(57)【要約】  本発明は、神経原線維変化病（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅ）に起因する又は関連する病患及び状態の治療において、治療及び診断に使用する方法及び組成物に関連する。具体的には、本発明は、リン酸化病態タンパク質タウコンフォーマーを特異的に認識しそれに結合する抗体に、そして、アルツハイマー病（ＡＤ）を含むタウオパシーの治療において治療及び診断に使用する前記抗体を含む方法及び組成物に、関連する。
2014531216.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物のタウタンパク質上又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する抗体又はその機能断片であって、前記抗体又は抗体断片が、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質に高い結合親和性を有し、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質のレベルを、インビボで検出、及び／又は調節することができる抗体又はその機能断片。
【請求項２】
前記抗体又は抗体断片が、リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）及び４０４番目の位置（ｐＳ４０４）に含むアミノ酸配列ＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲＨＬ（配列番号６２）（配列番号６７のタウ  ａａ  ３９３−４０８）を有する、又はその内部にあるホスホエピトープに結合する、抗体又はその機能断片。
【請求項３】
前記抗体又は抗体断片が、哺乳動物の脳における可溶性及び／又は不溶性タウのレベルを調節する調節抗体である、請求項２に記載の抗体又はその機能断片。
【請求項４】
前記抗体又は抗体断片が、大脳皮質及び／又は海馬おける可溶性及び／又は不溶性タウのレベルを調節する、請求項３に記載の抗体又はその機能断片。
【請求項５】
前記抗体又は抗体断片が、可溶性及び／又は不溶性の総タウタンパク質のレベルを低下させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
【請求項６】
前記抗体又は抗体断片が、可溶性及び／又は不溶性のリン酸化タウタンパク質のレベルを低下させる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
【請求項７】
前記抗体又は抗体断片が、過剰リン酸化タウタンパク質を含む対らせん状フィラメントのレベルを低下させる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
【請求項８】
前記抗体又は抗体断片が、可溶性の総タウタンパク質、可溶性リン酸化タウタンパク質、及びｐタウ対らせん状フィラメントのレベルを低下させる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
【請求項９】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
【請求項１０】
前記抗体又は抗体断片が、少なくとも１０ｎＭの解離定数を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
【請求項１１】
前記抗体又は抗体断片が、少なくとも８２ｎＭ、５ｎＭ、少なくとも２ｎＭ；少なくとも１ｎＭ、少なくとも５００ｐＭ、少なくとも３００ｐＭ、少なくとも２００ｐＭ、少なくとも１００ｐＭの解離定数を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
【請求項１２】
前記抗体又は抗体断片が、１０４Ｍ−１ｓ−１以上；１０５Ｍ−１ｓ−１以上、１０６Ｍ−１ｓ−１以上の会合速度定数を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
【請求項１３】
前記抗体又は抗体断片が高い結合親和性を有し、少なくとも４ｎＭの解離定数、及び１０５Ｍ−１ｓ−１以上の会合速度定数を伴う、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
【請求項１４】
前記抗体又は抗体断片が高い結合親和性を有し、少なくとも３ｎＭの解離定数、及び１０６Ｍ−１ｓ−１以上の会合速度定数を伴う、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
【請求項１５】
前記抗体又は抗体断片が高い結合親和性を有し、少なくとも２ｎＭの解離定数、及び１０４Ｍ−１ｓ−１以上の会合速度定数を伴う、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
【請求項１６】
前記抗体又は抗体断片が高い結合親和性を有し、少なくとも１ｎＭの解離定数、及び１０５Ｍ−１ｓ−１以上の会合速度定数を伴う、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
【請求項１７】
前記抗体又は抗体断片が高い結合親和性を有し、少なくとも２００ｐＭの解離定数、及び１０５Ｍ−１ｓ−１以上の会合速度定数を伴う、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
【請求項１８】
前記抗体又は抗体断片が高い結合親和性を有し、少なくとも１００ｐＭの解離定数、及び１０６Ｍ−１ｓ−１以上の会合速度定数を伴う、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
【請求項１９】
前記抗体又は抗体断片が:
ａ．  リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含む、ＶＹＫＳＰＶＶＳＧ（配列番号６７のタウ  ａａ  ３９３−４０１）；
b．  リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含む、ＳＰＶＶＳＧ（配列番号６７のタウ  ａａ  ３９６−４０１）；
ｃ．  リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含む、ＹＫＳＰＶＶＳ（配列番号６７のタウ  ａａ  ３９４−４００）；
ｄ．  リン酸化Ｓｅｒを４０４番目の位置（ｐＳ４０４）に含む、ＤＴＳＰＲ（配列番号６７のタウ  ａａ  ４０２−４０６）；及び
ｅ．  リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含む、ＶＹＫＳＰＶＶＳ（配列番号６７のタウ  ａａ  ３９３−４００）
からなる群から選択されるエピトープに結合する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
【請求項２０】
前記抗体又はその断片が、哺乳動物のタウタンパク質上の、具体的にはヒトタウタンパク質上の、しかし特に、リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含むタウ  ａａ  ３９３−４０１（ＶＹＫＳＰＶＶＳＧ）を含む配列番号６７に示すヒトタウタンパク質上のエピトープに結合する、請求項１〜１９のいずれかに記載の抗体又はその機能断片。
【請求項２１】
前記抗体又はその断片が、哺乳動物のタウタンパク質上の、具体的にはヒトタウタンパク質上の、しかし特に、リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含むタウ  ａａ  ３９６−４０１（ＳＰＶＶＳＧ）を含む配列番号６７に示すヒトタウタンパク質上のエピトープに結合する、請求項１〜２０のいずれかに記載の抗体又はその機能断片。
【請求項２２】
前記抗体又はその断片が、哺乳動物のタウタンパク質上の、具体的にはヒトタウタンパク質上の、しかし特に、リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含むタウ  ａａ  ３９４−４００  （ＹＫＳＰＶＶＳ）を含む配列番号６７に示すヒトタウタンパク質上のエピトープに結合する、請求項１〜２１のいずれかに記載の抗体又はその機能断片。
【請求項２３】
前記抗体又はその断片が、哺乳動物のタウタンパク質上の、具体的にはヒトタウタンパク質上の、しかし特にリン酸化Ｓｅｒを４０４番目の位置（ｐＳ４０４）に含むタウ  ａａ  ４０２−４０６（ＤＴＳＰＲ）を含む配列番号６７に示すヒトタウタンパク質上のエピトープに結合する、請求項１〜２２のいずれかに記載の抗体又はその機能断片。
【請求項２４】
前記抗体又はその断片が、哺乳動物のタウタンパク質上の、具体的にはヒトタウタンパク質上の、しかし特に、リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含むタウ  ａａ  ３９３−４００（ＶＹＫＳＰＶＶＳ）を含む配列番号６７に示すヒトタウタンパク質上のエピトープに結合する、請求項１〜２３のいずれかに記載の抗体又はその機能断片。
【請求項２５】
哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項１〜２４のいずれかに記載の抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片が、配列番号７３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号７４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号７５に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、具体的には少なくとも９７％、具体的には少なくとも９８％、具体的には少なくとも９９％若しくは１００％それに同一なアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む第１の結合ドメイン、及び／又は、配列番号７０に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも９５％、具体的には９８％、具体的には９９％それに同一なアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号７１に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、それに同一なアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号７２に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、具体的には少なくとも９７％、具体的には少なくとも９８％、具体的には少なくとも９９％若しくは１００％、それに同一なアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む第２の結合ドメインを含む、抗体又はその機能断片。
【請求項２６】
哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項１〜２５のいずれかに記載の抗体又はその機能断片抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片が：
ａ．  配列番号７３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号７４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号７５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む、第１の結合ドメイン；及び／又は
ｂ．  配列番号７０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号７１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号７２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含むアミノ酸配列を含む、第２の結合ドメインを含む、抗体又はその機能断片。
【請求項２７】
哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項１〜２６のいずれかに記載の抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片が、配列番号８１に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ１と、配列番号８２に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ２と、配列番号８３に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、具体的には少なくとも９７％、具体的には少なくとも９８％、具体的には少なくとも９９％若しくは１００％、それに同一なアミノ酸配列を伴うＣＤＲ３とを含む第１の結合ドメイン、及び／又は、配列番号７８に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ１と、配列番号７９に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ２と、配列番号８０に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、具体的には少なくとも９７％、具体的には少なくとも９８％、具体的には少なくとも９９％、若しくは１００％、それに同一なアミノ酸配列を伴うＣＤＲ３とを含む第２の結合ドメインを含む、抗体又はその機能断片。
【請求項２８】
哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項１〜２７のいずれかに記載の抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片が：
ａ．  配列番号８１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号８２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号８３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む第１の結合ドメイン；及び／又は
ｂ．  配列番号７８に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号７９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号８０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含むアミノ酸配列を含む第２の結合ドメイン
を含む、抗体又はその機能断片。
【請求項２９】
哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項１〜２８のいずれかに記載の抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片が、配列番号９３に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ１と、配列番号９４に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ２と、配列番号９５に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、具体的には少なくとも９７％、具体的には少なくとも９８％、具体的には少なくとも９９％、若しくは１００％、前記ＣＤＲのいずれか一つに同一なアミノ酸配列を伴うＣＤＲ３と含む第１の結合ドメイン、及び／又は、配列番号８９に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ１と、配列番号９０に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ２と、配列番号９１に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、具体的には少なくとも９７％、具体的には少なくとも９８％、具体的には少なくとも９９％、若しくは１００％、前記ＣＤＲのいずれか一つに同一なアミノ酸配列を伴うＣＤＲ３と含む第２の結合ドメインを含む、抗体又はその機能断片。
【請求項３０】
哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項１〜２９のいずれかに記載の抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片が：
a．  配列番号９３を含むアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号９４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号９５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む第１の結合ドメイン；及び／又は
ｂ．  配列番号８９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号９０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号９１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含むアミノ酸配列を含む第２の結合ドメイン
を含む、抗体又はその機能断片。
【請求項３１】
哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項１〜３０のいずれかに記載の抗体又はその機能断片であって、前記抗体又はその断片が、配列番号１０１に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ１と、配列番号１０２に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ２と、配列番号１０３に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、具体的には少なくとも９７％、具体的には少なくとも９８％、具体的には少なくとも９９％、若しくは１００％、前記ＣＤＲのいずれか一つに同一なアミノ酸配列を伴うＣＤＲ３とを含む第１の結合ドメイン、及び／又は、配列番号９８に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ１と、配列番号９９に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ２と、配列番号１００に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、具体的には少なくとも９７％、具体的には少なくとも９８％、具体的には少なくとも９９％、若しくは１００％、前記ＣＤＲのいずれか一つに同一なアミノ酸配列を伴うＣＤＲ３とを、順番に含む第２の結合ドメインを含む、抗体又はその機能断片。
【請求項３２】
哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項１〜３１のいずれかに記載の抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片が：
ａ．  配列番号１０１を含むアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号１０２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号１０３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む第１の結合ドメイン；及び／又は
ｂ．  配列番号９８に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号９９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号１００に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含むアミノ酸配列を含む第２の結合ドメイン
を含む、抗体又はその機能断片。
【請求項３３】
哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項１〜３２のいずれかに記載の抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片が、配列番号１０６に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ１と、配列番号１０７に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ２と、配列番号１０８に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、具体的には少なくとも９７％、具体的には少なくとも９８％、具体的には少なくとも９９％、若しくは１００％、前記ＣＤＲのいずれか一つに同一なアミノ酸配列を伴うＣＤＲ３とを含む第１の結合ドメイン、及び／又は、配列番号８９に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ１と、配列番号１１５に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ２と、配列番号９１に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、具体的には少なくとも９７％、具体的には少なくとも９８％、具体的には少なくとも９９％、若しくは１００％、前記ＣＤＲのいずれか一つに同一なアミノ酸配列を伴うＣＤＲ３とを含む第２の結合ドメインを含む、抗体又はその機能断片。
【請求項３４】
哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項１〜３３のいずれかに記載の抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片が:
ａ．  配列番号１０６を含むアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号１０７に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号１０８に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む第1の結合ドメイン;及び／又は
ｂ．  配列番号８９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号１１５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号９１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含むアミノ酸配列を含む第2の結合ドメイン
を含む、抗体又はその機能断片。
【請求項３５】
配列番号６９、７７、１１６、９２、１１８、９７、１０５から選択される示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、具体的には少なくとも９７％、具体的には少なくとも９８％、具体的には少なくとも９９％、若しくは１００％、それらと同一なアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン、及び／又は、配列番号６８、７６、８８、９６、１０４に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、具体的には少なくとも９７％、具体的には少なくとも９８％、具体的には少なくとも９９％、若しくは１００％、それらと同一なアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む、請求項１〜３4のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
【請求項３６】
哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片であって、前記抗体又はその機能断片が、配列番号６９に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも９８％若しくは９９％、それと同一なアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン；及び／又は、配列番号６８に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも９０％、９１％、９２％、若しくは９３％、それと同一なアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む、抗体又はその機能断片。
【請求項３７】
哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片であって、前記抗体又はその機能断片が、配列番号７７に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも９３％、９４％、若しくは９５％、それと同一なアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン；及び／又は、配列番号７６に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも８８％、８９％、若しくは９０％、それと同一なアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む、抗体又はその機能断片。
【請求項３８】
哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片であって、前記抗体又はその機能断片が、配列番号１１６，９２、若しくは１１８に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも９３％、９４％、若しくは９５％、それらと同一なアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン；及び／又は、配列番号８８に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも９０％、９１％、９２％、若しくは９３％、それと同一なアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む、抗体又はその機能断片。
【請求項３９】
哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片であって、前記抗体又はその機能断片が、配列番号９７に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも９９％、それと同一なアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン；及び／又は、配列番号９６に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも８６％、８７％、８８％、若しくは９０％、それと同一なアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む、抗体又はその機能断片。
【請求項４０】
哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片であって、前記抗体又はその機能断片が、配列番号１０５に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも９８％若しくは９９％、それと同一なアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン；及び／又は、配列番号１０４に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも８８％、８９％、若しくは９０％、それと同一なアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む、抗体又はその機能断片。
【請求項４１】
請求項１〜４０のいずれか一項に記載の、抗体又はその機能断片であって：
ａ．  配列番号６９に示すアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン、及び／若しくは配列番号６８に示すアミノ酸配列を含む第２の結合ドメイン；又は
ｂ．  配列番号７７に示すアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン、及び／若しくは配列番号７６に示すアミノ酸配列を含む第２の結合ドメイン；又は
ｃ．  配列番号１１６に示すアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン、及び／若しくは配列番号８８に示すアミノ酸配列を含む第２の結合ドメイン；又は
ｄ．  配列番号９２に示すアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン、及び／若しくは配列番号８８に示すアミノ酸配列を含む第２の結合ドメイン；又は
ｅ．  配列番号９７に示すアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン、及び／若しくは配列番号９６に示すアミノ酸配列を含む第２の結合ドメイン；又は
ｆ．  配列番号１０５に示すアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン、及び／若しくは配列番号１０４に示すアミノ酸配列を含む第２の結合ドメイン；又は
ｇ．  配列番号１１８に示すアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン、及び／若しくは配列番号８８に示すアミノ酸配列を含む第２の結合ドメイン、
を含む、抗体又はその機能断片。
【請求項４２】
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、若しくは完全ヒト抗体、又はそれらの機能断片である、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
【請求項４３】
ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ａ、又はＩｇＧ３アイソタイプである、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
【請求項４４】
前記哺乳動物のタウタンパク質が、ヒトのタウタンパク質である、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
【請求項４５】
前記抗体又はその断片が、病態タンパク質タウコンフォーマーには結合するが、対応する非リン酸化エピトープ、及び／又は非関連エピトープには結合しない、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
【請求項４６】
請求項１〜４５のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４７】
請求項４６のポリヌクレオチドであって：
ａ．  配列番号３５〜４５；配列番号８４〜８７、配列番号１０９〜１１２、及び１１７〜１１９に示す配列に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｂ．  配列番号３５〜４５；配列番号８４〜８７、配列番号１０９〜１１２、及び１１７に示す配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｃ．  配列番号３５〜４５；配列番号８４〜８７、配列番号１０９〜１１２、及び１１７〜１１９に示す配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｄ．  配列番号３５〜４５；配列番号８４〜８７、配列番号１０９〜１１２、及び１１７〜１１９に示す配列に対して、少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｅ．    配列番号３５〜４５；配列番号８４〜８７、配列番号１０９〜１１２、及び１１７〜１１９に示す配列に対して、１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｆ．  相補ストランドが、ａ）〜ｄ）のいずれかの核酸分子とハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含む核酸；又は
ｇ．  ａ）〜ｅ）のいずれかおいて遺伝暗号の縮重によって定義されるヌクレオチド配列から逸脱しているヌクレオチド配列を含む核酸分子：
からなる群から選択される核酸分子を含み、ａ）〜ｇ）のいずれかに定義される前記核酸分子は、哺乳動物上の、具体的には、ヒトタウタンパク質上の、又はその断片上のホスホエピトープ、具体的には病態タンパク質タウコンフォーマーを認識しそれに特異的に結合するが対応する非リン酸化エピトープ及び／又は非関連エピトープには結合しない抗体又はその機能断片をコードし、前記抗体又は抗体断片は、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質に高い結合親和性を有し、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質のレベルを、インビボで検出、及び／又は調節することができる、ポリヌクレオチド。
【請求項４８】
請求項１〜４７のいずれか一項に記載の抗体若しくはその機能断片、又はその組み合わせを、治療有効量で、薬剤的に許容できる担体とともに含む薬剤組成物。
【請求項４９】
哺乳動物のタウタンパク質上の二つの異なるホスホエピトープを認識しそれに結合する、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の少なくとも二つの抗体又はその機能断片を含む、請求項４８に記載の薬剤組成物。
【請求項５０】
アミロイド形成したタンパク質又はペプチドを認識しそれに結合する、さらなる抗体又はその機能断片をさらに含む、請求項４８又は４９に記載の薬剤組成物。
【請求項５１】
治療に使用する、具体的には、哺乳動物における、タウオパシー等の神経変性疾患、又は障害の、具体的にはそうした治療を必要とするヒトにおけるその治療に使用する、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の、抗体若しくはその機能断片、ポリヌクレオチド、若しくは薬剤組成物、又はその組み合わせ。
【請求項５２】
哺乳動物における神経変性疾患又は障害の治療に使用し、神経変性疾患又は障害はタウオパシーである、請求項５１に記載の、抗体若しくはその機能断片、ポリヌクレオチド、薬剤組成物、又はそれらの組み合わせ。
【請求項５３】
哺乳動物におけるタウオパシー等の、神経変性疾患又は障害の治療に使用し、哺乳動物はヒトである、請求項５１又は５２に記載の、抗体若しくはその機能断片、ポリヌクレオチド、薬剤組成物、又はそれらの組み合わせ。
【請求項５４】
哺乳動物における認識障害の治療又は軽減、具体的には、そうした障害を患うヒトにおけるその治療又は軽減に使用する、請求項１〜５３に記載の、抗体若しくはその機能断片、ポリヌクレオチド、又は薬剤組成物。
【請求項５５】
哺乳動物、具体的にはヒトにおける認識障害の治療又は軽減の結果として、認識障害の進行が停止する、請求項５４に記載の、抗体若しくはその機能断片、ポリヌクレオチド、又は薬剤組成物。
【請求項５６】
哺乳動物、具体的にはヒトにおける認識障害の治療又は軽減の結果として、治療対象における認識記憶能力の維持が増大する、具体的には完全に回復する、請求項５４に記載の、抗体若しくはその機能断片、ポリヌクレオチド、又は薬剤組成物。
【請求項５７】
タウオパシーが、アルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤコブ病、パンチドランカー、ダウン症候群、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー症候群、筋萎縮性側索硬化症／グアム島パーキンソン痴呆症候群、神経原線維変化病（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅ）を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、嗜銀顆粒性認知症、大脳皮質基底核変性症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、前頭側頭型認知症、ハラーフォルデン−シュパッツ病、多系統萎縮症、ニーマン−ピック病、Ｃ型、淡蒼球−橋脳−黒質退行変性、ピック病、進行性皮質下膠質症、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維型老年認知症、脳炎後パーキンソン症候群、及び筋強直性ジストロフィーからなる群から選択される、請求項５２に記載の、抗体若しくはその機能断片、ポリヌクレオチド、又は薬剤組成物。
