(57)【要約】本発明は、非ケラチノサイト上皮細胞を培養する方法を対象とし、方法は、培養中に、フィーダー細胞、非ケラチノサイト上皮細胞、またはこれら両方におけるＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の活性を阻害しながら、非ケラチノサイト上皮細胞をフィーダー細胞およびカルシウム含有培地の存在下で培養することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ケラチノサイト上皮細胞を連続的に培養する方法であって、
ａ）前記非ケラチノサイト上皮細胞をフィーダー細胞およびカルシウム含有培地の存在下で培養すること、及び
ｂ）培養中に、前記フィーダー細胞、前記非ケラチノサイト上皮細胞、またはこれら両方におけるＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の活性を阻害すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記非ケラチノサイト上皮細胞は、初代細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非ケラチノサイト上皮細胞は、初代細胞ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記非ケラチノサイト上皮細胞は、腫瘍細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記非ケラチノサイト上皮細胞は、扁平上皮細胞、円柱細胞、腺腫細胞、および移行上皮細胞からなる群から選択される、請求項２、３、または４に記載の方法。
【請求項６】
前記非ケラチノサイト上皮細胞は、前立腺細胞、乳房細胞、肝細胞、膵島細胞、肺上皮細胞、腎細胞、膀胱細胞、胃上皮細胞、大腸上皮細胞、小腸上皮細胞、尿道上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、胆嚢細胞、および下垂体細胞からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記カルシウム含有培地は、血清または血清代替物を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記フィーダー細胞は、増殖性線維芽細胞または非増殖性線維芽細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記非増殖性線維芽細胞は、マウス線維芽細胞またはヒト線維芽細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＯＣＫは、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤１（ＲＯＣＫ１）、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤２（ＲＯＣＫ２）、またはこれら両方である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ＲＯＣＫの活性の阻害は、前記非ケラチノサイト上皮細胞を小分子ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記小分子ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ−２７６３２、ＨＡ１１００塩酸塩、ＨＡ１０７７、およびＧＳＫ４２９２８６からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＲＯＣＫの活性の阻害は、前記非ケラチノサイト上皮細胞をＲＯＣＫ１、ＲＯＣＫ２、またはこれら両方に特異的なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子の存在下で培養することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ｃ）ＲＯＣＫを阻害した後に、前記非ケラチノサイト上皮細胞を継代すること、及び
ｄ）前記継代細胞をＲＯＣＫが阻害されていない細胞培養環境下に設置すること、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＲＯＣＫが阻害されていない環境は、三次元細胞培養環境である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＯＣＫが阻害されていない環境は、前記非ケラチノサイトの分化を通常誘導しない環境である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＲＯＣＫが阻害されていない環境は、前記非ケラチノサイトの分化を誘導する環境である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
条件的に不死化された非ケラチノサイト上皮細胞集団。
【請求項１９】
前記条件的に不死化された非ケラチノサイト上皮細胞は、正常な細胞に由来する、請求項１８に記載の細胞集団。
【請求項２０】
前記条件的に不死化された非ケラチノサイト上皮細胞は、腫瘍に由来する、請求項１８に記載の細胞集団。
【請求項２１】
前記条件的に不死化された非ケラチノサイト上皮細胞は、扁平上皮細胞、円柱細胞、腺腫細胞、および移行上皮細胞からなる群から選択される細胞に由来する、請求項１９または２０に記載の細胞集団。
【請求項２２】
前記条件的に不死化された非ケラチノサイト上皮細胞は、前立腺細胞、乳房細胞、肝細胞、膵島細胞、肺上皮細胞、腎細胞、膀胱細胞、胃上皮細胞、大腸上皮細胞、小腸上皮細胞、尿道上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、胆嚢細胞、および下垂体細胞からなる群から選択される細胞への分化を促進するその後の環境下に設置された後にそれらに分化することができる、請求項２１に記載の細胞集団。
【請求項２３】
非ケラチノサイト上皮細胞の増殖を刺激する方法であって、
ａ）前記非ケラチノサイト上皮細胞をフィーダー細胞およびカルシウム含有培地の存在下で培養すること、及び
ｂ）培養中に、前記フィーダー細胞、前記非ケラチノサイト上皮細胞、またはこれら両方におけるＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の活性を阻害すること、を含み、
それによって、前記Ｒｈｏキナーゼの活性を阻害しながら前記非ケラチノサイト上皮細胞を培養することが、非ケラチノサイト上皮細胞の増殖を刺激する、
前記方法。
【請求項２４】
前記非ケラチノサイト上皮細胞は、初代細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記非ケラチノサイト上皮細胞は、初代細胞ではない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記非ケラチノサイト上皮細胞は、腫瘍細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記非ケラチノサイト上皮細胞は、扁平上皮細胞、円柱細胞、腺腫細胞、および移行上皮細胞からなる群から選択される請求項２４、２５、または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記非ケラチノサイト上皮細胞は、前立腺細胞、乳房細胞、肝細胞、膵島細胞、肺上皮細胞、腎細胞、膀胱細胞、胃上皮細胞、大腸上皮細胞、小腸上皮細胞、尿道上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、胆嚢細胞、および下垂体細胞からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記カルシウム含有培地は、血清または血清代替物を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記フィーダー細胞は、非増殖性線維芽細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記非増殖性線維芽細胞は、マウス線維芽細胞またはヒト線維芽細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＲＯＣＫは、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤１（ＲＯＣＫ１）、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤２（ＲＯＣＫ２）、またはこれら両方である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ＲＯＣＫの活性の阻害は、前記非ケラチノサイト上皮細胞を小分子ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記小分子ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ−２７６３２、ＨＡ１１００塩酸塩、ＨＡ１０７７、およびＧＳＫ４２９２８６からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＲＯＣＫの活性の阻害は、前記非ケラチノサイト上皮細胞をＲＯＣＫ１、ＲＯＣＫ２、またはこれら両方に特異的なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子の存在下で培養することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記腫瘍細胞は、対象の血液循環から単離された、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記腫瘍細胞は、対象由来の異常な組織から単離された、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
異常な非ケラチノサイト上皮（ＮＫＥ）細胞の存在を特徴とする状態の治療を必要とする対象の候補治療を同定する方法であって、
ａ）前記異常なＮＫＥ細胞試料を前記対象から得ること、
ｂ）前記異常なＮＫＥ細胞をフィーダー細胞、カルシウム含有培地、および少なくとも１つのＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の存在下で培養して、生体外で異常なＮＫＥ細胞集団を産生すること、
ｃ）生体外で、前記異常なＮＫＥ細胞の少なくとも一部の応答プロファイルを決定すること、及び
ｄ）前記決定された応答プロファイルに基づいて、前記対象の候補治療を同定すること、
を含む、前記方法。
【請求項３９】
前記応答プロファイルは、生体外で、前記異常なＮＫＥ細胞から抽出されるＤＮＡの少なくとも一部の配列を同定することによって少なくとも部分的に決定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記応答プロファイルは、生体外で、前記異常なＮＫＥ細胞中に産生される少なくとも１つのｍＲＮＡを同定することによって少なくとも部分的に決定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記応答プロファイルは、生体外で、前記異常なＮＫＥ細胞中に産生されない少なくとも１つのｍＲＮＡを同定することによって少なくとも部分的に決定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記応答プロファイルは、生体外で、前記異常なＮＫＥ細胞が発現する１つ以上のタンパク質を同定することによって少なくとも部分的に決定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記応答プロファイルは、生体外で、前記異常なＮＫＥ細胞が発現しない１つ以上のタンパク質を同定することによって少なくとも部分的に決定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記応答プロファイルは、生体外で、前記異常なＮＫＥ細胞を化学療法剤に供し、かつ、生体外で、前記異常なＮＫＥ細胞に対する前記化学療法剤の治療指数を決定することによって少なくとも部分的に決定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記対象由来の前記異常なＮＫＥ細胞は、前記対象の血液循環から得られる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
対象における異常な非ケラチノサイト上皮（ＮＫＥ）細胞を同定する方法であって、
ａ）前記対象から単離された少なくとも１つの異常な候補ＮＫＥ細胞をフィーダー細胞、カルシウム含有培地、および少なくとも１つのＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の存在下で培養して、生体外で異常な候補ＮＫＥ細胞集団を産生すること、
ｂ）生体外で、前記異常な候補ＮＫＥ細胞集団の少なくとも一部の組織起源プロファイルを決定すること、及び
ｃ）前記異常な候補ＮＫＥ細胞の少なくとも１つの特性を、前記異常な候補ＮＫＥ細胞の前記決定された組織起源プロファイルの組織と同一の組織から得られる正常なＮＫＥ細胞の同一の特性と比較して、前記異常な候補ＮＫＥ細胞と前記正常なＮＫＥ細胞との間に差異があるかを決定すること、を含み、
差異は、前記異常な候補ＮＫＥ細胞が正常なＮＫＥ細胞と比較して異常であることを示す、
前記方法。
【請求項４７】
前記異常な候補ＮＫＥ細胞は、前記対象の血液循環から得られる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記組織起源プロファイルは、生体外で、前記異常な候補ＮＫＥ細胞中に産生される少なくとも１つのｍＲＮＡを同定することによって少なくとも部分的に決定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記組織起源プロファイルは、生体外で、前記異常な候補ＮＫＥ細胞中に産生されない少なくとも１つのｍＲＮＡを同定することによって少なくとも部分的に決定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記組織起源プロファイルは、生体外で、前記異常な候補ＮＫＥ細胞が発現する１つ以上のタンパク質を同定することによって少なくとも部分的に決定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記組織起源プロファイルは、生体外で、前記異常な候補ＮＫＥ細胞が発現しない１つ以上のタンパク質を同定することによって少なくとも部分的に決定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記組織起源プロファイルは、組織学的に少なくとも部分的に決定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
自家性標的非ケラチノサイト上皮（ＮＫＥ）細胞を、さらなる標的ＮＫＥ細胞を必要とする対象に投与する方法であって、
ａ）標的ＮＫＥ細胞の試料を前記対象から得ること、
ｂ）前記標的ＮＫＥ細胞をフィーダー細胞、カルシウム含有培地、および少なくとも１つのＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の存在下で培養して、生体外の自家性標的ＮＫＥ細胞集団を産生すること、
ｃ）前記生体外の自家性標的ＮＫＥ細胞集団を回収すること、及び
ｄ）前記自家性標的ＮＫＥ細胞の回収物を、自家性ＮＫＥ細胞を必要とする前記対象に投与すること、
を含む、前記方法。
【請求項５４】
前記自家性標的ＮＫＥ細胞は、前立腺細胞、乳房細胞、肝細胞、膵島細胞、肺上皮細胞、腎細胞、膀胱細胞、胃上皮細胞、大腸および小腸上皮細胞、尿道上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、胆嚢細胞、ならびに下垂体細胞からなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
遺伝子改変された自家性標的非ケラチノサイト上皮（ＮＫＥ）細胞を、さらなる標的ＮＫＥ細胞を必要とする対象に投与する方法であって、
ａ）標的ＮＫＥ細胞の試料を前記対象から得ること、
ｂ）前記標的ＮＫＥ細胞をフィーダー細胞、カルシウム含有培地、および少なくとも１つのＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の存在下で培養して、生体外の標的ＮＫＥ細胞集団を産生すること、
ｃ）生体外で前記標的ＮＫＥ細胞集団の少なくとも一部を遺伝子改変すること、
ｄ）遺伝子改変された前記標的ＮＫＥ細胞を選択すること、
ｅ）前記選択された遺伝子改変された標的ＮＫＥ細胞をフィーダー細胞、カルシウム含有培地、および少なくとも１つのＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の存在下で培養して、生体外の遺伝子改変された自家性標的ＮＫＥ細胞集団を産生すること、
ｆ）生体外で遺伝子改変された前記自家性標的ＮＫＥ細胞集団を回収すること、及び
ｇ）前記遺伝子改変された自家性標的ＮＫＥ細胞の回収物を、さらなる標的ＮＫＥ細胞を必要とする前記対象に投与すること、
を含む、前記方法。
【請求項５６】
前記対象から得られる前記標的ＮＫＥ細胞は、肝細胞、肺上皮細胞、および膵島細胞からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記対象から得られる前記標的肝細胞は、第ＶＩＩＩ因子のコーディング領域を含む導入遺伝子を挿入することによって遺伝子改変される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記対象から得られる前記標的肺上皮細胞は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）のコーディング領域を含む導入遺伝子を挿入することによって遺伝子改変される、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年１１月１２日出願の米国仮出願第６１／４１３，２９１号、および２０１１年４月１３日出願の同第６１／４７４，９０１号に対する優先権を主張するものであり、これら両方は、参照により組み込まれる。
