(57)【要約】  前立腺癌である、または前立腺癌であったヒト対象での前立腺癌の転移のリスクを決定する方法が本明細書に開示されている。その方法は、本明細書に開示した転移遺伝子シグネチャー・セットの遺伝子および／またはゲノム領域の細胞当たりのコピー数を対象の前立腺試料中で検出すること、ならびに非癌性の細胞での細胞当たりのコピー数と比較してシグネチャー・セットの遺伝子および／またはゲノム領域の細胞当たりのコピー数の変化を決定し、それにより前立腺癌転移のリスクを決定することに基づいている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺癌である、または前立腺癌であったヒト対象での前立腺癌の転移のリスクを決定する方法であって、
（ａ）対象から前立腺サンプルを得る工程、
（ｂ）ＰＰＰ３ＣＣゲノム領域、ＳＬＣＯ５Ａ１ゲノム領域、ＳＬＣ７Ａ５ゲノム領域、ＳＬＣ７Ａ２ゲノム領域、ＣＲＩＳＰＬＤ２ゲノム領域、ＣＤＨ１３遺伝子、ＣＤＨ８遺伝子、ＣＤＨ２遺伝子、ＡＳＡＨ１ゲノム領域、ＫＣＮＢ２ゲノム領域、ＫＣＮＨ４ゲノム領域、ＣＴＤ８遺伝子、ＪＰＨ１ゲノム領域、ＭＥＳＴゲノム領域、ＮＣＡＬＤゲノム領域、ＣＯＬ１９Ａ１遺伝子、ＭＡＰ３Ｋ７ゲノム領域、ＹＷＨＡＧ遺伝子、ＮＯＬ４ゲノム領域およびＥＮＯＸ１遺伝子からなる転移遺伝子シグネチャー・セットの少なくとも１２個の遺伝子および／またはゲノム領域の細胞当たりのコピー数を決定する工程、
（ｃ）非癌性の細胞での細胞当たりのコピー数と比較して、少なくとも１２個の遺伝子および／またはゲノム領域のそれぞれに関する細胞当たりのコピー数の変化を決定する工程、ならびに
（ｄ）工程（ｃ）で決定したコピー数変化（ＣＮＡ）に基づいて前立腺癌転移のリスクを決定する工程、
を含む、上記方法。
【請求項２】
少なくとも１２個の遺伝子および／またはゲノム領域は、ＰＰＰ３ＣＣゲノム領域、ＳＬＣＯ５Ａ１ゲノム領域、ＳＬＣ７Ａ５ゲノム領域、ＳＬＣ７Ａ２ゲノム領域、ＣＲＩＳＰＬＤ２ゲノム領域、ＣＤＨ１３遺伝子、ＣＤＨ８遺伝子、ＣＤＨ２遺伝子、ＡＳＡＨ１ゲノム領域、ＫＣＮＢ２ゲノム領域、ＫＣＮＨ４ゲノム領域およびＣＴＤ８遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１２個の遺伝子および／またはゲノム領域は、前記転移遺伝子シグネチャー・セットの遺伝子およびゲノム領域の全てを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＳＬＣＯ５Ａ１ゲノム領域、ＫＣＮＢ２ゲノム領域、ＫＣＮＨ４ゲノム領域、ＪＰＨ１ゲノム領域、ＮＣＡＬＤゲノム領域またはＹＷＨＡＧ遺伝子の何れかに関する細胞当たりのコピー数の増加は前立腺癌転移のリスクの増加と相関し；ＰＰＰ３ＣＣゲノム領域、ＳＬＣ７Ａ５ゲノム領域、ＳＬＣ７Ａ２ゲノム領域、ＣＲＩＳＰＬＤ２ゲノム領域、ＣＤＨ１３遺伝子、ＣＤＨ８遺伝子、ＣＤＨ２遺伝子、ＡＳＡＨ１ゲノム領域、ＣＴＤ８遺伝子、ＭＥＳＴゲノム領域、ＣＯＬ１９Ａ１遺伝子、ＭＡＰ３Ｋ７ゲノム領域、ＮＯＬ４ゲノム領域またはＥＮＯＸ１遺伝子の何れかに関する細胞当たりのコピー数の減少は前立腺癌転移のリスクの増加と相関する、請求項１または３に記載の方法。
【請求項５】
ＰＰＰ３ＣＣゲノム領域は、遺伝子ＰＰＰ３ＣＣ、ＫＩＡＡ１９６７、ＢＩＮ３、ＳＯＲＢＳ３、ＰＤＬＩＭ２、ＲＨＯＢＴＢ２、ＳＬＣ３９Ａ１４、ＥＧＲ３およびＣ８ｏｒｆ５８を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＳＬＣＯ５Ａ１ゲノム領域は、遺伝子ＳＬＣＯ５Ａ１、ＳＵＬＦ１、ＮＣＯＡ２、ＣＰＡ６、Ｃ８ｏｒｆ３４、ＰＲＤＭ１４およびＰＲＥＸ２を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＳＬＣ７Ａ５ゲノム領域は、遺伝子ＳＬＣ７Ａ５、ＣＡ５Ａ、ＢＡＮＰ、ＫＬＨＤＣ４、ＣＹＢＡ、ＪＰＨ３、ＺＦＰＭ１、ＳＮＡＩ３、ＺＣ３Ｈ１８、ＭＶＤ、ＩＬ１７Ｃ、Ｃ１６ｏｒｆ８５およびＲＮＦ１６６を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＳＬＣ７Ａ２ゲノム領域は、遺伝子ＳＬＣ７Ａ２、ＭＴＭＲ７およびＭＵＴＳ１を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＣＲＩＳＰＬＤ２ゲノム領域は、遺伝子ＣＲＩＳＰＬＤ２、ＺＤＨＨＣ７、ＫＩＡＡ０５１３、ＫＬＨＬ３６およびＵＳＰ１０を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＡＳＡＨ１ゲノム領域は、遺伝子ＡＳＡＨ１およびＰＣＭ１を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＫＣＮＢ２ゲノム領域は、遺伝子ＫＣＮＢ２、ＥＹＡ１、ＸＫＲ９およびＴＲＰＡ１を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＫＣＮＨ４ゲノム領域は、遺伝子ＫＣＮＨ４、ＲＡＢ５Ｃ、ＤＨＸ５８、ＫＡＴ２ＡおよびＨＳＰＢ９を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＪＰＨ１ゲノム領域は、遺伝子ＪＰＨ１、ＨＮＦ４Ｇ、ＣＲＩＳＰＬＤ１、ＰＩ１５およびＧＤＡＰ１を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＭＥＳＴゲノム領域は、遺伝子ＭＥＳＴ、ＣＯＰＧ２、ＣＰＡ５、ＣＰＡ２、ＣＰＡ１、ＣＰＡ４およびＴＳＧＡ１４を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＮＣＡＬＤゲノム領域は、遺伝子ＮＣＡＬＤ、ＺＮＦ７０６、ＧＲＨＬ２およびＹＷＨＡＺを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＭＡＰ３Ｋ７ゲノム領域は、遺伝子ＭＡＰ３Ｋ７およびＥＰＨＡ７を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ＮＯＬ４ゲノム領域は、遺伝子ＮＯＬ４およびＤＴＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
表６に列挙した少なくとも１個の追加の遺伝子またはゲノム領域の細胞当たりのコピー数を決定することを更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１個の追加の遺伝子またはゲノム領域は、表６に列挙した２０個の遺伝子および／またはゲノム領域を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記２０個の遺伝子および／またはゲノム領域は、表６中の２１〜４０に順位付けられた遺伝子およびゲノム領域である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
サンプル中に存在するゲノムＤＮＡの遺伝子またはゲノム領域とハイブリダイズする核酸プローブを使用して、遺伝子またはゲノム領域のコピー数を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
アレイフォーマットでハイブリダイゼーションを行う、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
転移能スコア：
【数１】
2014513957.tif 000048
（式中、転移シグネチャー・セットの各遺伝子に関するロジスティック調整Ｚスコア（Ｚ調整）は表６に記載されており、シグネチャーおよびサンプルのＣＮＡが同じ方向にある場合には、係数（Ｄｉｒ）は１になり；それらが反対方向にある場合には、係数は−１になり；遺伝子に関してコピー数の変化が検出されない場合には、その遺伝子に関する係数＝０）の算出；ならびにスコアの増加が転移のリスクの増加と相関する転移能スコアと対照値との比較に基づいてリスクを決定する、請求項４に記載の方法。
【請求項２４】
前立腺癌である、または前立腺癌であったヒト対象での前立腺癌の転移のリスクを決定するためのキットであって、ＰＰＰ３ＣＣゲノム領域、ＳＬＣＯ５Ａ１ゲノム領域、ＳＬＣ７Ａ５ゲノム領域、ＳＬＣ７Ａ２ゲノム領域、ＣＲＩＳＰＬＤ２ゲノム領域、ＣＤＨ１３遺伝子、ＣＤＨ８遺伝子、ＣＤＨ２遺伝子、ＡＳＡＨ１ゲノム領域、ＫＣＮＢ２ゲノム領域、ＫＣＮＨ４ゲノム領域、ＣＴＤ８遺伝子、ＪＰＨ１ゲノム領域、ＭＥＳＴゲノム領域、ＮＣＡＬＤゲノム領域、ＣＯＬ１９Ａ１遺伝子、ＭＡＰ３Ｋ７ゲノム領域、ＹＷＨＡＧ遺伝子、ＮＯＬ４ゲノム領域およびＥＮＯＸ１遺伝子からなる転移遺伝子シグネチャー・セットの少なくとも１２個の遺伝子および／またはゲノム領域と特異的にハイブリダイズする複数の核酸プローブを含む、上記キット。
【請求項２５】
前記転移遺伝子シグネチャー・セットの２０個の遺伝子および／またはゲノム領域の全てと特異的にハイブリダイズする複数の核酸プローブを含む、請求項２４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年４月２８日に出願した米国仮出願第６１／４７９，９１４号の優先権の利益を主張し、その全体の内容は参照により本明細書に組み入れる。
【０００２】
本開示は転移遺伝子シグネチャーに関する。より具体的には、本開示は、転移において出現頻度の高い遺伝子に関するコピー数変化（ＣＮＡ）を同定しており、このＣＮＡは、原発性腫瘍が転移するかどうかを予測する根拠としての役割を果たす。
【背景技術】
【０００３】
