(57)【要約】本発明は、カルシウム生体材料、破骨細胞、内皮細胞および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および／または骨芽細胞および／または脂肪細胞を含む、造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血前駆細胞（ＨＰ）のための培養基質に関する。本発明はまた、このような培養基質を調製するための方法、並びにＨＳＣおよび／またはＨＰをin vitroで培養するための方法に関する。ＨＳＣ／ＨＰの造血および／または分化に関与する細胞機序を研究するための、および／または候補医薬品の効力および／または毒性を研究するための、このような培養基質の使用も記載されている。
2014525238.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．カルシウム生体材料；
ｂ．破骨細胞；
ｃ．内皮細胞；および
ｄ．間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および／または骨芽細胞および／または脂肪細胞
を含む、造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血前駆細胞（ＨＰ）の培養支持体。
【請求項２】
前記カルシウム生体材料が、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）およびリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）を含む、請求項１記載の培養支持体。
【請求項３】
前記カルシウム生体材料が２次元または３次元である、請求項１または２記載の培養支持体。
【請求項４】
前記カルシウム生体材料が、生体材料Ｂ２ＤおよびＢ３Ｄ（BD Biocoat Osteologic Bone Cell Culture System）並びにCalciresorb３５（Ceraver, France）からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項記載の培養支持体。
【請求項５】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の１つ以上の成分をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の培養支持体。
【請求項６】
生物学的接着剤をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の培養支持体。
【請求項７】
少なくとも１つのカルシウム生体材料を、破骨細胞、内皮細胞および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および／または骨芽細胞および／または脂肪細胞および場合によりＥＣＭの１つ以上の成分と共に移植することから構成される工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項に定義された培養支持体を調製するための方法。
【請求項８】
ａ．請求項１〜５のいずれか１項に定義された少なくとも１つの培養支持体に、造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血前駆細胞（ＨＰ）を播種すること；および
ｂ．前記造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血前駆細胞を培養すること
から構成される工程を含む、造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血前駆細胞（ＨＰ）をin vitroで培養するための方法。
【請求項９】
造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血前駆細胞（ＨＰ）の造血および／または分化に関与する細胞機序を研究するための、請求項１〜６のいずれか１項に定義された培養支持体の使用。
【請求項１０】
造血移植片の生着能を評価するための請求項１〜６のいずれか１項に定義された培養支持体の使用。
【請求項１１】
医薬品候補の効力および／または毒性を研究するための請求項１〜６のいずれか１項に定義された培養支持体の使用。
【請求項１２】
ａ．カルシウム生体材料；
ｂ．破骨細胞、または造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血前駆細胞（ＨＰ）の破骨細胞への分化を可能とする１セットのサイトカインおよび／または増殖因子；
ｃ．内皮細胞、または循環中の内皮前駆細胞もしくは骨髄の単核細胞の、内皮細胞への分化を可能とする１セットのサイトカインおよび／または増殖因子；
ｄ．間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および／または骨芽細胞および／または脂肪細胞、および場合により、ＭＳＣの骨芽細胞／脂肪細胞および／または骨芽細胞および／または脂肪細胞への分化を可能とする１セットのサイトカインおよび／または増殖因子；および
ｅ．場合により、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の１つ以上の成分
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルシウム生体材料、破骨細胞、内皮細胞および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および／または骨芽細胞および／または脂肪細胞を含む、造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血前駆細胞（ＨＰ）を培養するための支持体に関する。本発明はまた、このような培養支持体を調製するための方法、並びに、ＨＳＣおよび／またはＨＰをin vitroにおいて培養するための方法に関する。造血および／またはＨＳＣ／ＰＨの分化に関与する細胞機序を研究するための、および／または薬物候補の効力および／または毒性を研究するためのこのような培養支持体の使用も記載されている。
【０００２】
発明の背景
成人の造血
造血は、造血幹細胞（ＨＳＣ）と呼ばれる少数部隊の細胞から形成された全血液成分の産生および連続的かつ調節された再生を可能とする、生理学的プロセスである。成人においては、造血は骨髄の特定の場所（ニッチと呼ばれる）で起こり、そこで造血は、分泌因子および／または細胞成分およびそれを囲む細胞外マトリックスとの直接的な相互作用によって厳密に調節されて、これは「微小環境」を形成している。多くの場合、このプロセスの調節異常は、悪性血液疾患の発症につながる。その種々の分化レベルにおける（ＨＳＣ、未成熟前駆細胞、分化が方向づけられた前駆細胞、成熟細胞および機能細胞）造血の調節の研究は、微小環境およびそれが発生するシグナルの重要性を強調する可能性を与えた。実際に、微小環境を模倣することによって、骨髄造血およびＢリンパ球新生並びに未成熟前駆細胞ＬＴＣ−ＩＣ（長期培養開始細胞）の研究をin vitroで可能とするのは、骨髄ストローマ細胞上での造血細胞の共培養系の開発である。これに対して、in vitroにおけるＴリンパ球新生は、胸腺の微小環境の存在下または直接的にＦＴＯＣ（胎児胸腺器官培養）型の器官典型的培養においてのみ可能であった。骨髄ストローマにおいてのその研究は、近年、これらのストローマを改変することによって可能となった（遺伝子導入によるＤｅｌｔａ ｌｉｋｅ−１の過剰発現）（De Smedt et al, Blood Cells Mol Dis, 2004, 33(3):227-32）。
【０００３】
これらのデータは、その全構成要素において正常なまたは病的な造血を研究および分析するために、微小環境によって放出されるシグナルをより良く理解する重要性を強調する。マウスに実施されたいくつかの近年の研究は、ニッチの造血微小環境の攪乱が、骨髄増殖性症候群（ＭＰＳ）の発症につながり得ることを示唆するため、これはいっそう重要である。ヒトにおいても、ますます多くの議論が、病的クローンの発達に好ましい、正常な造血が損傷されるに好ましい、環境を提供することによって、白血病およびＭＰＳの病気発生における微小環境の役割を支持している。この仮定は、特定の同種移植片患者においてＭＰＳの発症が観察される一方で、関連ドナーはそれらを全く発症しないということによって支持される。
