(57)【要約】ヘパラン−Ｎ−スルファターゼを調製および精製するためのプロセスが開示される。上記プロセスは、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼを非常に純粋なヘパラン−Ｎ−スルファターゼを精製する条件下で生成もしくは精製するためのクロマトグラフィー工程を包含する。一局面において、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼを精製するための方法が提供され、該方法は、ａ）ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物とアニオン交換クロマトグラフィー樹脂とを、該ヘパラン−Ｎ−スルファターゼが吸着される条件下で接触させる工程；ｂ）吸着された該ヘパラン−Ｎ−スルファターゼを、該アニオン交換クロマトグラフィー樹脂から溶出する工程などを包含する。
2014517692.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパラン−Ｎ−スルファターゼを精製するための方法であって、該方法は、
ａ）ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物とアニオン交換クロマトグラフィー樹脂とを、該ヘパラン−Ｎ−スルファターゼが吸着される条件下で接触させる工程；
ｂ）吸着された該ヘパラン−Ｎ−スルファターゼを、該アニオン交換クロマトグラフィー樹脂から溶出する工程；
ｃ）工程ｂ）から得られた該ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物と、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂とを接触させる工程；
ｄ）吸着された該ヘパラン−Ｎ−スルファターゼを、該疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂から溶出する工程；
ｅ）工程ｄ）から得られた該ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物とヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂とを接触させる工程；
ｆ）吸着された該ヘパラン−Ｎ−スルファターゼを、該ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂から溶出する工程；
ｇ）工程ｆ）から得られた該ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物とカチオン交換クロマトグラフィー樹脂とを接触させる工程；および
ｈ）吸着された該ヘパラン−Ｎ−スルファターゼを、該カチオン交換クロマトグラフィー樹脂から溶出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物と、４−メルカプト−エチル−ピリジンに連結したセルロースマトリクスとを接触させる工程
をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物中のウイルスを不活性化する工程
をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）の前記アニオン交換クロマトグラフィー樹脂は、Ｑセファロースファストフロー樹脂である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程ｃ）の前記疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂は、フェニルセファロース６ファストフロー樹脂である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程ｅ）の前記ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂は、セラミックヒドロキシアパタイトタイプＩ樹脂である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程ｇ）の前記カチオン交換クロマトグラフィー樹脂は、ＳＰセファロースファストフロー樹脂である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ヘパラン−Ｎ−スルファターゼを濾過する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
濾過工程は、ダイアフィルトレーションもしくは限外濾過によって行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程ａ）を行う前に、前記ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物をｐＨ  約７．０へと調節する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶液は、約５０〜約１００ｍＭの酢酸ナトリウム濃度を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程ａ）を行う前に、前記ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物を調節して、約３〜約４ｍＳ／ｃｍの導電率を得る工程、
をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
工程ｂ）の溶出剤は、約ｐＨ７．０において約２０ｍＭ  ＭＥＳ−Ｔｒｉｓおよび約１８０ｍＭ  ＮａＣｌを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
工程ｃ）を行う前に、前記ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物を、ＮａＣｌ濃度  約１．１Ｍ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌを達成するように調節する工程、
をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＮａＣｌ濃度は、約１．２Ｍである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物を、２５℃において導電率  約９０〜１１０ｍＳ／ｃｍを得るように調節する工程、
をさらに包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
工程ｃ）を行う前に、前記樹脂を、ｐＨ  約７．０および導電率  約１００〜約１２０ｍＳ／ｃｍにおいて約２０ｍＭ  ＭＥＳ−ＴｒｉｓおよびＮａＣｌ濃度  約１．２Ｍを含む緩衝液で平衡化する工程、
をさらに包含する、
請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
工程ｃ）の吸着された前記ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物を、ｐＨ  約７．０において約２０ｍＭ  ＭＥＳ−ＴｒｉｓおよびＮａＣｌ濃度  約１８０ｍＭ〜約２２０ｍＭを含む溶出剤で平衡化する工程、
をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＮａＣｌ濃度は、約２００ｍＭである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
工程ｄ）において得られた前記ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物を含む溶液を、工程ｅ）を行う前に、濃度  約２ｍＭ〜約４ｍＭのＮａＰＯ４へと調節する工程、
をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＮａＰＯ４の濃度は、約２ｍＭに調節される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
工程ｅ）において前記ヘパラン−Ｎ−スルファターゼを前記樹脂から、ｐＨ  約７．５において２５ｍＭ  ＮａＰＯ４を含む溶出剤で溶出する工程、
をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
工程ｆ）において得られた前記ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ組成物を、工程ｇ）を行う前に、導電率  約３〜約４ｍＳ／ｃｍを得るように調節する工程、
をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記導電率は、約３ｍＳ／ｃｍであり、前記溶液は、約ｐＨ  ５．０において約２０ｍＭ  酢酸ナトリウムを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記導電率は、約４ｍＳ／ｃｍであり、前記溶液は、約ｐＨ  ５．０において約４０ｍＭ  酢酸ナトリウムを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
工程ｈ）は、ｐＨ  約５において約５０ｍＭ  酢酸ナトリウムおよび約９０ｍＭ  ＮａＣｌを含む溶出剤で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記溶出剤は、導電率  約１２〜約１４ｍＳ／ｃｍを有する、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、２０１１年５月１９日に出願された米国仮出願第６１／４８８，０９０号（この全体の教示は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼを調製および精製するためのプロセスおよび方法に関する。開示されるプロセスおよび方法は、一般に、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼを、非常に純粋なヘパラン−Ｎ−スルファターゼを生成する条件下で１つ以上のクロマトグラフィー工程に供する工程を包含する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
