(57)【要約】本発明は式Ａ−ａ’：ａ−Ｓ−ｂ：ｂ’−Ｂ：Ｘ（ｎ）の結合剤に関し、ここでＡならびにＢは一価結合剤であり、ここでａ’：ａならびにｂ：ｂ’は結合対であり、ここでａ’およびａはｂのｂ’への結合に干渉せず、逆もまた同じであり、ここでＳは少なくとも１ｎｍの長さのスペーサーであり、ここで：Ｘはａ’、ａ、ｂ、ｂ’またはＳの少なくとも１つに共有結合的にまたは結合対を介してのどちらかで結合した官能性部分を示し、ここで（ｎ）は整数であり、少なくとも１であり、ここで−は共有結合を表し、ここでそのリンカーａ−Ｓ−ｂは６〜１００ｎｍの長さを有する。そのような結合剤を生成する方法およびその特定の使用も開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
Ａ−ａ’：ａ−Ｓ−ｂ：ｂ’−Ｂ：Ｘ（ｎ）
の結合剤であって、
ここでＡならびにＢは一価結合剤であり、
ここでａ’：ａならびにｂ：ｂ’は結合対であり、ここでａ’およびａはｂのｂ’への結合に干渉せず、逆もまた同じであり、
ここでＳは少なくとも１ｎｍの長さのスペーサーであり、
ここで（：Ｘ）はａ’、ａ、ｂ、ｂ’またはＳの少なくとも１つに共有結合的にまたは結合対を介してのどちらかで結合した官能性部分を示し、
ここで（ｎ）は整数であり、少なくとも１であり、
ここで−は共有結合を表し、そして
ここでリンカーａ−Ｓ−ｂは６〜１００ｎｍの長さを有する；
前記結合剤。
【請求項２】
スペーサーＳが１〜９５ｎｍの長さである、請求項１に記載の結合剤。
【請求項３】
結合対がロイシンジッパードメイン二量体およびハイブリダイズする核酸配列からなる群から選択される、請求項１または２に記載の結合剤。
【請求項４】
結合対が両方ともハイブリダイズする核酸配列であり、該結合対ａ’：ａおよびｂ：ｂ’の異なるハイブリダイズする核酸配列が互いにハイブリダイズしない、請求項１〜３のいずれかに記載の結合剤。
【請求項５】
スペーサーＳが核酸である、請求項１〜４のいずれかに記載の結合剤。
【請求項６】
スペーサーＳが核酸であり、両方の結合対ａ’：ａならびにｂ：ｂ’も核酸である、請求項１〜５のいずれかに記載の結合剤。
【請求項７】
スペーサーＳが核酸であり、両方の結合対ａ’：ａならびにｂ：ｂ’が核酸であり、一価結合剤ＡおよびＢが核酸である、請求項１〜６のいずれかに記載の結合剤。
【請求項８】
Ｘが標識基、結合基およびエフェクター基からなる群から選択される官能性部分である、請求項１〜７のいずれかに記載の結合剤。
【請求項９】
官能性部分Ｘがａ、ｂ、またはＳに結合している、請求項１〜８のいずれかに記載の結合剤。
【請求項１０】
官能性部分ＸがスペーサーＳに結合している、請求項１〜９のいずれかに記載の結合剤。
【請求項１１】
官能性部分ＸがスペーサーＳに共有結合している、請求項１〜１０のいずれかに記載の結合剤。
【請求項１２】
官能性部分ＸがスペーサーＳにハイブリダイズする核酸を介して結合している、請求項１〜１０のいずれかに記載の結合剤。
【請求項１３】
一価結合剤ＡおよびＢがポリペプチド、好ましくはモノクローナル抗体のＦａｂ断片である、請求項１〜３または請求項８〜１２のいずれかに記載の結合剤。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の結合剤の、目的の分析物の検出における使用。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれかに記載の結合剤の、免疫アッセイにおける使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は式Ａ−ａ’：ａ−Ｓ−ｂ：ｂ’−Ｂ：Ｘ（ｎ）の結合剤に関し、ここでＡならびにＢは一価結合剤であり、ここでａ’：ａならびにｂ：ｂ’は結合対であり、ここでａ’およびａはｂのｂ’への結合に干渉せず、逆もまた同じであり、ここでＳは少なくとも１ｎｍの長さのスペーサーであり、ここで：Ｘはａ’、ａ、ｂ、ｂ’またはＳの少なくとも１つに共有結合的にまたは結合対を介してのどちらかで結合した官能性部分を示し、ここで（ｎ）は整数であり、少なくとも１であり、ここで−は共有結合を表し、ここでそのリンカーａ−Ｓ−ｂは６〜１００ｎｍの長さを有する。そのような結合剤を生成する方法およびその特定の使用も開示する。
【背景技術】
【０００２】
二重特異性抗体または二重特異性結合剤は一般に、それらが１個の抗原上の２個の異なるエピトープに、または２個の異なる抗原に同時に結合することができるという意味で独特である。この特性は、従来のモノクローナル抗体では不可能であった新規の療法および診断戦略の開発を可能にする。二重特異性二重結合剤の、例えば二重特異性抗体の形態の大きなパネル（ｐａｎｅｌ）が発展しており、それはこれらの分子における強い科学的ならびに商業的興味を反映している。
【０００３】
抗原上の単一のエピトープに対して向けられているモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、通常はポリクローナル抗血清の結合活性よりも低い親和性で結合する。しかし、同じ抗原上の異なるエピトープに対して向けられたｍＡｂの特定の対は、その抗原により有効に、そしてその対応する個々のｍＡｂ単独の親和性の合計よりも大きい結合活性で結合することができる。
【０００４】
しかし、相乗作用を示すｍＡｂの対に関する、または化学的に架橋した二重特異性Ｆ（ａｂ’）２に関する結合活性定数は、個々のｍＡｂに関する親和性定数よりも１５倍まで大きいにすぎず、それはその反応物の間の理想的な組み合わせに期待される理論的な結合活性よりも著しく低い(Cheong, H. S., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 173 (1990) 795-800)。これに関する１つの理由は、最適な相乗作用のためには（高い結合活性をもたらす）相乗的結合に関わる個々のエピトープ／パラトープ相互作用が互いに関して特定の方向で配向されていなければならないことである可能性がある。
【０００５】
二重特異性抗体の生成は、例えば国際公開第2004/081051号において記述されている。この出願では、そのそれぞれが標的構造物の表面上に位置する異なるエピトープに対する結合特異性を有する２個の抗体を含む二重特異性抗体（ＢＡｂ）が開示されている。特異性における望まれる向上を達成するため、それぞれがそのそれぞれのエピトープに関して比較的低い結合親和性を有する２種類のＭＡｂが用いられる。生成されたＢＡｂは、結合相互作用の累積的性質のため、標的組織に関して高い結合活性を提供するが、それらを生成するために用いられる個々のＭＡｂのより低い親和性のため、交差反応する非標的組織に関してはるかに低い親和性を有する。これらの二重特異性抗体の生成は極めて複雑であり、例えば精巧な化学的カップリングおよび精製工程を必要とする。
【０００６】
二重特異性モノクローナル抗体は極めて興味深い新規の療法的様式でもある。広いスペクトルの二重特異性抗体の形態が設計および開発されてきた(例えばFischer, N. and Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14を参照)。そのような二重特異性療法用モノクローナル抗体は、例えば化学的架橋により、適切に設計されたタンパク質ドメインの相互作用により、完全に組み換えにより、等で得ることが出来る。明らかに、その結合剤のそれぞれの組み換えによる設計および望まれるヘテロ二量体の生化学的に類似したホモ二量体からの慎重な精製は、直面している課題の一部である。
【０００７】
Neri, D. et al. (1995)により最初に記述されたキレート性組換え抗体（ＣＲＡｂ）は、非常に高い親和性の抗体の種を表し、ここで同じ抗原分子上の重複しないエピトープに特異的な２個のｓｃＦｖが柔軟なリンカーポリペプチドにより連結される。最初の原型を作られ（ｍｏｄｅｌｅｄ）設計された抗鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）ＣＲＡｂは、２個のｓｃＦｖ抗体の間の距離にまたがる（ｓｐａｎ）ために１８アミノ酸のリンカーポリペプチドを用いて、結果として得られた親和性の増進は、様々な生物物理的方法により示されるように、その２個のｓｃＦｖのより優れた方よりも１００倍に至るまで高いことが続いて示された（Neri, D. et al., J. Mol. Biol. 246 (1995) 367-373）。
【０００８】
Wright M. J.およびDeonarain M. P.(Molecular Immunology 44 (2007) 2860-2869)は、キレート性組換え抗体の生成のためのファージディスプレイライブラリーを開発した。そこで記述されたライブラリーは、その２個の結合物の間において様々な長さのリンカーペプチドを有する二重結合剤を提供するような方法で考えられた（ｃｏｎｓｔｒｕｅｄ）発現ベクターを用いている。最高の結合剤、すなわちそのようなリンカーの最適な長さを有する二重結合剤の選択が、それにより促進される。しかし、それぞれのそのようなキレート性組換え抗体のために、（“結合剤１−（様々な長さの）リンカー−結合剤２”ポリペプチドの発現を可能にする）組み換え発現系の完全なライブラリーを考え（ｃｏｎｓｔｒｕｅｄ）なければならない。
【０００９】
上記で不十分な様式で概説したように、二重特異性二重結合剤の製造は依然として極めて困難であり、それらの二重特異性結合剤のそれぞれを個々に同定、解釈（ｃｏｎｓｔｒｕｅ）および生成するために精巧な技法を必要とする。そのような二重特異性結合剤を頻繁に誘導体化する、例えば標識する必要があることがさらなるレベルの複雑性を加えてさえいる。
【００１０】
ここで、驚くべきことに、先行技術から既知の不都合の少なくとも一部は本発明において開示される新規の二重特異性結合剤により克服され得ることが分かっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第2004/081051号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Cheong, H. S., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 173 (1990) 795-800
【非特許文献２】Fischer, N. and Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14
【非特許文献３】Neri, D. et al., J. Mol. Biol. 246 (1995) 367-373
【非特許文献４】Molecular Immunology 44 (2007) 2860-2869
【発明の概要】
【００１３】
本発明は式Ａ−ａ’：ａ−Ｓ−ｂ：ｂ’−Ｂ：Ｘ（ｎ）の結合剤に関し、ここでＡならびにＢは一価結合剤であり、ここでａ’：ａならびにｂ：ｂ’は結合対であり、ここでａ’およびａはｂのｂ’への結合に干渉せず、逆もまた同じであり、ここでＳは少なくとも１ｎｍの長さのスペーサーであり、ここで：Ｘはａ’、ａ、ｂ、ｂ’またはＳの少なくとも１つに共有結合的にまたは結合対を介してのどちらかで結合した官能性部分を示し、ここで（ｎ）は整数であり、少なくとも１であり、ここで−は共有結合を表し、ここでそのリンカーａ−Ｓ−ｂは６〜１００ｎｍの長さを有する。
【００１４】
さらに、そのような結合剤を作製する方法およびそのような剤の例えば免疫アッセイの手順における使用を開示する。
その新規結合剤の、特に免疫学的検出手順における使用も記述および特許請求する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１  抗ｐＩＧＦ１−Ｒ二重結合剤の組み立ての効率を評価する分析的ゲル濾過実験。線図ａ、ｂおよびｃは、個々の二重結合剤構成要素（フルオレセイン−ｓｓＦａｂ’  １．４．１６８、Ｃｙ５−ｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびリンカーＤＮＡ（Ｔ＝０）；Ｆａｂ’は一本鎖オリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたＦａｂ’断片を意味する）の溶離プロフィールを示す。線図ｄは、二価結合剤を形成するのに必要な３種類の構成要素を１：１：１のモル比で混合した後の溶離プロフィールを示す。より太い（一番下の）曲線は、ｓｓＦａｂ’タンパク質またはリンカーＤＮＡそれぞれの存在を示す２８０ｎｍにおいて測定された吸光度を表す。ｂ）およびｄ）におけるより細い一番上の曲線（４９５ｎｍにおける吸光度）はフルオレセインの存在を示し、ａ）におけるより細い一番上の曲線およびｄ）における中央の曲線（６３５ｎｍにおける吸光度）は、Ｃｙ５の存在を示す。単一の二重結合剤の構成要素の溶離体積（ＶＥｓｓＦａｂ’  １．４．１６８  約１５ｍｌ；ＶＥｓｓＦａｂ’  ８．１．２  約１５ｍｌ；ＶＥリンカー  約１６ｍｌ）の反応混合物の溶離体積（ＶＥ混合物  約１２ｍｌ）との比較は、二重結合剤組み立て反応が成功であったことを示す（収率：約９０％）。溶離された二重結合剤に相当する主な２８０ｎｍのピークは、４９５ｎｍおよび６３５ｎｍのチャンネルにおける主なピークとうまく重なっており、二価結合剤に相当するピーク中にｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８の両方が存在することを証明している。
【図２】図２  Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）実験のスキーム。模式的および例示的に、溶液中の２種類の結合分子を示す：Ｔ０−Ｔ−Ｄｉｇ（リンカー１６）、二価結合剤およびＴ４０−Ｔ−Ｄｉｇ（リンカー１５）、二価結合剤。これら両方の二価結合剤はそれらのリンカーの長さにおいてのみ異なる（２個のハイブリダイズする核酸配列の間に追加のＴを有しない中心のジゴキシゲニン化された（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｙｌａｔｅｄ）Ｔ対４０個の追加のＴ（中心のＴ−Ｄｉｇのそれぞれの側に２０個）を有する中心のジゴキシゲニン化されたＴ）。さらに、ｓｓＦａｂ’断片８．１．２および１．４．１６８を用いた。
【図３】図３  １００ｎＭ二価結合剤（Ｔ４０−Ｔ−Ｄｉｇ  ｓｓＤＮＡリンカー、すなわちリンカー１５上にハイブリダイズしたｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８からなる）の固定されたペプチドｐＩＧＦ−１Ｒとの相互作用を、１００ｎＭ  ｓｓＦａｂ’  １．４．１６８または１００ｎＭ  ｓｓＦａｂ’  ８．１．２の同じペプチドに対する結合特性と比較して示す、３つの速度論を重ねてプロットしたＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）。最も高い結合性能は二重結合剤コンストラクトを用いて得られ、これはその二重結合剤の協同的結合作用が標的ペプチドｐＩＧＦ−１Ｒに対する親和性を増大させることを明確に示している。
【図４】図４  Ｔ４０−Ｔ−Ｄｉｇ  ｓｓＤＮＡリンカー、すなわちリンカー１５上にハイブリダイズしたｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８からなる二価結合剤の固定されたペプチドｐＩＧＦ−１Ｒ（リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒ）、ＩＧＦ−１ＲまたはｐＩＲ（リン酸化されたインスリン受容体）との相互作用を示す３つの速度論を重ねてプロットしたＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。最も高い結合性能はｐＩＧＦ−１Ｒペプチドで得られ、これは二重結合剤の協同的結合作用が標的ペプチドｐＩＧＦ−１Ｒに対する特異性を例えばリン酸化されたインスリン受容体ペプチド（ｐＩＲ）と比較して増大させることを明確に示している。