【０００４】
造血幹細胞と骨髄ニッチ
造血ニッチの概念は、初めて、１９７８年にSchofieldによって紹介されたが、一連の実験の議論がその存在の実証に貢献するのは２０００年の初頭になってからである。
【０００５】
造血微小環境の現在の知識は、それぞれ、骨内膜ニッチおよび血管ニッチと呼ばれる、ＨＳＣを調節する２つのニッチの存在を報告する。骨内膜ニッチは骨と接触した場所にあり、そしてこれは骨芽細胞、線維芽細胞および脂肪細胞（これらは全て間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を起源とする）、並びにＨＳＣに由来しそして骨吸収に関与する破骨細胞からなる。つい最近の研究は、骨芽細胞および脂肪細胞は、ネスチン＋ＭＳＣに由来し得、その静止状態、増殖および分化は、交感神経系（ＳＮＳ）によって調節されることを示し、それ故、ニッチのモデリング、ＨＳＣの調節およびその動員における中枢神経系の役割が示唆される。これに対して、血管ニッチは、有窓型血管のネットワークからなり、内皮幹細胞（ＥＳＣ）に由来する内皮細胞からなる。骨髄に存在するいわゆる「ＣＡＲ」（ＣＸＣＬ１２を高発現する細網）細胞も、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１の産生を介してこれらのニッチの形成に関与する。
【０００６】
ＨＳＣは、そのニッチと交流対話を維持し、そこで種々のストローマ細胞との直接的な接触を介して並びに微小環境因子（Ｃａ２＋およびＯ２の濃度）を通して調節されている。特定数のリガンド／レセプター対、例えばアンジオポエチン−１／Ｔｉｅ２、ジャギド／ノッチ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／Ｗｎｔ、ソニックヘッジホッグ／Ｐａｔｃｈｅｄ、並びにＶＬＡ４、ＶＬＡ５、ＣＤ４４、Ｎ−カドヘリン型の接着分子が、骨芽細胞とＨＳＣの間の相互作用に関与し、そして後者の静止状態／自己再生平衡を調節する。さらに、ＨＳＣの特徴の１つである、薬剤排除のためのＳＰ（サイドポピュレーション）機能は、ニッチ内の、特に骨内膜ニッチ内のその局在に密接に関連し得る。それらに対する拡散因子は、特定のホルモン（副甲状腺ホルモン、セロトニンなど）、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）、サイトカイン（ＳＣＦ、ＶＥＧＦ、ＴＰＯなど）およびケモカイン（ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１、ＩＬ８など）によって示される。
【０００７】
骨と接触する相対的低酸素の中心である骨内膜ニッチは、間葉系（骨芽細胞、脂肪細胞、線維芽細胞）および造血系（破骨細胞および内皮細胞）のオステオコンピテント（osteocompetent）な細胞との相互作用を介して、幹細胞を静止状態に維持することに関与する。
【０００８】
支持体のその構造的な役割に加えて、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）もまた、ニッチ内のＨＳＣ／ＨＰの増殖／分化／生存における重要なレギュレーターとして作用する。このマトリックスの成分の中に、コラーゲンおよびエラスチン、フィブロネクチンおよびラミニンといった特殊タンパク質、並びにメタロプロテアーゼおよびプロテオグリカンのような調節タンパク質を含む構造タンパク質が見られる。プロテオグリカンは、タンパク質ファミリーを形成し、その主な利点は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のその鎖によって生じる。これらのＧＡＧは、増殖因子およびケモカインのバイオアベイラビリティーに干渉し、そしてそれらをそのタンパク質分解から防御する。
【０００９】
現在、造血に対する骨系の影響は、より良く知られ始めたが、骨リモデリングの生理機能における造血の相互的役割に関しては殆ど研究されていない。酸素濃度がより高い血管ニッチは、ＨＳＣの増殖および分化にかなり関与しているだろうが、近年の研究は、ＨＳＣの自己再生における内皮細胞の重要性を示した。しかしながら、今日まで、これらの両方のニッチが明確に異なるかどうか、またはそれらが共通のニッチに寄与するかどうかは明確に確立されていない。
【００１０】
造血の調節の解明および医薬品の薬理毒性の試験
ＨＳＣとオステオコンピテントな細胞との間のその調節ニッチ内での相互作用に関与する機序は、生理機能または病態においても依然としてあまりよく分かっていない。これらの機序の解明は、実際に、特にその微小環境的局面を統合して全体的な状況で造血を研究することを可能とする、in vitroのツールがないために限られている。
【００１１】
一方で、新規な治療分子の開発は、造血および潜在的には骨リモデリングに対するその毒性およびその効力を評価するのに適した試験の開発を必要とする。それ故、このようなツールは、認知、薬理および治療レベルにおいて、特に血液学において大きな利点を有する（di Maggio et al, Biomaterials, 2011, 32(2):321-9）。実際に、現在では、その微小環境の状況で正常または病的な造血の研究を可能とする培養系は全く存在しないか、非常に僅かしか存在しない：「ニッチ」成分は、存在しないか（サイトカイン条件での液体培養）、または制限されそしてあまり適合されていないか（ストローマ系における共培養）または得られない（in vivoでの実験、移植片）。今日までに報告された稀な研究の中で、開発されたモデルは、特定のストローマ細胞とＨＳＣとの間の相互作用に限定され、そしてそれらは全体的にニッチを考慮していない（de Barros et al, PLoS One, 2010, 8;5(2)）。
【００１２】
それ故、生理機能に近い状況で造血を研究するために入手可能で調整可能であるin vitroのツールを有するために、２次元（２Ｄ）または３次元（３Ｄ）のニッチをモデリングするのは大きな利点がある。
【００１３】
本発明の目的は、それ故、骨髄環境の複雑性を再構築する、２Ｄまたは３Ｄの造血ニッチモデルを提案することである。
【００１４】
本発明は、種々のカルシウム豊富度を有する生物学的（脱細胞化骨片）または製造された支持体の細胞化を、種々のタイプのストローマ細胞（骨芽細胞、破骨細胞、脂肪細胞、間葉系細胞、内皮細胞）を用いて実施すること、および、これらの細胞化支持体上で幹細胞または造血前駆細胞（ＳＰ、ＡＬＤＨｓｔｒｏｎｇ、ＣＤ３４＋、Ｌｉｎ−）を共培養することからなる。細胞外マトリックス（ＧＡＧ、フィブロネクチン、コラーゲンなど）の構成成分がこれらの支持体上に移植されることにより、ストローマ細胞によって産生される因子の良好なアベイラビリティーは確実となる。骨髄微小環境の酸素濃度の変動をできるだけ再現するために、０．１％〜２０％、優先的には１％〜３％まで変化するＯ２濃度で共培養を行なう。
【００１５】
このモデルは、幹細胞のＳＰ能を明らかにすることを可能とし、そして造血移植片の生着能のin vitro評価試験を形成し得る。それはまた、ＨＳＣの循環、増殖、分化および動員に対する、造血ニッチを形成している細胞性および体液性エレメントの役割の研究を可能とする。このシステムはまた、オステオコンピテント細胞および骨リモデリングに対する造血細胞の役割の研究を可能とする。最後に、このモデルは、血液疾患をターゲットとし、そして造血ニッチを形成している細胞エレメントに影響を及ぼし得る、新薬をin vitroで試験するための薬理学的および毒性学的ツールとして使用することができる。それ故、このモデルは、医薬品の薬理学的および毒性学的研究のために使用され得る。このツールはまた、特定の悪性血液疾患を特徴づける造血の調節異常における造血ニッチの役割の研究を可能とする。
【００１６】
発明の説明
培養支持体
本発明の第１の局面は、
ａ．カルシウム生体材料；
ｂ．破骨細胞；
ｃ．内皮細胞；および
ｄ．間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および／または骨芽細胞および／または脂肪細胞
を含む、造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血前駆細胞（ＨＰ）の培養支持体に関する。
【００１７】
