(57)【要約】  本開示は、耐熱性ワクチンに関する組成物及びそれを調製する方法を提供する。具体的には、本開示は、組換えリシン神経毒タンパク質に基づく耐熱性ワクチンを調製する方法及び対象において免疫応答を誘発することが可能である組成物を開発するための共アジュバントの使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫学的に活性なアジュバントに結合している乾燥ワクチン組成物を調製する方法であって、
（ａ）少なくとも１種のアルミニウム塩アジュバント、少なくとも１つの揮発性塩を含有する少なくとも１種の緩衝液系、少なくとも１種のガラス形成剤及び少なくとも１個の抗原を用意するステップと、
（ｂ）（ａ）を一緒に混合して、液体ワクチン処方を作製するステップと、
（ｃ）（ｂ）の前記液体ワクチン処方を凍結して、凍結ワクチン処方を作製するステップと、
（ｄ）（ｃ）の前記凍結ワクチン処方を凍結乾燥して、乾燥ワクチン組成物を作製するステップと
を含み、更に前記乾燥ワクチン組成物が対象において免疫応答を誘発することが可能である上記方法。
【請求項２】
前記対象によって発現される前記免疫応答が、抗原特異的な液性免疫及び／又は細胞媒介性免疫であることができる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１種のアルミニウム塩アジュバントが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及び硫酸アルミニウムから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１種の緩衝液系が、アセタート、スクシナート、シトラート、プロラミン、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、ボラート、カルボナート及びホスファートから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１種の緩衝液系が、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、トリエチルアンモニウムアセタート、トリエチルアンモニウムホルマート、トリエチルアンモニウムカルボナート、トリメチルアミンアセタート、トリメチルアミンホルマート、トリメチルアミンカルボナート、ピリジナルアセタート及びピリジナルホルマートから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１種のガラス形成剤が、トレハロース、スクロース、フィコール、デキストラン、スクロース、マルトトリオース、ラクトース、マンニトール、ヒドロキシエチルスターチ、グリシン、シクロデキストリン及びポビドンから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１種のガラス形成剤が、トレハロースであり、トレハロースが、フリーズドライ前の液体ワクチン処方中に約５％〜約１５％重量対容積濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１種のガラス形成剤が、トレハロースであり、トレハロースが、液体ワクチン処方中に約８％〜約２０％重量対容積濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１種の免疫学的に活性な共アジュバントが、ステップ（ａ）に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの免疫学的に活性な共アジュバントが、リピドＡ、リピドＡ誘導体、モノホスホリルリピドＡ、モノホスホリルリピドＡの化学的類似体、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、ＴＬＲ−４アゴニスト、フラジェリン、グラム陰性細菌由来フラジェリン、ＴＬＲ−５アゴニスト、ＴＬＲ−５受容体に結合可能なフラジェリン断片、サポニン、サポニン類似体、ＱＳ−２１、精製サポニン画分、ＩＳＣＯＭＳ並びにステロール及び脂質とサポニンとの混合物、から成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記凍結ステップが、トレイ凍結、棚凍結、噴霧凍結及びシェル凍結のうち１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記凍結ステップが、凍結ステップを始めるために予冷されたトレイの使用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗原が、ロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、口蹄疫ウイルス（ｆｏｏｔ  ａｎｄ  ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、Ａ型インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ  Ａ）、Ｂ型インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ  Ｂ）、Ｃ型インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ  Ｃ）、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７、ヒトパラインフルエンザ２型（ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｔｙｐｅ  ２）、単純疱疹ウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）、エプスタイン−バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、水痘ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ  ｖｉｒｕｓ）、豚ヘルペスウイルス１（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １）、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、リッサウイルス（ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）、炭疽菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、炭疽菌ＰＡ及び誘導体、ポリオウイルス（ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）、Ａ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）、Ｂ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ）、Ｅ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｅ  ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウイルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ベネズエラ馬脳脊髄炎（ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、ネコ白血病ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）、レオウイルス（ｒｅｏｖｉｒｕｓ）、ＲＳウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、ラッサ熱ウイルス（ｌａｓｓａ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ポリオーマ腫瘍ウイルス（ｐｏｌｙｏｍａ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓ）、イヌパーボウイルス（ｃａｎｉｎｅ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ｔｉｃｋ  ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウイルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、ヒトライノウイルス種（ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、エンテロウイルス種（ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、メンゴウイルス（ｍｅｎｇｏｖｉｒｕｓ）、パラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、トリ伝染性気管支炎ウイルス（ａｖｉａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ヒトＴ細胞白血病リンパ腫ウイルス１（ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ−ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｖｉｒｕｓ  １）、ヒト免疫不全ウイルス１（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  １）、ヒト免疫不全ウイルス２（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ２）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、パルボウイルスＢ１９（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｂ１９）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、風疹ウイルス（ｒｕｂｅｌｌａ  ｖｉｒｕｓ）、黄熱ウイルス（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、デング熱ウイルス（ｄｅ���ｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ）、ウシＲＳウイルス（ｂｏｖｉｎｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｉｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａ  ｖｉｒｕｓ）、百日咳菌（ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、気管支敗血症菌（ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、パラ百日咳菌（ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ウシ流産菌（ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｉｓ）、マルタ熱菌（ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブタ流産菌（ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ）、羊流産菌（ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｏｖｉｓ）、ブルセラ種（ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、大腸菌（ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ種（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、チフス菌（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、コレラ菌（ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、腸炎ビブリオ（ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、赤痢菌属（ｓｈｉｇｅｌｌａ）、シュードモナス属（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、結核菌（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、トリ結核菌（ａｖｉｕｍ）、カルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）、らい菌（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌属（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、エンテロバクター種（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、ロシャリメア・ヘンセラ（ｒｏｃｈａｌｉｍａｉａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）、ヘモリチカ菌（ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、出血性敗血症菌（ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、トラコーマ病原体（ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、オウム病クラミジア（ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、鼠径リンパ肉芽腫（ｌｙｍｐｈｏｇｒａｎｕｌｏｍａ  ｖｅｎｅｒｅｕｍ）、梅毒トレポネーマ（ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ヘモフィルス種（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、マイコプラズマ・ボヴィゲニタリウム（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、肺マイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｕｌｍｏｎｉｓ）、マイコプラズマ種（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、ライム病菌（ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、在郷軍人病菌（ｌｅｇｉｏｎａｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、ボツリヌス菌（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、ジフテリア菌（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、腸炎エルシニア（ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｃｏｌｉｔｉｃａ）、ロッキー山紅斑熱リケッチア（ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、発疹熱リケッチア（ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｙｐｈｉ）、発疹チフスリケッチア（ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗｓａｅｋｉｉ）、エーリキア・シャフェンシス（ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、熱帯熱マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）、住血吸虫属（ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｅｓ）、トリパノソーマ属（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅｓ）、リーシュマニア種（ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、フィラリア・ネマトデス（ｆｉｌａｒｉａｌ  ｎｅｍａｔｏｄｅｓ）、トリコモナス症（ｔｒｉｃｈｏｍｏｎｉａｓｉｓ）、肉胞子虫症（ｓａｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａｓｉｓ）、無鉤条虫（ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ）、有鉤条虫（ｔａｅｎｉａ  ｓｏｌｉｕｍ）、リーシュマニア属（ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、トキソプラズマ原虫（ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、旋毛虫（ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）、コクシジウム症（ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ）、鶏球虫（ｅｉｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、カンジダ・アルビカンス（ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎ）、アスペルギルス・フミガーツス（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、コクシジオイデス症（ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ）、淋菌（ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、マラリア原虫スポロゾイト表面タンパク質（ｍａｌａｒｉａ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、マラリアメロゾイトタンパク質（ｍａｌａｒｉａ  ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、トリパノソーマ表面抗原タンパク質（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、アルファウイルス属（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ジフテリアトキソイド（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｏｉｄ）、破傷風トキソイド（ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｏｉｄ）、髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）外膜タンパク質、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）Ｍタンパク質、インフルエンザ赤血球凝集素（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、癌抗原、腫瘍抗原、毒素、ウェルシュ菌（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）ε毒素、リシン毒素、シュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、外毒素、神経毒、サイトカイン、サイトカイン受容体、モノカイン、モノカイン受容体、植物花粉、動物の鱗屑及びほこりダニ、から成る群から選択される又はそれから得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
乾燥ワクチン組成物を水性希釈剤で再構成して、再構成されたワクチン組成物を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記再構成されたワクチン組成物が、１００マイクロメートル未満の平均粒子直径を含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記液体ワクチン処方が、最初に高張混合物として調製され、その後凍結され、次いで前記乾燥ワクチン組成物を水性希釈剤で希釈する際に等張レベルに調整される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ワクチン組成物であって
（ａ）少なくとも１種のアルミニウム塩アジュバントと、
（ｂ）少なくとも１種の緩衝剤が揮発性塩を含む、前記少なくとも１種の緩衝剤と、
（ｃ）少なくとも１種のガラス形成剤と、
（ｄ）少なくとも１個の抗原と
を含み、前記組成物を凍結乾燥して、乾燥ワクチン組成物を作製し、更に前記乾燥ワクチン組成物が、対象において免疫応答を誘発することが可能である上記ワクチン組成物。
【請求項１８】
前記少なくとも１種のアルミニウム塩アジュバントが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及び硫酸アルミニウムから成る群から選択される、請求項１７に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
前記少なくとも１種の緩衝剤が、アセタート、スクシナート、シトラート、プロラミン、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、ボラート、カルボナート及びホスファートから成る群から選択される、請求項１７に記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
前記少なくとも１種の緩衝剤が、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、トリエチルアンモニウムアセタート、トリエチルアンモニウムホルマート、トリエチルアンモニウムカルボナート、トリメチルアミンアセタート、トリメチルアミンホルマート、トリメチルアミンカルボナート、ピリジナルアセタート及びピリジナルホルマートから成る群から選択される、請求項１７に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
