(57)【要約】  本発明は、イン・ビトロで三次元多細胞集合体を形成する装置および関連した方法に関する。具体的には、本発明は、二次元接着性パターン上に固定された少なくとも１つの三次元多細胞集合体であって、標準化極性を有する組織化構造を有する、前記三次元多細胞集合体を含んでなる装置、および組織化構造を有する三次元多細胞集合体を形成する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
・表面を画定する支持体、および
・前記表面上の少なくとも１つの二次元接着性パターン、および
・前記二次元接着性パターン上に固定された少なくとも１つの三次元多細胞集合体であって、標準化された極性を有する組織化構造を有する、前記三次元多細胞集合体
を含んでなる、装置。
【請求項２】
・表面を画定する支持体、
・前記表面上の少なくとも２つの二次元接着性パターン、および
・前記二次元接着性パターン上に固定された少なくとも２つの三次元多細胞集合体であって、標準化された極性を有する組織化構造を有し且つ実質的に同じ構造、形状およびサイズを有する、前記三次元多細胞集合体
を含んでなる、装置。
【請求項３】
前記三次元多細胞集合体が、少なくとも１つの管腔を含んでなる、請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
前記三次元集合体が、腺房および管を含んでなる群から選択される構造を有する、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記接着性パターンが、三次元多細胞集合体の初期細胞伸展を制御するのに適合している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
前記初期細胞伸展の制御が、形状的および化学的、またはそれらの組合せからなる群から選択される手段によるものである、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記接着性パターンが、ディスク、クロスボウ、Ｈ、Ｙ、長方形、環およびＳ、またはそれらの任意の組合せを含んでなる群から選択される概形である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８】
前記接着性パターンが、管の形成を促進するのに適合している、請求項１〜７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項９】
前記接着性パターンの長さ対幅比が１０：１である、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記の長方形の概形の長さが約１００〜３００μｍであり、好ましくは２００〜３００μｍである、請求項８または９に記載の装置。
【請求項１１】
（ｉ）請求項５〜１０いずれか一項に記載の少なくとも１つの二次元接着性パターンを含んでなる支持体を提供し、
（ｉｉ）前記支持体に細胞を播種し、
（ｉｉｉ）前記細胞を、前記二次元接着性パターン上に三次元多細胞集合体を得る条件でおよびそのために十分な時間培養し、ここで、前記三次元多細胞集合体が標準化された極性を有する組織化構造を有する
ことを含んでなる、三次元多細胞集合体を形成させる方法。
【請求項１２】
工程（ｉｉｉ）が、前記細胞に培地をオーバーレイすることを含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記培地が、細胞外マトリックスタンパク質を含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ｉ）請求項５〜１０のいずれか一項に記載の少なくとも１つの二次元接着性パターンを含んでなる支持体を提供し、
（ｉｉ）前記支持体に細胞を播種し、
（ｉｉｉ）請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の前記二次元接着性パターン上に標準化された極性を有する組織化三次元多細胞集合体を形成し、前記三次元多細胞集合体が、実質的に同一の構造、形状およびサイズを有し、
（ｉｖ）前記三次元多細胞集合体を画像化し、前記三次元集合体の画像から得られるデーターを平均化することによって平均細胞を画定する
ことを含んでなる、平均細胞を画定する方法。
【請求項１５】
・表面を画定する支持体、
・前記表面上の少なくとも１つの二次元接着性パターンであって、管状構造を形成するのに適合している、前記接着性パターン
を含んでなる、三次元多細胞管状構造を形成する装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、三次元多細胞集合体をイン・ビトロで形成するための装置および関連の方法に関する。 具体的には、本発明は、組織化した構造を有する三次元多細胞集合体を形成するための装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
細胞生理学および病態生理学は、伝統的にイン・ビボでの動物試験またはイン・ビトロでの細胞または細胞系の細胞培養を用いて研究されてきた。プラスチック皿またはガラス製カバーグラスのような二次元支持体上で生育させると、細胞は単層を形成する傾向がある。更に最近では、イン・ビトロでの細胞外マトリックスゲル（例えば、コラーゲンゲルまたはマトリゲル（商標）、または両者の組合せ）で処理した支持体上の細胞のイン・ビトロでの培養は、細胞が閉鎖腔を発生させることができる三次元多細胞集合体に成長し、これにより一層生理学的に関連性のある構造を取得する能力を有することを証明している。これらの集合体は、より一般的にはオルガノイドと呼ばれ、また培養システムは、通常は器官型細胞培養と呼ばれている。
【０００３】
オルガノイド培養物は、それらの構造だけでなくそれらの機能においても元の組織に類似している。実際に、二次元単層細胞培養では必要とされない多くの経路および分子が、オルガノイド成長にとって極めて重要である。それ故、器官型培養システムは、細胞死に対して二次元単層細胞培養に比較してより強い。 従って、二次元細胞ベースアッセイを用いる高腎または肝細胞毒性のため重要なスクリーニングおよび試験から除外された多くの薬剤は、三次元細胞組織に影響を及ぼさないことがある。逆に、単層細胞培養において細胞傷害反応を誘導しない多くの薬剤は、器官生理学（例えば、イオンチャンネル輸送および傍細胞性水輸送）の状況を変更することがあり、これは三次元培養システムのみで研究することができる。更に、上皮間葉転換または管腔閉塞のような多くの病的状態は、オルガノイド培養細胞において生理学的に関連する特徴である。従って、オルガノイド培養は、診断、移植および薬品開発など多種多様な応用に有用である（Herlyn et al. 米国特許第７，２１７，５７０  Ｂ２号公報）。
【０００４】
しかしながら、現在用いられているオルガノイド細胞培養方法には、多くの問題がある。特に、オルガノイド細胞培養は、オルガノイド形成が制御されない環境で行われる。管腔形成を含むオルガノイド構造は、ランダムで散発的且つ予測不能であり、オルガノイドは互いに類似しておらず、ハイコンテンツな迅速分析は困難であるかまたは不可能である。従って、オルガノイド成長を標準化する試みがなされてきた (Kataoka et al. 米国特許第２００４／０１９７９０７号公報、Kataoka et al. 米国特許第２０１０／７６９１３６９Ｂ２号公報、Sokabe et al. 米国特許第２０１０／０３３１２１６Ａ１号公報、Fang et al. 米国特許第２００９／０２９８１６６Ａ１号公報)。
【０００５】
例えば、米国特許第２０１０／０３３１２１６Ａ１号公報には、側壁によって範囲を画されている正方形のウェルの配置を含んでなり、それぞれの側壁には隣接ウェル間で連絡できるようになっている中央開口部がある、細胞培養容器が開示されている。
【０００６】
中央開口部のサイズは、一方のウェルの細胞が隣接ウェルの細胞と接触するのを最小限になるように画定されている。
【０００７】
しかしながら、このような容器では、細胞はそれぞれのウェルで多層に形成されるので、組織化した構造を持たない。
【０００８】
