(57)【要約】種々の様式で、植物の細胞中のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素の１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質によるフィードバック阻害を防止することにより、これらの植物、具体的には油性植物の油含有量を増加させる方法および手段を提供する。
2014531194.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の細胞中の油含有量を増加させる方法であって、前記植物の前記細胞中の色素体アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素の１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質によるフィードバック阻害を防止するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記フィードバック阻害の防止が、前記植物細胞、具体的には前記植物細胞の色素体に、前記植物の野生型アセチルＣｏＡカルボキシラーゼよりも前記フィードバック阻害に対する感受性の低いアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ変異体酵素またはそのサブユニットを提供することにより達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
より感受性の低いアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ変異体またはそのサブユニットが、前記植物細胞中の変異型対立遺伝子によってコードされる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
より感受性の低いアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ変異体またはそのサブユニットが、前記植物細胞に導入された導入遺伝子によってコードされる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記植物細胞に、炭素固定のために３−ヒドロキシプロピオン酸サイクルを使用する生物由来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素またはそのサブユニットが提供される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼまたはそのサブユニットが、スルフォロブス目、ケナルカエウム目、アーケオグロブス目、デスルフロコックス目、テルモプロテウス目、サーモコッカス目、またはハロバクテリウム目からなる群から選択される生物に由来する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼまたはそのサブユニットが、メタッロスパエラ・セドゥラ、アシディアヌス・ブリエレイ、スルホロブス・ソルファタリカス、スルホロブス・トコダイイ、スルホロブス・アシドカルダリウス、ケナルカエウム・シュンビオスム、アーケオグロブス・フルギダス、ハイパーサーマス・ブチリカス、スタフィロサーマス・マリナス、テルモフィルム・ペンデンス、イグニコックス・ホスピタリス、ピロバキュラム・アエロフィラム、ピロバキュラム・イスランディクム、ピロバキュラム・カリディフォンティス、ピロバキュラムフリオサス、ピロバキュラム・アビシ、ピロバキュラム・ホリコシイ、ハロアーキュラ・マリスモルツイ、ハロバクテリウム属種ＮＲＣ−１、ハロクアドラトゥム・ワルスビイ、ハロラブラム・ラクスプロファンディ（Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ  ｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉ）、またはナトロノモナス・ファラオニスからなる群から選択される生物に由来する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼまたはそのサブユニットが、メタッロスパエラ・セドゥラ、アシディアヌス・ブリエレイ、またはケナルカエウム・シュンビオスムからなる群から選択される生物に由来する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記植物細胞に、クロロフレクサス・オーランティアカス由来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素またはそのサブユニットが提供される、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記植物細胞に、配列番号４６〜１２８のいずれかのアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素またはそのサブユニットが提供される、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記植物細胞に、操作可能に連結されたＤＮＡ断片：
ａ）植物発現可能プロモーター、
ｂ）配列番号２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする１つ以上のコード領域、好ましくは異種コード領域、または、配列番号２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有し、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの酵素活性を有するコード領域、ならびに任意選択的に、
ｃ）植物細胞において機能する転写終結および／またはポリアデニル化領域、を含むＤＮＡ分子が提供される、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ分子が、葉緑体標的ペプチドをコードするＤＮＡ領域をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記コード領域が、３３１位のヌクレオチド〜１８６０位のヌクレオチドの配列番号１、１８６０位のヌクレオチド〜２３６０位のヌクレオチドの配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、もしくは配列番号１８のヌクレオチド配列、またはそれと７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のヌクレオチド配列同一性を有するコード領域を含む、請求項１１、または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記植物発現可能プロモーターが、色素体において発現されるプロモーターであり、前記終結および／またはポリアデニル化領域が、色素体において機能する転写終結領域である、請求項１１または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡ分子が、前記植物細胞の核ゲノムに組み込まれる、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＮＡ分子が、前記植物細胞の色素体のゲノムに組み込まれる、請求項１１，１３、または１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記フィードバック阻害の防止が、前記植物細胞の前記色素体中の１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質のレベルを低下させることにより達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記色素体中の１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質のレベルの前記低下が、前記細胞の前記色素体中のＦＡＴＡ酵素のレベルを増加させることにより達成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＦＡＴＡ酵素のレベルが、操作可能に連結されたＤＮＡ断片：
ａ）植物発現可能プロモーター、
ｂ）ＦＡＴＡ酵素をコードするＤＮＡ領域、および任意選択的に、
ｃ）植物細胞中で機能する転写終結および／またはポリアデニル化領域、を含むＤＮＡ分子を前記植物細胞に導入することにより増加される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＦＡＴＡ酵素は、配列番号２１のアミノ酸配列、またはそれと７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＦＡＴＡ酵素をコードする前記ＤＮＡ領域が、配列番号２０のいずれかのヌクレオチド配列からのヌクレオチド配列、またはそれと７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡ分子が、葉緑体標的ペプチドをコードするＤＮＡ領域をさらに含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記植物発現可能プロモーターが、色素体において発現されるプロモーターであり、前記終結および／またはポリアデニル化領域が、色素体において機能する転写終結領域である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記色素体中の１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質のレベルの前記低下は、前記植物細胞中のアシル−ＣｏＡ結合タンパク質のレベルを増加させることにより達成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記アシル−ＣｏＡ結合タンパク質のレベルが、操作可能に連結されたＤＮＡ断片：
ａ）植物発現可能プロモーター、
ｂ）アシル−ＣｏＡ結合タンパク質をコードするＤＮＡ領域、および任意選択的に、
ｃ）植物細胞において機能する転写終結および／またはポリアデニル化領域、を含むＤＮＡ分子を前記植物細胞に導入することにより増加される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記アシル−ＣｏＡ結合タンパク質が、配列番号２３もしくは配列番号２５のうちのいずれかのアミノ酸配列、またはそれと７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記植物細胞が、植物中に存在する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記植物の油貯蔵部において前記油含有量が増加する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記植物の種子において前記油含有量が増加する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記植物が、アブラナ属の油糧種子、ヒマワリ、ベニバナ、ダイズ、ヤシ、ヤトロファ、アマ、クランベ、カメリナ、トウモロコシ、ゴマ、トウゴマから選択される含油植物である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記植物が、ブラッシカ・ナプス、ブラッシカ・カンペストリス（ラパ）、ブラッシカ・ユンケア、ブラッシカ・カリナータである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
その色素体に、前記植物の野生型アセチルＣｏＡカルボキシラーゼよりも１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質によるフィードバック阻害に対する感受性の低い１つ以上のＡＣＣａｓｅ変異体酵素またはそのサブユニットを含む、植物。
【請求項３３】
前記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素またはそのサブユニットが、炭素固定のために３−ヒドロキシプロピオン酸サイクルを使用する生物に由来する、請求項３２に記載の植物。
【請求項３４】
前記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼまたはそのサブユニットが、スルフォロブス目、ケナルカエウム目、アーケオグロブス目、デスルフロコックス目、サーモプロテウス目、サーモコッカス目、またはハロバクテリウム目からなる群から選択される生物に由来する、請求項３３に記載の植物。
【請求項３５】
前記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼまたはそのサブユニットが、メタッロスパエラ・セドゥラ、アシディアヌス・ブリエレイ、スルホロブス・ソルファタリカス、スルホロブス・トコダイイ、スルホロブス・アシドカルダリウス、ケナルカエウム・シュンビオスム、アーケオグロブス・フルギダス、ハイパーサーマス・ブチリカス、スタフィロサーマス・マリナス、テルモフィルム・ペンデンス、イグニコックス・ホスピタリス、ピロバキュラム・アエロフィラム、ピロバキュラム・イスランディクム、ピロバキュラム・カリディフォンティス、ピロバキュラム・フリオサス、ピロバキュラム・アビシ、ピロバキュラム・ホリコシイ、ハロアーキュラ・マリスモルツイ、ハロバクテリウム属種ＮＲＣ−１、ハロクアドラトゥム・ワルスビイ、ハロラブラム・ラクスプロファンディ（Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ  ｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉ）、またはナトロノモナス・ファラオニスからなる群から選択される生物に由来する、請求項３４に記載の植物。
【請求項３６】
前記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼまたはそのサブユニットが、メタッロスパエラ・セドゥラ、アシディアヌス・ブリエレイ、またはケナルカエウム・シュンビオスムからなる群から選択される生物に由来する、請求項３３に記載の植物。
【請求項３７】
前記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素またはそのサブユニットが、クロロフレクサス・オーランティアカスに由来する、請求項３２に記載の植物。
【請求項３８】
操作可能に連結されたＤＮＡ断片：
ａ）植物発現可能プロモーター、
ｂ）配列番号２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、または１９のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする１つ以上のコード領域、好ましくは異種コード領域；あるいは、配列番号２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、もしくは１９、または配列番号４６〜１２８のいずれかのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有し、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの酵素活性を有するコード領域、ならびに任意選択的に、
ｃ）植物細胞において機能する転写終結および／またはポリアデニル化領域、を含むＤＮＡ分子を含む、請求項３２に記載の植物。
【請求項３９】
前記ＤＮＡ分子が、葉緑体標的ペプチドをコードするＤＮＡ領域をさらに含む、請求項３８に記載の植物。
【請求項４０】
前記コード領域が、３３１位のヌクレオチド〜１８６０位のヌクレオチドの配列番号１、１８６０位のヌクレオチド〜２３６０位のヌクレオチドの配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、もしくは配列番号１８のヌクレオチド配列、またはそれと７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のヌクレオチド配列同一性を有するコード領域を含む、請求項３８に記載の植物。
【請求項４１】
前記植物発現可能プロモーターが、色素体において発現されるプロモーターであり、前記終結および／またはポリアデニル化域が、色素体において機能する転写終結領域である、請求項３８または４０に記載の植物。
【請求項４２】
請求項３２〜請求項４１のいずれか１項に記載の植物の細胞、組織、油貯蔵組織、または種子。
【請求項４３】
請求項３１〜請求項４１のいずれか１項に記載の植物に由来する、油。
【請求項４４】
操作可能に連結されたＤＮＡ断片：
ａ）植物発現可能プロモーター、
ｂ）配列番号２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、または１９のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする１つ以上のコード領域、好ましくは異種コード領域；あるいは、配列番号２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、もしくは１９、または配列番号４６〜１２８のいずれかのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有し、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの酵素活性を有するコード領域、ならびに任意選択的に、
ｃ）植物細胞において機能する転写終結および／またはポリアデニル化領域、を含む、キメラＤＮＡ。
【請求項４５】
植物の細胞中の油含有量を増加させるための、植物の野生型アセチルＣｏＡカルボキシラーゼよりも１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質によるフィードバック阻害に対する感受性の低い、色素体アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ変異体酵素またはそのサブユニットの使用。
【請求項４６】
植物の野生型アセチルＣｏＡカルボキシラーゼよりも１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質によるフィードバック阻害に対する感受性の低いアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素の変異体またはそのサブユニットを単離する方法であって、
ａ）好ましくは植物から、フィードバック阻害感受性ＣｏＡカルボキシラーゼに由来する多数の変異体アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素を作製するステップと、
ｂ）１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質または１８：１Ｔｗｅｅｎの存在下で、前記変異体アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素の各々の酵素活性を同定するステップと、
ｃ）１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質の存在下で前記フィードバック阻害感受性ＣｏＡカルボキシラーゼの酵素活性よりも高い酵素活性を有するこれらの酵素変異体を単離するステップと、を含む、方法。
【請求項４７】
植物の細胞中の油含有量を増加させる方法であって、
ａ）請求項４５に記載の方法に従って、植物の野生型アセチルＣｏＡカルボキシラーゼよりも１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質によるフィードバック阻害に対する感受性の低いアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素の変異体またはそのサブユニットを単離するステップと、
ｂ）前記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素の変異体またはそのサブユニットを、好ましくは、前記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ構築物からの転写により、植物に導入するステップと、を含む、方法。
【請求項４８】
植物の野生型アセチルＣｏＡカルボキシラーゼよりも１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質によるフィードバック阻害に対する感受性の低い色素体アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ変異体酵素またはそのサブユニットをコードする変異型対立遺伝子を含む植物細胞または植物を単離する方法であって、
ａ）各々が多数の変異体アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素もしくはそのサブユニットを含む、植物細胞または植物の集団を提供するステップと、
ｂ）１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質または１８：１Ｔｗｅｅｎの存在下で、前記変異体アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素またはそのサブユニットの各々の酵素活性を同定するステップと、
ｃ）１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質の存在下で前記フィードバック阻害感受性ＣｏＡカルボキシラーゼの酵素活性よりも高い酵素活性を有する酵素変異体を含むこれらの植物細胞または植物を単離するステップと、を含む、方法。
【請求項４９】
請求項４８に記載の方法によって得られる、植物細胞または植物。
【請求項５０】
食物、飼料、または産業製品を生成する方法であって、
ａ）請求項３２〜４１、および４９のいずれか１項に記載の植物またはその部分を得ることと、
ｂ）前記植物またはその部分から前記食物、飼料、または産業製品を調製することと、を含む、方法。
【請求項５１】
ａ）前記食物または飼料が、油、粗びき粉、穀物、デンプン、小麦粉、もしくはタンパク質であるか、または
ｂ）前記産業製品が、バイオ燃料、繊維、産業用化学物質、医薬品、もしくは栄養補助食品である、請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国エネルギー省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ）から授与された契約番号ＤＥ−ＡＣ０２−９８ＣＨ１０８８６に基づいて米国政府の支援を得てなされたものである。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
関連出願の相互参照および配列表の組み込み
【０００２】
本出願は、２０１１年６月２８日に出願された米国仮特許出願６１／５０２，１６３号の優先権の利益を主張するものであり、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。「５８７６４０００５１０ＰＣＴ」と称される２０１２年６月１５日に作製された２７６ｋｂ（ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓオペレーティングシステムにおいて測定）のファイルに含まれる配列表は、本明細書とともに出願され、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、農学の分野に関する。より具体的には、本発明は、ＦＡＴＡ遺伝子またはアセチルＣｏＡ結合タンパク質の過剰発現により、フィードバック非感受性またはより感受性の低いアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素を提供することを含む種々の様式で、植物の細胞中のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素の１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質によるフィードバック阻害を防止することにより、これらの植物、具体的には油性植物の油含有量を増加させる方法および手段を提供する。
