(57)【要約】  ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、および／またはＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）の阻害により細胞運命変化、特に腫瘍細胞の分化を促進する方法が本明細書で提供される。
2014533927.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞運命の変化を促進するＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストをスクリーニングするおよび／または同定する方法において、基準細胞の細胞運命である基準細胞運命（ｉ）を、ＵＳＰ１候補アンタゴニスト、ＵＡＦ１候補アンタゴニスト、および／またはＩＤ候補アンタゴニストの存在下での基準細胞の細胞運命である候補細胞運命（ｉｉ）と比較し、ＵＳＰ１候補アンタゴニストがＵＳＰ１に結合し、ＵＡＦ１候補アンタゴニストがＵＡＦ１に結合し、および／またはＩＤ候補アンタゴニストがＩＤに結合し、それによって基準細胞運命と候補細胞運命の間の細胞運命の違いがＵＳＰ１候補アンタゴニストおよび／またはＩＤ候補アンタゴニストを細胞運命の変化を促進するものと同定することを含む方法。
【請求項２】
ＵＳＰ１候補アンタゴニスト、ＵＡＦ１候補アンタゴニスト、および／またはＩＤ候補アンタゴニストがＵＳＰ１候補アンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＵＳＰ１候補アンタゴニスト、ＵＡＦ１候補アンタゴニスト、および／またはＩＤ候補アンタゴニストがＩＤ候補アンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＩＤ候補アンタゴニストが、ＩＤ１候補アンタゴニスト、ＩＤ２候補アンタゴニスト、および／またはＩＤ３候補アンタゴニストである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＵＳＰ１候補アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤ候補アンタゴニストがＵＡＦ１候補アンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
基準細胞運命が幹細胞運命である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
幹細胞運命が間葉幹細胞運命である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
候補細胞運命が、骨芽細胞運命、軟骨細胞運命、または脂肪細胞運命である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
候補細胞運命が骨芽細胞運命である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＵＳＰ１候補アンタゴニスト、ＵＡＦ１候補アンタゴニスト、および／またはＩＤ候補アンタゴニストが、抗体、結合ポリペプチド、結合小分子、またはポリヌクレオチドである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
細胞の細胞運命の変化を促進する方法において、細胞を有効量のＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストに接触させることを含む方法。
【請求項１２】
細胞周期停止を誘導する方法において、細胞を有効量のＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストに接触させることを含む方法。
【請求項１３】
細胞が幹細胞運命（例えば、間葉幹細胞運命）を有する細胞である、請求項１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
疾患または障害を治療する方法において、個体に有効量のＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストを投与することを含む方法。
【請求項１５】
個体が、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、およびＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、またはＩＤ３）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の（例えば、内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）上昇した発現レベルに基づく治療について選択されるか、または個体が、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、およびＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、またはＩＤ３）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の（例えば、内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）低い発現レベルに基づく治療について選択されない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
個体が、ｐ２１、ＲＵＮＸ２、ＯＳＴＥＲＩＸ、ＳＰＡＲＣ／ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ、ＳＰＰ１／ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＢＧＬＡＰ／ＯＳＴＥＯＣＡＬＣＩＮ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の（例えば、内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）低い発現レベルに基づく治療について選択されるか、または個体が、ｐ２１、ＲＵＮＸ２、ＯＳＴＥＲＩＸ、ＳＰＡＲＣ／ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ、ＳＰＰ１／ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＢＧＬＡＰ／ＯＳＴＥＯＣＡＬＣＩＮ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の（例えば、内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）上昇した発現レベルに基づく治療について選択されない、請求項１４または１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
個体が、ｐ２１、ＲＵＮＸ２、ＯＳＴＥＲＩＸ、ＳＰＡＲＣ／ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ、ＳＰＰ１／ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＢＧＬＡＰ／ＯＳＴＥＯＣＡＬＣＩＮ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の（例えば、内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）上昇した発現レベルに基づく治療に（例えば、治療開始時、中、または前の時点から後の時点まで）応答性である可能性が高いか、または個体が、ｐ２１、ＲＵＮＸ２、ＯＳＴＥＲＩＸ、ＳＰＡＲＣ／ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ、ＳＰＰ１／ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＢＧＬＡＰ／ＯＳＴＥＯＣＡＬＣＩＮ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の（例えば、内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）減少したまたは著しい変化のない発現レベルに基づく治療に（例えば、治療開始時、中、または前の時点から後の時点まで）応答性ではない可能性が高い、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストが細胞周期停止を誘導する、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストが細胞運命の変化を促進することができる、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
細胞運命の変化を促進することが、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、およびＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、またはＩＤ３）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の（例えば、内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）減少した発現レベルにより示される、請求項１１から１３および１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
細胞運命の変化を促進することが、ｐ２１、ＲＵＮＸ２、ＯＳＴＥＲＩＸ、ＳＰＡＲＣ／ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ、ＳＰＰ１／ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＢＧＬＡＰ／ＯＳＴＥＯＣＡＬＣＩＮ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の上昇した発現レベルにより示される、請求項１１から１３および１９または２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて上昇している、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
疾患または障害が幹細胞運命（例えば、間葉幹細胞運命）を有する細胞を含む、請求項１４から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
細胞がＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、およびＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、またはＩＤ３）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子を発現する、請求項１１から１３および２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて上昇している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
細胞がｐ２１、ＲＵＮＸ２、ＯＳＴＥＲＩＸ、ＳＰＡＲＣ／ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ、ＳＰＰ１／ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＢＧＬＡＰ／ＯＳＴＥＯＣＡＬＣＩＮ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子を著しく発現してはいない（例えば、内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて発現してはいないまたは低レベルで発現している）、請求項１１から１３および２３から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
疾患または障害が、癌である、請求項１４から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
癌が骨肉腫である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
癌がＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、およびＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、またはＩＤ３）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子を発現する、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて上昇している、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストがＵＳＰ１アンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストがＩＤアンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
ＩＤアンタゴニストが、ＩＤ１候補アンタゴニスト、ＩＤ２候補アンタゴニスト、および／またはＩＤ３アンタゴニストである、請求項３に記載の方法。
【請求項３４】
ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストがＵＡＦ１アンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストが、抗体、結合ポリペプチド、結合小分子、またはポリヌクレオチドである、請求項１１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストが抗体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
抗体がヒト、ヒト化、またはキメラ抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
抗体が抗体断片であり、前記抗体断片がＵＳＰ１、ＵＡＦ、および／またはＩＤに結合する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、３５ＵＳＣ§１１９の下で、２０１１年９月１５日出願の米国特許仮出願第６１／５３５，３３６号の優先権を主張するものであり、その内容は参照によりその全体を組み込まれている。
【０００２】
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出され、それにより参照によってその全体を組み込まれている配列表を含有している。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１２年９月１４日に作成され、Ｐ４７４５Ｒ１ＷＯ．ｔｘｔと称され、サイズは４９，０９６バイトである。
【０００３】
ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、および／またはＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）の阻害により細胞運命変化、特に腫瘍細胞の分化を促進する方法が本明細書で提供される。
【背景技術】
【０００４】
塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）転写因子はヒトゲノムにおいて認識された転写因子の３番目に大きなファミリーを構成しており（Ｔｕｐｌｅｒら、２００１）、Ｅボックスと呼ばれるＤＮＡエレメントに結合することを通じて発生および分化の不可欠な調節因子である（ＭａｓｓａｒｉおよびＭｕｒｒｅ、２０００）。クラスＩ  ｂＨＬＨホモ二量体は広く発現されており、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、およびＣＤＫＮ２Ｂなどの抗増殖性遺伝子の発現を促進する（ＹｏｋｏｔａおよびＭｏｒｉ、２００２）。クラスＩＩ  ｂＨＬＨタンパク質は、より限定された発現を示し、クラスＩタンパク質とヘテロ二量体を形成してＩＧＨ＠およびＳＰ７／ＯＳＴＥＲＩＸなどの組織特異的遺伝子を駆動させる（Ｌａｓｓａｒら、１９９１；Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、１９９４）。組織特異的および抗増殖性遺伝子の組み合わされた誘導を通じて、ｂＨＬＨ転写因子は分化系列決定のインテグレーターとしての働きをする。
【０００５】
ｂＨＬＨタンパク質のＤＮＡ結合は、ＤＮＡ結合タンパク質のインヒビター、またはＩＤとのヘテロ二量体化により制限される。ＩＤファミリーはＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、およびＩＤ４という４つのメンバーからなり（Ｌａｓｏｒｅｌｌａら、２００１）、これらの空間的および時間的発現プロファイルは重複している。４つのＩＤはすべて種々のｂＨＬＨタンパク質に類似する親和性で結合して遺伝子発現を調節している（Ｐｒａｂｈｕら、１９９７）。ＩＤは、骨形態形成タンパク質、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子を含む種々の増殖因子によりおよびＴ細胞受容体ライゲーションにより転写的に誘導される（ＹｏｋｏｔａおよびＭｏｒｉ、２００２）。ＩＤ１、ＩＤ２、およびＩＤ３は、Ｋ４８連結ポリユビキチン化とそれに続く２６Ｓプロテアソームによる分解を受けるが、ＩＤ４は受けない。その結果、ＩＤは大半の組織では短命である（Ｂｏｕｎｐｈｅｎｇら、１９９９）。一様に発現されるＡＰＣ／Ｃｄｈ１複合体は、ＩＤ安定性および存在量を支配するＥ３ユビキチンリガーゼである（Ｌａｓｏｒｅｌｌａら、２００６）が、ＩＤタンパク質は一部の状況では安定である。
【０００６】
ＩＤは哺乳動物発生に不可欠であり、２つ以上のＩＤ遺伝子が崩壊すると胚性致死にいたる（Ｌｙｄｅｎら、１９９９）。これとは対照的に、トランスジェニックマウスでＩＤタンパク質が過剰発現すると、致命的悪性腫瘍を生じる（Ｋｉｍら、１９９９）。同様に、膵臓癌から神経芽細胞腫までに及ぶ広範囲の脱分化型原発性ヒト悪性腫瘍ではＩＤタンパク質レベルの上昇が観察される（Ｐｅｒｋら、２００５）。操作されたＩＤ抑制ＨＬＨタンパク質は神経芽細胞腫腫瘍を分化させることが報告された（Ｃｉａｒａｐｉｃａら、２００９）。ＩＤタンパク質は正常な成人分化組織では乏しいが、胚性および成人幹細胞集団を含む増殖中の組織では豊富であり、ＩＤが「幹細胞性」を維持している可能性があることが示唆される（ＹｏｋｏｔａおよびＭｏｒｉ、２００２）。癌幹細胞生物学におけるＩＤ遺伝子の役割を解明するにはさらに多くの研究が必要である。
【発明の概要】
【０００７】
ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニスト（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）を使用して、細胞運命および／または細胞周期停止の変化をスクリーニングするおよび／または同定する方法ならびに前記変化を促進する方法が本明細書で提供される。
【０００８】
細胞運命の変化を促進するＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストを求めてスクリーニングするおよび／または同定する方法であって、基準細胞の細胞運命である（ｉ）基準細胞運命を、ＵＳＰ１候補アンタゴニスト、ＵＡＦ１候補アンタゴニスト、および／またはＩＤ候補アンタゴニストの存在下での基準細胞の細胞運命である（ｉｉ）候補細胞運命と比較し、ＵＳＰ１候補アンタゴニストがＵＳＰ１に結合し、ＵＡＦ１候補アンタゴニストがＵＡＦ１に結合し、および／またはＩＤ候補アンタゴニストがＩＤに結合して、それによって基準細胞運命と候補細胞運命の間の細胞運命の違いがＵＳＰ１候補アンタゴニストおよび／またはＩＤ候補アンタゴニストを細胞運命の変化を促進すると同定することを含む方法が本明細書で提供される。
【０００９】
細胞周期停止を誘導するＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストを求めてスクリーニングするおよび／または同定する方法であって、（ｉ）ＵＳＰ１候補アンタゴニスト、ＵＡＦ１候補アンタゴニスト、および／またはＩＤ候補アンタゴニストの存在下で基準細胞を接触させ、ＵＳＰ１候補アンタゴニストがＵＳＰ１に結合し、ＵＡＦ１候補アンタゴニストがＵＡＦ１に結合し、および／またはＩＤ候補アンタゴニストがＩＤに結合して、それによって細胞周期停止がＵＳＰ１候補アンタゴニストおよび／またはＩＤ候補アンタゴニストを細胞周期停止を誘導すると同定することを含む方法も本明細書で提供される。
【００１０】
スクリーニングする方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＵＳＰ１候補アンタゴニスト、ＵＡＦ１候補アンタゴニスト、および／またはＩＤ候補アンタゴニストがＵＳＰ１候補アンタゴニストである。スクリーニングする方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＵＳＰ１候補アンタゴニスト、ＵＡＦ１候補アンタゴニスト、および／またはＩＤ候補アンタゴニストがＩＤ候補アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＩＤ候補アンタゴニストは、ＩＤ１候補アンタゴニスト、ＩＤ２候補アンタゴニスト、および／またはＩＤ３候補アンタゴニストである。スクリーニングする方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＵＳＰ１候補アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤ候補アンタゴニストがＵＡＦ１候補アンタゴニストである。
【００１１】
スクリーニングする方法のいずれかのいくつかの実施形態では、基準細胞運命は幹細胞運命である。いくつかの実施形態では、幹細胞運命は間葉幹細胞運命である。スクリーニングする方法のいずれかのいくつかの実施形態では、候補細胞運命は、骨芽細胞運命、軟骨細胞運命、または脂肪細胞運命である。いくつかの実施形態では、候補細胞運命は骨芽細胞運命である。
【００１２】
スクリーニングする方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＵＳＰ１候補アンタゴニスト、ＵＡＦ１候補アンタゴニスト、および／またはＩＤ候補アンタゴニストは抗体、結合ポリペプチド、結合小分子、またはポリヌクレオチドである。
【００１３】
細胞の細胞運命の変化を促進する方法であって、細胞を有効量のＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストに接触させることを含む方法が本明細書でさらに提供される。細胞周期停止を誘導する方法であって、細胞を有効量のＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストに接触させることを含む方法も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、細胞は幹細胞運命（例えば、間葉幹細胞運命）を有する細胞である。
【００１４】
疾患または障害を治療する方法であって、個体に有効量のＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストを投与することを含む方法が本明細書で提供される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、個体は、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、およびＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、またはＩＤ３）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の（例えば、内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）上昇した発現レベルに基づく治療について選択されるか、または個体は、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、およびＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、またはＩＤ３）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の（例えば、内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）低い発現レベルに基づく治療について選択されない。いくつかの実施形態では、個体は、ｐ２１、ＲＵＮＸ２、ＯＳＴＥＲＩＸ、ＳＰＡＲＣ／ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ、ＳＰＰ１／ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＢＧＬＡＰ／ＯＳＴＥＯＣＡＬＣＩＮ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の（例えば、内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）低い発現レベルに基づく治療について選択されるか、または個体は、ｐ２１、ＲＵＮＸ２、ＯＳＴＥＲＩＸ、ＳＰＡＲＣ／ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ、ＳＰＰ１／ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＢＧＬＡＰ／ＯＳＴＥＯＣＡＬＣＩＮ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の（例えば、内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）上昇した発現レベルに基づく治療について選択されない。
【００１６】
いくつかの実施形態では、個体はｐ２１、ＲＵＮＸ２、ＯＳＴＥＲＩＸ、ＳＰＡＲＣ／ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ、ＳＰＰ１／ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＢＧＬＡＰ／ＯＳＴＥＯＣＡＬＣＩＮ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の（例えば、内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）上昇した発現レベルに基づく治療に（例えば、治療開始時、中、または前の時点から後の時点まで）応答性である可能性が高く、または個体はｐ２１、ＲＵＮＸ２、ＯＳＴＥＲＩＸ、ＳＰＡＲＣ／ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ、ＳＰＰ１／ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＢＧＬＡＰ／ＯＳＴＥＯＣＡＬＣＩＮ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の（例えば、内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）減少したまたは著しい変化のない発現レベルに基づく治療に（例えば、治療開始時、中、または前の時点から後の時点まで）応答性ではない可能性が高い。
【００１７】
前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストは細胞周期停止を誘導する。前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストは細胞運命の変化を促進することができる。
【００１８】
前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞運命の変化を促進することは、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、およびＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、またはＩＤ３）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の（例えば、内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）減少した発現レベルにより示される。前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞運命の変化を促進することは、ｐ２１、ＲＵＮＸ２、ＯＳＴＥＲＩＸ、ＳＰＡＲＣ／ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ、ＳＰＰ１／ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＢＧＬＡＰ／ＯＳＴＥＯＣＡＬＣＩＮ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の上昇した発現レベルにより示される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子の発現レベルは内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて上昇している。
【００１９】
前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、疾患または障害は幹細胞運命（例えば、間葉幹細胞運命）を有する細胞を含む。前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、前記細胞はＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、およびＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、またはＩＤ３）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子の発現レベルは内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて上昇している。前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、前記細胞はｐ２１、ＲＵＮＸ２、ＯＳＴＥＲＩＸ、ＳＰＡＲＣ／ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ、ＳＰＰ１／ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＢＧＬＡＰ／ＯＳＴＥＯＣＡＬＣＩＮ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子を著しく発現してはいない（例えば、内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて発現してはいないまたは低レベルで発現している）。
【００２０】
前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、疾患または障害は癌である。いくつかの実施形態では、癌は骨肉腫である。いくつかの実施形態では、前記癌はＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、およびＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、またはＩＤ３）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子の発現レベルは内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて上昇している。
【００２１】
前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストはＵＳＰ１アンタゴニストである。前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストはＩＤアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＩＤアンタゴニストは、ＩＤ１アンタゴニスト、ＩＤ２アンタゴニスト、および／またはＩＤ３アンタゴニストである。前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストはＵＦＡ１アンタゴニストである。
【００２２】
前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストは、抗体、結合ポリペプチド、結合小分子、またはポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストは抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト、ヒト化、またはキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は抗体断片であり、抗体断片はＵＳＰ１、ＵＡＦ、および／またはＩＤに結合する。
【００２３】
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。１つまたは複数のカラー図面付の本特許または特許出願公開の複製は、要求があり必要な料金が支払われ次第特許庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】ＵＳＰ１はＩＤタンパク質を脱ユビキチン化し安定化する。ベクターのみ（ＣＴＬ）、野生型ＵＳＰ１（ＷＴ）、または触媒的に不活性なＵＳＰ１  Ｃ９０Ｓでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のウェスタンブロット（ＷＢ）分析。細胞は、指定された時間２５ｍｇ／ｍｌのシクロヘキシミド（ＣＨＸ）で処理された（左パネル）。ＩＤ２はデンシトメトリーで定量された（右パネル）。
【図１Ｂ】ＵＳＰ１はＩＤタンパク質を脱ユビキチン化し安定化する。２９３Ｔ細胞は、Ｆｌａｇタグ付きＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、またはＩｋＢａ、および空ベクター（ＣＴＬ）、野生型ＵＳＰ１、またはＵＳＰ１  Ｃ９０Ｓを同時トランスフェクトされた。指定されている場合、細胞は１０ｍＭのＭＧ−１３２で４時間処理された。
【図１Ｃ】ＵＳＰ１はＩＤタンパク質を脱ユビキチン化し安定化する。ＨＡタグ付きユビキチンを同時トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞におけるＵＳＰ１またはＵＳＰ１  Ｃ９０ＳおよびＷＤＲ４８によるＩＤ２−Ｆｌａｇの脱ユビキチン化。
【図１Ｄ】ＵＳＰ１はＩＤタンパク質を脱ユビキチン化し安定化する。ＵＳＰ１−Ｆｌａｇ、ＵＳＰ１  Ｃ９０Ｓ−Ｆｌａｇ、ＷＤＲ４８−Ｆｌａｇ、およびユビキチン化ＩＤ２−Ｆｌａｇは２９３Ｔ抽出物から別々にアフィニティー精製され、次にインビトロ脱ユビキチン化アッセイにおいて６時間一緒に組み合わされた。ＮＥＭ、Ｎ−エチルマレイミド。
【図２Ａ】ＩＤ２−脱ユビキチン化酵素としてのＵＳＰ１の同定およびＵＳＰ１−ＩＤ２結合インターフェイスのマッピング。Ｆｌａｇタグ付きデユビキチナーゼ（ＤＵＢ）または空ベクター（−）をトランスフェクトされた２９３Ｔのウェスタンブロット（ＷＢ）分析。指定されている場合、細胞は１０ｍＭのＭＧ−１３２で４時間処理された。
【図２Ｂ】ＩＤ２−脱ユビキチン化酵素としてのＵＳＰ１の同定およびＵＳＰ１−ＩＤ２結合インターフェイスのマッピング。Ｆｌａｇタグ付きＤＵＢは、ＩＤ２を同時トランスフェクトされ、１０ｍＭのＭＧ−１３２で６時間処理された２９３Ｔ細胞から免疫沈降（ＩＰ）された。
【図２Ｃ】ＩＤ２−脱ユビキチン化酵素としてのＵＳＰ１の同定およびＵＳＰ１−ＩＤ２結合インターフェイスのマッピング。２９３Ｔ細胞において発現されたＵＳＰ１変異体は免疫沈降され同時発現されたＩＤ２に対してブロットされた。
【図２Ｄ】ＩＤ２−脱ユビキチン化酵素としてのＵＳＰ１の同定およびＵＳＰ１−ＩＤ２結合インターフェイスのマッピング。野生型（ＷＴ）または変異体ＵＳＰ１をトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞における内在性ＩＤ２のウェスタンブロット分析。
【図３Ａ】ＵＳＰ１は骨肉腫において過剰発現され、ＩＤ２タンパク質発現と相関している。正常および疾患組織由来の原発性ヒト骨生検におけるＵＳＰ１  ｍＲＮＡ発現の箱ヒゲ図。
【図３Ｂ】ＵＳＰ１は骨肉腫において過剰発現され、ＩＤ２タンパク質発現と相関している。原発性ヒト骨芽細胞および骨肉腫腫瘍試料におけるＵＳＰ１およびＩＤ２タンパク質発現のウェスタンブロット（ＷＢ）分析。
【図３Ｃ】ＵＳＰ１は骨肉腫において過剰発現され、ＩＤ２タンパク質発現と相関している。（Ｂ）における試料におけるＵＳＰ１発現のＲＴ−ＰＣＲ定量化。バーは３通りの観測値の平均±ＳＤを表す。
【図３Ｄ】ＵＳＰ１は骨肉腫において過剰発現され、ＩＤ２タンパク質発現と相関している。（Ｂ）における試料におけるＩＤ２（Ｄ）発現のＲＴ−ＰＣＲ定量化。バーは３通りの観測値の平均±ＳＤを表す。
【図３Ｅ】ＵＳＰ１は骨肉腫において過剰発現され、ＩＤ２タンパク質発現と相関している。ＩＤ２発現ベクター（上パネル）もしくはＩＤ２  ｓｈＲＮＡ（下パネル）をトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞におけるＩＤ２の免疫組織化学的検出。
【図３Ｆ】ＵＳＰ１は骨肉腫において過剰発現され、ＩＤ２タンパク質発現と相関している。ＩＤ２発現ベクター（上パネル）もしくはＩＤ２  ｓｈＲＮＡ（下パネル）をトランスフェクトされた原発性ヒト骨肉腫生検（Ｆ）におけるＩＤ２の免疫組織化学的検出。
【図３Ｇ】ＵＳＰ１は骨肉腫において過剰発現され、ＩＤ２タンパク質発現と相関している。原発性骨肉腫組織由来の連続切片におけるＵＳＰ１およびＩＤ２の免疫組織化学的染色。対照染色はアイソタイプ対照抗体を用いた。
【図４Ａ】ＵＳＰ１は骨肉腫においてＩＤタンパク質と物理的に会合し安定化させる。ＵＳＰ１または対照（ＣＴＬ）ｓｈＲＮＡ、プラス空ベクター（ＣＴＬ）またはｓｈＲＮＡ抵抗性ＵＳＰ１のどちらかで同時トランスフェクトされたＵ２−ＯＳ細胞のウェスタンブロット（ＷＢ）分析（野生型［ＷＴ］またはＵＳＰ１変異体Ｃ９０Ｓ）。
【図４Ｂ】ＵＳＰ１は骨肉腫においてＩＤタンパク質と物理的に会合し安定化させる。（Ａ）においてと同様に処理されＥボックス駆動ルシフェラーゼレポーターを同時トランスフェクトされたＵ２−ＯＳ細胞のルシフェラーゼ活性。バーは３通りの観測値の平均±ＳＤを表す。
【図４Ｃ】ＵＳＰ１は骨肉腫においてＩＤタンパク質と物理的に会合し安定化させる。Ｕ２−ＯＳ細胞はｓｈＲＮＡをトランスフェクトされ、指定された場合は１０ｍＭのＭＧ−１３２で４時間処理された。
【図４Ｄ】ＵＳＰ１は骨肉腫においてＩＤタンパク質と物理的に会合し安定化させる。Ｕ２−ＯＳ細胞はＩＤ２−Ｆｌａｇ、ＨＡ−ユビキチン、およびＣＴＬまたはＵＳＰ１  ｓｈＲＮＡのどちらかを同時トランスフェクトされた。指定された場合は、細胞は１０ｍＭのＭＧ−１３２で４時間処理された。ＩＤ２−Ｆｌａｇは、ＳＤＳ／熱変性された細胞ライセートから免疫沈降された。
【図４Ｅ】ＵＳＰ１は骨肉腫においてＩＤタンパク質と物理的に会合し安定化させる。ＵＳＰ１はＵ２−ＯＳ細胞から免疫沈降された。対照免疫沈降は非特異的ＩｇＧを用いた。アステリスク（＊）は、抗ＩＤ２抗体により認識された正体未知のバンドを示している。
【図４Ｆ】ＵＳＰ１は骨肉腫においてＩＤタンパク質と物理的に会合し安定化させる。ＩＤ２（Ｆ）はＵ２−ＯＳ細胞から免疫沈降された。対照免疫沈降は非特異的ＩｇＧを用いた。
【図５Ａ】ＵＳＰ１は複数の骨肉腫細胞系においてＩＤタンパク質を調節する。培養された原発性ヒト骨芽細胞およびヒト骨肉腫細胞系のウェスタンブロット（ＷＢ）分析。
【図５Ｂ】ＵＳＰ１は複数の骨肉腫細胞系においてＩＤタンパク質を調節する。骨肉腫細胞系は１０ｍＭのＭＧ−１３２で４時間処理された。
【図５Ｃ】ＵＳＰ１は複数の骨肉腫細胞系においてＩＤタンパク質を調節する。骨肉腫細胞系は対照（ＣＴＬ）またはＵＳＰ１  ｓｈＲＮＡをトランスフェクトされた。
【図５Ｄ】ＵＳＰ１は複数の骨肉腫細胞系においてＩＤタンパク質を調節する。骨肉腫細胞は空ベクターもしくはＷＤＲ４８をトランスフェクトされた、または１０ｍＭのＭＧ−１３２で４時間処理された。
【図５Ｅ】ＵＳＰ１は複数の骨肉腫細胞系においてＩＤタンパク質を調節する。ＵＳＰ１はＨＯＳ細胞から免疫沈降された。対照免疫沈降は非特異的ＩｇＧを用いた。（Ｆ）ＵＳＰ１+/-（ＷＴ）およびＵＳＰ１-/-ＤＴ４０細胞の分析。
【図５Ｆ】ＵＳＰ１は複数の骨肉腫細胞系においてＩＤタンパク質を調節する。ＵＳＰ１+/-（ＷＴ）およびＵＳＰ１-/-ＤＴ４０細胞の分析。
【図５Ｇ】ＵＳＰ１は複数の骨肉腫細胞系においてＩＤタンパク質を調節する。ＷＴおよびＵＳＰ１-/-ＤＴ４０細胞におけるＵＳＰ１  ｍＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ定量化。バーは３通りの観測値の平均±ｓ．ｄ．を表している。
【図５Ｈ】ＵＳＰ１は複数の骨肉腫細胞系においてＩＤタンパク質を調節する。ＷＴおよびＵＳＰ１-/-ＤＴ４０細胞は１０ｍＭのＭＧ−１３２で２時間処理された。
【図５Ｉ】ＵＳＰ１は複数の骨肉腫細胞系においてＩＤタンパク質を調節する。ＵＳＰ１-/-ＤＴ４０細胞は空ベクター（ＣＴＬ）、ＵＳＰ１野生型（ＷＴ）、またはＵＳＰ１  Ｃ９０Ｓをトランスフェクトされ、ＵＳＰ１-/-ＤＴ４０細胞と比較された。Ｕｎ、非トランスフェクト。
【図６Ａ】ＵＳＰ１は骨肉腫においてＩＤタンパク質を介して細胞周期を調節する。図４Ａにおける通りに処理されたＵ２−ＯＳ細胞のウェスタンブロット（ＷＢ）分析。
【図６Ｂ】ＵＳＰ１は骨肉腫においてＩＤタンパク質を介して細胞周期を調節する。（Ａ）における通りに処理されたＵ２−ＯＳ細胞の増殖は培養の５日後に数え上げられた。
【図６Ｃ】ＵＳＰ１は骨肉腫においてＩＤタンパク質を介して細胞周期を調節する。（Ａ）における通りに処理されたヨウ化プロピジウム染色されたＵ２−ＯＳ細胞の細胞周期状態。