三次元多細胞集合体を形成するためのもう一つの方法は、F. Xu et al.によって開示されている（「高処理量細胞パターニング基板を用いる三次元のイン・ビトロでの卵巣癌共培養モデル(A three-dimensional in vitro ovarian cancer coculture model using a high-throughput cell patterning platform)」, Biotechnol. J. 2011, 6, 204-212）。
【０００９】
この方法は、培養皿にマトリゲル（商標）をコーティングし、個々の細胞カプセル化小滴をマトリゲル（商標）の特定部位に沈澱させることからなっている。
【００１０】
しかしながら、それぞれの小滴中の細胞集合体の組織化は制御されず、細胞集合体はある小滴から別のものに様々な方法で組織化することがある。
【００１１】
三次元多細胞集合体の培養をより良好に制御するために、C. M. Williams et al.は、マイクロウェルのアレイを含んでなるマイクロ成形したＰＥＧ−フィブリノーゲンヒドロゲル支持体 を開示した（「マイクロパターン化ヒドロゲルアレイにおける初代肝細胞による組織様集合体のオートクライン制御された形成および機能 (Autocrine-Controlled Formation and Function of Tissue-Like Aggregates by Primary Hepatocytes in Micropatterned Hydrogel Arrays)」, Tissue Engineering: Part A, Vol. 17, Nos 7 and 8, 2011）。
【００１２】
マイクロウェルは肝細胞に非接着性であったが、初代肝細胞はそれぞれのマイクロウェルで成長し、集合して三次元集合体となり、その細胞によって分泌されたマトリックスは、マイクロウェルの壁に接着することができた。
【００１３】
しかしながら、本明細書で述べたように、二次元（すなわち、非成形）ヒドロゲル上での初代肝細胞の培養は、細胞が支持体に接着せず、浮遊スフェロイドを形成しただけであるので、 成功しなかった。
【００１４】
現在用いられている三次元培養システムはオルガノイド形成を効率的収率で提供するが、自動イメージングイメージングおよびデーター取得は複雑なままであり、従って、高処理量実験研究のためのこれらのオルガノイドの使用は困難なままである。
【００１５】
第一に、現在用いられている集合体は、通例は厚さが２０μｍを上回っている。このような集合体の高分解能イメージングには、ｚ断面スタックを有する共焦または二光子励起顕微鏡法が必要であり、これがためにイメージ取得過程の時間およびデーター量が著しく増加する。更に、オルガノイドは、ゲルに包埋されていることが多い。細胞播種および三次元成長中に、オルガノイドはゲル中の様々な平面にランダムに成長する。これにより、大イメージング量および資源消費が大きいデーター採掘が必要となる。
【００１６】
第二に、この方法は、高レベルのノイズによって妨害される。換言すれば、オルガノイド形成はランダム且つ散発的であるため、形成したオルガノイドの細胞は組織化されておらず、構造内部にランダムに分布する。従って、オルガノイドは、形状、サイズ、構造および細胞配置に関して互いに類似していない。このような変動性により、高処理量実験研究に必要な定性的且つ定量的分析は自動化できない。更に、測定は、再現性の欠如という問題点を有する。その上、オルガノイド形成はランダム且つ散発的であるため、オルガノイドの構造は制御することができない。 従って、腺房構造または管状構造は、必要なときに要求に応えて形成することはできない。実際に、イン・ビトロでの管状構造の形成は完全にランダムであり、今日までに任意の程度の制御または再現性を有する管状構造を形成する方法は、報告されていない。
【００１７】
最後に、現在用いられている三次元培養システムは細胞運動を抑制せず、この運動は、オルガノイド形成の経時観察を高効率の追跡システムを必要とする極めて複雑な仕事とする。
【００１８】
従って、高処理量実験研究での使用に適するオルガノイドまたは三次元多細胞集合体の制御形成が可能な細胞培養システムが必要であり、詳細には、細胞培養 システムは三次元多細胞管状構造を提供する。
【発明の概要】
【００１９】
概要
本発明は、高処理量実験研究での使用に適する組織化三次元多細胞集合体の制御された形成が可能な装置および方法を提供する。
【００２０】
従って、第一の側面では、本発明は、
・表面を画定する支持体、
・前記表面上の少なくとも１つの二次元接着性パターン、および
・前記の二次元接着性パターン上に固定された少なくとも１つの三次元多細胞集合体であって、標準化された極性を有する組織化構造を有する前記三次元多細胞集合体
を含んでなる、装置を提供する。
【００２１】
本発明による装置は、接着性パターン上に固定され、ゲルに包埋されていない三次元多細胞集合体を含んでなり、集合体のイメージングを容易にする（図１）。その上、接着性パターンは二次元であり、壁が細胞の三次元集合を援助するウェルにはその本質がないことを意味している。逆に、三次元多細胞集合体は接着性パターン上で成長し、この二次元表面を介して支持体と接触しているだけである。更に、生成する集合体は、支持体上、すなわち、接着性パターン上の所定位置に固定され、これによりイメージングが更に容易になり且つ経時観察が可能になる。更に、三次元多細胞集合体は組織化された構造を有しており、これは、この構造が標準化された極性とオルガノイド培養物で以前に達成されたよりも一層生理学的に関連性のある構造を示すことを意味している。
【００２２】
三次元多細胞集合体は、当該技術分野で知られている任意の集合体または配置であることができる。一つの特定の実施態様では、三次元多細胞集合体は、少なくとも１つの管腔を含んでなる。もう一つの実施態様では、前記三次元集合体は、腺房および管を含んでなる群から選択される構造である。
【００２３】
支持体上の接着性パターンの特性は、三次元集合体の特性および／または三次元集合体を含んでなる細胞の特性によって決定されることが理解されるであろう。
【００２４】
一実施態様では、前記接着性パターンは、三次元多細胞集合体の初期細胞伸展を制御するように適応する。  細胞伸展は、当該技術分野で知られている任意の手段によって制御することができる。一実施態様では、初期細胞伸展は、形状的手段におよび化学的手段を含んでなる群から選択される手段によるか、またはそれらの組合せによる。一実施態様では、初期細胞伸展の形状制御は、前記支持体の表面における凹面形から接着性パターンを形成することを含んでなる。 もう一つの実施態様では、初期細胞伸展の化学的制御は、細胞不親和性および／または細胞親和性材料から接着性パターンを形成することを含んでなる。もう一つの実施態様では、接着性パターンは、単一または小数の細胞を収容するように適合させている。  もう一つの実施態様では、接着性パターンは、細胞の極性に影響を与えるように適合させている。更にもう一つの実施態様では、接着性パターンは、単一または小数の細胞を収容するように適合させている。
【００２５】
一実施態様では、接着性パターンは、ディスク、クロスボウ、Ｈ、Ｙ、長方形、環およびＳ、またはそれらの任意の組合せを含んでなる群から選択される概形である。 特定の実施態様では、前記接着性パターンは、管の形成を促進するように適合させている。
【００２６】
従って、本発明は、三次元管状構造の制御形成を可能にする装置および方法も提供する。従って、第二の側面では、本発明は、
・表面を画定する支持体、および
・前記表面上の少なくとも１つの二次元接着性パターンであって、管状構造を形成するように適合させている前記接着性パターン
を含んでなる三次元多細胞管状構造を形成するための装置を提供する。一実施態様では、接着性パターンは、長さ対幅比が約５：１〜約１５：１である。もう一つの実施態様では、接着性パターンは長さ対幅比が１０：１である。
【００２７】
第四の側面では、本発明は、
（ｉ）少なくとも１つの二次元接着性パターンであって、管状構造を形成するように適合させている前記接着性パターンを含んでなる支持体を提供し、
（ｉｉ）前記支持体に細胞を播種し、
（ｉｉｉ）前記細胞を、二次元接着性パターン上に三次元多細胞管状構造を得る条件でおよびそのために十分な時間培養する
ことを含んでなる、三次元多細胞管状構造を形成する方法を提供する。
【００２８】
