(57)【要約】  磁性グラフェン様ナノ粒子あるいは黒鉛ナノまたは微小粒子は、高い緩和能を呈し、ＭＲＩ造影剤として有用である。十分な量の磁性グラフェン様ナノ粒子あるいは黒鉛ナノまたは微小粒子と、１つ以上の生理学的に容認可能な担体または賦形剤とを含む、ＭＲＩ撮像とともに使用するための組成物。ＭＲＩ造影剤として磁性グラフェン様ナノ粒子あるいは黒鉛ナノまたは微小粒子を使用する方法。磁性グラフェン様ナノ粒子あるいは黒鉛ナノまたは微小粒子を生産する方法。
2014516206.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性金属と、グラフェン様ナノ構造あるいは黒鉛ナノまたは微細構造を備える、磁性組成物。
【請求項２】
前記黒鉛ナノまたは微細構造は、５μｍ以下の厚さを有する、請求項１に記載の磁性組成物。
【請求項３】
約１０ｍＭ−１ｓ−１以上の緩和能ｒ１を有する、請求項１に記載の磁性組成物。
【請求項４】
約２０ｍＭ−１ｓ−１以上の緩和能ｒ１を有する、請求項３に記載の磁性組成物。
【請求項５】
約４５ｍＭ−１ｓ−１以上の緩和能ｒ１を有する、請求項３に記載の磁性組成物。
【請求項６】
前記黒鉛ナノまたは微細構造は、１〜５μｍの厚さを有する、請求項２に記載の磁性組成物。
【請求項７】
前記グラフェン様ナノ構造は、約２０ｎｍ以下の厚さを有する、請求項１に記載の磁性組成物。
【請求項８】
前記グラフェン様ナノ構造は、炭素の１〜１２原子層を備える、請求項７に記載の磁性組成物。
【請求項９】
前記グラフェン様ナノ構造は、炭素の１原子層を備える、請求項８に記載の磁性組成物。
【請求項１０】
前記グラフェン様ナノ構造は、炭素の２原子層を備える、請求項８に記載の磁性組成物。
【請求項１１】
前記グラフェン様ナノ構造は、炭素ナノプレートレットおよび炭素ナノリボンから成る群より選択される、請求項７に記載の磁性組成物。
【請求項１２】
前記グラフェン様炭素ナノ構造は、５〜１００ｎｍの範囲内の平均直径を有する、炭素ナノプレートレットである、請求項１１に記載の磁性組成物。
【請求項１３】
前記炭素ナノプレートレットは、約２０ｎｍの平均直径を有する、請求項１２に記載の磁性組成物。
【請求項１４】
前記炭素ナノプレートレットは、約５０ｎｍの平均直径を有する、請求項１２に記載の磁性組成物。
【請求項１５】
前記グラフェン様ナノ構造は、１〜２５０ｎｍの範囲内の平均幅、および２００〜５０００ｎｍの範囲内の平均長を有する、炭素ナノリボンである、請求項７に記載の磁性組成物。
【請求項１６】
前記炭素ナノリボンは、約１２０ｎｍの平均幅、および６００〜２０００ｎｍの範囲内の平均長を有する、請求項１５に記載の磁性組成物。
【請求項１７】
前記炭素ナノプレートレットは、酸化ナノプレートレットである、請求項７に記載の磁性組成物。
【請求項１８】
前記磁性金属は、Ｍｎ、Ｇｄ、およびＦｅから成る群より選択される、請求項１に記載の磁性組成物。
【請求項１９】
前記磁性金属は、Ｍｎである、請求項１８に記載の磁性組成物。
【請求項２０】
前記Ｍｎは、Ｍｎ酸化物の中に存在する、請求項１９に記載の磁性組成物。
【請求項２１】
前記Ｍｎ酸化物は、二価および／または三価Ｍｎを含む、請求項２０に記載の磁性組成物。
【請求項２２】
前記Ｍｎ酸化物は、ハウスマン鉱を含む、請求項２１に記載の磁性組成物。
【請求項２３】
１ｐｐｂ〜１０６ｐｐｍの範囲内の量でＭｎを含む、請求項１９に記載の磁性組成物。
【請求項２４】
前記グラフェン様ナノ構造は、炭素ナノプレートレットであり、前記磁性組成物は、１０６〜１０７ｐｐｍの範囲内の量でＭｎを含む、請求項２３に記載の磁性組成物。
【請求項２５】
前記磁性組成物は、約５×１０６ｐｐｍの量でＭｎを含む、請求項２４に記載の磁性組成物。
【請求項２６】
前記グラフェン様ナノ構造は、炭素ナノリボンであり、前記磁性組成物は、１０２〜１０３ｐｐｍの範囲内の量でＭｎを含む、請求項２３に記載の磁性組成物。
【請求項２７】
前記磁性組成物は、５×１０２ｐｐｍの量でＭｎを含む、請求項２６に記載の磁性組成物。
【請求項２８】
前記磁性金属は、Ｇｄである、請求項１８に記載の磁性組成物。
【請求項２９】
前記磁性金属は、Ｆｅである、請求項１８に記載の磁性組成物。
【請求項３０】
ＭｎおよびＦｅの両方を含む、請求項１に記載の磁性組成物。
【請求項３１】
前記グラフェン様ナノ構造は、炭素ナノリボンである、請求項３０に記載の磁性組成物。
【請求項３２】
前記グラフェン様ナノ構造あるいは黒鉛ナノまたは微細構造に付着した水溶性化部分をさらに含む、請求項１に記載の磁性組成物。
【請求項３３】
前記水溶性化部分は、前記グラフェン様ナノ構造あるいは黒鉛ナノまたは微細構造に共有結合している、請求項３２に記載の磁性組成物。
【請求項３４】
前記水溶性化部分は、前記グラフェン様ナノ構造あるいは黒鉛ナノまたは微細構造に付着した、マロン酸およびセリノールマロノジアミドから成る群より選択される、請求項３２に記載の磁性組成物。
【請求項３５】
（ｉ）請求項１〜３４のいずれか一項に記載の十分な量の磁性組成物と、（ｉｉ）１つ以上の生理学的に容認可能な担体または賦形剤とを含む、磁気共鳴映像法とともに使用するための組成物。
【請求項３６】
対象の磁気共鳴映像法を行う方法であって、
（ａ）請求項１〜３４のいずれか一項に記載の十分な量の磁性組成物を前記対象に投与することと、
（ｂ）磁気共鳴映像デバイスを使用して、前記対象を撮像することと、
を含む、方法。
【請求項３７】
前記対象は、ほ乳類である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ほ乳類は、ヒトである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
対象の磁気共鳴映像法のための請求項１〜３４のいずれか一項に記載の磁性組成物の使用。
【請求項４０】
磁性金属と、グラフェン様炭素ナノ構造とを含む、磁性組成物を生産する方法であって、
（ａ）硫酸Ｈ２ＳＯ４、硝酸ナトリウムＮａＮＯ３、ＭｎＣｌ２、および過マンガン酸カリウムＫＭｎＯ４の混合物で黒鉛を処理することと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた生成物の懸濁液を超音波で分解し、それにより、前記磁性組成物を生産することと、
を含む、方法。
【請求項４１】
（ｃ）還元剤で前記磁性組成物を処理することをさらに含む、
請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記還元剤は、ヒドラジン水和物である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
磁性金属と、グラフェン様炭素ナノ構造とを含む、磁性組成物を生産する方法であって、
（ａ）硫酸Ｈ２ＳＯ４、ＭｎＣｌ２、および過マンガン酸カリウムＫＭｎＯ４で多層炭素ナノチューブを処理することを含む、
方法。
【請求項４４】
前記ステップ（ａ）は、
（ａ１）Ｈ２ＳＯ４の中で前記多層炭素ナノチューブを懸濁させることと、
（ａ２）ＫＭｎＯ４およびＭｎＣｌ２を添加することと、
（ａ３）ステップ（ａ２）で得られた混合物を加熱することと、
を含む、方法によって実行される、
請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ステップ（ａ３）で、前記混合物は、５５〜７０℃まで加熱される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記磁性組成物を水溶性化することをさらに含む、請求項４０〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の参照］
本願は、その内容が、参照することによりその全体として本明細書に組み込まれる、２０１１年５月６日出願の米国仮出願第６１／４８３３０９号に対する優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、磁性グラフェン様ナノ粒子あるいは黒鉛ナノまたは微小粒子、およびそれらの生産方法に関する。本発明はまた、ＭＲＩ造影剤として磁性グラフェン様ナノ粒子あるいは黒鉛ナノまたは微小粒子を使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
ＭＲＩは、主に、多くの病変および疾患の向上した診断のために、解剖学的詳細を非侵襲的にレンダリングするために使用されている（非特許文献１、非特許文献２）。ＭＲＩの開発は、同時に、感度および診断の信頼を増加させることによって病変の検出を向上させる、造影剤（ＣＡ）と呼ばれる化学コントラスト強化製品の使用の増加につながってきた。
【０００４】
２つの主な種類は、Ｔ１およびＴ２ＭＲＩ  ＣＡであり、それぞれ、水プロトンの縦Ｔ１および横Ｔ２緩和時間に影響を及ぼす（短縮する）。水プロトンの緩和プロセスを加速する、それらの有効性の定量的尺度は、緩和能として知られており、ＭＲＩ  ＣＡの単位濃度あたりの緩和速度（緩和時間の逆数）の変化である。広く使用されている臨床Ｔ１ＭＲＩ  ＣＡは、主に、金属イオンキレート錯体として合成され、金属イオンは、ランタノイド元素ガドリニウム（Ｇｄ３＋）、または内部遷移元素マンガン（Ｍｎ２＋）である。過去３０年で行われた実験的および理論的研究の大半が、現在、これらの常磁性イオンキレート錯体の緩和能に影響を及ぼす、緩和機構、ならびに根本的な構造、化学、および分子力学性質の良好な理解を提供する（非特許文献３、非特許文献４、および非特許文献５）。理論は、これらのＭＲＩ造影剤の緩和能が準最適であり、少なくとも最大で５０倍から１００倍優れた緩和能の新しい造影剤を開発する可能性を予測する（非特許文献６、および非特許文献７）。
【０００５】
ほとんどの臨床ＭＲＩ  ＣＡは、ガドリニウム（Ｇｄ３＋）イオンベースのＴ１ＣＡ等の輝度が明確なコントラストを生じさせるようにＭＲ信号を強化する、常磁性Ｔ１加重ＣＡである。重度腎疾患がある、または肝臓移植後の一部の患者における腎性全身性線維症（ＮＳＦ）の近年の発見が、Ｇｄ３＋イオンベースのＥＣＦ  ＭＲＩ  ＣＡの臨床用途への米国食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ；ＦＤＡ）による制限につながる懸念を生成してきた（非特許文献８）。
【０００６】
近年、元素マンガンが、ガドリニウムに対する可能な代替案として注目を集めている。マンガンは、ＭＲＩ用の常磁性造影剤の実施例として早い時期に報告された。ランタニドと違って、それは、Ｃａ２＋に類似する天然細胞成分であり、しばしば、酵素および受容体のための調節補因子として機能する。マンガンの正常な１日の食事所要量が、３〜８μｍｏｌである一方で、正常な血中濃度は、０．００１μｍｏｌ／ｌである。マンガンの毒性は、神経症状をもたらす、長期暴露後、または高濃度でしか報告されていない（非特許文献２）。
【０００７】
過去１０年間にわたって、Ｇｄ３＋金属イオンをカプセル化する、ガドフラーレン（Ｇｄ＠Ｃ６０、Ｇｄ＠Ｃ８０、およびＧｄ＠Ｃ８２として表される）およびガドナノチューブ（Ｇｄ＠ＵＳチューブ、ＵＳチューブ＝超短ＳＷＮＴとして表される）等の炭素ナノ構造が、ＭＲＩ用のＴ１ＣＡとして提案されてきた（非特許文献１）。これらの錯体の開発における合成方策は、炭素ナノチューブまたはナノダイヤモンド等の炭素ナノ構造の外部炭素シート上に複数のＧｄ３＋キレート錯体を共有または非共有的に官能化すること（非特許文献９、および非特許文献１０）、またはフラーレン（別名ガドフラーレン）（非特許文献１１、非特許文献１２、および非特許文献１３）および単層炭素ナノチューブ（別名ガドナノチューブ）（非特許文献１４、および非特許文献１５）等の炭素ナノ構造の炭素シート内でのＧｄ３＋イオンのカプセル化に焦点を当ててきた。これらのＧｄ３＋イオン炭素ナノ構造は、低い磁場から高い磁場（０．０１〜３Ｔ）で最高緩和能を示す、ガドナノチューブを伴うＧｄ３＋キレート錯体と比較して、（磁場に応じて）緩和能の２倍から２次数の間の増加を示す。しかしながら、ＭＲＩ  ＣＡとしてのＭｎ２＋イオン炭素ナノ構造錯体の潜在性および効力は、依然として調査されていない。
【０００８】
ガドナノチューブの変動磁場（０．０１〜３Ｔ）緩和能または核磁気共鳴分散（ＮＭＲＤ）プロファイルは、任意の他のＭＲＩ  ＣＡについて得られるものとは特徴的に異なり、それらの緩和機構は、良く理解されていない。この理解の不足の主な理由としては、非常に高いレベルの純度で調製し、明確に特徴付けることができる、Ｇｄ３＋イオンキレートと違って、炭素ナノ構造Ｇｄ３＋イオン系は、主に、それらの微粒子性質、ならびにそれらの化学、幾何学、および磁気特性を、ＭＲＩ造影剤としてのそれらの性質に結び付ける複雑な関係により、かなり複雑である。それにもかかわらず、ナノ多孔性構造内のＧｄ３＋イオンの幾何学的閉じ込めが、１つの理由であり得る（非特許文献１５、および非特許文献１６）。シリコン（非特許文献１５）またはゼオライト（非特許文献１６）のナノ多孔性構造の中へのＧｄ３＋イオンの閉じ込めが、Ｇｄ３＋キレート化合物と比較して、緩和能を２倍から４倍増加させる一方で、Ｇｄ３＋イオンが単層炭素ナノチューブ内に閉じ込められたときのみ（非特許文献１４、および非特許文献１５）、他のＧｄ３＋イオンベースの錯体について報告されたものとは有意に異なるＮＭＲＤプロファイルを伴って、（磁場強度にかかわらず）緩和能の１桁以上の増加が存在している。加えて、現在まで、緩和能の高い増加および非従来的なＮＭＲＤプロファイルが、グラフェンシートから形成された継ぎ目のない円筒である、単層炭素ナノチューブに閉じ込められた常磁性イオンに特有であるか、または他のグラフェンあるいは黒鉛構造に閉じ込められた常磁性イオンについて一般的に観察されるかどうかを系統的に調査するような、いかなる研究も行われていない。
【０００９】
炭素の２次元（２Ｄ）ナノ構造であるグラフェンは、種々の材料および生物医科学用途の潜在性を示し、大いに注目を集めてきた（非特許文献１７）。理論的研究が、グラフェンにおける種々の磁気現象を予測し（非特許文献１８）、現在まで、これらの効果のうちのわずかが、実験的に探求されてきた（非特許文献１９）。近年、単純な過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ４）ベースの酸化化学手順が、黒鉛およびＭＷＣＮＴ等の出発原料を使用した酸化黒鉛、グラフェンナノプレートレット、およびグラフェンナノリボンの大規模生産で使用されてきた（非特許文献２０、および非特許文献２１）。本作業では、これらの技法の修正されたプロトコルを使用して合成された酸化黒鉛、グラフェンナノプレートレット、およびグラフェンナノリボンの物理化学的性質を特徴付けるように、実験的研究が行われた。我々は、微量のＭｎ２＋イオンが、合成プロセス中にグラフェンシート内に閉じ込められ（挿入され）、この閉じ込めが、一般的に、常磁性キレート化合物と比較して、緩和能を大幅に増加させ（最大で２次数）、これらの材料が、常磁性キレートのものとは異なるＮＭＲＤプロファイルを伴って、多様な構造、化学、および磁気性質を示すことを実証している。
【００１０】
近年の報告は、グラフェンナノプレートレット（ＧＮＰ）およびグラフェンナノリボン（ＧＮＲ）の手ごろな大規模生産が、化学的技法を使用することによって可能であることを示している（非特許文献２２、非特許文献２０、非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２１、非特許文献２５、非特許文献２６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓｉｔｈａｒａｍａｎ，Ｂ．＆  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｌ．Ｊ．、“Ｇａｄｏｆｕｌｌｅｒｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇａｄｏｎａｎｏｔｕｂｅｓ：  Ａ  ｎｅｗ  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ａｇｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ”、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３，３４２−３５２（２００７）
【非特許文献２】Ｐａｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．、“Ｒｅｖｉｓｉｔｉｎｇ  ａｎ  ｏｌｄ  ｆｒｉｅｎｄ：  ｍａｎｇａｎｅｓｅ−ｂａｓｅｄ  ＭＲＩ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ａｇｅｎｔｓ”、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（ＷＩＲＥｓ）  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３，１６２−１７３（２０１０）
【非特許文献３】Ａｉｍｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２７：１９−２９
【非特許文献４】Ｃａｒａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９、Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９９：２２９３−２３５２、
【非特許文献５】Ｌａｕｆｆｅｒ、１９８７、Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ８７：９０１−９２７
【非特許文献６】Ｍｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、２００１、“Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ”、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、４７１
【非特許文献７】Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．、２００９、Ａｃｃｏｕｎｔｓ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  ４２：９３８−９４７
【非特許文献８】Ｇｉｒｄｈａｒ，Ｇ．＆  Ｂｌｕｅｓｔｅｉｎ，Ｄ．、“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｓｈｅａｒ  Ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｉｃｅｓ”、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ５、１６７−１８１（２００８）
【非特許文献９】Ｒｉｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、２００８、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ８：２３２−２３６
【非特許文献１０】Ｍａｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００９、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：４８４−４８９
【非特許文献１１】Ｔｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、２００５、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２７：７９９−８０５
【非特許文献１２】Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００３、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２５：４３９１−４３９７
【非特許文献１３】Ｆａｔｏｕｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００６、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２４０：７５６−７６４
【非特許文献１４】Ｓｉｔｈａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００５、Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ：３９１５−３９１７
【非特許文献１５】Ａｎａｎｔａ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０、Ｎａｔｕｒｅ  ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：８１５−８２１
【非特許文献１６】Ｂｒｅｓｉｎｓｋａ  Ｉ、１９９４、Ｊ  Ｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  ９８：１２９８９−１２９９４
【非特許文献１７】Ｎｏｖｏｓｅｌｏｖ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、“Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄ  ｅｆｆｅｃｔ  ｉｎ  ａｔｏｍｉｃａｌｌｙ  ｔｈｉｎ  ｃａｒｂｏｎ  ｆｉｌｍｓ”、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０６，６６６（２００４）
【非特許文献１８】Ｍａｋａｒｏｖａ、２００４、Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒｓ  ３８：６１５−６３８
【非特許文献１９】Ｗａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．、“Ｒｏｏｍ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｆｅｒｒｏｍａｇｎｅｔｉｓｍ  ｏｆ  ｇｒａｐｈｅｎｅ”、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ９、２２０−２２４（２００８）