本発明による造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血前駆細胞（ＨＰ）の培養支持体は、細胞成分と、「カルシウム生体材料」と呼ばれる無細胞成分とを含み、これは骨誘導性支持体の役割を果たす。カルシウム生体材料は、単一または複数であり得、よって培養支持体を形成している細胞および培養細胞は、同じ生体材料上に、または異なる生体材料上に（同一または異なる性質の）、例えば１つの細胞型に対して１つなどのように播種され得る。「異なる生体材料」によって、同じ生体材料から、または異なる組成を有する生体材料から派生した個々の実体を意味する。
【００１８】
カルシウム生体材料の組成は変化し得る。カルシウム生体材料は、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）およびリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）を含むまたはからなり得る。例えば、カルシウム生体材料は、脱細胞化骨片または合成材料に相当し得る。ＨＡおよびＴＣＰの比率は変化し得る。これらの両方の構成成分の比率を変化させることによって、例えば、異なる多孔度を有する生体材料を得ることが可能である。特に、生体材料のＨＡの比率は、５５％〜７５％、好ましくは６０％〜７０％まで変化し得る。生体材料のＴＣＰの比率は、２５％〜４５％、好ましくは３０％〜４０％まで変化し得る。
【００１９】
カルシウム生体材料は２次元または３次元である。３次元型のカルシウム生体材料の使用は、特に、天然の造血ニッチ内に存在するものと類似したこれらの生理的条件下でＨＳＣおよび／またはＨＰの培養を実施できる可能性を与え得る。
【００２０】
特定の態様によると、カルシウム生体材料は、Ｂ２Ｄ型またはＢ３Ｄ型（BD Biocoat Osteologic Bone Cell Culture System）およびCalciresorb 35（Ceraver, France）の生体材料からなる群より選択される。Ｂ２ＤおよびＢ３Ｄの生体材料は、優れた生体適合性を有し、そして多くの型の細胞の増殖および分化を可能とするに適したリン酸カルシウムに基づいた多相性の合成材料である。Ｂ３Ｄ生体材料は、開孔を有する架橋構造を示し、そしてin vitroにおける研究のために理想的な孔サイズおよび多孔度を有する。Calciresorb 35は、多孔性ブロックの形態の、合成βリン酸三カルシウムＣａ３（ＰＯ４）２とヒドロキシアパタイトＣａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２の混合物である。この二相性セラミックは、６５％のＨＡと３５％のβＴＣＰからなる。その多孔度は約４５％であり、全多孔度は、マクロ多孔度（１００〜４００μmの孔）およびミクロ多孔度（１０μm未満の孔）からなる。
【００２１】
本発明による培養支持体の細胞成分を構成する細胞は、種々の起源を有し得る。特に、それらはヒト骨髄から派生し得る。骨髄単核細胞は、例えば、全人工股関節手術を行なった患者の手術残留物からの癌性骨片から単離され得る。本発明による培養支持体に含まれる内皮細胞はまた、患者の血液から単離された細胞、例えば末梢血中に存在する血中を循環している内皮前駆細胞（ＣＥＰ）または単核球中の造血細胞から派生し得る。
【００２２】
破骨細胞は、特定の分化によって造血前駆細胞から得ることができる。破骨細胞表現型は、例えば、メイ・グリュンワルド・ギムザ（ＭＧＧ）染色（これを用いて破骨細胞の融合から生じた多核局面を示すことが可能である）によって、および酒石酸耐性ホスファターゼ活性（ＴＲＡＰ）を示すことによって確認され得る。
【００２３】
本発明による培養支持体に含まれる内皮細胞は、造血細胞に運命づけられていない（「lineage陰性」すなわちＬｉｎ−と言われる）。さらに、それらはその表面にＣＤ１４４およびＫＤＲ分子を発現する。本発明の内皮細胞は、例えば、「lineage陽性」細胞の免疫磁気による除去を実施することによって（造血細胞に運命づけられた大部分の除去を可能とする）、そしてその後、ＣＤ１４４／ＫＤＲ選別を実施することによって、骨髄の単核細胞から得ることができる。選別された細胞は、その後、内皮細胞用培地中で培養され得る。内皮細胞用培養培地は、例えば、Lonzaによって販売されているＥＭＧ２−ＭＶ型の培地または等価な培地であり得る。内皮前駆細胞はまた、末梢血（ＰＥＣ）から得ることもできる。このために、ＰＥＣに由来するコロニーは、２０mLの血液から得られた単核細胞からプラスチックへの接着によって生成される。
【００２４】
本発明による培養支持体はさらに、ＭＳＣおよび／または骨芽細胞および／または脂肪細胞を含む。特に、本発明による培養支持体は、ＭＳＣまたは骨芽細胞または脂肪細胞を含み得る。
【００２５】
ＭＳＣは、ヒト骨髄から派生し得、そしてプラスチックへの接着によって単離され得る。例えば、ＭＳＣは、全人工股関節手術を行なった患者の手術残留物からの癌性骨片から単離された骨髄の単核細胞を培養することによって得ることができる。培養支持体がＭＳＣを含む場合には、後者は、その後、培養支持体の調製法について本明細書において後述したように、骨芽細胞および／または脂肪細胞へと分化する。それらは、その表現型に関して、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６などの特定数のマーカーの共発現によって、および他のマーカー、特にＣＤ４５およびＣＤ３４の発現がないことによって特徴づけられる。
【００２６】
本発明による培養支持体は、骨芽細胞を含み得、これは例えば、ＭＳＣの特定の分化から派生し得る。骨芽細胞表現型は、位相差顕微鏡でミネラル化レベルを評価することによって、ナフトールＡＳ−ＢＩリン酸を用いた化学反応によりアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を示すことによる免疫組織化学法によって、並びにオステオカルシン、オステオポンチンおよびＡＬＰの検出による間接的な免疫蛍光法（ＩＦＩ）によって評価され得る。
【００２７】
本発明による培養支持体は、脂肪細胞を含み得、これは例えば、ＭＳＣの特定の分化から派生し得る。細胞の脂肪細胞の性質は、脂質液胞の存在を示す位相差顕微鏡を用いての検査によって、および脂質液胞に結合するオイルレッドＯを用いての免疫組織化学的染色によって確認され得る。
【００２８】
特定の態様によると、本発明による培養支持体は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の１つ以上の成分をさらに含む。
【００２９】
「細胞外マトリックスの成分」という表現は、細胞外マトリックスの組成物に進入する任意の化合物を示す。細胞外マトリックスを形成する化合物は当業者には周知であり、そしてこれには例えば天然グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、フィブロネクチン、コラーゲン、ヒアルロン酸、ラミニンおよびエラスチンが挙げられる。本発明による細胞外マトリックスの成分はまた、ＧＡＧの模倣物に対応し得る。実際に、後者は、グリカナーゼによって分解されないという利点を有する。本発明の特定の態様によると、細胞外マトリックスの成分は、天然ＧＡＧ、ＧＡＧ模倣体、フィブロネクチン、コラーゲンおよび／またはヒアルロン酸である。好ましくは、使用されるＧＡＧ模倣体は、「ReGeneraTing Agents」に対するＲＧＴＡの名称でＯＴＲ３（Organ, Tissue, Regeneration, Repair and Replacement）によって販売されているものである。それらを本発明による培養支持体に結合させる場合、細胞外マトリックスの成分は、優先的には、８０〜１００ng/mLの濃度で使用される。
【００３０】
特定の態様によると、本発明による培養支持体はさらに、生物学的接着剤を含む。
【００３１】
「生物学的接着剤」という表現は、細胞を生体材料と共にそして生体材料と接触させて維持することを可能とする生物学的起源の任意の化合物を示す。生物学的接着剤として使用され得る化合物は、当業者に公知である。生物学的接着剤は、例えば、血漿から（フィブリン接着剤型の生物学的接着剤）、または血小板の豊富な血漿から（血小板ゲル型の生物学的接着剤）得ることができる。
【００３２】
培養支持体を調製するための方法
本発明の別の局面は、カルシウム生体材料に、破骨細胞、内皮細胞および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および／または骨芽細胞および／または脂肪細胞、並びに場合によりＥＣＭの１つ以上の成分を移植することからなる工程を含む、本発明による培養支持体を調製するための方法に関する。
