(57)【要約】  本発明は、増殖因子を含有する組成物を得るための方法であって、放出された増殖因子を含有する多血小板血漿又は多血小板血漿上清を、補体が除去され、その中に存在する免疫グロブリンが低減されるように温度を上げるために加熱処理すること；並びに容易に輸送、取り扱い及び保存され、血液化合物での定期的又は長期的治療を促進する最終乾燥組成物を得るために当該血漿又は上清を凍結乾燥することからなる段階を含む方法に関する。当該最終乾燥組成物が再懸濁されると、その元の生物学的特性が維持されている新たな湿性組成物が得られることが示されている。
2014521629.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖因子を含有する組成物を得るための方法であって、
ａ）放出された増殖因子を含有する多血小板血漿又は多血小板血漿の上清が提供される工程、
ｂ）多血小板血漿又は多血小板血漿の上清を加熱処理に供する工程であって、その間に血液化合物の温度が上がる工程、
ｃ）多血小板血漿又は多血小板血漿の上清を凍結乾燥する工程、
を含み、加熱処理工程及び凍結乾燥工程が任意の順序で行われる上記方法。
【請求項２】
凍結乾燥がアジュバント添加を伴わずに行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
加熱処理が凍結乾燥の前に行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
加熱処理工程が、
多血小板血漿又は多血小板血漿の上清を、３７℃を超える温度に１分間以上供する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
多血小板血漿又は多血小板血漿の上清が、５０から６０℃の間の温度に２０から７０分間供されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
多血小板血漿又は多血小板血漿の上清が、温度５６℃に３０から６０分間供されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
凍結乾燥する工程が、
多血小板血漿又は多血小板血漿の上清を０℃より低い温度に凍結する工程、
多血小板血漿又は多血小板血漿の上清の第１の乾燥を、温度０℃以下及び高真空下、１分間以上で行う工程、
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
多血小板血漿又は多血小板血漿の上清が、−６０から−４０℃の間の温度に１時間以上凍結されること、
多血小板血漿又は多血小板血漿の上清の第１の乾燥が、−６０から−４０℃の間の温度及び０．０５から０．１５ｍＢａｒの間の圧力で行われること、
を特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
多血小板血漿又は多血小板血漿の上清の凍結が、温度−５０℃で２時間を超えて行われること、
多血小板血漿又は多血小板血漿の上清の第１の乾燥が、温度−５０℃及び圧力０．１ｍＢａｒで行われること、
を特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
凍結乾燥する工程が、
多血小板血漿又は多血小板血漿の上清の第２の乾燥を、温度０℃以上及び高真空下、１分間以上で行う付加的な工程を含むこと、
を特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
多血小板血漿又は多血小板血漿の上清の第２の乾燥が、＋１５から＋２５℃の間の温度及び０．０５から０．１５ｍＢａｒの間の圧力で行われることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
多血小板血漿又は多血小板血漿の上清の第２の乾燥が、温度＋２０℃及び圧力０．１ｍＢａｒで行われることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
凍結乾燥する工程が、
多血小板血漿又は多血小板血漿の上清の第２の乾燥を、温度０℃以上及び低真空又は非真空下、１分間以上で行う付加的な工程を含むこと、
を特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
多血小板血漿又は多血小板血漿の上清の第３の乾燥を、温度０℃以上及び高真空下、１分間以上で行う付加的な工程を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
多血小板血漿又は多血小板血漿の上清の第３の乾燥が、＋１５から＋２５℃の間の温度及び高真空下で行われることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
多血小板血漿又は多血小板血漿の上清の第３の乾燥が、＋２０℃及び高真空下で行われることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
多血小板血漿又は多血小板血漿の上清の第３の乾燥を、温度０℃以上及び低真空又は非真空下、１分間以上行う、付加的な工程を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
凍結乾燥前に行われる、多血小板血漿又は多血小板血漿の上清をろ過する付加的な工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