前記少なくとも１種のガラス形成剤が、トレハロース、スクロース、フィコール、デキストラン、スクロース、マルトトリオース、ラクトース、マンニトール、ヒドロキシエチルスターチ、グリシン、シクロデキストリン及びポビドンから成る群から選択される、請求項１７に記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
前記組成物が、少なくとも１種の免疫学的に活性な共アジュバントを含む、請求項１７に記載のワクチン組成物。
【請求項２３】
前記少なくとも１種の免疫学的に活性な共アジュバントが、リピドＡ、リピドＡ誘導体、モノホスホリルリピドＡ、モノホスホリルリピドＡの化学的類似体、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、ＴＬＲ−４アゴニスト、フラジェリン、グラム陰性細菌由来フラジェリン、ＴＬＲ−５アゴニスト、ＴＬＲ−５受容体に結合可能なフラジェリン断片、サポニン、サポニン類似体、ＱＳ−２１、精製サポニン画分、ＩＳＣＯＭＳ並びにステロール及び脂質とサポニンとの混合物、から成る群から選択される、請求項２２に記載のワクチン組成物。
【請求項２４】
前記抗原が、ロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、口蹄疫ウイルス（ｆｏｏｔ  ａｎｄ  ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、Ａ型インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ  Ａ）、Ｂ型インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ  Ｂ）、Ｃ型インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ  Ｃ）、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７、ヒトパラインフルエンザ２型（ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｔｙｐｅ  ２）、単純疱疹ウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）、エプスタイン−バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、水痘ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ  ｖｉｒｕｓ）、豚ヘルペスウイルス１（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １）、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、リッサウイルス（ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）、炭疽菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、炭疽菌ＰＡ及び誘導体、ポリオウイルス（ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）、Ａ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）、Ｂ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ）、Ｅ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｅ  ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウイルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ベネズエラ馬脳脊髄炎（ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、ネコ白血病ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）、レオウイルス（ｒｅｏｖｉｒｕｓ）、ＲＳウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、ラッサ熱ウイルス（ｌａｓｓａ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ポリオーマ腫瘍ウイルス（ｐｏｌｙｏｍａ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓ）、イヌパーボウイルス（ｃａｎｉｎｅ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ｔｉｃｋ  ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウイルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、ヒトライノウイルス種（ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、エンテロウイルス種（ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、メンゴウイルス（ｍｅｎｇｏｖｉｒｕｓ）、パラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、トリ伝染性気管支炎ウイルス（ａｖｉａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ヒトＴ細胞白血病リンパ腫ウイルス１（ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ−ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｖｉｒｕｓ  １）、ヒト免疫不全ウイルス１（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  １）、ヒト免疫不全ウイルス２（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ２）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、パルボウイルスＢ１９（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｂ１９）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、風疹ウイルス（ｒｕｂｅｌｌａ  ｖｉｒｕｓ）、黄熱ウイルス（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、デング熱ウイルス（ｄｅ���ｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ）、ウシＲＳウイルス（ｂｏｖｉｎｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｉｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａ  ｖｉｒｕｓ）、百日咳菌（ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、気管支敗血症菌（ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、パラ百日咳菌（ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ウシ流産菌（ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｉｓ）、マルタ熱菌（ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブタ流産菌（ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ）、羊流産菌（ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｏｖｉｓ）、ブルセラ種（ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、大腸菌（ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ種（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、チフス菌（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、コレラ菌（ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、腸炎ビブリオ（ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、赤痢菌属（ｓｈｉｇｅｌｌａ）、シュードモナス属（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、結核菌（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、トリ結核菌（ａｖｉｕｍ）、カルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）、らい菌（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌属（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、エンテロバクター種（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、ロシャリメア・ヘンセラ（ｒｏｃｈａｌｉｍａｉａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）、ヘモリチカ菌（ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、出血性敗血症菌（ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、トラコーマ病原体（ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、オウム病クラミジア（ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、鼠径リンパ肉芽腫（ｌｙｍｐｈｏｇｒａｎｕｌｏｍａ  ｖｅｎｅｒｅｕｍ）、梅毒トレポネーマ（ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ヘモフィルス種（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、マイコプラズマ・ボヴィゲニタリウム（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、肺マイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｕｌｍｏｎｉｓ）、マイコプラズマ種（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、ライム病菌（ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、在郷軍人病菌（ｌｅｇｉｏｎａｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、ボツリヌス菌（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、ジフテリア菌（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、腸炎エルシニア（ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｃｏｌｉｔｉｃａ）、ロッキー山紅斑熱リケッチア（ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、発疹熱リケッチア（ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｙｐｈｉ）、発疹チフスリケッチア（ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗｓａｅｋｉｉ）、エーリキア・シャフェンシス（ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、熱帯熱マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）、住血吸虫属（ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｅｓ）、トリパノソーマ属（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅｓ）、リーシュマニア種（ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、フィラリア・ネマトデス（ｆｉｌａｒｉａｌ  ｎｅｍａｔｏｄｅｓ）、トリコモナス症（ｔｒｉｃｈｏｍｏｎｉａｓｉｓ）、肉胞子虫症（ｓａｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａｓｉｓ）、無鉤条虫（ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ）、有鉤条虫（ｔａｅｎｉａ  ｓｏｌｉｕｍ）、リーシュマニア属（ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、トキソプラズマ原虫（ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、旋毛虫（ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）、コクシジウム症（ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ）、鶏球虫（ｅｉｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、カンジダ・アルビカンス（ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎ）、アスペルギルス・フミガーツス（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、コクシジオイデス症（ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ）、淋菌（ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、マラリア原虫スポロゾイト表面タンパク質（ｍａｌａｒｉａ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、マラリアメロゾイトタンパク質（ｍａｌａｒｉａ  ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、トリパノソーマ表面抗原タンパク質（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、アルファウイルス属（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ジフテリアトキソイド（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｏｉｄ）、破傷風トキソイド（ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｏｉｄ）、髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）外膜タンパク質、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）Ｍタンパク質、インフルエンザ赤血球凝集素（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、癌抗原、腫瘍抗原、毒素、ウェルシュ菌（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）ε毒素、リシン毒素、シュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、外毒素、神経毒、サイトカイン、サイトカイン受容体、モノカイン、モノカイン受容体、植物花粉、動物の鱗屑及びほこりダニ、から成る群から選択される又はそれから得られる、請求項１７に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援に関する記載
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈからの補助金ＵＯ１−Ａ１−０８−２２１０に基づく政府支援で行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は一般に、乾燥ワクチン組成物の分野に関する。より具体的には、アジュバントに結合し、免疫賦活性分子を含有する乾燥ワクチン組成物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
組換えタンパク質を含有するワクチンは、免疫応答を誘発するのにアジュバントの恩恵を受けるか又はそれを無条件に必要とする。（Ｃａｌｌａｈａｎら、１９９１、抗原−アジュバント相互作用の最適化における表面電荷の重要性（Ｔｈｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｈａｒｇｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ａｄｊｕｖａｎｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．８（７）：８５１〜８５８頁；Ｓｉｎｇｈ及びＯ’Ｈａｇａｎ  １９９９、ワクチンアジュバントにおける進歩（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ）、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７（１１）：１０７５〜８１頁；及びＯ’Ｈａｇａｎら、２００１、感染症ワクチン用アジュバントにおける最近の動向（Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ  １８（３）：６９〜８５頁）。アルミニウム塩アジュバントは、小児及び成人に投与されるワクチンにおける安全使用の歴史が豊富なため、ヒトでの一般的な使用に現在最も広く使用されているアジュバントである。現在ＦＤＡに認可されているワクチンに記載されているアジュバントは、アルミニウム塩アジュバントである水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムだけである。アルミニウム塩アジュバントは、ワクチンの免疫原性を強化し、並びにワクチン中のタンパク質の用量レベルを減少させ、防御抗体の力価を上昇させ、最初の一連のワクチン接種が終了した後の年次ワクチン接種の必要性を減少させることによってワクチン接種の予後を著しく好転させる。それにもかかわらず、組換えタンパク質、ペプチド及び化学合成ワクチンに基づく多くのサブユニットワクチンにおけるアルミニウム塩アジュバントの使用は著しく制限される。アルミニウムアジュバントを含有するワクチンは狭い温度範囲内でしか貯蔵できず、冷凍できないので、これらの制限には、ワクチンの貯蔵及び安定性の一般的側面が有る。更なる制限には、アルミニウムアジュバントが比較的弱く、細胞性免疫の発現を促進せず、及びウイルス感染を阻止する又は生体毒素の活性を阻害するために中和抗体が必要である場合に非中和性である抗体の発現に有利に働き得るという一般に認められた見識がある。
【０００４】