【００３３】
本発明による培養支持体の調製は、同じウェルに異なるストローマを共有することを必要とする。第１位段階で、ニッチを形成している破骨細胞、内皮細胞およびＭＳＣおよび／または骨芽細胞および／または脂肪細胞を、１つまたはいくつかの２Ｄまたは３Ｄ生体材料に播種し得る。ＭＳＣを使用する場合、それらは続いて、骨芽細胞および／または脂肪細胞へと分化され得る。このようにして種々のタイプのストローマ細胞によって細胞化されたハイブリッドＢＭが得られる。これらは次いで、本発明による培養支持体を形成するために、全ハイブリッドＢＭを単一のウェルに集められ得る。あるいは、各々の分化した細胞型の培養を、球状の形態で、すなわち、それらがその分化中に支持体に付着することを妨げることによって実施し得る。種々の細胞型を、その後、混合し、そしてde Barros et al. (PLoS One, 2010, 8;5(2))によって記載されたように、同じ単一の生体材料上に播種し得る。
【００３４】
ＨＳＣ／ＨＰは、続いて、培養支持体上に添加され得る。これらのＨＳＣ／ＨＰの濃度は変化し得る。優先的には、ＨＳＣ／ＨＰ濃度は、１mlあたり１ウェルあたり、５×１０４〜２×１０５個の細胞であり、さらにより優先的には、ＨＳＣ／ＨＰ濃度は、１mlあたり１ウェルあたり、１０５〜２×１０５個の細胞である。
【００３５】
破骨細胞は、特定の分化によって造血前駆細胞から得ることができる。一般的に、造血前駆細胞の分化は、以下の抗原系列（ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＧＰＡ）を発現している分化した細胞を除去するためにアフィニティカラムで実施されたＬｉｎ−除去によって始まる。これにより得られたＬｉｎ−細胞は、その後、生体材料上で、例えば１０〜５０ng/mlまで変動する濃度でＳＣＦ、Ｆｌｔ３ＬおよびＴＰＯを含むサイトカインの混液の存在下で培養し得る。５日間培養した後、培養培地を、以下のサイトカイン（ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ−６およびＧＭ−ＣＳＦ）を１０〜５０ng/mlまで変動する濃度で含む骨髄分化培地と交換し得る。１５日間培養した後、細胞を、１０〜２０ng/mlまで変動する濃度でＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＫ−ＬおよびＩＬ−６を含む破骨細胞誘導培地中でインキュベーションし得る。分化の質は、全く生体材料を含まないウェル上で制御され得る。破骨細胞表現型は、例えば、破骨細胞の融合から生じる多核局面を示す可能性を与えるメイ・グリュンワルド・ギムザ（ＭＧＧ）染色によって、および酒石酸耐性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性を示すことによって確認され得る。
【００３６】
ＭＳＣが培養支持体上に移植されると、これらの細胞は、その後、骨芽細胞または脂肪細胞へと分化する。このために、ＭＳＣを２つのバッチに分配し得、そしてその後、各バッチを、１セットの増殖因子および／または特定のサイトカインの存在下で培養して、１つのバッチのＭＳＣの骨芽細胞への分化、および他のバッチのＭＳＣの脂肪細胞への分化を誘導する。
【００３７】
ＭＳＣからの骨芽細胞の分化の誘導は、培養培地に、デキサメタゾン、Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸およびβ−グリセロリン酸を加えることによって達成され得る。分化は、この誘導培地中での３週間の培養後に観察され得る。これらの誘導分子は、デキサメタゾンについては０．０５μMから０．２μM、Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸については０．０４mMから０．０６mM、そしてβ−グリセロリン酸については８mMから１２mMの濃度で使用され得る。これらの誘導分子のための好ましい濃度は、以下である：デキサメタゾンについては０．１μM、Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸については０．０５mM、およびβ−グリセロリン酸については１０mM。
【００３８】
骨芽細胞の分化の質は、その後、当業者に周知である種々の技術によって評価され得る。例えば、分化の質は、位相差顕微鏡でミネラル化レベルを評価することによって、ナフトールＡＳ−ＢＩリン酸を用いた化学反応によりアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を検出することによる免疫組織化学法によって、並びにオステオカルシン、オステオポンチンおよびＡＬＰの検出による間接的な免疫蛍光法（ＩＦＩ）によって評価され得る。特に、ＩＦＩ反応は、４％パラホルムアルデヒドと結合させた後、３％ウシアルブミンおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００で強化されたＰＢＳを用いて飽和／透過処理を行うことにより実施され得る。抗オステオカルシン、抗オステオポンチンおよび抗ＰＡＬ抗体は、１％ウシアルブミンおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で強化されたＰＢＳ溶液中でインキュベーションし得、そしてその後、標識は、マウス免疫グロブリンを標的とするフィコエリトリンと結合させた抗体によって明らかにされる。最後に、核を見ることを可能とするヘキストを用いての対比染色を実施し得る。
【００３９】
脂肪細胞の分化は、デキサメタゾン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、インドメタシンおよびインシュリンを用いての９日間の処理によりＭＳＣから誘導され得る。これらの分子は、デキサメタゾンについては０．０５μMから０．２μM、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）については０．４mMから０．６mM、インドメタシンについては０．１mMから０．３mM、インシュリンについては０．００５mg/mlから０．０２mg/mlの濃度で使用され得る。これらの分子の好ましい濃度は、以下である：デキサメタゾンについては１μM、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）については０．５mM、インドメタシンについては０．２mM、インシュリンについては０．０１mg/ml。
【００４０】
細胞の脂肪細胞性は、その後、脂質液胞の存在を示す位相差顕微鏡での検査によって、および脂質液胞に結合するオイルレッドＯを用いての免疫組織化学的染色によって確認され得る。
【００４１】
特定の態様によると、分化した骨芽細胞および脂肪細胞は、２つの明確に異なる培養支持体または同じ培養支持体に移植される。
【００４２】
本発明の支持体を形成している種々の細胞型の培養は、正常酸素圧、すなわち２０％の相対酸素濃度で、または骨髄の生理的状況に近い低酸素状態、すなわち１〜５％、好ましくは３％の酸素濃度のいずれかで実施され得る。特定の態様によると、培養支持体の調製は、酸素含量が１〜５％となるような条件下で実施される。例えば、培養支持体の調製は、チャンバーまたはインキュベーター中で実施され得、酸素含量は、プローブを用いて測定され得、そして決定値に自動的に調整され得る。
【００４３】
ＨＳＣおよび／またはＨＰをin vitroで培養するための方法
本発明の別の局面は、
ａ．上で定義したような少なくとも１つの培養支持体に、造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血前駆細胞（ＨＰ）を播種する工程；および
ｂ．前記造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血前駆細胞を培養する工程
からなる工程を含む、造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血前駆細胞（ＨＰ）をin vitroで培養するための方法に関する。
【００４４】