【請求項５８】
アルツハイマー病又は前頭側頭性認知症の治療に使用する、請求項１〜５７に記載の、抗体若しくはその機能断片、ポリヌクレオチド、又は薬剤組成物。
【請求項５９】
神経変性疾患又は障害が、タウとアミロイド両方の病態の存在を示す、請求項５１に記載の、抗体若しくはその機能断片、ポリヌクレオチド、又は薬剤組成物。
【請求項６０】
アルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤコブ病、パンチドランカー、ダウン症候群、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー症候群、封入体筋炎、及びプリオンタンパク質脳アミロイド血管症を含むがこれらには限定されない、タウ及びアミロイド両方の病態の存在を示す疾患又は障害を含む神経変性疾患又は障害と、外傷性脳損傷と、筋萎縮性側索硬化症／グアム島パーキンソン痴呆症候群、神経原線維変化病を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、嗜銀顆粒性認知症、大脳皮質基底核変性症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、前頭側頭型認知症、ハラーフォルデン−シュパッツ病、多系統萎縮症、ニーマン−ピック病、Ｃ型、淡蒼球−橋脳−黒質退行変性、ピック病、進行性皮質下膠質症、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維型老年認知症、脳炎後パーキンソン症候群、及び筋強直性ジストロフィー含むが、これらには限定されない、明瞭なアミロイド病態を示さないさらなる疾患又は障害との、異種の群を含むタウオパシーにおける主要な脳病態である神経原線維病変の形成に起因する又は関連する疾患及び障害の治療に使用する、請求項１〜５９に記載の、抗体若しくはその機能断片、ポリヌクレオチド、又は薬剤組成物。
【請求項６１】
哺乳動物がヒトである、請求項５４、５５、５６、又は５８に記載の、抗体若しくはその機能断片、ポリヌクレオチド、又は薬剤組成物。
【請求項６２】
タウオパシー等の神経変性疾患又は障害を治療、軽減、予防する方法であって、そうした疾患又は障害を患う哺乳動物に、請求項１〜６１に記載の、抗体若しくはその機能断片、ポリヌクレオチド、若しくは薬剤組成物、又はその組み合わせを投与することを含む方法。
【請求項６３】
神経変性疾患又は障害がタウオパシーである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
タウオパシーが、アルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤコブ病、パンチドランカー、ダウン症候群、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー症候群、封入体筋炎、及びプリオンタンパク質脳アミロイド血管症、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症／グアム島パーキンソン痴呆症候群、神経原線維変化病を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、嗜銀顆粒性認知症、大脳皮質基底核変性症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、頭側頭型認知症、ハラーフォルデン−シュパッツ病、多系統萎縮症、ニーマン−ピック病、Ｃ型、淡蒼球−橋脳−黒質退行変性、ピック病、進行性皮質下膠質症、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維型老年認知症、脳炎後パーキンソン症候群、及び筋強直性ジストロフィーからなる群から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
哺乳動物がヒトである、請求項６２、６３、及び６４に記載の方法。
【請求項６６】
タウオパシー等の神経変性障害を患う動物、具体的には哺乳動物又はヒトにおいて、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の、抗体若しくはその機能断片、若しくは薬剤組成物、又はその組み合わせを、前記動物又はヒトに投与することにより、受動免疫応答を誘導する方法。
【請求項６７】
患者における、タウタンパク質随伴疾患、障害若しくは状態、又はタウタンパク質随伴疾患、障害、若しくは状態の素因を診断する方法であって、タウタンパク質のエピトープへの、抗体又はその活性断片の免疫特異的結合を、試料において又はインサイチュで検出することを含み：
ａ．  タウ抗原を含むと疑われる、試料又は体の特定部分又は体の面積を、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の、タウタンパク質のエピトープに結合する抗体又はその断片に接触させる工程；
ｂ．  抗体をタウ抗原に結合させて免疫複合体を形成させる工程；
ｃ．  免疫複合体の形成を検出する工程；及び
ｄ．  免疫複合体の存在又は非存在を、試料、又は体の特定部分、若しくは面積におけるタウ抗原の存在又は非存在に関連づける工程
を含み、正常の対照値と比較した前記凝集体の量の増加が、前記患者がタウタンパク関連疾患又は状態を患っている、又は発症するリスクのあることを示す方法。
【請求項６８】
上記請求項のいずれか一項に記載の抗体又は薬剤組成物を用いた治療の後の患者における微小残存病変を監視する方法であって、前記方法が：
ａ．  タウ抗原を含むと疑われる、試料又は体の特定部分又は体の面積を、請求項１〜６７のいずれか一項に記載の抗体又はその断片に接触させ、そのペプチド又はその断片が、タウタンパク質のエピトープに結合する工程；
ｂ．  抗体をタウ抗原に結合させて免疫複合体を形成させる工程；
ｃ．  免疫複合体の形成を検出する工程；及び
ｄ．  免疫複合体の存在又は非存在を、試料、又は体の特定部分、若しくは面積におけるタウ抗原の存在又は非存在に関連づける工程
を含み、正常の対照値と比較した前記免疫複合体の量の増加が、前記患者が依然として微小残存病変患っていることを示す方法。
【請求項６９】
上記請求項のいずれか一項に記載の抗体又は薬剤組成物を用いて治療されている患者の反応性を予測する方法であって、
ａ．  タウ抗原を含むと疑われる、試料又は体の特定部分又は体の面積を、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の抗体又はその断片に接触させ、そのペプチド又はその断片が、タウタンパク質のエピトープに結合する工程；
ｂ．  抗体をタウ抗原に結合させて免疫複合体を形成させる工程；
ｃ．  免疫複合体の形成を検出する工程；
ｄ．  免疫複合体の存在又は非存在を、試料、又は体の特定部分、又は面積におけるタウ抗原の存在又は非存在に関連づける工程、及び
ｅ．  前記免疫複合体の量を治療の開始前後で比較する工程
を含み、前記免疫複合体の量の減少が、前記患者が有する治療反応性の潜在能力が高いことを示す方法。
【請求項７０】
免疫複合体の存在又は非存在を、試料又は体の特定部分又は面積におけるタウ抗原の存在又は非存在に関連づける工程が、前記免疫複合体の量を正常の対照値と比較する工程を含む、請求項６７〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
試料が、脳ホモジネート又は脳脊髄液である、請求項６７〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
タウ随伴疾患又は障害を患っていることが疑われる対象からの脳試料中のホスホタウ（ｐタウ）マルチマーを死後検出する方法であって：
ａ．  対象の脳試料を、請求項１〜７１のいずれか一項に記載の、ホスホタウタンパク質のエピトープに結合する抗体又はその断片に接触させる、こと；
ｂ．  抗体をタウタンパク質に結合させて免疫複合体を形成させること；
ｃ．  免疫複合体の形成を検出すること、及び
ｄ．  対象から得られた試料中の免疫複合体の量又は強度を、健康な対照対象から同一条件を用いて得られた免疫複合体の量又は強度と比較すること
を含み、対照値と比較した前記免疫複合体の量又は強度の増加が、前記患者がタウ随伴疾患又は障害を患っていたことを示す方法。
【請求項７３】
対照試料と比較した、試験試料中に観察される増加が３０％から１００％の間にある、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
工程（ａ）に先立って、固体支持体に付着させた抗タウ抗体又はその断片と接触させることにより、試料を免疫濃縮して試料中のタウタンパク質の濃度を増加させる、請求項６７〜７３のいずれか一項に記載の、タウタンパク質随伴疾患を診断する方法。
【請求項７５】
請求項１〜４５のいずれか一項に記載の抗体を含む、タウタンパク質随伴疾患、障害、又は状態を検出し診断する試験キット。
【請求項７６】
請求項１〜４５のいずれか一項に記載の一つ又は複数の抗体又は機能断片を入れた容器と、タウ抗原を結合させて免疫複合体を形成させ複合体の形成を検出して免疫複合体の存在又は非存在をタウ抗原の存在又は非存在に関連づける目的で該抗体を使用するための指示書とを含む、請求項１〜７５のいずれか一項に記載の試験キット。
【請求項７７】
リン酸化Ｓｅｒを３９６の位置（ｐＳ３９６）に含むＶＹＫＳＰＶＶＳＧ（配列番号６７のタウ  ａａ  ３９３−４０１）、リン酸化Ｓｅｒを３９６の位置（ｐＳ３９６）に含むＳＰＶＶＳＧ（配列番号６７のタウ  ａａ  ３９６−４０１）、リン酸化Ｓｅｒを３９６の位置（ｐＳ３９６）に含むＹＫＳＰＶＶＳ（配列番号６７のタウ  ａａ  ３９４−４００）、リン酸化Ｓｅｒを４０４の位置（ｐＳ４０４）に含むＤＴＳＰＲ（配列番号６７のタウ  ａａ  ４０２−４０６）、及びリン酸化Ｓｅｒを３９６の位置（ｐＳ３９６）に含むＶＹＫＳＰＶＶＳ（配列番号６７のタウ  ａａ  ３９３−４００）からなる群から選択されるエピトープ。
【請求項７８】
請求項１〜７７のいずれかに記載の抗体を産生する細胞株。
【請求項７９】
ＤＳＭ  ＡＣＣ３１３６として、２０１１年８月３０日に寄託されたハイブリドーマ細胞株Ａ４−４Ａ６−４８である、請求項７８に記載の細胞株。
【請求項８０】
ＤＳＭ  ＡＣＣ３１３７として、２０１１年８月３０日に寄託されたハイブリドーマ細胞株Ａ６−２Ｇ５−３０である、請求項７８に記載の細胞株。
【請求項８１】
ＤＳＭ  ＡＣＣ３１３８として、２０１１年８月３０日に寄託されたハイブリドーマ細胞株Ａ６−２Ｇ５−４１である、請求項７８に記載の細胞株。
【請求項８２】
ＤＳＭ  ＡＣＣ３１３９として、２０１１年８月３０日に寄託されたハイブリドーマ細胞株Ａ４−２Ａ１−１８である、請求項７８に記載の細胞株。
【請求項８３】
ＤＳＭ  ＡＣＣ３１４０として、２０１１年８月３０日に寄託されたハイブリドーマ細胞株Ａ４−２Ａ１−４０である、請求項７８に記載の細胞株。
【請求項８４】
ＤＳＭ  ＡＣＣ３１４１として、２０１１年９月６日に寄託されたハイブリドーマ細胞株Ａ６−１Ｄ２−１２である、請求項７８に記載の細胞株。
【請求項８５】
請求項４６又は４７に記載のポリヌクレオチドを含むベクターであって、前記ポリヌクレオチドが機能可能に連結するベクター。
【請求項８６】
請求項８５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８７】
請求項１〜４５のいずれか一項に記載の抗体、又はその機能断片を産生する、請求項８６に記載の宿主細胞。
【請求項８８】
哺乳動物の細胞である、請求項８６又は８７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項８９】
チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項８６又は８７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項９０】
請求項１〜８９のいずれかに記載の抗体、又はその機能断片を産生する方法であって、請求項８６〜８９のいずれか一項に記載の宿主細胞を、抗体又は断片の発現に適切な条件下で培養すること、及び抗体又は断片を回収することを含む方法。
【請求項９１】
脳試料中のホスホタウ（ｐタウ）マルチマーを検出する方法であって、
ａ．  試料を、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の、ホスホタウタンパク質のエピトープに結合する抗体又はその断片に接触させること；
ｂ．  抗体又は断片をタウタンパク質に結合させて免疫複合体を形成させること；及び
ｃ．  免疫複合体の形成を検出すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１２年４月５日に出願された欧州特許出願第１２１６３３１９．２号、及び２０１１年９月７日に出願された国際特許出願ＥＰ２０１１／０６７６０４号の利益を主張するものであり、それぞれの内容は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、神経原線維変化病（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅ）に起因する又は関連する疾患及び障害の治療において、治療及び診断に使用する方法及び組成物に関する。具体的には、本発明は、リン酸化した病態タンパク質タウコンフォーマーを特異的に認識しそれに結合する抗体と、アルツハイマー病（ＡＤ）を含むタウオパシーの治療において治療及び診断に使用する前記抗体を含む方法並びに組成物とに、関連する。
【背景技術】
【０００３】
神経原線維変化病及び糸屑状構造物（ＮＴ）は、アルツハイマー病（ＡＤ）の主要な神経病態的特徴である。それらは、アスパラギル又はアスパルチル残基上のリン酸化、脱アミド化、及び異性化を含む、翻訳後の修飾をうけた微小管随伴タンパク質タウから構成される。それらは、過剰リン酸化タンパク質タウ及びそのコンフォーマーの凝集に由来する。ＡＤは、この病態を、多くの神経変性タウオパシーと、具体的には特定のタイプの前頭側頭性認知症（ＦＴＤ）と共有する。
【０００４】
タンパク質タウは、微小管（ＭＴ）に強く結合して、それらの集合と安定性を促進する、自由に可溶性の「自然に折りたたまれた」タンパク質である。ＭＴは、神経細胞の細胞骨格の完全性に関して、そしてそれによる、神経回路の適切な形成や機能に関して、従って学習や記憶に関して、主に重要である。タウのＭＴへの結合は、動的なリン酸化及び脱リン酸化により制御されており、主にインビトロでそして非神経細胞において実証されている。多数の可能なリン酸化部位（８０箇所超）のせいで、それぞれの及ぼす影響や原因となるキナーゼの正体は、インビボにおいてほとんど突き止められていない。
【０００５】
ＡＤ脳では、タウ病態は、アミロイド病態よりも後、従っておそらくこれに反応して発症し、このことが、アミロイドカスケード仮説の核心を構成している。これは、ＡＤ及びダウン症の患者の研究に基づきそしてこれらの研究により示されており、アミロイド及びタウの複合的な病態を伴うトランスジェニックマウスでの研究によって裏付けられている(Lewis et al., 2001; Oddo et al., 2004; Ribe et al., 2005; Muyllaert et al, 2006; 2008; Terwel et al, 2008)。
【０００６】
アミロイドをタウ病態に結び付ける機序だけでなく、ヒトＡＤ患者における両病態の正確なタイミングは、未だほとんど知られていないが、しかし、主要な「タウキナーゼ」としてのＧＳＫ３及びｃｄｋ５に従って又はそれらにより作用する神経細胞情報伝達経路の活性化が関与しているとする説が提唱されている(Muyllaert et al, 2006, 2008の総説)。
【０００７】
タウオパシーが、ＡＤおいて無害な副作用ではなく、むしろ病態の主要な遂行者であるという仮説は、互いに完全に裏付けあう、妥当な、遺伝学的な、病態の、そして実験的な観察に基づいており：
・  アミロイドタンパク質前駆体（ＡＰＰ）、すなわちプレセニリンにおける突然変異を原因とする早期発症型の家族性ＡＤの例では、偏性の病態の原因は、アミロイドの蓄積であるが、病態は、後期発症型の散発性ＡＤの例におけるものと同一の付随的なタウオパシーを含むのが不可避であり；
・  認知障害及び痴呆症の重症度は、タウオパシーと相間があっても、アミロイド病態とはなく、これは、つい最近、臨床相１及び２のいくつかの研究で実証されており、これらの研究は、アミロイドについてのＰＩＢ−ＰＥＴ画像化を含み、多くの「偽陽性」、すなわち認知については正常で脳アミロイド量の高い個体を特定し；
・  家族性ＦＴＤでは、タウオパシーは、突然変異体タウによって誘発され、アミロイド病態なしに神経変性を直接引き起こし；
・  実験的なマウスモデルでは、アミロイド病態により生じる認識障害は、タンパク質タウの非存在により、ほとんど完全に軽減される(Roberson et al, 2007)。
【０００８】
議論の組み合わせにより、タンパク質タウが、ＡＤおよび関連する神経変性タウオパシーにおける認知の消滅において主要な役割を果たすものであるとする仮説が、支持されている。
【０００９】
優れた新しいＡＤ治療は、特異的ｍＡｂを用いた受動免疫治療であり、これは、神経毒性又はシナプス毒性があると推定される、アミロイドペプチド及びそれらの凝集体を除去するものである。
【００１０】
タウ病態を標的とする免疫治療は、本明細書で提唱するとおり、シナプスの機能障害及び神経細胞変性を引き起こすことが知られている又はそれらの前提とされる病態タンパク質タウコンフォーマーの影響を抑えることが期待される。
【００１１】
タンパク質タウを標的とする他の治療アプローチは多くはなく、主に:
・  タウのリン酸化を病態レベルにまで増加させると考えられているキナーゼの阻害剤、
・  過剰リン酸化タンパク質タウの細胞質での凝集をブロックする化合物、
が含まれる。
【００１２】
これらのアプローチは、特異性及び有効性についての多様な欠点を抱えており、それらに共通の課題は、ＡＰＰ及びアミロイドの代謝を改変しようと試みるものであり、すべて、タウに対する免疫治療を含むさらなる治療の選択肢を持続的に探索することの重要性をきわだたせるものである。実際、複合的なＡＤ様病態を伴う前臨床マウスモデルにおいてアミロイドを標的とする免疫治療もまた、タウ凝集体は存続しているものの、タウ病態に効果があることを実証した(Oddo et al., 2004)。
【００１３】
免疫治療による細胞内タンパク質タウへのアプローチの実現可能性には、いくつかの疑念が投げかけられてきた。これらに対しては、タウオパシーマウスモデルにおける、つい最近の実験的研究からの反論がある(Asuni et al., 2007)。これらの研究は、タンパク質タウに由来するホスホペプチドを用いたワクチン投与による、変化病の病態の低減及び機能改善を示した。これらのデータは、パーキンソン病（ＰＤ）及びレビー小体病のモデルにおけるα−シヌクレインを標的とする免疫治療（Masliah et al., 2005, 2011）の、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）モデルにおけるスーパーオキシドジスムターゼ（Urushitiani et al., 2007）の、これまでの報告を裏付けるものである。これらの疾患は、細胞内タンパク質が、未だ完全には理解されていない機序により、シナプス欠陥及び神経変性を生じる例である。
【００１４】
神経変性障害を生じることが知られている、又は予想されている病態タンパク質コンフォーマーの影響を抑制するように働く受動及び／又は能動免疫治療という、未だ満たされていない要求があり、これらの神経変性障害は、アミロイドとしてＡＤに典型的な、神経細胞内における過剰リン酸化タンパク質タウの凝集体により例えば生じる、ＡＤにおけるアミロイド病態等である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第２００４／０５８２５８号
【特許文献２】国際公開第９６／１３５９０号
【特許文献３】国際公開第９６／２９６０５号
【特許文献４】米国特許出願公開第２００２／００３８０８６号
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／００８３２９９号
【特許文献６】米国特許出願公開第２００２／００２５３１３号
【特許文献７】米国特許出願公開第２００４／０２０４３５４号
【特許文献８】米国特許出願公開第２００４／０１３１６９２号
【特許文献９】米国特許出願公開第２００２／００６５２５９号
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００３／０１６２６９５号
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００５／０１２４５３３号
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００５／００８９４７３号
【特許文献１３】米国特許出願公開第２００３／００７３７１３号
【特許文献１４】米国特許出願公開第２００３／０１２９１８６号
【特許文献１５】米国特許第５，１１２，５９６号
【特許文献１６】米国特許第５，２６８，１６４号
【特許文献１７】米国特許第５，５０６，２０６号
【特許文献１８】米国特許第５，６８６，４１６号
【特許文献１９】米国特許第５，００４，６９７号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Alonso A.D., et al. (1997),  Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 94, 298-303
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【非特許文献３５】Wagner et al (2002) Journal of Liposome Research Vol 12(3), pp 259-270
【発明の概要】
【００１７】
未だ満たされていないこの要求は、タウタンパク質の主要な病態ホスホエピトープを認識しそれに結合する結合タンパク質を提供する本発明によって満たされる。具体的には、本発明は、タンパク質タウ上の、具体的には、ＡＤを含むタウオパシーにおけるシナプス毒性、及び神経毒性の原因であると考えられている凝集タウタンパク質上の、線状及び立体構造をとる、単純な及び複雑なホスホエピトープに対する特異的抗体を提供する。
【００１８】
従って、本発明は、一実施形態において、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分に関連し、結合ペプチド又はタンパク質又は抗体は、哺乳動物、具体的にはヒトのタウタンパク質上又はその断片上のホスホエピトープ、具体的には凝集したタウタンパク質上のホスホエピトープ、具体的には、病態タンパク質タウコンフォーマーを認識しそれに特異的に結合するが、一実施形態では、対応する非リン酸化エピトープ及び／又は非関連エピトープには結合せず、前記結合ペプチド又は抗体は、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質に高い結合親和性を有し、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質のレベルを、インビボで、具体的には脳内で、検出及び／又は調節することができ、具体的には、少なくとも１０ｎＭの、具体的には少なくとも８ｎＭの、具体的には少なくとも５ｎＭ、具体的には少なくとも２ｎＭの、具体的には少なくとも１ｎＭの、具体的には少なくとも５００ｐＭの、具体的には少なくとも４００ｐＭ、具体的には少なくとも３００ｐＭの、具体的には少なくとも２００ｐＭの、具体的には少なくとも１００ｐＭの、具体的には少なくとも５０ｐＭの解離定数を伴う。
【００１９】
具体的には、解離定数は、２ｎＭと８０ｎＭの間の範囲にあり、具体的には２ｎＭと４０ｎＭの間の範囲にあり、具体的には２ｎＭと１０ｎＭの間の範囲にある。
【００２０】
特定の態様では、本明細書において抗体又はその機能断片が提供され、前記抗体又は抗体断片は、リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）、及び４０４番目の位置（ｐＳ４０４）に含むアミノ酸配列ＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲＨＬ（配列番号６２）（配列番号６７のタウ  ａａ  ３９３−４０８、例えば、表１に記載）を有する又はその内部にあるホスホエピトープに結合する。
【００２１】
第２の実施形態では、本発明は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分、具体的には上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、結合ペプチド又は抗体は、哺乳動物、具体的にはヒトのタウタンパク質上又はその断片上のホスホエピトープ、具体的には、病態タンパク質タウコンフォーマーを認識しそれに特異的に結合するが、一実施形態では、対応する非リン酸化エピトープ及び／又は非関連エピトープには結合せず、前記結合ペプチド又は抗体は、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質に高い結合親和性を有し、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質のレベルを、インビボで、検出及び／又は調節することができ、１０４Ｍ−１ｓ−１以上の、具体的には３〜５×１０４Ｍ−１ｓ−１以上の、具体的には１０５Ｍ−１ｓ−１以上の、具体的には２〜９×１０５Ｍ−１ｓ−１以上の；具体的には１０６Ｍ−１ｓ−１以上の、具体的には１〜４×１０６Ｍ−１ｓ−１以上の、具体的には１０７Ｍ−１ｓ−１以上の会合速度定数を有する。
【００２２】
具体的には、会合速度定数は、１．６×１０３と５×１０５の間の範囲にあり、より具体的には２．４×１０４と５×１０５の間、３×１０３と５×１０５の間の範囲にある。
【００２３】
第３の実施形態では、本発明は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分、具体的には上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、結合ペプチド又は抗体は、哺乳動物、具体的にはヒトのタウタンパク質上又はその断片上のホスホエピトープ、具体的には、病態タンパク質タウコンフォーマーを認識しそれに特異的に結合するが、一実施形態では、対応する非リン酸化エピトープ及び／又は非関連エピトープには結合せず、前記結合ペプチド又は抗体は、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質に高い結合親和性を有し、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質のレベルを、インビボで、検出及び／又は調節することができ、高い結合親和性を有し、少なくとも４ｎＭの解離定数、及び１０５Ｍ−１ｓ−１以上の会合速度定数、具体的には少なくとも３ｎＭの解離定数、及び１０６Ｍ−１ｓ−１以上の会合速度定数、具体的には少なくとも２ｎＭの解離定数、及び１０４Ｍ−１ｓ−１以上の会合速度定数、具体的には少なくとも１ｎＭの解離定数、及び１０５Ｍ−１ｓ−１以上の会合速度定数、具体的には少なくとも２００ｐＭの解離定数、及び１０５Ｍ−１ｓ−１以上の会合速度定数、具体的には少なくとも１００ｐＭの解離定数、及び１０６Ｍ−１ｓ−１以上の会合速度定数を伴う。
【００２４】
具体的には、解離定数は、２ｎＭと８０ｎＭの間の範囲、及び会合速度定数は、１．６×１０３と５×１０５の間の範囲、具体的には解離定数は、２ｎＭと４０ｎＭの間の範囲、会合速度定数は、２．４×１０４と５×１０５の間の範囲、具体的には解離定数は、２ｎＭと１０ｎＭの間の範囲、及び会合速度定数は、３×１０３と５×１０５の間の範囲にある。
【００２５】
一実施形態（４）では、本発明は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分、具体的には上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、結合ペプチド又は抗体は、哺乳動物、具体的にはヒトのタウタンパク質上又はその断片上のホスホエピトープ、具体的には、病態タンパク質タウコンフォーマーを認識しそれに特異的に結合するが、一実施形態では、対応する非リン酸化エピトープ及び／又は非関連エピトープには結合せず、前記結合ペプチド又は抗体は、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質に高い結合親和性を有し、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質のレベルを、インビボで、検出及び／又は調節することができ、前記結合ペプチド又は抗体は、哺乳動物、具体的にはヒトの、リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含むタウ  ａａ  ３９３−４０１、リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含むタウ  ａａ  ３９６−４０１、リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含むタウ  ａａ  ３９４−４００、リン酸化Ｓｅｒを４０４番目の位置（ｐＳ４０４）に含むタウ  ａａ  ４０２−４０６、及びリン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含むタウ  ａａ  ３９３−４００からなる群から選択される、配列番号６７に示すタウタンパク質上のエピトープに結合する。
【００２６】
一実施形態（５）は、上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、前記ペプチドは、哺乳動物、具体的にはヒトのタウタンパク質上の、しかし具体的には、リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含むタウ  ａａ  ３９３−４０１を含む、配列番号６７に示すヒトのタウタンパク質上のエピトープに結合する。
【００２７】
一実施形態（６）は、上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、前記ペプチドは、哺乳動物、具体的にはヒトのタンパク質上の、しかし具体的には、リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含むタウ  ａａ  ３９６−４０１を含む、配列番号６７に示すヒトのタウタンパク質上のエピトープに結合する。
【００２８】
一実施形態（７）は、上記実形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、前記ペプチドは、哺乳動物、具体的にはヒトのタンパク質上の、しかし具体的には、リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含むタウ  ａａ  ３９４−４００を含む、配列番号６７に示すヒトのタウタンパク質上のエピトープに結合する。
【００２９】
一実施形態（８）は、上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、前記ペプチドは、哺乳動物、具体的にはヒトのタンパク質上の、しかし具体的には、リン酸化Ｓｅｒを４０４番目の位置（ｐＳ４０４）に含むタウ  ａａ  ４０２−４０６を含む、配列番号６７に示すヒトのタウタンパク質上のエピトープに結合する。
【００３０】
一実施形態（９）は、上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、前記ペプチドは、哺乳動物、具体的にはヒトのタンパク質上の、しかし具体的には、リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含むタウ  ａａ  ３９３−４００を含む、配列番号６７に示すヒトのタウタンパク質上のエピトープに結合する。
【００３１】
一実施形態（１０）では、本発明は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分、具体的には上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、結合ペプチド又は抗体は、哺乳動物、具体的にはヒトのタウタンパク質上又はその断片上のホスホエピトープ、具体的には、病態タンパク質タウコンフォーマーを認識しそれに特異的に結合するが、しかし、一実施形態では、対応する非リン酸化エピトープ及び／又は非関連エピトープには結合せず、前記結合ペプチド又は抗体は、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質に高い結合親和性を有し、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質のレベルを、インビボで、検出及び／又は調節することができ、前記結合ペプチド又はその抗体は、配列番号７３に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ１と、配列番号７４に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ２と、配列番号７５に示すアミノ酸配列、若しくは、少なくとも少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、具体的には少なくとも９７％、具体的には少なくとも９８％、具体的には少なくとも９９％若しくは１００％、それに同一なアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを、順番に含む第１の結合ドメイン、及び／又は、配列番号７０に示すアミノ酸配列、若しくは、少なくとも９５％、具体的には９８％、具体的には９９％、それに同一なアミノ酸配列を伴うＣＤＲ１と、配列番号７１に示すアミノ酸配列、若しくは、少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、それに同一なアミノ酸配列を伴うＣＤＲ２と、配列番号７２に示すアミノ酸配列、若しくは、少なくとも少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、具体的には少なくとも９７％、具体的には少なくとも９８％、具体的には少なくとも９９％若しくは１００％、それに同一なアミノ酸配列を伴うＣＤＲ３とを、順番に含む第２の結合ドメインを含む。
【００３２】
一態様では、本明細書において、抗体又はその断片を提供し、抗体又はその断片は、哺乳動物のタウタンパク質上又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合し、前記抗体又はその断片は：
（ａ）  配列番号７３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号７４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号７５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む第１の結合ドメイン；及び／又は
（ｂ）  配列番号７０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号７１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号７２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含むアミノ酸配列を含む、第２の結合ドメインを含む。
【００３３】
一実施形態（１１）では、本発明は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分、具体的には上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、結合ペプチド又は抗体は、哺乳動物、具体的にはヒトのタウタンパク質上又はその断片上のホスホエピトープ、具体的には、病態タンパク質タウコンフォーマーを認識しそれに特異的に結合するが、一実施形態では、対応する非リン酸化エピトープ及び／又は非関連エピトープには結合せず、前記結合ペプチド又は抗体は、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質に高い結合親和性を有し、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質のレベルを、インビボで、検出及び／又は調節することができ、前記結合ペプチド又はその抗体は、配列番号８１に示すアミノ酸配列を伴う含ＣＤＲ１と、配列番号８２に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ２と、配列番号８３に示すアミノ酸配列、若しくは、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、具体的には少なくとも９７％、具体的には少なくとも９８％、具体的には少なくとも９９％若しくは１００％、それに同一なアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを、順番に含む第１の結合ドメイン、及び／又は、配列番号７８に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ１と、配列番号７９示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ２と、配列番号８０に示すアミノ酸配列、若しくは、少なくとも少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、具体的には少なくとも９７％、具体的には少なくとも９８％、具体的には少なくとも９９％若しくは１００％、それに同一なアミノ酸配列を伴うＣＤＲ３とを、順番に含む第２の結合ドメインを含む。