アルミニウムアジュバントの場合、適切な免疫原性を得るためには、抗原は、アジュバントの表面に吸着されなければならないことが示唆された（Ｇｕｐｔａら、１９９５、アルミニウム及びカルシウム化合物のアジュバント特性（Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ａｌｕｍｉｎｕｍ  ａｎｄ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．６：２２９〜２４８頁；並びにＷｈｉｔｅ及びＨｅｍ、２０００、アルミニウム含有アジュバントの特性評価（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｕｍｉｎｉｕｍ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ）、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ（Ｂａｓｅｌ）１０３：２１７〜２８頁）。この吸着は通常、抗原とアジュバントとの静電的相互作用よって促進され、処方ｐＨは通常、抗原とアジュバントが逆帯電するように選択される（Ｃａｌｌａｈａｎら、１９９１）。アジュバント上の表面電荷は、ホスファート、スクシナート及びシトラートなどの緩衝塩との表面交換反応によって改変することもできる（Ｈｅｍ及びＷｈｉｔｅ、１９８４、非経口ワクチンにおけるアジュバント用水酸化アルミニウムの特性評価（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ａｓ  ａｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｉｎ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）、Ｊ  Ｐａｒｅｎｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ、３８（１）：２〜１０頁；Ｃｈａｎｇら、１９９７、水酸化アルミニウムアジュバントによるタンパク質の吸着における静電引力の役割（Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ  ｆｏｒｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ）、ＰＤＡ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ、５１（１）：２５〜９頁；及びＲｉｎｅｌｌａら、１９９６、塩基性タンパク質の吸着を最適化するための水酸化アルミニウムアジュバントの処理（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｏ  ｏｐｔｉｍｉｚｅ  ｔｈｅ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ｖａｃｃｉｎｅ、１４（４）：２９８〜３００頁）。アルミニウム塩アジュバントの作用機序は、十分に理解されていないが、いくつかの異なる機序に起因する可能性がある（Ｌｉｎｄｂｌａｄ、２００４、「ワクチン用アルミニウム化合物（Ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８２（５）：４９７〜５０５頁；Ｇｕｐｔａ及びＳｉｂｅｒ、１９９５、ヒトワクチン用アジュバント−現状、問題点及び将来展望（Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ−−Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔａｔｕｓ，Ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ−Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ）、Ｖａｃｃｉｎｅ  １３（１４）：１２６３〜１２７６頁；Ｏ’Ｈａｇａｎ  Ｄ編、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．６５〜８９頁中の；Ｇｕｐｔａ及びＲｏｓｔ、２０００、ワクチンアジュバントとしてのアルミニウム化合物（Ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｓ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ）；Ｃｏｘ及びＣｏｕｌｔｅｒ、１９９７、アジュバント−−その作用機序の分類及び概説（Ａｄｊｕｖａｎｔｓ−−ａ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｍｏｄｅｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ）、Ｖａｃｃｉｎｅ  １５（３）：２４８〜２５６頁）。一般に提唱されている機序では、アジュバントは注入部位でデポとして作用し、投与後に抗原がゆっくりと放出される（Ｃｏｘ及びＣｏｕｌｔｅｒ、１９９７）。提唱されている別の機序では、アジュバントが抗原提示細胞への抗原の運搬を助ける（Ｌｉｎｄｂｌａｄ、２００４）。提唱されている更なる機序では、アジュバントは免疫賦活剤として機能し、Ｔｈ２サイトカインを誘発する（Ｇｒｕｎ及びＭａｕｒｅｒ、１９８９、マウスにおいて２つの異なるアジュバント媒体を利用して誘発される異なるヘルパーＴ細胞サブセット：増殖応答における内在性インターロイキン１の役割（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ：ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １  ｉｎ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２１（１）：１３４〜１４５頁）。提唱された更に別の機序では、アジュバントは、アジュバント表面上でタンパク質抗原を不安定化させ、タンパク質分解に対してより感受性にする（Ｊｏｎｅｓら、２００５、モデルタンパク質抗原の構造及び安定性に対するアルミニウム塩アジュバントへの吸着の効果（Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｓａｌｔ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍｏｄｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎｓ）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０（１４）：１３４０６〜１３４１４頁；及びＴｈａｔら、２００４、「抗原安定性は、抗原提示を制御する（Ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（４８）：５０２５７〜５０２６６頁）。
【０００５】
作用機序は十分に理解されていないが、表面領域、表面電荷及びアジュバントの形態が、これらアジュバント上に吸着した抗原に対する免疫応答を決定づける重要な要素である可能性がある（Ｈｅｍ及びＷｈｉｔｅ、１９８４）。ワクチンアジュバントの粒度が小さいほど、ワクチン製剤がより免疫原性になると一般に理論付けられており、特に粒度がおよそ１ミクロンであるとき、サイズは、プロフェッショナル抗原提示細胞への取り込みに最も適している（Ｍａａら、２００３、ミョウバン−アジュバント化乾燥粉末ワクチン処方の安定化：機序と適用（Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｕｍ−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｒｙ  ｐｏｗｄｅｒ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９２（２）：３１９〜３３２頁、Ｄｉｍｉｎｓｋｙら、１９９９、ＣＨＯ由来Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）粒子の物理的、化学的及び免疫学的安定性（Ｐｈｙｓｉｃａｌ，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ＣＨＯ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＢｓＡｇ）ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、Ｖａｃｃｉｎｅ  １８（１〜２）：３〜１７頁）。
【０００６】
凍結乾燥（フリーズドライ）は、様々なタンパク質製剤の長期安定性を改善するためにしばしば利用される工程である。しかし、安定性を改善しようとしてアルミニウム塩アジュバントと一緒に処方されたワクチンを、凍結及び凍結乾燥によって処理すると、効力の消失が起こる。ここで効力とは、動物における免疫原性、タンパク質抗原の化学分解、タンパク質抗原の変性、又は置換免疫原性エピトープの消失を含めることができる一連の試験によって測定可能なワクチンの質の総和である。ヒトにおいて、効力の消失は効能の消失を伴う。これまでの研究により、アジュバントを含有するフリーズドライワクチン生成物は、アジュバント粒子の凝集が原因で製造できないことが示唆されてきた（Ｄｉｍｉｎｓｋｙら、１９９９；Ｍａａら、２００３）。アルミニウム塩アジュバントを加えて処方したワクチンの凍結乾燥後の効力の消失に関与する可能性がある機序を説明するために、いくつかの原理が記載されてきた。粒子の凝集は、著しい消失の原因になり得る。例えば、凍結及び融解後のアルミニウムヒドロキシカーボネート及び水酸化マグネシウムゲルの凝集は、粒子を結合させる氷晶形成に起因しており、不可逆的凝集をもたらした。（Ｚａｐａｔａら、１９８４、アルミニウムヒドロキシカーボネート及び水酸化マグネシウムゲルの凍結融解不安定性の機序（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｆｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｙｃａｒｂｏｎａｔｅ  ａｎｄ  ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  ｇｅｌｓ）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ７３（１）：３〜８頁）。この説明は、Ｍａａら、２００３によって提唱され、冷却速度が速ければ速いほど氷核形成の速度は高まり、より小さい氷晶が形成され、それによりアルミニウム粒子を凝集させないことが更に示唆された。したがって、粒子の凝集によって、効力の消失を説明することはできるが、タンパク質立体構造（三次構造）の消失、タンパク質二次構造の消失、及びアミノ酸側鎖の脱アミド又は酸化による一次構造の修正など他の要素を説明することはできない。
【０００７】
アレルギー感作を増加させる粒子の能力は、粒子の質量ではなく、粒子数及び表面領域によって予測される。アジュバント粒子の抗原内部移行の程度は、逆に、アジュバント凝集体の粒度に関係することを、Ｍｏｏｒｅｆｉｅｌｄらは明らかにした（Ｍｏｏｒｅｆｉｅｌｄら、２００５、「樹状細胞によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗原内部移行における、アルミニウム含有アジュバントの役割（Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｌｕｍｉｎｕｍ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）」、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３（１３）：１５８８〜１５９５頁）。マウスにおいて、質量又は容積ではなく、粒子直径、従って表面領域及び粒子数が、ポリスチレン粒子の免疫学的応答における支配的な特性であることを、Ｎｙｇａａｒｄらは明らかにした（Ｎｙｇａａｒｄら、２００４）。粒度は免疫原性にとって重要な特性パラメータである可能性が高いが、処方に応じた粒度分布（ＰＳＤ）と冷却速度とを、製造された生成物の他の物性と一緒に検討する総合的な研究が更になされなければならない。
【０００８】
アルミニウムアジュバントを含む更に有効なワクチンは、抗原が溶液中で遊離しているのではなくアルミニウム表面に結合しているものであるという、いくつかの共通見解がある（Ｌｉｎｄｂｌａｄ、２００４、アルミニウムアジュバント−−回顧及び展望（Ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ−−ｉｎ  ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｐｅｃｔ）、Ｖａｃｃｉｎｅ（２２）：３６５８〜６８頁）。処方の再現性及び安定性については、抗原が結晶表面に最適に結合する条件、及び抗原が経時的に又は高いストレス条件下で脱着しない条件を定義することが望ましい。アルミニウムワクチンを構築するために、結合及び脱着を最適化するための研究を実施する必要がある。アルミニウムアジュバントは、特定の溶液ｐＨで電荷０の点（ＰＺＣ）を有するが、この値の上下のｐＨでは電荷がある。（Ｗｈｉｔｅ及びＨｅｍ、２０００、アルミニウム含有アジュバントの特性評価（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｕｍｉｎｉｕｍ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ）、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ（Ｂａｓｅｌ）、１０３：２１７〜２８頁）。組換えタンパク質ワクチンの場合、最適な処方ｐＨを選択することは更に複雑になり、一般に、望ましい免疫応答を得るにはアルミニウム塩アジュバントとの結合が必要とされる（ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ、Ｂｒｅｎｎａｎら、１９９９、ＨＩＶ−１ペプチドを提示しているキメラ植物ウイルスに対する免疫応答を強化する５つのアジュバントの能力の分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｆｉｖｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｌａｎｔ  ｖｉｒｕｓ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ａｎ  ＨＩＶ−１  ｐｅｐｔｉｄｅ）、Ｖａｃｃｉｎｅ、１７：１３５９〜６８頁）。アジュバントへのタンパク質結合を促進するために、タンパク質とアジュバントが反対の電荷を有する溶液ｐＨが選択される。しかし、最適なタンパク質安定性をもたらす溶液ｐＨは、ワクチンをアジュバントに適切に結合させない可能性が有る。そのような筋書では、ワクチンタンパク質を、安定性には次善のｐＨで調製し、長期貯蔵の間の分解を最小限に抑えるために適切な安定化賦形剤と共に凍結乾燥しなければならない可能性が有る。
【０００９】
貯蔵及び再構成する際に構造及び活性を安定化するためのタンパク質の凍結乾燥は、組換えタンパク質の治療用タンパク質に対して一般的に適用されてきた。これは通常、工程及び貯蔵の間にガラス状態を促進するトレハロースなどの二糖類並びに他の賦形剤存在下でのフリーズドライによって達成された。ガラス転移温度（Ｔｇ）以下で生成物が貯蔵される限り、タンパク質は長期間貯蔵でき、それ以上では材料がゴム様状態に遷移する。安定剤が、特定の部位と相互作用し、乾燥の間に水と置き換わることによって並びにタンパク質分子（α−緩和）又は分子の一部分（β−緩和）の並進及び回転運動を同時に抑制することによって、賦形剤は非晶質状態でタンパク質を安定化すると考えられる。特にリン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウムアジュバントに吸着しているワクチンの場合、それほど多くはないが、乾燥技術がワクチンの長期貯蔵に適用されてきた。乾燥ワクチンを生成する殆どの試みは、温度の穏やかな逸脱を生き延びられる吸引可能な粉末又は製剤を得ようとするものだったので、高温条件における乾燥ワクチンの貯蔵に関してはデータが殆ど利用できない。例えば、黄熱ワクチンは、主に熱帯気候において使用されるので、安定剤（ラクトース、ソルビトール）の存在下で凍結乾燥を使用して生ウイルスワクチンの生存率を維持してきた（Ｍｏｎａｔｈ、１９９６、黄熱ワクチンの安定性（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅ）、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ｓｔａｎｄ、８７：２１９〜２５頁）。賦形剤無しでは、凍結乾燥及び貯蔵の間、−２０℃を超えると活性は急速に失われるが、安定化ワクチンは３７℃で２週間以上耐えることができる。牛疾患牛疫用の凍結乾燥ワクチンも開発され、低温流通方式から離れた後でもアフリカの現場条件で１ヵ月間まで利用できる（Ｈｏｕｓｅ及びＭａｒｉｎｅｒ、１９９６、凍結乾燥工程の修正による牛疫ワクチンの安定化（Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｂｙ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ｓｔａｎｄ、８７：２３５〜４４頁）。最近、工程及び乾燥に関する変形を使用した類似の試みが、はしかワクチンの開発（Ｂｕｒｇｅｒ、Ｃａｐｅら、２００８、弱毒化生はしかウイルスワクチンの吸引可能な粉末用の安定化処方（Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｉｎｈａｌａｂｌｅ  ｐｏｗｄｅｒｓ  ｏｆ  ｌｉｖｅ−ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ）、Ｊ  Ａｅｒｏｓｏｌ  Ｍｅｄ  Ｐｕｌｍ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ、２１：２５〜３４頁；Ｂｕｒｇｅｒ、Ｃａｐｅら、２００８、弱毒化生はしかウイルスワクチンの吸引可能な粉末用の安定化処方（Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｈａｌａｂｌｅ  Ｐｏｗｄｅｒｓ  ｏｆ  Ｌｉｖｅ−Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｍｅａｓｌｅｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｖａｃｃｉｎｅ）、Ｊ  Ａｅｒｏｓｏｌ  Ｍｅｄ）及び免疫原の構造を保持できるような条件を考案することが恐らく非常に重要になるインフルエンザ用乾燥ワクチン粉末（Ａｍｏｒｉｊ、Ｍｅｕｌｅｎａａｒら、２００７、糖��ラス技術を用いるインフルエンザサブユニットワクチン粉末の合理的設計：凍結及びフリーズドライの間のヘムアグルチニンの立体構造変化の防止（Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｏｗｄｅｒ  ｗｉｔｈ  ｓｕｇａｒ  ｇｌａｓｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｆｒｅｅｚｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）、Ｖａｃｃｉｎｅ、２５：６４４７〜５７頁；Ａｍｏｒｉｊ、Ｈｕｃｋｒｉｅｄｅら、２００８、安定なインフルエンザワクチン粉末処方の開発：課題及び将来性（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐｏｗｄｅｒ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ：Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ）、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ）に適用された。現在のＡＶＡ炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）ワクチン（Ｂｉｏｔｈｒａｘ（登録商標））を含めたワクチンには、安定剤として少量のホルムアルデヒドが時々添加され、架橋タンパク質がアルミニウム結晶の表面上で免疫原性の高いタンパク質凝集体を形成して作用することができる（Ｌｉｔｔｌｅ、Ｉｖｉｎｓら、２００７、ｒＰＡ炭疽菌ワクチンの処方における水酸化アルミニウムアジュバント及びホルムアルデヒドの効果（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｎｄ  ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒＰＡ  ａｎｔｈｒａｘ  ｖａｃｃｉｎｅ）、Ｖａｃｃｉｎｅ、２５：２７７１〜７頁）。ホルムアルデヒドは、培養上清（例えば破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）トキソイド、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）トキソイドなど）から得られる旧式ワクチンにおける最適な安定剤として歴史的に使用されてきた。現在のＡＶＡワクチンは、３年間安定性のラベルが付けられており、安定性はいくつかの生化学的評価及び効力の作用である。中程度の量の安定性は液体懸濁液ワクチンで達成できるが、備蓄及び配布されるワクチンに必要とされる全ての安定性パラメータを、より長期の貯蔵期間に対して満たせる可能性はない。
【００１０】
構造と機能を保持しながらの、治療用タンパク質の乾燥の成功は、溶液中で起こる分解経路の知識に左右され、適切な乾燥及び安定化用賦形剤によって分解を遅延又は排除することができる。ワクチンの場合、機能は、酵素活性ではなく免疫原性及び防御試験によって主に決定される。アルミニウムアジュバント結晶に吸着しているタンパク質免疫原の場合、タンパク質を分離し、分析のために取り除くことが困難な場合が有るので、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける機能及び他のパラメータの測定は、それに応じて一層困難になる。したがって、機能は、免疫原性及び防御試験によってしか試験できない。タンパク質の三次立体構造は、酵素機能に明らかに影響を及ぼし得るが、存在する場合、立体構造によって決まるＢ細胞エピトープの免疫原性に影響を及ぼすことも有り得る。その中に含有される、Ｂ及びＴ細胞の直鎖状エピトープも、（メチオニン及びシステイン残基の）酸化及び（特にアスパラギン残基の）脱アミドによる影響を受け得る。ｐＨは、治療用タンパク質の安定性に影響を与える最も重要な処方変数の１つである（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ、Ｃｈａｎｇら、２００２、安定な凍結乾燥タンパク質処方の合理的な設計：理論と実際（Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｓｔａｂｌｅ  ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ：ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）、Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１３：１０９〜３３頁；Ｃｈｉ、Ｋｒｉｓｈｎａｎら、２００３、水溶液中のタンパク質の物理的安定性：外来性タンパク質の凝集の機序及び駆動力（Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ｍｅｃｈａｎｉｍ  ａｎｄ  ｄｒｉｖｉｎｇ  ｆｏｒｃｅｓ  ｉｎ  ｎｏｎｎａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ、２０：１３２５〜３６頁）。溶液中でのタンパク質の立体構造及びコロイド安定性に影響を及ぼすことによって、ｐＨは、その凝集速度を大きく変調することができる（Ｃｈｉ、Ｋｒｉｓｈｎａｎら、２００３、水溶液中のタンパク質の物理的安定性：外来性タンパク質の凝集の機序及び駆動力（Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ｍｅｃｈａｎｉｍ  ａｎｄ  ｄｒｉｖｉｎｇ  ｆｏｒｃｅｓ  ｉｎ  ｎｏｎｎａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ、２０：１３２５〜３６頁）。加えて、脱アミドの速度は、ｐＨに強く左右される（Ｍａｎｎｉｎｇ、Ｐａｔｅｌら、１９８９、タンパク質医薬品の安定性（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ、６：９０３〜１８頁）。所与のタンパク質について、物理的及び化学的安定性に対して最適ｐＨ値が異なることも有り得る（Ｋｏｌｖｅｎｂａｃｈ、Ｎａｒｈｉら、１９９７、顆粒球コロニー刺激因子は、ｐＨ２で、熱的に安定で、小型で、部分的に折り畳まれた構造を維持する（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｍａｉｎｔａｉｎｓ  ａ  ｔｈｅｒｍａｌｌｙ  ｓｔａｂｌｅ，  ｃｏｍｐａｃｔ，  ｐａ��ｔｉａｌｌｙ  ｆｏｌｄｅｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｔ  ｐＨ２）、Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｒｅｓ、５０：３１０〜８頁）。例えば、物理的安定性は、脱アミドが容認できないほど急速なｐＨで最適になる可能性が有る（Ｃｈａｎｇ、Ｒｅｅｄｅｒら、１９９６、組換えヒトインターロイキン−１受容体アンタゴニストの安定なフリーズドライ処方の開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ、１３：２４３〜９頁）。