【図５】図５  Ｔ４０−Ｔ−Ｄｉｇ  ｓｓＤＮＡリンカー、すなわちリンカー１５上にハイブリダイズしたｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８からなる１００ｎＭ二価結合剤ならびにリンカーＤＮＡを有しない１００ｎＭ  ｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８の混合物の相互作用を示す２つの速度論を重ねてプロットしたＢｉａｏｒｅ（商標）センサーグラム。最高の結合性能は二価結合剤を用いてのみ得られ、一方でリンカーを有しないｓｓＦａｂ’の混合物は、これらのｓｓＦａｂ’の合計濃度が２００ｎＭであったという事実にも関わらず、観察可能な協同的結合作用を示さない。
【図６】図６  Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）サンドイッチアッセイの概略図。このアッセイは、両方の抗体のリン酸化されたＩＧＦ−１Ｒペプチドへのエピトープ接近可能性を調べるために用いられた。＜ＭＩｇＧＦｃｙ＞Ｒはマウス抗体Ｍ−１．４．１６８を捕捉するために用いられたウサギ抗マウス抗体を示す。次いでＭ−１．４．１６８を用いてｐＩＧＦ−１Ｒペプチドを捕捉する。Ｍ−８．１．２が最終的にＭ−１．４．１６８、ペプチドおよびＭ−８．１．２からなるサンドイッチを形成する。
【図７】図７  二次抗体８．１．２のｐＩＧＦ−１Ｒペプチドに対する、これがＢｉａｃｏｒｅ（商標）チップ上で抗体１．４．１６８により捕捉された後の結合シグナル（太線）を示すＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。その他のシグナル（細い線）は対照シグナルである：一番上から一番下に向かって、それぞれ５００ｎＭの８．１．２、５００ｎＭの１．４．１６８；５００ｎＭの標的と無関係の抗体＜ＣＫＭＭ＞Ｍ−３３−ＩｇＧ；および５００ｎＭの標的と無関係の対照抗体＜ＴＳＨ＞Ｍ−１．２０−ＩｇＧの線を示す。これらの対照にいずれにおいても結合事象を検出することはできなかった。
【図８】図８  センサー表面上のビオチン化二重結合剤を示す、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイの概略図。フローセル１（＝ＦＣ１）（示していない）上で、アミノ−ＰＥＯ−ビオチンを捕捉させた。ＦＣ２、ＦＣ３およびＦＣ４上で、増大するリンカーの長さを有する二価結合剤を固定した（ＦＣ２上の二重結合剤（Ｔ０−ｂｉ＝１個の中央のＴ−Ｂｉのみ）およびＦＣ４上の二重結合剤（Ｔ４０−ｂｉ＝１個の中央のＴ−Ｂｉならびに上流および下流それぞれの２０個のＴ）をそれぞれ示す）。分析物１：そのペプチドの右側の末端においてＭ−１．４．１６８  ｓｓＦａｂ’エピトープを含有するＩＧＦ−１Ｒペプチド（一番上の線）−このペプチドはリン酸化されていないため、Ｍ−８．１．２  ｓｓＦａｂ’ホスホ−エピトープは存在しない；分析物２：Ｍ−８．１．２  ｓｓＦａｂ’ホスホ−エピトープ（Ｐ）およびＭ−１．４．１６８  ｓｓＦａｂ’エピトープを含有するｐＩＧＦ−１Ｒペプチド（２番目の線）；分析物３：交差反応するＭ−８．１．２  ｓｓＦａｂ’ホスホ−エピトープを含有するがＭ−１．４．１６８  ｓｓＦａｂ’に関するエピトープは含有しない、ｐＩＲペプチド（３番目の線）。
【図９】図９  二重結合剤実験の速度論データ。ｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８を有するＴ４０−Ｔ−Ｂｉリンカー二重結合剤（＝図中のＴ４０）は、ｐＩＧＦ−１Ｒに対して、ｐＩＲ（ｋｄ＝３．７０Ｅ−０２／ｓ）と比較した場合に１３００倍低い解離速度（ｋｄ＝２．７９Ｅ−０５／ｓ）を示す。
【図１０】図１０  Ｔ４０−Ｔ−Ｂｉ二重結合剤のｐＩＧＦ−１Ｒペプチド（リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒペプチド）に対する濃度依存的測定を示すＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。そのアッセイの構成は図８において示されている通りである。ｐＩＧＦ−１Ｒペプチドの濃度系列は、３０ｎＭ、１０ｎＭ、２×３．３ｎＭ、１．１ｎＭ、０．４ｎＭ、０ｎＭで注入された。対応するデータが図９の表において示されている。
【図１１】図１１  Ｔ４０−Ｔ−Ｂｉ二重結合剤のＩＧＦ−１Ｒペプチド（リン酸化されていないＩＧＦ−１Ｒペプチド）に対する濃度依存的測定を示すＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。そのアッセイの構成は図８において示されている通りである。ＩＧＦ−１Ｒペプチドの濃度系列は、３００ｎＭ、１００ｎＭ、２×３３ｎＭ、１１ｎＭ、４ｎＭ、０ｎＭで注入された。対応するデータが図９の表において示されている。
【図１２】図１２  Ｔ４０−Ｔ−Ｂｉ二重結合剤のｐＩＲペプチド（リン酸化されたインスリン受容体ペプチド）に対する濃度依存的測定を示すＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。そのアッセイの構成は図８において示されている通りである。ｐＩＲペプチドの濃度系列は、１００ｎＭ、２×３３ｎＭ、１１ｎＭ、４ｎＭ、０ｎＭで注入された。対応するデータを図９として示した表において示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は式：Ａ−ａ’：ａ−Ｓ−ｂ：ｂ’−Ｂ：Ｘ（ｎ）の結合剤に関し、ここでＡならびにＢは一価結合剤であり、ここでａ’：ａならびにｂ：ｂ’は結合対であり、ここでａ’およびａはｂのｂ’への結合に干渉せず、逆もまた同じであり、ここでＳは少なくとも１ｎｍの長さのスペーサーであり、ここで：Ｘはａ’、ａ、ｂ、ｂ’またはＳの少なくとも１つに共有結合的にまたは結合対を介してのどちらかで結合した官能性部分を示し、ここで（ｎ）は整数であり、少なくとも１であり、ここで−は共有結合を表し、ここでそのリンカーａ−Ｓ−ｂは６〜１００ｎｍの長さを有する。明らかであるように、本発明に従う結合剤は少なくとも２個の異なる特異性の一価結合剤を含む結合剤である。１態様において、本発明に従う結合剤は２個の一価結合剤を含む。１態様において、本発明に従う結合剤は二価または二重結合剤である。
【００１７】
当業者は理解するであろうように、本発明において記述される結合剤は、望まれるように単離および精製することができる。１態様において、本発明は本明細書において開示されるような単離された結合剤に関する。“単離された”結合剤は、同定され、例えばそのような結合剤の合成において用いられる試薬混合物から分離および／または回収された結合剤である。そのような反応混合物の望まれない構成要素は、例えば最終的にその望まれる結合剤にならなかった一価結合剤である。１態様において、その結合剤は８０％より大きい純度まで精製される。一部の態様において、その結合剤はそれぞれ９０重量％、９５重量％、９８重量％または９９重量％より大きい純度まで精製される。本発明に従う結合剤の両方の一価結合剤がポリペプチドである場合、純度は例えば還元または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、タンパク質検出において例えばクーマシーブルーまたは銀染色を用いて容易に決定される。純度を核酸レベルで評価する場合、サイズクロマトグラフィーを適用して結合剤を副産物から分離し、２６０ｎｍにおけるＤＯを監視してその純度を評価する。
【００１８】
冠詞“ａ”および“ａｎ”は、本明細書において、その冠詞の文法上の目的語の１個を、または１個より多くを（すなわち少なくとも１個を）指して用いられる。例として、“抗体（ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）”は１個の抗体または１個より多くの抗体を意味する。
【００１９】
用語“ポリペプチド”および“タンパク質”は互換的に用いられる。本発明の意味でのポリペプチドは、アルファアミノペプチド結合により連結された少なくとも５個のアミノ酸からなる。
【００２０】
“標的分子”は、それに関して決定または測定のための方法が求められている対象の生体分子である。好ましい標的分子は、リポタンパク質、ポリペプチド、ポリペプチドの複合体、二次修飾されたポリペプチドならびにポリペプチドおよび核酸の間の複合体である。１つの好ましい態様において、標的分子はポリペプチドである。
【００２１】
本発明に従う“一価結合剤”（式Ｉ中のＡおよびＢそれぞれ）は、標的分子と、例えば標的ポリペプチドと単一の部位（すなわち特異的結合部位）において相互作用する分子である。一価抗体または抗体断片が結合剤として用いられる場合、この部位はパラトープ（ｐａｒａｔｏｐ）と呼ばれる。
【００２２】
理解されるであろうように、その一価結合剤ＡおよびＢはそれぞれそれらの対応する抗原に特異的に結合する。好ましい態様において、その一価結合剤ＡおよびＢが特異的に結合するエピトープは重複しない。当業者は理解するであろうように、特異的という用語は、その試料中に存在する他の生体分子がその用いられる結合剤に有意に結合しないことを意味するために用いられる。好ましくは、特異的な結合剤に関して、その標的分子以外の生体分子に対する結合親和性のレベルは、結果としてそれが特異的に結合する標的分子に対して有する親和性の１０％以下、より好ましくは５％以下でしかない結合親和性をもたらす。
【００２３】
一価結合剤の例は、ペプチド、ペプチド模倣物、アプタマー、ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ、ｄａｒｐｉｎ、アンキリンリピートタンパク質、Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン、単一ドメイン抗体（Hey, T. and Fiedler, E., et al., Trends Biotechnol. 23 (2005) 514-522参照）および抗体の一価断片である。
【００２４】
特定の好ましい態様において、その一価結合剤はポリペプチドである。１つの好ましい態様において、その一価結合剤ＡおよびＢのそれぞれはポリペプチドである。
特定の好ましい態様において、その一価結合剤ＡおよびＢはそれぞれ一価抗体断片、好ましくはモノクローナル抗体に由来する一価断片である。
【００２５】
一価抗体断片には下記で提供するようなＦａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、単一ドメイン抗体、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ断片が含まれるが、それらに限定されない。
好ましい態様において、その一価結合剤のすくなくとも一方は、単一ドメイン抗体、モノクローナル抗体のＦａｂ断片またはＦａｂ’断片である。
【００２６】
本明細書で開示される結合剤においてその一価結合剤の両方がモノクローナル抗体に由来し、Ｆａｂ断片である、またはＦａｂ’断片である、またはＦａｂ断片およびＦａｂ’断片であることも、好ましい態様である。２個のＦａｂ断片を一価結合剤ＡおよびＢとして含む結合剤も好ましい。
【００２７】
モノクローナル抗体の技法は、特異的なモノクローナル抗体またはその断片の形態の極めて特異的な結合剤の製造を可能にする。当技術で特に周知であるのは、マウス、ウサギ、ハムスター、またはあらゆる他の哺乳類を目的のポリペプチドで免疫することによりモノクローナル抗体またはその断片を作り出すための技法である。モノクローナル抗体またはその断片を作り出す別の方法は、ｓＦｖ（単鎖可変領域）、特にヒトのｓＦｖのファージライブラリーの使用である（例えば、Griffiths et al.，米国特許第5,885,793号；McCafferty et al.，国際公開第92/01047号；Liming et al.，国際公開第99/06587号を参照）。
【００２８】
抗体断片は伝統的な手段、例えば酵素消化により、または組み換え技法により生成されてよい。特定の抗体断片の総説に関して、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照。
【００２９】
Ｆｖは完全な抗原結合部位を含有する最小限の抗体断片であり、定常領域を欠いている。１態様において、２鎖Ｆｖ種は堅固に非共有結合的に会合した１個の重鎖可変ドメインおよび１個の軽鎖可変ドメインの二量体からなる。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種の１態様において、１個の重鎖可変ドメインおよび１個の軽鎖可変ドメインが、その軽鎖および重鎖が２鎖Ｆｖ種における二量体構造に類似した二量体構造で会合することができるように、柔軟なペプチドリンカーにより共有結合的に連結されていることができる。ｓｃＦｖの総説に関して、例えばPlueckthun, In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (編者), Springer-Verlag, ニューヨーク(1994), pp. 269-315を参照；国際公開第93/16185号ならびに米国特許第5,571,894号および第5,587,458号も参照。一般に、６個の超可変領域（ＨＶＲ）が抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、単一の可変領域（または抗原に特異的な３個のＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえも抗原を認識して結合する能力を有する。
【００３０】
Ｆａｂ断片は重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含有し、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１個以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における少数の残基の追加によりＦａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、その定常ドメインのシステイン残基（単数または複数）が遊離のチオール基を有するＦａｂ’に関する本明細書における名称である。
【００３１】
抗体断片の生成のために様々な技法が開発されてきた。伝統的に、抗体断片は完全な抗体のタンパク質分解による消化により得られた(例えばMorimoto, K. et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24 (1992) 107-117;およびBrennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83を参照)。例えば、抗体のパパイン消化は、“Ｆａｂ”断片と呼ばれそれぞれが単一の抗原結合部位を有する２個の同一の抗原結合断片および残りの“Ｆｃ”断片を生成し、その名前は容易に結晶化するその能力を反映している。
【００３２】
抗体断片は組み換え宿主細胞により直接生成することもできる。Ｆａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖ抗体断片は全て大腸菌中で発現させてそれから分泌させることができ、従ってこれらの断片の容易な大量生産が可能である。抗体断片は、標準的な手順に従って抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができる(Carter, P. et al., Bio/Technology 10 (1992) 163-167)。哺乳類細胞系も、抗体断片を発現させる、そして望まれるならば分泌させるために用いることができる。
【００３３】
特定の態様において、本発明の一価結合剤は単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む単一のポリペプチド鎖である。特定の態様において、単一ドメイン抗体はヒトの単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば米国特許第6,248,516 B1号を参照）。１態様において、単一ドメイン抗体は抗体の重鎖可変ドメインの全部または一部からなる。