【図６Ｄ】ＵＳＰ１は骨肉腫においてＩＤタンパク質を介して細胞周期を調節する。指定されたｓｈＲＮＡおよび対照またはＣＤＫＮ１Ａ／ｐ２１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされたＵ２−ＯＳ細胞。
【図６Ｅ】ＵＳＰ１は骨肉腫においてＩＤタンパク質を介して細胞周期を調節する。（Ｄ）における通りに処理された細胞におけるＳ期の細胞の定量化。
【図６Ｆ】ＵＳＰ１は骨肉腫においてＩＤタンパク質を介して細胞周期を調節する。指定されたｓｈＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ抵抗性ＵＳＰ１（ｓｈＲｅｓ  ＵＳＰ１）、ＩＤ１、ＩＤ２、およびＩＤ３、または対照発現ベクターをトランスフェクトされたＵ２−ＯＳ細胞。
【図６Ｇ】ＵＳＰ１は骨肉腫においてＩＤタンパク質を介して細胞周期を調節する。（Ｆ）における通りに処理されたＵ２−ＯＳ細胞におけるＳ期の細胞の定量化。バーは３通りの観測値の平均±ＳＤを表している。
【図７Ａ】ＵＳＰ１はＩＤタンパク質を介して増殖および細胞周期停止を調節する。Ｕ２−ＯＳ細胞は対照（ＣＴＬ）またはＵＳＰ１  ｓｈＲＮＡを３日間トランスフェクトされ、等価密度で蒔かれ、生存可能細胞はそれに続く日々計測された。
【図７Ｂ】ＵＳＰ１はＩＤタンパク質を介して増殖および細胞周期停止を調節する。ｓｈＲＮＡ、および指定されている場合は、ｓｈＲＮＡ抵抗性ＵＳＰ１を同時トランスフェクトされたＵ２−ＯＳ細胞（野生型または変異体）。
【図７Ｃ】ＵＳＰ１はＩＤタンパク質を介して増殖および細胞周期停止を調節する。細胞周期のＳ期での（Ｂ）における細胞の百分率。
【図７Ｄ】ＵＳＰ１はＩＤタンパク質を介して増殖および細胞周期停止を調節する。骨肉腫細胞はｓｈＲＮＡをトランスフェクトされ、細胞は８日目に数え上げられた。
【図７Ｅ】ＵＳＰ１はＩＤタンパク質を介して増殖および細胞周期停止を調節する。（Ａ）における通りに処理されヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色されたＵ２−ＯＳ細胞のＤＮＡ含有量。
【図７Ｆ】ＵＳＰ１はＩＤタンパク質を介して増殖および細胞周期停止を調節する。Ｕ２−ＯＳ細胞は指定されたｓｈＲＮＡでおよび対照またはｐ２１  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた。
【図７Ｇ】ＵＳＰ１はＩＤタンパク質を介して増殖および細胞周期停止を調節する。（Ｆ）における細胞はヨウ化プロピジウムで染色され、フローサイトメトリーにより分析された。バーはＳ期の細胞の平均百分率を表す。
【図７Ｈ】ＵＳＰ１はＩＤタンパク質を介して増殖および細胞周期停止を調節する。Ｕ２−ＯＳ細胞は指定されたｓｈＲＮＡをトランスフェクトされた。
【図７Ｉ】ＵＳＰ１はＩＤタンパク質を介して増殖および細胞周期停止を調節する。（Ｈ）における細胞はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより評価された。
【図７Ｊ】ＵＳＰ１はＩＤタンパク質を介して増殖および細胞周期停止を調節する。（Ｈ）における細胞はＰＩ染色後フローサイトメトリーにより評価された。
【図７Ｋ】ＵＳＰ１はＩＤタンパク質を介して増殖および細胞周期停止を調節する。（Ｈ）における細胞はＰＩ染色後フローサイトメトリーにより評価された。
【図７Ｌ】ＵＳＰ１はＩＤタンパク質を介して増殖および細胞周期停止を調節する。Ｕ２−ＯＳ細胞はｓｈＲＮＡおよび対照またはｐ５３  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた。指定されている場合、細胞は１０ｍＭのエトポシドで１時間処理された。バーは３通りの観測値の平均±ｓ．ｄ．を表している。
【図８Ａ】ＵＳＰ１は骨肉腫において幹細胞同一性の保持を促進する。ＣＴＬまたはＵＳＰ１  ｓｈＲＮＡをトランスフェクトされたＵ２−ＯＳ細胞のウェスタンブロット（ＷＢ）分析。
【図８Ｂ】ＵＳＰ１は骨肉腫において幹細胞同一性の保持を促進する。（Ａ）における細胞は染色され、蛍光顕微鏡により分析された。
【図８Ｃ】ＵＳＰ１は骨肉腫において幹細胞同一性の保持を促進する。ドキシサイクリン（ＤＯＸ）誘導性ｓｈＵＳＰ１を有する１４３Ｂ細胞の異種移植片におけるＵＳＰ１またはＩＤ２についての免疫組織化学的染色。
【図８Ｄ】ＵＳＰ１は骨肉腫において幹細胞同一性の保持を促進する。（Ｃ）に記載される１４３Ｂ異種移植片の腫瘍量の定量化。バーは１０の異種移植片の平均±ＳＤを表している。
【図８Ｅ】ＵＳＰ１は骨肉腫において幹細胞同一性の保持を促進する。（Ｃ）における１４３Ｂ異種移植片由来のＵＳＰ１、ＩＤ２、ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ（ＯＮ）、ＲＵＮＸ（ＲＸ２）、ＯＳＴＥＲＩＸ（ＯＳＸ）、およびＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ（ＯＰ）のｍＲＮＡレベルＲＴ−ＰＣＲ定量化。バーは３通りの観測値の平均±ＳＤを表している。
【図８Ｆ】ＵＳＰ１は骨肉腫において幹細胞同一性の保持を促進する。（Ｃ）における１４３Ｂ異種移植片由来のＵＳＰ１、ＩＤ２、ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ（ＯＮ）、ＲＵＮＸ（ＲＸ２）、ＯＳＴＥＲＩＸ（ＯＳＸ）、およびＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ（ＯＰ）のＡＬＰ活性のＲＴ−ＰＣＲ定量化。バーは３通りの観測値の平均±ＳＤを表している。
【図８Ｇ】ＵＳＰ１は骨肉腫において幹細胞同一性の保持を促進する。（Ｃ）由来の代表的異種移植片腫瘍は、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）またはトリクローム染色で染色された。スケールバー、１００ｍｍ。
【図９Ａ】ＵＳＰ１が枯渇するとステムマーカーの喪失を誘導し、骨肉腫細胞系において骨形成プログラムを開始する。骨肉腫細胞は対照（ＣＴＬ）、ＵＳＰ１、またはＩＤ  ｓｈＲＮＡを連続してトランスフェクトされた。指定された間葉幹細胞マーカーの表面発現は、１１日後にフローサイトメトリーにより決定された。
【図９Ｂ】ＵＳＰ１が枯渇するとステムマーカーの喪失を誘導し、骨肉腫細胞系において骨形成プログラムを開始する。（Ａ）における細胞は、ＲＵＮＸ２、ＯＳＴＥＲＩＸ（ＯＳＸ）、およびＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ遺伝子発現についてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析された。
【図９Ｃ】ＵＳＰ１が枯渇するとステムマーカーの喪失を誘導し、骨肉腫細胞系において骨形成プログラムを開始する。（Ａ）における細胞は、ｐ−ニトロフェノール−ホスフェート（ｐＮＰＰ）切断によりアルカリホスファターゼ活性について評価された。
【図９Ｄ】ＵＳＰ１が枯渇するとステムマーカーの喪失を誘導し、骨肉腫細胞系において骨形成プログラムを開始する。ドキシサイクリン誘導性ＣＴＬまたはＵＳＰ１  ｓｈＲＮＡで形質導入された１４３Ｂ細胞のウェスタンブロット（ＷＢ）分析。指定されている場合、細胞は３ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリン（ＤＯＸ）で４日間処理された。
【図９Ｅ】ＵＳＰ１が枯渇するとステムマーカーの喪失を誘導し、骨肉腫細胞系において骨形成プログラムを開始する。５日間のドキシサイクリン処理に続く１４３Ｂ  ｓｈＵＳＰ１異種移植片腫瘍の切片におけるインサイツハイブリダイゼーションによるＯＳＴＥＯＣＡＬＣＩＮ遺伝子発現の明視野および暗視野顕微鏡。スケールバー、１００ｍｍ。
【図９Ｆ】ＵＳＰ１が枯渇するとステムマーカーの喪失を誘導し、骨肉腫細胞系において骨形成プログラムを開始する。対照およびＵＳＰ１  ｓｈＲＮＡ含有１４３Ｂ異種移植片腫瘍におけるＵＳＰ１遺伝子発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。バーは３通りの観測値の平均±ｓ．ｄ．を表している。
【図１０Ａ】ＵＳＰ１およびＩＤは間葉幹細胞分化を調節する。骨分化培地（ＯＤＭ）において、または非分化培地（Ｕｎ）において増殖したｈＭＳＣのウェスタンブロット（ＷＢ）分析。
【図１０Ｂ】ＵＳＰ１およびＩＤは間葉幹細胞分化を調節する。ｈＭＳＣはＩＤ２、ＵＳＰ１野生型（ＷＴ）、ＵＳＰ１  Ｃ９０Ｓ、または空ベクター（ＣＴＬ）を形質導入され、ＯＤＭにおいて９日間培養された。
【図１０Ｃ】ＵＳＰ１およびＩＤは間葉幹細胞分化を調節する。（Ｂ）におけるｈＭＳＣは、ＡＬＰ活性について評価された。バーは３通りの観測値の平均±ＳＤを表している。
【図１０Ｄ】ＵＳＰ１およびＩＤは間葉幹細胞分化を調節する。（Ｂ）におけるｈＭＳＣは、ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ、ＲＵＮＸ２、およびＯＳＴＥＲＩＸ  ｍＲＮＡについて評価された。バーは３通りの観測値の平均±ＳＤを表している。
【図１０Ｅ】ＵＳＰ１およびＩＤは間葉幹細胞分化を調節する。カルシウム沈着を視覚化するためにアリザリンレッドで染色された（Ｂ）におけるｈＭＳＣ。スケールバー、１００ｍｍ。
【図１０Ｆ】ＵＳＰ１およびＩＤは間葉幹細胞分化を調節する。指定された培養日数後の（Ｂ）におけるｈＭＳＣの数え上げ。バーは３通りの観測値の平均±ＳＤを表している。
【図１１Ａ】ＵＳＰ１はＮＩＨ  ３Ｔ３細胞のＩＤ依存性形質転換を誘導する。ＩＤ２、ＵＳＰ１野生型（ＷＴ）、ＵＳＰ１  Ｃ９０Ｓ、または空対照ベクター（ＣＴＬ）で形質導入されたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞のウェスタンブロット（ＷＢ）分析。
【図１１Ｂ】ＵＳＰ１はＮＩＨ  ３Ｔ３細胞のＩＤ依存性形質転換を誘導する。（Ａ）における細胞は軟寒天において増殖され、コロニーは数え上げられた。バーは３通りの観測値の平均±ｓ．ｄ．を表している。
【図１１Ｃ】ＵＳＰ１はＮＩＨ  ３Ｔ３細胞のＩＤ依存性形質転換を誘導する。対照（ＣＴＬ）、ＩＤ２、ＵＳＰ１野生型（ＷＴ）、またはＵＳＰ１  Ｃ９０Ｓを形質導入されたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞により形成される代表的コロニー。スケールバー、１００ｍｍ。
【図１１Ｄ】ＵＳＰ１はＮＩＨ  ３Ｔ３細胞のＩＤ依存性形質転換を誘導する。（Ａ）におけるＮＩＨ  ３Ｔ３細胞は、Ｃ．Ｂ−１７  ＳＣＩＤ．ｂｇマウス（上パネル）またはＮＣｒヌードマウス（下パネル）の皮下に移植され、腫瘍量がモニターされた。データポイントは１０頭のマウスの平均±ｓ．ｄ．を表している。
【図１１Ｅ】ＵＳＰ１はＮＩＨ  ３Ｔ３細胞のＩＤ依存性形質転換を誘導する。研究の終了時の（Ａ）由来のＣ．Ｂ−１７  ＳＣＩＤ．ｂｇ（上パネル）およびＮＣｒヌードマウス（下パネル）。
【図１１Ｆ】ＵＳＰ１はＮＩＨ  ３Ｔ３細胞のＩＤ依存性形質転換を誘導する。空ベクター（ＣＴＬ）−またはＵＳＰ１形質導入されたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞は、対照（ＣＴＬ）またはＩＤ  ｓｈＲＮＡを順次形質導入された。
【図１１Ｇ】ＵＳＰ１はＮＩＨ  ３Ｔ３細胞のＩＤ依存性形質転換を誘導する。（Ｆ）における細胞は軟寒天において増殖され、コロニーは数え上げられた。バーは３通りの観測値の平均±ｓ．ｄ．を表している。
【図１２Ａ】ＵＳＰ１は正常な骨格形成に必要である。１２日経過のＵＳＰ１+/+（ＷＴ）およびＵＳＰ１-/-マウス（上）および大腿骨（下）のマイクロコンピューティドトモグラフィ。
【図１２Ｂ】ＵＳＰ１は正常な骨格形成に必要である。（Ａ）におけるマウスの平均骨ミネラル化密度（ＢＭＤ）。バーはそれぞれの遺伝子型の４つの大腿骨の平均±ＳＤを表している。
【図１２Ｃ】ＵＳＰ１は正常な骨格形成に必要である。（Ａ）におけるマウスのミネラル化骨量（Ｍｉｎｚ．Ｖｏｌ．）。バーはそれぞれの遺伝子型の４つの大腿骨の平均±ＳＤを表している。
【図１２Ｄ】ＵＳＰ１は正常な骨格形成に必要である。Ｅ１８．５  ＵＳＰ１+/+（ＷＴ）およびＵＳＰ１-/-マウス由来の大腿骨幹端のウェスタンブロット（ＷＢ）分析。
【図１２Ｅ】ＵＳＰ１は正常な骨格形成に必要である。Ｅ１８．５  ＵＳＰ１+/+（ＷＴ）およびＵＳＰ１-/-胚の血清中のＢＡＬＰ。バーはそれぞれの遺伝子型の４つの胚の平均±ＳＤを表している。
【図１３Ａ】ＵＳＰ１は正常なマウス骨格形成に必要である。ＵＳＰ１の触媒システインをコードするエクソン３を枯渇させるためのＵＳＰ１ターゲティング戦略。黄色ボックスはエクソンを表している。
【図１３Ｂ】ＵＳＰ１は正常なマウス骨格形成に必要である。Ｅ１８．５  ＵＳＰ１+/+（ＷＴ）およびＵＳＰ１-/-胚のマイクロコンピューティドトモグラフィ。
【図１３Ｃ】ＵＳＰ１は正常なマウス骨格形成に必要である。（Ｂ）におけるマウスのミネラル化骨量（Ｍｉｎｚ．Ｖｏｌ．）。バーはそれぞれの遺伝子型の３頭のマウスの平均±ｓ．ｄ．を表している。
【図１３Ｄ】ＵＳＰ１は正常なマウス骨格形成に必要である。Ｐ１２  ＵＳＰ１+/+（ＷＴ）およびＵＳＰ１-/-大腿骨のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色切片。スケールバー、１００ｍｍ。
【図１３Ｅ】ＵＳＰ１は正常なマウス骨格形成に必要である。Ｐ１２  ＵＳＰ１+/+（ＷＴ）およびＵＳＰ１-/-大腿骨における骨片の長さあたりの類骨面積。バーはそれぞれの遺伝子型の３頭のマウスの平均±ｓ．ｄ．を表している。
【図１３Ｆ】ＵＳＰ１は正常なマウス骨格形成に必要である。Ｐ１２  ＵＳＰ１+/+（ＷＴ）およびＵＳＰ１-/-大腿骨幹端のＨ＆Ｅ、トリクローム、およびフォンコッサ染色。スケールバー、１００ｍｍ。
【図１３Ｇ】ＵＳＰ１は正常なマウス骨格形成に必要である。Ｐ１２  ＵＳＰ１+/+（ＷＴ）およびＵＳＰ１-/-大腿骨における常在性破骨細胞のＴＲＡＰ標識化。スケールバー、１００ｍｍ。
【図１３Ｈ】ＵＳＰ１は正常なマウス骨格形成に必要である。Ｐ１２  ＵＳＰ１+/+（ＷＴ）およびＵＳＰ１-/-大腿骨切片におけるＴＲＡＰ陽性細胞の数え上げ。
【図１３Ｉ】ＵＳＰ１は正常なマウス骨格形成に必要である。Ｅ１８．５羊水中のクレアニチン正常化デオキシピリジノリン（ＤＰＤ）レベル。
【図１３Ｊ】ＵＳＰ１は正常なマウス骨格形成に必要である。Ｐ１２  ＵＳＰ１+/+（ＷＴ）およびＵＳＰ１-/-大腿骨幹端におけるＵＳＰ１およびＩＤ２発現。スケールバー、１００ｍｍ。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
Ｉ．定義
用語「ユビキチン特異的ペプチダーゼ１」、「脱ユビキチン化酵素１」、および「ＵＳＰ１」とは本明細書では、天然配列ＵＳＰ１ポリペプチド、ポリペプチドバリアントならびに天然配列ポリペプチドおよびポリペプチドバリアントの断片のことである（これらは本明細書でさらに定義される）。本明細書に記載されるＵＳＰポリペプチドは、ヒト組織型からもしくは別の供給源からなどの種々の供給源から単離される、または組換えもしくは合成的方法により調製されるポリペプチドであってもよい。
【００２６】
「天然配列ＵＳＰ１ポリペプチド」は、天然に由来する対応するＵＳＰ１ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。一実施形態では、天然配列ＵＳＰ１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【００２７】
「ＵＳＰ１ポリペプチドバリアント」またはその変化したものは、本明細書で開示される天然配列ＵＳＰ１ポリペプチド配列のいずれかと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する本明細書で定義されるＵＳＰ１ポリペプチド、一般的には活性ＵＳＰ１ポリペプチドを意味する。そのようなＵＳＰ１ポリペプチドバリアントには、例えば、１つまたは複数のアミノ酸残基が天然アミノ酸配列のＮ−またはＣ−末端に付加されているまたは欠失しているＵＳＰ１ポリペプチドが含まれる。通常、ＵＳＰ１ポリペプチドバリアントは、本明細書で開示される天然配列ＵＳＰ１ポリペプチド配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有することになる。通常、ＵＳＰ１バリアントポリペプチドは少なくとも約１０アミノ酸長である、または少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００アミノ酸長、もしくはそれよりも長い。通常、ＵＳＰ１バリアントポリペプチドは、天然ＵＳＰ１ポリペプチド配列と比べた場合、１つ以下の保存的アミノ酸置換、または天然ＵＳＰ１ポリペプチド配列と比べた場合、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０以下の保存的アミノ酸置換を有することになる。
【００２８】
本明細書で定義される用語「ＵＳＰ１アンタゴニスト」は、天然配列ＵＳＰ１により媒介される生物活性を部分的にまたは完全にブロックする、阻害するまたは中和する任意の分子である。ある特定の実施形態では、そのようなアンタゴニストはＵＳＰ１に結合する。一実施形態によれば、アンタゴニストはポリペプチドである。別の実施形態によれば、アンタゴニストは抗ＵＳＰ１抗体である。別の実施形態によれば、アンタゴニストは小分子アンタゴニストである。別の実施形態によれば、アンタゴニストはポリヌクレオチドアンタゴニストである。
【００２９】
用語「ＷＤ繰り返しドメイン４８」、「ＵＳＰ１関連因子１」、および「ＵＡＦ１」とは本明細書では、天然配列ＵＡＦ１ポリペプチド、ポリペプチドバリアントならびに天然配列ポリペプチドおよびポリペプチドバリアントの断片のことである（これらは本明細書でさらに定義される）。本明細書に記載されるＵＡＦ１ポリペプチドは、ヒト組織型からもしくは別の供給源からなどの種々の供給源から単離される、または組換えもしくは合成的方法により調製されるポリペプチドであってもよい。
【００３０】
「天然配列ＵＡＦ１ポリペプチド」は、天然に由来する対応するＵＡＦ１ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。一実施形態では、天然配列ＵＡＦ１ポリペプチドは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。
【００３１】
「ＵＡＦ１ポリペプチドバリアント」またはその変化したものは、本明細書で開示される天然配列ＵＡＦ１ポリペプチド配列のいずれかと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する本明細書で定義されるＵＡＦ１ポリペプチド、一般的には活性ＵＡＦ１ポリペプチドを意味する。そのようなＵＡＦ１ポリペプチドバリアントには、例えば、１つまたは複数のアミノ酸残基が天然アミノ酸配列のＮ−またはＣ−末端に付加されているまたは欠失しているＵＡＦ１ポリペプチドが含まれる。通常、ＵＡＦ１ポリペプチドバリアントは、本明細書で開示される天然配列ＵＡＦ１ポリペプチド配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有することになる。通常、ＵＡＦ１バリアントポリペプチドは少なくとも約１０アミノ酸長である、または少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００アミノ酸長、もしくはそれよりも長い。場合により、ＵＡＦ１バリアントポリペプチドは、天然ＵＡＦ１ポリペプチド配列と比べた場合、１つ以下の保存的アミノ酸置換、または天然配列ＵＡＦ１ポリペプチド配列と比べた場合、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０以下の保存的アミノ酸置換を有することになる。
【００３２】
本明細書で定義される用語「ＵＡＦ１アンタゴニスト」は、天然配列ＵＡＦ１により媒介される生物活性を部分的にまたは完全にブロックする、阻害するまたは中和する任意の分子である。ある特定の実施形態では、そのようなアンタゴニストはＵＡＦ１に結合する。一実施形態によれば、アンタゴニストはポリペプチドである。別の実施形態によれば、アンタゴニストは抗ＵＡＦ１抗体である。別の実施形態によれば、アンタゴニストは小分子アンタゴニストである。別の実施形態によれば、アンタゴニストはポリヌクレオチドアンタゴニストである。
【００３３】
用語「ＤＮＡ結合のインヒビター」、および「ＩＤ」とは本明細書では、天然配列ＩＤポリペプチド、ポリペプチドバリアントならびに天然配列ポリペプチドおよびポリペプチドバリアントの断片のことである（これらは本明細書でさらに定義される）。本明細書に記載されるＩＤポリペプチドは、ヒト組織型からもしくは別の供給源からなどの種々の供給源から単離される、または組換えもしくは合成的方法により調製されるポリペプチドであってもよい。
【００３４】
「天然配列ＩＤポリペプチド」は、天然に由来する対応するＩＤポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。天然配列ＩＤポリペプチドのいずれかのいくつかの実施形態では、天然配列ＩＤポリペプチドは、配列番号２の天然配列ＩＤ１アイソフォームａポリペプチドを含む。天然配列ＩＤポリペプチドのいずれかのいくつかの実施形態では、天然配列ＩＤポリペプチドは、配列番号３の天然配列ＩＤ１アイソフォームｂポリペプチドを含む。天然配列ＩＤポリペプチドのいずれかのいくつかの実施形態では、天然配列ＩＤポリペプチドは、配列番号４の天然配列ＩＤ２ポリペプチドを含む。天然配列ＩＤポリペプチドのいずれかのいくつかの実施形態では、天然配列ＩＤポリペプチドは、配列番号５の天然配列ＩＤ３ポリペプチドを含む。
【００３５】
「ＩＤポリペプチドバリアント」またはその変化したものは、本明細書で開示される天然配列ＩＤポリペプチド配列のいずれかと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する本明細書で定義されるＩＤポリペプチド、一般的には活性ＩＤポリペプチドを意味する。そのようなＩＤポリペプチドバリアントには、例えば、１つまたは複数のアミノ酸残基が天然アミノ酸配列のＮ−またはＣ−末端に付加されているまたは欠失しているＩＤポリペプチドが含まれる。通常、ＩＤポリペプチドバリアントは、本明細書で開示される天然配列ＩＤポリペプチド配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有することになる。通常、ＩＤバリアントポリペプチドは少なくとも約１０アミノ酸長である、または少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００アミノ酸長、もしくはそれよりも長い。場合により、ＩＤバリアントポリペプチドは、天然ＩＤポリペプチド配列と比べた場合、１つ以下の保存的アミノ酸置換、または天然ＩＤポリペプチド配列と比べた場合、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０以下の保存的アミノ酸置換を有することになる。ＩＤポリペプチドバリアントのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩＤポリペプチドバリアントにはＩＤ１ポリペプチドバリアントが含まれる。ＩＤポリペプチドバリアントのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩＤポリペプチドバリアントにはＩＤ２ポリペプチドバリアントが含まれる。ＩＤポリペプチドバリアントのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩＤポリペプチドバリアントにはＩＤ３ポリペプチドバリアントが含まれる。
【００３６】
本明細書で定義される用語「ＩＤアンタゴニスト」は、天然配列ＩＤにより媒介される生物活性を部分的にまたは完全にブロックする、阻害するまたは中和する任意の分子である。ある特定の実施形態では、そのようなアンタゴニストはＩＤに結合する。一実施形態によれば、アンタゴニストはポリペプチドである。別の実施形態によれば、アンタゴニストは抗ＩＤ抗体である。別の実施形態によれば、アンタゴニストは小分子アンタゴニストである。別の実施形態によれば、アンタゴニストはポリヌクレオチドアンタゴニストである。ＩＤアンタゴニストのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩＤアンタゴニストはＩＤ１アンタゴニストである。ＩＤアンタゴニストのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩＤアンタゴニストはＩＤ２アンタゴニストである。ＩＤアンタゴニストのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩＤアンタゴニストはＩＤ３アンタゴニストである。
【００３７】
「ポリヌクレオチド」、または「核酸」とは、本明細書では互換的に使用されるように、任意の長さのヌクレオチドのポリマーのことであり、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはその類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、または合成反応によりポリマーに組み込むことができる任意の基質であることが可能である。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドおよびその類似体を含んでいてもよい。存在するとすれば、ヌクレオチド構造への改変をポリマーの組立て前にまたは後に加えてもよい。ヌクレオチドの配列に非ヌクレオチド成分が割り込んでいてもよい。ポリヌクレオチドは、合成後に標識を用いたコンジュゲーションによるなどさらに改変されてもよい。他の種類の改変には、例えば、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドの１つまたは複数の類似物での置換、例えば、無電荷連鎖（例えば、メチルホスホン酸、ホスホトリエステル、アミド亜リン酸エステル、カルバミン酸、等）および電荷連鎖（例えば、ホスホロチオエート、ジチオリン酸、等）を有する修飾、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リシン、等）などのペンダント部分を含有する修飾、介入物（例えば、アクリジン、ソラレン、等）を有する修飾、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属、等）を含有する修飾、アルキル化剤を含有する修飾、改変された連鎖（例えば、アルファアノマー核酸、等）を有する修飾などのヌクレオチド間修飾、ならびに非改変型の（１つまたは複数の）ポリヌクレオチドが含まれる。さらに、糖中に通常存在するヒドロキシル基のいずれでも、例えば、ホスホン酸エステル基、リン酸基で置換される、標準保護基により保護される、または活性化されて追加のヌクレオチドへの追加の連鎖を調製してもよいし、または固体もしくは半固体支持体にコンジュゲートされていてもよい。５’および３’末端ＯＨはリン酸化するまたはアミンもしくは１から２０炭素原子の有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルも標準保護基に誘導体化しうる。ポリヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似物、α−アノマー糖、アラビノーズ、キシロース、またはリキソースなどのエピメリック糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体およびメチルリボシドなどの脱塩基ヌクレオシド類似体を含む、当技術分野で一般に知られているリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態も含有することができる。１つまたは複数のホスホジエステル連鎖は代わりの連結基で置換してもよい。これらの代わりの連結基には、リン酸がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、“（Ｏ）ＮＲ2（「アミダート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ2（「ギ酸アセタール」）で置換されており、それぞれのＲまたはＲ’は独立してＨであるまたは場合によりエーテル（−Ｏ−）連鎖、アリール、アルケニル、シク��アルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジルを含有する置換されたもしくは非置換アルキル（１〜２０Ｃ）である実施形態が含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド内のすべての連鎖が同一である必要はない。先行する説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書で言及されるすべてのポリヌクレオチドに当てはまる。
【００３８】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」とは一般には、一般に約２００ヌクレオチド長未満であるが、必ずしもそうではない短い、一般的に一本鎖の、一般的に合成ポリヌクレオチドのことである。用語「オリゴヌクレオチド」と「ポリヌクレオチド」は相互排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記説明は、オリゴヌクレオチドに対して等しく、完全に適用可能である。
【００３９】
用語「小分子」とは、分子量が約２０００ダルトンまたはそれよりも少ない、好ましくは約５００ダルトンまたはそれよりも少ない任意の分子のことである。
【００４０】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞系」、および「宿主細胞培養」は互換的に使用されており、そのような細胞の子孫を含む、外来性核酸が導入されている細胞のことである。宿主細胞には、原発性形質転換細胞および継代の数とは無関係にそれに由来する子孫を含む「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれる。子孫は核酸含有量が親細胞と完全に同一というわけではないことがあるが、変異を含有することがある。最初の形質転換細胞においてスクリーニングしてまたは選択して求めた機能または生物活性と同じ機能または生物活性を有する変異体子孫は本明細書に含まれる。
【００４１】
用語「ベクター」とは、本明細書で使用されるように、それが連結されている別の核酸を増殖させることができる核酸のことである。前記用語には、自己複製核酸構造体としてのベクターならびにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれているベクターが含まれる。ある種のベクターは、それが作動可能に連結した核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
【００４２】
「単離された」抗体は、その天然環境の成分から分離されている抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）により決定される場合、９５％よりも多いまたは９９％純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法についての概説は、例えば、Ｆｌａｔｍａｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ８４８：７９〜８７（２００７）を参照されたい。
【００４３】
「単離された」核酸とは、その天然環境の成分から分離されている核酸分子のことである。単離された核酸には、通常その核酸分子を含有する細胞に含有される核酸分子が含まれるが、前記核酸分子は染色体外にまたはその天然の染色体上の位置とは異なる染色体上の位置に存在する。
【００４４】
用語「抗体」は本明細書では、その最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、および所望の抗原結合活性を示す限りで抗体断片を含むがこれらに限定されない種々の抗体構造体を包含する。
【００４５】
用語「抗ＵＳＰ１抗体」および「ＵＳＰ１に結合する抗体」とは、抗体がＵＳＰ１を標的にする際に診断薬および／または治療薬として有用であるように十分な親和性でＵＳＰ１に結合することができる抗体のことである。一実施形態では、抗ＵＳＰ１抗体が無関係な非ＵＳＰ１タンパク質に結合する程度は、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）により測定した場合、ＵＳＰ１への抗体の結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＵＳＰ１抗体は異なる種由来のＵＳＰ１間で保存されているＵＳＰ１のエピトープに結合する。
【００４６】
用語「抗ＩＤ抗体」および「ＩＤに結合する抗体」とは、抗体がＩＤを標的にする際に診断薬および／または治療薬として有用であるように十分な親和性でＩＤに結合することができる抗体のことである。一実施形態では、抗ＩＤ抗体が無関係な非ＩＤタンパク質に結合する程度は、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）により測定した場合、ＩＤへの抗体の結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＩＤ抗体は異なる種由来のＩＤ間で保存されているＩＤのエピトープに結合する。抗ＩＤ抗体のいずれかのいくつかの実施形態では、ＩＤ抗体は抗ＩＤ１抗体である。抗ＩＤ抗体のいずれかのいくつかの実施形態では、ＩＤ抗体は抗ＩＤ２抗体である。抗ＩＤ抗体のいずれかのいくつかの実施形態では、ＩＤ抗体は抗ＩＤ３抗体である。
【００４７】
「ブロッキング」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物活性を阻害するまたは減少させる抗体である。好ましいブロッキング抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的にまたは完全に阻害する。
【００４８】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）の間の非共有結合的相互作用の総和の強度のことである。他の方法で指示されていなければ、本明細書で使用されるように、「結合親和性」とは、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１対１の相互作用を反映する内因性結合親和性のことである。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は一般には解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当技術分野で公知の一般的方法により測定することができる。結合親和性を測定するための特定の説明的で例となる実施形態は以下に記載されている。
【００４９】
「親和性成熟」抗体とは、変更により抗原に対する抗体の親和性が改善されるような変更がない親抗体と比べて、１つまたは複数の高頻度可変性領域（ＨＶＲ）に１つまたは複数の変更がある抗体のことである。
【００５０】
「抗体断片」とは、無傷の抗体が結合する抗原に結合する無傷の抗体の一部を含む無傷の抗体以外の分子のことである。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）2；ダイアボディ；線形抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多重特異的抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
基準抗体として「同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて基準抗体のその抗原への結合を５０％以上ブロックする抗体のことであり、逆に基準抗体は競合アッセイにおいて抗体のその抗原への結合を５０％以上ブロックする。例となる競合アッセイは本明細書に提供されている。
【００５２】
用語「キメラ」抗体とは、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来しており、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なる供給源または種に由来する抗体のことである。
【００５３】
抗体の「クラス」とは、定常領域またはその重鎖により所有される定常領域の種類のことである。抗体には５つの主要クラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらの抗体のいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1、およびＩｇＡ2に分けられる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
【００５４】
用語「完全長抗体」、「無傷の抗体」、および「全抗体」は本明細書では互換的に使用されて、天然の抗体構造に実質的に類似する構造を有するまたは本明細書で定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。
【００５５】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、例えば、天然に存在する変異を含有するまたはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる可能なバリアント抗体（そのようなバリアントは一般に少量存在する）を除いて、実質的に均一な抗体の集団（すなわち、その集団を構成する個々の抗体が同一であるおよび／または同じエピトープに結合する）から得られる抗体のことである。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して向けられている異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物のそれぞれのモノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して向けられている。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特長を指しており、いかなる特定の方法による抗体の産生も必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない種々の技法により作製しうる（モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例となる方法は本明細書に記載されている）。
【００５６】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞により産生されるまたはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源由来の抗体のアミノ酸配列に一致するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００５７】
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基およびヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体のことである。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のＨＶＲに一致しており、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト抗体のＦＲに一致している少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むことになる。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含むことがある。「ヒト化型の」抗体、例えば、非ヒト抗体とはヒト化を受けた抗体のことである。
【００５８】
「免疫コンジュゲート」は、細胞傷害性薬剤を含むがこれに限定されない１つまたは複数の異種分子にコンジュゲートされた抗体である。
【００５９】
基準ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要な場合はギャップを導入して最大パーセント配列同一性を達成した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なすことなく、基準ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基のパーセントと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアライメントは、当分野の技術の範囲内である種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公表されているコンピュータソフトウェアを使用して実現することができる。当業者であれば、比較されている配列の全長にわたって最大アライメントを実現するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるのに適切なパラメータを決定することができる。しかし、本明細書での目的のために、％アミノ酸配列同一性値は配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生み出される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により生み出され、ソースコードは米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．２０５５９にユーザードキュメンテーションと一緒に提出され、そこに米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公表されており、またはソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上で使用するためにコンパイルすべきである。すべての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定されており変動しない。
【００６０】
ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較に用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ｂにとっての、これとの、またはこれに対する所与のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（代わりに、所与のアミノ酸配列Ｂにとって、これと、またはこれに対してある％のアミノ酸配列同一性を有するまたは含む所与のアミノ酸配列Ａと言い表すことができる）は以下の通りに計算され、
１００×分数Ｘ／Ｙ
ＸはＡとＢのそのプログラムアライメントにおいて配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により同一マッチとしてスコアー化されたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性はＡに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくならないことは認識されるであろう。他の方法で特に記述されていなければ、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用するすぐ前のパラグラフに記載されている通りに得られる。
【００６１】
「有効量」の薬剤とは、必要な用量で必要な期間、所望の治療結果または予防結果を達成するのに有効な量のことである。
【００６２】
本発明の「治療的有効量」の物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストは、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの能力に応じて変化しうる。治療的有効量は、物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの毒作用または有害作用よりも治療的に有益な効果のほうが上回る量でもある。「予防的有効量」とは、必要な用量で必要な期間、所望の予防結果を達成するのに有効な量のことである。典型的にはしかし必ずしもではないが、予防用量は疾患に先立ってまたはその初期段階で対象において使用されるために、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないことになる。
【００６３】
用語「薬学的製剤」とは、そこに含有される活性成分の生物活性が効果的であることを可能にするような形態であり、前記製剤が投与されると考えられる対象にとって容認できないほど有毒である追加の成分を含有しない調製物のことである。
【００６４】
「薬学的に許容される担体」とは、活性成分以外の薬学的製剤中の、対象にとって無毒の成分のことである。薬学的に許容される担体には、バッファー、賦形剤、安定化剤、または保存剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
本明細書で使用されるように、「治療」（および、「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などのその文法的変形）とは、治療を受けている個体の自然経過を変える試みにおける臨床的介入のことであり、予防のためにまたは臨床病理の経過中に実施することができる。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発を予防すること、症状の軽減、疾患のいかなる直接的または間接的病理学的結果も減少すること、転移を予防すること、疾患進行の速度を減少すること、疾患状態の寛解または緩和、および寛解または予後改善が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体を使用して疾患の発症を遅らせるまたは疾患の進行を遅くする。
【００６６】
用語「抗癌療法」とは、癌を治療するのに有用な療法のことである。抗癌治療剤には、例えば、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害性薬剤、放射線療法に使用される薬剤、抗血管形成剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、および癌を治療するための他の薬剤、抗ＣＤ２０抗体、血小板由来増殖因子阻害剤（例えば、Ｇｌｅｅｖｅｃ（商標）（イマチニブメチル酸塩））、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、以下の標的、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、（１つまたは複数の）ＢＣＭＡ受容体、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２のうちの１つまたは複数に結合するアンタゴニスト（例えば、中和抗体）、ならびに他の生体活性剤および有機化学剤、等が含まれるが、これらに限定されない。それらの組合せも本発明に含まれる。
【００６７】
本明細書で使用される用語「細胞傷害性薬剤」とは、細胞の機能を阻害するもしくは妨げるおよび／または細胞の破壊を引き起こす物質のことである。前記用語は放射性同位元素（例えば、Ａｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32およびＬｕの放射性同位元素）、化学療法剤、例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤、核酸分解酵素などの酵素およびその断片、抗体、ならびに小分子毒素または細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素（その断片および／またはバリアントを含む）、ならびに下に開示されている種々の抗腫瘍剤または抗癌剤を含むことが意図されている。他の細胞傷害性薬剤は下に記載されている。殺腫瘍性薬剤は腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【００６８】
「化学療法剤」とは、癌の治療に有用な化学化合物のことである。化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのアルキルスルホン酸塩；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリメチロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン、ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似物トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレチン、および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼルシンおよびビゼレシン合成類似物を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似物ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド（ｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）；フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニマスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンなどのニトロソウレア；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Ｎｉｃｏｌａｏｕら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３３：１８３〜１８６（１９９４）参照）；ＣＤＰ３２３、経口アルファ−４インテグリン阻害剤；ダイネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）Ａを含むダイネミシン；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連色素タンパク質エネジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎｓ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、��ルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ（ｐｙｒｒｏｌｉｎｏ）−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソームインジェクション（ＤＯＸＩＬ（登録商標））、リポソーマルドキソルビシン（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）ＴＬＣ  Ｄ−９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標））、ペグ化リポソーマルドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標））、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン、および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似物；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似物；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似物；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗アドレナル（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌｓ）；フォリン酸などの葉酸補液；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビスアントレン；エダトレキサート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジクオン；エルフロルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム：エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシンおよびアンサマイトシンなどのマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）ポリサッカライド複合体（ＪＨＳ天然物、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’−トリクロロトリエチルアミン；ト��コテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標））、およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン（例えば、ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））、およびカルボプラチンなどの白金薬剤；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））、およびビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））を含む、チューブリン重合が微小管を形成するのを妨げるビンカ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボリン；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロン酸；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＥＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））を含む、レチノイン酸などのレチノイド；クロドロン酸（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロン酸（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロン酸（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロン酸（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロン酸（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、またはリセドロン酸（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））などのビスホスホネート；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似物）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、および上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）などの、異常な細胞増殖に関係するシグナル伝達経路における遺伝子発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンおよび遺伝子療法ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなどのワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ＢＡＹ４３９００６（ソラフェニブ；Ｂａｙｅｒ）；ＳＵ−１１２４８（スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリフォシン、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブまたはエトリコキシブ）、プロテオソーム阻害剤（例えば、ＰＳ３４１）；ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））；ＣＣＩ−７７９；ティピファニブ（Ｒ１１５７７）；オラフェニブ、ＡＢＴ５１０；オブリメルセンナトリウムなどのＢｃｌ−２阻害剤（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））；ピクサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤（下の定義参照）；チロシンキナーゼ阻害剤（下の定義参照）；ラパマイシンなどのセリン−スレオニンキナーゼ阻害剤（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標））；ロナファーニブなどのファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＳＣＨ  ６６３６、ＳＡＲＡＳＡＲ（商標））；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体；ならびに、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法を表す略字）；ならびにＦＯＬＦＯＸ（オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））を５−ＦＵおよびロイコボリンと併用した治療レジメンを表す略字）などの上記のうちの２つ以上の薬剤の組合せが含まれる。
【００６９】
本明細書に定義される化学療法剤には、癌の増殖を促進することができるホルモンの効果を調節する、減少する、ブロックするまたは阻害するように作用する「抗ホルモン剤」または「内分泌療法」が含まれる。化学療法剤は、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標））、４−ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））、イドキシフェン、ドロロキシフェン（ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ）、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケイキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、およびＳＥＲＭ３などの選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）を含む、混合アゴニスト／アンタゴニストプロファイルを有する抗エストロゲン；フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））、およびＥＭ８００（そのような薬剤はエストロゲン受容体（ＥＲ）二量体化をブロックし、ＤＮＡ結合を阻害し、ＥＲターンオバーを増加させ、および／またはＥＲレベルを抑制しうる）などのアゴニスト特性のない純粋な抗エストロゲン；ホルメスタンおよびエキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））などのステロイドアロマターゼ阻害剤、ならびにアナストロゾール（ａｎａｓｔｒａｚｏｌｅ）（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））およびアミノグルテチミドなどの非ステロイドアロマターゼ阻害剤を含むアロマターゼ阻害剤、ならびに他のアロマターゼ阻害剤にはボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、ファドロゾール、および４（５）−イミダゾールが含まれる；リュープロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））、ゴセレリン、ブセレリン、およびトリプテレリンを含む、黄体ホルモン放出ホルモンアゴニスト；酢酸メゲストロールおよび酢酸メドロキシプロゲステロンなどのプロゲスチン、ジエチルスチルベストロールおよびプレマリンなどのエストロゲン、ならびにフルオキシメステロン、オールトランスレチオニン酸（ａｌｌ  ｔｒａｎｓｒｅｔｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）およびフェンレチニドなどのアンドロゲン／レチノイドを含む、性ステロイド；オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）；抗プロゲステロン（ａｎｔｉ−ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅｓ）；エストロゲン受容体下方調節因子（ＥＲＤ）；フルタミド、ニルタミドおよびビカルタミドなどの抗アンドロゲン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体；ならびに上記のうちの２つ以上の組合せを含むが、これらに限定されず、ホルモンそれ自体でもよい。
【００７０】
本出願において使用される用語「プロドラッグ」とは、親ドラッグと比べて腫瘍細胞に対して細胞傷害性が少なく、酵素的に活性化されるまたはより活性な親形態に転換することができる薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体形態のことである。例えば、Ｗｉｌｍａｎ、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、１４、３７５〜３８２ページ、６１５ｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｂｅｌｆａｓｔ  （１９８６）およびＳｔｅｌｌａら、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｂｏｒｃｈａｒｄｔら、（編）、２４７〜２６７ページ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照されたい。本発明のプロドラッグには、より活性な無細胞傷害性ドラッグに転換することができるリン酸含有プロドラッグ、チオリン酸含有プロドラッグ、硫酸含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、βラクタム含有プロドラッグ、場合により置換フェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは場合により置換フェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよび他の５−フルオロウリジンプロドラッグが含まれるが、これらに限定されない。本発明において使用するためにプロドラッグ形態に誘導化することができる細胞傷害性薬物の例には、上記の化学療法剤が含まれるがこれらに限定されない。
【００７１】
本明細書で使用される場合の「増殖阻害薬剤」とは、細胞（例えば、その増殖がインビトロまたはインビボのどちらかでＵＳＰ１発現に依拠している細胞）の増殖を阻害する化合物または組成物のことである。増殖阻害薬剤の例には、Ｇ１停止およびＭ期停止を誘導する薬剤などの細胞周期進行をブロックする（Ｓ期以外の場所で）薬剤が含まれる。古典的Ｍ期ブロッカーには、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン、ならびにドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンなどのトポイソメラーゼＩＩ阻害剤が含まれる。Ｇ１を停止させる薬剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、およびアラビノフラノシル−ＣなどのＤＮＡアルキル化剤はＳ期停止にも波及する。追加の情報は、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、ＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎおよびＩｓｒａｅｌ、編、Ｃｈａｐｔｅｒ  １、ｅｎｔｉｔｌｅｄ「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ、ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ」ｂｙ  Ｍｕｒａｋａｍｉら、（ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９５）、特に１３ページに見ることができる。タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル）は、両方ともイチイに由来する抗癌薬である。ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ）は、ヨーロッパイチイに由来するが、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成類似物である。パクリタキセルおよびドセタキセルはチューブリン二量体からの微小管の構築を促進し、細胞において有糸分裂を阻害する脱重合を妨げることにより微小管を安定化する。
【００７２】
「放射線療法」は、正常に機能する細胞の能力を制限するまたは細胞を完全に破壊するように細胞に対する十分な損傷を誘導する有向のガンマ線またはベータ線を使用することを意味する。治療の投与用量および持続時間を決定する当技術分野で公知の方法が数多く存在することが認識される。典型的な治療は１回投与として与えられ、典型的な投与用量は１日当たり１０から２００単位（グレイ）に及ぶ。
【００７３】
「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれる。ある特定の実施形態では、個体または対象はヒトである。
【００７４】
用語「同時に」とは、投与の少なくとも一部が時間的に重なっている２つ以上の治療薬の投与を指すのに本明細書では使用される。したがって、同時投与には、１つまたは複数の他の薬剤の投与を中断した後に１つまたは複数の薬剤の投与が続く投与計画が含まれる。
【００７５】
「減少させるまたは阻害する」は、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれよりも多い全体的減少を引き起こす能力を意味する。減少させるまたは阻害するは、治療されている障害の症状、転移の存在もしくは大きさ、または原発性腫瘍の大きさに言及することができる。
【００７６】
用語「添付文書」は、適応症、用法、投与量、投与、併用療法、禁忌症および／またはそのような治療製品に関する警告についての情報を含む、治療製品のコマーシャルパッケージに通例含まれる使用説明書に言及するのに使用される。
【００７７】
本明細書に記載される本発明の態様および実施形態には、態様および実施形態「からなる」および／または「基本的にからなる」が含まれることは理解されている。本明細書で使用されるように、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」には他の方法で指示されていなければ複数の参照が含まれる。
【００７８】
ＩＩ．方法および使用
ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストを利用する方法が本明細書で提供される。例えば、細胞を有効量のＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストに接触させることを含む、細胞の細胞運命の変化を促進する方法が本明細書で提供される。細胞を有効量のＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストに接触させることを含む、細胞周期停止を誘導する方法も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、細胞は幹細胞運命（例えば、間葉幹細胞運命）を有する細胞である。
【００７９】
個人に有効量のＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストを投与することを含む、疾患または障害を治療する方法が本明細書で提供される。
【００８０】
個人に有効量のＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストを投与することを含む、骨成長を誘導する方法が本明細書で提供される。
【００８１】
個人に有効量のＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストを投与することを含む、化学療法剤に対して個人を感作するおよび／または再感作する方法が本明細書で提供される。
【００８２】
個人に有効量のＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストを投与することを含む、ＥＭＴを誘導するおよび／または促進する方法が本明細書で提供される。
【００８３】
個人に有効量のＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストを投与することを含む、化学療法剤に抵抗性の癌を治療する方法が本明細書で提供される。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、およびＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、またはＩＤ３）からなる群から選択される１つもしくは複数の遺伝子の（例えば、標準値および／または内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）上昇した発現レベルに基づく治療のための個体が選択されるまたはＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、およびＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、またはＩＤ３）からなる群から選択される１つもしくは複数の遺伝子の（例えば、標準値および／または内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）低い発現レベルに基づく治療のための個体は選択されない。いくつかの実施形態では、ｐ２１、ＲＵＮＸ２、ＯＳＴＥＲＩＸ、ＳＰＡＲＣ／ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ、ＳＰＰ１／ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＢＧＬＡＰ／ＯＳＴＥＯＣＡＬＣＩＮ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）からなる群から選択される１つもしくは複数の遺伝子の（例えば、標準値および／または内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）低い発現レベルに基づく治療のための個体が選択されるまたはｐ２１、ＲＵＮＸ２、ＯＳＴＥＲＩＸ、ＳＰＡＲＣ／ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ、ＳＰＰ１／ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＢＧＬＡＰ／ＯＳＴＥＯＣＡＬＣＩＮ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）からなる群から選択される１つもしくは複数の遺伝子の（例えば、標準値および／または内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）上昇した発現レベルに基づく治療のための個体は選択されない。
【００８５】
いくつかの実施形態では、個体は、ｐ２１、ＲＵＮＸ２、ＯＳＴＥＲＩＸ、ＳＰＡＲＣ／ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ、ＳＰＰ１／ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＢＧＬＡＰ／ＯＳＴＥＯＣＡＬＣＩＮ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の（例えば、標準値および／または内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）上昇した発現レベルに基づく治療に（例えば、治療開始時、中、または前の時点から後の時点まで）応答性である可能性が高いか、または個体は、ｐ２１、ＲＵＮＸ２、ＯＳＴＥＲＩＸ、ＳＰＡＲＣ／ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ、ＳＰＰ１／ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＢＧＬＡＰ／ＯＳＴＥＯＣＡＬＣＩＮ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の（例えば、標準値および／または内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）減少したまたは著しい変化のない発現レベルに基づく治療に（例えば、治療開始時、中、または前の時点から後の時点まで）応答性ではない可能性が高い。
【００８６】
前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストは細胞周期停止を誘導する。前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストは細胞運命の変化を促進することができる。前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストはＥＭＴを促進するおよび／または誘導することができる。
【００８７】
前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞運命の変化を促進することは、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、およびＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、またはＩＤ３）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の（例えば、標準値および／または内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）減少した発現レベルにより示される。前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞運命の変化を促進することは、ｐ２１、ＲＵＮＸ２、ＯＳＴＥＲＩＸ、ＳＰＡＲＣ／ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ、ＳＰＰ１／ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＢＧＬＡＰ／ＯＳＴＥＯＣＡＬＣＩＮ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の上昇した発現レベルにより示される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子の発現レベルは内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて上昇している。
【００８８】
前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、疾患または障害は幹細胞運命（例えば、間葉幹細胞運命）を有する細胞を含む。前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、前記細胞はＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、およびＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、またはＩＤ３）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子の発現レベルは内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて上昇している。前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はｐ２１、ＲＵＮＸ２、ＯＳＴＥＲＩＸ、ＳＰＡＲＣ／ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ、ＳＰＰ１／ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＢＧＬＡＰ／ＯＳＴＥＯＣＡＬＣＩＮ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子を著しく発現してはいない（例えば、内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて発現してはいないまたは低レベルで発現している）。
【００８９】
前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、疾患または障害は癌である。癌の例には、細胞腫、リンパ腫、芽細胞腫（髄芽腫および網膜芽細胞腫を含む）、肉腫（脂肪肉腫および滑膜細胞肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍（カルチノイド腫瘍、ガストリン産生腫瘍、および膵島細胞癌を含む）、中皮腫、シュワン腫（聴神経腫瘍を含む）、髄膜腫、腺癌、黒色腫、および白血病またはリンパ系腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。そのような癌のさらに詳細な例には、扁平上皮癌（例えば、上皮扁平上皮癌）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌（転移性乳癌を含む）、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆管の腫瘍、ならびに頭頸部癌が含まれる。いくつかの実施形態では、癌は骨肉腫である。いくつかの実施形態では、癌はユーイング肉腫ではない。いくつかの実施形態では、癌は乳癌である。いくつかの実施形態では、癌は乳癌ではない。いくつかの実施形態では、癌はＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、およびＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、またはＩＤ３）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子を発現する（発現することが明らかにされている）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子の発現レベルは内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて上昇している。いくつかの実施形態では、癌は１つまたは複数の化学療法剤を用いた治療に抵抗性である。いくつかの実施形態では、癌は化学療法剤を用いて以前治療されている。
【００９０】
前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストはＵＳＰ１アンタゴニストである。前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストはＩＤアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＩＤアンタゴニストは、ＩＤ１アンタゴニスト、ＩＤ２アンタゴニスト、および／またはＩＤ３アンタゴニストである。前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストはＵＦＡ１アンタゴニストである。
【００９１】
前記方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストは、抗体、結合ポリペプチド、結合小分子、またはポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストは抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト、ヒト化、またはキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は抗体断片であり、抗体断片はＵＳＰ１、ＵＡＦ、および／またはＩＤに結合する。
【００９２】
上記実施形態のいずれかに従った「個体」はヒトであってよい。
【００９３】
追加の態様では、本発明は癌を治療するための方法を提供する。一実施形態では、方法はそのような癌を有する個人に有効量のＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストを投与することを含む。そのような一実施形態では、下に記載されるように、方法は個人に有効量の少なくとも１つの追加の療法剤を投与することを含む。上記実施形態のいずれかに従った「個体」はヒトであってよい。
【００９４】
追加の態様では、本発明は、ＥＭＴを誘導するおよび／もしくは促進する、骨成長を促進する、細胞増殖を阻害する、細胞周期停止を促進するまたは個人において細胞運命の変化を促進するための方法を提供する。一実施形態では、方法は、個人に有効量のＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストを投与して、ＥＭＴを誘導するおよび／もしくは促進する、骨成長を促進する、細胞増殖を阻害する、細胞周期停止を促進するまたは細胞運命の変化を促進することを含む。一実施形態では、「個体」はヒトである。いくつかの実施形態では、個人は癌に罹っている。いくつかの実施形態では、癌は化学療法剤を用いた治療に抵抗性または耐性である。
【００９５】
追加の態様では、本発明は、例えば、上記の治療方法のいずれかにおいて使用するために、本明細書に提供されるＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストのいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一実施形態では、薬学的製剤は、本明細書に提供されるＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストのいずれかならびに薬学的に許容される担体を含む。別の実施形態では、薬学的製剤は、例えば、下に記載されているように、本明細書に提供されるＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストのいずれかならびに少なくとも１つの追加の治療剤を含む。
【００９６】
本発明のアンタゴニストは、単独でまたは療法において他の薬剤と組み合わせてのどちらでも使用することができる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１つの追加の治療剤と同時投与してもよい。ある特定の実施形態では、追加の治療剤は化学療法剤である。
【００９７】
上記のそのような併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が同じまたは別々の製剤に含まれている）、および別々の投与を包含しており、後者の場合、本発明のアンタゴニストの投与は追加の治療剤および／またはアジュバンドの投与に先立って、同時におよび／または続いて行うことができる。本発明のアンタゴニストは、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
【００９８】
本発明のアンタゴニスト（例えば、抗体）（および任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、および鼻腔内、ならびに局所的治療のためには病巣内投与を含む、どんな適切な手段によっても投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。投与は、いかなる適切な経路によっても、例えば、一部、投与が短期か長期かにより、静脈注射または皮下注射などの注射によっても可能である。様々な時点にわたる単回または複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投与スケジュールが本明細書では想定されている。
【００９９】