増殖因子を含有し、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液化合物から、細胞性血液成分（血小板、赤血球及び白血球）の存在下又は非存在下で増殖因子を含有する組成物を得るための方法に関する。本発明は、前記方法によって得られた増殖因子を含有する組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
患者血液から得られる増殖因子を含有する血液化合物の調製は、従来技術において周知である。増殖因子を含有する前記血液化合物は、非常に重要な生物学的特性を有することが、特に組織再生を誘発及び刺激すること、ある種の疾患及び障害において疼痛を低減すること並びに他の複数の使用に関して示されている。
【０００３】
例として、本発明の１名と同じ出願人による特許出願ＷＯ００４４３１４Ａ１は自己血血漿由来ゲルの調製のための方法に関し、ゲルは増殖因子に富み、患者自身の血液から得られる；前記方法は、同様に本出願人によるより最近の特許出願ＷＯ２０１０１３０８５１Ａ２において更新された。両方法は、患者の血液の遠心分離、多血小板血漿の分離及び血漿を活性化するため（すなわち、血漿血小板に含有される増殖因子が放出されるように）及びゲル様稠度を獲得するまで血漿を凝集させるための多血小板血漿への塩化カルシウムの添加などの共通工程を共有している。
【０００４】
別の公知の例は、特許ＥＳ２２２１７７０Ｂ２に開示されている。本特許は増殖因子に富み、非常に有益な生物学的特性を有する血液化合物の調製のための方法に関する。この件では化合物は液体形態である。具体的には化合物は、多増殖因子血漿（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｉｃｈ  ｐｌａｓｍａ）の凝集及び続く退縮を誘導した後に生じる上清液相から得られる前記多増殖因子血漿の上清である。本特許は、上清の種々の使用、特に（その液体稠度により）眼疾患及び障害の治療のための点眼薬としてのその使用も記載する。
【０００５】
増殖因子を含有する血漿ゲル、上清又は従来技術（使用されることが意図される適用に関わらず）において公知の方法により調製された一般的な任意の自己血化合物は、それらがその生物学的特性を失う前に、直ちに適用されなければならないという不利益を呈する。この必要性は、血液化合物が放出された増殖因子を含有する場合に特に決定的である。したがって、血液化合物は室温で長期間持続的には調製されず、タンパク質及び増殖因子の分解及び変性又は生成物の細菌性混入の可能性を回避するために即時（上清の場合、その調製の８時間以内）の適用が推奨される。
【０００６】
自己血化合物の即時使用の必要性は、それらが用いられてきた適用（組織再生、細胞培養、急性適用又は週ごと若しくは月ごとなどの適用）が前記即時使用と適合していたことから、今までのところ限定するものではなかった。しかし、投与間の時間間隔が短い化合物の持続的浸透又は適用を必要とする、増殖因子を含む自己血化合物の新規の潜在的適用が近年生じている。自己血化合物（ゲル、上清など）の使用は、それらが現在公知であるとおり、これらの新規適用では患者からの持続的な血液抽出を必要とする。この状況は明らかに、患者の生活の質及び慢性又は変性疾患の長期間治療の実現可能に非常に悪い影響を与える。
【０００７】
増殖因子を含有する血液化合物で治療されうるが、血液化合物が即時に用いられなければならず、保存できないことから現在治療されていない慢性又は変性疾患の例は多数ある：眼、中枢神経系及び変性関節疾患並びに増殖因子を含有する血液化合物の慢性又は反復投与を必要とするすべての疾患又は障害一般。
【０００８】
前述の疾患は、これだけに限らないが次のものがある：全身性エリテマトーデス、結合組織を侵し、免疫系が炎症及び組織損傷をもたらすことを特徴とし、詳細には抗体の臓器細胞への結合及び抗原−抗体複合体の形成に起因する慢性自己免疫疾患；シェーグレン症候群、外分泌腺を主に侵し乾燥を生じる全身性自己免疫疾患；皮膚筋炎、筋肉及び皮膚の炎症を生じる結合組織の疾患；関節リウマチ、慢性炎症（主に関節）を誘発し、種々の程度の変形及び機能的傷害を進行性に生じる全身性自己免疫疾患。現在、患者に定期的に適用できる場合には、増殖因子を含有する自己血組成物が最も効果的にこれらすべての疾患を遅延できることを示す研究がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、多血小板血漿又は多血小板血漿の上清から増殖因子を含有する組成物を得るための方法を示すことであり、方法は、長期間保存することができ、容易に輸送することができる組成物の調達を可能にし、それにより組成物は即時使用ではなく、任意の所与のときに又は必要と考えられるときの適用に好適である。したがって、本発明による方法は、慢性疾患の治療的アプローチにおいて定期的に用いられうる組成物の調達を患者からの定常的な血液抽出の必要なく可能にし、それにより患者の生活の質を改善する。
【００１０】
本発明の別の目的は、本発明による方法から得られた組成物がその生物学的特性をインタクトな状態で維持することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、本発明による方法から得られた組成物が自己免疫疾患の治療に関して具体的に示される改善された生物学的特性を維持することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の目的は、いくつかの工程を含む、増殖因子を含有する組成物を得るための方法である。