【００３４】
用語“オリゴヌクレオチド”または“核酸配列”は、本明細書で用いられる際、一般に短い、一般に一本鎖の、少なくとも８ヌクレオチドを、最大で約１０００ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを指す。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも９、１０、１１、１２、１５、１８、２１、２４、２７または３０ヌクレオチドの長さを有するであろう。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５または３０ヌクレオチドより長くない長さを有するであろう。下記でポリヌクレオチドに関して示す記述は、オリゴヌクレオチドに等しく、かつ完全に適用可能である。
【００３５】
オリゴヌクレオチドという用語は広く理解されるべきであり、ＤＮＡおよびＲＮＡならびにそれらの類似体および修飾を含む。
オリゴヌクレオチドは、例えば標準的な塩基であるデオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）、デオキシシトシン（ｄＣ）、デオキシチミジン（ｄＴ）、デオキシウラシル（ｄＵ）において置換基を有する置換されたヌクレオチドを含有していてよい。そのような置換された核酸塩基の例は次のものである：５−置換ピリミジン類、例えば５メチルｄＣ、アミノアリルｄＵまたはｄＣ、５−（アミノエチル−３−アクリルイミド）−ｄＵ、５プロピニルｄＵまたはｄＣ、５ハロゲン化−ｄＵまたはｄＣ；Ｎ置換ピリミジン類、例えばＮ４エチルｄＣ；Ｎ置換プリン類、例えばＮ６エチルｄＡ、Ｎ２エチルｄＧ；８置換プリン類、例えば８−［６−アミノ）−ヘキサ−１−イル］−８−アミノ−ｄＧまたはｄＡ、８ハロゲン化ｄＡまたはｄＧ、８−アルキルｄＧまたはｄＡ；および２置換ｄＡ、例えば２アミノｄＡ。
【００３６】
オリゴヌクレオチドは、例えば標準的な塩基であるデオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）、デオキシシトシン（ｄＣ）、デオキシチミジン（ｄＴ）、デオキシウラシル（ｄＵ）において置換基を有する置換されたヌクレオチドを含有していてよい。そのような置換された核酸塩基の例は次のものである：５−置換ピリミジン類、例えば５メチルｄＣ、アミノアリルｄＵまたはｄＣ、５−（アミノエチル−３−アクリルイミド）−ｄＵ、５−プロピニル−ｄＵまたはｄＣ、５ハロゲン化−ｄＵまたはｄＣ；Ｎ置換ピリミジン類、例えばＮ４−エチル−ｄＣ；Ｎ置換プリン類、例えばＮ６−エチル−ｄＡ、Ｎ２−エチル−ｄＧ；８置換プリン類、例えば８−［６−アミノ）−ヘキサ−１−イル］−８−アミノ−ｄＧまたはｄＡ、８ハロゲン化ｄＡまたはｄＧ、８−アルキルｄＧまたはｄＡ；および２置換ｄＡ、例えば２アミノｄＡ。
【００３７】
オリゴヌクレオチドはヌクレオチドまたはヌクレオシド類似体を含有していてよい。すなわち、天然存在核酸塩基を以下のような核酸塩基類似体を用いることにより交換することができる：５−ニトロインドール  ｄ  リボシド；３ニトロピロール  ｄ  リボシド、デオキシイノシン（ｄＩ）、デオキシキサントシン（ｄｅｏｙｘａｎｔｈｏｓｉｎｅ）（ｄＸ）；７デアザ−ｄＧ、−ｄＡ、−ｄＩまたは−ｄＸ；７−デアザ−８−アザ−ｄＧ、−ｄＡ、−ｄＩまたは−ｄＸ；８−アザ−ｄＡ、−ｄＧ、−ｄＩまたは−ｄＸ；ｄホルマイシン；プソイドｄＵ；プソイドイソｄＣ；４チオｄＴ；６チオｄＧ；２チオｄＴ；イソｄＧ；５−メチル−イソ−ｄＣ；Ｎ８−結合型８−アザ−７−デアザ−ｄＡ；５，６−ジヒドロ−５−アザ−ｄＣ；およびエテノ−ｄＡまたはピロロ−ｄＣ（ｐｙｒｏｌｌｏ−ｄＣ）。当業者には明らかであるように、相補鎖中の核酸塩基は二本鎖形成が特異的であるような様式で選択されなければならない。例えば、５−メチル−イソ−ｄＣが一方の鎖（例えば（ａ））において用いられるならば、イソｄＧがその相補鎖（例えば（ａ’））中になければならない。
【００３８】
そのオリゴヌクレオチド主鎖は、置換された糖残基、糖類似体、ヌクレオシド間ホスフェート部分における改変を含有するように改変されてよく、および／またはＰＮＡであってよい。
【００３９】
オリゴヌクレオチドは、例えば２’−メトキシ、２’−フルオロ、２’−メチルセレノ、２’−アリルオキシ、４’−メチルｄＮ（ここでＮは核酸塩基、例えばＡ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵである）のような置換されたデオキシリボースを有するヌクレオチドを含有していてよい。
【００４０】
糖類似体は、例えばキシロース；（２’−Ｏ，４’−Ｃメチレン）−（ＬＮＡとして知られるオリゴマー）または（２’−Ｏ，４’−Ｃエチレン）−（ＥＮＡとして知られるオリゴマー）のような２’，４’架橋リボース；Ｌ−リボース、Ｌ−ｄ−リボース、ヘキシトール（ＨＮＡとして知られるオリゴマー）；シクロヘキセニル（ＣｅＮＡとして知られるオリゴマー）；アルトリトール（ＡＮＡとして知られるオリゴマー）；Ｃ３’およびＣ５’原子がエチレン架橋により連結されており、それが縮合してシクロプロパン環になっている三環式リボース類似体（トリシクロＤＮＡとして知られるオリゴマー）；グリセリン（ＧＮＡとして知られるオリゴマー）；グルコピラノース（ホモＤＮＡ（Ｈｏｍｏ  ＤＮＡ）として知られるオリゴマー）；カルバリボース（ｃａｒｂａｒｉｂｏｓｅ）（テトラヒドロフラン小単位の代わりにシクロペンタンを有する）；ヒドロキシメチル−モルホリン（モルホリノＤＮＡとして知られるオリゴマー）である。
【００４１】
多数のヌクレオシド間ホスフェート部分の改変もハイブリダイゼーション特性に干渉しないことが分かっており、そのような主鎖の改変は置換されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と組み合わせることもできる。例はホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートおよびメチルホスホネートオリゴヌクレオチドである。
【００４２】
ＰＮＡ（ホスフェートおよびｄ−リボースなしの主鎖を有する）もＤＮＡ類似体として用いることができる。
上記で言及した修飾されたヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ならびにオリゴヌクレオチド主鎖の改変は、本発明の意味でのオリゴヌクレオチド中で望まれるように組み合わせることができる。
【００４３】
ａ−Ｓ−ｂからなるリンカーＬは、６〜１００ｎｍの長さを有する。好ましくは、ａ−Ｓ−ｂからなるリンカーＬは６〜８０ｎｍの長さを有する。そのリンカーが６〜５０ｎｍの、または６〜４０ｎｍの長さを有することも好ましい。やはり好ましい態様において、そのリンカーは１０ｎｍ以上の長さを、または１５ｎｍ以上の長さを有するであろう。１態様において、そのリンカーは１０ｎｍ〜５０ｎｍの長さを有する。１態様において、ａおよびｂはそれぞれ結合対のメンバーであり、それぞれ少なくとも２．５ｎｍの長さを有する。
【００４４】
理論上の、および複合的な方法による、所与のリンカー（ａ−Ｓ−ｂ）の非ヌクレオシド構成要素の長さは、その非ヌクレオシド構成要素に化学的に類似した化合物の既知の結合距離および結合角を用いることにより計算することができる。そのような結合距離は、標準的な教本：CRC Handbook of Chemistry and Physics, 第９１版, 2010-2011, 第９節においていくつかの分子に関して要約されている。しかし、正確な結合距離はそれぞれの化合物に関して異なる。その結合角においても変動性が存在する。
【００４５】
従って、そのような計算において平均のパラメーター（分かりやすい近似値）を用いることがより実際的である。
スペーサーまたはリンカーの長さの計算において、以下の近似値が適用される：ａ）非ヌクレオシド構成要素の長さの計算に関して、連結された原子の性質とは無関係に、１８０°の結合角を伴う１３０ｐｍの平均結合長が用いられ；ｂ）一本鎖中の１個のヌクレオチドは５００ｐｍで計算され、そしてｃ）二本鎖中の１個のヌクレオチドは３３０ｐｍで計算される。
【００４６】
１３０ｐｍの値は、２個のＣ（ｓｐ３）の間の結合角が１０９°２８’および距離が１５３ｐｍであるＣ（ｓｐ３）−Ｃ（ｓｐ３）−Ｃ（ｓｐ３）鎖の２個の末端の炭素原子の距離がおおよそ２５０ｐｍであり、それは１８０°の仮定された結合角および１２５ｐｍの２個のＣ（Ｓｐ３）の間の結合距離に換算されるという計算に基づく。ＰおよびＳのような複素原子ならびにｓｐ２およびｓｐ１のＣ原子もそのスペーサーの一部であり得ることを考慮して、１３０ｐｍの値が採用される。スペーサーがシクロアルキルまたはアリールのような環構造を含む場合、その距離は類似の方法で、その距離を定めている原子鎖全体の一部である前記の環構造の結合の数を数えることにより計算される。
【００４７】
スペーサーＳは、例えば望まれる長さを、ならびに他の望まれる特性を提供するために必要であると解釈することができる。そのスペーサーは、例えば完全または部分的に天然存在または非天然存在アミノ酸で、ホスフェート−糖単位、例えば核酸塩基なしのＤＮＡ様主鎖で、グリコペプチド性（ｇｌｙｃｏ−ｐｅｐｔｉｄｉｃ）構造で、または少なくとも部分的に糖単位で、または少なくとも部分的にグリコール類もしくはアクリルアミドのような重合可能な小単位で構成されていることができる。
【００４８】
本発明に従う結合剤中のスペーサーＳの長さは、望まれるように異なっていてよい。多様な長さの利用可能なスペーサー（ライブラリー）を容易に作製するために、そのようなライブラリーのスペーサーへの簡単な合成経路（ａｃｃｅｓｓ）を有することが好ましい。スペーサーの組み合わせ固相合成が好ましい。スペーサーは約１００ｎｍの長さまで合成されなければならないため、その合成戦略は、その単量体合成構築ブロックが固相合成の間に高い効率で組み立てられるような方法で選択される。単量体構築ブロックとしてのホスホラミダイトの組み立てに基づくデオキシオリゴヌクレオチドの合成は、完全にこの要求を満たす。そのようなスペーサー中で、スペーサー内の単量体単位は、それぞれの場合においてホスフェートまたはホスフェート類似体部分により連結されている。
【００４９】
そのスペーサーＳは、多官能性アミノカルボン酸の遊離の正または／および負に荷電した基、例えばアミノ、カルボキシレートまたはホスフェートを含有することができる。例えば、その電荷担体は、ａ）１個のアミノ基および２個のカルボキシレート基またはｂ）２個のアミノ基および１個のカルボキシレート基を含有する三官能性アミノカルボン酸に由来することができる。そのような三官能性アミノカルボン酸の例は、リシン、オルニチン、ヒドロキシリシン、α，β−ジアミノプロピオン酸、アルギニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸、カルボキシグルタミン酸ならびにEP-A-0 618 192またはUS-A-5,519,142において記述されている合成三官能性カルボン酸のような合成三官能性カルボン酸である。あるいは、その三官能性アミノカルボン酸ａ）中のカルボキシレート基の１つをホスフェート、スルホネートまたはサルフェート基により置き換えることができる。そのような三官能性アミノ酸の例はホスホセリンである。
【００５０】
そのスペーサーＳは、無電荷の親水基も含有することができる。無電荷の親水基の好ましい例は、エチレンオキシドまたは好ましくは少なくとも３個のエチレンオキシド単位を有するポリエチレンオキシド基、スルホキシド、スルホン、カルボン酸アミド、カルボン酸エステル、ホスホン酸アミド、ホスホン酸エステル、リン酸アミド、リン酸エステル、スルホン酸アミド、スルホン酸エステル、硫酸アミドおよび硫酸エステル基である。そのアミド基は、好ましくは第１級アミド基、特に好ましくはアミノ酸（例えばアミノ酸アスパラギンおよびグルタミン）側鎖基中のカルボン酸アミド残基である。そのエステルは好ましくは親水性アルコール類、特にＣ１〜Ｃ３アルコール類またはジオール類またはトリオール類に由来する。
【００５１】
１態様において、そのスペーサーＳは１タイプの単量体からなる。例えば、そのスペーサーは排他的にアミノ酸、糖残基、ジオール類、リン糖酸（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｕｇａｒ）単位からなり、またはそれはそれぞれ核酸であることができる。
【００５２】
１態様において、そのスペーサーはＤＮＡである。１つの好ましい態様において、そのスペーサーは、ベータ−Ｌ−ＤＮＡ、Ｌ−−ＤＮＡまたは鏡像ＤＮＡとしても知られているＤＮＡのＬ−立体異性体である。Ｌ−ＤＮＡは、２本のＬ−ＤＮＡの相補的な一本鎖の間でのみ二本鎖が形成され、Ｌ−ＤＮＡの一本鎖および相補的なＤＮＡ鎖の間では二本鎖が形成されないことを意味する直交（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）ハイブリダイゼーション挙動、ヌクレアーゼ耐性、ならびに長いスペーサーでさえも合成が容易であることのような利点を特徴とする。指摘したように、合成の容易さおよびスペーサーの長さにおける変動可能性は、スペーサーライブラリーに関して重要である。変動可能な長さのスペーサーは、最適な長さのスペーサーを有する本発明に従う結合剤の同定、従って２個の一価結合剤の間の最適な距離の提供において極めて有用である。
【００５３】
スペーサー構築ブロックは、その名の通り、間隔を空ける部分をスペーサーＳの中に導入するために、またはリンカーａ−Ｓ−ｂのスペーサーＳを構築するために用いることができる。
【００５４】
異なる数および種類の非ヌクレオチド性ならびにヌクレオチド性スペーサー構築ブロックが、間隔を空ける部分を導入するためにすぐに利用できる。
多くの異なる非ヌクレオチド性二官能性スペーサー構築ブロックが文献において既知であり、多種多様なものが商業的に入手可能である。非ヌクレオチド性二官能性スペーサー構築の選択は、そのスペーサー分子の電荷および柔軟性に影響を及ぼす。
【００５５】
二官能性スペーサー構築ブロックにおいて、酸不安定性保護基で保護されたヒドロキシル基がホスホラミダイト基に連結されている。
１態様における二官能性スペーサー構築ブロックは、非ヌクレオシド性化合物である。例えば、そのようなスペーサーはＣ２〜Ｃ１８アルキル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｉｎｙｌ）炭素鎖であるが、前記のアルキル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｉｎｙｌ）鎖はそのリンカーの親水性を増大させるために追加のエチレンオキシおよび／またはアミド部分または四級化された（ｑｕａｒｔｅｒｎｉｚｅｄ）陽イオン性アミン部分により遮られていてよい。場合により１または２個のＣ１〜Ｃ６アルキル基で置換されているＣ５〜Ｃ６−シクロアルキル、Ｃ４Ｎ、Ｃ５Ｎ、Ｃ４Ｏ、Ｃ５Ｏ−ヘテロシクロアルキル、フェニルのような環状部分も、非ヌクレオシド性二官能性スペーサー部分として用いることができる。好ましい二官能性構築ブロックは、Ｃ３〜Ｃ６アルキル部分およびトリ−〜ヘキサ−エチレングリコール鎖を含む。表Ｉは、異なる親水性、異なる剛性および異なる電荷を有するヌクレオチド性二官能性スペーサー構築ブロックのいくつかの例を示す。一方の酸素原子は酸不安定性保護基、好ましくはジメトキシトリチルに連結されており、他方はホスホラミダイトの一部である。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
スペーサーＳを構築する、またはスペーサーＳ中に間隔を空ける部分を導入するための簡単な方法は、標準的なＤまたはＬヌクレオシドホスホラミダイト構築ブロックを用いることである。１態様において、一本鎖の一続きのｄＴが用いられる。ｄＴは塩基保護基を有しないため、これは好都合である。
【００５８】
二本鎖の長さは一本鎖と比較して低減し、二本鎖は一本鎖よりも堅いため、スペーサーの長さ（結合対のメンバーａおよびｂの間の距離）およびスペーサーの柔軟性を変化させるためにハイブリダイゼーションを用いることができる。
【００５９】