【非特許文献２０】Ｓｔａｎｋｏｖｉｃｈ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｇｒａｐｈｅｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｎａｎｏｓｈｅｅｔｓ  ｖｉａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｆｏｌｉａｔｅｄ  ｇｒａｐｈｉｔｅ  ｏｘｉｄ”、Ｃａｒｂｏｎ  ４５、１５５８−１５６５（２００７）
【非特許文献２１】Ｋｏｓｙｎｋｉｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．、“Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  ｕｎｚｉｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅｓ  ｔｏ  ｆｏｒｍ  ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｎａｎｏｒｉｂｂｏｎｓ”、Ｎａｔｕｒｅ  ４５８、８７２−８７６（２００９）
【非特許文献２２】Ｓｔａｎｋｏｖｉｃｈ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、“Ｓｔａｂｌｅ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇｒａｐｈｉｔｉｃ  ｎａｎｏｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｆｏｌｉａｔｅｄ  ｇｒａｐｈｉｔｅ  ｏｘｉｄｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙ  （ｓｏｄｉｕｍ  ４−ｓｔｙｒｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）”、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６、１５５−１５８（２００６）
【非特許文献２３】Ｓｔａｎｋｏｖｉｃｈ，Ｓ．、Ｐｉｎｅｒ，Ｒ．、Ｎｇｕｙｅｎ，Ｓ．、＆  Ｒｕｏｆｆ，Ｒ．、“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｘｆｏｌｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｏｃｙａｎａｔｅ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ  ｎａｎｏｐｌａｔｅｌｅｔｓ”、Ｃａｒｂｏｎ  ４４、３３４２−３３４７（２００６）
【非特許文献２４】Ｌｉ，Ｄ．、Ｍｕｌｌｅｒ，Ｍ．、Ｇｉｌｊｅ，Ｓ．、Ｋａｎｅｒ，Ｒ．、＆  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇ．、“Ｐｒｏｃｅｓｓａｂｌｅ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｎａｎｏｓｈｅｅｔｓ”、Ｎａｔｕｒｅ  ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３，１０１−１０５（２００８）、
【非特許文献２５】Ｈｉｇｇｉｎｂｏｔｈａｍ，Ａ．、Ｋｏｓｙｎｋｉｎ，Ｄ．、Ｓｉｎｉｔｓｋｉｉ，Ａ．、Ｓｕｎ，Ｚ．、＆  Ｔｏｕｒ，Ｊ．、“Ｌｏｗｅｒ−Ｄｅｆｅｃｔ  Ｇｒａｐｈｅｎｅ  Ｏｘｉｄｅ  Ｎａｎｏｒｉｂｂｏｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｕｌｔｉｗａｌｌｅｄ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｎａｎｏｔｕｂｅｓ”、ＡＣＳ  ｎａｎｏ  ４、２０５９−２０６９（２０１０）
【非特許文献２６】Ｇｅｎｇ，Ｙ．、Ｗａｎｇ，Ｓ．、＆  Ｋｉｍ，Ｊ、“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒａｐｈｉｔｅ  ｎａｎｏｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ａｎｄ  ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｓｈｅｅｔｓ”、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３６、５９２−５９８（２００９）
【非特許文献２７】Ｇｅｉｍ  ａｎｄ  Ｎｏｖｏｓｅｌｏｖ、２００７、“Ｔｈｅ  ｒｉｓｅ  ｏｆ  ｇｒａｐｈｅｎｅ”、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ６（３）：１８３−１９１
【非特許文献２８】Ｂｉｎｇｅｌ，Ｃ．、１９９３、“Ｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｉｅｒｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｆｕｌｌｅｒｅｎｅｎ”、Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ｂｅｒｉｃｈｔｅ  １２６（８）：１９５７
【非特許文献２９】Ｓｉｔｈａｍａｒａｎ，Ｂ．；Ｚａｋｈａｒｉａｎ，Ｔ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２００８、５、５６７
【非特許文献３０】Ｈｕｍｍｅｒｓ  Ｊｒ，Ｗ．  ＆  Ｏｆｆｅｍａｎ，Ｒ．、“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒａｐｈｉｔｉｃ  ｏｘｉｄｅ”、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ８０、１３３９−１３３９（１９５８）
【非特許文献３１】Ｌｕ，Ｇ．、Ｍａｏ，Ｓ．、Ｐａｒｋ，Ｓ．、Ｒｕｏｆｆ，Ｒ．＆  Ｃｈｅｎ，Ｊ．、“Ｆａｃｉｌｅ，  ｎｏｎｃｏｖａｌｅｎｔ  ｄｅｃｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ  ｓｈｅｅｔｓ  ｗｉｔｈ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ”、Ｎａｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２、１９２−２００（２００９）
【非特許文献３２】Ｔｕｉｎｓｔｒａ，Ｆ．＆  Ｋｏｅｎｉｇ，Ｊ．、“Ｒａｍａｎ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ｇｒａｐｈｉｔｅ”、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ５３、１１２６（１９７０）
【非特許文献３３】Ｓｏｕｔｈａｒｄ，Ｊ．＆  Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．、“Ｈｉｇｈ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｈｅａｔ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｎ３Ｏ４，  ＭｎＳｉＯ３  ａｎｄ  Ｍｎ３Ｃ１”、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ６４、１７６９−１７７０（１９４２）
【非特許文献３４】Ｕｒｓｕ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．、“Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌａｓｅｒ／ｔｈｅｒｍａｌ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｎ３Ｏ４  ｆｒｏｍ  ＭｎＣＯ３”、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｂ：  Ａｔｏｍｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  １９、Ｌ８２５（１９８６）
【非特許文献３５】Ｗｅｉｘｉｎ，Ｚ．、Ｃｈｅｎｇ，Ｗ．、Ｘｉａｏｍｉｎｇ，Ｚ．、Ｙｉ，Ｘ．＆  Ｙｉｔａｉ，Ｑ．、“Ｌｏｗ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  Ｍｎ３Ｏ４  ｂｙ  ａ  ｓｏｌｖｏｔｈｅｒｍａｌ  ｍｅｔｈｏｄ”、Ｓｏｌｉｄ  Ｓｔａｔｅ  Ｉｏｎｉｃｓ  １１７、３３１−３３５（１９９９）
【非特許文献３６】Ｚｈａｎｇ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．、“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｎ３Ｏ４  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｔｅｓ  ａｎｄ  ＭｎＯＯＨ  ｎａｎｏｒｏｄｓ  ｂｙ  ａ  ｓｏｌｖｏｔｈｅｒｍａｌ  ｍｅｔｈｏｄ”、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ２６３、３９４−３９９（２００４）
【非特許文献３７】Ｗｈｉｔｎｅｙ，Ｔ．、Ｓｅａｒｓｏｎ，Ｐ．、Ｊｉａｎｇ，Ｊ．＆  Ｃｈｉｅｎ，Ｃ、“Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ａｒｒａｙｓ  ｏｆ  Ｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｎａｎｏｗｉｒｅｓ”、Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）２６１，１３１６（１９９３）
【非特許文献３８】Ｗａｎｇ，Ｊ．、Ｃｈｅｎ，Ｑ．、Ｚｅｎｇ，Ｃ．＆  Ｈｏｕ，Ｂ．、“Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｆｉｅｌｄ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  Ｆｅ３Ｏ４  Ｎａｎｏｗｉｒｅｓ”、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  １６、１３７−１４０（２００４）
【非特許文献３９】Ｄｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ、“Ｈａｕｓｍａｎｎｉｔｅ  Ｍｎ３Ｏ４  ｎａｎｏｒｏｄｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”、Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７、４９２３（２００６）
【非特許文献４０】Ｍａｔｔｅ，Ｈ．Ｓ．Ｓ．Ｒ．、Ｓｕｂｒａｈｍａｎｙａｍ，Ｋ．＆  Ｒａｏ，Ｃ．、“Ｎｏｖｅｌ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｇｒａｐｈｅｎｅ：  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｆｅｒｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ａｎｔｉｆｅｒｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ａｓｐｅｃｔｓ”、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｃ  １１３、９９８２−９９８５（２００９）
【非特許文献４１】Ｄｅｎｇ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．、“Ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｆｅｒｒｉｔｅ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ”、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ４４，２７８２−２７８５（２００５）
【非特許文献４２】Ｚｈａｏ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．、“Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍａｇｎｅｔｉｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎａｎｏｐｏｒｏｕｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０、１９８−２０４（２００７）
【非特許文献４３】Ｓｕｎ，Ｓ．、Ｍｕｒｒａｙ，Ｃ．Ｂ．、Ｗｅｌｌｅｒ，Ｄ．、Ｆｏｌｋｓ，Ｌ．＆  Ｍｏｓｅｒ，Ａ．、“Ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  ＦｅＰｔ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｆｅｒｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ  ＦｅＰｔ  Ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｕｐｅｒｌａｔｔｉｃｅｓ”、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７、１９８９−１９９２（２０００）
【非特許文献４４】Ｔａｎ，Ｙ．、Ｚｈｕａｎｇ，Ｚ．、Ｐｅｎｇ，Ｑ．＆  Ｌｉ，Ｙ．、“Ｒｏｏｍ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｓｏｆｔ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ：  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｓｉｚｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０、５０２９−５０３４（２００８）
【非特許文献４５】Ｌｉ，Ｊ．−ｈ．ｅｔ  ａｌ．、“Ａｎ  ｅａｓｙ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ  Ｆｅ２Ｏ３  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｗａｌｌｅｄ  ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅｓ”、Ｎｅｗ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２５、１９２−１９８（２０１０）
【非特許文献４６】Ｓｃｈｗｅｒｔ，Ｄ．、Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ．＆  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｎ．  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ａｇｅｎｔｓ  １  Ｖｏｌ．２２１  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ｅｄ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｋｒａｕｓｅ）  １６５−１９９（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｂｅｒｌｉｎ／Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，２００２）
【非特許文献４７】Ｒｅｉｃｈｅｎｂａｃｈ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．、“１Ｈ  Ｔ１  ａｎｄ  Ｔ２  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＲ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ａｇｅｎｔｓ  Ｇｄ−ＤＴＰＡ  ａｎｄ  Ｇｄ−ＤＴＰＡ  ＢＭＡ  ａｔ  １．５  Ｔ”、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ７、２６４−２７４（１９９７）
【非特許文献４８】Ｃｏｒｏｔ，Ｃ、Ｒｏｂｅｒｔ，Ｐ．、Ｉｄｅｅ，Ｊ．Ｍ．＆  Ｐｏｒｔ，Ｍ．、“Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ”、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ５８、１４７１−１５０４（２００６）
【非特許文献４９】Ｓｔａｎｋｏｖｉｃｈ，Ｓ．；Ｄｉｋｉｎ，Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ２００６、４４２、２８２
【非特許文献５０】Ｖｏｇｌｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ；Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  １９９５、２１、１
【非特許文献５１】Ｃｏｈａｎ，Ｒ．Ｈ．；Ｌｅｄｅｒ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｒａｄｉｏｌ  １９９０、２６、２２４
【非特許文献５２】、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７ｔｈ  ｅｄｎ  １９８５、１４５５
【非特許文献５３】Ｒｕｎｇｅ，Ｖ．Ｍ．；Ｋｉｒｓｃｈ，Ｊ．Ｅ．；Ｂｕｒｋｅ，Ｖ．Ｊ．、Ｊ  Ｍａｇｎ  Ｒｅｓｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  １９９２、２、９
【非特許文献５４】Ｌｅｏ，Ａ．；Ｈａｎｓｃｈ，Ｃ；Ｅｌｋｉｎｓ，Ｄ．、Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  １９７１、７１、５２５
【非特許文献５５】Ｌｏｒｅｎｚ，Ｗ．；Ｄｏｅｎｉｃｋｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｉｎ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｉｎｔｒａｖｅｎｅｏｕｓ  ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ：  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，ｅｄｉｔｏｒ．  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ａｎａｅｓｔｈｅｔｉｃ  Ｄｒｕｇｓ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｒｅｓｓ  １９８１，１６９
【非特許文献５６】Ｈｅｉｎｚｅｌ，Ｇ．；Ｗｏｌｏｓｚｃｚａｋ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，  Ｊｅｎａ  １９９３
【非特許文献５７】Ｎｅｔｅｒ，Ｊ．；Ｋｕｔｎｅｒ，Ｍ．Ｈ．；ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  ｌｉｎｅａｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  １９９６，  ＷＣＢ  ＭｃＧｒａｗ
【非特許文献５８】Ｅｓｑｕｉｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００２、Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂ  ６６：０２４４２９
【非特許文献５９】Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０、Ｔｈｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｆｉｌｍｓ  ５１９：１９８９−１９９２
【非特許文献６０】Ｂｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０、Ｓｏｌｉｄ  Ｓｔａｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １２：１３６４−１３６７
【非特許文献６１】Ｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００６、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｌｌｏｙｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ４２３：１８４−１８７
【非特許文献６２】Ｓｃｈｏｅｎｈａｌｚ  ｅｔ  ａｌ．、２００９、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ９４：１６２５０３
【非特許文献６３】Ｋｕｎｄａｌｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．、２００４、Ｎａｔｕｒｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３  ：７０９−７１４
【非特許文献６４】Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１、Ｎｅｗ  Ｊ  Ｐｈｙｓ  １３：１１３００４