【００１３】
最初に、方法は、放出された増殖因子を含有する多血小板血漿又は多血小板血漿の上清が提供される工程を含む。多血小板血漿若しくは多血小板血漿の上清は、種々の種類であってよい：ＷＯ００４４３１４Ａ１、ＷＯ２０１０１３０８５１Ａ２に開示されている技術若しくは任意の他の適用可能な技術によって得られる増殖因子に富む血漿ゲル；多血小板血漿の凝集及び続く退縮を誘導した後に生じる液体成分として得られる上清であって、前記上清が例えば特許ＥＳ２２２１７７０Ｂ２に記載の技術により得ることができる上清；又は一般的な任意の多血小板血漿。
【００１４】
次に、本発明による方法は、多血小板血漿又は多血小板血漿の上清を加熱処理する工程を含み、その間に血液化合物の温度は上がる。加熱処理は、補体の除去を可能にし、免疫学的観点から交差反応において重要な役割を演じる、前記血漿又は上清中に最も頻繁に見出されるいくつかの免疫グロブリンの存在を低下させる。前記血漿又は上清中に存在する補体の前記除去又は十分な低減は、免疫系の疾患を治療するための生成物の適用性を大いに増強する。
【００１５】
加えて、本発明による方法は、実質的に湿気を含まない最終組成物を得るために血液化合物が凍結乾燥される工程を含む。
【００１６】
本発明により、前記血漿又は上清を加熱処理する工程及び凍結乾燥する工程がどの順序で実行されるかに差異はない、すなわちそれらは任意の順序で実施されてよい。
【００１７】
加えて、本発明による方法は、多血小板血漿又は多血小板血漿の上清をろ過する工程を含んでよい。前記工程は、凍結乾燥の前に実行されるが、凍結乾燥の直前である必要はない；例えば加熱処理が凍結乾燥の前に行われる場合、ろ過工程は加熱処理の前に行われる。
【００１８】
自己多血小板血漿又は自己多血小板血漿の上清から組成物を得るための方法は、伝統的な湿潤血漿（ｈｕｍｉｄ  ｐｌａｓｍａ）又は上清を超える多数の利点を表す最終乾燥組成物を可能にする。顕著な利点は、乾燥組成物が湿潤化合物（ｈｕｍｉｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（液体、より粘稠な若しくはあまり粘稠でないゲル又は任意の他の稠度）よりも取り扱い及び輸送が特に容易であることである。さらにそれが水を含有しない、長期間の安定性を有する生成物であることから、乾燥組成物は室温で維持することができ、無期限で保存することさえできる（結果としてその調製直後に用いられる必要がないことから、その使用は延長されうる）。加えて、実際に水を含んでいないことは汚染される危険性を排除する。乾燥組成物の別の利点は、その元の状態に迅速に回復されうることである；この方法は、日常的に用いられる任意の等張溶媒（例えば水）に乾燥組成物を単に再懸濁することによってその場で容易に行われうる。
【００１９】
本発明による乾燥組成物の付加的な利点は、投与される目的のために湿潤状態（ｈｕｍｉｄ  ｓｔａｔｅ）に戻すために乾燥組成物が再懸濁される場合に、前記再懸濁組成物が本発明による方法を受ける前の湿潤血漿又は上清の生物学的特性を保存していることであることが示されている。すなわち、再懸濁組成物は、生物学的活性を有する増殖因子の類似する濃度を維持している；加えて、再懸濁組成物によって誘導される細胞増殖、細胞遊走及び化学遊走並びに増殖因子の自己分泌及びパラクリン合成への効果は、湿潤血漿又は上清のものと同一である。この生物学的特性の保存は、とりわけ本発明による方法の際に生成物に適用される適切な温度の結果である。一方、方法の種々の工程において用いられる低い温度は、方法の際に生じる場合がある前記血漿又は上清に含有される揮発性成分の損失を最少に維持することを確実にする。低い温度は、細菌性混入の危険性の低さ及び調製物が酵素に関するいかなる改変も受けないことを確実にする（本発明の血漿又は上清の場合のように、酵素を含有する調製物がそれらへの損傷を回避するために低い温度で取り扱われることは有利である）。
【００２０】
本発明のその他の極めて有益な効果は、乾燥組成物、それゆえ最終再懸濁組成物が補体を含有しないか、又はその低減した量を含み、それにより再懸濁最終組成物が多数の自己免疫疾患を治療するために特に最適であるようになることである。
【００２１】
前述のすべてが乾燥組成物を非即時治療のため、例えば慢性障害（詳細には慢性自己免疫疾患）を定期的に治療するために用いられうるようにする。このように本発明により得られた乾燥組成物が保存される（例えば投与量で）場合、前記組成物での長期的治療は非常に簡便なプロセスとなる：慢性患者はその投与量を不安又は煩雑さなく何処へでも（例えば容器内で）携行できるようになる；投与に関して患者は単にそれを湿らせる又は再懸濁する必要があるだけであり、元の湿潤稠度（液体など）が回復すれば組成物の適応を開始する。
【００２２】
本発明による方法によって得られた組成物に関連するこれらすべての具体的な特徴及び利益は、次のとおり要約されうる：最適な安定性；多数の自己免疫疾患に対する具体的な効能；簡便、迅速及び完全な溶解性；無期限保存；外因来性有害因子に対する適切な保護並びに使用のための迅速な利用可能性。
【００２３】