ムコ多糖症（ＭＰＳ）は、特定のリソソーム酵素の欠損もしくは非存在によって引き起こされる、稀な、遺伝性のリソソーム蓄積症の群である。これら酵素の非存在は、細胞および組織において、ならびにリソソームといわれる細胞オルガネラにおいて、複雑な糖分子の蓄積を生じる。通常のリソソーム酵素の存在下で、これら糖は、他の物質へと変換され、身体によって使用される。これら複雑な糖は、ムコポリサッカリドもしくはグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）として公知であり、身体における結合組織の基本要素として働く。
【０００４】
ＭＰＳ  ＩＩＩは、ＧＡＧを分解するために必要な４種の異なる酵素が欠如していることから生じる。各々の酵素欠損は、サンフィリッポ症候群：タイプＩＩＩＡ（サンフィリッポＡ）、タイプＩＩＩＢ（サンフィリッポＢ）、タイプＩＩＩＣ（サンフィリッポＣ）、およびタイプＩＩＩＤ（サンフィリッポＤ）の異なる形態を規定する。ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ（ＨＮＳ）は、ヘパラン硫酸の段階的分解に関与する酵素である。ＨＮＳは、ヘパラン硫酸（ＧＡＧの１タイプ）のグルコサミン残基のアミノ基に結合したスルフェート部分を加水分解する。この酵素の欠損は、ムコ多糖症ＩＩＩＡ（ＭＰＳ、サンフィリッポ症候群Ａ）と関連する。ＭＰＳタイプＩＩＩＡに罹患した患者は、ＨＮＳをコードする遺伝子において変異を有し、この酵素の欠損もしくは非存在を生じる。
【０００５】
ＭＰＳ  ＩＩＩＡ（サンフィリッポＡ）の症状は、通常、２歳〜６歳の間に生じるが、いくつかの症例では、１３歳程度で診断がなされる。上記状態の臨床症状は、種々の重篤度を呈する。中枢神経系は、ＭＰＳ  ＩＩＩＡを有する患者における最も重篤に罹患した系である。ＨＮＳおよび他の二次的に蓄積される化合物は、主に中枢神経系に蓄積する。言語発達、運動技能、および知能発達における問題は、この状態を特徴付ける。全体的に、ＭＰＳ  ＩＩＩＡを有する個体は、顕著な発育遅延を有し、長期の生存は難しい。上記状態は、長期的に衰弱させ、生命を脅かす。
【０００６】
ＭＰＳ  ＩＩＩＡのための現在承認された治療的処置は、利用可能でない。骨髄移植は、疾患進行を遅らせようとする試みにおいて使用されてきた。ヘパラン硫酸は、ＨＮＳの天然の基質であるので、動物研究から、ＨＮＳはヘパラン硫酸の増大があるリソソーム蓄積症（例えば、ＭＰＳ  ＩＩＩＡ）の処置のために有用であり得ることが示された。
【０００７】
薬剤としてのＨＮＳにおける興味を考慮すると、費用効率的な様式において、多量の高度に精製された物質の調製は、未だに必要である。ＨＮＳを培養培地から精製する種々の報告が提示されてきた（非特許文献１）。ＨＮＳを精製するためのいくつかの方法が試みられ、記載されてきたものの、ＭＰＳ  ＩＩＩＡのヒト治療において使用するためのＨＮＳの生成に適したものは未だない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈｅｍｓｌｅｙら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．（２００７）９０：３１３〜３２８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（要旨）
本明細書に提供される実施形態は、一般に、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ（ＨＮＳ）の精製、特に、組換えヒトＨＮＳ（ｒｈＨＮＳ）の培養培地もしくは粗製組換えＨＭＳの半精製サンプルからの精製のためのプロセス、ならびに上記プロセスによって精製されたＨＮＳを含む組成物および処方物、ならびに上記精製されたＨＮＳを使用するための方法に関する。記載される方法は、ＨＮＳを精製するためのクロマトグラフィー法の組み合わせの使用を包含する。
【００１０】
本明細書に記載される実施形態は、ＨＮＳを単離するための公開された手順が、治療上有用であるように十分な純度および溶解度のＨＮＳを、再現可能に生成しないという認識に基づく。この認識に基づいて、夾雑物のレベルを低下させる条件下でＨＮＳを再現可能に調整するための方法およびアッセイの両方が、本明細書において提供される。これら方法によってＨＮＳを生成および精製することから、低下した量の夾雑物を含むＨＮＳが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法およびアッセイによって得られるＨＮＳは、その溶解度を低下させ得る高ｐＩのＨＮＳの低下した量を含むＨＮＳを生成する。上記精製プロセスは、公知のプロセスによって提供されるよりも多量の高収量のＨＮＳおよび高純度のＨＮＳを可能にする。この精製プロセスは、ヒトにおける使用のための製薬グレードのＨＮＳ（例えば、ｒｈＨＮＳ）を調製するために特に有用である。
【００１１】
一局面において、細胞培養培地から抽出された物質を精製し、上記抽出された物質を１種以上のカラムクロマトグラフィーもしくはバッチクロマトグラフィー媒体（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種以上）に曝すことによって、組換えヒトＨＮＳを精製するための方法およびアッセイが、本明細書において提供される。同様に、一局面において、１種以上のカラムクロマトグラフィーもしくはバッチクロマトグラフィー媒体から抽出された富化溶離液をさらに精製することによって、このような富化溶離液を１種以上のさらなるカラムクロマトグラフィーもしくはバッチクロマトグラフィー精製工程（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種以上）に曝すことによって、組換えヒトＨＮＳを精製するための方法およびアッセイが、本明細書において提供される。
【００１２】
一実施形態において、ＨＮＳは、４つのカラムプロセスを使用して精製され、上記プロセスは、１）細胞培養培地から抽出された溶液中の最初のＨＮＳを濾過する工程；２）上記濾過したＨＮＳをアニオン交換マトリクス（例えば、ＱセファロースファストフローＴＭカラム）に添加し（ｌｏａｄ）、上記カラムを洗浄し、上記富化されたＨＮＳを上記カラムから溶出する工程；３）上記アニオン交換カラムからの溶離液を疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）（例えば、フェニルセファロース）に添加し、上記カラムを洗浄し、上記富化されたＨＮＳを上記カラムから溶出する工程；４）上記ＨＩＣカラムからの溶離液をヒドロキシアパタイトカラム（ＨＡ）（例えば、セラミックヒドロキシアパタイトタイプ１）に添加し、上記カラムを洗浄し、上記富化されたＨＮＳを上記カラムから溶出する工程；および５）上記ＨＡカラムからの溶離液をカチオン交換カラム（例えば、ＳＰセファロース）に添加し、上記カラムを洗浄し、上記富化されたＨＮＳを上記カラムから溶出する工程、という精製工程を包含する。特定の実施形態において、上記カチオン交換カラムから回収された溶離液は、限外濾過もしくはダイアフィルトレーションによってさらに濾過および濃縮される。特定の実施形態において、上記カチオン交換カラムから回収された溶離液は、（例えば、このような溶離液を上記アニオン交換カラム、上記ＨＩＣカラム、上記ＨＡカラムおよび／もしくは上記カチオン交換カラムのうちの１種以上に添加しることによって）さらに精製される。
【００１３】
特定の実施形態において、上記カラムクロマトグラフィー精製工程の各々の実施は、以前に行われたカラムクロマトグラフィー精製工程に必ずしも依存する必要はないことに注意すべきである。よって、特定の実施形態において、上記カラムクロマトグラフィー精製工程の各々が行われる順序は重要ではなく、その後のカラムクロマトグラフィー精製工程において、例えば、前の工程からの特定の溶離液においてなされる言及は、便宜上および／もしくは明瞭さのためになされる。例えば、特定の実施形態において、ＨＮＳは、４つのカラムプロセスを使用して精製されるが、培養培地から抽出された溶液中の最初のＨＮＳを濾過した後、記載される精製工程は、異なる順序で行われる。例えば、上記精製工程は、１）上記濾過されたＨＮＳをアニオン交換マトリクス（例えば、ＱセファロースファストフローＴＭカラム）に添加し、上記カラムを洗浄し、上記富化されたＨＮＳを上記カラムから溶出する工程；２）上記アニオン交換カラムからの溶離液をヒドロキシアパタイト（ＨＡ）カラム（例えば、セラミックヒドロキシアパタイトタイプ１）に添加し、上記カラムを洗浄し、上記富化されたＨＮＳを上記カラムから溶出する工程；３）上記ＨＡカラムからの溶離液をカチオン交換カラム（例えば、ＳＰセファロース）に添加し、上記カラムを洗浄し、上記富化されたＨＮＳを上記カラムから溶出する工程；および４）上記カチオン交換カラムからの溶離液を疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）（例えば、フェニルセファロース）に添加し、上記カラムを洗浄し、上記富化されたＨＮＳを上記カラムから溶出する工程、を包含し得る。
【００１４】
特定の実施形態において、ＨＮＳは、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種以上のカラムクロマトグラフィー精製工程を使用して精製される。例えば、特定の実施形態において、ＨＮＳは、３つのカラムプロセスを使用して精製され、ここで細胞培養培地から抽出された溶液中の最初のＨＮＳを濾過した後、このような濾過したＨＮＳは、以下の工程を包含する精製に供される：１）上記ＨＮＳをアニオン交換マトリクス（例えば、ＱセファロースファストフローＴＭカラム）に添加し、上記カラムを洗浄し、上記富化されたＨＮＳを上記カラムから溶出する工程；２）上記アニオン交換カラムからの溶離液を疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）（例えば、フェニルセファロース）に添加し、上記カラムを洗浄し、上記富化されたＨＮＳを上記カラムから溶出する工程；および３）上記ＨＩＣカラムからの溶離液をヒドロキシアパタイトカラム（ＨＡ）（例えば、セラミックヒドロキシアパタイトタイプ１）に添加し、上記カラムを洗浄し、上記富化されたＨＮＳを上記カラムから溶出する工程。
【００１５】