ＨＳＣ／ＨＰは、骨髄細胞または単核球中の造血細胞から得ることができる。例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＧＰＡなどの分化抗原を全く発現していない細胞（いわゆる「lineage陰性」または「Ｌｉｎ−」細胞）は、例えばMiltenyi Biotecによって販売されている「Lineage cell depletion kit」などの種々の分化抗原に対して標的化される抗体の混液を用いて染色した後に選別することによって単離され得る。選別は、特に、オートマトンでの除去によって実施され得る。
【００４５】
本発明者らは、本発明に定義したような培養支持体上でのＨＳＣ／ＨＰのin vitroにおける培養は、末梢血Ｌｉｎ−細胞群からのＣＤ３４＋の細胞の増殖を促進することを示した。
【００４６】
さらに、本発明者らは、本発明に定義したような培養支持体上でのＨＳＣ／ＨＰのin vitroにおける培養は、ＳＰ機能の維持または獲得を促進することを示した。「ＳＰ機能」という表現は、幹細胞、特にＨＳＣが、蛍光着色剤ヘキスト−３３３４２または他の着色剤または薬物の流出を引き起こす能力を示す。この機能は、例えば、フローサイトメトリーによって、特徴的なサイトグラムの形態での細胞の残留蛍光の定量によって評価され得、最も強い流出能を有する細胞が、最も未分化であると判断される（Goodell et al, Methods Mol Biol, 2005, 290:343-52）。
【００４７】
また、特定の態様において、本発明による培養支持体上で培養されたＨＳＣ／ＨＰは、分化抗原を発現せず（Ｌｉｎ−）、高いレベルのＡＬＤＨ酵素活性（ＡＬＤＨｓｔｒｏｎｇ）に相当する高いレベルの蛍光を発現し、その表面にＣＤ３４を発現し（ＣＤ３４＋）、そしてＳＰ機能を有する。Ｌｉｎ−、ＡＬＤＨｓｔｒｏｎｇまたはＣＤ３４＋細胞の同定または選択は、実施例１に詳述したように実施され得る。
【００４８】
簡潔に言えば、ＳＰ機能は、ヘキスト−３３３４２の存在下でＬｉｎ−細胞を、例えばＤＭＥＭ＋２％ウシ胎児血清中１〜１０μg/mlで、０．２５×１０６〜２×１０６個の細胞/mLの量でインキュベーションすることによって決定され得る。インキュベーションは、優先的には、３７℃で６０〜１２０分間、特に９０分間実施される。その後、細胞を４℃で遠心分離にかけ、そして細胞ペレットを、Ｃａ２＋またはＭｇ２＋を含まないＨＢＳＳ中に、冷却条件下で２〜４×１０６個の細胞/mLの濃度で再懸濁する。ヘキスト−３３３４２の流出を、その後、フローサイトメトリーによって測定し得る。
【００４９】
ＡＬＤＨ活性の決定は、ＡＬＤＨ−Ａ１酵素の基質Ｂｏｄｉｐｙ（商標）−アミノアセトアルデヒドジエチルアセタール（ＢＡＡＡ−ＤＡ）を使用するＡＬＤＥＦＬＵＯＲ技術を使用することによって実施され得る。この基質をＤＭＳＯに溶解し、そしてＨＣｌの作用にさらして、酵素の蛍光基質であるＢＡＡＡへと変換する。細胞を、ＡＬＤＨによって細胞に保持される蛍光産物（ＢＡＡ）へと変換されるＢＡＡＡの存在下で、例えば１．５μMの濃度で３７℃でインキュベーションする。インキュベーション緩衝液ＡＬＤＥＦＬＵＯＲにおいて、高レベルのＡＬＤＨを発現する細胞は、フローサイトメトリーでＦＬ１チャンネル（ＦＩＴＣ蛍光）で測定されるように、高い蛍光レベルを有するものである。
【００５０】
ＣＤ３４＋細胞は、同種骨髄のサンプルに由来する単核細胞から、フィコール勾配による分離、その後、２％ヒトアルブミン（Vialebex, LFB）および０．５％ヒト多価免疫グロブリン（Tegeline, LFB）で強化されたＰＢＳ緩衝液中へのペレットの採取、そして少なくとも５分間のインキュベーションによって精製され得る。ＣＤ３４＋細胞は、その後、任意の適切な方法によって、例えば磁気ビーズと結合させた抗ＣＤ３４抗体の存在下でのインキュベーションによって、および免疫磁気カラムでの分離によって精製され得る。
【００５１】
培養支持体上でのＨＳＣ／ＨＰのin vitroでの培養は、好ましくは、適切な培養培地中で実施される。In vitroにおける細胞の培養に適した培地は当業者には周知である。これらは、特に、血清の添加、または無添加のいずれかである限定合成培地であり得る。ＨＳＣ／ＨＰのin vitroにおける培養のために適切な培養培地は、例えば、ＳｙｎＨ（AbcellBio）またはＳＴＥＭ ＡＬＰＨＡ．Ａ（Stem Alpha）に対応し得る。一般的に、培養は、培養細胞が所望の分化レベルに達するまで実施される。細胞の分化レベルは、細胞の表現型に従って評価され得る。細胞は、例えば、それらが未分化な表現型を示すまで培養され得、よってそれらは分化抗原を発現せず（Ｌｉｎ−）、それらは高いＡＬＤＨ酵素レベルを発現し（ＡＬＤＨｓｔｒｏｎｇ）、それらはその表面にＣＤ３４を発現し（ＣＤ３４＋）、そしてそれらはＳＰ機能を有する。
【００５２】
特定の態様において、培養支持体上でのＨＳＣ／ＨＰのin vitroにおける培養は、候補化合物の存在下で実施される。特に、候補化合物は、例えば、特定の悪性血液疾患などの造血の調節異常に関連した病態を予防または処置することを可能とする、医薬品候補であり得る。培養培地中の候補化合物の存在は、この化合物に対する薬理学または毒性学の研究を実施する可能性を与え得る。化合物の効力は、例えば、候補化合物の存在下または非存在下での培養後に、培養液中に存在する細胞の表現型を比較することによって試験され得る。化合物の毒性は、例えば、候補化合物の存在下または非存在下での培養後に、培養液中に存在するアポトーシス細胞または壊死細胞の量または比率を評価することによって試験され得る。
【００５３】
培養支持体の使用
その調節ニッチ内でのＨＳＣとオステオコンピテント細胞との間の相互作用に関与する機序は、生理学および病理学の両方において依然としてあまりよく分かっていない。これらの機序の解明は、実際に、特にその微小環境的局面を統合した全体的な状況で造血を研究することを可能とする、in vitroのツールがないために限られている。
【００５４】
本発明の培養支持体は、ＨＳＣの循環、増殖、分化および動員に対する、造血ニッチを形成している細胞性および体液性エレメントの役割の研究を可能とし得る。培養支持体はまた、オステオコンピテント細胞および骨リモデリングに対する造血細胞の役割の研究を可能とし得る。
【００５５】
また、本発明の別の局面は、ＨＳＣ／ＨＰの造血および／または分化に関与する細胞機序を研究するための本発明による培養支持体の使用に関する。
【００５６】
本発明の培養支持体は、幹細胞のＳＰ能を明らかにすることを可能とする。従って、それは、造血移植片の生着能のin vitroにおける評価を可能とし得る。
【００５７】
また、本発明の別の局面は、造血移植片の生着能を評価するための本発明による培養支持体の使用に関する。
【００５８】
現在までに、その微小環境の状況から正常または病的な造血を研究するための適切な培養系が全く存在しなかった。本発明による培養支持体は、生理機能に近い状況で造血を研究するために利用可能で調整可能であるin vitroのツールとして使用することができる。このようなツールは、薬理レベルおよび治療レベルに対して特に血液学に対して大きな利点を有する。実際に、新規治療分子の開発は、造血および潜在的には骨リモデリングに対するその毒性およびその効力を評価するための適切な試験の開発を必要とする。本発明による培養支持体は、血液疾患を標的化しそして造血ニッチを形成している細胞エレメントに影響を及ぼし得る、薬物の薬理学的および毒性学的研究のための、特に新薬のin vitroにおける試験のための、ツールとして有利に使用することができる。最後に、本発明による培養支持体はまた、特定の悪性血液疾患を特徴づける造血の調節異常における造血ニッチの役割の研究を可能とし得る。
【００５９】
また、本発明の別の局面は、医薬品候補の効力および／または毒性を研究するための本発明による培養支持体の使用に関する。
【００６０】
キット
本発明の最後の局面は、
ａ．カルシウム生体材料；
ｂ．破骨細胞、あるいは破骨細胞においてＨＳＣの分化を可能とする１セットのサイトカインおよび／または増殖因子；
ｃ．内皮細胞、あるいは循環中の内皮前駆細胞または骨髄の単核細胞の内皮細胞への分化を可能とする１セットのサイトカインおよび／または増殖因子；
ｄ．間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および／または骨芽細胞および／または脂肪細胞および場合によりＭＳＣの骨芽細胞および／または脂肪細胞への分化；および／または骨芽細胞および／または脂肪細胞の分化を可能とする１セットのサイトカインおよび／または増殖因子；および