本発明の別の目的は、増殖因子を含有する本発明による方法によって得られた組成物である。前記組成物は、上に記載のすべての利点を表す。
【００２４】
本発明の詳細は、例示的及び非限定的であることが意図される添付の図に記される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】加熱処理に供されていない従来の上清血漿液、及び本発明により加熱処理された上清で処置した３つの角膜における１平方センチメートルあたりの角膜実質細胞（ＨＣＫ）の数を示すグラフである。
【図２】本発明により加熱処理される前後での３名のドナーの上清におけるＰＤＧＦ−ＡＢレベルを示すグラフである。
【図３】本発明により加熱処理される前後での３名のドナーの上清における補体因子Ｄレベルを示すグラフである。
【図４】加熱処理に供されていない従来の上清血漿液、及び本発明により加熱処理された上清で処置した３つの角膜における１平方センチメートルあたりの線維芽細胞（ＨＣｏｎＦ）の数を示すグラフである。
【図５】凍結乾燥されていないもの及び本発明により凍結乾燥されたものの両方の３名のドナー由来の上清における増殖因子ＰＤＧＦ−ＡＢ及びＴＧＦ−β１の平均濃度を示すグラフである。
【図６】凍結乾燥されていないもの及び本発明により凍結乾燥されたものの両方の３名のドナー由来の上清における増殖因子ＶＥＧＦ及びＥＧＦの平均濃度を示すグラフである。
【図７】３つの上清液における（前記上清をろ過する前後での）１平方センチメートルあたりに含有される結膜線維芽細胞（ＨＣｏｎＦ）の量を示すグラフである。
【図８】ろ過された上清及びろ過されていない上清における増殖因子ＴＧＦ−β１の平均濃度を示すグラフである。
【図９】ろ過された上清及びろ過されていない上清における増殖因子ＩＧＦ−Ｉの平均濃度を示すグラフである。
【図１０】多増殖因子血漿の従来の上清（ＰＲＧＦ）、及び本発明によりろ過、加熱処理及び凍結乾燥された多増殖因子血漿（ＰＲＧＦ）の上清での７２時間処置後のヒト角膜の角膜実質細胞（ＨＣＫ）由来の初代細胞の数を示すグラフである。
【図１１】多増殖因子血漿の従来の上清（ＰＲＧＦ）、及び本発明によりろ過、加熱処理及び凍結乾燥された（続いて再懸濁された）多増殖因子血漿（ＰＲＧＦ）の上清での７２時間処置後のヒト結膜線維芽細胞（ＨＣｏｎＦ）由来の初代細胞の数を示すグラフである。
【図１２】多増殖因子血漿の従来の上清（ＰＲＧＦ）、及び本発明によりろ過、加熱処理及び凍結乾燥された（続いて再懸濁された）多増殖因子血漿（ＰＲＧＦ）の上清での処置後のヒト角膜の角膜実質細胞（ＨＣＫ）細胞培養物における遊走細胞の数を示すグラフである。
【図１３】多増殖因子血漿の従来の上清（ＰＲＧＦ）、及び本発明によりろ過、加熱処理及び凍結乾燥された（続いて再懸濁された）多増殖因子血漿（ＰＲＧＦ）の上清での処置後の結膜線維芽細胞（ＨＣＦ）細胞培養物における遊走細胞の数を示すグラフである。
【図１４】３種の異なる培地：加熱処理されていない活性化多血小板血漿、本発明により加熱処理されたが加熱処理の前に活性化されていない多血小板血漿及び活性化され次いで本発明により加熱処理された多血小板血漿において行われたヒト結膜線維芽細胞（ＨＣｏｎＦ）の初代細胞培養物の濃度を示すグラフである。
【図１５】前述の図の場合と同じ培地を用いたヒト角膜の角膜実質細胞（ＨＣＫ）の初代細胞培養物の濃度を示すグラフである。
【図１６】前述の２つの図に示す場合で細胞培養培地として用いた３つの組成物中のさまざまな増殖因子の濃度を示す数個のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の目的は、血液の細胞性成分（血小板、赤血球及び白血球）の存在下又は非存在下で増殖因子を含有する組成物を得るための方法であり、以下の工程を含む：
ａ）放出された増殖因子を含有する多血小板血漿又は多血小板血漿の上清、任意の適用可能な調製方法により調製される血漿又は上清が提供される工程。放出された増殖因子を含む血漿又は上清は、血小板に含有される増殖因子が放出され、凝集カスケードが、すべて適用可能な作用薬（塩化カルシウム、トロンビン、カルシウム塩、二価イオンを含有する他の作用薬若しくはそれらの組合せ又は凝集を活性化する任意の他の系）により活性化されたものであり、それによりタンパク質並びに、血漿性及び血小板関連増殖因子の両方に富む生成物を得る。前記血漿又は上清は、種々の種類であってよい：ＷＯ００４４３１４Ａ１、ＷＯ２０１０１３０８５１Ａ２に開示されている技術又は任意の他の適用可能な技術によって得られた増殖因子に富む血漿ゲル；血液血漿の凝集及び続く退縮を誘導した後に生じる液体成分として得られる上清、前記上清は例えば特許ＥＳ２２２１７７０Ｂ２に記載の技術により得ることができる；又は任意の所与の方法によって得られる一般的な任意の血漿若しくは上清。