そのような場合、これら反応の速度を最小限に抑える凍結乾燥処方を開発することにより、安定生成物を得るための実用的な戦略を提供できる。乾燥処方を凍結乾燥及び貯蔵する間の治療用タンパク質の安定性に対する凍結乾燥前の溶液のｐＨ効果を検査した僅かな公表された研究により、このパラメータの重要性が実証された（Ｐｒｅｓｔｒｅｌｓｋｉ、Ｐｉｋａｌら、１９９５、フーリエ変換赤外分光を使用する乾燥状態の立体構造分析による組換えヒトインターロイキン−２の凍結乾燥条件の最適化（Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｂｙ  ｄｒｉｅｄ−ｓｔａｔｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｆｏｕｒｉｅｒ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ、１２：１２５０〜９頁；Ｃｈａｎｇ、Ｒｅｅｄｅｒら、１９９６、組換えヒトインターロイキン−１受容体アンタゴニストの安定なフリーズドライ処方の開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ、１３：２４３〜９頁；Ｋａｔａｙａｍａ、Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆら、２００４、ＰＬＳを使用する、プロジェニポエチン（ｐｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎ）の凍結乾燥されたタンパク質処方の後向き統計分析：長期貯蔵安定性に重要なパラメータの決定（Ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ＰＬＳ：ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｆｏｒ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ、９３：２６０９〜２３頁）。これらの研究により、凍結乾燥及び貯蔵の間に、研究されるタンパク質に適切な物理的及び化学的安定性を付与する凍結乾燥前の溶液のｐＨを同定することの困難さが実証された。しかし、十分な量の安定化賦形剤が処方に含まれる場合、タンパク質の分解は最小限に抑えられる可能性がある。例えば、スクロース／タンパク質の質量比０．３未満のレベル及び６．５未満のｐＨの次善のスクロースを含有する溶液中で、組換えヒトインターロイキン��１−受容体アンタゴニスト（ｒｈＩＬ−１ｒａ）を処方した後に凍結乾燥するとき、凍結乾燥後、貯蔵及び再構成の間に激しいタンパク質凝集が起こった（Ｃｈａｎｇ、Ｒｅｅｄｅｒら、１９９６、組換えヒトインターロイキン−１受容体アンタゴニストの安定なフリーズドライ処方の開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ、１３：２４３〜９頁）。脱アミドは容認できないほど高い割合で起こったが、６より大きいｐＨで溶液から凍結乾燥した後、タンパク質の凝集は最小限に抑えられた。ｐＨ６．５で０．３より大きいスクロース／タンパク質質量比のスクロース量を含有する溶液から凍結乾燥した後には、両方の不安定化経路が阻害される可能性がある。別の例において、インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、ｐＨ７でフリーズドライする間に著しく大きい構造摂動を有し、貯蔵及び再水和の後に、その摂動はｐＨ５で溶液から凍結乾燥したサンプルより高いレベルの凝集をもたらした（Ｐｒｅｓｔｒｅｌｓｋｉ、Ｐｉｋａｌら、１９９５、フーリエ変換赤外分光を使用する乾燥状態の立体構造分析による組換えヒトインターロイキン−２の凍結乾燥条件の最適化（Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｂｙ  ｄｒｉｅｄ−ｓｔａｔｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｆｏｕｒｉｅｒ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ、１２：１２５０〜９頁）。ｐＨ７における、凍結乾燥前の溶液処方へのスクロースの添加により、凍結乾燥後の貯蔵の間のＩＬ−２の安定性が改善された。より最近、処方前に対するこの手法が、炭疽菌ｒＰＡで取り入れられ、経鼻投与用の乾燥粉末ワクチンの候補が作製された（Ｊｉａｎｇ、Ｊｏｓｈｉら、２００６、経鼻粘膜運搬用炭疽菌ワクチンの粉末処方（Ａｎｔｈｒａｘ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｏｗｄｅｒ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｎａｓａｌ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ｓｃｉ、９５：８０〜９６頁）。この場合、凍結乾燥前の溶液中のｒＰＡについて、ｐＨ及び賦形安定剤を最適化する条件が確立された。トレハロースは、熱応力に対して可溶性ｒＰＡを安定化するということが決定された賦形剤の１つなので、ｒＰＡが急速に消失した液体サンプルと比較して、トレハロース含有乾燥ワクチンが、ｒＰＡの総含有量に関して４０℃で少なくとも３０日間安定である証拠があった。ガス駆動注射装置を使用する表皮運搬用の乾燥粉末組成物を得るために、マンニトール、グリシン及びデキストラン（賦形剤総量の約６％ｗ／ｖを超えない）の混合物存在下でアルミニウムに吸着しているＢ型肝炎ワクチン（ＨＢｓＡｇ）を急速に凍結することにより、噴霧されるワクチンを液体窒素中に噴射した後に乾燥することを伴う急速凍結（噴霧フリーズドライ）の後に粒度及びマウスにおける相対的な免疫原性を保持したままのワクチンを得られることが判明した（Ｍａａ、Ｚｈａｏら、２００３、ミョウバン−アジュバント化乾燥粉末ワクチン処方の安定化：機序と適用（Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｕｍ−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｒｙ  ｐｏｗｄｅｒ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９２（２）：３１９〜３２頁）。通常通りの凍結乾燥したワクチンは処理後に凝集し、最小限の免疫原性しか無かったが、熱応力条件下で噴霧フリーズドライしたワクチンの挙動は決定されなかった。減少した免疫原性は、再構成後のアルミニウム粒子の凝集と関連付けられた。
【００１１】
より最近、Ｒｏｓｅｒらは、アルミニウム粒子の凝集を防止することができる凍結乾燥方法を示唆した。Ｒｏｓｅｒら、米国特許第６，８９０，５１２号は、１５％（ｗ／ｖ）の過剰なトレハロースを水酸化アルミニウムの粒子懸濁液に添加することによって、脱水及び再水和の間に懸濁液中の粒子全体が凝集することを防止する方法を開示している。トレハロース（α−Ｄ−グルコピラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシド）は、乾燥からの植物細胞の保護に関与する天然に存在する二糖類である。トレハロースは、タンパク質構造を固定する糖ガラスを形成することによって乾燥の間タンパク質の変性を防止することが示された。Ｒｏｓｅｒらは、全体の粒子の凝集の防止について開示しているが、粒子懸濁液の凍結速度の重要性又はトレハロース存在下におけるアルミニウム塩含有ワクチンの凍結乾燥前の粒度並びにタンパク質構造を制御及び維持するのに重要な他の要素については開示していない。粒度の維持は、アルミニウム粒子表面へのタンパク質免疫原の吸着の程度を制御するのに重要なパラメータであり、トレハロース又は他のガラス化賦形剤の含有量に加えて、凍結乾燥サイクルの間のいくつかの要素に影響される。これらの要素は、免疫原性及び防御免疫応答の生成に影響する。
【００１２】
アルミニウム塩アジュバントは、タンパク質又はペプチドサブユニットワクチンの免疫原性を増大させるために十分に調査された手段を提供する。ワクチンを強化するための様々な調査処方が、アルミニウム塩アジュバントの一層強力な代替物として開発されたが、ＦＤＡ公認のヒトワクチンにおいては現在利用できない。免疫応答を強化するために設計される処方には、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、自己集合性マクロ構造、サイトカイン、サポニン、トール様受容体（ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−５及びＴＬＲ−９）アゴニスト、免疫賦活性二本鎖ＲＮＡ種、非メチル化ＤＮＡオリゴヌクレオチド並びにポリマー性微粒子及びナノ構造に基づく様々な組成物がある。これら組成物の多くは、注射されたワクチンの免疫原性を改善することを目的とし、いくつかの変形は、鼻腔内又は経口ワクチン接種用として運搬経路の変更に適用することができる。ワクチンの免疫原性を強化するために使用できる免疫賦活性分子の一分類の例として、リンパ球を活性化する直接的な免疫賦活性効果という理由で、脊椎動物ＤＮＡではなく細菌ＤＮＡを使用することができる。これは、細菌ＤＮＡ中には非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドが期待される頻度で存在するが、脊椎動物ＤＮＡにおいては十分に存在しないか又はメチル化されていることによる（Ｋｒｉｅｇら、１９９５）。特定の配列構成で非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有する合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を添加することによって活性化が引き起こされる場合もある。ＣｐＧ  ＤＮＡは、殆ど全ての（＞９５％）Ｂ細胞の増殖を誘導し、免疫グロブリン（Ｉｇ）分泌を増加させる。ＣｐＧ  ＤＮＡによるこのＢ細胞活性化は、Ｔ細胞非依存的であり、抗原非特異的である。しかし、低濃度のＣｐＧ  ＤＮＡによるＢ細胞の活性化は、Ｂ細胞の増殖とＩｇ分泌の両方に関わるＢ細胞抗原受容体を介して伝達されるシグナルと強い相乗効果を有する（Ｋｒｉｅｇら、１９９５）。Ｂ細胞抗原受容体を介して及びＣｐＧ  ＤＮＡによって引き起こされるＢ細胞シグナル伝達経路間のこの強い相乗効果は、抗原特異的免疫応答を促進する。Ｂ細胞に対するその直接的な効果に加えて、ＣｐＧ  ＤＮＡは、単球、マクロファージ及び樹状細胞も直接活性化して、高レベルのＩＬ−１２を含めた様々なサイトカインを分泌させる（Ｋｌｉｎｍａｎら、１９９６；Ｈａｌｐｅｒｎら、１９９６；Ｃｏｗｄｅｒｙら、１９９６）。これらのサイトカインは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を刺激して、γ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）を分泌させ、溶解活性を増大させた（上記Ｋｌｉｎｍａｎら、１９９６；上記Ｃｏｗｄｅｒｙら、１９９６；Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９２；Ｂａｌｌａｓら、１９９６）。全体として、ＣｐＧ  ＤＮＡは、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γによって支配され、Ｔｈ２サイトカインを殆ど分泌しないＴｈ１様パターンのサイトカイン産生を誘導する（Ｋｌｉｎｍａｎら、１９９６）。他の分子は、トール様受容体を刺激する。一例は、フラジェリンであり、多数の細菌べん毛に含まれるタンパク質サブユニットである。フラジェリンは、ＴＬＲ−５リガンドであり、そのような結合に応じて抗原提示細胞の生物学的機能の少なくとも１つを引き起こす。べん毛は、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）及びコーロバクター属（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）のメンバーを含めた桿状及びらせん状細菌の表面に見られる。多形中央部位は、ＴＬＲ５との結合に影響を及ぼさずに欠失させることができるが、フラジェリンの保存領域はＴＬＲ５結合に重要である。Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｄ１３６８９、ＹＰ．ｓｕｂ．−−２７５５４９、ＹＰ．ｓｕｂ．−−２７５５５０、ＡＡＵ１８７１８、ＡＡＵ１８７１７、ＺＰ．ｓｕｂ．−−００７４３０９５、ＥＡＯ５２６２６、ＹＰ．ｓｕｂ．−−３１５３４８、ＡＡＴ２８３３７、ＡＡＴ２８３３６、ＡＡＴ２８３３５、ＡＡＴ２８３３４、ＡＡＴ２８３３３、ＡＡＺ３６３５６、ＡＡＺ３３１６７、ＡＡＺ９４４２４、ＡＡＺ９１６７０、ＮＰ．ｓｕｂ．−−４１４９０８、ＢＡＤ１８０５２及びＢＡＤ１８０５１など、数多くの細菌からのフラジェリン配列が当技術分野において利用可能である。精製アジュバント免疫刺激剤の３番目の例として、非毒性の、化学的に合成された又は酵素的に改変されたグラム陰性リポ多糖類の誘導体は強力なアジュバントであり、ＴＬＲ−４との結合及び活性化を介してリンパ球を刺激して作用する。例えば、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）は、リポ多糖類のリピドＡ成分の誘導体であり、炎症誘発性サイトカインの強力な活性剤である。天然のリピドＡ及びその元のＬＰＳは強力な発熱特性を有し、ヒトにおいて発熱反応を誘導するが（Ｇｒｅｉｓｍａｎ及びＨｏｍｉｃｋ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１０９：１２１０〜１２１５頁（１９７２）；Ｇｒｅｉｓｍａｎ及びＨｏｍｉｃｋ、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、１２８：２５７〜２６３頁（１９７３）；Ａｂｅｍａｔｈｙ及びＳｐｉｎｋ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、３７：２１９〜２２５頁（１９５８）；上記Ｒｉｅｔｓｃｈｅｌら；及び上記Ｒａｅｔｚ（１９９３））、ＭＰＬ及びその化学的に合成された類似体は毒性では無く、ＩＬ−１、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αを含めた一通りの宿主炎症誘発性サイトカインを誘導する。
【００１３】
加えて、ヒトにおいて、１又は２用量後のアルミニウム塩に吸着しているサブユニットに対する免疫応答を強化するには、有効な抗体応答を生成するために共アジュバントが必要になると考えられる。アルミニウム塩と適合性があるいくつかのアジュバント化合物が、近年、アジュバントとして評価されてきた。これらのアジュバントには主として、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）及びＱＳ−１並びにＣｐＧ配列がある。どのデータもＣｐＧ含有ワクチンの長期熱安定性については記載していないが、ヒト研究における炭疽菌ワクチンに関する最近のデータは、ヒト以外の霊長類及びヒトにおいてアジュバント処方にＣｐＧ７９０９を添加することによって、全抗ｒＰＡ抗体及び炭疽菌毒素中和抗体の点で、ＡＶＡ（ＡｌＯＨ吸着ワクチン）を著しく強化できることを示している（Ｋｌｉｎｍａｎ、２００６、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＡＶＡ、認可されている炭疽菌ワクチンによって誘発される免疫応答を加速し、促進する（ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ  ａｎｄ  ｂｏｏｓｔ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ＡＶＡ，  ｔｈｅ  ｌｉｃｅｎｓｅｄ  ａｎｔｈｒａｘ  ｖａｃｃｉｎｅ）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、５：３６５〜９頁）。ＭＰＬ及びＱＳ−２１は、アルミニウム塩と一緒に及びＧｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓによって開発された特許権の有る油エマルジョン処方中でも使用された。ヒト及び動物モデル中のＡｌＯＨワクチンにおいて、ＱＳ−２１が、耐性及び全身安全性についての十分な証拠で評価された。ＱＳ−２１は、イオン性及び疎水性相互作用よってアルミニウム塩に結合しており、その一部分がミセル形態で溶液（水性ワクチン中）中に残っていると考えられている。ＱＳ−２１は樹皮から精製されるサポニンであり、抗体と細胞媒介性免疫の両方を誘導するための広範なアジュバント効果を有する。機序は理解されていないが、ヒトワクチンとの関連で有効な用量レベルが評価された。アルミニウムを含むＱＳ−２１が臨床試験において評価され、抗原と一緒に処方されたＱＳ−２１の独立安全性試験が研究された。ＱＳ−２１は、注射部位に痛み（回復する）を伴ったが、全身性副作用の所見は殆ど無かった。（Ｗａｉｔｅ、Ｊａｃｏｂｓｏｎら、２００１、サポニンアジュバントＱＳ−２１の異なる処方の安全性及び耐性を評価する３つの無作為二重盲検法臨床試験（Ｔｈｒｅｅ  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌｓ  ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｐｏｎｉｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ＱＳ−２１）、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９：３９５７〜６７頁）。ヒトにおけるいくつかの研究により、ＱＳ−２１が、アルミニウムに吸着している抗原に対する応答を強化することが示された。これらには、マラリアワクチン候補におけるいくつかの臨床試験（Ｎａｒｄｉｎ、Ｏｌｉｖｅｉｒａら、２０００、合成マラリアペプチドワクチンは、定義したＨＬＡ遺伝子型のワクチン接種を受けた人において高レベルの抗体を誘発する（Ｓｙｎｔｈｅ��ｉｃ  ｍａｌａｒｉａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｌｉｃｉｔｓ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅｅｓ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ＨＬＡ  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ）、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、１８２：１４８６〜９６頁；Ｋａｓｈａｌａ、Ａｍａｄｏｒら、２００２、免疫学的アジュバントＱＳ−２１と混合された熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）マラリアペプチドワクチンＳＰｆ６６の新たな処方の安全性、耐性及び免疫原性（Ｓａｆｅｔｙ，  ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｍａｌａｒｉａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ＳＰｆ６６  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ＱＳ−２１）、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０：２２６３〜７７頁）、ＨＩＶ  ｇｐ１２０（Ｅｖａｎｓ、ＭｃＥｌｒａｔｈら、２００１、ＱＳ−２１はヒトにおいて、ＨＩＶ−１エンベロープサブユニットを免疫化する間の抗原用量を減らすことを可能にするアジュバントの効果を促進する（ＱＳ−２１  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｅｆｆｅｃｔ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｆｏｒ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｏｓｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ＨＩＶ−１  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ）、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９：２０８０〜９１頁）及びより最近では、ＱＳ−２１によって中和力価及び保護が強化されたデングウイルスサブユニットのアカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）臨床試験（Ｐｕｔｎａｋ、Ｃｏｌｌｅｒら、２００５、デング熱−２型の不活性化、組換え型サブユニット及び弱毒化生ワクチン候補の、アカゲザルモデルにおける評価（Ａｎ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｇｕｅ  ｔｙｐｅ−２  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ，  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｕｂｕｎｉｔ，  ａｎｄ  ｌｉｖｅ−ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ  ｍｏｄｅｌ）、Ｖａｃｃｉｎｅ、２３：４４４２〜５２頁）がある。ＱＳ−２１の溶液安定性は、長期安定性試験の下でよく研究されており、アジュバント活性があるＱＳ−２１（実際には２個の異性体から成る）が僅かに酸性の緩衝液中で４年間以上非常に安定しているのに対して４０℃では１０日未満であることを示した（Ｋｅｎｓｉｌ及びＫａｍｍｅｒ、１９９８、ＱＳ−２１：水溶性トリテルペン配糖体アジュバント（ＱＳ−２１：  ａ  ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ、７：１４７５〜８２頁）。ＱＳ−２１は乾燥粉末として貯蔵され、その形態では永久に安定している。
【００１４】