前立腺癌は一般的な公衆衛生問題である。２０１０年には、この疾患は推定２１７，７３０人の男性で診断されており（全ての男性の癌の２８％）、この疾患により３２，０５０人が死亡している（男性の癌による死亡の１１％）（非特許文献１）。治療しないまま放置すると、前立腺癌の大部分は数十年にわたって無症状および不活性なままである（非特許文献２）。根治的前立腺摘除術または放射線療法で治療した場合、転移のリスクは減少するが、勃起不全、尿失禁および直腸出血が発症して患者の生活の質に影響を及ぼす可能性がある。転移性疾患を発症するであろう患者を正確に決定することは現在では困難であることから、積極的な治療が必要ではない可能性がある場合でも、医師は、中期から末期の局所性疾患を有する患者を積極的に治療する。臨床的パラメータ、例えば前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の血清濃度、切除縁を超える拡大、精嚢の浸潤、被膜を超える拡大、グリーソン（Ｇｌｅａｓｏｎ）スコア、前立腺の重量、人種および手術の年齢が、局所再発を予測するための従来のノモグラムで用いられる（非特許文献３）が、遠位部位への疾患の進行の予測のために、局所再発、したがってこれらのパラメータの有効性には限界がある（非特許文献４）。局所的な前立腺癌が転移する可能性を正確に予測する頑健なリスク・モデルを開発することにより、高リスクの症例における積極的な治療が正当化され、不活性な疾患を有する男性の生活の質が高められるだろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊｅｍａｌ他、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ５９（４）：２２５〜４９頁（２００９）
【非特許文献２】Ｋｌｏｔｚ他、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  （２０１０）２８：１２６〜３１頁
【非特許文献３】Ｏｈｏｒｉ他、Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ  １７（３）：３４９〜３５９頁（２００４）
【非特許文献４】Ｎａｋａｇａｗａ他、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ３（５）：ｅ２３１８頁（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本開示は、前立腺癌である、または前立腺癌であったヒト対象での前立腺癌の転移のリスクを決定する方法に関する。その方法は、コピー数変化が転移において出現頻度の高い、転移シグネチャー遺伝子およびゲノム領域の同定に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一実施形態において、転移遺伝子シグネチャー・セットは、表６に示す少なくとも上位８０個の遺伝子およびゲノム領域を含む。別の実施形態において、転移遺伝子シグネチャー・セットは、表６に示す少なくとも上位４０個の遺伝子およびゲノム領域を含む。更に別の実施形態において、転移遺伝子シグネチャー・セットは、表６に示す少なくとも上位２０個の遺伝子およびゲノム領域を含む。更に別の実施形態において、転移遺伝子シグネチャー・セットは、表６に示す少なくとも上位１２個の遺伝子およびゲノム領域を含む。
【０００７】
特定の実施形態において、本明細書に開示した方法は、表６に列挙した上位２０個の遺伝子およびゲノム領域からなる転移遺伝子シグネチャー・セットの少なくとも１２個の遺伝子および／またはゲノム領域の細胞当たりのコピー数を対象の前立腺サンプル中で決定すること；非癌性の細胞での細胞当たりのコピー数と比較して、少なくとも１２個の遺伝子および／またはゲノム領域のそれぞれに関する細胞当たりのコピー数の変化を決定すること；ならびに決定したコピー数変化（ＣＮＡ）に基づいて前立腺癌の転移のリスクを決定することを含む。
【０００８】
一実施形態において、解析される少なくとも１２個の遺伝子および／またはゲノム領域は、上位１２個の遺伝子およびゲノム領域、即ちＰＰＰ３ＣＣゲノム領域、ＳＬＣＯ５Ａ１ゲノム領域、ＳＬＣ７Ａ５ゲノム領域、ＳＬＣ７Ａ２ゲノム領域、ＣＲＩＳＰＬＤ２ゲノム領域、ＣＤＨ１３遺伝子、ＣＤＨ８遺伝子、ＣＤＨ２遺伝子、ＡＳＡＨ１ゲノム領域、ＫＣＮＢ２ゲノム領域、ＫＣＮＨ４ゲノム領域、およびＣＴＤ８遺伝子である。
【０００９】
別の実施形態において、解析される少なくとも１２個の遺伝子および／またはゲノム領域は、表６に列挙した上位２０個の遺伝子およびゲノム領域、即ちＰＰＰ３ＣＣゲノム領域、ＳＬＣＯ５Ａ１ゲノム領域、ＳＬＣ７Ａ５ゲノム領域、ＳＬＣ７Ａ２ゲノム領域、ＣＲＩＳＰＬＤ２ゲノム領域、ＣＤＨ１３遺伝子、ＣＤＨ８遺伝子、ＣＤＨ２遺伝子、ＡＳＡＨ１ゲノム領域、ＫＣＮＢ２ゲノム領域、ＫＣＮＨ４ゲノム領域、ＣＴＤ８遺伝子、ＪＰＨ１ゲノム領域、ＭＥＳＴゲノム領域、ＮＣＡＬＤゲノム領域、ＣＯＬ１９Ａ１遺伝子、ＭＡＰ３Ｋ７ゲノム領域、ＹＷＨＡＧ遺伝子、ＮＯＬ４ゲノム領域、およびＥＮＯＸ１遺伝子の全てを含む。
【００１０】
本明細書に開示した方法によれば、ＳＬＣＯ５Ａ１ゲノム領域、ＫＣＮＢ２ゲノム領域、ＫＣＮＨ４ゲノム領域、ＪＰＨ１ゲノム領域、ＮＣＡＬＤゲノム領域またはＹＷＨＡＧ遺伝子の何れかに関する細胞当たりのコピー数の増加は前立腺癌転移のリスクの増加と相関し；ＰＰＰ３ＣＣゲノム領域、ＳＬＣ７Ａ５ゲノム領域、ＳＬＣ７Ａ２ゲノム領域、ＣＲＩＳＰＬＤ２ゲノム領域、ＣＤＨ１３遺伝子、ＣＤＨ８遺伝子、ＣＤＨ２遺伝子、ＡＳＡＨ１ゲノム領域、ＣＴＤ８遺伝子、ＭＥＳＴゲノム領域、ＣＯＬ１９Ａ１遺伝子、ＭＡＰ３Ｋ７ゲノム領域、ＮＯＬ４ゲノム領域またはＥＮＯＸ１遺伝子の何れかに関する細胞当たりのコピー数の減少は前立腺癌転移のリスクの増加と相関する。
【００１１】
サンプル中に存在するゲノムＤＮＡの遺伝子またはゲノム領域とハイブリダイズする核酸プローブを使用して、遺伝子またはゲノム領域のコピー数を決定することができる。例えばアレイフォーマットでハイブリダイゼーションを行うことができる。
【００１２】
転移能スコア（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｓｃｏｒｅ）：
【数１】
2014513957.tif 000002
（式中、転移シグネチャー・セットの各遺伝子に関するロジスティック補正Ｚスコア（ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ａｄｊｕｓｔｅｄ  Ｚ−ｓｃｏｒｅ）（Ｚ調整）は表６に記載されており、シグネチャーおよびサンプルのＣＮＡが同じ方向にある場合には、係数（Ｄｉｒ）は１になり；それらが反対方向にある場合には、係数は−１になり；遺伝子に関してコピー数の変化が検出されない場合には、その遺伝子に関する係数＝０）の算出；ならびにスコアの増加が転移のリスクの増加と相関する転移能スコアと対照値との比較に基づいて転移のリスクを決定することができる。
【００１３】
前立腺癌の転移のリスクを決定する方法を行うための診断キットを本明細書に更に開示する。そのキットは、本明細書に開示した１個またはそれ以上の転移シグネチャー遺伝子およびゲノム領域に結合する核酸プローブ、ならびに別のアッセイ試薬を含むことができる。核酸プローブを固体支持体、例えばマイクロアレイ・スライド上に設けることができる。キットはまた、別の材料、例えば上記方法を行うための指示書またはプロトコールを含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】解析に関わる全てのサンプルに関する転移能スコアを示すボックスプロットである。全ての高リスク腫瘍を左側の３つのボックス（転移、転移に進行した原発性腫瘍、およびリンパ節陽性原発性腫瘍）に示し、未知の対照原発性腫瘍および公的に入手可能な細胞株のデータを右側のボックスに示す。リンパ節陽性ボックスにおける「＋」記号はＭＳＫデータセットのそれらのサンプルを表し、２個のリンパ節陽性コホートの間に差異がないことを示す。対照原発性腫瘍プロットにおける「Ｘ」記号は、選択した低リスク原発性腫瘍（少なくとも８０ヶ月にわたって生化学的な再発（ＰＳＡ）がない個体）を表す。
【図２】左側のグラフは、転移能スコアを使用する、転移に進行した原発性腫瘍の予測に関するＲＯＣ曲線を示すグラフである。この予測の作成に使用したモデルを、データのサンプルのランダムな７５％を使用して実行し、残りの２５％（１３個の既知のｍＰＴおよび３９個の対照原発性腫瘍）を使用して予測を実行した。ランダム・モデルを対角線で示す（ＡＵＣ＝０．５）。十字は、生存解析に関するデータを分けるのに使用したカット・ポイントを示す（右側のグラフに示す）。右側のグラフは、無転移の確率を示しているＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率曲線を示すグラフである。転移能スコアによりデータを半分に分割し、進行状況および経過観察期間を評価した。ログランク検定（ｐ値）で高リスクのサンプル群と低リスクのサンプル群とを比較する。
【図３】遺伝子のサブセットのシミュレーションをサンプリングし（ｎ＝２０）、ＡＵＣおよびｒ２が最大化されている領域（ボックス）で出現頻度の高かった遺伝子を、その頻度により順位化したことを示す図である。このシミュレーションを、ｎ＝４０、５０、８０および１００個の遺伝子に関しても行った。
【図４】ソートした遺伝子の階層に基づく拡張ウィンドウ（ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ  ｗｉｎｄｏｗ）−ＡＵＣ（赤）、拡張ウィンドウ−ｒ２（黒）を示すグラフである。
【図５】ＲＯＣ曲線を示すグラフである（左側の区画）。Ｃｏｘ比例ハザード・モデルのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ描写を示すグラフである（右側の区画）。
【図６】既に研究したコホート（左側および中央の区画）に対して示したＤｕｋｅコホート検証研究（右側の区画）の原発性腫瘍サンプルについてのＭＰＳスコア（Ｙ軸）のボックスプロットである。