ｂ）補体を除去し、免疫学的観点から交差反応において重要な役割を演じる、前記血漿又は上清中に最も頻繁に見出されるいくつかの免疫グロブリンの存在を低減させるために血漿又は上清に加熱処理を適用する工程。前記血漿又は上清中に存在する補体の前記除去又は十分な低減は、免疫系の疾患への血液化合物の適用性に大いに利益になる。血液化合物中の補体系の存在は、免疫系の過剰刺激及び多くの場合、血液化合物が治療されなければならない疾患それ自体の総体症状に関与することから有害作用を生じる場合があることは公知である。血漿補体は、補体（古典的補体経路）によって介在される自己免疫疾患（（エリトマトーデス、関節炎など）における有害反応又は同様に補体によって介在される慢性炎症性疾患からの有害反応の可能性などの多数の変化に関連する。加えて、補体因子の一部は炎症及び食作用を増大させ、細胞及び微生物の溶解を誘発する。次に、免疫グロブリン（Ｉｇ）において血液化合物中で最も頻繁に見出されるのは、免疫グロブリンＩｇＧであり、その主な生物学的機能のいくつかは、補体の固定、食作用の際に粒子をオプソニン化するときの食作用性細胞中のＦｃ受容体への結合、及び抗体介在細胞傷害の際のＮＫ細胞中の受容体への結合である。これが血漿又は上清中に存在する補体の除去又は十分な低減が、免疫系の疾患への後者の適用のためにそのように重要な利点である理由である。免疫系障害を有する患者の必要性に適合される最終組成物を得ることを加熱処理が可能にする。免疫グロブリンに関して、その全体又は部分的な低減は、種々のＩｇＧが急性拒絶プロセスのいくつかに関与することから、自己免疫疾患を有する患者のために重要であり、それにより製剤中のそれらの存在を低減する工程は、拒絶又は急性免疫反応の危険を伴わずに種々の種類の組織を治療するために役立つ。
ｃ）含有される水の大部分を除去し、前記血漿又は上清を湿潤状態から（長期間保存することを可能にする）非湿潤状態にするために血漿又は上清を凍結乾燥する工程。
【００２７】
実際に、前記血漿又は上清は最初に活性化され（すなわち加熱処理の前に放出された増殖因子を含有する）驚くべき効果を提供する。一方では、活性化及びさらなる加熱処理の後に得られる血漿又は上清は、凝集及びフィブリン塊を形成する実質的にインタクトな能力を有する。それらの顆粒包（ｇｒａｎｕｌａｒ  ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）から因子を遊離させるインタクトな能力も有する。実際、影響を受けないままである血漿又は上清の能力は、図１４、１５及び１６のデータから理解されうる。図１４は、３種の異なる細胞培養培地：加熱処理されていない活性化多血小板血漿（「ＰＲＧＦ」と表示）、本発明により加熱処理されたが加熱処理の前に活性化されていない多血小板血漿（「ＰｏｓｔＡｃｔ」と表示）及び活性化され、次いで本発明により加熱処理された多血小板血漿（「ＰｒｉｏｒＡｃｔ」と表示）で行われたヒト結膜線維芽細胞（ＨＣｏｎＦ）の初代細胞培養物の濃度を示すグラフである。示されるとおり、細胞増殖は、本発明の組成物（「ＰｒｉｏｒＡｃｔ」）が用いられる場合と活性化及び非加熱処理血漿（「ＰＲＧＦ」）が用いられる場合とで実質的に同じである。反対に細胞増殖は、最初に加熱処理され、次いで活性化される多血小板血漿（「ＰｏｓｔＡｃｔ」）が細胞培養培地として用いられる場合には実質的にゼロである。図１５は、同様のグラフを示すが、ヒト角膜の角膜実質細胞（ＨＣＫ）を増殖させる。次に、図１６は、ＥＬＩＳＡによって測定する、さまざまな組成物中に存在するさまざまな増殖因子の濃度を示す。示すとおり増殖因子濃度は、活性化され、次いで本発明により加熱処理された多血小板血漿（「ＰｒｉｏｒＡｃｔ」と表示）においてと、活性化及び非加熱処理血漿（「ＰＲＧＦ」）においてとでは実質的に同じである。反対に、最初に加熱処理され、次いで活性化される多血小板血漿（「ＰｏｓｔＡｃｔ」）は全体的により悪化した増殖因子濃度を示す。
【００２８】
凍結乾燥は、好ましくはアジュバントの添加（トレハロースなどの糖、化学成分など）を伴わずに行われる。アジュバントは、多くの物質の凍結乾燥のために必要であるが、血漿又は上清がそれらの補助なしで凍結乾燥されうること及び、いかなるアジュバントも添加せずに凍結乾燥を実施することがより高い生体適合性を有する最終乾燥組成物（及び患者への適用のための再懸濁組成物）をもたらすことが示されている。例えばいくつかの研究は、トレハロースなどのある種のアジュバントが細胞増殖に悪影響を有することを実証している。
【００２９】
加えて、方法は、前記血漿又は上清を加熱処理する工程及び凍結乾燥する工程を実施する順序が原則的に定義されていないことを特徴とする。それにもかかわらず、血漿又は上清を加熱処理する工程を凍結乾燥する工程の前に実施することは、予め加熱処理された生成物が本プロセスの目的（補体及びＩｇＧの低減）であるそのすべての有益な特性及び潜在力を凍結乾燥される前に含有していることから好ましい。凍結乾燥が保存及び保管される化合物の能力を改善するために実行されることを考慮することは重要であり、したがって、それが最初の段階ではなく最終段階を構成することは好ましい。このように、要約すると、第１の目的は生成物を最適化することであり、第２が保存及び保管するための能力を改善することである。
【００３０】
加熱処理は、前記血漿又は上清の温度を適切に（好ましくは温度３７℃を超えて１分間以上）上げることを可能にする任意の処理であってよい。例えば，前記血漿又は上清は、前記温度の水浴に前記期間入れることができる。３７℃は身体の温度であり、補体及び免疫グロブリンがそれらの最大生物学的活性段階にある温度である事実を踏まえると、血漿又は上清が前述の成分のいくつかの除去を達成するために３７℃を超えて加熱されることは本発明により好ましい。
【００３１】
