(57)【要約】  対象におけるガン細胞の増殖または転移の予防、治療または抑制のための方法が開示される。１つの方法は、細胞傷害性薬物を含む治療的有効量の腫瘍関連抗原結合リガンドでコーティングされた遊星型ボールミル（ＰＢＭ）されたナノ粒子を対象に投与するステップを含む。【選択図】  図５Ａ
2014521743.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クルクミンを含む遊星型ボールミル（ＰＢＭ）されたナノ粒子を含む、ガン細胞を特異的に標的とするための医薬組成物であって、前記ＰＢＭナノ粒子が、葉酸または葉酸誘導体でコーティングされている、医薬組成物。
【請求項２】
前記ＰＢＭナノ粒子が、化学療法薬、放射性コンジュゲート、抗体、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖形成性オリゴヌクレオチドおよび細胞傷害性薬物からなる群から選択される１つ以上のさらなる細胞傷害性薬物をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ＰＢＭナノ粒子が、プラチナ系薬物、天然フェノール類、植物アルカロイド類およびタキサン類、その他のアルキル化剤、腫瘍抗生物質およびアントラサイクリン、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗剤、熱ショックタンパク質アンタゴニスト、並びに、種々の抗新生物薬からなる群から選択される１つ以上の化学療法薬をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＰＢＭナノ粒子が、１つ以上の腫瘍関連抗原と結合するペプチドまたは抗体由来の標的リガンドをさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ＰＢＭナノ粒子が、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、１８８Ｔｕ、および１８６Ｒｅからなる群から選択されるラジオアイソトープを含む放射性コンジュゲートをさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ＰＢＭナノ粒子が、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、アメリカヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ、ｅｎｏｍｙｃｉｎ、ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ、並びにそれらの断片からなる群から選択される１つ以上の細胞傷害性薬物をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ＰＢＭナノ粒子が、アルギネート、セルロース、コラーゲン、デンプンおよびＰＥＧからなる群から選択される１つ以上の生分解性ポリマーおよび多糖類を含むマトリックスコアを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ＰＢＭナノ粒子が、ＰＥＧと、アルギネート、セルロース、コラーゲンおよびデンプンからなる群から選択される別の生分解性多糖類とを含む、マトリックスコアを含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ＰＢＭナノ粒子が、ＰＥＧ、ＰＣＬまたはその混合物から選択される生分解性ポリマーを含む放出制御コーティングをさらに含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記葉酸または葉酸誘導体が、前記放出制御コーティングにコンジュゲートされている、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
それを必要とする対象におけるガンの治療方法であって、クルクミンを含む遊星型ボールミル（ＰＢＭ）されたナノ粒子を含む有効量の医薬組成物を前記対象に投与することを含み、前記ＰＢＭナノ粒子が葉酸、アデノシン、プリン、ホルモン、高親和性腫瘍受容体に対するペプチドリガンド、または抗腫瘍抗原抗体、あるいは、それらの混合物でコーティングされている、方法。
【請求項１２】
前記ガンが、上皮性悪性腫瘍、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、および芽細胞腫からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＢＭナノ粒子が、化学療法薬、放射性コンジュゲート、抗体、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖形成性オリゴヌクレオチドおよび細胞傷害性薬物からなる群から選択される１つ以上のさらなる細胞傷害性薬物をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＢＭナノ粒子が、カルボプラチン、シスプラチン、ドセタキセル、およびオキサリプラチンからなる群から選択される１つ以上の化学療法薬をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＢＭナノ粒子が、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅからなる群から選択されるラジオアイソトープを含む放射性コンジュゲートをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＢＭナノ粒子が、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、アメリカヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ、ｅｎｏｍｙｃｉｎ、ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ、並びにそれらの断片からなる群から選択される１つ以上の細胞傷害性薬物をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＢＭナノ粒子が、アルギネート、セルロース、コラーゲン、デンプンおよびＰＥＧからなる群から選択される１つ以上の生分解性ポリマーを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＢＭナノ粒子が、ＰＥＧと、アルギネート、セルロース、コラーゲンおよびデンプンからなる群から選択される別の生分解性ポリマーとを含む、マトリックスコアを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＢＭナノ粒子が、ＰＥＧ、ＰＣＬまたはその混合物を含む放出制御コーティングをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記葉酸または葉酸誘導体が、前記放出制御コーティングにコンジュゲートされている、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
それを必要とする対象におけるガン転移を抑制する方法であって、クルクミンを含む遊星型ボールミル（ＰＢＭ）されたナノ粒子を含む有効量の医薬組成物を前記対象に投与することを含み、前記ＰＢＭナノ粒子が葉酸でコーティングされている、方法。
【請求項２２】
それを必要とする対象における制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、Ｔｒｅｇ細胞に対して細胞傷害性である薬剤を含む有効量の葉酸でコーティングされた遊星型ボールミル（ＰＢＭ）されたナノ粒子を前記対象に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年８月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／５２３，６２６号の優先権を主張する。当該仮出願の全体は、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、概して、送達系およびガンの治療に関する。特に、ナノ粒子を用いた細胞傷害性薬物の送達に関する。
【背景技術】
【０００３】
全身毒性は、細胞の分裂および複製する能力を妨害する多くの細胞傷害性薬物に付随する主要な問題である。例えば、その利点は部分的であるとしても、プラチナ系薬物（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、トリプラチンテトラニン等）、天然フェノール類（例えば、カルダモン、クルクミン、ガランガル、ショウガ、マラゲータペッパー（ｍｅｌｅｇｕｅｔａ  ｐｅｐｐｅｒ）、ターメリック等）、植物アルカロイド類およびタキサン類（例えば、カンプトテシン、ドセタキセル、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン（ｖｉｒｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ビンクリスチン等）、その他のアルキル化剤（例えば、アルトレタミン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ダカルバジン、エチレンイミン、ヘキサメチルメラミン（ｈａｘｍｅｔｈｙｌ  ｍｅｌａｍｉｎｅ）、ヒドラジン、イホスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｏｓｏｕｒｅａｓ）、ピペリン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、テモゾロマイド、チオテパ、トリアジン等）、腫瘍抗生物質およびアントラサイクリン（例えば、ブレオマイシン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン等）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、アムサクリン、エトポシド、イリノテカン、テニポシド、トポテカン（ｔｏｐｔｅｃａｎ）等）、代謝拮抗剤（５−フルオロウラシル、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、アデノシンデアミナーゼ阻害剤、カペシタビン、クラドリビン、シタラビン、フロクスウリジン（ｆｏｘｕｒｉｄｉｎ）、フルダラビン、ゲムシタビン、メトトレキサート、ネララビン（ｎｅｌｅｒａｂｉｎｅ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔａｏｓｔａｔｉｎ）細胞分裂阻害薬、プリンアンタゴニスト、ピリミジンアンタゴニスト等）、並びに、種々の抗新生物薬（例えば、アスパラギナーゼ、ベキサロテン、エストラムスチン、ヒドロキウレア、イソトレチノイン、ミトタン、ペグアスパラガーゼ、レチノイド、トレチノイン等）は、ガン細胞を殺すのに非常に有効である。しかしながら、それらの有用性は依然として明確でなく、複雑であり、課題を有する尾という問題（ｆｒａｕｔ）がある。例えば、プラチナ系薬物は、ガンに対する第一に最適な治療ではなく、それは、これらの薬物が、健常組織によって容易に吸収され、投与された薬物の１％未満しかそれらの細胞内標的（すなわち、ガン細胞核／ＤＮＡ）に到達しないことによる。結果として、プラチナ系およびその他の抗ガン剤は、健常組織に対して非常に毒性であり得る。したがって、細胞傷害性薬物の送達のための、ガン細胞を特異的に標的とする送達系に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００４】
本出願の１つの態様は、高親和性および選択性を示す腫瘍細胞リガンドでコーティングされた、細胞傷害性薬物を含む遊星型ボールミル（planetary ball milled: ＰＢＭ）されたナノ粒子を含む、ガン細胞を特異的に標的とするための系に関する。
【０００５】
本出願の別の態様は、高親和性および選択性を示す腫瘍細胞リガンドでコーティングされた、細胞傷害性薬物を含む遊星型ボールミル（ＰＢＭ）されたナノ粒子を含む、ガン細胞を特異的に標的とするための有効量の系を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるガンの治療のための方法に関する。
【０００６】
本出願の別の態様は、高親和性および選択性を示す腫瘍細胞リガンドでコーティングされた、細胞傷害性薬物を含む遊星型ボールミル（ＰＢＭ）されたナノ粒子を含む、ガン細胞を特異的に標的とするための有効量の系を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるガン転移を抑制する方法に関する。
【０００７】
本出願の別の態様は、高親和性および選択性を示すＴｒｅｇリガンドでコーティングされた、Ｔｒｅｇ細胞に対して細胞傷害性である薬物を含む遊星型ボールミル（ＰＢＭ）された有効量のナノ粒子を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞のアポトーシスを誘導する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、生分解性の遊星型ボールミル（ＰＢＭ）されたナノ粒子の典型的な製造方法を示す。
【図２】図２は、クルクミンによって調節される分子標的の図である。
【図３】図３は、乳ガン組織および細胞系統による葉酸受容体の発現を示す。
【図４−１】図４は、ＰＢＭナノ粒子が介在する、乳ガン（ＢｒＣａ）細胞のアポトーシスを示す。
【図４−２】同上。
【図５Ａ】図５は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｌｕｃ異種移植片における、ＰＢＭナノ粒子が介在する腫瘍の退行を示す。
【図５Ｂ】同上。
【図６】図６は、ＣＤ４＋ＣＤ２５ＨｉｇｈＦｏｘＰ３＋（Ｔｒｅｇ）細胞のＰＢＭナノ粒子が介在するアポトーシスを示す。
【図７】図７は、葉酸受容体（ＦＲ）が、ＰＣ３およびＰＴＥＮ−ＣａＰ２腫瘍の両方によって発現されるが、細胞系統または正常細胞によっては発現されないことを示す。
【図８−１】図８は、シスプラチンを充填した、葉酸でコーティングされたＰＢＭナノ粒子が介在するインビトロにおけるＰＣ３細胞の破壊を示す。
【図８−２】同上。
【図９Ａ】図９は、シスプラチン溶液（８ｍｇ／ｋｇ／週）、またはシスプラチンを含有する、葉酸でコーティングされたＸＰｃｌａｄナノ粒子のいずれかを受容したＰＣ３−ｌｕｃ腫瘍を有するマウスにおける腫瘍の退行を示す。
【図９Ｂ】同上。
【図９Ｃ】同上。
【図９Ｄ】同上。
【図１０】図１０は、コーティングされているＰＢＭナノ粒子およびコーティングされていないＰＢＭナノ粒子の粒子サイズ分布を示す。
【図１１】図１１は、葉酸で表面がコンジュゲートされたポリカプロラクトンでコーティングされたＰＢＭナノ粒子を示す。
【図１２】図１２は、前立腺腫瘍特異的ＰＢＭ粒子のゼータ電位を示す。
【図１３】図１３は、前立腺細胞系統および腫瘍による葉酸受容体の発現を示す。
【図１４】図１４は、クルクミンを充填したＰＢＭナノ粒子と一緒にインキュベートされたＰＣ３細胞のアポトーシスを示す。
【図１５】図１５は、ＰＢＭナノ粒子の製造の典型図を示す。
【図１６】図１６は、ＰＣ３腫瘍細胞を脳室内および脛骨内に注入されたマウスを示す。
【図１７】図１７は、前立腺腫瘍特異的ＰＢＭナノ粒子の粒子サイズ分布を示す。
【図１８】図１８は、前立腺腫瘍特異的ＰＢＭナノ粒子のゼータ電位を示す。
【図１９】図１９は、ＰＢＭナノ粒子処理した前立腺ガン細胞のＴｕｎｅｌおよびＤＲＡＱ５染色を示す。
【図２０−１】図２０は、ＰＢＭナノ粒子が介在するガンおよび正常細胞のアポトーシスを示す。
【図２０−２】同上。
【図２１】図２１は、ＰＢＭナノ粒子の細胞核への転移およびＴＵＮＥＬ染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下の詳細な説明は、いずれの当業者も本発明を製造および使用することが可能となるように提供される。説明の目的のため、本発明の十分な理解を提供するために、特定の命名が示される。しかしながら、これらの特定の詳細が本発明を実施するためには必要でないことは、当業者には明らかであろう。特定の用途の記載は、代表例としてのみ提供される。本発明は、示された実施形態に限定されることを意図せず、本明細書において開示される原理および特徴と一致する可能な限り最大の範囲が認められるべきである。
【００１０】
別途規定されない限り、本発明に関連する科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は、複数も含むものとし、複数形の用語は、単数を含むものとする。
【００１１】
定義
本明細書において使用する場合、以下の用語は、以下の意味を有するものとする。
【００１２】
本明細書において使用する場合、用語「ガン」は、悪性新生物または悪性腫瘍のことを指し、ある細胞群が、制御されていない増殖、隣接組織へ侵入して破壊する侵襲、および、時には、転移、すなわち、リンパ液または血液を介してその他の場所への拡散を示す病気の分類である。ガンのこれらの３つの悪性特性は、ガンと、侵襲または転移しない良性腫瘍とを区別している。本明細書において使用する場合、用語「ガン」は、「上皮性悪性腫瘍」、「肉腫」、「リンパ腫」、「白血病」、「メラノーマ」、「胚細胞腫瘍」、および「芽細胞腫」の包括的用語である。
【００１３】
本明細書において使用する場合、用語「腫瘍」は、細胞の異常な増殖によって形成される新生物または充実性病変を指す。腫瘍は、良性、前悪性または悪性であり得る。
【００１４】
本明細書において使用する場合、用語「上皮性悪性腫瘍」は、形質転換した上皮細胞、または未知の組織発生由来の形質転換した細胞だが、上皮細胞と関連する特定の分子または組織学的特徴、例えば、サイトケラチンまたは細胞内架橋の産生を有する形質転換した細胞を指す。本発明の典型的な上皮性悪性腫瘍としては、メラノーマ、卵巣ガン、膣ガン、子宮頸ガン、子宮ガン、前立腺ガン、肛門ガン、直腸ガン、結腸ガン、胃ガン、膵臓ガン、膵島細胞腫、腺ガン、腺扁平上皮癌、神経内分泌腫瘍、乳ガン、肺ガン、食道ガン、口腔ガン、脳腫瘍、髄芽細胞腫、神経外胚葉性腫瘍、グリオーマ、下垂体ガン、および骨肉腫が挙げられる。
【００１５】
本明細書において使用する場合、用語「肉腫」は、結合組織、例えば、骨、軟骨、脂肪および神経組織から生じるガンを指し、それらはそれぞれ、骨髄の外側の間葉細胞に由来する細胞から発生する、すなわち、胚体中胚葉から発生する多数の組織のうちの１つにおける形質転換した細胞から生じるガンである。したがって、肉腫としては、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、造血組織が挙げられる。例えば、骨肉腫は骨から生じ、軟骨肉腫は軟骨から生じ、脂肪肉腫は脂肪から生じ、平滑筋肉腫は平滑筋から生じる。典型的な肉腫としては、アスキン腫瘍、ブドウ状肉腫、軟骨肉腫、ユーイング−ＰＮＥＴ、悪性血管内皮腫、悪性神経鞘腫、骨肉腫、軟組織肉腫が挙げられる。軟組織肉腫のサブクラスとしては、胞状軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢肉腫、皮膚線維肉腫、類腱腫瘍、線維形成小円形細胞腫瘍、類上皮肉腫、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管外皮細胞腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ血管肉腫、リンパ肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫、および滑膜肉腫が挙げられる。
【００１６】
本明細書において使用する場合、用語「リンパ腫」は、骨髄から離れ、リンパ節で成熟する、造血細胞に由来する免疫系のリンパ細胞のガンを指す。リンパ腫は、典型的には、固形腫瘍として存在する。典型的なリンパ腫としては：小リンパ球性リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、脾性辺縁層リンパ腫、形質細胞腫、節外性辺縁層Ｂ細胞リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、節性辺縁層Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性リンパ腫、古典的ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫、鼻型節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、芽球性ＮＫ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、セザリー症候群、皮膚原発ＣＤ３０陽性Ｔ細胞リンパ増殖性疾患、皮膚原発未分化大細胞リンパ腫、リンパ腫様丘疹症、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、非特定型辺縁性Ｔ細胞リンパ腫、および未分化大細胞リンパ腫が挙げられる。古典的ホジキンリンパ腫の典型的な形態としては、結節性硬化型、混合細胞型、リンパ球豊富型、およびリンパ球枯渇型または非枯渇型が挙げられる。
【００１７】
