(57)【要約】  ナノ粒子を用いて治療剤を組織へ送達する方法を提供する。該方法は、直径１０−１００ｎｍ、深さ５−５０ｎｍの表面特性を有するナノ粒子と治療剤とを組織へ送達する工程と、該組織に圧力波を照射する工程とにより構成される。該粒子、及び付随する治療・送達を制御・イメージングする方法も提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
超音波照射によって媒体においてキャビテーションを誘発するナノ粒子であって、
１０〜１０００ｎｍの範囲の直径と、深さが５〜５０ｎｍの範囲の表面特性を有することを特徴とするナノ粒子。
【請求項２】
人体におけるがん治療用のナノ粒子であって、
１０〜１０００ｎｍの範囲の直径と、深さが５〜５０ｎｍの範囲の表面特性を有し、
圧力波を照射されると人体においてキャビテーションを促進することを特徴とするナノ粒子。
【請求項３】
がん組織を治療するためのシステムであって、
圧力波源と、
該組織へ送達されるナノ粒子と、を有し、
該ナノ粒子は１０〜１０００ｎｍの範囲の直径と、深さが５〜５０ｎｍの範囲の表面特性を有しており、
該ナノ粒子は該圧力波源から圧力波を照射されると該組織においてキャビテーションを促進することを特徴とするシステム。
【請求項４】
組織におけるキャビテーションを制御する方法であって、
１０〜１０００ｎｍの範囲の直径と深さが５〜５０ｎｍの範囲の表面特性を有するナノ粒子を該組織まで送達する工程と、
該組織に圧力波を照射する工程と、により構成されることを特徴とする方法。
【請求項５】
対象物をイメージングする方法であって、
１０〜１０００ｎｍの範囲の直径と深さが５〜５０ｎｍの範囲の表面特性を有するナノ粒子を該組織まで送達する工程と、
該ナノ粒子が該対象物においてキャビテーションを誘発するよう該対象物に圧力波を照射する工程と、
検知器を用いて該キャビテーションによって生じる圧力波を検知する工程と、
該検知器からの信号を処理して該対象物のイメージを生成する工程と、により構成されることを特徴とする方法。
【請求項６】
治療剤の組織への送達をモニターする方法であって、
治療剤と、１０〜１０００ｎｍの範囲の直径と深さが５〜５０ｎｍの範囲の表面特性を有するナノ粒子とを該組織まで送達する工程と、
該ナノ粒子が該組織においてキャビテーションを誘発するよう該組織に圧力波を照射する工程と、
検知器を用いて該キャビテーションによって生じる圧力波を検知する工程と、
該検知器からの信号を処理して送達をモニターする工程と、により構成されることを特徴とする方法。
【請求項７】
治療剤を組織へ送達する方法であって、
治療剤と、１０〜１０００ｎｍの範囲の直径と深さが５〜５０ｎｍの範囲の表面特性を有するナノ粒子とを該組織まで送達する工程と、
該ナノ粒子が該組織においてキャビテーションを誘発するよう該組織に圧力波を照射する工程と、により構成されることを特徴とする方法。
【請求項８】
該表面特性は、直径が５〜５０ｎｍの球形あるいは一部球形、あるいは５〜５０ｎｍの深さ、または５〜５０ｎｍの幅を有する窪みによって形成されることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか一に記載のナノ粒子、システムまたは方法。
【請求項９】
該ナノ粒子は疎水性であることを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか一に記載のナノ粒子、システムまたは方法。
【請求項１０】
該ナノ粒子は薬剤を運搬することを特徴とする、請求項１乃至９のいずれか一に記載のナノ粒子、システムまたは方法。
【請求項１１】
該ナノ粒子は中空であり、ナノカプセルを形成することを特徴とする、請求項１乃至１０のいずれか一に記載のナノ粒子、システムまたは方法。
【請求項１２】
該ナノ粒子はフリーズ・ドライ、スプレー・フリーズ・ドライ、あるいはスプレー・ドライされることを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか一に記載のナノ粒子、システムまたは方法。
【請求項１３】
該ナノ粒子の各々は、内核と、該内核に外殻を設けて形成されることを特徴とする、請求項１乃至１２のいずれか一に記載のナノ粒子、システムまたは方法。
【請求項１４】
該内核はポリスチレン製であることを特徴とする、請求項１３に記載のナノ粒子、システムまたは方法。
【請求項１５】
該外殻は、少なくとも部分的に二酸化ケイ素あるいは二酸化チタンによって形成されることを特徴とする、請求項１３または１４に記載のナノ粒子、システムまたは方法。
【請求項１６】
該内核が取り出されて該外殻を中空にすることを特徴とする、請求項１３乃至１５のいずれか一に記載のナノ粒子、システムまたは方法。
【請求項１７】
該外殻は、該表面特性を有するよう、少なくとも部分的に５〜５０ｎｍの範囲の直径を有する粒子によって形成されることを特徴とする、請求項１３乃至１６のいずれか一に記載のナノ粒子、システムまたは方法。
【請求項１８】
該圧力波の周波数は少なくとも１００ｋＨｚであることを特徴とする、請求項４乃至７のいずれか一に記載の方法、または請求項３に記載のシステム。
【請求項１９】
該圧力波の周波数は少なくとも５００ｋＨｚであることを特徴とする、請求項４乃至７、請求項１８のいずれか一に記載の方法、または請求項３に記載のシステム。
【請求項２０】
該圧力波の周波数は１０ＭＨｚ以下であることを特徴とする、請求項４乃至７、請求項１８乃至１９のいずれか一に記載の方法、または請求項３に記載のシステム。
【請求項２１】
該圧力波の周波数は５ＭＨｚ以下であることを特徴とする、請求項４乃至７、請求項１８乃至２０のいずれか一に記載の方法、または請求項３に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はナノ粒子、およびナノ粒子を超音波のような圧力波にさらして音響キャビテーションを引き起こす作用に関する。
【背景技術】
【０００２】
超音波治療法においてキャビテーションの重要さはよく知られているが、生体においてキャビテーションを誘発することの難しさもまた知られている。キャビテーションの閾値を下げるためにこれまでに最もよく行われてきたアプローチは、脂質やプロテイン細胞（超音波造影剤としても知られる）によって安定化された注射用微小気泡を使用することである。こうした薬剤は閾値を下げはするものの、その大きさのため、微小循環とくに腫瘍に蓄積されるには不向きである。またガスを内包しているため、時間が経過するにつれて体内において微小気泡の大きさや作用も変わっていく。
【０００３】
