(57)【要約】  本発明は、核酸配列の存在に基づき試料中のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）を検出する迅速な方法、特に、ＰＣＲベースの検出方法、ならびにそれに有用なオリゴヌクレオチド分子および試薬およびキットに関する。ある実施形態において、本方法は、食物または水試料中のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）を検出するために用いられる。本発明はさらに、本発明の方法を実施するための単離されたポリヌクレオチド、複製組成物、およびキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の存在を検出する方法であって、前記試料は核酸を含み、
（ａ）少なくとも１つのプライマーおよびプローブを含む反応混合物を提供するステップであって、前記プライマーは少なくとも１１ヌクレオチド長であり、前記プローブは少なくとも１４ヌクレオチド長であり、
（ｉ）前記プライマーは、配列番号１の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含み、前記プローブは、配列番号２の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含む；または
（ｉｉ）前記プライマーは、配列番号３の核酸配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含み、前記プローブは、配列番号４の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含む、
前記ステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）の反応混合物を使用して前記試料の前記核酸のＰＣＲ増幅を実施するステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）の増幅を検出するステップと
を含む前記方法。
【請求項２】
反応混合物が、（ｉ）のプライマーおよびプローブならびに（ｉｉ）のプライマーおよびプローブの両方を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プライマーおよびプローブがそれぞれ、３’末端および５’末端を有し、前記プローブの３’末端が前記プライマーの５’末端に直接または間接的に結合しており、それによりプライマー−プローブ複合体を形成している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
プライマー−プローブ複合体が検出可能な標識を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
配列番号１に選択的にハイブリダイズし得るプライマーが配列番号４０〜５４からなる群から選択される核酸配列を含み、配列番号２に選択的にハイブリダイズし得るプローブが配列番号６〜３９からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１または３に記載の方法。
【請求項６】
配列番号３に選択的にハイブリダイズし得るプライマーが配列番号９５〜１１１からなる群から選択される核酸配列を含み、配列番号４に選択的にハイブリダイズし得るプローブが配列番号５５〜９４からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１または３に記載の方法。
【請求項７】
プライマー−プローブ複合体が５’ステム配列および３’ステム配列をさらに含み、前記５’ステム配列の３’末端が前記プローブの５’末端に直接または間接的に結合しており、前記３’ステム配列の５’末端が前記プローブの３’末端に直接または間接的に結合しており、前記３’ステム配列の３’末端が前記プライマーの５’末端に直接または間接的に結合している、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
５’ステム配列が配列番号１１２〜１１９からなる群から選択される核酸配列を含み、３’ステム配列が配列番号１２０〜１３０からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
反応混合物がプローブにストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得るクエンチャーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１または３に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号６〜１１１からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
プライマー−プローブ複合体を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記プライマー−プローブ複合体が核酸プライマー部分および核酸プローブ部分を含み、前記プライマー部分は少なくとも１１ヌクレオチド長であり、前記プローブ部分は少なくとも１４ヌクレオチド長であり、前記プローブ部分の３’末端は前記プライマー部分の５’末端に直接または間接的に結合しており、
（ｉ）前記プライマー部分は配列番号１の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含み、前記プローブ部分は配列番号２の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含むか；または
（ｉｉ）前記プライマー部分は配列番号３の核酸配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含み、前記プローブ部分は配列番号４の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含む、
前記単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
プライマー部分が配列番号４０〜５４からなる群から選択される核酸配列を含み、プローブ部分が配列番号６〜３９からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
プライマー部分が配列番号９５〜１１１からなる群から選択される核酸配列を含み、プローブ部分が配列番号５５〜９４からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
プライマー−プローブ複合体が５’ステム配列および３’ステム配列をさらに含み、前記５’ステム配列の３’末端が前記プローブ部分の５’末端に直接または間接的に結合しており、前記３’ステム配列の５’末端が前記プローブ部分の３’末端に直接または間接的に結合しており、前記３’ステム配列の３’末端が前記プライマー部分の５’末端に直接または間接的に結合している、請求項１１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５】
５’ステム配列が配列番号１１２〜１１９からなる群から選択される核酸配列を含み、３’ステム配列が配列番号１２０〜１３０からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１１に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、試料中のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の検出のためのキット。
【請求項１７】
請求項１１に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む試薬錠剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸配列の存在に基づき試料中のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の迅速な検出方法、特に、ＰＣＲベースの検出方法、ならびにそれに有用なオリゴヌクレオチド分子および試薬およびキットに関する。ある実施形態において、本方法は、食物または水試料中のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）を検出するために用いられる。本発明はさらに、本発明の方法を実施するための単離されたポリヌクレオチド、複製組成物、およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）は、多数の疾病、例として、食中毒および腸チフスを引き起こすことが公知であるグラム陰性桿菌の属である。サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）感染は、動物からヒトへ伝播され得、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）により汚染された食物の摂取を介してもたらされ得る。食中毒の原因であるエンティリディス（ｅｎｔｉｒｉｄｉｓ）タイプのサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）が関与する感染において、その生物は、典型的には、摂取を介して消化管に入り込む。健常成人においては、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）は、一般に、任意の疾患を引き起こすほど多数で摂取されるはずである。しかしながら、若年幼児においては、比較的少数の細菌の摂取が、この集団の感受性の増加に起因して疾患を引き起こすことが示されている。サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）感染の過程に関して、細菌は、典型的には、感染症状が現れる前日まで潜伏する。その潜伏期後、腸炎が生じ、下痢をもたらし、それは血性であることが多い。症状は、一般に軽度であり、敗血症を伴わないが、敗血症は免疫不全の個体において生じ得る。さらに、サルモネラ髄膜炎は幼児において生じ得る。
【発明の概要】
【０００３】