本明細書において使用する場合、用語「白血病」は、骨髄を離れ、血液中で成熟する造血細胞から生じるガンを指す。白血病はある範囲の疾患を網羅する広範囲の用語である。同様に、白血病は、血液新生物と呼ばれるさらに広い疾患群の一部である。白血病は様々な大きなグループにさらに細かく分けられ、第１の区分は、急性および慢性形態の白血病である。急性白血病は、未成熟な血液細胞の数の急速な増加によって特徴付けられる。これらの細胞の過密化によって、骨髄が健康な血液細胞を産生できなくなる。慢性白血病は、相対的に成熟しているが、依然として異常である白血球の過剰な集積によって特徴付けられる。典型的には、数ヶ月または数年、進行に要し、この細胞は、正常細胞よりもずっと多い割合で産生され、これにより、血液中に多くの異常な白血球がもたらされる。白血病はまた、病気に冒された血液細胞によってさらに細かく分けられる。この分類は、白血病をリンパ芽球性またはリンパ球性白血病と骨髄性白血病とに分ける。リンパ芽球性またはリンパ球性白血病において、ガン性の変化は、通常はリンパ球形成へと続くあるタイプの骨髄細胞において起こる。骨髄性白血病において、ガン性の変化は、通常は赤血球形成へと続くあるタイプの骨髄細胞、いくつかその他のタイプの白血球および血小板において起こる。これらの２つの分類を組み合わせることにより、合計で４つの主要なカテゴリーが提供される。これらの４つの主要なカテゴリーのそれぞれにおいて、典型的には、いくつかのサブカテゴリーが存在する。この分類スキーム外の珍しいタイプも存在する。典型的な白血病としては、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、毛状細胞白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、大型顆粒リンパ球性白血病、若年性骨髄単球性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、バーキット白血病、および成人Ｔ細胞白血病が挙げられる。
【００１８】
本明細書において使用する場合、用語「メラノーマ」は、メラニン細胞のガンまたは悪性腫瘍である。メラニン細胞は、皮膚の色に関与している暗色の色素メラニンを産生する細胞である。それらは、大部分は皮膚に存在するが、腸管および眼球などの体の他の部分においても見られる。メラノーマは、以下のステレオタイプおよびサブタイプに分けられる：悪性黒子、悪性黒子型メラノーマ、表在拡大型メラノーマ、末端性黒子性メラノーマ、粘膜性メラノーマ、結節型メラノーマ、ポリープ状メラノーマ、線維形成性メラノーマ、メラニン欠乏性メラノーマ、軟組織メラノーマ、小母斑様細胞を有するメラノーマ、スピッツ母斑の特徴を有するメラノーマ、およびブドウ膜メラノーマ。
【００１９】
本明細書において使用する場合、用語「胚細胞腫瘍」は、胚細胞または多能性細胞に由来するガンを指し、例えば、睾丸に存在するもの（精上皮腫）または卵巣の存在するもの（未分化胚細胞腫）が挙げられる。胚細胞腫瘍は、ガン性または非ガン性腫瘍であり得る。胚性細胞は、通常、性腺（卵巣および精巣）内に存在する。性腺の外部に由来する胚細胞腫瘍は、胚の発生中のエラーが原因となる先天性欠損症であり得る。胚細胞腫瘍は、大きくは２つの分類に分けられる：胚細胞性または精上皮性と非胚細胞性または非精上皮性胚細胞腫瘍。典型的な胚細胞性または精上皮性胚細胞腫瘍としては、胚細胞腫、未分化胚細胞腫、および精上皮腫が挙げられる。典型的な胚芽腫以外または精上皮腫以外の胚細胞腫瘍としては、胚性上皮性悪性腫瘍、内胚葉洞腫瘍または卵黄嚢腫瘍（ＥＳＴ、ＹＳＴ）、絨毛上皮性悪性腫瘍、成熟型奇形腫、類皮嚢腫、未熟型奇形腫，悪性形質転換を示す奇形腫、多胚腫、性腺芽細胞腫、および混合型ＧＣＴが挙げられる。
【００２０】
本明細書において使用する場合、用語「芽細胞腫」は、未成熟な前駆細胞または胚性組織由来のガンを指す。
【００２１】
本明細書において使用する場合、用語「ＢｒＣａ」は、乳ガンを指す。本明細書において使用する場合、用語「ＰＣａ」は、前立腺ガンを指す。
【００２２】
本明細書において使用する場合、用語「転移」は、１つの器官または部分から別の隣接しない器官または部分へのガンまたは上皮性悪性腫瘍の拡散を指す。
【００２３】
本明細書において使用する場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を指す。本明細書において使用する場合、用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および、それらが所望の生物学的活性を示す限り抗体断片を網羅する。「特異的に結合する」または「免疫反応する」とは、抗体が、所望の抗原の１つ以上の抗原決定基とは反応するが、その他のポリペプチドとは反応しない（すなわち、結合しない）か、または、ずっと低い親和性でその他のポリペプチドと結合することを意味する。本明細書において使用する場合、用語「抗体」は、全長抗体の一部、一般的には、その抗原結合領域または可変領域、を含む抗体断片も含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；二重特異性抗体；直線状抗体；一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）分子；および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。本発明の特定の実施形態において、例えば、腫瘍への浸透を増大させるために、無傷の抗体よりもむしろ抗体断片を使用するのが望ましいことがある。この場合、その血中半減期を増大させるために、当技術分野において知られている任意の手段によって修飾された抗体断片を使用するのが望ましいことがある。
【００２４】
本明細書において使用する場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、すなわち、少量存在し得るありうる天然の変異を除き同一である集団を含む個々の抗体、を指す。本明細書におけるモノクローナル抗体は、具体的には、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体、または、特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか、または、相同であり、かつ、鎖の残りの部分は、別の種に由来する抗体、または、別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか、または、相同である「キメラ」抗体、ならびに、それらが所望の生物学的活性を示す限りかかる抗体の断片、を含む。
【００２５】
「ヒト化」形態の非ヒト抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体の大部分は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類、の超可変領域由来の残基と置換されている、所望の特異性、親和性、および／または能力を有する、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ヒト化抗体およびその他のキメラ抗体の作製方法は、当技術分野において知られている。
【００２６】
「二重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する抗体である。二重特異性抗体の作製方法は、当技術分野において知られている。
【００２７】
「ヘテロコンジュゲート抗体」の使用もまた、本発明の範囲内である。ヘテロコンジュゲート抗体は、共有結合で結合された２つの抗体から構成される。この抗体は、例えば、不要な細胞に対して免疫系細胞を標的とすることが提示されている（米国特許第４，６７６，９８０号）。抗体は、合成タンパク質化学における既知の方法、例えば、架橋剤を伴うものを含む方法、を用いてインビトロで調製し得ることが意図される。
【００２８】
本出願はまた、細胞傷害性薬物、例えば、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、または動物由来の酵素的に活性な毒素、またはその断片）にコンジュゲートされた抗体、またはラジオアイソトープにコンジュゲートされた抗体（すなわち、放射性コンジュゲート）を含む「イムノコンジュゲート」の使用を意図する。使用し得る酵素的に活性な毒素およびその断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、アメリカヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ、ｅｎｏｍｙｃｉｎ、およびｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅが挙げられる。様々な放射性核種が、放射性コンジュゲート抗体の産生のために利用可能である。例えば、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。
【００２９】
治療目的のための「哺乳動物」とは、ヒト、非ヒト霊長類、家畜、および、動物園動物、狩猟動物またはペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む哺乳動物として分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００３０】
本明細書において使用する場合、用語「治療する」、「治療すること」または「治療」は、障害および／またはその付随する症候を緩和するまたは無くす方法を指す。本明細書において使用する場合、用語「予防する」、「予防すること」または「予防」は、障害および／またはその付随する症候を対象が獲得しないようにする方法を指す。特定の実施形態において、用語「予防する」、「予防すること」または「予防」は、障害および／またはその付随する症候を獲得するリスクを低減する方法を指す。
【００３１】
本明細書において使用する場合、用語「阻害する」は、相対的な用語であり、基準薬と比較した場合に、薬剤の投与後に反応または状態が定量的に減少する場合、あるいは、薬剤の投与後に反応または状態が減少する場合、その薬剤は反応または状態を阻害する。同様に、本明細書において使用する場合、用語「防止する」は、反応または状態の少なくとも１つの特徴が排除されない限り、必ずしも完全に反応または状態が排除されることを意味するわけではない。したがって、腫瘍増殖または反応、例えば、病理学的反応、を低減または防止する組成物は、必ずしも完全である必要はないが、増殖または反応が、測定可能な程度に、例えば、薬剤が存在しない場合、または基準薬と比較した場合における増殖または反応の少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約７０％、または約８０％、または少なくとも約９０％（すなわち、１０％以下まで）減少している限り、かかる増殖または反応を排除することができる。
【００３２】
本明細書において使用する場合、用語「増大したレベル」は、関連する技術分野において慣習的に規定されているまたは使用される通常のまたは対照となるレベルよりも高いレベルを指す。例えば、組織中の免疫染色の増大したレベルは、当業者によって対照組織中の免疫染色のレベルよりも高いと見なされ得る免疫染色のレベルである。
【００３３】
本明細書において使用する場合、用語「生物学的サンプル」は、生物起源の物質を指し、体液または身体産物、例えば、血液、血漿、尿、唾液、脊髄液、排泄物、汗または呼気であり得る。生物学的サンプルはまた、組織サンプルおよび細胞サンプルを含む。
【００３４】
本明細書において、範囲は、「約」１つの特定の値から、および／または、「約」別の特定の値として表現され得る。そのような範囲が表現される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、および／または、別の特定の値を含む。同様に、値が先行詞「約」の使用により概数として表現される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるであろう。範囲のそれぞれの端点は、他の端点との関連において、および、他の端点と独立して重要であることがさらに理解されるであろう。また、本明細書において多数の値が存在し、それぞれの値は、その値自体に加えて「約」その特定の値として本明細書において開示されることが理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、その結果、「約１０」も開示される。ある値が開示される場合、当業者には適当に理解されるように、その値「以下」、その値「以上」、および値と値の間の可能な範囲も開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０以下」ならびに「１０以上」も開示される。
【００３５】
本出願の文脈において、「有効量」とは、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な組成物の量、例えば、疾患の予防または治療に有効な量を指す。「疾患」は、抗体を用いた治療によって恩恵を受け得る任意の状態であり、例えば、上皮性悪性腫瘍および化学療法薬物耐性が挙げられる。これには、慢性および急性の障害または疾患が含まれ、哺乳動物を問題となる障害に罹りやすくする病理学的状態が含まれる。
【００３６】
ガン細胞を特異的に標的とする薬物運搬ナノ粒子
本出願の１つの態様は、特定の細胞、例えば、ガン細胞および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）を特異的に標的とする薬物運搬ナノ粒子に関する。いくつかの実施形態において、薬物運搬ナノ粒子は、遊星型ボールミルされたナノ粒子コア、１つ以上の細胞傷害性薬物、および１つ以上の細胞標的薬物を含む。特定の実施形態において、１つ以上の細胞傷害性薬物はクルクミンを含み、１つ以上の細胞標的薬物は葉酸を含む。特定のその他の実施形態において、１つ以上の細胞傷害性薬物は、クルクミンおよび１つ以上のその他の細胞傷害性薬物を含む。本出願の薬物運搬ナノ粒子は、より低用量の細胞傷害性薬物の使用を可能にし、有害事象を減少させ、有効性を増大させ、かつ、標的とする腫瘍またはガン細胞から薬物が迅速に消失する可能性を低減する。例えば、本出願の薬物運搬ナノ粒子は、乳ガンまたは前立腺ガン細胞を標的とし、取り込ませることができ、したがって、化学療法薬をガン細胞中の細胞内標的に効率的に送達し、アポトーシスのプロセスが完了するのに十分な量の薬物を運搬して、化学療法薬物耐性および全身毒性の可能性を制限し得る。
【００３７】
遊星型ボールミル（ＰＢＭ）されたナノ粒子
本明細書において使用する場合、用語「ＰＢＭナノ粒子」および「ＸＰｃｌａｄナノ粒子」は同義であり、互換的に使用し得る。いくつかの実施形態において、ＰＢＭナノ粒子は、０．１ｎｍ〜６０μｍ、０．１ｎｍ〜１μｍ、０．１ｎｍ〜５００ｎｍ、０．１ｎｍ〜２００ｎｍ、１ｎｍ〜２００ｎｍ、５ｎｍ〜６０μｍ、５ｎｍ〜３０ｎｍ、３０ｎｍ〜８０ｎｍ、３０ｎｍ〜１８０ｎｍ、８０ｎｍ〜１μｍ、１８０ｎｍ〜１μｍ、２００ｎｍ〜１μｍ、１μｍ〜６μｍ、４μｍ〜１２μｍ、および１０μｍ〜６０μｍの範囲の直径を有する。その他の実施形態において、ＰＢＭナノ粒子は生分解性ナノ粒子である。ＰＢＭナノ粒子は、全身、経口、または経皮送達のための、均一なサイズの粒子、疎水性または親水性薬物の１００％の充填効率、標的化送達のためのその後のコーティング、および表面ｌｏｇＰ（親油性：親水性分布のための測定基準）の制御をもたらすための新規製剤方法を用いて作ることができる。
【００３８】
本出願に開示されるＰＢＭナノ粒子は、全身、経口、または経皮送達のための、均一なサイズの粒子、疎水性または親水性薬物の１００％の充填効率、標的化送達のためのその後のコーティング、および表面ｌｏｇＰの制御をもたらすための、遊星型ボールミルを使用する新規ナノ粒子製剤方法を代表する。これらは、設計された表面特性を有する均一なサイズの粒子が、ＲＥＳによるクリアランス無しで、乳ガンにおけるＦＲ１およびＦＲ４を発現するＴｒｅｇ細胞を標的とする初期の研究である。
【００３９】
いくつかの実施形態において、ＰＢＭナノ粒子は、アルギネート、セルロース、コラーゲンおよびデンプン等の１つ以上の生分解性ポリマーまたは多糖類を含むナノマトリックスコアを含む。その他の適当な生分解性ポリマーとしては、限定するものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、乳酸−グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリヒドロキシブチレート−バレレート（ＰＨＢＶ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリグリコリド−ラクチド、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、乳酸−ε−カプロラクトンコポリマー（ＰＬＣＬ）、ポリジオキサノン（ＰＤＯ）、ポリトリメチレンカーボネート（ＰＴＭＣ）、ポリ（アミノ酸）、ポリジオキサノン、ポリオキサレート、ポリ無水物、ポリ（ホスホエステル）、ポリオルトエステルおよびそれらのコポリマーが挙げられる。特定の実施形態において、ナノ粒子コアマトリックスは、ＰＥＧと、アルギネート、セルロース、コラーゲンおよびデンプンからなる群から選択されるポリマーおよび多糖類との混合物を含む。細胞傷害性薬物の分子は、ナノ粒子コアマトリックス中に封入される。いくつかの実施形態において、細胞傷害性薬物は、マトリックスコアの形成中に、生分解性ポリマーおよび多糖類と共に混合される。その他の実施形態においては、マトリックスコアが最初に形成され、細胞傷害性薬物が、その後の段階で充填される。
【００４０】
いくつかの実施形態において、マトリックスコアは、バイオポリマー、例えば、アルギネート、セルロース、コラーゲンおよびデンプンを水中に溶解して水溶液を形成し、その水溶液に細胞傷害性薬物を添加してバイオポリマー／細胞傷害性薬物混合物を形成し、任意に、そのバイオポリマー／細胞傷害性薬物混合物に別のポリマー、例えば、ＰＥＧ、を添加して最終混合物を形成することにより、形成される。最終混合物を乾燥してペレットまたは錠剤形態にして、次に、制御された温度（＜37℃）下で、遊星型ボールミルを用いて研磨する。ナノ粒子のサイズは、遊星型ボールミルの速度および継続時間によって制御され得る。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、０．１〜５ｎｍ、５〜３０ｎｍ、３０〜８０ｎｍ、３０〜１８０ｎｍ、１８０〜１０００ｎｍ、または２００〜１０００ｎｍの範囲のサイズを有する。研磨速度は、１００〜６００ｒｐｍ、好ましくは、２００〜４００ｒｐｍの範囲である。
【００４１】
その他の実施形態において、ＰＢＭナノ粒子は、内容物の放出時間を制御し、粒子の機械的強度を増大し、および／または、ＰＢＭナノ粒子中の活性成分を安定化するために、放出制御ポリマーコーティングを用いてさらにコーティングされる。放出制御コーティングに適したポリマーとしては、限定するものではないが、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）およびＰＥＧが挙げられる。その他の実施形態において、ＰＢＭナノ粒子は、腫瘍特異的または細胞／組織特異的標的薬物を用いてさらにコーティング、コンジュゲートまたは修飾してもよい。腫瘍特異的または細胞／組織特異的標的薬物の例としては、限定するものではないが、リジン、ペプチド、抗体および葉酸が挙げられる。
【００４２】
図１に示されるように、生分解性の遊星型ボールミル（ＰＢＭ）されたナノ粒子は、ＰＥＧコーティングおよび負のＬｏｇＰ値を有することにより、封入された薬物の増加した血中半減期を有する。
【００４３】
現在、いくつかのタイプの薬物送達のためのナノ担体が存在する：ポリマー性、ミセル、デンドリマー、リポソーム、アルブミン、ウィルス性、カーボンナノチューブ、およびシリカ／金属製。一方、これらのナノ粒子は多くの制限（すなわち、不均一なサイズ、製造の難しさ、および／または、標的化の欠如）を有し、それらの有用性を減少して存在する。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ＰＢＭナノ粒子は、限定するものではないが、サトラプラチン、カペシタビン、またはエルロチニブを含む経口抗ガン剤を用いてコーティングすることにより、経口送達のために製剤化される。経口送達のためのナノ粒子は、腸管取り込みおよび初回通過効果中に加水分解されるコポリマーの添加に対する表面ＬｏｇＰ値、肝臓毒性無しでの肝臓胆管系の通過、ならびに、局所または転移腫瘍、例えば、乳ガンおよび前立腺腫瘍、への標的化全身送達を調節する。製剤は、微小転移の検出および活性化治療のための基質を含むように作製することもできる。
【００４５】
細胞傷害性薬物