【０００２】
連邦支援の研究または開発に関する声明
本発明の開発中に行われた作業の一部は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の助成金交付番号Ｒ０１ＣＡ１０６４００およびＲ０１−ＣＡ０５３３７１のもとで米国政府の資金を利用した。米国政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
本発明は、非ケラチノサイト上皮細胞を培養する方法を対象とし、方法は、培養中に、フィーダー細胞、非ケラチノサイト上皮細胞、またはこれら両方におけるＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の活性を阻害しながら、非ケラチノサイト上皮細胞をフィーダー細胞およびカルシウム含有培地の存在下で培養することを含む。本発明は、これらの不死化された非ケラチノサイト上皮細胞を使用する方法も対象とする。
【背景技術】
【０００４】
肺、腎臓、肝臓、膵臓、および皮膚等の生命維持に必要な器官は、とりわけ、器官特異的な分化上皮細胞の存在を特徴とする。分化上皮細胞は、言うまでもなく、それぞれのそのような器官の特定の機能に関連している。特定の機能は、例えば、肺でのガス交換、腎臓での濾過、肝臓での解毒および抱合、膵島細胞でのインスリン産生、または皮膚による危険な環境に対する保護と様々であり得る。そのような器官の疾患もしくは変性は、変性したか、または失われた器官構造が、多くの場合、十分に置換されず、かつ１つの器官の特殊化した細胞が、別の器官の機能を引き継ぐことができないため、多くの場合、生命にかかわる。
【０００５】
腎臓上皮細胞、膵臓のランゲルハンス島中のインスリン産生細胞、ならびに真皮の腺細胞および／または毛包細胞等の分化細胞は、可能であったとしても、回復困難であり、体内環境から取り出されると、維持するのがより困難である。実際、分化上皮細胞は、培養下で極めて限られた寿命を有する。一般的に言えば、動物から採取されるケラチノサイト以外の上皮細胞を、恐らく、１継代または２継代のみ培養下で増殖させることができる。
【０００６】
生体外の非ケラチノサイト上皮（ＮＫＥ）細胞を研究するために、ウイルス性または細胞性癌遺伝子の挿入等の一種の遺伝子操作は、細胞が数継代以上生存することを可能にするために必要とされている。しかしながら、これらの遺伝子操作は、細胞が正常な上皮細胞に類似しないか、または正常な上皮細胞のように機能しなくてもよいように、細胞の遺伝的背景、ならびに生理機能を変化させる。さらに、これらの遺伝子改変された細胞は、無傷の動物への移植の候補ではない。
【０００７】
細胞を遺伝子改変することなく、器官から採取されるＮＫＥ細胞を長期間培養する方法が、当技術分野で必要とされている。本発明は、遺伝子操作を必要とすることなく、ＮＫＥ細胞を長期間培養することに関連する問題を解決する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、非ケラチノサイト上皮細胞を培養する方法を対象とし、方法は、培養中に、フィーダー細胞、非ケラチノサイト上皮細胞、またはこれら両方におけるＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の活性を阻害しながら、非ケラチノサイト上皮細胞をフィーダー細胞およびカルシウム含有培地の存在下で培養することを含む。
【０００９】
本発明は、条件的に不死化された非ケラチノサイト上皮細胞を産生する方法も対象とし、方法は、フィーダー細胞、非ケラチノサイト上皮細胞、またはこれら両方におけるＲＯＣＫの活性を阻害しながら、非ケラチノサイト上皮細胞をフィーダー細胞およびカルシウム含有培地の存在下で培養することを含む。非ケラチノサイト上皮細胞をそのような条件下で培養して、条件的に不死化された非ケラチノサイト上皮細胞を産生する。
【００１０】
本発明は、少なくとも部分的に分化した非ケラチノサイト上皮細胞を産生する方法も対象とし、方法は、フィーダー細胞、非ケラチノサイト上皮細胞、またはこれら両方におけるＲＯＣＫの活性を阻害しながら、非ケラチノサイト上皮細胞をフィーダー細胞およびカルシウム含有培地の存在下である一定期間培養して、条件的に不死化された非ケラチノサイト上皮細胞を産生することを含む。条件的に不死化された非ケラチノサイト上皮細胞をこれらの条件下で培養した後、条件的に不死化された非ケラチノサイト上皮細胞は、条件的に不死化された非ケラチノサイト上皮細胞の分化を促進する条件下に設置される。
【００１１】
本発明は、非ケラチノサイト上皮細胞の増殖を刺激する方法も対象とし、方法は、フィーダー細胞、非ケラチノサイト上皮細胞、またはこれら両方におけるＲＯＣＫの活性を阻害しながら、非ケラチノサイト上皮細胞をフィーダー細胞およびカルシウム含有培地の存在下で培養することを含む。そのような条件下での非ケラチノサイト上皮細胞の培養が、非ケラチノサイト上皮細胞を刺激して増殖させるが、他の方法では、細胞は増殖することができない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の方法の一実施形態の流れ図を示す。
【図２】様々な増殖条件下でのヒト初代前立腺細胞およびヒト初代乳房細胞の生体外増殖曲線を示す。ＰｒＥＧＭは、市販の合成前立腺上皮細胞増殖培地であり、ＭＥＧＭは、市販の合成乳房上皮細胞培地であり、フィーダーは、照射されたか、またはマイトマイシンＣで処理されたＪ２マウス線維芽細胞であり、ＲＯＣＫ阻害剤は、最初のプレーティング時およびその後に細胞に適用された１０μＭの濃度のＹ２７６３２である。Ｙ軸は、集団倍加であり、Ｘ軸は、日数である。すべての群において、培地を３日毎に交換した。
【図３】本明細書に開示の方法および培養条件を用いて増殖させた初期継代の正常なヒト前立腺（Ａ）および正常なヒト乳房（Ｂ）上皮細胞を示す。すべての細胞を、５％のウシ胎児血清が補充されたＦ培地中および１０μＭの濃度のＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２の存在下で増殖させた。それぞれの図の中央の矢印は、マウス線維芽フィーダー細胞（周辺矢印）に包囲される堅固な細胞間結合を有するクラスター状に増殖する上皮細胞を強調している。
【図４】本明細書に開示の方法および培養条件を用いて、正常な後期継代ヒト前立腺上皮細胞（ＨＰＥＣ）（継代２９）および正常なヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）（継代３２）の細胞表面マーカー発現を示す。樹立されたヒト前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）を対照として用いた。細胞を基底上皮細胞マーカーＰ６３（Ｐ６３列）およびＤＮＡ（ＤＡＰＩ列）染色した。右の列は、２つの画像の統合である。ＨＰＥＣおよびＨＭＥＣのいずれも後期継代細胞であった。これらの後期継代のＨＰＥＣ細胞およびＨＭＥＣ細胞は、８０継代を超えた後も引き続きＰ６３マーカーを呈し、細胞が、依然として、幹様の正常な基底上皮細胞に類似していることを示す。最上列の中央のパネルの右上部分の大きな円形細胞は、フィーダー細胞である。非増殖性フィーダー細胞の斑点のあるＤＡＰＩ染色は、ＤＮＡが断片化されたことを示す。
【図５】本明細書に開示の方法および培養条件を用いて培養した後の後期継代ヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）およびヒト前立腺上皮細胞（ＨＰＥＣ）の形態学的構造を示す。ｍｙｃ変異体で形質転換された樹立された不死化ヒト乳房細胞株を対照として用いた。ＨＭＥＣおよびＨＰＥＣは継代されており（それぞれ、３５継代および３１継代）、その後、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ベースの三次元細胞培養物上にプレーティングした。（Ａ）５日目までに、ＨＭＥＣおよびＨＰＥＣが、多房状の球体構造として組織化された堅固なコロニーを形成し始めた一方で、不死化されたｍｙｃ変異体乳房細胞は、ランダムな組織化されていない塊を形成した。ＨＰＥＣおよびＨＭＥＣのいずれも、それぞれの球体の周辺で分極単層を形成した。（Ｂ）三次元表面上での培養の５日目の細胞の代表的な堅固なコロニーの拡大図である。ＨＭＥＣおよびＨＰＥＣの多層組織化がはっきりと見られ、ｍｙｃ変異体細胞の非組織化も見られる。（Ｃ）三次元細胞培養表面上での培養の５日後（継代３６）の組織化されたＨＭＥＣのクラスターのβカテニン染色の共焦点顕微鏡画像。
【図６】本明細書に開示の方法および培養条件を用いた正常なヒト前立腺細胞および腫瘍原性ヒト前立腺細胞の増殖を示す。正常な細胞および腫瘍細胞のいずれも凍結されており、この図は、解凍後最初のプレーティングである。（Ａ）６日目までに、本明細書に開示の方法および培養条件を用いることによって、正常な細胞および腫瘍のいずれも順調に増殖する。（Ｂ）（Ａ）由来の細胞を解凍後に２回継代し、その後、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ベースの三次元細胞培養上にプレーティングした。８日目までに、正常な細胞は、図５Ａにおいて見られるような球体構造として組織化された堅固なコロニーを形成し始め、腫瘍細胞は、ランダムな組織化されていない細胞塊を形成し始めた。
【図７】本明細書に開示の方法および培養条件を用いて、ヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）およびヒト前立腺上皮細胞（ＨＰＥＣ）に適応されるそれぞれの継代における（Ａ）平均レベルのテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）発現および（Ｂ）テロメアの平均長を示す。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）由来のＥ６Ｅ７で形質転換されたヒト包皮ケラチノサイト（ＨＦＫ）を対照として用い、ＲＯＣＫ阻害剤を使用することなく、血清を含まない培地中で培養した。テロメラーゼ活性は、ＨＰＥＣおよびＨＭＥＣにおいて、時間および継代数とともに増加する傾向があり、形質転換かつ不死化されたＨＦＫ細胞のテロメラーゼ活性を反映する。ＨＭＥＣおよびＨＰＥＣにおいて、テロメア長が時間経過とともに増加するように見えるが、テロメアの平均長は時間経過とともに減少し、平均長を約２ｋＢに安定化させる。
【図８】本明細書に開示の方法および培養条件を用いたマウス肝上皮細胞の増殖および維持を示す。それぞれのパネルは、はっきりと異なる遺伝的背景を有するＣ５７ＢＬ／６マウスから採取された肝細胞を表す。ｗｔ：継代２の野生型細胞、Ｄ：継代２のＳＴＡＴ３（シグナル伝達物質および転写３の活性化因子）の肝臓特異的なノックアウトマウス由来の肝細胞、Ｅｌｆ＋／−：継代２の（βスペクトリンである）ＥＬＦのへテロ接合体ノックアウトマウス由来の肝細胞、Ｌ−／−：継代２の「ＥＬＦ＋／−」と「Ｄ」マウスの異種交配の子孫由来の肝細胞。すべての細胞を５％のウシ胎児血清が補充されたＦ培地中および１０μＭの濃度のＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２の存在下で増殖させた。それぞれのパネルの中央で、上皮細胞は、マウス線維芽フィーダー細胞に包囲されるクラスター状に増殖している。
【図９】本明細書に開示の方法および培養条件を用いたマウス乳房上皮細胞の増殖および維持を示す。それぞれのパネルは、はっきりと異なる遺伝的背景を有するマウスから採取された乳房上皮を表す。ｍＭＥＣ  ＦＶＢ：継代２の野生型ＦＶＢ系統由来の乳房細胞、ｍＭＥＣ△３：継代２のＡＩＢ１（「乳癌増幅因子１」、ここでエクソン３が欠失された）の活性アイソフォームを過剰発現するトランスジェニックマウス由来の乳房細胞、ｍＭＥＣ  ＡＩＢ  ｕｐ：継代２のＴｅｔ誘導性ＡＩＢ１導入遺伝子を有する構築物を含有するトランスジェニックマウス由来の乳房細胞、ｈｅｒ２／ｎｅｕ：継代２のｈｅｒ２／ｎｅｕを過剰発現するトランスジェニックマウス由来の乳房細胞。すべての細胞を、５％のウシ胎児血清が補充されたＦ培地中および１０μＭの濃度のＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２の存在下で増殖させた。それぞれのパネルの中央で、上皮細胞は、マウス線維芽フィーダー細胞に包囲されるクラスター状に増殖している。
【図１０】本明細書に開示の方法および培養条件を用いた継代２のヒト気管−気管支上皮細胞の増殖および維持を示す。細胞を、５％のウシ胎児血清が補充されたＦ培地中および１０μＭの濃度のＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２の存在下で増殖させた。それぞれのパネルの中央で、上皮細胞は、マウス線維芽フィーダー細胞に包囲されるクラスター状に増殖している。
【図１１】数個の代表的なＲＯＣＫ阻害剤の化学構造を示す。
【図１２】対象の肺の右上葉部から採取された組織由来の匙型細胞様異型を有する扁平上皮乳頭腫の存在を示す、切除された標本の組織切片を示す。
【図１３】細胞株を生成するための正常な組織および腫瘍組織の両方から採取された組織生検の処理を示す。
【図１４】培養された腫瘍細胞から抽出されたＤＮＡの分析を示す。様々な種類のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）およびＰＣＲに特異的なプライマーを用いて、危険性の低いＨＰＶ（ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１）または危険性の高いＨＰＶ（ＨＰＶ−１６またはＨＰＶ−１８）が存在するかを評価した。危険性の低いＨＰＶ−１１  ＤＮＡのみが検出された。
【図１５】ＨＰＶ−１１ウイルスがＬ１遺伝子を担持するかを決定するための培養された腫瘍細胞から抽出されたＤＮＡの分析を示す。Ｌ１遺伝子の存在または不在は、抗Ｌ１ワクチンがこの患者の管理において有用であり得ることを示す。データは、全Ｌ１遺伝子（ｂｐ５７７５〜７００１）が異常なＮＫＥ細胞中で無傷であったことを示す。
【図１６】生検中に対象から採取され、本発明の方法に従って培養された異常なＮＫＥ細胞中に産生されたｍＲＮＡの分析を示す。これらの初期および後期遺伝子がｍＲＮＡに転写されたことが立証された。図１６は、初期Ｅ６およびＥ７形質転換遺伝子が転写されたが、Ｌ１遺伝子は転写されなかったことを示す。
【図１７】シドフォビル（Ａ）、ＨＤＡＣ阻害剤（ＳＡＨＡ、ボリノスタット）（Ｂ）、およびアルテミシニン誘導体（ＤＨＡ）（Ｃ）に応答した、生検中に対象から採取され、本発明の方法に従って培養された異常なＮＫＥ細胞を用いて作成された細胞生存率曲線を示す。正常な細胞および腫瘍細胞を、指示された濃度のシドフォビル、ボリノスタット、またはＤＨＡで２４時間処理した。細胞生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。
【図１８】本発明の細胞培養方法を用いたラット乳房腫瘍由来の針生検標本からの細胞の拡大を示す。２日目までに、ラット乳房腫瘍細胞は順調に増殖しており、細胞株を樹立して、生体外研究で使用することができた。
【図１９】本発明の方法の実施形態のうちの１つの流れ図および培養下で数日後の細胞の写真を示す。
【図２０】生体内で腫瘍原性である前立腺腫瘍細胞のみを示す。同一の患者由来の１×１０６の指数関数的に増殖している正常な前立腺細胞または腫瘍前立腺細胞をトリプシン処理し、単一細胞中に分散させ、２００μＬのＭａｔｒｉｇｅｌ  ＨＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）中に懸濁させた。Ｍａｔｒｉｇｅｌ中に懸濁した細胞を６週齢の雄ＩＣＲ  ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）の左側および右側（それぞれの細胞型の５匹のマウス、それぞれの細胞型の合計１０個の部位）に皮下注入した。異種移植片の増殖をノギスを用いて週に１回測定した。前立腺癌細胞は、８週間以内に１０個中７個の部位で腫瘍を誘導した。しかしながら、正常な前立腺細胞は、いずれの腫瘍も誘導しなかった（１０個中０個の部位）。右側のパネルは、腫瘍組織学を示す。
【図２１】培養下の気液界面（ＡＬＩ）にある繊毛由来の正常な気管−気管支細胞を示す。初代気管−気管支上皮細胞から生成された代表的な細胞株を、Ｓｎａｐｗｅｌｌｓｉｎ  ＡＬＩ培地およびＶｅｒｔｅｘ培地にプレーティングした。コンフルエンス時（通常、５〜７日目に始まる）、細胞をＡＬＩで維持した。頂端面をＰＢＳで洗浄し、基底コンパートメント中の培地のみを週に３回取り換えた。２８日目、ＡＬＩ培養物をホルムアルデヒド中に固定し、処理し、パラフィンに包理した。区分した後、細胞を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）（上のパネル）またはアルシアンブルー過ヨウ素酸シッフ（ＡＢＰＡＳ）（下のパネル）染料のいずれかで染色した。わずかな繊毛細胞および粘液分泌細胞の写真が撮影されている。
【図２２】循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を単離および培養するためのプロトコルを示す。
【図２３】Ｒｈｏ−Ｒｏｃｋミオシン経路の阻害が細胞の最終分化を阻止し、細胞が血清含有培地で増殖することを可能にすることを示す。通常、血清含有培地は、初代上皮細胞の最終分化を誘導し、次いで、培養下で老化を引き起こす。約５０００個のヒト前立腺細胞を、Ｒｏｃｋ阻害剤Ｙ−２７６３２（５μＭ）、ＨＡ−１１００（２０μＭ）、ＧＳＫ４２９２８６（０．１μＭ）、ファスジル（３０μＭ）、Ｒｈｏ阻害剤（Ｃ３トランスフェラーゼ、２μｇ／ｍＬ）、またはミオシン阻害剤（−ブレビスタチン、５μＭ）を添加したＦ培地中の６ウェルプレートにプレーティングした。８日後、細胞を固定し、０．０５％のクリスタルバイオレットで染色した。データは、阻害剤でのＲｈｏ−Ｒｏｃｋミオシン経路の阻害が、血清による細胞分化を抑圧することができたことを示唆する。