【背景技術】
【０００４】
植物油は、ヒトおよび動物の食生活、ならびに多くの産業用途（バイオ燃料またはバイオディーゼルを生成するための再生可能な源として等）において広く使用されているため、経済的にますます重要になってきている。最も広く使用されている植物油は、ヤシ（２００８年の世界消費量は４，１３１万トン）またはダイズ（４，１２８万トン）に由来し、ナタネ油（１，８２４）、ヒマワリ油（９９１）、ピーナッツ油（４８２）、綿実油（４９９）、パーム核油（４８５）、ヤシ油（３４８）、およびオリーブ油（２８４）がそれに続く。他の重要なトリグリセリド油は、トウモロコシ油、グレープシード油、ヘーゼルナッツ油、亜麻仁油、米糠油、ベニバナ油、およびゴマ油を含む。
【０００５】
植物当たりの油収量を増加させることは、これらの異なる目的に使用されるより多くの油を提供するための有望なアプローチであると考えられ、一方の食物および飼料として使用するための油と、他方の産業用途のための油との間の土地をめぐる競争を回避する。植物における油の合成は、脂肪酸の産生によって制限されると考えられ、脂肪酸生合成の最初の関与段階、すなわち、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼによるマロニルＣｏＡを産生するためのアセチルＣｏＡのカルボキシル化は、律速段階であることが示唆されている。
【０００６】
Ｒｏｅｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９７（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１３，７５−８１）は、シロイヌナズナのホモマーアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの発現、およびタンパク質にナタネの色素体を標的とさせることにより、種子油に５％の増加をもたらしたことを記載した。
【０００７】
Ｍａｄｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００２（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４３，１５１８−１５２５）は、色素体形質転換による色素体コードのアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ・カルボキシトランスフェラーゼβサブユニット（ａｃｃＤ）の過剰発現が、タバコの葉の油含有量の５〜１０％の増加を誘導したことを報告した。
【０００８】
米国特許第５，９６２，７６７号は、２５１ｋＤの細胞質アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードするシロイヌナズナのアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子の単離について記載している。
【０００９】
ＷＯ９４／１７１８８は、植物のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼに関するコードを含む別のＤＮＡ配列、ならびに前記ＤＮＡ配列の対立遺伝子および誘導体について開示している。
【００１０】
ＷＯ９５／１３３９０は、植物チオエステラーゼ、特に、パルミトイル−ＡＣＰ基質に対して実質的な活性を有する植物のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼに関する。植物種子細胞における植物パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現に有用なＤＮＡ構築物について記載している。トランスジェニック植物においてそのような構築物が発現される場合、そのような構築物は、他の植物組織と比較して、種子組織中の植物パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現を優先的に誘導することができる調節エレメントの制御下で対象となる植物パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするＤＮＡ配列を含有するであろう。この文献はまた、植物種子細胞において産生される遊離脂肪酸の割合を変更するために、植物パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするＤＮＡ配列を使用する方法についても記載している。本明細書に例示される植物パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ配列は、クフェア、ニラ、マンゴー、およびニレを含む。これらのパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ配列の発現の結果として、これらの種子中のＣ１６：０脂肪酸のレベルを増加させたトランスジェニック植物も提供される。
【００１１】
ＷＯ００／０９７２１は、ダイズ種子に見られる総トリグリセリドの構成成分としてのステアリン酸を増加させるための方法に関する。該方法は、一般に、転写の５’から３’の方向にダイズ植物種子細胞において機能するプロモーター、Ｃ１８：０アシル−ＡＣＰ基質で実質的な活性を有するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列、および植物細胞において機能する転写終結領域を含むＤＮＡ構築物をゲノム中に組み込んだダイズ植物を成長させることを含む。この文献はまた、種子トリグリセリドに見られる総脂肪酸の構成成分として、約３３重量パーセント以上のステアリン酸を含むダイズ種子も提供する。
【００１２】
ＵＳ２０１０／０３３３２９は、遺伝子操作した植物において低温耐性を向上させるためにアシル−ＣｏＡ結合タンパク質を使用する方法について記載している。
【００１３】
ＵＳ２００９／０２９１４７９は、微生物宿主における脂質産生量を改変するためのアシル−ＣｏＡ結合タンパク質の操作について記載している。
【００１４】
ＵＳ７，８８０，０５３は、ファイトレメディエーションにおいて植物由来のアシル−補酵素Ａ−結合タンパク質を発現する形質転換植物を使用する方法について記載している。
【００１５】
ＵＳ２００８／０２２９４５１は、改善された特性を有する植物を生成するための、植物における微生物タンパク質の発現について記載している。
【００１６】
生合成経路のフィードバック制御は、代謝産物の酵素に対する供給の要求を伝えることにより細胞の効率を最適化する。典型的には、フィードバックは、下流の代謝産物が堆積し、それを産生するための律速酵素の阻害を引き起こし、それによって、経路全体の流れが制限された場合に起こる。残念ながら、そのような機構は、未知であるかまたはほとんど解明されていない場合、良好な代謝工学の障壁として作用する可能性がある。植物の脂肪酸生合成は、フィードバック阻害を示す操作を標的とするそのような経路の１つである（Ｒａｍｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３６４，３８５−３９１、Ｓｈｉｎｔａｎｉ  ａｎｄ  Ｏｈｌｒｏｇｇｅ  １９９５，Ｐｌａｎｔ  Ｊ，７，５７７−５８７、Ｔｅｒｚａｇｈｉ  １９８６  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，８２，７８０−７８６．）。しかしながら、フィードバックの機構および標的（複数可）は、まだ特定されていない。この基本的なプロセスをより徹底的に理解することは、植物における脂肪酸の産生量を増加させる上で、将来の工学的な試みを設計および分析する上で役立つであろう。
【００１７】
動物、真菌、および細菌は、脂肪酸合成のフィードバック制御のための既知の機構を有する。これらの間に共通する特徴は、単独で脂肪酸合成のためのマロニルＣｏＡを産生し、脂肪酸合成の律速段階であると見なされている酵素、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ、ＥＣ６．４．１．２）の阻害である（Ｃｒｏｎａｎ  ａｎｄ  Ｗａｌｄｒｏｐ  ２００２  Ｐｒｏｇ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ，４１，４０７−４３５、Ｏｈｌｒｏｇｇｅ  ａｎｄ  Ｊａｗｏｒｓｋｉ  １９９７  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，４８，１０９−１３６．、Ｗａｋｉｌ  ｅｔ  ａｌ．１９８３  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，５２，５３７−５７９）。ラットおよび酵母において、脂肪酸合成の最終生成物であるパルミトイル−ＣｏＡがＡＣＣａｓｅに結合してそれを阻害する（Ｏｇｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９７８  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，８９，３３−４１．）。さらに、酵母ＡＣＣａｓｅおよび脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の遺伝子発現は、長鎖脂肪酸に一晩暴露することにより、アシル−ＣｏＡ依存的に低下する（Ｆｅｄｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，４０７，２１９−２３０）。細菌も同様の応答を有する。大腸菌ＡＣＣａｓｅおよびβ−ケトアシル−アシルキャリアータンパク質合成酵素（ＫＡＳ）は、両方とも、脂肪酸合成の中間体である長鎖（Ｃ１６−Ｃ１８）アシル−アシルキャリアータンパク質（アシル−ＡＣＰ）によって阻害される（Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｃｒｏｎａｎ  ２００１  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８３，１４９９−１５０３、Ｈｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｒｏｃｋ  １９９５  Ｊ  Ｂｉｏｉ  Ｃｈｅｍ，２７０，１５５３１−１５５３８）。外因性脂肪酸の存在下における増殖も、長鎖アシル−ＡＣＰまたはアシル−ＣｏＡと転写因子との相互作用により細菌の脂肪酸生合成遺伝子（ＡＣＣａｓｅを含む）の抑制をもたらす（Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｒｏｃｋ  ２００９  Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ，５０  Ｓｕｐｐｌ，Ｓ１１５−１１９）。これらの研究に基づいて、新規脂肪酸に対するより少ない要求は、アシル−ＡＣＰおよび／またはアシル−ＣｏＡの堆積によって通知されるという図が浮かび上がった。これらの代謝産物は、ＡＣＣａｓｅをアロステリックに阻害し、したがって、脂肪酸合成に使用されるマロニルＣｏＡの産生を急速に制限することができる。ＡＣＣａｓｅの阻害後にアシル−ＡＣＰおよびアシル−ＣｏＡのレベルが低下しない条件では、全体的な脂肪酸生合成経路のための遺伝子の発現が抑制される。以上を総合すると、これらの応答は、細胞要求における急性および慢性の低減期間中に不必要な脂肪酸の産生を防止する。
【００１８】
植物における脂肪酸合成のフィードバック制御のための機構は、まだ特定されていない。Ｔｗｅｅｎ脂肪酸エステルは、脂肪酸を補給するのに効果的であり（Ｔｅｒｚａｇｈｉ  １９８６  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，８２，７７１−７７９．）、タバコ（Ｓｈｉｎｔａｎｉ  ａｎｄ  Ｏｈｌｒｏｇｇｅ  １９９５，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．７，５７７−５８７）およびダイズ（Ｔｅｒｚａｇｈｉ  １９８６  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，８２，７８０−７８６）の細胞培養液ならびに油ヤシおよびオリーブのカルス（Ｒａｍｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３６４，３８５−３９１）においてフィードバック阻害を引き起こすことが示されている。タバコにおけるアシル−ＡＣＰの合成速度およびＡＣＣａｓｅタンパク質レベルに基づいて、ＳｈｉｎｔａｎｉとＯｈｌｒｏｇｇｅは、フィードバックは、ＡＣＣａｓｅ、および場合によってはＦＡＳの生化学的または転写後修飾によって起こるものであると仮説を立てた。精製したトウモロコシおよび珪藻ＡＣＣａｓｅは、パルミトイル−ＣｏＡによって阻害されたが（Ｎｉｋｏｌａｕ  ａｎｄ  Ｈａｗｋｅ  １９８４  Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，２２８，８６−９６、Ｒｏｅｓｓｌｅｒ  １９９０  Ｐｌａｎｔａ，１９８，５１７−５２５）、長鎖アシル−ＡＣＰは、トウゴマおよびエンドウマメ由来の部分的に精製されたＡＣＣａｓｅを阻害することができなかった（Ｒｏｅｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｐｌａｎｔａ，１９８，５１７−５２５）。しかしながら、中鎖アシル−ＡＣＰは、キャノーラおよびホウレンソウの粗抽出物においてＫＡＳ活性を阻害した（Ｂｒｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｐｌａｎｔａ，１９８，２７１−２７８）。フィードバック中のアシル−ＣｏＡまたはアシル−ＡＣＰの定常状態プールにおける変化が測定されていないため、これらの結果のフィードバック阻害との関連性は不明である。色素体および細胞質中に、それぞれ脂肪酸の合成および伸長に関与する、構造的に異なるＡＣＣａｓｅおよびＦＡＳ系が存在することから、植物における状況はさらに複雑である。細胞質の伸長経路がフィードバックに関与しているかどうかは未知である。以前の研究は、栄養組織または発芽した実生を使用して細胞培養を確立したため、油糧種子等の高い脂肪酸合成率が必要とされる組織においてフィードバックが起こるかどうかも分かっていない。
【００１９】
よって、従来技術には、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼのアイソフォームが植物においてフィードバック阻害に供されること、およびその分子がフィードバック阻害の原因であることに関する教示が不足している。本明細書において後述するように、この問題は解決され、異なる実施形態および特許請求の範囲から明白であるように、脂肪酸合成および油脂合成を増加させる目的で、植物細胞、植物部分、植物組織、種子、および植物におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのフィードバック阻害を防止または回避することができる。
【発明の概要】
【００２０】
一実施形態において、本発明は、植物の細胞中の油含有量を増加させる方法であって、植物の細胞中の色素体アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素の１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質によるフィードバック阻害を防止するステップを含む、方法に関する。このフィードバック阻害の防止は、植物細胞に、植物の野生型アセチルＣｏＡカルボキシラーゼよりもフィードバック阻害に対する感受性の低いアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ変異体酵素またはそのサブユニットを提供すること（植物細胞の色素体に提供することを含む）により達成することができる。より感受性の低いアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ変異体酵素またはそのサブユニットは、植物細胞中の変異型対立遺伝子によってコードされ得るか、または植物細胞に導入された導入遺伝子によってコードされ得る。
【００２１】
本発明の別の実施形態において、植物の細胞中の油含有量を増加させる方法であって、植物の細胞中の色素体アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素の１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質によるフィードバック阻害を防止するステップを含み、植物細胞に、スルフォロブス目、ケナルカエウム目、アーケオグロブス目、デスルフロコックス目、サーモプロテウス目、サーモコッカス目、またはハロバクテリウム目からなる群から選択される生物のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼまたはそのサブユニット等の、炭素固定のために３−ヒドロキシプロピオン酸サイクルを使用する生物由来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素またはその１つ以上のサブユニットが提供される、方法が提供される。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼまたはそのサブユニットは、メタッロスパエラ・セドゥラ、アシディアヌス・ブリエレイ、スルホロブス・ソルファタリカス、スルホロブス・トコダイイ、スルホロブス・アシドカルダリウス、ケナルカエウム・シュンビオスム、アーケオグロブス・フルギダス、ハイパーサーマス・ブチリカス、スタフィロサーマス・マリナス、テルモフィルム・ペンデンス、イグニコックス・ホスピタリス、ピロバキュラム・アエロフィラム、ピロバキュラム・イスランディクム、ピロバキュラム・カリディフォンティス、ピロバキュラムフリオサス、ピロバキュラム・アビシ、ピロバキュラム・ホリコシイ、ハロアーキュラ・マリスモルツイ、ハロバクテリウム属種ＮＲＣ−１、ハロクアドラトゥム・ワルスビイ、ハロラブラム・ラクスプロファンディ（Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ  ｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉ）、またはナトロノモナス・ファラオニスからなる群から選択される生物に由来し得る。また、植物細胞には、クロロフレクサス・オーランティアカス由来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素またはそのサブユニットが提供されてもよい。
【００２２】
本発明のさらに別の実施形態において、植物細胞に、以下の操作可能に連結されたＤＮＡ断片を含むＤＮＡ分子を提供するステップを含む、植物の細胞中の油含有量を増加させるための方法が提供される：
ａ）植物発現可能プロモーター、
ｂ）配列番号２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする１つ以上のコード領域、好ましくは異種コード領域；または、配列番号２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有し、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの酵素活性を有するコード領域；ならびに任意選択的に、
ｃ）植物細胞において機能する転写終結および／またはポリアデニル化領域。
ＤＮＡ分子は、葉緑体標的ペプチドをコードするＤＮＡ領域をさらに含み得る。コード領域は、３３１位のヌクレオチド〜１８６０位のヌクレオチドの配列番号１、１８６０位のヌクレオチド〜２３６０位のヌクレオチドの配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、もしくは配列番号１８のヌクレオチド配列、またはそれと７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のヌクレオチド配列同一性を有するコード領域から選択され得る。具体的な実施形態において、植物発現可能プロモーターは、色素体において発現されるプロモーターであり、終結および／またはポリアデニル化領域は、色素体において機能する転写終結領域である。ＤＮＡ分子は、植物細胞の核ゲノムに組み込まれてもよいか、または代替として、ＤＮＡ分子は、植物細胞の色素体のゲノムに組み込まれてもよい。植物細胞はまた、各々がアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素の１つのサブユニットを発現する、１つより多くのＤＮＡ分子を含有し得る。
【００２３】
本発明はまた、ある方法を提供する：植物の細胞中の油含有量を増加させる方法であって、植物の細胞中の色素体アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素の１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質によるフィードバック阻害を防止するステップを含み、ここでフィードバック阻害の防止は、植物細胞中の色素体中の１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質のレベルを低下させることにより達成される、方法が提供される。色素体中の１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質のレベルを低下させるための１つの代替実施形態は、細胞の色素体中のＦＡＴＡ酵素のレベルを増加させることによるものである。この目的を達成するために、配列番号２１のアミノ酸配列、またはそれと７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有するＦＡＴＡ酵素等のＦＡＴＡ酵素をコードするＤＮＡ領域と操作可能に連結された植物発現可能プロモーターと、任意選択的に、植物細胞において機能する転写終結および／またはポリアデニル化領域とを含むＤＮＡ分子が、植物細胞に導入されてもよい。ここでも同様に、ＤＮＡ分子は、葉緑体標的ペプチドをコードするＤＮＡ領域をさらに含み得るか、または植物発現可能プロモーターは、色素体において発現されるプロモーターであり、終結および／またはポリアデニル化領域は、転写終結領域である。
【００２４】
本発明のさらに別の実施形態において、植物の細胞中の油含有量を増加させるための方法であって、植物の細胞中の色素体アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素の１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質によるフィードバック阻害を防止するステップを含み、ここで色素体中の１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質のレベルの低下は、植物細胞中のアシル−ＣｏＡ結合タンパク質のレベルを増加させることにより達成される、方法が提供される。この目的を達成するために、ＤＮＡ分子が植物細胞に導入されてもよく、ここで該ＤＮＡ分子は、アシル−ＣｏＡ結合タンパク質をコードするＤＮＡ領域と操作可能に連結された植物発現可能プロモーターと；任意選択的に、植物細胞において機能する転写終結および／またはポリアデニル化領域とを含む。アシル−ＣｏＡ結合タンパク質は、配列番号２３もしくは配列番号２５のうちのいずれかのアミノ酸配列、またはそれと７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
【００２５】
記載される方法のうちのいずれかの植物細胞は、植物に再生することができる。したがって、本発明はまた、植物細胞が植物中に存在し、植物の種子等の油貯蔵部における油含有量が増加する、本明細書において前述したような方法も提供する。  
【００２６】
この方法は、いずれの植物にも適用され得るが、ブラッシカ・ナプス、ブラッシカ・カンペストリス（ラパ）、ブラッシカ・ユンケア、またはブラッシカ・カリナータを含むアブラナ属の油糧種子、ヒマワリ、ベニバナ、ダイズ、ヤシ、ヤトロファ、アマ、クランベ、カメリナ、トウモロコシ、ゴマ、トウゴマ等の含油植物に特に有用である。
【００２７】