異なる細胞内標的を有する様々な細胞傷害性薬物は、均一のアポトーシス表現型を誘導し得る。このことは、細胞傷害性薬物の細胞傷害活性は、単に特定の薬物−標的相互作用に依存しているのではなく、ガン細胞のアポトーシス（細胞シグナル伝達）メカニズムの活性にも依存する。細胞傷害性薬物の例としては、限定するものではないが、プラチナ系薬物（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、トリプラチンテトラニン等）、天然フェノール類（例えば、カルダモン、クルクミン、ガランガル、ショウガ、マラゲータペッパー（ｍｅｌｅｇｕｅｔａ  ｐｅｐｐｅｒ）、ターメリック等）、植物アルカロイド類およびタキサン類（例えば、カンプトテシン、ドセタキセル、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン（ｖｉｒｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ビンクリスチン等）、その他のアルキル化剤（例えば、アルトレタミン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ダカルバジン、エチレンイミン、ヘキサメチルメラミン（ｈａｘｍｅｔｈｙｌ  ｍｅｌａｍｉｎｅ）、ヒドラジン、イホスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｏｓｏｕｒｅａｓ）、ピペリン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、テモゾロマイド、チオテパ、トリアジン等）、腫瘍抗生物質およびアントラサイクリン（例えば、ブレオマイシン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン等）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、アムサクリン、エトポシド、イリノテカン、テニポシド、トポテカン（ｔｏｐｔｅｃａｎ）等）、代謝拮抗剤（５−フルオロウラシル、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、アデノシンデアミナーゼ阻害剤、カペシタビン、クラドリビン、シタラビン、フロクスウリジン（ｆｏｘｕｒｉｄｉｎ）、フルダラビン、ゲムシタビン、メトトレキサート、ネララビン（ｎｅｌｅｒａｂｉｎｅ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔａｏｓｔａｔｉｎ）細胞分裂阻害薬、プリンアンタゴニスト、ピリミジンアンタゴニスト等）、並びに、種々の抗新生物薬（例えば、アスパラギナーゼ、ベキサロテン、エストラムスチン、ヒドロキウレア、イソトレチノイン、ミトタン、ペグアスパラガーゼ、レチノイド、トレチノイン等）が挙げられる。
【００４６】
プラチナ系治療薬は広く使用されており、ＤＮＡを損傷し、チトクロームＣの放出および続くカスパーゼの活性化によりアポトーシスを誘導することにより機能する。多くの化学療法薬物耐性細胞系統は、ドセタキセル及びカルボプラチン等のプラチナ系薬物により感受性を示す。しかしながら、これらの薬物は多くの副作用を有し、例えば、限定するものではないが、好中球減少症、肝機能障害、貧血（７０％）、吐き気（４０％）、感染症（２０％）、運動神経障害（１５％）、腎不全、および、この治療を受けている１．７％の患者の死亡の原因になっていると考えられる心臓毒性が挙げられる。これらの副作用は、薬物の効果、耐性、毒性の固有のメカニズムを克服または回避し、同時に、初期段階の原発性または進行性（例えば、転移性、三種陰性）疾患を妨げる革新的なアプローチの必要性を明確に示す。
【００４７】
ドセタキセルによる豊富な臨床経験にもかかわらず、その使用を制限し得るドセタキセルの有効性および毒性に関しては、依然として高いレベルで予測不能である。ドセタキセルは、ＣＹＰ３が介在する酸化によって代謝され、これにより、細胞傷害性が減少した代謝産物が生じる。この排除経路は、薬物排出輸送物質ＡＢＣＢ１によって部分的に影響されるが、ＡＢＣＢ１遺伝子中のＣ１２３６Ｔ多型は、ドセタキセルのクリアランスを大きく減少させる。ＤＮＡ修復のためのコード遺伝子（例えば、ＮＥＲおよびＢＥＲ）および代謝不活性化酵素における多型が、カルボプラチンの抗腫瘍効果および毒性の個々の原因となり得るという証拠も存在する。毒性、感受性の減少、および、カルボプラチンに対する耐性をもたらすいくつかのメカニズムが記載されており、それらには、排出ポンプ（例えば、ＡＢＣＢ１）、解毒酵素の増加、およびそれぞれ関連するＮＥＲおよびＢＥＲが含まれる。プラチナ系薬物に関して、これらの多型は、ＮＥＲ／ＢＥＲの機能性およびプラチナ−ＤＮＡ損傷の修復を減少させ得る。
【００４８】
特定の実施形態において、細胞傷害性薬物はクルクミンである。別の実施形態において、細胞傷害性薬物は、クルクミンと、１つ以上のその他の細胞傷害性薬物とを含む。
【００４９】
別の特定の実施形態において、細胞傷害性薬物は、化学療法薬、放射性コンジュゲート、抗体、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、三重鎖形成性オリゴヌクレオチドおよびガン細胞に対して細胞傷害性である任意のその他の薬剤からなる群から選択される。
【００５０】
さらなる実施形態において、化学療法薬は、プラチナ系薬物、天然フェノール類、植物アルカロイド類およびタキサン類、その他のアルキル化剤、腫瘍抗生物質およびアントラサイクリン、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗剤、並びに、種々の抗新生物薬からなる群から選択される。
【００５１】
別のさらなる実施形態において、放射性コンジュゲートは、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、１８８Ｔｕ、および１８６Ｒｅからなる群から選択されるラジオアイソトープを含む。
【００５２】
別のさらなる実施形態において、抗体は、アデノシン受容体、αｖβ３インテグリン、アミノペプチダーゼＰ、αフェトプロテイン、ガン抗原１２５、ガン胎児性抗原、カベオリン−１、ケモカイン受容体、クラステリン、腫瘍胎児抗原、ＣＤ２０、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、Ｒａｓ、ｐ５３、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、葉酸受容体、前立腺特異的膜抗原、前立腺特異的抗原、プリン受容体、放射線誘導性細胞表面受容体、セルピンＢ３、セルピンＢ４、扁平上皮性悪性腫瘍抗原、トロンボスポンジン、腫瘍抗原４、腫瘍関連糖タンパク質７２、チロシナーゼ、およびチロシンキナーゼからなる群から選択される腫瘍関連抗原と結合することが可能である。
【００５３】
別のさらなる実施形態において、ガン細胞に対して細胞傷害性である薬剤は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、アメリカヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ、ｅｎｏｍｙｃｉｎ、ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ、並びにそれらの断片からなる群から選択される。
【００５４】
クルクミン
クルクミン（ジフェルロイルメタン）は、植物Ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａに由来するポリフェノールであり、一般的にはターメリックと呼ばれる。クルクミンは、抗酸化特性、抗炎症特性、抗発ガン特性、抗増殖特性、および抗血管新生特性を有する「体の洗浄剤」としてアーユルベーダ薬における高い地位を有する良く知られた疎水性の天然化合物である。しかし、クルクミンの疎水性は低いバイオアベイラビリティーをもたらし、これは、クルクミンの有効性および抗ガン剤としてのその有効な役割を妨げる。したがって、正常細胞への損傷を防ぎながら、その有効性を増大し、ガン細胞死を誘導するために、クルクミンをガン細胞へ直接送達することは重要な挑戦である。
【００５５】
クルクミンの低いバイオアベイラビリティーを克服し、細網内皮系（ＲＥＳ）によるクリアランスを避けることが可能である長時間循環するナノ粒子は、腫瘍による蓄積をもたらし得る。これにより、透過性および欠陥のあるリンパ液排出が増大する（すなわち、透過性および保持−ＥＰＲ効果が増大する）。これらのナノサイズのビヒクルの取り込みは、標的化送達による全身毒性の大きな減少を含むいくつかの利点を有し得る。これらのナノ粒子が化学療法薬物耐性の発生を防止し得ることも理にかなっている。前立腺腫瘍を標的とし、取り込まれ得るナノ粒子は、細胞内標的を摂動し、ガン細胞におけるアポトーシスのプロセスを誘導するのに十分生物的に利用可能であるために、クルクミンを効果的に送達し得る。
【００５６】
放出制御ポリマーコーティング
放出制御ポリマーコーティングは、内容物の放出時間を制御し、コーティングされたＰＢＭナノ粒子の機械的強度を増大し、および／または、ＰＢＭナノ粒子中の活性成分を安定化する。放出制御コーティングに適したポリマーとしては、限定するものではないが、ＰＥＧ、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、化学修飾されたＰＣＬおよびこれらの混合物が挙げられる。いくつかの実施形態において、放出制御ポリマーでコーティングされたＰＢＭナノ粒子は、例えば、ガン細胞またはＴｒｅｇ細胞と特異的に標的とする細胞標的薬物を用いて、さらに、コーティング、コンジュゲート、または修飾される。
【００５７】
細胞標的薬物
細胞標的薬物は、薬物含有ナノ粒子が、対象となる特定のタイプの細胞を標的とすることを可能にする。細胞標的薬物の例としては、限定するものではないが、標的または腫瘍関連抗原と結合する小さな分子（例えば、葉酸、アデノシン、プリン）および大きな分子（例えば、ペプチドまたは抗体）が挙げられる。腫瘍関連抗原の例としては、限定するものではないが、アデノシン受容体、αｖβ３、アミノペプチダーゼＰ、αフェトプロテイン、ガン抗原１２５、ガン胎児性抗原、カベオリン−１、ケモカイン受容体、クラステリン、腫瘍胎児抗原、ＣＤ２０、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、Ｒａｓ、ｐ５３、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、葉酸受容体、前立腺特異的膜抗原、前立腺特異的抗原、プリン受容体、放射線誘導性細胞表面受容体、セルピンＢ３、セルピンＢ４、扁平上皮性悪性腫瘍抗原、トロンボスポンジン、腫瘍抗原４、腫瘍関連糖タンパク質７２、チロシナーゼ、およびチロシンキナーゼが挙げられる。いくつかの実施形態において、細胞標的薬物は、葉酸受容体（ＦＲ）と特異的に結合する葉酸または葉酸誘導体である。
【００５８】
還元型葉酸担体（ＲＦＣ）は、薬理学的（μＭ）濃度で還元型葉酸のガン細胞への取り込みを介在する、低い親和性、高い能力の系である。薬理学的葉酸の濃度は、５〜５０ｎＭの範囲である。したがって、高い親和性のヒトＦＲが存在し、それらの相同する産物は、ＦＲタイプα、β、γ、またはδと呼ばれ、それぞれ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４とも呼ばれる遺伝子ファミリーによってコード化されている。膜アイソフォームＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ４は、葉酸または葉酸誘導体と結合し、細胞中へ葉酸または葉酸誘導体を輸送することができるのに対して、ＦＲ３は膜アンカーを欠如し、細胞から分泌される。ＦＲ１およびＦＲ２は、それぞれ、葉酸および６Ｓ  ５−ホルミルテトラヒドロ葉酸（すなわち、ロイコボリン）と、同様ではあるが異なる親和性１．５ｎＭ対０．３５ｎＭ（葉酸）および８００ｎＭ対７ｎＭ（ロイコボリンｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ）で結合する。６Ｓ  ５−メチルテトラヒドロ葉酸は、血液中に多く見られる葉酸であり、ＦＲ１およびＦＲ２に対して同様の親和性、それぞれ、５５ｎＭおよび１ｎＭ、を有する。ＰＣ３ヒト前立腺ガン細胞は、培養中、ＦＲ（例えば、ＦＲ１）を多く発現しないが、ＦＲはＰＣ３腫瘍によって発現される。ＦＲは、ＢｒＣａ細胞によっても発現され、不良転帰と関連するか、または、メトトレキサートに対する耐性にもかかわらず、これらの受容体を介して葉酸を輸送する。メトトレキサートに対する耐性にもかかわらず、これらの受容体を介して葉酸を輸送する。
【００５９】
多くの非増殖性組織は、機能的ＦＲ発現を欠如する。増殖正常組織におけるＦＲ発現は、特定の上皮細胞の管腔表面に限定され、したがって、循環に対してアクセス不可能である。しかしながら、悪性腫瘍および白血病における高レベルのＦＲ２（高親和性受容体）の存在は循環に曝露され、それらを腫瘍特異的治療薬の魅力的な候補としている。ＦＲ１（中程度親和性受容体）が尿細管中に発現されている腎臓は、糸球体ろ過によって排除されるＦＲ標的治療薬から保護される。さらなる保護は、腎尿細管細胞によるＦＲが介在するエンドサイトーシス後に、葉酸の迅速な解離および側底膜を通る血液中への輸送が存在する腎臓の葉酸保存メカニズムの結果である。
【００６０】
ガン細胞のメトトレキサート耐性は、大部分は、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の変異、細胞内ポリグルタミン酸化の減少、ＲＦＣを介する排出および輸送の増大により；したがって、本出願の生分解性の遊星型ボールミル（ＰＢＭ）されたナノ粒子に対する耐性は、この治療薬が、メトトレキサート耐性腫瘍中において中程度にのみ影響される、ＦＲとの結合および輸送を介して作用するので、起こりそうもない。
【００６１】
ＰＢＭナノ粒子中の標的薬物としての葉酸の使用はまた、腫瘍細胞および制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の両方を許容する。多数のＴｒｅｇ細胞が腫瘍免疫性を抑制することは、十分受け入れられている。具体的には、Ｔｒｅｇ細胞は、接触依存性またはサイトカイン（例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−b等）分泌によってそれらを死滅させることなく、（外来および自己）反応性Ｔ細胞を抑制する。ＦＲ４は、Ｔｒｅｇ細胞において選択的にアップレギュレートされる。ＦＲ４の抗体による妨害はＴｒｅｇ細胞を枯渇させ、腫瘍を有するマウスにおける腫瘍免疫性を引き起こすことが示されている。したがって、細胞傷害性薬物を運搬する、葉酸をコーティングしたＰＢＭナノ粒子は、ＦＲ発現細胞をそれらの破壊のために取り込み、腫瘍の進行を、直接的（すなわち、ＢｒＣａ細胞）および間接的（すなわち、乳ガン関連細胞および末梢Ｔｒｅｇ細胞）に阻害し得る。
【００６２】
別のさらなる実施形態において、標的薬物は、限定するものではないが、アデノシン受容体、αｖβ３、アミノペプチダーゼＰ、αフェトプロテイン、ガン抗原１２５、ガン胎児性抗原、カベオリン−１、ケモカイン受容体、クラステリン、腫瘍胎児抗原、ＣＤ２０、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、Ｒａｓ、ｐ５３、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、葉酸受容体、前立腺特異的膜抗原、前立腺特異的抗原、プリン受容体、放射線誘導性細胞表面受容体、セルピンＢ３、セルピンＢ４、扁平上皮性悪性腫瘍抗原、トロンボスポンジン、腫瘍抗原４、腫瘍関連糖タンパク質７２、チロシナーゼ、およびチロシンキナーゼ等からなる腫瘍関連抗原と結合することが可能な抗体またはペプチドである。
【００６３】
治療方法
本出願の別の態様は、細胞傷害性薬物および細胞標的薬物を含む、遊星型ボールミル（ＰＢＭ）されたナノ粒子を含む有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるガンの治療方法に関する。いくつかの実施形態において、細胞標的薬物は、葉酸または葉酸誘導体である。
【００６４】
薬物含有ＰＢＭナノ粒子は、マクロファージによるファゴサイトーシスに耐え、細網内皮系（ＲＥＳ）によるクリアランスを避けることが可能な長く循環するナノ粒子であり、このナノ粒子は、透過性の増大およびリンパ液排出の欠損を示す（すなわち、透過性および保持性を増大する−ＥＰＲ効果）腫瘍による蓄積をもたらし得る。これらのナノサイズ化されたビヒクルの取り込みは、いくつかの利点を有し得る。本出願の薬物含有ＰＢＭナノ粒子は、標的化された送達により、全身毒性を有意に低減し得る。
【００６５】
その他の実施形態において、本出願の薬物含有ＰＢＭナノ粒子は、化学療法薬耐性の発現を防ぐ。薬物耐性は２つの大きなメカニズムが介在する：（ｉ）標的細胞（および細胞内の作用部位）に到着するのに十分な量の化学療法薬の不足、ならびに（ｉｉ）アポトーシスメカニズムの誘導に続く細胞死の完了の失敗。乳ガンを標的とし、乳ガンによって取り込まれ得るナノ粒子は、化学療法薬および細胞内標的を効果的に送達し、アポトーシスの工程を完了するために十分な薬物を運搬し得る。
【００６６】
いくつかの実施形態において、ガンは、上皮性悪性腫瘍、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、および芽細胞腫からなる群から選択される。
【００６７】
さらなる実施形態において、上皮性悪性腫瘍は前立腺ガンである。いくつかのその他の実施形態において、ガンは前立腺ガンであり、本出願の医薬組成物が、有効量のビタミンＤと共に投与される。何人かの男性では極端に低いビタミンＤ状態もまた、ＰＣａ進行において示されている。さらに、抗ガン剤に関連する低カルシウム血症は通常、軽度であるが、前からビタミンＤの欠乏を有する患者の場合には、重篤となり得る。ビタミンＤは、プラチナ系抗ガン剤による腎毒性に対して効果的に保護し、ＰＣａの進行および薬物応答に寄与する、ＤＮＡ修復を調節するためのＮＥＲ遺伝子標的を制御する。
【００６８】
別のさらなる実施形態において、上皮性悪性腫瘍は乳ガンである。
【００６９】
別の特定の実施形態において、細胞傷害性薬物はクルクミンである。
【００７０】
別の特定の実施形態において、細胞傷害性薬物は、化学療法薬、放射性コンジュゲート、抗体、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド、およびガン細胞に対して細胞傷害性である任意のその他の薬物からなる群から選択される。
【００７１】
さらなる実施形態において、化学療法薬は、プラチナ系薬物、天然フェノール類、植物アルカロイド類およびタキサン類、その他のアルキル化剤、腫瘍抗生物質およびアントラサイクリン、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗剤、並びに、種々の抗新生物薬からなる群から選択される。
【００７２】
別のさらなる実施形態において、放射性コンジュゲートは、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、１８８Ｔｕ、および１８６Ｒｅからなる群から選択されるラジオアイソトープを含む。
【００７３】
別のさらなる実施形態において、抗体またはペプチドは、限定するものではないが、アデノシン受容体、αｖβ３、アミノペプチダーゼＰ、αフェトプロテイン、ガン抗原１２５、ガン胎児性抗原、カベオリン−１、ケモカイン受容体、クラステリン、腫瘍胎児抗原、ＣＤ２０、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、Ｒａｓ、ｐ５３、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、葉酸受容体、前立腺特異的膜抗原、前立腺特異的抗原、プリン受容体、放射線誘導性細胞表面受容体、セルピンＢ３、セルピンＢ４、扁平上皮性悪性腫瘍抗原、トロンボスポンジン、腫瘍抗原４、腫瘍関連糖タンパク質７２、チロシナーゼ、およびチロシンキナーゼ等からなる群から選択される腫瘍関連抗原と結合することが可能である。
【００７４】
別のさらなる実施形態において、ガン細胞に対して細胞傷害性である薬物は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、アメリカヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ、ｅｎｏｍｙｃｉｎ、ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ、並びにそれらの断片からなる群から選択される。
【００７５】
別の特定の実施形態において、細胞傷害性薬物は、天然フェノールと、化学療法薬、放射性コンジュゲート、抗体、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド、およびガン細胞に対して細胞傷害性である任意のその他の薬物からなる群から選択される１つ以上のその他の細胞傷害性薬物とを含む。
【００７６】
本出願の別の態様は、細胞傷害性薬物および細胞標的薬物を含有する遊星型ボールミル（ＰＢＭ）されたナノ粒子を含む有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする前記対象におけるガン転移を抑制する方法に関する。いくつかの実施形態において、細胞標的薬物は葉酸または葉酸誘導体である。
【００７７】
特定の実施形態において、ガンは、上皮性悪性腫瘍、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、および芽細胞腫からなる群から選択される。
【００７８】
さらなる実施形態において、上皮性悪性腫瘍は前立腺ガンである。
【００７９】
別のさらなる実施形態において、上皮性悪性腫瘍は乳ガンである。
【００８０】
別の特定の実施形態において、細胞傷害性薬物はクルクミンである。
【００８１】
別の特定の実施形態において、細胞傷害性薬物は、化学療法薬、放射性コンジュゲート、抗体、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド、およびガン細胞に対して細胞傷害性である任意のその他の薬物からなる群から選択される。
