(57)【要約】本発明は、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールを生成するのに充分な量で発現されるブタジエン経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含む２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を含めた非天然微生物体を提供する。本発明は、さらに、かかる微生物体を、本明細書に記載の２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を含めた非天然微生物体を２，４−ペンタジエノエートなどが生成される条件下で該生成に充分な期間、培養することにより、２，４−ペンタジエノエートなどを作製するために使用する方法を提供する。
2014521365.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，３−ブタンジオールを生成するのに充分な量で発現される１，３−ブタンジオール経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含む１，３−ブタンジオール経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、前記１，３−ブタンジオール経路は：
（３３）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｎおよび７ＡＡ；
（１）４Ａ，４Ｂ，４Ｃおよび４Ｄ；
（２）５Ａ，５Ｈ，５Ｊ，５Ｋおよび５Ｇ；
（３）５Ａ，５Ｈ，５Ｉおよび５Ｇ；
（４）５Ａ，５Ｈおよび５Ｌ；
（５）５Ａ，５Ｆおよび５Ｇ；
（６）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｇおよび７Ｓ；
（７）７Ａ，７Ｄ，７Ｉ，７Ｇおよび７Ｓ；
（８）７Ａ，７Ｄ，７Ｋ，および７Ｓ；
（９）７Ａ，７Ｈ，７Ｆ，７Ｇおよび７Ｓ；
（１０）７Ａ，７Ｊ，７Ｇおよび７Ｓ；
（１１）７Ａ，７Ｊ，７Ｒおよび７ＡＡ；
（１２）７Ａ，７Ｈ，７Ｆ，７Ｒおよび７ＡＡ；
（１３）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７Ｚおよび７ＡＡ；
（１４）７Ａ，７Ｄ，７Ｉ，７Ｒおよび７ＡＡ；
（１５）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒおよび７ＡＡ；
（１６）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７Ｚおよび７ＡＡ；
（１７）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｎおよび７ＡＡ；
（１８）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚおよび７ＡＡ；
（１９）７Ａ，７Ｂ，７Ｍおよび７ＡＡ；
（２０）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７Ｚおよび７ＡＡ；
（２１）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｎおよび７ＡＡ；
（２２）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７Ｚおよび７ＡＡ；
（２３）７Ａ，７Ｄ，７Ｐおよび７Ｏ；
（２４）７Ａ，７Ｂ，７Ｘおよび７Ｏ；
（２５）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＡ；
（２６）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｇ，７Ｓ；
（２７）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｇおよび７Ｓ；
（２８）７ＡＳ，７Ｉ，７Ｇおよび７Ｓ；
（２９）７ＡＳ，７Ｋ，および７Ｓ；
（３０）７ＡＳ，７Ｉ，７Ｒおよび７ＡＡ；
（３１）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒおよび７ＡＡ；
（３２）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７Ｚおよび７ＡＡ；
（３４）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚおよび７ＡＡ；
（３５）７ＡＳ，７Ｐおよび７Ｏ；
（３６）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，および７ＡＡ；ならびに
（３７）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｇ，および７Ｓ
から選択される経路を含み、
前記４Ａは３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡチオラーゼまたは３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンターゼであり、前記４Ｂは３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼであり、前記４Ｃは３−オキソ−５−ヒドロキシペンタン酸デカルボキシラーゼであり、前記４Ｄは３−オキソブタノールレダクターゼであり、前記５Ａは４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸アルドラーゼであり、前記５Ｆは４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸デカルボキシラーゼであり、前記５Ｇは３−ヒドロキシブタナールレダクターゼであり、前記５Ｈは４−ヒドロキシ−２−オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ、４−ヒドロキシ−２−オキソペンタン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼまたは４−ヒドロキシ−２−オキソペンタン酸ギ酸リアーゼであり、前記５Ｉは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、前記５Ｊは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンテターゼであり、前記５Ｋは３−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、前記５Ｌは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）であり、前記７Ａは３−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼであり、前記７Ｂはアセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼであり、前記７Ｄはアセトアセチル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、前記７Ｅはアセトアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアセトアセチル−ＣｏＡシンテターゼであり、前記７Ｆはアセト酢酸レダクターゼ（酸還元）であり、前記７Ｇは３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）であり、前記７Ｈはアセトアセチル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、前記７Ｉはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存性、アルデヒド形成）であり、前記７Ｊはアセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、前記７Ｋはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）であり、前記７Ｌは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、前記７Ｍは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、前記７Ｎは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、前記７Ｏは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）であり、前記７Ｐはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）であり、前記７Ｑはアセト酢酸レダクターゼ（ケトン還元）であり、前記７Ｒは３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）であり、前記７Ｓは４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼであり、前記７Ｘは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、前記７Ｙは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンテターゼであり、前記７Ｚは３−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、前記７ＡＡは３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼであり、前記７ＡＳはアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼである、
非天然微生物体。
【請求項２】
前記微生物体が、各々が１，３−ブタンジオール経路の酵素をコードしている２、３、４または５種類の外因性核酸を含むものである、請求項１に記載の非天然微生物体。
【請求項３】
前記微生物体が、（１）〜（３７）から選択される経路のうちの少なくとも１つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、請求項２に記載の非天然微生物体。
【請求項４】
前記少なくとも１種類の外因性核酸が異種核酸である、請求項１に記載の非天然微生物体。
【請求項５】
実質的に嫌気性の培養培地中に存在する、請求項１に記載の非天然微生物体。
【請求項６】
さらに：
（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、前記少なくとも１種類の外因性核酸がＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、シトリル−ＣｏＡシンテターゼ、シトリル−ＣｏＡリアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；
（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、前記少なくとも１種類の外因性核酸がピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または
（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸
を含む、請求項１に記載の非天然微生物体。
【請求項７】
（ｉ）を含む前記微生物体が、さらに、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、請求項６に記載の非天然微生物体。
【請求項８】
（ｉｉ）を含む前記微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、請求項６に記載の非天然微生物体。
【請求項９】
（ｉ）を含む前記微生物体が、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている３種類の外因性核酸を含むものである；
（ｉｉ）を含む前記微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ；ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；ＣＯデヒドロゲナーゼ；およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている４種類の外因性核酸を含むものである；または
（ｉｉｉ）を含む前記微生物体が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている２種類の外因性核酸を含むものである、
請求項６に記載の非天然微生物体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の非天然微生物体を、１，３−ブタンジオールが生成される条件下で前記生成に充分な期間、培養することを含む、１，３−ブタンジオールを生成するための方法。
【請求項１１】
２，４−ペンタジエノエートを生成するのに充分な量で発現される２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含む２，４−ペンタジエノエート経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、前記２，４−ペンタジエノエート経路は：
（１）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋおよび１Ｇ；
（２）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆおよび１Ｇ；
（３）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐおよび１Ｇ；
（４）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂおよび１Ｊ；
（５）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎおよび１Ｏ；
（６）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎおよび１Ｏ；
（７）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎおよび１Ｏ；
（８）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑおよび１Ｏ；
（９）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋおよび１Ｇ；
（１０）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆおよび１Ｇ；
（１１）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂおよび１Ｊ；
（１２）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎおよび１Ｏ；
（１３）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎおよび１Ｏ；
（１４）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎおよび１Ｏ；
（１５）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑおよび１Ｏ；
（１６）１Ｂ，１Ｃ，１Ｋおよび１Ｇ；
（１７）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆおよび１Ｇ；
（１８）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐおよび１Ｇ；
（１９）１Ｂおよび１Ｊ；
（２０）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎおよび１Ｏ；
（２１）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎおよび１Ｏ；
（２２）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑおよび１Ｏ；
（２３）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｄ，３Ｅおよび３Ｆ；ならびに
（２４）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｇおよび３Ｆ
から選択される経路を含み、
前記１Ｂは５−アミノペンタン酸レダクターゼであり、前記１Ｃは５−アミノペント−２−エン酸アミノトランスフェラーゼ、５−アミノペント−２−エン酸デヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼであり、前記１Ｄは２−オキソアジピン酸デカルボキシラーゼであり、前記１Ｅはグルタル酸セミアルデヒドレダクターゼであり、前記１Ｆは５−ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼであり、前記１Ｇは５−ヒドロキシペント−２−エン酸デヒドラターゼであり、前記１Ｉは５−アミノペンタン酸アミノトランスフェラーゼ、５−アミノペンタン酸デヒドロゲナーゼまたは５−アミノペンタン酸アミンオキシダーゼであり、前記１Ｊは５−アミノペント−２−エン酸デアミナーゼであり、前記１Ｋは５−ヒドロキシペント−２−エン酸レダクターゼであり、前記１Ｌは５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡシンテターゼであり、前記１Ｍは５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、前記１Ｎは５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼであり、前記１Ｏは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡシンテターゼまたは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡヒドロラーゼであり、前記１Ｐは５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼであり、前記１Ｑは５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡデヒドラターゼ／デヒドロゲナーゼであり、前記１Ｓはグルタリル−ＣｏＡレダクターゼであり、前記３Ａは３−オキソペンタノイル−ＣｏＡチオラーゼまたは３−オキソペンタノイル−ＣｏＡシンターゼであり、前記３Ｂは３−オキソペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼであり、前記３Ｃは３−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼであり、前記３Ｄはペント−２−エノイル−ＣｏＡイソメラーゼであり、前記３Ｅはペント−３−エノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、前記３Ｆは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡシンテターゼであり、前記３Ｇはペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼである、
非天然微生物体。
【請求項１２】
前記微生物体が、各々が２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードしている２、３、４、５、６、７、８、９または１０種類の外因性核酸を含むものである、請求項１１に記載の非天然微生物体。
【請求項１３】
前記微生物体が、（１）〜（２４）から選択される経路のうちの少なくとも１つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、請求項１２に記載の非天然微生物体。
【請求項１４】
前記少なくとも１種類の外因性核酸が異種核酸である、請求項１１に記載の非天然微生物体。
【請求項１５】
実質的に嫌気性の培養培地中に存在する、請求項１１に記載の非天然微生物体。
【請求項１６】
（９）〜（１５）から選択される２，４−ペンタジエノエート経路を含む前記非天然微生物体が、さらに、グルタリル−ＣｏＡを生成するのに充分な量で発現されるグルタリル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含むグルタリル−ＣｏＡ経路を含むものであり、前記グルタリル−ＣｏＡ経路が：
アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼもしくはアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ；アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ；およびグルタリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；または
２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、２−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼもしくは２−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼ；および２−オキソアジピン酸デヒドロゲナーゼ、２−オキソアジピン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼまたは２−オキソアジピン酸ギ酸リアーゼ
から選択される経路を含む、請求項１１に記載の非天然微生物体。
【請求項１７】
（１６）〜（２２）から選択される２，４−ペンタジエノエート経路を含む前記非天然微生物体が、さらに、５−アミノペンタノエートを生成するのに充分な量で発現される５−アミノペンタノエート経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含む５−アミノペンタノエート経路を含むものであり、前記５−アミノペンタノエート経路が、２−アミノアジピン酸デカルボキシラーゼ；または２−アミノアジピン酸デカルボキシラーゼおよび２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、２−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼもしくは２−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼを含むものである、請求項１１に記載の非天然微生物体。
【請求項１８】
（１）〜（８）から選択される２，４−ペンタジエノエート経路を含む前記非天然微生物体が、さらに、２−オキソアジペートを生成するのに充分な量で発現される２−オキソアジペート経路の酵素をコードしている外因性核酸を含む２−オキソアジペート経路を含むものであり、前記２−オキソアジペート経路が、２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、２−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼまたは２−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼを含むものである、請求項１１に記載の非天然微生物体。
【請求項１９】
さらに：
（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、前記少なくとも１種類の外因性核酸がＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、シトリル−ＣｏＡシンテターゼ、シトリル−ＣｏＡリアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；
（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、前記少なくとも１種類の外因性核酸がピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または
（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸
を含む、請求項１１に記載の非天然微生物体。
【請求項２０】
（ｉ）を含む前記微生物体が、さらに、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、請求項１９に記載の非天然微生物体。
【請求項２１】
（ｉｉ）を含む前記微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、請求項１９に記載の非天然微生物体。
【請求項２２】
（ｉ）を含む前記微生物体が、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている３種類の外因性核酸を含むものである；
（ｉｉ）を含む前記微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ；ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；ＣＯデヒドロゲナーゼ；およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている４種類の外因性核酸を含むものである；または
（ｉｉｉ）を含む前記微生物体が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている２種類の外因性核酸を含むものである、
請求項１９に記載の非天然微生物体。
【請求項２３】
請求項１１〜２２のいずれか１項に記載の非天然微生物体を、２，４−ペンタジエノエートが生成される条件下で前記生成に充分な期間、培養することを含む、２，４−ペンタジエノエートを生成するための方法。
【請求項２４】
ブタジエンを生成するのに充分な量で発現されるブタジエン経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含むブタジエン経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、前記ブタジエン経路は：
（１）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇおよび１Ｔ；
（２）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇおよび１Ｔ；
（３）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇおよび１Ｔ；
（４）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｊおよび１Ｔ；
（５）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏおよび１Ｔ；
（６）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏおよび１Ｔ；
（７）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏおよび１Ｔ；
（８）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏおよび１Ｔ；
（９）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｕおよび１Ｖ；
（１０）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｕおよび１Ｖ；
（１１）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｕおよび１Ｖ；
（１２）１Ｄ，１Ｅ，１Ｗおよび１Ｖ；
（１３）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ａおよび６Ｂ；
（１４）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ａおよび６Ｂ；
（１５）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇ，６Ａおよび６Ｂ；
（１６）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｊ，６Ａおよび６Ｂ；
（１７）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；
（１８）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；
（１９）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；
（２０）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；
（２１）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（２２）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（２３）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（２４）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｊ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（２５）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（２６）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（２７）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（２８）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（２９）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｃおよび６Ｂ；
（３０）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｃおよび６Ｂ；
（３１）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，６Ｃおよび６Ｂ；
（３２）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，６Ｃおよび６Ｂ；
（３３）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（３４）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（３５）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（３６）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（３７）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｃおよび６Ｂ；
（３８）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｃおよび６Ｂ；
（３９）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｃおよび６Ｂ；
（４０）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（４１）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（４２）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（４３）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇおよび１Ｔ；
（４４）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇおよび１Ｔ；
（４５）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｊおよび１Ｔ；
（４６）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏおよび１Ｔ；
（４７）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏおよび１Ｔ；
（４８）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏおよび１Ｔ；
（４９）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏおよび１Ｔ；
（５０）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｕおよび１Ｖ；
（５１）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｕおよび１Ｖ；
（５２）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｕおよび１Ｖ；
（５３）１Ｓ，１Ｅ，１Ｗおよび１Ｖ；
（５４）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ａおよび６Ｂ；
（５５）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ａおよび６Ｂ；
（５６）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｊ，６Ａおよび６Ｂ；
（５７）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；
（５８）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；
（５９）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；
（６０）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；
（６１）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（６２）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（６３）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｊ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（６４）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（６５）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（６６）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（６７）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（６８）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｃおよび６Ｂ；
（６９）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｃおよび６Ｂ；
（７０）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，６Ｃおよび６Ｂ；
（７１）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，６Ｃおよび６Ｂ；
（７２）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（７３）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（７４）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（７５）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（７６）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｃおよび６Ｂ；
（７７）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｃおよび６Ｂ；
（７８）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（７９）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（８０）１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇおよび１Ｔ；
（８１）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇおよび１Ｔ；
（８２）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇおよび１Ｔ；
（８３）１Ｂ，１Ｊおよび１Ｔ；
（８４）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏおよび１Ｔ；
（８５）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏおよび１Ｔ；
（８６）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏおよび１Ｔ；
（８７）１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｕおよび１Ｖ；
（８８）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｕおよび１Ｖ；
（８９）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｕおよび１Ｖ；
（９０）１Ｉ，１Ｅ，１Ｗおよび１Ｖ；
（９１）１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ａおよび６Ｂ；
（９２）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ａおよび６Ｂ；
（９３）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇ，６Ａおよび６Ｂ；
（９４）１Ｂ，１Ｊ，６Ａおよび６Ｂ；
（９５）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；
（９６）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；
（９７）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；
（９８）１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（９９）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１００）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１０１）１Ｂ，１Ｊ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１０２）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１０３）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１０４）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１０５）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｃおよび６Ｂ；
（１０６）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，６Ｃおよび６Ｂ；
（１０７）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，６Ｃおよび６Ｂ；
（１０８）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１０９）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１１０）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１１１）１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｃおよび６Ｂ；
（１１２）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｃおよび６Ｂ；
（１１３）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｃおよび６Ｂ；
（１１４）１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１１５）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１１６）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１１７）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｄ，３Ｅ，３Ｆおよび１Ｔ；
（１１８）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｄ，３Ｅ，３Ｆ，６Ａおよび６Ｂ；
（１１９）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｄ，３Ｅ，３Ｆ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１２０）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｄ，３Ｅ，６Ｃおよび６Ｂ；
（１２１）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｄ，３Ｅ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；ならびに
（１２２）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｇ，３Ｆおよび１Ｔ；
（１２３）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｇ，３Ｆ，６Ａおよび６Ｂ；
（１２４）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｇ，３Ｆ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１２５）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｇ，６Ｃおよび６Ｂ；
（１２６）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｇ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１２７）５Ａ，５Ｂ，５Ｃ，５Ｄおよび５Ｅ；
（１２８）７Ａ，７Ｊ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１２９）７Ａ，７Ｈ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１３０）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１３１）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１３２）７Ａ，７Ｄ，７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１３３）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１３４）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１３５）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１３６）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１３７）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１３８）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１３９）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１４０）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１４１）７Ａ，７Ｂ，７Ｍ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１４２）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１４３）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１４４）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１４５）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１４６）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１４７）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１４８）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｕ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１４９）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｔ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１５０）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１５１）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｗ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１５２）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７Ｗ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１５３）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７Ｗ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１５４）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７Ｖ，７ＡＨ；，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ
（１５５）７Ａ，７Ｊ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１５６）７Ａ，７Ｈ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１５７）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１５８）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１５９）７Ａ，７Ｄ，７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１６０）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１６１）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１６４）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１６３）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１６４）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１６５）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１６６）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１６７）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１６８）７Ａ，７Ｂ，７Ｍ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１６９）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１７０）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１７１）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１７２）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１７３）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１７４）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１７５）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｕ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１７６）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｔ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１７７）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１７８）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｗ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１７９）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７Ｗ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１８０）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７Ｗ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１８１）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１８２）７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１８３）７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１８４）７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１８５）７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１８６）７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１８７）７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１８８）７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１８９）７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１９０）７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１９１）７Ｐ，７ＡＢ，７Ｗ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１９２）７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１９３）７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１９４）７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１９５）７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１９６）７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１９７）７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１９８）７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１９９）７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（２００）７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（２０１）７Ｐ，７ＡＢ，７Ｗ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（２０２）７ＡＳ，７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（２０３）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（２０４）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（２０５）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（２０６）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（２０７）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（２０８）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（２０９）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（２１０）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（２１１）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｗ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（２１２）７ＡＳ，７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（２１３）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（２１４）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（２１５）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（２１６）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（２１７）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（２１８）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（２１９）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（２２０）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；ならびに
（２２１）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｗ，１２Ｄおよび１２Ｃ
から選択される経路を含み、
前記１Ｂは５−アミノペンタン酸レダクターゼ、５−アミノペント−２−エン酸アミノトランスフェラーゼ、５−アミノペント−２−エン酸デヒドロゲナーゼまたは５−アミノペント−２−エン酸アミンオキシダーゼであり、前記１Ｄは２−オキソアジピン酸デカルボキシラーゼであり、前記１Ｅはグルタル酸セミアルデヒドレダクターゼであり、前記１Ｆは５−ヒドロキシ吉草酸レダクターゼであり、前記１Ｇは５−ヒドロキシペント−２−エン酸デヒドラターゼであり、前記１Ｉは５−アミノペンタン酸アミノトランスフェラーゼ、５−アミノペンタン酸デヒドロゲナーゼまたは５−アミノペンタン酸アミンオキシダーゼであり、前記１Ｊは５−アミノペント−４−エン酸デアミナーゼであり、前記１Ｋは５−ヒドロキシペント−２−エン酸レダクターゼであり、前記１Ｌは５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡシンテターゼであり、前記１Ｍは５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、前記１Ｎは５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼであり、前記１Ｏは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡシンテターゼまたは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡヒドロラーゼであり、前記１Ｐは５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼであり、前記１Ｑは５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡデヒドラターゼ／デヒドロゲナーゼであり、前記１Ｓはグルタリル−ＣｏＡレダクターゼであり、前記１Ｔは２，４−ペンタジエン酸デカルボキシラーゼであり、前記１Ｕは５−ヒドロキシペント−２−エン酸デカルボキシラーゼであり、前記１Ｖは３−ブテン−１−オールデヒドラターゼであり、前記１Ｗは５−ヒドロキシ吉草酸デカルボキシラーゼであり、前記３Ａは３−オキソペンタノイル−ＣｏＡチオラーゼまたは３−オキソペンタノイル−ＣｏＡシンターゼであり、前記３Ｂは３−オキソペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼであり、前記３Ｃは３−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼであり、前記３Ｄはペント−２−エノイル−ＣｏＡイソメラーゼであり、前記３Ｅはペント−３−エノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、前記３Ｆは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡシンテターゼであり、前記３Ｇはペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、前記５Ａは４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸アルドラーゼであり、前記５Ｂは４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸デヒドラターゼであり、前記５Ｃは２−オキソペンテン酸デカルボキシラーゼであり、前記５Ｄは３−ブテン−１−アールレダクターゼであり、前記５Ｅは３−ブテン−１−オールデヒドラターゼであり、前記６Ａは２，４−ペンタジエン酸レダクターゼ（酸還元）であり、前記６Ｂはペンタ−２，４−ジエナールデカルボニラーゼであり、前記６Ｃは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（酸還元）であり、前記６Ｄは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡホスホトランスフェラーゼであり、前記６Ｅは２，４−ペンタジエノイル−リン酸レダクターゼであり、前記６Ｆは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡシンテターゼであり、前記６Ｈは２，４−ペンタジエン酸キナーゼであり、前記７Ａは３−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼであり、前記７Ｂはアセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼであり、前記７Ｃは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰデヒドラターゼであり、前記７Ｄはアセトアセチル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、前記７Ｅはアセトアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアセトアセチル−ＣｏＡシンテターゼであり、前記７Ｆはアセト酢酸レダクターゼ（酸還元）であり、前記７Ｈはアセトアセチル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、前記７Ｉはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存性，アルデヒド形成）であり、前記７Ｊはアセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、前記７Ｋはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）であり、前記７Ｌは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、前記７Ｍは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、前記７Ｎは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、前記７Ｏは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）であり、前記７Ｐはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）であり、前記７Ｑはアセト酢酸レダクターゼ（ケトン還元）であり、前記７Ｒは３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）であり、前記７Ｔはクロトニル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、前記７Ｕはクロトニル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、前記７Ｖはクロトニル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、前記７Ｗはクロトニル−ＣｏＡ（アルコール形成）であり、前記７Ｘは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、前記７Ｙは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンテターゼであり、前記７Ｚは３−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、前記７ＡＢは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼであり、前記７ＡＣは３−ヒドロキシ酪酸デヒドラターゼであり、前記７ＡＤは３−ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドラターゼであり、前記７ＡＥはクロトニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、前記７ＡＦはクロトニル−ＣｏＡヒドロラーゼ、クロトニル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはクロトニル−ＣｏＡシンテターゼであり、前記７ＡＧはクロトン酸レダクターゼであり、前記７ＡＨはクロトンアルデヒドレダクターゼであり、前記７ＡＳはアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼであり、前記１２Ａはクロチルアルコールキナーゼであり、前記１２Ｂは２−ブテニル−４−リン酸キナーゼであり、前記１２Ｃはブタジエンシンターゼであり、前記１２Ｄはクロチルアルコールジホスホキナーゼである、
非天然微生物体。
【請求項２５】
前記微生物体が、各々がブタジエン経路の酵素をコードしている２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１種類の外因性核酸を含むものである、請求項２４に記載の非天然微生物体。
【請求項２６】
前記微生物体が、（１）〜（２２１）から選択される経路のうちの少なくとも１つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、請求項２５に記載の非天然微生物体。
【請求項２７】
前記少なくとも１種類の外因性核酸が異種核酸である、請求項２４に記載の非天然微生物体。
【請求項２８】
実質的に嫌気性の培養培地中に存在する、請求項２４に記載の非天然微生物体。
【請求項２９】
（４３）〜（７９）から選択されるブタジエン経路を含む前記非天然微生物体が、さらに、グルタリル−ＣｏＡを生成するのに充分な量で発現されるグルタリル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含むグルタリル−ＣｏＡ経路を含むものであり、前記グルタリル−ＣｏＡ経路が：
アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼもしくはアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ；アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ；およびグルタリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；または
２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、２−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼもしくは２−アミノ（ａｍｉｎｉｎｏ）アジピン酸アミンオキシダーゼ；および２−オキソアジピン酸デヒドロゲナーゼ、２−オキソアジピン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼもしくは２−オキソアジピン酸ギ酸リアーゼ
から選択される経路を含む、請求項２４に記載の非天然微生物体。
【請求項３０】
（８０）〜（１１６）から選択されるブタジエン経路を含む前記非天然微生物体が、さらに、５−アミノペンタノエートを生成するのに充分な量で発現される５−アミノペンタノエート経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含む５−アミノペンタノエート経路を含むものであり、前記５−アミノペンタノエート経路が、２−アミノアジピン酸デカルボキシラーゼ；または２−アミノアジピン酸デカルボキシラーゼおよび２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、２−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼもしくは２−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼを含むものである、請求項２４に記載の非天然微生物体。
【請求項３１】
（１）〜（４２）から選択されるブタジエン経路を含む前記非天然微生物体が、さらに、２−オキソアジペートを生成するのに充分な量で発現される２−オキソアジペート経路の酵素をコードしている外因性核酸を含む２−オキソアジペート経路を含むものであり、前記２−オキソアジペート経路が２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、２−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼまたは２−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼを含むものである、請求項２４に記載の非天然微生物体。
【請求項３２】
さらに：
（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、前記少なくとも１種類の外因性核酸がＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、シトリル−ＣｏＡシンテターゼ、シトリル−ＣｏＡリアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；
（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、前記少なくとも１種類の外因性核酸がピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または
（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸
を含む、請求項２４に記載の非天然微生物体。
【請求項３３】
（ｉ）を含む前記微生物体が、さらに、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、請求項３２に記載の非天然微生物体。
【請求項３４】
（ｉｉ）を含む前記微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、請求項３２に記載の非天然微生物体。
【請求項３５】
（ｉ）を含む前記微生物体が、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている３種類の外因性核酸を含むものである；
（ｉｉ）を含む前記微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ；ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；ＣＯデヒドロゲナーゼ；およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている４種類の外因性核酸を含むものである；または
（ｉｉｉ）を含む前記微生物体が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている２種類の外因性核酸を含むものである、
請求項３２に記載の非天然微生物体。
【請求項３６】
請求項２４〜３５のいずれか１項に記載の非天然微生物体を、ブタジエンが生成される条件下で前記生成に充分な期間、培養することを含む、ブタジエンを生成するための方法。
【請求項３７】
３−ブテン−１−オールを生成するのに充分な量で発現される３−ブテン−１−オール経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含む３−ブテン−１−オール経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、前記３−ブテン−１−オール経路は：
（１）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆおよび１Ｕ；
（２）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋおよび１Ｕ；
（３）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐおよび１Ｕ；
（４）１Ｄ，１Ｅおよび１Ｗ；
（５）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆおよび１Ｕ；
（６）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋおよび１Ｕ；
（７）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐおよび１Ｕ；
（８）１Ｓ，１Ｅおよび１Ｗ；
（９）１Ｂ，１Ｃ，１Ｋおよび１Ｕ；
（１０）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆおよび１Ｕ；
（１１）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐおよび１Ｕ；
（１２）１Ｉ，１Ｅおよび１Ｗ；ならびに
（１３）５Ａ，５Ｂ，５Ｃおよび５Ｄ
から選択される経路を含み、
前記１Ｂは５−アミノペンタン酸レダクターゼであり、前記１Ｃは５−アミノペント−２−エン酸アミノトランスフェラーゼ、５−アミノペント−２−エン酸デヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼであり、前記１Ｄは２−オキソアジピン酸デカルボキシラーゼであり、前記１Ｅはグルタル酸セミアルデヒドレダクターゼであり、前記１Ｆは５−ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼであり、前記１Ｉは５−アミノペンタン酸アミノトランスフェラーゼ、５−アミノペンタン酸デヒドロゲナーゼまたは５−アミノペンタン酸アミンオキシダーゼであり、前記１Ｋは５−ヒドロキシペント−２−エン酸レダクターゼであり、前記１Ｌは５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡシンテターゼであり、前記１Ｍは５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、前記１Ｐは５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼであり、前記１Ｓはグルタリル−ＣｏＡレダクターゼであり、前記１Ｕは５−ヒドロキシペント−２−エン酸デカルボキシラーゼであり、前記１Ｗは５−ヒドロキシ吉草酸デカルボキシラーゼであり、前記５Ａは４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸アルドラーゼであり、前記５Ｂは４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸デヒドラターゼであり、前記５Ｃは２−オキソペンテン酸デカルボキシラーゼであり、前記５Ｄは３−ブテン−１−アールレダクターゼである、
非天然微生物体。
【請求項３８】
前記微生物体が、各々が３−ブテン−１−オール経路の酵素をコードしている２、３、４、５または６種類の外因性核酸を含むものである、請求項３７に記載の非天然微生物体。
【請求項３９】
前記微生物体が、（１）〜（１３）から選択される経路のうちの少なくとも１つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、請求項３８に記載の非天然微生物体。
【請求項４０】
前記少なくとも１種類の外因性核酸が異種核酸である、請求項３７に記載の非天然微生物体。
【請求項４１】
実質的に嫌気性の培養培地中に存在する、請求項３７に記載の非天然微生物体。
【請求項４２】
さらに：
（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、前記少なくとも１種類の外因性核酸がＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；
（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、前記少なくとも１種類の外因性核酸がピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または
（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸
を含む、請求項３７に記載の非天然微生物体。
【請求項４３】
（ｉ）を含む前記微生物体が、さらに、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、請求項４２に記載の非天然微生物体。
【請求項４４】
（ｉｉ）を含む前記微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、請求項４２に記載の非天然微生物体。
【請求項４５】
（ｉ）を含む前記微生物体が、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている３種類の外因性核酸を含むものである；
（ｉｉ）を含む前記微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ；ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；ＣＯデヒドロゲナーゼ；およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている４種類の外因性核酸を含むものである；または
（ｉｉｉ）を含む前記微生物体が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている２種類の外因性核酸を含むものである、
請求項４２に記載の非天然微生物体。
【請求項４６】
請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の非天然微生物体を、３−ブテン−１−オールが生成される条件下で前記生成に充分な期間、培養することを含む、３−ブテン−１−オールを生成するための方法。
【請求項４７】
請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の非天然微生物体を、３−ブテン−１−オールが生成される条件下で前記生成のために充分培養すること、および前記３−ブテン−１−オールを化学的に脱水させてブタジエンを生成させることを含む、ブタジエンを生成するための方法。
【請求項４８】
クロチルアルコールを生成するのに充分な量で発現されるクロチルアルコール経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含むクロチルアルコール経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、前記クロチルアルコール経路は：
（１）７Ａ，７Ｊ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（２）７Ａ，７Ｈ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（３）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（４）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（５）７Ａ，７Ｄ，７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（６）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（７）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（８）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（９）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（１０）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（１１）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（１２）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖおよび７ＡＨ；
（１３）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（１４）７Ａ，７Ｂ，７Ｍ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（１５）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（１６）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（１７）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（１８）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（１９）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７Ｖおよび７ＡＨ；
（２０）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（２１）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｕおよび７ＡＨ；
（２２）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｔ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（２３）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（２４）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢおよび７Ｗ；
（２５）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢおよび７Ｗ；
（２６）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥおよび７Ｗ；
（２７）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７Ｖおよび７ＡＨ；
（２８）７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（２９）７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（３０）７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（３１）７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（３２）７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（３３）７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（３４）７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（３５）７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖおよび７ＡＨ；
（３６）７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（３７）７Ｐ，７ＡＢおよび７Ｗ；
（３８）７ＡＳ，７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（３９）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（４０）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（４１）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（４２）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（４３）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（４４）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（４５）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖおよび７ＡＨ；
（４６）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＨ；ならびに
（４７）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢおよび７Ｗ
から選択される経路を含み、
前記７Ａは３−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼであり、前記７Ｂはアセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼであり、前記７Ｃは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰデヒドラターゼであり、前記７Ｄはアセトアセチル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、前記７Ｅはアセトアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアセトアセチル−ＣｏＡシンテターゼであり、前記７Ｆはアセト酢酸レダクターゼ（酸還元）であり、前記７Ｈはアセトアセチル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、前記７Ｉはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存性，アルデヒド形成）であり、前記７Ｊはアセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、前記７Ｋはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）であり、前記７Ｌは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、前記７Ｍは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、前記７Ｎは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、前記７Ｏは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）であり、前記７Ｐはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）であり、前記７Ｑはアセト酢酸レダクターゼ（ケトン還元）であり、前記７Ｒは３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）であり、前記７Ｔはクロトニル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、前記７Ｕはクロトニル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、前記７Ｖはクロトニル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、前記７Ｗはクロトニル−ＣｏＡ（アルコール形成）であり、前記７Ｘは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、前記７Ｙは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンテターゼであり、前記７Ｚは３−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、前記７ＡＢは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼであり、前記７ＡＣは３−ヒドロキシ酪酸デヒドラターゼであり、前記７ＡＤは３−ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドラターゼであり、前記７ＡＥはクロトニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、前記７ＡＦはクロトニル−ＣｏＡヒドロラーゼ、クロトニル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはクロトニル−ＣｏＡシンテターゼであり、前記７ＡＧはクロトン酸レダクターゼであり、前記７ＡＨはクロトンアルデヒドレダクターゼであり、前記７ＡＳはアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼである、
非天然微生物体。
【請求項４９】
前記微生物体が、各々がクロチルアルコール経路の酵素をコードしている２、３、４、５、６または７種類の外因性核酸を含むものである、請求項１に記載の非天然微生物体。
【請求項５０】
前記微生物体が、（１）〜（４７）から選択される経路のうちの少なくとも１つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、請求項１Ａに記載の非天然微生物体。
【請求項５１】
前記少なくとも１種類の外因性核酸が異種核酸である、請求項１に記載の非天然微生物体。
【請求項５２】
実質的に嫌気性の培養培地中に存在する、請求項１に記載の非天然微生物体。
【請求項５３】
さらに：
（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、前記少なくとも１種類の外因性核酸がＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、シトリル−ＣｏＡシンテターゼ、シトリル−ＣｏＡリアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；
（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、前記少なくとも１種類の外因性核酸がピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または
（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸
を含む、請求項４８に記載の非天然微生物体。
【請求項５４】
（ｉ）を含む前記微生物体が、さらに、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、請求項５３に記載の非天然微生物体。
【請求項５５】
（ｉｉ）を含む前記微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、請求項５３に記載の非天然微生物体。
【請求項５６】
（ｉ）を含む前記微生物体が、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている３種類の外因性核酸を含むものである；
（ｉｉ）を含む前記微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ；ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；ＣＯデヒドロゲナーゼ；およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている４種類の外因性核酸を含むものである；または
（ｉｉｉ）を含む前記微生物体が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている２種類の外因性核酸を含むものである、
請求項５３に記載の非天然微生物体。
【請求項５７】
請求項４８〜５６のいずれか１項に記載の非天然微生物体を、クロチルアルコールが生成される条件下で前記生成に充分な期間、培養することを含む、クロチルアルコールを生成するための方法。
【請求項５８】
プロピレンを生成するのに充分な量で発現されるプロピレン経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含むプロピレン経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、前記プロピレン経路は：
（１）７Ａ，７Ｊ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（２）７Ａ，７Ｈ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（３）７Ａ，７Ｄ，７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（４）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（５）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（６）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（７）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（８）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（９）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｎ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（１０）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（１１）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７Ｖ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（１２）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（１３）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（１４）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（１５）７Ａ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖおよび７ＡＯ；
（１６）７Ａ，７Ｂ，７Ｍ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（１７）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（１８）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｎ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（１９）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（２０）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｕおよび７ＡＯ；
（２１）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｔ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（２２）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７Ｖおよび７ＡＯ；
（２３）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（２４）７Ａ，７Ｈ，７Ｑおよび７ＡＲ；
（２５）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑおよび７ＡＲ；
（２６）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙおよび７ＡＲ；
（２７）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙおよび７ＡＲ；
（２８）７Ａ，７Ｂ，７Ｌおよび７ＡＲ；
（２９）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７ＡＣおよび７ＡＱ；
（３０）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣおよび７ＡＱ；
（３１）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣおよび７ＡＱ；
（３２）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦおよび７ＡＱ；
（３３）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７ＡＣおよび７ＡＱ；
（３４）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７ＡＣおよび７ＡＱ；
（３５）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７ＡＦおよび７ＡＱ；
（３６）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７ＡＦおよび７ＡＱ；
（３７）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｔおよび７ＡＱ；
（３８）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ
（３９）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（４０）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（４１）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（４２）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＭ，７ＡＪおよび７ＡＫ；
（４３）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（４４）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（４５）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（４６）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７ＡＭ，７ＡＪおよび７ＡＫ；
（４７）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｔ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（４８）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７ＡＦ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（４９）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７ＡＭ，７ＡＪおよび７ＡＫ；
（５０）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＬ，７ＡＰおよび７ＡＫ；
（５１）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＬ，７ＡＩ，７ＡＪおよび７ＡＫ；
（５２）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７Ｖおよび７ＡＯ；
（５３）７Ａ  ７Ｂ，７Ｌ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（５４）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（５５）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（５６）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（５７）７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（５８）７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（５９）７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（６０）７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（６１）７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（６２）７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（６３）７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（６４）７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（６５）７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖおよび７ＡＯ；
（６６）７Ｅ，７Ｑおよび７ＡＲ；
（６７）７Ｐ，７Ｙおよび７ＡＲ；
（６８）７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣおよび７ＡＱ；
（６９）７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣおよび７ＡＱ；
（７０）７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦおよび７ＡＱ；
（７１）７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（７２）７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（７３）７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（７４）７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＭ，７ＡＪおよび７ＡＫ；
（７５）７ＡＳ，７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（７６）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（７７）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（７８）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（７９）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（８０）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（８１）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（８２）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（８３）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑおよび７ＡＲ；
（８４）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙおよび７ＡＲ；
（８５）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣおよび７ＡＱ；
（８６）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣおよび７ＡＱ；
（８７）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦおよび７ＡＱ；
（８８）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（８９）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（９０）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＮおよび７ＡＫ；ならびに
（９１）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＭ，７ＡＪおよび７ＡＫ
から選択される経路を含み、
前記７Ａは３−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼであり、前記７Ｂはアセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼであり、前記７Ｃは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰデヒドラターゼであり、前記７Ｄはアセトアセチル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、前記７Ｅはアセトアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアセトアセチル−ＣｏＡシンテターゼであり、前記７Ｆはアセト酢酸レダクターゼ（酸還元）であり、前記７Ｈはアセトアセチル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、前記７Ｉはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存性，アルデヒド形成）であり、前記７Ｊはアセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、前記７Ｌは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、前記７Ｍは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、前記７Ｎは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、前記７Ｐはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）であり、前記７Ｑはアセト酢酸レダクターゼ（ケトン還元）であり、前記７Ｒは３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）であり、前記７Ｓは４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼであり、前記７Ｔはクロトニル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、前記７Ｕはクロトニル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、前記７Ｖはクロトニル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、前記７Ｘは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、前記７Ｙは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンテターゼであり、前記７Ｚは３−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、前記７ＡＢは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼであり、前記７ＡＣは３−ヒドロキシ酪酸デヒドラターゼであり、前記７ＡＤは３−ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドラターゼであり、前記７ＡＥはクロトニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、前記７ＡＦはクロトニル−ＣｏＡヒドロラーゼ、クロトニル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはクロトニル−ＣｏＡシンテターゼであり、前記７ＡＧはクロトン酸レダクターゼであり、前記７ＡＩはブチリル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、前記７ＡＪはブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、ブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼまたはブチリル−ＣｏＡシンテターゼであり、前記７ＡＫは酪酸デカルボキシラーゼであり、前記７ＡＬはクロトニル−ＡＣＰレダクターゼであり、前記７ＡＭはクロトニル−ＣｏＡレダクターゼであり、前記７ＡＮはクロトン酸レダクターゼであり、前記７ＡＯはクロトンアルデヒドデカルボニラーゼであり、前記７ＡＰはブチリル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、前記７ＡＱはクロトン酸デカルボキシラーゼであり、前記７ＡＲは３−ヒドロキシ酪酸デカルボキシラーゼであり、前記７ＡＳはアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼである、
非天然微生物体。
【請求項５９】
前記微生物体が、各々がプロピレン経路の酵素をコードしている２、３、４、５、６、７または８種類の外因性核酸を含むものである、請求項５８に記載の非天然微生物体。
【請求項６０】
前記微生物体が、（１）〜（９１）から選択される経路のうちの少なくとも１つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、請求項５９に記載の非天然微生物体。
【請求項６１】
前記少なくとも１種類の外因性核酸が異種核酸である、請求項５８に記載の非天然微生物体。
【請求項６２】
実質的に嫌気性の培養培地中に存在する、請求項５８に記載の非天然微生物体。
【請求項６３】
さらに：
（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、前記少なくとも１種類の外因性核酸がＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、シトリル−ＣｏＡシンテターゼ、シトリル−ＣｏＡリアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；
（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、前記少なくとも１種類の外因性核酸がピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または
（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸
を含む、請求項５８に記載の非天然微生物体。
【請求項６４】
（ｉ）を含む前記微生物体が、さらに、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、請求項６３に記載の非天然微生物体。
【請求項６５】
（ｉｉ）を含む前記微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、請求項６３に記載の非天然微生物体。
【請求項６６】
（ｉ）を含む前記微生物体が、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている３種類の外因性核酸を含むものである；
（ｉｉ）を含む前記微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ；ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；ＣＯデヒドロゲナーゼ；およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている４種類の外因性核酸を含むものである；または
（ｉｉｉ）を含む前記微生物体が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている２種類の外因性核酸を含むものである、
請求項６３に記載の非天然微生物体。
【請求項６７】
請求項５８〜６６のいずれか１項に記載の非天然微生物体を、プロピレンが生成される条件下で前記生成に充分な期間、培養することを含む、プロピレンを生成するための方法。
【請求項６８】
（ａ）充分な量の栄養素と培地中で、請求項４８〜５６のいずれか１項に記載の非天然微生物体を発酵により培養し、クロチルアルコールを生成させること；および
（ｂ）前記非天然微生物体を培養することによって生成したクロチルアルコールをブタジエンに変換させること
を含む、ブタジエンを生成するためのプロセス。
【請求項６９】
工程（ｂ）を触媒の存在下での化学的脱水によって行なう、請求項６８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１２年５月１０日に出願された米国仮出願第６１／６４５，５０９号、２０１１年９月１５日に出願された米国仮出願第６１／５３５，２６４号、２０１１年９月２日に出願された米国仮出願第６１／５３０，８８５号および２０１１年８月１９日に出願された米国仮出願第６１／５２５，６５９号（これらの全体の内容は、参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本発明は、一般的に生合成プロセス、より詳しくは、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成能を有する生物体に関する。
【０００３】
年間２５０億ポンドを超えるブタジエン（１，３−ブタジエン，ＢＤ）が生産され、ポリマー（合成ゴムおよびＡＢＳ樹脂など）ならびに化学薬品（ヘキサメチレンジアミンおよび１，４−ブタンジオールなど）の製造に適用されている。ブタジエンは、典型的には、石油原料、例えば、ナフサ、液化石油ガス、エタンまたは天然ガスをエチレンおよび他のオレフィンに変換させるための水蒸気分解過程の副生成物として生成する。ブタジエンを代替および／または再生可能原料から製造できることにより、より持続可能な化学製品製造プロセスを達成するための大きな進展が提示され得る。
【０００４】
再生可能源からブタジエンを生産するための考えられ得る方法の１つは、ジオール（１，４−ブタンジオールまたは１，３−ブタンジオールなど）を生成させるための糖質または他の原料の発酵を伴うものであり、該ジオールを分離し、精製し、次いで、金属系触媒作用を伴う第２工程で脱水させてブタジエンにする。再生可能原料からのブタジエンの直接発酵生産では脱水工程の必要性が排除され得、ブタジエンガス（沸点−４．４℃）が発酵槽から連続的に放出され得、容易に凝縮および収集され得る。発酵生産法の開発により化石系ブタジエンの必要性が排除され得、石油化学源由来ブタジエンと比べてコスト、エネルギーならびに有害な廃棄物および放出物のかなりの削減が可能となり得る。
【０００５】
２，４−ペンタジエノエートは、それ自体で有用な置換ブタジエン誘導体であり、また、例えばクルチウス転位によって得られ得る１−カルバモイル−１，３−ブタジエンなどの他の置換１，３−ブタジエン誘導体までの経路の重要な中間体である。得られるＮ−保護型１，３−ブタジエン誘導体は、置換アニリンの調製のためのディールス・アルダー反応に使用され得る。２，４−ペンタジエノエートは、種々のポリマーおよびコポリマーの調製に使用され得る。
【０００６】
１，３−ブタンジオール（１，３−ＢＤＯ）は炭素数が４のジオールであり、従来よりアセチレンからその水和によって生産される。得られたアセトアルデヒドを、次いで３−ヒドロキシブチルアルデヒド（ｂｕｔｙｒａｌｄｅｈｄｙｅ）に変換させ、続いて、これを還元すると１，３−ＢＤＯが形成される。さらに近年、アセチレンは、アセトアルデヒド源としてあまり高価でないエチレンに置き換えられてきている。１，３−ＢＤＯは、食品フレーバー剤用の有機溶媒として一般的に使用されている。また、これはポリウレタン樹脂およびポリエステル樹脂用のコモノマーとしても使用されており、血糖降下剤としても広く使用されている。光学活性１，３−ＢＤＯは、生物活性化合物および液晶の合成のための有用な出発物質である。１，３−ブタンジオールの商業的使用の一例は、その後に脱水し、合成ゴム（例えば、タイヤ）、ラテックスおよび樹脂を製造するために使用される２５０億ｌｂ／年の石油化学製品である１，３−ブタジエンを得ることである（非特許文献１；非特許文献２）。アセチレンまたはエチレンのいずれかを石油系原料に依存していることは、１，３−ブタンジオールおよびブタジエンまでの再生可能原料系の経路の開発の正当な理由となる。
【０００７】
３−ブテン−１−オールは、医薬品、農薬、香料および樹脂に使用される原材料である。３−ブテン−１−オールとハロゲン化アリールとのパラジウム触媒型カップリングは、アリール置換アルデヒド、例えば、抗葉酸化合物ペメトレキセド二ナトリウムなどの調製のための重要なプロセスである（非特許文献３および特許文献１）。３−ブテン−１−オールは、一般的にはプロピレンから調製され、触媒の存在下、高温高圧でアルデヒドを形成する。択一的には、これは、３，４−エポキシ−１−ブテンから調製される。再生可能原料からの３−ブテン−１−オールの調製は、これまでに示されていない。
【０００８】
プロピレンは、主に、精油の副生成物および炭化水素原料の水蒸気分解によるエチレン生産の副生成物として生成する。プロペンは分別蒸留によって、クラッキングおよび他の精製プロセスから得られた炭化水素混合物から分離される。典型的な炭化水素原料は、再生不能な化石燃料、例えば、石油、天然ガスおよびかなり程度は少ないが石炭に由来するものである。年間７５０億ポンドを超えるプロピレンが製造されており、エチレンに次いで２番目に大量に生産されている化石系化学薬品となっている。プロピレンは、広範なポリマー、ポリマー中間体および化学薬品に変換される基礎化学薬品である。化学薬品等級およびポリマー等級プロピレンの最も一般的な誘導体の一例は、ポリプロピレン、アクリル酸、ブタノール、ブタンジオール、アクリロニトリル、プロピレンオキシド、イソプロパノールおよびクメンである。プロピレン誘導体であるポリプロピレンのプラスチック（射出成形など）および繊維（カーペットなど）の生産における使用は、この誘導体の米国での消費の３分の１超を占めている。また、プロピレンは、合成ゴム生産にも、また、エーロゾル中の噴射剤または成分としても使用されている。
【０００９】
プロピレンを代替および／または再生可能原料から製造できることにより、より持続可能な化学製品製造プロセスを達成するための大きな進展が提示され得る。再生可能源からプロピレンを生産するための考えられ得る方法の１つは、アルコールである２−プロパノール（イソプロパノール）または１−プロパノールを生成させるための糖質または他の原料の発酵を伴うものであり、該アルコールを分離し、精製し、次いで、金属系触媒作用を伴う第２工程で脱水させてプロピレンにする。再生可能原料からのプロピレンの直接発酵生産では脱水の必要性が排除され得る。発酵生産中、プロピレンガスが発酵槽から連続的に放出され得、これは容易に収集および凝縮され得る。また、発酵生産法の開発により化石系プロピレンの必要性が排除され得、石油化学源由来プロピレンと比べてコスト、エネルギーならびに有害な廃棄物および放出物のかなりの削減が可能となり得る。
【００１０】
クロチルアルコール（２−ブテン−１−オールとも称される）は重要な化学中間体である。これは、さらにモノマー、ファインケミカル、農薬および医薬品の生産における化学中間体となるクロチルハライド、エステルおよびエーテルの前駆体として供される。例示的なファインケミカル製品としては、ソルビン酸、トリメチルヒドロキノン、クロトン酸および３−メトキシブタノールが挙げられる。また、クロチルアルコールは１，３−ブタジエンの前駆体でもある。クロチルアルコールは、現在、石油原料からしか生産されていない。例えば、特許文献２ならびに特許文献３、特許文献４および特許文献５には、１，２−エポキシブタンの異性化によるクロチルアルコールを生成するための方法が記載されている。
【００１１】
クロチルアルコールを代替および／または再生可能原料から製造できることにより、より持続可能な化学製品製造プロセスを達成するための大きな進展が提示され得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６，２６２，２６２号明細書
【特許文献２】特公昭４７−０１３００９号公報
【特許文献３】米国特許第３，０９０，８１５号明細書
【特許文献４】米国特許第３，０９０，８１６号明細書
【特許文献５】米国特許第３，５４２，８８３号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｉｃｈｉｋａｗａら，Ｊ．ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ａ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ（２００６）２５６：１０６〜１１２
【非特許文献２】Ｉｃｈｉｋａｗａら，Ｊ．ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ａ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ（２００５）２３１：１８１〜１８９
