(57)【要約】  識別子タグ付き制限酵素切断断片を用意し、ペア高スループットシーケンシング技術を使用して配列情報を取得し、この配列情報を組み合わせ、及び資料試料間の多型性を同定することによる、試料間の多型性を同時に探索し、検出し、及び遺伝子型解析を行う方法。両末端からの配列情報の組み合わせは、反復性の高いゲノムにおける、多型性の探索、検出、及び遺伝子型解析を可能にする。【選択図】  なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上又は複数の試料における１以上の多型性を、同時に探索、検出、及び遺伝子型解析する方法であって、
（ａ）１以上又は複数の試料からＤＮＡを用意するステップと、
（ｂ）少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡを消化して、制限酵素切断断片を産生することにより、前記試料ＤＮＡの複雑度を減少させるステップと、
（ｃ）少なくとも１つの識別子タグを試料の前記制限酵素切断断片に付与して、タグ付き制限酵素切断断片を産生するステップと、
（ｄ）前記タグ付き制限酵素切断断片の少なくとも一部分をペアエンドシーケンシングするステップと、
（ｅ）前記試料間の多型性を同定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
断片のペアエンドシーケンシングリードの第１のシーケンスリード及び第２のシーケンスリードが、二重タグに、好ましくはコンピューター上で（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１又は第２のシーケンスリードの１つが、二重タグに結合する前に逆相補される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記識別子タグが、
前記制限酵素切断断片にタグ付きアダプターをライゲーションして、タグ付きアダプター連結制限酵素切断断片を産生すること、又は
前記アダプターの少なくとも一部分に相補的な少なくとも１つのタグ付きプライマーで、前記アダプター連結制限酵素切断断片を増幅して、タグ付きアダプター連結制限酵素切断断片を産生すること
によって付与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記配列が、前記識別子タグに基づいて試料に配分される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記配分された配列が、試料間の配列における多型性を同定するために、前記試料の間で比較される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記二重タグが、前記試料の間で比較される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が、同定された多型性に基づいて遺伝子型解析される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記複雑度の減少が、２つ以上の制限エンドヌクレアーゼで前記試料ＤＮＡを消化して、制限酵素切断断片を産生することを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
アダプターが、制限酵素切断断片の１端又は両端にライゲーションして、アダプター連結断片を与える、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
異なる制限酵素によって得られる制限酵素切断断片の各末端に、異なるアダプターがライゲーションする、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記複雑度の減少が、アダプターの一部分に少なくとも相補的である少なくとも１つのプライマーで、アダプター連結断片を増幅することをさらに含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記プライマーが、制限エンドヌクレアーゼの認識配列の残存部分の少なくとも一部分にさらに相補的である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プライマーが、前記プライマーの３’末端に１以上のランダム選択性ヌクレオチドをさらに含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記プライマーが、１以上の試料に対して、前記プライマーの３’末端に前記同一の１以上のランダム選択性ヌクレオチドを含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
シーケンシングが高スループットシーケンシングに基づく、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
高スループットシーケンシングが好ましくは固形担体上のｄにおけるパイロシーケンシングに基づく、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
高スループットシーケンシングが、ライゲーションによるシーケンシング又はナノポアシーケンシングに基づく、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
現在利用できるマーカー探索（ｍａｒｋｅｒ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）及び遺伝子型解析技術の大多数は、一般に、一塩基多型（ＳＮＰ）の初期探索（ｉｎｉｔｉａｌ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）と、その後の多数の個体における遺伝子型解析という、２つの異なる技術に基づいている。これらの技術に基づいて、本出願人は、配列に基づいたマーカー探索と検出を同時に行う技術、すなわち、ランダムシーケンスに基づく遺伝子型解析（ｒＳＢＧ）技術を開発した。この技術は、イルミナＧＡＩＩ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡＩＩ）の高スループットシーケンシング能力とＡＦＬＰ（登録商標）（欧州特許第５３４８５８号明細書）のゲノムにおける複雑度を減少させる能力を併せ持つ。本出願人による国際公開第２００７／０７３１６５号パンフレットに、その一例が記載されている。対象が決まっていることが多い（すなわち、検出されるＳＮＰが、予め選択され、対象とされており、特異的な検出プローブが使用される）、他の様々な遺伝子型解析技術とは対照的に、ｒＳＢＧはランダムな手法である。その特異的な配列をＡＦＬＰテンプレートに含んでいる場合には、原則として、ライン間に存在するすべてのＳＮＰが招集される（一般に、厳密なマイニングフィルターの適用後に）。コショウのように、相対的に多くの反復配列を含むゲノム由来の試料を分析する場合、この反復配列の存在のために、ライン間の多型性の同定がますます困難になるということが問題点の１つである。