【００８２】
さらなる実施形態において、化学療法薬は、プラチナ系薬物、天然フェノール類、植物アルカロイド類およびタキサン類、その他のアルキル化剤、腫瘍抗生物質および    アントラサイクリン、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗剤、並びに、種々の抗新生物薬からなる群から選択される。
【００８３】
別のさらなる実施形態において、放射性コンジュゲートは、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、１８８Ｔｕおよび１８６Ｒｅからなる群から選択されるラジオアイソトープを含む。
【００８４】
別のさらなる実施形態において、抗体またはペプチドは、限定するものではないが、アデノシン受容体、αｖβ３、アミノペプチダーゼＰ、αフェトプロテイン、ガン抗原１２５、ガン胎児性抗原、カベオリン−１、ケモカイン受容体、クラステリン、腫瘍胎児抗原、ＣＤ２０、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、Ｒａｓ、ｐ５３、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、葉酸受容体、前立腺特異的膜抗原、前立腺特異的抗原、プリン受容体、放射線誘導性細胞表面受容体、セルピンＢ３、セルピンＢ４、扁平上皮性悪性腫瘍抗原、トロンボスポンジン、腫瘍抗原４、腫瘍関連糖タンパク質７２、チロシナーゼ、およびチロシンキナーゼ等からなる腫瘍関連抗原と結合することが可能である。
【００８５】
別のさらなる実施形態において、ガン細胞に対して細胞傷害性である薬物は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、アメリカヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ、ｅｎｏｍｙｃｉｎ、ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ、並びにそれらの断片からなる群から選択される。
【００８６】
別の特定の実施形態において、細胞傷害性薬物は、クルクミンと、化学療法薬、放射性コンジュゲート、抗体、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド、およびガン細胞に対して細胞傷害性である任意のその他の薬物からなる群から選択される１つ以上のその他の細胞傷害性薬物とを含む。
【００８７】
別の特定の実施形態において、標的リガンドは、限定するものではないが、アデノシン受容体、αｖβ３、アミノペプチダーゼＰ、αフェトプロテイン、ガン抗原１２５、ガン胎児性抗原、カベオリン−１、ケモカイン受容体、クラステリン、腫瘍胎児抗原、ＣＤ２０、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、Ｒａｓ、ｐ５３、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、葉酸受容体、前立腺特異的膜抗原、前立腺特異的抗原、プリン受容体、放射線誘導性細胞表面受容体、セルピンＢ３、セルピンＢ４、扁平上皮性悪性腫瘍抗原、トロンボスポンジン、腫瘍抗原４、腫瘍関連糖タンパク質７２、チロシナーゼ、およびチロシンキナーゼ等からなる腫瘍関連抗原と結合することが可能な抗体またはペプチドを含む。
【００８８】
本出願の別の態様は、細胞傷害性薬物および細胞標的薬物を含有する遊星型ボールミル（ＰＢＭ）されたナノ粒子を含む有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする前記対象における制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞のアポトーシスを誘導する方法に関する。いくつかの実施形態において、細胞標的薬物は葉酸または葉酸誘導体である。
【００８９】
本発明の別の態様は、ガンの進行を治療するために２つ以上の化学療法薬を含有する、葉酸でコーティングされた生分解性ＰＢＭナノ粒子の使用に関する。ドセタキセル−またはカルボプラチン−を充填した、葉酸でコーティングされたＰＢＭナノ粒子は、腫瘍治療効果を増大し、毒性を低減し、標的化およびＢｒＣａ細胞およびＴｒｅｇ細胞アポトーシスの誘導により腫瘍免疫性を増大する。
【００９０】
本出願の特定の態様は、インビボ効果を増大し、ガンに対する化学的予防戦略を向上させるための、葉酸でコーティングされた、クルクミンを充填したＰＢＭナノ粒子の標的化送達に関する。
【００９１】
本発明の別の態様は、治療上有効量の少なくとも１つのその他の治療薬、例えば、限定するものではないが、ＰＢＭナノ粒子中に含有されない、クルクミンまたは化学療法薬を用いた対象の治療と併せて、その前に、同時に、またはその後に、細胞傷害性薬物を含有するＰＢＭナノ粒子を用いて対象を治療することである。いくつかの実施形態において、ＰＢＭナノ粒子中に含有されない化学療法薬は、カルボプラチン、シスプラチン、ドセタキセル、およびオキサリプラチンから選択される。
【００９２】
本出願の医薬組成物は、既知の方法、例えば、ボーラスとしてまたは一定時間にわたる持続注入による静脈投与として、または、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所、または吸入経路によって、対象に投与してもよい。特定の実施形態において、本出願の医薬組成物は、侵襲的手技における腫瘍床への直接投与を含み、腫瘍またはガン組織へ直接投与される。本出願の医薬組成物はまた、冒された組織への投与のために、スポンジまたはガーゼ等の固体支持体上に配置してもよい。本発明の細胞傷害性薬物を含有するＰＢＭナノ粒子は、通常許容される薬学的に許容される担体に含まれた状態で投与することができる。許容される担体としては、限定するものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、およびグルコース含有生理食塩水が挙げられる。
【００９３】
本出願の医薬組成物の適当な用量（「治療上有効量」）は、例えば、治療される疾患、症状の重篤度および経過、本出願の医薬組成物が予防目的または治療目的で投与されるかどうか、薬歴、患者の病歴および医薬組成物中に含まれる細胞傷害性薬物に対する反応、使用される細胞傷害性薬物のタイプ、および担当医の判断力に依存し得る。本出願の医薬組成物は、一度にまたは一連の治療にわたって、適切に患者に投与することができ、診断後の任意の時点で患者に投与してもよい。本出願の医薬組成物は、単独の治療として、または、問題となっている症状を治療するのに有用なその他の薬物または治療と一緒に投与してもよい。
【００９４】
いくつかの実施形態において、本出願の医薬組成物は、クルクミンを含有し、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の１日クルクミン用量で投与される。クルクミン含有ＰＢＭナノ粒子は、連続的に、１時間ごと、１日あたり４回、１日あたり３回、１日あたり２回、毎日、または、２、３、４、５、６および７日ごと、または、１、２、３もしくは４週ごと投与してもよい。
【００９５】
一般的に、治療上有効量のＰＢＭナノ粒子中に含有される各細胞傷害性薬物、例えば、クルクミンまたはシスプラチンは、１回投与または複数回投与のいずれであれ、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲で投与される。特定の実施形態において、ＰＢＭナノ粒子中に含有される各細胞傷害性薬物は、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１μｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１μｇ／ｋｇ体重／日、１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１μｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日〜約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日〜約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日〜約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１００μｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００μｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００μｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲で投与される。
【００９６】
別の実施形態において、ＰＢＭナノ粒子中に含有される各細胞傷害性薬物は、約１０ｎｇ〜約１００ｎｇ／各投与、約１０ｎｇ〜約１μｇ／各投与、約１０ｎｇ〜約１０μｇ／各投与、約１０ｎｇ〜約１００μｇ／各投与、約１０ｎｇ〜約１ｍｇ／各投与、約１０ｎｇ〜約１０ｍｇ／各投与、約１０ｎｇ〜約１００ｍｇ／各投与、約１０ｎｇ〜約１０００ｍｇ／注入、約１０ｎｇ〜約１０，０００ｍｇ／各投与、約１００ｎｇ〜約１μｇ／各投与、約１００ｎｇ〜約１０μｇ／各投与、約１００ｎｇ〜約１００μｇ／各投与、約１００ｎｇ〜約１ｍｇ／各投与、約１００ｎｇ〜約１０ｍｇ／各投与、約１００ｎｇ〜約１００ｍｇ／各投与、約１００ｎｇ〜約１０００ｍｇ／注入、約１００ｎｇ〜約１０，０００ｍｇ／各投与、約１μｇ〜約１０μｇ／各投与、約１μｇ〜約１００μｇ／各投与、約１μｇ〜約１ｍｇ／各投与、約１μｇ〜約１０ｍｇ／各投与、約１μｇ〜約１００ｍｇ／各投与、約１μｇ〜約１０００ｍｇ／注入、約１μｇ〜約１０，０００ｍｇ／各投与、約１０μｇ〜約１００μｇ／各投与、約１０μｇ〜約１ｍｇ／各投与、約１０μｇ〜約１０ｍｇ／各投与、約１０μｇ〜約１００ｍｇ／各投与、約１０μｇ〜約１０００ｍｇ／注入、約１０μｇ〜約１０，０００ｍｇ／各投与、約１００μｇ〜約１ｍｇ／各投与、約１００μｇ〜約１０ｍｇ／各投与、約１００μｇ〜約１００ｍｇ／各投与、約１００μｇ〜約１０００ｍｇ／注入、約１００μｇ〜約１０，０００ｍｇ／各投与、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ／各投与、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ／各投与、約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ／注入、約１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ／各投与、約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ／各投与、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ／注入、約１０ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ／各投与、約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇ／注入、約１００ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ／各投与および約１０００ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ／各投与の範囲で投与される。ＰＢＭナノ粒子中に含有される化学療法薬は、毎日、または、２、３、４、５、６および７日ごと、または、１、２、３または４週ごと投与してもよい。
【００９７】
その他の特定の実施形態において、投与されるＰＢＭナノ粒子中に含有される各細胞傷害性薬物の量は、０．０００６ｍｇ／日、０．００１ｍｇ／日、０．００３ｍｇ／日、０．００６ｍｇ／日、０．０１ｍｇ／日、０．０３ｍｇ／日、０．０６ｍｇ／日、０．１ｍｇ／日、０．３ｍｇ／日、０．６ｍｇ／日、１ｍｇ／日、３ｍｇ／日、６ｍｇ／日、１０ｍｇ／日、３０ｍｇ／日、６０ｍｇ／日、１００ｍｇ／日、３００ｍｇ／日、６００ｍｇ／日、１０００ｍｇ／日、２０００ｍｇ／日、５０００ｍｇ／日または１０，０００ｍｇ／日、あるいは、約０．０００６ｍｇ／日、約０．００１ｍｇ／日、約０．００３ｍｇ／日、約０．００６ｍｇ／日、約０．０１ｍｇ／日、約０．０３ｍｇ／日、約０．０６ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日、約０．３ｍｇ／日、約０．６ｍｇ／日、約１ｍｇ／日、約３ｍｇ／日、約６ｍｇ／日、約１０ｍｇ／日、約３０ｍｇ／日、約６０ｍｇ／日、約１００ｍｇ／日、約３００ｍｇ／日、約６００ｍｇ／日、約１０００ｍｇ／日、約２０００ｍｇ／日、約５０００ｍｇ／日または約１０，０００ｍｇ／日である。予想される通り、用量は、患者の状態、サイズ、年齢および症状に依存し得る。予想される通り、用量は、患者の状態、サイズ、年齢および症状に依存し得る。
【００９８】
細胞傷害性薬物を含有するＰＢＭナノ粒子は、適宜または示された通り、ボーラスとしてもしくは持続注入により単回投与で、または、ボーラスもしくは持続注入により複数回投与として投与してもよい。複数回投与は、例えば、１日あたり複数回、１日１回、２、３、４、５、６または７日ごと、毎週、２、３、４、５または６週ごと、または毎月投与してもよい。しかしながら、その他の用法・用量も有用であり得る。この治療の進行は、従来の技術により容易にモニターされる。
【００９９】
本発明の特定の実施形態において、治療上有効量の細胞傷害性薬物を含有するＰＢＭナノ粒子は、単一の治療薬としてそれを必要とする対象に投与してもよい。特定の実施形態において、治療上有効量の細胞傷害性薬物を含有するＰＢＭナノ粒子は、腫瘍またはガン細胞を死滅させる、または、アポトーシスを促進させる。別の特定の実施形態において、治療上有効量の細胞傷害性薬物を含有するＰＢＭナノ粒子は、腫瘍またはガンの確立を阻害または防止する。さらなる特定の実施形態において、治療上有効量の細胞傷害性薬物を含有するＰＢＭナノ粒子は、既存の腫瘍またはガンからの腫瘍またはガン細胞の移動または転移を阻害または防止する。さらに別の実施形態において、治療上有効量の細胞傷害性薬物を含有するＰＢＭナノ粒子は、腫瘍またはガン細胞の非ガン性組織への侵襲を阻害または防止する。
【０１００】
本発明の特定の実施形態において、治療上有効量の細胞傷害性薬物を含有するＰＢＭナノ粒子は、１つ以上のさらなる治療上有効な細胞傷害性薬物と併せて、それを必要とする対象に投与してもよい。前記１つ以上のさらなる治療上有効な細胞傷害性薬物は、細胞傷害性薬物を含有するＰＢＭナノ粒子の前に、同時に、および／または、後に投与してもよい。
【０１０１】
特定の実施形態において、治療上有効量の細胞傷害性薬物を含有するＰＢＭナノ粒子は、腫瘍またはガン細胞を死滅させる際に、１つ以上のさらなる治療上有効な細胞傷害性薬物の有効性を増大させる。さらに特定の実施形態において、治療上有効量の細胞傷害性薬物を含有するＰＢＭナノ粒子は、腫瘍またはガン細胞を死滅させるために必要とされる１つ以上のさらなる治療上有効な細胞傷害性薬物の量を減少させる。さらなる特定の実施形態において、治療上有効量の細胞傷害性薬物を含有するＰＢＭナノ粒子は、既存の腫瘍またはガンからの腫瘍またはガン細胞の移動または転移を阻害または防止し、それにより、腫瘍またはガン細胞を死滅させる際に、１つ以上のさらなる治療上有効な細胞傷害性薬物の局所的有効性を向上させる。さらに別の実施形態において、治療上有効量の細胞傷害性薬物を含有するＰＢＭナノ粒子は、腫瘍またはガン細胞の非ガン性組織への侵襲を阻害または防止し、それにより、腫瘍またはガン細胞を死滅させる際に、１つ以上のさらなる治療上有効な細胞傷害性薬物の局所的有効性を向上させる。
【０１０２】
別の実施形態において、ＰＢＭナノ粒子は、ガン細胞に対して細胞傷害性である薬物を含有する。いくつかの実施形態において、ガン細胞に対して細胞傷害性である薬物は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、アメリカヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ、ｅｎｏｍｙｃｉｎ、ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ、並びにそれらの断片からなる群から選択される。
【０１０３】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、それらは限定するものとして解釈されるべきでない。本出願ならびに図面および表を通じて引用される、全ての参考文献、特許および公開特許出願は、参照により本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１０４】
実施例１：遊星型ボールミルされたナノ粒子の調製
初めに、１０〜１５％（ｗ／ｖ）のアルギネート、セルロース、コラーゲン、デンプン、ラクトース、その他のバイオポリマーまたはそれらの混合物（賦形剤／バイオポリマー）を水に溶解し、ホモジナイザーを用いて混合した。次に、１０〜２０％（ｗ／ｖ）のタンパク質（例えば、ＢＳＡまたはＩｇＧ）または巨大分子（例えば、ガドリニウム、パクリタキセル、およびシスプラチン等）（ｗ／ｖ）を、賦形剤／バイオポリマー溶液に、４℃にて添加した。次に、１０％のＰＥＧ（ｗ／ｖ）を、バイオポリマー−細胞傷害性薬物溶液に添加し、３０分間撹拌した。遠心分離後、溶液を約３ｍｍ３の錠剤中に注ぎ、乾燥させた。次いで、これらの錠剤を、制御された温度条件下（＜３７℃）で、遊星型ボールミルを用いて研磨した。得られた粒子は、単独で（すなわち、コーティングされていない状態で）使用するか、または、１０００ｒｐｍで連続撹拌することにより、５％、１０％または２０％ＰＣＬ溶液（塩化メチレン中）を用いてコーティングした。ＰＣＬでコーティングされたバイオポリマー−ＰＥＧ粒子は、最後に水ですすぎ、乾燥させ、粉末として保存した。
【０１０５】
ＰＣＬ活性化およびペプチドコンジュゲーション：粒子の標的化送達のためにその表面にペプチドまたは基質（例えば、葉酸）を結合させるために、ＰＣＬを活性化した。初めに、２ｇのＰＣＬを、６ｍｌの乾燥ジオキサン中に溶解し、５０℃の湯浴中で２時間加熱し、ポリマーを可溶化して、次に、室温（ＲＴ）まで冷却した。Ａ  ２ｍｌのＮ，Ｎ−ジスクシンイミジルカーボネート溶液（乾燥アセトン中、１５３．７ｍｇ／ｍｌ）および２ｍｌのピリジン溶液（乾燥アセトン中、４．７４５ｍｇ／ｍｌ）を、室温にて６時間連続撹拌しながら、ＰＣＬ懸濁液と混合した。この混合物を、次に、沈殿物を除去するために、１μｍの孔径を有するＧ２ガラスファイバーを用いて濾過した。得られた懸濁液は、４倍容量のジエチルエーテルを用いて沈殿させた。沈殿物をアセトン中で再懸濁し、ジエチルエーテルで再び沈殿させた。次に、活性化または反応性ＰＣＬは乾燥させ、4℃にて保存した。
【０１０６】
次いで、活性化ＰＣＬを、リジンまたはペプチド由来の任意の遊離アミン基とコンジュゲートさせた。所望のペプチドまたはアミノ酸（例えば、リジン）を、０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１  Ｍ  ホウ酸、ｐＨ８．５中に、２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させた。次に、アセトニトリル中に溶解したＰＣＬを、ペプチドまたはアミノ酸と、８：１（活性化ＰＣＬ：ペプチドまたはアミノ酸）の割合で、一晩、４℃にて、撹拌しながら混合した。過剰な活性化していて、コンジュゲートしていないＰＣＬを、ガラスフィルターを用いた濾過により除去した。
【０１０７】
粒子のコーティング：既知の量およびサイズの粒子を、連続撹拌（１０００ｒｐｍ）しながら塩化メチレン中に溶解させた、様々な濃度（例えば、５％、１０％および１０％）のＰＣＬまたはアミンをコンジュゲートさせたＰＣＬを用いてコーティングした。得られるＰＣＬでコーティングされた粒子は、遠心分離後、上清を排出させることにより、ＰＣＬコーティング溶液から分離した。得られるＰＣＬコーティングされたナノ粒子は濾過され（ｓｔｒａｉｎｅｄ）、空気乾燥され、４℃にて保存された。
【０１０８】
熱分析：示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＤＳＣおよび熱重量／示差熱分析を用いて実施した。初めに、約１ｍｇの粒子を、大気窒素中、３０℃から２５０℃まで一定の割合（１分間あたり１０℃）で加熱した。次いで、粒子の熱重量プロファイルを実施した。
【０１０９】
タンパク質充填の定量および特性判定：ＰＣＬでコーティングされたバイオポリマー−ＰＥＧ粒子のインビトロ放出試験を、それらの内容物の取り込み後に、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４中、３７℃にて行った。それらの放出速度を調べるために、およそ、１００ｍｇの粒子を、１００ｍｌのＰＢＳまたはクエン酸トリス緩衝液中、３７℃にて懸濁し、消化させた。粒子はまた、０．１、０．２２、または０．４５μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターを用いて濾過した。タンパク質を含有する内容物を、ＰＢＳまたはクエン酸トリス緩衝生理食塩水のいずれかに溶解し、放出速度はＬｏｗｒｙタンパク質アッセイを用いて測定した。ポリマーでコーティングされた粒子の場合、宿主の無限のシンク（ｓｉｎｋ）条件を模倣するためにＰＢＳを交換しながら、サンプルを４８時間ごとに回収した。