組織化構造および特性を有する三次元多細胞集合体の形成を促進する能力により、実質的に類似している多数の三次元多細胞集合体を含んでなり、高処理量実験研究を行うのに有用な装置を構築することができる。
【００２９】
従って、第五の側面では、本発明は、
・表面を画定する支持体、
・前記表面上の少なくとも２つの二次元接着性パターン、および
・前記二次元接着性パターン上に固定された少なくとも２つの三次元多細胞集合体であって、標準化された極性を有する組織化構造を有し且つ実質的に同じ構造を有する、前記三次元多細胞集合体
を含んでなる、装置を提供する。
【００３０】
本発明は、組織化構造を有する三次元多細胞集合体を形成する方法も提供することが分かるであろう。一実施態様では、
（ｉ）本発明による少なくとも１つの二次元接着性パターンを含んでなる支持体を提供し、
（ｉｉ）前記支持体に細胞を播種し、
（ｉｉｉ）前記細胞を様々な条件下で、前記二次元接着性パターン上に三次元多細胞集合体を得るのに十分な時間培養し、前記三次元多細胞集合体が組織化構造を有する
ことを含んでなる、三次元多細胞集合体を形成する方法を提供する。
【００３１】
従って、第六の側面では、本発明は、
（ｉ）少なくとも１つの二次元接着性パターンを含んでなる支持体を提供し、
（ｉｉ）前記支持体に細胞を播種し、
（ｉｉｉ）前記細胞を様々な条件下で、前記二次元接着性パターン上に三次元多細胞集合体を得るのに十分な時間培養し、前記三次元多細胞集合体が標準化された極性を有する組織化構造を有する
ことを含んでなる三次元多細胞集合体を形成する方法を提供する。
【００３２】
一実施態様では、工程（ｉｉｉ）は、細胞を培地で覆うことを含んでなる。特定の実施態様では、培地は、細胞外マトリックスタンパク質を含んでなる。
【００３３】
もう一つの実施態様では、工程（ｉｉ）は、更に細胞を支持体に接着させるのに十分な時間支持体と細胞をインキュベートすることを含んでなる。更にもう一つの実施態様では、工程（ｉｉ）は、更に支持体を洗浄して、支持体に接着しなかった細胞を除去する工程を含んでなる。
【００３４】
もう一つの実施態様では、この方法は、更に少なくとも１つの接着性パターンを含んでなる支持体を調製する工程を含んでなり、前記調製が、
（ａ）ガラス支持体の表面を活性化し、
（ｂ）活性表面に細胞不親和性ポリマーをコーティングし、
（ｃ）二次元接着性パターンをコーティングした表面に印刷する
ことを含んでなる。
【００３５】
三次元多細胞集合体は、任意の細胞から形成することができることが理解されるであろう。一実施態様では、細胞は、多能性幹細胞、上皮細胞、または上皮様細胞および上皮由来細胞を含んでなる群から選択される。特定の実施態様では、細胞はマディン−ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）またはＣａｃｏ２細胞である。
【００３６】
一実施態様では、本発明は、本明細書に記載の方法および装置によって生産された三次元多細胞集合体にも関する。
【００３７】
もう一つの実施態様では、本発明は、
（ｉ）少なくとも１つの本発明による二次元接着性パターンを含んでなる支持体、および
（ｉｉ）本発明による三次元多細胞集合体を形成するための使用説明書
を含んでなる、三次元培養システムに関する。
【００３８】
もう一つの実施態様では、本発明は、
（ｉ）少なくとも１つの本発明による二次元接着性パターンを含んでなる支持体を提供し、
（ｉｉ）前記支持体に細胞を播種し、
（ｉｉｉ）前記の本発明の方法による二次元接着性パターン上に標準化された極性を有する組織化三次元多細胞集合体を形成し、前記三次元多細胞集合体が、実質的に同一の構造、形状およびサイズを有し、
（ｉｖ）前記三次元多細胞集合体を画像化し、前記三次元集合体の画像から得られるデーターを平均化することによって平均細胞を画定する
ことを含んでなる、平均細胞を画定する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
図面の説明
【図１】三次元培養システム略図。Ａ．従来の方法： 細胞を濃厚なゲル上に播種し、生成する細胞をゲルに包埋する。およびＢ．本発明の一実施態様による方法：細胞を、ゲルの全くないマイクロパターン化した接着性支持体上に播種する。
【図２】腺房／管および小胞において標準化された頂底極性を示し、およびスフェロイドにおいて標準化された頂底極性の非存在を示す、腺房／管、小胞およびスフェロイドの略図。
【図３】本発明の実施態様による接着性パターンの略図例。
【図４】２４時間後にコラーゲン−ＩのＨ形マイクロパターン化接着性支持体上に形成されたＭＤＣＫ三次元２細胞集合体。極性マーカーは、緑色（頂点）および赤色（基底外側）に免疫蛍光標識されており、核は青色 （ヘキスト）に染色されている。
【図５】２４時間後にコラーゲン−ＩのＨ形マイクロパターン化接着性支持体上に形成されたＭＤＣＫ三次元２細胞集合体の標準化画像。極性マーカーは、緑色（頂点）および赤色（基底外側）に免疫蛍光標識されており、核は青色（ヘキスト）に染色されている。
【図６】極性マーカーについて免疫蛍光標識したラミニンＹ形マイクロパターン化接着性支持体上のＭＤＣＫ細胞から形成された腺房（頂点＝緑色、基底外側＝赤色、核＝青色)。
【図７】ＭＤＣＫ細胞から形成されたマイクロパターン化接着性支持体上の三次元多細胞集合体。Ａ．３日後にラミニンＹ形マイクロパターン上に形成された腺房。Ｂ．４日後に多数のＨ形マイクロパターンから形成されたコラーゲン−Ｉ管状マイクロパターン化した接着性支持体上の管。極性マーカーは、緑色（頂点）および赤色（基底外側）に免疫蛍光標識されており、核は青色 （ヘキスト）に染色されている。
【図８】５日後にＣａｃｏ２細胞からコラーゲン−Ｉディスク形マイクロパターン化接着性支持体上に形成された三次元多細胞集合体。 Ａ．完全培地で覆った小胞。Ｂ．２％マトリゲル（商標）および５％マトリゲル（商標）を補足した完全培地で覆った腺房。  極性マーカーは、赤色 （頂点）および緑色 （基底外側）に免疫蛍光標識されており、核は青色 （ヘキスト）に染色されている。
【図９】コラーゲン−ＩのＨ形マイクロパターン化接着性支持体上に形成された三次元 ＭＤＣＫ２細胞集合体における核およびアクチンの標準化された局在。
【図１０】播種５時間後のＹ形マイクロパターン上のＭＤＣＫ細胞。上部：コラーゲン−Ｉマイクロパターン上の細胞。下部：ラミニンマイクロパターン上の細胞。
【図１１】ＳｔａｒｔｅｒのＣＹＴＯＯｃｈｉｐ上の３Ｄ腺房サイズ分布のＳｔａｒｔｅｒの特性表示。ＭＤＣＫII腺房は、２．５％マトリゲルを補足したＭＥＭ培地＋２％ＦＣＳ中で７２時間のＳｔａｒｔｅｒのＣＹＴＯＯｃｈｉｐ上に形成された。固定化後、構造物をＤＮＡ、Ｆ−アクチン、ｇｐ１３５について染色し、画像化した。３Ｄ腺房サイズ（μｍ２）分布は、パターン形状およびサイズのそれぞれについて箱ひげグラフで表され、中央値はそれぞれの箱内部の水平棒線によって示され、箱は２５パーセンタイル値および７５パーセンタイル値を示し、ひげはデーターの広がりを示している。ＮＰ＝非パターン化、Ｄ＝ディスクパターン、Ｃ＝クロスボウパターン、Ｈ＝Ｈパターン、Ｙ＝Ｙパターン。Ｌ＝大（１７００μｍ２）、Ｍ＝中（１１００μｍ２）、Ｓ＝小（７００μｍ２）。ｎ＝腺房数。
【発明の具体的説明】
【００４０】
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、特に例示された方法に限定されず、もちろん変化し得ることを理解すべきである。本明細書で用いられる用語は、本発明の特定の実施態様を説明するためだけのものであり、限定的であることを意図せず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解すべきである。
【００４１】
本明細書に引用される総ての公表文献、特許および特許出願明細書は、前記または下記のいずれであっても、それらの全体を参照することによって本明細書に引用される。しかしながら、本明細書に記載される公表文献は、これらの公表文献に記録されており且つ本発明に関連して用いられることがあるプロトコルおよび試薬を記載および開示する目的で引用される。本発明が、先行発明のためにその開示内容に先立つものと呼ばれないことを容認するものと解釈すべきではない。
【００４２】