ｅ．場合により細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の１つ以上の成分
を含むキットに関する。
【００６１】
ＨＳＣの破骨細胞への分化を可能とし、本発明によるキットに含まれる、サイトカインおよび／または増殖因子としては、例えば、以下のサイトカイン／増殖因子：ＳＣＦ、Ｆｌｔ３、ＴＰＯ、ＩＬ−６およびＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよび／またはＲＡＮＫ−Ｌが挙げられ得る。これらの増殖因子のための好ましい濃度は以下である：ＳＣＦ、Ｆｌｔ３、ＴＰＯ、ＩＬ−６およびＧＭ−ＣＳＦについては１０ng/ml、そしてＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＫ−ＬおよびＩＬ−６については２０ng/ml。
【００６２】
循環中の内皮前駆細胞または骨髄の単核細胞の内皮細胞への分化を可能とし、そして本発明によるキットに含まれるサイトカインおよび／または増殖因子としては、例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦおよびＩＧＦ−１が挙げられ得る。
【００６３】
本発明によるキットに含まれるＭＳＣの骨芽細胞への分化および／または骨芽細胞の分化を可能とする分子としては、例えば、デキサメタゾン、Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸およびβ−グリセロリン酸が挙げられ得る。これらの分子は、デキサメタゾンについては０．０５μMから０．２μM、Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸については０．０４mMから０．０６mM、そしてβ−グリセロリン酸については８mMから１２mMの濃度で使用され得る。これらの増殖因子のために好ましい濃度は以下である：デキサメタゾンについては０．１μM、Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸については０．０５mM、そしてβ−グリセロリン酸については１０mM。
【００６４】
本発明によるキットに含まれるＭＳＣの脂肪細胞への分化および／または脂肪細胞の分化を可能とする分子としては、例えば、デキサメタゾン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、インドメタシンおよびインシュリンが挙げられ得る。これらの分子は、デキサメタゾンについては０．０５μMから０．２μM、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）については０．４mMから０．６mM、インドメタシンについては０．１mMから０．３mM、そしてインシュリンについては０．００５mg/mlから０．０２mg/mlの濃度で使用され得る。これらの増殖因子のための好ましい濃度は、以下である：デキサメタゾンについては１μM、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）については０．５mM、インドメタシンについては０．２mM、そしてインシュリンについては０．０１mg/ml。
【００６５】
本発明は、以下の図面および実施例でより詳細に記載されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明による２Ｄまたは３Ｄの培養支持体を調製するための手順。本発明による培養支持体の調製は、同じウェルに異なるストローマを共有することを必要とする。第１段階において、ニッチを形成している破骨細胞、内皮細胞およびＭＳＣを、１つまたは数個の２Ｄまたは３Ｄ生体材料上に播種し得る。ＭＳＣを続いて、骨芽細胞および／または脂肪細胞へと分化させ得る。種々のタイプのストローマ細胞によって細胞化されたハイブリッドＢＭがこのようにして得られる。その後、次いで、全ハイブリッドＢＭを単一のウェルに集め得、本発明による培養支持体を形成し得る。
【図２】本発明による２Ｄ培養支持体上でのＣＤ３４＋細胞の増殖（＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１）。３０％同等のＣＤ３４＋細胞の豊富度を初期に有する、動員されていない健康被験者の末梢血からのＬｉｎ−細胞群を、７日間、本発明による２Ｄ培養支持体上で培養した。この培養の終了時に、ＣＤ３４＋群は、産生された生細胞の約９６．２５％＋／−１．７１％（ｎ＝４）を示す。
【図３】本発明による培養支持体上で培養された細胞のＳＰ機能の維持／獲得の評価。本発明による培養支持体が未分化造血細胞のプールを維持する能力を検証するために、Ｌｉｎ−骨髄細胞のＳＰ機能の維持を、３〜７日間培養した後に評価した。この目的のために、Ｌｉｎ−骨髄細胞（２×１０５個）を、２Ｄ細胞化培養支持体（ｎ＝３から４）の存在下または非存在下において培養した。ＭＳＣおよび／または骨芽細胞へと分化したＭＳＣを有する細胞化培養支持体の存在下において、ＳＰ細胞の比率（１．４６＋／−０．３３）は、最初の日まで比較的に維持されているか（培養前：１．０２＋／−０．０３、ＮＳ）、またはさらには、細胞化培養支持体が全くない条件（０．０５＋／−０．０１、ｐ＜０．０１）およびトランスウェル条件（０．１７＋／−０．０５、ｐ＜０．０５）と比較して増加している。
【図４】ＳＰ機能の獲得に対するＭＳＣの効果。Ｌｉｎ−骨髄細胞を、ＭＳＣを有する２Ｄ細胞化培養支持体の存在下または非存在下で培養した。
【００６７】
実施例
実施例１：ニッチを形成する種々の細胞型の調製
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の単離および培養
骨髄単核細胞を、全人工股関節手術を行なった患者の手術残留物からの癌性骨片から単離し、そして１０％ウシ胎児血清（SVF, Hyclone）および１％シプロフロキサシン（Bayer）を含むＭＥＭα（ATGC/biological Industries）に基づいた培地中で１００，０００個の細胞／cm２の濃度で７５cm２のフラスコに播種する。培養フラスコを３７℃で５％ＣＯ２および２０％Ｏ２を含む雰囲気中でインキュベーションする。培養培地を、コンフルエンスに近い状態（８０％から９０％）となるまで、培養３日後、最初の週、その後は１週間に１回新しくする。細胞がコンフルエンスに達した場合、それらを、３７℃で５分間トリプシンの酵素作用（トリプシン１：２５０、Sigma）によってプラスチック支持体から剥離し、数を数え（トリパンブルー）、そしてその後、５％ヒトアルブミンおよび１０％ＤＭＳＯを含む凍結保護溶液中で凍結させる。その使用の観点から、その後、ＭＳＣを３７℃の水浴中で解凍し、そしてその後、再度希釈し、そしてＭＥＭα、１％シプロフロキサシンおよび２０％アルブミンからなる培地中で洗浄する。数を数えてトリパンブルーを用いての染色によって生存度を評価した後、その後、ＭＳＣを、下記した種々の実験条件下で、ＭＥＭα、１０％ＳＶＦ、１％シプロフロキサシンに基づいた培養培地中に播種する。培養培地を、細胞が８０％のコンフルエンスを得るまで１週間に１回新しくする。その後、それらをトリプシン処理し、そして２回目の継代のために再播種する。
【００６８】
ＭＳＣの骨芽細胞および脂肪細胞への分化
−  骨芽細胞への分化：骨芽細胞への分化は、０．１μMのデキサメタゾン、０．０５mMのＬ−アスコルビン酸２リン酸および１０mMのβ−グリセロリン酸（Sigma）で強化されたＭＥＭα、１０％ＳＶＦ、１％シプロフロキサシンの培地中でコンフルエンスとなったＭＳＣから誘導される。誘導培地は、１週間に２回、３週間新しくする。分化の質は、位相差顕微鏡でミネラル化レベルを評価することによって、ナフトールＡＳ−ＢＩリン酸（Sigma）を用いた化学反応によりアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を検出することによる免疫組織化学法によって、並びにオステオカルシン、オステオポンチンおよびＡＬＰの検出による間接的な免疫蛍光法（ＩＦＩ）によって評価される。ＩＦＩ反応は、４％パラホルムアルデヒド（Sigma）と結合させた後、３％ウシアルブミンおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００（Prolabo）で強化されたＰＢＳにより飽和／透過処理を行うことにより実施される。抗オステオカルシン、抗オステオポンチンおよび抗ＡＬＰ抗体は、１％ウシアルブミンおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Biorad）で強化されたＰＢＳ溶液中でインキュベーションし、そしてその後、標識を、フィコエリトリンと結合させたマウスＩｇを標的とする抗体（ヤギ抗マウスＰＥ；Caltag）によって明らかとする。最後に、核を見ることを可能とするヘキストを用いての対比染色を実施する（Hoechst 33258, Molecular Probes）。