アコースティック液滴蒸発によって気泡を形成する方法も知られている（http://ultrasound.med.umich.edu/Projects/ADV.htmlを参照）。この方法によれば、過熱液滴、例えばほぼナノメートル領域のペルフルオロカーボンを音響励起によって膨張させると、蒸気が充填された状態の気泡が形成される。デメリットとしては、生体における安定性がまだ実証されていないこと、また、形成された気泡が本質的には蒸気泡であるため、慣性的に崩壊するのが難しいことが挙げられる。したがって、この方法を用いた場合、慣性キャビテーションに付随する生体学的治療効果を引き出すことができない可能性もある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、何よりも、診断用あるいは治療用超音波に晒されると音響キャビテーションを容易に誘発することができる、表面の粗いナノ粒子の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
主たる目的は、治療用超音波とナノ粒子とを組み合わせて所望の薬を送達することにある。音響キャビテーション（ある音場の影響のもとでガスと蒸気とで満ちている空包を非線形振動させること）は、治療用超音波を利用する数々の場面において、主要な役割を果たしてきた。例えば所望の薬剤の放出・送達する場面、血流から周辺の組織への治療剤を溢出する場面などである。
【０００６】
しかしながら、体内には音響キャビテーションを促すような核（ヌクレイ）がほとんど存在しない。結果、音響キャビテーションを引き起こすためにはかなり大きな圧力振幅が必要となる。本発明のいくつかの実施の形態は、生態適合性のある、腫瘍内に自然に蓄積されるのに適したサイズ（１０〜１０００ｎｍ）のナノ粒子を製造することを目的とする。このナノ粒子の表面は、超音波励起によりキャビテーションを誘発しやすくするのに適切な特性（疎水性、表面粗さ）を有する。この粒子は、キャビテーションが重要な役割を果たすことが分かっている治療用超音波を適用する場面、例えば、高密度焦点式超音波を使った非侵襲性アブレージョン、高周波数超音波併用血栓溶解療法（ultrasound-enhanced thrombolysis）、ソノポレーション（sonoporation）、ソノフォレシス（sonophoresis）、血液脳関門の開放、砕石術などにおいて単にキャビテーション閾値を下げるために使われてもよい。しかしながら、高感度超音波ナノ粒子を薬剤、ワクチン、その他の治療剤に添付したり、結合させたりしてキャビテーションを媒介として所望の薬剤を放出・送達するために利用することもできる。
【０００７】
所望の粒子は適切な方法で入手することができる。好ましくは、以下にあげる技術のうちの一つによって（ただしこれに限定されるものではない）製造することができる。つまり、レイヤー・バイ・レイヤー・アセンブリー（layer-by-layer assembly）、スプレー・フリーズ・ドライング（spray-freeze-drying）、エマルション術（シングルもしくはダブルエマルション術）、エマルション・ディフュージョン（emulsion diffusion）、ポリマー・コアセルベーション（polymer coacervation）、ナノプレシピテーション（nanoprecipitation）、スプレー・ドライング（spray-drying）などである。最終的な粒子の直径は（動的光散乱、走査型電子顕微鏡、透過型電子顕微鏡、その他適切な分子サイズ決定方法で計測した場合）１０ｎｍ〜１０００ｎｍである。粒子は単分散でも多分散の粒度分布でもよい。粒子の核は空芯でも実芯でもよい。粒子の表面は（走査電子顕微鏡法で決められるところの）粗い形態であり、（気体吸着法、ＢＥＴにより決められるところの）理想的な球体より大きな表面積を有する。粒子は（ｉ）自然そして合成の、生態適合性かつ／または生分解性のあるポリマー、（ｉｉ）無機物、を含む（しかしこれに限られるものではない）様々な物質からなる。（ｉ）の例としては、例えばポリ乳酸、ポリ乳酸‐グリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリエチレングリコール、（ｉｉ）の例としては、例えば金、シリコン、二酸化チタンなどが挙げられる。
【０００８】
超音波を使って所望の薬剤を放出するためにナノサイズのキャリアを使うこともまた周知である。このようなキャリアとしては、現在リポゾームやミセルなどを利用することが多い。リポゾーム・キャリアは感熱性である、つまり、その外殻は加熱後に所定の温度になると漏れやすくなる性質がある。このようなキャリアがそのペイロード（payload）を放出するには、治療用超音波を使ってかなりのエネルギーを加えることが必要となる。その他リポゾームやミセルのキャリアは機械的な力を加えて破裂させてペイロードを放出させることもできるが（イーベン・ティー・ジェイ、ニールセン・イー・エー、ロンバルドソン・エス、ブランドル・エム、フォッシェム・エス・エル、「超音波媒介による薬剤送達のためのジステアロイルエタノールアミンベースのリポゾーム」、アー・ジェイ・ファーム・バイオファーム、２０１０年、７５（３）号、３２７−３３３ページ）、キャリア自体はローカル・キャビテーション閾値には全く影響を及ぼさないため、必要とされる圧力振幅はかなり高いことが知られている（メガヘルツ周波数域において１５ＭＰａ以上）。
【０００９】
本発明のいくつかの実施の形態においては、安定した頑丈なナノ粒子を利用して微小血管組織におけるキャビテーション閾値を局所的に変えることができる。キャビテーションはエネルギー主導というよりは圧力主導の現象であるため、封入されている薬剤を放出するにはキャビテーション閾値を超える短パルス超音波で十分足りる。したがって、超音波による低エネルギー放出メカニズムを提供することになる。
【００１０】
本発明は、上述のような超音波治療の領域で広く適用されることが期待される。健康管理以外にも、音響波と組み合わせて、音響化学、化学工学、その他音響キャビテーションの誘発が重要な局面において用いられてもよい。
【００１１】
本発明の根本にある技術は、負圧に晒された際のキャビテーション誘発を容易にするために、ナノ粒子の疎水性や表面粗さを適切に変化させて微小な量のガスを封じこめる方法を特定することにある。さらに、組織における音響キャビテーションに関する最新の実験的かつ数値的複合研究（エス・ラブレー、シー・シー・キュソス、ジャーナル・オブ・アコースティカル・ソサエティー・オブ・アメリカ、２０１１年近刊）によれば、組織中のキャビテーション核に見られる表面張力や粘弾性に関する特定の想定のもとで、特定のサイズの核は特定の励起周波数において特に慣性的に空洞化しやすいことが立証されている。この研究によれば、特に、負ピーク３ＭＰａ未満の圧力振幅でシングル・サイクルの音響励起（励振）のキャビテーションを起こすためには、８ｎｍ以下の核で１．６ＭＨｚ、１１ｎｍ以下の核で１ＭＨｚ、２８ｎｍ以下の核で０．５ＭＨＺ必要となることが証明されている。