【非特許文献３】Ｒ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８９）３０，６６２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、商業量の２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールなどの化合物を有効に生産するための代替方法の必要性が存在している。本発明は、この必要性を満たし、また、関連する利点を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の概要
本発明は、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールを生成するのに充分な量で発現されるブタジエン経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有する２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を含めた非天然微生物体を提供する。本発明は、さらに、かかる微生物体を、本明細書に記載の２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を含めた非天然微生物体を２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールが生成される条件下で該生成に充分な期間、培養することにより、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールを作製するために使用する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、２−オキソアジペート、２−アミノアジペート、５−アミノペンタノエートおよびグルタリル−ＣｏＡから３−ブテン−１−オール、２，４−ペンタジエノエートおよびブタジエンまでの例示的な経路を示す。酵素は：Ａ．２−アミノアジピン酸デカルボキシラーゼ、Ｂ．５−アミノペンタン酸レダクターゼ、Ｃ．５−アミノペント−２−エン酸アミノトランスフェラーゼ、デヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼ、Ｄ．２−オキソアジピン酸デカルボキシラーゼ、Ｅ．グルタル酸セミアルデヒドレダクターゼ、Ｆ．５−ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼ、Ｇ．５−ヒドロキシペント−２−エン酸デヒドラターゼ、Ｈ．２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、デヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼ、Ｉ．５−アミノペンタン酸アミノトランスフェラーゼ、デヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼ、Ｊ．５−アミノペント−２−エン酸デアミナーゼ、Ｋ．５−ヒドロキシペント−２−エン酸レダクターゼ、Ｌ．５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡトランスフェラーゼおよび／またはシンテターゼ、Ｍ．５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、Ｎ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｏ．２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、Ｐ．５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはシンテターゼ、Ｑ．５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡデヒドラターゼ／デヒドロゲナーゼ、Ｒ．２−オキソアジピン酸デヒドロゲナーゼ、２−オキソアジピン酸：フェレドキシン（ｆｅｒｒｉｄｏｘｉｎ）オキシドレダクターゼまたは２−オキソアジピン酸ギ酸リアーゼ、Ｓ．グルタリル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｔ．２，４−ペンタジエン酸デカルボキシラーゼ、Ｕ．５−ヒドロキシペント−２−エン酸デカルボキシラーゼ、Ｖ．３−ブテン−１−オールデヒドラターゼまたは化学変換、Ｗ．５−ヒドロキシ吉草酸デカルボキシラーゼである。
【図２】図２は、アセチル−ＣｏＡから２，４−ペンタジエノエート前駆体グルタリル−ＣｏＡまでの例示的なカーボン・エフィシェント経路を示す。酵素は：Ａ．アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼまたはシンターゼ、Ｂ．アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｃ．３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｄ．グルタリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼである。
【図３】図３は、プロピオニル−ＣｏＡから２，４−ペンタジエノエートへの変換の例示的な経路を示す。酵素は：Ａ．３−オキソペンタノイル−ＣｏＡチオラーゼまたはシンターゼ、Ｂ．３−オキソペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、Ｃ．３−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、Ｄ．ペント−２−エノイル−ＣｏＡイソメラーゼ、Ｅ．ペント−３−エノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、Ｆ．２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、トランスフェラーゼまたはシンテターゼ、Ｇ．ペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼである。
【図４】図４は、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡからの１，３−ブタンジオール形成の例示的な経路を示す。酵素は：Ａ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡチオラーゼまたはシンターゼ、Ｂ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、トランスフェラーゼまたはシンテターゼ、Ｃ．３−オキソ−５−ヒドロキシペンタン酸デカルボキシラーゼおよびＤ．３−オキソブタノールレダクターゼである。
【図５】図５は、ピルベートおよびアセトアルデヒドから１，３−ブタンジオール（１３−ＢＤＯ）、３−ブテン−１−オールおよびブタジエンまでの例示的な経路を示す。酵素は：Ａ．４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸アルドラーゼ、Ｂ．４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸デヒドラターゼ、Ｃ．２−オキソペンテン酸デカルボキシラーゼ、Ｄ．３−ブテン−１−アールレダクターゼ、Ｅ．３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ、Ｆ．４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸デカルボキシラーゼ、Ｇ．３−ヒドロキシブタナールレダクターゼ、Ｈ．４−ヒドロキシ−２−オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ、４−ヒドロキシ−２−オキソペンタン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼまたは４−ヒドロキシ−２−オキソペンタン酸ギ酸リアーゼ、Ｉ．３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、Ｊ．３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、トランスフェラーゼまたはシンテターゼ、Ｋ．３−ヒドロキシ酪酸レダクターゼ、Ｌ．３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）である。また、工程Ｅは化学的脱水によっても触媒され得る。
【図６】図６は、２，４−ペンタジエノエートおよび２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡからブタジエンまでの例示的な経路を示す。酵素は：Ａ．２，４−ペンタジエン酸レダクターゼ（酸還元）、Ｂ．ペンタ−２，４−ジエナールデカルボニラーゼ、Ｃ．２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（酸還元）、Ｄ．２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡホスホトランスフェラーゼ、Ｅ．２，４−ペンタジエノイル−リン酸レダクターゼ、Ｆ．２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、トランスフェラーゼまたはシンテターゼ、Ｇ．２，４−ペンタジエン酸デカルボキシラーゼ、Ｈ．２，４−ペンタジエン酸キナーゼである。
【図７】図７は、マロニル−ＡＣＰからの１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールおよびプロピレンの形成の例示的な経路を示す。酵素（Ｅｎｙｚｍｅｓ）は：Ａ．３−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、Ｂ．アセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼ、Ｃ．３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰデヒドラターゼ、Ｄ．アセトアセチル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼ、Ｅ．アセトアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ、トランスフェラーゼまたはシンテターゼ、Ｆ．アセト酢酸レダクターゼ（酸還元）、Ｇ．３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）、Ｈ．アセトアセチル−ＡＣＰチオエステラーゼ、Ｉ．アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存性，アルデヒド形成）、Ｊ．アセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）、Ｋ．アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）、Ｌ．３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰチオエステラーゼ、Ｍ．３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）、Ｎ．３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、Ｏ．３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）、Ｐ．アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、Ｑ．アセト酢酸レダクターゼ（ケトン還元）、Ｒ．３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）、Ｓ．４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼ、Ｔ．クロトニル−ＡＣＰチオエステラーゼ、Ｕ．クロトニル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）、Ｖ．クロトニル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、Ｗ．クロトニル−ＣｏＡ（アルコール形成）、Ｘ．３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼ、Ｙ．３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、トランスフェラーゼまたはシンテターゼ、Ｚ．３−ヒドロキシ酪酸レダクターゼ、ＡＡ．３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ、ＡＢ．３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ、ＡＣ．３−ヒドロキシ酪酸デヒドラターゼ、ＡＤ．３−ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドラターゼ、ＡＥ．クロトニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼ、ＡＦ．クロトニル−ＣｏＡヒドロラーゼ、トランスフェラーゼまたはシンテターゼ、ＡＧ．クロトン酸レダクターゼ、ＡＨ．クロトンアルデヒドレダクターゼ、ＡＩ．ブチリル（ｂｕｔｒｙｌ）−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼ、ＡＪ．ブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼまたはシンテターゼ、ＡＫ．酪酸デカルボキシラーゼ、ＡＬ．クロトニル−ＡＣＰレダクターゼ、ＡＭ．クロトニル−ＣｏＡレダクターゼ、ＡＮ．クロトン酸レダクターゼ、ＡＯ．クロトンアルデヒドデカルボニラーゼ、ＡＰ．ブチリル−ＡＣＰチオエステラーゼ、ＡＱ．クロトン酸デカルボキシラーゼ、ＡＲ．３−ヒドロキシ酪酸デカルボキシラーゼ、ＡＳ．アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼである。ＡＣＰはアシルキャリアータンパク質である。
【図８】図８は、基質としての炭水化物上へのＣＯ２の固定のための逆ＴＣＡ回路を示す。酵素変換は、表示した酵素によって行なわれる。
【図９】図９は、アセチル−ＣｏＡへのシンガスの変換のための、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびヒドロゲナーゼと共役した逆ＴＣＡ回路の経路を示す。
【図１０】図１０は、１０マイクログラムのＡＣＳ９０（レーン１）、ＡＣＳ９１（レーン２）、Ｍｔａ９８／９９（レーン３および４）細胞抽出物のウエスタンブロットを、サイズ標準（レーン５）ならびにＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  ＣＯＤＨ（Ｍｏｔｈ＿１２０２／１２０３）またはＭｔｒ（Ｍｏｔｈ＿１１９７）タンパク質（５０、１５０、２５０、３５０，４５０，５００，７５０、９００および１０００ｎｇ）対照とともに示す。
【図１１】図１１は、ＣＯ酸化アッセイの結果を示す。細胞（ＣＯＤＨ／ＡＣＳオペロン；ＡＣＳ９０もしくはＡＣＳ９１または空ベクター：ｐＺＡ３３Ｓを有するＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａまたは大腸菌）を培養し、抽出物を調製した。アッセイは５５℃にて、該抽出物を調製した日の種々の時点で行なった。続いて、メチルビオロゲンの還元を５７８ｎｍにて、１２０秒間のタイムコースで行なった。
【図１２】図１２は、ブタジエンへのクロチルアルコールの変換の経路を示す。酵素は：Ａ．クロチルアルコールキナーゼ、Ｂ．２−ブテニル−４−リン酸キナーゼ、Ｃ．ブタジエンシンターゼ、およびＤ．クロチルアルコールジホスホキナーゼである。工程Ｅは非酵素的に触媒される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成的生成能を有する細胞および生物体の設計および作製に関する。本発明は、特に、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の酵素をコードしている１種類以上の核酸を導入することにより、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールを生成し得る微生物体の設計に関する。
【００１８】
一実施形態において、本発明では、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成的生成の代謝的設計を確認する大腸菌代謝のインシリコ化学量論的モデルを使用する。本明細書に記載の結果は、大腸菌および他の細胞または生物体において、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成が行なわれるように代謝経路が設計され、組換えにより操作され得ることを示す。例えばインシリコ設計のための２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成的生成は、設計された代謝遺伝子型を有する株の構築によって確認され得る。また、このような代謝が操作された細胞または生物体を適応進化に供すると、ブタジエン生合成がさらに増強され得る（例えば、理論最大増殖に近い条件下）。
【００１９】
一部の特定の実施形態において、設計した株が２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールを生合成する特質により、該株は、遺伝的に安定で連続的バイオプロセスに特に有用なものとなる。個々の株設計ストラテジーは、種々の非天然または異種反応能力を大腸菌または他の宿主生物体に組み込み、２−アミノアジペート、５−アミノペンタノエート、２−オキソアジペート、グルタリル−ＣｏＡ、アセチル−ＣｏＡ、プロピオニル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡまたはピルベートからの２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール生成代謝経路をもたらすことにより確認した。インシリコ代謝的設計により、微生物において、これらの各基質または代謝中間体から２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成がもたらされることが確認された。
【００２０】
プラットフォームのコンピュータ上の成分によって特定された株は、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成的生成あるいは他の中間体および／または下流産物がもたらされる予測される代謝改変（あれば）を遺伝子操作することにより、実際の生成が行なわれ得る。またさらなる実施形態では、これらの化合物の生合成的生成を示す株は、生合成の生成をさらに増強するためにさらなる適応進化に供され得る。また、適応進化後の生成物の生合成収量レベルは、該系のコンピュータ上の成分によって予測され得る。
【００２１】
グルコースからの最大理論２，４−ペンタジエノエート収量は１．０９ｍｏｌ／ｍｏｌ（０．５９ｇ／ｇ）である。
【００２２】
１１Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＝１２Ｃ５Ｈ６Ｏ２＋６ＣＯ２＋３０Ｈ２Ｏ
図１に示した経路により、使用したグルコース１モルあたり０．８５モル収量の２，４−ペンタジエノエートが得られる。生成物収量の増大は、細胞がＣＯ２を還元的（もしくは逆）ＴＣＡ回路またはＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路などの経路によって固定し得る場合に可能である。また、図１に示した経路を有するように操作された生物体では、ほぼ理論最大２，４−ペンタジエノエート収量を達成することが可能である。
【００２３】
グルコースからの最大理論ブタジエン収量は１．０９ｍｏｌ／ｍｏｌ（０．３２７ｇ／ｇ）である。
【００２４】
１１Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＝１２Ｃ４Ｈ６＋１８ＣＯ２＋３０Ｈ２Ｏ
図１に示した経路により、使用したグルコース１モルあたり０．８５モル収量のブタジエンが得られる。ほぼ理論最大値までの生成物収量の増大は、細胞がＣＯ２を還元的（もしくは逆）ＴＣＡ回路またはＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路などの経路によって固定し得る場合に可能である。また、図５、６または図１に示した経路を図１２に示した経路との組合せで有するように操作された生物体では、ほぼ理論最大ブタジエン収量を達成することが可能である。
【００２５】
グルコースからの最大理論１，３−ブタンジオール収量は１．０９ｍｏｌ／ｍｏｌ（０．５４ｇ／ｇ）である。
【００２６】
１１Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＝１２Ｃ４Ｈ１０Ｏ２＋１８ＣＯ２＋６Ｈ２Ｏ
図５に示した経路により、使用したグルコース１モルあたり１モル収量の１，３−ブタンジオールが得られる。理論最大値までの生成物収量の増大は、細胞がＣＯ２を還元的（もしくは逆）ＴＣＡ回路またはＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路などの経路によって固定し得る場合に可能である。また、図７に示した経路を有するように操作された生物体では、理論最大１，３−ブタンジオール収量を達成することが可能である。
【００２７】
グルコースからの最大理論３−ブテン−１−オール収量は１．０９ｍｏｌ／ｍｏｌ（０．４３７ｇ／ｇ）である。
【００２８】
１１Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＝１２Ｃ４Ｈ８Ｏ＋１８ＣＯ２＋１８Ｈ２Ｏ
図１に示した経路により、使用したグルコース１モルあたり０．８５モル収量の３−ブテン−１−オールが得られる。ほぼ理論最大値までの生成物収量の増大は、細胞がＣＯ２を還元的（もしくは逆）ＴＣＡ回路またはＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路などの経路によって固定し得る場合に可能である。また、図５に示した経路を有するように操作された生物体では、ほぼ理論最大ブタジエン収量を達成することが可能である。
【００２９】
グルコースからの最大理論クロチルアルコール収量は１．０９ｍｏｌ／ｍｏｌ（０．４３６ｇ／ｇ）である。
【００３０】
１１Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＝１２Ｃ４Ｈ８Ｏ＋１８ＣＯ２＋１８Ｈ２Ｏ
図７に示した経路により、使用したグルコース１モルあたり１．０８モル収量のクロチルアルコールが得られる。理論最大値までの生成物収量の増大は、細胞がＣＯ２を還元的（もしくは逆）ＴＣＡ回路またはＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路などの経路によって固定し得る場合に可能である。
【００３１】
グルコースからの最大理論プロピレン収量は１．３３ｍｏｌ／ｍｏｌ（０．３１ｇ／ｇ）である。
【００３２】
３Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＝４Ｃ４Ｈ８Ｏ＋６ＣＯ２＋６Ｈ２Ｏ
図７に示した経路により、使用したグルコース１モルあたり１．２モル収量のプロピレンが得られる。ほぼ理論最大値までの生成物収量の増大は、細胞がＣＯ２を還元的（もしくは逆）ＴＣＡ回路またはＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路などの経路によって固定し得る場合に可能である。
【００３３】
本明細書で用いる場合、本発明の微生物体または微生物に関して使用している場合の用語「非天然」は、該微生物体が、言及している種の天然に存在する株（例えば、言及している種の野生型株）には通常みられない少なくとも１つの遺伝子改変を有していることを意味していることを意図する。遺伝子改変としては、例えば、代謝ポリペプチドをコードしている発現可能な核酸が導入される修飾、他の核酸付加、核酸欠失および／または微生物体の遺伝物質の他の機能破壊が挙げられる。かかる修飾としては、例えば、言及している種の異種ポリペプチド、同種ポリペプチド、または異種ポリペプチドと同種ポリペプチドの両方のコード領域およびその機能性断片が挙げられる。さらなる修飾としては、例えば、修飾によって遺伝子またはオペロンの発現が改変される非コード調節領域が挙げられる。例示的な代謝ポリペプチドとしては、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成経路内の酵素またはタンパク質が挙げられる。
【００３４】
代謝的修飾は、天然に存在する状態から改変される生化学反応をいう。したがって、非天然微生物は、代謝ポリペプチドをコードしている核酸またはその機能性断片に対する遺伝子修飾を有するものであり得る。例示的な代謝的修飾は本明細書に開示している。
【００３５】
本明細書で用いる場合、微生物体に関して使用している場合の用語「単離された」は、生物体が、言及している微生物体が自然界にみられる場合の少なくとも１種類の成分を実質的に含有していないことを意味していることを意図する。該用語は、微生物体が、天然環境においてみられるときの一部またはすべての成分から取り出されていることから取り出されていることを包含している。また、該用語は、微生物体が、該微生物体が非天然環境においてみられるときの一部またはすべての成分から取り出されていることも包含している。したがって、単離された微生物体は、自然界にみられるとき、または非天然環境において培養、保存もしくは存在しているときの他の物質から一部または完全に分離されている。単離された微生物体の具体例としては、一部純粋な微生物、実質的に純粋な微生物および非天然である培地中で培養された微生物が挙げられる。
【００３６】
本明細書で用いる場合、用語「微生物の」、「微生物体」または「微生物」は、微視的細胞として存在し、古細菌ドメイン、細菌ドメインまたは真核生物ドメインに含まれる任意の生物体を意味していることを意図する。したがって、該用語は、微視的サイズを有する原核生物または真核生物の細胞または生物体を包含していることを意図し、あらゆる種の細菌、古細菌および真正細菌ならびに真核生物性微生物（酵母および真菌など）を包含している。また、該用語は、生化学物質の作製のために培養され得る任意の種の細胞培養物も包含している。
【００３７】
本明細書で用いる場合、用語「ＣｏＡ」または「コエンザイムＡ」は、その存在が活性酵素系を形成するための多くの酵素（アポ酵素）の活性に必要とされる有機補因子または補欠分子族（酵素の非タンパク質部分）を意味していることを意図する。コエンザイムＡは、一部の特定の縮合酵素において機能を果たし、アセチルまたは他のアシル基転移ならびに脂肪酸の合成および酸化、ピルベートの酸化ならびに他のアセチル化において作用する。
【００３８】
本明細書で用いる場合、用語「ＡＣＰ」または「アシルキャリアータンパク質」は、細菌から植物までにわたる多くの生物体の脂肪酸シンターゼ系と会合している比較的小型の任意の酸性タンパク質をいう。ＡＣＰは、リン酸エステル結合によってセリン残基のヒドロキシル基に共有結合している１つの４’−ホスホパンテテイン補欠分子族を含有したものであり得る。４’−ホスホパンテテイン部分のスルフヒドリル基は、アシル中間体が脂肪酸合成の際に（チオ）エステル化されるアンカー部（ａｎｃｈｏｒ）としての機能を果たす。ＡＣＰの一例は、７７個のアミノ酸残基（８．８５ｋＤａ）を含み、ホスホパンテテイン基がセリン３６に結合している独立した単独（ｓｅｐａｒａｔｅ  ｓｉｎｇｌｅ）タンパク質である大腸菌ＡＣＰである。
【００３９】
本明細書で用いる場合、用語「ブタジエン」（分子式Ｃ４Ｈ６および５４．０９ｇ／ｍｏｌの分子量を有する（図１，５，６および１２参照）（ＩＵＰＡＣ名ブタ−１，３−ジエン））は、全体を通して、１，３−ブタジエン、ビエチレン、エリトレン、ジビニル、ビニルエチレンと互換的に用いている。ブタジエンは、弱い芳香族またはガソリン様の臭気を有する無色で非腐食性の液化ガスである。ブタジエンは、その低引火点のため爆発性であるとともに可燃性である。
【００４０】
本明細書で用いる場合、培養条件または増殖条件に関して使用している場合の用語「実質的に嫌気性」は、酸素の量が、液体培地中の溶存酸素について飽和の約１０％未満であることを意味していることを意図する。また、該用語は、約１％未満の酸素の雰囲気で維持された液体培地または固形培地の密封チャンバも包含していることを意図する。
【００４１】
「外因性」は、本明細書で用いる場合、言及している分子または言及している活性が宿主微生物体に導入されたものであることを意味していることを意図する。該分子は、例えば、宿主遺伝物質中へのコード核酸の導入によって（例えば、宿主の染色体内への組込みにより、または非染色体遺伝物質（プラスミドなど）として）導入され得る。したがって、該用語は、コード核酸の発現に関して使用している場合、微生物体への発現可能な形態でのコード核酸の導入をいう。生合成活性に関して使用している場合、該用語は、活性が、言及している宿主生物体に導入されたものであることをいう。供給源は、例えば、宿主微生物体への導入後に言及している活性を発揮させる同種または異種コード核酸であり得る。したがって、用語「内因性」は、言及している分子または活性が宿主内に存在していることをいう。同様に、コード核酸の発現に関して使用している場合の該用語は、微生物体に含有されているコード核酸の発現をいう。用語「異種」は、分子または活性が言及している種以外の供給源に由来していることをいい、一方、「同種」は、分子または活性が該宿主微生物体に由来していることをいう。したがって、本発明のコード核酸の外因性発現は、異種コード核酸または同種コード核酸のいずれかまたは両方を使用したものであり得る。
【００４２】
１種類より多くの外因性核酸が微生物体に含まれている場合、該１種類より多くの外因性核酸は、言及しているコード核酸または生合成活性（上記に論考）を示していることは理解されよう。さらに、本明細書に開示のように、かかる１種類より多くの外因性核酸は、宿主微生物体の別々の核酸分子に導入されても、多シストロン性核酸分子に導入されても、その組合せに導入されてもよく、なお１種類より多くの外因性核酸とみなされ得ることは理解されよう。例えば、本明細書に開示のように、微生物体は、所望の経路の酵素またはタンパク質をコードしている２種類以上の外因性核酸を発現する操作され得る。所望の活性をコードしている２種類の外因性核酸が宿主微生物体に導入される場合、該２種類の外因性核酸は、単一の核酸として例えば単一のプラスミドで導入してもよく、別々のプラスミドで導入してもよく、宿主の染色体の単一の部位または多数の部位に組み込んでもよく、なお２種類の外因性核酸とみなされ得ることは理解されよう。同様に、２種類より多くの外因性核酸は宿主生物体に、任意の所望の組合せで、例えば、単一のプラスミドで導入してもよく、別々のプラスミドで導入してもよく、宿主の染色体の単一の部位または多数の部位に組み込んでもよく、なお２種類以上の外因性核酸（例えば、３種類の外因性核酸）とみなされ得ることは理解されよう。したがって、言及している外因性核酸または生合成活性の数は、コード核酸の数または生合成活性の数を示しており、宿主生物体に導入された別々の核酸の数を示しているのではない。
【００４３】
本発明の非天然微生物（ｍｉｃｒｏｂａｌ）体は安定な遺伝子改変を含むものであり得、安定な遺伝子改変とは、微生物が該改変の喪失なく５世代より後まで培養されたものであり得ることをいう。一般的に、安定な遺伝子改変としては、１０世代より後まで持続している修飾が挙げられ、特に安定な修飾は約２５世代より多く持続しているものであり、より特別には、安定な遺伝子修飾は５０世代より後（例えば、無限）のものである。
【００４４】
当業者には、遺伝子改変（例えば、本明細書に例示した代謝的修飾）は、適当な宿主生物体（大腸菌など）およびその対応する代謝反応または所望の遺伝物質（所望の代謝経路の遺伝子など）の適当な供給源生物体に関して記載したものであることが理解されよう。しかしながら、さまざまな生物体の完全なゲノム配列決定およびゲノミクス分野における高レベルの技術に鑑みて、当業者は、本明細書に示した教示および手引きを本質的にすべての他の生物体に容易に適用することができよう。例えば、本明細書に例示した大腸菌代謝改変は他の種に、言及している種以外の種に由来する同じまたはアナロガスなコード核酸を組み込むことによって容易に適用され得る。かかる遺伝子改変としては、例えば、一般にはホモログ種の遺伝子改変、特に、オーソログ、パラログまたは非オーソロガス遺伝子の置換が挙げられる。
【００４５】
オーソログは、直系で（ｂｙ  ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｄｅｓｃｅｎｔ）関連しており、異なる生物体において実質的に同じまたは同一の機能を担っている遺伝子（１つまたは複数）である。例えば、マウスエポキシドヒドロラーゼおよびヒトエポキシドヒドロラーゼはエポキシドを加水分解する生物学的機能についてオーソログとみなされ得る。遺伝子は、例えば、相同であることが示されるのに充分な量の配列類似性を共有しているか、または共通の祖先からの進化によって関連している場合、直系で関連している。また、遺伝子は、一次配列の類似性が確認可能でない程度まで共通の祖先から進化したことが示されるのに充分な量の３次元構造を共有している（が必ずしも配列類似性を共有していない）場合もオーソログとみなされ得る。オーソロガスである遺伝子は、約２５％〜１００％のアミノ酸配列同一性の配列類似性を有するタンパク質をコードしたものであり得る。また、２５％未満のアミノ酸類似性を共有しているタンパク質をコードしている遺伝子は、３次元構造でも類似性が示された場合、直系で派生したものであるとみなされ得る。セリンプロテアーゼファミリーの構成員の酵素（例えば、組織プラスミノゲン活性化因子およびエラスターゼ）は、共通の祖先から直系で派生したものであるとみなされる。
【００４６】
オーソログには、例えば進化による構造または全般活性が分岐した遺伝子またはそのコードされた遺伝子産物が包含される。例えば、第１の種が２つの機能を示す遺伝子産物をコードしており、かつかかる機能が第２の種において相違する遺伝子に分離している場合、該３つの遺伝子およびその対応する産物はオーソログであるとみなされる。生化学的生成物の作製の場合、当業者には、導入または破壊対象の代謝活性を有するオーソロガス遺伝子が非天然微生物の構築に選択されることが理解されよう。分離され得る活性を示すオーソログの一例は、相違する活性が２種類以上の種間または単一の種内の相違する遺伝子産物に分離されている場合である。具体的な一例は、２つの型のセリンプロテアーゼ活性であるエラスターゼタンパク質分解とプラスミノゲンタンパク質分解の相違する分子内へのプラスミノゲン活性化因子とエラスターゼとしての分離である。第２の例は、マイコプラズマ５’−３’エキソヌクレアーゼとＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性の分離である。第１の種由来のＤＮＡポリメラーゼは、第２の種由来のエキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼのいずれかまたは両方のオーソログとみなされ得、逆も同様である。
【００４７】
対照的に、パラログは、例えば進化的分岐後の重複によって関連しているホモログであり、同様または共通しているが同一でない機能を有する。パラログは、例えば同じ種または異なる種に起源を有するもの、または由来するものであり得る。例えば、ミクロソームエポキシドヒドロラーゼ（エポキシドヒドロラーゼＩ）と可溶性エポキシドヒドロラーゼ（エポキシドヒドロラーゼＩＩ）は、共通の祖先から共進化し、相違する反応を触媒し、同じ種において相違する機能を有する相違する２種類の酵素であるためパラログとみなされ得る。パラログは、相同であるか、または共通の祖先からの共進化によって関連していることが示される互いに有意な配列類似性を有する同じ種に由来するタンパク質である。パラロガスなタンパク質ファミリーの群としては、ＨｉｐＡホモログ、ルシフェラーゼ遺伝子、ペプチダーゼなどが挙げられる。
【００４８】
非オーソロガス遺伝子置換は、ある種に由来する非オーソロガス遺伝子が、異なる種の言及している遺伝子機能と置換可能なことである。置換としては、例えば、言及している機能が、異なる種における場合と比べて元の種において、実質的に同じまたは同様の機能が発揮され得ることが挙げられる。一般的に、非オーソロガス遺伝子置換は、言及している機能をコードしている既知遺伝子と構造的に関連している場合に特定可能であるが、とはいえ、構造的な関連性は低いが機能的に同様の遺伝子およびその対応遺伝子産物もなお、本明細書で用いる場合の該用語の意味に包含される。機能的類似性には、例えば、置換対象の機能をコードしている遺伝子と比べて非オーソロガス遺伝子産物の活性部位または結合領域における少なくとも一部の構造的類似性が必要とされる。したがって、非オーソロガス遺伝子には、例えば、パラログまたは非関連遺伝子が包含される。
【００４９】
したがって、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成能を有する本発明の非天然微生物体の同定および構築において、当業者には、本明細書に示した教示および手引きを具体的な種に適用することで、代謝的修飾の確認にオーソログの確認および内包または不活性化が包含され得ることが理解されよう。また、同様または実質的に同様の代謝反応を触媒する酵素をコードしているパラログおよび／または非オーソロガス遺伝子置換が、言及している微生物に存在する限り、当業者は、このような進化上関連している遺伝子を利用することができよう。
【００５０】
オーソログ、パラログおよび非オーソロガス遺伝子置換は、当業者によく知られた方法によって調べることができる。例えば、２つのポリペプチドの核酸またはアミノ酸の配列を調べると、比較対象の配列間の配列の同一性および類似性が明らかになる。かかる類似性に基づき、当業者は、該類似性が、そのタンパク質が共通の祖先からの進化によって関連していることが示されるのに充分高度であるかどうかを判定することができよう。当業者によく知られたアルゴリズム、例えば、Ａｌｉｇｎ、ＢＬＡＳＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗなどにより、未加工の配列が比較され、類似性または同一性が調べられ、またウェイトまたはスコアを割り付けてもよい配列内のギャップ存在または有意性が調べられる。また、かかるアルゴリズムは当該技術分野で知られており、ヌクレオチド配列の類似性または同一性を調べるのに同様に適用可能である。関連性の判定に充分な類似性のためのパラメータは、統計学的類似性の計算のためのよく知られた方法またはランダムポリペプチドにおいて同様のマッチングがみられる可能性に基づいてコンピュータ処理され、マッチングの有意性が判定される。また、２つ以上の配列のコンピュータでの比較は、所望により、当業者によって視覚的に最適化され得る。関連する遺伝子産物またはタンパク質は、高い類似性、例えば２５％〜１００％の配列同一性を有することが予測され得る。非関連であるタンパク質は、充分なサイズのデータベースをスキャンした場合に偶然に起こることが予測され得るものと本質的に同じ同一性（約５％）を有するものであり得る。５％〜２４％の配列は、比較対象の配列が関連していると結論付けるのに充分な相同性を示す場合もあり、示さない場合もあり得る。該サイズのデータセットで示されたかかるマッチングの有意性を判定するため、さらなる統計学的解析を行ない、これらの配列の関連を調べてもよい。
【００５１】
例えばＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて２つ以上の配列の関連性を判定するための例示的なパラメータは、以下に示すとおりであり得る。簡単には、アミノ酸配列のアラインメントは、ＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．８（１９９９年１月５日）および以下のパラメータ：マトリックス：０  ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップ開始：１１；ギャップ伸長：１；ｘ＿ドロップオフ（ｄｒｏｐｏｆｆ）：５０；イクスペクト（ｅｘｐｅｃｔ）：１０．０；ワードサイズ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）：３；フィルター：オンを用いて行なわれ得る。核酸配列のアラインメントは、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．６（１９９８年９月１６日）および以下のパラメータ：マッチ：１；ミスマッチ：−２；ギャップ開始：５；ギャップ伸長：２；ｘ＿ドロップオフ：５０；イクスペクト：１０．０；ワードサイズ：１１；フィルター：オフを用いて行なわれ得る。当業者には、例えば、比較のストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）を上げるか下げるかのいずれかのため、および２つ以上の配列の関連性を判定するために、上記のパラメータに対してどのような改良を行なうとよいかがわかるであろう。
【００５２】
一部の実施形態において、本発明は、２，４−ペンタジエノエートを生成するのに充分な量で発現される２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有する２，４−ペンタジエノエート経路を有する微生物体を有する非天然微生物体であって、該２，４−ペンタジエノエート経路は：（１）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋおよび１Ｇ；（２）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆおよび１Ｇ；（３）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐおよび１Ｇ；（４）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂおよび１Ｊ；（５）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎおよび１Ｏ；（６）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎおよび１Ｏ；（７）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎおよび１Ｏ；（８）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑおよび１Ｏ；（９）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋおよび１Ｇ；（１０）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆおよび１Ｇ；（１１）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂおよび１Ｊ；（１２）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎおよび１Ｏ；（１３）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎおよび１Ｏ；（１４）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎおよび１Ｏ；（１５）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑおよび１Ｏ；（１６）１Ｂ，１Ｃ，１Ｋおよび１Ｇ；（１７）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆおよび１Ｇ；（１８）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐおよび１Ｇ；（１９）１Ｂおよび１Ｊ；（２０）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎおよび１Ｏ；（２１）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎおよび１Ｏ；（２２）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑおよび１Ｏ；（２３）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｄ，３Ｅおよび３Ｆ；ならびに（２４）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｇおよび３Ｆから選択される図１および／または３に示す経路を含み、該１Ｂは５−アミノペンタン酸レダクターゼであり、該１Ｃは５−アミノペント−２−エン酸アミノトランスフェラーゼ、５−アミノペント−２−エン酸デヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼであり、該１Ｄは２−オキソアジピン酸デカルボキシラーゼであり、該１Ｅはグルタル酸セミアルデヒドレダクターゼであり、該１Ｆは５−ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼであり、該１Ｇは５−ヒドロキシペント−２−エン酸デヒドラターゼであり、該１Ｉは５−アミノペンタン酸アミノトランスフェラーゼ、５−アミノペンタン酸デヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼであり、該１Ｊは５−アミノペント−２−エン酸デアミナーゼであり、該（ｗｈｅｒｉｎ）１Ｋは５−ヒドロキシペント−２−エン酸レダクターゼであり、該１Ｌは５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡシンテターゼであり、該１Ｍは５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、該１Ｎは５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼであり、該１Ｏは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡシンテターゼまたは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡヒドロラーゼであり、該１Ｐは５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼであり、該１Ｑは５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡデヒドラターゼ／デヒドロゲナーゼであり、該１Ｓはグルタリル−ＣｏＡレダクターゼであり、該３Ａは３−オキソペンタノイル−ＣｏＡチオラーゼまたは３−オキソペンタノイル−ＣｏＡシンターゼであり、該３Ｂは３−オキソペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼであり、該３Ｃは３−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼであり、該３Ｄはペント−２−エノイル−ＣｏＡイソメラーゼであり、該３Ｅはペント−３−エノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、該３Ｆは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡシンテターゼであり、該３Ｇはペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼである非天然微生物体を提供する。
【００５３】
本発明の一部の態様では、該微生物体は、各々が２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードしている２、３、４、５、６、７、８、９または１０種類の外因性核酸を含むものであり得る。本発明の一部の態様では、該微生物体は、上記の（１）〜（２４）から選択される経路のうちの少なくとも１つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものであり得る。一部の態様では、該少なくとも１種類の外因性核酸は異種核酸である。一部の態様では、該非天然微生物体を実質的に嫌気性の培養培地中に存在する。
【００５４】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の非天然微生物体であって、上記の（９）〜（１５）から選択される２，４−ペンタジエノエート経路を有する非天然微生物体が、さらに、グルタリル−ＣｏＡを生成するのに充分な量で発現されるグルタリル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有するグルタリル−ＣｏＡ経路を含むものであり、該グルタリル−ＣｏＡ経路が：アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼもしくはアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ；アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ；およびグルタリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；または２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、２−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼもしくは２−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼ；および２−オキソアジピン酸デヒドロゲナーゼ、２−オキソアジピン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼもしくは２−オキソアジピン酸ギ酸リアーゼから選択される経路を有する非天然微生物体を提供する。
【００５５】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の非天然微生物体であって、上記の（１６）〜（２２）から選択される２，４−ペンタジエノエート経路を有する非天然微生物体が、さらに、５−アミノペンタノエートを生成するのに充分な量で発現される５−アミノペンタノエート経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有する５−アミノペンタノエート経路を含むものであり、該５−アミノペンタノエート経路が２−アミノアジピン酸デカルボキシラーゼ；または２−アミノアジピン酸デカルボキシラーゼおよび２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、２−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼもしくは２−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼを有するものである非天然微生物体を提供する。
【００５６】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の非天然微生物体であって、上記の（１）〜（８）から選択される２，４−ペンタジエノエート経路を有する非天然微生物体が、さらに、２−オキソアジペートを生成するのに充分な量で発現される２−オキソアジペート経路の酵素をコードしている外因性核酸を有する２−オキソアジペート経路を含むものであり、該２−オキソアジペート経路が２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、２−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼもしくは２−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼを有するものである非天然微生物体を提供する。
【００５７】
一部の実施形態において、本発明は、２，４−ペンタジエノエートを生成するのに充分な量で発現される２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有する２，４−ペンタジエノエート経路を有する非天然微生物体であって、該２，４−ペンタジエノエート経路は、上記の経路を含み、さらに：（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有し、該少なくとも１種類の外因性核酸がＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有し、該少なくとも１種類の外因性核酸がピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている（ｅｎｃｏｄｅｓ）少なくとも１種類の外因性核酸を有するものである非天然微生物体を提供する。
【００５８】
一部の態様では、上記の（ｉ）を有する該微生物体が、さらに、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである。一部の態様では、（ｉｉ）を有する該微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである。一部の態様では、上記の（ｉ）を有する該微生物体が、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている４種類の外因性核酸を含むものである；上記の（ｉｉ）を有する該微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている５種類の外因性核酸を含むものである；または上記の（ｉｉｉ）を有する該微生物体が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている２種類の外因性核酸を含むものである。
【００５９】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の非天然微生物体を、２，４−ペンタジエノエートが生成される条件下で該生成に充分な期間、培養することを有する、２，４−ペンタジエノエートを生成するための方法を提供する。
【００６０】
一部の実施形態において、本発明は、ブタジエンを生成するのに充分な量で発現されるブタジエン経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有するブタジエン経路を有する微生物体を有する非天然微生物体であって、該ブタジエン経路は：（１）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇおよび１Ｔ；（２）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇおよび１Ｔ；（３）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇおよび１Ｔ；（４）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｊおよび１Ｔ；（５）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏおよび１Ｔ；（６）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏおよび１Ｔ；（７）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏおよび１Ｔ；（８）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏおよび１Ｔ；（９）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｕおよび１Ｖ；（１０）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｕおよび１Ｖ；（１１）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｕおよび１Ｖ；（１２）１Ｄ，１Ｅ，１Ｗおよび１Ｖ；（１３）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ａおよび６Ｂ；（１４）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ａおよび６Ｂ；（１５）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇ，６Ａおよび６Ｂ；（１６）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｊ，６Ａおよび６Ｂ；（１７）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；（１８）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；（１９）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；（２０）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；（２１）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；（２２）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；（２３）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；（２４）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｊ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；（２５）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；（２６）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；（２７）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；（２８）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；（２９）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｃおよび６Ｂ；（３０）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｃおよび６Ｂ；（３１）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，６Ｃおよび６Ｂ；（３２）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，６Ｃおよび６Ｂ；（３３）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；（３４）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；（３５）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；（３６）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；（３７）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｃおよび６Ｂ；（３８）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｃおよび６Ｂ；（３９）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｃおよび６Ｂ；（４０）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；（４１）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；（４２）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；（４３）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇおよび１Ｔ；（４４）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇおよび１Ｔ；（４５）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｊおよび１Ｔ；（４６）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏおよび１Ｔ；（４７）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏおよび１Ｔ；（４８）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏおよび１Ｔ；（４９）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏおよび１Ｔ；（５０）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｕおよび１Ｖ；（５１）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｕおよび１Ｖ；（５２）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｕおよび１Ｖ；（５３）１Ｓ，１Ｅ，１Ｗおよび１Ｖ；（５４）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ａおよび６Ｂ；（５５）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ａおよび６Ｂ；（５６）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｊ，６Ａおよび６Ｂ；（５７）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；（５８）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；（５９）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；（６０）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；（６１）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；（６２）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；（６３）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｊ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；（６４）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；（６５）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；（６６）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；（６７）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；（６８）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｃおよび６Ｂ；（６９）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｃおよび６Ｂ；（７０）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，６Ｃおよび６Ｂ；（７１）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，６Ｃおよび６Ｂ；（７２）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；（７３）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；（７４）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；（７５）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；（７６）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｃおよび６Ｂ；（７７）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｃおよび６Ｂ；（７８）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；（７９）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；（８０）１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇおよび１Ｔ；（８１）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇおよび１Ｔ；（８２）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇおよび１Ｔ；（８３）１Ｂ，１Ｊおよび１Ｔ；（８４）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏおよび１Ｔ；（８５）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏおよび１Ｔ；（８６）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏおよび１Ｔ；（８７）１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｕおよび１Ｖ；（８８）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｕおよび１Ｖ；（８９）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｕおよび１Ｖ；（９０）１Ｉ，１Ｅ，１Ｗおよび１Ｖ；（９１）１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ａおよび６Ｂ；（９２）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ａおよび６Ｂ；（９３）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇ，６Ａおよび６Ｂ；（９４）１Ｂ，１Ｊ，６Ａおよび６Ｂ；（９５）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；（９６）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；（９７）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；（９８）１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；（９９）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；（１００）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；（１０１）１Ｂ，１Ｊ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；（１０２）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；（１０３）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；（１０４）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；（１０５）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｃおよび６Ｂ；（１０６）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，６Ｃおよび６Ｂ；（１０７）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，６Ｃおよび６Ｂ；（１０８）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；（１０９）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；（１１０）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；（１１１）１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｃおよび６Ｂ；（１１２）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｃおよび６Ｂ；（１１３）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｃおよび６Ｂ；（１１４）１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；（１１５）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；（１１６）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；（１１７）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｄ，３Ｅ，３Ｆおよび１Ｔ；（１１８）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｄ，３Ｅ，３Ｆ，６Ａおよび６Ｂ；（１１９）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｄ，３Ｅ，３Ｆ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；（１２０）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｄ，３Ｅ，６Ｃおよび６Ｂ；（１２１）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｄ，３Ｅ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；ならびに（１２２）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｇ，３Ｆおよび１Ｔ；（１２３）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｇ，３Ｆ，６Ａおよび６Ｂ；（１２４）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｇ，３Ｆ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；（１２５）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｇ，６Ｃおよび６Ｂ；（１２６）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｇ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；（１２７）５Ａ，５Ｂ，５Ｃ，５Ｄおよび５Ｅ；（１２８）７Ａ，７Ｊ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１２９）７Ａ，７Ｈ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１３０）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１３１）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１３２）７Ａ，７Ｄ，７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１３３）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１３４）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１３５）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１３６）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１３７）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１３８）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１３９）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１４０）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１４１）７Ａ，７Ｂ，７Ｍ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１４２）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１４３）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１４４）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１４５）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１４６）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１４７）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１４８）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｕ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１４９）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｔ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１５０）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１５１）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｗ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１５２）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７Ｗ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１５３）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７Ｗ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１５４）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７Ｖ，７ＡＨ；，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ（１５５）７Ａ，７Ｊ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１５６）７Ａ，７Ｈ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１５７）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１５８）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１５９）７Ａ，７Ｄ，７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１６０）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１６１）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１６４）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１６３）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１６４）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄ
および１２Ｃ；（１６５）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１６６）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１６７）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１６８）７Ａ，７Ｂ，７Ｍ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１６９）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１７０）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１７１）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１７２）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１７３）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１７４）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１７５）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｕ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１７６）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｔ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１７７）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１７８）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｗ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１７９）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７Ｗ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１８０）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７Ｗ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１８１）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１８２）７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１８３）７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１８４）７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１８５）７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１８６）７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１８７）７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１８８）７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１８９）７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１９０）７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１９１）７Ｐ，７ＡＢ，７Ｗ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（１９２）７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１９３）７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１９４）７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１９５）７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１９６）７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１９７）７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１９８）７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（１９９）７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（２００）７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（２０１）７Ｐ，７ＡＢ，７Ｗ，１２Ｄおよび１２Ｃ，（２０２）７ＡＳ，７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（２０３）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（２０４）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（２０５）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（２０６）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（２０７）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（２０８）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（２０９）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（２１０）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（２１１）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｗ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；（２１２）７ＡＳ，７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（２１３）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（２１４）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（２１５）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（２１６）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（２１７）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（２１８）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（２１９）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；（２２０）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；ならびに（２２１）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｗ，１２Ｄおよび１２Ｃから選択される図１、３，５、６および／または１２に示す経路を含み、該１Ｂは５−アミノペンタン酸レダクターゼ、５−アミノペント−２−エン酸アミノトランスフェラーゼ、５−アミノペント−２−エン酸デヒドロゲナーゼまたは５−アミノペント−２−エン酸アミンオキシダーゼであり、該１Ｄは２−オキソアジピン酸デカルボキシラーゼであり、該１Ｅはグルタル酸セミアルデヒドレダクターゼであり、該１Ｆは５−ヒドロキシ吉草酸レダクターゼであり、該１Ｇは５−ヒドロキシペント−２−エン酸デヒドラターゼであり、該１Ｉは５−アミノペンタン酸アミノトランスフェラーゼ、５−アミノペンタン酸デヒドロゲナーゼまたは５−アミノペンタン酸アミンオキシダーゼであり、該１Ｊは５−アミノペント−４−エン酸デアミナーゼであり、該１Ｋは５−ヒドロキシペント−２−エン酸レダクターゼであり、該１Ｌは５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡシンテターゼであり、該１Ｍは５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、該１Ｎは５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼであり、該１Ｏは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡシンテターゼまたは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡヒドロラーゼであり、該１Ｐは５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼであり、該（ｗｈｅｒｅｉｎ  ｉｎ）１Ｑは５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡデヒドラターゼ／デヒドロゲナーゼであり、該１Ｓはグルタリル−ＣｏＡレダクターゼであり、該１Ｔは２，４���ペンタジエン酸デカルボキシラーゼであり、該１Ｕは５−ヒドロキシペント−２−エン酸デカルボキシラーゼであり、該１Ｖは３−ブテン−１−オールデヒドラターゼであり、該１Ｗは５−ヒドロキシ吉草酸デカルボキシラーゼであり、該３Ａは３−オキソペンタノイル−ＣｏＡチオラーゼまたは３−オキソペンタノイル−ＣｏＡシンターゼであり、該３Ｂは３−オキソペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼであり、該３Ｃは３−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼであり、該３Ｄはペント−２−エノイル−ＣｏＡイソメラーゼであり、該３Ｅはペント−３−エノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、該３Ｆは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡシンテターゼであり、該３Ｇはペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、該５Ａは４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸アルドラーゼであり、該５Ｂは４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸デヒドラターゼであり、該５Ｃは２−オキソペンテン酸デカルボキシラーゼであり、該５Ｄは３−ブテン−１−アールレダクターゼであり、該５Ｅは３−ブテン−１−オールデヒドラターゼであり、該６Ａは２，４−ペンタジエン酸レダクターゼ（酸還元）であり、該６Ｂはペンタ−２，４−ジエナールデカルボニラーゼであり、該６Ｃは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（酸還元）であり、該６Ｄは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡホスホトランスフェラーゼであり、該６Ｅは２，４−ペンタジエノイル−リン酸レダクターゼであり、該６Ｆは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡシンテターゼであり、該６Ｈは２，４−ペンタジエン酸キナーゼであり、該７Ａは３−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼであり、該７Ｂはアセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼであり、該７Ｃは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰデヒドラターゼであり、該７Ｄはアセトアセチル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、該７Ｅはアセトアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアセトアセチル−ＣｏＡシンテターゼであり、該７Ｆはアセト酢酸レダクターゼ（酸還元）であり、該７Ｈはアセトアセチル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、該７Ｉはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存性，アルデヒド形成）であり、該７Ｊはアセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、該７Ｋはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）であり、該７Ｌは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、該７Ｍは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、該７Ｎは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、該７Ｏは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）であり、該７Ｐはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）であり、該７Ｑはアセト酢酸レダクターゼ（ケトン還元）であり、該７Ｒは３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）であり、���７Ｔはクロトニル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、該７Ｕはクロトニル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、該７Ｖはクロトニル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、該７Ｗはクロトニル−ＣｏＡ（アルコール形成）であり、該７Ｘは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、該７Ｙは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンテターゼであり、該７Ｚは３−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、該７ＡＢは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼであり、該７ＡＣは３−ヒドロキシ酪酸デヒドラターゼであり、該７ＡＤは３−ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドラターゼであり、該７ＡＥはクロトニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、該７ＡＦはクロトニル−ＣｏＡヒドロラーゼ、クロトニル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはクロトニル−ＣｏＡシンテターゼであり、該７ＡＧはクロトン酸レダクターゼであり、該７ＡＨはクロトンアルデヒドレダクターゼであり、該７ＡＳはアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼであり、該１２Ａはクロチルアルコールキナーゼであり、該１２Ｂは２−ブテニル−４−リン酸キナーゼであり、該１２Ｃはブタジエンシンターゼであり、該１２Ｄはクロチルアルコールジホスホキナーゼである非天然微生物体を提供する。
【００６１】
本発明の一部の態様では、該微生物体は、各々がブタジエン経路の酵素をコードしている２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１種類の外因性核酸を含むものであり得る。一部の態様では、該微生物体は、（１）〜（２２１）から選択される経路のうちの少なくとも１つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである。一部の態様では、該少なくとも１種類の外因性核酸は異種核酸である。一部の態様では、該非天然微生物体を実質的に嫌気性の培養培地中に存在する。
【００６２】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の非天然微生物体であって、上記の（４３）〜（７９）から選択されるブタジエン経路を有する該非天然微生物体が、さらに、グルタリル−ＣｏＡを生成するのに充分な量で発現されるグルタリル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有するグルタリル−ＣｏＡ経路を含むものであり、該グルタリル−ＣｏＡ経路が：アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼもしくはアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ；アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ；およびグルタリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；または２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、２−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼもしくは２−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼ；および２−オキソアジピン酸デヒドロゲナーゼ、２−オキソアジピン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼもしくは２−オキソアジピン酸ギ酸リアーゼから選択される経路を有する非天然微生物体を提供する。
【００６３】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の非天然微生物体であって、上記の（８０）〜（１１６）から選択されるブタジエン経路を有する該非天然微生物体が、さらに、５−アミノペンタノエートを生成するのに充分な量で発現される５−アミノペンタノエート経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有する５−アミノペンタノエート経路を含むものであり、該５−アミノペンタノエート経路が２−アミノアジピン酸デカルボキシラーゼ；または２−アミノアジピン酸デカルボキシラーゼおよび２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、２−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼもしくは２−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼを有するものである非天然微生物体を提供する。
【００６４】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の非天然微生物体であって、上記の（１）〜（４２）から選択されるブタジエン経路を有する該非天然微生物体が、さらに、２−オキソアジペートを生成するのに充分な量で発現される２−オキソアジペート経路の酵素をコードしている外因性核酸を有する２−オキソアジペート経路を含むものであり、該２−オキソアジペート経路が２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、２−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼもしくは２−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼを有するものである非天然微生物体を提供する。
【００６５】
一部の実施形態において、本発明は、ブタジエンを生成するのに充分な量で発現されるブタジエン経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有するブタジエン経路を有する非天然微生物体であって、該ブタジエン経路は、上記の経路を含み、さらに：（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有し、該少なくとも１種類の外因性核酸がＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有し、該少なくとも１種類の外因性核酸がピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有するものである、非天然微生物体を提供する。
【００６６】
一部の態様では、上記の（ｉ）を有する該微生物体が、さらに、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである。一部の態様では、上記の（ｉｉ）を有する該微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである。一部の態様では、上記の（ｉ）を有する該微生物体が、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている４種類の外因性核酸を含むものである；上記の（ｉｉ）を有する該微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている５種類の外因性核酸を含むものである；または上記の（ｉｉｉ）を有する該微生物体が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている２種類の外因性核酸を含むものである。
【００６７】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の非天然微生物体を、ブタジエンが生成される条件下で該生成に充分な期間、培養することを有する、ブタジエンを生成するための方法を提供する。
【００６８】
一部の実施形態において、本発明は、１，３−ブタンジオールを生成するのに充分な量で発現される１，３−ブタンジオール経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有する１，３−ブタンジオール経路を有する微生物体を有する非天然微生物体であって、該１，３−ブタンジオール経路は：（１）４Ａ，４Ｂ，４Ｃおよび４Ｄ；（２）５Ａ，５Ｈ，５Ｊ，５Ｋおよび５Ｇ；（３）５Ａ，５Ｈ，５Ｉおよび５Ｇ；（４）５Ａ，５Ｈおよび５Ｌ；（５）５Ａ，５Ｆおよび５Ｇ；（６）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｇおよび７Ｓ；（７）７Ａ，７Ｄ，７Ｉ，７Ｇおよび７Ｓ；（８）７Ａ，７Ｄ，７Ｋ，および７Ｓ；（９）７Ａ，７Ｈ，７Ｆ，７Ｇおよび７Ｓ；（１０）７Ａ，７Ｊ，７Ｇおよび７Ｓ；（１１）７Ａ，７Ｊ，７Ｒおよび７ＡＡ；（１２）７Ａ，７Ｈ，７Ｆ，７Ｒおよび７ＡＡ；（１３）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７Ｚおよび７ＡＡ；（１４）７Ａ，７Ｄ，７Ｉ，７Ｒおよび７ＡＡ；（１５）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒおよび７ＡＡ；（１６）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７Ｚおよび７ＡＡ；（１７）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｎおよび７ＡＡ；（１８）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚおよび７ＡＡ；（１９）７Ａ，７Ｂ，７Ｍおよび７ＡＡ；（２０）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７Ｚおよび７ＡＡ；（２１）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｎおよび７ＡＡ；（２２）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７Ｚおよび７ＡＡ；（２３）７Ａ，７Ｄ，７Ｐおよび７Ｏ；（２４）７Ａ，７Ｂ，７Ｘおよび７Ｏ；（２５）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＡ；（２６）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｇ，７Ｓ，（２７）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｇおよび７Ｓ；（２８）７ＡＳ，７Ｉ，７Ｇおよび７Ｓ；（２９）７ＡＳ，７Ｋ，および７Ｓ；（３０）７ＡＳ，７Ｉ，７Ｒおよび７ＡＡ；（３１）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒおよび７ＡＡ；（３２）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７Ｚおよび７ＡＡ；（３３）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｎおよび７ＡＡ；（３４）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚおよび７ＡＡ；（３５）７ＡＳ，７Ｐおよび７Ｏ；（３６）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，および７ＡＡ；ならびに（３７）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｇ，および７Ｓから選択される図４，５および／または７に示す経路を含み、該４Ａは３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡチオラーゼまたは３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンターゼであり、該４Ｂは３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼであり、該４Ｃは３−オキソ−５−ヒドロキシペンタン酸デカルボキシラーゼであり、該４Ｄは３−オキソブタノールレダクターゼであり、該５Ａは４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸アルドラーゼであり、該５Ｆは４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸デカルボキシラーゼであり、該５Ｇは３−ヒドロキシブタナールレダクターゼであり、該５Ｈは４−ヒドロキシ−２−オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ、４−ヒドロキシ−２−オキソペンタン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼまたは４−ヒドロキシ−２−オキソペンタン酸ギ酸リアーゼであり、該５Ｉは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、該５Ｊは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンテターゼであり、該５Ｋは３−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、該５Ｌは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）であり、該７Ａは３−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼであり、該７Ｂはアセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼであり、該７Ｄはアセトアセチル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、該７Ｅはアセトアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアセトアセチル−ＣｏＡシンテターゼであり、該７Ｆはアセト酢酸レダクターゼ（酸還元）であり、該７Ｇは３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）であり、該７Ｈはアセトアセチル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、該７Ｉはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存性，アルデヒド形成）であり、該７Ｊはアセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、該７Ｋはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）であり、該７Ｌは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、該７Ｍは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、該７Ｎは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、該７Ｏは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）であり、該７Ｐはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）であり、該７Ｑはアセト酢酸レダクターゼ（ケトン還元）であり、該７Ｒは３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）であり、該７Ｓは４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼであり、該７Ｘは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、該７Ｙは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンテターゼであり、該７Ｚは３−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、該７ＡＡは３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼであり、該７ＡＳはアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼである非天然微生物体を提供する。
【００６９】
一部の態様では、該微生物体は、各々が１，３−ブタンジオール経路の酵素をコードしている２、３、４または５種類の外因性核酸を含むものである。一部の態様では、該微生物体は、上記の（１）〜（３７）から選択される経路のうちの少なくとも１つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである。一部の態様では、該少なくとも１種類の外因性核酸は異種核酸である。一部の態様では、該非天然微生物体を実質的に嫌気性の培養培地中に存在する。
【００７０】
一部の実施形態において、本発明は、１，３−ブタンジオールを生成するのに充分な量で発現される１，３−ブタンジオール経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有する１，３−ブタンジオール経路を有する非天然微生物体であって、該１，３−ブタンジオール経路は、上記の経路を含み、さらに：（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有し、該少なくとも１種類の外因性核酸がＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有し、該少なくとも１種類の外因性核酸がピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有するものである非天然微生物体を提供する。
【００７１】
一部の態様では、上記の（ｉ）を有する該微生物体が、さらに、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである。一部の態様では、上記の（ｉｉ）を有する該微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである。一部の態様では、本明細書に記載の（ｉ）を有する該微生物体が、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている４種類の外因性核酸を含むものである；（ｉｉ）を有する該微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている５種類の外因性核酸を含むものである；または（ｉｉｉ）を有する該微生物体が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている２種類の外因性核酸を含むものである。
【００７２】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の非天然微生物体を、１，３−ブタンジオールが生成される条件下で該生成に充分な期間、培養することを有する、１，３−ブタンジオールを生成するための方法を提供する。
【００７３】
一部の実施形態において、本発明は、３−ブテン−１−オールを生成するのに充分な量で発現される３−ブテン−１−オール経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有する３−ブテン−１−オール経路を有する微生物体を有する非天然微生物体であって、該３−ブテン−１−オール経路は：（１）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆおよび１Ｕ；（２）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋおよび１Ｕ；（３）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐおよび１Ｕ；（４）１Ｄ，１Ｅおよび１Ｗ；（５）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆおよび１Ｕ；（６）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋおよび１Ｕ；（７）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐおよび１Ｕ；（８）１Ｓ，１Ｅおよび１Ｗ；（９）１Ｂ，１Ｃ，１Ｋおよび１Ｕ；（１０）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆおよび１Ｕ；（１１）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐおよび１Ｕ；（１２）１Ｉ，１Ｅおよび１Ｗ；ならびに（１３）５Ａ，５Ｂ，５Ｃおよび５Ｄから選択される図１および／または５に示す経路を含み、該１Ｂは５−アミノペンタン酸レダクターゼであり、該１Ｃは５−アミノペント−２−エン酸アミノトランスフェラーゼ、５−アミノペント−２−エン酸デヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼであり、該１Ｄは２−オキソアジピン酸デカルボキシラーゼであり、該１Ｅはグルタル酸セミアルデヒドレダクターゼであり、該１Ｆは５−ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼであり、該１Ｉは５−アミノペンタン酸アミノトランスフェラーゼ、５−アミノペンタン酸デヒドロゲナーゼまたは５−アミノペンタン酸アミンオキシダーゼであり、該１Ｋは５−ヒドロキシペント−２−エン酸レダクターゼであり、該１Ｌは５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡシンテターゼであり、該１Ｍは５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、該１Ｐは５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼであり、該１Ｓはグルタリル−ＣｏＡレダクターゼであり、該１Ｕは５−ヒドロキシペント−２−エン酸デカルボキシラーゼであり、該１Ｗは５−ヒドロキシ吉草酸デカルボキシラーゼであり、該５Ａは４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸アルドラーゼであり、該５Ｂは４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸デヒドラターゼであり、該５Ｃは２−オキソペンテン酸デカルボキシラーゼであり、該５Ｄは３−ブテン−１−アールレダクターゼである非天然微生物体を提供する。
【００７４】
一部の態様では、該微生物体は、各々が３−ブテン−１−オール経路の酵素をコードしている２、３、４、５または６種類の外因性核酸を含むものである。一部の態様では、該微生物体は、上記の（１）〜（１３）から選択される経路のうちの少なくとも１つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである。一部の態様では、該少なくとも１種類の外因性核酸は異種核酸である。一部の態様では、該非天然微生物体を実質的に嫌気性の培養培地中に存在する。
【００７５】
一部の実施形態において、本発明は、３−ブテン−１−オールを生成するのに充分な量で発現される３−ブテン−１−オール経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有する３−ブテン−１−オール経路を有する非天然微生物体であって、該３−ブテン−１−オール経路は、上記の経路を含み、さらに：（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有し、該少なくとも１種類の外因性核酸がＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有し、該少なくとも１種類の外因性核酸がピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有するものである非天然微生物体を提供する。
【００７６】
一部の態様では、上記の（ｉ）を有する該微生物体が、さらに、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである。一部の態様では、上記の（ｉｉ）を有する該微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである。一部の態様では、上記の（ｉ）を有する該微生物体が、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている４種類の外因性核酸を含むものである；上記の（ｉｉ）を有する該微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている５種類の外因性核酸を含むものである；または上記の（ｉｉｉ）を有する該微生物体が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている２種類の外因性核酸を含むものである。
【００７７】
一部の実施形態において、本発明は、上記の非天然微生物体を、３−ブテン−１−オールが生成される条件下で該生成に充分な期間、培養することを有する、３−ブテン−１−オールを生成するための方法を提供する。
【００７８】
一部の実施形態において、本発明は、上記の非天然微生物体を、３−ブテン−１−オールが生成される条件下で該生成のために充分培養すること、および該３−ブテン−１−オールを化学的に脱水させてブタジエンを生成させることを有する、ブタジエンを生成するための方法を提供する。
【００７９】