【図２４】本明細書に記載の条件下で増殖させた前立腺細胞と比較した、合成培地におけるヒト初代前立腺細胞の生体外増殖曲線を示す。ＰｒＥＧＭは、市販の合成前立腺上皮細胞増殖培地であり、フィーダーは、照射されたか、またはマイトマイシンＣで処理されたＪ２マウス線維芽細胞であり、ＲＯＣＫ阻害剤は、３０μＭの濃度のファスジルであった。Ｙ軸は集団倍加であり、Ｘ軸は日数である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、非ケラチノサイト上皮細胞を培養する方法を対象とし、方法は、培養中に、フィーダー細胞、非ケラチノサイト上皮細胞、またはこれら両方におけるＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の活性を阻害しながら、非ケラチノサイト上皮細胞をフィーダー細胞およびカルシウム含有培地の存在下で培養することを含む。
【００１４】
本明細書で使用される「上皮」または「上皮細胞」という用語は、管腔器官を一列に並べる細胞（単数もしくは複数）、ならびに体の腺および外表面を構成する細胞（単数または複数）を指す。概して、４種類の上皮細胞、すなわち、扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺腫上皮細胞、および移行上皮細胞が存在すると考えられ得る。器官および位置に応じて、上皮細胞を単層または多層に設置することができる。ケラチノサイトは、皮膚、食道、および頸部等の解剖学的部位に見られる扁平上皮を構成する細胞である。ケラチノサイトは、防護壁を形成することによって環境および感染からの保護を助ける平坦な高度に角化した非生存細胞に最終分化する。本発明は、任意の種類の非ケラチノサイト上皮細胞（「ＮＫＥ細胞」）を対象とする。ＮＫＥ細胞は、乳房、前立腺、肝臓、および消化管等に見られる体の腺上皮を形成する。ＮＫＥ細胞は、吸収および／または分泌のいずれかにおいて機能することができる機能的な生存細胞に分化し、これらの細胞は、扁平上皮細胞の特徴を示す高度に角化した構造を形成しない。「非ケラチノサイト上皮細胞」という語句は、当技術分野において十分に理解されており、当業者であれば、その用語の共通の一般的な意味を容易に理解するであろう。本発明の方法において使用されるＮＫＥ細胞は、任意の種類または起源組織であってもよい。
【００１５】
本明細書で使用される用語によって包含されるＮＫＥ細胞の例には、前立腺細胞、乳房細胞、肝細胞、β細胞を含む膵島細胞、肺上皮細胞、腎細胞、膀胱細胞、胃上皮細胞、大腸および小腸上皮細胞、尿道上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、胆嚢細胞、下垂体細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
細胞は、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、非ヒトおよびヒト霊長類等の任意の哺乳動物を含むが、これらに限定されない任意の動物由来であってもよい。本培地での培養に特に好適な哺乳類細胞には、乳房、前立腺、肝臓、膵臓、腎臓、気管支、および気管等であるが、これらに限定されない組織に由来する初代細胞であり得るヒト起源の上皮細胞が含まれる。加えて、形質転換細胞または樹立細胞株、例えば、ＨｅＬａ子宮頸部上皮細胞株を使用することができる。本発明で使用される細胞は、罹患していないか、または遺伝子改変されていない正常な健常細胞であってもよく、あるいは細胞は、罹患しているか、または遺伝子改変されていてもよい。したがって、「罹患した上皮細胞」は、本明細書において、ＮＫＥ細胞の一部である。「罹患した細胞」とは、細胞が、動物の血液循環、すなわち、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）から単離された罹患した細胞を含むが、これらに限定されない、新生物形成、過形成、または悪性腫瘍もしくは良性腫瘍等に由来する異常な組織に由来することを意味する。ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞（ＢＨＫ−２１細胞を含む）およびそれらの誘導体またはサブクローン等であるが、これらに限定されない他の哺乳類細胞も、本発明の方法に好適である。一実施形態において、細胞は、正常な組織または異常な組織の試料由来の初代または二次ヒトＮＫＥ細胞である。別の実施形態では、細胞は、樹立細胞株、形質転換細胞、以前に凍結させた回収物由来の解凍細胞等由来の細胞等の初代細胞ではない。本発明による培養用の動物細胞を、例えば、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）、Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｋｉｒｋｌａｎｄ，Ｗａｓｈ．）、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）、またはＣａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，Ｏｒｅｇ．）から商業的に入手することができる。
【００１７】
本明細書で使用されるとき、初代細胞は、生検等の生体組織から直接採取されたか、または血液循環から単離され、継代されていないか、または１代のみ継代された細胞である。したがって、初代細胞は、多くの場合、組織消化を介して新たに単離され、プレーティングされたものである。細胞が１代以下継代された場合、初代細胞は、凍結されてもされなくてもよく、その後、しばらく経ってから解凍されてもよい。加えて、初代細胞が単離される組織は、処理の直前に他のある様式で凍結または保存されてもされなくてもよい。
【００１８】
本発明で使用するＮＫＥ細胞は、未分化な胚幹細胞ではない。したがって、本明細書で使用される非ケラチノサイト上皮細胞という語句は、未分化胚幹細胞を自動的に排除する。本明細書および当技術分野で使用されるとき、胚幹細胞は、永久に再生または自己再生する能力を有する未分化細胞である。本明細書の方法で使用されるＮＫＥ細胞は、成人幹細胞であってもなくてもよい。本明細書で使用されるとき、成人幹細胞は、動物組織から単離され、完全に分化した細胞よりも分化の程度が低いが、胚幹細胞よりも分化の程度は高い。一実施形態において、本発明の方法に従って培養されるＮＫＥ細胞は、成人幹細胞である。本発明の別の実施形態では、本発明の方法に従って培養されるＮＫＥ細胞は、成人幹細胞ではない。本発明で使用されるＮＫＥ細胞は、通常、永久に自己再生する能力を有しない。さらに、ＮＫＥ細胞は、ＮＫＥ細胞が未分化幹細胞に典型的に関連しない細胞表面マーカーを有するか、または逆に、ＮＫＥ細胞が未分化幹細胞に典型的に関連した細胞表面マーカーを有しないという点で、最初の単離およびプレーティング時は完全に未分化した細胞ではない。
【００１９】
初代細胞を単離するとき、組織は、理想的には、標準の滅菌技術および層流安全キャビネットを用いて取り扱われるべきである。一実施形態において、単一針生検は、本発明の細胞培養方法を開始するのに十分な数の初代細胞を単離するのに十分である。組織生検の場合、組織を、滅菌器具を用いて小片に切断することができる。別の実施形態では、対象の血液循環から単離された単一細胞は、本発明の細胞培養方法を開始するのに十分な材料である。その後、小片を、滅菌食塩水、または抗生物質もしくは他の成分が補充されてもされなくてもよいＰＢＳ等の他の緩衝液で数回洗浄することができる。洗浄後、小片は、組織基質からの細胞の解離を促進するために、多くの場合、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、またはトリプシン等であるが、これらに限定されない酵素液で処理されるが、必須ではない。
【００２０】
ディスパーゼは、多くの場合、上皮を下層組織から解離するために使用される。その後、この無傷の上皮を、トリプシンまたはコラゲナーゼで処理してもよい。これらの消化ステップは、多くの場合、解離細胞および組織基質を含有するスラリーをもたらす。その後、スラリーの残りから細胞を分離するのに十分な力でスラリーを遠心分離してもよい。その後、細胞ペレットを除去し、緩衝液および／または生理食塩水および／または細胞培養培地で洗浄してもよい。遠心分離および洗浄を、何度でも繰り返してもよい。最終洗浄後、細胞を、任意の好適な細胞培養培地で洗浄してもよい。言うまでもなく、単離時に細胞が下層組織から十分に分離されない場合、例えば、針生検の場合、または血液循環から単離される場合、消化および洗浄ステップを行う必要はない。例えば、腫瘍細胞等の細胞を、特定の種類の腫瘍細胞に特異的な細胞マーカーを発現する細胞を単離する現在利用可能な技術を用いて、生物の血液循環から単離してもよい。参照により組み込まれる、Ｌｕ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１２６（３）：６６９−６８３（２０１０）およびＹｕ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９２（３）：３７３−３８２（２０１１）を参照されたい。コールターカウンター等の電子細胞カウンターを使用して細胞を計数してもしなくてもよく、または血球計を使用して細胞を手動で計数してもよい。言うまでもなく、細胞を計数する必要は全くない。
【００２１】
本発明の目的のために、細胞は、１代以上継代された後、初代細胞であるとは見なされない。加えて、１代以上継代され、かつ継代直後に凍結された細胞も、解凍されると初代細胞とは見なされない。本発明の選択実施形態において、ＮＫＥ細胞は、最初は初代細胞であり、本発明の方法を用いることにより、継代後に非初代細胞になる。
【００２２】
「細胞培養」または「培養」とは、人工的な生体外環境での細胞の維持を意味する。「細胞培養」という用語は、個々の細胞および組織の培養も包含する
【００２３】
初代であるか否かにかかわらず、本発明に従って培養される細胞は、必要に応じて、実験条件に従って技術者によって培養およびプレーティングされてもよい。本明細書における例は、本明細書に記載の方法と併せて用いることができる少なくとも１つの機能な一連の培養条件を示す。所与の動物細胞型のプレーティングおよび培養条件が知られていない場合、日常的な実験のみを用いて、当業者が決定することができる。細胞を、付着因子を用いて培養容器の表面にプレーティングしてもしなくてもよい。付着因子が使用される場合、培養容器を、コラーゲン、フィブロネクチン、およびそれらの天然または合成断片等であるが、これらに限定されない天然組換えもしくは合成付着因子（単数もしくは複数）またはそのペプチド断片で予め被覆してもよい。
【００２４】
それぞれの実験条件の細胞播種密度を、必要とされる特定の培養条件のために操作することができる。プラスチック製の培養容器内での日常的な培養について、１ｃｍ２当たり約１×１０４細胞から約１〜１０×１０５細胞の初期播種密度が極めて典型的であり、例えば、１×１０６細胞は、多くの場合、７５ｃｍ２の培養フラスコ中で培養される。しかしながら、本発明の方法を用いて、単一の細胞さえも最初にプレーティングすることができる。したがって、最初の細胞播種に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個、またはそれ以上の数の細胞を用いて、本発明の方法を行うことができる。言うまでもなく、１×１０３、１×１０４、１×１０５等であるが、これらに限定されないより多い細胞播種数を使用することができる。細胞密度を任意の継代で必要に応じて変更してもよい。
【００２５】
哺乳類細胞は、典型的には、細胞インキュベータ（標準大気圧で約３７℃）内で培養される。インキュベータ内の大気は、通常、加湿され、多くの場合、空中に約３〜１０％の二酸化炭素を含有する。温度、圧力、およびＣＯ２濃度を必要に応じて変更してもよいが、但し、細胞が依然として生存していることを条件とする。培養培地のｐＨは、約７．１〜約７．６、具体的には、約７．１〜約７．４、より具体的には、約７．１〜約７．３の範囲内であり得る。
【００２６】
細胞培養培地は、通常、１〜２日毎に、または特定の細胞型が必要とするより高い頻度もしくは低い頻度で取り換えられる。ＮＫＥ細胞が培養容器内でコンフルエンスに近づくと、それらは、通常、継代される。本明細書で使用される細胞継代は、当技術分野で使用されるように使用され、細胞を分割または分裂し、その細胞の一部を新たな培養容器または培養環境に移すことを意味する。本発明の方法で使用されるＮＫＥ細胞は、細胞培養表面に付着している可能性が高く、剥離する必要がある。付着細胞を培養容器の表面から剥離する方法は周知であり、一般的に採用されており、トリプシン等の酵素の使用を含んでもよい。
【００２７】
単一継代は、技術者が細胞を１回分割または手動で分裂し、より少ない数の細胞を新たな容器または環境に移すときを指す。継代するとき、細胞が付着および増殖することを可能にする任意の比率に細胞を分割してもよい。したがって、単一継代時、細胞を、１：２、１：３、１：４、１：５等の比率に分割してもよい。したがって、細胞の継代は、集団倍加と同等ではない。本明細書で使用される集団倍加は、培養下の細胞の数が約２倍になるように、細胞が培養下で１回分裂するときである。細胞を計数して、細胞集団が他のある要因によって２倍になるか、３倍になるか、または累加されるかを決定する必要がある。言い換えると、さらに生体外で培養するために、細胞を継代してそれらを１：３の比率で分割することが、細胞集団が３倍になるということと同等であると見なされるべきではない。
【００２８】
本発明の一実施形態において、ＮＫＥ細胞は、生体外で連続的に培養される。本明細書で使用される「連続的に培養する」とは、細胞が健康状態を維持するために継代および新たな培地を必要とするように、細胞が細胞培養容器内で連続的に分裂して、コンフルエンスに達するか、またはそれに近づくという観念である。したがって、「連続的に培養する」という概念は、ＮＫＥ細胞が不死化されるという概念に類似している。一実施形態において、本発明の方法および条件を用いて培養されるとき、正常なＮＫＥ細胞は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、もしくは３００代継代、またはそれ以上増殖および分裂し続けることができる。
【００２９】
本発明は、ＮＫＥ細胞、具体的には、正常なＮＫＥ細胞の増殖を生体外で刺激する方法も対象とし、方法は、フィーダー細胞、ＮＫＥ細胞、またはこれら両方におけるＲＯＣＫの活性を阻害しながら、ＮＫＥ細胞をフィーダー細胞およびカルシウム含有培地の存在下で培養することを含む。そのような条件下でのＮＫＥ細胞培養が、ＮＫＥ細胞を刺激して増殖または増殖させるが、他の方法では、細胞は増殖することができない。特定の一実施形態において、細胞は、堅固なクラスター状に増殖し、すなわち、細胞は、堅固に付着するようになる。一実施形態において、培養されたＮＫＥ細胞は、ｅ−カドヘリン、非筋ミオシン、およびｐ１２０カテニンを含む接合部を形成する。これらの種類の接合部を、参照により組み込まれるＬｉ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９１（３）：６３１−６４４（２０１０）に従ってアッセイすることができる。
【００３０】
本明細書で使用され、かつ本明細書を通じて使用される「細胞増殖」は、１つの「母細胞」が２つの「娘細胞」に分裂するような細胞分裂を指す。本明細書で使用される「細胞増殖」は、細胞の実寸法の増加を指さない。細胞集団を時間経過とともにプロットすることによって、細胞増殖の刺激をアッセイすることができる。より急な増殖曲線を有する細胞集団は、さほど急ではない曲線を有する細胞集団よりも早く増殖していると見なすことができる。増殖曲線を、同一の細胞型間の様々な治療のために比較することができるか、または増殖曲線を、同一の状態を有する異なる細胞型のために比較することができる。
【００３１】
後期継代ＮＫＥ細胞、具体的には、本発明の正常な後期継代ＮＫＥ細胞は、それらのテロメア長を特徴としてもしなくてもよい。一般に起こるように、テロメア長は、概して、細胞が分裂するときに短くなる。細胞は、通常、テロメアの平均長が臨界長、例えば、４ｋｂまで減少したときに分裂を停止する。本発明において、後期継代細胞のテロメアの平均長は、最短で２ｋｂの長さまで減少し、増殖し続けることができる。テロメアの平均長は、当技術分野において日常的な方法および技術を用いて容易に決定される。したがって、一実施形態において、本発明は、本発明の培養条件下で分裂することができるＮＫＥ細胞、具体的には、正常なＮＫＥ細胞を提供し、ＮＫＥ細胞のテロメアの平均長は、異なる培養条件または従来の日常的な培養条件下に設置されるときに通常分裂しないであろうＮＫＥ細胞のテロメアの平均長よりも短い。例えば、老化したヒト前立腺上皮細胞（ＨＰＥＣ）のテロメアの平均長は約４ｋｂであり、したがって、ＨＰＥＣのテロメアの平均長が約４ｋｂまで減少すると、細胞は、通常、現在当技術分野において前立腺細胞の培養を許容できるか、またはさらにはそれに最適であると見なされる培養条件下に設置されるとき、分裂しない。しかしながら、本発明の培養条件を用いて、ＨＰＥＣのテロメアの平均長を、最短で２ｋｂ、またはさらにはそれ以下の長さに減少させることができ、依然として、分裂および増殖することができる。したがって、本発明の方法は、条件的に不死化されたＮＫＥ細胞、具体的には、条件的に不死化された正常なＮＫＥ細胞を生成することができ、それによって、細胞は、通常分裂することができるＮＫＥ細胞のテロメアの平均長よりも短いテロメアの平均長を有し、それによって、条件的に不死化されたＮＫＥ細胞は、テロメア長が減少したにもかかわらず、依然として分裂することができる。明確にするために、ＮＫＥ細胞、具体的には、正常なＮＫＥ細胞は、現在当技術分野において前立腺細胞の培養を許容できるか、またはさらにはそれに最適であると見なされる培養条件下に設置される場合であっても、通常、テロメアの平均長がある特定の長さまで減少されるとき、分裂を停止する。テロメアの平均長は、細胞型によって異なり得る。
【００３２】
そのような現在許容できるか、または最適な上皮細胞の培養条件は、概して、明確に定義されたか、または合成の血清を含まない培地での細胞の培養を含む。例えば、前立腺細胞の培養は、通常、血清の添加を伴わない前立腺細胞特異的培地での培養を含む。加えて、前立腺細胞、およびすべての他のＮＫＥ細胞は、概して、フィーダー細胞の不在下で培養される。したがって、「現在許容できる」または「現在最適な」培養条件は、培地が血清または血清代替物を含まず、フィーダー細胞の使用を含まない培養条件である。「現在許容できる」または「現在最適な」培養条件は、明確に定義されたか、または合成の培地、例えば、前立腺細胞に対して前立腺特異的な細胞培地の使用も含み得る。したがって、本発明の方法は、ＮＫＥ細胞、具体的には、正常なＮＫＥ細胞を培養および継代することができるという予期せぬ結果を提供し、現在許容できる条件または現在最適な条件を用いてそのように培養および継代することができたであろう頃からずいぶん経っている。
