(57)【要約】  アルツハイマー病を診断する方法および処置する方法が提供される。特に、抗血管新生薬またはタイトジャンクション完全性を回復可能な薬剤を投与することによって、アルツハイマー病に罹患した人において血液脳関門の完全性を回復するおよび／または血管リバースを促進する方法。また、対象においてアルツハイマー病を予防する方法またはその発症を遅延する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病を有するまたは発症するリスクのある患者において、アルツハイマー病を処置するまたはその発症を遅延する方法であって、有効量の抗血管新生薬を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
アルツハイマー病を有するまたは発症するリスクのある患者において、血液脳関門（ＢＢＢ）の完全性を維持するおよび／または回復する方法であって、有効量の抗血管新生薬および／またはＡβアミロイド形成を抑制するまたは脳からのＡβペプチドの除去を促進する薬剤を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項３】
アルツハイマー病を有するまたは発症するリスクのある患者の脳において血管リバースを促進する方法であって、有効量の抗血管新生薬および／または脳からのＡβペプチドの除去を促進する薬剤を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項４】
前記抗血管新生薬が、ベキサロテン、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、イマチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、レフルノミド（ＳＵ１０１）、ミドスタウリン（ＰＫＣ４１２）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ＡＧ０１３７３６、ＡＺＤ２１７１、ＣＰ５４７，６３２、ＣＰ６７３，４５１、ＲＰＩ．４６１０、ＶＥＧＦトラップ、ＺＤ６４７４、ＹＭ３５９４４５、ＳＵ５４１６、テムシロリムス（トリセル（登録商標））、バチマスタット、マリマスタット、ネオバスタット、プリノマスタット、カルボキシアミドトリアゾール、ＴＮＰ−４７０、ＣＭ１０１、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１２、血小板因子−４、スラミン、ＳＵ５４１６、トロンボスポンジン、アンジオスタチン、エンドスタチン、サリドマイド、テトラチオモリブデート、テコガラン、ラゾキサンまたはレスベラトロールである、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記脳からのＡβペプチドの除去を促進する薬剤が、Ａβペプチド、またはＡβペプチドに特異的に結合する抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
アルツハイマー病を発症するリスクのあるまたは早期アルツハイマー病を有する対象を特定する方法であって、対象の脳における、血管新生、タイトジャンクション破壊および／または血液脳関門破壊を検出することを含む、前記方法。
【請求項７】
アルツハイマー病の処置に有望な治療薬を特定する方法であって、脳血管におけるタイトジャンクションを回復するまたは脳における血管リバースを促進する候補薬剤の能力をテストすることを含む、前記方法。
【請求項８】
血液脳関門の機能的生体外モデルを形成する株化細胞の培養物を提供する工程、
該培養物をタイトジャンクションを破壊する薬剤に接触させる工程、
該培養物を前記候補薬剤に接触させる工程、および
該細胞培養物における該タイトジャンクションの完全性を評価する工程を含み、
前記候補薬剤を投与しない対照動物と比較して、該タイトジャンクションにおける完全性が増加していることが、前記薬剤が有望な治療薬であることを示す、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アルツハイマー病の動物モデルに前記候補薬剤を投与する工程、および
脳血管におけるタイトジャンクションの完全性を評価する工程を含み、
前記候補薬剤を投与しない対照動物と比較して、該タイトジャンクションにおける完全性が増加していることが、前記薬剤が有望な治療薬であることを示す、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断法および治療法の分野に関し、特に、アルツハイマー病に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、痴呆症のもっとも一般的な形態である。この疾患の原因および進行に関してはよく理解されていないが、アミロイドプラーク形成の進行およびアミロイドβペプチドの血管沈着物がアルツハイマー病の病理学的特徴であると長い間考えられてきた。
【０００３】
血液脳関門（ＢＢＢ）機能障害が、アルツハイマー病の動物モデルにおいて最初に同定され、これらの動物モデルにおいて老人斑の形成に先行する (Ujiie, et al., (2003), Microcirculation, 10: 463-470)。後に、患者において、血液脳関門機能障害が、アルツハイマー病の、未解明ではあるが顕著な臨床的特徴であることが確認された (Farrall & Wardlaw, (2009) Neurobiol Aging 30: 337-352)。アルツハイマー病における血液脳関門機能障害の起源は不明であるが、アミロイドβペプチド（Ａβ）が直接このプロセスに関与している可能性がある。なぜなら、血液脳関門の漏出が、数種のアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）が過剰発現している多数のアルツハイマー病遺伝子導入動物モデルにおいて実証されているからである (Ujiie, et al., ibid.; Kumar-Singh, et al. (2005) Am J Pathol 167: 527-543; Paul, et al., (2007) J Exp Med 204: 1999-2008; Dickstein, et al. (2006) Faseb J, 20: 426-433)。Ａβペプチドをワクチン接種することで、血液脳関門病変を逆行させることが示されている(Dickstein, et al., ibid.)。
【０００４】
Anderson, et al. (Cardiovascular Psychiatry and Neurology, (2011), Article ID 616829) は、アルツハイマー病においては水分の調節が阻害され、血液脳関門の透過率の異常および血管壁を通る交換速度の異常をもたらすと提案した。
【０００５】
アルツハイマー病において、微小血管障害が高い発生率で起こることが報告されている (Perlmutter, et al., (1990), Brain Res. 508(1):13-19)。アルツハイマー病の影響を受けた脳の領域において血管新生が進行していることも報告されており、組織障害に関係していることが示唆されている (Desai, et al., (2009), J Neural Transmission, 116(5):587-597)。
【０００６】
非ステロイド性抗炎症薬、脂質低下性スタチン、ヒスタミンＨ２レセプター遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬などのある特定の薬剤の慢性的な使用により、高リスク集団におけるアルツハイマー病のリスクを減少させることが報告されている。これらの薬剤は抗血管新生の特性も有する可能性があり、アルツハイマー病が病理的血管新生に媒介されるという、また、脳内皮の血管新生活性化がβアミロイドプラークを沈着させ、重要な神経細胞を殺傷する神経毒性のペプチドを分泌させるという予備的仮説を導いている (Vagnucci & Li, (2003), Lancet, 361:605-608)。
【０００７】
黄プラーク変性症、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、アルツハイマー病、肥満症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管奇形、血管腫、子宮内膜症などの血管新生の増加を特徴とする血管新生関連疾患や障害において、ｐｌ９０ＲｈｏＧＡＰ活性化薬、ＴＦＩＩ−Ｉ活性化薬、ＧＡＴＡ−２阻害剤から選択された抗血管新生薬を使用して血管新生を抑制する方法は、既に開示されている (WO 2009/155504)。
【０００８】
この背景情報は、本発明に関係する可能性があると出願人が考える情報を公表する目的で提供されるものである。前記の情報が本発明に対する先行技術を構成するものであると認めることを必ずしも意図するものではなく、またそう解釈されるべきでもない。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、アルツハイマー病を診断および処置する方法を提供することを目的とする。
【００１０】
本発明のある側面によれば、アルツハイマー病を有するまたはそのリスクにある個体の脳における血管新生を抑制することにより、アルツハイマー病を処置するまたは発症を遅延する方法が提供される。
【００１１】
本発明の他の側面によれば、抗血管新生薬単独でまたは治療薬と併用で投与することによってアルツハイマー病を処置する方法が提供される。
【００１２】
本発明のある側面によれば、アルツハイマー病を有するまたは発症するリスクのある患者において血液脳関門（ＢＢＢ）の完全性を回復する方法であって、有効量の抗血管新生薬および／またはＡβアミロイド形成を予防するおよび／または脳からのＡβペプチドの除去を促進する薬剤を対象に投与することを含む、前記方法が提供される。
【００１３】
本発明のある側面によれば、対象において血液脳関門の完全性を維持する方法であって、有効量の抗血管新生薬および／またはＡβアミロイド形成を抑制するおよび／または脳からのＡβペプチドの除去を促進する薬剤を対象に投与することを含む、前記方法が提供される。
【００１４】
本発明の他の側面によれば、アルツハイマー病を有するまたは発症するリスクのある患者において脳における血管リバースを促進する方法であって、有効量の抗血管新生薬および／または脳からのＡβペプチドの除去を促進する薬剤を対象に投与することを含む、前記方法が提供される。
【００１５】
本発明の他の側面によれば、対象において血液脳関門漏出を予防または遅延する方法であって、有効量の抗血管新生薬および／またはＡβアミロイド形成を抑制するおよび／または脳からのＡβペプチドの除去を促進する薬剤を対象に投与することを含む、前記方法が提供される。
【００１６】
本発明の他の側面によれば、アルツハイマー病を発症するリスクを有するまたは早期アルツハイマー病を有する対象を特定する方法であって、対象の脳における、血管新生、タイトジャンクション破壊、および／または血液脳関門破壊を検出することを含む、前記方法が提供される。
【００１７】
本発明の他の側面によれば、アルツハイマー病の処置に有望な治療薬を特定する方法であって、脳血管におけるタイトジャンクションを回復するまたは脳における血管リバースを促進する候補薬剤の能力をテストすることを含む、前記方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
本発明の上記および他の特徴は、添付の図面を参照した以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【００１９】
【図１】Ｔｇ２５７６ＡＤマウスは、大脳タイトジャンクション病変を有する。この図は、オクルディンまたはＺＯ−１（赤色）のどちからを免疫標識し、ＴＯＴＯ−３でＤＮＡ（青色）を対比染色した、老齢Ｔｇ２５７６および野生型マウスの脳血管の代表的な共焦点顕微鏡像を示す。野生型に示されているように、新皮質および海馬にみられる高強度の連続した直線状のオクルディン（Ａ、Ｃ）またはＺＯ−１（Ｅ、Ｇ）の発現を示す血管は、正常とみなされた。Ｔｇ２５７６脳血管構造に見られるような、オクルディン（Ｂ、Ｆ）およびＺＯ−１（Ｄ、Ｈ）の異常な染色では、点状（白色矢頭）や不連続または断続（中空白色矢印）が示された。結果は、３つの別々の実験におけるそれぞれの群につき３匹のマウスから得た代表的なものである。目盛は２０μｍを示す。
【００２０】
【図２−１】老齢Ｔｇ２５７６マウスではタイトジャンクションの発現が減少した。新皮質（Ａ、Ｂ）におけるオクルディンまたはＺＯ−１の発現を、野生型およびＴｇ２５７６マウス間で定量的に比較した。（Ａ）ＺＯ−１発現パターンに異常がみられる皮質の脳血管の割合は、同年齢野生型（＊＊＊ｐ＜０．００１）と比較して老齢Ｔｇ２５７６マウスにおいて有意に高かった。皮質におけるＺＯ−１阻害の発生率も、若年Ｔｇ２５７６（若年野生型、ｎ＝４；若年Ｔｇ２５７６、ｎ＝３；老齢野生型、ｎ＝５；老齢Ｔｇ２５７６、ｎ＝４；＊ｐ＜０．０５）と比較して老齢Ｔｇ２５７６マウスにおいて有意に高かった。（Ｂ）老齢Ｔｇ２５７６マウスでは、同年齢野生型（ｎ＝７、＊＊ｐ＝０．００７２）と比較して、皮質におけるオクルディンタンパク質レベルが有意に減少した。数値は、平均値±ＳＥＭを示す。
【図２−２】老齢Ｔｇ２５７６マウスではタイトジャンクションの発現が減少した。海馬（Ｃ、Ｄ）におけるオクルディンまたはＺＯ−１の発現を、野生型およびＴｇ２５７６マウス間で定量的に比較した。（Ｃ）ＺＯ−１発現パターンに異常がみられる海馬の脳血管の割合が、同年齢野生型（＊＊＊ｐ＜０．００１）と比較して老齢Ｔｇ２５７６マウスにおいて有意に高かった。同様に、海馬におけるＺＯ−１阻害の発生率も、若年Ｔｇ２５７６（若年野生型、ｎ＝４；若年Ｔｇ２５７６、ｎ＝３；老齢野生型、ｎ＝５；老齢Ｔｇ２５７６、ｎ＝４；＊ｐ＜０．０５）に比較して老齢Ｔｇ２５７６マウスにおいて有意に高かった。（Ｄ）老齢Ｔｇ２５７６マウスでは、同年齢野生型（ｎ＝７、＊＊ｐ＝０．００７６）と比較して、海馬におけるオクルディンタンパク質レベルが有意に減少した。数値は、平均値±ＳＥＭを示す。
【００２１】
【図３】アポトーシスではなく血管新生が、Ｔｇ２５７６マウスにおけるタイトジャンクション免疫反応性の変化を誘発する。この図は、老齢野生型およびＴｇ２５７６マウスにおいて、血管新生またはアポトーシスのマーカーを二重染色したタイトジャンクション（ＺＯ−１）の代表的な共焦点顕微鏡像を示す。すべての血管において、タイトジャンクション発現パターンにかかわらず、ＣＤ１０５が染色された。白色矢頭は、血管構造におけるタイトジャンクション異常領域を示す。野生型（ａ）およびＴｇ２５７６（ｂ）の新皮質におけるＺＯ−１（赤色）およびＣＤ１０５（緑色）を有する血管の二重染色。野生型（ｃ）およびＴｇ２５７６（ｄ）の新皮質におけるＺＯ−１（赤色）およびカスパーゼ３（緑色）を有する血管の二重染色。カスパーゼ３の染色がＺＯ−１の染色と共存しなかったことは、血管構造におけるアポトーシスの不在を示唆した。（Ｅ、Ｆ）ＣＤ１０５およびカスパーゼ３のウェスタンブロット分析。結果は、３つの別々の実験において検査した脳組織のそれぞれの群につき３匹のマウスから得た代表的なものである。目盛は２０μｍを示す。
【００２２】
【図４−１】微小血管密度は、老齢Ｔｇ２５７６およびヒトＡＤ患者において増加する。脳血管構造におけるＣＤ１０５染色による微小血管密度およびＣＤ１０５タンパク質発現を、老齢および若年Ｔｇ２５７６ならびに野生型において定量した。（Ａ）老齢Ｔｇ２５７６マウスでは、同年齢野生型と比較して微小血管密度が有意に高かった（＊＊＊ｐ＜０．００１）。老齢Ｔｇ２５７６では、若年Ｔｇ２５７６と比較して、微小血管密度が有意に高かった（老齢野生型、ｎ＝５；老齢Ｔｇ２５７６、ｎ＝４；若年野生型、ｎ＝４；若年Ｔｇ２５７６、ｎ＝３；＊ｐ＜０．０５）。有意ではないが、若年Ｔｇ２５７６マウスでは、野生型と比較して平均微小血管密度が高い傾向があった。（Ｂ）老齢Ｔｇ２５７６マウスでは、同年齢野生型（野生型、ｎ＝５；Ｔｇ２５７６、ｎ＝６；＊＊＊ｐ＜０．００１）と比較して、皮質におけるＣＤ１０５タンパク質レベルが有意に増加した。数値は、平均値±ＳＥＭを示す。
【図４−２】微小血管密度は、老齢Ｔｇ２５７６およびヒトＡＤ患者において増加する。脳血管構造におけるＣＤ１０５染色による微小血管密度およびＣＤ１０５タンパク質発現を、老齢および若年Ｔｇ２５７６ならびに野生型において定量した。（Ｃ）老齢Ｔｇ２５７６マウスでは、同年齢野生型（ｎ＝７、＊ｐ＜０．０５）と比較して、海馬におけるＣＤ１０５タンパク質レベルが有意に増加した。（Ｄ）ＡＤ患者の皮質では、ＮＤ患者（ｎ＝４、＊ｐ＜０．０５）と比較して、ラミニン染色が占める面積率として測定した微小血管密度が有意に増加した。（Ｅ）ＡＤ患者の海馬では、ＮＤ患者（ｎ＝４、＊＊＊ｐ＜０．００１）と比較して、ラミニン染色が占める面積率として測定した微小血管密度が有意に増加した。数値は、平均値±ＳＥＭを示す。
【図４−３】微小血管密度は、老齢Ｔｇ２５７６およびヒトＡＤ患者において増加する。ＮＤ患者（Ｆ）およびＡＤ患者（Ｇ）の皮質におけるラミニンの免疫組織化学染色の代表的な像。目盛は９５μｍを示す。
【００２３】
