(57)【要約】  本発明は、調節機能を有するリンパ球亜集団の減少及び／又はエフェクター機能を有するリンパ球亜集団の増加に起因する、内在性抗原又は外来性抗原に対する免疫応答の増強によって利益を得る障害の予防若しくは治療又は治療介入に使用される、スカベンジャー様リンパ球受容体であるＣＤ５及びＣＤ６の可溶性アイソフォームを開示する。特別な障害は細胞成長障害、細菌、ウイルス、真菌又は寄生虫起源の慢性感染である。本発明は自己免疫疾患、がん及び慢性感染の研究及び予防法／治療用の動物モデルも提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん若しくは腫瘍の予防若しくは治療に使用されるか、又はアジュバントとして使用されるＣＤ５又はＣＤ６の可溶性タンパク質アイソフォーム。
【請求項２】
ＣＤ５がヒトＣＤ５であり、ＣＤ６がヒトＣＤ６である、請求項１に記載のＣＤ５又はＣＤ６の可溶性タンパク質アイソフォーム。
【請求項３】
配列番号２及び配列番号３からなる群より選択される配列を含む、請求項３に記載の可溶性タンパク質アイソフォーム。
【請求項４】
以下の（ａ）及び（ｂ）から選択されるポリペプチド配列を有することを更に特徴とする、請求項１に記載の可溶性タンパク質アイソフォーム：
（ａ）配列番号２と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更により好ましくは９９％以上の同一性を有するポリペプチド配列、又は、
（ｂ）配列番号３と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更により好ましくは９９％以上の同一性を有するポリペプチド配列。
【請求項５】
前記腫瘍が造血起源の腫瘍及び非造血起源の腫瘍から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質アイソフォーム。
【請求項６】
前記がんが黒色腫、肉腫、結腸がん、皮膚がん、上皮腫、結腸直腸がん、乳がん、胃がん、卵巣がん、膵臓がん、脳がん、頭頸部がん、食道がん、精巣がん、奇形腫、子宮頸がんから選択される、請求項５に記載の可溶性タンパク質アイソフォーム。
【請求項７】
アジュバントとして使用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の可溶性タンパク質アイソフォーム。
【請求項８】
前記アジュバントが肺炎連鎖球菌の細菌莢膜多糖類、（重合）サルモネラフラジェリン、ポリ−Ｄ−アミノ酸及び大腸菌リポ多糖類のような胸腺依存性（ＴＤ）抗原又は胸腺非依存性（ＴＩ）抗原の群から選択される抗原と併用される、請求項７に記載の可溶性タンパク質アイソフォーム。
【請求項９】
がん若しくは腫瘍の予防若しくは治療に使用されるか、又はアジュバントとして使用される、少なくとも１つの請求項１〜８のいずれか一項に記載のＣＤ５又はＣＤ６の可溶性タンパク質アイソフォームと、任意の薬学的に許容可能な賦形剤又は担体とを含む医薬組成物。
【請求項１０】
少なくとも１つの更なる活性成分を含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記更なる活性成分が化学療法剤及び治療抗体の群から選択され、該化学療法剤が更に好ましくは細胞増殖抑制剤及び細胞毒性剤、より好ましくはビンクリスチン、ドキソルビシン、カルボプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ビノレルビン、ゲムシタビン、イリノテカン、ドセタキセル、ダカルバジン、ゲフィチニブ、ダサチニブ、イマチニブ、エトポシド、シクロホスファミド及びミトキサントロンの中から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記更なる活性成分が抗原である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＣＤ５の可溶性アイソフォームを発現し、好ましくは配列番号２を含むアミノ酸配列をコードする配列番号１を含むヌクレオチド構築物を含む非ヒト動物。
【請求項１４】
実験的に誘発された自己免疫疾患の増強の表現型及び腫瘍／がん進行に対する耐性を示す、請求項１３に記載の非ヒト動物。
【請求項１５】
配列番号２が過剰発現される、請求項１３又は１４に記載の非ヒト動物。
【請求項１６】
ＣＤ６の（好ましくは可溶性）アイソフォームを発現する非ヒト動物。
【請求項１７】
配列番号３を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の非ヒト動物。
【請求項１８】
前記ＣＤ６のアイソフォームが本質的にＢ細胞及び／又はＴ細胞のみで、好ましくはｌｃｋプロモーターの制御下で発現される、請求項１６又は１７に記載の非ヒト動物。
【請求項１９】
マウスである、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍又はがんと闘う医学的アプローチの分野及びアジュバントに関する。これらの用途には、外来性抗原又は内在性抗原に対する免疫応答の強化によって利益を得るという共通した技術的特徴がある。本発明は、医薬に適用される有用な手段（tools）を更に提供する。
【背景技術】
【０００２】
調節／抑制機能を有するリンパ球亜集団の数若しくは機能の低減、又はエフェクター亜集団の数若しくは機能の増大による正常又は不十分な免疫応答の強化によって利益を得る可能性のある多くの障害が存在する。これらの障害には、がんだけでなく、種々の病因（ウイルス、真菌、原生動物、細菌）の一部の慢性感染が含まれる。さらに、アジュバントを提供することは、とりわけ免疫原性の低い抗原の分野において有益であり得る。
【０００３】
がん又は悪性新生物は、細胞群が無制御な成長、隣接組織に侵入し破壊する浸潤、場合によっては転移又はリンパ若しくは血液による体内の他の部位への進展を示す疾患群である。がん又は悪性新生物は、これら３つの極めて有害な特性によって浸潤又は転移しない良性腫瘍と区別される。
【０００４】
腫瘍は、腫脹のように見える、細胞の異常成長（新生物性と称される）によって形成される新生物又は充実性病変の名前である。腫瘍はがんの同義語ではない。腫瘍は良性、前悪性又は悪性であり得るが、がんは本質的に悪性である。
【０００５】
腫瘍及びがんは、実際には正常な細胞成長の障害（異常又は無制御）である。
【０００６】
多くのアプローチががん及び悪性腫瘍との闘いに用いられている。がんは外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、モノクローナル抗体療法又は他の方法によって治療することができる。治療法の選択は腫瘍の位置及び悪性度、並びに疾患の段階及び患者の状態（年齢、性別等）によって決まる。がんは世界的に主要な死因の１つであることから、幾つかの実験的がん治療も開発中である。一般に、がん治療法は悪性腫瘍の治療にも適用可能である。
【０００７】
身体の他の部位に損傷を与えることなくがん又は腫瘍を完全除去することが治療の目的である。これは外科手術によって達成することができる場合もあるが、隣接組織に浸潤するか、又は微小転移によって遠隔部位に進展するがん及び悪性腫瘍の傾向から、その有効性が制限されることが多い。
【０００８】
大まかに言えば、化学療法は化学薬品による、とりわけ微生物又はがん性細胞を死滅させることによる病気の治療である。一般的な用法では、化学療法はがんの治療に使用される抗新生物薬を指す。しかしながら、化学療法は、大半の治療が体内の非がん組織に対しても有害であることから欠点を有する。
【０００９】
がん又は腫瘍を治療する別の治療的アプローチは、免疫応答を誘導、強化又は抑制するように設計された化合物である免疫調節剤を用いるものである。免疫応答を誘発又は増幅するように設計された免疫療法は、活性化免疫療法に分類される。自己免疫又はアレルギーの場合のように既存の免疫応答を低減、抑制又はより適切には誘導するように設計された免疫療法は、抑制免疫療法に分類される。免疫療法の活性剤は免疫調節物質と総称される。免疫調節物質には組換え調製物、合成調製物及び天然調製物が含まれ、サイトカインである場合が多い。
【００１０】
最後に、モノクローナル抗体療法は、標的の細胞又は可溶性分子に特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の使用を指す。これにより患者の免疫系が刺激され、これらの細胞又は分子を攻撃又は中和することができる。ほぼ全ての細胞外／細胞表面標的に特異的なｍＡｂを作り出すことが可能であるため、がんを含む多数の重篤な疾患に対してｍＡｂを作り出す多くの研究開発が現在行われている。ｍＡｂは、例えば特異的な細胞受容体を遮断することによって悪性腫瘍細胞を破壊し、腫瘍成長を防ぐ治療法に使用することができる。ｍＡｂを放射性同位体標識する場合もあり、これは抗体が標的に到達すると、致死放射線量が標的細胞に送達されることを意味する。
【００１１】
注目すべきは、より高度な細胞成長障害療法及びそれを行う手段が必要とされていることである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明の基礎となる技術的課題は、例えば腫瘍及び／又はがんの治療及び／又は予防法に対する並びにアジュバントとしての免疫刺激剤を提供することとみなすことができる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、特定の医学的使用に対する作用物質を提供する。該作用物質はＣＤ５又はＣＤ６の可溶性タンパク質アイソフォームであり得る。ＣＤ５はヒトＣＤ５であり、ＣＤ６はヒトＣＤ６であるのが好ましい。ＣＤ５及び／又はＣＤ６と本質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドも、本発明の作用物質として使用することができる。その実施の形態には、（ａ）配列番号２と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、更により好ましくは９９％以上の同一性を有するポリペプチド配列、又は（ｂ）配列番号３と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、更により好ましくは９９％以上の同一性を有するポリペプチド配列から選択されるポリペプチド配列の変異体が含まれる。更により好ましくは、本発明の作用物質は、配列番号２及び配列番号３の群から選択される配列を含むか、又はそれからなるタンパク質の中から選択される。
【００１４】
本発明者らは驚くべきことに、スカベンジャー様リンパ球受容体群に属するヒト糖タンパク質の可溶性アイソフォームが、治療に用いられるという興味深い特徴を示すことを見出した。すなわち、これらの可溶性アイソフォームは免疫調節剤として有用である。
【００１５】
したがって、本発明は、調節機能を有するリンパ球亜集団の減少及び／又はエフェクター機能を有するリンパ球亜集団の増加に起因する、内在性抗原又は外来性抗原に対する免疫応答の増強によって利益を得る可能性のある障害の予防若しくは治療又は治療介入に使用されるスカベンジャー様リンパ球受容体の可溶性アイソフォームを目的とする。
【００１６】
本発明の医学的使用は、調節機能を有するリンパ球亜集団の減少及び／又はエフェクター機能を有するリンパ球亜集団の増加に起因する、内在性抗原又は外来性抗原に対する免疫応答の増強によって利益を得る可能性のある障害の予防若しくは治療又は治療介入における使用であり得る。特に、該使用はがん若しくは腫瘍の予防若しくは治療における又はアジュバントとしての使用であり得る。
【００１７】
医学的使用ががん／腫瘍の予防又は治療である場合、腫瘍は造血起源の腫瘍及び非造血起源の腫瘍から選択され得る。
【００１８】
アジュバントとしての本発明の作用物質の使用は、特定の抗原に限定されないが、免疫原性の低い抗原とともに投与することが好ましい。
【００１９】
さらに、本発明は、がん若しくは腫瘍の予防若しくは治療に使用されるか、又はアジュバントとして使用される、少なくとも１つの上に規定されるＣＤ５又はＣＤ６の可溶性タンパク質アイソフォームと、任意の薬学的に許容可能な賦形剤又は担体とを含む医薬組成物を提供する。該医薬組成物は少なくとも１つの更なる活性成分を含んでいてもよい。更なる活性成分は化学療法剤及び治療抗体の群から選択され、該化学療法剤は更に好ましくは細胞増殖抑制剤及び細胞毒性剤の中から選択され得る。
【００２０】
本発明は、ＣＤ５の可溶性アイソフォーム又はＣＤ６の可溶性アイソフォームを発現する非ヒト動物も提供する。該動物はマウスであり得る。
【００２１】
その一実施の形態では、動物は配列番号２を含むアミノ酸配列をコードする配列番号１を含むヌクレオチド構築物を含む。本発明者らは、この動物が実験的に誘発された自己免疫疾患の増強の表現型及び腫瘍／がん進行に対する耐性を示すことを示した。配列番号２が動物において過剰発現されることが好ましい場合もある。
【００２２】
別の実施の形態では、動物はＣＤ６をコードするヌクレオチド構築物を含む。ＣＤ６がｌｃｋプロモーター及びＩｇＨエンハンサー下で発現されることが好ましい場合もある。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施例１に関する、テールＤＮＡに由来するｒｓｈＣＤ５をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）のＰＣＲ増幅の結果であるアガロースゲルの画像である。ヒトＣＤ５の細胞外ドメインの一部を含むＰＣＲ産物が、トランスジェニックマウスにおいて期待されるサイズ（４５０塩基対（ｂｐ））で検出された（ゲルの上部の黒字の数字）。マウスＭＨＣクラスＩＩ関連不変鎖（ＬＩＥＸ）遺伝子のエキソン領域に相当する１５０ｂｐの断片も、ＰＣＲの内部対照として増幅した。
【図２】実施例１に関する、野生型非トランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｂ／６）及び配列番号２を過剰発現するトランスジェニックｒｓｈＣＤ５Ｔｇマウス（ｔｇＣＤ５）からのプール血清のウエスタンブロット分析の画像である。更に右のレーンは、５０ｎｇのアフィニティー精製ｒｓｈＣＤ５を陽性対照として含有する。ｒｓｈＣＤ５（配列番号２）は、ＣＮＢｒ活性化セファロースビーズに結合させた抗ヒトＣＤ５  Ｃｒｉｓ−１  ｍＡｂを用いてプールマウス血清から免疫沈降した。次いで、免疫複合体を、抗ヒトＣＤ５  ｍＡｂ  Ｌｅｕ−１及びホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇを用いたウエスタンブロット法によって分析した。分子量標準をパネルの左側に示す。ＬＤは分子量標準のレーンである。
【図３】実施例２に関する、野生型（ｗｔ又は丸）非トランスジェニックマウスに対する、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５Ｔｇマウス（四角の点）における末梢Ｔリンパ球亜集団のフローサイトメトリー分析の結果を示す図である。すなわち、この画像は、リンパ節（ＬＮＣ）及び脾臓（ＳＣ）におけるシングルポジティブ（ＣＤ４＋又はＣＤ８＋）Ｔ細胞の比率を示す。データは、リンパ節細胞及び脾臓細胞を抗ＣＤ３特異的ｍＡｂ、抗ＣＤ４特異的ｍＡｂ及び抗ＣＤ８特異的ｍＡｂで染色して、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞又はＣＤ４−ＣＤ８−細胞を同定したアッセイによるものである。