【００１２】
本発明のある実施の形態は、表面が粗いナノ粒子上に特定のサイズの核（ヌクレイ）を形成すれば、特定の励起周波数において好ましく反応することを利用するものである。
【００１３】
したがって、本発明は更に、ナノ粒子の疎水性や表面粗さを適切に変化させて特定のサイズ範囲の微小な量のガスを封じこめる方法に関する。これにより、負圧に晒された場合に特定の超音波周波数でキャビテーションを誘発しやすくなる。
【００１４】
本発明は更に、インソネーション時（超音波に晒された時）媒体においてキャビテーションを誘発するナノ粒子を提供する。このナノ粒子は１０００ｎｍ以下（オプションとして１０〜１０００ｎｍの範囲）の直径を有し、５０ｎｍ以下（オプションとして５〜５０ｎｍの範囲）の深さの表面特性を有する。
【００１５】
本発明は更に体内でのがん治療用のナノ粒子を提供する。このナノ粒子は１０００ｎｍ以下（オプションとして１０〜１０００ｎｍの範囲）の直径を有し、５０ｎｍ以下（オプションとして５〜５０ｎｍの範囲）の深さの表面特性を有する。このナノ粒子は、体が圧力波に晒されると体内においてキャビテーションを促進するよう構成される。
【００１６】
本発明は更にがん組織治療用システムを提供する。このシステムは、圧力波源と、組織への送達に使われるナノ粒子と、から成る。このナノ粒子は１０００ｎｍ以下（オプションとして１０〜１０００ｎｍの範囲）の直径を有し、５０ｎｍ以下（オプションとして５〜５０ｎｍの範囲）の深さの表面特性を有する。このナノ粒子は、組織が圧力波源からの圧力波に晒された際、該組織においてキャビテーションを促進するよう構成される。
【００１７】
本発明は更に組織においてキャビテーションを制御する方法を提供する。この方法は、ナノ粒子を組織まで送達する工程と、その組織を圧力波に晒す工程と、から成る。このナノ粒子は１０００ｎｍ以下（オプションとして１０〜１０００ｎｍの範囲）の直径を有し、５０ｎｍ以下（オプションとして５〜５０ｎｍの範囲）の深さの表面特性を有する。
【００１８】
本発明は更に対象物をイメージ化（イメージング）する方法を提供する。この方法は、ナノ粒子を対象物まで送達する工程と、その対象物内で該ナノ粒子がキャビテーションを誘発するよう対象物を圧力波に晒す工程と、検知器を用いてキャビテーションにより発生する圧力波を検知する工程と、検知器からの信号を処理して該対象物の画像かつ／あるいはキャビテーションの領域の画像を生成する工程と、から成る。このナノ粒子は１０００ｎｍ以下（オプションとして１０〜１０００ｎｍの範囲）の直径を有し、５０ｎｍ以下（オプションとして５〜５０ｎｍの範囲）の深さの表面特性を有する。
【００１９】
本発明は更に治療剤が組織まで送達されるのをモニターする方法を提供する。この方法は、治療剤とナノ粒子とを組織まで送達する工程と、その組織内でナノ粒子がキャビテーションを誘発するよう組織を圧力波に晒す工程と、検知器を用いてキャビテーションによって発生する圧力波を検知する工程と、検知器からの信号を処理して送達をモニターする工程と、から成る。このナノ粒子は１０００ｎｍ以下（オプションとして１０〜１０００ｎｍの範囲）の直径を有し、５０ｎｍ以下（オプションとして５〜５０ｎｍの範囲）の深さの表面特性を有する。
【００２０】
本発明は更に治療剤を組織へ送達する方法を提供する。この方法は、治療剤とナノ粒子とを組織まで送達する工程と、その組織を圧力波に晒す工程と、から成る。このナノ粒子は１０００ｎｍ以下（オプションとして１０〜１０００ｎｍの範囲）の直径を有し、５０ｎｍ以下（オプションとして５〜５０ｎｍの範囲）の深さの表面特性を有する。
【００２１】
本発明は更にナノ粒子の位置をマッピングし、治療剤を組織へ送達する方法を提供する。この方法は２つ以上の特徴的な長さスケールのキャビテーション核を有するナノ粒子を使用することで実現される。１つ目の長さスケールは、特定の励起周波数に反応してキャビテーションを誘発する核生成長さスケール（nucleation lengthscale）であって、粒子の位置をイメージングするために用いられる。２つ目の長さスケールは、また別の励起周波数に反応する長さスケール（lengthscale）であって、治療剤の送達を促進する慣性キャビテーション（例えば、ナノ粒子を破裂させる）を引き起こして内包された治療剤を送達する目的で用いられる。ある実施形態においては、２つのグループのナノ粒子からなる混合物を用い、各グループのナノ粒子がいずれか一方の長さスケールの表面特性をそれぞれ有していればよい。別の実施形態では、各粒子が両方の長さスケールの表面特性を有しているナノ粒子を使用してもよい。
【００２２】
好ましい粒子の直径は生理学的要因によって決められる。１０００ｎｍまでの粒子は一般的な微小血管系に容易に取り込まれる（例えば、脳への薬剤送達に用いられる）。しかしながら、約６００ｎｍ以下の粒子については、ＥＰＲ効果（Enhanced Permeability and Retention effect）の影響で、脆くなっている腫瘍血管系に容易に留まる。１００〜３００ｎｍの直径の粒子は腫瘍血管系で取り込まれることが望ましい。したがって、上記のどの場合においても、粒子の直径は８００ｎｍ以下、例えば５０〜８００ｎｍの範囲にあればよい。６００ｎｍ以下の直径、例えば５０〜６００ｎｍの範囲の場合があってもよいし、３００ｎｍ以下の直径、例えば５０〜３００ｎｍの範囲の場合があってもよい。また、直径が少なくとも１００ｎｍあること、例えば１０〜３００ｎｍの範囲にあることが好ましい場合もある。この直径は平均粒径（例えば体積モーメント平均粒径Ｄ４，３（volume moment mean diameter D[4,3]））で計測されてもよい。
【００２３】
粒子は表面特性を有しているが、球状でも部分的球状でもよい。粒子の直径は５０ｎｍ以下、例えば５〜５０ｎｍの範囲にあればよい。表面特性は５０ｎｍ以下、例えば５〜５０ｎｍの範囲の深さ、及び／あるいは５０ｎｍ以下、例えば５〜５０ｎｍの範囲の幅を有していてもよい。これは、ある特定の超音波励起周波数における音響キャビテーションに好ましい核サイズに合致させるためでる。
【００２４】
上記すべての方法やシステムにおいて、超音波の周波数は少なくとも１００ｋＨｚであるとよい。実際、各ケースにおける超音波の周波数は１００ｋＨｚから１０ＭＨｚまでの範囲にあってもよい。各ケースにおいて超音波周波数が少なくとも５００ｋＨｚであってもよいし、５００ｋＨｚから５ＭＨｚまでの範囲にあってもよい。
【００２５】
