(57)【要約】宿主細胞におけるアセチル−ＣｏＡ由来イソプレノイドの異種生産のための組成物および方法を本明細書に提供する。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）（ＡＤＡ、Ｅ．Ｃ．１．２．１．１０）と、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含むＭＥＶ経路とをコードしている異種ヌクレオチド配列を含むように遺伝子改変されている。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ＡＤＡと、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼを含むＭＥＶ経路とをコードしている異種ヌクレオチド配列を含むように遺伝子改変される。一部の実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、ホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼをコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、天然ＰＤＨ−バイパスの機能破壊をさらに含む。
2014532444.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、
（ａ）イソペンテニルピロリン酸を作るためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種核酸と、
（ｂ）アシル化アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＤＡ）をコードしている異種核酸と
を含む細胞。
【請求項２】
前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素が、アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡと縮合させてアセトアセチル−ＣｏＡを形成する酵素を含む、請求項１に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項３】
前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素が、アセチル−ＣｏＡ：マロニル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼを含む、請求項１または請求項２に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項４】
前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素が、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）をメバロネートに変換するＮＡＤＨ使用酵素を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項５】
前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素が、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項６】
ホスホケトラーゼ（ＰＫ）をコードしている異種核酸をさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項７】
ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）をコードしている異種核酸をさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項８】
天然ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）−バイパスの１つ以上の酵素の機能破壊をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項９】
前記ＰＤＨ−バイパスの１つ以上の酵素が、アセチル−ＣｏＡシンターゼ１（ＡＣＳ１）、アセチル−ＣｏＡシンターゼ２（ＡＣＳ２）、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ６（ＡＬＤ６）から選択される、請求項８に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項１０】
ＡＣＳ１が、機能的に破壊されている、請求項９に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項１１】
ＡＣＳ２が、機能的に破壊されている、請求項９に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項１２】
ＡＬＤ６が、機能的に破壊されている、請求項９に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項１３】
ＡＣＳ１およびＡＣＳ２が、機能的に破壊されている、請求項９に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項１４】
ＡＣＳ１、ＡＣＳ２およびＡＬＤ６が、機能的に破壊されている、請求項９に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項１５】
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）活性を有する１つ以上の酵素の機能破壊をさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項１６】
ＡＤＨ活性を有する前記１つ以上の酵素が、アルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ１）、アルコールデヒドロゲナーゼ３（ＡＤＨ３）、アルコールデヒドロゲナーゼ４（ＡＤＨ４）およびアルコールデヒドロゲナーゼ５（ＡＤＨ５）から選択される、請求項１５に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項１７】
前記ＡＤＡのアミノ酸配列が、配列番号２と少なくとも８０％同一である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項１８】
前記アセチル−ＣｏＡ：マロニル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列が、配列番号１６と少なくとも８０％同一である、請求項３に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項１９】
前記ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのアミノ酸配列が、配列番号２０と少なくとも８０％同一である、請求項５に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項２０】
前記ホスホケトラーゼ（ＰＫ）のアミノ酸配列が、配列番号１２と少なくとも８０％同一である、請求項６に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項２１】
前記ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）のアミノ酸配列が、配列番号１４と少なくとも８０％同一である、請求項７に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項２２】
前記ＭＥＶ経路の前記１つ以上の酵素が、アセチル−ＣｏＡの２つの分子を縮合させてアセトアセチル−ＣｏＡを形成する酵素を含む、請求項１、４から１７、および１９から２１のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項２３】
前記ＭＥＶ経路の前記１つ以上の酵素が、アセトアセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡと縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項２４】
前記ＭＥＶ経路の前記１つ以上の酵素が、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換する酵素を含む、請求項１から３、６から１８、および２０から２２のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項２５】
前記ＭＥＶ経路の前記１つ以上の酵素が、メバロネートをメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項２６】
前記ＭＥＶ経路の前記１つ以上の酵素が、メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する酵素を含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項２７】
前記ＭＥＶ経路の前記１つ以上の酵素が、メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素を含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項２８】
前記ＭＥＶ経路の前記１つ以上の酵素が、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼおよびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼから選択される、請求項１から２７のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項２９】
前記ＭＥＶ経路の前記酵素のすべてをコードしている複数の異種核酸を含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項３０】
前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素をコードしている前記１つ以上の異種核酸が、単一の転写調節因子の制御下にある、請求項１から２９のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項３１】
前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素をコードしている前記１つ以上の異種核酸が、複数の異種転写調節因子の制御下にある、請求項１から２９のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項３２】
イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換し得る酵素をコードしている異種核酸をさらに含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項３３】
ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合させてポリプレニル化合物を形成し得る酵素をコードしている異種核酸をさらに含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項３４】
ＩＰＰまたはポリプレニルを修飾してイソプレノイド化合物を形成し得る酵素をコードしている異種核酸をさらに含む、請求項１から３３のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項３５】
ＩＰＰまたはポリプレニルを修飾してイソプレノイド化合物を形成し得る前記酵素が、カレンシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、リナロールシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、オシメンシンターゼ、α−ピネンシンターゼ、β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、β−ファルネセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、パチュロールシンターゼ、ノートカトンシンターゼおよびアビエタジエンシンターゼからなる群より選択される、請求項３４に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項３６】
前記イソプレノイドが、ヘミテルペン、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペンおよびポリテルペンからなる群より選択される、請求項３４に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項３７】
前記イソプレノイドが、セスキテルペンである、請求項３４に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項３８】
前記イソプレノイドが、Ｃ５〜Ｃ２０イソプレノイドである、請求項３４に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項３９】
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチュロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレンおよびバレンセンからなる群より選択される、請求項３４に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項４０】
前記細胞が、酵母細胞である、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項４１】
前記酵母細胞が、Ａｃｉｃｕｌｏｃｏｎｉｄｉｕｍ、Ａｍｂｒｏｓｉｏｚｙｍａ、Ａｒｔｈｒｏａｓｃｕｓ、Ａｒｘｉｏｚｙｍａ、Ａｓｈｂｙａ、Ｂａｂｊｅｖｉａ、Ｂｅｎｓｉｎｇｔｏｎｉａ、Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ、Ｂｏｔｒｙｏｚｙｍａ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｂｕｌｌｅｒａ、Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｄｅｋｋａｒａ、Ｄｉｐｏｄａｓｃｏｐｓｉｓ、Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ、Ｅｅｎｉｅｌｌａ、Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｅｌｌａ、Ｅｒｅｍａｓｃｕｓ、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｈａｓｅｇａｗａｅａ、Ｈｏｌｔｅｒｍａｎｎｉａ、Ｈｏｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈｉａ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａｓｐｏｒａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｏｎｄｏａ、Ｋｕｒａｉｓｈｉａ、Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ、Ｍｒａｋｉａ、Ｍｙｘｏｚｙｍａ、Ｎａｄｓｏｎｉａ、Ｎａｋａｚａｗａｅａ、Ｎｅｍａｔｏｓｐｏｒａ、Ｏｇａｔａｅａ、Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ、Ｐｈａｃｈｙｔｉｃｈｏｓｐｏｒａ、Ｐｈａｆｆｉａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｓａｉｔｏｅｌｌａ、Ｓａｋａｇｕｃｈｉａ、Ｓａｔｕｒｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｃｈｉｚｏｂｌａｓｔｏｓｐｏｒｉｏｎ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｒｏｐａｃｈｙｄｅｒｍｉａ、Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ、Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ、Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｅｓ、Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｅｌｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ、Ｔｓｕｃｈｉｙａｅａ、Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅｓ、Ｗａｌｔｏｍｙｃｅｓ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ、Ｙａｍａｄａｚｙｍａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｚｙｇｏａｓｃｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｚｙｇｏｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ、およびＺｙｇｏｚｙｍａからなる群より選択される属に属する、請求項４０に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項４２】
前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｄｅｋｋｅｒａ  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ  （以前はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓと呼ばれていた）、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓおよびＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（今ではＰｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａとして公知）からなる群より選択される、請求項４０に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項４３】
前記酵母が、Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓおよびＣａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓからなる群より選択される、請求項４０に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項４４】
前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項４０に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項４５】
前記酵母が、パン酵母、ＣＢＳ  ７９５９、ＣＢＳ  ７９６０、ＣＢＳ  ７９６１、ＣＢＳ  ７９６２、ＣＢＳ  ７９６３、ＣＢＳ  ７９６４、ＩＺ−１９０４、ＴＡ、ＢＧ−１、ＣＲ−１、ＳＡ−１、Ｍ−２６、Ｙ−９０４、ＰＥ−２、ＰＥ−５、ＶＲ−１、ＢＲ−１、ＢＲ−２、ＭＥ−２、ＶＲ−２、ＭＡ−３、ＭＡ−４、ＣＡＴ−１、ＣＢ−１、ＮＲ−１、ＢＴ−１およびＡＬ−１からなる群より選択されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株である、請求項４４に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項４６】
イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、
（ａ）イソペンテニルピロリン酸を作るためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種核酸と、
（ｂ）アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）（ＡＤＡ）をコードしている異種核酸と、
（ｃ）アセチル−ＣｏＡシンターゼ１（ＡＣＳ１）、アセチル−ＣｏＡシンターゼ２（ＡＣＳ２）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ６（ＡＬＤ６）からなる群より選択される天然ＰＤＨ−バイパスの少なくとも１つの酵素の機能破壊と、
（ｄ）ホスホケトラーゼ（ＰＫ）をコードしている異種核酸と、
（ｅ）ホスホケトラーゼ（ＰＴＡ）をコードしている異種核酸と
を含む、遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項４７】
イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、
（ａ）イソペンテニルピロリン酸を作るためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種核酸であって、該１つ以上の酵素が、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む、１つ以上の異種核酸と、
（ｂ）アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）（ＡＤＡ）をコードしている異種核酸と、
（ｃ）アセチル−ＣｏＡシンターゼ１（ＡＣＳ１）、アセチル−ＣｏＡシンターゼ２（ＡＣＳ２）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ６（ＡＬＤ６）からなる群より選択される天然ＰＤＨ−バイパスの少なくとも１つの酵素の機能破壊と
を含む、遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項４８】
イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、
（ａ）イソペンテニルピロリン酸を作るためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種核酸であって、該１つ以上の酵素が、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む、１つ以上の異種核酸と、
（ｂ）アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）（ＡＤＡ）をコードしている異種核酸と、
（ｃ）アセチル−ＣｏＡシンターゼ１（ＡＣＳ１）、アセチル−ＣｏＡシンターゼ２（ＡＣＳ２）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ６（ＡＬＤ６）からなる群より選択される天然ＰＤＨ−バイパスの少なくとも１つの酵素の機能破壊と
（ｄ）ホスホケトラーゼ（ＰＫ）をコードしている異種核酸と、
（ｅ）ホスホケトラーゼ（ＰＴＡ）をコードしている異種核酸と
を含む、遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項４９】
イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、
（ａ）イソペンテニルピロリン酸を作るためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種核酸であって、該１つ以上の酵素が、アセチル−ＣｏＡ：マロニル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼを含む、１つ以上の異種核酸と、
（ｂ）アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）（ＡＤＡ）をコードしている異種核酸と、
（ｃ）アセチル−ＣｏＡシンターゼ１（ＡＣＳ１）、アセチル−ＣｏＡシンターゼ２（ＡＣＳ２）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ６（ＡＬＤ６）からなる群より選択される天然ＰＤＨ−バイパスの少なくとも１つの酵素の機能破壊と
を含む、遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項５０】
イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、
（ａ）イソペンテニルピロリン酸を作るためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の複数の酵素をコードしている１つ以上の異種核酸であって、該複数の酵素が、アセチル−ＣｏＡ：マロニル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼおよびＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む、１つ以上の異種核酸と、
（ｂ）アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）（ＡＤＡ）をコードしている異種核酸と、
（ｃ）アセチル−ＣｏＡシンターゼ１（ＡＣＳ１）、アセチル−ＣｏＡシンターゼ２（ＡＣＳ２）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ６（ＡＬＤ６）からなる群より選択される天然ＰＤＨ−バイパスの少なくとも１つの酵素の機能破壊と
（ｄ）ホスホケトラーゼ（ＰＫ）をコードしている異種核酸と、
（ｅ）ホスホケトラーゼ（ＰＴＡ）をコードしている異種核酸と
を含む、遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項５１】
イソプレノイドを生産するための方法であって、
（ａ）請求項１から５０のいずれか一項に記載の遺伝子改変された酵母細胞の集団を、炭素源を有する培地において、該イソプレノイド化合物の製造に適する条件下で培養すること；および
（ｂ）該イソプレノイド化合物を培地から回収すること
を含む方法。
【請求項５２】
前記イソプレノイド化合物が、培地１リットルにつき約１０グラムより多い量で生産される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記イソプレノイド化合物が、乾燥細胞重量１グラムにつき約５０ｍｇより多い量で生産される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記宿主細胞が、前記ＡＤＡをコードしている異種ヌクレオチド配列を含まない同じ宿主細胞と比較して増加された量のイソプレノイド化合物を生産する、請求項５１から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記増加された量が、少なくとも１０％である、請求項５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１１年１１月９日に出願した米国仮出願第６１／５５７，８９３号の優先権の利益を主張する。米国仮出願第６１／５５７，８９３号の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
１．発明の分野
本開示は、（遺伝子）操作された宿主細胞においてアセチル−ＣｏＡを生産するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．背景
アセチル補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）は、ポリケチド、脂肪酸、イソプレノイド、フェノール類、アルカロイド、ビタミンおよびアミノ酸をはじめとする必要不可欠な生体化合物の合成における重要な中間体である。アセチル−ＣｏＡに由来する代謝産物には一次および二次代謝産物があり、それらは工業的に有用な化合物を含む。例えばイソプレノイドは、医薬製品において、ならびにバイオ燃料、食品添加物および他の特殊化学製品として使用される。イソプレノイド製品は、不規則なイソプレノイドおよびポリテルペンが報告されているが、典型的には、５炭素イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）繰り返し単位からなる。自然界では、イソプレノイドは、それらの前駆体ＩＰＰとその異性体ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）の逐次的縮合によって合成される。これらの前駆体についての２つの経路が公知である。原核生物は、若干の例外はあるが、典型的にはデオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路を利用してピルビン酸およびグリセルアルデヒド３−リン酸（Ｇ３Ｐ）をＩＰＰおよびＤＭＡＰＰに変換する。真核生物は、植物を除き、一般にはメバロン酸依存性（ＭＥＶ）経路を使用してアセチル−ＣｏＡをＩＰＰに変換し、その後、そのＩＰＰがＤＭＡＰＰに異性体化される。
【０００４】
単細胞真菌Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびその近縁種は、２つの内因性経路を使用してアセチル−ＣｏＡを産生する。１つの経路は、ミトコンドリアマトリックスにおいて起こり、そこではＰＤＨ複合体が、グルコースから解糖によって産生されたピルベートのアセチルＣｏＡへの酸化的脱カルボキシル化を触媒する。前記ＰＤＨ複合体は、６０ポリペプチド鎖−すなわち、リポアミドレダクターゼ−トランスアセチラーゼの２４鎖、ジヒドロリポイル（ｄｉｈｙｄｒｏｌｉｐｙｌ）デヒドロゲナーゼの１２鎖、およびピルビン酸デカルボキシラーゼの２４鎖−からなる。この巨大複合体は、ピルベートをアセチル−ＣｏＡに変換して、ＮＡＤＨを副産物として産生する。その後、その得られたアセチル−ＣｏＡは、エネルギー産生のためにクエン酸回路によってＣＯ２およびＨ２Ｏに完全に酸化されることもあり、またはミトコンドリア内で行われる生合成反応に使用されることもある。
【０００５】
ミトコンドリア内で産生されたアセチル−ＣｏＡは、ミトコンドリア膜を横断してサイトゾルに行くことができない。したがって、重要な一次および二次代謝産物の生合成に必要とされるサイトゾルアセチル−ＣｏＡを産生するために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、「ＰＤＨ−バイパス」として公知の、サイトゾル内にある独立したメカニズムを使用する。この多段階経路は、（１）ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ、ＥＣ４．１．１．１）により、ピルベートのアセトアルデヒドへの脱カルボキシル化を触媒する；（２）１つのＮＡＤＰ＋を１つのＮＡＤＰＨに還元するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤＨ、ＥＣ１．２．１．５およびＥＣ１．２．１．４）により、アセトアルデヒドのアセテートへの変換を触媒する；および（３）１つのＡＴＰを１つのＡＭＰに加水分解する（２つのＡＤＰへの２つのＡＴＰ加水分解のエネルギー当量）、アセチル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ、ＥＣ６．２．１．１）により、アセテートおよびＣｏＡからのアセチル−ＣｏＡの合成を触媒する。
【０００６】
自然は、多くのアセチル−ＣｏＡ由来生体分子の抽出ために収量の低い源しか与えてくれないので、遺伝子改変微生物を使用する発酵生産は、それらの生産の有望な代替策になっている。しかし、アセチル−ＣｏＡ中間体の生産のための天然アセチル−ＣｏＡ経路の利用には、一定の制限がある。例えば、天然ＭＥＶ経路によるイソプレノイド生産は、図１に示すように、３つのアセチル−ＣｏＡ分子と、産生されるメバロネートの各分子に対して２つのＮＡＤＰＨの酸化とを要する。ＰＤＨ−バイパスは、アセチル−ＣｏＡ  １つにつき１つのＮＡＤＰＨを産生する一方で、２ＡＴＰ当量がこのプロセスで消費される。したがって、ＮＡＤＰＨの産生は、天然ＭＥＶ経路の補因子要求量に関しては有益であるが、産生されるメバロネート１つにつき６ＡＴＰ当量の消費は、エネルギー不足の反応を生じさせる結果となる。製品収率を犠牲にして、より多くの炭素源を、例えばＴＣＡ回路および酸化的リン酸化によって、ＡＴＰ合成に転用しなければならないからである。
【０００７】
したがって、アセチル−ＣｏＡ由来化合物を効率的に生産する生産宿主を設計することの課題の１つは、ＡＴＰ要求量を最少にするようにアセチル−ＣｏＡ生産を最適化すると同時に、生合成経路の補因子および要求量も満たすことである。本明細書に提供する組成物および方法は、この要求に対処し、および関連した利点も提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
３．発明の概要
本明細書に記載する組成物および方法は、アセチル−ＣｏＡ由来イソプレノイドのエネルギー効率の良い、かつ補因子のバランスの取れた生産に備えるものである。異種アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（あるいは「アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセチル化」、「アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アシル化」または「ＡＤＡ」（ＥＣ１．２．１．１０）とも呼ばれる）をアセチル−ＣｏＡのサイトゾル生産のＰＤＨ−バイパスの代替として利用することにより、生産されるアセチル−ＣｏＡの分子１つにつき２当量のＡＴＰが保存される。ＡＤＡは、ＡＴＰを消費せずにアセトアルデヒドを直接アセチル−ＣｏＡに変換し、そのプロセスで１つのＮＡＤ＋を１つのＮＡＤＨに還元する。
【０００９】
ＡＤＡでのＰＤＨ−バイパスの置換から得られるＡＴＰ保存量を、より高い製品産出に利用することができるが、ＡＤＡと天然メバロン酸経路の併用には潜在的欠陥が付随する。第一に、天然ＰＤＨ−バイパスの不活性化は、１つのＮＡＤＰＨ源を除去するが、ＡＤＡによって触媒される反応がＮＡＤＨを生産する。したがって、さらなる経路修飾がなければＡＤＡでのＰＤＨ−バイパスの置換により、ＮＡＤＰＨを消費するイソプレノイド合成に酸化還元不均衡が導入される。
【００１０】
第二に、ＡＤＡは、次の可逆的反応を触媒する：
【数１】
2014532444.tif 000003
アセチル−ＣｏＡを形成するための天然ＰＤＨ−バイパス反応は、この反応がＡＴＰのＡＭＰへの加水分解に結びつけられるので、熱力学的に好適である。対照的に、ＡＤＡ反応は、ＡＴＰに結びつけられず、アセチル−ＣｏＡを形成するための天然ＰＤＨ−バイパス反応よりはるかに平衡に近い。したがって、ＡＤＡによって触媒される前記反応は、アセトアルデヒドのアセチル−ＣｏＡへの変換の背後にある熱力学的駆動力がより低く、さらなる経路修飾がなければＡＤＡの理論的エネルギー獲得を実現できない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書に記載する組成物および方法は、これらの欠点に対処する。一部の実施形態では、ＰＤＨ−バイパスのＡＤＡでの置換によって導入される酸化還元不均衡に対処するために、前記遺伝子改変された宿主細胞は、イソプレノイド経路におけるＮＡＤＨ使用酵素をさらに利用してＡＤＡ産生ＮＡＤＨを消費する。したがって、アルデヒドのアセチル−ＣｏＡへのＡＤＡ媒介変換によって産生されるＮＡＤＨのプールをイソプレノイド合成に直接利用することができる。一部の実施形態において、ＮＡＤＨ使用酵素は、イソプレノイド経路に本来はない酵素である。例えば、前記ＮＡＤＨ使用酵素は、イソプレノイド経路に本来あるＮＡＤＰＨ使用酵素に取って代わることができる。特定の実施形態において、前記ＮＡＤＨ使用酵素は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換するＮＡＤＨ使用３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）である。
【００１２】
一部の実施形態では、前記ＡＤＡ反応の背後にあるより低い熱力学的駆動力に対処するために、前記遺伝子改変された宿主細胞は、メバロン酸経路における第一段階として、アセチル−ＣｏＡの直ぐ下流での熱力学的に好適な反応をさらに利用して、ＡＤＡ反応を引っ張る。一部の実施形態において、アセトアセチル−ＣｏＡのアセチル−ＣｏＡからの形成は、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＡＡＣＳ；あるいはアセチル−ＣｏＡ：マロニル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼと呼ばれる）によって触媒される。ＡＡＣＳによって触媒される前記反応は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼによるマロニル−ＣｏＡの産生の結果として生ずる１つのＡＴＰの加水分解のため、天然メバロン酸経路のアセチル−ＣｏＡチオラーゼによって触媒される反応より熱力学的に好適である（図５）。したがって、ＡＡＣＳは、ＡＤＡ反応を前に行かせるようにアセチル−ＣｏＡをより強く引っ張る。
【００１３】