同様に、特定の実施形態において、ＨＮＳは、少なくとも２つのカラムクロマトグラフィー工程を使用して精製される。例えば、特定の実施形態において、細胞培養培地から抽出された溶液から最初のＨＮＳを濾過した後、このようなＨＮＳは、以下の精製工程を包含する２つのカラムプロセスを使用して精製される：１）上記ＨＮＳを疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）（例えば、フェニルセファロース）に添加し、上記カラムを洗浄し、上記富化されたＨＮＳを上記カラムから溶出する工程；および２）上記ＨＩＣカラムからの溶離液をヒドロキシアパタイトカラム（ＨＡ）（例えば、セラミックヒドロキシアパタイトタイプ２）に添加し、上記カラムを洗浄し、上記富化されたＨＮＳを上記カラムから溶出する工程。
【００１６】
上記記載されるカラムクロマトグラフィー精製工程の各々は、前のカラムクロマトグラフィー精製工程に関せずに行われ得るが、上記カラムクロマトグラフィー精製工程の各々を含む個々の構成要素が、記載される順序において行われることが意図されることは理解されるべきである。例えば、最初のＨＮＳ抽出物（もしくは代わりに、前に行われたカラムクロマトグラフィー精製工程からの溶離液）をカラムに添加しる工程は、そのカラムを洗浄する前に行われなければならず、上記カラムを洗浄する工程は、上記富化されたＨＮＳをそのカラムから溶出する前に行われなければならない。
【００１７】
本明細書に提供されるさらなる局面によれば、精製された組換えＨＮＳ組成物が記載され、これは、ＭＰＳ  ＩＩＩＡのようなリソソーム酵素欠損に罹患している被験体を処置するために有用であり得る。ＨＮＳは、ＭＰＳ  ＩＩＩＡの天然に存在するマウスモデルにおける脳脊髄液を介して投与される場合に活性を有することが示された。Ｈｅｍｓｌｅｙら、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｍｅｔａｂ．９０：３１３−３２８（２００７）。ＭＰＳ  ＩＩＩＡ  ＨｕｎｔａｗａｙイヌモデルにおけるＨＮＳの槽内送達はまた、治療活性を示した。Ｈｅｍｓｌｅｙら、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｍｅｔａｂ．  ９８（４）：  ３８３−９２（２００９）。
【００１８】
本明細書に提供されるさらに別の局面によれば、ＨＮＳの組成物が記載され、これは、高ｐＩのＨＮＳを実質的に含まない。別の局面において、本開示は、実質的に純粋なＨＮＳであるＨＮＳの組成物を提供する。特定の実施形態において、上記精製されたＨＮＳ調製物は、夾雑物を約９０％超含まない。好ましくは、上記物質は、夾雑物を、８０％超、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％超含まない。
【００１９】
別の局面によれば、治療上有効な量の、本明細書に記載されるプロセスによって調製されるとおりの精製された組換えＨＮＳを、適切な賦形剤と一緒に含む薬学的組成物が、本明細書において提供される。組換えＨＮＳの上記薬学的組成物は、被験体への局所投与、経口投与もしくは非経口投与（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与もしくは髄腔内投与）に特に適している。
【００２０】
本発明の上記で考察される、多くの他の特徴および付随する利点は、添付の実施例とともに理解される場合、本発明の以下の詳細な説明を参照することによってよりよく理解されることになる。本明細書に記載される種々の実施形態は、無償提供され、本明細書に含まれる教示に鑑みて、当業者によって理解される様式において一緒に組み合わされ得るかもしくは使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本明細書に提供される実施形態の精製プロセスフロー図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（詳細な説明）
本明細書に記載される特定の実施形態は、精製されたＨＮＳ（ＭＰＳ  ＩＩＩＡの処置において使用するためのリソソーム酵素）を調製するための方法およびプロセスを提供する。本明細書に記載される特定の実施形態は、被験体（例えば、ＭＰＳ  ＩＩＩＡを有する被験体）を、本明細書で開示される精製されたＨＮＳ組成物で処置するための方法を提供する。ＨＮＳを精製するためのプロセスは、当該分野で公知である。例えば、Ｈｅｍｓｌｅｙら、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｍｅｔａｂ．  ９０：３１３〜３２８（２００７）；米国特許出願公開番号２００９／０１８６０１１（これらの各々は、本明細書に参考として援用される）を参照のこと。しかし、ＨＮＳを精製するための以前に公開された方法は、製造可能ではなかったし、容易にスケールアップされなかったし、そして／またはヒトにおける使用に適した純粋なＨＮＳを再現可能に生成しない。
【００２３】
本明細書に開示される方法に従ってＨＮＳを生成および精製すると、低下した量の夾雑物を含むＨＮＳが提供される。本明細書に記載される方法によって生成されるＨＮＳは、治療剤（例えば、ＭＰＳ  ＩＩＩＡの処置のための）としての使用に特に十分に適している。
【００２４】
ヘパラン−Ｎ−スルファターゼは、名称Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ；ＳＧＳＨ；ＥＣ  ３．１０．１．１；Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ；２−デスオキシ−Ｄ−グルコシド−２−スルファメートスルホヒドロラーゼ（スルファメートスルホヒドロラーゼ）；ヘパリンスルファミダーゼ；スルホグルコサミンスルファミダーゼ；スルファミダーゼ；ＨＮＳ、ｒｈＨＮＳ、スルファミダーゼ、ｒｈＮＳ、およびｒｈＳＧＳＨによって、当該分野でも公知であるリソソーム酵素である。用語「ＨＮＳ」とは、本明細書で使用される場合、この酵素（その機能的フラグメントおよび／もしくは誘導体を含む）およびその任意の薬学的に受容可能な形態を包含する。ヘパリン−Ｎ−スルファターゼは、Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ  （ＯＭＩＭ）識別番号ＯＭＩＭ  ６０５２７０（この登録は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｉｍ／６０５２７０においてオンラインにて公に利用可能である）と関連する。このオンライン登録の内容全体、およびそこにリンクされた全てのページは、本明細書に参考として援用される。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「ＨＮＳ組成物」とは、種々の純度状態において、ＨＮＳを含む任意の組成物を意味する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「実質的に純粋な」とは、タンパク質もしくはポリペプチドが、それらの意図された使用に実用的かつ適切な程度まで、他の物質を本質的に含まないことを意味する。特に、上記タンパク質は十分に純粋であり、例えば、薬学的調製物において有用であるように、それらの宿主細胞およびウイルスの他の生物学的夾雑物を十分に含まない。本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なＨＮＳ」とは、単離されたかもしくは合成され、かつ夾雑物を約９０％超含まない、ＨＮＳの調製物である。好ましくは、上記物質は、夾雑物を、８０％超、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくはさらに９９％超含まない。純度の程度は、当該分野で公知の手段によって評価され得る。
【００２７】
用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」および「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、本明細書で使用される場合、被験体における疾患の進行を逆転させる（ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ）もしくはブロックすることをいう。
【００２８】
ＨＮＳは、天然に存在する酵素であるので、これは、上記タンパク質を作製するために適した宿主細胞から得られた細胞培養上清培地から単離することによって、代表的には調製される。特定の実施形態において、上記宿主細胞は、ＨＮＳを生成するように遺伝的に操作される。例えば、ＨＮＳを生成する細胞機構を担う遺伝子は、細菌もしくは真菌のような微生物へと入れられ得る。他の実施形態において、ＨＮＳを生成する上記細胞機構を担う遺伝子は、哺乳動物細胞へと入れられ得る。使用され得る哺乳動物細胞の非限定的例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／ｌ，  ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ：  ８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６，  ＣｒｕＣｅｌｌ，  Ｌｅｉｄｅｎ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，  ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３細胞もしくは懸濁培養物において増殖するためにサブクローニングされた２９３細胞，  Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，  ３６：５９，１９７７）；ヒト線維肉腫細胞株（ＨＴ１０８０）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞  ＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，  Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７７：４２１６，  １９８０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，  Ｍａｔｈｅｒ，  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．，  ２３：２４３−２５１，  １９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，  ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ，  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ  ｒａｔ）肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，  ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，  ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２，  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ３８３：４４−６８，  １９８２）；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）が挙げられる。