【発明の概要】
【０００２】
本発明者らは、複数の試料における、遺伝子型解析され評価された多型性の数において、特に、試料が反復性の高い、すなわち、多くの繰り返しを含む、とみなされるゲノムを使用している場合、高スループットシーケンシング法を制限酵素切断断片の両末端のシーケンスに使用すると、改良が達成され得ることを見出した。いわゆる、ペアエンドシーケンス法を用いることによって、２組の配列データ（配列リード（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅａｄ）とも言われる）が、同一の制限酵素切断断片から得られ、制限酵素切断断片のそれぞれの端から１組ずつ得られる。これらのセットを組み合わせることによって、例えば、１つの繰り返し配列から生じたため、他の点でそれぞれを決して区別できなかった制限酵素切断断片からの配列データ（配列リード）が、区別可能となる。つまり、数百又は数千ヌクレオチド分離れて位置する制限酵素切断断片（多くの場合、使用される制限酵素又は断片化の方法による）の他の末端から配列リードを読み取ることにより、その配列リードの組み合わせを一意的なものとすることが可能となる（図１を参照）。また、これによって、反復性の高いゲノム由来の試料における多型性の探索、検出、及び遺伝子型解析が可能となる。したがって、本発明の方法は、最も幅の広い形において、反復性の高い試料でも読み取り可能となるため、従来技術による方法よりもより広範囲の試料に適用できる。本発明者らは、断片のそれぞれの末端のリードを独立に解析する方法に比べて、このペアエンド法を用いることにより、より多くのＳＮＰが探索され、遺伝子型解析を行い得ること、すなわち、ＳＮＰの探索及び遺伝子型解析を同時に行うペアエンドシーケンシングを使用することによって、相乗効果が得られることを見出した。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
【図１】ペアエンドランダムシーケンスに基づく遺伝子型解析を示す略図。二重タグ（ｄｉｔａｇ）は、ＳＮＰ同定の際、繰り返し配列を最も離れさせるように制限酵素切断断片のそれぞれの末端から調製される。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
定義
以下に示す説明及び実施例において、多くの用語が使用されている。明細書及び請求項について明確かつ一貫性のある理解を提供するために、これらの用語の意味する範囲を含めて、以下の定義を記載する。本明細書で他の意味に定義されない限り、使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。すべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献における開示は、その全体が参照により本明細書において援用される。
【０００５】
本発明の方法に使用される従来技術を実行する方法は、熟練者にとって明らかであろう。分子生物学、生化学、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、バイオインフォマティックス、ゲノム科学、シーケンシング、及び関連分野における従来技術の実施は、当業者にとって周知であり、例えば、以下の参考文献において論じられる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、  １９８７及び定期的更新、及びシリーズ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ。
【０００６】
本明細書で使用する場合、文脈上明確に他の意味を示す以外は、単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含む。例えば、「ＤＮＡ分子」を単離する方法は、複数の分子（例えば、１０の、１００の、１０００の、１万の、１０万の、１００万の、又はそれ以上の分子）を単離することを含む。
【０００７】
多型性：多型性とは、１つの個体群における、２つ以上のヌクレオチド配列の変異型の存在を意味する。多型性は、１以上の塩基置換、挿入、繰り返し、又は欠失を含み得る。多型性には、例えば、単純配列反復（ＳＳＲ）と一塩基多型（ＳＮＰ）があり、ＳＮＰはアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、又はグアニン（Ｇ）である単一ヌクレオチドが変化したときに生じるＤＮＡ配列変異である。一般に、ＳＮＰと考えられる変異は個体群の少なくとも１％に起こる。ＳＮＰは、例えば、すべてのヒトの遺伝的変異の９０％を構成し、ヒトゲノムの１００から３００塩基毎に起こる。ＳＮＰの３分の２は、シトシン（Ｃ）をチミン（Ｔ）に置換する。ヒトや植物等のＤＮＡ配列における変異は、疾患、バクテリア、ウイルス、化学物質、薬品等への感受性に影響を与え得る。
【０００８】
遺伝子型解析は、種の個体間での遺伝的変異を決定するプロセスを意味する。生物の遺伝子型は、その遺伝子コード内に保持する遺伝的に継承した命令である。同じ遺伝子型を持った生物であっても、見かけが異なり、又は異なる行動をする。見かけや行動は、環境や発育状況によって影響されるからである。同様に、外見が似ている生物であっても、必ずしも同じ遺伝子型を持っているわけではない。一塩基多型（ＳＮＰ）は、最も一般的な遺伝子変異型であり、定義上、個体群に１％以上認められる特定の位置での一塩基変化である。ＳＮＰは、ゲノムのコード領域及び非コード領域の両方において見られ、異なる表現型を生じ得る。例えば、コード領域に見られる場合に、疾患感受性、又は疾患抵抗性が異なる。したがって、ＳＮＰは、特定の疾患又はいくつかの表現型のマーカーとして多く使用される。非コード領域に見られる場合には、ＳＮＰは進化論的ゲノミクス研究のマーカーとして機能する。「インデル（ＩｎＤｅｌ）」又は種々の長さのヌクレオチドの挿入と欠失がＳＮＰに関連する。遺伝的変異の第３のタイプは、コピー数多型（ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ（ＣＮＶ））であり、様々なゲノムにおいてＤＮＡセグメントのコピーの数が異なるものである。コード化された遺伝子がコピー数多型である場合には、その変異は疾患感受性又は疾患耐性を生じ得る。表現型の中には、用量感応性であるものもあり、コピー数は種のメンバー間での変異性のわずかな相違の原因である。ＳＮＰとＣＮＶ両方の遺伝子型解析において、個体間の遺伝子型を決定する方法が多く存在する。選択される方法は、一般にスループットの必要性に依存し、遺伝子型解析される個体の数及び各個体における分析される遺伝子型の数の両方によって決まる。選択される方法は、各個体又は試料から利用できる試料材料の量にも依存する。