【図４】実施例２に関する、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウス（四角い点）及び非トランスジェニックマウス（ｗｔ又は丸い点）におけるＢリンパ球亜集団のフローサイトメトリー分析の結果を示す図である。脾臓細胞をＩｇＭ、ＩｇＤ、Ｂ２２０、ＣＤ２３及びＣＤ９３／ＡＡ４に対するｍＡｂで染色して、移行性１（Ｔ１）細胞、移行性２（Ｔ２）細胞及び辺縁帯（ＭＺ）細胞を区別した。
【図５】実施例２に関して、パネルＡには、Ｂ２２０、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＣＤ５に対するｍＡｂでの染色によって同定された、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウス（四角）及び非トランスジェニックマウス（ｗｔ又は丸）からの腹腔洗浄サンプルにおける種々の割合のＢ１ｂ細胞、Ｂ１ａ細胞及び成熟Ｂ細胞（Ｍ）を示す。パネルＢには、野生型非トランスジェニックＣ５７Ｂｌ／６マウスへのｒｓｈＣＤ５の外因性投与によって引き起こされたＢ１ａ細胞の変化を示す。ｓｈｒＣＤ５は可溶性ヒト組換えＣＤ５（配列番号２である）を意味する。ｓｈｒＣＤ５及びｒｓｈＣＤ５は、本発明において同義語として使用される。
【図６】同様に実施例２に関する、調節性Ｂ（Ｂｒｅｇ）細胞及び調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の分析を示す図である。パネルＡには、ｒｓｈＣＤ５ｔｇトランスジェニックマウス（四角）及び非トランスジェニックマウス（ｗｔ又は丸い点）からの腹腔洗浄（ＰＣ）サンプル及び脾臓（ＳＣ）サンプルにおけるＢｒｅｇ細胞（Ｂ２２０、ＩＬ−１０、ＣＤ１ｄ、ＣＤ５に対する抗体で染色した）の分析を示す。パネルＢには、非トランスジェニック野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスへのｒｓｈＣＤ５（ｓｈｒＣＤ５）の外因性投与によって引き起こされたＢｒｅｇ亜集団の変化を示す。パネルＣには、ＣＤ５欠損マウス（ＣＤ５  ＫＯ）及びＣＤ５の切断型を発現するトランスジェニックマウス（ΔＣＫＩＩ）における脾臓Ｂｒｅｇ（ＳＣ  Ｂ１０）細胞の比率を示す。パネルＤには、非トランスジェニック野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスへのｒｓｈＣＤ５（ｓｈｒＣＤ５）の外因性投与によって引き起こされたＴｒｅｇ亜集団（抗ＣＤ４、抗ＣＤ２５及び抗ＦｏｘＰ３で染色した）の変化を示す。最後に、パネルＥには、ｒｓｈＣＤ５ｔｇマウス及び非トランスジェニックマウスの胸腺（ＴＣ）、脾臓（ＳＣ）及びリンパ節（ＬＮＣ）におけるＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４、ＣＤ２５及びＦｏｘＰ３に対するｍＡｂで染色した）の分析を示す。
【図７】同様に実施例２に関して、パネルＡから、ｒｓｈＣＤ５ｔｇトランスジェニックマウス（四角い点）が、非トランスジェニックマウス（丸い点）と比較して脾臓におけるＮＫＴ細胞数の増加を示すことが示される。パネルＢから、この増加が野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスへのｒｓｈＣＤ５又は対照非関連タンパク質（ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）の投与後にも観察され得ることが示される。ＮＫＴ細胞は、ＣＤ３及びＮＫ１．１に対するｍＡｂでの染色によって同定した。
【図８】実施例２に関する、ｒｓｈＣＤ５ｔｇトランスジェニックマウス（四角い点）及び非トランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウス（丸い点）における実験的アレルギー性脳炎（ＥＡＥ）誘導の分析を示す図である。疾患進行は、疾患誘導後の時間（Ｔ、日数（ｄ））の関数としての臨床スコア（ＣＳ）で表される。
【図９】同様に実施例２に関する、ｒｓｈＣＤ５ｔｇトランスジェニックマウス（四角い点）及び非トランスジェニックマウス又は野生型（丸い点）におけるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）の誘導の分析を示す図である。疾患進行はＣＳで表される。放射線医学的所見（関節インピンジメント、ＪＩ；辺縁部侵食、ＭＥ；浮腫、Ｅ；及び骨減少、Ｏ）の個々のスコアを各マウスについて示す。
【図１０】同様に実施例２に関する、ＣＩＡの誘導後のＤＢＡ／１マウスとトランスジェニックｒｓｈＣＤ５Ｔｇマウス（Ｆ１  ＴｇＣＤ５＋）及び非トランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｆ１  ＷＴ）との交配によるＦ１マウスにおけるサイトカイン及び抗コラーゲン抗体のレベルを示す図である。パネルＡには、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって関節組織において測定し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化したＩＬ−６のレベルを示す。結果は任意単位（Ａ．Ｕ．）で表される。Ｃは対照（非免疫付与）動物を意味する。パネルＢには、０日目及び８週目（Ｗ８）のトランスジェニックマウス血清（四角い点）及び非トランスジェニックマウス血清（丸い点）における、ＥＬＩＳＡで測定されるＩＩ型コラーゲンに対するＩｇＧ１、ＩｇＧ２及び全ＩｇＧの４０５ｎｍでの光学密度（ＯＤ）として抗体のレベルを示す。
【図１１】実施例３に関する、非トランスジェニック野生型（丸）Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｗｔ）と比較した、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウス（四角）におけるＢ１６黒色腫腫瘍の成長を示すグラフである。ＴＤは、ミリメートル（ｍｍ）単位の腫瘍直径である。Ｔは日数（ｄ）単位の時間である。
【図１２】トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウス（四角い点）と非トランスジェニックマウス野生型Ｃ５７Ｂｌ／６（ｗｔ、丸い点）とを比較する実験的転移アッセイの結果である。ＮＭは、Ｂ１６細胞のｉ．ｖ．注射の１５日後に肺表面で計数した肉眼的肺転移数を意味する。
【図１３】Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて腫瘍細胞の注射の１８日後に観察された腫瘍直径（ＴＤ）（ｍｍ）を示す図である。マウスをｒｓｈＣＤ５（配列番号２、腫瘍細胞注射の日から４８時間毎に２５μｇ）＋化学療法（腫瘍細胞注射の３日後のビンクリスチン０．５ｍｇ／ｋｇ＋ドキソルビシン３．３ｍｇ／ｋｇの単回投与）（ｒｓｈＣＤＤ５、四角い点）又は化学療法単独（ビヒクル、Ｖ、丸い点）で処理した。
【図１４】実施例３に関する、ＲＭＡ−Ｓリンパ腫細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの成長を示す図である。５×１０４個の（Ａ）ＲＭＡ−Ｓ細胞を、ｒｓｈＣＤ５Ｔｇマウス又は非トランスジェニックＣ５７Ｂｌ／６マウス（１群当たりｎ＝５〜７）の背部にｓ．ｃ．注射した。腫瘍成長を週に３回ノギスを用いてモニタリングした。（Ｂ）１×１０５個のＲＭＡ−Ｓ細胞を、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（１群当たりｎ＝５）の背部にｓ．ｃ．注射した。マウスを５日目から開始して４８時間毎にビヒクル又はｒｓｈＣＤ５（２５μｇ）でｉ．ｐ．処理した。化学療法（２ｍＭドキソルビシン、５０μｌ）を１４日目に腫瘍内投与した（矢印）。腫瘍成長を週に３回ノギスを用いてモニタリングした。（Ｃ）ＲＭＡ−Ｓ腫瘍を切除し、加圧型細胞破砕装置を用いた機械的破砕によって腫瘍溶解物を得た。次いで、ＥＬＩＳＡによって粗腫瘍溶解物中の腫瘍内ＩＬ−１０サイトカインを測定した。結果を全タンパク質１ｍｇ当たりで表す。
【図１５】同様に実施例３に関する、ＭＣＡ２０５肉腫細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの成長を示す図である。（Ａ）５×１０４個のＭＣＡ２０５細胞を、ｒｓｈＣＤ５Ｔｇマウス又は非トランスジェニックＣ５７Ｂｌ／６マウス（非Ｔｇはｎ＝８及びｒｓｈＣＤ５Ｔｇはｎ＝６）の背部にｓ．ｃ．注射した。化学療法（２ｍＭドキソルビシン、５０μｌ）を１４日目にｉ．ｐ．投与した（矢印）。（Ｂ）実験終了時に腫瘍を切除し、測定し、秤量した。腫瘍重量はグラム量である。
【図１６】実施例４に関する、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスにおけるハプテン特異的抗体応答を示す図である。トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウス同腹子（ｎ＝３、三角の点）及び非トランスジェニック野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウス同腹子（ｎ＝４、四角い点）のＩ型胸腺非依存性応答を、マウス免疫付与後の抗体産生によって決定した。マウスに５０μｇのＴＮＰ−ＬＰＳのｉ．ｐ．注射を１回行った。ＴＮＰに特異的なＩｇＭ並びにＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ及びＩｇＧ３の力価を、０日目（ｄ０）、７日目（ｄ７）及び１４日目（ｄ１４）に２０００倍希釈の血清を用いたＥＬＩＳＡ（光学密度ＯＤ、４５０ｎｍ）によって決定した。
【図１７】実施例５に関する、敗血症誘導の３日後の脾臓Ｔｒｅｇ亜集団（％ＣＤ４４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）の分析の結果を示す図である。選ばれたモデルにおいて、野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの盲腸結紮穿刺（cecal ligation and puncture）（ＣＬＰ）によって実験的敗血症を誘導した。調節性Ｔ細胞亜集団を偽（ＳＨ）手術マウス、非処理マウス（生理食塩溶液、ＳＳ）及びｒｓｈＣＤ６（ＣＤ６）で処理したマウスにおいて分析した。ＳＳ群とＣＤ６群との間のＰ値は０．０５未満である。
【図１８】実施例６に関する、腫瘍成長におけるｒｓｈＣＤ６の役割の分析を示す図である。（Ａ）１×１０５個のＢ１６黒色腫細胞を、ｒｓｈＣＤ６ｌｃｋトランスジェニックマウス又は非トランスジェニックＣ５７Ｂｌ／６マウス（１群当たりｎ＝５）の背部にｓ．ｃ．注射した。腫瘍成長を週に３回ノギスを用いてモニタリングした。（Ｂ）１×１０５個のＢ１６細胞を、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（１群当たりｎ＝５）の背部にｓ．ｃ．注射した。マウスを腫瘍注射の日から開始して４８時間毎にビヒクル又はｒｓｈＣＤ６（２５μｇ）でｉ．ｐ．処理した。化学療法（ビンクリスチン１ｍｇ／ｋｇ、ドキソルビシン３．３ｍｇ／ｋｇ）を、腫瘍注射の３日後にｉ．ｐ．投与した。（Ｃ）１×１０５個のＲＭＡ−Ｓリンパ腫細胞を、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（１群当たりｎ＝５）の背部にｓ．ｃ．注射した。マウスを腫瘍注射の日から開始して４８時間毎にビヒクル又はｒｓｈＣＤ６（２５μｇ）でｉ．ｐ．処理した。化学療法（ドキソルビシン３．３ｍｇ／ｋｇ）を腫瘍注射の５日後及び１２日後にｉ．ｐ．投与した。
【図１９】ヒト組換え可溶性タンパク質ＣＤ５（ｒｓｈＣＤ５すなわち配列番号２）を発現する発現ベクター構築の概略図である。ｓＣＤ５は配列番号１を意味し、Ａｍｐはアンピシリン耐性をもたらす遺伝子であり、Ｎｅｏはネオマイシン耐性をもたらす遺伝子であり、ＳｃａＩ、ＸｈｏＩ、ＡｐａＩ、ＡｐａＬＩは制限エンドヌクレアーゼ部位であり、ＳＶ４０プロモーターはＳＶ４０プロモーターをコードする配列、すなわち配列番号１０であり、ＥμはＥμエンハンサーをコードする配列であり、ＳＶ４０−Ｐｏｌｉ  Ａはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０ウイルス）に由来するポリアデニル化シグナルをコードする配列であり、ｐＩｇＨＳＶ４０ｓＣＤ５はｒｓｈＣＤ５、すなわち配列番号２を産生する発現ベクターである。
【図２０】ヒト組換え可溶性タンパク質ＣＤ６（ｒｓｈＣＤ６すなわち配列番号３）を発現する発現ベクター構築の概略図である。ｒｓｈＣＤ６は配列番号３を意味し、ＸｂａＩ、ＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩは制限エンドヌクレアーゼ部位であり、ｌｃｋ近位プロモーターはｌｃｋキナーゼの近位プロモーターをコードする配列であり、ＥμはＥμエンハンサーをコードする配列であり、ｐ１０２６×ｒｓｈＣＤ６はｒｓｈＣＤ６、すなわち配列番号３を産生する発現ベクターである。
【図２１】実施例７に関する、耳ＤＮＡに由来するｒｓｈＣＤ６をコードするヌクレオチド配列（配列番号３）のＰＣＲ増幅の結果であるアガロースゲルの画像である。ヒトＣＤ６の細胞外ドメインの一部を含むＰＣＲ産物が、トランスジェニックマウスにおいて期待されるサイズ（４９５塩基対（ｂｐ））で検出された。マウスＭＨＣクラスＩＩ関連不変鎖（ＬＩＥＸ）遺伝子のエキソン領域に相当する１５０ｂｐの断片も、ＰＣＲの内部対照として増幅した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書中で使用される用語及び定義
本発明の意味において、「細胞成長障害」は異常な、無制御な、異所性の又は悪性の細胞成長を伴って進行する任意の疾患又は病気を包含する。これは、細胞が正常時よりも急速に成長又は分裂すること、及び／又は細胞が循環系（リンパ又は血液）に入り、通常とは異なる他の器官又は系に侵入し得ること（転移）を意味する。細胞成長障害はがん及び／又は腫瘍を含む。
【００２５】
タンパク質「アイソフォーム」は、同じタンパク質の幾つかの異なる形態のいずれかを意味する。種々の形態のタンパク質が関連遺伝子から産生されるか、又は同じ遺伝子から選択的スプライシング若しくはタンパク質分解切断、リン酸化、グリコシル化等の翻訳後修飾によって生じる場合がある。また、同じ遺伝子の対立遺伝子間の僅かな遺伝的差異である単一ヌクレオチド多型（single-nucleotide polymorphisms）、すなわちＳＮＰによって多数のアイソフォームが生じる。これらは遺伝子内の特異的な個々のヌクレオチド位置で起こる。代替的には、アイソフォームを従来の分子生物学的手法によって人工的に生成することができる。アイソフォームは、本明細書中で使用される場合、完全長タンパク質の断片も含む。例えば、（例えば天然）完全長タンパク質の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％のアミノ酸配列を有するポリペプチドを、該完全長タンパク質のアイソフォームと称することができる。例としては、本明細書中でそれぞれ開示されるＣＤ５及びＣＤ６の可溶性アイソフォームが挙げられる。