【図５】ＡβおよびＰＢＳ免疫Ｔｇ２５７６マウスは、共焦点顕微鏡により評価すると、正常および異常タイトジャンクション発現を示す。オクルディンまたはＺＯ−１（赤色）のどちらかを免疫標識し、ＴＯＴＯ−３でＤＮＡ（青色）を対比染色したＡβ免疫（予防的にまたは治療的に）Ｔｇ２５７６マウスの脳血管の代表的な共焦点顕微鏡像。正常なタイトジャンクションの発現は、血管における高強度の連続した直線状のオクルディンまたはＺＯ−１発現を示した。（ａ）Ａβで治療的に免疫したＴｇ２５７６マウスの海馬の微小血管における正常なオクルディン発現。（ｂ）Ａβで予防的に免疫したＴｇ２５７６マウスの皮質の微小血管における正常なＺＯ−１発現。皮質および海馬の血管における異常なタイトジャンクション発現は、薄い、点状および不連続状の形態（白色矢頭）を示した。（ｃ）治療的に免疫したＴｇ２５７６マウスの皮質における異常なＺＯ−１発現。（ｄ）予防的に免疫したＴｇ２５７６マウスの海馬における異常なオクルディン発現。（ｅ）治療的に免疫したＴｇ２５７６マウスにおける異常なオクルディン発現を示す大血管の横断面。（ｆ）予防的に免疫したＴｇ２５７６マウスにおける異常なＺＯ−１発現を示す大血管の横断面。結果は、３つの別々の実験においてそれぞれの群につき３匹のマウスから得た代表的なものである。目盛は２０μｍを示す。
【００２４】
【図６】Ａβで一年間予防的に免疫したＴｇ２５７６マウスは、ＰＢＳ免疫対照と比較して、タイトジャンクション異常を低減した。ＰＢＳまたはＡβのどちらかで予防的に免疫したＴｇ２５７６（Ｔｇ／＋）および野生型（＋／＋）マウスの（ａ）皮質および（ｂ）海馬におけるタイトジャンクションの異常の発生率を、定量的に比較した。グラフは、ＺＯ−１発現パターンにより、タイトジャンクション異常を示す血管の割合を示す。（ａ）皮質においては、ＰＢＳ＋／＋と比較して、ＰＢＳ免疫Ｔｇ／＋は、タイトジャンクション破壊の発生率が有意に高かった（＊＊ｐ＝０．００８０）。Ａβ免疫Ｔｇ／＋マウスと比較しても、タイトジャンクション破壊の発生率は、ＰＢＳ Ｔｇ／＋において有意に高かった（＊ｐ＝０．０１８８）。（ｂ）海馬においては、ＰＢＳ＋／＋と比較して、ＰＢＳ免疫Ｔｇ／＋は、タイトジャンクション破壊の発生率が有意に高かった（＊＊＊＊ｐ＝０．０００６）。Ａβ免疫Ｔｇ／＋マウスと比較しても、タイトジャンクション破壊の発生率は、ＰＢＳ Ｔｇ／＋において有意に高かった（＊＊＊ｐ＝０．０００９）。数値は、平均値±ＳＥＭを示す。ＰＢＳ＋／＋、ｎ＝３；ＰＢＳ Ｔｇ／＋、ｎ＝４；Ａβ＋／＋、ｎ＝３；Ａβ Ｔｇ／＋、ｎ＝３。
【００２５】
【図７】Ａβで４ヶ月間治療的に免疫したＴｇ２５７６マウスは、ＰＢＳ免疫対照と比較して、タイトジャンクション異常が減少した。ＰＢＳまたはＡβで治療的に免疫したＴｇ２５７６（Ｔｇ／＋）および野生型（＋／＋）マウスの（ａ）皮質および（ｂ）海馬におけるタイトジャンクションの異常の発生率を、定量的に比較した。グラフは、ＺＯ−１発現パターンにより、タイトジャンクション異常を示す血管の割合を示す。（ａ）皮質においては、ＰＢＳ＋／＋と比較して、ＰＢＳ免疫Ｔｇ／＋は、タイトジャンクション破壊の発生率が有意に高かった（＊＊ｐ＝０．００４６）。Ａβ免疫Ｔｇ／＋マウスと比較しても、ＰＢＳ Ｔｇ／＋は、タイトジャンクション破壊の発生率が有意に高かった（＊ｐ＝０．００２８）。（ｂ）海馬においては、ＰＢＳ＋／＋と比較して、ＰＢＳ免疫Ｔｇ／＋は、タイトジャンクション破壊の発生率が有意に高かった（＊＊＊＊ｐ＝０．０１１５）。Ａβ免疫Ｔｇ／＋マウスと比較しても、ＰＢＳ Ｔｇ／＋は、タイトジャンクション破壊の発生率が有意に高かった（＊＊＊ｐ＝０．００８３）。ＰＢＳ＋／＋、ｎ＝４；ＰＢＳ Ｔｇ／＋、ｎ＝３；Ａβ＋／＋、ｎ＝４；Ａβ Ｔｇ／＋、ｎ＝５。数値は、を示す平均値±ＳＥＭ。
【００２６】
【図８】Ａβ免疫Ｔｇ２５７６マウスは、全体的に血管漏出が減少した。ＺＯ−１（赤色）、マウスアルブミン（ｍＡｌｂ、緑色）またはＡβ（緑色）に対して免疫標識した、Ａβで予防的に免疫したＴｇ２５７６マウスの脳血管の共焦点顕微鏡の代表的な像。微小血管（ａ）は典型的に正常なＺＯ−１発現を示し、アルブミンの漏出を示さなかった。白色の矢印は、ＺＯ−１を発現している２つの正常な微小血管を示している。アルブミン漏出は典型的には大血管と関連し（ｂ）、タイトジャンクション異常を示している。漏出（白色矢頭）は、血管から拡散した濃度勾配のある染色として示される。（ｃ）Ａβの血管沈着を含む異常なタイトジャンクション発現（中空白色矢印）を有する大血管。結果は、３つの別々の実験においてそれぞれの群につき３匹のマウスから得た代表的なものである。目盛は２０μｍを示す。
【００２７】
【図９】Ａβ免疫Ｔｇ２５７６マウスは、活性化カスパーゼ３染色を減少した。代表的な共焦点顕微鏡像（２０ｘで撮影）は、オクルディン（ｏｃｃｌｕ、赤色）タイトジャンクションとともに、活性化カスパーゼ３染色（ｃａｓｐ３、緑色）を示す。（ａ）ＰＢＳで治療的に免疫したＴｇ２５７６マウスの皮質における活性化カスパーゼ３染色は、タイトジャンクションハローを包囲した。（ｂ）Ａβで予防的に免疫した野生型マウスの海馬内の活性化カスパーゼ３染色。神経細胞に対応すると思われる糸状構造は、緑色で示される。オクルディンまたはＺＯ−１のどちらかで標識した血管との重なりや共染色は見られなかった。（ｃ）Ａβで治療的に免疫したＴｇ２５７６マウスの皮質における活性化カスパーゼ３染色。脳のこの領域では、カスパーゼ３染色が限定される。結果は、３つの別々の実験においてそれぞれの群につき３匹のマウスから得た代表的なものである。目盛は２０μｍを示す。
【００２８】
【図１０】対照と比較して、Ａβ免疫Ｔｇ２５７６マウスでは微小血管密度が減少した。ＡβまたはＰＢＳで予防的または治療的免疫したＴｇ２５７６（Ｔｇ／＋）および野生型（＋／＋）マウスの脳血管構造における微小血管密度を、ＣＤ１０５染色により定量した。（ａ）ＰＢＳで予防的に免疫したＴｇ／＋マウスは、ＰＢＳ免疫＋／＋と比較して、微小血管密度が有意に増加した（＊ｐ＜０．０００１、ｔ検定）。Ａβ免疫Ｔｇ／＋は、ＰＢＳで免疫したＴｇ／＋と比較して、微小血管密度が有意に減少した（＊＊ｐ＜０．０００１、ｔ検定）。ＰＢＳ＋／＋、ｎ＝４；ＰＢＳ Ｔｇ／＋、ｎ＝４；Ａβ＋／＋、ｎ＝４；Ａβ Ｔｇ／＋、ｎ＝４。（ｂ）ＰＢＳで治療的に免疫したＴｇ／＋は、ＰＢＳ免疫＋／＋と比較して、微小血管密度が有意に増加した（＊＊＊ｐ＝０．０００１、ｔ検定）。Ａβ免疫Ｔｇ／＋は、ＰＢＳで免疫したＴｇ／＋と比較して、微小血管密度が有意に減少した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｔ検定）。ＰＢＳ＋／＋、ｎ＝５；ＰＢＳ Ｔｇ／＋、ｎ＝４；Ａβ＋／＋、ｎ＝４；Ａβ Ｔｇ／＋、ｎ＝３。数値は、平均値±ＳＥＭを示す。
【００２９】
【図１１】Ａβ免疫Ｔｇ２５７６マウスは、正常タイトジャンクション形態を有する。ＺＯ−１（赤色）を免疫標識しＤＮＡ（青色）を対比染色した、ＡβまたはＰＢＳで（予防的または治療的に）免疫した＋／＋およびＴｇ／＋マウスの脳血管構造の代表的な像。正常なＺＯ−１発現は、＋／＋、ＰＢＳ（Ａ、Ｂ）、＋／＋、Ａβ（Ｃ、Ｄ）およびＴｇ／＋、Ａβ（Ｇ、Ｈ）で見られるような、高強度の連続した直線状の染色パターンを有した。横断（Ｈ）した血管において正常ＺＯ−１は、ほぼ平行な線を生じた。異常なＺＯ−１染色パターンは、Ｔｇ／＋、ＰＢＳ（Ｅ、Ｆ）の小血管およびＴｇ／＋、Ａβ（Ｉ、Ｊ）の大血管で見られるような、点状、断続または不連続な（白色矢頭）として観察された。目盛は２０μｍを示す。
【００３０】
【図１２−１】Ａβ免疫Ｔｇ２５７６マウスは、タイトジャンクション異常が減少した。異常なＺＯ−１発現パターンを有する血管の割合は、Ｔｇ／＋、Ａβおよび＋／＋、ＰＢＳ免疫マウスと比較して、Ｔｇ／＋、ＰＢＳにおいて有意に増加した。これらの知見は、免疫方法、（ａ、ｂ）予防的および（ｃ、ｄ）治療的、ならびに脳領域、（ａ、ｃ）皮質または（ｂ、ｄ）海馬において一貫していた。予防的方法では、＋／＋、ＰＢＳ、ｎ＝３；Ｔｇ／＋、ＰＢＳ、ｎ＝４；Ａβ、＋／＋、ｎ＝３；Ｔｇ／＋、Ａβ、ｎ＝３。治療的方法では、＋／＋、ＰＢＳ、ｎ＝４；Ｔｇ／＋、ＰＢＳｎ＝３；＋／＋、Ａβ、ｎ＝４；Ｔｇ／＋、Ａβ、ｎ＝５。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１２−２】Ａβ免疫Ｔｇ２５７６マウスは、タイトジャンクション異常が減少した。異常なＺＯ−１発現パターンを有する血管の割合は、Ｔｇ／＋、Ａβおよび＋／＋、ＰＢＳ免疫マウスと比較して、Ｔｇ／＋、ＰＢＳにおいて有意に増加した。これらの知見は、免疫方法、（ａ、ｂ）予防的および（ｃ、ｄ）治療的、ならびに脳領域、（ａ、ｃ）皮質または（ｂ、ｄ）海馬において一貫していた。予防的方法では、＋／＋、ＰＢＳ、ｎ＝３；Ｔｇ／＋、ＰＢＳ、ｎ＝４；Ａβ、＋／＋、ｎ＝３；Ｔｇ／＋、Ａβ、ｎ＝３。治療的方法では、＋／＋、ＰＢＳ、ｎ＝４；Ｔｇ／＋、ＰＢＳｎ＝３；＋／＋、Ａβ、ｎ＝４；Ｔｇ／＋、Ａβ、ｎ＝５。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００３１】
【図１３−１】Ａβ免疫Ｔｇ２５７６マウスは、微小血管密度を減少した。ＺＯ−１（赤色）異常が（ａ）無しまたは（ｂ）有り（白色矢頭）に関係なく、遍在性ＣＤ１０５（緑色）が脳血管構造を染色する代表的な像。目盛は２０μｍを示す。
【図１３−２】Ａβ免疫Ｔｇ２５７６マウスは、微小血管密度を減少した。Ｔｇ／＋、Ａβおよび＋／＋、ＰＢＳ免疫マウスと比較して、Ｔｇ／＋、ＰＢＳで微小血管密度が有意に増加した。これらの知見は、（ｃ）予防的（すべての群でｎ＝４）および（ｄ）治療的（＋／＋、ＰＢＳ、ｎ＝４；Ｔｇ／＋、ＰＢＳ、ｎ＝３；＋／＋、Ａβ、ｎ＝４；Ｔｇ／＋、Ａβ、ｎ＝４）免疫方法で一貫していた。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１３−３】Ａβ免疫Ｔｇ２５７６マウスは、微小血管密度を減少した。（ｅ）予防的（＋／＋、ＰＢＳ、ｎ＝５；Ｔｇ／＋、ＰＢＳ、ｎ＝４；＋／＋、Ａβ、ｎ＝５；Ｔｇ／＋、Ａβ、ｎ＝３）または（ｆ）治療的（＋／＋、ＰＢＳ、ｎ＝４；Ｔｇ／＋、ＰＢＳ、ｎ＝４；＋／＋、Ａβ、ｎ＝５；Ｔｇ／＋、Ａβ、ｎ＝５）のどちらかで免疫したマウスの脳の体重比の平均には、有意差はなかった。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００３２】
【図１４】免疫Ｔｇ２５７６マウスにおけるＡβ沈着は変化する。（ａ、ｂ）治療的または（ｃ、ｄ）予防的のどちらかで免疫した（ａ、ｃ）Ｔｇ／＋、ＰＢＳマウスと比較して、（ｂ、ｄ）Ｔｇ／＋、ＡβにおいてＡβ沈着（緑色）の一般的な減少を示す代表的な像。
【００３３】
発明の詳細な説明
血液脳関門の完全性の低減は、アミロイドプラークなどの他のアルツハイマー病の病変に先行するので、血液脳関門の完全性を維持または再建することが、アルツハイマー病の処置および／または予防において有用であろう。本発明は、本明細書に記載する、この血液脳関門の完全性の低減が脳における血管新生によるものであるという知見に関するものである。特に、脳における血管新生は、血液脳関門を維持するタイトジャンクションの破壊をもたらす。血管新生の抑制は、タイトジャンクションを回復させ、その結果、血液脳関門の「漏出」を減少させるであろう。さらに、Ａβペプチドのワクチン接種は、血管リバースおよびタイトジャンクションの回復をもたらすことが示された。
【００３４】
従って、ある態様では、脳における血管新生を抑制することにより、アルツハイマー病の病変を処置するおよび／またはその発症を遅延する方法が提供される。ある態様では、本発明は、脳における血管新生を抑制するおよび／または脳血管におけるタイトジャンクションを回復することにより、人において血液脳関門の完全性を維持するおよび／または回復する方法が提供される。ある態様では、これらの方法は、１つまたは２つ以上の抗血管新生薬、１つまたは２つ以上の脳からのＡβペプチドの除去を促進する薬剤、１つまたは２つ以上のアミロイド形成を抑制する薬剤、１つまたは２つ以上の脳血管におけるタイトジャンクションを回復する薬剤、またはその組合せを投与することを含む。ある態様では、Ａβペプチドを単独または１つまたは２つ以上の他の治療薬、例えば、１つまたは２つ以上の抗血管新生薬との組合せで投与することによって、アルツハイマー病を有する対象の脳における血管リバースを促進する方法が提供される。
【００３５】
ある態様では、本発明は、アルツハイマー病の予防および／または処置のための薬剤を特定する方法であって、候補薬剤の、脳における血管新生を抑制する能力、血液脳関門の完全性を維持または回復する能力および／または脳血管におけるタイトジャンクションを回復する能力をテストすることを含む、前記方法を提供する。
【００３６】
本発明のある態様では、アルツハイマー病を発症するリスクのあるまたは早期アルツハイマー病を有する対象を特定する診断方法であって、対象の脳における血管新生、タイトジャンクション（ＴＪ）破壊および／または脳における血液脳関門破壊を検出することを含む、前記方法を提供する。
【００３７】
定義
特に定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００３８】
本明細書で互換可能に使用される「治療」および「処置」という用語は、対象の状態を改善する意図で行われる介入を意味する。改善は、主観的であっても客観的であってもよく、処置する疾患と関連する症状を改良すること、その発症を予防すること、その病状を変化させることに関係する。このように、治療および処置という用語は、最も広い意味で使用され、様々な段階の疾患の予防（病気の予防）、緩和、軽減、治癒を含む。対象の状態の悪化を予防することも、この用語に含まれる。従って、治療／処置を必要とする対象には、疾患を既に有するものだけでなく、疾患に罹りやすい、すなわち発症するリスクのあるもの、および疾患を予防すべきものが含まれる。
【００３９】
本明細書で使用される「対象」および「患者」という用語は、処置を必要とする、哺乳類やヒトなどの動物を意味する。
【００４０】
本明細書で使用される、「約」という用語は、所与の値のおよそ±１０％の変動を意味する。かかる変動は、具体的な記載の有無にかかわらず、本明細書の任意の所与の値において含まれるものであることを理解すべきである。
【００４１】
治療方法
本発明のある側面は、抗血管新生薬および／またはＡβアミロイド形成を予防するおよび／またはＡβペプチドの除去を促進する薬剤の単独使用または追加の治療薬との併用によって、アルツハイマー病を処置するまたはその発症を遅延する方法を提供する。ある態様では、抗血管新生薬および／またはタイトジャンクションの完全性を回復および／またはアミロイド形成を予防および／またはＡβペプチドの除去を促進可能な薬剤の使用により、血液脳関門（ＢＢＢ）の完全性を維持および／または回復するおよび／またはタイトジャンクション（ＴＪ）の完全性を回復することによって、アルツハイマー病を予防および／または処置する方法が提供される。本発明によれば、かかる薬剤としては、従来の小分子薬剤だけでなく、核酸分子、組換えベクター、オリゴヌクレオチド阻害剤（アプタマー、アンチセンスおよびｓｉＲＮＡ）、ペプチド、タンパク質、抗体などの生物学的製剤が挙げられる。
【００４２】
抗血管新生薬の例としては、限定されるものではないが、ＨＤＡＣ阻害剤、バルプロ酸；抗血管新生ケモカイン（ＩＰ−１０、ＰＦ−４、ＭＩＰなど）、セツキシマブ、パニツムマブ、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路阻害剤、ＭＡＰＫ−ファルネシル転移酵素ＲｈｏおよびＲａｓ阻害剤、エルロチニブ、ベキサロテン、パゾパニブ（ヴォトリエント（登録商標））；エベロリムス（アフィニトール（登録商標））；ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、イマチニブ、ソラフェニブ、レセプターチロシンキナーゼ阻害薬、２メトキシエストラジオール、スニチニブ、レフルノミド（ＳＵ１０１）、ミドスタウリン（ＰＫＣ４１２）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ＡＧ０１３７３６、ＡＺＤ２１７１、ＣＰ５４７，６３２、ＣＰ６７３，４５１、ＲＰＩ．４６１０、ＶＥＧＦトラップ、ＺＤ６４７４、ＹＭ３５９４４５、ＳＵ５４１６、テムシロリムス（トリセル（登録商標））、バチマスタット、マリマスタット、ネオバスタット、プリノマスタット、カルボキシアミドトリアゾール、フマギリン、ＴＩＭＰ、ＴＮＰ−４７０、ＣＭ１０１、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１２、血小板因子−４、スラミン、ＳＵ５４１６、トロンボスポンジン、アンジオスタチン、エンドスタチン、サリドマイド、テトラチオモリブデート、テコガラン、ラゾキサン；イスミン（ｉｓｔｈｍｉｎ）；二重Ｍｅｔ／ＶＥＧＦレセプター２キナーゼ阻害薬Ｅ７０５０；リコリン塩酸塩、レスベラトロールが挙げられる。
【００４３】