ナノ粒子は疎水性であってもよい。この疎水性は、主に、そのナノ粒子の外層を構成する材料に何を選択するかによって決まる。したがって、こうした材料は高い接触角、理想的には６０度以上の接触角を有する必要がある。接触角は以下に記載された方法のうちの一つによって計算される。つまり、静的液滴法（static sessile drop method）、動的液滴法（dynamic sessile drop method）、ダイナミック・ウィルヘルミー法（dynamic Wilhelmy method）、シングル・ファイバー・ウィルヘルミー法（single-fiber Wilhelmy method）、そして粉体接触角法（powder contact angle method）である。したがって、二酸化ケイ素と同等あるいはそれ以上の接触角を有する材料が好ましい。
【００２６】
ナノ粒子は薬剤を運搬する。例えば、ナノ粒子は中空であり、薬剤を封入したナノカプセルとしてもよい。あるいは、薬剤がナノ粒子の構造に組み込まれていてもよい。
【００２７】
ナノ粒子はフリーズドライしても、スプレー・フリーズドライしても、スプレー・ドライしてもよい。これは粒子中に薬剤を封入した後に行われる。これにより、要求されたスケール（大きさ）の表面特性を形成することができる。あるいは、その他の表面改質法を用いて、要求されたスケールの表面特性が確実に形成されるようにしてもよい。
【００２８】
各ナノ粒子は内核（コア）の周りに外殻（シェル）を形成することで構成されてもよい。内核としては、例えばポリスチレンが利用できる。外殻の少なくとも一部は二酸化ケイ素あるいは二酸化チタンで形成されてもよい。内核を取り除いて、中空の外殻を形成してもよい。
【００２９】
要求された表面特性を形成するため、外殻は、少なくともその一部が５〜５０ｎｍの範囲の直径を有する粒子によって形成されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明のある実施の形態にかかるナノ粒子の形成方法における工程を示す概略図である。
【図２】本発明のある実施の形態によって形成された内核と外殻とを有するナノ粒子（core-shell nanoparticles）のイメージを示す図である。
【図３】本発明のある実施の形態によって形成された内核と外殻とを有するナノ粒子（core-shell nanoparticles）の更なるイメージを示す図である。
【図４】本発明のある実施の形態によって形成された外殻を有するナノ粒子（shell nanoparticles）の更なるイメージを示す図である。
【図５】様々な物質についてキャビテーション確率をピーク圧の関数として示したグラフである。
【図６】様々な物質についてキャビテーションノイズ放射（cavitation noise emission）をピーク圧の関数として示したグラフである。
【図７】様々な物質についてキャビテーション確率をピーク圧の関数として示したグラフである。
【図８】様々な物質についてキャビテーションノイズ放射をピーク圧の関数として示したグラフである。
【図９】シングル・エマルジョン術で形成された粒子のイメージを示す図である。
【図１０】ショウノウを用いたシングル・エマルジョン術で形成された粒子のイメージを示す図である。
【図１１】ダブル・エマルジョン術で形成された粒子のイメージを示す図である。
【図１２】本発明のある実施の形態によって動作するシステムを図示したものである。
【図１３】本発明のある実施の形態にかかるナノ粒子を含む水、血液、およびナノ粒子を含まない血液、それぞれのキャビテーション閾値を示す図である。
【図１４（ａ）】各コーティング粒子サイズについて、異なる超音波周波数におけるキャビテーション確率をピーク圧の関数として示したグラフである。
【図１４（ｂ）】各コーティング粒子サイズについて、異なる超音波周波数におけるキャビテーション確率をピーク圧の関数として示したグラフである。
【図１４（ｃ）】各コーティング粒子サイズについて、異なる超音波周波数におけるキャビテーション確率をピーク圧の関数として示したグラフである。
【図１５（ａ）】各粒子サイズについて、異なる超音波周波数におけるキャビテーション確率をピーク圧の関数として示したグラフである。
【図１５（ｂ）】各粒子サイズについて、異なる超音波周波数におけるキャビテーション確率をピーク圧の関数として示したグラフである。
【図１５（ｃ）】各粒子サイズについて、異なる超音波周波数におけるキャビテーション確率をピーク圧の関数として示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明の好適な実施の形態について、あくまでも例として、添付の図面を参照しつつ説明する。
【００３２】
本発明において使用されるのに好適なナノ粒子は様々な方法で製造可能だが、そのうちのいくつかの例を以下に記載する。
【００３３】
＜レイヤー・バイ・レイヤー・アセンブリー＞
図１を参照して、本発明の一実施形態にかかるナノ粒子がレイヤー・バイ・レイヤー・アセンブリー法によって製造された。２０〜６００ｎｍのサイズ範囲の好適なナノ粒子（例えば、ポリスチレン、金など）がレイヤー・バイ・レイヤー高分子電解質沈着用のテンプレートとして用意された。
【００３４】
アニオン性テンプレート粒子をソニケーションしつつ溶液に懸濁した後、０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液にカチオン性ポリマーポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド（ＰＤＡＤＭＡＣ）を入れたもので培養する。これにより、図１（ａ）に示されるように、テンプレートの表面にＰＤＡＤＭＡＣが沈着する。この粒子を１３，５００ｘｇで遠心分離機にかけてナノ粒子ペレットを形成し、再びソニケーションしながら脱イオン化水（純水）に懸濁する。粒子をこの状況下で更に２回洗浄し、過剰なＰＤＡＤＭＡＣを除去する。これらの粒子を０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液にアニオン性ポリスチレン・スルホン酸ポリマー（ＰＳＳ）を溶かした溶液中に懸濁し、培養する。これにより、図１（ｂ）に示されるように、陽イオンでコーティングされた表面にＰＳＳが沈着する。
【００３５】
この溶液を再度１３，５００ｘｇで遠心分離機にかけると、図１（ｃ）に示されるようなナノ粒子ペレットが形成される。この粒子を更に２回洗浄し、余分なＰＳＳを除去する。この粒子を、０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液にアニオン性ポリマーＰＤＡＤＭＡＣを溶かした溶液に再び懸濁し、更に３回脱イオン水で洗浄する。これにより、余分な高分子電解質が粒子から除去される。
【００３６】
最後の懸濁は、０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液にコロイド状シリカ（登録商標ＬＵＤＯＸ）を４０％の濃度で溶かした溶液に対して行われる。培養して陽イオンでコーティングされた表面に二酸化ケイ素が沈着した後、図１（ｄ）に示されるように、再び遠心分離・再懸濁のステップを繰り返して粒子を洗浄し、粒子から余分な二酸化ケイ素を除去する。その後この粒子を洗浄し、フリーズドライすると、水分を飛ばし、粒子の表面に空気が閉じ込められることになる。