【００２６】
アイソフォームは、本明細書中で使用される場合、糖型、すなわち（本質的に）そのグリコシル化パターンが異なるタンパク質変異体の概念も含む。
【００２７】
「腫瘍進行耐性」とは、（治療した）腫瘍が対照（未治療）腫瘍のように成長及び／又は転移しないことを意味する。治療の際に、その成長速度を治療によって遅くすることができる。腫瘍の成長速度が低下する場合、治療の成功のために健康への及び審美的なプラスの影響が生じることが示唆される。
【００２８】
本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して、「含む（comprise）」という単語及び単語の変化形は、通常は限定的なものではなく、例えば技術的特徴、付加物、構成要素又は工程であり得る他の特徴を排除するものではない。しかしながら、「含む」という単語が本明細書中で使用される場合には、この単語が限定的なものとして理解される特別な実施形態も含まれる。この特定の実施形態では、「含む」という単語は「のみからなる（consist of）」という用語の意味を有する。
【００２９】
「アジュバント」は、本明細書中で使用される場合、単独では薬理効果を僅かしか又は全く有しないが、他の作用物質と（本質的に）同時に、しばしば（本質的に）同じ投与経路で（本質的に）同じ部位に（例えば同じ筋肉への注射）与えられる場合、他の作用物質の効力又は効能を増大させることができる物質である。より具体的には、免疫付与との関連で使用される場合、アジュバントは、それ自体で任意の特異的な抗原性効果を有することなく免疫系を刺激するか、又は免疫系を刺激し、免疫剤に対する応答を増大させることができる物質である。より具体的には、免疫学的アジュバントは、特定の抗原剤（複数の場合もあり）と併用した場合に抗原特異的な免疫応答を促進、延長又は強化するように作用する物質として定義することができる。
【００３０】
本発明の作用物質
本発明は、ＣＤ５及び／又はＣＤ６並びにこれらのタンパク質のアイソフォームの新たな医学的使用を提供する。分化抗原群（Cluster of differentiation）５及び６（ＣＤ５及びＣＤ６）は、スカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメインから構成されるスカベンジャー様リンパ球受容体である。本発明者らは驚くべきことに、これらの作用物質が免疫調節特性を有することを見出した。この観察結果に基づいて、本発明者らは、免疫刺激によって利益を得る可能性のある病態に対するこれらの作用物質を提供する。特に、本発明者らは、がん及び／又は腫瘍の治療又は予防のための、並びに免疫付与のために用いられるアジュバントとしての、ＣＤ５及び／又はＣＤ６の使用を提供する。
【００３１】
分化抗原群５（ＣＤ５）は、リンパ球表面上のアクセサリー分子として作用する６７ｋＤａのモノマー糖タンパク質である。ＣＤ５は発生の初期段階の胸腺細胞、成熟末梢Ｔリンパ球、及びＢ１ａと呼ばれる成熟Ｂリンパ球亜集団で発現される。ＣＤ５は、免疫応答と関連する、よく保存された古代タンパク質群であるスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）スーパーファミリーのＢ群に属する。ＳＲＣＲのＢ群のメンバーには、免疫細胞の発生並びに先天性免疫応答及び特異的免疫応答の調節に関与する膜タンパク質及び分泌タンパク質の両方が含まれる。これらの中には、ＣＤ５と密接に関連する糖タンパク質であり、主にリンパ系に限局されるために共通した多くの構造的特徴及び機能的特徴、並びに同様の組織発現パターンを有するＣＤ６が含まれる。興味深いことに、ＣＤ５及びＣＤ６をコードする遺伝子は同じ染色体領域に位置し、共通の祖先遺伝子の重複から生じると考えられる。これより、これらをスカベンジャー様リンパ球受容体と称するものとする。
【００３２】
ＣＤ５は、シグナル伝達における機能に適合する、潜在的なチロシンリン酸化モチーフ及びセリン／トレオニンリン酸化モチーフを有する比較的大きな細胞質ドメインを有する。実際に、ＣＤ５は、Ｔ細胞及びＢ細胞上に存在する抗原特異的受容体と結合することにより、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びＢ細胞受容体（ＢＣＲ）のシグナル伝達を調節することが示されている。興味深いことに、ＣＤ５の関与は、分析する細胞型及び成熟段階に応じて異なる調節シグナルをもたらし得る。成熟Ｔ細胞では、ＣＤ５は初めＴＣＲ受容体シグナル伝達の共同刺激因子とみなされていたが、その後の研究から、胸腺細胞におけるＴＣＲシグナル伝達及びＢ１ａ細胞におけるＢＣＲシグナル伝達の負の調節因子としてのこの分子の役割が示されている。これら全てのデータから、ＣＤ５が直接的又は間接的に関与するプロセスの複雑さが示される。
【００３３】
ＣＤ５は膜貫通分子であるが、ＣＤ５の可溶性形態（ｓｈＣＤ５）が活性化Ｔリンパ球においてタンパク質分解切断の結果として生成され得る（Calvo et al. "Identification of a natural soluble form of human CD5" Tissue Antigens-1999, Vol. 54(2), pp:128-37）。低レベルのｓｈＣＤ５（ピコモル範囲）が健常ヒト個体の血清中で同定されたが、この形態の個別の発現の増大が関節リウマチ、原発性シェーグレン症候群及びアトピー性皮膚炎等の幾つかの自己免疫障害において報告されている。ｓｈＣＤ５の機能的関連性は未だ完全に調べられてはいないが、このタンパク質のレベルの上昇が或る特定の自己免疫疾患において見られることから、ｓｈＣＤ５が慢性の若しくは増強したＴ細胞活性化の指標であり得るか、又は代替的には未だ特徴が明らかでなく、議論の的になっているＣＤ５リガンド（単数又は複数）と相互作用することによって免疫応答の調節に役割を果たし得ることが示唆されている。
【００３４】
免疫応答におけるＣＤ５の複雑な役割を考慮し、この分子を妨げることによって応答を調節し、がん療法を更に促進することを目的として、ｍＡｂをＴ細胞分化受容体ＣＤ５に対して産生させる幾つかのアプローチが開発されている。
【００３５】
本発明者の発見は、従来技術が異なる方向を指し示すことを考えれば驚くべきものである。例えば、Hollander et al.（"Immunotherapy of lymphoid and nonlymphoid tumours with monoclonal anti-Lyt-1 antibodies", The Journal of Immunology-1984, Vol. 133(5), pp.:2801-2805）は、抗ＣＤ５抗体の使用によるＣＤ５の架橋が有益な抗腫瘍効果を有することを示唆している。Hollander et al.は、抗体とヒトＣＤ５のマウスオーソログであるＬｙｔ−１受容体との相互作用によってリンパ系腫瘍及び非リンパ系腫瘍（肺癌及びＥＬ４白血病）の成長を阻害する能力を有する、非細胞毒性の抗Ｌｙｔ−１  ｍＡｂを開示している。基礎となる細胞機構、すなわち有益な抗腫瘍効果がＣＤ５エフェクター機能の誘起又は遮断のいずれに起因するかについては、依然として謎である。
【００３６】
一方、Axtell et al.（"Cutting Edge: Critical Role for CD5 in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis: Inhibition of Engagement Reverses Disease in Mice", The Journal of Immunology-2004, Vol. 173, pp.: 2928-2932）は、ＣＤ５−／−マウスにおいて実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の発症が遅れ、その重症度が軽減されたことを記載している。Axtell et al.は、ＣＤ５活性の遮断がマウスにおけるＥＡＥの治療に対して治療的に有益であると結論付けている。
【００３７】
したがって、Axtell et al.の教示は、ＣＤ５の非発現又は遮断をＥＡＥ（自己免疫疾患）を治療するのに良い方法とみなすことの論理的根拠をもたらす。ＣＤ５−／−マウスでは自己免疫応答が軽減されるため、ＣＤ５の非発現又は遮断はがんと闘うのに有望な戦略ではない。この論理的根拠はHollander et al.（上掲）の教示とは正反対である。
【００３８】
この議論の的になっている状況を考えると、現時点ではＣＤ５の推定リガンド（単数又は複数）について殆ど知られていないことが更に述べられる。これに関し、Brown et al.は"A Ligand for CD5 Is CD5", The Journal of Immunology-2010, Vol. 185, pp.: 6068-6074において、ＣＤ５自身がＣＤ５のリガンドであると提唱している。この結論は、固定化したビオチン化ＣＤ５−ＣＤ４融合タンパク質と相互作用させたラット、マウス及びヒトに由来する可溶性ＣＤ５アイソフォームの配列を含有する種々のキメラ可溶性タンパク質の試験の結果によって得られる。Brown et al.は、マウスＣＤ５がヒト、マウス及びラットに由来するＣＤ５と再現性良く結合するが、ヒトＣＤ５はヒトＣＤ５としか反応しないと結論付けている。
【００３９】
多数のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験から、ＣＤ５がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を介したシグナル伝達を調節することが可能なタンパク質であると示されている。ＣＤ５−／−マウスから単離された免疫細胞が多様な刺激に対して過反応性であったため、ＣＤ５欠損マウスの発生によって、このタンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏでＴＣＲ／ＢＣＲシグナル伝達に対する全体的阻害効果を有することが明らかになった（"A role for CD5 in TCR-mediated signal transduction and thymocyte selection" Science 1995, Vol 269(5223), pp.: 535-7）。このことから、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＤ５機能の欠陥が、ＴＣＲ／ＢＣＲシグナル阻害の低減によって免疫応答を強化し得ることが示唆される。
【００４０】
ＣＤ５欠損マウスはＣＤ５機能の研究にとって良好なモデルであるが、患者の遺伝子の不活性化が現在実現可能でも現実的でもないため、このモデルから得られた発見を直接臨床に置き換えることはできない。そのため、ＣＤ５の機能を損なう可能な方法は、膜結合ＣＤ５とそのリガンド（単数又は複数）との間の相互作用の遮断であり得る。残念なことに、このアプローチは現時点でのＣＤ５リガンド（単数又は複数）に関する情報の不足によって妨げられる。様々なグループによって報告されたＣＤ５リガンドに関し、別のグループによって報告された結果を再現することができたグループが存在しないという議論の重要な要素がある。さらに、これまでに記載されたリガンドはＣＤ５の機能を完全に説明することはできない。そのため、ＣＤ５とそのリガンド（単数又は複数）との間の相互作用をリガンドに依存せずに遮断し得る代替的なアプローチを開発する必要がある。
【００４１】
病原体に結合するその能力から、ＣＤ５はスカベンジャー様リンパ球受容体とみなされ、これはＣＤ５と多数の共通した構造的特徴及び機能的特徴を有するＣＤ６にも適用される定義である（上記を参照されたい）。ＣＤ６の可溶性形態（ｓＣＤ６）も以前に記載されているが（Ramos-Casals et al "High circulating levels of soluble scavenger receptors (sCD5 and sCD6) in patients with primary Sjoegren's syndrome" Rheumatology-2001 Vol. 40(9), pp.:1056-1059）、その表面上の保存構造（病原体関連分子パターン（pathogen-associated molecular patterns）、ＰＡＭＰ）との相互作用によって病原体に結合することが可能であることを除いて、その生理的機能（単数又は複数）に関する情報は実質的に皆無である。
【００４２】
ＣＤ５及び／又はＣＤ６は、各々単独で又は両方一緒に本明細書中で「本発明の作用物質」と称される。本発明の作用物質の好ましい実施形態を以下に記載する。
【００４３】
好ましくは、ＣＤ５は哺乳動物ＣＤ５、より好ましくはヒトＣＤ５である。好ましくは、ＣＤ６は哺乳動物ＣＤ６、より好ましくはヒトＣＤ６である。
【００４４】
このため、好ましい実施形態では、本発明の作用物質はヒトＣＤ５及びヒトＣＤ６からなる群より選択される。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、ＣＤ５はＣＤ５の可溶性アイソフォームであるのが好ましく、ＣＤ６はＣＤ６の可溶性アイソフォームであるのが好ましい。「可溶性」とは、本発明の作用物質が生理的条件下、すなわち生理的ｐＨ及び生理的イオン強度で可溶性形態で存在することを意味する。好ましい実施形態では、可溶性アイソフォームはＣＤ５又はＣＤ６の細胞外ドメインからなる。
【００４６】
明らかに、本発明の作用物質として使用される配列番号２及び配列番号３の変異体には、これらの全ての個体間自然変異体又は人工的に誘導された変異体が含まれる。かかる変異体としては、一部のアミノ酸、例えば２個又は３個のアミノ酸の数及びタイプの変化、並びに全体的なタンパク質３次元構造を変えず、タンパク質機能の維持を可能にするアミノ酸置換（任意）を示す変異体を挙げることができる。タンパク質機能の維持は、配列番号２又は配列番号３に由来する外来性タンパク質を未処理又はＢ１６黒色腫細胞を皮下移植したＣ５７Ｂｌ／６マウスに全身投与及び長期投与することによって試験することができる。前者の場合は、調節性Ｔ細胞及び／又は調節性Ｂ細胞の数が減少するか又はエフェクターＮＫＴ細胞の数が増加すると、タンパク質が機能的であるとみなされる。後者の場合は、非処理動物に対して腫瘍及び転移の数が減少すると、タンパク質が機能的であるとみなされる。より典型的には、本発明のタンパク質は配列番号２又は配列番号３との配列同一性によって規定される。その実施形態には、（ａ）配列番号２と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、更により好ましくは９９％以上の同一性を有するポリペプチド配列、又は（ｂ）配列番号３と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、更により好ましくは９９％以上の同一性を有するポリペプチド配列から選択されるポリペプチド配列の変異体が含まれる。更により好ましくは、本発明の作用物質は、配列番号２及び配列番号３の群から選択される配列を含むか、又はそれからなるタンパク質の中から選択される。