【００２９】
本明細書に提供される特定の局面において、上記宿主細胞の培養条件は、高レベルのＨＮＳと最小レベルの夾雑物を生成するように最適化される。本明細書に提供される別の局面において、ＨＮＳを精製するためのプロセスは、生物学的物質、特に、ＨＮＳおよび他の夾雑タンパク質を含む粗製混合物（出発材料サンプルもしくはバルク材料といわれる）との使用について意図される。本明細書に提供される一局面によれば、ＨＮＳを精製するための方法は、特に、組換えプロセスの培養培地もしくはバルク材料の粗製調製物からの組換えヒトＨＮＳ（ｒｈＨＮＳ）の精製について記載される。この方法によって得られるｒｈＨＮＳは、高い程度の純度および高い生体比活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ）（例えば、少なくとも１０ユニット／ｍｇ、少なくとも１５ユニット／ｍｇ、少なくとも２０ユニット／ｍｇ、少なくとも２５ユニット／ｍｇ、少なくとも３０ユニット／ｍｇ、少なくとも３５ユニット／ｍｇ、少なくとも４０ユニット／ｍｇ、少なくとも４５ユニット／ｍｇ、少なくとも４７ユニット／ｍｇ、少なくとも５０ユニット／ｍｇ、少なくとも６０ユニット／ｍｇ、少なくとも７０ユニット／ｍｇ、少なくとも７５ユニット／ｍｇ、少なくとも８５ユニット／ｍｇ、少なくとも９０ユニット／ｍｇ、少なくとも１００ユニット／ｍｇ以上の範囲において）を有し、上記培養培地に存在する宿主細胞タンパク質および上記組換えプロセスにおいて使用される宿主細胞に含まれる核酸もしくは他の夾雑物を、事実上含まない。
【００３０】
一実施形態において、ＨＮＳの上記サンプルは、細胞培養上清培地を集めることによって最初に構成される。上記粗製溶液は、濾過もしくは濃縮され得、上記細胞培養に由来する夾雑物を除去して、バルク材料を生成するために１つ以上の工程に供され得ることが予期される。本明細書に記載される精製プロセスは、ＨＮＳの所望の程度の純度を達成するために、１種以上のその後のクロマトグラフィー工程（例えば、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、もしくはより多くのクロマトグラフィー工程）を包含し得る。
【００３１】
特定の実施形態において、半精製材料が、メルカプト−エチル−ピリジンに曝すことによって最初に捕捉される。一実施形態において、上記メルカプト−エチル−ピリジンは、セルロースマトリクスに連結された４−メルカプト−エチル−ピリジンである。
【００３２】
別の実施形態において、上記ＨＮＳ材料は、さらに精製される前に、ウイルス不活性化に供される。ウイルス不活性化は、例えば、１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０および０．３％  ＴｎＢＰを、処理中のＨＮＳサンプルもしくは培地に加え、周囲温度において３〜１６時間保持することによって、達成され得る。この工程は、上記精製スキームにおいて任意の時点で行われ得る。さらに、０．２μｍフィルタを使用して上記ＨＮＳ組成物を濾過することが、任意の添加する工程へと組み込まれ得る。
【００３３】
さらに他の実施形態において、上記得られたＨＮＳ材料は、必要に応じて、カラムクロマトグラフィー精製の前に容積を低下させられ得る。他の実施形態において、上記容積は、上記カラムクロマトグラフィー工程の後に富化されたＨＮＳ溶離液の回収後に低下させられる。
【００３４】
特定の実施形態において、一連のクロマトグラフィー工程によってＨＮＳを精製するための方法およびプロセスが、含まれる。特定の実施形態において、上記開示されるカラムクロマトグラフィー精製工程の各々の実施は、必ずしも行われる必要はない。同様に、複数のカラムクロマトグラフィー工程が開示される程度まで、このような工程は、逐次的にもしくは記載される順序において行われる必要はない。例えば、特定の実施形態において、上記ＨＮＳは、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種以上のカラムクロマトグラフィー精製工程を使用して精製される。同様に、特定の実施形態において、上記記載されるカラムクロマトグラフィー工程のうちの１種以上が、複数回行われ得る。いくつかの実施形態において、上記クロマトグラフィー工程のうちの１種以上は、クロマトグラフィー媒体もしくは樹脂を添加する工程、平衡化する工程、洗浄する工程、および溶出する工程を包含する。上記クロマトグラフィー精製工程の各々の逐次的実施に関する前述の記述にも関わらず、上記カラムクロマトグラフィー精製工程の各々を含む個々の構成要素が、記載される順序において行われることが意図されることは理解されるべきである。例えば、当業者によって認識されるように、各クロマトグラフィー精製工程を一般に含む添加する工程、平衡化する工程、洗浄する工程および溶出する工程は、上記記載される順序において行われることが意図される。
【００３５】
例示的精製技術としては、バッチクロマトグラフィーおよびカラムクロマトグラフィーが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＨＮＳ組成物は、精製の間に一連のクロマトグラフィー媒体と接触させられる。特定の実施形態において、上記クロマトグラフィー媒体もしくは樹脂は、１種以上のアニオン交換樹脂を含む。別の実施形態において、上記クロマトグラフィー媒体もしくは樹脂は、１種以上の疎水性相互作用樹脂を含む。さらに別の実施形態において、上記クロマトグラフィー媒体もしくは樹脂は、１種以上のヒドロキシアパタイト樹脂を含む。他の実施形態において、上記クロマトグラフィー媒体もしくは樹脂は、１種以上のカチオン交換樹脂を含む。
【００３６】
特定の実施形態において、上記クロマトグラフィー媒体もしくは樹脂は、アニオン交換樹脂、疎水性相互作用樹脂、ヒドロキシアパタイト樹脂、およびカチオン交換樹脂を含む。特定の実施形態において、上記抽出された材料は、Ｑセファロースを充填したカラム、続いて、フェニルセファロースを充填したカラム、続いて、セラミックヒドロキシアパタイトタイプＩを充填したカラム；そして続いて最後に、ＳＰセファロースを充填した別のカラムを使用して精製される。上記抽出された材料を精製するための予期された工程は、全て行われる必要はない。例えば、特定の実施形態において、上記抽出された材料は、Ｑセファロースを充填したカラム、続いて、フェニルセファロースを充填したカラム、続いて、セラミックヒドロキシアパタイトタイプＩを充填したカラムを使用して精製される。同様に、上記抽出された材料を精製するための予期された工程は、任意の特定の順序で行われる必要はない。例えば、特定の実施形態において、上記抽出された材料は、Ｑセファロースを充填したカラム、続いて、フェニルセファロースを充填したカラム、続いて、ＳＰセファロースを充填した別のカラム；続いて最後に、セラミックヒドロキシアパタイトタイプＩを充填したカラムを使用して精製される。前述の実施形態の各々において、上記カラムの各々は、必要に応じて、緩衝化溶液もしくは他の水溶液で洗浄され、続いて、水溶液を用いてＨＮＳが溶出される。特定の実施形態において、上記ＨＮＳ組成物は、各工程の間に上記クロマトグラフィー媒体から溶出される。各溶出工程は、次の精製工程に進む前に、１回以上反復され得ることが予期される。特定の実施形態において、上記抽出された材料は、濾過によってさらに精製される。さらに他の実施形態において、上記抽出された材料は、クロマトグラフィーの前、後もしくは間に、ウイルス不活性化に供される。
【００３７】
一実施形態において、上記クロマトグラフィー媒体もしくは樹脂は、アニオン交換樹脂を含む。特定の実施形態において、上記ＨＮＳ組成物と上記アニオン交換クロマトグラフィー樹脂とを接触させる工程は、例えば、第１、第２、第３もしくは第４のクロマトグラフィー工程である。種々のクロマトグラフィー樹脂もしくは媒体が使用され得、これらとしては、例えば、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ製、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、Ｂｉｏ−Ｒａｄ製、およびＰａｌｌ製の樹脂が挙げられる。適切なアニオン交換クロマトグラフィー媒体の例は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、四級アミノエチル（ＱＡＥ）もしくは四級アンモニウム（Ｑ）樹脂である。特定の実施形態において、上記アニオン交換クロマトグラフィー樹脂は、Ｑセファロースファストフロー樹脂である。
【００３８】
別の実施形態において、上記ＨＮＳを精製するためのプロセスは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程を含む。いくつかの実施形態において、上記ＨＮＳ組成物は、上記精製プロセスにおける中間工程として、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂と接触させられる。他の実施形態において、上記ＨＮＳ組成物と上記疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂とを接触させる工程は、例えば、第１、第２、第３もしくは第４のクロマトグラフィー工程である。適切な疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体の例としては、フェニル、オクチル、ブチル、ヘキシル、プロピル、ＰＰＧ、もしくはエーテルが挙げられる。特定の実施形態において、上記ＨＮＳ抽出物の精製は、フェニルセファロース  ６ファストフローカラムを使用して行われる。特定の実施形態において、上記疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂との接触から生じる上記ＨＮＳ組成物もしくは溶離液は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂とさらに接触させられる。