血管新生を抑制するペプチドの例としては、限定するものではないが、ＳＰＡＲＣペプチド；細胞外基質タンパク質由来のペプチド（シレンジタイド（ＥＭＤ１２１９７４）；標的ＲＧＤ；ＡＴＮ−１６１；タムスタチンペプチド；タムスタチン断片；ペンタスタチン−１；エンドスタチンペプチド；エンドスタチン断片ＩＶ、ＩＶｏｘ；エンドスタチンペプチド断片Ｉ（１８０−１９９）；Ｃ１６Ｙ；Ｃ１６Ｓ）；成長因子またはそれらの受容体由来ペプチド（ＶＥＧＦ由来ペプチドＤ（ＬＰＲ）すなわちＫＳＶＲＧＫＧＫＧＱＫＲＫＲＫＫＳＲＹＫ；ＦＧＦ由来ペプチドＡｃ−ＡＲＰＣＡ；Ｐ１４４ＴＳＬＤＡＳＩＩＷＡＭＭＱＮ）；凝固カスケードに関与するタンパク質由来ペプチド（Ｂ９８７０；ＨＰＲＧ由来（（ＨＨＰＨＧ）４）；Ａ−７７９；ＫＶ１１；ＫＰＳＳＰＰＥ；フィブリノーゲン由来ＡＲＰＡＫＡＡＡＴＱＫＫＶＥＲＫＡＰＤＡ）など）；ケモカイン由来ペプチド（ＰＦ４由来（ＮＧＲＫＩＳＬＤＬＲＡＰＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ）；ケモカイノスタチン−１；アンジネックスなど）；ＴＳＰ１ドメイン含有タンパク質由来ペプチド（ＤＩ−ＴＳＰａ；ＡＢＴ−５１０；ＡＢＴ−５２６；プロペリジスタチンなど）；セルピンタンパク質由来ペプチド（ＰＥＤＦ−ＴＧＡ断片；ＰＥＤＦ３４アミノ酸長断片ＰＥＤＦＰ１８；ＳｖＯｒｔｈ−２など）；ｐＴｎＩ；ＲＣ−３９４０−ＩＩ；ＰＡＭＰ１２−２０；ＩＭ８６２；Ａβ；テトラスタチン−１（ＬＰＶＦＳＴＬＰＦＡＹＣＮＩＨＱＶＣＨＹ）；テトラスタチン−３（ＡＡＰＦＬＥＣＱＧＲＱＧＴＣＨＦＦＡＮ）；ペンタスタチン−３（ＳＡＰＦＩＥＣＨＧＲＧＴＣＮＹＹＡＮＳ）；スロンボスタチンコン−３（ＳＰＷＳＰＣＳＧＮＣＳＴＧＫＱＱＲＴＲ）；ケモカイノスタチン−７（ＤＧＲＫＩＣＬＤＰＤＡＰＲＩＫＫＩＶＱＫＫＬ）；ケモカイノスタチン−８（ＤＧＲＥＬＣＬＤＰＫＥＮＷＶＱＲＶＶＥＫＦＬＫ）；セマスタチン−５Ａ．１（ＧＰＷＥＲＣＴＡＱＣＧＧＧＩＱＡＲＲＲ）；セマスタチン−５Ｂ（ＴＳＷＳＰＣＳＡＳＣＧＧＧＨＹＱＲＴＲ）；プロペリジスタチン（ＧＰＷＥＰＣＳＶＴＣＳＫＧＴＲＴＲＲＲ）；スコスポンジスタチン（ＧＰＷＥＤＣＳＶＳＣＧＧＧＥＱＬＲＳＲ）；ケモカイノスタチン−１（ＮＧＲＫＡＣＬＮＰＡＳＰＩＶＫＫＩＩＥＫＭＬＮＳ）；ケモカイノスタチン−３（ＮＧＫＫＡＣＬＮＰＡＳＰＭＶＱＫＩＩＥＫＩＬ）；ケモカイノスタチン−５（ＮＧＫＥＩＣＬＤＰＥＡＰＦＬＫＫＶＩＱＫＩＬＤ）；ケモカイノスタチン−６（ＮＧＫＱＶＣＬＤＰＥＡＰＦＬＫＫＶＩＱＫＩＬＤＳ）；セマスタチン−５Ａ．２（ＳＰＷＴＫＣＳＡＴＣＧＧＧＨＹＭＲＴＲ）；ネフロブラストスタチン（ＴＥＷＴＡＣＳＫＳＣＧＭＧＦＳＴＲＶ）；ウィスポスタチン−１（ＳＰＷＳＰＣＳＴＳＣＧＬＧＶＳＴＲＩ）；スロンボスタチンコン−１（ＱＰＷＳＱＣＳＡＴＣＧＤＧＶＲＥＲＲＲ）；ネトリンスタチン−５Ｃ（ＴＥＷＳＶＣＮＳＲＣＧＲＧＹＱＫＲＴＲ）；スロンボスタチンコン−６、サイクリックＣｙｓ４およびＣｙｓ８（ＷＴＲＣＳＳＳＣＧＲＧＶＳＶＲＳＲ）；ウィスポスタチン−２（ＴＡＷＧＰＣＳＴＴＣＧＬＧＭＡＴＲＶ）；ウィスポスタチン−３（ＴＫＷＴＰＣＳＲＴＣＧＭＧＩＳＮＲＶ）；パピロス���チン−１（ＧＰＷＡＰＣＳＡＳＣＧＧＧＳＱＳＲＳ）；パピロスタチン−２（ＳＱＷＳＰＣＳＲＴＣＧＧＧＶＳＦＲＥＲ）；ヘキサスタチン−２（ＹＣＮＩＮＥＶＣＨＹＡＲＲＮＤＫＳＹＷＬ）；スポンジンスタチン−１（ＳＥＷＳＤＣＳＶＴＣＧＫＧＭＲＴＲＱＲ）；コネクトスタチン（ＴＥＷＳＡＣＳＫＴＣＧＭＧＩＳＴＲＶ）；サイロスタチン（ＴＳＷＳＱＣＳＫＴＣＧＴＧＩＳＴＲＶ）；ネトリンスタチン−５Ｄ（ＴＥＷＳＡＣＮＶＲＣＧＲＧＷＱＫＲＳＲ）；フィブロスタチン−６．１（ＳＡＷＲＡＣＳＶＴＣＧＫＧＩＱＫＲＳＲ）；フィブロスタチン−６．２（ＡＳＷＳＡＣＳＶＳＣＧＧＧＡＲＱＲＴＲ）；フィブロスタチン−６．３（ＱＰＷＧＴＣＳＥＳＣＧＫＧＴＱＴＲＡＲ）；カーティロスタチン−１（ＳＰＷＳＫＣＳＡＡＣＧＱＴＧＶＱＴＲＴＲ）；カーティロスタチン−２（ＧＰＷＧＰＣＳＧＳＣＧＰＧＲＲＬＲＲＲ）；アダムソスタチン−４（ＧＰＷＧＤＣＳＲＴＣＧＧＧＶＱＦＳＳＲ）；アダムソスタチン−１６（ＳＰＷＳＱＣＴＡＳＣＧＧＧＶＱＴＲ）；アダムソスタチン−１８（ＳＫＷＳＥＣＳＲＴＣＧＧＧＶＫＦＱＥＲ）；アダムソスタチン様４（ＳＰＷＳＱＣＳＶＲＣＧＲＧＱＲＳＲＱＶＲ）；コンプルスタチン−Ｃ６（ＴＱＷＴＳＣＳＫＴＣＮＳＧＴＱＳＲＨＲ）；テトラスタチン−２（ＹＣＮＩＨＱＶＣＨＹＡＱＲＮＤＲＳＹＷＬ）；ヘキサスタチン−３（ＬＰＲＦＳＴＭＰＦＩＹＣＮＩＮＥＶＣＨＹ） (Rosca et al. Curr Pharm Biotechnol. 2011 August 1; 12(8): 1101-1116 概説参照) が挙げられる。
【００４４】
ある態様では、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＦＧＦレセプター、ＥＧＦ、ＥＧＦレセプター、ＴＧＦβ（限定されるものではないがＴＧＦβ１など）、ＶＥＧＦレセプター、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦレセプター、一酸化窒素合成酵素、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インターロイキン−１β、ＭＭＰ、ＴＮＦαまたはアンジオポエチン−２を抑制する薬剤の投与によりアルツハイマー病を処置する方法が提供される。かかる薬剤の例としては、限定するものではないが、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、イマチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、レフルノミド（ＳＵ１０１）、ミドスタウリン（ＰＫＣ４１２）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ＡＧ０１３７３６、ＡＺＤ２１７１、ＣＰ５４７，６３２、ＣＰ６７３，４５１、ＲＰＩ．４６１０、ＶＥＧＦトラップ、ＺＤ６４７４、ＹＭ３５９４４５、インフリキシマブおよびレスベラトロールが挙げられる。ある態様では、γ−分泌酵素活性を刺激するおよび／またはノッチ標的遺伝子の発現を刺激する薬剤の投与により、アルツハイマー病を処置する方法が提供される。
【００４５】
ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス技術の使用などの遺伝学的手法による血管新生分子の発現の抑制も考えられている。ベクターにより発現された単鎖抗体などの抗体やペプチドを使用した血管新生分子の活性の抑制も考えられている。
【００４６】
いくつかの態様では、血管新生において役割を果たすことが示されているニューロピリン−１またはネスチンを抑制する薬剤の投与によって、アルツハイマー病を処置する方法が提供される。例えば、可溶性ニューロピリン−１は、血管新生を低減させることが知られている。
【００４７】
本明細書で実証されるように、脳の微小血管構造からＡβペプチドを除去することにより、血管リバースおよびタイトジャンクションの回復がもたらされる。従って、ある態様では、血管リバースを促進する方法は、例えば、Ａβに選択的に結合する抗体や他の化合物などのＡβペプチドを除去する薬剤、またはＡβそれ自身を投与することを含む。本発明のいくつかの態様は、Ａβペプチドに対する内因性抗体の産生を刺激する方法を提供する。いくつかの態様は、Ａβペプチド単独または例えば抗血管新生薬などの他の治療薬を組み合わせて投与することによって、アルツハイマー病を有するまたはアルツハイマー病を発症するリスクのある対象の脳において血管リバースを促進する方法を提供する。
【００４８】
血液脳関門の破壊は、アルツハイマー病における他の病変に先行することが知られている。従って、ある態様では、抗血管新生薬または脳血管におけるタイトジャンクションを回復する薬剤の投与により、患者における血液脳関門の完全性を回復することによって、アルツハイマー病と関連する１つまたは２つ以上の疾患病変の発症を遅延または予防する方法が提供される。ある態様では、かかる薬剤の投与により疾患予後を改変する方法が提供される。
【００４９】
ある薬剤は、血液脳関門および／またはタイトジャンクション完全性の回復に作用することが当該分野で知られている。本発明のいくつかの態様は、これらの薬剤の使用を含む治療方法を提供する。かかる薬剤の例としては、限定するものではないが、ブリオスタチン−１、ブチリル酸ナトリウム、レスベラトロール、ケルセチン、デカルシンおよびクラスタリンが挙げられる。グルココルチコステロイド類も血液脳関門の完全性を回復することが示されおり (Marchi, et al., 2011, Cardiovascular Psychiatry and Neurology, Vol. 201, Article ID 482415)、本発明の治療方法での使用が考えられている。
【００５０】
アルツハイマー病における血液脳関門およびタイトジャンクションの破壊は、滲出型黄プラーク変性症で起こる血液網膜関門（ＢＲＢ）の破壊と類似している。従って、本発明のある態様では、例えばＶＥＧＦ阻害剤や抗酸化剤などの、滲出型黄プラーク変性症の処置に使用されるまたはそのために開発中の薬剤を、アルツハイマー病を処置するために使用することが提供される。かかる薬剤の例としては、限定するものではないが、ラニビズマブ（ルセンティス（登録商標））、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、ペガプタニブ（マクジェン（登録商標））、ＶＥＧＦトラップ、ベバシラニブ、パゾパニブ（ヴォトリエント（商標））、ＲＴＰ８０１ｉ−１４／／ＰＦ−６５５、ＡＧＮ−７４５／ＳＩＲＮＡ−０２７、フェンレチニド、ｉＳＯＮＥＰ（商標）、エビゾン（商標）が挙げられる。
【００５１】
血液脳関門およびタイトジャンクションの破壊は、多発性硬化症（ＭＳ）において起こることが知られており、血液脳関門の完全性を改善する多くの薬剤が多発性硬化症の処置のために開発されている。従って、本発明のある態様では、多発性硬化症の処置またはその開発に使用される薬剤を、アルツハイマー病を処置するために使用することが提供される。例としては、限定するものではないが、インターフェロンβ１ａ（例、アボネックス（登録商標）、レビフ（登録商標）、シノベックス（登録商標））およびインターフェロンβ１ｂ（例、ベタフェロン（登録商標）、ベータセロン（登録商標）、エクスタヴィア（登録商標）、ジフェロン（登録商標））などのインターフェロンβ類が挙げられる。ある態様では、グラチラマー・アセテート（コパクソン（登録商標））、ナタリズマブ（タイサブリ（登録商標））および／またはフィンゴリモド（ジレニア（登録商標））など、他の多発性硬化症の処置の使用も、これらの化合物の血液脳関門の完全性に対する有効性はあまり記述されてはいないが、本発明の治療方法での使用が考えられている。
【００５２】
グルココルチコステロイド、抗酸化剤、抗炎症剤、免疫療法などの他の処置様式と抗血管新生薬の組合せのような、抗血管新生薬との併用も本発明のある態様において考えられている。本発明のいくつかの態様では、抗血管新生薬とＡβペプチド免疫との併用が提供される。
【００５３】
ある態様では、前記患者または対象が、アルツハイマー病に関連する公知のリスク因子を有さない、またはアルツハイマー病に関連するリスク因子を有すると特定されていない。他の態様では、前記患者または対象が、アルツハイマー病に関連する１つまたは２つ以上のリスク因子を有すると特定されている。これらのリスク因子としては、限定するものではないが、座りがちな生活様式、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、滲出型黄プラーク変性症、脳卒中、高コレステロール血症、脳アミロイド血管症、脳血管疾患、高血圧、低血圧、震盪症、手術、化学療法、麻酔剤暴露、代謝疾患またはメタボリック症候群、ダウン症、白内障、嗅覚および味覚の消失、歩行変化、認識・記憶能力の変化およびＭＲＩ測定脳容積（サイズ縮小またはサイズ変化）が挙げられる。
【００５４】
診断方法
本発明のある側面は、アルツハイマー病を発症するリスクにあるまたは早期アルツハイマー病を有する対象を特定する診断方法であって、対象の脳における血管新生、タイトジャンクション破壊および／または血液脳関門破壊を検出することを含む、前記方法を提供する。血管新生、タイトジャンクション破壊および／または血液脳関門破壊は、例えば、血管新生、タイトジャンクション破壊および／または血液脳関門の破壊を示すバイオマーカーについて対象からの生物学的サンプルを分析試験すること、または当該分野で公知の医用画像技法を使用して血管新生、タイトジャンクション破壊および／または血液脳関門の破壊を分析試験することにより検出可能である。
【００５５】
本発明の文脈において、生物学的サンプルは、生物学的材料を含むサンプルである。限定するものではないが具体例としては、血液、血清、血漿および脳脊髄液が挙げられる。生物学的サンプルには、例えば、脳組織などの生検サンプルも含まれる。
【００５６】
血管新生の検出に使用可能なバイオマーカーの例としては、例えば、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＭＭＰ−９、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＨＧＦなどの循環血管新生因子；ｓＶＥＧＦＲ１、ｓＶＥＧＦＲ２、ｓＶＥＧＦＲ３、ｓＴｉｅ−２、ＶＣＡＭ−１などの内皮細胞由来分子；エンドスタチン、タムスタチンなどの他の循環タンパク質またはペプチドが挙げられる。
【００５７】
タイトジャンクション破壊の検出に使用可能なバイオマーカーの例としては、例えば、ＩＬ−８、シングリン、ＺＯ−１、ＺＯ−２、オクルディン、クローディン−６、Ｌｆｃ、Ｅ−カドヘリン類、およびこれらのタンパク質の可溶化体または断片が挙げられる。
【００５８】
血液脳関門破壊の指標として血液中に検出可能なバイオマーカーは通常、一般に通常脳脊髄液（ＣＳＦ）に存在するタンパク質である。かかるバイオマーカーの例としては、例えば、トランスサイレチン (Marchi, et al, 2003, J. Neuroscience, 23(5): 1949-1955 参照 )、Ｓ−１００β、可溶性接合部接着分子−３（ｓＪＡＭ−３） (Zrabquer, et al.,2010, J. Immunol., 185(3):1777-1785 参照) が挙げられる。
【００５９】
サンプル中のかかるバイオマーカーをタンパク質またはＤＮＡ／ＲＮＡレベルで検出する方法は当該分野で公知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、プロテオミクス、様々なＰＣＲに基づく技法および様々な配列技法が挙げられる (Ausubel et al. (1994 & updates) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York, NY, and Current Protocols in Protein Science, ed. Coligan, J.E., et al., Wiley & Sons, New York, NY など参照)。
【００６０】
好適な医用画像技法には、一般に（例えば、静脈内または髄腔内注射により）血管構造を増強する造影剤やトレーサーの投与が含まれる。画像は、例えば磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、陽電子放射型断層撮影法（ＰＥＴ）、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、超音波法などから選択された画像法で、造影剤の投与前および投与後に適切な時間間隔で取得される。造影剤およびトレーサーの例としては、限定するものではないが、ガドリニウムキレートトレーサー、ヨウ素に基づくトレーサー、Ｈ２１５Ｏトレーサー、マイクロバブル、さらに血管標的に対するモノクロナール抗体またはペプチドに結合するトレーサーが挙げられる。
【００６１】
所与の処置における有効性をモニタリングする方法も、本発明のひとつの態様で提供される。有効性は、例えば処置前および処置後の様々な時点で対象からサンプルを採取し、血管新生、タイトジャンクション破壊および／または血液脳関門破壊に対する処置の効果を評価するために、上述のように血管新生、タイトジャンクション破壊および／または血液脳関門破壊を示すバイオマーカーについてサンプルを分析試験することにより評価することが可能である。あるいは、血管新生、タイトジャンクション破壊および／または血液脳関門破壊に対する処置の効果を評価するために、処置前および処置後の様々な時点で、前記対象を、上述したように血管新生、タイトジャンクション破壊および／または血液脳関門破壊を分析試験するための医用画像技法に付すことが可能である。
【００６２】
スクリーニング法
本発明のある側面は、候補薬剤の、脳血管におけるタイトジャンクションを回復するおよび／または血管リバースを促進する能力をテストすることによって、アルツハイマー病の処置用の薬剤を特定する方法を提供する。ある態様では、前記方法が、脳血管におけるタイトジャンクションを回復するおよび／または血管リバースを促進する能力を有するものを選ぶために、公知の抗血管新生薬をスクリーニングするために用いられる。
【００６３】
スクリーニング法は、生体外で適切な細胞培養物でまたは生体内で適切な動物モデルにおいて実施することが可能である。
【００６４】
生体外テストのために、血液脳関門の機能的生体外モデルを提供可能な、脳毛細血管内皮細胞、不死化ヒト脳内皮株化細胞ＨＣＭＥＣ／Ｄ３、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、不死化ヒト微小血管内皮株化細胞ＨＭＥＣ−１などの適切な株化細胞の培養物を、タイトジャンクションを破壊する薬剤、例えば血清または血清由来因子（リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、ＶＥＧＦなど）、ＩＬ−２、またはインターフェロンガンマで処理してもよい。その後、培養物を候補薬剤と接触させ、タイトジャンクションの回復の程度を適切な時間間隔の後に測定する。タイトジャンクションの回復は、例えば、ＺＯ−１、オクルディン、クローディンなどのタイトジャンクションタンパク質の局在を決定する免疫組織化学的方法、顕微鏡による視覚的観察、または経内皮電気抵抗（ＴＥＲ）により評価可能である。