異種ＡＤＡをこれらの修飾と併用することの利点は、ＭＥＶ経路を含む宿主細胞におけるセスキテルペンファルネセンの理論収率向上によって例示される。天然メバロン酸経路によるイソプレノイド生産を図１および図２に図示する。図３に示すように、サイトゾルアセチル−ＣｏＡを、天然酵母代謝ネットワークにおいて発生する化学反応のみを使用してグルコースから合成する場合、メバロン酸経路によるグルコースのファルネセンへの変換についての最大可能化学量論的収率は、２３．６重量％であり、４．７７のグルコース分子がファルネセンの各分子の合成に必要とされる。ファルネセン１分子につき２７ＡＴＰが要求され、そのうちの１８は、ＰＤＨ−バイパスによるアセトアルデヒドからのサイトゾルアセチル−ＣｏＡの合成で消費される。しかし、図４に図示するように、ＡＤＡおよびＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼによって触媒される反応をメバロネート生産の代謝ネットワークに含めることにより、最大理論化学量論的収率は、２５．２重量％に向上される。詳細には、ＡＤＡは、一切ＡＴＰインプットなしでアセトアルデヒドをアセチル−ＣｏＡに変換する；これは、ファルネセン合成に必要とされるＡＴＰ当量を９に低減させ、その結果、生産されるファルネセン１分子につき１８ＡＴＰ当量（（２ＡＴＰ当量／アセチル−ＣｏＡ）×（９アセチル−ＣｏＡ／１ファルネセン））が保存される。アセチル−ＣｏＡ生産中のＡＴＰ使用量のこの保存は、ファルネセン生産のためにＴＣＡ回路を実行するための細胞の酸素必要量を削減する。グルコースのファルネセンへの変換のための酸素要求量は、消費されるグルコース１つにつきＯ２分子７．８から６へと減少し、その結果、発酵槽に酸素を供給する大きな生産コストが大規模に低減される。加えて、酸化還元不均衡は、ＡＤＡによって産生されるＮＡＤＨを消費するＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの同時導入によって緩和される。
【００１４】
図４に示すように、ＡＤＡとＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの両方を含む株には、細胞が維持および成長のために使用することができる化学量論的過剰量のＡＴＰが残存する。あるいは、この過剰ＡＴＰの一部を、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＡＡＣＳ）の導入によりアセトアセチル−ＣｏＡ生産の動態の向上に利用することができる。図５に図示するように、ＡＡＣＳは、マロニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを合成する酵素である。マロニル−ＣｏＡ合成は、（アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼによって触媒されて）変換されるアセチル−ＣｏＡの１分子につき１ＡＴＰのエネルギーインプットを要し、それによって、アセチル−ＣｏＡからのアセトアセチル−ＣｏＡ合成の熱力学的駆動力を向上させる。重要なこととして、これは、図６に図示するようにこの株の設計には利用可能な過剰ＡＴＰがまだあるので、この経路の糖または酸素要求量からのファルネセンの最大化学量論的収率に影響を及ぼさない。
【００１５】
図７に示すように、ホスホケトラーゼ（ＰＫ）およびホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）酵素の導入によりさらなる効率を得ることができる。ＰＫおよびＰＴＡは、フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）またはキシルロース（ｘｙｕｌｏｓｅ）−５−リン酸（Ｘ５Ｐ）をアセチル−ＣｏＡに変換するための反応を触媒する。利用可能なこれらの代謝経路を用いて、最適で、前記反応ネットワークは、２９．８重量％物質収率以上に達すること、最大理論収率の有意な増加、が可能である。この解決法は、低解糖（ｌｏｗｅｒ  ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）（Ｇ３Ｐ→ピルベート）からの炭素の転用を含み、その結果、ＡＴＰおよびＮＡＤＨ（これらの両方が、ＡＤＡおよびＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ修飾を含むネットワーク内に既に過剰にある）の産生がより少なくなる。低解糖によってフラックスを低下させることの１つの利点は、ピルベートのアセトアルデヒドへの変換の際により少ないＣＯ２が生産される点であり、したがって、より多くの炭素が最終製品内に捕捉され、その結果、ネットワークの最大理論収率を増加させることができる。第二の利点は、より少ないＮＡＤＨが生産される点であり、したがって、それを再酸化させるために必要とされる酸素が有意に少ない。詳細には、酸素要求量は、最適で、消費されるグルコース１つにつきたった１．８４のＯ２分子である。ＰＫおよびＰＴＡのＡＤＡバックグラウンドへの追加についての酸化還元インパクトは、図１３に図示するように、マイクロスケールでの低収率ではあるものの明白であり、グリセロール生産が野生型レベルに戻る。
【００１６】
したがって、遺伝子改変された宿主細胞、およびアセチル−ＣｏＡ由来イソプレノイドの生産のためのそれらの使用方法を、本明細書に提供する。１つの態様では、イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、（ａ）イソペンテニルピロリン酸を作るためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種核酸と（ｂ）アシル化アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードしている異種核酸とを含む細胞を、本明細書に提供する。
【００１７】
一部の実施形態において、前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素は、アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡと縮合させてアセトアセチル−ＣｏＡを形成する酵素を含む。一部の実施形態において、前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素は、アセチル−ＣｏＡ：マロニル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ（すなわち、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＡＡＣＳ））を含む。
【００１８】
一部の実施形態において、前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換するＮＡＤＨ使用酵素を含む。一部の実施形態において、前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素は、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む。
【００１９】
一部の実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、ホスホケトラーゼをコードしている異種核酸をさらに含む。一部の実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、ホスホトランスアセチラーゼをコードしている異種核酸をさらに含む。
【００２０】
一部の実施形態において、前記ＡＤＡのアミノ酸配列は、配列番号２と少なくとも８０％同一である。一部の実施形態において、前記アセチル−ＣｏＡ：マロニル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１６と少なくとも８０％同一である。一部の実施形態において、前記ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのアミノ酸配列は、配列番号２０と少なくとも８０％同一である。一部の実施形態において、前記ホスホケトラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１２と少なくとも８０％同一である。一部の実施形態において、前記ホスホトランスアセチラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１４と少なくとも８０％同一である。
【００２１】
一部の実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、天然ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）−バイパスの１つ以上の酵素の機能破壊をさらに含む。一部の実施形態において、前記ＰＤＨ−バイパスの１つ以上の酵素は、アセチル−ＣｏＡシンターゼ１（ＡＣＳ１）、アセチル−ＣｏＡシンターゼ２（ＡＣＳ２）、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ６（ＡＬＤ６）から選択される。一部の実施形態において、ＡＣＳ１は、機能的に破壊されている。一部の実施形態において、ＡＣＳ２は、機能的に破壊されている。一部の実施形態において、ＡＬＤ６は、機能的に破壊されている。一部の実施形態において、ＡＣＳ１およびＡＣＳ２は、機能的に破壊されている。一部の実施形態において、ＡＣＳ１、ＡＣＳ２およびＡＬＤ６は、機能的に破壊されている。
【００２２】
一部の実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）活性を有する１つ以上の酵素の機能破壊をさらに含む。一部の実施形態において、ＡＤＨ活性を有する前記１つ以上の酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ１）、アルコールデヒドロゲナーゼ３（ＡＤＨ３）、アルコールデヒドロゲナーゼ４（ＡＤＨ４）およびアルコールデヒドロゲナーゼ５（ＡＤＨ５）から選択される。
【００２３】
一部の実施形態において、前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素は、アセチル−ＣｏＡの２つの分子を縮合させてアセトアセチル−ＣｏＡを形成する酵素を含む。一部の実施形態において、前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素は、アセトアセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡと縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素を含む。一部の実施形態において、前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換する酵素を含む。一部の実施形態において、前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素は、メバロネートをメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素を含む。一部の実施形態において、前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素は、メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する酵素を含む。一部の実施形態において、前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素は、メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素を含む。一部の実施形態において、前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼおよびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼから選択される。
【００２４】
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、前記ＭＥＶ経路のすべての酵素をコードしている複数の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種核酸は、単一の転写調節因子の制御下にある。一部の実施形態において、前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種核酸は、多数の異種転写調節因子の制御下にある。
【００２５】
一部の実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換することができる酵素をコードしている異種核酸をさらに含む。一部の実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合させてポリプレニル化合物を形成することができる酵素をコードしている異種核酸をさらに含む。一部の実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、ＩＰＰまたはポリプレニルを、イソプレノイド化合物を形成するように修飾することができる酵素をコードしている異種核酸をさらに含む。一部の実施形態において、ＩＰＰまたはポリプレニルを、イソプレノイド化合物を形成するように修飾することができる前記酵素は、カレンシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、リナロールシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、オシメンシンターゼ、α−ピネンシンターゼ、β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、β−ファルネセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、パチュロールシンターゼ、ノートカトンシンターゼおよびアビエタジエンシンターゼからなる群より選択される。一部の実施形態において、前記イソプレノイドは、ヘミテルペン、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペンおよびポリテルペンからなる群より選択される。一部の実施形態において、前記イソプレノイドは、Ｃ５〜Ｃ２０イソプレノイドである。一部の実施形態において、前記イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチュロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレンおよびバレンセンからなる群より選択される。
【００２６】
一部の実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、酵母細胞である。一部の実施形態において、前記酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【００２７】
もう１つの態様では、イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、（ａ）イソペンテニルピロリン酸を作るためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種核酸と、（ｂ）アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）（ＡＤＡ）をコードしている異種核酸と、（ｃ）アセチル−ＣｏＡシンターゼ１（ＡＣＳ１）、アセチル−ＣｏＡシンターゼ２（ＡＣＳ２）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ６（ＡＬＤ６）からなる群より選択される天然ＰＤＨ−バイパスの少なくとも１つの酵素の機能破壊と、（ｄ）ホスホケトラーゼ（ＰＫ）をコードしている異種核酸と、（ｅ）ホスホケトラーゼ（ＰＴＡ）をコードしている異種核酸とを含む細胞を、本明細書に提供する。
【００２８】
もう１つの態様では、イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、（ａ）イソペンテニルピロリン酸を作るためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種核酸であって、前記１つ以上の酵素が、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む、１つ以上の異種核酸と、（ｂ）アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）（ＡＤＡ）をコードしている異種核酸と、（ｃ）アセチル−ＣｏＡシンターゼ１（ＡＣＳ１）、アセチル−ＣｏＡシンターゼ２（ＡＣＳ２）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ６（ＡＬＤ６）からなる群より選択される天然ＰＤＨ−バイパスの少なくとも１つの酵素の機能破壊とを含む細胞を、本明細書に提供する。
【００２９】
もう１つの態様では、イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、（ａ）イソペンテニルピロリン酸を作るためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種核酸であって、前記１つ以上の酵素が、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む、１つ以上の異種核酸と、（ｂ）アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）（ＡＤＡ）をコードしている異種核酸と、（ｃ）アセチル−ＣｏＡシンターゼ１（ＡＣＳ１）、アセチル−ＣｏＡシンターゼ２（ＡＣＳ２）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ６（ＡＬＤ６）からなる群より選択される天然ＰＤＨ−バイパスの少なくとも１つの酵素の機能破壊と（ｄ）ホスホケトラーゼ（ＰＫ）をコードしている異種核酸と、（ｅ）ホスホケトラーゼ（ＰＴＡ）をコードしている異種核酸とを含む細胞を、本明細書に提供する。
【００３０】
もう１つの態様では、イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、（ａ）イソペンテニルピロリン酸を作るためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１つ以上の酵素をコードしている１つ以上の異種核酸であって、前記１つ以上の酵素が、アセチル−ＣｏＡ：マロニル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼを含む、１つ以上の異種核酸と、（ｂ）アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）（ＡＤＡ）をコードしている異種核酸と、（ｃ）アセチル−ＣｏＡシンターゼ１（ＡＣＳ１）、アセチル−ＣｏＡシンターゼ２（ＡＣＳ２）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ６（ＡＬＤ６）からなる群より選択される天然ＰＤＨ−バイパスの少なくとも１つの酵素の機能破壊とを含む細胞を、本明細書に提供する。
【００３１】
もう１つの態様では、イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、（ａ）イソペンテニルピロリン酸を作るためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の複数の酵素をコードしている１つ以上の異種核酸であって、前記複数の酵素が、アセチル−ＣｏＡ：マロニル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼおよびＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む、１つ以上の異種核酸と、（ｂ）アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）（ＡＤＡ）をコードしている異種核酸と、（ｃ）アセチル−ＣｏＡシンターゼ１（ＡＣＳ１）、アセチル−ＣｏＡシンターゼ２（ＡＣＳ２）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ６（ＡＬＤ６）からなる群より選択される天然ＰＤＨ−バイパスの少なくとも１つの酵素の機能破壊と、（ｄ）ホスホケトラーゼ（ＰＫ）をコードしている異種核酸と、（ｅ）ホスホケトラーゼ（ＰＴＡ）をコードしている異種核酸とを含む細胞を、本明細書に提供する。
【００３２】
もう１つの態様では、イソプレノイドを生産するための方法であって、（ａ）本明細書に記載する遺伝子改変された酵母細胞の集団を、炭素源を有する培地において、前記イソプレノイド化合物の製造に適する条件下で培養すること；および（ｂ）前記イソプレノイド化合物を前記培地から回収することを含む方法を、本明細書に提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、イソペンテニル二リン酸（「ＩＰＰ」）の生産のためのメバロン酸（「ＭＥＶ」）経路の略図を提供する。
【図２】図２は、ＩＰＰおよびジメチルアリルピロリン酸（「ＤＭＡＰＰ」）のゲラニルピロリン酸（「ＧＰＰ」）、ファルネシルピロリン酸（「ＦＰＰ」）およびゲラニルゲラニルピロリン酸（「ＧＧＰＰ」）への変換の略図を提供する。
【図３】図３は、サイトゾルアセチル−ＣｏＡが「野生型」ＰＤＨ−バイパスによって産生されるメバロン酸経路によるグルコースのファルネセンへの変換における炭素および代謝要求量の最適な流れならびに収率の略図を提供する。
【図４】図４は、サイトゾルアセチル−ＣｏＡがＡＤＡよって産生されるメバロン酸経路によるグルコースのファルネセンへの変換における、炭素および代謝要求量の最適な流れならびに収率の略図を提供し、このメバロン酸経路は、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧｒをＮＡＤＰＨ使用ＨＭＧｒの代わりに含む。
【図５】図５は、アセトアセチル−ＣｏＡ（ＡｃＡｃＣｏＡ）がマロニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡ（ＡｃＣｏＡ）からアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＡＡＣＳ）によって合成される、アセチル−ＣｏＡからのファルネセン生産の略図を提供する。マロニル−ＣｏＡ合成は、（アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ１）によって触媒されて）変換されるアセチル−ＣｏＡの１分子につき１ＡＴＰのエネルギーインプットを要する。
【図６】図６は、サイトゾルアセチル−ＣｏＡがＡＤＡよって産生されるメバロン酸経路によるグルコースのファルネセンへの変換における炭素および代謝要求量の最適な流れならびに収率の略図を提供し、このメバロン酸経路は、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧｒをＮＡＤＰＨ使用ＨＭＧｒの代わりに含み、ならびにアセトアセチル−ＣｏＡが、マロニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼによって合成される。
【図７】図７は、サイトゾルアセチル−ＣｏＡがＡＤＡよって産生されるメバロン酸経路によるグルコースのファルネセンへの変換における炭素および代謝要求量の最適な流れならびに収率の略図を提供し、このメバロン酸経路は、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧｒをＮＡＤＰＨ使用ＨＭＧｒの代わりに含み、ならびにホスホケトラーゼ（ＰＫ）およびホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）が、フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）をアセチル−ＣｏＡに変換するための反応を触媒する。
【図８】図８は、Ｓａｃｃｈｏｒｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｓｃ．ｔＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉ（Ｐｍ．）、Ｄｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ（Ｄａ．）およびＳｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉ（Ｓｐ．）からのヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼのＮＡＤＰＨ比活性またはＮＡＤＨ比活性（ｎｍｏｌ／ｍｇ／分として測定）を提供する。
【図９】図９は、ＮＡＤＰＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（Ｓｃ．ｔＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）を含む異種ＭｅｖＴ経路を含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓｃ．）株、またはＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む異種ＭｅｖＴ経路を含む株（Ｐｍ．−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉ；Ｄａ．−−Ｄｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ；Ｓｐ．−−Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉ）についての、野生型ＡＤＨ１およびＡＤＨ１ノックアウト（ａｄｈ１Δ）バックグラウンド、それぞれにおける、２４時間および４８時間後の細胞密度（ＯＤ６００として測定）を提供する。
【図１０】図１０は、ＮＡＤＰＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（Ｓｃ．ｔＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）を含む異種ＭｅｖＴ経路を含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓｃ．）株、またはＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む異種ＭｅｖＴ経路を含む株（Ｐｍ．−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉ；Ｄａ．−−Ｄｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ；Ｓｐ．−−Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉ）についての、野生型ＡＤＨ１とＡＤＨ１ノックアウトバックグラウンドの両方における、２４時間および４８時間後のグリセロール生産（ｇ／Ｌとして測定）を提供する。
【図１１】図１１は、ＮＡＤＰＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（Ｓｃ．ｔＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）を含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓｃ．）株、またはＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む株（Ｐｍ．−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉ；Ｄａ．−−Ｄｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ；Ｓｐ．−−Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉ）についての、野生型ＡＤＨ１とＡＤＨ１ノックアウト（ａｄｈ１Δ）バックグラウンドの両方における、２４時間および４８時間後のメバロン酸生産（ｇ／Ｌとして測定）を提供する。
【図１２】図１２は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株のファルネセン生産および細胞密度を提供するものであり、（Ａ）ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δと結び付けて考えられる異種発現ＡＤＡ（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）、およびＮＡＤＰＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼまたはＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのいずれかを含むＭＥＶ経路；（Ｂ）インタクト（野生型）ＰＤＨ−バイパス、およびＮＡＤＰＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼまたはＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのいずれかを含むＭＥＶ経路を含む。「空」と示されているカラムは、培地のみを有する（細胞なし）ウェルを表す。
【図１３】図１３は、（Ａ）野生型株（Ｙ９６８）；ＡＤＡ（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）を異種発現する株（Ｙ１２８６９）；ならびに（Ｂ）ＡＤＡ（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）、ホスホケトラーゼ（ＰＫ）およびホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）を異種発現する株（Ｙ１２７４５）による、グリセロール生産（上方パネル）およびグルコース消費（下方パネル）を提供する。
【図１４】図１４は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株によるメバロネート生産を提供するものであり、インタクト（野生型）ＰＤＨ−バイパス、またはａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δと結び付けて考えられる異種発現ＡＤＡ（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）のいずれか；およびＥＲＧ１０（アセチル−ＣｏＡチオラーゼ）またはｎｐｈＴ７（アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ）のいずれかを含むＭＥＶ経路を含む。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
５．実施形態の詳細な説明
５．１  用語
本明細書において用いる場合、用語「異種（の）」は、自然界で通常は見つけられないものを指す。用語「異種ヌクレオチド配列」は、自然界で所与の細胞において通常は見つけられないヌクレオチド配列を指す。したがって、異種ヌクレオチド配列は、（ａ）その宿主細胞にとって外来である（すなわち、その細胞にとって「外因性」である）ことがあり；（ｂ）宿主細胞において天然に見つけられる（すなわち「内因性」である）が、その細胞内に不自然な量（例えば、その宿主細胞において天然に見つけられる量より多いもしくは少ない量）で存在することがあり；または（ｃ）宿主細胞において天然に見つけられるが、その天然配座以外に位置することがある。用語「異種酵素」は、自然界での所与の細胞において通常は見つけられない酵素を指す。この用語は、（ａ）所与の細胞にとって外因性である（すなわち、その宿主細胞に天然に存在しないまたはその宿主細胞において所与の状況では天然に存在しないヌクレオチド配列によってコードされている）；および（ｂ）宿主細胞において天然に見つけられる（例えば、その酵素は、その細胞にとって内因性であるヌクレオチド配列によってコードされている）が、その宿主細胞内に不自然な量（例えば、天然に見つけられる量より多いまたは少ない量）で生産される酵素を包含する。
【００３５】
一方、本明細書において分子、特に、酵素および核酸に関連して用いる場合の用語「天然（の）」または「内因性（の）」は、それらが由来するまたは自然界で見つけられる生物において発現される分子を、その発現レベルに関係なく示し、前記発現レベルは、天然微生物におけるその分子の発現レベルより低いこともあり、該発現レベルに等しいこともあり、または該発現レベルより高いこともある。天然酵素またはポリヌクレオチドの発現が組換え微生物では修飾され得ることは理解される。
【００３６】
本明細書で使用する場合、例えば、標的遺伝子、例えばＰＤＨ−バイパスの１つ以上の遺伝子の、「機能的に破壊する」ことまたは「機能的破壊」は、標的遺伝子によってコードされているタンパク質の活性をその宿主細胞において減少させるようにその標的遺伝子を変性させることを意味する。類似して、例えば、標的タンパク質、例えばＰＤＨ−バイパスの１つ以上の酵素の、「機能的に破壊する」ことまたは「機能的破壊」は、タンパク質の活性をその宿主細胞において減少させるようにその標的タンパク質を変性させることを意味する。一部の実施形態では、前記標的遺伝子によってコードされている前記標的タンパク質の活性を前記宿主細胞においてなくす。他の実施形態では、前記標的遺伝子によってコードされている前記標的タンパク質の活性を前記宿主細胞において減少させる。前記標的遺伝子の機能破壊は、遺伝子発現をなくすもしくは低減させるように、または遺伝子産物の活性をなくすもしくは低減させるように、前記遺伝子のすべてまたは一部を欠失させることによって果たすことができる。前記標的遺伝子の機能破壊はまた、発現をなくすもしくは低減させるように前記遺伝子の調節要素、例えば前記遺伝子のプロモーターを突然変異させることによって、または遺伝産物の活性をなくすもしくは低減させるように前記遺伝子のコード配列を突然変異させることによって果たすことができる。一部の実施形態において、前記標的遺伝子の機能破壊は、前記標的遺伝子の完全オープン・リーディング・フレームを除去する結果となる。
【００３７】
本明細書において用いる場合、用語「親細胞」は、本明細書に開示する遺伝子改変された宿主細胞と、その改変された宿主細胞へと（遺伝子）操作される１つ以上の特定の遺伝子改変、例えば、ＡＤＡの異種発現、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの異種発現、ＡＡＣＳの異種発現、ホスホケトラーゼの異種発現、ホスホトランスアセチラーゼの異種発現、およびメバロン酸経路の１つ以上の酵素の異種発現からなる群より選択される１つ以上の改変を含まないことを除き、同一の遺伝学的バックグラウンドを有する細胞である細胞を指す。
【００３８】
本明細書において用いる場合、用語「生産」は、一般に、本明細書に提供する遺伝子改変された宿主細胞によって生産されるイソプレノイドの量を指す。一部の実施形態では、生産を、宿主細胞によるイソプレノイドの収率として表す。他の実施形態では、生産を、イソプレノイドの生産に関する宿主細胞の生産性として表す。
【００３９】
本明細書において用いる場合、用語「生産性」は、経時的に（時間あたりで）、宿主細胞を培養する発酵ブロスの（重量での）量に対する、生産されるイソプレノイドの（重量での）量として表される、宿主細胞によるイソプレノイドの生産を指す。
【００４０】
本明細書において用いる場合、用語「収率」は、重量で、宿主細胞によって消費される炭素源の量に対する、生産されるイソプレノイドの量として表される、宿主細胞によるイソプレノイドの生産を指す。
【００４１】
５．２  アセチル−ＣｏＡ由来イソプレノイドを生産する遺伝子改変された微生物
５．２．１  宿主細胞
本明細書に提供する組成物および方法に有用な宿主細胞としては、古細菌、原核細胞または真核細胞が挙げられる。
【００４２】
適する原核生物宿主としては、様々なグラム陽性、グラム陰性またはグラム不定菌のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。例としては、属：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｎ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｒｏｍｙｃｅｓ、ＳｙｎｎｅｃｏｃｃｕｓおよびＺｙｍｏｍｏｎａｓに属する細胞が挙げられるが、これらに限定されない。原核生物株の例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｇｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｄｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、前記宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞である。
【００４３】
適する古細菌宿主としては、属：Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ、Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、ａｎｄ  Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａに属する細胞が挙げられるが、これらに限定されない。古細菌株の例としては、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．，  Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉおよびＡｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