試料、例えば、食物または飲料試料中のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の検出は、一部の感染のその伝達様式および重症度のため、集団の安全性に重要である。したがって、試料中のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の迅速および正確な検出のための試験を有することが望まれる。
【０００４】
本発明の一態様は、試料中のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の存在を検出する方法であって、前記試料は核酸を含み、（ａ）少なくとも１つのプライマーおよびプローブを含む反応混合物を提供するステップであって、前記プライマーは少なくとも１１ヌクレオチド長であり、前記プローブは少なくとも１４ヌクレオチド長であり、（ｉ）前記プライマーは配列番号１の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含み、前記プローブは配列番号２の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含む；または（ｉｉ）前記プライマーは配列番号３の核酸配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含み、前記プローブは配列番号４の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含む、前記ステップと；（ｂ）ステップ（ａ）の反応混合物を使用して前記試料の前記核酸のＰＣＲ増幅を実施するステップと；（ｃ）ステップ（ｂ）の増幅を検出するステップ、とを含む方法である。
【０００５】
ある実施形態において、反応混合物は、（ｉ）のプライマーおよびプローブならびに（ｉｉ）のプライマーおよびプローブの両方を含む。ある他の実施形態において、プライマーおよびプローブはそれぞれ３’末端および５’末端を有し、前記プローブの３’末端は前記プライマーの５’末端に直接または間接的に結合しており、それによりプライマー−プローブ複合体を形成する。いっそうさらなる実施形態において、プライマー−プローブ複合体は５’ステム配列および３’ステム配列をさらに含み、前記５’ステム配列の３’末端は前記プローブの５’末端に直接または間接的に結合しており、前記３’ステム配列の５’末端は前記プローブの３’末端に直接または間接的に結合しており、前記３’ステム配列の３’末端は前記プライマーの５’末端に直接または間接的に結合している。追加の実施形態において、プライマー−プローブ複合体は、検出可能な標識を含む。さらなる実施形態において、反応混合物は、前記プローブにストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得るクエンチャーオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【０００６】
ある例において、配列番号１に選択的にハイブリダイズし得るプライマーは配列番号４０〜５４からなる群から選択される核酸配列を含み、配列番号２に選択的にハイブリダイズし得るプローブは配列番号６〜３９からなる群から選択される核酸配列を含む。他の例において、配列番号３に選択的にハイブリダイズし得るプライマーは配列番号９５〜１１１からなる群から選択される核酸配列を含み、前記配列番号４に選択的にハイブリダイズし得るプローブは配列番号５５〜９４からなる群から選択される核酸配列を含む。さらなる例において、５’ステム配列は配列番号１１２〜１１９からなる群から選択される核酸配列を含み、前記３’ステム配列は配列番号１２０〜１３０からなる群から選択される核酸配列を含む。
【０００７】
別の態様において、本発明は、配列番号６〜１１１からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。他の実施形態において、本発明はプライマー−プローブ複合体を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記プライマー−プローブ複合体は核酸プライマー部分および核酸プローブ部分を含み、前記プライマー部分は少なくとも１１ヌクレオチド長であり、前記プローブ部分は少なくとも１４ヌクレオチド長であり、前記プローブ部分の３’末端は前記プライマー部分の５’末端に直接または間接的に結合しており、（ｉ）前記プライマー部分は配列番号１の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含み、前記プローブ部分は配列番号２の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含む；または（ｉｉ）前記プライマー部分は配列番号３の核酸配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含み、前記プローブ部分は配列番号４の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。ある例において、プライマー部分は配列番号４０〜５４からなる群から選択される核酸配列を含み、および／またはプローブ部分は配列番号６〜３９からなる群から選択される核酸配列を含む。他の例において、プライマー部分は配列番号９５〜１１１からなる群から選択される核酸配列を含み、および／またはプローブ部分は配列番号５５〜９４からなる群から選択される核酸配列を含む。
【０００８】
追加の実施形態において、プライマー−プローブ複合体は５’ステム配列および３’ステム配列をさらに含み、前記５’ステム配列の３’末端は前記プローブ部分の５’末端に直接または間接的に結合しており、前記３’ステム配列の５’末端は前記プローブ部分の３’末端に直接または間接的に結合しており、前記３’ステム配列の３’末端は前記プライマー部分の５’末端に直接または間接的に結合している。ある例において、５’ステム配列は配列番号１１２〜１１９からなる群から選択される核酸配列を含み、および／または３’ステム配列は配列番号１２０〜１３０からなる群から選択される核酸配列を含む。
別の態様において、本発明は、試料中のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の検出のための試薬錠剤またはキットに関する。
【０００９】
配列の要約
配列番号１〜５は、試料中のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の存在を検出するために有用なサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ゲノムの一部のヌクレオチド配列である。ある例において、配列番号１に対するプライマーは配列番号２に対するプローブとともに使用される。他の例において、配列番号３に対するプライマーは配列番号４または５に対するプローブとともに使用される。ある他の例において、プライマーおよびプローブはプライマー−プローブ複合体を形成するように結合しており、プローブ部分の３’末端はプライマー部分の５’末端に直接または間接的に結合している。配列番号１にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得るプライマーおよび／またはプローブは配列番号４０〜５４を含む。配列番号２にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得るプライマーおよび／またはプローブは配列番号６〜３９を含む。配列番号３にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得るプライマーおよび／またはプローブは配列番号９５〜１１１を含む。配列番号４にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得るプライマーおよび／またはプローブは、配列番号５５〜９４を含む。
【００１０】
配列番号６〜３９は、ストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズさせ、最終的に配列番号２の配列を検出するためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。
配列番号４０〜５４は、ストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズさせ、最終的に配列番号１の配列を検出するためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。
配列番号５５〜９４は、ストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズさせ、最終的に配列番号４の配列を検出するためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である、または。
配列番号９５〜１１１は、ストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズさせ、最終的に配列番号３の配列を検出するためのプライマーまたはプローブとして使用することができるヌクレオチド配列である。
【００１１】
配列番号１１２〜１１９は、例えば、好適なプローブ配列、例えば、配列番号６〜３９および５５〜９４により記載されるものとともに５’ステム配列として使用することができるヌクレオチド配列である。ある例において、５’ステム配列は、５’ステム配列の３’末端がプローブ配列の５’末端に直接または間接的に結合するようにプローブ配列に直接または間接的に結合している。
配列番号１２０〜１３０は、例えば、好適なプローブ配列、例えば、配列番号６〜３９および５５〜９４により記載されるものとともに３’ステム配列として使用することができるヌクレオチド配列である。ある例において、３’ステム配列は、３’ステム配列の５’末端がプローブ配列の３’末端に直接または間接的に結合し、前記３’ステム配列の３’末端がプライマー配列の５’末端に直接または間接的に結合するようにプローブ配列およびプライマー配列に直接または間接的に結合している。
配列番号１３１は、例えば、陽性対照増幅反応のための標的として有効に用いることができる合成ＳＶ４０（「ｓＳＶ４０」）配列を含むヌクレオチド配列である。ある実施形態において、この配列は、「添加」対照として使用することができ、配列番号１３２〜１３６を使用して増幅および検出することができる。
【００１２】