【非特許文献６５】Ｒｏｈｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００５、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ４０：７１５−７２４
【非特許文献６６】Ｌａｕｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００８、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １０８：２０６４−２１１０
【非特許文献６７】Ｓｕｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５、Ｊ  Ｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  ９９：４９００−４９０５
【非特許文献６８】Ａｉｍｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００２、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７：５８−６７
【非特許文献６９】Ｍａｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００８、Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９：２０５７０８
【非特許文献７０】Ｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．、２００９、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ７２：３９７−４０４
【非特許文献７１】Ｓｗｉｆｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９６２、Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓ  ３７：３０７
【非特許文献７２】Ｔｒｏｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００４、Ｉｎｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ４３：６３１３−６３２３
【非特許文献７３】Ｃａｒａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００９、Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ｍｅｄｉａ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ４：８９−１００
【非特許文献７４】Ｂｒｙａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ９：３４８−３５２
【非特許文献７５】Ｓｏｒｏｋｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．、２００５、Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７５：１６２−１６８
【非特許文献７６】Ｔｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、２００１、Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｉｎ：  Ｍｅｒｂａｃｈ  Ａ、Ｔｏｔｈ  Ｅ、  ｅｄｉｔｏｒｓ．  Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ：  Ｗｉｌｅｙ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、１つ以上の磁性金属と、グラフェン様ナノ構造あるいは黒鉛ナノまたは微細構造を備える、磁性組成物を提供する。
【００１３】
好ましくは、本発明の磁性組成物は、少なくとも約３、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、または５００ｍＭ−１ｓ−１の緩和能ｒ１を呈する。
【００１４】
好ましくは、本発明の磁性組成物は、少なくとも約３、５、１０、２０、３０、４０、５０、５００、または１０００ｍＭ−１ｓ−１の緩和能ｒ２を呈する。
【００１５】
グラフェン様ナノ構造は、炭素ナノプレートレットまたは炭素ナノリボンであり得る。炭素ナノプレートレットまたは炭素ナノリボンは、酸化させることができる。好ましくは、グラフェン様ナノ構造、例えば、炭素ナノプレートレットまたは炭素ナノリボンは、約２０ｎｍ以下、１５ｎｍ以下、１０ｎｍ以下、５ｎｍ以下、３ｎｍ以下、少なくとも２原子炭素シート、少なくとも５原子炭素シート、または少なくとも１０原子炭素シートの厚さを有する。
【００１６】
好ましくは、黒鉛ナノ構造または微細構造は、５μｍ以下、４μｍ以下、３μｍ以下、２μｍ以下、１μｍ以下、５００ｎｍ以下、２５０ｎｍ以下、または１００ｎｍ以下の厚さを有する。
【００１７】
好ましくは、炭素ナノプレートレットは、５〜１００ｎｍ、１０〜７５ｎｍ、２０〜５０ｎｍ、または３０〜４０ｎｍの範囲内の平均直径を有する。好ましくは、炭素ナノリボンは、１〜２５０ｎｍ、１０〜２００ｎｍ、５０〜１５０ｎｍ、または７０〜１００ｎｍの範囲内の平均幅を有する。
【００１８】
グラフェン様ナノ構造あるいは黒鉛ナノまたは微細構造はさらに、グラフェン様ナノ構造または微細構造に付着した、例えば、グラフェン様ナノ構造あるいは黒鉛ナノまたは微細構造に共有結合した、水溶性化部分を含むことができる。
【００１９】
一実施形態では、磁性金属は、限定されないが、内部遷移金属Ｍｎを含む、室温常磁性金属元素である。別の実施形態では、磁性金属は、限定されないが、内部遷移金属Ｆｅ、Ｃｏ、およびＮｉを含む、室温強磁性金属元素である。なおも別の実施形態では、磁性金属は、限定されないが、ランタノイド元素Ｇｄ、Ｅｕ、Ｐｒ、Ｎｄ、およびＳｍを含む、希土類金属である。本発明で使用することができる好ましい磁性金属は、Ｍｎ、Ｇｄ、およびＦｅを含む。
【００２０】
磁性組成物は、１つよりも多くの磁性金属を含むことができる。一実施形態では、磁性組成物は、２つの異なる磁性金属を含む。
【００２１】
磁性金属は、イオンとして磁性組成物の中に存在することができる。磁性金属はまた、限定されないが、金属酸化物および金属塩を含む、金属化合物の形態で、磁性組成物の中に存在することもできる。磁性金属またはその化合物は、グラフェン様ナノ構造あるいは黒鉛ナノまたは微細構造に挿入することができる。
【００２２】
本発明の磁性組成物は、１ｐｐｂ（質量パーツ・パー・ビリオン）〜１０７ｐｐｍ（質量パーツ・パー・ミリオン）、１０２ｐｐｂ〜１０６ｐｐｍ、１ｐｐｍ〜１０５ｐｐｍ、１０〜１０４ｐｐｍ、または１０２〜１０３ｐｐｍの範囲内の量で磁性金属を含むことができる。
【００２３】
本発明はまた、本発明の十分な量の磁性組成物を対象に投与することと、磁気共鳴映像デバイスを使用して、対象を撮像することとを含む、対象の磁気共鳴映像法を行う方法も提供する。対象は、限定されないが、ほ乳類、例えば、ヒトを含む、任意の動物であり得る。
【００２４】
本発明はまた、十分な量の磁性組成物と、１つ以上の生理学的に容認可能な担体または賦形剤とを含む、ＭＲＩ撮像のための組成物も提供する。
【００２５】
本発明はまた、磁性金属と、グラフェン様炭素ナノ構造とを含む、磁性組成物を生産する方法も提供する。本方法は、硫酸Ｈ２ＳＯ４、硝酸（ＨＮＯ３）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、硝酸ナトリウムＮａＮＯ３、および過マンガン酸カリウムＫＭｎＯ４の混合物で黒鉛を酸化させることと、前のステップで得られた生成物の懸濁液を超音波で分解することとを含む。本方法はさらに、還元剤で磁性組成物を還元するステップを含むことができる。
【００２６】
本発明はまた、磁性金属と、グラフェン様炭素ナノ構造とを含む、磁性組成物を生産する方法も提供する。本方法は、硫酸Ｈ２ＳＯ４、硝酸（ＨＮＯ３）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、および過マンガン酸カリウムＫＭｎＯ４で多層炭素ナノチューブを処理することを含む。一実施形態では、処理は、濃縮Ｈ２ＳＯ４、硝酸（ＨＮＯ３）の中で該多層炭素ナノチューブを懸濁させることと、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、ＫＭｎＯ４を添加することと、混合物を加熱することと、前のステップで得られた生成物の懸濁液を超音波で分解することを含む、方法によって実行される。具体的実施形態では、混合物は、５５〜７０℃まで加熱される。
【００２７】
磁性組成物はさらに、当技術分野で公知の方法を使用して、例えば、（１）フラーレンおよび金属内包フラーレンの炭素炭素二重結合にわたって、カルボン酸官能基を添加するために使用される、付加環化反応に類似する合成プロトコルを使用して、水溶性化することができる。（２）デキストラン等の天然ポリマーまたはポリエチレングリコール等の合成両親媒性ポリマーで共有または非共有的に官能化する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】マンガン挿入グラフェンナノプレートレットおよびナノリボンの２００ｋＶにおけるＴＥＭ画像。（ａ）幅約２０ｎｍの少数層および多層還元グラフェンナノプレートレットを示す。
【図１Ｂ】マンガン挿入グラフェンナノプレートレットおよびナノリボンの２００ｋＶにおけるＴＥＭ画像。（ｂ）還元グラフェンナノプレートレット上の炭素原子の格子構造を示すＨＲＴＥＭ画像。
【図１Ｃ】マンガン挿入グラフェンナノプレートレットおよびナノリボンの２００ｋＶにおけるＴＥＭ画像。（ｃ）幅約１２０ｎｍおよび長さ約０．６〜２μｍのグラフェンナノリボン構造を表す画像。
【図１Ｄ】マンガン挿入グラフェンナノプレートレットおよびナノリボンの２００ｋＶにおけるＴＥＭ画像。（ｄ）（矢印によって示される）グラフェンナノリボンシートの複数の層を表す高倍率画像。
【図２Ａ】（ａ）黒鉛、酸化黒鉛、グラフェンナノプレートレット、および還元グラフェンナノプレートレットのＤおよびＧバンドならびに対応するピークを表す、５３０ｎｍレーザを使用したラマンスペクトル。
【図２Ｂ】（ｂ）ＭＷＣＮＴおよびグラフェンナノリボンのＤおよびＧバンドを表す、５３０ｎｍレーザを使用したラマンスペクトル。
【図３Ａ】ＳＱＵＩＤプロット：−５０，０００から５０，０００Ｏｅの間の３０Ｋ、１５０、および３００Ｋにおける（ａ）黒鉛の磁化（Ｍ）対磁場強度（Ｈ）。
【図３Ｂ】ＳＱＵＩＤプロット：−５０，０００から５０，０００Ｏｅの間の３０Ｋ、１５０、および３００Ｋにおける（ｂ）酸化黒鉛の磁化（Ｍ）対磁場強度（Ｈ）。
【図３Ｃ】ＳＱＵＩＤプロット：−５０，０００から５０，０００Ｏｅの間の３０Ｋ、１５０、および３００Ｋにおける（ｃ）グラフェンナノプレートレットの磁化（Ｍ）対磁場強度（Ｈ）。
【図３Ｄ】ＳＱＵＩＤプロット：−５０，０００から５０，０００Ｏｅの間の３０Ｋ、１５０、および３００Ｋにおける（ｄ）還元グラフェンナノプレートレットの磁化（Ｍ）対磁場強度（Ｈ）、差し込み図：３００Ｋにおける−５０００から５０００Ｏｅの間のプロット。
【図３Ｅ】（ｅ）４０Ｋのブロッキング温度を表す、還元グラフェンナノプレートレットのＺＦＣおよびＦＣ磁化曲線。
【図４Ａ】ＳＱＵＩＤプロット：−５０，０００Ｏｅから５０，０００Ｏｅの間の磁化（Ｍ）対磁場強度（Ｈ）、（ａ）ＭＷＣＮＴの３つの温度（１０、１５０、および３００Ｋ）におけるＭ対Ｈ。
【図４Ｂ】ＳＱＵＩＤプロット：−５０，０００Ｏｅから５０，０００Ｏｅの間の磁化（Ｍ）対磁場強度（Ｈ）、（ｂ）３０Ｋ、１５０Ｋ、および３００ＫにおけるグラフェンナノリボンのＭ対Ｈプロット、差し込み図：ヒステリシスループを示す、３００Ｋにおける−４０００Ｏｅから４０００Ｏｅの間のＭ対Ｈ。
【図４Ｃ】（ｃ）３００Ｋを上回る高いブロッキング温度を表す、ＧＮＲのＺＦＣおよびＦＣプロット。
【図５】ＭｎＣｌ２および水と比較した、ＧＯＮＲのＴ１加重ＭＲＩファントム。
【図６】０．２５ｍｍｏｌｓ／ｋｇの投与量での水溶性ＧＮＰ  ＭＲＩ  ＣＡの注入前および後のマウスの代表的なＭＲ画像。Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ等の臨床ＧｄベースのＣＡに使用される用量よりも１００倍低い、これらの低い用量において、優れた輝度コントラスト強化が、循環ナノ粒子により、血管構造の全体を通して得られる。
【図７】約１．１３７ｎｍの均一な厚さを示す、シリコン基材上に分散されたグラフェンナノプレートレットのＡＦＭ区分分析。
【図８】６５７、３７０および３２０ｃｍ−１においてスペクトルピークを示す、５３２ｎｍにおけるハウスマン鉱（Ｍｎ３Ｏ４）、酸化黒鉛、および還元グラフェンナノプレートレットのラマンスペクトルの比較。
【図９Ａ】−５０，０００から５０，０００Ｏｅの間の３０Ｋ、１５０、および３００Ｋにおける（ａ）微小黒鉛の磁化（Ｍ）対磁場強度（Ｈ）のプロット。
【図９Ｂ】−５０，０００から５０，０００Ｏｅの間の３０Ｋ、１５０、および３００Ｋにおける（ｂ）酸化黒鉛の磁化（Ｍ）対磁場強度（Ｈ）のプロット。
【図９Ｃ】−５０，０００から５０，０００Ｏｅの間の３０Ｋ、１５０、および３００Ｋにおける（ｃ）酸化グラフェンナノプレートレットの磁化（Ｍ）対磁場強度（Ｈ）のプロット。
【図９Ｄ】−５０，０００から５０，０００Ｏｅの間の３０Ｋ、１５０、および３００Ｋにおける（ｄ）還元グラフェンナノプレートレットの磁化（Ｍ）対磁場強度（Ｈ）のプロット（差し込み図は３００Ｋにおける−５０００Ｏｅから５０００Ｏｅの間のプロットを示す）。
【図９Ｅ】（ｅ）還元グラフェンナノプレートレットのＺＦＣおよびＦＣ磁化プロット。
【図１０Ａ】−５０，０００Ｏｅから５０，０００Ｏｅの間の１０、１５０、および３００Ｋにおける（ａ）ＭＷＣＮＴの磁化（Ｍ）対磁場強度（Ｈ）。
【図１０Ｂ】−５０，０００Ｏｅから５０，０００Ｏｅの間の１０、１５０、および３００Ｋにおける（ｂ）グラフェンナノリボンの磁化（Ｍ）対磁場強度（Ｈ）（差し込み図は３００Ｋにおける−４０００Ｏｅから４０００Ｏｅの間のＭ対Ｈを示す）。
【図１０Ｃ】（ｃ）グラフェンナノリボンのＺＦＣおよびＦＣプロット。
【図１１Ａ】（ａ）酸化微小黒鉛の固体の室温ＥＰＲスペクトル。
【図１１Ｂ】（ｂ）酸化グラフェンナノプレートレットの固体の室温ＥＰＲスペクトル。
【図１１Ｃ】（ｃ）還元グラフェンナノプレートレットの固体の室温ＥＰＲスペクトル。
【図１１Ｄ】（ｄ）グラフェンナノリボンの固体の室温ＥＰＲスペクトル。
【図１２Ａ】（ａ）酸化微小黒鉛の水溶液の室温ＥＰＲスペクトル。
【図１２Ｂ】（ｂ）酸化グラフェンナノプレートレットの水溶液の室温ＥＰＲスペクトル。
【図１２Ｃ】（ｃ）還元グラフェンナノプレートレットの水溶液の室温ＥＰＲスペクトル。
【図１２Ｄ】（ｄ）グラフェンナノリボンの水溶液の室温ＥＰＲスペクトル。
【図１３Ａ】（ａ）酸化黒鉛のＳＢＭ理論に由来する、実験的ＮＭＲＤプロファイル（ドット）および最良適合（実線）。
【図１３Ｂ】（ｂ）グラフェンナノプレートレットのＳＢＭ理論に由来する、実験的ＮＭＲＤプロファイル（ドット）および最良適合（実線）。
【図１３Ｃ】（ｃ）還元グラフェンナノプレートレットのＳＢＭ理論に由来する、実験的ＮＭＲＤプロファイル（ドット）および最良適合（実線）。
【図１３Ｄ】（ｄ）グラフェンナノリボンのＳＢＭ理論に由来する、実験的ＮＭＲＤプロファイル（ドット）および最良適合（実線）。
【図１４Ａ】（ａ）酸化微小黒鉛の代表的なＳＥＭ画像
【図１４Ｂ】（ｂ）還元グラフェンナノプレートレットのＴＥＭ画像。
【図１４Ｃ】（ｃ）還元グラフェンナノプレートレットのＴＥＭ画像。
【図１４Ｄ】（ｄ）グラフェンナノリボンのＴＥＭ画像。
【図１４Ｅ】（ｅ）グラフェンナノリボンのＴＥＭ画像。（ｅ）の中の矢印は、グラフェンナノリボンシートの複数の層を示す。
【図１４Ｆ】（ｆ）幅約２０ｎｍの少数層および多層還元グラフェンナノプレートレットを示す、還元グラフェンナノプレートレットの２００ｋＶにおけるＴＥＭ画像。
【図１４Ｇ】（ｇ）約１．１３７ｎｍの均一な厚さを示す、シリコン基材上に分散されたグラフェンナノプレートレットのＡＦＭ区分分析。
【図１５Ａ】（ａ）黒鉛、酸化黒鉛、酸化グラフェンナノプレートレット、および還元グラフェンナノプレートレットのＤおよびＧバンドピークを伴うラマンスペクトル。
【図１５Ｂ】（ｂ）ＭＷＣＮＴおよびグラフェンナノリボンのＤおよびＧバンドピークを伴うラマンスペクトル。
【図１５Ｃ】（ｃ）６５７、３７０、および３２０ｃｍ−１においてスペクトルピークを示す、５３２ｎｍにおけるハウスマン鉱（Ｍｎ３Ｏ４）、酸化黒鉛、および還元グラフェンナノプレートレットの間のラマンスペクトルの比較。
【図１６Ａ】５３０ｅＶにおいて酸素ピークを示す、（ａ）還元グラフェンナノプレートレットのＥＥＬＳスペクトル。
【図１６Ｂ】５３０ｅＶにおいて酸素ピークを示す、（ｂ）酸化グラフェンナノプレートレットのＥＥＬＳスペクトル。
【図１７Ａ】（ａ）固体サンプルの測定に使用されるＷｉｌｍａｄ石英ＥＰＲ管のＥＰＲスペクトル。
【図１７Ｂ】（ｂ）水性サンプルに使用される石英ＥＰＲ平坦管のＥＰＲスペクトル。
【図１７Ｃ】（ｃ）ＤＰＰＨ標準（固体）のＥＰＲスペクトル。
【図１７Ｄ】（ｄ）ＤＰＰＨ標準（水性）のＥＰＲスペクトル。
【図１８Ａ】全ての浮動ＳＢＭパラメータを浮動させて得られる曲線。Ａ）酸化黒鉛。
【図１８Ｂ】全ての浮動ＳＢＭパラメータを浮動させて得られる曲線。Ｂ）酸化グラフェンナノプレートレット。
【図１８Ｃ】全ての浮動ＳＢＭパラメータを浮動させて得られる曲線。Ｃ）還元グラフェンナノプレートレット。
【図１８Ｄ】全ての浮動ＳＢＭパラメータを浮動させて得られる曲線。Ｄ）グラフェンナノリボン。
【図１９Ａ】残りのＳＢＭパラメータを浮動させた、固定Ｑ＝２について得られた曲線。Ａ）酸化黒鉛。
【図１９Ｂ】残りのＳＢＭパラメータを浮動させた、固定Ｑ＝２について得られた曲線。Ｂ）酸化グラフェンナノプレートレット。
【図１９Ｃ】残りのＳＢＭパラメータを浮動させた、固定Ｑ＝２について得られた曲線。Ｃ）還元グラフェンナノプレートレット。
【図１９Ｄ】残りのＳＢＭパラメータを浮動させた、固定Ｑ＝２について得られた曲線。Ｄ）グラフェンナノリボン。
【図２０Ａ】残りのＳＢＭパラメータを浮動させた、固定Ｑ＝４について得られた曲線。Ａ）酸化黒鉛。
【図２０Ｂ】残りのＳＢＭパラメータを浮動させた、固定Ｑ＝４について得られた曲線。Ｂ）酸化グラフェンナノプレートレット。
【図２０Ｃ】残りのＳＢＭパラメータを浮動させた、固定Ｑ＝４について得られた曲線。Ｃ）還元グラフェンナノプレートレット。
【図２０Ｄ】残りのＳＢＭパラメータを浮動させた、固定Ｑ＝４について得られた曲線。Ｄ）グラフェンナノリボン。
【図２１Ａ】残りのＳＢＭパラメータを浮動させた、固定Ｑ＝６について得られた曲線。Ａ）酸化黒鉛。
【図２１Ｂ】残りのＳＢＭパラメータを浮動させた、固定Ｑ＝６について得られた曲線。Ｂ）酸化グラフェンナノプレートレット。
【図２１Ｃ】残りのＳＢＭパラメータを浮動させた、固定Ｑ＝６について得られた曲線。Ｃ）還元グラフェンナノプレートレット。
【図２１Ｄ】残りのＳＢＭパラメータを浮動させた、固定Ｑ＝６について得られた曲線。Ｄ）グラフェンナノリボン。
【図２２Ａ】残りのＳＢＭパラメータを浮動させた、固定Ｑ＝８について得られた曲線。Ａ）酸化黒鉛。
【図２２Ｂ】残りのＳＢＭパラメータを浮動させた、固定Ｑ＝８について得られた曲線。Ｂ）酸化グラフェンナノプレートレット。
【図２２Ｃ】残りのＳＢＭパラメータを浮動させた、固定Ｑ＝８について得られた曲線。Ｃ）還元グラフェンナノプレートレット。
【図２２Ｄ】残りのＳＢＭパラメータを浮動させた、固定Ｑ＝８について得られた曲線。Ｄ）グラフェンナノリボン。
【図２３Ａ】残りのＳＢＭパラメータを浮動させた、表８に示された値における固定Ｑ＝８および固定Ｔｍについて得られた曲線。Ａ）酸化黒鉛。
【図２３Ｂ】残りのＳＢＭパラメータを浮動させた、表８に示された値における固定Ｑ＝８および固定Ｔｍについて得られた曲線。Ｂ）酸化グラフェンナノプレートレット。
【図２３Ｃ】残りのＳＢＭパラメータを浮動させた、表８に示された値における固定Ｑ＝８および固定Ｔｍについて得られた曲線。Ｃ）還元グラフェンナノプレートレット。
【図２３Ｄ】残りのＳＢＭパラメータを浮動させた、表８に示された値における固定Ｑ＝８および固定Ｔｍについて得られた曲線。Ｄ）グラフェンナノリボン。Ｄの中のグラフェンナノリボンの適合は、予想以上に驚くほど悪い。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、１つ以上の磁性金属と、グラフェン様ナノ構造あるいは黒鉛ナノまたは微細構造を備える、磁性組成物を提供する。磁性組成物は、常磁性または反磁性であり得る。好ましくは、磁性組成物は、常磁性である。磁性組成物は、強磁性であり得る。磁性組成物はまた、超常磁性でもあり得る。
【００３０】
好ましくは、本発明の磁性組成物は、少なくとも約３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、または５００ｍＭ−１ｓ−１の緩和能ｒ１を呈する。具体的実施形態では、本発明の磁性組成物は、約４５ｍＭ−１ｓ−１の緩和能ｒ１を呈する。別の具体的実施形態では、本発明の磁性組成物は、約７３ｍＭ−１ｓ−１の緩和能ｒ１を呈する。
【００３１】
好ましくは、本発明の磁性組成物は、少なくとも約３、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１０００ｍＭ−１ｓ−１の緩和能ｒ２を呈する。具体的実施形態では、本発明の磁性組成物は、約１５ｍＭ−１ｓ−１の緩和能ｒ２を呈する。別の具体的実施形態では、本発明の磁性組成物は、約２５１ｍＭ−１ｓ−１の緩和能ｒ２を呈する。
【００３２】