前記血漿又は上清を５０から６０℃の間の温度（好ましくは５６℃）に供することは、この温度で補体成分が最適に分解され、生成物中に含有されるタンパク質及び増殖因子の保護が最大化されることから特に有利である。したがって、この範囲より低い温度がインキュベーションの際に前記血漿又は上清中の補体が除去されることを確実にしないことが示されている。一方、６０〜６５℃を超える温度でのインキュベーションは、血漿又は上清に含有される増殖因子及びタンパク質の変性を生じる。これに加えて、前記血漿又は上清が前記温度に２０から７０分間（好ましくは３０から６０分間の間）供されることは好ましく、この時間は補体成分が最適に分解され、生成物に含有されるタンパク質及び増殖因子の保護も最大化される。
【００３２】
凍結乾燥する工程は、好ましくは次の副工程：
−  前記血漿又は上清を０℃より低い温度に凍結する工程；
−  温度０℃以下及び高真空下、１分間以上で当該血漿又は上清の第１の乾燥を、当該血漿又は上清に含有される遊離水の大部分が蒸発される方法で実施する工程；
−  任意選択で、当該血漿又は上清の第２の乾燥を温度０℃以上及び高真空、低真空又は非真空下、１分間以上で、当該血漿又は上清に含有される未凍結水を最終湿度が１％未満に達するまで蒸発させる工程によって最終痕跡量の水蒸気さえ除去される方法で実施する工程；
−  任意選択で、当該血漿又は上清の第３の乾燥を温度０℃以上及び高真空、低真空又は非真空下、１分間以上で、生成物中に残るいかなる残存湿度も蒸発を通じて除去され、その湿度含有量が低減され、最終生成物の安定性を改善する方法で実施する工程
を含む。
【００３３】
当該血漿又は上清を−６０から−４０℃の間の温度（好ましくは−５０℃）に１時間以上（好ましくは２時間以上）凍結することは、この範囲外の温度（特により低い凍結温度）が当該血漿又は上清が凍結の結果としてその生物学的特性を失う危険性を増大させることから特に有利である。これに加えて、血液化合物が均一に凍結される（この均一性が凍結乾燥の安定性及び生成物の生物学的特性が変化しないことを保証する）ことを確実にするために少なくとも１時間、血液化合物が凍結されることは好ましい。
【００３４】
第１の乾燥に関して、−６０から−４０℃の間の温度及び０．０５から０．１５ｍＢａｒの間（好ましくは−５０℃及び０．１ｍＢａｒ）でそれを実施することは特に有利である。低い温度範囲は、生成物が昇華のプロセスの際に完全に凍結され、初期生成物の物理的、化学的及び生物学的特性を保存することを確実にし、それにより凍結乾燥生成物のタンパク質の潜在的変性を回避するために本明細書により用いられる。プロセスの正確な期間は、凍結乾燥される生成物の量に依存し、適切な乾燥のために必要である氷の完全な昇華を確実にするために確立されている。
【００３５】
第２の乾燥に関して、＋１５から＋２５℃の間の温度及び０．０５から０．１５ｍＢａｒの間（好ましくは＋２０℃及び０．１ｍＢａｒ）でそれを実施することは、これらの条件が蒸発を通じて生成物に残るいかなる残存湿度も除去し、最終生成物の安定性を改善する目的でその湿度含有量を１％未満に低減することを可能にすることから特に有利である。
【００３６】
最後に、第３の乾燥を＋１５から＋２５℃の間の温度及び高真空下（好ましくは＋２０℃及び高真空下）で実施することは特に有利であり、それによりいかなる最終痕跡量の湿度も除去され、均一性及び安定性に関して最適な特徴を有する最終生成物を提供する。
【００３７】
本発明による方法は、凍結プロセスの均一性及び凍結乾燥プロセスの安定性に影響を与えうる（結果として乾燥組成物の再懸濁に悪影響を有する可能性がある）高分子量成分、血小板凝集物又はフィブリン残渣の存在を除去又は回避するために、当該血漿又は上清をろ過する付加的な工程を含みうる（凍結乾燥生成物の溶解速度が、それを構成する粒子の大きさに反比例し、乾燥組成物に含有される大きな粒子が溶解を遅延させ、不可能にする場合さえあることも考慮されるべきである）。この付加的なプロセスが行われる場合、当該血漿又は上清のろ過は凍結乾燥の前に（直前である必要はないが）実行される。また、当該血漿又は上清をろ過する工程は、例えば方法の最初に当該血漿又は上清が既にろ過されている場合は、必要ではない。
【００３８】
方法の実施例
方法の実施例は以下に説明され、増殖因子に富む上清から得られる乾燥組成物からの最終再懸濁組成物の調製を示し、そして本発明による方法の工程を行う。
【００３９】
最初に、多増殖因子血漿は、患者由来の血液抽出物から調製される。この目的のために血液は、先行技術において公知の種々の画分に分離されるように遠心分離される。次に、血漿画分はＰＴＤ（血漿抽出デバイス（Ｐｌａｓｍａ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅ））を用いて９ｍｌ分取チューブに抽出される。血漿画分は次いで活性化される；活性化は、分取チューブに含まれる血漿容量を推定すること及び続いて血漿１ミリリットルあたり５０μｌのＰＲＧＦ（登録商標）Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（塩化カルシウムに基づく活性化因子）を添加することによって実行される。血漿活性化は、血漿に含有される血小板から増殖因子が放出されることと同等である。
【００４０】