【００６５】
生体内テストのために、適切な動物モデルが使用される。アルツハイマー病の様々な動物モデルが当該分野で公知である（例えば、Handbook of Animal Models in Alzheimer's Disease,Ed. G. Casadesus, 2011, IOS Press, Inc., Fairfax, VA 参照）。好適なマウスモデルの例としては、本明細書に記載の例において記述されるＴｇ２５７６マウスモデルだけでなく、Ｂｒｉ−ｗｔ−Ａβ１−４２Ａ、ＰＤＡＰＰ、ＡＰＰ−Ｌｏｎｄｏｎ、ＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈ、Ｃ３−３、Ｒ．１．４０、ＡＰＰ２３、Ｔｇ−ＣＲＤＮ８、ＡＰＰＤｕｔｃｈ、Ｔｇ−ＳｗｅＤ１、Ｔｇ−ＡｒｃＳｗｅ、ＡＰＰａｒｃ、ＰＳＡＰＰ、３ｘＴｇ−ＡＤ、５ｘＦＡＤ、ＡＰＰ／ＰＳ１Ｋ１、ＴＢＡ２が挙げられる。
【００６６】
一般に、生体内テストのために、テスト動物を、テスト群と候補薬剤を投与しない対照群を含む複数の群に分別する。所望であれば、タイトジャンクション完全性を回復することが既知の薬剤を投与する陽性対照群を含んでもよい。前記候補薬剤をテスト群に投与し、例えば処置の結果として外部に出現した何らかの変化をチェックするなどして動物を定期的にモニタリングする。適切な時間の経過後、動物を屠殺し、脳血管におけるタイトジャンクションの完全性を定法で評価する。例えば、免疫組織化学的方法を使用して、ＺＯ−１、オクルディン、クローディンなどのタイトジャンクションのタンパク質の局在を決定することが可能であり、あるいは生検で得たサンプルを顕微鏡で視覚的に観察してもよい。上述のような血液脳関門またはタイトジャンクションの完全性に関するバイオマーカーへの候補薬剤の有効性の評価と同じように、エバンスブルー染料に対する血液脳関門の透過率を測定して評価することも可能である。
【００６７】
本発明のある態様では、血管新生を抑制する候補薬剤の能力をテストすることにより、アルツハイマー病の予防および／または処置に有用であろう薬剤を特定する方法が提供される。例えば、前記薬剤を、それらの内皮細胞増殖または毛細管形成を抑制する能力に関してテストしてもよい。ある態様では、血管新生タンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制するまたは血管新生の阻害剤をコードする遺伝子の発現を高める候補薬剤の能力をテストすることにより、アルツハイマー病の予防および／または処置に有用であろう薬剤を特定する方法が提供される。目的とする遺伝子のプロモーターをレポーター遺伝子（蛍光タンパク質など）へ連結するレポーター遺伝子アッセイが、当該分野で公知である。ある態様では、血管新生を抑制する候補薬剤の能力をテストする方法も提供される。具体的な態様では、前記テスト方法は、Ａβまたはアミロイド誘引血管新生を抑制する候補薬剤の能力をテストする。血管新生を抑制する方法は当該分野で公知であり、限定するものではないが、内皮細胞増殖アッセイ、毛細管形成アッセイ、ＣＡＭアッセイ、角膜ポケットアッセイが挙げられる。
【００６８】
本明細書に記載する本発明をより良く理解するために、以下に例を記載する。これらの例は本発明の例示的な態様の記載を意図するものであり、本発明の範囲の限定を意図するものでは決してないと理解されたい。
【００６９】
例
例１：アルツハイマー病の病態生理における血管新生および血液脳関門タイトジャンクション破壊の併発
概要：
例１に記載する研究は、アポトーシスおよび血管新生のマーカーと組み合わせて、タイトジャンクション（ＴＪ）のタンパク質であるオクルディンおよびＺＯ−１の発現を調べることにより、スウェーデンの家系に見つかった早発性ＡＤを引き起こす２つのミスセンス突然変異を含む、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を過剰発現するＴｇ２５７６ＡＤモデルマウスにおける脳血管完全性をキャラクタリゼーションするために行った。同年齢の野生型同腹仔および両遺伝子型の若年マウスと比較して、老齢ＡＤマウスにおけるタイトジャンクション破壊の発生率の有意な増加は、アポトーシスではなく微小血管密度の増加と直接関連しており、それは、血液脳関門破壊の根拠としてＡβ（アミロイドβペプチド）誘因血管過多を強く支持するものである。ヒト患者における血管過多は、ＡＤおよび対照の死後の脳組織の比較により実証された。ここに記載する結果は、Ａβが血管新生に因る血液脳関門破壊を媒介し、関門を維持するタイトジャンクションの再分布をもたらすことを示している。
【００７０】
本研究の目的は、Ｔｇ２５７６ＡＤマウスにおけるタイトジャンクション形態によりＡβと血液脳関門の完全性との関係をキャラクラリゼーションし、ＡＤにおける血液脳関門破壊を説明可能な機序を見つけることである。本研究の結果は、Ｔｇ２５７６マウスが、血管新生増加に関連する血管密度増加に直接関連する顕著なタイトジャンクション破壊を有していたことを示している。
【００７１】
材料と方法：
マウス
本研究では、Ｔｇ２５７６遺伝子導入（Ｔｇ／＋）マウスを使用した。これらのマウスは、ハムスタープリオンタンパク質プロモーター（タコニック社）の制御下において、スウェーデンのミスセンス突然変異（Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ）を含む、ヒトＡＰＰ６９５を発現する [Hsiao et al. (1996) Science 274: 99-102]。マウスは、ヘテロ接合体Ｔｇ２５７６オスをＣ５７Ｂｌ６／ＳＪＬ  Ｆ１メスと交配することによりＣ５７Ｂｌ６／ＳＪＬ混合型遺伝背景を維持した。野生型（＋／＋）同腹仔を対照として使用した。老齢マウスは、１８〜２４ヶ月齢であり、一方若年マウスは５ヶ月齢であった。マウスは標準的なラボ固形飼料と水を自由摂取で飼育し、１２時間の明暗サイクルで保持した。
【００７２】
ヒト脳組織の分類
キャラクタリゼーション済みの死後の内側皮質および海馬脳の組織参照標準物質は、ブリティッシュコロンビア大学のキンズメンラボラトリー脳バンク（バンクーバー、ＢＣ、カナダ）から入手した。無疾患（ＮＤ）およびＡＤ患者からの脳の参照標準物質を使用した。各患者の臨床的および病理学的病歴の分類は、[Jantaratnotai et al. (2010) Curr Alzheimer Res 7: 625-636] に記載したものと同じである。
【００７３】
組織調製
マウスはアベルチン（０．０２ｍＬ／１ｇ）で終末麻酔をした。脳を迅速に摘出し、嗅球を除去し、４℃で４日間４％パラフォルムアルデヒド中で後固定した。その後、脳をパラフィンに包埋し、５μｍの連続切片を作成した。パラフィン包埋、切片作成、脱パラフィンは、ワックスイット・ヒストロジー・サービス社（バンクーバー、ＢＣ、カナダ）が行った。免疫ブロットのために、脳を迅速に摘出し、Hagihara et al.［Hagihara et al. (2009) J Vis Exp. 33: pii 1543] により示された方法を使用して海馬および新皮質を両大脳半球から単離した。
【００７４】
免疫染色
脱パラフィン切片からの抗原回収は、従来の料理用圧力鍋で０．７ｍＭのＥＤＴＡ添加２０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ９．０）を使用して、最大パワーで２分間行った。その後、冷却したスライドを、ブロッキングバッファー（２５％正常ヤギ血清、３％ＢＳＡ、０．３％トリトンＸ１００、シグマ社）中で室温にて１時間インキュベートした。一次抗体としては、ウサギ抗ＺＯ−１（１：２００、インビトロジェン社）、マウス抗ＺＯ−１（１：２００、インビトロジェン社）、ウサギ抗オクルディン（１：２００、インビトロジェン社）、ウサギ抗活性化カスパーゼ３（１：１０００、イムジェネックス社）、マウス抗ヒトＣＤ１０５（１：２０、ダコ社）を使用した。一次抗体染色は、染色バッファー（１０％正常ヤギ血清、３％ＢＳＡ、０．３％トリトンＸ１００）中で４℃で一晩行った。ヤギ一次抗体で染色するときは、正常ロバ血清を使用した。使用した二次抗体は、アレクサフルオル４８８または５６８（１：５００、インビトロジェン社）のどちらかと結合したもので、一次抗体化学種に相補的なものであった。二次抗体染色は、染色バッファー中室温で１時間行った。ＴＯＴＯ−３（１：１００００、インビトロジェン社）を核対比染色に使用した。切片は、各染色工程の間に、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（シグマ社）添加ＰＢＳで３回各５分間洗浄した。染色した切片上に、フルオロマウントＧ（サザンバイオテック社）を使用してカバースリップを載せ、暗所で一晩風乾した。
【００７５】
ヒト脳組織は、 [Ujiie (2003) et al. Microcirculation 10: 463-470] に記載の方法を使用して染色した。簡単に述べると、浮遊性の３０μｍ厚の切片を、抗ラミニン一次抗体（１：１００、ウサギ、シグマ社）で免疫標識した。その後、切片を適切なビオチン化二次抗体（１：１０００、ダコ社）で室温で１時間処理後、アビジン・ビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（１：１０００、ＡＢＣエリート、ベクターラボ社）中でインキュベートした。ペルオキシダーゼ標識は、０．０１％の３，３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、シグマ社）溶液中でインキュベートすることにより可視化した。濃紫／黒色を呈示したとき、切片を洗浄し、ガラススライドにマウント、風乾し、エンテラン（ＥＭＤバイオサイエンス社）を使用してカバースリップを載せた。
【００７６】
タイトジャンクション形態の共焦点および定量分析
脳切片としては、パラフィンブロックから得た５つ目毎の切片を分析した。４０ｘ／１．３Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌａｕｒ油浸対物レンズを使用してツァイスＬＳＭ５１０Ｍｅｔａ（ツァイス、ドイツ国）で撮像した画像が、Ｚ面に沿って１６スライスを用いて、４回平均化して得られた。合成投影画像を６００ｄｐｉでアドビフォトショップに取り込み、コントラストと輝度を最適化した。タイトジャンクション形態の定量分析は、Plumb et al. [Brain Pathol 12: 154-169] により開発された方法に従って分析した。共焦点データセットは、前頭皮質および海馬における若年および老齢Ｔｇ２５７６ならびに同腹仔対照の約１００個の脳血管から得た。個々の血管は、ＺＯ−１発現に関して正常（１）または異常（０）のどちからとして点数化した。正常ＺＯ−１発現は、強く、連続した、顕著な、直線状染色として判断した。それとは対照的に、異常ＺＯ−１発現は、弱く、点状および／または不連続な染色として判断した。異常ＺＯ−１血管発現を、正常対照に見られた正常血管または疾患脳の正常血管と比較した。ＺＯ−１染色において観察された「ギャップ」のために、不完全なまたは波状の血管を異常として記録することを避けるために、血管連続性の証拠を画像で確かめた。例えば、（ＴＯＴＯ−３で）染色された核または点状もしくは散在したＺＯ−１残余物の存在を使用して、血管路に沿った異常ギャップの位置を決定した。タイトジャンクション破壊の発生率は、脳の所与の領域における異常タイトジャンクション形態を示した血管の割合の平均として定義した。
【００７７】
マウス組織における微小血管密度定量
微小血管密度（ＭＶＤ）の定量は、Guo et al. [Angiogenesis 4: 187-191] により開発された方法を多少改良して共焦点顕微鏡法により行った。血管新生脳血管構造のマーカーとしてＣＤ１０５ [Holley et al. (2010) Neurosci Lett 470: 65-70] を使用し、ツァイスＬＳＭ５１０Ｍｅｔａソフトウェアを使用して蛍光強度が最大である画像を取得、分析した。高密度のＣＤ１０５染色（「ホットスポット」）[Weidner et al. (1991) N Engl J Med 324: 1-8] を含む脳切片の区域を、前述の共焦点画像解析パラメーターを使用して２０ｘ／０．４５Ｎ−アクロプラン対物レンズで画像化した。各ホットスポットについて前記ソフトウェアによりバックグラウンドより高い全蛍光面積（ＴＦＡ、単位μｍ２）を積分した。マウス一匹につき４つの異なるホットスポットの平均ＴＦＡを定量した。ＴＦＡを、ＣＤ１０５抗体により染色された全微小血管の数値表示として使用した。画像化した視野の微小血管密度は、画像の全面積に対するＴＦＡの比として表した。
【００７８】
ヒト組織における微小血管密度定量
マウスにおける微小血管密度を定量した方法と同様に、ホットスポット法を使用してＭＶＤを定量した。簡単に述べると、高密度（「ホットスポット」）[Holley (2010) et al. Neurosci Lett 470: 65-70] ラミニン染色を含む脳切片内の区域を、ＤＶＣカメラ（ダイアグノスティック・インスツルメンツ社）搭載ツァイスアキシオプラン−２光学顕微鏡でオリンパスＬＣプランＦＬ２０ｘ／０．４０対物レンズを使用して画像化した。微小血管密度の定量は、ImageJ (Rasband, W.S., ImageJ v1.44p, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2011) を使用して行った。バックグラウンド閾値レベルは、最初は、一次抗体なしに処理した対照スライドにおいて、元の白黒画像から得た８ビットグレースケールから決定した。対応する閾値よりも大きい染色強度を有するピクセルの割合を使用して、各ホットスポットに関してラミニン染色した面積の割合を積分した。一人の患者のひとつの脳領域につき４つの異なるホットスポットのラミニン染色した面積の割合の平均を定量した。画像化したフィールドの微小血管密度を、画像の全面積に対するラミニン染色した面積の割合として表した。
【００７９】
定量ウェスタンブロット分析
単離した新皮質および海馬組織を、１９Ｈｚに設定したキアゲンティッシュライザーＩＩを使用して１％ＮＰ−４０溶解バッファー（２０ｍＭのトリス塩基（ｐＨ８．８）、２ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、プロテアーゼ阻害剤添加１％ＮＰ−４０（ロシェ社））中で２０分間ホモジナイズした。ゲノムＤＮＡをせん断するために、ホモジナイズしたサンプルを、２１ゲージ針を１０回通過させ、氷上で３０分間インキュベートした。得られたホモジネートを、４℃、１４０００ｘｇで３０分間遠心分離した。上澄みのタンパク質濃度はＢＣＡアッセイ（ピアス社）により決定し、サンプルはレーン毎に最終濃度を３０μｇに調整した。タンパク質を標準技法に従って１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で分解した。免疫ブロットは、ウサギ抗オクルディン（１：１０００、インビトロジェン社）、マウス抗ヒトＣＤ１０５（１：１０００、ダコ社）およびマウス抗βアクチン（１：１０００、サンタクルーズ社）を使用してニトロセルロース膜（ポール社）上で行った。アレクサフルオル６８０結合抗ウサギＩｇＧ（インビトロジェン社）およびＩＲダイ８００結合抗マウスＩｇＧ（ロックランド社）を、二次抗体として使用した。すべての抗体希釈液はミルクタンパク質溶液で作成した。シグナル強度をオデッセイ赤外線イメージングシステム（ＬＩＣＯＲ社）を使用して分析した。
【００８０】
統計分析
すべての実験は、３組ずつで少なくとも３回行った。老齢および若年Ｔｇ２５７６ＡＤマウスならびに野生型対照同腹仔のデータの統計比較は、ボンフェローニ事後テストで不一致の値に対して、スチューデントｔ検定または２元配置分散分析のどちらかで行った。統計分析はすべてグラフパッドプリズム（Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用ｖ５．０１、グラフパッドソフトウェア、サンディエゴ、カリフォルニア、米国、www.graphpad.com）を使用して行った。０．０５未満のｐ値を有意とみなした。値は平均値±ＳＥＭで表した。
【００８１】
結果：
Ｔｇ２５７６マウスは、脳血管タイトジャンクションにおける異常形態の発生率が高い。
タイトジャンクション形態の変化を評価するために、ともに確立されたタイトジャンクションマーカーであるオクルディンおよびＺＯ−１の染色パターンを、共焦点顕微鏡で観察した。タイトジャンクション形態のキャラクタリゼーションは、野生型およびＴｇ２５７６マウスの新皮質、海馬および脈絡叢を含むいくつかの脳領域において行った。観察したほぼすべての血管が長さ方向に切断されていた。横断された血管はまれであった。脳血管構造内の強い、連続した、直線状のオクルディンおよびＺＯ−１の染色パターンは正常とみなされ、年齢または遺伝子型にかかわらず皮質または海馬の両方で区別不能であった［図１：Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ］。血管路の薄い輪郭は核対比染色により強調することで、ジャンクションの異常を見つけることを容易にした。対照と比較して、Ｔｇ２５７６マウスは、新皮質および海馬のそれぞれにおけるオクルディン［図１：ＢおよびＦ］およびＺＯ−１［図１：ＤおよびＨ］の点状染色の発生率が高かった。ＡＤの影響を受けない脳の領域である脈絡叢は、すべてのマウスにおいてオクルディンおよびＺＯ−１の両方で正常なタイトジャンクションパターンを示した（データ示さず）。
【００８２】