【００６９】
−  脂肪細胞への分化：脂肪細胞への分化は、１μMのデキサメタゾン、０．５mMの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、０．２mMのインドメタシンおよび０．０１mg/mlのインシュリン（Sigma）を用いての３回の処理サイクルを用いてコンフルエントに近いＭＳＣから誘導される。各処理サイクルは３日間続き、最後のサイクルは、特定の培地（０．０１mg/mlのインシュリンで補充された１０％ＦＣＳ）中での３日間の維持で終了する。培養液の脂肪細胞性は、脂質液胞の存在を示す位相差顕微鏡での検査によって、および脂質液胞に結合するオイルレッドＯを用いての免疫組織化学的染色によって確認される。
【００７０】
造血前駆細胞から破骨細胞への分化
全人工股関節手術を行なった患者の手術残留物からの癌性骨片から得られたヒト骨髄の単核細胞を、フィコールクッションでの密度勾配によって分離し、そしてその後、３７℃のインキュベーター中で、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中で一晩培養する。翌日、Ｌｉｎ−除去を、アフィニティカラムで行ない、これにより、以下の抗原系列を発現している分化細胞を除去する：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＧＰＡ。これにより得られたＬｉｎ−細胞（約１０７個の細胞）を、サイトカインの混液（１０ng/mlのＳＣＦ、Ｆｌｔ３およびＴＰＯ）を含む培地中でＨＡ／ＴＣＰ生体材料上で培養する。Ｌｉｎ−細胞（２×１０６個のＬｉｎ−細胞）を２Ｄまたは３Ｄの生体材料上に蒔く。５日間培養した後、培養培地を、以下のサイトカインを含む骨髄分化培地と交換する：１０ng/mlのＳＣＦ、Ｆｌｔ３、ＴＰＯ、ＩＬ−６およびＧＭ−ＣＳＦ。１５日間培養した後、細胞を、Ｍ−ＣＳＦ、ＲＡＮＫ−ＬおよびＩＬ−６を２０ng/mlで含む破骨細胞誘導培地中でインキュベーションする。
【００７１】
分化の質は、全く生体材料を含まないウェル上で制御される。破骨細胞表現型は、破骨細胞の融合から生じた多核局面を示す可能性を与えるメイ・グリュンワルド・ギムザ（ＭＧＧ）染色によって、および酒石酸耐性ホスファターゼ活性（ＴＲＡＰ）の検出によって決定される。
【００７２】
内皮細胞の入手
内皮細胞は、２つの入手源から得ることができる：
１）末梢血からの循環中の内皮前駆細胞（ＥＣＰ）。このために、ＥＣＰに由来するコロニーを、２０mLの血液から得られた単核細胞から生成する。各コロニーは、２回の継代後に約１０６個の細胞を産生する。従って、３または４回の継代後、１０８個の機能性内皮細胞を得ることが可能である。
【００７３】
２）骨髄の単核細胞。第１工程は、運命づけられた造血細胞の大部分の除去を可能とする、免疫磁気によるlineage陽性細胞の除去からなる。Ｌｉｎ−群で、その後、ＣＤ１４４／ＫＤＲ選別を実施し、そして選別された細胞を内皮細胞用培地中で培養する。単離された骨髄内皮細胞は、その後、この培地中で急速に増殖する。
【００７４】
造血幹細胞（ＨＳＣ）／造血前駆細胞（ＨＰ）の単離
Ｌｉｎ−：骨髄細胞または単核球中の造血細胞は、フィコールハイパック密度勾配での遠心分離後に得られる。その後、Ｌｉｎ−細胞（lineage陰性）は、種々の分化抗原に対して標的化される抗体の混液（Lineage cell depletion kit, Miltenyi Biotec）を用いて標識した後に選別される。緩衝液媒体中で洗浄した後、選別は、オートマトン（Automacs, Miltenyi Biotech）での除去によって実施される。
【００７５】
ＳＰ：Ｌｉｎ−細胞を、２％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で１０６個の細胞/mlの量で、ＤＮＡのインターカレーターであるヘキスト−３３３４２（５μg/ml）の存在下インキュベーションする。その後、細胞を９０分間３７℃でインキュベーションする：残りの実験は、冷却条件下で実施して、ポンプを発現していない細胞によるＨｏの受動的流出を回避する。その後、細胞を１５分間４℃で１，５００rpmで遠心分離にかけ、そして細胞ペレットを、Ｃａ２＋またはＭｇ２＋を含まないＨＢＳＳ中に、冷却条件下で、２〜４×１０６個の細胞/mlの濃度で再懸濁する。
【００７６】
ＡＬＤＨｓｔｒｏｎｇ：ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ技術は、ＡＬＤＨ−Ａ１酵素のＢｏｄｉｐｙ（商標）−アミノアセトアルデヒドジエチルアセタール（ＢＡＡＡ−ＤＡ基質）を使用する。この基質をＤＭＳＯに溶解し、そしてＨＣｌの作用にさらし、よって酵素の蛍光基質であるＢＡＡＡへと変換する。細胞を、生細胞の形質膜を通して拡散するＢＡＡＡＡ（１．５μM）の存在下で３７℃でインキュベーションする。ＡＬＤＨ酵素は、この基質を、蛍光産物（ＢＡＡ）へと変換し、これはその後、細胞膜のその陰性電荷および極性のために細胞内に保持される。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲインキュベーション緩衝液は、ＭＤＲ流出ポンプの阻害剤を含む。それ故、高レベルのＡＬＤＨを発現する細胞は、その細胞質内にＢＡＡを保持するものであるが、高い蛍光レベルを有するものでもある。この蛍光は、フローサイトメトリーでＦＬ１チャネル（ＦＩＴＣ蛍光）で測定され得る。
【００７７】
ＣＤ３４＋：ＣＤ３４＋細胞は、同種骨髄サンプルから派生した単核細胞から精製される。単核細胞をフィコール勾配に従って分離し、そしてペレットを、２％ヒトアルブミン（Vialebex, LFB）および０．５％ヒト多価免疫グロブリン（Tegeline, LFB）で強化されたＰＢＳ緩衝液で希釈し、そしてその後、５分間インキュベーションして、ＣＤ３４＋細胞の表面に存在する免疫グロブリン（Ｉｇ）に非特異的なレセプターを飽和させる。その後、細胞を、磁気ビーズ（２０μl/１０８個の細胞；Clinimacs, Miltenyi Biotech）と結合させた抗ＣＤ３４抗体の存在下で３０分間インキュベーションし、そしてその後、ＰＢＳ−２％アルブミン（ＰＡ）中で洗浄し、その後、免疫磁気カラム（Automacs, Miltenyi Biotech）上にのせる。その後、細胞を５％アルブミン、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Sigma）中で凍結させ得る。選別の品質は、フローサイトメトリーによって制御され、これにより最終細胞懸濁液中のＣＤ３４＋細胞の純度を評価する。
【００７８】
実施例２：生体材料の選択
ニッチのモデリングは、同じ骨誘導性２Ｄまたは３Ｄ支持体上での種々のストローマの共有を必要とする。これらの生体材料（ＢＭ）は、特に、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）およびリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）を種々の比率で含み得、そして様々な多孔度を有する。後者の中から、６５％のＨＡおよび３５％のβＴＣＰを含む二相性セラミックであるＢ２ＤおよびＢ３Ｄ（BD Biocoat Osteologic Bone Cell Culture System）並びにCalciresorb 35（Ceraver）に言及させて頂きたい。実施例５に示された結果は、Calciresorb 35（Ceraver）を用いて得られた。
【００７９】
実施例３：細胞外マトリックスの選択
天然グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）またはその模倣体（これはグリカナーゼによって分解されないという利点を有する）を、生体材料と結合させ得る。優先的に使用される模倣体ＧＡＧは、ＯＴＲ３（Organ, Tissue, Regeneration, Repair and Replacement）によって、「ReGeneraTing Agents」に対するＲＧＴＡの名称で販売され、そして１０〜５０mg/mlの濃度で理想的に使用される。実施例５に示された結果は、ＯＴＲ４１３１を用いて得られた。