本発明はさらに、炭素固定のために３−ヒドロキシプロピオン酸サイクルを使用する生物由来のＣｏＡカルボキシラーゼ酵素またはそのサブユニット等の、植物の野生型アセチルＣｏＡカルボキシラーゼよりも１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質によるフィードバック阻害に対する感受性の低い、１つ以上の色素体ＡＣＣａｓｅ変異体酵素またはそのサブユニットを含む植物を提供し、具体的には、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼまたはそのサブユニットは、スルフォロブス目、ケナルカエウム目、アーケオグロブス目、デスルフロコックス目、サーモプロテウス目、サーモコッカス目、またはハロバクテリウム目、例えば、メタッロスパエラ・セドゥラ、アシディアヌス・ブリエレイ、スルホロブス・ソルファタリカス、スルホロブス・トコダイイ、スルホロブス・アシドカルダリウス、ケナルカエウム・シュンビオスム、アーケオグロブス・フルギダス、ハイパーサーマス・ブチリカス、スタフィロサーマス・マリナス、テルモフィルム・ペンデンス、イグニコックス・ホスピタリス、ピロバキュラム・アエロフィラム、ピロバキュラム・イスランディクム、ピロバキュラム・カリディフォンティス、ピロバキュラムフリオサス、ピロバキュラム・アビシ、ピロバキュラム・ホリコシイ、ハロアーキュラ・マリスモルツイ、ハロバクテリウム属種ＮＲＣ−１、ハロクアドラトゥム・ワルスビイ、ハロラブラム・ラクスプロファンディ（Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ  ｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉ）、またはナトロノモナス・ファラオニスからなる群から選択される生物に由来する。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素またはそのサブユニットは、クロロフレクサス・オーランティアカスに由来してもよい。
【００２８】
さらに代替の実施形態において、本発明は、以下の操作可能に連結されたＤＮＡ断片を含むＤＮＡ分子を含む植物を提供する：
ａ．植物発現可能プロモーター、
ｂ．配列番号２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする１つ以上のコード領域、好ましくは異種コード領域；または、配列番号２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有し、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの酵素活性を有するコード領域、例えば、３３１位のヌクレオチド〜１８６０位のヌクレオチドの配列番号１、１８６０位のヌクレオチド〜２３６０位のヌクレオチドの配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、もしくは配列番号１８のヌクレオチド配列、またはそれと７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のヌクレオチド配列同一性を有するコード領域；ならびに任意選択的に、
ｃ．植物細胞において機能する転写終結および／またはポリアデニル化領域。
ＤＮＡ分子は、葉緑体標的ペプチドをコードするＤＮＡ領域をさらに含み得るか、植物発現可能プロモーターは、色素体において発現されるプロモーターであり得、終結および／またはポリアデニル化領域は、色素体において機能する転写終結領域であり得る。植物細胞はまた、各々がアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素の１つのサブユニットを発現する、１つより多くのＤＮＡ分子を含有し得る。
【００２９】
本発明はさらに、本明細書に記載されるような植物の細胞、組織、油貯蔵組織、または種子、およびそのような植物から生成される油を提供する。
【００３０】
以下の操作可能に連結されたＤＮＡ断片を含むキメラＤＮＡを提供することが、本発明のさらに別の目的である：
ａ．植物発現可能プロモーター、
ｂ．配列番号２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する１つ以上のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする１つ以上のコード領域、好ましくは異種コード領域；または、配列番号２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有し、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの酵素活性を有するコード領域；ならびに任意選択的に、
ｃ．植物細胞において機能する転写終結および／またはポリアデニル化領域。
【００３１】
よって、本発明は、植物の細胞中の油含有量を増加させるために、植物の細胞の色素体中の野生型アセチルＣｏＡカルボキシラーゼよりも１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質によるフィードバック阻害に対する感受性の低いアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ変異体酵素またはそのサブユニットの使用に関する。
【００３２】
本発明のさらに別の実施形態において、植物の野生型アセチルＣｏＡカルボキシラーゼよりも１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質によるフィードバック阻害に対する感受性の低い色素体アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素の変異体またはそのサブユニットを単離する方法が提供され、該方法は、
ａ．好ましくは植物から、特に植物の色素体から、フィードバック阻害感受性ＣｏＡカルボキシラーゼに由来する多数の変異体アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素またはそのサブユニットを作製するステップと、
ｂ．１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質または１８：１Ｔｗｅｅｎの存在下で、変異体アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素またはそのサブユニットの各々の酵素活性を同定するステップと、
ｃ．１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質または１８：１Ｔｗｅｅｎの存在下でフィードバック阻害感受性ＣｏＡカルボキシラーゼの酵素活性よりも高い酵素活性を有するこれらの酵素変異体またはそのサブユニットを単離するステップと、を含む。
【００３３】
本発明はまた、植物の細胞中の油含有量を増加させる方法であって、植物の野生型アセチルＣｏＡカルボキシラーゼよりも１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質によるフィードバック阻害に対する感受性の低いアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素の変異体またはそのサブユニットを単離するステップと；好ましくは、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼまたはそのサブユニットをコードするＤＮＡ構築物からの転写により、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素の変異体またはそのサブユニットを植物の細胞に導入するステップとを含む、方法を提供する。
【００３４】
本発明のさらに別の目的は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ変異体酵素、例えば、植物の野生型アセチルＣｏＡカルボキシラーゼよりも１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質によるフィードバック阻害に対する感受性の低い色素体アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ変異体酵素またはそのサブユニットをコードする変異型対立遺伝子を含む植物細胞または植物を単離する方法であって、
ａ．多数の変異体アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素もしくはそのサブユニットを含む植物細胞または植物の集団を提供するステップと、
ｂ．１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質または１８：１Ｔｗｅｅｎの存在下で、変異体アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素またはそのサブユニットの各々の酵素活性を同定するステップと、
ｃ．１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質の存在下でフィードバック阻害感受性ＣｏＡカルボキシラーゼの酵素活性よりも高い酵素活性を有する酵素変異体またはそのサブユニットを含むこれらの植物細胞または植物を単離するステップとを含む、方法、およびこの方法によって得られた植物細胞または植物である。
【００３５】
本発明はさらに、本明細書に記載されるような植物を得るステップと、植物またはその部分から、食物、飼料、または産業製品を調製するステップとを含む、食物、飼料、または産業製品を生成する方法に関する。食物または飼料は、油、粗びき粉、穀物、デンプン、小麦粉、もしくはタンパク質であり得るか、または産業製品は、バイオ燃料、繊維、産業用化学物質、医薬品、もしくは栄養補助食品であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１−１】種々の濃度のＴｗｅｅｎ−８０で増殖させた細胞の（ａ）増殖、（ｂ）タンパク質組成、および（ｃ）脂質プロファイル。
【図１−２】種々の濃度のＴｗｅｅｎ−８０で増殖させた細胞の（ａ）増殖、（ｂ）タンパク質組成、および（ｃ）脂質プロファイル。
【図２】種々の濃度のＴｗｅｅｎ−８０を用いた増殖から８日後のＢ．ナプス細胞中の脂肪酸含有量。（ａ）極性脂質中の脂肪酸、（ｂ）トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）中の脂肪酸、（ｃ）総脂肪酸含有量。全てのデータは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）である。ＦＷは新鮮重量を表す。
【図３】Ｂ．ナプス細胞による１３Ｃ−オレオイル−Ｔｗｅｅｎからの脂肪酸摂取量の定量化。細胞に１０ｍＭ  １３Ｃ−オレオイル−Ｔｗｅｅｎを補給したときの、１３Ｃ−脂肪酸の（ａ）極性脂質および（ｂ）トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）への出現の経時変化。暗色領域は、非標識の内因性脂肪酸であり、明色領域は、Ｔｗｅｅｎからの１３Ｃ−脂肪酸である。個々の脂肪酸種は、各グラフの左上角に列挙される。全てのデータは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）である。ＦＷは新鮮重量を表す。
【図４】Ｔｗｅｅｎ−８０の存在下における、１４Ｃ−アセテートによる脂質標識のＢ．ナプス細胞による阻害。（ａ）１０ｍＭ  Ｔｗｅｅｎ−８０の存在下における、総脂質への１４Ｃ−アセテートの取り込みを示す経時変化。（ｂ）種々の濃度のＴｗｅｅｎ−８０に対する暴露から３時間後の総脂質の１４Ｃ−アセテートによる標識。（ｃ）Ｔｗｅｅｎ−８０を除去し、続いて１０ｍＭ  Ｔｗｅｅｎ−８０に３時間暴露した後の、１４Ｃ−アセテートによる総脂質の標識の経時変化。全てのデータは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）である。
【図５】Ｔｗｅｅｎ−８０の存在下または非存在下における、（ａ）ステロールおよび（ｂ）遊離脂肪酸への１４Ｃ−アセテートの取り込み。
【図６−１】Ｔｗｅｅｎ−８０を補給してから３時間後のＢ．ナプス細胞中の色素体ＡＣＣａｓｅの特異的阻害。（ａ）１０ｍＭ  Ｔｗｅｅｎ−８０を補給してから３時間後の、個々の脂肪酸への相対的な１４Ｃ−アセテートの取り込み。（ｂ）１０ｍＭ  Ｔｗｅｅｎ−８０を補給してから３時間後の、種々の濃度のハロキシホップを補給した細胞による総脂質への１４Ｃ−アセテートの取り込み。（ｃ）１０ｍＭ  Ｔｗｅｅｎ−８０を補給してから３時間後の、１４Ｃ−マロネートおよび１４Ｃ−アセテートから１６および１８炭素脂肪酸への標識の取り込み。全てのデータは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）である。
【図６−２】Ｔｗｅｅｎ−８０を補給してから３時間後のＢ．ナプス細胞中の色素体ＡＣＣａｓｅの特異的阻害。（ａ）１０ｍＭ  Ｔｗｅｅｎ−８０を補給してから３時間後の、個々の脂肪酸への相対的な１４Ｃ−アセテートの取り込み。（ｂ）１０ｍＭ  Ｔｗｅｅｎ−８０を補給してから３時間後の、種々の濃度のハロキシホップを補給した細胞による総脂質への１４Ｃ−アセテートの取り込み。（ｃ）１０ｍＭ  Ｔｗｅｅｎ−８０を補給してから３時間後の、１４Ｃ−マロネートおよび１４Ｃ−アセテートから１６および１８炭素脂肪酸への標識の取り込み。全てのデータは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）である。
【図７】（ａ）ハロキシホップ、（ｂ）ホスファターゼ処理および２−オキソグルタル酸、ならびに（ｃ）Ｔｗｅｅｎ−８０が、粗細胞抽出物のＡＣＣａｓｅ酵素活性に及ぼす影響。
【図８】マロネートが、（ａ）極性脂質および（ｂ）ＴＡＧ中の脂肪酸含有量、および（ｃ）脂質の１４Ｃ−アセテートによる標識に及ぼす影響。
【図９】Ｔｗｅｅｎ−８０を補給してから３時間後の、Ｂ．ナプス細胞中の脂質中間体の定量化。１０ｍＭ  Ｔｗｅｅｎ−８０を補給してから３時間後の、細胞中の（ａ）遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、（ｂ）アシル−ＡＣＰ、および（ｃ）アシル−ＣｏＡの含有量。存在する場合、数字は、１０ｍＭ  １３Ｃ−オレオイル−Ｔｗｅｅｎを補給してから３時間後に１３Ｃによって標識された１８：１のパーセントを表す。全てのデータは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）である。
【図１０】脂質中間体が粗Ｂ．ナプス細胞抽出物のＡＣＣａｓｅ活性に及ぼす影響。（ａ）１０μΜ遊離脂肪酸が粗抽出物のＡＣＣａｓｅ活性に及ぼす影響。（ｂ）Ｂ．ナプス１６：０−および１８：１−ＡＣＰが粗抽出物のＡＣＣａｓｅ活性に及ぼす影響。（ｃ）種々の長鎖アシル−ＣｏＡが粗抽出物のＡＣＣａｓｅ活性に及ぼす影響。全てのデータは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）である。
【図１１】脂肪酸合成のフィードバック阻害として提案される機構のモデル。  色素体ＡＣＣａｓｅは、１８：１−ＡＣＰおよび１８：１−ＣｏＡによって阻害される。これらの代謝産物は、色素体内の新規脂肪酸合成の産物であり、Ｔｗｅｅｎ−１８：１によって提供される外因性脂肪酸から合成される。１８：１−ＡＣＰまたは１８：１−ＣｏＡを生成または消費することができ、したがってその制御に関与し得る反応が矢印で示される。
【図１２】ＡＣＣａｓｅサブユニットを含まない骨格Ｔ−ＤＮＡベクター（ＥＶＬ：空ベクター系）で形質転換したアラビドプシス・サリアナ系統の種子油含有量と比較した、ケナルカエウム・シュンビオスムのＡＣＣａｓｅサブユニット（ＡＣＣａｓｅ系）を過剰発現するアラビドプシス・サリアナ系統の種子油含有量。系列当たり３つの種子サンプルの分析に基づいて、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）濃度を決定した。分析した種子は、Ｔ２−種子であった。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、脂肪酸合成における初期段階のフィードバック阻害を生じさせる標的および分子の同定に基づいている。特に、実施例において後に実証されるように、本発明者は、植物において、フィードバック阻害に供されるのは、具体的には、色素体のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのヘテロマー型であること、ならびに、エフェクター分子は、具体的には、オレオイル−ＡＣＰおよびオレオイル−ＣｏＡであることを同定した。
【００３８】
したがって、本発明は、植物の細胞中の油含有量を増加させるための方法であって、前記植物の前記細胞中の色素体アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素の１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質によるフィードバック阻害を防止するステップを含む、方法を提供する。
【００３９】
本発明の第１の実施形態において、植物細胞、具体的には、植物細胞の色素体に、該植物の対応する野生型アセチルＣｏＡカルボキシラーゼよりも前記フィードバック阻害に対する感受性の低いアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ変異体酵素またはそのサブユニットを提供することにより、フィードバック阻害が防止される。
【００４０】
本明細書において使用される場合、「アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ」（ＡＣＣ）Ｅ．Ｃ．番号６．４．１．２は、脂肪酸生合成における第１の関与触媒段階、すなわち、アセチルＣｏＡの不可逆的カルボキシル化を触媒して、その２つの触媒活性であるビオチンカルボキシラーゼ（ＢＣ）およびカルボキシルトランスフェラーゼ（ＣＴ）によりマロニルＣｏＡを産生する、ビオチン依存性酵素である。初期の部分的反応は、ビオチンカルボキシラーゼによって触媒され、炭酸水素およびＡＴＰを使用して、リジン残基を介してビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）に結合するビオチン補欠分子族を、カルボキシホスフェート中間体を介してカルボキシル化する。
ＨＣＯ３−＋ＡＴＰ＋ＢＣＣＰ＝＞ＡＤＰ＋Ｐｉ＋ＢＣＣＰ−ＣＯＯ−
次いで、カルボキシル基がアクセプターであるアセチル補酵素Ａに転移されてマロニル補酵素Ａを生成する（カルボキシルトランスフェラーゼによって触媒される反応）。
ＢＣＣＰ−ＣＯＯ−＋アセチル−ＣｏＡ＝＞マロニルＣｏＡ＋ＢＣＣＰ
ＡＣＣは、古細菌、細菌、酵母、真菌、植物、動物、およびヒトを含むほとんどの生命体において発見されている。ほとんどの真核生物において、ＡＣＣは、ＢＣ、ＢＣＣＰ、およびＣＴの活性が大きなポリペプチド（＞２００ｋＤａ）に位置する、マルチドメイン酵素（ホモマー型）である。原核生物は、異なる遺伝子によってコードされるいくつかのポリペプチドからなるマルチサブユニットＡＣＣを有する。ビオチンカルボキシラーゼ（ＢＣ）の活性、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）は、それぞれ異なるサブユニットに含有され、コード遺伝子は、通常、それぞれａｃｃＣおよびａｃｃＢと称される。カルボキシルトランスフェラーゼ（ＣＴ）の活性は、２つのペプチドであるα−カルボキシルトランスフェラーゼ（ａｃｃＡによってコードされる）およびβ−カルボキシルトランスフェラーゼ（ａｃｃＤによってコードされる）に分割される。古細菌において、αおよびβサブユニットは１つの遺伝子によってコードされる。イネ科以外のほとんどの植物が、ヘテロマーの「原核生物」型およびホモマーの「真核生物」型を含有する。ヘテロマー型は、色素体に位置し、脂肪酸の新規合成のために使用される。コード遺伝子のうちの３つ（ビオチンカルボキシラーゼ、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質、およびα−カルボキシルトランスフェラーゼサブユニット）は、核にコードされた遺伝子である一方で、β−カルボキシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、色素体ゲノムに位置する。ホモマー型は、色素体の外の細胞質に位置し、イネ科は、ＡＣＣの「原核生物」型は含有しないが、色素体および細胞質の両方にホモマー型を含有する。
【００４１】
ＡＣＣの活性を測定するためのアッセイは、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｈｏｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｒｉｄｌｅｙ，１９９０（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２６１，２，２６１−２６４  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９９０）によって記載されるような、酵素活性を推定するためにリン酸塩の測定を用いるアッセイ、またはＫｒｏｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ＢｉｏＣｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１１，１００−１０５）によって記載される分光光度アッセイを含む。
【００４２】
植物のＡＣＣマルチドメインタンパク質またはＡＣＣサブユニットをコードする多数の遺伝子が単離されており、ＡＣＣマルチドメインタンパク質またはＡＣＣサブユニットのタンパク質配列は、データベースに見出すことができる。アラビドプシス・サリアナのホモマーＡＣＣタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、受入番号ＮＰ＿１７４８５０（アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２）またはＮＰ＿１７４８４９（アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２）の下に見出すことができる。ＮＰ＿１９７１４３（ＡＣＣ１のビオチンカルボキシルキャリアータンパク質）、ＮＰ＿００１０３１９６８（ビオチンカルボキシラーゼ）ＮＰ＿８５０２９１（カルボキシルトランスフェラーゼサブユニットα）、およびＡＣＣＤ＿ＡＲＡＴＨ（カルボキシルトランスフェラーゼサブユニットβ）は、アラビドプシス・サリアナのヘテロマーＡＣＣの異なるサブユニットのアミノ酸配列を表す。
【００４３】
ブラッシカ・ナプス、ブラッシカ・オレラセア、ブラッシカ・ラパ、およびブラッシカ・ユンケアのヘテロマータンパク質に対するホモマーＡＣＣタンパク質または異なるサブユニットのアミノ酸配列の受入番号は、以下の表１〜５に見出すことができる。全てのアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
表１：ブラッシカ種のホモマーアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ
【表１】
2014531194.tif 000003
表２：ブラッシカ種−ビオチンカルボキシラーゼサブユニットのヘテロマーアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ
【表２】
2014531194.tif 000004
表３：ブラッシカ種−ビオチンカルボキシラーゼキャリアータンパク質のヘテロマーアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ
【表３】
2014531194.tif 000005
表４：ブラッシカ種−カルボキシルトランスフェラーゼαサブユニットのヘテロマーアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ
【表４】
2014531194.tif 000006
表５：ブラッシカ種−カルボキシルトランスフェラーゼβサブユニットのヘテロマーアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ
【表５】
2014531194.tif 000007
【００４４】
１８：１−ＡＣＰまたは１８：１−ＣｏＡによるフィードバック阻害に対する感受性の低いアセチルｃｏＡカルボキシラーゼ変異体酵素またはその変異体サブユニットを得るための１つの方法は、本明細書に記載されるまたは参照により本明細書に組み込まれるもの等の、植物由来のビオチンカルボキシラーゼ、ビオチンカルボキシラーゼキャリアータンパク質、および／またはカルボキシルトランスフェラーゼサブユニットをコードするアミノ酸配列、またはそれらをコードするヌクレオチド配列から出発して、そのような変異体を単離することである。
【００４５】
この目的を達成するために、タンパク質工学の技術において慣習的な方法を用いて、好ましくは植物から、フィードバック阻害感受性ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素またはそのサブユニットに由来する多数の変異体アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素またはそのサブユニットを作製することができる。例えば、ＡＣＣａｓｅまたはそのサブユニットをコードするヌクレオチド配列は、その変異体を作製するために、エラープローン条件下でＰＣＲに供されてもよい。次いで、これらの同様ではあるが同一ではないＤＮＡ配列を再構成およびシャッフルするために、ＰＣＲを用いて多様性をさらに高めることができる。変異体ＡＣＣａｓｅまたはそれらのサブユニットは、大腸菌またはサッカロマイセス・セレビシエ、ピキア・パストリス、植物細胞等の宿主細胞において発現させることができる。次に、本明細書に記載されるように、１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質または１８：１Ｔｗｅｅｎの非存在下および存在下で、これらの変異体アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素またはそれらのサブユニットの酵素活性が同定され、１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質の存在下で前記フィードバック阻害感受性ＣｏＡカルボキシラーゼの酵素活性よりも高い酵素活性を有するこれらの酵素変異体（またはそれらのサブユニット）が単離され、任意選択的に、植物細胞の色素体に導入されるために使用される。
【００４６】
また、変異体色素体アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素またはそのサブユニットは、変異型対立遺伝子によって植物細胞中で作製されてもよい。この目的を達成するために、多数の変異体アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素もしくはサブユニットを含む植物細胞または植物の集団を、例えば、変異誘発を使用することにより、作製することができる。この場合も同様に、１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質または１８：１Ｔｗｅｅｎの存在下における変異体アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素またはそのサブユニットの各々の酵素活性が、本明細書に記載されるように決定され、１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質の存在下でフィードバック阻害感受性ＣｏＡカルボキシラーゼの酵素活性よりも高い酵素活性を有する酵素変異体を含むこれらの植物細胞または植物が同定される。植物細胞は、変異型対立遺伝子を含む植物を再生するために使用されてもよい。これらの植物は、最適な植物変種において必要な変異型対立遺伝子を組み合わせるために、さらなる交雑において使用されてもよい。
【００４７】
本明細書において使用される場合、「変異誘発」は、植物細胞（例えば、複数の植物の種子または花粉等の他の部分）が、化学物質（エチルメチルスルホン酸（ＥＭＳ）、エチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）等）、もしくは電離放射線（中性子（高速中性子変異誘発等において）、α線、γ線（コバルト６０源によって供給されるもの等）、Ｘ線、ＵＶ照射等）、またはこれらのうちの２つ以上の組み合わせ等の突然変異誘発物質との接触等の、細胞のＤＮＡに突然変異を誘発する技術に供されるプロセスを指す。よって、対立遺伝子をコードする１つ以上のＡＣＣａｓｅの所望の変異誘発は、１つ以上の植物組織と、エチルメチルスルホン酸（ＥＭＳ）、エチルニトロソ尿素等との接触等の化学的手段の使用によって、Ｘ線等の物理的手段の使用によって、またはコバルト６０源によって供給されるもの等のγ照射によって達成され得る。照射によって作製される突然変異は、転座もしくは複雑な転位等の大きな欠失または他の全体的な損傷であることが多いが、化学的突然変異原によって作製される突然変異は、点突然変異等のより別個な損傷である。例えば、ＥＭＳは、グアニン塩基をアルキル化し、塩基の誤対合をもたらす：アルキル化グアニンは、チミン塩基と対を形成し、主にＧ／ＣからＡ／Ｔへの転移をもたらす。突然変異誘発後、既知の技術を用いて処理細胞から植物を再生することができる。例えば、結果として得られた種子は、従来の生育手順に従って植えられてもよく、自家受粉後に該植物に種子が形成される。代替として、例えば、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８，Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ．Ｄｅｐ．Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎ．Ｂｕｌｌ．ＯＡＣ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ０４８９．Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｇｕｅｌｐｈ，Ｇｕｅｌｐｈ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）によって記載されるように、倍加半数体小植物を抽出して、迅速にホモ接合植物を形成することもできる。現世代または次の世代におけるそのような自家受粉の結果として形成されるさらなる種子を収集し、突然変異対立遺伝子の存在についてスクリーニングすることができる。特定の突然変異対立遺伝子についてスクリーニングするためのいくつかの技術が既知であり、Ｄｅｌｅｔｅａｇｅｎｅ（商標）（Ｄｅｌｅｔｅ−ａ−ｇｅｎｅ；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ２７：２３５−２４２）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを用いて、高速中性子変異誘発によって作製された欠失変異をスクリーンし、ＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノムにおける標的誘発による局所損傷；ＭｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８：４５５−４５７）は、ＥＭＳによって誘発される点突然変異等を同定する。
【００４８】
１８：１−ＡＣＰまたは１８：１−ＣｏＡによるフィードバック阻害を低下させる別の方法は、炭素固定に関与するが、脂肪酸合成には関与しないマルチサブユニットＡＣＣａｓｅを保持する他の生物、例えば、細菌または古細菌から単離されたフィードバック非感受性ＡＣＣａｓｅまたはそのサブユニットを使用することである。炭素固定のためにいわゆる３−ヒドロキシプロピオン酸サイクルを使用する生物が含まれる（Ｈｕｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，７３６−７３４）。これらのＡＣＣａｓｅのうちの１つの性質決定により、それが確かにアシル−ＣｏＡによって阻害されないことが示された（Ｃｈｕａｋｒｕｔ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５（３）：９３８−９４７）。
【００４９】
よって、植物の細胞の色素体に、スルフォロブス目、ケナルカエウム目、アーケオグロブス目、デスルフロコックス目、サーモプロテウス目、サーモコッカス目、またはハロバクテリウム目、例えば、メタッロスパエラ・セドゥラ、アシディアヌス・ブリエレイ、スルホロブス・ソルファタリカス、スルホロブス・トコダイイ、スルホロブス・アシドカルダリウス、ケナルカエウム・シュンビオスム、アーケオグロブス・フルギダス、ハイパーサーマス・ブチリカス、スタフィロサーマス・マリナス、テルモフィルム・ペンデンス、イグニコックス・ホスピタリス、ピロバキュラム・アエロフィラム、ピロバキュラム・イスランディクム、ピロバキュラム・カリディフォンティス、ピロバキュラムフリオサス、ピロバキュラム・アビシ、ピロバキュラム・ホリコシイ、ハロアーキュラ・マリスモルツイ、ハロバクテリウム属種ＮＲＣ−１、ハロクアドラトゥム・ワルスビイ、ハロラブラム・ラクスプロファンディ（Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ  ｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉ）、またはナトロノモナス・ファラオニスのアセチルＣｏＡカルボキシラーゼまたはそのサブユニットを提供することにより、植物の細胞中の油含有量を増加させる方法が提供される。
【００５０】
好適なＡＣＣａｓｅサブユニットは、３３１位のヌクレオチド〜１８６０位のヌクレオチドの配列番号１、１８６０位のヌクレオチド〜２３６０位のヌクレオチドの配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０のヌクレオチド配列によってコードされ得る、配列番号２、３、５、７、９、または１１の配列のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。
【００５１】
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの他の好適なサブユニットは、クロロフレクサス・オーランティアカスのビオチンカルボキシラーゼ（ａｃｃＣ）、クロロフレクサス・オーランティアカスのビオチンカルボキシラーゼキャリアータンパク質（ａｃｃＢ）、クロロフレクサス・オーランティアカスのカルボキシトランスフェラーゼ−α（ａｃｃＡ）、およびクロロフレクサス・オーランティアカスのカルボキシトランスフェラーゼ−β（ａｃｃＤ）、例えば、配列番号１２、１４、１６、および１８のヌクレオチド配列によってコードされ得る配列番号１３、１５、１７、および１９のアミノ酸配列を有するタンパク質等である。
【００５２】
スルホロブス・メタリクス（配列番号４６）、アシディアヌス・ブリエレイ（配列番号４７）、スルホロブス・トコダイイ種７（配列番号４８）、アシディアヌス・ホスピタリスＷ１（配列番号４９）、メタッロスパエラ・セドゥラＤＳＭ５３４８（配列番号５０）、メタッロスパエラ・クプリナＡｒ−４（配列番号５１）、スルホロブス・アシドカルダリウスＤＳＭ６３９（配列番号５２）、スルホロブス・ソルファタリカスＰ２（配列番号５３）、スルホロブス・ソルファタリカス９８／２（配列番号５４）、スルホロブス・アイランディカスＬ．Ｓ．２．１５（配列番号５５）、スルホロブス・アイランディカスＭ．．１４．２５（配列番号５６）、スルホロブス・アイランディカスＹ．Ｎ．１５．５１（配列番号５７）、スルホロブス・アイランディカスＲＥＹ１５Ａ（配列番号５８）、アキドゥリプロフンドゥム・ボオネイＴ４６９（配列番号５９）、クロロフレクサス・アグリガンスＤＳＭ９４８５（配列番号６０）、オシロクロリス・トリコイデスＤＧ６（配列番号６１）、ロゼイフレクサス・キャステンホルツィＤＳＭ１３９４１（配列番号６２）、ロゼイフレクサス種ＲＳ−１（配列番号６３）、ヘルペトシフォン・オーランティアカスＡＴＣＣ２３７７９（配列番号６４）、ニトロソアルカエウム・リムニアＳＦＢ１（配列番号６５）、ニトロソプミルス・マリティムスＳＣＭ１（配列番号６６）、グループＩクレンアーキアＨＦ４０００ＡＰＫＧ６Ｄ３（配列番号６７）、グループＩクレンアーキアＨＦ４０００ＡＮＩＷ９７Ｐ９（配列番号６８）、ヒッペア・マリティマＤＳＭ１０４１１（配列番号６９）、もしくはクロセイバクター・アトランチクスＨＴＣＣ２５５９（配列番号７０）由来のＢＣＣＰ相同体をコードするヌクレオチド配列；アシディアヌス・ホスピタリスＷ１（配列番号７１）、スルホロブス・トコダイイ種７（配列番号７２）、アシディアヌス・ブリエレイ（配列番号７３）、メタッロスパエラ・セドゥラＤＳＭ５３４８（配列番号７４）、メタッロスパエラ・クプリナＡｒ−４（配列番号７５）、スルホロブス・アシドカルダリウスＤＳＭ６３９（配列番号７６）、スルホロブス・アイランディカスＭ．１６．４（配列番号７７）、スルホロブス・アイランディカスＹ．Ｇ．５７．１４（配列番号７８）、スルホロブス・ソルファタリカス９８／２（配列番号７９）、スルホロブス・アイランディカス．Ｌ．Ｄ．８．５（配列番号８０）、スルホロブス・アイランディカスＭ．１４．２５（配列番号８１）、スルホロブス・アイランディカスＨＶＥ１０／４（配列番号８２）、スルホロブス・アイランディカスＹ．Ｎ．１５．５１（配列番号８３）、スルホロブス・ソルファタリカスＰ２（配列番号８４）、スルホロブス・アイランディカス．Ｌ．Ｓ．２．１５（配列番号８５）、スルホロブス・アイランディカスＲＥＹ１５Ａ（配列番号８６）、クロロフレクサス・アグリガンスＤＳＭ９４８５（配列番号８７）、オシロクロリス・トリコイデスＤＧ６（配列番号８８）、ロゼイフレクサス種ＲＳ−１（配列番号８９）、ロゼイフレクサス・キャステンホルツィＤＳＭ１３９４１（配列番号９０）、ヘルペトシフォン・オーランティアカスＡＴＣＣ２３７７９（配列番号９１）、ニトロソプミルス・マリティムスＳＣＭ１（配列番号９２）、ニトロソアルカエウム・リムニアＳＦＢ１（配列番号９３）、グループＩクレンアーキアＨＦ４０００ＡＰＫＧ６Ｄ３（配列番号９４）、もしくはグループＩクレンアーキアＨＦ４０００ＡＮＩＷ９７Ｐ９（配列番号９５）由来のＢＣ相同体をコードするヌクレオチド配列；アシディアヌス・ホスピタリスＷ１（配列番号９６）、メタッロスパエラ・セドゥラＤＳＭ５３４８（配列番号９７）、アシディアヌス・ブリエレイ（配列番号９８）、メタッロスパエラ・クプリナＡｒ−４（配列番号９９）、スルホロブス・ソルファタリカス９８／２（配列番号１００）、スルホロブス・トコダイイ種７（配列番号１０１）、スルホロブス・アイランディカスＭ．１４．２５  （配列番号１０２）、スルホロブス・アイランディカス．ＬＤ．８．５（配列番号１０３）、スルホロブス・アイランディカスＹ．Ｎ．１５．５１（配列番号１０４）、スルホロブス・ソルファタリカスＰ２（配列番号１０５）、スルホロブス・アシドカルダリウスＤＳＭ６３９（配列番号１０６）、もしくはアキドゥリプロフンドゥム・ボオネイＴ４６９（配列番号１０７）由来のＣＴ相同体をコードするヌクレオチド配列；クロロフレクサス・アグリガンスＤＳＭ９４８５（配列番号１０８）、オシロクロリス・トリコイデスＤＧ６（配列番号１０９）、ロゼイフレクサス種ＲＳ−１（配列番号１１０）、ロゼイフレクサス・キャステンホルツィＤＳＭ１３９４１（配列番号１１１）、アンモニフェツクス・デゲンシイＫＣ４（配列番号１１２）、スファエロバクター・サーモフィルスＤＳＭ２０４７５（配列番号１１３）、ロゼイフレクサス種ＲＳ−１（配列番号１１４）、ヘルペトシフォン・オーランティアカスＡＴＣＣ２３７７９（配列番号１１５）、もしくはロゼイフレクサス・キャステンホルツィＤＳＭ１３９４１（配列番号１１６）由来のＣＴα相同体をコードするヌクレオチド配列；クロロフレクサス・アグリガンスＤＳＭ９４８５（配列番号１１７）、オシロクロリス・トリコイデスＤＧ６（配列番号１１８）、ロゼイフレクサス・キャステンホルツィＤＳＭ１３９４１（配列番号１１９）、ロゼイフレクサス種ＲＳ−１（配列番号１２０）、ロゼイフレクサス種ＲＳ−１（配列番号１２１）、ロゼイフレクサス・キャステンホルツィＤＳＭ１３９４１（配列番号１２２）、ヘルペトシフォン・オーランティアカスＡＴＣＣ２３７７９（配列番号１２３）、もしくはスファエロバクター・サーモフィルスＤＳＭ２０４７５（配列番号１２４）由来のＣＴβ相同体をコードするヌクレオチド配列、またはニトロソプミルス・マリティムスＳＣＭ１（配列番号１２５）、ニトロソアルカエウム・リムニアＳＦＢ１（配列番号１２６）、グループＩクレンアーキアＨＦ４０００ＡＰＫＧ６Ｄ３（配列番号１２７）、もしくはグループクレンアーキアＨＦ４０００ＡＮＩＷ９７Ｐ９（配列番号１２８）由来のＣＴ相同体をコードするヌクレオチド配列もまた、好適である。
【００５３】
また、本明細書に記載されるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの変異体またはそのサブユニットも、本発明に好適である。
【００５４】
「変異体」という用語は、実質的に同様である配列を意味することが意図される。自然に生じる対立遺伝子変異体は、周知の分子生物学の技術を用いて、例えば、本明細書に概説されるようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技術を用いて、同定することができる。変異体（ヌクレオチド）配列はまた、合成的に誘導される（ヌクレオチド）配列、例えば、部位特異的変異誘発を使用することによって作製される配列等も含む。一般に、本明細書に記載されるＡＣＣａｓｅのアミノ酸配列変異体またはサブユニットは、本明細書に記載されるＡＣＣａｓｅのアミノ酸配列またはサブユニットと、少なくとも４０％、５０％、６０％〜７０％、例えば、好ましくは７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％〜７９％、一般に、少なくとも８０％、例えば、８１％〜８４％、少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％〜９８％、および９９％の配列同一性を有し、（単独で、または他のサブユニットと組み合わさって）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を保持する。一般に、ヌクレオチド配列変異体は、本明細書に記載されるＡＣＣａｓｅまたはサブユニットをコードするヌクレオチド配列と、少なくとも４０％、５０％、６０％〜７０％、例えば、好ましくは７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％〜７９％、一般に、少なくとも８０％、例えば、８１％〜８４％、少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％〜９８％、および９９％の配列同一性を有し、コードされた生成物は、（単独で、または他のサブユニットと組み合わさって）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を保持する。
【００５５】
変異体は、欠失、付加、置換、挿入を含むが、これらに限定されない。
【００５６】
本発明の目的のために、２つの関連するヌクレオチドまたはアミノ酸配列の「配列同一性」は、パーセントで表され、比較する位置の数で除した同一の残基（×１００）を有する最適に整列させた２つの配列における位置の数を指す。ギャップ、すなわち、残基が一方の配列には存在するが、他方には存在しない場合のアラインメントにおける位置は、非同一残基を伴う位置であると見なされる。２つの配列の「最適なアラインメント」は、Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＯＳＳ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１６（６）：２７６-２７７、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌを参照）において、デフォルト設定（ギャップ開始ペナルティ＝１０（ヌクレオチド）／１０（タンパク質）およびギャップ伸長ペナルティ＝０．５（ヌクレオチド）／０．５（タンパク質））を使用して、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  ｇｌｏｂａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８（３）：４４３−５３）に従って全長にわたって２つの配列を整列させることにより見出される。ヌクレオチドの場合、使用されるデフォルトのスコアリングマトリックスはＥＤＮＡＦＵＬＬであり、タンパク質の場合、デフォルトのスコアリングマトリックスはＥＢＬＯＳＵＭ６２である。
【００５７】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、所与のヌクレオチド配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を同定するために使用することができる。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、異なる状況において異なる。一般に、ストリンジェントな条件は、既定のイオン強度およびｐＨでの特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が、完全にマッチするプローブとハイブリダイズする（規定されたイオン強度およびｐＨ下の）温度である。典型的には、塩濃度がｐＨ７で約０．０２モルであり、温度が少なくとも６０℃であるストリンジェントな条件が選択される。塩濃度を低下させ、かつ／または温度を上昇させることにより、ストリンジェンシーを高める。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション（例えば、１００ｎｔのプローブを使用したノーザンブロット）のためのストリンジェントな条件は、例えば、６３℃の０．２×ＳＳＣ中、２０分間に少なくとも１回の洗浄を含む条件、またはそれに相当する条件である。
【００５８】
「高ストリンジェンシーな条件」は、例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは、３．０Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  クエン酸Ｎａ、ｐＨ７．０を含有する）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液は２％Ｆｉｃｏｌｌ、２％ポリビニルピロリドン、２％ウシ血清アルブミンを含有する）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および非特異的競合者として２０μｇ／ｍｌ変性キャリアＤＮＡ（平均長１２０〜３０００ヌクレオチドの一本鎖魚精子ＤＮＡ）を含有する水溶液中で、６５℃でハイブリダイゼーションすることにより提供することができる。ハイブリダイゼーション後、いくつかのステップにおいて高ストリンジェンシーな洗浄が行われてもよく、０．２〜０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、ハイブリダイゼーション温度で最終洗浄（約３０分）が行われる。
【００５９】
「中程度のストリンジェンシーな条件」は、上述の溶液中ではあるが、約６０〜６２℃でのハイブリダイゼーションに相当する条件を指す。中程度のストリンジェンシーな洗浄は、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中のハイブリダイゼーション温度で行われてもよい。
【００６０】
「低ストリンジェンシー」は、約５０〜５２℃での上述の溶液中のハイブリダイゼーションに相当する条件を指す。低ストリンジェンシーな洗浄は、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中のハイブリダイゼーション温度で行われてもよい。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）も参照されたい。
【００６１】