第二に上清は、多増殖因子血漿から得られる。この目的のために、既に活性化された多増殖因子血漿は３７℃の加熱ブロックで１時間から１時間半、フィブリン塊が完全に退縮されるまでインキュベートされる。次いで分取チューブを、２つの主な目的のため（形成されたフィブリン塊を沈殿させるため、及び塊中に保持されている可能性がある上清の可能な最大容量を抽出するため）に１０００ｇで１０分間遠心分離される。その後遠心チューブを試料の完全な無菌性を確実にして開封できる層流キャビネット内に入れる。放出された上清は鈍筋肉内用針（ｂｌｕｎｔ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｎｅｅｄｌｅ）を装着した１０ｍｌシリンジで回収される。次いで針はシリンジから外され、０．２２μｍ  ＰＶＤＦフィルターが装着され、上清がろ過される。ろ過プロセスの際にフィルター付きシリンジをマルチドーズディスペンサーに連結し、デバイスあたりろ過した上清１ｍｌを入れる。最後に容器は密封される。
【００４１】
次に、本発明による方法は、ろ過した液体上清から最終乾燥組成物を得るために遂行される。ろ過した上清を含む複数用量容器は予め５６℃に加熱した水浴に３０から６０分間導入されることによって加熱処理される。この後、容器は直ちにそれらを凍結させるために−５０℃に冷却された凍結乾燥機に上清の容量に応じて２から８時間の間、試料が均質に凍結するまで入れられる。次に、第１の乾燥が−５０℃及び０．１ｍＢａｒ、最長２４時間で行われる。次いで第２の乾燥が＋２０℃及び０．１ｍＢａｒで最長６時間行われ、＋２０℃及び高真空下、最長１２時間で行われる第３の乾燥が続く。得られた生成物は、均一で均質な粉末であり、若干緻密であると考えられ、水性溶液に接触した場合に簡便且つ迅速に再懸濁されうる（すなわち溶解し、上清の元の稠度に回復する）。
【００４２】
最終乾燥組成物は、適用されるために再懸濁される必要がある。したがって、医師又は患者は、最終乾燥組成物の投与量を予め定義した容量の滅菌蒸留水に容器内で浸し、次いで再度湿潤化した又は液体の最終組成物を得るために乾燥組成物が完全に溶解されるまで容器を振盪する必要がある。この最終組成物は、加熱処理及び凍結乾燥される前の元の湿潤上清のすべての生物学的特性を維持している。前記最終組成物は、次いで患者に、例えば点眼薬として直接適用されうる。
【００４３】
実験結果
以下は、多増殖因子血漿の上清及び本発明により得られた組成物に行われた方法について実行された３つの実験研究の結果を記載する。前記結果に達した技術的結論も以下に詳述される。
【００４４】
１．最終乾燥上清の生物学的効果及び増殖因子レベルへの加熱処理温度の影響
前述のとおり、本発明により適切な温度で行われる加熱処理は、上清の生物学的特性の保存を可能にする。換言すると、最終乾燥組成物は最初の液体上清と同じ特性を実質上表す。
【００４５】
これに関連して、眼表面細胞培養物に行われた実験は、加熱処理プロセス（水浴５６℃、３０分間）が角膜の角膜実質細胞（ＨＣＫ）、結膜線維芽細胞（ＨＣｏｎＦ）及び角膜の上皮細胞の増殖へ上清の生物学的効果に影響しなかったことを示した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養での前記細胞の増殖は、加熱処理されていない上清の内の１つに類似していた。これは、加熱処理に供されていない従来の上清血漿液、及び本発明により加熱処理された上清でそれぞれ処置された３つの角膜における１平方センチメートルあたりの角膜実質細胞（ＨＣＫ）の数を示す図１において観察されうる。加熱処理に供されていない従来の上清血漿液への応答における、及び本発明により加熱処理された上清への応答における角膜の角膜実質細胞の増殖は、実質的に同等である。同じことが結膜線維芽細胞及び角膜上皮細胞を研究した場合にも生じた。
【００４６】
従来の上清血漿液及び本発明により加熱処理された上清に存在する増殖因子レベルについても分析が実行された。血小板因子ＰＤＧＦ−ＡＢ及びＴＧＦ−β１に関して、加熱処理が最終上清中のそれらの存在に影響しなかったことが示された。ＩＧＦ−Ｉなどの血漿増殖因子の分析された濃度が適用された温度によって変化しなかった一方で、免疫グロブリンＧ及びＭ（ＩｇＧ及びＩｇＭ）などの他の作用薬の値は９％及び１３％それぞれ低減されることがさらに示された。上清が加熱処理に供された場合に補体因子Ｄが完全に消失することも示された。これらの結果の例は、続く図において見ることができる。例えば図２は、本発明により加熱処理される前後での３名のドナーの上清におけるＰＤＧＦ−ＡＢレベルを示す。観察されるとおり、前記レベルは実質的に一定のままである（最初の上清ではそれらはわずかに減少し、２つめではそれらは一定のままであり、３つめではそれらはわずかに増加していた）。一方図３は、本発明により加熱処理された前後での３名のドナーの上清における補体因子Ｄレベルを示す。観察されるとおり、因子Ｄは最初の上清液には存在したが、加熱処理された上清では完全に消失していた。
【００４７】
２．上清の生物学的効果及び増殖因子レベルへの凍結乾燥プロセスの影響
本記載において既に述べたとおり、本発明により行われた凍結乾燥のプロセスは、上清の生物学的特性の保存を可能にする。換言すると最終乾燥組成物は、最初の液体上清と同様の特性を実質上表す。
【００４８】
血漿上清を凍結乾燥することの、結膜線維芽細胞及び角膜実質細胞の増殖における効果を実験作業の間分析した。結果は、研究された３つの上清（３名のドナーそれぞれ）のいずれでも凍結乾燥が前記細胞型の増殖に影響しなかったことを示した。このことは、例えば、加熱処理に供されていない従来の上清血漿液、及び本発明により加熱処理された上清で処置した３つの角膜における１平方センチメートルあたりの線維芽細胞（ＨＣｏｎＦ）の数を示す図４において見ることができる。線維芽細胞の存在は、比較的一定のままであった（最初の上清ではそれらはわずかに減少し、２つめではそれらはわずかに増加し、３つめではそれらはわずかに減少していた）。