タイトジャンクションの破壊は、異常形態を示す血管の割合の平均を計算することにより定量した。老齢Ｔｇ２５７６マウスの新皮質では、タイトジャンクション破壊が、野生型同腹仔（平均１０％）と比較して有意に増加した（３０．５０±１．９４％；＊＊＊ｐ＜０．００１、２元配置分散分析）［図２：Ａ］。また、老齢Ｔｇ２５７６と若年Ｔｇ２５７６マウスとの間でタイトジャンクション破壊の発生率に有意な差があった（＊ｐ＜０．０５、２元配置分散分析）［図２：Ａ］。
【００８３】
同様の結果が海馬においても見られた。野生型同腹仔（平均１０％）と比較して、老齢Ｔｇ２５７６マウス（２４．７５±２．３２％；＊＊＊ｐ＜０．００１、２元配置分散分析）では、タイトジャンクション破壊の発生率が有意に増加した［図２：Ｃ］。若年Ｔｇ２５７６マウスと比較して、老齢Ｔｇ２５７６マウスにおいて、タイトジャンクション破壊の発生率が有意に増加した（＊ｐ＜０．０５、２元配置分散分析）［図２：Ｃ］。皮質および海馬の両方において、両遺伝子型の若年マウスにおけるタイトジャンクション破壊の量は、平均約１０％であり、有意ではなかった。
【００８４】
老齢Ｔｇ２５７６マウスの新皮質および海馬におけるオクルディンタンパク質レベルを、ウェスタンブロットにより検討した。野生型（６．８１±０．８０、＊＊ｐ＝０．００７２、ｔ検定）と比較して、皮質におけるβアクチンに対するオクルディンの比は、遺伝子導入マウス（３．７８±０．４９）ではほぼ半分に減少した［図２：Ｂ］。海馬においても、野生型（１０．３１±１．１５、＊＊ｐ＝０．００７６、ｔ検定）と比較して、老齢Ｔｇ２５７６マウス（５．８９±０．７６）では、βアクチンに対するオクルディンの比に同様の減少が見られた［図２：Ｄ］。
【００８５】
老齢Ｔｇ２５７６の脳では、アポトーシスのシグナルが制限され、血管新生の脳血管シグナルが増加した。
老齢Ｔｇ２５７６マウスにおいて観察された脳血管タイトジャンクションの異常を説明するための機序の可能性として、アポトーシスおよび血管新生を調べた。活性化カスパーゼ３をアポトーシスのマーカーとして使用した［図３：Ｃ−Ｅ］。調べたすべての切片において、内皮細胞における活性化カスパーゼ３免疫反応性はなかった。活性化カスパーゼ３染色は他の細胞タイプにおいてみられ、糸状形態であった。若年および老齢野生型マウスでは、新皮質内での活性化カスパーゼ３染色は大変限られていた［図３：Ｃ］。タイトジャンクションの異常を示す皮質および海馬における血管は［図３：Ｄ］、血管に隣接または重複する神経細胞様の染色を示した［図３：Ｄ（白色矢印）］。すべてのマウスは、ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３、ＤＧ領域において様々な程度で活性化カスパーゼ３の海馬染色が見られた。若年Ｔｇ２５７６および野生型（若年および老齢の両方）では、皮質に比べて海馬において活性化カスパーゼ３染色濃度が有意に高かった。若年Ｔｇ２５７６および野生型（すべての年齢）マウスのカスパーゼ３海馬染色の全体の密度は、老齢Ｔｇ２５７６マウスのものよりも低いことがわかった。しかしながら、老齢Ｔｇ２５７６マウスは、新皮質および海馬内の両方において顕著な活性化カスパーゼ３染色を示し、それはおそらくプラークの位置を中心に集まる傾向があった。
【００８６】
血管新生を評価するために、確立された内皮マーカーであるＣＤ１０５を使用した [Duff et al. (2003) FASEB J 17: 984-992]。ＣＤ１０５は、年齢および遺伝子型にかかわらずすべての血管において均一な染色を示した。しかしながら、同年齢野生型同腹仔および両遺伝子型の若年マウスと比較して、老齢Ｔｇ２５７６では、ＣＤ１０５が染色された血管の割合が高かった［図３：Ｂ］。
【００８７】
老齢Ｔｇ２５７６マウスは微小血管密度が増加した。
老齢Ｔｇ２５７６マウスにおいてＣＤ１０５が染色された血管の割合が高いことを先に指摘した。若年および老齢Ｔｇ２５７６マウスならびに同年齢野生型同腹仔の脳において、微小血管密度（ＭＶＤ）をＣＤ１０５染色により定量した。微小血管密度は、画像化したフィールドの全面積に対するＴＦＡの比として定義し、血管新生の代理測定値として使用した。野生型と比較して、老齢Ｔｇ２５７６マウスの微小血管密度は有意に高かった。老齢Ｔｇ２５７６マウスの平均微小血管密度（０．４４５３±０．０１４６；＊＊＊ｐ＜０．００１、２元配置分散分析）は、野生型（０．１８８２±０．００１０）［図４：Ａ］のものの２倍以上であった。若年Ｔｇ２５７６マウスと比較したとき、老齢Ｔｇ２５７６の微小血管密度は１．５倍以上であった（＊ｐ＜０．０５、２元配置分散分析）。若年Ｔｇ２５７６マウスは平均微小血管密度が高い傾向にあるが（０．２６７４±０．０１６１）、その差は、野生型（０．２３２１±０．０１１０）と比較して有意ではなかった［図４：Ａ］。
【００８８】
老齢Ｔｇ２５７６および野生型マウスの新皮質および海馬の両方におけるＣＤ１０５タンパク質発現レベルをウェスタンブロットにより定量した。皮質におけるβアクチンに対するＣＤ１０５の比は、野生型（２．５２±０．２７、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｔ検定）と比較して、Ｔｇ２５７６マウス（４．５７±０．２７）ではほぼ２倍であった［図４：Ｂ］。海馬におけるβアクチンに対するＣＤ１０５の比は、野生型（３．５３±０．４６、＊ｐ＜０．０５、ｔ検定）と比較して、老齢Ｔｇ２５７６マウス（５．６６±０．６２）では同様の増加を示した［図４：Ｃ］。
【００８９】
ヒト組織の予備的な観察では、無疾患（ＮＤ）およびＡＤ患者の脳におけるラミニン染色量の数量化を、ブリティッシュコロンビア大学のキンズメンラボラトリー脳バンクから得た慎重に検証したケースで行った。脳血管密度の増加がＡＤの動物モデルからヒトにおける臨床疾患までみられることを支持するために、これらのサンプルを、死後の内側皮質および海馬脳組織の参照標準物質として使用した [Jantaratnotai et al. (2010) Curr Alzheimer Res 7: 625-636]。ＡＤ参照標準の皮質では、面積率による平均微小血管密度は、ＮＤ患者（７．２５±１．２５％）と比較してほぼ２倍であった（１２．２３±１．２８％、＊ｐ＜０．０５、ｔ検定）［図４：Ｄ］。同様に、ＡＤ参照の海馬は、ＮＤ参照（７．１０±０．２３％）と比較して、平均微小血管密度が２倍であった（１１．３５±０．６０％、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｔ検定）［図４：Ｅ］。ＡＤ患者におけるラミニン染色から求めた皮質脳血管密度の増加率は［図４：Ｇ］、ＮＤ患者対照と比較して、代表的画像に視認可能である［図４：Ｆ］。海馬組織は、ＡＤおよびＮＤ患者で同様の染色パターンを示した（データ示さず）。
【００９０】
考察
エバンスブルー染料法を使用した定量により、Ｔｇ２５７６ＡＤモデルマウスにおいて血液脳関門が損なわれており、Ａβで免疫することによりその崩壊が低減可能であることが既に証明されている [Ujiie et al. (2003) Microcirculation 10: 463-470; Dickstein et al. (2006) FASEB J 20: 426-433]。アミロイドプラークなどの他のＡＤ神経病変に先行する血液脳関門の完全性の低下は、脳血管増生とアルツハイマー病（ＡＤ）との強い関連を示した。しかしながら、現在の定説では、ＡＤにおける血液脳関門漏出は血管劣化およびアポトーシスによるらしいということになっている。例１に記載した本研究の目的は、血管新生および血管過多がＡＤにおける血管透過性の増加の根底にあるという仮説をテストするためであった。血液脳関門の完全性は、スウェーデンの家系に見つかった早発性ＡＤの原因となる２つのミスセンス突然変異を含む、ヒトＡＰＰを発現するＴｇ２５７６ＡＤマウスにおけるタイトジャンクション形態を観察することにより評価した。５ヶ月齢（疾患発症前）および老齢１８ヶ月齢以上（疾患発症のかなり後）の２つの別々の年齢群のマウスを観察した。老齢Ｔｇ２５７６マウスは、対照と比較して、異常なタイトジャンクションを有意に発現することがわかり、これは異常な血管新生増加と関連していた。合わせて考えると、Ａβ誘引血管新生が、Ｔｇ２５７６マウスにおいて、タイトジャンクションのレベルで血液脳関門崩壊を引き起こしたようである。
【００９１】
近年、ＡＤ病変の特徴である大きな塊状の細胞外Ａβプラークが、ＡＤにおいて神経変性作用を直接引き起こすかどうかが問われている。現在では、より小さく、より有毒な、可溶性のＡβオリゴマーが直接疾患を開始すると考えられている (Sakono M, Zako T (2010) FEBS J 277: 1348-1358概説参照)。これら有毒なオリゴマーの存在が、内皮生存およびタイトジャンクションの発現に影響を及ぼす可能性がある。いくつかの生体外での証拠が、Ａβによる内皮機能障害を示した。Marco et al. [Neurosci Lett 401: 219-224] は、Ａβ１−４２刺激内皮培養物が、クローディン、オクルディン、ＺＯ−１などのタイトジャンクションタンパク質の異常な発現を誘引したことを示した。Gonzalez et al. [Gonzalez-Velasquez et al. (2008) J Neurochem 107: 466-477] は、より小さなＡβ１−４０凝集物が内皮細胞透過率およびＺＯ−１の細胞質への再局在化を誘引することを示した。活性酸素種（ＲＯＳ）を解毒する酵素の存在が、Ａβが誘引する損傷に影響しなかったので、Ａβ誘引ＲＯＳが血液脳関門漏出の原因である可能性は否定された [Nagababu et al. (2009) J Alzheimers Dis 17: 845-854]。しかしながら、細胞骨格タンパク質の再構築が、血液脳関門の完全性に直接影響していると考えられていた [Nagababu et al. ibid]。Ａβ関連のＲＯＳ産生の関与は現在再検討中であるが、ミクログリア活性および炎症などの他の起源や血清漏出によるＲＯＳが、血液脳関門の完全性に影響を及ぼす可能性はあるかもしれない [Pun et al. (2009) Free Radic Res 43: 348-364]。
【００９２】
「Ａβ＊５６」と呼ばれる、特定の毒性の高い十二量体の５６ｋＤａのＡβオリゴマーと、Ｔｇ２５７６マウスにおける記憶喪失との直接の関与が示唆されている [Lesne et al. (2006) Nature 440: 352-357]。このオリゴマーは、Ｔｇ２５７６マウスの記憶欠損が最初に明らかになる約６ヶ月齢になったとき出現するが、それより若年のマウスには不在である [Lesne et al. ibid.]。本研究では、５ヶ月齢マウスが異常血管タイトジャンクションの増加傾向を示した。しかしながら、Ｔｇ２５７６マウスは、より早い４ヶ月齢から血液脳関門の完全性の損失を示し始める [Ujiie et al. (2003) Microcirculation 10: 463-470]。この間、毒性のより低いオリゴマーの堆積がこのマウスにおける血液脳関門の完全性に悪影響を与え始めている可能性がある。６ヶ月齢までに、有毒なＡβ＊５６の存在がＴｇ２５７６マウスに関連する一連の病理学的事象を開始すると仮定される。しかしながら、６ヶ月齢から１３ヶ月齢までの間、Ｔｇ２５７６マウスにおけるＡβ＊５６の相対レベルは不変であった [Lesne et al. ibid.]。この間におこるプラークおよび栄養障害性神経細胞の蓄積は、このマウスにおいて更なる病理学的損失を引き起こすのに十分である。これが、老齢Ｔｇ２５７６マウスにおいて異常な脳血管タイトジャンクションの発現が顕著となることを説明するかもしれない。
【００９３】
例１に示す本研究では、活性化カスパーゼ３に対する抗体によっては、内皮アポトーシス性事象の検出はできなかった。しかしながら、若年（５ヶ月齢）および老齢（１８〜２４ヶ月齢）Ｔｇ２５７６ならびに対応する野生型マウスは、主として海馬内における非内皮の染色により活性化カスパーゼ３発現を示した。これらのデータは、広範な内皮細胞死の不在と一致する。アポトーシス性内皮細胞は本研究において観察されなかったが、生体外での証拠は、特にダッチ変異種に属する突然変異において、Ａβが、培養した内皮細胞においてアポトーシスを誘引したことを示唆している [Fossati S, et al. (2010) FASEB J 24: 229-241; Miravalle et al. (2000) J Biol Chem 275: 27110-27116; Paris et al. (2005) Brain Res Mol Brain Res 136: 212-230]。
【００９４】
血管新生も、脳血管内皮におけるタイトジャンクション破壊の機序のもう一つの可能性として検討した。ＡＤの間に血管新生が起こることを示唆するいくつかの証拠がある。まず、神経炎症がＡＤの病理学的特徴であり [Streit WJ, Mrak RE, Griffin WS (2004) J Neuroinflammation 1: 14]、血管新生を誘引可能なＩＬ−１βなどのサイトカインの増加が随伴する [Pogue AI, Lukiw WJ (2004) Neuroreport 15: 1507-1510]。促進性血管新生成長因子薬であるＶＥＧＦも、これらのサイトカインにより誘発され [Schultheiss et al. (2006) Angiogenesis 9: 59-65] 、ＡＤ患者で増加する [Tarkowski et al. (2002) Neurobiol Aging 23: 237-243]。ＶＥＧＦは内皮増殖を直接刺激する [Shibuya M (2009) FEBS J 276: 4636-4643]。Ａβペプチド自身も、血管新生性を有することが示されている [Boscolo et al. (2007) Int J Mol Med 19: 581-587]。
【００９５】
ここに記載する本研究では、ＣＤ１０５を、タイトジャンクションマーカーで標識した脳血管における血管新生を検討するために使用した。抗体染色は、タイトジャンクションの異常を有する血管を、異常を有さないものから区別することはできなかった [Duff et al. (2003) FASEB J 17: 984-992]。本研究では、ＣＤ１０５の明らかな汎内皮染色が、脳全体におけるＣＤ１０５染色の密度、従って微小血管密度（ＭＶＤ）を定量可能とするので大変有用であった。微小血管密度を、組織切片の所与の領域内に存在する血管新生の量の代理マーカーとして使用した。血管密度が大きいほど、血管新生がより多く起こったと考えられる。微小血管密度の測定は、標準化の欠如や、客観性の喪失をもたらす偏りを避けることを操作者に依存しているなど、限界がないわけではない [Goddard et al. (2002) Angiogenesis 5: 15-20]。にもかかわらず、老齢Ｔｇ２５７６マウスは、同年齢野生型マウスと比較して、微小血管密度がほぼ２倍であった。若年Ｔｇ２５７６マウスは微小血管密度に有意な差を示さなかったが、対照と比較して微小血管密度の増加の傾向があった。
【００９６】
Ｔｇ２５７６マウスにおける血管新生には議論の余地がある。Paris et al [Neurosci Lett 366: 80-85] は、Ｔｇ２５７６マウスの血管新生が限定されていることを指摘した。汎内皮マーカーのＰＥＣＡＭを使用して、１７ヶ月齢までのマウスにおける血管新生を定量した。文献においてどれが「最良の」抗体であるかについての合意はないが、ＰＥＣＡＭは汎内皮発現に限定されず血漿や炎症細胞も通常免疫標識するので [Giatromanolaki et al. (1999) Oncol Res 11: 205-212]、ＰＥＣＡＭはＣＤ１０５と比較して血管新生マーカーとして支持されていない [El-Gohary et al. (2007) Am J Clin Pathol 127: 572-579]。一方、ＣＤ１０５は内皮細胞 [El-Gohary et al. ibid]、特に血管新生中のものと一貫して反応することを示しており、間質細胞や炎症細胞とは反応しない [Saad et al. (2003) J Gynecol Pathol 22: 248-253;  Saad et al. (2004) Mod Pathol 17: 197-203]。ここに示すデータは、ＣＤ１０５関連微小血管密度の増加が、Ｔｇ２５７６マウスにおいて血管新生とタイトジャンクション異常が関連していることを間接的に示すことを、実証している。促進性血管新生シグナルがＴｇ２５７６マウスにおいて検出されている。２０ヶ月齢のＴｇ２５７６マウスの皮質組織におけるＶＥＧＦの増加 [Burger et al. (2009) Int J Dev Neurosci 27: 517-523]は、血管新生がこのＡＤモデルにおいて起きているという仮説を支持する。最後に、脳血管構造の血管新生と関連するマーカーの発現増加が、ヒトＡＤ脳 [Jantaratnotai (2010) Curr Alzheimer Res 7: 625-636] （ラミニンまたはフォンウィルブランド因子発現）、 [Desai et al. (2009) J Neural Transm 116: 587-597] （インテグリンαＶ−β３発現）およびＡＰＰ２３ＡＤマウスモデル（β３−インテグリンサブユニット発現）において観察されている。しかしながら、これらの研究からの結論は、血管新生が、血管障害および血管死をもたらす神経炎症の結果として起こる血管の再構築の結果であることを教示している。
【００９７】