リシン毒素は、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）の実によって産生される６４ｋＤａのタンパク質である（Ｄｏａｎ  ＬＧ、リシン：毒性の機序、臨床症状及びワクチンの開発（Ｒｉｃｉｎ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ，  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ，  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、Ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、２００４；４２（２）：２０１〜８頁；Ａｕｄｉ  Ｊ、Ｂｅｌｓｏｎ  Ｍ、Ｐａｔｅｌ  Ｍ、Ｓｃｈｉｅｒ  Ｊ、Ｏｓｔｅｒｌｏｈ  Ｊ、リシン中毒：包括的総説（Ｒｉｃｉｎ  ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ：ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ）、ＪＡＭＡ、２００５；２９４（１８）：２３４２〜５１頁）。ホロ毒素は、ジスルフィド結合によって結合した二本のポリペプチド鎖（Ａ及びＢ）から成る。Ａ鎖（ＲＴＡ）は、哺乳動物細胞においてタンパク質合成を阻害するリボゾーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）である。Ｂ鎖（ＲＴＢ）は、細胞表面のガラクトース残基に結合するレクチンである。一旦細胞に吸収されると、ＲＴＡは細胞質ゾルに移行し、６０Ｓリボゾームを酵素的に不活性化する（Ｓｍａｌｌｓｈａｗ，ＪＥ及びＶｉｔｅｔｔａ，ＥＳ、組換えリシンサブユニットワクチンであるＲｉＶａｘ（登録商標）の凍結乾燥処方は、免疫原性を保持している（Ａ  ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲｉＶａｘ，  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｒｉｃｉｎ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅ，  ｒｅｔａｉｎｓ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０１０、３月１１日；２８（１２）：２４２８〜２４３５頁）。細胞の細胞質中にある一分子のＲＴＡが、タンパク質合成を完全に阻害する。ヒトにおけるリシンの報告されている推定致死量は、吸入、注入、又は摂取された場合、１〜２５μｇ／ｋｇである（Ａｕｄｉら）。その広い有用性と驚くべき毒性のため、リシンはバイオテロリズムに使用される潜在的薬剤に相当し、したがって疾病対策センター、アトランタ  ＧＡ（ＣＤＣ）によって、レベルＢの生物学的脅威に分類されている。実験的動物では、リシン中毒は、トキソイド又は脱グリコシル化リシンＡ鎖（ｄｇＲＴＡ）を用いるワクチン接種によって、又は抗リシン抗体を用いる受動免疫によって防止できる。しかし、トキソイドはヒトにおける日常的な使用には毒性が強過ぎると考えられており、ｄｇＲＴＡは製造が困難且つ高価であり、また両方の活性部位を保持し、ヒトにおいて毒性の副作用を誘導する可能性がある。抗リシン抗体を用いる受動免疫は、リシン用量が比較的低く、抗体が曝露後数時間以内に投与される場合しか有効でない（Ｈｅｗｅｔｓｏｎ  ＪＦ、Ｒｉｖｅｒａ  ＶＲ、Ｃｒｅａｓｉａ  ＤＡ、Ｌｅｍｌｅｙ  ＰＶ、Ｒｉｐｐｙ  ＭＫ、Ｐｏｌｉ  ＭＡ、リシンを用いるワクチン接種による又は異種抗体を用いる受動的処置による、吸入されたリシンからのマウスの保護（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ｉｎｈａｌｅｄ  ｒｉｃｉｎ  ｂｙ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｉｃｉｎ  ｏｒ  ｂｙ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｈｅ���ｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９３；１１（７）：７４３〜６頁）。
【００１５】
これらの制限を避けるために、組換えＲＴＡワクチン（ＲｉＶａｘ（登録商標））が開発された（Ｓｍａｌｌｓｈａｗら）。ＲｉＶａｘ（登録商標）には２個所の点突然変異、Ｙ８０ＡとＶ７６Ｍが組み込まれて、公知の毒性、すなわちリボ毒性と脈管漏出誘導能の両方を大きく低下させた又は除去した。マウス、ウサギ及びヒトにおけるアジュバント非存在下で、ＲｉＶａｘ（登録商標）は非毒性であり、免疫原性である（Ｓｍａｌｌｓｈａｗ  ＪＥ、Ｆｉｒａｎ  Ａ、Ｆｕｌｍｅｒ  ＪＲ、Ｒｕｂａｃｋ  ＳＬ、Ｇｈｅｔｉｅ  Ｖ、Ｖｉｔｅｔｔａ  ＥＳ、リシン中毒に対してマウスを保護する新規な組換えワクチン（Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｗｈｉｃｈ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒｉｃｉｎ  ｉｎｔｏｘｉｃａｔｉｏｎ）、Ｖａｃｃｉｎｅ、２００２；２０（２７〜２８）：３４２２〜７頁）。そのようなモデルによって、他のワクチンモデルと関係している毒性の多くを含まない肯定的な結果をもたらすことが明らかになった。
【００１６】
リシンは、現在、ＮＩＡＩＤ及び疾病対策予防センター（ＣＤＣ）によって、レベルＢの生物学的脅威剤として記載されている（Ｒｏｔｚ、Ｋｈａｎら、２００２、潜在的バイオテロ薬剤の公衆衛生評価（Ｐｕｂｌｉｃ  ｈｅａｌｔｈ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｒｏｒｉｓｍ  ａｇｅｎｔｓ）、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、８：２２５〜３０頁）。ワクチン候補は、よく特徴付けられた分子の活性に関与するリシン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ）内の残基を遺伝的に不活性化することによって得られる、リシン毒素に対する組換えサブユニットワクチンに基づいている。この改変された分子は、マウス、ウサギ及びヒトにおいて免疫原性であり、毒素を中和する抗体を誘導し、又は各生物種において全身的若しくは粘膜的な毒素の除去に関与している。天然痘又は炭疽菌の場合、テロが引き起こした流行病は、発生の徴候後の集団的ワクチン接種、選択的ワクチン接種又は包囲ワクチン接種によって防除することができる（Ｈａｌｌｏｒａｎ、Ｌｏｎｇｉｎｉら、２００２、バイオテロリスト天然痘封じ込め（Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｂｉｏｔｅｒｒｏｒｉｓｔ  ｓｍａｌｌｐｏｘ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９８：１４２８〜３２頁；Ｋａｐｌａｎ、Ｃｒａｆｔら、２００２、天然痘攻撃に対する緊急対応：集団的ワクチン接種の場合（Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  ｓｍａｌｌｐｏｘ  ａｔｔａｃｋ：ｔｈｅ  ｃａｓｅ  ｆｏｒ  ｍａｓｓ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  ｓｃｉ  ＵＳＡ、９９：１０９３５〜４０頁；Ｂｏｚｚｅｔｔｅ、Ｂｏｅｒら、２００３、天然痘ワクチン接種方針のモデル（Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ａ  ｓｍａｌｌｐｏｘ−ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｐｏｌｉｃｙ）、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３４８：４１６〜２５頁；Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｆら、２００４、包囲ワクチン接種と天然痘防除（Ｒｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｍａｌｌｐｏｘ  ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、１０：８３２〜４１頁）。一方、薬剤は複製しないので、生体毒素へのバイオテロリスト曝露に対するワクチン接種は、集団的ワクチン接種ではなく軍又は第一応答者など選ばれた集団において使用される可能性が高い。リシンの単離されたＡ及びＢサブユニットは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）及び他の組換え宿主で産生することができる。Ｂ鎖も、ワクチン候補に含まれるが、Ａ鎖より免疫原性が低く、防御性が低いと考えられている（Ｍａｄｄａｌｏｎｉ、Ｃｏｏｋｅら、２００４、リシンに対する抗体の防御効果に関連する免疫学的特質（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｒｉｃｉｎ）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７２：６２２１〜８頁）。リシンＡ鎖は、天然のリシンより少なくとも１０００倍毒性が低いが、ワクチンとして使用したときに毒性をもたらす可能性が有る酵素活性をなおも保持している（Ｔｈｏｒｐｅ、Ｄｅｔｒｅら、１９８５、メ��過ヨウ素酸−シアノボロヒドリド混合物を用いるリシン内の炭水化物の修飾。毒性及びｉｎ  ｖｉｖｏでの分布に対する効果（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｉｎ  ｒｉｃｉｎ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｐｅｒｉｏｄａｔｅ−ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１４７：１９７〜２０６頁）。リシンＡ鎖内のいくつかの重要なアミノ酸残基、Ｙ８０、Ｙ１２３、Ｅ１７７、Ｒ１８０、Ｎ２０９及びＷ２１１は、酵素活性部位を構成している（Ｏｌｓｏｎ、１９９７、結合基質類似体に対するリシンＡ鎖の構造決定基：分子力学シミュレーション分析（Ｒｉｃｉｎ  Ａ−ｃｈａｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｆｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、２７：８０〜９５頁；Ｌｅｂｅｄａ及びＯｌｓｏｎ、１９９９、リボゾーム不活化タンパク質において保存されている中和エピトープの予測（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ，  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｉｎ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２４：１９〜２６頁）。これらアミノ酸残基のいくつかの変異により、タンパク質合成の阻害で決定されたように、僅かな毒性を有するリシンＡ鎖が得られた（Ｋｉｍ及びＲｏｂｅｒｔｕｓ、１９９２、突然変異生成及びＸ線結晶解析によるリシンＡ鎖のいくつかの重要な活性部位残基の分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｋｅｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  ｒｉｃｉｎ  Ａ  ｃｈａｉｎ  ｂｙ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｘ−ｒａｙ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、５：７７５〜９頁）。内皮細胞に対するＲＴＡの結合に関与する追加的な部位及び残基も同定され、その結合は細胞外で起こり、宿主細胞内への毒素侵入を必要としない（Ｂａｌｕｎａ及びＶｉｔｅｔｔａ、１９９９、ヒト組織における抗毒素誘導脈管漏出を研究するためのｉｎ  ｖｉｖｏモデル（Ａｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｏｄｅｌ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｌｅａｋ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅ）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２２：４１〜７頁；Ｂａｌｕｎａ、Ｃｏｌｅｍａｎら、２０００、リシンＡ鎖由来ペプチドに結合しているモノクローナル抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける内皮細胞に対する効果：毒素媒介性脈管損傷に対する洞察（Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ  ｒｉｃｉｎ  Ａ  ｃｈａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｏｘｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ���ａｍａｇｅ）、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、２５８：４１７〜２４頁；Ｓｍａｌｌｓｈａｗ、Ｇｈｅｔｉｅら、２００３、マウスにおける肺血管性漏出を除去するための抗毒素の遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｔｏ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｌｅａｋ  ｉｎ  ｍｉｃｅ）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１：３８７〜９１頁）。ＲＴＡ上の内皮結合部位は、単離されたＨＵＶＥＣ細胞への損傷及び血管漏出症候群（ＶＬＳ）の誘導に関係しており、ＲＴＡ含有免疫毒素の使用における用量規定毒性であると決定された。（Ｓｍａｌｌｓｈａｗ、Ｇｈｅｔｉｅら、２００３、マウスにおける肺血管性漏出を除去するための抗毒素の遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｔｏ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｌｅａｋ  ｉｎ  ｍｉｃｅ）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１：３８７〜９１頁）。ＳＣＩＤマウス中のヒト皮膚異種移植片における肺血管性漏出及び脈管漏出とＨＵＶＥＣ細胞の両方に関与するＲＴＡの部分は、アミノ酸残基Ｌ７４、Ｄ７５及びＶ７６と関係していると思われる（Ｂａｌｕｎａ、Ｒｉｚｏら、１９９９、内皮細胞への結合及び血管漏出症候群の開始に関与する可能性が有る、毒素並びにインターロイキン−２の構造的モチーフの証拠（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｏｔｉｆ  ｉｎ  ｔｏｘｉｎｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｔｈａｔ  ｍａｙ  ｂｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｌｅａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、９６：３９５７〜６２頁）。したがって、これらの毒性部位を考慮したＡ鎖ワクチンが構築され、リシンＡ鎖の二重変異体を含む。内皮細胞の損傷のどんな可能性も最小限に抑えるために、酵素的部位にあるチロシン８０はアラニンに変異され、脈管漏出部位にあるバリン７６はメチオニンに変異される。このタンパク質が天然のリシンＡ鎖（ＲＴＡ）と構造的に同一であることは、結晶構造データに基づいて現在公知であり、分子に含まれる点突然変異がどんな潜在的三次構造（又は、高次構造に依存的な潜在的エピトープ）も破壊しないことを示している。アジュバント非存在下でマウスに筋肉内（ｉ．ｍ．）投与したとき、変異体Ａ鎖はリシンを認識する抗体を誘発し、動物を１０ｘＬＤ５０用量のリシンから保護した（Ｓｍａｌｌｓｈａｗ、Ｆｉｒａｎら、２００２、リシン中毒に対してマウスを保護する新規な組換えワクチン（Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｗｈｉｃｈ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒｉｃｉｎｉｎ  ｉｎｔｏｘｉｃａｔｉｏｎ）、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０：３４２２〜７頁）。
【００１７】
天然ＰＡは、ＡＶＡ（吸着炭疽ワクチン）において支配的な免疫原であり、単一成分ワクチンとして曝露前及び曝露後の予防において防御免疫の標的になる。無毒性炭疽菌の天然ＰＡの発現に基づいたアルミニウムに吸着しているいくつかの組換えＰＡワクチン（第２の世代）が進歩し、最近の第Ｉ相臨床試験において試験され、ＡＶＡに関して免疫原性であることが示された（Ｇｏｒｓｅ、Ｋｅｉｔｅｌら、２００６、組換え防御抗原（ｒＰＡ１０２）炭疽菌ワクチンの用量上昇に対する免疫原性及び耐性：ランダム化二重盲検、対照、多施設臨床試験（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｏｆ  ａｓｃｅｎｄｉｎｇ  ｄｏｓｅ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（ｒＰＡ１０２）  ａｎｔｈｒａｘ  ｖａｃｃｉｎｅ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｔｒｉａｌ）、Ｖａｃｃｉｎｅ、２４：５９５０〜９頁；Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｃｌｅｍｅｎｔら、２００７、健康な成人に投与された組換え防御抗原炭疽菌ワクチンの安全性、反応原性及び免疫原性（Ｓａｆｅｔｙ，  ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｔｈｒａｘ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｇｉｖｅｎ  ｔｏ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｄｕｌｔｓ）、Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ、３：２０５〜１１頁）。免疫の主要な相関は、ウサギ噴霧胞子抗原投与試験においてよく特徴付けられた（ＥＬＩＳＡ反応性抗体の総量及び毒素中和活性（ＴＮＡ））（Ｌｉｔｔｌｅ、Ｉｖｉｎｓら、２００４、ウサギにおける組換え炭疽菌ワクチンに対する防御の血清学的相関の定義（Ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ａ  ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔｓ  ｆｏｒ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｈｒａｘ  ｖａｃｃｉｎｅ）、Ｖａｃｃｉｎｅ、２２：４２２〜３０頁）。炭疽菌毒素が、炭疽菌によって発現される、プラスミドにコードされた３個組のタンパク質から成る三成分毒素であることは周知である：防御抗原（ＰＡ；８３ｋＤａ）、致死因子（ＬＦ；９０ｋＤａ）及び浮腫因子（ＥＦ；８９ｋＤａ）。７量体化したＰＡによって、ＬＦ及びＥＦは細胞外表面から細胞質内へと輸送され、哺乳動物細胞の分子標的を酵素的に改変して作用する。ＬＦはいくつかのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫキナーゼ）を切断し、活性化するメタロプロテアーゼであり、ＥＦは細胞内ｃＡＭＰレベルの急速な増加を引き起こすカルモジュリン依存性アデニル酸シクラーゼである。（Ｙｏｕｎｇ及びＣｏｌｌｉｅｒ、２００７、炭疽菌毒素：受容体結合、内部移行、細孔形成及び移行（Ａｎｔｈｒａｘ  ｔｏｘｉｎ：ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ，  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ，  ｐｏｒｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、７６：２４３〜６５頁）。これらのタンパク質はそれぞれ無毒であるが、一緒に投与された場合には強力な毒素となり、急激な細胞死を引き起こす。
【００１８】
ＡＶＡワクチンは、今なお炭疽菌に対する唯一のワクチンであり、それを改善するための主要な動きは、いくつかの認知されている欠点に基づいている：固体免疫を実現するために６倍用量の投与計画が必要であること、それが安全ではなく反応原性が高いという認識、及びＡＶＡの調製処理が未完成であり整合性が不足しているという認識。ＰＡは、ＡＶＡにおける主要な免疫原であるが、いくつかのロット中に存在する恐れがある少量のＬＦ及びＥＦがワクチンの有効性に寄与するかどうかは明白でない。炭疽菌ｒＰＡの免疫原性の消失の主な要素には、アジュバント表面上での脱アミドの加速が関与している。これは、表面ｐＨを低下させるための少量のホスファートの存在によって防止できる。開発中の他の特別なｒＰＡワクチン候補がある。一般に、ＡＶＡ又はＰＡを基にしたワクチンは、毒素中和抗体を誘導する（Ｐｉｔｔ、Ｌｉｔｔｌｅら、１９９９、吸入炭疽菌の動物モデルにおける免疫のｉｎ  ｖｉｔｒｏ相関（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｉｎｈａｌａｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｈｒａｘ）、Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、８７：３０４頁；Ｒｅｕｖｅｎｙ、Ｗｈｉｔｅら、２００１、炭疽菌ワクチンによって付与される防御免疫の相関の探索（Ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｃｏｎｆｅｒｒｅｄ  ｂｙ  ａｎｔｈｒａｘ  ｖａｃｃｉｎｅ）、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ、６９：２８８８〜９３頁；Ｌｉｔｔｌｅ、Ｉｖｉｎｓら、２００４、ウサギにおける組換え炭疽菌ワクチンに対する防御の血清学的相関の定義（Ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ａ  ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔｓ  ｆｏｒ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｈｒａｘ  ｖａｃｃｉｎｅ）、Ｖａｃｃｉｎｅ、２２：４２２〜３０頁）。ＰＡワクチンは感染の発生を制限するように設計されていないが、ＰＡを基にしたワクチンの防御作用の根底にある機序は、中毒から宿主を保護する、従って免疫系が生物に対処できるようにする抗ＰＡ抗体に起因する。
【００１９】