【００４９】
従来の上清血漿液及び本発明により凍結乾燥された上清に存在する増殖因子レベルについても分析が実行された。増殖因子レベルは凍結乾燥後に変化しなかったことが示された。これは、ＴＧＦ−β１、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＶＥＧＦ及びＥＧＦなどの血小板因子並びにＩＧＦ−Ｉ又は補体因子Ｄなどの血漿因子の両方に適用された。例として、図５は、３名のドナーの上清（凍結乾燥も加熱処理もされていない又は本発明により凍結乾燥及び加熱処理されたかのいずれかであった）における増殖因子ＰＤＧＦ−ＡＢ及びＴＧＦ−β１の平均濃度を示し、前者の濃度がわずかに増加した一方で後者の濃度はわずかに減少したが依然として顕著に高いままであることが観察されうる。同様に図６は、３名のドナーの上清（凍結乾燥も加熱処理もされていない又は本発明により凍結乾燥及び加熱処理されたかのいずれかであった）における増殖因子ＶＥＧＦ及びＥＧＦの濃度を示し、両方の因子の濃度はわずかに減少したが高い値のままであることが観察されうる。
【００５０】
３．上清の生物学的効果及び増殖因子レベルへのろ過プロセスの影響
上清をろ過することが上清に望ましくない生物学的効果を有する可能性があるか又は反対に生物学的特性が未変化のままであるかについても研究した。
【００５１】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究は、上清をろ過するプロセスが結膜線維芽細胞、角膜実質細胞及び角膜上皮の増殖への生物学的効果を変化させなかったことを示した。
【００５２】
図７は、例えば、３つの上清液において上清をろ過した前後での１平方センチメートルあたりに含有される結膜線維芽細胞（ＨＣｏｎＦ）の量を示す。観察されうるとおり、ろ過した上清での結膜線維芽細胞の増殖はろ過されていない上清におけるものと同様であった。
【００５３】
ろ過された上清及びろ過されていない上清において測定された増殖因子のレベルに関して、それらが分析された３つの上清（すべての場合と同様に３名の異なるドナー由来）において類似していたことが示された。図８は、ろ過された上清及びろ過されていない上清におけるＴＧＦ−β１増殖因子の平均濃度を示し、上清のろ過が前記濃度を顕著に変化させなかった証拠を提供している。この事実は、血小板α顆粒に含有される増殖因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ又はＴＳＰ−１）にだけではなく、ＩＧＦ−Ｉ（１型インスリン様増殖因子）又はエンドスタチンなどの血漿に存在する増殖因子にも適用される。これに関連して図９は、ろ過を実施した前後での３名のドナーの上清における増殖因子ＩＧＦ−Ｉの平均濃度を示す。観察されうるとおり、ＩＧＦ−Ｉレベルは３つすべての場合において実質的に一定のままであった。
【００５４】
４．ろ過、加熱処理及び凍結乾燥する工程を含む本発明による方法の種々の上清特性への影響
図１０は、多増殖因子血漿の従来の上清（ＰＲＧＦ上清）、及び本発明によりろ過、加熱処理、凍結乾燥及び続いて再懸濁されたＰＲＧＦ上清での７２時間処置後のヒト角膜の角膜実質細胞（ＨＣＫ）由来の初代細胞の増殖のグラフを示す。観察されうるとおり、初代細胞の数は本発明による方法によって得られた上清においてわずかに高かった。
【００５５】
図１１は、従来のＰＲＧＦ上清、及び本発明によりろ過、加熱処理、凍結乾燥及び続いて再懸濁されたＰＲＧＦ上清での７２時間処置後のヒト結膜線維芽細胞（ＨＣｏｎＦ）由来の初代細胞の増殖のグラフを示す。前述のグラフと全く同じように、初代細胞の数は本発明による方法によって得られた上清においてわずかに高かった。
【００５６】
図１２は、従来のＰＲＧＦ上清、及び本発明によりろ過、加熱処理、凍結乾燥及び続いて再懸濁したＰＲＧＦ上清の適用の、ヒト角膜の角膜実質細胞（ＨＣＫ）由来の初代細胞培養物の遊走への効果を示す。観察されうるとおり、初代細胞の数は、従来の上清が増殖培地として用いられる場合にほんのわずかに高い。
【００５７】
図１３は、従来のＰＲＧＦ上清、及び本発明によりろ過、加熱処理、凍結乾燥及び続いて再懸濁されたＰＲＧＦ上清の適用の、ヒト結膜線維芽細胞（ＨＣｏｎＦ）由来の初代細胞培養物（２４時間細胞インキュベーションを実行した後）の遊走への効果を示す。観察されうるとおり、両方の場合における挙動はよく似ていたが、本発明によって得られた上清の結果はいくらか良かった。
【００５８】
要約すると、実験結果のすべてのグラフを分析した後に、最終再懸濁組成物の挙動及び特性は（わずかな重要ではない変動を伴って）即時適用を必要とする従来の上清の挙動及び特性に非常に類似していることが結論されうる。したがって、乾燥した再懸濁可能な生成物を得るために湿潤上清をろ過、加熱処理及び凍結乾燥する事実は、一方で生成物の特性に影響を与えず、一方それは本明細書に列挙する多数の利益を提供することが結論されうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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