【００３３】
本明細書で使用される「条件的に不死化された」という用語は、ＮＫＥ細胞が、正常な老化したＮＫＥのテロメアの平均長にわたって減少したテロメアの平均長を有するが、依然として、無限に増殖することができることを示すが、但し、条件的に不死化された正常なＮＫＥ細胞を含むが、これに限定されない条件的に不死化されたＮＫＥ細胞が、本発明の培養条件下で維持されることを条件とする。細胞が条件的に不死化されるかを決定するとき、条件的に不死化された細胞のテロメアの平均長を、通常生体外で老化した非条件的に不死化されたＮＫＥ細胞のテロメアの平均長と比較することを必要とし得る。「通常老化した」という語句は、本明細書に概説される条件がなくても、分裂能力を生体外でさらに低下させ、したがって、これ以上継代される必要のない細胞集団を指すために使用される。したがって、本発明は、ＮＫＥ細胞、具体的には、正常なＮＫＥ細胞を条件的に不死化する方法を提供し、方法は、培養中に、フィーダー細胞、ＮＫＥ細胞、またはこれら両方におけるＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の活性を阻害しながら、ＮＫＥ細胞、具体的には、正常なＮＫＥ細胞をフィーダー細胞およびカルシウム含有培地の存在下で培養することを含む。本明細書で使用される「条件的に不死化された細胞」は、誘導された多能性幹細胞（ＩＰＳ細胞）ではない。誘導された多能性幹細胞は、多能性幹細胞に類似し、かつ多能性幹細胞のように機能するように再プログラミングされた細胞であり、したがって、ＩＰＳ細胞は、複数の異なる組織を生成することができる。対照的に、本発明の条件的に不死化されたＮＫＥ細胞は、最終分化ＮＫＥ細胞よりも分化の程度は低くなり得るが、本明細書に概説される条件下で増殖することができる。本明細書で定義されるとき、本発明の条件的に不死化されたＮＫＥ細胞は、複数の組織型に分化する能力を獲得しない。本発明の一実施形態において、本明細書に記載の方法によって生成された条件的に不死化された細胞は、初代細胞が単離された組織に戻し分化するか、またはそれを形成する能力を保持する。別の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成された条件的に不死化されたＮＫＥ細胞は、初代細胞が単離された組織に完全に戻し分化するか、またはそれを形成する能力を保持しない。
【００３４】
ＮＫＥ細胞は、生体外で増殖し、連続的な培養を必要とするようになり、かつ／またはあらゆる代に継代した後に細胞の核型を明らかに変化させることなく条件的に不死化され得る。したがって、本発明の方法は、ＮＫＥ細胞、具体的には、正常なＮＫＥ細胞を連続的に培養することを含み、それによって、初代細胞または初期継代細胞の同一の種類の核型と比較して、任意の継代の細胞の核型は、変化しないか、または実質的には変化しない。細胞の核型の変化には、染色体もしくはその一部分の重複または欠失、および／または１つの染色体の一部分から別の染色体の一部分への転座が含まれるが、これらに限定されない。核型の同定およびその変化は、当技術分野において一般的な技術である。したがって、本発明の一実施形態は、後期継代ＮＫＥ細胞、具体的には、正常な後期継代ＮＫＥ細胞を対象とし、後期継代ＮＫＥ細胞は、（ａ）同一の起源の初代ＮＫＥ細胞の核型と比較して、変化していない核型、または（ｂ）同一の起源の最初に解凍したＮＫＥ細胞の核型と比較して、変化していない核型を有する。本明細書で使用される後期継代ＮＫＥ細胞は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、もしくは３００代継代、またはそれ以上の継代を経験したＮＫＥ細胞と定義される。
【００３５】
本発明は、条件的に不死化されたＮＫＥ細胞、具体的には、条件的に不死化された正常なＮＫＥ細胞も対象とする。選択実施形態において、条件的に不死化されたＮＫＥ細胞、具体的には、条件的に不死化された正常なＮＫＥ細胞は、（ａ）同一の起源の初代ＮＫＥ細胞の核型と比較して、変化していない核型、または（ｂ）同一の起源の最初に解凍したＮＫＥ細胞の核型と比較して、変化していない核型を有する。
【００３６】
本発明の方法は、フィーダー細胞の使用を含む。「フィーダー細胞」という用語は、当技術分野で使用されるように本明細書で使用される。すなわち、フィーダー細胞は、本発明のＮＫＥ細胞とともに培養される細胞である。本明細書で使用される「ＮＫＥ細胞とともに培養する」とは、フィーダー細胞が同一の培地および同一の容器をＮＫＥ細胞と共有して培養されることを意味する。したがって、それら両方の組の細胞が、同一の培地を共有する同一の容器内に存在するが、フィーダー細胞は、ＮＫＥ細胞と直接接触しなくてもよく、例えば、ＮＫＥ細胞から、例えば、多孔質フィルタを用いて、物理的に分離されてもよい。一実施形態において、フィーダー細胞は、非増殖性フィーダー細胞である。本発明の一実施形態において、引き続きそれらを存続させ、かつ代謝的に活性にしながら、フィーダーの増殖を阻害するようにフィーダー細胞を処理することができる。例えば、フィーダー細胞を、ガンマ線照射で照射し、かつ／またはマイトマイシンＣで処理することができ、これは、細胞分裂を停止するが、細胞を代謝的に活性な状態で維持する。細胞分裂を停止するが、代謝的に活性な状態を維持するように細胞を処理する方法は、当技術分野で周知である。別の実施形態では、フィーダー細胞は、増殖を阻害するように処理されていない。例えば、フィーダーの増殖を阻害するようにフィーダー細胞を処理することを必要とすることなく、ＮＫＥ細胞との物理的接触を阻止する多孔質フィルタ上に設置されるフィーダー細胞を、ＮＫＥ細胞とともに培養することができる。
【００３７】
フィーダー細胞は、任意の哺乳動物由来であってもよく、フィーダー細胞の動物源は、培養されるＮＫＥ細胞と同一の動物源である必要はない。例えば、フィーダー細胞は、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、非ヒト、およびヒト霊長類フィーダー細胞であってもよいが、これらに限定されない。使用されるフィーダー細胞の種類は、典型的には、脾臓細胞、マクロファージ、胸腺細胞、および／または線維芽細胞である。一実施形態において、脾臓細胞、マクロファージ、胸腺細胞、および／または線維芽細胞は、それらが非増殖性であるように処理されている。本発明の方法で使用することができるフィーダー細胞の一例には、Ｊ２細胞集団がある。Ｊ２細胞は、樹立されたスイス３Ｔ３細胞株に由来するマウス線維芽細胞のサブクローンである。一実施形態において、Ｊ２細胞は、ガンマ線照射される。別の実施形態では、Ｊ２細胞は、マイトマイシンＣで処理される。
【００３８】
別の実施形態では、フィーダー細胞で馴化された培地が、フィーダー細胞のＮＫＥ細胞との培養の代わりに使用される。馴化培地の調製は、当技術分野では日常的である。概して、馴化培地の調製は、培地、例えば、本明細書で定義されるＦ培地中で細胞を数日間培養することと、この培地を回収することとを含む。馴化培地は、多くの場合、希釈された様式で新たな培地と合わせられるが、必須ではない。「新たな培地」に対する馴化培地の最適な希釈比率を見出すことは日常的であるが、比率は、約１：９９〜約９９：１の「馴化培地」：「新たな培地」であってもよい。本明細書で使用される「馴化培地」は、培地のすべてまたはある割合の培地が培養中で使用された任意の培地である。
【００３９】
さらに別の実施形態では、フィーダー細胞抽出物を、フィーダー細胞自体の代わりに培地に添加することができる。フィーダー細胞抽出物の調製方法は一般的であり、Ｇｒａｈａｍ，Ｊ．ａｎｄ  Ｓａｎｄａｌｌ  Ｊ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１８２：１５７−１６４（１９７９）、Ｇｒａｈａｍ，Ｊ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１３０：１１１３−１１２４（１９７２）、およびＤｉｃｋｓｏｎ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：５３３５−５３３９（１９８３）に記載されており、これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれる。培地に対するフィーダー細胞抽出物の最適な希釈比率を見出すことは日常的であるが、比率は、約１：９９〜約９９：１の抽出：培地であってもよい。
【００４０】
本発明の細胞培養培地は、任意の水ベースの培地であってもよく、ＤＭＥＭ（ダルベッコ修飾必須培地）、ハムＦ１２培地、ハムＦ１０培地、ＲＰＭＩ１６４０、イーグル基礎培地（ＥＢＭ）、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ＨＥＰＥＳ、培地１９９等であるが、これらに限定されない任意の「古典的な」培地を含み得る。培養培地は、ＤＭＥＭおよびＦ１２培地の組み合わせ等であるが、これらに限定されない古典的な培地のうちのいずれかの組み合わせであってもよい。
【００４１】
さらなる成分を、本発明の方法で使用される培養培地に添加することができる。そのようなさらなる成分には、アミノ酸、ビタミン、無機塩、アデニン、エタノールアミン、Ｄ−グルコース、ヘパリン、Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）、ヒドロコルチゾン、インスリン、リポ酸、フェノールレッド、リン酸エタノールアミン、プトレッシン、ピルビン酸ナトリウム、トリヨードチロニン（Ｔ３）、チミジン、およびトランスフェリンが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、インスリンおよびトランスフェリンを、クエン酸第二鉄または硫酸第一鉄キレートに置き換えてもよい。これらのさらなる成分はそれぞれ市販されている。
【００４２】
本発明の培地に含んでもよいアミノ酸成分には、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、およびＬ−バリンが含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
添加してもよいビタミンには、ビオチン、塩化コリン、Ｄ−Ｃａ＋２−パントテン酸塩、葉酸、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、およびビタミンＢ１２が含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
添加してもよい無機塩成分には、カルシウム塩（例えば、ＣａＣｌ２）、ＣｕＳＯ４、ＦｅＳＯ４、ＫＣｌ、マグネシウム塩、例えば、ＭｇＣｌ２、マンガン塩、例えば、ＭｎＣｌ２、酢酸ナトリウム、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、ならびに微量元素セレン、シリコン、モリブデン、バナジウム、ニッケル、錫、および亜鉛のイオンが含まれるが、これらに限定されない。これらの微量元素を、様々な形態、好ましくは、Ｎａ２ＳｅＯ３、Ｎａ２  ＳｉＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７  Ｏ２４、ＮＨ４  ＶＯ３、ＮｉＳＯ４、ＳｎＣｌ、およびＺｎＳＯ等の塩形態で提供することができる。
【００４５】
さらなる成分には、ヘパリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを増加させる少なくとも１つの作用物質、および少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）が含まれるが、これらに限定されない。ヘパリン、ＥＧＦ、ｃＡＭＰ増加作用物質（複数を含む）およびＦＧＦ（複数を含む）を、基礎培地に添加することができるか、またはそれらを、例えば、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）の溶液中に混合し、基礎培地に添加して本発明の方法で使用する培地を作成するまで凍結状態で保管してもよい。
【００４６】
ヘパリンを商業的に入手することができる。ヘパリンは、主に増殖因子成分、例えば、ＦＧＦの活性を安定化させるために、本培地に添加される。ヘパリンが使用される場合、それを約１〜５００ＵＳＰ単位／リットルの濃度で基礎培地に添加してもよい。ＥＧＦは、市販されている。ＥＧＦが使用される場合、それを約０．００００１〜１０ｍｇ／Ｌの濃度で基礎培地に添加してもよい。
【００４７】
細胞内ｃＡＭＰレベルを増加させる様々な作用物質を、本発明の培地を作成する際に使用することができる。細胞内ｃＡＭＰレベルの直接増加を誘導する作用物質（例えば、ジブチリルｃＡＭＰ）、細胞Ｇタンパク質との相互作用によって細胞内ｃＡＭＰレベルの増加を引き起こす作用物質（例えば、コレラ毒素およびホルスコリン）、βアドレナリン受容体の作動薬として作用することによって細胞内ｃＡＭＰレベルの増加を引き起こす作用物質（例えば、イソプロテレノール）、ならびにｃＡＭＰホスホジエステラーゼの活性を阻害することによって細胞内ｃＡＭＰレベルの増加を引き起こす作用物質（例えば、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）およびテオフィリン）が含まれる。これらのｃＡＭＰを増加させる作用物質は市販されている。
【００４８】
本発明の方法で使用される培養培地は、カルシウム源を含む。一実施形態において、カルシウム源は、血清または血清代替物である。別の実施形態では、カルシウム源は、培地に添加されるカルシウム含有塩である。血清がカルシウム源として使用される場合、血清は、約１％〜約３５％の濃度（ｖ／ｖ）であり得る。選択実施形態において、血清は、約１％〜約２０％、または約１％〜約１５％、または約１％〜約１０％、または約１％〜約５％の濃度である。血清代用物または血清代替物がカルシウム源として使用される場合、これらを製造業者が推奨するプロトコルに従って培地に添加することができる。血清代用物の例には、Ｐａｌｌ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＵｌｔｒｏｓｅｒ（商標）等の市販の代用物、脱脂粉乳濾過物等であるが、これに限定されない乳汁または乳汁画分が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
本発明の実施形態で使用されるＣａ＋２濃度の範囲は、細胞型によって異なり得る。一実施形態において、本発明の方法で使用される培地中のＣａ＋２の濃度は、０．１ｍＭ〜１０．０ｍＭである。より具体的な実施形態では、本発明の方法で使用される培地中のＣａ＋２の濃度は、約０．２ｍＭ〜約８ｍＭ、約０．４ｍＭ〜約７ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．８ｍＭ〜約４ｍＭ、約１．０ｍＭ〜約３ｍＭ、約１．２ｍＭ〜約２．８ｍＭ、約１．４ｍＭ〜約２．６ｍＭ、および約１．５ｍＭ〜約２．５ｍＭであり得る。
【００５０】
本発明の方法は、培養物中でのＲｈｏ関連コイルドコイルタンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）の阻害を含む。Ｒｈｏキナーゼは、Ｒｈｏ、Ｒａｃ１、およびＣｄｃ４２キナーゼを含むＲｈｏ  ＧＴＰａｓｅタンパク質ファミリーに属する。Ｒｈｏの最もよく特徴付けられたエフェクタ分子のうちの１つは、ＲＯＣＫであり、これは、ＲｈｏのＧＴＰ結合形態に結合するセリン／トレオニンキナーゼである。セリン／トレオニンキナーゼの特徴を示している保存モチーフを含むＲＯＣＫの触媒キナーゼドメインがＮ末端に見られる。ＲＯＣＫタンパク質は、Ｒｈｏ結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む中央コイルドコイルドメインも有する。Ｃ末端は、内部高システインドメインを有するプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインで構成されている。コイルドコイルドメインは、他のαヘリックスタンパク質と相互作用すると考えられている。コイルドコイルドメイン内に位置するＲＢＤは、ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ、およびＲｈｏＣを含む活性化したＲｈｏ  ＧＴＰａｓｅｓのみと相互作用する。ｐＨドメインは、アラキドン酸およびスフィンゴシルホスフォリルコリン等の脂質メディエータと相互作用すると考えられており、タンパク質局在化に関与し得る。ｐＨドメインおよびＲＢＤのキナーゼドメインとの相互作用は、自己阻害ループをもたらす。加えて、キナーゼドメインは、ＲＯＣＫ活性の負の調節因子であるＲｈｏＥへの結合に関与する。
【００５１】
ＲＯＣＫファミリーは、現在、２つのメンバー、ＲＯＣＫ１（別名、ＲＯＫβまたはｐ１６０ＲＯＣＫ）およびＲＯＣＫ２（別名、ＲＯＫα）からなる。ＲＯＣＫ１は、約１３５４アミノ酸長であり、ＲＯＣＫ２は、約１３８８アミノ酸長である。ヒトＲＯＣＫ１およびヒトＲＯＣＫ２のアミノ酸配列は周知である。例えば、ＲＯＣＫ１およびＲＯＣＫ２のアミノ酸配列を、それぞれ、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）受入番号Ｑ１３４６４およびＯ７５１１６で見出すことができる。ヒトＲＯＣＫ１およびＲＯＣＫ２のヌクレオチド配列を、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００５４０６．２およびＮＭ＿００４８５０で見出すことができる。様々な動物由来のＲＯＣＫ１およびＲＯＣＫ２タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は周知であり、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＧｅｎＢａｎｋデータベースの両方で見出すことができる。
【００５２】