【０００９】
遺伝子型は、細胞、生物、又は個体の遺伝的構造（すなわち、個体の特異的な対立遺伝子構造）であり、通常、対象の特性又は特徴に関連する。
【００１０】
表現型は、例えば、形態、発達、生化学的又は生理的特性、フェノロジー（ｐｈｅｎｏｌｏｇｙ）、行動、及び行動結果など、生物の目に見える特性又は特徴である。表現型は、環境要因の影響と同様、遺伝子の発現やそれら２つの相互作用に起因する。表現型は、生物が示す目に見える特性の全体的な効果であるが、用語フェノム（ｐｈｅｎｏｍｅ）は、特徴の集合体を意味するものとして使用される場合があり、フェノムの同時研究はフェノミクス（ｐｈｅｎｏｍｉｃｓ）と言われる。
【００１１】
表現型解析（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）は、生物の表現型を決定することである。
【００１２】
制限エンドヌクレアーゼ：制限エンドヌクレアーゼ又は制限酵素は、二本鎖ＤＮＡ分子の特定のヌクレオチド配列（標的部位）を認識する酵素であり、すべての標的部位又はその近傍でＤＮＡ分子の二本鎖を切断し、平滑末端（ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄ）又は付着末端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｅｎｄ）を残す。
【００１３】
制限酵素切断断片：制限エンドヌクレアーゼによる消化によって生成したＤＮＡ分子は、制限酵素切断断片と呼ばれる。いかなる所与のゲノムも（又は核酸、その起源によらない）、特定の制限エンドヌクレアーゼによって別々の制限酵素切断断片のセットへ消化されるだろう。制限エンドヌクレアーゼの切断によるこのＤＮＡ断片は、さらに様々な技術へと利用され得る。
【００１４】
タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）：用語タギングは、核酸試料へタグを付加することを意味し、それによって、第２の又はさらなる核酸試料から区別することを可能とする。
【００１５】
識別子又は識別子タグ：アダプター若しくはプライマーに付加され、又はその配列に含まれ、又はそうでなければ特有の識別子を提供するためのラベルとして使用され得る短い配列である。このような配列識別子（タグ）は、様々ながら明確な長さ、典型的には４から１６ｂｐの、特有の塩基配列であり得る。識別子又は識別子の組み合わせは、特異的な核酸試料を同定するために、又は、例えば、断片若しくはＰＣＲ産物などのＤＮＡ産物を、それが生じる元の試料に結合させ若しくは関連させるために使用され得る。例えば、４ｂｐのタグは、４（ｅｘｐ４）＝２５６の異なるタグを可能にする。このような識別子を使用して、試料の起源を、さらなるプロセッシングに基づいて決定することができる。異なる核酸試料から生じたプロセッシング産物を組み合わせる場合において、異なる核酸試料は一般に異なる識別子を用いて同定される。識別子は、互いに少なくとも２塩基対異なることが好ましく、ミスリードを防ぐために、同一の塩基が２つ連続しないことが好ましい。識別子機能は、時としてアダプター又はプライマーなどの他の機能性と結合することができる。
【００１６】
タグ付き制限酵素切断断片：識別子タグを伴って提供される制限酵素切断断片。
【００１７】
アダプター連結制限酵素切断断片：アダプターを取り付けた制限酵素切断断片。
【００１８】
アダプター：制限酵素切断断片の末端にライゲーションされ得るように設計された、限られた数の塩基対、例えば、約１０から約３０塩基対の長さを有する短い二本鎖ＤＮＡ分子。アダプターは、一般に、部分的に互いに相補的なヌクレオチド配列を有する、２つの合成オリゴヌクレオチドから構成される。適切な条件の溶液中で、この２つの合成オリゴヌクレオチドを混合すると、互いにアニールして、二本鎖構造を形成する。アニーリングの後、アダプター分子の一端は、制限酵素切断断片の末端と適合するように設計されており、そこへライゲーションされ得る。アダプターの他の末端はライゲーションできないように設計され得るが、必ずしもそうである必要はない（二重ライゲーションアダプター）。
【００１９】
ライゲーション：２つの二本鎖ＤＮＡ分子を共有結合する、リガーゼ酵素によって触媒される酵素反応は、ライゲーションと呼ばれる。一般に、両方のＤＮＡ鎖を共有結合するが、ＤＮＡ鎖の末端の１つに化学修飾又は酵素反応による修飾をすることによって、二本鎖のうちの１本のライゲーションを防止することも可能である。その場合、共有結合は２つのＤＮＡ鎖の一方のみで起こるだろう。
【００２０】
プライマー：一般に、用語プライマーは、ＤＮＡの合成を誘導することができるＤＮＡ鎖を意味する。ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーなしにＤＮＡをｄｅ  ｎｏｖｏ合成できない。すなわち、ＤＮＡポリメラーゼは、ヌクレオチドが構築される順序を指示する鋳型として相補的な鎖が使用される反応において、既存のＤＮＡ鎖を伸長させることができるだけである。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーとして使用される合成オリゴヌクレオチド分子を意味するだろう。
【００２１】
合成オリゴヌクレオチド：好ましくは、約１０から約５０塩基を有する一本鎖ＤＮＡ分子であり、化学的に合成され得るものを合成オリゴヌクレオチドと呼ぶ。一般に、これらの合成ＤＮＡ分子は特有の又は所望のヌクレオチド配列を有するように設計され、関連する配列を有する一群の分子を合成することが可能であり、ヌクレオチド配列内の特定の位置に異なるヌクレオチド構成物を有する。用語合成オリゴヌクレオチドは、設計され、又は所望のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子を意味するために使用されるだろう。