本発明の実施には、特に断らない限り、細胞培養、細胞生物学およびマイクロファブリケーションの通常の手法であって、当該技術分野の技術の範囲内にあるものが用いられる。このような手法は、文献に記載されている。例えば、Coligan et al. , １９９９年「タンパク質科学における最新のプロトコル(Current protocols in Protein Science)第ＩおよびＩＩ巻(John Wiley & Sons Inc.)、Ross et al.,１９９５年「組織学：テキストおよび図解書(Histology: Text and Atlas)」第３版 (Williams & Wilkins)、Kruse & Patterson （監修）１９７７年「組織培養(Tissue Culture)」(Academic Press)、およびAlberts et al.２０００年「細胞の分子生物学(Molecular Biology of the Cell)」(Garland Science)を参照されたい。
【００４３】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に断らない限り、複数表示を包含することに留意しなければならない。従って、 例えば、「１個の細胞」という表示は、複数のそのような細胞を包含し、「１個の接着性パターン」という表示は１個以上の接着性パターンに対する表示などである。特に断らない限り、本明細書で用いられる総ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野における通常の既述を有する者によって一般に理解されているのと同一の意味を有する。
【００４４】
本明細書に記載されているのと同様のまたは同等の任意の材料または方法を用いて本発明を実施または試験することができるが、好ましい材料および方法を説明することにする。
【００４５】
広義には、本発明は、一般的には三次元多細胞集合体を含んでなる装置に関する。「三次元多細胞集合体」、「三次元多細胞集合体類」またはそれらの文法上同等な用語は、２個以上の細胞を含んでなる任意の配置を表す。
【００４６】
本発明の三次元多細胞集合体は、組織化構造を有する。本明細書で用いられる「組織化された構造」という用語は、集合体を構成する細胞の配置が調和していることを示している。以前に記載された三次元集合体は、集合体内部でランダム配置および配向を有する細胞のランダム集合からなっていた。対照的に、本発明による三次元集合体の細胞はランダムに配置されておらず、互いおよび集合体に関してそれらの位置および配向に関して調和している。換言すれば、本発明の三次元多細胞集合体は、「標準化された極性」を有する。細胞および組織極性および標準化された極性の概念は、当業者に周知である（例えば、Bryant and Mostov, Nat Rev Mol Cell Biol. 2008 November; 9(11): 887-901に記載されている）。しかしながら、簡単に言えば、細胞極性はほとんど総ての真核細胞の基本的特徴である。大抵の細胞は、単一の明確な非対称軸、すなわち「前」および「後」を有する。イン・サイチューでは、細胞の極性は個々の細胞について組織を形成するために空間および時間において調和していなければならない。例えば、上皮細胞は、明確な「頂点」および「基底外側」表面を特徴としている。組織内では、総ての細胞の先端面は管腔に面しており、一方、総ての細胞の基底外側表面は他の細胞および細胞外マトリックスに面している。従って、本明細書で用いられる「標準化された極性」という用語は、三次元多細胞集合体における実質的に総ての細胞は非対称性の軸を有しており、この集合体における実質的に総ての細胞は生理学的に関連したやり方で非対称性の軸に従って配向していることを示している。
【００４７】
当業者であれば、細胞の特定の組織化および配向は、形成される集合体の種類によって変化することが分かるであろう。特定の実施態様では、三次元多細胞集合体は、「標準化された頂底極性」を有する。「標準化された頂底極性」または「標準化された頂点−基底極性」という用語は、集合体の実質的に総ての細胞が「頂点」表面と「基底外側」表面を含んでなり、且つ集合体の実質的に総ての細胞が生理学的に関連したやり方で非対称性の軸に従って配向していることを示している。例えば、腺房における実質的に総ての細胞は、閉じられた内腔または管腔に面しているそれらの頂極および培地に面しているそれらの基底外側表面により配向される。しかしながら、小胞では、実質的に総ての細胞は、培地に面している頂極により配向される。これらの形成物は、通常は標準化頂底極性を持たないスフェロイドを形成する従来技術で報告された三次元集合体と対照的である（図２参照）。
【００４８】
三次元多細胞集合体内の細胞の極性は、当業者によって通常のイメージング手法を用いて容易に決定することができる。例えば、マイクロパターン化接着性支持体上の三次元多細胞集合体は、パラホルムアルデヒドまたはメタノールのような固定試薬を用いて固定することができる。次いで、固定した集合体を、核、マイクロフィラメント、微小管、頂点および基底外側膜のような様々な区画を可視化することができる免疫蛍光法を用いて染色する。例えば、細胞の頂極に特異的に局在化したタンパク質であるＧｐ１３５を標識し、細胞の配向を可視化することができる。免疫蛍光で用いられる他のマーカーとしては、ファロイジン（頂点）、β−カテニン（基底外側）、ヘキスト（核／ＤＮＡ）およびＤＡＰＩ（核／ＤＮＡ）が挙げられる。固定され染色された集合体を有するマイクロパターン化接着性支持体は、次にＰｒｏＬｏｎｇ（商標）Ｇｏｌｄ（Invitrogen, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, California 92008, 米国）、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（商標）（Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, Missouri 63103, 米国）またはＭｏｗｉｏｌ（商標）４−８８（Polysciences Europe GmbH, Handelsstrasse 3 D-69214 Eppelheim, ドイツ）のような封入剤でスライドガラス上に固定することができる。次いで、スライドを、集合体における様々な構造の画像を取得するため共焦または広視野顕微鏡を用いて分析することができる。
【００４９】
染色は、ある種のイメージング法には必要なことがあるが、本発明による三次元集合体は、染色を必要としないイン・ビボイメージング実験に用いることもできる。
【００５０】
熟練者であれば、染色が必要かどうかを決定することができ、可能ならば、適当な着色剤を画定することができる。
【００５１】
本発明の三次元集合体は、当該技術分野で知られている任意の構造を形成することができる。好ましくは、三次元多細胞集合体は、細胞が由来するイン・ビボ組織と類似した構造を有する。好ましい三次元構造は、小胞、腺房または管のいずれかから選択される。
【００５２】
特定の実施態様では三次元多細胞集合体の細胞は、管腔を取り囲んでいる。本明細書で用いられる「管腔」という用語は、細胞によって囲まれ、細胞−細胞接合点によって画定されている空間または腔部を表し、前記空間または腔部は実質的に細胞がなく且つ培地から隔離されている。典型的には、管腔は、細胞活性の結果として、培地とは生理学的に異なる組成を有する。一般的には、集合体は単一管腔を含んでなるが、より大きな集合体では、多数の管腔が存在することがある。本発明の特定の実施態様では、三次元多細胞集合体は腺房または管である。本明細書で用いられる「腺房」または「腺房類」という用語は、少なくとも１個の管腔を含んでなるほぼ球形の多細胞集合体を表す。本明細書で用いられる「管」および「管状」という用語は、少なくとも１個の管腔を含んでなる細長い多細胞集合体を表す。
【００５３】
本発明の三次元多細胞集合体を構成する細胞は、三次元多細胞集合体を形成することができる任意の細胞でよく、そのような細胞は当業者に知られていることが理解されるであろう。更に、細胞の型の選択は、三次元多細胞集合体を必要とする目的によって変化する。好ましくは、細胞は真核細胞であり、更に好ましくは哺乳類細胞である。
【００５４】