ハイブリダイゼーションに関して、１態様において、官能性部分Ｘで修飾されたオリゴヌクレオチドが用いられる。ハイブリダイゼーションのために用いられるオリゴヌクレオチドは、そのスペーサーとハイブリダイズしない１または２個の末端の延長部分を有することができ、および／またはそれは内部で分枝している。そのようなスペーサーとハイブリダイズしない（かつ結合対ａ：ａ’およびｂ：ｂ’に干渉しない）末端の延長部分は、さらなるハイブリダイゼーション事象のために用いることができる。１態様において、末端の延長部分とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは標識されたオリゴヌクレオチドである。この標識されたオリゴヌクレオチドも、さらなるハイブリダイゼーションを可能にするための末端の延長部分を含んでいてよく、または分枝していてよく、それによりポリヌクレオチドの凝集体またはデンドリマーを得ることができる。多数の標識（ｐｏｌｙｌａｂｅｌ）をもたらすために、またはＸの高い局所的濃度を得るために、好ましくはポリオリゴ核酸デンドリマーが用いられる。
【００６０】
１態様において、スペーサーＳは１〜１００ｎｍの主鎖の長さを有する。言い換えると、ここで式Ｉの基ａおよびｂは１〜１００ｎｍ離れている。１態様において、ａおよびｂはそれぞれ結合対のメンバーであり、そのスペーサーＳは１〜９５ｎｍの主鎖の長さを有する。
【００６１】
“ａ’：ａ”ならびに“ｂ：ｂ’”はそれぞれ独立して結合対を表す。１態様において、その結合対のメンバーａおよびｂのそれぞれは少なくとも２．５ｎｍの長さを有する。
それぞれａおよびａ’は結合対ａ’：ａのメンバーであり、ｂおよびｂ’は結合対ｂ：ｂ’のメンバーである。好ましくは、結合対のそれぞれのメンバーは１０ｋＤ以下の分子量である。さらなるやはり好ましい態様において、そのような結合対のそれぞれの結合剤の分子量は８、７、６、５または４ｋＤ以下である。
【００６２】
結合対ａ：ａ’またはｂ’：ｂそれぞれに関する（結合対ａ：ａ’またはｂ’：ｂそれぞれ内の）結合親和性は少なくとも１０８ｌ／ｍｏｌである。両方の結合対は異なる。ある結合対に関して、違いは例えば相互結合（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、例えばａならびにａ’のｂまたはｂ’に対する結合に関する親和性が対ａ：ａ’内の親和性の１０％以下である場合に認められる。その相互結合、すなわちａならびにａ’のｂまたはｂ’それぞれに対する結合が対ａ：ａ’内の親和性の５％以下である、またはそれが対ａ：ａ’内の親和性の２％以下である場合も好ましい。１態様において、その違いは、その相互（交差反応性）結合が結合対内の特異的結合親和性と比較して１％以下であるほど顕著である。
【００６３】
１態様において、ａ’：ａおよびｂ：ｂ’は結合対であり、結合対ａ’：ａおよびｂ：ｂ’のメンバーはロイシンジッパードメイン二量体およびハイブリダイズする核酸配列からなる群から選択される。１態様において、両方の結合対はロイシンジッパードメイン二量体を表す。１態様において、両方の結合対はハイブリダイズする核酸配列である。
【００６４】
用語“ロイシンジッパードメイン”は、一続きのおおよそ３５残基中に７残基ごとにロイシン残基が存在することを特徴とする一般的に認識されている二量体化ドメインを示すために用いられている。ロイシンジッパードメインは、それらがあるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーはいくつかのＤＮＡ結合タンパク質中で最初に同定され(Landschulz, W.H. et al., Science 240 (1988) 1759-1764)、それ以来様々な異なるタンパク質中で見付かってきた。既知のロイシンジッパーの中には、二量体化または３量体化する天然存在ペプチドおよびその誘導体がある。可溶性多量体タンパク質を生成するのに適したロイシンジッパードメインの例がＰＣＴ出願国際公開第94/10308号において記述されており、そのロイシンジッパーはHoppe, H.J. et al., FEBS Lett. 344 (1994) 191-195において記述されている肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来する。
【００６５】
ロイシンジッパードメインは、アルファらせんのコイルドコイルにより一緒の状態を保たれた二量体（結合対）を形成する。コイルドコイルは一周につき３．５残基を有し、それは７残基ごとにそのらせんの軸に関して同等の位置を占めることを意味する。そのコイルドコイルの内側のロイシンの規則的な配列は、疎水性およびファンデルワールス相互作用によりその構造を安定化する。
【００６６】
ロイシンジッパードメインが第１結合対（ａ’：ａ）および第２結合対（ｂ：ｂ’）を形成する場合、両方のロイシンジッパー配列は異なり、すなわち、配列ａおよびａ’はｂおよびｂ’に結合しない。ロイシンジッパードメインは、そのようなドメインを含有することが既知である天然タンパク質、例えば転写因子から単離することができる。１つのロイシンジッパードメインが例えば転写因子ｆｏｓに由来し、第２のロイシンジッパードメインが転写因子ｊｕｎに由来することができる。ロイシンジッパードメインは合成および設計のための当技術で既知の標準的な技法を用いて人工的に設計および合成することもできる。
【００６７】
１つの好ましい態様において、結合対ａ’：ａおよびｂ：ｂ’の両方のメンバー、すなわちａ、ａ’、ｂおよびｂ’はロイシンジッパードメインを表し、スペーサーＳはアミノ酸からなる。この態様において、コンストラクトａ−Ｓ−ｂの生成は容易に可能である。そのようなスペーサーＳの長さを望まれるように変えることは、当業者にとって簡単である。そのようなポリペプチドは合成することができ、または組み換えにより生成することができる。
【００６８】
例えば、Ｎ末端においてロイシンジッパーペプチドに、そしてＣ末端においてロイシンジッパーペプチドに融合したスペーサーポリペプチドを含む組み換え融合タンパク質を、標準的な技法に従って適切な宿主細胞中で発現させることができる。望まれるペプチドスペーサーをコードするＤＮＡ配列を、第１ロイシンジッパードメインａのメンバーをコードする配列および同じ読み枠中で第２ロイシンジッパードメインｂのメンバーをコードするＤＮＡ配列の間に挿入することができる。
【００６９】
そのスペーサーＳは、そのリンカーａ−Ｓ−ｂがポリペプチドである場合、１態様において、GGGGS(SEQ ID NO:13)アミノ酸配列モチーフを１回または数回含む。そのスペーサーＳはタグ配列も含んでいてよい。そのタグ配列は、一般的に用いられるタンパク質認識タグ、例えばYPYDVPDYA(HA-タグ)(SEQ ID NO:14)またはGLNDIFEAQKIEWHE(Avi-タグ)(SEQ ID NO:15)から選択されてよい。
【００７０】
１つの好ましい態様において、結合対（ａ’：ａ）および（ｂ：ｂ’）の両方がハイブリダイズする核酸配列である。
名称により既に示されているように、ａおよびａ’ならびにｂおよびｂ’はそれぞれ互いにハイブリダイズする。一方でａおよびａ’中に含まれる核酸配列と他方でｂおよびｂ’中に含まれる核酸配列は異なる。言い換えると、結合対ａ’：ａ中の配列はそれぞれ結合対ｂ：ｂ’の配列に結合せず、逆もまた同じである。１態様において、本発明は式Ｉの少なくとも二重の結合剤に関し、ここでその結合対ａ：ａ’およびｂ：ｂ’それぞれは両方ともハイブリダイズする核酸配列であり、ここでその異なる結合対ａ’：ａおよびｂ：ｂ’のハイブリダイズする核酸配列は互いとハイブリダイズしない。言い換えると、ａおよびａ’は互いにハイブリダイズするが、ｂまたはｂ’のいずれにも結合せず、それらのハイブリダイゼーションにも干渉せず、逆もまた同じである。ハイブリダイゼーションの速度論およびハイブリダイゼーションの特異性は、融点分析により容易に監視することができる。結合対（例えばａ：ａ’）の特異的なハイブリダイゼーションおよび（例えばｂまたはｂ’への）不干渉は、対ａ：ａ’に関する融解温度がｂまたはｂ’とのあらゆる可能性のある組み合わせそれぞれ（すなわちａ：ｂ；ａ：ｂ’；ａ’：ｂおよびａ’：ｂ’）と比較して少なくとも２０℃高い場合に認められる。
【００７１】
結合対、例えば（ａ：ａ’）またはあらゆる他の核酸配列に基づく結合対を形成する核酸配列は、あらゆる天然存在核酸塩基またはそれらに対する類似体を弱めて（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）よく、上記で記述したような改変された、もしくは改変されていない主鎖を、それが多数の塩基対合により安定な二本鎖を形成することができる限り、有していてよい。安定は、その二本鎖の融解温度が３７℃より高いことを意味する。好ましくは、その二本鎖は２本の完全に相補的な一本鎖からなる。しかし、３７℃における安定性が与えられる限り、ミスマッチまたは挿入が可能である。
【００７２】
当業者は理解しているであろうように、核酸二本鎖は鎖間架橋によりさらに安定化され得る。いくつかの適切な架橋法、例えばソラレンを用いる、またはチオヌクレオシドに基づく方法が当業者に既知である。
【００７３】
結合対のメンバーである核酸配列は、好ましくは１２〜５０ヌクレオチドからなる。そのような核酸配列が１５〜３５ヌクレオチドからなるであろうことも好ましい。
ＲＮアーゼは至る所にあり、ＲＮＡに基づく結合対および／またはスペーサー配列の望まれない消化を避けるために特別な注意を払わなければならない。例えばＲＮＡに基づく結合対および／またはスペーサーを用いることは確かに可能であるが、ＤＮＡに基づく結合対および／またはスペーサーが好ましい態様である。
【００７４】
直交相補性オリゴヌクレオチドの２つより多くの対を提供するために、適切なハイブリダイズする核酸配列を容易に設計することができ、２つより多くの結合対の容易な生成および使用が可能になる。本発明の結合剤においてハイブリダイズする核酸配列を用いることの別の利点は、核酸配列中に容易に修飾を導入することができることである。修飾された構築ブロックは商業的に入手可能であり、それは例えば官能性部分を含むリンカーの容易な合成を可能にする。そのような官能性部分は、あらゆる望まれる位置において、構造ａおよびａ’ならびにｂおよびｂ’および／またはＳのいずれの中にも、それらがオリゴヌクレオチドを表す限り、容易に導入することができる。
【００７５】
１つの好ましい態様において、式Ｉに従う結合剤中に含まれるスペーサーＳは核酸である。１つの好ましい態様において、両方の結合対がハイブリダイズする核酸配列であり、スペーサーＳも核酸である。この態様において、ａ−Ｓ−ｂからなるリンカーＬはオリゴヌクレオチドである。
【００７６】
そのスペーサーＳならびに配列ａ、ａ’、ｂおよびｂ’が全てオリゴヌクレオチド配列である場合、Ｓならびに結合対ａ’：ａおよびｂ：ｂ’それぞれのメンバーａおよびｂを含むリンカーＬに相当する単一のオリゴヌクレオチドを提供および合成することは、容易に可能である。その一価結合剤ＡおよびＢがそれぞれポリペプチドである場合、それらはそれぞれそのハイブリダイズする核酸配列ａ’およびｂ’それぞれに容易に連結することができる。そのようなコンストラクト中に含まれるスペーサーＳの長さは、あらゆる望まれる方法で容易に変えることができる。３つのコンストラクトａ−Ｓ−ｂ、Ａ−ａ’およびｂ’−Ｂを元にして、式Ｉの結合剤を、標準的な手順に従って、ａ’：ａおよびｂ：ｂ’それぞれの間のハイブリダイゼーションにより最も用意に得ることができる。異なる長さのスペーサーが用いられる場合、結果として得られるコンストラクトは他の点では同一の結合剤を提供するが、一価結合剤ＡおよびＢの間において異なる距離を有する。これは最適な距離および／または柔軟性を可能にする。
【００７７】
１つの好ましい態様において、そのスペーサＳならびに配列ａ、ａ’、ｂおよびｂ’はＤＮＡである。
鏡像異性のＬ−ＤＮＡは、その直交ハイブリダイゼーション挙動、そのヌクレアーゼ耐性に関して、および変動可能な長さのオリゴヌクレオチドの合成の容易さに関して知られている。この適切なスペーサーを設計することによるリンカーの長さの変動の容易さは、本明細書で開示されるような結合剤のその抗原（単数または複数）への結合を最適化するために重要である。
【００７８】
１つの好ましい態様において、そのリンカーＬ（＝ａ−Ｓ−ｂ）は鏡像異性のＬ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡである。１つの好ましい態様において、リンカーａ−Ｓ−ｂは鏡像異性のＬ−ＤＮＡである。１つの好ましい態様において、ａ、ａ’、ｂおよびｂ’ならびにそのスペーサーＳは鏡像異性のＬ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡである。１つの好ましい態様において、ａ、ａ’、ｂおよびｂ’ならびにそのスペーサーＳは鏡像異性のＬ−ＤＮＡである。
【００７９】
１態様において、そのスペーサーＳはオリゴヌクレオチドであり、互いにハイブリダイズすることができる末端を含む２つの部分で合成される。この場合、そのスペーサーＳはこれらのハイブリダイズすることができる末端の互いとのハイブリダイゼーションにより簡単に構築することができる。結果として得られたスペーサーコンストラクトは、オリゴヌクレオチド二本鎖部分を含む。明らかであるように、そのスペーサーをその方法で解釈した（ｃｏｎｓｔｒｕｅｄ）場合、前記の二本鎖を形成するそのハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド構成要素の配列は、結合対ａ：ａ’およびｂ：ｂ’とのハイブリダイゼーションまたはそれらへの干渉が起こり得ないような様式で選択される。
【００８０】
上記で既に記述したように、式Ｉの一価特異的結合剤ＡおよびＢは核酸であってよい。本発明の１態様において、ａ’、ａ、ｂ、ｂ’、Ａ、Ｂおよびｓは全てオリゴヌクレオチド配列である。この態様において、式ＩのサブユニットＡ−ａ’、ａ−Ｓ−ｂおよびｂ’−Ｂは標準的な手順に従って容易に、かつ独立して合成することができ、一般に用いられる標準的な手順に従ってハイブリダイゼーションにより組み合わせることができる。その官能性部分Ｘは、好ましくは結合基、標識基、エフェクター基および反応基からなる群から選択される。
【００８１】
１個より多くの官能性部分Ｘが存在する場合、それぞれのそのような官能性部分はそれぞれの場合において独立して結合基、標識基、エフェクター基または反応基であることができる。
【００８２】
１態様において、その官能性部分Ｘは好ましくは結合基、標識基およびエフェクター基からなる群から選択される。
１態様において、その基Ｘは結合基である。当業者には明らかであるように、その結合基Ｘは対ａ’：ａおよびｂ：ｂ’に干渉しないように選択されるであろう。
【００８３】
結合基の例はバイオアフィン（ｂｉｏａｆｆｉｎｅ）結合対のパートナーであり、それはそのバイオアフィン結合対の他方のパートナーと特異的に相互作用することができる。適切なバイオアフィン結合対は、ハプテンまたは抗原および抗体；ビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン；糖およびレクチン、オリゴヌクレオチドおよび相補性オリゴヌクレオチド、受容体およびリガンド、例えばステロイドホルモン受容体およびステロイドホルモンである。１態様において、Ｘは結合基であり、式Ｉの化合物のａ’、ａ、ｂ、ｂ’またはＳの少なくとも１つに共有結合している。好ましくは、バイオアフィン結合対のより小さいパートナー、例えばビオチンもしくはそれに対する類似体、受容体リガンド、ハプテンまたはオリゴヌクレオチドは、上記で定義されたようなａ’、ａ、Ｓ、ｂまたはｂ’の少なくとも（ａｔ  ｌｅｓｔ）１個に共有結合している。
【００８４】
１態様において、官能性部分Ｘは、ハプテン；ビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン；オリゴヌクレオチドおよびステロイドホルモンから選択される結合基である。
【００８５】