【００２２】
増幅：用語増幅は、一般にＰＣＲを使用する、二本鎖ＤＮＡ分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成を示す用語として一般に使用されるだろう。他の増幅方法が存在し、それらの方法が、本発明においてその主旨を逸脱せずに使用され得ることに留意されたい。
【００２３】
アンプリコン：ポリヌクレオチド増幅反応の産物、すなわち、１以上の開始配列から複製されるポリヌクレオチドの集まり。アンプリコンは、これに限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リニアポリメラーゼ反応（ｌｉｎｅａｒ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、核酸配列に基づく増幅、ローリングサークル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び同様の反応を含む、様々な増幅反応によって産生され得る。
【００２４】
複雑度の減少：用語複雑度の減少は、ゲノムＤＮＡのような核酸試料の複雑度が、試料のサブセットを作成することで低減される方法を示すために使用される。このサブセットは、試料全体（すなわち複雑な資料）を代表することができ、再現性のあるサブセットであることが好ましい。本明細書において再現性があるとは、同一の試料の複雑度を同一の方法によって減少させる場合、同一の、又は少なくとも同等のサブセットが得られることを意味する。複雑度の減少に使用される方法は、当該技術分野で公知の複雑度減少の方法のいかなるものであってもよい。複雑度減少の方法の例として、例えば、ＡＦＬＰ（登録商標）（Ｋｅｙｇｅｎｅ  Ｎ．Ｖ．、ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；例えば、欧州特許第５３４８５８号明細書を参照）、Ｄｏｎｇにより記載された方法（例えば、国際公開第０３／０１２１１８号パンフレット、国際公開第００／２４９３９号パンフレットを参照）、インデックスリンク（ｉｎｄｅｘｅｄ  ｌｉｎｋｉｎｇ）（Ｕｎｒａｕら、１９９４、Ｇｅｎｅ、１４５：１６３−１６９）などを含む。本発明で使用される複雑度を減少させる方法は、再現性があるという点で共通する。同一の試料の複雑度が同一の方法で低減される場合、同一の試料サブセットが得られることを意味する再現性があるとは、マイクロダイセクション（ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）又は、選択された組織で転写されたゲノムの一部分を表し、その再現性は組織や単離時間などの選択によるｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を使用するといった、よりランダムな複雑度減少とは対照的である。
【００２５】
選択性塩基、選択性ヌクレオチド、ランダム選択性ヌクレオチド：プライマーの３’末端に位置する、選択的塩基は、Ａ、Ｃ、Ｔ、又はＧ（又は場合によって、Ｕであってもよい）からランダムに選択される。選択性塩基でプライマーを伸長させることによって、その後の増幅では、アダプター連結制限酵素切断断片の再現性のあるサブセットのみ、すなわち、選択性塩基を保持するプライマーを使用して増幅可能である断片のみが産生されるだろう。１から１０の間の数の選択性ヌクレオチドが、プライマーの３’末端に付加され得、一般に１から４個が十分な数である。（ＰＣＲの）両プライマーは、様々な数の選択的塩基を含むことができる。それぞれ付加された選択的塩基を伴ったサブセットは、係数約４によるサブセットにおいて、アダプター連結制限酵素切断断片の増幅量を減少させる。このタイプの複雑度の減少は、既存の配列知識を必要とせず、又は既存の配列知識を考慮せず、選択性ヌクレオチドに基づくのみであるため、ランダムとみなされる。一般に、ＡＦＬＰ技術（欧州特許第５３４８５８号明細書）で使用される選択性塩基の数は、＋Ｎ＋Ｍと示され、１つのプライマーは、Ｎ個の選択性ヌクレオチドを保持し、他のプライマーはＭ個の選択性ヌクレオチドを保持する。したがって、Ｅｃｏ／Ｍｓｅ  ＋１／＋２  ＡＦＬＰは、ＥｃｏＲＩとＭｓｅＩで開始ＤＮＡを消化し、適切なアダプターをライゲーションし、ＥｃｏＲＩの限定された位置を指向した１つの選択性塩基を保持するプライマーと、ＭｓｅＩの限定された位置を指向した２つの選択性ヌクレオチドを保持する他のプライマーで増幅することを示す省略表現である。ＡＦＬＰで使用される、その３’末端に少なくとも１つの選択性ヌクレオチドを保持するプライマーは、ＡＦＬＰ−プライマーとも記載される。その３’末端に選択性ヌクレオチドを保持せず、アダプター及び制限酵素認識部位の残りの部分に事実上相補的なプライマーは、ＡＦＬＰ＋０プライマーと示される場合がある。用語選択性ヌクレオチドは、アダプター部分の近傍に位置し、選択的プライマーの使用によって同定され、その結果として公知となっている、ターゲット配列を有するヌクレオチドに対しても使用される。
【００２６】
シーケンシング：用語シーケンシングは、核酸試料、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡのヌクレオチドの順序（塩基配列）を決定することを意味する。サンガー（Ｓａｎｅｒ）シーケンシング、及び高スループットシーケンシング技術（次世代シーケンシング技術としても知られる）、例えば共にパイロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）に基づく、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅによって提供されるＧＳ  ＦＬＸプラットフォーム及びＩｌｌｕｍｉｎａ社のゲノムアナライザーなどの多くの技術が利用可能である。他のプラットフォームも存在する。
【００２７】