一部の実施形態において、本発明は、クロチルアルコールを生成するのに充分な量で発現されるクロチルアルコール経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含むクロチルアルコール経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、該クロチルアルコール経路は：（１）７Ａ，７Ｊ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＨ；（２）７Ａ，７Ｈ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＨ；（３）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；（４）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；（５）７Ａ，７Ｄ，７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＨ；（６）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＨ；（７）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；（８）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；（９）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤおよび７ＡＨ；（１０）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；（１１）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；（１２）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖおよび７ＡＨ；（１３）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＨ（１４）７Ａ，７Ｂ，７Ｍ，７ＡＤおよび７ＡＨ；（１５）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；（１６）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；（１７）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；（１８）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；（１９）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７Ｖおよび７ＡＨ；（２０）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＨ；（２１）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｕおよび７ＡＨ；（２２）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｔ，７ＡＧおよび７ＡＨ；（２３）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＨ；（２４）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢおよび７Ｗ；（２５）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢおよび７Ｗ；（２６）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥおよび７Ｗ；（２７）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７Ｖおよび７ＡＨ；（２８）７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＨ；（２９）７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＨ；（３０）７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；（３１）７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；（３２）７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤおよび７ＡＨ；（３３）７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；（３４）７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；（３５）７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖおよび７ＡＨ；（３６）７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＨ；（３７）７Ｐ，７ＡＢおよび７Ｗ，（３８）７ＡＳ，７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＨ；（３９）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＨ；（４０）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；（４１）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；（４２）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤおよび７ＡＨ；（４３）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；（４４）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；（４５）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖおよび７ＡＨ；（４６）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＨ；ならびに（４７）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢおよび７Ｗから選択される図７に示す経路を含み、該７Ａは３−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼであり、該７Ｂはアセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼであり、該７Ｃは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰデヒドラターゼであり、該７Ｄはアセトアセチル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、該７Ｅはアセトアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアセトアセチル−ＣｏＡシンテターゼであり、該７Ｆはアセト酢酸レダクターゼ（酸還元）であり、該７Ｈはアセトアセチル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、該７Ｉはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存性，アルデヒド形成）であり、該７Ｊはアセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、該７Ｋはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）であり、該７Ｌは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、該７Ｍは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、該７Ｎは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、該７Ｏは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）であり、該７Ｐはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）であり、該７Ｑはアセト酢酸レダクターゼ（ケトン還元）であり、該７Ｒは３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）であり、該７Ｔはクロトニル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、該７Ｕはクロトニル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、該７Ｖはクロトニル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、該７Ｗはクロトニル−ＣｏＡ（アルコール形成）であり、該７Ｘは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、該７Ｙは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンテターゼであり、該７Ｚは３−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、該７ＡＢは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼであり、該７ＡＣは３−ヒドロキシ酪酸デヒドラターゼであり、該７ＡＤは３−ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドラターゼであり、該７ＡＥはクロトニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、該７ＡＦはクロトニル−ＣｏＡヒドロラーゼ、クロトニル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはクロトニル−ＣｏＡシンテターゼであり、該７ＡＧはクロトン酸レダクターゼであり、該７ＡＨはクロトンアルデヒドレダクターゼであり、該７ＡＳはアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼである非天然微生物体を提供する。
【００８０】
一部の態様では、本発明は、上記のクロチルアルコール経路を有する該微生物体であって、各々がクロチルアルコール経路の酵素をコードしている２、３、４、５、６または７種類の外因性核酸を含むものである微生物体を提供する。一部の態様では、該微生物体が、上記の（１）〜（４７）から選択されるクロチルアルコール経路のうちの少なくとも１つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである。一部の態様では、該少なくとも１種類の外因性核酸は異種核酸である。一部の（ｓｏｍ）態様では、該非天然微生物体を実質的に嫌気性の培養培地中に存在する。
【００８１】
一部の実施形態において、本発明は、クロチルアルコールを生成するのに充分な量で発現されるクロチルアルコール経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有するクロチルアルコール経路を有する非天然微生物体であって、該クロチルアルコール経路は、上記の経路を含み、さらに：（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、該少なくとも１種類の外因性核酸がＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、該少なくとも１種類の外因性核酸がピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含むものである非天然微生物体を提供する。
【００８２】
一部の態様では、上記の（ｉ）を含む該微生物体が、さらに、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである。一部の態様では、上記の（ｉｉ）を含む該微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである。一部の態様では、上記の（ｉ）を含む該微生物体が、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている４種類の外因性核酸を含むものである；（ｉｉ）を含む該微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている５種類の外因性核酸を含むものである；または（ｉｉｉ）を含む該微生物体が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている２種類の外因性核酸を含むものである。
【００８３】
一部の実施形態において、本発明は、上記の非天然微生物体を、クロチルアルコールが生成される条件下で該生成に充分な期間、培養することを含む、クロチルアルコールを生成するための方法を提供する。
【００８４】
一部の実施形態において、ブタジエンの取得は、クロチルアルコールの生合成的生成およびその後のブタジエンへの化学的脱水によって行なわれ得る。一部の実施形態において、本発明は、（ａ）充分な量の栄養素と培地中で、本明細書に記載の非天然微生物体を発酵により培養し、クロチルアルコールを生成させること；および（ｂ）該非天然微生物体を培養することによって生成したクロチルアルコールをブタジエンに変換させることを含む、ブタジエンを生成するための方法を提供する。
【００８５】
アルコールの脱水は、当該技術分野で知られており、種々の熱的プロセス（触媒型および非触媒型のどちらも）が挙げられ得る。一部の実施形態において、触媒型の熱的脱水では、金属酸化物触媒またはシリカが使用される。一部の実施形態において、該方法の工程（ｂ）は触媒の存在下での化学的脱水によって行なわれる。例えば、クロチルアルコールをモリブデン酸ビスマスで脱水させると（Ａｄａｍｓ，Ｃ．Ｒ．Ｊ．Ｃａｔａｌ．１０：３５５−３６１，１９６８）、１，３−ブタジエンが得られ得ることが示されている。
【００８６】
脱水は、アルコール基の活性化およびその後の脱離は、標準的な脱離機構（Ｅ１またはＥ２脱離など）によって行なわれ得る。活性化は、アルコール基のハロゲン（ヨージド、クロライドまたはブロミドなど）への変換によって行なわれ得る。また、活性化は、アルコールを良好な脱離基に変換させるスルホニル、ホスフェートまたは他の活性化官能部によっても行なわれ得る。一部の実施形態において、該活性化基は、トシレート、メシレート、ノシレート、ブロシレートおよびトリフレートから選択されるスルフェートまたはスルホン酸エステルである。一部の実施形態において、脱離基はホスフェートまたはリン酸エステルである。一部のかかる実施形態では、脱水剤は五酸化リンである。
【００８７】
一部の実施形態において、本発明は、プロピレンを生成するのに充分な量で発現されるプロピレン経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含むプロピレン経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、該プロピレン経路は：（１）７Ａ，７Ｊ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＯ；（２）７Ａ，７Ｈ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＯ；（３）７Ａ，７Ｄ，７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＯ；（４）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＯ；（５）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＯ；（６）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＤおよび７ＡＯ；（７）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＯ；（８）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤおよび７ＡＯ；（９）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｎ，７ＡＤおよび７ＡＯ；（１０）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＯ；（１１）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７Ｖ，７ＡＧおよび７ＡＯ；（１２）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；（１３）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；（１４）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧおよびＡＯ；（１５）７Ａ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖおよび７ＡＯ；（１６）７Ａ，７Ｂ，７Ｍ，７ＡＤおよび７ＡＯ；（１７）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＯ；（１８）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｎ，７ＡＤおよび７ＡＯ；（１９）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＯ；（２０）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｕおよび７ＡＯ；（２１）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｔ，７ＡＧおよび７ＡＯ；（２２）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７Ｖおよび７ＡＯ；（２３）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＯ；（２４）７Ａ，７Ｈ，７Ｑおよび７ＡＲ；（２５）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑおよび７ＡＲ；（２６）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙおよび７ＡＲ；（２７）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙおよび７ＡＲ；（２８）７Ａ，７Ｂ，７Ｌおよび７ＡＲ；（２９）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７ＡＣおよび７ＡＱ；（３０）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣおよび７ＡＱ；（３１）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣおよび７ＡＱ；（３２）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦおよび７ＡＱ；（３３）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７ＡＣおよび７ＡＱ；（３４）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７ＡＣおよび７ＡＱ；（３５）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７ＡＦおよび７ＡＱ；（３６）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７ＡＦおよび７ＡＱ；（３７）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｔおよび７ＡＱ；（３８）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；（３９）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；（４０）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；（４１）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＮおよび７ＡＫ；（４２）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＭ，７ＡＪおよび７ＡＫ；（４３）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；（４４）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；（４５）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＮおよび７ＡＫ；（４６）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７ＡＭ，７ＡＪおよび７ＡＫ；（４７）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｔ，７ＡＮおよび７ＡＫ；（４８）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７ＡＦ，７ＡＮおよび７ＡＫ；（４９）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７ＡＭ，７ＡＪおよび７ＡＫ；（５０）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＬ，７ＡＰおよび７ＡＫ；（５１）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＬ，７ＡＩ，７ＡＪおよび７ＡＫ；（５２）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７Ｖおよび７ＡＯ；（５３）７Ａ  ７Ｂ，７Ｌ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；（５４）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；（５５）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＯ；ａｎｄ（５６）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；（５７）７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＯ；（５８）７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＯ；（５９）７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＯ；（６０）７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＯ；（６１）７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤおよび７ＡＯ；（６２）７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；（６３）７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；（６４）７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＯ；（６５）７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖおよび７ＡＯ；（６６）７Ｅ，７Ｑおよび７ＡＲ；（６７）７Ｐ，７Ｙおよび７ＡＲ；（６８）７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣおよび７ＡＱ；（６９）７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣおよび７ＡＱ；（７０）７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦおよび７ＡＱ；（７１）７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；（７２）７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；（７３）７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＮおよび７ＡＫ；（７４）７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＭ，７ＡＪおよび７ＡＫ，（７５）７ＡＳ，７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＯ；（７６）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＯ；（７７）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＤおよび７ＡＯ；（７８）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＯ；（７９）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤおよび７ＡＯ；（８０）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；（８１）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；（８２）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＯ；（８３）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑおよび７ＡＲ；（８４）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙおよび７ＡＲ；（８５）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣおよび７ＡＱ；（８６）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣおよび７ＡＱ；（８７）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦおよび７ＡＱ；（８８）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；（８９）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；（９０）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＮおよび７ＡＫ；ならびに（９１）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＭ，７ＡＪおよび７ＡＫから選択される図７に示す経路を含み、該７Ａは３−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼであり、該７Ｂはアセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼであり、該７Ｃは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰデヒドラターゼであり、該７Ｄはアセトアセチル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、該７Ｅはアセトアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアセトアセチル−ＣｏＡシンテターゼであり、該７Ｆはアセト酢酸レダクターゼ（酸還元）であり、該７Ｈはアセトアセチル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、該７Ｉはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存性，アルデヒド形成）で���り、該７Ｊはアセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、該７Ｌは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、該７Ｍは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、該７Ｎは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、該７Ｐはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）であり、該７Ｑはアセト酢酸レダクターゼ（ケトン還元）であり、該７Ｒは３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）であり、該７Ｓは４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼであり、該７Ｔはクロトニル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、該７Ｕはクロトニル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、該７Ｖはクロトニル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、該７Ｘは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、該７Ｙは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンテターゼであり、該７Ｚは３−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、該７ＡＢは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼであり、該７ＡＣは３−ヒドロキシ酪酸デヒドラターゼであり、該７ＡＤは３−ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドラターゼであり、該７ＡＥはクロトニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、該７ＡＦはクロトニル−ＣｏＡヒドロラーゼ、クロトニル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはクロトニル−ＣｏＡシンテターゼであり、該７ＡＧはクロトン酸レダクターゼであり、該７ＡＩはブチリル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、該７ＡＪはブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、ブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼまたはブチリル−ＣｏＡシンテターゼであり、該７ＡＫは酪酸デカルボキシラーゼであり、該７ＡＬはクロトニル−ＡＣＰレダクターゼであり、該７ＡＭはクロトニル−ＣｏＡレダクターゼであり、該７ＡＮはクロトン酸レダクターゼであり、該７ＡＯはクロトンアルデヒドデカルボニラーゼであり、該７ＡＰはブチリル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、該７ＡＱはクロトン酸デカルボキシラーゼであり、該７ＡＲは３−ヒドロキシ酪酸デカルボキシラーゼであり、該７ＡＳはアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼである非天然微生物体を提供する。
【００８８】
一部の態様では、本発明は、上記のプロピレン経路を有する微生物体であって、各々がプロピレン経路の酵素をコードしている２、３、４、５、６、７または８種類の外因性核酸を含む微生物体を提供する。一部の態様では、該微生物体は、上記の（１）〜（９１）から選択される経路のうちの少なくとも１つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである。一部の態様では、該少なくとも１種類の外因性核酸は異種核酸である。一部の態様では、該非天然微生物体を実質的に嫌気性の培養培地中に存在する。
【００８９】
一部の実施形態において、本発明は、プロピレンを生成するのに充分な量で発現されるプロピレン経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有するプロピレン経路を有する非天然微生物体であって、該プロピレン経路は、上記の経路を含み、さらに：（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、該少なくとも１種類の外因性核酸がＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、該少なくとも１種類の外因性核酸がピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含むものである非天然微生物体を提供する。
【００９０】
一部の態様では、上記の（ｉ）を含む該微生物体が、さらに、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである。一部の態様では、上記の（ｉｉ）を含む該微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである。一部の態様では、上記の（ｉ）を含む該微生物体が、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている４種類の外因性核酸を含むものである；上記の（ｉｉ）を含む該微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ、およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている５種類の外因性核酸を含むものである；または上記の（ｉｉｉ）を含む該微生物体が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている２種類の外因性核酸を含むものである。
【００９１】
一部の実施形態において、本発明は、上記の非天然微生物体を、プロピレンが生成される条件下で該生成に充分な期間、培養することを含む、プロピレンを生成するための方法を提供する。
【００９２】
さらなる実施形態において、本発明は、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を有する非天然微生物体であって、２−アミノアジペートを５−アミノペンタノエートに、２−アミノアジペートを２−オキソアジペートに、５−アミノペンタノエートをグルタル酸セミアルデヒドに、２−オキソアジペートをグルタル酸セミアルデヒドに、２−オキソアジペートをグルタリル−ＣｏＡに、グルタリル−ＣｏＡをグルタル酸セミアルデヒドに、グルタル酸セミアルデヒドを５−ヒドロキシバレレートに、５−アミノペンタノエートを５−アミノペント−２エノエートに、５−アミノペント−２エノエートを５−ヒドロキシペント−２−エノエートに、５−ヒドロキシペント−２−エノエートを５−ヒドロキシペント−２−エノエートに、５−ヒドロキシバレレートを５−ヒドロキシペント−２−エノエートに、５−ヒドロキシバレレートを５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡに、５−ヒドロキシバレレートを３−ブテン−１−オールに、５−アミノペント−２−エノエートを２，４−ペンタジエノエートに、５−ヒドロキシペント−２−エノエートを３−ブテン−１−オールに、５−ヒドロキシペント−２−エノエートを２，４−ペンタジエノエートに、５−ヒドロキシペント−２−エノエートを５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡに、５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡを５−ヒドロキシペント−２−エノエートに、グルタル酸セミアルデヒドを５−アミノペンタノエートに、２−オキソアジペートを２−アミノアジペートに、５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡを５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡに、５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡを２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡに、５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡを２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡに、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡを２，４−ペンタジエノエートに、２，４−ペンジエノエートをブタジエンに、３−ブテン−１−オールをブタジエンに、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに、アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡをクロトニル−ＣｏＡに、クロトニル−ＣｏＡ、グルタリル−ＣｏＡ、プロピオニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡを３−オキソペンタノイル−ＣｏＡに、プロピオニル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡを３−オキソペンタノイル−ＣｏＡに、３−オキソペンタノイル−ＣｏＡを３−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡをペント−２−オノイル−ＣｏＡに、ペント−２−オノイル−ＣｏＡをペント−３−エノイル−ＣｏＡに、ペント−３−エノイル−ＣｏＡを２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡを３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡに、３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡを３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートに、３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートを３−オキソブタノールに、３−オキソブタノールを１，３−ブタンジオールに、ピルベートおよびアセトアルデヒドを４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートに、４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートを２−オキソペンテノエートに、２−オキソペンテノエートを３−ブテン−１−アールに、３−ブテン−１−アールを３−ブテン−１−オールに、４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに、４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートを３−ヒドロキシブタナールに、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブタナールに、３−ヒドロキシブタナールを１，３−ブタンジオールに、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチレートに、３−ヒドロキシブチレートを３−ヒドロキシブチレートを３−ヒドロキシブタナールに、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを１，３−ブタンジオールに、２，４−ペンタジエノエートを２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡに、２，４−ペンタジエノエートをペンタ−２，４−ジエナールに、ペンタ−２，４−ジエナールをブタジエンに、２，４−ペンタジエノエートを２，４−ペンタジエノイル−ホスフェートに、２，４−ペンタジエノイル−ホスフェートをペンタ−２，４−ジエナールに、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡを２，４−ペンタジエノイル−ホスフェートに、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡをペンタ−２，４−ジエナールに、マロニル−ＡＣＰおよびアセチル−ＣｏＡまたはアセチル−ＡＣＰをアセトアセチル−ＡＣＰに、アセトアセチル−ＡＣＰを３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰに、３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰをクロトニル−ＡＣＰに、アセトアセチル−ＡＣＰをアセトアセチル−ＣｏＡに、マロニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに、アセトアセチル−ＣｏＡをアセトアセテートに、アセトアセテートを３−オキソブチルアルデヒドに、３−オキソブチルアルデヒドを４−ヒドロキシ−２−ブタノンに、アセトアセチル−ＡＣＰをアセトアセテートに、アセトアセチル−ＣｏＡを３−オキソブチルアルデヒドに、アセトアセチル−ＡＣＰを３−オキソブチルアルデヒドに、アセトアセチル−ＣｏＡを４−ヒドロキシ−２−ブタノンに、３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰを３−ヒドロキシブチレートに、３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰを３−ヒドロキシブチルアルデヒドに、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチルアルデヒドに、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを１，３−ブタンジオールに、アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに、アセトアセテートを３−ヒドロキシブチレートに、３−オキソブチルアルデヒドを３−ヒドロキシブチルアルデヒドに、４−ヒドロキシ−２−ブタノンを１，３−ブタンジオールに、クロトニル−ＡＣＰをクロトネートに、クロトニル−ＡＣＰをクロトンアルデヒドに、クロトニル−ＣｏＡをクロトンアルデヒドに、クロトニル−ＣｏＡをクロチルアルコールに、３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチレートに、３−ヒドロキシブチレートを３−ヒドロキシブチルアルデヒドに、３−ヒドロキシブチルアルデヒドを１，３−ブタンジオールに、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡをクロトニル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシブチレートをクロトネートに、３−ヒドロキシブチルアルデヒドをクロトンアルデヒドに、クロトニル−ＡＣＰをクロトニル−ＣｏＡに、クロトニル−ＣｏＡをクロトネートに、クロトネートをクロトンアルデヒドに、クロトンアルデヒドをクロチルアルコールに、ブチリル−ＡＣＰをブチリル−ＣｏＡに、ブチリル−ＣｏＡをブチレートに、ブチレートをプロピレンに、クロトニル−ＡＣＰをブチリル−ＡＣＰに、クロトニル−ＣｏＡをブチリル−ＣｏＡに、クロトネートをブチレートに、クロトンアルデヒドをプロピレンに、ブチリル−ＡＣＰをブチレートに、クロトネートをプロピレンに、３−ヒドロキシブチレートをプロピレンに、クロチルアルコールを２−ブテニル−４−ホスフェートに、２−ブテニル−４−ホスフェートを２−ブテニル−４−ジホスフェートに、クロチルアルコールを２−ブテニル−４−ジホスフェートに、および２−ブテニル−４−ジホスフェートをブタジエンに、からなる群より選択される、基質を生成物に変換させる酵素またはタンパク質をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含む非天然微生物体を提供する。当業者には、これらは例示にすぎないこと、および所望の生成物の作製に適しており、かつ基質から生成物の変換で適切な活性が得られ得る本明細書に開示した任意の基質−生成物ペアは、当業者により本明細書における教示に基づいて容易に決定することができるであろうことが理解されよう。したがって、本発明は、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路（図１〜７および１２に示したものなど）の基質および生成物を変換させる酵素またはタンパク質をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含む非天然微生物体を提供する。
【００９３】
本明細書では、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を含む微生物体として一般的に記載しているが、本発明では、さらに、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の中間体を生成するのに充分な量で発現される２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有する非天然微生物体が提供されることは理解されよう。例えば、本明細書に開示のように、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を図１〜７および１２に例示している。したがって、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールが生成される２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を含む微生物体に加え、本発明では、さらに、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を有する非天然微生物体であって、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の中間体、例えば、５−アミノペント−２−エノエート、グルタル酸セミアルデヒド、５−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡ、５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡ、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡ、５−ヒドロキシペント−２−エノエート、５−ヒドロキシペント−２−エノエート、アセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、クロトイル−ＣｏＡ、グルタリル−ＣｏＡ、３−オキソペンタノイル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡ、ペント−２−エノイル−ＣｏＡ、ペント−３−エノイル−ＣｏＡ、３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡ、３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエート、３−オキソブタノール、４−ヒドロキシ−２−オキソバレレート、２−オキソペンテノエート、３−ブテン−１−アール、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシブタナール、２，４−ペンタジエノイル−ホスフェート、ペンタ−２，４−ジエナール、アセトアセチル−ＡＣＰ、アセトアセチル−ＣｏＡ、アセトアセテート、３−オキソブチルアルデヒド、４−ヒドロキシ−２−ブタノン、３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシブチルアルデヒド、クロトニル−ＡＣＰ、クロトニル−ＣｏＡ、クロトネート、クロトンアルデヒド、ブチリル−ＡＣＰ、ブチリル−ＣｏＡ、ブチレート、２−ブテニル−４−ホスフェート、または２−ブテニル−４−ジホスフェートを生成する非天然微生物体が提供される。
【００９４】
本実施例に記載し、図面に例示した本明細書に開示の経路（例えば、図１〜９および１２の経路）はいずれも、所望により、任意の経路の中間体または生成物を生成する非天然微生物体の作製に使用され得ることは理解されよう。本明細書に開示のように、中間体を生成するような微生物体は、下流経路の酵素を発現して所望の生成物を生成する別の微生物体と組み合わせて使用され得る。しかしながら、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の中間体を生成する非天然微生物体は、該中間体を所望の生成物として生成させるために使用できることは理解されよう。
【００９５】
本明細書において本発明を、代謝反応、反応体もしくはその生成物に関して一般的に記載しているか、または言及している代謝反応、反応体もしくは生成物と関連している、あるいは触媒する酵素、または言及している代謝反応、反応体もしくは生成物と関連しているタンパク質をコードしている１種類以上の核酸もしくは遺伝子に関して具体的に記載している。本文中にそうでないことを明示していない限り、当業者には、反応に対する言及が、該反応の反応体および生成物に対する言及をも構成していることが理解されよう。同様に、本文中にそうでないことを明示していない限り、反応体または生成物に対する言及はその反応に対する言及をも構成しており、このような代謝上の任意の構成要素に対する言及は、言及している反応、反応体もしくは生成物を触媒する酵素または言及している反応、反応体もしくは生成物に関与しているタンパク質をコードしている遺伝子（１つまたは複数）にも言及している。同様に、既知の代謝の生化学、酵素学およびゲノミクスの分野に鑑みて、本明細書における遺伝子またはコード核酸に対する言及は、コードされた対応酵素およびこれを触媒する反応または該反応と関連しているタンパク質ならびに該反応の反応体および生成物に対する言及をも構成している。
【００９６】
本明細書に開示のように、生成物２，４−ペンタジエノエートおよび中間体５−アミノペンタノエート、５−アミノペント−２−エノエート、５−ヒドロキシペント−２−エノエート、５−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシペント−２−エノエート、３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエート、３−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシ−２−エキソバレレート、２−オキソペンテノエート、アセトアセテート、クロトネート、ブチレートならびに他の中間体は、種々のイオン化形態、例えば、完全プロトン化形態、部分プロトン化形態および間然脱プロトン化形態で存在し得るカルボン酸である。したがって、接尾辞「エート（−ａｔｅ）」または酸形態は、遊離酸形態ならびに任意の脱プロトン化形態の両方を示すために（特に、イオン化形態は該化合物がみられるｐＨに依存することが知られているため）、互換的に用いている場合があり得る。カルボキシレート生成物または中間体には、カルボキシレート生成物または経路の中間体のエステル形態、例えば、Ｏ−カルボン酸エステルおよびＳ−カルボン酸エステルが包含されることは理解されよう。Ｏ−およびＳ−カルボキシレートとしては、分枝鎖または直鎖カルボン酸低級アルキル（すなわちＣ１〜Ｃ６）が挙げられ得る。かかるＯ−またはＳ−カルボキシレートの一例としては、限定されないが、Ｏ−またはＳ−カルボン酸メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−プロピル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルが挙げられ、これらはいずれも、さらに不飽和を有し、例えば、Ｏ−またはＳ−カルボン酸プロペニル、ブテニル、ペンチルおよびヘキセニルをもたらすものであってもよい。Ｏ−カルボキシレートは生合成経路の生成物であってもよい。生合成経路によって得られる例示的なＯ−カルボキシレートとしては、限定されないが、メチル２，４−ペンタジエノエート、エチル２，４−ペンタジエノエート、およびｎ−プロピル２，４−ペンタジエノエートが挙げられ得る。生合成により得られ得る他のＯ−カルボキシレートとしては、脂肪族アルコール、例えば（ｓｕｃｈ）、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ラウリル、トリデシル、ミリスチル、ペンタデシル、セチル、パルミトイル、ヘプタデシル、ステアリル、ノナデシル、アラキジル、ヘンエイコシルおよびベヘニルアルコール（これらのいずれか１つが任意選択で分枝および／または不飽和を含むものであってもよい）から誘導される中鎖から長鎖の基（すなわちＣ７〜Ｃ２２）であるＯ−カルボン酸エステルが挙げられ得る。また、Ｏ−カルボン酸エステルは、生化学的または化学的プロセス、例えば、遊離カルボン酸生成物のエステル化またはＯ−もしくはＳ−カルボキシレートのエステル交換によっても得られ得る。Ｓ−カルボキシレートは、ＣｏＡ  Ｓ−エステル、システイニルＳ−エステル、アルキルチオエステルならびに種々のアリールおよびヘテロアリールチオエステルが例示される。本発明の非天然微生物体は、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成経路の１つ以上に関与する１種類以上の酵素またはタンパ���質をコードしている発現可能な核酸を導入することにより作製され得る。生合成に選択した宿主微生物体に応じて、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの具体的な生合成経路の一部または全部の核酸が発現され得る。例えば、選択した宿主が所望の生合成経路の１種類以上の酵素またはタンパク質を欠損している場合、該欠損している酵素（１種類もしくは複数種）またはタンパク質（１種類もしくは複数種）の発現可能な核酸が、その後の外因性発現のために該宿主に導入される。あるいはまた、選択した宿主が一部の経路の遺伝子の内因性発現を示すが、他のものは欠損している場合、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成を得るための該欠損している酵素（１種類もしくは複数種）またはタンパク質（１種類もしくは複数種）のコード核酸が必要である。したがって、本発明の非天然微生物体は、所望の生合成経路を得るための外因性酵素もしくはタンパク質活性を導入することにより作製され得るか、または所望の生合成経路は、１種類以上の内因性酵素もしくはタンパク質とともに所望の生成物、例えば、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オールを生成させる１つ以上の外因性酵素もしくはタンパク質活性を導入することにより得られ得る。
【００９７】
宿主微生物体は例えば、細菌、酵母、真菌または発酵プロセスに適用可能なさまざまな任意の他の微生物から選択され得、該宿主微生物体において非天然微生物体が作製され得る。例示的な細菌としては、大腸菌、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ、Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ、枯草菌、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａから選択される種が挙げられる。例示的な酵母または真菌としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｒｈｉｚｏｂｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓなどから選択される種が挙げられる。大腸菌は、遺伝子操作に適していると充分に特性評価された微生物体であるため特に有用な宿主生物体である。特に有用な他の宿主生物体としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母が挙げられる。所望の生成物を得るための代謝的および／または遺伝子修飾の導入には、任意の適当な微生物の宿主生物体が使用され得ることは理解されよう。
【００９８】
選択した宿主微生物体の２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成経路の構成要素に応じて、本発明の非天然微生物体は、少なくとも１種類の外因的に発現される２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路コード核酸および１つ以上の２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成経路の全部までのコード核酸を含む。例えば、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成は、経路の酵素またはタンパク質が欠損している宿主において、対応するコード核酸の外因性発現によって確立させることができる。２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路のすべての酵素またはタンパク質が欠損している宿主には、該経路のすべての酵素またはタンパク質の外因性発現が含められ得るが、該宿主に該経路の酵素またはタンパク質のうちの少なくとも１つを含めた場合であっても経路のすべての酵素またはタンパク質が発現され得ることは理解されよう。例えば、ブタジエンの生成のための経路のすべての酵素またはタンパク質、例えば、グルタリル−ＣｏＡレダクターゼ、グルタル酸セミアルデヒドレダクターゼ、５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡトランスフェラーゼおよび／またはシンテターゼ、５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡデヒドラターゼ／デヒドロゲナーゼ、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼならびに２，４−ペンタジエン酸デカルボキシラーゼの外因性発現を含めることができる。別の例として、１，３−ブタンジオールの生成のための経路のすべての酵素またはタンパク質、例えば、３−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、アセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、トランスフェラーゼまたはシンテターゼ、３−ヒドロキシ酪酸レダクターゼ、および３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼの外因性発現を含めることができる。また別の例として、クロチル−アルコールの生成のための経路のすべての酵素またはタンパク質、例えば、３−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、アセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰデヒドラターゼ、クロトニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼ、クロトニル−ＣｏＡヒドロラーゼ、トランスフェラーゼまたはシンテターゼ、クロトン酸レダクターゼおよびクロトンアルデヒドレダクターゼの外因性発現を含めることができる。
【００９９】
本明細書に示した教示および手引きに鑑みて、当業者には、発現可能な形態で導入されるコード核酸の数は、選択した宿主微生物体の２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の欠損数と少なくとも同等であることが理解されよう。したがって、本発明の非天然微生物体は、本明細書に開示した２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成経路を構成する酵素またはタンパク質をコードしている１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１種の全部までの核酸を有するものであり得る。一部の実施形態では、該非天然微生物体に、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オールの生合成を助長もしくは最適化するか、または宿主微生物体に他の有用な機能を付与する他の遺伝子修飾もまた含めてもよい。かかる他の機能性の一例としては、例えば、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の前駆体の１種類以上、例えば、２−アミノアジペート、５−アミノペンタノエート、２−オキソアジペート、グルタリル−ＣｏＡ、プロピオニル−ＣｏＡ、アセチル−ＣｏＡ、マロニル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ、マロニル−ＡＣＰまたはピルベートの合成の増強が挙げられ得る。
【０１００】
一般的に、宿主微生物体は、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の前駆体を、自然に生産される分子として、または所望の前駆体のデノボ生成あるいは宿主微生物体によって自然に生産される前駆体の生成の増大のいずれかをもたらす操作された生成物としてのいずれかで生成するように選択される。例えば、２−アミノアジペート、５−アミノペンタノエート、２−オキソアジペート、グルタリル−ＣｏＡ、プロピオニル−ＣｏＡ、アセチル−ＣｏＡ、マロニル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ、ピルベートまたはマロニル−ＡＣＰは宿主生物体（大腸菌など）において自然に生成される。宿主生物体は、本明細書に開示した前駆体の生成が増大するように操作され得る。また、所望の前駆体を生成するように操作した微生物体を宿主生物体として使用し、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の酵素またはタンパク質が発現されるようにさらに操作してもよい。
【０１０１】
一部の実施形態において、本発明の非天然微生物体は、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールを合成する酵素能を含む宿主から作製する。この具体的な実施形態では、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の生成物の合成または蓄積を、例えば、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の反応が２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールが生成する方向に駆動されるように増大させることが有用であり得る。合成または蓄積の増大は、例えば、上記の２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の酵素またはタンパク質の１種類以上をコードしている核酸の過剰発現によって行なわれ得る。２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の酵素（１種類もしくは複数種）および／またはタンパク質（１種類もしくは複数種）の過剰発現は、例えば、内因性遺伝子（１種類もしくは複数種）の外因性発現によって、または異種遺伝子（１種類もしくは複数種）の外因性発現によって起こすことができる。したがって、天然に存在する生物体は、例えば２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールを生成する本発明の非天然微生物体となるように、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成経路の酵素またはタンパク質をコードしている１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１種類の、すなわち全部までの核酸の過剰発現によって容易に作製することができる。また、非天然生物体を、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成経路の酵素の活性の増大をもたらす内因性遺伝子の変異誘発によって作製してもよい。
【０１０２】
特に有用な実施形態では、コード核酸の外因性発現が使用される。外因性発現により、宿主に対して発現エレメントおよび／または調節エレメントを適応させる能力が付与され、ユーザーによって制御される所望の発現レベルを得るための適用が付与される。しかしながら、他の実施形態において、例えば、負の調節エフェクターの除去または遺伝子のプロモーター（誘導性プロモーターもしくは他の調節エレメントに連結されている場合）の誘導により内因性発現を使用することもできる。したがって、天然に存在する誘導性プロモーターを有する内因性遺伝子を適切な誘導剤を供給することによって上方調節してもよく、誘導性調節エレメントを組み込み、それにより所望の時点での内因性遺伝子の発現の増大の調節が可能となるように内因性遺伝子の調節領域を操作してもよい。同様に、誘導性プロモーターを、非天然微生物体に導入する外因性遺伝子の調節エレメントとして含めてもよい。
【０１０３】
本発明の方法において、１種類以上の任意の外因性核酸は微生物体に、本発明の非天然微生物体が作製されるように導入され得ることは理解されよう。該核酸は、例えば、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成経路が微生物体に付与されるように導入され得る。あるいはまた、コード核酸を導入し、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成能を付与するための必要とされる反応の一部を触媒する生合成能を有する中間微生物体を生成させてもよい。例えば、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成経路を有する非天然微生物体は、所望の酵素またはタンパク質、例えば、５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼと２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼの組合せ、あるいはまた５−アミノペンタン酸レダクターゼと５−アミノペント−２−エン酸デアミナーゼ、あるいはまた２，４−ペンタジエン酸デカルボキシラーゼと３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ、あるいはまた３−オキソペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼと２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、あるいはまた４−ヒドロキシ−２−オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼと３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）、あるいはまた３−ヒドロキシ酪酸レダクターゼと３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼなどをコードしている少なくとも２種類の外因性核酸を含むものであり得る。したがって、生合成経路の２種類以上の酵素またはタンパク質の任意の組合せを本発明の非天然微生物体に含めることができることは理解されよう。同様に、生合成経路の３種類以上の酵素またはタンパク質の任意の組合せ、例えば、５−ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼ、５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼおよび５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、あるいはまた（ａｌｔｅｒｎａｖｅｌｙ）ペンタ−２，４−ジエナールデカルボニラーゼ、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（酸還元）および５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡデヒドラターゼ／デヒドロゲナーゼ、あるいはまた２−オキソペンテン酸デカルボキシラーゼ、３−ブテン−１−アールレダクターゼおよび３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ、あるいはまたクロトンアルデヒドレダクターゼ、クロトン酸レダクターゼおよびクロトニル−ＣｏＡヒドロラーゼなどを、所望に応じて、所望の生合成経路の酵素および／またはタンパク質の組合せにより対応する所望の生成物の生成がもたらされる限り、本発明の非天然微生物体に含めることができることは理解されよう。同様に、本明細書に開示の生合成経路の４、５、６、７、８、９、１０、１１種類またはそれ以上の酵素またはタンパク質の任意の組合せを、所望に応じて、所望の生合成経路の酵素および／またはタンパク質の組合せにより対応する所望の生成物の生成がもたらされる限り、本発明の非天然微生物体に含めることができる。
【０１０４】
本明細書に記載の２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成に加えて、本発明の非天然微生物体および方法はまた、互いとの、ならびに他の経路による生成物の生合成を行なうための当該技術分野でよく知られた他の微生物体および方法との種々の組合せで使用され得る。例えば、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール生成体の使用以外で２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールを作製するための代替法の一例は、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の中間体を２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールに変換させ得る別の微生物体の添加によるものである。かかる手順の一例としては、例えば、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の中間体を生成する微生物体の発酵が挙げられる。２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の中間体は、次いで、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の中間体を２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールに変換させる第２の微生物体の基質として使用され得る。２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の中間体を第２の生物体の別の培養物に直接添加してもよく、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の中間体の生成体の最初の培養物から該微生物体を、例えば細胞分離によって枯渇させ、次いで、該発酵ブロスへの第２の生物体の後続添加を使用し、中間の精製工程なしで最終生成物を生成させてもよい。
【０１０５】
他の実施形態において、本発明の非天然微生物体および方法は、さまざまな下位経路において、例えば、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成を行なわせるためにアセンブリングされ得る。このような実施形態では、本発明の所望の生成物の生合成経路は異なる微生物体に分離され得、該異なる微生物体を共培養して最終生成物が生成され得る。かかる生合成スキームでは、第１の微生物体の生成物が、最終生成物が合成されるまで第２の微生物体の基質となる。例えば、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成は、ある経路の中間体を別の経路の中間体または生成物に変換させるための生合成経路を含む微生物体を構築することにより行なわれ得る。あるいはまた、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールは微生物体から、同じ槽内で２種類の生物体を使用する共培養または共発酵によって生合成的に生成させることもでき、この場合、第１の微生物体は、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール中間体を生成するものであり、第２の微生物体は、該中間体を２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールに変換させるものである。
【０１０６】
本明細書に示した教示および手引きに鑑みて、当業者には、本発明の非天然微生物体および方法について、一緒に合わせる他の微生物体、下位経路を有する他の非天然微生物体の共培養ならびに２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールを作製するための当該技術分野でよく知られた他の化学的および／または生化学的手順の組合せとのさまざまな組合せおよび入れ替えが存在することが理解されよう。
【０１０７】
２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の酵素またはタンパク質のコード核酸の供給源としては、例えば、コードされた遺伝子産物が言及している反応触媒し得るものである任意の種が挙げられ得る。かかる種としては、原核生物生物体と真核生物生物体の両方、例えば限定されないが、細菌、例えば、古細菌および真正細菌、ならびに真核生物、例えば、酵母、植物、昆虫、動物および哺乳動物、例えばヒトが挙げられる。かかる供給源の例示的な種としては、例えば、大腸菌、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、アシネトバクター属の一種ＡＤＰ１、アシネトバクター属の一種Ｍ−１株、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ  ＤＳＭ  １８０、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ  ＤＳＭ  １４６６２、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ  ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｙａｍａｍａｉ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ａｒｃｈａｅｇｌｕｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｒｏｍａｔｏｌｅｕｍ  ａｒｏｍａｔｉｃｕｍ  ＥｂＮ１、Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ、Ａｓｃａｒｉｕｓ  ｓｕｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ  ＮＩＨ２６２４、アゾアルカス属の一種ＣＩＢ、アゾアルカス属の一種Ｔ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ  ＤＪ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｈｕｉｌｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、枯草菌、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ、Ｂａｌｎｅａｒｉｕｍ  ｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  ＵＳＤＡ１１０、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｓｕｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｍｂｉｆａｒｉａ  ＡＭＭＤ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｍａｔｕ��、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ、酪酸産生菌Ｌ２−５０、酪酸産生菌Ｌ２−５０、酪酸産生菌ＳＳ３／４、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｕｒｖｕｓ  ５２５．９２、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｌｉｍｉｃｏｌａ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｐｈａｅｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＤＳＭ  ２６６、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｙｏｕｎｇａｅ  ＡＴＣＣ  ２９２２０、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ＮＲＲＬ  Ｂ５９３、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ａ３  ｓｔｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｃ  ｓｔｒ．Ｅｋｌｕｎｄ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ  Ｐ７、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ  Ｐ７、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ  Ｈ１０、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ  ＤＳＭ  ５５５、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｏｖｙｉ  ＮＴ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ、クロストリジウム属の一種ＳＳ２／１、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、コマモナス属の一種ＣＮＢ−１、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｎｉｃｕｍ、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｃｙａｎｏｂｉｕｍ  ＰＣＣ７００１、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ、ＤｅｓｕｌｆｏＶｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  Ｇ２０、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓの亜種ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  ｓｔｒ．ＡＴＣＣ  ２７７７４、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｆｒｕｃｔｏｓｏｖｏｒａｎｓ  ＪＪ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｓｔｒ．Ｈｉｌｄｅｎｂｏｒｏｕｇｈ、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ    ＡＸ４、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ  ｍｅｎｉｎｇ��ｓｅｐｔｉｃａ、エリスロバクター属の一種ＮＡＰ１、大腸菌Ｃ、大腸菌Ｋ１２、大腸菌Ｋ１２の亜種ＭＧ１６５５、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７  ｓｔｒ．Ｓａｋａｉ、大腸菌ｓｔｒ．Ｋ−１２  ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５、大腸菌Ｗ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂａｒｋｅｒｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ  ＡＴＣＣ  ３３６５６、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｙｕｒｉｉ、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｎｉｄｉａｆｏｒｍａｎｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ  、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｕｃｅｎｓ  ＧＳ−１５、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ、インフルエンザ菌、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ  ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ、Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄａｂａｎｅｎｓｉｓ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｉｎａｒｕｍ、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、ピロリ菌、ピロリ菌２６６９５、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、ホモサピエンス、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ジェオトガリコッカス（Ｊｅｏｔｇａｌｉｃｏｃｃｕｓ）属の一種ＡＴＣＣ８４５６、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｏｃｕｒｉａ  ｒｏｓｅａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、ラクトバチルス属の一種３０ａ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、ｍａｒｉｎｅ  ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＨＴＣＣ２０８０、Ｍａｒｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍの亜種ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｋ−１０、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍの亜種Ｐｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ  Ｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ���ｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ＭＣ２  １５５、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｆａｒｃｉｎｉｃａ  ＩＦＭ  １０１５２、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｉｏｗｅｎｓｉｓ、ノストック属の一種ＰＣＣ  ７１２０、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｐｅｄｉｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｒｂｉｎｏｌｉｃｕｓ  ＤＳＭ  ２３８０、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ  ｈａｒｅｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｔｕｎｉｃａｔｅ、緑膿菌、緑膿菌ＰＡＯ１、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＫＵ−７、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  Ｐｆ−５、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｋｎａｃｋｍｕｓｓｉｉ（Ｂ１３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｅｋｅｉ  ＭＴ１、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ、シュードモナス属の一種ＣＦ６００、シュードモナス属の一種ＣＦ６００、シュードモナス属の一種ＣＦ６００、シュードモナス属の一種Ｂ１３株、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｒａｍｉｂａｃｔｅｒ  ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ  ｔｏｒｑｕｉｓ  ＡＴＣＣ  ７００７５５、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ  ｓｔｒ．ＩＭ２、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＪＭＰ１３４
、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｅｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  ＣＧＡ００９、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ  Ｌ１−８２、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ、ロゼブリア属の一種Ａ２−１８３、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ  ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ  ａｒｅｎｉｃｏｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａの亜種ａｒｉｚｏｎａｅ  ｓｅｒｏｖａｒ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＬＴ２、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｓｏｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｓｏｒｄａｒｉａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ  ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｌｉｇｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ  １０７８２、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓの亜種ｇｒｉｓｅｕｓ  ＮＢＲＣ  １３３５０、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌａｒｉｕｓ、スルフォロブス属の一種７株、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ７、Ｓｕｌｆｕｒｉｈｙｄｒｏｇｅｎｉｂｉｕｍ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｍ、Ｓｕｌｆｕｒｉｍｏｎａｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｔｒ．ＰＣＣ  ６８０３、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｕｓ  ａｃｉｄｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｔｈａｕｅｒａ  ａｒｏｍａｔｉｃ、Ｔｈａｕｅｒａ  ａｒｏｍａｔｉｃ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ  ＨＴＤ４、Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｎｉｓ  ａｌｂｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍｅ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ  Ｇ３、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ  ｐａｕｒｏｍｅｔ��ｂｏｌａ  ＤＳＭ  ２０１６２、コレラ菌、Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ  ＡＴＣＣ  ２９９０９、Ｚｅａ  ｍａｙｓ、Ｚｏｏｇｌｏｅａ  ｒａｍｉｇｅｒａ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ、Ｃｕｐｈｅａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、シアノセイス属の一種ＰＣＣ  ７４２５、Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃａ、リングビア属の一種ＰＣＣ  ８１０６、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ  ｓｐｕｍｉｇｅｎａ  ＣＣＹ９４１４、Ｎｏｓｔｏｃ  ａｚｏｌｌａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ、肺炎連鎖球菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ  １０７８２、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｌｉｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ７９４２、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ、Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｃｏｌ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｍ１２９、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ、Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ、黄色ブドウ球菌、ストレプトマイセス属の一種ＡＣＴ−１、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍｅ  ＭＳＢ８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ  ＣＬ１９０、ストレプトマイセス属の一種ＫＯ−３９８８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｎｕｌａｔｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓが挙げられるとともに、本明細書に開示した他の例示的な種が、対応遺伝子の供給源生物体として利用可能である。しかしながら、現在、３９５種の微生物ゲノムならびにさまざまな酵母、真菌、植物および哺乳動物ゲノムなどを含む５５０種超について完全なゲノム配列が入手可能なことにより（これらの半数超はＮＣＢＩなどの公的データベースで入手可能である）、関連種または遠縁種における１つ以上の遺伝子（例えば、既知遺伝子のホモログ、オーソログ、パラログおよび非オーソロガス遺伝子置換など、ならびに生物体間での遺伝子改変の交換）について、必要とする２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成活性をコードしている遺伝子を同定することは常套的であり、当該技術分野でよく知られている。したがって、大腸菌などの具体的な生物体に関する本明細書に記載の２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成を可能にする代謝改変は、他の微生物、例えば、原核生物生物体および真核生物生物体に同様に容易に適用され得る。本明細書に示した教示および手引きに鑑���て、当業者には、ある生物体において例示した代謝改変が他の生物体に等しく適用され得ることがわかるであろう。
【０１０８】
一部の場合、例えば、択一的な２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成経路が非関連の種に存在する場合、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成は宿主の種に、例えば、言及している反応に置き換わる同様だが同一でない代謝反応を触媒する非関連の種に由来するパラログ（１種類または複数種）の外因性発現によって付与され得る。異なる生物体間では代謝ネットワーク間に一定の差が存在するため、当業者には、異なる生物体間の実際の遺伝子出現頻度（ｕｓａｇｅ）は異なり得ることが理解されよう。しかしながら、本明細書に示した教示および手引きに鑑みて、当業者には、本発明の教示および方法は、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールが合成される対象の種で微生物体を構築するために本明細書に例示したものに対応する代謝改変を用いて、あらゆる微生物体に適用され得ることも理解されよう。
【０１０９】
非天然２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール産生宿主構築およびその発現レベルの試験のための方法は、例えば、当該技術分野でよく知られた組換え法および検出方法によって行なわれ得る。かかる方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；およびＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９９）の記載において知得され得る。
【０１１０】
２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生成の経路に関与している外因性核酸配列は、安定的または一過的に宿主細胞内に、当該技術分野でよく知られた手法、例えば限定されないが、コンジュゲーション、エレクトロポレーション、化学変換、形質導入、トランスフェクション、および超音波形質転換を用いて導入され得る。大腸菌または他の原核生物細胞における外因性発現では、真核生物の核酸の遺伝子またはｃＤＮＡの一部の核酸配列に標的化シグナル（例えば、Ｎ末端ミトコンドリアシグナルまたは他の標的化シグナル）をコードさせてもよく、該シグナルを所望により、原核生物の宿主細胞への形質転換前に除去してもよい。例えば、ミトコンドリアリーダー配列を除去すると大腸菌において発現の増大がもたらされた（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：４３２９−４３３８（２００５））。酵母または他の真核生物細胞における外因性発現では、遺伝子を、リーダー配列の付加なしでサイトゾル内にて発現させてもよく、適当な標的化配列（宿主細胞に適したミトコンドリア標的化または分泌シグナルなど）を付加することによってミトコンドリアもしくは他の細胞小器官に標的化させるか、または分泌されるように標的化させてもよい。したがって、標的化配列を除去または含有させるための核酸配列に対する適切な修飾が、外因性核酸配列内に、望ましい特性が付与されるように組み込まれ得ることは理解されよう。さらに、遺伝子を当該技術分野でよく知られた手法によるコドン最適化に供し、タンパク質の発現の最適化を行なってもよい。
【０１１１】
発現ベクター（１つまたは複数）は、宿主生物体において機能性の発現制御配列に作動可能に連結された本明細書に例示した２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成経路の１つ以上のコード核酸を含むように構築され得る。本発明の微生物宿主生物体における使用に適用可能な発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソームおよび人工染色体、例えば、宿主の染色体への安定な組込みのために作動可能なベクターおよび選択配列またはマーカーが挙げられる。さらに、発現ベクターは、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子および適切な発現制御配列を含むものであり得る。また、例えば、抗生物質もしくは毒素に対する耐性をもたらす、栄養素要求性欠乏を補う、または培養培地中にない重要栄養素を供給する選択可能なマーカー遺伝子を含めてもよい。発現制御配列としては、構成的および誘導性プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどが挙げられ得、これらは当該技術分野でよく知られている。２種類以上の外因性コード核酸を共発現させる場合、両方の核酸は、例えば、単一の発現ベクターまたは別々の発現ベクターに挿入され得る。単一ベクターの発現では、コード核酸を、共通の１つの発現制御配列に作動可能に連結させてもよく、異なる発現制御配列（例えば、１つの誘導性プロモーターと１つの構成的プロモーター）に連結させてもよい。代謝経路または合成経路に関与している外因性核酸配列の形質転換は、当該技術分野でよく知られた方法を用いて確認され得る。かかる方法としては、例えば、核酸解析、例えば、ｍＲＮＡのノザンブロットもしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、または遺伝子産物の発現のイムノブロッティング、または導入された核酸配列もしくはその対応遺伝子産物の発現を試験するための他の適当な解析方法が挙げられる。当業者には、外因性核酸は、所望の生成物を生成するのに充分な量で発現させることが理解されよう、また、さらに、発現レベルは、充分な発現が得られるように当該技術分野でよく知られた方法を用いて本明細書に開示したようにして最適化され得ることが理解されよう。
【０１１２】
２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生成を試験するための好適な精製および／またはアッセイは、よく知られた方法を用いて行なわれ得る。試験対象の各操作株について、適当な多数の連（３連など）で培養物を培養するのがよい。例えば、操作した産生宿主における生成物および副生成物の形成がモニタリングされ得る。最終生成物および中間体ならびに他の有機化合物は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−質量分析）およびＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）または当該技術分野でよく知られた常套的手順を使用する他の適当な解析方法などの方法によって解析され得る。また、発酵ブロス中への生成物の放出は、培養上清みを用いて試験することもできる。副生成物および残留グルコースはＨＰＬＣにより、例えば、グルコースおよびアルコールには屈折率検出器、ならびに有機酸にはＵＶ検出器（Ｌｉｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９０：７７５−７７９（２００５））、または当該技術分野でよく知られた他の適当なアッセイおよび検出方法を用いて定量され得る。また、外因性ＤＮＡ配列による個々の酵素またはタンパク質の活性も、当該技術分野でよく知られた方法を用いてアッセイされ得る。
【０１１３】
２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールは培養物中の他の成分から、当該技術分野でよく知られたさまざまな方法を用いて分離され得る。かかる分離方法としては、例えば、抽出手順ならびに連続液−液抽出、パーベーパレーション、膜濾過、膜分離、逆浸透、電気透析、蒸留、晶出、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーおよび限外濾過を含む方法が挙げられる。上記の方法はすべて、当該技術分野でよく知られている。
【０１１４】
本明細書に記載の非天然微生物体はいずれも、本発明の生合成生成物が生成および／または分泌されるように培養され得る。例えば、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール生成体は、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成的生成のために培養され得る。
【０１１５】
２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生成のため、組換え株が炭素源と他の必須栄養素を有する培地中で培養される。場合によっては、全過程のコストを削減するために発酵槽内を嫌気性条件に維持することが望ましく、非常に望ましい場合もあり得る。かかる条件は、例えば、まず培地に窒素をスパージングし、次いでフラスコをセプタムとクリンプキャップで密封することにより得られ得る。嫌気性では増殖が観察されない株では、セプタムに制限的通気のための小孔を開けることにより微好気性または実質的に嫌気性の条件を適用してもよい。例示的な嫌気性条件はこれまでに報告されており、当該技術分野でよく知られている。例示的な好気性条件および嫌気性条件は、例えば、米国特許出願公開第２００９／００４７７１９号（２００７年８月１０日出願）に記載されている。発酵は、バッチ式、フェドバッチ式または連続的様式（本明細書に開示）で行なわれ得る。また、所望により発酵を２期で行なってもよい。最初の期は、高度増殖、したがって高度産生を可能にするために好気性とされ得、続いて、高い２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール収量の嫌気性期にする。
【０１１６】
所望により、培地のｐＨは、培養培地を望ましいｐＨに維持する必要に応じて塩基（ＮａＯＨなど、もしくは他の塩基）または酸の添加により、所望のｐＨ、特に中性ｐＨ（例えば７前後のｐＨ）に維持され得る。増殖速度は分光測光器（６００ｎｍ）を用いて光学密度を測定することにより測定され得、グルコース取り込み率は経時的な炭素源枯渇をモニタリングすることにより測定され得る。
【０１１７】
増殖培地としては、例えば、非天然微生物に炭素源を供給し得る任意の炭水化物供給源が挙げられ得る。かかる供給源としては、例えば、糖質、例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、スクロースおよびデンプンが挙げられる。他の炭水化物供給源としては、例えば、再生可能原料およびバイオマスが挙げられる。本発明の方法における原料として使用され得るバイオマス例示的な型としては、セルロース系バイオマス、ヘミセルロース系バイオマスおよびリグニン原料または該原料の一部分が挙げられる。かかるバイオマス原料は、例えば、炭素源として有用な炭水化物基質、例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトースおよびデンプンを含有しているものである。本明細書に示した教示および手引きに鑑みて、当業者には、上記に例示したもの以外の再生可能原料およびバイオマスもまた、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生成のための本発明の微生物体の培養に使用され得ることが理解されよう。
【０１１８】
また、上記に例示したものなどの再生可能原料に加え、本発明の２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール微生物体を、炭素源としてシンガスで増殖するように改良してもよい。この具体的な実施形態では、１種類以上のタンパク質または酵素を２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール産生生物体において発現させ、シンガスまたは他のガス状炭素源の利用のための代謝経路を得る。
【０１１９】
合成ガスは、シンガスまたは発生炉ガスとしても知られており、石炭のガス化ならびに炭素質材料（例えば、農作物および農業残渣などのバイオマス材料）の主生成物である。シンガスは、主にＨ２とＣＯの混合物であり、任意の有機原料、例えば限定されないが、石炭、コールオイル、天然ガス、バイオマスおよび有機廃棄物のガス化によって得られ得る。ガス化は、一般的に、高い対酸素燃料比で行なわれる。Ｈ２とＣＯが大部分であるが、シンガスには少量のＣＯ２および他のガスが含まれていることもあり得る。したがって、合成ガスにより、コスト効率のよいガス状炭素源（ＣＯ、さらにはＣＯ２など）が供給される。
【０１２０】
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路では、ＣＯのＨ２アセチル−ＣｏＡおよびアセテートなどの他の生成物への変換が触媒される。ＣＯおよびシンガスを利用することができる生物体は、一般的に、ＣＯ２およびＣＯ２／Ｈ２混合物もまた、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路によって包含される同じ基本的な酵素と変換の組によって利用することができる能力を有する。微生物によるＣＯ２からアセテートへのＨ２依存性変換は、同じ生物体によってＣＯも使用され得ること、および同じ経路が関与していることが明らかになるずっと前から認識されていた。アセトゲンの多くはＣＯ２の存在下で増殖し、必要な還元性対応物（ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）が供給される水素が存在する限り、アセテートなどの化合物を生成することが示されている（例えば、Ｄｒａｋｅ，Ａｃｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｐｐ．３−６０  Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９４）参照）。これは、以下の式：
２ＣＯ２＋４Ｈ２＋ｎ  ＡＤＰ＋ｎ  Ｐｉ  →  ＣＨ３ＣＯＯＨ＋２Ｈ２Ｏ＋ｎ  ＡＴＰ
によって要約され得る。
【０１２１】
したがって、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を有する非天然微生物は、アセチル−ＣｏＡおよび他の所望の生成物の生成のためにＣＯ２とＨ２の混合物も同様に利用することができる。
【０１２２】
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、当該技術分野でよく知られており、１２の反応からなり、該反応は２つの分岐路（ｂｒａｎｃｈ）：（１）メチル分岐路と（２）カルボニル分岐路に分離され得る。メチル分岐路ではシンガスがメチル−テトラヒドロフォレート（メチル−ＴＨＦ）に変換され、一方、カルボニル分岐路ではメチル−ＴＨＦがアセチル−ＣｏＡに変換される。メチル分岐路における反応は、順に、以下の酵素またはタンパク質：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロデヒドラターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼによって触媒される。カルボニル分岐路における反応は、順に、以下の酵素またはタンパク質：メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（例えば、ＡｃｓＥ）、コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ニッケル−タンパク質集合体タンパク質（例えば、ＡｃｓＦ）、フェレドキシン、アセチル−ＣｏＡシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびニッケル−タンパク質集合体タンパク質（例えば、ＣｏｏＣ）によって触媒される。２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を得るのに充分な数のコード核酸を導入するための本明細書に示した教示および手引きに従い、当業者には、同じ操作設計が、少なくとも、宿主生物体に存在しないＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌの酵素またはタンパク質をコードしている核酸の導入に関しても行なわれ得ることが理解されよう。したがって、１種類以上のコード核酸を本発明の微生物体に、改良された該生物体が完全なＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含むように導入することにより、シンガス利用能が付与される。
【０１２３】
さらに、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよび／またはヒドロゲナーゼ活性と共役した還元的（逆）トリカルボン酸回路もまた、ＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２のアセチル−ＣｏＡおよびアセテートなどの他の生成物への変換に使用され得る。炭素を還元的ＴＣＡ経路によって固定し得る生物体は、以下の酵素：ＡＴＰクエン酸−リアーゼ、クエン酸リアーゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマル酸レダクターゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、およびヒドロゲナーゼのうちの１種類以上を利用することができる。具体的には、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびヒドロゲナーゼによってＣＯおよび／またはＨ２から抽出された還元性対応物が、アセチル−ＣｏＡまたはアセテートへの還元的ＴＣＡ回路によるＣＯ２の固定に使用される。アセテートはアセチル−ＣｏＡに、アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ／ホスホトランスアセチラーゼ、およびアセチル−ＣｏＡシンテターゼなどの酵素によって変換され得る。アセチル−ＣｏＡは、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール前駆体、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート、ホスホエノールピルビン酸およびピルベートに、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼおよび糖新生酵素によって変換され得る。２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を得るのに充分な数のコード核酸を導入するための本明細書に示した教示および手引きに従い、当業者には、同じ操作設計が、少なくとも、宿主生物体に存在しない還元的ＴＣＡ経路の酵素またはタンパク質をコードしている核酸の導入に関しても行なわれ得ることが理解されよう。したがって、１種類以上のコード核酸を本発明の微生物体に、改良された該生物体が還元的ＴＣＡ経路を含むように導入することにより、シンガス利用能が付与され得る。
【０１２４】
したがって、本発明はまた、一部において、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールまでの経路における中央（ｃｅｎｔｒａｌ）代謝中間体を介した炭素フラックスを改善するために操作された生合成経路に関する。本発明は、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールまでの経路において種々の酵素変換を触媒し得る酵素をコードしている１つ以上の外因性遺伝子を有する非天然微生物体を提供する。一部の実施形態において、このような酵素変換は、還元的トリカルボン酸（ＲＴＣＡ）回路の一部であり、例えば限定されないが炭水化物系炭素原料からの生成物収量を改善するために使用される。
【０１２５】
数多くの操作された経路において、炭水化物原料に対して最大生成物収量を実現することは、不充分な還元性対応物によって、または副生成物への還元性対応物および／または炭素の減損によって障害されている。一部の実施形態によれば、本発明により２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの収量が、（ｉ）還元的ＴＣＡ回路によって炭素固定が向上すること、および／または（ｉｉ）ガス状炭素源および／またはシンガス成分（ＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２など）からさらなる還元性対応物が得られることによって増大する。シンガスに加え、かかるガスの他の供給源としては、限定されないが、自然界にみられるもの、または発生させたもののいずれかとしての大気が挙げられる。
【０１２６】
ＣＯ２固定性還元的トリカルボン酸（ＲＴＣＡ）回路は、還元性対応物とＡＴＰが使用されるＣＯ２同化のエネルギー吸収性同化作用経路である（図８）。１回のＲＴＣＡ回路で２モルのＣＯ２が１モルのアセチル−ＣｏＡに、または４モルのＣＯ２が１モルのオキサロアセテートに同化される。このアセチル−ＣｏＡのさらなる利用可能性により、炭水化物系炭素原料に由来する生成物分子の最大理論収量が改善される。例示的な炭水化物としては、限定されないが、グルコース、スクロース、キシロース、アラビノースおよびグリセロールが挙げられる。
【０１２７】
一部の実施形態において、還元的ＴＣＡ回路は、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよび／またはヒドロゲナーゼ酵素と共役させて、微生物によるシンガス、ＣＯ２、ＣＯ、Ｈ２、および／または他のガス状炭素源の利用を可能にするために使用され得る。合成ガス（シンガス）は特に、主にＨ２とＣＯの混合物であり、場合によってはいくらかの量のＣＯ２が含まれており、任意の有機原料、例えば、石炭、コールオイル、天然ガス、バイオマスまたは有機廃棄物のガス化によって得られ得る。数多くのガス化方法が開発されており、ほとんどの設計は、酸素の制限により高温（５００〜１５００℃）での有機物質の完全燃焼を回避し、シンガスを０．５：１〜３：１のＨ２／ＣＯ混合物として得る部分酸化に基づいたものである。石炭に加え、多くの型のバイオマスがシンガス生産に使用されており、再生可能な化学薬品および燃料の生物学的生産のための安価で柔軟な原料となっている。二酸化炭素は、大気から、または例えばタンクシリンダーから凝縮形態で、または固体のＣＯ２の昇華によって得られ得る。同様に、ＣＯおよび水素ガスは、試薬の形態で得られ得る、および／または任意の所望の比率で混合され得る。他のガス状炭素形態としては、例えば、メタノールまたは同様の揮発性有機溶媒が挙げられ得る。
【０１２８】
合成ガスおよび／または他の炭素源の成分から、還元的ＴＣＡ回路が機能するのに充分なＣＯ２、還元性対応物およびＡＴＰが得られる場合もあり得る。１回のＲＴＣＡ回路により、２モルのＣＯ２が１モルのアセチル−ＣｏＡに同化され、２つのＡＴＰと４つの還元性対応物が必要とされ得る。ＣＯおよび／またはＨ２により、それぞれ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびヒドロゲナーゼ酵素によって還元性対応物が得られ得る。還元性対応物は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤＨ、還元型キノン、還元型フェレドキシン、還元型フラボドキシンおよびチオレドキシンの形態で生成され得る。還元性対応物、特にＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨおよび還元型フェレドキシンは、ＲＴＣＡ回路の酵素、例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマル酸レダクターゼ、α−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（あるいはまた、２−オキソグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、α−ケトグルタル酸シンターゼ、または２−オキソグルタル酸シンターゼとしても知られている）、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびイソクエン酸デヒドロゲナーゼの補因子としての機能を果たし得る。あるいはまた、このような還元性対応物からの電子はイオン勾配生成電子伝達系を通過する場合もあり得、この場合、該電子は酸素、ナイトレート、酸化型金属イオン、プロトンまたは電極などの受容体に送られる。次いで該イオン勾配が、ＡＴＰシンターゼまたは同様の酵素によるＡＴＰ生成に使用され得る。
【０１２９】
還元的ＴＣＡ回路は、最初に緑色硫黄光合成細菌Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｌｉｍｉｃｏｌａにおいて報告された（Ｅｖａｎｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．５５：９２８−９３４（１９６６））。同様の経路が一部の原核生物（プロテオバクテリア、緑色硫黄細菌および好熱性水素酸化細菌）ならびに硫黄依存性古細菌（Ｈｕｇｌｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７：３０２０−３０２７（２００５；Ｈｕｇｌｅｒら，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：８１−９２（２００７）において特性評価されている。一部の場合では、還元的および酸化的（クレブス）ＴＣＡ回路が同じ生物体に存在している（Ｈｕｇｌｅｒら（前出）（２００７）；Ｓｉｅｂｅｒｓら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：２１７９−２１９４（２００４））。一部のメタン生成細菌および偏性嫌気性微生物は、生合成の中間体を合成する機能を果たし得る不完全な酸化的または還元的ＴＣＡ回路を有する（Ｅｋｉｅｌら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：９０５−９０８（１９８５）；Ｗｏｏｄら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２８：３３５−３５２（２００４））。
【０１３０】
還元的ＴＣＡ回路の枢要な炭素固定酵素は、α−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびイソクエン酸デヒドロゲナーゼである。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼによるホスホエノールピルビン酸のオキサロアセテートへの変換中に、またはリンゴ酸酵素によるピルベートのマレエートへの変換によって、さらなる炭素が固定され得る。
【０１３１】
ＴＣＡ回路の酵素の多くは可逆的であり、還元方向および酸化方向の反応を触媒し得るものである。しかしながら、一部のＴＣＡ回路の反応はインビボで不可逆的であり、したがって、このような逆ＴＣＡ回路に必要とされる方向の反応の触媒には異なる酵素が使用される。このような反応は：（１）シトレートのオキサロアセテートおよびアセチル−ＣｏＡへの変換、（２）フマレートのスクシネートへの変換、および（３）スクシニル−ＣｏＡのα−ケトグルタレートへの変換である。ＴＣＡ回路では、シトレートがオキサロアセテートとアセチル−ＣｏＡの縮合により形成される。逆反応であるシトレートのオキサロアセテートとアセチル−ＣｏＡへの切断はＡＴＰ依存性であり、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、またはシトリル−ＣｏＡシンテターゼとシトリル−ＣｏＡリアーゼによって触媒される。あるいはまた、クエン酸リアーゼがアセチル−ＣｏＡシンテターゼ、アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、またはホスホトランスアセチラーゼと酢酸キナーゼと共役すると、シトレートからアセチル−ＣｏＡとオキサロアセテートが形成され得る。スクシネートのフマレートへの変換はコハク酸デヒドロゲナーゼによって触媒され、一方、逆反応はフマル酸レダクターゼによって触媒される。ＴＣＡ回路ではスクシニル−ＣｏＡが、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体によるα−ケトグルタレートのＮＡＤ（Ｐ）＋依存性脱炭酸によって形成される。逆反応はα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼによって触媒される。
【０１３２】
１）ＣＯ、２）ＣＯ２とＨ２、３）ＣＯとＣＯ２、４）ＣＯとＨ２を含む合成ガス、ならびに５）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２を含む合成ガスまたは他のガス状炭素源でアセチル−ＣｏＡ由来生成物の生成を可能にするために逆トリカルボン酸回路を利用することができる生物体は、以下の酵素活性：ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマル酸レダクターゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、およびフェレドキシンのいずれかを含むものであり得る（図９参照）。これらの活性に必要とされる酵素および対応遺伝子は本明細書において上記に記載している。
【０１３３】
シンガスまたは他のガス状炭素源由来の炭素は、逆ＴＣＡ回路およびその成分によって固定され得る。具体的には、特定の炭素ガス利用経路成分と、アセチル−ＣｏＡからの２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの形成のための経路との組合せによって、二酸化炭素中に存在するか、外因的に供給されるか、またはＣＯから内因的に生成される炭素をアセチル−ＣｏＡに固定するための効率的な機構が得られることにより、これらの生成物の高収量がもたらされる。
【０１３４】
一部の実施形態では、本発明の非天然微生物体における２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路に、（１）ＣＯ、（２）ＣＯ２、（３）Ｈ２の任意の組合せまたはその混合物が使用（例えば、還元的ＴＣＡ回路を駆動するために添加）され、還元を伴う生合成工程の収量が向上し得る。
【０１３５】
一部の実施形態では、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を有する非天然微生物体は、還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含むものである。該少なくとも１種類の外因性核酸は、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、およびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ；ならびに一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびフェレドキシンから選択され、（１）ＣＯ、（２）ＣＯ２、（３）Ｈ２、（４）ＣＯ２とＨ２、（５）ＣＯとＣＯ２、（６）ＣＯとＨ２、または（７）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２の利用が可能となるのに充分な量で発現される少なくとも１種類の外因性酵素から選択される。
【０１３６】
一部の実施形態では、該方法は、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を有し、また、還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸も含む非天然微生物体を培養することを含むものである。該少なくとも１種類の外因性核酸は、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニターゼ、およびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される。さらに、かかる生物体はまた、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびフェレドキシンから選択され、生成物の生成のために（１）ＣＯ、（２）ＣＯ２、（３）Ｈ２、（４）ＣＯ２とＨ２、（５）ＣＯとＣＯ２、（６）ＣＯとＨ２、または（７）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２の利用が可能となるのに充分な量で発現される少なくとも１種類の外因性酵素も含むものであってもよい。
【０１３７】
一部の実施形態では、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を有する非天然微生物体が、さらに、アセチル−ＣｏＡを介した炭素フラックスが向上するのに充分な量で発現される還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含むものである。該少なくとも１種類の外因性核酸は、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニターゼおよびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される。
【０１３８】