グラフェンは、２次元（２Ｄ）ハニカム格子に緊密に詰め込まれた炭素原子の平坦な単分子層であり、全ての他の次元の黒鉛材料に対する基礎構成要素であり、０Ｄフラーレンに包み込む、１Ｄナノチューブに巻き込む、または３Ｄ黒鉛に積み重ねることができる（非特許文献２７）。本明細書で使用されるように、「グラフェン様ナノ構造」（または「グラフェン様ナノ粒子」）という用語は、１つ以上の原子炭素シートまたは層を備える、炭素ナノ構造を指す。本願では、簡単にする理由で、「グラフェンナノ構造」という用語も、グラフェン様ナノ構造を指すために使用される。したがって、明示的に記述されない限り、「グラフェンナノ構造」という用語は、単一の原子炭素シートのみを有するナノ構造に限定されない。グラフェン様ナノ構造は、炭素ナノプレートレットまたは炭素ナノリボンであり得る。炭素ナノプレートレットまたは炭素ナノリボンは、酸化させることができる。
【００３３】
好ましくは、黒鉛ナノ構造または微細構造は、５μｍ以下、４μｍ以下、３μｍ以下、２μｍ以下、１μｍ以下、５００ｎｍ以下、２５０ｎｍ以下、または１００ｎｍ以下の厚さを有する。
【００３４】
一実施形態では、黒鉛微細構造は、１〜５μｍ、２〜４μｍ、または２〜３μｍの範囲内の厚さを有する。別の実施形態では、黒鉛微細構造は、１〜５μｍ、２〜４μｍ、または２〜３μｍの範囲内の構造の最長の長さを有する。
【００３５】
好ましくは、グラフェン様ナノ構造、例えば、炭素ナノプレートレットまたは炭素ナノリボンは、約２０ｎｍ以下、１５ｎｍ以下、１０ｎｍ以下、５ｎｍ以下、または３ｎｍ以下の厚さを有する。グラフェン様ナノ構造、例えば、炭素ナノプレートレットまたは炭素ナノリボンは、少なくとも１原子炭素シート、少なくとも２原子炭素シート、少なくとも５原子炭素シート、または少なくとも１０原子炭素シートを備えることができる。一実施形態では、グラフェン様ナノ構造、例えば、炭素ナノプレートレットまたは炭素ナノリボンは、１〜１２原子炭素シートを備える。具体的実施形態では、グラフェン様ナノ構造、例えば、炭素ナノプレートレットまたは炭素ナノリボンは、１〜２原子炭素シートを備える。
【００３６】
好ましくは、グラフェン様ナノ構造は、５〜１００ｎｍ、１０〜７５ｎｍ、２０〜５０ｎｍ、または３０〜４０ｎｍの範囲内の平均直径を有する、炭素ナノプレートレットである。具体的実施形態では、炭素ナノプレートレットは、約２０ｎｍの平均直径を有する。別の具体的実施形態では、炭素ナノプレートレットは、約５０ｎｍの平均直径を有する。なおも別の具体的実施形態では、グラフェン様ナノプレートレットは、１〜５ｎｍの範囲内の厚さ、および約５０ｎｍの直径を有する。
【００３７】
好ましくは、グラフェン様ナノ構造は、１〜２５０ｎｍ、１０〜２００ｎｍ、５０〜１５０ｎｍ、または７０〜１００ｎｍの範囲内の平均幅を有する、炭素ナノリボンである。具体的実施形態では、炭素ナノリボンは、約１２０ｎｍの平均幅を有する。好ましくは、炭素ナノリボンは、２００〜５０００ｎｍ、４００〜４０００ｎｍ、または５００〜３０００ｎｍの範囲内の平均長を有する。具体的実施形態では、炭素ナノリボンは、６００〜２０００ｎｍの範囲内の平均長を有する。
【００３８】
グラフェン様ナノ構造あるいは黒鉛ナノまたは微細構造はさらに、グラフェン様ナノ構造または微細構造に付着した水溶性化部分を含むことができる。一実施形態では、水溶性化部分は、グラフェン様ナノ構造あるいは黒鉛ナノまたは微細構造に共有結合している。具体的実施形態では、水溶性化部分は、グラフェン様ナノ構造あるいは黒鉛ナノまたは微細構造に付着した、マロン酸およびセリノールマロノジアミドから成る群より選択される。水溶性化部分は、当技術分野で公知である任意の方法を使用して、例えば、ビンゲル型反応（非特許文献２８）を使用して、グラフェン様ナノ構造あるいは黒鉛ナノまたは微細構造に付着させることができる。別の具体的実施形態では、水溶性化部分は、天然ポリマーデキストランまたは合成ポリマーポリエチレングリコールである。水溶性化部分は、当技術分野で公知である任意の方法を使用して、高温（６０〜９５℃）で１〜３時間にわたって超音波処理を使用して、共有または非共有結合することができる。
【００３９】
本発明の磁性組成物の中の磁性金属は、外部から印加された磁場の存在または非存在下で磁性を呈する、任意の金属であり得る。一実施形態では、磁性金属は、限定されないが、内部遷移金属Ｍｎを含む、室温常磁性金属元素である。別の実施形態では、磁性金属は、限定されないが、内部遷移金属Ｆｅ、Ｃｏ、およびＮｉを含む、室温強磁性金属元素である。なおも別の実施形態では、磁性金属は、限定されないが、ランタノイドＧｄ、Ｅｕ、Ｐｒ、Ｎｄ、およびＳｍを含む、希土類金属である。本発明で使用することができる好ましい磁性金属は、Ｍｎ、Ｇｄ、およびＦｅを含む。
【００４０】
磁性組成物は、１つよりも多くの磁性金属を含むことができる。一実施形態では、磁性組成物は、２つの異なる磁性金属を含む。好ましい実施形態では、磁性組成物は、ＭｎおよびＦｅを含む。
【００４１】
磁性金属は、イオンとして磁性組成物の中に存在することができる。磁性金属はまた、限定されないが、金属酸化物および金属塩を含む、金属化合物の形態で、磁性組成物の中に存在することもできる。好ましい実施形態では、磁性金属は、金属酸化物の形態で磁性組成物の中に存在する。
【００４２】
好ましい実施形態では、磁性金属またはその化合物は、グラフェン様ナノ構造あるいは黒鉛ナノまたは微細構造に挿入することができる。
【００４３】
本発明の磁性組成物は、１ｐｐｂ（質量パーツ・パー・ビリオン）〜１０７ｐｐｍ（質量パーツ・パー・ミリオン）、１０２ｐｐｂ〜１０６ｐｐｍ、１０２ｐｐｂ〜１０２ｐｐｍ、１ｐｐｍ〜１０５ｐｐｍ、１０〜１０４ｐｐｍ、または１０２〜１０３ｐｐｍの範囲内の量で磁性金属を含むことができる。
【００４４】
特に好ましい実施形態では、本発明の磁性組成物は、本明細書で説明されるようなグラフェン様ナノ構造と、Ｍｎとを含む。一実施形態では、Ｍｎは、酸化Ｍｎとして存在する。別の実施形態では、Ｍｎは、二価および／または三価Ｍｎとして存在する。なおも別の実施形態では、酸化Ｍｎは、ハウスマン鉱を含む。
【００４５】
一実施形態では、磁性組成物は、炭素ナノプレートレットと、１０６〜５．５×１０７ｐｐｍの範囲内、例えば、約５×１０６ｐｐｍの量でＭｎとを含む。
【００４６】
別の実施形態では、磁性組成物は、炭素ナノリボンと、１０２〜１０３ｐｐｍの範囲内、例えば、約５×１０２ｐｐｍの量でＭｎとを含む。なおも別の実施形態では、Ｍｎは、０．１〜２ｐｐｍ、０．２〜１．５ｐｐｍ、または０．５〜１ｐｐｍの範囲内の量である。
【００４７】
本発明はまた、本発明の十分な量の磁性組成物を対象に投与することと、磁気共鳴映像デバイスを使用して、対象を撮像することとを含む、対象の磁気共鳴映像法を行う方法も提供する。対象は、限定されないが、ほ乳類を含む、任意の動物であり得る。好ましい実施形態では、対象は、ヒトである。本発明の磁性組成物は、単独で、または限定されないが、別のＭＲＩ造影剤を含む、別の作用物質と組み合わせて使用することができる。磁性組成物は、限定されないが、静脈内、血管内注射、および経口投与を含む、当技術分野で公知である任意の方法によって、対象に投与することができる。当業者であれば、目的とする組織、器官、または体内の他の領域、および／またはスキャンの目的にしたがって、適切な投与経路を選択することができるであろう。磁気共鳴映像法は、当技術分野で公知である任意の標準方法およびデバイスによって実行することができる。本発明の磁性組成物および／または別のＭＲＩ  ＣＡは、限定されないが、細胞外液または初回通過ＭＲＩ  ＣＡ、血液プールＭＲＩ  ＣＡ、器官特異的ＭＲＩ  ＣＡ、および分子撮像ＭＲＩ  ＣＡを含む、撮像剤の任意の好適な形態であり得る。
【００４８】
本発明はまた、１つ以上のコンテナの中に十分な量の１つ以上の磁性組成物を備える、ＭＲＩ撮像で使用するためのキットも提供する。十分な量の磁性組成物とは、ＭＲＩ画像において画像コントラストの強化をもたらすのに十分な組成物の量を指す。磁性組成物は、限定されないが、細胞外液または初回通過ＭＲＩ  ＣＡ、血液プールＭＲＩ  ＣＡ、器官特異的ＭＲＩ  ＣＡ、および分子撮像ＭＲＩ  ＣＡを含む、撮像剤の任意の好適な形態であり得る。
【００４９】
磁性組成物の毒性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％までの致死量）を判定するために、細胞培養および／または実験動物において標準手順によって判定することができる。有効量は、臨床的に容認された標準に従って推定することができる。細胞培養検定および／または動物実験から得られたデータは、ヒトで使用するための投与量の範囲を製剤化するために使用することができる。そのような磁性組成物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどまたは全くない、ＭＲＩ画像を強化するのに効果的である、濃度の範囲内である。投与量は、採用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動してもよい。当業者であれば、標準プロトコルに基づいて、磁性組成物の好適な投与量を選択することができるであろう。
【００５０】
本発明に従って使用するための組成物は、例えば、投与経路、例えば、経口または非経口投与に応じて、１つ以上の生理学的に容認可能な担体または賦形剤を使用して、従来の様式で製剤化することができる。
【００５１】
経口投与については、磁性組成物は、例えば、結合剤（例えば、アルファトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えば、乳糖、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、滑石、またはシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）等の薬学的に容認可能な賦形剤を用いて、従来の手段によって調製される、錠剤またはカプセルの形態を成してもよい。錠剤は、当技術分野で周知の方法によって被覆されてもよい。経口投与用の液体製剤は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態を成してもよく、あるいはそれらは、使用前に水または他の好適な媒介物とともに構成するための乾燥製品として提示されてもよい。そのような液体製剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、非水性媒介物（例えば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコール、または分画植物油）、および防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピル、あるいはソルビン酸）等の薬学的に容認可能な添加剤を用いて、従来の手段によって調製されてもよい。製剤はまた、適宜に、緩衝塩、香味料、着色料、および甘味剤を含有してもよい。
【００５２】
化合物は、注射による、例えば、ボーラス注射または連続注入による、非経口投与のために製剤化されてもよい。注射用の製剤は、例えば、アンプルの中で、または多用量コンテナの中で、単位剤形で提示されてもよい。組成物は、油性または水性媒介物において懸濁液、溶液、または乳剤等の形態を成してもよく、懸濁化、安定、および／または分散剤等の製剤化剤を含有してもよい。代替として、有効性分は、使用前に、好適な媒介物、例えば、発熱物質を含まない滅菌水とともに構成するための粉末形態であってもよい。
【００５３】
好適な投与経路は、例えば、筋肉内、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射を含む、経口および非経口送達を含んでもよい。
【００５４】
さらに、標的薬剤送達システムにおいて、例えば、罹患細胞に特異的な抗体で被覆されたリポソームにおいて、薬剤を投与してもよい。リポソームは、目的とする細胞に標的化され、それによって選択的に取り込まれるであろう。
【００５５】
組成物は、所望であれば、磁性組成物を含有する１つ以上の単位剤形を含有し得る、パックまたはディスペンサデバイスの中で提示されてもよい。パックまたはディスペンサデバイスは、投与のための指示書を伴ってもよい。適合性担体の中で製剤化される本発明の磁性組成物を含む、組成物もまた、調製され、適切なコンテナの中に配置され、使用のために標識されてもよい。
【００５６】
したがって、本発明はまた、対象の磁気共鳴映像法で使用するための本発明の磁性組成物も提供する。
【００５７】
本発明はまた、磁性金属と、グラフェン様炭素ナノ構造とを含む、磁性組成物を生産する方法も提供する。本方法は、硫酸Ｈ２ＳＯ４、硝酸（ＨＮＯ３）、硝酸ナトリウムＮａＮＯ３、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、および過マンガン酸カリウムＫＭｎＯ４の混合物で黒鉛を酸化させることと、前のステップで得られた生成物の懸濁液を超音波で分解することとを含む。本方法はさらに、還元剤で磁性組成物を還元するステップを含むことができる。一実施形態では、還元剤は、ヒドラジン水和物である。一実施形態では、本発明の方法で使用される黒鉛は、例えば、約４５μｍのサイズを有する、微小黒鉛である。
【００５８】
本発明はまた、磁性金属と、グラフェン様炭素ナノ構造とを含む、磁性組成物を生産する方法も提供する。本方法は、硫酸Ｈ２ＳＯ４、硝酸（ＨＮＯ３）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、および過マンガン酸カリウムＫＭｎＯ４で多層炭素ナノチューブを処理することを含む。一実施形態では、処理は、濃縮Ｈ２ＳＯ４の中で該多層炭素ナノチューブを懸濁させることと、ＫＭｎＯ４を添加することと、混合物を加熱することとを含む、方法によって実行される。具体的実施形態では、混合物は、５５〜７０℃まで加熱される。
【００５９】
磁性組成物は、当技術分野で公知の方法を使用して、水溶性化することができる。一実施形態では、磁性組成物は、フラーレンおよび金属内包フラーレンの炭素炭素二重結合にわたって、カルボン酸官能基を添加するために使用される、付加環化反応に類似する合成プロトコルを使用して、水溶性化することができる（非特許文献２９）。
【００６０】
［実施例］
以下の実施例は、本発明の例証として提示され、いかようにも本発明を限定することを目的としていない。
【００６１】
［実施例１］
材料および方法
【００６２】
グラフェンナノプレートレット（ＧＮＰ）合成：
【００６３】
修正されたＨｕｍｍｅｒの方法（非特許文献２６、非特許文献３０）を使用して、分析グレード微小黒鉛（４５μｍ、４９６５９６−Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）から酸化黒鉛を調製した。典型的な剥離手順で、乾燥酸化黒鉛（２００ｍｇ）を、ＭｎＣｌ２とともに水（２００ｍｌ）を含有する丸底フラスコの中で懸濁させ、超音波浴クリーナ（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＦＳ６０、２３０Ｗ）の中で１時間にわたって超音波で分解した（非特許文献２０）。この均一な溶液の５０ｍｌを遠心分離し、ペレットを一晩乾燥させて、酸化グラフェンナノプレートレット（ＧＮＰ）を得た。残りの１５０ｍｌをヒドラジン水和物（１．５ｍｌ、３７．１ｍｍｏｌ）で処理し、水冷凝縮器の下で１００℃にて油浴の中で１２時間加熱し、黒い沈殿物をもたらした。生成物を単離し、媒体焼結ガラス濾過漏斗上で水（５００ｍｌ）およびメタノール（５００ｍｌ）により洗浄し、連続空気流によって乾燥させ、還元グラフェンナノプレートレットを生じた。
【００６４】
グラフェンナノリボン（ＧＮＲ）合成：
【００６５】
前述のものに対する修正された手順（非特許文献２１、非特許文献２５）を使用して、ＭＷＣＮＴ（６３６８４３−Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）からグラフェンナノリボンを調製した。ＭＷＣＮＴ（１５０ｍｇ、１２．５ミリ等量の炭素）を、３０ｍｌの濃縮のＨ２ＳＯ４中で２時間懸濁させた。ＫＭｎＯ４（７５０ｍｇ、４．７５ｍｍｏｌ）、ＭｎＣｌ２（１〜５０ｍｇ）を添加し、混合物を１時間撹拌させた。次いで、反応物を、完了するまで５５〜７０℃にて油浴の中でさらに１時間加熱した。それを室温まで冷却し、生成物を酸性水、エタノール、およびエーテルで洗浄し、後続の遠心分離によって単離した。遠心分離は、１００％収率で単純で容易かつ迅速な単離をもたらす。
【００６６】
サンプル分析：
【００６７】
ＪＥＯＬ  ＪＥＭ２０１０Ｆ（ＦＥＧ−ＴＥＭ）高分解能分析透過型電子顕微鏡を使用して、高分解能透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像分析を、ＧＮＰおよびＧＮＲサンプルに行った。撮像は、２００ｋＶ加速電圧で実行された。均質混合物を形成するように１：１エタノール：水の中で乾燥粉末を分散させることによって、ＴＥＭサンプルを調製した。次いで、懸濁液を、レーシー炭素膜（ＥＭＳ、Ｃａｔ  ＃  ＬＣ３０５−Ｃｕ）で覆われた３００メッシュＣｕグリッド上に堆積させた。５３０ｎｍダイオードレーザ励起波長および室温にてＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＤＸＲラマン共焦点顕微鏡を使用して、黒鉛、酸化黒鉛、および全てのグラフェンサンプルのラマンスペクトル分析を、２００〜３０００ｃｍ−１の間で行った。
磁気的挙動の特性化：
【００６８】
約１０−８ｅｍｕの感度を伴う超電導量子干渉素子（ＳＱＵＩＤ）磁気探知機を使用して、グラフェンサンプルの磁化を検討した。サンプルの重量を慎重に量り、ゼラチンカプセルの中に装填した。０から３００Ｋの間で、−５００００Ｏｅから５００００Ｏｅの印加磁場範囲の間でサンプルを分析した。磁場冷却およびゼロ磁場冷却モードで、温度の関数としての磁化を検討するために、５００Ｏｅの保磁場を印加した。
【００６９】
緩和能の特性化：
【００７０】
緩和能測定について、全てのグラフェンナノプレートレットおよびグラフェンナノリボンサンプルの１ｍｇを、２ｍｌの生物学的に適合した１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７界面活性剤溶液の中で、均一に分散させた。次いで、これらの飽和溶液（懸濁液）の浮遊物を、緩和時間測定に使用した。２１．４２ＭＨｚのプロトンＮＭＲ周波数および０．５Ｔ磁場強度において、ｉＳｐｉｎ−ＮＭＲシステム（Ｓｐｉｎｃｏｒｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、縦および横緩和時間（Ｔ１、Ｔ２）を測定した。Ｔ１、Ｔ２は、それぞれ、反転回復法およびＣＰＭＧ方法を使用して測定された。緩和時間の逆数は、それぞれの緩和速度Ｒ１およびＲ２を表す。ＭＲＩ造影剤の効力の尺度である、緩和能（ｒ１、ｒ２）は、その濃度の関数として表される。それは、式ｒ１，２＝（Ｒ１，２−Ｒ０）／［Ｍｎ２＋］を使用して計算された。Ｒ１，２およびＲ０は、それぞれ、サンプルおよび１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７界面活性剤溶液の縦または横緩和速度であり、［Ｍｎ２＋］は、緩和測定で使用される溶液の体積の中のマンガンの濃度である。
【００７１】
金属含有量分析
【００７２】
我々のサンプルの中のマンガンの存在を確認するため、およびその濃度を判定するために、２つの民間分析試験所（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  Ｔｕｃｓｏｎ，  ＡＺ、およびＧａｌｂｒａｉｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，  ＴＮ）で別々に、誘導結合プラズマ発光分光法（ＩＣＰＯＥＳ）を実行した。カリウム［Ｋ］含有量も、全てのサンプルで推定された。ＩＣＰサンプル調製について、緩和時間測定に使用されたＰｌｕｒｏｎｉｃ溶液中のサンプルの懸濁液を、濃縮ＨＮＯ３で処理し、慎重に加熱して固体残渣を得た。次いで、それらを３０％Ｈ２Ｏ２でさらに処理し、再び加熱して炭素質物質を排除した。固体サンプルの場合、それらを過酸化物および熱処理に直接さらして、炭素質含有量を除去した。それぞれの場合において、残りの残渣を２％ＨＮＯ３の中で溶解させ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｊａｒｒｅｌｌ  Ａｓｈ  ＩＣＡＰ  ６１誘導結合プラズマ分光計を使用したＩＣＰによって分析した。
【００７３】
生体外ファントムＭＲＩ
【００７４】
３Ｔ  Ｔｒｉｏ  Ｓｉｅｍｅｎｓ  ＭＲＩシステムを使用して、生体外Ｔ１およびＴ２ＭＲＩファントム実験をナノリボンサンプルに行い、Ｔ１には５００ミリ秒の繰り返し時間（ＴＲ）および１０ミリ秒のエコー時間（ＴＥ）、Ｔ２測定には８０００ミリ秒のＴＲおよび１１２ミリ秒のＴＥで２Ｄスピンエコー映像法を使用して、画像を得た。
結果および考察
【００７５】
本実施例は、黒鉛およびＭＷＣＮＴ等の出発原料を使用した単純化学酸化手順（例えば、合成の詳細については方法および材料の節を参照）が、ＭＲＩ造影剤としての潜在性を示し、磁性マンガン挿入グラフェンナノプレートレットおよびグラフェンナノリボンを生じることを示す。
【００７６】
図１（ａ、ｂ）は、それぞれ、それらの構造および形態学的情報を提供する、還元グラフェンナノプレートレットの代表的な低倍率および高倍率ＴＥＭ画像を示す。図１（ａ）で見られるように、それらは、約２０ｎｍの平均幅を伴って形状が丸く見える。いくつかのプレートレットは、他のプレートレットよりも色が濃く見え、これは、多層酸化グラフェンシートの存在によるものである。ほとんど透明である、より色が薄いものは、単層または二重層酸化グラフェンシートである。図１（ｂ）は、格子グリッド線および六角炭素原子環が明確に可視的である、個々のグラフェンシートの原子格子縞構造を表す（非特許文献３１）。Ｓｉ基材上の酸化グラフェンナノプレートレット分散のＡＦＭ区分分析は、約１．１３７ｎｍの均一な厚さを見せた（図７）。本来のグラフェンシートは、０．３４ｎｍの原子層厚さ（ファン・デル・ワールス）を有する。カルボキシルおよびヒドロキシル基との共有結合の存在、および酸化グラフェンナノプレートレット構造の中のｓｐ３炭素原子の変位が、厚さの増加の理由であることが知られている（非特許文献２０）。
【００７７】