細胞の色素体に好適なＡＣＣａｓｅまたはそのサブユニットを提供することは、植物発現可能プロモーター、ならびに任意選択的に、植物において機能する転写終結領域および／またはポリアデニル化領域と操作可能に連結されたＡＣＣａｓｅのサブユニットをコードする１つ以上のＤＮＡ領域を発現する１つ以上のＤＮＡ分子を植物に提供することにより、都合よく達成され得る。１つ以上のＤＮＡ分子は、いずれの核に提供されてもよく、その場合、コード領域は、色素体標的シグナルと操作可能に連結されるべきである。代替として、１つ以上のＤＮＡ分子は、色素体のゲノムに組み込まれてもよく、植物発現可能プロモーターは、植物の色素体で発現可能なプロモーターであり、任意選択的な終結領域は、色素体の転写の終結領域である。色素体における発現のためのＤＮＡ分子は、１つ以上のコード領域を含んでもよく、後者はオペロンに配置される。
【００６２】
本発明の別の実施形態において、フィードバック阻害は、植物の色素体中の１８：１−ＣｏＡおよび／または１８：１−ＡＣＰのレベルを低下させることにより防止される。
【００６３】
色素体中の１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質のレベルの低下は、例えば、キメラＤＮＡ構築物からの過剰発現によって、前記細胞の色素体中のＦＡＴＡ酵素のレベルを増加させることにより達成され得る。
【００６４】
ＤＮＡ領域をコードする好適なＦＡＴ Ａの例は、配列番号２０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、例えば、配列番号２１のヌクレオチド配列、またはそれと７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列である。
【００６５】
色素体中の１８：１−補酵素Ａまたは１８：１−アシルキャリアータンパク質のレベルの低下は、例えば、キメラＤＮＡ構築物からの過剰発現によって、前記植物細胞中のアシル−ＣｏＡ結合タンパク質のレベルを増加させることにより達成され得る。
【００６６】
好適なＡＣＢタンパク質の例は、配列番号２３または配列番号２５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、例えば、ヌクレオチド１０３〜２１０９の配列番号２２のヌクレオチド配列、またはヌクレオチド１０６〜３８４の配列番号２４のヌクレオチド配列、またはそれと７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列である。
【００６７】
本明細書において使用される場合、用語「植物発現可能プロモーター」は、植物細胞において転写を制御（開始）することができるＤＮＡ配列を意味する。これは、植物起源の任意のプロモーターだけでなく、植物細胞において転写を司ることが可能な非植物起源の任意のプロモーター、すなわち、ＣａＭＶ３５Ｓ（Ｈａｒｐｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９８８  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１２，１８２−１９０）、サブタレニアンクローバーウイルスプロモーターＮｏ４もしくはＮｏ７（ＷＯ９６０６９３２）、もしくはＴ−ＤＮＡ遺伝子プロモーター等のウイルスまたは細菌起源の特定のプロモーターも含むが、また、限定されないが、種子特異的プロモーター（例えば、ＷＯ８９／０３８８７）、器官原基特異的プロモーター（Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８，１５−３０）、茎特異的プロモーター（Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＥＭＢＯ  Ｊ．７，３６２５−３６３３）、葉特異的プロモーター（Ｈｕｄｓｐｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １２，５７９−５８９）、葉肉特異的プロモーター（光誘導性Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーター等）、根特異的プロモーター（Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌ．３，１６３９−１６４６）、塊茎特異的プロモーター（Ｋｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，ＥＭＢＯ  Ｊ．８，１３２３−１３３０）、維管束組織特異的プロモーター（Ｐｅｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８９、Ｇｅｎｅ ８４，３５９−３６９）、雄しべ選択的プロモーター（ＷＯ８９／１０３９６、ＷＯ９２／１３９５６）、裂開部特異的プロモーター（ＷＯ９７／１３８６５）等を含む、組織特異的または器官特異的プロモーターも同様に含む。
【００６８】
ＤＥ１０２１１６１７に記載されるヴィキア・ファバ由来のＵＳＰプロモーター、ＷＯ２００９／０７３７３８に記載されるプロモーター配列、ＷＯ２００９／０７７４７８に記載されるような種子特異的遺伝子発現のためのブラッシカ・ナプス由来のプロモーター、ＵＳ２００７／００２２５０２に記載される植物種子特異的プロモーター、ＷＯ０３／０１４３４７に記載される植物種子特異的プロモーター、ＷＯ２００９／１２５８２６に記載される種子特異的プロモーター、ＷＯ２００６／００５８０７に記載されるω３脂肪酸デサチュラーゼファミリーのプロモーター等を含む種子特異的プロモーターが、当該技術分野において周知である。
【００６９】
植物発現可能プロモーターは、好ましくは異種プロモーターであるべきであり、すなわち、本発明によるＤＮＡ分子において、プロモーターは、プロモーターと操作可能に連結されたコードＤＮＡ領域と、通常、自然の関係では会合していない。
【００７０】
シグナルペプチドは、タンパク質の輸送を司る短い（３〜６０アミノ酸長）ペプチド鎖である。シグナルペプチドはまた、標的シグナル、シグナル配列、輸送ペプチド、または局在化シグナルとも称され得る。本システムにおいて使用される「輸送ペプチド」は、タンパク質を、他の小器官（ミトコンドリア、葉緑体、およびアポプラスト等）に向かわせるプレ配列の一部を指す。色素体輸送ペプチドは、タンパク質を色素体に向かわせる輸送ペプチドを指す。色素体輸送ペプチドは、当該技術分野において周知である（例えば、Ｐａｔｒｏｎ  ａｎｄ  Ｗａｌｌｅｒによる考察を参照：２００７  Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，２９（１０）１０４８−１０５８）。
【００７１】
好適な葉緑体標的ペプチドは、アラビドプシス・サリアナのａｔＳ１Ａリブロース１，５二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子の輸送ペプチド（Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８−８６、配列番号３８〜３９）、双子葉類のリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット葉緑体標的配列のコンセンサス配列に基づく合成葉緑体標的配列（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０１：６８５２−６８５７、配列番号４０〜４１）、ブラッシカのコドン使用頻度に適合させたソラヌム・ツベロスムのリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット由来の輸送ペプチドのコード配列（Ｆｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｇｅｎｅ，１３７（２）：２７１−４、配列番号４２〜４３）、ゼア・マイズ（トウモロコシ）およびヘリアンサス・アナス（ヒマワリ）のＲｕＢｉｓＣＯ小サブユニット遺伝子の配列を含有する最適化された輸送ペプチドのコード配列（Ｌｅｂｒｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  米国特許第５５１０４７１号、配列番号４４〜４５）、またはΔ９−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼをコードするリシナス・コムニスのｃＤＮＡ由来の輸送ペプチド（Ｓｈａｎｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．Ｍａｒ １５；８８（６）：２５１０−４、配列番号３６−３７）を含む。
【００７２】
色素体形質転換の方法は、当該技術分野において既知である。Ｍａｌｉｇａ，２００４（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．２００４；５５：２８９−３１３）は、そのような方法の考察を提供している。ブラッシカの色素体形質転換は、Ｎｕｇｅｎｔらによる米国特許第６，８９１，０８６号  ２００６（Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １７０（１）１３５−１４２）に、またはＣｈｅｎｇらによって２０１０（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２９（４）３７１−３８１に記載されている。ダイズ色素体形質転換の方法は、Ｄｕｆｏｕｒｍａｎｔｅｌらによって２００４，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ５５（４）４７９−４８９に記載されている。
【００７３】
色素体発現可能プロモーターもまた、当該技術分野において周知であり、色素体リボソームＲＮＡオペロンプロモーター（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１５，１９５−２０５）を含む。ＫｕｎｇとＬｉｎは、より高等な植物から６０個の葉緑体プロモーター配列を集めた（１９８５，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：７５４３−７５４９）。
【００７４】
トランスジェニック植物を得るための方法は、本発明にとって重要であるとは見なされず、特定の植物種に好適な形質転換方法および再生を使用することができる。そのような方法は、当該技術分野において周知であり、アグロバクテリウム媒介形質転換、粒子銃による送達、マイクロインジェクション、インタクトな細胞の電気穿孔、ポリエチレングリコール媒介プロトプラスト形質転換、プロトプラストの電気穿孔、リポソーム媒介形質転換、シリコンウィスカー媒介形質転換等を含む。このような方法において得られた形質転換細胞は、次いで成熟な稔性植物に再生することができる。
【００７５】
得られた形質転換植物は、同じ特徴を有するより多くの形質転換植物を生成するため、あるいは、同じもしくは関連する植物種の他の品種またはハイブリッド植物に本発明によるキメラ遺伝子を導入するための従来の育種スキームにおいて使用することができる。形質転換植物から得られた種子は、安定したゲノムインサートとして本発明のキメラ遺伝子を含有し、また本発明に包含される。
【００７６】
本明細書に記載される方法および手段は、限定されないが、ワタ、ブラッシカ属の野菜、アブラナ、コムギ、トウモロコシまたはメイズ、オオムギ、ヒマワリ、コメ、カラスムギ、サトウキビ、ダイズ、野菜（チコリ、レタス、トマトを含む）、タバコ、イモ、サトウダイコン、パパイヤ、パイナップル、マンゴー、アラビドプシス・サリアナ、またそれだけではなく、園芸、花卉園芸、もしくは林業において使用される植物も含む、全ての植物細胞および植物、双子葉および単子葉の両方の細胞および植物に好適であると考えられる。特に適切なのは、ナタネ（ブラッシカ種）、アマ（リナム・ウシタティッシマム）、ベニバナ（カルタムス・ティンクトリウス）、ヒマワリ（ヘリアンサス・アナス）、メイズまたはトウモロコシ（ゼア・マイズ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、カラシナ（ブラッシカ種およびシナピス・アルバ）、クランベ（クランベ・アビシニカ）、エルーカ（エルーカ・サティバ）、アブラヤシ（エラエイス・グイネンシス）、綿実（ゴシッピウム種）、落花生（アラキス・ヒポガエア）、ココナツ（ココス・ヌシフェラ）、トウゴマ（リシナス・コムニス）、コリアンダー（コリアンドラム・サティヴァム）、カボチャ（ククルビタ・マキシマ）、ブラジルナッツ（バーソレシア・エクセルサ）またはホホバ（シモンジア・チネンシス）、ナガミノアマナズナ（カメリナ・サティバ）、ナンヨウアブラギリ（ヤトロファ・クルカス）、シャゼンムラサキ種、カレンデュラ（カレンデュラ・オフィシナリス）、オリーブ（オレア・エウロパエア）、コムギ（トリチカム種）、カラスムギ（アベナ種）、ライムギ（セカレ・ケレアレ）、コメ（オリザ・サティバ）、レスケレーラ種、クフェア種、メドウフォーム（リムナンテス・アルバ）、アボカド（パーシー・アメリカーナ）、ヘーゼルナッツ（コリルス）、ゴマ（セサムム・インディクム）、ベニバナ（カルタムス・ティンクトリウス）、アブラギリ（アレウリテス・フォルジ）、ケシ（パパベル・ソムニフェルム）、タバコ（ニコチアナ種）等の油を産生する植物である。
【００７７】
本明細書に記載される方法および手段は、セネデスムス・ジモルファス、ユーグレナ・グラシリス、ファエオダクチルム・トリコルヌツム、プリュウロクリシスカルテレ、プリムネシウム・パルバム、テトラセルミス・チュイ、テトラセルミス・スエシカ、イソクリシス・ガルバナ、ナンノクロロプシス・サリーナ、ボツリオコッカス・ブラウニー、デュナリエラ・ターティオレクタ、ナノクロリス種、またはスピルリナ種等の藻類にも使用することができる。
【００７８】
本明細書において使用される場合、「ブラッシカ植物」は、ブラッシカ・ナプス、ブラッシカ・ラパ（もしくはカンペストリス）、またはブラッシカ・ユンケアといった種のうちの１つに属する植物である。代替として、該植物は、Ｂ．ナポカンペストリス等のこれらのブラッシカ種の交雑、またはこれらのブラッシカ種のうちの１つとアブラナ科の別の種との人工交雑に由来する種に属し得る。本明細書において使用される場合、「油糧種子植物」は、ブラッシカ・ナプス、ブラッシカ・ラパ（もしくはカンペストリス）、ブラッシカ・カリナータ、ブラッシカ・ニグラ、またはブラッシカ・ユンケアといった種のうちのいずれか１つを指す。
【００７９】
本明細書において使用される場合、「含む」は、記載される特徴、整数、ステップ、または構成成分の存在を言及されるように特定することとして解釈されるべきであるが、１つ以上の特徴、整数、ステップ、もしくは構成成分、またはその群の存在あるいは付加を除外しない。よって、例えば、ヌクレオチドもしくはアミノ酸の配列を含む核酸またはタンパク質は、実際に列挙されるよりも多くのヌクレオチドもしくはアミノ酸を含み得る、すなわち、より大きな核酸またはタンパク質に埋め込まれてもよい。機能的にまたは構造的に定義されたＤＮＡ領域を含むキメラ遺伝子は、さらなるＤＮＡ領域等を含み得る。
【００８０】
実施例において別途記載のない限り、全ての組換えＤＮＡ技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＵＳＡの１巻および２巻に記載されるような標準プロトコルに従って実行される。植物分子操作のための標準的な材料および方法は、Ｒ．Ｄ．Ｄ．ＣｒｏｙによるＰｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｆａｘ（１９９３）（ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ（ＵＫ）およびＢｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＵＫから共同出版）に記載されている。標準的な分子生物学技術に関する他の参考文献は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ、Ｂｒｏｗｎ（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＬａｂＦａｘ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎの１巻および２巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（ＵＫ）を含む。ポリメラーゼ連鎖反応に関する標準的な材料および方法は、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５）ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、およびＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ａｔ  ａｌ．（２０００）ＰＣＲ−Ｂａｓｉｃｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｂｅｎｃｈ，Ｆｉｒｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｇｅｒｍａｎｙに見出すことができる。
【００８１】
本発明および実施例を通して、以下の配列に対して言及がなされる。
配列番号１：メタッロスパエラ・セドゥラのビオチンカルボキシラーゼ（ａｃｃＣ）およびＢＣＣＰ（ａｃｃＢ）サブユニットのヌクレオチド配列
配列番号２：メタッロスパエラ・セドゥラのａｃｃＣサブユニットのアミノ酸配列
配列番号３：メタッロスパエラ・セドゥラのａｃｃＢサブユニットのアミノ酸配列
配列番号４：メタッロスパエラ・セドゥラのカルボキシルトランスフェラーゼ（ｐｃｃＢ）のヌクレオチド配列
配列番号５：メタッロスパエラ・セドゥラのカルボキシルトランスフェラーゼ（ｐｃｃＢ）のアミノ酸配列
配列番号６：ケナルカエウム・シュンビオスム由来のＢＣＣＰのヌクレオチド配列
配列番号７：ケナルカエウム・シュンビオスム由来のＢＣＣＰのアミノ酸配列
配列番号８：ケナルカエウム・シュンビオスム由来のビオチンカルボキシラーゼのヌクレオチド配列
配列番号９：ケナルカエウム・シュンビオスム由来のビオチンカルボキシラーゼのアミノ酸配列
配列番号１０：ケナルカエウム・シュンビオスム由来のカルボキシトランスフェラーゼのヌクレオチド配列
配列番号１１：ケナルカエウム・シュンビオスム由来のカルボキシトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号１２：クロロフレクサス・オーランティアカス由来のビオチンカルボキシラーゼ（ａｃｃＣ）のヌクレオチド配列
配列番号１３：クロロフレクサス・オーランティアカス由来のビオチンカルボキシラーゼ（ａｃｃＣ）のアミノ酸配列
配列番号１４：クロロフレクサス・オーランティアカス由来のＢＣＣＰ（ａｃｃＢ）のヌクレオチド配列
配列番号１５：クロロフレクサス・オーランティアカス由来のＢＣＣＰ（ａｃｃＢ）のアミノ酸配列
配列番号１６：クロロフレクサス・オーランティアカス由来のカルボキシトランスフェラーゼ−α（ａｃｃＡ）のヌクレオチド配列
配列番号１７：クロロフレクサス・オーランティアカス由来のカルボキシトランスフェラーゼ−α（ａｃｃＡ）のアミノ酸配列
配列番号１８：クロロフレクサス・オーランティアカス由来のカルボキシトランスフェラーゼ−β（ａｃｃＤ）のヌクレオチド配列
配列番号１９：クロロフレクサス・オーランティアカス由来のカルボキシトランスフェラーゼ−β（ａｃｃＤ）のアミノ酸配列
配列番号２０：リシナス・コムニス由来のＦＡＴＡをコードするヌクレオチド配列
配列番号２１：リシナス・コムニス由来のＦＡＴＡのアミノ酸配列
配列番号２２：アセチルＣｏＡ結合タンパク質ＡＣＢＰ４のヌクレオチド配列
配列番号２３：アセチルＣｏＡ結合タンパク質ＡＣＢＰ４のアミノ酸配列
配列番号２４：アセチルＣｏＡ結合タンパク質ＡＣＢＰ６のヌクレオチド配列
配列番号２５：アセチルＣｏＡ結合タンパク質ＡＣＢＰ６のアミノ酸配列
配列番号２６：Ｂ．ナプスＡＣＰのクローニング用順方向プライマー
配列番号２７：Ｂ．ナプスＡＣＰのクローニング用逆方向プライマー
配列番号２８：Ｂ．ナプスＢＣのクローニング用順方向プライマー
配列番号２９：Ｂ．ナプスＢＣのクローニング用逆方向プライマー
配列番号３０：Ｂ．ナプスＢＣＣＰのクローニング用順方向プライマー
配列番号３１：Ｂ．ナプスＢＣＣＰのクローニング用逆方向プライマー
配列番号３２：Ｂ．ナプスＣＴ−αのクローニング用順方向プライマー
配列番号３３：Ｂ．ナプスＣＴ−αのクローニング用逆方向プライマー
配列番号３４：Ｂ．ナプスＣＴ−βのクローニング用順方向プライマー
配列番号３５：Ｂ．ナプスＣＴ−βのクローニング用逆方向プライマー
配列番号３６：Δ９−１８：０−ＡＣＰデサチュラーゼをコードするリシナス・コムニスｃＤＮＡ由来の輸送ペプチドのヌクレオチド配列
配列番号３７：Δ９−ｌ８：０−ＡＣＰデサチュラーゼをコードするリシナス・コムニスｃＤＮＡ由来の輸送ペプチドのアミノ酸配列
配列番号３８：アラビドプシス・サリアナのａｔＳ１Ａリブロース１，５二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット由来の輸送ペプチドのヌクレオチド配列
配列番号３９：アラビドプシス・サリアナのａｔＳ１Ａリブロース１，５二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット由来の輸送ペプチドのアミノ酸配列
配列番号４０：リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼに基づく合成葉緑体標的プレ配列のヌクレオチド配列
配列番号４１：リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼに基づく合成葉緑体標的プレ配列のアミノ酸配列
配列番号４２：ソラヌム・ツベロスムのリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット由来の輸送ペプチドのブラッシカのコドン使用頻度に適合させたコード配列のヌクレオチド配列
配列番号４３：ソラヌム・ツベロスムリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット由来の輸送ペプチドのブラッシカのコドン使用頻度に適合させたコード配列のアミノ酸配列
配列番号４４：ゼア・マイズ（トウモロコシ）およびヘリアンサス・アナス（ヒマワリ）のＲｕＢｉｓＣＯ小サブユニット遺伝子の配列を含有する最適化輸送ペプチドのヌクレオチド配列
配列番号４５：ゼア・マイズ（トウモロコシ）およびヘリアンサス・アナス（ヒマワリ）のＲｕＢｉｓＣＯ小サブユニット遺伝子の配列を含有する最適化輸送ペプチドのアミノ酸配列
