(57)【要約】  サッカロミケス  ケレウィシアエ  変種  ブラウディおよび酵素スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）を含有する組成物が開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サッカロミケス  ケレウィシアエ  変種  ブラウディおよび酵素スーパーオキシドディスムターゼを含有する組成物。
【請求項２】
スーパーオキシドディスムターゼは、胃酸に対する保護がなされた形態であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
同時投与、個別投与、または、逐次的投与に適合する、キットの形態であることを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
栄養補助食品としての使用を目的とすることを特徴とする、請求項１、２または３に記載の組成物。
【請求項５】
肥満に関連する、代謝性機能不全の進展のリスクの低減または抑制における使用を目的とすることを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６】
肥満と関係する、全身性の炎症性症状の改善、食事摂取の低減、体脂肪の蓄積の低減、ならびに、体重増加の低減における使用を目的とすることを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、栄養補助食品として有用な、生菌酵母菌  サッカロミケス  ブラウディ(Saccharomyces boulardii)と、抗酸化性酵素  スーパーオキシドディスムターゼを含有する製剤に関する。本発明にかかる製剤は、肥満に関連する、代謝症候群の進行のリスクを低減する目的に有用である。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、体脂肪が過剰な状態と定義され、そして、心血管疾患（ＣＶＤ）やインシュリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）を初めとする、多数の機能障害と関連している。
【０００３】
成人、子供、青年における、肥満ならびに過体重の有病率は、過去３０年の間に急速に伸びており、そして、増加が継続しており、高額な社会的費用を引き起こしている。
【０００４】
肥満は、ほとんど体を動かさない生活習慣と、過剰なエネルギー摂取との組み合わせの結果と、一般に見做されているが、これらの要因は、当然、大きな影響力があるものの、最適下限を下回る腸内の常在細菌量も影響を有しており（Tennyson C.A., Friedman G., Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes., 2008 Oct; 15(5): 422-7）、一方、肥満している個人において発生する、低悪性度の全身性の炎症と全身的な代謝性合併症は関連している（Fantuzzi G.,J.Allergy Clin.Immunol., 2005; 115: 911-919, Backhed F., Ding H., Wang T.、PNAS 2004；101: 15718-15723）ことが、最近示唆されている。
【０００５】
更には、ラクトバシラス  ガセリ（L.gasseri）、ラクトバシラス  カゼイ（L.casei）、ラクトバシラス  アシドフィルス（L.acidophilus）種中の乳酸産生細菌等の、幾つかの種の細菌は、炭水化物を多く含む食餌で肥育されたラットにおける体重増加を軽減できることが実証された（Kang J.H., Yun S.I., Park H.O., J.Microbiol., 2010 Oct.; 48(5): 712-4, Epub. 2010 Nov. 3）。
【０００６】
これらの研究を根拠として、肥満に由来する代謝性機能障害の治療、あるいは、予防が可能であるラクトバシラス属ならびにビフィドバクテリウム属に属する生菌の細菌を含有する製品が記載されている（ＷＯ２０１０/１４６５６８(特許文献１); ＷＯ２０１０/０９１９９２;ＵＳ２００８/２６７９３３）。
【０００７】