【００３４】
一態様では、本明細書において、抗体又はその断片を提供し、抗体又はその断片は、哺乳動物のタウタンパク質上又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合し、前記抗体又はその断片は：
（ａ）  配列番号８１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号８２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号８３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む第１の結合ドメイン；及び／又は
（ｂ）  配列番号７８に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号７９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号８０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含むアミノ酸配列を含む、第２の結合ドメインを含む。
【００３５】
一実施形態（１２）では、本発明は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分、具体的には上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、結合ペプチド又は抗体は、哺乳動物、具体的にはヒトのタウタンパク質上又はその断片上のホスホエピトープ、具体的には、病態タンパク質タウコンフォーマーを認識しそれに特異的に結合するが、一実施形態では、対応する非リン酸化エピトープ及び／又は非関連エピトープには結合せず、前記結合ペプチド又は抗体は、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質に高い結合親和性を有し、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質のレベルを、インビボで、検出及び／又は調節することができ、前記結合ペプチド又はその抗体は、配列番号９３に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ１と、配列番号９４に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ２と、配列番号９５に示すアミノ酸配列、若しくは、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、具体的には少なくとも９７％、具体的には少なくとも９８％、具体的には少なくとも９９％若しくは１００％、上のＣＤＲのいずれか一つに同一なアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを、順番に含む第１の結合ドメイン、及び／又は、配列番号８９に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ１と、配列番号９０示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ２と、配列番号９１に示すアミノ酸配列、若しくは、少なくとも少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、具体的には少なくとも９７％、具体的には少なくとも９８％、具体的には少なくとも９９％若しくは１００％、上のＣＤＲのいずれか一つに同一なアミノ酸配列を伴うＣＤＲ３とを、順番に含む第２の結合ドメインを含む。
【００３６】
特定の態様では、本明細書において、抗体又はその断片を提供し、抗体又はその断片は、哺乳動物のタウタンパク質上又はその部分上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合し、前記抗体又はその断片は：
（ａ）  配列番号９３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号９４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号９５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む第１の結合ドメイン；及び／又は
（ｂ）  配列番号８９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号９０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号９１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含むアミノ酸配列を含む、第２の結合ドメインを含む。
【００３７】
一実施形態（１３）では、本発明は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分、具体的には上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、結合ペプチド又は抗体は、哺乳動物、具体的にはヒトのタウタンパク質上又はその断片上のホスホエピトープ、具体的には、病態タンパク質タウコンフォーマーを認識しそれに特異的に結合するが、一実施形態では、対応する非リン酸化エピトープ及び／又は非関連エピトープには結合せず、前記結合ペプチド又は抗体は、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質に高い結合親和性を有し、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質のレベルを、インビボで、検出及び／又は調節することができ、前記結合ペプチド又はその抗体は、配列番号１０１に示すアミノ酸配列を伴う含むＣＤＲ１と、配列番号１０２に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ２と、配列番号１０３に示すアミノ酸配列、若しくは、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、具体的には少なくとも９７％、具体的には少なくとも９８％、具体的には少なくとも９９％若しくは１００％、上のＣＤＲのいずれか一つに同一なアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを、順番に含む第１の結合ドメイン、及び／又は、配列番号９８に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ１と、配列番号９９示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ２と、配列番号１００に示すアミノ酸配列、若しくは、少なくとも少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、具体的には少なくとも９７％、具体的には少なくとも９８％、具体的には少なくとも９９％若しくは１００％、上のＣＤＲのいずれか一つに同一なアミノ酸配列を伴うＣＤＲ３とを、順番に含む第２の結合ドメインを含む。
【００３８】
一態様では、本明細書において、抗体又はその断片を提供し、抗体又はその断片は、哺乳動物のタウタンパク質上又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合し、前記抗体又はその断片は：
（ａ）  配列番号１０１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号１０２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号１０３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む第１の結合ドメイン；及び／又は
（ｂ）  配列番号９８に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号９９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号１００に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含むアミノ酸配列を含む、第２の結合ドメインを含む。
【００３９】
一実施形態（１４）では、本発明は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分、具体的には上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、結合ペプチド又は抗体は、哺乳動物、具体的にはヒトのタウタンパク質上又はその断片上のホスホエピトープ、具体的には、病態タンパク質タウコンフォーマーを認識しそれに特異的に結合するが、一実施形態では、対応する非リン酸化エピトープ及び／又は非関連エピトープには結合せず、前記結合ペプチド又は抗体は、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質に高い結合親和性を有し、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質のレベルを、インビボで、検出及び／又は調節することができ、前記結合ペプチド又はその抗体は、配列番号１０６に示すアミノ酸配列を伴う含むＣＤＲ１と、配列番号１０７に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ２と、配列番号１０８に示すアミノ酸配列、若しくは、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、具体的には少なくとも９７％、具体的には少なくとも９８％、具体的には少なくとも９９％若しくは１００％、上のＣＤＲのいずれか一つに同一なアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを、順番に含む第１の結合ドメイン、及び／又は、配列番号８９に示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ１と、配列番号１１５示すアミノ酸配列を伴うＣＤＲ２と、配列番号９１に示すアミノ酸配列、若しくは、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、具体的には少なくとも９７％、具体的には少なくとも９８％、具体的には少なくとも９９％若しくは１００％、上のＣＤＲのいずれか一つに同一なアミノ酸配列を伴うＣＤＲ３とを、順番に含む第２の結合ドメインを含む。
【００４０】
具体的な態様では、本明細書において、抗体又はその断片を提供し、抗体又はその断片は、哺乳動物のタウタンパク質上又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合し、前記抗体又はその断片は：
（ａ）  配列番号１０６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号１０７に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号１０８に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む第１の結合ドメイン；及び／又は
（ｂ）  配列番号８９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号１１５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号９１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含むアミノ酸配列を含む、第２の結合ドメインを含む。
【００４１】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体又はその抗体断片の第１の結合ドメインは、軽鎖可変領域であり、本明細書に記載の抗体又はその抗体断片の第２の結合ドメインは、重鎖可変領域である。
【００４２】
別の実施形態（１５）では、本発明は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分、具体的には上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、結合ペプチド又は抗体は、哺乳動物、具体的にはヒトのタウタンパク質上又はその断片上のホスホエピトープ、具体的には、病態タンパク質タウコンフォーマーを認識しそれに特異的に結合するが、一実施形態では、対応する非リン酸化エピトープ及び／又は非関連エピトープには結合せず、前記結合ペプチド又は抗体は、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質に高い結合親和性を有し、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質のレベルを、インビボで、検出及び／又は調節することができ、前記結合ペプチド又はその抗体は、配列番号６９、７７、１１６／９２、１１８、９７、１０５に示すアミノ酸配列、若しくは、少なくとも８５％、具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、具体的には少なくとも９７％、具体的には少なくとも９８％、具体的には少なくとも９９％若しくは１００％、それらに同一なアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン、及び／又は、配列番号６８、７６、８８、９６、１０４に示すアミノ酸配列、若しくは、少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、具体的には少なくとも８６％、具体的には少なくとも８７％、具体的には少なくとも８８％、具体的には少なくとも８９％、具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６％、具体的には少なくとも９７％、具体的には少なくとも９８％、具体的には少なくとも９９％、若しくは１００％、それらに同一なアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む。
【００４３】
本明細書の一実施形態（１６）は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分、具体的には上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、結合ペプチド又は抗体は、哺乳動物、具体的にはヒトのタウタンパク質上又はその断片上のホスホエピトープ、具体的には、病態タンパク質タウコンフォーマーを認識しそれに特異的に結合するが、一実施形態では、対応する非リン酸化エピトープ及び／又は非関連エピトープには結合せず、前記結合ペプチド又は抗体は、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質に高い結合親和性を有し、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質のレベルを、インビボで、検出及び／又は調節することができ、前記結合ペプチド又はその抗体は、配列番号６９に示すアミノ酸配列、若しくは、少なくとも９８％、若しくは９９％、それに同一なアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン、及び／又は、配列番号６８に示すアミノ酸配列、若しくは、少なくとも９０％、９１％、９２％、若しくは９３％、それに同一なアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む。
【００４４】
本明細書の一実施形態（１７）は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分、具体的には上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、結合ペプチド又は抗体は、哺乳動物、具体的にはヒトのタウタンパク質上又はその断片上のホスホエピトープ、具体的には、病態タンパク質タウコンフォーマーを認識しそれに特異的に結合するが、一実施形態では、対応する非リン酸化エピトープ及び／又は非関連エピトープには結合せず、前記結合ペプチド又は抗体は、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質に高い結合親和性を有し、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質のレベルを、インビボで、検出及び／又は調節することができ、前記結合ペプチド又はその抗体は、配列番号７７に示すアミノ酸配列、若しくは、少なくとも９３％、９４％、若しくは９５％、それに同一なアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン、及び／又は、配列番号７６に示すアミノ酸配列、若しくは、少なくとも８８％、８９％、若しくは９０％、それに同一なアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む。
【００４５】
本明細書の一実施形態（１８）は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分、具体的には上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、結合ペプチド又は抗体は、哺乳動物、具体的にはヒトのタウタンパク質上又はその断片上のホスホエピトープ、具体的には、病態タンパク質タウコンフォーマーを認識しそれに特異的に結合するが、一実施形態では、対応する非リン酸化エピトープ及び／又は非関連エピトープには結合せず、前記結合ペプチド又は抗体は、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質に高い結合親和性を有し、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質のレベルを、インビボで、検出及び／又は調節することができ、前記結合ペプチド又はその抗体は、配列番号１１６、９２、又は１１８に示すアミノ酸配列、若しくは、少なくとも９３％、９４％、若しくは９５％、それらに同一なアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン、及び／又は、配列番号８８に示すアミノ酸配列、若しくは、少なくとも９０％、９１％、若しくは９３％、それに同一なアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む。
【００４６】
本明細書の一実施形態（１９）は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分、具体的には上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、結合ペプチド又は抗体は、哺乳動物、具体的にはヒトのタウタンパク質上又はその断片上のホスホエピトープ、具体的には、病態タンパク質タウコンフォーマーを認識しそれに特異的に結合するが、一実施形態では、対応する非リン酸化エピトープ及び／又は非関連エピトープには結合せず、前記結合ペプチド又は抗体は、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質に高い結合親和性を有し、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質のレベルを、インビボで、検出及び／又は調節することができ、前記結合ペプチド又はその抗体は、配列番号９７に示すアミノ酸配列、若しくは、少なくとも９９％、それに同一なアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン、及び／又は、配列番号９６に示すアミノ酸配列、若しくは、少なくとも８６％、８７％、８８％、若しくは９０％、それに同一なアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む。
【００４７】
本明細書の一実施形態（２０）は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分、具体的には上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、結合ペプチド又は抗体は、哺乳動物、具体的にはヒトのタウタンパク質上又はその断片上のホスホエピトープ、具体的には、病態タンパク質タウコンフォーマーを認識しそれに特異的に結合するが、一実施形態では、対応する非リン酸化エピトープ及び／又は非関連エピトープには結合せず、前記結合ペプチド又は抗体は、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質に高い結合親和性を有し、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質のレベルを、インビボで、検出及び／又は調節することができ、前記結合ペプチド又はその抗体は、配列番号１０５に示すアミノ酸配列、若しくは、少なくとも９８％、若しくは９９％、それに同一なアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン、及び／又は、配列番号１０４に示すアミノ酸配列、若しくは、少なくとも８８％、８９％、８８％、若しくは９０％、それに同一なアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む。
【００４８】
本明細書の一実施形態（２１）は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分、具体的には上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、前記結合ペプチド又はその抗体は、配列番号６９に示すアミノ酸配列、若しくは、９９％、それに同一なアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン；及び／又は、配列番号６８に示すアミノ酸配列、若しくは、９３％、それに同一なアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む。
【００４９】
本明細書の一実施形態（２２）は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分、具体的には上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、前記結合ペプチド又はその抗体は、配列番号７７に示すアミノ酸配列、若しくは、９５％、それに同一なアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン、及び／又は、配列番号７６に示すアミノ酸配列、若しくは、９０％、それに同一なアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む。
【００５０】
本明細書の一実施形態（２３）は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分、具体的には上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、前記結合ペプチド又はその抗体は、配列番号１１６，９２、又は１１８に示すアミノ酸配列、若しくは、９３  ９５％それらに同一なアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン；及び／又は、配列番号８８に示すアミノ酸配列、若しくは、９３％、それに同一なアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む。
【００５１】
本明細書の一実施形態（２４）は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分、具体的には上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、前記結合ペプチド又はその抗体は、配列番号９７に示すアミノ酸配列、若しくは、９９％、それに同一なアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン；及び／又は、配列番号９６に示すアミノ酸配列、若しくは、９０％、それに同一なアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む。
【００５２】
本明細書の一実施形態（２５）は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分、具体的には上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、前記結合ペプチド又はその抗体は、配列番号１０５に示すアミノ酸配列、若しくは、９８％若しくは９９％、それに同一なアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン；及び／又は、配列番号１０４に示すアミノ酸配列、若しくは、９０％、それに同一なアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む。
【００５３】
本明細書の一実施形態（２６）は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的には実施形態（１６）の、モノクローナル抗体又はその機能部分に関連し、前記第１の結合ドメインは、配列番号７３〜７５に示すＣＤＲを含み、前記第２の結合ドメインは、配列番号７０〜７２に示すＣＤＲを含む。
【００５４】
本明細書の一実施形態（２７）は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的には実施形態（１７）の、モノクローナル抗体又はその機能部分に関連し、前記第１の結合ドメインは、配列番号８１〜８３に示すＣＤＲを含み、前記第２の結合ドメインは、配列番号７８〜８０に示すＣＤＲを含む。
【００５５】
本明細書の一実施形態（２８）は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的には実施形態（１８）の、モノクローナル抗体又はその機能部分に関連し、前記第１の結合ドメインは、配列番号９３〜９５に示すＣＤＲを含み、前記第２の結合ドメインが配列番号８９〜９１に示すＣＤＲを含む。
【００５６】
本明細書の一実施形態（２９）は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的には実施形態（１９）の、モノクローナル抗体又はその機能部分に関連し、前記第１の結合ドメインは、配列番号１０１〜１０３に示すＣＤＲを含み、前記第２の結合ドメインが配列番号９８〜１００に示すＣＤＲを含む。
【００５７】
本明細書の一実施形態（３０）は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的には実施形態（１８）の、モノクローナル抗体又はその機能部分に関連し、前記第１の結合ドメインは、配列番号８９、１１５、及び９１に示すＣＤＲを含み、前記第２の結合ドメインは、配列番号１０６〜１０８に示すＣＤＲを含む。
【００５８】
さらに別の一実施形態（３１）では、本発明は、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分、具体的には上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチド又は抗体に関連し、結合ペプチド又は抗体は、哺乳動物、具体的にはヒトのタウタンパク質上又はその断片上のホスホエピトープ、具体的には、病態タンパク質タウコンフォーマーを認識しそれに特異的に結合するが、一実施形態では、対応する非リン酸化エピトープ及び／又は非関連エピトープには結合せず、前記結合ペプチド又は抗体は、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質に高い結合親和性を有し、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質のレベルを、インビボで、検出及び／又は調節することができ、前記結合ペプチド又は抗体は、
ａ．  配列番号６９に示すアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン、及び／若しくは、配列番号６８に示すアミノ酸配列を含む第２の結合ドメイン；又は、
ｂ．  配列番号７７に示すアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン、及び／若しくは、配列番号７６に示すアミノ酸配列を含む第２の結合ドメイン；又は、
ｃ．  配列番号１１６に示すアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン、及び／若しくは、配列番号８８に示すアミノ酸配列を含む第２の結合ドメイン；又は、
ｄ．  配列番号９２に示すアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン、及び／若しくは、配列番号８８に示すアミノ酸配列を含む第２の結合ドメイン；又は、
ｅ．  配列番号９７に示すアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン、及び／若しくは、配列番号９６に示すアミノ酸配列を含む第２の結合ドメイン；又は、
ｆ．  配列番号１０５に示すアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン、及び／若しくは、配列番号１０４に示すアミノ酸配列を含む第２の結合ドメイン；
ｇ．  配列番号１１８に示すアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン、及び／若しくは、配列番号８８に示すアミノ酸配列を含む第２の結合ドメイン、
を含む。
【００５９】
本発明の一実施形態（３２）では、上記実施形態のいずれかに記載の結合ペプチドは、抗体、具体的にはＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、又はＩｇＧ３アイソタイプの抗体、具体的には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体である。
【００６０】
本発明の一実施形態（３３）は、上記実施形態のいずれか一つに記載の結合ペプチドをコードするポリヌクレオチドに関連する。
【００６１】
一実施形態（３４）では、前記ポリヌクレオチドは：
ａ．  配列番号８４〜８７；配列番号１０９〜１１４、１１７、及び１１９に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｂ．  配列番号８４〜８７、配列番号１０９〜１１４、１１７、及び１１９に示す配列に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｃ．  配列番号８４〜８７、配列番号１０９〜１１４、１１７、及び１１９に示す配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｄ．  配列番号８４〜８７、配列番号１０９〜１１４、１１７、及び１１９に示す配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｅ．  配列番号８４〜８７、配列番号１０９〜１１４及び１１７、及び１１９に示す配列に対して、少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｆ．  配列番号８４〜８７、配列番号１０９〜１１４、１１７及び１１９に示す配列に対して、９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｇ．  相補ストランドが、ａ）〜ｆ）のいずれかの核酸分子とハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含む核酸；
ｈ．  ａ）〜ｇ）のいずれかおいて遺伝コードの縮重によって定義されるヌクレオチド配列から逸脱しているヌクレオチド配列を含む核酸分子：
からなる群から選択される核酸分子を含み、
ａ）〜ｈ）のいずれかに定義される前記核酸分子は、哺乳動物、具体的にはヒトのタウタンパク質上又はその断片上の、具体的には、リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含むタウ  ａａ  ３９３−４０１、リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含むタウ  ａａ  ３９６−４０１、リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含むタウ  ａａ  ３９４−４００、リン酸化Ｓｅｒを４０４番目の位置（ｐＳ４０４）に含むタウ  ａａ  ４０２−４０６、及びリン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含むタウ  ａａ  ３９３−４００からなる群から選択される、配列番号６７に示す、ヒトのタウタンパク質上の、ホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合し、一実施形態では、前記結合ペプチドは、高い結合親和性を有し、少なくとも１０ｎＭの、具体的には少なくとも８ｎＭの、具体的には少なくとも５ｎＭの、具体的には少なくとも２ｎＭの、具体的には少なくとも１ｎＭの、具体的には少なくとも５００ｐＭの、具体的には少なくとも４００ｐＭの、具体的には少なくとも３００ｐＭの、具体的には少なくとも２００ｐＭの、具体的には少なくとも１００ｐＭの、具体的には少なくとも５０ｐＭの解離定数を伴い、及び／又は、１０４Ｍ−１ｓ−１以上の、具体的には、３〜５×１０４Ｍ−１ｓ−１の間又はそれ以上の、具体的には１０５Ｍ−１ｓ−１以上の；具体的には６〜９×１０５Ｍ−１ｓ−１又はそれ以上の；具体的には１０６Ｍ−１ｓ−１以上の、具体的には１〜４×１０６Ｍ−１ｓ−１又はそれ以上の、具体的には１０７Ｍ−１ｓ−１以上の会合速度定数を有するが、しかし、一実施形態では、対応する非リン酸化エピトープ及び／又は非関連エピトープには結合しない。
【００６２】
本発明の多様な実施形態（３５）では、結合ペプチド若しくはその機能部分、具体的には抗体、具体的には前述の実施形態のいずれか一つのモノクローナル抗体若しくはその機能部分若しくはポリヌクレオチド、又はその組成物を提供し、それは、哺乳動物、具体的にはヒトのタウタンパク質上の、具体的には、神経原線維変化病、糸屑状構造物、及びジストロフィー性神経突起において支配的な構造である対らせん状フィラメント（ＰＨＦ）に存在するもの等の微小管随伴及び過剰リン酸化タンパク質タウ上のホスホエピトープを特異的に認識しそれに結合することができるが、しかし、一実施形態では、対応する非リン酸化エピトープ及び／又は非関連エピトープには結合しない。
【００６３】
本発明の特定の実施形態（３６）では、ヒトタウタンパク質は、配列番号６７に示すヒトタウタンパク質である。
【００６４】
上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド及び抗体は、従って、（３７）可溶性総タウタンパク質の、具体的には可溶性リン酸化タウタンパク質のレベルを、可溶性タウタンパク質及び／又は可溶性リン酸化タウタンパク質のレベルが増加した哺乳動物又はヒトの、脳、具体的には、大脳皮質及び／又は海馬において、減少させるのに使用することができる。
【００６５】
上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド及び抗体はまた、（３８）過剰リン酸化タウタンパク質（ｐタウ  ＰＨＦ）を含む対らせん状フィラメントのレベルを、前記ｐタウ対らせん状フィラメントのレベルが増加した哺乳動物又はヒトの脳において、具体的には大脳皮質及び／又は海馬において減少させるのに使用することができる。
【００６６】
総可溶性タウタンパク質及び／又は可溶性リン酸化タウタンパク質及び／又はｐタウ対らせん状フィラメントのレベルを、脳において、具体的には、前記哺乳動物又はヒトにおいてタウタンパク質随伴疾患、障害又は状態の原因となる前記タウタンパク質変異体のレベルが増加した哺乳動物又はヒトの脳において、具体的には、大脳皮質及び／又は海馬において、減少させることによって、そのようなタウタンパク質随伴疾患、障害又は状態を伴う症状の改善及び／又は軽減という結果が得られる可能性がある（３９）。