本明細書で用いられる「哺乳類細胞」という用語は、ヒト細胞を包含する哺乳類または哺乳類腫瘍に由来の細胞を表す。総ての哺乳動物は、特定の機能の実行を専門に扱う細胞の群または「組織」から構成されている。本発明の方法および装置に特に適している細胞は、上皮（上皮）組織、結合組織、神経組織および筋肉組織などの組織に由来する。これらの組織の総ては、普通の交差種における表現型特性を有する細胞を含んでなる。例えば、総ての哺乳動物種由来の上皮は、一般的には密着結合と呼ばれる閉鎖結合によって互いに保持されている細胞の単層を含んでなる。更に重要なことには、任意の哺乳動物種由来の上皮内の総ての細胞は、同様な成長特性を有する。あるいは、細胞は、多数の細胞型に分化する能力を有する未成熟細胞、例えば、分化全能性、多能性(pluripotent)または多能性(multipotent) 幹細胞であることがある。細胞は、健康なまたは病気の組織に由来するものでよい。好ましい細胞は、多能性幹細胞(pluripotent)、上皮細胞、または上皮様細胞および上皮由来細胞である。
【００５５】
上皮細胞としては、皮膚、肺、腸上皮、結腸上皮、精巣、乳房、前立腺、脳、腎臓、卵巣および胸腺に由来する細胞が挙げられる。「上皮様細胞」という用語は、上皮細胞に似ており、上皮細胞に特有であり、上皮細胞の形態または外観を有する細胞を表す。「上皮由来細胞」という用語は、上皮細胞、例えば、上皮由来細胞系および癌から生じた細胞の個体群を表す。従って、上皮由来細胞の例としては、皮膚細胞、肺細胞、腸上皮細胞、結腸上皮細胞、精巣細胞、乳房細胞、前立腺細胞、脳細胞、腎臓細胞、卵巣細胞および胸腺細胞に由来する細胞系および腫瘍細胞が挙げられる。好ましい細胞株は、ＭＤＣＫ、Ｃａｃｏ２、ＲＰＥ−１、ＣＨＯ、ＢＳＣおよびＭＣＦ１０Ａのいずれか１つから選択される。
【００５６】
好ましくは、細胞、特に幹細胞は、ヒト胚の破壊を必要とする方法によっては得られない。
【００５７】
伝統的には、細胞は、いったん播種されると、それらが置かれている表面上で成長して広がるが、本発明の三次元集合体は接着性パターン上に固定されている。本明細書で用いられる「接着性パターン」という用語は、細胞が接着することができる表面を画定する任意の範囲を表す。如何なる特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、初期細胞伸展および細胞接着を含むことによって、組織化三次元集合体の形成が促進されると考えられる。 従って、一実施態様では、装置は、初期細胞伸展を制御する接着性パターンを含んでなる。細胞伸展は、当該技術分野で知られている任意の手段によって制御することができる。例えば、三次元多細胞構造の伸展は、形状的にまたは化学的に、あるいはそれらの組合せによって制御することができる。例えば、初期細胞伸展は、支持体の表面における凹面形から接着性パターンを形成することによって形状的に制御することができる。初期細胞伸展も、化学的に、例えば、細胞親和性材料を用いて接着性パターンを積極的に形成することによって制御することができる。好ましい細胞親和性材料は、ラミニンタンパク質、コラーゲンＩ型（コラーゲン−Ｉ）タンパク質、ＢＭＥ−抽出物、コラーゲンＩＶ型タンパク質、フィブロネクチン、抗カドヘリンＦａｂ抗体断片および抗インテグリン阻止抗体のいずれか１つから選択される。 あるいは、初期細胞伸展は、細胞不親和性材料を用いて接着性パターンを消極的に形成することによって化学的に制御することができる。好ましい細胞不親和性材料は、ポリ（エチレングリコール）− ポリ−Ｌ−リジン（ＰＥＧ−ＰＬＬ）、ポリエチレンオキシド、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）のようなオリゴまたはポリ（エチレン）グリコールの誘導体、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、シラン（特に過フッ化シラン）のようなシリコン、アニオン性ポリマー、ホスホリルコリンポリマー、アルブミン、カゼイン、ヒアルロン酸、リポサッカライド、糖タンパク質、リン脂質またはこれらの化合物の混合物である。
【００５８】
初期細胞伸展は、単一または小数の細胞を収容するのに適合している接着性パターンを用いることによって促進することもできる。本明細書で用いられる「単一または小数の細胞を収容する」という用語は、接着性パターンのサイズが、１個または極めて小数の細胞に対するパターンに接着に十分なだけの部分があるようになっていることを示している。本明細書で用いられる「小数の細胞」という用語は、典型的には１０個未満の細胞、好ましくは５個未満の細胞を示している。このようなパターンの例は、当該技術分野で周知であり、他の場所に記載されており、例えば、Bornens et al. ＷＯ２００５／０２６３１３号公報を参照されたい。
【００５９】
支持体上の接着性パターンの特性は、三次元集合体で所望な特性および／または三次元集合体を構築するのに用いられている細胞の特性によって変化することを理解されるであろう。例えば、パターンが大きくなれば、三次元集合体も大きくなる。その上、管の形成を促進するのに適合している接着性パターンは、細長い形状を含んでなることがあるが、腺房または小胞の形成を促進するのに適合している接着性パターンはそうした形状を含まないであろう。一実施態様では、前記接着性パターンは、ほぼディスク、クロスボウ、ＨおよびＹの形状、またはそれらの任意の組合せである。もう一つの実施態様では、前記接着性パターンは、長方形、環およびＳを含んでなる群から選択される概形である。接着性パターンは、単一形状を含んでなることもまたは多数の形状を含んでなることもある。その上、接着性パターンは、細胞の極性に影響を与えるように構築されることがある。このようなパターンの例は、当該技術分野で周知であり、他の場所に記載されており、例えば、Bornens et al.ＷＯ２００５／０２６３１３号公報を参照されたい。特定の接着性パターンの例は、下記において議論され、図３に示されている。好ましい接着性パターンは、ディスク、クロスボウ、Ｈ、Ｙ、長方形、環またはＳのいずれか一つから選択される。
【００６０】
上記のように、本発明は、管状構造を含んでなる装置他および管状構造の形成方法にも関する。管状構造を形成するのに適合している接着性パターンは、通常は細長い形状を含んでなるが、管状構造は、直線で囲まれた形状以外の形状、例えば、環から形成されることもある。管状構造を形成するのに適合している好ましい接着性パターンは、長さ対幅比がおよそで約２：１−約２０：１であり、更に好ましくは約５：１−約１５：１であり、更に一層好ましくは約１０：１である。好ましくは、管状構造を形成するのに適合している接着性パターンは、長さが約１００μｍを上回り、更に好ましくは約１００−約３００μｍであり、更に一層好ましくはおよそで約２００−約３００μｍである。管状構造に関して本明細書で用いられる「長さ」という用語は、管腔形成構造の形状の長さではなく、構造の長さを表す。  例えば、管状構造を形成する環の長さは、環形状の直径ではなく、環形状の円周となる。
【００６１】
従って、三次元集合体の特性は、接着性パターンの配置によって制御されまたは予め決定される。換言すれば、本発明は、所定の構造、形状およびサイズを有する三次元多細胞集合体を作製する方法を提供する。本明細書で用いられる「所定の構造、形状およびサイズ」という用語は、三次元多細胞集合体の構造、形状およびサイズが、形成の開始前（すなわち、播種前）に画定され、生成する三次元多細胞集合体が実質的に所望な構造、形状およびサイズを有する、三次元多細胞集合体を表す。
【００６２】
三次元多細胞集合体の「構造」とは、形成された集合体の種類、例えば、小胞、腺房または管を表す。上記で述べたように、本発明の三次元集合体は、当該技術分野で知られている任意の構造を形成することができる。このような構造を画定し、形成する特性および方法を包含する本発明に関する構造の例は、本明細書の他の箇所で検討する。
【００６３】