【００３９】
さらに別の実施形態において、上記クロマトグラフィー媒体もしくは樹脂は、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）樹脂を含む。他の実施形態において、上記ＨＮＳ組成物と上記ヒドロキシアパタイト樹脂とを接触させる工程は、例えば、第１、第２、第３もしくは第４のクロマトグラフィー工程である。いくつかの実施形態において、上記ＨＮＳを含む抽出物は、セラミックヒドロキシアパタイトタイプＩを充填したカラムを使用して精製される。いくつかの実施形態において、上記ＨＮＳを含む抽出物は、セラミックヒドロキシアパタイトタイプＩＩを充填したカラムを使用して精製される。さらに別の実施形態において、上記ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂との相互作用から集められた上記ＨＮＳ組成物もしくは溶離液は、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂とさらに接触させられる。
【００４０】
特定の実施形態において、上記ＨＮＳ組成物は、カチオン交換クロマトグラフィー工程を使用してさらに精製される。特定の実施形態において、上記カチオン交換クロマトグラフィー工程を使用する精製は、ＨＮＳの精製における中間工程である。他の実施形態において、上記ＨＮＳ組成物と上記カチオン交換クロマトグラフィー樹脂とを接触させる工程は、第１、第２、第３、第４もしくは最後のクロマトグラフィー工程である。いくつかの実施形態において、上記クロマトグラフィー媒体もしくは樹脂は、カチオン交換樹脂を含む。適切なカチオン交換クロマトグラフィー媒体の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホプロピル（ＳＰ）もしくはメチルスルホネート（Ｓ）のようなクロマトグラフィー媒体が挙げられる。いくつかの実施形態において、上記カチオン交換クロマトグラフィー樹脂は、ＳＰセファロースファストフロー樹脂である。
【００４１】
一実施形態において、上記カチオン交換工程後に得られたＨＮＳは、さらに濾過される。特定の実施形態において、上記ＨＮＳは、例えば、ダイアフィルトレーションもしくは限外濾過によってさらに濾過される。
【００４２】
一工程において、上記精製は、上記粗製ＨＮＳを含む材料が、マトリクスに添加しられ、予備平衡化された場合に生じる。次いで、上記マトリクスは、不純物を除去するために洗浄される。カラム特性は、種々の勾配での溶出を可能にするためにサイズおよび長さの両方において変化させられ得ることが予期される。当業者によって認識されるように、上記洗浄溶媒もしくは溶出溶媒は、使用されるマトリクスおよびこのような環境における上記ＨＮＳの極性によって決定される。
【００４３】
アニオン交換クロマトグラフィー樹脂からの上記バルクＨＮＳ組成物からのＨＮＳの抽出および／もしくは精製は、ｐＨレベルを調節する際に最適化され得る。例えば、７．０というｐＨレベルは、抽出および精製を最適化することが示された。よって、特定の実施形態において、上記未精製バルクＨＮＳ組成物のｐＨは、上記ＨＮＳと上記アニオン交換クロマトグラフィー樹脂とを接触させる前に、ｐＨ  約７．０に調節される。特定の実施形態において、上記アニオン交換カラムに添加しられるべき材料は、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ  酢酸Ｎａに調節される。いくつかの実施形態において、上記アニオン交換樹脂に添加しられるべき上記ＨＮＳ組成物を含む溶液は、約５０〜約１００ｍＭの酢酸ナトリウム濃度を有する。上記ＨＮＳ組成物の導電率  約３〜４ｍＳ／ｃｍは、アニオン交換クロマトグラフィー樹脂を使用して、高ｐＩのＨＮＳ種の除去を促進することが決定された。よって、特定の実施形態において、上記ＨＮＳ組成物の導電率は、上記ＨＮＳ組成物とアニオン交換クロマトグラフィー樹脂とを接触させる前に、導電率  約３〜約４ｍＳ／ｃｍを得るように調節される。別の実施形態において、上記導電率は、上記ＨＮＳ組成物と上記アニオン交換クロマトグラフィー樹脂とを接触させる前に、約３．５ｍＳ／ｃｍへと調節される。特定の実施形態において、上記ＨＮＳ組成物は、上記アニオン交換カラムに添加しる前に、ウイルス不活性化される。さらに別の実施形態において、上記ＨＮＳ組成物は、上記アニオン交換カラムに添加しる前に、０．２μｍフィルタを使用して濾過される。
【００４４】
一実施形態において、上記アニオン交換カラムは、上記富化されたＨＮＳ組成物を上記アニオン交換カラムから溶出する前に、ｐＨ  約７．０において約２０ｍＭ  ＭＥＳ−Ｔｒｉｓおよび約２０ｍＭ  ＮａＣｌを含む約５カラム容積の緩衝液で洗浄される。特定の実施形態においては、各クロマトグラフィー樹脂との接触の間にさらなる溶出工程がある。一実施形態において、上記ＨＮＳは、上記アニオン交換クロマトグラフィー樹脂から、約ｐＨ  ７．０において約２０ｍＭ  ＭＥＳ−Ｔｒｉｓおよび約１８０ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液を使用して溶出される。特定の実施形態において、上記フロースルーおよび洗浄物中の富化されたＨＮＳの％回収は、吸光度単位、酵素活性もしくはＥＬＩＳＡによって測定される。一実施形態において、上記宿主細胞タンパク質クリアランスは、この工程後、約２倍である。別の実施形態において、上記プロセスは、高ｐＩのＨＮＳのうちの約１０〜約２５％を除去する。さらに別の実施形態において、上記高ｐＩのＨＮＳの除去は、改善された溶解度をもたらす。
【００４５】
特定の実施形態において、上記疎水性相互作用樹脂は、上記ＨＮＳ組成物と上記疎水性相互作用カラムとを接触させる前に、ｐＨ  約７．０において約２０ｍＭ  ＭＥＳ−ＴｒｉｓおよびＮａＣｌ濃度  約１．１〜１．５Ｍ、ならびに導電率  約９０〜約１２０ｍＳ／ｃｍを含む緩衝液で平衡化される。このような濃度、ｐＨおよび導電率は、上記疎水性相互作用カラムへのＨＮＳの結合、それによって、上記ＨＮＳ組成物の精製の最適化を促進する。
【００４６】
特定の実施形態において、富化されたＨＮＳを含む、上記アニオン交換クロマトグラフィー工程からの溶離液は、上記疎水性相互作用工程のための出発材料である。一実施形態において、上記ＨＮＳ組成物のＮａＣｌ濃度は、上記ＨＮＳ組成物と上記疎水性相互作用カラムとを接触させる前に、ＮａＣｌ濃度  約１．１Ｍ〜約１．５Ｍ  ＮａＣｌを達成するために調節される。別の実施形態において、上記ＮａＣｌ濃度は、上記ＨＮＳ組成物と上記疎水性相互作用カラムとを接触させる前に、約１．２Ｍに調節される。上記ＨＮＳ組成物のｐＨは、上記疎水性相互作用カラムと接触させられる前に、約７．０へと調節される。いくつかの実施形態において、上記ＨＮＳ組成物は、上記ＨＮＳ組成物と上記疎水性相互作用カラムとを接触させる前に、２５℃において導電率  約８５〜１２０ｍＳ／ｃｍを得るように調節される。いくつかの実施形態において、上記ＨＮＳ組成物は、上記ＨＮＳ組成物と上記疎水性相互作用カラムとを接触させる前に、２５℃において導電率  約９０〜１１０ｍＳ／ｃｍを得るように調節される。
【００４７】
特定の実施形態において、上記疎水性相互作用樹脂に吸着される上記ＨＮＳ組成物は、ｐＨ  約７．０において、不純物を洗い流すために約２０ｍＭ  ＭＥＳ−ＴｒｉｓおよびＮａＣｌ濃度  約１．１Ｍ〜約１．５Ｍを含む４カラム容積の緩衝液で洗浄される。さらに別の実施形態において、上記ＮａＣｌ濃度は、約１．２Ｍである。
【００４８】
一実施形態において、上記疎水性相互作用カラムは、上記疎水性相互作用カラムから上記富化されたＨＮＳ組成物を溶出するために、ｐＨ  約７．０において約２０ｍＭ  ＭＥＳ−Ｔｒｉｓおよび約１８０〜２２０ｍＭ  ＮａＣｌを含む約４カラム容積の緩衝液で溶出される。特定の実施形態においては、さらなる溶出工程がある。一実施形態において、上記ＨＮＳは、精製されたＨＮＳの回収を最適化するために、約ｐＨ  ７．０において約２０ｍＭ  ＭＥＳ−Ｔｒｉｓおよび約２００ｍＭ  ＮａＣｌを含み、導電率が２５℃において約１９〜約２３ｍＳ／ｃｍの範囲の緩衝液を使用して、上記疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂から溶出される。別の実施形態において、上記ｐＨ範囲は、約６．９〜７．１である。特定の実施形態において、上記フロースルーおよび洗浄物中の富化されたＨＮＳの％回収は、吸光度単位、酵素活性もしくはＥＬＩＳＡによって測定される。一実施形態において、上記宿主細胞タンパク質クリアランスは、この工程後、約３５〜４５倍である。
【００４９】
特定の実施形態において、上記疎水性相互作用カラムから得られた、富化されたＨＮＳのプールされた溶離液は、ヒドロキシアパタイトカラムを使用する精製のための出発材料として使用され得る。いくつかの実施形態において、上記疎水性相互作用カラムからの溶出後の上記ＨＮＳ組成物を含む溶液は、精製を最適化するために、約２ｍＭ〜約４ｍＭのＮａＰＯ４の濃度に調節される。特定の実施形態において、ＮａＰＯ４の濃度は、約２ｍＭおよびｐＨ  約７．０＋０．１に調節される。一実施形態において、上記平衡化緩衝液は、約ｐＨ  ７．０において、約２０ｍＭ  ＭＥＳ−Ｔｒｉｓおよび約２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む。特定の実施形態において、上記平衡化緩衝液のｐＨは、約７．０〜約７．２に調節される。さらに別の実施形態において、上記ＨＮＳ組成物は、上記アニオン交換カラムに添加しる前に、０．２μｍフィルタを使用して濾過される。別の実施形態において、上記平衡化緩衝液は、ｐＨ  約７．０において、約２ｍＭ  ＮａＰＯ４、約２０ｍＭ  ＭＥＳ−Ｔｒｉｓおよび約２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む。
【００５０】
一実施形態において、上記ヒドロキシアパタイトカラムは、上記富化されたＨＮＳ組成物を上記ヒドロキシアパタイトカラムから溶出する前に、ｐＨ  約７．０〜約７．２において、約２ｍＭ〜約４ｍＭのＮａＰＯ４、約２０ｍＭ  ＭＥＳ−Ｔｒｉｓおよび約２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む約４カラム容積の緩衝液で洗浄される。別の実施形態において、上記洗浄緩衝液は、ｐＨ  約７．０において、約２ｍＭ  ＮａＰＯ４、約２０ｍＭ  ＭＥＳ−Ｔｒｉｓおよび約２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む。