高スループットシーケンシング又は次世代シーケンシングは、大量のリード、一般には、一度に数百ではなく、何千もの単位（すなわち、数万若しくは数十万）又は数百万の配列リードを得ることができるシーケンシング技術である。高スループットシーケンシングは、従来のサンガーシーケンシング又はキャピラリーシーケンシングを凌駕する、異なる技術である。一般に、シーケンス産物は、約６００から３０ｂｐの間の比較的短いリードを一般に有するシーケンス産物そのものである。このような方法の例は、国際公開第０３／００４６９０号パンフレット、国際公開第０３／０５４１４２号パンフレット、国際公開第２００４／０６９８４９号パンフレット、国際公開第２００４／０７０００５号パンフレット、国際公開第２００４／０７０００７号パンフレット、及び国際公開第２００５／００３３７５号パンフレット、Ｓｅｏら、（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１：５４８８−９３に開示されるパイロシーケンシングに基づいた方法により提供される。これらの技術は、より典型的には、広範囲にわたる複雑なデータ蓄積とリード構築のための調製ワークフローなどを含む。高スループットシーケンシングを有効に利用するためには、従来の多くのワークフローと、現在得られているデータのタイプと質を適合させるために再設計されるゲノム解析のための方法が必要とされる。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「ペアエンドシーケンシング」は、高スループットシーケンシング、特に、Ｉｌｌｕｍｉｎａ及びＲｏｃｈｅによって現在販売されているプラットフォームに基づいた方法である。Ｉｌｌｕｍｉｎａは、既存のシーケンサーにインストールしてアップグレードすることができる、ハードウェアモジュール（ＰＥ  Ｍｏｄｕｌｅ）を発売した。これは、鋳型の両端をシーケンシングすることによって、ペアエンドリードを作成することができる。ペアエンドシーケンシングは、「次世代シーケンシング：オーダーメイド医療に向けて  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｊａｎｉｔｚ  編集、２００８、Ｗｉｌｅｙ  ｓｅｃｔｉｏｎ  ２．４に、Ｌａｋｄａｗａｌｌａによって記載されているように、ＤＮＡ分子の鎖の再配向により、シーケンシングが行われる担体上でシーケンシングすることを可能とする。このタイプのペアエンドシーケンシングは、一般に、より小さい断片（約１０００ｂｐまで）に使用される。ペアエンドシーケンシングの別の変法は、メイトペアシーケンシングとして示されることがあり、メイトペアシーケンシングでは、シーケンシングアダプターがＤＮＡ断片にライゲーションされ、このライゲーションされたＤＮＡは、その認識配列がアダプターに含まれるＩＩｓ型制限酵素によって消化され、自己環状化し、ＩＩｓ型消化された結果のペアエンドがシーケンスされる。これは、より長い断片（約１０００ｂｐ以上）を分析する際に特に有用である。Ｗｅｉら、「次世代シーケンシング：オーダーメイド医療に向けて  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｊａｎｉｔｚ  編集、２００８、Ｗｉｌｅｙ  ｓｅｃｔｉｏｎ  １３．２、図１３．１も参照。
【００２９】
ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼは、制限酵素認識部位から離れた位置にある認識配列を有するエンドヌクレアーゼである。換言すれば、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼは、一方の側で、認識配列の外側を切断する。その例は、ＮｍｅＡＩＩＩ（ＧＣＣＧＡＧ（２１／１９）及びＦｏｋｌ、Ａｌｗｌ、Ｍｍｅｌである。両側で認識配列の外側を切断するＩＩｓ型酵素もある。
【００３０】
アライン（ａｌｉｇｎｉｎｇ）及びアラインメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）：用語「アライン」及び「アラインメント」は、短い又は長い一続きのヌクレオチドが、同一又は類似であることに基づいて、２つ以上のヌクレオチド配列を比較することを意味する。当該技術分野で知られているヌクレオチド配列のアラインメント法はいくつかある。
【００３１】
プーリング（ｐｏｏｌｉｎｇ）は、本明細書で使用する場合、貯留された多数の試料（又は人工染色体、クローン、ゲノムのサブセット、又は再現性のある複雑度低減ゲノム）の組み合わせに関する。プーリングは、多くの個々の試料を１つの試料に入れる（例えば、１００個の試料を１０個のプールとし、それぞれのプールは１０個の試料を含む）という単純な組み合わせとすることができるが、さらに複雑なプーリング戦略を使用することもできる。プール上に分布する試料は、少なくとも２つ以上のプールに所属するようにするのが好ましい。１つのプールには、好ましくは、１０から１００００個、好ましくは、１００から１０００個、より好ましくは、２５０から７５０個の試料が含まれる。プールあたりの試料の数は、広い範囲で変えることができ、この変化の範囲は、例えば、ゲノムのサイズ又は検討している試料の数に関連することが観察される。一般に、プール又はサブプールの最大サイズは、プール中の試料を一意的に同定する能力、例えば、識別子のセットによって左右される。プールは当該技術分野に周知のプーリング戦略に基づいて作成される。当業者は、ゲノムサイズ、試料の数などの要因に基づいて、最適なプーリング戦略を選択することができる。結果として生じるプーリング戦略は、状況により変わるだろう。その例としては、プレートプーリング（ｐｌａｔｅ  ｐｏｏｌｉｎｇ）や、例えば、３Ｄ−プーリング、６Ｄ−プーリング、又は複合プーリングのようなＮ次元プーリング（Ｎ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｐｏｏｌｉｎｇ）がある。多数のプールの扱いを容易にするために、プールは、次にスーパープールに結合することができ（すなわち、スーパープールは試料のプールのプールである）、又はサブプールに分けることができる。プーリング戦略及びそれらのデコンボリューション（すなわち、１以上のプール又はサブプールの中の試料の、関連する既知のインジケーター（すなわち、ラベル又は識別子）の検出による、ライブラリーの中の個々の試料の正確な同定）の他の例は、例えば、米国特許第６９７５９４３号明細書又はＫｌｅｉｎら、ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、（２０００）、１０、７９８−８０７に記載されている。プーリング戦略は、すべての試料についてプールの組み合わせが一意的になるように、ライブラリーのすべての試料がプール上に分布することが好ましい。結論は、(サブ)プールの一定の組み合わせが、試料を一意的に同定することである。
【００３２】