適切な真核宿主としては、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞および植物細胞が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、本方法において有用な酵母としては、微生物寄託機関（例えば、ＩＦＯ、ＡＴＣＣなど）に寄託されている酵母であって、数ある中でも、以下の属：Ａｃｉｃｕｌｏｃｏｎｉｄｉｕｍ、Ａｍｂｒｏｓｉｏｚｙｍａ、Ａｒｔｈｒｏａｓｃｕｓ、Ａｒｘｉｏｚｙｍａ、Ａｓｈｂｙａ、Ｂａｂｊｅｖｉａ、Ｂｅｎｓｉｎｇｔｏｎｉａ、Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ、Ｂｏｔｒｙｏｚｙｍａ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｂｕｌｌｅｒａ、Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｄｅｋｋａｒａ、Ｄｉｐｏｄａｓｃｏｐｓｉｓ、Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ、Ｅｅｎｉｅｌｌａ、Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｅｌｌａ、Ｅｒｅｍａｓｃｕｓ、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｈａｓｅｇａｗａｅａ、Ｈｏｌｔｅｒｍａｎｎｉａ、Ｈｏｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈｉａ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａｓｐｏｒａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｏｎｄｏａ、Ｋｕｒａｉｓｈｉａ、Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ、Ｍｒａｋｉａ、Ｍｙｘｏｚｙｍａ、Ｎａｄｓｏｎｉａ、Ｎａｋａｚａｗａｅａ、Ｎｅｍａｔｏｓｐｏｒａ、Ｏｇａｔａｅａ、Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ、Ｐｈａｃｈｙｔｉｃｈｏｓｐｏｒａ、Ｐｈａｆｆｉａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｓａｉｔｏｅｌｌａ、Ｓａｋａｇｕｃｈｉａ、Ｓａｔｕｒｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｃｈｉｚｏｂｌａｓｔｏｓｐｏｒｉｏｎ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｒｏｐａｃｈｙｄｅｒｍｉａ、Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ、Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ、Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｅｓ、Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｅｌｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ、Ｔｓｕｃｈｉｙａｅａ、Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅｓ、Ｗａｌｔｏｍｙｃｅｓ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ、Ｙａｍａｄａｚｙｍａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｚｙｇｏａｓｃｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＺｙｇｏｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓおよびＺｙｇｏｚｙｍａに属する酵母が挙げられる。
【００４５】
一部の実施形態において、前記宿主微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｄｅｋｋｅｒａ  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ（以前はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓと呼ばれていた）、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、またはＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（今ではＰｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａとして公知）である。一部の実施形態において、前記宿主微生物は、Ｃａｎｄｉｄａ属の株、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓまたはＣａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓである。
【００４６】
特定の実施形態において、前記宿主微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。一部の実施形態において、前記宿主は、パン酵母、ＣＢＳ  ７９５９、ＣＢＳ  ７９６０、ＣＢＳ  ７９６１、ＣＢＳ  ７９６２、ＣＢＳ  ７９６３、ＣＢＳ  ７９６４、ＩＺ−１９０４、ＴＡ、ＢＧ−１、ＣＲ−１、ＳＡ−１、Ｍ−２６、Ｙ−９０４、ＰＥ−２、ＰＥ−５、ＶＲ−１、ＢＲ−１、ＢＲ−２、ＭＥ−２、ＶＲ−２、ＭＡ−３、ＭＡ−４、ＣＡＴ−１、ＣＢ−１、ＮＲ−１、ＢＴ−１およびＡＬ−１からなる群より選択されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株である。一部の実施形態において、前記宿主微生物は、ＰＥ−２、ＣＡＴ−１、ＶＲ−１、ＢＧ−１、ＣＲ−１およびＳＡ−１からなる群より選択されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株である。特定の実施形態において、前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株は、ＰＥ−２である。もう１つの特定の実施形態において、前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株は、ＣＡＴ−１である。もう１つの特定の実施形態において、前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株は、ＢＧ−１である。
【００４７】
一部の実施形態において、前記宿主微生物は、工業的発酵に適している微生物である。特定の実施形態では、前記微生物は、工業的発酵環境について認知されているストレス条件である高い溶媒濃度、高温、基質利用拡大、栄養制限、糖および塩に起因する浸透圧ストレス、酸性度、亜硫酸塩および細菌汚染またはこれらの組み合わせのもとで生存するように馴化される。
【００４８】
５．２．２  アセチル−ＣｏＡ生産のための異種ＡＤＡ
１つの態様では、アセチル−ＣｏＡ由来イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（あるいは「アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）」、「アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アシル化」、またはＡＤＡ（ＥＣ１．２．１．１０）と呼ばれる）をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む細胞を、本明細書に提供する。
【００４９】
本明細書に提供する組成物および方法に有用であるこの反応を触媒する能力があるタンパク質は、次の４タイプのタンパク質を含む：
【００５０】
（１）アセチル−ＣｏＡのアセトアルデヒドへの可逆的変換、およびその後のアセトアルデヒドのエタノールへの可逆的変換を触媒する二機能性タンパク質。このタイプのタンパク質の一例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＡｄｈＥタンパク質（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ番号ＮＰ＿４１５７５７）である。ＡｄｈＥは、遺伝子融合の進化産物であるように思われる。ＡｄｈＥタンパク質のＮＨ２末端領域は、アルデヒド：ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼと高度に相同であり、これに対してそのＣＯＯＨ末端領域は、Ｆｅ２＋依存性エタノール：ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼのファミリーと相同である（Ｍｅｍｂｒｉｌｌｏ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３３８６９−３３８７５）。大腸菌ＡｄｈＥは、金属触媒酸化を受ける、したがって、酸素感受性である（Ｔａｍａｒｉｔら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３０２７−３２）。
【００５１】
（２）絶対的または条件的嫌気性微生物においてアセチル−ＣｏＡのアセトアルデヒドへの可逆的変換を触媒するが、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を保有しないタンパク質。このタイプのタンパク質の一例は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉにおいて報告されている（Ｓｍｉｔｈら（１９８０）  Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２０３：６６３−６７５）。ＡＤＡは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ  ＤＳＭ  ５５５（アクセッション番号：ＥＤＫ３３１１６）のゲノムにおいてアノテーションされている。相同タンパク質ＡｃｄＨは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ（アクセッション番号ＮＰ＿７８４１４１）のゲノムにおいて同定されている。このタイプのタンパク質のもう１つの例は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ＮＲＲＬ  Ｂ５９３におけるａｌｄ遺伝子産物である（Ｔｏｔｈら（１９９９）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：４９７３−４９８０、アクセッション番号：ＡＡＤ３１８４１）。
【００５２】
（３）エタノールアミン異化に関与するタンパク質。エタノールアミンは、多くの腸内細菌により炭素源と窒素原の両方として利用され得る（Ｓｔｏｊｉｌｊｋｏｖｉｃら（１９９５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：１３５７−１３６６）。エタノールアミンは、先ず、エタノールアミンアンモニアリアーゼによってアンモニアおよびアセトアルデヒドに変換され、その後、アセトアルデヒドは、ＡＤＡによってアセチル−ＣｏＡに変換される。このタイプのＡＤＡの一例は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍにおけるＥｕｔＥタンパク質である（Ｓｔｏｊｉｌｊｋｏｖｉｃら（１９９５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：１３５７−１３６６、アクセッション番号：ＡＡＬ２１３５７；Ｕ１８５６０．１も参照されたし）。大腸菌もまたエタノールアミンを利用することができ（Ｓｃａｒｌｅｔｔら（１９７６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９５：１７３−１７６）、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍにおけるＥｕｔＥタンパク質と相同であるＥｕｔＥタンパク質（アクセッション番号：ＡＡＧ５７５６４；ＥＵ８９７７２２．１も参照されたし）を有する。  
【００５３】
（４）４−ヒドロキシ−２−ケト吉草酸異化に関与する二機能性アルドラーゼ−デヒドロゲナーゼ複合体の一部分であるタンパク質。かかる二機能性酵素は、カテコール（多くの細菌種におけるフェノール、トルエート、ナフタレン、ビフェニルおよび他の芳香族化合物の分解の中間体）のメタ切断経路の最後の２段階を触媒する（ＰｏｗｌｏｗｓｋｉおよびＳｈｉｎｇｌｅｒ（１９９４）Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ５、２１９−２３６）。４−ヒドロキシ−２−ケトバレレートが先ず４−ヒドロキシ−２−ケト吉草酸アルドラーゼによってピルベートおよびアセトアルデヒドに変換され、その後、アセトアルデヒドがＡＤＡによってアセチル−ＣｏＡに変換される。このタイプのＡＤＡの一例は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ＣＦ６００におけるＤｍｐＦタンパク質（アクセッション番号：ＣＡＡ４３２２６）である（Ｓｈｉｎｇｌｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：７１  １−２４）。大腸菌は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＣＦ６００におけるＤｍｐＦタンパク質との相同ＭｐｈＦタンパク質を有する（Ｆｅｒｒａｎｄｅｚら（１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：２５７３−２５８１、アクセッション番号：ＮＰ＿４１４８８５）。
【００５４】
一部の実施形態において、本明細書に記載する組成物および方法に有用なＡＤＡ（またはかかる活性をコードしている核酸配列）は、国際公開番号ＷＯ２００９／０１３１５９パンフレット（この内容は、それら全体が参照により本明細書に援用されている）に記載されているような、大腸菌ａｄｈＥ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ  ａｄｈ２、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ａｄｈＥ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．Ｅ２  ａｄｈＥ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ（ＥＤＫ３３１１６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ａｃｄＨおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ（ＹＰ  ００１２６８１８９）からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記ＡＤＡは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｅｕｔＥ（ＦＲ７４５８７５．１）、Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ  ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ  ｅｕｔＥ（ＣＲ５２２８７０．１）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＨＢＳ−２  ｅｕｔＥ（ＡＢＱ４４５１１．２）、Ｃａｌｄｉｔｈｒｉｘ  ａｂｙｓｓｉ  ｅｕｔＥ（ＺＰ＿０９５４９５７６）およびＨａｌｏｒｕｂｒｕｍ  ｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉ  ＡＴＣＣ  ４９２３９（ＹＰ＿００２５６５３３７．１）からなる群より選択される。
【００５５】
特定の実施形態において、本明細書に提供する組成物および方法に有用なＡＤＡは、Ｄｉｃｋｅｙａ  ｚｅａｅからのｅｕｔＥである。Ｄｉｃｋｅｙａ  ｚｅａｅの代表的ｅｕｔＥヌクレオチド配列としては、アクセッション番号ＮＣ＿０１２９１２．１：１１１０４７６．．１１１１８５５、および本明細書提供の配列番号１が挙げられる。Ｄｉｃｋｅｙａ  ｚｅａｅの代表的ｅｕｔＥタンパク質配列としては、アクセッション番号ＹＰ＿００３００３３１６、および本明細書提供の配列番号２が挙げられる。
【００５６】
本明細書に提供する組成物および方法において同じく有用であるＡＤＡは、本明細書に記載するＡＤＡのいずれかの「誘導体」であると言われる分子を含む。かかる「誘導体」は、次の特徴を有する：（１）それは、本明細書に記載するＡＤＡのいずれかと実質的相同性を共有する；および（２）アセトアルデヒドのアセチル−ＣｏＡへの変換を触媒する能力がある。ＡＤＡの誘導体は、該誘導体のアミノ酸配列が、本明細書に記載するＡＤＡのいずれかのものと少なくとも８０％、少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは９５％同じである場合、ＡＤＡと「実質的相同性」を共有すると言われる。
【００５７】
５．２．２．１  機能性ＡＤＡの同定方法
もう１つの態様では、高いｉｎ  ｖｉｖｏ性能を有するＡＤＡについてのスクリーニング方法を本明細書に提供する。このスクリーニング方法では、高いｉｎ  ｖｉｖｏ性能を有するＡＤＡを、（遺伝子）操作された宿主細胞を細胞死からレスキューするそれらの能力によって同定する。前記（遺伝子）操作された宿主細胞は、サイトゾルアセチル−ＣｏＡ由来二次代謝産物、例えばイソプレノイド、の生産のための異種経路を含む。一部の実施形態において、前記（遺伝子）操作された宿主細胞は、機能的に破壊されたＰＤＨ−バイパス経路と、弱い活性のＡＤＡとをさらに含み、前記機能的に破壊されたＰＤＨ−バイパス経路と前記弱い活性のＡＤＡの総合活性は、（１）サイトゾルアセチル−ＣｏＡ由来二次代謝物と（２）細胞生存、健康および／または成長に要するサイトゾルアセチル−ＣｏＡ由来一次代謝物、両方の生産の要件を満たすために十分なサイトゾルアセチル−ＣｏＡを生じさせない。したがって、生存、健康および／または成長のために、前記宿主細胞は、増大したサイトゾルアセチル−ＣｏＡプールの生産が可能である活性ＡＤＡを要する。
【００５８】
一部の実施形態において、高いｉｎ  ｖｉｖｏ性能を有するＡＤＡについてスクリーニングするための方法は、（ａ）機能的に破壊されたＰＤＨ−バイパス経路を有する宿主細胞において対照ＡＤＡを発現させて、高レベルのサイトゾルアセチル−ＣｏＡ由来二次代謝産物を生産すること（この場合、前記高レベルのサイトゾルアセチル−ＣｏＡ由来二次代謝産物の生産は、前記宿主細胞の生存度を、前記高レベルのサイトゾルアセチル−ＣｏＡ由来二次代謝産物を生産しない親細胞と比較して低減させる）；および
（ｂ）前記宿主細胞において対照ＡＤＡではなく試験ＡＤＡを発現させること（それによって、前記対照ＡＤＡを発現する宿主細胞と比較して前記試験ＡＤＡを発現する宿主細胞の生存度の増加より、前記試験ＡＤＡが前記対照ＡＤＡと比較して向上したｉｎ  ｖｉｖｏ性能を有すると確認される）を含む。
【００５９】
一部の実施形態において、前記宿主細胞における前記高レベルのサイトゾルアセチル−ＣｏＡ由来二次代謝産物の生産は、誘導可能である。誘導は、誘導剤（例えば、ガラクトース（ｇａｌｃａｔｏｓｅ））または特異的成長条件（例えば、成長温度）に応答して起こり得る。誘導剤の不在下で成長したとき、その宿主細胞のＡＤＡ活性は、該宿主細胞が生存に要するサイトゾルアセチル−ＣｏＡの生産を可能にするために十分なものである。しかし、誘導剤の存在下で成長したとき、その宿主細胞のＡＤＡ活性は、該宿主細胞が生存に要するサイトゾルアセチル−ＣｏＡと、高レベルのサイトゾルアセチル−ＣｏＡ由来二次代謝産物の両方の生産を可能にするために十分なものではない。したがって、後者の場合、前記宿主細胞は、増大したサイトゾルアセチル−ＣｏＡプールの生産を可能にする、より活性の高いＡＤＡを生存のために要する。前記宿主細胞におけるサイトゾルアセチル−ＣｏＡ由来二次代謝産物の生産は、その親細胞におけるサイトゾルアセチル−ＣｏＡ由来二次代謝産物の生産より約１０％から少なくとも約１，０００倍高い、またはそれ以上高い範囲にわたり得る。
【００６０】
前記親細胞と比較した前記対照ＡＤＡを発現する宿主細胞の生存度低減は、細胞成長減少から致死にわたり得る。したがって、一部の実施形態において、前記対照ＡＤＡを発現する宿主細胞は、液体培地中または寒天プレート上で、前記親細胞と比較して低減された数の子孫細胞を生産する。他の実施形態において、前記ＡＤＡを発現する宿主細胞は、液体培地中または寒天プレート上で、前記親細胞と比較して子孫細胞を生産しない。したがって、対照ＡＤＡではなく試験ＡＤＡを発現する宿主細胞の生存度の増加は、対照ＡＤＡを発現する宿主細胞によって生産される子孫細胞の数またはコロニーサイズと比較して、液体培地中ではより多数の子孫細胞によって、または寒天プレート上ではより大きいコロニーサイズによってはっきりと分かるであろう。
【００６１】
前記宿主細胞におけるサイトゾルアセチル−ＣｏＡ由来二次代謝産物またはその前駆体の生産に関与する酵素の発現および／または活性を改変することによって、前記宿主細胞において高レベルのサイトゾルアセチル−ＣｏＡ由来二次代謝産物の生産を果たすことができる。一部のかかる実施形態では、前記ＭＥＶまたはＤＸＰ経路の酵素の発現および／または活性を改変する。一部のかかる実施形態では、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼおよび／またはメバロン酸キナーゼの発現および／または活性を改変する。
【００６２】
前記対照ＡＤＡおよび試験ＡＤＡは、天然に存在するＡＤＡであってもよいし、または天然に存在しないＡＤＡであってもよい。一部の実施形態において、試験ＡＤＡは、１つ以上のアミノ酸置換、欠失および／または付加が対照ＡＤＡと異なる、対照ＡＤＡの変異体である。一部の実施形態において、試験ＡＤＡは、対照ＡＤＡと同一のアミノ酸を含むが、これらのアミノ酸をコードしているコドンは、試験ＡＤＡと対照ＡＤＡ間で異なる。一部の実施形態において、前記コドンは、宿主細胞における使用頻度について最適化される。一部の実施形態において、対照ＡＤＡおよび／または試験ＡＤＡは、ピルビン酸デカルボキシラーゼに融合している。一部の実施形態において、前記試験ＡＤＡの発現は、強力なプロモーターの調節制御下にある。一部の実施形態において、試験ＡＤＡの発現は、中等度の強度のプロモーターの調節制御下にある。一部の実施形態において、試験ＡＤＡの発現は、弱いプロモーターの調節制御下にある。
【００６３】
試験ＡＤＡの存在下での宿主細胞の生存度の増加は、対照ＡＤＡより活性が高い試験ＡＤＡによって果たされることもあり、または対照ＡＤＡと同様に活性であるもしくは活性が低いが、より高レベルで発現される試験ＡＤＡによって果たされることもある。宿主細胞において対照ＡＤＡと試験ＡＤＡを同様のレベルで発現させることによって、増加した活性を有する試験ＡＤＡの同定を果たすことができる。これは、例えば、宿主細胞における対照ＡＤＡおよび試験ＡＤＡをコードしているヌクレオチド配列を同じ調節要素の制御下に置くことによって果たすことができる。例えば所望の発現レベルをもたらす調節要素（例えば、プロモーター）を同定するために、前記方法を用いる他の実施形態において、試験ＡＤＡは、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列ではなく発現レベルが対照ＡＤＡと異なる。かかる実施形態では、異なる調節要素を対照ＡＤＡおよび試験ＡＤＡの発現に使用することができ、および宿主細胞生存度の比較により、試験ＡＤＡの活性についてではなく、試験ＡＤＡの発現を駆動する調節要素の強度についての情報が得られる。
【００６４】
向上したＡＤＡ変異体ではなく成長促進突然変異を含む急速成長偽陽性宿主細胞が宿主細胞培養物に取って代わる競合成長刺激を防止するために、前記スクリーニング方法の１つの実施形態は、寒天プレートベースの選択システムを含む。この実施形態では、宿主細胞を寒天プレートにプレーティングし、向上したｉｎ  ｖｉｖｏ性能を有する試験ＡＤＡ変異体を含む宿主細胞をコロニー成長によって同定する。
【００６５】
本開示スクリーニング方法の実質的利点は、ハイスループット実現についてのその単純性および能力である。ＡＤＡ変異体は、細胞生存度に基づいて容易に同定され、これにより、他の費用の嵩むかつ時間のかかるスクリーニング方法が事実上不要になる。したがって、１つの実施形態では、前記方法を用いて、ＡＤＡ変異体のコレクション（例えば、突然変異体ＡＤＡのライブラリー）を、向上したｉｎ  ｖｉｖｏ性能を有するＡＤＡ変異体についてスクリーニングする。かかる実施形態では、単一の試験ＡＤＡを宿主細胞において発現させるのではなく、試験ＡＤＡのコレクションを宿主細胞のコレクションにおいて発現させる。その後、それらの宿主細胞を寒天プレート上で成長させ、向上したｉｎ  ｖｉｖｏ性能を有するＡＤＡ変異体を発現する宿主細胞をコロニー成長に基づいて同定することができる。一部の実施形態において、ＡＤＡ変異体の前記コレクションは、２から５、５から１０、１０から５０、５０から１００、１００から５００、５００から１，０００、１，０００から１０，０００、１０，０００から１００，０００、１００，０００から１，０００，０００、およびそれ以上のＡＤＡ変異体を含む。
【００６６】
本開示スクリーニング方法のもう１つの大きな利点は、ある反復で同定された試験ＡＤＡが後続の反復で対照ＡＤＡとして使用される反復様式でどんどんよいＡＤＡ変異体を選択するその継続能力である。しかし、かかる実施形態には、反復するごとに、宿主細胞におけるサイトゾルアセチル−ＣｏＡ由来二次代謝産物の生産を確認することおよびことによると、宿主細胞が新たな対照ＡＤＡ（すなわち、前の反復の試験ＡＤＡ）を発現したときに低減された生存度を生じさせるレベルに（例えば、酵素の発現レベルを増加もしくは減少させること、酵素を足すもしくは引くこと、遺伝子のコピー数を増加もしくは減少させること、酵素の発現を制御するプロモーターを交換すること、または遺伝子突然変異により酵素を変性させることによって）増加させることが求められる。あるいは、または加えて、反復するごとに、対照ＡＤＡの発現を（例えば、対照ＡＤＡ転写産物もしくはポリペプチドの発現を減少させることによって、またはより弱いプロモーターを使用することによって、または対照ＡＤＡ転写産物もしくはポリペプチドの安定性を低減させることによって）低減させて、低減された対照ＡＤＡ活性をもたらすことができる。次の反復の際に、前の反復のその試験ＡＤＡと比較して増加されたｉｎ  ｖｉｖｏ性能をまだ有する試験ＡＤＡを同定することができる。
【００６７】
本開示スクリーニング方法のもう１つの大きな利点は、向上したＡＤＡについての選択をｉｎ  ｖｉｔｒｏではなくｉｎ  ｖｉｖｏで行う点である。結果として、ＡＤＡ変異体のｉｎ  ｖｉｖｏ性能を強化する多数の酵素特性の向上を得ることができる。
【００６８】
本開示スクリーニング方法を使用して開発した酵素を、蛍光スクリーニングおよび／またはサイトゾルアセチル−ＣｏＡ由来二次代謝産物のガスクロマトグラフィーによる直接定量をはじめとする（しかしこれらに限定されない）さらなる任意選択スクリーニング手段に付すことができる。より具体的には、これは、ファルネセンなどのセスキテルペンの生産を測定するためのナイルレッドベースのハイスループット蛍光アッセイ、およびファルネセンなどのセスキテルペンの力価を測定するためのガスクロマトグラフィー（ＧＣ）ベースの直接定量方法を含む。それらの向上した酵素を、誘導突然変異およびこれらに類するものなどの遺伝子操作方法によってさらに向上させることもできる。結果として、最終酵素性能を強化する多数の酵素特性の向上が継続的に遂行され、最も有効な酵素変異体が同定される。
【００６９】
５．２．３  ＰＤＨ−バイパスの機能破壊
アセチル−ＣｏＡは、ミトコンドリアにおいてＰＤＨ複合体によって触媒されるピルベートの酸化的脱カルボキシル化によって形成され得る。しかし、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはアセチル−ＣｏＡをミトコンドリアから外に輸送することができないため、ＰＤＨバイパスは、サイトゾル区画へのアセチル−ＣｏＡの供給に不可欠な役割を有し、およびピルベートのアセチル−ＣｏＡへの変換のためのＰＤＨ反応への代替ルートを提供する。前記ＰＤＨバイパスは、酵素ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ；ＥＣ４．１．１．１）、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤＨ；ＥＣ１．２．１．５およびＥＣ１．２．１．４）およびアセチル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ；ＥＣ６．２．１．１）を含む。ピルビン酸デカルボキシラーゼは、ピルベートのアセトアルデヒドおよび二酸化炭素への脱カルボキシル化を触媒する。アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、アセトアルデヒドを酢酸に酸化させる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるアルデヒドデヒドロゲナーゼのファミリーは、５つのメンバーを含有する。ＡＬＤ２（ＹＭＲ１７０ｃ）、ＡＬＤ３（ＹＭＲ１６９ｃ）およびＡＬＤ６（ＹＰＬ０６１ｗ）は、サイトゾルアイソフォームに対応し、その一方でＡＬＤ４（ＹＯＲ３７４ｗ）およびＡＬＤ５（ＹＥＲ０７３ｗ）は、ミトコンドリア酵素をコードしている。主サイトゾルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアイソフォームは、ＡＬＤ６によってコードされている。アセテートからのアセチル−ＣｏＡの形成は、ＡＣＳによって触媒され、ＡＴＰの加水分解を伴う。２つの構造遺伝子、ＡＣＳ１およびＡＣＳ２、はＡＣＳをコードしている。
【００７０】
一部の実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、ＰＤＨ−バイパス経路の１つ以上の遺伝子の機能破壊を含む。一部の実施形態において、前記宿主細胞のＰＤＨ−バイパスの１つ以上の遺伝子の破壊は、次の反応の１つ以上を触媒するその能力が損なわれている遺伝子改変された微生物細胞を生じさせる結果となる：（１）ピルビン酸デカルボキシラーゼによるピルベートのアセトアルデヒドへの脱カルボキシル化；（２）アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼによるアセトアルデヒドのアセテートへの変換；および（３）アセチル−ＣｏＡシンセターゼによるアセテートおよびＣｏＡからのアセチル−ＣｏＡの合成。
【００７１】
一部の実施形態において、親細胞と比較して、宿主細胞は、ＰＤＨ−バイパス経路の１つ以上の遺伝子の機能破壊を含み、この場合、単独または弱いＡＤＡとの組み合わせでの、低減された機能または非機能性ＰＤＨ−バイパス経路の活性は、宿主細胞の成長、生存および／または健康を支援するために十分でない。
【００７２】
一部の実施形態において、前記ＰＤＨ−バイパスの１つ以上の内因性タンパク質の活性または発現は、少なくとも約５０％低減される。もう１つの実施形態において、前記ＰＤＨ−バイパスの１つ以上の内因性タンパク質の活性または発現は、前記ＰＤＨ−バイパスの１つ以上の内因性タンパク質の活性または発現の低減または欠失を含まない組換え微生物と比較して、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％低減される。
【００７３】
当業者には理解されるように、タンパク質、例えばＰＤＨ−バイパスのタンパク質、の活性を低減させるまたは破壊するために利用可能な幾つかのメカニズムがあり、それらとしては、調節されたプロモーターの使用、弱い構成プロモーターの使用、二倍体酵母におけるタンパク質をコードしている遺伝子の２つのコピーの一方の破壊、二倍体酵母における前記遺伝子の両方のコピーの破壊、アンチセンス核酸の発現、ｓｉＲＮＡの発現、内因性プロモーターの負の調節因子の過発現、内因性もしくは異種遺伝子の活性の変性、より低い比活性を有する異種遺伝子の使用、これらに類するものまたはこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
【００７４】
一部の実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、ＰＤＨ−バイパスのタンパク質をコードしている少なくとも１つの遺伝子の突然変異であって、該遺伝子によってコードされているポリペプチドの活性を低減させる結果となる突然変異を含む。もう１つの実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、ＰＤＨ−バイパスのタンパク質をコードしている遺伝子の部分的欠失であって、該遺伝子によってコードされているポリペプチドの活性を低減させる結果となる欠失を含む。もう１つの実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、ＰＤＨ−バイパスのタンパク質をコードしている遺伝子の完全欠失であって、該遺伝子によってコードされているポリペプチドの活性を低減させる結果となる欠失を含む。さらにもう１つの実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、ＰＤＨ−バイパスのタンパク質をコードしている遺伝子に付随する調節領域の改変であって、該遺伝子によってコードされているポリペプチドの発現を低減させる結果となる改変を含む。さらにもう１つの実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、ＰＤＨ−バイパスのタンパク質をコードしている遺伝子の転写の低減を生じさせる結果となる、転写調節因子の改変を含む。さらにもう１つの実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、ＰＤＨ−バイパスのタンパク質をコードしているすべての遺伝子の突然変異であって、該遺伝子（単数または複数）によってコードされているポリペプチドの活性を低減させる結果となる突然変異を含む。１つの実施形態において、前記ＰＤＨ−バイパスのタンパク質の活性または発現は、少なくとも約５０％低減される。もう１つの実施形態において、前記ＰＤＨ−バイパスのタンパク質の活性または発現は、前記ＰＤＨ−バイパスのタンパク質の活性または発現の低減を含まない組換え微生物と比較して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％低減される。
【００７５】
一部の実施形態において、ＰＤＨバイパスの１つまたはそれより多くの遺伝子の破壊は、微生物細胞への構築物の導入でＰＤＨバイパスの遺伝子を特異的に破壊する能力がある「破壊構築物」を用いて、破壊される遺伝子を非機能性にすることによって達成される。いくつかの実施形態において、標的遺伝子の破壊は、機能性タンパク質の発現を阻止する。いくつかの実施形態において、標的遺伝子の破壊は、破壊される遺伝子からの非機能性タンパク質の発現を生じる。一部の実施形態において、ＰＤＨバイパスの遺伝子の破壊は、相同組換えにより標的遺伝子座内の「破壊配列」の組込みによって達成される。そのような実施形態において、破壊構築物は、標的遺伝子座の１対のヌクレオチド配列に相同である１対のヌクレオチド配列（相同配列）に隣接した破壊配列を含む。破壊構築物による標的遺伝子の標的部分の置換で、破壊配列は、機能性タンパク質の発現を阻止し、または標的遺伝子からの非機能性タンパク質の発現を引き起こす。
【００７６】
１つまたはそれより多くのＰＤＨバイパスの遺伝子を破壊する能力がある破壊構築物は、当該技術分野において周知の標準の分子生物学技術を用いて構築することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹおよびＡｕｓｕｂｅｌら編、現行版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを参照。本方法の実施において変わり得る破壊構築物のパラメータには、相同配列の長さ、相同配列のヌクレオチド配列、破壊配列の長さ、破壊配列のヌクレオチド配列、および標的遺伝子のヌクレオチド配列が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、各相同配列の長さについての有効な範囲は５０〜５，０００塩基対である。特定の実施形態において、各相同配列の長さは約５００塩基対である。遺伝子を標的にするのに必要とされる相同性の長さの議論については、Ｈａｓｔｙら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１：５５８６−９１（１９９１）を参照されたい。いくつかの実施形態において、相同配列は、標的遺伝子のコード配列を含む。他の実施形態において、相同配列は、標的遺伝子の上流配列または下流配列を含む。いくつかの実施形態において、一方の相同配列は、標的遺伝子のコード配列の５’に位置するヌクレオチド配列と相同であるヌクレオチド配列を含み、他方の相同配列は、標的遺伝子のコード配列の３’に位置するヌクレオチド配列と相同であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、破壊配列は、破壊配列を含む微生物細胞の選択を可能にする選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む。したがって、そのような実施形態において、破壊構築物は、二重機能、すなわち、標的遺伝子を機能的に破壊すること、および標的遺伝子が機能的に破壊されている細胞の同定のための選択マーカーを提供することを有する。いくつかの実施形態において、終止コドンは、標的遺伝子によってコードされる野生型タンパク質のある程度の活性を有する融合タンパク質を生じる可能性がある翻訳の読み過ごしを防ぐために選択マーカーをコードするヌクレオチド配列とインフレームで、および、それの下流に位置する。いくつかの実施形態において、破壊配列の長さは、１塩基対である。単一塩基対の挿入は、コード配列における単一塩基対の挿入が、機能性タンパク質の発現を阻止することができるフレームシフト突然変異を構成することができるため、標的遺伝子を破壊するのに十分であり得る。いくつかの実施形態において、破壊配列の配列は、相同配列の間に位置する標的遺伝子のヌクレオチド配列と単一塩基対だけ、異なる。標的遺伝子内のヌクレオチド配列の破壊配列との置換で