現在、米国において、７２種のワクチンがＦＤＡに認可されている（米国食品医薬品局、米国における予防接種及び流通用として許諾されたワクチンの完全リスト（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｌｉｓｔ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｌｉｃｅｎｓｅｄ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＳ．）ＦＤＡ．６／３／２０１０）。これら７２種のワクチンのうち、３６％はアルミニウムアジュバントを含有し、３０％はフリーズドライされている。７２種のワクチンのいずれも、アルミニウムアジュバントとフリーズドライ成分の両方を含有してはいない。
【００２０】
当技術分野において、耐熱性の免疫学的に活性なフリーズドライワクチン製剤を製造する方法を開発する必要性があり、それには、防御免疫の急速な発生を促進するために組換え抗原が含まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本開示は、耐熱性のフリーズドライワクチンアジュバント含有製剤を製造する方法を提供する。本開示は、ワクチン抗原が組換え抗原である耐熱性のフリーズドライワクチン製剤を製造する方法を更に提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
一実施形態において、本開示は、免疫学的に活性なアジュバントに結合している乾燥ワクチン組成物を調製する方法であって、少なくとも１種のアルミニウム塩アジュバント、少なくとも１つの揮発性塩を含有する少なくとも１種の緩衝液系、少なくとも１種のガラス形成剤、少なくとも１種の免疫学的に活性がある共アジュバント及び少なくとも１個の抗原を混合して、液体ワクチン処方を作製するステップと、液体ワクチン処方を凍結して、凍結ワクチン処方を作製するステップと、凍結ワクチン処方を凍結乾燥して、乾燥ワクチン組成物を作製するステップとを含み、その組成物が対象において免疫応答を誘発することが可能である方法を提供する。対象によって発現される免疫応答は、抗原特異的な液性免疫及び／又は細胞媒介性免疫であることができる。一態様において、少なくとも１種のアルミニウム塩アジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及び硫酸アルミニウムから成る群から選択される。別の態様において、アルミニウム塩アジュバントは、水酸化アルミニウムである。更なる態様において、少なくとも１種の緩衝液系は、アセタート、スクシナート、シトラート、プロラミン、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、ボラート、カルボナート及びホスファート緩衝液系から成る群から選択される。更に別の態様において、少なくとも１種の緩衝液系は、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、トリエチルアンモニウムアセタート、トリエチルアンモニウムホルマート、トリエチルアンモニウムカルボナート、トリメチルアミンアセタート、トリメチルアミンホルマート、トリメチルアミンカルボナート、ピリジナルアセタート及びピリジナルホルマートから成る群から選択される。別の態様において、少なくとも１種のガラス形成剤は、トレハロース、スクロース、フィコール、デキストラン、スクロース、マルトトリオース、ラクトース、マンニトール、ヒドロキシエチルスターチ、グリシン、シクロデキストリン及びポビドンから成る群から選択される。更なる態様において、ガラス形成剤は、トレハロースである。一態様において、ガラス形成剤のトレハロースは、フリーズドライ前の液体ワクチン処方中に約５％〜約１５％重量対容積濃度で存在する。別の態様において、ガラス形成剤のトレハロースは、液体ワクチン処方中に約８％〜約２０％重量対容積濃度で存在する。別の実施形態において、少なくとも１種の免疫学的に活性な共アジュバントが、本方法のステップに添加される。この態様において、少なくとも１つの免疫学的に活性な共アジュバントは、リピドＡ、リピドＡ誘導体、モノホスホリルリピドＡ、モノホスホリルリピドＡの化学的類似体、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、ＴＬＲ−４アゴニスト、フラジェリン、グラム陰性細菌由来フラジェリン、ＴＬＲ−５アゴニスト、ＴＬＲ−５受容体に結合可能なフラジェリン断片、サポニン、サポニン類似体、ＱＳ−２１、精製サポニン画分、ＩＳＣＯＭＳ、ステロール及び脂質とサポニンとの混合物、から成る群から選択される。更なる態様において、共アジュバント化合物は、ＱＳ−２１である。更なる態様において、凍結ステップは、トレイ凍結、棚凍結、噴霧凍結及びシェル凍結のうち１つを含む。好ましい実施形態において、凍結ステップは、凍結ステップを始めるために予冷されたトレイの使用を含む。
【００２３】
別の態様において、抗原は、ロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、口蹄疫ウイルス（ｆｏｏｔ  ａｎｄ  ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、Ａ型インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ  Ａ）、Ｂ型インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ  Ｂ）、Ｃ型インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ  Ｃ）、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７、ヒトパラインフルエンザ２型（ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｔｙｐｅ  ２）、単純疱疹ウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）、エプスタイン−バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、水痘ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ  ｖｉｒｕｓ）、豚ヘルペスウイルス１（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １）、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、リッサウイルス（ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）、炭疽菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、炭疽菌ＰＡ及び誘導体、ポリオウイルス（ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）、Ａ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）、Ｂ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ）、Ｅ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｅ  ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウイルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ベネズエラ馬脳脊髄炎（ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、ネコ白血病ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）、レオウイルス（ｒｅｏｖｉｒｕｓ）、ＲＳウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、ラッサ熱ウイルス（ｌａｓｓａ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ポリオーマ腫瘍ウイルス（ｐｏｌｙｏｍａ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓ）、イヌパーボウイルス（ｃａｎｉｎｅ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ｔｉｃｋ  ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウイルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、ヒトライノウイルス種（ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、エンテロウイルス種（ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、メンゴウイルス（ｍｅｎｇｏｖｉｒｕｓ）、パラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、トリ伝染性気管支炎ウイルス（ａｖｉａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ヒトＴ細胞白血病リンパ腫ウイルス１（ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌｌｅｕｋｅｍｉａ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｖｉｒｕｓ  １）、ヒト免疫不全ウイルス１（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  １）、ヒト免疫不全ウイルス２（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ２）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、パルボウイルスＢ１９（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｂ１９）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、風疹ウイルス（ｒｕｂｅｌｌａ  ｖｉｒｕｓ）、黄熱ウイルス（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、デング熱ウ���ルス（ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ）、ウシＲＳウイルス（ｂｏｖｉｎｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｉｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａ  ｖｉｒｕｓ）、百日咳菌（ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、気管支敗血症菌（ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、パラ百日咳菌（ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ウシ流産菌（ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｉｓ）、マルタ熱菌（ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブタ流産菌（ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ）、羊流産菌（ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｏｖｉｓ）、ブルセラ種（ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、大腸菌（ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ種（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、チフス菌（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、コレラ菌（ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、腸炎ビブリオ（ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、赤痢菌属（ｓｈｉｇｅｌｌａ）、シュードモナス属（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、結核菌（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、トリ結核菌（ａｖｉｕｍ）、カルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）、らい菌（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌属（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、エンテロバクター種（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、ロシャリメア・ヘンセラ（ｒｏｃｈａｌｉｍａｉａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）、ヘモリチカ菌（ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、出血性敗血症菌（ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、トラコーマ病原体（ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、オウム病クラミジア（ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、鼠径リンパ肉芽腫（ｌｙｍｐｈｏｇｒａｎｕｌｏｍａ  ｖｅｎｅｒｅｕｍ）、梅毒トレポネーマ（ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ヘモフィルス種（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、マイコプラズマ・ボヴィゲニタリウム（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、肺マイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｕｌｍｏｎｉｓ）、マイコプラズマ種（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、ライム病菌（ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、在郷軍人病菌（ｌｅｇｉｏｎａｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、ボツリヌス菌（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、ジフテリア菌（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、腸炎エルシニア（ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｃｏｌｉｔｉｃａ）、ロッキー山紅斑熱リケッチア（ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、発疹熱リケッチア（ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｙｐｈｉ）、発疹チフスリケッチア（ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗｓａｅｋｉｉ）、エーリキア・シャフェンシス（ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、熱帯熱マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）、住血吸虫属（ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｅｓ）、トリパノソーマ属（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅｓ）、リーシュマニア種（ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、フィラリア・ネマトデス（ｆｉｌａｒｉａｌ  ｎｅｍａｔｏｄｅｓ）、トリコモナス症（ｔｒｉｃｈｏｍｏｎｉａｓｉｓ）、肉胞子虫症（ｓａｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａｓｉｓ）、無鉤条虫（ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ）、有鉤条虫（ｔａｅｎｉａ  ｓｏｌｉｕｍ）、リーシュマニア属（ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、トキソプラズマ原虫（ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、旋毛虫（ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）、コクシジウム症（ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ）、鶏球虫（ｅｉｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、カンジダ・アルビカンス（ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎ）、アスペルギルス・フミガーツス（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、コクシジオイデス症（ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ）、淋菌（ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、マラリア原虫スポロゾイト表面タンパク質（ｍａｌａｒｉａ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、マラリアメロゾイトタンパク質（ｍａｌａｒｉａ  ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、トリパノソーマ表面抗原タンパク質（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、アルファウイルス属（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ジフテリアトキソイド（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｏｉｄ）、破傷風トキソイド（ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｏｉｄ）、髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）外膜タンパク質、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）Ｍタンパク質、インフルエンザ赤血球凝集素（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、癌抗原、腫瘍抗原、毒素、ウェルシュ菌（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）ε毒素、リシン毒素、シュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、外毒素、神経毒、サイトカイン、サイトカイン受容体、モノカイン、モノカイン受容体、植物花粉、動物の鱗屑及びほこりダニ、から成る群から選択される又はそれから得られる。
【００２４】
別の実施形態において、本開示は、ワクチン組成物であって、少なくとも１種のアルミニウム塩アジュバントと、少なくとも１種の緩衝剤が揮発性塩を含む、少なくとも１種の緩衝剤と、少なくとも１種のガラス形成剤と、少なくとも１個の抗原とを含み、組成物を凍結乾燥して、乾燥ワクチン組成物を作製し、更に乾燥ワクチン組成物が、対象において免疫応答を誘発することが可能である組成物を提供する。一態様において、少なくとも１種のアルミニウム塩アジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及び硫酸アルミニウムから成る群から選択される。別の態様において、少なくとも１種の緩衝剤は、アセタート、スクシナート、シトラート、プロラミン、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、ボラート、カルボナート及びホスファートから成る群から選択される。別の態様において、少なくとも１種の緩衝剤は、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、トリエチルアンモニウムアセタート、トリエチルアンモニウムホルマート、トリエチルアンモニウムカルボナート、トリメチルアミンアセタート、トリメチルアミンホルマート、トリメチルアミンカルボナート、ピリジナルアセタート及びピリジナルホルマートから成る群から選択される。更に別の態様において、少なくとも１種のガラス形成剤は、トレハロース、スクロース、フィコール、デキストラン、スクロース、マルトトリオース、ラクトース、マンニトール、ヒドロキシエチルスターチ、グリシン、シクロデキストリン及びポビドンから成る群から選択される。更なる態様において、抗原は、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７、ヒトパラインフルエンザ２型、単純疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、水痘ウイルス、豚ヘルペスウイルス１、サイトメガロウイルス、リッサウイルス、炭疽菌、炭疽菌ＰＡ及び誘導体、ポリオウイルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｅ型肝炎、ジステンパーウイルス、ベネズエラ馬脳脊髄炎、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ＲＳウイルス、ラッサ熱ウイルス、ポリオーマ腫瘍ウイルス、イヌパーボウイルス、パピローマウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、牛疫ウイルス、ヒトライノウイルス種、エンテロウイルス種、メンゴウイルス、パラミクソウイルス、トリ伝染性気管支炎ウイルス、ヒトＴ細胞白血病リンパ腫ウイルス１、ヒト免疫不全ウイルス１、ヒト免疫不全ウイルス２、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、パルボウイルスＢ１９、アデノウイルス、風疹ウイルス、黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、ウシＲＳウイルス、コロナウイルス、百日咳菌、気管支敗血症菌、パラ百日咳菌、ウシ流産菌、マルタ熱菌、ブタ流産菌、羊流産菌、ブルセラ種、大腸菌、サルモネラ種、チフス菌、連鎖球菌、コレラ菌、腸炎ビブリオ、赤痢菌属、シュードモナス属、結核菌、トリ結核菌、カルメット・ゲラン桿菌、らい菌、肺炎球菌、ブドウ球菌属、エンテロバクター種、ロシャリメア・ヘンセラ、ヘモリチカ菌、出血性敗血症菌、トラコーマ病原体、オウム病クラミジア、鼠径リンパ肉芽腫、梅毒トレポネーマ、ヘモフィルス種、マイコプラズマ・ボヴィゲニタリウム、肺マイコプラズマ、マイコプラズマ種、ライム病菌、在郷軍人病菌、ボツリヌス菌、ジフテリア菌、腸炎エルシニア、ロッキー山紅斑熱リケッチア、発疹熱リケッチア、発疹チフスリケッチア、エーリキア・シャフェンシス、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、住血吸虫属、トリパノソーマ属、リーシュマニア種、フィラリア・ネマトデス、トリコモナス症、肉胞子虫症、無鉤条虫、有鉤条虫、リーシュマニア属、トキソプラズマ原虫、旋毛虫、コクシジウム症、鶏球虫、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガーツス、コクシジオイデス症、淋菌、マラリア原虫スポロゾイト表面タンパク質、マラリアメロゾイトタンパク質、トリパノソーマ表面抗原タンパク質、百日咳、アルファウイルス属、アデノウイルス、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、髄膜炎菌外膜タンパク質、連鎖球菌Ｍタンパク質、インフルエンザ赤血球凝集素、癌抗原、腫瘍抗原、毒素、ウェルシュ菌ε毒素、リシン毒素、シュードモナス外毒素、外毒素、神経毒、サイトカイン、サイトカイン受容体、モノカイン、モノカイン受容体、植物花粉、動物の鱗屑及びほこりダニ、から成る群から選択される又はそれから得られる。