ここに記載する研究では、Ｔｇ２５７６マウスにおける脳血管死の証拠は見つかっておらず、対照的に、両方のＴｇ２５７６マウスにおける血管新生の大幅な増加の証拠が観察された。また、十分にキャラクタリゼーションされた死後の内側皮質および海馬脳組織の正常およびＡＤ参照標準物質の予備的な観察では、これらの組織もＡＤにおいて有意な血管過多が呈示されることを示している（図４Ｆ−Ｇ）。
【００９８】
要約すると、本研究は、Ｔｇ２５７６マウスにおいてタイトジャンクションの破壊が有意に増加し、これらの破壊は、加齢および疾患の重症化とともに現れる。これらのデータは、タイトジャンクション破壊が、Ａβ産生の増加により引き起こされるＡＤにおける極度の血管新生の間に起こる血管透過性の増加の結果であるというモデルを支持している。これらの病態生理的特徴は、顕著で重度であり、疾患発症の初期に現れ、ＡＤの特徴的徴候としてタウおよびＡβに匹敵する。
【００９９】
例２：アミロイドβで免疫したアルツハイマー病マウスにおいて、血管過多およびタイトジャンクション破壊が解消する
概要：
例２に記載する研究は、アポトーシスおよび血管新生のマーカーと組み合わせてタイトジャンクション（ＴＪ）タンパク質（オクルディンおよびＺＯ−１）の発現を調べることにより、Ｔｇ２５７６ＡＤモデルマウスにおける脳血管の完全性をキャラクタリゼーションすることである。老齢ＡＤマウスにおいて、タイトジャンクション破壊の発生率の有意な増加は、微小血管密度の増加に直接関係していたが、アポトーシスには直接関係しておらず、これは、血液脳関門機能障害の根拠として血管過多を強く支持している。血管過多、タイトジャンクション組織化、および血液脳関門再シール形成のすべてが、Ａβペプチドのワクチン接種により解決された。
【０１００】
本研究は、能動的Ａβ免疫ＡＤマウスモデルにおいて、血液脳関門タイトジャンクションの完全性がＡβの存在と関係していることを示した。脳実質からＡβを除去すると、微小血管関連タイトジャンクション病変が消失し、血管新生を解消する。さらに、ヒト免疫試験において観察された脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）関連微小出血は、罹患した血管におけるタイトジャンクションの喪失により説明可能である。本研究は、血管再構築をＡＤと関係付け、この再評価がＡＤ患者の治療選択肢を改善するであろう。
【０１０１】
材料と方法
マウス
例１と同様。
【０１０２】
Ａβワクチン接種
Ａβワクチン接種は、Schenk et al. (Nature 400、173-177) により開発されたプロトコールを使用して、(Dickstein et al. (2006) FASEB J 20、426-433) に記載の方法で行った。簡単に述べると、治療的および予防的の２つの異なるワクチン接種方法を用いた。免疫の前に、マウスを伏在静脈から出血させ、血清を収集した。予防的アプローチでは、マウスは６週齢の初めにワクチンを接種し、１２ヶ月で屠殺した。治療的方法で使用したマウスは、１１ヶ月齢の初めにワクチンを接種し、１５ヶ月で屠殺した。Ａβペプチドは、各組の注射ごとに凍結乾燥粉末から新たに調製した。接種は、２ｍｇのＡβ（ヒトＡβ１−４０、ビーチャム社）を０．９ｍＬの脱イオン水に添加し、完全に混合した。そして、１００μＬの１０ＸＰＢＳを添加し、最終的に１ＸＰＢＳ濃度を得た。溶液をボルテックスで攪拌し、翌日使用するまで３７℃に一晩保った。１回目の免疫では、Ａβ１−４０（注射一回に付き抗原１００μｇ）またはＰＢＳ（対照）を、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）と１：１（ｖ／ｖ）で混合した。この２週後およびその後１ヶ月毎に、Ａβ１−４０（１００μｇ）またはＰＢＳとフロイント不完全アジュバント（ＩＣＦＡ）の混合物１：１（ｖ／ｖ）を追加免疫した。５回目の免疫以降は、ＰＢＳまたはＡβをそのまま注射した。注射は腹腔内に行った。
【０１０３】
組織調製
マウスはケタミン／キシラジン（１００ｍｇ／ｋｇ；１０ｍｇ／ｋｇ）で終末麻酔をした。脳を迅速に摘出し、嗅球を除去し、４℃で４日間４％パラフォルムアルデヒド中で後固定した。その後、脳をパラフィンに包埋し、５μｍの連続切片を作成した。パラフィン包埋、切片作成、脱パラフィンは、ワックスイット・ヒストロジー・サービス社（バンクーバー）が行った。
【０１０４】
免疫染色
脱パラフィン切片からの抗原回収は、従来の料理用圧力鍋で０．７ｍＭのＥＤＴＡ添加２０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ９．０）を使用して、最大パワーで２分間行った。その後、冷却したスライドを、ブロッキングバッファー（２５％正常ヤギ血清；３％ＢＳＡ；０．３％トリトンＸ１００、シグマ社）中で室温にて１時間インキュベートした。一次抗体としては、ウサギ抗ＺＯ−１（１：２００、インビトロジェン社）、マウス抗ＺＯ−１（１：２００、インビトロジェン社）、ウサギ抗オクルディン（１：２００、インビトロジェン社）、ウサギ抗活性化カスパーゼ３（１：１０００、イムジェネックス社）、マウス抗ヒトＣＤ１０５（１：２０、ダコ社）を使用した。一次抗体染色は、染色バッファー（１０％正常ヤギ血清；３％ＢＳＡ；０．３％トリトンＸ１００）中で４℃で一晩行った。ヤギ一次抗体で染色するときは、正常ロバ血清を使用した。使用した二次抗体は、アレクサフルオル４８８または５６８（１：５００、インビトロジェン社）のどちらかと結合したもので、一次抗体化学種に相補的なものであった。二次抗体染色は、染色バッファー中室温で１時間行った。ＴＯＴＯ−３（１：１００００、インビトロジェン社）を核対比染色に使用した。切片は、各染色工程の間に、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（シグマ社）添加ＰＢＳで３回各５分間洗浄した。染色した切片上に、フルオロマウントＧ（サザンバイオテック社）を使用してカバースリップを載せ、暗所で一晩風乾した。
【０１０５】
タイトジャンクション形態の共焦点および定量分析
脳切片としては、パラフィンブロックから得た５つ目毎の切片を分析した。４０ｘ／１．３Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌａｕｒ油浸対物レンズを使用してツァイスＬＳＭ５１０Ｍｅｔａ（ツァイス、ドイツ国）で撮像した画像が、Ｚ面に沿って１６スライスを用いて、４回平均化して得られた。合成投影画像を６００ｄｐｉでアドビフォトショップに取り込み、コントラストと輝度を最適化した。タイトジャンクション形態の定量分析は、Plumb et al. (Brain Pathol 12: 154-169) により開発された方法に従って行った。共焦点データセットは、前頭皮質および海馬における若年および老齢Ｔｇ２５７６ならびに同腹仔対照の約１００個の脳血管から得た。個々の血管は、ＺＯ−１発現に関して正常（１）または異常（０）のどちからとして点数化した。正常ＺＯ−１発現は、強く、連続した、顕著な、直線状染色として判断した。それとは対照的に、異常ＺＯ−１発現は、弱く、点状および／または不連続な染色として判断した。異常ＺＯ−１血管発現を、正常対照に見られた正常血管または疾患脳の正常血管と比較した。ＺＯ−１染色において観察された「ギャップ」のために、不完全なまたは波状の血管を異常として記録することを避けるために、血管連続性の証拠を画像で確かめた。例えば、（ＴＯＴＯ−３で）染色された核または点状もしくは散在したＺＯ−１残余物の存在を使用して、血管路に沿った異常ギャップの位置を決定した。タイトジャンクション破壊の発生率は、脳の所与の領域における異常タイトジャンクション形態を示した血管の割合の平均として定義した。
【０１０６】
微小血管密度定量
微小血管密度（ＭＶＤ）の定量は、Guo et al. (Angiogenesis 4, 187-191) により開発された方法を多少改良して共焦点顕微鏡法により行った。血管新生脳血管構造のマーカーとしてＣＤ１０５ (Masliah et al. (2005) Neurology 64, 129-131) を使用し、ツァイスＬＳＭ５１０Ｍｅｔａソフトウェアを使用して蛍光強度が最大である画像を取得、分析した。高密度のＣＤ１０５染色（「ホットスポット」）(Bombois et al. (2007) Arch Neurol 64, 583-587) を含む脳切片の区域を、前述の共焦点画像解析パラメーターを使用して２０ｘ／０．４５Ｎ−アクロプラン対物レンズで画像化した。各ホットスポットについて前記ソフトウェアによりバックグラウンドより高い全蛍光面積（ＴＦＡ、単位μｍ２）を積分した。マウス一匹につき４つの異なるホットスポットの平均ＴＦＡを定量した。ＴＦＡを、ＣＤ１０５抗体により染色された全微小血管の数値表示として使用した。画像化した視野の微小血管密度は、画像の全面積に対するＴＦＡの比として表した。
【０１０７】
統計分析
すべての実験は、３組ずつで少なくとも３回行った。老齢および若年Ｔｇ２５７６ＡＤマウスならびに野生型対照同腹仔のデータの統計比較は、ボンフェローニ事後テストで不一致の値に対して、スチューデントｔ検定または２元配置分散分析のどちらかで行った。統計分析はすべてグラフパッドプリズム（Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用ｖ５．０１、グラフパッドソフトウェア、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）を使用して行った。０．０５未満のｐ値を有意とみなした。値は平均値±ＳＥＭで表した。
【０１０８】
結果
免疫Ｔｇ２５７６マウスは脳血管タイトジャンクション病変を低減する
タイトジャンクション（ＴＪ）形態および病変のキャラクタリゼーションを、ＡβまたはＰＢＳのどちらかで免疫したＴｇ２５７６および野生型マウスの皮質および海馬において行った。脳血管構造内のオクルディンおよびＺＯ−１の強く、連続した、直線状染色パターンは正常とみなされ（図５ａ、ｂ）、遺伝子型、免疫方法、または薬剤にかかわらず、皮質または海馬のどちらにおいても一貫しており区別不能であった。脳血管構造上のオクルディンおよびＺＯ−１の両方の薄い点状およびまたは不連続な染色パターン（白色矢頭）は異常とみなした（図５ｃ、ｄ）。タイトジャンクション異常の発現パターンは、遺伝子型、免疫方法、または薬剤にかかわらずすべてのマウスにおいて皮質および海馬において一貫しており区別不能であった。Ａβ免疫Ｔｇ２５７６マウスにおいて観察した微小血管のほとんどは、正常なタイトジャンクションを有しており、タイトジャンクションの異常を示す血管はまれであった（図５ａ、ｂ）。しかしながら、予防的または治療的のどちらかでＡβで免疫したＴｇ２５７６マウスにおける大血管は、毛細血管と比較して、異常タイトジャンクション発現の割合が大きいようであった（図５ｅ、ｆ、白色矢頭）。
【０１０９】
免疫マウスにおける脳血管タイトジャンクション病変の定量的評価
治療的または予防的方法の一環としてＡβまたはＰＢＳのどちらかで免疫したＴｇ２５７６マウスにおいて、タイトジャンクション病変の発生率を共焦点顕微鏡により定量的に評価した。タイトジャンクションの病変の発生率は、異常タイトジャンクション形態を示す血管の割合の平均と定義した。ＰＢＳで予防的に免疫したＴｇ２５７６マウスの皮質は、ＰＢＳの野生型（約１０％）と比較して、破壊されたタイトジャンクション発現の割合が有意に高かった（２９．００±４．０２％；＊＊ｐ＜０．０５、２元配置分散分析）（図６ａ）。Ａβ免疫Ｔｇ２５７６マウスは、ＰＢＳ遺伝子導入対応物と比較して、皮質における異常な血管タイトジャンクション発現の割合が有意に低かった（１１．３３±２．４０％；＊ｐ＜０．０５、２元配置分散分析）（図６ａ）。予防的に免疫したマウスでは、海馬におけるタイトジャンクション破壊の発生率は、皮質と同様であった。ＰＢＳで免疫したＴｇ２５７６マウスは、ＰＢＳマウス（約１０％）と比較して、有意に高い破壊を示した（２９．７５±１．８９％；＊＊＊＊ｐ＜０．０５、２元配置分散分析）（図６ｂ）。Ａβ免疫Ｔｇ２５７６マウスにおける海馬タイトジャンクション破壊は、ＰＢＳ免疫Ｔｇ２５７６マウスと比較して有意に低かった（１１．９１±１．７３％；＊＊＊ｐ＜０．０５、２元配置分散分析）（図６ｂ）。
【０１１０】
治療的に免疫したマウスは、予防的マウスと同様な血管タイトジャンクションの破壊の発生を示した。ＰＢＳで治療的に免疫したＴｇ２５７６マウスの皮質では、ＰＢＳ野生型（約１０％）と比較して、破壊されたタイトジャンクション発現の割合が有意に高かった（２８．６７±４．９１％；＊＊ｐ＜０．０５、２元配置分散分析）（図７ａ）。Ａβ免疫Ｔｇ２５７６マウスは、ＰＢＳ遺伝子導入対応物と比較して、皮質における異常な血管タイトジャンクションの発現が有意に低かった（１０．４０±０．８１％；＊ｐ＜０．０５、２元配置分散分析）（図７ａ）。治療的に免疫したマウスでは、海馬におけるタイトジャンクション破壊の発生率は、皮質と同様であった。ＰＢＳで免疫したＴｇ２５７６マウスは、ＰＢＳ野生型マウス（約１０％）と比較して、有意に高い破壊を示した（２７．３３±４．０６％；＊＊＊＊ｐ＜０．０５、２元配置分散分析）（図７ｂ）。Ａβ免疫Ｔｇ２５７６マウスにおける海馬のタイトジャンクション破壊は、ＰＢＳ免疫Ｔｇ２５７６マウスと比較して有意に低かった（１１．００±２．２６％；＊＊＊ｐ＜０．０５、２元配置分散分析）（図７ｂ）。
【０１１１】
Ａβ免疫Ｔｇ２５７６では、脳血管漏出が全体として減少した。
ＡβまたはＰＢＳのどちらかで予防的または治療的に免疫したＴｇ２５７６および野生型マウスにおいて、脳血管漏出およびタイトジャンクション異常を共焦点顕微鏡により評価した。マウスアルブミンを血管漏出のマーカーとして使用し、血管から発する拡散した濃度勾配のある染色として可視化した（図８ｂ、白色矢頭）。免疫方法や薬剤にかかわらず、観察したすべての野生型マウスが血管漏出を示さず、図８ａに類似した染色パターンを与えた。予防的または治療的のどちらかでＰＢＳで免疫したＴｇ２５７６マウスは、皮質または海馬において血管漏出の顕著なサインを示さなかった。ＰＢＳ免疫Ｔｇ２５７６マウスでの血管漏出は、オクルディンおよびＺＯ−１の両方での染色で決定されたタイトジャンクション異常と関連していた（図示せず）。
【０１１２】
Ａβで免疫したＴｇ２５７６マウスは、微小血管内の血管漏出はほとんどあるいは全く示さなかった（図８ａ）。しかしながら、Ａβ免疫Ｔｇ２５７６マウスの大血管は、周期的に血管漏出を示した（図８ｂ、白色矢頭）。オクルディン（図示せず）およびＺＯ−１（図８ｂ）の両者で示された異常なタイトジャンクション発現は、血管漏出を有する大血管において一貫して見られた。Ａβで免疫したＴｇ２５７６マウスの大血管がタイトジャンクション破壊の病変を有することが、血管Ａβ沈着物と関連しているかどうかを評価するために、タイトジャンクションおよびＡβの２重染色を行った（図８ｃ）。予防的および治療的の両方のＡβ免疫Ｔｇ２５７６マウスにおいては大血管でのみ、軽度の血管Ａβ沈着が見られた。Ａβの血管沈着を有する大血管は、オクルディン（図示せず）およびＺＯ−１（図８ｃ、中空白色矢印）の両方で示されたように、タイトジャンクション病変も有した。Ａβ免疫Ｔｇ２５７６マウスにおける大脳毛細血管においては、Ａβ沈着は見られなかった。処置した野生型は血管Ａβがなかった。１年または４ヶ月のどちらかの期間ＰＢＳで処理したＴｇ２５７６は、極限られた血管Ａβを有した。
【０１１３】
免疫Ｔｇ２５７６の脳における血管新生およびアポトーシス
ＡβまたはＰＢＳのどちらかで予防的または治療的に免疫したＴｇ２５７６マウスにおいて、アポトーシスおよび血管新生の発生を共焦点顕微鏡により観察した。抗活性化カスパーゼ３抗体をアポトーシスのマーカーとして使用した（図９）。観察したすべての切片において、活性化カスパーゼ３は内皮を直接染色しなかった。老齢および若年Ｔｇ２５７６マウスに特徴的であった染色パターンでのように、活性化カスパーゼ３は、神経細胞と推定される糸状細胞体に見られた。すべての免疫マウスが、海馬におけるＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３およびＤＧ領域でそれぞれ異なる量であるが活性化カスパーゼ３染色を示した。予防的および治療的の両方のＰＢＳ免疫Ｔｇ２５７６マウスが、皮質（図９ａ）および海馬（図示せず）内で、おそらくＡβプラークを囲む傾向を示す顕著な活性化カスパーゼ３染色を示した。野生型（ＡβおよびＰＢＳ）ならびにＡβ免疫Ｔｇ２５７６マウスは、海馬に限定されたカスパーゼ３染色を示した（図９ｂ）。これらのマウスにおける活性化カスパーゼ３染色の全密度は、Ａβで処置したＴｇ２５７６より低いことが注目された。予防的および治療的の両方でＡβ免疫したＴｇ２５７６マウスの皮質では、カスパーゼ３染色は限定されていた（図９ｃ）。皮質の活性化カスパーゼ３染色は、Ａβ免疫Ｔｇ２５７６で野生型変異体と同様である。これらの結果は、観察したすべてのマウスで一貫していた。
【０１１４】
ＣＤ１０５染色を血管新生内皮マーカーとして使用したが、ＣＤ１０５染色は、タイトジャンクションの異常の有無にかかわらず脳血管構造のすべてで見られた。ＣＤ１０５染色による微小血管密度（ＭＶＤ）を、治療的または予防的方法の一環としてＡβまたはＰＢＳのどちらかで免疫したマウスにおいて、共焦点顕微鏡で定量した。微小血管密度は、画像化したフィールドの全面積に対するＴＦＡの比として定義し、血管新生の代理測定値として使用した。ＰＢＳで予防的に１年間免疫したＴｇ２５７６マウスの平均微小血管密度（０．４５６０±０．００７２；＊ｐ＜０．０００１、ｔ検定）は、ＰＢＳで免疫した野生型（０．１９５１±０．０１２３）と比較して有意に高かった（図１０ａ）。Ａβで予防的に免疫したＴｇ２５７６マウスは、ＰＢＳで免疫した遺伝子導入体と比較して、微小血管密度が有意に減少した（０．１９７２±０．００７５；＊＊ｐ＜０．０００１、ｔ検定）（図１０ａ）。治療的に免疫したマウスにおける微小血管密度は、予防的免疫群と同様であった。治療的に４ヶ月ＰＢＳで免疫したＴｇ２５７６マウスにおける平均微小血管密度（０．４９３９±０．００７７；＊＊＊ｐ＝０．０００１、ｔ検定）は、ＰＢＳで免疫した野生型（０．２０４４±０．０２２２）と比較して有意に高かった（図１０ｂ）。治療的にＡβで免疫したＴｇ２５７６マウスの微小血管密度（０．２１８０±０．０１３０；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｔ検定）はＰＢＳで免疫した遺伝子導入体と比較して有意に減少した（図１０ｂ）。