三次元多細胞集合体の「形状」とは、三次元多細胞集合体の空間的形状または輪郭を表す。三次元多細胞集合体は、当該技術分野で知られている任意の形状でよく、球形、長方形、環またはＳが挙げられる。更に、三次元多細胞集合体の形状は、通常の手法を用いて熟練者が容易に決定することができる。例えば、三次元多細胞集合体は、古典的な免疫蛍光プロトコルを用いて固定して染色した後、古典的な反射型落射蛍光顕微鏡により画像形成することができ、または生きたまま保持してビデオマイクロスコープを用いて経時的に位相差で観察することができる。次いで、生成する画像を分析して、多細胞集合体上の様々な形状ファクターを測定することができる。上記のように、イメージング手法によっては、染色を必要としないことがある。
【００６４】
三次元多細胞集合体の「サイズ」とは、三次元多細胞集合体の寸法、すなわち、集合体の長さ、幅および深さ、または三次元多細胞集合体を構成する細胞の数を表す。三次元多細胞集合体の寸法は、当業者であれば、上記のイメージング法などごく普通の手法を用いて容易に決定することができる。あるいは、極めて小数の細胞を含んでなる非常に小さな三次元多細胞集合体については、集合体のサイズを集合体が含んでなる細胞の数によって測定するのが一層好都合であることがある。三次元多細胞集合体における細胞の数は、熟練者であればごく普通の手法を用いて容易に決定することができる。例えば、多細胞集合体を構成する細胞の核は、ヘキストで染色した後、画像形成し、自動プログラム（例えば、ＩｍａｇｅＪ  ｍａｃｒｏ）で簡単に計数することができる。多細胞集合体当たりの核の数は、多細胞集合体当たりの細胞の数に相当する。
【００６５】
本発明によって形成された特定の三次元多細胞集合体の特定のサイズは、使用者の要求によって変化し、三次元多細胞集合体を構築するのに用いられる細胞の種類によって限定されることがあることを理解されるであろう。どのサイズが特定の細胞の種類にとって最も適当であるかを決定する方法は、当業者であればごく普通の実験を通じて容易に決定することができる。例えば、様々なサイズのマイクロパターンを含んでなるマイクロパターン化接着性支持体が発売されており、どの寸法が特定の細胞の種類から三次元多細胞集合体を形成するのに最も適当であるかを決定するのに用いることができる（例えば、CYTOO‘s Starter CYTOOchip, CYTOO S.A.7, parvis Louis Neel, BHT 52, BP50, 38040 Grenoble cedex 9, フランス）。
【００６６】
所定の構造、形状およびサイズを有する三次元多細胞集合体を形成することの利点は、これにより、実質的に同一の構造、形状およびサイズを有し、高処理量実験研究に用いることができる多数の組織化三次元多細胞集合体を含んでなる装置の構築が可能になることである。
【００６７】
本明細書で用いられる「実質的に同一の構造、形状およびサイズ」という用語は、三次元多細胞集合体が類似の構造、形状およびサイズを有し、これらの特徴は集合体の間で余り異ならないことを示している。
【００６８】
従って、本明細書で用いられる「実質的に同一の構造」は、集合体が、実質的に同一の配向および位置において実質的に同一の形状およびサイズを有する細胞から構成されていることを意味する。例えば、装置は、それぞれが単一管腔を含んでなる腺房の配列を含み、実質的に総ての細胞が、細胞の頂極が集合体の管腔に面するように配向していることがある。
【００６９】
本明細書で用いられる「実質的に同一の形状」は、三次元多細胞集合体の全般的な空間的形状または輪郭が前記集合体の間で余り違わないことを意味する。例えば、ほぼ長方形の形状をした２個の集合体は、実質的に同一の形状を有するが、ほぼ球形状の１個の集合体とほぼ長方形状の集合体とは、実質的に同一の形状とはならない。
【００７０】
本明細書で用いられる「実質的に同一のサイズ」とは、三次元多細胞集合体の寸法（すなわち、長さ、幅および深さ）または三次元多細胞集合体を構成する細胞の数が、前記集合体の間で余り違わないことを意味する。典型的には、前記の差異は、５０％以下であり、好ましくは２５％以下であり、最も好ましくは１０％以下である。
【００７１】
多数の三次元多細胞集合体の構造、形状およびサイズを決定する方法は、当業者に知られており、上記および以下において検討される。
【００７２】
本発明による装置は、実質的に同一の構造、形状およびサイズを有する組織化三次元多細胞集合体の配列を含んでなることがあることを理解されるであろう。 あるいは、装置は、異なる組織化三次元多細胞集合体を含んでなる区画に分割された組織化三次元多細胞集合体の配列を含んでなることがあるが、区画内の三次元多細胞集合体は、実質的に同一の構造、形状およびサイズを有する。例えば、装置は、腺房の配列と管の配列、あるいは一つの寸法の腺房と異なる寸法の腺房を含んでなることがある。
【００７３】
更に、実質的に同一の構造、形状およびサイズを有する組織化三次元多細胞集合体を作製する能力により、「平均細胞」または「参照細胞」の定義が可能になる。平均細胞は、幾つかの同様な三次元多細胞集合体内の多数の同様な細胞から得られるデーターを平均することによって作製される。データーの例としては、細胞に関する構造情報、例えば、細胞の寸法および形状、および一次繊毛、頂端膜、中心体、核、マイクロフィラメント、微小管、ゴルジ層およびミトコンドリアのような細胞区画の位置、サイズおよび形状が挙げられる。２個の細胞からのデーターは「平均細胞」を画定するのに十分であるが、生成する「参照細胞」の精度はデーターが収集される細胞の数と共に増加する。好ましくは、少なくとも２個の細胞からのデーターが用いられ、更に好ましくは少なくとも６個の細胞が、更に一層好ましくは少なくとも１０個の細胞が用いられる。
【００７４】
このようなデーターを収集し平均細胞を作る方法は、当業者に知られており、例えば、Thery et al., Cell Motil Cytoskeleton 2006, 63(6):341-55に記載されている。しかしながら、簡単に説明すれば、三次元培養物は、固定試薬４％ＰＦＡで処理し、免疫染色を様々な細胞区画（例えば、一次繊毛、頂端膜、中心体、核、マイクロフィラメント、微小管、ゴルジ層、ミトコンドリア）について行うことができる。次いで、画像は、共焦または広視野デコンボリューション顕微鏡検査法を用いて取得することができる。典型的な細胞の少なくとも１０個の個々の画像の配列は、同一試料から作製される。それぞれの染色した細胞小器官について、多くの画像を作成することができる。様々な画像の翻訳アライメントは、細胞小器官の一つの重心（典型的には、核） を空間参照として用いて行うことができる。次いで、画像のそれぞれのスタックの投影を、スタックの総てにおけるそれぞれの画素のシグナルを個々に合計することによって行うことができる。次に、そのような投影から生じる画像を、様々なカラーコードを用いてそれぞれの細胞小器官の生成画像と組み合わせる。次いで、強度測定、細胞小器官分布および他の誘導されるパラメーターを用いて分析することができる。
【００７５】
本発明は、組織化構造を有する三次元多細胞集合体を形成する方法にも関することが分かるであろう。従って、一実施態様では、実質的に上記した少なくとも１つの接着性パターンを有する支持体に、細胞を播種することができる。支持体上にいったん播種した後、細胞を様々な条件下で、三次元多細胞集合体を得るのに十分な時間培養する。細胞の培養に適当な方法および材料は、当業者に知られており、以下に記載する。
【００７６】
培養条件および時間枠は、当然のことであるが、成長させる細胞の種類および形成される集合体のサイズによって変化することが分かるであろう。一実施態様では、細胞は、少なくとも約２４時間、更に好ましくは少なくとも約４８時間培養される。一つの特定の実施態様では、細胞培養は、前記細胞を培地で覆うことを含んでなる。本明細書で用いられる「覆う」という用語は、十分な容積の培地を、細胞が完全に被覆されるように細胞に加えることを包含する。一実施態様では、培地は、細胞外マトリックスタンパク質を含んでなる。本発明での使用に適している適当な培地および細胞外マトリックスタンパク質は、当業者に知られている。好ましい実施態様では、 オーバーレイは、マトリゲル（商標）（BD, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, New Jersey米国）のような商業生産された培地を含んでなる。一実施態様では、オーバーレイは、約２％−約１００％のマトリゲル（商標）、更に好ましくは約２％−約２０％のマトリゲル（商標）、更に一層好ましくは約２％−約５％のマトリゲル（商標）、更に一層好ましくは約２％マトリゲル（商標）を含んでなる。