【００２５】
別の実施形態において、ワクチン組成物は、少なくとも１種の免疫学的に活性な共アジュバントを更に含む。一態様において、少なくとも１種の免疫学的に活性な共アジュバントは、リピドＡ、リピドＡ誘導体、モノホスホリルリピドＡ、モノホスホリルリピドＡの化学的類似体、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、ＴＬＲ−４アゴニスト、フラジェリン、グラム陰性細菌由来フラジェリン、ＴＬＲ−５アゴニスト、ＴＬＲ−５受容体に結合可能なフラジェリン断片、サポニン、サポニン類似体、ＱＳ−２１、精製サポニン画分、ＩＳＣＯＭＳ、並びにステロール及び脂質とサポニンとの混合物、から成る群から選択される。
【００２６】
更に別の実施形態において、本開示はアジュバント結合乾燥ワクチン組成物の粒度を制御する方法であって、少なくとも１種のアルミニウム塩アジュバント、少なくとも１種の緩衝液系、少なくとも１種のガラス形成剤、及び少なくとも１個の抗原を混合して、液体ワクチン処方を作製するステップと、液体ワクチン処方を凍結して、凍結ワクチン処方を作製するステップと、凍結ワクチン処方を凍結乾燥して、乾燥ワクチン組成物を作製するステップとを含み、乾燥ワクチン組成物を水性希釈剤で希釈して、再構成されたワクチン組成物を形成させた後に、再構成されたワクチン組成物の平均粒子直径が１００マイクロメートル未満である方法を提供する。別の態様において、少なくとも１種のアルミニウム塩アジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及び硫酸アルミニウムから成る群から選択される。更なる態様において、アルミニウム塩アジュバントは、水酸化アルミニウムである。別の態様において、少なくとも１種の緩衝液系は、アセタート、スクシナート、シトラート、プロラミン、ヒスチジン、ボラート、カルボナート及びホスファート緩衝液系から成る群から選択される。更なる態様において、少なくとも１種の緩衝液系は、スクシナート及びホスファート緩衝液系から選択される。一態様において、少なくとも１種のガラス形成剤は、トレハロース、スクロース、フィコール、デキストラン、スクロース、マルトトリオース、ラクトース、マンニトール、ヒドロキシエチルスターチ、グリシン、シクロデキストリン、ポビドン及びカリウム塩から成る群から選択される。具体的な態様において、ガラス形成剤は、トレハロースである。更に具体的な態様において、ガラス形成剤のトレハロースは、液体ワクチン処方中に約５％〜約２０％重量対容積濃度で存在する。別の態様において、ガラス形成剤のトレハロースは、液体ワクチン処方中に約７％〜約１５％重量対容積濃度で存在する。一態様において、凍結ステップは、トレイ凍結、棚凍結、噴霧凍結及びシェル凍結のうち１つを含む。別の態様において、凍結ステップは、噴霧凍結を含む。更なる態様において、再構成されたワクチン組成物の平均粒子直径は、６マイクロメートル未満である。一態様において、冷却ステップ中に液体ワクチン処方を凍結状態へと冷却する速度が増加するにつれて、選択ステップにおけるガラス形成剤の濃度は低下する。
【００２７】
別の実施形態において、本開示は乾燥ワクチン組成物用のアジュバント組成物を提供し、そのアジュバント組成物は、アルミニウム塩アジュバント、ガラス形成剤及び緩衝塩を含む。一態様において、アルミニウム塩アジュバントは、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムから選択される。別の態様において、ガラス形成剤は、トレハロースである。更なる態様において、緩衝塩は、コハク酸ナトリウム、コハク酸カリウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カリウムから成る群のうち１つ又は複数から選択される。
【００２８】
更に別の実施形態において、本開示は限られた平均粒子直径を有するアジュバントに結合している乾燥ワクチン組成物であって、少なくとも１種のアジュバント、少なくとも１種のガラス形成剤及び少なくとも１個の抗原を緩衝液系中で混ぜ合わせて、液体ワクチン処方を作製するステップと、液体ワクチン処方を凍結状態へと急速に冷却して、凍結ワクチン処方を作製するステップと、凍結ワクチン処方を凍結乾燥して、乾燥ワクチン組成物を作製するステップとを含み、乾燥ワクチン組成物を水性希釈剤で希釈して、再構成されたワクチン組成物を形成させた後に、再構成されたワクチン組成物の平均粒子直径が１００マイクロメートル未満である方法によって製造される組成物を提供する。
【００２９】
別の実施形態において、本開示は凍結ワクチン処方の粒度を制御する方法であって、少なくとも１種のアルミニウム塩アジュバント、少なくとも１種の緩衝液系、少なくとも１種のガラス形成剤、及び少なくとも１個の抗原を混合して、液体ワクチン処方を作製するステップと、液体ワクチン処方を凍結して、凍結ワクチン処方を作製するステップと、凍結ワクチン処方を凍結乾燥して、乾燥ワクチン組成物を作製するステップとを含み、乾燥ワクチン組成物を水性希釈剤で融解及び希釈して、再構成されたワクチン組成物を形成させた後に、再構成されたワクチン組成物の平均粒子直径が１００マイクロメートル未満である方法を提供する。一態様において、少なくとも１種のアルミニウム塩アジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及び硫酸アルミニウムから成る群から選択される。別の態様において、アルミニウム塩アジュバントは、水酸化アルミニウムである。更なる態様において、少なくとも１種の緩衝液系は、アセタート、スクシナート、シトラート、プロラミン、ヒスチジン、ボラート、カルボナート及びホスファート緩衝液系から成る群から選択される。一態様において、少なくとも１種の緩衝液系は、スクシナート及びホスファート緩衝液系から選択される。別の態様において、少なくとも１種のガラス形成剤は、トレハロース、スクロース、フィコール、デキストラン、スクロース、マルトトリオース、ラクトース、マンニトール、ヒドロキシエチルスターチ、グリシン、シクロデキストリン、ポビドン及びカリウム塩から成る群から選択される。特定の態様において、ガラス形成剤は、トレハロースである。更に具体的な態様において、ガラス形成剤のトレハロースは、液体ワクチン処方中に約５％〜約２０％重量対容積濃度で存在する。別の具体的な態様において、ガラス形成剤のトレハロースは、液体ワクチン処方中に約７％〜約１５％重量対容積濃度で存在する。一態様において、凍結ステップは、トレイ凍結、棚凍結、噴霧凍結及びシェル凍結のうち１つを含む。別の態様において、凍結ステップは、噴霧凍結を含む。更なる態様において、再構成されたワクチン組成物の平均粒子直径は、６マイクロメートル未満である。
【００３０】
別の態様において、液体ワクチン処方は、高張混合物として調製され、その後凍結され、乾燥ワクチン組成物を水性希釈剤で希釈して再構成されたワクチン組成物を形成する際に、再構成されたワクチン組成物の張度は等張レベルに調整される。更に別の態様において、処方が調製され、凍結乾燥によって揮発性塩を除去し、再構成する際に、抗原とアジュバントは同じ濃度を保つが開始処方と比較して張度が低下したワクチン製剤を得る。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】フリーズドライ及び再構成の前後の％表面領域に基づく粒度分布を表す図である。
【図２】フリーズドライの前後の％表面領域に基づくヒスチジン処方の粒度分布を表す図である。
【図３】フリーズドライの前後の％表面領域に基づくアルギニン処方の粒度分布を表す図である。
【図４】フリーズドライの前後の％表面領域に基づくグリシン処方の粒度分布を表す図である。
【図５】１０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６中で経時的に沈殿させたアルハイドロゲル粒子を示す図である。（ａ）沈殿無し、（ｂ）３０分間の沈殿後、（ｃ）３時間の沈殿後。
【図６】−１０℃に予冷した棚でフリーズドライ前に粒子を様々な時間沈澱させておいた後の、表面領域に基づく粒度分布を表す図である。サンプルは、１０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６中に１ｍｇ／ｍＬ  Ａｌを含有した。
【図７】−１０℃に予冷した棚でフリーズドライ前に粒子を様々な時間沈澱させておいた後の、表面領域に基づく粒度分布を表す図である。サンプルは、１０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６中に１ｍｇ／ｍＬ  Ａｌ及び８ｗ／ｖ％トレハロースを含有した。
【図８】１０ｍＭヒスチジン中にトレハロース有り無しで、１ｍｇ／ｍＬ  Ａｌ処方を、フリーズドライ前に様々な時間沈殿させた時の平均粒度の比較を示す図である。
【図９】一次及び二次凍結の前に、３ｍｌのガラス製バイアルに入っている１ｍｌのワクチンサンプルを、ＦＴＳ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＬｙｏＳｔａｒ  Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて様々な凍結速度で処理した凍結乾燥のステップを実証する図である。フリーズドライ後、バイアルを窒素ガスでパージし、密閉し、更なる分析前に−８０℃で貯蔵した。
【図１０】４条件下でトレハロース濃度を増加させた、フリーズドライサイクル前後の粒度分布を示す図である。一次及び二次乾燥前における速い凍結速度及び高いトレハロース濃度により、開始時の粒子分布に最も類似したフリーズドライ後の粒度分布が得られる。最も遅い速度から最も速い速度へ順に：室温トレイＡ（Ａ）、−１０℃に予冷したトレイ（Ｂ）、液体窒素浸漬（Ｃ）、液体窒素噴霧フリーズドライ（Ｄ）。処方は、０〜１２％トレハロースを含む１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、アルハイドロゲルとして１ｍｇ／ｍｌから成った。
【図１１】室温フリーズドライでフリーズドライした後の、粒度分布への依存度を示す図である。図１０のように、室温フリーズドライを実施した。凍結サイクル前にトレイ上で、室温でインキュベーションした場合、粒度分布は１ミクロン未満から２０ミクロン超に移動し、８％トレハロースの存在により粒度移動の量は低下した。
【図１２】５０％ｗ／ｖグリセリンを含む１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、１４４ｍＭ  ＮａＣｌに溶解したＲＴＡと、透析し、濃縮し、−２０℃で貯蔵したＲＴＡとを比較したＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す図である。（上パネル−銀染色、下パネル−クーマシー染色。同じ組のサンプルを使用して両方の研究を実施した）。
【図１３】凍結乾燥前における、ＲＴＡのアルハイドロゲルへの吸着を示す図である。Ａｌの濃度を１ｍｇ／ｍＬに保ったままＲＴＡの濃度を変化させた。ｐＨ６．０で、ＲＴＡタンパク質の少なくとも９５％がアルハイドロゲルの表面に吸着した。
【図１４】様々な用量のＲＴＡを使用して８匹のＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの群にワクチン接種した、アルハイドロゲルに吸着している液体ＲＴＡワクチンをワクチン接種した結果を示す図である。ワクチンを４０℃で１ヵ月間貯蔵した後にワクチン接種したとき、リシン毒素に曝露された動物はいずれも生き残らず、免疫原性の著しい消失が観察された。４℃で１ヵ月間貯蔵したワクチンは、マウスにおいて最大用量で完全保護を、低用量で部分的な保護を誘導した。
【図１５】インキュベーション無し、１週間及び１ヵ月間４０℃でインキュベーションした後の各ワクチンについて、１回の注射後（３週目）及び２回の注射後（５週目）におけるｒＲＴＡ抗体力価を示す図である。平均力価は、応答したマウスだけの平均として、それらマウスの標準偏差と共に示す。
【図１６】免疫したマウスのエンドポイント抗体価データを示す図である。エンドポイント抗体価＝逆エンドポイント（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｅｎｄｐｏｉｎｔ）抗ＲＴＡ力価。中和ＩＣ５０力価＝リシン細胞毒性からウェル中の細胞を５０％保護するのに必要とされる血清の希釈度。ここには示さないが、疑似免疫したマウス（＃１〜１０（５を除く））のいずれも、その血清中に抗ＲＴＡ力価は全く無かった。また、疑似免疫したマウス＃１の血清も、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける中和能力について試験したが、細胞を保護しなかった。
【図１７】凍結乾燥前に吸着させた液体ワクチンを用いるＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの２回目のワクチン接種後に、個々の血清から得られた総及び中和力価を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
定義
乾燥トレハロース（高純度、低エンドトキシン）は、Ｆｅｒｒｏ  Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）から入手した。アルギニン、グリシン、ヒスチジン、クエン酸ナトリウム及び酢酸アンモニウムは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ製アルハイドロゲル（商標）２．０％（水酸化アルミニウムアジュバント）を、Ｅ．Ｍ．Ｓｅｒｇｅａｎｔ  Ｐｕｌｐ  ＆  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，Ｉｎｃ（Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ）から購入した。３ｍｌ及び５ｍｌの凍結乾燥バイアルとキャップを、Ｗｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓから入手した。
【００３３】
試料調製
異なる濃度（０〜１５ｗ／ｖ％）のトレハロースを含有する水溶液を調製した。特に明記しない限り、サンプルは、１０ｍＭ緩衝液（示した通り）ｐＨ６．０中に調製され、１ｍｇ／ｍｌ  Ａｌ（アルハイドロゲル（商標）として）を含有した。サンプルは、１ｍｌをアリコートとして処理した。処方する前に、アジュバントを除く全ての水溶液を０．２μｍフィルタに通した。
【００３４】
表面電荷ゼータ電位
様々な処方について水酸化アルミニウム（アルハイドロゲル）懸濁液のゼータ電位を測定して、静電的相互作用を調べた。次いで、抗原を含まない処方を調製して、フリーズドライの間に粒子の凝集が起こるかどうか決定した。濃度１ｍｇＡｌ／ｍＬのアルハイドロゲルを、１０ｍＭ緩衝液（グリシン、アルギニン、ヒスチジン、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム）ｐＨ６中で、０〜１２ｗ／ｖ％の範囲にある安定剤トレハロースと混合した。凍結の速度が粒子の凝集に影響を及ぼすかどうか決定するために、４種の凍結方法を使用して処方をフリーズドライした：一次及び二次乾燥前に、室温トレイ凍結、−１０℃に予冷したトレイ凍結、液体窒素浸漬凍結、及び液体窒素噴霧凍結。タンパク質を処方に添加して、フリーズドライ及び再構成した後の粒度に対するその効果も見た。レーザー回折によって、０．０４〜２０００μｍの範囲にある粒度分布が各処方について特徴付けられた。
【００３５】
凍結乾燥
ＦＴＳ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｙｏｓｔａｒ凍結乾燥機を使用して、サンプルをフリーズドライした。サンプルを、以下の通り最も遅くから最速へ様々な冷却速度で凍結した：（ｉ）室温で調製したバイアルを凍結乾燥機のトレイに置き室温に１時間保った後に始める、（ｉｉ）サンプルを凍結乾燥機内に置き、−１０℃の棚温度で１時間平衡化し、次いで、棚を０．５℃／分で−４０℃へと冷却することによる凍結（「−１０℃に予冷したトレイ−凍結」）；（ｉｉ）バイアルの底部を液体Ｎ２に浸すことによる凍結（ＬＮ２浸漬フリーズドライ）；及び（ｉｉｉ）液体Ｎ２中に約２０μｌまでの液滴を滴下することによる噴霧凍結（ＬＮ２噴霧フリーズドライ）。トレイ凍結及び液体Ｎ２浸漬サンプルは、３ｍｌ凍結乾燥バイアル内で処理し、一方で噴霧凍結サンプルは５ｍｌ凍結乾燥バイアル内で処理した。液体Ｎ２を使用して凍結させたサンプルが入っているバイアルを凍結乾燥機にすばやく移し、−４０℃に予冷した凍結乾燥機の棚の上に置いた。サンプルを、各々が互いに離れるように凍結乾燥機内に間隔を置いて配置し、水が入っているバイアルの列で囲んだ。
【００３６】
サンプルの一次乾燥は、棚温度を−２０℃に設定し、６０ｍ  Ｔｏｒｒ（８  Ｐａ）で２０時間減圧することによって達成され、その後二次乾燥を続け、ここで棚温度を０．２℃／分で−２０℃から０℃に、０．５℃／分で３０℃に上昇させ、最終的に３０℃で５時間保った。サンプルを、真空下で密閉し、ＤＩ水で再構成した後に分析した。凍結及び乾燥サイクルの変化を、（図１０）に表す。
【００３７】
粒度分布
Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＳ２３０レーザー回折粒度分析装置を使用して粒度分布（ＰＳＤ）を測定した。各測定には１ｍｌサンプルを３つ必要とし、１処方当たり各測定を３回反復して行った。報告されているＰＳＤは重み付けした表面領域であり、３回の測定の合成物である。
【実施例】
【００３８】
Ｉ．様々な沈澱時間の粒子を用いる、−１０℃に予冷したトレイフリーズドライ
１０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６．０、アルハイドロゲルからのＡｌ  １ｍｇ／ｍＬ及び０、４、８又は１２ｗ／ｖ％トレハロースを混合し、４℃で３０分間回転させた。溶液１ｍＬを、各３ｍＬのガラス製フリーズドライバイアルに入れた。その処方を、フリーズドライヤー内の−１０℃に予冷した棚の上に置き、下表の通りにフリーズドライした。フリーズドライ後に、チャンバを乾燥窒素ガスで再度満たし、バイアルを密閉した。
【表１】
2014516967.tif 000002
【００３９】
粒度分析
フリーズドライ前の溶液に対して及びＤＩ水１ｍＬ中に再構成したフリーズドライサンプルに対して、粒度分析を行った。Ｂｅｃｋｍａｎ製ＬＳ  ２３０機器を使用して、レーザー回折粒度分析を行った。分析する際に、サンプルチャンバに超音波処理は行わなかった。粒度分布を算出するために使用したモデルには、１．３３の溶液屈折率及び１．５７のサンプル屈折率を使用した。測定値を取得する前に、分析装置中のろ過したＤＩ水におよそ６ｍＬのサンプルを添加する必要があった。各測定について、３／９２の平均粒度分布を取得した。各処方について、３回の測定を行った。
【００４０】
結果
図１に示すように、処方がより高濃度のトレハロース（８〜１２ｗ／ｖ％）を含有するとき、開始時の粒度分布を維持することができた。
【００４１】
ＩＩ．−１０℃に予冷したトレイフリーズドライ
１０ｍＭ緩衝液、１ｍｇ／ｍＬアルハイドロゲルからのＡｌ、１０ｗ／ｖ％トレハロースを、０．２６ｍｇ／ｍＬ  ｒＲＴＡの有り無しで混合し、４℃で３０分間回転させた。溶液１ｍＬを、各３ｍＬのガラス製フリーズドライバイアルに入れた。その処方を、フリーズドライヤー内の−１０℃に予冷した棚の上に置き、下表の通りにフリーズドライした。フリーズドライ後に、チャンバを乾燥窒素ガスで再度満たし、バイアルを密閉した。
【表２】
2014516967.tif 000003
【００４２】
粒度分析
フリーズドライ前の溶液に対して及びＤＩ水１ｍＬ中に再構成したフリーズドライサンプルに対して、粒度分析を行った。Ｂｅｃｋｍａｎ製ＬＳ２３０機器を使用して、レーザー回折粒度分析を行った。分析する際に、サンプルチャンバに超音波処理は行わなかった。粒度分布を算出するために使用したモデルには、１．３３の溶液屈折率及び１．５７のサンプル屈折率を使用した。測定値を取得する前に、分析装置中のろ過したＤＩ水におよそ６〜７ｍＬのサンプルを添加する必要があった。各測定について、３／９２の平均粒度分布を取得した。各処方について、３回の測定を行った。
【００４３】
結果
１０ｗ／ｖ％トレハロースを含有するアルギニン、ヒスチジン及びグリシン緩衝液中にｒＲＴＡタンパク質の有り無し両方で、フリーズドライ前と、フリーズドライ前に−１０℃に予冷した棚を使用した後とで、粒度分布を維持することができた。粒度分布は、図１〜３に見られる。予冷した棚を使用する場合、処方を凍結する前にアジュバント粒子が沈澱する時間が短いので、フリーズドライ前に予冷した棚を用いるとトレイフリーズドライより粒度分布をより良好に維持できる可能性が有る。
【００４４】
ＩＩＩ．フリーズドライ前に３時間、３０分間及び０時点と様々な時間沈殿させた粒子を用いる、−１０℃に予冷したトレイフリーズドライ