１態様において、その官能性部分Ｘは反応基である。その反応基は、アミノ、スルフヒドリル、カルボキシレート、ヒドロキシル、アジド、アルキニル（Ａｌｋｉｎｙｌ）またはアルケニルのようなあらゆる既知の反応基から選択することができる。１態様において、その反応基はマレインイミド、スクシンイミジル、ジチオピリジル、ニトロフェニルエステル、ヘキサフルオロフェニルエステルから選択される。
【００８６】
１態様において、その官能性部分Ｘは標識基である。その標識基はあらゆる既知の検出可能な基から選択することができる。当業者は、最少の消光での最高の感度のために適切であるように標識の数を選択するであろう。
【００８７】
その標識基はあらゆる既知の検出可能な基から選択することができる。１態様において、その標識基は、色素、例えば発光標識基、例えば化学発光基、例えばアクリジニウムエステル類もしくはジオキセタン類、または蛍光色素、例えばフルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニンおよびそれらの誘導体、発光性金属錯体、例えばルテニウムもしくはユーロピウム錯体、ＣＥＤＩＡ（クローン化酵素供与体免疫アッセイ（Ｃｌｏｎｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｄｏｎｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、例えば欧州特許第0 061 888号）に関して用いられるような酵素、微粒子もしくはナノ粒子、例えばラテックス粒子または金属ゾル、ならびに放射性同位体から選択される。
【００８８】
１態様において、その標識基は発光性金属錯体であり、その化合物は一般式（ＩＩ）の構造を有し：
［Ｍ（Ｌ１Ｌ２Ｌ３）］ｎ  −  Ｙ  −  ＸｍＡ          （ＩＩ）
式中、Ｍは希土類または遷移金属イオンから選択される二価または三価金属陽イオンであり、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は同じまたは異なっており、少なくとも２個の窒素含有複素環を有するリガンドを示し、ここでＬ１、Ｌ２およびＬ３はその金属陽イオンに窒素原子を介して結合しており、ＸはリンカーＹを介してそのリガンドＬ１、Ｌ２およびＬ３の少なくとも１個に共有結合している反応性官能基であり、ｎは１から１０まで、好ましくは１から４までの整数であり、ｍは１または２、好ましくは１であり、Ａは電荷を等しくするために必要である可能性のある対イオンを示す。
【００８９】
その金属錯体は好ましくは発光性金属錯体、すなわち適切な励起後に検出可能な発光反応を経る金属錯体である。その発光反応は、例えば蛍光または電気化学発光測定により検出することができる。この錯体中の金属陽イオンは、例えば遷移金属または希土類金属である。その金属は好ましくはルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、インジウム、パラジウム、モリブデン、テクネチウム、銅、クロムまたはタングステンである。ルテニウム、イリジウム、レニウム、クロムおよびオスミウムが特に好ましい。ルテニウムが最も好ましい。
【００９０】
リガンドＬ１、Ｌ２およびＬ３は、少なくとも２個の窒素含有複素環を有するリガンドである。芳香族複素環、例えばビピリジル、ビピラジル、ターピリジルおよびフェナントロリルが好ましい。そのリガンドＬ１、Ｌ２およびＬ３は、特に好ましくはビピリジンおよびフェナントロリン環系から選択される。
【００９１】
その錯体はさらに電荷を等しくするための１個または数個の対イオンＡを含有することができる。適切な負に荷電した対イオンの例は、ハロゲン化物、ＯＨ−、カーボネート、アルキルカルボキシレート、例えばトリフルオロアセテート、サルフェート、ヘキサフルオロホスフェートおよびテトラフルオロボレート基である。ヘキサフルオロホスフェート、トリフルオロアセテートおよびテトラフルオロボレート基が特に好ましい。適切な正に荷電した対イオンの例は、一価陽イオン、例えばアルカリ金属およびアンモニウムイオンである。
【００９２】
さらに好ましい態様において、その官能性部分Ｘはエフェクター基である。好ましいエフェクター基は療法上有効物質である。
療法上有効物質は、例えば癌の抑制においてそれらが有効である方式が異なる。それらはアルキル化により、架橋により、またはＤＮＡの二本鎖の切断によりＤＮＡ鋳型を損傷することができる。他の療法上有効物質はインターカレーションによりＲＮＡ合成を遮断することができる。一部の薬剤は紡錘体毒、例えばビンカアルカロイド類、または酵素活性を阻害する抗代謝剤、またはホルモン性薬剤および抗ホルモン性薬剤である。エフェクター基Ｘは、アルキル化剤、抗代謝剤、抗腫瘍性抗生物質、ビンカアルカロイド類、エピポドフィロトキシン類、ニトロソ尿素類、ホルモン性薬剤および抗ホルモン性薬剤、ならびに毒素から選択されてよい。
【００９３】
現在より好ましいアルキル化剤は、シクロホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、チオテパ、イホスファミド、ナイトロジェンマスタードにより例示することができる。
【００９４】
現在より好ましい抗代謝剤は、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、６−チオグアニン、６−メルカプトプリンにより例示することができる。
現在より好ましい抗腫瘍性抗生物質は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イドルビシン（ｉｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ニミトキサントロン（ｎｉｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎ）、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、およびプリカマイシンにより例示することができる。
【００９５】
現在より好ましい紡錘体毒はメイタンシンおよびメイタンシノイド類により例示することができ、ビンカアルカロイド類およびエピポドフィロトキシン類はビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデスチン（ｖｉｎｄｅｓｔｉｎ）、エトポシド、テニポシドにより例示することができる。
【００９６】
現在より好ましいニトロソ尿素類は、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシンにより例示することができる。
現在より好ましいホルモン性薬剤および抗ホルモン性薬剤は、アドレノコルチコルチコイド類（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ）、エストロゲン類、抗エストロゲン剤、プロゲスチン類、アロマターゼ阻害剤、アンドロゲン類、抗アンドロゲン剤により例示することができる。
【００９７】
追加の好ましい無作為な合成薬剤は、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、プロカルバジド（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｄｅ）、シスプラチン、カルボプラチンにより例示することができる。
【００９８】
官能性部分Ｘは、共有結合的に、または追加の結合対を介してのどちらかで、（ａ’）、（ａ）、（ｂ）、（ｂ’）またはＳの少なくとも１つに結合している。その官能性部分Ｘは１回または数（ｎ）回存在することができる。（ｎ）は整数であり、１または１より大きい。好ましくは、（ｎ）は１〜１００である。（ｎ）が１〜５０であることも好ましい。特定の態様において、ｎは１〜１０、または１〜５である。さらなる態様において、ｎは１または２である。
【００９９】
官能性部分Ｘのａ’、ａ、ｂ、ｂ’またはＳの少なくとも１つへの共有結合に関して、あらゆる適切なカップリング化学を用いることができる。当業者はそのようなカップリング化学を標準的なプロトコルから容易に選択することができる。ａ’、ａ、ｂ、ｂ’またはＳを合成する際に適切な構築ブロックの使用により官能性部分を組み込むことも可能である。
【０１００】
１つの好ましい態様において、官能性部分Ｘは式Ｉにより定義されるような結合剤のａ、ｂ、またはＳに結合している。
１つの好ましい態様において、官能性部分Ｘは式Ｉにより定義されるような結合剤のスペーサーＳに結合している。
【０１０１】
１つの好ましい態様において、官能性部分Ｘは式Ｉにより定義されるような結合剤のａ、ｂ、またはＳに共有結合している。
官能性部分Ｘがａ、ａ’、ｂまたはｂ’それぞれに相当するハイブリダイズするオリゴヌクレオチド内に位置する場合、好ましくはそのような官能性部分は修飾されたヌクレオチドに結合しており、またはヌクレオシド間のＰ原子に結合している（国際公開第2007/059816号）。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに干渉しない修飾されたヌクレオチドがそれらのオリゴヌクレオチド中に組み込まれる。そのような修飾されたヌクレオチドは、好ましくはＣ５置換ピリミジン類またはＣ７置換７デアザプリン類である。
【０１０２】
オリゴヌクレオチドは、内部で、または５’もしくは３’末端において、官能性部分の導入のために用いられる非ヌクレオチド性構成要素で修飾することができる。好ましくは、そのような非ヌクレオチド性構成要素はスペーサーＳの内部、すなわち２個の結合対メンバーａおよびｂの間に位置している。
【０１０３】
スペーサーの構築のための多くの異なる非ヌクレオチド性修飾剤（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）構築ブロックが文献において既知であり、多種多様なものが商業的に入手可能である。官能性部分の導入に関して、非ヌクレオシド性二官能性修飾剤構築ブロックまたは非ヌクレオシド性の三官能性修飾された構築ブロックのどちらも、末端標識のためのＣＰＧとして、または内部標識のためのホスホラミダイトとしてのどちらでも用いられる（Wojczewski, C. et al., Synlett 10 (1999) 1667-1678参照）。
【０１０４】
二官能性修飾剤構築ブロック
二官能性修飾剤構築ブロックは、官能性部分または（必要であれば）保護された官能性部分をホスホラミダイト基に、その構築ブロックを成長しているオリゴヌクレオチド鎖の末端のヒドロキシル基に５’末端において（通常の合成）または３’末端において（逆向きの合成）取り付けるために連結する。
【０１０５】
二官能性修飾剤構築ブロックは、好ましくは非ヌクレオシド性化合物である。例えば、そのような修飾された構築ブロックはＣ２〜Ｃ１８アルキル、アルケニル、アルキニル炭素鎖であるが、前記のアルキル、アルケニル、アルキニル鎖はそのスペーサーの、それによりリンカー構造全体の親水性を増大させるために追加のエチレンオキシおよび／またはアミド部分により遮られていてよい。場合により１または２個のＣ１〜Ｃ６アルキル基で置換されているＣ５〜Ｃ６−シクロアルキル、Ｃ４Ｎ、Ｃ５Ｎ、Ｃ４Ｏ、Ｃ５Ｏ−ヘテロシクロアルキル、フェニルのような環状部分も、非ヌクレオシド性の二官能性修飾された構築ブロックとして用いることができる。好ましい修飾された二官能性構築ブロックは、Ｃ３〜Ｃ６アルキル部分およびトリ−〜ヘキサ−エチレングリコール鎖を含む。二官能性修飾剤構築ブロックの限定的でないが好ましい例を、下記の表ＩＩにおいて示す。
【０１０６】
【表２】
2014504157.tif 000003
【０１０７】
三官能性修飾剤構築ブロック
三官能性構築ブロックは、（ｉ）官能性部分または（必要であれば）保護された官能性部分、（ｉｉ）レポーターまたは官能性部分または（必要であれば）保護された官能性部分をオリゴヌクレオチド合成の間に成長しているオリゴヌクレオチド鎖のヒドロキシル基に連結するためのホスホラミダイト基、および（ｉｉｉ）酸不安定性保護基で、好ましくはジメトキシトリチル保護基で保護されているヒドロキシル基を連結する。この酸不安定性保護基を除去した後、ヒドロキシル基が解放され、それはさらなるホスホラミダイトと反応することができる。従って、三官能性構築ブロックは官能性部分をオリゴヌクレオチド内のあらゆる位置に配置することを可能にする。三官能性構築ブロックは、固体支持体、例えば制御細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）を用いる合成にも必須であり、それはオリゴヌクレオチドの３’末端標識のために用いられる。この場合、その三官能性構築ブロックは官能性部分または（必要であれば）保護された官能性部分にＣ２〜Ｃ１８アルキル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｉｎｙｌ）炭素鎖を介して連結されるが、前記のアルキル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｙｉｎｙｌ）鎖はそのスペーサーの、それによりリンカー構造全体の親水性を増大させるために追加のエチレンオキシおよび／またはアミド部分により遮られていてよく、切断可能なスペーサーを介して固体支持体に結合したヒドロキシル基および酸不安定性保護基で保護されたヒドロキシル基を含む。この保護基の除去の後、ヒドロキシル基が解放され、次いでそれはホスホラミダイトと反応することができるであろう。
【０１０８】
三官能性構築ブロックは非ヌクレオシド性またはヌクレオシド性であってよい。
非ヌクレオシド性三官能性構築ブロックはＣ２〜Ｃ１８アルキル、アルケニル、アルキニル炭素鎖であるが、前記のアルキル、アルケニル、アルキニルはそのスペーサーの、それによりリンカー構造全体の親水性を増大させるために追加のエチレンオキシおよび／またはアミド部分により遮られている。他の三官能性構築ブロックは、場合により１または２個のＣ１〜Ｃ６アルキル基で置換されているＣ５〜Ｃ６−シクロアルキル、Ｃ４Ｎ、Ｃ５Ｎ、Ｃ４Ｏ、Ｃ５Ｏヘテロシクロアルキル、フェニルのような環式基である。環式および非環式基は１個の−（Ｃ１〜Ｃ１８）アルキル−Ｏ−ＰＧ基により置換されていてよいが、前記のＣ１〜Ｃ１８アルキルは（エチレンオキシ）ｎ、（アミド）ｍ部分を含み、ｎおよびｍは互いに独立して０〜６であり、ＰＧは酸不安定性保護基である。好ましい三官能性構築ブロックは、場合により１個のアミド結合を含みＣ１〜Ｃ６アルキルＯ−ＰＧ基で置換されたＣ３〜Ｃ６アルキル、シクロアルキル、Ｃ５Ｏヘテロシクロアルキル部分であり、ここでＰＧは酸不安定性保護基、好ましくはモノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、ピキシル、キサンチル、最も好ましくはジメトキシトリチルである。
【０１０９】
非ヌクレオシド性三官能性構築ブロックに関する限定的でないが好ましい例が、例えば表ＩＩＩにおいて要約されている。
【０１１０】
【表３−１】
2014504157.tif 000004
【０１１１】
【表３−２】
2014504157.tif 000005
【０１１２】
ヌクレオシド性修飾剤構築ブロック：
ヌクレオシド性修飾剤構築ブロックは、未修飾のオリゴヌクレオチドと比較してそのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性に影響を及ぼさない必要がある場合に内部標識のために用いられる。従って、ヌクレオシド性構築ブロックは、なお相補的塩基とハイブリダイズすることができる塩基または塩基類似体を含む。本発明の式Ｉに従う結合剤中に含まれるａ、ａ’、ｂ、ｂ’またはＳの１個以上の核酸配列を標識するための標識化合物の一般式は、式ＩＩにおいて与えられる。
【０１１３】
【化１】
2014504157.tif 000006
【０１１４】
式中、ＰＧは酸不安定性保護基、好ましくはモノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、ピキシル、キサンチル、最も好ましくはジメトキシトリチルであり、ここでＹはＣ２〜Ｃ１８アルキル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｉｎｙｌ）であり、ここで前記のアルキル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｉｎｙｌ）はエチレンオキシおよび／またはアミド部分を含んでいてよく、ここでＹは好ましくはＣ４〜Ｃ１８アルキル、アルケニルまたはアルキニル（ａｌｋｉｎｙｌ）であり、１個のアミド部分を含有し、ここでＸは官能性部分である。