配列番号１３２〜１３６は配列番号１３１の陽性対照配列を増幅および検出するために有用なヌクレオチド配列である。ある実施形態において、配列番号１３２は５’ステム配列であり、配列番号１３３はプローブ配列であり、配列番号１３４は３’ステム配列であり、配列番号１３５はフォワードプライマー配列であり、配列番号１３６はリバースプライマー配列である。他の実施形態において、配列番号１３２〜１３５はステム−ループ構造を形成し得るプライマー−プローブ複合体を形成するように合わさっている。他の実施形態において、そのプライマー−プローブ複合体は配列番号１３１を増幅および検出するためにリバースプライマーとしての配列番号１３６とともにフォワードプライマー／プローブとして使用される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】プライマー−プローブ複合体のプローブ部分、プライマー部分、５’および３’ステム配列、結合部分、ならびに検出可能な標識の例示的な組合せを示す。
【図１Ｂ】プライマー−プローブ複合体のプローブ部分、プライマー部分、５’および３’ステム配列、結合部分、ならびに検出可能な標識の例示的な組合せを示す。
【図１Ｃ】プライマー−プローブ複合体のプローブ部分、プライマー部分、５’および３’ステム配列、結合部分、ならびに検出可能な標識の例示的な組合せを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本出願人らは、本開示における全ての引用文献の全内容を具体的に取り込む。さらに、量、濃度、または他の値もしくはパラメータが、範囲、好ましい範囲、または好ましい上限値および好ましい下限値の列挙のいずれかとして挙げられる場合、範囲が別個に開示されるかにかかわらず、任意の範囲上限値または好ましい値および任意の範囲下限値または好ましい値の任意のペアから形成される全ての範囲を具体的に開示するものとして理解すべきである。数値の範囲が本明細書に引用される場合、特に記載のない限り、範囲は、その終点、ならびにその範囲内の全ての整数および分数を含むものとする。本発明の範囲は、範囲を定義する場合に引用される具体値に限定されるものではない。
【００１５】
定義
本開示において、多数の用語および略語が使用される。以下の定義が提供される。
本明細書において使用される用語「約」または「およそ」は、所与の値または範囲の２０％以内、好ましくは、１０％以内、より好ましくは、５％以内を意味する。
用語「含む」は、用語「から本質的になる」および「からなる」により包含される実施形態を含むものとする。同様に、用語「から本質的になる」は、用語「からなる」により包含される実施形態を含むものとする。
ＰＣＲは「ポリメラーゼ連鎖反応」の略語である。
【００１６】
用語「単離された」は材料について言及するものであり、通常、天然環境中でその材料に付随しまたはそれと相互作用する成分を実質的に含まない、または天然環境中でその材料に付随しまたはそれと相互作用する成分から取り出された材料、例えば、核酸分子存在している宿主細胞から精製することができる。当業者に公知の慣用の核酸精製法を使用して単離されたポリヌクレオチドを得ることができる。この用語は組換えポリヌクレオチドおよび化学合成ポリヌクレオチドも包含する。
用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸断片」、および「オリゴヌクレオチド」は、本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、合成、非天然、または変化したヌクレオチド塩基を含有してもよい一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであり得る。ＤＮＡのポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡの１つまたは複数の鎖、またはそれらの混合物からなっていてよい。
【００１７】
用語「増幅産物」または「アンプリコン」は、プライマー指向増幅反応の間に産生される核酸断片を指す。典型的なプライマー指向増幅の方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、または鎖置換増幅（ＳＤＡ）、が含まれる。ＰＣＲ法が選択される場合、複製組成物は典型的には、核酸複製のための成分、例えば：デオキシヌクレオチド三リン酸、適切な配列を有する２つ（以上）のプライマーまたはプライマー−プローブ複合体、耐熱性ポリメラーゼ、緩衝液、溶質およびタンパク質を含み得る。これらの試薬および核酸の増幅におけるそれらの使用についての手順を説明する詳細は、米国特許第４，６８３，２０２号明細書（１９８７，Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．）および米国特許第４，６８３，１９５号明細書（１９８６，Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．）に提供されている。ＬＣＲ法が選択される場合、核酸複製組成物は、例えば：耐熱性リガーゼ（例えば、テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）リガーゼ）、２組の隣接オリゴヌクレオチド（それぞれの組のうち一方のメンバーは、標的鎖のそれぞれと相補的である）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＫＣｌ、ＥＤＴＡ、ＮＡＤ、ジチオスレイトール、およびサケ精子ＤＮＡを含み得る。例えば、Ｔａｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：１０７４−１０７８（１９８５）参照。
【００１８】
用語「プライマー」は、相補鎖の合成がポリメラーゼにより触媒される条件下に置かれた場合、相補鎖に沿っての核酸合成または複製の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチド（合成または天然）を指す。プライマーは、検出可能な標識、例えば、５’末端標識をさらに含有し得る。ある実施形態において、本発明のプライマーは、８〜６０核酸長である。他の実施形態において、プライマーは、１０〜５０、１４〜４０，または２０〜３０核酸長である。ある具体的な実施形態において、プライマーは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である。
用語「プローブ」は、目的のポリヌクレオチドと相補的（必ずしも完全に相補的である必要はない）であり、目的のポリヌクレオチドの少なくとも一方の鎖とのハイブリダイゼーションにより二本鎖構造を形成するオリゴヌクレオチド（合成または天然）を指す。プローブまたはプライマー−プローブ複合体は、検出可能な標識をさらに含有し得る。ある実施形態において、本発明のプローブは、８〜６０核酸長である。他の実施形態において、プローブは、１０〜５０、１４〜４０、または２０〜３０核酸長である。特定の実施形態において、プローブは、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である。
【００１９】
プローブは、独立した実体であるか、またはプライマーと複合体化もしくはそうでなければプライマーに結合していてよく、例えば、プローブはその３’末端を介してプライマーの５’末端に直接または間接的に連結される。一部の例において、プローブおよびプライマーは、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーであってよく、非増幅性リンカーであり得るリンカー、例えば、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）または１８炭素リンカーを介して結合している。このような場合、これは「プライマー−プローブ複合体」と称される。このようなプライマー−プローブ複合体の一例は、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第６，３２６，１４５号明細書に見出すことができ、それは「Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブ」または「Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー」と称されることが多い。典型的なプライマープローブ複合体において、プライマー部分は、例えば、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長であり得る一方、プローブ部分は、例えば、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長であり得る。
【００２０】
本明細書において使用される用語「標識」および「検出可能な標識」は、検出することができる分子、例として、限定されるものではないが、放射性同位体、蛍光体（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）、化学発光体（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、半導体ナノ結晶、リガンド（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、またはハプテン）などを指す。検出可能な標識には、レポーターおよびクエンチャーの組合せも含まれ得る。
用語「レポーター」は、クエンチャーにより抑制することができる検出可能なシグナルを示し得る物質またはその一部を指す。レポーターの検出可能なシグナルは、例えば、検出可能な範囲の蛍光である。用語「クエンチャー」は、レポーターにより産生される検出可能なシグナルを抑制し、低減させ、阻害などし得る物質またはその一部を指す。
本明細書において使用される用語「クエンチング」および「蛍光エネルギー移動」は、レポーターおよびクエンチャーが接近しており、レポーターがエネルギー源により励起される場合、励起状態のエネルギーの実質的な部分は非放射的に（ｎｏｎｒａｄｉａｔｉｖｅｌｙ）クエンチャーに移動し、それは非放射的に消失しまたはレポーターのそれとは異なる発光波長において放出されるプロセスを指す。
【００２１】