【０１１０】
また、標準または封入タンパク質（例えば、ＢＳＡまたはＩｇＧ）と比較することにより、円二色性スペクトル分析を使用して分子組立の規則性を評価した。放出されるタンパク質の分子内構造（例えば、αヘリックス、βシート等）の立体構造を、それらの円二色性をΔεに関して測定すること、および、円二色性を標準物質としての未封入タンパク質と比較することにより決定した。
【０１１１】
粒子のサイズ、電荷および形態の分析：粒子を、Ｍａｌｖｅｒｎ粒子サイズ・電荷分析装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ）を用いたレーザー回折により、それらの粒子サイズについて分析した。粒子をｄＨ２Ｏ中に分散し、電荷およびサイズについて分析した。ＰＣＬでコーティングされたバイオポリマー−ＰＥＧ粒子の表面形態を、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって特性判定した。ＳＥＭ分析のために、アルミニウムスタブに付着された両面テープの一方の側の上に乾燥させた粒子を配することにより、粒子を調製した。次に、スタブを、Ｐｏｌａｒｏｎ  ＳＣ  Ｓ００−スパッタコーティング装置を用いて、金で２０〜３０ｎｍの厚さにコーティングした。次に、サンプルを、走査型電子顕微鏡の試料チャンバに導入し、表面形態について調べた。異なる段階におけるＰＣＬでコーティングされたバイオポリマー−ＰＥＧ粒子製剤の赤外スペクトルを、初めに、１ｍｇのサンプルと１００ｍｇの乾燥臭化カリウム粉末を混合することによって取得した。次に、サンプルの赤外スペクトルをフーリエ変換赤外分光計を用いてアッセイした。
【０１１２】
ナノ粒子のサイジングについては、以下の指示が指針を提供する。一般的に、５〜３０ｎｍ、３０〜１８０ｎｍ、０．２〜１μｍ、１〜６μｍ、４〜１２μｍまたは１０〜６０μｍの範囲の粒子サイズは、封入されるサンプルと賦形剤と一緒に１〜３個の２０ｍｍボールおよび１０〜１６個の１０ｍｍボールを満たした５０ｍｌ研磨ジャーを、２００〜４００ｒｐｍに維持される研磨速度を用いて使用することにより、制御することができる。この研磨間隔は、１０分間、続く１５分間の休止サイクル、に設定されるべきである。１０〜２５サイクル（研磨および休止）は、＞９９．５％の粒子のサイズを５〜３０ｎｍ、３０〜１８０ｎｍ、０．２〜１μｍ、１〜６μｍ、４〜１２μｍまたは１０〜６０μｍの範囲にする。研磨ジャーのサイズが＞５０ｍｌ（例えば、１２５ｍｌ、５００ｍｌ等）に大きくなった場合、ボールの数はジャー容量の増加に比例して増加する。
【０１１３】
研磨ボールおよび動作−休止サイクルによる粒子サイズ調節の例：５〜３０ｎｍの範囲の粒子サイズは、封入されるサンプルと賦形剤と一緒に３個の２０ｍｍボールおよび１０個の１０ｍｍボールを満たした５０ｍｌ研磨ジャーを、２００〜４００ｒｐｍに維持される研磨速度を用いて使用することにより得ることができる。この研磨間隔は、１０分間、続く１５分間の休止サイクル、に設定される。１５〜２５サイクル（研磨および休止）は、＞９９．５％の粒子のサイズを５〜３０ｎｍの範囲にする。
【０１１４】
３０〜１８０ｎｍの範囲の粒子サイズは、封入されるサンプルと賦形剤と一緒に３個の２０ｍｍボールおよび１０個の１０ｍｍボールを満たした５０ｍｌ研磨ジャーを、４００ｒｐｍに維持される研磨速度を用いて使用することにより得ることができる。この研磨間隔は、１０分間、続く１５分間の休止サイクル、に設定されるべきである。１５〜２０サイクル（研磨および休止）は、＞９９．５％の粒子のサイズを３０〜１８０ｎｍの範囲にする。
【０１１５】
０．２〜１μｍの範囲の粒子サイズは、封入されるサンプルと賦形剤と一緒に３個の２０ｍｍボールおよび１０個の１０ｍｍボールを満たした５０ｍｌ研磨ジャーを、３００ｒｐｍに維持される研磨速度を用いて使用することにより得ることができる。この研磨間隔は、１０分間、続く１５分間の休止サイクル、に設定されるべきである。１５〜２０サイクル（研磨および休止）は、＞９９．５％の粒子のサイズを０．２〜１μｍの範囲にする。
【０１１６】
１〜６μｍの範囲の粒子サイズは、封入されるサンプルと賦形剤と一緒に２個の２０ｍｍボールおよび１３個の１０ｍｍボールを満たした５０ｍｌ研磨ジャーを、３００ｒｐｍに維持される研磨速度を用いて使用することにより得ることができる。この研磨間隔は、１０分間、続く１５分間の休止サイクル、に設定されるべきである。２０〜２５サイクル（研磨および休止）は、＞９９．５％の粒子のサイズを１〜６μｍの範囲にする。
【０１１７】
４〜１２μｍの範囲の粒子サイズは、封入されるサンプルと賦形剤と一緒に２個の２０ｍｍボールおよび１３個の１０ｍｍボールを満たした５０ｍｌ研磨ジャーを、２５０ｒｐｍに維持される研磨速度を用いて使用することにより得ることができる。この研磨間隔は、１０分間、続く１５分間の休止サイクル、に設定されるべきである。１５〜２０サイクル（研磨および休止）は、＞９９．５％の粒子のサイズを４〜１２μｍの範囲にする。
【０１１８】
１０〜６０μｍの範囲の粒子サイズは、封入されるサンプルと賦形剤と一緒に１個の２０ｍｍボールおよび１６個の１０ｍｍボールを満たした５０ｍｌ研磨ジャーを、２００ｒｐｍに維持される研磨速度を用いて使用することにより得ることができる。この研磨間隔は、１０分間、続く１５分間の休止サイクル、に設定されるべきである。１０〜１５サイクル（研磨および休止）は、＞９９．５％の粒子のサイズを１０〜６０μｍの範囲にする。
【０１１９】
粒子の特性に対する賦形剤／バイオポリマー濃度の効果：様々なサイズ（５ｎｍ〜６０μｍ±平均サイズの１０％）を有する粒子を、約１０％（ｗ／ｖ）のアルギン酸ナトリウム、約８％（ｗ／ｖ）のセルロースまたは約１０％（ｗ／ｖ）のｄＨ２Ｏ中デンプン（賦形剤／バイオポリマー溶液）を用いて作製した。２％未満（ｗ／ｖ）のアルギン酸ナトリウム、セルロースまたはデンプンでは、＞１０％変動しない平均サイズを有する粒子の収率は低いことが分かった。１５％よりも多いアルギン酸ナトリウムまたは１０％よりも多いセルロースでは、賦形剤／バイオポリマー溶液は高い粘性のままであり、錠剤形成および続く粒子調製のために使用することができなかった。同様に、デンプン（賦形剤／バイオポリマー）溶液は、最適な溶解性および粘性のために、２０分間、５０℃まで加熱することを必要とし、デンプン濃度は１２％（ｗ／ｖ）を越え得なかった。
【０１２０】
賦形剤／バイオポリマー溶液の粘性もまた、粒子の形態に大きな影響を有した。粒子は、賦形剤／バイオポリマー溶液の濃度が増大すると（＞１％（ｗ／ｖ））、より滑らかに、より球形になった。しかしながら、＜１０％の賦形剤／バイオポリマー溶液は、理想の粒子サイズをもたらした。最適な収率は、ナノまたはマイクロ粒子の作製のために、それぞれ、１０％、８％、または１０％（ｗ／ｖ）のアルギン酸ナトリウム、セルロースまたはデンプンの濃度で達成された。したがって、続く試験において、これらの最適な濃度を、粒子へ研磨するための３ｍｍ３錠剤の作製のために調製した。
【０１２１】
粒子サイズに対する研磨速度および遊星型ボールのサイズの効果：遊星型ボールミル装置（Ｒｅｔｓｃｈ  ＰＭ１００）の研磨速度および研磨ボールのサイズは、上記実施例において示されるように、粒子サイズを制御するのに重要な役割を果たした。２０分間で０〜１００ｒｐｍに速度を変化させ、１０個の１０ｍｍのボールと３個の２０ｍｍのボールを用いることにより、２０〜５０μｍの範囲のサイズの粒子が得られたのに対して、２０分間で１００〜２００ｒｐｍに速度を変化させることにより、１０〜２０μｍの範囲のサイズのマイクロ粒子が得られた。２０分間で２００〜３００ｒｐｍに速度を調節し、５個の５ｍｍのボールと１５個の１０ｍｍのボールを用いることにより、１〜５μｍのサイズの粒子が得られた。３００〜４００ｒｐｍに速度を増加し、１００個の５ｍｍのボールを用いることにより、０．５〜１μｍの範囲の粒子が得られた。
【０１２２】
＜５００ｎｍの粒子を作製するために、初めに、錠剤を研磨して、−２０〜５０μｍのサイズのマイクロ粒子を生産した。得られたマイクロ粒子は、１００個の３ｍｍのボールと５００個の２ｍｍのボールを用いることにより、２０分間、４００〜６００ｒｐｍの速度でさらに研磨することにより、５〜５００ｎｍの範囲のサイズのナノ粒子が生産された。速度のさらなる増加は、サイズの減少に大きな影響を与えなかった。
【０１２３】
粒子によるタンパク質封入および充填の効率：ＢＳＡの充填率は、４〜２５％（ｗ／ｖ）で変動し得る。研磨後に形成され得られた粒子は、凝集し、＞２０％（ｗ／ｖ）のタンパク質充填率で形態的に変形した。ナノまたはマイクロ粒子中、最高約２０％のＢＳＡ充填は、１００％の効率で達成することができた。
【０１２４】
コーティングされていないバイオポリマー−ＰＥＧ粒子、およびＰＣＬコーティングされたバイオポリマー−ＰＥＧ粒子の形態：ＰＣＬコーティングによって修飾された粒子は、コーティングされていない粒子と比較して、滑らかで、均一であるように見られたことはＳＥＭから明らかである。ＰＣＬのマルチコーティングにより、さらに滑らかな粒子表面特性が生じた。しかしながら、粒子の表面は、滑らかかつ球状から粗いかつ非球状へと変化し、インビトロでの内容物放出後、空胞化した。
【０１２５】
実施例２：  乳ガン細胞に対する、腫瘍関連抗原リガンドでコーティングされ、かつ、化学療法薬物を充填したＰＢＭナノ粒子
細胞傷害性薬物が充填され、生分解性の遊星型ボールミル（ＰＢＭ）された、直径〜２０ｎｍのナノ粒子を、葉酸をコンジュゲートさせたポリカプロラクトン−ポリエチレングリコールコポリマーでコーティングする。葉酸をコーティングしたＰＢＭナノ粒子にはさらに、ドセタキセル、カルボプラチン、またはシスプラチンを充填する。２０μＭのシスプラチン溶液を用いた一次細胞および細胞系統のインキュベーションにより、２４時間の培養後、ＢｒＣａ細胞（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、および４Ｔ１）および正常（一次）乳房上皮細胞の両方の＞９０％の細胞死がもたらされた。しかしながら、１０倍より少ない化学療法薬物を含有するＰＢＭナノ粒子は取り込まれ、それぞれ、シスプラチン、ドセタキセル、またはカルボプラチン溶液と同じレベルのＢｒＣａ細胞アポトーシスを誘導するが、一次乳房上皮細胞では誘導しなかった。また、シスプラチン溶液（８ｍｇ／ｋｇ／週）またはシスプラチンを封入した、葉酸でコーティングされたＰＢＭナノ粒子（相当するシスプラチン用量＝０．０８ｍｇ／ｋｇ／週）を静脈注射により受容した、乳ガンを有するマウスは有意に（および同様に）腫瘍が退行した。シスプラチン溶液を受容したマウスは、ナイーブなマウスまたはＰＢＭナノ粒子で処理したマウスよりも有意に高い腎毒性および肝毒性を示した。高レベルの葉酸受容体a（ＦＲa／ＦＲ１）を発現するガン細胞と同様に、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞がＦＲg（ＦＲ４）を発現し、ＦＲ４の妨害は腫瘍免疫性を増大することが知られている。したがって、本出願の新規ＰＢＭナノ粒子は、ＢｒＣａ治療効率を増大し、毒性を低減し、乳ガン免疫性を増大する。
【０１２６】
ＰＢＭナノ粒子（カルボプラチンまたはドセタキセル含有）が介在する腫瘍退行について特性判定される。ナノ粒子を用いて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ルシフェラーゼ−陽性（ｌｕｃ）ならびにＭＣＦ−７−ｌｕｃ異種移植片腫瘍（発生前および発生後）を処理する。いくつかの実施形態において、Ｃａｌｉｐｅｒ／Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ（商標）Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃイメージングシステムを使用して、乳ガン組織量を定量する。免疫組織化学（ＩＨＣ）による、切除した腫瘍の生体外分析および形態分析によって、Ａｐｅｒｉｏ  ＳｃａｎｓｃｏｐｅおよびＳｐｅｃｔｒｕｍソフトウェアを用いて、乳ガンアポトーシス（カスパーゼ−３および−９陽性）および増殖（Ｋｉ６７陽性）表現型の変化を測定する。
【０１２７】
図３は、高い親和性の葉酸受容体（ＦＲ）が、ＢｒＣａ腫瘍および細胞系統で発現されることを示す。
【０１２８】
図４は、シスプラチン−、ドセタキセル−、またはカルボプラチン−が充填された、葉酸でコーティングされたＰＢＭナノ粒子が、選択的にＢｒＣａ細胞を標的とし、ＢｒＣａ細胞中でのアポトーシスを誘導することを示す。
【０１２９】
図５は、シスプラチン溶液（８ｍｇ／ｋｇ／週）またはシスプラチンを含有する、葉酸でコーティングされたＰＢＭナノ粒子（相当するシスプラチン用量＝０．０８ｍｇ／ｋｇ／週）を静脈注射により受容した、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１−ｌｕｃ腫瘍を有するマウスが、有意に腫瘍が退行したことを示す。シスプラチン溶液（８ｍｇ／ｋｇ／週）またはシスプラチンを含有する、葉酸でコーティングされたＰＢＭナノ粒子（相当するシスプラチン用量＝０．０８ｍｇ／ｋｇ／週）を静脈注射により受容した、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１−ｌｕｃ腫瘍を有するマウスは、有意に腫瘍が退行した。
【０１３０】
シスプラチン溶液を受容した腫瘍を有するマウスは、ナイーブなマウスまたはＰＢＭナノ粒子で処理したマウスと比較して、有意に高い腎毒性および肝毒性を示した。ＰＢＭナノ粒子（カルボプラチンまたはドセタキセル含有）が介在する腫瘍退行は、ルシフェラーゼを発現するヒトＢｒＣａ細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ；ＥＲＮｅｇ  ＰＲＮｅｇ  Ｈｅｒ２ＮｅｇおよびＭＣＦ−７−ｌｕｃ；ＥＲＰｏｓ  ＰＲＰｏｓ  Ｈｅｒ２Ｐｏｓ）の同所の乳腺脂肪体（ｍａｍｍａｒｙ  ｆａｔ  ｐａｄ）への注入後、特性判定される。腫瘍の進行または腫瘍の退行に続いて、ドセタキセル、カルボプラチン、または薬物を含まずテキサスレッド色素のみを含有する、葉酸でコーティングされたＰＢＭナノ粒子の送達後に、Ｃａｌｉｐｅｒ／Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ−１００イメージングシステムを用いて、腫瘍を有するＮｕ／Ｘｉｄマウスを非侵襲的に撮像する。免疫組織化学生体外分析によって、乳ガンアポトーシス（カスパーゼ−３および−９）および新規ＰＢＭナノ粒子で処理した腫瘍の表現型の変化を測定する。ＮＩＨ−ＩＩＩマウスを用いて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃおよびＭＣＦ−７−ｌｕｃ細胞系統を移植する。
【０１３１】
ＰＢＭナノ粒子は、腫瘍の進行、免疫性、および自然発生的な腫瘍の成長に影響を及ぼし、それぞれ、４Ｔ１−ｌｕｃ−ｓｙｎｏｇｒａｆｔおよび新規ＰｙＭＴ−ｌｕｃマウスモデルを用いて測定される。臨床的に関連する移植された乳ガン（４Ｔ１）および自然発生的な乳ガン（ＰｙＭＴ）の成長は、Ｃａｌｉｐｅｒ／Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ−１００イメージングシステムを用いて、非侵襲的にモニターされる。Ａｐｅｒｉｏ組織スキャナーおよび分析システムを用いる免疫組織化学的分析および顕微鏡的形態学的分析によって、乳ガンアポトーシス（カスパーゼ−３および−９）および増殖性（Ｋｉ６７）表現型の変化が定量される。さらに、末梢のリンパ節および腫瘍関連Ｔｒｅｇ細胞の数および活性は、ＣＤ２５、ＦＲ４、ＦｏｘＰ３、ＩＬ−１０、および／またはＴＧＦ−b１発現およびＴｈ１／Ｔｈ２細胞増殖を抑制する能力について特性判定される。
【０１３２】
本出願のＰｙＭＴ−ｌｕｃトランスジェニックマウスは、初めに、Ｆ３  ＭＭＴＶ−ｌｕｃマウスを作出するために３代に亘るマウスを交配することにより、確立される。
【０１３３】
図６は、ＰＢＭナノ粒子が、選択的にＴｒｅｇ（ＦｏｘＰ３＋  ＣＤ２５Ｈｉｇｈ）を死滅させるが、Ｔヘルパー（ＦｏｘＰ３−  ＣＤ２５Ｌｏ）細胞は死滅させなかったことを示す。高レベルのＦＲを発現するガン細胞と同様に、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞はＦＲg（ＦＲ４）を発現して、ＦＲ４の妨害は腫瘍免疫性を増大し；（ｖｉ）は、我々が選択的にＴｒｅｇ（ＦｏｘＰ３＋  ＣＤ２５Ｈｉｇｈ）を選択的に破壊し得るが、Ｔヘルパー細胞は破壊し得ないことを示す。図３〜５は共に、新規ドセタキセル−又はカルボプラチン−を充填した、葉酸でコーティングされたＰＢＭなノ粒子が、化学療法に関連する健康格差を減少させるために、腫瘍治療効率を増大し、毒性を減少し、かつターゲティングとＢｒＣａおよびＴｒｅｇ細胞死を誘導することにより腫瘍免疫性を増大するための生物学的および臨床的根拠を提供する。
【０１３４】
実施例３：  前立腺ガン細胞における腫瘍細胞ターゲティングおよび化学療法薬物を充填したＰＢＭナノ粒子の効果
細胞傷害性薬物を充填した、生分解性の直径〜２０ｎｍのＰＢＭナノ粒子を、ポリカプロラクトン−ポリエチレングリコールコポリマーおよび葉酸でコーティングする。２０μＭのシスプラチンを用いたＰＣａ細胞（ＰＣ３およびＰＴＥＮ−ＣａＰ２）および正常の前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣおよびＲＷＰＥ−１）の両方の処理によって、＞９０％の細胞死がもたらされた。１００倍より少ないシスプラチンを含有するＰＢＭナノ粒子は取り込まれ、シスプラチン溶液と同じレベルのＰＣａ細胞アポトーシスを誘導するが、正常細胞には有意に影響を及ぼさなかった。シスプラチン溶液（８ｍｇ／ｋｇ／週）または葉酸でコーティングされたＰＢＭナノ粒子（０．０８ｍｇ／ｋｇ／週の相当するシスプラチン用量を含有）のいずれかを受容した腫瘍を有するマウスは有意に（および同様に）腫瘍が退行した。しかしながら、シスプラチン溶液を受容したマウスは、ナイーブなマウスまたはＰＢＭナノ粒子で処理したマウスよりも有意に高い腎毒性および肝毒性を示した。ＰＣａ細胞は、高レベルの葉酸受容体a（ＦＲa／ＦＲ１）を発現し；同様に、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞は、ＦＲg／ＦＲ４を発現し、ＦＲ４の妨害は腫瘍免疫性を増大する。ＰＢＭナノ粒子は、ビタミンＤの欠損、カベオリン−１の発現、およびＮＥＲの遺伝子型に関連する健康格差にもかかわらず、腫瘍治療効率を増大し、毒性を低減し、腫瘍免疫性を増大する。
【０１３５】
図７は、ＦＲが、ＰＣ３およびＰＴＥＮ−ＣａＰ２腫瘍の両方によって発現されるが、細胞系統または正常細胞によっては発現されないことを示す。
【０１３６】
図８で示されるように、シスプラチンを充填した、葉酸でコーティングされたＰＢＭナノ粒子は、インビトロで、ＰＣ３細胞の破壊を選択的に標的とした。
【０１３７】
図９に示されるよう、シスプラチン溶液（８ｍｇ／ｋｇ／週）、またはシスプラチンを含有する、葉酸でコーティングされたＸＰｃｌａｄ（登録商標）ナノ粒子（相当するシスプラチン用量＝０．０８ｍｇ／ｋｇ／週）のいずれかを静脈注射により受容したＰＣ３−ｌｕｃ腫瘍を有するマウスは、有意な腫瘍の退行を示す。しかしながら、重要なことに、シスプラチン溶液を受容したマウスは、表２に示されるように、ナイーブなマウスまたはＰＢＭナノ粒子で処理したマウスよりも有意に高い腎毒性および肝毒性を示した。
表２．  シスプラチン溶液またはＸＰｃｌａｄナノ粒子の（１週間あたり）６回投与後の血液化学の変化
【表１】
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正常範囲を超える有意な変化は太字で強調表示している。
【０１３８】
実施例４：  前立腺ガン細胞における腫瘍関連抗原ターゲティングおよびクルクミンを充填したＰＢＭナノ粒子の効果
本出願のＰＢＭナノ粒子は、クルクミンのガン細胞への送達のための既存のナノビヒクルと比較して、いくつかの利点を有する。ＰＢＭナノ粒子の製造方法は、図１０および１１に示されるように、短時間であり（〜４時間）、再現性をもって（ＳＤ＝５ｎｍ；ＬｏｇＰ＝−１．１±０．３）  ｃｒｅａｔｅｓ  〜２５ｎｍのサイズのナノ粒子を作製する。葉酸とコンジュゲートさせたポリカプロラクトン−ポリエチレングリコールコポリマーでコーティングした、クルクミンを充填した生分解性ナノ粒子は、図１２に示されるように、〜６０ｍＶのゼータ電位を有する。
【０１３９】
図１３は、ＳＣｉＤマウスにおいて確立されたＰＣａ細胞およびＰＣａ腫瘍によるＦＲの発現を示す。
【０１４０】
図１４に示されるように、クルクミンを充填した、葉酸でコーティングされたＰＢＭナノ粒子は、ＰＣａ細胞を選択的に標的とし、アポトーシスを誘導する。フローサイトメトリーによるＩｍａｇｅ  Ｓｔｒｅａｍマルチスペクトルイメージングを用いて、ナノ−クルクミンおよび遊離クルクミンの両方の治療に対する様々なＰＣａ細胞の反応を測定した。我々の結果は、クルクミンのＰＢＭ製剤が、遊離クルクミンのＩＣ５０よりも低い濃度であっても、ガン細胞を死滅させるのに非常に有効であった（７０−８５％）ことを示す。重要なことに、ナノ担体単独では、実際に細胞傷害性を示さなかった。予備データは、ＰＢＭナノ粒子が、ＦＲを介した特異的な腫瘍ターゲティングと共により効果的なクルクミンが介在する効果を得るために、クルクミンを封入する革新的な方法を提供することを示す。