【００６７】
上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド及び抗体を、従って、（４０）タウタンパク質随伴疾患、障害、若しくは状態の進行を減速させる又は停止させる治療において、具体的にはヒトの治療において、使用することができる。
【００６８】
上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド及び抗体をさらに、（４１）例えば、論理的思考、状況判断、記憶容量、学習、特別なナビゲーション（special navigation）等を含む認知機能の欠陥又は喪失等のタウタンパク質随伴疾患、障害、又は状態を伴う症状を改善又は軽減する治療において、具体的にはヒトの治療おいて、使用することができる。
【００６９】
一実施形態（４２）では、本発明は、治療に使用する、具体的には、タウオパシー、すなわち一群のタウタンパク質随伴疾患及び障害を治療するのに、又はタウオパシーを伴う症状を軽減させるのに使用する、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド及び抗体に関連する。
【００７０】
一実施形態（４３）では、本発明は、タウオパシーを患う哺乳動物における認知記憶能力を保持又は増加させる、上記実施形態のいずれか一つに記載の結合ペプチド及び抗体に関連する。
【００７１】
本発明の別の具体的な実施形態（４４）では、配列番号７３〜７５，８１〜８３，９３〜９５，１０１〜１０３，１０６〜１０８に与えられる、抗体ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１；ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ２；ＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ１；ＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ２；ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１；ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ１；ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ２；ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３；の軽鎖ＣＤＲの少なくとも一つ又は全部、及び／又は、配列番号７０〜７２、７８〜８０、８９〜９１、９８〜１００、（８９、１１５、９１）に与えられる、抗体ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１；ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ２；ＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ１；ＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ２；ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１；ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ１；ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ２；ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３；の重鎖ＣＤＲの少なくとも一つ又は全部を含む結合ペプチド及び抗体を、例えば、論理的思考、状況判断、記憶容量、学習、特別なナビゲーション(special navigation)等を含む認知機能の欠陥又は喪失等のタウタンパク質随伴疾患、障害、又は状態を伴う症状を改善又は軽減させる治療において、具体的にはヒトの治療において使用する。
【００７２】
本発明の別の具体的な実施形態（４５）では、配列番号１０６〜１０８に与えられる、抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ２；ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３；の軽鎖ＣＤＲの少なくとも一つ又は全部、及び／又は、配列番号８９、１１５、及び９１に与えられる、抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ２；ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３；の重鎖ＣＤＲの少なくとも一つ又は全部を含む結合ペプチド及び抗体を、例えば、論理的思考、状況判断、記憶容量、学習、特別なナビゲーション等を含む認知機能の欠陥又は喪失等のタウタンパク質随伴疾患、障害、又は状態を伴う症状を改善又は軽減させる治療において、具体的にはヒトの治療において使用する。
【００７３】
上記実施形態のいずれか一つに記載した、ペプチド又は抗体の、脳上のタウタングル及びｐタウへの結合は、実施例に記載のとおり、選別された脳切片をそれぞれ、タンパク質免疫反応性試験に適用すること、及び脳ホモジネートをウェスタンブロット法に適用することにより定量してもよい。
【００７４】
別の実施形態（４６）では、本発明は、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド又はその機能部分、具体的には、抗体、具体的には、モノクローナル抗体若しくはその機能部分若しくはポリヌクレオチド、又はその組み合わせを、薬剤的に許容できる担体とともに治療有効量で含む薬剤組成物を提供する。
【００７５】
別の実施形態（４７）では、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド又はその機能部分、具体的には抗体、具体的には、モノクローナル抗体若しくはその機能部分若しくはポリヌクレオチド若しくは薬剤組成物、又はその組み合わせを、タウオパシー等の神経変性障害を含むタウタンパク質随伴疾患又は障害の症状を治療又は低減する治療において、具体的には、ヒトの治療において使用する。
【００７６】
上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド、抗体及び／又は薬剤組成物を、従って、（４８）タウタンパク質随伴疾患、障害又は状態の進行を減速させるまたは停止させるために、前記結合ペプチド、抗体及び／又は薬剤組成物を、そうした疾患又は状態を患う、動物、具体的には哺乳動物、具体的にはヒトに投与して、用いてもよい。
【００７７】
上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド、抗体及び／又は薬剤組成物はさらに、（４９）例えば、論理的思考、状況判断、記憶容量、学習、特別なナビゲーション等を含む認知機能の欠陥又は喪失等の、タウタンパク質随伴疾患、障害、又は状態を伴う症状を改善又は軽減するために、前記結合ペプチド、抗体及び／又は薬剤組成物を、そうした疾患又は状態を患う、動物、具体的には哺乳動物、具体的にはヒトに投与して、用いてもよい。
【００７８】
一実施形態（５０）では、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体若しくはその機能部分若しくはポリヌクレオチド若しくは薬剤組成物、又はそれらの組み合わせを、アルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤコブ病、パンチドランカー、ダウン症候群、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー症候群、封入体筋炎、及びプリオンタンパク質脳アミロイド血管症を含むが、これらには限定されない、タウ及びアミロイド両方の病態を発現する疾患又は障害を含む神経変性疾患又は障害と、外傷性脳損傷と、筋萎縮性側索硬化症／グアム島パーキンソン痴呆症候群、神経原線維変化病を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、嗜銀顆粒性認知症、大脳皮質基底核変性症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、ハラーフォルデン−シュパッツ病、多系統萎縮症、ニーマン−ピック病、Ｃ型、淡蒼球−橋脳−黒質退行変性、ピック病、進行性皮質下膠質症、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維型老年認知症、脳炎後パーキンソン症候群、及び筋強直性ジストロフィー含むが、これらには限定されない、明瞭なアミロイド病態を示さないさらなる疾患又は障害との、異種の群を含むタウオパシーにおける脳の主要な病態である、神経原線維病変の形成を原因とする又は伴う疾患及び障害の治療において使用する。
【００７９】
一実施形態（５１）では、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド若しくはその機能部分、具体的には抗体、具体的には、モノクローナル抗体若しくはその機能部分若しくはポリヌクレオチド若しくは薬剤組成物、又はそれらの組み合わせを、アルツハイマー病の治療において用いる。
【００８０】
本発明の一実施形態（５２）では、可溶性の及び／又はオリゴマーの及び／又は不溶性のリン酸化タウタンパク質のレベルを、具体的にはインビボで、具体的には動物の、具体的には哺乳動物又はヒトの、脳、具体的には大脳皮質及び／又は海馬において、検出及び／又は調節する方法を提供し、方法は、前記動物、具体的には前記哺乳動物又はヒトに、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド若しくはその機能部分、具体的には抗体、具体的には、モノクローナル抗体若しくはその機能部分若しくはポリヌクレオチド若しくは薬剤組成物、又はその組み合わせを投与することを含む。
【００８１】
一態様では、調節は、可溶性タウタンパク質の、具体的には可溶性リン酸化タウタンパク質のレベルを、可溶性タウタンパク質及び／又は可溶性リン酸化タウタンパク質の増加した動物の、具体的には、哺乳動物又はヒトの、脳、具体的には大脳皮質及び／又は海馬において、低減させることに関連する。
【００８２】
本発明の一実施形態（５３）では、不溶性タウタンパク質の、具体的には、過剰リン酸化タウタンパク質（ｐタウＰＨＦ）を含む対らせん状フィラメントのレベルを、不溶性タウタンパク質の増加した動物、具体的には、哺乳動物又はヒトの、脳、具体的には、大脳皮質及び／又は海馬において、低減する方法を提供し、方法は、前記動物、具体的には前記哺乳動物又はヒトに、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド若しくはその機能部分、具体的には抗体、具体的には、モノクローナル抗体若しくはその機能部分若しくはポリヌクレオチド若しくは薬剤組成物、又はそれらの組み合わせを投与することを含む。
【００８３】
一実施形態（５４）では、本発明は、タウタンパク質随伴疾患、障害又は状態を、動物において、具体的には哺乳動物又はヒトにおいて減速させる又は停止させる方法に関連し、方法は、そうした疾患又は状態を患う前記動物に、具体的には前記哺乳動物又はヒトに、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド若しくはその機能部分、具体的には抗体、具体的には、モノクローナル抗体若しくはその機能部分若しくはポリヌクレオチド若しくは薬剤組成物、又はそれらの組み合わせを投与することを含む。
【００８４】
一実施形態（５５）では、本発明は、例えば、論理的思考、状況判断、記憶容量、学習、特別なナビゲーション等を含む認知機能の欠陥又は喪失等の、タウタンパク質随伴疾患、障害、又は状態を伴う症状を、動物において、具体的には哺乳動物又はヒトにおいて、改善又は軽減する方法に関連し、方法は、そうした疾患又は状態を患う前記動物に、具体的には前記哺乳動物又はヒトに、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド若しくはその機能部分、具体的には抗体、具体的には、モノクローナル抗体若しくはその機能部分、若しくはポリヌクレオチド、若しくは又は薬剤組成物、又はそれらの組み合わせを投与することを含む。
【００８５】
一実施形態（５６）では、本発明はタウオパシーを患う哺乳動物における認知記憶能力を保持又は増加させる方法に関連する。
【００８６】
本発明のさらに別の実施形態（５７）では、タウオパシー等の神経変性疾患又は障害を含む、タウタンパク質随伴疾患又は障害を治療する方法を提供し、方法は、そうした疾患又は障害を患う動物に、具体的には哺乳動物に、しかし具体的にはヒトに、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド若しくはその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体若しくはその機能部分、若しくはポリヌクレオチド、若しくは薬剤組成物、又はそれらの組み合わせを投与することを含む。
【００８７】
本発明の一実施形態（５８）では、アルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤコブ病、パンチドランカー、ダウン症候群、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー症候群、封入体筋炎、及びプリオンタンパク質脳アミロイド血管症を含むがこれらには限定されない、タウ及びアミロイドの両方の病態の存在を示す疾患又は障害を含む神経変性疾患又は障害と、外傷性脳損傷と、筋萎縮性側索硬化症／グアム島パーキンソン痴呆症候群、神経原線維変化病を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、嗜銀顆粒性認知症、大脳皮質基底核変性症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、ハラーフォルデン−シュパッツ病、多系統萎縮症、ニーマン−ピック病、Ｃ型、淡蒼球−橋脳−黒質退行変性、ピック病、進行性皮質下膠質症、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維型老年認知症、脳炎後パーキンソン症候群、及び筋強直性ジストロフィー含むが、これらには限定されない、明瞭なアミロイド病態を示さないさらなる疾患又は障害と、の異種の群を含むタウオパシーにおける脳の主要な病態である、神経原線維病変の形成を原因とする又は伴う疾患及び障害を治療する方法を提供し、方法は、そうした疾患又は障害を患う動物に、具体的には哺乳動物に、しかし具体的にはヒトに、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド若しくはその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体若しくはその機能部分、若しくはポリヌクレオチド、若しくは薬剤組成物、又はそれらの組み合わせを投与することを含む。
【００８８】
本発明の別の実施形態（５９）では、タウオパシー等の神経変性障害を患う動物に、具体的には哺乳動物又はヒトに、受動免疫応答を、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド若しくはその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体若しくはその機能部分、若しくはポリヌクレオチド、若しくは薬剤組成物、又はそれらの組み合わせを前記動物又はヒトに投与することによって、誘導する方法を提供する。
【００８９】
本発明のさらに別の実施形態（６０）では、患者において、タウタンパク質随伴疾患、障害又は状態を診断する方法を提供し、方法は、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド又はその活性断片、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分の、タウタンパク質のエピトープへの免疫特異的結合を、試料において又はインサイチュで検出することを含み、
ａ．  タウタンパク質を含むことが疑われる、試料又は体の特定部分若しくは体の面積を、上記の請求項のいずれか一項に記載の、結合ペプチド又はその断片、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分に接触させる工程（前記結合ペプチド又は抗体又はその断片は、タウタンパク質のエピトープに結合する）；
ｂ．  前記結合ペプチド、具体的には前記抗体、具体的には前記モノクローナル抗体又はその機能部分をタウタンパク質に結合させて免疫複合体を形成させる工程；
ｃ．  免疫複合体の形成を検出する工程；及び
ｄ．  免疫複合体の存在又は非存在を、試料又は体の特定部分若しくは面積におけるタウ抗原の存在又は非存在に関連づける工程
を含む。
【００９０】
本発明のさらに別の実施形態（６１）では、患者において、タウタンパク質随伴疾患、障害又は状態の素因を診断する方法を提供し、方法は、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド又はその活性断片、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分の、タウタンパク質のエピトープへの免疫特異的結合を、試料において又はインサイチュで検出することを含み、
ａ．  タウ抗原を含むことが疑われる、試料又は体の特定部分若しくは体の面積を、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド又はその活性断片、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分に接触させる工程（結合ペプチド又はその断片は、タウタンパク質のエピトープに結合する）；
ｂ．  前記結合ペプチド、具体的には前記抗体、具体的には前記モノクローナル抗体又はその機能部分をタウ抗原に結合させて免疫複合体を形成させる工程；
ｃ．  免疫複合体の形成を検出する工程；及び
ｄ．  免疫複合体の存在又は非存在を、試料又は体の特定部分若しくは面積におけるタウ抗原の存在又は非存在と関連づる工程、
ｅ．  前記免疫複合体の量を対照正常値と比較する工程；
を含み、対照正常値と比較した前記凝集体の量の増加は、前記患者がタウタンパク関連疾患又は状態を患っている、又は発症するリスクのあることを示す。
【００９１】
本発明の一実施形態（６２）では、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド若しくはその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体若しくはその機能部分、若しくはポリヌクレオチド、又は薬剤組成物を用いた治療の後に、患者において、微小残存病変を監視する方法を提供し、方法は：
ａ．  タウ抗原を含むことが疑われる、試料又は体の特定部分若しくは面積を、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分に接触させること（結合ペプチド又はその断片は、タウタンパク質のエピトープに結合する）；
ｂ．  前記結合ペプチド、具体的には前記抗体、具体的には前記モノクローナル抗体又はその機能部分をタウ抗原に結合させて免疫複合体を形成させること；
ｃ．  免疫複合体の形成を検出すること；及び
ｄ．  免疫複合体の存在又は非存在を、試料又は体の特定部分若しくは面積におけるタウ抗原の存在又は非存在と関連づけること、
ｅ．  前記免疫複合体の量を対照正常値と比較すること；
を含み、対照正常値と比較した前記凝集体の量の増加は、前記患者が依然として微小残存病変を患っていることを示す。
【００９２】
一実施形態（６３）では、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分、又はポリヌクレオチド、又は薬剤組成物を用いて治療されている患者の反応性を予測する方法が提供され、方法は、
ａ．  タウ抗原を含むことが疑われる、試料又は体の特定部分若しくは体の面積を、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド又はその活性断片、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分に接触させること（前記結合ペプチド又はその断片は、タウタンパク質のエピトープに結合する）；
ｂ．  前記結合ペプチド、具体的には前記抗体、具体的には前記モノクローナル抗体又はその機能部分をタウ抗原に結合させて免疫複合体を形成させ；
ｃ．  免疫複合体の形成を検出すること；及び
ｄ．  免疫複合体の存在又は非存在を、試料又は体の特定部分若しくは面積におけるタウ抗原の存在又は非存在と関連づけること、
ｅ．  前記免疫複合体の量を治療開始の前後で比較すること；
を含み、前記免疫複合体の量の減少が、前記患者が有する治療応答性の潜在能力が高いことを示す。
【００９３】
抗タウ抗体及びその断片を、本発明の上述の方法において用いていもよい。上述の方法では、抗体又はその断片を含む試料を、固体支持体に付着させた抗タウ抗体又はその断片と試料を接触させることにより免疫濃縮し、試料中のタウタンパク質の濃度を増加させてもよい。
【００９４】
工程(a)に先立って、試料を、固体支持体に付着させた抗タウ抗体又はその断片と試料を接触させることにより免疫濃縮し、試料中のタウタンパク質の濃度を増加させてもよい。
【００９５】
別の実施形態（６４）では、本発明は、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド又はその活性断片、具体的には抗体、具体的には、モノクローナル抗体又はその機能部分を含む、タウタンパク質随伴疾患、障害、又は状態を検出及び診断する試験キットに関連する。
【００９６】
一実施形態（６５）では、前記試験キットは、上記実施形態のいずれか一つに記載の、一つ又は複数の結合ペプチド又はその活性断片、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分を入れた容器と、タウ抗原を結合させて免疫複合体を形成させ、免疫複合体の存在又は非存在をタウ抗原の存在又は非存在に関連づけるように複合体の形成を検出する目的で結合ペプチド又は抗体を使用するための指示書とを含む。
【００９７】
さらに別の実施形態（６６）では、本発明は、リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含むタウ  ａａ  ３９３−４０１、リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含むタウ  ａａ  ３９６−４０１、リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含むタウ  ａａ  ３９４−４００、リン酸化Ｓｅｒを４０４番目の位置（ｐＳ４０４）に含むタウ  ａａ  ４０２−４０６、及びリン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含むタウ  ａａ  ３９３−４００、からなる群から選択される、配列番号６７に示す、哺乳動物の、具体的にはヒトのタウタンパク質上のエピトープに関連する。
【００９８】
一実施形態（６７）では、前記エピトープは、リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含む、タウ  ａａ  ３９３−４０１からなる。
【００９９】
一実施形態（６８）では、前記エピトープは、リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含む、タウ  ａａ  ３９６−４０１からなる。
【０１００】
一実施形態（６９）では、前記エピトープは、リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含む、タウ  ａａ  ３９４−４００からなる。
【０１０１】
一実施形態（７０）では、前記エピトープは、リン酸化Ｓｅｒを４０４番目の位置（ｐＳ４０４）に含む、タウ  ａａ  ４０２−４０６からなる。
【０１０２】
一実施形態（７１）では、前記エピトープは、リン酸化Ｓｅｒを３９６番目の位置（ｐＳ３９６）に含む、タウ  ａａ  ３９３−４００からなる。
【０１０３】
別の実施形態（７２）では、本発明は、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド又はその活性断片、具体的には抗体、具体的には、モノクローナル抗体又はその機能部分を産生する細胞株に関連する。
【０１０４】
一実施形態（７３）では、本発明は、ＤＳＭ  ＡＣＣ３１３６として２０１１年８月３０日に寄託されたハイブリドーマ細胞株Ａ４−４Ａ６−４８である細胞株に関連する。
【０１０５】
一実施形態（７４）では、本発明は、ＤＳＭ  ＡＣＣ３１３７として２０１１年８月３０日に寄託されたハイブリドーマ細胞株Ａ６−２Ｇ５−３０である細胞株に関連する。
【０１０６】
一実施形態（７５）では、本発明は、ＤＳＭ  ＡＣＣ３１３８として２０１１年８月３０日に寄託されたハイブリドーマ細胞株Ａ６−２Ｇ５−４１である細胞株に関連する。
【０１０７】
一実施形態（７６）では、本発明は、ＤＳＭ  ＡＣＣ３１３９として２０１１年８月３０日に寄託されたハイブリドーマ細胞株Ａ４−２Ａ１−１８である細胞株に関連する。
【０１０８】
一実施形態（７７）では、本発明は、ＤＳＭ  ＡＣＣ３１４０として２０１１年８月３０日に寄託されたハイブリドーマ細胞株Ａ４−２Ａ１−４０である細胞株に関連する。
【０１０９】
一実施形態（７８）では、本発明は、ＤＳＭ  ＡＣＣ３１４１として２０１１年９月６日に寄託されたハイブリドーマ細胞株Ａ６−１Ｄ２−１２である細胞株に関連する。
【０１１０】
一実施形態（７９）では、本発明は、軽鎖（ＶＬ）及び／又は重鎖（ＶＨ）ドメインを含む、モノクローナル抗体又はその機能部分に関連し、モノクローナル抗体又はその機能部分は、２０１１年８月３０日にＤＳＭ  ＡＣＣ３１３９として寄託されたハイブリドーマ細胞株Ａ４−２Ａ１−１８のＤＮＡを
ａ．  第１の結合ドメインを増幅する、配列番号１４９の５’プライマー及び配列番号５１の３’プライマーを含むプライマー対；並びに／又は
ｂ．  第２の結合ドメインを増幅する、配列番号１２０、１２３、１２４、１３６、１３７、１３８、１３９、及び１４０からなる群から選択される５’プライマー、及び、配列番号１３１、１３４、及び１４１〜１４８からなる群から選択される３’プライマーを含むプライマーの混合物、
を用いてＰＣＲ増幅により得ることができるヌクレオチド断片上に位置するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１１１】
一実施形態（８０）では、本発明は、軽鎖（ＶＬ）及び／又は重鎖（ＶＨ）ドメインを含むモノクローナル抗体又はその機能部分に関連し、モノクローナル抗体又はその機能部分は、２０１１年８月３０日にＤＳＭ  ＡＣＣ３１３７として寄託されたハイブリドーマ細胞株Ａ６−２Ｇ５−３０のＤＮＡを、
ａ．  第１の結合ドメインを増幅する、配列番号５１及び１６９〜１７４からなる群から選択される５’プライマー、及び配列番号５１の３’プライマーを含むプライマーの混合物；並びに／又は
ｂ．  第２の結合ドメインを増幅する、配列番号１２４、１２７、及び１５０〜１５８からなる群から選択される５’プライマー、及び、配列番号１３０、及び１５９〜１６８からなる群から選択される３’プライマーを含むプライマーの混合物、
を用いてＰＣＲ増幅により得ることができるヌクレオチド断片上に位置するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１１２】
一実施形態（８１）では、本発明は、軽鎖（ＶＬ）及び／又は重鎖（ＶＨ）ドメインを含むモノクローナル抗体又はその機能部分に関連し、モノクローナル抗体又はその機能部分は、２０１１年８月３０日にＤＳＭ  ＡＣＣ３１４０として寄託されたハイブリドーマ細胞株Ａ４−２Ａ１−４０のＤＮＡを
ａ．  第１の結合ドメインを増幅する、配列番号１７８、１７９、及び１８０からなる群から選択される５’プライマー、及び配列番号５１の３’プライマーを含むプライマーの混合物；並びに／又は
ｂ．  第２の結合ドメインを増幅する、配列番号１２１、１２７、１３９、１５４、１５５、及び１７５からなる群から選択される５’プライマー、及び配列番号１２８、１２９、１４７、１７６、及び１７７からなる群から選択される３’プライマーを含むプライマーの混合物、
を用いてＰＣＲ増幅により得ることができるヌクレオチド断片上に位置するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１１３】
一実施形態（８２）では、本発明は、軽鎖（ＶＬ）及び／又は重鎖（ＶＨ）ドメインを含むモノクローナル抗体又はその機能部分に関連し、モノクローナル抗体又はその機能部分は、２０１１年８月３０日にＤＳＭ  ＡＣＣ３１３８として寄託されたハイブリドーマ細胞株Ａ６−２Ｇ５−４１のＤＮＡを、
ａ．  第１の結合ドメインを増幅する、配列番号５１、及び１８８〜１９２からなる群から選択される５’プライマー、及び配列番号５１の３’プライマーを含むプライマーの混合物；並びに／又は、
ｂ．  第２の結合ドメインを増幅する、配列番号１２０、１２４、１２６、１８１、１８２、及び１８３からなる群から選択される５’プライマー、及び配列番号１４４、１４５、及び１８４〜１８７からなる群から選択される３’プライマーを含むプライマーの混合物、
を用いてＰＣＲ増幅により得ることができるヌクレオチド断片上に位置するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１１４】
一実施形態（８３）では、本発明は、軽鎖（ＶＬ）及び／又は重鎖（ＶＨ）ドメインを含むモノクローナル抗体又はその機能部分に関連し、モノクローナル抗体又はその機能部分は、２０１１年８月３０日にＤＳＭ  ＡＣＣ３１３６として寄託されたハイブリドーマ細胞株Ａ４−４Ａ６−４８のＤＮＡを、
ａ．  第１の結合ドメインを増幅する、配列番号５０、及び２０１〜２０４からなる群から選択される５’プライマー、及び配列番号５１の３’プライマーを含むプライマーの混合物；並びに／又は
ｂ．  第２の結合ドメインを増幅する、配列番号１２１、１３７、１５１、及び１９３〜１９７からなる群から選択される５’プライマー、及び配列番号１３１、１４１、１４４、１６６、１９８、１９９、及び２００からなる群から選択される３’プライマーを含むプライマー混合物、
を用いてＰＣＲ増幅により得ることができるヌクレオチド断片上に位置するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１１５】
一実施形態（８４）では、本発明は、軽鎖（ＶＬ）及び／又は重鎖（ＶＨ）ドメインを含むモノクローナル抗体又はその機能部分に関連し、２０１１年9月６日にＤＳＭ  ＡＣＣ３１４１として寄託されたハイブリドーマ細胞株Ａ６−１Ｄ２−１２のＤＮＡを、
ａ．  第１の結合ドメインを増幅する、配列番号２０９〜２１４、及び２１９〜２２１からなる群から選択される５’プライマー、及び配列番号２１５の３’プライマーを含むプライマー混合物；並びに／又は
ｂ．  第２の結合ドメインを増幅する、配列番号２１６，２１７、及び２１８からなる群から選択される５’プライマー、及び、配列番号２０８からなる群から選択される３’プライマーを含むプライマー混合物、
を用いてＰＣＲ増幅により得ることができるヌクレオチド断片上に位置するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１１６】
一実施形態（８５）では、上記実施形態のいずれか一つに記載の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ラクダ科動物抗体、二価抗体、又は修飾若しくは改変抗体であってもよい。
【０１１７】
一実施形態（８６）では、本発明は、上記実施形態のいずれか一つに記載の結合ペプチド又は抗体を産生する方法を提供し、方法は、上記実施形態のいずれかに記載の細胞株を適切な培地で培養し、随意に、結合ペプチド又は抗体を細胞株又は培地から精製する工程を含む。
【０１１８】
他の実施形態（８７）において、本発明は、脳試料中にホスホタウ（ｐタウ）マルチマーを検出する方法を提供し、方法は：
a.  試料を、上記請求項のいずれか一つに記載の抗体又はその断片に接触させること（ペプチド又はその断片が、ホスホタウタンパク質のエピトープに結合する）;
b.  抗体をタウタンパク質に結合させて免疫複合体を形成させること;
c.  免疫複合体の形成を、具体的にはＥＬＩＳＡアッセイを適用して検出することを含む。
【０１１９】
具体的には、本発明は、特定の実施形態（８８）において、タウ随伴疾患又は障害を患っていることが疑われる対象から、及び健康な対照対象から得られた脳ホモジネート中のホスホタウ（ｐタウ)マルチマーを死後検出する方法に関連し、方法は:
a.  両対象の脳ホモジネートを、上記請求項のいずれか一つに記載の抗体又はその断片に接触させること（ペプチド又はその断片が、ホスホタウタンパク質のエピトープに結合する）;
b.  抗体をタウタンパク質に結合させて免疫複合体を形成させること；
ｃ．  免疫複合体の形成を、具体的にはＥＬＩＳＡアッセイを適用して検出すること、及び
d.  タウ随伴疾患を患っていることが疑われる対象から得られた試料中の免疫複合体の量又は強度を、対照試料のそれと比較することを含み、
対照値と比較した前記免疫複合体の量又は強度の増加は、前記患者が微小残存病変を患っていたことを示す。
【０１２０】
一実施形態（８９）では、対照試料と比較した、試験試料に観察される増加は、３０％と５０％の間、具体的には３５％と４５％の間である。
【０１２１】
一実施形態（９０）では、本発明は、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド若しくはタンパク質又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分を提供し、抗体又は断片は、好都合なｐＫプロファイルを示す。具体的には、前記抗体又は断片は、投与後１０日まで高い血清濃度を有し、このことは、前記抗体を治療抗体として使用することを好都合に裏付ける薬物動態（ＰＫ）プロファイルを示すものである(Deng et al., Expert Opin Drug Metab Toxicol, 2012, 8(2) 141-60; Putman et al., Trends Biotech, 2010 (28) 509-516 ; Bai, S. Clin Pharmacokinet 2012;  51 (2): 119-135。 
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１（左パネル）、ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３（中パネル）、及び対照抗体（ＨＴ７；右パネル）により、対照及びＡＤ対象からのヒト脳ホモジネート中に、リン酸化タウマルチマーを検出した結果を示す。
【図２Ａ】総タウ、及びｐタウを、市販の抗体によりヒト脳ホモジネート中に検出した結果を、（２Ａ及び２Ｂ）に示す。
【図２Ｂ】同上。
【図３Ａ】ホスホタウを、ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１（Ａ）、ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１（Ｂ）、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３（Ｃ）によりヒト脳ホモジネート中に検出した結果を、（３Ａ、３Ｂ、３Ｃ）に示す。
【図３Ｂ】同上。
【図３Ｃ】同上。
【図４Ａ】タウ−ｐＳ３９６を、ヒトＡＤ及び対照（Ｃｔｒｌ）の脳中に、ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１（Ａ）、ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１（Ｂ）、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３（Ｃ）の抗体により、ＡｌｐｈａＬＩＳＡを用いて検出した結果を、（４Ａ，４Ｂ，４Ｃ）に示す。マン・ホイットニーの検定により、＊＊＊＊は、p＜０．０００１、＊＊は、ｐ＜０．０１である。
【図４Ｂ】同上。
【図４Ｃ】同上。
【図５Ａ】ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３を用いてタウトランスジェニックマウスを治療した後の、扁桃体（Ａ）及び海馬（Ｂ）におけるタウ−ｐＴ２３１（ＡＴ１８０）のＩＨＣ染色を、（５Ａ及び５Ｂ）に示す。
【図５Ｂ】同上。
【図６Ａ】ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３を用いてタウトランスジェニックマウスを治療した後の、扁桃体（Ａ）及び海馬（Ｂ）における総タウ（ＨＴ７）のＩＨＣ染色を、（６Ａ及び６Ｂ）に示す。