クラスタリング（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）：用語「クラスタリング」は、短い又は長い一続きのヌクレオチドが同一又は類似であることに基づいて、２つ以上のヌクレオチド配列を比較し、短い（又はより長い）一続きの配列が同一又は類似であることに基づいて、一定のレベル以上の配列相同性を有する配列をグループ分けすることを意味する。
［発明の詳細な説明］
【００３３】
第１の態様では、本発明は、１以上の又は複数の試料における１以上の多型性を、同時に探索し、検出し、及び遺伝子型解析を行う方法に関し、この方法は、
（ａ）１以上の又は複数の試料からＤＮＡを用意するステップと、
（ｂ）制限酵素切断断片を産生する少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡを消化することによって、この試料ＤＮＡの複雑度を減少させるステップと、
（ｃ）タグ付き制限酵素切断断片を産生する識別子タグで、試料のこの制限酵素切断断片を用意するステップと、
（ｄ）このタグ付き制限酵素切断断片の少なくとも一部分をペアエンドシーケンシングするステップと、
（ｅ）この試料間の多型性を同定するステップと
を含む。
【００３４】
複雑度の減少は、１以上の制限酵素で試料からＤＮＡを消化することに専ら基づくことができる。ある実施形態では、２つ以上の制限酵素を使用することができる。この制限酵素切断断片に、アダプターをライゲーションすることができる。このアダプターは、制限酵素切断断片の一末端又は両末端にライゲーションしてもよく、同一でも異なっていてもよい。制限酵素切断断片が２つ以上の異なる制限酵素でＤＮＡを制限して得られると、異なるアダプターを使用することができる。さらに、複雑度の減少は、例えば、アダプター又はその部分に対して向けられたプライマーを使用して、制限酵素切断断片を増幅することによって達成してもよい。さらに、この増幅に使用されるプライマーは、制限酵素の認識配列の残りの部分に相補的な部分を含んでもよい。ある実施形態では、ＡＦＬＰ（登録商標）（欧州特許第５３４８５８号明細書）のような既定の科学技術を使用してもよく、１から１０のランダム選択性ヌクレオチドが、断片の再現性のあるサブセットを提供するため、少なくとも１つのプライマーの３’末端に付加される。再現性がある限り、他の複雑度減少技術も可能である。ここで、再現性があるとは、同一の試料に二度、複雑度減少技術を実施したとき、同一のサブセットが得られ、２つの試料間でも実質的に同一のサブセットが得られることを意味する。
【００３５】
タグ付き制限酵素切断断片を作成する識別子タグは、多くの方法で用意することができる。この識別子タグは、
タグ付きアダプター連結制限酵素切断断片を作成するこの制限酵素切断断片にタグ付きアダプターをライゲーションすること、又は
タグ付きアダプター連結制限酵素切断断片を作成するこのアダプターの少なくとも一部分に相補的な、少なくとも１つのタグ付きプライマーで、このアダプター連結制限酵素切断断片を増幅すること
によって用意することができる。
【００３６】
このアダプターは、識別子タグのみから構成されてもよく、又はこのアダプターは、例えば、タグ付き制限酵素切断断片（の一部分）の選択を可能とし、例えば、アレイ（ａｒｒａｙ）で、試料の複雑度を減少するような機能性をさらに備えていてもよい。
【００３７】
識別子タグは、その元になる試料に制限酵素切断断片を関連付ける一意的なタグが資料毎に用意される限り、アダプターライゲーション、増幅、又は複雑度減少の前又は後に、別のステップで付加してもよい。
【００３８】
シーケンシングステップは、好ましくは、高スループットシーケンシングを使用し、メイトペアシーケンシングを含むペアエンドシーケンシングを使用して実施する。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態では、制限酵素切断断片の配列の部分が決定される。好ましくは、制限酵素切断断片の両末端の配列を決定し、好ましくは同時に、すなわち同じシーケンスランで決定する。このような配列決定法を提供する手順書が、本明細書の別の箇所で記述されているように、一般に存在する（メイトペアシーケンシングを含むペアエンドシーケンシングのためのＧＡＩＩ及びＲｏｃｈｅプラットフォーム）。
【００４０】
メイトペアシーケンシングを含むペアエンドシーケンシングを使用すると、一般に、制限酵素切断断片の両末端の配列情報が得られる。制限酵素切断断片の両末端(識別子を含む、第１リード及び第２リード)からの配列情報は組み合わせることができ、いわゆる「二重タグ」を生じる。二重タグは、識別子タグを使用して試料に関連付けられ得ることが好ましい第１及び第２リードの情報を組み合わせた形で含む。識別子タグは、好ましくは、第１リードに付随する（又は含まれる）。二重タグの作成は、コンピューター上で（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）行うことができる。好ましい実施形態では、リードの１つ、好ましくは第２リードが、二重タグの作成の前に逆相補される。ここで、逆相補されるとは、リードの配列が逆にされる（例えば、Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５Ｎ６が、Ｎ６Ｎ５Ｎ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１となる）ことを意味する。したがって、二重タグをより詳細に説明すると、ＩＤ−リード１−リード２（逆相補）：ＩＤＩＤＩＤＩＤＭ１Ｍ２Ｍ３Ｍ４Ｍ５Ｍ６Ｎ６Ｎ５Ｎ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１となる。
【００４１】
本概念を示す一例として図１も参照されたい。反復配列から得られる部分もあるが、二重タグの他の部分がゲノム配列の別の部分由来である場合があり、それによって、２つの部分から一意的な組み合わせが生じる機会が増える。これによって、他の方法では不可能であった、配列間の多型性を同定することが可能となる。現在の科学技術では、断片の両側から１５０個のヌクレオチドを読み取ることができ、３００個のヌクレオチドの情報を得ることができる。この技術は、試料あたりの一意的な組み合わせ断片の数を激烈に増やすため、結果として、同定される多型性の数も激増する。同じ技術概念が、メイトペアシーケンシングを含むペアエンドシーケンシングを可能にする他のシーケンシングプラットフォームに実施可能である。
【００４２】