好ましくは、レポーターは、オリゴヌクレオチドへの、例えば、末端３’炭素または末端５’炭素への結合に好適な連結基により修飾された蛍光性有機色素から選択することができる。クエンチャーも、本発明の実施形態に応じて、有機色素（蛍光性であってもなくてもよい）から選択することができる。一般に、クエンチャーが蛍光性でありまたはレポーターからの移動されたエネルギーを非放射崩壊により単に放出するかに関わらず、クエンチャーの吸収バンドは、クエンチングを最適化するためにレポーターの蛍光発光バンドと少なくとも実質的に重複するべきである。非蛍光性クエンチャーまたはダーククエンチャーは、典型的には、励起されたレポーターからのエネルギーを吸収することにより機能するが、エネルギーを発光により放出しない。
特定のプローブに適切なレポーター−クエンチャーペアの選択は、公知の技術に従って行うことができる。蛍光性およびダーククエンチャー、ならびに例示的なレポーター−クエンチャーペアを選択することができるそれらの関連する光学特性は、例えば、Ｂｅｒｌｍａｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７１に列挙および記載されており、この内容は参照により本明細書に組み込まれる。本発明におけるオリゴヌクレオチドに付加することができる一般的な反応基を介する共有結合のためにレポーターおよびクエンチャーを修飾する例は、例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．，１９９２に見出すことができ、この内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００２２】
好ましいレポーター−クエンチャーペアは、キサンテン色素、例としてフルオレセインおよびローダミン色素から選択することができる。これらの化合物の多くの好適な形態は、オリゴヌクレオチドへの結合のための結合部位としてまたは結合官能基として使用することができるフェニル基上の置換基とともに市販されている。レポーターとしての使用のための蛍光性化合物の別の好ましい群は、αまたはβ位にアミノ基を有するナフチルアミンである。このようなナフチルアミノ化合物の中には、１−ジメチルアミノナフチル−５スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネートおよび２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネートが含まれる。他の色素には、３−フェニル−７−イソシアナトクマリン；アクリジン、例えば、９−イソチオシアナトアクリジン；Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド；ベンゾオキサジアゾール；スチルベン；ピレンなどが含まれる。
最も好ましくは、レポーターおよびクエンチャーは、フルオレセインおよびローダミン色素から選択される。これらの色素およびオリゴヌクレオチドへの結合のための適切な連結法は、当分野において周知である。
クエンチャーの好適な例は、６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン、４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＹＬ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、それぞれがＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｎｏｖａｔｏ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能であるＢＨＱ−０（商標）、ＢＨＱ−１（商標）、ＢＨＱ−２（商標）、およびＢＨＱ−３（商標）、それぞれがＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能であるＱＳＹ−７（商標）、ＱＳＹ−９（商標）、ＱＳＹ−２１（商標）およびＱＳＹ−３５（商標）などから選択することができる。
【００２３】
レポーターの好適な例は、色素、例えば、ＳＹＢＲグリーン、５−カルボキシフルオレセイン（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｏｆ  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能な５−ＦＡＭ（商標））、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＴＥＴ）、２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能な６−ＴＥＴ（商標））、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能な６−ＪＯＥ（商標））、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＶＩＣ（商標）色素製品、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能な入手可能なＮＥＤ（商標）色素製品などから選択することができる。
【００２４】
レポーターおよびクエンチャーを含有するプローブの一例は、単分子または二分子立体構造のいずれかのスコーピオン（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）プローブである。単分子Ｓｃｏｒｐｉｏｎにおいて、プライマー−プローブ複合体のプローブ部分は、プローブがその標的ＤＮＡから解離した場合、プローブがステム−ループ構造を形成することを可能にする、自己相補的領域によりフランキングされている。ある実施形態において、これらは、プローブの５’末端に結合している３’末端を有する５’ステム配列、およびプローブの３’末端に結合している５’末端およびプライマーに結合している３’末端を有する３’ステム配列と称される。これらの結合は、直接的または例えばリンカーを介して間接的のいずれかであり得る。さらに、単分子Ｓｃｏｒｐｉｏｎにおいて、レポーターは、典型的には、自己相補的領域の一方またはその付近において、例えば、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブの５’末端において結合しており、クエンチャーは、他方の自己相補的領域またはその付近において、例えば、非増幅性リンカーの５’に接して結合しており、その結果、クエンチャーは、プローブがステム−ループ構造をとっている場合、クエンチングを引き起こすために十分にレポーターに接近している。二分子Ｓｃｏｒｐｉｏｎにおいて、自己相補的フランキング領域が典型的には用いられるのではなく、むしろ別個の「ブロッキングオリゴヌクレオチド」または「クエンチングオリゴヌクレオチド」がＳｃｏｒｐｉｏｎプローブとともに用いられる。このブロッキングオリゴヌクレオチドは、プローブがその標的ＤＮＡから解離した場合、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブのプローブ領域へハイブリダイズし得る。さらに、二分子Ｓｃｏｒｐｉｏｎにおいて、レポーターは、典型的には、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブのプローブ領域に、例えば、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブの５’末端において結合している一方、クエンチャーは、ブロッキングオリゴヌクレオチドに、例えば、ブロッキングオリゴヌクレオチドの３’末端において結合しており、その結果、クエンチャーは、プローブがその標的ＤＮＡから解離して代わりにブロッキングオリゴヌクレオチドへハイブリダイズした場合にクエンチングを引き起こすために十分なほどレポーターに接近している。
【００２５】
レポーターおよびクエンチャーを含有するプローブの別の例は、５’−エキソヌクレアーゼアッセイ、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲ技術において使用することができるプローブである。この文脈において、オリゴヌクレオチドプローブは、その５’末端に隣接する十分な数のホスホジエステル結合を有し、その結果、用いられる５’→３’ヌクレアーゼ活性が結合プローブを効率的に分解してレポーターおよびクエンチャーを分離させ得る。レポーターおよびクエンチャーを含有するプローブのさらに別の例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ型プローブであり、これは、標的配列から解離した場合、プローブがステム−ループ構造を形成することを可能にする自己相補的領域によりフランキングされたプローブ領域を含有する。このようなプローブは、典型的には、一方の末端またはその付近において結合しているレポーターおよび他方の末端またはその付近において結合しているクエンチャーを有し、その結果、クエンチャーは、プローブが非結合形態、したがってステム−ループ形態である場合、クエンチングを引き起こすために十分にレポーターに接近している。
【００２６】
用語「複製インヒビター部分」は、核酸鎖の複製のための鎖伸長の開始をブロックするオリゴヌクレオチドの３’末端ヒドロキシル基に結合している任意の原子、分子または化学基を指す。例には、限定されるものではないが：３’−デオキシヌクレオチド（例えば、コルジセピン）、ジデオキシヌクレオチド、ホスフェート、リガンド（例えば、ビオチンおよびジニトロフェノール）、レポーター分子（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、炭素鎖（例えば、プロパノール）、ミスマッチヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、またはペプチド核酸単位が含まれる。用語「非関与」は、核酸分子の増幅についての反応におけるプローブまたはプライマーの関与の欠如を指す。具体的には、非関与プローブまたはプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼについての基質としてもＲＮＡポリメラーゼについての基質としても機能せずまたはＤＮＡポリメラーゼによってもＲＮＡポリメラーゼによっても伸長されないものである。「非関与プローブ」は、本質的にポリメラーゼにより鎖伸長され得ない。非関与プローブは、複製インヒビター部分を有しても有さなくてもよい。
【００２７】