【図６Ｂ】同上。
【図７】異なるＧＳＫ３β条件、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３抗体を用いてブロットしたメンブレンを用いて生成したタウ−ｐＳ３９６についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図８】ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３−ＢＴ、及びタウ−１３抗体を用いた特異的ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイのセットアップ示す。
【図９】タウ−ｐＳ３９６を、一人のＡＤドナーから得られたヒトＳ１脳画分に検出したこと；ＩＰ及び非ＩＰ試料により濃縮された試料から得られたシグナルの比較を示す。
【図１０】タウ−ｐＳ３９６を、ヒトＡＤ及び対照（Ｃｔｒｌ）ＣＳＦ中に、ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３抗体によりＩＰを用いて検出した後のＡｌｐｈａＬＩＳＡの結果を示す。マン・ホイットニーの検定により＊＊＊は、ｐ＝０．０００３である。
【０１２３】
配列
配列番号４６〜５７は、ＶＨ／ＶＫ順方向及び逆方向プライマーのヌクレオチド配列を表す。
配列番号６２は、タウ抗原、ペプチドＴ３のアミノ酸配列を表す（表１を見られたい）。
配列番号６７は、タウ４０とも称される、ヒトタウの最長のアイソフォーム（４４１  ａａ）のアミノ酸配列を表す。
配列番号６８は、ハイブリドーマ細胞株Ａ４−４Ａ６−１８により産生されるモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ１の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列を表す。
配列番号６９は、ハイブリドーマ細胞株Ａ４−４Ａ６−１８により産生されるモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ１の軽鎖可変領域（ＶＫ）のアミノ酸配列を表す。
配列番号７０は、モノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ１の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１のアミノ酸配列を表す。
配列番号７１は、モノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ１の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ２のアミノ酸配列を表す。
配列番号７２は、モノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ１の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ３のアミノ酸配列を表す。
配列番号７３は、モノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ１の軽鎖可変領域（ＶＫ）のＣＤＲ１のアミノ酸配列を表す。
配列番号７４は、モノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ１の軽鎖可変領域（ＶＫ）のＣＤＲ２のアミノ酸配列を表す。
配列番号７５は、モノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ１の軽鎖可変領域（ＶＫ）のＣＤＲ３のアミノ酸配列を表す。
配列番号７６は、ハイブリドーマ細胞株Ａ６−１Ｄ２−１２により産生されるモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列を表す。
配列番号７７は、ハイブリドーマ細胞株Ａ６−１Ｄ２−１２により産生されるモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１の軽鎖可変領域（ＶＫ）のアミノ酸配列を表す。
配列番号７８は、モノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１のアミノ酸配列を表す。
配列番号７９は、モノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ２のアミノ酸配列を表す。
配列番号８０は、モノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ３のアミノ酸配列を表す。
配列番号８１は、モノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１の軽鎖可変領域（ＶＫ）のＣＤＲ１のアミノ酸配列を表す。
配列番号８２は、モノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１の軽鎖可変領域（ＶＫ）のＣＤＲ２のアミノ酸配列を表す。
配列番号８３は、モノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１の軽鎖可変領域（ＶＫ）のＣＤＲ３のアミノ酸配列を表す。
配列番号８４は、ハイブリドーマ細胞株Ａ４−４Ａ６−１８により産生されるモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ１の重鎖可変領域（ＶＨ）のヌクレオチド配列を表す。
配列番号８５は、ハイブリドーマ細胞株Ａ４−４Ａ６−１８により産生されるモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ１の軽鎖可変領域（ＶＫ）のヌクレオチド配列を表す。
配列番号８６は、ハイブリドーマ細胞株Ａ６−１Ｄ２−１２により産生されるモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１の重鎖可変領域（ＶＨ）のヌクレオチド配列を表す。
配列番号８７は、ハイブリドーマ細胞株Ａ６−１Ｄ２−１２により産生されるモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１の軽鎖可変領域（ＶＫ）のヌクレオチド配列を表す。
配列番号８８は、それぞれハイブリドーマ細胞株Ａ４−２Ａ１−１８、Ａ４−２Ａ１−４０、及びＡ４−４Ａ６−４８により産生される、それぞれモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１、ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ２、及びＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ２の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列を表す。
配列番号８９は、それぞれモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１、ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ２、ＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ２、ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−ＡＢ２、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−ＡＢ３の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１のアミノ酸配列を表す。
配列番号９０は、それぞれモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１、ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ２、及びＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ２の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ２のアミノ酸配列を表す。
配列番号９１は、それぞれモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１、ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ２、ＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ２、ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−ＡＢ２、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−ＡＢ３の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ３のアミノ酸配列を表す。
配列番号９２は、ハイブリドーマ細胞株Ａ４−２Ａ１−４０により産生されるモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ２の軽鎖可変領域（ＶＫ）のアミノ酸配列を表す。
配列番号９３は、モノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ２の軽鎖可変領域（ＶＫ）のＣＤＲ１のアミノ酸配列を表す。
配列番号９４は、モノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ２の軽鎖可変領域（ＶＫ）のＣＤＲ２のアミノ酸配列を表す。
配列番号９５は、モノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ２の軽鎖可変領域（ＶＫ）のＣＤＲ３のアミノ酸配列を表す。
配列番号９６は、ハイブリドーマ細胞株Ａ６−２Ｇ５−０８により産生されるモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ１の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列を表す。
配列番号９７は、ハイブリドーマ細胞株Ａ６−２Ｇ５−０８により産生されるモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ１の軽鎖可変領域（ＶＫ）のアミノ酸配列を表す。
配列番号９８は、モノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ１の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１のアミノ酸配列を表す。
配列番号９９は、モノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ１の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ２のアミノ酸配列を表す。
配列番号１００は、モノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ１の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ３のアミノ酸配列を表す。
配列番号１０１は、モノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ１の軽鎖可変領域（ＶＫ）のＣＤＲ１のアミノ酸配列を表す。
配列番号１０２は、モノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ１の軽鎖可変領域（ＶＫ）のＣＤＲ２のアミノ酸配列を表す。
配列番号１０３は、モノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ１の軽鎖可変領域（ＶＫ）のＣＤＲ３のアミノ酸配列を表す。
配列番号１０４は、それぞれハイブリドーマ細胞株Ａ６−２Ｇ５−３０、及びＡ６−２Ｇ５−４１により産生される、それぞれモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−ＡＢ２、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−ＡＢ３の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１０５は、それぞれハイブリドーマ細胞株Ａ６−２Ｇ５−３０、及びＡ６−２Ｇ５−４１により産生される、それぞれモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−ＡＢ２、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−ＡＢ３の軽鎖可変領域（ＶＫ）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１０６は、それぞれモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−ＡＢ２、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−ＡＢ３の軽鎖可変領域（ＶＫ）のＣＤＲ１のアミノ酸配列を表す。
配列番号１０７は、それぞれモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−ＡＢ２、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−ＡＢ３の軽鎖可変領域（ＶＫ）のＣＤＲ２のアミノ酸配列を表す。
配列番号１０８は、それぞれモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−ＡＢ２、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−ＡＢ３の軽鎖可変領域（ＶＫ）のＣＤＲ３のアミノ酸配列を表す。
配列番号１０９は、それぞれハイブリドーマ細胞株Ａ４−２Ａ１−１８、Ａ４−２Ａ１−４０、及びＡ４−４Ａ６−４８により産生される、それぞれモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１、ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ２、及びＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ２の重鎖可変領域（ＶＨ）のヌクレオチド配列を表す。
配列番号１１０は、ハイブリドーマ細胞株Ａ４−２Ａ１−４０により産生されるモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ２の軽鎖可変領域（ＶＫ）のヌクレオチド配列を表す。
配列番号１１１は、ハイブリドーマ細胞株Ａ６−２Ｇ５−０８により産生されるモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−ＡＢ１の重鎖可変領域（ＶＨ）のヌクレオチド配列を表す。
配列番号１１２は、ハイブリドーマ細胞株Ａ６−２Ｇ５−０８により産生されるモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−ＡＢ１の軽鎖可変領域（ＶＫ）のヌクレオチド配列を表す。
配列番号１１３は、それぞれハイブリドーマ細胞株Ａ６−２Ｇ５−３０、及びＡ６−２Ｇ５−４１により産生される、それぞれモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−ＡＢ２、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−ＡＢ３の重鎖可変領域（ＶＨ）のヌクレオチド配列を表す。
配列番号１１４は、それぞれハイブリドーマ細胞株Ａ６−２Ｇ５−３０、及びＡ６−２Ｇ５−４１により産生される、それぞれモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−ＡＢ２、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−ＡＢ３の軽鎖可変領域（ＶＫ）のヌクレオチド配列を表す。
配列番号１１５は、モノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−ＡＢ２、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−ＡＢ３の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ２のアミノ酸配列を表す。
配列番号１１６は、ハイブリドーマ細胞株Ａ４−２Ａ１−１８により産生されるモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１の軽鎖可変領域（ＶＫ）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１１７は、ハイブリドーマ細胞株Ａ４−２Ａ１−１８により産生されるモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１の軽鎖可変領域（ＶＫ）のヌクレオチド配列を表す。
配列番号１１８は、ハイブリドーマ細胞株Ａ４−４Ａ６−４８により産生されるモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ２の軽鎖可変領域（ＶＫ）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１１９は、ハイブリドーマ細胞株Ａ４−４Ａ６−４８により産生されるモノクローナル抗体ＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ２の軽鎖可変領域（ＶＫ）のヌクレオチド配列を表す。
配列番号１２０〜２２１は、ＶＨ／ＶＫ順方向及び逆方向プライマーのヌクレオチド配列を表す。
【０１２４】
用語の定義
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書で使用されるとおり、交換可能であり、ペプチド結合により連結されるアミノ酸から構成される生体分子を意味するように定義される。
【０１２５】
「ペプチド」、又は「結合ペプチド」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、一つのアミノ酸のアルファ炭素のカルボキシル基と、もう一つのアミノ酸のアルファ炭素のアミノ基との間の縮合反応により形成されるペプチド結合を介してアルファ炭素が連結するアミノ酸（典型的にはＬ−アミノ酸）鎖をさす。鎖の一方の端（すなわち、アミノ末端）での末端アミノ酸が、遊離アミノ基を有する一方、鎖のもう一方の端（すなわちカルボキシ末端）での末端アミノ酸が、遊離カルボキシル基を有する。従って、「アミノ末端」（省略してＮ−末端）という用語は、ペプチドのアミノ末端でのアミノ基酸の遊離アルファアミノ基を、又はペプチド内での他の任意の場所にあるアミノ酸のアルファアミノ基（ペプチド結合に関与している場合にはイミノ基）をさす。同様に「カルボキシ末端」（省略してＣ−末端）という用語は、ペプチドのカルボキシ末端でのアミノ酸上の遊離カルボキシル基を、又はペプチド内の他の任意の場所にあるアミノ酸のカルボキシル基をさす。結合ペプチドは、本明細書に定義される、ポリクローナル若しくはモノクローナル抗体、ヒト若しくはヒト化抗体、二重特異性抗体、ラクダ化動物抗体等、又はその機能部分、等の抗体を構成することもある。
【０１２６】
ペプチドに関する文脈において本明細書で使用される、「その断片」又は「断片」という用語は、本明細書に定義される完全なペプチドと実質的に同一の（生物学的）活性を有する機能性ペプチド断片をさす。抗体に関する文脈において本明細書で使用される場合、これらの用語は、完全抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む完全抗体の部分を含む抗体断片をさす。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；二価抗体；単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子等の単鎖抗体分子；及び二重特異性及び多重特異性抗体、並びに／または抗体断片が挙げられる。
【０１２７】
典型的には、ペプチドを構成するアミノ酸は、ぺプチドのアミノ末端に始まり、カルボキシ末端に向けて増加する順番に番号付けされる。従って、一つのアミノ酸が、他のもの「の後に続く(follow)」と言われる場合には、そのアミノ酸は、前にあるアミノ酸よりも、ペプチドのカルボキシ末端にさらに近接する位置にある。
【０１２８】
「残基」という用語は、本明細書では、アミド結合によりペプチドに組み込まれたアミノ酸をさすのに用いられる。従って、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であることもあり、又は、他に制限されない限り、天然に存在するアミノ酸と類似の形で機能する、天然アミノ酸の類似体（すなわち、アミノ酸模倣体）を包含することもある。さらに、アミド結合模倣体には、当業者に周知のペプチド骨格修飾体が挙げられる。
【０１２９】
「〜から実質的になる」という表現は、本明細書では、その表現がさし示すペプチドの基本的な性質を実質的に変更する可能性のあるいかなる要素も排除するために使用される。従って、「〜から実質的になる」というペプチドに関する記述は、そのペプチドの生物活性を実質的に変更する可能性のあるいかなるアミノ酸置換体、付加体、又は欠失体も排除する。
【０１３０】
さらに、当業者は、上述したように、コードされた配列中の単一アミノ酸、又は複数アミノ酸の少数パーセント割合（典型的には５％未満、より典型的には１％未満）を変更、付加、又は欠失する、個々の置換体、欠失体、又は付加体が、保存的に修飾された変異体であり、それらの変異体では変更の結果として、化学的に同様なアミノ酸によるアミノ酸の置換が起きることを理解するであろう。機能的に同様なアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当業者に周知である。以下の６個の群はそれぞれ、互いに保存的置換体となるアミノ酸を含んでいる：
１）  アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）  アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）  アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）  アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）  イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び
６）  フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【０１３１】
「単離された」又は「生物学的に純粋な」という表現は、自然状態で正常見られる場合には付随する構成成分を、本質的に又は実質的に含まない物質をさす。従って、本明細書に記載されるペプチドは、インサイチュ環境では正常伴う物質を含まない。典型的には、本明細書に記載された、単離された、免疫原生ペプチドは、銀染色ゲル上のバンド強度により測定して、少なくとも約８０％純粋、正常少なくとも約９０％、そして好ましくは少なくとも約９５％である。
【０１３２】
タンパク質純度又は均質性は、タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動等の、当業者に周知の多くの方法を用いた後、染色時の可視化により表示してもよい。特定の目的のためには、高分解能が必要となるので、ＨＰＬＣ又は精製を行う同様な手段が使用されるであろう。
【０１３３】
免疫原性ペプチドは、その長さが比較的短い（すなわち、約５０個未満のアミノ酸）場合には、標準的な化学的ペプチド合成技術により合成されることが多い。
【０１３４】
固相合成法は、配列のＣ−末端アミノ酸を不溶性の支持体に付着させた後、順次、配列の残りのアミノ酸を連続して付加させるものであり、本明細書に記載の免疫原性ペプチドを化学合成する好ましい方法である。固相合成する技術は、当業者には既知である。
【０１３５】
代わりに、本明細書に記載の免疫原性ペプチドは、組み換え核酸技術を用いて合成される。これは一般的に、ペプチドをコードする核酸配列を創生し、特定のプロモータの制御下で発現カセット中に核酸を配置し、宿主中にペプチドを発現させ、発現したペプチド又はポリペプチドを単離し、もし必要であれば、ペプチドを再生することを含んでいる。そうした手順を通じて当業者を指導するのに充分な技術は、文献に見出される。
【０１３６】
組み換えペプチドは、いったん発現すると、硫酸アンモニウム沈殿法、アフィ二ティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等の標準的な手順番に従って精製することができる。約５０％から９５％の均質性の、実質的に純粋な組成物が好ましく、治療剤として使用するには８０％から９５％又はそれ以上の均質性が非常に好ましい。
【０１３７】
当業者は、化学合成、生物学的発現、又は精製の後、免疫原性ペプチドが、構成ペプチドの本来の立体構造とは実質的に異なる立体構造を有することもあるのを理解するであろう。この場合にはしばしば、抗増殖ペプチドを変性させ還元した後、好ましい立体構造へのリフォールディングをこのペプチドに生じさせる必要がある。たんぱく質の還元、変性、及びリフォールディング誘導の方法は、当業者には周知である。
【０１３８】
精製タンパク質の抗原性は、例えば、免疫血清、又はタンパク質それ自体に対して産生した抗血清との反応を実証することによって確認してもよい。
【０１３９】
本明細書で使用される、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という用語は、文脈が不適切でない限り、「一つ又は複数」を意味し複数を含んでいると定義される。
【０１４０】
本明細書で使用される、「検出する」、又は「検出される」という用語は、免疫化学的又は組織学的方法等、生物分子を検出する既知の技術を使用することを意味し、調べている生物分子の存在又は濃度を定性的又は定量的に決定することをさす。
【０１４１】
「単離される」は、天然には共存している少なくとも幾つかの構成成分を含まない生物分子を意図している。
【０１４２】
本明細書で使用される、「抗体」若しくは「抗体（複数）」又は「その機能部分」という用語は、当技術分野で認められている用語であり、既知の抗原、具体的には、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリンの免疫学的に活性な部分に結合する、分子又は分子の活性断片、すなわち抗原に免疫特異的に結合する結合部位を含む分子をさすものと理解される。本発明の免疫グロブリンは、（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）のいずれかのタイプ、若しくは（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）のクラス、又は免疫グロブリン分子のサブクラスであってもよい。
【０１４３】
本発明の範囲では「抗体」には、モノクローナル抗体、ポリクローナル、キメラの、単鎖の、二重特異性の、サル化、ヒト及びヒト化抗体、ラクダ科動物抗体、二価抗体、並びにその機能部分又は活性断片が挙げられる。既知の抗原に結合する分子の活性断片の例は、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片を含み、Ｆａｂ免疫グロブリン発現ライブラリーの産生物、並びに上述の抗体及び断片のいずれかのエピトープ結合断片が挙げられる。
【０１４４】
これらの活性断片は、多数の技術による本発明の抗体に由来してもよい。例えば、精製されたモノクローナル抗体は、ペプシン等の酵素で開裂させて、ＨＰＬＣゲルろ過に付すことができる。Ｆａｂ断片を含む適切な画分はその後、メンブレンろ過法等により集めて濃縮することができる。抗体の活性断片を単離する一般的な技術のさらなる記載については、例えば、Khaw, B. A. et al. J. Nucl. Med. 23:1011-1019 (1982); Rousseaux et al. Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, (1986)を見られたい。
【０１４５】
「ヒト化抗体」とは、改変抗体のタイプであって、そのＣＤＲは、非ヒトであるドナーの免疫グロブリンに由来し、その分子の、免疫グロブリン由来する残りの部分は、一つ（又は複数）のヒト免疫グロブリンに由来するものをさす。
【０１４６】
ヒト化抗体はさらに、それが有する可変領域において、それの一つ又は複数の骨格領域がヒト又は霊長類のアミノ酸を有するものをさすこともある。加えて骨格支持残基が、結合親和性を保存するように改変されていてもよい。「ヒト化抗体」を得る方法は、当業者には周知である(例えば、Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technoloy, 9:421 (1991)を見られたい)。
【０１４７】
「ヒト化抗体」はまた、親和性成熟したヒト様ポリクローナル抗体の産生を、大きな動物、例えばウサギ等において可能にする新規の遺伝子工学的手法により、得てもよい(http://www.rctech.com/bioventures/therapeutic.php)。
【０１４８】
「完全ヒト抗体」、又は「ヒト」抗体という用語は、ヒト抗体遺伝子をもつトランスジェニックマウスに由来する、又はヒト細胞に由来する抗体をさすことを意図している。ヒト免疫系に対しては、しかしながら、「完全ヒト」抗体、「ヒト」抗体、及び「ヒト化」抗体の間にある差異は、無視してもよいか存在せず、従ってこれら三つは、等しい効能と安全性をもつとしてよい。
【０１４９】
「モノクローナル抗体」という用語はまた、当技術分野でよく理解されており、実験室で単一クローンから大量に産生され、ただ一つの抗原を認識する抗体をさす。モノクローナル抗体は典型的には、正常短寿命の抗体産生Ｂ細胞を、増殖の速い細胞、例えばがん細胞（「不死化」細胞と称されることもある）に融合させることによって作成される。結果として得られるハイブリッド細胞、すなわちハイブリドーマは急速に増殖し、大量の抗体を産生するクローンを創生する。
【０１５０】
「抗原」という用語は、生物体、具体的には動物、さらに具体的にはヒトを含む哺乳動物において、免疫応答を誘導することができる実体又はその断片をさす。この用語は、免疫原と、免疫原性又は抗原決定因子の原因となる領域とを含む。
【０１５１】
本明細書に使用されるとおり、「可溶性」という用語は、水溶液に部分的又は完全に溶解したことを意味する。
【０１５２】
また本明細書に使用されるとおり、「免疫原性」という用語は、免疫原性をもつ作用物質に対する、抗体、Ｔ細胞、及び他の反応性免疫細胞の産生を誘導し促進させ、ヒト又は動物における免疫応答に寄与する物質をさす。
【０１５３】
免疫応答は、治療しようとする障害を和らげる又は緩和するために投与された、免疫原性をもつ本発明の組成物に対して、充分な抗体、Ｔ細胞、及び他の反応性免疫細胞を、個体が産生する場合に生じる。
【０１５４】
「ハイブリドーマ」という用語は、当技術分野で認められており、抗体産生細胞と不死化細胞、例えば多発性骨髄腫細胞の融合により産生される細胞をさすことが当業者によって理解されている。このハイブリッド細胞は、抗体を絶え間なく供給することができる。上の「モノクローナル抗体」の定義、及び融合方法のより詳細な記載については以下の実施例を参照されたい。
【０１５５】
本明細書で使用される「担体」という用語は、抗原ペプチド又は超分子コンストラクトを内部に組み込むことができ、又は伴うことができ、それによって抗原ペプチド又はペプチドの部分を、ヒト又は動物の免疫系に提示する又は露出させることができる構造体を意味する。動物又はヒトの治療において適切に使用することのできる、例えば、ベシクル、粒子又は粒子状物質等のいかなる粒子も、本発明の文脈の範囲内で担体として使用してもよい。
【０１５６】
「担体」という用語はさらに送達の方法も含んでもよく、その場合、抗原ペプチドを含む超分子コンストラクト組成物を、送達機構により所望の部位に輸送してもよい。そうした送達系の一例では、コロイド状の金等のコロイド状金属を使用する。
【０１５７】
本発明の超分子抗原コンストラクト組成物において使用することのできる担体タンパク質には、マルトース結合ペプチド「ＭＢＰ」；ウシ血清アルブミン「ＢＳＡ」；キーホールリンペットヘモシニアン「ＫＬＨ」；卵アルブミン；フラジェリン（flagellin）；チログロブリン（thyroglobulin）；あらゆゆる種類の血清アルブミン；あるゆる種類のガンマグロブリン；同系細胞；Ｉａ抗原をもつ同系細胞；及びＤ−及び／又はＬ−アミノ酸のポリマーが挙げられるが、これらには限定されない。
【０１５８】
さらに、「治療有効量」又は「薬剤有効量」という用語は、ヒト又は動物に投与された場合に、前記ヒト又は動物に治療効果を結果として生じさせるのに充分である結合ペプチドの量をさす。有効量は、当業者により以下の正常の手順番において容易に決定される。
【０１５９】
「ｐタウＰＨＦ」、「ＰＨＦ」、及び「対らせん状フィラメント」は、本明細書では同義的に用いられ、電子顕微鏡で見ることができる１６０ｎｍ周期のらせん状に巻かれたおよそ１０ｎｍのフィラメント対をさす。幅は、１０から２２ｎｍの間で変化する。ＰＨＦは、アルツハイマー病（ＡＤ）の神経原線維変化病および糸屑状構造物における支配的構造体である。ＰＨＦはまた、老人斑を伴うジストロフィー性神経突起の、全部ではないがいくつかの中に見られることもある。ＰＨＦの主要構成成分は、微小管随伴タンパク質タウの過剰リン酸化形態である。ＰＨＦは、ジスルフィド結合した逆並行の過剰リン酸化タウタンパク質から構成される。ＰＨＦタウは、そのＣ−末端のアミノ酸残基２０個が欠失していることもある。ＰＨＦ形成の根底にある機序は確かではないが、タウの過剰リン酸化が、それを微小管から切り離し、タウの可溶性プールを増加させている可能性がある。
【０１６０】
本発明の範囲内では、本発明の抗原性組成物に対する抗体誘導反応は、おおむねＴ細胞に依存しないことが実証された。この点に関しては、ヌードマウスモデルを使用し、ヌードマウスにワクチン投与し、抗体反応を測定して、免疫されたヌードマウスにおいて本発明の抗原性組成物により誘導されたＡβ−特異抗体反応を評価した。ヌードマウスは、Ｆｏｘｎ１ｎｕ変異体をもち、その結果として、適切な胸腺の欠損により低下したＴ細胞機能を有する。
【０１６１】
本明細書で使用される「薬剤有効量」とは、治療しようとする疾患、障害若しくは状態、又はそれに伴うあらゆる合併症の症状を治療する、又は少なくとも部分的に停止させるのに適切な、薬剤組成物中の活性成分の用量をさす。
【０１６２】
本発明は、タウタンパク質の主要な病態ホスホエピトープを認識しそれに結合する結合ペプチドを提供する。具体的には、本発明は、ＡＤを含むタウオパシーにおいてシナプス毒性及び神経毒性の原因となると考えられている、タンパク質タウ上の直線状、立体構造の、単純な、及び複雑なホスホエピトープに対する特異的抗体を提供する。
【０１６３】
従って、本発明は、一つの実施形態においては、結合ペプチド又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分に関連し、結合ペプチド又は抗体は、哺乳動物の、具体的にはヒトのタウタンパク質又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合し、具体的には病態タンパク質タウコンフォーマーに結合するが、一実施形態では、関連する非リン酸化エピトープ及び／又は非関連エピトープには結合せず、前記結合ペプチド又は抗体は、高い結合親和性を有し、少なくとも１０ｎＭの、具体的には少なくとも８ｎＭの、具体的には少なくとも５ｎＭの、具体的には少なくとも２ｎＭの、具体的には少なくとも１ｎＭの、具体的には少なくとも５００ｐＭの、具体的には少なくとも４００ｐＭの、具体的には少なくとも３００ｐＭの、具体的には少なくとも２００ｐＭの、具体的には少なくとも１００ｐＭの、具体的には少なくとも５０ｐＭの解離定数を伴う。
【０１６４】
本明細書で使用される「可溶性タウ」タンパク質は、完全に可溶化したタウタンパク質/ペプチドモノマーからなる、又はタウ様ペプチド/タンパク質からなる、又は修飾された若しくは切断型タウペプチド/タンパク質からなる、又はタウペプチド/タンパク質モノマーの他の由来物からなるタンパク質と、タウタンパク質オリゴマーからなるタンパク質との、両方からなるタンパク質をさす。「可溶性タウ」は、具体的には神経原線維変化病（ＮＦＴ）を除外する。
【０１６５】
本明細書で使用される「不溶性タウ」は、タウペプチド若しくはタンパク質の、又はタウ様ペプチド/タンパク質の、又は修飾された若しくは切断型タウペプチド/タンパク質の、又はタウペプチド/タンパク質の他の由来物の、多数の凝集モノマーであって、インビトロでは水性媒質においても、インビボでは哺乳動物又はヒトの体、より具体的には脳においても、どちらでも不溶性であるオリゴマー又はポリマー構造を形成するモノマーを、しかし具体的には、哺乳動物の又はヒトの体において、具体的には脳においてそれぞれ不溶性である、タウの、若しくは修飾された若しくは切断型タウペプチド/タンパク質の、又はその誘導体の、多数の凝集モノマーをさす。「不溶性タウ」は、具体的には「神経原線維変化病（ＮＦＴ）」を含む。