、導入される単一塩基対置換は、タンパク質における重要部位での単一アミノ酸置換、および非機能性タンパク質の発現を生じ得る。しかしながら、非常に短い破壊配列を用いてもたらされる破壊は、自然突然変異によって野生型配列への復帰変異を起こしやすく、したがって、ＰＤＨバイパス機能の回復を宿主株にもたらすことは認識されるべきである。したがって、特定の実施形態において、破壊配列は、１〜２、３塩基対より長い。それとは正反対に、過剰な長さの破壊配列は、中程度の長さの破壊配列に優る少しの利点でも与える可能性は低く、トランスフェクションまたはターゲティングの効率を減少させる可能性がある。この関連における過剰な長さは、標的遺伝子における選択された相同配列間の距離より何倍も長い。このように、ある特定の実施形態において、破壊配列についての長さは、２塩基対から２，０００塩基対までであり得る。他の実施形態において、破壊配列についての長さは、破壊構築物における相同配列とマッチする標的遺伝子座の領域間の距離とおよそ等しい長さである。
【００７７】
いくつかの実施形態において、破壊構築物は、直鎖ＤＮＡ分子である。他の実施形態において、破壊構築物は、環状ＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、環状破壊構築物は、上記のような破壊配列によって分離した１対の相同配列を含む。いくつかの実施形態において、環状破壊構築物は、単一の相同配列を含む。そのような環状破壊構築物は、標的遺伝子座での組込みで、直鎖状になり、相同配列の部分は各末端に位置し、破壊構築物の残りのセグメントは、標的遺伝子ヌクレオチド配列のいずれとも置換することなく、標的遺伝子に挿入され、それを破壊するであろう。特定の実施形態において、環状破壊構築物の単一の相同配列は、標的遺伝子のコード配列内に位置する配列と相同である。
【００７８】
破壊構築物は、非限定的に、当業者に公知の任意の方法によって微生物細胞へ導入することができる。そのような方法には、溶液からの細胞による分子の直接的取り込み、または例えば、リポソームもしくは免疫リポソームを用いるリポフェクションによる促進性取り込み；粒子媒介性トランスフェクションなどが挙げられるが、それらに限定されない。例えば、米国特許第５，２７２，０６５号；Ｇｏｅｄｄｅｌら編、１９９０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、ＣＡ；Ｋｒｉｅｇｅｒ、１９９０、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌら編、現行版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを参照。酵母細胞を形質転換する特定の方法は当技術分野において周知である。Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１２９２−３（１９７８）；Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６−３３８５（１９８５）参照。例示的な技術として、スフェロプラスト化、エレクトロポレーション、ＰＥＧ  １０００媒介性形質転換、および酢酸リチウムまたは塩化リチウム媒介性形質転換が挙げられるが、それらに限定されない。
【００７９】
5.2.3.1  ALD4およびALD6
一部の実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤＨ）活性をコードしている１つ以上の遺伝子を宿主細胞において機能的に破壊する。一部の実施形態において、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、ＡＬＤ２、ＡＬＤ３、ＡＬＤ４、ＡＬＤ５、ＡＬＤ６、ならびにそれらの相同体および変異体からなる群より選択される遺伝子によってコードされている。
【００８０】
一部の実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、ＡＬＤ４の機能破壊を含む。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的ＡＬＤ４ヌクレオチド配列としては、アクセッション番号ＮＭ＿００１１８３７９４、および本明細書提供の配列番号７が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的Ａｌｄ４タンパク質配列としては、アクセッション番号ＮＰ＿０１５０１９．１、および本明細書提供の配列番号８が挙げられる。
【００８１】
一部の実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、サイトゾルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤ６）の機能破壊を含む。Ａｌｄ６ｐは、天然ＰＤＨ−バイパスにおいてアセトアルデヒドをアセテートに変換するように機能する。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的ＡＬＤ６ヌクレオチド配列としては、アクセッション番号ＳＣＵ５６６０４、および本明細書提供の配列番号９が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的Ａｌｄ６タンパク質配列としては、アクセッション番号ＡＡＢ０１２１９、および本明細書提供の配列番号１０が挙げられる。
【００８２】
当該技術分野では理解されるであろうように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ以外の酵母におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼの天然に存在する相同体を、本明細書に記載する方法を用いて同様に不活性化することができる。
【００８３】
当業者には理解されるであろうように、１つより多くのアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性または発現を低減させるまたはなくすことができる。１つの特定の実施形態では、ＡＬＤ４およびＡＬＤ６またはそれらの相同体もしくは変異体の活性または発現を低減させるまたはなくすことができる。もう１つの特定の実施形態では、ＡＬＤ５およびＡＬＤ６またはそれらの相同体もしくは変異体の活性または発現を低減させるまたはなくすことができる。さらにもう１つの特定の実施形態では、ＡＬＤ４、ＡＬＤ５およびＡＬＤ６またはそれらの相同体もしくは変異体の活性または発現を低減させるまたはなくすことができる。さらにもう１つの特定の実施形態では、サイトゾルに局在しているアルデヒドデヒドロゲナーゼＡＬＤ２、ＡＬＤ３およびＡＬＤ６またはそれらの相同体もしくは変異体の活性または発現を低減させるまたはなくすことができる。さらにもう１つの特定の実施形態では、ミトコンドリアに局在しているアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＡＬＤ４およびＡＬＤ５またはそれらの相同体もしくは変異体の活性または発現を低減させるまたはなくすことができる。
【００８４】
５．２．３．２  ＡＣＳ１およびＡＣＳ２
一部の実施形態では、アセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）活性をコードしている１つ以上の遺伝子を宿主細胞において機能的に破壊する。一部の実施形態において、前記アセチル−ＣｏＡシンターゼは、ＡＣＳ１、ＡＣＳ２、ならびにその相同体および変異体からなる群より選択される遺伝子によってコードされている。
【００８５】
一部の実施形態では、アセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）活性をコードしている１つ以上の遺伝子を宿主細胞において機能的に破壊する。ＡＣＳ１およびＡＣＳ２は両方とも、アセテートをアセチル−ＣｏＡに変換することができるアセチル−ＣｏＡシンターゼである。ＡＣＳ１は、呼吸条件下でしか発現されないが、ＡＣＳ２は、構成的に発現される。ＡＣＳ２がノックアウトされると、株は、呼吸条件（例えば、エタノール、グリセロールまたはアセテート培地）では成長できるが、発酵性炭素源（例えば、スクロース、グルコース）では死滅する。
【００８６】
一部の実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、ＡＣＳ１の機能破壊を含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＣＳ１遺伝子の配列は、以前に記載されている。例えば、Ｎａｇａｓｕら、Ｇｅｎｅ  ３７（１−３）：２４７−２５３（１９８５）を参照されたし。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的ＡＣＳ１ヌクレオチド配列としては、アクセッション番号Ｘ６６４２５、および本明細書提供の配列番号３が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的Ａｃｓ１タンパク質配列としては、アクセッション番号ＡＡＣ０４９７９、および本明細書提供の配列番号４が挙げられる。
【００８７】
一部の実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、ＡＣＳ２の機能破壊を含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＣＳ２遺伝子の配列は、以前に記載されている。例えば、Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３１（３）：７０４−７１３（１９９５）を参照されたし。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的ＡＣＳ２ヌクレオチド配列としては、アクセッション番号Ｓ７９４５６、および本明細書提供の配列番号５が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代表的Ａｃｓ２タンパク質配列としては、アクセッション番号ＣＡＡ９７７２５、および本明細書提供の配列番号６が挙げられる。
【００８８】
当該技術分野では理解されるであろうように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ以外の酵母におけるアセチル−ＣｏＡシンターゼの天然に存在する相同体を、本明細書に記載する方法を用いて同様に不活性化することができる。
【００８９】
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、呼吸条件下で（すなわち、前記宿主細胞を、例えばエタノール、グリセロールまたはアセテートの存在下で成長させた場合）アセテートをアセチル−ＣｏＡに変換することができるサイトゾルアセチル−ｃｏＡシンターゼ活性を含む。一部のかかる実施形態において、前記宿主細胞は、ＡＣＳ１活性を含む酵母細胞である。他の実施形態において、前記宿主細胞は、親細胞と比較して、呼吸条件下で内因性アセチル−ＣｏＡシンターゼ活性を含まない、または低減された内因性アセチル−ＣｏＡシンターゼ活性を含む。一部のかかる実施形態において、酵母細胞である宿主細胞は、親細胞と比較して、ＡＣＳ１活性を含まない、または低減されたＡＣＳ１活性を含む。
【００９０】
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、非呼吸条件下で（すなわち、前記宿主細胞を発酵性炭素源（例えば、スクロース、グルコース）の存在下で成長させた場合）アセテートをアセチル−ＣｏＡに変換することができるサイトゾルアセチル−ｃｏＡシンターゼ活性を含む。一部のかかる実施形態において、前記宿主細胞は、ＡＣＳ２活性を含む酵母細胞である。他の実施形態において、親細胞と比較して、前記宿主細胞は、非呼吸条件下で内因性アセチル−ＣｏＡシンターゼ活性を含まない、または低減された内因性アセチル−ＣｏＡシンターゼ活性を含む。一部のかかる実施形態において、前記宿主細胞は、親細胞と比較して、ＡＣＳ２活性を含まないまたは低減されたＡＣＳ２活性を含む酵母細胞である。
【００９１】
５．２．４  ホスホケトラーゼ（ＰＫ）およびホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）
酵母において、アセチル−ＣｏＡは、解糖、トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路、酸化的リン酸化、およびビルビン酸代謝によってグルコースから生合成される。しかし、この生合成経路では、ＣＯ２が、ピルビン酸代謝中にピルビン酸カルボキシラーゼによって、ならびにＴＣＡ回路でピルビン酸デヒドロゲナーゼおよびイソクエン酸デヒドロゲナーゼによって失われる。工業的発酵設定で、低解糖によってフラックスを低下させることの１つの利点は、ピルベートのアセトアルデヒドへの変換の際により少ないＣＯ２が生産される点であり、したがって、より多くの炭素が最終製品内に捕捉され、その結果、最大理論収率を増加させることができる。第二の利点は、より少ないＮＡＤＨが生産される点であり、したがって、それを再酸化させるために必要とされる酸素は有意に少ない。炭素原子の損失は、理論的には、ＴＣＡ回路を迂回することによって回避することができる。これは、ホスホケトラーゼ（ＰＫ）（酵素クラスＥＣ４．１．２．９、ＥＣ４．１．２．２２）をホスホアセチルトランスフェラーゼ（ＰＴＡ）（ＥＣ２．３．１．８）と併用することによって果たすことができる。
【００９２】
ＰＫおよびＰＴＡは、フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）またはキシルロース−５−リン酸（Ｘ５Ｐ）をアセチル−ＣｏＡに変換するための反応を触媒する（図７）。ＰＫは、ペントースリン酸中間体キシルロース（ｘｙｕｌｏｓｅ）５−リン酸から、または高解糖（ｕｐｐｅｒ  ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）中間体Ｄ−フルクトース６−リン酸（Ｆ６Ｐ）から取り出す；ＰＫは、Ｘ５Ｐをグリセルアルデヒド３−リン酸（Ｇ３Ｐ）およびアセチルリン酸に、またはＦ６Ｐをエリトロース４−リン酸（Ｅ４Ｐ）に分裂させる。その後ＰＴＡは、そのアセチルリン酸をアセチル−ＣｏＡに変換する。Ｇ３Ｐは、低解糖に再び入ることができ、Ｅ４Ｐは、ペントースリン酸経路に再び入ることができ、またはトランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの非酸化的ペントースリン酸経路ネットワークの循環によって解糖に再び入ることができる。
【００９３】
一部の実施形態において、本明細書に提供する遺伝子改変された宿主細胞は、ホスホケトラーゼをコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記ホスホケトラーゼは、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓからのもの（Ｌｅｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．２７（１２）；８５３−８５８（２００５））である。Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓの代表的ホスホケトラーゼヌクレオチド配列としては、アクセッション番号ＡＹ８０４１９０、および本明細書提供の配列番号１１が挙げられる。Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓの代表的ホスホケトラーゼタンパク質配列としては、アクセッション番号ＹＰ＿８１９４０５、ＡＡＶ６６０７７．１、および本明細書提供の配列番号１２が挙げられる。他の有用なホスホケトラーゼとしては、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ  ＡＴＣＣ  ２７６７８からのもの（ＡＢＩＸ０２０００００２．１：２３５０４００．．２３５２８７７；ＥＤＴ４６３５６．１）；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓからのもの（ＮＣ＿０１７８３４．１：１１２７５８０．．１１３００５７；ＹＰ＿００６２８０１３１．１）；およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍからのもの（ＡＹ５１８２１６．１：９８８．．３４６５；ＡＡＲ９８７８８．１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
本明細書に提供する組成物および方法において同じく有用なホスホケトラーゼは、本明細書に記載するホスホケトラーゼのいずれかの「誘導体」と言われる分子を含む。かかる「誘導体」は、次の特徴を有する：（１）それは、本明細書に記載するホスホケトラーゼのいずれかと実質的相同性を共有する；および（２）Ｘ５Ｐのグリセルアルデヒド３−リン酸（Ｇ３Ｐ）およびアセチルリン酸への変換またはＦ６Ｐのエリトロース４−リン酸（Ｅ４Ｐ）への変換を触媒する能力がある。ホスホケトラーゼの誘導体は、該誘導体のアミノ酸配列がホスホケトラーゼのものと少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％および最も好ましくは少なくとも９５％同一である場合、ホスホケトラーゼと「実質的相同性」を共有すると言われる。
【００９５】
一部の実施形態において、本明細書に提供する遺伝子改変された宿主細胞は、ホスホトランスアセチラーゼをコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記ホスホトランスアセチラーゼは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉからのものである。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉからの代表的ホスホトランスアセチラーゼヌクレオチド配列としては、アクセッション番号ＮＣ＿００９７０６．１：１４２８５５４．．１４２９５５５、および本明細書提供の配列番号１３が挙げられる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉからの代表的ホスホトランスアセチラーゼタンパク質配列としては、アクセッション番号ＹＰ＿００１３９４７８０、および本明細書提供の配列番号１４が挙げられる。他の有用なホスホトランスアセチラーゼとしては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉからのもの（ＮＣ＿０１０６０９．１：４６０３０３．．４６１２７７；ＹＰ＿００１８４１３８９．１０）；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓからのもの（ＮＣ＿０１４４７９．１：３６７１８６５．．３６７２８３６；ＹＰ＿００３８６８０６３．１）；およびＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅからのもの（Ｌ２３１４７．１：２０７．．１２０８；ＡＡＡ７２０４１．１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
本明細書に提供する組成物および方法において同じく有用なホスホトランスアセチラーゼは、本明細書に記載するホスホトランスアセチラーゼのいずれかの「誘導体」であると言われる分子を含む。かかる「誘導体」は、次の特徴を有する：（１）それは、本明細書に記載するホスホトランスアセチラーゼのいずれかと実質的相同性を共有する；および（２）アセチルリン酸のアセチル−ＣｏＡへの変換を触媒する能力がある。ホスホトランスアセチラーゼの誘導体は、該誘導体のアミノ酸配列がホスホトランスアセチラーゼのものと少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％および最も好ましくは少なくとも９５％同一である場合、ホスホトランスアセチラーゼと「実質的相同性」を共有すると言われる。
【００９７】
５．２．５  ＭＥＶ経路
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ＭＥＶ経路の１つ以上の異種酵素を含む。一部の実施形態において、前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素は、アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡと縮合させてアセトアセチル−ＣｏＡを形成する酵素を含む。一部の実施形態において、前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素は、アセチル−ＣｏＡの２つの分子を縮合させてアセトアセチル−ＣｏＡを形成する酵素を含む。一部の実施形態において、前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素は、アセトアセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡと縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素を含む。一部の実施形態において、前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換する酵素を含む。一部の実施形態において、前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素は、メバロネートをメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素を含む。一部の実施形態において、前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素は、メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する酵素を含む。一部の実施形態において、前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素は、メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素を含む。
【００９８】
一部の実施形態において、前記ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素は、アセチル−ＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼおよびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼからなる群より選択される。一部の実施形態において、アセトアセチル−ＣｏＡの形成を触媒する能力があるＭＥＶ経路の酵素に関して、前記遺伝子改変された宿主細胞は、アセチル−ＣｏＡの２つの分子を縮合させてアセトアセチル−ＣｏＡを形成する酵素、例えば、アセチル−ＣｏＡチオラーゼ；またはアセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡと縮合させてアセトアセチル−ＣｏＡを形成する酵素、例えばアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼのいずれかを含む。一部の実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、アセチル−ＣｏＡの２つの分子を縮合させてアセトアセチル−ＣｏＡを形成する酵素、例えば、アセチル−ＣｏＡチオラーゼ；およびアセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡと縮合させてアセトアセチル−ＣｏＡを形成する酵素、例えばアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、両方を含む。
【００９９】
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ＭＥＶ経路の１つより多くの酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ＭＥＶ経路の２つの酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換することができる酵素とメバロネートをメバロン酸５−リン酸に変換することができる酵素とをコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ＭＥＶ経路の３つの酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ＭＥＶ経路の４つの酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ＭＥＶ経路の５つの酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ＭＥＶ経路の６つの酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ＭＥＶ経路の７つの酵素をコードしている１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ＭＥＶ経路の酵素の全てをコードしている複数の異種核酸を含む。
【０１００】
一部の実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換することができる酵素をコードしている異種核酸をさらに含む。一部の実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合させてポリプレニル化合物を形成する酵素をコードしている異種核酸をさらに含む。一部の実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、ＩＰＰまたはポリプレニルを、イソプレノイド化合物を形成するように修飾することができる酵素をコードしている異種核酸をさらに含む。
【０１０１】
５．２．５．１  アセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの変換
一部の実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、アセチル−補酵素Ａの２つの分子を縮合させてアセトアセチル−ＣｏＡを形成することができる酵素、例えば、アセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＮＣ＿０００９１３  ＲＥＧＩＯＮ：２３２４１３１．２３２５３１５；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、（Ｄ４９３６２；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、および（Ｌ２０４２８；  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
アセチル−ＣｏＡチオラーゼは、アセトアセチル−ＣｏＡを生じさせるための２つのアセチル−ＣｏＡ分子の可逆的縮合を触媒するが、この反応は、熱力学的に好適でない；アセトアセチル−ＣｏＡチオリシスのほうがアセトアセチル−ＣｏＡ合成より有利である。アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＡＡＣＳ）（あるいはアセチル−ＣｏＡ：マロニル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼと呼ばれる；ＥＣ．２．３．１．１９４）は、アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡと縮合させてアセトアセチル−ＣｏＡを形成する。アセチル−ＣｏＡチオラーゼとは対照的に、ＡＡＣＳによって触媒されるアセトアセチル−ＣｏＡ合成は、マロニル−ＣｏＡの付随する脱カルボキシル化のため、本質的にエネルギー好適反応（ｅｎｅｒｇｙ−ｆａｖｏｒｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。加えて、ＡＡＣＳは、アセトアセチル−ＣｏＡに対してチオリシス活性を呈示せず、したがって、この反応は不可逆的である。
【０１０３】
異種ＡＤＡおよびアセチル−ＣｏＡチオラーゼを含む宿主細胞において、アセトアセチル−ＣｏＡチオリシスに有利である、アセチル−ＣｏＡチオラーゼによって触媒される可逆的反応は、大きなアセチル−ＣｏＡプールを生じさせる結果となり得る。ＡＤＡの可逆的反応性にかんがみて、このアセチル−ＣｏＡプールは、アセチル−ＣｏＡをアセトアルデヒドに変換する可逆的反応にＡＤＡを次々に向かわせ、その結果、ＡＤＡによって提供されるアセチル−ＣｏＡ生産の利点は減少される。したがって、一部の実施形態では、ＡＤＡの正反応を駆動するようにアセチル−ＣｏＡを強く引っ張る、本明細書に提供する遺伝子改変された宿主細胞のＭＥＶ経路は、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼを利用して、アセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを形成する。
【０１０４】
一部の実施形態において、前記ＡＡＣＳは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．株ＣＬ１９０からのもの（Ｏｋａｍｕｒａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７（２５）：１１２６５−７０（２０１０））である。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．株ＣＬ１９０の代表的ＡＡＣＳヌクレオチド配列としては、アクセッション番号ＡＢ５４０１３１．１、および本明細書提供の配列番号１５が挙げられる。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．株ＣＬ１９０の代表的ＡＡＣＳタンパク質配列としては、アクセッション番号Ｄ７ＵＲＶ０、ＢＡＪ１００４８、および本明細書提供の配列番号１６が挙げられる。本明細書に提供する組成物および方法に有用な他のアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼとしては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．（ＡＢ１８３７５０；ＫＯ−３９８８  ＢＡＤ８６８０６）；Ｓ．ａｎｕｌａｔｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  ９６６３（ＦＮ１７８４９８；ＣＡＸ４８６６２）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＫＯ−３９８８（ＡＢ２１２６２４；ＢＡＥ７８９８３）；Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｓｐ．Ａ４０６４４（ＡＢ１１３５６８；ＢＡＤ０７３８１）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．Ｃ（ＮＺ＿ＡＣＥＷ０１００００６４０；ＺＰ＿０５５１１７０２）；Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ  ＤＳＭ  ４３１１１（ＮＺ＿ＡＢＵＩ０１００００２３；ＺＰ＿０４３３５２８８）；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ  Ａｇｙ９９（ＮＣ＿００８６１１；ＹＰ＿９０７１５２）；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ  Ｍ（ＮＣ＿０１０６１２；ＹＰ＿００１８５１５０２）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．Ｍｇ１（ＮＺ＿ＤＳ５７０５０１；ＺＰ＿０５００２６２６）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＡＡ４（ＮＺ＿ＡＣＥＶ０１００００３７；ＺＰ＿０５４７８９９２）；Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ  ＮＲＲＬ  １５９９８（ＮＺ＿ＡＢＹＢ０１０００２９５；ＺＰ＿０４６９６７６３）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＡＣＴＥ（ＮＺ＿ＡＤＦＤ０１００００３０；ＺＰ＿０６２７５８３４）；Ｓ．ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ  ＤＳＭ  ４０７３６（ＮＺ＿ＡＣＥＺ０１００００３１；ＺＰ＿０５５２９６９１）；Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐ．ＣｃＩ３（ＮＣ＿００７７７７；ＹＰ＿４８０１０１）；Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（ＮＣ＿０１８６８１；ＹＰ＿００６８１２４４０．１）；およびＡｕｓｔｗｉｃｋｉａ  ｃｈｅｌｏｎａｅ（ＮＺ＿ＢＡＧＺ０１０００００５；ＺＰ＿１０９５０４９３．１）が挙げられるが、これらに限定されない。追加の適するアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼとしては、米国特許出願公開第２０１０／０２８５５４９号および同第２０１１／０２８１３１５号明細書に記載されているものが挙げられ、前記明細書の内容は、それら全体が参照により本明細書に援用されている。
【０１０５】
本明細書に提供する組成物および方法において同じく有用なアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼは、本明細書に記載するアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼのいずれかの「誘導体」であると言われる分子を含む。かかる「誘導体」は、次の特徴を有する：（１）それは、本明細書に記載するアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼのいずれかと実質的相同性を共有する；および（２）アセトアセチル−ＣｏＡを形成するためのアセチル−ＣｏＡとマロニル−ＣｏＡの不可逆的縮合を触媒する能力がある。アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼの誘導体は、該誘導体のアミノ酸配列がアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼのものと少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％および最も好ましくは少なくとも９５％同一である場合、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼと「実質的相同性」を共有すると言われる。
【０１０６】
５．２．５．２  アセトアセチル−ＣｏＡのＨＭＧ−ＣｏＡへの変換
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、アセトアセチル−ＣｏＡを別のアセチル−ＣｏＡ分子と縮合させて、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を形成することができる酵素、例えばＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＮＣ＿００１１４５．補体１９０６１．２０５３６；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（Ｘ９６６１７；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（Ｘ８３８８２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＢ０３７９０７；Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ  ｇｒｉｓｅｏｌａ）、（ＢＴ００７３０２；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、および（ＮＣ＿００２７５８、Ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ  ＳＡＶ２５４６、ＧｅｎｅＩＤ  １１２２５７１；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
５．２．５．３  ＨＭＧ−ＣｏＡのメバロネートへの変換