【図７】ＭＳＫおよびＤｕｋｅ検証サンプルの統合ＲＯＣ−ＡＵＣ解析を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示は、偽陽性率を最小化するとともに治療決定の特異度を増加させながら、転移する可能性の高い腫瘍を確実に予測するリスク・モデルを提供する。
【００１６】
リスク・モデルは、転移および後に転移に進行した原発性腫瘍において出現頻度の高かった遺伝子に関するコピー数変化（ＣＮＡ）の同定によって開発された。このＣＮＡは、原発性腫瘍が転移するかどうかを予測する。交差検証解析により８０．５％の予測精度が明らかになっており、転移能スコアのログランク解析は、無転移生存（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）のエンドポイントと有意に関連していることが示されている（Ｐ＝０．０１４）。検証事例は真実のｍＰＴ（１３個の後に遠隔転移に発展した原発性腫瘍）で構成されて、検証対照は、転帰が未知である腫瘍のランダムサンプル（対照ＭＳＫコホートの２５％）由来であった。これらの事例または対照の何れもモデルの訓練に使用しなかった。別に報告されたリスク・モデルとは対照的に、本明細書に開示した、ＣＡＮの研究に基づくリスク・モデルは、中間エンドポイント（例えば進行の生化学マーカー）を使用することなく、臨床的エンドポイントとして遠隔転移の進行を予測する。転移能の予測に寄与する遺伝子およびゲノム領域の階層も決定されている。
【００１７】
したがって、本明細書では、前立腺癌である、または前立腺癌であったヒト対象での前立腺癌の転移のリスクの決定方法が開示されている。本方法は、転移遺伝子シグネチャー・セットの遺伝子およびゲノム領域のコピー数変化（ＣＮＡ）を対象の前立腺サンプル中で決定すること、ならびにＣＮＡを前立腺癌の転移のリスクと相関させることに基づいている。
【００１８】
転移遺伝子シグネチャー
下記実施例でより詳細に記載されているように、転移の遺伝シグネチャーは、２９４個の原発性前立腺腫瘍および５個の独立したコホートからの４９個の前立腺転移におけるコピー数変化についてのゲノムの全体像の研究から本発明者らにより開発されている。転移において出現頻度が高く、原発性腫瘍が転移するかどうかを予測する遺伝子に関する、３６８個のコピー数変化が同定されている。交差検証解析により、８０．５％の予測精度が明らかになっている。
【００１９】
したがって、一実施形態において、本開示は、表６に記載の、本明細書で同定された３６８個の遺伝子を含む転移遺伝子シグネチャー・セットを提供する。
【００２０】
表６に表示されているように、３６８個の遺伝子は多数の「クランプ」を含み、各クランプは「クランプ・インデックス番号（Ｃｌｕｍｐ  Ｉｎｄｅｘ  Ｎｕｍｂｅｒ）」で同定される。本明細書で使用するとき、「クランプ」は染色体上で互いに隣接する遺伝子の群を指しており、前立腺癌の転移に関連して、この遺伝子の群を含むゲノム領域に関してコピー数変化が検出される。マルチメンバー・クランプ（ｍｕｌｔｉ−ｍｅｍｂｅｒ  ｃｌｕｍｐ）は、ドライバー（転移を引き起こすか、または転移により直接的に関与する遺伝子）およびパッセンジャー（転移のドライバー遺伝子が近接するために、転移に間接的に関与する遺伝子）の両方を含むことができる。
【００２１】
本明細書において用語「ゲノム領域」は用語「クランプ」と互換的に使用され、通常は本明細書においてゲノム領域またはクランプ内のメンバー遺伝子の名称と共に使用される。例えば、表６の第１行に列挙したＰＰ３ＣＣ遺伝子はクランプ・インデックス２６に属しており、クランプ・インデックス２６はまた、遺伝子ＫＩＡＡ１９６７、ＢＩＮ３、ＳＯＲＢＳ３、ＰＤＬＩＭ２、ＲＨＯＢＴＢ２、ＳＬＣ３９Ａ１４、ＥＧＲ３およびＣ８ｏｒｆ５８を含む。したがって、クランプ・インデックス２６はまた、本明細書において「ＰＰ３ＣＣゲノム領域」を指す。
【００２２】
３６８個の遺伝子の多くがクランプに属しているが一部の遺伝子は何れのクランプにも属しておらず、コピー数変化は、前立腺癌の転移に関連して、これらの遺伝子のそれぞれに関して特異的に同定される。例えば、多くの他の遺伝子の中でも、表６に示す（クランプ・インデックス欄において「該当なし」）ように、ＣＤＨ１３、ＣＤＨ８、ＣＤＨ２、ＣＴＤ８、ＣＯＬ１９Ａ１、ＹＷＨＡＧおよびＥＮＯＸ１は、何れのクランプにも属さない遺伝子である。
【００２３】
他の実施形態において、本開示は、表６に列挙した少なくとも８０個、少なくとも４０個、少なくとも２０個、または少なくとも１２個の重複しない遺伝子および／またはゲノム領域を含む、より小さい転移遺伝子シグネチャー・セットを提供する。
【００２４】
「重複しない」とは、より小さいシグネチャー・セットを構成するために選択された遺伝子が同じゲノム領域またはクランプに属さないことを意味する。
【００２５】
以下の実施例で詳細に記載しているように、３６８個の遺伝子の完全なセットから得られる転移能スコアはＡＵＣ＝８１％の予測精度となった。この予測に寄与する遺伝子の階層は、予測精度（ＡＵＣ＝８１％）を最大化し、遺伝子のランダムにサンプリングしたサブセットの任意の反復に対する３６８個の遺伝子の転移能スコア間の回帰係数も最大化する遺伝子を同定しようとする手順に基づいて、表６に示すように決定されている。
【００２６】
したがって、一実施形態において、転移遺伝子シグネチャー・セットは、表６に示す少なくとも上位８０個の遺伝子およびゲノム領域を含む。
【００２７】
別の実施形態において、転移遺伝子シグネチャー・セットは、表６に示す少なくとも上位４０個の遺伝子およびゲノム領域を含む。
【００２８】
更に別の実施形態において、転移遺伝子シグネチャー・セットは、表６に示す少なくとも上位２０個の遺伝子およびゲノム領域を含む。
【００２９】
更に別の実施形態において、転移遺伝子シグネチャー・セットは、表６に示す少なくとも上位１２個の遺伝子およびゲノム領域を含む。
【００３０】
コピー数変化（ＣＮＡ）の決定
コピー数変化とは、細胞のゲノム中に存在する遺伝子またはゲノム領域のコピーの数の変動のことである。正常な２倍体細胞は通常、各染色体およびそこに含有される遺伝子の２つのコピーを有している。コピー数変化は、コピー数の増加でもよいしコピー数の減少でもよい。
【００３１】
転移に関連する３６８個の各転移シグネチャー遺伝子に関するコピー数変化の方向は、表６において、欠失および増幅をそれぞれ示す−１または１として同定される。例えば、表６において「−１」と同定されるＰＰ３ＣＣゲノム領域（クランプ・インデックス２６）に関して、このゲノム領域の欠失は、転移性前立腺癌、または後に転移に進行した原発性前立腺癌において出現頻度が高く、したがって前立腺癌の転移のより高いリスクを示す。欠失により前立腺癌の転移のより高いリスクが予測される別の遺伝子およびゲノム領域として、例えばＳＬＣ７Ａ５ゲノム領域、ＳＬＣ７Ａ２ゲノム領域、ＣＲＩＳＰＬＤ２ゲノム領域、ＣＤＨ１３遺伝子、ＣＤＨ８遺伝子、ＣＤＨ２遺伝子、ＡＳＡＨ１ゲノム領域、ＣＴＤ８遺伝子、ＭＥＳＴゲノム領域、ＣＯＬ１９Ａ１遺伝子、ＭＡＰ３Ｋ７ゲノム領域、ＮＯＬ４ゲノム領域およびＥＮＯＸ１遺伝子が挙げられる。一方、表６において「１」と同定されるＳＬＣＯ５Ａ１ゲノム領域（クランプ・インデックス３３）に関して、このゲノム領域の増幅は、転移性前立腺癌、または後に転移に進行した原発性前立腺癌において出現頻度が高く、したがって前立腺癌の転移のより高いリスクを示す。増幅が前立腺癌の転移のより高いリスクを示す別の遺伝子およびゲノム領域として、例えばＫＣＮＢ２ゲノム領域、ＫＣＮＨ４ゲノム領域、ＪＰＨ１ゲノム領域、ＮＣＡＬＤゲノム領域およびＹＷＨＡＧ遺伝子が挙げられる。
【００３２】
所与の遺伝子またはゲノム領域に関してコピー数変化があるかどうかを決定するために、対象とする対象から前立腺サンプルを得る。前立腺サンプルは、対象とする対象の前立腺から採取した細胞または組織サンプルを指しており、サンプルは、ＣＮＡに関して解析されるゲノムＤＮＡを含有する。細胞および組織サンプルを得る方法は当業者に周知であり、その方法として、例えば組織切片、針生検、外科的生検等が挙げられる。癌患者に関して、細胞および組織を腫瘍から得ることができる。更なる解析のために細胞または組織サンプルを処理してサンプル中の核酸を抽出、精製もしくは部分的精製、または濃縮もしくは増幅することができる。
【００３３】
遺伝子およびゲノム領域中のＣＮＡの検出および定量化を可能にする転移シグネチャー遺伝子セットの遺伝子およびゲノム領域に基づいて、核酸プローブが設計される。
【００３４】
一実施形態において、プローブは、転移シグネチャー遺伝子セットの３６８個の遺伝子のフルセットに特異的にハイブリダイズする核酸の集合で構成されている。
【００３５】
別の実施形態において、プローブは、表６に示す上位８０個の遺伝子およびゲノム領域に特異的にハイブリダイズする核酸の集合で構成されている。
【００３６】
更に別の実施形態において、プローブは、表６に示す上位４０個の遺伝子およびゲノム領域に特異的にハイブリダイズする核酸の集合で構成されている。
【００３７】
更に別の実施形態において、プローブは、表６に示す上位２０個の遺伝子およびゲノム領域と特異的にハイブリダイズする核酸の集合で構成されている。
【００３８】
更なる実施形態において、プローブは、表６に示す上位１２個の遺伝子およびゲノム領域に特異的にハイブリダイズする核酸の集合で構成されている。
【００３９】
「特異的にハイブリダイズする」とは、ストリンジェントな条件下で核酸プローブが標的遺伝子またはゲノム領域に優先的に結合し、別の遺伝子またはゲノム領域への結合の程度が低い、または全く結合しないことを意味する。
【００４０】