【００３７】
上述のようにして製造された粒子は内核と外殻を有し、その表面には二酸化ケイ素の粒子が沈着して表面粗さが形成されるため、そのまま使用することができる。しかしながら、上述の内核と外殻とを有し表面が粗いナノ粒子を、焼成したり化学分解したりして核を取り除くと、無機の外殻（二酸化ケイ素／二酸化チタンによる外殻）を有する粒子を製造することもできる。
【００３８】
ある実施の形態では、上述のフリーズドライ工程の前に、該表面が粗いナノ粒子の内核を焼成したり化学分解したりして中空にした。使用されたのは、乾燥だき（ファーナス・ドライング）した後の粒子（焼成、例えばポリスチレン核のナノ粒子）、あるいはフリーズドライの前に脱イオン水もしくは高分子界面活性剤安定溶液（polymeric/surfactant stabilizer solution）に懸濁した粒子（内核である粒子の化学分解）である。
【００３９】
上述した方法の一例として、３００ｎｍの粒子を用意するにあたって、１５０ｕｌ（マイクロリットル）の０．３ｕｍ（マイクロメートル）ポリスチレンラテックスを３０ｍｌのＰＤＡＤＭＡＣ（１ｍｇ／ｍｌ、０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液）で３０分間回転させながら培養した。これにより、ポリスチレン核の表面にポリマーが確実に沈着する。サンプルを１３，５００ｘｇで２０分間遠心分離機にかけた後、超音波洗浄機中で脱イオン水に再分散し、その後さらに２０分間１３，５００ｘｇで遠心分離機にかけた。上記の遠心分離・再懸濁という洗浄サイクルを計３回繰り返した後、３０ｍｌのＰＳＳ溶液（０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液中に１ｍｇ／ｍｌ）に懸濁した。
【００４０】
上述した遠心分離・再懸濁という洗浄サイクルを３回繰り返して洗浄する前に、サンプルを２０分間回転させながら培養した。洗浄後は３０ｍｌの第２ＰＤＡＤＭＡＣ溶液（１ｍｇ／ｍｌ、０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液）中でさらに２０分間再懸濁し、遠心分離・再懸濁の洗浄サイクルをさらに３回繰り返して粒子を洗浄した。最後に、３０ｍｌのＬＵＤＯＸ（登録商標）溶液（０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液中に４０％（ｖ／ｖ）の溶液）に再懸濁して２０分間培養し、最後に３回遠心分離・再懸濁の洗浄サイクルを行った。その後、残っている水分を除去し粒子の表面に空気を閉じ込めるため、ソニケーションしながら１０ｍｌの脱イオン水に粒子を懸濁した後、フリーズドライした。
【００４１】
こうしてできた粒子が図２、３に示される。図２、３からわかるように、粒子は予測通り約３００ｎｍの直径を有していた。二酸化ケイ素の粒子は該ナノ粒子の表面に付着しており、その直径は約１５〜２０ｎｍであった。これにより、ナノ粒子の表面が５〜２０ｎｍの範囲の深さの表面特性を有することになる。たとえば、比較的なめらかな球状のナノ粒子の表面に二酸化ケイ素で部分的に球状が形成されている場合、なめらかな表面上における上記の特徴の少なくとも一部は高さが２〜２０ｎｍの範囲にある。二酸化ケイ素粒子が密接してナノ粒子の表面のほぼ全体を構成しているような場合、各二酸化ケイ素粒子が一つの表面特性を形成し、５〜２０ｎｍの範囲の深さの深さを有する。各二酸化ケイ素粒子の表面自体も小規模な表面特性の表面粗さを有していることが好ましい。
【００４２】
ナノ粒子は、例えば内核の形状における凹凸やレイヤー・オン・レイヤープロセスにおける不均一等により、より大きなスケールの凹凸を有していてもよい。しかしながら、５〜２０ｎｍという範囲内の表面粗さがキャビテーションに対して与える影響を大きく変えるものであってはならない。異なるサイズの二酸化ケイ素粒子が使用された中でも、ナノ粒子はわずかに異なるスケール、例えば５０ｎｍまでの表面粗さを有していてもよい。
【００４３】
上述した内核・外殻を有する凹凸のあるナノ粒子からポリスチレンのテンプレートを焼成して、中空の無機（二酸化ケイ素／酸化チタン）の外殻を有するナノ粒子を用意する場合の例を示す。洗浄し、再懸濁して表面が粗い内核・外殻を有する上述のナノ粒子５ｍｌを大気環境で６００℃まで管理の下で加熱し、その温度のまま４時間維持することでポリスチレンの内核を完全に焼成した。こうして製造された粒子が図４に示される。この図からわかるように、ナノ粒子は中空であり、主に互いに密着した二酸化ケイ素の粒子からなる外殻を有する。この外殻の厚さは粒子２、３個分である。したがって、この場合、表面粗さは、各二酸化ケイ素の粒子の一部が一つの表面特性を形成し、かつ各二酸化ケイ素粒子の直径くらいまでの深さ、つまり、およそ２０ｎｍまでの深さの表面特性を有する。
【００４４】
図５を参照して、様々な物質を１ＭＨｚの治療用超音波に晒し、キャビテーションによって生じた超音波を超音波検知器列で検知してキャビテーション確率を計測した。検証に使用された物質は、淡水、ＬＵＤＯＸ（登録商標）を用いずにレイヤー・バイ・レイヤー法によって製造された３００ｎｍの粒子を含む水、表面粗さを増すためにＬＵＤＯＸ（登録商標）を用いてレイヤー・バイ・レイヤー法で製造された３００ｎｍの粒子を含む水、そして、ＬＵＤＯＸそのもの、である。これより、ナノ粒子が存在するとキャビテーション確率は上がるが、より表面が粗い粒子が更にキャビテーションを助長することがわかる。
【００４５】
図６は、同じ実験において、キャビテーションノイズ放射をピーク圧の関数としてあらわしたものである。
【００４６】
図７は図５と似ているが、ＬＵＤＯＸ（登録商標）を用いて製造された直径が３００ｎｍと６００ｎｍのナノ粒子についてのものである。図８は、図６と同じように、同じ実験の結果がキャビテーション確率で表されている。これより、小さい粒子より大きい粒子の方がキャビテーションが増加していることがわかる。
【００４７】
＜エマルション法＞
本発明の実施の形態にかかるナノ粒子は、シングル・エマルション法もしくはダブル・エマルション法によって製造することもできる。シングル・エマルション法を用いたあるケースの場合、適当な不水溶性ポリマー（例えば、ＰＬＧＡ、ＰＬＡなど）を水と混和しない有機溶媒（例えば、水飽和したジクロロメタンあるいはクロロフォルム）に溶解する。孔形成用物質（例えば、ショウノウ）および／あるいは活性薬剤を追加してもよい。こうしたできた溶液を大容量の含水安定溶液中で乳化し、水中油滴（Ｏ／Ｗ型）エマルションを製造する。