高スループットシーケンシングは、好ましくは、合成法シーケンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＧａＩＩ、Ｈｉｓｅｑ、ＭｉＳｅｑ）又はＲｏｃｈｅ  ＧＳ  ＦＬＸによって提供されるプラットフォームのようなパイロシーケンシング（固形担体上）に基づき、一般に次世代シーケンシングと言われる。次世代シーケンシングと言われる技術もまた使用することができる。その例は、ライゲーション、ハイブリダイゼーションシーケンシング、ナノポアシーケンシング（Ｏｘｆｏｒｄ  ｎａｎｏｐｏｒｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ又はＮＡＢｓｙｓ（米国特許出願公開第２０１０／００９６２６８号明細書、米国特許出願公開第２０１０／００７８３２５号明細書、米国特許出願公開第２００９／００９９７８６号明細書））、又はＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ及びＩｏｎ  ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｎａｔｕｒｅ  ４７５、３４８−３５２ページ）により提供されるシーケンシングに基づく。
【００４３】
配列情報を得ると、この配列は識別子タグに基づいて試料毎に配分される。配列をクラスタリング（又はアライン）することにより、配列間で、したがって試料間で、多型性を同定することができる。これによって、多様な試料において、ＳＮＰの同定、ＳＮＰの検出、及び遺伝子型の決定を同時に行うことが可能となる。クラスタリング又はアラインメントは、当該技術分野における通常の技術を使用して実施することができる。
【００４４】
比較を目的とする配列のアラインメント法は、当該技術分野において周知である。様々なプログラム及びアラインメントアルゴリズムが以下に記載されている。すなわち、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３、Ｃｏｒｐｅｔら、（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０、Ｈｕａｎｇら、（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌ．ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉ．８：１５５−６５、及びＰｅａｒｓｏｎら、（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３１、これらは参照により本明細書において援用される。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．６：１１９−２９（参照により本明細書において援用される）は、配列アラインメント法及び相同性演算について詳細に検討している。
【００４５】
ＢＬＡＳＴ（ｔｈｅ  ＮＣＢＬ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．５；２１５（３）：４０３−１０）が、国立生物工学情報センター（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．）及びインターネット上を含む種々の情報源から利用可能であり、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘと関連して供されている。＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／＞でアクセス可能である。本プログラムを使用して配列同一性を決定する方法は、＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ＞で利用可能である。
【００４６】
一般に、アラインメントは、アダプター／プライマー、及び／又は識別子に対して整えられている配列データに実施され、すなわち、核酸試料から生じる断片から得られる配列データのみを使用する。一般に、得られた配列データは、断片の起源（すなわち何の試料からか）を同定するために使用され、アダプター及び／又は識別子由来の配列はデータから除去され、アラインメントはこの整えられたセットにおいて実施される。
【００４７】
本方法の例において、試料のゲノムＤＮＡは２つの制限酵素、ＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩで消化され、アダプターが断片にライゲーションされる。ＡＦＬＰ複雑度減少を適用することができる(ゲノムの複雑度に応じて)。最後に、取得断片をＧＡＩＩシーケンシングに適する形にし、ペアエンド式で（各方向７６ヌクレオチド）シーケンシングする。タグの決定及び遺伝子型コーリングに対してバイオインフォマティックス的な手法が実施され、取得データを分析することにより、試料間の多型性の同定が可能となる。詳細な結果を実施例に記載する。
【００４８】
当該技術は、様々な点で価値を与えている。
【００４９】
制限酵素切断断片の高スループットシーケンシングに基づく物理地図（ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｍａｐ）を作成する際に使用されるものと同じ制限酵素を使用することよって、シーケンスタグ及び取得した遺伝子型を、この物理地図に容易にリンクすることができる。
【００５０】
ペアエンドシーケンシング（すなわち、制限酵素切断断片の両末端、例えば、各断片のＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩ末端のシーケンシング）を適用し、次にＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩタグの一意的な組み合わせのみをアラインすることにより、重なった領域におけるＳＮＰコーリング及び遺伝子型解析が最大限に活用される。
【００５１】
ＡＦＬＰの堅牢な複雑度減少を適用することにより、大量の試料のプーリングが可能となる。したがって、ある実施形態では、複雑度を低減された試料が、シーケンシングに先だってプールの中へプールされる。
【００５２】
当該技術は、好ましくは、全ゲノムＤＮＡに依存する。
【００５３】
本出願の全体にわたって、本発明に関する技術分野の現状をより完全に記述するため、様々な参照文献を括弧内に引用する。本明細書に引用されるすべての特許及び参考文献は、本明細書によりその全体が参照により援用される。
【００５４】