【０１１５】
考察
予防的または治療的のどちらでもＡβで免疫したマウスは抗Ａβ抗体価の増加として測定されるように、このペプチドへの免疫応答を誘発することが既に示されている (Dickstein et al. (2006) FASEB J 20, 426-433)。病理学的にみると、これらのＡβ免疫Ｔｇ２５７６マウスは、プラークバーデンおよび小膠細胞症が有意に減少した。これらの知見は、同様のＡＤマウスモデルおよび免疫療法を使用した文献の結果と一致しており、血液脳関門の全体的な完全性は、Ａβ免疫後のＴｇ２５７６マウスで有意に改善していることを示している。
【０１１６】
本研究で提起された疑問は、改善された血液脳関門は、タイトジャンクションのレベルまで及ぶかどうかということであった。Ａβ免疫Ｔｇ２５７６マウスは微小血管構造におけるタイトジャンクション病変を顕著に減少したことが示された。タイトジャンクション病変の低減は、新皮質および海馬の両方で見られたが、これらは通常ＡＤにおいて重度に影響を受けている (Hsiao et al. (1996) Science 274, 99-102; Braak & Braak, E. (1991) Acta Neuropathol 82, 239-259)。Ａβ免疫Ｔｇ２５７６マウスの微小血管からの血清マウスアルブミン漏出は最小であった。しかしながら、マウスアルブミン漏出の増加が大血管でみられ、そこでタイトジャンクションの異常および軽度のＡβの血管沈着が示された。軽度の血管Ａβ沈着および血清漏出が本研究で定性的に観察されたが、Wilcock et al. (J Neuroscinflammation 1, 24) は、同一のＡＤマウス系統の受動免疫においてＣＡＡおよびＣＡＡ関連微小出血が有意に増加することを記載している。この差異は、おそらくそれぞれのワクチン接種実験において使用したマウスの年齢に起因するであろう。本研究では、予防的に免疫したマウスは１年で屠殺した。治療的に免疫したマウスは１５ヶ月で屠殺した。Ｔｇ２５７６マウスにおける血管沈着は１５ヶ月ではほぼ「中度」であると考えられている (Domnitz et al. (2005) J Neuropathol Exp Neurol 64, 588-594)。上述のWilcock et al. の研究におけるＴｇ２５７６免疫マウスは、ＣＡＡが「広範に及ぶ」と考えられている２３ヶ月齢の初めにワクチンを接種した (Domnitz et al. (2005) J Neuropathol Exp Neurol 64, 588-594)。つまり、脳血管構造のタイトジャンクション破壊は、Ａβの存在に直接関係しており、従ってＡβの蓄積を予防することで微小血管構造の損傷の修復を可能とする。
【０１１７】
Ａβ免疫療法の機序を説明するためにいくつかの仮説が提案されている。簡単に述べると、最も指示されている機序は、Ａβプラークの小膠細胞による除去、触媒作用的溶解、末梢シンク仮説である。Ａβの小膠細胞による除去の機序は、要約されている (Morgan, D. (2009) CNS Neurol Disord Drug Targets 8, 7-15)。簡潔に述べると、末梢循環する抗Ａβ抗体が脳に入り、プラークをオプソニン化する。小膠細胞、すなわち脳常在マクロファージが、Ｆｃ−受容体媒介食作用によりプラークを除去する。触媒作用的溶解では、末梢循環する抗Ａβ抗体が結合して、プラークの立体構造を破壊することでＡβ凝集を破壊する (Solomon et al. (1997) Proc Natl Acad Sci U S A 94, 4109-4112)。最後の機序は、末梢シンク仮説である (DeMattos et al. (2001) Proc Natl Acad Sci U S A 98, 8850-8855)。この機序において、循環する抗Ａβ抗体は、血液脳関門を通るＡβの流出入の平衡を破壊する血漿Ａβに結合してこれを隔離する。正味の結果は、Ａβの脳からの除去である。この機序は、ヒトでのＡβ免疫療法の試験においてＣＡＡの発生率および関連する微小出血が増加したため、近年有望とされている (Masliah et al. (2005) Neurology 64, 129-131; Nicoll et al. (2006) J Neuropathol Exp Neurol 65, 1040-1048; Nicoll et al. (2003) Nat Med 9, 448-452; Ferrer et al. (2004) Brain Pathol 14, 11-20)。ＣＡＡは、Ａβが血管構造に沈着し大脳動脈の肥厚を生ずる独立した疾患であり、タンパク質除去機能不全動脈症と記載される (Weller et al. (2009) Alzheimers Res Ther 1, 6)。免疫療法の結果として脳から除去されたＡβは動脈に沈着して、観察されたように、免疫療法関連のＣＡＡを悪化させる (Weller et al., ibid)。これらの機序のどれかがＡβの低減または排除に卓越した役割を果たすのならばどれであるかは議論の余地がある。しかしながら、３つのすべての機序の組み合わせの可能性が高い。
【０１１８】
Ａβ免疫の臨床試験の失敗で観察された副作用は、ＣＡＡ関連大脳微小出血であった (Boche, D., Zotova, E., Weller, R. O., Love, S., Neal, J. W., Pickering, R. M., Wilkinson, D., Holmes, C., and Nicoll, J. A. (2008) Brain 131, 3299-3310)。いくつかの研究が、多様なＡＤマウスモデルにおいて、能動免疫 (Wilcock et al. (2007) Neuroscience 144, 950-960; Petrushina et al. (2008) J Neuroinflammation 5, 42; Wilcock et al. (2009) J Neurosci 29, 7957-7965) および受動免疫 (Pfeifer et al. (2002) Science 298, 1379; Racke et al. (2005) J Neurosci 25, 629-636; Wilcock et al. (2004) J Neuroinflammation 1, 24) 後の脳血管構造上における微小出血に注目している。脳血管のタイトジャンクションの破壊が、末梢シンク仮説との関係でこの副作用を説明する。以下のＡβ除去モデルが提案されている。免疫前に大量に存在するＡβは、血液脳関門内皮の完全性に影響を与え、タイトジャンクションを破壊する。そして、微小血管の漏出が起こる。免疫の間は、小膠細胞による除去および抗体による脱凝集などの様々なＡβ排除機序が活性化される。Ａβプラークが溶解すると、溶解したＡβは、血管周囲の排出路に沿って脳実質から除去される (Weller et al. (2009) Alzheimers Res Ther 1, 6)。何らかの理由により、Ａβが血管周囲から排出されなくなり、大脳動脈に沈着し、ＣＡＡを引き起こす。ＣＡＡに罹患した血管構造に沈着しているのが見つかったＡβ一次種は、より溶解性の高いＡβ１−４０であり、神経細胞由来であると考えられている (Herzig et al. (2006) Brain Pathol 16, 40-54)。Ａβの沈着は周囲の内皮タイトジャンクションを損傷し微小出血を生じるが、これは、Ａβが誘発するＮＡＤＰＨオキシダーゼ由来のＲＯＳにより媒介された可能性がある (Park et al. (2005) J Neurosci 25, 1769-1777)。このモデルは、ヒトＡＤにおけるＡβ免疫試験の失敗を説明すると思われる (Boche et al. (2008) Brain 131, 3299-3310)。
【０１１９】
活性化カスパーゼ３染色により測定可能な内皮アポトーシスは、すべてのマウスにおける活性化カスパーゼ３染色で観察されなかった。野生型およびＴｇ２５７６のすべての免疫マウスは、海馬において神経細胞様の強度の活性化カスパーゼ３染色を呈示した。野生型およびＴｇ２５７６マウスの両方の海馬における活性化カスパーゼ３の存在は、以前の研究 (Niu et al. (2010) Neurosci Bull 26, 37-46)と一致している。しかしながら、ＰＢＳ免疫Ｔｇ２５７６では、皮質および海馬の全域で強度の神経細胞様活性化カスパーゼ３を示した。ほとんどのカスパーゼ染色は、タイトジャンクション（特にＺＯ−１）ハローに関連するプラークを中心としてみられた。プラーク病変のないＡβ免疫Ｔｇ２５７６では、海馬内でのみカスパーゼ３染色を示した。ＡＤの間に起こる細胞死の正確な特性は依然議論の的であるが、アポトーシスが重要な役割を果たしていると考えられている (Rohn, T. T., and Head, E. (2008) アルツハイマー病におけるカスパーゼ活性化：早起きと夜更かし。Rev Neurosci 19, 383-393)。さらに、Ｔｇ２５７６マウスは神経細胞喪失を呈示しないと考えられている (Irizarry et al. (1997) J Neuropathol Exp Neurol 56, 965-973)。対照として処置したＴｇ２５７６マウスの皮質に活性化カスパーゼ３が存在することは、おそらくＡβのせいでアポトーシスのシグナルが増加していることを示唆している。いったんＡβが除去されると、アポトーシスシグナルも減少すると推定される。
【０１２０】
Ａβ免疫は、処置したマウスにおいて血管新生シグナルも調節するようであった。血管新生は、脳におけるＣＤ１０５の平均微小胞染色濃度により定量化可能である (Holley et al. (2010) Neurosci Lett 470, 65-70; Barresi et al. (2007) Acta Neuropathol 114, 147-156)。血管新生の相対量は、ＣＤ１０５染色の微小血管密度により定量した。予防的および治療的の両方でＰＢＳで処置したＴｇ２５７６マウスは、野生型マウスおよびＡβ処置Ｔｇ２５７６マウスと比較して血管濃度が有意に高かった。これは、Ａβが除去されると血管新生シグナルが減少することを意味する。アミロイド免疫療法の結果、神経炎症が低減すると推定される。小膠細胞は、神経変性疾患における神経炎症の重要な源であると考えられている (Perry et al. (2010) Nat Rev Neurol 6, 193-201)。神経炎症およびＡβの両方の減少は、直接または間接的に、両者に関連する血管新生シグナルを減少させるかもしれない (Pogue, A. I., and Lukiw, W. J. (2004) Neuroreport 15, 1507-1510; Naldini, A., and Carraro, F. (2005) Curr Drug Targets Inflamm Allergy 4, 3-8; Boscoloet al. (2007) Int J Mol Med 19, 581-587)。本研究とは反対に、ＡＰＰ＋ＰＳ１マウスを使用した受動免疫研究は、神経発生関連血管新生を対象とした (Biscaro et al.(2009) J Neurosci 29, 14108-14119)。血管新生（複製）中の血管ではなくＤＮＡ修復中の細胞を標識可能なＢｒｄＵ染色によって (Schmitz et al. (1999) Acta Neuropathol 97, 71-81)、遺伝子導入ＡＤマウスにおける受動免疫後に海馬で血管新生が増加しているのが見つかった。
【０１２１】
例３：アミロイドβ免疫後のアルツハイマー病における血管リバース
アルツハイマー病（ＡＤ）は、不治の神経変性疾患であり、高齢者における痴呆の主要な原因である (Castellani et al., Dis Mon 56, 484-546 (2010))。ＡＤの重要な神経病理学的特徴は、アミロイドβペプチド（Ａβ）からなる細胞外神経老人斑の存在である (Castellani et al., Dis Mon 56, 484-546 (2010))。近年の研究では、ＡＤの発病に不可欠な役割を果たすものとして、神経血管性機能障害 (Zlokovic, Nat Rev Neurosci 12, 723-738 (2011))と血管リスク因子 (Dickstein et al., Mt Sinai J Med 77, 82-102 (2010))とを結びつけた。アルツハイマー病の遺伝子導入マウスモデルにおけるＡβワクチン接種は、アミロイド沈着を顕著に低減し、記憶喪失を予防可能である。近年、我々は、アミロイド形成が、ＡＤにおける血管透過性の増加その後の血管過多へと導く広範な血管新生を促進することを提案した (Biron et al., PLoS ONE 6, e23789 (2011))。ここでは、我々は、免疫がＡＤの病態生理学的特徴を解消するという仮説をテストする。我々は、ＡＤマウスモデルにおいて、能動Ａβ免疫がプラークバーデンを解消し、血管新生へと導くアミロイドトリガーを中和し、血管過多を逆行させることを示す。これらのデータは、血管新生がＡＤにおけるプラーク形成の根底にある重要なプロセスであるという結論を支持する。これは、治療介入後に血管リバースが見られた最初の例と思われ、血管新生の調整が、ＡＤ脳における損傷を修復できるであろうという結論を支持する。
【０１２２】
Ａβ免疫療法は、様々なＡＤマウスモデルでの処置が成功したため (Golde et al., CNS Neurol Disord Drug Targets 8, 31-49 (2009))、ＡＤ修正処置方法として多大な注目を集めている (Morgan, J Intern Med 269, 54-63 (2011))。これらの知見を補足するために、我々は、ＡＤマウスモデルにおいて能動Ａβ免疫が血液脳関門（ＢＢＢ）の完全性を回復することを既に実証した (Dickstein et al., FASEB J 20, 426-433 (2006))。前臨床動物試験でのＡβ免疫の全体としてのポジティブな結果は、１９９９年後期におけるエラン／ワイスによるヒト臨床治験を促すこととなった (Wilcock & Colton, J Alzheimer’s Dis 15, 555-569 (2008))。未完となった臨床治験では、プラークの病変を低減したが、タウパシーおよび神経炎症は持続するという、複雑な結果となった (Masliah et al., Neurology 64, 129-131 (2005))。初期のヒト臨床治験においてみられた予期しなかった副作用は、ＡβおよびＡＤ発病に関する我々の知識が不完全であることを実証している。
【０１２３】
方法
マウス：例１と同様。
【０１２４】
Ａβワクチン接種：例２と同様。
【０１２５】
組織調製：組織は、Dickstein et al. (FASEB J 20, 426-433 (2006)) により既に報告されているように調製した。マウスはケタミン／キシラジン（１００ｍｇ／ｋｇ；１０ｍｇ／ｋｇ）で終末麻酔をし、ＰＢＳで５分間灌流した。脳を迅速に摘出し、嗅球を除去し、４℃で４日間４％パラフォルムアルデヒド中で後固定した。その後、脳をパラフィンに包埋し、５μｍの連続切片を作成した。パラフィン包埋、切片作成、脱パラフィンは、ワックスイット・ヒストロジー・サービス社（バンクーバー）が行った。脳体重比を比較することにより、脳の平均重量を免疫マウス間で比較した。
【０１２６】
免疫染色：脱パラフィン切片からの抗原回収は、従来の料理用圧力鍋で０．７ｍＭのＥＤＴＡ添加２０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ９．０）を使用して、最大パワーで５分間行った。その後、冷却したスライドを、ブロッキングバッファー（２５％正常ヤギ血清、３％ＢＳＡ、０．３％トリトンＸ１００、シグマ社）中で室温にて１時間インキュベートした。一次抗体としては、ウサギ抗ＺＯ−１（１：２００、インビトロジェン社）、マウス抗ヒトＣＤ１０５（１：２０、ダコ社）、マウス抗Ａβ１−１６（６Ｅ１０）（１：２０００、コーヴァンス社）を使用した。一次抗体染色は、染色バッファー（１０％正常ヤギ血清、３％ＢＳＡ、０．３％トリトンＸ１００）中で４℃で一晩行った。使用した二次抗体は、アレクサフルオル４８８または５６８（１：５００、インビトロジェン社）のどちらかと結合したもので、一次抗体化学種に相補的なものであった。二次抗体染色は、染色バッファー中室温で１時間行った。ＴＯＴＯ−３（１：１００００、インビトロジェン社）を核対比染色に使用した。切片は、各染色工程の間に、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（シグマ社）添加ＰＢＳで３回各５分間洗浄した。染色した切片上に、フルオロマウントＧ（サザンバイオテック社）を使用してカバースリップを載せ、暗所で一晩風乾した。
【０１２７】