本発明のアンタゴニスト（例えば、抗体）は、良好な医療行為と一致する様式で処方される、服用される、および投与されると考えられる。この文脈で考慮する要因には、治療されている特定の障害、治療されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジューリング、および医師に知られている他の要因が含まれる。抗体は、問題の障害を予防するまたは治療するのに現在使用されている１つまたは複数の薬剤と一緒に処方される必要はないが、場合によりそのように処方される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するアンタゴニストの量、障害または治療の種類、および上で考察された他の要因に依拠する。これらの薬剤は一般に、本明細書に記載されるのと同じ投与量で投与経路を用いて、または本明細書に記載される投与量の約１〜９９％、または経験的に／臨床的に適切であると判定されているいかなる投与量でもおよびいかなる経路でも使用される。
【０１００】
疾患の予防または治療では、本発明の抗体の適切な投与量（単独でまたは１つもしくは複数の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）は、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度および経過、抗体が予防目的でまたは治療目的で投与されるのかどうか、前の療法、抗体に対する患者の臨床歴および応答、ならびに主治医の慎重さに依拠することになる。抗体は１回または一連の治療にわたって患者に適切に投与される。疾患の種類および重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体は、例えば、１または複数回の別々の投与によりであれ、連続注入によりであれ、患者への投与のための初回候補投与量であることが可能である。１つの典型的な一日投与量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれよりも多いに及んでいてもよい。数日またはそれよりも長い期間にわたる繰り返し投与では、状態に応じて、治療は一般に、疾患症状の所望の抑制が起こるまで持続されることになる。抗体の１つの例となる投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲になる。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの１つまたは複数の用量（またはその任意の組合せ）を患者に投与してもよい。そのような用量は、断続的に、例えば、毎週または３週間ごとに（例えば、患者が抗体の約２〜約２０、または、例えば、６容量を受けるように）投与してもよい。もっと多い初回負荷量とそれに続くもっと低い１または複数回の用量を投与してもよい。例となる投与計画は投与することを含む。しかし、他の投与量計画が有用である場合もある。この療法の進行は、従来の技法およびアッセイにより容易にモニターされる。
【０１０１】
上記製剤または治療方法のいずれも、ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストの代わりにまたはこれらアンタゴニストに加えて本発明の免疫コンジュゲートを使用して実施しうることは理解される。
【０１０２】
ＩＩＩ．治療組成物
本明細書に記載される方法において有用なＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニスト（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニスト（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）は、抗体、結合ペプチド、結合小分子、またはポリヌクレオチドである。
【０１０３】
Ａ．抗体
一態様では、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、および／またはＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、またはＩＤ３）に結合する単離された抗体が本明細書で提供される。上記実施形態のいずれにおいても、抗体はヒト化されている。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、抗体はＵＳＰ１アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、抗体はＵＡＦ１アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、抗体はＩＤ１アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、抗体はＩＤ２アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、抗体はＩＤ３アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、抗体は１つよりも多いＩＤ（例えば、２つのＩＤ、３つのＩＤ、または４つのＩＤ）を阻害することができる。いくつかの実施形態では、抗体はＵＡＦ１とのＵＳＰ１の相互作用を阻害する。いくつかの実施形態では、抗体はＩＤの脱ユビキチン化をブロックする。いくつかの実施形態では、抗体はｂＨＬＨとのＩＤの相互作用を阻害する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、抗体はＵＳＰ１アンタゴニストであり、ＵＳＰ１アンタゴニストは米国特許出願公開第２０１０／０３３０５９９号に開示されている抗体である。前記特許文献の内容は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている。いくつかの実施形態では、抗体はＩＤ１アンタゴニストであり、ＩＤ１アンタゴニストは米国特許第７，５７１，６６３号に開示されている抗体である。前記特許文献の内容は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている。いくつかの実施形態では、抗体はＩＤ３アンタゴニストであり、ＩＤ３アンタゴニストは米国特許第７，６２９，１３１号に開示されている抗体である。前記特許文献の内容は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、抗ＩＤ３抗体は、ＱＶＬＴＱＴＰＳＰＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＮＣＱＡＳＱＳＩＹＮＤＮＤＬＡＷＦＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＤＡＳＴＬＴＳＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＳＤＬＤＣＤＤＡＡＴＹＹＣＡＡＲＹＳＧＮＩＹＧＦ（配列番号４１）を含む可変軽鎖配列および／または
ＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＶＳＧＩＤＬＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶＩＦＰＳＮＮＶＹＹＡＳＷＡＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＴＴＶＤＬＫＩＴＳＰＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＳＭＧＡＦＤＳＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳＧ（配列番号４２）を含む可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＩＤ３抗体は、
ＡＶＬＴＱＴＰＳＰＶＳＡＡＶＧＧＴＶＳＩＳＣＱＳＳＱＳＶＷＮＮＮＷＬＳＷＦＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＥＴＳＫＬＥＳＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＳＤＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＬＧＧＹＷＴＴＳＤＮＮＶＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫ（配列番号４３）を含む可変軽鎖配列および／または
ＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＡＳＧＦＳＬＳＮＶＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＳＤＧＤＴＡＲＹＡＴＷＡＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＳＴＴＶＮＬＫＭＴＳＬＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＱＧＦＮＩＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＬ（配列番号４４）を含む可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＩＤ３抗体は、
ＡＶＬＴＱＴＰＳＰＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＳＣＱＳＳＱＳＶＹＮＮＮＷＬＳＷＦＱＱＫＳＧＱＰＰＫＬＬＩＹＥＴＳＫＬＥＳＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＩＤＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＬＧＧＹＷＴＴＳＤＮＮＩＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫ（配列番号４５）を含む可変軽鎖配列および／または
ＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＡＳＧＦＳＬＳＳＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＡＬＥＷＩＧＹＩＳＤＧＧＴＴＹＹＡＳＷＡＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＳＴＴＶＤＬＫＭＴＳＬＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＱＧＦＮＩＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＬ（配列番号４６）を含む可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＩＤ３抗体は、
ＡＶＬＴＱＴＰＳＰＶＳＡＡＶＧＧＴＶＳＩＳＣＱＳＳＱＳＶＷＮＮＮＷＬＳＷＦＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＥＴＳＫＬＥＳＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＳＤＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＬＧＧＹＷＴＴＳＤＮＮＶＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫ（配列番号４７）を含む可変軽鎖配列および／または
ＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＡＳＧＦＳＬＳＮＶＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＳＤＧＤＴＡＲＹＡＴＷＡＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＳＴＴＶＮＬＫＭＴＳＬＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＱＧＦＮＩＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＬ（配列番号４８）を含む可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＩＤ３抗体は、
ＡＶＬＴＱＴＰＳＰＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＳＣＱＳＳＱＳＶＹＮＮＮＷＬＳＷＦＱＱＫＳＧＱＰＰＫＬＬＩＹＥＴＳＫＬＥＳＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＩＤＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＬＧＧＹＷＳＴＳＤＮＮＩＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫ（配列番号４９）を含む可変軽鎖配列および／または
ＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＡＳＧＦＳＬＳＳＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＡＬＥＷＩＧＹＩＳＤＧＧＴＴＹＹＡＳＷＡＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＳＴＴＶＤＬＫＭＴＳＬＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＱＧＦＮＩＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＬ（配列番号５０）
を含む可変重鎖配列を含む。
【０１０７】
本発明の追加の態様では、上記実施形態のいずれかに従った抗ＵＳＰ１抗体、抗ＵＡＦ１抗体および／または抗ＩＤ抗体は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体を含む、モノクローナル抗体である。一実施形態では、抗ＵＳＰ１抗体、抗ＵＡＦ１抗体および／または抗ＩＤ抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦ（ａｂ’）2断片である。別の実施形態では、抗体は完全長抗体、例えば、無傷のＩｇＧ１’’抗体または本明細書で定義される他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。
【０１０８】
追加の態様では、上記実施形態のいずれかに従った抗ＵＳＰ１抗体、抗ＵＡＦ１抗体および／または抗ＩＤ抗体は、下のセクションに記載されているように、前記特長のいずれかを単独でまたは組み合わせて組み込んでいることがある。
【０１０９】
１．抗体親和性
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は解離定数（Ｋｄ）≦１μＭを有する。一実施形態では、Ｋｄは、以下のアッセイにより説明される対象の抗体のＦａｂバージョンおよびその抗原を用いて実施される放射標識された抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、非標識抗原の滴定シリーズの存在下でＦａｂを最小濃度の（125Ｉ）−標識抗原で平衡にし、次に結合抗原を抗Ｆａｂ被覆プレートで捕捉することにより測定される（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５〜８８１（１９９９）参照）。前記アッセイの条件を確立するため、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）で一晩被覆され、それに続いて室温（およそ２３℃）で２から５時間、ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンでブロックされる。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）では、１００ｐＭまたは２６ｐＭの（125Ｉ）−抗原は対象のＦａｂの段階希釈を用いて混合される（例えば、Ｐｒｅｓｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３〜４５９９（１９９７）における抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。次に、対象のＦａｂは一晩インキュベートされるが、インキュベーションは平衡に達していることを確実にするためにさらに長い期間（例えば、約６５時間）続いてもよい。その後、前記混合物は室温でのインキュベーション（例えば、１時間）のために捕捉プレートに移される。次に、溶液は取り除かれ、プレートはＰＢＳ中０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））で８回洗浄される。プレートが乾燥すると、１５０μｌ／ウェルのシンチラント（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）；Ｐａｃｋａｒｄ）が添加され、プレートは１０分間ＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）上で計測される。最大結合の２０％以下を与えるそれぞれのＦａｂの濃度が、競合結合アッセイにおいて使用するために選択される。
【０１１０】
別の実施形態に従えば、Ｋｄは約１０応答単位（ＲＵ）で固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。手短に言えば、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）は、供給業者の使用説明書に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）で活性化される。抗原は、流速５μｌ／分での注入前に１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）まで希釈されて、およそ１０応答単位（ＲＵ）の連結タンパク質を達成する。抗原の注入に続いて、１Ｍのエタノールアミンが注入されて、未反応基をブロックする。動態測定では、Ｆａｂの２倍の段階希釈液（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）が、２５℃、流速およそ２５μｌ／分で、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）と一緒にＰＢＳに注入される。会合速度（ｋon）および解離速度（ｋoff）は、会合および解離センサーグラムを同時に適合させることにより、単純な１対１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して計算される。平衡解離定数（Ｋｄ）は比ｋoff／ｋonとして計算される。例えば、Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５〜８８１（１９９９）を参照されたい。上記のオンレート（ｏｎ−ｒａｔｅ）が表面プラズモン共鳴アッセイにより１０6Ｍ-1ｓ-1を超える場合、オンレートは、流れ停止装備スペクトロフォメーター（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ）（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌されたキュベット付の８００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計において測定される場合、増加する濃度の抗原の存在下、２５℃でＰＢＳ中２０ｎＭの抗−抗原抗体（Ｆａｂ形態）、ｐＨ７．２の蛍光放出強度の増加または減少を測定する（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）蛍光消光技法を使用することにより決定することができる。
【０１１１】
２．抗体断片
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は抗体断片である。抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）2、ＦｖおよびｓｃＦｖ断片ならびに下に記載される他の断片が含まれるが、これらに限定されない。ある種の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９〜１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、２６９〜３１５ページ（１９９４）を参照されたい。ＷＯ９３／１６１８５；ならびに米国特許第５，５７１，８９４号および米国特許第５，５８７，４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含みインビボ半減期が増大しているＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2断片の考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。
【０１１２】
ダイアボディは、二価または二重特異性のこともある２つの抗原結合部位のある抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ.９：１２９〜１３４（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディもＨｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９〜１３４（２００３）に記載されている。
【０１１３】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部を含む抗体断片である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号Ｂ１を参照）。
【０１１４】
抗体断片は、本明細書に記載されているように、無傷の抗体のタンパク質消化および組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはファージ）による産生を含むがこれらに限定されない種々の技法により作製することができる。
【０１１５】
３．キメラおよびヒト化抗体
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体はキメラ抗体である。ある種のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１〜６８５５（１９８４）に記載されている。一例では、キメラ抗体は非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類由来の可変領域）およびヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変えられている「クラス転換された」抗体である。キメラ抗体にはその抗原結合断片が含まれる。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトへの免疫原性を抑えるために親非ヒト抗体の特異性および親和性を保持したままヒト化される。一般的には、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその部分）が非ヒト抗体由来でＦＲ（またはその部分）がヒト抗体配列由来である１つまたは複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、場合によって、ヒト定常領域の少なくとも一部も含むことになる。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体中の一部のＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復または改善するために非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
【０１１７】
ヒト化抗体およびそれを作製する方法は、例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９〜１６３３（２００８）で概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９〜１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、米国特許第７，５２７，７９１号、米国特許第６，９８２，３２１号、および米国特許第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５〜３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）移植法を記載している）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９〜４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」を記載している）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３〜６０（２００５）（「ＦＲシャフリング」を記載している）；ならびにＯｓｂｏｕｒｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１〜６８（２００５）およびＫｌｉｍｋａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８３：２５２〜２６０（２０００）（ＦＲシャフリングへの「誘導選択」アプローチを記載している）にさらに記載されている。
【０１１８】
ヒト化のために使用されうるヒトフレームワーク領域には、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３））；軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５（１９９２）；およびＰｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２６２３（１９９３））；ヒト成熟（体細胞的に変異した）フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域（ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９〜１６３３（２００８））；およびＦＲライブラリーをスクリーニングすることに由来するフレームワーク領域（Ｂａｃａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８〜１０６８４（１９９７）およびＲｏｓｏｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１〜２２６１８（１９９６））が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１９】
４．ヒト抗体
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は当技術分野で公知の種々の技法を使用して産生することができる。ヒト抗体は一般的には、ｖａｎ  Ｄｉｊｋおよびｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８〜７４（２００１）ならびにＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０〜４５９（２００８）に記載されている。
【０１２０】
ヒト抗体は、抗原投与に応答してヒト可変領域を有する無傷のヒト抗体または無傷の抗体を産生するように改変されているトランスジェニック動物に免疫原を投与することにより調製しうる。そのような動物は典型的には、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部を含有しており、その遺伝子座は内在性免疫グロブリン遺伝子座に取って代わる、または染色体外に存在するもしくは動物の染色体中に無作為に取り込まれる。そのようなトランスジェニックマウスでは、内在性免疫グロブリン遺伝子座は一般的には不活化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７〜１１２５（２００５）を参照されたい。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ（商標）技術を記載している米国特許第６，０７５，１８１号および米国特許第６，１５０，５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７，０４１，８７０号およびＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。そのような動物により産生される無傷の抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによりさらに改変しうる。
【０１２１】
ヒト抗体はハイブリドーマベースの方法によっても作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系は記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３ページ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）；およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：８６（１９９１）を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して産生されるヒト抗体も、Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：３５５７〜３５６２（２００６）に記載されている。追加の方法には、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞系からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）およびＮｉ、Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ、２６（４）：２６５〜２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されている方法が含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ（Ｔｒｉｏｍａ）技術）も、ＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０（３）：９２７〜９３７（２００５）ならびにＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２７（３）：１８５〜９１（２００５）に記載されている。
【０１２２】
ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても産生しうる。次に、そのような可変ドメイン配列は所望のヒト定常ドメインと組み合わせうる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択する技法は下に記載されている。
【０１２３】
５．ライブラリー由来抗体
本発明の抗体は、１種または複数の所望の活性を有する抗体を求めてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離しうる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し所望の結合特徴を有する抗体を求めてそのようなライブラリーをスクリーニングするための種々の方法は当技術分野では公知である。そのような方法は、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１〜３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００１）で概説されており、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４〜６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７（１９９２）；ＭａｒｋｓおよびＢｒａｄｂｕｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１〜１７５（Ｌｏ編  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００３）；Ｓｉｄｈｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９〜３１０（２００４）；Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３〜１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７〜１２４７２（２００４）；ならびにＬｅｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９〜１３２（２００４）にさらに記載されている。
【０１２４】
ある種のファージディスプレイ法では、Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：４３３〜４５５（１９９４）に記載されているように、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリーはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングされ、ファージライブラリーにおいて無作為に組み換えられ、これは次に抗原結合ファージを求めてスクリーニングすることができる。ファージは典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片としてまたはＦａｂ断片としてのいずれかで抗体断片を提示する。免疫源由来のライブラリーは、ハイブリドーマの構築を要することなく免疫原に対して高親和性の抗体を提供する。代わりに、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ、１２：７２５〜７３４（１９９３）により記載されているように、未処置のレパートリーをクローニングして（例えば、ヒトから）いかなる免疫化もせずに広範な非自己抗原および自己抗原にも単一源の抗体を提供することができる。最後に、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１〜３８８（１９９２）により記載されているように、幹細胞から再配列されていないＶ−遺伝子セグメントをクローニングし、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再配列を実現するランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用することにより、未処置のライブラリーを合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許公報には、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、米国特許出願公開第２００５／０１１９４５５号、米国特許出願公開第２００５／０２６６０００号、米国特許出願公開第２００７／０１１７１２６号、米国特許出願公開第２００７／０１６０５９８号、米国特許出願公開第２００７／０２３７７６４号、米国特許出願公開第２００７／０２９２９３６号、および米国特許出願公開第２００９／０００２３６０号が含まれる。
【０１２５】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書ではヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。
【０１２６】
６．多特異的抗体
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は多特異的抗体、例えば、二重特異的抗体である。多特異的抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、結合特異性の1つはＵＳＰ１またはＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、またはＩＤ３）に対してであり、もう１つは他の任意の抗原に対してである。ある特定の実施形態では、二重特異的抗体はＵＳＰ１またはＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、またはＩＤ３）の２つの異なるエピトープに結合しうる。二重特異的抗体を使用して、細胞傷害性薬剤をＵＳＰ１および／またはＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）を発現する細胞に局在化させてもよい。二重特異的抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製することができる。
【０１２７】
多特異的抗体を作製するための技法には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え同時発現（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３）、ＷＯ９３／０８８２９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１）参照）、および「ノブインホール」工学（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号参照）が含まれるが、これらに限定されない。抗体Ｆｃヘテロダイマー分子を作製するために静電気的ステアリング効果を操作する（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）；２つまたはそれよりも多い抗体または断片を架橋する（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１（１９８５）参照）；ロイシンジッパーを使用して二重特異的抗体を産生する（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８（５）：１５４７〜１５５３（１９９２）参照）；二重特異的抗体断片を作製するために「ダイアボディ」技術を使用する（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８（１９９３）参照）；および一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用する（例えば、Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：５３６８（１９９４）参照）；ならびにＴｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されている三重特異的抗体を調製することにより、多特異的抗体を作製してもよい。
【０１２８】
「オクタパス抗体」を含む、３つまたはそれよりも多い機能的抗原結合部位を有する操作された抗体も本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１参照）。
【０１２９】
本明細書の抗体または断片には、ＵＳＰ１またはＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、またはＩＤ３）および別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」も含まれる（例えば、ＵＳ２００８／００６９８２０参照）。
【０１３０】
７．抗体バリアント
ａ）グリコシル化バリアント
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加するまたは減少するように変化させる。抗体へのグリコシル化部位の付加または削除は、１つまたは複数のグリコシル化部位が作り出されるまたは取り除かれるようにアミノ酸配列を変化させることにより都合よく実現しうる。
【０１３１】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合している炭水化物を変化させうる。哺乳動物細胞により産生された未処置の抗体は典型的には、一般的にはＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ連結により結合している分岐した二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６〜３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖は種々の炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造体の「幹」においてＧｌｃＮＡｃに結合しているフコースを含むことがある。いくつかの実施形態では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は、ある種の改善された特性を有する抗体バリアントを生み出すためになされうる。
【０１３２】