【００５１】
いくつかの実施形態において、上記ヒドロキシアパタイトカラムと接触させられたＨＮＳは、ｐＨ  約７．４〜約７．６において、約２５ｍＭ  ＮａＰＯ４を含む溶液で溶出される。別の実施形態において、上記ヒドロキシアパタイトカラムに添加しられたＨＮＳは、ｐＨ  約７．０〜約７．６において、約２０ｍＭ  ＮａＰＯ４〜約３０ｍＭ  ＮａＰＯ４を含む溶出剤で溶出される。一実施形態において、上記溶出緩衝液は、ｐＨ  約７．５＋０．１において、約２０ｍＭ  ＮａＰＯ４、約２５ｍＭ  ＭＥＳ−Ｔｒｉｓを含む。特定の実施形態において、上記溶出工程は、少なくとも１回反復され得る。特定の実施形態において、上記フロースルーおよび洗浄物中の富化されたＨＮＳの％回収は、吸光度単位、酵素活性もしくはＥＬＩＳＡによって測定される。
【００５２】
特定の実施形態において、上記ヒドロキシアパタイトカラムから得られた、富化されたＨＮＳのプールされた溶離液は、カチオン交換カラムを使用する精製のための出発材料として使用され得る。さらに別の実施形態において、上記出発材料中のＨＮＳ組成物は、上記カチオン樹脂へのＨＮＳの結合を最適化するために、上記カチオン交換カラムに添加しられる前に、導電率  約３〜約４ｍＳ／ｃｍを得るように調節される。いくつかの実施形態において、上記導電率は、約３ｍＳ／ｃｍに調節され、上記溶液は、上記カチオンカラムへのＨＮＳの結合を最適化するために、約ｐＨ  ５．０において約２０ｍＭ  酢酸ナトリウムを含む。さらに別の実施形態において、上記カチオン交換樹脂に添加しられる上記ＨＮＳ組成物の導電率は、約４ｍＳ／ｃｍであり、上記溶液は、上記カチオンカラムへのＨＮＳの結合を最適化するために、約ｐＨ  ５．０において約４０ｍＭ  酢酸ナトリウムを含む。別の実施形態において、上記カチオン交換樹脂に添加しられる上記ＨＮＳ組成物の導電率は、約３．５ｍＳ／ｃｍ＋０．５であり、上記ｐＨは、約５．０である。別の実施形態において、上記ＨＮＳ組成物は、  上記カチオン交換カラムに添加しる前に、０．２μｍフィルタを使用して濾過される。
【００５３】
一実施形態において、上記平衡化緩衝液は、約５０ｍＭ  酢酸Ｎａ、約２０〜約４０ｍＭ  ＮａＣｌおよびｐＨ  約５．０を含む。特定の実施形態において、上記平衡化緩衝液のｐＨは、約４．９〜約５．１に調節される。別の実施形態において、上記平衡化緩衝液は、約５０ｍＭ  酢酸Ｎａ、約２０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  約５．０を含み、導電率は、約５〜約７ｍＳ／ｃｍの範囲に及ぶ。
【００５４】
一実施形態において、上記カチオン交換カラムは、上記カチオン交換カラムから上記富化されたＨＮＳ組成物を溶出する前に、ｐＨ  約５．０〜約７．２において、約５０ｍＭ  酢酸Ｎａ、約２０ｍＭ〜４０ｍＭ  ＮａＣｌを含む約４カラム容積の緩衝液で洗浄される。別の実施形態において、上記洗浄緩衝液は、約５０ｍＭ  酢酸Ｎａ、約２０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  約５．０を含み、導電率は、約５〜約７ｍＳ／ｃｍの範囲に及ぶ。
【００５５】
いくつかの実施形態において、上記カチオン交換樹脂からの上記ＨＮＳの溶出は、ｐＨ  約４．９〜約５．１において、約５０ｍＭ  酢酸ナトリウムおよび約９０ｍＭ〜約１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む溶出剤で行われる。特定の実施形態において、上記カチオン交換樹脂からの上記ＨＮＳの溶出は、ｐＨ  約５．０＋０．１において、約５０ｍＭ  酢酸ナトリウムおよび約９０ｍＭ  ＮａＣｌを含む溶出剤で行われる。特定の実施形態において、上記溶出剤は、約１２〜約１４ｍＳ／ｃｍの導電率範囲を有する。特定の実施形態において、上記溶出工程は、少なくとも１回反復され得る。特定の実施形態において、上記フロースルーおよび洗浄物中の上記富化されたＨＮＳの％回収は、吸光度単位、酵素活性もしくはＥＬＩＳＡによって測定される。
【００５６】
本明細書に記載される別の実施形態は、夾雑物を約９０％超含まない純度レベルへと上記の方法によって単離された、精製されたＨＮＳである。好ましくは、上記材料は、夾雑物を８０％超、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくはさらに９９％超含まない。純度の程度は、当該分野で公知の任意の適切な手段によって評価され得る。
【００５７】
本明細書で記載される生成物およびプロセスは、グリコサミノグリカンが、上記疾患の発生および／もしくは進行において重要であることが分かった、被験体における任意の疾患／状態を処置および／もしくは予防するために有用であり得る。特定の実施形態は、ＨＮＳが非機能的であるか存在しないかのいずれかである、被験体における任意の疾患もしくは状態を処置および／もしくは予防のために特に有用であり得る。疾患を処置することはまた、上記疾患もしくは上記疾患の症状における所望の改善を実行する（ｅｘａｃｔｉｎｇ）工程を包含する。
【００５８】
本明細書で開示される組成物は、単独で、もしくは被験体におけるムコ多糖症もしくはその後遺症と関連する疾患を処置するための別の治療剤と組み合わせて、使用され得る。これらさらなる治療剤は、上記組成物を投与する前に投与され得るか、またはそれらは、上記組成物を投与すると同時にもしくは投与した後に、投与され得る。被験体は、例えば、任意のヒトもしくは非ヒト脊椎動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ）であり得る。
【００５９】
一実施形態において、上記精製されたＨＮＳ組成物のための処方緩衝液は、リン酸緩衝液（例えば、５ｍＭ  リン酸ナトリウム、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．０）であり得る。他の適切な緩衝液は、当業者に公知である。
【００６０】
特定の実施形態において、最終ＨＮＳ濃度は、５ｇ／Ｌを上回るか、１０ｇ／Ｌを上回るか、１５ｇ／Ｌを上回るか、２０ｇ／Ｌを上回る。
【００６１】
本明細書に記載される精製されたＨＮＳ組成物は、局所的に（眼科的に、ならびに膣送達および直腸送達を含む粘膜に対するものを含む）、肺に（例えば、ネブライザーによるものを含む散剤もしくはエアロゾルの吸入法もしくは通気法によって；気管内に、鼻内に）、経口的にもしくは非経口的に、投与され得る。特定の実施形態において、非経口投与が好ましく、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、頭蓋内投与、髄腔内投与もしくは心室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）投与を含む。
【００６２】
本明細書に記載される実施形態は、以下の実施例によってさらに例示される。上記実施例は、限定するとして解釈されるべきではない。冠詞「１つの、ある（ａ）」および「１つの、ある（ａｎ）」は、本明細書および特許請求の範囲においてここで使用される場合、明らかにそうでないことが示されなければ、複数形への言及を含むことが理解されるべきである。ある群の１つ以上のメンバー間で「もしくは、または、あるいは（ｏｒ）」を含む請求項もしくは説明は、上記群のメンバーのうちの１つ、１つより多い、もしくは全てが、そうでないことが示されなければ、もしくは別段状況から明らかにならなければ、所定の生成物もしくはプロセスに存在するか、使用されるか、または他の点で関連するのであれば、満たしていると考えられる。本発明は、上記群のうちの正確に１つのメンバーが、所定の生成物もしくはプロセスに存在するか、使用されるか、もしくは他の点で関連する実施形態を包含する。本発明はまた、１つより多くの、もしくは全体の群のメンバーが、所定の生成物もしくはプロセスに存在するか、使用されるか、もしくは他の点で関連する実施形態を包含する。さらに、本発明は、全てのバリエーション、組み合わせ、および置換（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）（ここで列挙された請求項のうちの１つ以上からの１つ以上の限定、要素、節（ｃｌａｕｓｅ）、記述用語などは、別段示されなければ、もしくは矛盾もしくは不整合が生じることが当業者に明らかでなければ、同じ基礎請求項（もしくは関連する任意の他の請求項として）に従属する別の請求項へと導入される）を包含することは、理解されるべきである。要素が列挙として示される場合、（例えば、マーカッシュグループもしくは類似の形式において）上記要素の各サブグループもまた開示され、任意の要素が上記グループから除かれ得ることは、理解されるべきである。一般に、本発明、もしくは本発明の局面が特定の要素、特徴などを含むとして言及される場合、本発明もしくは本発明の局面の特定の実施形態が、このような要素、特徴などからなるか、もしくはこれらから本質的になることは、理解されるべきである。単純化する目的で、それら実施形態は、あらゆる場合において、本明細書中で非常に多くの語句で具体的に示されてこなかった。本発明の任意の実施形態もしくは局面は、具体的な除外が本明細書に記載されるか否かに拘わらず、特許請求の範囲から明確に排除され得ることもまた、理解されるべきである。本願全体を通して引用される参考文献（文献参照、発行された特許および公開された特許出願およびウェブサイトを含む）の全ての内容全体は、明示的に本明細書に参考として援用される。
【実施例】
【００６３】
実施例Ｉ
ヒトＨＮＳの精製