核酸ハイブリダイゼーションに関連する「ストリンジェントな条件」は当分野で公知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）第１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載されている。通常、高ストリンジェント・ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定のイオン強度およびｐＨでの特定の配列に関する熱的融点（ｔｈｅｒｍａｌ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）よりも約５℃低くなるように選択される。高ストリンジェント・ハイブリダイゼーションの条件の例は、標準ハイブリダイゼーション溶液中での４２℃である。高ストリンジェント洗浄条件の例として、１５分間にわたる６５℃での０．２×ＳＳＣが挙げられる。中程度のストリンジェント洗浄条件の例は、１５分間にわたる４５℃での１×ＳＳＣである。低ストリンジェント洗浄の例は、１５分間にわたる室温から４０℃での４×〜６×ＳＳＣである。
【００４１】
本発明の目的のための核酸プローブは、標的遺伝子またはゲノム領域への特異的なハイブリダイゼーションを可能にする長さである少なくとも１５個のヌクレオチドでなくてはならならず、長さは５０、１００、２００、４００、６００、８００、１０００個もしくはそれ以上のヌクレオチドであることができ、または上に列挙した値の内の任意の２つの値の間の範囲の長さであることができる。標的遺伝子に特異的にハイブリダイズするように設計された核酸プローブは、遺伝子の完全長配列または断片を含むことができる。特定の標的ゲノム領域に特異的にハイブリダイズするように設計された核酸プローブは、少なくともゲノム領域の断片、例えばゲノム領域内の遺伝子（任意の遺伝子）の完全長配列または断片を含むことができる。また、核酸プローブは、特異的ハイブリダイゼーションを可能にするために、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を標的遺伝子と共有している。
【００４２】
サンプルまたはプローブの核酸に付着した１つまたはそれ以上の標識を検出することにより、ハイブリダイズした核酸を検出することができる。当分野で公知の様々な方法により標識を組み込むことができ、その標識として、検出可能な標識、例えば磁気ビーズ、蛍光化合物（例えばテキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質等）、放射性同位体、酵素、比色標識（例えばコロイド金粒子）が挙げられる。他の実施形態において、サンプルまたはプローブの核酸は結合対の一方とコンジュゲートすることができ、結合対の他方は、検出可能な標識とコンジュゲートする。本明細書での使用に適した結合対として、ビオチンおよびアビジン、ならびにハプテンおよびハプテン特異的抗体が挙げられる。
【００４３】
染色体変化を解析する多くの技術が当分野で周知である。例えば、染色体上の個々の遺伝子座または領域のコピー数を研究するのに蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用することができる。例えばＰｉｎｋｅｌ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：９１３８〜９１４２頁（１９８８）参照。染色体領域のコピー数変化を検出するために、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）も使用することができる。例えば米国特許第７，６３８，２７８号参照。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションは固体支持体上で行われる。例えば、シグネチャー遺伝子およびゲノム領域に特異的にハイブリダイズするプローブを例えばアレイフォーマットで表面上に点在または固定させることができ、続いてゲノムＤＮＡを含有するサンプルをアレイに添加することにより特異的ハイブリダイゼーションが可能になる。
【００４５】
当分野で公知の方法および技術を使用することにより、様々な固体表面上への、および所望の密度（例えば各プローブが狭い範囲に集中する高密度）での核酸プローブの固定化を達成することができる。例えば米国特許第７，４８２，１２３（Ｂ２）号参照。固体表面の例として、特にニトロセルロース、ナイロン、ガラス、石英、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース；ならびにプラスチック、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン等；ゼラチン、アガロースおよびケイ酸塩が挙げられる。核酸プローブの高密度固定化は、各固定化プローブへの結合に必要なサンプルの核酸の全量を減少させるであろう高複雑度の比較ハイブリダイゼーション（ｈｉｇｈ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）に使用される。
【００４６】
いくつかの実施形態において、核酸プローブのアレイをサンプルの１つの集団とハイブリダイズすることができ、またはサンプルの２つの集団（１つの試験サンプルおよび１つの参照サンプル）と共に使用することができる。例えば、比較ゲノム・ハイブリダイゼーション・アッセイにおいて、核酸（例えば可能性のある腫瘍のサンプル）の第１の集合が第１の標識で標識され、核酸（例えば正常な細胞または組織からの対照）の第２の集合が第２の標識で標識される。アレイの各メンバーに結合する２種類の標識の割合により、核酸のハイブリダイゼーションの割合が決定される。ゲノムの欠失または増幅がある場合、２種類の標識からのシグナルの割合の差異が検出され、コピー数の測定が行われるだろう。
【００４７】
リスクの決定
各転移シグネチャー遺伝子セットに関するコピー数変化を決定した時点で、転移のリスクを検出したコピー数変化と相関させることができる。本明細書に開示した転移シグネチャー遺伝子セットの１個またはそれ以上の遺伝子またはゲノム領域（その増幅は転移性前立腺癌に関連している）に関するサンプルの細胞当たりのコピー数の増加は、コピー数の増加が生じない対照（例えば健康な個体から得たサンプル）と比較して転移のより高いリスクを示すだろう。一方、本明細書に開示した転移シグネチャー遺伝子セットの１個またはそれ以上の遺伝子またはゲノム領域（その欠失は転移性前立腺癌に関連している）のコピー数のサンプルにおける減少は、コピー数の減少が観察されない対照と比較して転移のより高いリスクを示すだろう。
【００４８】
例えば、表６に列挙した上位２０個の遺伝子およびゲノム領域で構成されている転移シグネチャー遺伝子セットに関して、ＳＬＣＯ５Ａ１ゲノム領域、ＫＣＮＢ２ゲノム領域、ＫＣＮＨ４ゲノム領域、ＪＰＨ１ゲノム領域、ＮＣＡＬＤゲノム領域およびＹＷＨＡＧ遺伝子の全てに関するサンプルの細胞当たりのコピー数の増加、ならびにＰＰＰ３ＣＣゲノム領域、ＳＬＣ７Ａ５ゲノム領域、ＳＬＣ７Ａ２ゲノム領域、ＣＲＩＳＰＬＤ２ゲノム領域、ＣＤＨ１３遺伝子、ＣＤＨ８遺伝子、ＣＤＨ２遺伝子、ＡＳＡＨ１ゲノム領域、ＣＴＤ８遺伝子、ＭＥＳＴゲノム領域、ＣＯＬ１９Ａ１遺伝子、ＭＡＰ３Ｋ７ゲノム領域、ＮＯＬ４ゲノム領域およびＥＮＯＸ１遺伝子の全てに関するサンプルの細胞当たりのコピー数のサンプルにおける減少は、前立腺癌の転移のリスクの増加と相関する。しかしながら、リスクの合理的に信頼可能な予測を得るために、必ずしもシグネチャー・セット中の全ての遺伝子およびゲノム領域が表６に記載されているのと同じ方向に変化する必要は無い。即ち、ＳＬＣＯ５Ａ１ゲノム領域、ＫＣＮＢ２ゲノム領域、ＫＣＮＨ４ゲノム領域、ＪＰＨ１ゲノム領域、ＮＣＡＬＤゲノム領域およびＹＷＨＡＧ遺伝子の１個またはそれ以上、好ましくは複数に関するサンプルの細胞当たりのコピー数の増加、ならびに／またはＰＰＰ３ＣＣゲノム領域、ＳＬＣ７Ａ５ゲノム領域、ＳＬＣ７Ａ２ゲノム領域、ＣＲＩＳＰＬＤ２ゲノム領域、ＣＤＨ１３遺伝子、ＣＤＨ８遺伝子、ＣＤＨ２遺伝子、ＡＳＡＨ１ゲノム領域、ＣＴＤ８遺伝子、ＭＥＳＴゲノム領域、ＣＯＬ１９Ａ１遺伝子、ＭＡＰ３Ｋ７ゲノム領域、ＮＯＬ４ゲノム領域またはＥＮＯＸ１遺伝子の１個またはそれ以上、好ましくは複数に関するサンプルの細胞当たりのコピー数のサンプルにおける減少に基づいてリスクの増加を予測することができる。「複数」とは、表６に列挙した上位２０個の遺伝子およびゲノム領域の少なくとも１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個を意味する。
【００４９】
本開示はまた、本明細書に開示したシグネチャー遺伝子セットのコピー数変化に基づくリスクの定量的測定を提供する。より具体的には、転移のリスクは、式：
【数２】
2014513957.tif 000003
に基づいて算出される転移能スコアと相関することが分かっている。
【００５０】
即ち、特定の遺伝子またはゲノム領域に関して、シグネチャーのＣＮＡおよびサンプルのＣＮＡが同じ方向（増幅または欠失）にある場合には、係数は１になり、この遺伝子またはゲノム領域に関するロジスティック補正Ｚスコア（Ｚ調整）が足され；反対方向である場合には、係数は−１になり、遺伝子またはゲノム領域に関するロジスティック補正Ｚスコア（Ｚ調整）が引かれ；Ｄｉｒサンプル（ｉ）＝０の場合には、スコアに対して全ての項がカウントされないだろう。したがって、基本的には、転移シグネチャーと一致する遺伝子（ｉ〜ｎ）からのロジスティック補正Ｚスコアが足され、シグネチャーと一致しない遺伝子からのロジスティック補正Ｚスコアが引かれる。完全な転移シグネチャー・セットの３６８個の各遺伝子に関するロジスティック補正Ｚスコア（Ｚ調整）が表６で明らかになっている。
【００５１】
算出した転移能スコアは、サンプルの参照分布（無転移生存の臨床転帰情報を有する前立腺癌の男性の集団で決定した転移能スコア、本明細書では「参照転移能スコア」とも称する）と比較される。このような参照分布を予め定めることができ、または研究されるサンプルとして同じ実験で並行して算出することができる。多くの実施形態において、参照転移能スコアは１．０と等しいか、または約１．０である。したがって、参照分布の対照スコアに対する試験対象の転移能スコアの増加は、前立腺癌の転移のリスクの増加と相関する。本開示によれば、転移能スコアにおける１点の増加は、転移への進行（Ｐ＝０．０１）に関する６．３のオッズ比に相当する。いくつかの実施形態において、参照スコアに対する少なくとも約０．５、０．５３、０．５６、０．５８、０．６、０．６５、０．７またはそれ以上の差での転移能スコアの増加は、転移の有意に高いリスクを示すと考えられる。