一実施形態では、Ｆｃ領域に結合している（直接的にまたは間接的に）フコースを欠く炭水化物構造体を有する抗体バリアントが提供される。例えば、そのような抗体中のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％または２０％〜４０％まででもよい。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により測定された場合、Ａｓｎ２９７に結合しているすべてのグリコ構造体（例えば、複合体、ハイブリッドおよび高マンノース構造体）の合計と比べたＡｓｎ２９７での糖鎖内のフコースの平均量を計算することにより決定される。Ａｓｎ２９７とは、Ｆｃ領域のおおよそ２９７位（Ｆｃ残基のＥｕ番号付け）に位置しているアスパラギン残基のことであるが、Ａｓｎ２９７は、抗体中の小さな配列変動のせいで、２９７位から約±３アミノ酸上流または下流、すなわち、２９４位〜３００位までの間に位置していることもある。そのようなフコシル化バリアントは改善されたＡＤＣＣ機能を有することがある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。「デフコシル化（ｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）」または「フコース欠損」抗体バリアントに関係する出版物の例には、ＵＳ２００３／０１５７１０８；ＷＯ２０００／６１７３９；ＷＯ２００１／２９２４６；ＵＳ２００３／０１１５６１４；ＵＳ２００２／０１６４３２８；ＵＳ２００４／００９３６２１；ＵＳ２００４／０１３２１４０；ＵＳ２００４／０１１０７０４；ＵＳ２００４／０１１０２８２；ＵＳ２００４／０１０９８６５；ＷＯ２００３／０８５１１９；ＷＯ２００３／０８４５７０；ＷＯ２００５／０３５５８６；ＷＯ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；ＷＯ２００２／０３１１４０；Ｏｋａｚａｋｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９〜１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が含まれる。デフコシル化抗体を産生することができる細胞系の例には、タンパク質フコシル化を欠損するＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３〜５４５（１９８６）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８Ａ１、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；およびＷＯ２００４／０５６３１２Ａ１、Ａｄａｍｓら、特に実施例１１）；およびアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞系（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４ページ（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、９４（４）：６８０〜６８８（２００６）；およびＷＯ２００３／０８５１０７）が含まれる。
【０１３３】
二分されたオリゴ糖を有する、すなわち、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されている抗体バリアントがさらに提供される。そのような抗体バリアントは減少したフコシル化および／または改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。そのような抗体バリアントの例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔら）；米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａら）；およびＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合しているオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体バリアントも提供される。そのような抗体バリアントは改善されたＣＤＣ機能を有しうる。そのような抗体バリアントは、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌら）；ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；およびＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０１３４】
ｂ）Ｆｃ領域バリアント
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変を本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域バリアントを産生しうる。前記Ｆｃ領域バリアントは、１つまたは複数のアミノ酸位にアミノ酸改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含みうる。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、本発明は、いくつかのしかしすべてではないエフェクター機能を有する抗体バリアントであって、そのエフェクター機能のおかげで、インビボでの抗体の半減期は重要であるがある種のエフェクター機能（例えば、補体およびＡＤＣＣ）は必要ではないまたは有害である適用のための望ましい候補になる抗体バリアントを想定している。インビトロおよび／またはインビボ細胞傷害性アッセイを行えば、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行えば、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがって、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）が、ＦｃＲｎ結合力は保持していることを確認することができる。ＡＤＣＣを媒介するための一次細胞、すなわちＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７〜４９２（１９９１）の４６４ページ表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７０５９〜７０６３（１９８６）参照）およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１４９９〜１５０２（１９８５）；米国特許第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１〜１３６１（１９８７）参照）に記載されている。代わりに、非放射アッセイ法を用いることもある（例えば、ＡＣＴＩ（商標）ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）；およびＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）参照）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代わりに、またはさらに、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２〜６５６（１９９８）に開示されている動物モデルなどの動物モデルで評価しうる。Ｃ１ｑ結合アッセイも実施して、抗体がＣ１ｑに結合することができずしたがってＣＤＣ活性を欠くことを確認しうる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９およびＷＯ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するため、ＣＤＣアッセイを実施しうる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５〜１０５２（２００３）；ならびにＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．およびＭ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ、Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８〜２７４３（２０���４）参照）。ＦｃＲｎ結合およびインビボ排除／半減期決定も、当技術分野で公知の方法を使用して実施することができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９〜１７６９（２００６）参照）。
【０１３６】
エフェクター機能が減少した抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および３２９のうちの１つまたは複数の置換がある抗体が含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体には、残基２６５および２９７のアラニンへの置換があるいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位および３２７位のうちの２つまたはそれよりも多い位での置換のあるＦｃ変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０１３７】
ＦｃＲｓへの結合が改善されているまたは減少しているある種の抗体バリアントは記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；ＷＯ２００４／０５６３１２、およびＳｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１〜６６０４（２００１）参照）。ある特定の実施形態では、抗体バリアントはＡＤＣＣを改善する１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位、および／または３３４位での置換のあるＦｃ領域を含む（残基のＥＵ番号付け）。いくつかの実施形態では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、およびＩｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８〜４１８４（２０００）に記載されているように、変化した（すなわち、改善されたまたは減少した）Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす変化がＦｃ領域においてなされる。
【０１３８】
半減期が増加し、母性ＩｇＧの胎児への移行の原因となる（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体はＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。それらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つまたは複数の置換がその中にあるＦｃ領域を含む。そのようなＦｃバリアントには、Ｆｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４または４３４のうちの１つまたは複数に置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換のあるＦｃバリアントが含まれる（米国特許第７，３７１，８２６号）。Ｆｃ領域バリアントの他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８〜４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；およびＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。
【０１３９】
ｃ）システイン操作抗体バリアント
ある特定の実施形態では、抗体の１つまたは複数の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗体、例えば、「チオＭＡｂ」を作り出すのが望ましいことがある。特定の実施形態では、置換される残基は抗体の接触可能部位に存在する。さらに本明細書で説明されるように、それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基はそれにより抗体の接触可能部位に置かれ、この基を使用して抗体を、薬物部分またはリンカー薬物部分などの他の部分にコンジュゲートさせて、免疫コンジュゲートを作り出しうる。ある特定の実施形態では、以下の残基：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）のうちの任意の１つまたは複数をシステインで置換しうる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載される通りに産生しうる。
【０１４０】
Ｂ．免疫コンジュゲート
化学療法剤もしくは薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源のタンパク質毒素、酵素的に活性な毒素またはその断片）または放射性同位体などの１つまたは複数の細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされた本明細書の抗ＵＳＰ１抗体および／または抗ＩＤ抗体（例えば、抗ＩＤ１抗体、抗ＩＤ２抗体、または抗ＩＤ３抗体）を含む免疫コンジュゲートが本明細書でさらに提供される。
【０１４１】
一実施形態では、免疫コンジュゲートは、マイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、米国特許第５，４１６，０６４号および欧州特許ＥＰ０  ４２５  ２３５Ｂ１参照）；モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦ（ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）などのオーリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号および米国特許第５，７８０，５８８号および米国特許第７，４９８，２９８号参照）；ドラスタチン；カリチアマイシンもしくはその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、米国特許第５，７１４，５８６号、米国特許第５，７３９，１１６号、米国特許第５，７６７，２８５号、米国特許第５，７７０，７０１号、米国特許第５，７７０，７１０号、米国特許第５，７７３，００１号、および米国特許第５，８７７，２９６号；Ｈｉｎｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６〜３３４２（１９９３）；およびＬｏｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２５〜２９２８（１９９８）参照）；ダウノマイシンもしくはドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Ｋｒａｔｚら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７〜５２３（２００６）；Ｊｅｆｆｒｅｙら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １６：３５８〜３６２（２００６）；Ｔｏｒｇｏｖら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７〜７２１（２００５）；Ｎａｇｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：８２９〜８３４（２０００）；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら、Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：１５２９〜１５３２（２００２）；Ｋｉｎｇら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６〜４３４３（２００２）；および米国特許第６，６３０，５７９号参照）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキシル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、およびオルタタキセルなどのタキサン；トリコテシン；ならびにＣＣ１０６５を含むがこれらに限定されない１つまたは複数の薬物に抗体がコンジュゲートされている抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。
【０１４２】
別の実施形態では、免疫コンジュゲートは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）を含むがこれらの限定されない酵素的に活性な毒素またはその断片にコンジュゲートされた本明細書に記載される抗体を含む。
【０１４３】
別の実施形態では、免疫コンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされて放射性コンジュゲートを形成する本明細書に記載される抗体を含む。放射性コンジュゲートの産生には種々の放射性同位元素が利用可能である。例には、Ａｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32、Ｐｂ212およびＬｕの放射性同位体が含まれる。放射性コンジュゲートが検出に使用される場合、シンチグラフィー研究用の放射性原子、例えば、ｔｃ99もしくはＩ123、または再びヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１１、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄などの核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ｍｒｉとしても知られる）用のスピン標識を含むことがある。
【０１４４】
抗体と細胞傷害性薬剤のコンジュゲートは、Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジサクシニミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアン酸（例えば、トルエン２，６−ジイソシアン酸）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの種々の二機能的タンパク質カップリング剤を使用して作製しうる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載される通りに調製することができる。炭素１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体にコンジュゲートするための例となるキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。前記リンカーは、細胞中での細胞傷害性薬の放出を促進する「切断可能リンカー」でありうる。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１２７〜１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用してもよい。
【０１４５】
本明細書の免疫コンジュゲートまたはＡＤＣは、市販されているＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、およびスルホ−ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（サクシニミジル−（４−ビニルスルホン）安息香酸（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ．、Ｕ．Ｓ．Ａから）を含むがこれらの限定されない架橋剤試薬で調製されたそのようなコンジュゲートを明確に想定しているが、これらに限定されない。
【０１４６】
Ｃ．結合ポリペプチド
結合ポリペプチドは、本明細書に記載されるＵＳＰ１、ＵＡＦ１、および／またはＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）に好ましくは特異的に結合するポリペプチドである。結合ポリペプチドは、既知のポリペプチド合成法を使用して化学的に合成してもよいし、または組換え技術を使用して調製し精製してもよい。結合ポリペプチドは通常、少なくとも約５アミノ酸長、または少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００アミノ酸長もしくはそれよりも長く、そのような結合ポリペプチドは、本明細書に記載される標的、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、および／またはＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）に好ましくは特異的に結合することができる。結合ポリペプチドは、周知の技法を使用する必要以上の実験をせずに同定しうる。この点に関して、ポリペプチド標的に特異的に結合することができる結合ポリペプチドを求めてポリペプチドライブラリーをスクリーニングするための技法は当技術分野では周知であることは知られている（例えば、米国特許第５，５５６，７６２号、米国特許第５，７５０，３７３号、米国特許第４，７０８，８７１号、米国特許第４，８３３，０９２号、米国特許第５，２２３，４０９号、米国特許第５，４０３，４８４号、米国特許第５，５７１，６８９号、米国特許第５，６６３，１４３号；ＰＣＴ出願番号ＷＯ８４／０３５０６およびＷＯ８４／０３５６４；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１：３９９８〜４００２（１９８４）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２：１７８〜１８２（１９８５）；Ｇｅｙｓｅｎら、ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ、１３０〜１４９（１９８６）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１０２：２５９〜２７４（１９８７）；Ｓｃｈｏｏｆｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４０：６１１〜６１６（１９８８）、Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６３７８；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：１０８３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、（１９９１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：８３６３、およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．��２：６６８参照）。
【０１４７】
この点に関して、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは、大量のポリペプチドライブラリーをスクリーニングして、標的ポリペプチド、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、および／またはＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）に特異的に結合することができるライブラリーの１つまたは複数のメンバーを同定することができる１つの周知の技法である。ファージディスプレイは、バリアントポリペプチドがバクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質への融合タンパク質として提示される技法である（Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：３８６）。ファージディスプレイの有用性は、選択的に無作為化されたタンパク質バリアント（または無作為にクローニングされたｃＤＮＡ）の大きなライブラリーを、標的分子に高親和性で結合する配列について迅速かつ効率的に分類することができることにある。ファージ上へのペプチド（Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６３７８）またはタンパク質（Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：１０８３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ Ｊ．Ｄ．ら、（１９９１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：８３６３）ライブラリーの提示は、特異的結合特性を有するものを求めて何百万のポリペプチドまたはオリゴペプチドをスクリーニングするために使用されてきた（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２：６６８）。ランダム変異体のファージライブラリーを分類するには、多数のバリアントを構築し増殖させるための戦略、標的受容体を使用する親和性精製のための手順、および結合濃縮の結果を評価する手段が必要である。米国特許第５，２２３，４０９号、米国特許第５，４０３，４８４号、米国特許第５，５７１，６８９号、および米国特許第５，６６３，１４３号。
【０１４８】
大半のファージディスプレイ法は繊維状ファージを使用してきたが、ラムダ状ファージディスプレイシステム（ＷＯ９５／３４６８３；Ｕ．Ｓ．５，６２７，０２４）、Ｔ４ファージディスプレイシステム（Ｒｅｎら、Ｇｅｎｅ、２１５：４３９（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５８（１５）：３２０９〜３２１４（１９９８）；Ｊｉａｎｇら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ＆Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６５（１１）：４７７０〜４７７７（１９９７）；Ｒｅｎら、Ｇｅｎｅ、１９５（２）：３０３〜３１１（１９９７）；Ｒｅｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、５：１８３３（１９９６）；Ｅｆｉｍｏｖら、Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ、１０：１７３（１９９５））およびＴ７ファージディスプレイシステム（ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２１７：２２８〜２５７（１９９３）；Ｕ．Ｓ．５，７６６，９０５）も知られている。
【０１４９】
追加の改良により、選択された標的分子への結合についてペプチドライブラリーをスクリーニングし、所望の特性を求めてこれらのタンパク質をスクリーニングする可能性のある機能的タンパク質を提示するディスプレイシステムの能力は増強されている。ファージディスプレイ反応のためのコンビナトリアル反応装置が開発され（ＷＯ９８／１４２７７）、ファージディスプレイライブラリーを使用して、二分子相互作用（ＷＯ９８／２０１６９；ＷＯ９８／２０１５９）および束縛されたヘリックスペプチドの特性（ＷＯ９８／２００３６）を解析し制御してきた。ＷＯ９７／３５１９６は、ファージディスプレイライブラリーを、リガンドが標的分子に結合する１つの溶液とアフィニティーリガンドが標的分子に結合しない第２の溶液に接触させて、結合リガンドを選択的に単離する、アフィニティーリガンドを単離する方法を記載している。ＷＯ９７／４６２５１は、ランダムファージディスプレイライブラリーを親和性精製された抗体でバイオパンし、次に結合ファージを単離し、続いて高親和性結合ファージを単離するためのマイクロプレートウェルを使用するマイクロパンニングプロセスの方法を記載している。親和性タグとしての黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｌｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）タンパク質Ａの使用も報告されている（Ｌｉら、（１９９８）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、９：１８７）。ＷＯ９７／４７３１４は、ファージディスプレイライブラリーであることもあるコンビナトリアルライブラリーを使用して酵素特異性を区別するための基質サブストラクションライブラリーの使用を記載している。ファージディスプレイを使用する洗剤中で使用するのに適した酵素を選択するための方法はＷＯ９７／０９４４６に記載されている。特異的結合タンパク質を選択する追加の方法は、米国特許第５，４９８，５３８号、米国特許第５，４３２，０１８号、およびＷＯ９８／１５８３３に記載されている。
【０１５０】
ペプチドライブラリーを作製しこれらのライブラリーをスクリーニングする方法も、米国特許第５，７２３，２８６号、米国特許第５，４３２，０１８号、米国特許第５，５８０，７１７号、米国特許第５，４２７，９０８号、米国特許第５，４９８，５３０号、米国特許第５，７７０，４３４号、米国特許第５，７３４，０１８号、米国特許第５，６９８，４２６号、米国特許第５，７６３，１９２号、および米国特許第５，７２３，３２３号に開示されている。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドはＵＳＰ１アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドはＵＡＦ１アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドはＩＤ１アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドはＩＤ２アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドはＩＤ３アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドは１つよりも多いＩＤ（例えば、２つのＩＤ、３つのＩＤ、または４つのＩＤ）を阻害することができる。いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドはＵＡＦ１とのＵＳＰ１の相互作用を阻害する。いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドはＩＤの脱ユビキチン化をブロックする。いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドはｂＨＬＨとのＩＤの相互作用を阻害する。いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドはＵＳＰ１の切断を阻害する。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドはＩＤアンタゴニストでありＩＤアンタゴニストはＩＤタンパク質の細胞質への輸送を阻害するポリペプチドである。いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドはＩＤアンタゴニストでありＩＤアンタゴニストは細胞質においてＩＤタンパク質を隔離するポリペプチドである。いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドはＩＤアンタゴニストでありＩＤアンタゴニストは少なくとも１つのＬＩＭドメインを含むタンパク質である。ＬＩＭドメインはシステイン豊富な二重の亜鉛フィンガーモチーフであり、このモチーフはタンパク質−タンパク質相互作用を媒介する。いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドはＩＤアンタゴニストでありＩＤアンタゴニストは少なくとも１つのＬＩＭ−ＰＤＺタンパク質を含むタンパク質である。「ＬＩＭ−ＰＤＺタンパク質ファミリー」メンバー、または「ＬＩＭ−ＰＤＺタンパク質」とは、そのＰＤＺおよびＬＩＭタンパク質ドメインにおいて高度なアミノ酸類似性（最大７０％配列類似性）を共有するタンパク質（およびその相同物、変異体、バリアント）の天然に存在するグループのことである。前記ファミリーは現在では７つのタンパク質を含有し、そのそれぞれがＮ末端ＰＤＺドメインに続いて１つのＣ末端ＬＩＭドメイン（ＡＬＰサブファミリー；ＡＬＰ、ＲＩＬ、ＣＬＰ−３６／ｈＣｌｉｍ１／Ｅｌｆｉｎ、Ｍｙｓｔｉｑｕｅ）または３つのＣ末端ＬＩＭドメイン（Ｅｎｉｇｍａサブファミリー；Ｅｎｉｇｍａ／ＬＭＰ−１、ＥＮＨ、ＺＡＳＰ／Ｃｙｐｈｅｒ１）のどちらかを含有する（Ｘｉａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２７１：１５９３４〜１５９４１、１９９７）。いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドはＩＤアンタゴニストでありＩＤアンタゴニストはエニグマ相同物（ＥＮＨ）タンパク質またはその断片である。例えば、米国特許出願公開第２００７／００４１９４４号を参照されたい。前記特許文献の内容は参照によりその全体を組み込まれている。いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドはＩＤ２アンタゴニストでありＩＤ２アンタゴニストはそのＥＮＨタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＥＮＨタンパク質はアミノ酸配列（配列番号５１）
2014533927.tif 000003
を含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、ＥＮＨタンパク質はアミノ酸配列（配列番号５２）
2014533927.tif 000004
を含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドはＵＡＦ１アンタゴニストでありＵＡＦ１アンタゴニストは、１つまたは複数のＵＳＦ１  ＷＤ４０リピート、例えば、ＷＤ４０リピート２〜４、ＷＤ４０リピート２、ＷＤ４０リピート３、ＷＤ４０リピート４、ＷＤ４０リピート８に結合するポリペプチドである。
【０１５５】
Ｄ．結合小分子
ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１および／またはＩＤアンタゴニスト（例えば、ＩＤ１アンタゴニスト、ＩＤ２アンタゴニスト、および／またはＩＤ３アンタゴニスト）として使用するための結合小分子が本明細書に提供される。
【０１５６】
結合小分子は好ましくは、本明細書に記載されるＵＳＰ１、ＵＡＦ１、および／またはＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）に好ましくは特異的に結合する本明細書で定義される結合ポリペプチドまたは抗体以外の有機分子である。結合有機小分子は公知の方法を使用して同定され化学的に合成されうる（例えば、ＰＣＴ出願番号ＷＯ００／００８２３およびＷＯ００／３９５８５参照）。結合有機小分子は通常大きさは約２０００ダルトン未満である、または大きさは約１５００、７５０、５００、２５０もしくは２００ダルトン未満であり、本明細書に記載されるポリペプチドに好ましくは特異的に結合することができるそのような有機小分子は、周知の技法を使用する不必要な実験なしで同定しうる。この点に関して、ポリペプチド標的に結合することができる分子を求めて有機小分子ライブラリーをスクリーニングするための技法は当技術分野では周知であることが知られている（例えば、ＰＣＴ出願番号ＷＯ００／００８２３およびＷＯ００／３９５８５参照）。結合有機小分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ−置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、ウレア、カルバミン酸、炭酸、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、ハロゲン化アリール、アリールスルホン酸、ハロゲン化アルキル、アルキルスルホン酸、芳香族化合物、複素環式化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン（ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｅ）、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアン酸、スルホニルクロリド、ジアゾ化合物、酸クロリド、または同類の物でありうる。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、結合小分子はＵＳＰ１アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、結合小分子はＵＡＦ１アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、結合小分子はＩＤ１アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、結合小分子はＩＤ２アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、結合小分子はＩＤ３アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、結合小分子は１つよりも多いＩＤ（例えば、２つのＩＤ、３つのＩＤ、または４つのＩＤ）を阻害することができる。いくつかの実施形態では、結合小分子はＵＡＦ１とのＵＳＰ１の相互作用を阻害する。いくつかの実施形態では、結合小分子はＩＤの脱ユビキチン化をブロックする。いくつかの実施形態では、結合小分子はｂＨＬＨとのＩＤの相互作用を阻害する。いくつかの実施形態では、結合小分子はＵＳＰ１の切断を阻害する。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、結合小分子はＵＳＰ１アンタゴニストでありＵＳＰ１アンタゴニストはユビキチンアルデヒドである。この場合、ＵＳＰ１アンタゴニストはＨｅｒｓｈｋｏら、（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ａｌｄｅｈｙｄｅ：ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １９８７年４月；８４（７）：１８２９〜３３）に記載されている通りに、ＵＳＰ１酵素と緊密な複合体を形成することにより作用すると考えられている。前記文献は参照により本明細書に組み込まれている。ユビキチンアルデヒド、例えば、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能である。いくつかの実施形態では、結合小分子はＵＳＰ１アンタゴニストでありＵＳＰ１アンタゴニストはカンプトテンシンである。カンプトテンシンは、ＵＳＰ１とＵＡＦ１複合体の形成を阻害すると考えられている。例えば、Ｍｕｒａら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（２０１１）３１：２４６２を参照されたい。いくつかの実施形態では、結合小分子はＵＳＰ１アンタゴニストおよびＵＳＰ１アンタゴニストＮＳＣ６３２８３９塩酸塩（３，５−ビス［（４−メチルフェニル）メチレン］−４−ピペリドン塩酸塩；ＣＡＳ  Ｎｏ．１５７６５４−６７−６）（Ｔｏｃｒｉｓ）である。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、結合小分子はＩＤアンタゴニストでありＩＤアンタゴニストは１つよりも多いＩＤ（例えば、２つのＩＤ、３つのＩＤ、または４つのＩＤ）を阻害することができる。いくつかの実施形態では、結合小分子はＩＤアンタゴニストでありＩＤアンタゴニストはＩＤ１およびＩＤ３を阻害することができる。いくつかの実施形態では、ＩＤ１およびＩＤ３を阻害することができるＩＤアンタゴニストはテトラサイクリンである。米国特許出願公開第２００３／００２２８７１号は、Ｉｄ１およびＩｄ３のアンタゴニストとしてのテトラサイクリンの使用を記載しており、前記特許文献の内容は参照によりその全体を組み込まれている。「テトラサイクリン」とは、基本式Ｃ22Ｈ24Ｎ2Ｏ8および命名［４Ｓ−（４Ｉ，５ａＩ，５ａＩ，６Ｊ，１２ａＩ）］−４−（ジメチルアミノ）−１，４，４ａ，５，５ａ，６−１１，１２ａ−オクタヒドロ−３，６，１０，１２，１２ａ−ペイズタイイドロキシ（ｐｅｉｚｔａｉｙｄｒｏｘｙ）−６−メチル−１，１１−ジオキソ−２−ナフタセンカルボキサミドを有する化合物である。テトラサイクリンの構造は以下に記載されている。
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【０１６０】
あるいは、前記化合物はテトラサイクリンの類似物または誘導体を含む。テトラサイクリンの数多くの類似物および誘導体は本明細書に記載される方法に用途がある。特定の実施形態では、本明細書に用途を有するテトラサイクリンの類似物または誘導体は、
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を含む一般構造を有し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、およびＲ5は同じでも異なっていてもよく、Ｈ、低級アルキル（Ｃ1〜Ｃ4）、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシル、シクロアルキル、アリール、または複素環式環構造を含む。
【０１６１】
本明細書に用途を有するテトラサイクリンの類似物または誘導体の他の例は、米国特許第５，５８９，４７０号、米国特許第５，０６４，８２１号、米国特許第５，８１１，４１２号、米国特許第４，０８９，９００号、米国特許第４，９６０，９１３号、米国特許第４，０６６，６９４号、米国特許第４，０６０，６０５号、米国特許第３，９１１，１１１号、および米国特許第３，９５１，９６２号に記載されており、これにより前記特許文献の内容は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている。
【０１６２】
Ｅ．アンタゴニストポリヌクレオチド
ポリヌクレオチドアンタゴニストが本明細書で提供される。ポリヌクレオチドはアンチセンス核酸および／またはリボザイムでもよい。アンチセンス核酸は、ＵＳＰ１遺伝子、ＵＡＦ１遺伝子、および／またはＩＤ遺伝子（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２および／またはＩＤ３）のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的な配列を含む。しかし、絶対的相補性は、好ましいが、必要ではない。本明細書で言及される「ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な」配列とは、前記ＲＮＡとハイブリダイズして、安定な二重鎖を形成することができるのに十分な相補性を有する配列を意味し、二本鎖ＵＳＰ１、ＵＡＦ１および／またはＩＤアンチセンス核酸の場合、したがって、二重鎖ＤＮＡの一本鎖を試験することができ、または三重鎖形成をアッセイしうる。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の程度と長さの両方に依拠することになる。一般に、ハイブリダイズしている核酸が大きいほど、核酸はＵＳＰ１、ＵＡＦ１および／またはＩＤ  ＲＮＡとそれだけ多くの塩基ミスマッチを含有するが、それでも安定な二重鎖（または、場合によっては、三重鎖）を形成しうる。当業者であれば、ハイブリダイズした複合体の融点を決定する標準法の使用によりミスマッチの許容可能な程度を確認することができる。