【０１４１】
実施例５：  ＰＢＭナノ粒子が介在する腫瘍の退行
ＰＢＭナノ粒子（オキサリプラチンまたはドセタキセル含有）が介在する腫瘍退行が、アンドロゲン非依存性であり、ルシフェラーゼを発現するヒトＰＣ３細胞（ＰＣ３−ｌｕｃ；ＡＲＮｅｇＰＴＥＮＮｅｇ）ならびに通常の食物およびビタミンＤを欠損する食物を与えたマウスＰＴＥＮ−ＣａＰ２−ｌｕｃ（ＡＲＰｏｓＰＴＥＮ−／−）の脛骨内注入後に特性判定される。進行（骨転移）ＰＣａを模倣するために、ビタミンＤを欠損する食物または通常の食物を受容するＮＩＨ−ＩＩＩまたはＢ６雄マウスに、それぞれ、ＰＣ３−ｌｕｃまたはＰＴＥＮ−ＣａＰ２−ｌｕｃ細胞を左脛骨内に注入する。腫瘍の進行は、Ｃａｌｉｐｅｒ／Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ−１００イメージングシステムを用いて、去勢されていないマウスにおいて非侵襲的に追跡調査する。腫瘍が＞１０５フォトン／秒／ｃｍ２の発光を放射した後、一群のマウスを去勢して、アンドロゲンアブレーションを模倣し、第二群では去勢しない。次に、マウスを、０、０．１または１０ｍｇ／ｋｇのドセタキセルまたはオキサリプラチン、あるいは、０．１ｍｇ／ｋｇ有効用量のドセタキセル、またはオキサリプラチンとテキサスレッド、または薬物を含まず、テキサスレッドのみを含有する、葉酸でコーティングされたＸＰｃｌａｄナノ粒子を用いて、毎週静脈内に処理する。マウスを、腫瘍の進行／退行をモニターするために、毎週撮像する。陰性対照（生理食塩水ビヒクル処理単独）の腫瘍が１０８フォトン／秒／ｃｍ２を超える場合、各セットのグループを屠殺にする。ＩＨＣによる生体外分析を用いて、新規ＸＰｃｌａｄナノ粒子で処理したマウスから切除された腫瘍における前立腺腫瘍アポトーシス（カスパーゼ−３および−９）または増殖性（Ｋｉ６７）表現型の変化を測定する。顕微鏡的分析および形態分析によって、前立腺腫瘍アポトーシスにおける処理の重要性およびＰＣａ細胞の発生頻度または生存における変化が測定される。毎週の生物発光イメージングと共に、血液化学および末梢血白血球のサブ集団を、腫瘍関連毒性または薬物関連毒性を評価するためにモニターする。血液サンプルを用いて、質量分析により、血清中のドセタキセルおよびオキサリプラチンＰＫ／ＰＤを測定する。
【０１４２】
細胞系統および細胞培養
２つの正常前立腺上皮細胞系統（ＰｒＥＣおよびＲＷＰＥ−１）、１つの良性（ＰＴＥＮ−Ｐ２−ｌｕｃ）、および２つのＰＴＥＮ欠損性およびアンドロゲン非依存性前立腺上皮性悪性腫瘍細胞系統（ＰＣ３−ｌｕｃおよびＰＴＥＮ−ＣａＰ２−ｌｕｃ）をこれらの研究において使用する。ＰｒＥＣ細胞は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ−Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒから取得し、ＰｒＥＭＢ培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ−Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で培養した。ＲＷＰＥ−１は、ＡＴＣＣから取得し、ウシ下垂体抽出物の要素０．０５ｍｇ／ｍｌおよび５ｎｇ／ｍｌの上皮成長因子が補充されたケラチノサイト血清不含培地（Ｋ−ＳＦＭ；Ｇｉｂｃｏ）中で成長した。ＰＣ３−ｌｕｃ細胞は、Ｃａｌｉｐｅｒ／Ｘｅｎｏｇｅｎから取得した。ＰＣ３−ｌｕｃ細胞は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含むＨａｍ’ｓＦ１２Ｋ培地中で培養し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２条件下で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム（ＡＴＣＣ）を含有するように調整した。Ｈａｍ’ｓＦ１２Ｋ培地中での５世代継代後、ＰＣ３細胞を、１０％ウシ胎仔血清ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０に移した。ＰＴＥＮ−Ｐ２−ｌｕｃおよびＰＴＥＮ−ＣａＰ２−ｌｕｃ細胞は、親切にも、Ｄｒ．Ｈｏｎｇ  Ｗｕによって提供された。ＰＴＥＮ−Ｐ２−ｌｕｃおよびＰＴＥＮ−ＣａＰ２−ｌｕｃ細胞は、１０％ウシ胎仔血清、２５ｕｇ／ｍＬウシ下垂体抽出物、５ｕｇ／ｍＬウシインシュリン、および６ｎｇ／ｍＬ組み換えヒト上皮成長因子（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＤＭＥＭ中で培養され得る。
【０１４３】
動物
ＮＩＨ−ＩＩＩおよびＢ６雄マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入する。動物は、モアハウス医科大学の動物施設において、標準的飼育条件下、微生物遮断ケージ中で飼育し、維持する。米国学術研究会議−ライフサイエンス部門の実験動物資源ケア委員会によって提案されたガイドラインは、動物の苦痛を最小限にし、ストレスを無くすために順守されている。８〜１０週齢のマウスの右脛骨内に、１０６  ＰＴＥＮ−Ｐ２−ｌｕｃ（対応良性）、ＰＴＥＮ−ＣａＰ２−ｌｕｃ（前立腺ガン）、またはＰＣ３−ｌｕｃ細胞を注入する。細胞傷害性薬物またはＰＢＭナノ粒子の感受性に対するホルモンアブレーションの影響を評価するために、前立腺腫瘍検出後に別のグループのマウスを去勢する。
【０１４４】
ＰＢＭナノ粒子、ドセタキセル、およびオキサリプラチンによる処理
正味の増加量＞１０５フォトン／秒／ｃｍ２を有する原発腫瘍（非侵襲的イメージングによって測定される）の確立後、陽性および陰性対照マウスに、ＰＢＳ単独、１００μｌのＰＢＳ中、１２ｍｇ／ｋｇまたは０．１２ｍｇ／ｋｇのドセタキセル、および１２ｍｇ／ｋｇまたは０．１２ｍｇ／ｋｇのオキサリプラチンを毎週静脈注入する。マウスの体重は約２０ｇであり；したがって、マウスは、〜２４０μｇまたは〜２．４μｇの細胞傷害性薬物を受容する。実験群に、１００μｌのＰＢＳ中、０．４％  ｗ／ｗのスルホローダミン１０１酸塩化物（テキサスレッド蛍光色素；ＴｘＲｅｄ）単独、ＴｘＲｅｄ（０．４％  ｗ／ｗ）＋オキサリプラチン（４％  ｗ／ｗ）、またはＴｘＲｅｄ（０．４％  ｗ／ｗ）＋ドセタキセル（４％  ｗ／ｗ）を含有する、６０μｇの葉酸がコンジュゲートされたまたはコンジュゲートされていないＰＢＭナノ粒子を用いて、毎週静脈内に投与される（Ｐｒｅｗｅｔｔ  ａｔ  ｅｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３：３４３２−３４４０  ２００７）。ＰＢＭナノ粒子を用いて送達する場合、マウスは、１００倍未満の推薦された用量のドセタキセルまたはオキサリプラチン（すなわち、マウスあたり２４０μｇの代わりに２．４μｇ）を受容する。
【０１４５】
ＰＣａ腫瘍の進行、毒性、およびＰＫ／ＰＤの分析
８週間、毎週、２５ゲージｘ５／８”針を用いた腹腔内注入により、マウスに、ホタルルシフェリン１５０ｍｇ／ｋｇ（Ｃａｌｉｐｅｒ／Ｘｅｎｏｇｅｎ）を注入する。ＰＣ３−ｌｕｃ、ＰＴＥＮ−Ｐ２−ｌｕｃおよびＰＴＥＮ−ＣａＰ２−ｌｕｃ細胞系統の腫瘍の成長および転移を、ＩＶＩＳ  Ｃａｌｉｐｅｒ／Ｘｅｎｏｇｅｎイメージングシステムを用いてマウスを非侵襲的に撮像することにより評価する。個々の細胞系統が異なるコピーの活性ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子を有する可能性がある。その後、Ｐｅａｒｓｏｎのモーメント相関分析を用い、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ／Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して、腫瘍成長と転移との間のフォトン発現の増加の相互関係の有意性を調べる。屠殺時に血清を回収し、尿素Ｎ２、クレアチン、Ｐ、Ｃａ、Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ、重炭酸塩、アルカリホスファターゼ、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、コレステロール、総ビリルビン、総タンパク質、アルブミン、グロブリン、アルブミン／グロブリン比、グルコースおよびアミラーゼについて測定する。ドセタキセルおよびオキサリプラチンを、毎週回収した血清サンプルおよび屠殺したマウス臓器において、ＭＳＭ分析化学およびタンパク質プロファイリングコア設備（ＭＳＭ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｃｏｒｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙ）を用いる液体クロマトグラフィー質量分析によって定量する。
【０１４６】
免疫組織化学、顕微鏡法、および分析
パラフィンで包埋された、マウスから切除された腫瘍組織を切片化し（厚さ６μｍ）、正に荷電したスーパーフロストスライド（ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  ｓｌｉｄｅ）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に載せて、一晩乾燥させた。切片をキシレン中で脱パラフィンし、次に、一連のアルコール［１００％、９５％、および８０％エタノール／再蒸留Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）］で処理し、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中で再水和させる。切片をＴｒｉｓ−クエン酸標的回収溶液と一緒に、９５°Ｃ、２０分間インキュベートし、さらに２０分間冷却し、次いで、Ｔｒｉｓ−緩衝生理食塩水−Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．６）中で順次すすぐ。切片を３％過酸化水素と一緒に１２分間インキュベートし、内因性のペルオキシダーゼをブロックして、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中で洗浄する。ＰＢＳによる洗浄後、切片をタンパク質ブロッキング溶液［ＰＢＳ（ｖ／ｖ）中、５％正常ヒト血清／０．５％正常ヤギ血清］中で２０分間インキュベートする。ＤＡＫＯから取得されたシグナル増幅システムが、製造業者のプロトコールにしたがって使用される。簡潔に述べるならば、スライドを、以下：抗ＡＲ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｕｐｓｔａｔｅ）、抗カスパーゼ−３（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、抗カスパーゼ−９（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗ＣＤ４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗クロモグラニンＡ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、抗サイトケラチン５（Ｃｏｖａｎｃｅ）、抗サイトケラチン８（Ｃｏｖａｎｃｅ）、抗ＦｏｘＰ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＩＬ−１０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗Ｋｉ６７（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、および／または抗シナプトフィジン（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１：２００希釈一次抗体、ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体、ストレプトアビジン−ビオチン複合体、増幅試薬、およびペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で１５分間、その間に洗浄しながら、順次インキュベートする。陽性反応は、基質としてのジアミノベンジディン／過酸化水素（ＤＡＢ；Ｓｉｇｍａ）と一緒にスライドをインキュベートすることにより可視化される。次に、切片は、蒸留水を用いてすすぎ、Ｇｉｌｌ’ｓヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ）と共に対比染色し、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｏｕｎｔ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いてマウントする。対照サンプルを非特異的染色のために二次抗体単独に曝露する。
【０１４７】
前立腺全体の全横断面を、４０倍対物レンズを用いたＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＧＬシステム（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりスキャンし、次いで、可逆圧縮および同一の解剖学的領域における全ての免疫染色の評価を行う。ガラススライドからの画像をデジタル化した後、得られるデジタル画像を、標準化された、偏りのない、調整された結果のために、複雑なコンピューターアルゴリズムを用いて自動的に分析する。切片の形態計測分析を、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｐｌｕｓソフトウェア（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行う。自動イメージ分析は、ｉ）２つ以上の着色について面積あたりの強度を測定および定量するための陽性ピクセル数および色解析（例えば、カスパーゼ−９発現の増大；ｉｉ）個々の細胞についての膜関連染色の検出ならびに強度および完全性の定量のための免疫組織化学的膜イメージ分析（例えば、サイトケラチン５および８における変化）；ｉｉｉ）個々の核についての核染色を検出し、それらの強度を定量する免疫組織化学的核イメージ分析アルゴリズム（例えば、Ｋｉ６７＋の核の数の変化）。核は、それらの強度に基づいて、０、１＋、２＋、および３＋として分類される；ｉｖ）Ｍｉｃｒｏｍｅｔは、正常組織中の腫瘍細胞のマイクロ転移を検出するために具体的に設計される、のための、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｐｌｕｓアルゴリズムを用いて行われる。
【０１４８】
腫瘍組織および単一細胞の分離
原発腫瘍および臓器（例えば、肺、肝臓、および骨）を外科的に除去する。腫瘍の一部を、免疫組織化学評価のために、ホルムアルデヒド中に固定し、残りの部分を用いて、次のＡｍｎｉｓ  ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍおよびフローサイトメトリー分析のための単一細胞懸濁液を作製する。両端を切断した後、シリンジを用いて、骨髄における腫瘍を吸引する。肝臓および肺から二次性腫瘍を摘出する。腫瘍細胞の単一細胞懸濁液は、サンプルの繊維を解きほぐし、細胞を懸濁液中に放出させるために、外科用メスおよび針を用いて機械的に調製する。線維腫は、十分脱凝集していないか、または、細胞懸濁液が十分得られず、コラゲナーゼ（タイプＩＶ）を用いて一晩消化させる。回収された細胞の懸濁液をＲＰＭＩ中で洗浄する。５５〜７５％の不連続Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上の遠心分離により、腫瘍細胞をその他の細胞タイプから分離する。要するに、細胞混合物（５ｍｌ  ＲＰＭＩ中の細胞）は、７５％Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅの上に重層される５５％Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅの勾配の上部に配置され、７００ｘｇで２５分間、室温にて遠心分離される。５５％Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅの上部から腫瘍細胞を回収し、ＲＰＭＩ、ペニシリン５０ＩＵ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０ｐｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン５０ｐｇ／ｍｌ、ＨＥＰＥＳバッファー１０ｍＭ、およびＬ−グルタミン２ｍＭ（完全培地）中で洗浄する。
【０１４９】
結果の解釈
最適な（１０ｍｇ／ｋｇ／週）、しかし次善最適ではない（０．１ｍｇ／ｋｇ／週）、治療用量のドセタキセルまたはオキサリプラチンは、ＰＣ３−ｌｕｃおよびＰＴＥＮ−ＣａＰ２−ｌｕｃ腫瘍の退行をもたらすが、顕著に高い肝毒性および腎毒性（すなわち、上昇したＡＳＴ＆ＡＬＴ、低カルシウム血症および低血糖症）ももたらす。去勢はＰＣ３−ｌｕｃ腫瘍の成長を遅らないが、継続的な成長が続いて起こるＰＴＥＮ−ＣａＰ２−ｌｕｃ腫瘍の成長は初めは遅らせる。ビタミンＤの欠乏は、ドセタキセルおよびオキサリプラチン毒性の両方に対して有害な影響を及ぼすが、これらの薬物の腫瘍退行効果に対しては及ぼさない。通常の食事またはビタミンＤを欠乏する食事が与えられたマウスにおける、アンドロゲン感受性およびホルモン不応性の両方のＰＣａ成長が、ドセタキセルまたはオキサリプラチンを含有するＸＰｃｌａｄナノ粒子によって有意に阻害される。オキサリプラチンを含有するナノ粒子は、プラチナ系治療薬に対してＡＲＮｅｇ細胞がより影響を受けやすいことにより、ドセタキセルよりもＰＣ３−ｌｕｃに対してより効果的である。次善最適な用量の細胞傷害性薬物単独で有意な腫瘍退行を導く場合、その用量は、１．０ｍｇ／ｋｇと低く、ナノ粒子によって送達される等価の薬物用量１０μｇ／ｋｇと比較される。
【０１５０】
実施例６：  自然発生的な腫瘍およびＴｒｅｇ細胞の成長に対するＰＢＭナノ粒子の効果
自然発生的な腫瘍およびＴｒｅｇ細胞の成長に対するＰＢＭナノ粒子の効果は、ｃＰｔｅｎ−／−ＰＢｃｒｅ４＋ｌｕｃ＋またはｃＰｔｅｎ−／−ＰＢｃｒｅ４＋ｌｕｃ＋ｃａｖ１＋（去勢または非去勢）マウスを用いて調べられる。Ｃｒｅ遺伝子を含まないＰｔｅｎｆｌｏｘｅｄ／ｆｌｏｘｅｄｌｕｃ＋は、陰性腫瘍対照としての役割を果たし、雄ｃＰｔｅｎ−／−ＰＢｃｒｅ４＋ｌｕｃ＋またはｃＰｔｅｎ−／−ＰＢｃｒｅ４＋ｌｕｃ＋ｃａｖ１＋（去勢または非去勢）マウスを、ＰＣａ成長中に、マウスＰＩＮ（６週齢）、侵襲性腺ガン（＞９週齢）、ならびに１２週齢における転移リンパ節、肺、および、場合により、骨から毎週撮像する。９週齢後、腫瘍は、＜９週齢のマウスで検出される発光から正味の増加が１０５フォトン／秒／ｃｍ２となるまで進行する。一群のマウスを、アンドロゲン非依存性ホルモン不応性ＰＣａを研究するために去勢し、別の群は、アンドロゲンと共にＰＴＥNが介在するＰＣａの進行をさらに研究するために去勢しない。次いで、マウスに、０または１０ｍｇ／ｋｇのドセタキセルまたはオキサリプラチン、または、０．１ｍｇ／ｋｇの有効量のドセタキセルまたはオキサリプラチンにテキサスレッドを加えたもの、または薬物を含まずテキサスレッドを加えたものを含有する、葉酸でコーティングされたＰＢＭナノ粒子を、毎週静脈内投与する。マウスは、腫瘍の進行／退行をモニターするために毎週撮像される。陰性対照（生理食塩水ビヒクル処理単独）における腫瘍が１０８フォトン／秒／ｃｍ２ｇを超えるとき、各セットの群を屠殺する。新規なＰＢＭナノ粒子により処理された腫瘍における、前立腺腫瘍アポトーシス（カスパーゼ−３および−９）および、分泌系内腔的（ＣＫ８およびＡＲ）、基底的（ＣＫ５）、神経内分泌的（シナプトフィジンおよびクロモグラニンＡ））、および増殖的な（Ｋｉ６７）表現型における有病率における変化を調べるために、免疫組織化学による生体外分析を用いる。顕微鏡的分析および形態分析によって、前立腺腫瘍アポトーシスにおける処理の重要性および分泌系内腔的、基底的、神経内分泌的、および増殖的なＰＣａ細胞の発生頻度または生存における変化が測定される。さらに、末梢のリンパ節および腫瘍に関連するリンパ球の数および活性は分離され、精製されたＣＤ４＋Ｔ（ＣＤ３＋）細胞親和性およびＴｈ１（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＬＴ）、Ｔｈ２（ＩＬ−４およびＩＬ−１０）、Ｔｈ１７（ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７−Ｆ、ＩＬ−２２、およびＴＮＦ−α）、ならびにＴｒｅｇ（ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、および／またはＦｏｘＰ３）細胞発現頻度のフローサイトメトリー分析のために細胞内および表面が染色される。Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞増殖を評価するために、精製されたＴリンパ球の増殖を、ＦＲ４を用いる、または用いない、ＣＤ３とＣＤ２８の刺激（すなわち、抗体でコーティングされたプレート上でのインキュベーション）後に、測定する。
【０１５１】
ＣＤ４＋Ｔリンパ球の単離