【００４７】
より好ましい実施形態では、本発明の作用物質は、配列番号２及び配列番号３からなる群より選択される配列を含むか又はそれからなり、配列番号２が特に好ましい。したがって、より好ましい実施形態では、スカベンジャー様リンパ球受容体の可溶性タンパク質アイソフォームは配列番号２からなる。
【００４８】
配列番号２は、ヒトＣＤ５の成熟可溶性アイソフォームに相当する。この成熟アイソフォームは、ヒトＣＤ５の未成熟タンパク質アイソフォームのプロテアーゼによるタンパク質分解プロセスの結果である。該未成熟アイソフォームは配列番号１３を含み、配列番号１のヌクレオチド配列の転写及び翻訳によって生じる。配列番号１３からリーダーペプチドシグナル配列に相当する最初の２４個のＮ末端アミノ酸（すなわち配列番号１４）が失われると、配列番号２が得られる。ヒトＣＤ５受容体の全配列は、アクセッション番号Ｐ０６１２７（ＣＤ５＿ＨＵＭＡＮ、最終更新日２０１０年１１月３０日。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースのバージョン２）で特定されるものである。この配列は膜アイソフォームの受容体に相当する。生理学的には、ＣＤ５の可溶性アイソフォームは膜結合アイソフォームのタンパク質分解切断によって得られるが、正確な切断部位は知られておらず、配列番号２は推定切断部位付近への終止コドンの付加によって得られる。終止コドンは、このタンパク質の発現に使用されるヌクレオチド配列である配列番号１の最初のヌクレオチドに対して１１８０位にある。この終止コドンは、３４５個のアミノ酸を有するタンパク質を成熟（プロセシング）形態でもたらす。すなわち、配列番号１３（３６９個のアミノ酸を有する）から最初の２４個のＮ末端アミノ酸すなわち配列番号１４が失われる。本明細書全体を通して、不明確ではあるが配列番号２又は配列番号１３のアミノ酸配列が配列番号１から生じると述べられる。配列番号１３は細胞内で最終的にプロセシングされ、配列番号２となり、ヒトＣＤ５の成熟可溶性アイソフォームをもたらすことを理解されたい。
【００４９】
配列番号３は、ヒトＣＤ６の成熟（完全にプロセシングされた）可溶性アイソフォームに相当する。ヒトＣＤ６受容体の配列は、アクセッション番号Ｐ３０２０３（ＣＤ６＿ＨＵＭＡＮ、最終更新日２００９年１２月１５日。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースのバージョン３）で特定されるものである。この配列は膜アイソフォームの受容体に相当する。ＣＤ６の可溶性アイソフォームが同様にタンパク質分解切断によって生成されるかは未だ完全に決定されていない。配列番号３は、膜貫通領域の前にあるストーク領域（stalk region）への終止コドンの付加によって得られる。したがって、別のより好ましい実施形態では、スカベンジャー様リンパ球受容体の可溶性タンパク質アイソフォームは配列番号３を含むか、又はそれからなる。
【００５０】
配列番号１３又は配列番号２のその成熟形態、及び配列番号３は、それぞれ配列番号４及び配列番号５を含むヌクレオチド配列の転写及び翻訳によって生じる。
【００５１】
配列番号１３又は配列番号２のその成熟形態、及び配列番号３はグリコシル化膜受容体の誘導体であるため、グリコシル化可溶性タンパク質である。スカベンジャー様リンパ球受容体の（可溶性及び膜結合）アイソフォームは、どちらも推定Ｎ−グリコシル化モチーフ及びＯ−グリコシル化モチーフを含有する。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動アッセイで泳動する場合の予測分子量と実測分子量との間の相違、及び種々のグリコシダーゼに対する感度から推定することができるように、これらのモチーフの少なくとも一部がグリコシル化されている。現在、具体的なグリコシル化の程度及びタイプは依然として解明されていない。
【００５２】
これらの選好性（preferences）の任意の組合せも本発明で可能であり、例えば本発明のＣＤ５がヒトＣＤ５の可溶性アイソフォームであり、本発明のＣＤ６がヒトＣＤ６の可溶性アイソフォームであってもよい。
【００５３】
本発明の作用物質を組み合わせること、すなわち可溶性ＣＤ５と可溶性ＣＤ６とを配合及び／又はともに投与することも可能である。
【００５４】
本発明の使用
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、調節／抑制機能を有するリンパ球亜集団の数若しくは機能の低減、又はエフェクター亜集団の数若しくは機能の増大による正常又は不十分な免疫応答の強化によって利益を得る可能性のある障害の予防法若しくは免疫療法又は治療介入に使用される可溶性タンパク質アイソフォームは、ＣＤ５及びＣＤ６からなる群より選択される。内在性抗原又は外来性抗原に対する免疫応答の増強によって利益を得る障害又は治療介入は、調節機能を有するリンパ球亜集団の数及び／又は機能が減少する場合、又はエフェクター機能を有する亜集団の数及び／又は機能が増加する場合に起こるように、正常又は不十分な免疫応答の強化によって利益を得る可能性のあるものである。
【００５５】
これらの障害には、既知の調節／抑制機能を有する一部のリンパ球亜集団の数及び／又は機能の減少、又はエフェクター亜集団の数及び／又は機能の増加によって利益を得る可能性のある細胞成長障害又は任意の他の障害が含まれる。これらの例は、正常免疫応答が病原体を完全に排除するのに不十分である、種々の病原体起源（細菌、ウイルス、真菌又は寄生虫）の慢性感染である。同様に、可溶性アイソフォームは、同様に免疫応答の強化によって利益を得る可能性のある治療介入にも有用であり得る。
【００５６】
「免疫応答の強化によって利益を得る可能性のある」ものとして定義される障害又は治療介入は、調節性Ｔリンパ球亜集団及び調節性Ｂリンパ球亜集団の数及び／又は機能の減少、及び／又はエフェクターＴ亜集団、エフェクターＢ亜集団及びナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）亜集団の数及び／又は機能の増加によって利益を得ることができるものである。これらのＴ亜集団、Ｂ亜集団及び非Ｔ非Ｂ亜集団は、例えば蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を用いた表現型分析によって検出することができる。種々のタイプの調節性Ｔ細胞亜集団が存在するが、本発明は中でもＣＤ４、ＣＤ２５及びＦｏｘＰ３の同時発現（joint expression）を特徴とする細胞（本発明において「Ｔｒｅｇ」と呼ばれる）に焦点を合わせるものである。同様に、幾つかの異なるタイプの調節性Ｂ細胞亜集団が存在するが、本発明はＢ２２０、ＣＤ１ｄ、ＣＤ５及びＩＬ−１０の同時発現を特徴とする細胞（本発明においてＢ１０又は「Ｂｒｅｇ」と称される）に焦点を合わせるものである。同様に、本発明はＣＤ３及びＮＫ１．１を同時発現するエフェクター細胞の亜集団（「ＮＫＴ」と呼ばれる）、並びにＢ２２０＋ＩｇＭｈｉｇｈＩｇＤｌｏｗＣＤ２３ｌｏｗＣＤ２１ｈｉｇｈを同時発現する亜集団（辺縁帯（ＭＺ）Ｂ細胞と呼ばれる）に焦点を合わせるものである。
【００５７】
下記の実施例で説明されるように、細胞成長障害（がん又は腫瘍）の特定の事例では、成長障害の予防又は治療へのスカベンジャー様リンパ球受容体の可溶性又は循環タンパク質アイソフォームの使用は、腫瘍及びがん細胞成長を阻害する予期せぬ効果を示唆し、同時に或る器官又は器官の一部から別の非隣接器官又は器官の一部への転移又は細胞進展を回避するものである。
【００５８】
本発明におけるＣＤ５及びＣＤ６の具体的な使用は、（１）がん及び／又は腫瘍の予防又は治療における使用、並びに（２）アジュバントとしての使用である。
【００５９】
がん又は腫瘍の予防又は治療におけるＣＤ５（配列番号２によって例示される）及びＣＤ６の可溶性タンパク質アイソフォームの具体的な使用は、腫瘍成長の進行を顕著に低下させるだけでなく、転移の数を減少させるため、魅力的である。ＣＤ５がＣＤ５のリガンドであり得ると仮定すると、ヒトアイソフォームがマウスモデルにおいて作用することが可能であることは、以前の報告（Brown et al., 2010）に反するため、予期せぬことである。ヒトアイソフォームは他の種に由来するオーソログとは相互作用しない。
【００６０】
がんの治療用のスカベンジャー様リンパ球受容体を伴う従来技術の取組みは、ＣＤ５膜受容体に対するｍＡｂを使用することであった。このため、文献中の証拠は、がんの治療におけるスカベンジャー様リンパ球受容体の可溶性アイソフォーム（ＣＤ５又はＣＤ６）の潜在的な役割を指摘していない。下記に説明されるように、本発明者らが提唱する戦略は、膜受容体自体ではなく、そのリガンド（単数又は複数）を架橋すると予測される、スカベンジャー様リンパ球受容体の可溶性形態の使用を伴う非ｍＡｂアプローチに基づく。
【００６１】
本発明のこの態様は、免疫応答の強化によって利益を得る可能性のある障害、がん及び腫瘍からなる群より選択される細胞成長障害の予防又は治療（例えば免疫療法）に使用されるスカベンジャー様リンパ球受容体の可溶性タンパク質アイソフォームの使用としても定式化され得る。より具体的に言い換えると、本発明は、がん又は悪性腫瘍を患う被験体を治療的に有効な量の本発明の作用物質の可溶性タンパク質アイソフォームで治療する方法を導き出すものである。
【００６２】
本発明者らは、ＣＤ５及びＣＤ６をアジュバントとして使用することができることを更に示した。ＣＤ５及び／又はＣＤ６が抗原の効果を強化すると結論付けることができる。これを受けて、本発明の作用物質は通常は抗原とともに投与される。該抗原は、胸腺依存性（ＴＤ）抗原及び胸腺非依存性（ＴＩ）抗原の中から選択することができる。免疫原性の低い抗原が好ましい。本発明の作用物質は、免疫原性の低い抗原又は非免疫原性の抗原とともに投与するのが好ましい。これらの抗原としては、とりわけ糖脂質性分子、例えば肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）の莢膜多糖類、（重合）サルモネラフラジェリン、ポリ−Ｄ−アミノ酸及びリポ多糖類、例えば大腸菌リポ多糖類のような外来性起源のＴＩタイプ１（実施例４）抗原；並びにムチン（結腸直腸がん抗原）及び他の腫瘍抗原等の内在性起源の抗原が挙げられる。
【００６３】
本明細書中に報告されるデータから、注入した可溶性ヒトＣＤ５アイソフォームが内在性マウスＣＤ５表面受容体と相互作用せず、その推定免疫調節効果はマウスリンパ球亜集団上で内因性発現したＣＤ５のエフェクター機能の遮断又は活性化に容易に帰されないと推論することができる。
【００６４】
スカベンジャー様リンパ球受容体の可溶性タンパク質アイソフォーム、好ましくはヒトＣＤ５及びヒトＣＤ６が、細胞成長障害及び慢性感染からなる群より選択される障害の予防又は免疫療法において使用されることも本明細書に記載されている。これらの障害は、調節／抑制機能を有するリンパ球亜集団の数若しくは機能の減少、又はエフェクター亜集団の数若しくは機能の増加による正常又は不十分な免疫応答の強化によって利益を得るという共通のパターンを有する。
【００６５】
可溶性タンパク質アイソフォームは、がん及び腫瘍からなる群より選択される細胞成長障害に使用するのが好ましい。より好ましくは、腫瘍は造血器腫瘍（例えば白血病、リンパ腫）又は非造血器腫瘍（例えば肺癌、黒色腫、肉腫、結腸がん、皮膚がん、上皮腫、結腸直腸がん、乳がん、胃がん、卵巣がん、膵臓がん、脳がん、頭頸部がん、食道がん、精巣がん、奇形腫、子宮頸がん）である。
【００６６】
がんが免疫原性腫瘍の中から選択されることも好ましい場合がある。
【００６７】
本明細書中で開示される別の好ましい実施形態では、慢性感染は慢性ウイルス感染（例えばＢ型肝炎及びＣ型肝炎）、慢性原生動物感染（例えばリーシュマニア症、トキソプラズマ症）、慢性細菌感染（例えば結核、ハンセン病）及び慢性真菌感染（例えば粘膜皮膚カンジダ症、クリプトコッカス症）からなる群より選択される。
【００６８】
医薬組成物
本発明の更なる態様は、上記に記載の医学的使用に対する少なくとも１つの本発明の作用物質と、更なる任意の薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
【００６９】
特定の態様は併用療法に使用される医薬組成物に関する。これを受けて、上記の医薬組成物は少なくとも１つの更なる作用物質を更に含む。更なる作用物質のタイプは、当然ながら使用目的に応じて選択される。例えば、医薬組成物ががん療法又は腫瘍療法に使用される場合、更なる作用物質はがん治療剤又は腫瘍治療剤である。一方、医薬組成物が免疫付与に使用される場合（この場合、上記で強調されるように本発明の作用物質はアジュバントである）、更なる作用物質はそれに対して免疫付与が望まれる抗原であり得る。いずれの場合も、更なる作用物質は従来及び／又は現在利用可能な治療法に使用される作用物質の中から選択することができる。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態では、医薬組成物は、スカベンジャー様リンパ球受容体としてＣＤ５、ＣＤ６又はそれらの混合物の可溶性タンパク質アイソフォームの１つを含む。スカベンジャー様リンパ球受容体は、ヒトＣＤ５及びヒトＣＤ６からなる群より選択されるのが好ましい。
【００７１】
さらに、より好ましい実施形態では、医薬組成物は配列番号２及び配列番号３又はそれらの組合せからなる群より選択されるスカベンジャー様リンパ球受容体を含む。配列番号２が最も好ましい。
【００７２】
がんの治療又は予防のための併用療法における医薬組成物の使用
本実施形態では、医薬組成物は放射線療法剤、化学療法剤、免疫療法剤、抗体及びそれらの混合物からなる群より選択されるがん治療剤又は腫瘍治療剤を含み得る。
【００７３】
例としては、更なるがん治療剤又は腫瘍治療剤が化学療法剤である場合、この薬剤はがん治療又は腫瘍治療に有用な既知の全ての薬剤（抗体ではない）の中から選択される。かかる薬剤は多くの場合、細胞増殖抑制剤と細胞毒性剤とに細分することができ、いずれの群も医薬組成物に含まれ得る。具体的な例では、この薬剤はビンクリスチン、ドキソルビシン、カルボプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ビノレルビン、ゲムシタビン、イリノテカン、ドセタキセル、ダカルバジン、ゲフィチニブ、ダサチニブ、イマチニブ、エトポシド、シクロホスファミド及びミトキサントロンからなる群より選択される。
【００７４】
医薬組成物が抗体を含む場合、かかる抗体はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であり得る。「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、ヒト化抗体及び完全ヒト抗体、並びに抗体の変異体、例えば一本鎖抗体（モノクローナルである場合に限る）も含む。特定の場合では、モノクローナル抗体は抗ＣＤ２０抗体及び抗ＨＥＲ２抗体の群から選択することができる。その例はトラスツズマブ及びリツキシマブからなる。
【００７５】
本実施形態で使用される場合、実施例に示されるように併用に起因するプラス効果が存在し得る。多くの化学療法薬が免疫調節効果も示すため、本発明者らはｒｓｈＣＤ５（更にはｒｓｈＣＤ６）が化学療法とより良好に併用されると考えている。