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換することができる酵素、例えばＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＨ使用ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ−ＣｏＡレダクターゼである。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３４；ＥＣ１．１．１．８８）は、（Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡの（Ｒ）−メバロネートへの還元的脱アシル化を触媒し、および該ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを２つのクラス、クラスＩおよびクラスＩＩ、にカテゴリー分けすることができる。クラスＩは、真核生物および大部分の古細菌からの酵素を含み、クラスＩＩは、一定の原核生物および古細菌のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む。配列の相違に加えて、前記２つのクラスの酵素は、それらの補因子特異性に関して異なる。ＮＡＤＰＨを排他的に利用するクラスＩ酵素とは異なり、クラスＩＩ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＰＨとＮＡＤＨとを識別する能力が様々である。例えば、Ｈｅｄｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８６（７）：１９２７−１９３２（２００４）を参照されたし。抜粋したクラスＩＩ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼについての補因子特異性を下に提供する。
【０１０８】
【表１】
2014532444.tif 000004
【０１０９】
本明細書に提供する組成物および方法に有用なＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼとしては、ＮＡＤＨを補因子として利用する能力があるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、例えば、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓまたはＳ．ａｕｒｅｕｓからのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼが挙げられる。特定の実施形態において、前記ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、例えば、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｓ．ｐｏｍｅｒｏｙｉまたはＤ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓからのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＨを補因子として専ら利用する能力がある。
【０１１０】
一部の実施形態において、前記ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉからのものである。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．８８）をコードしている、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉの野生型ｍｖａＡ遺伝子の配列は、以前に記載されている。ＢｅａｃｈおよびＲｏｄｗｅｌｌ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：２９９４−３００１（１９８９）を参照されたし。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉの代表的ｍｖａＡヌクレオチド配列としては、アクセッション番号Ｍ２４０１５、および本明細書記載の配列番号１７が挙げられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉの代表的ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼタンパク質配列としては、アクセッション番号ＡＡＡ２５８３７、Ｐ１３７０２、ＭＶＡＡ＿ＰＳＥＭＶ、および本明細書記載の配列番号１８が挙げられる。
【０１１１】
一部の実施形態において、前記ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉからのものである。Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉの代表的ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼヌクレオチド配列としては、アクセッション番号ＮＣ＿００６５６９．１、および本明細書記載の配列番号１９が挙げられる。Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉの代表的ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼタンパク質配列としては、アクセッション番号ＹＰ＿１６４９９４、および本明細書記載の配列番号２０が挙げられる。
【０１１２】
一部の実施形態において、前記ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、Ｄｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓからのものである。Ｄｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓからの代表的ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼヌクレオチド配列としては、ＮＣ＿０１０００２  ＲＥＧＩＯＮ：補体（３１９９８０．．３２１２６９）、および本明細書記載の配列番号２１が挙げられる。Ｄｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓからの代表的ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼタンパク質配列としては、アクセッション番号ＹＰ＿００１５６１３１８、および本明細書記載の配列番号２２が挙げられる。
【０１１３】
一部の実施形態において、前記ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍからのもの（Ｃｒａｎｅら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５９：１３０１−１３０７（２００２））である。
【０１１４】
本明細書に提供する組成物および方法において同じく有用なＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、本明細書に記載する、例えばＰ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｓ．ｐｏｍｅｒｏｙｉおよびＤ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓからの、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのいずれかの「誘導体」であると言われる分子を含む。かかる「誘導体」は、次の特徴を有する：（１）それは、本明細書に記載するＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのいずれかと実質的相同性を共有する；および（２）（Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡの（Ｒ）−メバロネートへの還元的脱アシル化を触媒する能力があり、同時に補因子としてＮＡＤＨを優先的に使用する能力がある。ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの誘導体は、該誘導体のアミノ酸配列がＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのものと少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％および最も好ましくは少なくとも９５％同一である場合、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼと「実質的相同性」を共有すると言われる。
【０１１５】
本明細書において用いる場合、句「ＮＡＤＨ使用」は、そのＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼが、例えば、ＮＡＤＰＨよりＮＡＤＨに対して高い比活性を明示することにより、補因子としてＮＡＤＰＨよりＮＡＤＨに対して選択的であることを意味する。一部の実施形態では、補因子としてのＮＡＤＨに対する選択性を、κｃａｔ（ＮＡＤＨ）／κｃａｔ（ＮＡＤＰＨ）比として表す。一部の実施形態において、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、または２５より大きいκｃａｔ（ＮＡＤＨ）／κｃａｔ（ＮＡＤＰＨ）比を有する。一部の実施形態において、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＨを排他的に使用する。例えば、ＮＡＤＨを排他的に使用するＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで唯一の補因子として供給されるＮＡＤＨに伴って多少の活性を表示し（例えば、下の実施例１およびセクション６．１．１．３を参照されたし）、ＮＡＤＰＨを唯一の補因子として供給すると検出可能な活性を表示しない。Ｋｉｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９：１２２６−１２３４（２０００）；およびＷｉｌｄｉｎｇら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２（１８）：５１４７−５２（２０００）によって記載されたもの（これらの内容は、それら全体が本明細書に援用されている）をはじめとする、当該技術分野において公知の補因子特異性を判定するための任意の方法を利用して、補因子としてＮＡＤＨを選好するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを同定することができる。
【０１１６】
一部の実施形態では、例えば補因子結合ポケットの部位特異的突然変異誘発によって、前記ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをＮＡＰＤＨよりＮＡＤＨに対して選択的であるように（遺伝子）操作する。ＮＡＤＨ−選択性を（遺伝子）操作するための方法は、Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５３：３０４４−３０５４（２００７）に記載されており、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの補因子特異性を判定するための方法は、Ｋｉｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．９：１２２６−１２３４（２０００）に記載されており、前記参考文献の内容は、それら全体が参照により本明細書に援用されている。
【０１１７】
一部の実施形態において、前記ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、メバロン酸分解経路を天然に含む宿主種、例えば、メバロネートをその唯一の炭素源として異化する宿主種に由来する。これらの実施形態の中で、その天然宿主細胞内の内在化（Ｒ）−メバロネートの（Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡへの酸化的アシル化を正常に触媒するＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを利用して、メバロン酸生合成経路を含む遺伝子改変された宿主細胞において逆反応、すなわち（Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡの（Ｒ）−メバロネートへの還元的脱アシル化、を触媒する。唯一の炭素源としてメバロネートを用いて成長する能力がある原核生物は、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７１（１２）：６４６８−６４７２（１９８９）；Ｂｅａｃｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：２９９４−３００１（１９８９）；Ｂｅｎｓｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５：３７５５−３７６２；Ｆｉｍｏｎｇｎａｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４：２０８６−２０９０（１９６５）；Ｓｉｄｄｉｑｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８：１１０−１１３（１９６２）；Ｓｉｄｄｉｑｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９３：２０７−２１４（１９６７）；およびＴａｋａｔｓｕｊｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１０：１８７−１９３（１９８３）により記載されており、前記参考文献の内容は、それら全体が参照により本明細書に援用されている。
【０１１８】
本明細書に記載する組成物および方法の一部の実施形態において、前記宿主は、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧｒとＮＡＤＰＨ−使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの両方を含む。ＮＡＤＰＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＮＭ＿２０６５４８；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、（ＮＣ＿００２７５８、Ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ  ＳＡＶ２５４５、ＧｅｎｅＩＤ  １１２２５７０；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、（ＡＢ０１５６２７；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＫＯ  ３９８８）、（トランケート型ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードしている配列を提供する、ＡＸ１２８２１３；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、および（ＮＣ＿００１１４５：補体（１１５７３４．１１８８９８；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
５．２．５．４  メバロネートのメバロン酸−５−リン酸への変換
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、メバロネートをメバロン酸−５−リン酸に変換することができる酵素、例えばメバロン酸キナーゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、（Ｌ７７６８８；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、および（Ｘ５５８７５；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
５．２．５．５  メバロン酸−５−リン酸のメバロン酸−５−ピロリン酸への変換
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換することができる酵素、例えばホスホメバロン酸キナーゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＡＦ４２９３８５；Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、（ＮＭ＿００６５５６；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、および（ＮＣ＿００１１４５．補体７１２３１５．７１３６７０；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
５．２．５．６  メバロン酸−５−ピロリン酸のＩＰＰへの変換
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）に変換することができる酵素、例えばメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、（Ｘ９７５５７；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（ＡＦ２９００９５；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、および（Ｕ４９２６０；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
５．２．５．７  ＩＰＰのＤＭＡＰＰへの変換
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、前記ＭＥＶ経路によって産生されたＩＰＰをジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換することができる酵素、例えばＩＰＰイソメラーゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列をさらに含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＮＣ＿０００９１３，３０３１０８７．３０３１６３５；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、および（ＡＦ０８２３２６；Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２３】
５．２．５．８  ポリプレニルシンターゼ
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合させて、５個より多くの炭素を含有するポリプレニル化合物を形成することができるポリプレニルシンターゼをコードしている異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１２４】
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、１つのＩＰＰ分子と１つのＤＭＡＰＰ分子を縮合させてゲラニルピロリン酸（「ＧＰＰ」）を形成することができる酵素、例えばＧＰＰシンターゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＡＦ５１３１１１；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＦ５１３１１２；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＦ５１３１１３；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＹ５３４６８６；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＹ５３４６８７；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（Ｙ１７３７６；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＥ０１６８７７、遺伝子座ＡＰ１１０９２；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ；ＡＴＣＣ  １４５７９）、（ＡＪ２４３７３９；Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、（ＡＹ５３４７４５；Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、（ＡＹ９５３５０８；Ｉｐｓ  ｐｉｎｉ）、（ＤＱ２８６９３０；Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、（ＡＦ１８２８２８；Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）、（ＡＦ１８２８２７；Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）、（ＭＰＩ２４９４５３；Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）、（ＰＺＥ４３１６９７、遺伝子座ＣＡＤ２４４２５；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、（ＡＹ８６６４９８；Ｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ  ｋｕｒｒｏｏａ）、（ＡＹ３５１８６２；Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）および（ＡＦ２０３８８１、遺伝子座ＡＡＦ１２８４３；Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２５】
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、２つのＩＰＰ分子と１つのＤＭＡＰＰ分子を縮合させるか、またはＩＰＰ分子をＧＰＰ分子に付加させて、ファルネシルピロリン酸（「ＦＰＰ」）を形成することができる酵素、例えばＦＰＰシンターゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＡＴＵ８０６０５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＴＨＦＰＳ２Ｒ；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＡＵ３６３７６；Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）、（ＡＦ４６１０５０；Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）、（Ｄ００６９４；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２）、（ＡＥ００９９５１、遺伝子座ＡＡＬ９５５２３；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ＡＴＣＣ  ２５５８６）、（ＧＦＦＰＰＳＧＥＮ；Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、（ＣＰ０００００９、遺伝子座ＡＡＷ６００３４；Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ  ６２１Ｈ）、（ＡＦ０１９８９２；Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、（ＨＵＭＦＡＰＳ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、（ＫＬＰＦＰＳＱＣＲ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、（ＬＡＵ１５７７７；Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ）、（ＬＡＵ２０７７１；Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ）、（ＡＦ３０９５０８；Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、（ＮＣＦＰＰＳＧＥＮ；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、（ＰＡＦＰＳ１；Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、（ＰＡＦＰＳ２；Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、（ＲＡＴＦＡＰＳ；Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、（ＹＳＣＦＰＰ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（Ｄ８９１０４；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、（ＣＰ０００００３、遺伝子座ＡＡＴ８７３８６；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、（ＣＰ００００１７、遺伝子座ＡＡＺ５１８４９；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、（ＮＣ＿００８０２２、遺伝子座ＹＰ＿５９８８５６；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＭＧＡＳ１０２７０）、（ＮＣ＿００８０２３、遺伝子座ＹＰ＿６００８４５；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＭＧＡＳ２０９６）、（ＮＣ＿００８０２４、遺伝子座ＹＰ＿６０２８３２；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＭＧＡＳ１０７５０）、（ＭＺＥＦＰＳ；Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、（ＡＥ０００６５７、遺伝子座ＡＡＣ０６９１３；Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５）、（ＮＭ＿２０２８３６；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（Ｄ８４４３２、遺伝子座ＢＡＡ１２５７５；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、（Ｕ１２６７８、遺伝子座ＡＡＣ２８８９４；Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  ＵＳＤＡ  １１０）、（ＢＡＣＦＤＰＳ；Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、（ＮＣ＿００２９４０、遺伝子座ＮＰ＿８７３７５４；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ  ３５０００ＨＰ）、（Ｌ４２��２３、遺伝子座ＡＡＣ２３０８７；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｒｄ  ＫＷ２０）、（Ｊ０５２６２；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、（ＹＰ＿３９５２９４；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ｓａｋｅｉ  ２３Ｋ）、（ＮＣ＿００５８２３、遺伝子座ＹＰ＿０００２７３；Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎｉ  ｓｔｒ．Ｆｉｏｃｒｕｚ  Ｌ１−１３０）、（ＡＢ００３１８７；Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、（ＮＣ＿００２９４６、遺伝子座ＹＰ＿２０８７６８；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ  ＦＡ  １０９０）、（Ｕ０００９０、遺伝子座ＡＡＢ９１７５２；Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＮＧＲ２３４）、（Ｊ０５０９１；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、（ＣＰ００００３１、遺伝子座ＡＡＶ９３５６８；Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉ  ＤＳＳ−３）、（ＡＥ００８４８１、遺伝子座ＡＡＫ９９８９０；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｒ６）および（ＮＣ＿００４５５６、遺伝子座ＮＰ  ７７９７０６；Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ  Ｔｅｍｅｃｕｌａ１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ＩＰＰとＤＭＡＰＰまたはＩＰＰとＦＰＰを組み合わせてゲラニルゲラニルピロリン酸（「ＧＧＰＰ」）を形成することができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列をさらに含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＡＴＨＧＥＲＰＹＲＳ；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＢＴ００５３２８；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＭ＿１１９８４５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＺ＿ＡＡＪＭ０１０００３８０、遺伝子座ＺＰ＿００７４３０５２；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ、ＡＴＣＣ  ３５６４６  ｓｑ１５６３）、（ＣＲＧＧＰＰＳ；Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）、（ＮＺ＿ＡＡＢＦ０２００００７４、遺伝子座ＺＰ＿００１４４５０９；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、ＡＴＣＣ  ４９２５６）、（ＧＦＧＧＰＰＳＧＮ；Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、（ＡＹ３７１３２１；Ｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａ）、（ＡＢ０５５４９６；Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、（ＡＢ０１７９７１；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、（ＭＣＩ２７６１２９；Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ  ｆ．ｌｕｓｉｔａｎｉｃｕｓ）、（ＡＢ０１６０４４；Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、（ＡＡＢＸ０１０００２９８、遺伝子座ＮＣＵ０１４２７；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、（ＮＣＵ２０９４０；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、（ＮＺ＿ＡＡＫＬ０１０００００８、遺伝子座ＺＰ＿００９４３５６６；Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＵＷ５５１）、（ＡＢ１１８２３８；Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、（ＳＣＵ３１６３２；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（ＡＢ０１６０９５；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｅｓ）、（ＳＡＧＧＰＳ；Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ）、（ＳＳＯＧＤＳ；Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、（ＮＣ＿００７７５９、遺伝子座ＹＰ＿４６１８３２；Ｓｙｎｔｒｏｐｈｕｓ  ａｃｉｄｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓ  ＳＢ）、（ＮＣ＿００６８４０、遺伝子座ＹＰ＿２０４０９５；Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ  ＥＳ１１４）、（ＮＭ＿１１２３１５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＥＲＷＣＲＴＥ；Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、（Ｄ９００８７、遺伝子座ＢＡＡ１４１２４；Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）、（Ｘ５２２９１、遺伝子座ＣＡＡ３６５３８；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、（ＡＦ１９５１２２、遺伝子座ＡＡＦ２４２９４；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）および（ＮＣ＿００４３５０、遺伝子座ＮＰ＿７２１０１５；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  ＵＡ１５９）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２７】
５．２．５．９  テルペンシンターゼ