両方のＲＯＣＫアイソフォームが組織内で遍在的に発現するが、それらは、いくつかの組織において異なる強度を呈する。例えば、ＲＯＣＫ２が、脳および骨格筋により蔓延している一方で、ＲＯＣＫ１は、肝臓、精巣、および腎臓でより豊富である。両方のアイソフォームが、血管平滑筋および心臓内で発現する。休止状態にあるとき、ＲＯＣＫ１およびＲＯＣＫ２のいずれも主として細胞質であるが、Ｒｈｏを活性化するときに膜に転位置する。ＲＯＣＫ活性は、いくつかの異なる機構によって調節され、したがって、Ｒｈｏ依存性ＲＯＣＫ活性化は、収縮性の変化、細胞透過性、移行、および増殖からアポトーシスに至るまで、高度に細胞型依存的である。少なくとも２０個のＲＯＣＫ基質が同定されている。Ｈｕ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ  ９：７１５−７３６（２００５）、Ｌｏｉｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．９８：３２２−３３４（２００６）、およびＲｉｅｎｔｏ  ａｎｄ  Ｒｉｄｌｅｙ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：４４６−４５６（２００３）を参照されたく、これらはすべて、参照により組み込まれる。
【００５３】
アポトーシスシグナル伝達の調節におけるＲＯＣＫの役割は、高度に細胞型依存的かつ刺激依存的である。その一方で、ＲＯＣＫは、生体外および生体内細胞生存シグナルの媒介に関連している。ＲＯＣＫ媒介性生存促進性効果は、上皮細胞、癌細胞、および内皮細胞、ならびに他の細胞型において報告されている。気道上皮細胞において、Ｙ−２７６３２またはＨＡ１０７７（別名、ファスジル）での阻害は、膜の波打ち現象、アクチンストレスファイバーの喪失、およびアポトーシスを誘導する（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．３０：３７９−３８７，２００４）。
【００５４】
Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ活性化は、酸化的ストレス誘導性腸上皮細胞傷害中に生存促進の役割も果たし得る（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９０：Ｃ１４６９−１４７６，２００６）。ＲＯＣＫは、甲状腺癌細胞（Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４４：３８５２−３８５９，２００３）、グリオーマ細胞（Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．８３：２４３−２５５，２００６）、ヒト臍静脈内皮細胞（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１５３０９−１５３１６，２００２）、肝星細胞（Ｉｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８５：Ｇ８８０−８８６，２００３）、およびヒト神経芽腫細胞（Ｄｅ  Ｓａｒｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１０４１：１１２−１１５，２００５）における生存促進事象にも関連している。ＲＯＣＫが生存促進の役割を果たすという証拠も、例えば、管平滑筋細胞（Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３：２８４−２８９，２００１）および脊髄運動ニューロン（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：３４８０−３４８８，２００４）において生体内で報告されている。
【００５５】
本明細書で使用されるとき、ＲＯＣＫの阻害とは、ＲＯＣＫ１またはＲＯＣＫ２のうちの少なくとも１つの活性、機能、もしくは発現の低下を意味し得る。活性、機能、もしくは発現を完全に抑圧することができ、すなわち、活性、機能、もしくは発現が存在しないか、または活性、機能、もしくは発現は、処理されていない細胞と比較して処理された細胞において単に低い場合がある。概して、ＲＯＣＫは、ＧＴＰ結合Ｒｈｏの結合を介して活性化された後に、ＬＩＭキナーゼおよびミオシン軽鎖（ＭＬＣ）ホスファターゼをリン酸化する。したがって、本発明の一実施形態は、ＲＯＣＫ１および／もしくはＲＯＣＫ２が活性化されないか、またはその活性が処理されていない細胞よりも低くなるように、ＲＯＣＫ１および／もしくはＲＯＣＫ２、例えば、ＧＴＰ結合Ｒｈｏの上流経路の遮断を含む。他の上流エフェクタには、インテグリン；ＴＧＦ−βおよびＥＧＦＲを含むが、これらに限定されない増殖因子受容体；カドヘリン；Ｇタンパク質共役受容体等が含まれるが、これらに限定されない。したがって、本発明の別の実施形態は、ＲＯＣＫ１および／またはＲＯＣＫ２が任意のシグナルを伝播することができないか、または処理されていない細胞と比較して低下したシグナルのみを伝播することができるように、活性化されたＲＯＣＫ１および／またはＲＯＣＫ２の下流エフェクタ分子の活性、機能、もしくは発現の遮断を含む。下流エフェクタには、ミオシンホスファターゼ標的タンパク質（ＭＹＰＴ）、ビメンチン、ＬＩＭＫ、ミオシン軽鎖キナーゼ、ＮＨＥ１、コフィリン、ミオシンＩＩ等が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｒｈｏの活性を阻害するＲＯＣＫ上流阻害剤であるＣ３トランスフェラーゼ、およびミオシンＩＩの活性を阻害するＲＯＣＫ下流阻害剤であるブレビスタチンのいずれも、ＲＯＣＫ阻害剤の代わりに本明細書に記載の培養条件下で使用されるとき、細胞が分化を回避することを可能にし、かつ生体外増殖を可能にするような様式で細胞に影響を及ぼした（図２３）。直接ＲＯＣＫ阻害の代わりに、かつ本明細書に記載および要求される他の培養条件と併せて、ＲＯＣＫの上流または下流阻害は、条件的に不死化されたＮＫＥ細胞を生成する場合もしない場合もある。
【００５６】
本発明の方法は、ＮＫＥ細胞、具体的には、正常なＮＫＥ細胞を培養しながら、ＲＯＣＫを阻害することを含む。一実施形態において、ＲＯＣＫの阻害は、ＲＯＣＫ阻害剤を培養培地に添加することによって達成される。ＲＯＣＫ阻害剤が培養培地に添加されるこの実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤がＮＫＥ細胞に加えてフィーダー細胞にも影響を及ぼし得る可能性がある。
【００５７】
ＲＯＣＫ阻害剤の例には、Ｙ−２７６３２、ＨＡ１１００、ＨＡ１０７７、チアゾビビン、およびＧＳＫ４２９２８６が挙げられるが、これらに限定されず、これらの構造は、図１１に示される。これらの化合物は周知であり、市販されている。さらなる小分子Ｒｈｏキナーゼ阻害剤には、ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０５９９１３号、同第ＷＯ０３／０６４３９７号、同第ＷＯ０５／００３１０１号、同第ＷＯ０４／１１２７１９号、同第ＷＯ０３／０６２２２５号、および同第ＷＯ０３／０６２２２７号に記載されている阻害剤、ならびに米国特許第７，２１７，７２２号および同第７，１９９，１４７号、ならびに米国特許出願公開第２００３／０２２０３５７号、同第２００６／０２４１１２７号、同第２００５／０１８２０４０号、および同第２００５／０１９７３２８号に記載されている阻害剤が含まれるが、これらに限定されず、これらのすべての内容は、参照により組み込まれる。
【００５８】
ＲＯＣＫキナーゼを阻害する別の方法は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いることである。ＲＮＡｉ技術は周知であり、ｄｓＲＮＡの一方の鎖がＲＯＣＫ１をコードするｍＲＮＡのコード鎖に対応し、もう一方の鎖が第１の鎖に補完的である二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）に依存する。所与のヌクレオチド配列に最適なＲＮＡｉ種の要件は周知であるか、または最高水準を考慮して容易に解明することができる。例えば、最適なｄｓＲＮＡは、約２０〜２５ｎｔの長さであることが知られており、ｄｓＲＮＡのそれぞれの鎖の３’末端に２塩基オーバーハンドを有し、多くの場合、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と称される。言うまでもなく、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）等の他の周知の形状も功を奏し得る。ｓｈＲＮＡは、分子が少なくとも一部分において二本鎖であるように一部分が自己相補的な１つの連続したＲＮＡ鎖である。細胞がｓｈＲＮＡをｓｉＲＮＡに処理したと考えられる。本明細書で使用されるＲＮＡｉ分子という用語は、ｄｓＲＮＡの一方の鎖がサイレンシングされる標的遺伝子をコードするｍＲＮＡのコード鎖に対応し、もう一方の鎖が第１の鎖に補完的である任意の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。
【００５９】
したがって、本発明の一実施形態は、ＲＯＣＫの活性を阻害するために、少なくとも１つのＲＮＡｉ分子および／または少なくとも１つのアンチセンス分子の使用を含む。特定の一実施形態において、ＲＮＡｉ分子および／またはアンチセンス分子は、ＲＯＣＫ１に特異的である。別の実施形態では、ＲＮＡｉ分子またはアンチセンス分子は、ＲＯＣＫ２に特異的である。さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉ分子および／またはアンチセンス分子は、ＲＯＣＫ１およびＲＯＣＫ２の両方に特異的である。さらに別の実施形態では、少なくとも２つのＲＮＡｉ分子および／またはアンチセンス分子が使用され、一方はＲＯＣＫ１に特異的であり、もう一方はＲＯＣＫ２に特異的である。
【００６０】
ＲＮＡｉ分子および／またはアンチセンス分子は、参照により組み込まれるＣｌｅｍｅｎｓ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９７（１２）：６４９９−６５０３（２０００）において報告されているように、ネイキッドＲＮＡｉ分子および／またはアンチセンス分子を有する細胞を単に浸漬することによる細胞培養物の一部であり得る。ＲＮＡｉ分子および／またはアンチセンス分子は、ＲＮＡｉ分子またはアンチセンス／分子を細胞に挿入するために使用され得るリポソーム複合体等の複合体の一部であり得る。
【００６１】
リポソームは、２つの広範なクラスに分類される。カチオン性リポソームは、安定した複合体を形成するために負に荷電したｄｓＲＮＡ分子と相互作用する正に荷電したリポソームである。正に荷電したｄｓＲＮＡ／リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドソームに内部移行される。エンドソーム内の酸性ｐＨにより、リポソームは破裂され、それらの内容物を細胞質に放出する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｔ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０−９８５）。
【００６２】
ｐＨ感受性であるか、または負に荷電したリポソームは、それを有する複合体ではなくｄｓＲＮＡを捕捉する。ｄｓＲＮＡおよび脂質のいずれも同様に荷電されるため、複合体形成ではなく反発が生じる。したがって、ｄｓＲＮＡは、これらのリポソームの水性内部に捕捉される。ｐＨ感受性リポソームは、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするｄｓＲＮＡを培養下の細胞単層に送達するために使用されている（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９−２７４）。リポソーム組成物の主な種類の１つに、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質がある。天然リポソーム組成物を、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物が、概して、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成される一方で、アニオン性融合性リポソームは、主に、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。リポソーム組成物の別の種類は、例えば、大豆ＰＣ、および卵ＰＣ等のホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別の種類は、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。核酸を含むリポソームは、例えば、国際公開第ＷＯ９６／４００６２号、米国特許第５，２６４，２２１号、米国特許第５，６６５，７１０号、およびＬｏｖｅらの国際公開第ＷＯ９７／０４７８７号に記載されており、これらすべて、参照により組み込まれる。
【００６３】
リポソームの別の種類であるトランスファーソームは、薬物送達ビヒクルにとって魅力的な高度に変形可能な脂質凝集体である（Ｃｅｖｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１３６８（２）：２０１−１５）。トランスファーソームは、高度に変形可能であるため、それらが脂質滴よりも小さい孔を貫通することができる脂質滴と称されてもよい。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応可能であり、例えば、それらは、形状に適応でき、自己修復性であり、高い頻度で、断片化することなくそれらの標的に達し、多くの場合、自動装填式である。例えば、表面エッジ活性剤、通常、界面活性剤を、標準のリポソーム組成物に添加することによって、トランスファーソームを作製することができる。
【００６４】
ＲＯＣＫ１および／またはＲＯＣＫ２  ＲＮＡｉが細胞にアクセスすることができる本発明の方法における別の方法は、ＲＮＡｉ分子および／またはアンチセンス分子をコードするＤＮＡ発現ベクターの使用である。ある特定の実施形態は、例えば、ＲＮＡｉ分子がｓｈＲＮＡであるとき、または対抗するプロモーターがＲＮＡｉ分子のコード配列のいずれかの端に配置されるとき、１つのみのベクターを利用する。したがって、「ＲＯＣＫの活性の阻害」は、転写されるときにＲＯＣＫの活性、機能、または産生を遮断することができるＤＮＡの使用を含む。上述のリポソーム送達系は、ＲＮＡｉおよび／またはアンチセンスをコードするＤＮＡが細胞に進入することができる１つの手段である。
【００６５】
あるいは、ＲＮＡｉおよび／またはアンチセンスをコードするＤＮＡを、細胞に進入する能力を有するウイルスベクター系において調製することができる。これらは当技術分野で周知であり、Ｍａｄｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：１５３３−３６（１９９２）（パポバウイルスＳＶ４０）、Ｂｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：３９−６１（１９９２）（アデノウイルス）、Ｍｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：２５−３８（１９９２）（ワクシニアウイルス）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７−１２３（１９９２）（アデノ随伴ウイルス）、Ｍａｒｇｕｌｓｋｅｅ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：６７−９３（１９９２）（単純ヘルペスウイルス（ＩＳＶ）およびエプスタイン・バーウイルス（ＨＢＶ））、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：１−２４（１９９２）（レトロウイルス）、Ｂｒａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４：７４９−７５４（１９８４）（レトロウイルス）、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５７：４５５−４５０（１９９２）（レトロウイルス）、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：８０８−８１３（１９９２）（レトロウイルス）、Ｃ．Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５；９２，ｐｐ．１００９９−１０１０３（バキュロウイルス）を含む。
【００６６】
別の実施形態では、ＲＯＣＫ１および／もしくはＲＯＣＫ２は、ノックアウト構築物またはドミナントネガティブ構築物のいずれかを含むトランスジェニック技術等であるが、これに限定されない遺伝子操作技術を用いて阻害される。そのような構築物は、参照により本明細書に組み込まれるＫｈｙｒｕｌ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（５２）：５４１３１−５４１３９（２００４）に記載されている。
【００６７】
上述のように、ＲＯＣＫを遮断する一実施形態は、小分子阻害剤、ＲＮＡｉ技術、アンチセンス技術、および／または遺伝子操作等であるが、これらに限定されない本明細書に記載の方法のうちのいずれかを用いて、ＲＯＣＫの上流もしくは下流エフェクタ分子を個別または集合的に遮断または阻害することである。したがって、阻害することができる任意の上流エフェクタには、インテグリン；ＴＧＦ−βおよびＥＧＦＲを含むが、これらに限定されない増殖因子受容体；カドヘリン；Ｇタンパク質共役受容体等が含まれるが、これらに限定されない。加えて、阻害することができる任意の下流エフェクタには、ビメンチン、ＬＩＭＫ、ミオシン軽鎖キナーゼ、ＮＨＥ１、コフィリン等が含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