【０１１５】
その塩基の具体的な位置は、そのような置換に関してハイブリダイゼーション特性への影響が最小限になるように選択されてよい。従って、以下の位置が置換に関して好ましい：ａ）天然塩基に関して：Ｃ５で置換されたウラシル；Ｃ５で、またはＮ４で置換されたシトシン；Ｃ８で、またはＮ６で置換されたアデニン、およびＣ８で、またはＮ２で置換されたグアニン、ならびにｂ）塩基類似体に関して：Ｃ７で置換された７デアザＡおよび７デアザＧ；Ｃ７で置換された７デアザ８アザＡおよび７デアザ８アザＧ；Ｃ７で置換された７デアザアザ２アミノＡ；Ｎ１で置換されたプソイドウリジンおよびＮ２で置換されたホルマイシン。
【０１１６】
ヌクレオシド性三官能性構築ブロックに関する限定的でないが好ましい例を表ＩＶにおいて示す。
【０１１７】
【表４−１】
2014504157.tif 000007
【０１１８】
【表４−２】
2014504157.tif 000008
【０１１９】
【表４−３】
2014504157.tif 000009
【０１２０】
表ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶにおいて、二官能性部分の末端の酸素原子の１個または三官能性部分の末端の酸素原子の１個はホスホラミダイトの一部であり、それは完全に詳細には示されていないが当業者には明らかである。三官能性構築ブロックの第２の末端の酸素原子は、上記で式ＩＩに関して定義されたように、酸不安定性保護基ＰＧで保護されている。
【０１２１】
合成後修飾は、共有結合した官能性部分をリンカーまたはスペーサー分子中に導入するための別の戦略である。このアプローチにおいて、固相合成の間に二官能性または三官能性構築ブロックを用いることによりアミノ基が導入される。そのアミノ修飾されたオリゴヌクレオチドの支持体からの切断および精製の後、官能性部分の活性化されたエステルと、またはその中の１個の官能基が活性エステルである二官能性試薬と反応させる。好ましい活性エステルはＮＨＳエステルまたはペンタフルオロ（ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒ）フェニルエステル類である。
【０１２２】
合成後修飾は、固相合成および脱保護の間に安定でない官能性部分を導入するために特に有用である。例は、シュタウディンガーライゲーションのためのトリフェニルホスフィンカルボキシメチルエステルによる修飾(Wang, C.C. et al., Bioconjugate Chemistry 14 (2003) 697-701)、ジゴキシゲニンによる、または商業的に入手できるスルホＳＭＣＣを用いてマレインイミド基を導入するための修飾である。
【０１２３】
官能性部分Ｘは、１態様において、ａ’、ａ、ｂ、ｂ’またはＳの少なくとも１個に追加の結合対を介して結合している。
官能性部分Ｘを結合させることができる追加の結合対は、好ましくはロイシンジッパードメインまたはハイブリダイズする核酸である。その官能性部分Ｘがａ’、ａ、ｂ、ｂ’またはＳの少なくとも１個に追加の結合対のメンバーを介して結合している場合、Ｘが結合している結合対のメンバーならびに結合対ａ’：ａおよびｂ：ｂ’それぞれは全て異なる特異性を有するように選択される。その結合対ａ：ａ’、ｂ：ｂ’およびＸが結合している結合対はそれぞれ、その他の結合対のいずれの結合にも干渉せずに、それらのそれぞれのパートナーに結合する（例えばハイブリダイズする）。
【０１２４】
結合対のメンバーの一価結合剤への共有結合性カップリング
その結合剤の生化学的性質に応じて、異なるコンジュゲーション戦略がすぐに利用できる。
【０１２５】
その結合剤が５０〜５００アミノ酸の天然存在タンパク質または組み換えポリペプチドである場合、タンパク質コンジュゲートの合成に関する化学を記述する教本中に標準的な手順があり、当業者は容易にそれに従うことができる(Hackenberger, C.P. et al., Angew. Chem., Int. Ed., 47 (2008)10030-10074)。
【０１２６】
１態様において、マレインイミド部分のそのタンパク質内のシステイン残基との反応が用いられる。これは、例えば抗体のＦａｂまたはＦａｂ’断片が一価結合剤として用いられる場合に好ましいカップリング化学である。あるいは、１態様において、結合対のメンバー（式Ｉのａ’またはｂ’それぞれ）のその結合剤ポリペプチドのＣ末端へのカップリングが実施される。タンパク質の、例えばＦａｂ断片のＣ末端修飾は、例えば記述されたように実施することができる(Sunbul, Murat and Yin, Jun, Organic & Biomolecular Chemistry  7 (2009) 3361-3371)。
【０１２７】
一般に、結合対のメンバーの一価ポリペプチド性結合剤への部位特異的反応および共有結合性カップリングは、天然アミノ酸をタンパク質中に存在する他の官能基の反応性に対して直交性である反応性を有するアミノ酸に変換することに基づく。例えば、稀な配列前後関係（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｎｔｅｘｔ）内の特定のシステインをアルデヒド中で酵素的に変換することができる(Frese, M.-A. et al.,  ChemBioChem 10 (2009) 425-427参照)。特定の酵素の所与の配列前後関係中の天然アミノ酸との特異的な酵素反応性を利用することにより望まれるアミノ酸修飾を得ることも可能である（例えば以下の参考文献を参照：Taki, M. et al., Protein Engineering, Design & Selection 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al., Chemistry & Biology 15 (2008) 128-136;プロテアーゼに触媒されるＣ−Ｎ結合の形成がBordusa, F., HighlightsによりBioorganic Chemistry (2004) 389-403において用いられており、ソルターゼ（Ｓｏｒｔａｓｅ）に媒介されるタンパク質ライゲーションがMao, H.らによりJ. Am Chem Soc. 126 (2004) 2670-2671において用いられており、Proft, T.によりBiotechnol. Lett 32 (2010) 1-10において総説されている）。
【０１２８】
結合対のメンバーの一価ポリペプチド性結合剤への部位特異的反応および共有結合性カップリングは、末端のアミノ酸の適切な修飾試薬との選択的反応によっても達成することができる。
【０１２９】
Ｎ末端システインのベンゾニトリル類との反応性(Ren, Hongjun Xiao et al., Angewandte Chemie, International Edition 48 (2009) 9658-9662)を、部位特異的共有結合性カップリングを達成するために用いることができる。
【０１３０】
天然型（Ｎａｔｉｖｅ）化学的ライゲーションはＣ末端システイン残基に頼ることもできる(Taylor, E. Vogel, Imperiali, B., Nucleic Acids and Molecular Biology 22 (2009) (Protein Engineering) 65-96)。
【０１３１】
欧州特許第1 074 563号は、一続きの負に荷電したアミノ酸内のシステインの一続きの正に荷電したアミノ酸中に位置するシステインとのより速い反応に基づくコンジュゲーション法を記述している。
【０１３２】
その一価結合剤は、合成ペプチドまたはペプチド模倣物であってもよい。ポリペプチドが化学的に合成される場合、直交性化学反応性を有するアミノ酸をそのような合成の間に組み込むことができる(de Graaf, A.J. et al., Bioconjugate Chemistry 20 (2009) 1281-1295)。多種多様な直交性官能基が賭かっており（ａｔ  ｓｔａｋｅ）、合成ペプチド中に導入することができるため、そのようなペプチドのリンカー中へのコンジュゲーションは標準的な化学である。
【０１３３】
単一標識された（ｍｏｎｏ−ｌａｂｅｌｅｄ）タンパク質を得るため、１：１の化学量論を有するコンジュゲートをクロマトグラフィーにより他のコンジュゲーション産物から分離することができる。この手順は色素標識された結合対のメンバーおよび荷電したスペーサーを用いることにより促進される。この種類の標識された、および高度に負に荷電した結合対のメンバーを用いることにより、電荷および分子量の違いを分離のために用いることができるため、１コンジュゲート化タンパク質が未標識のタンパク質および１個より多くのリンカーを有するタンパク質から容易に分離される。その蛍光色素は、その結合剤を標識された一価結合剤のような未結合の構成要素から精製するために役立つ。
【０１３４】
従って、１態様において、本発明の結合剤を形成するために、（例えば合成の間に二官能性または三官能性修飾剤構築ブロックを二官能性スペーサー構築ブロックとの組み合わせで用いて合成された）蛍光色素で標識されている結合対のメンバー（式Ｉのａ’および／またはｂ’それぞれ）を用いることが好ましい。１つの好ましい態様において、そのスペーサーＳならびにその配列ａ、ａ’、ｂおよびｂ’はＤＮＡであり、ａ’またはｂ’それぞれの少なくとも一方は蛍光色素で標識されている。１つの好ましい態様において、そのスペーサーＳならびにその配列ａ、ａ’、ｂおよびｂ’はＤＮＡであり、ａ’およびｂ’それぞれは両方ともそれぞれ異なる蛍光色素で標識されている。
【０１３５】
１態様において、本発明は式Ｉ：Ａ−ａ’：ａ−Ｓ−ｂ：ｂ’−Ｂ：Ｘ（ｎ）の二重特異性結合剤に関し、ここでＡならびにＢは一価特異的結合剤であり、ここでａ’：ａならびにｂ：ｂ’は結合対を表し、ａ’：ａおよびｂ：ｂ’は異なる特異性を有し、ここでＳはスペーサーを表し、ここで（：Ｘ）はａ’、ａ、ｂ、ｂ’またはＳの少なくとも１つにさらなる結合対を介して結合した官能性部分を示し、ここで（ｎ）は整数であり、少なくとも１であり、ここで−は共有結合を表し、ここでそのリンカーａ−Ｓ−ｂは６〜１００ｎｍの長さを有する。
【０１３６】
１つの好ましい態様において、結合対ａ’：ａおよびｂ：ｂ’はハイブリダイズする核酸配列であり、官能性部分Ｘが結合しているさらなる結合対も核酸である。この態様において、好ましくはそのスペーサーＳは、その２個の特異的にハイブリダイズする配列ａおよびａ’ならびにｂおよびｂ’それぞれに加えて、それのまたはそれらの相補的な配列にハイブリダイズすることもできる１個以上のさらなる配列を含むように考えられる（ｃｏｎｓｔｒｕｅｄ）。この態様において、官能性部分ＸはそのスペーサーＳに、やはりハイブリダイズする核酸配列からなるさらなる結合対を介して結合している。
【０１３７】
本明細書で開示されるような結合剤の構築における使用のための一価結合剤は、１０−２／秒から１０−５／秒までのＫｄｉｓｓを有していなければならない。本明細書で開示されるような結合剤の構築における使用のための一価結合剤が１０−３／秒から１０−５／秒までのＫｄｉｓｓを有していなければならないことも好ましい。
【０１３８】
好ましくは、式Ｉに従う結合剤において、一価結合剤ＡおよびＢのそれぞれは、それぞれ１０−２／秒から１０−５／秒まで、好ましくは１０−３／秒から１０−５／秒までのＫｄｉｓｓを有する。
【０１３９】
好ましくは、式Ｉに従う結合剤は１０−５／秒またはよりよいＫｄｉｓｓを有し、１０−６／秒またはよりよいＫｄｉｓｓも好ましい。式Ｉに従う結合剤が１０−７／秒またはよりよいＫｄｉｓｓを有することも好ましい。
【０１４０】
当業者は理解しているであろうように、そのＫｄｉｓｓは温度依存性の値である。理論上、本発明に従う結合剤のＫｄｉｓｓ値は同じ温度で決定される。理解されるであろうように、好ましくはＫｄｉｓｓ値はその結合剤が用いられることになる、例えばアッセイが実施されることになる温度と同じ温度で決定される。１態様において、そのＫｄｉｓｓ値は室温で、すなわち２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃または２５℃それぞれで確立される。１態様において、そのＫｄｉｓｓ値は４または８℃それぞれで確立される。１態様において、そのＫｄｉｓｓ値は２５℃で確立される。１態様において、そのＫｄｉｓｓ値は３７℃で確立される。
【０１４１】
上記で既に言及したように、今では式Ｉで定義されるような結合剤を製造することが可能であり、非常に容易である。式Ｉに従う結合剤の完全なライブラリーを容易に提供、分析することができ、そのようなライブラリーからの最も強力な結合剤を必要に応じて大規模で製造することができる。
【０１４２】
上記で言及したライブラリーは式Ｉに従う結合剤の完全なセットを指し、ここでそれぞれのＡ、ａ、ａ’、ｂ、ｂ’およびＢは同一であり、ここでそのスペーサーＳの長さはその結合剤に関して提示された要求を最もよく満たすように調節される。まず、１〜１００ｎｍの範囲全体にわたり、約１０ｎｍ離れた段階（ｓｔｅｐｓ）を有するスペーサーのラダー（ｌａｄｄｅｒ）を用いることが容易に可能である。次いで、そのスペーサーの長さは、第１ラウンドで同定された最も適切な長さの周辺で再度容易にさらに精密化される。
【０１４３】
１態様において、本発明は式Ｉ：Ａ−ａ’：ａ−Ｓ−ｂ：ｂ’−Ｂ：Ｘ（ｎ）の結合剤を製造する方法に関し、ここでＡならびにＢは一価結合剤であり、ここでａ’：ａならびにｂ：ｂ’は結合対であり、ここでａ’およびａはｂのｂ’への結合に干渉せず、逆もまた同じであり、ここでＳは少なくとも１ｎｍの長さのスペーサーであり、ここで（：Ｘ）はａ’、ａ、ｂ、ｂ’またはＳの少なくとも１つに共有結合的にまたは結合対を介してのどちらかで結合した官能性部分を示し、ここで（ｎ）は整数であり、少なくとも１であり、ここで−は共有結合を表し、ここでそのリンカーａ−Ｓ−ｂは６〜１００ｎｍの長さを有し、その方法は以下の工程を含み：ａ）Ａ−ａ’およびｂ’−Ｂをそれぞれ合成し、ｂ）リンカーａ−Ｓ−ｂを合成し、そしてｃ）式Ｉの結合剤を形成し、ここでａ’、ａ、ｂ、ｂ’またはＳの少なくとも１つに結合した官能性部分Ｘは、工程ａ）、ｂ）またはｃ）において結合させる。
【０１４４】
この方法の好ましい態様において、様々な長さのスペーサーを有するいくつかのリンカー分子を合成し、様々な長さのスペーサーを含む式Ｉに従う結合剤の形成において用いて、その２個の一価結合剤のよりよい方を超える少なくとも５倍のＫｄｉｓｓにおける向上を有する結合剤（単数または複数）を選択する。１態様における望まれるＫｄｉｓｓを有する結合剤の選択は、実施例２．８において開示されるようなＢｉａＣｏｒｅ分析により実施される。
【０１４５】
本発明に従う結合剤は、例えば免疫アッセイにおいて分析物に強く結合させるために用いることができる。例えば分析物が少なくとも２個の重複しないエピトープを有する場合、本発明の結合剤は、そのスペーサーＳがこれらのエピトープに対する一価結合剤の相乗的結合のための最適な長さを有するように考えられる（ｃｏｎｓｔｒｕｅｄ）。この向上は、例えばそのような結合剤を用いる分析物の検出のための方法において非常に有用であり得る。従って、１態様において、本発明は、目的の分析物の検出における本明細書において上記で開示したような結合剤の使用に関する。特定の態様において、用いられる検出法は、あらゆる適切なシグナル検出の方法、例えば電気化学発光を用いる酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、直接的、間接的、競合的もしくはサンドイッチ免疫アッセイであり、またはその結合剤は免疫組織化学において用いられる。
【０１４６】
以下の実施例、配列リストおよび図は本発明の理解を助けるために提供されており、その正確な範囲は添付された特許請求の範囲において述べられている。述べられた手順において本発明の精神から逸脱することなく修正を行うことができることは理解されている。