【００７６】
免疫付与用の医薬組成物の使用
本例では、本発明の作用物質はアジュバントとして使用される。上記組成物に含まれる更なる作用物質は、免疫付与が望まれる抗原であり得る。これらの抗原としては、とりわけ胸腺非依存性タイプＩ（ＴＩ−１）抗原（実施例４）、例えば（好ましくは重合した）肺炎連鎖球菌の莢膜多糖類、サルモネラフラジェリン、ポリ−Ｄ−アミノ酸及び大腸菌由来のリポ多糖類が挙げられる。抗原にはタンパク質性の胸腺依存性抗原（ＴＤ）、例えばウシＩＩ型コラーゲン（実施例２）も含まれる。
【００７７】
任意で、１つ又は複数の更なるアジュバントが医薬組成物中に存在していてもよい。更なるアジュバントは、アルミニウム塩、例えばリン酸アルミニウム及び水酸化アルミニウム等の無機アジュバント、並びにスクアレン又は油性アジュバント等の有機アジュバントを含む既知のアジュバントの中から選択することができる。
【００７８】
本発明の医薬組成物は、同時に投与する、又は代替的には順番に投与するように本発明の作用物質及び更なる作用物質が提供される医薬品である。
【００７９】
本発明の動物
本発明は、上記の「本発明の作用物質」に記載のいずれか１つ又は複数の実施形態において本発明の作用物質を発現する動物も提供する。
【００８０】
初めに、本発明者らは、マウスモデルにおける外来性ｓＣＤ５のトランスジェニック発現又は投与が、天然ＣＤ５リガンド（単数又は複数）を隔絶することによって膜結合ＣＤ５機能を損ない、これらのタンパク質間の相互作用を妨げることが可能であり得ると仮定した。結果として、本発明者らは、ｓＣＤ５のヒト組換え型（ｒｓｈＣＤ５）を発現するトランスジェニックマウスを開発した。これらのマウスをｒｓｈＣＤ５Ｔｇと命名した（実施例１）。これらのマウスの表現型は、全体的な亜集団分析に関して非トランスジェニックマウスに極めて類似している。すなわち、ｒｓｈＣＤ５Ｔｇマウスは主要なＴリンパ球亜集団又はＢリンパ球亜集団（例えばＣＤ４＋Ｔリンパ球又はＣＤ８＋Ｔリンパ球）、又は種々の成熟段階のリンパ球（例えばダブルネガティブＴリンパ球若しくはダブルポジティブＴリンパ球、又はプレＢ細胞若しくはプロＢ細胞）の数又は相対的比率に相違を示さない。しかしながら、本発明者らの観察結果から、調節／抑制機能を有するリンパ球亜集団、すなわち調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及び調節性Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）、並びに高レベルの膜ＣＤ５を正常に発現するＢ細胞の亜集団（Ｂ１ａ細胞）の顕著な減少が明らかになった。これらの亜集団の数及び相対的比率の減少は、リンパ球活性化のＣＤ５媒介性阻害の欠陥による期待される免疫応答の強化に一致している。さらに、顕著なＮＫＴ細胞数の増加も観察されている。ＮＫＴは免疫系のエフェクター細胞であり、その数の増加が同様に免疫応答の強化をもたらし得る。
【００８１】
このため、好ましい実施形態では動物は配列番号１を含み、配列番号２を含むタンパク質を過剰発現する。非ヒト動物は、実施例１に記載のようにマウスであるのが好ましい。
【００８２】
ＣＤ５の可溶性アイソフォーム（配列番号２）を過剰発現するマウスが、十分に確立した実験的に誘発された自己免疫疾患、例えばＣＩＡ及びＥＡＥの増強した形態と相関する表現型を示すことに留意されたい。
【００８３】
さらに、マウスはがん及び悪性腫瘍に使用されるアジュバント療法をアッセイする、すなわちヒト可溶性ＣＤ５（トランスジェニック非ヒト動物において過剰発現される）と同時投与される複数の化合物の効果を試験するのに興味深い手段である。
【００８４】
加えて、実施例において説明されるように、ヒトＣＤ５の可溶性アイソフォームによるマウス免疫系の調節は、非トランスジェニック同腹子と比較してトランスジェニックマウスでよりゆっくりと成長するＢ１６黒色腫腫瘍も生じた。さらに、ヒトＣＤ５の可溶性アイソフォームの外因性投与は、化学療法と併用すると、化学療法単独の有効性と比較してがんの進行も遅らせる。このため、これら全てのデータは、調節性細胞及びエフェクター細胞のプールの恒常性におけるＣＤ５とそのリガンド（単数又は複数）（ＣＤ５Ｌと総称される）との間の相互作用の役割を支持するものであるが、驚くべきことに、がん療法及び腫瘍療法だけでなく、内在性抗原又は外来性抗原に対する免疫応答の増強によって利益を得る慢性感染性障害又は治療介入においてもアジュバントとしての可溶性ヒトＣＤ５の使用に焦点を合わせるものである。
【００８５】
可溶性ヒトＣＤ５を過剰発現するトランスジェニックマウス、又はこのタンパク質の外因性投与によって得られた結果を考えると、この可溶性アイソフォームが、膜受容体又はＣＤ５を含有する他のキメラＦｃタンパク質に対する抗体とは異なる方法で免疫系の応答を調節すると結論付けることが適切であるようである。
【００８６】
好ましい実施形態では、細胞成長障害はがんである。より好ましくは、細胞成長障害（がん）は黒色腫、肉腫、結腸がん、皮膚がん、上皮腫、結腸直腸がん、乳がん、胃がん、卵巣がん、膵臓がん、脳がん、頭頸部がん、食道がん、精巣がん、奇形腫、子宮頸がんから選択される。
【００８７】
本発明のこの態様は、配列番号２を含むアミノ酸配列をコードする配列番号１を含むヌクレオチド構築物（construction）を含む遺伝子操作された非ヒト動物に関し、非ヒト動物は実験的に誘発された自己免疫疾患の増強の表現型及び腫瘍／がん進行に対する耐性を示す。
【００８８】
配列番号１を含む非ヒトトランスジェニック動物は、ヒトスカベンジャー様リンパ球受容体の可溶性アイソフォーム（ｒｓｈＣＤ５すなわち配列番号２）を発現し、報告された調節機能を有するリンパ系サブセットの数の減少（調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及び調節性Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）の割合の減少）、及びエフェクター機能を有するリンパ系サブセット（ＭＺ  Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞）の数の増加を示す。この非ヒトトランスジェニック動物は任意の明らかな自己免疫障害を自然には発症しないが、実験的に誘導した場合に自己免疫応答の増強を示す。さらに、非ヒトトランスジェニック動物は、その非トランスジェニック同腹子と比較して腫瘍進行に対する耐性の増加を示す。実際に、腫瘍発生を誘導すると（すなわち、Ｂ１６細胞の注射による）、腫瘍がより遅い速度で成長し、驚くべきことにその転移能力は低下する。この非ヒトトランスジェニック動物は、胸腺非依存性抗原（例えばリポ多糖類のトリニトロフェニル化誘導体（ＴＮＰ−ＬＰＳ））による免疫付与に対する免疫応答の増大も示す。
【００８９】
興味深いことに、精製可溶性スカベンジャー様リンパ球受容体タンパク質（配列番号２）を野生型非トランスジェニック動物に２週間にわたって隔日で体外から投与すると、動物はトランスジェニック動物について上記に報告したものと同じリンパ球サブセット変化を示した（Ｔｒｅｇ細胞及びＢｒｅｇ細胞の割合の減少、並びにＮＫＴの割合の増加）。同様に、化学療法と組み合わせたｒｓｈＣＤ５で処理した野生型マウスは、化学療法単独で処理したマウスとよりも遅い腫瘍成長を示した。
【００９０】
ＣＤ６は、構造的かつ機能的に高度の相同性を有するＣＤ５と密接に関連した受容体である。ＣＤ６は、ＣＤ５と同様、リンパ球上の膜結合形態としても発現され、免疫シナプスの形成に寄与する。ＣＤ６の可溶性形態は、ＣＤ５にはよくあるように循環中にも検出することができる。野生型マウスに対するヒト可溶性ＣＤ６の組換え型（ｒｓｈＣＤ６）の外因性投与は、同様に調節／抑制機能を有する亜集団における表現型変化をもたらした（データは示さない）。このため、本発明者らは第二に、マウスモデルにおける外来性ｓＣＤ６のトランスジェニック発現又は投与は、本発明の発見を更に支持し得ると仮定した。結果として、本発明者らはｓＣＤ６のヒト組換え型（ｒｓｈＣＤ６）を発現するトランスジェニックマウスを開発した。このマウスをｒｓｈＣＤ６ｌｃｋと命名した（実施例７）。このため、本発明は特にＣＤ６を発現する非ヒト動物にも関する。その一例を実施例７に提示する。ＣＤ６の任意の形態又は変異体を発現させることができるが、ＣＤ６の可溶性変異体及び／又はヒト変異体が特に好ましく、その様々な実施形態が上記の「本発明の作用物質」に示される。
【００９１】
上記に詳述したＣＤ６は、トランスジェニック動物において任意のプロモーターの制御下で発現され得るが、特に又は好ましくは又は排他的に免疫系の細胞、例えばＴ細胞及び／又はＢ細胞においてＣＤ６を発現させることが好ましい場合がある。ＣＤ６が本質的にＴ細胞のみで発現されるか、又はＣＤ６が本質的にＢ細胞及びＴ細胞のみで発現されるか、又はＣＤ６が本質的に免疫系の任意の細胞のみで発現されるのが好ましい場合もある。「本質的に〜のみ」とは、それぞれの細胞におけるＣＤ６の発現レベルが対照細胞よりも少なくとも１００％高い、対照細胞よりも少なくとも２００％高い、対照細胞よりも少なくとも５００％高い、又は対照細胞よりも少なくとも１０００％高いか、又はＣＤ６の発現が対照細胞において検出不能であることを意味する。同じ動物の任意の細胞又は組織を、例えば肝臓又は筋肉から採取された、規定の対照細胞として使用することができる。
【００９２】
本発明のこの態様の目的上、ＣＤ６をプロモーターの制御下で発現させ、これらの細胞における特定の又は排他的な発現を可能にすることができる。当業者は、かかる特性を有する既知の任意のプロモーターから選択を行うことができ、特定の実施形態では、プロモーターは実施例７に記載のようにｌｃｋプロモーターである。ＩｇＨエンハンサー（Ｅμ）を使用するのが好ましい場合もある。後者は、ｒｓｈＣＤ６の発現を選択的にＢリンパ球に指向するよう意図されている。最も好ましくは、マウスが発現するＣＤ６が配列番号３によって表される。
【００９３】
本発明のマウスを用いて、抗腫瘍応答における組換え可溶性ヒトＣＤ６の潜在的な免疫調節効果を評価した。これを実施例６に詳述する。ｒｓｈＣＤ６をリンパ球特異的プロモーターｌｃｋ及びＩｇＨエンハンサー（Ｅμ）の制御下で発現するトランスジェニックマウスをこの研究に使用した（ｒｓｈＣＤ６ｌｃｋマウス、実施例７を参照）。内在性タンパク質の場合にはよくあるように、このマウスはＴリンパ球だけでなくＢリンパ球においてもｒｓｈＣＤ６を選択的に発現し、高いレベルが予想される。図１８に示されるように、様々な腫瘍細胞型の注射によって、ｒｓｈＣＤ６ｌｃｋマウスは、非トランスジェニックマウスと比較して僅かに遅い腫瘍成長速度を示した。
【００９４】
本発明の動物は、この目的に好適な任意の方法によって得ることができる。特にマウスの場合、これは例えば、ａ）発現させる本発明の作用物質をコードするヌクレオチド構築物を得ること；ｂ）工程ａ）の構築物を受精卵の前核に微量注入すること；ｃ）受精卵を培養すること；ｄ）卵を偽妊娠雌性マウスに移植すること；及びｅ）子孫から本発明の作用物質をコードするｃＤＮＡを含有する動物を選択することによって行うことができる。
【００９５】
非医療方法
本発明の動物は、本発明の非医療方法に使用される有用な手段でもある。
【００９６】
本発明は、本発明の作用物質を発現する生物において自己免疫疾患の重症度及び／又は腫瘍進行耐性を増大させる非医療実験方法を包含する。その具体例は、配列番号２をコードする構築物を過剰発現する非ヒト動物である。別の例は、例えば配列番号３によって表される可溶性ＣＤ６を発現する非ヒト動物である。
【実施例】
【００９７】
以下の実施例及び図面は例示として提示され、本発明の限定を意図するものではない。さらに、本発明は、本明細書に記載される特定の好ましい実施形態の可能な全ての組合せを包含する。
【００９８】
実施例１．  ｒｓｈＣＤ５Ｔｇトランスジェニックマウス（配列番号２、すなわちヒト可溶性ＣＤ５アイソフォームを過剰発現するマウス）の作製
ｉｎ  ｖｉｖｏでのｓｈＣＤ５の機能的関連性を調べるために、本発明者らは、ＳＶ４０プロモーター（配列番号１０）及びＩｇＨエンハンサー（Ｅμ）の制御下で組換えｓｈＣＤ５（ｒｓｈＣＤ５、配列番号２とも称される）を発現する新たなマウス株を作製した。後者は、ｒｓｈＣＤ５の発現を選択的にＢリンパ球へと指向するよう意図されている。
【００９９】
組換えヒト可溶性ＣＤ５アイソフォームの発現の構築を、Calvo et al. "Interaction of recombinant and natural soluble CD5 forms with alternative cell surface ligand", Eur. J. Immunol. - 1999, Vol. 29, pp.: 2119-2129によって開示される手順に従って行った。この手順は、ｐＨβＡＰｒ−１−ｎｅｏ発現ベクターの改変体のＥｃｏＲＩ部位への２つの以前に報告されたｃＤＮＡクローンｐＴ１−１及びｐＴ１−２のＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩクローニングによる構築を含む。これら２つのクローンは、Jones et al.によって"Isolation of complementary DNA clones encoding the human lymphocyte glycoprotein T1/Leu-1", Nature-1986, Vol. 323, pp.:346-349に開示されている。ヒトＣＤ５の可溶性アイソフォームをコードする配列番号１を、ｐＨβＡＰｒ−１−ｎｅｏ発現ベクターに導入した。この工程は、Gunning et al., "A human β-actin expresion vector system directs high-level accumulation of antisense transcripts", Proc. natl. Acad. Sci. USA. - 1987, Vol. 84, pp.: 4831-4835に報告されるように行った。可溶性ヒトＣＤ５形態の作製については、ｐＴ１−２をＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ断片としてＭ１３ｍｐ１８にクローニングした後、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発に供し、Ｐ３４６に未成熟終止コドンを導入し、これにより新たなＭｓｅＩ制限酵素部位を作り出した。実際に、終止コドンＰ３４６は、未成熟タンパク質のＮ末端のリーダー配列に相当する２４アミノ酸が失われた場合の成熟タンパク質に関連して命名されている。
【０１００】
ｒｓｈＣＤ５（配列番号２）をコードする相補的ＤＮＡ断片を、鋳型としてｐＨβＡＰｒ−１−ｎｅｏ／ＣＤ５．Ｐ３４６ＳＴＯＰを用いるＰＣＲによって得て（Calvo et al. "Interaction of recombinant and natural soluble CD5 forms with alternative cell surface ligand", Eur. J. Immunol. - 1999, Vol. 29, pp.: 2119-2129）、ＥμエンハンサーとＳＶ４０プロモーターとを含有する発現プラスミドにクローニングした。このプラスミドは、図１９に見られるようにｐＩｇＨＳＶ４０ｓＣＤ５として同定された。