配列番号４６：スルホロブス・メタリクス由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号４７：アシディアヌス・ブリエレイ由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号４８：スルホロブス・トコダイイ種７由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号４９：アシディアヌス・ホスピタリスＷ１由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号５０：メタッロスパエラ・セドゥラＤＳＭ５３４８由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号５１：メタッロスパエラ・クプリナＡｒ−４由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号５２：スルホロブス・アシドカルダリウスＤＳＭ６３９由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号５３：スルホロブス・ソルファタリカスＰ２由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号５４：スルホロブス・ソルファタリカス９８／２由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号５５：スルホロブス・アイランディカスＬ．Ｓ．２．１５由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号５６：スルホロブス・アイランディカスＭ．．１４．２５由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号５７：スルホロブス・アイランディカスＹ．Ｎ．１５．５１由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号５８：スルホロブス・アイランディカスＲＥＹ１５Ａ由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号５９：アキドゥリプロフンドゥム・ボオネイＴ４６９由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号６０：クロロフレクサス・アグリガンスＤＳＭ９４８５由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号６１：オシロクロリス・トリコイデスＤＧ６由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号６２：ロゼイフレクサス・キャステンホルツィＤＳＭ１３９４１由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号６３：ロゼイフレクサス種ＲＳ−１由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号６４：ヘルペトシフォン・オーランティアカスＡＴＣＣ２３７７９由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号６５：ニトロソアルカエウム・リムニアＳＦＢ１由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号６６：ニトロソプミルス・マリティムスＳＣＭ１由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号６７：グループＩクレンアーキアＨＦ４０００ＡＰＫＧ６Ｄ３由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号６８：グループＩクレンアーキアＨＦ４０００ＡＮＩＷ９７Ｐ９由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号６９：ヒッペア・マリティマＤＳＭ１０４１１由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号７０：クロセイバクター・アトランチクスＨＴＣＣ２５５９由来のＢＣＣＰ相同体
配列番号７１：アシディアヌス・ホスピタリスＷ１由来のＢＣ相同体
配列番号７２：スルホロブス・トコダイイ種７由来のＢＣ相同体
配列番号７３：アシディアヌス・ブリエレイ由来のＢＣ相同体
配列番号７４：メタッロスパエラ・セドゥラＤＳＭ５３４８由来のＢＣ相同体
配列番号７５：メタッロスパエラ・クプリナＡｒ−４由来のＢＣ相同体
配列番号７６：スルホロブス・アシドカルダリウスＤＳＭ６３９由来のＢＣ相同体
配列番号７７：スルホロブス・アイランディカスＭ．１６．４由来のＢＣ相同体
配列番号７８：スルホロブス・アイランディカスＹ．Ｇ．５７．１４由来のＢＣ相同体
配列番号７９：スルホロブス・ソルファタリカス９８／２由来のＢＣ相同体
配列番号８０：スルホロブス・アイランディカス．Ｌ．Ｄ．８．５由来のＢＣ相同体
配列番号８１：スルホロブス・アイランディカスＨＶＥ１０／４由来のＢＣ相同体
配列番号８２：スルホロブス・アイランディカスＭ．１６．４由来のＢＣ相同体
配列番号８３：スルホロブス・アイランディカスＹ．Ｎ．１５．５１由来のＢＣ相同体
配列番号８４：スルホロブス・ソルファタリカスＰ２由来のＢＣ相同体
配列番号８５：スルホロブス・アイランディカス．Ｌ．Ｓ．２．１５由来のＢＣ相同体
配列番号８６：スルホロブス・アイランディカスＲＥＹ１５Ａ由来のＢＣ相同体
配列番号８７：クロロフレクサス・アグリガンスＤＳＭ９４８５由来のＢＣ相同体
配列番号８８：オシロクロリス・トリコイデスＤＧ６由来のＢＣ相同体
配列番号８９：ロゼイフレクサス種ＲＳ−１由来のＢＣ相同体
配列番号９０：ロゼイフレクサス・キャステンホルツィＤＳＭ１３９４１由来のＢＣ相同体
配列番号９１：ヘルペトシフォン・オーランティアカスＡＴＣＣ  ２３７７９由来のＢＣ相同体
配列番号９２：ニトロソプミルス・マリティムスＳＣＭ１由来のＢＣ相同体
配列番号９３：ニトロソアルカエウム・リムニアＳＦＢ１由来のＢＣ相同体
配列番号９４：グループＩクレンアーキアＨＦ４０００ＡＰＫＧ６Ｄ３由来のＢＣ相同体
配列番号９５：グループＩクレンアーキアＨＦ４０００ＡＮＩＷ９７Ｐ９由来のＢＣ相同体
配列番号９６：アシディアヌス・ホスピタリスＷ１由来のＣＴ相同体
配列番号９７：メタッロスパエラ・セドゥラＤＳＭ５３４８由来のＣＴ相同体
配列番号９８：アシディアヌス・ブリエレイ由来のＣＴ相同体
配列番号９９：メタッロスパエラ・クプリナＡｒ−４由来のＣＴ相同体
配列番号１００：スルホロブス・ソルファタリカス９８／２由来のＣＴ相同体
配列番号１０１：スルホロブス・トコダイイ種７由来のＣＴ相同体
配列番号１０２：スルホロブス・アイランディカスＭ．１４．２５由来のＣＴ相同体
配列番号１０３：スルホロブス・アイランディカスＬ．Ｄ．８．５由来のＣＴ相同体
配列番号１０４：スルホロブス・アイランディカスＹ．Ｎ．１５．５１由来のＣＴ相同体
配列番号１０５：スルホロブス・ソルファタリカスＰ２由来のＣＴ相同体
配列番号１０６：スルホロブス・アシドカルダリウスＤＳＭ６３９由来のＣＴ相同体
配列番号１０７：アキドゥリプロフンドゥム・ボオネイＴ４６９由来のＣＴ相同体
配列番号１０８：クロロフレクサス・アグリガンスＤＳＭ９４８５由来のＣＴα相同体
配列番号１０９：オシロクロリス・トリコイデスＤＧ６由来のＣＴα相同体
配列番号１１０：ロゼイフレクサス種ＲＳ−１由来のＣＴα相同体
配列番号１１１：ロゼイフレクサス・キャステンホルツィＤＳＭ１３９４１由来のＣＴα相同体
配列番号１１２：アンモニフェツクス・デゲンシイＫＣ４由来のＣＴα相同体
配列番号１１３：スファエロバクター・サーモフィルスＤＳＭ２０４７５由来のＣＴα相同体
配列番号１１４：ロゼイフレクサス種ＲＳ−１由来のＣＴα相同体
配列番号１１５：ヘルペトシフォン・オーランティアカスＡＴＣＣ２３７７９由来のＣＴα相同体
配列番号１１６：ロゼイフレクサス・キャステンホルツィＤＳＭ１３９４１由来のＣＴα相同体
配列番号１１７：クロロフレクサス・アグリガンスＤＳＭ９４８５由来のＣＴβ相同体
配列番号１１８：オシロクロリス・トリコイデスＤＧ６由来のＣＴβ相同体
配列番号１１９：ロゼイフレクサス・キャステンホルツィＤＳＭ１３９４１由来のＣＴβ相同体
配列番号１２０：ロゼイフレクサス種ＲＳ−１由来のＣＴβ相同体
配列番号１２１：ロゼイフレクサス種ＲＳ−１由来のＣＴβ相同体
配列番号１２２：ロゼイフレクサス・キャステンホルツィＤＳＭ１３９４１由来のＣＴβ相同体
配列番号１２３：ヘルペトシフォン・オーランティアカスＡＴＣＣ２３７７９由来のＣＴβ相同体
配列番号１２４：スファエロバクター・サーモフィルスＤＳＭ２０４７５由来のＣＴβ相同体
配列番号１２５：ニトロソプミルス・マリティムスＳＣＭ１由来のＣＴ相同体
配列番号１２６：ニトロソアルカエウム・リムニアＳＦＢ１由来のＣＴ相同体
配列番号１２７：グループＩクレンアーキアＨＦ４０００ＡＰＫＧ６Ｄ３由来のＣＴ相同体
配列番号１２８：グループＩクレンアーキアＨＦ４０００ＡＮＩＷ９７Ｐ９由来のＣＴ相同体
配列番号１２９：リシナス・コムニスのステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ由来のＮ末端結合葉緑体タンパク質を有するケナルカエウム・シュンビオスムのビオチンカルボキシルキャリアータンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３０：リシナス・コムニスのステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ由来のＮ末端結合葉緑体タンパク質を有するケナルカエウム・シュンビオスムのビオチンカルボキシルキャリアータンパク質のヌクレオチド配列（アラビドプシス・サリアナにおける発現のためにコドン最適化した）
配列番号１３１：リシナス・コムニスのステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ由来のＮ末端結合葉緑体タンパク質を有するケナルカエウム・シュンビオスムのビオチンカルボキシラーゼのアミノ酸配列
配列番号１３２：リシナス・コムニスのステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ由来のＮ末端結合葉緑体タンパク質を有するケナルカエウム・シュンビオスムのビオチンカルボキシラーゼのヌクレオチド配列（アラビドプシス・サリアナにおける発現のためにコドン最適化した）
配列番号１３３：リシナス・コムニスのステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ由来のＮ末端結合葉緑体タンパク質を有するケナルカエウム・シュンビオスムのカルボキシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号１３４：リシナス・コムニスのステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ由来のＮ末端結合葉緑体タンパク質を有するケナルカエウム・シュンビオスムのカルボキシルトランスフェラーゼのヌクレオチド配列（アラビドプシス・サリアナにおける発現のためにコドン最適化した）
実施例
実施例１：実験手順
細胞培養増殖および分析
【００８２】
ブラッシカ・ナプス栽培品種Ｊｅｔ  Ｎｅｕｆの細胞懸濁培養液を、改変した（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２００８，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓ  Ｏｒｇ，９２  １３１−１３９）ＮＬＮ培地で増殖させた（Ｌｉｃｈｔｅｒ  １９８２，Ｚ．Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ，１０５，４２７−４３４）。５０μｍｏｌ  ｍ−１ｓ−１の一定の蛍光下、５０ｍＬまたは１００ｍＬいずれかの体積（それぞれ、１２５ｍＬまたは２５０ｍＬフラスコ中）で、２５℃、１６０ｒｐｍで振盪しながら細胞を増殖させた。２日以上続いた実験では、４８時間ごとに培地を新しくした。ＴｗｅｅｎエステルはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ  ＵＳＡ）から調達した。水５０ｍＬに９．８ｇを溶解することにより１５０ｍＭの原液を作製し、培養液に加える前に濾過滅菌した。８日ごとに継代培養を行い、新しい培養液に約２００ｍｇの細胞を播種した。Ｂｕｃｈｎｅｒ漏斗を用いて濾過することにより細胞を回収し、蒸留水で３回すすぎ、事前に重量を計測したアルミ箔の袋の中で、液体Ｎ２中で瞬間冷凍した。新鮮重量に対する乾燥重量の割合は、既知の新鮮重量の細胞を凍結乾燥することにより決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、３体積（ｗ／ｖ）の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中でタンパク質を抽出し、ブラッドフォードアッセイにより定量化した。
脂肪の抽出および定量化  
【００８３】
ガラスビーズを使用して、５００μＬのメタノール：クロロホルム：ギ酸（２０：１０：１ｖ／ｖ）中で２回ホモジナイズすることにより、新鮮重量１００ｍｇまでの冷凍細胞から脂質を抽出した。５００μＬの１Ｍ  ＫＣｌ、０．２Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を用いて合わせた有機溶媒で抽出し、有機相を回収し、Ｎ２下で乾燥させ、ヘキサンに再懸濁した。天然脂質の場合、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸（８０：２０：１、ｖ／ｖ）とともに、または極性脂質の場合、０．１５Ｍ硫酸アンモニウムを含浸させたプレートを用いてアセトン：トルエン：水（９１：３０：７ｖ／ｖ）とともに、シリカゲルＧ  ＴＬＣ  Ｕｎｉｐｌａｔｅ（Ａｎａｌｔｅｃｈ、Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ，ＵＳＡ）を使用したＴＬＣによって脂質クラスを分離した。負荷は、１０または２０ｍｇの新鮮重量と均等であった。ヨウ素蒸気を用いて脂質を可視化した。
【００８４】
脂肪酸の定量化は、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の分析により行った。ＦＡＭＥは、１７：０内部標準と、ＴＬＣプレートから掻き出した脂質抽出物またはシリカ粉末とを、メタノール中１ｍＬの１２％（ｗ／ｗ）ＢＣｌ３で１時間８５℃でインキュベーションし、１ｍＬの水および２ｍＬのヘキサンでそれらを抽出し、次いでＮ２下で乾燥させることにより調製した。ヘキサンに再懸濁したＦＡＭＥを、６０ｍ×２５０μｍのＳＰ−２３４０キャピラリーカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ）に適合させたＨＰ６８９０ガスクロマトグラフ−炎イオン化検出器（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＨＰ５８９０ガスクロマトグラフ−質量分析計（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて分析した。ヘリウムの流速は１．１ｍＬ／分−１であり、オーブン温度は１００℃から出発して１５℃／分−１〜２４０℃まで上昇させ、その温度で５分間維持した。質量分析は、ＨＰ５９７３質量選択型分析器（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて行った。
１−１３Ｃ−オレオイル−Ｔｗｅｅｎの合成
【００８５】
Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）から１−１３Ｃ−オレイン酸を調達した。塩化アシルをＴｗｅｅｎの骨格と反応させることにより、特別なＴｗｅｅｎエステルを合成した。Ｔｗｅｅｎの骨格は、以前に記載されたように合成し（Ｔｅｒｚａｇｈｉ  １９８６，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，８２，７７１−７７９）、精製した（Ｗｉｓｎｉｅｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．１９７３，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，７０，３６６９−３６７３）。塩化アシルは、最初に３５０ｍｇの１−１３Ｃ−オレイン酸を１０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に懸濁することにより調製し、この溶液を氷上で冷却し、アルゴン下で乾燥させ、２．５モル当量の塩化オキサリルと反応させた。ＣＯおよびＣＯ２が溶液から泡立たなくなるまで、３０分かけて滴下（５〜１０滴）でＤＭＦを加えた。過剰な塩化オキサリルを真空下で除去し、塩化アシルを８ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に懸濁した。約２５ｍｇの４−ジメチルアミノピリジンおよび７５０μＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを２ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、８ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解した１ｇのＴｗｅｅｎ骨格に加えた。溶解したＴｗｅｅｎ骨格に塩化アシルを加え、２５℃で２４時間反応物を撹拌した。Ｔｗｅｅｎエステルをクロマトグラフィーにより精製し、ＧＣ−ＭＳおよびＮＭＲにより検証した。１−１３Ｃ−オレオイル−Ｔｗｅｅｎを水に懸濁し、濾過滅菌し、Ｔｗｅｅｎ−８０とともに細胞培養液に加えた。上述のように脂肪抽出およびＧＣ／ＭＳを行った。１３Ｃ−脂肪酸を検出して定量化し、以前に記載されたように、天然の同位体存在比に対して補正した（Ｓｃｈｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７８，２９４４２−２９４５３）。
１４Ｃによる標識
【００８６】
全ての放射性同位体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ  ＵＳＡ）から調達した。１６時間前に培地を新しくして、新鮮重量約２０ｍｇ／ｍＬ−１の細胞密度で継代培養してから５日後に、細胞の標識を行った。標識のために、３つの１ｍＬアリコートの細胞を各フラスコから慎重に除去し、０．２μＣｉの１，２−１４Ｃ−アセテート（５０〜６０ｍＣｉ  ｍｍｏｌ−１）または２−１４Ｃ−マロネート（４０〜６０ｍＣｉ  ｍｍｏｌ−１）のいずれかで、時々振盪しながら１５分間２５℃で標識した。ハロキシホップ（Ｓｉｇｍａ）をＤＭＳＯに溶解し、標識する３０分前に加えた。脂質を抽出し、上述のようにＴＬＣにより分離した。放射活性は、蛍光体を用いた画像化によって検出し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を使用した定量化した。個々の脂肪酸への標識の取り込みは、上述のようにＦＡＭＥを作製し、（Ｋｏｏ，Ｆｕｌｄａ，Ｂｒｏｗｓｅ  ａｎｄ  Ｏｈｌｒｏｇｇｅ  ２００５，Ｐｌａｎｔ  Ｊ，４４，６２０−６３２）に記載されるようにＴＬＣによりメチルエステルを分離し、蛍光体を用いた画像化によって放射活性を測定することにより判定した。
遊離脂肪酸、アシル−ＣｏＡ、およびアシル−ＡＣＰの抽出
【００８７】
沸騰した２ｍＬのイソプロパノール中で５分間、約３００ｍｇの冷凍細胞を反応停止することにより、組織から遊離脂肪酸を抽出した。冷却してから２ｍＬの０．９％ＮａＣｌを加え、４ｍＬのヘキサンで２回脂質を抽出した。ＴＬＣにより中性脂質を分離し、遊離脂肪酸を掻き出してＦＡＭＥを作製し、上述のようにＧＣ−ＦＩＤまたはＧＣ−ＭＳによって分析した。新鮮重量約１５ｍｇの細胞からアシル−ＣｏＡを抽出し、以前に記載されたように定量化した（Ｌａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇｒａｈａｍ  ２００１，Ｐｌａｎｔ  Ｊ，２５，１１５−１２５）。アシル−ＡＣＰを抽出し、以前に記載されたように定量化した（Ｋｏｐｋａ，Ｏｈｌｒｏｇｇｅ  ａｎｄ−Ｊａｗｏｒｓｋｉ  １９９５，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２２４，５１−６０）が、次のように変更を加えた。１）使用した内部標準は１１：０−ＣｏＡ（Ｓｉｇｍａ）であり、以前に記載されたように、ホウレンソウＡＣＰから１７：０−ＡＣＰを作製した（Ｂｒｏａｄｗａｔｅｒ  ａｎｄ  Ｆｏｘ  １９９９，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，１５，３１４−３２６）。２）ＴＣＡ沈殿タンパク質を完全に溶解させるには、１回ではなく３回、ＭＯＰＳバッファを用いて抽出する必要があった。
酵素アッセイ
【００８８】
全ての化学物質はＳｉｇｍａから、また放射性同位体はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから調達し、１４Ｃ−ＮａＨＣＯ３の酸生成物および安定生成物へのアセチルＣｏＡ依存性取り込みとしてＡＣＣａｓｅの活性を測定した。３体積（ｗ／ｖ）の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％グリセロール、および植物プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）中に新鮮細胞を粉砕することにより、粗細胞抽出物を調製した。氷上で破砕物を１０分間穏やかに混合し、次いで、５分間３０００ｇで遠心分離した。抽出物の脱塩は、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。アッセイ条件は、以前に記載される通りであった（Ｔｈｅｌｅｎ  ａｎｄ  Ｏｈｌｒｏｇｇｅ  ２００２，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，４００，２４５−２５７）。反応は、５μｌＬの細胞抽出物の添加により開始し、１５μＬの１２Ｎ  ＨＣＬの添加により停止した。内容物を５５℃で完全に乾燥させ、３０μＬの水に固体を再懸濁し、液体シンチレーション分光法によりカウントした。アセチルＣｏＡの陰性対照は常に含まれていた。代謝産物の影響を測定する場合（１０分）を除いて、アッセイには３０分かかった。不安定なチオエステル結合を保存するために、細胞抽出の直後に代謝産物を反応物に加えた。エタノール中でＦＦＡ原液を作製し、アシル−ＣｏＡを水に懸濁した。使用したアシル−ＡＣＰは、代わりにＢｎＡＣＰ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ１３１２７．１）を使用したこと以外は、ホウレンソウＡＣＰについて記載されるように作製した（Ｂｒｏａｄｗａｔｅｒ  ａｎｄ  Ｆｏｘ  １９９９，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，１５，３１４−３２６）。ＡＣＰ  ｃＤＮＡは、以下のプライマーを使用して細胞培養液からクローニングした：Ｆ−ＧＣＧＧＣＣＡＡＡＣＣＡＧＡＧＡＣＧ（配列番号２６）および６ｘ  ｈｉｓ−タグを組み込んだＲ−ＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＧＣＡＣＣＡＧＣＴＣＴ（配列番号２７）。アッセイバッファがＡＣＣａｓｅアッセイのものと同じであったこと以外は、以前に記載されたように、粗細胞抽出物に対するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼアッセイを行った（Ｅｃｃｌｅｓｔｏｎ  ａｎｄ  Ｏｈｌｒｏｇｇｅ  １９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１０，６１３−６２２）。
ｑＰＣＲ分析
【００８９】
培養した細胞からＴｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してＲＮＡを単離し、ＤＮａｓｅで処理した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キットを使用して、１μｇの総ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。１：５０のｃＤＮＡ生成物およびＳＳＯ  Ｆａｓｔ  ＥｖａＧｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてｑＰＣＲを行った。参照遺伝子は、ＡＣＴ７およびＵＢＣ２１であり、以前に記載されたようにプライマーを使用した（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，４０５，１３８−１４０）。実験用遺伝子のためのプライマーは次の通りであった：ＢＣ、ビオチンカルボキシラーゼ（ＣｅｎＢａｎｋ：Ａ  Ｙ０３４４１０．１）、Ｆ−ＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＣＣＴＡＧＣＡＡＣＣＡＧＴ（配列番号２８）およびＲ−ＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＴＣＴＣＣＣＴＧＧＣＡＧＴＴ（配列番号２９）；ＢＣＣＰ、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ９０７３０．１）、Ｆ−ＡＧＴＧＡＣＴＡＡＣＧＧＴＧＧＧＴＧＣＴＴＧＡＡ（配列番号３０）、Ｒ−ＴＧＡＴＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴ（配列番号３１）；ＣＴ−α、カルボキシトランスフェラーゼ−α（ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＱ３４１６２４．１）、Ｆ−ＴＡＣＧＴＧＡＣＡＧＣＴＣＧＣＣＴＣＡＡＧＡＡＡ（配列番号３２）、Ｒ−ＣＡＡＡＣＣＡＧＴＴＴＣＡＧＣＣＧＣＣＡＴＣＴＴ（配列番号３３）；ＣＴ−β、カルボキシトランスフェラーゼ−β（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｚ５０８６８．１）、Ｆ−ＧＧＡＧＣＡＣＧＡＡＴＧＣＡＡＧＡＡＧＧＡＡＧＴ（配列番号３４）、Ｒ−ＡＣＡＴＡＣＣＣＡＡＡＣＴＴＧＣＴＧＴＣＡＣＣＣ（配列番号３５）。ＲＥＳＴソフトウェア（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して相対的な発現レベルを計算した。