これまでに、プロバイオティクス細菌の広く言及されている特徴に加えて、科学刊行物中の多くの論文が、酵母菌サッカロミケス  ブラウディによる、クロストリジウム  ディフィシル（Clostridium difficile）の毒素Ａの不活性化（Castagliuolo I., Riegler M.F., Valenick L., LaMont J.T., Pothoulakis C., Infect. Immun., 1999 Jan.; 67(1): 302-7）、および腸内病原体による感染または抗生物質治療に起因する下痢の予防における、サッカロミケス  ブラウディの有効性（Surawicz C.M., Elmer G.W., Speelman P., McFarland L.V., Chinn J., van Belle G., Gastroenterology, 1989 Apr.; 96(4): 981-8(非特許文献１); McFarland L.V., World J. Gastroentrol., 2010 May 14; 16(18): 2202-22）等の、プロバイオティクス酵母菌の健康に対するいくつかの有益な効果を記載している。
【０００８】
酵素スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）は、非経口的に投与した際、多くの炎症性疾患において、フリーラジカル種の生成ならびに組織の損傷を低減する、改善効果を有する（Carroll I.M., et al., Am J Physiol Gastrointest. Liver Physiol., 2007 Oct.; 293(4): G729-38(非特許文献２); Oku T., et al., Inflamm Bowel Dis., 2006 Jul.; 12(7): 630-40）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１４６５６８号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Surawicz C.M., Elmer G.W., Speelman P., McFarland L.V., Chinn J., van Belle G., Gastroenterology, 1989 Apr.; 96(4): 981-8
【非特許文献２】Carroll I.M., et al., Am J Physiol Gastrointest. Liver Physiol., 2007 Oct.; 293(4): G729-38
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
これらの詳細な、多くの研究にも関わらず、肥満ならびに関連する疾患の予防、あるいは、対抗を可能とする、生菌の酵母菌を基礎とする組成物は、これまで、研究あるいは提案もなされていない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の開示
本発明は、肥満ならびに、それに関連する代謝症候群の進行のリスクを低減する上で有用な、生菌の酵母菌と抗酸化剤とを含有する組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ｓｂ単独ではそうでもないが、Ｓｂ＋ＳＯＤによる食餌の栄養補助は、高カロリー食餌に付随する体重増加を有意に抑制することを示す図である。
【図２−１】Ｓｂ単独の投与を受けていた動物、ならびにＳＯＤと組み合わせてＳｂの投与を受けていた動物において、腹部の断面での脂肪組織の蓄積は、有意に軽減されたことを示す図２である。
【図２−２】試験期間の終了時、動物を解体し、そして、腹部の脂肪を注意して採取し、計量し、引き続く、組織学的試験のため、ホルマリン中で固定化した図２ａである。
【図３−１】グルコース耐容性を曲線下面積（ＡＵＣ）として算出した図３ａである。
【図３−２】グルコース耐容性を曲線下面積（ＡＵＣ）として算出した図３ｂである。
【図４】肝臓の試料から全タンパク質を抽出し、ＩＲＳ１タンパク質のリン酸化レベルを評価するため、免疫ブロット試験にかけた結果を示す。
【図５】炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ−α）の循環血液中濃度を測定した結果を示す図である。
【図６】アディボカイン（レプチン）の循環血液中濃度を測定した結果を示す図である。
【図７】炎症誘発性サイトカイン  ＩＬ１−βレベルを比較した結果を示す図である。
【図８】炎症誘発性サイトカイン  ＴＮＦ−αレベルを比較した結果を示す図である。
【図９】回腸におけるグルタチオン（ＧＳＨ）を比較した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