【０１０１】
ｐＩｇＨＳＶ４０ｓＣＤ５構築物を制限酵素消化によって線状化し、ゲル精製し、標準プロトコルを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×ＳＪＬ／Ｊ（Ｂ６ＳＪＬ  Ｆ２）過剰排卵雌から得られた単細胞状態のマウス受精胚に微量注入した。
【０１０２】
このため、本発明の非ヒトマウスは、ａ）配列番号１を含む構築物を得ること；ｂ）工程ａ）の構築物を受精卵の前核に微量注入すること；ｃ）受精卵を培養すること；ｄ）卵を偽妊娠雌性マウスに移植すること；及びｅ）子孫から配列番号２、すなわち（ｒｓｈＣＤ５）をコードするｃＤＮＡを含有する動物を選択することによって得られる。
【０１０３】
トランスジェニックマウスを同定するために、ヒトＣＤ５の細胞外領域に特異的な配列番号６のフォワードプライマー（５’−ＧＣＴＧＴＣＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＧＡＡＣＴ−３’）及び配列番号７のリバースプライマー（５’−ＧＡＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＴＧＴＣＣＴＣＡＴ−３’）を用いた尾又は耳のＤＮＡからのＰＣＲを行った。図１は代表的なＰＣＲ分析を示し、トランスジェニックＤＮＡを特定する期待される４５０ｂｐのバンドが示されている。１５０ｂｐのバンドが、配列番号８のフォワードプライマー（５’−ＴＣＡＣＴＣＡＡＧＧＣＡＡＣＣＴＴＣＣＴＧＣ−３’）及び配列番号９のリバースプライマー（５’−ＣＧＡＣＣＴＣＡＴＣＴＣＴＡＡＣＣＡＴＧＡＡＣＡＧ−３’）を用いたハウスキーピングＬＩＥＸ遺伝子からの内部ＰＣＲ増幅対照に相当する。この実験では、マウス１．２及び１．７は非トランスジェニック同腹子であり、残りのマウスはｒｓｈＣＤ５導入遺伝子に陽性である。
【０１０４】
ｒｓｈＣＤ５（配列番号２）の発現を確認するために、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウス又はその非トランスジェニック同腹子（各群についてｎ＝５）からのプール血清を、抗ヒトＣＤ５マウスｍＡｂ（Ｃｒｉｓ−１、Alberola-Ila et al. "Intracellular events involved in CD5-induced human T cell activation and proliferation" The Journal of Immunology-1992, Vol. 148(5), pp: 1287-1293）を用いて免疫沈降し、免疫複合体を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、続いてｈＣＤ５の細胞外領域に対するウサギポリクローナル抗血清を用いたウエスタンブロット法を行った。図２に示されるように、ブロットはｒｓｈＣＤ５ｔｇ血清中の５２ｋＤａのバンドを示すが（ｔｇＣＤ５レーン）、これは非トランスジェニック同腹子の血清には存在しなかった。
【０１０５】
ｒｓｈＣＤ５のトランスジェニック発現は出生時から生じると予想されているため、トランスジェニックマウスはこのヒトタンパク質に耐性を有するはずである。体外から投与されたｒｓｈＣＤ５への応答がないことを確認するために、本発明者らは、ｒｓｈＣＤ５又は対照としてｒｓｈＣＤ６で免疫付与したトランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスにおける抗ｈＣＤ５抗体の存在を調べた。連続する２回の隔週の免疫付与（各２５μｇのｒｓｈＣＤ５又はｒｓｈＣＤ６）を、それぞれ完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中で行い、最初の免疫付与の４週間後に血清を採取し、コートタンパク質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｒｓｈＣＤ５及びｒｓｈＣＤ６を用いたＥＬＩＳＡによって、抗ｒｓｈＣＤ５反応性又は抗ｒｓｈＣＤ６反応性について分析した。ｒｓｈＣＤ５で免疫付与したｒｓｈＣＤ５ｔｇの群では、マウス血清は、野生型マウス血清と比較してＯＤで測定されるようにｒｓｈＣＤ５に対する非常に低い抗体力価を示した。対照的に、ｒｓｈＣＤ６で免疫付与したトランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウス及び野生型非トランスジェニックマウスはどちらも、同様に高い抗ｒｓｈＣＤ６抗体力価を示した。陰性対照として、ＢＳＡで免疫付与したマウスは、検出可能なレベルのｒｓｈＣＤ５又はｒｓｈＣＤ６に対する特異的Ｉｇを示さなかった（データは示さない）。これらの結果は、期待されるように、外来性ｒｓｈＣＤ５（ｒｓｈＣＤ６ではない）は、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスに対する免疫原性が低いという考えを支持するものである。
【０１０６】
実施例２．  トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスにおける既知の調節機能に付随したリンパ球亜集団の割合の低下及び自己免疫応答の増強
Ｔ細胞の発生及び恒常性におけるｒｓｈＣＤ５の影響を調べるために、本発明者らは、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウス及びその非トランスジェニック同腹子の胸腺、リンパ節及び脾臓におけるＴ細胞の主要な亜集団を分析した。総細胞数及びＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＤ８＋Ｔリンパ球の比率は、トランスジェニックマウスの胸腺、リンパ節又は脾臓において、非トランスジェニック同腹子と比較して有意差はなかった（データは示さない）。フローサイトメトリーによる骨髄、リンパ節及び胸腺に由来する主要なＴ細胞及びＢ細胞の集団の分析では、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスで非トランスジェニック同腹子と比較して任意の全体的な表現型異常は検出されなかった。これらのデータは、種々のＴ細胞及びＢ細胞の亜集団のフローサイトメトリー分析を示す図３及び図４から読み出される。ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  Ｉフローサイトメーター（BD Biosciences，USA）を用いてフローサイトメトリーを行った。トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスのリンパ及び脾臓で、非トランスジェニックマウス（ｗｔ）と比較して主要な（ＣＤ４＋又はＣＤ８＋）Ｔリンパ球亜集団の比率（図３を参照されたい）又は絶対数（図示しない）に有意差が観察された。
【０１０７】
Ｂリンパ球発生におけるｒｓｈＣＤ５の影響を分析するために、骨髄細胞を一連の抗体（ＣＤ４３、Ｂ２２０、ＣＤ２４及びＢＰ−１）で染色し、様々な成熟段階の種々のＢ細胞サブセットを同定した。ゲーティングしたＣＤ４３＋Ｂ２２０＋亜集団から、プレプロＢ細胞、初期プロＢ細胞、後期プロＢ細胞及びプレＢ細胞をＣＤ２４及びＢＰ１の発現に基づいて同定することができた（データは示さない）。ｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスの骨髄のＢ細胞サブセットにおいて有意差は観察されず、トランスジェニックマウスにおいて骨髄Ｂ細胞発生時に大きな変化は起こらないことが示唆された。
【０１０８】
骨髄Ｂ細胞集団において大きな相違は観察されなかったが、本発明者らは脾臓に由来する末梢Ｂ細胞サブセットについても分析した。末梢Ｂ細胞サブセットを分析するために、Cariappa et al "The recirculating B cell pool contains two functionally distinct, long-lived, post-transitional, follicular B cell populations", Journal of Immunology - 2007, Vol. 179(4), pp.: 2270-2281のゲーティング戦略を用いた。ＩｇＭｈｉｇｈＩｇＤｌｏｗでのゲーティングによって、移行性１（Ｔ１）Ｂ細胞、移行性２（Ｔ２）Ｂ細胞及び辺縁帯（ＭＺ）Ｂ細胞をその表面マーカーＣＤ２３及びＣＤ９３／ＡＡ４の差次的発現に基づいて区別することができる。一方、移行性３（Ｔ３）細胞及び濾胞性Ｉ（ＦＯＬＩ）細胞を、ＣＤ２１／３５マーカー及びＣＤ９３／ＡＡ４マーカーを用いてＩｇＭｌｏｗＩｇＤｈｉｇｈゲーティング亜集団において区別することができる。最後に、ＩｇＭｈｉｇｈＩｇＤｌｏｗゲーティング亜集団は、ＣＤ９３／ＡＡ４及びＣＤ２１／３５の表面発現に基づく濾胞性ＩＩ（ＦＯＬＩＩ）細胞及び辺縁帯前駆体（ＭＺＰ）の検出を可能にする。トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスで、非トランスジェニック同腹子と比較してＴ１亜集団の比率の顕著な減少及びＭＺ細胞の増加が検出された。これらの結果は、Ｂ２２０＋亜集団細胞（ＩｇＭｈｉｇｈＩｇＤｌｏｗでゲーティングした）の比率をＭＺ、Ｔ１及びＴ２について示す図４から直接導き出すことができる。これらの結果は、細菌莢膜多糖類抗原等の胸腺非依存性（ＴＩ）抗原に対する応答における脾臓ＭＺ  Ｂ細胞の既知の機能的重要性のために臨床的に関連している。
【０１０９】
Ｂリンパ球のＣＤ５＋亜集団（Ｂ１ａ）は腹腔内に豊富であるため、本発明者らは、これがｒｓｈＣＤ５の循環レベルの存在に影響を受ける可能性があると仮定した。腹腔Ｂ細胞をＩｇＭ及びＩｇＤ、更にはＣＤ５の染色によって分析し、Ｂ１ａ（ＣＤ５＋Ｂ２２０ｌｏｗ）亜集団とＢ１ｂ（ＣＤ５−Ｂ２２０ｈｉｇｈ）亜集団とを区別した。Ｂ２２０＋集団でのＣＤ５発現の分析では、Ｂ１ａ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ５＋）の比率の顕著な減少及びＢ１ｂ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ５−）の比率の僅かな増加が示された。これらのデータを図５のパネルＡに示す。興味深いことに、図５のパネルＢから導き出すことができるように、Ｂ１ａ細胞の減少は、２週間にわたって隔日で外来性ｒｓｈＣＤ５（配列番号２）によって処理した非トランスジェニック野生型マウス（ｗｔ）においても観察された。
【０１１０】
ＣＤ５シグナル伝達は腹腔Ｂ１ａ細胞の恒常性及びＩＬ−１０産生に必要とされ、ｒｓｈＣＤ５が発生中のＢリンパ球の表面上で発現される内在性ＣＤ５の推定リガンド結合を妨げ得ると考えられる。このため、本発明者らは、調節性Ｂ細胞亜集団が循環レベルの増大したｒｓｈＣＤ５の存在下で変化するか否かについてアッセイした。
【０１１１】
報告された調節機能を有するＩＬ−１０産生Ｂ細胞亜集団には、ＣＤ５陽性のものとＣＤ５陰性のものとがある。ＣＤ５陽性のものには、腹腔Ｂ１ａ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ５＋）及びＢ１０細胞と称される最近報告された脾臓Ｂ細胞サブセットの両方が含まれる。これらのＩＬ−１０産生Ｂ細胞（Ｂ１０  Ｂ細胞）は独自のＣＤ５＋ＣＤ１ｄｈｉｇｈ表現型を示し、脾臓Ｂ細胞の僅か１％〜２％であるが、この亜集団は腹腔内で極めて豊富である。
【０１１２】
本発明者らは、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５Ｔｇマウス及び非トランスジェニック同腹子（ｗｔ）の腹腔洗浄サンプル及び脾臓サンプルにおける調節性Ｂ１０（Ｂ２２０＋ＣＤ１ｄ＋ＣＤ５＋ＩＬ１０＋）細胞亜集団の存在を更に分析した。図６のパネルＡから明らかなように、Ｂ１０細胞は腹腔洗浄細胞サンプル（ＰＣ）及び脾臓細胞サンプル（ＳＣ）の両方で顕著に減少した。さらに、図６のパネルＣに示されるように、脾臓Ｂ１０細胞（ＳＣ）は、細胞質尾部のＣ末端のカゼインキナーゼＩＩ結合／リン酸化部位を欠いたＣＤ５の切断型を発現するため、細胞内シグナルを伝達することができないＣＤ５ノックアウトマウス株（ＣＤ５−／−）及びＣＤ５ΔＣＫＩＩマウス株においても減少した。
【０１１３】
加えて、ＣＤ５媒介性シグナルは、胸腺由来のナチュラル調節性Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ）の生成を調節すると考えられる。このため、本発明者らは、ナチュラル調節性Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ）の割合を表面抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２５及び細胞内Ｆｏｘｐ３での染色によってモニタリングした。図６のパネルＥによると、ｎＴｒｅｇの比率又は数の相違は、ｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスの胸腺（ＴＣ）において野生型同腹子と比較して観察されなかった。しかしながら、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの比率及び総細胞数の顕著な減少が、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスの脾臓（ＳＣ）及び鼠径リンパ節（ＬＮＣ）において、その非トランスジェニック同腹子と比較して観察された。
【０１１４】
ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞は、抗感染特性及び抗腫瘍特性を有する亜集団を構成する。これらの細胞は、ＮＫ１．１マーカーとＣＤ３との同時発現を特徴とする。図７のパネルＡに見られるように、全ＮＫＴ細胞は、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５マウスの脾臓において、非トランスジェニック同腹子と比較して明らかに増加していた。興味深いことに、野生型非トランスジェニックＣ５７Ｂｌ／６マウスへの精製外来性ｒｓｈＣＤ５タンパク質（２週間にわたって隔日で２５μｇ）の注入は、ＢＳＡ注入対照マウスと比較して同様の脾臓ＮＫＴ細胞の増加を誘導した（図７、パネルＢ）。
【０１１５】
全体として、これらのデータから、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスが、その非トランスジェニック同腹子と比較して既知の調節機能を有する一部の細胞亜集団（Ｂ１ａ、Ｂ１０、Ｔｒｅｇ）の数及び／又は割合の顕著な減少を示すことが示唆される。この調節性細胞の減少は、このマウスの免疫応答において重大な結果をもたらし得る。さらに、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスは、関連エフェクター機能を有する一部の細胞亜集団（ＭＺ  Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞）の数及び／又は割合の顕著な増加も示す。この場合も、このエフェクター細胞の増加は、このマウスの免疫応答において重大な結果をもたらし得る。