【００５２】
開示した遠隔転移の見込みの予測方法は、前立腺癌の診断および治療に大きな進歩を表す。この予測因子は、診断時に男性を正確に類別するのに重要である可能性があり、積極的な治療を避けることができる場合に、生存の機会を最大化するとともに不都合な副作用を最小化するであろう療法の選択につながる可能性がある。したがって、治療転帰および生活の質の両方を改善することができる。加えて、提案した手段である腫瘍のゲノム解析は、発病および転移を伴う遺伝子変化の同定にとって包括的であることから、鋭敏な予測因子および特異的な予測因子の両方である十分な数のマーカーを選択する見込みがより高い。更に、これらのゲノム変化はそれ自体、薬剤、放射線、または別の療法による処置の影響を受けやすいことから、ゲノム変化は、中間エンドポイント、例えばアンドロゲン感受性および放射線への応答を評価するための基準を提供する可能性がある。最終的に、コピー数変化は、前立腺以外の癌用を含む個別のテーラーメイド療法の開発を導く可能性がある。
【００５３】
診断キット
更に、本明細書に記載した方法を行うための診断キットを本明細書に開示する。キットは、任意の、および全ての試薬、例えば前述の１個またはそれ以上の転移シグネチャー遺伝子に結合する核酸プローブならびに別のアッセイ試薬を含むことができる。核酸プローブを固体支持体、例えばマイクロアレイ・スライド上に設けることができる。キットはまた、別の物質、例えば前記方法を行うための指示書またはプロトコールを含むことができ、指示書およびプロトコールを電子版で、例えばコンパクト・ディスク上等に設けることができる。
【実施例】
【００５４】
本明細書は、如何なる意味においても限定的に解釈してはならない以下の実施例により更に説明される。全ての引用された参照（この出願中に引用された文献参照、交付済み特許および公開された特許出願を含む）の内容は、参照により明示的に組み入れる。
【００５５】
［実施例１］
本実施例には、予測転移モデルを開発するために用いる方法およびサンプルの起源を記載した。
【００５６】
予測バイオマーカー
予測転移モデルを開発するための方法として、前立腺癌におけるコピー数変化（ＣＮＡ）の解析を選択した。この癌はＣＮＡに起因する多数のゲノム不均衡を持っていることが知られていた（Ｂｅｒｏｕｋｈｉｍ他、Ｎａｔｕｒｅ  ４６３（７２８３）：８９９〜９０５頁（２０１０）；Ｓｕｎ他、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ６７（７）：６９２〜７００頁（２００７））。ＣＮＡの高分解能測定値は、場合によっては癌細胞中の正常な、変異した、またはハイブリッド融合した転写産物およびタンパク質の量の変化の直接的証拠を提供する有益な値を有していた。結果として生じるＲＮＡ転写産物およびタンパク質は、細胞の適応度に影響を与える可能性があり、ならびに移動、浸潤および成長に必要な機序をもたらす可能性があった。原発性腫瘍が転移に進行する見込みを予測するために、腫瘍中で同定した多数のＣＮＡから、ＣＮＡに基づく遺伝子シグネチャーを開発した。
【００５７】
サンプル、コホートおよびデータ
表１にまとめたように、４個の公的に入手可能な前立腺癌コホートおよび本明細書で報告した５番目のコホート（ＧＳＥ２７１０５）を研究した：１）ＮＹＵ医科大学（ＮＹＵ、ｎ＝２９）、Ｂａｙｌｏｒ医科大学（Ｂａｙｌｏｒ、ｎ＝２０、Ｃａｓｔｒｏ他、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  １１（３）：３０５〜１２頁（２００９））、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ癌センター（ＭＳＫ、ｎ＝１８１、Ｔａｙｌｏｒ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １８（１）：１１〜２２頁（２０１０））およびＳｔａｎｆｏｒｄ大学（ＳＵ、ｎ＝６４（各腫瘍の参照に用いる唯一の正常組織）、ＬａＰｏｉｎｔｅ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７（１８）：８５０４〜１０頁（２００７））からの２９４個の原発性腫瘍および対応する正常組織のサンプル；２）Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ医科大学（Ｈｏｐｋｉｎｓ、ｎ＝１３、Ｌｉｕ他、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １５（５）：５５９〜６５頁（２００９））およびＭＳＫ（ｎ＝３６、Ｔａｙｌｏｒ他、上記参照）からの４９個の転移性腫瘍および対応する正常サンプル。正常な前立腺組織および腫瘍組織（ＮＹＵ）をＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅから得た（表２）。４個の公的に入手可能なコホート（Ｃａｓｔｒｏ他、上記参照；Ｔａｙｌｏｒ他、上記参照；ＬａＰｏｉｎｔｅ他、上記参照；Ｌｉｕ他、上記参照）の配列データをＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓからダウンロードした（Ｂａｒｒｅｔｔ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３９（データベース号（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ））：Ｄ１００５−１０（２０１１））（ＧＳＥ１２７０２、ＧＳＥ１４９９６、ＧＳＥ６４６９、ＧＳＥ２１０３５）。本明細書で開発した遺伝子シグネチャーおよび予測モデルが別の癌に応用可能であるかどうかを判定するために、様々な腫瘍起源の周知の細胞株コホートをＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ  ｄａｔａｂａｓｅから得た（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３９（データベース号）：Ｄ１００２−４）（Ｅ−ＭＴＡＢ−３８）。
【００５８】
サンプルの処理（ＮＹＵコホート）
Ｇｅｎｔｒａ  ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。精製したｇＤＮＡを、希釈したＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で水和した。ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）２０００分光光度計を使用し、２６０ｎｍの波長の光学密度（ＯＤ）でｇＤＮＡ濃度を測定した。タンパク質および有機混入物を２８０ｎｍおよび２３０ｎｍのＯＤでそれぞれ測定した。次いで、品質管理閾値を超えるサンプルを１％アガロース・ゲルで泳動してｇＤＮＡの完全性を評価した。Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒにおいて、標準操作手順書を使用し、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトＳＮＰアレイ６．０でｇＤＮＡサンプル５００ｎｇを泳動した。Ｂｉｒｄｓｅｅｄ  ｖ２．０ソフトウェアを使用してシグナル強度データ（．ｃｅｌファイル）を処理した（Ｋｏｒｎ他、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４０（１０）：１２５３〜６０頁（２００８））。
【００５９】
研究デザイン
本研究における症例のサンプルは、転移性腫瘍（ＭＥＴＳ）、または根治的前立腺摘除術で治療した男性の、後に遠隔転移の形成に進行した原発性腫瘍（ｍＰＴ）であった。ＭＥＴＳおよびｍＰＴは明瞭に認識可能な表現型であり、この表現型を症例として確実に分類することができた。対照のサンプルを、根治的前立腺摘除術後に遠隔転移の形成に進行しなかった原発性腫瘍として定義した。転移しないであろう不活性の原発性腫瘍（ｉＰＴ）および治療しないまま放置すると通常であれば転移の形成に進行するであろう原発性腫瘍の両方が根治的前立腺摘除術で治療されると仮定すると、対照の原発性腫瘍は、実際にはｉＰＴおよび現実化していないｍＰＴの混合を示していただろう。コホートをランダムにサンプリングしたと仮定して、原発性腫瘍の対照群の約３０％が現実化していないｍＰＴであるだろうと予期した。本明細書で開発した方法は、サンプルが転移に起因するものであるかどうかの事前情報のみを必要としており、該方法を混合表現型の交絡要因に対して頑健であるように設計した。
【００６０】
転移予測モデルの統計
実施例２に記載したように、転移能スコア（ＭＰＳ）を算出するために、より高いスコアがより大きな転移の見込みを示す重み付きＺスコア・アルゴリズムを開発した。交差検証試験によって即時モデル（ｉｎｓｔａｎｔ  ｍｏｄｅｌ）の予測力を評価した。４個のコホートの組合せを使用して２個の予測モデルを訓練した。ＮＹＵ（ｎ＝２９）およびＢａｙｌｏｒ（ｎ＝２０）からの臨床転帰が不明な４９個の原発性腫瘍、ならびにＨｏｐｋｉｎｓ（ｎ＝１３）からの転移コホートを使用して第１のモデルを訓練した。一連の転移性腫瘍（ｎ＝３６）に加えて転帰が不明な原発性腫瘍（ｎ＝１２６）のＭＳＫコホートの７５％を使用して第２のモデルを訓練した。これら２個のモデルから得られる遺伝子シグネチャーおよびＭＰＳスコアをロジスティック回帰モデルに適合させるために組み合わせるとともに、真実のｍＰＴ（後に遠隔転移に発展した原発性腫瘍）およびどちらのモデルの訓練にも使用しなかったＭＳＫコホートからの２５％の対照腫瘍のランダムサンプルの予測に使用した。受信者動作特性曲線下面積およびＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒの無転移生存により予測精度を測定した。