核酸分子は、核酸分子の一本鎖形態が温度および溶液イオン強度の適切な条件下で他の核酸分子にアニールし得る場合、別の核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡに「ハイブリダイズ可能」という。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、特に第１１章およびその中の表１１．１（参照により本明細書に完全に組み込まれる）に例示されている。温度およびイオン強度の条件がハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同核酸についての予備スクリーニングについて、５５℃のＴｍに対応する低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を使用することができ、例えば、５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、０．２５％のミルク、およびホルムアミド無し；または３０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍ、例えば、４０％のホルムアミド、５×または６×ＳＳＣに対応する。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチがあり得る。核酸をハイブリダイズさせるための適切なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度、当分野において周知の変数に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高いほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドについてのＴｍの値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順序で減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドについて、Ｔｍを計算するための公式が導かれた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，前掲，９．５０−９．５１参照）。より短い核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーションについて、ミスマッチの位置はより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さはその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，前掲，１１．７−１１．８参照）。１つの好ましい実施形態において、ハイブリダイズ可能な核酸についての長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。より好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸についての最小の長さは少なくとも約１１ヌクレオチド、少なくとも約１２ヌクレオチド、少なくとも約１３ヌクレオチド、少なくとも約１４ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約１６ヌクレオチド、少なくとも約１７ヌクレオチド、少なくとも約１８ヌクレオチド、少なくとも約１９ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２１ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２３ヌクレオチド、少なくとも約２４ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約２６ヌクレオチド、少なくとも約２７ヌクレオチド、少なくとも約２８ヌクレオチド、少なくとも約２９ヌクレオチド、または最も好ましくは、少なくとも３０ヌクレオチドである。さらに、当業者は、温度および洗浄溶液塩濃度を因子、例えば、プローブの長さに従って必要に応じて調節することができることを認識する。
【００２８】
ある実施形態において、プライマープローブは、選択的（例えば、ストリンジェントな）ハイブリダイゼーション条件下で標的核酸配列に選択的にハイブリダイズし得る。用語「選択的にハイブリダイズする」には、非標的核酸配列へのハイブリダイゼーションよりも検出可能に大きい程度（例えば、バックグラウンドと比べて少なくとも２倍）での、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での、核酸配列の規定核酸標的配列へのハイブリダイゼーションおよび非標的核酸の実質的排除への言及が含まれる。選択的にハイブリダイズする核酸配列は、典型的には、互いに少なくとも約７０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも８０％の配列同一性、最も好ましくは、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。
本明細書において使用される標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（前掲）；およびＧｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより出版されたＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）により記載されている。
【００２９】
オリゴヌクレオチド
１つまたは複数の標的核酸配列を検出することにより試料中のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌を検出する方法を開発した。ある実施形態において、本方法は、単離されたポリヌクレオチドならびに／またはプライマーおよびプローブを含む反応混合物を用い、（ｉ）プライマーは配列番号１またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズすることができ、プローブは配列番号２またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズすることができ；または（ｉｉ）プライマーは配列番号３またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズすることができ、プローブは配列番号４またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズすることができる。一部の実施形態において、配列番号１に選択的にハイブリダイズし得るプローブは配列番号４０〜５４を含む。他の実施形態において、配列番号２に選択的にハイブリダイズし得るプライマーは配列番号６〜３９を含む。さらなる実施形態において、配列番号３に選択的にハイブリダイズし得るプローブは配列番号９５〜１１１を含む。いっそうさらなる実施形態において、配列番号４に選択的にハイブリダイズし得るプライマーは配列番号５５〜９４を含む。
【００３０】
一部の実施形態において、プライマーおよびプローブは直接または間接的に結合しており、それによりプライマー−プローブ複合体を形成する。一部の例において、プライマー−プローブ複合体はプローブの３’末端をプライマーの５’末端に直接または間接的に結合させることにより形成される。本発明のこれらのプライマープローブ複合体は、プローブ領域の３’末端をプライマー領域の５’末端に連結する非増幅性リンカーも含有し得る。この非増幅性リンカーは相補鎖の伸長がプライマー−プローブ複合体のプローブ領域中に進行することを停止させる。このような非増幅性結合の例には、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）および好ましくは、１８炭素リンカーが含まれる。
本発明のプライマー−プローブ複合体は、プローブがその標的ＤＮＡから解離した場合、プライマー−プローブ複合体がステム−ループ構造を形成することを可能とする３’ステム配列および５’ステム配列を含む自己相補的領域も含有してもよく、これは、例えば、レポーターシグナルをクエンチさせるために十分に互いにレポーターおよびクエンチャーを接近させることにおいて有用であり得る。一部の実施形態において、５’ステム配列は配列番号１１２〜１１９のものであり、３’ステム配列は配列番号１２０〜１３０のものである。
【００３１】
追加の実施形態において、プライマー、プローブ、またはプライマー−プローブ複合体は、検出可能な標識、例えば、５’末端標識またはレポーター−クエンチャーペアをさらに含む。一部の例において、クエンチャーオリゴヌクレオチドは、プローブまたはプライマー−プローブ複合体とともに用いることができ、そのクエンチャーオリゴヌクレオチドは、プローブがその標的ＤＮＡから解離した場合、プローブまたはプライマー−プローブ複合体のプローブ領域にハイブリダイズし得る。レポーターがプローブまたはプライマー−プローブ複合体に結合しており、クエンチャーがブロッキングオリゴヌクレオチドに結合している場合、これは、クエンチングを生じさせるために十分に互いにレポーターおよびクエンチャーを接近させ得る。
ある実施形態において、プライマーまたはプライマー−プローブ複合体は、リバースプライマーとともに使用される。いっそうさらなる実施形態において、このような２つのプライマー−プローブ複合体は、一方をフォワードプライマー−プローブ複合体として、他方をリバースプライマー−プローブ複合体として用いられる。プローブ部分、プライマー部分、５’および３’ステム配列、結合部分、ならびに検出可能な標識の例示的な組合せを図１Ａ〜１Ｃに提供する。
【００３２】
これらのプライマー−プローブ複合体は、ＰＣＲにおけるその有用性に加え、他の核酸増幅法、例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｂａｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、欧州特許第０３２０３０８号明細書；Ｃａｒｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３：３−２０）；核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、（Ｃａｒｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，前掲）；および自家持続配列複製（３ＳＲ）および「Ｑレプリカーゼ増幅」（Ｐｆｅｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９：３７５−４０７）にも有用であり得る。
さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションプローブとして使用することもできる。ＤＮＡプローブを使用するハイブリダイゼーションは、食物、臨床および環境試料中の病原菌の検出に使用されることが多く、方法は、一般に当業者に公知である。プローブハイブリダイゼーションの感度および特異性の程度は、既に記載された増幅技術を介して達成されるものよりも低いことが一般に認識されている。
【００３３】
アッセイ方法
選択遺伝子標的の検出、および後続の試料中のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の存在の検出は、任意の好適な様式で達成することができる。好ましい方法は、プライマー指向増幅法および核酸ハイブリダイゼーション法である。これらの方法は、例えば、汚染が疑われる動物、環境、または食物供給源からの複雑なマトリックスまたは精製培養物のいずれかである試料中のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）を検出するために使用することができる。
本発明の好ましい実施形態は、（１）非選択的増殖培地において複合試料混合物を培養して標的細菌を活性化させること、（２）標的細菌全ＤＮＡを放出させること、ならびに（３）本発明のプライマーおよびプローブ、またはプライマー−プローブ複合体、ならびに本発明のリバースプライマー、または２つのプライマー−プローブ複合体（一方はフォワードプライマーとして作用し、第２のものはリバースプライマーとして作用する）を用いての、増幅プロトコルに全ＤＮＡを供することを含む。
【００３４】
プライマー指向増幅アッセイ方法
本発明において用いることができる種々のプライマー指向核酸増幅法、例として、熱サイクル法（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、およびＬＣＲ）、ならびに等温法および鎖置換増幅（ＳＤＡ）が当分野において公知である。好ましい方法はＰＣＲである。１つの好ましい実施形態において、図１Ａ〜１Ｃに記載のプライマー−プローブ複合体を、標的核酸の検出、および最終的にはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の検出のためのプライマー指向核酸増幅における使用のためのプライマーとして使用することができる。
【００３５】
試料調製：
本発明によるオリゴヌクレオチドおよび方法は、いかなる試料調製も必要とせず、任意の好適な臨床または環境試料を用いて直接使用することができる。より高い感度を達成するため、および時間が制限因子ではない状況において、試料を前処理し、プレ増幅濃縮を実施することが好ましい。
食物経由細菌病原体の検出についての最低業界基準は、Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，“Ｆｏｏｄ  Ｓａｍｐｌｅ  ａｎｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ”，Ｃｈａｐｔｅｒ  １  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ａ，Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＶＡに記載されるように、食物マトリックス２５ｇ中１つの病原体細胞の存在を確実に検出する方法である。このストリンジェントな基準を満たすため、生化学的、標的病原体細胞の増殖を向上させて免疫学的または核酸ハイブリダイゼーション手段によるその検出を容易にするための濃縮法および培地が開発されている。典型的な濃縮手順は、標的細菌の増殖および健康を向上させ、さらには存在する任意のバックグラウンドまたは非標的微生物の増殖を阻害する培地を用いる。例えば、ＵＳＤＡは、病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）について検査すべき牛挽肉の試料の濃縮のためのプロトコルを記載している（米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ）。
【００３６】
種々の細菌病原体についての選択培地が開発されており、当業者は、濃縮すべき特定の生物に適切な培地を選択することを把握する。非選択的培地の全般的な議論およびレシピは、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ｓｕｉｔｅ  ４００，２２００  Ｗｉｌｓｏｎ  Ｂｌｖｄ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＶＡ  ２２２０１−３３０１により出版および配布されたＦＤＡ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ．（１９９８）に記載されている。
選択的増殖後、複雑な混合物の試料をさらなる分析のために取り出す。このサンプリング手順は当業者に周知の種々の手段により達成することができる。好ましい実施形態において、５μｌの濃縮培養物を取り出し、プロテアーゼを含有する２００μｌの溶解溶液に添加する。ＢＡＸ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，ＤｕＰｏｎｔ  Ｑｕａｌｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥに記載されるとおり、溶解溶液を３７℃において２０分間加熱し、次いで９５℃において１０分間プロテアーゼ不活性化を行う。
【００３７】
ＰＣＲアッセイ方法：
試料中の本発明の標的核酸および後続のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の存在を検出する好ましい方法は、（ａ）本発明のプライマーおよびプローブ、またはプライマー−プローブ複合体、例えば、図１Ａ〜１Ｃに記載のもの、ならびに好適なリバースプライマーを使用してＰＣＲ増幅を実施すること；および（ｂ）増幅を検出し、それにより増幅の陽性検出が試料中のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の存在を示すことを含む。別の実施形態において、ＰＣＲ増幅は、一方のプライマー−プローブ複合体がフォワードプライマーとして作用し、第２のプライマー−プローブ複合体がリバースプライマーとして作用するように十分離れたプライマー結合領域を有する本発明の２つの異なるプライマー−プローブ複合体を使用して実施される。図１Ａ〜１Ｃによれば、このようなフォワード作用プライマー−プローブ複合体の例には、Ｓ３５Ｃ６１０−１、Ｓ３５Ｃ６１０−２、Ｓ３５Ｃ６１０−２ａ、Ｓ３５Ｃ６１０−３ａ、Ｓ３５Ｃ６１０−３ａ、Ｓ３５Ｃ６１０−３ａ、Ｓ３５Ｃ６１０−３ｂ、Ｓ３５Ｃ６１０−４ｂ、Ｓ３５Ｃ６１０−５ｂ、Ｓ３５ＦＡＭ−３ａ、Ｓ３５Ｑ６７０−２ａ、Ｓ３５ＴＥＸ１、Ｓ３５ＴＥＸ１ａ、Ｓ３５ＴＥＸ２、Ｓ３５ＴＥＸ２、Ｓ３５ＴＥＸ２ｂ、Ｓ３５ＴＥＸ２ｃ、Ｓ３５ＴＥＸ３、Ｓ３５ＴＥＸ３ａ、Ｓ３５ＴＥＸ３ａ、Ｓ３５ＴＥＸ−３ａ、およびＳＢ３５Ｃ６１０が含まれる一方、このようなリバース作用プライマー−プローブ複合体の例には、Ｓ７６１ａＣ６１０−４ｄ、Ｓ７６１ｂＣ６１０−４ｇ、Ｓ７６１ｂＣ６１０−５ｇ、Ｓ７６１Ｃ６１０−３、Ｓ７６１Ｃ６１０−３ａ、Ｓ７６１Ｃ６１０−３ｂ、Ｓ７６１Ｃ６１０−３ｃ、Ｓ７６１Ｃ６１０−４ｃ、Ｓ７６１Ｃ６１０−４ｄ、Ｓ７６１Ｃ６１０−４ｅ、Ｓ７６１Ｃ６１０−４ｆ、Ｓ７６１Ｃ６１０−４ｇ、Ｓ７６１Ｃ６１０−５ｆ、Ｓ７６１Ｃ６１０−５ｇ、ＳＢ７６１Ｃ６１０、およびＳＢ７６１Ｃ６１０−ｇが含まれる。
別の好ましい実施形態において、ＰＣＲ増幅を実施する前、試料を調製するステップを実施することができる。調製ステップは、以下のプロセスの少なくとも１つを含み得る：（１）細菌濃縮、（２）試料からの細菌細胞の分離、（３）細胞溶解、および（４）全ＤＮＡ抽出。
【００３８】
増幅条件：
当業者は、任意の一般に許容可能なＰＣＲ条件を、本発明のオリゴヌクレオチドを使用して、核酸標的および標的サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌を良好に検出するために使用することができ、試験すべき試料および他の実験室条件に応じて、ＰＣＲ条件についての定型的な最適化が、最適な感度および特異性を達成するために必要であり得ることを理解する。
検出／検査／分析：
本発明の方法により産生されたプライマー指向増幅産物は種々の方法を使用して分析することができる。均質検出は、テンプレートまたはプライマーからの増幅産物の（例えば、ゲル電気泳動による）分離が必要でない、増幅産物の検出の好ましい方法を指す。均質検出は、典型的には、増幅の間またはその直後に反応混合物の蛍光のレベルを計測することにより通常達成される。さらに、検出の間または前に増幅産物の分離を含む不均質検出法を本発明において用いることができる。
【００３９】
均質検出は、本発明のプライマー−プローブ複合体を使用して「リアルタイム」プライマー指向核酸増幅および検出を実施するために用いることができる（例えば、「リアルタイム」ＰＣＲおよび「リアルタイム」ＲＴ−ＰＣＲ）。特に好ましい「リアルタイム」検出法は、米国特許第６，３２６，１４５号明細書に記載されるようなＳｃｏｒｐｉｏｎプローブアッセイであり、これは参照により全体として本明細書に組み込まれる。Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブアッセイにおいて、ＰＣＲ増幅は、プライマー−プローブ複合体としてＳｃｏｒｐｉｏｎプローブ（単分子または二分子のいずれか）を使用して実施され、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブは、レポーターの検出可能なシグナルがプライマーの伸長前にクエンチされることを可能にする適切なレポーター−クエンチャーペアを有する。伸長後、クエンチング効果は排除され、存在するシグナルの量が定量化される。増幅産物の量が増加するにつれて、検出可能なシグナルの等価な増加が観察され、したがって、存在する増幅産物の量を、計測される検出可能なシグナルの量の関数として測定することが可能となる。２つ以上のＳｃｏｒｐｉｏｎプローブが本発明のＳｃｏｒｐｉｏｎプローブアッセイにおいて用いられる場合、それぞれのプローブは、結合している同一の検出可能な標識または結合している異なる検出可能な標識を有してもよく、したがって、それぞれのプローブを他のプローブと独立して検出することが可能となる。