本発明の条件下で培養された後、細胞をこれらの条件から除去し、フィーダー細胞を欠き、カルシウム源を欠き、かつ／またはＲＯＣＫ阻害剤を欠く細胞培養環境下に設置される。フィーダー細胞、カルシウム源、およびＲＯＣＫ阻害剤の１つ、２つ、または３つの任意の組み合わせが、その後の環境に不在であってもよい。本明細書で使用される「その後の環境」とは、胞培養環境に関連して使用されるとき、フィーダー細胞、カルシウム源、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの少なくとも１つを欠く細胞培養環境である。一実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤、カルシウム源、またはフィーダー細胞が、その後の環境に不在である。別の実施形態では、フィーダー細胞およびＲＯＣＫ阻害剤が、その後の環境に不在である。別の実施形態では、フィーダー細胞およびカルシウム源が、その後の環境に不在である。別の実施形態では、カルシウム源およびＲＯＣＫ阻害剤が、その後の環境に不在である。別の実施形態では、フィーダー細胞、ＲＯＣＫ阻害剤、およびカルシウム源が、その後の環境に不在である。
【００６９】
一実施形態において、ＮＫＥ細胞、後期継代ＮＫＥ細胞、および／もしくは条件的に不死化されたＮＫＥ細胞に対するその後の環境は、分化を促進することができ、かつ／またはＮＫＥ細胞、後期継代ＮＫＥ細胞、および／もしくは条件的に不死化されたＮＫＥ細胞の永久増殖を可能にしない環境である。その後の環境は、細胞が元来由来した器官、すなわち、自家性移植片と同様または同一の生体内環境であり得る。例えば、本発明の方法に従って培養された肝細胞を、その細胞が最初に生検または単離された対象の肝臓に再導入することができる。図２０は、条件的に不死化された前立腺癌細胞株を作成するために、採取して本明細書に記載の培養条件に供したヒト前立腺腫瘍細胞を示す。条件的に不死化された前立腺癌細胞は、ＳＣＩＤマウス、すなわち、その後の生体内環境下に設置され、これらの条件的に不死化された前立腺癌細胞は、マウスにおいて新たな腫瘍を生成することができた。
【００７０】
その後の環境は、このその後の環境下に設置された時点で細胞が元来由来した器官の生化学的性質または生理学的性質により密接に類似した生体外環境であってもよい。その後の環境は、生体外での分化を促進することで知られている因子が細胞培養に添加されるような「合成環境」であってもよい。例えば、後期継代肝上皮細胞は、細胞の分化を促進するように設計されたその後の環境下に設置されると、クラスターの形成および／または成熟肝上皮細胞に類似したタンパク質の発現を開始し得る。
【００７１】
一実施形態において、ＮＫＥ細胞、後期継代ＮＫＥ細胞、および／または条件的に不死化されたＮＫＥ細胞は、細胞が元来由来した器官の細胞への細胞の分化の刺激に特異的なその後の環境下に設置される。例えば、条件的に不死化された前立腺上皮細胞を本発明の条件から除去し、前立腺細胞の分化を促進するように設計された培養条件下に設置することができる。上皮細胞を培養するための様々な環境は、参照により組み込まれる、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｉａｎ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  ａｎｄ  Ｍａｒｙ  Ｇ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）（第２版、２００２年）に詳述されている。
【００７２】
あるいは、細胞を、その後の環境下で、天然もしくは合成三次元細胞培養表面の中に、またはその上に播種することができる。三次元表面の１つの非限定的な例は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）でコーティングされた培養表面である。他の三次元培養環境は、ヒドロゲル等であるが、これに限定されない任意の形状のコラーゲンゲルおよび／または合成生体高分子材料を含む表面を含む。言うまでもなく、様々な三次元培養表面を本発明の方法と同時に用いることができる。三次元培養環境が使用される場合、フィーダー細胞も同様に使用してもしなくてもよい。これらの三次元細胞培養表面環境は、分化を促進する場合もしない場合もある。
【００７３】
一実施形態において、ＮＫＥ細胞、後期継代ＮＫＥ細胞、および／または条件的に不死化されたＮＫＥ細胞を、目的とするタンパク質を発現するように遺伝子改変することができる。細胞の遺伝子改変は、ウイルスタンパク質の挿入等の細胞を不死化させるように設計された改変ではない。むしろ、細胞の遺伝子改変は、例えば、タンパク質をコードする導入遺伝子を挿入するように設計される。例えば、肝細胞を、本発明の細胞培養方法を用いて単離および拡大することができる。続いて、これらの細胞を操作してもよく、細胞が第ＶＩＩＩ因子を産生することができるように、第ＶＩＩＩ因子をコードする導入遺伝子を細胞のゲノムに挿入することができる。その後、これらの細胞をその後の環境下に設置すること、例えば、自家性移植片を対象に設置することによって、細胞は、第ＶＩＩＩ因子を産生することができる。別の例として、肺上皮細胞を、嚢胞性線維症に罹患する対象から単離してもよい。その後、これらの細胞を、本発明の細胞培養方法を用いて拡大してもよく、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子をコードする導入遺伝子をこれらの細胞に生体外で挿入してもよい。その後、遺伝子改変されたＮＫＥ細胞を、裸にされた気管支上皮上に再構成して、正常機能を回復させることができる。正常機能を回復させるために上皮表面の１０％のみが取り換えられる必要があると推定される。偽重層円柱上皮の繊毛細胞での形成が、正常な組織の再形成を示す。参照により組み込まれる、Ｆｕｌｃｈｅｒ  Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｗｅｌｌ−Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ａｉｒｗａｙ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０７：Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ１８３−２０６，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｊ．Ｐｉｃｏｔ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪを参照されたい。
【００７４】
導入遺伝子が細胞に導入される方法は、ＤＮＡの哺乳類細胞への生体外移動についての文献から既知の標準の方法、例えば、参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ９３／０７２８３号に記載の電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、または受容体媒介エンドサイトーシスに基づく方法等である。目的とする遺伝子を細胞に挿入するための他の方法および物質は、参照により組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）に開示されている。
【００７５】
多種多様の目的とする遺伝子を、ＮＫＥ細胞、後期継代ＮＫＥ細胞、および／または条件的に不死化されたＮＫＥ細胞内で発現させることができる。これらの目的とする遺伝子は、毒素、凝固因子、酵素、プロドラッグ変換酵素、免疫応答を刺激する抗原、腫瘍壊死因子、サイトカイン、ならびに治療用途を有する様々なタンパク質（例えば、増殖ホルモンおよび調節因子）をコードする配列を含むが、これらに限定されない。
【００７６】
本発明のＮＫＥ細胞、後期継代ＮＫＥ細胞、および／または条件的に不死化されたＮＫＥ細胞をトランスフェクトした後、うまくトランスフェクトされたこれらの細胞を、当技術分野で周知のマーカーを用いて選択することができる。うまくトランスフェクトされた細胞を選択した後、本発明の遺伝子改変されたＮＫＥ細胞、後期継代ＮＫＥ細胞、および／または条件的に不死化されたＮＫＥ細胞を、本発明の細胞培養技術を用いて培養して、遺伝子改変されたＮＫＥ細胞、後期継代ＮＫＥ細胞、および／または条件的に不死化されたＮＫＥ細胞の集団を産生することができる。続いて、これらの細胞を回収し、対象に戻して設置することを含むが、これに限定されない上述のその後の環境下、すなわち、自家性移植片に設置することができる。
【００７７】
本発明は、治療を必要とする対象のために候補治療を同定する方法も対象とし、対象は、異常なＮＫＥ細胞または罹患したＮＫＥ細胞の存在を特徴とする状態を有する。異常なＮＫＥ細胞または罹患したＮＫＥ細胞の存在を特徴とするそのような状態には、新生物形成、過形成、または悪性腫瘍もしくは良性腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。方法は、本発明の培養方法のいずれかに従って、異常なＮＫＥ細胞の試料を対象から得ることと、異常なＮＫＥ細胞を培養して、生体外の異常なＮＫＥ細胞集団を産生することとを含む。例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を生物の血液循環から単離することができ、本発明の方法を利用して、さらなる分析での使用に十分な数の細胞を得ることができ、これらの細胞は、表現型的または遺伝的に特徴付けられた細胞等であるが、これらに限定されない。ＣＴＣを単離する１つの方法が本明細書に開示されているが、本発明は、ＣＴＣが単離される任意の方法に限定されない。これまで、ＣＴＣは単離されたが、研究および分析を可能にするのに有意な期間さえも培養下で保つことができなかった。しかしながら、本発明は、最小数のＣＴＣ、さらには単一の細胞が単離およびプレーティングされることを可能にすることによりこの問題を解決する。その後、プレーティングされたＣＴＣ（複数を含む）は、その後の遺伝分析、機能分析、および／または表現型分析を可能にするのに十分な数の細胞を達成および維持するために、本発明の発明的方法に供される。実際、十分な数の異常なＮＫＥ細胞または罹患したＮＫＥ細胞が得られると、それらの源にかかわらず、これらの細胞をアッセイして、対象の候補治療を同定するために用いることができる応答プロファイルを決定することもできる。
【００７８】
本明細書で使用される応答プロファイルは、異常なＮＫＥ細胞が生体内設定にある場合、例えば、臨床医に、特定の治療がそれらの異常なＮＫＥ細胞における所望の応答を産生する可能性を示す１つ以上のデータ点の収集である。応答プロファイルに関連して使用される「応答」は、任意の手段による細胞死（壊死、毒性、アポトーシス等）または異常な細胞の増殖速度の低下のいずれかであってもなくてもよい。応答プロファイルは、１００％の精度で応答を予測する必要はない。応答プロファイルは、単一のデータ点であっても、データの収集であってもよい。
【００７９】
任意の方法を用いて、所与の異常なＮＫＥ細胞集団の応答プロファイルを同定または決定することができる。例えば、異常な細胞から単離されるＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも一部を配列決定することにより、応答プロファイルを評価することができる。これは、ウイルス、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）が異常な状態を引き起こしている可能性を疑うときに特に有用であり得る。少なくとも１つのデータ点を応答プロファイルに提供するために、ＤＮＡ／ＲＮＡのすべてが配列決定される必要はない。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む周知の技術を用いて、生成物が作成されるかを決定するために、ＰＣＲ反応において、例えば、ＨＰＶまたはＨＩＶが存在する疑いのあるＤＮＡ／ＲＮＡに特異的な配列を有するＰＣＲプライマーを用いることは、現在、簡単な手順の問題である。検出可能な生成物が特定のプライマーを用いたＰＣＲ反応後に生成されない場合、ＰＣＲプライマーが特異的なウイルスの一部が存在しないかもしれないという結論を下すことが可能であり得る。同様に、特定のＤＮＡ／ＲＮＡ配列の不在の決定も、応答プロファイルにおけるデータ点であり得る。この様式で、細胞から単離されたＤＮＡ／ＲＮＡの全配列の正確な配列は決定されないが、ＤＮＡまたはＲＮＡは、本発明の目的のために「配列決定される」。したがって、本明細書で使用される「配列決定」は、単離したＤＮＡ／ＲＮＡの全ヌクレオチド配列の生成をもたらす場合も、もたらさない場合もある。サザンブロット、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、自動配列決定等であるが、これらに限定されない他の方法を用いて、単離したＤＮＡ／ＲＮＡの配列を決定することもできる。ＤＮＡ／ＲＮＡを配列決定する方法は、当技術分野で周知であり、本明細書で繰り返す必要はない。
【００８０】
同様に、生体外の異常なＮＫＥ細胞中に産生され得る１つのｍＲＮＡの少なくとも一部の存在または不在を同定することによって、応答プロファイルを評価することができる。上のＤＮＡ／ＲＮＡの配列を決定するように、ｍＲＮＡの正確な配列を、細胞から単離される全ｍＲＮＡにおいて決定する必要はない。単離したｍＲＮＡの配列の存在または不在を決定するために用いることができる方法には、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、自動配列決定等が含まれるが、これらに限定されない。少なくとも１つのｍＲＮＡの存在または不在を同定する方法は、当技術分野で周知であり、本明細書で繰り返す必要はない。
【００８１】
同様に、生体外の異常なＮＫＥ細胞中に産生され得る１つのタンパク質の少なくとも一部の存在または不在を同定することによって、応答プロファイルを評価することができる。上のＤＮＡ／ＲＮＡの配列を決定するように、存在するか、または不在のタンパク質の正確なアミノ酸配列を、全タンパク質において決定する必要はない。単離したタンパク質の配列の存在または不在を決定するために用いることができる方法には、ウエスタンブロット、免疫組織化学的方法、ＥＬＩＳＡ法等が含まれるが、これらに限定されない。少なくとも１つのタンパク質の存在または不在を同定する方法は、当技術分野で周知であり、本明細書で繰り返す必要はない。タンパク質、例えば、受容体の存在または不在は、細胞が、例えば、細胞死をもたらし得る特定の治療の影響を受けやすいことを示し得る。
【００８２】
生体外の異常なＮＫＥ細胞を化学療法剤に供し、化学療法剤に対する細胞の応答を決定することによって、応答プロファイルを評価することができる。本明細書で使用される化学療法剤は、従来の癌治療に限定されないが、化学物質を用いた任意の種類の治療療法を示すために使用される。一実施形態において、細胞に対する治療薬の治療指数を決定することによって、治療薬への応答を評価することができる。治療指数の決定は、当技術分野で一般的であり、単にＬＤ５０／ＥＣ５０の比率であり、ＬＤ５０は、細胞上での治療薬の平均致死量を表し、ＥＣ５０は、その半最大用量を表す。治療薬への応答を評価する他の方法には、容量応答曲線の決定、細胞生存曲線の決定等が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、治療薬への異常なＮＫＥ細胞の応答を決定するために使用される治療薬は、後に対象に投与される治療薬と同一または異なる治療薬であってもよい。
【００８３】
本発明は、対象における異常な非ケラチノサイト上皮（ＮＫＥ）細胞を同定する方法も対象とする。これらの方法は、本発明の細胞培養方法に従って、対象から単離された少なくとも１つの異常な候補ＮＫＥ細胞を培養することを含む。ＮＫＥ細胞、後期継代ＮＫＥ細胞、および／または条件的に不死化されたＮＫＥ細胞が拡大された時点で、細胞の組織起源プロファイルを決定して、異常な候補ＮＫＥ細胞の可能性のある起源組織を決定することができる。ＮＫＥ細胞、後期継代ＮＫＥ細胞、および／または条件的に不死化されたＮＫＥ細胞の少なくとも１つの特性を、異常な候補ＮＫＥ細胞の決定された組織起源プロファイルの組織と同一の組織から得られる正常なＮＫＥ細胞の同一の特性と比較することができる。細胞増殖特性、例えば、細胞表面、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、または他の三次元表面上でのコロニー形成を含むが、これらに限定されない、異常な細胞または罹患した細胞と正常な細胞との間の任意の差異を用いることができる。疾患した細胞と正常な細胞との間の差異を決定する他の手段は、細胞のプロテオミクスプロファイルの評価、細胞の代謝学的プロファイルの評価、ゲノムプロファイルの評価、および／または疾患した細胞もしくは異常な細胞と正常な細胞との間の差異を強調する他の生物学的アッセイの使用を含むが、これらに限定されない。異常な候補ＮＫＥ細胞と正常なＮＫＥ細胞との間の検出された差異は、異常な候補ＮＫＥ細胞が、正常なＮＫＥ細胞と比較して、異常であることを示す。
【００８４】
応答プロファイルを評価するために使用される同一の方法を用いて、組織起源プロファイルを評価することができる。例えば、異常な候補細胞をｍＲＮＡ転写産生、タンパク質発現についてアッセイすることができ、組織起源も組織学的評価を介して視覚的に評価することができる。組織起源プロファイルを評価する方法は、免疫組織化学的染色も含む。異常な候補細胞の可能性のある起源組織が樹立された時点で、細胞を同一の組織由来の正常な細胞の少なくとも１つの特性についてアッセイすることができる。例えば、異常な候補細胞が乳房組織に由来すると同定された場合、これらの細胞を、ＢＲＣＡ１および／またはＢＲＣＡ２変異、ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ増殖因子受容体の過剰発現等についてアッセイすることができる。異常な候補細胞がＢＲＣＡ１変異を有する場合、細胞が異常な乳房細胞であると確定することができる。本発明は、起源組織を同定するために使用されるアッセイの種類にも、正常な細胞と異常である可能性のある細胞の間の差異を決定するために使用されるアッセイの種類にも限定されない。本発明の細胞培養方法は、単離した細胞を拡大するための方法を提供することにより、これらの細胞の同定を可能にする。
【００８５】