前述の記載及び図等が、本発明のいくつかの実施形態を説明する際に含まれることは明らかであろうが、保護の範囲を限定するものではない。本開示を始めとして、保護の範囲及び本発明の本質に含まれ、従来技術と本特許における開示との関連を明確に示す、さらに多くの実施形態が当業者にとって明白であろう。以下に述べる実施例によって本発明はさらに説明されるが、これに限定されるものではない。
【実施例】
【００５５】
本研究のゴールは、ランダムシーケンスに基づく遺伝子型解析（ｒＳＢＧ）に関して、ペアエンドシーケンスデータ分析の戦略を作成することであった。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）における、単一末端戦略に対するペアエンド（二重タグ）を使用したときのデータ分析の実績を評価、比較した。これらの目的において、イルミナＧＡＩＩ  ＮＧＳプラットフォームによる配列データと共にｄｅ  ｎｏｖｏアセンブリーストラテジー（ｄｅ  ｎｏｖｏ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）を使用して、参照配列が作成された。続いて、このイルミナリードを参照配列にマッピングした。その後、このマッピングした結果について、ＳＮＰを調べた。
【００５６】
シロイヌナズナデータセットの遺伝物質は、２つの親、２つのＦ１個体及び戻し交配（ＢＣ）集団からの２８の子孫からなる。
【００５７】
ペアエンドリードは、コンストラクトを構築するために使用し、二重タグと名付けられ、シングル「リード」と結合した。二重タグの長さは、対におけるそれぞれのリードの長さの総和であった。さらに、二重タグを構築する前に、参照（ゲノム）配列に対して二重タグのマッピングを可能にするために、リード２リード（ｒｅａｄ２  ｒｅａｄ）が逆相補された。したがって、二重タグの最終的な構造は、ＩＤ  ｔａｇ−リード１−リード２（逆相補）であった。二重タグを構築した後、あらゆる品質管理ステップが実施され、ペアエンドシーケンスデータからそれぞれのリードファイルを選別する（ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）ために使用される基準と同一のこの品質管理手順は、二重タグの選別に適合していた。
【００５８】
ＩＤ  ｔａｇは、ペアエンドシーケンスデータのリード１及びリード２配列の両方において存在した。
【００５９】
ＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩ  ライブラリーをシロイヌナズナの各試料について作成し、イルミナＧＡＩＩを使用してシーケンスした。品質管理試験を二重タグ並びにペアエンドシーケンスデータ由来のリード１及びリード２ファイルについて実施した。
【００６０】
シロイヌナズナシーケンスデータに適用された品質管理を施した選別についての統計一覧を表１に示す。
【表１】
2014502513.tif 000003
【００６１】
このシーケンシングレーン（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｌａｎｅ）で生じたリードの総数は、１９，６２２，３１９であった。リード全体の９７％が当初はＩＤ  ｔａｇを有しており、これは、どの試料にもマッチできなかったリードのために、わずかな割合の配列が除去されたことを示す。すべての選別基準を適用した後に、データセットに残っているリードの数は、１０．９Ｍ（二重タグ）から１２．１（リード１）まで変動した。データセットからリードが除去された主な理由は、予想された制限酵素モチーフ（ＥｃｏＲＩ又はＭｓｅＩのどちらでもよい）が存在しなかったこと、及びリードがクロロプラスト／ミトコンドリアデータベースに対して有意にヒットしたためである。
【００６２】
二重タグ又は単一末端のデータの分析性能を評価するため、シロイヌナズナの単一末端と二重タグの比較を、ユニークリード（ｕｎｉｑｕｅ  ｒｅａｄ）を用いたＣＡＰ３アセンブリー（Ｈｕａｎｇら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９９９  Ｓｅｐ；９（９）：８６８−７７）を使用して実施した。単一末端分析は、ペアエンドシーケンスデータの各リードファイルとは別に実施し、最終結果は、各リードファイルの分析で得られた数を集計することによって決定した。本評価の結果一覧を表３に示す。
【００６３】
【表２】
2014502513.tif 000004
【００６４】
それぞれの遺伝子型解析率の閾値におけるＳＮＰ及び遺伝子型の数は、二重タグについて分析されたデータでより高かった。このように性能が増したことにより、９０％及び８０％の遺伝子型解析率において、それぞれＳＮＰでは１１％、遺伝子型では７％の同定率の増加となった。続いて、シロイヌナズナデータにおいて利用可能な、戻し交配集団構造を使用して、各ＳＮＰデータセットに対する遺伝子型Ａ、Ｂ及びＨの数を決定した。戻し交配集団の性質から、観察されるホモ接合体遺伝子型はただ１つであろう。したがって、遺伝子型Ｂの数は、遺伝子型コーリング（ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｃａｌｌｉｎｇ）における全エラー率を示す良い指標である。加えて、遺伝子型Ａ及びＨの出現率はおよそ５０％と予測され、この出現率から大きく逸脱することは、遺伝子型コーリングにおける問題のサインでもある。表４は、シロイヌナズナデータにおいて実施された遺伝子型試験の結果を含む。
【００６５】
【表３】
2014502513.tif 000005
【００６６】
遺伝子型コーリングの精度は、親が代替的対立遺伝子（ａｌｔｅｒｎａｔｅ  ａｌｌｅｌｅ）に対してホモ接合体であるＳＮＰに対してのみ実施された。これらの結果より、遺伝子型Ｂの出現率が、すべての戦略試験に対して１％未満であったため、遺伝子型解析の精度が高いことが確認された。さらに、この３つの解析戦略試験における遺伝子型解析の精度において、実質的な差異も示されなかった。なぜなら、各遺伝子型クラスの出現率は、すべての戦略試験においてほぼ同じであったからである。
【００６７】
これらの結果より、ＳＮＰコーリングや遺伝子型解析の精度を損なうことなしに、二重タグ分析はより多くの数のＳＮＰ及び遺伝子型を生じることが確認された。
【図１】
2014502513.tif 000006
【国際調査報告】
2014502513.tif 000007
2014502513.tif 000008
2014502513.tif 000009
2014502513.tif 000010
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