【００４０】
別の好ましい「リアルタイム」検出法は、米国特許第５，８０４，３７５号明細書、米国特許第５，５３８，８４８号明細書、米国特許第５，４８７，９７２号明細書、および米国特許第５，２１０，０１５号明細書に記載されるような、５’−エキソヌクレアーゼ検出法であり、これらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。５’−エキソヌクレアーゼ検出アッセイにおいて増幅プライマーペアの２つのメンバーの中間（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｔｏ）またはその間で結合する改変プローブがＰＣＲの間に用いられる。改変プローブは、レポーターおよびクエンチャーを有し、ＰＣＲの間にそれが標的核酸配列とハイブリダイズしたことを示すための検出可能なシグナルを生成するように設計される。レポーターおよびクエンチャーの両方がプローブ上に存在する限り、クエンチャーはレポーターが検出可能なシグナルを放出することを停止させる。しかしながら、ポリメラーゼが増幅の間プライマーを伸長するにつれて、ポリメラーゼの内因性５’→３’ヌクレアーゼ活性はプローブを分解し、クエンチャーからレポーターを分離し、検出可能なシグナルが放出されることが可能となる。一般に、増幅サイクルの間に生成される検出可能なシグナルの量は、それぞれのサイクルにおいて生成される生成物の量に比例する。
【００４１】
クエンチングの効率はレポーターおよびクエンチャーの近さの強い関数であること、すなわち、２つの分子がより接近するほど、クエンチング効率は増加することが周知である。クエンチングはレポーターおよびクエンチャーの物理的近接に強く依存するため、レポーターおよびクエンチャーは、好ましくは、互いの数個のヌクレオチド以内に、通常、互いの３０ヌクレオチド以内に、より好ましくは約６から１６ヌクレオチド離れてプローブに結合している。典型的には、この分離は、レポーター−クエンチャーペアの一方のメンバーをプローブの５’末端に他方のメンバーを約６から１６ヌクレオチド離れたヌクレオチドに結合することにより達成される。
さらに、２つ以上のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、例えば、配列番号６８６〜６９６の２つ以上に対するものが本発明の５’−エキソヌクレアーゼ検出アッセイにおいて用いられる場合、それぞれのプローブは、結合している異なる検出可能な標識（例えば、レポーター−クエンチャーペア）を有してよく、したがって、それぞれのプローブが他のプローブと独立して検出されることが可能となる。
均質検出法に加えて、本発明において用いることができる種々の他の不均質検出法、例として、標準非変性ゲル電気泳動（例えば、アクリルアミドまたはアガロース）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動、および温度勾配ゲル電気泳動が当分野において公知である。標準非変性ゲル電気泳動は、簡易で迅速なＰＣＲ検出法であるが、全ての用途に好適ではない場合がある。
【００４２】
装置類：
均質検出が用いられる場合、蛍光のレベルは、好ましくはレーザー蛍光光度計、例えば、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｍｏｄｅｌ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒなどを使用して測定される。しかしながら、試料中の蛍光のレベルを計測するための同様の検出システムが本発明に含まれる。
【００４３】
試薬およびキット：
任意の形式の任意の好適な核酸複製組成物（「複製組成物」）を使用することができる。ＰＣＲ増幅のための典型的な複製組成物は、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、標的特異的プライマー、プローブ、またはプライマー−プローブ複合体および好適なポリメラーゼを含み得る。
複製組成物が液体形態である場合、当分野において公知の好適な緩衝液を使用することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，前掲）。
あるいは、複製組成物が錠剤形態で含有される場合、典型的な錠剤化試薬、例えば、安定剤および結合剤を含めることができる。好ましい錠剤化技術は、米国特許第４，７６２，８５７号明細書および米国特許第４，６７８，８１２号明細書に記載されており、これらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【００４４】
ある実施形態において、本発明の複製組成物は、少なくとも１つのプライマーおよびプローブならびに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含み、プライマーは少なくとも１０ヌクレオチド長であり、プローブは少なくとも１０ヌクレオチド長であり、（ｉ）プライマーは、配列番号１の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含み、プローブは、配列番号２の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含み；または（ｉｉ）プライマーは、配列番号３の核酸配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含み、プローブは、配列番号４の配列またはそれと相補的な配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得る核酸配列を含む。ある具体的な実施形態において、プライマーは少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である。さらなる実施形態において、プローブは少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である。
【００４５】
一部の例において、プライマーおよびプローブは直接または間接的に結合しており、それによりプライマー−プローブ複合体を形成する。他の例において、プライマー−プローブ複合体は、プライマーの５’末端へのプローブの３’末端の直接または間接的結合を含む。さらなる例において、プライマー−プローブ複合体のプローブ部分は、例えば、配列番号１１２〜１１９に記載の５’ステム配列、および例えば、配列番号１２０〜１３０に記載の３’ステム配列によりフランキングされている。
一部の実施形態において、配列番号１の配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得るプライマー部分は配列番号４０〜５４からなる群から選択される核酸配列を含む。他の実施形態において、配列番号２の配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得るプライマー部分は配列番号５〜３９からなる群から選択される核酸配列を含む。さらなる実施形態において、配列番号３の配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得るプライマー部分は、配列番号９５〜１１１からなる群から選択される核酸配列を含む。いっそうさらなる実施形態において、配列番号４の配列にストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし得るプライマー部分は、配列番号５５〜９４からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００４６】
他の具体的な実施形態において、本発明の複製組成物は、（ａ）図１Ａ〜１Ｃから選択される少なくとも１つのプライマー−プローブ複合体、および（ｂ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む。別の好ましい複製組成物は、（ａ）一方の複合体がフォワードプライマーとして作用し、他方がリバースプライマーとして作用するように異なるそれぞれの標的ＤＮＡ領域に対する、図１Ａ〜１Ｃから選択される少なくとも２つのプライマー−プローブ複合体；および（ｂ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む。ある例において、フォワード作用プライマー−プローブ複合体は、Ｓ３５Ｃ６１０−１、Ｓ３５Ｃ６１０−２、Ｓ３５Ｃ６１０−２ａ、Ｓ３５Ｃ６１０−３ａ、Ｓ３５Ｃ６１０−３ａ、Ｓ３５Ｃ６１０−３ａ、Ｓ３５Ｃ６１０−３ｂ、Ｓ３５Ｃ６１０−４ｂ、Ｓ３５Ｃ６１０−５ｂ、Ｓ３５ＦＡＭ−３ａ、Ｓ３５Ｑ６７０−２ａ、Ｓ３５ＴＥＸ１、Ｓ３５ＴＥＸ１ａ、Ｓ３５ＴＥＸ２、Ｓ３５ＴＥＸ２、Ｓ３５ＴＥＸ２ｂ、Ｓ３５ＴＥＸ２ｃ、Ｓ３５ＴＥＸ３、Ｓ３５ＴＥＸ３ａ、Ｓ３５ＴＥＸ３ａ、Ｓ３５ＴＥＸ−３ａ、およびＳＢ３５Ｃ６１０からなる群から選択される一方、リバース作用プライマー−プローブ複合体は、Ｓ７６１ａＣ６１０−４ｄ、Ｓ７６１ｂＣ６１０−４ｇ、Ｓ７６１ｂＣ６１０−５ｇ、Ｓ７６１Ｃ６１０−３、Ｓ７６１Ｃ６１０−３ａ、Ｓ７６１Ｃ６１０−３ｂ、Ｓ７６１Ｃ６１０−３ｃ、Ｓ７６１Ｃ６１０−４ｃ、Ｓ７６１Ｃ６１０−４ｄ、Ｓ７６１Ｃ６１０−４ｅ、Ｓ７６１Ｃ６１０−４ｆ、Ｓ７６１Ｃ６１０−４ｇ、Ｓ７６１Ｃ６１０−５ｆ、Ｓ７６１Ｃ６１０−５ｇ、ＳＢ７６１Ｃ６１０、およびＳＢ７６１Ｃ６１０−ｇからなる群から選択される。ある例において、複製組成物は、プライマー−プローブ複合体のプローブ部分に結合し、そのシグナルをクエンチし得る好適なクエンチャーオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【００４７】
本発明の好ましいキットは、上記の複製組成物のいずれか１つを含む。本発明の好ましい錠剤は、上記の複製組成物のいずれか１つを含む。より好ましくは、本発明のキットは、上記の好ましい錠剤を含む。