【０１６６】
本明細書で使用される「モノマーのタウ」又は「タウモノマー」は、凝集した複合体を伴わずに水性媒質に完全に可溶化したタウンパク質をさす。
【０１６７】
「凝集タウ」、「オリゴマーのタウ」及び「タウオリゴマー」は、タウペプチド若しくはタンパク質の、又はタウ様ペプチド/タンパク質の、又は修飾された若しくは切断型タウペプチド/タンパク質の、又はタウペプチド/タンパク質の他の由来物の、多数の凝集モノマーであって、インビトロでは水性媒質においても、インビボでは哺乳動物又はヒトの体、より具体的には脳においても、どちらでも不溶性又は可溶性であるオリゴマー又はポリマー構造を形成するモノマーを、しかし具体的には、哺乳動物の又はヒトの体において、具体的には脳においてそれぞれ不溶性又は可溶性である、タウの、若しくは修飾された若しくは切断型タウペプチド/タンパク質の、又はその誘導体の、多数の凝集モノマーをさす。
【０１６８】
「調節抗体」とは、本明細書において多様な実施形態に記載される抗体又はその機能断片をさし、抗体又はその機能断片は、可溶性及び／若しくは不溶性及び／若しくはオリゴマーのタウタンパク質の、具体的には可溶性リン酸化タウタンパク質の、機能的性質、生物活性、又はレベルを、インビボで、具体的には、可溶性タウタンパク質及び／又は可溶性リン酸化タウタンパク質のレベルが増加した動物、具体的には、哺乳動物又はヒトの、脳、具体的には、大脳皮質及び／又は海馬において、上方制御する（例えば、活性化する又は刺激する）、下方制御する（例えば、阻害する又は抑制する）又はそうでなければ変化させる、のいずれかであることもある。調節抗体又はその機能断片が作用して、タウタンパク質、又は前記タウタンパク質をコードするポリペプチドを、直接的に又は間接的に、のいずれかにより調節することもある。特定の実施形態では、調節抗体又はその機能断片は、可溶性及び／又は不溶性及び／又はオリゴマーの、具体的には可溶性及び不溶性タウタンパク質、具体的には可溶性及び不溶性及びオリゴマーのタウタンパク質のレベルを減少させる。一態様では、可溶性の及び／又は不溶性の及び／又はオリゴマーのタウタンパク質は、リン酸化タウタンパク質、具体的には、動物の、具体的には、タウタンパク質及び／又はリン酸化タウタンパク質、具体的には、可溶性タウタンパク質及び／又は可溶性リン酸化タウタンパク質の増加した哺乳動物又はヒトの、脳、具体的には大脳皮質及び／又は海馬における、可溶性リン酸化タウタンパク質である。
【０１６９】
一実施形態では、本発明は、本明細書において記載され特許請求される実施形態のいずれか一つの、結合ペプチド若しくはその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体若しくはその機能部分、若しくは前記結合ペプチド若しくは抗体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、又はその組み合わせを、薬剤有効量で、薬剤的に許容できる担体とともに含む薬剤組成物を提供する。
【０１７０】
適切な薬剤担体、希釈剤及び／又は賦形剤は、当技術分野で周知であり、例えば、リン酸塩緩衝食塩水、水、油／水エマルジョン等のエマルジョン、多様なタイプの湿潤剤、滅菌溶液等が挙げられる。
【０１７１】
抗体、具体的にはモノクローナル抗体及びその活性断片を含む、本発明の結合ペプチドは、生理的に許容できる製剤に調製することができ、既知の技術を用いた、薬剤的に許容できる担体、希釈剤及び／又は賦形剤を含んでいてもよい。例えば、機能的に等価なあらゆる結合ペプチド又はその機能部分を、具体的には、機能的に等価なあらゆる抗体又はその機能部分を含む本発明のモノクローナル抗体を含む、本明細書に記載の本発明の結合ペプチドを、薬剤的に許容できる担体、希釈剤／又は賦形剤と組み合わせて、治療組成物を形成する。適切な薬剤担体、希釈剤及び／又は賦形剤は、当技術分野では周知であり、例えば、リン酸塩緩衝食塩水、水、油／水エマルジョン等のエマルジョン、多様なタイプの湿潤剤、滅菌溶液等が挙げられる。
【０１７２】
本発明の薬剤組成物の製剤は、当業者に既知の標準的な方法に従って遂行することができる。 
【０１７３】
本発明の組成物は、固体、液体、又はエアロゾルの形態で、適切な薬剤有効用量で、対象に投与してもよい。固体組成物の例には、錠剤、クリーム、及び移植可能な投与ユニットが挙げられる。錠剤は、経口投与してもよい。治療クリームは局所投与してもよい。移植可能な投与ユニットは、限局的に、例えば、腫瘍部位に投与してもよく、又は移植して治療組成物を系統的に皮下に放出してもよい。液体組成物の例には、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内への注射に適応させた製剤、並びに局所的に及び眼内に投与する製剤が挙げられる。エアロゾル製剤の例には、肺投与のための吸入製剤が挙げられる。
【０１７４】
組成物は、標準的な投与経路により投与してもよい。概して、組成物は、局所的、経口的、直腸内の、経鼻的、皮内の、腹腔内の、非経口的(例えば、静脈内、皮下、筋肉内)経路で投与してもよい。
【０１７５】
加えて、組成物は、生物分解性ポリマー、すなわち送達が望まれる場所の近傍、例えば腫瘍部位に移植されたポリマー等の持続放出マトリクスに組み込んでもよい。方法には、単回投与、予定の時間間隔での反復投与、及び所定の期間の持続投与が挙げられる。
【０１７６】
持続性放出マトリクスは、本明細書で使用されるとおり、酵素による若しくは酸/塩基による加水分解、又は溶解により分解される物質、正常はポリマーで作られたマトリクスである。マトリクスは、ひとたび体内に挿入されると、酵素及び体液の作用を受ける。持続性放出マトリクスは、リポソーム、ポリ乳酸（polylactide）(ポリ乳酸（polylactide acid）)、ポリグリコール酸(グリコール酸のポリマー)、ポリ乳酸コグリコール酸(乳酸とグリコール酸のコポリマー)、ポリ無水物、ポリ(オルト)エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン乳酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖類、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン等のアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピルレン、ポリビニルピロリドン、及びシリコーン等の、生体適合性のある物質から選択されるのが望ましい。好ましい生体適合性のあるマトリクスは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、又はポリ乳酸コグリコール乳酸(乳酸とグリコール酸のコポリマー)のいずれかのうち一つのマトリクスである。
【０１７７】
組成物の投与は、多様な因子、例えば、治療している状態、使用する具体的な組成物、並びに、患者の体重、大きさ、性別、総合的な健康状態、体表面積、投与しようとする具体的な化合物又は組成物、同時に投与する他の薬物、及び投与経路等の他の臨床因子に依存することは、関連技術の業者には周知である。
【０１７８】
本発明の組成物は、アミロイド、又はアルツハイマー病に関与するアミロイドβタンパク質等のアミロイド様タンパク質を伴う一群の疾患及び障害である、タウオパシーの及び／又はアミロイドーシスの薬物療法において使用する既知の化合物等の生物活性をもつ物質又は化合物を含む、他の組成物と組み合わせて投与してもよい。
【０１７９】
他の生物学的活性な物質又は化合物は、本発明の治療ワクチンと同一若しくは同様な機序により、又は無関係の作用機序により、又は関連する及び／若しくは無関係の多くの作用機序により、その生物学的効果を発揮することもある。
【０１８０】
概して、他の生物学的活性な化合物は、中性子透過増強剤（neutron-transmission enhancer）、精神治療薬、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、カルシウムチャネル遮断薬、生体アミン、ベンゾジアゼピン精神安定剤、アセチルコリン合成（acetylcholine synthesis）、ストレージ又はリリースエンハンサー（storage or release enhancer）、アセチルコリン後シナプス受容体作動薬（acetylcholine postsynaptic receptor agonist）、モノアミンオキシダーゼ−Ａ又はＢ阻害剤、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテートグルタミン酸受容体拮抗剤、非ステロイド系抗炎症薬、抗酸化剤、及びセロトニン受容体を含んでいてもよい。
【０１８１】
具体的には、生物学的活性な薬剤又は化合物は、酸化ストレスに対抗する化合物、抗アポトーシス性化合物、金属キレート剤、ピレンゼピン及び代謝物質等のＤＮＡ修復の阻害剤、３−アミノ−１−プロパンスルホン酸（３ＡＰＳ）、１，３−プロパン二スルホン酸塩（１，３ＰＤＳ）、セクレターゼ活性化剤、［ベータ］−及び７セクレターゼ阻害剤、タウタンパク質、神経伝達物質、／３−シートブレイカ−、抗炎症分子、例えばクロザピン、ジプラジドン、リスぺリドン、アリピプラゾール若しくはオランザピン等の「非定型抗精神病薬」、又はタクリン、リバスチグミン、ドネぺジル、及び／若しくはガランタミン等のコリンエステラーゼ阻害剤（ＣｈＥＩ）、並びにビタミンＢ１２、システイン、アセチルコリン前駆体、レシチン、コリン、銀杏、アセチル−Ｌ−カルニチン、イデベノン、プロペントフィリン、若しくはキサンチン誘導体等の他の薬物及び栄養補助剤、からなる群から選択される、少なくとも一つの化合物を、抗体、具体的にはモノクローナル抗体及びその活性断片を含む本発明の結合ペプチド、及び、随意に、薬剤的に許容できる担体及び／又は希釈剤及び／又は賦形剤、並びに疾患を治療するための説明書とともに含んでいてもよい。
【０１８２】
さらなる実施形態では、本発明の組成物は、ナイアシン又はメマンチンを、抗体、具体的にはモノクローナル抗体及びその活性断片、並びに、随意に、薬剤的に許容できる担体及び／又は希釈剤及び／又は賦形剤を含む、本発明の結合ペプチドとともに含んでいてもよい。
【０１８３】
本発明のさらならる実施形態では、幻覚、妄想、思考障害(顕著な思考散乱、脱線、脱線思考によって表される), 及び奇妙な又は混乱した振る舞い、並びに快感喪失、平坦な情動、感情鈍麻、及び引きこもりを含む、陽性又は陰性の精神病症状を治療する、例えばクロザピン、ジプラジドン、リスぺリドン、アリピプラゾール又はオランザピン等の「非定型抗精神病薬」を、抗体、具体的にはモノクローナル抗体及びその活性断片、並びに、随意に、薬剤的に許容できる担体及び／又は希釈剤及び／又は賦形剤を含む本発明の結合ペプチドとともに含む、組成物を提供する。
【０１８４】
本発明の結合ペプチドに加えて、組成物で適切に使用できる他の化合物は、例えば国際公開第２００４／０５８２５８号に開示されているもの（具体的には１６頁と１７頁を見られたい）であり、それらには、治療薬物標的（３６頁〜３９頁）、アルカンスルホン酸及びアルカノール硫酸（３９頁〜５１頁）、コリンセステラーゼ阻害剤（５１頁〜５６頁）、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬（５６頁〜５８頁）、エストロゲン（５８頁〜５９頁）、非ステロイド系抗炎症薬（６０頁〜６１頁）、抗酸化剤（６１頁〜６２頁）、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）拮抗薬（６３頁〜６７頁）、コレステロール降下剤（６８頁〜７５頁）；アミロイド阻害剤（７５頁〜７７頁）、アミロイド形成阻害剤（７７頁〜７８頁）、金属キレート剤（７８頁〜７９頁）、抗精神薬及び抗うつ剤（８０頁〜８２頁）、栄養補助剤（８３頁〜８９頁）、及び脳内で生物学的に活性な物質の効用を増加させる化合物（８９頁〜９３頁を参照されたい）、並びにプロドラッグ（９３頁〜９４頁）が挙げられ、その文書は、参照により本明細書に組み込まれるが、しかし、特に、その頁で言及される化合物を上に示す。
【０１８５】
タンパク質性の薬剤活性物質が、単位用量あたり１ｎｇと１０ｍｇの間の量で存在してもよい。概して、投与レジームは、本発明の抗体０．１μｇと１０ｍｇの間の範囲内の、本発明の抗体、具体的には１．０μｇ〜１．０ｍｇの範囲内、及びさらに具体的には１．０μｇ〜１００μｇの範囲内であるべきであり、それらの範囲に収まるそれぞれの数字全部もまた、本発明の一部である。もし投与が、連続的な注入を通じて生じるならば、さらに適切な用量は、１時間当たり、体重１キログラムあたり０．０１μｇと１０ｍｇ単位の間の範囲内にあってもよく、それらの範囲に収まるそれぞれの数字全部もまた、本発明の一部である。
【０１８６】
投与は、概して非経口的、例えば静脈内又は皮下になされるであろう。非経口投与のための調製物には、滅菌された水溶液又は非水溶液、懸濁液、及びエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒には、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルが挙げられるが、これらには限定されない。水性溶媒は、水、アルコール／水溶液、食塩水及び緩衝媒体を含むエマルジョン又は懸濁液からなる群から選択してもよい。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖と塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、又は不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルには、流体と栄養素の補充剤、電解質の補充剤（リンゲルブドウ糖を用いたもの等）及びその他が挙げられる。保存剤もまた存在してもよく、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス等が挙げられる。
【０１８７】
薬剤組成物はさらに、例えば、血清アルブミン又は免疫グロブリン、具体的にはヒト由来のもの等の、タンパク質性の担体を含んでいてもよい。さらに生物学的に活性な薬剤が、その意図された使用に応じて、本発明の薬剤組成物中に存在してもよい。
【０１８８】
結合標的が脳内に位置している場合には、本発明の特定の実施形態は、脳血液関門を通過する、抗体、具体的にはモノクローナル抗体及びその活性断片を含む、本発明の結合ペプチドを提供する。特定の神経変性疾患は、抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその活性断片を含む本発明の結合ペプチドが容易に脳に脳に取り込まれるような、脳血液関門の浸透性の増加と関連している。脳血液関門が無傷のままである場合には、そこを越えて分子を輸送する、当技術分野で知られたアプローチが存在し、それらには、物理的方法、脂質を用いる方法、及び、受容体とチャネルに基づく方法が挙げられるが、これらには限定されない。
【０１８９】
抗体、具体的にはモノクローナル抗体、又はその活性断片を含む本発明の結合ペプチドを、脳血液関門を越えて輸送する物理的方法には、脳血液関門を完全に迂回するもの、又は脳血液関門に開口を創生することによるものが挙げられるが、これらには限定されない。迂回方法には、脳内への直接注射（例えば、Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)を見られたい)、及び脳内への送達デバイスの移植(例えば、Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003);およびGliadel Wafers(TM), Guildford Pharmaceuticalを見られたい)が挙げられるが、これらには限定されない。関門に開口を創生する方法には、超音波（例えば、米国特許出願公開第２００２／００３８０８６号を見られたい）、浸透圧（例えば、高膨性マンニトールの投与(Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, VoIs 1 & 2, Plenum Press, N. Y. (1989))、例えば、ブラジキン又は透過剤Ａ−７による透過処理（例えば、米国特許第５，１１２，５９６号、同第５，２６８，１６４号、同第５，５０６，２０６号、及び同５，６８６，４１６号を見られたい）、及び、結合ペプチド又は抗原結合断片をコードする遺伝子を含むベクターを用いた、脳血液関門をまたぐニューロンの移入（例えば、米国特許出願公開第２００３／００８３２９９号を見られたい）が挙げられるが、これらには限定されれない。
【０１９０】
抗体、具体的にはモノクローナル抗体、又はその活性断片を含む、本発明の結合ペプチドを、脳血液関門を越えて輸送する、脂質を用いる方法には、抗体、具体的にはモノクローナル抗体、又はその活性断片を含む本発明の結合ペプチドをリポソームに封入し、リポソームをその活性断片に結合させ、活性断片を、脳血液関門の血管内皮上の受容体に結合させること（例えば、米国特許出願公開第２００２００２５３１３号を見られたい）、及び、抗体、具体的にはモノクローナル抗体、又はその活性断片を含む本発明の結合ペプチドを、低濃度リポプロテイン粒子（例えば、米国特許出願公開第２００４０２０４３５４号を見られたい）、又はアポリポプロテインＥ（例えば、米国特許出願公開第２００４０１３１６９２号を見られたい）中に被覆することが挙げられるが、これらには限定されない。
【０１９１】
抗体、具体的にはモノクローナル抗体、又はその活性断片を含む、本発明の結合ペプチドを、脳血液関門を越えて輸送する、受容体とチャネルに基づく方法には、グルココルチコイド遮断薬を用いて脳血液関門の透過性を増加させること（例えば、米国特許出願公開第２００２／００６５２５９号、同第２００３／０１６２６９５号、及び同第２００５／０１２４５３３号を見られたい）；カリウムチャンネルを活性化させること（例えば、米国特許出願公開第２００５／００８９４７３号）、ＡＢＣ薬物トランスポーターを阻害すること（例えば、米国特許出願公開第２００３／００７３７１３号を見られたい）；抗体をトランスフェリンで被覆し、一つ又は複数のトランスフェリン受容体の活性を調節すること（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１２９１８６号）、及び抗体のカチオン化（例えば、米国特許第５，００４，６９７号を見られたい）が挙げられるが、これらには限定されない。
【０１９２】
抗体、具体的にはモノクローナル抗体、又はその活性断片を含む、本発明の結合ペプチド、又は本発明の薬剤組成物の単回又は反復投与を、対象に長期間にわたって提供してもよい。投与の期間は、１週間から１２ヶ月まで、またはそれ以上であってもよい。この期間中、結合ペプチド、抗体又は薬剤組成物は、１週間に１回、２週間、３週間、４週間に１回等、又は治療される対象の必要に応じてさらに高い若しくは低い頻度で投与してもよい。
【０１９３】
さらなる実施形態では、本発明は、タウタンパク質随伴疾患、障害、又は状態を検出及び診断する方法及びキットを提供し、タウタンパク質随伴疾患、障害、又は状態には、アルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤコブ病、パンチドランカー、ダウン症候群、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー症候群、封入体筋炎、及びプリオンタンパク質脳アミロイド血管症を含むが、これらには限定されない、タウ及びアミロイド両方の病態を発現する疾患又は障害を含む神経変性疾患又は障害と、外傷性脳損傷と、筋萎縮性側索硬化症／グアム島パーキンソン痴呆症候群、神経原線維変化病を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、嗜銀顆粒性認知症、大脳皮質基底核変性症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、ハラーフォルデン−シュパッツ病、多系統萎縮症、ニーマン−ピック病、Ｃ型、淡蒼球−橋脳−黒質退行変性、ピック病、進行性皮質下膠質症、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維型老年認知症、脳炎後パーキンソン症候群、及び筋強直性ジストロフィー含むが、これらには限定されない、明瞭なアミロイド病態を示さないさらなる疾患又は障害との、異種の群を含むタウオパシー等の神経変性の疾患又は障害が挙げられる。病態異常性は、神経原線維病変の形成、すなわちタウオパシーにおける主要な脳病態に起因する、又は関連することもある。
【０１９４】
さらに、本発明は、タウとアミロイドの両方の病態を共発現する疾患若しくは障害を含む神経変性疾患若しくは障害の異種の群を含むタウオパシー等の、神経変性疾患若しくは障害を含む、タウタンパク質随伴疾患、障害、若しくは状態の素因を診断する、又は、患者における微小残存病変を監視する、又は、抗体、具体的には、モノクローナル抗体、及びその活性断片を含む本発明の結合ペプチド、若しくは本明細書に記載の本発明の組成物を用いた治療に対する患者の反応性を予測する、方法及びキットを提供する。これらの方法には、生体試料において、又はインサイチュ条件において、物質を検出又は定量するのに一般に使用される既知の免疫学的方法が挙げられる。
【０１９５】
タウとアミロイドの両方の病態を発現する疾患又は障害を含む、神経変性の疾患又は障害の異質な群を含むタウオパシー等の、神経変性の疾患又は障害を含む、診断の必要な対象、具体的には哺乳動物、さらに具体的にはヒトにおけるタウタンパク質随伴疾患若しくは状態、又はタウタンパク質随伴疾患若しくは状態の素因の診断は、タウタンパク質のエピトープへの、本発明の結合ペプチドの、具体的には抗体の、具体的にはモノクローナル抗体又はその活性断片の免疫特異的結合を、試料において又はインサイチュで、検出することにより達成してもよく、それには、タウタンパク質を含むと疑われる試料又は体の特定部分若しくは体の面積を、タウタンパク質のエピトープに結合する抗体に接触させ、抗体をタウタンパク質に結合させて免疫複合体を形成させ、免疫複合体の形成を検出し、免疫複合体の存在又は非存在を、試料又は体の特定部分若しくは面積におけるタウタンパク質の存在又は非存在に関連づけ、随意に、免疫複合体の量を対照正常値と比較することを含み、対照正常値と比較した免疫複合体の量の増加は、対象がタウタンパク質随伴疾患若しくは状態を患っている又はその発症のリスクがあることを示している。
【０１９６】
抗体、具体的にはモノクローナル抗体及びその活性断片を含む本発明の結合ペプチド、又は本発明の組成物を用いた治療の後での、対象、具体的には哺乳動物、さらに具体的にはヒトにおける微小残存病変の監視は、タウタンパク質のエピトープへの、本発明の結合ペプチド、具体的には抗体の、具体的にはモノクローナル抗体又はその活性断片の免疫特異的結合を、試料中において又はインサイチュで、検出することにより達成してもよく、それには、タウタンパク質を含むと疑われる試料又は体の特定部分若しくは体の面積を、抗体、具体的にはモノクローナル抗体及びその活性断片を含みタウタンパク質のエピトープに結合する、本発明の結合ペプチドに接触させ、抗体、具体的にはモノクローナル抗体及びその活性断片を含む結合ペプチドを、タウタンパク質に結合させて免疫複合体を形成させ、免疫複合体の形成を検出し、免疫複合体の存在又は非存在を、試料又は体の特定部分若しくは面積におけるタウタンパク質の存在又は非存在に関連づけ、随意に、前記免疫複合体の量を対照正常値と比較することを含み、対照正常値と比較した前記免疫複合体の量の増加は、対象が微小残存病変を依然として患っていることを示している。
【０１９７】
抗体、具体的にはモノクローナル抗体及びその活性断片を含む、本発明の結合ペプチド、又は本発明の組成物を用いた治療に対する、対象、具体的には哺乳動物、さらに具体的にはヒトの反応性を予測することは、タウタンパク質のエピトープへの、結合ペプチドの、具体的にはモノクローナル抗体又はその活性断片の免疫特異的結合を、試料において又はインサイチュで、検出することにより達成してもよく、それには、タウタンパク質を含むと疑われる試料又は体の特定部分若しくは体の面積を、抗体、具体的にはモノクローナル抗体及びその活性断片を含みタウタンパク質のエピトープに結合する、本発明の結合ペプチドに接触させ、抗体、具体的にはモノクローナル抗体及びその活性断片を含む結合ペプチドをタウタンパク質に結合させて免疫複合体を形成させ、免疫複合体の形成を検出し、免疫複合体の存在又は非存在を、試料又は体の特定部分若しくは面積におけるタウタンパク質の存在又は非存在に関連づけ、随意に、前記免疫複合体の治療開始の前後での量を比較することを含み、前記免疫複合体の量の減少は、治療に対する前記患者の有する反応性の潜在能力が高いことを示している。
【０１９８】
タウとアミロイドの両方の病態を発現する疾患又は障害を含む、神経変性の疾患又は障害の異質な群を含むタウオパシー等の神経変性の疾患又は障害を含む、タウタンパク質随伴疾患若しくは状態状態の素因を診断するために、又は、患者における微小残存病変を監視するために、又は、抗体、具体的にはモノクローナル抗体及びその活性断片を含む本発明の結合ペプチド、又は本明細書に記載の本発明の組成物を用いた治療に対する患者の反応性を予測するために、タウタンパク質随伴疾患又は状態の診断において使用してもよい生物学的試料は、例えば、血清、血漿、唾液、胃液分泌、粘液、脳脊髄液、リンパ液等の流体、又は、神経の、脳の、心臓の、血管の組織等の、生物から得られる組織又は細胞の試料である。試料中のタウタンパク質の存在又は非存在を定量するには、当業者に既知のあらゆるイムノアッセイを使用してもよく、例えば、検出用の二次試薬を用いる間接検出法を使用するアッセイ、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、及び凝集アッセイ等がある。これらのアッセイの詳細な記載は、例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988 555-612、Maertens and Stuyver, Zrein et al. (1998)の国際公開第９６／１３５９０号、及び国際公開第９６／２９６０５号から得られる。
【０１９９】
インサイチュ診断のためには、抗体、具体的にはモノクローナル抗体及びその活性断片を含む、本発明の結合ペプチド、又はそのあらゆる活性及び機能部分を、診断される生物体に、例えば、静脈内、皮下、鼻腔内、腹腔内、脳内、動脈内への注射等の、当技術分野で既知の方法により投与してもよく、それにより、本発明の抗体とアミロイドタンパク質上のエピトープ領域との特異的結合が生じてもよい。結合ペプチド/抗原複合体は、抗体、具体的にはモノクローナル抗体、又はその機能断片を含む、本発明の結合ペプチドに付着する標識、又は当技術分野で既知の他のあらゆる検出方法を通じて検出するのが好都合なこともある。
【０２００】
診断的応用、すなわち、タウとアミロイドの両方の病態を発現する疾患又は障害を含む、神経変性の疾患又は障害の異質な群を含むタウオパシー等の神経変性の疾患又は障害を含む、タウタンパク質随伴疾患若しくは状態の素因を診断する、又は、患者における微小残存病変を監視する、又は、抗体、具体的にはモノクローナル抗体及びその活性断片を含む本発明の結合ペプチド、若しくは本明細書に記載の本発明の組成物を用いた治療に対する患者の反応性を予測する応用において使用されるイムノアッセイは、典型的には、標識された、抗原、結合ペプチド、又は検出用の二次試薬に依存している。これらのタンパク質、又は試薬は、当業者に概して既知の化合物で標識してもよく、化合物には、酵素、放射性同位元素、並びに蛍光を発する、発光する、及び色素を生成する物質が挙げられ、物質には、コロイド状金及びラテックスビーズ等の着色粒子が挙げられるがこれらには限定されない。これらのうち、放射性標識は、ほとんどすべてのタイプのアッセイで多くの変形を伴って使用することができる。酵素に結合させた標識は、放射能を避けなければならない場合、又は結果をすぐに得たい場合にとりわけ役に立つ。蛍光色素は、その使用には高価な機器が必要ではあるが、非常に高感度な検出方法である。これらのアッセイで役立つ結合ペプチドは、本明細書に開示、特許請求されるものであり、それらには、抗体、具体的にはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及びアフィニティー精製したポリクローナル抗体が挙げられる。
【０２０１】
代りに、抗体、具体的にはモノクローナル抗体及びその活性断片を含む、本発明の結合ペプチドを、タンパク質Ａ若しくはＧ又は二次抗体等の、免疫グロブリンに対する親和性を有する標識された物質との反応により、間接的に標識してもよい。抗体、具体的にはモノクローナル抗体及びその活性断片を含む、本発明の結合ペプチドを、第２の物質に結合させ、抗体に結合した第２の物質に親和性を有する、標識された第３の物質で検出してもよい。例えば、抗体、具体的にはモノクローナル抗体及びその活性断片を含む、本発明の結合ペプチドを、ビオチンに結合させて、結合ペプチド／ビオチン結合体を、標識されたアビジン又はストプトアタビジンを用いて検出してもよい。同様に、結合ペプチドを、ハプテンに結合させて、結合ペプチド／ハプテン結合体を、標識された抗ハプテン結合ペプチドを用いて検出してもよい。
【０２０２】
当業者は、本発明に従って適用することのできる、これらの及び他の適切な標識について知るであろう。結合ペプチド又はその断片へのこれらの標識の結合は、当業者に周知の標準的な技術を用いて実行することができる。典型的な技術は、Kennedy, J. H., et al., 1976 (Clin. Chim. Acta 70:1-31), and Schurs, A. H. W. M., et al. 1977 (Clin. Chim Acta 57:1-40)に記載されている。以下に言及するカップリング技術は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸塩法、ジマレイミド法、その他であり、すべて、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０３】
現在のイムノアッセイは、分析物の存在を検出する二重抗体法を使用し、その場合、抗体は、検出可能な標識ですでに標識されている二次抗体との反応性により、間接的に標識される。二次抗体は、モノクローナル抗体が由来するもとの動物の抗体に結合するものであるのが好ましい。換言すれば、もし、モノクローナル抗体が、マウス抗体であるなら、その場合、標識された二次抗体は、抗マウス抗体である。本明細書に記載のアッセイにおいて使用される抗体については、この標識は、抗体結合ビーズ、具体的には磁気ビーズであるのが好ましい。本明細書に記載のイムノアッセイにおいて適用される抗体については、標識は、放射性の、蛍光を発する、又は電気化学発光する物質等の、検出可能な分子であるのが好ましい。
【０２０４】
代りの二重抗体系は、分析物の存在を高速定量するのに適合しているので、しばしば高速フォーマット（fast format）系と称され、本発明の範囲内でも使用してもよい。この系は、抗体と分析物との間に高い親和性が必要である。本発明の一実施形態によれば、アミロイドタンパク質の存在は、一対の抗体を用いて定量され、それぞれはアミロイドタンパク質に特異的である。前記一対の抗体の一つは、本明細書では「ディテクター（detector）抗体」と称し、前記一対の抗体のもう一つを「キャプチャー（capture）抗体」と称する。本発明のモノクローナル抗体は、キャプチャー抗体又はディテクター抗体のどちらかとして使用することができる。本発明のモノクローナル抗体はまた、単一アッセイにおいて、キャプチャー及びディテクターの両方としても使用することができる。本発明の一実施形態はこのように、二重抗体によるサンドイッチ法を使用して、生物学的流体の試料中にアミロイドタンパク質を検出する。この方法では、分析物(アミロイドタンパク質)は、ディテクター抗体とキャプチャー抗体の間に挟まみこまれ、キャプチャー抗体は、不可逆的に固体支持体上に固定化される。ディテクター抗体は、抗体-分析物サンドイッチの存在、従って分析物の存在を同定するために、検出可能な標識を含む可能性がある。
【０２０５】
例示的な固相物質には、ラジオイムノアッセイ、及び酵素イムノアッセイの分野で周知の、マイクロタイタープレート、ポリスチレン製テストチューブ、磁性のプラスチック製又はガラス製のビーズ、及びスライドが挙げられるが、これらには限定されない。抗体を固相に結合させる方法もまた、当業者には周知である。さらに最近では、ナイロン、ニトロセルロース、セルロースアセテート、グラスファイバー、及び他の多孔性ポリマー等の多くの多孔性物質が、固体支持体として使用されている。
【０２０６】
本発明はまた、上に定義された組成物を含む、生物学的試料中のタウタンパク質を検出する診断キットに関連する。さらに、本発明は、上に定義された組成物に加えて、上に定義された検出試薬も含む最近の診断キットに関連する。「診断キット」という用語は概ね、当技術分野で既知のあらゆるキットをさす。より具体的は、最近の用語は、Zrein et al. (1998)に記載の診断キットをさす。
【０２０７】
本発明のさらに他の目的は、タウタンパク質随伴疾患及び状態を検出し診断する、本発明の結合ペプチドを含む新規の免疫プローブ及び試験キットを提供することである。免疫プローブの目的には、結合ペプチドは、適切なリポーター分子、例えば、酵素、又は放射性核種に、直接的又は間接的に付着する。試験キットは、本発明の一つ又は複数の結合ペプチドを保持する容器と、タウ抗原を結合させて免疫複合体を形成させ、免疫複合体の存在を検出して、免疫複合体の存在又は非存在をタウタンパクの存在又は非存在に関連づけるようにするのを目的として結合ペプチドを使用するための説明書とを含む。
【実施例１】
【０２０８】
ハイブリドーマ及び抗体の生成とスクリーニング
この研究の目的は、抗タウmAbs(モノクローナル抗体)を生成してスクリーニングすることであった。ハイブリドーマを、タウワクチン免疫化マウス脾臓細胞と骨髄腫細胞株との融合により生成した。ハイブリドーマを、ワクチン調製に使用したリン酸化及び非リン酸化タウ抗原ペプチドだけでなく、リン酸化及び非リン酸化の両方の完全長タウタンパク質に対する反応性について評価した。ハイブリドーマのスクリーニングもまた、タウタングルに対するハイブリドーマ上清の反応性について、タウトランスジェニックマウス脳切片上での免疫化学を用いて実行した。
【０２０９】
1.1  方法
1.1.1  融合
ハイブリドーマの産生には、ＡＣＩ−３５（タウ３９３−４０８［ｐＳ３９６、ｐＳ４０４］）をワクチン投与した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いた。マウスを、０日目に、その後、再び４日目に、ＡＣＩ−３５ワクチンを用いて追加免疫し、融合を７日目に実行した。
【０２１０】
免疫マウスからの６×１０７個（ＡＣＩ−３５）の脾細胞を、２×１０７個のＳＰ２−Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫細胞と、脾細胞３個／骨髄腫細胞１個の比率で融合させた。
【０２１１】
融合は、８×９６ウェルプレート中で生じ、クローンを、プレート（１〜８）、さらに列（Ａ〜Ｇ）、最後に行（１〜１２）に従って命名した。
【０２１２】
１．１．２  クローンを選択するスクリーニング
８×９６ウェルプレートをまず、ＩｇＧに発現に関して２回、スクリーニングした。陽性発現するクローンをその後、２４ウェルプレートに移し、増殖細胞の細胞上清（＝クローン）を、タウＥＬＩＳＡスクリーン、及び免疫組織学的ＴＡＵＰＩＲスクリーンにおいて試験した。ＥＬＩＳＡ及び／又はＴＡＵＰＩＲでの陽性の上清をＴ２５フラスコに移して、クローンを再び、タウＥＬＩＳＡスクリーン及びＴＡＵＰＩＲスクリーンにおいて、ＩｇＧ発現に関してスクリーニングした。
【０２１３】
１．１．３  ＩｇＧスクリーン
ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ；シグマ社（Ｓｉｇｍａ））を、コーティング緩衝液中の５０μｌ／ウェルの抗マウスＩｇＧ抗体（ＡｂＤセロテック社（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ドイツ、デュッセルドルフ）で、１６時間４℃でコーティングした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、ウェルを、１００μｌ／ウェルのブロッキング溶液で１時間、外界温度でブロッキング処理した。希釈しないハイブリドーマ上清（１ウェルあたり５０μｌ）を、１時間、外界温度でインキュベートした。洗浄の後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、又はＩｇＭ（ＡｂＤセロテック社）の混合物を、１時間、外界温度で塗布した。最終洗浄の後、ＨＲＰ基質（ＴＭＢ；３−３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）を用いて検出を実行し、プレートを４０５ｎｍで、マイクロプレートリーダーを用いて読み取った。結果は、光学濃度（Ｏ．Ｄ．）で表現する。
【０２１４】
１．１．４  ハイブリドーマタウＥＬＩＳＡスクリーン