肥満に関連する代謝症候群の進行のリスクを低減することが可能な、該組成物中に存在する生菌の酵母菌は、サッカロミケス属に属し、より好ましくはサッカロミケス  ケレウィシアエ  変種  ブラウディ（以降、Ｓｂと称する）の種に属する。
【００１５】
該生菌の酵母菌Ｓｂと組み合わせて使用される抗酸化性物質は、抗酸化性酵素の部類に属し、より好ましくは酵素スーパーオキシドディスムターゼ（以降、ＳＯＤと称する）である。
【００１６】
ＳＯＤは、従来の手法ならびに賦形剤を用いて、胃酸保護の形態に調製することが好ましい。生菌の酵母菌の有効投与量は、１日の投与当たり、１０6〜１０9のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の範囲、好ましくは約１０7ＣＦＵであり、一方、ＳＯＤの有効投与量は、１日当たり、１〜１００ｍｇの範囲、好ましくは２〜５０ｍｇの範囲、そしてより好ましくは５〜２０ｍｇの範囲である。１日当たり約１０ｍｇの投与が特に好ましい。
【００１７】
また、酵母菌ならびにＳＯＤは、同時投与、個別投与、または逐次的投与することができる：その際、二つの活性成分は、単一の投与単位に纏める必要はなく、そして、任意に二つの活性成分について個別の投与形状を具えるキット形態の製品として使用することができる。
【００１８】
本発明が供給する食餌栄養補助剤の有効性は、体重、腹部の脂肪蓄積ならびに食事摂取量等の身体的な特性の観察、ならびに、炎症誘導性サイトカイン濃度や血液中のグルコース濃度等のいくつかの生化学的指標の測定によって、評価されている。
【００１９】
食餌栄養補助剤としての、本発明にかかる組成物の有効性は、毎日、ＳｂとＳＯＤを補足した、または担体のみを補足した、高カロリー食餌あるいは標準カロリー食餌を、４週齢から与えられた、Ｃ５７ＢＬ/６系統の雄のマウスにより作製された、非遺伝性マウス肥満モデルにおいて、試験した。
【００２０】
９週間にわたる、食餌栄養補助剤の投与の間、毎週、体重と食餌摂取量を量った。
【００２１】
投与期間の終了時、動物は、終夜絶食させた後、グルコース耐容性試験に供した；他の動物は、循環血液中のサイトカインの定量に要する、末梢血液の採取、ならびに、蓄積した腹部脂肪の測定のため、解体した。
【実施例】
【００２２】
下記の事例において、本発明をより詳細に説明する。
【００２３】
例１：体重、食餌摂取ならびに体脂肪の調節
肥満による影響を受ける、身体的な特性の調整における、ＳｂとＳＯＤの組成物からなる食餌栄養補助剤の効果を評価する目的で、４週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウス(１５．２±０．３ｇ)を無作為に選別した群に区分し、１０7ＣＦＵのＳｂ（胃プローブにより投与）および／または、酵母から抽出し、１８００００Ｕ/ｇの比活性まで精製した後、マイクロカプセル化によって胃抵抗性とした上で、食餌中に混ぜ合わせた、１０ｍｇのＳＯＤからなる、毎日の食餌栄養補助の有る状態または無い状態で、標準カロリー食餌（７７％炭水化物、１９％タンパク質、および４％脂肪）あるいは高カロリー食餌（ＶＨＦ、２１％炭水化物、１９％タンパク質、および６０％脂肪）を与えた。しかし、グリアジン  フィルム媒体あるいは他の等価な手段等の他の胃保護の手法も、同等の効果を奏し、従って、本発明の目的に対しては等価と考えることができる。
【００２４】
食餌ならびに食餌栄養補助剤は、延べ９週間の間、継続して投与した。
【００２５】
動物の食餌摂取量（表）ならびにその体重は、週毎にモニターし、一方、内臓の脂肪の蓄積は、９週間にわたる食餌栄養補助の後に、定量した。
【００２６】
試験期間の終了時、動物を解体し、そして、腹部の脂肪を注意して採取し、計量し、引き続く、組織学的試験のため、ホルマリン中で固定化した（図２ａ）。
【００２７】
Ｓｂ単独ではそうでもないが、Ｓｂ＋ＳＯＤによる食餌の栄養補助は、高カロリー食餌に付随する体重増加を有意に抑制する（図１）。更には、Ｓｂ単独の投与を受けていた動物、ならびにＳＯＤと組み合わせてＳｂの投与を受けていた動物において、腹部の断面での脂肪組織の蓄積は、有意に軽減された（図２と図２ａ）。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
例２：肥満における、生化学的指標の制御
９週間にわたる例１に記載する試験の後、肥満に付随する代謝性合併症における、ＳｂとＳＯＤの組成物からなる食餌栄養補助剤の効果を評価する目的で、マウスを、経口的グルコース負荷試験ならびに対象とする臓器（肝臓）における、インシュリンにより誘起される一連の信号の研究にかけた。
【００３０】