本研究の目的は、多量の組換えヒトＨＮＳ（増大した溶解度を有する）を得ることであった。安定にトランスフェクトしたＨＴ１０８０細胞を、バイオリアクター培養条件下で増殖させ、活性ＨＮＳ酵素を、細胞培地から精製した。使用される液体クロマトグラフィー装置は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）製のＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｏｄｅｌ：  １８−１４０３−００）およびＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）製のＧｅｎｅｓｙｓ  ６  ＵＶ−Ｖｉｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、カタログ番号＃３３５９０８０００，Ｓｅｒｉａｌ  ２Ｍ６Ｆ０７８００７）であった。以下のクロマトグラフィー樹脂を使用した：  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）製のＱセファロースファストフロー，カタログ番号１７−０５１０−０４）；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）製のフェニルセファロース  ６ファストフロー，カタログ番号１７−０９７３−０４）；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）製のＳＰセファロースファストフロー，カタログ番号１７−０７２９−０４）；およびＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）製のセラミックヒドロキシアパタイト，タイプＩ，８０μｍ粒度，カタログ番号１５７−００８５）。
【００６４】
本実施例において使用されるクロマトグラフィーカラムは、Ｋｏｎｔｅｓ  Ｇｌａｓ（Ｖｉｎｅｌａｎｄ，  ＮＪ）製のＫｏｎｔｅｓ  ３０×１．０ｃｍカラム（カタログ番号４２０８３０−３０００）；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）製のＸＫ  １６／４０カラム（カタログ番号１８−８７７４−０１）；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）製のＸＫ  ５／３０カラム（カタログ番号１８−８７５１−０１）；およびＢｉｏ−Ｃｈｅｍ  Ｖａｌｖｅ（Ｂｏｏｎｔｏｎ，  ＮＪ）製のＯｍｎｉｆｉｔ  １０×２５ｍｍカラム（カタログ番号００６ＣＣ−１０−０２−ＡＦ）を含む。
【００６５】
Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに特注したＨＴ１０８０宿主細胞溶解物に対するヤギ抗体を利用するサンドイッチベースのＥＬＩＳＡアッセイを使用して、宿主細胞タンパク質濃度を決定した。サンプル希釈剤（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．１％  ＰｒｏＣｌｉｎ  ３００，  ｐＨ  ６．０）中で希釈した５０μｌのサンプル、アッセイコントロール（７５ｎｇ／ｍｌ）および標準物質を、１００μｌのＨＲＰ結合体化抗体（結合体希釈剤：３ｍｇ／ｍｌ  通常ヤギＩｇＧを有するＣｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＨＲＰ結合体希釈剤中で１：９５希釈）とともに、予め被覆したマイクロＥＬＩＳＡプレート上で２時間にわたって周囲温度において、Ｔｉｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ振盪機で同時にインキュベートした。
【００６６】
上記ウェルの内容物をインキュベーションの最後に除去し、上記プレートを、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（０．４２５％  ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）、０．０２５％  ＰｒｏＣｌｉｎ  ３００を含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２）で４回洗浄した。次いで、ＴＭＢ基質溶液（テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｂｅｎｚｅｄｉｅｎｅ）；ＢｉｏＦｘ  ＴＭＢＷ１０００−０１）の１００μｌを、各ウェルに加え、上記プレートをさらに３０分間インキュベートした。比色反応を、１００μｌの停止溶液（０．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）を加えることによって停止させ、４５０ｎｍの吸光度を、６５０ｎｍに設定したバックグラウンドを差し引きしてＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ＰＬＵＳ  ３８４  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを使用して測定した。標準曲線（０〜２００ｎｇ／ｍｌ）を、ＳｏｆｔＭａｘ  ４．８ソフトウェアを使用して構築し、上記サンプル中のＨＣＰ濃度を内挿（ｉｎｔｒａｐｏｌａｔｅ）した。このアッセイを使用して、ＨＮＳサンプル中の上記ＨＴ１０８０細胞株に由来するＨＣＰの量を、定量した。
【００６７】
内部（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）ＩｇＧ精製したＨＮＳに対して特異的なＴＫ１３１５ウサギポリクローナル抗体を、ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏプレートに１時間にわたって３７℃で５．０μｇ／ｍＬにて被覆した。上記プレートを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した後、上記ウェルを、ＰＢＳＴ中２％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。適切に希釈したサンプルおよび参照標準物質を、１時間にわたって３７℃においてインキュベートした。上記プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した後、二次抗体である、ＨＮＳ  内部ＩｇＧ精製ＨＲＰ結合体に対して特異的なＴＫ１３１５ウサギポリクローナル抗体（１：３０００）を適用した。３７℃において３０分間インキュベートした後、上記プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。ＴＭＢ基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を適用し、上記プレートを、１５分間にわたって３７℃でインキュベートし、その後、２Ｍ  硫酸で上記反応を停止させた。上記プレートを４５０ｎｍにおいて読み取り、二次曲線当てはめを使用して、標準曲線を生成した。このアッセイを使用して、上記サンプル中のＨＮＳの量を定量した。上記精製したＨＮＳタンパク質の濃度を、Ｇｅｎｅｓｙｓ  ６  ＵＶ−Ｖｉｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを使用して、Ａ２８０吸光度によって測定した。
【００６８】
４−メチルウンベリフェリル２−スルファミノ−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシドを基質として利用する２工程ＨＮＳ活性アッセイを、ＨＮＳ活性を決定するために使用した。基質／反応緩衝液中に希釈したサンプル１０μｌを、上記アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ９６ウェルプレート，  Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＃３９１２）に加え、続いて、２０μｌの基質溶液（基質／反応緩衝液中の２０ｍＭ  ４−メチルウンベリフェリル２−スルファミノ−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド）を加えた。上記プレートを、Ｊｉｔｔｅｒｂｕｇ  （Ｂｏｅｋｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の中で、最初の３分間にわたって１に設定したミキサーで３７℃において１時間にわたってインキュベートした。インキュベーションの最後に、６μｌのＰｉ／Ｃｉ停止緩衝液を加え、上記プレートを、３分間にわたってＪｉｔｔｅｒｂｕｇの中で、１に設定したミキサーで混合して、上記反応の第１の工程を停止させた。次いで、４６μｌの標準物質（基質／反応緩衝液中０〜５０μＭ  ４−メチルウンベリフェロン；０〜２３００ピコモル）を、上記プレートの最初の２つのブランクの行に加え、続いて、１０μｌのα−グルコシダーゼ（ａ−ｇｌｕｃｏｄｉｄａｓｅ）（０．２％  不活性化ＢＳＡ中２５０Ｕ／ｍｌ）をサンプルおよび基質／反応緩衝液ブランク（標準物質ではない）を含むウェルに加えた。上記プレートを、３７℃においてさらに１時間にわたって、最初の３分間にわたって１に設定したミキサーを備えたＪｉｔｔｅｒｂｕｇの中でインキュベートした。インキュベートの最後に、２００μｌの炭酸塩停止緩衝液（０．５Ｍ  炭酸ナトリウム，ｐＨ  １０．７，０．０２５％  Ｔｒｉｔｏｎ−１００）を、標準物質、サンプルおよびブランクを含むウェルに加えて、上記反応を停止させた。
【００６９】
各ウェルの内容物を、「振盪プレート」機能でＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２マルチ検出マイクロプレートリーダーを使用して３回混合し、４６０ｎｍの蛍光を測定した。標準曲線（０〜２３００ピコモル）を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを使用して構築し、上記サンプル中のＨＮＳ活性を内挿した。１活性単位を、１時間において３７℃で１ピコモルの４−メチルウンベリフェロンを生成するとして規定する。ＨＮＳ活性を計算し、Ｕ／ｍｌ（もしくは上記タンパク質濃度が既知である場合は、Ｕ／ｍｇ）として表した。このアッセイを使用して、ＨＮＳサンプルの活性値を定量した。
【００７０】
精製のためのプロセスは、ＢｉｏＳｅｐｒａＴＭ  ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ吸着剤（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｐ／Ｎ  ＃  １２０３５−０３６）捕捉を使用して、未精製バルク材料を生成することからなった。
【００７１】