ハイブリドーマＥＬＩＳＡスクリーンを、タウペプチド（ＡＣＩ−３５、Ｔ３．５：タウ３９３−４０８［ｐＳ３９６／ｐＳ４０４；ポリペプチドラボラトリーズ（ＰｏｌｙＰｅｐｔｉｄｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、デンマーク、ヒレレズ）、対応する非リン酸化タウペプチド（Ｔ３．６：タウ３９３−４０８、ポリペプチドラボラトリーズ）、リン酸化完全長（４４１ａａ）タウタンパク質（ｐタウタンパク質、Vandebroek et al., 2005）、及び完全長（４４１ａａ）タウタンパク質（タウタンパク質、シグマケム社（ＳｉｇｎａｌＣｈｅｍ）、カナダ、リッチモンド）上で実行した。最後に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、陰性対照として用いた。
【０２１５】
プレートを、１０μｇ／ｍｌの対応するタウペプチド、及び１μｇ／ｍｌの対応するタウタンパク質を用いて一晩、４℃でコーティングした。各ウェルを、ＰＢＳ−０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、ＰＢＳ−０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０中、１％のＢＳＡでブロッキング処理した後、希釈しないハイブリドーマ上清又は培地の陰性対照をプレートに加えて、３７℃で２時間、インキュベートした。洗浄の後、プレートをアルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合抗マウスＩｇＧ総抗体（ジャクソンラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、米国、ペンシルベニア州、ボルチモア）で２時間、３７℃でインキュベートした。洗浄の後、プレートをｐＮＰＰ（パラニトロフェニルリン酸塩）、すなわちＡＰに対するホスファターゼ基質でインキュベートし、４０５ｎｍで、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて読み取った。結果を、Ｏ．Ｄ．（光学濃度）として表現する。
【０２１６】
１．１．５  ハイブリドーマＩＨＣスクリーン：トランスジェニックマウス（ＴＡＵＰＩＲ）からの脳断片における抗タウ抗体の変化病への結合
ＴＡＵＰＩＲ実験を、実施例３．１．２．からのプロトコルに従って行った。
【０２１７】
１．１．６  Ｔ２５フラスコＩｇＧスクリーン
ＥＬＩＳＡプレートを、炭酸塩−重炭酸塩コーティング緩衝液ｐＨ９．６（シグマ社、スイス、ブーフス）中の５ｕｇ／ｍｌの抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片特異抗体（ジャクソンラボラトリーズ、米国、ペンシルベニア州、ボルチモア）を用いて一晩、４℃でコーティングした。プレートを洗浄後、希釈しないハイブリドーマ上清、陽性対照ＩｇＧ１抗体（１ｕｇ／ｍｌで６Ｅ１０：コーバンス社（Ｃｏｖａｎｃｅ）、米国、カリフォルニア州、エメリービル）又は陰性対照（培地単独）を、１時間、室温でインキュベートした。洗浄工程の後、二次ＡＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１＋２ａ＋２ｂ＋３のサブクラス）Ｆｃγ断片特異抗体（ジャクソンラボラトリーズ、米国、ペンシルベニア州、ボルチモア）を、プレート上で２時間、３７℃でインキュベートした。最終洗浄の後、ｐＮＰＰ（パラニトロフェニルリン酸塩）、すなわちＡＰに対するホスファターゼ基質で検出を行ない、プレートを、４０５ｎｍで、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて読みとった。結果を、結果を、Ｏ．Ｄ．（光学濃度）として表現する。
【０２１８】
１．２  結果
融合の結果得られた、８×９６ウェルプレートからの細胞上清を、ＩｇＧの産生に関してスクリーニングした。試験した７６８ウェル（８×９６ウェル）から、ＩｇＧ産生に対して陽性の４８ウェルを、ワクチンホスホペプチド、及び完全長ホスホタウに最も良好に結合した結果に基づいて選択した。選択は、ＥＬＩＳＡによる、ペプチド及び完全長ホスホタウタンパク質への結合、並びに、非ホスホペプチド及び非ホスホ完全長タウタンパク質と比較した場合の選択性に基づいた。２４とおりの選別されたハイブリドーマを、ハイブリドーマあたり２プレートに１個の細胞／ウェルで、及び１プレートに０．５個の細胞／ウェルで播種して、サブクローンニングした。上清を再び試験して、ホスホペプチド及びホスホタンパク質に結合させて結合プロファイルを確認し、その後、６週間の培養後に安定性を評価した。その後、８とおりの安定クローンを選択し、「方法」に記載のＥＬＩＳＡ及びＴＡＵＰＩＲを用いて、アイソタイプ判定及び結合に関して試験した。
【０２１９】
１．３．  結論
生成した抗体は、ｐタウペプチドへの高い特異性を示し、非リン酸化ペプチドには限界でしか結合しなかった。
【０２２０】
全部で８とおりのクローンを、さらなるサブクローニングのために選別し、配列決定し（表６及び表７を見られたい）、６とおりのクローンをＤＳＭＺ（表１０を見られたい）に寄託した。
【０２２１】
上述の陽性の母クローンを、さらに９６ウェルプレート中、その後、２４ウェルプレート中、最後にＴ２５フラスコ中で培養した。各段階で、ハイブリドーマクローンの上清をＥＬＩＳＡ、Ｔａｕｐｉｒ、及びウェスタンブロット法によりスクリーニングした。
【実施例２】
【０２２２】
抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のクローニング
ハイブリドーマ細胞からの、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子を、クローニングし、抗体結合の特徴だけでなく、ＤＮＡ配列、相補性決定領域（ＣＤＲ）の位置を決定した。
【０２２３】
総ＲＮＡを、３×１０６個のハイブリドーマ細胞（１バイアル）から、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（カタログ番号：７４１０４）を用いて調製した。ＲＮＡを５０ｕＬの水中に溶出し、１．２％のアガロースゲル上で調べた。
【０２２４】
ＶＨ及びＶＫのｃＤＮＡを、逆転写酵素をＩｇＧ及びカッパ定常領域プライマーともに用いて調製した。第１のストランドｃＤＮＡを、大きいセットのシグナル配列プライマーを用いるＰＣＲにより増幅した。増幅したＤＮＡを、ゲル精製し、ベクターｐＧｅｍ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙ（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））にクローニングした。得られたＶＨ及びＶＫクローンを、予想サイズのインサート関してスクリーニングした。選択したクローンのＤＮＡ配列を、自動化された塩基配列決定により両方向で決定した。配列中の相補性決定領域（ＣＤＲ）の位置を、他の抗体配列を参照して決定した(Kabat EA et al., 1991)。
【実施例３】
【０２２５】
結合の研究I
目的は、タウリポソームワクチンで免疫されたマウスに由来するサブクローニングされたハイブリドーマから生成した抗体のホスホタウ（ｐタウ）結合を測定することであった。これを試験するため、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、リポソームワクチン調製に使用したリン酸化及び非リン酸化タウ抗原ペプチドだけでなく、リン酸化及び非リン酸化された両方の完全長タウタンパク質への、精製抗体の結合を測定した。
【０２２６】
スクリーニングを、２つの他の方法で実行した。抗タウ抗体を一次抗体として用いる、タウトランスジェニック動物（ＴＡＵＰＩＲ）からの脳断片上での免疫組織化学（ＩＨＣ）を行った。加えて、トランスジェニックマウスからの脳タンパク質ホモジネート上でのウェスタンブロット法（ＷＢ）を、抗タウ抗体をブロッティング抗体として用いて実行した。
【０２２７】
３．１  方法
３．１．１．  ＥＬＩＳＡ：ホスホタウ結合アッセイ
精製抗体のタウ又はｐタウへの結合を試験するため、ＥＬＩＳＡアッセイを使用した。簡潔には、Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ウェルプレート（ヌンク社（Ｎｕｎｃ）、デンマーク、ロスキレ）を、１μｇ／ｍＬの完全長（４４１  ａａ）タウタンパク質（シグナルケム社（ＳｉｇｎａｌＣｈｅｍ）、カナダ，リッチモンド）、又はリン酸化完全長（４４１  ａａ）タウタンパク質（Vandebroek et al., 2005）でコーティングした。加えて、プレートを、１０μｇ／ｍＬのタウ由来のワクチンペプチド、タウ３９３−４０８（Ｓ３９６及びＳ４０４上でリン酸化された、又はそうでないもの）でコーティングした。ワクチン調製で使用しなかった異なるｐタウエピトープのタウ及びｐタウ配列への交差反応性について試験するため、プレートを、１０μｇ／ｍＬの以下のペプチド：タウ３９３−４０８（Ｓ３９６及びＳ４０４上でリン酸化された、又はそうでないもの）でコーティングした。コーティングは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、４℃で一晩、行った。プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／ＰＢＳを用いて完全に洗浄した後、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて１時間、３７℃でブロッキング処理した。試験される抗体をその後、２０から０μｇ／ｍＬの間の、８又は１６とおりの２倍希釈系列に加え、３７°Ｃで２時間、インキュベートした。プレートをその後、前述のとおり洗浄し、ＡＰ結合抗マウスＩｇＧ二次抗体（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、英国、サフォーク）を１／６０００に希釈して、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ中に、３７℃で２時間、加えた。洗浄の後、プレートを、ｐニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物（ｐＮＰＰ；グマアルドリッチ社、スイス、ブーフス）すなわちホスファターゼ基質溶液を用いてインキュベートし、３０分、１、２、又は１６時間の培養時間の後に、４０５ｎｍで、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて読み取った。
【０２２８】
３．１．２．ＴＡＵＰＩＲ及びウェスタンブロット：タウトランスジェニック動物（ＴＡＵＰＩＲ）からの脳断片におけるタウタングルへの抗タウ抗体の結合
ＴＡＵＰＩＲ染色のために、脳断片を、ＴＰＬＨマウス（ｈＴａｕＰ３０１Ｌの最長のアイソフォーム（４４１ａａ）を発現するトランスジェニックマウス）、老いた（１８月齢より高齢）ダブルトランスジェニックｂｉＧＴ（ＴＰＬＨと交配させたＧＳＫ−３βトランスジェニックマウス）マウス、及びダブルトランスジェニックｂｉＡＴ（ＴＰＬＨと交配させたｈＡＰＰＶ７１７Ｉトランスジェニックマウス）マウスから得た。陰性対照については、タウノックアウトマウス（ＴＫＯ；６月齢）からの断片を使用した。脳断片を、５分間、ＰＢＳ中で洗浄した後、１５分間、室温で、ＰＢＳ：ＭｅＯＨ（１：１）中の１．５％のＨ２Ｏ２中でインキュベートして、内因性のペルオキシダーゼ活性をブロッキング処理した。断片を３回、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００）中で洗浄した後、それらを３０分間、室温でＰＢＳＴ＋１０％のＦＣＳ（ウシ胎仔血清）ブロッキング溶液中でインキュベートした。試験している抗タウ抗体を用いるインキュベーションを一晩、４℃で、以下の抗体濃度：ＰＢＳＴ／１０％ＦＣＳ中、０．００５３μｇ／ｍＬのＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１、０．００４８μｇ／ｍＬのＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ２、０．０１５μｇ／ｍＬのＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ１、０．００４７μｇ／ｍＬのＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１、０．００５５μｇ／ｍＬのＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ１、並びに、０．０１μｇ／ｍＬのＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ２及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３、を用いて行った。断片を次に３回、ＰＢＳＴ中で洗浄した後、ＰＢＳＴ／１０％ＦＣＳ中のＨＲＰ結合ヤギ抗マウス（ダコ社（Ｄａｋｏ）、デンマーク、グロスストルプから購入）二次抗体を用いて、一時間、室温でインキュベートした。検出に先立って、断片を３回、ＰＢＳＴで洗浄し、５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．６中で５分、インキュベートした。検出は、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ：５０ｍＭのトリスＨＣｌを１０ｍｌ＋３０％のＨ２Ｏ２を３μｌの中に1錠剤；ＭＰバイオケミカルズ社（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）米国、オハイオ州、ソロン）中で３分間、断片をインキュベートすることにより、実行した。反応を、断片を３回、ＰＢＳＴ中で洗浄することにより停止させた。断片をその後、シラン処理したガラスプレートに移し、ウォームプレート上で２時間、５０℃で風乾した。対比染色を、マイヤーヘマトキシリン（フルカケミ社（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ）、スイス、ブーフス）を用いた１分間の培養を用いて実行した後、水道水を流して４分間の洗浄工程を実行した。断片を、５０％、７０％、９０％のエタノール槽に通し、１００％のエタノール槽に２回通した後、キシロール中を２回、１分間通すことにより脱水させた。最後に断片を、ＤｅＰｅＸ（ＢＤＨケミカル社（ＢＤＨ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．）、英国、プール）を用いてマウントし、撮像のため上にカバースリップガラスを置いた。
【０２２９】
さらなる染色（ウェスタンブロット法の実行）を、野生型マウス（ＦＶＢ）タウトランスジェニックマウス（ＴＰＬＨ及びｂｉＧＴ）、又はタウノックアウトマウス（ＴＫＯ）からの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）で分離した脳ホモジネートタンパク質上で行った。ウェスタンブロット法実行のため、抗体を、以下の濃度で使用した：０．５３μｇ／ｍＬのＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１、０．４８μｇ／ｍＬのＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ２、０．５μｇ／ｍＬのＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ１、０．４７μｇ／ｍＬのＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１、０．５５μｇ／ｍＬのＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ１、０．３３μｇ／ｍＬのＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ２、及び０．５μｇ／ｍＬのＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３。
【０２３０】
３．２  結果
抗体ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１、ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ２、ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１、ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ２、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３は、リン酸化ヒトタウタンパク質への高い結合活性と特異性を示し（表２）、より詳細には、対応するワクチンにおいて使用した抗原性ホスホタウペプチドへの高い結合活性と特異性を示した。非リン酸化タウへの、又は他のリン酸化及び非リン酸化タウ由来の試験ペプチドへの交差反応性は、観察されなかった。抗体ＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ１は、その選択のとおり、ワクチン調製に使用した抗原性ホスホタウペプチドへのみ高い結合活性を示した。ワクチン調製に使用した抗原性ペプチドの、非リン酸化対応物への低い交差反応性が見出され、これはクローン選択にもとづいて予測されていたものである。抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ１は、ワクチン調製において使用した抗原性リン酸化タウペプチドへのみ、高い結合活性と特異性を示した。ワクチンにおいて使用した抗原性ペプチド配列の一部を含むＴ４．５リン酸化ペプチドへの小さい交差反応性が観察された。
【０２３１】
ＴＡＵＰＩＲ及びＷＢを使用して、進行したタウオパシー（ｂｉＧＴ＞１８か月）を伴うマウスの脳におけるタウタングルへの、及びこれらのマウスに由来する変性したホモジネートにおける完全長タウへの結合を見た。異なる脳領域：大脳皮質、並びに海馬のＣＡ１、ＣＡ３、及び歯状回（ＤＧ）部分を分析した。抗体ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１、及びＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ２は、最良のＴＡＵＰＩＲ結果を示し、特に海馬のＣＡ１及びＣＡ３領域において、濃い細胞質染色及び明瞭な糸屑状構造物が見られた。抗体ＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ１は、ＴＡＵＰＩＲにおいて陰性であり、散在するかすかなタングル状構造が軽度に染色されているのみであった。抗体ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１は、良好な細胞質ＴＡＵＰＩＲ染色を示し、糸屑状構造物がＣＡ１領域に見られた。抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ１は、ＴＡＵＰＩＲにおいて陰性であり、核染色および一部のみのタングル染色が見られた。最後に、ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ２及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３抗体は、同様に良好な細胞質ＴＡＵＰＩＲ染色を示し、海馬のＣＡ１及びＣＡ３に糸屑状構造物が見られた。＋又は−符号を用いた染色の質の等級づけを、表２に示す。タウトランスジェニックマウスからの脳ホモジネートをブロットし、予想されたタウバンドに良好にすべての抗体が結合したことが示され（表２、＋として等級づけ）、ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ１もまた、さらなる非特異的結合（−／＋）を示している。
【実施例４】
【０２３２】
結合の研究ＩＩ
４．１  方法
４．１．１  ＳＰＲ結合アッセイ
すべてのＳＰＲ実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ機器（ＧＥヘルスケア社（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））上で実行した。センサーチップＳＡ（カルボキシメチルデキストランに由来するストレプトアビジン）は、ＧＥヘルスケア社から購入した。ランニング緩衝液（Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）は、ＰＢＳ（ダルベッコＰＢＳ、シグマ社  Ｄ８５３７）であった。まず、結合しないストレプトアビジンを、１６ｍＭのＮａＯＨ（ａｑ）を８パルス（それぞれ約１μＬ）、注入することにより、センサー表面から除去した。ホスホタウペプチドをその後、ＰＢＳ中に可溶化して、最終ペプチド濃度１μＭにし、その後、センサーチップのフローセル（ｆｃ）２の上に、５μｌ／分で注入（３５μＬ）した。カップリングの後、最終の固定化レベルの１３０ＲＵが得られた。チップ表面への抗体の結合を研究するため、ランニング緩衝液を連続して２倍希釈することにより、いくつかの抗体濃度を調製した。注入を、ｆｃ１及び２の両方の上に、流量５０μＬ／分で１２０秒間、実行した。フローセル１は誘導体化させず、ｆｃ１の応答をｆｃ２から引き算して、機器ノイズ及び、バルク反射率の変化を補正した。各注入の後、表面をランニング緩衝液で即座に、１００秒間洗浄した。残存するあらゆる結合した抗体をチップから除去し、表面の再生を、１μＬの１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ１．７を注入することにより実行した。動態解析を、数値積分のアルゴリズム、及びＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．０を用いた大域解析を用いて実行した。異なる濃度抗体の注入に関して得られたセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）を重ね合わせ、ベースラインをゼロに調節した。曲線のフィッティングのために、すべてのデータを同時に1:1均質(ラングミュア（Ｌｕｎｇｍｕｉｒ）)モデルにフィッティングした。
2014531216.tif 000003
【０２３３】
４．２  結果
抗タウ抗体の、リン酸化タウペプチドへの結合を、ＳＰＲを用いてリアルタイムで監視した。抗体結合の結合相及び解離相の解析を用いて、解離定数ＫＤだけでなく、会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）を決定することができた。
【０２３４】
すべての抗体は、誘導体化されなかったカルボキシメチルデキストラン表面上のペプチドＴ３．３０に、解析した抗体４６→７３４ｎＭの範囲（又は、ＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ１については１１．５→１８４ｎＭ）で、特異的に結合することが見出された。センサーグラムの動態解析により、様々な抗体とＴ３．３０との間の結合相互作用に対する解離定数ＫＤは、２と８２ｎＭの間であることが明らかになった。従ってこのことは、抗体が、ホスホペプチドＴ３．３０を非常に高い親和性で識別することを示している（表３）。
【実施例５】
【０２３５】
結合の研究ＩＩＩ  ヒト脳試料上でのＥＬＩＳＡ（リン酸化タウのマルチマーを検出するＥＬＩＳＡ）
５．１  方法
５．１．１．  ヒト試料：本明細書に記載のアッセイに使用されるヒト脳試料の調製
アルツハイマー病（ＡＤ）の１０人、及び年齢適合対照１０人に関しての死後の側頭皮質を、マイアミ大学の脳遺贈バンク（Ｂｒａｉｎ  Ｅｎｄｏｗｍｅｎｔ  Ｂａｎｋ）から得た。ＡＤ患者（女性７人、男性３人）に関してに死亡時の平均年齢は、８１．１±７．３歳であり、対照（神経学的症状なし；女性９人、男性１人）については、８７．０±５．８歳であった（スチューデントｔ検定によれば、ＡＤ患者との有意差無し）。すべての試料は、白人起源であった。ＡＤ試料を、表４に示すとおり、ブラーク（Ｂｒａａｋ）病期（Braak and Braak (1991) Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol 82:239-259）に関して評価した。
【０２３６】
ＡＤの１０人、及び年齢適合対照１０人についての死後の側頭皮質を、以下のプロトコルに従ってホモジネートした。脳断片を計量し、ホスファターゼ阻害剤（３０ｍＭのＮａＦ、０．２ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１ｎＭのオカダ酸、１ｍＭのＰＭＳＦ、５ｍＭのＮａ４Ｐ２Ｏ７）、及びプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ；ロッシュ社（Ｒｏｃｈｅ）、スイス）を含む、９体積の２５ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ中でホモジネートした。ホモジネーションはガラス製ポッター(ｐｏｔｔｅｒ)を用いて実行した。これは、総ホモジネート（Ｔｏｔａｌ  Ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ（ＴＨ））画分を構成する。タンパク質濃度を、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）試薬（シグマ社）を用いて測定した。
【０２３７】
５．１．２．  セットアップ１のＥＬＩＳＡ：ＡＤに冒された個体及び年齢適合対照からのヒト死後皮質脳ホモジネートにおけるリン酸化タウのマルチマーの存在を検出するセットアップ１のＥＬＩＳＡアッセイ
マルチタイター９６ウェルプレートを、炭酸塩／重炭酸塩緩衝剤中、抗体を用い一晩、４℃、５μｇ／ｍｌでコーティングした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で４回の洗浄の後、プレートに、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中１０％のＢＳＡを、３７℃で１時間、染み込ませた。脳ホモジネートをその後、ウェルに、５０μＬのＰＢＳ中、１００ｎｇ／μＬの濃度で加え、３７℃で２時間、インキュベートした。プレートを洗浄した後、コーティングに使用したのと同じ抗体、しかしビオチン化したものを、３７℃で１時間、５μｇ／ｍＬの最終濃度でインキュベートした。プレートを洗浄し、アビジンぺルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  ｋｉｔ、ベクターラボラトリーズ社（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））、及びその基質（ＡＢＴＳ、ロッシュ  １０８８１４２０）を加えた後、プレートを、異なる時点で読み取った。値は、ＡＤ１０人、及び対照対象１０人に関して、平均のＯＤ±ＳＤとして表現される。
【０２３８】
５．２  結果
抗体ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３を、ＡＤ及び対照の対象からの脳ホモジネート中のホスホタウ（ｐタウ）マルチマーを検出する能力に関して、ホスホ及びマルチマー特異的なセットアップ１のＥＬＩＳＡを用いて試験した。我々は、両抗体についてのこのアッセイにおいて、ＡＤと年齢適合対照（ｎ＝１０）との間の高度に有意な（ｐ＜０．００１）差異を観察した（図１）。ＡＤ及び年齢適合対照の脳からのヒト死後皮質ホモジネートを用いて、我々は、死後ヒト脳試料におけるタウ−ｐＳ３９６のマルチマーを検出する、ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３抗ｐタウ抗体の能力を実証した。
【実施例６】
【０２３９】
結合の研究ＩＶ  −ヒト脳試料上でのウェスタンブロット
６．１  方法
６．１．１．  ヒト試料：方法５．１．１に記載のヒト試料を調製する同じ方法
６．１．２  ウェスタンブロット：ＡＤに冒された個体及び年齢適合対照からのヒト死後皮質脳ホモジネートにおけるリン酸化タウの存在を検出するウェスタンブロットアッセイ
【０２４０】
この研究に使用した抗ヒトタウ抗体は、マウスＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１、ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３であり、すべて、タウｐＳ３９６に対するものであった。総ヒトタウに対するマウスモノクローナルタウ１３抗体（アブカム社（Ａｂｃａｍ）  ａｂ２４６３６）、及びタウｐＳ３９６（アブカム社  ａｂ３２０５７）に対するウサギモノクローナル抗体Ｅ１７８を、対照として用いた。それぞれ２０μｇの総ホモジネートをレーンごとに、１０％のポリアクリルアミドビストリスプレキャストゲル（Ｎｕｐａｇｅ  Ｎｏｖｅｘ  １０％のＢｉｓ−ＴＲＩＳ  Ｍｉｄｉ  Ｇｅｌ、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））上に添加した。タンパク質を、ＮｕＰＡＧＥ  ＭＯＰＳ  ＳＤＳランニング緩衝液（インビトロジェン社ＮＰ０００１）中で、製造元の推奨のとおりに分離した。タンパク質ブロッティングを、ＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ、ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）  ＩＰＦＬ０００１０）上で３時間、２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．６、１９０ｍＭのグリシン緩衝液、２０％のメタノール中、氷上で行った。メンブレンを、ＰＢＳ中１／３に希釈したＬｉｃｏｒブロッキング緩衝液（オデッセイ社（Ｏｄｙｓｓｅｙ））中で、１時間、ブロックキング処理した。メンブレンを一晩、一次抗体を用いて以下の濃度でインキュベートした：０．６μｇ／ｍＬのＴＡＵ−１３、１／５０００に希釈したＥ１７８、０．５３μｇ／ｍＬのＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１、０．４７μｇ／ｍＬのＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１、及び０．５μｇ／ｍＬのＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３、１／３のＬｉｎｃｏｒ緩衝液、及び２／３の０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で希釈。ＰＢＳ−Ｔ中で４回、洗浄した後、メンブレンを、ＬＩＣＯＲ  ８００染料（ヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ  ８００  ＣＷ、オデッセイ社）に室温で１時間、カップリングさせたヤギ抗マウス抗体でインキュベートし、再び４回、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＬＩＣＯＲシステムを用いてスキャンし画像生成した。
【０２４１】
６．２  結果
抗体ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１、ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３を、ＡＤ及び対照の対象からの脳ホモジネートにおけるホスホタウ（ｐタウ）を検出するその能力について、ホスホ特異的ウェスタンブロットを用いて試験した。すべての死後ヒト皮質試料をまず、ヒトタウに対する市販の抗体を用いて評価した：抗総タウ（ＴＡＵ−１３）及び抗ｐＳ３９６タウ（Ｅ１７８）抗体。図２Ａに示すとおり、我々は、ＴＡＵ−１３抗体を用いて、すべての試料に、５０〜７０ｋＤａの範囲の異なるタウアイソマーに対応する特徴的なタウラダーを検出した。興味深いことに、ＡＤ脳ホモジネートでは、我々はまた、ＡＤ脳における過剰リン酸化タウの存在に関して予想されていた、タウの移動パターンにおける相対的なずれを観察した。市販の抗ｐＳ３９６タウ抗体は、この仮説を確認し、対照とＡＤを非常に良好に識別した（図２Ｂ）。実際、抗ｐＳ３９６タウ抗体は、タウの（過剰）リン酸化アイソフォームに対応する、三つの主要な免疫反応性バンドを、すべてのＡＤ脳ホモジネートにおいて、そして健康な対照には、非常に弱い強度で、又は存在しないことを明らかにした。加えて、ＡＤ試料は、凝集タウの存在を反映する可能性の高い、高分子量のＴＡＵ−１３免疫反応性塗抹を示した（図２Ａ）。
【０２４２】
ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１を用いたウェスタンブロッティングは、ホスホタウについて予想されたサイズの二つの免疫反応性タンパク質バンドが、ＡＤ脳ホモジネートには存在するが、しかし対照には存在しないことを明らかにした（図３Ａ）。ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１を用いたウェスタンブロットによる弱い免疫反応は、約３５と約４０ｋＤａでの二つの主要な非特異的バンドの存在により説明することもできる。ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１を用いたウェスタンブロッティングは、ホスホタウについて予想されたサイズの二つの免疫反応性タンパク質バンドが、ＡＤ脳ホモジネートには存在するが、しかし対照には存在しないことを明らかにした（図３Ｂ）。ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１を用いたウェスタンブロットによる弱い免疫反応は、８０ｋＤａと１５０ｋＤａの間での四つの非特異的バンドだけでなく、約４０と約５０ｋＤａでの非特異的バンドの存在により説明することもできる。ＡＣＩ−２Ｇ５−Ａｂ３を用いたウェスタンブロットは、タウの（過剰）リン酸化アイソフォームに対応する三つの主要な免疫反応性バンドが、すべてのＡＤ脳ホモジネートに存在するが、しかし健康な対照には、一人の対照対象（Ｃ２２）を例外として存在しないことを明らかにしたが、この一人にはＡＤの家族歴があった（図３Ｃ）。この報告は、ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１、ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３が、ヒト死後皮質におけるｐＳ３９６タウの存在について、ＡＤと年齢適合対照とを識別することができること、従って、これらのモノクローナル抗体がＡＤ随伴病態タウアイソフォームを認識することを実証した。
【実施例７】
【０２４３】
結合研究Ｖ−セットアップ１  （ヒト脳試料上でのＥＬＩＳＡ）
７．１  方法
７．１．１．  ヒト試料。方法５．１．１．に記載の方法と同じであるが、最後の部分、Ｓ１画分の調整は別であるヒト試料を調製する方法
７．１．２．  Ｓ１タウタンパク質画分：可溶性タウ及びホスホタウタンパク質を得る、総ホモジネート画分の細分画
ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイに使用する可溶性タウ（Ｓ１）画分の調整のため、ＴＨ画分を等分して、半分の体積を−８０℃で保存した。残りのＴＨ画分をさらに処理し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えて最終濃度０．４％にした。試料をよく混合して、何回か攪拌した後、５’０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離した。上清は、Ｓ１画分を構成する。試料を等分し、−８０℃で保存した。タンパク質濃度を、ブラッドフォード試薬を用いて測定した。
【０２４４】
７．１．３．  ＡｌｐｈａＬＩＳＡ：ＡＤに冒された個体及び年齢適合対照からのヒト死後皮質脳ホモジネートにおけるリン酸化タウの存在を検出する、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイ
抗体ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１、ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３は、すべてタウｐＳ３９６に対するものであり、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を用いて、製造元の推奨に従ってビオチン化した。標識化反応においては、抗体に対して２５倍のモル過剰なビオチンを使用した。ビオチン化の後、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  ＭＩＮＩ透析デバイス、１０Ｋ  ＭＷＣＯ（サーモサイエンティフィック社）を用いて、ＰＢＳに対する透析により、過剰な遊離ビオチンを除去した。ビオチン化抗体を、ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１−ＢＴ、ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１−ＢＴ、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３−ＢＴと表した。抗体Ｔａｕ−１３を、活性化したＡｌｐｈａアクセプタービーズ（Ａｌｐｈａ  Ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｂｅａｄｓ）（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））に、以下のプロトコルを用いて結合させた：０．１ｍｇのＴａｕ−１３抗体溶液（タンパク質Ａカラムで精製）を、１ｍｇのＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズペレットと混合し、０．１３Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）で補充して２００μＬの最終反応体積にした。次に、１０％のＴｗｅｅｎ−２０を１．２５μＬ及び２５ｍｇ／ｍＬのＮａＢＨ３ＣＮの溶液１０μＬを加え、チューブを３７℃で４８時間、軽度の回転数（７ｒｐｍ）で回転させてインキュベートした。結合反応の後、ビーズ上の活性部位を、１０μＬのカルボキシメトキシルアミン溶液を加えることによりブロッキング処理し、さらに、３７℃で１時間、インキュベートした。最後に、ビーズを２回、２００μＬの０．１ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄し、２００μＬの保存緩衝液（０．０５％のプロクリン３００を含むＰＢＳ）中に４°Ｃで保存し、最終的に、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ濃度を５ｍｇ／ｍｌにした。
【０２４５】
ＡｌｐｈａＬＩＳＡは、近接化学発光法（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を用いる均質系のアッセイである。もし、Ａｌｐｈａドナー（Ｄｏｎｏｒ）及びアクセプター（Ａｃｃｅｐｔｏｒ）ビーズが近接していると、レーザー励起されるとすぐに、化学反応のカスケードにより増幅信号を生じる。６８０ｎｍで励起が生じるとすぐに、ドナービーズに含まれる光増感剤が、周囲の酸素をさらに反応性の高い一重項酸素種に転換する。これらの一重項酸素は、拡散し（４μｓｅｃの半減期以内に２００ｎｍまで）、アクセプタービーズ中で化学発光反応を生じ、その結果として光が放出される。このアッセイの設定は以下のとおりである：
Ｓ１試料をＡｌｐｈａアッセイ緩衝液（パーキンエルマー  ＡＬ０００Ｃ）中であらかじめ希釈して、２０μｇ／ｍＬの貯蔵濃度を得た。以下の試薬を３８４ウェルの白色のＯｐｔｉＰｌａｔｅ（パーキンエルマー）に加えて、５０μＬの最終体積にした：Ｓ１脳ホモジネート（５μＬ）、１０μＬのＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１−ＢＴ、ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１−ＢＴ、又はＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３−ＢＴは、それぞれ０．２ｎＭ、０．５ｎＭ、又は０．５ｎＭの最終抗体濃度、及び１０μＬのタウ１３−アクセプタービーズ結合体は、２．５μｇ／ｍＬの最終ビーズ濃度。反応混合物を、１時間、室温でインキュベートし、２５μＬのストレプトアビジンドナービーズを加えて、さらに２時間、室温、暗所でインキュベートした。読み出しは、ＥｎＳｐｉｒｅ  Ａｌｐｈａ機器を用いて行い、分析は、ＥｎＳｐｉｒｅ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．００を用いて行った。データの統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて実行した。結果を、Ａｌｐｈａ単位±ＳＤとして表示する。
【０２４６】
７．２  結果
ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイを使用して、抗体ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１、ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３を、死後ヒト脳ホモジネート中のタウｐＳ３９６を検出し、ＡＤを年齢適合対照から識別する能力について試験した。すべての抗体が、タウｐＳ３９６を検出した（図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ）。ＡＤと対照（ｎ＝１０）の間の信号検出の差異はまた、すべての抗体について高度に有意であり、ＡＤ対象の脳において信号の増加を示した；ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１（ｐ＜０．０００１）、ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１（ｐ＜０．０００１）、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３（ｐ＝０．００２）。結論として、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ技術を使用して、ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１、ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３の、ＡＤ対象の脳におけるｐＳ３９６タウを検出し、ＡＤと対照のドナーを差別化する能力を実証した。
【実施例８】
【０２４７】
インビボでのＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３抗体の有効性
８．１  方法
８．１．１．  研究のセットアップ：タウトランスジェニックマウスにおける、抗ｐタウ抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３の投与例２例の、インビボでの治療効果
Ｃ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡの背景を有する、６〜７月齢の雌及び雄のタウトランスジェニックマウス（ＴＭＨＴ）に、ｉ．ｐ．注射により３又は１０ｍｇ／ｋｇのＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３、又はビヒクル（ＰＢＳ）を２回、１週間空けて投与した。１４日目に、免疫組織学（ＩＨＣ）のために、動物を安楽死させ、脳を採取し、処理した。海馬及び扁桃体におけるタウ病態の定量のために、脳１個あたり、５枚の切片（各高さから１枚）を、ＡＴ１８０（タウｐＴ２３１に関して）及びＨＴ７（総ヒトタウ抗体に関して）抗体を用いて標識し、続いて、免疫活性な面積を、Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ（ｖ６．２）ソフトウェアを用いて評価した。免疫活性な対象を、サイズ制限（扁桃体では３０μｍ２、海馬では７μｍ２）以上、及び動態強度閾値以上で測定した。対象の全面積及び強度、並びに各閾値は、自動的に保管した。もし使用した場合には、動態閾値は、強度面積（ａｒｅａ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｉｔｙ）（ＡＯＩ）内の平均強度に加えてＡＯＩ内のピクセル強度の標準偏差を係数倍したものとして定義した。領域サイズは、海馬及び扁桃体を手作業で線引きして測定した。ＡＴ１８０及びＨＴ７のＩＲ面積データは、（海馬では）領域、又は（扁桃体では）ＡＯＩサイズで規格化した。
【０２４８】
８．２  結果
ＡＴ１８０ｐタウ抗体は、内因性でヒトのヒトｐタウ（Ｔｈｒ２３１及びＳｅｒ２３５で二重にリン酸化された）を検出する。この研究で使用したタウトランスジェニックマウスに関しては、ＡＴ１８０の組織学的測定は、海馬の及び類扁桃の神経細胞に対して集中的に行った。ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３で治療したマウスは、扁桃体と海馬の両方で、体細胞標識のＡＴ１８０の平均強度及び規格化された総和強度について有意な減少を有し（図５Ａ及び５Ｂ）、治療マウスにおける、体細胞のＡＴ１８０陽性ｐタウ全体の減少を示していた。
【０２４９】
総ヒト（トランスジェニック）タウに関しては、ＨＴ７抗体を使用した。ＨＴ７は、残基１５９及び１６３の間の正常のヒトタウを認識する。組織学的測定は、海馬の及び類扁桃の神経細胞の免疫反応性細胞体に対して集中的に行った。ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３で治療したマウスは、扁桃体における免疫反応性の総和の及び平均のＨＴ７強度だけでなく、ＨＴ７免疫活性面積も減少させた（図６Ａ）。海馬では、平均強度に関して同じことが観察された（図６Ｂ）。しかしながら、１０ｍｇ／ｋｇで治療したマウスにおいて、海馬における免疫活性面積、及び総和強度に関して、ＨＴ７標識の増加が観察された。海馬に観察されたこの増加は主に、調査した全８匹のマウスのうち３匹のマウスによるものであった。
【０２５０】
ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３治療は、ＡＴ１８０免疫反応性ｐタウレベルを、両方の調査領域において、従って、海馬の及び類扁桃の神経細胞の細胞体において有意に減少させた。扁桃体においては、標識の総和強度は、ＡＴ１８０免疫反応性ｐタウ及びＨＴ７免疫反応性総ヒトタウの両方に関して減少した。３ｍｇ／ｋｇの用量での治療もまた、平均ＨＴ７強度を、両領域にいて有意に減少させた。しかしながら、１０ｍｇ／ｋｇでは、海馬における平均のＨＴ７免疫反応性面積及び総和強度は、対照の治療マウスに対して増大し、ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３治療が、結果として病態ｐタウからの転換をもたらすことを示した。
【実施例９】
【０２５１】
抗ｐタウ抗体のエピトープマッピング
9.1  方法
抗ホスホタウマウスのモノクローナル抗体のエピトープマッピングを、異なるホスホ及び非ホスホペプチドライブラリーを用いてＥＬＩＳＡにより実行した。使用したペプチドライブラリーＴ３のアミノ酸配列を、表１１Ａに示す。各ライブラリーは、ペプチドワクチン中に存在するホスホ及び非ホスホ配列にまたがる、短いビオチン化ペプチドからなる。加えて、ペプチドライブラリーを、抗体に結合するペプチド配列の各残基をアラニン（Ａｌａ）で置換して生成し、それらは表１１Ｂ及び１１Ｃに示すとおりである。各ライブラリーは、ペプチドワクチンに存在するホスホ及び非ホスホ配列にまたがる短いビオチン化ペプチドからなる。ペプチドライブラリーは、ＡＮＡＷＡトレーディングＳＡ社（ＡＮＡＷＡ  Ｔｒａｄｉｎｇ  ＳＡ）から購入した。ペプチドライブラリーは、ＡＮＡＷＡトレーディングＳＡ社Ａから購入した。エピトープマッピングを、製造元（ミモトープス社（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ））の指示に従って行った。簡単に述べると、ストレプトアビジンでコーティングしたプレート（ＮＵＮＣ社）を、リン酸塩緩衝正常生理食塩水（ＰＢＳ）中、０．１％のＢＳＡで、４℃で一晩、ブロッキング処理した。ＰＢＳ−０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０で洗浄の後、プレートを室温で１時間、各ライブラリーからの異なるペプチドでコーティングし、ＰＢＳ中、０．１％のＢＳＡ、０．１％のアジ化ナトリウムで希釈して、１０μＭの最終濃度とした。洗浄の後、プレートを室温で１時間、ＰＢＳ中の２％ＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウム中に４０ｎｇ／ｍｌに希釈した試験抗体でインキュベートした。プレートを再び洗浄した後、ＡＰ結合抗マウスＩｇＧ二次抗体（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ、英国、サフォーク）を用いて、１／６０００希釈で１時間、室温でインキュベートした。最終洗浄の後、プレートを、ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物（ｐＮＰＰ；シグマアルドリッチ社、スイス、ブーフス）ホスファターゼ基質溶液でインキュベートし、２時間のインキュベートした後、４０５ｎｍで、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて読み取った。もし、光学強度（Ｏ．Ｄ．）が、バックグラウンドＯ．Ｄの少なくとも２倍であった場合には、結合は陽性であると考えた。
【０２５２】
９．２  結果
エピトープマッピング実験の結果として、本明細書に開示の抗体が特異的に結合する、必須のリン酸化アミノ酸残基（表５を見られたい）を含め、エピトープを同定することができた。
・  タウ  ａａ  ３９３−４０１、ｐＳ３９６（ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ１；ＡＣＩ−３５−２Ａ１−Ａｂ２）を必須
・  タウ  ａａ  ３９６−４０１、ｐＳ３９６（ＡＣＩ−３５−４Ａ６−Ａｂ１）を必須
・  タウ  ａａ  ３９４−４００、ｐＳ３９６（ＡＣＩ−３５−１Ｄ２−Ａｂ１）を必須
・  タウ  ａａ  ４０２−４０６、ｐＳ４０４（ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ１）を必須
・  タウａａ  ３９３−４００、ｐ３９６（ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ２；  ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３）を必須
【実施例１０】
【０２５３】
ＧＳＫ３βキナーゼを用いた、セリン３９６（ｐＳ３９６）でのタウのリン酸化、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロット分析
１０．１  方法
１６μＭ（２０μｇのタウ／２５μＬの反応物）の最終濃度での、ヒト完全長タウの最長のアイソフォーム（ＴＡＵ４４１；シグマケム社（ＳｉｇｎａｌＣｈｅｍ））を、ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６４（４０ｍＭ）、ＥＧＴＡ（５ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（３ｍＭ）、及びＡＴＰ（２ｍＭ）を含むリン酸化緩衝液中、０．０１８単位（Ｕ）のＧＳＫ３β／ｐｍｏｌのタウで、１、６、又は２０時間、４、３０、又は３７℃で、インキュベートした。ＧＳＫ３βの１単位は、製造元（ニューイングランドバイオラボ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ））によって、１ｐｍｏｌのホスフェートを３０℃でＡＴＰからＣＲＥＢリン酸化ペプチド（ＫＲＲＥＩＬＳＲＲＰｐＳＹＲ）に１分間で転写する酵素量として定義される。ＧＳＫ３βでリン酸化されたタウ（ｐタウ−ＧＳＫ３β）を、セリン２０２、３９６、４０４、４０９、トレオニン１８１、２０５、及び２３１の位置でリン酸化されたタウ、並びに総タウに対する抗体を用い、直接ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット（ＷＢ）上で泳動させて調べ、キナーゼ活性及び特異性（示さず）を最適化し実証した。加えて、ブロットを、ＧＳＫ３βの存在について、抗ＧＳＫ３α／β抗体（バイオソース社、インビトロジェン社)を用いて調べた。すべてのＷＢについて、ｐタウ−ＧＳＫ３βを、等体積の試料緩衝液Ａ（１２５ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ６．８、４％［ｗ／ｖ］のドデシル硫酸ナトリウム［ＳＤＳ］、２０％のグリセロール、０．０１％のブロモフェノールブルー、５％のβ−メルカプトエタノール）を加えて希釈し、試料を９５℃に１０分間、加熱した。３０μｇの試料を、４〜１２％のビストリスゲル（インビトロジェン社）上に載せて、ＭＯＤ  ＳＤＳ緩衝液（インビトロゲン社）中で泳動させ、タンパク質を、転写緩衝液（２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．６、１９０ｍＭのグリシン、２０％のメタノール）中の、０．４５μｍのＰＶＤＦメンブレンに転写した。タンパク質の転写を確認するため、メンブレンを、Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓで５分間、染色した。続いてメンブレンを洗浄した後、１時間、ブロッキング緩衝液（ＴＢＳ［５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．６、１５０μｍＭのＮａＣｌ］中、５％のＢＳＡ）中でブロッキング処理した。メンブレンを４℃で一晩、ブロッキング緩衝液、及び０．１％のＴｗｅｅｎ中、一次抗体で染色した。ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３を用いたブロットを、０．５μｇ／ｍＬの抗体希釈で行った。
【０２５４】
１０．２  結果
ＧＳＫ３βで治療したタウは、異なるタウホスホセリン及びタウホスホトレオニン残基（示さず）に特異的な抗体を用いて確認したとおり、タウセリン３９６（タウ−ｐＳ３９６）でのリン酸化が高度に存在する結果となった。図７に、異なるＧＳＫ３β条件を用いて生成したタウｐＳ３９６に関するＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３抗体を用いてブロットしたメンブレンを示す。ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３抗体は、タウｐＳ３９６について特異的であり、タウｐＳ３９６関して良好な信号を示し、ともに観察されたバンドは、これがタウｐＳ３９６ダイマーに結合することを示唆している（図７、レーン１１、及び１３）。ＧＳＫ３β治療が存在しない場合には、バンドは観察されなかった（レーン６〜８、及び１４〜１５）。
【実施例１１】
【０２５５】
ヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）試料におけるタウ（ｐＳｅｒ３９６）のリン酸化の検出
１１．１  方法
１１．１．１  ヒト試料−死後脳試料
１人のアルツハイマー病（ＡＤ）のドナー、ＡＤ１９の死後の側頭皮質が、マイアミ大学の脳遺贈バンクから得られた。我々は、この研究のための試料提供に関し、マイアミ大学の脳遺贈バンクに心から感謝する。ドナーに関する人口統計学的情報を以下の表１２に示し、その中でブラーク病期(Braak and Braak (1991) Neuropathologicalstageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol 82:239-259)もまた表示する。
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【０２５６】
１１．１．２．  死後脳からのホモジネート画分Ｓ１の調整
ＡＤ１９ドナーの死後の側頭皮質を、以下のプロトコルに従って、ホモジネートした。脳断片を計量し、ホスファターゼ阻害剤（３０ｍＭのＮａＦ、０．２ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１ｎＭのオカダ酸、１ｍＭのＰＭＳＦ、５ｍＭのＮａ４Ｐ２Ｏ７）及びプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ、ロッシュ社（Ｒｏｃｈｅ）  ０４  ６９３  １２４  ００１）を含む、９体積の２５ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ中でホモジネートした。ホモジネートは、ガラス製ポッターを用い氷上で行った。これは、総ホモジネート（Ｔｏｔａｌ  Ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ（ＴＨ））画分を構成する。ＴＨ画分を、半分の体積に等分し、−８０℃で保存した。ＴＨ画分の残りをさらにＴｒｉｔｏｎ  ｘ−１００を加えて処理し、０．４％の最終濃度にした。試料をよく混合し、数回攪拌した後、５’０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離した。上清はＳ１画分から構成される。試料を等分して、−８０℃で保存した。タンパク質濃度を、ブラッドフォード試薬（シグマ社  Ｂ６９１６−５００）を用いて測定した。
【０２５７】
１１．１．３  ヒトＣＳＦ試料
臨床的に確認された軽度〜中程度のアルツハイマー病（ＡＤ）患者、及び健康なボランティア対照ドナー（Ｃｔｒｌ）からの脳脊髄液（ＣＳＦ）試料の提供を、ベルリン医科大学チャリテ（ＣｈａｒｉｔＥ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｂｅｒｌｉｎ）から受けた。我々は、試料提供について、ベルリン医科大学チャリテに、心から感謝する。試料を等分して−８０℃で保存し、それ以上処理せずに使用した。ＣＳＦ試料ドナーに関する人口学的及び臨床的な情報を、以下の表１３に示す。
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【０２５８】
１１．１．４  ＣＳＦタウの免疫濃縮
１１．１．４．１  抗体カップリング
ＣＳＦタウの免疫濃縮に関しては、市販のヒトタウ抗体（クローンＨＴ７、サーモサイエンティフィック社  ＭＮ  １０００）を使用した。ＨＴ７をタンパク質Ｇダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｒａｄｓ）（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）  １０００４Ｄ）にカップリングさせるため、各試料に対して、１．５ｍｇ（５０μＬ）のタンパク質Ｇダイナビーズを、攪拌により再懸濁させて、１．７ｍＬのＭａｘｉｍｕｍ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙチューブ（アキシジェン社（Ａｘｙｇｅｎ）  ＭＣＴ−１７５−Ｌ−Ｃ）に移した。ビーズをチューブ側面に集めて緩衝液を除去するため、チューブを磁気支持体（ＤｙｎａＭａｇ、ライフテクノロジーズ社  １２３．２１Ｄ）上に置いた。２００μＬのＰＢＳ中、１μｇのＨＴ７を、Ｈｕｌａ  Ｍｉｘｅｒ（ライフテクノロジーズ社）を用い、１０／２０ｒｐｍ、２５°／１０のｔｉｌｔ、  ５°／２のｖｉｂｒｏで１０分間、タンパク質Ｇダイナビーズに結合させた後、チューブを磁石上に置き、緩衝液を除去し、チューブを１回、２００μＬのＰＢＳ／０．０２％のＴｗｅｅｎ２０を用い優しいピペット操作で、そして２回、２００μＬの結合緩衝液（新たに調製した、２０ｍＭのリン酸Ｎａ、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で、洗浄した。洗浄緩衝液は常に、磁石上で除去した。ＨＴ７をタンパク質Ｇダイナビーズへ架橋させるために、ＨＴ７−ビーズを、結合緩衝液中に溶解させた５ｍＭのＢＳ３溶液（シグマアルドリッチ社  Ｓ５７９９）２５０μＬの中に再懸濁させて、室温（ＲＴ）で３０分間、回転させて（上のセッティングと同じ）、インキュベートし、１２．５μＬのクエンチング緩衝液（１ＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５）を１５分間、加えて反応を停止させた後、２００μＬのＰＢＳ／０．０２％のＴｗｅｅｎ  ２０で３回、洗浄した。
【０２５９】
１１．１．４．２  ＣＳＦタウの免疫濃縮
ＣＳＦを希釈せずに使用し、各ドナーについて１ｍＬのＣＳＦを、ＨＴ７架橋ビーズを含むチューブに移し、４℃で１時間、連続回転（１０ｒｐｍ）下でインキュベートした。結合しなかった物質を磁石上で除去した後、ビーズを２００μＬのＰＢＳ／０．０２％のＴｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、タウを、ＰＢＳ中、２０μＬの１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中に、７０℃で１０分間、溶出した。ビーズの沈降を避けるために、チューブを短時間（加熱した水平ミキサー中、３００ｒｐｍで１分ごとに５秒間）混合した。このインキュベーションの後、チューブを磁石上に置いて、溶出試料を集めた。
【０２６０】
陽性対照として、タウをまた、ヒト脳ホモジネートから濃縮した。このため、ＡＤ１９ドナーからのヒト脳Ｓ１画分の一連の希釈物をＰＢＳ中で調整した（０．５μｇ／ｍＬ、０．１７μｇ／ｍＬ、０．０５６μｇ／ｍＬ、０．０１９μｇ／ｍＬ、０．００６μｇ／ｍＬ、０．００２μｇ／ｍＬ、０．０００７μｇ／ｍＬ）。次に、各試料（１ｍＬ）を、上に記載のとおりに処理し、２５μＬ１％のＳＤＳに溶出した。
【０２６１】
１１．１．５  ＡｌｐｈａＬＩＳＡ
１１．１．５．１  ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイの記述
【０２６２】
ＡｌｐｈａＬＩＳＡは、ビーズを用いるＡｌｐｈａ技術を用いる均質系アッセイである。ＡｌｐｈａＬＩＳＡを、工程数が最小限であるということ及び感度に基づき、技術プラットホームとして選択した。簡潔に述べると、アッセイは、ビーズの近接性に基づいている。６８０ｎｍで励起されると、ドナービーズを含む光増感剤が、周囲の酸素を一重項酸素種に転換し、これらが（４μｓｅｃの半減期以内で２００ｎｍまで）拡散し、アクセプタービーズに化学発光反応を生成させる結果、光が放出される。
【０２６３】
我々の実験に使用したアッセイのセッティングは、以下のとおりである（図８も見られたい）：
・  Ａｌｐｈａアクセプタービーズにカップリングした、汎タウ（Ｐａｎ−Ｔａｕ）抗体タウ−１３（アブカム社（Ａｂｃａｍ）  ａｂ２４６３６）が、試料中に存在するヒトタウに結合し、「タウタンパク質−タウ−１３抗体−アクセプタービーズ」複合体を形成する。
・  検出抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３−ＢＴが、ヒトタウのｐＳ３９６に結合することにより、ストレプトアビジン（ＳＡｖ）でコーティングしたＡｌｐｈａドナービーズが複合体に結合する。
すべての試薬を反応させた後、化学発光信号を、ＥｎＳｐｉｒｅ  Ａｌｐｈａ  ２３９０リーダーを用いて読み出す。
【０２６４】
１１．１．５．２  ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３抗体のビオチン化
ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイで使用するため、抗体ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３を、製造元の指示に従って、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック社  ２１９３５）を用いてビオチン化した。抗体に対し２５倍過剰のモル数のビオチンを、標識反応に用いた。ビオチン化の後、過剰の遊離ビオチンを除去し、抗体を４回、ＰＢＳ中で、５０’０００  ＭＷＣＯ  Ｓｐｉｎ−Ｘ  ＵＦ  ５００  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ）  ４３１４８０）を用いて洗浄した。ビオチン化したＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３抗体を、ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３−ＢＴと表示する。
【０２６５】
１１．１．５．３  ＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズへのタウ−１３抗体のカップリング
ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイで使用するため、抗体タウ−１３を、活性化Ａｌｐｈａアクセプタービーズ（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）  ６７７２００１）に結合させた。以下の結合プロトコルを使用した：０．１ｍｇのタウ−１３抗体溶液（タンパク質Ａカラム上で精製）を、１ｍｇのＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズのペレットと混合し、０．１３Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）で補充し、最終反応体積の２００μＬとした。次に、１０％のＴｗｅｅｎ−２０を１．２５μＬ、及び２５ｍｇ／ｍＬのＮａＢＨ３ＣＮ溶液１０μＬを加え、チューブを３７℃で４８時間、優しく回転（７ｒｐｍ）させてインキュベートした。結合反応の後、ビーズ上の活性部位を、１０μＬのカルボキシメトキシルアミン溶液を加えることによりブロッキング処理し、さらに３７℃で１時間、インキュベートした。最後に、ビーズを２回、２００μＬの０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄し、２００μＬの保存緩衝液（０．０５％のプロクリン−３００を含むＰＢＳ）中、最終のＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ濃度５ｍｇ／ｍｌとして、４℃で保存した。
【０２６６】
１１．１．５．４  脳ｐＳ３９６−タウを用いた定量の検出限界
免疫濃縮したタウ脳試料、Ｓ１脳画分試料及び緩衝液ブランクを、この実験に使用した。各試料を、５０μＬの最終体積中で、３８４ウェルの白色ＯｐｔｉＰｌａｔｅ（パーキンエルマー社  ６００７２９１）を用いて分析した。すべての試薬の希釈を、Ａｌｐｈａアッセイ緩衝液（パーキンエルマー社  ＡＬ０００Ｃ）を用いて行った。
・  ５μＬの試料（最終体積の１／１０、従って、アッセイにおける最終タンパク質濃度は、試料濃度の１／１０に相当する）。
・  Ｓ１脳画分試料については０．５％のＳＤＳ、１０μＬを、又は免疫濃縮されたタウ脳試料については１０μＬの単独の緩衝剤を加えた。
・  １５μＬのＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３−ＢＴ抗体（最終濃度：５ｎＭ）をタウ１３−アクセプタービーズ結合体と混合させた（最終ビーズ濃度：２．５μｇ／ｍＬ）。
・  室温で１時間、インキュベート。
・  ２０μＬのストレプトアビジンドナービーズ（最終ビーズ濃度：２５μｇ／ｍＬ）。
・  室温３０分、インキュベート（遮光）。
・  ＥｎＳｐｉｒｅ  Ａｌｐｈａ機器を用いて読み取り、ＥｎＳｐｉｒｅ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．００を用いて分析。
【０２６７】
１１．１．５．５  ＣＳＦ中の免疫濃縮されたｐＳ３９６−タウの定量
各試料を、５０μＬの最終体積中で、３８４ウェルの白色ＯｐｔｉＰｌａｔｅ（パーキンエルマー社  ６００７２９１）を用いて分析した。すべての試薬の希釈を、Ａｌｐｈａアッセイ緩衝液（パーキンエルマー社  ＡＬ０００Ｃ）を用いて行った。
・  各ドナーから免疫沈降させた溶出物５μＬ。
・  ２０μＬのＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３−ＢＴ抗体（最終濃度：５ｎＭ）を、タウ１３−アクセプタービーズ結合体と混合（最終ビーズ濃度：２．５μｇ／ｍＬ）。
・  室温で１時間、インキュベート。
・  ２５μＬのストレプトアビジンドナービーズ（最終ビーズ濃度：２５μｇ／ｍＬ）。
・  室温で３０分、インキュベート（遮光）。
・  ＥｎＳｐｉｒｅ  Ａｌｐｈａ機器で読み出し、ＥｎＳｐｉｒｅ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．００で分析。
【０２６８】
１１．１．６  統計解析
データの統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて実行した。
【０２６９】
１１．２  結果
予備実験からは、ヒトＣＳＦ中に存在するｐＳ３９６の量が、検出するには少なすぎることが示された。この理由から、高感度免疫検出と組み合わせた免疫学的濃縮プロトコルを開発した。免疫学的濃縮プロトコルを最初に、ヒトＡＤ死後脳物質を用いて確認した。未処理の脳ホモジネート試料の、タウ免疫学的濃縮試料との対照比較から、対応する濃度では、タウ１３／ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３  ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイの検出限界は、未処理の試料については０．５μｇ／ｍＬ、免疫学的に濃縮した試料については０．００２〜０．００６μｇ／ｍＬの間に達し、１００倍の濃縮を示すことが明らかになった（図９）。
【０２７０】
次に、免疫学的濃縮プロトコルを、生きたドナーＣＳＦ試料（軽度から中程度のＡＤ患者についてはｎ＝１７、年齢適合させた健康なボランティアについてはｎ＝１６）に適用した。得られたデータ（図１０）から：ａ）免疫学的濃縮プロトコルの後、タウ１３／ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３のＡｌｐｈａＬＩＳＡは、すべてのヒトＣＳＦ試料中のｐＳ３９６−タウを検出したこと；及びｂ）さらに重要なことには、対照と比較した場合、ＡＤのＣＳＦ中のｐＳ３９６−タウの量に有意な増加が観察された（マン・ホイットニーの検定によりｐ＝０．０００３）ことが示された。
【０２７１】
結論として、免疫学的濃縮／免疫検出プロトコルを開発し、ヒトＣＳＦ中のｐＳ３９６−タウを検出することが可能になった。軽度から中程度のＡＤのＣＳＦにおけるｐＳ３９６−タウの増加は、この方法が、疾患の進行、患者の層別化、及び治療有効性を評価する臨床学的生物マーカー研究において成功裏に使用できる可能性があることを示唆している。ＡＣＩ−３５−２Ｇ５−Ａｂ３抗体は、すべてのヒトＣＳＦ試料中のｐＳ３９６−タウを検出し、さらに重要なことには、抗体は、対照と比較した場合に、ＡＤのＣＳＦを識別することができた。  
【０２７２】
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【０２７３】
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【０２７４】
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【０２７５】
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【０２７６】
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【０２７７】
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【０２７８】
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【０２７９】
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【０２８０】
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【０２８１】
寄託：
表１０．  以下のハイブリドーマ細胞株を、ＡＣ  Ｉｍｍｕｎｅ  ＳＡ社  スイス  ローザンヌ  １０１５  ＰＳＥ−ＥＰＦＬビルディング  Ｂ（ＰＳＥ−ＥＰＦＬ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  Ｂ，  １０１５  Ｌａｕｓａｎｎｅ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、及びルーヴェンカトリック大学  ベルギー  ルーヴェン  ３０００、  ワアイストラート  ６−Ｂｏｘ  ５１０５（Ｗａａｉｓｔｒａａｔ  ６  −  Ｂｏｘ  ５１０５，  ３０００  Ｌｅｕｖｅｎ／Ｂｅｌｇｉｕｍ）の名のもとで、「ドイツ微生物収集および細胞培養（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）ＧｍｂＨ  （ＤＳＭＺ）ブラウンシュヴアイヒ  ３８１２４  インホッフェンシュトラーセ  ７Ｂ（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ７  Ｂ，  ３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）」に、ブダペスト条約の定めるところに従って寄託した：
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【０２８２】
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【０２８３】
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【０２８４】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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