【０１４７】
配列リストの記述
１．抗体断片
【０１４８】
【化２】
2014504157.tif 000010
【０１４９】
２．ｓｓＤＮＡの配列
ａ）１７塩基長ｓｓＤＮＡ（５’末端により抗トロポニンＴ  ＭＡＢ  ａのＦａｂ’またはＩＧＦ−１Ｒに対するＦａｂ’  １．４．１６８それぞれに共有結合している）
5’-AGT TCT ATC GTC GTC CA-3’(SEQ ID NO:5)
ｂ）１９塩基長ｓｓＤＮＡ（３’末端により抗トロポニンＴ  ＭＡＢ  ｂのＦａｂ’またはリン酸化されたＩＧＦ−１Ｒに対するＦａｂ’  ８．１．２それぞれに共有結合している）
5’-A GTC TAT TAA TGC TTC TGC-3’(SEQ ID NO:6)
ｃ）相補性１９塩基長ｓｓＤＮＡ（リンカーの一部として用いられる）
5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-3’(SEQ ID NO:7)
ｄ）相補性１７塩基長ｓｓＤＮＡ（リンカーの一部として用いられる）
5’-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’(SEQ ID NO:8)
３．トロポニンＴエピトープの配列
SEQ ID NO:9 = ERAEQQRIRAEREKEUUSLKDRIEKRRRAERAEアミド、ここでＵはβアラニンを表す。（抗トロポニン抗体ａに関するエピトープ“Ａ”）
SEQ ID NO:10 = SLKDRIERRRAERAEOOERAEQQRIRAEREKEアミド、ここでＯはアミノ−トリオキサ−オクタン酸を表す。（抗トロポニン抗体ｂに関するエピトープ“Ｂ”）
４．ＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲエピトープの配列：
SEQ ID NO:11 = FDERQPYAHMNGGRKNERALPLPQSST; IGF-1R (1340〜1366)
SEQ ID NO:12 = YEEHIPYTHMNGGKKNGRILTLPRSNPS; hIR(1355〜1382)
５．タンパク質リンカーおよびタグ配列：
SEQ ID NO:13 = GGGGS (=G4S)モチーフ（例えばポリペプチドリンカーの一部として）
SEQ ID NO:14 = YPYDVPDYA （ＨＡ−タグ）
SEQ ID NO:15 = GLNDIFEAQKIEWHE （Ａｖｉ−タグ）
図の説明
図１  抗ｐＩＧＦ１−Ｒ二重結合剤の組み立ての効率を評価する分析的ゲル濾過実験。線図ａ、ｂおよびｃは、個々の二重結合剤構成要素（フルオレセイン−ｓｓＦａｂ’  １．４．１６８、Ｃｙ５−ｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびリンカーＤＮＡ（Ｔ＝０）；Ｆａｂ’は一本鎖オリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたＦａｂ’断片を意味する）の溶離プロフィールを示す。線図ｄは、二価結合剤を形成するのに必要な３種類の構成要素を１：１：１のモル比で混合した後の溶離プロフィールを示す。より太い（一番下の）曲線は、ｓｓＦａｂ’タンパク質またはリンカーＤＮＡそれぞれの存在を示す２８０ｎｍにおいて測定された吸光度を表す。ｂ）およびｄ）におけるより細い一番上の曲線（４９５ｎｍにおける吸光度）はフルオレセインの存在を示し、ａ）におけるより細い一番上の曲線およびｄ）における中央の曲線（６３５ｎｍにおける吸光度）は、Ｃｙ５の存在を示す。単一の二重結合剤の構成要素の溶離体積（ＶＥｓｓＦａｂ’  １．４．１６８  約１５ｍｌ；ＶＥｓｓＦａｂ’  ８．１．２  約１５ｍｌ；ＶＥリンカー  約１６ｍｌ）の反応混合物の溶離体積（ＶＥ混合物  約１２ｍｌ）との比較は、二重結合剤組み立て反応が成功であったことを示す（収率：約９０％）。溶離された二重結合剤に相当する主な２８０ｎｍのピークは、４９５ｎｍおよび６３５ｎｍのチャンネルにおける主なピークとうまく重なっており、二価結合剤に相当するピーク中にｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８の両方が存在することを証明している。
【０１５０】
図２  Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）実験のスキーム。模式的および例示的に、溶液中の２種類の結合分子を示す：Ｔ０−Ｔ−Ｄｉｇ（リンカー１６）、二価結合剤およびＴ４０−Ｔ−Ｄｉｇ（リンカー１５）、二価結合剤。これら両方の二価結合剤はそれらのリンカーの長さにおいてのみ異なる（２個のハイブリダイズする核酸配列の間に追加のＴを有しない中心のジゴキシゲニン化された（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｙｌａｔｅｄ）Ｔ対４０個の追加のＴ（中心のＴ−Ｄｉｇのそれぞれの側に２０個）を有する中心のジゴキシゲニン化されたＴ）。さらに、ｓｓＦａｂ’断片８．１．２および１．４．１６８を用いた。
【０１５１】
図３  １００ｎＭ二価結合剤（Ｔ４０−Ｔ−Ｄｉｇ  ｓｓＤＮＡリンカー、すなわちリンカー１５上にハイブリダイズしたｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８からなる）の固定されたペプチドｐＩＧＦ−１Ｒとの相互作用を、１００ｎＭ  ｓｓＦａｂ’  １．４．１６８または１００ｎＭ  ｓｓＦａｂ’  ８．１．２の同じペプチドに対する結合特性と比較して示す、３つの速度論を重ねてプロットしたＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）。最も高い結合性能は二重結合剤コンストラクトを用いて得られ、これはその二重結合剤の協同的結合作用が標的ペプチドｐＩＧＦ−１Ｒに対する親和性を増大させることを明確に示している。
【０１５２】
図４  Ｔ４０−Ｔ−Ｄｉｇ  ｓｓＤＮＡリンカー、すなわちリンカー１５上にハイブリダイズしたｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８からなる二価結合剤の固定されたペプチドｐＩＧＦ−１Ｒ（リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒ）、ＩＧＦ−１ＲまたはｐＩＲ（リン酸化されたインスリン受容体）との相互作用を示す３つの速度論を重ねてプロットしたＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。最も高い結合性能はｐＩＧＦ−１Ｒペプチドで得られ、これは二重結合剤の協同的結合作用が標的ペプチドｐＩＧＦ−１Ｒに対する特異性を例えばリン酸化されたインスリン受容体ペプチド（ｐＩＲ）と比較して増大させることを明確に示している。
図５  Ｔ４０−Ｔ−Ｄｉｇ  ｓｓＤＮＡリンカー、すなわちリンカー１５上にハイブリダイズしたｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８からなる１００ｎＭ二価結合剤ならびにリンカーＤＮＡを有しない１００ｎＭ  ｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８の混合物の相互作用を示す２つの速度論を重ねてプロットしたＢｉａｏｒｅ（商標）センサーグラム。最高の結合性能は二価結合剤を用いてのみ得られ、一方でリンカーを有しないｓｓＦａｂ’の混合物は、これらのｓｓＦａｂ’の合計濃度が２００ｎＭであったという事実にも関わらず、観察可能な協同的結合作用を示さない。
【０１５３】
図６  Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）サンドイッチアッセイの概略図。このアッセイは、両方の抗体のリン酸化されたＩＧＦ−１Ｒペプチドへのエピトープ接近可能性を調べるために用いられた。＜ＭＩｇＧＦｃｙ＞Ｒはマウス抗体Ｍ−１．４．１６８を捕捉するために用いられたウサギ抗マウス抗体を示す。次いでＭ−１．４．１６８を用いてｐＩＧＦ−１Ｒペプチドを捕捉する。Ｍ−８．１．２が最終的にＭ−１．４．１６８、ペプチドおよびＭ−８．１．２からなるサンドイッチを形成する。
【０１５４】
図７  二次抗体８．１．２のｐＩＧＦ−１Ｒペプチドに対する、これがＢｉａｃｏｒｅ（商標）チップ上で抗体１．４．１６８により捕捉された後の結合シグナル（太線）を示すＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。その他のシグナル（細い線）は対照シグナルである：一番上から一番下に向かって、それぞれ５００ｎＭの８．１．２、５００ｎＭの１．４．１６８；５００ｎＭの標的と無関係の抗体＜ＣＫＭＭ＞Ｍ−３３−ＩｇＧ；および５００ｎＭの標的と無関係の対照抗体＜ＴＳＨ＞Ｍ−１．２０−ＩｇＧの線を示す。これらの対照にいずれにおいても結合事象を検出することはできなかった。
【０１５５】
図８  センサー表面上のビオチン化二重結合剤を示す、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイの概略図。フローセル１（＝ＦＣ１）（示していない）上で、アミノ−ＰＥＯ−ビオチンを捕捉させた。ＦＣ２、ＦＣ３およびＦＣ４上で、増大するリンカーの長さを有する二価結合剤を固定した（ＦＣ２上の二重結合剤（Ｔ０−ｂｉ＝１個の中央のＴ−Ｂｉのみ）およびＦＣ４上の二重結合剤（Ｔ４０−ｂｉ＝１個の中央のＴ−Ｂｉならびに上流および下流それぞれの２０個のＴ）をそれぞれ示す）。分析物１：そのペプチドの右側の末端においてＭ−１．４．１６８  ｓｓＦａｂ’エピトープを含有するＩＧＦ−１Ｒペプチド（一番上の線）−このペプチドはリン酸化されていないため、Ｍ−８．１．２  ｓｓＦａｂ’ホスホ−エピトープは存在しない；分析物２：Ｍ−８．１．２  ｓｓＦａｂ’ホスホ−エピトープ（Ｐ）およびＭ−１．４．１６８  ｓｓＦａｂ’エピトープを含有するｐＩＧＦ−１Ｒペプチド（２番目の線）；分析物３：交差反応するＭ−８．１．２  ｓｓＦａｂ’ホスホ−エピトープを含有するがＭ−１．４．１６８  ｓｓＦａｂ’に関するエピトープは含有しない、ｐＩＲペプチド（３番目の線）。
【０１５６】
図９  二重結合剤実験の速度論データ。ｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８を有するＴ４０−Ｔ−Ｂｉリンカー二重結合剤（＝図中のＴ４０）は、ｐＩＧＦ−１Ｒに対して、ｐＩＲ（ｋｄ＝３．７０Ｅ−０２／ｓ）と比較した場合に１３００倍低い解離速度（ｋｄ＝２．７９Ｅ−０５／ｓ）を示す。
【０１５７】
図１０  Ｔ４０−Ｔ−Ｂｉ二重結合剤のｐＩＧＦ−１Ｒペプチド（リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒペプチド）に対する濃度依存的測定を示すＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。そのアッセイの構成は図８において示されている通りである。ｐＩＧＦ−１Ｒペプチドの濃度系列は、３０ｎＭ、１０ｎＭ、２×３．３ｎＭ、１．１ｎＭ、０．４ｎＭ、０ｎＭで注入された。対応するデータが図９の表において示されている。
【０１５８】
図１１  Ｔ４０−Ｔ−Ｂｉ二重結合剤のＩＧＦ−１Ｒペプチド（リン酸化されていないＩＧＦ−１Ｒペプチド）に対する濃度依存的測定を示すＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。そのアッセイの構成は図８において示されている通りである。ＩＧＦ−１Ｒペプチドの濃度系列は、３００ｎＭ、１００ｎＭ、２×３３ｎＭ、１１ｎＭ、４ｎＭ、０ｎＭで注入された。対応するデータが図９の表において示されている。
【０１５９】
図１２  Ｔ４０−Ｔ−Ｂｉ二重結合剤のｐＩＲペプチド（リン酸化されたインスリン受容体ペプチド）に対する濃度依存的測定を示すＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。そのアッセイの構成は図８において示されている通りである。ｐＩＲペプチドの濃度系列は、１００ｎＭ、２×３３ｎＭ、１１ｎＭ、４ｎＭ、０ｎＭで注入された。対応するデータを図９として示した表において示す。
【実施例】
【０１６０】
実施例１
トロポニンＴに対する二価結合剤
１．１  モノクローナル抗体およびＦａｂ’断片
ヒト心臓トロポニンＴに異なる重複しないエピトープ（それぞれエピトープＡ’およびエピトープＢ’）で結合する２種類のモノクローナル抗体を用いた。これらの抗体は両方とも最新のＲｏｃｈｅ  Ｅｌｅｃｓｙｓ（商標）トロポニンＴアッセイにおいて用いられ、ここでトロポニンＴはサンドイッチ免疫アッセイの形式で検出される。
【０１６１】
モノクローナル抗体の培養上清からの精製は、タンパク質化学の現状技術の方法を用いて実施された。
その精製されたモノクローナル抗体を、予め活性化した（ｐｒｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）パパイン（抗エピトープＡ’  ＭＡｂ）またはペプシン（抗エピトープＢ’  ＭＡｂ）のどちらかを用いてプロテアーゼ消化するとＦ（ａｂ’）２断片が得られ、続いてそれを低濃度のシステアミンを用いて３７℃で還元すると、Ｆａｂ’断片、すなわち式Ｉ（Ａ−ａ’：ａ−Ｓ−ｂ：ｂ’−Ｂ：Ｘｎ）におけるＡおよびＢそれぞれになる。その反応を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でシステアミンをその試料のポリペプチド含有部分から分離することにより停止する。
【０１６２】
１．２  Ｆａｂ’断片のｓｓＤＮＡ−オリゴヌクレオチドへのコンジュゲーション
そのＦａｂ’断片を、下記で記述する活性化されたｓｓＤＮＡａおよびｓｓＤＮＡｂオリゴヌクレオチドとコンジュゲートさせる。
【０１６３】
Ｆａｂ−断片−ｓｓＤＮＡコンジュゲートＡ”およびＢ”それぞれの調製：
ａ）Ｆａｂ’−抗トロポニンＴ＜エピトープＡ’＞−ｓｓＤＮＡ−コンジュゲート（＝Ａ”）
Ｆａｂ’−抗トロポニンＴ＜エピトープＡ’＞−ｓｓＤＮＡａ−コンジュゲートＡ”の調製のために、SED ID NO:5の誘導体、すなわち5’-AGT CTA TTA ATG CTT CTG C(=SEQ ID NO:5)-XXX-Y-Z-3’が用いられ、ここでX＝ホスホラミダイトC3 (3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)により導入されたプロピレン−ホスフェートであり、ここでY＝3’-アミノ修飾剤TFAアミノC-6 lcaa CPG (ChemGenes)により導入された3’-アミノ-修飾剤C6であり、ここでZ＝スルホスクシンイミジル 4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート(ThermoFischer)により導入された4[N-マレインイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシである。
【０１６４】
ｂ）Ｆａｂ’−抗トロポニンＴ＜エピトープＢ’＞−ｓｓＤＮＡｂ−コンジュゲート（＝Ｂ”）
Ｆａｂ’−抗トロポニンＴ＜エピトープＢ’＞−ｓｓＤＮＡ−コンジュゲート（Ｂ”）の調製のために、SED ID NO:6の誘導体、すなわち5’-Y-Z-XXX-AGT TCT ATC GTC GTC CA-3’が用いられ、ここでX＝ホスホラミダイトC3 (3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)により導入されたプロピレン−ホスフェートであり、ここでY＝(6-(4-モノメトキシトリチルアミノ)ヘキシル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト(Glen Research)により導入された5'-アミノ-修飾剤C6であり、Z＝スルホスクシンイミジル 4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート(ThermoFischer)により導入された4[N-マレインイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシである。