一部の実施形態では、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を有する非天然微生物体は、一酸化炭素および／または水素の存在下での還元性対応物の利用可能性が向上し、それにより炭水化物系炭素原料によるレドックス限定生成物（ｒｅｄｏｘ−ｌｉｍｉｔｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）の収量が増大するのに充分な量で発現される酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含むものである。該少なくとも１種類の外因性核酸は、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびフェレドキシンから選択される。一部の実施形態において、本発明は、一酸化炭素または水素の存在下での還元性対応物の利用可能性を向上させ、それにより炭水化物系炭素原料（糖質またはガス状炭素源など）によるレドックス限定生成物の収量を増大させるための方法を提供し、該方法は、この非天然微生物体を、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールが生成される条件下で該生成に充分な期間、培養することを含むものである。
【０１３９】
一部の実施形態において、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を有する非天然微生物体は、各々が還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている２種類の外因性核酸を含むものである。一部の実施形態では、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を有する非天然微生物体は、各々が還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている３種類の外因性核酸を含むものである。一部の実施形態において、該非天然微生物体は、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている３種類の外因性核酸を含むものである。一部の実施形態において、該非天然微生物体は、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている３種類の外因性核酸を含むものである。一部の実施形態において、該非天然微生物体は、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ；ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼまたはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ；およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている４種類の外因性核酸を含むものである。一部の実施形態において、該非天然微生物体は、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている２種類の外因性核酸を含むものである。
【０１４０】
一部の実施形態において、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を有する非天然微生物体は、さらに、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、およびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである。
【０１４１】
一部の実施形態では、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を有する非天然微生物体は、さらに、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、アセチル−ＣｏＡシンターゼ、フェレドキシン、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである。
【０１４２】
一部の実施形態において、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を有する非天然微生物体は、（１）ＣＯ、（２）ＣＯ２、（３）ＣＯ２とＨ２、（４）ＣＯとＨ２、または（５）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２から選択される炭素原料を利用するものである。一部の実施形態において、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を有する非天然微生物体は、還元性対応物に水素を利用するものである。一部の実施形態では、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を有する非天然微生物体は、還元性対応物にＣＯを利用するものである。一部の実施形態では、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を有する非天然微生物体は、還元性対応物にＣＯと水素の組合せを利用するものである。
【０１４３】
一部の実施形態では、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を有する非天然微生物体は、さらに、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼおよびリンゴ酸酵素から選択される酵素をコードしている１種類以上の核酸を含むものである。
【０１４４】
一部の実施形態では、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を有する非天然微生物体は、さらに、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、フマル酸レダクターゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼおよびスクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼから選択される酵素をコードしている１種類以上の核酸を含むものである。
【０１４５】
一部の実施形態では、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路を有する非天然微生物体は、さらに、クエン酸リアーゼ、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、シトリル−ＣｏＡシンテターゼ、シトリル−ＣｏＡリアーゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼおよびフェレドキシンをコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含むものである。
【０１４６】
したがって、本明細書に示した教示および手引きに鑑みて、当業者には、炭水化物などの炭素源で培養すると本発明の生合成化合物を分泌する非天然微生物体が作製され得ることが理解されよう。かかる化合物としては、例えば、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールおよび２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の任意の中間代謝産物が挙げられる。必要なことは、必要とされる酵素またはタンパク質の活性の１つ以上を、所望の化合物または中間体の生合成が行なわれるように操作する、例えば、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成経路の一部または全部を含めることなどだけである。したがって、本発明は、炭水化物または他の炭素源で培養すると２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールを生成および／または分泌する非天然微生物体、ならびに炭水化物または他の炭素源で培養すると２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路で示される任意の中間代謝産物を生成および／または分泌する非天然微生物体を提供する。本発明の２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール産生微生物体は、合成を中間体から、例えば、５−アミノペント−２−エノエート、グルタル酸セミアルデヒド、５−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡ、５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡ、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡ、５−ヒドロキシペント−２−エノエート、５−ヒドロキシペント−２−エノエート、アセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、クロトイル−ＣｏＡ、グルタリル−ＣｏＡ、３−オキソペンタノイル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡ、ペント−２−エノイル−ＣｏＡ、ペント−３−エノイル−ＣｏＡ、３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡ、３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエート、３−オキソブタノール、４−ヒドロキシ−２−オキソバレレート、２−オキソペンテノエート、３−ブテン−１−アール、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシブタナール、２，４−ペンタジエノイル−ホスフェート、またはペンタ−２，４−ジエナールから開始するものであってもよい。
【０１４７】
本発明の非天然微生物体は、本明細書に例示した当該技術分野でよく知られた方法を用いて、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の酵素またはタンパク質をコードしている少なくとも１種類の核酸が２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールを生成するのに充分な量で外因的に発現されるように構築される。本発明の微生物体は、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールを生成するのに充分な条件下で培養されることは理解されよう。本明細書に示した教示および手引きに従い、本発明の非天然微生物体により、約０．１〜２００ｍＭ以上の細胞内濃度がもたらされる２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成が行なわれ得る。一般的に、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの細胞内濃度は約３〜１５０ｍＭ、特に約５〜１２５ｍＭ、さらに特別には約８〜１００ｍＭ、例えば約１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、８０ｍＭまたはそれ以上である。また、これらの例示的な各範囲の中間およびそれより上の細胞内濃度が本発明の非天然微生物体により得られる場合もあり得る。
【０１４８】
一部の実施形態において、培養条件としては、嫌気性または実質的に嫌気性の培養条件または維持条件が挙げられる。例示的な嫌気性条件はこれまでに報告されたものであり、当該技術分野でよく知られている。発酵プロセスのための例示的な嫌気性条件は本明細書に記載したものであり、例えば、米国特許出願公開第２００９／００４７７１９号（２００７年８月１０日出願）に記載されている。このような条件の任意のもの、ならびに当該技術分野でよく知られた他の嫌気性条件が非天然微生物体に使用され得る。かかる嫌気性または実質的に嫌気性の条件下で、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール生成体は、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールを５〜１０ｍＭ以上の細胞内濃度ならびに本明細書に例示した他のすべての濃度で合成し得る。上記の記載は細胞内濃度について言及したものではあるが、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール産生微生物体は、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールを細胞内で生成し得る、および／または該生成物を培養培地中に分泌し得ることは理解されよう。
【０１４９】
本明細書に開示した培養条件および発酵条件に加え、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成が行なわれるための培養条件として、培養条件に対する浸透圧保護剤の添加も挙げられ得る。一部の特定の実施形態において、本発明の非天然微生物体は、浸透圧保護剤の存在下で、本明細書に記載のようにして維持、培養または発酵され得る。簡単には、浸透圧保護剤は、オスモライトとして作用し、本明細書に記載の微生物体が浸透圧ストレスをしのぐのを補助する化合物をいう。浸透圧保護剤としては、限定されないが、ベタイン、アミノ酸および糖質トレハロースが挙げられる。かかるのもの非限定的な例は、グリシンベタイン、プラリネベタイン、ジメチルテチン、ジメチルスルホニオプロピオナート（ｓｌｆｏｎｉｏｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）、３−ジメチルスルホニオ−２−メチルプロピオナート（ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）、ピペコリン酸、ジメチルスルホニオアセタート、コリン、Ｌ−カルニチンおよびエクトインである。一態様において、浸透圧保護剤はグリシンベタインである。当業者には、浸透圧ストレスからの本明細書に記載の微生物体の保護に適した浸透圧保護剤の量および型は使用される微生物体に依存することが理解されよう。培養条件における浸透圧保護剤の量は、例えば、約０．１ｍＭ以下、約０．５ｍＭ以下、約１．０ｍＭ以下、約１．５ｍＭ以下、約２．０ｍＭ以下、約２．５ｍＭ以下、約３．０ｍＭ以下、約５．０ｍＭ以下、約７．０ｍＭ以下、約１０ｍＭ以下、約５０ｍＭ以下、約１００ｍＭ以下または約５００ｍＭ以下であり得る。
【０１５０】
一部の実施形態では、炭素原料ならびに他の細胞内取込み供給源、例えば、ホスフェート、アンモニア、スルフェート、クロリドおよび他のハロゲンは、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オールまたは任意の２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の中間体中に存在する原子の同位体分布が改変されるように選択され得る。上記に列挙した種々の炭素原料および他の取込み供給源を、本明細書において集合的に「取込み供給源」と称する。取込み供給源は、生成物２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オールまたは２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの経路の中間体中、あるいは２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路から分かれた反応で生成した副生成物に存在する任意の原子の同位体富化をもたらすものであり得る。同位体富化は、任意の対象原子、例えば、炭素、水素、酸素、窒素、イオウ、リン、クロリドまたは他のハロゲンなどに対して行なわれ得る。
【０１５１】
一部の実施形態では、取込み供給源は、炭素−１２、炭素−１３および炭素−１４比が改変されるように選択され得る。一部の実施形態では、取込み供給源は、酸素−１６、酸素−１７および酸素−１８比が改変されるように選択され得る。一部の実施形態では、取込み供給源は、水素、ジューテリウムおよびトリチウム比が改変されるように選択され得る。一部の実施形態では、取込み供給源は、窒素−１４および窒素−１５比が改変されるように選択され得る。一部の実施形態では、取込み供給源は、イオウ−３２、イオウ−３３、イオウ−３４およびイオウ−３５比が改変されるように選択され得る。一部の実施形態では、取込み供給源は、リン−３１、リン−３２およびリン−３３比が改変されるように選択され得る。一部の実施形態では、取込み供給源は、塩素−３５、塩素−３６および塩素−３７比が改変されるように選択され得る。
【０１５２】
一部の実施形態において、対象原子の同位体比は、１種類以上の取込み供給源を選択することにより所望の比率に変更することができる。取込み供給源は自然界にみられる天然供給源に由来するものであっても人工供給源に由来するものであってもよく、当業者は、対象原子の所望の同位体比を得るために天然供給源、人工供給源またはその組合せを選択することができよう。人工の取込み供給源の一例としては、例えば、少なくとも一部が化学合成反応により誘導された取込み供給源が挙げられる。かかる同位体富化取込み供給源は、市販品で購入してもよく、実験室で調製および／または任意選択で所望の同位体比が得られるように天然供給源である取込み供給源と混合してもよい。一部の実施形態において、取込み供給源の対象原子の同位体比は、自然界にみられる所望の起源の取込み供給源を選択することにより得られ得る。例えば、本明細書において論考しているように、天然供給源は、生体生物体または石油系製品もしくは大気などの供給源に由来するバイオベースであってもよく、該生体生物体または供給源によって合成されたものであってもよい。一部のかかる実施形態では、例えば炭素源は、化石燃料由来炭素源（これは、相対的に炭素−１４が枯渇したものであり得る）、または環境炭素源もしくは大気中の炭素源（ＣＯ２など）（これは、その石油由来の対応物よりも大量の炭素−１４を有するものであり得る）から選択され得る。
【０１５３】
不安定な炭素同位体である炭素−１４または放射性炭素は、地球の大気中、ほぼ１０１２個に１個の炭素原子を構成しており、約５７００年の半減期を有する。炭素のストックは、大気圏上層部において宇宙線および通常の窒素（１４Ｎ）を伴う核反応によって補給される。化石燃料には、炭素−１４がずっと以前に崩壊したため含有されていない。化石燃料を燃やすと大気中の炭素−１４分率が低下する（いわゆる「スース効果」）。
【０１５４】
化合物中の原子の同位体比を調べる方法は当業者によく知られている。同位体富化は質量分析により、当該技術分野で知られた手法、例えば、加速器質量分析（ＡＭＳ）、安定同位体比質量分析（ＳＩＲＭＳ）および位置特異的天然同位体の核磁気共鳴分別（ＳＮＩＦ−ＮＭＲ）を用いて容易に評価される。かかるマススペクトルによる手法は、分離手法、例えば、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および／またはガスクロマトグラフィーなどとともに組み込まれ得る。
【０１５５】
炭素の場合、ＡＳＴＭ  Ｄ６８６６が米国において、放射性炭素年代測定法を用いて固体、液体および気体の試料のバイオベース含有量を測定するための標準化解析方法として、米国材料試験協会（ＡＳＴＭ）インターナショナルによって開発された。この標準法は、生成物のバイオベース含有量の測定に放射性炭素年代測定法を使用することに基づいたものである。ＡＳＴＭ  Ｄ６８６６は最初に２００４年に公表され、該標準法の現在有効なバージョンはＡＳＴＭ  Ｄ６８６６−１１（２０１１年４月１日実効）である。放射性炭素年代測定手法は当業者によく知られている（例えば、本明細書に記載のもの）。
【０１５６】
化合物のバイオベース含有量は、炭素−１２（１２Ｃ）に対する炭素−１４（１４Ｃ）の比によって推定される。具体的には、フラクションモダン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｒｎ）（Ｆｍ）を式：Ｆｍ＝（Ｓ−Ｂ）／（Ｍ−Ｂ）によってコンピュータ処理し、式中、Ｂ、ＳおよびＭは、それぞれ、ブランク、試料およびモダン参照の１４Ｃ／１２Ｃ比を表す。フラクションモダンは、「モダン」からの試料の１４Ｃ／１２Ｃ比の偏差の測定値である。モダンは、米規格基準局（ＮＢＳ）シュウ酸Ｉ（すなわち、δ１３ＣＶＰＤＢ＝−１９／ミルに規格化された標準参照物質（ＳＲＭ）４９９０ｂ）（Ｏｌｓｓｏｎ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｏｘａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓ  ａ  Ｓｔａｎｄａｒｄ．，Ｒａｄｉｏｃａｒｂｏｎ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｙ，Ｎｏｂｅｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，１２ｔｈ  Ｐｒｏｃ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７０））の放射性炭素濃度（ＡＤ  １９５０）の９５％と定義する。例えばＡＳＭによって測定される質量分析の結果は、δ１３ＣＶＰＤＢ＝−１９／ミルに規格化されたＮＢＳシュウ酸Ｉ（ＳＲＭ  ４９９０ｂ）の比活性の０．９５倍という国際的に承認された定義を用いて計算される。これは、絶対（ＡＤ  １９５０）１４Ｃ／１２Ｃ比１．１７６±０．０１０×１０−１２に相当する（Ｋａｒｌｅｎら，Ａｒｋｉｖ  Ｇｅｏｆｙｓｉｋ，４：４６５−４７１（１９６８））。この標準計算法には、ある同位体（ｉｓｔｏｐｅ）の別の同位体と比べた取込みの差、例えば、生物学的系におけるＣ１２とＣ１３とＣ１４を比べた優先的取込みが考慮されており、このような補正を、δ１３に対して補正したＦｍとして反映させる。
【０１５７】
シュウ酸標準（ＳＲＭ  ４９９０ｂまたはＨＯｘ  １）は、１９５５年の作物テンサイから作製された。このシュウ酸標準は、１０００ｌｂ作製されたが、もう市販されていない。シュウ酸ＩＩ標準（ＨＯｘ  ２；Ｎ．Ｉ．Ｓ．Ｔ指定ＳＲＭ  ４９９０  Ｃ）は、１９７７年の作物フランスのビートの糖蜜から作製された。１９８０年代初期、１２の研究所のグループにより、この２つの標準の比率が測定された。シュウ酸ＩＩの１に対する活性の比率は１．２９３３±０．００１である（加重平均）。ＨＯｘ  ＩＩの同位体比は−１７．８／ミル（ｍｉｌｌｅ）である。ＡＳＴＭ  Ｄ６８６６−１１には、モダン標準に対して入手可能なシュウ酸ＩＩ標準ＳＲＭ  ４９９０  Ｃ（Ｈｏｘ２）の使用が提案されている（Ｍａｎｎ，Ｒａｄｉｏｃａｒｂｏｎ，２５（２）：５１９−５２７（１９８３）における最初のシュウ酸標準と現在入手可能なシュウ酸標準（対比）の論考を参照のこと）。Ｆｍ＝０％は、物質中に炭素−１４原子が全くないことを表し、したがって化石（例えば、石油系）炭素源を示す。Ｆｍ＝１００％（１９５０年以降の核実験による大気中への炭素−１４の注入について補正後）は完全なモダン炭素源を示す。本明細書に記載のように、かかる「モダン」供給源にはバイオベース供給源が包含される。
【０１５８】
ＡＳＴＭ  Ｄ６８６６に記載のように、モダン炭素パーセント（ｐＭＣ）は、１９５０年代の核実験プログラム（これにより、ＡＳＴＭ  Ｄ６８６６−１１に記載のように大気中にかなりの炭素−１４の富化がもたらされた）の、継続しているが減少しつつある効果のため、１００％より大きくなる場合があり得る。試料の炭素−１４活性はすべて「爆弾前」標準を基準にしているため、および新しいバイオベース生成物はほぼすべて爆弾後環境において生成されたものであるため、ｐＭＣ値（同位体分率について補正後）はすべて、試料の真のバイオベース含有量をよりよく反映させるために０．９５（２０１０年現在）を乗じなければならない。バイオベース含有量が１０３％より大きいことは、解析エラーが起こったか、またはバイオベース炭素源が数年以上古いものであるかのいずれかを示す。
【０１５９】
ＡＳＴＭ  Ｄ６８６６により物質の総有機分に相対するバイオベース含有量が定量され、存在する無機炭素および他の非炭素含有物質は考慮されない。例えば、５０％がデンプン系物質および５０％が水である生成物は、ＡＳＴＭ  Ｄ６８６６に基づいてバイオベース含有量＝１００％を有するとみなされ得る（５０％の有機分が１００％バイオベースである）。別の例において、５０％がデンプン系物質、２５％が石油系および２５％が水である生成物は、バイオベース含有量＝６６．７％を有するものであり得る（該生成物の７５％は有機分だがその５０％しかバイオベースでない）。別の例において、５０％が有機炭素であり石油系製品である生成物は、バイオベース含有量＝０％を有するとみなされ得る（５０％は有機炭素であるが化石供給源由来でない）。したがって、化合物または物質のバイオベース含有量を測定するためのよく知られた方法および既知標準に基づき、当業者は、バイオベース含有量を容易に測定すること、および／または本発明が用いられた所望のバイオベース含有量を有する下流生成物を調製することができよう。
【０１６０】
物質のバイオベース含有量を定量するための炭素−１４年代測定手法の適用は当該技術分野で知られている（Ｃｕｒｒｉｅら，Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂ，１７２：２８１−２８７（２０００））。例えば、炭素−１４年代測定法は、テレフタレート含有物質のバイオベース含有量を定量するために使用されている（Ｃｏｌｏｎｎａら，Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：２５４３−２５４８（２０１１））。注目すべきことに、再生可能な１，３−プロパンジオールと石油由来テレフタル酸に由来するポリプロピレンテレフタレート（ＰＰＴ）ポリマーではほぼ３０％のＦｍ値が得られた（すなわち、該ポリマーの炭素の３／１１が再生可能な１，３−プロパンジオールに由来し、８／１１が化石の端成分であるテレフタル酸に由来するため）（Ｃｕｒｒｉｅら（前出），２０００）。対照的に、ともに再生可能な１，４−ブタンジオールと再生可能なテレフタル酸に由来するポリブチレンテレフタレートポリマーでは、９０％を超えるバイオベース含有量が得られた（Ｃｏｌｏｎｎａら（前出），２０１１）。
【０１６１】
したがって、一部の実施形態において、本発明は、大気中炭素（環境炭素とも称する）取込み供給源を反映している炭素−１２、炭素−１３および炭素−１４比を有する２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オールまたは２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オール経路の中間体を提供する。例えば、一部の態様では、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オールまたは２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オール経路の中間体は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または１００％ものＦｍ値を有するものであり得る。一部のかかる実施形態では、取込み供給源はＣＯ２である。一部の実施形態において、本発明は、石油系炭素取込み供給源を反映している炭素−１２、炭素−１３および炭素−１４比を有する２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オールまたは２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オール中間体を提供する。この態様では、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オールまたは２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オール経路の中間体は、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満または１％未満のＦｍ値を有するものであり得る。一部の実施形態では、本発明は、大気中炭素取込み供給源と石油系取込み供給源の組合せによって得られる炭素−１２、炭素−１３および炭素−１４比を有する２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オールまたは２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オール中間体を提供する。かかる取込み供給源の組合せの使用は、炭素−１２、炭素−１３および炭素−１４比を変更し得る方法の１つであり、それぞれの比は取込み供給源の割合を反映し得る。
【０１６２】
さらに、本発明は、本明細書に開示のような生物学的に作製される２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オールまたは２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オール経路の中間体およびこれらに由来する生成物であって、該２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オールまたは２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オール経路の中間体が環境中に存在するＣＯ２とほぼ同じ値の炭素−１２、炭素−１３および炭素−１４同位体比を有するものに関する。例えば、一部の態様において、本発明は：環境中に存在するＣＯ２とほぼ同じ値または本明細書に開示した任意のその他の比の炭素−１２対炭素−１３対炭素−１４同位体比を有する生物由来の２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オールまたは生物由来の２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オール経路の中間体を提供する。本明細書に開示のように、生成物は、環境中に存在するＣＯ２とほぼ同じ値または本明細書に開示した任意の比の炭素−１２対炭素−１３対炭素−１４同位体比を有するものであり得、該生成物は、本明細書に開示の生物由来の２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オールまたは生物由来の２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オール中間体から作製されるものであり、該生物由来の生成物は最終生成物を作製するために化学修飾されることが理解されよう。生物由来の生成物である２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オールまたはその中間体を、所望の生成物を作製するために化学修飾する方法は、本明細書に記載のように当業者によく知られている。さらに、本発明は、環境中に存在するＣＯ２とほぼ同じ値の炭素−１２対炭素−１３対炭素−１４同位体比を有するポリウレタン、ポリマー、コポリマー、合成ゴム、樹脂、化学薬品、ポリマー中間体、有機溶媒、血糖降下剤、ポリエステル樹脂、ラテックス、モノマー、ファインケミカル、農薬、医薬品または香料であって、本明細書に開示した生物由来の２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オールまたは生物由来の２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールもしくは３−ブテン−１−オール中間体から直接、あるいはこれらを組み合わせて作製されたものであるポリウレタン、ポリマー、コポリマー、合成ゴム、樹脂、化学薬品、ポリマー中間体、有機溶媒、血糖降下剤、ポリエステル樹脂、ラテックス、モノマー、ファインケミカル、農薬、医薬品または香料を提供する。
【０１６３】
２，４−ペンタジエノエートは有用な置換ブタジエン誘導体であり、他の置換１，３−ブタジエン誘導体（例えば、１−カルバモイル−１，３−ブタジエンなど）までの経路の重要な中間体である。２，４−ペンタジエノエートの用途の非限定的な例としては、アニリン（多くの工業用（ｉｎｄｕｃｔｒｉａｌ）化学薬品、例えばポリウレタンの前駆体）の調製に使用され得るＮ−保護型１，３−ブタジエン誘導体の作製ならびに種々のポリマーおよびコポリマーの作製が挙げられる。したがって、一部の実施形態において、本発明は、本発明の非天然微生物によって生成されるか、または本明細書に開示した方法を用いて作製される１種類以上の生物由来の２，４−ペンタジエノエートまたは生物由来の２，４−ペンタジエノエート中間体を含むものであるバイオベースのポリウレタン、ポリマーまたはコポリマーを提供する。
【０１６４】
ブタジエンは、多くの商業的および工業的用途に一般的に使用されている化学薬品である。かかる用途の非限定的な例としては、ポリマー、例えば合成ゴムおよびＡＢＳ樹脂、ならびに化学薬品、例えばヘキサメチレンジアミンおよび１，４−ブタンジオールの生産が挙げられる。したがって、一部の実施形態において、本発明は、本発明の非天然微生物によって生成されるか、または本明細書に開示した方法を用いて作製される１種類以上の生物由来のブタジエンまたは生物由来のブタジエン中間体を含むものであるバイオベースのポリマー、合成ゴム、樹脂または化学薬品を提供する。
【０１６５】
プロピレンは、多くの商業的および工業的用途に一般的に使用されている化学薬品である。かかる用途の非限定的な例としては、ポリマー、ポリマー中間体および化学薬品、例えば、ポリプロピレン、アクリル酸、ブタノール、ブタンジオール、アクリロニトリル、プロピレンオキシド、イソプロパノールおよびクメンの生産が挙げられる。さらに、このようなプロピレン誘導体、例えばポリプロピレンは、広範な製品、例えば、プラスチック（射出成形など）および繊維類（カーペットなど）の生産に使用される。したがって、一部の実施形態において、本発明は、本発明の非天然微生物によって生成されるか、または本明細書に開示した方法を用いて作製される１種類以上の生物由来のプロピレンまたは生物由来のプロピレン中間体を含むものであるバイオベースのポリマー、ポリマー中間体または化学薬品を提供する。
【０１６６】
１，３−ブタンジオールは、多くの商業的および工業的用途に一般的に使用されている化学薬品である。かかる用途の非限定的な例としては、食品用フレーバー剤の有機溶媒として、または血糖降下剤としての使用、ならびにポリウレタン樹脂およびポリエステル樹脂の生産における使用が挙げられる。さらに、光学活性１，３−ブタンジオールもまた、生物活性化合物および液晶の合成に使用される。なおさらには、１，３−ブタンジオールは、合成ゴム（例えば、タイヤ）、ラテックスおよび樹脂の製造に使用される化合物である１，３−ブタジエンの商業的生産に使用され得る。したがって、一部の実施形態において、本発明は、本発明の非天然微生物によって生成されるか、または本明細書に開示した方法を用いて作製される１種類以上の生物由来の１，３−ブタンジオールまたは生物由来の１，３−ブタンジオール中間体を含むものであるバイオベースの有機溶媒、血糖降下剤、ポリウレタン、ポリエステル樹脂、合成ゴム、ラテックスまたは樹脂を提供する。
【０１６７】
クロチルアルコールは、多くの商業的および工業的用途に一般的に使用されている化学薬品である。かかる用途の非限定的な例としてはクロチルハライド、エステルおよびエーテルの生産が挙げられ、さらにこれらも化学薬品であり、モノマー、ファインケミカル、例えば、ソルビン酸、トリメチルヒドロキノン、クロトン酸および３−メトキシブタノール、農薬ならびに医薬品の生産における化学中間体である。また、クロチルアルコールは１，３−ブタジエンの生産における前駆体としても使用され得る。したがって、一部の実施形態において、本発明は、本発明の非天然微生物によって生成されるか、または本明細書に開示した方法を用いて作製される１種類以上の生物由来のクロチルアルコールまたは生物由来のクロチルアルコール中間体を含むものであるバイオベースのモノマー、ファインケミカル、農薬または医薬品を提供する。
【０１６８】
３−ブテン−１−オールは、多くの商業的および工業的用途に一般的に使用されている化学薬品である。かかる用途の非限定的な例としては、医薬品、農薬、香料および樹脂の生産が挙げられる。したがって、一部の実施形態において、本発明は、本発明の非天然微生物によって生成されるか、または本明細書に開示した方法を用いて作製される１種類以上の生物由来の３−ブテン−１−オールまたは生物由来の３−ブテン−１−オール中間体を含むものであるバイオベースの医薬品、農薬、香料または樹脂を提供する。
【０１６９】
本明細書で用いる場合、用語「生物由来の」は、生体生物体に由来しているか、または生体生物体によって合成されたことを意味し、生体生物体によって作製されたものであり得るため再生可能資源とみなされ得る。かかる生体生物体、特に、本明細書に開示した本発明の微生物体は、農業、植物、細菌または動物による供給源から得られる原料またはバイオマス（糖質または炭水化物など）を利用することができるものである。あるいはまた、該生体生物体は、大気中炭素を利用することができるものである。本明細書で用いる場合、用語「バイオベースの」は、上記の生成物の全部または一部が本発明の生物由来の化合物で構成されていることを意味する。バイオベースまたは生物由来の生成物は、石油由来生成物（かかる生成物は石油もしくは石油化学系原料に由来しているか、またはこれらから合成されたものである）とは対照的である。
【０１７０】
一部の実施形態において、本発明は、生物由来の２，４−ペンタジエノエートまたは生物由来の２，４−ペンタジエノエート経路の中間体を含むものであるポリウレタン、ポリマーまたはコポリマーであって、該生物由来の２，４−ペンタジエノエートまたは生物由来の２，４−ペンタジエノエート経路の中間体が、ポリウレタン、ポリマーまたはコポリマーの生産に使用される２，４−ペンタジエノエートまたは２，４−ペンタジエノエート経路の中間体の全部または一部を含むポリウレタン、ポリマーまたはコポリマーを提供する。したがって、一部の態様において、本発明は、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または１００％の本明細書に開示した生物由来の２，４−ペンタジエノエートまたは生物由来の２，４−ペンタジエノエート経路の中間体を含むものであるバイオベースのポリウレタン、ポリマーまたはコポリマーを提供する。さらに、一部の態様では、本発明は、作製に使用される２，４−ペンタジエノエートまたは２，４−ペンタジエノエート経路の中間体が生物由来および石油由来の２，４−ペンタジエノエートまたは２，４−ペンタジエノエート経路の中間体の組合せであるバイオベースのポリウレタン、ポリマーまたはコポリマーを提供する。例えば、バイオベースのポリウレタン、ポリマーまたはコポリマーは、５０％の生物由来の２，４−ペンタジエノエートと５０％の石油由来の２，４−ペンタジエノエートまたは他の所望の比率、例えば、６０％／４０％、７０％／３０％、８０％／２０％、９０％／１０％、９５％／５％、１００％／０％、４０％／６０％、３０％／７０％、２０％／８０％、１０％／９０％の生物由来／石油由来の前駆体を用いて作製されたものであり得る（該生成物の少なくとも一部分が本明細書に開示した微生物体によって生成された生物由来の生成物を含むものである限り）。本発明の生物由来の２，４−ペンタジエノエートまたは生物由来の２，４−ペンタジエノエート経路の中間体を用いてポリウレタン、ポリマーまたはコポリマーを作製するための方法は当該技術分野でよく知られたものであることは理解されよう。
【０１７１】
一部の実施形態では、本発明は、生物由来のブタジエンまたは生物由来のブタジエン経路の中間体を含むものであるポリマー、合成ゴム、樹脂または化学薬品であって、該生物由来のブタジエンまたは生物由来のブタジエン経路の中間体が、ポリマー、合成ゴム、樹脂または化学薬品の生産に使用されるブタジエンまたはブタジエン経路の中間体の全部または一部を含むポリマー、合成ゴム、樹脂または化学薬品を提供する。したがって、一部の態様において、本発明は、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または１００％の生物由来の本明細書に開示したブタジエンまたは生物由来のブタジエン経路の中間体を含むものであるバイオベースのポリマー、合成ゴム、樹脂または化学薬品を提供する。さらに、一部の態様では、本発明は、作製に使用されるブタジエンまたはブタジエン経路の中間体が生物由来および石油由来のブタジエンまたはブタジエン経路の中間体の組合せであるバイオベースのポリマー、合成ゴム、樹脂または化学薬品を提供する。例えば、バイオベースのポリマー、合成ゴム、樹脂または化学薬品は、５０％の生物由来のブタジエンと５０％の石油由来のブタジエンまたは他の所望の比率、例えば、６０％／４０％、７０％／３０％、８０％／２０％、９０％／１０％、９５％／５％、１００％／０％、４０％／６０％、３０％／７０％、２０％／８０％、１０％／９０％の生物由来／石油由来の前駆体を用いて作製されたものであり得る（該生成物の少なくとも一部分が本明細書に開示した微生物体によって生成された生物由来の生成物を含むものである限り）。本発明の生物由来のブタジエンまたは生物由来のブタジエン経路の中間体を用いてポリマー、合成ゴム、樹脂または化学薬品を作製するための方法は当該技術分野でよく知られたものであることは理解されよう。
【０１７２】
一部の実施形態では、本発明は、生物由来のプロピレンまたは生物由来のプロピレン経路の中間体を含むものであるポリマー、ポリマー中間体または化学薬品であって、該生物由来のプロピレンまたは生物由来のプロピレン経路の中間体が、ポリマー、ポリマー中間体または化学薬品の生産に使用されるプロピレンまたはプロピレン経路の中間体の全部または一部を含むポリマー、ポリマー中間体または化学薬品を提供する。したがって、一部の態様において、本発明は、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または１００％の本明細書に開示した生物由来のプロピレンまたは生物由来のプロピレン経路の中間体を含むものであるバイオベースのポリマー、ポリマー中間体または化学薬品を提供する。さらに、一部の態様では、本発明は、作製に使用されるプロピレンまたはプロピレン経路の中間体が生物由来および石油由来のプロピレンまたはプロピレン経路の中間体の組合せであるバイオベースのポリマー、ポリマー中間体または化学薬品を提供する。例えば、バイオベースのポリマー、ポリマー中間体または化学薬品は、５０％の生物由来のプロピレンと５０％の石油由来のプロピレンまたは他の所望の比率、例えば、６０％／４０％、７０％／３０％、８０％／２０％、９０％／１０％、９５％／５％、１００％／０％、４０％／６０％、３０％／７０％、２０％／８０％、１０％／９０％の生物由来／石油由来の前駆体を用いて作製されたものであり得る（該生成物の少なくとも一部分が本明細書に開示した微生物体によって生成された生物由来の生成物を含むものである限り）。本発明の生物由来のプロピレンまたは生物由来のプロピレン経路の中間体を用いてポリマー、ポリマー中間体または化学薬品を作製するための方法は当該技術分野でよく知られたものであることは理解されよう。
【０１７３】
一部の実施形態では、本発明は、生物由来の１，３−ブタンジオールまたは生物由来の１，３−ブタンジオール経路の中間体を含むものである有機溶媒、血糖降下剤、ポリウレタン、ポリエステル樹脂、合成ゴム、ラテックスまたは樹脂であって、該生物由来の１，３−ブタンジオールまたは生物由来の１，３−ブタンジオール経路の中間体が、有機溶媒、血糖降下剤、ポリウレタン、ポリエステル樹脂、合成ゴム、ラテックスまたは樹脂の生産に使用される１，３−ブタンジオールまたは１，３−ブタンジオール経路の中間体の全部または一部を含む有機溶媒、血糖降下剤、ポリウレタン、ポリエステル樹脂、合成ゴム、ラテックスまたは樹脂を提供する。したがって、一部の態様において、本発明は、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または１００％の生物由来の本明細書に開示した１，３−ブタンジオールまたは生物由来の１，３−ブタンジオール経路の中間体を含むものであるバイオベースの有機溶媒、血糖降下剤、ポリウレタン、ポリエステル樹脂、合成ゴム、ラテックスまたは樹脂を提供する。さらに、一部の態様では、本発明は、作製に使用される１，３−ブタンジオールまたは１，３−ブタンジオール経路の中間体が生物由来および石油由来の１，３−ブタンジオールまたは１，３−ブタンジオール経路の中間体の組合せであるバイオベースの有機溶媒、血糖降下剤、ポリウレタン、ポリエステル樹脂、合成ゴム、ラテックスまたは樹脂を提供する。例えば、バイオベースの有機溶媒、血糖降下剤、ポリウレタン、ポリエステル樹脂、合成ゴム、ラテックスまたは樹脂は、５０％の生物由来の１，３−ブタンジオールと５０％の石油由来の１，３−ブタンジオールまたは他の所望の比率、例えば、６０％／４０％、７０％／３０％、８０％／２０％、９０％／１０％、９５％／５％、１００％／０％、４０％／６０％、３０％／７０％、２０％／８０％、１０％／９０％の生物由来／石油由来の前駆体を用いて作製されたものであり得る（該生成物の少なくとも一部分が本明細書に開示した微生物体によって生成された生物由来の生成物を含むものである限り）。本発明の生物由来の１，３−ブタンジオールまたは生物由来の１，３−ブタンジオール経路の中間体を用いて有機溶媒、血糖降下剤、ポリウレタン、ポリエステル樹脂、合成ゴム、ラテックスまたは樹脂を作製するための方法は当該技術分野でよく知られたものであることは理解されよう。
【０１７４】
一部の実施形態では、本発明は、生物由来のクロチルアルコールまたは生物由来のクロチルアルコール経路の中間体を含むものであるモノマー、ファインケミカル、農薬または医薬品であって、該生物由来のクロチルアルコールまたは生物由来のクロチルアルコール経路の中間体が、モノマー、ファインケミカル、農薬または医薬品の生産に使用されるクロチルアルコールまたはクロチルアルコール経路の中間体の全部または一部を含むモノマー、ファインケミカル、農薬または医薬品を提供する。したがって、一部の態様において、本発明は、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または１００％の本明細書に開示した生物由来のクロチルアルコールまたは生物由来のクロチルアルコール経路の中間体を含むものであるバイオベースのモノマー、ファインケミカル、農薬または医薬品を提供する。さらに、一部の態様では、本発明は、作製に使用されるクロチルアルコールまたはクロチルアルコール経路の中間体が生物由来および石油由来のクロチルアルコールまたはクロチルアルコール経路の中間体の組合せであるバイオベースのモノマー、ファインケミカル、農薬または医薬品を提供する。例えば、バイオベースのモノマー、ファインケミカル、農薬または医薬品は、５０％の生物由来のクロチルアルコールと５０％の石油由来のクロチルアルコールまたは他の所望の比率、例えば、６０％／４０％、７０％／３０％、８０％／２０％、９０％／１０％、９５％／５％、１００％／０％、４０％／６０％、３０％／７０％、２０％／８０％、１０％／９０％の生物由来／石油由来の前駆体を用いて作製されたものであり得る（該生成物の少なくとも一部分が本明細書に開示した微生物体によって生成された生物由来の生成物を含むものである限り）。本発明の生物由来のクロチルアルコールまたは生物由来のクロチルアルコール経路の中間体を用いてモノマー、ファインケミカル、農薬または医薬品を作製するための方法は当該技術分野でよく知られたものであることは理解されよう。
【０１７５】
一部の実施形態では、本発明は、生物由来の３−ブテン−１−オールまたは生物由来の３−ブテン−１−オール経路の中間体を含むものである医薬品、農薬、香料または樹脂であって、該生物由来の３−ブテン−１−オールまたは生物由来の３−ブテン−１−オール経路の中間体が、医薬品、農薬、香料または樹脂の生産に使用される３−ブテン−１−オールまたは３−ブテン−１−オール経路の中間体の全部または一部を含む医薬品、農薬、香料または樹脂を提供する。したがって、一部の態様において、本発明は、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または１００％の本明細書に開示した生物由来の３−ブテン−１−オールまたは生物由来の３−ブテン−１−オール経路の中間体を含むものであるバイオベースの医薬品、農薬、香料または樹脂を提供する。さらに、一部の態様では、本発明は、作製に使用される３−ブテン−１−オールまたは３−ブテン−１−オール経路の中間体が生物由来および石油由来の３−ブテン−１−オールまたは３−ブテン−１−オール経路の中間体の組合せであるバイオベースの医薬品、農薬、香料または樹脂を提供する。例えば、バイオベースの医薬品、農薬、香料または樹脂は、５０％の生物由来の３−ブテン−１−オールと５０％の石油由来の３−ブテン−１−オールまたは他の所望の比率、例えば、６０％／４０％、７０％／３０％、８０％／２０％、９０％／１０％、９５％／５％、１００％／０％、４０％／６０％、３０％／７０％、２０％／８０％、１０％／９０％の生物由来／石油由来の前駆体を用いて作製されたものであり得る（該生成物の少なくとも一部分が本明細書に開示した微生物体によって生成された生物由来の生成物を含むものである限り）。本発明の生物由来の３−ブテン−１−オールまたは生物由来の３−ブテン−１−オール経路の中間体を用いて医薬品、農薬、香料または樹脂を作製するための方法は当該技術分野でよく知られたものであることは理解されよう。
【０１７６】
培養条件としては、例えば、液体培養手順ならびに発酵および他の大規模培養手順が挙げられ得る。本明細書に記載のように、本発明の生合成生成物の特に有用な収量は、嫌気性または実質的に嫌気性の培養条件下で得られ得る。
【０１７７】
本明細書に記載のように、例示的な２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成が行なわれるための培養条件の一例としては、嫌気性の培養または発酵条件が挙げられる。一部の特定の実施形態において、本発明の非天然微生物体は、嫌気性または実質的に嫌気性の条件下で維持、培養または発酵され得る。簡単には、嫌気性条件は酸素がない環境をいう。実質的に嫌気性の条件としては、例えば、培地中の溶存酸素濃度が飽和の０〜１０％に維持されているような培養、バッチ発酵または連続発酵が挙げられる。また、実質的に嫌気性の条件としては、１％未満の酸素の雰囲気で維持された密封チャンバ内部での液体培地中または固形寒天上の細胞の培養または静止も挙げられる。酸素の割合は、例えば、培養物にＮ２／ＣＯ２混合物または他の適当な非酸素ガス（１種類もしくは複数種）をスパージングすることによって維持され得る。
【０１７８】
本明細書に記載の培養条件は、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの製造のためにスケールアップし、連続培養することができる。例示的な培養手順としては、例えば、フェドバッチ発酵とバッチ分離；フェドバッチ発酵と連続分離、または連続発酵と連続分離が挙げられる。これらの方法はすべて、当該技術分野でよく知られている。発酵手順は、商業量の２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成的生成に特に有用である。一般的に、非連続培養手順と同様、連続的および／またはほぼ連続的な２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生成は、本発明の非天然２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール産生生物体を、増殖が対数増殖期に維持および／またはほぼ維持されるのに充分な栄養素および培地中で培養することを含む。かかる条件下での連続培養としては、例えば、１日、２、３、４、５、６もしくは７日間またはそれ以上の培養が挙げられ得る。さらに、連続培養には、１週間、２、３、４もしくは５週間またはそれ以上、および数ヶ月間までという長期間も包含され得る。あるいはまた、本発明の生物体は、具体的な用途に適している場合は数時間の培養であってもよい。連続的および／またはほぼ連続的な培養条件にはこれらの例示的な期間の中間のあらゆる時間枠も包含され得ることは理解されよう。さらに、本発明の微生物体の培養期間は、所望の目的に充分な量の生成物を生成するのに充分な期間であることは理解されよう。
【０１７９】
発酵手順は当該技術分野でよく知られている。簡単には、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生合成的生成のための発酵は、例えば、フェドバッチ発酵とバッチ式分離；フェドバッチ発酵と連続分離、または連続発酵と連続分離において使用され得る。バッチ式および連続式発酵手順の例は当該技術分野でよく知られている。
【０１８０】
また、本発明の２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール生成体を２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの連続大量生産に使用する上記の発酵手順に加え、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール生成体を例えば、同時に化学合成手順に供して生成物を他の化合物に変換させてもよく、所望により、生成物を発酵培養物から分離し、逐次、化学的または酵素的変換に供して生成物を他の化合物に変換させてもよい。
【０１８１】
より良好な生成体を作製するため、代謝モデリングを使用して培養条件を最適化してもよい。また、モデリングは、該経路の利用がさらに最適化される遺伝子ノックアウトを設計するためにも使用され得る（例えば、米国特許出願公開第２００２／００１２９３９号、同第２００３／０２２４３６３号、同第２００４／００２９１４９号、同第２００４／００７２７２３号、同第２００３／００５９７９２号、同第２００２／０１６８６５４号および同第２００４／０００９４６６号、ならびに米国特許第７，１２７，３７９号参照）。モデリング解析により、代謝をより効率的な２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生成にシフトさせることの細胞増殖に対する効果の信頼性のある予測が可能となる。
【０１８２】
所望の生成物の生合成を有利にする代謝改変の同定および設計のためのコンピュータによる方法の一例は、ＯｐｔＫｎｏｃｋコンピューテーショナルフレームワーク（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）である（Ｂｕｒｇａｒｄら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８４：６４７−６５７（２００３））。ＯｐｔＫｎｏｃｋは、目的産物を過剰生成する遺伝学的に安定な微生物がもたらされる遺伝子の欠失または破壊ストラテジーが提案される代謝モデリング／シミュレーションプログラムである。具体的には、該フレームワークにより、所望の生化学物質を強制的に細胞増殖の不可避的副生成物にする遺伝子操作が提案されるように微生物の完全な代謝的および／または生化学的ネットワークが検査される。生化学的生成を、戦略的に配した遺伝子欠失または他の機能性遺伝子破壊による細胞増殖とカップリングすることにより、バイオリアクター内で長期間後の操作株に負荷される増殖淘汰圧によって、強制増殖をカップリングさせた生化学的生成の結果として成績の改善がもたらされる。最後に、遺伝子欠失を構築する場合、設計した株は、ＯｐｔＫｎｏｃｋによって選択された遺伝子がそのゲノムから完全に除去されるため、その野生型状態に戻る可能性がごくわずかに存在する。したがって、このコンピュータによる方法論は、所望の生成物の生合成をもたらす代替の経路を同定するために使用され得るか、または所望の生成物の生合成のさらなる最適化のために該非天然微生物体とともに使用され得るかのいずれかである。
【０１８３】
簡単には、ＯｐｔＫｎｏｃｋは、本明細書において、細胞代謝のモデリングのためのコンピュータによる方法およびシステムを示すために用いている用語である。ＯｐｔＫｎｏｃｋプログラムは、具体的な制約を流速均衡解析（ＦＢＡ）モデルに組み込んだモデルおよび方法のフレームワークに関するものである。このような制約としては、例えば、定性的速度論情報、定性的調節情報および／またはＤＮＡマイクロアレイ実験データが挙げられる。また、ＯｐｔＫｎｏｃｋにより、種々の代謝問題の解が、例えば、フラックスバランスモデルによって誘導されるフラックスの範囲（ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ）をしぼり（ｔｉｇｈｔｅｎ）、続いて、遺伝子の付加または欠失の存在下での代謝ネットワークの性能限界を検索することによりコンピュータ計算される。ＯｐｔＫｎｏｃｋコンピューテーショナルフレームワークにより、代謝ネットワークの性能限界の有効な問い合わせ配列を可能にするモデル公式化の構築が可能となり、得られた混合整数線形計画法問題の解法が得られる。本明細書においてＯｐｔＫｎｏｃｋと称する代謝モデリングおよびシミュレーション方法は、例えば、米国特許出願公開第２００２／０１６８６５４号（２００２年１月１０日出願）、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／００６６０（２００２年１月１０日出願）、および米国特許出願公開第２００９／００４７７１９号（２００７年８月１０日出願）に記載されている。
【０１８４】
生成物の生合成的生成を有利にする代謝改変を同定および設計するための別のコンピュータによる方法は、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）と称される代謝モデリング／シミュレーションシステムである。このコンピュータによる方法およびシステムは、例えば、米国特許出願公開第２００３／０２３３２１８号（２００２年６月１４日出願）および国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／１８８３８（２００３年６月１３日出願）に記載されている。ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）は、ネットワークモデルをインシリコで作製するため、および生物学的系の化学反応による質量フラックス、エネルギーまたは電荷をシミュレーションし、該系における化学反応の任意あらゆる考えられ得る機能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）を含む解空間を規定し、それにより該生物学的系に許容される活性の範囲を求めるために使用され得る計算システムである。このアプローチは、解空間が、含まれる反応の既知の化学量論ならびに反応中の最大フラックスと関連する反応の熱力学的および能力制約などの制約によって規定されるため、制約系モデリングと称される。このような制約によって規定される該空間は、インテロゲーションにより、生物学的系またはその生化学的成分の表現型能力および挙動が判定され得る。
【０１８５】
このようなコンピュータによるアプローチは、生物学的系が柔軟であり、多くの異なる様式で同じ結果に到達し得るため、生物学的リアリティと整合する。生物学的系は、あらゆる生物系が直面するはずの基本的な制約によって制限されてきた進化機構によって設計される。したがって、制約系モデリングストラテジーにはこのような一般的リアリティが包含されている。さらに、制約を厳しくすることによってネットワークモデルにさらなる制限を連続的に課すことが可能なことにより、解空間のサイズ縮小がもたらされ、それにより生理機能または表現型が予測され得る厳密性が向上する。
【０１８６】
本明細書に示した教示および手引きに鑑みて、当業者は、代謝モデリング／シミュレーションのための種々のコンピューテーショナルフレームワークを、宿主微生物体における所望の化合物の生合成の設計および実施に適用することができよう。かかる代謝モデリング／シミュレーション方法としては、例えば、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）およびＯｐｔＫｎｏｃｋとして上記に例示した計算システムが挙げられる。本発明の実例を示すため、本明細書において、モデリングおよびシミュレーションのためのＯｐｔＫｎｏｃｋコンピューテーションフレームワークに関する方法の一例を記載している。当業者には、代謝改変の同定、設計および実施を、どのようにしてＯｐｔＫｎｏｃｋを用いて任意のかかる他の代謝モデリング／シミュレーションコンピューテーショナルフレームワークおよび当該技術分野でよく知られた方法に適用するかがわかるであろう。
【０１８７】
上記の方法により、破壊すべき一組の代謝反応を得る。該組内の各反応の排除または代謝的修飾により、所望の生成物が生物体の増殖期における不可避的生成物としてもたらされ得る。また、該反応は既知であるため、２値の（ｂｉｌｅｖｅｌ）ＯｐｔＫｎｏｃｋ問題の解により、該反応の組の各反応を触媒する１種類以上の酵素をコードしている関連する遺伝子（１つまたは複数）が得られる。一組の反応および各反応に関与している酵素をコードしている対応遺伝子の同定は、一般的に、反応と、酵素とコード遺伝子間に関係を有する反応データベースとの相関によって行なわれる自動化プロセスである。
【０１８８】
同定されたら、所望の生成物の生成が行なわれるように破壊する該反応の組を、該組の各代謝反応物をコードしている少なくとも１つの遺伝子の機能破壊によって標的細胞または生物体において実施させる。該反応の組の機能破壊を行なうのに特に有用な手段の一例は、各コード遺伝子の欠失によるものである。しかしながら、一部の場合では、該反応を他の遺伝子異常、例えば、変異、調節領域（プロモーターもしくは調節因子のシス結合部位など）の欠失などによって、またはいくつかの位置のいずれかのコード配列の切断によって破壊することが有益であり得る。このような後者の異常では、該遺伝子の組の総数より少ない欠失がもたらされ、例えば、生成物の共役の迅速な評価が所望される場合、または遺伝的復帰があまり起こりそうにない場合に有用であり得る。
【０１８９】
上記の２値のＯｐｔＫｎｏｃｋ問題に対し、破壊すべきさらなる反応の組がもたらされるさらなる生産的解、または生合成（例えば、増殖−共役型の所望の生成物の生合成）がもたらされ得る代謝的修飾を特定するため、整数カットと称される最適化方法が行なわれ得る。この方法は、各イテレーションにおいて整数カットと称されるさらなる制約を組み込むことにより、上記に例示したＯｐｔＫｎｏｃｋ問題の解を反復して得ることにより進められる。整数カット制約により、生成物の生合成を増殖に不可避的に共役させる先のいずれかのイテレーションにおいて特定されたものと全く同じ反応の組が解法手順によって選択されることが有効に防止される。例えば、先で特定された増殖−共役型の代謝的修飾により破壊に反応１、２および３が指定された場合、以降の制約では、その後の解法において同じ反応が同時に考慮されることが防止される。整数カット法は当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｂｕｒｇａｒｄら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１７：７９１−７９７（２００１）の記載において知得され得る。代謝モデリングおよびシミュレーションのためのＯｐｔＫｎｏｃｋコンピューテーショナルフレームワークとの併用に関して本明細書に記載したすべての方法と同様、反復コンピュータ解析における冗長性を低減させる整数カット法もまた、当該技術分野でよく知られた他のコンピューテーショナルフレームワーク（例えば、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）など）とともに適用され得る。
【０１９０】
本明細書に例示した方法により、所望の生成物を生合成的に生成する、例えば、標的生化学的生成物の生成を、特定された遺伝子改変を有するように操作された細胞または生物体の増殖と不可避的に共役させる細胞および生物体の構築が可能となる。したがって、本明細書に記載のコンピュータによる方法により、ＯｐｔＫｎｏｃｋまたはＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）から選択されるインシリコ方法によって同定される代謝的修飾の同定および実施が可能となる。代謝的修飾の組としては、例えば、１つ以上の生合成経路の酵素の追加および／または１つ以上の代謝反応の機能破壊（例えば、遺伝子欠失による破壊など）が挙げられ得る。
【０１９１】
上記に論考したように、ＯｐｔＫｎｏｃｋ方法論は、変異型微生物のネットワークは、長期間の増殖淘汰に供した場合、コンピュータにより予測される最大増殖表現型の方向に進化し得るという前提を基づいて開発された。換言すると、該アプローチは、淘汰圧下での生物体の自己最適化能を活用したものである。ＯｐｔＫｎｏｃｋフレームワークにより、ネットワーク化学量論に基づいて生化学的生成と細胞増殖の共役を強制する遺伝子欠失の組合せの網羅的列挙が可能となる。最適な遺伝子／反応ノックアウトの同定には、得られるネットワークの最適増殖の解が目的の生化学物質を過剰生成させるものであるような活性な反応の組が選択される２値の最適化問題の解が必要とされる（Ｂｕｒｇａｒｄら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８４：６４７−６５７（２００３））。
【０１９２】
大腸菌代謝のインシリコ化学量論的モデルは、先に例示し、例えば、米国特許出願公開第２００２／００１２９３９号、同第２００３／０２２４３６３号、同第２００４／００２９１４９号、同第２００４／００７２７２３号、同第２００３／００５９７９２号、同第２００２／０１６８６５４号および同第２００４／０００９４６６号、ならびに米国特許第７，１２７，３７９号に記載されている代謝経路の必須遺伝子を同定するために使用され得る。本明細書に開示のように、ＯｐｔＫｎｏｃｋ数学的フレームワークは、所望の生成物の増殖−共役型生成をもたらす遺伝子欠失の特定に適用され得る。さらに、２値のＯｐｔＫｎｏｃｋ問題の解では一組の欠失しか得られない。有意義なすべての解、すなわち、増殖−共役型の生成の形成をもたらすすべてのノックアウトの組を列挙するため、整数カットと称される最適化手法が行なわれ得る。これは、上記で論考したように、各イテレーションにおいて整数カットと称されるさらなる制約を組み込むことにより、ＯｐｔＫｎｏｃｋ問題の解を反復して得ることを伴う。
【０１９３】
本明細書に開示のように、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の所望の活性をコードしている核酸は、宿主生物体に導入され得る。一部の場合では、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の酵素またはタンパク質の活性を、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オールの生成が増大するように改良することが望ましい場合があり得る。例えば、タンパク質または酵素の活性を増大させる既知の変異がコード核酸分子に導入され得る。さらに、最適化方法は、酵素もしくはタンパク質の活性を増大させるため、および／または阻害活性を低減させるため、例えば負の調節因子の活性を低減させるために適用され得る。
【０１９４】
かかる最適化方法の一例は指向性進化である。指向性進化は、酵素の特性を改善および／または改変するために特定の遺伝子を標的とした変異の導入を伴う強力なアプローチである。酵素の改善および／または改変は、多くの酵素バリアント（例えば、＞１０４）の自動化スクリーニングを可能にする感度のよいハイスループットスクリーニングアッセイの開発および実施によって確認され得る。変異誘発／スクリーニングの反復ラウンドは、典型的には、最適化された特性を有する酵素が得られるように行なわれる。また、変異誘発のための遺伝子領域の特定を補助し得る計算アルゴリズムも開発されており、作製およびスクリーニングが必要とされる酵素バリアントの数が有意に低減され得る。多様なバリアントライブラリーの作製において有効である数多くの指向性進化技術が開発されており（概説については、Ｈｉｂｂｅｒｔら，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ  ２２：１１−１９（２００５）；ＨｕｉｓｍａｎおよびＬａｌｏｎｄｅ，Ｉｎ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  第７１７〜７４２頁（２００７），Ｐａｔｅｌ（編），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；ＯｔｔｅｎおよびＱｕａｘ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ  ２２：１−９（２００５）．；ならびにＳｅｎら，Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４３：２１２−２２３（２００７）を参照されたい）、このような方法は、多くの酵素分類において広範な特性の改善に成功裡に適用されている。指向性進化技術によって改善および／または改変されている酵素の特徴としては、例えば：非天然基質の変換に対する選択性／特異性；激しい高温加工のための温度安定性；低または高ｐＨ条件下でのバイオプロセスのためのｐＨ安定性；高い生成物力価が得られ得るような基質または生成物の耐容性；結合（Ｋｍ）、例えば、非天然基質を含むような基質結合の拡大；生成物、基質または枢要な中間体による阻害を除く阻害（Ｋｉ）；所望のフラックスが得られるように酵素反応速度を増大させる活性（ｋｃａｔ）；タンパク質収量および全経路フラックスを増大させる発現レベル；好気性条件下で空気感受性酵素が働くための酸素安定性；ならびに酸素の非存在下での好気性酵素が働くための嫌気性活性が挙げられる。
【０１９５】
特異的酵素の所望の特性を標的化する遺伝子の変異誘発および多様化のためのいくつかの例示的な方法が開発されている。かかる方法は当業者によく知られている。これらの任意のものが、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、クロチルアルコールまたは３−ブテン−１−オール経路の酵素またはタンパク質の活性の改変および／または最適化に使用され得る。かかる方法としては、限定されないが、ＥｐＰＣＲ（これは、ＰＣＲ反応におけるＤＮＡポリメラーゼの忠実度を低減させることによりランダム点変異を導入する）（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら，Ｊ  Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．２３４：４９７−５０９（２００５））；エラープローンローリングサークル型（ｅｐＲＣＡ）（これは、完全環状プラスミドが鋳型として使用され、最後の２個のヌクレオチドにエキソヌクレアーゼ耐性チオリン酸結合を有するランダム６量体が該プラスミドの増幅に使用され、続いて細胞を形質転換し、該細胞内で該プラスミドがタンデム反復配列で再環状化される以外はｅｐＰＣＲと同様である）（Ｆｕｊｉｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：ｅ１４５（２００４）；およびＦｕｊｉｉら，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１：２４９３−２４９７（２００６））；ＤＮＡまたはファミリーシャフリング（これは、典型的には、ＤｎアーゼＩまたはＥｎｄｏＶなどのヌクレアーゼでの２種類以上のバリアント遺伝子の消化により、ＤＮＡポリメラーゼの存在下でのアニーリングと伸長のサイクルによって再アセンブリングされるランダム断片のプールを得、キメラ遺伝子のライブラリーを作出することを伴う）（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１（１９９４）；およびＳｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１（１９９４））；付着伸長（ＳｔＥＰ）（これは、鋳型プライミングの後、変性および非常に短時間のアニーリング／伸長（５秒程度の短時間）を有する２工程ＰＣＲの反復サイクルを伴う）（Ｚｈａｏら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２５８−２６１（１９９８））；ランダムプライミング組換え（ＲＰＲ）（この場合、ランダム配列プライマーが、鋳型の異なるセグメントに相補的な多くの短鎖ＤＮＡ断片の作製に使用される（Ｓｈａｏら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２６：６８１−６８３（１９９８））が挙げられる。
【０１９６】
さらなる方法としては、ヘテロ二本鎖組換え（この場合、線状化プラスミドＤＮＡを使用し、ミスマッチ修復によって修復されるヘテロ二本鎖を形成する（Ｖｏｌｋｏｖら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：ｅ１８（１９９９）；およびＶｏｌｋｏｖら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２８：４５６−４６３（２０００））；Ｒａｎｄｏｍ  Ｃｈｉｍｅｒａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｎ  Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ（ＲＡＣＨＩＴＴ）（これは、ＤｎアーゼＩ断片化および一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のサイズ分画を使用する）（Ｃｏｃｏら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：３５４−３５９（２００１））；Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｔｅｍｐｌａｔｅｓ（ＲＥＴＴ）（これは、鋳型プールとして使用される一方向ｓｓＤＮＡ断片の存在下でのプライマー由来の一方向に伸長する鎖のテンプレートスイッチを伴う）（Ｌｅｅら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ２６：１１９−１２９（２００３））；縮重オリゴヌクレオチド遺伝子シャッフリング（ＤＯＧＳ）（この場合、縮重プライマーを使用し、分子間の組換えを制御する；（ＢｅｒｇｑｕｉｓｔおよびＧｉｂｂｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ３５２：１９１−２０４（２００７）；Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔら，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ  ２２：６３−７２（２００５）；Ｇｉｂｂｓら，Ｇｅｎｅ  ２７１：１３−２０（２００１））；Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＴＣＨＹ）（これにより、対象の遺伝子または遺伝子断片の１塩基対の欠失を有するコンビナトリアルライブラリーが作出される）（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：３５６２−３５６７（１９９９）；およびＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１２０５−１２０９（１９９９））；Ｔｈｉｏ−Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＴＨＩＯ−ＩＴＣＨＹ）（これは、切断の作製にホスホチオエートｄＮＴＰが使用されること以外はＩＴＣＨＹと同様である）（Ｌｕｔｚら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９：Ｅ１６（２００１））；ＳＣＲＡＴＣＨＹ（これは、２つの遺伝子組み換え方法、ＩＴＣＨＹとＤＮＡシャッフリングを併せたものである）（Ｌｕｔｚら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１１２４８−１１２５３（２００１））；ランダムドリフト変異誘発（ＲＮＤＭ）（この場合、ｅｐＰＣＲによって作出した変異を、使用可能な活性を保持しているものについてスクリーニング／選択によって追跡する）（Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔら，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．２２：６３−７２（２００５））；配列飽和変異誘発（ＳｅＳａＭ）（ホスホチオエートヌクレオチドおよび切断片のランダム組込みを用いてランダム長の断片のプールを作製し、これを、イノシンなどの「ユニバーサル」塩基の存在下での伸長のための鋳型として使用し、イノシン含有相補鎖の複製によりランダム塩基の組込み、その結果として変異誘発をも��らすランダム変異誘発法）（Ｗｏｎｇら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．３：７４−８２（２００８）；Ｗｏｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：ｅ２６（２００４）；およびＷｏｎｇら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４１：１８７−１８９（２００５））；合成的シャッフリング（これは、「標的のすべての遺伝的多様性」をコードするように設計されたオーバーラップオリゴヌクレオチドを使用し、シャッフルされた子孫について非常に高い多様性を可能にする）（Ｎｅｓｓら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１２５１−１２５５（２００２））；Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  ａｎｄ  Ｅｘｃｉｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＮｅｘＴ（これは、ｄＵＴＰの組込みと、その後のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、次いでピペリジンでの処理の組合せを利用し、エンドポイントＤＮＡ断片化を行なうもの）（Ｍｕｌｌｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅ１１７（２００５））が挙げられる。
【０１９７】
さらなる方法としては、配列相同性非依存的タンパク質組換え（ＳＨＩＰＲＥＣ）（この場合、２つの遠縁または非関連の遺伝子間の融合を助長するためにリンカーが使用され、該２種類の遺伝子の一連のキメラを作製し、シングルクロスオーバーハイブリッドのライブラリーを得る）（Ｓｉｅｂｅｒら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：４５６−４６０（２００１））；Ｇｅｎｅ  Ｓｉｔｅ  Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（商標）（ＧＳＳＭ（商標））（この場合、出発物質としては、挿入配列と所望の変異部位が縮重している２つのプライマーを含むスーパーコイル二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）プラスミドが挙げられる）（Ｋｒｅｔｚら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３８８：３−１１（２００４））；コンビナトリアルカセット変異誘発（ＣＣＭ）（これは、多数の考えられ得るアミノ酸配列改変を有する限定領域の置き換えのために短鎖オリゴヌクレオチドカセットの使用を伴う）（Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−５８６（１９９１）；およびＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７（１９８８））；コンビナトリアル多重カセット変異誘発（ＣＭＣＭ）（これは、本質的にＣＣＭと同様であり、変異多発点および変異多発領域を特定するための高い変異率でのｅｐＰＣＲ、次いで、規定のタンパク質配列空間領域を包含するＣＭＣＭによる伸長を使用する）（Ｒｅｅｔｚら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．４０：３５８９−３５９１（２００１））；変異誘発株（Ｍｕｔａｔｏｒ  Ｓｔｒａｉｎｓ）手法（この場合、条件付きｔｓ異誘発体プラスミド，ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの変異型サブユニットをコードしているｍｕｔＤ５遺伝子を使用し、選択の際、ランダムおよび天然変異頻度の２０〜４０００−Ｘの増大を可能にし、選択が必要とされない場合は有害な変異の蓄積を阻止する）（Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖａら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：３６４５−３６４９（２００１））；Ｌｏｗら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０：３５９−３６８０（１９９６））が挙げられる。
【０１９８】
さらなる例示的な方法としては、Ｌｏｏｋ−Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ＬＴＭ）（これは、選択されたアミノ酸のコンビナトリアル変異を評価および最適化する多次元変異誘発法である）（Ｒａｊｐａｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：８４６６−８４７１（２００５））；遺伝子再アセンブリング（Ｇｅｎｅ  Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ）（これは、一度に遺伝子を増やすため、または単一の遺伝子のキメラ（多重変異）の大型ライブラリーを作出するために適用され得るＤＮＡシャッフリング法である）（Ｔｕｎａｂｌｅ  ＧｅｎｅＲｅａｓｓｅｍｂｌｙ（商標）（ＴＧＲ（商標））Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｅｒｅｎｉｕｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって供給）、インシリコタンパク質設計自動化（ＰＤＡ）（これは、特定のフォールド（ｆｏｌｄ）を有する構造的に規定されタンパク質主鎖を固定（ａｎｃｈｏｒ）し、該フォールドおよびタンパク質全体のエネルギー論を安定化させ得、かつ一般的に、既知の３次元構造を有するタンパク質に対して最も有効に作用するアミノ酸置換について配列空間を検索する最適化アルゴリズムである）（Ｈａｙｅｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１５９２６−１５９３１（２００２））；ならびに反復飽和変異誘発（ＩＳＭ）（これは、酵素改善が起こり得る部位を選択するための構造／機能の知識の使用、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）などの変異誘発法を用いた選択部位における飽和変異誘発の実施、所望の特性についてのスクリーニング／選択、および改善されたクローン（１種類または複数種）の使用を伴い、別の部位で再開し、所望の活性が得られるまで反復を継続する）（Ｒｅｅｔｚら，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２：８９１−９０３（２００７）；およびＲｅｅｔｚら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．４５：７７４５−７７５１（２００６））が挙げられる。
【０１９９】
前述の任意の変異誘発方法は単独または任意の組合せで使用され得る。さらに、指向性進化の方法のいずれか１つまたは組合せが、本明細書に記載の適応進化手法とともに使用され得る。
【０２００】
本発明の種々の実施形態の活性に実質的に影響しない変形例もまた本明細書に示した本発明の定義に含まれていることは理解されよう。したがって、以下の実施例は、本発明の限定でなく実例を示すことを意図したものである。
【実施例】
【０２０１】
実施例Ｉ
２−アミノペンタノエート、２−オキソアジペートおよびグルタリル−ＣｏＡから２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オールおよびブタジエンを作製するための経路
２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オールおよびブタジエンまでのいくつかの経路を図１に示す。出発代謝産物としては、２−オキソアジペート、グルタリル−ＣｏＡ、および５−アミノペンタノエートが挙げられる。これらの経路は、以下の酵素：２−アミノアジピン酸デカルボキシラーゼ、５−アミノペンタン酸レダクターゼ、５−アミノペント−２−エン酸アミノトランスフェラーゼ、デヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼ、２−オキソアジピン酸デカルボキシラーゼ、グルタル酸セミアルデヒドレダクターゼ、５−ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼ、５−ヒドロキシペント−２−エン酸デヒドラターゼ、２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、デヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼ、５−アミノペンタン酸アミノトランスフェラーゼ、デヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼ、５−アミノペント−２−エン酸デアミナーゼ、５−ヒドロキシペント−２−エン酸レダクターゼ、５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡトランスフェラーゼおよび／またはシンテターゼ、５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼ、５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはシンテターゼ、５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡデヒドラターゼ／デヒドロゲナーゼ、２−オキソアジピン酸デヒドロゲナーゼ、２−オキソアジピン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、２−オキソアジピン酸ギ酸リアーゼ、グルタリル−ＣｏＡレダクターゼ、２，４−ペンタジエン酸デカルボキシラーゼ、５−ヒドロキシペント−２−エン酸デカルボキシラーゼ、３−ブテン−１−オールデヒドラターゼおよび５−ヒドロキシ吉草酸デカルボキシラーゼのうちの１種類以上によって触媒される。
【０２０２】
グルタリル−ＣｏＡは、数多くの代謝産物、例えば、ベンゾイル−ＣｏＡ、リシンおよびトリプトファンの分解における中間体である。また、グルタリル−ＣｏＡは、例えば、図２に示す経路によっても生合成され得る。グルタリル−ＣｏＡは、５つ以上の酵素的工程で２，４−ペンタジエノエートに変換され得る。第１工程では、グルタリル−ＣｏＡがグルタリル−ＣｏＡレダクターゼによってグルタル酸セミアルデヒドに還元される（工程Ｓ）。５−ヒドロキシバレレート（ｖａｌｅｒｔｅ）までのさらなる還元（ｒｅｄｕｃｔ  ｉｏｎ）は、アルデヒドレダクターゼ酵素によって触媒される（工程Ｅ）。５−ヒドロキシバレレートは、続いて、工程ＬでＣｏＡトランスフェラーゼまたはシンテターゼによって５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡに活性化される。５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡの２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡへの変換は、デヒドラターゼ／デヒドロゲナーゼ活性を有する二元機能酵素によって触媒される（工程Ｑ）。択一的には、該反応は、２つの工程で別々の酵素によって触媒される（工程Ｍ，Ｎ）。２，４−ペンタジエノエートは、ＣｏＡトランスフェラーゼ、シンテターゼまたはヒドロラーゼによるＣｏＡ部分の除去によって形成される（工程Ｏ）。２，４−ペンタジエノエートまたは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡは、さらに、図６に示したいくつかの経路によってブタジエンに変換され得る。また、５−ヒドロキシバレレートを２，４−ペンタジエノエートおよびブタジエンに変換させるための択一的な経路も示す。５−ヒドロキシバレレート中間体を、１つ以上の酵素的工程で３−ブテン−１−オールに変換させることもできる。５−ヒドロキシバレレートの３−ブテン−１−オールへの直接変換は、アルケン形成性デカルボキシラーゼによって触媒される（工程Ｗ）。間接的変換は、５−ヒドロキシバレレートの５−ヒドロキシペント−２−エノエートへの酸化、続いて３−ブテン−１−オールへの脱炭酸を伴う（工程ＦおよびＵ）。３−ブテン−１−オールは、生成物として単離してもよく、さらに脱水させてブタジエンを形成してもよい。該脱水は、酵素的または触媒的反応によって進行する。
【０２０３】
図１に示す経路の別の出発代謝産物は５−アミノペンタノエートである。５−アミノペンタノエートは、リシン、オルニチンおよびプロリンの分解中に形成される中間体である。アミノトランスフェラーゼ、デヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼは、５−アミノペンタノエートがグルタル酸セミアルデヒドに変換されるのに必要とされる。次いでグルタル酸セミアルデヒドが上記の２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オールまたはブタジエンに変換される。択一的には、５−アミノペンタノエートは、エン酸レダクターゼによって５−アミノペント−２−エノエートに酸化される（工程Ｂ）。５−アミノペント−２−エノエートの脱アミノ化により２，４−ペンタジエノエートが生じる。また別の実施形態では、５−アミノペント−２−エノエートがまず、アミノトランスフェラーゼ、デヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼによって、その対応するアルデヒドである５−ヒドロキシペント−２−エノエートに変換される。次いで５−ヒドロキシペント−２−エノエートは、直接（工程Ｇ）またはＣｏＡ中間体（工程Ｐ，Ｎ，Ｑ）を経由して２，４−ペンタジエノエートに脱水される。
【０２０４】
２−アミノアジペートおよび２−オキソアジペート（α−ケトアジペートとも称される）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの生物体におけるリシン代謝の中間体である。また、２−オキソアジペートは、コエンザイムＢ生合成（ｂｉｏｓｙｎｅｔｈｅｓｉｓ）の中間体でもあり、この場合、これは、α−ケトグルタレートとアセチル−ＣｏＡから酵素ホモクエン酸シンターゼ、ホモアコニターゼおよびホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼによって形成される。２−オキソアジペートと２−アミノアジペートは、アミノトランスフェラーゼ、デヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼ酵素によって相互変換される。ケト酸デカルボキシラーゼによる２−オキソアジペートの脱炭酸によりグルタル酸セミアルデヒドが生じる（工程Ｄ）。択一的には、α−ケトアジピン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するアシル化性デカルボキシラーゼにより２−オキソアジペートからグルタリル−ＣｏＡが形成される（工程Ｒ）。アミノ酸デカルボキシラーゼによる２−アミノアジペートの脱炭酸により５−アミノペンタノエートが生じる。グルタリル−ＣｏＡ、グルタル酸セミアルデヒドまたは５−アミノペンタノエート中間体の２，４−ペンタジエノエート、３−ブテン−１−オールまたはブタジエンまでのさらなる変換は、図１に示したとおりに進行し、これまでに報告されている。
【０２０５】
図１に示した反応の酵素候補を実施例ＶＩＩに示す。
【０２０６】
実施例ＩＩ．
アセチル−ＣｏＡからグルタリル−ＣｏＡを作製するための経路
図２は、２分子のアセチル−ＣｏＡをグルタリル−ＣｏＡに変換させるためのカーボン・エフィシェント経路を示す。第１工程では、アセトアセチル−ＣｏＡが、β−ケトチオラーゼ酵素であるアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼによる２分子のアセチル−ＣｏＡの縮合によって形成される。択一的には、アセトアセチル−ＣｏＡは、マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼによって形成され得る。次いで、アセトアセチル−ＣｏＡの３−ケト基が還元および脱水され、クロトニル−ＣｏＡが形成される。グルタリル−ＣｏＡは、クロトニル−ＣｏＡの還元的カルボキシル化により形成される。アセトアセチル−ＣｏＡのグルタリル−ＣｏＡへの変換のための酵素および遺伝子候補を実施例ＶＩＩにさらに詳細に記載する。
【０２０７】
実施例ＩＩＩ．
プロピオニル−ＣｏＡから２，４−ペンタジエノエートを作製するための経路
この実施例では、図３に示すプロピオニル−ＣｏＡを２，４−ペンタジエノエートに変換させるための経路を説明する。酵素としては：３−オキソペンタノイル−ＣｏＡチオラーゼまたはシンターゼ、３−オキソペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼ、ペント−２−エノイル−ＣｏＡイソメラーゼ、ペント−３−エノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、１種類以上の２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、トランスフェラーゼまたはシンテターゼおよびペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼが挙げられる。
【０２０８】
プロピオニル−ＣｏＡは、数多くの生物学的経路、例えば、ＣＯ２固定の３−ヒドロキシプロピオン酸／４−ヒドロキシ酪酸および３−ヒドロキシプロピオン酸回路、スクシネートまたはピルベートのプロピオネートへの変換、グリオキシル酸同化およびアミノ酸分解において代謝中間体として形成される。図３の経路において、プロピオニル−ＣｏＡは、さらに２，４−ペンタジエノエートに変換される。該経路の第１工程では、プロピオニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡが３−オキソペンタノイル−ＣｏＡチオラーゼによって縮合され、３−オキソペンタノイル−ＣｏＡになる。択一的には、プロピオニル−ＣｏＡとマロニル−ＣｏＡが、３−オキソペンタノイル−ＣｏＡシンターゼ活性を有する酵素によって縮合される。択一的には、３−オキソペンタノイル−ＣｏＡ中間体が２工程で、まずプロピオニル−ＣｏＡとマロニル−ＡＣＰが３−オキソペンタノイル−ＡＣＰに変換され、次いでＡＣＰがＣｏＡに変換されることにより形成され得る。次いで、３−オキソペンタノイル−ＣｏＡが、それぞれ、３−オキソアシル−ＣｏＡレダクターゼおよび３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼによって３−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡに還元され、続いて脱水されてペント−２−エノイル−ＣｏＡになる（工程Ｂ，Ｃ）。δ−イソメラーゼにより二重結合が２位から３位にシフトされ、ペント−３−エノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの基質となるペント−３−エノイル−ＣｏＡが形成される（工程ＤおよびＥ）。工程Ｂを触媒する酵素とともに、Ｃ、ＤおよびＥは、５−アミノバレレートを利用する生物体（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃｕｍなど）において逆方向に関与する。択一的には、ペント−２−エノイル−ＣｏＡ中間体は、ペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡに酸化される。該経路の最終工程では、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡが、ＣｏＡヒドロラーゼ、トランスフェラーゼ（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｅ）またはシンテターゼによって、その対応する酸に変換される（工程Ｆ）。２，４−ペンタジエンを生成物として単離してもよく、図６に示すように、２，４−ペンタジエノエートまたは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡを、さらにブタジエンに変換させてもよい。プロピオニル−ＣｏＡの２，４−ペンタジエノエートへの変換のための酵素および遺伝子候補を実施例ＶＩＩにさらに詳細に記載する。
【０２０９】
実施例ＩＶ．
３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡから１，３−ブタンジオールを合成するための経路．
この実施例では、図４に示す３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡを１，３−ブタンジオールに変換させるための経路を説明する。酵素としては：３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡチオラーゼまたは３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンターゼ、３−オキソ−５−ヒドロキシペンタン酸デカルボキシラーゼ、３−オキソブタノールレダクターゼおよび１種類以上の３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、トランスフェラーゼまたはシンテターゼが挙げられる。
【０２１０】
３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡは、自家栄養生物の３−ヒドロキシプロピオン酸／４−ヒドロキシ酪酸ＣＯ２固定回路および光合成細菌において見出された関連３−ヒドロキシプロピオン酸回路の中間体である（Ｂｅｒｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８（５８５７）：１７８２−６（２００７）；ＳｔｒａｕｓｓおよびＦｕｃｈｓ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２１５（３）：６３３−４３（１９９３））。１，３−ブタンジオールまでの経路では、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡが３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡチオラーゼによって縮合され、３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡが形成される（工程Ａ）。択一的には、３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡ中間体が３−ＨＰ−ＣｏＡとマロニル−ＣｏＡから３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンターゼによって形成される。ＣｏＡシンテターゼ、トランスフェラーゼまたはヒドロラーゼによるＣｏＡ部分の除去により３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートが生じる（工程Ｂ）。３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノエートの３−オキソブタノールへの脱炭酸は、ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒される（工程Ｃ）。該経路の最終工程では、３−オキソブタノールがアルコールデヒドロゲナーゼまたはケトンレダクターゼによって１，３−ブタノールに還元される。酵素および遺伝子候補を実施例ＶＩＩにさらに詳細に記載する。
【０２１１】
実施例Ｖ．
ピルベートおよびアセトアルデヒドからの１，３−ブタンジオール、３−ブテン−１−オールおよびブタジエンの形成のための経路．
この実施例では、ピルベートおよびアセトアルデヒドを１，３−ブタンジオール、３−ブテン−１−オールおよびブタジエンに変換させるための経路を説明する。該経路を図５に示す。該当する酵素としては：４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸アルドラーゼ、４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸デヒドラターゼ、２−オキソペンテン酸デカルボキシラーゼ、３−ブテン−１−アールレダクターゼ、３−ブテン−１−オールデヒドラターゼ、４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸デカルボキシラーゼ、３−ヒドロキシブタナールレダクターゼ、４−ヒドロキシ−２−オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ、４−ヒドロキシ−２−オキソペンタン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンテターゼ、３−ヒドロキシ酪酸レダクターゼおよび３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）が挙げられる。また、工程Ｅは化学的脱水によっても触媒され得る。
【０２１２】
ピルベートとアセトアルデヒドから３−ブテン−１−オールへの変換は４つの酵素的工程で行なわれる。ピルベートとアセトアルデヒドが、まず４−ヒドロキシ−２−ケト吉草酸アルドラーゼによって縮合され、４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートになる（図５の工程Ａ）。４−ヒドロキシ−２−オキソバレレート生成物は、続いて脱水され、２−オキソペンテノエートになる（図５の工程Ｂ）。２−オキソペンテノエートの脱炭酸により３−ブテン−１−アールが生じ（工程Ｃ）、これはさらに、アルコールデヒドロゲナーゼによって３−ブテン−１−オールに還元される（工程Ｄ）。３−ブテン−１−オール生成物のブタジエンへのさらなる脱水は酵素または化学触媒によって行なわれる。
【０２１３】
また、４−ヒドロキシ−２−オキソバレレート中間体は２つ以上の酵素的工程で１，３−ブタンジオールに変換され得る。一実施形態では、４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートは３−ヒドロキシブタナールに脱炭酸化され（工程Ｆ）、還元され、１，３−ブタンジオールが形成される（工程Ｇ）。択一的には、４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートはアシル化性／脱炭酸化性オキシドレダクターゼまたはギ酸リアーゼによって３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換される（工程Ｈ）。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ中間体は、さらに１つまたは２つの酵素的工程で、アルデヒド形成性アシル−ＣｏＡレダクターゼ（工程Ｉ）または３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、トランスフェラーゼもしくはシンテターゼと３−ヒドロキシ酪酸レダクターゼの複合反応のいずれかによって３−ヒドロキシブタナールに還元される（工程Ｊ，Ｋ）。３−ヒドロキシブタナールは、さらに、３−ヒドロキシブタナールレダクターゼによって１，３−ブタンジオールに還元される（工程Ｇ）。別の実施形態では、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ中間体が、直接アルコール形成性二元機能アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼによって１，３−ブタンジオールに変換される（工程Ｌ）。酵素および遺伝子候補を実施例ＶＩＩにさらに詳細に記載する。
【０２１４】
実施例ＶＩ．
２，４−ペンタジエノエートまたは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡをブタジエンに変換させるための経路．
図１および３は、２，４−ペンタジエノエートまたは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡを共通の代謝前駆体から形成するための経路を示す。図６は、さらに２，４−ペンタジエノエートまたは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡをブタジエンに変換させるための経路を示す。２，４−ペンタジエノエートはいくつかの択一的な経路によってブタジエンに変換される。経路の１つは、工程Ｇに示した直接脱炭酸である。択一的には、該酸部分がカルボン酸レダクターゼ酵素によってアルデヒドに還元される（工程Ａ）。ペンタ−２，４−ジエナール中間体の脱カルボニルによりブタジエンが形成される（工程Ｂ）。工程ＨとＥは、２，４−ペンタジエノエートが、まずキナーゼによって２，４−ペンタジエノイル−ホスフェートに活性化され、続いてリン酸レダクターゼによってペンタ−２，４−ジエナールに還元される択一的な経路を示す。２，４−ペンタジエノエートと２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡは、ＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼまたはシンテターゼによって相互変換される。２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡのその対応するアルデヒドへの還元は、アシル化性アルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒される（工程Ｃ）。択一的には、ＣｏＡ部分が２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡホスホトランスフェラーゼによってホスフェートに交換される（工程Ｄ）。２，４−ペンタジエノイル−ホスフェートまたはペンタ−２，４−ジエナール中間体は、既述のように、さらにブタジエンに変換される。図６に示した反応の酵素および遺伝子候補を実施例ＶＩＩにさらに詳細に記載する。
【０２１５】
実施例ＶＩＩ．
図１〜６に示した反応の酵素候補
【０２１６】
【表１】
2014521365.tif 000003
１．１．１．ａ  オキシドレダクターゼ（オキソをアルコールに）
図１〜５に示したいくつかの反応はアルコールデヒドロゲナーゼ酵素によって触媒される。このような反応としては、図１の工程ＥとＫ、図２の工程Ｂ、図３の工程Ｂ、図４の工程Ｄおよび図５の工程ＤとＧが挙げられる。例示的なアルコールデヒドロゲナーゼ酵素を以下にさらに詳細に記載する。
【０２１７】
グルタル酸セミアルデヒドレダクターゼによるグルタル酸セミアルデヒドの５−ヒドロキシバレレートへの還元は、アルデヒドのその対応するアルコールへの還元を伴う。グルタル酸セミアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓのＡＴＥＧ＿００５３９遺伝子産物および４ｈｂｄにコードされたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＷＯ２０１０／０６８９５３Ａ２）が挙げられる。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの酵素をクローニングし、酵母において特性評価した（Ｂｒｅｉｔｋｒｅｕｚら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４１５５２−４１５５６（２００３））。
【０２１８】
【表２】
2014521365.tif 000004
アルデヒドのアルコールへの還元を触媒する酵素（すなわち、アルコールデヒドロゲナーゼまたは等しくアルデヒドレダクターゼ）をコードしているさらなる遺伝子としては、Ｃ２〜Ｃ１４の中鎖アルコールデヒドロゲナーゼをコードしているａｌｒＡ（Ｔａｎｉら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：５２３１−５２３５（２０００））、大腸菌由来のｙｑｈＤおよびｆｕｃＯ（Ｓｕｌｚｅｎｂａｃｈｅｒら，３４２：４８９−５０２（２００４））、ならびにブチリル（ｂｕｔｙｒｙ）アルデヒドをブタノールに変換させるＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のｂｄｈ  Ｉおよびｂｄｈ  ＩＩ（Ｗａｌｔｅｒら，１７４：７１４９−７１５８（１９９２））が挙げられる。ＹｑｈＤは、ＮＡＤＰＨが補因子として使用される広範なアルデヒド（好ましくはＣ（３）より長い鎖長）の還元を触媒する（Ｓｕｌｚｅｎｂａｃｈｅｒら，３４２：４８９−５０２（２００４）；Ｐｅｒｅｚら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：７３４６−７３５３（２００８））。Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓＥ由来のａｄｈＡ遺伝子産物は、いくつかのアルデヒド、例えば、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、およびアクロレインに対して活性を有することが示されている（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａら，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：２４９−２５４（１９８５））。さらなるアルデヒドレダクターゼ候補は、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍのｂｄｈならびにＣ．ＢｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉのＣｂｅｉ＿１７２２、Ｃｂｅｉ＿２１８１およびＣｂｅｉ＿２４２１にコードされたものである。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのさらなるアルデヒドレダクターゼ遺伝子候補としては、アルデヒドレダクターゼＧＲＥ３、ＡＬＤ２−６およびＨＦＤ１、グリオキシル酸レダクターゼＧＯＲ１およびＹＰＬ１１３ＣならびにグリセロールデヒドロゲナーゼＧＣＹ１が挙げられる（ＷＯ２０１１／０２２６５１Ａ１；Ａｔｓｕｍｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ４５１：８６−８９（２００８））。また、メチルグリオキサルのアセトールまたはラクトアルデヒドへの還元を触媒する既述の酵素候補も好適なラクトアルデヒドレダクターゼ酵素候補である。
【０２１９】
【表３】
2014521365.tif 000005
また、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を示す酵素（ＥＣ  １．１．１．６１）もこのカテゴリーに含まれる。かかる酵素はＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ（Ｂｒａｖｏら，Ｊ  Ｆｏｒｅｎｓ  Ｓｃｉ，４９：３７９−３８７（２００４））およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ（Ｗｏｌｆｆら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６：２０６−２１２（１９９５））において特性評価されている。また別の遺伝子はＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ由来のアルコールデヒドロゲナーゼａｄｈＩである（Ｊｅｏｎら，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １３５：１２７−１３３（２００８））。
【０２２０】
【表４】
2014521365.tif 000006
別の例示的なアルデヒドレダクターゼはメチルマロン酸セミアルデヒドレダクターゼであり、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．３１）としても知られている。この酵素は、バリン、ロイシンおよびイソロイシンの分解に関与しており、細菌、真核生物および哺乳動物において確認されている。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８由来のＰ８４０６７にコードされた酵素は構造が特性評価されている（Ｌｏｋａｎａｔｈら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３５２：９０５−１７（２００５））。ヒト３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼの可逆性が同位体標識基質を用いて実証された（Ｍａｎｎｉｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，２３１：４８１−４（１９８５））。この酵素をコードしているさらなる遺伝子としては、ホモサピエンス（Ｈａｗｅｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，３２４：２１８−２２８（２０００））およびＯｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ（Ｈａｗｅｓら（前出）；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０：２０４３−２０４７（１９９６））の３ｈｉｄｈ、緑膿菌およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａのｍｍｓＢ、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａのｄｈａｔ（Ａｂｅｒｈａｒｔら，Ｊ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［Ｐｅｒｋｉｎ  １］６：１４０４−１４０６（１９７９）；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０：２０４３−２０４７（１９９６）；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：４３８−４４１（２００３））が挙げられる。いくつかの３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ酵素が還元方向で特性評価されている（例えば、緑膿菌由来のｍｍｓＢ（Ｇｏｋａｒｎら，米国特許第７３９６７６号，（２００８））およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来のｍｍｓＢ）。
【０２２１】
【表５】
2014521365.tif 000007
ケトンをヒドロキシル官能基に変換させる例示的なアルコールデヒドロゲナーゼがいくつか存在している。大腸菌に由来するかかる酵素の２つの例は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）にコードされたものである。また、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来の乳酸デヒドロゲナーゼは、種々の鎖長の２−ケト酸、例えば、ラクテート、２−オキソブチレート、２−オキソペンタノエートおよび２−オキソグルタレートに対して高い活性を示すことが示されている（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３０：３２９−３３４（１９８３））。α−ケトアジペートのα−ヒドロキシアジペートへの変換は、ラットに、およびヒト胎盤にみられることが報告されている酵素２−ケトアジピン酸レダクターゼによって触媒され得る（Ｓｕｄａら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１７６：６１０−６２０（１９７６）；Ｓｕｄａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７７：５８６−５９１（１９７７））。さらなるオキシドレダクターゼはヒト心臓由来のミトコンドリア３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ｂｄｈ）であり、これはクローニングされ、特性評価されている（Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５４５９−１５４６３（１９９２））。Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ（Ｉｓｍａｉｅｌら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：５０９７−５１０５（１９９３））およびＴ．ｂｒｏｃｋｉｉ（Ｌａｍｅｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９５：１８３−１９０（１９８１）；Ｐｅｒｅｔｚら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２８：６５４９−６５５５（１９８９））のアルコールデヒドロゲナーゼ酵素は、アセトンをイソプロパノールに変換させる。メチルエチルケトンレダクターゼはＭＥＫの２−ブタノールへの還元を触媒する。例示的なＭＥＫレダクターゼ酵素は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ（Ｋｏｓｊｅｋら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．８６：５５−６２（２００４））およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｏｏｓｔら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：３０６２−３０６８（２００１））にみられ得るものである。
【０２２２】
【表６】
2014521365.tif 000008
Ｍａｔｓｕｙａｍａら  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃａｔ  Ｂ  Ｅｎｚ，１１：５１３−５２１（２００１）に記載のように、いくつかの生物体、例えば、とりわけバチルス属、ブレビバクテリウム属、カンジダ属およびクレブシエラ属に属するものには、３−オキソブタノールの１，３−ブタンジオールへの還元を触媒する遺伝子がコードされている。このような酵素の一例であるＣａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ由来のＳＡＤＨをクローニングし、大腸菌において特性評価した。また、変異型ロドコッカス属のフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ（Ｓａｒ２６８）およびＬｅｉｆｏｎｉａ属のアルコールデヒドロゲナーゼも、高い収量でこの変換を触媒することが示されている（Ｉｔｏｈら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７５：１２４９−１２５６（２００７））。
【０２２３】
【表７】
2014521365.tif 000009
また、３−オキソアシル−ＣｏＡ基質をその対応する３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ生成物に還元するアルコールデヒドロゲナーゼ酵素も、図２（工程Ｂ）および図３（工程Ｂ）に示した経路に該当している。例示的な酵素としては、３−オキソアシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼが挙げられる。３−オキソアシル−ＣｏＡレダクターゼ酵素（ＥＣ  １．１．１．３５）は、３−オキソアシル−ＣｏＡ分子を３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ分子に変換させ、多くの場合、脂肪酸のβ−酸化またはフェニルアセテートの異化に関与している。例えば、ｆａｄＢとｆａｄＪにコードされた大腸菌の２つの脂肪酸酸化複合体のサブユニットは３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼとしての機能を果たす（Ｂｉｎｓｔｏｃｋら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７１  Ｐｔ  Ｃ：４０３−４１１（１９８１））。大腸菌においてｐａａＨがフェニルアセテート分解オペロン内の他の遺伝子と近接していること（Ｎｏｇａｌｅｓら，１５３：３５７−３６５（２００７））およびｐａａＨ変異型はフェニルアセテートでは増殖し得ないという事実（Ｉｓｍａｉｌら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３０４７−３０５４（２００３））に鑑みると、大腸菌ｐａａＨ遺伝子は３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼもコードしていることが予測される。さらなる３−オキソアシル−ＣｏＡ酵素としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａのｐｈａＣ（Ｏｌｉｖｅｒａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ  ９５：６４１９−６４２４（１９９８））およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのｐａａＣ（Ｄｉら，１８８：１１７−１２５（２００７））の遺伝子産物が挙げられる。このような酵素は、フェニルアセテートまたはスチレンの異化の際に３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡの３−オキソアジピル−ＣｏＡへの可逆的酸化を触媒する。
【０２２４】
アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．３６）は、アセトアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの還元を触媒する。この酵素は、クロストリジウム属のいくつかの種のブチレートまでのアセチル−ＣｏＡ発酵経路に関与しており、詳細に研究されている（Ｊｏｎｅｓら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．５０：４８４−５２４（１９８６））。また、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ｒｅｄｕｃａｔｓｅ）は、多くの生物体のポリヒドロキシブチレートの生合成にも関与しており、また、ＰＨＢと３−ヒドロキシイソブチレートの過剰生産のための代謝操作用途にも使用されている（Ｌｉｕら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：８１１−８１８（２００７）；Ｑｕｉら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６９：５３７−５４２（２００６））。ｈｂｄにコードされたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来の酵素は大腸菌においてクローニングされ、機能発現されている（Ｙｏｕｎｇｌｅｓｏｎら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：６８００−６８０７（１９８９））。さらなる遺伝子候補としては、Ｚｏｏｇｌｏｅａ  ｒａｍｉｇｅｒａ由来のｐｈｂＢ（Ｐｌｏｕｘら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７４：１７７−１８２（１９８８））およびＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のｐｈａＢ（Ａｌｂｅｒら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６１：２９７−３０９（２００６））が挙げられる。Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａの該遺伝子はＮＡＤＰＨ依存性であり、該遺伝子は大腸菌において発現されている（Ｐｅｏｐｌｅｓら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３：３４９−３５７（１９８９））。該遺伝子に関する基質特異性試験により、これは、アセトアセチル−ＣｏＡに加えて３−オキソプロピオニル−ＣｏＡも基質として許容し得るという結論に至った（Ｐｌｏｕｘら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７４：１７７−１８２（１９８８））。さらなる遺伝子としては、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓのｐｈａＢ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉのＨｂｄ１（Ｃ末端ドメイン）およびＨｂｄ２（Ｎ末端ドメイン）（ＨｉｌｌｍｅｒおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３３３４：１２−２３（１９７４））ならびにＢｏｓ  ｔａｕｒｕｓのＨＳＤ１７Ｂ１０（Ｗａｋｉｌら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０７：６３１−６３８（１９５４））が挙げられる。Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ由来の酵素は大腸菌において機能発現され、特性評価されている。（Ｙａｂｕｔａｎｉら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１３３：８５−９０（１９９５））。いくつかの同様の酵素が、クロストリジウム属の他の種およびＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａにおいても見出されている（Ｂｅｒｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１８：１７８２−１７８６（２００７））。Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来の酵素は、ペルオキシソーム脂肪酸のβ−酸化多元機能酵素２型（ＭＦＥ−２）の一成分である。このタンパク質のデヒドロゲナーゼＢドメインはアセトアセチル−ＣｏＡに対して触媒活性である。該ドメインは大腸菌において機能発現されており、結晶構造が入手可能であり、触媒機構が充分に理解されている（Ｙｌｉａｎｔｔｉｌａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３２４：２５−３０（２００４）；Ｙｌｉａｎｔｔｉｌａら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３５８：１２８６−１２９５（２００６））。
【０２２５】
【表８】
2014521365.tif 000010
１．１．１．ｃ  オキシドレダクターゼ（アシル−ＣｏＡをアルコールに）
二元機能オキシドレダクターゼは、アシル−ＣｏＡをその対応するアルコールに変換させる。この活性を有する酵素が３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの１，３−ブタンジオールへの変換に必要とされる（図５の工程Ｌ）。
【０２２６】
アシル−ＣｏＡをアルコールに変換させる例示的な二元機能オキシドレダクターゼとしては、基質、例えば、アセチル−ＣｏＡをエタノールに（例えば、大腸菌由来のａｄｈＥ（Ｋｅｓｓｌｅｒら，ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．２８１：５９−６３（１９９１）））およびブチリル−ＣｏＡをブタノールに（例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のａｄｈＥ２（Ｆｏｎｔａｉｎｅら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：８２１−８３０（２００２）））変換させるものが挙げられる。ｂｄｈ  Ｉおよびｂｄｈ  ＩＩにコードされたＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍの酵素（Ｗａｌｔｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：７１４９−７１５８（１９９２））は、アセチル−ＣｏＡおよびブチリル−ＣｏＡを、それぞれエタノールおよびブタノールに還元する。アセチル−ＣｏＡのエタノールへの還元に加え、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓのａｄｈＥにコードされた酵素は、分枝状化合物であるイソブチルアルデヒドをイソブチリル−ＣｏＡに酸化する（ｏｘｉｄｅ）ことが示されている（Ｋａｚａｈａｙａら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：４３−５５（１９７２）；Ｋｏｏら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ，２７：５０５−５１０（２００５））。別の例示的な酵素は、マロニル−ＣｏＡを３−ＨＰに変換させ得るものである。この活性を有するＮＡＤＰＨ依存性酵素はＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓにおいて特性評価されており、この場合、これは３−ヒドロキシプロピオン酸回路に関与している（Ｈｕｇｌｅｒら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８４：２４０４−２４１０（２００２）；Ｓｔｒａｕｓｓら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２１５：６３３−６４３（１９９３））。この酵素は、３００ｋＤａの質量を有し、高度に基質特異性であり、他の既知のオキシドレダクターゼとほとんど配列類似性を示さない（Ｈｕｇｌｅｒら（前出））。他の生物体において、この特異的反応を触媒することが示されている酵素はない；しかしながら、他の生物体も同様の経路を有しているかもしれないという生命情報科学的証拠がある（Ｋｌａｔｔら，Ｅｎｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，９：２０６７−２０７８（２００７））。他の生物体、例えば、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ  ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ、エリスロバクター属の一種ＮＡＰ１および海洋性γプロテオバクテリアＨＴＣＣ２０８０の酵素候補が配列類似性によって推断され得る。
【０２２７】
【表９】
2014521365.tif 000011
長鎖アシル−ＣｏＡ分子は、アルコール形成性脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードしているホホバ（Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）ＦＡＲなどの酵素によって、その対応するアルコールに還元され得る。大腸菌におけるその過剰発現により、ＦＡＲ活性および脂肪族アルコールの蓄積がもたらされた（Ｍｅｔｚら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１２２：６３５−６４４（２０００））。
【０２２８】
【表１０】
2014521365.tif 000012
このような工程を触媒する別の候補は３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（またはＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）である。この酵素は、自然状態で３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡのＣｏＡ基をアルコール形成性メバロネートに還元する。３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼをコードしているＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓのｈｍｇＡ遺伝子がクローニングされ、配列決定され、大腸菌において発現されている（Ｂｏｃｈａｒら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：３６３２−３６３８（１９９７））。また、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅも２つのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを有している（Ｂａｓｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８３：５５６３−５５６７（１９８６））。該遺伝子はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａからも単離されており、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨＭＧ−ＣＯＡレダクターゼ活性を補足することが示されている（Ｌｅａｒｎｅｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８６：２７７９−２７８３（１９８９））。
【０２２９】
【表１１】
2014521365.tif 000013
１．２．１．ｂ  オキシドレダクターゼ（アシル−ＣｏＡをアルデヒドに）
１．２．１ファミリーのアシル−ＣｏＡレダクターゼは、アシル−ＣｏＡをその対応するアルデヒドに還元する。かかる変換は、グルタリル−ＣｏＡのグルタル酸セミアルデヒドへの（図１の工程Ｓ）、および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの３−ヒドロキシブチルアルデヒドへの（図５の工程Ｉ）還元を触媒するために必要とされる。いくつかのアシル−ＣｏＡレダクターゼ酵素が周知文献において報告されており、この工程の好適な候補となる。このようなものを以下に記載する。
【０２３０】
アシル−ＣｏＡレダクターゼまたはアシル化性アルデヒドデヒドロゲナーゼはアシル−ＣｏＡをその対応するアルデヒドに還元する。例示的な酵素としては、脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼ、スクシニル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．２．１．７６）、アセチル−ＣｏＡレダクターゼ、ブチリル−ＣｏＡレダクターゼおよびプロピオニル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．２．１．３）が挙げられる。例示的な脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼ酵素は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（Ｒｅｉｓｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７９：２９６９−２９７５（１９９７））およびアシネトバクター属の一種Ｍ−１（Ｉｓｈｉｇｅら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：１１９２−１１９５（２００２））のａｃｒ１にコードされている。スクシニル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有する酵素は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉのｓｕｃＤ（Ｓｏｈｌｉｎｇ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１−８８０（１９９６））およびＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのｓｕｃＤ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８２：４７０４−４７１０（２０００））にコードされている。さらなるスクシニル−ＣｏＡレダクターゼ酵素は、好熱性古細菌、例えば、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ（Ｂｅｒｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１７８２−１７８６（２００７））およびＴｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｕｓ（Ｒａｍｏｓ−Ｖｅｒａら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９１：４２８６−４２９７（２００９））の３−ヒドロキシプロピオン酸／４−ヒドロキシ酪酸回路に関与するものである。Ｍ．ｓｅｄｕｌａの該酵素は、Ｍｓｅｄ＿０７０９にコードされており、厳密にＮＡＤＰＨ依存性であり、また、マロニル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有する。Ｔ．ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｕｓの該酵素はＮＡＤＰＨとＮＡＤＨのどちらでも活性である。ｂｐｈＧにコードされたシュードモナス属の一種の酵素アシル化性アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒドおよびホルムアルデヒドを酸化およびアシル化することが示されているため、また別のものである（Ｐｏｗｌｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：３７７−３８５（１９９３））。アセチル−ＣｏＡのエタノールへの還元に加え、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓのａｄｈＥにコードされた酵素は、分枝状化合物であるイソブチルアルデヒドをイソブチリル−ＣｏＡに酸化することが示されている（Ｋａｚａｈａｙａ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：４３−５５（１９７２）；およびＫｏｏら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．２７：５０５−５１０（２００５））。ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、同様の反応、溶媒生成（ｓｏｌｖｅｎｔｏｇｅｎｉｃ）生物体（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍなど）におけるブチリル−ＣｏＡのブチルアルデヒドへの変換を触媒する（Ｋｏｓａｋａら，Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７��：５８−６８（２００７））。例示的なプロピオニル−ＣｏＡレダクターゼ酵素としては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＬＴ２のｐｄｕＰ（Ｌｅａｌ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８０：３５３−３６１（２００３））および大腸菌由来のｅｕｔＥ（Ｓｋｒａｌｙ，ＷＯ特許公開番号２００４／０２４８７６）が挙げられる。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＬＴ２のプロピオニル−ＣｏＡレダクターゼは、自然状態でプロピオニル−ＣｏＡをプロピオンアルデヒドに変換させ、また、５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡの５−ヒドロキシペンタナールへの還元も触媒する（ＷＯ２０１０／０６８９５３Ａ２）。
【０２３１】
【表１２】
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アシル−ＣｏＡをその対応するアルデヒドに変換させるさらなる酵素は、マロニル−ＣｏＡをマロン酸セミアルデヒドに変換させるマロニル−ＣｏＡレダクターゼである。マロニル−ＣｏＡレダクターゼは、好熱酸性古細菌の３−ヒドロキシプロピオン酸回路による独立栄養的炭素固定における枢要な酵素である（Ｂｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１７８２−１７８６（２００７）；およびＴｈａｕｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１７３２−１７３３（２００７））。該酵素は、補因子としてＮＡＤＰＨを利用し、メタロスパエラ属およびスルフォロブス属の一種において特性評価されている（Ａｌｂｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８：８５５１−８５５９（２００６）；およびＨｕｇｌｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：２４０４−２４１０（２００２））。該酵素はＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａのＭｓｅｄ＿０７０９にコードされている（Ａｌｂｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８：８５５１−８５５９（２００６）；およびＢｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１７８２−１７８６（２００７））。Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ由来のマロニル−ＣｏＡレダクターゼをコードしている遺伝子が大腸菌においてクローニングされ、異種発現された（Ａｌｂｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８８：８５５１−８５５９（２００６）。また、この酵素はメチルマロニル−ＣｏＡのその対応するアルデヒドへの変換も触媒することが示されている（ＷＯ２００７１４１２０８（２００７））。このような酵素のアルデヒドデヒドロゲナーゼ官能部は、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来の二元機能デヒドロゲナーゼと同様であるが、配列類似性はほとんどない。どちらのマロニル−ＣｏＡレダクターゼ酵素候補も、アスパルチル−４−ホスフェートのアスパラギン酸セミアルデヒドへの還元および同時脱リン酸化を触媒する酵素であるアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼと高い配列類似性を有する。さらなる遺伝子候補は、他の生物体（例えば、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓおよびＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）のタンパク質との配列相同性によって見出され得、以下に列挙している。ＣｏＡ−アシル化性アルデヒドデヒドロゲナーゼのまた別の候補はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ由来のａｌｄ遺伝子である（Ｔｏｔｈ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：４９７３−４９８０（１９９９）。この酵素は、アセチル−ＣｏＡおよびブチリル−ＣｏＡをその対応するアルデヒドに還元することが報告されている。この遺伝子は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよび大腸菌のアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードしているｅｕｔＥと非常に類似している（Ｔｏｔｈ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：４９７３−４９８０（１９９９）。
【０２３２】
【表１３】
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１．２．１．ｃ  オキシドレダクターゼ  ２−オキソ酸をアシル−ＣｏＡに、脱炭酸
２−オキソアジペートのグルタル酸セミアルデヒドへの還元的脱炭酸およびアシル化（図１の工程Ｄ）は、ＥＣ分類１．２のオキシドレダクターゼによって触媒される。同様の酵素が４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートの３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換に必要とされる（図５の工程Ｈ）。例示的な酵素は、２−ケト酸デヒドロゲナーゼファミリーおよび２−ケトグルタル酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＯＦＯＲ）ファミリーにみられるものである。
【０２３３】
α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（ＡＫＧＤ）は、α−ケトグルタレートをスクシニル−ＣｏＡに変換させ、ＴＣＡ回路による代謝フラックスの制御の主要部位である（Ｈａｎｓｆｏｒｄ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．１０：２１７−２７８（１９８０））。大腸菌の遺伝子ｓｕｃＡ、ｓｕｃＢおよびｌｐｄにコードされているため、ＡＫＧＤ遺伝子発現は嫌気性条件下およびグルコースでの培養時において下方調節される（Ｐａｒｋら，１５：４７３−４８２（１９９５））。ＡＫＧＤの基質範囲は狭いが、Ｅ２成分の触媒コアの構造研究により、基質特異性を担う特異的残基が特定されている（Ｋｎａｐｐら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：６５５−６６８（１９９８））。枯草菌のＡＫＧＤは、ｏｄｈＡＢ（Ｅ１とＥ２）およびｐｄｈＤ（Ｅ３，共有ドメイン）にコードされており、転写レベルで調節され、炭素源および該生物体の増殖期に依存性である（Ｒｅｓｎｅｋｏｖら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３４：２８５−２９６（１９９２））。酵母では、Ｅ３成分をコードしているＬＰＤ１遺伝子がグルコースによって転写レベルで調節される（Ｒｏｙら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３３：９２５−９３３（１９８７））。Ｅ１成分は、ＫＧＤ１にコードされており、これもまたグルコースによって調節され、ＨＡＰ２およびＨＡＰ３の産物によって活性化される（Ｒｅｐｅｔｔｏら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：２６９５−２７０５（１９８９））。ＡＫＧＤ酵素複合体は、生成物ＮＡＤＨおよびスクシニル−ＣｏＡによって阻害され、哺乳動物の系において充分に試験されており、その機能障害はいくつかの神経系の疾患と関連している。
【０２３４】
【表１４】
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分枝状２−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＢＣＫＡＤ）は、２−オキソイソ吉草酸デヒドロゲナーゼとしても知られており、分枝状アミノ酸の分解経路に関与し、バリン、ロイシンおよびイソロイシンの２−ケト酸誘導体をそのアシル−ＣｏＡ誘導体とＣＯ２に変換させる。該複合体は、多くの生物体、例えば、枯草菌（Ｗａｎｇら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１３：１０９１−１０９９（１９９３））、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（Ｎａｍｂａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４：４４３７−４４４７（１９６９））およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ（Ｓｏｋａｔｃｈら，１４８：６４７−６５２（１９８１））で研究されている。枯草菌では、該酵素は遺伝子ｐｄｈＤ（Ｅ３成分）、ｂｆｍＢＢ（Ｅ２成分）、ｂｆｍＢＡＡおよびｂｆｍＢＡＢ（Ｅ１成分）にコードされている（Ｗａｎｇら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１３：１０９１−１０９９（１９９３））。哺乳動物では、該複合体は、特異的ホスファターゼおよびプロテインキナーゼによるリン酸化によって調節されている。該複合体はラット肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｉｔｅ）において研究され（Ｃｈｉｃｃｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９４２７−１９４３４（１９９４））、遺伝子Ｂｃｋｄｈａ（Ｅ１α）、Ｂｃｋｄｈｂ（Ｅ１β）、Ｄｂｔ（Ｅ２）およびＤｌｄ（Ｅ３）にコードされている。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａのＢＣＫＡＤ複合体のＥ１およびＥ３成分は結晶化されており（Ａｅｖａｒｓｓｏｎら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：７８５−７９２（１９９９）；Ｍａｔｔｅｖｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５５：１５４４−１５５０（１９９２））、該酵素複合体は研究されている（Ｓｏｋａｔｃｈら，１４８：６４７−６５２（１９８１））。Ｐ．ｐｕｔｉｄａのＢＣＫＡＤ遺伝子の転写はｂｋｄＲの遺伝子産物によって活性化される（Ｈｅｓｔｅｒら，２３３：８２８−８３６（１９９５））。一部の生物体、例えば、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（Ｐａｘｔｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３４：２９５−３０３（１９８６））およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓｉｎｃｌａｉｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．３１：９１１−９２２（１９９３））では、この複合体は、分枝状アミノ酸前駆体に加えて線状オキソ酸（２−オキソブタノエートおよびα−ケトグルタレートなど）を含む広い基質範囲を有することが示されている。ウシＢＣＫＡＤの活性部位が、別の基質アセチル−ＣｏＡに有利になるように操作された（Ｍｅｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３３：１２８７９−１２８８５（１９９４））。
【０２３５】
【表１５】
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ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体は、ピルベートのアセチル−ＣｏＡへの変換を触媒し、これも広く研究されている。大腸菌の酵素では、Ｅ１成分内の特異的残基が基質特異性を担っている（Ｂｉｓｓｗａｎｇｅｒ，２５６：８１５−８２２（１９８１）；Ｂｒｅｍｅｒ，８：５３５−５４０（１９６９）；Ｇｏｎｇら，２７５：１３６４５−１３６５３（２０００））。前述のように、酵素操作の取り組みにより、嫌気性条件下での大腸菌ＰＤＨ酵素活性が改善されている（Ｋｉｍら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０：３８５１−３８５８（２００８）；Ｋｉｍら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７３：１７６６−１７７１（２００７）；Ｚｈｏｕら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３０：３３５−３４２（２００８））。大腸菌ＰＤＨとは対照的に、枯草菌の該複合体は活性であり、嫌気性条件下での増殖に必要とされる（Ｎａｋａｎｏら，１７９：６７４９−６７５５（１９９７））。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＰＤＨは、グリセロールでの増殖時において特性評価され、これも嫌気性条件下で活性である（Ｍｅｎｚｅｌら，５６：１３５−１４２（１９９７））。ウシ腎臓由来の酵素複合体（Ｚｈｏｕら，９８：１４８０２−１４８０７（２００１））およびＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ由来のＥ２触媒ドメインの結晶構造が入手可能である（Ｍａｔｔｅｖｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５５：１５４４−１５５０（１９９２））。一部の哺乳動物のＰＤＨ酵素複合体は、２−オキソブタノエートなどの代替基質と反応し得るＲａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓのＰＤＨとＢＣＫＡＤの速度論の比較により、ＢＣＫＡＤの方が、基質としての２−オキソブタノエートに対する活性が高いことが示されている（Ｐａｘｔｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３４：２９５−３０３（１９８６））。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの該複合体は、Ｅ１（ＰＤＡ１、ＰＤＢ１）に結合しているＥ２（ＬＡＴ１）コア、Ｅ３（ＬＰＤ１）およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｘ（ＰＤＸ１）成分からなる（Ｐｒｏｎｋら，Ｙｅａｓｔ  １２：１６０７−１６３３（１９９６））。
【０２３６】
【表１６】
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上記の大型の２−ケト酸デヒドロゲナーゼ多酵素複合体の代わりに、一部の嫌気性生物体は、２−ケト酸のアシル化性酸化的脱炭酸を触媒するために２−ケト酸オキシドレダクターゼファミリー（ＯＦＯＲ）の酵素を利用する。デヒドロゲナーゼ複合体とは異なり、このような酵素は、鉄−硫黄クラスターを含有しており、異なる補因子を利用し、電子供与体としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈの代わりにフェレドキシン、フラボドキシン（ｆｌａｖｏｄｉｘｉｎ）またはＦＡＤを用いる。このファミリーのほとんどの酵素は基質としてのピルベートに特異的であり（ＰＯＲ）、一部の２−ケト酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼは、基質として広範な２−ケト酸、例えば、α−ケトグルタレートおよび２−オキソブタノエートを許容することが示されている（Ｚｈａｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：５８７−５９９（１９９６）；Ｆｕｋｕｄａら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５９７：７４−８０（２００２））。かかる酵素の一例は好熱酸性古細菌Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ７由来のＯＦＯＲであり、これは、遺伝子ＳＴ２３００にコードされたαおよびβサブユニットを含むものである（Ｚｈａｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：５８７−５９９（１９９６）；ＦｕｋｕｄａおよびＷａｋａｇｉ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５９７：７４−８０（２００２））。大腸菌においてこのタンパク質を効率的に発現させるためのプラスミド系発現系が開発されており（Ｆｕｋｕｄａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：５６３９−５６４６（２００１））、基質特異性に関与している残基が決定された（ＦｕｋｕｄａおよびＷａｋａｇｉ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５９７：７４−８０（２００２））。また、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  Ｐ１由来の２−オキソ酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼも広範な２−オキソ酸に対して活性である（Ｐａｒｋら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９：４６−５４（２００６））。Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  ｓｔｒ．Ｋ１由来のＡｐｅ１４７２／Ａｐｅ１４７３にコードされたＯＦＯＲ酵素が最近、大腸菌においてクローニングされ、特性評価され、２−オキソグルタレートおよび広範な２−オキソ酸と反応することがわかった（Ｎｉｓｈｉｚａｗａら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５７９：２３１９−２３２２（２００５））。同様の酵素がすべての古細菌、一部の嫌気性細菌およびａｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｅｕｋａｒｙａに存在しているという生命情報科学的証拠がある（ＦｕｋｕｄａおよびＷａｋａｇｉ（前出））。また、ＯＦＯＲ酵素はＲＴＣＡ回路によって炭素を固定する生物体、例えば、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌｕｓおよびクロロビウム属の種にもみられる（Ｓｈｉｂａら，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４１：１９８−２０３（１９８５）；Ｅｖａｎｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ５５：９２８−９３４（１９６６））。Ｈ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のｋｏｒＡＢにコードされて��る該２サブユニット酵素は、大腸菌においてクローニングされ、発現された（Ｙｕｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８２：５８９−５９４（２００１））。
【０２３７】
【表１７】
2014521365.tif 000019
１．２．１．ｄ  オキシドレダクターゼ（脱リン酸化）
ホスホン酸のその対応するアルデヒドへの還元は、ＥＣ分類１．２．１のオキシドレダクターゼまたはリン酸レダクターゼによって触媒される。図６の工程Ｅには、２，４−ペンタジエノイル−ホスフェートのその対応するアルデヒドへの還元のためにかかる酵素が必要とされる。この変換は、これまでに文献において特性評価されていない。例示的なホスホン酸レダクターゼ酵素としては、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．１２）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．１１）アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（ＥＣ  １．２．１．３８）およびグルタミン酸−５−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．−）が挙げられる。アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＳＤ，ＥＣ  １．２．１．１１）は、４−アスパルチルホスフェートのアスパラギン酸−４−セミアルデヒドへのＮＡＤＰＨ依存性還元を触媒する。ＡＳＤは、アミノ酸の生合成に関与しており、最近では、抗菌薬の標的として研究されている（Ｈａｄｆｉｅｌｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：１４４７５−１４４８３（２００１））。大腸菌のＡＳＤの構造が解明され（Ｈａｄｆｉｅｌｄら，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８９：９９１−１００２（１９９９））、該酵素は、代替基質β−３−メチルアスパルチルホスフェートを許容することが示されている（Ｓｈａｍｅｓら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１５３３１−１５３３９（１９８４））。インフルエンザ菌の該酵素は、活性部位における基質結合親和性を改変するための酵素操作研究の主題となっている（Ｂｌａｎｃｏら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６０：１３８８−１３９５（２００４）；Ｂｌａｎｃｏら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６０：１８０８−１８１５（２００４））。他のＡＳＤ候補は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｓｈａｆｉａｎｉら，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ９８：８３２−８３８（２００５））、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｆａｅｈｎｌｅら，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５３：１０５５−１０６８（２００５））、および感染性微生物であるコレラ菌およびピロリ菌（Ｍｏｏｒｅら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２５：１８９−１９４（２００２））に見出されている。関連する酵素候補は、自然状態でアセチルグルタミルホスフェートをアセチルグルタミン酸−５−セミアルデヒドに還元し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｐａｕｗｅｌｓら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１０１４−１０２４（２００３））、枯草菌（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４０（Ｐｔ  ５）：１０２３−１０２５（１９９４））、大腸菌（Ｐａｒｓｏｔら，Ｇｅｎｅ．６８：２７５−２８３（１９８８））および他の生物体にみられる酵素アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（ＥＣ  １．２．１．３８）である。大腸菌のさらなるリン酸レダクターゼ酵素としては、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ（Ｂｒａｎｌａｎｔら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏ���ｈｅｍ．１５０：６１−６６（１９８５）））およびグルタミン酸−５−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｐｒｏＡ（Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５７：５４５−５５１（１９８４）））が挙げられる。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ｍａｈａｎら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５６：１２４９−１２６２（１９８３））およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ（Ｌｏｕｉｅら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４０：２９−３５（１９９３））由来のグルタミン酸−５−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素をコードしている遺伝子が大腸菌においてクローニングされ、発現された。
【０２３８】
【表１８】
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１．２．１．ｅ  オキシドレダクターゼ（酸をアルデヒドに）
酸のアルデヒドへの変換は熱力学的に有利でなく、典型的には高エネルギー補因子および多酵素工程が必要とされる。単独酵素による酸のアルデヒドへの直接変換は、１．２．１ファミリーの酸レダクターゼ酵素によって触媒される。このＥＣ分類の酵素は、３−ヒドロキシブチレートの３−ヒドロキシブタナールへの（図５の工程５Ｋ）、および２，４−ペンタジエノエートのペンタ−２，４−ジエナールへの（図６の工程Ａ）の変換に必要とされる。
【０２３９】
例示的な酸レダクターゼ酵素としては、カルボン酸レダクターゼ、α−アミノアジピン酸レダクターゼおよびレチノイン酸レダクターゼが挙げられる。カルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）は、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｉｏｗｅｎｓｉｓにおいて見出され、カルボン酸のその対応するアルデヒドへのマグネシウム、ＡＴＰおよびＮＡＤＰＨ依存性還元を触媒する（Ｖｅｎｋｉｔａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：４７８−４８５（２００７））。この酵素の天然基質はベンゾエートであり、該酵素は、芳香族基質（例えばｐ−トルエート）の広範な許容性を示す（Ｖｅｎｋｉｔａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら，Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ．ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ（２００６））。Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｉｏｗｅｎｓｉｓ由来の該酵素は、ｃａｒにコードされており、大腸菌においてクローニングされ、機能発現された（Ｖｅｎｋｉｔａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：４７８−４８５（２００７））。ＣＡＲには、不活性なアポ酵素を活性なホロ酵素に変換させるホスホパンテテイントランスフェラーゼ（ＰＰＴアーゼ）による翻訳後活性化が必要とされる（Ｈａｎｓｅｎら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７５：２７６５−２７７４（２００９））。ｎｐｔ遺伝子（特異的ＰＰＴアーゼをコードしている）産物の発現により該酵素の活性が改善された。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓにみられるさらなる酵素候補はｇｒｉＣおよびｇｒｉＤ遺伝子にコードされている。この酵素は、ｇｒｉＣまたはｇｒｉＤのいずれかの欠失により３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸代謝のシャント（ｓｈｕｎｔ）生成物である細胞外３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸の蓄積がもたらされたため、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を３−アミノ−４−ヒドロキシベンズアルデヒドに変換させると考えられている（Ｓｕｚｕｋｉら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．６０（６）：３８０−３８７（２００７））。ｇｒｉＣおよびｇｒｉＤと、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｉｏｗｅｎｓｉｓのｎｐｔと配列が類似している酵素ＳＧＲ＿６６５との共発現は有益であり得る。
【０２４０】
【表１９】
2014521365.tif 000021
さらなるｃａｒおよびｎｐｔ遺伝子は配列相同性に基づいて同定され得る。
【０２４１】
【表２０】
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同様の特性を有する酵素α−アミノアジピン酸レダクターゼ（ＡＡＲ，ＥＣ  １．２．１．３１）は一部の真菌種のリシン生合成経路に関与している。この酵素は、自然状態でα−アミノアジペートをα−アミノアジピン酸セミアルデヒドに還元する。カルボキシル基がまず、アデニレートのＡＴＰ依存性形成によって活性化され、次いでＮＡＤ（Ｐ）Ｈによって還元され、アルデヒドとＡＭＰが生じる。ＣＡＲと同様、この酵素はマグネシウムを利用し、ＰＰＴアーゼによる活性化が必要とされる。ＡＡＲおよびその対応するＰＰＴアーゼの酵素候補は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｍｏｒｒｉｓら，Ｇｅｎｅ  ９８：１４１−１４５（１９９１））、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｇｕｏら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２６９：２７１−２７９（２００３））、およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ（Ｆｏｒｄら，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２８：１３１−１３７（１９９５））に見出されている。Ｓ．ｐｏｍｂｅ由来のＡＡＲは、大腸菌において発現させると有意な活性を示した（Ｇｕｏら，Ｙｅａｓｔ  ２１：１２７９−１２８８（２００４））。Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のＡＡＲは、代替基質としてＳ−カルボキシメチル−Ｌ−システインを許容するが、アジペート、Ｌ−グルタメートまたはジアミノピメレートと反応しなかった（Ｈｉｊａｒｒｕｂｉａら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：８２５０−８２５６（２００３））。Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのＰＰＴアーゼをコードしている遺伝子はこれまでに同定されておらず、配列比較相同性検索による高信頼性ヒットは確認されなかった。
【０２４２】
【表２１】
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１．３．１．ａ  オキシドレダクターゼ（アルカンをアルケンに）
図１のいくつかの変換、例えば、工程Ｂ、ＦおよびＭはアルカンのアルケンへの酸化を伴うものである。工程ＢおよびＦは、逆方向に作動するデヒドロゲナーゼまたはエン酸レダクターゼによって触媒される。工程Ｍは、５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼまたはエン酸レダクターゼによって触媒される。図３の工程ＥとＧは、それぞれ、ペント−３−エノイル−ＣｏＡまたはペント−２−エノイル−ＣｏＡの２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡへの酸化を伴うものである。例示的な酵素候補を以下に記載する。
【０２４３】
ペント−３−エノイル−ＣｏＡまたはペント−２−エノイル−ＣｏＡの２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡへの酸化は、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡ形成性デヒドロゲナーゼ酵素によって触媒される。２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼ酵素（ＥＣ  １．３．１．３４）はこのような変換に好適な候補である。一般的に、細菌の２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼでは２−エノイル−ＣｏＡ生成物が生じるが、真核生物の２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼでは３−エノイル−ＣｏＡ生成物が生じる（ＤｏｍｍｅｓおよびＫｕｎａｕ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２５９：１７８１−１７８８（１９８４））。大腸菌のｆａｄＨ遺伝子産物はＮＡＤＰＨ依存性２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼであり、これは不飽和脂肪酸のβ−酸化に関与している（Ｔｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍ，４７：１１６７−１１７５（２００８）。一連の変異型ＤＣＲ酵素が構築され、２−エノイル−ＣｏＡと３−エノイル−ＣｏＡ生成物の両方を生成することが示された（Ｔｕら（前出））。真核生物のＤＣＲ酵素はヒトおよびマウスにおいて特性評価されている（Ｋｏｉｖｕｒａｎｔａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３０４：７８７−７９２（１９９４）；Ｇｅｉｓｂｒｅｃｈｔら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：２５８１４−２０（１９９９）；Ｍｉｉｎａｌａｉｎｅｎら，ＰＬｏＳ  ｇｅｎｅｔ．５：Ｅ１０００５４３（２００９））。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃｕｍの２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡレダクターゼは、３−ペント−３−エノイル−ＣｏＡの２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡへの酸化を触媒することが示された。この酵素は精製され、特性評価され、結晶化されている（Ｅｉｋｍａｎｎｓ，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ，Ｄ５０：９１３−９１４（１９９４）およびＥｉｋｍａｎｎｓ  ａｎｄ  Ｂｕｃｋｅｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９８：２６３−２６６（１９９１））。この酵素の電子伝達体は不明である；しかしながら、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈではない。該酵素の配列はこれまでに公表されていない。
【０２４４】
【表２２】
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ＥＣ分類１．３．＊の２−エン酸レダクターゼ酵素は、さまざまなα，β−不飽和カルボン酸およびアルデヒドの可逆的還元を触媒することが知られている（Ｒｏｈｄｉｃｈら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：５７７９−５７８７（２００１））。最近公表されたＣ．ｋｌｕｙｖｅｒｉのゲノム配列において、エン酸レダクターゼの９つのコード配列が報告され、そのうち１つが特性評価されている（Ｓｅｅｄｏｒｆら，ＰＮＡＳ  １０５：２１２８−２１３３（２００８））。Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍとＭｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍの両方のｅｎｒ遺伝子がクローニングされ、配列決定され、互いに５９％の同一性を示す。また、前者の遺伝子は、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉにおいて特性評価された遺伝子とおよそ７５％の類似性を有することがわかっている（Ｇｉｅｓｅｌら，１３５：５１−５７（１９８３））。このような配列の結果に基づき、Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍのｅｎｒは大腸菌のＦａｄＨジエノイルＣｏＡレダクターゼと非常に類似していることが報告されている（Ｒｏｈｄｉｃｈら（前出））。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍのｅｎｒ遺伝子は、大腸菌において触媒活性な形態で発現された（Ｒｏｈｄｉｃｈら（前出））。この酵素は広範なα，β−不飽和カルボニル化合物に対して活性を示す。
【０２４５】
【表２３】
2014521365.tif 000025
別の候補２−エン酸レダクターゼは、２−マレイルアセテート（４−オキソヘキス−２−エンジオエート）の３−オキソアジペートへの還元を触媒する酵素マレイル酢酸レダクターゼ（ＭＡＲ，ＥＣ  １．３．１．３２）である。ＭＡＲ酵素は、自然状態で芳香族の分解経路に関与している（Ｋａｓｃｈａｂｅｋら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：６０７５−６０８１（１９９３）；Ｋａｓｃｈａｂｅｋら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：３２０−３２５（１９９５）；Ｃａｍａｒａら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（２００９）；Ｈｕａｎｇら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７２：７２３８−７２４５（２００６））。該酵素活性はシュードモナス属の一種Ｂ１３株において確認され、特性評価され（Ｋａｓｃｈａｂｅｋら，１７５：６０７５−６０８１（１９９３）；Ｋａｓｃｈａｂｅｋら，１７７：３２０−３２５（１９９５））、コード遺伝子がクローニングされ、配列決定された（Ｋａｓｂｅｒｇら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：３８０１−３８０３（１９９７））。さらなるＭＡＲ遺伝子候補としては、シュードモナス属の一種Ｂ１３株由来のｃｌｃＥ遺伝子（Ｋａｓｂｅｒｇら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：３８０１−３８０３（１９９７））、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ由来のｍａｃＡ遺伝子（Ｓｅｉｂｅｒｔら，１８０：３５０３−３５０８（１９９８））、およびＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒとしても知られている）由来のｍａｃＡ遺伝子（Ｓｅｉｂｅｒｔら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５０：４６３−４７２（２００４））、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のｔｆｄＦＩＩ（Ｓｅｉｂｅｒｔら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：６７４５−６７５４（１９９３））およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のＮＣｇｌ１１１２（Ｈｕａｎｇら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７２：７２３８−７２４５（２００６））が挙げられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｅｋｅｉ  ＭＴ１のＭＡＲは、ｃｃａＤにコードされており、最近、同定された（Ｃａｍａｒａら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（２００９））。
【０２４６】
【表２４】
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アルケン形成性酸化方向に有利な例示的なエン酸レダクターゼは、コハク酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ分類１．３．９９または１．３．５）（コハク酸−ユビキノンオキシドレダクターゼおよび複合体ＩＩとしても知られている）である。ＳＤＨは、スクシネートをフマレートに変換させ、かつ電子をユビキノンに移動させる膜結合型酵素複合体である。該酵素は、ｓｄｈＡＢにコードされた２つの触媒性サブユニットとｓｄｈＣＤにコードされた２つの膜サブユニットで構成されている。大腸菌のＳＤＨは可逆性であるが、該酵素はフマレートの還元よりもスクシネートの酸化において５０倍大きく奏功する（Ｍａｋｌａｓｈｉｎａら  Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：１１３５７−１１３６５（２００６））。
【０２４７】
【表２５】
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例示的なアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼまたはエノイル−ＣｏＡレダクターゼはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のｂｃｄの遺伝子産物（Ａｔｓｕｍｉら，１０：３０５−３１１（２００８）；Ｂｏｙｎｔｏｎら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：３０１５−３０２４（１９９６））であり、これは、自然状態では、クロトニル−ＣｏＡのブチリル−ＣｏＡ（ＥＣ  １．３．９９．２）への還元を触媒する。この酵素は、クロストリジウム属の種におけるブチレートへのアセチル−ＣｏＡ発酵経路に関与している（Ｊｏｎｅｓら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．５０：４８４−５２４（１９８６））。ブチリル−ＣｏＡレダクターゼの活性は、ｂｃｄを、電子移動フラボタンパク質をコードしているＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのｅｔｆＡＢ遺伝子の発現とともに発現させることにより向上し得る。エノイル−ＣｏＡレダクターゼ工程のさらなる候補は、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ由来のミトコンドリアエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．３．１．４４）である（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２８０：４３２９−４３３８（２００５））。ミトコンドリアの標的化リーダー配列の除去後のこの配列由来の構築物を大腸菌においてクローニングすると活性な酵素がもたらされた（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒら（前出））。原核生物Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ由来の該タンパク質の近縁ホモログが、ＴＤＥ０５９７にコードされており、これも大腸菌においてクローニングされ、発現されている（Ｔｕｃｃｉら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，５８１：１５６１−１５６６（２００７））。Ｓｙｎｔｒｏｐｈｕｓ  ａｃｉｄｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓにおいて、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのｂｃｄ遺伝子産物との配列相同性により６つの遺伝子が同定された。Ｓ．ａｃｉｄｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓの遺伝子ｓｙｎ＿０２６３７およびｓｙｎ＿０２６３６は、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのｅｔｆＡＢ遺伝子との高い配列相同性を有し、電子移動フラボタンパク質のαおよびβサブユニットをコードしていることが予測される。
【０２４８】
【表２６】
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さらなるエノイル−ＣｏＡレダクターゼ酵素候補は、芳香族化合物を分解する生物体に見出されている。Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓは、ベンゾエート分解のモデル生物体であり、ピメロイル−ＣｏＡのβ−酸化によってピメレートを分解する酵素能を有する。ｐｉｍオペロン内の隣接遺伝子ｐｉｍＣおよびｐｉｍＤは、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのｂｃｄと配列相同性を有し、フラビン含有ピメロイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードしていることが予測される（Ｈａｒｒｉｓｏｎら，１５１：７２７−７３６（２００５））。また、窒素固定性ダイズ共生生物Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍのゲノムにも、Ｒ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓのｐｉｍＣおよびｐｉｍＤと高い配列類似性を有する遺伝子で構成されたｐｉｍオペロンが含まれている（ＨａｒｒｉｓｏｎおよびＨａｒｗｏｏｄ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５１：７２７−７３６（２００５））。
【０２４９】
【表２７】
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さらなる候補は、立体障害性トランス−エノイル−ＣｏＡ基質の還元を触媒する酵素２−メチル−分枝状エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．３．１．５２およびＥＣ  １．３．９９．１２）である。この酵素は、線虫Ａｓｃａｒｉｕｓ  ｓｕｕｍにおいて分枝状脂肪酸の合成に関与しており、さまざまな線状および分枝状の基質、例えば、２−メチルバレリル−ＣｏＡ、２−メチルブタノイル−ＣｏＡ、２−メチルペンタノイル−ＣｏＡ、オクタノイル−ＣｏＡおよびペンタノイル−ＣｏＡを還元し得る（Ｄｕｒａｎら，２６８：２２３９１−２２３９６（１９９３））。遺伝子ａｃａｄ１およびａｃａｄにコードされた該酵素の２種類のアイソフォームが特性評価されている。
【０２５０】
【表２８】
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１．４．１．ａ  オキシドレダクターゼ（アミンをオキソに）
ＥＣ分類１．４．１の酵素は、アミンのアルデヒドまたはケトンへの酸化的脱アミノ化を触媒する。このＥＣ分類の酵素は、典型的には電子受容体としてＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋またはＦＡＤを使用し、反応は典型的には可逆的である。図１の工程Ｃ、ＨおよびＩは、脱アミノ化性オキシドレダクターゼによって触媒され得る。酵素候補を以下に記載する。
【０２５１】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．２）、ロイシン  デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．９）およびアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．２１）は、アミノ酸をその対応する２−ケト酸に変換させる。大腸菌由来のｇｄｈＡ遺伝子産物（Ｋｏｒｂｅｒら，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４：１２７０−１２７３（１９９３）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：５２５７−５２６６（１９８３））、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍｅ由来のｇｄｈ（Ｋｏｒｔら，Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ．１：５２−６０（１９９７）；Ｌｅｂｂｉｎｋら，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：２８７−２９６（１９９８）；Ｌｅｂｂｉｎｋら，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８９：３５７−３６９（１９９９））、およびＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｉｎａｒｕｍ由来のｇｄｈＡ１（Ｉｎｇｏｌｄｓｂｙら，Ｇｅｎｅ  ３４９：２３７−２４４（２００５））は、グルタメートの２−オキソグルタレートとアンモニアへの可逆的変換を触媒するが、ＮＡＤＰ（Ｈ）、ＮＡＤ（Ｈ）または両方のそれぞれに有利である。さらなるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子候補は、枯草菌（Ｋｈａｎら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．６９：１８６１−１８７０（２００５））、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ（Ｐｕｒｎｅｌｌら，Ｐｌａｎｔａ  ２２２：１６７−１８０（２００５））、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（Ａｂｉｋｏら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ４６：１７２４−１７３４（２００５））、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ（Ｄｉａｚら，Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ．１０：１０５−１１５（２００６））およびＨａｌｏｂａｃｔｒｅｉｕｍ  ｓａｌｉｎａｒｕｍ（Ｈａｙｄｅｎら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２１１：３７−４１（２００２））において見出されている。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍの該酵素は、ｇｄｈ１およびｇｄｈ２にコードされたαおよびβサブユニットで構成されている（Ｐｕｒｎｅｌｌら，Ｐｌａｎｔａ  ２２２：１６７−１８０（２００５））。ＮＡＤＨ依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼの過剰発現により、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの操作株においてエタノール生成が改善されることがわかった（Ｒｏｃａら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６９：４７３２−４７３６（２００３））。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓのｌｄｈ遺伝子には広範な基質、例えば、ロイシン、イソロイシン、バリンおよび２−アミノブタノエートを許容するＬｅｕＤＨタンパク質がコードされている（Ａｎｓｏｒｇｅら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ６８：５５７−５６２（２０００）；Ｓｔｏｙａｎら，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５４：７７−８０（１９９７））。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のｎａｄＸ遺伝子にはＮＡＤの生合成に関与しているアスパラギン酸デヒドロゲナーゼがコードされている（Ｙａｎｇら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：８８０４−８８０８（２００３））。
【０２５２】
【表２９】
2014521365.tif 000031
第１級アミンのその対応するアルデヒドへの変換を触媒するための例示的な酵素は、ｌｙｓＤＨ遺伝子にコードされたリシン６−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．１８）である。この酵素は、Ｌ−リシンの６−アミノ基の酸化的脱アミノ化を触媒し、２−アミノアジピン酸−６−セミアルデヒドを形成させる（Ｍｉｓｏｎｏら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５０：３９８−４０１（１９８２））。例示的なリシン６−デヒドロゲナーゼ酵素は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｈｅｙｄａｒｉら，ＡＥＭ  ７０：９３７−９４２（２００４））、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０６：７６−８０（１９８９）；ＭｉｓｏｎｏおよびＮａｇａｓａｋｉ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５０：３９８−４０１（１９８２））、ならびにＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（Ｒｕｌｄｅｅｋｕｌｔｈａｍｒｏｎｇら，ＢＭＢ．Ｒｅｐ．４１：７９０−７９５（２００８））にみられるものである。
【０２５３】
【表３０】
2014521365.tif 000032
１．４．３．ａ  アミンオキシダーゼ
ＥＣ分類１．４．３のアミンオキシダーゼ酵素は、アミノ基のその対応するアルデヒドまたはケトンへの酸化的脱アミノ化を触媒する。この分類の酵素は、電子受容体として酸素を利用し、アミン、Ｏ２および水をアルデヒドまたはケトン、アンモニアおよび過酸化水素に変換させる。Ｌ−アミノ酸オキシダーゼは、いくつかのＬ−アミノ酸のそのそれぞれの２−オキソ酸への酸化的脱アミノ化を触媒する。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｌｉｇｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの該酵素は大腸菌において過剰発現された（Ｔｏｎｇら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １９０：４７１６−２１（２００８））。他のアミンオキシダーゼ酵素、例えば、リシン−６−オキシダーゼ（ＥＣ  １．４．３．２０）およびプトレシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．４．３．１０）は末端アミンに特異的である。リシン−６−オキシダーゼ酵素は、Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａのｌｏｄＡ（Ｌｕｃａｓ−Ｅｌｉｏら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８８：２４９３−５０１（２００６））およびＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｔｕｎｉｃａｔａのａｌｐＰ（Ｍａｉ−Ｐｒｏｃｈｎｏｗら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １９０：５４９３−５０１（２００８））にコードされている。プトレシンオキシダーゼ酵素は、Ｋｏｃｕｒｉａ  ｒｏｓｅａのｐｕｏ（Ｉｓｈｉｚｕｋａら，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １３９：４２５−３２（１９９３））ならびにＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＡＴＡＯ１（ＭｏｌｌｅｒおよびＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １３：７８１−９１（１９９８））にコードされている。
【０２５４】
【表３１】
2014521365.tif 000033
２．３．１．ａ  アシルトランスフェラーゼ（リン酸基をＣｏＡに転移；ホスホトランスアシラーゼ）
２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡホスホトランスフェラーゼ活性を有する酵素が２，４−ペンタジエノイル−ＣＡの２，４−ペンタジエノイル−ホスフェートへの変換に必要とされる（図６，工程Ｄ）。例示的なリン酸基転移性アシルトランスフェラーゼとしては、ホスホトランスアセチラーゼ（ＥＣ  ２．３．１．８）およびホスホトランスブチリラーゼ（ＥＣ  ２．３．１．１９）が挙げられる。大腸菌由来のｐｔａ遺伝子には、アセチル−ＣｏＡをアセチル−ホスフェートに可逆的に変換させるホスホトランスアセチラーゼがコードされている（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９１：５５９−５６９（１９６９））。また、この酵素は基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用することもでき、該過程においてプロピオネートが形成される（Ｈｅｓｓｌｉｎｇｅｒら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２７：４７７−４９２（１９９８））。プロピオニル−ＣｏＡに対して活性を示す他のリン酸アセチルトランスフェラーゼは、枯草菌（Ｒａｄｏら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３２１：１１４−１２５（１９７３））、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ（Ｓｔａｄｔｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １：５９６−５９９（１９５５））、およびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｂｏｃｋら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：１８６１−１８６７（１９９９））において見出されている。同様に、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のｐｔｂ遺伝子には、ブチリル−ＣｏＡをブチリル−ホスフェートに可逆的に変換させる酵素ホスホトランスブチリラーゼがコードされている（Ｗｉｅｓｅｎｂｏｒｎら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５５：３１７−３２２（１９８９）；Ｗａｌｔｅｒら，Ｇｅｎｅ  １３４：１０７−１１１（１９９３））。さらなるｐｔｂ遺伝子は、酪酸産生菌Ｌ２−５０（Ｌｏｕｉｓら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：２０９９−２１０６（２００４））およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（Ｖａｚｑｕｅｚら，Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４２：３４５−３４９（２００１））において見出されている。
【０２５５】
【表３２】
2014521365.tif 000034
２．３．１．ｂ  β−ケトチオラーゼ
ＥＣ分類２．３．１のβ−ケトチオラーゼ酵素は、２つのアシル−ＣｏＡ基質の縮合を触媒する。図２〜４のいくつかの変換にはβ−ケトチオラーゼ、が必要とされる（例えば、図２の工程Ａ、図３の工程Ａおよび図４の工程Ａ）。
【０２５６】
アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性を有する例示的なβ−ケトチオラーゼとしては、大腸菌由来のａｔｏＢの遺伝子産物（Ｍａｒｔｉｎら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１：７９６−８０２（２００３））、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のｔｈｌＡおよびｔｈｌＢ（Ｈａｎａｉら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７３：７８１４−７８１８（２００７）；Ｗｉｎｚｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２：５３１−５４１（２０００））、ならびにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＥＲＧ１０（Ｈｉｓｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１３８３−３１３８９（１９９４））が挙げられる。
【０２５７】
【表３３】
2014521365.tif 000035
また、アセチル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡからのβ−ケトバレレートの形成を触媒するβ−ケトチオラーゼ酵素も好適な候補である。Ｚｏｏｇｌｏｅａ  ｒａｍｉｇｅｒａは、プロピオニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡから３−ケトバレリル−ＣｏＡを形成し得る２種類のケトチオラーゼを有し、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａは、同様にこの変換を触媒し得るβ−酸化ケトチオラーゼを有する（Ｇｒｕｙｓら，米国特許第５，９５８，７４５号（１９９９））。このような遺伝子またはその翻訳されたタンパク質の配列は報告されていないが、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａまたは他の生物体においていくつかの候補が、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のｂｋｔＢとの配列相同性に基づいて特定され得る。このようなものとしては、以下が挙げられる：
【０２５８】
【表３４】
2014521365.tif 000036
別の好適な候補は３−オキソアジピル−ＣｏＡチオラーゼ（ＥＣ  ２．３．１．１７４）であり、これは、β−ケトアジピル−ＣｏＡをスクシニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡに変換させ、芳香族化合物の分解のためのβ−ケトアジピン酸経路の枢要な酵素である。該酵素は、土壌細菌および真菌、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ（Ｈａｒｗｏｏｄら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：６４７９−６４８８（１９９４））およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（Ｄｏｔｅｎら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：３１６８−３１７４（１９８７））に広く見られる。シュードモナス属のｓｔｒａｉｎ  Ｂ１３のｐｃａＦにコードされた遺伝子産物（Ｋａｓｃｈａｂｅｋら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：２０７−２１５（２００２））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＵのｐｈａＤ（Ｏｌｉｖｅｒａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ  ９５：６４１９−６４２４（１９９８））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＳＴのｐａａＥ（Ｄｉら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １８８：１１７−１２５（２００７））、および大腸菌由来のｐａａＪ（Ｎｏｇａｌｅｓら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５３：３５７−３６５（２００７））もまたこの変換を触媒する。いくつかのβ−ケトチオラーゼ、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来のｂｋｔ、緑膿菌ＰＡＯ１由来のｐｃａＦおよびｂｋｔ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｍｂｉｆａｒｉａ  ＡＭＭＤ由来のｂｋｔ、大腸菌由来のｐａａＪ、ならびにＰ．ｐｕｔｉｄａ由来のｐｈａＤは、オキソアジピル−ＣｏＡが形成される方向に有意で選択的な活性を示す。
【０２５９】
【表３５】
2014521365.tif 000037
２．３．１．ｄ  ギ酸Ｃ−アシルトランスフェラーゼ
ＥＣ分類２．３．１のギ酸Ｃ−アシルトランスフェラーゼ酵素は、ケト酸のアシル化およびホルメートの同時放出を触媒する。かかる酵素は、図１（工程Ｒ）の２−オキソアジペートのグルタリル−ＣｏＡへの変換および図５の工程Ｈの４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートの３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換に適している。
【０２６０】
この分類の酵素としては、ピルビン酸ギ酸リアーゼおよびケト酸ギ酸リアーゼが挙げられる。ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＰＦＬ，ＥＣ  ２．３．１．５４）は、大腸菌のｐｆｌＢにコードされており、ピルベートをアセチル−ＣｏＡとホルメートに変換させる。ＰＦＬの活性部位には触媒的に必須のグリシル残基が含まれており、該残基は嫌気性条件下で、ｐｆｌＡにコードされたＰＦＬ活性化酵素（ＰＦＬ−ＡＥ，ＥＣ  １．９７．１．４）によって翻訳後活性化される（Ｋｎａｐｐｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ  ８１：１３３２−１３３５（１９８４）；Ｗｏｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１４１０２−１４１１０（１９９３））。ケト酸ギ酸リアーゼ（ＥＣ  ２．３．１．−）は、２−ケト酪酸ギ酸リアーゼ（ＫＦＬ）およびピルビン酸ギ酸リアーゼ４としても知られており、大腸菌のｔｄｃＥの遺伝子産物である。この酵素は、嫌気性トレオニン分解の際に２−ケトブチレートのプロピオニル−ＣｏＡとホルメートへの変換を触媒し、また、嫌気性異化においてピルビン酸ギ酸リアーゼの代わりに使用されることもあり得る（Ｓｉｍａｎｓｈｕら，Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ．３２：１１９５−１２０６（２００７））。該酵素は酸素感受性であり、ＰｆｌＢと同様、活性部位内のグリシル残基の活性化のためにＰＦＬ−ＡＥによる翻訳後修飾を必要とする（Ｈｅｓｓｌｉｎｇｅｒら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２７：４７７−４９２（１９９８））。ｐｆｌＤにコードされたＡｒｃｈａｅｇｌｕｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来のピルビン酸ギ酸リアーゼが大腸菌においてクローニングされ、発現され、特性評価されている（Ｌｅｈｔｉｏら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  １７：５４５−５５２（２００４））。Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓおよび大腸菌の該酵素の結晶構造が解明されている（Ｌｅｈｔｉｏら，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５７：２２１−２３５（２００６）；Ｌｅｐｐａｎｅｎら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．７：７３３−７４４（１９９９））。さらなるＰＦＬおよびＰＦＬ−ＡＥ候補は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ（Ｍｅｌｃｈｉｏｒｓｅｎら，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５８：３３８−３４４（２００２））、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ−Ａｂｂｅら，Ｏｒａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：２９３−２９７（２００３））、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ（Ｈｅｍｓｃｈｅｍｅｉｅｒら，Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｃｅｌｌ  ７：５１８−５２６（２００８ｂ）；Ａｔｔｅｉａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：９９０９−９９１８（２００６））およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ（Ｗｅｉｄｎｅｒら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：２４４０−２４４４（１９９６））に見出されている。
【０２６１】
【表３６】
2014521365.tif 000038
２．３．１．ｈ  ３−オキソアシル−ＣｏＡシンターゼ
３−オキソアシル−ＣｏＡ生成物、例えば、アセトアセチル−ＣｏＡ、３−オキソペンタノイル−ＣｏＡ、３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡは、アシル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡ基質から３−オキソアシル−ＣｏＡシンターゼによって合成され得る（工程２Ａ，３Ａ，４Ａ，７ＡＳ）。この分類の酵素は本質的に不可逆的な反応を触媒するため、３−オキソアシル−ＣｏＡ中間体（アセトアセチル−ＣｏＡなど）から誘導される代謝産物、燃料または化学薬品を過剰生産させるための代謝操作用途に特に有用である。例えば、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼは、ブタノール（Ｌａｎら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ（２０１２））およびポリ−（３−ヒドロキシブチレート）（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら，Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，７５：３６４−３６６（２０１１）を生合成する生物体において異種発現されている。アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．１９４）酵素（ＦｈｓＡ）は土壌細菌ストレプトマイセス属の一種ＣＬ１９０（ここで、これはメバロネート生合成に関与している）において特性評価されている（Ｏｋａｍｕｒａら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０７：１１２６５−７０（２０１０））。他のアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子はｆｈｓＡとの配列相同性により同定され得る。
【０２６２】
【表３７】
2014521365.tif 000039
２．６．１．ａ  アミノトランスフェラーゼ
アミノトランスフェラーゼはアミノ基をアルデヒドまたはケトンに可逆的に変換させる。アルデヒドを第１級アミンに変換するための例示的な酵素としては、リシン−６−アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．３６）、５−アミノ吉草酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．４８）、γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼおよびジアミンアミノトランスフェラーゼ、例えばプトレシンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．８２および２．６．１．２９）が挙げられる。このような酵素は図１の工程ＣおよびＩの触媒に適している。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよび同様の酵素は、アミノ酸をその対応する２−ケト酸に変換させる。アミノ酸アミノトランスフェラーゼは、２−オキソアジペートと２−アミノアジペートの相互変換に好適な候補である（図１の工程Ｈ）。
【０２６３】
リシン−６−アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．３６）は、リシンをα−アミノアジピン酸セミアルデヒドに変換させ、酵母および細菌において特性評価されている。Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ（Ｈａｍｍｅｒら，Ｊ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３２：２１−２７（１９９２））、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ（Ｆｕｊｉｉら，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２８：３９１−３９７（２０００））およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｎｕｓ（Ｒｏｍｅｒｏら，Ｊ  Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８：２４１−２４６（１９９７））由来の候補が特性評価されている。Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｎｕｓ由来の組換えリシン−６−アミノトランスフェラーゼが大腸菌において機能発現された（Ｔｏｂｉｎら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：６２２３−６２２９（１９９１））。Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓの該酵素はアミノ受容体としてのα−ケトグルタレートに特異的である（Ｓｏｄａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７：４１１０−４１１９（１９６８））。関連酵素ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．４６およびＥＣ  ２．６．１．７６）は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉおよびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａのｄａｔ遺伝子産物にコードされている（Ｉｋａｉら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：５１１８−５１２５（１９９７）；Ｉｋａｉら，Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２１：１７０−１７３（１９９８））。天然基質である２，４−ジアミノブチレートに加え、Ａ．ｂａｕｍａｎｉｉのＤＡＴは、リシン、４−アミノブチレートおよびオルニチンの末端アミンをアミノ基転移させる。さらなるジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子候補としては、Ｍａｒｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓおよびＨａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄａｂａｎｅｎｓｉｓのｅｃｔＢ遺伝子産物（Ｚｈａｏら，Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５３：１８３−１８８（２００６）；Ｌｏｕｉｓら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４３（Ｐｔ  ４）：１１４１−１１４９（１９９７））ならびに緑膿菌のｐｖｄＨ遺伝子産物（Ｖａｎｄｅｎｅｎｄｅら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：５５９６−５６０２（２００４））が挙げられる。また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのβ−アラニンアミノトランスフェラーゼも、基質として２，４−ジアミノブチレート許容する（Ｈａｙａｉｓｈｉら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２３６：７８１−７９０（１９６１））；しかしながら、この活性は、これまでの遺伝子との関連がみられていない。
【０２６４】
【表３８】
2014521365.tif 000040
また、アルデヒドの末端アミンへの変換は、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）トランスアミナーゼ（ＥＣ  ２．６．１．１９）または５−アミノ吉草酸トランスアミナーゼによって触媒され得る。ＧＡＢＡアミノトランスフェラーゼは、コハク酸セミアルデヒドおよびグルタメートを４−アミノブチレートおよびα−ケトグルタレートに相互変換させ、広い基質範囲を有することが知られている（Ｓｃｈｕｌｚら，５６：１−６（１９９０）；Ｌｉｕら，４３：１０８９６−１０９０５（２００４））。大腸菌の２種類のＧＡＢＡトランスアミナーゼはｇａｂＴ（Ｂａｒｔｓｃｈら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：７０３５−７０４２（１９９０））とｐｕｕＥ（Ｋｕｒｉｈａｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：４６０２−４６０８（２００５））にコードされている。また、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓとＳｕｓ  ｓｃｒｏｆａのＧＡＢＡトランスアミナーゼも代替基質、例えば６−アミノカプロン酸のアミノ基転移を触媒する（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１３：８０−８２（１９８５））。５−アミノ吉草酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．４８）は、リシン分解の際に５−アミノバレレートを５−オキソバレレートに変換させる。該酵素はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａのｄａｖＴ（Ｅｓｐｉｎｏｓａ−Ｕｒｇｅｌら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，６７：５２１９−２４（２００１））および緑膿菌のＰＡ０２６６（Ｙａｍａｎｉｓｈｉら，ＦＥＢＳ  Ｊ．２７４：２２６２−７３（２００７））にコードされている。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃｕｍ由来の５−アミノ吉草酸アミノトランスフェラーゼが精製され、特性評価されたが、その配列はこれまでに公表されていない（Ｂａｒｋｅｒら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２６２：８９９４−９００３（１９８７））。
【０２６５】
【表３９】
2014521365.tif 000041
プトレシンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．８２）および他のジアミンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．２９）もまた、アルデヒドと第１級アミンの相互変換を触媒する。大腸菌のプトレシンアミノトランスフェラーゼはｙｇｊＧ遺伝子にコードされており、精製された該酵素は、代替基質カダベリン、スペルミジンおよび１，７−ジアミノヘプタンをアミノ基転移させる（Ｓａｍｓｏｎｏｖａら，ＢＭＣ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３：２（２００３））。２−オキソグルタレート以外のアミノ受容体（例えば、ピルベート、２−オキソブタノエート）を有するこの酵素の活性が報告されている（Ｓａｍｓｏｎｏｖａら，ＢＭＣ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３：２（２００３）；ＫＩＭ，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３９：７８３−７８６（１９６４））。別のプトレシンアミノトランスフェラーゼ酵素は緑膿菌のｓｐｕＣ遺伝子にコードされている（Ｌｕら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：３７６５−３７７３（２００２））。
【０２６６】
【表４０】
2014521365.tif 000042
いくつかのアミノトランスフェラーゼはアミノ酸基のアミノ基をアミノ基転移させ、２−オキソ酸を形成させる。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼは、自然状態でオキソ基をオキサロアセテートからグルタメートに転移させ、α−ケトグルタレートとアスパルテートを形成させる酵素である。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性は、例えば、大腸菌由来のａｓｐＣ（Ｙａｇｉら，１００：８１−８４（１９７９）；Ｙａｇｉら，１１３：８３−８９（１９８５））、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡＡＴ２（Ｙａｇｉら，９２：３５−４３（１９８２））およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＡＳＰ５（Ｋｗｏｋら，５５：５９５−６０４（２００４）；ｄｅ  ｌａら，４６：４１４−４２５（２００６）；Ｗｉｌｋｉｅら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１２：３８１−３８９（１９９８））の遺伝子産物によって触媒される。Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来の該酵素は、代替基質、例えば、２−アミノヘキサン二酸および２，４−ジアミノ酪酸をアミノ基転移させることが示されている（Ｒｅｃａｓｅｎｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９：４５８３−４５８９（１９８０））。また、他のアミノ酸基質に対して作用するアミノトランスフェラーゼによってこのような変換が触媒され得ることもあり得る。バリンアミノトランスフェラーゼは、バリンおよびピルベートの２−ケトイソバレレートおよびアラニンへの変換を触媒する。大腸菌の遺伝子ａｖｔＡはかかる酵素の１つをコードしている（Ｗｈａｌｅｎら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５０：７３９−７４６（１９８２））。この遺伝子産物もまた、α−ケトブチレートのアミノ基転移を触媒し、α−アミノブチレートを生成させるが、この反応におけるアミン供与体は特定されていない（Ｗｈａｌｅｎら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：５７１−５７４（１９８４））。大腸菌のｓｅｒＣの遺伝子産物は、２つの反応ホスホセリンアミノトランスフェラーゼおよびホスホヒドロキシトレオニンアミノトランスフェラーゼを触媒し（Ｌａｍら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６５１８−６５２８（１９９０））、非リン酸化基質に対する活性は検出されなかった（Ｄｒｅｗｋｅら，ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．３９０：１７９−１８２（１９９６））。別の酵素候補は、一部の生物体においてリシンの生合成と分解に関与している酵素α−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．３９）である。この酵素は、アミノ受容体としてα−ケトグルタレートを用いて２−アミノアジペートと２−オキソアジペートを相互変換させる。遺伝子候補は、ホモサピエンス（Ｏｋｕｎｏら，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ４７：１３６−１４８（１９９３））およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｍｉｙａｚａｋｉら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５０：２３２７−２３３４（２００４））に見出されている。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの該酵素はｌｙｓＮにコードされており、いくつかの代替基質、例えば、オキサロアセテート、２−オキソイソカプロエート、２−オキソイソバレレートおよび２−オキソ−３−メチルバレレートに関��ても活性である。
【０２６７】
【表４１】
2014521365.tif 000043
２．７．２．ａ  ホスホトランスフェラーゼ（キナーゼ）
ＥＣ分類２．７．２のキナーゼまたはホスホトランスフェラーゼ酵素は、カルボン酸をホスホン酸に変換させるとともに１分子のＡＴＰの同時加水分解を伴う。２，４−ペンタジエン酸キナーゼ活性を有する酵素が図６の工程Ｈに必要とされる。例示的な酵素候補としては、酪酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．７）、イソ酪酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．１４）、アスパルトキナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．４）、酢酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．１）およびグリセリン酸キナーゼが挙げられる。酪酸キナーゼは、クロストリジウム属の種における酸生成（ａｃｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ）の際のブチリル−ホスフェートのブチレートへの可逆的変換を触媒する（Ｃａｒｙら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５６：１５７６−１５８３（１９９０））。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍの該酵素は、２種類のｂｕｋ遺伝子産物のいずれかにコードされている（Ｈｕａｎｇら，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２：３３−３８（２０００））。他の酪酸キナーゼ酵素は、Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍおよびＣ．ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ（Ｔｗａｒｏｇら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８６：１１２−１１７（１９６３））において見出されている。関連酵素であるＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のイソ酪酸キナーゼは大腸菌において発現され、結晶化された（Ｄｉａｏら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９１：２５２１−２５２９（２００９）；Ｄｉａｏら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５９：１１００−１１０２（２００３））。アスパルトキナーゼは、アスパルテートのＡＴＰ依存性リン酸化を触媒し、いくつかのアミノ酸の合成に関与している。大腸菌のアスパルトキナーゼＩＩＩ酵素は、ｌｙｓＣにコードされており、広い基質範囲を有し、基質特異性に関与している触媒性残基が解明されている（Ｋｅｎｇら，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３３５：７３−８１（１９９６））。また、大腸菌の２種類のさらなるキナーゼも酢酸キナーゼおよびγ−グルタミルキナーゼである。大腸菌の酢酸キナーゼは、ａｃｋＡにコードされており（Ｓｋａｒｓｔｅｄｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：６７７５−６７８３（１９７６））、アセテートに加えてプロピオネートもリン酸化する（Ｈｅｓｓｌｉｎｇｅｒら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２７：４７７−４９２（１９９８））。大腸菌のγ−グルタミルキナーゼは、ｐｒｏＢにコードされており（Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５７：５４５−５５１（１９８４））、グルタメートのγ炭酸基をリン酸化する。
【０２６８】
【表４２】
2014521365.tif 000044
グリセリン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．３１）はグリセレートをグリセレート−２−ホスフェートまたはグリセレート−３−ホスフェートに活性化する。グリセリン酸キナーゼには３つのクラスが確認されている。クラスＩとＩＩの酵素はグリセレート−２−ホスフェートを生成させ、一方、植物および酵母にみられるクラスＩＩＩの酵素はグリセレート−３−ホスフェートを生成させる（Ｂａｒｔｓｃｈら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５８２：３０２５−３０２８（２００８））。最近の研究において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のクラスＩＩＩのグリセリン酸キナーゼ酵素が大腸菌において異種発現され、特性評価された（Ｂａｒｔｓｃｈら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５８２：３０２５−３０２８（２００８））。また、この研究では、大腸菌のｇｌｘＫ遺伝子産物もグリセレート−３−ホスフェートを形成する能力についてアッセイされ、該酵素は、以前の研究とは異なり、グリセレート−２−ホスフェートの形成のみを触媒し得ることがわかった（Ｄｏｕｇｈｔｙら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４１：５６８−５７２（１９６６））。
【０２６９】
【表４３】
2014521365.tif 000045
２．８．３．ａ  ＣｏＡトランスフェラーゼ
２．８．３ファミリーの酵素は、ある分子から別の分子へのＣｏＡ部分の可逆的転移を触媒する。かかる変換は図１の工程Ｌ、ＰおよびＯ、図３の工程Ｆ、図４の工程Ｂ、図５の工程Ｊならびに図６の工程Ｆに必要とされる。いくつかのＣｏＡトランスフェラーゼ酵素が周知文献において報告されており、これらの工程の好適な候補となる。このようなものを以下に記載する。
【０２７０】
多くのトランスフェラーゼは広い特異性を有し、したがって、とりわけアセテート、スクシネート、プロピオネート、ブチレート、２−メチルアセトアセテート、３−ケトヘキサノエート、３−ケトペンタノエート、バレレート、クロトネート、３−メルカプトプロピオネート、プロピオネート、ビニルアセテート、ブチレートという多様なＣｏＡ受容体を利用することができる。例えば、ロゼブリア属の一種Ａ２−１８３由来の酵素は、ブチリル−ＣｏＡ：酢酸：ＣｏＡトランスフェラーゼおよびプロピオニル−ＣｏＡ：酢酸：ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有することが示された（Ｃｈａｒｒｉｅｒら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５２，１７９−１８５（２００６））。近縁ホモログが、例えば、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ  Ｌ１−８２、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ  ＤＳＭ  １６８４１、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ  ＡＴＣＣ  ３３６５６にみられ得る。プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有する別の酵素はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ（Ｓｅｌｍｅｒら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６９，３７２−３８０（２００２））にみられ得る。この酵素は、ＣｏＡ受容体としてアセテート、（Ｒ）−ラクテート、（Ｓ）−ラクテート、アクリレートおよびブチレートを使用することができる（Ｓｅｌｍｅｒら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６９，３７２−３８０（２００２）；ＳｃｈｗｅｉｇｅｒおよびＢｕｃｋｅｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１７１（１）７９−８４（１９８４））。近縁ホモログが、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｏｖｙｉ  ＮＴ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ＮＣＩＭＢ  ８０５２、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｃ  ｓｔｒ．Ｅｋｌｕｎｄにみられ得る。ＹｇｆＨは、大腸菌のプロピオニル  ＣｏＡ：コハク酸ＣｏＡトランスフェラーゼをコードしている（Ｈａｌｌｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９（１６）４６２２−４６２９）。近縁ホモログが、例えば、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｙｏｕｎｇａｅ  ＡＴＣＣ  ２９２２０、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａの亜種ａｒｉｚｏｎａｅ  ｓｅｒｏｖａｒ、およびＹｅｒｓｉｎｉａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ  ＡＴＣＣ  ２９９０９にみられ得る。これらのタンパク質を以下に特定する。
【０２７１】
【表４４】
2014521365.tif 000046
さらなる候補酵素は、シュードモナス属のｐｃａＩとｐｃａＪにコードされた２ユニット（ｔｗｏ−ｕｎｉｔ）酵素であり、これは、３−オキソアジピル−ＣｏＡ／コハク酸トランスフェラーゼ活性を有することが示されている（Ｋａｓｃｈａｂｅｋら（前出））。相同性に基づいた同様の酵素がアシネトバクター属の一種ＡＤＰ１（Ｋｏｗａｌｃｈｕｋら，Ｇｅｎｅ  １４６：２３−３０（１９９４））およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒに存在している。さらなる例示的なスクシニル−ＣｏＡ：３：オキソ酸−ＣｏＡトランスフェラーゼは、ピロリ菌（Ｃｏｒｔｈｅｓｙ−Ｔｈｅｕｌａｚら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２５６５９−２５６６７（１９９７））および枯草菌（Ｓｔｏｌｓら，Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．５３：３９６−４０３（２００７））に存在しているものである。これらのタンパク質を以下に特定する。
【０２７２】
【表４５】
2014521365.tif 000047
アセテートをＣｏＡ受容体として利用することができるＣｏＡトランスフェラーゼは、大腸菌のａｔｏＡ（αサブユニット）およびａｔｏＤ（βサブユニット）遺伝子にコードされたアセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼである（Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３３：９０２−９０８（１９６８）；Ｋｏｒｏｌｅｖら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５８：２１１６−２１２１（２００２））。また、この酵素はＣｏＡ部分を、さまざまな分枝状および線状のアシル−ＣｏＡ基質、例えば、イソブチレート（Ｍａｔｔｈｉｅｓら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５８：１４３５−１４３９（１９９２））、バレレート（Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら（前出））およびブタノエート（Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌら（前出））からアセテートに転移させることも示されている。同様の酵素がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２（Ｄｕｎｃａｎら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６８：５１８６−５１９０（２００２））、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（Ｃａｒｙら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５６：１５７６−１５８３（１９９０））、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ（Ｋｏｓａｋａら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７１：５８−６８（２００７））にも存在している。これらのタンパク質を以下に特定する。
【０２７３】
【表４６】
2014521365.tif 000048
さらなる例示的なトランスフェラーゼ候補は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉのｃａｔ１、ｃａｔ２およびｃａｔ３の遺伝子産物によって触媒されるものであり、これらは、それぞれ、スクシニル−ＣｏＡ活性、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ活性およびブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を示すことが示されている（Ｓｅｅｄｏｒｆら（前出）；Ｓｏｈｌｉｎｇら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２：１２１−１２７（１９９３）；Ｓｏｈｌｉｎｇら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１−８８０（１９９６））。また、同様のＣｏＡトランスフェラーゼ活性がＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ（ｖａｎ  Ｇｒｉｎｓｖｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：１４１１−１４１８（２００８））およびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ（Ｒｉｖｉｅｒｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４５３３７−４５３４６（２００４））にも存在している。これらのタンパク質を以下に特定する。
【０２７４】
【表４７】
2014521365.tif 000049
嫌気性細菌Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来のグルタコン酸−ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．８．３．１２）酵素は、二酸グルタコニル−ＣｏＡおよび３−ブテノイル−ＣｏＡと反応する（Ｍａｃｋら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４０５：２０９−２１２（１９９７））。この酵素をコードしている遺伝子はｇｃｔＡおよびｇｃｔＢである。この酵素は、他のＣｏＡ誘導体、例えば、グルタリル−ＣｏＡ、２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡ、アジピル−ＣｏＡおよびアクリリル−ＣｏＡとも低いが検出可能な活性を有する（Ｂｕｃｋｅｌら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：３１５−３２１（１９８１））。この酵素は、大腸菌においてクローニングされ、発現された（Ｍａｃｋら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６：４１−５１（１９９４））。これらのタンパク質を以下に特定する。
【０２７５】
【表４８】
2014521365.tif 000050
３．１．２．ａ  ＣｏＡヒドロラーゼ
３．１．２ファミリーの酵素はアシル−ＣｏＡ分子をその対応する酸に加水分解する。かかる変換は、図１の工程Ｏ、図３の工程Ｆ、図４の工程Ｂ、図５の工程Ｊおよび図６の工程Ｆに必要とされる。いくつかのかかる酵素が文献に記載されており、これらの工程の好適な候補となる。
【０２７６】
例えば、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｂｒａｉｎ由来のａｃｏｔ１２にコードされた酵素（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７１：９５９−９６５（１９７６））は、ブチリル−ＣｏＡ、ヘキサノイル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡと反応し得る。ヒトジカルボン酸チオエステラーゼは、ａｃｏｔ８にコードされており、グルタリル−ＣｏＡ、アジピル−ＣｏＡ、スベリル−ＣｏＡ、セバシル−ＣｏＡ、およびドデカンジオイル−ＣｏＡに対して活性を示す（Ｗｅｓｔｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：３８１２５−３８１３２（２００５））。この酵素の最も近縁の大腸菌ホモログであるｔｅｓＢもまた、一連のＣｏＡチオールエステルを加水分解し得る（Ｎａｇｇｅｒｔら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６：１１０４４−１１０５０（１９９１））。また、同様の酵素がラット肝臓においても特性評価されている（Ｄｅａｎａ  Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  ２６：７６７−７７３（１９９２））。ヒドロラーゼ活性を有する大腸菌のさらなる酵素としては、ｙｂｇＣ、ｐａａＩおよびｙｂｄＢが挙げられる（Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖａら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ，２００５，２９（２）：２６３−２７９；Ｓｏｎｇら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００６，２８１（１６）：１１０２８−３８）。その配列は報告されていないが、エンドウ豆の葉のミトコンドリア由来の該酵素は広い基質特異性を有し、アセチル−ＣｏＡ、プロピオニル−ＣｏＡ、ブチリル−ＣｏＡ、パルミトイル−ＣｏＡ、オレオイル−ＣｏＡ、スクシニル−ＣｏＡおよびクロトニル−ＣｏＡに対する活性が示されている（Ｚｅｉｈｅｒら，Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９４：２０−２７（１９９０））。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼＡＣＨ１は別の候補ヒドロラーゼである（Ｂｕｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１７２０３−１７２０９（２００３））。