１０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６、アルハイドロゲルからのＡｌ  １ｍｇ／ｍＬ及び０又は８ｗ／ｖ％トレハロースを混合し、４℃で３０分間回転させた。溶液１ｍＬを、各３ｍＬのガラス製フリーズドライバイアルに入れた。バイアルを、フリーズドライヤー内に置く前に、３時間、３０分間及び０分間静置させておく３群に分けた。バイアルは一旦充填されたら、フリーズドライヤー内に入れるときまで、４℃に置いておくことが可能である。その処方を、フリーズドライヤー内の−１０℃に予冷した棚の上に置き、下表の通りにフリーズドライした。フリーズドライ後に、チャンバを乾燥窒素ガスで再度満たし、バイアルを密閉した。
【表３】
2014516967.tif 000004
【００４５】
粒度分析
フリーズドライ前の溶液に対して及びＤＩ水１ｍＬ中に再構成したフリーズドライサンプルに対して、粒度分析を行った。Ｂｅｃｋｍａｎ製ＬＳ  ２３０機器を使用して、レーザー回折粒度分析を行った。分析する際に、サンプルチャンバに超音波処理は行わなかった。粒度分布を算出するために使用したモデルには、１．３３の溶液屈折率及び１．５７のサンプル屈折率を使用した。測定値を取得する前に、分析装置中のろ過したＤＩ水におよそ６ｍＬのサンプルを添加する必要があった。各測定について、３／９２の平均粒度分布を取得した。各処方について、２回の測定を行った。
【００４６】
結果
サンプルをフリーズドライヤー内に置く前に、サンプルを０分間、３０分間又は３時間を沈澱させておいた。沈澱の間の様々な時点における、１０ｍＭヒスチジン中にアルハイドロゲルからのＡｌ  １ｍｇ／ｍＬを含有するバイアルを図５に示す。沈殿無しでは、処方は、溶液全体にわたって濁っているように見える（図５ａ）。３０分間沈殿させた後には、アルハイドロゲル粒子の大多数は、バイアルの底部近くにあり、その上に少し濁った溶液が有るように見える（図５ｂ）。３時間沈殿させた後には、アルハイドロゲル粒子は、バイアルの底部の一層近くに沈殿しており、アルハイドロゲル層の上に透明な溶液が残った（図５ｃ）。
【００４７】
処方がアルハイドロゲル及びヒスチジンを含有し、トレハロースを含まないとき、粒度分布は開始時の粒度分布から大きい粒子の方へと移動した（図６）。短時間沈澱させておいた処方は、長時間沈殿させておいたものより僅かに小さな粒子を産生した。
【００４８】
処方が８ｗ／ｖ％トレハロースを含有するとき、フリーズドライヤー内に置く前にサンプルを沈澱させておく時間の長さは、粒度分布に影響を与えた（図７）。フリーズドライヤー内に置く前に処方を沈澱させておかないとき、粒度分布はフリーズドライ前の開始時の粒度分布に極めて類似していた。３０分間の沈殿後、粒度分布はより大きな粒度に移動し始め、３時間の沈殿では、粒子は開始時の粒度分布より著しく大きくなる。
【００４９】
トレハロースを含む処方をトレハロース無しのものと相対的に比較するとき、処方中のトレハロース存在により、フリーズドライ工程後の粒度分布が維持される。図８で分かるように、フリーズドライ前の開始時の平均粒度は、処方中に存在するトレハロースの有り無しで同じだが、処方中にトレハロースが存在する場合、フリーズドライ前の各沈殿量でフリーズドライ後の平均粒度が小さくなる。これらの実験から、開始時の粒度を維持することが望ましい場合、フリーズドライヤー内に入れる前にサンプルを沈殿させておかないことが重要であることも分かる。
【００５０】
ＩＶ．実験動物におけるリシンワクチンサブユニットの免疫原性
一例として、耐熱性の凍結乾燥リシンサブユニットワクチンが構築され、試験された。リシンＡ鎖ワクチンは、水性緩衝液中で凝集及び変性の影響を受けやすく、免疫原性及びリシン毒素曝露からの保護に関与する中和抗体の誘導に影響を及ぼす構造的な完全性を低下させる傾向にあるので、これが使用された。凍結乾燥リシンワクチンを、以下の通りに調製した。グリセリンに溶解されたＲＴＡを、１０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６．０に対して透析して、グリセリンを取り除いた（図１１）。−１０℃に予冷したフリーズドライと室温のワクチンとを比較するために、液体懸濁液ワクチンをバイアルに入れ、図１０に説明したように凍結乾燥に供した後に、−４０℃での一次フリーズドライサイクルを開始した。乾燥ワクチンを、冷蔵温度（４〜８℃）で、又は高温（４０〜６０℃）のいずれかで貯蔵した。貯蔵した凍結乾燥ワクチンからサンプルを定期的に取り出し、Ｒ７０と称される診断モノクローナル抗体の結合の評価によって、構造的な完全性について試験した（Ｎｅａｌ，Ｏ’Ｈａｒａら、２０１０、リシンＡ鎖上で免疫優性である直鎖状エピトープに対して作られるモノクローナル免疫グロブリンＧ抗体は、リシンに対する全身性及び粘膜免疫を付与する（Ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ｌｉｎｅａｒ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｉｃｉｎ  Ａ  ｃｈａｉｎ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｎｄ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｒｉｃｉｎ）、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ、７８：５５２〜６１頁）。加えて、アルミニウムに結合しているタンパク質の三次構造の指標となる内部蛍光の決定、残留水分の決定及びマウスにおける免疫原性／効力を含めた追加的な生物物理学的な試験にワクチンを供した。下記のようにＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを注射すること及びＥＬＩＳＡによってワクチンに対する抗体総量を決定し、リシン中和抗体を決定することにより、免疫原性を決定した。３５日目に１０ｘＬＤ５０用量の毒素を注射することによってマウスをリシン毒素に曝露させ、曝露動物における致死性を決定した。加えて、ペプチドスキャンを実施し、ＲＴＡ分子を包含するように重なり合っているペプチドに対する応答について、ワクチン接種した及び対照マウスから採った血清を評価した。免疫優性領域並びに高温及び低温貯蔵条件におけるそれらの保存状態を決定するためにこれを行った。対照液体ワクチンを使用して筋肉注射によりマウス３匹をワクチン接種したとき、ワクチンを４０℃で１ヵ月間インキュベーションすることにより、免疫原性及び防御免疫を誘導する能力が消失した（図１４）。
【００５１】
研究の間、各Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを、３回採血し、ワクチン処方で２回注射した。最初の注射の前にマウスを採血し、次いで０日目にワクチン処方を注射した。開始時に採血することが必要であり、それにより各マウスをそれ自身の基準値にすることができる。２１日後に、マウスを採血し、ブースタワクチン処方を注射した。開始時の注射の３５日後に、マウスを最後にもう一度だけ採血した。採血手順の前に、イソフルラン吸入器を使用してマウスに麻酔をかけた。血液は、マウスの眼窩後静脈洞から採血した。一滴のプロパラカインを目に滴下し、そこから採血し、次いで５０μＬ毛細管チューブを使用して血液を集めた。各採血においておよそ１００〜２００μＬの血液を採血した。
【表４】
2014516967.tif 000005
【００５２】
処方粒度の変化を作製するために、ヒスチジン及び酢酸アンモニウムなど異なる緩衝液並びにフリーズドライ前の凍結速度の変化（フリーズドライ前に室温の棚又は予冷した棚など）を使用した。全てのサンプルは１５％（ｗ／Ｖ）以下の二糖類トレハロースを含有し、アルハイドロゲルは、総アルミニウム量０．８５〜１ｍｇ／ｍｌで使用される水酸化アルミニウムワクチンアジュバントである。
【００５３】
Ｖ．吸着しているリシンワクチンの制御された凍結乾燥
この発明の中心的な目的は、タンパク質、アルミニウムアジュバント及び免疫賦活薬成分の制御された凍結乾燥を利用することによって、使用場所で、水で再構成するためのサブユニットワクチンを作製することである。アルミニウムアジュバントを使用して、ワクチンの有効性を消失すること無く、一方で全体が凝集すること及び適切に再水和できなくなること無くこれらの成分を適切に一つに混合することは、この時点まで実現不可能であった。ある範囲の緩衝液条件、塩条件及び凍結乾燥サイクル条件を検査する凍結乾燥サイクル内の要点を精密に制御するためのいくつかの異なる条件、並びに凍結乾燥前後のタンパク質構造を含めた全体の完全性を保持するための条件を定義できたことが報告された。
【００５４】
ＶＩ．試作品フリーズドライワクチンの生成
表１に示した一般的な凍結乾燥スキームに従って、一連のフリーズドライ処方を作製した。１０ｍＭヒスチジン若しくは酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ６中に１．０ｍｇ  Ａｌ／ｍＬ、８ｗ／ｖ％トレハロース及び０．２若しくは０ｍｇ／ｍＬ  ｒＲＴＡを含有する、ＲＴＡタンパク質を含むフリーズドライ処方及びタンパク質を含まないプラセボ処方を、凍結乾燥前に予冷する（ＰＣ）又は凍結乾燥前に室温でインキュベーションするいずれかの状態で作製した。４〜８℃で１時間、攪拌子を用いて混合し、タンパク質をアルハイドロゲルアジュバントに吸着させることによって、処方を調製した。処方１ｍＬを、３ｍＬのガラス製バイアルに入れ、表４に説明したようにフリーズドライした。各工程条件からのサンプルを、４０℃でインキュベートし、分析及びワクチン接種試験のために１週目、１ヵ月目（及び６ヵ月間に渡って続ける）に取り出した。凍結乾燥前後のサンプルも得た。
【表５】
2014516967.tif 000006
【００５５】
ＶＩＩ．再構成乾燥ワクチンの粒度分析
フリーズドライ前の溶液について及び１ｍＬ脱イオン水に再構成したフリーズドライサンプルについて、粒度分析を行った。Ｂｅｃｋｍａｎ製ＬＳ  ２３０機器を使用して、レーザー回折粒度分析を実行した。分析する際に、サンプルチャンバに超音波処理は行わなかった。粒度分布を算出するために使用したモデルには、１．３３の溶液屈折率及び１．５７のサンプル屈折率を使用した。測定値を取得する前に、分析装置中のろ過したＤＩ水におよそ６ｍＬのサンプルを添加する必要があった。各測定について、３／９２の平均粒度分布を取得した。各処方について、３回の測定を行った。プラセボ安定性試験サンプルの粒度分布を、レーザー回折を使用して観察した。表５で分かるように、開始時の時間０での液体処方は全て、表面領域に基づいて類似の粒度分布及び平均粒度であった。処方を室温からトレイフリーズドライしたとき、粒度の増加が見られた。処方を−１０℃に予冷した棚からトレイフリーズドライしたとき、粒度分布は開始時の粒度分布に極めて類似した状態を保った。
【表６】
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【００５６】
ＶＩＩＩ．動物のワクチン接種
０日目及び２０日目に、雌のＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウス５〜６週齢に、１０マイクログラムのＲＴＡタンパク質を含有する表示の処方５０μＬを皮下にワクチン接種した。０、２０及び３４日目に、イソフルランによる麻酔下のマウスを、眼窩後腔を通して採血し、およそ２００μＬの血液を集めた。各群に、１０匹のマウスを使用した。マウスは１檻につき５匹飼育され、飼料と水は常に許された。１０，０００ｒｐｍで、４℃で、１４分間遠心分離することにより、血液と血清とを分離した。
【００５７】
ＥＬＩＳＡによって、ワクチン接種したＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスから採った個々の血清中のＲＴＡに対する抗体総量を決定し、中和抗体を決定した（図６及び図７）。ＰＢＳ中に１μｇ  ｒＲＴＡ／ｍＬになるよう希釈した貯蔵タンパク質５０μＬ／ウェルでＮｕｎｃ平底ＭａｘｉＳｏｒｂ９６ウェルプレートを被覆し、２〜６℃で終夜インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ  ３００μＬ／ウェルで、プレートを４回洗浄した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳ  ３００μＬ／ウェルでプレートをブロッキングし、室温で２時間インキュベートした。前述したように、プレートを洗浄した。１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ４０μＬを、各々のウェルに添加した。１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳの希釈緩衝液に、血清を最初に希釈した。サンプル７０μＬを開始ウェルに添加し、次いで、各サンプルについてプレートに７つの２．３３倍希釈を作製した。次いで、プレートを室温で２時間インキュベートした。プレートを再度洗浄した。１０，０００倍に希釈したＨＲＰ結合ロバ抗マウス抗体４０μＬを、各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを、再度洗浄した。ＴＭＢを、各ウェルに４０μＬ添加し、３０分間インキュベートした。２Ｎ硫酸の停止溶液を、各ウェルに４０μＬ添加した。プレートを、４５０ｎｍで読み取った。ワクチン接種したマウスから採った個々の血清サンプルのエンドポイント希釈分析を、図１５に示す。試験したワクチンを、以下の通りに略記する：
ＲＴ  Ｈｉｓ−陰性対照（タンパク質無しヒスチジン中で室温トレイフリーズドライ）
ＲＴ  ＡＡ−陰性対照（タンパク質無し酢酸アンモニウム中で室温トレイフリーズドライ）
Ｈｉｓ＋ｒＲＴＡ液体−陽性対照（タンパク質有りヒスチジン中の液体処方）
ＲＴ  Ｈｉｓ＋ｒＲＴＡ−実験１（タンパク質有りヒスチジン中で室温トレイフリーズドライ）
ＲＴ  ＡＡ＋ｒＲＴＡ−実験２（タンパク質有り酢酸アンモニウム中で室温トレイフリーズドライ）
ＲＰＣ  Ｈｉｓ＋ｒＲＴＡ−実験３（タンパク質有りヒスチジン中で予冷したトレイフリーズドライ）
ＰＣ  ＡＡ＋ｒＲＴＡ−実験４（タンパク質有り酢酸アンモニウム中で予冷したトレイフリーズドライ）
【００５８】
ワクチンを４０℃で１又は１ヵ月間貯蔵したとき、１０マイクログラムを１回注射（３週目の力価）又は２回注射（５週目）した後に、４０℃で貯蔵せずに調製したワクチン（図１５における時間０）との関係において、ＲＴＡに対する抗体を生成するワクチンの能力に著しい差異は無かった（ＥＬＩＳＡによる）。３週目には、各実験マウスの９０〜１００％及び陽性対照群が応答し、５週目までには全ての実験及び陽性対照が応答した（表３）。より重要なことに、２回接種後（５週目）から得た血清はリシンを中和する抗体（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）を含有し、力価及びそのような力価を持つマウスの比率は時間０のワクチン（図１６）又は液体ワクチン（図１７）と明白な差異が無かった。更に、フリーズドライ前に室温トレイ上に置いたワクチンを投与したマウスから採った血清において、凍結乾燥したＲＴＡワクチンを４０℃で１ヵ月間貯蔵した後に中和力価は低下した。対照的に、フリーズドライ前に予冷することによって作製したワクチンは、液体ワクチンで免疫したものより強い総及び中和抗ＲＴＡ力価を有した。
【表７】
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【００５９】
ＩＸ．二次共アジュバントを含有するワクチンを用いる動物のワクチン接種
表１に示した一般的な凍結乾燥スキームに従って、一連のフリーズドライ処方を作製した。１．０ｍｇ  Ａｌ／ｍＬ、８ｗ／ｖ％トレハロース及び０．２又は０ｍｇ／ｍＬ  ｒＲＴＡ並びにＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）から入手したＴＬＲ−４アゴニスト（ＰＨＡＤと称されるモノホスホリルリピドＡ合成誘導体（ＭＰＬ））６０マイクログラムを含有する、ＲＴＡタンパク質を含むフリーズドライ処方及びタンパク質を含まないプラセボ処方を作製した。ワクチンは、いくつかの異なる方法で作製された。方法（１）において、ＲＴＡタンパク質を、１０ｍＭヒスチジン又は酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ６、８％トレハロース存在下で、水酸化アルミニウムに吸着（結合）させ、続いて水性懸濁液にＰＨＡＤアゴニストを添加した。この方法の場合、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０及び１４４ｍＭ  ＮａＣｌから成る安定剤緩衝液中に貯蔵したＲＴＡを、グリセリン及び塩を含まない緩衝液中での透析に供した後に、アルミニウムアジュバントに吸着させた。方法（２）において、安定化グリセリン緩衝液中で貯蔵したＲＴＡを、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、１４４ｍＭ  ＮａＣｌに１０倍希釈した後に、希釈した安定化緩衝液にアルミニウムを添加した。この方法の場合、４℃で５時間以上吸着を起こさせておき、その結果９５％を超えるＲＴＡが、アルミニウムゲル粒子に結合した。その後、アルミニウム粒子を吸着容器の底に沈殿させて、又は混合物を遠心分離に供して、粒子と水性緩衝液とを分離した。このアルミニウム混合物に、８％トレハロースを含有する緩衝液系（酢酸アンモニウム又はヒスチジン）を添加した。この方法で、系の等張性を維持することができた。方法１及び方法２の場合、その後の凍結乾燥は、凍結乾燥前に予冷する（ＰＣ）又は凍結乾燥前に室温でインキュベーションするいずれかの状態で進めた。
【００６０】
各工程条件からのサンプルを、４℃及び４０℃でインキュベートし、分析及びワクチン接種試験のために１週目、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、６ヵ月、９ヵ月、１２ヵ月、１８ヵ月及び２４ヵ月目に取り出した。効力分析の場合、ＲＴＡ免疫原の用量を変化させるが、アジュバント成分（アルミニウム及びＰＨＡＤ）を一定に保つ濃度範囲で、Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスをワクチン接種した。対照試験の場合、ＰＨＡＤ含有凍結乾燥ワクチンと同じ用量範囲を使用して、共アジュバントＰＨＡＤを含有しないワクチンでマウスをワクチン接種した。２種類のワクチン接種手順を使用した。
【００６１】
１組のマウスを試験１日目に１用量のワクチンでワクチン接種し、もう１組のマウスを試験１日目及び２１日目にワクチンでワクチン接種した。各ワクチン接種時及びその２週間後に、動物から血清を得た。最終的な分析では、３５日目に、マウスを１０ｘＬＤ５０のリシン毒素に曝露し、生存を記録した。共アジュバントを含まないワクチンと比較して、ＰＨＡＤを含有する再構成された乾燥ワクチンサンプルを用いてワクチン接種した動物によって、リシン曝露に供したときに血清学的エンドポイント（ＲＴＡ反応性抗体総量及びリシン中和抗体）に対する用量反応曲線が、低用量のＲＴＡ免疫原の方へ著しく移動することが実証され、また低用量範囲での防御免疫も実証された。高温でインキュベートしたワクチンサンプルも同様に著しい免疫応答の強化が実証され、ワクチン成分の全てが安定化したことが示された。更に、ＰＨＡＤワクチンは、中和抗体の高力価に反映される広い免疫応答及び中和エピトープの広い応答を誘導した。
【００６２】
Ｘ．ガラス転移温度
ガラス転移温度（Ｔｇ）は、ワクチン生成物の安定性の指標である。Ｔｇ以下又はその近くでは、ワクチンはガラスとして振る舞い、ワクチンの全ての成分がガラス内で安定化される。Ｔｇを超えると、サンプルは不安定になり、マトリックス内の成分も不安定になる。Ｔｇは、以下の方法にある示差走査熱量測定によって測定される。サンプルのＴｇは、１０℃／分の速度で０℃から１５０℃へと制御された温度プログラムにサンプルを供することによって決定される。サンプルへの／からの熱流量が測定され、基準値の移動として表される。Ｔｇは、この基準値移動の中間点における温度として表される。
【００６３】
ＤＳＣ分析に供した凍結乾燥ＲＴＡワクチンは、１００℃を超える高いガラス転移温度及び０．５％未満の水分含量を実証する（カールフィッシャー分析）。
【００６４】
この明細書及び添付の特許請求の範囲において使用するように、単数形は複数形を含む。例えば、文脈に別段の明確な指図がない限り、用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含む。加えて、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、一連の全ての要素のことを指すと理解されるものとする。本明細書において例示的に記載される本発明は、本明細書において特に開示しないどんな要素（単数又は複数）、制限（単数又は複数）が無い場合も最適に実行され得る。したがって、例えば用語、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などは、拡張的に、制限なしに読み取るものとする。更に、本明細書に使用されている用語及び表現は、説明の用語として使用され限定するものではなく、そのような用語並びに表現の使用において図示及び記述された将来のいかなる等価物又はそのいかなる部分も排除する意図はなく、特許請求されている本発明の範囲内で様々な修正が可能であることは認識されよう。したがって、本発明を好ましい実施形態及び任意の特徴によって具体的に開示してきたが、本明細書に開示された本発明の修正及び変形は当業者によって使用されてよく、そのような修正及び変形は、本明細書に開示された本発明の範囲内に含まれると見なされることを理解されたい。本発明については、本明細書に広く、一般的に記述されてきた。一般的開示の範囲に含まれるそれぞれのより狭い種及び亜属集団もまた、本発明の一部を形成する。これは、削除された材料が本明細書に具体的に属したか否かに関わらず、その属の任意の対象を除くという条件又は消極的な限定を伴って、各発明の一般的記述を含む。加えて、発明の特徴又は態様がマーカッシュグループ（Ｍａｒｋｕｓｈ  ｇｒｏｕｐ）の用語で記述される場合、当業者は、本発明がマーカッシュグループの任意の個別のメンバー又はメンバーのサブグループの用語によって記述されることも認識するはずである。前記説明が例示的であり限定的でないことを意図することも、理解されよう。多くの実施形態は、前記説明を見直せば、即座に当業者に明らかになる。したがって、本発明の範囲は前記説明を参照して決定されるべきではなく、その代わりに、添付の特許請求の範囲を、そのような請求項が付与する等価物の完全な範囲と同時に参照して決定されるべきである。当業者は、記載される本発明の特定の実施形態の多くの等価物を僅かな通常の実験を用いて、認識又は確認することができるようになる。そのような等価物は、以下の請求項に包含されることを意図する。
【図５（ａ）−５（ｃ）】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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