本発明は、対象における疾患の進行または疾患の治療を監視する方法も対象とする。本明細書で使用される「進行を監視する」という語句は、ＮＫＥ細胞および／またはそれらの細胞内容物を、進行もしくは退行の様々なマーカーについてアッセイすることによって、個人における異常な状態が、進行（悪化）しているか、退行（改善）しているか、または停滞したままである（検出可能な変化なし）かを決定するために、対象における異常な状態が定期的にチェックされることを示すために使用される。これらの治療の有効性を監視するために、監視方法を、異常な状態の他の監視方法または治療レジメンと併せて用いてもよい。したがって、「進行を監視する」ことは、ＮＫＥ細胞および／またはそれらの細胞内容物を、進行もしくは退行の様々なマーカーについて定期的にアッセイし、かつ対象における経時的な任意の差異を、異常な状態の進行、退行、または停滞と相関させることによって、治療レジメンの有効性を評価することも示すよう意図されている。例えば、本発明の方法を用いて、乳房切除術中または乳房切除術後の対象を監視することができる。具体的には、本方法を用いて、乳房切除術が成功した患者を監視することができ、したがって、本方法を用いて、ＣＴＣを単離し、患者のＣＴＣにおいて様々な分析を行うのに十分な数のＣＴＣを生体外で培養および生成し、例えば、フォローアップマンモグラムまたはボディースキャンが必要であるかを決定することができる。監視方法を用いて、最初の治療後に好適なフォローアップ治療レジメンを決定することもできる。例えば、最初の治療後、ＮＫＥ細胞を生検または単離することができ、培養方法を用いて、十分な数の細胞を生体外で生成し、残りの異常な細胞の遺伝子構造または表現型が新たな治療を保証するのに十分に異なるかを決定することができる。したがって、一実施形態において、本発明は、治療レジメンを個別化する方法を提供する。監視することは、試料が採取される２つの時点でＮＫＥ細胞における特定のマーカーのレベルを評価することも含んでもよく、またはそれは、より多くの時点を含んでもよく、所与の対象由来の１つの特定の時点でのマーカーのレベルのうちのいずれかを、それぞれ、１つ以上の他の時点で、同一の対象におけるバイオマーカーのレベルと比較することができる。
【００８６】
方法は、異常なＮＫＥ細胞の試料を対象から得ることと、本発明の培養方法のうちのいずれかに従って異常なＮＫＥ細胞を培養して、生体外で異常なＮＫＥ細胞集団を産生することとを含む。
【００８７】
「進行を監視する」という語句は、本発明の方法を用いた対象におけるＡＩＢ１−△４ペプチドのレベルである。
【００８８】
本発明は、ＮＫＥ細胞を培養し、かつ／または条件的に不死化されたＮＫＥ細胞を生成するためのキットも提供する。キットは、培養容器、湿式形態もしくは乾式形態の培養培地、および／または血清もしくはいくつかの他のカルシウム源等の個々の培地成分を含んでもよい。キットは、凍結フィーダー細胞、細胞を継代するためのトリプシン等の他の化学物質等を含んでも含まなくてもよい。
【実施例】
【００８９】
実施例１−初代ヒト前立腺細胞（ＨＰＥＣ）の採取および培養
【００９０】
十分に説明した上で患者または親の同意を得て、正常なヒト前立腺組織を回収した。トリプシンを用いた確立した手順に従って、初代前立腺細胞懸濁液を調製した。簡潔に、前立腺組織を採取し、トリプシンで消化した。その後、細胞を、（トリプシンを中和するために）１０％の血清を含有するＤＭＥＭ中に懸濁し、即座に遠心分離して、ペレット状の細胞を単離した。そのような前立腺上皮細胞の日常的な単離および培養方法は、参照により組み込まれるＣｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｉａｎ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  ａｎｄ  Ｍａｒｙ  Ｇ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）（第２版、２００２年）で見出される。
【００９１】
回転させた後、ペレットを除去し、分配し、「Ｆ培地」にプレーティングした。Ｆ培地を、５％のウシ胎児血清を有する３：１（ｖ／ｖ）比率のＦ−１２およびＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、０．４μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン、５μｇ／ｍＬのインスリン、８．４ｎｇ／ｍＬのコレラ毒素、１０ｎｇ／ｍＬの上皮増殖因子（ＥＧＦ）、２４μｇ／ｍＬのアデニン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを混合することによって調製する。ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ０２７６３２を、約１０μＭの濃度でＦ培地に添加した。
【００９２】
細胞を非増殖性フィーダー細胞の存在下でプレーティングした。この具体的な場合において、フィーダー細胞は、ガンマ線照射されたスイス３Ｔ３細胞のサブクローンである周知のマウス線維芽細胞フィーダーＪ２細胞である。ガンマ線照射またはマイトマイシンＣでの処理は、これらの細胞を増殖不能にする。
【００９３】
正常細胞培養条件下（３７℃で５％のＣＯ２および標準大気圧）で、細胞を標準の細胞培養容器中で培養した。培地を、増殖速度に応じて２〜３日毎に取り換えた。
【００９４】
細胞がコンフルエンスに達した後、細胞を、参照により組み込まれるＣｈａｐｍａｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２０（７）：２６１９−２６２６（２０１０）に記載の標準の細胞培養技術を用いて採取および継代した。
【００９５】
図３Ａに示されるように、初期継代ＨＰＥＣは単層に増殖することができ、これらの細胞は増殖し続けた。
【００９６】
実施例２−初代ヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）の採取および培養
【００９７】
十分に説明した上で患者または親の同意を得て、正常なヒト乳房組織を回収した。初代乳房細胞懸濁液を、当技術分野で確立した手順に従って調製した。簡潔に、乳房組織を採取し、ディスパーゼおよびコラゲナーゼ１Ａの混合物での消化に供し、続いて、トリプシンで消化した。そのような乳房上皮細胞の日常的な単離および培養方法は、参照により組み込まれるＣｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｉａｎ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  ａｎｄ  Ｍａｒｙ  Ｇ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）（第２版、２００２年）で見出される。
【００９８】
回転させた後、ペレットを除去し、分配し、「Ｆ培地」にプレーティングした。Ｆ培地を、５％のウシ胎児血清を有する３：１（ｖ／ｖ）比率のＦ−１２（Ｇｉｂｃｏ）、０．４μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン、５μｇ／ｍＬのインスリン、８．４ｎｇ／ｍＬのコレラ毒素、１０ｎｇ／ｍＬの上皮増殖因子（ＥＧＦ）、２４μｇ／ｍＬのアデニン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを混合することによって調製する。ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ０２７６３２を、約１０μＭの濃度でＦ培地に添加した。細胞をガンマ線照射された非増殖性Ｊ２細胞の存在下でプレーティングした。
【００９９】
正常細胞培養条件下（３７℃で５％のＣＯ２および標準大気圧）で、細胞を標準の細胞培養容器中で培養した。培地を、２〜３日毎に取り換えた。
【０１００】
細胞がコンフルエンスに達した後、細胞を、参照により組み込まれるＣｈａｐｍａｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２０（７）：２６１９−２６２６（２０１０）に記載の標準の細胞培養技術を用いて採取および継代した。
【０１０１】
図３Ｂに示されるように、初期継代ＨＭＥＣは単層に増殖することができ、これらの細胞は増殖し続けた。
【０１０２】
実施例３−様々な条件下におけるＨＭＥＣおよびＨＰＥＣの増殖曲線の比較
【０１０３】
初代ＨＭＥＣおよびＨＰＥＣを、図２に記述される４つの異なる条件下で増殖させた。図２を参照して、ＰｒＥＧＭ（Ｌｉｆｅｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、血清を含有しない前立腺上皮細胞を培養するために特別に設計された合成培地（「Ｐｏｓｔａｌｉｆｅ上皮細胞培養培地」）であり、その中で、補助剤が合成であり、明確に定義される。ＭＥＧＭ（Ｌｉｆｅｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、血清を含有しない乳房上皮細胞を培養するために特別に設計された合成培地（「Ｂｒｏｃｈｉａｌｉｆｅ上皮細胞培養培地」）であり、その中で、補助剤が合成であり、明確に定義される。フィーダーは、ガンマ線照射されたＪ２マウス線維芽細胞であった。ＲＯＣＫ阻害剤は、最初のプレーティング時およびその後に細胞に適用された１０μＭの濃度のＹ２７６３２であった。Ｙ軸は集団倍加であり、Ｘ軸は日数である。すべての群の培地を、２〜３日毎に取り換えた。
【０１０４】
図２は、ＰｒＥＧＭ中で増殖した初代前立腺細胞の増殖が約２５日後に止まり、ＭＥＧＭ中で増殖した初代乳房細胞の増殖が約５０〜６０日後に止まったことを示す。ＲＯＣＫ阻害剤を合成培地に添加しても、増殖には影響を及ぼさなかった。ＲＯＣＫ阻害剤を有しないＦ培地中のフィーダー細胞の存在下で増殖した細胞は、ほぼ同一の増殖速度を有し、すなわち、線の勾配はほぼ同一であったが、フィーダー細胞の存在下で増殖した細胞の増殖は、最終的に止まった。Ｆ培地中のフィーダー細胞の存在下で増殖し、かつＲＯＣＫ阻害剤が補充された初代細胞は、増殖し続けた。
【０１０５】
実施例４−後期継代ＨＭＥＣおよびＨＰＥＣの細胞表面マーカー染色
【０１０６】
継代２９のＨＰＥＣおよび継代３２のＨＭＥＣを滅菌ガラス製カバースリップ上で増殖させ、４％（重量／体積）のパラホルムアルデヒド中に固定し、製造業者のプロトコルに従って、初代抗体（マウス抗ｐ６３、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−８６３）および二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８ロバ抗マウスＩｇＧ）で標識した。細胞中のＤＮＡを、室温で３分間、ＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍＬのＨｏｅｓｃｈｔ（３３３４２）で染色し、ＰＢＳで３回洗浄した。カバースリップをＰｒｏＬｏｎｇ退色防止封入剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて室温で１時間ガラススライド上に載置し、４℃で保管した。６３倍対物レンズおよびＨａｍｍａｍｕｔｓｕ電荷結合素子カメラを装備したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）を用いて細胞を撮像した。画像をＯｐｅｎｌａｂ３．０．７ソフトウェアを用いて処理した。図４は、後期継代ＨＭＥＣおよびＨＰＥＣのいずれも基底細胞マーカーｐ６３を発現した一方で、陰性対照細胞（ＬｎＣＡＰ）は発現しなかったことを示す。
【０１０７】
実施例５−条件的に不死化されたＨＭＥＣおよびＨＰＥＣの形態学的構造
【０１０８】
条件的に不死化されたＨＰＥＣ（継代３２）、ＨＭＥＣ（継代３６）、および遺伝的に不死化されたＨＭＥＣ（ＭｙｃＴ５８Ａ）（継代３９）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ベースの三次元培養に移した。
【０１０９】
三次元培養の５日目までに、条件的に不死化された正常なＨＭＥＣおよびＨＰＥＣが、組織化された多房状の球体構造を形成した一方で、遺伝的に不死化されたｍｙｃ変異体乳房細胞は、ランダムな組織化されていない塊を形成した。
【０１１０】
三次元培養下で５日後のＨＭＥＣの代表的なクラスターを、標準の技術を用いてβカテニン染色した。βカテニンは、正常な上皮細胞層を維持するのに必要な接着結合の形成に関与するタンパク質である。ＨＭＥＣは、正にβカテニン染色し、組織化された多房状の球体構造を示した。
【０１１１】
実施例６−同一の患者由来の正常な前立腺細胞および前立腺腫瘍細胞の培養および拡大
【０１１２】
先に採取および凍結された正常な前立腺細胞および前立腺腫瘍細胞を別個に解凍し、上の実施例１に記載の条件を用いてプレーティングした。図６に示されるように、両方の組の細胞が、解凍後６日目までに、増殖し、拡大し、細胞培養表面上に単層を作成した。
【０１１３】
２代継代した後、正常な細胞および腫瘍細胞を、上の実施例５のように三次元細胞培養上にプレーティングした。実施例５の後期継代ＨＰＥＣと同一でないにしても、その後期継代ＨＰＥＣと同様に、解凍した正常なＨＰＥＣは、組織化された多房状の球体構造を形成し、腫瘍細胞は、ランダムな組織化されていない塊を形成した。
【０１１４】
実施例７−条件的に不死化された細胞のテロメラーゼ活性およびテロメア長
【０１１５】
全細胞ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離し、製造業者の指示に従ってＤＮＡを含まないキット（Ａｍｂｉｏｎ）で処理した。第１鎖ｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従って、２μｇの全細胞ＲＮＡを用いていくらか改変して合成した。ＴａｑｍａｎリアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲを、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの定量化のために、参照により組み込まれるＦｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３，７８１５-７８２４，（２００３）で以前に報告されたように、プライマーおよびプローブセンスプライマー５’−ＴＧＡＣＡＣＣＴＣＡＣＣＴＣＡＣＣＣＡＣ−３’、アンチセンスプライマー５’−ＣＡＣＴＧＴＣＴＴＣＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣ−３’、およびＴａｑｍａｎプローブ５’−ＡＣＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧ−３’を用いて、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒ  ＭｙｉＱ上で行った。ゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ血液および組織キット（カタログ番号６９５０６）を用いて細胞から抽出した。テロメアの平均長を、参照により組み込まれるＣａｗｔｈｏｎ  Ｒ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７（３）：ｅ２１（２００９）およびＣａｗｔｈｏｎ  Ｒ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０（１０）：ｅ４７（２００２）に以前に記載されたリアルタイムＰＣＲベースのテロメアアッセイの修正法を用いて評価した。
【０１１６】
簡潔に、テロメア反復コピー数対一遺伝子コピー数（Ｔ／Ｓ）の比率を、９６ウェル形式のＢｉｏ−Ｒａｄ  ＩＱ５サーモサイクラーを用いて決定した。５ナノグラムのゲノムＤＮＡを、Ｒｉｏ−Ｒａｄ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒ混合物とのＰＣＲ反応に供した。テロメア長およびＨＢＧ１（単一コピー遺伝子）のプライマーは、Ｔｅｌ−１：５’ＣＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴ−３、およびＴｅｌ−２：５’−ＧＧＣＴＴＧＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴ−３’、ＨＢＧ１  ５’−ＴＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＡＴＣＡＣＴＴＴＧ、およびＨＢＧ２  ５’−ＡＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＣＴＴＴＣＴＧＡＴＡＧＧ−３’であった。１サイクルの反応は９５℃で５分間進み、続いて、４１サイクルの反応は９５℃で１５秒間、６０℃で４５秒間進んだ。テロメア反応およびグロビン反応の両方の試料すべてを三重に行った。これらの試料に加えて、それぞれの９６ウェルプレートは、Ｒｏｃｈｅ  ＴｅｌｏキットのゲノムＤＮＡ（テロメア長１０．４ｋｂ）を用いた０、０．２、１、５、２５、１２５ｎｇの６点標準曲線を含有した。平均ＨＢＧ  Ｃｔ値を平均テロメアＣｔ値から正規化することによって、それぞれの試料におけるＴ／Ｓ比（ｄＣｔ）を計算した。
【０１１７】
実施例８−非ケラチノサイト上皮細胞の他の種類の培養
【０１１８】
肝組織（図８）または乳房組織（図９）を異なる遺伝的背景を有するマウスから回収した。異なる細胞型を説明するために、初代細胞懸濁液を実施例１の方法に従って調製し、当技術分野で確立した手順に従って必要に応じて改変した。簡潔に、組織を採取し、ディスパーゼおよびコラゲナーゼ１Ａの混合物での消化に供し、続いて、トリプシンで消化した。
【０１１９】
回転させた後、ペレットを除去し、分配し、「Ｆ培地」にプレーティングした。Ｆ培地を、５％のウシ胎児血清を有する３：１（ｖ／ｖ）比率のＦ−１２およびＤＭＥＭ、０．４μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン、５μｇ／ｍＬのインスリン、８．４ｎｇ／ｍＬのコレラ毒素、１０ｎｇ／ｍＬの上皮増殖因子（ＥＧＦ）、２４μｇ／ｍＬのアデニン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを混合することによって調製する。ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ０２７６３２を、約１０μＭの濃度でＦ培地に添加した。細胞をＪ２フィーダー細胞の存在下でプレーティングした。
【０１２０】