タイトジャンクション形態の共焦点および定量分析：脳切片としては、パラフィンブロックから得た５つ目毎の切片を分析した。画像は、４０ｘ／１．３Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌａｕｒ油浸対物レンズを使用してツァイスＬＳＭ５１０Ｍｅｔａ（ツァイス、ドイツ国）で撮像した。合成投影画像を６００ｄｐｉでアドビフォトショップに取り込み、コントラストと輝度を最適化した。タイトジャンクション形態の定量分析は、前記の方法に従って分析した。共焦点データセットは、前頭皮質および海馬における若年および老齢Ｔｇ２５７６ならびに同腹仔対照の約１００個の脳血管から得た。個々の血管は、ＺＯ−１発現に関して正常（１）または異常（０）のどちからとして点数化した。正常ＺＯ−１発現は、強く、連続した、顕著な、直線状染色として判断した。それとは対照的に、異常ＺＯ−１発現は、弱く、点状および／または不連続な染色として判断した。異常ＺＯ−１血管発現を、正常対照に見られた正常血管または疾患脳の正常血管と比較した。ＺＯ−１染色において観察された「ギャップ」のために、不完全なまたは波状の血管を異常として記録することを避けるために、血管連続性の証拠を画像で確かめた。例えば、（ＴＯＴＯ−３で）染色された核または点状もしくは散在したＺＯ−１残余物の存在を使用して、血管路に沿った異常ギャップの位置を決定した。タイトジャンクション破壊の発生率は、脳の所与の領域における異常タイトジャンクション形態を示した血管の割合の平均として定義した。Ａβは、ツァイスＬＳＭ７１０レーザー走査により画像化した。
【０１２８】
微小血管密度定量：微小血管密度の定量は、公知の方法 (Biron et al., PLoS ONE 6, e23789 (2011)) を使用して共焦点顕微鏡法により行った。血管新生脳血管構造のマーカーとしてＣＤ１０５ (Holley et al. Neurosci Lett 470, 65-70 (2010)) を使用し、ツァイスＬＳＭ５１０Ｍｅｔａソフトウェアを使用して蛍光強度が最大である画像を取得、分析した。高密度のＣＤ１０５染色（「ホットスポット」）を含む脳切片の区域を、前述の共焦点画像解析パラメーターを使用して２０ｘ／０．４５Ｎ−アクロプラン対物レンズで画像化した。全蛍光面積（ＴＦＡ、単位μｍ２）は、前記ソフトウェアを使用して、各ホットスポットについてバックグラウンドより上を積分した。マウス一匹につき４つの異なるホットスポットの平均ＴＦＡを求めた。得られたＴＦＡを、ＣＤ１０５抗体により染色された全微小血管の数値表示として使用した。画像化した視野の微小血管密度は、画像の全面積に対するＴＦＡの比として表した。
【０１２９】
統計分析：ＰＢＳまたはＡβを使用した異なる免疫方法で免疫したＴｇ２５７６（Ｔｇ／＋）ＡＤマウスと野生型（＋／＋）対照同腹仔のデータの統計比較は、ボンフェローニ事後テストで不一致の値に対して、２元配置分散分析で行った。
【０１３０】
すべての実験は、３組ずつで少なくとも３回行った。異なる免疫方法において、ＰＢＳまたはＡβで免疫したＴｇ２５７６（Ｔｇ／＋）ＡＤマウスと野生型（＋／＋）対照同腹仔の統計比較は、ボンフェローニ事後テストで不一致の値に対して、２元配置分散分析で行った。統計分析はすべてグラフパッドプリズム（Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用ｖ５．０１、グラフパッドソフトウェア、サンディエゴ、カリフォルニア、米国、www.graphpad.com)で行った。０．０５未満のｐ値を有意とみなした。値は平均値±ＳＥＭで表した。
【０１３１】
免疫Ｔｇ２５７６マウスは脳血管タイトジャンクションの病変の低減を呈示する：免疫はタイトジャンクション完全性を回復するのか？  ＺＯ−１発現パターンを、予防的および治療的の両方でＡβおよびＰＢＳで免疫したＴｇ２５７６（Ｔｇ／＋）マウスおよび野生型（＋／＋）同腹仔の新皮質および海馬における脳血管構造において評価した。正常なタイトジャンクションの発現は、強い、連続した、不断の染色パターンとして観察された。異常発現は、薄い、点状のおよび／または不連続な染色として確認された。ＡβまたはＰＢＳで免疫した＋／＋マウスは、正常なＺＯ−１染色パターンを有し、脳の領域にかかわらず区別不能であった（図１１ａ〜ｄ）。予防的および治療的にＡβで免疫したＴｇ／＋マウスは、＋／＋マウスと同様に毛細血管において正常なＺＯ−１発現を呈示した（図１１ｇ、ｈ）。極まれに観察された正常な横断血管では、ＺＯ−１の発現は、短く、通常は平行（図１１ｈ）または放射状（図示せず）の腕部を有していた。ＰＢＳを投与したＴｇ／＋マウスは、タイトジャンクションの病変が顕著であった（図１１ｅ、ｆ）。興味深いことに、Ａβで免疫したＴｇ／＋マウスは、主に大血管に何らかの異常タイトジャンクション病変を示した（図１１ｉ、ｊ）。Ａβ免疫Ｔｇ／＋マウスにおけるＺＯ−１病変の毛細血管から大血管への移行は、他のＡＤ免疫療法モデルで観察されたＣＡＡ病変の増加および臨床所見に類似している (Vasilevko et al., Annals of the New York Academy of Sciences 1207, 58-70 (2010) 概説参照)。
【０１３２】
免疫マウスにおける脳血管タイトジャンクション病変の定量的評価：タイトジャンクションの病変の発生率を、無傷対穿孔タイトジャンクションを有する脳血管の割合を数値化することにより定量した。予防的および治療的の両方でＰＢＳで免疫したＴｇ／＋マウスは、ＰＢＳで免疫した＋／＋と比較して、新皮質および海馬において破壊されたタイトジャンクション発現の割合が有意に高かった（図１２）。血液脳関門病変に対するＡβ免疫の利益を実証する我々の以前のデータ (Dickstein et al., FASEB J. 20, 426-433 (2006)) と一致して、６週齢の初めに予防的に免疫したＴｇ／＋マウスは、ＰＢＳ遺伝子導入対応物と比較して、新皮質および海馬における異常血管タイトジャンクション発現の割合が有意に低かった（平均１０％；＊ｐ＜０．０５、２元配置分散分析）（図１２ａ、ｂ）。これらのマウスにおけるタイトジャンクション破壊のレベルは、ＡβおよびＰＢＳを注射した＋／＋対照と同様であった。１１ヶ月齢で治療的にＡβで免疫したＴｇ／＋マウスのタイトジャンクション病変は、新皮質および海馬の両方において、ＰＢＳで免疫したＴｇ／＋マウスと比較して、タイトジャンクション病変が顕著に低減した（平均１０％；＊ｐ＜０．０５、２元配置分散分析）（図１２ｃ、ｄ）。さらに、疾患発症後のＡβでの免疫は、タイトジャンクションタンパク質発現を＋／＋と同様のレベルまで回復した（図１２ｃ、ｄ）。ＰＢＳまたはＡβで処置した＋／＋マウスにおけるタイトジャンクション破壊が最小であったことは重要である。
【０１３３】
免疫Ｔｇ２５７６脳における血管新生：老齢Ｔｇ２５７６ＡＤモデルマウスにおいて微小血管密度（ＭＶＤ）が増加したことは (Biron et al., PLoS ONE 6, e23789 (2011))、疾患進行および重症化により血管新生が増加することを示唆している。能動的Ａβ免疫は、ＡＤマウスにおける血管密度を変化させるか？  新皮質および海馬における微小血管密度を、公知の血管新生内皮マーカーであるＣＤ１０５の免疫蛍光染色パターンにより定量した。タイトジャンクションの異常の無し（図１３ａ）または有り（図１３ｂ）にかかわらず、ＣＤ１０５染色部は脳血管構造において遍在していた。ＰＢＳで予防的に免疫したＴｇ／＋マウスは、ＰＢＳ＋／＋と比較して（０．１９５１±０．０１３０）、微小血管密度が２倍以上であった（０．４５６０±０．００７２；＊＊＊ｐ＜０．００１、２元配置分散分析）（図１３ｃ）。これとは対照的に、Ａβで予防的に免疫したＴｇ／＋マウスにおける微小血管密度は、同じ遺伝子型のＰＢＳ対照と比較して有意に減少し（０．１９７２±０．００７５；＊ｐ＜０．０５、２元配置分散分析）（図１３ｃ）、＋／＋の動物で観察されたレベルと同様であった。治療的に処置したマウスにおける微小血管密度は、予防的に免疫したマウスにおける観察結果と同様であった。疾患発症後にＰＢＳで免疫したＴｇ／＋マウス（０．４９３９±０．００７７）は、ＰＢＳ＋／＋（０．２０４４±０．０２２２；＊＊＊ｐ＜０．００１、２元配置分散分析）と比較して、微小血管密度が２倍以上であった（図１３ｄ）。疾患発症前に免疫したＴｇ／＋マウスで見られるように、疾患発症後にＡβで免疫したＴｇ／＋マウスは、ＰＢＳで免疫したＴｇ／＋マウスと比較して、微小血管密度が有意に減少した（０．２１８０±０．０１３０；＊ｐ＜０．０５、２元配置分散分析）（図１３ｄ）。血管密度の変化は、マウス脳の物理的大きさとは無関係のようである。平均脳体重比は、遺伝子型、免疫原あるいは免疫方法にかかわらず有意ではなかった（図１３ｅ、ｆ）。
【０１３４】
免疫Ｔｇ２５７６脳におけるＡβ沈着：既に記述されているように (Dickstein et al., FASEB J 20, 426-433 (2006))、Ａβで免疫したＴｇ／＋マウスは、脳実質のＡβプラークが顕著に減少した（図１４ａ〜ｄ）。Ａβで予防的に免疫したＴｇ／＋マウスにおいて、Ａβプラークの完全な消失が観察された（図１４ｄ）。しかしながら、Ａβで治療的に処置したＴｇ／＋では、Ａβプラーク病変は顕著に低減した（図１４ｂ）。
【０１３５】
考察
ＡＤの実験的な処置の選択肢として、Ａβ免疫療法の探求を続ける。ヒトＡＤワクチンの初期臨床試験に見られた予期しなかったネガティブな血管副作用は、ＡβおよびＡＤ発病に関する我々の知識が限定されていることを示している。既存のモデルには、これらの観察結果を説明できる教義が組み込まれていない。本研究は、能動的Ａβ免疫ＡＤマウスモデルにおいて、血液脳関門のタイトジャンクションの完全性が、アミロイド形成により促進される血管新生と関係していることを実証した。脳実質からＡβを除去することで、微小血管関連タイトジャンクション病変が消失する。さらに、ヒト免疫試験において観察されたＣＡＡ関連微小出血が、罹患した血管におけるタイトジャンクションの損失により説明できるかもしれない。
【０１３６】
ＢＢＢ機能障害は、ＡＤの動物モデルで最初に特定され (Ujiie et al., Microcirculation 10, 463-470 (2003))、その後患者におけるＡＤの顕著な、けれども説明不能な臨床的特徴として確認された (Farrall & Wardlaw, Neurobiol Aging 30, 337-352 (2009))。我々は、ＡＤにおける血液脳関門に関するデータ内容と一致する新たな仮説、すなわちアミロイド形成が極度の血管新生を促進し、ＡＤにおける血管透過性を増加し、引き続く血管過多へと導くことを最近提案した (Biron et al., PLoS ONE 6, e23789 (2011))。ここでは、我々は、早発性ＡＤを発症させる、スウェーデンの２つのミスセンス突然変異を含む、ヒトＡＰＰ６９５を過剰発現するＴｇ２５７６マウスにおいて、Ａβ免疫処置が血管新生シグナルを調節することを実証する（Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ）。血管新生の相対量は、脳におけるＣＤ１０５の微小血管染色濃度の平均値により定量可能である (Holley et al. Neurosci Lett 470, 65-70 (2010); Barresi et al., Acta Neuropathol 114, 147-156 (2007))。予防的および治療的の両方でＰＢＳで処置したＴｇ２５７６マウスは、野生型マウスおよびＡβで処置したＴｇ２５７６マウスと比較して血管密度が有意に高かった。血管密度の変化は、マウス脳の物理的大きさとは無関係のようであった。これは、Ａβが除去されると血管新生シグナルが減少されることを意味している。アミロイド免疫療法の結果、神経炎症が低減されると推定される。神経炎症およびＡβの両方の減少は、直接または間接的に両者に関連する血管新生シグナルを減少させる (Boscolo et al., Int J Mol Med 19, 581-587 (2007))。
【０１３７】
臨床Ａβ免疫試験の失敗で見られた副作用は、ＣＡＡ関連大脳微小出血の増加 (Boche et al., Brain 131, 3299-3310 (2008))であったが、これは能動免疫 (Wilcock et al., Neuroscience 144, 950-960 (2007); Petrushina et al., J Neuroinflammaton 5, 42 (2008); Wilcock et al., J Neurosci 29, 7957-7965 (2009)) および受動免疫 (Pfeifer et al., Science 298, 1379, (2002); Racke, M. M. et al., J Neurosci 25, 629-636 (2005) ; Wilcock, D. M. et al., J Neuroinflammation 1, 24 (2004)) 後の多様なＡＤマウスモデルにおいてもみられた。血管新生による脳血管構造タイトジャンクションの破壊も、この副作用を説明する。以下のＡβ除去モデルが提案される。免疫前に大量に存在するＡβは血管新生を引き起こしてタイトジャンクションの破壊を生じることにより、血液脳関門内皮の完全性に影響を与える。そして、微小血管の漏出が起こり、末梢アミロイドが脳に進入し、神経毒性のアミロイドプラークとして癒着することを可能とする。脳血管の損傷は、Ａβが誘発したＮＡＤＰＨオキシダーゼ由来ＲＯＳによりさらに悪化する (Park, L. et al., J Neurosci 25, 1769-1777 (2005))。血管過多へと導く血管新生の結果、弱まったタイトジャンクションが微小出血を起こす。免疫の間は、オプソニン化、小膠細胞による除去および抗体による脱凝集などの様々なＡβ排除機序が活性化される。Ａβプラークが溶解すると、溶解したＡβは、血管周囲の排出路に沿って脳実質から除去される (Weller et al., Alzheimers Res Ther 1, 6 (2009))。従って、免疫は、Ａβへの免疫応答を刺激することにより血管新生促進シグナルを中和するが、いったん形成された疾患の他の側面は、免疫では解消しないであろう。何らかの未知の理由により、おそらく血液脳関門の再シール形成により、Ａβの血管周囲からの排出が停止され、大脳動脈に沈着し、ＣＡＡを引き起こす。ＣＡＡ罹患血管構造に沈着が見つかった最初のＡβは、より溶解性の高いＡβ１−４０であり、神経細胞由来であると考えられていることに留意すべきであろう (Herzig et al., Brain Pathol 16, 40-54 (2006))。このモデルは、ヒトＡＤＡβ免疫試験の失敗を説明していると思われる (Boche et al., Brain 131, 3299-3310 (2008))。
【０１３８】
我々の目的は、Ｔｇ２５７６ＡＤマウスにおいて、Ａβペプチドでの免疫が、アミロイド形成により引き起こされた血管新生および血管過多を解消できるかどうかを決定することであった。我々は、Ａβでの免疫の後に、血管過多のリバースがおこることを見出した。これは、治療介入後血管密度が正常レベルまで戻った血管リバースの最初の例であると思われる。また、これらのデータは、以前に報告されていたよりもより大きい血管可変性が存在することを意味するものである。血管密度を解消せずに血管新生を停止することが想定できるが、これは、アミロイド形成シグナルが血管過多を維持するために必要であることを意味している可能性がある。いったんシグナルが除去されると、血管過多は鎮静する。これらのデータは明らかに、ＡＤ病態生理の血管新生モデルの根底となり、血管新生を調節することでＡＤ脳の損傷を修復する最初の証拠を提供する。近年、経口抗がん薬である抗増殖剤ベキサロテンが、ＡＤの動物モデルにおいてプラークバーデンを低減し記憶機能を向上することが示された (http://www.sciencemag.org/content/early/2012/02/08/science.1217697)。この研究は、ベキサロテンがレチノイドＸ受容体に作用してＡＰＯＥ輸送に影響してプラーク蓄積や代謝回転を低減すると解釈するものであるが、ＡＤにおける他の作用態様も可能である。ベキサロテン（タルグレチン）は、アポトーシスを増加させ、細胞サイクル制御、分化、転移抑制活性、そして最終的に血管新生抑制活性を変化させることも知られている (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3120806/)。それは、内皮細胞の増殖、接着、浸潤、遊走を直接抑制して血管新生を阻害し、ＶＥＧＦの発現に影響する (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3120806/)。これらのデータおよび本明細書に提示したデータは、従って、ＡＤの新たな治療様式として、脳血管構造での血管新生のリバースを直接指摘するものである。
【０１３９】
本明細書で参照したすべての特許、特許申請広報を含む刊行物、およびデータベース項目の開示は、それぞれの特許、刊行物、データベース項目が明白にかつ個々に参照により組込むことが表示されている場合と同じ程度に、そのすべてが参照により明白に組込まれるものである。
【０１４０】
本発明は、特定の具体的な態様を参照して記載されているが、その様々な変更は、本発明の主旨を超えない範囲で当業者には明らかであろう。当業者に明らかであろうそのようなすべての変更は、以下の請求の範囲内に含まれることを意図するものである。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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