【０１１６】
調節性細胞及び／又はエフェクター細胞の亜集団で観察された変化は、ｒｓｈＣＤ５レベルの上昇ではなく、マウスゲノムへの導入遺伝子コピーのランダム組込みの潜在的悪影響に起因し得るため、本発明者らが、アフィニティー精製外来性ｒｓｈＣＤ５（配列番号２）の腹腔内（ｉ．ｐ．）反復投与によって処理した野生型非トランスジェニックマウスにおいて亜集団分析を行ったことに留意されたい。図５のパネルＢ、図６のパネルＢ及びパネルＤ、並びに図７のパネルＢに示されるように、上述のトランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスについて報告された細胞亜集団における全ての変化は、精製外来性ｒｓｈＣＤ５タンパク質の反復注入後に正常非トランスジェニック野生型マウスにおいて容易に再現された。これらのデータから、ｒｓｈＣＤ５レベルの上昇が、特異的な調節性亜集団（Ｂ１ａ、Ｂ１０、Ｔｒｅｇ）の減少及び特異的なエフェクター亜集団（ＭＺ  Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞）の増加に関与することが示される。
【０１１７】
トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスにおいて観察された細胞サブセットの変化の機能的関連性を更に立証するために、その免疫応答を幾つかの実験条件下で分析した。まず、このマウスを２つの異なる自己免疫実験モデル、すなわち実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）及びコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）に供した。
【０１１８】
ヒト多発性硬化症に類似した広く認められているモデルであるＥＡＥを、標準プロトコルに従う、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中のミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチドでの免疫付与によってマウスに誘導した。図８に示されるように、疾患の臨床スコア（ＣＳ）は、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスで非トランスジェニック同腹子と比較して顕著に増加した。図８のデータは、８週齢〜１０週齢のマウスにおけるＣＦＡ中の抗原（ＭＯＧ）の皮下投与についてまとめたものである。免疫付与時及び４８時間後に、２００ｎｇの百日咳毒素を同様に腹腔内注射した。臨床スコア（ＣＳ）を毎日決定した。スコアは各マウスの平均値を表し、０＝疾患なし；０．５＝尾部の部分的な硬直（motionless）；１＝尾部の硬直；２＝運動失調；３＝一肢の運動機能の喪失；４＝後肢の運動機能の喪失；５＝瀕死状態である。グラフは、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウス（ｎ＝５）（四角い点）と非トランスジェニックマウス（Ｃ５７Ｂ１６；ｎ＝１０；丸い点）とのＣＳ間の比較を示す。
【０１１９】
別の十分に確立したＴ細胞媒介性自己免疫疾患のモデルは、（Ｂ６×ＤＢＡ／１）Ｆ１マウスにおける関節リウマチに類似したコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）である。図９に示されるように、関節炎症状（浮腫（Ｅ）、関節クランピング（clamping）（ＪＩ）、辺縁部侵食（ＭＥ）、骨減少（Ｏ））の重症度の増大及び全体臨床スコア（ＣＳ）の増加が、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスで非トランスジェニック同腹子と比較して観察された。さらに、ＩＬ−６レベルが、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５マウスで非トランスジェニックマウスと比較して顕著に増加した（図１０、パネルＡ）。他の炎症性サイトカインもトランスジェニックマウスにおいて僅かな増加を示したが、定量ＲＴ−ＰＣＲで測定したところ有意ではなかった（データは示さない）。ＩＩ型コラーゲンに対する抗体レベルも、トランスジェニックマウスで非トランスジェニック同腹子と比較して増加した。これらの抗体の大部分はＩｇＧ２であり（図１０、パネルＢ）、Ｔｈ１応答の増強が示唆される。
【０１２０】
まとめると、自己免疫疾患を誘導した２つのマウスモデルによって得られたデータは、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスが非トランスジェニック同腹子と比較して自己免疫応答の増強を示すという考えを支持するものである。この誘導された自己免疫の増強の表現型は、これらのトランスジェニックマウスに特徴的な観察された既知の調節機能を有するＢ細胞及びＴ細胞の亜集団の減少に適合する。
【０１２１】
このため、本発明の非ヒトトランスジェニックマウスは、自己免疫疾患の研究及びかかる障害を治療する化合物のスクリーニングの有望な出発点を示す。
【０１２２】
実施例３．  外来性ｒｓｈＣＤ５＋化学療法で処理したトランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウス又は野生型非トランスジェニックＣ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＢ１６黒色腫、ＲＭＡ−Ｓリンパ腫及びＭＣＡ２０５肉腫の腫瘍成長の減退
トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスにおいて観察された調節性Ｔ細胞及び調節性Ｂ細胞の亜集団の減少、並びにＮＫＴエフェクター細胞亜集団の増加の機能的結果を更に調査するために、Ｂ１６マウス黒色腫細胞に対する抗腫瘍免疫応答を分析した。Ｂ１６細胞（１×１０５個）をトランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウス又はその非トランスジェニック同腹子に皮下（ｓ．ｃ．）注射し、腫瘍成長を経時的に直径で記録した。図１１に示されるように、Ｂ１６腫瘍はトランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスで非トランスジェニックマウスと比較して顕著によりゆっくりと成長した。
【０１２３】
これらのデータを考慮して、本発明者らは、転移性播種に対するトランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスの潜在的な応答の改善についても、２×１０５個のＢ１６黒色腫細胞の静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって評価した。１５日後にマウスを屠殺し、その肺を摘出し、肺表面への転移を計数した。図１２にこの実験的転移アッセイの結果を示すが、ｒｓｈＣＤ５ｔｇで非トランスジェニック同腹子と比較して観察される、肺転移数の減少傾向（ｐ＝０．０９９）が明らかになった。
【０１２４】
さらに、標準化学療法とｒｓｈＣＤ５との潜在的な相乗効果を試験した。１×１０５個のＢ１６細胞をｓ．ｃ．移植した野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、腫瘍注射後３日目に従来の化学療法（ビンクリスチン０．５ｍｇ／ｋｇ、ドキソルビシン３．３ｍｇ／ｋｇ）の単回投与で処理した。一部のマウスには、腫瘍注射の日から４８時間毎に投与されるｒｓｈＣＤ５（２５μｇの配列番号２）を更に注入した。図１３に見られるように、腫瘍の進行は、化学療法＋ｒｓｈＣＤ５（配列番号２）で処理した野生型非トランスジェニックマウスにおいて化学療法＋ビヒクル（Ｖ）で処理した同一タイプのマウスと比較して遅延した。
【０１２５】
観察された効果が腫瘍型に依存しないことを示すために、異なる腫瘍細胞株、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスと同系のリンパ腫細胞株であるＲＭＡ−Ｓを選択した。ＲＭＡ−Ｓ細胞（実験に応じて２×１０５個又は５×１０４個）を、ｒｓｈＣＤ５Ｔｇマウス及び非トランスジェニック同腹子の背部にｓ．ｃ．注射し、腫瘍の成長をキャリパーで測定することによって経時的に記録した。図１４Ａに示されるように、ＲＭＡ−Ｓ腫瘍は、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスで、非トランスジェニックマウスと比較して顕著によりゆっくりと成長した。この効果はより多くの細胞を注射した場合に減少し（データは示さない）、大量の腫瘍細胞を注射した場合に免疫応答の強化が腫瘍成長を制御する能力が限られていることが示される。
【０１２６】
腫瘍療法は通常２つ以上の薬物を用いた同時治療を含むため、ｒｓｈＣＤ５が標準化学療法薬に対するアジュバントとして作用し得ると推測された。１×１０５個のＲＭＡ−Ｓ細胞をｓ．ｃ．移植した野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、腫瘍が直径５ｍｍ超に達した時点で、腫瘍内投与される従来の化学療法（２ｍＭドキソルビシン、５０μｌ）の単回投与によって処理した。一部のマウスには、腫瘍注射の日から４８時間毎に投与されるｒｓｈＣＤ５（２５μｇの配列番号２）を更に注入した。図１４Ｂに見られるように、腫瘍の進行は、化学療法＋ｒｓｈＣＤ５（配列番号２）で処理した野生型非トランスジェニックマウスで化学療法＋ビヒクルで処理したマウスと比較して遅延した。サイトカインを粗腫瘍溶解物中でＥＬＩＳＡによって測定したが、結果から化学療法＋ｒｓｈＣＤ５で処理した腫瘍において、化学療法単独で処理した腫瘍と比較して顕著な腫瘍ＩＬ−１０の減少が示された（図１４Ｃ）。このことから、ｒｓｈＣＤ５の添加が、化学療法で処理した場合の腫瘍における免疫抑制状態の低減に寄与し、自然抗腫瘍免疫応答を促し得ることが示唆される。
【０１２７】
リンパ腫の腫瘍は免疫原性であると考えられ、それに対する免疫応答を支持し得る。肉腫等の免疫原性の低い腫瘍は、免疫強化療法に対して良好に反応しない場合がある。次いで、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスと同系の肉腫であるＭＣＡ２０５腫瘍を、２×１０５個の腫瘍細胞をｓ．ｃ．注射したトランスジェニックマウス対非トランスジェニックマウスで試験した。ＭＣＡ２０５細胞は、ｒｓｈＣＤ５Ｔｇマウスで、非トランスジェニックマウスと比較して僅かにゆっくりと成長した（データは示さない）。少ない細胞数でマウスに注射した場合にｒｓｈＣＤ５の効果が観察されるというＲＭＡ−Ｓ細胞によって得られた結果を考慮して、より少量の細胞（５×１０４個）を用いて実験を繰り返し、ｒｓｈＣＤ５Ｔｇマウス及び非トランスジェニックマウスを、どちらも腫瘍が直径５ｍｍ超に達した時点で化学療法（２ｍＭドキソルビシン、５０μｌ、腫瘍内）の単回投与によって処理した。図１５Ａに示されるように、腫瘍はｒｓｈＣＤ５Ｔｇで非トランスジェニックマウスと比較して僅かに遅く成長するようであるが、腫瘍重量を減少させる明確な傾向がトランスジェニックマウスで非トランスジェニックマウスと比較して観察された（図１５Ｂ）。
【０１２８】
まとめると、これらのデータは、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスが、その非トランスジェニック同腹子と比較して抗腫瘍免疫応答の増強を示すという考えを支持するものである。この抗腫瘍応答の増強の表現型は、反復投与量の精製外来性ｒｓｈＣＤ５タンパク質を注入したトランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウス及び非トランスジェニックマウスの両方に特徴的である、観察された既知の調節機能を有するＢ細胞及びＴ細胞の亜集団の減少並びに既知の抗腫瘍機能を有するエフェクター細胞亜集団の増加にも適合する。これらのマウスは、ｒｓｈＣＤ５の単独での又は現行及び／又は将来のがん療法のアジュバントとしての使用に基づく新たな抗腫瘍戦略の研究の有望な出発点を示す。
【０１２９】
実施例４．  胸腺非依存性タイプ１抗原による免疫付与による体液性応答の増大
ＣＩＡの誘導は、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスにおいて非トランスジェニック同腹子と比較して増大した胸腺依存性（ＴＤ）抗原（コラーゲン）に対するＴｈ１体液性応答の存在を示した。胸腺非依存性抗原に対しても体液性応答の増大が存在する可能性を更に調べるために、本発明者らは、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスを、既知の胸腺非依存性タイプ１（ＴＩ−１）抗原であるＴＮＰ（リニトロフェニル）−ＬＰＳで免疫付与した。種々の免疫グロブリンのタイプ及びサブタイプに由来する特異的抗体のレベルを、免疫付与後のマウス血清においてＥＬＩＳＡで測定した。図１６に示されるように、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスは、非トランスジェニックＣ５７Ｂｌ／６マウスと比較して、免疫付与に応じたＩｇＧ２ｂ抗体及びＩｇＧ３抗体のレベルの上昇を示した。
【０１３０】
まとめると、これらのデータから、トランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウスが、その非トランスジェニック同腹子と比較してＴＤ抗原及びＴＩ−１抗原の両方に対する体液性免疫応答の増強を示すことが示される。この体液性応答の増強の表現型は、反復投与量の精製外来性ｒｓｈＣＤ５タンパク質を注入したトランスジェニックｒｓｈＣＤ５ｔｇマウス及び非トランスジェニックマウスの両方に特徴的である、観察された既知の調節機能を有するＢ細胞及びＴ細胞の亜集団の減少並びにＭＺ  Ｂ細胞の増加にも適合する。このことは、抗原、特にＴＩ−１等の免疫原性の低い抗原とともに投与されるアジュバントとしてのｒｓｈＣＤ５の使用の有望な出発点を示す。
【０１３１】
実施例５．  可溶性ＣＤ６の注入は、敗血症後期に観察される脾臓Ｔｒｅｇ細胞の増加を顕著に低減する
スカベンジャー様リンパ球受容体ＣＤ５及びＣＤ６は、相当の構造的相同性、並びに機能的類似性及び同様の発現パターンを有する。本発明者らは、可溶性のＣＤ５及びＣＤ６がどちらも真菌敗血症及び細菌敗血症それぞれのマウスモデルにおいて効果的であることを示した。敗血症から生き残ったマウスは、脾臓Ｔｒｅｇ細胞数の増加から推定されるように免疫抑制状態であることが知られる。図１７に見られるように、組換え可溶性ヒトＣＤ６（ｒｓｈＣＤ６すなわち配列番号３）の単回投与（１ｍｇ／Ｋｇ）は、野生型Ｃ５６Ｂｌ／６マウスにおいて、非処理マウスと比較して（盲腸結紮穿刺による）複数菌敗血症の誘導の３日後に観察される脾臓Ｔｒｅｇ細胞数を有意に低減する（ｐ＜０．０５）。このことは、実施例２においてｒｓｈＣＤ５（配列番号２）について既に示したように、可溶性ＣＤ６が調節機能を有する細胞亜集団の動力学に影響を与えることによって同様に免疫調節特性を有するという考えを支持するものである。このｒｓｈＣＤ６の免疫調節特性は、ｒｓｈＣＤ５と同様に細胞成長障害の予防又は治療に有用であり得る。