マウスをＣＯ２吸入により屠殺する。原発腫瘍およびリンパ節を外科的に除去する。肝臓および肺から二次性腫瘍を摘出する。腫瘍細胞の単一細胞懸濁液は、サンプルの繊維を解きほぐし、細胞を懸濁液中に放出させるために、外科用メスおよび針を用いて機械的に調製する。線維腫は、十分脱凝集していないか、または、細胞懸濁液が十分得られず、コラゲナーゼ（タイプＩＶ）を用いて一晩消化させる。回収された細胞の懸濁液をＲＰＭＩ中で洗浄する。７５〜１００％の不連続Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上の遠心分離により、腫瘍細胞をその他の細胞タイプから分離する。要するに、細胞混合物（５ｍｌ  ＲＰＭＩ中の細胞）は、１００％Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅの上に重層される７５％Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅの勾配の上部に配置され、７００ｘｇで２５分間、室温にて遠心分離される。７５％および１００％Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅの界面からリンパ球を回収し、１０％熱不活化ウシ胎仔血清が補充されたＲＰＭＩ、ペニシリン５０ＩＵ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０ｐｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン５０ｐｇ／ｍｌ、ＨＥＰＥＳバッファー１０ｍＭ、およびＬ−グルタミン２ｍＭ（完全培地）中で洗浄する。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、製造業者のプロトコールにしたがって、我々のＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＡｕｔｏＭＡＣＳシステムを用いて陰性選択により単離する。
【０１５２】
リンパ球の細胞内サイトカインおよび表面染色
フルオロフォアをコンジュゲートさせたラット抗マウスＣＤ４、ＣＤ２５、ＦＲ４、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７Ａ−、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−２２、ＩＬ−４、ＴＧＦ−β１、ＩＬ−１０、およびＦｏｘＰ３（ＢＤ−ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用いて、免疫蛍光染色を行う。簡潔に述べるならば、原発腫瘍および転移部位から単離された１０５個のリンパ球を、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中、２％ウシ血清アルブミン）中で洗浄する。非特異的結合をブロッキングするために、氷上で３０分間、１０５個あたり０．５μｇのＦｃ  Ｂｌｏｃｋ（商標）（ＢＤ−ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）と共に細胞をインキュベートする。細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄することによりＦｃ  Ｂｌｏｃｋを除去し、細胞ペレットを、蛍光色素がコンジュゲートされたラット抗マウスＣＤ４、ＣＤ２５および／またはＦＲ４抗体を含む１０μｌの一次抗体および９０μｌのＦＡＣＳバッファーと共に４０分間、氷上でインキュベートする。これらの細胞をＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄することにより、過剰な抗体を除去する。細胞内マーカー（例えば、サイトカイン）および核マーカー（例えば、ＦｏｘＰ３）の検出のため、細胞内染色のために、これらの細胞をサポニン溶液中に再懸濁し、１ＸＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ(商標)溶液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）中で洗浄する。透過化後、細胞ペレットを、１０μｌの一次抗体（ラット抗マウス［ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＬＴ］または［ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、およびＩＬ−２２］または［ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１０］または［ＴＧＦ−β１、ＩＬ−１０、およびＦＯＸＰ３］）ならびに９０μｌのＦＡＣＳバッファーと共に、４０分間、氷上でインキュベートする。過剰な着色は、これらの細胞を３回、ＦＡＣＳバッファー中で洗浄することにより除去する。細胞を、７０μｌの固定剤（ＰＢＳ中、１％パラホルムアルデヒド）中に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析する。
【０１５３】
Ａｍｎｉｓ  ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍシステムを用いる生体外表現型分析
ＦＡＣＳ染色後のＣＤ４＋Ｔ細胞群またはＰＣａ腫瘍細胞の発生頻度の変化を、Ａｍｎｉｓ  ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍシステムを用いて分析する。このシステムは、フローサイトメトリーに基づく画像の取得ならびに６つのチャンネル（明視野、暗視野、および異なる蛍光色素に対する４つのチャンネル）による分析を可能にする。取得される画像は、Ｉｍａｇｅ  Ｄａｔａ  Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ＩＤＥＡＳ）を用いて分析される。この方法により、テキサスレッド陽性ナノ粒子が、ルシフェラーゼ陽性ＰＣａ細胞およびＦＲ４＋Ｔｒｅｇ細胞のアポトーシスと関連することが確認される。
【０１５４】
動物（自然発生的な生物発光前立腺腺ガン）
Ｐｔｅｎ対立遺伝子が条件付きで不活性化されているマウスならびにルシフェラーゼレポーターおよびカベオリン−１遺伝子が活性化されているマウスを作出するために、ＡＲＲ２ＰＢプロモーター駆動性の前立腺上皮細胞特異的Ｃｒｅ株ＰＢ−Ｃｒｅ４（株Ｂ６．Ｄ２−ＴｇＰｂｓｎ−ｃｒｅ／４Ｐｒｂ；ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＭＭＨＣＣ）、Ｂ６．１２９−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ２（ＡＣＴＢ−Ｌｕｃ）Ｔｙｊマウス（ＬＳＬ−Ｌｕｃマウス、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、および／またはＰＢｃａｖ１＋マウスを初めに繁殖させて、ＰＢｃｒｅ４＋ｌｕｃ＋およびＰＢｃｒｅ４＋ｌｕｃ＋ｃａｖ１＋マウスを作出する。次に、これらのマウスから雌のホモ接合性の子孫を、ホモ接合性のｌｏｘＰ導入Ｐｔｅｎ（株Ｃ．１２９Ｓ４−Ｐｔｅｎｔｍ１Ｈｗｕ／Ｊ；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）マウスを用いて繁殖させる。ＰＢｃｒｅ４＋ｃＰｔｅｎ−／−ｌｕｃ＋およびＰＢｃｒｅ４＋ｃＰｔｅｎ−／−ｌｕｃ＋ｃａｖ１＋を有する雄のホモ接合性の子孫マウスを、提案される投薬計画のために使用する。雄ＰＢｃｒｅ４＋ｃＰｔｅｎ−／−ｌｕｃ＋およびＰＢｃｒｅ４＋ｃＰｔｅｎ−／−ｌｕｃ＋ｃａｖ１＋子孫のＦ２世代が使用され、上述されたＰｏｗｅｒ’ｓ分析により、治療応答の重要性を評価するために、各グループにおける１０匹のｃＰｔｅｎ−／−Ｌマウスが必要となることが明らかとなった。非組み換え同腹子、例えば、Ｃｒｅ遺伝子を有しないＰｔｅｎｆｌｏｘｅｄ／ｆｌｏｘｅｄＬが対照としての役割を果たす。ホルモンアブレーションに対するＰｔｅｎ  ｎｕｌｌ  ＰＣａの応答を評価するために、別のセットのマウスを、アンドロゲンの使用中止に対する即時型（＜２週）応答および延長型（〜１０週）応答の分析のために、１６週の時点（侵襲的腺ガンが形成した時点）で去勢する。
【０１５５】
ＰＣａ腫瘍進行の分析
８週間、毎週、２５ｘ５／８”ゲージ針を用いた腹腔内注入により、マウスに、ホタルルシフェリン１５０ｍｇ／ｋｇ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を注入する。Ｐｔｅｎ遺伝子欠失についてホモ接合性であるにもかかわらず、個々のＰＢｃｒｅ４＋  ｃＰｔｅｎ−／−  ｌｕｃ＋およびＰＢｃｒｅ４＋ｃＰｔｅｎ−／−  ｌｕｃ＋  ｃａｖ１＋マウスは、異なるコピーのルシフェラーゼ（Ｌ）遺伝子を有し得る。トランスＬ遺伝子のコピー数が、ルシフェラーゼのためのＬ遺伝子の数が各実験において変化しないことを保証するために、多重ポリメラーゼ連鎖反応増幅およびサザンブロット分析により測定および確認される。マウスをＰＩＮの開始前（すなわち、＜６週齢）に撮像し、正味の増加＞１０５フォトン／秒／ｃｍ２だけで、ＰＢｃｒｅ４＋ｃＰｔｅｎ−／−ｌｕｃ＋およびＰＢｃｒｅ４＋ｃＰｔｅｎ−／−ｌｕｃ＋ｃａｖ１＋マウスにおけるＰＣａの開始を構成し得る。その後、Ｐｅａｒｓｏｎのモーメント相関分析を用い、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ／Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して、腫瘍成長と転移との間のフォトン発現の増加の相互関係の有意性を調べる。
【０１５６】
結果の解釈
最適な（１０ｍｇ／ｋｇ／週）、しかし次善最適ではない（０．１ｍｇ／ｋｇ／週）、治療用量の細胞傷害性薬物は、ＰＢｃｒｅ４＋ｃＰｔｅｎ−／−ｌｕｃ＋マウスには腫瘍の退行をもたらすが、ＰＢｃｒｅ４＋ｃＰｔｅｎ−／−ｌｕｃ＋ｃａｖ１＋マウスにはもたらさず、顕著に高い肝毒性および腎毒性（すなわち、上昇したＡＳＴ＆ＡＬＴ、低カルシウム血症および低血糖症）を伴う。去勢は腫瘍の成長を遅らせるが、「再発」し、より遅い速度ではあるが成長し続け得る。アンドロゲン感受性およびホルモン不応性の両方のＰＣａ腫瘍進行は、腫瘍中のカベオリン−１発現レベルにはかかわらず、ドセタキセルまたはオキサリプラチンを含むＰＢＭナノ粒子によって有意に阻害される。ドセタキセルおよびオキサリプラチン（単独でまたは封入されている）はまた、このモデルにおいて、より少ない転移病変をもたらす。ＣＫ５Ｐｏｓ基底細胞部分のＣＫ８ＰｏｓＡＲＰｏｓ腔内新生物および過形成が生じている間、Ｐｔｅｎの不活性化も神経内分泌分化（すなわち、シナプトフィジンＰｏｓ、クロモグラニンＡＰｏｓおよび増加するＡＲＮｅｇ）の拡大ももたらされる。神経内分泌細胞はＡＲＮｅｇであり、したがって、アンドロゲン非依存性であり；すなわち、ホルモン不応性ＰＣａは、アンドロゲン非依存性腫瘍細胞またはその後の遺伝子変異および去勢後の選択による細胞のサブ集団に由来することができた。この潜在的な分化は、オキサリプラチンまたはオキサリプラチンを含有するＰＢＭナノ粒子によって低減される。ＰＢｃｒｅ４＋ｃＰｔｅｎ−／−ｌｕｃ＋およびＰＢｃｒｅ４＋ｃＰｔｅｎ−／−ｌｕｃ＋ｃａｖ１＋マウスを繁殖させるための代替的モデルとして、発現ベクターによってカベオリン−１を過剰に発現するＰＴＥＮ−ＣａＰ２−ｌｕｃ腫瘍細胞を、Ｂ６マウスに移植する。
【０１５７】
実施例  ７：  ＰＴＥＮ−ＣＡＰ２−ＬＵＣ腫瘍の進行における全身毒性および免疫毒性
去勢および非去勢の野生型およびＸｐｃ−／−マウスにおける、ドセタキセル、オキサリプラチンおよびＰＢＭナノ粒子に起因するＰＴＥＮ−ＣａＰ２−ｌｕｃ腫瘍進行における全身毒性および免疫毒性が解明される。ＥＲＣＣ１変異個体における進行（骨転移）ＰＣａを模倣するために、Ｂ６およびＢ６．Ｘｐｃ−／−マウスの左脛骨にＰＴＥＮ−ＣａＰ２−ｌｕｃ細胞を注入する。腫瘍の進行は、非去勢マウスにおいて、我々のＣａｌｉｐｅｒ／Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ−１００イメージングシステムを用いて非侵襲的に追跡される。腫瘍が１０５フォトン／秒／ｃｍ２を超える蛍光を発するようになった後に、１セットのマウスを去勢し（すなわち、アンドロゲン不応を模倣するため）、第２のセットは去勢しない。次いで、マウスに、０または１０ｍｇ／ｋｇのドセタキセルまたはオキサリプラチン、または、０．１ｍｇ／ｋｇの有効量のドセタキセルまたはオキサリプラチンにテキサスレッドを加えたもの、または薬物を含まずテキサスレッドを加えたものを含有する、葉酸でコーティングされたＰＢＭナノ粒子を、毎週静脈内投与する。腫瘍の進行／退行を追跡するため、マウスを毎週撮像する。陰性対照（生理食塩水ビヒクル処理単独）における腫瘍が１０８フォトン／秒／ｃｍ２ｇを超えるとき、各セットの群を屠殺する。新規なＰＢＭナノ粒子により処理された腫瘍における、前立腺腫瘍アポトーシス（カスパーゼ−３および−９）および、分泌系内腔的表現型（ＣＫ８およびＡＲ）、基底的表現型（ＣＫ５）、神経内分泌的表現型（シナプトフィジンおよびクロモグラニンＡ））、および増殖的な（Ｋｉ６７）表現型における有病率における変化を調べるために、免疫組織化学による生体外分析を用いる。末梢のリンパ節および腫瘍に関連するリンパ球の数および活性は分離され、精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞親和性およびＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７細胞発現頻度のフローサイトメトリー分析のために細胞内および表面が染色される。具体的には、前述のようなＴｈ１／Ｔｈ２細胞の増殖を行わせるために、ＦＲ４を用いる、または用いない、ＣＤ３に加えたＣＤ２８の刺激後の、精製されたＴリンパ球の増殖である。毎週の生物発光撮像に加えて、血液化学および末梢リンパ球サブ集団をモニターし、Ｘｐｃ欠乏に関連し得る、腫瘍関連または薬物関連毒性を評価する。
【０１５８】
結果の解釈
最適な（１０ｍｇ／ｋｇ／週）、しかし次善最適ではない（０．１ｍｇ／ｋｇ／週）、治療用量のドセタキセルまたはオキサリプラチンは、Ｂ６およびＢ６．Ｘｐｃ−／−マウスの両方においてＰＴＥＮ−ＣａＰ２−ｌｕｃ腫瘍の退行をもたらした。腫瘍の成長におけるこの退行は、Ｂ６．Ｘｐｃ−／−マウスにおける、Ｂ６マウスと比較した場合よりも顕著に高い毒性（すなわち、上昇したＡＳＴ＆ＡＬＴ、低カルシウム血症および低血糖症）とも一致する。去勢はＰＴＥＮ−ＣａＰ２−ｌｕｃ腫瘍の成長を遅らせ、おそらくは停止させるが、Ｂ６およびＢ６．Ｘｐｃ−／−マウスの両方における継続的な成長が続いて起こる。Ｘｐｃの欠乏は、ＰＢＭナノ粒子（ドセタキセルまたはオキサリプラチンを含む）が介在するアンドロゲン感受性またはホルモン不応性ＰＣａ成長退行における悪化効果を有しない。重要なことに、ＰＢＭナノ粒子は、Ｂ６およびＢ６．Ｘｐｃ−／−マウスの両方において、毒性を有さずに腫瘍退行を介在する。これらの発見は、抗ガン剤溶液を受容する群と比較した場合の、より高い腫瘍バイオアベイラビリティー、または、ＰＢＭナノ粒子により送達されるドセタキセルおよびオキサリプラチンの局在化と合致する。ＰＴＥＮ−ＣａＰ２−ｌｕｃ腫瘍移植片に対する代替的モデルにおいて、ＮＩＨ−ＩＩＩ  Ｘｐｃ−／−は、ＰＣ３−ｌｕｃ異種移植片モデルを用いたこれらの実験を行うために確立されたマウスである。
【０１５９】
実施例  ８：  クルクミンが充填されたＰＢＭナノ粒子が介在する腫瘍の退行
ＰＢＭナノ粒子製剤、ＮＨＳ−活性化葉酸の合成、ＤＳＣ−活性化ＰＥＧ、および葉酸がコンジュゲートされたＰＥＧ
図１５に示されるように、クルクミンが充填されたＰＢＭナノ粒子を、熱吸収材である酸化ジルコニウム製の研磨ボールを保持する研磨ジャー中で形成する。研磨ジャーは、それ自身の軸の周りを回転し、ならびに、チャンバホイールの共通軸の周りを逆方向に回転する。このことが遊星型ボールの回転および、デンプン、ポリエチレングリコール、テキサスレッドおよびクルクミンを含有するマクロ粒子由来の粒子の研磨を引き起こす。
【０１６０】
最少有効量（ＭＥＤ）、最適投与スケジュール（ＯＤＳ）およびＰＢＭナノ粒子の安全性
ＭＥＤの決定および最適スケジュールを、ＰＣ３−ｌｕｃ細胞を脛骨内に注入された雄無胸腺ＮＩＨ−ＩＩＩマウスにおいて評価する（図１６）。投与は、正味の増加が＞１０５フォトン／秒／ｃｍ２となる原発腫瘍の確立（非侵襲的イメージングにより測定）後に開始した。ＭＥＤに関しては、マウス１匹あたり１０μｇ、２０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、２００μｇおよび４００μｇのクルクミン充填されたＰＢＭナノ粒子の投与量で処理、無処理、およびナノ粒子のみ（クルクミンなし）を、週に３回、２８日間、尾静脈注射により行った。最適投与スケジュールについては、３つの付加的なスケジュールを評価し、週３回の対照と比較した；毎日（１週に５回）、４日毎、および毎週、２８日間。すべてのマウスの体重を測定し、腫瘍の測定を毎週３回行って、ＰＢＭナノ粒子の毒性、有効性、および安全性を評価した。
【０１６１】
インビボ薬物動態学的研究
ルシフェラーゼ発現ヒトアンドロゲン不応（ＰＣ３−ｌｕｃ；ＡＲＮｅｇ）細胞系統を、６群（ｎ＝１０）の体重２５〜３０ｇの雄ヌードマウスの脛骨内に注入した。骨髄への腫瘍細胞の直接的な注入は、ＰＣａおよび骨細胞の相互作用の研究のため進行骨転移を模倣する目的で、自然発生的な転移への代替として開発された。第１群には２０ｍｇ／マウスのクルクミン懸濁液を投与し；第２群には２００μｇまたは最適ＭＥＤのクルクミン充填されたナノ粒子を葉酸がコンジュゲートした状態で投与する。第３群には２００μｇのクルクミン充填されたナノ粒子を、葉酸がコンジュゲートされない状態で投与する。第４群には２００μｇのクルクミン充填されたナノ粒子をテキサスレッド（生体外での粒子の細胞内での局在を追跡するために）＋葉酸でコンジュゲートされた状態で投与する。第５群には２００μｇのクルクミン充填されたナノ粒子をテキサスレッド＋葉酸がコンジュゲートされない状態で投与する。第６群にはＰＢＳのみを陰性対照として投与する。穏やかな麻酔下で、後眼窩神経叢から血液サンプル（０．５ｍｌ）を回収し、ヘパリン化した微量遠心チューブに入れる。各々のサンプリングの後、中心コンパートメントの容積や電解質の変化を防ぐために、１ｍｌのデキストロース標準生理食塩水を投与する。血液サンプルを４０００ｒｃｆにて１０分間、４℃で遠心分離することにより、血漿を分離する。２５μｌの血漿に、２５μｌの２．８％酢酸を添加し（クルクミンを安定化するため）、５０μｌの内部標準（ＩＳ）１７−b酢酸エストラジオールを添加して、２０秒間ボルテックスする。１０，０００ｒｃｆで１０分間遠心分離後、クルクミンおよびＩＳを含有する有機溶媒層を分離する。残る残渣を１２５μｌのメタノール中に再構築し、ＨＰＬＣで分析する。
【０１６２】
ＰＣａ腫瘍の進行および毒性の分析
毎週、マウスに、１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリン（Ｃａｌｉｐｅｒ社）を、２５ｘ５／８”ゲージ針を用いて腹腔内注入することにより注入する。腫瘍の成長および転移は、ＩＶＩＳ  Ｃａｌｉｐｅｒイメージングシステムを用いて、非侵襲的にマウスを撮像することにより調べる。フォトンの発現における増加、腫瘍の成長および転移における顕著性を試験するために、リビングイメージソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ社）を使用してピアソンの積率相関分析を用いる。屠殺時に血清を回収し、血液化学分析器（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ／Ｈｉｔａｃｈｉ  ９１１）を用いて、尿素窒素、クレアチン、Ｐ、Ｃａ、Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ、重炭酸塩、アルカリホスファターゼ、アラニントランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、コレステロール、総ビリルビン、総タンパク、アルブミン、グロブリン、アルブミン／グロブリン比、グルコースおよびアミラーゼを測定する。
【０１６３】
粒子サイズ、トポグラフィーおよびゼータ電位解析
粒子サイズは、Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いたダイナミックライトスキャッタリングにより、５回測定の平均をとることで測定し、ゼータ電位は、電場下での電気泳動的移動度に基づいて、３０測定の平均として測定する。ナノ粒子の表面形態は、ナノスコープソフトウェアを用いて、Ｎｉｋｏｎ  ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ  ２０００−Ｓ顕微鏡を接続した原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）（Ｖｅｅｃｏ  Ｂｉｏｓｃｏｐｅ  ＩＩ）により分析する。ナノ粒子の懸濁液をピペットチップの支援によってシリコンウエハー上に置き、空気乾燥する。顕微鏡は振動を減衰した状態で、測定は市販のピラミッド型Ｓｉ３Ｎ４チップ（Ｖｅｅｃｏ’ｓ）を用いて行う。０．１Ｎ／ｍのごくわずかな力定数でスキャンを行うためにカンチレバーを使用する。トレース方向におけるカンチレバーの増幅シグナルを表示することにより、画像が得られ、両シグナルの再トレース方向における高さシグナルが同時に記録される。