図１（ｃ、ｄ）は、それぞれ、グラフェンナノリボンの代表的な低倍率および高倍率ＴＥＭ画像を示す。図１（ｃ）で見られるように、グラフェンナノリボンは、グラフェンシートの完全アンジッピング層を有する。図１（ｄ）の高分解能ＴＥＭ画像は、ＭＷＣＮＴの同心壁の連続アンジッピングにより、ナノリボンが多層（矢印）であることを明確に示す。酸化グラフェンナノリボンの原子構造表面の質は、欠陥がほとんどなく、大部分が均一かつ平滑に見える。出発原料であるＭＷＣＮＴは、４０〜７０ｎｍの外径および５００〜２０００ｎｍの長さを有する。ＭＷＣＮＴは、円筒であるため、アンジッピング時に、１２５〜２２０ｎｍである直径×πの範囲内の幅および５００〜２０００ｎｍの長さを有するように完全に開くべきである。ＴＥＭ画像の分析は、グラフェンナノリボンの平均幅が、７０ｎｍのＭＷＣＮＴの最外管の外径よりも大きい、約１２０ｎｍであることを示し、したがって、アンジッピングのプロセスを検証する。しかしながら、この平均値は、完全に平坦なリボンに必要とされる範囲１２５〜２２０ｎｍよりもわずかに小さく、これは、アンジッピングプロセスが完全に平坦なリボンをレンダリングしないが、リボンが依然として管の何らかの曲率を保持し、したがって、完全に平坦なシートに期待されるよりも小さい幅を有するという事実によって、立証することができる。ＴＥＭ画像は、アンジッピングＭＷＣＮＴに対する計算された範囲内に入る、約６００〜２０００ｎｍの平均長を示す。
【００７８】
図２（ａ）は、酸化および還元グラフェンナノプレートレットのラマンスペクトルを示す。また、黒鉛および酸化黒鉛のラマンスペクトルも対照として含まれる。黒鉛のスペクトルは、二重退縮ゾーン中心Ｅ２ｇモード（非特許文献３２）に起因するＧバンドを示す、１５８１ｃｍ−１における顕著で急なピークを示す。酸化黒鉛の場合、Ｇバンドの広がりおよび１５９５ｃｍ−１へのピーク偏移がある。さらに、ゾーン境界光子が、１３４５ｃｍ−１においてＤバンドを生じ、それは、酸化による不規則ｓｐ２ドメインの増加および結晶サイズの縮小を示して顕著になる。黒鉛の酸化のプロセスにより、黒鉛に対する０．４０７から酸化黒鉛に対する１．２まで、Ｄ対Ｇピークの強度の比（ＩＤ／ＩＧ）の増加がある（非特許文献３２）。酸化グラフェンナノプレートレットおよび還元グラフェンナノプレートレットのスペクトルは、それぞれ、１．３および１．４４といったＩＤ／ＩＧのさらなる増加を示す。図２（ａ）は、還元グラフェンナノプレートレットの場合、ＤおよびＧバンドのピークが、黒鉛の値（それぞれ１３３０ｃｍ−１および１５９０ｃｍ−１）により近く偏移させられており、それが、ある程度の次数の削減および回復中に酸素官能基の除去に起因することを示す。しかしながら、ＩＤ／ＩＧ１．４４の増加は、そのような小さいサイズの不規則ドメインの数の増加に加えて、ｓｐ２ドメインの平均サイズの縮小によるものである（非特許文献２１）。
【００７９】
加えて、酸化黒鉛および還元グラフェンナノプレートレットのラマンスペクトルはまた、約６５７ｃｍ−１、３７０ｃｍ−１、および３２０ｃｍ−１において、付加的なピークも示した（図８）。ピークを識別するために、ＲＲＵＦＦ（商標）プロジェクト収集を使用したラマンスペクトルデータベース検索を行った。これは、観察されたピークが、ハウスマン鉱として知られている、二価および三価マンガンを含有する錯体によるものであることを確認した（図８参照）。図８では、サンプルのＧおよびＤバンドが、ハウスマン鉱の付加的なピークとともに見られ、酸化マンガンが、これらの領域において炭素質基質に挿入されることを確認する。ハウスマン鉱（Μｎ３Ｏ４）ナノ結晶は、空気中で高温にてマンガンの酸化物、水酸化物、炭酸塩、硝酸塩、または硫酸塩の焼成を伴う、種々の方法によって合成されることが知られている（非特許文献３３、非特許文献３４）。これらの方法の大部分がＭｎ（ＩＩ）化合物の酸化を伴う一方で、ＫＭｎＯ４の還元もまた、Ｍｎ３Ｏ４の形成をもたらすことが知られている（非特許文献３５、非特許文献３６）。この場合、正確な機構は依然として不明であるが、硝酸（ＨＮＯ３）等の強力な酸化剤の存在が、ＫＭｎＯ４の還元を引き起こしたことが示唆されている。分析を行いながら、酸化黒鉛およびグラフェンナノプレートレットの全てのスペクトルがハウスマン鉱ピークを示したわけではないことが観察された。ハウスマン鉱ピークの存在は、サンプルの配向およびサンプルスポットサイズに敏感であり、これらのピークが、酸化マンガン挿入の領域のみで見られたことを確認した。
【００８０】
図２（ｂ）は、グラフェンナノリボンおよびＭＷＣＮＴのラマンスペクトルを示す。（図２（ａ）の）ナノプレートレットのスペクトルと同様に、ナノリボンのスペクトルは、１６００ｃｍ−１における偏移ピークを伴う広いＧバンド、ならびに１３１０ｃｍ−１における顕著なＤバンドを確認する。ＭＷＣＮＴのラマンスペクトルと比較して、０．０４５から１．５７までのＩＤ／ＩＧ値の増加が見られた。これは、１よりも大きいＩＤ／ＩＧがナノリボンについて観察された、ＭＷＣＮＴの化学酸化に由来するナノリボンのラマンスペクトルについての以前の報告と一致する（非特許文献２１）。偏移Ｇバンドは、図２（ａ）の黒鉛の酸化により見られる偏移と同様に、ＭＷＣＮＴの酸化アンジッピングによるものである。高い強度および広いＤバンドは、そのような小さいサイズの不規則ドメインの数の増加に加えて、ｓｐ２ドメインの平均サイズの縮小の効果によるものである。ナノリボンを用いると、ナノプレートレットについて見られるハウスマン鉱ピーク等のマンガンを示すいかなる異常なラマンピークも検出することができなかった。
【００８１】
ナノプレートレットおよびナノリボンの中のマンガン（Ｍｎ２＋）の存在を確認するために、ＩＣＰＯＥＳによる元素分析を乾燥固体サンプルについて行った。酸化黒鉛、グラフェンナノプレートレット、および還元グラフェンナノプレートレットは、それぞれ、４８４０００、５４００００、および５１６０００ｐｐｍのマンガンを有すると報告されているが、対照黒鉛は、わずか０．１ｐｐｍのマンガンを有する。これは、これらのサンプルの中のマンガンの支配的な存在を確認する。グラフェンナノリボンの場合、５７０ｐｐｍが報告された。実験は、グラフェンナノリボンのラマンスペクトルにおいて、いかなるマンガン関連ピークも検出することができなかったが、この値は、その存在を確認した。それがＭＷＣＮＴのＫＭｎＯ４ベースの酸化を通して導入されたことを明確にするために、出発原料、ＭＷＣＮＴ、および最終ナノリボン製品の含有量を比較した。ＭＷＣＮＴに対する２５ｐｐｍからナノリボンに対する５７０ｐｐｍまで、マンガン含有量の約２５倍増加が観察された。これは、本方法で使用される酸化手順に起因する。図３は、全てのサンプルのＳＱＵＩＤ磁性特性化を示す。図３（ａ）は、３つの温度（３０Ｋ、１５０Ｋ、および３００Ｋ）に対する−５０，０００Ｏｅから５０，０００Ｏｅの間の対照である黒鉛の磁化（Ｍ）対磁場強度（Ｈ）のプロットを示す。負の傾斜は、反磁性挙動の特徴である印加磁場の増加とともに、磁気モーメントの値の減少を示唆する。図３（ｂ）は、酸化黒鉛のＭ対Ｈプロットを示す。磁場強度とともに磁性モーメントの値の増加を示す、正の傾斜は、サンプルの常磁性挙動を確認する。黒鉛の酸化時の常磁性への変化は、修正されたＨｕｍｍｅｒのプロトコル中に複合酸化マンガンとしてサンプルに挿入された、常磁性Ｍｎ２＋イオンの存在に起因し得る。黒鉛に由来する還元グラフェンナノプレートレットにおける超常磁性挙動が観察された。強磁性質のナノ粒子集団（＜３０ｎｍ）で観察される磁気現象である、超常磁性は、磁性モーメントの整合の方向でのランダムな反転が温度の影響を受けて起こる、サイズ依存性現象である。サンプルが所与の温度で様々な磁場を受ける、磁化測定中に、超常磁性材料は、Ｍ対Ｈプロットにおいて「Ｓ」字形曲線を帯びる。これは、磁化を測定するのにかかる時間が、モーメントにおける連続反転のための時間よりもはるかに長いためである。結果として、磁場がない場合、平均磁化はゼロとして測定され、曲線はヒステリシスループの代わりに「Ｓ」字形を帯びる。図３（ｃ、ｄ）は、それぞれ、グラフェンナノプレートレットおよび還元グラフェンナノプレートレットのＭ対Ｈプロットを示す。図３（ｄ）から、より低い温度（３０Ｋ）で、ナノプレートレットサンプルが強磁性ヒステリシス曲線を示すことが明白である（非特許文献３７、非特許文献３８）。図３（ｄ）の差し込み図から、超常磁性挙動が室温で観察されることが明白である。５００Ｏｅの均一な磁場強度および０から３００Ｋの間で描画されたゼロ磁場冷却（ＺＦＣ）および磁場冷却（ＦＣ）曲線が、図３（ｅ）で見られる。ＺＦＣ曲線におけるピークは、強磁性および超常磁性状態の間の遷移を示す、４０Ｋのブロッキング温度（ＴＢ）を表す。
【００８２】
還元グラフェンナノプレートレットの磁気的挙動は、以前に報告されたようなハウスマン鉱とのはっきりした類似性を呈する（非特許文献３９）。低温での強磁性および高温での常磁性が、ハウスマン鉱で報告された。還元グラフェンナノプレートレットと同様に、ハウスマン鉱は、４０ＫのＴＢ、および両方の材料の異なる温度でのＭ対Ｈのプロットが類似することを示す（非特許文献３９）。これは、ナノプレートレットの中の複合酸化マンガンの挿入を検証し、我々は、グラフェンナノプレートレットのナノ構造（幅約２０ｎｍ）に加えて、この挙動が複合酸化マンガンの存在に起因すると考えることができる。３０Ｋにおけるヒステリシス曲線の残余磁化は、１２．４７ｅｍｕ／ｇであり、飽和保磁力は、６２９８．６８Ｏｅである。以前の文献によれば、高い飽和保磁力は、サンプルの単一ドメイン性質および高い形状異方性に起因し得る。
【００８３】
グラフェン、酸化グラフェン、およびナノリボンサンプルにおける室温強磁性の存在について、いくつかの理論的報告および少数の実験的報告がある（非特許文献４０、非特許文献１９）。酸化黒鉛から調製され、後に還元および焼鈍されたグラフェンサンプルについてのＳＱＵＩＤを使用した、Ｗａｎｇらによる近年の実験研究は、室温強磁性を示している（非特許文献１９）。考えられる磁性の起源は、焼鈍プロセスによる欠陥として存在するスピンユニットの長距離結合に起因する。それらは、金属不純物の欠如を検証し、磁性は処理によるグラフェンの固有特徴に起因すると考えられる。この場合、サンプルの中のマンガンの存在は、ＩＣＰＯＥＳおよびラマン分光法を通して確立される。これは、ナノプレートレットおよびハウスマン鉱の磁気データの類似性によって、さらに裏付けされる。たとえ酸化黒鉛サンプルがハウスマン鉱の存在を示したとしても、それらは常磁性挙動を呈する（非特許文献３９）。還元グラフェンナノプレートレットの場合、いくつか他の因子が効果を現すと考慮して、ナノプレートレットの室温超常磁性は、挿入酸化マンガン、プレートレットのナノクラスタサイズ、およびグラフェンの中のｓｐ２炭素原子上の欠陥部位として存在するスピンユニットの長距離結合の組み合わせに起因する。さらに、スピンユニットの長距離の規則的な結合は、個々のシートの中の分子内挿入、またはグラフェン多層の隣接シート間の分子間挿入によるものであり得る。
【００８４】
ＭＷＣＮＴから合成されたグラフェンナノリボンのＳＱＵＩＤ分析はまた、室温で興味深い磁気的性質も示す。ＭＷＣＮＴの磁化対磁場強度のプロットが、図４（ａ）に示される。一貫した磁気パターンが見られず、磁気信号は、３つ全ての温度で極めて弱い。グラフェンナノリボンのＭ対Ｈのプロットは、図４（ｂ）で見られるように超常磁性挙動を示す。しかしながら、図４（ｂ）の差し込み図は、非常に低い残留磁気とともに強磁性挙動を示す、３００Ｋにおけるヒステリシス曲線の平行線を示す。図４（ｃ）は、ＦＣ／ＺＦＣプロットを示し、ＺＦＣ曲線上の最大値は、室温を上回る高いブロッキング温度ＴＢを表す、約＞３００Ｋで見られる。これは、磁気状態の遷移が効果を現した、３００Ｋにおける薄いヒステリシスループを説明した。３００Ｋで見られた飽和磁化は、２５００Ｏｅにおいて０．１ｅｍｕ／ｇであった。サンプルは、１０Ｋにおいて２５０Ｏｅの保磁場を示した。酸化鉄ナノ粒子ならびに微細構造が室温超常磁性を呈することが報告されている（非特許文献４１、非特許文献４２）。しかしながら、酸化鉄またはグラフェンにおいて室温強磁性を得ることは、合成後高温焼鈍プロセス、または反強磁性錯体に粒子を埋め込むことを必要とする（非特許文献１９、非特許文献４３）。近年、磁鉄鉱および磁赤鉄鉱酸化鉄ナノ粒子における比較的低い温度（１８５℃）での合成プロセスによる室温強磁性が報告されている（非特許文献４４）。この研究報告は、サイズ依存性磁気的挙動を報告し、ブロッキング温度（ＴＢ、強磁性から超常磁性への遷移の指標）は、３．２ｎｍ粒子に対する２５Ｋから５．４ｎｍ粒子に対する３３０Ｋまでの増加を示す。この場合、７０℃の温度で単純化学合成手順を用いて、ＴＢ値＞３００Ｋを伴う室温強磁性から超常磁性の遷移を達成することが可能であった。Ｆｅ２Ｏ３充填ＭＷＣＮＴにおける室温超常磁性についての以前の報告が報告されている（非特許文献４５）。
【００８５】
酸化グラフェンナノプレートレットおよびナノリボンの緩和能：
【００８６】
０．０５％濃度の１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７界面活性剤溶液の中で分散された全てのグラフェンサンプルに、２１．４２ＭＨｚ、０．５Ｔ、および２７℃で単一点緩和測定を行った。水中の酸化黒鉛の超音波剥離は、酸化グラフェンの薄いシートを含有する、安定したコロイド懸濁液をもたらした。これは、ヒドロキシルおよびカルボキシル基の親水性により実行可能であった。したがって、酸化グラフェンシートは、本来のグラフェンとは異なる。ここで使用されるような還元のプロセスは、全ての酸素基を完全には除去しなかった。ＭＷＣＮＴの酸化アンジッピングもまた、これらの官能基を酸化グラフェンナノリボンに追加することが分かった。グラフェンナノプレートレット、還元グラフェンナノプレートレット、およびグラフェンナノリボンは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ等の水性生体適合性溶液中で均質な安定した分散を形成することができる。表１（ａ、ｂ）は、各サンプルの金属イオン（マンガン）の濃度、緩和速度、および緩和能についての詳細を提供する。表１（ａ）から、酸化黒鉛が、グラフェンナノプレートレットおよび還元グラフェンナノプレートレットと比較したときに、強化されたｒ１およびｒ２緩和能を示したことが明確である。マンガンベースのＭＲＩ造影剤である、Ｍｎ−ＤＰＤＰ（商業的にＴｅｓｌａｓｃａｎ（登録商標）として知られている）のＮＭＲ緩和能測定は、２０ＭＨｚにおいて水溶液中でｒ１＝１．８８ｍＭ−１ｓ−１およびｒ２＝２．１８ｍＭ−１ｓ−１の緩和能値を示すことが報告されている（非特許文献４６）。Ｔｅｓｌａｓｃａｎ（登録商標）と比較して、酸化黒鉛は、ｒの２倍の速度およびｒ２の場合は４倍を示した。グラフェンナノプレートレットは、臨床対照物Ｔｅｓｌａｓｃａｎ（登録商標）と比較したときに、類似緩和能値を示した。しかしながら、表１（ｂ）で見られるように、グラフェンナノリボンは、Ｔｅｓｌａｓｃａｎおよびナノプレートレットと比較して、はるかに高い緩和能範囲を示した。少ないサンプル体積の中の微量のマンガンを分析する際の機器の検出制限により、ナノリボンの中の一連の濃度のマンガンを我々に提供した、２つの異なる分析研究所から、サンプルの金属含有量が分析され、したがって、ナノリボンの緩和能の上限および下限を計算した。ｒ１の範囲は、２．９２〜９．８ｍＭ−１ｓ−１であり、ｒ２は、１４．８〜５０．３ｍＭ−１ｓ−１である。表１（ｂ）はまた、ガドリニウム（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）および超常磁性酸化鉄（Ｃｏｍｉｂｉｄｅｘ）に基づく他の臨床造影剤の緩和能と比較したときに、ナノリボンが有望な造影剤性能を呈することも示す（非特許文献４７、非特許文献４８）。
【００８７】
生体外ファントムＭＲＩ：
【００８８】
水性グラフェンナノリボンサンプル、対照として、前臨床ＭＲＩ造影剤として広く使用されているＭｎＣｌ２および水の間でＭＲ信号コントラストを比較するように、ＭＲＩファントム撮像を行った。代表的なＴ１およびＴ２加重ファントムＭＲＩ画像は、同一のＭｎ２＋濃度におけるＭｎＣｌ２（ｒ１＝９．２ｍＭ−１ｓ−１、ｒ２＝９３ｍＭ−１ｓ−１）および水と比較したときに、ナノリボンサンプルの場合の有意なコントラスト強化を示す。水に対するナノリボンおよびＭｎＣｌ２の平均信号強度比を比較し、表２（ｂ）に示されるように、ナノリボンのより高い信号コントラストが、Ｔ１ならびにＴ２の場合に見られた。これは、プロトン分子の緩和速度の有意な強化をもたらす、ナノリボンの興味深い室温磁気性質に起因する。
【００８９】
【表１ａ】
2014516206.tif 000003
【００９０】
【表１ｂ】
2014516206.tif 000004
【００９１】
【表２】
2014516206.tif 000005
【００９２】
要約すると、この実施例は、単純化学酸化手順による新しい部類の官能化グラフェンナノプレートレットおよびナノリボンの合成を実証した。本実施例では、官能化グラフェンナノプレートレットおよびナノリボンの合成が成功し、グラフェンナノプレートレットにおけるマンガンの存在およびその磁気的寄与が検証された。グラフェンナノリボンの場合、強磁性から超常磁性への室温磁性遷移とともに、非常に興味深い磁気的性質が見出された。本実施例はまた、マンガンおよび鉄等の磁性金属イオンの構造、キラリティ、および存在が、これらの炭素物質の緩和速度を有意に強化することも示す。これらのナノプレートレットおよびナノリボンは、ＭＲＩ撮像のための官能化グラフェンベースの造影剤として使用することができる。
【００９３】
［実施例２］
新規のグラフェンナノプレートレット（ＧＮＰ、１〜５ナノメートル（ｎｍ）の厚さおよび約５０ｎｍの直径を伴うグラフェン（黒鉛の１原子厚さのシート）の小さいスタック（１〜１２層））（図１ａおよび１ｂ）が、マウスのＭＲＩスキャンにおいてＭＲＩ造影剤として試験された。ＧＮＰは、単分散、水溶性であり、挿入され（２つのグラフェンシート間の空隙内の化学種の挿入）、微量のマンガン（ＧＮＰの中の０．１％ｗ／ｗ（ｗ＝重量）のマンガン、すなわち、１００グラムのＧＮＰにつき０．１グラムのマンガン）と協調した。ＧＮＰは、Ｍｎ−ＤＰＤＰ（Ｔｅｓｌａｓｃａｎ、臨床ＭｎベースのＣＡ、３Ｔでｒ１＝２．８ｍＭ−１ｓ−１）よりもほぼ１６倍高く、Ｇｄ−ＤＴＰＡ（Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ、臨床ＧｄベースのＣＡ、３Ｔでｒ１＝４．２ｍＭ−１ｓ−１）よりも約１０倍高い、ｒ１＝４５ｍＭ−１ｓ−１の緩和能を示した。３テスラ臨床スキャナを使用した、Ｔ１加重小動物ＭＲＩを使用したスキャン（図６）は、臨床投与量におけるＭａｇｎｅｖｉｓｔと比較して、約１００倍優れたコントラスト強化を示した。
【００９４】
［実施例３］
グラフェンナノプレートレット（ＧＮＰ）
【００９５】
最初に、修正されたＨｕｍｍｅｒの方法（過マンガン酸カリウムおよび濃縮硫酸による処理）を使用して、酸化黒鉛（ＧＯ）を分析グレード微小黒鉛から調製し、超音波浴クリーナの中で１時間の超音波処理によって、グラフェンナノプレートレット（ＧＮＰ）に変換した（非特許文献４９）。次に、フラーレンおよび金属内包フラーレンの炭素炭素二重結合にわたって、カルボン酸官能基を添加するために使用される、付加環化反応に類似する合成プロトコルを使用して、ＧＮＰが水溶性化される（非特許文献２９）。ＧＮＰは、デキストラン等の天然ポリマーまたはポリエチレングリコール等の合成ポリマーでそれらを共有または非共有的に被覆することによって、水溶性化される。
【００９６】
対照
【００９７】
Ｍａｇｎｅｖｉｓｔは、臨床ＭＲＩ造影剤の基準と見なされるため、対照が必要とされる実験で使用される。加えて、ＧＮＰ  ＭＲＩ  ＣＡの生理化学、薬理学、薬物動態、および撮像性質が、Ｏｍｎｉｓｃａｎ（ガドジアミド、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＭＡ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＯｐｔｉＭＡＲＫ（ガドベルセタミド、Ｇｄ−ＤＴＰＡＢＭＥＡ、Ｃｏｖｉｄｉｅｎ）、Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ（ガドペンテト酸ジメグルミン、Ｇｄ−ＤＴＰＡ、Ｂａｙｅｒ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａ）、ＭｕｌｔｉＨａｎｃｅ（ガドベン酸ジメグルミン、Ｇｄ−ＢＯＰＴＡ、Ｂｒａｃｃｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｇａｄｏｖｉｓｔ（ガドブトロール、Ｇｄ−ＢＴ−ＤＯ３Ａ、Ｂａｙｅｒ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａ）、およびＤｏｔａｒｅｍ（ガドテル酸メグルミン、Ｇｄ−ＤＯＴＡ、Ｇｕｅｒｂｅｔ）等の他のＦＤＡ承認された臨床ＧｄベースのＭＲＩ  ＣＡの公表値５，９と比較される。
【００９８】
動物
【００９９】
ウィスター系ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ｌａｂｓ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ）が、以前の前臨床研究（非特許文献５０）で広く使用されているため、この動物モデルが使用される。
【０１００】
水溶性および生理化学的特性化のためにＧＮＰ  ＭＲＩ  ＣＡを合成および官能化する
【０１０１】
重量オスモル濃度
【０１０２】
この試験は、血液の流体成分で見出される全ての化学粒子の濃度を測定する。重量オスモル濃度は、造影剤に対する耐性の分析における重要な因子であり、それにより、局所および全身反応の両方が、特に、より高い用量で役割を果たす（非特許文献５１、非特許文献５２、非特許文献５３）。重量オスモル濃度は、３７℃で示差サーミスタ浸透圧計を使用して判定される。２つのＧＮＰ濃度、０．５ｍｏｌ／１溶液（０．５７オスモル／ｋｇ）および１ｍｏｌ／１溶液（１．３９オスモル／ｋｇ）が使用される。これらの値は、他のＧｄベースのＭＲＩ  ＣＡの前臨床研究に基づいて選択されている。
【０１０３】
分配係数
【０１０４】
分配係数分析は、ＧＮＰ  ＭＲＩ  ＣＡの親水性（「水を好む」）または疎水性（「水を避ける」）レベルの尺度を提供する（非特許文献５４）。分配係数は、体内のＧＮＰ分布の推定を可能にする。ＧＮＰが高い分配係数を示す場合、これは、このＣＡが、細胞の脂質二重層等の疎水性区画に優先的に分配されるであろうという指標であり、低い分配係数が観察される場合、ＧＮＰは、血清等の親水性区画で優先的に見出されるであろう。分配係数は、ブタノールおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）を使用して測定される。相の完全な分離後、ブタノールおよび緩衝液中のＧＮＰ濃度が、ラマン分光法によって判定される。