【０２７７】
【表４９】
2014521365.tif 000051
さらなるヒドロラーゼ酵素としては３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼが挙げられ、これは、バリン分解の際に３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡから３−ヒドロキシイソブチレートへの変換を効率的に触媒することが報告されている（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９：１４２４８−１４２５３（１９９４））。この酵素をコードしている遺伝子としては、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２４：２２９−２４０（２０００））およびホモサピエンス（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら（前出））のｈｉｂｃｈが挙げられる。また、同様の遺伝子候補が配列相同性によって特定され得、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｈｉｂｃｈおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓのＢＣ＿２２９２が挙げられる。
【０２７８】
【表５０】
2014521365.tif 000052
また別の候補ヒドロラーゼはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来のグルタコン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼである。この酵素は、グルタリル−ＣｏＡ、アセチル−ＣｏＡおよび３−ブテノイル−ＣｏＡに対して活性を有するアシル−ＣｏＡヒドロラーゼへの部位特異的変異誘発によって形質転換されたものである（Ｍａｃｋら，ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．４０５：２０９−２１２（１９９７））。これは、スクシニル−ＣｏＡ：３−ケト酸−ＣｏＡトランスフェラーゼおよびアセトアセチル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼをコードしている酵素もまたこの反応工程の候補として供され得るが、その機能を変更するために特定の変異が必要とされ得ることを示唆する。ｇｃｔＡおよびｇｃｔＢ遺伝子のＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号は上記に示している。
【０２７９】
４．１．１．ａ  デカルボキシラーゼ
ＥＣ分類４．１．１のデカルボキシラーゼ酵素は図１の工程Ａ、Ｄ、ＴおよびＵ、図２の工程Ｄ、図４の工程Ｃ、図５の工程ＣおよびＦならびに図６の工程Ｇを触媒するために必要とされる。
【０２８０】
２，４−ペンタジエノエートのブタジエンへの（図１の工程Ｔおよび図６の工程Ｇ）、ならびに５−ヒドロキシペント−２−エノエートの３−ブテン−１−オールへの（図１の工程Ｕ）脱炭酸反応はエン酸デカルボキシラーゼ酵素によって触媒される。例示的な酵素は、ソルビン酸デカルボキシラーゼ、アコニット酸デカルボキシラーゼ、４−オキサロクロトン酸デカルボキシラーゼおよび桂皮酸デカルボキシラーゼである。ソルビン酸デカルボキシラーゼは、ソルビン酸を１，３−ペンタジエンに変換させる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒによるソルビン酸の脱炭酸には、３つの遺伝子：ｐａｄＡ１、ｏｈｂＡ１およびｓｄｒＡが必要とされる（Ｐｌｕｍｒｉｄｇｅら  Ｆｕｎｇ．Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏ，４７：６８３−６９２（２０１０）。ＰａｄＡ１はフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼと注釈され、ｏｈｂＡ１は推定４−ヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼであり、ｓｄｒＡはソルビン酸デカルボキシラーゼ調節因子である。また、さらなる種、例えば、いくつかの真菌種および酵母種もソルビン酸を脱炭酸することが示されている（ＫｉｎｄｅｒｌｅｒｌｅｒおよびＨａｔｔｏｎ，Ｆｏｏｄ  Ａｄｄｉｔ  Ｃｏｎｔａｍ．，７（５）：６５７−６９（１９９０）；Ｃａｓａｓら，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏ．，９４（１）：９３−９６（２００４）；ＰｉｎｃｈｅｓおよびＡｐｐｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１６：１８２-１８５（２００７））。例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅおよびＮｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉはソルビン酸を脱炭酸し、ｐａｄＡ１、ｏｈｂＡ１およびｓｄｒＡの近縁ホモログを有することが示されている。
【０２８１】
【表５１】
2014521365.tif 000053
アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．６）は、Ｃａｎｄｉｄａ株、また糸状菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓのイタコネート生合成の最終工程を触媒する（Ｂｏｎｎａｒｍｅら  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：３５７３−３５７８（１９９５）；ＷｉｌｌｋｅおよびＶｏｒｌｏｐ，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５６：２８９−２９５（２００１））。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ由来のシス−アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＣＡＤ）（ＥＣ  ４．１．１６）が精製され、特性評価されている（Ｄｗｉａｒｔｉら，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４（１）：２９−３３（２００２））。最近、その遺伝子がクローニングされ、機能が特性評価された（Ｋａｎａｍａｓａら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８０：２２３−２２９（２００８））および（ＷＯ／２００９／０１４４３７）。ＣＡＤのいくつかの近縁ホモログを以下に示す（ＥＰ２０１７３４４Ａ１；ＷＯ２００９／０１４４３７Ａ１）。ＣＡＤの遺伝子およびタンパク質の配列は以前に報告されており（ＥＰ２０１７３４４Ａ１；ＷＯ２００９／０１４４３７Ａ１）、いくつかの近縁ホモログとともに以下の表に示す。
【０２８２】
【表５２】
2014521365.tif 000054
シンナメート（フェニルアクリレート）および置換シンナメート誘導体の対応するスチレン誘導体への変換を触媒するさらなる類型のデカルボキシラーゼが特性評価されている。このような酵素はさまざまな生物体に共通しており、このような酵素をコードしており、大腸菌においてクローニングされ、発現された具体的な遺伝子は：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ由来のｐａｄ  １（Ｃｌａｕｓｅｎら，Ｇｅｎｅ  １４２：１０７−１１２（１９９４））、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来のｐｄｃ（Ｂａｒｔｈｅｌｍｅｂｓら，６７：１０６３−１０６９（２００１）；Ｑｉら，Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ  ９：２６８−２７６（２００７）；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５６：３０６８−３０７２（２００８））、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ由来のｐｏｆＫ（ｐａｄ）（Ｕｃｈｉｙａｍａら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：１１６−１２３（２００８）；Ｈａｓｈｉｄｏｋｏら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：２１７−２１８（１９９４））、Ｐｅｄｉｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ（Ｂａｒｔｈｅｌｍｅｂｓら，６７：１０６３−１０６９（２００１））、ならびに枯草菌およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ由来のｐａｄＣ（Ｓｈｉｎｇｌｅｒら，１７４：７１１−７２４（１９９２））である。また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のフェルラ酸デカルボキシラーゼも精製され、特性評価されている（Ｈｕａｎｇら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：５９１２−５９１８（１９９４））。重要なことに、この分類の酵素は、安定であり、外因性または内部結合型補因子のいずれも必要としないことが示されており、したがって、このような酵素は生体内変換理想的に好適なものとなる（Ｓａｒｉａｓｌａｎｉ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１：５１−６９（２００７））。
【０２８３】
【表５３】
2014521365.tif 000055
４−オキサロクロトン酸（ｏｘａｌｏｃｒｏｎａｔｅ）デカルボキシラーゼは、４−オキサロクロトネートの２−オキソペンタノエートへの脱炭酸を触媒する。この酵素は数多くの生物体から単離されており、特性評価されている。該デカルボキシラーゼは、典型的にはビニルピルビン酸ヒドラターゼとの複合体で機能する。この酵素をコードしている遺伝子としては、シュードモナス属の一種（６００株）のｄｍｐＨおよびｄｍｐＥ（Ｓｈｉｎｇｌｅｒら，１７４：７１１−７２４（１９９２））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来のｘｙｌＩＩおよびｘｙｌＩＩＩ（Ｋａｔｏら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １６８：４５７−４６３（１９９７）；Ｓｔａｎｌｅｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：３５１４（２０００）；Ｌｉａｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：１０４０３−１０４１１（１９９４））ならびにＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＪＭＰ１３４由来のＲｅｕｔ＿Ｂ５６９１およびＲｅｕｔ＿Ｂ５６９２（Ｈｕｇｈｅｓら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１５８：７９−８３（１９８４））が挙げられる。シュードモナス属の一種（６００株）由来の該酵素をコードしている遺伝子は大腸菌においてクローニングされ、発現されている（Ｓｈｉｎｇｌｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：７１１−７２４（１９９２））。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａのｘｙｌＩにコードされた４−オキサロクロトン酸デカルボキシラーゼはビニルピルビン酸ヒドラターゼとの複合体で機能する。ヒドラターゼ活性を欠き、野生型デカルボキシラーゼ活性を保持しているこの酵素の組換え形態が特性評価されている（Ｓｔａｎｌｅｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：７１８−２６（２０００））。同様の酵素がＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ（以前は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ）にみられる（Ｋｕｋｏｒら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：４５８７−９４（１９９１））。
【０２８４】
【表５４】
2014521365.tif 000056
２−オキソアジペートなどの２−ケト酸の脱炭酸（図１の工程Ｄ）は、多様な基質特異性を有するさまざまな酵素、例えば、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．１）、ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．７）、α−ケトグルタル酸デカルボキシラーゼおよび分枝状α−ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒される。ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）は、ケト酸デカルボキシラーゼとも称され、アルコール発酵の枢要な酵素であり、ピルベートのアセトアルデヒドへの脱炭酸を触媒する。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の該酵素は、脂肪族２−ケト酸、例えば、２−ケトブチレート、２−ケトバレレート、３−ヒドロキシピルベートおよび２−フェニルピルベート（２２）に対して広い基質範囲を有する。この酵素は広く研究されており、活性の改変のために操作され、大腸菌において機能発現されている（Ｋｉｌｌｅｎｂｅｒｇ−Ｊａｂｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：１６９８−１７０４（２００１）；Ｌｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３８：１０００４−１００１２（１９９９）；ｔｅｒ  Ｓｃｈｕｒｅら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：１３０３−１３０７（１９９８））。Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｕｓ由来のＰＤＣは、ｐｄｃにコードされており、これも広い基質範囲を有し、種々の基質に対する親和性を改変するための指向型操作研究の主題となっている（Ｓｉｅｇｅｒｔら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  １８：３４５−３５７（２００５））。この酵素の結晶構造は入手可能である（Ｋｉｌｌｅｎｂｅｒｇ−Ｊａｂｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：１６９８−１７０４（２００１））。他の充分に特性評価されたＰＤＣ候補としては、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｓ（Ｃｈａｎｄｒａら，１７６：４４３−４５１（２００１））およびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ（Ｋｒｉｅｇｅｒら，２６９：３２５６−３２６３（２００２））由来の該酵素が挙げられる。
【０２８５】
【表５５】
2014521365.tif 000057
ＰＤＣと同様、ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．７）は広い基質範囲を有し、酵素操作研究の的となっている。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来の該酵素は広く研究されており、この酵素の結晶構造は入手可能である（Ｐｏｌｏｖｎｉｋｏｖａら，４２：１８２０−１８３０（２００３）；Ｈａｓｓｏｎら，３７：９９１８−９９３０（１９９８））。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａの該酵素の活性部位内の２つの残基の部位特異的変異誘発により、天然および非天然の基質の親和性（Ｋｍ）が改変された（Ｓｉｅｇｅｒｔら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  １８：３４５−３５７（２００５））。この酵素の特性が指向型操作によってさらに改良されている（Ｌｉｎｇｅｎら，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．４：７２１−７２６（２００３）；Ｌｉｎｇｅｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １５：５８５−５９３（２００２））。緑膿菌由来の該酵素は、ｍｄｌＣにコードされており、これも実験により特性評価されている（Ｂａｒｒｏｗｍａｎら，３４：５７−６０（１９８６））。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓおよび他の生物体由来のさらなる遺伝子候補が配列相同性によって推断され得、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａにおいて開発された増殖淘汰系を用いて特定され得る（Ｈｅｎｎｉｎｇら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７２：７５１０−７５１７（２００６））。
【０２８６】
【表５６】
2014521365.tif 000058
２−オキソ酸の脱炭酸化を行ない得る第３の酵素はα−ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ（ＫＧＤ）である。この分類の酵素の基質範囲はこれまでに研究されていない。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＫＤＣ（Ｔｉａｎら，１０２：１０６７０−１０６７５（２００５））がクローニングされ、機能発現されている。ＫＤＣ酵素活性は、根粒菌のいくつかの種、例えばＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍおよびＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉで検出されている（Ｇｒｅｅｎら，１８２：２８３８−２８４４（２０００））。ＫＤＣコード遺伝子（１種類または複数種）はこれらの生物体で単離されていないが、ゲノム配列は入手可能であり、各ゲノムのいくつかの遺伝子に推定ＫＤＣと注釈されている。また、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ由来のＫＤＣも特性評価されているが、この活性と関連している遺伝子はこれまでに同定されていない（Ｓｈｉｇｅｏｋａら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２８８：２２−２８（１９９１））。Ｎ末端から始まる最初の２０個のアミノ酸配列ＭＴＹＫＡＰＶＫＤＶＫＦＬＬＤＫＶＦＫＶ（配列番号）が決定された（ＳｈｉｇｅｏｋａおよびＮａｋａｎｏ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２８８：２２−２８（１９９１））。該遺伝子は、ＫＤＣ活性のためのこのＮ末端配列を含む候補遺伝子を試験することにより同定された。
【０２８７】
【表５７】
2014521365.tif 000059
この反応を触媒するための第４の候補酵素は分枝状α−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＢＣＫＡ）である。この分類の酵素は、３〜６の種々の炭素鎖長のさまざまな化合物に対して作用することが示されている（Ｏｋｕら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６３：１８３８６−１８３９６（１９８８）；Ｓｍｉｔら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７１：３０３−３１１（２００５））。Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓの該酵素は、さまざまな分枝状および線状の基質、例えば、２−オキソブタノエート、２−オキソヘキサノエート、２−オキソペンタノエート、３−メチル−２−オキソブタノエート、４−メチル−２−オキソブタノエートおよびイソカプロエートにおいて特性評価されている（Ｓｍｉｔら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７１：３０３−３１１（２００５））。該酵素は構造が特性評価されている（Ｂｅｒｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１８：１７８２−１７８６（２００７））。Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓの該酵素とＺｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｕｓのピルビン酸デカルボキシラーゼとの配列アラインメントにより、触媒性残基と基質認識残基がほぼ同一であることが示されており（Ｓｉｅｇｅｒｔら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  １８：３４５−３５７（２００５））、そのため、この酵素は指向型操作の有望な候補であり得る。ＢＣＫＡによるα−ケトグルタレートの脱炭酸が枯草菌において検出された；しかしながら、この活性は、他の分枝状基質に対する活性と比べて低く（５％）（ＯｋｕおよびＫａｎｅｄａ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６３：１８３８６−１８３９６（１９８８））、この酵素をコードしている遺伝子はこれまでに同定されていない。さらなるＢＣＫＡ遺伝子候補は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓの該タンパク質の配列との相同性によって同定され得る。この酵素に対するハイスコアリングＢＬＡＳＴｐヒットの多くには、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．７４）と注釈されている。インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＩＰＤＡ）は、植物および植物細菌におけるインドールピルベートのインドールアセトアルデヒドへの脱炭酸を触媒する酵素である。ホモサピエンスおよびＢｏｓ  ｔａｕｒｕｓに由来するミトコンドリア分枝状ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体のＥ１サブユニットに由来する組換え分枝状α−ケト酸デカルボキシラーゼ酵素が大腸菌においてクローニングされ、機能発現されている（Ｄａｖｉｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６６０１−１６６０６（１９９２）；Ｗｙｎｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２４００−１２４０３（１９９２）；Ｗｙｎｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１８８１−１８８７（１９９２））。これらの研究において、著者らは、シャペロニンＧｒｏＥＬとＧｒｏＥＳの共発現によりデカルボキシラーゼの比活性が５００倍向上することを見出した（Ｗｙｎｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２４００−１２４０３（１９９２））。このような酵素は２つのαサブユニットと２つのβサブユニットで構成されている。
【０２８８】
【表５８】
2014521365.tif 000060
脱炭酸化性３−ケト酸に適したデカルボキシラーゼ酵素はアセト酢酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．４）である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来の該酵素は、ａｄｃにコードされており、広い基質特異性を有し、数多くの代替基質、例えば、２−ケトシクロヘキサンカルボキシレート、３−オキソペンタノエート、２−オキソ−３−フェニルプロピオン酸、２−メチル−３−オキソブチレートおよびベンゾイル−アセテートを脱炭酸することが示されている（Ｒｏｚｚｅｌら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：４９３７−４９４１（１９８４）；ＢｅｎｎｅｒおよびＲｏｚｚｅｌｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：９９３−９９４（１９８１）；Ａｕｔｏｒら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５：５２１４−５２２２（１９７０））。また、アセト酢酸デカルボキシラーゼはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉにおいても特性評価されている（Ｒａｖａｇｎａｎｉら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３７：１１７２−１１８５（２０００））。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ由来のアセト酢酸デカルボキシラーゼは、無細胞抽出物において特性評価され、これも３−ケト酸に対して広い基質特異性を有し、３−オキソペンタノエートを脱炭酸することができる（Ｍａｔｉａｓｅｋら，Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４２：２７６−２８１（２００１））。この酵素をコードしている遺伝子はこれまでに同定されておらず、Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａのゲノム配列はまだ得られていない。別のａｄｃがＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍに見出されている（Ｋｏｓａｋａら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７１：５８−６８（２００７））。他の生物体、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＦＺＢ４２におけるさらなる遺伝子候補は配列相同性によって同定することができる。
【０２８９】
【表５９】
2014521365.tif 000061
数多くの特性評価された酵素は、アミノ酸および同様の化合物、例えば、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ、リシンデカルボキシラーゼおよびオルニチンデカルボキシラーゼを脱炭酸する。アスパラギン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．１１）は、アスパルテートを脱炭酸し、β−アラニンを形成させる。この酵素はパントテネートの生合成に関与しており、大腸菌の遺伝子ｐａｎＤにコードされている（Ｄｕｓｃｈら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６５：１５３０−１５３９（１９９９）；Ｒａｍｊｅｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ  ３２３（Ｐｔ  ３）：６６１−６６９（１９９７）；Ｍｅｒｋｅｌら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１４３：２４７−２５２（１９９６）；Ｓｃｈｍｉｔｚｂｅｒｇｅｒら，ＥＭＢＯ  Ｊ  ２２：６１９３−６２０４（２００３））。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｃｈｏｐｒａら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２５：５３３−５４０（２００２））およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｎｉｃｕｍ（Ｄｕｓｃｈら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６５：１５３０−１５３９（１９９９））由来の該酵素が大腸菌において発現され、特性評価されている。
【０２９０】
【表６０】
2014521365.tif 000062
リシンデカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．１８）はリシンのカダベリンへの脱炭酸を触媒する。この酵素の２種類のアイソザイムが大腸菌ゲノムの遺伝子ｃａｄＡとｌｄｃＣにコードされている。ｃａｄＡは耐酸性に関与しており、ｃａｄＣ遺伝子産物によって正の調節に供される（Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４４（Ｐｔ  ３）：７５１−７６０（１９９８））。ＣａｄＣはヒドロキシリシンとＳ−アミノエチルシステインを代替基質としてを許容し、２−アミノピメレートと６−アミノカプロエートは、この酵素の競合的インヒビターとしての機能を果たす。（Ｓａｂｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：６６２−６７０（１９７４））。構成的に発現されるｌｄｃ遺伝子産物はＣａｄＡよりも活性が低い（ＬｅｍｏｎｎｉｅｒおよびＬａｎｅ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４４（Ｐｔ  ３）：７５１−７６０（１９９８））。ＣａｄＡにアナロガスなリシンデカルボキシラーゼが、最近、Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓにおいて確認された（Ｔａｎａｋａら，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １０４：１２８３−１２９３（２００８））。Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ由来のリシンデカルボキシラーゼは、ｌｄｃにコードされており、真核生物のオルニチンデカルボキシラーゼと配列類似性を有し、Ｌ−リシンとＬ−オルニチンの両方を基質として許容する（Ｔａｋａｔｓｕｋａら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３：１８４３−１８４６（１９９９））。活性部位残基が特定され、該酵素の基質特異性が改変されるように操作された（Ｔａｋａｔｓｕｋａら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：６７３２−６７４１（２０００））。また、いくつかのオルニチンデカルボキシラーゼ酵素（ＥＣ  ４．１．１．１７）もリシンおよび他の同様の化合物に対して活性を示す。かかる酵素は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｇｌｕｔｉｎｏｓａ（Ｌｅｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ  ３６０：６５７−６６５（２００１））、ラクトバチルス属の一種３０ａ（Ｇｕｉｒａｒｄら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：５９６０−５９６４（１９８０））およびＶｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ（Ｌｅｅら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：２７１１５−２７１２５（２００７））において見出されている。ラクトバチルス属の一種３０ａ（Ｍｏｍａｎｙら，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５２：６４３−６５５（１９９５））およびＶ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ由来の該酵素は結晶化されている。Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓの該酵素はリシンの脱炭酸を効率的に触媒し、基質特異性に関与している残基が解明されている（Ｌｅｅら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：２７１１５−２７１２５（２００７））。同様の酵素がＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓにおいて特性評価されているが、この酵素をコードしている遺伝子はわかっていない（Ｙａｒｌｅｔｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ  ２９３（Ｐｔ  ２）：４８７−４９３（１９９３））。
【０２９１】
【表６１】
2014521365.tif 000063
グルタリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＧＣＤ，ＥＣ  １．３．９９．７およびＥＣ  ４．１．１．７０）は、グルタリル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの酸化的脱炭酸を触媒する二元機能酵素である（図３，工程３）。二元機能ＧＣＤ酵素は、電子受容体として電子移動フラボタンパク質を利用するホモ四量体である（Ｈａｒｔｅｌら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １５９：１７４−１８１（１９９３））。かかる酵素は、最初に、芳香族化合物での培養の際にシュードモナス属のＫＢ７４０株およびＫ１７２株の細胞抽出物において特性評価された（Ｈａｒｔｅｌら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １５９：１７４−１８１（１９９３））が、この生物体における関連遺伝子は未知である。グルタリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｇｃｄＨ）およびその対応する転写調節因子（ｇｃｄＲ）をコードしている遺伝子がアゾアルカス属の一種ＣＩＢにおいて同定された（Ｂｌａｚｑｕｅｚら，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １０：４７４−４８２（２００８））。ｇｃｄＨ活性が欠損しているアゾアルカス株を使用し、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来の異種ｇｃｄＨ遺伝子が同定された（Ｂｌａｚｑｕｅｚら，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １０：４７４−４８２（２００８））。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａの対応する転写調節因子は特定されていないが、遺伝子座ＰＰ＿０１５７がアゾアルカス属の該酵素と高い配列相同性（＞６９％の同一性）を有する。さらなるＧＣＤ酵素がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓおよびＰａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓにおいて見出されている（Ｈｕｓａｉｎら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６３：７０９−７１５（１９８５））。ヒトのＧＣＤは広く研究されており、大腸菌において過剰発現されており（Ｄｗｙｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：１１４８８−１１４９９（２０００））、結晶化され、活性部位の保存されたグルタミン酸残基が関与している触媒機構が報告されている（Ｆｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：９６７４−９６８４（２００４））。Ｓｙｎｔｒｏｐｈｕｓ  ａｃｉｄｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓのＧＣＤは、クロトネートでの培養の際にＣＯ２同化方向に作用する（Ｍｏｕｔｔａｋｉら，７３：９３０−９３８（２００７）））。Ｓ．ａｃｉｄｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓにおいて２つのＧＣＤ遺伝子が、アゾアルカス属のＧｃｄＨ：ｓｙｎ＿００４８０（３１％）およびｓｙｎ＿０１１４６（３１％）とのタンパク質配列の相同性によって同定された。アゾアルカス属のＧｃｄＲ調節タンパク質との有意な相同性はみられなかった。
【０２９２】
【表６２】
2014521365.tif 000064
あるいはまた、クロトニル−ＣｏＡのグルタコニル−ＣｏＡのカルボキシル化、およびその後のグルタリル−ＣｏＡへの還元は、別々の酵素：グルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼおよびグルタコニル−ＣｏＡレダクターゼによって触媒され得る。グルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ酵素は、グルタメート発酵性嫌気性細菌において特性評価されており、補因子としてビオチンを利用し、かつ４つのサブユニット（α、β、γおよびδ）で構成されたナトリウムイオン転位性デカルボキシラーゼである（Ｂｏｉａｎｇｉｕら，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０：１０５−１１９（２００５）；Ｂｕｃｋｅｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５０５：１５−２７（２００１））。かかる酵素はＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ（Ｂｅａｔｒｉｘら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １５４：３６２−３６９（１９９０））およびＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ（Ｂｒａｕｎｅら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３１：４７３−４８７（１９９９））において特性評価されている。Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍのグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼのα、βおよびδサブユニットのアナログがＳ．ａｃｉｄｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓにおいて見出されている。エノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼと注釈されている遺伝子ｓｙｎ＿００４８０は、別のＧＣＤであり、ビオチン−カルボキシルキャリアー（ｓｙｎ＿００４７９）とグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼαサブユニット（ｓｙｎ＿００４８１）の間の推定オペロンに存在している。例示的な遺伝子産物のタンパク質配列は、以下に示す以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号を用いるとわかる。エノイル−ＣｏＡレダクターゼ酵素は上記に記載している（ＥＣ  １．３．１参照）。
【０２９３】
【表６３】
2014521365.tif 000065
４．１．１．ｂ  デカルボキシラーゼ，アルケン形成
オレフィン形成デカルボキシラーゼ酵素は５−ヒドロキシバレレートの３−ブテン−１−オールへの変換を触媒する（図１の工程Ｗ）。末端オレフィン形成性脂肪酸デカルボキシラーゼは、ジェオトガリコッカス属の一種ＡＴＣＣ８４５６のｏｌｅＴ遺伝子産物にコードされている（Ｒｕｄｅら，ＡＥＭ  ７７（５）：１７１８−２７（２０１１））。この最近見出された酵素は、シトクロムＰ４５０酵素ファミリーの構成員であり、脂肪酸のヒドロキシル化を触媒するＰ４５０ｓと類似している。ｏｌｅＴおよびホモログを以下の表に示す。さらなる脂肪酸デカルボキシラーゼ酵素はＵＳ２０１１／０１９６１８０において知得される。
【０２９４】
【表６４】
2014521365.tif 000066
４．１．９９．ａ  デカルボニラーゼ
ペンタ−２，４−ジエナールのブタジエンへの変換はデカルボニラーゼによって触媒される（図６の工程Ｂ）。デカルボニラーゼ酵素は、植物、哺乳動物および細菌におけるアルカンの生合成の最終工程を触媒する（Ｄｅｎｎｉｓら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２８７：２６８−２７５（１９９１））。非酸化性デカルボニラーゼはアルデヒドをアルカンに変換し、同時にＣＯの放出を伴う。例示的なデカルボニラーゼ酵素としては、オクタデカナールデカルボニラーゼ（ＥＣ  ４．１．９９．５）、ステロールデサチュラーゼおよび脂肪アルデヒドデカルボニラーゼが挙げられる。コバルト−ポルフィリン含有デカルボニラーゼが藻類Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉにおいて精製され、特性評価された；しかしながら、この活性と関連している遺伝子はこれまでにない（Ｄｅｎｎｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８９：５３０６−５３１０（１９９２））。また、Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ由来の銅含有デカルボニラーゼも精製され、特性評価された（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−Ｂｅｌｈａｄｄａｄら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３７７：３４１−３４９（２０００））。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＣＥＲ１遺伝子は、エピクチクラワックスの形成に関与している脂肪酸デカルボニラーゼをコードしている（ＵＳ  ６，４３７，２１８）。さらなる脂肪酸デカルボニラーゼは、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａおよびＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａにおいて見出されている（米国特許出願公開第２００９／００６１４９３号）。
【０２９５】
【表６５】
2014521365.tif 000067
択一的には、酸化性デカルボニラーゼはアルデヒドをアルカンに変換させ得る。酸化性デカルボニラーゼは、ＮＡＤＰＨとＯ２を補因子として利用し、ＣＯ２、水およびＮＡＤＰ＋を放出するシトクロムＰ４５０酵素である。この活性は、Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＣＹＰ４Ｇ２ｖ１およびＣＹＰ４Ｇ１遺伝子産物において示された（米国特許出願公開第２０１０／０１３６５９５号）。酸化性デカルボニラーゼ活性を有するさらなる酵素候補は、他の生物体、例えば、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａおよびＡｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍにおいて配列相同性によって同定され得る。
【０２９６】
【表６６】
2014521365.tif 000068
４．１．３．ａ  リアーゼ
ピルベートとアセトアルデヒドの４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートへの縮合（図５の工程Ａ）は４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．３．３９）によって触媒される。この酵素は、フェノール、クレゾールおよびカテコールの分解経路に関与している。大腸菌の該酵素は、ｍｈｐＥにコードされており、受容体としてのアセトアルデヒドに高度に特異的であるが、供与体として代替基質２−ケトブチレートまたはフェニルピルベートを許容する（Ｐｏｌｌａｒｄら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６４：４０９３−４０９４（１９９８））。同様の酵素がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａのｃｍｔＧおよびｔｏｄＨ遺伝子にコードされている（Ｌａｕら，Ｇｅｎｅ  １４６：７−１３（１９９４）；Ｅａｔｏｎ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１３５１−１３６２（１９９６））。シュードモナス属のＣＦ６００では、この酵素はｄｍｐＦＧにコードされた二元機能アルドラーゼ−デヒドロゲナーゼヘテロ二量体の一部である（Ｍａｎｊａｓｅｔｔｙら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５７：５８２−５８５（２００１））。該デヒドロゲナーゼ機能性はアセトアルデヒドとアセチル−ＣｏＡを相互変換させ、一部の細胞に対して毒性であるアセトアルデヒドの細胞内濃度の低下という利点をもたらす。同様のアルドラーゼ−デヒドロゲナーゼ複合体がＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓのＢｐｈＩＪにコードされている（Ｂａｋｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４８：６５５１−８（２００９））。
【０２９７】
【表６７】
2014521365.tif 000069
４．２．１．ａ  ヒドロ−リアーゼ
水の除去による二重結合の形成は４．２．１酵素ファミリーのデヒドラターゼ酵素によって触媒される。ヒドラターゼ酵素は場合によっては可逆性であり、脱水も触媒する。デヒドラターゼ酵素は場合によっては可逆性であり、水和も触媒する。所与の基質からの水の除去は、図１の工程Ｇ、ＮおよびＶ、図２の工程Ｃ、図３の工程Ｃおよび図５の工程ＢとＥに必要とされる。いくつかのヒドラターゼおよびデヒドラターゼ酵素が文献に記載されており、これらの工程の好適な候補となる。
【０２９８】
例えば、多くのデヒドラターゼ酵素は、電子求引性のカルボニル、カルボキシレートまたはＣｏＡ−チオールエステル基によるα−水素の活性化およびβ位からのヒドロキシル基の除去を伴う水のα，β−脱離を触媒する（Ｂｕｃｋｅｌら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１１７：１２４８−６０（１９７４）；Ｍａｒｔｉｎｓら，ＰＮＡＳ  １０１：１５６４５−９（２００４））。例示的な酵素としては、２−（ヒドロキシメチル）グルタル酸デヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．−）、フマラーゼ（ＥＣ  ４．２．１．２）、３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．１０）、シクロヘキサノンヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．−）および２−ケト−４−ペンテン酸デヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．８０）、シトラマル酸ヒドロリアーゼならびにジメチルマレイン酸ヒドラターゼが挙げられる。
【０２９９】
２−（ヒドロキシメチル）グルタル酸デヒドラターゼは、２−（ヒドロキシメチル）グルタレートを２−メチレン−グルタレートに脱水させる［４Ｆｅ−４Ｓ］含有酵素であり、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂａｒｋｅｒｉ（以前は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂａｒｋｅｒｉ）におけるニコチネートの異化におけるその役割について研究されている（Ａｌｈａｐｅｌら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０３：１２３４１−６（２００６））。高い配列相同性を有する同様の酵素が、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ  ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓおよびＮａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓにおいて見出されている。このような酵素は、［４Ｆｅ−４Ｓ］含有細菌のセリンデヒドラターゼ（例えば、ｔｄｃＧ、ｓｄｈＢおよびｓｄａＡにコードされた大腸菌の酵素）のαおよびβサブユニットと相同である。Ｅ．ｂａｒｋｅｒｉと同様の機能性を有する酵素は、ジメチルマレート（ｍａｅａｔｅ）を水和して（２Ｒ，３Ｓ）−２，３−ジメチルマレートを形成させるアコニターゼファミリーの可逆性Ｆｅ２＋依存性および酸素感受性酵素ジメチルマレイン酸ヒドラターゼである。この酵素はｄｍｄＡＢにコードされている（Ａｌｈａｐｅｌら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０３：１２３４１−６（２００６）；Ｋｏｌｌｍａｎｎ−Ｋｏｃｈら，Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒｓ．Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．３６５：８４７−８５７（１９８４））。
【０３００】
【表６８】
2014521365.tif 000070
フマル酸ヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．２）酵素は、自然状態でフマレートのマレートへの可逆的水和を触媒する。フマル酸ヒドラターゼが基質としての３−オキソブタノールと反応する能力は文献に記載されていないが、この酵素に関する豊富な構造的情報が入手可能であり、他の研究者らにより、該酵素は活性、阻害および局在が改変されるように成功裡に操作されている（Ｗｅａｖｅｒ，６１：１３９５−１４０１（２００５））。大腸菌は３種類のフマラーゼ：ＦｕｍＡ、ＦｕｍＢおよびＦｕｍＣを有し、これらは培養条件によって調節される。ＦｕｍＢは酸素感受性であり、嫌気性条件下でのみ活性である。ＦｕｍＡは微嫌気性条件下で活性であり、ＦｕｍＣは、好気性培養における唯一の活性酵素である（Ｔｓｅｎｇら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８３：４６１−４６７（２００１）；Ｗｏｏｄｓら，９５４：１４−２６（１９８８）；Ｇｕｅｓｔら，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １３１：２９７１−２９８４（１９８５））。さらなる酵素候補は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ（Ｓｍｉｔｈら，Ｉｎｔ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３１：９６１−９７５（１９９９））、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｍｉｚｏｂａｔａら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５５：４９−５５（１９９８））およびＲａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，８９：１９２３−１９３１（１９８１））に見出されている。高い配列相同性を有する同様の酵素としては、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のｆｕｍ１およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のｆｕｍＣが挙げられる。Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来のＭｍｃＢＣフマラーゼは、２つのサブユニットを有する別の類型のフマラーゼである（Ｓｈｉｍｏｙａｍａら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ，２７０：２０７−２１３（２００７））。
【０３０１】
【表６９】
2014521365.tif 000071
４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートの２−オキソペンテノエートへの脱水は、４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸ヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．８０）によって触媒される。この酵素は芳香族の分解経路に関与しており、典型的には、４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードしている遺伝子とともに共転写される。例示的な遺伝子産物は、大腸菌のｍｈｐＤ（Ｆｅｒｒａｎｄｅｚら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：２５７３−２５８１（１９９７）；Ｐｏｌｌａｒｄら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５１：９８−１０６（１９９８））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａのｔｏｄＧおよびｃｍｔＦ（Ｌａｕら，Ｇｅｎｅ  １４６：７−１３（１９９４）；Ｅａｔｏｎ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１３５１−１３６２（１９９６））、コマモナス属の一種ＣＮＢ−１のｃｎｂＥ（Ｍａら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７３：４４７７−４４８３（２００７））ならびにＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓのｍｈｐＤ（Ｗａｎｇら，ＦＥＢＳ  Ｊ  ２７２：９６６−９７４（２００５））にコードされているものである。近縁の酵素２−オキソヘプタ−４−エン−１，７−二酸ヒドラターゼは４−ヒドロキシフェニル酢酸の分解に関与しており、この場合、これは、補因子としてマグネシウムを使用し、２−オキソ−ヘプト−４−エン−１，７−ジオエート（ＯＨＥＤ）を２−オキソ−４−ヒドロキシ−ヘプタ−１，７−ジオエートに変換させる（Ｂｕｒｋｓら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：（１９９８））。ＯＨＥＤヒドラターゼ酵素候補は、大腸菌Ｃ（Ｒｏｐｅｒら，Ｇｅｎｅ  １５６：４７−５１（１９９５）；Ｉｚｕｍｉら，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７０：８９９−９１１（２００７））および大腸菌Ｗ（Ｐｒｉｅｔｏら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１１１−１２０（１９９６））において確認され、特性評価されている。配列比較により、広範な細菌、植物および動物のホモログが明らかになっている。高度に類似した配列を有する酵素は、とりわけ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（９１％の同一性、ｅｖａｌ＝２ｅ−１３８）およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ（９１％の同一性、ｅｖａｌ＝４ｅ−１３８）に含まれたものである。
【０３０２】
【表７０】
2014521365.tif 000072
別の酵素候補は、自然状態で２−メチルマレートをメサコネートに脱水させる酵素シトラマル酸ヒドロリアーゼ（ＥＣ  ４．２．１．３４）である。この酵素はＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉにおいて、２−オキソブタノエートまでのピルビン酸経路に関して研究されており、この場合、これは広い基質範囲を有することが示されている（Ｄｒｅｖｌａｎｄら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９：４３９１−４４００（２００７））。また、この酵素活性はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓにおいても検出され、この場合、これはグルタメートの分解に関与していると考えられている（Ｋａｔｏら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １６８：４５７−４６３（１９９７））。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉの該タンパク質の配列はこれらの生物体の遺伝子と有意な相同性を有していない。
【０３０３】
【表７１】
2014521365.tif 000073
ジメチルマレイン酸ヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．８５）は、ジメチルマレートを水和して（２Ｒ，３Ｓ）−２，３−ジメチルマレートを形成させるアコニターゼファミリーの可逆性Ｆｅ２＋依存性酸素感受性酵素である。この酵素は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂａｒｋｅｒｉのｄｍｄＡＢ（Ａｌｈａｐｅｌら（前出）；Ｋｏｌｌｍａｎｎ−Ｋｏｃｈら，Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒｓ．Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．３６５：８４７−８５７（１９８４））にコードされている。
【０３０４】
【表７２】
2014521365.tif 000074
オレイン酸ヒドラターゼは、ＷＯ２０１１０７６６９１に示唆されているように、さらなる好適な候補である。例としては以下のタンパク質が挙げられる。
【０３０５】
【表７３】
2014521365.tif 000075
エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．１７）は一連の３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ基質の脱水を触媒する（Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １１７：９９−１０８（１９７８）；Ａｇｎｉｈｏｔｒｉら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１１：９−２０（２００３）；Ｃｏｎｒａｄら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１８：１０３−１１１（１９７４））。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａのエノイル−ＣｏＡヒドラターゼは、ｅｃｈにコードされており、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する（Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １１７：９９−１０８（１９７８））。また、この変換は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのｃｒｔ遺伝子産物、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉのｃｒｔ１遺伝子産物、および他のクロストリジウム生物体によっても触媒される。Ａｔｓｕｍｉら，Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ  １０：３０５−３１１（２００８）；Ｂｏｙｎｔｏｎら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：３０１５−３０２４（１９９６）；Ｈｉｌｌｍｅｒら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１：３５１−３５４（１９７２））。さらなるエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ候補は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａのｐｈａＡおよびｐｈａＢ、ならびにＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のｐａａＡおよびｐａａＢである（Ｏｌｉｖｅｒａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ  ９５：６４１９−６４２４（１９９８））。Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓのｐｉｍＦの遺伝子産物は、ピメロイル−ＣｏＡの分解に関与しているエノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードしていることが予測されている（Ｈａｒｒｉｓｏｎら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５１：７２７−７３６（２００５））。最後に、いくつかの大腸菌の遺伝子、例えば、ｍａｏＣ（Ｐａｒｋら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５：５３９１−５３９７（２００３））、ｐａａＦ（Ｉｓｍａｉｌら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３０４７−３０５４（２００３）；Ｐａｒｋら，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １１３−１１６：３３５−３４６（２００４）；Ｐａｒｋら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８６：６８１−６８６（２００４））ならびにｐａａＧ（Ｉｓｍａｉｌら，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３０４７−３０５４（２００３）；ＰａｒｋおよびＬｅｅ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １１３−１１６：３３５−３４６（２００４）；ＰａｒｋおよびＹｕｐ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８６：６８１−６８６（２００４））がエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ機能性を示すことが示されている。
【０３０６】
【表７４】
2014521365.tif 000076
あるいはまた、ｆａｄＡおよびｆａｄＢの大腸菌の遺伝子産物は、脂肪酸の酸化に関与しており、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を示す多酵素複合体をコードしている（Ｙａｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：６７８８−６７９５（１９９１）；Ｙａｎｇ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：７４０５−７４０６（１９９１）；Ｎａｋａｈｉｇａｓｈｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：４９３７（１９９０））。ｆａｄＲにコードされた負の調節因子のノックアウトはｆａｄＢ遺伝子産物の活性化に使用され得る（Ｓａｔｏら，Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ  １０３：３８−４４（２００７））。ｆａｄＩおよびｆａｄＪ遺伝子は同様の機能をコードしており、自然状態では嫌気性条件下で発現される（Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４７：７９３−８０５（２００３））。
【０３０７】
【表７５】
2014521365.tif 000077
４．３．１．ａ  アンモニア−リアーゼ
図１の工程Ｊでは、ＥＣ分類４．３．１のアンモニアリアーゼが、５−アミノペン−２−エノエートの２，４−ペンタジエノエートへの脱アミノ化を触媒するために必要とされる。例示的な酵素はアスパルターゼおよび３−メチルアスパルターゼである。アスパルターゼ（ＥＣ  ４．３．１．１）は、アスパルテートのフマレートへの脱アミノ化を触媒し、広く特性評価されている（Ｖｉｏｌａ，Ａｄｖ  Ｅｎｚｙｍ  Ｒｅｌａｔ  Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，７４：２９５−３４１（２０００））。大腸菌の該酵素は、さまざまな代替基質、例えば、アスパラギン酸フェニルメチルエステル、アスパラギン、ベンジル−アスパルテートおよびマレートに対して活性である（Ｍａら，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，６７２：６０−６５（１９９２））。また、この酵素に対して基質特異性を改変するために指向性進化が使用された（Ａｓａｎｏら，Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ  ２２：９５−１０１（２００５））。ａｓｐＡにコードされた大腸菌のアスパルターゼの結晶構造が解明されている（Ｓｈｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ，３６：９１３６−９１４４（１９９７））。また、アスパルターゼ機能性を有する酵素は、インフルエンザ菌（Ｓｊｏｓｔｒｏｍら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３２４：１８２−１９０（１９９７））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（Ｔａｋａｇｉら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９６：５４５−５５２（１９８４））、枯草菌（Ｓｊｏｓｔｒｏｍら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １３２４：１８２−１９０（１９９７））およびＳｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ（Ｔａｋａｇｉら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１６１：１−６（１９８５））においても特性評価されている。３−メチルアスパルターゼは、トレオ−３−メチルアスパルテート（ａｓｐａｒａｔａｔｅ）のメサコネートへの脱アミノ化を触媒する。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ由来の３−メチルアスパルターゼは大腸菌においてクローニングされ、機能発現されており、結晶化されている（Ａｓｕｎｃｉｏｎら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇ，５７：７３１−７３３（２００１）；Ａｓｕｎｃｉｏｎら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７７：８３０６−８３１１（２００２）；Ｂｏｔｔｉｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２７：２９５３−２９５５（１９８８）；Ｇｏｄａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３１：１０７４７−１０７５６（１９９２））。Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓでは、この酵素はＢＡＡ２８７０９にコードされている（Ｋａｔｏら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １６８：４５７−４６３（１９９７））。また、大腸菌ＹＧ１００２由来の３−メチルアスパルターゼも結晶化されている（Ａｓａｎｏら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１１８：２５５−２５８（１９９４））が、該タンパク質の配列はＧｅｎＢａｎｋなどの公的データベースには示されていない。配列相同性を用いて、さらなる候補遺伝子、例えば、Ｃ．ｔｅｔａｎｉのＣＴＣ＿０２５６３および大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のＥＣｓ０７６１が特定され得る。
【０３０８】
【表７６】
2014521365.tif 000078
５．３．３．ａ  δ−イソメラーゼ
いくつかの特性評価された酵素は、エノイル−ＣｏＡ基質の二重結合を２位から３位にシフトさせる。かかる変換は図３の工程Ｄに必要とされる。例示的な酵素としては、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ／ビニルアセチル−ＣｏＡδ−イソメラーゼ（ＥＣ  ５．３．３．３）、δ−３，δ−２−エノイル−ＣｏＡイソメラーゼ（ＥＣ  ５．３．３．８）および脂肪酸酸化複合体が挙げられる。４−ヒドロキシブチリル（ｂｕｔｙｒｕｌ）−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素は、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの可逆的変換を触媒する。このような酵素は二元機能であり、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡのビニルアセチル−ＣｏＡへの脱水、またビニルアセチル−ＣｏＡとクロトニル−ＣｏＡの異性化の両方を触媒する。Ｃ．ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｕｍおよびＣ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来の４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素が精製され、特性評価され、Ｎ末端の配列が決定された（Ｓｃｈｅｒｆら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １６１：２３９−２４５（１９９４）；ＳｃｈｅｒｆおよびＢｕｃｋｅｌ，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１５：４２１−４２９（１９９３））。Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉの酵素は、ａｂｆＤにコードされており、大腸菌においてクローニングされ、配列決定され、発現された（Ｇｅｒｈａｒｄｔら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １７４：１８９−１９９（２０００））。Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ３３２７７由来のａｂｆＤ遺伝子産物は、クロストリジウム属の遺伝子産物との配列相同性により近縁である。４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ／イソメラーゼ活性はＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａにおいても検出され、おそらくＭｓｅｄ＿１２２０遺伝子と関連している（Ｂｅｒｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８（５８５７）：１７８２−６（２００７）。また、δ異性化反応は脂肪酸酸化複合体によって触媒される。大腸菌では、ｆａｄＪおよびｆａｄＢ遺伝子産物が、それぞれ、好気性条件下および嫌気性条件下でシス−３−エノイル−ＣｏＡ分子をトランス−２−エノイル−ＣｏＡ分子に変換させる（Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏ  ４７（３）：７９３−８０５（２００３））。Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓのペルオキシソームから単離された単機能性δ−イソメラーゼは、シス−およびトランス−３−エノイル−ＣｏＡのどちらのトランス−２−エノイル−ＣｏＡへの可逆的変換も触媒する（Ｅｎｇｅｌａｎｄら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９６（３）：６９９−７０５（１９９１）。この酵素と関連している遺伝子はこれまでに同定されていない。また、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ由来のいくつかの多元機能タンパク質（ＭＦＰ）、例えば、ＭＦＰ−ａの遺伝子産物もこの活性を触媒する（Ｐｒｅｉｓｉｇ−Ｍｕｌｌｅｒら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：２０４７５−８１（１９９４））。
【０３０９】
【表７７】
2014521365.tif 000079
６．２．１．ａ  酸−チオールリガーゼ
アシル−ＣｏＡ基質のその酸生成物への変換は６．２．１酵素ファミリーのＣｏＡ酸−チオールリガーゼまたはＣｏＡシンテターゼによって触媒され得、該酵素のうちいくつかは可逆性である。図１〜６に示したいくつかの反応は酸−チオールリガーゼ酵素によって触媒される。このような反応としては、図１の工程Ｌ、ＰおよびＯ、図３の工程Ｆ、図４の工程Ｂ、図５の工程Ｊならびに図６の工程Ｆが挙げられる。ＣｏＡ酸−チオールリガーゼ活性またはＣｏＡシンテターゼ活性を触媒するいくつかの酵素が文献に記載されており、これらの工程の好適な候補となる。
【０３１０】
例えば、ＡＤＰ形成性アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＤ，ＥＣ  ６．２．１．１３）は、アシル−ＣｏＡエステルのその対応する酸への変換をＡＴＰの並存的合成と共役させる酵素である。Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来のＡＣＤ  Ｉは、ＡＦ１２１１にコードされており、さまざまな線状および分枝状の基質、例えば、イソブチレート、イソペンタノエートおよびフマレートに対して作用することが示された（Ｍｕｓｆｅｌｄｔら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：６３６−６４４（２００２））。Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓの第２の可逆性ＡＣＤは、ＡＦ１９８３にコードされており、これも広い基質範囲を有し、環状化合物であるフェニルアセテートおよびインドールアセテートに対して高い活性を有することが示された（ＭｕｓｆｅｌｄｔおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：６３６−６４４（２００２））。Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ  ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の該酵素（スクシニル−ＣｏＡシンテターゼと注釈される）は、プロピオネート、ブチレート、ならびに分枝状の酸（イソバレレートおよびイソブチレート）を基質として許容し、順方向および逆方向に作用することが示された（Ｂｒａｓｅｎら，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １８２：２７７−２８７（２００４））。超好熱性クレン古細菌（ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｎ）Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のＰＡＥ３２５０にコードされたＡＣＤは、アセチル−ＣｏＡ、イソブチリル−ＣｏＡ（好ましい基質）およびフェニルアセチル−ＣｏＡと反応するすべての特性評価したＡＣＤの中で最も広い基質範囲を示した（Ｂｒａｓｅｎら（前出））。指向性進化または操作を使用し、この酵素が宿主生物体の生理学的温度で作用するように修飾することができる。Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉおよびＰ．ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来の該酵素はすべて、大腸菌においてクローニングされ、機能発現され、特性評価されている（ＢｒａｓｅｎおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ（前出）；ＭｕｓｆｅｌｄｔおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：６３６−６４４（２００２））。さらなる候補は、大腸菌のｓｕｃＣＤならびにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＬＳＣ１およびＬＳＣ２遺伝子にコードされたスクシニル−ＣｏＡシンテターゼである。このような酵素は、スクシネートからのスクシニル−ＣｏＡの形成を触媒し、インビボで可逆的な反応において１分子のＡＴＰの並存的消費を伴う（Ｂｕｃｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：６２４５−６２５２（１９８５））。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来のアシルＣｏＡリガーゼは、いくつかの脂肪族基質（例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸およびオクタン酸）ならびに芳香族化合物（フェニル酢酸およびフェノキシ酢酸など）に対して作用することが示されている（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｖａｌｖｅｒｄｅら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１１４９−１１５４（１９９３））。関連酵素であるＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ由来のマロニルＣｏＡシンテターゼ（６．３．４．９）は、いくつかの二酸、すなわち、エチル−、プロピル−、アリル−、イソプロピル−、ジメチル−、シクロプロピル−、シクロプロピルメチレン−、シクロブチル−およびベンジル−マロネートをその対応するモノチオエステルに変換させ得る（Ｐｏｈｌら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：５８２２−５８２３（２００１））。
【０３１１】
【表７８】
2014521365.tif 000080
このような工程のための別の候補酵素は６−カルボキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼであり、ピメロイル−ＣｏＡリガーゼ（ＥＣ  ６．２．１．１４）としても知られており、自然状態でグラム陽性菌においてビオチンの生合成の際にピメレートをピメロイル−ＣｏＡに活性化する。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ由来の該酵素は、大腸菌においてクローニングされ、代替基質ヘキサンジオエートおよびノナンジオエートを許容することが示された（Ｂｉｎｉｅｄａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ  ３４０（Ｐｔ  ３）：７９３−８０１（１９９９））。他の候補は、枯草菌（Ｂｏｗｅｒら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：４１２２−４１３０（１９９６））およびＬｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ（以前は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）（Ｐｌｏｕｘら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ  ２８７（Ｐｔ  ３）：６８５−６９０（１９９２））に見出されている。
【０３１２】
【表７９】
2014521365.tif 000081
さらなるＣｏＡ−リガーゼとしては、ラットジカルボン酸−ＣｏＡリガーゼ（その配列はまだ特性評価されていない）（Ｖａｍｅｃｑら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ  ２３０：６８３−６９３（１９８５））、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来の特性評価された２種類のフェニルアセテート−ＣｏＡリガーゼのいずれか（Ｌａｍａｓ−Ｍａｃｅｉｒａｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ  ３９５：１４７−１５５（２００６）；Ｗａｎｇら，３６０：４５３−４５８（２００７））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来のフェニルアセテート−ＣｏＡリガーゼ（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｂｌａｎｃｏら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５：７０８４−７０９０（１９９０））および枯草菌由来の６−カルボキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼ（Ｂｏｗｅｒら  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７８（１４）：４１２２−４１３０（１９９６））が挙げられる。Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（Ｈａｓｅｇａｗａら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７７９：４１４−４１９（２００８））ａｎｄ  ホモサピエンス（Ｏｈｇａｍｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６５：９８９−９９４（２００３））由来のアセトアセチル−ＣｏＡシンテターゼは、自然状態でアセトアセテートのアセトアセチル−ＣｏＡへのＡＴＰ依存性変換を触媒する。
【０３１３】
【表８０】
2014521365.tif 000082
他の類型の酵素と同様、ＥＣ分類６．２．１の特定の酵素は広い基質特異性を有することが測定されている。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来のアシルＣｏＡリガーゼは、いくつかの脂肪族基質（例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸およびオクタン酸）ならびに芳香族化合物（フェニル酢酸およびフェノキシ酢酸など）に対して作用することが示されている（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｖａｌｖｅｒｄｅら，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５９：１１４９−１１５４（１９９３））。関連酵素であるＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｔｒｉｆｏｌｉｉ由来のマロニルＣｏＡシンテターゼ（６．３．４．９）は、いくつかの二酸、すなわち、エチル−、プロピル−、アリル−、イソプロピル−、ジメチル−、シクロプロピル−、シクロプロピルメチレン−、シクロブチル−およびベンジル−マロネートをその対応するモノチオエステルに変換させ得る（Ｐｏｈｌら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：５８２２−５８２３（２００１））。
【０３１４】
Ｎ／Ａ（ＥＣ番号なし）
図１の工程Ｑでは、５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡの２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡへの変換が、二元機能酵素５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡデヒドラターゼ／デヒドラターゼによって触媒される。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃｕｍによる５−アミノバレレート発酵に関与しているため、この酵素が精製され、特性評価され、結晶化された（Ｅｉｋｍａｎｎｓら，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ  Ｆｕｎ  Ｇｅｎ  １９：２６９−２７１（１９９４）、ＥｉｋｍａｎｎｓおよびＢｕｃｋｅｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９７：６６１−６６８（１９９１））。そのタンパク質配列は既知であるが、これまでにＧｅｎＢａｎｋ識別番号は割り当てられていない。類似したタンパク質配列を有するホモログを以下の表に示す。
【０３１５】
【表８１】
2014521365.tif 000083
実施例ＶＩＩＩ
１，３−ブタンジオールおよび３−ブテン−１−オールのブタジエンへの化学的脱水
アルコールは、適切な条件下での適当な脱水触媒との反応によりオレフィンに変換され得る。ブタノールおよびペンタノールなどのアルコールをオレフィンに変換させる典型的な脱水触媒としては、種々の酸処理および未処理のアルミナ（例えば、γ−アルミナ）ならびにシリカ触媒およびクレイ、例えば、ゼオライト（例えば、β−型ゼオライト、ＺＳＭ−５またはＹ−型ゼオライト、フッ化物処理β−ゼオライト触媒、フッ化物処理クレイ触媒など）、スルホン酸樹脂（例えば、スルホン化スチレン系樹脂（Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）１５）など）、強酸（リン酸および硫酸など）、ルイス酸（三フッ化ホウ素および三塩化アルミニウムなど）、ならびに多くの異なる型の金属塩、例えば金属酸化物（例えば、酸化ジルコニウムまたはに酸化チタン）および金属塩化物（例えば、Ｌａｔｓｈａｗ  Ｂ  Ｅ，Ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｓｏｂｕｔａｎｏｌ  ｔｏ  Ｉｓｏｂｕｔｙｌｅｎｅ  ｉｎ  ａ  Ｓｌｕｒｒｙ  Ｒｅａｃｔｏｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｏｐｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９９４）が挙げられる。
【０３１６】
脱水反応は、多くの種々の反応器構成において、気相および液相のどちらでも、均一触媒系および不均一触媒系のどちらでも行なわれ得る。典型的には、使用される触媒は、反応によって生成する水に対して安定なものである。該水は、通常、反応ゾーンから生成物とともに取り出される。得られるアルケン（１種類または複数種）は、反応器から気相もしくは液相で（例えば、反応器の条件に応じて）排出され、下流の精製プロセスによって捕捉されるか、または本明細書に記載のように反応器内で他の化合物（ブタジエンもしくはイソプレンなど）にさらに変換されるかのいずれかである。脱水反応によって生成した水は反応器から、未反応アルコールおよびアルケン生成物（１種類または複数種）とともに排出され、蒸留または相分離によって分離される。水は脱水工程で大量に生成するため、使用される脱水触媒は一般的に水に対して耐性のものであり、水を基質および生成物から除去するためのプロセスは、脱水工程を含むいずれかのプロセスの一部であり得る。この理由のため、脱水反応のための基質としてウェット（ｗｅｔ）（すなわち、約９５％または９８％までの水分（重量基準）の）アルコールを使用し、この水を脱水反応によって生成した水とともに除去すること（例えば、米国特許第４，６９８，４５２号および同第４，８７３，３９２号に記載のゼオライト触媒を使用）が可能である。さらに、中性のアルミナおよびゼオライトはアルコールをアルケンに脱水させるが、一般的に、これらの触媒の酸性型よりも高温高圧においてである。
【０３１７】
１，３−ブタン（ｂｕｔａｅ）ジオールの３−ブテン−１−オールおよびブタジエンへの脱水は当該技術分野で知られている。例えば、３−ブテン−１−オールは１，３−ブタンジオールから、該ジオールを三価金属硫酸塩の存在下でセ氏７０〜１００度の範囲の温度まで加熱することにより合成される（米国特許４４００５６２）。１，３−ブタンジオールのブタジエンへの脱水は、例えば、１，３−ブタンジオールを過熱蒸気およびホスフェート−リン酸触媒の存在下で加熱することを伴うものである（Ｓａｔｏら，Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，５（８），２００４，ｐ．３９７−４００）。また、３−ブテン−１−オールのブタジエンへの脱水も当該技術分野でよく知られている（Ｇｕｓｔａｖ．ＥｇｌｏｆｆおよびＧｅｏｒｇｅ．Ｈｕｌｌａ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１９４５，３６（１），第６３〜１４１頁）。
【０３１８】
実施例ＩＸ
シンガスからの還元性対応物の抽出のための例示的なヒドロゲナーゼおよびＣＯデヒドロゲナーゼ酵素ならびに例示的な還元的ＴＣＡ回路酵素
本発明の非天然微生物体に有用な還元的ＴＣＡ回路の酵素としては、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼおよび３種類のＣＯ２固定酵素：イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼのうちの１種類以上が挙げられる。ＡＴＰ−クエン酸リアーゼまたはクエン酸リアーゼおよびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼの存在は、生物体における活発な還元的ＴＣＡ回路の存在を示す。還元的ＴＣＡ回路の各工程の酵素を以下に示す。
【０３１９】
ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ（ＡＣＬ，ＥＣ  ２．３．３．８）は、ＡＴＰクエン酸シンターゼとも称され、シトレートのオキサロアセテートおよびアセチル−ＣｏＡへのＡＴＰ依存性切断を触媒する。ＡＣＬは、緑色硫黄細菌Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｌｉｍｉｃｏｌａおよびＣｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍにおいて研究されているＲＴＣＡ回路の酵素である。Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｌｉｍｉｃｏｌａ由来のα（４）β（４）ヘテロマー酵素が大腸菌においてクローニングされ、特性評価された（Ｋａｎａｏら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：３４０９−３４１６（２００２）。Ｃ．ｌｉｍｉｃｏｌａの該酵素は、ａｃｌＡＢにコードされており、不可逆性であり、該酵素の活性はＡＤＰ／ＡＴＰ比によって調節されている。また、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ由来の組換えＡＣＬも大腸菌において発現され、触媒機構におけるαおよびβサブユニットの役割を解明する研究において、ホロ酵素がインビトロで再構築された（ＫｉｍおよびＴａｂｉｔａ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８：６５４４−６５５２（２００６）。また、ＡＣＬ酵素は、Ｂａｌｎｅａｒｉｕｍ  ｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｓｕｌｆｕｒｉｈｙｄｒｏｇｅｎｉｂｉｕｍ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｍおよび他のアクウィフェクス門の構成員の細菌においても確認されている（Ｈｕｇｌｅｒら，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：８１−９２（２００７））。この活性（ａｃｉｔｉｖｙ）は一部の真菌でも報告されている。例示的な生物体としては、Ｓｏｒｄａｒｉａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ（Ｎｏｗｒｏｕｓｉａｎら，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．３７：１８９−９３（２０００）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（ＨｙｎｅｓおよびＭｕｒｒａｙ，Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ，Ｊｕｌｙ：１０３９−１０４８，（２０１０）ならびにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（Ｍｅｉｊｅｒら  Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：１２７５−１２８０（２００９）が挙げられる。他の候補は配列相同性に基づいて見出され得る。これらの酵素に関する情報を以下に表にする：
【０３２０】
【表８２】
2014521365.tif 000084
一部の生物体では、シトレートのオキサロアセテートとアセチル−ＣｏＡへの変換はシトリル−ＣｏＡ中間体を経て進行し、２種類の別々の酵素シトリル−ＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ  ６．２．１．１８）およびシトリル−ＣｏＡリアーゼ（ＥＣ  ４．１．３．３４）によって触媒される（Ａｏｓｈｉｍａ，Ｍ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７５：２４９−２５５（２００７）。シトリル−ＣｏＡシンテターゼはシトレートのシトリル−ＣｏＡへの活性化を触媒する。Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの該酵素は、それぞれｃｃｓＡとｃｃｓＢにコードされた大サブユニットと小サブユニットで構成されている（Ａｏｓｈｉｍａら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｂｉｏｌ．５２：７５１−７６１（２００４））。Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓシトリル−ＣｏＡシンテターゼは、ｓｕｃＣ１およびｓｕｃＤ１にコードされたαおよびβサブユニットで構成されている（Ｈｕｇｌｅｒら，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：８１−９２（２００７））。シトリル−ＣｏＡリアーゼは、シトリル−ＣｏＡをオキサロアセテートとアセチル−ＣｏＡに分裂させる。この酵素は、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｃｃｌ（Ａｏｓｈｉｍａら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２：７６３−７７０（２００４））およびＡｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓのａｑ＿１５０（Ｈｕｇｌｅｒら（前出）（２００７））にコードされたホモ三量体である。シトレートをオキサロアセテートとシトリル−ＣｏＡに変換させるこの機構の遺伝子が、最近、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍにおいても報告された（Ｅｉｓｅｎら，ＰＮＡＳ  ９９（１４）：９５０９−１４（２００２）。
【０３２１】
【表８３】
2014521365.tif 000085
オキサロアセテートは、順方向および逆方向のどちらでも機能する酵素リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．３７）によってマレートに変換される。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、３コピーのリンゴ酸デヒドロゲナーゼＭＤＨ１（ＭｃＡｌｉｓｔｅｒ−ＨｅｎｎおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５１５７−５１６６（１９８７）、ＭＤＨ２（ＭｉｎａｒｄおよびＭｃＡｌｉｓｔｅｒ−Ｈｅｎｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：３７０−３８０（１９９１）；ＧｉｂｓｏｎおよびＭｃＡｌｉｓｔｅｒ−Ｈｅｎｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２５６２８−２５６３６（２００３））ならびにＭＤＨ３（ＳｔｅｆｆａｎおよびＭｃＡｌｉｓｔｅｒ−Ｈｅｎｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２４７０８−２４７１５（１９９２））を有し、これらは、それぞれミトコンドリア、サイトゾルおよびペルオキシソームに局在している。大腸菌は、ｍｄｈにコードされた活性なリンゴ酸デヒドロゲナーゼを有することが知られている。
【０３２２】
【表８４】
2014521365.tif 000086
フマル酸ヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．２）はフマレートのマレートへの可逆的水和を触媒する。ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢおよびｆｕｍＣにコードされた大腸菌の３種類のフマラーゼは、異なる酸素利用可能性条件下で調節される。ＦｕｍＢは酸素感受性であり、嫌気性条件下で活性である。ＦｕｍＡは微嫌気性条件下で活性であり、ＦｕｍＣは好気性培養条件下で活性である（Ｔｓｅｎｇら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：４６１−４６７（２００１）；Ｗｏｏｄｓら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９５４：１４−２６（１９８８）；Ｇｕｅｓｔら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３１：２９７１−２９８４（１９８５））。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅには１コピーのフマラーゼコード遺伝子ＦＵＭ１が含まれており、その産物はサイトゾルとミトコンドリアの両方に局在している（Ｓａｓｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４５１０９−４５１１６（２００３））。さらなるフマラーゼ酵素は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ（Ｓｍｉｔｈら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３１：９６１−９７５（１９９９））、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｍｉｚｏｂａｔａら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５５：４９−５５（１９９８））およびＲａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８９：１９２３−１９３１（１９８１））において見出されている。高い配列相同性を有する同様の酵素としては、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のｆｕｍ１およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のｆｕｍＣが挙げられる。Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来のＭｍｃＢＣフマラーゼは、２つのサブユニットを有する別の類型のフマラーゼである（Ｓｈｉｍｏｙａｍａら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２７０：２０７−２１３（２００７））。
【０３２３】
【表８５】
2014521365.tif 000087
フマル酸レダクターゼはフマレートのスクシネートへの還元を触媒する。大腸菌のフマル酸レダクターゼは、ｆｒｄＡＢＣＤにコードされた４つのサブユニットで構成されており、膜結合型であり、嫌気性条件下で活性である。この反応の電子供与体はメナキノンであり、この反応で生じる２つのプロトンはプロトン勾配に寄与しない（Ｉｖｅｒｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１９６１−１９６６（１９９９））。酵母ゲノムには、ＦＲＤＳ１（Ｅｎｏｍｏｔｏら，ＤＮＡ  Ｒｅｓ．３：２６３−２６７（１９９６））およびＦＲＤＳ２（Ｍｕｒａｔｓｕｂａｋｉら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５２：１７５−１８１（１９９８））にコードされた２種類の可溶性フマル酸レダクターゼアイソザイムがコードされており、これらは、それぞれサイトゾルおよびプロミトコンドリアに局在しており、グルコースでの嫌気性培養の際に使用される（Ａｒｉｋａｗａら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１６５：１１１−１１６（１９９８））。
【０３２４】
【表８６】
2014521365.tif 000088
スクシネートのスクシニル−ＣｏＡへのＡＴＰ依存性アシル化はスクシニル−ＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ  ６．２．１．５）によって触媒される。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＬＳＣ１およびＬＳＣ２遺伝子ならびに大腸菌のｓｕｃＣおよびｓｕｃＤ遺伝子の産物は、自然状態で、スクシネートからのスクシニル−ＣｏＡの形成を触媒するスクシニル−ＣｏＡシンテターゼ複合体を形成し、インビボで可逆的な反応である１分子のＡＴＰの並存的消費を伴う（Ｂｕｃｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：６２４５−６２５２（１９８５））。これらのタンパク質を以下に特定する：
【０３２５】
【表８７】
2014521365.tif 000089
α−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＥＣ  １．２．７．３）は、２−オキソグルタル酸シンターゼまたは２−オキソグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＯＦＯＲ）としても知られており、ＣＯ２とスクシニル−ＣｏＡからα−ケトグルタレートを形成し、２分子の還元フェレドキシン対応物の同時消費を伴う。ＯＦＯＲおよびピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）は、チアミンピロホスフェート、ＣｏＡおよび鉄−硫黄クラスターを補因子として、ならびにフェレドキシン、フラボドキシンおよびＦＡＤを電子伝達体として利用する多様な２−オキソ酸：フェレドキシン（フラボドキシン）オキシドレダクターゼファミリーの構成員である（Ａｄａｍｓら，Ａｒｃｈａｅａ．Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．４８：１０１−１８０（１９９６））。この分類の酵素は可逆性であり、ＲＴＣＡ回路によって炭素を固定する生物体、例えば、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌｕｓおよびクロロビウム属の種においてカルボキシル化方向に機能する（Ｓｈｉｂａら  １９８５；Ｅｖａｎｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＩ．Ｕ．Ｓ．Ａ．５５：９２９３４（１９６６）；Ｂｕｃｈａｎａｎ，１９７１）。Ｈ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の該２サブユニット酵素は、ｋｏｒＡＢにコードされており、大腸菌においてクローニングされ、発現されている（Ｙｕｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８２：５８９−５９４（２００１））。スクシニル−ＣｏＡに対して厳密な基質特異性を有する同生物体由来の５サブユニットＯＦＯＲは、ｆｏｒＤＡＢＧＥにコードされており、最近、大腸菌において確認され、発現された（Ｙｕｎら  ２００２）。どちらのＨ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＯＦＯＲ酵素のＣＯ２固定の速度論も特性評価されている（Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ  １４：７９−８５（２０１０））。Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｏｐｈｉｌｕｍ由来のＣＯ２固定ＯＦＯＲが精製され、特性評価されているが、この酵素をコードしている遺伝子はこれまでに同定されていない。クロロビウム属の種における酵素候補は、Ｈ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの該遺伝子との配列類似性によって推断され得る。例えば、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｌｉｍｉｃｏｌａのゲノムには２種類の類似したタンパク質がコードされている。Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａなどの酢酸産生菌は２種類のＯＦＯＲ酵素をコードしていることが予測される。Ｍｏｔｈ＿００３４にコードされた酵素はＣＯ２同化方向に機能することが予測される。この酵素と関連している遺伝子Ｍｏｔｈ＿００３４は、これまでに実験によって確認されていないが、既知のＯＦＯＲ酵素との配列類似性によって推断され得る。
【０３２６】
また、生理学的条件下で脱炭酸方向に機能するＯＦＯＲ酵素は逆反応も触媒し得る。好熱酸性古細菌スルフォロブス属の一種７株に由来するＯＦＯＲは、ＳＴ２３００にコードされており、広く研究されており（Ｚｈａｎｇら  １９９６．Ａ  ｐｌａｓｍｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｈａｓ  ｂｅｅｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ  （Ｆｕｋｕｄａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：５６３９−５６４６  （２００１））、基質特異性に関与している残基が決定された（ＦｕｋｕｄａおよびＷａｋａｇｉ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５９７：７４−８０（２００２））。Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  ｓｔｒ．Ｋ１由来のＡｐｅ１４７２／Ａｐｅ１４７３にコードされたＯＦＯＲが最近、大腸菌においてクローニングされ、特性評価され、２−オキソグルタレートおよび広範な２−オキソ酸と反応することがわかった（Ｎｉｓｈｉｚａｗａら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５７９：２３１９−２３２２（２００５））。別の例示的なＯＦＯＲはピロリ菌のｏｏｒＤＡＢＣにコードされたものである（Ｈｕｇｈｅｓら  １９９８）。α−ケトグルタレートに特異的な酵素がＴｈａｕｅｒａ  ａｒｏｍａｔｉｃａにおいて報告されている（ＤｏｒｎｅｒおよびＢｏｌｌ，Ｊ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４（１４），３９７５−８３（２００２）。同様の酵素が、配列相同性によってＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍにみられ得る。また、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍにおいて２サブユニット酵素が確認されている（Ｅｉｓｅｎら，ＰＮＡＳ  ９９（１４）：９５０９−１４（２００２））。
【０３２７】
【表８８】
2014521365.tif 000090
イソクエン酸デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤ（Ｐ）＋の還元と共役しているイソシトレートの２−オキソグルタレートへの可逆的脱炭酸を触媒する。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび大腸菌のＩＤＨ酵素は、それぞれＩＤＰ１およびｉｃｄにコードされている（ＨａｓｅｌｂｅｃｋおよびＭｃＡｌｉｓｔｅｒ−Ｈｅｎｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２３３９−２３４５（１９９１）；Ｎｉｍｍｏ，Ｈ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３４：３１７−２３３２（１９８６））。還元的ＴＣＡ回路の逆反応である２−オキソグルタレートのイソシトレートへの還元的カルボキシル化は、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｌｉｍｉｃｏｌａ由来のＮＡＤＰＨ依存性ＣＯ２固定ＩＤＨによって有利となり、大腸菌において機能発現された（Ｋａｎａｏら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：１９２６−１９３１（２００２））。９５％の配列同一性を有する同様の酵素が、以下に示す他の候補に加えてＣ．ｔｅｐｉｄｕｍゲノムにもみられる。
【０３２８】
【表８９】
2014521365.tif 000091
Ｈ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓでは、２−オキソグルタレートのイソシトレートへの還元的カルボキシル化は、２種類の酵素：２−オキソグルタル酸カルボキシラーゼおよびオキサロコハク酸レダクターゼによって触媒される。２−オキソグルタル酸カルボキシラーゼ（ＥＣ  ６．４．１．７）は、α−ケトグルタレートのオキサロスクシネートへのＡＴＰ依存性カルボキシル化を触媒する（ＡｏｓｈｉｍａおよびＩｇａｒａｓｈｉ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：７４８−７５９（２００６））。この酵素は、２つのサブユニットで構成された大型複合体である。該大型（Ａ）サブユニットのビオチン化が酵素機能に必要とされる（Ａｏｓｈｉｍａら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：７９１−７９８（２００４））。オキサロコハク酸レダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．−）は、オキサロスクシネートのＤ−トレオ−イソシトレートへのＮＡＤ依存性変換を触媒する。該酵素は、Ｈ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｉｃｄにコードされたホモ二量体である。この酵素の速度論パラメータは、該酵素が、他の生物体のイソクエン酸デヒドロゲナーゼ酵素とは対照的に、インビボで還元的カルボキシル化方向のみに作用することを示す（ＡｏｓｈｉｍａおよびＩｇａｒａｓｈｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０：２０５０−２０５５（２００８））。配列相同性に基づき、遺伝子候補がＴｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓおよびＴｈｅｒｍｏｃｒｉｎｉｓ  ａｌｂｕｓにおいても見出されている。
【０３２９】
【表９０】
2014521365.tif 000092
アコニターゼ（ＥＣ  ４．２．１．３）は、中間体シス−アコニテートを経るシトレートとイソ−シトレートの可逆的異性化を触媒する鉄−硫黄含有タンパク質である。２種類のアコニターゼ酵素が大腸菌ゲノムのａｃｎＡおよびａｃｎＢにコードされている。ＡｃｎＢは主要異化酵素であり、一方、ＡｃｎＡはより安定であり、酸化的ストレスまたは酸ストレスの条件下で活性なようである（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４３（Ｐｔ  １２）：３７９５−３８０５（１９９７））。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍにはアコニターゼの２種類のアイソザイムがａｃｎＡおよびａｃｎＢにコードされている（ＨｏｒｓｗｉｌｌおよびＥｓｃａｌａｎｔｅ−Ｓｅｍｅｒｅｎａ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：４７０３−４７１３（２００１））。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアコニターゼは、ＡＣＯ１にコードされており、ミトコンドリア（ここでは、これはＴＣＡ回路に関与している）（Ｇａｎｇｌｏｆｆら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３５５１−３５６１（１９９０））およびサイトゾル（ここでは、これはグリオキシレートシャントに関与している）に局在している（Ｒｅｇｅｖ−Ｒｕｄｚｋｉら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．１６：４１６３−４１７１（２００５））。
【０３３０】
【表９１】
2014521365.tif 000093
ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）はピルベートの可逆的酸化を触媒し、アセチル−ＣｏＡを形成させる。Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ由来のＰＦＯＲが大腸菌においてクローニングされ、発現され、活性な組換え酵素が得られており、これは酸素の存在下で数日間安定であった（Ｐｉｅｕｌｌｅら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：５６８４−５６９２（１９９７））。酸素安定性は、ＰＦＯＲでは比較的珍しく、Ｄ．ａｆｒｉｃａｎｕｓの該酵素のポリペプチド鎖の６０残基の伸長部によって付与されると考えられている。この酵素内の２個のシステイン残基がジスルフィド結合を形成し、これにより酸素の形態の不活性化から保護される。このジスルフィド結合および酸素の存在下で安定性は、他のデスルフォビブリオ属の種でもみられる（Ｖｉｔａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４７：９５７−６４（２００８））。また、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＰＦＯＲも充分に特性評価されており（ＭｅｎｏｎおよびＲａｇｓｄａｌｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：８４８４−８４９４（１９９７））、独立栄養的培養の際にピルベート合成方向に高い活性を有することが示された（ＦｕｒｄｕｉおよびＲａｇｓｄａｌｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２８４９４−２８４９９（２０００））。さらに、大腸菌は、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＰＦＯＲと５１％同一のタンパク質をコードしている特性評価されていないオープンリーディングフレームｙｄｂＫを有する。大腸菌におけるピルビン酸オキシドレダクターゼ活性の証拠が報告されている（Ｂｌａｓｃｈｋｏｗｓｋｉら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２３：５６３−５６９（１９８２））、また、ＰＦＯＲは他の生物体、例えば、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔａｓ（ＹａｋｕｎｉｎおよびＨａｌｌｅｎｂｅｃｋ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １４０９（１９９８）３９−４９（１９９８））およびＣｈｏｌｏｂｏｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ（Ｅｉｓｅｎら，ＰＮＡＳ  ９９（１４）：９５０９−１４（２００２））においても報告されている。Ｈ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の５サブユニットＰＦＯＲは、ｐｏｒＥＤＡＢＧにコードされており、大腸菌においてクローニングされ、脱炭酸化方向およびＣＯ２同化方向のどちらにも機能することが示された（Ｉｋｅｄａら  ２００６；Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ  １４：７９−８５（２０１０））。またＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ  Ｐ７にはホモログが存在している。いくつかのさらなるＰＦＯＲ酵素が、その後の概説において報告されている（Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｓ．Ｗ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０３：２３３３−２３４６（２００３））。最後に、フラボドキシンレダクターゼ（例えば、ピロリ菌もしくはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ由来のｆｑｒＢ）（Ｓｔ  Ｍａｕｒｉｃｅら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９：４７６４−４７７３（２００７））またはＲｎｆ−型タンパク質（Ｓｅｅｄｏｒｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５：２１２８−２１３３（２００８）；およびＨｅｒｒｍａｎｎ，Ｊ．Ｂ��ｃｔｅｒｉｏｌ  １９０：７８４−７９１（２００８））により、ＰＦＯＲによって生成された還元型フェレドキシンからＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生成させる手段が得られる。これらのタンパク質を以下に特定する。
【０３３１】
【表９２】
2014521365.tif 000094