【００７７】
一実施態様では、細胞を培養する前に、この方法は、前記支持体と細胞を十分な時間インキュベートして、細胞が支持体に接着できるようにする工程を含んでなる。細胞を支持体に接着するのに要する時間は、当然のことながら、細胞の種類および接着性パターンの性質のような他の条件によって変化する。もう一つの実施態様では、この方法は、支持体を洗浄して支持体に接着しない細胞を除去する工程を含んでなる。洗浄工程に有用な方法および溶液は、当業者に知られており、以下において検討する。
【００７８】
更に、本発明は、接着性パターンを含んでなる支持体の調製方法、並びにキット、三次元培養システム、スクリーニングの方法などにも関する。一実施態様では、本発明の方法は、更に少なくとも１つの接着性パターンを含んでなる支持体を調製する工程を含んでなり、その調製が、（ａ）ガラス支持体の表面を活性化し、（ｂ）活性表面に細胞不親和性ポリマーをコーティングし、（ｃ）接着性パターンをコーティングした表面に印刷することを含んでなる。もう一つの実施態様では、（ｉ）少なくとも１つの接着性パターンを含んでなる支持体、および（ｉｉ）本発明による三次元多細胞集合体を形成するための使用説明書を含んでなる三次元培養システムが提供される。
【００７９】
上記のように、本発明の方法および装置は、高処理量実験研究を行うのに用いることができる実質的に同様な多数の三次元多細胞集合体を提供する。一実施態様では、本発明は、前記の方法によって形成された三次元多細胞集合体を物質と接触させ、前記物質との接触によって生じる集合体の細胞における任意の表現型または代謝変化を測定し、前記変化を細胞毒性、細胞吸収または治療効果と相関させることを含んでなる、物質毒性、吸収または治療応用についてのスクリーニングの方法を提供する。
【００８０】
更に、細胞播種、伸展(spreading)およびオルガノイド形成は、支持体に特に好適なインキュベーションチャンバーを用いて生細胞ビデオマイクロスコープ検査法によって観察することができる。これらの培養物は、（管腔形成前、後または中に）様々な試薬で処理して、上皮構造、透過性、管腔形成効率または細胞移動に対するそれらの効果を評価することができる。検討は、生細胞について行うか、または細胞を固定して染色し、様々な細胞マーカーの局在化を検討することができる。
【実施例】
【００８１】
実施例１：パターン化支持体の調製
ガラス支持体を血漿チャンバー中で酸化して表面を活性化し、ポリ（エチレングリコール）−ポリ−Ｌ−リジン（ＰＥＧ−ＰＬＬ）をコーティングした。次いで、様々な形状のパターンを、写真平板法によって印刷した。次いで、２０μｇ／ｍｌリン酸緩衝食塩水の十分な容積のラミニンまたはコラーゲン−Ｉを加えて、支持体を完全に被覆した後、室温で２時間または４℃で一晩インキュベートした。インキュベーションの後、溶液をＰＢＳに代えた後、支持体をＰＢＳ１０ｍｌで１時間２回洗浄した。次いで、ＰＢＳ溶液を吸引し、支持体を乾燥させた。支持体は、直ちに用いるかまたは４℃で２４−４８時間保管した。
【００８２】
実施例２：細胞沈着
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ; Manassas, Virginia 米国）から入手したＭＤＣＫ細胞（ＭＤＣＫ（ＮＢＬ−２）ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４（商標））を、ＰＢＳで２回洗浄した。一回目の洗浄は速やかであったのに対して、二回目の洗浄は細胞をＰＢＳ中で室温にて２０−３０分間インキュベーションすることからなっていた。その後、細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡを加えることによってフラスコから分離し、３７℃にて５分間インキュベートした。完全培地をフラスコに加え、収集した細胞を１４００ｒｐｍで４分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を、１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補足したＧｌｕｔａｍａｘ−Ｉ、Ｅａｒｌｅｓ（Invitrogen, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, California 米国）を含む最小必須培地を含む完全培地中で再懸濁した。次いで、細胞溶液を、約１０，０００−２０，０００個／ｃｍ２の最終密度でマイクロパターン化接着性支持体に加えた。次いで、細胞とマイクロパターン化接着性支持体を、室温にて約３０−４０分間または大多数の細胞がマイクロパターンに接着するまでインキュベートした。非接着細胞は、支持体の一方の側に加えて他方の側で吸引する培地の流れによって除去した。次いで、細胞を播種した支持体を細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に更に３時間置き、細胞を支持体に完全に接着できるようにした。
【００８３】
実施例３：細胞外マトリックスタンパク質を含んでなる培地による細胞のオーバーレイ
２％マトリゲル（商標）（BD, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, New Jersey 米国）の溶液を、低温の完全培地で調製した後、３７℃に加温した。播種から３時間後、細胞を播種した支持培地(support media)を、希釈したマトリゲル（商標）と交換した。
【００８４】
コラーゲン−ＩのＨ形マイクロパターン化接着性支持体上に播種したＭＤＣＫ細胞は、多細胞集合体を形成し、管腔形成は２４時間後に明らかになった（図４および５）。集合体は、細胞構造を支持することができなくなり支持体から脱離する（およそ８日目、図示せず）まで成長を続けた。
【００８５】
実施例４：三次元構造の形成
ＭＤＣＫ細胞を調製して、実施例１−３に記載のマイクロパターン化接着性支持体に播種し、三次元集合体を形成できるようにした。マトリゲル（商標）溶液は、４８時間毎に交換した。
【００８６】
三次元集合体が形成された後、集合体を、４％パラホルムアルデヒドを用いて支持体上に２０分間固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００／ＰＢＳ溶液で透過処理した。頂端膜を、一次抗体抗ＧＰ１３５および二次抗体抗マウスＩｇＧ−ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８（Thermo Fisher Scientific Inc., 3747 North Meridian Road, Rockford, Illinois 61101, 米国）で染色した。基底外側膜は、一次抗体抗β−カテニンおよび二次抗体抗ウサギＩｇＧ−Ｃｙ３で染色した。核（ＤＮＡ）は、ヘキストで染色した。固定後、支持体をＰｒｏＬｏｎｇ（商標）Ｇｏｌｄ（Invitrogen, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, California 92008, 米国）を用いてガラススライドに固定した。スライドを、共焦または広視野顕微鏡を用いて分析し、腺房における様々な構造の画像を取得した。
【００８７】
ラミニンのＹ形マイクロパターン化接着性支持体上に播種したＭＤＣＫ細胞は、２−３日後に管腔を有する腺房を形成した（図７Ａ）。集合体は標準化極性を示し、細胞の先端面は管腔に面し、細胞の基底外側表面は他の細胞に面していた（図６）。
【００８８】
管状構造は、ＭＤＣＫ細胞を、長さが２００μｍであり長さ−幅比が５：１のコラーゲン−Ｉの多数のＨ形マイクロパターンから形成した管状マイクロパターン化接着性支持体上に播種することによって形成した（図７Ｂ）。細長い管が約４日後に管腔を形成し（図７Ｂ）、標準化極性も示した。
【００８９】
実施例５：Ｃａｃｏ２細胞による三次元構造の形成