【０１０５】
生体外緩和能
【０１０６】
Ｒ１およびＲ０が、それぞれ、ＧＮＰ溶液および淡水またはウシ血漿の縦緩和速度（Ｒ０，１＝ｌ／Ｔ０，１  Ｓ−１）であり、［Ｍｍ＋］が、マンガン濃度である、方程式ｒ１＝（Ｒ１−Ｒ０）／［Ｍｎ２＋］を使用して、水およびウシ血漿中のＧＮＰの緩和能ｒ１（３Ｔ臨床ＭＲスキャナ、温度＝３７℃）が計算される。
【０１０７】
タンパク質結合
【０１０８】
ＣＡの効力は、それが血漿タンパク質に結合する程度の影響を受け得る（非特許文献５０）。したがって、タンパク質結合が、限外濾過を用いて、１ｍｍｏｌ／ｌの濃度のヒト血漿において測定される。
【０１０９】
ヒスタミン放出
マクロファージのヒスタミン放出は、ＭＲＩ  ＣＡに対する種々の有害反応に関連した重要な現象である（非特許文献５５）。ヒスタミンが豊富な顆粒を含有する、いくつかの細胞型における常在細胞である、マスト細胞（肥満細胞および肥大細胞としても知られている）が、０〜２５０ｍｍｏｌ／ｌに及ぶＧＮＰ  ＭＲＩ  ＣＡ（Ｍａｇｎｅｖｉｓｔが対照として使用される）濃度を含有する、緩衝液中で培養される。ヒスタミン放出が、ヒスタミン解放化合物４８／８０によって引き起こされる放出の５０％に近づく濃度である、Ｉ５０が計算される。
【０１１０】
ラットにおける高性能ＭＲＩ  ＣＡとしての水溶性ＧＮＰの影響を評価する生体内ＭＲＩ研究
【０１１１】
ＭＲＩ調査が、ヒトの心臓、脳、または筋肉内の病変を模倣する病変を伴うラットに行われる。ラット（雄、ウィスター系ラット、１７０〜１８０ｇ、ｎ＝１群あたり３）における脳梗塞、脳腫瘍、または筋肉内腫瘍の誘発が、十分に確立されたプロトコル（非特許文献５０）を使用して達成される。撮像前に、動物は麻酔され（イソフルラン）、カテーテルが、造影剤の注射のために尾静脈に固定される。造影剤注射の直後に、全てのＭＲＩ  ＣＡが注入管から取り除かれていることを確実にするように、約５ｍＬの０．９％生理食塩水が注射される。３Ｔ臨床ＭＲスキャナ（Ｓｉｅｍｅｎｓ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍａｌｖｅｒｎｓ，  ＰＡ）が使用され、Ｔ１加重スピンエコー画像が獲得される。撮像は、０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＧＮＰまたはＭａｇｎｅｖｉｓｔ（対照）の注射の１分前および後に、ならびに同一動物への初回投与の５分後に与えられる０．２ｍｍｏｌ／ｋｇの付加的な用量の注射の１分後に行われる。造影剤注射前検査と同一の平面内で、同一のパラメータを用いて、造影剤注射後画像が得られる。実験および対照群における信号対雑音比およびコントラスト対雑音比（ＣＮＲ）が、目的とする領域で得られ、統計分析が行われる。ＭＲ画像の解釈の経験がある２人の放射線医によって、画像が精査される。ＣＡの効力が評価され、ａ）診断に向けた付加的な情報の提供、ｂ）診断の信頼の増加、ｃ）そうでなければ可視的ではない病変の検出、およびｄ）他のパルスシーケンスで見られる病変のより優れた特性化のための重要な情報の提供といった、基準を使用して、臨床施術者間の合意に到達する。病変強化が明白である場合において、造影剤は、診断でａ）役に立たない、ｂ）軽微に役立つ、ｃ）中程度に役立つ、またはｄ）極めて役立つと判断される。
【０１１２】
ラットにおける生体内薬物動態、生体内分布、および毒性研究
【０１１３】
排出および生体内分布
【０１１４】
長期排出および生体内分布を判定するために、０．２５ｍｍｏｌ／ｋｇのＧＮＰ  ＭＲＩ  ＣＡが、体重９０〜１１０ｇの５匹の雄および５匹の雌ウィスター系ラットの尾静脈に静脈内注射される。次いで、動物は代謝ケージの中に入れられる。
【０１１５】
糞尿が毎日収集され、ＧＮＰおよびマンガン含有量が測定される。
【０１１６】
動物は、注射後７日に犠牲にされる。血液、肝臓、腎臓、脾臓、骨サンプル（大腿骨）、脳、および残りの身体が、ラマン分光法によるＧＮＰ含有量および誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）分光法によるマンガン含有量の測定のために収集される。
【０１１７】
薬物動態
【０１１８】
体重９０〜１１０ｇの５匹のウィスター系ラットに実験が行われる。実験の前および間に、動物は、個々の代謝ケージの中に収容される。１２５Ｉ−ＧＮＰ（１２５Ｉ半減期＝５９．４日）が、０．２５ｍｍｏｌ／ｋｇ血液（０．５ｍｌ）の用量で尾静脈に注射され、血液が、ＧＮＰ  ＭＲＩ  ＣＡ注射の前、５、１０、２０、および３０分、ならびに１、１．５、２、３、６、および２４時間で、および７日後に、頸静脈から引き出される。尿が、０．５、１、２、３、６、および２４時間で、次いで、７日間にわたって毎日、定量的に収集される。糞が、７日にわたって毎日、定量的に収集される。尿、糞、および血漿サンプルのアリコートが、ガンマ線シンチレーションカウンタによって放射分析される。尿画分および血漿サンプル（注射の５または２０分および２時間後）が、ＨＰＬＣ分析を使用して、潜在的な代謝産物について分析される。
【０１１９】
血漿中の最終的な排出半減期の計算のための薬物動態プログラムＴＯＰＦＩＴ、ならびに血漿および尿データからの分布のクリアランスおよび定常状態体積を使用して、モデル独立アプローチが適用される（非特許文献５６）。
【０１２０】
急性毒性
【０１２１】
ＧＮＰ  ＭＲＩ  ＣＡ（２ｍｏｌｓ／ｌ）が、雄および雌ウィスター系ラット（９０〜１１０ｇ、雄対雌比１：１）に静脈内注射される。用量は、１０、５０、１００、２５０ｍｍｏｌ／ｋｇであり、各投与量群は、８匹の動物から成る。動物は、注射後７日の観察期間の全体を通して監視される。ＬＤ５０は、プロビット分析を用いて計算される（非特許文献５７）。
【０１２２】
［実施例４］
【０１２３】
本実施例は、酸化黒鉛またはグラフェンナノ粒子を合成するために使用される酸化化学手順が、グラフェンシート間の微量のＭｎ２＋イオンの閉じ込め（挿入）につながり、これらのマンガン挿入黒鉛およびグラフェン構造が、異種の構造、化学、および磁気的性質、ならびに常磁性キレート化合物と比較して、高い緩和能（最大で２次数）および明確に異なる核磁気共鳴分散プロファイルを示すことを実証する。結果は、黒鉛炭素粒子のサイズ、形状、または構造ではなく、グラフェンシート内の常磁性金属イオンの閉じ込め（挿入）が、緩和能を増加させるための主要な決定因子であり、したがって、高緩和能ＭＲＩ造影剤としての常磁性金属イオン黒鉛炭素錯体を開発するための新規の一般方策として、常磁性イオンのナノ閉じ込めを識別することを示す。
【０１２４】
材料および方法
【０１２５】
１．グラフェンナノプレートレットおよびナノリボン合成
【０１２６】
合計５バッチのグラフェンナノプレートレットおよびナノリボンを調製し、特徴付けた。緩和能結果を除く、提示された全ての結果は、単一のバッチのデータを表す。実施例１で描写されるような修正されたＨｕｍｍｅｒの方法によって、分析グレード微小黒鉛（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）から酸化微小黒鉛を調製した。典型的な剥離手順で、乾燥酸化黒鉛（２００ｍｇ）を、水（２００ｍｌ）を含有する丸底フラスコの中で懸濁させ、超音波浴クリーナ（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＦＳ６０、２３０Ｗ）の中で１時間にわたって超音波で分解した。この均一な溶液の５０ｍｌを遠心分離し、ペレットを一晩乾燥させて、酸化グラフェンナノプレートレットを得た。残りの１５０ｍｌをヒドラジン水和物（１．５ｍｌ、３７．１ｍｍｏｌ）で処理し、水冷凝縮器の下で１００℃にて油浴の中で１２時間加熱し、黒い沈殿物をもたらした。生成物を単離し、媒体焼結ガラス濾過漏斗上で水（５００ｍｌ）およびメタノール（５００ｍｌ）により洗浄し、連続空気流によって乾燥させ、還元グラフェンナノプレートレットを生じた。
【０１２７】
実施例１で説明されるものに類似する手順で、ＭＷＣＮＴ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）からグラフェンナノリボンを調製した。ＭＷＣＮＴ（１５０ｍｇ、１２．５ミリ等量の炭素）を、３０ｍｌの濃縮のＨ２ＳＯ４中で２時間懸濁させた。ＫＭｎＯ４（７５０ｍｇ、４．７５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を１時間撹拌させた。次いで、反応物を、完了するまで５５〜７０℃にて油浴の中でさらに１時間加熱した。それを室温まで冷却し、生成物を水、エタノール、およびエーテルで洗浄し、後に遠心分離によって単離した。
【０１２８】
２．磁気的挙動の特性化
【０１２９】
約１０−８ｅｍｕの感度を伴う超電導量子干渉素子（ＳＱＵＩＤ）磁気探知機を使用して、黒鉛、グラフェン、および対照サンプルの磁化を検討した。サンプルの重量を慎重に量り、ゼラチンカプセルの中に装填した。０から３００Ｋの間で、−５００００Ｏｅから５００００Ｏｅの印加磁場範囲の間でサンプルを分析した。磁場冷却およびゼロ磁場冷却モードで、温度の関数としての磁化を検討するために、５００Ｏｅの保磁場を印加した。
【０１３０】
３．ＥＰＲ測定
【０１３１】
高い１００ＫＨｚ磁場変調周波数とともに約９．８ＧＨｚのマイクロ波周波数で動作する、Ｂｒｕｋｅｒ  ＸバンドＥＰＲ分光計上の類似実験条件下で、全てのＥＰＲスペクトルを室温（約２９６Ｋ）にて測定した。ジフェニルピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ、ｇ＝２．００３６）の標準固体サンプルを用いて、磁場およびｇ値を較正した。ＥＰＲスペクトルのＥＰＲ基準を較正するように、ブランク石英管のＥＰＲを測定した。１回は１ｋガウス掃引幅を用いて、次は６ｋガウス掃引幅を用いて、全てのＥＰＲスペクトルを２回測定した。黒鉛、グラフェン、および対照の固体サンプルを、Ｗｉｌｍａｄ石英ＥＰＲ管の中に装填した。石英ＥＰＲサンプル管を、脱イオン水で徹底的に洗浄し、サンプルを装填する前に乾燥させた。高い誘電率を伴う水性および他の溶剤のために設計された石英平坦管を使用することによって、水性サンプルのＥＰＲ測定が行われた。液体サンプルを装填する前に、石英ＥＰＲ平坦管を脱イオン水で徹底的に洗浄し、乾燥させた。石英平坦管の中への水性サンプルの装填を、最大感度のために、管の平坦部分の中へ慎重に行った。
【０１３２】
４．プロトン緩和能測定
【０１３３】
緩和能測定について、酸化微小黒鉛、酸化グラフェンナノプレートレット、および還元グラフェンナノプレートレットまたはグラフェンナノリボンサンプルの１ｍｇを、２ｍｌの生物学的に適合した１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７界面活性剤溶液中で分散させ、３０Ｗにて１０分間にわたって超音波で分解し、最終的に５０００ｒｐｍにて１時間にわたって遠心分離した。遠心分離は、水溶性化されていない大型の濃密グラフェンナノ粒子が底部に沈むことを可能にし、浮遊物中の可溶性グラフェンナノ粒子の分離を可能にした。上澄み液も、任意の遊離Ｍｎ２＋イオンの存在についてチェックした。これは、最初にＨＣｌでグラフェンナノ粒子を凝集させ、次いで、ＨＮＯ３中のビスマス酸ナトリウム（ＮａＢｉＯ３）を用いて透明溶液を試験することによって達成された。この反応では、マンガンは、＋２酸化状態（Ｍｎ＋２）から、独特の紫またはピンク色を有する、＋７酸化状態（ＭｎＯ４−）まで酸化させられる。そのような色の変化は観察されず、遊離Ｍｎ２＋イオンが上澄み液の中に存在しなかったことを示す。
【０１３４】
可溶性グラフェンナノ粒子を含有する上澄み液を、緩和時間測定に使用した。Ｍｉｎｉｓｐｅｃ  ＮＭＲ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｗｏｏｄｌａｎｄ，  Ｔｅｘａｓ）上で２０ＭＨｚ（０．４７Ｔ）において、縦および横緩和時間（Ｔ１，Ｔ２）を測定した。連続希釈法によって、５つの既知の濃度で各サンプルを調製した。温度は測定中に４０℃で維持された。各実験サンプルおよび対照（１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  １２７溶液）のＴ１およびＴ２緩和時間は、それぞれ、反転回復法およびＣＰＭＧ方法を使用して測定された。緩和時間の逆数は、それぞれの緩和速度Ｒ１およびＲ２を表す。緩和速度（ｙ軸）対濃度（ｘ軸）のプロットを作成し、直線に適合させた。この線形適合の傾斜は、緩和能の値を生じた。単一点緩和能（ｒ１）が、ＮＭＲＤ測定中に得られた。緩和能値（ｒ１）は、式ｒ１＝（Ｒ１−Ｒ２）／［Ｍｎ２＋］を使用して計算され、Ｒ１，２およびＲ０は、それぞれ、サンプルおよび１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７界面活性剤溶液の縦または横緩和速度であり、［Ｍｎ２＋］は、緩和測定で使用される溶液の体積の中のマンガンの濃度である。高速磁場サイクリング緩和測定計（ＳＰＩＮＭＡＳＴＥＲ  ＦＦＣ２０００，  Ｓｔｅｌａｒ  Ｉｎｃ，  Ｐａｖｉａ，  Ｉｔａｌｙ）を使用して、プロトンラーモア周波数範囲０．０１〜４０  ＭＨｚに対応する磁場における１／Ｔ１ＮＭＲ分散（ＮＭＲＤ）プロファイルを得た。プロトンラーモア周波数の２５〜８０ＭＨｚ範囲から緩和データを獲得するために、高速磁場超電導ダイポール（ＨＴＳ）電磁石を使用した。温度を、２７℃に固定し、銅コンスタンタン熱電対を装備したＳｔｅｌａｒ  ＶＴＣ−９１空気流加熱器によって制御し、０．５℃の絶対精度で、Ｄｅｌｔａ  ＯＨＭデジタル温度計を用いて、プローブヘッドの温度較正を行った。
【０１３５】
結果および考察
【０１３６】
図９は、酸化黒鉛、酸化グラフェンナノプレートレット、および還元グラフェンナノプレートレットのＳＱＵＩＤ磁性特性化を示す。これらの粒子の調製のための出発原料として使用される分析グレード微小黒鉛が、これらの実験での対照であった。図９ａは、３つの温度（３０Ｋ、１５０Ｋ、および３００Ｋ）に対する−５０，０００Ｏｅから５０，０００Ｏｅの間の分析グレード微小黒鉛（対照）の磁化（Ｍ）対磁場強度（Ｈ）のプロットを示す。負の傾斜は、反磁性挙動の特徴である印加磁場の増加とともに、磁気モーメントの値の減少を示す。図９ｂおよび９ｃは、それぞれ、酸化黒鉛および酸化グラフェンナノプレートレットのＭ対Ｈプロットを示す。プロットは、酸化黒鉛および酸化グラフェンナノプレートレットの両方の常磁性挙動を示す磁場強度とともに、磁気モーメントの値の線形増加を示す。黒鉛の酸化時の常磁性への変化は、サンプルの中に存在する常磁性Ｍｎ２＋イオンの存在に起因し得る。図９ｄは、還元グラフェンナノプレートレットのＭ対Ｈプロットを示す。プロットは、室温（３００Ｋ）における超常磁性挙動（図９ｄの差し込み図）を示す、より低い温度（３０Ｋ）における強磁性ヒステリシス曲線を表示する。室温超常磁性は、ナノ粒子集団（＜３０ｎｍ）で広く報告されており（非特許文献３７、非特許文献３８）、ナノ粒子の熱エネルギーが、磁気スピン方向への反転を可能にするのに十分であり、スピン・スピン交換結合エネルギーを克服するのには不十分である、サイズ依存性現象である。結果として、磁場がない場合、正味の磁化はゼロと測定され、Ｍ対Ｈ曲線は、ヒステリシスループの代わりに「Ｓ」字形を帯びる。５００Ｏｅの均一な磁場強度における１０Ｋから３００Ｋの間の還元グラフェンナノプレートレットのゼロ磁場冷却（ＺＦＣ）および磁場冷却（ＦＣ）曲線が、図９ｅに示される。ＺＦＣ曲線におけるピークは、強磁性および超常磁性状態の間の遷移を示す、４０Ｋのブロッキング温度（ＴＢ）を表す。３０Ｋにおけるヒステリシス曲線の残余磁化は、１２．４７ｅｍｕ／ｇであり、飽和保磁力は、６２９８．６８Ｏｅであり、サンプルの単一ドメイン性質および高い形状異方性に起因し得る（非特許文献３９）。還元グラフェンナノプレートレットの結果は、ハウスマン鉱とのはっきりした類似性を呈する（非特許文献３９）。室温磁性が、フラーレン、炭素ナノチューブ、炭素ナノフォーム、グラフェン、ナノダイヤモンド、および黒鉛等の炭素ナノ材料で報告されている（非特許文献１８、非特許文献１９、および非特許文献５８）。これらの材料の磁気特性は、金属不純物の存在または黒鉛格子構造における欠陥の存在のいずれかに起因する、スピングラス様常磁性または強磁性挙動を含む。酸化黒鉛、酸化グラフェンナノプレートレットおよび還元グラフェンナノプレートレットの場合、酸化または剥離プロセス中に黒鉛格子構造に作成される欠陥は、観察された磁気的挙動に寄与し得る。しかしながら、理論的および実験的研究は、黒鉛構造における欠陥が、約１０−３〜１０−６ｅｍｕ／ｇの飽和磁気モーメントを伴って非常に弱い磁気的挙動を誘発することを示す（非特許文献５９）。したがって、上記で報告される、観察された磁気的挙動は、主に、マンガンの存在に依るものであり得る。
【０１３７】
図１０は、ＭＷＣＮＴ（対照）およびグラフェンナノリボンのＳＱＵＩＤ磁性特性化を示す。図１０ａは、３つの温度（１０Ｋ、１５０Ｋ、および３００Ｋ）に対する−５０，０００Ｏｅから５０，０００Ｏｅの間のＭＷＣＮＴの磁化（Ｍ）対磁場強度（Ｈ）のプロットを示す。プロットは、一貫した磁気パターンを示さず、磁気信号は、３つ全ての温度で極めて弱く、ＭＷＣＮＴの中の鉄触媒の存在にもかかわらず、反磁性挙動を示す。
【０１３８】
図１０ｂは、３つの温度（１０Ｋ、１５０Ｋ、および３００Ｋ）に対する−５０，０００Ｏｅから５０，０００Ｏｅの間のグラフェンナノリボンのＭ対Ｈのプロットを表示する。たとえＭ対Ｈ曲線がヒステリシスループの代わりに「Ｓ」字形を成すように見えたとしても、曲線のより綿密な分析（図１０ｂの差し込み図を参照）は、非常に低い残留磁気を伴う強磁性挙動を示す。ＳＱＵＩＤ分析は、３０Ｋ、１５０Ｋ、および３００Ｋにおいて強磁性を示す。より綿密な分析は、室温において興味深い磁気的性質を示す。ゼロ磁場冷却（ＺＦＣ）ならびに磁場冷却（ＦＣ）条件での磁化の温度依存性が、磁場強度５００Ｏｅ（温度範囲１０〜３００Ｋ）において図１０ｃで描写される。グラフから、全てのグラフェンナノリボンは、低温で強磁性挙動を示し、ＺＦＣおよびＦＣ枝の分岐を示すことが明確である。ＦＣおよびＺＦＣ曲線が分岐する温度（不可逆性温度とも呼ばれる）、ならびにブロッキング温度（ＴＢ）は、３００Ｋである。図１０ｃは、ＦＣ／ＺＦＣプロットを示し、ＺＦＣ曲線上の最大値は、室温を上回る値＞３００Ｋで見られる。ＺＦＣ磁化曲線は、分岐温度を下回る広い最大値を示す。分岐ＦＣおよびＺＦＣ曲線は、熱力学的不可逆性を示し、強磁性および反強磁性相の間の強い競合相互作用、および低温スピングラス様状態または混合相の発生によるナノスケールでの相分離のような効果に、その起源を有することができる（非特許文献５９、非特許文献６０、非特許文献６１）。３００Ｋで見られる飽和磁化は、２５００Ｏｅにおいて０．１ｅｍｕ／ｇである。サンプルは、１０Ｋにおいて２５０Ｏｅの保磁場を示す。磁性結果は、グラフェンナノリボンが室温弱強磁性を呈することを明確に示す。グラフェンナノリボンの元素分析は、マンガンは別として、微量の鉄（０．００５重量％または５０μｇＦｅ／グラム）も、これらのサンプルの中に存在したことを示した。グラフェンナノリボンの調製に使用されたＭＷＣＮＴは、たとえグラフェンナノリボンで見出される量よりも２０倍多い鉄ナノ粒子を触媒（０．１重量％）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉ分析証明書−ＭＷＣＮＴ）として含有したとしても、いかなる磁気的挙動も示さない。さらに、１〜５００μｇＦｅ／グラム（１ｐｐｍ）黒鉛のＦｅ濃度を伴うＦｅまたはＦｅ３Ｏ４集団の存在は、２．２×１０−５〜４×１０−３ｅｍｕ／ｇを磁化に与えることが報告されている（非特許文献５８）。総合される上記の情報は、微量の鉄の存在が、グラフェンナノリボンの観察された磁気的挙動に有意に寄与しないことを示唆する。いくつかの近年の研究は、金属酸化物ナノ構造の中の酸素空孔の点欠陥が、弱強磁性をもたらすことができ（非特許文献６２、非特許文献６３）、グラフェンナノリボンとのその相互作用による酸化マンガンにおける類似欠陥が、観察された磁気的挙動に関与し得ることを示す。しかしながら、この仮説を確認するために、より多くの研究が必要とされる。
【０１３９】
図１１ａ〜１１ｄは、それぞれ、酸化微小黒鉛、酸化グラフェンナノプレートレット、還元グラフェンナノプレートレット、およびグラフェンナノリボンのＥＰＲスペクトルを示す（石英ＥＰＲ管およびＤＰＰＨ標準のブランクＥＰＲスペクトルが図１７に示される）。各ＥＰＲスペクトルのｇ値、ＥＰＲ線半値幅（ΔΗ１／２、ガウス）、および電子緩和時間（Ｔ２ｅ）が、表３ａに記載される。全てのサンプルは、それぞれのｇ値において広いピーク（ΔΗ１／２）を示す。しかしながら、グラフェンナノリボンは、類似ΔΗ１／２値を有する、酸化微小黒鉛、酸化グラフェンナノプレートレット、および還元グラフェンナノプレートレットよりも２．６倍大きいΔΗ１／２値を示す。より大きい線幅は、短い電子緩和時間（Ｔ２ｅ）を示し、計算されたＴ２ｅ値は、酸化微小黒鉛、酸化グラフェンナノプレートレット、および還元グラフェンナノプレートレットについて、０．１９〜２１ナノ秒の間であった。グラフェンナノリボンは、０．０７２ナノ秒のＴ２ｅ値を有し、他の化合物よりも少なくとも２．９倍短い。グラフェンナノリボンサンプルのＥＰＲスペクトルはまた、おそらく、報告されたようなナノリボン構造における欠陥中心による、フリーラジカル種の存在を示す、狭いピークを中心で示す（非特許文献６４）。フリーラジカル種は、２．００７のｇおよび１．２ガウスの線幅を有し、したがって、８８．２ナノ秒の非常に長い電子緩和時間（Ｔ２ｅ）を有する。全ての化合物における大きい線の広がりは、有意なマンガン対マンガン双極子相互作用を示す。サンプル中のマンガンの量の削減は、線の広がりを減少させ、ＥＰＲスペクトルにおける６本線マンガン超極細構造を分解し、その結果として、電子緩和時間を短縮させるべきである。
【０１４０】