ピルベートのアセチル−ＣｏＡへの変換はいくつかの他の酵素またはその組合せによって触媒され得る。例えば、ピルビン酸デヒドロゲナーゼは、ピルベートをアセチル−ＣｏＡに変換することができ、ＮＡＤのＮＡＤＨへの分子の並存的還元を伴う。これは、ピルベートのアシル化性酸化的脱炭酸をもたらす一連の部分反応を触媒する多酵素複合体である。該酵素には３つのサブユニット：ピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ｅ１）、ジヒドロリポアミドアシルトランスフェラーゼ（Ｅ２）およびジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（Ｅ３）が含まれている。この酵素は、自然状態でいくつかの生物体、例えば、大腸菌およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに存在している。大腸菌の該酵素では、Ｅ１成分内の特異的残基が基質特異性を担っている（Ｂｉｓｓｗａｎｇｅｒ，Ｈ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：８１５−８２（１９８１）；Ｂｒｅｍｅｒ，Ｊ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８：５３５−５４０（１９６９）；Ｇｏｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１３６４５−１３６５３（２０００））。酵素操作の取り組みにより、嫌気性条件下における大腸菌のＰＤＨ酵素活性が改善されている（Ｋｉｍら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０：３８５１−３８５８（２００８）；Ｋｉｍら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７３：１７６６−１７７１（２００７）；Ｚｈｏｕら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３０：３３５−３４２（２００８））。大腸菌ＰＤＨとは対照的に、枯草菌の該複合体は活性であり、嫌気性条件下での増殖に必要とされる（Ｎａｋａｎｏら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６７４９−６７５５（１９９７））。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＰＤＨは、グリセロールでの培養において特性評価され、これも嫌気性条件下で活性である（５）。ウシ腎臓由来の酵素複合体（１８）およびＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ由来のＥ２触媒ドメインの結晶構造が入手可能である（４）。この変換を触媒し得るまた別の酵素はピルビン酸ギ酸リアーゼである。この酵素は、ピルベートとＣｏＡのアセチル−ＣｏＡとホルメートへの変換を触媒する。ピルビン酸ギ酸リアーゼは原核生物の生物体に共通する酵素であり、嫌気性レドックスバランスの調節の補助に使用される。例示的な酵素は、大腸菌（ｐｆｌＢにコード）（ＫｎａｐｐｅおよびＳａｗｅｒｓ，ＦＥＭＳ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．６：３８３−３９８（１９９０））、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ（Ｍｅｌｃｈｉｏｒｓｅｎら，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５８：３３８−３４４（２００２））、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ−Ａｂｂｅら，Ｏｒａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：２９３−２９７（２００３））にみられ得るものである。大腸菌は、ｔｄｃＥにコードされ、かつピルベートまたは２−オキソブタノエートのそれぞれ、アセチル−ＣｏＡまたはプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒するさらなるピルビン酸ギ酸リアーゼを有する（Ｈｅｓｓｌｉｎｇｅｒら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２７：４７７−４９２（１９９８））。大腸菌由来のｐｆｌＢ���よびｔｄｃＥはどちらも、ｐｆｌＡにコードされたピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素の存在を必要とする。さらに、大腸菌のｙｆｉＤにコードされた短鎖タンパク質は、酸素切断型ピルビン酸ギ酸リアーゼに対する活性と関連しており、該活性を回復させ得るものである（Ｖｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５：１６１３７−１６１４１（２００８）。ＷＯ／２００８／０８０１２４］に記載のように、大腸菌由来のｐｆｌＡおよびｐｆｌＢはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ブタノール生成のためにサイトゾル内アセチル−ＣｏＡを増加させるための手段として発現されたことに留意されたい。それぞれｐｆｌおよびａｃｔにコードされたさらなるピルビン酸ギ酸リアーゼおよび活性化酵素の候補は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍに見出されている（Ｗｅｉｄｎｅｒら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：２４４０−２４４４（１９９６））。
【０３３２】
さらに、異なる酵素が組合せで、ピルベートのアセチル−ＣｏＡへの変換に使用され得る。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、アセチル−ＣｏＡはサイトゾル内で、まずピルベートの脱炭酸化によりアセトアルデヒドが形成され；後者がアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼによってアセテートに酸化され、続いて、アセチル−ＣｏＡシンテターゼによって活性化されてアセチル−ＣｏＡが形成されることにより得られる。アセチル−ＣｏＡシンテターゼは、いくつかの他の生物体、例えば、大腸菌（Ｋｕｍａｒｉら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：２８７８−２８８６（１９９５））、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ（Ｓｔａｒａｉら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５１：３７９３−３８０１（２００５）；Ｓｔａｒａｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２６２００−２６２０５（２００５））およびＭｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ（既報）における天然の酵素である。あるいはまた、アセテートは、酢酸キナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼによって活性化され、アセチル−ＣｏＡが形成され得る。酢酸キナーゼは、まず、１分子のＡＴＰの使用を伴ってアセテートをアセチル−ホスフェートに変換させる。次に、アセチル−ホスフェートとＣｏＡが、ホスホトランスアセチラーゼによる１分子のホスフェートの放出を伴ってアセチル−ＣｏＡに変換される。酢酸キナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼ（ａｃｅｔｌｙａｓｅ）はどちらも、いくつかのクロストリジウム属およびＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａの充分に研究された酵素である。
【０３３３】
ピルベートのアセチル−ＣｏＡへのまた別の変換様式はピルビン酸オキシダーゼによるものである。ピルビン酸オキシダーゼは、電子受容体としてユビキノン（ｕｂｉｑｕｉｏｎｅ）を用いてピルベートをアセテートに変換させる。大腸菌では、この活性はｐｏｘＢにコードされている。ｐｏｘＢは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＺｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓのピルビン酸デカルボキシラーゼと類似性を有する。該酵素は、チアミンピロリン酸補因子（ＫｏｌａｎｄおよびＧｅｎｎｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２１：４４３８−４４４２（１９８２））；Ｏ’Ｂｒｉｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６：３１０５−３１０９（１９７７）；Ｏ’ＢｒｉｅｎおよびＧｅｎｎｉｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：３３０２−３３０７（１９８０））ならびにフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）補因子を有する。次いでアセテートは、先に記載のように、アセチル−ＣｏＡシンテターゼまたは酢酸キナーゼのいずれかとホスホトランスアセチラーゼによってアセチル−ＣｏＡに変換され得る。また、このような酵素の一部のものは、アセチル−ＣｏＡからピルベートへの逆反応も触媒し得る。
【０３３４】
ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの形態の還元性対応物を使用する酵素では、この還元型キャリアーは、還元型フェレドキシンからの電子の移動により生成され得る。２種類の酵素フェレドキシン：ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼ（ＥＣ  １．１８．１．３）とフェレドキシン：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ（ＦＮＲ，ＥＣ  １．１８．１．２）が還元型フェレドキシンからＮＡＤ（Ｐ）＋への可逆的電子移動を触媒する。フェレドキシン：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ（ＦＮＲ，ＥＣ  １．１８．１．２）は非共有結合ＦＡＤ補因子を有し、該補因子は、ＮＡＤＰＨから低電位受容体、例えばフェレドキシンまたはフラボドキシンへの可逆的電子移動を助長する（Ｂｌａｓｃｈｋｏｗｓｋｉら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２３：５６３−５６９（１９８２）；Ｆｕｊｉｉら，１９７７）。ピロリ菌のＦＮＲは、ＨＰ１１６４（ｆｑｒＢ）にコードされており、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）の活性と共役し、ＮＡＤＰＨのピルベート依存性生成をもたらす（Ｓｔら  ２００７）。アナロガスな酵素がＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉにおいて見出されている（Ｓｔら  ２００７）。フェレドキシン：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ酵素は大腸菌ゲノムのｆｐｒにコードされている（Ｂｉａｎｃｈｉら  １９９３）。フェレドキシン：ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼは還元型フェレドキシンを利用し、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成させる。いくつかの生物体、例えば大腸菌では、この酵素は、多元機能ジオキシゲナーゼ酵素複合体の一成分である。大腸菌のフェレドキシン：ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼは、ｈｃａＤにコードされており、３−フェニルプロピオン酸（ｐｒｏｐｐｉｏｎａｔｅ）ジオキシゲナーゼ系の一成分であり、芳香族酸の利用に関与している（ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ）（Ｄｉａｚら  １９９８）。ＮＡＤＨ：フェレドキシンレダクターゼ活性はＨｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴＫ−６株の細胞抽出物において検出されたが、この活性を有する遺伝子はまだ示されていない（Ｙｏｏｎら  ２００６）。最後に、省エネルギー性膜結合型Ｒｎｆ−型タンパク質（Ｓｅｅｄｏｒｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５：２１２８−２１３３（２００８）；Ｈｅｒｒｍａｎｎら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０：７８４−７９１（２００８））は、還元型フェレドキシンからＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生成させるための手段をもたらす。さらなるフェレドキシン：ＮＡＤ（Ｐ）＋オキシドレダクターゼはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ  Ｐ７において注釈されている。
【０３３５】
【表９３】
2014521365.tif 000095
フェレドキシンは、低い還元電位を有する細胞内電子伝達体としての機能を果たす１つ以上の鉄−硫黄クラスターを含むものである小型の酸性タンパク質である。還元型フェレドキシンは電子をＦｅ依存性酵素に、例えば、フェレドキシン−ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）および２−オキソグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＯＦＯＲ）に供与する。Ｈ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの遺伝子ｆｄｘ１は［４Ｆｅ−４Ｓ］−型フェレドキシンをコードしており、これは、それぞれＯＦＯＲおよびＰＦＯＲによる２−オキソグルタレートおよびピルベートの可逆的カルボキシル化に必要とされる（Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ  １４：７９−８５（２０１０））。Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓの２−オキソ酸：フェレドキシンレダクターゼと関連しているフェレドキシンは、モノマー型ジクラスター［３Ｆｅ−４Ｓ］［４Ｆｅ−４Ｓ］型フェレドキシンである（Ｐａｒｋら  ２００６）。このタンパク質と関連している遺伝子は充分に配列決定されていないが、そのＮ末端ドメインはＳ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来のｚｆｘフェレドキシンと９３％の相同性を共有している。大腸菌のゲノムには、生理学的機能が未知の可溶性フェレドキシンｆｄｘがコードされている。いくつかの証拠により、このタンパク質は鉄−硫黄クラスターアセンブリで機能し得ることが示されている（ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＮａｋａｍｕｒａ，１９９９）。さらなるフェレドキシンタンパク質がピロリ菌（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら  ２００３）およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ（ｖａｎ  Ｖｌｉｅｔら  ２００１）において特性評価されている。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ由来の２Ｆｅ−２Ｓフェレドキシンが大腸菌においてクローニングされ、発現されている（ＦｕｊｉｎａｇａおよびＭｅｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９２（３）：（１９９３））。酢酸産生菌、例えば、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ  Ｐ７およびＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍには、以下の表に示すいくつかのフェレドキシンがコードされていることが予測される。
【０３３６】
【表９４−１】
2014521365.tif 000096
【０３３７】
【表９４−２】
2014521365.tif 000097
スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼは、スクシニル−ＣｏＡのスクシネートへの変換を触媒するとともに、ＣｏＡ部分をＣｏＡ受容体分子に移動させる。多くのトランスフェラーゼは広い特異性を有し、とりわけアセテート、スクシネート、プロピオネート、ブチレート、２−メチルアセトアセテート、３−ケトヘキサノエート、３−ケトペンタノエート、バレレート、クロトネート、３−メルカプトプロピオネート、プロピオネート、ビニルアセテートおよびブチレートという多様なＣｏＡ受容体を利用することができる。
【０３３８】
スクシネートのスクシニル−ＣｏＡへの変換は、ＡＴＰまたはＧＴＰの直接消費を必要としないトランスフェラーゼによって行なわれ得る。この型の反応はいくつかの生物体において共通している。また、スクシネートのスクシニル−ＣｏＡへの変換は、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼによっても触媒され得る。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉのｃａｔ１の遺伝子産物はスクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を示すことが示されている（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１−８８０（１９９６））。また、この活性はＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ（ｖａｎ  Ｇｒｉｎｓｖｅｎら  ２００８）およびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ（Ｒｉｖｉｅｒｅら  ２００４）にも存在している。Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ由来のスクシニル−ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、ａａｒＣにコードされており、異型ＴＣＡ回路においてスクシニル−ＣｏＡシンテターゼの代わりとなる（Ｍｕｌｌｉｎｓら  ２００８）。同様のスクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性がＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ（ｖａｎ  Ｇｒｉｎｓｖｅｎら  ２００８）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ（Ｒｉｖｉｅｒｅら  ２００４）ならびにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，１９９６ｃ）にも存在している。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａのｐｃａＩとｐｃａＪにコードされたβ−ケトアジピン酸：スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼは、また別の候補である（Ｋａｓｃｈａｂｅｋら  ２００２）。前述のタンパク質を以下に特定する。
【０３３９】
【表９５】
2014521365.tif 000098
スクシネートをスクシニル−ＣｏＡに変換させるとともに３−ケトアシル−ＣｏＡを３−ケト酸に変換させるさらなる例示的なトランスフェラーゼはスクシニル−ＣｏＡ：３：ケト酸−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．８．３．５）である。例示的なスクシニル−ＣｏＡ：３：ケト酸−ＣｏＡトランスフェラーゼは、ピロリ菌（Ｃｏｒｔｈｅｓｙ−Ｔｈｅｕｌａｚら  １９９７）、枯草菌およびホモサピエンス（Ｆｕｋａｏら  ２０００；Ｔａｎａｋａら  ２００２）に存在しているものである。前述のタンパク質を以下に特定する。
【０３４０】
【表９６】
2014521365.tif 000099
スクシニル−ＣｏＡ：３：ケト酸−ＣｏＡトランスフェラーゼによるスクシネートのスクシニル−ＣｏＡへの変換には、３−ケトアシル−ＣｏＡ（アセトアセチル−ＣｏＡなど）の３−ケト酸（アセトアセテートなど）への同時変換が必要とされる。３−ケト酸を３−ケトアシル−ＣｏＡに戻す変換はアセトアセチル−ＣｏＡ：酢酸：ＣｏＡトランスフェラーゼによって触媒され得る。アセトアセチル−ＣｏＡ：酢酸：ＣｏＡトランスフェラーゼはアセトアセチル−ＣｏＡとアセテートをアセトアセテートとアセチル−ＣｏＡに、またはその逆に変換させる。例示的な酵素としては、大腸菌由来のａｔｏＡＤ（Ｈａｎａｉら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７３：７８１４−７８１８（２００７）、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のｃｔｆＡＢ（Ｊｏｊｉｍａら，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７７：１２１９−１２２４（２００８）およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ  ｃｔｆＡＢ（Ｋｏｓａｋａら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７１：５８−６８（２００７））の遺伝子産物が挙げられ、以下に示す。
【０３４１】
【表９７】
2014521365.tif 000100
また別の考えられ得るＣｏＡ受容体はベンジルスクシネートである。スクシニル−ＣｏＡ：（Ｒ）−ベンジルコハク酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、Ｔｈａｕｅｒａ  ａｒｏｍａｔｉｃａなどの生物体においてトルエンの嫌気性分解経路の一部としての機能を果たす（ＬｅｕｔｗｅｉｎおよびＨｅｉｄｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１８３（１４）４２８８−４２９５（２００１））。ホモログが、アゾアルカス属の一種Ｔ、Ａｒｏｍａｔｏｌｅｕｍ  ａｒｏｍａｔｉｃｕｍ  ＥｂＮ１、およびＧｅｏｂａｃｔｅｒ  ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｕｃｅｎｓ  ＧＳ−１５にみられ得る。前述のタンパク質を以下に特定する。
【０３４２】
【表９８】
2014521365.tif 000101
さらに、ｙｇｆＨは、大腸菌のプロピオニルＣｏＡ：コハク酸ＣｏＡトランスフェラーゼをコードしている（Ｈａｌｌｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９（１６）４６２２−４６２９）。近縁ホモログが、例えば、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｙｏｕｎｇａｅ  ＡＴＣＣ  ２９２２０、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａの亜種ａｒｉｚｏｎａｅ  ｓｅｒｏｖａｒ、およびＹｅｒｓｉｎｉａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ  ＡＴＣＣ  ２９９０９にみられ得る。前述のタンパク質を以下に特定する。
【０３４３】
【表９９】
2014521365.tif 000102
クエン酸リアーゼ（ＥＣ  ４．１．３．６）は、シトレートのアセテートとオキサロアセテートへの切断をもたらす一連の反応を触媒する。該酵素は嫌気性条件下で活性であり、３つのサブユニット：アシル−キャリアータンパク質（ＡＣＰ，γ）、ＡＣＰトランスフェラーゼ（α）およびアシルリアーゼ（β）で構成されている。酵素の活性化には、アセチル−ＣｏＡと構造が類似している稀な補欠分子族２’−（５”−ホスホリボシル）−３−‘−デホスホ−ＣｏＡの共有結合およびアセチル化が使用される。アシル化は、クエン酸リアーゼシンテターゼであるＣｉｔＣによって触媒される。２種類のさらなるタンパク質ＣｉｔＧとＣｉｔＸがアポ酵素の活性なホロ酵素への変換に使用される（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：９４３８−９４５０（２０００））。野生型大腸菌はクエン酸リアーゼ活性を有していない；しかしながら、モリブデン補因子の合成が欠損している変異型は活性なクエン酸リアーゼを有する（Ｃｌａｒｋ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．５５：２４５−２４９（１９９０））。大腸菌の該酵素はｃｉｔＥＦＤにコードされており、クエン酸リアーゼシンテターゼはｃｉｔＣにコードされている（ＮｉｌｅｋａｎｉおよびＳｉｖａＲａｍａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２：４６５７−４６６３（１９８３））。Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓのクエン酸リアーゼが大腸菌においてクローニングされ、特性評価され、発現されている（Ｂｅｋａｌら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：６４７−６５４（１９９８））。また、クエン酸リアーゼ酵素は、シトレートを炭素源およびエネルギー源として利用する腸内細菌、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおいても確認されている（Ｂｏｔｔ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６７：７８−８８（１９９７）；ＢｏｔｔおよびＤｉｍｒｏｔｈ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４：３４７−３５６（１９９４））。前述のタンパク質を以下に表にする。
【０３４４】
【表１００】
2014521365.tif 000103
酢酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．１）は、アセテートのアセチルホスフェートへの可逆的ＡＴＰ依存性リン酸化を触媒する。例示的な酢酸キナーゼ酵素は、多くの生物体、例えば、大腸菌、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍおよびＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａにおいて特性評価されている（Ｉｎｇｒａｍ−Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７：２３８６−２３９４（２００５）；ＦｏｘおよびＲｏｓｅｍａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１３４８７−１３４９７（１９８６）；Ｗｉｎｚｅｒら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｙ  １４３（Ｐｔ  １０）：３２７９−３２８６（１９９７））。また、酢酸キナーゼ活性は、大腸菌ｐｕｒＴの遺伝子産物でも示されている（Ｍａｒｏｌｅｗｓｋｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：２５３１−２５３７（１９９４）。一部の酪酸キナーゼ酵素（ＥＣ  ２．７．２．７）、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のｂｕｋ１およびｂｕｋ２は、アセテートも基質として許容する（Ｈａｒｔｍａｎｉｓ，Ｍ．Ｇ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：６１７−６２１（１９８７））。
【０３４５】
【表１０１】
2014521365.tif 000104
アセチルホスフェートからのアセチル−ＣｏＡの形成はホスホトランスアセチラーゼ（ＥＣ  ２．３．１．８）によって触媒される。大腸菌由来のｐｔａ遺伝子は、アセチル−ＣｏＡをアセチル−ホスフェートに可逆的に変換させる酵素をコードしている（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９１：５５９−５６９（９６９））。さらなるアセチルトランスフェラーゼ酵素が、枯草菌（ＲａｄｏおよびＨｏｃｈ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３２１：１１４−１２５（１９７３）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ（Ｓｔａｄｔｍａｎ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１：５８９６−５９９（１９５５）およびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｂｏｃｋら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：１８６１−１８６７（１９９９））において特性評価されている。この反応は、一部のホスホトランブチリラーゼ酵素（ＥＣ  ２．３．１．１９）、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のｐｔｂ遺伝子産物によっても触媒される（Ｗｉｅｓｅｎｂｏｒｎら，Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５：３１７−３２２（１９８９）；Ｗａｌｔｅｒら，Ｇｅｎｅ  １３４：１０７−１１１（１９９３））。さらなるｐｔｂ遺伝子は、酪酸産生菌Ｌ２−５０（Ｌｏｕｉｓら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：２０９９−２１０６（２００４）およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（Ｖａｚｑｕｅｚら，Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：３４５−３４９（２００１）において見出されている。
【０３４６】
【表１０２】
2014521365.tif 000105
アセテートのアセチル−ＣｏＡへのアシル化は、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ活性を有する酵素によって触媒される。この反応を触媒する２種類の酵素は、ＡＭＰ形成性アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ  ６．２．１．１）とＡＤＰ形成性アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ  ６．２．１．１３）である。ＡＭＰ形成性アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ）は、アセテートをアセチル−ＣｏＡに活性化するための主要酵素である。例示的なＡＣＳ酵素は、大腸菌（Ｂｒｏｗｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０２：３２７−３３６（１９７７））、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ（ＰｒｉｅｆｅｒｔおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：６５９０−６５９９（１９９２））、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ（Ｉｎｇｒａｍ−ＳｍｉｔｈおよびＳｍｉｔｈ，Ａｒｃｈａｅａ  ２：９５−１０７（２００７））、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ（Ｇｕｌｉｃｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：２８６６−２８７３（２００３））ならびにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＪｏｇｌおよびＴｏｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１４２５−１４３１（２００４））において見出されている。ＡＤＰ形成性アセチル−ＣｏＡシンテターゼは、一般的に広い基質範囲を有する可逆性酵素である（ＭｕｓｆｅｌｄｔおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：６３６−６４４（２００２））。ＡＤＰ形成性アセチル−ＣｏＡシンテターゼの２種類のアイソザイムがＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓのゲノムのＡＦ１２１１とＡＦ１９８３にコードされている（ＭｕｓｆｅｌｄｔおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ（前出）（２００２））。Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ  ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の該酵素（スクシニル−ＣｏＡシンテターゼと注釈）は基質としてアセテートも許容し、該酵素の可逆性が示された（ＢｒａｓｅｎおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８２：２７７−２８７（２００４））。超好熱性クレン古細菌Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のＰＡＥ３２５０にコードされたＡＣＤでは、アセテート、イソブチリル−ＣｏＡ（好ましい基質）およびフェニルアセチル−ＣｏＡと反応するすべての特性評価したＡＣＤの中で最も広い基質範囲が示された（ＢｒａｓｅｎおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ（前出）（２００４））。指向性進化または操作を使用し、この酵素が宿主生物体の生理学的温度で作用するように修飾することができる。Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉおよびＰ．ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来の該酵素はすべて、大腸菌においてクローニングされ、機能発現され、特性評価されている（ＢｒａｓｅｎおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ（前出）（２００４）；ＭｕｓｆｅｌｄｔおよびＳｃｈｏｎｈｅｉｔ（前出）（２００２））。さらなる候補としては、大腸菌のｓｕｃＣＤ（Ｂｕｃｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：６２４５−６２５２（１９８５））およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来のアシル−ＣｏＡリガーゼ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｖａｌｖｅｒｄｅら��Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１１４９−１１５４（１９９３））にコードされたスクシニル−ＣｏＡシンテターゼが挙げられる。前述のタンパク質を以下に表にする。
【０３４７】
【表１０３】
2014521365.tif 000106
還元型発酵産物、例えば、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、１，３−ブタンジオールまたは３−ブテン−１−オールを合成する微生物細胞の基質の炭素モル（Ｃ−ｍｏｌ）あたりの生成物収量は、炭水化物原料中の不充分な還元性対応物によって制限される。還元性対応物または電子は、合成ガス成分、例えばＣＯおよびＨ２から、それぞれ一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＣＯＤＨ）およびヒドロゲナーゼ酵素を用いて抽出され得る。次いで、還元性対応物は、受容体、例えば酸化型フェレドキシン、酸化型キノン、酸化型シトクロム、ＮＡＤ（Ｐ）＋、水または過酸化水素に送られ、それぞれ、還元型フェレドキシン、還元型キノン、還元型シトクロム、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、Ｈ２または水が形成される。還元型フェレドキシンとＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、種々のＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路および還元的ＴＣＡ回路の酵素のためのレドックスキャリアーとしての機能を果たし得るため特に有用である。
【０３４８】
ここに、本発明者らは、ＣＯおよび／またはＨ２からのさらなるレドックス利用可能性により、どのようにして還元型生成物、例えば、２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、１，３−ブタンジオールまたは３−ブテン−１−オールの収量が改善され得るかの具体例を示す。
【０３４９】
本発明の一部の実施形態では、シンガスを糖質系原料または他の炭素基質と併用する併用原料ストラテジーにより、理論収量が大きく改善され得る。この共供給アプローチでは、シンガス成分Ｈ２とＣＯがヒドロゲナーゼとＣＯデヒドロゲナーゼによって使用され、還元性対応物が生成され得、これが、糖質または他の炭素基質由来の炭素が最大限に保存され、理論収量が改善される化学製品製造経路の動力供給に使用され得る。かかる改善により、環境的および経済的有益性がもたらされ、持続可能な化学製品製造が大きく向上する。
【０３５０】
以下、本明細書において、シンガス（ｓｙｎａｇｓ）成分からのレドックスの抽出に使用される酵素および対応遺伝子を記載する。ＣＯＤＨは、電子を放出または取得してＣＯとＣＯ２を相互変換させる可逆性酵素である。ＡＣＳ／ＣＯＤＨ複合体におけるＣＯＤＨの天然の生理学的役割は、アセチル−ＣｏＡシンターゼによりアセチル−ＣｏＡ内に組み込まれるようにＣＯ２をＣＯに変換することである。とはいうものの、かかるＣＯＤＨ酵素は、かかる酵素の可逆的性質のため、ＣＯからの還元性対応物の抽出に適している。ＡＣＳの非存在下でのかかるＣＯＤＨ酵素の発現により、該酵素がその天然の生理学的役割（すなわち、ＣＯ酸化）と反対の方向に作用することが可能となる。
【０３５１】
Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ  Ｐ７およびいくつかの他の生物体では、さらなるＣＯＤＨコード遺伝子がＡＣＳ／ＣＯＤＨオペロンの外側に存在している。このような酵素は、一酸化炭素の二酸化炭素への変換から電子（または還元性対応物）を抽出するための手段をもたらす。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａの該遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＹＰ＿４３０８１３）はオペロンにて単独で発現され、「ピンポン」反応にて電子をＣＯからフェレドキシンなどの外部媒介物に移動させると考えられている。還元された該媒介物は、次いで他の還元型ニコチンアミド（ｎｉｃｏｌｉｎａｍｉｄｅ）アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）キャリアーまたはフェレドキシン依存性細胞内プロセスに共役される（Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １１２５：１２９−１３６（２００８））。Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓのＣＯＤＨ−ＩＩとＣｏｏＦ（近接（ｎｅｉｇｈｂｏｒｉｎｇ）タンパク質）をコードしている遺伝子がクローニングされ、配列決定された（ＧｏｎｚａｌｅｚおよびＲｏｂｂ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１９１：２４３−２４７（２０００））。得られた複合体は膜結合型であったが、ＣＯＤＨ−ＩＩの細胞質画分はＮＡＤＰＨの形成を触媒することが示され、同化作用的役割が示唆された（Ｓｖｅｔｌｉｔｃｈｎｙｉら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：５１３４−５１４４（２００１））。ＣＯＤＨ−ＩＩの結晶構造も入手可能である（Ｄｏｂｂｅｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：１２８１−１２８５（２００１））。同様の無ＡＣＳ型ＣＯＤＨ酵素が、多様な一連の生物体、例えばＧｅｏｂａｃｔｅｒ  ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｕｃｅｎｓ  ＧＳ−１５、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｐｈａｅｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＤＳＭ  ２６６、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ  Ｈ１０、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓの亜種ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  ｓｔｒ．ＡＴＣＣ  ２７７７４、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｒｂｉｎｏｌｉｃｕｓ  ＤＳＭ  ２３８０、およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｕｒｖｕｓ  ５２５．９２にもみられ得る。
【０３５２】
【表１０４】
2014521365.tif 000107
一部の場合において、ヒドロゲナーゼコード遺伝子はＣＯＤＨに隣接してに存在している。Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍでは、コードされたＣＯＤＨ／ヒドロゲナーゼタンパク質は膜結合型酵素複合体を形成しており、該複合体は、ＣＯとＨ２ＯのＣＯ２とＨ２への変換によってプロトン勾配の形態のエネルギーが発生する部位であることが示されている（Ｆｏｘら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：６２００−６２０８（１９９６））。Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓのＣＯＤＨ−Ｉおよびその隣接遺伝子は、そのＲ．ｒｕｂｒｕｍ  ＣＯＤＨ／ヒドロゲナーゼ遺伝子クラスターとの類似性に基づいて、同様の機能的役割を触媒することが提案されている（Ｗｕら，ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．１：ｅ６５（２００５））。また、Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓのＣＯＤＨ−Ｉは、電極に結合させると強力なＣＯ酸化およびＣＯ２還元活性を示すことも示された（Ｐａｒｋｉｎら，Ｊ  Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９：１０３２８−１０３２９（２００７））。例示的なＣＯＤＨおよびヒドロゲナーゼの遺伝子のタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号によって特定され得る。
【０３５３】
【表１０５】
2014521365.tif 000108
４種類までのヒドロゲナーゼをコードしている同義遺伝子が大腸菌および他の腸内細菌に天然に存在している（Ｓａｗｅｒｓ，Ｇ．，Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ  ６６：５７−８８（１９９４）；Ｓａｗｅｒｓら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４：１３２４−１３３１（１９８５）；ＳａｗｅｒｓおよびＢｏｘｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５６：２６５−２７５（１９８６）；Ｓａｗｅｒｓら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８：３９８−４０４（１９８６））。酵素活性の多重性に鑑みると、大腸菌または別の宿主生物体では、入ってきた分子状水素を分裂させ、対応する受容体を還元するのに充分なヒドロゲナーゼ活性が得られ得る。大腸菌は、それぞれｈｙａＡＢＣＤＥＦおよびｈｙｂＯＡＢＣＤＥＦＧ遺伝子クラスターにコードされた２種類の取込みヒドロゲナーゼＨｙｄ−１およびＨｙｄ−２を有する（Ｌｕｋｅｙら，Ｈｏｗ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｉｓ  ｅｑｕｉｐｐｅｄ  ｔｏ  ｏｘｉｄｉｚｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｕｎｄｅｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｒｅｄｏｘ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｎｏｖ  １６，２００９）。Ｈｙｄ−１は酸素耐性で不可逆性であり、ｈｙａＣシトクロムによるキノン還元と共役する。Ｈｙｄ−２はＯ２に対して感受性であり、可逆性であり、電子をペリプラスムフェレドキシンｈｙｂＡに移動させ、これによりｈｙｂＢ膜内在性タンパク質によってキノンが還元される。還元型キノンは、ＴＣＡ回路の還元性分岐路においてフマル酸レダクターゼの電子供給源として供され得る。還元型フェレドキシンは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼなどの酵素によって使用され、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨが生成され得る。あるいはまた、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ＡＫＧフェレドキシンオキシドレダクターゼおよび５，１０−メチレン−Ｈ４葉酸レダクターゼなどの反応の電子供与体として使用され得る。
【０３５４】
【表１０６】
2014521365.tif 000109
大腸菌の水素−リアーゼ系としては、ヒドロゲナーゼ３（受容体としてフェレドキシンが使用された膜結合型酵素複合体）、およびヒドロゲナーゼ４（これもフェレドキシン受容体が使用されている）が挙げられる。ヒドロゲナーゼ３および４は、それぞれｈｙｃおよびｈｙｆ遺伝子クラスターにコードされている。ヒドロゲナーゼ３は可逆性酵素であることが示されている（Ｍａｅｄａら，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７６（５）：１０３５−４２（２００７））。また、大腸菌におけるヒドロゲナーゼ活性は、対応するタンパク質がヒドロゲナーゼ複合体のアセンブリに関与しているｈｙｐ遺伝子の発現に依存性である（Ｊａｃｏｂｉら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １５８：４４４−４５１（１９９２）；Ｒａｎｇａｒａｊａｎら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９０：１４４７−１４５８（２００８））。
【０３５５】
【表１０７】
2014521365.tif 000110
Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのヒドロゲナーゼは、充分な内因性ヒドロゲナーゼ活性が欠損している宿主に適している。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａは排他的炭素源としてＣＯ２で増殖することができ、Ｈ２から還元性対応物が抽出され、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路によるアセチル−ＣｏＡ合成を可能にすることが示されている（Ｄｒａｋｅ，Ｈ．Ｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５０：７０２−７０９（１９８２）；ＤｒａｋｅおよびＤａｎｉｅｌ，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５５：８６９−８８３（２００４）；ＫｅｌｌｕｍおよびＤｒａｋｅ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６０：４６６−４６９（１９８４））（図７参照）。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａは、大腸菌由来のいくつかのｈｙｐ、ｈｙｃおよびｈｙｆ遺伝子のホモログを有する。これらの遺伝子にコードされたタンパク質の配列は以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号によって特定される。
【０３５６】
遺伝子が大腸菌のｈｙｐ遺伝子に相同であるＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのタンパク質を以下に示す。
【０３５７】
【表１０８】
2014521365.tif 000111
大腸菌のヒドロゲナーゼ３および／または４タンパク質に相同なＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのタンパク質を以下の表に示す。
【０３５８】
【表１０９】
2014521365.tif 000112
また、ヒドロゲナーゼ機能性をコードしているいくつかの遺伝子クラスターがＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａに存在しており、その対応するタンパク質配列を以下に示す。
【０３５９】
【表１１０】
2014521365.tif 000113
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６は、末端電子受容体として酸素とともにエネルギー源として水素を使用する。その膜結合型取込み［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼは「Ｏ２−耐性の」ヒドロゲナーゼである（Ｃｒａｃｋｎｅｌｌら  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１０６（４９）２０６８１−２０６８６（２００９））、これはペリプラスム配向型であり、ｂ型シトクロムによって呼吸鎖に連鎖される（ＳｃｈｉｎｋおよびＳｃｈｌｅｇｅｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５６７，３１５−３２４（１９７９）；Ｂｅｒｎｈａｒｄら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４８，１７９−１８６（１９９７））。また、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａにはＨｏｘオペロンにコードされ、細胞質性であり、水素を放出してＮＡＤ＋を直接還元するＯ２耐性可溶性ヒドロゲナーゼが含まれている（ＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＳｃｈｌｅｇｅｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４５２，６６−８０（１９７６）；Ｂｕｒｇｄｏｒｆ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１８７（９）３１２２−３１３２（２００５））。可溶性ヒドロゲナーゼ酵素は、さらに、いくつかの他の生物体、例えば、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ（Ｃｏｐｐｉ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５１，１２３９−１２５４（２００５））、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｔｒ．ＰＣＣ  ６８０３（Ｇｅｒｍｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４（５２）、３６４６２−３６４７２（２００９））およびＴｈｉｏｃａｐｓａ  ｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａ（Ｒａｋｈｅｌｙ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０（２）７２２−７２８（２００４））にも存在している。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓの該酵素は水素からＮＡＤＰＨを生成させ得る。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｔｒ．ＰＣＣ  ６８０３由来のＨｏｘオペロンおよびノストック属の一種ＰＣＣ  ７１２０由来のＨｙｐオペロンにコードされたアクセサリー遺伝子の両方の過剰発現により、Ｈｏｘ遺伝子単独の発現と比べてヒドロゲナーゼ活性の増大がもたらされた（Ｇｅｒｍｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４（５２），３６４６２−３６４７２（２００９））。
【０３６０】
【表１１１】
2014521365.tif 000114
ＴＣＡ回路中間体オキサロアセテートまたはマレートを形成するためのピルベートまたはホスホエノールピルベートのいずれかへの二酸化炭素の固定に使用されるいくつかの酵素および対応遺伝子を以下に記載する。
【０３６１】
ホスホエノールピルベートのオキサロアセテートへのカルボキシル化はホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼによって触媒される。例示的なＰＥＰカルボキシラーゼ酵素は、大腸菌のｐｐｃ（Ｋａｉら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．４１４：１７０−１７９（２００３）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ  ＡＭ１のｐｐｃＡ（Ａｒｐｓら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：３７７６−３７８３（１９９３）、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｐｐｃ（Ｅｉｋｍａｎｎｓら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８：３３０−３３９（１９８９）にコードされたものである。
【０３６２】
【表１１２】
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ホスホエノールピルベートのオキサロアセテートへの変換のための択一的な酵素はＰＥＰカルボキシキナーゼであり、これはＡＴＰの形成とＰＥＰのカルボキシル化を同時に行なう。ほとんどの生物体では、ＰＥＰカルボキシキナーゼは糖新生機能を果たし、１分子のＡＴＰを放出してオキサロアセテートをＰＥＰに変換させる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、その天然のＰＥＰカルボキシキナーゼＰＣＫ１が糖新生の役割を果たすかかる生物体の一例である（Ｖａｌｄｅｓ−Ｈｅｖｉａら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２５８：３１３−３１６（１９８９）。大腸菌は、オキサロアセテートの生成におけるＰＥＰカルボキシキナーゼの役割が、ＡＴＰを形成しないＰＥＰカルボキシラーゼと比較したとき軽微である（おそらくＰＥＰカルボキシキナーゼのビカーボネートのＫｍの方が高いため）と考えられているため、かかる生物体の別の例である（Ｋｉｍら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：１２３８−１２４１（２００４））。とはいうものの、ＰＥＰ由来の天然の大腸菌ＰＥＰカルボキシキナーゼのオキサロアセテートに対する活性が、最近、大腸菌Ｋ−１２のｐｐｃ変異型において示された（Ｋｗｏｎら，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：１４４８−１４５２（２００６））。この株では増殖欠陥は示されず、高ＮａＨＣＯ３濃度におけるスクシネートの生成が増大した。大腸菌の変異型株には、適応進化後に優性（ｄｏｍｉｎａｎｔ）ＣＯ２固定酵素としてＰｃｋが採用され得る（Ｚｈａｎｇら  ２００９）。一部の生物体、特にルーメン細菌では、ＰＥＰカルボキシキナーゼは、ＰＥＰからのオキサロアセテートの生成およびＡＴＰの発生においてかなり効率的である。大腸菌においてクローニングされているＰＥＰカルボキシキナーゼ遺伝子の例としては、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ（Ｌｅｅら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇ．７：９５−９９（２００２））、Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ（Ｌａｉｖｅｎｉｅｋｓら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：２２７３−２２８０（１９９７）、およびＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ（Ｋｉｍら  （前出））由来のものが挙げられる。インフルエンザ菌にコードされたＰＥＰカルボキシキナーゼ酵素はＰＥＰからのオキサロアセテートの形成に有効である。
【０３６３】
【表１１３】
2014521365.tif 000116
ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＥＣ  ６．４．１．１）は、１分子のＡＴＰを放出してピルベートをオキサロアセテートに直接変換させる。ピルビン酸カルボキシラーゼ酵素は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＹＣ１（Ｗａｌｋｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７６：１２１０−１２１７（１９９１）およびＰＹＣ２（Ｗａｌｋｅｒら（前出））ならびにＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのｐｙｃ（ＭｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙおよびＰｕｒｗａｎｔｉｎｉ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４７５：１９１−２０６（２０００））にコードされている。
【０３６４】
【表１１４】
2014521365.tif 000117
リンゴ酸酵素は、１分子の還元性対応物が放出されるＣＯ２とピルベートのマレートへの変換に適用され得る。この目的のためのリンゴ酸酵素としては、限定されないが、リンゴ酸酵素（ＮＡＤ依存性）およびリンゴ酸酵素（ＮＡＤＰ依存性）が挙げられ得る。例えば、大腸菌のリンゴ酸酵素のうちの１種類（Ｔａｋｅｏ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：３７９−３８７（１９６９））または高活性を有する同様の酵素を発現させると、ピルベートとＣＯ２のマレートへの変換が可能となり得る。ＰＥＰとは対照的に炭素がピルベートに固定されることにより、リンゴ酸酵素では、ピルビン酸キナーゼによって保存されるＰＥＰによる高エネルギーリン酸結合が可能となり、これにより、ピルベートの形成時において、またはグルコース輸送のためのホスホトランスフェラーゼ系によってＡＴＰが生成される。リンゴ酸酵素は典型的にはマレートからピルベートが形成される方向に作用すると想定されているが、ｍａｅＡにコードされたＮＡＤ依存性酵素の過剰発現により、大腸菌においてスクシネートの生成が増大する一方、炭素固定方向に作用することにより、嫌気性条件下で致死性  ｐｆｌ−  ｌｄｈＡ表現型が復元されることが示されている（ＳｔｏｌｓおよびＤｏｎｎｅｌｌｙ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３（７）２６９５−２７０１（１９９７））。大腸菌におけるＡｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ由来のリンゴ酸酵素の過剰発現に関して同様の観察結果が得られた（Ｓｔｏｌｓら，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６３−６５（１），１５３−１５８（１９９７））。ｍａｅＢにコードされた第２の大腸菌のリンゴ酸酵素はＮＡＤＰ依存性であり、これもオキサロアセテートおよび他のα−ケト酸を脱炭酸する（Ｉｗａｋｕｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８５（５）：１３５５−６５（１９７９））。
【０３６５】
【表１１５】
2014521365.tif 000118
オキサロアセテート（例えば、ＰＥＰカルボキシラーゼ、ＰＥＰカルボキシキナーゼもしくはピルビン酸カルボキシラーゼから形成）またはマレート（例えば、リンゴ酸酵素もしくはリンゴ酸デヒドロゲナーゼから形成）を、ＴＣＡ回路の還元性分岐路によってスクシニル−ＣｏＡに変換するのに使用される酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマル酸デヒドラターゼ（フマラーゼ）、フマル酸レダクターゼおよびスクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼである。各酵素の遺伝子は本明細書において上記に記載している。
【０３６６】
微生物におけるスクシニル−ＣｏＡから種々の生成物までの経路を操作するための酵素、遺伝子および方法は現在、当該技術分野で知られている。ＣＯおよび／またはＨ２から得られるさらなる還元性対応物により、本明細書に開示のように、炭水化物系原料を用いた場合の２，４−ペンタジエノエート、ブタジエン、１，３−ブタンジオールまたは３−ブテン−１−オールの収量が改善される。
【０３６７】
微生物における解糖中間体から種々の生成物までの経路を操作するための酵素、遺伝子および方法は当該技術分野で知られている。ＣＯおよびＨ２から得られるさらなる還元性対応物により、本明細書に記載のように、炭水化物でのこれらの生成物すべての収量が改善される。
【０３６８】
実施例Ｘ
ＣＯおよび嫌気性培養物の取り扱い方法
この実施例では、ＣＯおよび嫌気性培養物の取り扱いに使用される方法を説明する。
【０３６９】
Ａ．アッセイおよび少量培養物のための少量でのＣＯの取り扱い．ＣＯは、無色で無味無臭の毒物であるガスである。したがって、ＣＯが使用される培養物およびアッセイには特別な取り扱いが必要とされる。少量バッチ培養物でのいくつかのアッセイ、例えば、ＣＯ酸化、アセチル−ＣｏＡ合成、ミオグロビンを使用するＣＯ濃度、およびＣＯ耐容性／利用では、少量のＣＯガスをドラフト内で分注し、取り扱うことが求められた。生化学的アッセイでは、非常に少量（＜２ｍＬ）の生化学的アッセイ培地またはバッファーをＣＯで飽和させ、次いでアッセイを行なうことが求められた。ＣＯを取り扱う工程はすべて、サッシを適正な高さにセットし、送風機のスイッチをオンにしたドラフト内で行なった；ＣＯは圧縮ガスシリンダーから分注し、レギュレータをシュレンクラインに接続した。後者により、等濃度のＣＯがいくつかの可能なキュベットまたはバイアルの各々に分注されたことが確保される。入口側に酸素スクラバーおよび他方側に油圧解放バブラーと通気口を含むシュレンクラインをセットアップした。アッセイキュベットは嫌気性およびＣＯ含有の両方とした。したがって、アッセイキュベットをゴムストッパーで気密性にし、試薬は機密性のニードルとシリンジを用いて添加または取り出した。次に、少量（約５０ｍＬ）の培養物を機密性ストッパー付きの血清ビン内にて飽和ＣＯで培養した。生化学的アッセイと同様、ＣＯ飽和の微生物培養物は、ドラフト内でシュレンクラインセットアップを用いて平衡化した。生化学的アッセイ物および微生物培養物はどちらも携帯型の密封容器内に少容量で入れ、ドラフト外での取り扱いを安全にした。圧縮ＣＯタンクはドラフトに隣接させた。
【０３７０】
典型的には、シュレンクラインは、ＣＯをキュベットに分注するために使用し、各々を通気した。キュベットのゴムストッパーには１９または２０ゲージの使い捨てシリンジニードルで穿孔し、同シリンジニードルで通気した。油圧解放（ｏｉｌ）バブラーはＣＯタンクおよび酸素スクラバーとともに使用した。ガラスまたは石英製の分光測光器キュベットは上面に丸孔を有し、この孔にＫｏｎｔｅｓストッパースリーブＳｚ７  ７７４２５０−０００７を取り付けた。ＣＯ検出器ユニットをドラフトに近接して配置した。
【０３７１】
Ｂ．大量培養物に供給される大量でのＣＯの取り扱い．発酵培養物は、発酵生産における原料としてのシンガスをシミュレーションするためにＣＯまたはＣＯとＨ２の混合物のいずれかに供給される。したがって、培地中のＣＯの溶存濃度を増大させるために、１リットルから数リットルの範囲の量の細胞にＣＯガスの添加が含められ得る。このような状況では、連続的に投与されるかなり大量のＣＯガスが培養物に添加される。種々の時点で、培養物が収集されるか、または試料が取り出される。あるいはまた、細胞は、発酵槽の一部である一体型連続フロー遠心分離機により収集される。
【０３７２】
発酵プロセスは嫌気性条件下に行なわれる。一部の場合では、呼吸環境をもたらすための充分な酸素飽和を確保するために発酵槽内に酸素または空気をポンプ輸送することは非経済的である。また、嫌気性発酵の際に生じる還元力が、呼吸ではなく生成物の形成に必要とされる場合があり得る。さらに、種々の経路の酵素の多くは、さまざまな度合いで酸素感受性である。古典的アセトゲン、例えばＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａは偏性嫌気性微生物であり、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の酵素は、分子状の酸素による不可逆的不活性化に対して高度に感受性である。酸素耐性のアセトゲンも存在しているが、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の酵素のレパトアは酸素の存在下では不適合性であり得る、というのは、ほとんどがメタロ酵素であり、枢要な成分がフェレドキシンであり、エネルギー獲得を最大にするために調節によって代謝がＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路から離れるように逸らされ得るためである。同時に、培養中の細胞は、大量細胞増殖の存在下における極端な手段の必要性を和らげる酸素スカベンジャーとして作用する。
【０３７３】
Ｃ．嫌気性のチャンバおよび条件．例示的な嫌気性チャンバは市販されている（例えば、Ｖａｃｕｕｍ  Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ  ＣＡ；ＭＢｒａｕｎ，Ｎｅｗｂｕｒｙｐｏｒｔ  ＭＡ参照）。条件には、１ｐｐｍ以下のＯ２濃度および１気圧の純粋Ｎ２を含めた。一例では、３台の酸素スクラバー／触媒再生器を使用し、チャンバにはＯ２電極（例えば、Ｔｅｌｅｄｙｎｅ；Ｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  ＣＡ）を含めた。対象物および試薬はほぼすべて、チャンバのエアロック内を４回循環させた後、内部チャンバドアに開放した。＞５ｍＬ容量の試薬には、チャンバへの導入前に純粋なＮ２をスパージングした。手袋は年に２回交換し、触媒容器は、チャンバで酸素レベルの変化に対する緩慢な応答の増大が示された場合、定期的に再生させた。チャンバの圧力は、ソレノイドによって作動される一方向弁によって制御した。この機構により、非常に小さい管をパージ弁内で移動させるためにチャンバの圧力を周囲より高いレベルに設定することが可能であった。
【０３７４】
嫌気性チャンバでは、一貫して非常に低く、かつ高度に酸素感受性の嫌気性条件に必要とされるＯ２レベルが得られた。しかしながら、細胞の培養および取り扱いには、通常、かかる事前対策は必要とされない。択一的な嫌気性チャンバ構成では、混合体中にいくらかの水素ガスを必要とする白金またはパラジウムが触媒として使用され得る。ソレノイド弁の使用の代わりに、圧力解放はバブラーによって制御され得る。機器に基づいたＯ２モニタリングの使用の代わりに、テストストリップが代わりに使用され得る。
【０３７５】
Ｄ．嫌気性微生物学的試験．少量培養物は、ＣＯ取り扱いについて上記のようにして取り扱った。特に、血清ビンまたは培地ビンには、厚いゴムストッパーを取り付け、ビンの密封にはアルミニウムクリンプを使用する。培地、例えばＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈは慣用的な様式で作製し、適切な大きさの血清ビンに分注する。ビンには中程度の起泡窒素を約３０分間スパージングする。これによりほとんどの酸素が培地から除去され、この工程後、各ビンをゴムストッパー（例えば、Ｂｅｌｌｃｏ  ２０ｍｍセプタムストッパー；Ｂｅｌｌｃｏ，Ｖｉｎｅｌａｎｄ，ＮＪ）でキャッピングし、クリンプで密封する（Ｂｅｌｌｃｏ  ２０ｍｍ）。次いで、培地のビンを、低速（液状物）排気サイクルを用いてオートクレーブ処理する。少なくとも時々はニードルをストッパー内に突き刺し、オートクレーブ処理中に排気をもたらしてもよい；ニードルは、オートクレーブから取り出したらすぐに除去する必要がある。滅菌培地は、シリンジおよびニードルから添加された残留培地成分、例えばバッファーまたは抗生物質を有する。還元剤の添加前、ビンを窒素（または使用によってはＣＯ）で３０〜６０分間平衡化させる。還元剤、例えば、１００×１５０ｍＭ硫化ナトリウム，２００ｍＭシステイン−ＨＣｌを添加する。これは、硫化ナトリウムを乾燥ビーカーに、およびシステインを血清ビンに量り入れ、両方を嫌気性チャンバ内に入れ、硫化ナトリウムを嫌気性水に溶解させ、次いで、これを血清ビン内のシステインに添加することにより行なわれる。硫化ナトリウム溶液はシステインと接触すると硫化水素ガスが発生するため、ビンにはすぐにストッパーを付ける。培養物に注入する際、溶液の滅菌のためにシリンジフィルターが使用される。他の成分、例えば、Ｂ１２（１０μＭのシアノコバラミン）、塩化ニッケル（ＮｉＣｌ２，チャンバ内の嫌気性水で作製し、培養物への注入のときにオートクレーブ処理またはシリンジフィルターの使用によって滅菌した４０ｍＭストックで２０マイクロＭの終濃度）、および硫酸第一鉄アンモニウム（必要とされる終濃度は１００μＭ−チャンバ内の嫌気性水中１００〜１０００×ストック溶液として作製し、培養物への注入のときにオートクレーブ処理またはシリンジフィルターの使用によって滅菌）がシリンジニードルによって添加される。嫌気性条件下でのより高速の増殖を助長するため、１リットル容のビンに嫌気性で培養した５０ｍＬの予備培養物を播種した。ベクター内のｐＡ１−ｌａｃＯ１プロモーターの誘導は、終濃度０．２ｍＭまでのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって行ない、約３時間行なった。
【０３７６】
大量培養物は、大型のビン内で、起泡させながらの連続的ガス添加を用いて培養することができる。培地添加後にゴムストッパーを金属製バブラーとともにビン内に配置し、窒素を３０分以上スパージングする。ビンの残部をセットアップする。各ビンを、内部で起泡しているガスが滅菌フィルターによって滅菌されるように一緒にし、ビン上のホースを小さいＣ型クランプで圧縮性にする。培地と細胞を磁気撹拌バーで撹拌する。培地の成分と細胞をすべて添加したら、ビンをインキュベータ内で、室内空気中だがビン内を連続窒素スパージングしながらインキュベートする。
【０３７７】
実施例ＸＩ
ＣＯ酸化（ＣＯＤＨ）アッセイ
この実施例では、ＣＯ酸化（ＣＯデヒドロゲナーゼ；ＣＯＤＨ）を測定するためのアッセイ方法を説明する。
【０３７８】
Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａの７遺伝子ＣＯＤＨ／ＡＣＳオペロンを大腸菌発現ベクターにクローニングした。インタクトな約１０ｋｂｐのＤＮＡ断片をクローニングした。おそらく、この領域内のいくつかの遺伝子がその自身の内因性プロモーターにより発現され、すべてに内因性リボソーム結合部位が含まれている。これらのクローンをＣＯ酸化について、ＣＯＤＨ活性を定量的に測定するアッセイを用いてアッセイした。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａの該遺伝子の産物に対する抗血清をウエスタンブロットに使用し、比活性を推定した。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａはグラム陽性であり、リボソーム結合部位エレメントは大腸菌において良好に機能することが予測される。この活性（以下により詳細に記載する）はＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａの比活性の約５０分の１であると推定された。組換え大腸菌細胞のＣＯＤＨ活性は、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａの酵素が５５℃付近に最適温度を有するという事実によって制限され得ることが考えられ得る。したがって、中等温度好性のＣＯＤＨ／ＡＣＳ経路、例えば、中等温度好性であり、かつ明らかにインタクトなＣＯＤＨ／ＡＣＳオペロンおよびＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を有するＭｏｏｒｅｌｌａの近縁のものＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｆｎｉｅｎｓｅが好都合であり得る。潜在的宿主生物体としてのアセトゲンとしては、限定されないが、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａおよびＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｆｎｉｅｎｓｅが挙げられる。
【０３７９】
ＣＯ酸化は、最も感度がよく、かつ最もロバストなＣＯＤＨ／ＡＣＳアッセイである。おそらく、大腸菌系のシンガス使用系には最終的に、特に最大活性のために、ほぼクロストリジウム属の（すなわち、Ｍｏｏｒｅｌｌａ）系と同程度の嫌気性が必要とされる。ＣＯＤＨの改善は可能であろうが、最終的には水中へのＣＯガスの溶解性によって制限される。
【０３８０】
最初に、各遺伝子を個々に発現ベクター内にクローニングした。多サブユニット／１複合体の組合せ発現ユニットを作製した。タンパク質レベルでの大腸菌における発現を調べた。組合せＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  ＣＯＤＨ／ＡＣＳオペロンおよび個々の発現クローンの両方を作製した。
【０３８１】
ＣＯ酸化アッセイ．このアッセイは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路内の酵素活性のより単純で、信頼性があり、より多目的なアッセイの１つであり、ＣＯＤＨを試験するものである（Ｓｅｒａｖａｌｌｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：３９４４−３９５５（２００４））。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＣＯＤＨ比活性の典型的な活性は５５℃で５００Ｕまたは２５℃で約６０Ｕである。このアッセイでは、ＣＯの存在下でのメチルビオロゲンの還元が使用される。これは、ストッパー付きの嫌気性ガラス製キュベット内で５７８ｎｍにて測定される。
【０３８２】
より詳細には、まず脱イオン水中で４回およびアセトンで１回洗浄した後のガラス製ゴムストッパー付きのキュベットを準備した。少量の真空用グリースをゴム製ガスケットの上面に塗り付けた。キュベットにＣＯガスを供給し、２２Ｇａ．ニードル＋排気ニードルで１０分間乾燥させた。０．９８ｍｌＬ容量の反応バッファー（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ８．５，２ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を、２２Ｇａ．ニードルを排出ニードルとともに１００％ＣＯを用いて添加した。メチルビオロゲン（ＣＨ３ビオロゲン）ストックは水中１Ｍとした。各アッセイでは、２０マイクロリットルを２０ｍＭ終濃度で使用した。メチルビオロゲンを添加する際は、１８Ｇａニードル（一部分）を、ＣＨ３ビオロゲンを採取するためのハミルトンシリンジの使用を容易にするためのジャケットとして使用した。４〜５回分のアリコートを抜き出して廃棄し、シリンジの洗浄およびガス平衡を行なった。ＣＨ３ビオロゲンを若干減らしたＣＨ３ビオロゲンストックを構成する場合は少量の亜ジチオン酸ナトリウム（０．１Ｍストック）を添加した。温度は、加熱したＯｌｉｓ分光測光器（Ｂｏｇａｒｔ  ＧＡ）内で５５℃に平衡化した。まず、ＣＨ３ビオロゲン還元の基準速度を測定するためにブランク反応（ＣＨ３ビオロゲン＋バッファー）を実施した。ＡＣＳ９０およびＡＣＳ９１（それぞれ、第１のｃｏｏＣを有する、および有しないＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＣＯＤＨ−ＡＣＳオペロン）の粗製大腸菌細胞抽出物。１回に１０マイクロリットルの抽出物を添加し、混合し、アッセイした。還元型ＣＨ３ビオロゲンは紫色になる。アッセイの結果を表Ｉに示す。
【０３８３】
【表１１６】
2014521365.tif 000119
Ｍｔａ９８／Ｍｔａ９９は大腸菌ＭＧ１６５５株であり、これは、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉａ由来のメタノールメチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現し、したがって、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＣＯＤＨオペロンを含むＡＣＳ９０  ＡＣＳ９１大腸菌株の陰性対照である。
【０３８４】
細胞内タンパク質の約１％がＣＯＤＨである場合、この数値は、純粋なＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＣＯＤＨの５００Ｕ／ｍｇの活性よりもおよそ１００倍少ないことになり得る。ウエスタンブロットに基づいた実際の推定値は細胞内タンパク質の０．５％であり、そのため該活性はＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＣＯＤＨより約５０倍少ない。とはいうものの、この実験では、組換え大腸菌において、陰性対照よりもずっと少ない量のＣＯ酸化活性が示されている。陰性対照で見られた少ない量のＣＯ酸化（ＣＨ３ビオロゲン還元）は、大腸菌のＣＨ３ビオロゲンの還元能が限定的であり得ることを示す。
【０３８５】
ＣＯＤＨおよびＭｔｒタンパク質の終濃度を推定するため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてウエスタンブロット解析を、ＣＯ酸化、ＡＣＳ、メチルトランスフェラーゼおよびコリノイドＦｅ−Ｓアッセイに使用したものと同じ細胞抽出物で行なった。使用した抗血清は、精製したＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＣＯＤＨ−ＡＣＳおよびＭｔｒタンパク質に対してポリクローナルであり、アルカリホスファターゼ結合ヤギ−抗ウサギ二次抗体を用いて可視化した。ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎｓ）を行ない、結果を図９に示す。ＡＣＳ９０およびＡＣＳ９１における内のＣＯＤＨの量は、対照レーンとの比較により５０ｎｇと推定された。２つのＣＯＤＨサブユニットを含むＣＯＤＨ−ＡＣＳオペロン遺伝子の発現およびメチルトランスフェラーゼはウエスタンブロット解析によって確認した。したがって、組換え大腸菌細胞は７遺伝子オペロンの多数の成分を発現する。また、メチルトランスフェラーゼおよびコリノイド鉄硫黄タンパク質はどちらも同じ組換え大腸菌細胞において活性であった。これらのタンパク質は、同じ細胞内にクローニングされた同じオペロンの一部分である。
【０３８６】
ＣＯ酸化アッセイを、陽性対照としてＭｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ細胞の抽出物を用いて繰り返した。大腸菌ＡＣＳ９０およびＡＣＳ９１におけるＣＯＤＨ活性は測定可能であったが、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ対照よりも約１３０〜１５０倍低かった。アッセイの結果を図１０に示す。簡単には、細胞（ＣＯＤＨ／ＡＣＳオペロン；ＡＣＳ９０もしくはＡＣＳ９１または空ベクター：ｐＺＡ３３Ｓを有するＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａまたは大腸菌）を培養し、上記のようにして抽出物を調製した。アッセイは、上記のようにして５５℃にて、該抽出物を調製した日の種々の時点で行なった。続いて、メチルビオロゲンの還元を５７８ｎｍにて、１２０秒間のタイムコースで行なった。
【０３８７】
これらの結果は、ＣＯ酸化（ＣＯＤＨ）のアッセイおよび結果を示す。組換え大腸菌細胞は、メチルビオロゲン還元アッセイによって測定されたように、ＣＯ酸化活性を示した。
【０３８８】
実施例ＸＩＩ
大腸菌のＣＯ耐容性実験およびＣＯ濃度アッセイ（ミオグロビンアッセイ）
この実施例では、大腸菌の高濃度のＣＯに対する耐容性を説明する。
【０３８９】
大腸菌を飽和量のＣＯの存在下で嫌気性培養可能か否かを試験するため、培養物を、５０ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地（＋還元溶液、ＮｉＣｌ２、Ｆｅ（ＩＩ）ＮＨ４ＳＯ４、シアノコバラミン、ＩＰＴＧ、およびクロラムフェニコール）を入れた１２０ｍｌ容血清ビン内に、少量での嫌気性微生物学的試験について上記のようにしてセットアップした。これらのビンの半数を窒素ガスで３０分間平衡化し、半数をＣＯガスで３０分間平衡化した。空ベクター（ｐＺＡ３３）は対照として使用し、ｐＺＡ３３空ベクターならびにＡＣＳ９０とＡＣＳ９１の両方を含む培養物を、Ｎ２およびＣＯの両方で試験した。すべてにイノキュレーションし、振盪しながら（２５０ｒｐｍ）３７℃で３６時間培養した。３６時間の終了時、フラスコの検査により、すべてにおいて高量の増殖が示された。観察された増殖は、長時間の時間差を伴って一晩で塊となった。
【０３９０】
すべての培養物がＣＯの存在下で充分に培養されるようであったことを考慮し、最終ＣＯ濃度を確認した。これは、ＣＯへの曝露時のミオグロビンのスペクトルシフトのアッセイを用いて行なった。亜ジチオン酸ナトリウムで還元したミオグロビンは、４３５ｎｍに吸光度ピークを有する；このピークはＣＯにより４２３ｎｍにシフトされる。低波長および３００ｎｍ以上の全スペクトルを記録する必要性のため、石英キュベットを使用しなければならない。ＣＯ濃度は、標準曲線に対して測定され、最大水溶性のＣＯのヘンリーの法則の定数＝９７０マイクロモル（２０℃，１気圧）に依存する。
【０３９１】
ＣＯ濃度のミオグロビン試験のため、キュベットを水で１０回、アセトンで１回洗浄し、次いで、ＣＯＤＨアッセイの場合と同様に栓をした。Ｎ２をキュベット内に約１０分間吹き入れた。１ｍｌ容量の嫌気性のバッファー（ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０，２ｍＭのＤＴＴ）をブランク（ＣＯでの平衡化なし）にハミルトンシリンジで添加した。１０マイクロリットル容量のミオグロビン（約１ｍＭ−種々であり得る、かなり多くの量が必要とされるにすぎない）および１マイクロリットルのジチオナイト（２０ｍＭストック）を添加した。ＣＯ標準曲線を、１マイクロリットル漸増で添加したＣＯ飽和バッファーを用いて作成した。各漸増時のピークの高さおよびシフトを記録した。試験した培養物は、ｐＺＡ３３／ＣＯ、ＡＣＳ９０／ＣＯ、およびＡＣＳ９１／ＣＯであった。これらの各々を同じキュベットに１マイクロリットル漸増で添加した。実験の途中で、第２のキュベットをセットアップし、使用した。結果を表ＩＩに示す。
【０３９２】
【表１１７】
2014521365.tif 000120
表ＩＩに示した結果は、菌株がＣＯの存在下で培養されるものであれ、そうでないものであれ、培養物が培養されたことを示す。このような結果は、大腸菌が嫌気性条件下でのＣＯへの曝露に耐え得ること、およびＣＯＤＨ−ＡＣＳオペロンを発現する大腸菌細胞がいくらかのＣＯを代謝し得ることを示す。
【０３９３】
このような結果は、大腸菌細胞が、ＣＯＤＨ／ＡＣＳを発現するものであれ、そうでないものであれ、飽和量のＣＯの存在下で培養可能であったことを示す。さらに、該細胞は、ＣＯの代わりに窒素中でも対照と等しく良好に培養された。この実験により、実験室株の大腸菌は、標準大気圧で行なわれるシンガスプロジェクトで得られ得るレベルのＣＯに対して非感受性であることが示された。また、予備実験により、ＣＯＤＨ／ＡＣＳを発現する組換え大腸菌細胞が実際に、おそらく二酸化炭素への酸化によっていくらかのＣＯを消費することが示された。
【０３９４】
実施例ＸＩＩＩ
１，３−ブタンジオール、プロピレンおよびクロチルアルコールまでの経路
１，３−ブタンジオール、プロピレンおよびクロチルアルコールまでの経路を図７に示す。これらの経路は、マロニル−ＡＣＰがアセチル−ＣｏＡまたはアセチル−ＡＣＰと縮合し、アセトアセチル−ＡＣＰが形成される脂肪酸生合成の開始により開始され得る（工程Ａ）。第２工程は、アセトアセチル−ＡＣＰの３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰへの還元を伴う。クロトニル−ＡＣＰへの脱水およびさらなる還元後、ブチリル−ＡＣＰが形成される。鎖伸長が典型的には長鎖アシル鎖が形成されるまでのマロニル−ＡＣＰのさらなる付加に伴って継続され、次いで、チオエステラーゼによって遊離Ｃ１６脂肪酸に加水分解される。細菌の脂肪酸合成系（ＦＡＳ  ＩＩ）では各工程で個別の（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）タンパク質が使用されるが、真菌および哺乳動物の脂肪酸合成系（ＦＡＳ  Ｉ）では複合体の多元機能タンパク質が使用される。該経路には、Ｃ３およびＣ４生成物プロピレン、１，３−ブタンジオールおよびクロチルアルコールの生成のために脂肪酸生合成の１種類以上の酵素が使用される。
【０３９５】
アセトアセチル−ＡＣＰを１，３−ブタンジオールに変換させるためのいくつかの経路を図７に示す。いくつかの経路では、アセトアセチル−ＡＣＰを、まずアセトアセチル−ＣｏＡに変換させる（工程Ｄ）。あるいはまた、アセトアセチル−ＣｏＡを、アセチル−ＣｏＡとマロニル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．１９４）によって合成してもよい。アセトアセチル−ＣｏＡは、次いで、ＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼまたはシンテターゼによってアセトアセテートに加水分解され得る（工程Ｅ）。アセトアセテートは、次いで、カルボン酸レダクターゼによって３−オキソブチルアルデヒドに還元される（工程Ｆ）。択一的には、アセトアセチル−ＣｏＡは、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼによって３−オキソブチルアルデヒドに直接変換される（工程Ｉ）。また別の実施形態（ｅｍｂｏｄｉｅｍｅｎｔ）では、アセトアセチル−ＡＣＰは、アシル−ＡＣＰレダクターゼによって３−オキソブチルアルデヒドに直接変換される（工程Ｊ）。３−オキソブチルアルデヒドは、さらに、４−ヒドロキシ−２−ブタノンまたは３−ヒドロキシブチルアルデヒド中間体を経て１，３−ブタンジオールに還元される（工程ＧおよびＳ、または工程ＲおよびＡＡ）。別の選択肢は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ／アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する二元機能酵素によるアセトアセチル−ＣｏＡの４−ヒドロキシ−２−ブタノンへの直接変換である（工程Ｋ）。また、１，３−ブタンジオールまでの経路を３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ中間体を経由して進めてもよい。この中間体は、アセトアセチル−ＣｏＡの還元（工程Ｐ）または３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰのアシル基転移によって形成される（工程Ｘ）。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡはさらに、３−ヒドロキシブチレート（工程Ｙ）、３−ヒドロキシブチルアルデヒド（工程Ｎ）または１，３−ブタンジオール（工程Ｏ）に変換される。択一的には、３−ヒドロキシブチレート中間体は、アセトアセテートから（工程Ｑ）、または３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰの加水分解によって（工程Ｌ）形成される。３−ヒドロキシブチルアルデヒド中間体は、３−ヒドロキシブチリル（ｂｕｔｙｒｌ）−ＡＣＰレダクターゼの生成物でもある（工程Ｍ）。
【０３９６】
また、図７にマロニル−ＡＣＰからクロチルアルコールへの経路も示す。一実施形態において、脂肪酸イニシエーション／伸長酵素によりクロトニル−ＡＣＰ中間体が生じる（工程Ａ，Ｂ，Ｃ）。次いでクロトニル−ＡＣＰは、それぞれクロトニル−ＣｏＡ、クロトネートまたはクロトンアルデヒドにアシル基転移、加水分解または還元される（工程ＡＥ，Ｔ，Ｕ）。クロトニル−ＣｏＡとクロトネートはＣｏＡヒドロラーゼ、トランスフェラーゼまたはシンテターゼによって相互変換される（工程ＡＦ）。クロトネートはカルボン酸レダクターゼによってクロトンアルデヒドに還元される（工程ＡＧ）。すべての経路の最終工程では、クロトンアルデヒドが工程ＡＨでアルデヒドレダクターゼによってクロチルアルコールに還元される。以下の表に列挙した数多くの択一的な経路も本発明に包含される。クロトニル−ＣｏＡはクロトンアルデヒドまたはクロチルアルコールに還元され得る（工程Ｖ，Ｗ）。択一的には、前述の１，３−ブタンジオール経路の３−ヒドロキシブチリル中間体はまた、クロチルアルコール前駆体に変換され得る。例えば、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチレートまたは３−ヒドロキシブチルアルデヒドの脱水により、それぞれ、クロトニル−ＣｏＡ、クロトネートまたはクロトンアルデヒドが得られる（工程ＡＢ，ＡＣ，ＡＤ）。
【０３９７】
また、プロピレンまでの経路も図７に示す。一実施形態において、クロトンアルデヒド中間体はプロピレンに脱カルボニル化される（工程ＡＯ）。別の実施形態では、３−ヒドロキシブチレート中間体はアルケン形成性デカルボキシラーゼによってプロピレンに変換される（工程ＡＲ）。また、クロトネートの脱炭酸によってもプロピレンが形成される（工程ＡＱ）。また別の実施形態では、脂肪酸生合成の酵素により、さらにクロトニル−ＡＣＰがブチリル−ＡＣＰに変換され（工程ＡＬ）、次いでこれが、ブチリル−ＣｏＡにアシル基転移され得るか（工程ＡＩ）またはブチレートに加水分解され得る（工程ＡＰ）。ブチリル−ＣｏＡ中間体はクロトニル−ＣｏＡの還元によっても形成される（工程ＡＭ）。また、ブチレート中間体はクロトネートの還元またはブチリル−ＣｏＡのＣｏＡ部分の除去により形成される（工程ＡＮまたはＡＪ）。プロピレンがブチレートから、アルケン形成性デカルボキシラーゼによって形成される（工程ＡＫ）。マロニル−ＡＣＰからプロピレンまでの経路を以下の表に示す。
【０３９８】
図７に示した例示的な経路を以下の表に示す：
【０３９９】
【表１１８−１】
2014521365.tif 000121
【０４００】
【表１１８−２】
2014521365.tif 000122
図７に示した反応に必要とされる酵素活性を以下の表に示す。
【０４０１】
【表１１９】
2014521365.tif 000123
これらのＥＣ分類の多くにおける酵素候補は、先に記載しており、図７に示した変換の好適な候補となる。このような酵素分類としては、ＥＣ  １．１．１．ａ、１．１．１．ｃ、１．２．１．ｂ、１．２．１．ｅ、２．３．１．ｂ、２．３．１．ｈ、２．８．３．ａ、３．１．２．ａ、４．１．１．ａ、４．１．９９．ａ、４．２．１．ａおよび６．２．１．ａが挙げられる。図７の経路に該当する新たな酵素候補を以下に記載する。
【０４０２】
１．１．１．ａ  オキシドレダクターゼ（オキソをアルコールに）
図７に示したいくつかの反応は、アルコールデヒドロゲナーゼ酵素によって触媒される。このような反応としては工程Ｂ、Ｇ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＡＡおよびＡＨが挙げられる。工程Ｇ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＡＡおよびＡＨを触媒するための例示的なアルコールデヒドロゲナーゼ酵素は実施例ＶＩＩにおいて上記に記載した。工程Ｂの触媒に適した酵素候補を以下に記載する。
【０４０３】
アセトアセチル−ＡＣＰの３−ヒドロキシアセチル−ＡＣＰへの還元は、アセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼまたは３−オキソアシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．１００）によって触媒される。大腸菌の３−オキソアシル−ＡＣＰレダクターゼはｆａｂＧにコードされている。アシル−ＡＣＰ基質の該酵素への結合を担う枢要な残基が解明されている（Ｚｈａｎｇら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：５２９３５−４３（２００３））。この活性を有するさらなる酵素が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（Ｚａｃｃａｉら，Ｐｒｏｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｆｕｎｃｔ  Ｇｅｎ  ７０：５６２−７（２００８））およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｇｕｒｖｉｔｚ，Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２８２：４０７−１６（２００９））において特性評価されている。また、真核生物の脂肪酸シンターゼのβ−ケトアシルレダクターゼ（ＫＲ）ドメインもこの活性を触媒する（Ｓｍｉｔｈ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ，８：１２４８−５９（１９９４））。
【０４０４】
【表１２０】
2014521365.tif 000124
１．２．１．ｆ  オキシドレダクターゼ（アシル−ＡＣＰをアルデヒドに）
アシル−ＡＣＰのその対応するアルデヒドへの還元はアシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＡＡＲ）によって触媒される。かかる変換を図７の工程Ｊ、ＭおよびＵに示す。好適な酵素候補としては、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ７９４２のｏｒｆ１５９４遺伝子産物およびそのホモログが挙げられる（Ｓｃｈｉｒｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２９：５５９−６２（２０１０））。Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｅｓ  ＰＣＣ７９４２のアシル−ＡＣＰレダクターゼは、藍色細菌生物体の大部分において保存されているようであるオペロン内でアルデヒドデカルボニラーゼと共発現される。この酵素は、大腸菌において該アルデヒドデカルボニラーゼとともに発現され、アルカン生成能を付与した。また、Ｐ．ｍａｒｉｎｕｓのＡＡＲも大腸菌においてクローニングされ、デカルボニラーゼとともにアルカン生成を示した（米国特許出願公開第２０１１／０２０７２０３号）。
【０４０５】
【表１２１】
2014521365.tif 000125
１．３．１．ａ（アルカンをアルケンに）
図７のいくつかの変換はアルケンのアルカンへの還元を伴うものである。工程ＡＭおよびＡＮでは、エノイル−ＣｏＡがその対応するアシル−ＣｏＡに還元される。このような反応を触媒するための酵素候補は実施例ＶＩＩにおいて先に報告した。工程ＡＬは、ブチリル−ＡＣＰレダクターゼによって触媒されるクロトニル−ＡＣＰのブチリル−ＡＣＰへの還元を示す。この工程に好適な酵素候補は本明細書に記載している。
【０４０６】
エノイル−ＡＣＰレダクターゼは、エノイル−ＡＣＰ二重結合のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性還元による飽和アシル−ＡＣＰの形成を触媒する。大腸菌のＦａｂＩタンパク質は、４〜１６の炭素長のエノイル基質の還元を触媒する充分に特性評価されたエノイル−ＡＣＰレダクターゼである（Ｒａｆｉら，ＪＢＣ  ２８１：３９２８５−９３（２００６））。ＦａｂＩは、生成阻害によりアシル−ＡＣＰによって阻害される（Ｈｅａｔｈ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：１８３３−６（１９９６））。枯草菌には２種類のエノイル−ＡＣＰレダクターゼアイソザイムＦａｂＩおよびＦａｂＬが含まれている（Ｈｅａｔｈら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：４０１２８−３３（２０００））。肺炎連鎖球菌のＦａｂＫタンパク質は、同じ活性を触媒するトリクロサン耐性フラボタンパク質である（ＨｅａｔｈおよびＲｏｃｋ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：１４５−６（２０００））。さらなる候補は緑膿菌のＦａｂＩタンパク質であり、これは最近、結晶化された（Ｌｅｅら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｓｅｃｔ  Ｆ  ６７：２１４−２１６（２０１１））。
【０４０７】
【表１２２】
2014521365.tif 000126
２．３．１．ｅ  アシル−ＡＣＰ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ（脱炭酸化）
図７の工程Ａでは、アセトアセチル−ＡＣＰがマロニル−ＡＣＰとアセチル−ＣｏＡまたはアセチル−ＡＣＰのいずれかとから形成される。この反応は、ＥＣ分類２．３．１のアシル−ＡＣＰ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼによって触媒される。マロニル−ＡＣＰとアセチル−ＣｏＡの縮合はβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＡＳ，ＥＣ  ２．３．１．１８０）によって触媒される。大腸菌は、ｆａｂＢ、ｆａｂＦおよびｆａｂＨにコードされた３種類のＫＡＳ酵素を有する。ＦａｂＨ（ＫＡＳ  ＩＩＩ）は、大腸菌における脂肪酸生合成の開始の枢要な酵素であり、アセトアセチル−ＡＣＰの形成に選択的である。ＦａｂＢとＦａｂＦは、マロニル−ＡＣＰとアシル−ＡＣＰ基質との縮合を触媒し、主に脂肪酸の伸長において機能するが、アセチル−ＡＣＰと反応することもでき、それにより脂肪酸の開始に関与する。例えば、枯草菌のＫＡＳ酵素はＦａｂＨと類似しているが選択性は低く、分枝状アシル−ＣｏＡ基質を許容する（Ｃｈｏｉら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８２：３６５−７０（２０００））。
【０４０８】
【表１２３】
2014521365.tif 000127
択一的には、アセチル−ＣｏＡは、まずアセチル−ＡＣＰに活性化され、続いて、２種類の酵素アセチル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ（ＥＣ  ２．３．１．３８）とアセトアセチル−ＡＣＰシンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．４１）によってアセトアセチル−ＡＣＰに縮合され得る。アセチル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼはアセチル−ＣｏＡとアシルキャリアータンパク質をアセチル−ＡＣＰに変換させ、ＣｏＡが放出される。アセチル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼの酵素候補は以下のセクションＥＣ  ２．３．１．ｆに記載している。アセトアセチル−ＡＣＰシンターゼ酵素はアセチル−ＡＣＰとマロニル−ＡＣＰの縮合を触媒する。この活性は、大腸菌のＦａｂＦおよびＦａｂＢならびにＥＣ  ２．３．１．ｇに記載の真核生物の多元機能脂肪酸シンターゼ酵素複合体によって触媒される。
【０４０９】
２．３．１．ｆ  ＣｏＡ−ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ
ＡＣＰ部分のＣｏＡでの交換はＥＣ分類２．３．１の酵素によって触媒される。この反応を図７の工程Ｄ、Ｘ、ＡＥおよびＡＩに示す。また、アセチル−ＣｏＡのアセチル−ＡＣＰへの活性化（図７の工程Ａ）はＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼによっても触媒される。ＣｏＡ−ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素としては、アセチル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ（ＥＣ  ２．３．１．３８）およびマロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ（ＥＣ  ２．３．１．３９）が挙げられる。
【０４１０】
大腸菌のＦａｂＨ（ＫＡＳＩＩＩ）酵素は、その主要なアセトアセチル−ＡＣＰ形成活性に加えてアシル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼとしての機能も果たす。ブチリル−ＡＣＰはＦａｂＨの代替基質として許容される（Ｐｒｅｓｃｏｔｔら，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ，３６：２６９−３１１（１９７２））。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｌｉｓ由来のアセチル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ酵素が大腸菌において異種発現されている（Ｌｏｂｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４０：１１９５５−６４（２００１））。ｆａｂＨ欠損Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ宿主で発現させたＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ由来の合成ＫＡＳＩＩＩ（ＦａｂＨ）は、天然ｆａｄＨ活性を補足できるものであった（Ｄｕら，ＡＥＭ  ７６：３９５９−６６（２０１０））。Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ由来のアセチル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ酵素は、基質として他のアシル−ＡＣＰ分子、例えばブチリル−ＡＣＰを許容する（Ｓｈｉｍａｋａｔａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍ  １２２：５３−９（１９８６））。この酵素の配列はこれまでに決定されていない。マロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ酵素としては、大腸菌およびＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｓｕｓのＦａｂＤが挙げられる（Ｖｅｒｗｏｅｒｔら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７４：２８５１−７（１９９２）；Ｓｉｍｏｎら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４３５：２０４−６（１９９８））。Ｂ．ｎａｐｓｕｓのＦａｂＤはｆａｂＤ欠損大腸菌を補足できるものであった。また、真核生物の多元機能脂肪酸シンターゼ酵素複合体（ＥＣ  ２．３．１．ｇに記載）もこの活性を触媒する。
【０４１１】
【表１２４】
2014521365.tif 000128
２．３．１．ｇ  脂肪酸シンターゼ
図７の工程Ａ、Ｂ、ＣおよびＡＬは、脂肪酸シンターゼまたは脂肪アシル−ＣｏＡシンターゼ、多コピーの１種類以上のサブユニットで構成された多元機能酵素複合体によって総合的に触媒され得る。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの脂肪酸シンターゼは、脂肪酸合成に必要とされるすべての反応：活性化、プライミング、伸長および終結を一緒になって触媒する２つの多元機能サブユニットＦＡＳ１とＦＡＳ２で構成された１２量体である（Ｌｏｍａｋｉｎら，Ｃｅｌｌ  １２９：３１９−３２（２００７））。この酵素複合体は、アセチル−ＣｏＡとマロニル−ＣｏＡからの長鎖脂肪酸の形成を触媒する。真核生物のＦＡＳ系で有利に生成されるのはパルミチン酸（Ｃ１６）である。同様の脂肪酸シンターゼ複合体がＣａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓおよびＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓにおいて見出されている（Ｎｇｕｙｅｎら，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２２：ｅ８４２１（２００９）；Ｊｅｎｎｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６：２５４−６１（２００７））。また、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよび哺乳動物（ホモサピエンスなど）の多元機能Ｆａｓ酵素も好適な候補である（ＦｅｒｎａｎｄｅｓおよびＫｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ，Ｇｅｎｅ  １７０：９５−９９（１９９６）ならびにＳｍｉｔｈら，Ｐｒｏｇ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ４２：２８９−３１７（２００３））。
【０４１２】
【表１２５】
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３．１．２．ｂ  アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ酵素はアシル−ＡＣＰをその対応する酸に変換させる。かかる変換は図７の工程Ｈ、Ｌ、ＴおよびＡＰに必要とされる。例示的な酵素としては、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＦａｔＡおよびＦａｔＢアイソフォームが挙げられる（Ｓａｌａｓら，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ４０３：２５−３４（２００２））。この２つのタンパク質の活性は炭素鎖長によって異なり、ＦａｔＡはオレイル−ＡＣＰを好み、ＦａｔＢはパルミトイル−ＡＣＰを好む（３．１．２．１４参照）。異なる鎖長特異性を有するいくつかのチオエステラーゼがＷＯ２００８／１１３０４１に示されており、以下の表に含めている［該特許の１２６頁の表２Ａ参照］。例えば、大腸菌における植物性中鎖チオエステラーゼ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ由来のＦａｔＢなど）の発現により高レベルの中鎖脂肪酸、主にラウレート（Ｃ１２：０）の蓄積がもたらされることが以前に示されている。同様に、大腸菌におけるＣｕｐｈｅａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  ＦａｔＢ１のチオエステラーゼの発現によりＣ８−１０：０アシル−ＡＣＰの蓄積がもたらされた（Ｄｅｈｅｓｈら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １１０：２０３−１０（１９９６））。同様に、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓのチオエステラーゼでは、大腸菌において発現させると、Ｃ１８：１鎖終結および遊離脂肪酸としての放出の＞５０倍の上昇がもたらされる（Ｋｎｕｔｚｏｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １００：１７５１−５８（１９９２））。また、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの基質特異性の改変方法も当該技術分野で知られている（例えば、ＥＰ１６０５０４８）。
【０４１３】
【表１２６】
2014521365.tif 000130
４．１．９９．ａ  デカルボニラーゼ
実施例ＶＩＩに記載のデカルボニラーゼ酵素候補もこの場合に該当する。図１〜７の脱カルボニル反応の触媒に適したさらなる酵素候補としては、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ７９４２のｏｒｆ１５９３遺伝子産物およびそのホモログが挙げられる。（米国特許出願公開第２０１１／０２０７２０３号）。
【０４１４】
【表１２７】
2014521365.tif 000131
４．２．１．ａ  ヒドロ−リアーゼ
図７のいくつかの反応、例えば工程Ｃ、ＡＢ、ＡＣおよびＡＤは脱水反応を示す。実施例ＶＩＩに記載の候補ヒドロ−リアーゼ酵素もこの場合に適用可能である。オレイン酸ヒドラターゼ酵素は、図１〜７のすべての脱水反応、特に３−ブテン−１−オールをブタジエンに脱水を触媒するのに適用可能である。オレイン酸ヒドラターゼ酵素は、非活性化型アルケンのその対応するアルコールへの可逆的水和を触媒する。このような酵素は、ＷＯ２０１１０７６６９１に示唆されているように、さらなる好適な候補である。Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃａおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のオレイン酸ヒドラターゼが特性評価されている（ＷＯ２００８／１１９７３５）。例としては以下のタンパク質が挙げられる。
【０４１５】
【表１２８】
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３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラターゼ酵素は、３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰのクロトニル−ＡＣＰへの脱水に好適な候補である（図７の工程Ｃ）。この活性を有する酵素としては大腸菌のＦａｂＡおよびＦａｂＺが挙げられ、これらは重複する広い基質特異性を有する（Ｈｅａｔｈ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：１８３３−６（１９９６））。また、上記の脂肪酸シンターゼ複合体もこの反応を触媒する。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ由来のＦａｂＺタンパク質が結晶化されている（Ｋｏｓｔｒｅｗら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４：１５７０−８０（２００５））。さらなる候補は、酵母のＨｔｄ２ｐならびにホモサピエンスおよびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉのＴｂＨＴＤ２にコードされたミトコンドリア３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラターゼである（Ｋａｓｔａｎｏｉｔｉｓら，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏ  ５３：１４０７−２１（２００４）；Ｋａｉｊａら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５８２：７２９−３３（２００８））。
【０４１６】
【表１２９】
2014521365.tif 000133
実施例ＸＩＶ
クロチルアルコールからのブタジエンの化学的作製
クロチルアルコールをブタジエンに変換するための典型的なプロセスでは、クロチルアルコールを無希釈または溶媒中のいずれかで、および蒸気の存在下または非存在下のいずれかで、４０〜４００℃の範囲の温度まで加熱した固形の無機、有機または金属含有脱水触媒上を反応槽または管の内部で通過させて水の脱離とブタジエンのガスとしての放出をもたらし、これを凝縮させ（ブタジエンの沸点＝−４．４℃）、さらなる加工、保存または使用のためのレザーバ内に収集する。典型的な触媒としては、モリブデン酸ビスマス、ホスフェート−リン酸、酸化セリウム、カオリン−酸化鉄、カオリン−リン酸、シリカ−アルミナ、およびアルミナが挙げられ得る。典型的なプロセス処理量は０．１〜２０，０００ｋｇ／時間の範囲である。典型的な溶媒はトルエン、ヘプタン、オクタン、エチルベンゼンおよびキシレンである。
【０４１７】
実施例ＸＶ
クロチルアルコールからのブタジエンの生成のための酵素的経路
この実施例では、クロチルアルコールをブタジエンに変換させるための酵素的経路を説明する。２つの経路を図１２に示す。一方の経路では、クロチルアルコールがクロチルアルコールキナーゼによって２−ブテニル−４−ホスフェートにリン酸化される（工程Ａ）。２−ブテニル−４−ホスフェート中間体が２−ブテニル−４−ジホスフェートに再度リン酸化される（工程Ｂ）。ブタジエンシンターゼ酵素は２−ブテニル−４−ジホスフェートのブタジエンへのの変換を触媒する（工程Ｃ）。かかるブタジエンシンターゼは、リン酸リアーゼ酵素（イソプレンシンターゼなど）から本明細書に記載の指向性進化などの方法を用いて誘導されたものであり得る。択一的な経路では、クロチルアルコールがジホスホキナーゼによって直接２−ブテニル−４−ジホスフェートに変換される（工程Ｄ）。工程Ａ〜Ｄの酵素候補は以下に示している。
【０４１８】
クロチルアルコールキナーゼ（図１２，工程Ａ）
クロチルアルコールキナーゼ酵素はクロチルアルコールのヒドロキシル基へのリン酸基の転移を触媒する。後述する酵素は、自然状態でかかる活性を有するか、またはこの活性を示すように操作され得るものである。アルコール基へのリン酸基の転移を触媒するキナーゼはＥＣ  ２．７．１酵素分類の構成員である。以下の表に、ＥＣ  ２．７．１酵素分類のいくつかの有用なキナーゼ酵素を示す。
【０４１９】
【表１３０−１】
2014521365.tif 000134
【０４２０】
【表１３０−２】
2014521365.tif 000135
【０４２１】
【表１３０−３】
2014521365.tif 000136
【０４２２】
【表１３０−４】
2014521365.tif 000137
メバロン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．３６）はメバロネートの末端ヒドロキシル基をリン酸化する。この工程の遺伝子候補としては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のｅｒｇ１２、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉ由来のｍｖｋ、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｅｉｎｓ）由来のＭＶＫ、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｃｏｌ由来のｍｖｋが挙げられる。さらなるメバロン酸キナーゼ候補としては、古細菌（ａｒｃｈｅｏｎ）Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ由来のフィードバック耐性メバロン酸キナーゼ（Ｐｒｉｍａｋら，ＡＥＭ（近刊）（２０１１））および肺炎連鎖球菌由来のＭｖｋタンパク質（Ａｎｄｒｅａｓｓｉら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ、１６：９８３−９（２００７））が挙げられる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、肺炎連鎖球菌およびＭ．ｍａｚｅｉ由来のＭｖｋタンパク質が大腸菌において異種発現され、特性評価された（Ｐｒｉｍａｋら（前出））。肺炎連鎖球菌のメバロン酸キナーゼはいくつかの代替基質、例えば、シロ（ｃｙｌｏ）プロピルメバロネート、ビニルメバロネートおよびエチニルメバロネートに対して活性であり（Ｋｕｄｏｈら，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １８：１１２４−３４（２０１０））、その後の研究によりリガンド結合部位がコンパクトな電子豊富Ｃ（３）−置換基に選択的であることが示された（Ｌｅｆｕｒｇｙら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５：２０６５４−６３（２０１０））。
【０４２３】
【表１３１】
2014521365.tif 000138
また、グリセロールキナーゼは、グリセロールの末端ヒドロキシル基をリン酸化し、グリセロール−３−ホスフェートを形成させる。この反応はいくつかの種で、例えば、大腸菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、およびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａで行なわれている。大腸菌のグリセロールキナーゼはジヒドロキシアセトンおよびグリセルアルデヒドなどの代替基質を許容することが示されている（Ｈａｙａｓｈｉら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４２：１０３０−１０３５（１９６７））。Ｔ，ｍａｒｉｔｉｍｅは２種類のグリセロールキナーゼを有する（Ｎｅｌｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９９：３２３−３２９（１９９９））。グリセロールキナーゼは広範な基質特異性を有することが示されている。ＣｒａｎｓおよびＷｈｉｔｅｓｉｄｅにより、４種類の異なる生物体（大腸菌、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、およびＣａｎｄｉｄａ  ｍｙｃｏｄｅｒｍａ）に由来するグリセロールキナーゼが研究された（Ｃｒａｎｓら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０７：７００８−７０１８（２０１０）；Ｎｅｌｓｏｎら（前出），（１９９９））。彼らは、グリセロールの６６種類の異なるアナログを研究し、該酵素は１個の末端ヒドロキシル基の代わりに一連の置換基を許容し得る、およびＣ２の水素原子がメチル基に置き換えられ得ると結論付けた。興味深いことに、４種類の生物体すべてに由来する酵素の速度定数は非常に類似していた。
【０４２４】
【表１３２】
2014521365.tif 000139
ホモセリンキナーゼは別の考えられ得る候補である。この酵素もいくつかの生物体、例えば、大腸菌、ストレプトマイセス属の種、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに存在している。大腸菌由来のホモセリンキナーゼは、数多くの基質、例えば、Ｌ−２−アミノ、１，４−  ブタンジオール、アスパラギン酸セミアルデヒドおよび２−アミノ−５−ヒドロキシバレレートに対して活性を有することが示されている（Ｈｕｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１６１８０−１６１８５（１９９６）；Ｈｕｏら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３３０：３７３−３７９（１９９６））。この酵素は、α位のカルボキシル基がエステルまたはヒドロキシメチル基で置き換えられた基質に対して作用し得る。遺伝子候補は、以下である：
【０４２５】
【表１３３】
2014521365.tif 000140
２−ブテニル−４−リン酸キナーゼ（図１２，工程Ｂ）
２−ブテニル−４−リン酸キナーゼ酵素は、２−ブテニル−４−ホスフェートのリン酸基へのリン酸基の転移を触媒する。後述する酵素は、自然状態でかかる活性を有するか、またはこの活性を示すように操作され得るものである。別のリン酸基へのリン酸基の転移を触媒するキナーゼはＥＣ  ２．７．４酵素分類の構成員である。以下の表に、ＥＣ  ２．７．４酵素分類のいくつかの有用なキナーゼ酵素を示す。
【０４２６】
【表１３４】
2014521365.tif 000141
ホスホメバロン酸キナーゼ酵素は特に重要である。ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．４．２）は２−ブテニル−４−リン酸キナーゼへのアナロガス変換を触媒する。この酵素は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｅｒｇ８（Ｔｓａｙら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：６２０−６３１（１９９１））ならびに肺炎連鎖球菌、黄色ブドウ球菌およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓのｍｖａＫ２（Ｄｏｕｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１４：１１３４−１１３９（２００５）；Ｗｉｌｄｉｎｇら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：４３１９−４３２７（２０００））にコードされている。肺炎連鎖球菌およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓの該酵素は大腸菌においてクローニングされ、特性評価された（Ｐｉｌｌｏｆｆら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４５１０−４５１５（２００３）；Ｄｏｕｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１４：１１３４−１１３９（２００５））。肺炎連鎖球菌のホスホメバロン酸キナーゼは、いくつかの代替基質、例えば、シロプロピルメバロネートホスフェート、ビニルメバロネートホスフェートおよびエチニルメバロネートホスフェートに対して活性であった（Ｋｕｄｏｈら，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １８：１１２４−３４（２０１０））。
【０４２７】
【表１３５】
2014521365.tif 000142
ファルネシルモノリン酸キナーゼ酵素は、ファルネシルモノホスフェートのファルネシルジホスフェートへのＣＴＰ依存性リン酸化を触媒する。同様に、ゲラニルゲラニルリン酸キナーゼはＣＴＰ依存性リン酸化を触媒する。このような活性を有する酵素は培養Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍのミクロソーム画分において確認された（Ｔｈａｉら，ＰＮＡＳ  ９６：１３０８０−５（１９９９））。しかしながら、関連遺伝子はこれまでに同定されていない。
【０４２８】
ブタジエンシンターゼ（図１２，工程Ｃ）