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ポリプレニルを、ヘミテルペン、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、ポリテルペン、ステロイド化合物、カロテノイドまたは修飾イソプレノイド化合物を形成するように修飾することができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１２８】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、カレンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＡＦ４６１４６０、領域  ４３．１９２６；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）および（ＡＦ５２７４１６、領域：７８．１８７１；Ｓａｌｖｉａ  ｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２９】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、ゲラニオールシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＡＪ４５７０７０；Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｔｅｎｕｉｐｉｌｕｍ）、（ＡＹ３６２５５３；Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）、（ＤＱ２３４３００；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｓｔｒａｉｎ  １８６４）、（ＤＱ２３４２９９；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ  ｓｔｒａｉｎ  １８６１）、（ＤＱ２３４２９８；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ  ｓｔｒａｉｎ  ４９３５）および（ＤＱ０８８６６７；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３０】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、リナロールシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＡＦ４９７４８５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＣ００２２９４、遺伝子座ＡＡＢ７１４８２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＹ０５９７５７；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＭ＿１０４７９３；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＦ１５４１２４；Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）、（ＡＦ０６７６０３；Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、（ＡＦ０６７６０２；Ｃｌａｒｋｉａ  ｃｏｎｃｉｎｎａ）、（ＡＦ０６７６０１；Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、（Ｕ５８３１４；Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、（ＡＹ８４００９１；Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、（ＤＱ２６３７４１；Ｌａｖａｎｄｕｌａ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）、（ＡＹ０８３６５３；Ｍｅｎｔｈａ  ｃｉｔｒａｔｅ）、（ＡＹ６９３６４７；Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）、（ＸＭ＿４６３９１８；Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、（ＡＰ００４０７８、遺伝子座ＢＡＤ０７６０５；Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、（ＸＭ＿４６３９１８、遺伝子座ＸＰ＿４６３９１８；Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、（ＡＹ９１７１９３；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）、（ＡＦ２７１２５９；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、（ＡＹ４７３６２３；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）、（ＤＱ１９５２７４；Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）および（ＡＦ４４４７９８；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｖａｒ．ｃｒｉｓｐａ  ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｎｏ．７９）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３１】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、リモネンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、（＋）−リモネンシンターゼ（ＡＦ５１４２８７、領域：４７．１８６７；Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ）および（ＡＹ０５５２１４、領域：４８．１８８９；Ａｇａｓｔａｃｈｅ  ｒｕｇｏｓａ）ならびに（−）−リモネンシンターゼ（ＤＱ１９５２７５、領域：１．１９０５；Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）、（ＡＦ００６１９３、領域：７３．１９８６；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）および（ＭＨＣ４ＳＬＳＰ、領域：２９．１８２８；Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、ミルセンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、（Ｕ８７９０８；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＹ１９５６０９；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＹ１９５６０８；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＮＭ＿１２７９８２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＰＳ１０）、（ＮＭ＿１１３４８５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１３４８３；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＡＦ２７１２５９；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、（ＡＹ４７３６２６；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）、（ＡＦ３６９９１９；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）および（ＡＪ３０４８３９；Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｉｌｅｘ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、オシメンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、（ＡＹ１９５６０７；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＹ１９５６０９；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＹ１９５６０８；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＫ２２１０２４；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＭ＿１１３４８５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１３４８３；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１７７７５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ０３）、（ＮＭ＿００１０３６５７４；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ０３）、（ＮＭ＿１２７９８２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＰＳ１０）、（ＡＢ１１０６４２；Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ  ＣｉｔＭＴＳＬ４）および（ＡＹ５７５９７０；Ｌｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ  ｖａｒ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、α−ピネンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、（＋）α−ピネンシンターゼ（ＡＦ５４３５３０、領域：１．１８８７；Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）、（−）α−ピネンシンターゼ（ＡＦ５４３５２７、領域：３２．１９２１；Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）および（＋）／（−）α−ピネンシンターゼ（ＡＧＵ８７９０９、領域：６１１１８９２；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３５】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、β−ピネンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、（−）β−ピネンシンターゼ（ＡＦ２７６０７２、領域：１．１７４９；Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）および（ＡＦ５１４２８８、領域：２６．１８３４；Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、サビネンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、Ｓａｌｖｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓからのＡＦ０５１９０１、領域：２６．１７９８が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、γ−テルピネンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎからのＡＦ５１４２８６、領域：３０．１８３２）および（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕからのＡＢ１１０６４０、領域１．１８０３）が挙げられる。
【０１３８】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、テルピノレンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、（Ｏｓｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍからのＡＹ６９３６５０）および（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉからのＡＹ９０６８６６、領域：１０．１８８７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、アモルファジエンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例は、米国特許出願公開第２００４／０００５６７８号の配列番号３７である。
【０１４０】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、α−ファルネセンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、Ｐｙｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ  ｃｕｌｔｉｖａｒ  ｄ’ＡｎｊｏｕからのＤＱ３０９０３４（セイヨウナシ；遺伝子名ＡＦＳ１）およびＭａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａからのＡＹ１８２２４１（リンゴ；遺伝子ＡＦＳ１）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｐｅｃｈｏｕｕｓら、
Ｐｌａｎｔａ  ２１９（１）：８４−９４（２００４）。
【０１４１】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、β−ファルネセンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａからのアクセッション番号ＡＦ０２４６１５（ペパーミント；遺伝子Ｔｓｐａ１１）、およびＡｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａからのＡＹ８３５３９８が挙げられるが、これらに限定されない。Ｐｉｃａｕｄら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６６（９）：９６１−９６７（２００５）。
【０１４２】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、ファルネソールシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、Ｚｅａ  ｍａｙｓからのアクセッション番号ＡＦ５２９２６６、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＹＤＲ４８１Ｃ（遺伝子Ｐｈｏ８）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｓｏｎｇ，Ｌ．、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２８：１４９−１５８（２００６）。
【０１４３】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、ネロリドールシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、Ｚｅａ  ｍａｙｓからのＡＦ５２９２６６（トウモロコシ；遺伝子ｔｐｓ１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、パチュロール（ｐａｔｃｈｏｕｌｉｏｌ）シンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ  ｃａｂｌｉｎからのＡＹ５０８７３０  領域：１．１６５９が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、ノートカトンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓからのＡＦ４４１１２４  領域：１．１６４７およびＰｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓからのＡＹ９１７１９５  領域：１．１６５３が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４６】
一部の実施形態において、前記異種ヌクレオチドは、アビエタジエンシンターゼをコードしている。適するヌクレオチド配列の例証となる例としては、（Ｕ５０７６８；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）および（ＡＹ４７３６２１；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４７】
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、Ｃ５イソプレノイドを生産する。これらの化合物は、１つのイソプレン単位に由来し、ヘミテルペンとも呼ばれる。ヘミテルペンの例証となる例は、イソプレンである。他の実施形態において、前記イソプレノイドは、Ｃ１０イソプレノイドである。これらの化合物は、２つのイソプレン単位に由来し、モノテルペンとも呼ばれる。モノテルペンの例証となる例は、リモネン、シトラネロール、ゲラニオール、メントール、ペリリルアルコール、リナロール、ツジョンおよびミルセンである。他の実施形態において、前記イソプレノイドは、Ｃ１５イソプレノイドである。これらの化合物は、３つのイソプレン単位に由来し、セスキテルペンとも呼ばれる。セスキテルペンの例証となる例は、ペリプラノンＢ、ギンコライド（ｇｉｎｇｋｏｌｉｄｅ）Ｂ、アモルファジエン、アルテミシニン、アルテミシン酸、バレンセン、ノートカトン、エピセドロール、エピアリストロケン、フェルネソール、ゴシポール、サノニン、ペリプラノン、フォルスコリン、およびパチュロール（パチュリアルコールとしても公知である）である。他の実施形態において、前記イソプレノイドは、Ｃ２０イソプレノイドである。これらの化合物は、４つのイソプレン単位に由来し、ジテルペンとも呼ばれる。ジテルペンの例証となる例は、カスベン、エロイテロビン、パクリタキセル、プロスタチン、プソイドプテロシンおよびタキサジエンである。さらに他の例では、前記イソプレノイドは、Ｃ２０＋イソプレノイドである。これらの化合物は、４つより多くのイソプレン単位に由来し、トリテルペン（６つのイソプレン単位に由来するＣ３０イソプレノイド化合物）、例えば、アルブルシドＥ（ａｒｂｒｕｓｉｄｅＥ）、ブルセアンチン、テストステロン、プロゲステロン、コルチゾン、ジギトキシンおよびスクアレン；テトラテルペン（８つのイソプレン単位に由来するＣ４０イソプレノイド化合物）、例えば、β−カロテン；ならびにポリテルペン（８つより多くのイソプレン単位に由来するＣ４０＋イソプレノイド化合物）、例えば、ポリイソプレンを含む。一部の実施形態において、前記イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチュロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレンおよびバレンセンからなる群より選択される。イソプレノイド化合物としては、カロテノイド（例えば、リコペン、α−およびβ−カロテン、α−およびβ−クリプトキサンチン、ビキシン、ゼアキサンチン、アスタキサンチンならびにルテイン）、ステロイド化合物、ならびに他の化学基によって修飾されているイソプレノイドからなる化合物、例えば混合テルペン−アルカロイド、および補酵素Ｑ−１０も挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４８】
５．３  遺伝子改変された細胞の作製方法
上に記載した改変の１つ以上、例えば、ＡＤＡ、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、ＡＡＣＳ、ＰＫ、ＰＴＡおよび他のメバロン酸経路酵素から選択される１つ以上の酵素をコードする１つ以上の異種核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、を含むように遺伝子操作されている宿主細胞を生産するための方法も、本明細書に提供する。宿主細胞における異種酵素の発現は、該酵素をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸を該宿主細胞に、該宿主細胞における発現を可能にする調節要素の制御下で導入することによって果たすことができる。一部の実施形態において、前記核酸は、染色体外プラスミドである。他の実施形態において、前記核酸は、ヌクレオチド配列を宿主細胞の染色体に組み込むことができる染色体組み込みベクターである。
【０１４９】
これらのタンパク質をコードしている核酸を、宿主細胞に、当業者に公知の任意の方法によって無制限に導入することができる（例えば、Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１２９２−３；Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６−３３８５；Ｇｏｅｄｄｅｌら編、１９９０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ＣＡ；Ｋｒｉｅｇｅｒ、１９９０、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  −−  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −−  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌら編、現行版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを参照されたし）。例示的技術としては、スフェロプラスト、エレクトロポレーション、ＰＥＧ  １０００媒介形質転換、および酢酸リチウムまたは塩化リチウム媒介形質転換が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５０】
宿主細胞における酵素のコピー数を、該酵素をコードしている遺伝子の転写を修飾することによって変えることができる。これは、例えば、前記酵素をコードしているヌクレオチド配列のコピー数を（例えば、前記ヌクレオチド配列を含む、より高もしくはより低コピー数発現ベクターを使用することによって、または前記ヌクレオチド配列の追加のコピーを宿主細胞のゲノムに導入することによって、または宿主細胞のゲノムにおける前記ヌクレオチド配列を欠失もしくは破壊することによって）変更することによって；オペロンの多シストロン性ｍＲＮＡ上のコード配列の順序を変化させること、もしくはオペロンを破壊して、各々がその固有の制御要素を有する個々の遺伝子にすることによって；または前記ヌクレオチド配列が作動可能に連結されているプロモーターもしくはオペレーターの強度を増加させることによって、果たすことができる。あるいは、または加えて、宿主細胞における酵素のコピー数を、該酵素をコードしているｍＲＮＡの翻訳レベルを修飾することによって、変えることができる。これは、例えば、前記ｍＲＮＡの安定性を修飾することによって；リボソーム結合部位の配列を修飾することによって；リボソーム結合部位と前記酵素コード配列の開始コドンの間の距離を変更もしくは配列を修飾することによって；前記酵素コード領域の開始コドンの５’側「の上流に」もしくは５’側に隣接して位置する全シストロン間領域を修飾することによって；ヘアピンおよび専用配列を使用して前記ｍＲＮＡ転写産物の３’末端を安定させることによって；酵素のコドン使用頻度を変更することによって；前記酵素の生合成に使用されるレアコドンｔＲＮＡの発現を変えることによって；ならびに／または前記酵素の安定性を例えばそのコード配列の突然変異などにより増加させることによって、果たすことができる。
【０１５１】
宿主細胞における酵素の活性を多数の方法で変性させることができ、それらの方法としては、前記宿主細胞において溶解度増加または減少を呈示する改変された形態の酵素を発現させる方法、前記酵素の活性を阻害するドメインがない変性された形態の酵素を発現させる方法、基質に対してのより高いもしくはより低いＫｃａｔまたはより低いもしくはより高いＫｍを有する修飾形態の酵素を発現させる方法、あるいは前記経路の別の分子によるフィードバックまたはフィードフォワード調節による影響をより大きくまたはより小さく受ける変性された形態の酵素を発現させる方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
一部の実施形態において、宿主細胞を遺伝子改変するために使用する核酸は、形質転換された宿主細胞の選択に有用な、および外来ＤＮＡを維持するために前記宿主細胞に選択圧をかけるのに有用な、１つ以上の選択可能マーカーを含む。
【０１５３】
一部の実施形態において、前記選択可能マーカーは、抗生物質耐性マーカーである。抗生物質耐性マーカーの例証となる例としては、ＢＬＡ、ＮＡＴ１、ＰＡＴ、ＡＵＲ１−Ｃ、ＰＤＲ４、ＳＭＲ１、ＣＡＴ、マウスｄｈｆｒ、ＨＰＨ、ＤＳＤＡ、ＫＡＮＲおよびＳＨ  ＢＬＥ遺伝子産物が挙げられるが、これらに限定されない。大腸菌からのＢＬＡ遺伝子産物は、a−ラクタム抗生物質（例えば、狭域セファロスポリン、セファマイシン、およびカルバペネム（エルタペネム）、セファマンドール、およびセフォペラゾン）に対する耐性およびテモシリンを除くすべての抗グラム陰性菌ペニシリンに対する耐性を付与し；Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉからのＮＡＴ１遺伝子産物は、ノウルセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）に対する耐性を付与し；Ｓ．ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ  Ｔｕ９４からのＰＡＴ遺伝子産物は、ビアロフォス（ｂｉａｌｏｐｈｏｓ）に対する耐性を付与し、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＡＵＲ１−Ｃ遺伝子産物は、オーレオバシジン（Ａｕｅｒｏｂａｓｉｄｉｎ）Ａ（ＡｂＡ）に対する耐性を付与し；ＰＤＲ４遺伝子産物は、セルレニンに対する耐性を付与し；ＳＭＲ１遺伝子産物は、スルホメツロンメチル（ｓｕｌｆｏｍｅｔｕｒｏｎ  ｍｅｔｈｙｌ）に対する耐性を付与し；Ｔｎ９トランスポゾンからのＣＡＴ遺伝子産物は、クロラムフェニコールに対する耐性を付与し；マウスｄｈｆｒ遺伝子産物は、メトトレキサートに対する耐性を付与し、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａのＨＰＨ遺伝子産物は、ヒグロマイシンＢに対する耐性を付与し；大腸菌のＤＳＤＡ遺伝子産物は、唯一の窒素原としてＤ−セリンを伴うプレートでの細胞の成長を可能にし；Ｔｎ９０３トランスポゾンのＫＡＮＲ遺伝子は、Ｇ４１８に対する耐性を付与し；およびＳｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓからのＳＨ  ＢＬＥ遺伝子産物は、ゼオシン（ブレオマイシン）に対する耐性を付与する。一部の実施形態において、前記抗生物質耐性マーカーは、本明細書中に記載の遺伝子改変された宿主細胞が単離された後に欠失される。
【０１５４】
一部の実施形態において、前記選択可能マーカーは、遺伝子改変された微生物中の栄養要求性（例えば、栄養学的栄養要求性（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ａｕｘｏｔｒｏｐｈｙ））をレスキューする。かかる実施形態において、親微生物は、アミノ酸またはヌクレオチド生合成経路において機能する１つ以上の遺伝子産物に関する機能破壊を含み、非機能的な場合には、該親細胞を、１つ以上の栄養素を補給せずに培地で成長することができないものにする。このような遺伝子産物としては、例えば酵母におけるＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ１、ＬＹＳ２、ＭＥＴ１５、ＴＲＰ１、ＡＤＥ２およびＵＲＡ３の遺伝子産物が挙げられるがこれらに限定されない。その後、破壊された遺伝子産物の機能性コピーをコードするように発現ベクターまたは染色体組み込み構築物で前記親細胞を形質転換することによって前記栄養要求性表現型をレスキューすることができ、生じた遺伝子改変された微生物細胞をその親細胞の栄養要求性表現型の喪失に基づいて選択することができる。ＵＲＡ３、ＴＲＰ１およびＬＹＳ２遺伝子の選択可能マーカーとしての利用は、ポジティブセレクションとネガティブセレクションの両方が可能であるので、顕著な利点を有する。ポジティブセレクションは、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１およびＬＹＳ２突然変異の栄養要求性の相補によって行われ、これに対してネガティブセレクションは、特異的阻害剤、すなわち、それぞれ５−フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）、５−フルオロアントラニル酸およびアミノアジピン酸（ａＡＡ）に基づき、これらは、それぞれ、原栄養株の成長を妨げるが、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１およびＬＹＳ２変異体の成長を可能にする。他の実施形態において、選択可能マーカーは、公知の選択法によって同定され得る他の非致死的欠失または表現型をレスキューする。
【０１５５】
本開示の方法、組成物および生物において有用な特異的遺伝子およびタンパク質を本明細書に記載するが、かかる遺伝子の絶対的一致が必要ないことは理解されるであろう。例えば、ポリペプチドまたは酵素をコードしている配列を含む特定の遺伝子またはポリヌクレオチドの変更を行うことができ、活性についてスクリーニングすることができる。典型的に、かかる変更は、保存的突然変異およびサイレント突然変異を含む。かかる改変されたまたは突然変異したポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、当該技術分野において公知の方法を用いて機能性酵素の発現についてスクリーニングすることができる。
【０１５６】
遺伝子コードの固有の縮重に起因して、実質的に同じまたは機能的に等価のポリペプチドをコードしている他のポリヌクレオチドを使用して、かかる酵素をコードしているポリヌクレオチドをクローニングすることおよび発現させることもできる。
【０１５７】
当業者には理解されるであろうように、コード配列を、特定の宿主におけるその発現を増進するように改変することは、有利であり得る。遺伝子コードは、可能性のある６４のコドンが重複しているが、大部分の生物は、典型的にこれらのコドンのサブセットを使用する。種の中で最も多く利用されるコドンは、最適コドンと呼ばれ、殆ど利用されないものは、レアまたは低使用頻度コドンとして分類される。ときとして「コドン最適化」または「種のコドンバイアスの制御」と呼ばれるプロセスで、宿主の好ましいコドン使用頻度を反映するようにコドンを置換することができる。
【０１５８】
特定の原核生物または真核生物宿主によって選好されるコドンを含有する最適化コドン配列（Ｍｕｒｒａｙら、１９８９、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４７７−５０８）を、例えば、翻訳速度を増加させるように、または非最適化配列から生産された転写産物と比較してより長い半減期などの望ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写産物を生産するように、調製することができる。宿主選好を反映するように翻訳終止コドンを改変することもできる。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび哺乳動物の典型的な終止コドンは、それぞれ、ＵＡＡおよびＵＧＡである。単子葉植物の典型的な終止コドンは、ＵＧＡであり、その一方で昆虫および大腸菌は、一般にＵＡＡを終止コドンとして使用する（Ｄａｌｐｈｉｎら、１９９６、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２１６−８）。
【０１５９】
遺伝子コードの縮重性に起因して、ヌクレオチド配列が異なる様々なＤＮＡ分子を、本開示の所与の酵素をコードするために使用することができることは、当業者には分かるであろう。上に記載した生合成酵素をコードしている天然ＤＮＡ配列は、単に本開示の実施形態を例証するために本明細書中で言及するものであり、本開示は、本開示の方法において用いる酵素のポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列をコードしている任意の配列のＤＮＡ分子を含む。同様に、ポリペプチドは、典型的に、所望の活性の喪失または有意な喪失を伴うことなく、そのアミノ酸配列における１つ以上のアミノ酸置換、欠失および挿入を許容することができる。本開示は、本明細書に記載する特定のタンパク質とは異なるアミノ酸配列を有するそのようなポリペプチドを、該改変されたまたは変異体ポリペプチドが参照ポリペプチドの酵素的同化または異化活性を有する限り含む。さらに、本明細書に示すＤＮＡ配列によってコードされているアミノ酸配列は、本開示の実施形態を例証するものに過ぎない。
【０１６０】
加えて、本明細書に提供する組成物および方法に有用な酵素の相同体は、本開示に包含される。一部の実施形態において、２つのタンパク質（またはそれらのタンパク質の領域）は、それらのアミノ酸配列が、少なくとも約３０％、４０％、５０％  ６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するとき、実質的に相同である。２つのアミノ酸配列の、または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、最適比較を目的としてそれらの配列をアラインする（例えば、最適なアラインメントのために第一および第二のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、ならびに比較を目的として非相同配列を無視することができる）。１つの実施形態において、比較を目的としてアラインする参照配列の長さは、その参照配列の長さの少なくとも３０％、典型的には少なくとも４０％、さらに典型的には少なくとも５０％、さらにいっそう典型的には少なくとも６０％、およびさらにいっそう典型的には少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。その後、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列内の位置が、第二の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されているときには、それらの分子は、その位置で同一である（本明細書において用いる場合、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と同義である）。２配列間の同一性パーセントは、それら２配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れて、それらの配列が共有する同一位置の数の関数である。
【０１６１】
タンパク質またはペプチドに言及する際に「相同の」を用いるとき、同一でない残基位置は、多くの場合、保存的アミノ酸置換が異なることは認知されている。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質に変化させることにならない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換の点で互いに異なる場合、配列同一性パーセントまたは相同度を上方調整して、置換の保存的性質を修正することができる。この調整を行う手段は、当業者には周知である（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ．Ｒ．、１９９４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５：３６５−８９を参照されたし）。
【０１６２】
次の６群各々は、互いに保存的置換であるアミノ酸を有する：１）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【０１６３】
配列同一性パーセントとも呼ばれる、ポリペプチドについての配列相同性は、典型的に、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。異なる生物からの多数の配列を含有するデータベースと分子配列を比較するために使用される典型的なアルゴリズムは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴである。多数の異なる生物からの配列を含有するデータベースを検索するとき、アミノ酸配列を比較することは一般的である。
【０１６４】
さらに、上述の酵素をコードしている任意の遺伝子（または本明細書中で言及する任意の他のもの（またはそれらの発現を制御もしくは修飾する任意の調節要素））を、当業者に公知である遺伝子／タンパク質（遺伝子）操作技術、例えば、指向性進化または合理的突然変異誘発によって最適化することができる。かかる作業によって、当業者は、酵母における発現および活性について酵素を最適化することができる。
【０１６５】
加えて、これらの酵素をコードしている遺伝子を、他の真菌および細菌種から同定することができ、この経路の修飾のために発現させることができる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳ．ｕｖａｒｕｍを含む）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓおよびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓを含む）、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｐ．（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａを含む）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｓｐｐ．、Ｙａｍａｄａｚｙｍａ  ｓｐｐ．（Ｙ．ｓｐｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ，Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ，Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓを含む）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ（Ｓ．ｐｏｍｂｅを含む）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．、またはＵｓｔｉｌａｇｏ  ｓｐｐ．をはじめとする（しかしこれらに限定されない）様々な生物が、これらの酵素の源としての役割を果たすことができよう。嫌気性真菌からの遺伝子源としては、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．またはＮｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ  ｓｐｐ．が挙げられるが、これらに限定されない。有用である原核生物酵素源としては、大腸菌、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６６】