【００６１】
［実施例２］
本実施例には、転移能の臨床的リスク・モデルを開発するための解析パイプラインを記載した。
【００６２】
４つの主要な工程で構成されているＲ統計ソフトウェア１を使用して解析パイプラインを開発した：
【００６３】
工程１において、各腫瘍ゲノムに関するコピー数の増幅および欠失現象を呼び出した。腫瘍ゲノムのシグナル強度プロファイルを対応する正常なゲノム強度プロファイルから参照することにより（引くことにより）、各腫瘍に関するコピー数プロファイルを得た。アレイでアッセイした各ゲノム位置に関して、各サンプルのコピー数プロファイルを−１、０または１（欠失、事象無し、または増幅）のように数値的に示した。概要転移プロファイル（高頻度の事象を指標化する）も作成し、ここで−１および１は、転移コホートの２５％超で観察される欠失および増幅をそれぞれ示した。
【００６４】
工程２において、ブートストラップ・クラスタリング法を用いて、未知の原発性腫瘍のための初期グループ分けを開発した。転移サンプルに関する概要コピー数プロファイルを未知の原発性腫瘍からの個々のプロファイルと組み合わせ、階層クラスタリング（２値距離メトリック（ｂｉｎａｒｙ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｍｅｔｒｉｃ）法および完全なクラスタリング法）を使用して処理した。各ブートストラップ反復に関して、原発性腫瘍のサブセットを置換によりサンプリングし、転移プロファイルと同じクラスター内であった場合には１と点数化し、別のクラスター内であった場合には０と点数化した。クラスタリングでの２０，０００回の反復の結果を使用して、転移プロファイルを有するクラスターに入った回数を示す類似度スコアを各サンプルに関して生成した。スコアが高いサンプルは、より転移性である（ｍＰＴ）と考えられたが、より低いスコアの腫瘍は、より不活性であった（ｉＰＴ）。値の可能な範囲（０〜１）全体にわたって類似度スコアが分布し、高い転移距離および低い転移距離の間に顕著な対比を有する腫瘍の明瞭な群を形成することが可能になった。
【００６５】
工程３において、これらｍＰＴおよびｉＰＴの対比群を使用して、プローブ毎にコピー数の量的差異を評価した。アレイ上の各プローブに関して、各下位群（転移、ｍＰＴおよびｉＰＴ）で観察される、欠失に対する増幅の相対量を示すエンリッチメント・スコアＥ（ｘ）を算出した。
【数３】
2014513957.tif 000004
【００６６】
次に、転移およびｍＰＴのコピー数変化をｉＰＴ群で観察されるものと対比することにより、相対的エンリッチメントをモデル化した。
【数４】
2014513957.tif 000005
【００６７】
ＭＥＴＳおよびｍＰＴのサンプルが欠失に比べて多く増幅していた場合により高いスコアを割り当てるために、合計される最初の２つのエンリッチメント項を設計した。ＭＥＴＳおよびｍＰＴにおける増幅エンリッチメントがより大きくなることにより、より高いスコアを得た。３番目の項は、ｉＰＴのサンプルが逆の結果（増幅を超える欠失に関するエンリッチメント）を示す場合により高かった。中央の項に、プローブ毎にｍＰＴの平均寄与度を示すデータ駆動係数（ｄａｔａ−ｄｒｉｖｅｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）ｑを乗じた。例えば、全ての転移およびｍＰＴで増幅したが全てのｉＰＴで欠失したプローブは、最も高い可能なスコアを得たであろう。同様に、全ての転移およびｍＰＴのサンプルで欠失したが全てのｉＰＴのサンプルで増幅したプローブも、この最大の可能なスコアに達したであろう。次に、プローブのスコアを遺伝子毎に集計してＺスコアを算出することにより、残余のゲノムと比較して各遺伝子のスコアを評価した。
【００６８】
各遺伝子に関して複数のＺスコアがある場合には（表６参照）、３個のシグネチャーの生成に使用した様々なコホートに対応していた。したがって、各個体は３個の異なるＭＰＳを有するはずであった。下記の順位法の改変を使用して各シグネチャーに関して３個のＭＰＳを組み合わせることにより、最終のＭＰＳ（表６に示す）を算出した。
【００６９】
Ｚ調整では、上記３つの工程から得られる各遺伝子のＺスコアを、ロジスティック分布に適合するように以下の標準関数により変換した：
【数５】
2014513957.tif 000006
【００７０】
この変換の目的は、ＭＰＳ全体に関する個々の遺伝子のＺスコアの影響を最小化する（スコアを異常値に対して頑健にする）ことであった。
【００７１】
最後に、工程４において、局所的な前立腺癌が遠隔転移を形成する能力を有するかどうかを予測するために、それらの選択モデルＺスコアの有意性により決定したゲノム領域に重複するＣＮＡの上位のセットのシグネチャーに基づいて、重み付きＺスコアのリスク・モデルを開発した。カットオフ・ポイントとして、有意な遺伝子（Ｚ≧１．７）を工程３から使用した。転移予測リスク・モデル・スコアを以下のように定義した：
【数６】
2014513957.tif 000007
【００７２】
各腫瘍プロファイルに関して、転移シグネチャーと対応する遺伝子（ｉ〜ｎ）からのロジスティック補正Ｚスコア（Ｚ調整）を足し、シグネチャーと一致しない遺伝子からのを引いた。リスク・モデル・スコア（Ｄｉｒ）の方向成分が示すように、シグネチャーのＣＮＡおよびサンプルのＣＮＡが同じ方向にある場合には、係数は１になり；それらが反対方向にある場合には、係数は−１になり；Ｄｉｒサンプル（ｉ）＝０の場合には、スコアに関して全ての項がカウントされないはずであった。例えば、通常は転移において増幅され、未知のプロファイルにおいてｍＰＴも増幅される遺伝子ｉの場合、そのＺスコアは足されたが、プロファイルにおいて遺伝子ｉが欠失する場合、ｉＰＴにおいて予期したようにＺスコアは引かれた。このモデルでは、未知のプロファイルにおいて増幅も欠失もしない中立遺伝子を点数化しなかった。
【００７３】
［実施例３］
本実施例には、実施例１〜２に記載したように開発した予測転移モデルにより得た結果を記載した。
【００７４】
転移能スコア分布
対照の原発性腫瘍と比較して、転移（Ｐ＝１．０３Ｅ−１８）およびｍＰＴ（Ｐ＝０．００５）の群に関して転移能スコアの有意な差異を観察した（図１および表３）。リンパ節陽性原発性腫瘍（ＭＳＫ（ｎ＝９）およびＳＵ（ｎ＝９）コホートから得られる）の転移能スコアは、遠隔転移を予測するための、この臨床的パラメータの限界能力を示す対照の腫瘍群（ＰMSK＝０．２３、ＰSU＝０．１９、Ｐ組合せ＝０．０８）とは有意に異なっていなかった（ＢＯＯＲＪＩＡＮ他、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ  １７８（３Ｐｔ１）：８６４〜７０頁；考察７０−１（２００７））。対照コホートはｍＰＴの一部を含有するという発明者らの仮定と一致するように、それらの転移能スコアは、この場合の範囲と重複した。更に、経過観察の８０ヶ月後に生化学的に再発しなかった（ＰＳＡにより測定した）対照の原発性腫瘍（図１においてＸで示す）は、転移能スコアと相関していなかった。別の癌のタイプが前立腺癌で観察されるのと類似のＣＮＡの転移の全体像を示すかどうかを判定するために、３３７個の癌細胞株に関して転移能スコアを算出した。低リスクの前立腺の原発性腫瘍と重複する全体的分布を観察した（図１）。しかしながら、３３７個の細胞株の内の２２個は、ＭＰＳによって順位付けした、前立腺の原発性腫瘍および転移の７５パーセンタイルよりも上に現れた。これらの細胞株は、肺（ｎ＝１０）、乳房（ｎ＝３）、結腸（ｎ＝２）および黒色腫（ｎ＝２）の腫瘍を起源とした。２２個の細胞株のこの群における別のシングルトンは、甲状腺、直腸、咽頭、膵臓および腎臓を起源とした（表４）
【００７５】
交差検証および生存期間解析
モデル（ｎ＝１３ｍＰＴおよびｎ＝３９対照の原発性腫瘍）の訓練に使用しなかった、原発性腫瘍（ｎ＝５２）のサブセットを予測する交差検証解析では、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ−ＡＵＣ、図２、左側のグラフ）下面積により測定したところ８０．５％の精度となった。対照の原発性腫瘍が、治療したｍＰＴおよびｉＰＴの混合物であったことを考慮して、適合の品質は過小評価されていると思われた。無転移生存（図２、右側のグラフ）の臨床的エンドポイントを有するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析への即時予測の適用により、（転移能スコアに基づく）コホートの半分の低リスクは、半分の高リスクと比較して有意に分離した（Ｐ＝０．０１４）。転移能スコアの１点の増加は、転移への進行に関する６．３のオッズ比に相当した（Ｐ＝０．０１）。
【００７６】
バイオマーカーの機能的有意性
解析により同定した、上位に順位付けられている転移遺伝子の多くは、核および細胞外基質構造の変化、ならびに代謝のプロセス特性、例えば運動性、浸潤およびアノイキスの回避を高める代謝改変に関わる分子機能を有していた。全ての前立腺腫瘍に関するシグネチャー遺伝子のＣＮＡ事象についてのヒート・マップは、高リスクの腫瘍および低リスクの腫瘍を対比する、様々な高頻度の増幅事象対欠失事象に至る経路を示唆していた。相対的に少ない遺伝子事象を有する中間のリスク領域は、一方は転移に至るとともに他方は不活性状態に至る、その後のコピー数変化の２つの代替経路の開始点を示した可能性がある。不活性な腫瘍におけるこの「抗転移」事象の固定化は、長期間の待機療法にもかかわらず、なぜ不活性な腫瘍が転移しないかを説明することができた。