【０１３２】
Gimferrer I et al. "Relevance of CD6-mediated interactions in T cell activation and proliferation" J Immunol. 2004, Vol. 173, pp.: 2262-2270によって報告されるように、ヒトＣＤ６の可溶性細胞外ドメイン（ｒｓｈＣＤ６、配列番号３）を、ＨＥＫ  ２９３−ＥＢＮＡにおいてエピソーム発現系を用いて発現させた。簡潔に述べると、ＣＤ６の細胞外領域を、配列番号１１（５’−ＣＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＣＣＡＧＣＴＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡ−３’）及び配列番号１２（５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＴＣＴＡＴＡＧＴＧＡＣＴＧＴＣＴＧＡＡＣＡ−３’）をそれぞれフォワードプライマー及びリバースプライマーとして、ＣＤ６−ＰＢ１  ｃＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をＸｂａＩ／ＢａｍＨＩによって切断し（restricted）、適切に消化したｐＣＥＰ−Ｐｕベクターにクローニングした。得られた構築物を、記載のようにＨＥＫ  ２９３−ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトした。ｒｓｈＣＤ６タンパク質を、１６８．１（抗ヒトＣＤ６）マウスｍＡｂを共有結合させたＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂカラムでアフィニティー精製した。
【０１３３】
実施例６：外来性ｒｓｈＣＤ６＋化学療法で処理した、トランスジェニックｒｓｈＣＤ６ｌｃｋマウス（実施例７）又は野生型非トランスジェニックＣ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＢ１６黒色腫及びＲＭＡ−Ｓリンパ腫の腫瘍成長の低減
Ｃ５７Ｂｌ／６マウス株と同系の黒色腫細胞株Ｂ１６を本実験に使用した。ｒｓｈＣＤ６ｌｃｋマウスに１×１０５個のＢ１６細胞を注射し、腫瘍成長を経時的に測定した。図１８Ａに示されるように、ｒｓｈＣＤ６ｌｃｋマウスは、主に初期に非トランスジェニックマウスと比較して僅かに遅い腫瘍成長速度を示した。
【０１３４】
ｒｓｈＣＤ６と化学療法との潜在的相乗効果を調べるために、１×１０５個のＢ１６細胞を野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにｓ．ｃ．注射し、腫瘍注射の３日後に化学療法（ビンクリスチン０．５ｍｇ／ｋｇ、ドキソルビシン３．３ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の単回投与で処理した。マウスに腫瘍注射の日から４８時間毎に投与されるビヒクル又はｒｓｈＣＤ６（２５μｇ）を更に注入した。図１８Ｂに見られるように、腫瘍の進行は、化学療法＋ｒｓｈＣＤ６で処理した野生型非トランスジェニックマウスにおいて、化学療法＋ビヒクルで処理したマウスと比較して初期に遅延した。
【０１３５】
ＲＭＡ−Ｓリンパ腫細胞を用いて同様の実験を行った。１×１０５個のＲＭＡ−Ｓ細胞を野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにｓ．ｃ．注射し、腫瘍注射の５日後及び１２日後にドキソルビシン３．３ｍｇ／ｋｇでｉ．ｐ．処理した。マウスに腫瘍注射の日から４８時間毎に投与されるビヒクル又はｒｓｈＣＤ６（２５μｇ）を更に注入した。図１８Ｃに見られるように、腫瘍の進行は、化学療法＋ｒｓｈＣＤ６で処理した野生型非トランスジェニックマウスにおいて、化学療法＋ビヒクルで処理したマウスと比較して顕著に遅延した。
【０１３６】
実施例７．  ｒｓｈＣＤ６ｌｃｋトランスジェニックマウス（配列番号３、すなわちヒト可溶性ＣＤ６アイソフォームを過剰発現するマウス）の作製
ｉｎ  ｖｉｖｏでのｓｈＣＤ６の機能的関連性を調べるために、本発明者らは、ｌｃｋプロモーター及びＥμエンハンサーの制御下で組換えｓｈＣＤ６（ｒｓｈＣＤ６、配列番号３とも称される）を発現する新たなマウス株を作製した（図２０）。このアプローチは、ｒｓｈＣＤ６の発現を選択的にＴリンパ球及びＢリンパ球へと指向するよう意図されている。ｌｃｋプロモーターは、Garvin et al "Structure of the murine lck gene and its rearrangement in a murine lymphoma cell line". Mol Cell Biol  1988 Vol. 8(8), pp.:3058-64に開示されている。
【０１３７】
ｒｓｈＣＤ６をコードする配列（配列番号３）をｐ１０２６ｘベクターにクローニングした。このベクターは、免疫グロブリン重鎖エンハンサー（Ｅμ）の０．９２ｂｐ断片を、ｐ１０１７ベクターのｌｃｋ近位プロモーター部分のＸｂａＩ部位にライゲーションすることによって作製した（Chaffin et al. "Dissection of thymocyte signaling pathways by in vivo expression of pertussis toxin ADP-ribosyltransferase" EMBO J-1990 Vol. 9, pp:3821-3829）。驚くべきことに、この構築物を用いて初めに作製されたトランスジェニックマウスは、恐らくは翻訳の再開のために、機能的ヒト成長ホルモン及びＨ−ｒａｓＮ１７  ｃＤＮＡによってコードされる産物の両方を産生した（データは示さない）。したがって、ｈＧＨの４番目のエクソンのＢｇｌＩＩ部位を切断し、平滑化して（filled in）再ライゲーションし、インフレーム終止コドンを作製した。突然変異ｈＧｘカセットをもたらすこの処理は、同様のトランスジェニック構築物において機能的成長ホルモンタンパク質の発現を防ぐことが示されている（Iritani et al. "Control of B cell development by Ras-mediated activation of Raf" EMBO J - 1997 Vol. 16(23), pp:7019-7031）。
【０１３８】
ｒｓｈＣＤ６配列（配列番号３）を含有する断片を、GenScriptの施設（New Jersey，USA）でｐＵＣ５７ベクターに合成し、ＢａｍＨＩで切断し、５’末端がｌｃｋ近位プロモーターのすぐ下流に位置し、３’末端がｈＧＨリピートの上流に位置するような方向でｐ１０２６ｘベクターのＢａｍＨＩ部位にクローニングした。
【０１３９】
トランスジェニックマウスをPolyGeneの施設（Ruemlang，Switzerland）で作製した。発現プラスミドのｌｃｋ−ＣＤ６断片を、ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて１０μｇのプラスミドを切断することによってｐ１０２６ｘベクターから（Ｅμエンハンサー、ｌｃｋプロモーター及びｈＧＨリピートとともに）切り出した。Ｑｂｉｏｇｅｎｅ  Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ  Ｓｐｉｎキットを用いてＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧアガロース（紫外線曝露を回避する）から断片を精製した後、２ｌの微量注入バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に対して２４時間透析し、４ｎｇ／μｌの濃度まで希釈した。ＤＮＡをＣ５７ＢＬ／６Ｎ由来の接合子に３回（sessions）注射した。この目的で、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ雌性マウス（Charles River WIGA（Sulzfeld）から入手した両親からPolyGeneで繁殖させた）を２８日齢〜３４日齢で過剰排卵させ、PolyGeneのマウス施設で同様に元はCharles Riverから入手したＣ５７ＢＬ／６Ｎ繁殖用雄と交配した。
【０１４０】
注射した接合子を一晩培養し、同様にCharles Riverから入手した偽妊娠Ｂ６ＣＢＡＦ１雌に移した。動物を個別換気ケージ（ＩＶＣ）に入れた。生まれた第一仔を離乳時点で生検し、ＰＣＲプライマーである配列番号１３（５’−ＡＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＴＣＡＡＣＡＣ−３’）及び配列番号１４（５’−ＣＡＧＴＡＧＣＧＴＧＴＧＡＣＴＡＧＧ−３’）を用いたＰＣＲによって導入遺伝子の組込みについて分析した。２匹の陽性子孫が検出され、これらを再生検し、再試験すると、再度陽性と見出された。
【０１４１】
このため、本発明の非ヒトマウスは、ａ）配列番号３を含むコンストラクションを得ること；ｂ）工程ａ）のコンストラクションを受精卵の前核に微量注入すること；ｃ）受精卵を培養すること；ｄ）卵を偽妊娠雌性マウスに移植すること；及びｅ）子孫から配列番号３、すなわち（ｒｓｈＣＤ６）をコードするｃＤＮＡを含有する動物を選択することによって得られる。
【０１４２】
トランスジェニックマウスを同定するために、ヒトＣＤ６の細胞外領域に特異的なフォワードプライマー（５’−ＧＣＴＧＴＣＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＧＡＡＣＴ−３’）及びリバースプライマー（５’−ＧＡＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＴＧＴＣＣＴＣＡＴ−３’）を用いた尾又は耳のＤＮＡからのＰＣＲを行った。図２１は代表的なＰＣＲ分析を示し、トランスジェニックＤＮＡを特定する期待される４９５ｂｐのバンドが示されている。１５０ｂｐのバンドが、配列番号８のフォワードプライマー（５’−ＴＣＡＣＴＣＡＡＧＧＣＡＡＣＣＴＴＣＣＴＧＣ−３’）及び配列番号９のリバースプライマー（５’−ＣＧＡＣＣＴＣＡＴＣＴＣＴＡＡＣＣＡＴＧＡＡＣＡＧ−３’）を用いたハウスキーピングＬＩＥＸ遺伝子からの内部ＰＣＲ増幅対照に相当する。この実験では、マウス２、マウス４及びマウス５は非トランスジェニック同腹子であり、残りのマウスはｒｓｈＣＤ６導入遺伝子に陽性である。
【０１４３】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年4月22日(2014.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん若しくは腫瘍の予防若しくは治療に使用されるか、又はアジュバントとして使用される、ＣＤ５又はＣＤ６の可溶性タンパク質アイソフォームを含有する組成物。
【請求項２】
ＣＤ５がヒトＣＤ５であり、ＣＤ６がヒトＣＤ６である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
可溶性タンパク質アイソフォームが、配列番号２及び配列番号３からなる群より選択される配列を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項４】
可溶性タンパク質アイソフォームが、以下の（ａ）及び（ｂ）から選択されるポリペプチド配列を有することを更に特徴とする、請求項１に記載の組成物：
（ａ）配列番号２と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更により好ましくは９９％以上の同一性を有するポリペプチド配列、又は、
（ｂ）配列番号３と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更により好ましくは９９％以上の同一性を有するポリペプチド配列。
【請求項５】
前記腫瘍が造血起源の腫瘍及び非造血起源の腫瘍から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記がんが黒色腫、肉腫、結腸がん、皮膚がん、上皮腫、結腸直腸がん、乳がん、胃がん、卵巣がん、膵臓がん、脳がん、頭頸部がん、食道がん、精巣がん、奇形腫、子宮頸がんから選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
アジュバントとして使用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記アジュバントが肺炎連鎖球菌の細菌莢膜多糖類、（重合）サルモネラフラジェリン、ポリ−Ｄ−アミノ酸及び大腸菌リポ多糖類のような胸腺依存性（ＴＤ）抗原又は胸腺非依存性（ＴＩ）抗原の群から選択される抗原と併用される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
がん若しくは腫瘍の予防若しくは治療に使用されるか、又はアジュバントとして使用される、少なくとも１つの請求項１〜８のいずれか一項に記載のＣＤ５又はＣＤ６の可溶性タンパク質アイソフォームと、任意の薬学的に許容可能な賦形剤又は担体とを含む医薬組成物。
【請求項１０】
少なくとも１つの更なる活性成分を含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記更なる活性成分が化学療法剤及び治療抗体の群から選択され、該化学療法剤が更に好ましくは細胞増殖抑制剤及び細胞毒性剤、より好ましくはビンクリスチン、ドキソルビシン、カルボプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ビノレルビン、ゲムシタビン、イリノテカン、ドセタキセル、ダカルバジン、ゲフィチニブ、ダサチニブ、イマチニブ、エトポシド、シクロホスファミド及びミトキサントロンの中から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記更なる活性成分が抗原である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＣＤ５の可溶性アイソフォームを発現し、好ましくは配列番号２を含むアミノ酸配列をコードする配列番号１を含むヌクレオチド構築物を含む非ヒト動物。
【請求項１４】
実験的に誘発された自己免疫疾患の増強の表現型及び腫瘍／がん進行に対する耐性を示す、請求項１３に記載の非ヒト動物。
【請求項１５】
配列番号２が過剰発現される、請求項１３又は１４に記載の非ヒト動物。
【請求項１６】
ＣＤ６の（好ましくは可溶性）アイソフォームを発現する非ヒト動物。
【請求項１７】
配列番号３を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の非ヒト動物。
【請求項１８】
前記ＣＤ６のアイソフォームが本質的にＢ細胞及び／又はＴ細胞のみで、好ましくはｌｃｋプロモーターの制御下で発現される、請求項１６又は１７に記載の非ヒト動物。
【請求項１９】
マウスである、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【国際調査報告】
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