当業者に公知の技術は、さらなる相同遺伝子および相同酵素の同定に適し得る。一般に、相似遺伝子および／または相似酵素を機能分析によって同定することができ、それらは、機能的類似性を有することになる。当業者に公知の技術は、相似遺伝子および相似酵素の同定に適し得る。例えば、相同または相似ＡＤＡ遺伝子、タンパク質または酵素を同定するための技術としては、ＡＤＡ遺伝子／酵素の公開配列に基づくプライマーを使用するＰＣＲによるまたはＡＤＡ遺伝子間の保存領域を増幅するように設計された縮重プライマーを使用する縮重ＰＣＲによる遺伝子のクローニングが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、当業者は、機能的相同性または類似性を有する相同もしくは相似遺伝子、タンパク質または酵素を同定するための技術を用いることができる。技術には、細胞または細胞培養物を酵素の触媒活性について、該活性についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイにより（例えば、本明細書に記載するまたはＫｉｒｉｔａｎｉ，Ｋ．、Ｂｒａｎｃｈｅｄ−Ｃｈａｉｎ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９７０に記載されているように）検査すること；その後、前記活性を有する酵素を精製によって単離すること；前記酵素のタンパク質配列をエドマン分解などの技術によって決定すること；可能性の高い核酸配列に対するＰＣＲプライマーの設計；ＰＣＲによる前記ＤＮＡ配列の増幅；および前記核酸配列のクローニングが含まれる。相同もしくは類似遺伝子および／または相同もしくは類似酵素、相似遺伝子および／または相似酵素もしくはタンパク質を同定するための技術には、候補遺伝子または酵素に関するデータとデータベース、例えば、ＢＲＥＮＤＡ、ＫＥＧＧまたはＭｅｔａＣＹＣとの比較も含まれる。候補遺伝子または酵素を上述のデータベース内でここでの技術に従って同定することができる。
【０１６７】
５．４  イソプレノイドを生産する方法
もう１つの態様では、イソプレノイドの生産方法であって、（ａ）本明細書に記載する遺伝子改変された宿主細胞のいずれかの集団を、炭素源を有する培地中、イソプレノイド化合物の作製に適する条件下で培養する工程；および（ｂ）前記イソプレノイドを前記培地から回収する工程を含む方法を、本明細書に提供する。
【０１６８】
一部の実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、ＡＤＡの異種発現、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの異種発現、ＡＡＣＳの異種発現、ホスホケトラーゼの異種発現、ホスホトランスアセチラーゼの異種発現、およびメバロン酸経路の１つ以上の酵素の異種発現からなる群より選択される１つ以上の改変を含み；前記遺伝子改変された宿主細胞は、前記１つ以上の改変を含まない親細胞、または前記遺伝子改変された宿主細胞の１つ以上の改変のサブセットしか含まず、他の点では遺伝子的に同一である親細胞と比較して増加された量のイソプレノイド化合物を生産する。一部の実施形態において、前記増加された量は、例えば、収率、生産、生産性に関して、細胞培養物１リットルあたりのグラム数で、乾燥細胞重量１グラムあたりのミリグラム数で、細胞培養物の単位体積あたりベースで、単位乾燥細胞重量あたりベースで、単位時間あたりの細胞培養物の単位体積あたりベースで、または単位時間あたりの単位乾燥細胞重量あたりベースで測定して、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％である、または１００％より多い。
【０１６９】
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、発酵培地１リットルあたり約１０グラムより多い、高レベルのイソプレノイドを生産する。一部のかかる実施形態において、前記イソプレノイドは、細胞培養物１リットルあたり約１０から約５０グラムの、約１５グラムよりより多い、約２０グラムより多い、約２５グラムより多い、または約３０グラムより多い量で生産される。
【０１７０】
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、乾燥細胞重量１グラムあたり約５０ミリグラムより多い、高レベルのイソプレノイドを生産する。一部のかかる実施形態において、前記イソプレノイドは、乾燥細胞重量１グラムあたり約５０から約１５００ミリグラムの、約１００ミリグラムより多い、約１５０ミリグラムより多い、約２００ミリグラムより多い、約２５０ミリグラムより多い、約５００ミリグラムより多い、約７５０ミリグラムより多い、または約１０００ミリグラムより多い量で生産される。
【０１７１】
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、細胞培養物の単位体積あたりベースで、親細胞によって生産されるイソプレノイドのレベルより少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍もしくは少なくとも約１，０００倍またはそれ以上高い、高レベルのイソプレノイドを生産する。
【０１７２】
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、単位乾燥細胞重量あたりベースで、親細胞によって生産されるイソプレノイドのレベルより少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍もしくは少なくとも約１，０００倍またはそれ以上高い、高レベルのイソプレノイドを生産する。
【０１７３】
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、単位時間あたりの細胞培養物の単位体積あたりベースで、親細胞によって生産されるイソプレノイドのレベルより少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍もしくは少なくとも約１，０００倍またはそれ以上高い、高レベルのイソプレノイドを生産する。
【０１７４】
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、単位時間あたりの単位乾燥細胞重量あたりベースで、親細胞によって生産されるイソプレノイドのレベルより少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍もしくは少なくとも約１，０００倍またはそれ以上高い、高レベルのイソプレノイドを生産する。
【０１７５】
殆どの実施形態において、前記宿主細胞による高レベルのイソプレノイドの生産は、誘導化合物によって誘導可能である。かかる宿主細胞を誘導化合物不在下で容易に操作することができる。その後、誘導化合物を添加して、前記宿主細胞による高レベルのイソプレノイドの生産を誘導する。他の実施形態において、前記宿主細胞による高レベルのイソプレノイドの生産は、例えば成長温度、培地成分およびこれらに類するものなどの、培養条件を変更することによって誘導可能である。
【０１７６】
５．４．１  培養培地および条件
微生物培養物の維持および成長のための材料および方法は、微生物学または発酵科学技術分野の当業者には周知である（例えば、Ｂａｉｌｅｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ、第二版、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８６を参照されたし）。宿主細胞、発酵およびプロセスの特異的要件に依存して、好気性、微好気性または嫌気性条件のための適切な培養培地、ｐＨ、温度および要件を考慮しなければならない。
【０１７７】
本明細書に提供するイソプレノイドの生産方法は、細胞培養プレート、フラスコまたは発酵槽をはじめとする（しかしこれらに限定されない）適する容器において（例えば、パントテン酸塩を補足したまたはしていない）適する培養培地で行うことができる。さらに、前記方法を当該技術分野において公知の任意の発酵規模で行って、微生物製品の工業生産を支援することができる。撹拌タンク型発酵槽、エアーリフト型発酵槽、気泡発酵槽またはこれらの任意の組み合わせをはじめとする、任意の適する発酵槽を使用することができる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを宿主細胞として利用する特定の実施形態では、ＫｏｓａｒｉｃらによってＵｌｌｍａｎｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第六版、第１２巻、３９８−４７３頁、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＤａＡ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙに詳細に記載されているような発酵槽で、株を成長させることができる。
【０１７８】
一部の実施形態において、前記培養培地は、イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された微生物が存続することができる、すなわち成長および生存を維持することができる、任意の培養培地である。一部の実施形態において、前記培養培地は、同化性炭素、窒素およびホスフェート源を含む水性培地である。かかる培地は、適切な塩、無機質、金属および他の栄養素も含み得る。一部の実施形態では、前記炭素源および各々の必須細胞栄養素を発酵培地に漸増的にまたは継続的に添加し、例えば、炭素源をバイオマスに変換する細胞の代謝または呼吸機能に基づく所定の細胞成長曲線に従って、成長細胞による十分な同化に必要な本質的に最低のレベルで各必要栄養素を維持する。
【０１７９】
微生物の培養に適する条件および適する培地は、当該技術分野において周知である。一部の実施形態では、その適する培地に１つ以上の追加の薬剤、例えば、誘導物質（例えば、遺伝子産物をコードしている１つ以上のヌクレオチド配列が、誘導性プロモーターの制御下にあるとき）、抑制剤（例えば、遺伝子産物をコードしている１つ以上のヌクレオチド配列が、抑制性プロモーターの制御下にあるとき）、または選択剤（例えば、前記遺伝子改変を含む微生物について選択するための抗生物質）などを補足する。
【０１８０】
一部の実施形態において、前記炭素源は、単糖類（単純糖）、二糖類、多糖類、非発酵性炭素源、またはこれらの１つ以上の組み合わせである。適する単糖類の非限定的な例としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、リボース、およびこれらの組み合わせが挙げられる。適する二糖類の非限定的な例としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、およびこれらの組み合わせが挙げられる。適する多糖類の非限定的な例としては、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。適する非発酵性炭素源の非限定的な例としては、アセテートおよびグリセロールが挙げられる。
【０１８１】
培養培地中の炭素源、例えばグルコース、の濃度は、細胞成長を促進すべきであるが、使用する微生物の成長を抑制するほど高くあってはならない。典型的には、（約０．１ｇ／Ｌ未満である検出限界を用いて）検出不能なレベルでだが所望の成長およびバイオマスレベルを達成するようなレベルで、炭素源、例えばグルコースを添加して、培養を実行する。他の実施形態において、前記培養培地中の炭素源、例えばグルコース、の濃度は、約１ｇ／Ｌより高く、好ましくは約２ｇ／Ｌより高く、およびさらに好ましくは約５ｇ／Ｌより高い。加えて、前記培養培地中の炭素源、例えばグルコース、の濃度は、典型的には、約１００ｇ／Ｌ未満、好ましくは約５０ｇ／Ｌ未満、およびさらに好ましくは２０ｇ／Ｌ未満である。培養成分の濃度への言及は、初期成分濃度および／または進行中の成分濃度、両方を指すことに留意しなければならない。場合によっては、培養中に培養培地の炭素源を枯渇させることが望ましいことがある。
【０１８２】
適する培養培地で使用することができる同化性窒素原としては、単純窒素原、有機窒素原および複合窒素原が挙げられるが、これらに限定されない。かる窒素原としては、無水アンモニア、アンモニウム塩、ならびに動物、植物および／または微生物起源の物質が挙げられる。適する窒素原としては、タンパク質加水分解産物、微生物バイオマス加水分解産物、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、尿素、およびアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、前記培養培地中の窒素原の濃度は、約０．１ｇ／Ｌより高く、好ましくは約０．２５ｇ／Ｌより高く、およびさらに好ましくは約１．０ｇ／Ｌより高い。しかし、一定の濃度を超えての、前記培養培地への窒素原の添加は、微生物の成長に有利ではない。結果として、前記培養培地中の窒素原の濃度は、約２０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約１０ｇ／Ｌ未満、およびさらに好ましくは約５ｇ／Ｌ未満である。さらに、場合によっては、培養中に培養培地の窒素原を枯渇させることが望ましいことがある。
【０１８３】
有効な培養培地は、他の化合物、例えば無機塩、ビタミン、微量金属または成長促進剤を含有し得る。かかる他の化合物は、有効な培地中の炭素、窒素または無機質源中にも存在することもあり、または前記培地に特別に添加されることもある。
【０１８４】
前記培養培地は、適するホスフェート源も含有し得る。かかるホスフェート源は、無機ホスフェート源と有機ホスフェート源の両方を含む。好ましいホスフェート源としては、リン酸塩、例えば、一または二塩基性リン酸ナトリウムおよびカリウム、リン酸アンモニウム、およびこれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されない。典型的には、前記培養培地中のホスフェートの濃度は、約１．０ｇ／Ｌより高く、好ましくは約２．０ｇ／Ｌより高く、およびさらに好ましくは約５．０ｇ／Ｌより高い。しかし、一定の濃度を超えての、前記培養培地へのホスフェートの添加は、微生物の成長に有利ではない。したがって、前記培養培地中のホスフェートの濃度は、典型的には約２０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約１５ｇ／Ｌ未満、およびさらに好ましくは約１０ｇ／Ｌ未満である。
【０１８５】
適する培養培地はまた、マグネシウム源を、好ましくは、生理的に許容され得る塩、例えば、硫酸マグネシウム・七水和物の形態で含み得るが、同様のマグネシウム量に寄与する濃度で他のマグネシウム源を使用してもよい。典型的には、前記培養培地中のマグネシウムの濃度は、約０．５ｇ／Ｌより高く、好ましくは約１．０ｇ／Ｌより高く、およびさらに好ましくは約２．０ｇ／Ｌより高い。しかし、一定の濃度を超えての、前記培養培地へのマグネシウムの添加は、微生物の成長に有利ではない。したがって、前記培養培地中のマグネシウムの濃度は、典型的には約１０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約５ｇ／Ｌ未満、およびさらに好ましくは約３ｇ／Ｌ未満である。さらに、場合によっては、培養中に培養培地のマグネシウム源を枯渇させることが望ましいことがある。
【０１８６】
一部の実施形態において、前記培養培地はまた、生物学的に許容され得るキレート剤、例えばクエン酸三ナトリウムの二水和物を含み得る。そのような場合、前記培養培地中のキレート剤の濃度は、約０．２ｇ／Ｌより高く、好ましくは約０．５ｇ／Ｌより高く、およびさらに好ましくは約１ｇ／Ｌより高い。しかし、一定の濃度を超えての、前記培養培地へのキレート剤の添加は、微生物の成長に有利ではない。したがって、前記培養培地中のキレート剤の濃度は、典型的には約１０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約５ｇ／Ｌ未満、およびさらに好ましくは約２ｇ／Ｌ未満である。
【０１８７】
前記培養培地はまた、該培養培地の所望のｐＨを維持するために生物学的に許容され得る酸または塩基を最初に含み得る。生物学的に許容され得る酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、およびこれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されない。生物学的に許容され得る塩基としては、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、およびこれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されない。一部の実施形態において、使用される塩基は、水酸化アンモニウムである。
【０１８８】
前記培養培地はまた、塩化カルシウムをはじめとする（しかしこれに限定されない）、生物学的に許容され得るカルシウム源を含み得る。典型的に、前記培養培地中のカルシウム源、例えば、塩化カルシウム・二水和物、の濃度は、約５ｍｇ／Ｌから約２０００ｍｇ／Ｌの範囲内、好ましくは約２０ｍｇ／Ｌから約１０００ｍｇ／Ｌの範囲内、およびさらに好ましくは約５０ｍｇ／Ｌから約５００ｍｇ／Ｌの範囲内である。
【０１８９】
前記培養培地はまた、塩化ナトリウムを含み得る。典型的に、前記培養培地中の塩化ナトリウムの濃度は、約０．１ｇ／Ｌから約５ｇ／Ｌの範囲内、好ましくは約１ｇ／Ｌから約４ｇ／Ｌの範囲内、およびさらに好ましくは約２ｇ／Ｌから約４ｇ／Ｌの範囲内である。
【０１９０】
一部の実施形態において、前記培養培地はまた、微量金属を含み得る。かかる微量金属を前記培養培地に保存溶液として添加することができ、その保存溶液を、便宜上、前記培養培地の残部から別途調製することができる。典型的に、前記培養培地に添加されるかかる微量金属溶液の量は、約１ｍＬ／Ｌより多く、好ましくは約５ｍＬ／Ｌより多く、およびさらに好ましくは約１０ｍＬ／Ｌより多い。しかし、一定の濃度を超えての、前記培養培地への微量金属の添加は、微生物の成長に有利ではない。したがって、前記培養培地に添加される微量金属溶液の量は、典型的には、約１００ｍＬ／Ｌ未満、好ましくは約５０ｍＬ／Ｌ未満、およびさらに好ましくは約３０ｍＬ／Ｌ未満である。微量金属を保存溶液で添加することに加えて、個々の成分を、上記の微量金属溶液範囲によって指示される成分の量に各々独立して対応する範囲内で、別々に添加してもよいことに留意されたい。
【０１９１】
前記培養培地は、他のビタミン、例えば、パントテン酸塩、ビオチン、カルシウム、パントテン酸塩、イノシトール、ピリドキシン−ＨＣｌ、およびチアミン−ＨＣｌを含み得る。かかるビタミンを前記培養培地に保存溶液としてとして添加することができ、その保存溶液を、便宜上、前記培養培地の残部から別途調製することができる。しかし、一定の濃度を超えての、前記培養培地へのビタミンの添加は、微生物の成長に有利ではない。
【０１９２】
本明細書に記載する発酵方法を、バッチ、フェッドバッチ、細胞再循環、連続および半連続モードを含む（しかしこれらに限定されない）、従来の培養モードで行うことができる。一部の実施形態では、フェッドバッチモードで発酵を行う。そのような場合、発酵生産工程中にパントテン酸塩を含めて、前記培地の成分の一部が培養中に枯渇される。一部の実施形態では、最初に、例えば生産工程の最初に、前記培養物に比較的高濃度のかかる成分を補足することができ、その結果、追加が必要とされる前、一定の期間にわたって成長および／またはイソプレノイド生産を支援する。培養によってレベルが枯渇されるにつれて添加を行うことにより、その培養を通してこれらの成分の好ましい範囲を維持する。例えば、前記培養培地を定期的にサンプリングし、濃度についてアッセイすることによって、前記培養培地中の成分のレベルをモニターすることができる。あるいは、基準培養手順を開発したら、その培養を通して特定の時点での既知レベルに応じて設定した時間間隔で添加を行うことができる。当業者には認知されているであろうように、栄養素の消費速度は、培養中に培地の細胞密度が増加するにつれて増加する。さらに、外来微生物の培養培地への導入を回避するために、当該技術分野において公知であるような無菌添加方法を用いて添加を行う。加えて、少量の消泡剤を培養中に添加してもよい。
【０１９３】
前記培養培地の温度は、前記遺伝子改変された細胞の成長、および／またはイソプレノイドの生産に適する任意の温度であり得る。例えば、前記培養培地に接種物を接種する前に、その培養培地を約２０℃から約４５℃の範囲の温度、好ましくは約２５℃から約４０℃の範囲の温度、およびさらに好ましくは約２８℃から約３２℃の範囲の温度にし、その温度で維持することができる。
【０１９４】
前記培養培地のｐＨを、その培養培地への酸または塩基の添加によって制御することができる。そのような場合、ｐＨを制御するためにアンモニアを使用すると、それがその培養培地の窒素原としても適便に役立つ。好ましくは、前記ｐＨを約３．０から約８．０、さらに好ましくは約３．５から約７．０、および最も好ましくは約４．０から約６．５に維持する。
【０１９５】
一部の実施形態では、前記培養培地の炭素源濃度、例えばグルコース濃度を、培養中にモニターする。前記培養培地のグルコース濃度は、上清中のグルコース濃度、例えばその培養培地の無細胞成分、をモニターするために用いることができる公知の技術、例えば、グルコースオキシダーゼ酵素試験または高圧液体クロマトグラフィーの使用などを用いてモニターすることができる。前に述べたように、炭素源濃度を、細胞成長阻害が起こるレベル未満に保持すべきである。かかる濃度は生物によって様々であり得るが、炭素源としてのグルコースについては、細胞成長阻害が約６０ｇ／Ｌより高いグルコース濃度で起こり、それを試験によって容易に判定することができる。したがって、グルコースを炭素源として使用するとき、好ましくは、グルコースを発酵槽に供給し、検出限界未満で維持する。あるいは、前記培養培地中のグルコース濃度を約１ｇ／Ｌから約１００ｇ／Ｌの範囲、さらに好ましくは約２ｇ／Ｌから約５０ｇ／Ｌの範囲、およびさらにいっそう好ましくは約５ｇ／Ｌから約２０ｇ／Ｌの範囲で維持する。前記炭素源濃度を、例えば実質的に純粋なグルコース溶液の添加によって所望のレベル内で維持してもよいが、元の培養培地のアリコートの添加によって前記培養培地の炭素源濃度を維持することは、許容可能であり、そのほうが好ましいこともある。元の培養培地のアリコートの使用は、その培地中の他の栄養素（例えば、窒素およびホスフェート源）の濃度を同時に維持することができるので、望ましいことがある。同様に、前記培養培地中の微量金属濃度を、微量金属溶液のアリコートの添加によって維持することができる。
【０１９６】
５．４．２  イソプレノイドの回収
イソプレノイドが前記宿主細胞によって生産されたら、当該技術分野において公知の任意の適する分離および精製方法を用いて、後の使用のためにそれを回収または単離することができる。一部の実施形態では、イソプレノイドを含む有機相を遠心分離によって発酵から分離する。他の実施形態では、イソプレノイドを含む有機相が発酵から自然に分離する。他の実施形態では、イソプレノイドを含む有機相を、発酵反応に解乳化剤および／または成核剤を添加することによって発酵から分離する。解乳化剤の例証となる例としては、凝集剤および凝固剤が挙げられる。成核剤の例証となる例としては、イソプレノイド自体の液滴、ならびに有機溶媒、例えばドデカン、ミリスチン酸イソプロピルおよびオレイン酸メチルが挙げられる。
【０１９７】
これらの細胞において生産されるイソプレノイドは、培養上清中に存在することもあり、および／またはそれらの宿主細胞に付随することもある。イソプレノイドが宿主細胞に付随している実施形態において、そのイソプレノイドの回収は、前記細胞を透過性にするまたは溶解する方法を含み得る。あるいは、または同時に、前記培養培地中のイソプレノイドを、クロマトグラフィー、抽出、溶媒抽出、膜分離、電気透析、逆浸透圧、蒸留、化学的誘導体化および結晶化をはじめとする（しかしこれらに限定されない）回収プロセスを用いて、回収することができる。
【０１９８】
一部の実施形態では、イソプレノイドをその有機相中に存在し得る他の産物から分離する。一部の実施形態では、吸着、蒸留、気液抽出（ストリッピング）、液液抽出（溶媒抽出）、限外濾過および標準的なクロマトグラフ技術を用いて分離を果たす。
【実施例】
【０１９９】
６．実施例
６．１  実施例１：
ＮＡＤＨ特異的ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの同定および特徴づけ
この実施例は、ＮＡＤＨ補因子特異性を有することが以前には公知でないＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの同定および特徴づけを記載するものである。
【０２００】
６．１．１  材料および方法
６．１．１．１  株の（遺伝子）操作
野生型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（ＣＥＮ．ＰＫ２、Ｍａｔ  ａ、ｕｒａ３−、ＴＲＰ１＋、ｌｅｕ２−、ＭＡＬ２−８Ｃ、ＳＵＣ２）を、（アセチル−ＣｏＡチオラーゼ（ＥＲＧ１０）がアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換し；ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＥＲＧ１３）がアセトアセチル−ＣｏＡをＨＭＧ−ＣｏＡに変換し；そしてＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼがＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換する（図１））メバロン酸（ＭｅｖＴ）経路の発現のための宿主として使用した。
【０２０１】
この株を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＺＰ＿０６８１５０５２）、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（ＹＰ＿００１５４６３０３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉ（Ｐ１３７０２）、Ｄｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ（ＹＰ＿００１５６１３１８）、Ｍｅｎｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｔｈｅｒｍｏｆｉｌａ（ＹＰ＿８４３３６４）もしくはＳｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｏｙｒｉ（ＹＰ＿１６４９９４）に由来する異種クラスＩＩ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ；または前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのＮ末端トランケートバージョン（ｔＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）（ＥＥＵ０５００４）のいずれかをコードしているプラスミドで形質転換した。前記クラスＩＩ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを酵母発現のためにコドン最適化し、ｃ末端ＦＬＡＧ−ＨＩＳタグを用いて化学合成したが、例外としてＰ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、次の追加の改変を伴うように合成した：
【０２０２】
ＮｏｔＩ部位−ＧＡＬ１プロモーター−ＮｄｅＩ部位−［Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ］−−−ＥｃｏＲＩ部位−ＦＬＡＧタグ−ＨＩＳタグ−終止コドン−ＰＧＫ１ターミネーター−−−ＮｏｔＩ部位
【０２０３】
このＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＮｏｔＩ部位にクローニングした。野生型ＣＥＮＰＫ２株のゲノムＤＮＡ抽出物をテンプレートとして使用し、オリゴヌクレオチドＹＴ＿１６４＿３０＿Ｇａｌ７Ｆ（これは、５’末端にＳａｃＩおよびＮｏｔＩ制限部位を含有する）およびＹＴ＿１６４＿３０＿Ｇａｌ７Ｒ（これは、３’末端にＮｄｅＩ制限部位を含有する）を使用して、酵母Ｇａｌ７プロモーターをＰＣＲ増幅した（表２参照）。そのＰＣＲ産物をｐＣＲ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ＳａｃＩおよびＮｏｔＩを使用して両方のプラスミドを切断し、切除されたＳｃ．ＧＡＬ７プロモーターを使用して、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子の上流のＧａｌ１プロモーターを交換した。得られたプラスミドおよびｐＡＭ７０（配列番号２３）、ＵＲＡ３マーカーを有する酵母エピソームベクターｐＲＳ４２６、を両方ともＮｏｔＩで消化した。その後、そのＮｏｔＩ断片をｐＡＭ７０のＮｏｔＩ消化部位にライゲートすることによってプラスミドｐＡＭ０１１４７（配列番号２４）を構築した。このプラスミドをベースプラスミドとして使用して、そのプラスミドをＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化すること、そして５’および３’末端にそれぞれＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位を有する対象となる消化されたＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼコード配列をライゲートすることにより、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼコード配列を、対象となる任意のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（酵母ｔＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む）コード配列と交換した。プラスミドＤＮＡの増殖を大腸菌株ＤＨ５αで行った。その後、異なるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼについてのコード配列を内部に持つプラスミドで株Ｙ１３８９を形質転換し、２％グルコースを含有するウラシル不含のＣＳＭ培地プレートを用いて形質転換体を選択した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅへのすべてのＤＮＡ媒介形質転換を、Ｇｉｅｔｚ  ＲＷおよびＷｏｏｄｓ  ＲＡ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｐａｒｔ  Ｂ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、８７−９６頁（２００２）により記載されているような標準的酢酸リチウム法を用いて行った。
【０２０４】
Ｓｃ．アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ（ＥＲＧ１０）およびＳｃ．ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＥＲＧ１３）のゲノム組み込みを、下に示す組み込み構築物（配列番号２５）を使用して宿主株のＧａｌ８０遺伝子座に標的化した。
【化１】
2014532444.tif 000005
【０２０５】
１００ｎｇのＹ００２ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して、前記組み込み構築物の各成分をＰＣＲ増幅した。位置−１０００から−１の上流ＧＡＬ８０遺伝子座のＰＣＲ増幅を、オリゴヌクレオチドＹＴ＿１６４＿３６＿００１およびＹＴ＿１６４＿３６＿００３で行った（表２参照）。酵母ＥＲＧ１０およびＥＲＧ１３遺伝子のＰＣＲ増幅を、ＥＲＧ１３についてはオリゴヌクレオチドＹＴ＿１６４＿３６＿００２とＹＴ＿１６４＿３６＿００５のペアを、ＥＲＧ１０についてはＹＴ＿１６４＿３６＿００６とＹＴ＿１６４＿３６＿００９のペアを使用して行った。オリゴヌクレオチドＹＴ＿１６４＿３６＿００４およびＹＴ＿１６４＿３６＿００７を使用してＧＡＬ１／１０プロモーターを増幅し、その一方でプライマーＹＴ＿１６４＿３６＿００８およびＹＴ＿１６４＿３６＿０１１を使用してＬＥＵ２遺伝子を増幅した。下流ＧＡＬ８０遺伝子座位置２３から１０００（終止コドンの後）のＰＣＲ増幅は、オリゴヌクレオチドＹＴ＿１６４＿３６＿０１０およびＹＴ＿１６４＿３６＿０１２で行った。１００ｆｍｏｌの各ＤＮＡ片を単一チューブに添加し、プライマーＹＴ＿１６４＿３６＿００１およびＹＴ＿１６４＿３６＿０１２を使用してステッチングＰＣＲ反応（ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ  ＰＣＲ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（米国特許第８，２２１，９８２号明細書に記載されているとおり；その内容は参照により本明細書に援用されている）によって組み立てた。予想した分子量を有するＰＣＲ産物をゲル精製した。
【０２０６】
【表２】
2014532444.tif 000006
【０２０７】
異なるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（上で示したとおり）で形質転換されたＹ１３８９の誘導体を、ＥＲＧ１０／ＥＲＧ１３組み込み構築物で形質転換して、下の表３に収載する株を作成した。ウラシルおよびロイシン不含の２％グルコース培地プレートを含有するＣＳＭで形質転換体を選択した。すべての遺伝子破壊および置換を表現型分析およびコロニーＰＣＲによって確認した。
【０２０８】
【表３】
2014532444.tif 000007
【０２０９】
株Ｙ１４３１、Ｙ１４３３、Ｙ１４３５およびＹ１４８７について、下に示す分解構築物（配列番号４４）を使用してＡＤＨ１遺伝子をノックアウトした：
【０２１０】
【化２】
2014532444.tif 000008
【０２１１】
前記破壊構築物を、米国特許第８，２２１，９８２号明細書に記載されているポリヌクレオチド組み立て方法によって産生した。前記組み込み構築物のＡＤＨ１  ５’相同領域は、ＡＤＨ１コード配列の位置−５６３から−７７に相同であり、前記ＡＤＨ１  ３’相同領域は、位置８７から５３８（ＡＤＨ１遺伝子の終止コドンの後）に相同であった。プライマーＲＹＳＥ  ０およびＲＹＳＥ  １９を使用して、その産物を増幅した。株Ｙ１４３１、Ｙ１４３３、Ｙ１４３５およびＹ１４８７（表２）をその産物で形質転換し、２％グルコースとＧ４１８（ジェネテシン）とを含有するＹＰＤ培地プレートを用いて形質転換体を選択した。ＡＤＨ１遺伝子破壊を表現型分析およびコロニーＰＣＲによって確認した。
【０２１２】
６．１．１．２  細胞培養
所与の酵母株のシングルコロニーを２％スクロースを有する３ｍＬの酵母窒素塩基（ＹＮＢ）培地中でスターター一夜培養物（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  ｓｔａｒｔｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅ）として培養した。翌日、２５０ｍＬ使い捨てＰＥＴＧ滅菌フラスコ（Ｎａｌｇｅｎｅ）内の４０ｍＬ  ＹＮＢ−４％スクロース生産培養培地で前記スターター培養物から希釈した０．０５の初期ＯＤ６００を有する生産フラスコを用意した。前記フラスコを、下に示す継続時間にわたって２５０ＲＰＭで振盪することによって３０℃でインキュベートした。
【０２１３】
６．１．１．３  無細胞抽出物を使用するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ活性アッセイ
酵母細胞を４８時間ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ活性アッセイ（図８）のために、または７２時間、メバロネートアッセイ（表４）のために成長させ、Ｆａｌｃｏｎチューブ用の固有のカートリッジを有するスインギング・バケット・ローターＪＳ−５．３において１５ｍＬ  Ｆａｌｃｏｎチューブ中で１０分間、４０００×ｇで遠心分離することによって回収した。その細胞ペレットを１ｍＬで再懸濁させ、冷溶解バッファー（Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤タブレット（Ｒｏｃｈｅ）を添加した１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を使用して１回洗浄した。その後、Ｏリングキャップを有する２ｍＬプラスチック製スクリューキャップマイクロチューブ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｂｒａｎｄ  ５２０−ＧＲＤ）に細胞を移し、分解ビース（Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｂｅａｄｓ、０．５Ｍｍ、Ｆｉｓｈｅｒ）およびビーズビーターを使用して１分間、６Ｍ／Ｓで細胞を溶解した。直ちにそれらのチューブを氷水浴内に、少なくとも５分間、置いた。チューブを最低８０００×ｇで２０分間、回転させた。その後、上清を新たな低温チューブに移した。タンパク質についての古典的ブラッドフォードアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ＭＭ、「Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ」、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７２、２４８−２５４（１９７６））を用いて、タンパク質濃度を測定した。
【０２１４】
ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼアッセイのために、反応バッファー（１００ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を最初に９６ウェルプレートにおいて３０℃でプレインキュベートした。最終濃度１５０μＭのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれか、最終濃度４００μＭ  ＨＭＧ−ＣｏＡ、および５ｍＭ最終濃度のＤＴＴを各ウェルにおける１９０μＬの総容積に添加した。線形活性範囲に希釈した１０マイクロリットルの無細胞抽出物を添加することによってアッセイを開始させた。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５プレートリーダーを使用して３４０ｎｍでＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの吸光度の減少を測定することによって、反応をモニターした。３４０ｎｍでの吸光度の線の傾きとともにタンパク質濃度を用いて、各無細胞抽出物についてのＨＭＧｒの比活性を計算した。