【００７７】
予測シグネチャーが得られるこれらの増幅または欠失領域内の遺伝子の多くは、前立腺癌の転移において役割を果たすことが既に示されていた。上位の予測遺伝子の１つ、染色体１６ｑ２４．２で欠失している溶質担体ファミリーＳＬＣ７Ａ５遺伝子は、多発性癌に関与している中性アミノ酸輸送タンパク質（ＬＡＴ１）をコードしており（前立腺（Ｓａｋａｔａ他、Ｐａｔｈｏｌ  Ｉｎｔ  ５９（１）：７〜１８頁（２００９））、乳房（Ｋａｉｒａ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９９（１２）：２３８０〜６頁（２００８））、卵巣（Ｋａｊｉ他、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０（３）：３２９〜３６頁（２０１０））、肺（Ｉｍａｉ他、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ５４（７）：８０４〜１３頁（２００９））および脳（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ他、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ６２（２）：４９３〜５０３頁；考察−４（２００８）））、ならびに診断（Ｂａｒｔｌｅｔｔ他、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（４）：Ｒ４７頁（２０１０）；Ｒｉｎｇ他、Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ  ２２（８）：１０３２〜４３頁（２００９）；Ｒｉｎｇ他、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２４（１９）：３０３９〜４７頁（２００６））、細胞株における薬剤標的（Ｆａｎ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ８０（６）：８１１〜８頁（２０１０）；Ｙａｍａｕｃｈｉ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒ  ２７６（１）：９５〜１０１頁（２００９）；Ｋｉｍ他、Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ  ３１（６）：１０９６〜１００頁（２００８））、および臨床前動物モデル（Ｏｄａ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０１（１）：１７３〜９頁（２０１０））としての有用性を有していることが示されていた。ＬＡＴ１の通常の機能は、細胞のアミノ酸濃度、即ちＬ−グルタミン（流出）およびＬ−ロイシン（流入）を調節することであった。ＬＡＴ１の活性の低下はＬ−グルタミンの濃度上昇をもたらし、これによりｍＴＯＲ活性が構造的に刺激され（Ｎｉｃｋｌｉｎ他、Ｃｅｌｌ  １３６（３）：５２１〜３４頁（２００９））、グルタミン類似体の使用を介したグルタミン利用を標的にして細胞内およびｉｎ  ｖｉｖｏマウス・モデルにおける腫瘍の成長および転移が著しく抑えられることが示されていた（Ｓｈｅｌｔｏｎ他、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  １２７（１０）：２４７８〜８５頁）。５個の別の溶質担体スーパファミリー・メンバー（ＳＬＣ７Ａ２、ＳＬＣ９Ａ９、ＳＬＣ２６Ａ７、ＳＬＣ３９Ａ１４およびＳＬＣＯ５Ａ１）は、本明細書に開示したモデルにおいて転移能を予測した。生化学的に再発した男性と根治的前立腺摘除術で治療した男性の転移した前立腺の原発性腫瘍とを比較して、コリン輸送体をコードする（Ｍｉｃｈｅｌ他、Ｆａｓｅｂ  Ｊ  ２３（８）：２７４９〜５８頁（２００９））９番目のＳＬＣ遺伝子ＳＬＣ４４Ａ１を１７個の遺伝子発現シグネチャーの一部として同定したが転移しなかった（Ｎａｋａｇａｗａ
他、上記参照）。
【００７８】
シグネチャー遺伝子の２番目のセットは、カルシウム依存性細胞接着糖タンパク質をコードする６個のＣａｄｈｅｒｉｎファミリー・メンバー（ＣＤＨ２、ＣＤＨ８、ＣＤＨ１３、ＣＤＨ１５、ＣＤＨ１７およびＰＣＤＨ９）を含んでいた。Ｃａｄｈｅｒｉｎファミリー・タンパク質の多くは、転移進行に関連する推定機能を有しており（Ｙｉｌｍａｚ他、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ８（５）：６２９〜４２頁、２０１０）、診断パネルに含まれていた（Ｃｅｌｅｂｉｌｅｒ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  １００（１２）：２３４１〜５頁（２００９）；Ｌｕ他、ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ  ３（１２）：ｅ４６７頁（２００６））。ＣＤＨ２を標的とするモノクローナル抗体治療の最近の研究では、アンドロゲン非依存性の前立腺癌の異種移植モデルにおける前立腺癌の成長および転移が阻害されていた（Ｔａｎａｋａ他、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  （２０１０）１６：１４１４〜２０頁）。
【００７９】
転移能に寄与すると予測される６個の遺伝子の３番目のセットは、カリウム・チャネルＫＣＮＢ２、ＫＣＮＱ３、ＫＣＮＡＢ１、ＫＣＴＤ８、ＫＣＴＤ９およびＫＣＮＨ４であった。８ｑ１３から８ｑ２４の間の高増幅領域に存在する３つの別のカリウム・チャネル（ＫＣＮＳ２、ＫＣＮＶ１およびＫＣＮＫ９）は発明者らの解析において高く順位付けられていなかったが、弱い効果または修飾因子効果を有した可能性がある。カリウム・チャネル転写の阻害を通して、推定癌遺伝子ＢＣＬ−２により、高レベルの細胞質のカリウム・イオン濃度が維持された。この高レベルにより、膜破壊の特徴的なミトコンドリアのアポトーシス・カスケード、およびその後のシトクロムＣ、カスパーゼの放出、ならびに細胞成分のヌクレアーゼ分解に必要な前駆体が阻害されることが示されていた（Ｅｋｈｔｅｒａｅ他、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００１；２８１（１）：Ｃ１５７〜６５頁（２００１））。更に、別の研究は、カリウム・チャネルＫＣＮＭＡ１（１０ｑ２２．３）の高頻度メチル化状態（ｈｙｐｅｒ−ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｕｓ）は前立腺癌の再発を予測するのに役立つことを示していた（Ｖａｎａｊａ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２７（５）：５４９〜６０頁（２００９））。前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ（低転移能）およびＰＣ３（高転移能）における電位依存性カリウム・チャネルの活性は著しく異なっていることが観察された（Ｌａｎｉａｄｏ他、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ４６（４）：２６２〜７４頁（２００１））。山のような証拠もカリウム・チャネルの関与および乳癌細胞の移動で観察されていた（Ｚｈａｎｇ他、Ｓｈｅｎｇ  Ｌｉ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ  ６１（１）：１５〜２０頁（２００９））。
【００８０】
予測モデルで使用した転移シグネチャー遺伝子の完全なセット（ｎ＝３６８、表６）は機能の様々なサブセットを表し、各腫瘍が転移に進行するのに必要な固有のプロファイルを明らかにした。
【００８１】
［実施例４］
予測可能性に基づく転移遺伝子の順位付け
３６８個の転移遺伝子の完全なセットから得た転移能スコアでは、実施例１〜３に記載のコホートにおいてＡＵＣ＝８１％の予測精度になった。この予測に寄与する遺伝子の階層を決めるために、３６８個の遺伝子からのサブセットの遺伝子（ｎ）をランダムにサンプリングすることにより、いくつかのシミュレーション（Ｋ）を行った（ｎ＝２０、４０、５０、８０、１００）。この方法は、予測精度（ＡＵＣ＝８１％）を最大化し、遺伝子のランダムにサンプリングしたサブセットの任意のランダム反復に対する３６８個の遺伝子からのＭＰＳスコア間の回帰係数も最大化する遺伝子を同定しようとした。例えば、３６８個の遺伝子シグネチャー由来のＭＰＳと比較して予測精度＝８１％およびｒ2＝１．０を達成する２０個の遺伝子のランダム・サブセットは、理論的に最良の性能を得たであろう（図３）。
【００８２】
５つのシミュレーションに関する遺伝子の順位付けを確定した時点で、ノンパラトメトリック順位付け法を使用して、Ｋ回の解析にわたる順位Ｇ位を評価した（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ他、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５７３：８３〜９２頁（２００４））：
【数７】
2014513957.tif 000008
【００８３】
ｋ回の解析にわたる各Ｇの順位の単純平均の改良として、この方法を選択した。なぜならば、別の解析における順位に関係なく解析の内の何れか１つにおいて高順位を有することにより重点をおいていたからである。順位の積分についてのこのモデルは、例えば２つの異なる解析において１００位に順位付けた遺伝子に比べて、それぞれで１位および１００位に順位付けた遺伝子に重みを与えた。
【００８４】
本方法の性能を評価するために、拡張ウィンドウを使用して、遺伝子の順位化した複合的な階層を評価した。最小の１２個の遺伝子から始めて反復毎に１個の遺伝子を加え、ＡＵＣおよびｒ２を算出した。図４の結果は、ＡＵＣは約８０個の遺伝子で頭打ちとなり、最適なＡＵＣ約０．８１およびｒ２＞０．９５を得ることを示した。具体的には、上位１２個、２０個、４０個、８０個および１００個の遺伝子に関する結果を表５に示した。