正常細胞培養条件下（３７℃で５％のＣＯ２および標準大気圧）で、細胞を標準の細胞培養容器中で培養した。培地を、２〜３日毎に取り換えた。
【０１２１】
細胞がコンフルエンスに達した後、細胞を、標準の細胞培養技術を用いて採取および継代した。
【０１２２】
実施例９−気管支由来のヒト上皮細胞の培養
【０１２３】
凍結細胞をＬｉｆｅｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、上記の本明細書で使用されるＦ培地中で解凍した。ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ０２７６３２を、約１０μＭの濃度でＦ培地に添加した。細胞をガンマ線照射された非増殖性Ｊ２細胞の存在下でプレーティングした。
【０１２４】
正常細胞培養条件下（３７℃で５％のＣＯ２および標準大気圧）で、細胞を標準の細胞培養容器中で培養した。培地を、２〜３日毎に取り換えた。
【０１２５】
実施例１０−条件的に不死化されたＨＰＥＣと正常なＨＰＥＣとの間の増殖速度の比較
【０１２６】
ＨＰＥＣを採取し、実施例１の方法に従って培養する。並行して、別の組のＨＰＥＣを採取し、フィーダー細胞を用いず、前立腺上皮細胞用に設計された合成細胞培養培地を用いて培養する。この第２の組の条件下で培養される細胞は、「正常なＨＰＥＣ」と称される。簡潔に、正常なＨＰＥＣを、明確に定義されたＰｒＥＧＭ血清を含まない培地または２５μｇ／ｍＬのウシ下垂体抽出物および０．２ｎｇ／ｍＬの組換え上皮増殖因子が補充されたケラチノサイト血清を含まない（ＫＳＦ）培地中に存在するフィーダー細胞を用いることなく増殖させる。
【０１２７】
組織の消化後、それぞれの群由来の細胞を計数し、７５ｃｍ２の培養フラスコ中に約１×１０５でプレーティングする。正常細胞培養条件下（３７℃で５％のＣＯ２および標準大気圧）で、細胞を標準の細胞培養容器中で培養する。それぞれの群の培地を、増殖速度に応じて２〜３日毎に取り換える。
【０１２８】
数日後、細胞を採取し、標準の細胞培養技術を用いて計数する。ＰｒＥＧＭ培地またはＫＳＦ培地のいずれかにおいて、条件的に不死化された細胞が正常な細胞よりも多く生成され、この培養条件が現在標準の条件よりもＨＰＥＣの増殖を刺激することを示す。
【０１２９】
実施例１１−条件的に不死化されたＨＭＥＣと正常なＨＭＥＣとの間の増殖速度の比較
【０１３０】
ＨＭＥＣを採取し、実施例２の方法に従って培養する。並行して、別の組のＨＭＥＣを採取し、フィーダー細胞を用いず、前立腺上皮細胞用に設計された合成細胞培養培地を用いて培養する。この第２の組の条件下で培養される細胞は、「正常なＨＭＥＣ」と称される。簡潔に、正常なＨＭＥＣを、明確に定義されたＭＥＧＭ血清を含まない培地または２５μｇ／ｍＬのウシ下垂体抽出物および０．２ｎｇ／ｍＬの組換え上皮増殖因子が補充されたケラチノサイト血清を含まない（ＫＳＦ）培地中に存在するフィーダー細胞を用いることなく増殖させる。
【０１３１】
組織の消化後、それぞれの群由来の細胞を計数し、７５ｃｍ２の培養フラスコ中に約１×１０５でプレーティングする。細胞を１ウェル当たり合計約１０，０００個の細胞でプレーティングする。正常細胞培養条件下（３７℃で５％のＣＯ２および標準大気圧）で、細胞を標準の細胞培養容器中で培養する。それぞれの群の培地を、２〜３日毎に取り換える。
【０１３２】
数日後、細胞を採取し、標準の細胞培養技術を用いて計数する。ＭＥＧＭ培地またはＫＳＦ培地のいずれかにおいて、条件的に不死化された細胞が正常な細胞よりも多く生成され、この培養条件が現在標準の条件よりもＨＭＥＣの増殖を刺激することを示す。
【０１３３】
肝細胞、膵臓細胞等であるが、これらに限定されない任意の種類のＮＫＥにおいて、実施例１０および実施例１１を繰り返すことができる。
【０１３４】
実施例１２−個人の候補治療薬の同定
【０１３５】
再発性喉頭乳頭腫症に１６年間罹患する２２歳の男性患者をこの研究に選んだ。疾患は、徐々に喉頭を巻き込んだだけでなく、上気道（気管および気管支）、近年では、肺実質にも転移した。患者は、３５０回以上の手術を受けた。手術以外では、インターフェロン治療（１９９６〜２０１０）、メトトレキサート（２００１〜０３）、病巣内シドフォビル（２００７〜２０１０）、および病巣内アバスチン（２０１０）を含む複数の治療が失敗に終わった。２００８年のＣＴスキャンは、複数の肺結節が存在したことを示した。２０１０年の１０月までには、検査したそれぞれの肺病巣の大きさが増大していた。最後の外科的介入期間中、転移性腫瘍を除去するために右肺上葉の楔状切除術を行った。切除された標本の病理学的分析は、匙型細胞様異型を有する扁平上皮乳頭腫の存在を示した（図１２）。そのような腫瘍の細胞空胞化は、腫瘍が感染性ＨＰＶを産生していることを示す。しかしながら、介入時、この腫瘍に関与するＨＰＶの種類は同定されなかった。腫瘍がいくつもの異なる治療モダリティに応答しなかったため、手術後に患者をどのように治療すべきかも不明であった。
【０１３６】
手術時に肺腫瘍（および正常な肺組織）の生検を少量得て、組織を処理して細胞株を生成した（図１３）。本明細書に記載の細胞培養方法を用いて、正常な組織および腫瘍組織の両方から細胞株を生成し、その後、これらを用いて、どの種類のＨＰＶがこの腫瘍の病原体であるかを決定した。図１４に示されるように、ＤＮＡを腫瘍細胞から抽出し、特定のプライマーおよびＰＣＲを、危険性の低いＨＰＶ（ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１）または危険性の高いＨＰＶ（ＨＰＶ−１６またはＨＰＶ−１８）が存在するかについて評価した。危険性の低いＨＰＶ−１１のＤＮＡのみが検出された。
【０１３７】
ＨＰＶ−１１のＤＮＡの一部を配列決定して、ゲノムの初期領域および後期領域のいずれも無傷であるかを決定した。Ｌ１後期遺伝子（ウイルスカプシドタンパク質）と同様に、Ｅ６初期形質転換遺伝子およびＥ７初期形質転換遺伝子の両方が存在したことは明らかであった。「プライマー歩行法」を利用して、全Ｌ１遺伝子が存在するかについても評価した。Ｌ１遺伝子の存在または不在は、抗Ｌ１ワクチンをこの患者の治療において使用することができるかを決定するのに有用である。図１５のデータは、全Ｌ１遺伝子（ｂｐ５７７５〜７００１由来）が異常なＮＫＥ細胞において無傷であったことを示す。最終的に、これらの初期遺伝子および後期遺伝子がｍＲＮＡに転写されたことが立証された。図１６は、初期Ｅ６およびＥ７形質転換遺伝子が転写されたが、Ｌ１遺伝子は転写されなかったことを示す。Ｌ１タンパク質が産生されなかったため、ＨＰＶワクチンの使用（Ｌ１タンパク質に基づく）がこの患者に有効ではないという理由から、これは重大な所見であった。したがって、この遺伝分析に基づいて、この腫瘍を治療する代替方法を用いるべきであると決定された。
【０１３８】
ＤＮｅａｓｙ血液および組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、全ＤＮＡを患者の培養細胞または組織から単離した。Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ  ＲＣＡキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＤＮＡを増幅した。生成物をＢａｍＨＩで消化し、ｐＵＣ１９ベクターにクローニングした。プライマー歩行サービス（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｗａｌｋｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）（Ｇｅｎｅｗｉｚ）を用いてウイルスゲノムを二方向から配列決定した。
【０１３９】
Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒ  ＭｙｉＱ上でＴａｑＭａｎ（商標）キットを用いて、ＨＰＶ１１  Ｌ２（センスプライマー５’−ＴＧＡＣＡＣＣＴＣＡＣＣＴＣＡＣＣＣＡＣ−３’、抗センスプライマー５−ＣＡＣＴＧＴＣＴＴＣＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣ−３’、およびＴａｑＭａｎプローブ５’−ＡＣＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧ−３’）の定量化のためにプライマーおよびプローブを用いて、リアルタイム定量ＰＣＲを行った。それぞれの反応において、ヒトβグロビン遺伝子を内因性の参照として使用した。すべての試料において、リアルタイムＰＣＲ反応を三重で行った。製造業者（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のガイドラインに従って、正規化発現（｛Ｄｅｌｔａ｝｛Ｄｅｌｔａ｝ＣＴ）法を有するｉＱ５ソフトウェアを用いてＨＰＶ  ＤＮＡのレベルを分析した。
【０１４０】
ほとんどのＲＲＰ症例はＨＰＶ６またはＨＰＶ１１によって引き起こされる。いくつかの研究は、ＨＰＶ１１が、通常、より攻撃的なウイルスであると考えられており、かつ肺病変を有するＲＲＰの大部分がＨＰＶ１１によって引き起こされたことを示している。一般的なＨＰＶ検出プライマーおよびＨＰＶ型特異的プライマーをＨＰＶ分類アッセイに用いた。ＨＰＶ１１感染を確認するために、ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）を用いてエピソームＨＰＶ  ＤＮＡを増幅した。驚いたことに、制限消化は、典型的なＨＰＶ１１のパターンと一致しなかった。原型ＨＰＶ１１が１つのＢａｍＨＩ部位を有したのに対し、原型ＨＰＶ１１が肺腫瘍細胞から単離されたウイルスゲノムは、２つのＢａｍＨＩ部位を有した。さらに重要なことに、ウイルスゲノムの大きさは、１０ｋｂ以上であると推定された。ほとんどのＨＰＶが約８ｋｂの大きさのゲノムを有し、原型ＨＰＶ１１の大きさは、７９３１個の塩基対である。さらなる制限酵素消化は、ＢａｍＨＩ以外に、Ｌ１−ＬＣＲ−Ｅ６−Ｅ７−Ｅ１の領域中の酵素ＡａｔＩＩ、ＡｇｅＩ、ＦｓｐＩ、ＸｃｍＩ、およびｐＰｕＭＩがすべて、ウイルスゲノムを１回のみではなく２回切断することを明らかにした。ＨＰＶ１１のすべての他の単一消化酵素部位がウイルスゲノム上に保持され、ウイルスＤＮＡがＬ１−ＬＣＲ−Ｅ６−Ｅ７−Ｅ１の重複を有し得ることを示唆する。重複の詳細を決定するために、全ウイルスゲノムをベクターｐＵＣ１９にクローニングし、ウイルスゲノムを二方向から配列決定した。配列決定データが立証され、ＧｅｎＢａｎｋ（受入番号ＪＮ６４４１４１）に提出された。肺腫瘍細胞中のＨＰＶ１１は、１０，４２４塩基対長のエピソームゲノムを有した。２４９３塩基対長の確認された重複配列は、部分Ｌ１−ＬＣＲ−Ｅ６−Ｅ７−部分Ｅ１配列を含んだ。これらの重複配列を、Ｌ１（Ｂ）、ＬＣＲ（Ｂ）、Ｅ６（Ｂ）、Ｅ７（Ｂ）、およびＥ１（Ｂ）と注釈を付けた。患者が変異ウイルスに感染したか、または変異が患者において疾患進行中に起こったかを解明するために、患者の喉頭組織由来のウイルスゲノムを単離した。喉頭由来のウイルスゲノムもクローニングし、配列決定した（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＮ６４４１４２）。最初の感染部位のウイルスゲノムは、７９３３個の塩基対であり、かつ重複を有しないという点において、原型ＨＰＶ１１に非常に類似しており、ウイルスゲノム変異が再発性呼吸乳頭腫の腫瘍進行を併発したことを示唆する。定量リアルタイムＰＣＲを用いてウイルス力価を測定し、肺腫瘍細胞は、喉頭病巣よりも７倍多くのＨＰＶゲノムを含有した。肺における１細胞当たり約４０．１６コピーのウイルスＤＮＡ、および喉頭における１細胞当たり約５．７４コピーのウイルスＤＮＡで、ウイルスゲノムを計算した。
【０１４１】
以前の研究は、アルテミシニン誘導体（ＤＨＡおよびアーテスネート）ならびにＨＤＡＣ阻害剤（ＳＡＨＡ）が危険性の高いＨＰＶを発現する子宮頸癌細胞を効率的に死滅させることができることを示した。しかしながら、ＨＰＶ−６またはＨＰＶ−１１を含有する樹立された細胞株が存在しないため、これらの阻害剤の危険性の低いＨＰＶを含有する細胞への効果を分析するデータは文献内には存在しない。細胞培養方法は、ＨＰＶ−１１を発現する細胞株の樹立を可能にした。さらに重要なことに、上の阻害剤に対する感受性を評価し、これを同一の患者から単離された正常な肺細胞の感受性と比較するために、この細胞株を使用した（図１７）。
【０１４２】
患者由来のＨＰＶ−１１含有腫瘍細胞のＤＨＡおよびＳＡＨＡに対する感受性が、正常な肺細胞よりも約１００倍高いことは明らかである。例えば、ＳＡＨＡのＥＣ５０は２μＭであり、ＬＤ５０は約２００μＭである。治療指数は、ＬＤ５０／ＥＣ５０と定義され、この場合、それは１００である。この値は、優れた治療指数を表し、ＳＡＨＡが治療用の実行可能な薬剤に相当し得ることを示唆する。ＤＨＡの治療指数は１００ではないが、ＤＨＡにおいても同一のことが言える。シドフォビルは、ＲＲＰの治療に使用される最も一般的な薬物である。興味深いことに、シドフォビル（図１７Ａ）は、非常に高い濃度（５０〜２００μＭ）でも生体外では全く無効であった。
【０１４３】
生体外の感受性データに基づいて、患者は、２０１１年１月にボリノスタット治療を受けた。ボリノスタット治療は、４００ｍｇ／日の４週間サイクル（３週間継続、１週間中断）から成った。その後のＣＴスキャンは、新たな病巣が同定されず、比較的小さい病巣が縮小し、かついくつかの比較的大きい病巣も小さくなったという非常に有望な結果を示した。より最近のＣＴスキャンは、すべての病巣が安定化し、かつ主な副作用が観察されなかったことを示した。したがって、本発明の細胞培養方法の使用は、異常な細胞の応答プロファイルの決定に重要であり、これは、この患者の腫瘍を治療するのに有用であり得る少なくとも２つの化学療法剤の同定を可能にした。本発明の細胞培養方法を用いて、遺伝分析および治療指数を含む応答プロファイルは、生検の１週間以内に作成された。
【０１４４】
実施例１３−単一針生検由来の細胞株の樹立
【０１４５】
別個の実験において、ラット乳房腫瘍由来の針生検標本を本発明の細胞培養方法で使用した。ラット乳房腫瘍細胞は順調に増殖し、細胞株は樹立され、これを生体外研究で使用することができた（図１８）。したがって、細胞株を生成するのに十分な数の腫瘍細胞を単一針生検で得た。これは、非常に小さい臨床試料上での遺伝学的研究、生化学的研究、および分子的研究を行う可能性を大いに拡大した。例えば、乳房腫瘍の場合において、針生検の評価は、現在に至るまで、これらの細胞を拡大および培養するいかなる方法も存在しなかったため、現在、試料のＨ＆ＥおよびＩＨＣ染色に限定されている。
【０１４６】
本明細書に開示の実施形態の例は、例示目的であり、いかなる様式でも本発明の範囲を限定することを意図していない。
【０１４７】
実施例１４−冷凍および解凍後の細胞株の樹立
【０１４８】
縮小乳房形成患者由来の新たなヒト乳房組織を、最大１〜３ｍｍの大きさで小片または薄片に細分化した。その後、組織片を、−８０℃の９０％のウシ胎児血清／１０％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）／５μＭのＹ−２７６３２中、または液体窒素中で凍結させた。凍結させた組織を３７℃で解凍し、ペレット状にし、Ｆ培地中に懸濁して、ディスパーゼ／コラゲナーゼで短時間消化した。細胞懸濁液を上述のように培養系に供した。細胞培養の写真（図１９）をプレーティングの５日後（上のパネル）および８日後（下のパネル）に撮影した。
【０１４９】
実施例１５−循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）由来の細胞株の樹立
【０１５０】
７ｍＬのヒト血液試料を健常なドナーから取り出し、ＣＰＴ管（ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＣＰＴ（商標）ヘパリンナトリウムＮを有する細胞調製管）に注入した。血液試料を回収後した後、ＬｎＣＡＰ（前立腺癌細胞株）細胞（総細胞数５０〜１０００個）をスパイクした。試料を、水平ローター遠心分離機内で、１５００〜１８００ＲＣＦ（相対遠心力）で最低１５分間、室温で遠心分離した。遠心分離した後、単核細胞および血小板は血漿層真下の白っぽい層内に位置した（ＣＰＴ管を参照のこと）。細胞層を乱さないように注意して、血漿のおよそ半分を吸引した。その後、細胞層をパスツールピペットで回収し、蓋を有する１５ｍＬの「Ｕ」底円錐形遠心分離管に移した。ヒト系統細胞枯渇カクテル（ＬｉｎｅａｇｅＣｅｌｌ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ）（カタログ番号：５１−９００５２２５）を管に添加し、混合し、室温で約１５分間静置させた。静置させた後、約１２ｍＬの１倍ＰＢＳを管に添加し、管を約１０００ｒｍｐで回転させた。上清を吸引した。ＩＭａｇストレプトアビジン粒子プラスＤＭ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ：カタログ番号：５１−９００３７４６）をボルテックスし、細胞ペレットを７５μＬのＩＭａｇ粒子と完全に混合した。混合物を室温で約３０分間インキュベートさせた。インキュベートさせた後、１ｍＬの１倍ＰＢＳを管に添加し、混合し、管をＢＤ  ＩＭａｇｎｅｔ上に６分間設置した。上清を新たな管に移した。ＢＤ  ＩＭａｇｎｅｔに付着した管内の残り部分を１ｍＬのＰＢＳと再度混合した。この第２の上清を別の新たな管に移した。これらの２つの管を沈降させ、ペレットを３ｍＬのＦ培地（＋Ｙ−２７６３２）に再懸濁し、フィーダー細胞を有する６ウェルプレートに設置した。図２２は、スパイクされた腫瘍細胞が血液から回収され、本明細書に記載の培養条件に供した後に、これらの細胞がコロニーを形成し始めたことを示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１５１】
配列番号１：センスプライマー
配列番号２：アンチセンスプライマー
配列番号３：ＴａｑＭａｎプローブ
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：センスプライマー
配列番号９：アンチセンスプライマー
配列番号１０：ＴａｑＭａｎプローブ
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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