ＡＴＣＣから得たＣａｃｏ２細胞（Ｃ２ＢＢｅｌ（Ｃａｃｏ２のクローンＨＴＢ−３７）ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１０２（商標））を調製し、本質的に実施例１−３に記載のコラーゲン−Ｉのディスク形マイクロパターン化接着性支持体に播種し、三次元集合体の形成を可能にした。Ｃａｃｏ２細胞に、２％または５％マトリゲル（商標）および１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補足したダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ; Invitrogen）を含んでなる完全培地または完全培地のみの溶液をオーバーレイした。多細胞集合体と管腔の形成は、５日間の培養後には明らかであった（図８）。
【００９０】
細胞集合体を、４％パラホルムアルデヒドを用いて２０分間支持体上に固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００／ＰＢＳ溶液で透過処理した。次いで、支持体をＰＢＳ−３％ＢＳＡでインキュベートした後、希釈したβ−カテニン抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc. 2145 Delaware Avenue, Santa Cruz, California 米国）および二次抗体を含むＰＢＳ−３％ＢＳＡの溶液を用いてインキュベートした。支持体も、核染色（ＤＮＡ）のためＤＡＰＩを用いてインキュベートした。ＴＲＩＴＣ−ファロイジンを、上皮細胞の頂端の刷子縁に局在化し、従って頂端極性マーカーとして役立つアクチンのマイクロフィラメント染色（Ｆ−アクチン）に用いた。スライドを、ＰｒｏＬｏｎｇ−Ｇｏｌｄ（商標） (Invitrogen)を用いて固定した後、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦顕微鏡を用いて画像形成した。画像を、ＺＥＮ  ２０１０ソフトウェアを用いて取得した後、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて処理した。
【００９１】
完全培地のみ（すなわち、マトリゲル（商標）を添加していない培地）をオーバーレイしたＣａｃｏ２細胞は、反転極性を有する小胞を形成した（図８Ａ）。マトリゲル（商標）を補足した培地を添加したところ、３−５日後にＣａｃｏ２腺房形成を誘発した図８Ｂ）。
【００９２】
実施例６：内部細胞組織の平均化
６個の実質的に同一の２細胞三次元構造のアレイを、コラーゲン−ＩのＨ形マイクロパターン上に実施例１−３に記載の方法に従って作製した。
【００９３】
生成する三次元構造を固定試薬４％ＰＦＡで処理し、免疫染色を様々な細胞区画について行った。頂端膜は、一次抗体抗ＧＰ１３５および二次抗体抗マウスＩｇＧ−ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８ (Thermo Fisher Scientific Inc.)で染色した。アクチンは、ファロイジン−ＦＩＴＣで染色した。基底外側膜は、一次抗体抗β−カテニンおよび二次抗体抗ウサギＩｇＧ−Ｃｙ３で染色した。核は、ヘキストで染色した。画像は、共焦または広視野デコンボリューション顕微鏡法を用いて取得し、画像分析ソフトウェアに移した（ＩｍａｇｅＪ）。典型的な細胞の少なくとも１０個の個々の画像のアレイを同じ試料から作製した。それぞれの染色した細胞小器官について、画像のスタックファイルを作製した。スタック画像の翻訳アライメントは、核の一つの重心を空間参照として用いて行った。次いで、画像のそれぞれのスタックの投影を、スタックの総てにおけるそれぞれの画素のシグナルを個々に合計することによって行った。次に、そのような投影から生じる画像を、様々なカラーコードを用いてそれぞれの細胞小器官の生成画像と組み合わせる。次いで、強度測定、細胞小器官分布および他の誘導パラメーターを用いて分析する（図９）。
【００９４】
実施例７：接着性タンパク質およびマイクロパターンサイズの効果
ＭＤＣＫ細胞を調製し、実施例１−３に記載の方法に従ってコラーゲン−ＩまたはラミニンのＹ形マイクロパターン上に播種した。前記のように播種の５時間後に、細胞を固定して染色した。コラーゲン−Ｉのマイクロパターン上の細胞は、伸展してストレスファイバーを形成し、パターンの形状を採るが、ラミニンのマイクロパターン上の細胞は、丸くてストレスファイバーを持たないことが観察された（図１０）。
【００９５】
従って、マイクロパターンのコーティングに用いられる接着タンパク質によっては、細胞は異なった動きをするが、集合体は総ての場合に標準化極性を示す。これは、接着性支持体上の細胞伸展と細胞−細胞接着の間の競合によるものと考えられる。同じ理由で、本発明者らは、マイクロパターンサイズと腺房形成の速度との間に逆相関も観察し、小さなマイクロパターンでは、細胞は丸いままで、大きなマイクロパターン上で伸展した細胞より速やかに腺房を形成する傾向がある。
【００９６】
従って、コーティングのためのタンパク質および／または様々なパターン／形状のサイズを変更することによって、多種多様な組合せが提供され、これにより、所定の問題またはスクリーンに対する最も好適な多細胞配列の選択が可能になる。
【００９７】
実施例８：３Ｄ嚢胞サイズのマイクロパターン標準化
ＥＣＡＣＣ（カタログ番号：０００６２１０７）から入手したＭＤＣＫＩＩ細胞を、実施例２に記載したのと同様にして、ラミニンコートしたＳｔａｒｔｅｒ’ｓ  ＣＹＴＯＯｃｈｉｐ上での細胞沈着の目的で調製した。細胞（２０，０００／チップ）を、更に洗浄工程を行うことなく播種した。細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で３−４時間インキュベーションした後、２．５％マトリゲル（商標）のオーバーレイを実施例３に記載したのと同様にして添加した。培養７２時間で、三次元構造を実施例４に記載したのと同様にして、固定して、染色した。画像を、１０×対物レンズを用いてＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）(Thermo Fischer Scientific)上で取得し、Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ｖ４．０  ＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎソフトウェアを用いて分析した。頂端−基底外側極性を有する球状嚢胞は、Ｆ−アクチン染色によって画定された目的の領域内部における管腔（頂端膜マーカーｇｐ１３５によって染色）の存在に基づいて明確に同定された。腺房面積（μｍ２）は、２Ｄ顕微鏡画像からの断面積として計算した。
【００９８】
Ｓｔａｒｔｅｒ’ｓ  ＣＹＴＯＯｃｈｉｐで利用可能な４種類のパターンおよび３種類のサイズのそれぞれで形成される腺房のサイズ 分布の定量は、ディスク・スモール （ＤＳ  ７００μｍ２）マイクロパターンは、集団内の嚢胞サイズの不均一性を有意に低下させることを示した（図１１）。ＤＳマイクロパターン上では、腺房のかなりの部分（５０％）がサイズ範囲４８０−６１０μｍ２に観察された。管腔サイズの範囲および腺房当たりの細胞数も、これらの条件下で標準化されることが予想される。対照的に、非パターン化（ＮＰ）した完全に均一なコーティング上では、腺房の５０％は５６０−１０２０μｍ２で変動する広いサイズ範囲を有する。
【００９９】
これらの結果は、腺房の標準化した個体群を、ある種のマイクロパターンの形状およびサイズを選択することによって、管腔形成または極性の効率に悪影響を及ぼすことなく得ることができることを示している。本発明者らは、クロスボウ、ＨおよびＹと比較して、対称的な完全に接着性のディスクは、嚢胞形成の際に均一性を促進する外形およびサイズを提供する。ディスク形状およびサイズの変動は、嚢胞個体群の標準化を更に向上させることがある。均一サイズの腺房の個体群を再現性のあるやり方で得ることができることは、薬剤浸透度、従ってデーターの解釈および薬理学的研究のエラー強さに直接影響を与える複雑な３Ｄアッセイにとって極めて重要である。
【０１００】
参照文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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