実施例２：Ｂ．ナプス細胞懸濁液に対する脂肪酸補給条件の確立
【００９０】
脂肪酸合成のフィードバック制御について調べるために、最初に、あらゆる負の多面発現性効果を最小限に抑えながら脂肪酸を補給することができる条件を確立することが必要であった。主としてオレイン酸（１８：１）を含有する市販のＴｗｅｅｎ−８０を１０ｍＭまでの濃度で加えたとき、増殖率には影響を及ぼさなかった（図１ａ）。発生中の胚の組成と非常によく似た細胞のタンパク質組成には、Ｔｗｅｅｎ−８０を８日間補給した後も、影響は認められなかった（図１ｂ）。細胞の水分含有量に対する影響もなかった：乾燥重量に対する新鮮重量の割合は、対照で１６．２±０．４、１０ｍＭ  Ｔｗｅｅｎ：−８０を補給した細胞で１６．０±０．５であった。ダイズ細胞培養について報告されているように（Ｔｅｒｚａｇｈｉ  １９８６，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，８２，７７１−７７９）、Ｔｗｅｅｎ−８０によりＢ．ナプス細胞の脂肪酸組成を改変した。Ｔｗｅｅｎ−８０を８日間補給した細胞の極性脂質およびＴＡＧを定量化し、その結果を図２に示す。両方の脂質クラスにおいて、１８：１が、Ｔｗｅｅｎ−８０の濃度に依存するレベルまで堆積した。極性脂質（すなわち、膜脂質）の場合、市販のＴｗｅｅｎ−８０の微量成分であるパルミトレイン酸（１６：１）以外の他の全ての脂肪酸の量を減少させることによりこれを達成した（図２ａ）。一方では、ＴＡＧにおいて全ての脂肪酸が一定であるかまたは増加した（図２ｂ）。これらの変化にもかかわらず、総脂肪酸量は一定に保たれたが（図２ｃ）、ＴＡＧは例外であり、極性および中性脂質特性には変化が見られなかった（図１ｃ）。
【００９１】
Ｔｗｅｅｎ−８０からの脂肪酸が脂肪酸組成の変化に及ぼす寄与を定量化するために、我々は１−１３Ｃ−オレオイル−Ｔｗｅｅｎを合成し、１３Ｃ同位体の存在によって外因性脂肪酸を識別することができる経時的実験を行った（図３）。１０ｍＭ  １３Ｃ−オレオイル−Ｔｗｅｅｎの存在下でわずか３時間後、１３Ｃ−１８：１は全１８：１の約１０％を構成し、迅速な摂取および取り込みが示唆された。時間が経過するにつれて、不飽和産物に標識が現れ（１８：２および１８：３）、４８時間目までには、１３Ｃ標識の割合が１８炭素脂肪酸の約７０％まで増加した。他のいずれの脂肪酸にも、標識（伸長産物を含む）は検出されなかった。ＴＡＧの場合、個々の脂肪酸量の増加は、主に１３Ｃ−１８：１の摂取および代謝によるものであった（図３ｂ）。極性脂質の場合、１３Ｃ−１８：１は、１８：１量の増加の原因にならないばかりか、実際には内因性脂肪酸に取って代わった。このことは、非標識脂肪酸が減少した一方で、１３Ｃ標識が増加したという事実から明白である（図３ａ）。このような効果は、新規脂肪酸の代謝回転の増加または合成の低下のいずれかによるものであり得る。この効果は、非標識（すなわち、新規）脂肪酸に特異的であると考えられ、合成の低下を示唆する。
実施例３：色素体ＡＣＣａｓｅはＴｗｅｅｎ−８０に応答して可逆的に阻害される
【００９２】
脂肪酸合成のフィードバック阻害を１４Ｃ−アセテートトレーサーの添加により測定した。図４ａは、実際に、１０ｍＭ  Ｔｗｅｅｎ−８０を培地に加えてから３時間後直ちに、脂質への１４Ｃ−アセテートの取り込みの速度が４０％減少したことを示す。ステロール合成は、アセチル−ＣｏＡおよびＡＴＰに依存性であり、そのどちらも脂肪酸合成に必要である。したがって、基質の制限のために脂肪酸合成が阻害されると、ステロール合成も阻害されるはずである。ステロールへの１４Ｃ−アセテートの取り込みはＴｗｅｅｎ−８０の補給による影響を受けなかったが、遊離脂肪酸への取り込みは総脂質の取り込みに酷似しており（図５）、この効果が脂肪酸合成に限定されていることが示された。我々は、フィードバック阻害の程度は、培地中のＴｗｅｅｎ−８０の濃度に依存性であり（図４ｂ）、その除去後には完全に可逆性であること（図４ｃ）を発見した。これらの結果は、フィードバック阻害の作用の生化学的様式と一致している。本試験の残りには３時間時点を用いて、最大フィードバック阻害の期間を、長期にわたるＴｗｅｅｎ−８０の補給によって引き起こされる全体的な脂肪酸組成の変化から生じる、あらゆる脂質の恒常性維持機構と区別した。
【００９３】
植物は、色素体ならびに細胞質のＡＣＣａｓｅおよびＦＡＳ酵素系を含有し、そのどちらも脂肪酸に１４Ｃ−アセテートを取り込むことができる。したがって、個々の脂肪酸種における標識の分布を比較することにより、これらの経路の相対分布に関する情報を提供することができる。Ｔｗｅｅｎ−８０の補給は、脂肪酸への１４Ｃ−アセテートの取り込みを４０％低下させたが（図６ａ）、標識パターンには影響を及ぼさなかった（図６ｂ）。これは、より高い割合の長鎖脂肪酸レベルをもたらしたであろう細胞質伸長の低下よりもむしろ、色素体内における新規脂肪酸合成の低下と一致している。１４Ｃ−アセテートによる標識は、多機能（細胞質）ＡＣＣａｓｅの特異的阻害剤であるハロキシホップの存在下でも行われた。ハロキシホップによって１４Ｃ−アセテートの取り込みが阻害される程度は、細胞質の伸長活性に比例していたのに対し、ハロキシホップ抵抗性の取り込みは、色素体内の新規経路からであった。図６ｃは、阻害曲線が互いに平行であるという事実から明らかであるように、ハロキシホップが、Ｔｗｅｅｎ−８０を含むまたは含まない培養液中で同じ量だけ１４Ｃ−アセテートの取り込みを阻害したことを示す。しかしながら、ハロキシホップ抵抗性の取り込み（曲線下面積によって表される）は、１０ｍＭ  Ｔｗｅｅｎ−８０を含む培養液中で約半分に減少し、Ｔｗｅｅｎ−８０の補給が色素体における新規脂肪酸合成の阻害を特異的に引き起こすことを示した。
【００９４】
これらのデータは、色素体中のＡＣＣａｓｅ、またはＦＡＳの何らかの下流構成成分が、Ｔｗｅｅｎ−８０を添加した時に阻害されたことを示す。これらの可能性を区別するために、我々は、外因性マロネートがマロニルＣｏＡに変換され得、ＦＡＳによって使用され得るという事実を利用して、ＡＣＣａｓｅの反応を回避した（Ｋａｎｎａｎｇａｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９７３，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，５２，１５６−１６１）。ＡＣＣａｓｅが唯一の阻害点である場合、１４Ｃ−マロネートによる新規脂肪酸の標識の割合は、Ｔｗｅｅｎ−８０を含むまたは含まない培養液において同じであるはずである。図６ｄは、１４Ｃ−アセテートで標識した対照と比較して、１６および１８炭素脂肪酸への１４Ｃ−マロネートの取り込みがＴｗｅｅｎ−８０によって阻害されなかったことを示す。したがって、ＦＡＳではなく、ＡＣＣａｓｅが、Ｔｗｅｅｎ−８０の補給によって阻害される。以上を総合すると、図６のデータにより、Ｔｗｅｅｎ−８０によって誘導されるフィードバック阻害の標的として色素体ＡＣＣａｓｅが明白に特定される。
実施例４：ＡＣＣａｓｅ活性およびメッセージはＴｗｅｅｎ補給細胞において低下しない
【００９５】
Ｔｗｅｅｎ−８０補給中のＡＣＣａｓｅ活性の明らかな低下をよりよく理解するために、遺伝子発現分析および酵素アッセイを行った。定量的リアルタイムＰＣＲを用いて、色素体ＡＣＣａｓｅサブユニットをコードする遺伝子の発現を測定した。分析のために選択された特異的遺伝子は、元々、ブラッシカ・ナプス植物に発現された胚として同定された遺伝子であった（Ｅｌｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，３１５，１０３−１１２）。表１は、４つ全ての遺伝子の発現が、Ｔｗｅｅｎ−８０を用いた３時間の処理による影響を受けないことを示している。さらに、同じ細胞の粗抽出物のＡＣＣａｓｅ活性の測定から、最大ＡＣＣａｓｅ活性には概ね影響が見られなかったことが明らかになった（表１）。脱塩した抽出物からも同じ結果が得られた。ハロキシホップを用いた処理は、約１５％の活性低下をもたらし、これらのアッセイにおいて色素体ＡＣＣａｓｅが優勢であることを示唆した（図７ａ）。脱リン酸化による不活性化（Ｓａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｏｈｌｒｏｇｇｅ  １９９９，Ｐｌａｎｔ  Ｊ，１８，５２１−５２７）またはΡＩＩタンパク質との２−オキソグルタル酸依存性の相互作用による阻害（Ｆｅｒｉａ  Ｂｏｕｒｒｅｌｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０７，５０２−５０７）が、ＡＣＣａｓｅ活性を制御する他の手段として提唱されている。脱リン酸化がフィードバックに関与している場合、ホスファターゼを用いた処理が、阻害された細胞のＡＣＣａｓｅ活性を対照の活性よりも低い程度まで低下させることが予想される。ΡＩＩの相互作用が関与する場合、２−オキソグルタル酸の存在下におけるインキュベーションがＴｗｅｅｎ補給抽出物からのＡＣＣａｓｅを対照よりも多く阻害する可能性がある。粗抽出物のホスファターゼ処理後または５ｍＭ  ２−オキソグルタル酸の存在下におけるＡＣＣａｓｅアッセイからは、対照とＴｗｅｅｎ−８０補給培養液との間には違いが認められず（図７ｂ）、このことは、これらの機構がＴｗｅｅｎ−８０によって誘導されるフィードバックとほとんどまたは全く関係がないことと一致している。総合すると、これらの結果は、色素体のＡＣＣａｓｅ転写物またはタンパク質の量の減少、および既知の転写後機構が、Ｔｗｅｅｎ−８０を補給したときに観察されたフィードバック阻害の原因ではないことを示唆している。
【表６】
2014531194.tif 000008
実施例５：ＡＣＣａｓｅは１８：１含有Ｔｗｅｅｎによって阻害される
【００９６】
市販のＴｗｅｅｎ−８０は、脂肪酸の混合物を含有する。個々の構成成分の影響を精査するために、様々なＴｗｅｅｎ−エステルをそれらが脂肪酸合成に与える影響について検査した。個々のＴｗｅｅｎの組成を、１４Ｃ−アセテート標識実験の結果とともに表２に列挙する。飽和脂肪酸のみを含有するＴｗｅｅｎ−４０およびＴｗｅｅｎ−６０は、主として１８：１を含有するＴｗｅｅｎ−８０または８５と同程度にはアセテートによる脂質の標識を阻害しなかった。特別に合成したＴｗｅｅｎ−１８：１は、最大の阻害ももたらした。さらに、（おそらくは）マロニルＣｏＡプールに補給することにより脂肪酸の産生を刺激するマロネートの補給は、１４Ｃ−アセテートの取り込みの阻害を引き起こさないことから（図８）、ＡＣＣａｓｅがｉｎ  ｖｉｖｏでマロニルＣｏＡによって阻害される可能性が低いことが示唆される。総合すると、これらの結果は、１８：１または下流代謝産物をフィードバック阻害の原因として指摘している。
【表７】
2014531194.tif 000009
実施例６：Ｔｗｅｅｎ−８０による阻害の機構
【００９７】
Ｔｗｅｅｎ脂肪酸エステルは、細胞に進入し、加水分解されて遊離脂肪酸を生じる（Ｔｅｒｚａｇｈｉ
【００９８】
１９８６  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，８２，７７１−７７９）。遊離脂肪酸は、細胞脂質中に沈殿する前にＣｏＡまたはＡＣＰに対してエステル化することにより活性化することができる。定常状態プールのアシル−ＡＣＰおよびアシル−ＣｏＡ、ならびに遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を、Ｔｗｅｅｎ−８０を補給した細胞において測定した。３時間の補給後、１８：１ＦＦＡが出現した（未処理細胞ではまったく検出されなかった）（図９ａ）。同様に、１８：１−ＡＣＰおよび１８：１−ＣｏＡの両方の量を２倍にしてＴｗｅｅｎ−８０を補給したところ、他のほとんどの分子種が沈殿した（図９ｂ、ｃ）。Ｔｗｅｅｎからの脂肪酸の組み込みをフィードバック阻害の副次的影響と区別するように設計された別の実験において、１３Ｃ−オレオイル−Ｔｗｅｅｎを補給した細胞でＦＦＡおよびアシルＡＣＰを分析した。その結果は、３時間で、９９．１±２．２％の１８：１ＦＦＡおよび４６．２±４．２％の１８：１−ＡＣＰが、１３Ｃ−オレイン酸を含有し（図９）、これらの代謝産物において観察された増加がＴｗｅｅｎからの脂肪酸の直接的な取り込みの結果であることを意味していた。１８：１ＦＦＡ、１８：１−ＡＣＰ、および１８：１−ＣｏＡを、それらがＡＣＣａｓｅ酵素活性に与える影響について調べた。最初に、図９の値の範囲および細胞の水分含有量に基づいて、これらの中間体のｉｎ  ｖｉｖｏ濃度を計算した。１８：１ＦＦＡの細胞内濃度は０〜１００μΜであると推定された。１８：１−ＡＣＰの推定濃度は０．６〜１．２μΜであった。しかしながら、アシル−ＡＣＰが色素体に限定されていることを考慮すると、そのうちの胚が発生する体積は細胞の１０％であると判断され（Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｂｒｉａｒｔｙ  １９９２，Ｃａｎ  Ｊ  Ｂｏｔ，７０，１５１−１６４）、推定値は５〜１０μΜに増加した。細胞の１８：１−ＣｏＡの合計は１〜３μΜであると推定された。これらの値から、検査する濃度範囲を確立した。粗細胞抽出物のアッセイに含まれたとき、１０μΜまでのＦＦＡは、ＡＣＣａｓｅ活性に影響を及ぼさなかった（図１０ａ）。アシル−ＡＣＰおよび−ＣｏＡの影響をテストするときに２つのことを考慮した。１つ目は、チオエステル結合は、ＡＣＣａｓｅアッセイで使用される塩基条件において不安定であるため、粗抽出物中に存在するチオエステラーゼと組み合わせると、アシル−ＡＣＰおよび−ＣｏＡが迅速に分解し得るということである。ＡＣＣａｓｅアッセイと同じ条件を用いてチオエステラーゼ活性を測定した。３μΜ（１５０ｐｍｏｌアッセイ−１）１−１４Ｃ−オレオイル−ＡＣＰを基質として用いた場合、チオエステラーゼ活性は７．９±２．２ｐｍｏｌ／分であることが分かり、２０分までには全部のアシル−ＡＣＰが分解したことを意味していた。したがって、ＡＣＣａｓｅアッセイの長さは３０分から１０分短縮され、チオエステル結合の切断を低減させるために、粗抽出した後直ちに代謝産物を加えた。２つ目に考慮したことは、大腸菌ＡＣＣａｓｅが、その同族のアシル−ＡＣＰによってのみ阻害されたということであった（Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｃｒｏｎａｎ  ２００１，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８３，１４９９−１５０３）。したがって、種子において高度に発現されたＡＣＰ（Ｓａｆｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．１９８８  Ｅｕｒ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７４，２８７−２９５）を細胞培養液からクローニングし、これらの実験に使用した。１８：１−ＡＣＰが＞３μΜの濃度で含まれたときにＡＣＣａｓｅの阻害が観察された（図１０ｂ）。１８：１−ＣｏＡでも同様の効果が観察された（図１０ｃ）。どちらの場合も、阻害は部分的であった。１８：１アシル部分に対する阻害の特異性は、最大フィードバックを引き起こした１８：１含有Ｔｗｅｅｎと一致する（表２）。対照として、Ｔｗｅｅｎ−８０自体をＡＣＣａｓｅの阻害剤として検査したところ、酵素活性には影響しないことが分かり（図７ｃ）、阻害はＴｗｅｅｎエステルから生じるのではなく、むしろその下流代謝産物から生じることが示唆された。
【００９９】
植物における脂肪酸合成のフィードバック阻害に関する以前の研究により、野菜組織においてその存在が実証され、ＡＣＣａｓｅまたはＦＡＳが阻害の部位として提唱された（Ｒａｍｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３６４，３９３−４０１、Ｓｈｉｎｔａｎｉ  ａｎｄ  Ｏｈｌｒｏｇｇｅ  １９９５  Ｐｌａｎｔ  Ｊ，７，５７７−５８７、Ｔｅｒｚａｇｈｉ  １９８６ａ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，８２，７８０−７８６）。特有の胚様細胞株を用いることにより、高い脂肪酸合成率が予想される組織においてフィードバック制御の存在が実証された。放射標識実験を用いて、色素体ＡＣＣａｓｅを特異的な阻害の部位として関連付けた。遺伝子発現および酵素活性の分析により、ＡＣＣａｓｅの転写および転写後調節は考慮に入れなかった。最後に、フィードバック阻害を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＣＣａｓｅ活性を阻害する１８：１−ＡＣＰおよび１８：１−ＣｏＡの量の増加と相関させた。これらの結果に基づいて、我々は、１８：１−ＡＣＰおよび／または１８：１−ＣｏＡの濃度が、色素体ＡＣＣａｓｅの生化学的阻害を通して植物の脂肪酸合成のフィードバック制御を媒介する機構を提唱する（図１１）。
【０１００】
ここで使用したＢ．ナプス細胞株は、Ｔｗｅｅｎから脂肪酸を迅速に輸送して取り込んだ。細胞は、約１０倍高い濃度のＴｗｅｅｎ−８０に耐性を示すことができ、タバコおよびダイズの細胞培養について以前に報告されたもの（Ｓｈｉｎｔａｎｉ  ａｎｄ  Ｏｈｌｒｏｇｇｅ  １９９５（上記参照）、Ｔｅｒｚａｇｈｉ  １９８６ｂ（上記参照））と同等のフィードバック阻害を達成するためには、より高いレベルを必要とした。ＴＡＧが我々のＢ．ナプス細胞における外因性脂肪酸の強力なシンクであるということは、それらの貯蔵油を合成する傾向を反映している。細胞の年齢または透過性等の物理学的説明とは対照的に、なぜ、フィードバックを誘導するためにより高い濃度のＴｗｅｅｎ−８０が必要なのかが、そのような代謝素因により説明され得る。タバコにおける以前の研究は、脂肪酸合成の中間体の産生率について報告しているが、それらの実際のプールサイズについては報告されていない（Ｓｈｉｎｔａｎｉ  ａｎｄ  Ｏｈｌｒｏｇｇｅ  １９９５（上記参照））。長鎖ＡＣＰの合成の低下は、それらがフィードバックに関与する可能性が低いという結論を導いた。実際に、我々のシステムにおいて、Ｔｗｅｅｎを補給した時にほとんどのアシル−ＡＣＰが減少した。しかしながら、１８：１−ＡＣＰは、実際にはＴｗｅｅｎからの脂肪酸の取り込みの結果として増加した。色素体局在性アシル−ＡＣＰ合成酵素は、ＦＦＡをＡＣＰにエステル化することが可能であることが特定されている（Ｋｏｏ  ｅｔ  ａｌ．２００５，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７９，１６１０１−１６１１０）。アシル−ＡＣＰもまた、ＫＡＳの副反応として（Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．１９７２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２４７，３１９０−３１９８）、またはホロ−ＡＣＰ合成酵素によるアシル−ＣｏＡからａｐｏ−ＡＣＰへの脂肪酸−ホスホパンテテインアームの移動により（Ｌａｍｂａｌｏｔ  ａｎｄ  Ｗａｌｓｈ  １９９５，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７０，２４６５８−２４６６１）、アシル−ＣｏＡおよび遊離ＡＣＰから合成することができる。外因性脂肪酸がどのように色素体に進入するのかは分かっていない。この研究で報告されたアシル−ＡＣＰの量は、ホウレンソウの葉における量よりも約１０倍多いが、個々の分子種の組成は類似している（Ｋｏｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．１９９５  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２２４，５１−６０）。この量的な差は、使用した細胞の胚様同一性（および関連するより高い脂肪酸合成率）に起因する可能性がある。アシル−ＣｏＡ含有量が、Ｂ．ナプスの葉よりもむしろ種子の含有量に近いという事実が、この見解を強固なものにしている（Ｌａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇｒａｈａｍ  ２００１，Ｐｌａｎｔ  Ｊ，２５，１１５−１２５）。
【０１０１】
Ｔｗｅｅｎ補給中の脂肪酸合成率の低下は、外因性脂肪酸の代謝が遊離ＡＣＰおよびＣｏＡの不足を引き起こしたことから生じた可能性がある。そうである場合、ＡＣＰまたはＣｏＡのいずれかの不足は、１４Ｃ−アセテートおよび１４Ｃ−マロネートの両方の脂肪酸への取り込みの減少として現れる。しかしながら、１４Ｃ−アセテートの取り込みのみが減少したことから、その効果はＡＣＣａｓｅ活性に特異的であったことが示唆される。色素体ＡＣＣａｓｅがフィードバック制御の標的であるということは、脂肪酸合成の律速段階としてのその役割と一致している（Ｏｈｌｒｏｇｇｅ  ａｎｄ  Ｊａｗｏｒｓｋｉ  １９９７，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，４８，１０９−１３６）。ＦＡＳの阻害は、予想通りにマロニルＣｏＡの蓄積を導くであろう。ＦＡＳ活性の非存在下では、マロニルＣｏＡが色素体における終末産物となるため、ＡＣＣａｓｅの阻害はＦＡＳの阻害よりも効率的である。細胞質において、マロニルＣｏＡはフラボノイドの生合成に必要とされ、ＡＣＣａｓｅ活性の損失は胚性致死をもたらす（Ｂａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｐｌａｎｔ  Ｊ，３３，７５−８６）。この細胞質ＡＣＣａｓｅの副次的機能により、フィードバックの影響に対するその確かな免疫が説明され得る。色素体ＡＣＣａｓｅは、様々な要素によりｉｎ  ｖｉｖｏで調節されることが分かっている。他の状況では一見して明らかであるが、転写および翻訳後調節は、Ｔｗｅｅｎ−８０によって誘導されたフィードバックの場合には検出されなかった。光は、光合成的に誘導される間質のｐＨ、Ｍｇ２＋濃度、および還元電位の変化を介して間接的にＡＣＣａｓｅを調節する。この試験で使用した細胞は、従属栄養的に一定の光の中で増殖させたため、光合成が間質環境またはＡＣＣａｓｅ活性に多くの影響を及ぼしたとは考えにくい。ＡＴＰは、ＡＣＣａｓｅ反応に必要であり、色素体におけるその利用可能性も活性に影響を与え得る。長鎖アシル−ＣｏＡは、ＡＴＰ輸送の阻害により単離色素体における脂肪酸合成を低下させることが示されている（Ｆｏｘ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１２６，１２５９−１２６５，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３４８，１４５−１５０）。しかしながら、これは全ての長鎖ＣｏＡの全体的な効果であり、長鎖アシル−ＣｏＡを合わせた量はＴｗｅｅｎの補給による影響を受けなかったため、ＡＴＰの輸送が阻害された可能性は低い。さらに、ステロールの生合成および細胞増殖率は、どちらも限られたＡＴＰ供給による悪影響を受けたが、この場合も同様にＴｗｅｅｎの補給による影響は受けなかった。
【０１０２】