【０１６３】
メッセージの５’末端、例えば、ＡＵＧ開始コドンまでのおよびを含む５’非翻訳配列に相補的であるポリヌクレオチドは翻訳の阻害に最も効率よく機能するはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列も同様にｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに効果的であることが明らかにされている。一般的には、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３３〜３３５を参照されたい。したがって、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１および／またはＩＤ遺伝子の５’−または３’−非翻訳、非コード領域のどちらかに相補的であるオリゴヌクレオチドであれば、内在性Ｘ  ｍＲＮＡの翻訳を阻害するのにアンチセンスアプローチを使用することができる。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なポリヌクレオチドであればＡＵＧ開始コドンの相補体を含むはずである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは翻訳を阻害する効率は低くなるが、本発明に従えば使用することができる。ＵＳＰ１、ＵＡＦ１および／またはＩＤ  ｍＲＮＡの５’−、３’−またはコード領域にハイブリダイズするように設計されていようと、アンチセンス核酸は少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、好ましくは６〜約５０ヌクレオチド長に及ぶオリゴヌクレオチドである。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０１６４】
一実施形態では、本発明のＵＳＰ１、ＵＡＦ１および／またはＩＤアンチセンス核酸は、外来性配列の転写により細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその一部は転写されて、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１および／またはＩＤ遺伝子のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。そのようなベクターであれば、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１および／またはＩＤアンチセンス核酸をコードする配列を含有していると考えられる。そのようなベクターは、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生することができさえすれば、エピソームのままであるまたは染色体に組み込まれることも可能である。そのようなベクターは、当技術分野で標準的方法である組換えＤＮＡ技術により構築することができる。ベクターは、脊椎動物細胞における複製および発現のために使用されるプラスミド、ウイルス、または当技術分野で公知の他のものであることが可能である。ＵＳＰ１、ＵＡＦ１および／またはＩＤをコードする配列またはその断片の発現は、脊椎動物、好ましくはヒト細胞において作用する当技術分野で公知のいかなるプロモーターによっても可能である。そのようなプロモーターは誘導性でも構成的でも可能である。そのようなプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２９：３０４〜３１０（１９８１））、ラウス（Ｒｏｕｓ）肉腫ウイルスの３’長末端リピートに含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ  ２２：７８７〜７９７（１９８０））、ヘルペスチミジンプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１〜１４４５（１９８１））、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９〜４２（１９８２））、等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６５】
アンタゴニストポリヌクレオチドは本明細書で開示され例証されている。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、アンタゴニストポリヌクレオチドはＵＳＰ１アンタゴニストであり、ＵＳＰ１アンタゴニストは５’−ＴＴＧＧＣＡＡＧＴＴＡＴＧＡＡＴＴＧＡＴＡ−３’（配列番号５３）および／または５’−ＴＣＧＧＣＡＡＴＡＣＴＴＧＣＴＡＴＣＴＴＡ−３’（配列番号５４）である。一実施形態では、アンタゴニストポリヌクレオチドはＵＳＰ１アンタゴニストであり、ＵＳＰ１アンタゴニストは５’−ＡＣＡＧＴＴＣＧＣＴＴＣＴＡＣＡＣＡＡ−３’（配列番号５５）である。例えば、米国特許出願公開第２０１０／０３３０５９９号を参照されたい。これにより前記特許文献の内容は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、アンタゴニストポリヌクレオチドはＩＤ２アンタゴニストであり、ＩＤ２アンタゴニストは５’−ｇｃｇｇｔｇｔｔｃａｔｇａｔｔｔｃｔｔ−３’（配列番号５６）および／または５’−ｃａａａｇｃａｃｔｇｔｇｔｇｔｇｇｇｃｔｇａ−３’（配列場合５７）である。いくつかの実施形態では、アンタゴニストポリヌクレオチドはＩＤ２アンタゴニストであり、ＩＤ２アンタゴニストはＷＯ１９９７／００５２８３、ＷＯ２００９／０５９２０１およびＷＯ１９９７／００５２８３に開示されており、これにより前記特許文献の内容は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、アンタゴニストポリヌクレオチドはＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３および／またはＩＤ４アンタゴニストであり、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３および／またはＩＤ４アンタゴニストはＷＯ２００１／０６６１１６に開示されており、これにより前記特許文献の内容は参照によりその全体を組み込まれている。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、アンタゴニストポリヌクレオチドはＵＡＦ１アンタゴニストであり、ＵＡＦ１アンタゴニストは５’−ＣＣＧＧＴＣＧＡＧＡＣＴＣＴＡＴＣＡＴＡＡ−３’（配列番号５８）および／または５’−ＣＡＣＡＡＧＣＡＡＧＡＴＣＣＡＴＡＴＡＴＡ−３’（配列番号５９）である。いくつかの実施形態では、アンタゴニストポリヌクレオチドはＵＡＦ１アンタゴニストであり、ＵＡＦ１アンタゴニストは５’−ＣＡＡＧＣＡＡＧＡＴＣＣＡＴＡＴＡＴＡ−３’（配列番号６０）である。
【０１７０】
Ｆ．抗体および結合ポリペプチドバリアント
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体および／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントが想定されている。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善するのが望ましいことがある。抗体および／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、適切な改変を抗体および／または結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中に導入することにより、またはペプチド合成により調製しうる。そのような改変には、例えば、抗体および／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列からの残基の欠失、および／または内への残基の挿入および／または残基の置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴、例えば、標的結合性を有するのであれば、欠失、挿入、および置換のどんな組み合わせでも行って最終構築物に到達することができる。
【０１７１】
ある特定に実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体バリアントおよび／または結合ポリペプチドバリアントが提供される。置換的変異誘発のための対象の部位には、ＨＶＲおよびＦＲが含まれる。保存的置換は表１の「保存的置換」の項目の下に示されている。さらに多くの実質的変化は表１の「例となる置換」の項目の下に提供されており、アミノ酸側鎖クラスに関しては下にさらに記載されている通りである。アミノ酸置換は対象の抗体に導入され、生成物は、所望の活性、例えば、保持された／改善された抗原結合性、減少した免疫原性、または改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣについてスクリーニングされうる。
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【０１７２】
アミノ酸は、共通の側鎖特性に従ってグループ化されうる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
【０１７３】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを必要とする。
【０１７４】
置換的バリアントの一種は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つまたは複数の高頻度可変領域残基を置換することを伴う。一般に、さらなる研究のために選択される１つまたは複数のこうして得られるバリアントは、親抗体と比べてある種の生物学的特性（例えば、増加した親和性、減少した免疫原性）に改変（例えば、改善）を有することになるおよび／または親抗体のある種の生物学的特性を実質的に保持していることになる。例となる置換的バリアントは親和性成熟抗体であり、この抗体は、例えば、本明細書に記載されている技法などのファージディスプレイベースの親和性成熟技法を使用して都合よく産生しうる。手短に言えば、１つまたは複数のＨＶＲ残基は変異され、バリアント抗体はファージ上に提示され、特定の生物活性（例えば、結合親和性）を求めてスクリーニングされる。
【０１７５】
例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲにおいて変更（例えば、置換）を加えることもできる。そのような変更はＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンによりコードされている残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９〜１９６（２００８）参照）、および／またはＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）において加えることができ、こうして得られるバリアントＶＨまたはＶＬは結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築しそこから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍｒａ、ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１〜３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ（２００１））に記載された。親和性成熟のいくつかの実施形態では、種々の方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、チェインシャフッリング、またはオリゴヌクレオチド指向性突然変異）のうちのいずれかにより成熟のために選択された可変遺伝子に多様性が導入される。次に、二次ライブラリーが作製される。次に、前記ライブラリーはスクリーニングされて、所望の親和性を有る任意の抗体バリアントを同定する。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＨＶＲ領域（例えば、１度に４〜６残基）がランダム化されるＨＶＲ指向性アプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを使用して、特異的に同定しうる。ＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ３は特に標的にされることが多い。
【０１７６】
ある特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、そのような変更が抗原に結合する抗体の能力を実質的に減少させない限り、１つまたは複数のＨＶＲ内で起こってもよい。例えば、結合親和性を実質的に減少させない保存的変更（例えば、本明細書で提供される保存的置換）をＨＶＲにおいて加えうる。そのような変更はＨＶＲ「ホットスポット」またはＳＤＲの外側であってよい。上に提供されるバリアントＶＨおよびＶＬ配列のある特定の実施形態では、それぞれのＨＶＲは変更されない、または１つ以下、２つ以下または３つ以下のアミノ酸置換を含有する。
【０１７７】
変異誘発のために標的にされうる抗体および／または結合ポリペプチドの残基または領域の同定のための有用な方法は、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１〜１０８５により記載されているように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基または残基のグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）は中性または負電荷を帯びたアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）により同定され置き換えられて、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかが決定される。追加の置換が前記アミノ酸位に導入されて、最初の置換に対する機能的感受性を実証してもよい。その代わりに、またはそれに加えて、抗体と抗原の間の接触点を同定する抗原−抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基および隣接する残基は置換の候補として標的されても取り除かれてもよい。バリアントはスクリーニングされて、所望の特性を含有するかどうかを決定してもよい。
【０１７８】
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００またはそれよりも多い残基を含有するポリペプチドまでの長さに及ぶアミノ−および／またはカルボキシル末端融合物、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入バリアントには、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのため）またはポリペプチドへの抗体のＮ−またはＣ−末端の融合が含まれる。
【０１７９】
Ｇ．抗体および結合ポリペプチド誘導体
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体および／または結合ポリペプチドは、当技術分野では公知であり容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに改変することができる。抗体および／または結合ポリペプチドの誘導化に適した部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、デキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキサイド／エチレンオキサイドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、およびこれらの混合物。エチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のおかげで製造に有利でありうる。前記ポリマーはいかなる分子量でもよく、分岐していることも分岐していないこともある。抗体に結合しているポリマーの数は変動してもよく、１つよりも多いポリマーが結合している場合、前記ポリマーは同じまたは異なる分子であることが可能である。一般に、誘導化のために使用されるポリマーの数および／または種類は、改善される抗体および／または結合ポリペプチドの特定の特性または機能、抗体誘導体および／または結合ポリペプチド誘導体が限定された条件下の治療において使用されるのかどうか、等を含むが、これらに限定されない検討事項に基づいて決定することができる。
【０１８０】
別の実施形態では、放射線に曝露されることにより選択的に加熱されうる非タンパク質性部分への抗体および／または結合ポリペプチドのコンジュゲートが提供される。一実施形態では、非タンパク質性部分はカーボンナノチューブである（Ｋａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１１６００〜１１６０５（２００５））。放射線はどんな波長でもよく、普通の細胞を損傷しないが、抗体−非タンパク質性部分の近位の細胞を死滅させる温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長を含むが、これに限定されない。
【０１８１】
Ｈ．組換え法および組成物
抗体および／または結合ポリペプチドは、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されている組換え法および組成物を使用して産生しうる。一実施形態では、抗ＵＳＰ１抗体、抗ＵＡＦ１抗体または抗ＩＤ抗体（例えば、抗ＩＤ１抗体、抗ＩＤ２抗体、または抗ＩＤ３抗体）をコードする単離された核酸。そのような核酸は抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および／またはＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードしうる。追加の実施形態では、抗体および／または結合ポリペプチドをコードするそのような核酸を含む１つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。追加の実施形態では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一そのような実施形態では、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクターおよび抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のベクターを含む（例えば、これらのベクターで形質転換されている）。一実施形態では、宿主細胞は真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態では、抗ＵＳＰ１抗体、抗ＵＡＦ１抗体および／もしく抗ＩＤ抗体（例えば、抗ＩＤ１抗体、抗ＩＤ２抗体、または抗ＩＤ３抗体）などの抗体ならびに／または結合ポリペプチドを作製する方法であって、抗体および／または結合ポリペプチドの発現に適した条件下で、上に提供される抗体および／または結合ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を培養し、場合により、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体および／またはポリペプチドを回収することを含む方法が提供される。
【０１８２】
抗ＵＳＰ１抗体、抗ＵＡＦ１抗体および／もしくは抗ＩＤ抗体（例えば、抗ＩＤ１抗体、抗ＩＤ２抗体、または抗ＩＤ３抗体）などの抗体ならびに／または結合ポリペプチドの組換え産生では、例えば、上に記載される抗体および／または結合ポリペプチドをコードする核酸は単離され宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび／または発現のために１つまたは複数のベクター内に挿入される。そのような核酸は従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離され塩基配列決定される。
【０１８３】
ベクターのクローニングまたは発現に適した宿主細胞には、本明細書に記載される原核または真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要ではない場合は細菌において産生しうる。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、米国特許第５，７８９，１９９号、および米国特許第５，８４０，５２３号を参照されたい（大腸菌における抗体断片の発現を記載しているＣｈａｒｌｔｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００３）、２４５〜２５４ページも参照）。発現後、抗体は可溶画分中の細菌細胞ペーストから単離しうる。
【０１８４】
原核生物に加えて、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的にまたは完全にヒトグリコシル化パターンで抗体が産生される真菌および酵母株を含む、繊維状真菌または酵母などの真核微生物はベクターに適したクローニングまたは発現宿主である。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９〜１４１４（２００４）、およびＬｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０〜２１５（２００６）を参照されたい。
【０１８５】
グリコシル化抗体および／またはグリコシル化結合ポリペプチドの発現に適した宿主細胞も多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例には植物および昆虫細胞が含まれる。特にスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために昆虫細胞と併せて使用しうる多数のバキュロウイルス株が同定されている。
【０１８６】
植物細胞培養物も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、米国特許第６，０４０，４９８号、米国特許第６，４２０，５４８号、米国特許第７，１２５，９７８号、および米国特許第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ（商標）技術を記載している）を参照されたい。
【０１８７】
脊椎動物細胞も宿主として使用しうる。例えば、懸濁液で増殖するように適合されている哺乳動物細胞系統は有用でありうる。有用な哺乳動物細胞系統の他の例は、ＳＶ４０で形質転換されているサル腎臓ＣＶ１系統、ヒト胚性腎臓系統（例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載されている２９３または２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ，  ｅ．ｇ．，  ｉｎ  Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３〜２５１（１９８０）に記載されているＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、例えば、Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４〜６８（１９８２）に記載されているＴＲＩ細胞、ＭＲＣ  ５細胞、およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞系統には、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ならびにＹ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞系が含まれる。抗体産生に適したある種の哺乳動物宿主細胞系の概説については、例えば、ＹａｚａｋｉおよびＷｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ、編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）、２５５〜２６８ページ（２００３）を参照されたい。
【０１８８】
本説明は主に抗体および結合ポリペプチドコード核酸を含有するベクターで形質転換されたまたはトランスフェクトされた細胞を培養することによる抗体および／または結合ポリペプチドの産生に関係するが、当然のことながら、当技術分野で周知の代替の方法を用いて抗体および／または結合ポリペプチドを調製しうることを想定している。例えば、適切なアミノ酸配列、またはその一部は固相技法［例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ（１９６９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９〜２１５４（１９６３）参照］を使用する直接ペプチド合成により産生しうる。インビトロタンパク質合成は手作業技法を使用してまたは自動化により実施しうる。自動化合成は、例えば、製造業者の使用説明書を使用してＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて実現しうる。抗体または結合ポリペプチドの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的または酵素的方法を使用して組み合わせて所望の抗体または結合ポリペプチドを産生してもよい。
【０１８９】
抗体および結合ポリペプチドの形態は培養培地からまたは宿主細胞ライセートから回収しうる。膜結合している場合は、適切な清浄液（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）を使用してまたは酵素切断により膜から放出することができる。抗体および結合ポリペプチドの発現において用いられる細胞は、凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤などの種々の物理的または化学的手段により破壊することができる。
【０１９０】
抗体および結合ポリペプチドを組換え細胞タンパク質またはポリペプチドから精製するのが望ましいことがある。以下の手順、イオン交換カラム上での分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ上またはＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿法；例えば、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５を使用するゲル濾過；ＩｇＧなどの汚染物質を取り除くためのプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム；ならびに抗体および結合ポリペプチドのエピトープタグ付き形態を結合させる金属キレートカラムによるは、適切な精製手順の例である。タンパク質精製の種々の方法を用いることができ、そのような方法は当技術分野では公知であり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８２（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）に記載されている。選択される１つまたは複数の精製ステップは、例えば、使用される精製工程および産生される特定の抗体または結合ポリペプチドの性質に依拠することになる。
【０１９１】
組換え技法を使用する場合、抗体は細胞膜周辺腔の細胞内に産生する、または培地に直接分泌することができる。抗体が細胞内に産生される場合、第一ステップとして、特定のデブリ、宿主細胞または溶解された断片のどちらかは、例えば、遠心分離または限外濾過により取り除かれる。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３〜１６７（１９９２）は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順を記載している。手短に言えば、細胞ペーストは約３０分かけて酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で解凍される。細胞デブリは遠心分離により取り除くことができる。抗体が培地に分泌される場合、そのような発現系からの上澄みは一般に先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を使用して濃縮される。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤は前述のステップのいずれかに含まれてタンパク質分解を阻害してもよく、抗体が含まれて偶発的汚染物質の増殖を妨げてもよい。
【０１９２】
細胞から調製される抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティクロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技法である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依拠する。プロテインＡを使用して、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖を主成分とする抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１〜１３（１９８３））。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプにおよびヒトγ３に推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが付着されるマトリックスはアガロースであることが最も多いが、他のマトリックスが利用可能である。制御ポアガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスであれば、アガロースを用いて達成することができるよりも迅速な流速および短い処理時間が可能になる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）が精製には有用である。イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿法などのタンパク質精製のための他の技法も、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０１９３】
１つまたは複数の任意の予備精製ステップに続いて、対象の抗体および汚染物質を含む混合物は、２．５〜４．５までのｐＨの溶質バッファーを使用する低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけてもよく、好ましくは低塩濃度（例えば、０〜０．２５Ｍ塩）で実施される。
【０１９４】
ＩＩＩ．所望の機能を有するＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニストおよび／またはＩＤアンタゴニストをスクリーニングするおよび／または同定する方法
抗体、結合ポリペプチド、および／または小分子を作製するための技法は上に記載されている。抗ＵＳＰ１抗体、抗ＵＡＦ１抗体および／または抗ＩＤ抗体（例えば、抗ＩＤ１抗体、抗ＩＤ２抗体、または抗ＩＤ３抗体）などの抗体をさらに選択してもよく、ならびに本明細書に提供される結合ポリペプチド、および／または結合小分子を、当技術分野で公知の種々のアッセイにより、同定する、これらを求めてスクリーニングする、またはその物理的／化学的特性および／または生物活性について特徴付けてもよい。
【０１９５】
本発明の抗体、結合ポリペプチドまたは結合小分子の増殖阻害効果は、当技術分野で公知の方法により、例えば、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、および／またはＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）を内因的にまたは１つもしくは複数のそれぞれの遺伝子でのトランスフェクションに続いて発現する細胞を使用してアッセイしうる。例えば、適切な腫瘍細胞系、ならびにＵＳＰ１、ＵＡＦ１、および／またはＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）ポリペプチドトランスフェクト細胞を、本発明のモノクローナル抗体、結合ポリペプチドまたは他の小分子で数（例えば、２〜７）日間、様々な濃度で処理し、クリスタルバイオレットもしくはＭＴＴで染色し、または何か他の比色アッセイにより分析してもよい。増殖を測定する別の方法は、本発明の抗体、結合ポリペプチドまたは結合小分子の存在または非存在下で処理された細胞による３Ｈ−チミジン取り込みを比較することによる方法になるであろう。処理後、細胞は収穫され、ＤＮＡに取り込まれた放射線の量がシンチレーション計測器において定量される。適切な陽性対照には、選択された細胞系をその細胞系の増殖を阻害することが分かっている増殖阻害抗体で処理することが含まれる。インビボでの腫瘍細胞の増殖阻害は、当技術分野で公知の様々なやり方で決定することができる。腫瘍細胞は、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、および／またはＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）ポリペプチドを過剰発現する細胞であってよい。抗体、結合ポリペプチドおよび／または結合小分子は、一実施形態では約０．５〜３０μｇ／ｍｌの抗体濃度で、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、および／またはＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）発現腫瘍細胞のインビトロでのまたはインビボでの細胞増殖を、非処理の腫瘍細胞と比べて約２５〜１００％、さらに好ましくは約３０〜１００％、さらに好ましくは約５０〜１００％または約７０〜１００％阻害することになる。増殖阻害は細胞培養において約０．５〜約３０μｌ／ｍｌまたは約０．５ｎＭ〜約２００ｎＭの抗体濃度で測定することが可能であり、増殖阻害は抗体への腫瘍細胞の曝露の１〜１０日後に決定される。抗体の約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重での投与により、抗体の最初の投与から約５日〜３か月以内に、好ましくは約５〜３０日以内に腫瘍サイズが減少するまたは腫瘍細胞増殖が減少すれば、抗体はインビボで増殖阻害性である。
【０１９６】
脱ユビキチン化を阻害する抗体、結合ポリペプチド、および／または結合小分子を求めて選択するため、ＵＳＰ１および／またはＵＡＦ１のデユビキチナーゼ活性はＵＳ２０１０／０３３０５９９およびＵＳ２００７／００６１９０７に開示されている方法に従って測定しうる。これにより前記特許文献の内容は参照によりその全体を組み込まれている。
【０１９７】
細胞死を誘導する抗体、結合ポリペプチド、および／または結合小分子を求めて選択するため、例えば、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルーまたは７ＡＡＤ取り込みにより示される膜統合性の消失は対照と比べて評価しうる。ＰＩ取り込みアッセイは補体および免疫エフェクター細胞の非存在下で実施することができる。ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、および／またはＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）ポリペプチド発現腫瘍細胞は、培地単独とまたは適切な抗体（例えば、約１０μｇ／ｍｌで）、結合ポリペプチドまたは結合小分子を含有する培地と一緒にインキュベートされる。細胞は３日の期間インキュベートされる。それぞれの処理に続いて、細胞は洗浄され、細胞集塊を取り除くために３５ｍｍストレーナーキャップ付き１２×７５チューブ（チューブあたり１ｍｌ、処理群あたり３チューブ）にアリコートされる。次に、チューブはＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）を受ける。試料はＦＡＣＳＣＡＮ（登録商標）フローサイトメーターおよびＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ（登録商標）ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して解析しうる。ＰＩ取り込みにより決定される場合、統計的に有意なレベルでの細胞死を誘導する抗体、結合ポリペプチドまたは結合小分子は細胞死誘導抗体、結合ポリペプチドまたは結合小分子として選択することができる。
【０１９８】
対象の抗体が結合しているポリペプチド上のエピトープに結合する抗体、結合ポリペプチド、および／または結合小分子を求めてスクリーニングするため、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、編  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているアッセイなどの常用のクロスブロッキングアッセイを実施することができる。このアッセイを使用すれば、試験抗体、結合ポリペプチドまたは結合小分子が既知の抗体と同じ部位またはエピトープに結合するかどうかを決定することができる。その代わりに、またはそれに加えて、当技術分野で公知の方法によりエピトープマッピングを実施することができる。例えば、抗体配列はアラニンスキャニングなどにより変異誘発させて接触残基を同定することができる。変異抗体は最初、ポリクローナル抗体との結合について試験されて適切なフォールディングを確認する。異なる方法では、ポリペプチドの異なる領域に対応するペプチドは、試験抗体とのまたは試験抗体と特徴付けられたもしくは既知のエピトープを有する抗体との競合アッセイに使用することができる。
【０１９９】
細胞運命の変化を促進するＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストを求めてスクリーニングするおよび／または同定する方法であって、基準細胞の細胞運命である（ｉ）基準細胞運命を、ＵＳＰ１候補アンタゴニスト、ＵＡＦ１候補アンタゴニスト、および／またはＩＤ候補アンタゴニストの存在下での基準細胞の細胞運命である（ｉｉ）候補細胞運命と比較し、ＵＳＰ１候補アンタゴニストがＵＳＰ１に結合し、ＵＡＦ１候補アンタゴニストがＵＡＦ１に結合し、および／またはＩＤ候補アンタゴニストがＩＤに結合して、それによって基準細胞運命と候補細胞運命の間の細胞運命の違いがＵＳＰ１候補アンタゴニストおよび／またはＩＤ候補アンタゴニストを細胞運命の変化を促進すると同定することを含む前記方法が本明細書で提供される。
【０２００】
細胞周期停止を誘導するＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニスト、および／またはＩＤアンタゴニストを求めてスクリーニングするおよび／または同定する方法であって、ＵＳＰ１候補アンタゴニスト、ＵＡＦ１候補アンタゴニスト、および／またはＩＤ候補アンタゴニストの存在下で（ｉ）基準細胞運命を接触させ、ＵＳＰ１候補アンタゴニストがＵＳＰ１に結合し、ＵＡＦ１候補アンタゴニストがＵＡＦ１に結合し、および／またはＩＤ候補アンタゴニストがＩＤに結合して、それによって細胞周期停止がＵＳＰ１候補アンタゴニストおよび／またはＩＤ候補アンタゴニストを細胞周期停止を誘導すると同定することを含む前記方法も本明細書で提供される。
【０２０１】
スクリーニングする方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＵＳＰ１候補アンタゴニスト、ＵＡＦ１候補アンタゴニスト、および／またはＩＤ候補アンタゴニストがＵＳＰ１候補アンタゴニストである。スクリーニングする方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＵＳＰ１候補アンタゴニスト、ＵＡＦ１候補アンタゴニスト、および／またはＩＤ候補アンタゴニストがＩＤ候補アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＩＤ候補アンタゴニストは、ＩＤ１候補アンタゴニスト、ＩＤ２候補アンタゴニスト、および／またはＩＤ３候補アンタゴニストである。スクリーニングする方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＵＳＰ１候補アンタゴニスト、ＵＡＦ１候補アンタゴニスト、および／またはＩＤ候補アンタゴニストがＵＡＦ１候補アンタゴニストである。
【０２０２】
スクリーニングする方法のいずれかのいくつかの実施形態では、基準細胞運命は幹細胞運命である。いくつかの実施形態では、幹細胞運命は間葉幹細胞運命である。スクリーニングする方法のいずれかのいくつかの実施形態では、候補細胞運命は、骨芽細胞運命、軟骨細胞運命、または脂肪細胞運命である。いくつかの実施形態では、候補細胞運命は骨芽細胞運命である。
【０２０３】
スクリーニングする方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＵＳＰ１候補アンタゴニスト、ＵＡＦ１候補アンタゴニスト、および／またはＩＤ候補アンタゴニストは抗体、結合ポリペプチド、結合小分子、またはポリヌクレオチドである。
【０２０４】
Ｉ．結合アッセイおよび他のアッセイ
一態様では、本発明の抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、等などの公知の方法によりその抗原結合活性について試験される。
【０２０５】