Ｑカラム工程を行う前に、１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０および０．３％  ＴｎＢＰを上記未精製バルクに加え、上記混合物を周囲環境において３〜１６時間保持することによって、ウイルス不活性化プロセスを行った。ウイルス不活性化の後、上記混合物を０．２μｍフィルタで濾過した。３．０、３．５および４．０ｍＳ／ｃｍのＱ添加導電率（Ｑ  ｌｏａｄ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）を研究した。３回の試行の操作条件を表１にまとめる。上記Ｑ試行のバルク添加材料を、１００ｍＭ  酢酸Ｎａに調節した。上記Ｑ試行の流量は、１５０ｃｍ／時間であった。
【００７２】
【表１】
2014517692.tif 000003
上記Ｑ試行の結果を、表２にまとめる。
【００７３】
【表２】
2014517692.tif 000004
上記Ｑプロセスを設計して、高ｐＩのＨＮＳのうちの１０〜２５％を除去しＨＮＳ薬物物質の溶解度を改善した。上記Ｑ評価試行の結果（表２）に基づいて、３．０ｍＳ／ｃｍ、３．５ｍＳ／ｃｍ、および４．０ｍＳ／ｃｍにおいて上記Ｑカラムに添加すると、Ｑ  ＦＴ／洗浄において類似のＨＮＳ喪失および上記溶離液の類似のＨＣＰクリアランスが生じた。活性およびＥＬＩＳＡによる溶離液回収には、ある程度の変動があった。これは、アッセイの変動によって引き起こされ得る。上記回収は、ＦＴ／洗浄において類似のＨＮＳ損失があったので、３回全ての試行について類似であることが予測された。ＡＵ、活性、およびＥＬＩＳＡによる全ての回収は、許容可能であると考えられた。これら結果に基づいて、上記添加材料の導電率を、３．５±０．５ｍＳ／ｃｍに設定した。
【００７４】
実施例２
フェニルセファロースカラム
１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、および１．５Ｍ  ＮａＣｌでのフェニル添加を研究した。１８０ｍＭ、２００ｍＭ、および２２０ｍＭ  ＮａＣｌでのフェニル溶出もまた、研究した。上記フェニル添加のｐＨは試験しなかった。なぜならＨＩＣカラムは、添加プロセスにおけるｐＨ変化（ｐＨ  ７．０±０．１）に対して感受性であるとは予測されないからである。上記フェニル試行の操作条件を、表３および表４にまとめる。上記フェニル試行の流量は、１５０ｃｍ／時間であった。
【００７５】
【表３】
2014517692.tif 000005
【００７６】
【表４】
2014517692.tif 000006
上記フェニル試行の結果を、表５および表６にまとめる。
【００７７】
【表５】
2014517692.tif 000007
【００７８】
【表６】
2014517692.tif 000008
１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、および１．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．０（２５℃において９０〜１１７ｍＳ／ｃｍの導電率範囲）において添加すると、上記フェニル溶離液のＦＴ／洗浄、溶出容積、回収、およびＨＣＰクリアランスにおいて類似のＨＮＳ損失が生じた（表５）。１８０ｍＭ、２００ｍＭ、および２２０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．０（２５℃において２０〜２３ｍＳ／ｃｍの導電率範囲）における上記フェニルカラムの溶出は、上記フェニル溶離液の類似の溶出容積、回収、およびＨＣＰクリアランスを生じた（表６）。
【００７９】
これら結果に基づくと、上記フェニル添加を、２５℃において導電率範囲  ９０〜１１０ｍＳ／ｃｍを有する１．２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．０±へと調節することが好ましいと思われる。推奨されるフェニル平衡化および洗浄緩衝液は、２５℃において導電率範囲  １００〜１２０ｍＳ／ｃｍを有する２０ｍＭ  ＭＥＳ−Ｔｒｉｓ、１．２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．０±１．０である。推奨されるフェニル溶出緩衝液は、２５℃において導電率範囲  １９〜２３ｍＳ／ｃｍを有する２０ｍＭ  ＭＥＳ−Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．０±１．０である。
【００８０】
実施例３
セラミックヒドロキシアパタイト（ＨＡ）カラム
異なるリン酸ナトリウム濃度および異なるｐＨ値のＨＡ添加および溶出を研究した。上記実験試行の操作条件を、表７および表８にまとめる。上記ＨＡ試行の流量は、１５０ｃｍ／時間であった。
【００８１】
【表７】
2014517692.tif 000009
【００８２】
【表８】
2014517692.tif 000010
結果
上記ＨＡ試行からの結果を、表９および表１０にまとめる。定量レベル（ＬＯＣ）は、＜１５０Ｕ／ｍｌに等しい。
【００８３】
【表９】
2014517692.tif 000011
【００８４】
【表１０】
2014517692.tif 000012
４ｍＭ  ＮａＰＯ４での上記ＨＡカラムの添加から、上記ＦＴ／洗浄において吸光度単位でより高い％損失および溶離液における吸光度によるより低い％回収が生じた（表９）。上記ＨＡ状態において、上記ＨＡ溶離液の純度は、９５％を上回り、吸光度単位による回収は、活性もしくはＥＬＩＳＡ結果に基づく回収より、これらアッセイにおける比較的大きな変動性に起因して信頼性が高い。上記ＨＡカラムを２ｍＭ  ＮａＰＯ４，ｐＨ  ７．２において添加すると、上記溶離液においてより低いＨＣＰクリアランスが生じた。これら結果に基づくと、上記ＨＡプロセスは、ホスフェート濃度およびｐＨに対して感受性が高いようであった。上記ＨＡ添加を２ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ  ７．０±０．１に調節することは、好ましいと思われる。２ｍＭ  ＮａＰＯ４、２０ｍＭ  ＭＥＳ−Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．０±０．１のＨＡ平衡化および洗浄緩衝液もまた、好ましいと思われる。
【００８５】
上記ＨＡカラムを２０ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ  ７．５緩衝液で溶出すると、吸光度単位によって測定される場合、より低い％回収が生じた（表１０）。ホスフェート濃度を３０ｍＭに増大させると、％回収は増大したが、上記溶離液におけるＨＣＰクリアランスは低下した。上記溶出緩衝液のｐＨを変化させることはまた、上記溶離液におけるＨＣＰクリアランスを低下させることにも注意した。推奨されるＨＡ溶出緩衝液は、２０ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ  ７．５±０．１である。
【００８６】
実施例４
ＳＰセファロースカラム
３．０および４．０ｍＳ／ｃｍでのＳＰ添加、ならびに２０ｍＭ  ＮａＣｌおよび４０ｍＭ  ＮａＣｌでのＳＰ  ＥＱ／洗浄を研究した。異なる塩濃度（８０ｍＭ  ＮａＣｌ、９０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）および異なるｐＨ値（ｐＨ  ４．９、ｐＨ  ５．０、およびｐＨ  ５．１）でのＳＰ溶出もまた、研究した。上記実験試行の操作条件を、表１１および表１２にまとめる。上記ＳＰ試行の流量は、１５０ｃｍ／時間であった。
【００８７】
【表１１】
2014517692.tif 000013
【００８８】
【表１２】
2014517692.tif 000014
上記ＳＰ試行の結果を、表１３および表１４にまとめる。
【００８９】
【表１３】
2014517692.tif 000015
【００９０】
【表１４】
2014517692.tif 000016
上記ＳＰカラムを希釈もしくは未希釈条件下（導電率範囲  ３．０〜４．０ｍＳ／ｃｍ）での負荷（ｌｏａｄ）で添加すると、上記ＳＰ溶離液の類似の回収およびＨＣＰクリアランスが生じた（表１３）。上記ＳＰカラムを２０ｍＭもしくは４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ５．０（２５℃において導電率範囲  ５．０〜７．２ｍＳ／ｃｍ）で洗浄すると、上記ＳＰ溶離液の類似の回収およびＨＣＰクリアランスが生じた（表１３）。これら結果に基づくと、ＳＰ添加を、添加について導電率範囲  ３．５±０．５ｍＳ／ｃｍを有するｐＨ  ５．０±０．１に調節することは、好ましいと思われる。推奨されるＳＰ平衡化および洗浄緩衝液は、導電率範囲  ５〜７ｍＳ／ｃｍを有する５０ｍＭ  酢酸Ｎａ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ５．０±０．１である。
【００９１】
上記ＳＰカラムを８０ｍＭ、９０ｍＭ、および１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ５．０（２５℃において導電率範囲  １１．５〜１３．７ｍＳ／ｃｍ）で溶出すると、類似の回収およびＨＣＰクリアランスが生じた（表１４）。しかし、８０ｍＭ  ＮａＣｌでの上記溶離液のカラム容積は、９０ｍＭ  ＮａＣｌでの２．３ＣＶと比較して、４．７ＣＶであった。また、上記ＳＰカラムを９０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ４．９、ｐＨ  ５．０、およびｐＨ  ５．１において溶出すると、類似の回収およびＨＣＰクリアランスが生じた。しかし、上記ｐＨ  ４．９溶出の溶離液容積は、ｐＨ  ５．０での溶離液の２．３ＣＶと比較して、４．４ＣＶであった。両方の場合において、上記溶離液の容積の増加は、上記溶出プロフィールのテーリングに起因した。過度なピークテールを集めるのを回避するために、上記溶離液を５０ｍＡＵから５０ｍＡＵまで、もしくは最大３ＣＶまでのいずれか早い方を集めることが推奨される。推奨されるＳＰ溶出緩衝液は、導電率範囲  １２〜１４  ｍＳ／ｃｍおよび５０ｍＡＵから５０ｍＡＵまでもしくは最大３ＣＶまでのいずれか早い方の上記溶離液のピーク回収を伴う５０ｍＭ  酢酸Ｎａ、９０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ５．０＋０．１である。
【００９２】
これらアッセイは、組換えリソソームスルファターゼ酵素を調製するための上記に記載されるプロトコルが、多量の高度に精製された酵素、ヒトヘパラン−Ｎ−スルファターゼ（ＨＮＳ）の生成のための効率的方法を提供することを示す。
【図１】
2014517692.tif 000017
【国際調査報告】
2014517692.tif 000018