ブタジエンシンターゼは２−ブテニル−４−ジホスフェートの１，３−ブタジエンの変換を触媒する。後述する酵素は、自然状態でかかる活性を有するか、またはこの活性を示すように操作され得るものである。ホスフェートに対して作用する炭素−酸素リアーゼが、ＥＣ  ４．２．３酵素分類において見出されている。以下の表に、ＥＣ分類４．２．３のいくつかの有用な酵素を示す。
【０４２９】
【表１３６】
2014521365.tif 000143
特に有用な酵素としては、イソプレンシンターゼ、ミルセンシンターゼおよびファルネセンシンターゼが挙げられる。酵素候補を以下に記載する。
【０４３０】
イソプレンシンターゼは、自然状態でジメチルアリルジホスフェートのイソプレンの変換を触媒するが、２−ブテニル−４−ジホスフェートからの１，３−ブタジエン合成も触媒し得る。イソプレンシンターゼは、いくつかの生物体、例えば、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ（Ｓａｓａｋｉら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００５，５７９（１１）、２５１４−２５１８）、Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ（Ｌｉｎｄｂｅｒｇら，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇ，１２（１）：７０−７９（２０１０）；Ｓｈａｒｋｅｙら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１３７（２）：７００−７１２（２００５））、およびＰｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ  ｘ  Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｃａｎｅｓｃｅｎｓとも称される）（Ｍｉｌｌｅｒら，Ｐｌａｎｔａ，２００１，２１３（３），４８３−４８７）にみられ得る。Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｃａｎｅｓｃｅｎｓのイソプレンシンターゼの結晶構造が決定された（Ｋｏｋｓａｌら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４０２：３６３−３７３（２０１０））。さらなるイソプレンシンターゼ酵素が報告されている（Ｃｈｏｔａｎｉら，ＷＯ／２０１０／０３１０７９，Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｓｏｐｒｅｎｅ；Ｃｅｒｖｉｎら，米国特許出願公開第２０１００００３７１６号、Ｉｓｏｐｒｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  Ｖａｒｉａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｓｏｐｒｅｎｅ）。
【０４３１】
【表１３７】
2014521365.tif 000144
ミルセンシンターゼ酵素は、ゲラニルジホスフェートのβ−ミルセン（ＥＣ  ４．２．３．１５）への脱リン酸化を触媒する。例示的なミルセンシンターゼは、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍのＭＳＴ２（ｖａｎ  Ｓｃｈｉｅら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ６４：Ｄ４７３−７９（２００７））、Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓのＴＰＳ−Ｍｙｒ（Ｍａｒｔｉｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １３５：１９０８−２７（２００４））Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓのｇ−ｍｙｒ（Ｂｏｈｌｍａｎｎら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：２１７８４−９２（１９９７））およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＴＰＳ１０（Ｂｏｈｌｍａｎｎら，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３７５：２６１−９（２０００））にコードされたものである。これらの酵素は大腸菌において異種発現された。
【０４３２】
【表１３８】
2014521365.tif 000145
ファルネシルジホスフェートは、それぞれ、α−ファルネセンシンターゼとβ−ファルネセンシンターゼによってα−ファルネセンとβ−ファルネセンに変換される。例示的なα−ファルネセンシンターゼ酵素としては、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＴＰＳ０３およびＴＰＳ０２（Ｆａｌｄｔら，Ｐｌａｎｔａ  ２１６：７４５−５１（２００３）；Ｈｕａｎｇら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １５３：１２９３−３１０（２０１０））、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓのａｆｓ（Ｍｅｒｃｋｅら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １３５：２０１２−１４（２００４）、Ｍａｌｕｓ  ｘ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａのｅａｆａｒ（Ｇｒｅｅｎら，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ  ６８：１７６−８８（２００７））ならびにＰｉｃｅａ  ａｂｉｅｓのＴＰＳ−Ｆａｒ（Ｍａｒｔｉｎ（前出））が挙げられる。例示的なβ−ファルネセンシンターゼ酵素は、Ｚｅａ  ｍａｙｓのＴＰＳ１にコードされたものである（Ｓｃｈｎｅｅら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １３０：２０４９−６０（２００２））。
【０４３３】
【表１３９】
2014521365.tif 000146
クロチルアルコールジホスホキナーゼ（図１２，工程Ｄ）
クロチルアルコールジホスホキナーゼ酵素は、クロチルアルコールのヒドロキシル基への二リン酸基の転移を触媒する。後述する酵素は、自然状態でかかる活性を有するか、またはこの活性を示すように操作され得るものである。二リン酸基の転移を触媒するキナーゼはＥＣ  ２．７．６酵素分類の構成員である。以下の表に、ＥＣ  ２．７．６酵素分類のいくつかの有用なキナーゼ酵素を示す。
【０４３４】
【表１４０】
2014521365.tif 000147
特に重要なのはリボース−リン酸ジホスホキナーゼ酵素（これは、大腸菌（Ｈｏｖｅ−Ｊｅｎｓｏｎら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９８６，２６１（１５）；６７６５−７１）およびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｍ１２９（ＭｃＥｌｗａｉｎら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９８８，３８：４１７−４２３）において確認されている）ならびにチアミンジホスホキナーゼ酵素である。例示的なチアミンジホスホキナーゼ酵素がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａにおいて見出されている（Ａｊｊａｗｉ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２００７，６５（１−２）；１５１−６２）。
【０４３５】
【表１４１】
2014521365.tif 000148
本出願を通して種々の刊行物に言及している。これらの刊行物の開示は、本発明が関する技術分野の水準をより充分に説明するために、その全体（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＧＩ番号の公表）が本出願における引用により本明細書に組み込まれる。本発明を、上記に示した実施例に関して説明したが、本発明の精神から逸脱することなく種々の修正が行なわれ得ることを理解されたい。
（項目１）
１，３−ブタンジオールを生成するのに充分な量で発現される１，３−ブタンジオール経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含む１，３−ブタンジオール経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、上記１，３−ブタンジオール経路は：
（３３）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｎおよび７ＡＡ；
（１）４Ａ，４Ｂ，４Ｃおよび４Ｄ；
（２）５Ａ，５Ｈ，５Ｊ，５Ｋおよび５Ｇ；
（３）５Ａ，５Ｈ，５Ｉおよび５Ｇ；
（４）５Ａ，５Ｈおよび５Ｌ；
（５）５Ａ，５Ｆおよび５Ｇ；
（６）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｇおよび７Ｓ；
（７）７Ａ，７Ｄ，７Ｉ，７Ｇおよび７Ｓ；
（８）７Ａ，７Ｄ，７Ｋ，および７Ｓ；
（９）７Ａ，７Ｈ，７Ｆ，７Ｇおよび７Ｓ；
（１０）７Ａ，７Ｊ，７Ｇおよび７Ｓ；
（１１）７Ａ，７Ｊ，７Ｒおよび７ＡＡ；
（１２）７Ａ，７Ｈ，７Ｆ，７Ｒおよび７ＡＡ；
（１３）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７Ｚおよび７ＡＡ；
（１４）７Ａ，７Ｄ，７Ｉ，７Ｒおよび７ＡＡ；
（１５）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒおよび７ＡＡ；
（１６）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７Ｚおよび７ＡＡ；
（１７）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｎおよび７ＡＡ；
（１８）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚおよび７ＡＡ；
（１９）７Ａ，７Ｂ，７Ｍおよび７ＡＡ；
（２０）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７Ｚおよび７ＡＡ；
（２１）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｎおよび７ＡＡ；
（２２）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７Ｚおよび７ＡＡ；
（２３）７Ａ，７Ｄ，７Ｐおよび７Ｏ；
（２４）７Ａ，７Ｂ，７Ｘおよび７Ｏ；
（２５）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＡ；
（２６）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｇ，７Ｓ；
（２７）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｇおよび７Ｓ；
（２８）７ＡＳ，７Ｉ，７Ｇおよび７Ｓ；
（２９）７ＡＳ，７Ｋ，および７Ｓ；
（３０）７ＡＳ，７Ｉ，７Ｒおよび７ＡＡ；
（３１）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒおよび７ＡＡ；
（３２）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７Ｚおよび７ＡＡ；
（３４）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚおよび７ＡＡ；
（３５）７ＡＳ，７Ｐおよび７Ｏ；
（３６）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，および７ＡＡ；ならびに
（３７）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｇ，および７Ｓ
から選択される経路を含み、
上記４Ａは３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡチオラーゼまたは３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンターゼであり、上記４Ｂは３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは３−オキソ−５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡシンテターゼであり、上記４Ｃは３−オキソ−５−ヒドロキシペンタン酸デカルボキシラーゼであり、上記４Ｄは３−オキソブタノールレダクターゼであり、上記５Ａは４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸アルドラーゼであり、上記５Ｆは４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸デカルボキシラーゼであり、上記５Ｇは３−ヒドロキシブタナールレダクターゼであり、上記５Ｈは４−ヒドロキシ−２−オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ、４−ヒドロキシ−２−オキソペンタン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼまたは４−ヒドロキシ−２−オキソペンタン酸ギ酸リアーゼであり、上記５Ｉは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、上記５Ｊは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンテターゼであり、上記５Ｋは３−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、上記５Ｌは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）であり、上記７Ａは３−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼであり、上記７Ｂはアセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼであり、上記７Ｄはアセトアセチル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、上記７Ｅはアセトアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアセトアセチル−ＣｏＡシンテターゼであり、上記７Ｆはアセト酢酸レダクターゼ（酸還元）であり、上記７Ｇは３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（アルデヒド還元）であり、上記７Ｈはアセトアセチル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、上記７Ｉはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存性、アルデヒド形成）であり、上記７Ｊはアセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、上記７Ｋはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）であり、上記７Ｌは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、上記７Ｍは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、上記７Ｎは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、上記７Ｏは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）であり、上記７Ｐはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）であり、上記７Ｑはアセト酢酸レダクターゼ（ケトン還元）であり、上記７Ｒは３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）であり、上記７Ｓは４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼであり、上記７Ｘは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、上記７Ｙは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンテターゼであり、上記７Ｚは３−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、上記７ＡＡは３−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼであり、上記７ＡＳはアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼである、
非天然微生物体。
（項目２）
上記微生物体が、各々が１，３−ブタンジオール経路の酵素をコードしている２、３、４または５種類の外因性核酸を含むものである、項目１に記載の非天然微生物体。
（項目３）
上記微生物体が、（１）〜（３７）から選択される経路のうちの少なくとも１つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目２に記載の非天然微生物体。
（項目４）
上記少なくとも１種類の外因性核酸が異種核酸である、項目１に記載の非天然微生物体。
（項目５）
実質的に嫌気性の培養培地中に存在する、項目１に記載の非天然微生物体。
（項目６）
さらに：
（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、上記少なくとも１種類の外因性核酸がＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、シトリル−ＣｏＡシンテターゼ、シトリル−ＣｏＡリアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；
（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、上記少なくとも１種類の外因性核酸がピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または
（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸
を含む、項目１に記載の非天然微生物体。
（項目７）
（ｉ）を含む上記微生物体が、さらに、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目６に記載の非天然微生物体。
（項目８）
（ｉｉ）を含む上記微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目６に記載の非天然微生物体。
（項目９）
（ｉ）を含む上記微生物体が、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている３種類の外因性核酸を含むものである；
（ｉｉ）を含む上記微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ；ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；ＣＯデヒドロゲナーゼ；およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている４種類の外因性核酸を含むものである；または
（ｉｉｉ）を含む上記微生物体が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている２種類の外因性核酸を含むものである、
項目６に記載の非天然微生物体。
（項目１０）
項目１〜９のいずれか１項に記載の非天然微生物体を、１，３−ブタンジオールが生成される条件下で上記生成に充分な期間、培養することを含む、１，３−ブタンジオールを生成するための方法。
（項目１１）
２，４−ペンタジエノエートを生成するのに充分な量で発現される２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含む２，４−ペンタジエノエート経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、上記２，４−ペンタジエノエート経路は：
（１）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋおよび１Ｇ；
（２）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆおよび１Ｇ；
（３）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐおよび１Ｇ；
（４）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂおよび１Ｊ；
（５）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎおよび１Ｏ；
（６）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎおよび１Ｏ；
（７）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎおよび１Ｏ；
（８）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑおよび１Ｏ；
（９）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋおよび１Ｇ；
（１０）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆおよび１Ｇ；
（１１）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂおよび１Ｊ；
（１２）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎおよび１Ｏ；
（１３）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎおよび１Ｏ；
（１４）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎおよび１Ｏ；
（１５）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑおよび１Ｏ；
（１６）１Ｂ，１Ｃ，１Ｋおよび１Ｇ；
（１７）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆおよび１Ｇ；
（１８）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐおよび１Ｇ；
（１９）１Ｂおよび１Ｊ；
（２０）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎおよび１Ｏ；
（２１）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎおよび１Ｏ；
（２２）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑおよび１Ｏ；
（２３）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｄ，３Ｅおよび３Ｆ；ならびに
（２４）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｇおよび３Ｆ
から選択される経路を含み、
上記１Ｂは５−アミノペンタン酸レダクターゼであり、上記１Ｃは５−アミノペント−２−エン酸アミノトランスフェラーゼ、５−アミノペント−２−エン酸デヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼであり、上記１Ｄは２−オキソアジピン酸デカルボキシラーゼであり、上記１Ｅはグルタル酸セミアルデヒドレダクターゼであり、上記１Ｆは５−ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼであり、上記１Ｇは５−ヒドロキシペント−２−エン酸デヒドラターゼであり、上記１Ｉは５−アミノペンタン酸アミノトランスフェラーゼ、５−アミノペンタン酸デヒドロゲナーゼまたは５−アミノペンタン酸アミンオキシダーゼであり、上記１Ｊは５−アミノペント−２−エン酸デアミナーゼであり、上記１Ｋは５−ヒドロキシペント−２−エン酸レダクターゼであり、上記１Ｌは５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡシンテターゼであり、上記１Ｍは５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、上記１Ｎは５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼであり、上記１Ｏは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡシンテターゼまたは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡヒドロラーゼであり、上記１Ｐは５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼであり、上記１Ｑは５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡデヒドラターゼ／デヒドロゲナーゼであり、上記１Ｓはグルタリル−ＣｏＡレダクターゼであり、上記３Ａは３−オキソペンタノイル−ＣｏＡチオラーゼまたは３−オキソペンタノイル−ＣｏＡシンターゼであり、上記３Ｂは３−オキソペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼであり、上記３Ｃは３−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼであり、上記３Ｄはペント−２−エノイル−ＣｏＡイソメラーゼであり、上記３Ｅはペント−３−エノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、上記３Ｆは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡシンテターゼであり、上記３Ｇはペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼである、
非天然微生物体。
（項目１２）
上記微生物体が、各々が２，４−ペンタジエノエート経路の酵素をコードしている２、３、４、５、６、７、８、９または１０種類の外因性核酸を含むものである、項目１１に記載の非天然微生物体。
（項目１３）
上記微生物体が、（１）〜（２４）から選択される経路のうちの少なくとも１つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目１２に記載の非天然微生物体。
（項目１４）
上記少なくとも１種類の外因性核酸が異種核酸である、項目１１に記載の非天然微生物体。
（項目１５）
実質的に嫌気性の培養培地中に存在する、項目１１に記載の非天然微生物体。
（項目１６）
（９）〜（１５）から選択される２，４−ペンタジエノエート経路を含む上記非天然微生物体が、さらに、グルタリル−ＣｏＡを生成するのに充分な量で発現されるグルタリル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含むグルタリル−ＣｏＡ経路を含むものであり、上記グルタリル−ＣｏＡ経路が：
アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼもしくはアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ；アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ；およびグルタリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；または
２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、２−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼもしくは２−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼ；および２−オキソアジピン酸デヒドロゲナーゼ、２−オキソアジピン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼまたは２−オキソアジピン酸ギ酸リアーゼ
から選択される経路を含む、項目１１に記載の非天然微生物体。
（項目１７）
（１６）〜（２２）から選択される２，４−ペンタジエノエート経路を含む上記非天然微生物体が、さらに、５−アミノペンタノエートを生成するのに充分な量で発現される５−アミノペンタノエート経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含む５−アミノペンタノエート経路を含むものであり、上記５−アミノペンタノエート経路が、２−アミノアジピン酸デカルボキシラーゼ；または２−アミノアジピン酸デカルボキシラーゼおよび２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、２−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼもしくは２−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼを含むものである、項目１１に記載の非天然微生物体。
（項目１８）
（１）〜（８）から選択される２，４−ペンタジエノエート経路を含む上記非天然微生物体が、さらに、２−オキソアジペートを生成するのに充分な量で発現される２−オキソアジペート経路の酵素をコードしている外因性核酸を含む２−オキソアジペート経路を含むものであり、上記２−オキソアジペート経路が、２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、２−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼまたは２−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼを含むものである、項目１１に記載の非天然微生物体。
（項目１９）
さらに：
（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、上記少なくとも１種類の外因性核酸がＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、シトリル−ＣｏＡシンテターゼ、シトリル−ＣｏＡリアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；
（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、上記少なくとも１種類の外因性核酸がピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または
（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸
を含む、項目１１に記載の非天然微生物体。
（項目２０）
（ｉ）を含む上記微生物体が、さらに、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目１９に記載の非天然微生物体。
（項目２１）
（ｉｉ）を含む上記微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目１９に記載の非天然微生物体。
（項目２２）
（ｉ）を含む上記微生物体が、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている３種類の外因性核酸を含むものである；
（ｉｉ）を含む上記微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ；ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；ＣＯデヒドロゲナーゼ；およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている４種類の外因性核酸を含むものである；または
（ｉｉｉ）を含む上記微生物体が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている２種類の外因性核酸を含むものである、
項目１９に記載の非天然微生物体。
（項目２３）
項目１１〜２２のいずれか１項に記載の非天然微生物体を、２，４−ペンタジエノエートが生成される条件下で上記生成に充分な期間、培養することを含む、２，４−ペンタジエノエートを生成するための方法。
（項目２４）
ブタジエンを生成するのに充分な量で発現されるブタジエン経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含むブタジエン経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、上記ブタジエン経路は：
（１）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇおよび１Ｔ；
（２）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇおよび１Ｔ；
（３）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇおよび１Ｔ；
（４）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｊおよび１Ｔ；
（５）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏおよび１Ｔ；
（６）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏおよび１Ｔ；
（７）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏおよび１Ｔ；
（８）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏおよび１Ｔ；
（９）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｕおよび１Ｖ；
（１０）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｕおよび１Ｖ；
（１１）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｕおよび１Ｖ；
（１２）１Ｄ，１Ｅ，１Ｗおよび１Ｖ；
（１３）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ａおよび６Ｂ；
（１４）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ａおよび６Ｂ；
（１５）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇ，６Ａおよび６Ｂ；
（１６）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｊ，６Ａおよび６Ｂ；
（１７）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；
（１８）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；
（１９）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；
（２０）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；
（２１）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（２２）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（２３）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（２４）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｊ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（２５）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（２６）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（２７）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（２８）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（２９）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｃおよび６Ｂ；
（３０）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｃおよび６Ｂ；
（３１）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，６Ｃおよび６Ｂ；
（３２）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，６Ｃおよび６Ｂ；
（３３）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（３４）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（３５）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（３６）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（３７）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｃおよび６Ｂ；
（３８）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｃおよび６Ｂ；
（３９）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｃおよび６Ｂ；
（４０）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（４１）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（４２）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（４３）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇおよび１Ｔ；
（４４）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇおよび１Ｔ；
（４５）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｊおよび１Ｔ；
（４６）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏおよび１Ｔ；
（４７）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏおよび１Ｔ；
（４８）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏおよび１Ｔ；
（４９）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏおよび１Ｔ；
（５０）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｕおよび１Ｖ；
（５１）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｕおよび１Ｖ；
（５２）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｕおよび１Ｖ；
（５３）１Ｓ，１Ｅ，１Ｗおよび１Ｖ；
（５４）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ａおよび６Ｂ；
（５５）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ａおよび６Ｂ；
（５６）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｊ，６Ａおよび６Ｂ；
（５７）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；
（５８）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；
（５９）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；
（６０）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；
（６１）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（６２）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（６３）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｊ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（６４）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（６５）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（６６）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（６７）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（６８）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｃおよび６Ｂ；
（６９）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｃおよび６Ｂ；
（７０）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，６Ｃおよび６Ｂ；
（７１）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，６Ｃおよび６Ｂ；
（７２）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（７３）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（７４）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（７５）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（７６）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｃおよび６Ｂ；
（７７）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｃおよび６Ｂ；
（７８）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（７９）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（８０）１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇおよび１Ｔ；
（８１）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇおよび１Ｔ；
（８２）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇおよび１Ｔ；
（８３）１Ｂ，１Ｊおよび１Ｔ；
（８４）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏおよび１Ｔ；
（８５）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏおよび１Ｔ；
（８６）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏおよび１Ｔ；
（８７）１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｕおよび１Ｖ；
（８８）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｕおよび１Ｖ；
（８９）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｕおよび１Ｖ；
（９０）１Ｉ，１Ｅ，１Ｗおよび１Ｖ；
（９１）１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ａおよび６Ｂ；
（９２）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ａおよび６Ｂ；
（９３）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇ，６Ａおよび６Ｂ；
（９４）１Ｂ，１Ｊ，６Ａおよび６Ｂ；
（９５）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；
（９６）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；
（９７）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏ，６Ａおよび６Ｂ；
（９８）１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（９９）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１００）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１０１）１Ｂ，１Ｊ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１０２）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１０３）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１０４）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，１Ｏ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１０５）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｃおよび６Ｂ；
（１０６）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，６Ｃおよび６Ｂ；
（１０７）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，６Ｃおよび６Ｂ；
（１０８）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｐ，１Ｎ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１０９）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｎ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１１０）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｑ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１１１）１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｃおよび６Ｂ；
（１１２）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｃおよび６Ｂ；
（１１３）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｃおよび６Ｂ；
（１１４）１Ｂ，１Ｃ，１Ｋ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１１５）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１１６）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐ，１Ｇ，６Ｆ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１１７）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｄ，３Ｅ，３Ｆおよび１Ｔ；
（１１８）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｄ，３Ｅ，３Ｆ，６Ａおよび６Ｂ；
（１１９）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｄ，３Ｅ，３Ｆ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１２０）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｄ，３Ｅ，６Ｃおよび６Ｂ；
（１２１）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｄ，３Ｅ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；ならびに
（１２２）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｇ，３Ｆおよび１Ｔ；
（１２３）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｇ，３Ｆ，６Ａおよび６Ｂ；
（１２４）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｇ，３Ｆ，６Ｈ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１２５）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｇ，６Ｃおよび６Ｂ；
（１２６）３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｇ，６Ｄ，６Ｅおよび６Ｂ；
（１２７）５Ａ，５Ｂ，５Ｃ，５Ｄおよび５Ｅ；
（１２８）７Ａ，７Ｊ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１２９）７Ａ，７Ｈ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１３０）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１３１）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１３２）７Ａ，７Ｄ，７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１３３）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１３４）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１３５）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１３６）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１３７）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１３８）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１３９）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１４０）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１４１）７Ａ，７Ｂ，７Ｍ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１４２）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１４３）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１４４）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１４５）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１４６）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１４７）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１４８）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｕ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１４９）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｔ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１５０）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１５１）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｗ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１５２）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７Ｗ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１５３）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７Ｗ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１５４）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７Ｖ，７ＡＨ；，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ
（１５５）７Ａ，７Ｊ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１５６）７Ａ，７Ｈ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１５７）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１５８）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１５９）７Ａ，７Ｄ，７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１６０）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１６１）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１６４）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１６３）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１６４）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１６５）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１６６）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１６７）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１６８）７Ａ，７Ｂ，７Ｍ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１６９）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１７０）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１７１）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１７２）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１７３）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１７４）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１７５）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｕ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１７６）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｔ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１７７）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１７８）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｗ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１７９）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７Ｗ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１８０）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７Ｗ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１８１）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１８２）７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１８３）７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１８４）７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１８５）７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１８６）７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１８７）７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１８８）７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１８９）７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１９０）７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１９１）７Ｐ，７ＡＢ，７Ｗ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（１９２）７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１９３）７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１９４）７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１９５）７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１９６）７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１９７）７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１９８）７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（１９９）７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（２００）７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（２０１）７Ｐ，７ＡＢ，７Ｗ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（２０２）７ＡＳ，７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（２０３）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（２０４）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（２０５）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（２０６）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（２０７）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（２０８）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（２０９）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（２１０）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（２１１）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｗ，１２Ａ，１２Ｂおよび１２Ｃ；
（２１２）７ＡＳ，７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（２１３）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（２１４）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（２１５）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（２１６）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（２１７）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（２１８）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（２１９）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；
（２２０）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧ，７ＡＨ，１２Ｄおよび１２Ｃ；ならびに
（２２１）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｗ，１２Ｄおよび１２Ｃ
から選択される経路を含み、
上記１Ｂは５−アミノペンタン酸レダクターゼ、５−アミノペント−２−エン酸アミノトランスフェラーゼ、５−アミノペント−２−エン酸デヒドロゲナーゼまたは５−アミノペント−２−エン酸アミンオキシダーゼであり、上記１Ｄは２−オキソアジピン酸デカルボキシラーゼであり、上記１Ｅはグルタル酸セミアルデヒドレダクターゼであり、上記１Ｆは５−ヒドロキシ吉草酸レダクターゼであり、上記１Ｇは５−ヒドロキシペント−２−エン酸デヒドラターゼであり、上記１Ｉは５−アミノペンタン酸アミノトランスフェラーゼ、５−アミノペンタン酸デヒドロゲナーゼまたは５−アミノペンタン酸アミンオキシダーゼであり、上記１Ｊは５−アミノペント−４−エン酸デアミナーゼであり、上記１Ｋは５−ヒドロキシペント−２−エン酸レダクターゼであり、上記１Ｌは５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡシンテターゼであり、上記１Ｍは５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、上記１Ｎは５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドラターゼであり、上記１Ｏは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡシンテターゼまたは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡヒドロラーゼであり、上記１Ｐは５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼであり、上記１Ｑは５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡデヒドラターゼ／デヒドロゲナーゼであり、上記１Ｓはグルタリル−ＣｏＡレダクターゼであり、上記１Ｔは２，４−ペンタジエン酸デカルボキシラーゼであり、上記１Ｕは５−ヒドロキシペント−２−エン酸デカルボキシラーゼであり、上記１Ｖは３−ブテン−１−オールデヒドラターゼであり、上記１Ｗは５−ヒドロキシ吉草酸デカルボキシラーゼであり、上記３Ａは３−オキソペンタノイル−ＣｏＡチオラーゼまたは３−オキソペンタノイル−ＣｏＡシンターゼであり、上記３Ｂは３−オキソペンタノイル−ＣｏＡレダクターゼであり、上記３Ｃは３−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドラターゼであり、上記３Ｄはペント−２−エノイル−ＣｏＡイソメラーゼであり、上記３Ｅはペント−３−エノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、上記３Ｆは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡシンテターゼであり、上記３Ｇはペント−２−エノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、上記５Ａは４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸アルドラーゼであり、上記５Ｂは４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸デヒドラターゼであり、上記５Ｃは２−オキソペンテン酸デカルボキシラーゼであり、上記５Ｄは３−ブテン−１−アールレダクターゼであり、上記５Ｅは３−ブテン−１−オールデヒドラターゼであり、上記６Ａは２，４−ペンタジエン酸レダクターゼ（酸還元）であり、上記６Ｂはペンタ−２，４−ジエナールデカルボニラーゼであり、上記６Ｃは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（酸還元）であり、上記６Ｄは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡホスホトランスフェラーゼであり、上記６Ｅは２，４−ペンタジエノイル−リン酸レダクターゼであり、上記６Ｆは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは２，４−ペンタジエノイル−ＣｏＡシンテターゼであり、上記６Ｈは２，４−ペンタジエン酸キナーゼであり、上記７Ａは３−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼであり、上記７Ｂはアセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼであり、上記７Ｃは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰデヒドラターゼであり、上記７Ｄはアセトアセチル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、上記７Ｅはアセトアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアセトアセチル−ＣｏＡシンテターゼであり、上記７Ｆはアセト酢酸レダクターゼ（酸還元）であり、上記７Ｈはアセトアセチル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、上記７Ｉはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存性，アルデヒド形成）であり、上記７Ｊはアセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、上記７Ｋはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）であり、上記７Ｌは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、上記７Ｍは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、上記７Ｎは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、上記７Ｏは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）であり、上記７Ｐはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）であり、上記７Ｑはアセト酢酸レダクターゼ（ケトン還元）であり、上記７Ｒは３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）であり、上記７Ｔはクロトニル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、上記７Ｕはクロトニル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、上記７Ｖはクロトニル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、上記７Ｗはクロトニル−ＣｏＡ（アルコール形成）であり、上記７Ｘは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、上記７Ｙは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンテターゼであり、上記７Ｚは３−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、上記７ＡＢは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼであり、上記７ＡＣは３−ヒドロキシ酪酸デヒドラターゼであり、上記７ＡＤは３−ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドラターゼであり、上記７ＡＥはクロトニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、上記７ＡＦはクロトニル−ＣｏＡヒドロラーゼ、クロトニル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはクロトニル−ＣｏＡシンテターゼであり、上記７ＡＧはクロトン酸レダクターゼであり、上記７ＡＨはクロトンアルデヒドレダクターゼであり、上記７ＡＳはアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼであり、上記１２Ａはクロチルアルコールキナーゼであり、上記１２Ｂは２−ブテニル−４−リン酸キナーゼであり、上記１２Ｃはブタジエンシンターゼであり、上記１２Ｄはクロチルアルコールジホスホキナーゼである、
非天然微生物体。
（項目２５）
上記微生物体が、各々がブタジエン経路の酵素をコードしている２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１種類の外因性核酸を含むものである、項目２４に記載の非天然微生物体。
（項目２６）
上記微生物体が、（１）〜（２２１）から選択される経路のうちの少なくとも１つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目２５に記載の非天然微生物体。
（項目２７）
上記少なくとも１種類の外因性核酸が異種核酸である、項目２４に記載の非天然微生物体。
（項目２８）
実質的に嫌気性の培養培地中に存在する、項目２４に記載の非天然微生物体。
（項目２９）
（４３）〜（７９）から選択されるブタジエン経路を含む上記非天然微生物体が、さらに、グルタリル−ＣｏＡを生成するのに充分な量で発現されるグルタリル−ＣｏＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含むグルタリル−ＣｏＡ経路を含むものであり、上記グルタリル−ＣｏＡ経路が：
アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼもしくはアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ；アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ；およびグルタリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；または
２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、２−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼもしくは２−アミノ（ａｍｉｎｉｎｏ）アジピン酸アミンオキシダーゼ；および２−オキソアジピン酸デヒドロゲナーゼ、２−オキソアジピン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼもしくは２−オキソアジピン酸ギ酸リアーゼ
から選択される経路を含む、項目２４に記載の非天然微生物体。
（項目３０）
（８０）〜（１１６）から選択されるブタジエン経路を含む上記非天然微生物体が、さらに、５−アミノペンタノエートを生成するのに充分な量で発現される５−アミノペンタノエート経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含む５−アミノペンタノエート経路を含むものであり、上記５−アミノペンタノエート経路が、２−アミノアジピン酸デカルボキシラーゼ；または２−アミノアジピン酸デカルボキシラーゼおよび２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、２−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼもしくは２−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼを含むものである、項目２４に記載の非天然微生物体。
（項目３１）
（１）〜（４２）から選択されるブタジエン経路を含む上記非天然微生物体が、さらに、２−オキソアジペートを生成するのに充分な量で発現される２−オキソアジペート経路の酵素をコードしている外因性核酸を含む２−オキソアジペート経路を含むものであり、上記２−オキソアジペート経路が２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ、２−アミノアジピン酸デヒドロゲナーゼまたは２−アミノアジピン酸アミンオキシダーゼを含むものである、項目２４に記載の非天然微生物体。
（項目３２）
さらに：
（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、上記少なくとも１種類の外因性核酸がＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、シトリル−ＣｏＡシンテターゼ、シトリル−ＣｏＡリアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；
（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、上記少なくとも１種類の外因性核酸がピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または
（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸
を含む、項目２４に記載の非天然微生物体。
（項目３３）
（ｉ）を含む上記微生物体が、さらに、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目３２に記載の非天然微生物体。
（項目３４）
（ｉｉ）を含む上記微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目３２に記載の非天然微生物体。
（項目３５）
（ｉ）を含む上記微生物体が、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている３種類の外因性核酸を含むものである；
（ｉｉ）を含む上記微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ；ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；ＣＯデヒドロゲナーゼ；およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている４種類の外因性核酸を含むものである；または
（ｉｉｉ）を含む上記微生物体が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている２種類の外因性核酸を含むものである、
項目３２に記載の非天然微生物体。
（項目３６）
項目２４〜３５のいずれか１項に記載の非天然微生物体を、ブタジエンが生成される条件下で上記生成に充分な期間、培養することを含む、ブタジエンを生成するための方法。
（項目３７）
３−ブテン−１−オールを生成するのに充分な量で発現される３−ブテン−１−オール経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含む３−ブテン−１−オール経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、上記３−ブテン−１−オール経路は：
（１）１Ｄ，１Ｅ，１Ｆおよび１Ｕ；
（２）１Ｄ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋおよび１Ｕ；
（３）１Ｄ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐおよび１Ｕ；
（４）１Ｄ，１Ｅおよび１Ｗ；
（５）１Ｓ，１Ｅ，１Ｆおよび１Ｕ；
（６）１Ｓ，１Ｉ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｋおよび１Ｕ；
（７）１Ｓ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐおよび１Ｕ；
（８）１Ｓ，１Ｅおよび１Ｗ；
（９）１Ｂ，１Ｃ，１Ｋおよび１Ｕ；
（１０）１Ｉ，１Ｅ，１Ｆおよび１Ｕ；
（１１）１Ｉ，１Ｅ，１Ｌ，１Ｍ，１Ｐおよび１Ｕ；
（１２）１Ｉ，１Ｅおよび１Ｗ；ならびに
（１３）５Ａ，５Ｂ，５Ｃおよび５Ｄ
から選択される経路を含み、
上記１Ｂは５−アミノペンタン酸レダクターゼであり、上記１Ｃは５−アミノペント−２−エン酸アミノトランスフェラーゼ、５−アミノペント−２−エン酸デヒドロゲナーゼまたはアミンオキシダーゼであり、上記１Ｄは２−オキソアジピン酸デカルボキシラーゼであり、上記１Ｅはグルタル酸セミアルデヒドレダクターゼであり、上記１Ｆは５−ヒドロキシ吉草酸デヒドロゲナーゼであり、上記１Ｉは５−アミノペンタン酸アミノトランスフェラーゼ、５−アミノペンタン酸デヒドロゲナーゼまたは５−アミノペンタン酸アミンオキシダーゼであり、上記１Ｋは５−ヒドロキシペント−２−エン酸レダクターゼであり、上記１Ｌは５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡシンテターゼであり、上記１Ｍは５−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、上記１Ｐは５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは５−ヒドロキシペント−２−エノイル−ＣｏＡシンテターゼであり、上記１Ｓはグルタリル−ＣｏＡレダクターゼであり、上記１Ｕは５−ヒドロキシペント−２−エン酸デカルボキシラーゼであり、上記１Ｗは５−ヒドロキシ吉草酸デカルボキシラーゼであり、上記５Ａは４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸アルドラーゼであり、上記５Ｂは４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸デヒドラターゼであり、上記５Ｃは２−オキソペンテン酸デカルボキシラーゼであり、上記５Ｄは３−ブテン−１−アールレダクターゼである、
非天然微生物体。
（項目３８）
上記微生物体が、各々が３−ブテン−１−オール経路の酵素をコードしている２、３、４、５または６種類の外因性核酸を含むものである、項目３７に記載の非天然微生物体。
（項目３９）
上記微生物体が、（１）〜（１３）から選択される経路のうちの少なくとも１つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目３８に記載の非天然微生物体。
（項目４０）
上記少なくとも１種類の外因性核酸が異種核酸である、項目３７に記載の非天然微生物体。
（項目４１）
実質的に嫌気性の培養培地中に存在する、項目３７に記載の非天然微生物体。
（項目４２）
さらに：
（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、上記少なくとも１種類の外因性核酸がＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；
（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、上記少なくとも１種類の外因性核酸がピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または
（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸
を含む、項目３７に記載の非天然微生物体。
（項目４３）
（ｉ）を含む上記微生物体が、さらに、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目４２に記載の非天然微生物体。
（項目４４）
（ｉｉ）を含む上記微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目４２に記載の非天然微生物体。
（項目４５）
（ｉ）を含む上記微生物体が、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている３種類の外因性核酸を含むものである；
（ｉｉ）を含む上記微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ；ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；ＣＯデヒドロゲナーゼ；およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている４種類の外因性核酸を含むものである；または
（ｉｉｉ）を含む上記微生物体が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている２種類の外因性核酸を含むものである、
項目４２に記載の非天然微生物体。
（項目４６）
項目３７〜４５のいずれか１項に記載の非天然微生物体を、３−ブテン−１−オールが生成される条件下で上記生成に充分な期間、培養することを含む、３−ブテン−１−オールを生成するための方法。
（項目４７）
項目３７〜４５のいずれか１項に記載の非天然微生物体を、３−ブテン−１−オールが生成される条件下で上記生成のために充分培養すること、および上記３−ブテン−１−オールを化学的に脱水させてブタジエンを生成させることを含む、ブタジエンを生成するための方法。
（項目４８）
クロチルアルコールを生成するのに充分な量で発現されるクロチルアルコール経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含むクロチルアルコール経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、上記クロチルアルコール経路は：
（１）７Ａ，７Ｊ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（２）７Ａ，７Ｈ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（３）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（４）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（５）７Ａ，７Ｄ，７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（６）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（７）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（８）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（９）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（１０）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（１１）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（１２）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖおよび７ＡＨ；
（１３）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（１４）７Ａ，７Ｂ，７Ｍ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（１５）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（１６）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（１７）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（１８）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（１９）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７Ｖおよび７ＡＨ；
（２０）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（２１）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｕおよび７ＡＨ；
（２２）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｔ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（２３）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（２４）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢおよび７Ｗ；
（２５）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢおよび７Ｗ；
（２６）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥおよび７Ｗ；
（２７）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７Ｖおよび７ＡＨ；
（２８）７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（２９）７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（３０）７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（３１）７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（３２）７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（３３）７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（３４）７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（３５）７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖおよび７ＡＨ；
（３６）７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（３７）７Ｐ，７ＡＢおよび７Ｗ；
（３８）７ＡＳ，７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（３９）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（４０）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（４１）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（４２）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（４３）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＨ；
（４４）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＨ；
（４５）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖおよび７ＡＨ；
（４６）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＨ；ならびに
（４７）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢおよび７Ｗ
から選択される経路を含み、
上記７Ａは３−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼであり、上記７Ｂはアセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼであり、上記７Ｃは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰデヒドラターゼであり、上記７Ｄはアセトアセチル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、上記７Ｅはアセトアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアセトアセチル−ＣｏＡシンテターゼであり、上記７Ｆはアセト酢酸レダクターゼ（酸還元）であり、上記７Ｈはアセトアセチル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、上記７Ｉはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存性，アルデヒド形成）であり、上記７Ｊはアセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、上記７Ｋはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）であり、上記７Ｌは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、上記７Ｍは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、上記７Ｎは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、上記７Ｏは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成）であり、上記７Ｐはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）であり、上記７Ｑはアセト酢酸レダクターゼ（ケトン還元）であり、上記７Ｒは３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）であり、上記７Ｔはクロトニル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、上記７Ｕはクロトニル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、上記７Ｖはクロトニル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、上記７Ｗはクロトニル−ＣｏＡ（アルコール形成）であり、上記７Ｘは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、上記７Ｙは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンテターゼであり、上記７Ｚは３−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、上記７ＡＢは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼであり、上記７ＡＣは３−ヒドロキシ酪酸デヒドラターゼであり、上記７ＡＤは３−ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドラターゼであり、上記７ＡＥはクロトニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、上記７ＡＦはクロトニル−ＣｏＡヒドロラーゼ、クロトニル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはクロトニル−ＣｏＡシンテターゼであり、上記７ＡＧはクロトン酸レダクターゼであり、上記７ＡＨはクロトンアルデヒドレダクターゼであり、上記７ＡＳはアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼである、
非天然微生物体。
（項目４９）
上記微生物体が、各々がクロチルアルコール経路の酵素をコードしている２、３、４、５、６または７種類の外因性核酸を含むものである、項目１に記載の非天然微生物体。
（項目５０）
上記微生物体が、（１）〜（４７）から選択される経路のうちの少なくとも１つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目１Ａに記載の非天然微生物体。
（項目５１）
上記少なくとも１種類の外因性核酸が異種核酸である、項目１に記載の非天然微生物体。
（項目５２）
実質的に嫌気性の培養培地中に存在する、項目１に記載の非天然微生物体。
（項目５３）
さらに：
（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、上記少なくとも１種類の外因性核酸がＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、シトリル−ＣｏＡシンテターゼ、シトリル−ＣｏＡリアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；
（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、上記少なくとも１種類の外因性核酸がピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または
（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸
を含む、項目４８に記載の非天然微生物体。
（項目５４）
（ｉ）を含む上記微生物体が、さらに、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目５３に記載の非天然微生物体。
（項目５５）
（ｉｉ）を含む上記微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目５３に記載の非天然微生物体。
（項目５６）
（ｉ）を含む上記微生物体が、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている３種類の外因性核酸を含むものである；
（ｉｉ）を含む上記微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ；ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；ＣＯデヒドロゲナーゼ；およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている４種類の外因性核酸を含むものである；または
（ｉｉｉ）を含む上記微生物体が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている２種類の外因性核酸を含むものである、
項目５３に記載の非天然微生物体。
（項目５７）
項目４８〜５６のいずれか１項に記載の非天然微生物体を、クロチルアルコールが生成される条件下で上記生成に充分な期間、培養することを含む、クロチルアルコールを生成するための方法。
（項目５８）
プロピレンを生成するのに充分な量で発現されるプロピレン経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含むプロピレン経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、上記プロピレン経路は：
（１）７Ａ，７Ｊ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（２）７Ａ，７Ｈ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（３）７Ａ，７Ｄ，７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（４）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（５）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（６）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（７）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（８）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（９）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｎ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（１０）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（１１）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７Ｖ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（１２）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（１３）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（１４）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（１５）７Ａ，７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖおよび７ＡＯ；
（１６）７Ａ，７Ｂ，７Ｍ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（１７）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（１８）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｎ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（１９）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（２０）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｕおよび７ＡＯ；
（２１）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｔ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（２２）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７Ｖおよび７ＡＯ；
（２３）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（２４）７Ａ，７Ｈ，７Ｑおよび７ＡＲ；
（２５）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑおよび７ＡＲ；
（２６）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙおよび７ＡＲ；
（２７）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙおよび７ＡＲ；
（２８）７Ａ，７Ｂ，７Ｌおよび７ＡＲ；
（２９）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７ＡＣおよび７ＡＱ；
（３０）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣおよび７ＡＱ；
（３１）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣおよび７ＡＱ；
（３２）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦおよび７ＡＱ；
（３３）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７ＡＣおよび７ＡＱ；
（３４）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７ＡＣおよび７ＡＱ；
（３５）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７ＡＦおよび７ＡＱ；
（３６）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７ＡＦおよび７ＡＱ；
（３７）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｔおよび７ＡＱ；
（３８）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ
（３９）７Ａ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（４０）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（４１）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（４２）７Ａ，７Ｄ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＭ，７ＡＪおよび７ＡＫ；
（４３）７Ａ，７Ｂ，７Ｌ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（４４）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（４５）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（４６）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７ＡＭ，７ＡＪおよび７ＡＫ；
（４７）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｔ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（４８）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７ＡＦ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（４９）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＥ，７ＡＭ，７ＡＪおよび７ＡＫ；
（５０）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＬ，７ＡＰおよび７ＡＫ；
（５１）７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７ＡＬ，７ＡＩ，７ＡＪおよび７ＡＫ；
（５２）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７Ｖおよび７ＡＯ；
（５３）７Ａ  ７Ｂ，７Ｌ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（５４）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（５５）７Ａ，７Ｂ，７Ｘ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（５６）７Ａ，７Ｈ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（５７）７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（５８）７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（５９）７Ｅ，７Ｑ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（６０）７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（６１）７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（６２）７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（６３）７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（６４）７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（６５）７Ｐ，７ＡＢ，７Ｖおよび７ＡＯ；
（６６）７Ｅ，７Ｑおよび７ＡＲ；
（６７）７Ｐ，７Ｙおよび７ＡＲ；
（６８）７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣおよび７ＡＱ；
（６９）７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣおよび７ＡＱ；
（７０）７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦおよび７ＡＱ；
（７１）７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（７２）７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（７３）７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（７４）７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＭ，７ＡＪおよび７ＡＫ；
（７５）７ＡＳ，７Ｉ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（７６）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｒ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（７７）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（７８）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７Ｚ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（７９）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｎ，７ＡＤおよび７ＡＯ；
（８０）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（８１）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（８２）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＧおよび７ＡＯ；
（８３）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑおよび７ＡＲ；
（８４）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙおよび７ＡＲ；
（８５）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣおよび７ＡＱ；
（８６）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣおよび７ＡＱ；
（８７）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦおよび７ＡＱ；
（８８）７ＡＳ，７Ｅ，７Ｑ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（８９）７ＡＳ，７Ｐ，７Ｙ，７ＡＣ，７ＡＮおよび７ＡＫ；
（９０）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＦ，７ＡＮおよび７ＡＫ；ならびに
（９１）７ＡＳ，７Ｐ，７ＡＢ，７ＡＭ，７ＡＪおよび７ＡＫ
から選択される経路を含み、
上記７Ａは３−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼであり、上記７Ｂはアセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼであり、上記７Ｃは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰデヒドラターゼであり、上記７Ｄはアセトアセチル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、上記７Ｅはアセトアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアセトアセチル−ＣｏＡシンテターゼであり、上記７Ｆはアセト酢酸レダクターゼ（酸還元）であり、上記７Ｈはアセトアセチル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、上記７Ｉはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ依存性，アルデヒド形成）であり、上記７Ｊはアセトアセチル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、上記７Ｌは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、上記７Ｍは３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、上記７Ｎは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、上記７Ｐはアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）であり、上記７Ｑはアセト酢酸レダクターゼ（ケトン還元）であり、上記７Ｒは３−オキソブチルアルデヒドレダクターゼ（ケトン還元）であり、上記７Ｓは４−ヒドロキシ−２−ブタノンレダクターゼであり、上記７Ｔはクロトニル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、上記７Ｕはクロトニル−ＡＣＰレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、上記７Ｖはクロトニル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成）であり、上記７Ｘは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、上記７Ｙは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンテターゼであり、上記７Ｚは３−ヒドロキシ酪酸レダクターゼであり、上記７ＡＢは３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼであり、上記７ＡＣは３−ヒドロキシ酪酸デヒドラターゼであり、上記７ＡＤは３−ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドラターゼであり、上記７ＡＥはクロトニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、上記７ＡＦはクロトニル−ＣｏＡヒドロラーゼ、クロトニル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはクロトニル−ＣｏＡシンテターゼであり、上記７ＡＧはクロトン酸レダクターゼであり、上記７ＡＩはブチリル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼであり、上記７ＡＪはブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、ブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼまたはブチリル−ＣｏＡシンテターゼであり、上記７ＡＫは酪酸デカルボキシラーゼであり、上記７ＡＬはクロトニル−ＡＣＰレダクターゼであり、上記７ＡＭはクロトニル−ＣｏＡレダクターゼであり、上記７ＡＮはクロトン酸レダクターゼであり、上記７ＡＯはクロトンアルデヒドデカルボニラーゼであり、上記７ＡＰはブチリル−ＡＣＰチオエステラーゼであり、上記７ＡＱはクロトン酸デカルボキシラーゼであり、上記７ＡＲは３−ヒドロキシ酪酸デカルボキシラーゼであり、上記７ＡＳはアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼである、
非天然微生物体。
（項目５９）
上記微生物体が、各々がプロピレン経路の酵素をコードしている２、３、４、５、６、７または８種類の外因性核酸を含むものである、項目５８に記載の非天然微生物体。
（項目６０）
上記微生物体が、（１）〜（９１）から選択される経路のうちの少なくとも１つの各酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目５９に記載の非天然微生物体。
（項目６１）
上記少なくとも１種類の外因性核酸が異種核酸である、項目５８に記載の非天然微生物体。
（項目６２）
実質的に嫌気性の培養培地中に存在する、項目５８に記載の非天然微生物体。
（項目６３）
さらに：
（ｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、上記少なくとも１種類の外因性核酸がＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、シトリル−ＣｏＡシンテターゼ、シトリル−ＣｏＡリアーゼ、フマル酸レダクターゼおよびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；
（ｉｉ）還元的ＴＣＡ経路の酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸を含み、上記少なくとも１種類の外因性核酸がピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼから選択される、還元的ＴＣＡ経路；または
（ｉｉｉ）ＣＯデヒドロゲナーゼ、Ｈ２ヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている少なくとも１種類の外因性核酸
を含む、項目５８に記載の非天然微生物体。
（項目６４）
（ｉ）を含む上記微生物体が、さらに、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェレドキシンおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目６３に記載の非天然微生物体。
（項目６５）
（ｉｉ）を含む上記微生物体が、さらに、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびその組合せから選択される酵素をコードしている外因性核酸を含むものである、項目６３に記載の非天然微生物体。
（項目６６）
（ｉ）を含む上記微生物体が、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼもしくはクエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、およびα−ケトグルタル酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードしている３種類の外因性核酸を含むものである；
（ｉｉ）を含む上記微生物体が、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ；ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼもしくはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；ＣＯデヒドロゲナーゼ；およびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている４種類の外因性核酸を含むものである；または
（ｉｉｉ）を含む上記微生物体が、ＣＯデヒドロゲナーゼおよびＨ２ヒドロゲナーゼをコードしている２種類の外因性核酸を含むものである、
項目６３に記載の非天然微生物体。
（項目６７）
項目５８〜６６のいずれか１項に記載の非天然微生物体を、プロピレンが生成される条件下で上記生成に充分な期間、培養することを含む、プロピレンを生成するための方法。
（項目６８）
（ａ）充分な量の栄養素と培地中で、項目４８〜５６のいずれか１項に記載の非天然微生物体を発酵により培養し、クロチルアルコールを生成させること；および
（ｂ）上記非天然微生物体を培養することによって生成したクロチルアルコールをブタジエンに変換させること
を含む、ブタジエンを生成するためのプロセス。
（項目６９）
工程（ｂ）を触媒の存在下での化学的脱水によって行なう、項目６８に記載の方法。
【図１０】
2014521365.tif 000149
【図１】
2014521365.tif 000150
【図２】
2014521365.tif 000151
【図３】
2014521365.tif 000152
【図４】
2014521365.tif 000153
【図５】
2014521365.tif 000154
【図６】
2014521365.tif 000155
【図７】
2014521365.tif 000156
【図８】
2014521365.tif 000157
【図９】
2014521365.tif 000158
【図１１】
2014521365.tif 000159
【図１２】
2014521365.tif 000160
【国際調査報告】
2014521365.tif 000161
2014521365.tif 000162
2014521365.tif 000163