【０２１５】
６．１．１．４  有機酸およびアルコール測定
有機酸およびアルコールアッセイのための試料を、１ｍＬの発酵ブロスを使い、それらの試料を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移すことによって調製した。卓上エッペンドルフ遠心機を使用して１分間、１３，０００ＲＰＭで試料を回転させた。その後、その上清を１５ｍＭ硫酸で希釈した（１：１  ｖ／ｖ）。その混合物をボルテックスにかけ、１分間、１３，０００ＲＰＭで遠心分離した。その清澄化された上清をＨＰＬＣ分析用のバイアルに移した。
【０２１６】
ＨＰＬＣ  Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒを使用して、およびＣｏｌｕｍｎ  Ｗａｔｅｒｓ  ＩＣ−Ｐａｋ  ７．８ｍｍ  ｘ  ３００ｍｍ、７μｍ、５０Å（Ｗａｔｅｒｓ）を使用するイオン排除クロマトグラフィーによって、および屈折率（ＲＩ）検出（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて、グリセロールおよびメバロネート含有量についてのＨＰＬＣ分析を行った。１５ｍＭ硫酸水系移動相を０．６ｍＬ／分の流量で使用して均一濃度で溶離を行った。
【０２１７】
６．１．２  結果
６．１．２．１  クラスＩＩ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼについての補因子特異性の判定
図８に示すように、Ｄ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓおよびＳ．ｐｏｍｅｒｏｙｉからのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＨに対する高い特異性および高い比活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで呈示する。これらのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＰＨの存在下では比活性を事実上表示しないが、ＮＡＤＨの存在下では比活性がほぼ４００ｎｍｏｌ／ｍｇ／分であった。同様に、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉからのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、以前に発表された報告と一致して、補因子としてのＮＡＤＨに対して選択性を明示した。例えば、Ｈｅｄｌら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８６（７）：１９２７−１９３２  （２００４）を参照されたし。対照的に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＨ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓからのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＨの存在下で測定可能な活性を示さず、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｌａからのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＰＨとＮＡＤＨ両方の存在下でかろうじて検出可能な活性を示した。これらの結果は、Ｄ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓおよびＳ．ｐｏｍｅｒｏｙｉからのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼが、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉからのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼと同様の、ＮＡＤＨ感受性ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼであることを示す。
【０２１８】
加えて、表４は、（Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｄ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓおよびＳ．ｐｏｍｅｒｏｙｉ、それぞれからの）ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含むＭｅｖＴ経路を含む株が、（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＨ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、それぞれからの）ＮＡＤＰＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含むＭｅｖＴ経路を含む株より実質的に少ないメバロネートを生産することを示す。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、さらなるＮＡＤＨ源が、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの全触媒能をメバロネートおよび下流イソプレノイド生産に利用するために必要とされることを示唆する。
【表４】
2014532444.tif 000009
【０２１９】
６．１．２．２  増加された細胞内ＮＡＤＨはＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ活性を向上させる
図９〜１１に示すように、メバロネート生産は、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含むＭｅｖＴ経路を含む細胞において、細胞内ＮＡＤＨ濃度を増加させる代謝攪乱を導入すると、実質的に向上される。ＡＤＨ１は、ＮＡＤＨ依存様式でアセトアルデヒドをエタノールに還元する。ａｄｈ１Δバックグラウンドでは、宿主細胞は、成長低下（図９）およびグリセロール生産増加（図１０）を被り、これは、細胞内ＮＡＤＨの蓄積に起因する可能性が高い酸化還元不均衡を示す。しかし、ＮＡＤＰＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓｃ．）ｔＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）を含むＭｅｖＴ経路を含む細胞は、ａｄｈ１Δバックグラウンドで低減されたメバロネート生産を表示するが、（Ｐ，ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｄ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓおよびＳ．ｐｏｍｅｒｏｙｉ、それぞれからの）ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含むＭｅｖＴ経路を含む細胞は、同様に酸化還元ストレスの徴候を示すことにもかかわらず、メバロネート生産の実質的向上を表示する（図１１）。これらのデータは、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼが、増加された細胞内ＮＡＤＨプールを利用してメバロネート生産を後押しすることができることを示唆する。これらの結果はまた、増加された細胞内ＮＡＤＨ源の不在下では、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼが限定された補因子であることを示唆する。
【０２２０】
注目に値することとして、発表された以前の報告は、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼがメバロネートの分解に利用されることを示している。Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１７１（１２）：６４６８−６４７２（１９８９）を参照されたし。Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉは、その唯一の炭素源としてメバロネートを用いて存続する能力があると確認されている数少ない原核生物のうちの１つである。しかし、ここに提示する結果は、メバロネートの生合成経路での使用へのＰ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの予想外の利用を明示する。
【０２２１】
６．２  実施例２：アセチル−ＣｏＡおよび代替ＭＥＶ経路酵素への代替ルートでの向上したイソプレノイド生産および酸化の還元均衡
この実施例は、サイトゾルアセチル−ＣｏＡ生産への代替ルート、例えば、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセチル化（ＡＤＡ、Ｅ．Ｃ．１．２．１．１０）の異種発現による経路を、野生型ＰＤＨ−バイパスの代わりに、および代替ＭＥＶ経路酵素との様々な組み合わせで利用することによって、ＭＥＶ経路からのメバロネートおよび下流イソプレノイド生産を向上させることができることを実証するものである。これらの結果は、ＮＡＤＰＨ生産ＰＤＨ−バイパス酵素をＮＡＤＨ生産ＡＤＡで置換することによって導入される酸化還元不均衡を、１つには、ＡＤＡ発現をＭＥＶ経路のＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼと、ならびに／またはホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの異種発現と併用することによって緩和することができることを示し、サイトゾルアセチル−ＣｏＡ生産へのさらなる代替ルートも提供することができる。これらの結果は、ＭＥＶ経路にアセチル−ＣｏＡ基質を供給するためのＡＤＡの触媒能力が、アセチル−ＣｏＡ：マロニル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼによってもたらされるものなどの、アセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの熱力学的に好適な下流の変換をもたらすことによって実質的に向上されることをさらに明示する。
【０２２２】
６．２．１  材料および方法
６．２．１．１  株の（遺伝子）操作
表５に収載する株を構築して、（１）ＡＤＡをＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼとペアにしたときの、ＮＡＤＰＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼとペアにしたときに対しての、細胞成長および異種イソプレノイド生産に対する効果；（２）ＡＤＡの発現によって生ずる酸化還元不均衡に対するホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼ発現の効果；および（３）ＡＤＡを発現する株におけるメバロネートレベルに対するアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ発現の効果を判定した。
【表５】
2014532444.tif 000010
【０２２３】
６．２．１．１．１  Ｙ９６８
Ｙ９６８は、野生型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫ２，Ｍａｔａｌｐｈａである。Ｙ１２８６９、Ｙ１２７４６、およびそれらのすべての誘導体についての出発株は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｔｒａｉｎ（ＣＥＮ．ＰＫ２，Ｍａｔ  ａｌｐｈａ，ｕｒａ３−５２，ｔｒｐ１−２８９，ｌｅｕ２−３，１２２，ｈｉｓ３＾１），Ｙ００３であった。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅへのすべてのＤＮＡ媒介形質転換を、Ｇｉｅｔｚ  ＲＷおよびＷｏｏｄｓ  ＲＡ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｐａｒｔ  Ｂ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、８７−９６頁（２００２）によって記載されているような標準的酢酸リチウム法を用いて行い、すべての場合、それらの構築物の組み込みをゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によって確認した。
【０２２４】
６．２．１．１．２  Ｙ１２８６９
Ｙ１２８６９をＹ００３への３回の逐次的組み込みによって産生した。先ず、遺伝子ＡＣＳ２を、天然Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＬＥＵ２遺伝子からなる組み込み構築物（ｉ２２３５；配列番号４５）を導入することによって欠失させ、その結果、この構築物にＡＣＳ２遺伝子座の上流および下流ヌクレオチド配列からなる配列が隣接した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞の導入により、この構築物は、相同組換えによってそのゲノムのＡＣＳ２遺伝子座と一体化し、それによってＡＣＳ２コード配列をその組み込み配列で置換することによりＡＣＳ２を機能的に破壊することができる。唯一の炭素源として２％ＥｔＯＨを含有するＣＳＭ−ｌｅｕプレートに形質転換体をプレーティングし、ＰＣＲ増幅によって確認した。得られた株は、Ｙ４９４０であった。
【０２２５】
次に、ＡＬＤ６を欠失させ、下に図示する組み込み構築物（ｉ７４８０４；配列番号４６）を用いてＤｉｃｋｅｙａ  ｚｅａｅ  ｅｕｔＥをＹ４９４０に導入した。
【化３】
2014532444.tif 000011
【０２２６】
この組み込み構築物は、選択可能マーカー（ＴＲＰ１）と、ＴＤＨ３プロモーター（天然Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＤＨ３コード領域の上流８４０塩基対）およびＴＥＦ２ターミネーター（天然Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＥＦ２コード領域の下流５０８塩基対）の制御下のＤｉｃｋｅｙａ  ｚｅａｅからの遺伝子ｅｕｔＥをコードしている酵母−コドン最適化配列（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＹＰ＿００３００３３１６．１）１つにつき２つのコピーとを含む。これらの成分にＡＬＤ６遺伝子座の上流および下流ヌクレオチド配列が隣接している。宿主細胞への導入により、この構築物は、相同組換えによってその宿主細胞ゲノムと一体化し、それによってＡＬＤ６コード配列をその組み込み配列で置換することによりＡＬＤ６を機能的に破壊する。米国特許第８，２２１，９８２号明細書に記載されている方法を用いてこの構築物を組み立てた。この構築物をＹ４９４０に形質転換し、２％グルコースを有するＣＳＭ−ＴＲＰプレートで形質転換体を選択し、ＰＣＲ増幅によって確認した。得られた株は、１２６０２であった。
【０２２７】
次に、ＡＣＳ１の上流および下流ヌクレオチド配列からなる組み込み構築物（ｉ７６２２０；配列番号４７）を導入することにより、Ｙ１２６０２におけるＡＣＳ１を、その固有のプロモーターおよびターミネーターのもとにある天然Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＩＳ３遺伝子に隣接して欠失させた。唯一の炭素源として２％グルコースを含有するＣＳＭ−ｈｉｓプレートに形質転換体をプレーティングし、ＰＣＲ増幅によって確認した。得られた株は、Ｙ１２７４７であった。
【０２２８】
次に、Ｙ１２７４７を、天然ＵＲＡ３配列から増幅したＰＣＲ産物で形質転換した。この配列は、ｕｒａ３−５２突然変異を回復させる。ＲｏｓｅおよびＷｉｎｓｔｏｎ、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  １９３：５５７−５６０（１９８４）を参照されたし。唯一の炭素源として２％グルコースを含有するＣＳＭ−ｕｒａプレートに形質転換体をプレーティングし、ＰＣＲ増幅によって確認した。得られた株は、Ｙ１２８６９であった。
【０２２９】
６．２．１．１．３  Ｙ１２７４６
Ｙ１２７４６を、Ｙ４９４０への３回の逐次的組み込みよって産生させた。先ず、Ｙ４９４０を、下に図示する組み込み構築物（ｉ７３８３０；配列番号４８）で形質転換した。
【化４】
2014532444.tif 000012
【０２３０】
この組み込み構築物は、選択可能マーカー（ＵＲＡ３）と；ＴＤＨ３プロモーター（ＴＤＨ３コード配列の上流８７０ｂｐ）およびＴＤＨ３ターミネーター（ＴＤＨ３コード配列の下流２５９ｂｐ）のもとにあるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓからのホスホケトラーゼの酵母コドン最適化バージョン（ＮＣＢＩリファレンス配列ＹＰ＿８１９４０５．１と；ＴＤＨ３プロモーター（ＴＤＨ３コード配列の上流８７０ｂｐ）およびＰＧＫ１ターミネーター（ＰＧＫ１コード配列の下流２５９ｂｐ）の制御下のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉホスホトランスアセチラーゼの酵母コドン最適化バージョン（ＮＣＢＩリファレンス配列ＹＰ＿００１３９４７８０．１）とを含み；これらにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＵＤ９遺伝子座の上流および下流ヌクレオチド配列からなる相同配列が隣接している。宿主細胞への導入により、この構築物は、相同組換えによって宿主細胞ゲノムと一体化し、それによってＢＵＤ９コード配列をその組み込み配列で置換することによりＢＵＤ９を機能的に破壊する。米国特許第８，２２１，９８２号明細書に記載されている方法を用いてこの構築物を組み立てた。２％グルコースを有するＣＳＭ−ＵＲＡプレートで形質転換体を選択した。
【０２３１】
得られた株を、下に示す構築物（ｉ７４８１０；配列番号４９）で形質転換した。
【化５】
2014532444.tif 000013
【０２３２】
この構築物は、選択可能マーカー（ＴＲＰ１）と；ＴＤＨ３プロモーター（ＴＤＨ３コード配列の上流８７０ｂｐ）およびＴＤＨ３ターミネーター（ＴＤＨ３コード配列の下流２５９ｂｐ）のもとにあるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓからのホスホケトラーゼの２つのコピーとを含み；これらにＡＬＤ６遺伝子座の上流および下流ヌクレオチド配列からなる相同配列が隣接している。宿主細胞への導入により、この構築物は、相同組換えによって宿主細胞ゲノムと一体化し、それによってＡＬＤ６コード配列をその組み込み配列で置換することによりＡＬＤ６を機能的に破壊する。米国特許第８，２２１，９８２号明細書に記載されている方法を用いてこの構築物を組み立てた。２％グルコースを有するＣＳＭ−ＵＲＡプレートで形質転換体を選択し、ＰＣＲ増幅によって確認した。
【０２３３】
最後に、得られた株を、下に示す構築物（ｉ７６２２１；配列番号５０）で形質転換した。
【化６】
2014532444.tif 000014
【０２３４】
この構築物は、選択可能マーカー（ＨＩＳ３）と；ＴＤＨ３プロモーター（天然Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＤＨ３コード領域の上流８４０塩基対）およびＴＥＦ２ターミネーター（天然Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＥＦ２コード領域の下流５０８塩基対）の制御下のＤｉｃｋｅｙａ  ｚｅａｅからの遺伝子ｅｕｔＥをコードしている酵母−コドン最適化配列（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＹＰ＿００３００３３１６．１）１つにつき２つのコピーとを含む。これらの成分にＡＣＳ１遺伝子座の上流および下流ヌクレオチド配列が隣接している。宿主細胞への導入により、この構築物は、相同組換えによってその宿主細胞ゲノムと一体化し、それによってＡＣＳ１コード配列をその組み込み配列で置換することによりＡＣＳ１を機能的に破壊する。米国特許第８，２２１，９８２号明細書に記載されている方法を用いてこの構築物を組み立てた。２％グルコースを有するＣＳＭ−ＨＩＳプレートで形質転換体を選択し、ＰＣＲ増幅によって確認した。得られた株は、Ｙ１２７４６であった。
【０２３５】
６．２．１．１．４  ｍｓ６３９０７、ｍｓ６３９０８、ｍｓ６３９０９およびｍｓ６４４７２組み込み構築物
ｍｓ６３９０７組み込み構築物（ｉ８４０２２；配列番号５１）を下に示す。
【化７】
2014532444.tif 000015
この構築物は、選択可能マーカー（ＵＲＡ３）と；その固有のプロモーターのもとにある天然酵母ＧＡＬ４転写因子のコピーと；メバロン酸経路の２つの天然酵母酵素（アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードしているＥＲＧ１０、およびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードするＥＲＧ１３）、ならびにＳｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの酵母コドン最適化バージョンの２つのコピー［すべて、ガラクトース誘導性プロモーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０のプロモーター）のもとにある］とをコードしているヌクレオチド配列を含み、これらに、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＯエンドヌクレアーゼ遺伝子座の上流および下流ヌクレオチド配列からなる相同配列が隣接している。宿主細胞への導入により、このｍｓ６３９０７構築物は、相同組込みによってその宿主細胞ゲノムと一体化し、それによってＨＯコード配列をその組み込み配列で置換することによりＨＯを機能的に破壊する。米国特許第８，２２１，９８２号明細書に記載されている方法を用いてこの構築物を組み立てた。２％グルコースを有するＣＳＭ−ＵＲＡプレートで形質転換体を選択し、ＰＣＲ増幅によって確認した。
【０２３６】
ｍｓ６３９０８組み込み構築物（ｉ８４０２４；配列番号５２）は、次の２つのことを除き、ｍｓ６３９０７と同一である：第一に、ＥＲＧ１０が、ＡＨＰ１ターミネーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＡＨＰ１コード配列の下流１２５ｂｐ）に融合しているアセチル−ＣｏＡ：マロニル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ（アクセッション番号：ＡＢ５４０１３１．１）をコードしているＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０のｎｐｈＴ７遺伝子の酵母コドン最適化バージョンによって置換されている；第二に、Ｓ．ｐｏｍｅｒｏｙｉ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードしている配列が、ｔＨＭＧｒ、すなわち天然Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードしているトランケート型ＨＭＧ１コード配列、によって置換されている。
【０２３７】
ｍｓ６３９０９組み込み構築物（ｉ８４０２６；配列番号５３）は、次の１つのことを除き、ｍｓ６３９０７と同一である：Ｓ．ｐｏｍｅｒｏｙｉ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードしている配列が、ｔＨＭＧｒ、すなわち天然Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードしているトランケート型ＨＭＧ１コード配列、によって置換されている。
【０２３８】
ｍｓ６４４７２組み込み構築物（ｉ８５２０７；配列番号５４）を下に示す。
【化８】
2014532444.tif 000016
この構築物は、選択可能マーカー（ＵＲＡ３）と；エルゴステロール経路の５つの天然酵母酵素（メバロン酸キナーゼをコードしているＥＲＧ１２、ホスホメバロン酸キナーゼをコードしているＥＲＧ８、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼをコードしているＥＲＧ１９、ジメチルアリル二リン酸イソメラーゼをコードしているＩＤＩ１、およびファルネシルピロリン酸シンセターゼをコードしているＥＲＧ２０）、およびＡｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａファルネセンシンターゼの進化した酵母コドン最適化バージョン（すべて、ガラクトース誘導性プロモーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０およびＧＡＬ７のプロモーター）のもとにある）とをコードしているヌクレオチド配列を含む。これらの配列に、ＧＡＬ８０の上流および下流ヌクレオチド配列からなる相同配列が隣接している。宿主細胞への導入により、このｍｓ６４４７２構築物は、相同組込みによってその宿主細胞ゲノムと一体化し、それによってＧＡＬ８０コード配列をその組み込み配列で置換することによりＧＡＬ８０を機能的に破壊する。米国特許第８，２２１，９８２号明細書に記載されている方法を用いてこの構築物を組み立てた。２％グルコースを有するＣＳＭ−ＵＲＡプレートで形質転換体を選択し、ＰＣＲ増幅によって確認した。
【０２３９】
６．２．１．２  メバロネートの定量
９６ウェルプレートのウェル内の、５０ｍＭ  コハク酸塩  ｐＨ５．０および２０ｇ／Ｌ  スクロースを有するシード培地（１５ｇ／Ｌ  硫酸アンモニウム、８ｇ／Ｌ  リン酸カリウム、６．１ｇ／Ｌ  硫酸マグネシウム、１５０ｍｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、５７．５ｍｇ／Ｌ  硫酸亜鉛、４．８ｍｇ／Ｌ  塩化コバルト、３．２４ｍｇ／Ｌ  塩化マンガン、５ｍｇ／Ｌ  硫酸銅、２９．４ｍｇ／Ｌ  塩化カルシウム、２７．８ｍｇ／Ｌ  硫酸鉄、４．８ｍｇ／Ｌ  モリブデン酸ナトリウム、０．６ｍｇ／Ｌ  ビオチン、１２ｍｇ／Ｌ  パントテン酸カルシウム、１２ｍｇ／Ｌ  ニコチン酸、３０ｍｇ／Ｌ  イノシトール、１２ｍｇ／Ｌ  塩酸チアミン、１２ｍｇ／Ｌ  塩酸ピリドキシン、０．２４ｍｇ／Ｌ  パラ−アミノ安息香酸）にシングルコロニーを接種し、３０℃で３日間、成長させた。その後、１４．４ｕＬの培養物を、５０ｍＭ  コハク酸塩  ｐＨ５．０および４０ｇ／Ｌ  ガラクトースを有するシード培地に移して二次培養し、３０℃で２日間、成長させた。
【０２４０】
選択されたメバロネートを定量するために、先ず、全細胞ブロスを１４，０００ＲＰＭで５分間、回転させた。その後、１０ｕＬの清澄化されたブロスを１９０ｕＬのアッセイバッファー（１ｍＭ  ＣｏＡ、２ｍＭ  ＮＡＤ、０．２ｍｇ／ｍＬの精製かつ凍結乾燥されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、０．１ｍｇ／ｍＬの精製かつ凍結乾燥されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉ  ＨＭＧ−ＣｏＡリアーゼ、９５ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ  ｐＨ８．５、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および５ｍＭ  ＤＴＴ）とともにインキュベートした。試料を３０分間、３０℃でインキュベートし、その後、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｍ５プレートリーダーで３４０ｎＭ吸光度についてアッセイした。精製されたメバロネートを用いて作成した標準曲線にプロットすることにより、メバロネート濃度を定量した。
【０２４１】
６．２．１．３  ファルネセンの定量
先ず、培養物を上で説明したように成長させた。ファルネセンを定量するために、６００ｕＬの２−ブトキシエタノールを、各２００ｕＬの３回の添加で１５０ｕＬの全細胞ブロスに添加し、各添加間に９６ウェルプレートシェーカーを用いて１０００ｒｐｍで９０秒間、振盪した。その後、それらの試料を４０分間インキュベートした。８ｕＬの２−ブトキシエタノール抽出物を９６ウェルＵＶプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６３５）において２００ｕＬのイソプロピルアルコールと混合し、その後、プレートリーダーで吸光度２２２について読取った。
【０２４２】
６．２．１．４  光学密度の定量
９６ウェルアッセイプレートにおいて、８ｕＬの培養物を希釈液（２０％ＰＥＧ  ２００、２０％エタノール、２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。そのアッセイプレートをボルテックスにかけた後、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｍ５プレートリーダーでＯＤ６００を測定した。
【０２４３】
６．２．１．５  バッチ発酵
Ｙ９６７、Ｙ１２８６９およびＹ１２７４６の接種培養物を、５０ｍＭ  コハク酸塩  ｐＨ５．０および２０ｇ／Ｌ  スクロースを有する５ｍＬのシード培地においてシングルコロニーから成長させた。３日の成長の後、それらの予備培養物を、５０ｍＭ  コハク酸塩ｐＨ５．０および４０ｇ／Ｌ  スクロースを有する２５ｍＬのシード培地に移して二次培養して０．１の初期光学密度（ＯＤ）にした。１０時間後、それらの培養物を、再び、５０ｍＭ  コハク酸塩ｐＨ５．０および４０ｇ／Ｌ  スクロースを有する５０ｍＬのシード培地に移して二次培養して０．０５のＯＤにした。培養物を３０℃で成長させた。ＯＤがおおよそ３になったら、３つのフラスコを半分に分割し、回転沈降させ、培地を廃棄した。それらの培養物を、４０ｇ／Ｌ  グルコース（コハク酸塩不含）を有する１．５Ｌシード培地に再懸濁させ、発酵槽に移した。２Ｌ  Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｂ  ｐｌｕｓ容器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ドイツ）において発酵実験を行った。撹拌を１２００ｒｐｍに制御し、発酵槽を０．５Ｌ／分の空気で継続的にスパージした。１４．４Ｍ  ＮＨ４ＯＨを用いてｐＨを５．０で維持し、温度を３０℃で維持した。おおよそ１．５時間ごとに試料を抜き取って、ＯＤ、乾燥細胞重量、ならびに有機酸および糖を測定した。
【０２４４】
６．２．２  結果
６．２．２．１  ＡＤＡ株は、ＮＡＤＰＨ使用ＨＭＧｒとペアにしたときに対してＮＡＤＨ使用ＨＭＧｒとペアにしたときのほうが多くのイソプレノイドを生産する
図１２Ａは、ＰＤＨ−バイパスの欠失（ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δ）を含み、ＡＤＡ（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）を異種発現する、株Ｙ１２８６９が、ＮＡＤＰＨ使用ＨＭＧｒを含むＭＥＶ経路（構築物ｍｓ６３９０９）よりＮＡＤＨ使用ＨＭＧｒを含むＭＥＶ経路（構築物ｍｓ６３９０７）を発現するときのほうが多くのファルネセンを生産することを示す。対照的に、図１２Ｂは、インタクトＰＤＨ−バイパスを含む株Ｙ９６８が、ＮＡＤＰＨ使用ＨＭＧｒとペアにしたときにより多くのファルネセンを生産することを示す。これらの結果は、ＭＥＶ経路からのイソプレノイド生産のためのＡＤＡの利用が、ＭＥＶ経路がＮＡＤＨ使用ＨＭＧｒを含むときに向上されることを明示する。
【０２４５】
６．２．２．２  ＡＤＡの発現は酸化還元不均衡を引き起こし、この不均衡は、ＰＫおよびＰＴＡが解糖に伴うフラックスを共有するときに緩和される
天然酵母は、解糖によって消費されるグルコース１つにつき２つのＮＡＤＨを生産する。エタノールに発酵されると、２つのＮＡＤＨは、ＮＡＤ＋に再び酸化される。しかし、グルコースの小部分はエタノールに発酵されずにバイオマスに変換され、その結果、過剰なＮＡＤＨが生ずる。この過剰なＮＡＤＨは、ジヒドロキシアセトンリン酸のグリセロール３リン酸への還元によってＮＡＤ＋に再酸化され、グリセロール３リン酸は、グリセロールに加水分解される。アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを天然ＰＤＨ−バイパスの代わりに使用する株は、ＮＡＤＰＨではなくＮＡＤＨを生産し、その結果、さらなる過剰量のＮＡＤＨが生ずる。バイオマスに変換される各グルコースに対して、ＡＤＡを天然ＰＤＨ−バイパスの代わりに使用する株は、まさに２倍のＮＡＤＨを生産し、これは、過剰なＮＡＤＨを再酸化させるために２倍のグリセロールを生産しなければならないことを意味する。図１３Ａに示すように、Ｙ１２８６９（ＡＤＡを野生型ＰＤＨ−バイパスの代わりに使用する株）は、Ｙ９６８（インタクトＰＤＨ−バイパスを含む）の２倍のグリセロールを生産する一方で、バッチグルコース発酵において匹敵するレベルのグルコースを消費する。これらの結果は、ＡＤＡ反応の化学量論によって予測されるようにＹ１２８６９が酸化還元不均衡であることを明示する。
【０２４６】
ホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼのＡＤＡ株への添加は、解糖によって生産されるＮＡＤＨを低減させ、酸化還元均衡を向上させる、グルコースからのＡｃＣｏＡ産生の代替の非解糖ルートを提供する。図１３Ｂに示すように、Ｙ１２７４５（ＡＤＡに加えてホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼを保有する株）は、Ｙ１２８６９の半分のグリセロールを生産する一方で、バッチグルコース発酵において匹敵するレベルのグルコースを消費する。
【０２４７】
６．２．２．３  ＡＤＡ株内でのＡＴＰ保存により熱力学的駆動力が犠牲になり、その犠牲が、下流でアセチル−ＣｏＡを強く引っ張ることによって緩和される
アセチル−ＣｏＡを形成するための天然ＰＤＨ−バイパス反応は、この反応がＡＴＰのＡＭＰへの加水分解に結びつけられるので、熱力学的に好適である。対照的に、アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ反応は、ＡＴＰに結びつけられず、アセチル−ＣｏＡを形成するための天然ＰＤＨ−バイパス反応よりはるかに平衡に近い。それ故、メバロネートを生産するために天然Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ経路遺伝子を使用すると、ＡＤＡおよびＡｌｄ６のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの匹敵する動態特性にもかかわらず、ＡＤＡを用いる株のほうが野生型ＰＤＨ−バイパスを使用する株よりはるかに少ないメバロネートを生産する。図１４（第１および第２カラム）に示すように、ＡＤＡ株（Ｙ１２８６９．ｍｓ６３９０９）におけるメバロネート生産は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定される十分な動態能力にもかかわらず、等価の野生型株（Ｙ９６８．ｍｓ６３９０９）のものの約３０％に過ぎない。この結果は、ＡＤＡによるアセトアルデヒドのアセチル−ＣｏＡの変換の背後にある熱力学的駆動力の不足を表す。
【０２４８】
Ｅｒｇ１０アセチル−ＣｏＡチオラーゼは、２つのアセチル−ＣｏＡからのアセトアセチル−ＣｏＡの形成を触媒し、この反応は熱力学的に好適でない。ｎｐｈＴ７によってコードされているアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（すなわち、アセチル−ＣｏＡ：マロニル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ）は、アセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡからのアセトアセチル−ＣｏＡの形成を触媒し、この反応は、マロニル−ＣｏＡの脱カルボキシル化のため熱力学的に好適である。この熱力学的に好適な反応をＡｃＣｏＡ生産の下流に直接投ずることで、ＡＤＡの順方向活性を増加させる熱力学的駆動力が得られる。図１４（第３および第４カラム）に示すように、ｎｐｈＴ７をＥＲＧ１０の代わりに過発現させると、Ｙ９６８．ｍｓ６３９０８およびＹ１２８６９．ｍｓ６３９０８は、匹敵するレベルのメバロネートを作る。さらに、それらは、ＭＥＶ経路の第一段階にＥＲＧ１０を使用する等価の株（Ｙ９６８．ｍｓ６３９０９およびＹ１２８６９．６３９０９）よりさらに実質的に多くのメバロネートを生産する。
【０２４９】
本明細書に引用した特許および特許出願は、個々の公報および特許出願各々が参照により援用されていると具体的にかつ個々に示されているかのごとく参考として本明細書に援用されている。理解の明確さのために上記発明を実例および実施例として多少詳細に説明したが、本発明の教示にかんがみて、添付の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく本発明に一定の変更および修飾を施すことができることは、当業者には容易に分かるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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