【００４８】
使用される安定剤はたいていポロキサマー、ポリビニル・アルコールなどの界面活性ポリマー、あるいはポリソルベート２０やポリソルベート８０などのＯ／Ｗ型界面活性剤である。エマルションの均質化は、超音波ホモジナイザー、高圧ホモジナイザー、高せん断ホモジナイザーなどを用いて行うことが出来る。こうして、含水安定溶液に有機ポリマーのナノ液滴溶液が分散された、ナノエマルションが製造される。有機溶液と液体安定溶液との体積比は通常１：５から１：１０の間であるが、これに限定されるものではない。
【００４９】
次に、こうしてできたエマルションを大量の水、あるいは水混和性溶媒を水に溶かした低濃度の溶液（例えば、２％のイソプロパノール溶液）に撹拌しながら注ぐ。すると、有機溶媒が内油相から外水相へ拡散され、粒子を固めることが出来る。その後、この粒子を洗浄、フリーズドライして水分を除去し、孔形成用物質を昇華する。
【００５０】
ダブル・エマルション法を用いるケースの場合、（水と混和しない）有機溶媒に不水溶性ポリマー（例えば、ＰＬＡ、ＰＬＧＡなど）加えた有機溶液に、少量の水を乳化する。こうして、油中水型（Ｗ／Ｏ型）エマルションを製造する。有機相は、Ｗ／Ｏ型界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０やポリソルベート８０）、孔形成用物質（例えば、ショウノウ）などを付加的に含んでもよい。水と有機相の体積比は通常１：５から１：１０の間だが、これに限定されるものではない。乳化は、超音波ホモジナイザー、高圧ホモジナイザー、高せん断ホモジナイザーなどを用いて行うことが出来る。こうして、有機溶液中に含水ナノ液滴が分散されたナノエマルションが製造される。
【００５１】
次に、こうしてできた油中水型（Ｗ／Ｏ型）エマルションを含水安定溶液中に乳化して、水中油中水型（Ｗ／Ｏ／Ｗ型）ダブル・エマルションを製造する。使用される安定剤はたいていポロキサマー、ポリビニル・アルコールなどの界面活性ポリマー、あるいはポリソルベート２０やポリソルベート８０などのＯ／Ｗ型界面活性剤である。ダブル・エマルションの均質化には、超音波ホモジナイザー、高圧ホモジナイザー、高せん断ホモジナイザーなどを用いることができる。こうして、ナノエマルションが製造される。一次エマルションと液体安定溶液の体積比は通常１：５から１：１０の間だが、これに限定されるものではない。
【００５２】
つぎに、製造されたダブル・エマルションを大量の水、あるいは水混和性溶媒を水に溶かした低濃度の溶液（例えば、２％のイソプロパノール溶液）に撹拌しながら注ぐ。すると、有機溶媒が内油相から外水相へ拡散され、粒子を固めることができる。この粒子を洗浄、フリーズドライして水分を除去し、孔形成用物質を昇華する。
【００５３】
シングル・エマルションの例
まず、２５０ｍｇのショウノウを１００ｍｌの塩化メチレンに溶解した。次に、２５００ｍｇのＰＬＧＡを１００ｍｌのショウノウ溶液に溶解し、最終油相を製造した。こうしてできたＰＬＧＡ溶液２０ｍｌを４℃で５０ｍｇ／ｍｌのＰＶＡ溶液１００ｍｌに加え、超音波ホモジナイザー（ソニケーター、タイプ７５３３Ａ）を用いて４分間２０Ｗで均質化した。得られたエマルションを２％のイソプロパノール溶液５００ｍｌに注ぎ、３００ｒｐｍでアイスバス上でさらに４時間撹拌して、塩化メチレンを蒸発させて、粒子を固めた。次にこれらのナノ粒子を１５℃で２０分間、７５００ｒｐｍで遠心分離機にかけて集めた。これらの粒子を脱イオン水で３回洗浄した後、再び脱イオン水に懸濁し、フリーズドライのため２０ｍｌの血清が入ったチューブ状のガラス薬瓶に注いだ。フリーズドライはまず−１５℃の一次乾燥温度で、次に＋２５℃の二次乾燥温度で行われた。乾燥中、真空状態を１００ｍトールで一定に保持した。
【００５４】
図９、１０に、前述のシングル・エマルション工程によって製造された粒子の例を示す。これより、前述のソニケーションでは正しいサイズの粒子が製造されたが、ソニケーションせずに製造すると粒子のサイズは大きくなることがわかる。製造された粒子の表面粗さは、上述したレイヤー・バイ・レイヤー法で二酸化ケイ素粒子を沈着させることで増すことができる。
【００５５】
ダブル・エマルションの例
まず、２５０ｍｇのショウノウを１００ｍｌの塩化メチレンに溶解した。次に、２５００ｍｇのＰＬＧＡを１００ｍｌのショウノウ溶液に溶解し、最終油相を製造した。一次油中水型（Ｗ／Ｏ型）エマルションを製造するため、１ｍｌの脱イオン水を２０ｍｌのポリマー溶液に加え、超音波ホモジナイザーを使って３０秒間、２０ｗで超音波を照射した。こうしてできた油中水型（Ｗ／Ｏ型）エマルションを５％のＰＶＡ溶液１００ｍｌ（４℃）に注ぎ、超音波ホモジナイザーを使って２０ｗで均質化して、水中油中水型（Ｗ／Ｏ／Ｗ型）ダブル・エマルションを製造した。このダブル・エマルションを次に２％のイソプロパノール溶液５００ｍｌに注ぎ、アイスバス上でさらに４時間３００ｒｐｍで撹拌して、塩化メチレンを蒸発させて、粒子を固めた。次にこれらのナノ粒子を１５℃で２０分間、７５００ｒｐｍで遠心分離機にかけて集めた。これらの粒子を脱イオン水で３回洗浄した後、再び脱イオン水に懸濁し、フリーズドライのため２０ｍｌの血清が入ったチューブ状のガラス薬瓶に注いだ。フリーズドライはまず−１５℃の一次乾燥温度で、次に＋２５℃の二次乾燥温度で行われた。乾燥中、真空状態を１００ｍトールで一定に保持した。
【００５６】
図１１にダブル・エマルション工程で製造された粒子の例を示す。やはり、ソニケーションでは必要なサイズの粒子が製造されたが、ソニケーションせずに製造すると粒子サイズは大きくなる傾向にあることがわかる。製造された粒子の表面粗さは、上述したレイヤー・バイ・レイヤー法で二酸化ケイ素粒子を沈着させることで増すことができる。
【００５７】
＜ナノプレシピテーション（溶媒置換）＞
この方法においては、不水溶性ポリマー物質（例えば、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ）を水混和性の有機溶媒に溶解する。この有機溶媒にポリマーを溶解した溶液に、少量の、水混和性でも水不混和性でもよいが、別の有機溶媒（例えば、安息香酸ベンジル、ベンジル・アルコールなど）、液体油、孔形成用物質（例えば、ショウノウ）を付加的に入れてもよい。更に、疎水性の活性治療成分を溶液に加えることもできる。この有機溶液を大量の含水安定溶液に常時撹拌しながら通常１：１０の体積比（これには限定されない）になるよう追加することで、粒子を製造することができる。ナノプレシピテーション（溶媒置換）メカニズムにより、ナノ粒子が自然発生的に製造される。安定剤としては、界面活性ポリマーが適している。例えば、０．５％から５％までの濃度のポリビニル・アルコール、ポロキサマーなどである。表面が粗く、表面や内部にエアー・ポケットを有する粒子を製造するため、粒子をフリーズドライして水分を除去し、孔形成用物質を昇華する。