Ｊ．診断および検出のための方法および組成物
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＵＳＰ１抗体、抗ＵＡＦ１抗体、および／または抗ＩＤ抗体（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）のいずれも、生体試料中のＵＳＰ１、ＵＡＦ１、および／またはＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）の存在を検出するのに有用である。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＵＳＰ１結合ポリペプチド、抗ＵＡＦ１結合ポリペプチド、および／または抗ＩＤ結合ポリペプチド（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）のいずれも、生体試料中のＵＳＰ１、ＵＡＦ１、および／またはＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）の存在を検出するのに有用である。本明細書で使用される用語「検出する」は定量的または定性的検出を包含する。ある特定の実施形態では、生体試料は細胞または骨などの組織を含む。
【０２０６】
一実施形態では、診断または検出の方法において使用するための抗ＵＳＰ１抗体、抗ＵＡＦ１抗体、および／または抗ＩＤ抗体（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）が提供される。追加の態様では、生体試料中のＵＳＰ１、ＵＡＦ１、および／またはＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）の存在を検出する方法が提供される。追加の態様では、個人をＵＳＰ１、ＵＡＦ１、および／またはＩＤアンタゴニストで治療するのに適していると同定する方法であって、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、および／またはＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現（例えば、発現レベル）を決定することを含む方法が提供される。追加の態様では、個人をＵＳＰ１、ＵＡＦ１、および／またはＩＤアンタゴニストで治療するのに適していると同定する方法であって、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、およびＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、またはＩＤ３）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現（例えば、発現レベル）を（例えば、基準値および／または内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）決定することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、およびＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、またはＩＤ３）からなる群から選択される１つもしくは複数の遺伝子の（例えば、基準値および／または内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）上昇した発現レベルに基づく治療のための個体が選択される。いくつかの実施形態では、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、およびＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、またはＩＤ３）からなる群から選択される１つもしくは複数の遺伝子の（例えば、基準値および／または内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）低い発現レベルに基づく治療のための個体は選択されない。いくつかの実施形態では、ｐ２１、ＲＵＮＸ２、ＯＳＴＥＲＩＸ、ＳＰＡＲＣ／ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ、ＳＰＰ１／ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＢＧＬＡＰ／ＯＳＴＥＯＣＡＬＣＩＮ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）からなる群から選択される１つもしくは複数の遺伝子の（例えば、基準値および／または内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）低い発現レベルに基づく治療のための個体が選択される。いくつかの実施形態では、ｐ２１、ＲＵＮＸ２、ＯＳＴＥＲＩＸ、ＳＰＡＲＣ／ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ、ＳＰＰ１／ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＢＧＬＡＰ／ＯＳＴＥＯＣＡＬＣＩＮ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）からなる群から選択される１つもしくは複数の遺伝子の（例えば、基準値および／または内部標準（例えば、ＣＤ１４４）と比べて）上昇した発現レベルに基づく治療のための個体は選択されない。
【０２０７】
ある特定の実施形態では、発現はタンパク質発現である。ある特定の実施形態では、発現はポリヌクレオチド発現である。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。
【０２０８】
ｍＲＮＡ、タンパク質、または遺伝子増幅の発現を決定するための様々な方法には、遺伝子発現プロファイリング、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、ＦＩＳＨ、マイクロアレイ解析、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ、プロテオミクス、免疫組織化学（ＩＨＣ）、等が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、タンパク質発現は定量される。そのようなタンパク質分析は、ＩＨＣを使用して、例えば、患者腫瘍試料で実施しうる。
【０２０９】
一態様では、バイオマーカーのレベルは、（ａ）試料（例えば、患者腫瘍試料）で遺伝子発現プロファイリング、ＰＣＲ（例えば、ｒｔＰＣＲ）、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、マイクロアレイ解析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技法、またはＦＩＳＨを実施する、および（ｂ）試料においてバイオマーカーの発現を決定することを含む方法を使用して決定される。一態様では、バイオマーカーのレベルは、（ａ）抗体を用いて試料（例えば、患者腫瘍試料）のＩＨＣ分析を実施する、および（ｂ）試料においてバイオマーカーの発現を決定することを含む方法を使用して決定される。いくつかの実施形態では、ＩＨＣ染色強度は基準値と比べて決定される。
【０２１０】
ある特定の実施形態では、方法は、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、および／またはＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）への抗ＵＳＰ１抗体の結合を許容する条件下で本明細書に記載される抗ＵＳＰ１抗体、抗ＵＡＦ１抗体、および／または抗ＩＤ抗体（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）に生体試料を接触させ、抗ＵＳＰ１抗体、抗ＵＡＦ１抗体、および／または抗ＩＤ抗体（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）とＵＳＰ１、ＵＡＦ１、および／またはＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）の間で複合体が形成されるかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロまたはインビボ法でもよい。一実施形態では、抗ＵＳＰ１抗体を使用して、例えば、ＵＳＰ１、ＵＡＦ１、および／またはＩＤ（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）が患者の選択のためのバイオマーカーである場合、抗ＵＳＰ１抗体、抗ＵＡＦ１抗体、および／または抗ＩＤ抗体（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）を用いた療法にふさわしい対象を選択する。
【０２１１】
ある特定の実施形態では、標識された抗ＵＳＰ１抗体、抗ＵＡＦ１抗体、および／または抗ＩＤ抗体（例えば、ＩＤ１、ＩＤ２、および／またはＩＤ３）が提供される。標識には、直接検出される標識または部分（例えば、蛍光、発色団、高電子密度、化学発光、および放射標識）、ならびに、例えば、酵素反応または分子相互作用を通じて間接的に検出される酵素またはリガンドなどの部分が含まれるが、これらに限定されない。例となる標識には、放射性同位体、32Ｐ、14Ｃ、125Ｉ、3Ｈ、および131Ｉ、希土キレートまたはフルオレセインおよびその誘導体などのフルオロフォア、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルセリフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅｓ）、例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソザイム、糖類オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デハイドロゲナーゼ；過酸化水素を用いてＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼなどの色素前駆体を酸化する酵素と結合している、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなどの複素環オキシダーゼ；ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカル、その他同類のものが含まれるが、これらに限定されない。
【０２１２】
Ｋ．薬学的製剤
本明細書に記載されるＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１および／またはＩＤアンタゴニスト（例えば、ＩＤ１アンタゴニスト、ＩＤ２アンタゴニスト、および／またはＩＤ３アンタゴニスト）の薬学的製剤は、所望の純度を有するそのような抗体を１つまたは複数の随意の薬学的に許容される担体と混合することにより、凍結乾燥剤または水溶液の形態で調製される。いくつかの実施形態では、ＵＳＰ１アンタゴニストおよび／またはＩＤアンタゴニスト（例えば、ＩＤ１アンタゴニスト、ＩＤ２アンタゴニスト、またはＩＤ３アンタゴニスト）は結合小分子、抗体、結合ポリペプチド、またはポリヌクレオチドである。薬学的に許容される担体は一般に、用いられる投与量および濃度ではレシピエントには無毒であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。例となる薬学的に許容される担体は、本明細書ではさらに、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などの可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質などの間質性薬分散剤が含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある種の例となるｓＨＡＳＥＧＰおよび使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号および米国特許出願公開第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つまたは複数の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
【０２１３】
例となる凍結乾燥抗体製剤は米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤には、米国特許第６，１７１，５８６号およびＷＯ２００６／０４４９０８に記載されている製剤が含まれ、後者の製剤にはヒスチジン−アセテートバッファーが含まれる。
【０２１４】
本明細書の製剤は治療されている特定の適応症に必要な１つよりも多い、好ましくは互いに悪影響を与えない補完的活性を有する活性成分も含有しうる。そのような活性成分は、意図している目的に有効である量で組み合わせて適切に存在している。
【０２１５】
活性成分は、コロイド薬送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）においてまたはマクロエマルションにおいて、例えば、コアセルベーション技法によりまたは界面重合により調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルに封入してもよい。そのような技法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版  Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示されている。
【０２１６】
徐放性製剤を調製しうる。徐放性製剤の適切な例には、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、前記マトリックスは造形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形状をしている。
【０２１７】
インビボ投与のために使用される製剤は一般に無菌である。無菌性は、例えば、除菌膜を通す濾過により容易に実現しうる。
【０２１８】
Ｌ．製品
本発明の別の態様では、上記障害の治療、予防および／または診断に有用な物質を含有する製品が提供される。製品は、容器および容器上のまたはこれに付属するラベルもしくは添付文書を含む。適切な容器には、例えば、ビン、バイアル、注射器、ＩＶ溶液袋、等が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成しうる。容器には、状態を治療する、予防するおよび／または診断するのに単独で効果的なまたはこれに効果的な別の組成物と組み合わされる組成物が入っており、無菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は静脈注射液袋または皮下注射針により突き刺し可能な栓付のバイアルでもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が最適の状態を治療するのに使用されることを表示している。さらに、製品は、（ａ）ＵＳＰ１アンタゴニスト、ＵＡＦ１アンタゴニストおよび／またはＩＤアンタゴニスト（例えば、ＩＤ１アンタゴニスト、ＩＤ２アンタゴニスト、またはＩＤ３アンタゴニスト）を含む組成物がそこに含有されている第１の容器、ならびに（ｂ）追加の細胞傷害性または他の方法での治療薬を含む組成物がそこに含有されている第２の容器を含んでいてもよい。本発明のこの実施形態における製品は、組成物を使用して特定の状態を治療することができることを表示する添付文書をさらに含んでいてもよい。その代わりに、またはそれに加えて、製品は、注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー液およびデキストロース溶液などの薬学的に許容されるバッファーを含む第２（または第３）の容器をさらに含んでいてもよい。製品は、他のバッファー、希釈剤、充填剤、針、および注射器を含む、商業的および使用者の立場から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
【０２１９】
上記製品のいずれも、抗ＵＳＰ１抗体、抗ＵＡＦ１抗体、および／または抗ＩＤ抗体（例えば、抗ＩＤ１抗体、抗ＩＤ２抗体、または抗ＩＤ３抗体）に代わってまたはこれに加えて本発明の免疫コンジュゲートを含んでいてもよいことは理解される。
【実施例】
【０２２０】
以下は本発明の方法および組成物の例である。上で提供される概要を考慮すれば、様々な他の実施形態を実行しうることは理解される。
【０２２１】
実施例のための材料および方法
細胞系および培養条件
ヒト細胞系、１４３Ｂ、２９３Ｔ、ＨＯＳ、ＭＧ−６３、ＳＡＯＳ−２、ＳＪＳＡ、およびＵ２−ＯＳ（ＡＴＣＣ）は、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、１０ユニット／ｍｌペニシリン、および１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭにおいて維持された。原発性ヒト骨芽細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）は原発性骨芽細胞培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）に広げられ、上記の通りに補充されたＤＭＥＭにおいて継代された。正常骨髄由来の原発性ヒト間葉幹細胞（Ｌｏｎｚａ）は間葉幹細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ）で継代された。骨分化研究のため、ｈＭＳＣは、１００ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ−９（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充された骨分化培地（Ｌｏｎｚａ）で培養された。原発性ヒト骨肉腫は、ＣｙｔｏＭｉｘ、ＬＬＣから、およびＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋから入手した。原発性骨芽細胞は、継代２〜３で使用され、ＲＴ−ＰＣＲにより評価した場合、アルカリホスファターゼ、アラザリンレッド反応性、および骨芽細胞特異的転写物ＯｓｔｅｒｉｘおよびＯｓｔｅｏｎｅｃｔｉｎの発現により確認された。マウスＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣ）は補充されたＤＭＥＭにおいて培養された。野生型およびＵＳＰ１-/-ＤＴ−４０細胞はＫ．Ｐａｔｅｌから寄贈され、７％ＦＢＳおよび３％ニワトリ血清を含むＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）において培養された。ＭＧ−１３２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）は１０μＭで使用された。シクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ）は２５μｇ／ｍｌで使用された。
【０２２２】
発現ベクター
ＵＳＰ１および変異ＵＳＰ１  Ｃ９０Ｓを含むヒトデユビキチナーゼのｃＤＮＡは合成され（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、インフレームＣ末端ＦｌａｇエピトープのあるまたはなしでｐＲＫ２００１にクローニングされた。ｓｈＲＮＡ−抵抗性ＵＳＰ１はコドン保存部位特異的変異誘発により作製された。ＩＤ１、ＩＤ２、およびＩＤ３はジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）由来ｃＤＮＡから増幅され、Ｃ末端ＦｌａｇエピトープのあるインフレームでｐＲＫ２００１にクローニングされた。ＷＤＲ４８は発現ベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ）から増幅され、ｐＲＫ２００１にサブクローニングされた。ＨＡユビキチンをコードするプラスミドは記載されている（Ｗｅｒｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ  ４３０、６９４、２００４）。切断型マウスＭＨＣクラスＩＨ−２Ｋk発現ベクターであるｐＭＡＣＳは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ．から入手した。ウイルス発現研究のために、ＩＤ２およびＵＳＰ１バリアントは、レトロウイルスベクターｐＱＣＸＩＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）またはレンチウイルスベクターｐＨＵＳＨ．Ｌｅｎｔｉ．Ｐｕｒｏ（Ｄａｖｉｄ  Ｄａｖｉｓ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７  Ｓｅｐ２６；７：６１）にクローニングされた。
【０２２３】
ＵＳＰ１（Ａ−ＴＩ３３３８７４（配列番号６）５’−ＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＡＧＡＴＣＡＡＣＡＣＴＣＣＴＴ−３’）もしくは（Ｂ−ＴＩ３３３８７６（配列番号７）５’−ＣＡＡＧＧＡＡＴＣＣＡＧＴＧＡＣＣＡＡＡＣＡＧＧＣＡＴＴＡ−３’）、ＩＤ１（ＴＩ３１５９７９（配列番号８）５’−ＧＡＧＡＴＴＣＴＣＣＡＧＣＡＣＧＴＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＡＴ−３’）、ＩＤ２（ＴＩ３４９０４８（配列番号９）５’−ＣＣＴＴＣＴＧＡＧＴＴＡＡＴＧＴＣＡＡＡＴＧＡＣＡＧＣＡＡ−３’）、ＩＤ３（ＴＩ３７５１５７（配列番号１０）５’−ＴＧＧＴＣＴＣＣＴＴＧＧＡＧＡＡＡＧＧＴＴＣＴＧＴＴＧＣＣ−３’）をターゲティングするｐＲＳ発現ベクター中のｓｈＲＮＡベクターまたは非ターゲティング対照配列（ｐＲＳ３０００３（配列番号１１）５’−ＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣ−３’）はＯｒｉｇｅｎｅから入手した。他の方法で指示がなければ、ｓｈＵＳＰ１−ＢはＵＳＰ１ノックダウン実験で使用された。
【０２２４】
ヒトＵＳＰ１（５’−ＡＧＧＣＡＡＴＡＣＴＴＧＣＴＡＴＣＴＴＡＡＴ−３’（配列番号１２））、マウスＩＤ１（５’−ＣＧＣＡＧＣＡＣＧＴＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＡＴ−３’（配列番号１３））、マウスＩＤ２（５’−ＣＧＣＡＡＡＧＴＡＣＴＣＴＧＴＧＧＣＴＡＡＡ−３’（配列番号１４））（５’−ＣＧＣＡＧＣＡＣＧＴＣＡＴＣＧＡＴＴＡＣＡＴ−３’（配列番号１５））、（５’−ＣＴＧＡＣＴＧＣＴＡＣＴＣＣＡＡＧＣＴＣＡＡ−３’（配列番号１６））、マウスＩＤ３（５’−ＣＧＣＣＣＴＧＡＴＴＡＴＧＡＡＣＴＣＴＡＴＡ−３’（配列番号１７））、（５’−ＡＣＣＴＧＡＴＴＡＴＧＡＡＣＴＣＴＡＴＡＡＴ−３’（配列番号１８））、（５’−ＣＧＣＣＣＴＣＴＴＣＡＣＴＴＡＣＣＣＴＧＡＡ−３’（配列番号１９））をターゲティングするｐＴＲＩＰＺ発現ベクター中のドキシサイクリン誘導性ｓｈＲＮＡ構築物または非ターゲティング対照はＯｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した。
【０２２５】
トランスフェクション、細胞選別、ＲＮＡ、およびタンパク質抽出
Ｕ２−ＯＳ、ＨＯＳ、ＳＪＳＡ、ＳＡＯＳ、またはＭＧ−６３細胞は１０〜２５％コンフルエンスまで増殖され、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｓｉｇｍａ）を使用してマーカープラスミドｐＭＡＣＳと組み合わせて指示されたプラスミドをトランスフェクトさせた。トランスフェクト細胞は、ＭＡＣＳセレクトＨ−２Ｋkマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で選別された。ＲＮＡは、培養されたまたは選別されトランスフェクト細胞からＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキットで抽出された。タンパク質は、プロテアーゼ阻害剤カクテルＩならびにホスファターゼ阻害剤カクテル１および２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を補充されたＮＰ−４０バッファー（１％ＮＰ−４０、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中での溶解により抽出された。ライセートは解析に先立って、１５，０００×Ｇで１０分間の遠心分離により澄ませた。タンパク質含有量はＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により正規化された。二重ｓｈＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ実験では、細胞はＦｕｇｅｎｅによりＤＮＡ発現ベクターをトランスフェクトされ、それに続いて、ヌクレオフェクション溶液Ｖ（Ｌｏｎｚａ）中プログラムＸ−００１でのヌクレオフェクションにより、対照ｓｉＲＮＡ（センス−５’−ＡＡＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵ−３’（配列番号２０））またはｓｉＲＮＡターゲティングｐ２１（５’−ＣＧＡＴＧＧＡＡＣＴＴＣＧＡＣＴＴＴＧＴＴ−３’（配列番号２１））をトランスフェクトされた。ＤＴ−４０細胞は、ヌクレオフェクション溶液Ｔ（Ｌｏｎｚａ）中プログラムＢ−０２３でのヌクレオフェクションによりトランスフェクトされた。
【０２２６】
抗体、ウェスタンブロッティング、および免疫沈降
ラットモノクローナル抗体はヒトＵＳＰ１またはＷＤＲ４８のＣ末端１００アミノ酸に対して産生されて、モノクローナルＵＳＰ１抗体５Ｅ１０およびＷＤＲ４８抗体９Ｆ１０を産生した。ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、Ｅ４７、およびｐ５３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＧＡＰＤＨ（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ）、Ｆｌａｇ、ＨＡ、チューブリン、およびアクチン（Ｓｉｇｍａ）、ｐ２１WAF1/CIP1（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｅ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリン（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｓ）、ならびにフィブロネクチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）は商業的供給源から入手した。免疫沈降は、指示された抗体およびプロテインＡ／Ｇアガロースビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて１０μＭのＭＧ−１３２の存在下で実施された。タンパク質抽出物はＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離され、免疫ブロット解析のために０．２μＭニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移された。
【０２２７】
ＲＮＡ解析
ＲＮＡはＱｉａｇｅｎ  ＲＮＥａｓｙ  ＲＮＡ単離キットを使用して抽出された。ＵＳＰ１（５’：５’−ＧＣＣＡＣＴＣＡＧＣＣＡＡＧＧＣＧＡＣＴＧ−３’（配列番号２２）；３’：５’−ＣＡＧＡＡＴＧＣＣＴＣＡＴＡＣＴＧＴＣＣＡＴＣＴＣＴＡＴＧＣ−３’（配列番号２３））、ＩＤ１（５’：５’−ＧＡＧＣＴＧＧＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣ−３’（配列番号２４）；３’：５’−ＧＡＴＣＧＴＣＣＧＣＡＧＧＡＡＣＧＣＡＴ−３’（配列番号２５））、ＩＤ２（５’：５’−ＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＴＣＣＴ−３’（配列番号２６）；３’：５’−ＡＣＡＧＴＧＣＴＴＴＧＣＴＧＴＣＡＴＴＴＧＡＣＡＴＴＡＡＣＴＣ−３’（配列番号２７））、ＩＤ３（５’：５’−ＧＡＧＣＣＧＣＴＧＡＧＣＴＴＧＣＴＧＧＡ−３’（配列番号２８）；３’：５’−ＡＴＧＡＣＡＡＧＴＴＣＣＧＧＡＧＴＧＡＧＣＴＣＧ−３’（配列番号２９））、ｐ２１（５’：５’−ＣＴＴＧＧＣＣＴＧＣＣＣＡＡＧＣＴＣＴＡＣＣＴＴＣＣＣＡＣＧ−３’（配列番号３０）；３’：５’−ＧＧＧＣＴＴＣＣＴＣＴＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＡＧＣＣＧＧＣＧ−３’（配列番号３１））、Ｒｕｎｘ２（５’：５’−ＡＴＧＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＴＡＣＴＧＴＣＡＴＧＧＣＧＧＧ−３’（配列番号３２）；３’：５’−ＣＴＧＧＧＴＴＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴＡＣＴＧＴＡＡＣＴＴＴＡＡＴＴＧＣ−３’（配列番号３３））、Ｏｓｔｅｒｉｘ（５’：５’−ＣＴＣＴＣＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＧＣＴＣＣＴＴＧＧＧＡＣ−３’（配列番号３４）；３’：５’−ＣＣＴＣＡＧＧＣＴＡＴＧＣＴＡＡＴＧＡＴＴＡＣＣＣＴＣＣＣＴＴＴＴＣＣＣ−３’（配列番号３５））、Ｏｓｔｅｏｎｅｃｔｉｎ（５’：５’−ＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＴＣＴＴＣＴＴＴＣＴＣＣ−３’（配列番号３６）；３’：５’−ＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＧＧＧＡＴＴＴＴＣＣＧＣＣＡＣＣ−３’（配列番号３７））またはβ−アクチン（５’：５’−ＧＴＣＧＡＣＡＡＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣ−３’（配列番号３８）；３’：５’−ＧＧＴＧＴＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＴＴＴＣＴ−３’（配列番号３９））をターゲティングするＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてそれぞれの遺伝子から増幅させ、ＡＢＩ  ７５００  Ｒｅａｌ  ＴｉｍｅＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でサーモサイクラーにかけた。データはＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ１．４（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析された。β−アクチンｍＲＮＡレベルを使用してＵＳＰ１およびＩＤ  ｍＲＮＡレベルを正規化し、負荷および試料誤差を補正した。
【０２２８】
原発性腫瘍ＲＮＡデータは、発現プローブ（ＩＤ１）で２０８９３７＿ｓ＿、（ＩＤ２）で２１３９３１＿、（ＩＤ３）で２０７８２６＿ｓ＿、（ＵＳＰ１）で２０２４１２＿ｓ＿、（ｐ２１）で２０２２８４＿ｓ＿、（ｐ５７）で２１９５３４＿ｘ＿、（ｐ１５）で２３６３１３＿、および（ｐ１６）で２０７０３９＿を使用して指示されたヒト骨試料中のＲＮＡ発現レベルのＧｅｎｅＬｏｇｉｃマイクロアレイ解析（Ｏｃｉｍｕｍ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）から入手した。試料はＨＧＵ１３３Ｐ  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップにハイブリダイズされた。
【０２２９】
免疫組織化学
ホルマリン固定、パラフィン包埋組織切片をスライドに載せ、脱パラフィンし、ｄＨ２０で再水和した。抗原を回収するため、試料は９９℃で２０分間、Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄａｋｏ）中でインキュベートされ、２０分間で７４℃まで冷却された。内在性ペルオキシダーゼ、アビジン、ビオチン、および免疫グロブリンはＡｖｉｄｉｎ／Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｋｉｔバッファー（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）中でのインキュベーションによりクエンチされ、続いてＲＴで３０分間、３％ＢＳＡ中でインキュベートされた。クエンチングに続いて、試料はＲＴで６０分間、一次抗体でインキュベートされ、Ｄａｋｏ洗浄バッファーで２回すすがれ、３０分間Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）バッファー中でインキュベートされた。染色はＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）中でインキュベートすることにより視覚化された。試料はＭａｙｅｒ’ｓ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎで対比染色され、撮像に先立ってカバーガラスに載せられた。ＲＴ＝室温。
【０２３０】
フローサイトメトリー
細胞周期解析は、ＦＩＴＣ−コンジュゲートＨ−２Ｋk抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で染色し、続いて７０％エタノール固定およびＲＮＡｓｅ  Ａ（Ｓｉｇｍａ）を用いたヨウ化プロピジウムでのＤＮＡ標識化により実施された（Ｋｒｉｓｈａｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６６：１８８、１９７５）。ＦＩＴＣ＋細胞のＤＮＡ含有量は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して評価された。データはＦｌｏｗＪｏ  ｖ８．７．３ソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて解析された。細胞周期パーセンタイルはＦｌｏｗＪｏ細胞周期プラットホームを用いて定量された。
【０２３１】
ｈＭＳＣマーカー発現は、ＣＤ９０（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ＣＤ１０５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＣＤ１０６（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）、およびＣＤ１４４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはアイソタイプ対照（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に特異的なＰＥ−コンジュゲート抗体で染色することにより骨肉腫細胞系およびｈＭＳＣで評価された。マーカーの幾何平均発現はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメターを使用して定量された。
【０２３２】
免疫蛍光アッセイ
記載された通りにベクターを安定的に形質導入されたＵ２−ＯＳ細胞は、チャンバースライド上でコンフルエンスまで増殖され、３μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で１４日間処理され、ＰＢＳ中１％ＰＦＡに固定され、Ｅ−カドヘリン−ＦＩＴＣ、Ｎ−カドヘリン（ＢＤ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、またはフィブロネクチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で探索された。非連結抗体はヤギ抗マウスＦＩＴＣ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）で検出された。カバーガラスはＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ封入剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をマウントされた。
【０２３３】
インビボ脱ユビキチン化アッセイ
２９３Ｔ細胞は記載の通りにトランスフェクトされ、１０μＭのＭＧ−１３２および１０ｍＭのＮ−エチルマレイミド（Ｓｉｇｍａ）を補充されたＮＰ−４０バッファー中での溶解に先立って１０μＭのＭＧ−１３２で処理された。澄んだライセートは１％ＳＤＳで解離され、９５℃で５分間煮沸し、次にＭ２−アガロース抗Ｆｌａｇビーズ（Ｓｉｇｍａ）を用いた免疫沈降に先立って溶解バッファーに１対２０で希釈された。ユビキチンレベルはＨＡ抗体を用いた免疫ブロットにより評価された。
【０２３４】
インビトロ脱ユビキチン化アッセイ
２９３Ｔ細胞は、別々のバッチで、ＵＳＰ１−Ｆｌａｇ、ＵＳＰ１−Ｃ９０Ｓ−ＦｌａｇまたはＩＤ２−ＦｌａｇおよびＨＡ−ユビキチンをトランスフェクトされた。ユビキチン化ＩＤ２−Ｆｌａｇは、ＳＤＳ煮沸ライセートから上記の通りに免疫沈降された。ＵＳＰ１およびＵＳＰ１  Ｃ９０Ｓは、ＮＰ−４０溶解バッファー中での溶解に続いてＦｌａｇ  Ｍ２−アガロースビーズで免疫沈降された。すべての試料は、５００μｇ／ｍｌの３×Ｆｌａｇペプチド（Ｓｉｇｍａ）でビーズから溶出された。試料は脱ユビキチン化バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２０ｍＭのＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、５００μＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ＝８．３）中で組み換えられ、室温で指示された時間インキュベートされた。ユビキチンレベルはＨＡ抗体を用いた免疫ブロットにより評価された。
【０２３５】
骨肉腫分化アッセイ
Ｕ２−ＯＳ、ＨＯＳ、またはＳＡＯＳ細胞は以下の通りにｐＲＳ  ｓｈＵＳＰ１またはｓｈＣＴＬを３回トランスフェクトされ、細胞は最初、ｓｈＵＳＰ１またはｓｈＣＴＬをトランスフェクトされ、２日間培養され、３日間ピューロマイシンで選択された。細胞はｐＭＡＣＳおよびｓｈＵＳＰ１またはｓｈＣＴＬをトランスフェクトされ、２日間培養され、抗Ｈ−２Ｋｋビーズソート（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）により選別され、１日間培養され、連続してｓｈＵＳＰ１またはｓｈＣＴＬを再トランスフェクトされた。細胞はさらに３日間培養され、骨芽細胞およびｈＭＳＣマーカーは、フローサイトメトリー、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、およびＡＬＰアッセイにより評価された。１４３Ｂ細胞はｐＴＲＩＰＺベースの誘導性ＵＳＰ１または対照ｓｈＲＮＡベクターを形質導入され、ピューロマイシン耐性細胞は継代された。
【０２３６】
ｐ−ニトロフェノールリン酸切断アッセイ
細胞ライセートはプロテアソーム阻害剤を用いてＮＰ−４０バッファーで産生されたが、ホスファターゼ阻害剤はなく、タンパク質含有量について正規化された。ライセートは、クリアー底９６ウェルプレートにおいてｐ−ニトロフェノールホスファターゼ基質系溶液（Ｓｉｇｍａ）に添加され、室温で０．５〜２０時間インキュベートされた。既知量の４−ニトロフェノール（Ｓｉｇｍａ）の希釈シリーズは基準として使用された。活性は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  １９０分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）付のＯＤ吸光度測定により４０５ｎｍで定量され、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５．３ソフトウェア（ＭＤＳ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で解析された。データは、タンパク質入力および反応時間について正規化された。
【０２３７】
アリザリンレッド染色
８ウェルチャンバースライド上に蒔かれた分化ｈＭＳＣは、氷冷７０％エタノールで３０分間固定され、脱イオン水で洗浄され、０．２％アリザリンレッド染色（Ｒｉｃｃａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ｐＨ６．４中で３０分間インキュベートされた。染色に続いて、細胞は脱イオン水で２回すすがれ、画像が得られた。
【０２３８】
３Ｔ３形質転換アッセイ
マウス３Ｔ３線維芽細胞は、ＵＳＰ１−Ｆｌａｇ、ＵＳＰ１−Ｃ９０Ｓ−Ｆｌａｇ、ＩＤ２−Ｆｌａｇ、または空対照発現ベクターを形質導入され、２日間の発現に続いて、１％寒天ベッド上に０．５％低融点寒天と一緒にＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭに蒔かれた。細胞は２１日間インキュベートされ、８以上の細胞のコロニーは目視検査によりスコアー化された。ＵＳＰ１形質転換試料由来の形質転換コロニーは寒天から回収され、継代され、軟寒天に再播種されて形質転換を確かめた。すべての継代された試料において強いコロニー増殖が観察された（データは示されていない）。
【０２３９】
ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３ノックダウン研究では、ＵＳＰ１形質導入された３Ｔ３細胞はｐＴＲＩＰＺベースのＩＤ１−、ＩＤ２−、およびＩＤ３誘導性ｓｈＲＮＡ発現ベクターまたは対照ｓｈＲＮＡベクターを形質導入され、寒天包埋に先立って７２時間３μｇ／ｍｌドキシサイクリン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で処理された。３μｇ／ｍｌドキシサイクリンは１％と０．５％寒天の両方に含まれていた。
【０２４０】
インビボ研究