経口的グルコース耐容性試験を実施するため、１８時間の絶食後、経口的グルコース負荷（２ｍｇ／ｇ体重）の投与前に、血液中のクルコースを測定した。
【００３１】
その後、血液中のクルコースを３０分間於きに１２０分間の間測定し、グルコース耐容性を曲線下面積（ＡＵＣ）として算出した（図３ａと図３ｂ）。
【００３２】
インシュリンにより誘起される一連の信号の機能状態を評価するため、マウスに対して、インシュリン負荷（１０Ｕ／ｋｇ体重）を腹腔内に投与した。今回は、５分後に動物を解体し、そして、肝臓の試料を採取し、凍結した。
【００３３】
肝臓の試料から全タンパク質を抽出し、ＩＲＳ１（インスリン受容体基質：Insulin Receptor Substrate 1）タンパク質のリン酸化レベルを評価するため、免疫ブロット試験にかけた（図４）。
【００３４】
正常状態では、インシュリンとその受容体との間の結合は、ＩＲＳ１タンパク質のＴｙｒ941残基に対するリン酸化を引き起こすが、肥満に付随する代謝症候群の場合には、この信号は抑制される。
【００３５】
例１と同じ投与量と同じ調製物を使用した、ＳｂとＳＯＤの同時投与、あるいはＳｂによる栄養補助は、肥満に付随するグルコース負荷後の高血糖の程度を低下させた（図３ａと図３ｂ）。ＳｂとＳＯＤの同時投与は、負荷後の高血糖のより顕著な低下を引き起こした。肥満したマウスにおける、ＳｂとＳＯＤによる食餌の栄養補助は、血液中のグルコース負荷に応答したＩＲＳ１のＴｙｒ941残基に対するリン酸化を回復させ、従ってインシュリンに対する対象組織の不感受性を治す（図４）。
【００３６】
例３：肥満に起因する、全身性炎症
９週間にわたる食餌の栄養補助後、肥満した個体において共通する症状である全身性炎症に対するＳｂとＳＯＤの組成物からなる食餌栄養補助剤の効果を評価する目的で、循環している血液の試料を採取して、炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ−α）ならびにアディボカイン（レプチン）の循環血液中濃度を測定した。ＥＬＩＳＡアッセイ法を使用して血清に対する定量を行った（図５と図６）。
【００３７】
肥満した動物の場合、全身性炎症の発症の一因となるＴＮＦ−αとレプチンの循環血液中濃度の増加が観測された。例１と同じ投与量と同じ調製物を使用した、Ｓｂ＋ＳＯＤあるいはＳｂによる食餌の栄養補助は、ＴＮＦ−αとレプチンの循環血液中濃度を有意に低減させる（図５と図６）。特に、ＳｂまたはＳＯＤのいずれかによる単独の栄養補助と比較しても、有意に高い比率で、Ｓｂ＋ＳＯＤによる栄養補助によって食餌摂取の調整における機能を有する、脂肪組織由来の炎症誘起性アディボカインである、レプチンの血清中濃度は、低減されている（図６）。
【００３８】
例４：肥満における、腸粘膜の炎症状態
９週間にわたる食餌の栄養補助後、肥満に付随する粘膜の炎症症状に対する、ＳｂとＳＯＤの組成物からなる食餌栄養補助剤の効果を評価する目的で、被験動物を解体することで、回腸の部分が回収された。全タンパク質を抽出するために、プロテアーゼ阻害剤の混合物を予め添加したリン酸緩衝液中において、該腸の切片の破砕均一化処理を行った。破砕物は、４℃で、１３０００×ｒｐｍで１０分間遠心し、そして固形物を除去した、上清を使用して、ＥＬＩＳＡアッセイによる、炎症誘発性サイトカイン  ＩＬ１−βとＴＮＦ−αの定量、ならびに、最も効果的な抗酸化性の天然化合物である、グルタチオン（ＧＳＨ）の定量を行った。ブラッドフォード  アッセイ法で決定した、全タンパク質濃度に対して、サイトカインの濃度を規格化した。
【００３９】
肥満した個体の場合、全身性の合併症の発症の一因となる、ＩＬ１−βとＴＮＦ−αの濃度の増加が、腸の粘膜で観測される。例１と同じ投与量と同じ調製物を使用した、ＳｂとＳＯＤの同時投与、あるいは、Ｓｂによる食餌の栄養補助は、両サイトカインの有意な低減を引き起こす（図７と図８）。図７と図８は、ＳｂとＳＯＤの同時投与のみが、コントロール群のマウスと同等の値まで、腸の粘膜中のＩＬ１−βとＴＮＦ−αを戻すことを明確に示している。
【００４０】
強力な抗酸化活性を具え、そして、粘膜の濃度において、抗炎症性機能に関与できる、グルタチオン（ＧＳＨ）は、肥満した動物の回腸において有意な減少を示す。Ｓｂ＋ＳＯＤにより栄養補助した場合、その濃度は非常に上昇するが、ＳｂまたはＳＯＤのいずれかによる単独の栄養補助のみは、有効ではない（図９）。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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