【００５８】
ナノプレシピテーションの例
１２５ｍｇのポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）ポリマー（ＰＬＡ）をまずアセトン（２５ｍｌ）に溶解した。０．５ｍｌの安息香酸ベンジルあるいはベンジル・アルコールと、１２．５ｍｇのショウノウとを次に該アセトン溶液に追加した。こうしてできた有機溶液を、ポロキサマー２５０ｍｇを含む５０ｍｌの水に磁力撹拌しながら注いだ。次に、水相に拡散されたアセトンを環境気圧の下で、アイスバス中で４℃で撹拌して取り除いた。１５℃で粒子を遠心分離し、上澄みを捨て、粒子を再び脱イオン水に懸濁して立体安定剤を取り除いた。この工程を３回繰り返した。最終的な粒子懸濁液をフリーズドライして、ドライ・ナノカプセルを製造し、粒子製剤中に存在していたショウノウを昇華した。ショウノウを昇華すると、孔が形成され、フリーズドライ後の表面粗さが増加する。
【００５９】
＜スプレー・フリーズ・ドライング＞
この方法では、あらゆるスプレー・フリーズ・ドライング形式によって初期溶液（イニシャル・リキッド・フィード）からナノカプセルを形成する。この初期溶液は、０．０１％（あるいはそれ以下）から１０％の濃度の粒子成分（複数も可）を含む溶液、エマルション、あるいは懸濁液からなる。特に、この初期溶液は水溶液でも、懸濁液でも、有機溶剤でもよく、溶液であれ懸濁液であれ、薬理学的活性成分や必要な賦形剤あるいは安定剤などを含む粒子成分が含まれていてもよい。初期溶液はシングル・エマルション、ダブル・エマルション、マイクロ・エマルションなどのエマルションの類でもよい。エマルションには、適切な溶媒や分散媒を一つあるいは複数用いてもよい。該溶媒や分散媒には、ｐＨ、張度、粘度、表面張力などの初期溶液の特性調整のため、適当な物質が溶解されていてもよい。初期溶液からスプレー・フリーズ・ドライングした後、超音波均質化（ソニケーション）、圧縮、ミリング（milling）、ろ過、スプレー・コーティング、ナノカプセル化などの処理を更に行ってもよい。また、上述した技術を組み合わせて粒子を製造してもよい。
【００６０】
スプレー・フリーズ・ドライングの例１
低い濃度（例えば１％未満）の生分解性ポリマー（例えばＰＬＧＡ）を有機溶媒（アセトニトリルなど）に溶かした後、その溶液を適当なノズルシステム（超音波アトマイザー、二流体ノズル、単分散液滴ジェネレーターなど）を用いて適当な低温液体（液体窒素など）が入ったコンテナに噴霧化する。液滴が低温液体との衝突で瞬時に凍結したら、フリーズ・ドライング・システムの事前に冷却されていた棚に運ぶ。フリーズ・ドライングは低温で、かつ圧力をかけて、つまり、溶媒の溶融温度以下、製剤の崩壊温度以下で行われる。フリーズ・ドライングの後、乾燥ナノ粒子はその後の処理なくそのまま使ってもよいし、あるいは、スプレー・フリーズ・ドライング後の生分解性パウダーを適切な分散媒に懸濁した後数分間超音波を照射して均質化することで更に粒子サイズを小さくしてもよい。後者の処理のあとは、更にフリーズ・ドライングするなどの乾燥処理を適宜行って分散媒を除去すると、乾燥物が得られる。
【００６１】
スプレー・フリーズ・ドライングの例２
２０ｍｇのＰＬＡを、磁気撹拌器を使って常時撹拌しながら２０ｇのｐ−キシレンに溶解する。当該溶液を、液体窒素で満たされたステンレス製のボウルに、６０ｋＨｚ超音波ノズル（米国Ｓｏｎｏｔｅｋ社製）を使って１ｍｌ／ｍｉｎの流量で噴霧し、スプレー・フリージングを行った。ノズルのパワーは４ワットに設定した。スプレー・フリージング工程の最後に、スプレー・フリージングされた液滴が入ったステンレス製のボウルに液体窒素を注ぎ、実験室のフリーズ・ドライング・システム（米国、ＦＴＳ社製、Ｌｙｏｓｔａｒ  １）の事前に冷却されていた棚（−４０℃）に運んだ。フリーズ・ドライングはまず−１５℃の初期乾燥温度で、次に＋２５℃の二次乾燥温度で行われた。フリーズ・ドライング工程の最後に、最終的な乾燥パウダーは、湿度管理された（２０℃で相対湿度０．５％）グローブボックス中で、ステンレス製のボウルから２０ｍｌの血清が入ったチューブ状のガラス薬瓶に移された。
【００６２】
図１２を参照して、上述した方法のいずれかに基づいて製造された所望のサイズと表面粗さを有する粒子は、超音波照射下で組織においてキャビテーションを誘発するのに使用することができる。キャビテーションはイメージング用に、あるいは治療剤を組織まできちんと送達するために利用される。図１２はこれら両方の機能を実行する超音波システムを示す。この超音波システムは、超音波源としての超音波トランスデューサー１０、それを制御するコントローラーとしてのコンピューター１２から構成される。超音波検知器列１４は超音波トランスデューサー１０の中央に配置され、組織におけるキャビテーションによって放射される高周波の超音波を受動検知するよう構成されている。ディスプレイ画面１６はコンピューター１２に接続される。コンピューター１２はメモリとプロセッサを有しており、超音波トランスデューサー１０の操作を制御し、超音波検知器列１４からの信号を処理し、ディスプレイ画面１６上に表示するためのイメージを生成するよう構成される。超音波トランスデューサー１０は超音波照射領域１８を照射するよう構成されており、ナノ粒子源２０は、超音波照射領域１８内の所定の位置で、患者２２、この例の場合は患者の肝臓にナノ粒子を点滴することできるようになっている。コンピューター１２は超音波トランスデューサー１０を制御して１００ｋＨｚ〜１０ＭＨｚまでの範囲のいかなる超音波をも発生させることができる構成になっている。
【００６３】
ある実施の形態においては、ナノ粒子を患者の肝臓に点滴する。そのサイズのため、粒子は肝臓中のどんな癌腫瘍の血管系中にも入り込み、蓄積される。次にコンピューター１２で超音波トランスデューサー１０を制御して超音波照射領域１８を超音波照射し、超音波検知器列１４からの信号を処理する。ナノ粒子の表面粗さによりキャビテーションが誘発されるが、粒子が蓄積されている場所において集中して起こるため、キャビテーションはコンピューター１２によって検知され、イメージ化される。ナノ粒子は上述したいずれの方法によっても製造できる。
【００６４】