図１２ａ〜ｄは、それぞれ、酸化微小黒鉛、酸化グラフェンナノプレートレット、還元グラフェンナノプレートレット、およびグラフェンナノリボンの水溶液のＥＰＲスペクトルを示す（石英ＥＰＲ管のブランクＥＰＲスペクトルおよびＤＰＰＨのＥＰＲスペクトルが図１７に示される）。各ＥＰＲスペクトルのｇ値、ＥＰＲ線半値幅（ΔΗ１／２、ガウス）、超極細結合定数、および電子緩和時間（Ｔ２ｅ）が、表３ｂに記載される。４つ全てのサンプルは、スピンＩ＝５／２を伴うＭｎ−５５核に結合された電子の特性を示す、６本線ＥＰＲを示す。グラフェンナノリボンのＥＰＲスペクトルはまた、フリーラジカルの存在により、約２．００７のｇおよび１．２ガウスの線幅を伴って、狭いＥＰＲ線を中心で示す。観察されたｇ値は、遊離電子スピン値に非常に近く、４つ全てのサンプルの中に存在するマンガン鉄の基底状態におけるスピン軌道結合の欠如を示唆する。これらのサンプルにおける約９５ガウスのマンガン超極細結合（ＡΜｎ）は、マンガンのアクアイオンΜｎ（Η２Ｏ）６のものに非常に近い。大きい超極細結合は、４つ全てのサンプルのマンガン種における正８面体配位を示す。４つの水性サンプルはまた、長い電子緩和時間を示す、２９．２〜３１．５ガウスの間の類似する狭い線幅（ΔΗ１／２）値も示す。計算されたＴ２ｅ値は、２．０８〜２．２５ナノ秒の間であった。グラフェンナノリボンの中に存在するフリーラジカル種は、５５ナノ秒の１桁長い電子緩和時間（Ｔ２ｅ）を有する。ＥＰＲスペクトルは、Ｍｎ（ＩＩ）イオンのみを示すことに留意されたい。たとえ少なくとも還元グラフェンナノプレートレットのラマンスペクトルがＭｎ（ＩＩＩ）イオンの存在を示したとしても、スペクトルは、Ｍｎ（ＩＩＩ）イオンの存在またはマンガンの他の酸化状態を示さなかった。この非検出の考えられる理由は、全てのＥＰＲ測定が室温で行われたこととであり得る。Ｍｎ（ＩＩＩ）イオンまたはマンガンの他の酸化状態は、非常に短い電子緩和時間を有し、ＥＰＲスペクトルを得るために非常に低いサンプル温度（約７７Ｋ）を必要とする。したがって、低温測定も、４つ全てのサンプルに実行した。したがって、ＥＰＲスペクトル（結果は示されていない）は、Ｍｎ（ＩＩ）寄与によって支配され、マンガンの他の酸化状態の存在を確認することができず、４つのサンプルの中に存在するマンガンイオンの大部分が、Ｍｎ（ＩＩ）状態で存在することを示唆する。
【０１４１】
緩和能（ｒ１，２）は、ＭＲＩ造影剤の効力の重要な尺度である。表４は、４０℃での酸化微小黒鉛、酸化グラフェンナノプレートレット、還元グラフェンナノプレートレット、およびグラフェンナノリボンの０．４７Ｔにおける緩和能値を示す。また、比較目的で、臨床的に承認されたＧｄ３＋ベースおよびＭｎ２＋ベースのキレート錯体の緩和能値の範囲も含まれる（非特許文献６５）。本表は、４つ全ての化合物が、常磁性キレート錯体と比較して、優位に高いｒ１およびｒ２緩和能を示すことを明確に示す。０．４７Ｔにおいて、黒鉛およびグラフェンサンプルのｒ１およびｒ２値は、常磁性キレート錯体よりも約８〜１０倍および１９〜６０倍大きい。黒鉛およびグラフェンサンプルの中でも、０．４７Ｔにおいて、グラフェンナノリボンおよび酸化黒鉛は、酸化グラフェンナノプレートレットおよび還元グラフェンナノプレートレットよりも高い（約２０％）ｒ１値を示した。しかしながら、ｒ２：ｒ１比の動向は、還元グラフェンナノプレートレット＞グラフェンナノリボン＞酸化微小黒鉛＞酸化グラフェンナノプレートレットであった。グラフェンナノプレートレットおよびグラフェンナノリボンが４０℃で超常磁性であることを磁性結果が示すため、この動向は、予期される線に沿っている。超常磁性材料は、主に、横Ｔ２緩和に影響を及ぼし、したがって、ｒ２／ｒ１比を増加させることが周知である。しかしながら、ｒ２／ｒ１比は、１０以上の比を有する鉄ベースのＴ２造影剤よりも低い。Ｔ１造影剤は、約１〜２のｒ２／ｒ１比を有する（非特許文献６６）。したがって、より高い磁場（３Ｔ以上）で、たとえ還元グラフェンナノプレートレットおよびグラフェンナノリボンがＴ２＊効果を生じさせたとしても、マンガン挿入黒鉛、およびグラフェン粒子は、Ｔ１造影剤として適し得る。
【０１４２】
酸化黒鉛、酸化グラフェンナノプレートレット、還元グラフェンナノプレートレット、およびグラフェンナノリボンの水溶液の０．０１〜８０ＭＨｚの間のＮＭＲＤプロファイルが、図１３ａ〜ｄで提示される。これは、そのような広い磁場範囲（０．０１〜８０）にわたるこれらの化合物の縦ｒ１緩和能の第１の報告である。酸化微小黒鉛および還元グラフェンナノプレートレットが類似ＮＭＲＤプロファイルを示す一方で、酸化グラフェンナノプレートレットおよびグラフェンナノリボンは、これら２つのサンプルとは明確に異なるプロファイルを示す。中間から高い磁場（＜１０ＭＨｚ）で、酸化微小黒鉛は、磁場の減少とともにより小さい増加（５０〜６６ｍＭ−１ｓ−１）、およびより低い磁場への減少とともにより大きい増加（７０〜２２２ｍＭ−１ｓ−１）を示す。酸化グラフェンナノプレートレットは、３０ＭＨｚにおいて５５ｍＭ−１ｓ−１の最大値を伴って中間から高い磁場で釣鐘形分布を示し、磁場が１０ＭＨｚ以下に減少するにつれて最大で８６ｍＭ−１ｓ−１の漸増を示す。還元グラフェンナノプレートレットは、８０〜１０ＭＨｚの間の磁場の減少とともにわずかな増加（４４〜５９ｍＭ−１ｓ−１）を示し、緩和能は、０．０１ＭＨｚにおいて２５８ｍＭ−１ｓ−１の最大値を伴って、より低い磁場で増加する。グラフェンナノリボンは、最大１０ＭＨｚの磁場の減少とともに線形増加（６５〜１００ｍＭ−１ｓ−１の間の緩和能）を示し、次いで、０．０１ＭＨｚにおいて７２４ｍＭ−１ｓ−１の値に達する１０ＭＨｚ以下の連続急増を示す。
【０１４３】
これらの化合物のＮＭＲＤプロファイルは、他のマンガンベースの小分子または高分子錯体のプロファイルとは異なる（非特許文献５、および非特許文献６７）。例えば、Ｍｎ−ＤＴＰＡ（ＤＴＰＡ＝ジエチレントリアミペンタアセテート酸）等の小分子Ｍｎ２＋錯体は、１０ＭＨｚよりも大きい磁場で約１．９ｍＭ−１ｓ−１の一定値、および１０ＭＨｚ未満の磁場で限界増加を示す。高分子錯体Ｍｎ２＋−ＤＴＰＡ−ＢＳＡ（ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン）は、２０ＭＨｚにおいて２６ｍＭ−１ｓ−１のピーク値を伴って、１０〜８０ＭＨｚの間の磁場で釣鐘形緩和能分布を示す（非特許文献５）。１０ＭＨｚ未満の磁場で、緩和能は、約１４ｍＭ−１ｓ−１において一定である。類似プロファイルが、Ｇｄ３＋イオンの小および巨大分子錯体について報告されている（非特許文献５）。プロファイルはまた、Ｍｎ２＋またはＧｄ３＋高分子錯体のものに類似するプロファイルを示す、Ｇｄ３＋＠Ｃ６０（ガドフラーレン）のプロファイルとは異なる（非特許文献１１）。しかしながら、Ｇｄ３＋＠超短単層炭素管（ガドナノチューブ）（非特許文献１５）のプロファイルは、Ｍｎ２＋挿入黒鉛およびグラフェン化合物によって観察されるものに類似する特徴、すなわち、１０ＭＨｚ以下の磁場で、より大きい増加とともに磁場の減少を伴う緩和能の増加を有する。より低い磁場（＜１０ＭＨｚ）でのガドナノチューブのプロファイルは、グラフェンナノリボンのプロファイルに最も類似する。
【０１４４】
Ｓｏｌｏｍｏｎ−Ｂｌｏｅｍｂｅｒｇａｎ−Ｍｏｒｇａｎ（ＳＢＭ）の一式の方程式（下記参照）は、造影剤との水プロトンの相互作用、造影剤の磁気的性質、および造影剤の分子動力学等の因子が、０．１テスラよりも大きい磁場で、水プロトンの緩和速度にどのように影響を及ぼすかについての最良の論理的説明を与えると考えられる（非特許文献６）。ＭＲＩ  ＣＡの影響を受けることができる３種類の水分子があることが、広く受け入れられており、（ａ）ＣＡの常磁性金属中心に直接配位された水分子は、内圏水分子として知られており、（ｂ）造影剤の磁性金属中心に配位されていないが、ＣＡの他の分子（例えば、リガンド、キレート）に化学結合された水分子は、第２圏水分子と呼ばれ、および（ｃ）ＭＲＩ  ＣＡに結合されていないが、それの近くに拡散する、より遠くの水分子は、外圏水分子と小される。実験的核磁気緩和分散（ＮＭＲＤ）プロファイルは、典型的には、プロトン緩和能に影響を及ぼす、これらの因子を判定するために、ＳＢＭ方程式を使用して適合される（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。最近の報告は、ガドナノチューブについて、プロトン／水交換速度および回転相関時間等の内圏水プロトンとのそれらの相互作用を支配する因子が、観察されたｒ１緩和能の大部分に関与することを示唆する（非特許文献１５）。したがって、内圏相互作用を表すＳＢＭ方程式が、主要な焦点であった。図１３ａ〜ｄは、それぞれ、酸化黒鉛、酸化グラフェンナノプレートレット、還元グラフェンナノプレートレット、およびグラフェンナノリボンのＮＭＲＤプロファイルを示す。また、種々の内圏パラメータの対応する最良適合した物理的正当値（他のＧｄ（ＩＩＩ）およびＭｎ（ＩＩ）ベースの化合物について報告された値の範囲内）も含まれる（我々の適合アプローチの論議は以下で提示される）。表５は、計算されたパラメータ、それらの定義および値を記載する（表８は、固定パラメータ、それらの定義および値を記載する）。一般に、ＳＢＭ方程式は、高い磁場（＞１０ＭＨｚ）または低い磁場（＜０．５ＭＨｚ）で、容認可能な適合を提供する。全体的には、適合は、酸化グラフェンナノプレートレットおよびナノリボンよりも、酸化微小黒鉛および還元グラフェンナノプレートレットについて正確であった。これは、ＳＢＭ方程式が、ここで合成される全ての化合物にとって完全に満足できるモデルではない場合があることを示す。それでもなお、他の場所で報告されたものと一致するかどうかを調べるように、曲線適合アルゴリズムによって返されるパラメータを以下で論議した。
【０１４５】
パラメータΔ２は、常磁性金属の電子のゼロ磁場分裂エネルギーを表す。通常はゼーマン分裂を生じさせるために使用される、印加磁場がない場合でさえも、ランダム運動および錯体の歪曲により、分裂が依然として起こり得る。これらの相互作用によって生成される磁場は、近傍のプロトンにおいて緩和を誘発するエネルギーを産生する。この分裂のための相関時間は、τνと称される。これらの２つのパラメータは、常磁性中心の有効性を判定する際に重要である。Δ２は、概して、１０１８〜１０２０ｓ−２の範囲内である。適合から求められる値は、十分に容認範囲内である。τνの値は、概して、１〜１００ピコ秒であるものとして容認される（非特許文献５）。我々が求めた値は、この範囲内である。回転相関時間であるτＲの場合、１０ピコ秒から２ナノ秒範囲内の値が報告された（非特許文献６８、非特許文献５、および非特許文献１１）一方で、ガドナノチューブについては、ナノ秒からマイクロ秒範囲にある値も報告された（非特許文献１５）。微小黒鉛およびグラフェンサンプルについて得られる結果は、ナノ秒時間尺度にある。パラメータｑは、内圏内の高速交換水分子の数を表し、その値は、全てのサンプルについて８であった。これらの値は、１から６の間である、種々の常磁性錯体について得られたｑの値の範囲外にある。しかしながら、２０ほども高いｑ値が、ガドフラーレンについて報告されている（非特許文献１１）。グラフェン内のマンガン挿入についての理論的研究は、１〜３個の配位結合を伴うグラフェンシートへのマンガンの配位を示唆する（非特許文献６９）。挿入グラフェンの大部分が高スピン状態でＭｎ２＋であると仮定すると、配位数は、４から８の間となり得、したがって、水分子の可能な配位部位は、１から７の間となり、ＮＭＲＤ適合から得られる値が、この値に近い。加えて、ＥＰＲ結果はまた、この値が妥当であることも示す。水滞在時間であるパラメータτΜは、緩和能に二重効果を及ぼす。一方で、水分子が内圏の中でより長く滞在するほど、より多くの時間で常磁性中心がそのスピンに影響を及ぼすことができる。しかしながら、その滞在時間が長過ぎる場合、他の水分子が常磁性金属中心へ配位する能力を阻止し、全体的な緩和能を低減させ得る。したがって、最適な緩和能は、考えられる極限の間のいずれかにある。文献は、広範囲のτΜ値を示す。小分子錯体が、概して、１１〜１００ピコ秒の範囲内である一方で、常磁性リポソーム（非特許文献７０）、ガドフラーレン（非特許文献１１）、ガドナノチューブ（非特許文献１５）等の高分子は、１００〜５００ナノ秒の間の値を有する。適合から求められた値は、数ナノ秒から数百ナノ秒の間に及ぶ。このデータを裏付けるために、１７Ｏ測定を１４Ｔにおいて行い、ＳｗｉｆｔおよびＣｏｎｎｉｃｋの理論（以下参照）（非特許文献７１）に従ってデータを分析することによって、水交換相関時間（τΜ）を推定した。τΜ値は、２７℃で全てのサンプルについて、数百ナノ秒であると推定された。これらの値は、ＮＭＲＤ適合から得られたτΜ値を用いて、酸化微小黒鉛および酸化グラフェンナノプレートレットを十分に裏付ける一方で、それらは、還元グラフェンナノプレートレットおよびグラフェンナ��リボンの値よりも１００倍大きい。これら２つのサンプルについて、数百ナノ秒でτΜの値を固定することによって得られたＮＭＲＤ適合は、良好な適合を生じ、還元グラフェンナノプレートレットの場合は、他のパラメータの妥当な値を生じたが、グラフェンナノリボンについては不良な適合が得られた（図２３参照）。水プロトンと常磁性金属イオン（この場合はＭｎ２＋イオン）との間の分離距離ｒＭｎＨは、ＳＢＭ方程式における６乗である。したがって、それは、緩和能に非常に大きな影響を及ぼし、距離が短くなるほど、影響が大きくなる。本作業では、我々は、２．９オングストロームの最も一般的に報告されている値（非特許文献７２）で固定されたパラメータを保持するよりもむしろ、わずかに変化させることを見出した。我々が得た適合値は、いずれの場合も公称値に非常に近かったが、この値に向けたＳＢＭ方程式の極端な感度により、向上した適合を可能にした。
【０１４６】
緩和機構に影響を及ぼす上記の因子が、新しい高効率のＭｎ２＋ベースまたはＧｄ３＋ベースのＴ１ＭＲＩ  ＣＡを設計するように改変されている、複数のアプローチが開発されてきた（表６）。これらのアプローチは、以下のパラメータのうちの１つ以上を改変することに焦点を合わせてきた：（１）内圏水分子の数（ｑ）を増加させること、（２）内圏水滞在時間（τΜ）を短縮し、造影剤（ＣＡ）の回転相関時間（τＲ）を増加させること、（３）キレートを設計するときに結合角および配向を改変することによってｒＭｎＨを減少させること（非特許文献７３）。Ｍｎ２＋ベースの高分子造影剤の場合、２０ＭＨｚにおいて、いかなるキレートも伴わない、または４〜１０ｍＭ−１ｓ−１の間のｒ１値を示す種々の小分子ポリカルボン酸リガンドとキレートされたＭｎ２＋イオンと比較して、５５ｍＭ−１ほども高いｒ１値が報告されている。これらの研究で操作されている２つのパラメータは、τＭおよび／またはτＲである。本作業の結果は、グラフェンシートの間に常磁性金属を閉じ込め、それに従って、特徴的なパラメータｑ、τＲ、およびτＭが修正されることを可能にすることによって、ｒ１緩和能を強化する新規の一般的アプローチを導入する。結果は、黒鉛炭素粒子のサイズ、形状、または構造ではなく、グラフェンシート内の常磁性金属イオンの閉じ込め（挿入）が、緩和能を増加させるための主要な決定因子であり、したがって、高緩和能ＭＲＩ  ＣＡとしての金属イオン黒鉛炭素錯体を開発するための新規の一般方策として、常磁性イオンのナノ閉じ込めを識別することを示す。
【０１４７】
これらの実施例で報告される、黒鉛およびグラフェン構造の生理化学的特性化、および有望な緩和能結果は、ＭＲＩ  ＣＡとしてのそれらの安全性および効力を評価する生体外および生体内研究のための手段を開く。近年の報告によれば、米国では、２７５０万件の臨床ＭＲＩ手技の約４３％が、ＣＡを使用し、ＭＲＩ  ＣＡ市場は、２０１２年に１８億７千万ドルまで増大すると予測される（（２０１１）  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ．  Ｇｌｏｂａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｓｔｓ，  Ｉｎｃ：  http://www.strategyr.com/Imaging_Agents_Market_Report.asp）。大抵の臨床ＭＲＩ  ＣＡは、輝度が明確なコントラストを生成するようにＭＲ信号を強化する、ガドリニウム（Ｇｄ３＋）イオンベースの常磁性ＣＡである。重度腎疾患がある、または肝臓移植後の一部の患者における腎性全身性線維症（ＮＳＦ）の近年の発見が、Ｇｄ３＋イオンベースのＭＲＩ  ＣＡの臨床用途への米国食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ；ＦＤＡ）による制限につながる懸念を生成してきた（ＵＳ  ＦＤＡ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ａｇｅｎｔｓ  ２００８，  http://wwwfdagov/cder/drug/infopage/gcca/）。ＭＲＩ用の常磁性造影剤の実施例として早い時期に報告されたマンガンが、ガドリニウムに対する可能な代替案として再び注目を集めている（非特許文献２）。ランタニドと違って、それは、Ｃａ２＋に類似する天然細胞成分であり、しばしば、酵素および受容体のための調節補因子として機能する。マンガンの正常な１日の食事所要量が、０．１〜０．４ミリグラムである一方で、正常な血中濃度は、１ナノモルである。マンガンの毒性は、神経症状をもたらす、長期暴露後、または高濃度でしか報告されていない（非特許文献２）。したがって、本作業で報告された微小およびナノ粒子のさらなる開発が、高効率のＭＲＩ  ＣＡとしての新しい部類のＭｎ２＋炭素ナノ構造錯体の開発につながり得る。
【０１４８】
【表３ａ】
2014516206.tif 000006
【０１４９】
【表３ｂ】
2014516206.tif 000007
【０１５０】
【表４】
2014516206.tif 000008
【０１５１】
【表５】
2014516206.tif 000009
【０１５２】
【表６】
2014516206.tif 000010
【０１５３】
構造、化学、および元素分析
【０１５４】
１．構造特性化およびラマン分析
【０１５５】
走査型電子顕微鏡検査（ＳＥＭ、ＪＳＭ  ５３００、ＪＥＯＬ）を、酸化微小黒鉛サンプルに８０ｋＶで行い、それらのサイズおよび構造を特徴付けた。高分解能分析透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ  ＪＥＭ２０１０Ｆ（ＦＥＧ−ＴＥＭ））を使用して、高分解能透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像分析を、グラフェンナノプレートレットおよびナノリボンサンプルに行った。撮像は、２００ｋＶ加速電圧で実行された。均質混合物を形成するために１：１エタノール：水の中で乾燥粉末を分散させることによって、ＴＥＭサンプルを調製した。次いで、懸濁液を、レーシー炭素膜で覆われた３００メッシュＣｕグリッド上に堆積させた。収差（Ｃｓ）補正されたＴＥＭ特性化について、対物レンズ用の球面収差補正器を装備した８０ｋＶで操作されるＴｉｔａｎ  ｃｕｂｅｄ  ３００−６０ｋＶにおいて、実験を行った。一般的に０．４秒にわたって画像を記録した。この場合にスペクトルを収集するために使用された電子エネルギー損失スペクトル（ＥＥＬＳ）は、Ｔｒｉｄｉｅｍであった。５３０ｎｍダイオードレーザ励起波長および室温にてＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＤＸＲラマン共焦点顕微鏡を使用して、黒鉛、酸化黒鉛、および全てのグラフェンサンプルのラマンスペクトル分析を、２００〜３０００ｃｍ−１の間で行った。
【０１５６】
図１４ａは、酸化微小黒鉛粒子の走査型電子顕微鏡画像を表示する。画像は、酸化微小黒鉛粒子が破砕構造として存在し、２．５μｍの平均サイズとともに３〜４μｍの間のサイズ（破砕構造の最長の長さ）を有することを示す。図１４ｂおよび１４ｃは、それぞれ、それらの構造および形態学的情報を提供する、還元グラフェンナノプレートレットの代表的な低倍率および高倍率ＴＥＭ画像を表示する。グラフェンナノ粒子の構造的性質は、グラフェンナノプレートレットおよびグラフェンナノリボンの大規模生産についての最近の報告に類似する（非特許文献２２、非特許文献２０、非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２１、非特許文献２５、非特許文献２６）。図１４ｂで見られるように、還元グラフェンナノプレートレットは、約２０ｎｍの平均幅を伴って形状が円形である。いくつかのプレートレットは、他のプレートレットよりも色が濃く見え、これは、多層グラフェンシートの存在によるものである。ほとんど透明である、より色が薄いものは、単層または二重層グラフェンシートである。図１４ｃは、個々のグラフェンシートの原子格子縞構造を見せ、格子グリッド線および六角炭素原子環が、明確に可視的である（非特許文献３１）。Ｓｉ基材上の還元グラフェンナノプレートレット分散のＡＦＭ区分分析は、約１．１３７ｎｍの均一な厚さを見せた（図１４ｇ）。本来のグラフェンシートは、０．３４ｎｍの原子層厚さ（ファン・デル・ワールス）を有する。カルボキシルおよびヒドロキシル基との共有結合の存在、およびグラフェンナノプレートレット構造の中のｓｐ３炭素原子の変位が、厚さの増加の理由であることが報告されている（非特許文献２０）。酸化グラフェンナノ粒子が、類似サイズおよび構造を示す（図１４ｆ）。
【０１５７】
図１４ｄおよびｅは、それぞれ、グラフェンナノリボンの代表的な低倍率および高倍率ＴＥＭ画像を表示する。図１４ｄで見られるように、グラフェンナノリボンは、グラフェンシートの完全アンジッピング層を有する。図１４ｅの高分解能ＴＥＭ画像は、ＭＷＣＮＴの同心壁の連続アンジッピングにより、ナノリボンが多層（矢印）であることを明確に示す。酸化グラフェンナノリボン構造は、欠陥がほとんどなく、大部分が均一かつ平滑に見える。出発原料であるＭＷＣＮＴは、４０〜７０ｎｍの外径および５００〜２０００ｎｍの長さを有する。ＭＷＣＮＴは、円筒であるため、アンジッピング時に、約１２５〜２２０ｎｍの幅（π×直径）および５００〜２０００ｎｍの長さを有するように完全に開くべきである。ＴＥＭ画像の分析は、グラフェンナノリボンの幅が、７０ｎｍのＭＷＣＮＴの最外管の外径よりも大きい、約１２０ｎｍであることを示し、アンジッピングのプロセスを検証する。しかしながら、この幅は、完全に平坦なリボンに必要とされる範囲（１２５〜２２０ｎｍ）よりもわずかに小さく、アンジッピング時のグラフェンナノリボンが、完全に平坦なシートではない場合があるが、ＭＷＣＮＴの何らかの曲率を保持し得ることを示唆する。ＴＥＭ画像はまた、グラフェンナノリボンが、ＭＷＣＮＴに類似する約６００〜２０００ｎｍの長さを有することも示す。
【０１５８】