８週齢メスＮＣｒヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ）またはＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ．ｂｇマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）は、容積１００μｌのＨＢＳＳ中１×１０6マウス３Ｔ３線維芽細胞（ＵＳＰ１、ＵＳＰ１−Ｃ９０Ｓ、ＩＤ−２、またはベクター対照を形質導入されている）を右後部横腹に皮下注射された。マウスは、腫瘍定着および増殖ならびに体重変化についてモニターされた。所与の群内のマウスが平均腫瘍量２０００ｍｍ3を達成するおよび／または接種後４０日に達すると、マウスは安楽死され解剖されて、腫瘍形成の存在または非存在を確かめた。
【０２４１】
８週齢メスＮＣｒヌードマウスは、容積１００μｌのＨＢＳＳ＋マトリゲル中２．５×１０6１４３ＢｓｈＵＳＰ１細胞を右後部横腹に皮下注射された。ドキシサイクリン処置マウスは、５％ショ糖水中１ｍｇ／ｍＬのドキシサイクリン溶液を与えられた。マウスは、腫瘍定着および増殖ならびに体重変化についてモニターされた。所与の群内のマウスが平均腫瘍量２０００ｍｍ3を達成するおよび／または接種後７８日に達すると、マウスは安楽死され解剖されて、腫瘍形成の存在または非存在を確かめた。
【０２４２】
ＵＳＰ１-/-マウスの作製
ＵＳＰ１遺伝子標的Ｃ５７ＢＬ／６マウスＥＳ細胞は、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＫＯＭＰ）Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（Ｄａｖｉｓ、ＣＡ）から入手した。条件付き対立遺伝子はＥＳ細胞では、胚盤胞注入に先立ってＣｒｅリコンビナーゼを用いたエレクトロポレーションにより除去されていた。
【０２４３】
マイクロコンピュータ処理トモグラフィ
ｄ１２．５マウス子、受胎１８．５日後の胚仔、またはその解剖された大腿骨は、以下のパラメータ：ｘ線チューブエネルギーレベル＝大腿で７０ｋＶもしくはホールマウスで４５ｋＶ、またはｘ線チューブエネルギーレベル＝４５ｋＶ、電流＝１７７μＡ、積分時間＝３００ミリ秒、大腿骨では１０００プロジェクションを用いたμＣＴ４０（ＳＣＡＮＣＯ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｂａｓｓｅｒｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）ｘ線マイクロコンピュータ処理トモグラフィシステムで撮像された。軸位像は、大腿骨分析では１２μｍまたは胎仔／子では３０μｍの等方性解像度で得られた。ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）ファントムを使用して、ｘ線吸収を骨塩量（ＢＭＤ）に較正した。マイクロコンピュータ処理トモグラフィスキャンはＡｎａｌｙｚｅ（ＡｎａｌｙｚｅＤｉｒｅｃｔ  Ｉｎｃ．、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ、ＵＳＡ）で解析された。最大値投影およびサジタル平面における３Ｄサーフィスレンダリングは試料ごとに作成された。スキャン設定に基づいて、収縮−膨脹（ｅｒｏｓｉｏｎ−ｄｉｌａｔｉｏｎ）が続く閾値を適用して、軟組織由来のミネラル化骨格を分割した。
【０２４４】
破骨細胞のインサイツＴＲＡＰ染色
ホルマリン固定パラフィン包埋Ｐ１２マウス大腿骨由来のスライドに載せた５μｍの切片が調製され、製造業者の使用説明書に従って３８７Ａ酸ホスファターゼ白血球（ＴＲＡＰ）キットを用いるＴＲＡＰ染色（ＳＩＧＭＡ）に供された。列挙研究では、ＴＲＡＰ陽性破骨細胞は１０のフィールドで計測された。
【０２４５】
デオキシピリジノリンおよびクレアチニン定量化
羊水がＥ１８．５マウスから収集され、デオキシピリジノリンはＥＬＩＳＡ（ＴＳＺ  ＥＬＩＳＡ）により検出され、クレアチニンは製造業者のプロトコールの通りに比色化学アッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により検出された。
【０２４６】
ＵＳＰ１はＩＤタンパク質を脱ユビキチン化し安定化する
ＩＤタンパク質を安定化するデユビキチナーゼ（ＤＵＢ）を同定するため、Ｃ末端Ｆｌａｇエピトープを有する９４のヒトＤＵＢが２９３Ｔ細胞において過剰発現され、ウェスタンブロットにより内在性ＩＤ２存在量が評価された（オンラインで入手可能な表Ｓ１参照）。２９３Ｔ細胞は、プロテアソーム阻害剤ＭＧ−１３２での処理後にＩＤ２が蓄積するので、ＩＤ２をプロテアソーム依存的に劣化させる（図２Ａ）。内在性ＩＤ２を増加させるＤＵＢは、ＵＳＰ３６、ＵＳＰ３３、ＳＥＮＰ３、ＳＥＮＰ５、ＵＳＰ３７、ＯＴＵＤ５、ＵＳＰ９Ｙ、ＵＳＰ４５、およびＵＳＰ１であった（図２Ａ）。ＩＤ２発現を増加させる間接的機構を排除するため、ＩＤ２相互作用ＤＵＢ  ＵＳＰ１およびＵＳＰ３３に焦点を合わせた（図２Ｂ）。しかし、ＵＳＰ１と違って、ＵＳＰ３３はＩＤ２に対する脱ユビキチン化活性を欠いていた（データは示されていない）。
【０２４７】
ＵＳＰ１がＩＤ２の半減期を伸ばすのかどうかを決定するために、２９３Ｔ細胞はＵＳＰ１をトランスフェクトされ、翻訳阻害剤シクロヘキシミドで処理された後のＩＤ２存在量がモニターされた。新たなタンパク質合成の非存在下では、ＩＤ２は対照ベクターをトランスフェクトされた細胞からは急速に排除され、半減期はおよそ２分であった（図１Ａ）。過剰発現されたＵＳＰ１はＩＤ２の半減期を８０分を超えるまで伸ばした。触媒的に不活性な点変異体ＵＳＰ１  Ｃ９０Ｓ（Ｎｉｊｍａｎら、２００５）はＩＤ２の半減期を増大しない（図１Ａ）し、ＩＤ２の定常状態存在量を変えない（図１Ｂ）ので、ＵＳＰ１のタンパク質分解活性はＩＤ２蓄積に必要であった。類似の結果はＩＤ１およびＩＤ３で得られた。ＵＳＰ１は、不安定なＩｋＢａの発現を増強しなかったので、ＩＤを特異的に標的にすると思われる（Ｐａｌｏｍｂｅｌｌａら、１９９４）。
【０２４８】
次に、ＩＤ２ユビキチン化に対するＵＳＰ１の効果が評価された。野生型ＵＳＰ１はＨＡタグ付きユビキチンで修飾されたＩＤ２の量を減少させたが、ＵＳＰ１  Ｃ９０Ｓは減少させなかった（図１Ｃ）。基本のＩＤ２脱ユビキチン化もＵＳＰ１誘導ＩＤ２脱ユビキチン化も、ＵＳＰ１のコファクターＷＤＲ４８の同時発現により増強された（Ｃｏｈｎら、２００７）（図１Ｃ）。ＵＳＰ１がＩＤ２を直接脱ユビキチン化したのかどうかに取り組むため、２９３Ｔ細胞から精製されたユビキチン化ＩＤ２は、２９３Ｔ細胞から別々に精製された野生型ＵＳＰ１またはＵＳＰ１  Ｃ９０Ｓのどちらかと一緒にインビトロでインキュベートされた。ユビキチン化ＩＤ２は野生型ＵＳＰ１により減少したが、ＵＳＰ１  Ｃ９０Ｓでは減少せず（図１Ｄ）、脱ユビキチン化が共溶出したプロテアーゼの結果である見込みはないことが示された。ＩＤ２ユビキチン化の減少はＮ−エチルマレイミドにも感受性であり、システインプロテアーゼの関与が確かめられた（図１Ｄ）。ユビキチン化ＩＤ２がＵＳＰ１基質であることと一致して、欠失変異体ＵＳＰ１Ｄ２６０〜３００はＩＤ２との相互作用が弱く（図２Ｃ）、ＩＤ２存在量を増強しなかった（図２Ｄ）。
【０２４９】
ＵＳＰ１とＩＤ２は原発性骨肉腫腫瘍のサブセットにおいて協調的に過剰発現される
ＵＳＰ１がＩＤタンパク質を脱ユビキチン化する生物学的状況を同定するために、ＵＳＰ１発現パターンが解析された。健康なおよび疾患ヒト組織のマイクロアレイ解析により、骨肉腫腫瘍が健康なまたは骨関節炎骨生検よりも多くのＵＳＰ１  ｍＲＮＡを発現することが明らかにされた（図３Ａ）。原発性ヒト骨肉腫生検の別々のセットのウェスタンブロッティングにより、ＵＳＰ１が、３つの正常な原発性ヒト骨芽細胞試料と比べた場合、１４の骨肉腫のうちの７つで上昇していることが分かった（図３Ｂ）。驚くべきことに、これらの原発性ヒト腫瘍試料におけるＩＤ２タンパク質存在量はＵＳＰ１存在量とよく相関していた。１つの異常な試料はＵＳＰ１を豊富に含有していたがＩＤ２はほとんどなく（図３Ｂ、レーン６）、これはおそらくＵＳＰ１のコファクターＷＤＲ４８の発現が不十分だったためである。別の試料は豊富なＩＤ２を含有していたがＵＳＰ１はほとんどなく（図３Ｂ、レーン１６）、これはＩＤ２ユビキチン化の減少をまたは他のＤＵＢが活性であることを反映している可能性がある。
【０２５０】
原発性骨肉腫におけるＵＳＰ１タンパク質の量はＵＳＰ１  ｍＲＮＡ存在量と大いに相関しており（図３Ｃ）、骨肉腫における上昇したＵＳＰ１が転写上方調節のためであることが示唆される。これとは対照的に、ＩＤ２タンパク質とｍＲＮＡレベルの相関は弱かった（図３Ｄ）。原発性骨肉腫におけるＵＳＰ１とＩＤ２の同時過剰発現は、免疫組織化学により確かめられた（図３Ｅ〜３Ｇ）。これらの結果は、ＵＳＰ１が骨肉腫においてＩＤタンパク質を翻訳後に改変することを強く示唆している。
【０２５１】
ＵＳＰ１は骨肉腫においてＩＤタンパク質を安定化する
ヒト骨肉腫細胞系におけるおよび原発性骨芽細胞におけるＵＳＰ１存在量およびＩＤ２安定性も評価された（図５Ａ）。Ｕ２−ＯＳ骨肉腫細胞では、ＵＳＰ１は上昇しており、正常に不安定なＩＤ２は安定していた（図５Ａおよび５Ｂ）。２つの異なるＵＳＰ１  ｓｈＲＮＡでのＵＳＰ１ノックダウンにより、ＩＤ１、ＩＤ２、およびＩＤ３は減少したが、ＩＤ４に対しては何の効果もなかった（図４Ａ）。ＩＤ１、ＩＤ２、およびＩＤ３  ｍＲＮＡは減少しておらず、ＩＤタンパク質存在量の低下の理由として転写の減少は除外された（図７Ｉ）。ＵＳＰ１ノックダウン特異性は、ＩＤ１、ＩＤ２、およびＩＤ３を基本レベルにまで回復させるｓｈＲＮＡ抵抗性ＵＳＰ１で確かめられた。ＵＳＰ１触媒活性は、ｓｈＲＮＡ抵抗性ＵＳＰ１  Ｃ９０ＳではＩＤタンパク質レベルを回復しなかったので、ＩＤ安定性には不可欠であった。類似の結果が、骨肉腫細胞系、ＨＯＳ、ＳＡＯＳ、およびＳＪＳＡにおいて観察された（図５Ｃ）。ＵＳＰ１ノックダウンはＭＧ−６３骨肉腫細胞においてＩＤ２存在量に影響を与えなかったが、これはおそらくこれらの細胞がＷＤＲ４８をほとんど発現しないからである（図５Ｃ）。ＭＧ−６３細胞におけるＵＳＰ１活性を制限するＷＤＲ４８欠損と一致して、異所性ＷＤＲ４８はＩＤ２を増加させた（図５Ｄ）。
【０２５２】
ＵＳＰ１ノックダウンがＩＤ１〜３調節ｂＨＬＨ転写活性を減少させたのかどうかを決定するために、Ｕ２−ＯＳ細胞はＥボックス駆動ルシフェラーゼレポーター遺伝子をトランスフェクトされた。ＵＳＰ１  ｓｈＲＮＡは、対照ｓｈＲＮＡよりも７倍〜１０倍このレポーターの発現を増強し、ＩＤタンパク質が減少する場合のｂＨＬＨタンパク質の活性化と一致していた（図４Ｂ）。ｓｈＲＮＡ抵抗性野生型ＵＳＰ１は、ＵＳＰ１ノックダウンにより引き起こされるＥボックス駆動レポーター活性を抑制したが、ＵＳＰ１  Ｃ９０Ｓは抑制せず、ＵＳＰ１触媒活性が、ｂＨＬＨ依存性転写ならびにＩＤタンパク質安定化に必要であることが確かめられた。
【０２５３】
内在性ＵＳＰ１のノックダウンに続くＩＤ１〜３の深刻な消失により、プロテアソーム媒介分解によるＩＤタンパク質の不安定化が示唆された。予想通り、プロテアソーム阻害剤ＭＧ−１３２はそれだけではＵ２−ＯＳ細胞におけるＩＤタンパク質存在量を変えることはなく、ＩＤはＵＳＰ１を高度に発現する細胞では内因的に安定であることが示唆される（図４Ｃ）。しかし、ＭＧ−１３２処理ではＵＳＰ１ノックダウン後のＩＤ発現を回復することはなく、ＩＤタンパク質はＵＳＰ１が枯渇するとプロテアソーム媒介排除を受けることが示される。このシナリオに沿って行くと、ＭＧ−１３２処理ＵＳ−ＯＳ細胞におけるＵＳＰ１ノックダウンはユビキチン化ＩＤ２の量を増加させた（図４Ｄ）。
【０２５４】
次に、内在性ＵＳＰ１は骨肉腫細胞において内在性ＩＤと会合することが確かめられた。ＩＤ２は、Ｕ２−ＯＳ細胞から内在性ＵＳＰ１と共免疫沈降し（図４Ｅ）、１対１の化学量論でではないにしても、一過性の酵素−基質相互作用ではこれが予想されるはずである。類似の結果がＨＯＳ細胞において得られた（図５Ｅ）。ＵＳＰ１もＩＤ２と共免疫沈降した（図４Ｆ）。まとめると、これらの結果により、骨肉腫においてはＵＳＰ１が強力なＤＵＢならびにＩＤ１、ＩＤ２、およびＩＤ３に対する安定化因子であることが示唆される。
【０２５５】
ＵＳＰ１によるＩＤ２安定化は骨肉腫という設定に限られてはいなかった。ＵＳＰ１-/-ＤＴ４０ニワトリＢ細胞は（Ｏｅｓｔｅｒｇａａｒｄら、２００７）、類似のレベルのＩＤ２  ｍＲＮＡを発現しているにもかかわらず（図５Ｇ）、発現しているＩＤ２タンパク質はその野生型細胞よりは少なかった（図５Ｆ）。ＵＳＰ１がＩＤ２を脱ユビキチン化し安定化することと一致して、ＭＧ−１３２でのプロテアソーム阻害はＵＳＰ１-/-ではＩＤ２を増加させたが、野生型ＤＴ４０細胞では増加させなかった（図５Ｈ）。さらに、野生型ＵＳＰ１で再構成されたＵＳＰ１-/-ＤＴ４０細胞は、野生型ＤＴ４０細胞に相当するＩＤ２を含有していたが、ＵＳＰ１  Ｃ９０Ｓはそうではなかった（図５Ｉ）。
【０２５６】
骨肉腫においてＵＳＰ１はｐ２１媒介細胞周期停止を抑制する
骨肉腫細胞におけるＵＳＰ１欠損および増大したｂＨＬＨ転写活性の一つの潜在的結果はｂＨＬＨ調節ＣＤＫＩｐ２１が誘導されることである。実際、ｐ２１は、対照ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされた細胞と比べてＵＳＰ１  ｓｈＲＮＡがトランスフェクトされたＵ２−ＯＳ細胞では増加していた（図６Ａ）。ｓｈＲＮＡ抵抗性野生型ＵＳＰ１はｐ２１を対照細胞において観察されるレベルにまで減少させたが、ＵＳＰ１  Ｃ９０Ｓは減少させることはなく、この設定におけるノックダウン特異性が確認された。ＣＤＫＮ１Ａの周知の誘導因子である腫瘍抑制ｐ５３は、ＵＳＰ１ノックダウンにより増加することはなく、増大したｐ２１はｐ５３非依存性であったことが示唆される。
【０２５７】
ｐ２１は細胞周期進行の強力なインヒビターであり（Ｐｏｌｙａｋら、１９９６）、したがってＵＳＰ１ノックダウンに続くＵ２−ＯＳ細胞の増殖能力が評価された。増大したｐ２１と一致して、ＵＳＰ１ノックダウンはＵＳ−ＯＳ細胞増殖を減少させた（図６Ｂおよび図７Ａ）。ｓｈＲＮＡ抵抗性野生型ＵＳＰ１は細胞増殖を回復させたが、ＵＳＰ１  Ｃ９０ＳもＵＳＰ１Ｄ２６０〜３００も回復させることはなく（図７Ｂおよび７Ｃ）、ＵＳＰ１触媒活性とＩＤ基質認識の両方がＵ２−ＯＳ細胞増殖を維持するには必要であることが示された。ＵＳＰ１ノックダウンは、ＨＯＳ、ＳＡＯＳ、およびＳＪＳＡでは同様に増殖を減少させたが、ＭＧ−６３骨肉腫細胞では減少させなかった（図７Ｄ）。
【０２５８】
ＵＳＰ１ノックダウン後のＵ２−ＯＳ細胞におけるＤＮＡ含有量のフローサイトメトリー解析により、細胞周期のＧ１およびＧ２期の細胞の中程度の増加とＳ期の細胞の明白な減少が明らかになった（図６Ｃおよび図７Ｅ）。ＵＳＰ１ノックダウンに続くアポトーシス誘導は顕著ではなく、サブデプロイドＤＮＡ含有量を有する細胞はほとんど観察されず、アネキシンＶで染色された細胞の増加はなくカスパーゼ３のプロセッシングの増加は検出されなかった（図７Ｅ；データは示されていない）。意義深いことに、ＣＤＫＮ１Ａ  ｓｉＲＮＡは、ＵＳＰ１欠損Ｕ２−ＯＳ細胞においてＳ期進入を回復させており、ｐ２１がＵＳＰ１ノックダウンにより誘導される細胞周期停止に不可欠であることが示される。
【０２５９】
ＵＳＰ１はＩＤタンパク質を介して骨肉腫におけるｐ２１発現および細胞周期停止を調節する
ＵＳＰ１の非存在下におけるＩＤ分解がｐ２１誘導を引き起こすとすれば、ＩＤタンパク質のノックダウンはＵＳＰ１ノックダウンをフェノコピーするはずである。ＩＤ１〜３のｓｈＲＮＡノックダウンは個々にはｐ２１レベルを変えないが、ＩＤ１、ＩＤ２、およびＩＤ３のノックダウンを組み合わせるとＵＳＰ１ノックダウンに類似してｐ２１を増加させた（図７Ｈ）。ＩＤおよびＵＳＰ１欠損細胞も匹敵するレベルのＣＤＫＮ１Ａ  ｍＲＮＡを発現した（図７Ｉ）。これらの所見と一致して、ＩＤ欠損はＵＳＰ１欠損に類似して細胞周期停止を引き起こし（図Ｓ３ＪおよびＳ３Ｋ）、これはｐ２１ノックダウンにより救済された（図６Ｄおよび６Ｅ）。
【０２６０】
ＣＤＫＮ１Ａは、ＤＮＡ損傷に応答して活性化されるｐ５３を含む多くの転写因子により調節されている（Ｋａｓｔａｎら、１９９１）。ｐ５３ノックダウンはＵ２−ＯＳ細胞においてエトポシド誘導ｐ２１を阻害したが、ＵＳＰ１ノックダウン後に見られるｐ２１タンパク質の増加をブロックすることはなく（図７Ｌ）、ｐ２１誘導のｐ５３非依存性機構が支持される。ＵＳＰ１はＤＮＡ修復中ＰＣＮＡおよびＦＡＮＣＤ２を標的にすることが報告されているので（Ｎｉｊｍａｎら、２００５；Ｈｕａｎｇら、２００６）、ＵＳＰ１ノックダウンの結果としてのＤＮＡ損傷発生が決定された。ＤＮＡ損傷に関連するＨ２ＡＸリン酸化（Ｒｏｇａｋｏｕら、１９９９）はエトポシド処理後に増加したが、ＵＳＰ１ノックダウン後には増加しなかった（データは示されていない）。これらの所見は、ｐ５３欠損ＳＡＯＳ細胞を停止させるＵＳＰ１  ｓｈＲＮの能力（図７Ｄ）と併せると、全般的ＤＮＡ損傷、および特にＵＳＰ１ノックダウンに続くｐ２１誘導における媒介物としてのｐ５３は除外される。
【０２６１】
ＵＳＰ１は、ＩＤ１、ＩＤ２、およびＩＤ３の異所性発現を有するＵＳ−ＯＳ細胞においてＵＳＰ１ノックダウンの効果を救済することによりＩＤを介してｐ２１発現および細胞周期を調節することが確かめられた。ＵＳＰ１枯渇細胞におけるＩＤ発現はｐ２１発現を阻害し（図６Ｆ）、細胞周期停止をブロックした（図６Ｇ）。合わせると、前記結果により、ＵＳＰ１が骨肉腫においてＩＤタンパク質安定化およびｂＨＬＨ転写活性の阻害によりｐ２１を抑制することが実証されている。
【０２６２】
ＵＳＰ１およびＩＤタンパク質は骨肉腫において骨原性関与を制限する
骨肉腫は、骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞の無秩序な塊からなる不均一な腫瘍である。これらの腫瘍は、これらの分化系列すべてを生じることができる間葉幹細胞集団から発生すると考えられている（Ｔａｎｇら、２００８）。したがって、骨肉腫細胞系は、ＲＵＮＸ２、ＯＳＴＥＲＩＸ、ＳＰＡＲＣ／ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）などの古典的骨芽細胞マーカーを発現することができない（Ｌｕｏら、２００８）。骨肉腫細胞系は、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１０６を含む、間葉幹細胞に特徴的な表面マーカーも発現する（Ｄｉ  Ｆｉｏｒｅら、２００９）。幹細胞維持および分化の調節においてＩＤが果たしている役割に照らして、骨肉腫におけるＵＳＰ１またはＩＤノックダウンのどちらかによる骨芽細胞分化の始動が調べられた。ＵＳＰ１またはＩＤ  ｓｈＲＮＡをトランスフェクトされたＵ２−ＯＳ細胞は対照細胞と比べて発現するＣＤ１０５、ＣＤ１０６、およびＣＤ９０は少なかったが、すべての細胞が同等量の無関係な表面マーカーＣＤ１４４を発現した（図９Ａ）。類似の結果はＨＯＳ、ＳＪＳＡ、およびＳＡＯＳ細胞系について観察された。ＵＳＰ１またはＩＤノックダウンは骨芽細胞ＲＵＮＸ２、ＯＳＴＥＲＩＸ、およびＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮの発現も増加させ（図９Ｂ）、ＡＬＰ活性を増大させた（図９Ｃ）。Ｕ２−ＯＳ細胞におけるＵＳＰ１ノックダウンに続くＥカドヘリン発現の増加ならびにＮカドヘリンおよびフィブロネクチンの減少により、骨肉腫の悪性状態に伴う間葉移行への上皮の逆戻りが示された（図８Ａおよび８Ｂ）（Ｔｈｉｅｒｙら、２００９）。まとめると、これらのデータにより、骨肉腫におけるＵＳＰ１によるＩＤタンパク質安定化が正常な骨原性分化プログラムをブロックしていることが示唆される。
【０２６３】
腫瘍分化戦略としてのＵＳＰ１阻害の潜在力は１４３Ｂ骨肉種異種移植片モデルにおいて調べられた。ドキシサイクリン誘導ＵＳＰ１  ｓｈＲＮＡは、異種移植片においてＵＳＰ１発現を抑制し、ＩＤ１およびＩＤ２を減少させた（図８Ｃおよび図９Ｄ）。ＩＤ３はこの設定では検出可能ではなかった（データは示されていない）。ＵＳＰ１ノックダウンは、１４３Ｂ腫瘍増殖を減少させ（図８Ｄ）、ＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮ、ＲＵＮＸ２、ＳＰＰ１／ＯＳＴＥＯＰＯＮＴＩＮ、ＯＳＴＥＲＩＸ、およびＢＧＬＡＰ／ＯＳＴＥＯＣＡＬＣＩＮ発現を促進し（図８Ｅおよび図９Ｅ）、ＡＬＰ活性を増強した（図８Ｆ）。注目すべきことには、１０のＵＳＰ１欠損異種移植片腫瘍のうち４つがインサイツでうっ滞および分化に達し、著しく変化した細胞形態および原骨化に一致する無細胞コラーゲン性塊の蓄積を示した（図８Ｇ）。増殖し続けた腫瘍は、おそらくｓｈＲＮＡの消失またはサイレンシングによりノックダウンからの逃避の証拠を示した（図９Ｆ）。これらのデータにより、ＵＳＰ１を減少させるだけで骨肉種において骨原性分化プログラムを開始するのに十分であることが示される。
【０２６４】
調節不全ＵＳＰ１発現はｈＭＳＣ分化を阻害する
次に、ＩＤのＵＳＰ１安定化が正常な間葉幹細胞維持に寄与するかどうかが決定された。ＵＳＰ１は原発性ｈＭＳＣで発現されるが、細胞が骨芽細胞分化に有利な条件下で培養されると着実に低下した（図１０Ａ）。以前の研究（Ｐｅｎｇら、２００３）と一致して、ＩＤ１およびＩＤ２は一過性に誘導されるがその後同様に低下した。ＩＤ３は検出されなかった（データは示されていない）。これらのデータは、誤制御されたＩＤ発現が骨原性分化を阻害することを示す研究（Ｐｅｎｇら、２００４）と合わせて、ＵＳＰ１過剰発現がｈＭＳＣ分化を妨害するのかどうかに関する調査を促した。ＵＳＰ１を過剰発現し骨原性分化培地で培養されたｈＭＳＣは異常に高いレベルのＩＤ１およびＩＤ２を発現し（図１０Ｂ）、低いＡＬＰ活性を示し（図１０Ｃ）、ＲＵＮＸ２、ＯＳＴＥＲＩＸ、およびＯＳＴＥＯＮＥＣＴＩＮの最小の誘導を示し（図１０Ｄ）、骨芽細胞活性の古典的マーカーであるミネラル沈着を明らかにするアリザリンレッドでの染色は不十分であった（図１０Ｅ）。これらのデータにより、ＵＳＰ１を過剰発現しているｈＭＳＣは分化しなかったことが暗示される。類似の分化欠損はＩＤ２を過剰発現しているｈＭＳＣで観察されたが、ＵＳＰ１  Ｃ９０Ｓを過剰発現しているｈＭＳＣは対象細胞と同様に分化した。したがって、ＵＳＰ１の触媒活性は必要であり、ＩＤ安定化だけで骨原性分化を阻害するのに十分であった。
【０２６５】
その一見すると分化できないことと同時に、ＵＳＰ１またはＩＤ２を過剰発現しているｈＭＳＣは過剰な骨原性分化因子の存在下では著しく増殖した（図１０Ｆ）。これとは対照的に、対照ｈＭＳＣまたはＵＳＰ１  Ｃ９０Ｓを発現しているｈＭＳＣの増殖は培養中に分化するにしたがって遅くなった。まとめると、これらの所見によれば、ＵＳＰ１またはＩＤ２の過剰発現は、骨原性分化をブロックし、幹様特長の保持を促進し、細胞を分化の合図に抵抗性にするのに十分である。
【０２６６】
ＵＳＰ１は形質転換および腫瘍形成を促進する
間葉幹細胞分化を阻害し骨肉種細胞系の増殖を持続するＵＳＰ１の能力は、ＵＳＰ１が細胞形質転換を促進する可能性を示唆していた。ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞は、空ベクター、ＩＤ２、ＵＳＰ１、またはＵＳＰ１  Ｃ９０Ｓを安定的に形質導入された。野生型ＵＳＰ１はＩＤ１〜３の発現を増加させ（図１１Ａ）、発癌性形質転換の古典的特徴である（ＨａｎａｈａｎおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、２０００）軟寒天における足場非依存性細胞増殖を引き起こした（図１１Ｂ）。これとは対照的に、空ベクターまたはＵＳＰ１  Ｃ９０Ｓを形質導入された細胞は軟寒天では十分には増殖しなかった（図１１Ｂおよび１１Ｃ）。興味深いことに、ＵＳＰ１はＩＤ２よりも大きく数が多いコロニーを産生し（図１１Ｃ）、複数のＩＤタンパク質の安定化はＩＤ２過剰発現単独よりも形質転換性である場合があることが示唆される。
【０２６７】
ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞がＣ．Ｂ−１７  ＳＣＩＤ．ｂｇマウスに皮下移植されると、インビトロ所見はインビボで繰り返された。対照細胞およびＵＳＰ１  Ｃ９０Ｓを発現している細胞は測定可能な腫瘍を生じることはなかったが、ＵＳＰ１またはＩＤ２を過剰発現している細胞は移植後早くも７日目には測定可能な腫瘍を生じた（図１１Ｄ）。研究終了点での腫瘍の全体的目視検査により、ＵＳＰ１またはＩＤ２を過剰発現している細胞は侵襲性悪性病変を生じたことが確認された（図１１Ｅ）。類似する結果がＮＣｒヌードマウスで観察された。
【０２６８】
ＩＤ１、ＩＤ２、およびＩＤ３  ｓｈＲＮＡを用いたＵＳＰ１によるＮＩＨ  ３Ｔ３細胞形質転換へのＩＤの寄与が評価された。ＩＤ１〜３の抑制（図１１Ｆ）により軟寒天におけるコロニー形成がブロックされ（図１１Ｇ）、ＩＤがＮＩＨ  ３Ｔ３細胞のＵＳＰ１形質転換に不可欠であることが示された。
【０２６９】
ＵＳＰ１は骨発生を調節する
ＵＳＰ１過剰発現は間葉前駆体の骨芽細胞分化を損なうが、ＵＳＰ１消失は骨肉腫細胞の骨芽細胞分化を引き起こしたので、正常な骨発生の調節におけるＵＳＰ１の役割はＵＳＰ１遺伝子標的マウスを用いて評価された。Ｐ１２  ＵＳＰ１-/-マウスは頭蓋および長骨の骨形成に欠損のある骨減少性であった（図１２Ａ）。未発育真性肋骨がおそらくＵＳＰ１-/-子の致死性チアノーゼ呼吸不全の一因である（Ｋｉｍら、２００９）。ＵＳＰ１-/-新生仔およびＥ１８．５胎仔における骨塩量および容積は野生型同腹仔よりもはるかに少なかった（図１２Ｂおよび１２Ｃならびに図１３Ｂおよび１３Ｃ）。ＦＡＮＣＤ２−欠損マウスもＰＣＮＡ−欠損マウスも出生時致死を示さず（Ｐａｒｍａｒら、２０１０；Ｒｏａら、２００８）、ＵＳＰ１欠損に関連する出生時致死の主因としてこれらＵＳＰ１基質の不安定化は排除される。
【０２７０】
ＵＳＰ１-/-およびＵＳＰ１+/+大腿骨は類似する数の静止、移行性、増殖、および肥大性軟骨細胞を含有していたが、飛び出た骨棘上の類骨の沈着は減少しており、類骨沈着骨芽細胞の活性が低下していることが示唆された（図１３Ｄ〜１３Ｆ）。骨芽細胞機能の欠損と一致して、全身的骨芽細胞活性のマーカーである骨アルカリホスファターゼ（ＢＡＬＰ）の血清レベルはＵＳＰ１-/-Ｅ１８．５胎仔では減少していた（図１２Ｅ）。ＵＳＰ１欠損は破骨細胞存在量も活性も変えることはなく（図１３Ｇ〜１３Ｉ）、ＵＳＰ１-/-マウスにおける増大した骨吸収は排除された。意義深いことに、ならびに骨肉腫および間葉幹細胞培養物において見られる所見に沿って、ＵＳＰ１-/-大腿骨幹端が含有するＩＤ１およびＩＤ２はその野生型の相当物よりも少なかった（図１２Ｄおよび図１３Ｊ）。これらのデータにより、骨肉腫において分化を調節しているＵＳＰ１−ＩＤ系は正常な骨格の発達において繰り返されることが示されている。
【０２７１】
考察
これらの実験により、ＵＳＰ１がＩＤ１、ＩＤ２、およびＩＤ３を脱ユビキチン化し安定化する結果、その存在量が増加することが明らかにされている。意義深いことに、原発性骨肉腫腫瘍のサブセットにおける上昇したＵＳＰ１タンパク質およびｍＲＮＡは増加したＩＤタンパク質レベルと相関していた。骨肉腫細胞におけるＵＳＰ１ノックダウンにより、ＩＤタンパク質脱安定化、サイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＤＫＩ）ｐ２１をコードするＣＤＫＮＩＡのｐ５３非依存性誘導、および細胞周期停止が引き起こされた。さらに、間葉幹細胞マーカーの発現が減少し、骨原性分化が再開された。これらのデータは、骨肉腫が、急性前骨髄球性白血病と同様に、分化療法を受け入れられる可能性があることを示唆している（Ｓｏｉｇｎｅｔら、１９９８）。ＵＳＰ１ノックダウンとは対照的に、原発性ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）におけるＵＳＰ１過剰発現はＩＤタンパク質蓄積を引き起こし、正常な分化を妨げた。実際、ＵＳＰ１は間葉細胞系において形質転換を促進した。最後に、遺伝子標的マウスにおけるＵＳＰ１の消失により、重篤な骨減少症が引き起こされ、これは間葉系統におけるＵＳＰ１の役割と一貫している。これらの結果により、ＵＳＰ１は発癌能を有しており、正常な間葉幹細胞関与および分化の破壊を通じて腫瘍形成を促進することが強く示唆される。
【０２７２】
特に、本研究において、ＵＳＰ１によるＩＤ安定化はヒト骨肉腫のかなりの部分を持続していることが明らかにされた。ＵＳＰ１は原発性骨肉腫および骨肉腫細胞系においては頻繁に過剰発現されており（図３）、ＩＤタンパク質を脱ユビキチン化することにより（図１および４）、ＣＤＫＩ  ｐ２１のｂＨＬＨ依存性発現を阻害し（図６）、細胞増殖が抑制されなくなった（図８）。ＵＳＰ１過剰発現はいくつかの骨肉腫細胞系の増殖に必要であるだけでなく、ＵＳＰ１過剰発現だけでも、幹様状態の細胞を捕捉して、正常な間葉細胞分化を妨げるのに十分であった（図１０）。対照的に、骨肉腫細胞系におけるＵＳＰ１ノックダウンは間葉幹細胞マーカーの発現を減少させ、骨原性発生プログラムを開始した（図８）。マウスのけるＵＳＰ１欠損は正常な骨形成を損ない、はっきりとした骨減少症が生じた（図１２）。したがって、過剰発現したＵＳＰ１は間葉幹細胞分化を妨げそれにより悪性間葉細胞集団の発生を助長すると仮定される。
【０２７３】
ＵＳＰ１は骨肉腫において過剰発現されたＩＤ  ＤＵＢである
ＩＤ２を安定化することができるＤＵＢを求めるスクリーニングにより（図２）、ＵＳＰ１とＵＳＰ３３の両方が同定されたが、ＵＳＰ３３はＩＤ２を脱ユビキチン化することはできなかった（データは示されていない）。ＩＤ２に結合するＵＳＰ３３はプロテアソームによるＩＤ２認識を妨げ、その分解を防いだ。スクリーニングにおいてＩＤ２発現を増強した他のＤＵＢはＩＤ２と相互作用するとは思われず、ＩＤ２存在量に間接的に影響を及ぼすにちがいない。これらのＤＵＢはＩＤ遺伝子発現を上方調節し、ユビキチンコンジュゲーション機構を妨げ、または他の方法でプロテアソーム機能を損なっている可能性がある。例えば、ＵＳＰ９Ｘは、転写因子ＳＭＡＤ４を脱ユビキチン化し安定化することによりＩＤ２遺伝子発現を上方調節している可能性がある（Ｄｕｐｏｎｔら、２００９）。
【０２７４】
骨肉腫のサブセットにおけるＵＳＰ１過剰発現（図３）の原因である機構ははっきりしない。ＵＳＰ１  ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルは強く相関しており、転写上方調節が暗示される。とりわけ、最近のＣＧＨ解析により、ＵＳＰ１遺伝子座１ｐ３１．３は骨肉腫腫瘍の２６％〜５７％において増幅されていることが見出された（Ｏｚａｋｉら、２００３；Ｓｔｏｃｋら、２０００）。
【０２７５】
ＵＳＰ１は、ＣＤＫＩｐ２１のＩＤ媒介抑圧により増殖を促進する
ＵＳＰ１によるＩＤタンパク質安定化は、骨肉腫においてｂＨＬＨ依存性ｐ２１発現を妨害することが明らかになった（図４および図Ｓ３）。したがって、ＵＳＰ１過剰発現は、複数のＣＤＫＩのｐ５３非依存性上方調節により特徴付けられる正常な骨芽細胞分化を撹乱する（Ｆｕｎａｔｏら、２００１；Ｋｅｎｎｅｒら、２００４；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、１９９８；Ｙａｎら、１９９７；Ｚｈａｎｇら、１９９７）。骨肉腫においてはＣＤＫＩ機能が損なわれることが多く、プロモーターメチル化に起因する遺伝子不活性化（Ｏｈら、２００６）と同じように、ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびＣＤＫＮ２Ｂ／ｐ１５ＩＮＫ４ｂ遺伝子欠失がよく起こる（Ｍｉｌｌｅｒら、１９９６；Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９８）。これとは対照的に、ＣＤＫＩの標的であるＣＤＫ４は、遺伝子増幅により骨肉腫では過剰発現されることが多い（Ｏｚａｋｉら、２００３）。ｐ２１のＩＤ媒介転写抑圧は、骨肉腫における追加の発癌機構を表している。
【０２７６】
ＩＤタンパク質過剰発現は様々なヒト癌において観察されてきたが、主に増大したＩＤ転写に起因すると考えられてきた（Ｐｅｒｋら、２００５）。例えば、骨肉腫に強く類似している類骨腫瘍であるユーイング肉腫においては、ＩＤ２はＥＷＳ−Ｅｔにより転写的に上方調節されている（Ｎｉｓｈｉｍｏｒｉら、２００２）。ＲＢ１遺伝子の破壊されたコピーを有する患者は骨肉腫の発生に強く感作し（Ｆｒｉｅｎｄら、１９８６）、ＲＢはＩＤ２を隔離し不活性化することができる（Ｉａｖａｒｏｎｅら、１９９４；Ｌａｓｏｒｅｌｌａら、２０００）。本研究により、骨肉腫においてＩＤタンパク質、および順にＣＤＫＩを調節不全にすることができる追加の機構が明らかにされている。
【０２７７】
ＩＤタンパク質は間葉前駆体の骨原性発生を調節する
これらのデータは、正常な骨原性発生におけるＩＤタンパク質も意味づける。間葉幹細胞におけるＩＤ２またはＵＳＰ１過剰発現は骨分化を阻害し、間葉幹細胞特長の保持を促進した（図１０）。これらの発見は、間葉分化におけるＩＤタンパク質の役割を記載している最近の研究を支持している（Ｐｅｎｇら、２００４）。興味深いことに、Ｉｄ１／Ｉｄ３化合物ヘテロ接合変異体マウスは頭蓋骨欠損および減少した骨芽細胞増生を示し（Ｍａｅｄａら、２００４）、間葉増殖欠損を示唆している。追加のＩｄ２欠損が早期致死性によりこの表現型を悪化させるのかどうかは分かっていない。Ｉｄ遺伝子欠失を間葉系統に制限すれば情報価値があることが判明する可能性がある。
【０２７８】
ＵＳＰ１-/-マウスで起きる骨減少症は、骨肉腫におけるＵＳＰ１ノックダウンおよび原発性ｈＭＳＣにおけるＵＳＰ１過剰発現により予測される表現型と一致している（図１２および図１３）。それぞれの設定では、これらのデータにより、ＵＳＰ１−ＩＤ系が分化系列決定を阻害していることが示唆される。非依存性ＵＳＰ１欠損マウス系統は、成長阻害および出生時致死性も示した（Ｋｉｍら、２００９）。複数のＩｄ遺伝子を欠くマウスは胚形成初期に死亡し（Ｌｙｄｅｎら、１９９９）、追加のＤＵＢが初期発生においてＩＤタンパク質安定性を調節しており、他のＤＵＢがＵＳＰ１の非存在を埋め合わせすることができることが示されうる。
【０２７９】
最近の研究によれば、骨形成中ＩＤ１〜３により阻害されるｂＨＬＨタンパク質はＨｅｙ／Ｈｅｓファミリーの属している可能性があることが示唆される。Ｈｅｙ１過剰発現は骨芽細胞分化を促進するが、Ｈｅｙ１ノックダウンはそれを阻害した（Ｓｈａｒｆｆら、２００９）。同様に、Ｈｅｓ１過剰発現は骨関与を促進した（Ｓｕｈら、２００８）。複数のｂＨＬＨ転写因子が並行して作用して、骨芽細胞発生を促進する可能性がある。ＵＳＰ１およびＩＤタンパク質は、間葉幹細胞の分化中に関与するｂＨＬＨ駆動関与シグナルを広く制限するように配置されていると考えられる。これらの研究に基づいて、ＵＳＰ１は、正常幹（ラテン語で「ｃａｕｌｏ」）細胞生物学の破壊を通じて腫瘍形成を促進するカウロ（ｃａｕｌｏ）発癌遺伝子の出現セットに属していることが提唱される。
【０２８０】
重大な治療的派生効果を有する結果であるこれらの発見の結果は、ＵＳＰ１プロテアーゼ活性の阻害により、悪性骨肉腫における分化プログラムが開始されるはずであり、増殖能力の急激な低下および形質転換表現型の潜在的逆転がもたらされることである。ＵＳＰ１をターゲティングすれば、ＦＡＮＣＤ２を含むすべてのＵＳＰ１基質に影響すると考えられるが、正常なｐ５３チェックポイントを欠く腫瘍細胞における不完全なＤＮＡ修復は架橋化学療法剤またはＰＡＲＰ阻害剤に前記細胞を感作すると予測されているので、これは有益でありうる（Ｄ’Ａｎｄｒｅａ、２０１０）。急性前骨髄球性白血病に対する分化療法としてのヒ素の華々しい成功により証明されているように、癌に対する分化治療は、以前は致死性であった癌の効果的治療に胸躍る選択肢を提供する。ＵＳＰ１をターゲティングすれば、骨原性肉腫にそのような機会を提供しうる。
【０２８１】
配列
ＵＳＰ１（配列番号１）
ｍｐｇｖｉｐｓｅｓｎ  ｇｌｓｒｇｓｐｓｋｋ  ｎｒｌｓｌｋｆｆｑｋ  ｋｅｔｋｒａｌｄｆｔ  ｄｓｑｅｎｅｅａｌｋｄｅａｎｑｋ  ｄｋｇｎｃｋｅｄｓｌ  ａｓｙｅｌｉｃｓｌｑ  ｓｌｉｉｓｖｅｑｌｑ  ａｓｆｌｌｎｐｅｋｙ  ｔｄｅｌａｔｑｐｒｒ  ｌｌｎｔｌｒｅｌｎｐ  ｍｙｅｇｙｌｑｈｄａ  ｑｅｖｌｑｃｉｌｇｎ  ｉｑｅｔｃｑｌｌｋｋ  ｅｅｖｋｎｖａｅｌｐ  ｔｋｖｅｅｉｐｈｐｋ  ｅｅｍｎｇｉｎｓｉｅ  ｍｄｓｍｒｈｓｅｄｆ  ｋｅｋｌｐｋｇｎｇｋ  ｒｋｓｄｔｅｆｇｎｍ  ｋｋｋｖｋｌｓｋｅｈ  ｑｓｌｅｅｎｑｒｑｔ  ｒｓｋｒｋａｔｓｄｔ  ｌｅｓｐｐｋｉｉｐｋ  ｙｉｓｅｎｅｓｐｒｐ  ｓｑｋｋｓｒｖｋｉｎ  ｗｌｋｓａｔｋｑｐｓ  ｉｌｓｋｆｃｓｌｇｋ  ｉｔｔｎｑｇｖｋｇｑ  ｓｋｅｎｅｃｄｐｅｅ  ｄｌｇｋｃｅｓｄｎｔ  ｔｎｇｃｇｌｅｓｐｇ  ｎｔｖｔｐｖｎｖｎｅ  ｖｋｐｉｎｋｇｅｅｑ  ｉｇｆｅｌｖｅｋｌｆ  ｑｇｑｌｖｌｒｔｒｃ  ｌｅｃｅｓｌｔｅｒｒ  ｅｄｆｑｄｉｓｖｐｖ  ｑｅｄｅｌｓｋｖｅｅ  ｓｓｅｉｓｐｅｐｋｔ  ｅｍｋｔｌｒｗａｉｓ  ｑｆａｓｖｅｒｉｖｇ  ｅｄｋｙｆｃｅｎｃｈ  ｈｙｔｅａｅｒｓｌｌ  ｆｄｋｍｐｅｖｉｔｉ ｈｌｋｃｆａａｓｇｌ  ｅｆｄｃｙｇｇｇｌｓ  ｋｉｎｔｐｌｌｔｐｌ  ｋｌｓｌｅｅｗｓｔｋ  ｐｔｎｄｓｙｇｌｆａ  ｖｖｍｈｓｇｉｔｉｓ  ｓｇｈｙｔａｓｖｋｖ  ｔｄｌｎｓｌｅｌｄｋ  ｇｎｆｖｖｄｑｍｃｅ  ｉｇｋｐｅｐｌｎｅｅ  ｅａｒｇｖｖｅｎｙｎ  ｄｅｅｖｓｉｒｖｇｇ  ｎｔｑｐｓｋｖｌｎｋ  ｋｎｖｅａｉｇｌｌｇ  ｇｑｋｓｋａｄｙｅｌ  ｙｎｋａｓｎｐｄｋｖ  ａｓｔａｆａｅｎｒｎ  ｓｅｔｓｄｔｔｇｔｈ  ｅｓｄｒｎｋｅｓｓｄ  ｑｔｇｉｎｉｓｇｆｅ  ｎｋｉｓｙｖｖｑｓｌ  ｋｅｙｅｇｋｗｌｌｆ  ｄｄｓｅｖｋｖｔｅｅ  ｋｄｆｌｎｓｌｓｐｓ  ｔｓｐｔｓｔｐｙｌｌ  ｆｙｋｋｌ
ＵＡＦ（配列番号４０）
ｍａａｈｈｒｑｎｔａ  ｇｒｒｋｖｑｖｓｙｖ  ｉｒｄｅｖｅｋｙｎｒ  ｎｇｖｎａｌｑｌｄｐ  ａｌｎｒｌｆｔａｇｒ  ｄｓｉｉｒｉｗｓｖｎ  ｑｈｋｑｄｐｙｉａｓ  ｍｅｈｈｔｄｗｖｎｄ  ｉｖｌｃｃｎｇｋｔｌ  ｉｓａｓｓｄｔｔｖｋ  ｖｗｎａｈｋｇｆｃｍ  ｓｔｌｒｔｈｋｄｙｖ  ｋａｌａｙａｋｄｋｅ  ｌｖａｓａｇｌｄｒｑ  ｉｆｌｗｄｖｎｔｌｔ  ａｌｔａｓｎｎｔｖｔ  ｔｓｓｌｓｇｎｋｄｓ  ｉｙｓｌａｍｎｑｌｇ  ｔｉｉｖｓｇｓｔｅｋ  ｖｌｒｖｗｄｐｒｔｃ  ａｋｌｍｋｌｋｇｈｔ  ｄｎｖｋａｌｌｌｎｒ  ｄｇｔｑｃｌｓｇｓｓ  ｄｇｔｉｒｌｗｓｌｇ  ｑｑｒｃｉａｔｙｒｖ  ｈｄｅｇｖｗａｌｑｖ  ｎｄａｆｔｈｖｙｓｇ  ｇｒｄｒｋｉｙｃｔｄ  ｌｒｎｐｄｉｒｖｌｉ  ｃｅｅｋａｐｖｌｋｍ  ｅｌｄｒｓａｄｐｐｐ  ａｉｗｖａｔｔｋｓｔ  ｖｎｋｗｔｌｋｇｉｈ  ｎｆｒａｓｇｄｙｄｎ  ｄｃｔｎｐｉｔｐｌｃ  ｔｑｐｄｑｖｉｋｇｇ  ａｓｉｉｑｃｈｉｌｎ  ｄｋｒｈｉｌｔｋｄｔ  ｎｎｎｖａｙｗｄｖｌ  ｋａｃｋｖｅｄｌｇｋ  ｖｄｆｅｄｅｉｋｋｒ  ｆｋｍｖｙｖｐｎｗｆ  ｓｖｄｌｋｔｇｍｌｔ  ｉｔｌｄｅｓｄｃｆａ  ａｗｖｓａｋｄａｇｆ  ｓｓｐｄｇｓｄｐｋｌ  ｎｌｇｇｌｌｌｑａｌ  ｌｅｙｗｐｒｔｈｖｎ  ｐｍｄｅｅｅｎｅｖｎ  ｈｖｎｇｅｑｅｎｒｖ  ｑｋｇｎｇｙｆｑｖｐ  ｐｈｔｐｖｉｆｇｅａ  ｇｇｒｔｌｆｒｌｌｃ  ｒｄｓｇｇｅｔｅｓｍ  ｌｌｎｅｔｖｐｑｗｖ  ｉｄｉｔｖｄｋｎｍｐ  ｋｆｎｋｉｐｆｙｌｑ  ｐｈａｓｓｇａｋｔｌ  ｋｋｄｒｌｓａｓｄｍ  ｌｑｖｒｋｖｍｅｈｖ  ｙｅｋｉｉｎｌｄｎｅ  ｓｑｔｔｓｓｓｎｎｅ  ｋｐｇｅｑｅｋｅｅｄ  ｉａｖｌａｅｅｋｉｅ  ｌｌｃｑｄｑｖｌｄｐ  ｎｍｄｌｒｔｖｋｈｆ  ｉｗｋｓｇｇｄｌｔｌ  ｈｙｒｑｋｓｔ
ＩＤ１アイソフォームａ（配列番号２）
ｍｋｖａｓｇｓｔａｔ  ａａａｇｐｓｃａｌｋ  ａｇｋｔａｓｇａｇｅ  ｖｖｒｃｌｓｅｑｓｖ  ａｉｓｒｃａｇｇａｇ  ａｒｌｐａｌｌｄｅｑ  ｑｖｎｖｌｌｙｄｍｎ  ｇｃｙｓｒｌｋｅｌｖ  ｐｔｌｐｑｎｒｋｖｓ  ｋｖｅｉｌｑｈｖｉｄ  ｙｉｒｄｌｑｌｅｌｎ  ｓｅｓｅｖｇｔｐｇｇ  ｒｇｌｐｖｒａｐｌｓ  ｔｌｎｇｅｉｓａｌｔ  ａｅａａｃｖｐａｄｄ  ｒｉｌｃｒ
ＩＤ１アイソフォームｂ（配列番号３）
ｍｋｖａｓｇｓｔａｔ  ａａａｇｐｓｃａｌｋ  ａｇｋｔａｓｇａｇｅ  ｖｖｒｃｌｓｅｑｓｖ  ａｉｓｒｃａｇｇａｇ  ａｒｌｐａｌｌｄｅｑ  ｑｖｎｖｌｌｙｄｍｎ  ｇｃｙｓｒｌｋｅｌｖ  ｐｔｌｐｑｎｒｋｖｓ  ｋｖｅｉｌｑｈｖｉｄ  ｙｉｒｄｌｑｌｅｌｎ  ｓｅｓｅｖｇｔｐｇｇ  ｒｇｌｐｖｒａｐｌｓ  ｔｌｎｇｅｉｓａｌｔ  ａｅｖｒｓｒｓｄｈ
ＩＤ２（配列番号４）
ｍｋａｆｓｐｖｒｓｖ  ｒｋｎｓｌｓｄｈｓｌ  ｇｉｓｒｓｋｔｐｖｄ  ｄｐｍｓｌｌｙｎｍｎ  ｄｃｙｓｋｌｋｅｌｖ  ｐｓｉｐｑｎｋｋｖｓ  ｋｍｅｉｌｑｈｖｉｄ  ｙｉｌｄｌｑｉａｌｄ  ｓｈｐｔｉｖｓｌｈｈ  ｑｒｐｇｑｎｑａｓｒ  ｔｐｌｔｔｌｎｔｄｉ  ｓｉｌｓｌｑａｓｅｆ  ｐｓｅｌｍｓｎｄｓｋ  ａｌｃｇ
ＩＤ３（配列番号５）
ｍｋａｌｓｐｖｒｇｃ  ｙｅａｖｃｃｌｓｅｒ  ｓｌａｉａｒｇｒｇｋ  ｇｐａａｅｅｐｌｓｌ  ｌｄｄｍｎｈｃｙｓｒ  ｌｒｅｌｖｐｇｖｐｒ  ｇｔｑｌｓｑｖｅｉｌ  ｑｒｖｉｄｙｉｌｄｌ  ｑｖｖｌａｅｐａｐｇ  ｐｐｄｇｐｈｌｐｉｑ  ｔａｅｌｔｐｅｌｖｉ  ｓｎｄｋｒｓｆｃｈ
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【０２８２】
上述の発明は、理解の明確さを目的に図解と実施例によりある程度詳細に説明されてきたが、説明と実施例を発明の範囲を限定するものと解釈するべきではない。本明細書に引用されるすべての特許および科学文献は参照によりその全体を明確に組み込まれている。
【図１Ａ】
2014533927.tif 000008
【図１Ｂ】
2014533927.tif 000009
【図１Ｃ】
2014533927.tif 000010
【図１Ｄ】
2014533927.tif 000011
【図２Ａ】
2014533927.tif 000012
【図２Ｂ】
2014533927.tif 000013
【図２Ｃ】
2014533927.tif 000014
【図２Ｄ】
2014533927.tif 000015
【図３Ａ】
2014533927.tif 000016
【図３Ｂ】
2014533927.tif 000017
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2014533927.tif 000019
【図３Ｅ】
2014533927.tif 000020
【図３Ｆ】
2014533927.tif 000021
【図３Ｇ】
2014533927.tif 000022
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図７Ｋ】
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【図７Ｌ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１３Ｉ】
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【図１３Ｊ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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