【０１６４】
ＰＢＭクルクミンナノ粒子のインビトロ放出の反応速度論
クルクミンがカプセル化されたＰＢＭナノ粒子（１００ｍｇ）を１０ｍｌのリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４中に分散させ、２０本の遠心チューブに小分けする。チューブを室温にて恒温水槽中で保持する。遊離のクルクミンは水中で完全に不溶性であり；従って、測定前の合間の時間に、この溶液を３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して、ナノ粒子から遊離した（ペレット化）クルクミンを分離する。遊離したクルクミンを１ｍｌのエタノール中に溶解し、４５０ｎｍの吸光度を分光光学的に測定する。クルクミンのエタノール溶液の標準曲線と以下の式：遊離（％）＝［クルクミン］ｒｅｌ／［クルクミン］ｔｏｔ×１００  ここで、［クルクミン］ｒｅｌはｔ時間において回収される遊離したクルクミンの濃度、［クルクミン］ｔｏｔは  ナノ粒子中に補足されているクルクミンの総量である。
【０１６５】
血清および肝臓の酵素レベルの分析は、選択される用量のいずれかが毒性であって、さらなる研究のためにこのような用量を低減するか否かの情報を提供する。有効性の試験のためには、以下の実施例で、許容できる最も高い投与量が用いられる。
【０１６６】
実施例９：ＰＣａに対して向けられた、クルクミンが充填されたＰＢＭナノ粒子のインビボ効率および細胞死のメカニズム
腫瘍の転移は、心腔内（骨転移、主として造骨性の特性を呈する）を通じて起こり、図１６に示されるように、ルシフェラーゼ発現ヒトアンドロゲン非依存性（ＰＣ３−ｌｕｃ；ＡＲＮｅｇ  ＰＴＥＮＮｅｇ）ＰＣａ細胞系統を雄無胸腺ＮＩＨ−ＩＩＩマウスの左心室へと注入することを通じて起こる。正味の増加が＞１０５フォトン／秒／ｃｍ２となり原発腫瘍が確立（非侵襲的イメージングにより測定される）後、陰性および陽性対照マウスに、ＰＢＳ単独または２０ｍｇ／マウスのクルクミン懸濁液単独を、毎週、静脈内注射で投与する。免疫組織化学による生体外分析を用いて、新規なＰＢＭナノ粒子により処理した腫瘍における、前立腺腫瘍アポトーシス（カスパーゼ−３および−９）および増殖的（Ｋｉ６７）表現型の変化を調べる。
【０１６７】
細胞系統および細胞培養
ＰＣ３−ｌｕｃ細胞はＣａｌｉｐｅｒ／Ｘｅｎｏｇｅｎ社より入手した。ＰＣ３−ｌｕｃ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含み、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム（ＡＴＣＣ）を含有するよう調整されたＨａｍ’ｓ  Ｆ１２Ｋ培地にて、３７°Ｃ、５％  ＣＯ２にて培養した。
【０１６８】
動物および処理
ＮＩＨ−ＩＩＩ雄マウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより購入される。動物は、モアハウス医科大学の動物施設において、標準的な飼育条件下、微生物遮断ケージ中で飼育し、維持する。正味の増加が＞１０５フォトン／秒／ｃｍ２となり原発腫瘍が確立（非侵襲的イメージングにより測定される）後、陰性および陽性対照マウスに、ＰＢＳ単独または２０ｍｇ／マウスのクルクミン懸濁液単独を、毎週、静脈内注射で投与する。実験群には、葉酸がコンジュゲートされた、またはコンジュゲートされていない、２００μｇのクルクミン（ｗ／ｗ）を充填されたナノ粒子、０．４％  ｗ／ｗのスルホローダミン１０１酸塩化物（テキサスレッド蛍光染料；ＴｘＲｅｄ）単独を含有するナノ粒子、葉酸でコンジュゲートされたＴｘＲｅｄ（０．４％ｗ／ｗ）＋クルクミン（４％ｗ／ｗ）、または葉酸でコンジュゲートされていないＴｘＲｅｄ（０．４％ｗ／ｗ）＋クルクミン（４％ｗ／ｗ）を１００μｌのＰＢＳ中に含むものを、毎週、静脈内投与する。すなわち、マウスは、ＰＢＭナノ粒子によって送達されるときには、１００倍少ないクルクミン（すなわち、マウスあたり２０ｍｇに代えて２００μｇ）を受容する。次いでピアソンの積率相関分析を用い、リビングイメージソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ社）を用いて、フォトンの発現における増加、腫瘍の成長および転移との相関関係を試験する。
【０１６９】
免疫組織化学、顕微鏡観察および分析
パラフィン包埋したマウス由来の腫瘍組織、腎臓、膵臓、および肝臓を切片化（６μｍ厚）する。標準的プロトコルを用いてスライドを処理し、抗カスパーゼ−３（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、抗カスパーゼ−９（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗ＦＲ２および抗ＦＲ４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）および／または抗Ｋｉ６７（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）について染色する。全ての横断面をスキャンし、４０倍の対物レンズを用いたＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＧＬ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、次いで、ロスレス圧縮および評価によって、全ての同一の解剖学的部位の免疫染色を行う。切片の形態学的分析は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｐｌｕｓ  ソフトウェア（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の助けを使って実行する。自動化された画像解析は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｐｌｕｓ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓを用いて、ｉ）陽性画素カウントおよび色彩解析；ｉｉ）免疫組織化学膜；ｉｉｉ）免疫組織化学核；およびｉｖ）Ｍｉｃｒｏｍｅｔについて実行する。
【０１７０】
腫瘍の成長を阻害する能力に基づいて、ＰＢＭナノ粒子および遊離のクルクミンの有効性を調べる。クルクミンを含有し、葉酸でコーティングされたＰＢＭナノ粒子を受容するマウスは、肝臓または腎臓毒性を起こすことなくマウスにおける腫瘍の退行をもたらし、心腔内チャレンジモデルにおいて、転移の病変がより少なくなる。遊離のクルクミン（カプセル化されていない）は本質的な活性が低く、吸収性も乏しく、および／または迅速に減少し体内から消去されて、バイオアベイラビリティーの低さをもたらす。葉酸でコーティングされた、ターゲット化されたＰＢＭナノ粒子の送達は、クルクミンの有効性ならびにバイオアベイラビリティーを向上させる。
【０１７１】
実施例１０：クルクミンナノ粒子による細胞死の分子メカニズムの特性判定
クルクミンは、前立腺ガン細胞の、インビトロでの増殖的な潜在能力を減少させ、アポトーシス的な潜在能力を増加させる、このことは主に、アポトーシスサプレッサータンパク質の変調、および、ＥＧＦ受容体により例示される成長因子受容体シグナリング経路との相互作用による。それはまた、ＰＣ−３およびＬＮＣａＰヒト前立腺ガン細胞において、インビトロにおけるマイクロフィラメント器官および細胞運動性を顕著に変化させる。この研究は、クルクミンナノ粒子が、前立腺ガン細胞において、細胞骨格のアクチンに対し、マイクロフィラメント組織や機能の変化を含む顕著な効果を与えることを立証する。このことは、クルクミンが化学的予防剤として、および、血管新生および転移の阻害剤として機能することによる、重要なメカニズムを示し得る。
【０１７２】
前立腺ガン細胞系統におけるＰＢＭナノ粒子の作用のメカニズム、および、遊離のクルクミンに関して先に報告されているものに対して比較される、ＰＢＭナノ粒子により影響される機能的経路。ガン細胞における、クルクミンの主たる細胞的なターゲットは、活性化された核因子ｋａｐｐａ  Ｂ（ＮＦ−κＢ）であり、この影響力が大きい転写因子を阻害することに起因する、クルクミンの多数の多面的な効果を伴う。ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合能力に関する検証を行うために、電気泳動での移動度のシフト（“ゲルシフト”）アッセイが用いられる。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）における、ＰＢＭナノ粒子が炎症前サイトカインを阻害する能力も、調査される。これらのサイトカインの多く（ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦα）は、血管新生の誘導を含む発ガンプロセスに関与している。遊離およびＰＢＭナノ粒子の両方で刺激されたＰＢＭＣのインキュベーションと、両薬物による投与量依存的なＩＬ−６の減少を試験するための、ＤＭＳＯおよび空のナノ粒子で処理した細胞と比較した、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦαのｍＲＮＡレベルの測定。さらに、クルクミンが充填されたナノ粒子が、カスパーゼ依存的または非依存的な（１または複数の）アポトーシスシグナルが介在する前立腺ガン細胞の死を引き起こすか否かを調べるために、インビトロの方法が用いられる。手短に言えば、アンドロゲン応答性（ＬＮＣａＰ）およびアンドロゲン不応ＰＣａ細胞（ＰＣ３）を、クルクミン単独（１０μＭ）ならびに、葉酸でコーティングされた、および、コーティングされていないクルクミンが充填された（１０ｎＭ）ナノ粒子の存在下で、２４、４８および７２時間、ＴＮＦおよびＦａｓ阻害がある状態、またはない状態で成長させる。アポトーシスおよび／またはネクローシスは、ＴＵＮＥＬおよびフローサイトメトリーにより測定する。ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロット分析も、プロアポトーシス性および生存促進性の分子、例えば、ＣＤ９５、ＦａｓＬ、ＴＮＦ、ＴＮＦ−Ｒ１、ＮＦ−κＢ、Ｂａｘ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ  ＸＬ、チトクロームＣ、ならびにカスパーゼ−９および−３の発現を測定するために実施される。
【０１７３】
細胞増殖アッセイ
細胞増殖アッセイを、異なる濃度のクルクミンナノ粒子および遊離クルクミンを用いて実施する。製造業者のプロトコールを用いて、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）細胞増殖キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して細胞増殖を測定する。
【０１７４】
アポトーシスアッセイ
アポトーシスアッセイを、製造業者の説明書にしたがって、Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）アポトーシスアッセイキット３（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて、処理した細胞のアネキシンＶ表面染色により実施する。
【０１７５】
ウェスタンブロット分析
簡潔に述べるならば、細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、ＲＩＰＡ溶解バッファー中に溶解させる。総タンパクをＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより調べる。等量のタンパクを載せて１５％ＳＤＳ−ポリアクリアルアミドゲルにより分離し、タンパク質をニトロセルロース膜に転写する。その膜を５％脱脂ドライミルクでブロックし、それぞれの１次および２次抗体によりプローブする。最終的な検出は、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  ＵＳＡ）を用いて実行する。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（ＮＩＨ）を用いてバンドを分析し、βアクチン対照により標準化する。対照の濃度を１とし、相対的な単位（ＲＵ）として対照に対する比率で処理の結果を表すものとする。遊離のクルクミンまたはＰＢＭナノ粒子で処理後に、細胞の運動性およびガン転移におけるその役割を試験するために、Ｉｍａｇｅ  Ｓｔｒｅａｍ分析を用いて、アクチンのポリマー化およびＰＣａ細胞系統における仮足形成を実行する。
【０１７６】
ＰＢＭナノ粒子におけるクルクミンのカプセル化は、クルクミンのバイオアベイラビリティーを向上させ、インビトロで１μＭの遊離のクルクミンと比較した場合に、１０ｎＭのクルクミンが充填されたＰＢＭナノ粒子は、ホルモン不応（ＰＣ３）ＰＣａ細胞系統のアポトーシス、ＮＦ−κＢの抑止、および前炎症サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦα）の下方制御を引き起こす。さらに、クルクミンを含有するナノ粒子は、ＬＮＣａＰに対し、より効果的である、なぜなら、クルクミンはアンドロゲン応答性ＴＲＡＩＬ耐性ガン細胞を感作し、ＰＢＭナノ粒子の標的化された送達はクルクミンのバイオアベイラビリティーを増加させ、さらに、クルクミンの有効性および、より高い細胞運動性（アクチンのポリマー化および仮足形成）を促進するからである。
【０１７７】
実施例１１：ペプチドをコンジュゲートさせた薬物含有ナノ粒子を用いた前立腺ガン細胞のターゲティング
シスプラチン（Ｃｉｓｐｔ）およびテキサスレッド（ＴＲ）を封入し、ガン細胞結合ペプチド（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ）または葉酸をコンジュゲートさせた、ポリカプロラクトンがコーティングされたナノ粒子を、上記方法を用いて調製した。ペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである：
ペプチド  Ｉ  −  ＨＴＩＲＹＤＷＨＦＴＡＲ  （配列番号１）
ペプチド  ＩＩ  −  ＦＲＰＮＲＡＱＤＹＮＴＮ  （配列番号２、ＥＰ１５３１１５９およびＺｉｔｚｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５，１１：１３９−１４６も参照されたい）。
ペプチド  ＩＩＩ  −  ＴＩＨＹＤＦＷＨＴＲＲＡ  （配列番号３）
ペプチド  ＩＶ  −  ＮＦＴＲＰＮＮＹＲＤＡＱ  （配列番号４）
前立腺腫瘍特異的ＰＢＭナノ粒子のサイズ分布。粒子サイズ分布は、０．１ｍｇ／Ｌ濃度（５％質量、１ｇ／ｃｍ３の密度と仮定）のナノ粒子を用いて、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＺｅｔａＳｉｚｅｒ  ＮＳ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用して測定した。図１７は、前立腺腫瘍特異的ＰＢＭナノ粒子の粒子サイズ分布を示す。
【０１７８】
前立腺腫瘍特異的なＰＢＭナノ粒子のゼータ電位。シスプラチン（Ｃｉｓｐｔ）およびテキサスレッド（ＴＲ）をカプセル化し、ガン細胞結合性のペプチド（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ）または葉酸をコンジュゲートしたポリカプロラクトンでコーティングされたナノ粒子のゼータ電位分布を、０．１ｍｇ／Ｌ濃度（５％質量、１ｇ／ｃｍ３の密度と仮定）のナノ粒子を用いて、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＺｅｔａＳｉｚｅｒ  ＮＳを使用して測定した。図１８は、前立腺腫瘍特異的ＰＢＭナノ粒子のゼータ電位を示す。
【０１７９】
ＰＢＭナノ粒子で処理したガン細胞のＴｕｎｅｌおよびＤＲＡＱ５染色。ＰＣ３細胞を２μＭのシスプラチン溶液単独、シスプラチンを含有するガン細胞結合ペプチド（Ｉ，  ＩＩ，  ＩＩＩ，  および  ＩＶ）または葉酸をコンジュゲートしたポリカプロラクトンでコーティングしたＰＢＭナノ粒子、またはコーティンングされていないナノ粒子で処理した。ＰＢＭ粒子を１時間吸着させて、非吸着の粒子をＰＢＳで５回洗浄することにより除去した。陽性対照としては、細胞をシスプラチン溶液（２０μＭ）でも処理した。次に、細胞を４８時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。次いで、細胞を固定し、およびＡｖｉｄｉｎｅ−ＦＩＴＣおよびＤＲＡＱ５を用いて、Ａｍｎｉｓ  ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ分析のために染色した。図１９は、ＰＢＭナノ粒子処理されたガン細胞のＴｕｎｅｌおよびＤＲＡＱ５染色を示す。核の形態計測によるアポトーシスの同定。Ｔｕｎｅｌ（ＦＩＴＣ）強度をＹ軸、核ＤＲＡＱ５強度をＸ軸状にプロットする。非アポトーシス事象は赤色に陰影を付けられ、真のアポトーシス事象は明るい緑色、および、形態的に正常な細胞であってアポトーシス的な核断片を伴うものは、暗い緑色に陰影が付けられる。
【０１８０】
ＰＢＭナノ粒子が介在するガンおよび正常細胞のアポトーシス。ＤＵ１４５  （前立腺ガン細胞系統）およびＰｒＥＣ（初代前立腺上皮細胞）細胞をシスプラチン溶液またはシスプラチンを含有し、ガン細胞結合性のペプチド（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ）または葉酸をコンジュゲートしたポリカプロラクトンでコーティングされたＰＢＭナノ粒子、またはコーティングされていないナノ粒子で処理した。細胞をシスプラチン溶液濃度（２０μＭ）および、異なるペプチドおよび葉酸を伴うナノ粒子濃度（２μＭ）で処理し、処理後、細胞を１時間インキュベートし、ＰＢＳで５回洗浄して、再び細胞を４８時間、３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートし、固定して、その細胞をアビジンＦＩＴＣおよび蛍光ＤＮＡ結合色素ＤＲＡＱ５で染色し、Ｉｍａｇｅ  ｓｔｒｅａｍ  ｓｙｓｔｅｍで撮像する。
【０１８１】
図２０は、ＰＢＭナノ粒子が介在するガンおよび正常細胞のアポトーシスを示す。アポトーシスの細胞は、ＩＤＥＡＳパッケージから、２つの標準的な画像をベースとした特徴：「Ａｒｅａ」および「Ｓｐｏｔ  Ｓｍａｌｌ  Ｔｏｔａｌ」を用いて同定された。凝縮されたアポトーシスの核は、生きている細胞と比較したときに、より低い「ｎｕｃｌｅａｒ  ａｒｅａ」値を有する。また、断片化されたアポトーシスの核の画像は、正常な核の単一の画像と比較して、より高い「ｓｐｏｔ  ｓｍａｌｌ  ｔｏｔａｌ」値を伴う、小さくてはっきりとした領域を呈する。シスプラチン溶液がＤＵ１４５および  ＰｒＥＣ細胞の両方のアポトーシスをもたらした一方で、標的化されたＰＢＭナノ粒子シスプラチン製剤は、ＤＵ１４５細胞のアポトーシスのみをもたらした。
【０１８２】
ＰＢＭナノ粒子の細胞核への転移ＴＵＮＥＬ染色。ＤＵ１４５（前立腺ガン細胞系統）細胞を、シスプラチン溶液またはシスプラチンおよびテキサスレッドを含有し、ガン細胞結合性のペプチド（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ）または葉酸でコンジュゲートしたポリカプロラクトンでコーティングされたＰＢＭナノ粒子、または、コーティングされていないナノ粒子で処理した。細胞をシスプラチン溶液濃度（２０μＭ）および、異なるペプチドおよび葉酸を伴うナノ粒子濃度（２μＭ）で処理し、処理後、細胞を１時間インキュベートし、ＰＢＳで５回洗浄して、再び細胞を４８時間、３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートし、固定して、その細胞をＴＵＮＥＬ−ＦＩＴＣおよび蛍光ＤＮＡ結合色素ＤＲＡＱ５で染色し、Ｉｍａｇｅ  ｓｔｒｅａｍ  ｓｙｓｔｅｍで撮像する。図２１は、ＰＢＭナノ粒子の細胞核への転移およびＴＵＮＥＬ染色を示す。テキサスレッドおよびＴＵＮＥＬ−ＦＩＴＣの間のＡｍｎｉｓ  ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  Ｂｒｉｇｈｔ  Ｄｅｔａｉｌ分析は、  葉酸、ペプチドＩ、ペプチドＩＩ、ペプチドＩＩＩ、およびペプチドＩＶでコーティングされたＰＢＭナノ粒子が核に対し共局在化することを示した。このことは、コーティングされていない粒子では観察されなかった。
【０１８３】
上記の記述は、本発明の実践の仕方について当業者に教示する目的のものであって、その記載を読む当業者にとって明白であるであろう全てのそれらの明白な修飾およびバリエーションを詳述することを意図しているものではない。しかしながら、全てのそれらの明白な修飾およびバリエーションは、以下の実施態様により定義される本発明の範囲内に包含されることが意図される。実施態様は、具体的にそれを打ち消す文脈がない限り、意図される目的に合致するために効果的である要素およびステップを任意の順序でカバーすることを意図される。
【図１】
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【図２】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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