図１５ａは、酸化微小黒鉛、酸化グラフェンナノプレートレット、および還元グラフェンナノプレートレットのラマンスペクトルを示す。また、本来の微小黒鉛のラマンスペクトルも対照として含まれる。本来の微小黒鉛のスペクトルは、二重退縮ゾーン中心Ｅ２ｇモードに起因するＧバンドを示す、１５８１ｃｍ−１における顕著で急なピークを示す（非特許文献３２）。酸化黒鉛の場合、Ｇバンドの広がりおよび１５９５ｃｍ−１へのピーク偏移がある。さらに、ゾーン境界光子が、１３４５ｃｍ−１においてＤバンドを生じ、それは、酸化による不規則ｓｐ２ドメインの増加および結晶サイズの縮小を示して顕著になる。黒鉛の酸化により、黒鉛に対する０．４０７から酸化黒鉛に対する１．２まで、Ｄ対Ｇピークの強度の比（ＩＤ／ＩＧ）の増加がある（非特許文献３２）。酸化グラフェンナノプレートレットおよび還元グラフェンナノプレートレットのスペクトルは、それぞれ、１．３および１．４４までのＩＤ／ＩＧのさらなる増加を示す。還元グラフェンナノプレートレットの場合、ＤおよびＧバンドのピークが、黒鉛の値（それぞれ１３３０ｃｍ−１および１５９０ｃｍ−１）により近く偏移させられ、還元中の酸素の除去、およびｓｐ２  炭素原子のいくらかの回復を示唆する。しかしながら、ＩＤ／ＩＧ比は、そのような小さいサイズの不規則ドメインの数の増加に加えて、おそらくｓｐ２ドメインの平均サイズの縮小により、酸化グラフェンナノプレートレットと比較して、より高い（非特許文献２０）。
【０１５９】
図１５ｂは、グラフェンナノリボンおよびＭＷＣＮＴのラマンスペクトルを示す。グラフェンナノリボンのスペクトルは、ＭＷＣＮＴと比較して１６００ｃｍ−１で赤方偏移される広いＧバンドを有し、１３１０ｃｍ−１において顕著なＤバンドを有する。以前の報告に類似する、ＭＷＣＮＴに対する０．０４５からグラフェンナノリボンに対する１．５７までのＩＤ／ＩＧ値の増加がある（非特許文献２１）。グラフェンナノリボンのＧバンドにおける赤方偏移は、ＭＷＣＮＴの酸化アンジッピングによるものであり、黒鉛の酸化による、酸化グラフェンナノプレートレットのスペクトルにおける偏移（図１５ａ）に類似する。
【０１６０】
還元グラフェンナノプレートレットのラマンスペクトルはまた、約６５７ｃｍ−１、３７０ｃｍ−１、および３２０ｃｍ−１において、付加的なピークも示す（図１５ｃ）。ピークを識別するために、ラマンスペクトルデータベース検索（ＲＲＵＦＦ（商標）プロジェクト収集を使用する、http://rruff.info/R040090）が、ピークは、二価および三価マンガンを含有する複雑酸化物であるハウスマン鉱（Ｍｎ３Ｏ４）に起因すると考えた。ハウスマン鉱は、マンガンの最も安定した酸化物であり、マンガンの任意の他の酸化物、水酸化物、炭酸塩、硝酸塩、または硫酸塩が焼成されたときに形成される（非特許文献３３、非特許文献３４、非特許文献６０）。我々の場合、還元グラフェンナノプレートレットの合成中に加熱する高温（約１００℃）が、ハウスマン鉱の形成につながった場合がある。ハウスマン鉱ピークの検出は、サンプルの配向、および非常に少量でのその存在を示すサンプルスポットサイズに敏感であった。サンプルのＥＰＲスペクトル（図１１および１２参照）はまた、いかなるＭｎ（ＩＩＩ）イオンも検出せず、ハウスマン鉱が、二価マンガンの酸化物と比較して、比較的少量で存在し得ることを、さらに裏付ける。
【０１６１】
還元グラフェンナノプレートレットと違って、いずれのハウスマン鉱ピークも、酸化微小黒鉛、酸化グラフェンナノプレートレット、またはナノリボンサンプルのラマンスペクトルで検出されなかった。酸化および還元グラフェンナノプレートレットの電子エネルギー損失分光法（ＥＥＬＳ）が、マンガンおよび酸素を検出した（図１６）。しかしながら、（中心または縁における）グラフェンナノリボンのＥＥＬＳ分光法は、いかなるマンガンも示さなかった。加えて、全てのサンプル（酸化微小黒鉛、酸化グラフェンナノプレートレット、還元グラフェンナノプレートレット、およびグラフェンナノリボン）の微量元素分析（表７ａ〜ｂ）が、マンガンの存在を検出した。したがって、ＥＥＬＳおよび元素分析測定とともに得られたラマン分光法の結果は、酸化微小黒鉛、酸化グラフェンナノプレートレット、還元グラフェンナノプレートレット、およびグラフェンナノリボンの場合、硫酸との過マンガン酸カリウムの反応が二価マンガンの形成につながるため、硫酸マンガンまたは酸化マンガンの形態の二価マンガンが、グラフェン層の間に挿入され得ることを示す。加えて、微量のハウスマン鉱が、還元グラフェンナノプレートレットのためにグラフェン層の間に挿入されてもよい（非特許文献７５）。
【０１６２】
２．元素分析
【０１６３】
マンガンおよびカリウムの濃度を確認および判定するために、２つの微量分析試験所（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  Ｔｕｃｓｏｎ，  ＡＺ、およびＧａｌｂｒａｉｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，  ＴＮ）で、誘導結合プラズマ発光分光法（ＩＣＰ−ＯＥＳ）によって、固体および液体グラフェンナノプレートレットおよびナノリボンサンプルを分析した。加えて、鉄がＭＷＣＮＴ（出発原料）の調製で触媒として使用されるため、鉄含有量分析がグラフェンナノリボンサンプルについて実行された。ＩＣＰ分析について、固体および液体グラフェンナノプレートレットおよびナノリボンサンプル（既知の重量または濃度）を、濃縮ＨＮＯ３で処理し、慎重に加熱して固体残渣を得た。次に、それらを３０％Ｈ２Ｏ２で処理し、再び加熱して炭素質物質を排除した。残りの固体残渣を２％ＨＮＯ３の中で溶解させ、ＩＣＰによって分析した。
【０１６４】
表７ａおよび７ｂは、それぞれ、酸化微小黒鉛、酸化グラフェンナノプレートレット、還元グラフェンナノプレートレット、およびグラフェンナノリボンの固体および含水サンプルの微量元素分析を提示する。固体サンプル（表７ａ）については、過マンガン酸カリウムが、これらのナノ粒子の調製で使用されたため、これらのサンプル中のカリウムおよびマンガンの濃度を分析した。加えて、鉄触媒が、グラフェンナノリボンの調製で使用される出発材料であるＭＷＣＮＴの中に存在したため、鉄元素分析もグラフェンナノリボンに行った。全ての固体サンプルは、０．２２〜０．５２重量％の間のカリウムを示した。グラフェンナノリボンは、３．８４〜５．１１重量％の間のマンガンを示した他の固体サンプルと比較して、少なくとも４倍少ない量のマンガン（０．９３重量％）を示した。含水サンプル（表７ｂ）については、これらのサンプルの緩和能の計算に必要とされるため、マンガンの濃度を全てのサンプルについて分析した。グラフェンナノリボン溶液について、計算された緩和能値にも寄与し得るため、鉄元素分析も行った。全ての含水サンプル中のマンガンの濃度は、０．２７〜１．４８ｐｐｍの間で可変であった。この広い範囲の濃度の値は、１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７溶液中で安定した懸濁液を形成する異なるサンプルの可変傾向によるものである（プロトン緩和能測定についての方法の節を参照）。鉄はグラフェンナノリボンの水溶液中で検出されなかった。この鉄の非検出は、以下の理由によるものであり得る。緩和能に使用されるグラフェンナノリボンの濃度は、１０μｇ／ｍｌである。３００μｌ体積溶液を、緩和能実験および微量元素分析に使用した。したがって、グラフェンナノリボンの総量は３μｇである。Ｆｅ濃度が３μｇの０．００５％であると見なす場合、Ｆｅの量は、ＩＣＰシステムの検出限界（約１ｎｇの検出限界）を十分下回る、０．１５ｎｇとなるであろう。
【０１６５】
３．緩和能のＳｏｌｏｍｏｎ−Ｂｌｏｅｍｂｅｒｇａｎ−Ｍｏｒｇａｎ理論
【０１６６】
以下は、一式のＳＢＭ方程式である（非特許文献７６）。
【数１】
2014516206.tif 000011
式中、Ｍｎのモル分率であるＰｍが、方程式１３で定義される。
正味プロトン緩和時間であるＴ１ｍおよびＴ２ｍが、以下によって求められる。
【数２】
2014516206.tif 000012
Ｃｄｄは、双極子間相互作用を支配する物理定数を含有する：τｃｌ
【数３】
2014516206.tif 000013
常磁性中心の緩和有効性：
【数４】
2014516206.tif 000014
前述の通り、双極子間相互作用を介した常磁性中心からＨプロトンまでの移動効率は、以下によって求められる相関時間τｃ１およびτｃ２によって調節される。
【数５】
2014516206.tif 000015
スカラー相互作用について、関連相関時間は、以下によって求められるτｅである。
【数６】
2014516206.tif 000016
最終的に、
【数７】
2014516206.tif 000017
および
【数８】
2014516206.tif 000018
を有し、式中、ωＩおよびωＳは、それぞれ、常磁性金属の電子スピンおよび水プロトンの核スピンのラーモア周波数である。
ＰＭは、Ｍｎ＋２および水（Ｈ２Ｏ）のモル総数に対するマンガン（Ｍｎ＋２）のモル分率である。ここで使用されたＭｎ＋２の濃度は、１ｍＭであった。
【数９】
2014516206.tif 000019
上記の方程式の中の残りの物理定数は、以下の表８で挙げられる。
【０１６７】
常磁性錯体が緩和能を向上させる機構は、プロトンスピンの常磁性イオンの電子スピンの結合を介する。この結合は、（結合を通した）スカラーおよび（空間を通した）双極子間（ＤＤ）相互作用といった、２つの主な方法によって起こる。ＤＤ相互作用は、概して、より強いが、水分子中のＨ原子の配向に対する常磁性イオンのスピンシステムの配向に依存する。分子が相互に対して継続的に回転しているため、相互に対するラジアンによる、おおよそ分子が回転する時間の尺度である、回転コヒーレンス時間τＲが、ＤＤ相互作用にとって重要な因子である。τＲが長くなるほど、常磁性中心の影響がより効果的である。しかしながら、スカラー結合については、化合物の結合を通して影響が及ぼされるため、物理的配向は無関係である。この理由により、τＲは、それぞれ、Ｔ１およびＴ２のＤＤ相誤作用を支配する上記の方程式８および９に存在するが、スカラー相誤作用を支配する方程式１０では欠けている。相互作用の総強度は、ＤＤおよびスカラー寄与の合計であり、第１項がＤＤ寄与を表し、第２項がスカラー寄与を表す、方程式３で反映される。
【０１６８】
内圏の寄与をモデル化する際の主要な因子は、任意の所与の時に常磁性中心に結合することができる、水分子の数を識別することである。方程式１は、緩和能がこの水和数ｑに正比例することを知らせる。方程式１から明白である別の点は、造影剤の濃度は別として、緩和能ｒ１およびｒ２が、それぞれ、結合内圏水分子Ｔ１ｍおよびＴ２ｍの総緩和時間によって、ならびに脱離および別の水分子による置換の前に、水分子が常磁性中心に結合されたままである時間の長さである、滞在時間τｍによって判定されることである。ひいては、因子Ｔ１ｍおよびＴ２ｍは、常磁性中心の電子緩和時間である、因子Ｔ１ｅおよびＴ２ｅに依存している。これらは、縦および横の場合について、それぞれ、方程式６および７で定義され、とりわけ、印加磁場に依存する。常磁性中心の電子からプロトンまでの緩和能の移動の有効性は、ＤＤの場合については方程式８および９、スカラーの場合については方程式１０によって支配される。常磁性作用物質の強度は別として、方程式８および９は、プロトンへの造影剤の電子によって生成されるＲＦ磁場の移動の有効性もまた、全体的な緩和能において重要な因子であることを知らせる。この移動は、回転時間τＲおよび滞在時間τｍによって調節される。これらが長くなるほど、移動がより効果的になる。
【０１６９】
最小二乗アルゴリズム（ＦｉｎｄＦｉｔ  ｉｎ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａ（登録商標））を使用して、ＳＢＭ方程式を実験データに適合させた。曲線適合アルゴリズムは、物理的に実現不可能または無意味な解答を生じさせることで悪評が高いため、考えられる解答を限定するために制約を使用した。データはまた、より良い適合を生じさせたレーベンバーグ・マーカートアルゴリズムにも適合されたが、返されたパラメータはしばしば、負の値等無意味であった、および／または容認された値から何桁も異なってきた。レーベンバーグ・マーカートアルゴリズムを本制約とともに使用することができないため、制約の使用を可能にするＦｉｎｄＦｉｔ関数における最小限化オプションが使用され、急速に結果を返した。また、ＮＭＲＤデータを適合させながら、アルゴリズムによって返されるパラメータが、大域的最小点ではなく、極小点のみを表し得ることにも留意されたい。より良い解答が存在し得る可能性がある。しかしながら、これらは、特定して検証することが非常に困難である。加えて、１つのパラメータのわずかな調整が、他のパラメータの広く変動する変化を引き起こし得る。
【０１７０】
ここで報告される４つの材料のそれぞれについて、ＮＭＲＤデータを最も良く分析するように、いくつかの曲線適合実験を行った。浮動することが許可され、曲線適合アルゴリズムによって計算される変数の数と、固定されていると仮定され、他の手段によって判定されている数との間にはトレードオフがある。いくつかの変数の独立確証は、概して、これらのパラメータのより正確な値を生じさせるが、適合の緊密性に悪影響を及ぼし得る。逆に、アルゴリズムが全てのパラメータを見出すことを可能にすることにより、しばしば、優れた適合につながるが、時折、時間の負の値を含む、物理的に無意味な結果につながる。これらの発生を制限するために、我々は、概して、アルゴリズムの実行中に物理的に正当な範囲内に位置するように、所望のパラメータを制約した。
【０１７１】
ＳＢＭパラメータのうちのいくつかを裏付けるために、我々は、独立して、ＥＰＲおよび１７Ｏ横緩和速度測定によって、ｑおよびτＭの値を判定した。得られたｑの値は、全てのサンプルについて８であり、τΜの値は、酸化黒鉛＝２００ナノ秒、酸化グラフェンナノプレートレット＝５００ナノ秒、還元グラフェンナノプレートレット＝３５０ナノ秒、およびグラフェンナノリボン＝４００ナノ秒であった。
【０１７２】
最良適合が、ＥＰＲ測定によって裏付けされるｑ＝８について得られた。しかしながら、我々は、Ｍｎ（ＩＩ）イオンがグラフェンシートまたは酸素原子に配位される可能性を考慮し、また、ｑ＝２、４、および６について適合を得るとともに、ｑの値を浮動させた。以下の適合方策を採用した。
１．全てのＳＢＭパラメータを浮動させる（図１８）。
２．Ｑを２で固定し、残りのＳＢＭパラメータを浮動させる（図１９）。
３．Ｑを４で固定し、残りのＳＢＭパラメータを浮動させる（図２０）。
４．Ｑを６で固定し、残りのＳＢＭパラメータを浮動させる（図２１）。
５．Ｑを８で固定し、残りのＳＢＭパラメータを浮動させる（図２２）。
６．Ｑを８で固定し、Ｔｍを固定し、残りのＳＢＭパラメータを浮動させる（図２３）。
【０１７３】
４．１７Ｏ横緩和速度測定
【０１７４】
Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ５００分光計を、１７Ｏ測定に使用した。実験設定は、サンプル回転なし、スペクトル幅１０ｋＨｚ、９０°パルス、獲得時間２５ミリ秒、および２５６スキャンであった。磁場周波数ロックを実行するために、実験サンプルを含有する５ｍｍ管に同軸上に挿入された毛細管の中に含有された、ＣＤ３ＣＮを使用した。検出感度を向上させるように１７Ｏ豊富水（１０％Ｈ２１７Ｏ）を添加することによって、実験溶液を１７Ｏアイソトープの中で（３％まで）濃縮した。水１７Ｏ信号の半値幅を測定し、１７Ｏ横緩和速度測定を計算するために、この値を使用した（Ｒ２＝π×半値幅）。ＳｗｉｆｔおよびＣｏｎｎｉｃｋ理論（非特許文献７１）を使用して、１７Ｏ水中に分散された４つのサンプルの横緩和速度の温度依存性（１５〜８０℃の間）の分析から、水交換相関時間（τΜ）を推定した。２７℃で、４つのサンプルのτΜ値は、以下の通りであった。酸化黒鉛＝２００ナノ秒、酸化グラフェンナノプレートレット＝５００ナノ秒、還元グラフェンナノプレートレット＝３５０ナノ秒、およびグラフェンナノリボン＝４００ナノ秒。
【０１７５】
【表７ａ】
2014516206.tif 000020
【０１７６】
【表７ｂ】
2014516206.tif 000021
【０１７７】
【表８】
2014516206.tif 000022
【０１７８】
【表９】
2014516206.tif 000023
【０１７９】
【表１０】
2014516206.tif 000024
【０１８０】
【表１１】
2014516206.tif 000025
【０１８１】
【表１２】
2014516206.tif 000026
【０１８２】
【表１３】
2014516206.tif 000027
【０１８３】
【表１４】
2014516206.tif 000028
【０１８４】
本明細書で引用される全ての参考文献は、各個別出版物あるいは特許または特許出願が、あらゆる目的で、その全体で参照することにより組み込まれるように具体的および個別に示された場合と同程度に、それらの全体で、およびあらゆる目的で、参照することにより組み込まれる。
【０１８５】
当業者に明白となるように、その精神および範囲から逸脱することなく、本発明の多くの修正および変更を行うことができる。本明細書で説明される具体的実施形態は、一例のみとして提供され、本発明は、添付の請求項が享有する同等物の全範囲とともに、そのような請求項の用語のみによって限定されるものである。
【図１Ａ】
2014516206.tif 000029
【図１Ｂ】
2014516206.tif 000030
【図１Ｃ】
2014516206.tif 000031
【図１Ｄ】
2014516206.tif 000032
【図３Ａ】
2014516206.tif 000033
【図３Ｂ】
2014516206.tif 000034
【図３Ｃ】
2014516206.tif 000035
【図３Ｄ】
2014516206.tif 000036
【図３Ｅ】
2014516206.tif 000037
【図４Ａ】
2014516206.tif 000038
【図４Ｂ】
2014516206.tif 000039
【図４Ｃ】
2014516206.tif 000040
【図７】
2014516206.tif 000041
【図９Ａ】
2014516206.tif 000042
【図９Ｂ】
2014516206.tif 000043
【図９Ｃ】
2014516206.tif 000044
【図９Ｄ】
2014516206.tif 000045
【図９Ｅ】
2014516206.tif 000046
【図１０Ａ】
2014516206.tif 000047
【図１０Ｂ】
2014516206.tif 000048
【図１０Ｃ】
2014516206.tif 000049
【図１３Ａ】
2014516206.tif 000050
【図１３Ｂ】
2014516206.tif 000051
【図１３Ｃ】
2014516206.tif 000052
【図１３Ｄ】
2014516206.tif 000053
【図１４Ａ】
2014516206.tif 000054
【図１４Ｂ】
2014516206.tif 000055
【図１４Ｃ】
2014516206.tif 000056
【図１４Ｄ】
2014516206.tif 000057
【図１４Ｅ】
2014516206.tif 000058
【図１４Ｆ】
2014516206.tif 000059
【図１４Ｇ】
2014516206.tif 000060
【図１６Ａ】
2014516206.tif 000061
【図１６Ｂ】
2014516206.tif 000062
【図１８Ａ】
2014516206.tif 000063
【図１８Ｂ】
2014516206.tif 000064
【図１８Ｃ】
2014516206.tif 000065
【図１８Ｄ】
2014516206.tif 000066
【図１９Ａ】
2014516206.tif 000067
【図１９Ｂ】
2014516206.tif 000068
【図１９Ｃ】
2014516206.tif 000069
【図１９Ｄ】
2014516206.tif 000070
【図２０Ａ】
2014516206.tif 000071
【図２０Ｂ】
2014516206.tif 000072
【図２０Ｃ】
2014516206.tif 000073
【図２０Ｄ】
2014516206.tif 000074
【図２１Ａ】
2014516206.tif 000075
【図２１Ｂ】
2014516206.tif 000076
【図２１Ｃ】
2014516206.tif 000077
【図２１Ｄ】
2014516206.tif 000078
【図２２Ａ】
2014516206.tif 000079
【図２２Ｂ】
2014516206.tif 000080
【図２２Ｃ】
2014516206.tif 000081
【図２２Ｄ】
2014516206.tif 000082
【図２３Ａ】
2014516206.tif 000083
【図２３Ｂ】
2014516206.tif 000084
【図２３Ｃ】
2014516206.tif 000085
【図２３Ｄ】
2014516206.tif 000086
【図２Ａ】
2014516206.tif 000087
【図２Ｂ】
2014516206.tif 000088
【図５】
2014516206.tif 000089
【図６】
2014516206.tif 000090
【図８】
2014516206.tif 000091
【図１１Ａ】
2014516206.tif 000092
【図１１Ｂ】
2014516206.tif 000093
【図１１Ｃ】
2014516206.tif 000094
【図１１Ｄ】
2014516206.tif 000095
【図１２Ａ】
2014516206.tif 000096
【図１２Ｂ】
2014516206.tif 000097
【図１２Ｃ】
2014516206.tif 000098
【図１２Ｄ】
2014516206.tif 000099
【図１５Ａ】
2014516206.tif 000100
【図１５Ｂ】
2014516206.tif 000101
【図１５Ｃ】
2014516206.tif 000102
【図１７Ａ】
2014516206.tif 000103
【図１７Ｂ】
2014516206.tif 000104
【図１７Ｃ】
2014516206.tif 000105
【図１７Ｄ】
2014516206.tif 000106
【国際調査報告】
2014516206.tif 000107
2014516206.tif 000108