１８：１−ＡＣＰによるＡＣＣａｓｅの阻害は、大腸菌のフィードバック機構（Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｃｒｏｎａｎ  ２００１  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８３，１４９９−１５０３）および原核生物の色素体ＡＣＣａｓｅの進化的起源と一致している（Ｃｒｏｎａｎ  ａｎｄ  Ｗａｌｄｒｏｐ  ２００２  Ｐｒｏｇ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ，４１，４０７−４３５）。しかしながら、アシル−ＡＣＰは、以前に、植物のＡＣＣａｓｅを阻害しないことが示された（Ｒｏｅｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１１３，７５−８１）。この矛盾は、いくつかの方法論の相違に起因する可能性が高い。１つには、大腸菌のＡＣＣａｓｅは、ホウレンソウではなく大腸菌のアシル−ＡＣＰが使用された場合にのみ阻害された（Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｃｒｏｎａｎ  ２００１（上記参照））。最近の研究では、Ｂ．ナプスのＡＣＣａｓｅを阻害するためにＢ．ナプスのアシル−ＡＣＰが使用された。一方、Ｒｏｅｓｌｅｒらは、トウゴマおよびエンドウマメのＡＣＣａｓｅを用いたアッセイにホウレンソウのアシル−ＡＣＰを使用した。したがって、ＡＣＣａｓｅの阻害はＡＣＰの源に依存すると考えられる。
【０１０３】
もう１つの相違は、Ｒｏｅｓｌｅｒらが半精製ＡＣＣａｓｅを使用したのに対し、本試験および大腸菌試験では、粗抽出物に対して酵素アッセイを行ったことである。精製中に酵素が（例えば、リン酸化またはタンパク質分解により）修飾され、アシル−ＡＣＰに対して非応答性になった可能性があるか、または、ＡＣＣａｓｅの阻害を促進する何か他の要因が粗抽出物中に存在した可能性がある。アシル−ＣｏＡによるＡＣＣａｓｅの阻害は、酵母および動物ＡＣＣａｓｅについて（Ｏｇｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９７８，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，８９，３３−４１）、ならびに精製された植物酵素についても（Ｎｉｋｏｌａｕ  ａｎｄ  Ｈａｗｋｅ  １９８４，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，２２８，８６−９６，Ｒｏｅｓｓｌｅｒ  １９９０，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１１３，７５−８１）報告されている。
【０１０４】
Ｔｗｅｅｎ−８０という形態での外因性脂肪酸の供給は、生化学的機構を解明するために使用された非生理学的処理であり、これらの結果が全植物に対して意味を有するのかどうかという問題を提起する。色素体脂肪酸合成は、１６：０−または１８：１−ＡＣＰの産生で終結する。これらの産物は、次いでチオエステラーゼにより切断され、遊離脂肪酸は、色素体から輸送されるとアシル−ＣｏＡに変換される。ＡＣＣａｓｅ（Ｔｈｅｌｅｎ  ａｎｄ  Ｏｈｌｒｏｇｇｅ  ２００２，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，４００，２４５−２５７）、ＦＡＳ（Ｒｏｕｇｈａｎ  ａｎｄ  Ｏｈｌｒｏｇｇｅ  １９９６，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１１０，１２３９−１２４７）、チオエステラーゼ（Ｓｈｉｎｅ  ｅｔ  ａｔ．１９７６，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，１７２，１１０−１１６）、およびアシル−ＣｏＡの合成（Ａｎｄｒｅｗｓ  ａｎｄ  Ｋｅｅｇｓｔｒａ  １９８３，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，７２，７３５−７４０）は、全て葉緑体膜と関連しており、脂肪酸合成の中間体をアセチル−ＣｏＡからアシル−ＣｏＡまで通す超複合体を形成することが提唱されている（Ｋｏｏ  ｅｔ  ａｔ．２００４，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７９，１６１０１−１６１１０，Ｔｈｅｌｅｎ  ａｎｄ  Ｏｈｌｒｏｇｇｅ  ２００２，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，４００，２４５−２５７）。この膜との関連性は、色素体における脂肪酸生産と、細胞質におけるそれらの需要との間の連絡を容易にすると仮説が立てられる。そのような複合体の中で、１８：１−ＡＣＰおよび１８：１−ＣｏＡの局所濃度は、１〜３μΜの推定範囲よりも高いレベルに到達し得る。ＡＣＣａｓｅは、本明細書で使用した生理学的範囲の代謝産物濃度によって部分的に阻害されたに過ぎない。しかしながら、部分的阻害は、ここで見られたフィードバックの規模を説明するのに十分である。アシル−ＡＣＰは主として色素体に生じるため、１８：１−ＡＣＰによるＡＣＣａｓｅの阻害は実現可能である。しかしながら、１８：１−ＣｏＡは、以前に単離葉緑体において検出不能であり（Ｐｏｓｔ−Ｂｅｉｔｔｅｎｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６６，１８５８−１８６５）、アシル−ＣｏＡに関する我々の結果は、コンパートメント特異的な情報を提供しない。しかしながら、色素体には、１８：１−ＣｏＡを基質として使用することができる酵素、例えば、Ｇ３Ｐ−アシルトランスフェラーゼ等が存在する（Ｆｒｅｎｔｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８３  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１２９，６２９−６３６）。さらに、単離葉緑体は、外因性１８：１−ＣｏＡを脂質に取り込むことが可能であり、摂取能および取り込み能が示唆される（Ｋｊｅｌｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１４８５，１００−１１０）。細胞質のアシルＣｏＡの需要が低く、新規１８：１−ＣｏＡの合成よりも低い速度でその拡散が引き起こされるため、色素体における堆積がもたらされるといった状況を想定することができる。ＫＡＳがアシル−ＡＣＰで遊離ＣｏＡをトランス活性化する能力と合わせると（Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．１９７２）、１８：１−���ｏＡが色素体に堆積し、ＡＣＣａｓｅを阻害し得ることは妥当であると考えられる。
【０１０５】
本明細書で使用した全ての細胞株にフィードバックが存在するということは、フィードバックが種子様組織において、脂肪酸合成が主な代謝機能である場合に生じ得ることを実証しているため、興味深い。このことは、なぜＡＣＣａｓｅの過剰発現によって種子中の脂肪酸の産生量がごくわずかに増加するのかを説明し得る（Ｒｏｅｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９７，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１１３，７５−８１）。これはまた、油糧種子が、フィードバック阻害を克服する手段を進化させたことを意味している。チオエステラーゼは、阻害性１８：１−ＡＣＰのレベルを低下させるために使用することができ、実際に、Ｂ．ナプスチオエステラーゼは、基質として１８：１−ＡＣＰを好み、胚発生の間に誘導される（Ｈｅｌｌｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ  １９９２，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２０，７６３−７８０，）。チオエステラーゼの過剰発現により大腸菌においてフィードバック阻害が緩和され（Ｊｉａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｒｏｎａｎ  １９９４，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ，１７６，２８１４−２８２１）、Ｂ．ナプスにおいて、中鎖チオエステラーゼの過剰発現による１８：１−ＡＣＰの間接的な低下が、より高い脂肪酸合成率をもたらした（Ｅｃｃｌｅｓｔｏｎ  ａｎｄ  Ｏｈｌｒｏｇｇｅ  １９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１０，６１３−６２２）という事実が、この見解を支持している。Ｂ．ナプスにおける合成とアセンブリとの間の油蓄積の共通制御も、フィードバック阻害によって説明され得る（Ｒａｍｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２００２ａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３６４，３９３−４０１）。細胞質においてアシル−ＣｏＡを消費するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）は、油蓄積を制御し（Ｐｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９９  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５２，７９９−８０４，Ｗｅｓｅｌａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｐｒｏｇ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ，３８，４０１−４６０）、シロイヌナズナにおけるこの酵素の過剰発現が油含有量の上昇をもたらすと示唆されている（Ｊａｋｏ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１２６，８６１−８７４）。脂肪酸合成の増加は、油含有量の上昇の論理的必要条件である。反対に、ＤＧＡＴを欠損するシロイヌナズナのａｓｉｌ（ｔａｇ１）変異体は、野生型よりも少ない油を有し、１４Ｃ−アセテートの脂質への取り込みが少ないことから、脂肪酸合成の低下が示唆される（Ｋａｔａｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１０８，３９９−４０９）。これらの結果および最近の研究を前提として、ＤＧＡＴは、細胞質中のアシル−ＣｏＡを消費することにより油蓄積に対する制御を発揮する可能性があり、よって、色素体からの新規脂肪酸のベクトル輸送を駆動し、フィードバック阻害を防止する。
【０１０６】
脂肪酸生合成は、ＡＴＰおよび還元体の需要が高い、必要不可欠な生合成経路である。したがって、その制御が多くのレベルで起こることは理にかなっている。本研究は、生化学的フィードバックにおける初期事象を対象として設計された。しかしながら、フィードバックは、長期にわたるＴｗｅｅｎ補給の間持続し（本試験、Ｓｈｉｎｔａｎｉ  ａｎｄ  Ｏｈｌｒｏｇｇｅ  １９９５）、他のシステムとの類推によって、脂肪酸の過剰供給に対する迅速な応答、そして次に持続性の応答が可能である、動的な一連の機構に関与する可能性がある。さらに、粗細胞抽出物をアッセイした場合にのみアシル−ＡＣＰによるＡＣＣａｓｅの阻害が観察されたという事実は、何か他の要因が阻害に必要とされる可能性を残す。
実施例７：Ｔ−ＤＮＡベクターの構築、および代替のＡＣＣサブユニットを有するトランスジェニック植物の単離
【０１０７】
標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、以下のＤＮＡ断片を操作可能に連結することにより、以下のキメラ遺伝子を作製した。
ベクターＭＳ１
●二重強化ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域
●葉緑体標的シグナルをコードするＤＮＡ領域（配列番号３６〜３７）
●メタッロスパエラ・セドゥラからのビオチンカルボキシラーゼをコードするヌクレオチド位３３１〜ヌクレオチド位１８６０の配列番号１のＤＮＡ領域
●３’ノパリン合成酵素遺伝子からの転写終結およびポリアデニル化シグナル
ベクターＭＳ２
●二重強化ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域
●葉緑体標的シグナルをコードするＤＮＡ領域（配列番号３６〜３７）
●メタッロスパエラ・セドゥラからのビオチンカルボキシラーゼキャリアータンパク質をコードするヌクレオチド位１８６０〜ヌクレオチド位２３６０の配列番号１のＤＮＡ領域
●３’ノパリン合成酵素遺伝子からの転写終結およびポリアデニル化シグナル
ベクターＭＳ３
●二重強化ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域
●葉緑体標的シグナルをコードするＤＮＡ領域
●メタッロスパエラ・セドゥラからのカルボキシトランスフェラーゼタンパク質をコードするヌクレオチド位６５９〜ヌクレオチド位２２３０の配列番号２のＤＮＡ領域
●３’ノパリン合成酵素遺伝子からの転写終結およびポリアデニル化シグナル
ベクターＣＳ１
●二重強化ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域
●葉緑体標的シグナルをコードするＤＮＡ領域（配列番号３６〜３７）
●ケナルカエウム・シュンビオスムからのビオチンカルボキシラーゼキャリアータンパク質をコードする配列番号６のＤＮＡ領域
●３’ノパリン合成酵素遺伝子からの転写終結およびポリアデニル化シグナル
ベクターＣＳ２
●二重強化ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域
●葉緑体標的シグナルをコードするＤＮＡ領域（配列番号３６〜３７）
●ケナルカエウム・シュンビオスムからのビオチンカルボキシラーゼをコードする配列番号８のＤＮＡ領域
●３’ノパリン合成酵素遺伝子からの転写終結およびポリアデニル化シグナル
ベクターＣＳ３
●二重強化ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域
●葉緑体標的シグナルをコードするＤＮＡ領域（配列番号３６〜３７）
●ケナルカエウム・シュンビオスムからのカルボキシトランスフェラーゼをコードする配列番号１０のＤＮＡ領域
●３’ノパリン合成酵素遺伝子からの転写終結およびポリアデニル化シグナル
ベクターＣＡ１
●二重強化ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域
●葉緑体標的シグナルをコードするＤＮＡ領域（配列番号３６〜３７）
●クロロフレクサス・オーランティアカスからのビオチンカルボキシラーゼをコードする配列番号１２のＤＮＡ領域
●３’ノパリン合成酵素遺伝子からの転写終結およびポリアデニル化シグナル
ベクターＣＡ２
●二重強化ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域
●葉緑体標的シグナルをコードするＤＮＡ領域（配列番号３６〜３７）
●クロロフレクサス・オーランティアカスからのビオチンカルボキシラーゼキャリアータンパク質をコードする配列番号１４のＤＮＡ領域
●３’ノパリン合成酵素遺伝子からの転写終結およびポリアデニル化シグナル
ベクターＣＡ３
●二重強化ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域
●葉緑体標的シグナルをコードするＤＮＡ領域（配列番号３６〜３７）
●クロロフレクサス・オーランティアカスからのビオチンカルボキシトランスフェラーゼαをコードする配列番号１６のＤＮＡ領域
●３’ノパリン合成酵素遺伝子からの転写終結およびポリアデニル化シグナル
ベクターＣＡ４
●二重強化ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域
●葉緑体標的シグナルをコードするＤＮＡ領域（配列番号３６〜３７）
●クロロフレクサス・オーランティアカスからのビオチンカルボキシトランスフェラーゼβをコードする配列番号１８のＤＮＡ領域
●３’ノパリン合成酵素遺伝子からの転写終結およびポリアデニル化シグナル
【０１０８】
ベクターＭＳ１、ＭＳ２、およびＭＳ３のキメラ遺伝子は、選択可能なマーカー遺伝子をさらに含む１つのＴ−ＤＮＡベクター中に組み合わされる。
【０１０９】
同様に、ベクターＣＳ１、ＣＳ２、およびＣＳ３のキメラ遺伝子は、選択可能なマーカー遺伝子をさらに含む１つのＴ−ＤＮＡベクター中に組み合わされる。
【０１１０】
また、ベクターＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３、およびＣＡ４のキメラ遺伝子も、選択可能なマーカー遺伝子をさらに含む１つのＴ−ＤＮＡベクター中に組み合わされる。
【０１１１】
従来の方法を用いて、ヘルパーＴｉ−プラスミドを含むアグロバクテリウム株にＴ−ＤＮＡベクターを導入する。ブラッシカ・ナプスの胚軸外植片を入手し、培養し、本質的にＤｅ  Ｂｌｏｃｋらの（１９８９），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：６９４）に記載されるように形質転換し、キメラ遺伝子をブラッシカ・ナプス植物に移植した。
【０１１２】
トランスジェニックブラッシカ・ナプス植物を同定し、油含有量の増加について分析する。
実施例８：Ｔ−ＤＮＡベクターの構築、およびＦＡＴＡタンパク質を過剰発現するトランスジェニック植物の単離
【０１１３】
標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、以下のＤＮＡ断片を操作可能に連結することにより、以下のキメラ遺伝子を作製した。
ベクターＲＣ１
●二重強化ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域
●リシナス・コムニスのＦＡＴタンパク質をコードする配列番号２０のＤＮＡ領域
●３’ノパリン合成酵素遺伝子からの転写終結およびポリアデニル化シグナル
【０１１４】
選択可能なマーカー遺伝子とともに、キメラ遺伝子をＴ−ＤＮＡの左側および右側の境界に導入した。
【０１１５】
従来の方法を用いて、ヘルパーＴｉ−プラスミドを含むアグロバクテリウム株にＴ−ＤＮＡベクターを導入する。ブラッシカ・ナプスの胚軸外植片を入手し、培養し、本質的にＤｅ  Ｂｌｏｃｋらの（１９８９），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：６９４）に記載されるように形質転換し、キメラ遺伝子をブラッシカ・ナプス植物に移植した。
【０１１６】
トランスジェニックブラッシカ・ナプス植物を同定し、油含有量の増加について分析する。
実施例９：Ｔ−ＤＮＡベクターの構築、およびアシル−ＣｏＡ結合タンパク質を過剰発現するトランスジェニック植物の単離
【０１１７】
標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、以下のＤＮＡ断片を操作可能に連結することにより、以下のキメラ遺伝子を作製した。
ベクターＡＣＢＰ４
●二重強化ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域
●アラビドプシス・サリアナのＡＣＢＰ４タンパク質をコードするヌクレオチド１０３〜ヌクレオチド２１０９の配列番号２２のＤＮＡ領域
●３’ノパリン合成酵素遺伝子からの転写終結およびポリアデニル化シグナル
ベクターＡＣＢＰ６
●二重強化ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域
●アラビドプシス・サリアナのＡＣＢＰ４タンパク質をコードするヌクレオチド１０６〜ヌクレオチド３８４の配列番号２４のＤＮＡ領域
●３’ノパリン合成酵素遺伝子からの転写終結およびポリアデニル化シグナル
【０１１８】
選択可能なマーカー遺伝子とともに、キメラ遺伝子をＴ−ＤＮＡの左側および右側の境界に（別個に）導入した。
【０１１９】
従来の方法を用いて、ヘルパーＴｉ−プラスミドを含むアグロバクテリウム株にＴ−ＤＮＡベクターを導入する。ブラッシカ・ナプスの胚軸外植片を入手し、培養し、本質的にＤｅ  Ｂｌｏｃｋらの（１９８９），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：６９４）に記載されるように形質転換し、キメラ遺伝子をブラッシカ・ナプス植物に移植した。
【０１２０】
トランスジェニックブラッシカ・ナプス植物を同定し、油含有量の増加について分析する。
実施例１０：Ｔ−ＤＮＡベクターの構築およびアシル−ＣｏＡ結合タンパク質を過剰発現するトランスジェニック植物の単離
【０１２１】
各々がリシナス・コムニスのステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼからの葉緑体輸送ペプチドを持つＣｓＡＣＣａｓｅ（ケナルカエウム・シュンビオスム由来のＡＣＣａｓｅ）サブユニットを、Ｔｚｆｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７，５０３−５１６に記載されるようにｐＳＡＴ発現系にクローニングした。コドン最適化ＣｓＡＣＣａｓｅサブユニットの場合、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでＢＣＣＰ（配列番号１２９−１３０）をｐＳＡＴｌ−ｍｃｓに、ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩでＢＣ（配列番号１３１−１３２）をｐＳＡＴ４−ｍｃｓに、そしてＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いてＣＴ（配列番号１３３−１３４）をｐＳＡＴ５−ｍｃｓにクローニングした。３つ全ての発現カセットは、３５Ｓプロモーターを含有していた。
【０１２２】
ｐＳＡＴ４−ｎｐｔＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ８１８３７１）およびｐＳＡＴ６−ＤｓＲｅｄ２−Ｃ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ８１８３７５）の発現カセットを含有するｐＰＺＰ−ＲＣＳ２−ｎｐｔＩＩ−ｄｓＲｅｄを、ＣｓＡＣＣａｓｅ発現カセットをクローニングするために使用し、また空ベクター対照としても使用した。ｐＰＺＰ−ＲＣＳ２は、複数の発現カセットをクローニングするために設計され（Ｇｏｄｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、バイナリーベクターｐＰＺＰ２００に基づいている（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ１０４６０、Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。
【０１２３】
最適化したＣｓＡＣＣａｓｅ遺伝子を含有する発現カセットを、それぞれのｐＳＡＴベクターから切り出し、ｐＰＺＰ−ＲＣＳ２−ｎｐｔＩＩ−ｄｓＲｅｄに挿入した。ｎｐｔＩＩは、ｐＰＺＰ−ＲＣＳ２のｐＳＡＴ４挿入部位に存在していたため、ＣｓＡＣＣａｓｅ遺伝子を含有する最終構築物はｎｐｔＩＩを含有しなかった。それはｐＳＡＴ４−ｍｃｓにクローニングされたＣｓＢＣ遺伝子と置き換えられたため、ｐＰＺＰ−ＲＣＳ２のｐＳＡＴ４挿入部位に挿入されなければならなかった。
【０１２４】
最終構築物は、部位１にＣｓＢＣＣＰ、部位４にＣｓＢＣ、部位５にＣｓＣＴ、そして部位６にＤｓＲｅｄを含むｐＰＺＰ−ＲＣＳ２骨格を有する。全てのカセットは、３５Ｓプロモーターによって駆動される。
【０１２５】
従来の方法を用いて、ヘルパーＴｉ−プラスミドを含むアグロバクテリウム株にＴ−ＤＮＡベクター（ＣｓＡＣＣａｓｅサブユニットを有するまたは有しない）を導入し、アグロバクテリウム株を使用して、従来の様式でシロイヌナズナを形質転換した。
【０１２６】
ＣｓＡＣＣａｓｅサブユニット（ＡＣＣａｓｅ  Ｌ１−１３）または「空ベクター」（ＥＶＬ１−９）のいずれかで形質転換したトランスジェニックシロイヌナズナ系統を得た。種子当たりの脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の含有量（μｇで表される）を測定することにより、Ｔ２種子をそれらの種子油含有量（系統当たり３つのサンプル）について分析した。
【０１２７】
その結果を、表３にまとめ、かつ図１２にグラフ表示する。これらの結果から推定され得るように、いくつかのＡｃｃａｓｅ系統は、ＥＶＬ対照系統のうちのいくつかよりも高い種子油含有量を有する。
【表８】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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