【００８０】
実施例４：２Ｄまたは３Ｄの造血ニッチのモデリング
ニッチのモデリングは、同じウェル中に種々のストローマを共有することを必要とし、ＭＳＣ、破骨細胞および内皮細胞は、同じＢＭまたは異なる２Ｄもしくは３ＤのＢＭ上に理想的に播種される（１つの細胞型につき１つ）（図１）。実施例５で示された結果は、Calciresorb35型の種々の３ＤのＢＭ上に播種することによって得られた。ＭＳＣは、破骨細胞および脂肪細胞への分化に向けて誘導される。種々の型のストローマ細胞によって細胞化されたハイブリッドＢＭがこれにより得られる。その後、後者は、全ハイブリッドＢＭを含む単一のウェルに収集され、これにその後、ＨＳＣ／ＨＰが種々の濃度で加えられ、これにより共培養液が産生される。実施例５で示された結果は、Ｌｉｎ−細胞を１×１０５個の細胞/ml/ウェルの濃度となるまで加えた後に得られた。この手順の代替方法は、球状の形態で各々の分化した細胞型の培養液を産生することからなる（それらがその分化中に支持体に付着することを防ぐことによって）。その後、種々の細胞型を混合し、そして単一の同じ生体材料上に播種する（De Barros et al., PLoS One. 2010; 5(2)、１１頁、第３段落）。
【００８１】
詳細には、独立したＢＭ上での種々のタイプのストローマ細胞の調製の場合、ＢＭを、１mlあたり１つのＢＭあたり５×１０４〜２×１０５個の細胞の濃度でマイクロチューブに個々に播種する。５％ＣＯ２で強化された雰囲気中３７℃で３時間インキュベーションした後、細胞化ＢＭを、マイクロプレート（４つのウェル）中のＭＥＭα培地、１０％ＦＣＳ、１％シプロフロキサシン中に移し、これにより２〜５日後に骨芽細胞および脂肪細胞の誘導を達成する。骨芽細胞誘導期間は１４日間までに限られる。なぜなら、ＢＭは、それ自体、骨芽細胞系へとＭＳＣの自己誘導を誘導するからである。いくつかのＢＭ「対照」（１つの細胞型あたり１つ）を、ナフトールＡＳ−ＢＩリン酸との反応による、およびオイルレッドＯを用いての染色による免疫組織化学法で分析して、骨芽細胞および脂肪細胞への分化の陽性を確認する。
【００８２】
ＨＳＣ／ＰＨは、共培養液に入れられる日に解凍し、そして造血増殖因子（ＦＣＨ、１０ng/mL）：トロンボポエチン（Tpo, Peprotech）、幹細胞因子（ＳＣＦ、Peprotech）およびＦｌｔ３−リガンド（RetD System）で強化された、１％シプロフロキサシンを含むＳＹＮＨ培地（95L01HSA, AbCys）中で希釈する。解凍したサンプルの品質はフローサイトメトリー（ＣＤ３４の発現）によって、および半固体培地中での培養によって評価される。その後、解凍した細胞を、種々のハイブリッドＢＭの存在下で播種して（１つのウェルあたり５×１０４〜２×１０５個の細胞）ニッチを形成し、その後、以前に定義されたＳＹＮＨ培地中で１〜２週間培養する。
【００８３】
これらの培養液は、２０％の相対酸素濃度で、または骨髄の生理的状況に近い低酸素状態で、すなわち１〜５％の濃度で達成される。実施例５に示された結果は、３％の相対酸素濃度の条件下で得られた。
【００８４】
実施例５：ニッチの生物学的特徴付け
ニッチの種々の細胞型の特徴付け
特異的誘導の試験を用いての骨芽細胞、脂肪細胞および破骨細胞の分化の評価は、実施例１に記載されているように染色によって実施される。
【００８５】
ニッチの機能的評価
３Ｄニッチによって分泌された因子の評価
造血の調節に関与しそしてそこでモデリングされたニッチ内で産生された主な分子は、ＨＳＣ／ＨＰ ＣＤ３４＋の存在下、７日間の共培養後にＥＬＩＳＡ試験によって定量された。結果は、１０５個のストローマ細胞（ＭＳＣ、骨芽細胞、破骨細胞および脂肪細胞）および５×１０４個の最初に播種されたＣＤ３４＋細胞あたりのpg/mlで表現される。以下の表１は、種々の因子の有意な産生を示す；骨芽細胞およびＭＳＣが産生細胞の大半である。これらの結果は、そこでモデリングされたニッチを形成している細胞の機能的能力を証明する。
【００８６】
【表１】
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【００８７】
モデリングされた２Ｄおよび３Ｄニッチのストローマ細胞力の評価
２Ｄのモデリングニッチ（骨芽細胞、脂肪細胞、ＭＳＣおよび破骨細胞）は、動員されていない健康被験者（ＣＤ３４＋細胞の豊富度は３０％に等しい）の末梢血からのＬｉｎ−細胞群からのＣＤ３４＋細胞の増殖を促進する。結果は、７日間の共培養後、ＣＤ３４＋群が、産生された生細胞の約９６．２５％＋／−１．７１％（ｎ＝４）を示すことを示す。
【００８８】
ＣＤ３４＋細胞の比率は、いわゆる「ニッチを含まない」条件で、すなわち、ストローマ細胞によってコロニー形成されていない生体材料の存在下で観察されたものよりも有意に高い（９７％＋／−２％ｖｓ８５％＋／−８％；ｐ＜０．０５）。全細胞の増殖速度は、ニッチを含まない条件（１３．６７％＋／−３．０６％；有意ではない）と比べて、ニッチ条件下（７．７５％＋／−３．５％）の方が僅かに低いが、ニッチ内のＣＤ３４ｓｔｒｏｎｇ細胞数の増殖速度は、０日目よりも約３．５倍速い。逆に、ＣＤ３４細胞を「ニッチを含まない」条件下で培養した場合、ＣＤ３４ｓｔｒｏｎｇ細胞の数は、最初の数字よりも低い。これによりモデリングされたニッチは、ＣＤ３４Ｗｅｅｋ細胞を損ねて、ＣＤ３４Ｓｔｒｏｎｇ細胞の増殖を可能とし、これは、ニッチの考慮は、ＣＤ３４Ｓｔｒｏｎｇ細胞の培養手順の最適化に関心があり得ることを示唆し、分化を犠牲にして増殖を促進する可能性を与える。
【００８９】
さらに、ＣＤ３４＋細胞が、トランスウェルシステムによって２Ｄニッチから分離されると、ＣＤ３４＋細胞数の維持に関する結果は、完全なニッチを再現する条件よりも劣り、これは、細胞接触およびこのプロセスでストローマ細胞によって主に分泌される因子の重要性を示唆する。
【００９０】
モデリングされたニッチによるＳＰ機能の維持／獲得の評価
未分化造血細胞のプールを維持する造血ニッチの能力を実証するために、本発明者らはまた、３〜７日間培養した後、Ｌｉｎ−骨髄細胞のＳＰ機能を維持するその能力を評価した。ＳＰ機能は、幹細胞および特にＨＳＣが、蛍光着色剤ヘキスト−３３３４２または他の着色剤および薬物の流出を引き起こす能力によって定義される。この機能は、特徴的なサイトグラムの形態の細胞の残留蛍光の定量によってフローサイトメトリーによって評価され得、最も高い流出能を有する細胞が、最も未分化であると判断される。この目的のために、本発明者らは、２Ｄ細胞化ニッチ（ｎ＝３〜４）の存在下または非存在下でＬｉｎ−骨髄細胞（２×１０５個）を培養した。
【００９１】
図３は、細胞化ニッチ（骨芽細胞、脂肪細胞、破骨細胞、ＭＳＣ）の存在下、Ｌｉｎ−骨髄細胞は、非細胞化生体材料（ニッチを含まない条件）またはトランスウェルシステム（Boyden条件）での共培養と比較して、そのＳＰ機能を保持することを示す。従って、細胞化ニッチの存在下、ＳＰ細胞の比率（１．４６＋／−０．３３）は、最初の日まで比較的維持されるか（培養前：１．０２＋／−０．０３、ＮＳ）、またはさらにはニッチを含まない条件（０．０５＋／−０．０１、ｐ＜０．０１）およびトランスウェル条件（０．１７＋／−０．０５、ｐ＜０．０５）と比較してさらに増加している。従って、ＳＰ細胞の絶対数に関して、２Ｄニッチ上での培養は、３日間、共培養液中でＳＰ細胞のプールを維持する可能性を示し（ニッチの存在下では約２９２０個）、これはニッチの非存在下またはトランスウェル条件（ニッチの非存在下では約１００個）ではそうではない。これらの結果は、ストローマ細胞と造血細胞との間の細胞間相互作用が、ＳＰ機能の維持に必要とされることを示唆する。
【００９２】
骨髄のＨＳＣ／ＨＰとは異なり、末梢血の細胞は、ＳＰ機能を発現しない。後者がモデルニッチ上に３〜５日間播種された場合、それらの特定の比率（０．５〜２％）がＳＰ機能を獲得した。種々の細胞構成成分を使用することによって実施された実験は、別々に、ＭＳＣが、この獲得において主要な役割を果たしているようであることを示す（図４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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