ある場合において、内部陽性対照を反応に含めることができる。内部陽性対照は、対照鋳型核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、対照プライマー、および対照核酸プローブを含み得る。ＰＣＲ反応内に含有される内部陽性対照の利点は、既に記載されており（米国特許第６，３１２，９３０号明細書およびＰＣＴ出願国際公開第９７／１１１９７号パンフレット；これらのそれぞれは、参照により全体として本明細書に組み込まれる）、以下を含む：（ｉ）対照は、単一のプライマーを使用して増幅することができ；（ｉｉ）対照増幅産物の量は、試料中に含有される任意の標的ＤＮＡまたはＲＮＡから独立しており；（ｉｉｉ）対照ＤＮＡは、手動および自動試験手順の両方における使用容易性および高度の再現性のために他の増幅試薬とともに錠剤化することができ；（ｉｖ）対照は、均質検出について、すなわち、反応物質から産物ＤＮＡを分離することなく使用することができ；（ｖ）内部対照は、反応中の他の潜在的な増幅産物とは異なる融解プロファイル、および／または標的に対する核酸プローブ上の検出可能な標識とは異なる対照核酸上の検出可能な標識を有する。
【００４８】
対照ＤＮＡは、プライマー指向増幅反応において増幅を可能にするための適切なサイズおよび塩基組成のものである。対照鋳型ＤＮＡ配列は任意の好適な源から得ることができるが、標的増幅産物の増幅を可能にする同一条件下で再現性良く増幅されなければならない。
【００４９】
好ましい対照配列には、例えば、ＳＶ４０ＤＮＡに対する対照プライマーおよびプローブが含まれる。
対照反応は増幅反応の確認に有用である。対照ＤＮＡの増幅は試験される試料と同一の反応管内で起こり、したがって試料が標的陰性である場合、すなわち、標的増幅産物が産生されない場合に良好な増幅反応の指標となる。増幅反応の有意な確認を達成するため、対照ＤＮＡ鋳型の好適な数のコピーをそれぞれの増幅反応に含めなければならない。
一部の例において、追加の陰性対照複製組成物を含めることが有用であり得る。陰性対照複製組成物は複製組成物と同一の試薬を含有するが、ポリメラーゼを含まない。このような対照の主な機能は、本方法が蛍光検出手段を用いる場合に均質形式での擬似バックグラウンド蛍光をモニタリングすることである。
複製組成物は、それらが標的ＤＮＡまたは対照ＤＮＡを増幅するために使用されるように設計されるかどうかに応じて改変することができる。標的ＤＮＡを増幅する複製組成物（試験複製組成物）は、（ｉ）ポリメラーゼ（一般に耐熱性）、（ｉｉ）標的ＤＮＡにハイブリダイズし得るプライマーペアおよび（ｉｉｉ）増幅反応の進行に必要な緩衝液を含み得る。対照ＤＮＡを増幅する複製組成物（陽性対照または陽性複製組成物）は、（ｉ）ポリメラーゼ（一般に耐熱性）；（ｉｉ）対照ＤＮＡ；（ｉｉｉ）対照ＤＮＡにハイブリダイズし得る少なくとも１つのプライマー；および（ｉｖ）増幅反応の進行に必要な緩衝液を含み得る。さらに、標的ＤＮＡまたは対照ＤＮＡ増幅のいずれかのための複製組成物は、好ましくは検出可能な標識を有する核酸プローブを含有し得る。
【００５０】
実施例
本発明を下記の実施例においてさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方、説明のためにのみ提供されることを理解すべきである。
【実施例１】
【００５１】
Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）アッセイを介する個々の標的の包含性／排他性の決定
生物の試料を分析して本発明の多数のＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブの包含性および排他性を確立した。包含性については、独立した真正サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）単離物を使用した。排他性については、密接に関連する非標的生物を使用してこのアッセイにより標的生物と他の非標的生物とが区別されることを確保した。
【００５２】
ＤＮＡ溶解物調製
試験材料は、ＢＨＩ培地中で３７℃において増殖させた標的および非標的生物の一晩増殖純粋培養物とした。純粋培養物は、およそ１×１０9ｃｆｕ／ｍｌの細胞密度に一晩増殖させた。排他性については、一晩培養物の１：１０希釈物を試験した。包含性については、一晩培養物をＴＳＢ中におよそ１：１０，０００に希釈した。５μｌの試験すべき材料を、２００μｌのＢＡＸ（登録商標）溶解試薬（ＤｕＰｏｎｔ  Ｑｕａｌｉｃｏｎ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）に添加した。混合物を３７℃において２０分間インキュベートし、次いでさらに９５℃において１０分間インキュベートし、最後に５℃に冷却した。
【００５３】
ＰＣＲ条件
３０μｌのＤＮＡ溶解物を使用して凍結乾燥ＰＣＲ反応成分を水和し、ＤＮＡ溶解物／ＰＣＲ反応成分混合物を得た。ＰＣＲ反応成分は、ＧｏＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、デオキシヌクレオチド（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＢＳＡ、およびｓｕｒｆａｃｔａｍｐｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する特注試薬の形態であった。さらに、表１に列挙されるプライマーおよびＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブを提供される量で含めた。この表が示すとおり、これらのＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブのそれぞれは、その構造が５’蛍光末端標識、５’ステム配列、プローブ配列、３’ステム配列、内部クエンチャー、１８炭素非増幅性リンカー、およびプライマー配列、を（５’→３’の順序で）含むように、単分子Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）として設計した。
【００５４】
2014533111.tif 000002
【００５５】
増幅および試験は、ＢＡＸ（登録商標）Ｑ７装置（ＤｕＰｏｎｔ  Ｑｕａｌｉｃｏｎ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）上で実施した。熱サイクリング条件は、以下のとおり：９５℃において２分間、次いで９５℃１０秒間および７０℃５０秒間の４６サイクルであり、それぞれのサイクルにおける７０℃の工程の間に蛍光シグナルを捕捉した。
【００５６】
結果
表２〜３から把握することができるとおり、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブを使用して、本発明の方法は、種々の標的を適切に検出することができ、例として、標的生物と非標的生物とを弁別した。
【００５７】
表2.包含性結果
2014533111.tif 000003
【００５８】
2014533111.tif 000004
【００５９】
2014533111.tif 000005
【００６０】
2014533111.tif 000006
【００６１】
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【００６２】
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【００６３】
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【００６４】
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【００６５】
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【００６６】
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【００６７】
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【００６８】
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【００６９】
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【００７０】
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【００７１】
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【００７２】
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【００７３】
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【００７４】
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【００７５】
2014533111.tif 000021
【００７６】
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【００７７】
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【００７８】
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【００７９】
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【００８０】
2014533111.tif 000026
【００８１】
2014533111.tif 000027
【００８２】
表3. 排他性結果
2014533111.tif 000028
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【図１Ａ】
2014533111.tif 000030
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
2014533111.tif 000032
【配列表】
2014533111000001.app
【国際調査報告】
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