【００８５】
３６８個の遺伝子の順位を表６に示した。
【００８６】
［実施例５］
患者への予測の報告
Ｃｏｘ比例ハザード比モデルにより評価した前立腺癌の転移能スコアは、無転移の確率を決定するための根拠を提供した。図５（左側の区画、ＲＯＣ曲線）において、全ての真陽性（即ち、転移に進行するであろう男性）を同定するために、（ＲＯＣ曲線のＹ軸上の１００％または１．０における）発明者らの感度を最大にする保守的な閾値を選択した。この高リスク群内において偽陽性率（通常であれば転移に発展しなかったであろう男性）は５９％であり、このことにより、低リスクの前立腺癌である何人かの男性が積極的に治療されることになったであろう。しかしながら、現在では男性の１００％が積極的に治療されており、そのため、本明細書の保守的な閾値は男性の３１％が積極的な治療を免れることを可能にしただろう。
【００８７】
この保守的な閾値をＣｏｘ比例ハザード・モデルのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析（図５、右側の区画）に適用することにより、様々な時間間隔で無転移生存の低リスクおよび高リスクの確率を得た。したがって、このモデルに関して、低リスクであると指定された男性が１０年以内に転移に発展する機会は非常に低かった（＜５％）であろう。一方、高リスクであると指定されることにより、６０ヶ月以内に転移に進行する機会は４０％になり、１０年以内に転移に進行する機会は＞９０％になった。
【００８８】
比較として、ＦＤＡが認可した乳癌の遺伝性発現シグネチャー診断「マンマプリント（ＭａｍｍａＰｒｉｎｔ）」は、そのリスク報告戦略を開発するために、類似のＣｏｘ比例ハザード解析を使用した（Ｂｏｇａｒｔｓ他、Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｏｎｃｏｌ  ３：５４０〜５１頁、２００６）。現在、ＦＤＡ低リスク割り当てでは１０年以内に転移性疾患に進行する機会は１０％であり、高リスク割り当てでは１０年以内に進行する機会は２９％であった。
【００８９】
［実施例６］
Ｄｕｋｅコホートによる検証
発明者らの転移シグネチャーおよび転移能スコア（ＭＰＳ）予測モデルの妥当性を評価するために、発明者らは、Ｄｕｋｅ大学病院にて根治的前立腺摘除術で治療した３０人の男性から原発性前立腺癌腫瘍の後ろ向きコホートおよび対応する正常な組織を集めた（Ｄｕｋｅコホート）。保存されたホルマリン固定パラフィン包埋（ｆｆｐｅ）したブロックから癌組織を得た。５ミクロンのＨ＆Ｅ染色切片を得るために各ブロックを病理学者が処理し、腫瘍内容物に関して評価した。Ｑｉａｇｅｎ  ｆｆｐｅ  ｇＤＮＡカラム抽出キットを使用してゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。サンプルをカリフォルニア州サンタ・クララにあるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒに送付し、ｆｆｐｅ保存組織から抽出したｇＤＮＡサンプル用に特別に開発したＯｎｃｏｓｃａｎ（商標）Ｖ２  ＳＮＰアレイ上を泳動させた。アレイは約３０万個のプローブを有しており（表７参照）、その大部分は別のアレイ・プラットホームにより既に開発された遺伝子シグネチャーと重複した。
【００９０】
根治的前立腺摘除術後に転移した原発性腫瘍（ｍＰＴ、ｎ＝１３）、遠隔転移に発展しなかった高リスク腫瘍群（ｈｉＰＴ、ｎ＝８）および遠隔転移に発展しなかった低リスク腫瘍群（ｉＰＴ、ｎ＝７）によりＤｕｋｅコホートを構成した。患者が生化学的に再発を経験するかどうか、ならびに手術後に補助放射線および／またはホルモン療法を受けるかどうかに基づいて、ｈｉＰＴ／ｉＰＴ群の高リスク指定を割り当てた。
【００９１】
Ｄｕｋｅコホートに関してＭＰＳスコアを算出し（図６）、ＭＰＳスコアは、ｍＰＴ、ｉＰＴおよびｈｉＰＴに関して予測したように分布することを示した。ＤｕｋｅコホートｍＰｔおよびｉＰｔのみに適用した受信者動作特性−曲線下面積解析（ＲＯＣ−ＡＵＣ）により、精度が０．９１になった。ＤｕｋｅコホートｍＰｔおよびｉＰｔをｍｓｋ検証セット（前述した）とともにプールし、ＲＯＣ−ＡＵＣにより測定した精度が０．７７になった（図７）。
【００９２】
【表１】
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【００９３】
【表２】
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【００９４】
【表３】
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【００９５】
【表４】
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【００９６】
【表５】
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【００９７】
【表６】
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【００９８】
【表７】
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【００９９】
【表８】
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【０１００】
【表９】
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【０１０１】
【表１０】
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【０１０２】
【表１１】
2014513957.tif 000019
【０１０３】
【表１２】
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【０１０４】
【表１３】
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【０１０５】
【表１４】
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【０１０６】
【表１５】
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【０１０７】
【表１６】
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【０１０８】
【表１７】
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【０１０９】
【表１８】
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【０１１０】
【表１９】
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【０１１１】
【表２０】
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【０１１２】
【表２１】
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【０１１３】
【表２２】
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【０１１４】
【表２３】
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【０１１５】
【表２４】
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【０１１６】
【表２５】
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【０１１７】
【表２６】
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【０１１８】
【表２７】
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【０１１９】
【表２８】
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【０１２０】
【表２９】
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【０１２１】
【表３０】
2014513957.tif 000038
【０１２２】
【表３１】
2014513957.tif 000039
【０１２３】
【表３２】
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【０１２４】
【表３３】
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【０１２５】
【表３４】
2014513957.tif 000042
【０１２６】
【表３５】
2014513957.tif 000043
【０１２７】
【表３６】
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【０１２８】
【表３７】
2014513957.tif 000045
【０１２９】
【表３８】
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【０１３０】
【表３９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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