別の実施の形態においては、ナノ粒子は治療剤と混合される。治療剤は同等サイズのナノ粒子として形成されても、あるいは同等サイズのナノ粒子によって運搬されてもよいが、該ナノ粒子は、最適に摂取されるべく、５０〜８００ｎｍ、好ましくは１００〜６００ｎｍのサイズを有する。治療剤はどんな種類の薬剤でもよいが、例えば、抗がん剤、ＳｉＲＮＡ、アデノウィルス・ベクター、その他の小さな微粒子薬剤などが挙げられる。この場合の治療剤を運搬するナノ粒子はキャビテーションを誘発する必要はなく、表面粗さはそれほど重要ではない。混合体は患者に点滴され、高感度超音波ナノ粒子とナノ粒子を運搬する薬剤とは、ともに同じようなサイズであるため、互いに患者の同じ部分に蓄積する傾向がある。ゆえに、超音波トランスデューサー１０による超音波照射がキャビテーションを誘発し、超音波検知器列１４によってイメージ化されることで、該混合体に含まれる高感度超音波ナノ粒子の位置、ひいてはナノ粒子を運搬している薬剤の位置が示されることになる。イメージングはリアルタイムで行われるため、治療対象であるがん組織においてナノ粒子を運搬している薬剤が蓄積するのをリアルタイムでモニターすることができる。したがって、薬剤がターゲット領域に薬剤が届くのをリアルタイムでイメージングすることができる。この実施の形態では、高感度超音波ナノ粒子によって誘発されるキャビテーションが更に薬剤の対象領域への送達を促進することが望ましい。
【００６５】
更なる実施の形態では、治療剤を高感度超音波ナノ粒子内に封入したり、高感度超音波ナノ粒子に運搬させたりすることで、ターゲットとなる場所へ送達する。この場合、ナノ粒子を運搬する薬剤自体が、その表面粗さのため、超音波を照射された際にキャビテーションを誘発する。ナノ粒子によって誘発されたキャビテーションをイメージングすることで、薬剤が送達されるのをモニターすることが可能となる。同時に、キャビテーションはターゲットとなる場所に薬剤を送達しやすくする。
【００６６】
更なる実施の形態にかかる方法においては、ナノ粒子の場所のマッピング、および組織への薬剤の送達の助長／マッピングを行う。この場合、使用される薬剤を送達するナノ粒子は、それぞれが２種類の異なる深さの表面特性を有する。ナノ粒子が患者に点滴される間、２つのうち１つ目の特徴サイズ（深さあるいはその他のスケール）にマッチした超音波をナノ粒子に照射してキャビテーションを引き起こす。このキャビテーションを上述のようにイメージ化して、点滴の過程をモニターすることができる。次に、所望の位置にナノ粒子が蓄積されたら、２つ目の深さやスケールの表面特性に合った、２つ目の異なる周波数の超音波を照射する。これにより、最初の超音波照射（インソネーション）時とは異なる特性（例えば異なるサイズ）のキャビテーション・バブルが発生し、ナノ粒子の崩壊を引き起こす。
【００６７】
図１３を参照して、ナノ粒子は上述のレイヤー・バイ・レイヤー法で製造され、粒子サイズは３００ｎｍ、コーティング粒子は２８ｎｍである。この粒子を含む水、この粒子を含む血液、粒子を含まない血液、それぞれのサンプルに１ＭＨｚで超音波を照射した。結果は、粒子を含まない血液と比べると、粒子を含んだ血液および水において、キャビテーション閾値は大幅に低かった。これは、血漿タンパクでコーティングされた場合でも、ナノ粒子の疎水性や表面粗さは影響を受けないことを示唆している。
【００６８】
図１４（ａ）を参照して、同等の粒子（内核サイズ３００ｎｍ、コーティング粒子１５ｎｍ）を水に入れ、５０８ｋＨｚ、１．０６７ＭＨｚ、１．６８２ＭＨｚ、３．４６ＭＨＺで超音波を照射した。ピーク圧の増加に伴い、キャビテーションが誘発されたが、５０８ｋＨｚのピーク圧が最も低く、１．０６７ＭＨｚが次に若干高く、１．６８２ＭＨｚがより高く、３．４６ＭＨＺがまた少し高かった。
【００６９】
図１４（ｂ）を参照して、コーティング粒子のサイズが２８ｎｍである以外は同じ粒子を用いて同様の計測を行った。図からわかるように、限界圧力の減少は、特に１．６８２ＭＨｚでは、ほとんど見られなかった。
【００７０】
図１４（ｃ）を参照して、コーティング粒子のサイズが７ｎｍである以外は同じ粒子を用いて同様の計測を行った。図からわかるように、すべての周波数について限界圧力の減少が大きく見られた。
【００７１】
３．４６ＭＨＺにおける実験結果を３００ｎｍ内核、７ｎｍコーティングの場合と３００ｎｍ内核２８ｎｍコーティングの場合とで比較すると、圧が低い場合、７ｎｍコーティングの場合にキャビテーション確率が大幅に増加した。これは、同じテンプレート（核粒子サイズ）の曲線においては、コーティング粒子が小さいほど、より小さな核（ヌクレイ）を閉じ込めることができることを示唆している。核（ヌクレイ）は、小さいほど、より高い周波数で慣性キャビテーションを引き起こすのに適している、
【００７２】
図１５（ａ）を参照して、同等の粒子（今度は内核サイズが５００ｎｍ、コーティング粒子が２８ｎｍ）を用意して水に入れ、５０８ｋＨｚ、１．０６７ＭＨｚ、１．６８２ＭＨｚ、３．４６ＭＨＺで超音波を照射した。図１４ａの結果と同じように、周波数が小さいほど限界圧力が大きく減少することがわかる。
【００７３】
図１５（ｂ）を参照して、今度は内核サイズを６００ｎｍに変更したが、他のパラメータは同じである。周波数が高いほど限界圧力が更に大きく減少することがわかる。図１５（ｃ）を参照して、核サイズが８００ｎｍの場合、３．４６ＭＨＺで限界圧力の更なる減少がみられる。
【００７４】
１５ｎｍコーティングのすべての内核サイズについて、３．４６ＭＨＺにおける結果をみると、テンプレート（核）サイズが３００ｎｍから５００ｎｍ、８００ｎｍと大きくなるにつれて、より低い圧力においてキャビテーション確率が高くなる（つまり、慣性キャビテーションがより容易に引き起こされる）。これは、より大きなテンプレートに由来する減少曲線が、より小さな核（ヌクレイ）、つまり、小さいほど、より高い周波数で慣性キャビテーションを引き起こすのに適している核（ヌクレイ）を閉じ込めることができることを強く示唆している。
【符号の説明】
【００７５】
１０    超音波トランスデューサー
１２    コンピューター
１４    超音波検知器列
１６    ディスプレイ画面
１８    超音波照射領域
２０    ナノ粒子源
２２    患者
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４（ａ）】
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【図１４（ｂ）】
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【図１４（ｃ）】
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【図１５（ａ）】
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【図１５（ｂ）】
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【図１５（ｃ）】
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【国際調査報告】
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