【０１６５】
SEQ ID NO:5または6のオリゴヌクレオチドはそれぞれ現状技術のオリゴヌクレオチド合成法により合成された。そのマレインイミド基の導入は、Yのアミノ基のZのスクシンイミジル基との反応により行われ、それは固相オリゴヌクレオチド合成プロセスの間に組み込まれた。
【０１６６】
上記で示した一本鎖ＤＮＡコンストラクトはチオール反応性マレイミド基を有し、それはシステアミン処理により生成されたＦａｂ’のヒンジ領域のシステインと反応する。高い百分率の単一標識されたＦａｂ’断片を得るため、ｓｓＤＮＡのＦａｂ’断片に対する相対的なモル比は低く保たれる。単一標識されたＦａｂ’断片（ｓｓＤＮＡ：Ｆａｂ’＝１：１）の精製は、陰イオン交換クロマトグラフィー（カラム：ＭｏｎｏＱ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により行われる。効率的な標識および精製の検証は、分析的ゲル濾過クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより達成される。
【０１６７】
１．３  ビオチン化されたリンカー分子
ｓｓＤＮＡリンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３それぞれにおいて用いられるオリゴヌクレオチドは、現状技術のオリゴヌクレオチド合成法により、ビオチン化に関してビオチン化ホスホラミダイト試薬を用いて合成された。
【０１６８】
リンカー１（＝Ｌ１）（ビオチン化チミジンの他にスペーサーを有しないビオチン化ｓｓＤＮＡリンカー１）は、以下の組成を有する：5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T (ビオチン-dT)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’。それはそれぞれSEQ ID NO:7および8のｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、そのスペーサーの中央においてビオチン-dT (=T-Bi) (5’-ジメトキシトリチルオキシ-5-[N-((4-t-ブチルベンゾイル)-ビオチニル)-アミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン-3’-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)の使用によりビオチン化された。
【０１６９】
リンカー２（＝Ｌ２）（１１塩基長のスペーサーを有するビオチン化ｓｓＤＮＡリンカー２）は、以下の組成を有する：
5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T5-(ビオチン-dT)-T5 TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’。それはそれぞれSEQ ID NO:7および8のｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド、それぞれ５個のチミジンからなる２回のオリゴヌクレオチドの一続きを含み、そのスペーサーの中央においてビオチン-dT (5’-ジメトキシトリチルオキシ-5-[N-((4-t-ブチルベンゾイル)-ビオチニル)-アミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン-3’-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)の使用によりビオチン化された。
【０１７０】
リンカー３（＝Ｌ３）（３１塩基長のスペーサーを有するビオチン化ｓｓＤＮＡリンカー３）は、以下の組成を有する：
5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T15-(ビオチン-dT)-T15 TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’。それはそれぞれSEQ ID NO:7および8のｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド、それぞれ１５個のチミジンからなる２回のオリゴヌクレオチドの一続きを含み、ビオチン-dT (5’-ジメトキシトリチルオキシ-5-[N-((4-t-ブチルベンゾイル)-ビオチニル)-アミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン-3’-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)の使用によりビオチン化された。
【０１７１】
１．４  一価トロポニンＴ結合剤ＡおよびＢそれぞれに関するエピトープ
抗トロポニンＴ抗体ａおよびｂそれぞれに由来する対応するＦａｂ’断片に対してそれぞれ中程度の親和性しか有しない合成ペプチドが考えられた（ｃｏｎｓｔｒｕｅｄ）。
【０１７２】
ａ）抗体ａに関するエピトープＡ’は次の配列中に含まれ：
SEQ ID NO:9 = ERAEQQRIRAEREKEUUSLKDRIEKRRRAERAEアミド
ここでUはβアラニンを表す。
【０１７３】
ｂ）抗体ｂに関するエピトープＢ’は次の配列中に含まれ：
SEQ ID NO:10 = SLKDRIERRRAERAEOOERAEQQRIRAEREKEアミド
ここでOはアミノ-トリオキサ-オクタン酸を表す。
【０１７４】
当業者は理解するであろうように、これら２種類のエピトープを含有するペプチドを２通りで組み合わせることが可能であり、両方の変種はエピトープＡ’およびＢ’を線状に組み合わせることにより設計および調製された。両方の変種の配列：エピトープの線状配列Ａ’−Ｂ’（＝ＴｎＴ−１）およびＢ’−Ａ’（＝ＴｎＴ−２）はそれぞれ現状技術のペプチド合成法により調製された。
【０１７５】
エピトープＡ’およびＢ’に関する配列はそれぞれ、ヒトの心臓トロポニンＴの配列（Ｐ４５３７９／ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）上の本来のエピトープと比較してそれらに対するＦａｂのそれぞれに関する結合親和性を低減するために修正されていた。これらの状況下で、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）技術により結合親和性を分析することにより、ヘテロ二価結合の作用の動態をよりよく観察することができる。
【０１７６】
１．５  生体分子相互作用分析
この実験に関して、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、系の中に取り付けられたＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＳＡセンサーと共にＴ＝２５℃で用いた。前条件付け（Ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）は１００μｌ／分で５０ｍＭ  ＮａＯＨ中の１Ｍ  ＮａＣｌの３×１分間の注入および１分間の１０ｍＭ  ＨＣｌの注入で行われた。
【０１７７】
ＨＢＳ−ＥＴ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）をシステム緩衝液として用いた。試料緩衝液はシステム緩衝液と同一であった。
【０１７８】
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００システムは制御ソフトウェアＶ１．１．１の下で運転された。フローセル１を７ＲＵのＤ−ビオチンで飽和させた。フローセル２上に１０６３ＲＵのビオチン化ｓｓＤＮＡリンカーＬ１を固定した。フローセル３上に８７９ＲＵのビオチン化ｓｓＤＮＡリンカーＬ２を固定した。フローセル４上に６７４ＲＵのビオチン化ｓｓＤＮＡリンカーＬ３を捕捉させた。
【０１７９】
その後、Ｆａｂ’断片ＤＮＡコンジュゲートＡ”を６００ｎＭで注入した。Ｆａｂ’断片ＤＮＡコンジュゲートＢ”をシステム中に９００ｎＭで注入した。そのコンジュゲートを２μｌ／分の流速で３分間注入した。そのコンジュゲートを連続的に注入してそれぞれのＦａｂ’断片ＤＮＡコンジュゲートのそのそれぞれのリンカー上でのそれぞれの飽和シグナルを監視した。Ｆａｂ’の組み合わせは、それぞれのリンカー上に存在する単一のＦａｂ’断片ＤＮＡコンジュゲートＡ”、単一のＦａｂ’断片ＤＮＡコンジュゲートＢ”ならびに両方のＦａｂ’断片ＤＮＡコンジュゲートＡ”およびＢ”を用いて駆動された（ｄｒｉｖｅｎ）。安定なベースラインはそのリンカーがＦａｂ’断片ＤＮＡコンジュゲートにより飽和された後に生成され、それはさらなる速度論的測定のための必要条件であった。
【０１８０】
人工のペプチド分析物ＴｎＴ−１およびＴｎＴ−２を、溶液中の分析物として、表面に提示されたＦａｂ’断片と相互作用させるためにそのシステム中に注入した。
ＴｎＴ−１を５００ｎＭの分析物濃度で注入し、ＴｎＴ−２を９００ｎＭの分析物濃度で注入した。両方のペプチドを５０μｌ／分で４分間の会合時間で注入した。解離を５分間監視した。全てのフローセルに関して、５０ｍＭ  ＮａＯＨの５０μｌ／分での１分間の注入により再生を行った。
【０１８１】
速度論データをＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｖ．４．１）を用いて決定した。ＴｎＴ−１およびＴｎＴ−２ペプチドのそれぞれの表面に提示されたＦａｂ’断片の組み合わせからの解離速度ｋｄ（１／ｓ）を、線形ラングミュア１：１当てはめ（ｆｉｔｔｉｎｇ）モデルに従って決定した。その複合体の分での半減時間を一次速度方程式：ｌｎ（２）／（６０＊ｋｄ）の解法に従って計算した。
【０１８２】
結果：
表１および２それぞれにおいて示した実験データは、分析物（ＴｎＴ−１またはＴｎＴ−２）それぞれおよび様々なヘテロ二価Ｆａｂ’−Ｆａｂ’二量体Ａ”−Ｂ”の間の複合体の安定性における一価ｄｓＤＮＡ  Ｆａｂ’Ａ”またはＢ”コンジュゲートそれぞれと比較した場合の増大を実証している。この作用はそれぞれの表において２および３行目（ｌｉｎｅ）と比較した１行目において見られる。
【０１８３】
【表５】
2014504157.tif 000011
【０１８４】
【表６】
2014504157.tif 000012
【０１８５】
その結合活性作用はさらにそのリンカーの長さに依存している。表１の下に示した副表（ｓｕｂ−ｔａｂｌｅｓ）において、すなわち人工分析物ＴｎＴ−１に関して、３１塩基長のチミジンに基づくスペーサーを含むリンカーＬ３は最低の解離速度または最高の複合体安定性を示す。
【０１８６】
表２の下に示した副表において、１１塩基長のチミジンに基づくスペーサーを含むリンカーＬ２は人工分析物ＴｎＴ−２に関して最低の解離速度または最高の複合体安定性を示す。
【０１８７】
これらのデータをまとめると、本発明において与えられるアプローチに本来備わっているようなリンカーの長さにおける柔軟性は非常に有用かつ好都合であることを実証している。
【０１８８】
実施例２
リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒに対する二価結合剤
２．１  モノクローナル抗体の開発（ｍＡｂ  ８．１．２およびｍＡｂ  １．４．１６８）
ａ）マウスの免疫処置
ＢＡＬＢ／Ｃマウスを０、３、６および９週目においてそれぞれ免疫する。免疫処置あたり１００μｇのリン酸化されたペプチドｐＩＧＦ−１Ｒ（１３４０〜１３６６）(SEQ ID NO:11)を含むコンジュゲートを用いる。このペプチドは、チロシン１３４６においてリン酸化され（＝１３４６−ｐＴｙｒ）、Ｃ末端のシステインを介してＫＬＨに連結されて（＝Ａｏｃ−Ｃｙｓ−ＭＰ−ＫＬＨ−１３４０）、免疫処置のために用いられるコンジュゲートがもたらされた。０および６週目それぞれにおいて腹腔内に、３および９週目それぞれにおいてマウスの体の様々な部分において皮下に（ｓｕｂｃｕｔａｎｕｏｓｌｙ）免疫処置を実施する。
【０１８９】
ｂ）融合およびクローニング
免疫したマウスの脾臓細胞を、Galfre G., and Milstein C., Methods in Enzymology 73 (1981) 3-46に従って骨髄腫細胞と融合させる。このプロセスにおいて、免疫したマウスの約１×１０８個の脾臓細胞を２×１０７個の骨髄腫細胞ａ（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８６５３、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）と混合し、遠心分離する（２５０ｇおよび３７℃において１０分間）。次いでその細胞をウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含まないＲＰＭＩ  １６４０培地で１回洗浄し、５０ｍｌコニカルチューブ中で２５０ｇで再度遠心分離する。上清を廃棄し、細胞沈降物をタッピングにより穏やかにほぐし、１ｍｌのＰＥＧ（分子量４０００、Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット）を添加し、ピペット操作により混合する。３７℃の水浴中で１分間保温した後、５ｍｌのＦＣＳを含まないＲＰＭＩ  １６４０を室温で４〜５分の期間内に滴加する。この工程をさらに１０ｍｌのＦＣＳを含まないＲＰＭＩ  １６４０を用いて繰り返す。その後、２５ｍｌの１０％  ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０を添加し、続いて３７℃、５％ＣＯ２において３０分間の保温工程を行う。２５０ｇおよび４℃において１０分間の遠心分離の後、その沈降した細胞を１０％  ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０中に回収し、ヒポキサンチン−アザセリン選択培地（ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％  ＦＣＳ中１００ｍｍｏｌ／ｌヒポキサンチン、１μｇ／ｍｌアザセリン）中で蒔く。１００Ｕ／ｍｌのインターロイキン６をその培地に増殖因子として添加する。７日後、その培地を新しい培地と交換する。１０日目に、その初代培養物を特異的な抗体に関して試験する。陽性の初代培養物を、蛍光活性化セルソーターにより、９６ウェル細胞培養プレートにおいてクローニングする。
【０１９０】
ｃ）細胞培養上清からの免疫グロブリンの単離
得られたハイブリドーマ細胞をＣＥＬＬｉｎｅ  １０００  ＣＬフラスコ（Ｉｎｔｅｇｒａ）中で１×１０７細胞の密度で蒔く。ＩｇＧを含有するハイブリドーマ細胞上清を週２回収集する。収量は典型的には１ｍｌの上清あたり４００μｇ〜２０００μｇのモノクローナル抗体の範囲である。抗体の培養上清からの精製は、タンパク質化学の一般的に用いられる方法を用いて（例えばBruck, C., Methods in Enzymology 121 (1986) 587-695に従って）実施した。
【０１９１】
２．２  ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの合成
それぞれSEQ ID NO: 5および6において示した配列を含む、以下のアミノ修飾された前駆体を、標準的な方法に従って合成した。下記で示したオリゴヌクレオチドは、いわゆるアミノリンカーだけでなく蛍光色素も含む。当業者はすぐに理解するであろうように、この蛍光色素はオリゴヌクレオチド自体の、ならびにそれらを含む構成要素の精製を促進するために非常に好都合である。
【０１９２】
ａ）  5’-フルオレセイン-AGT CTA TTA ATG CTT CTG C-(スペーサーC3)3-C7アミノリンカー-;
ｂ）  5’-Cy5 AGT CTA TTA ATG CTT CTG C-(スペーサーC3)3-C7アミノリンカー-;
ｃ）  5’-アミノリンカー-(スペーサーC3)3-AGT TCT ATC GTC GTC CA-フルオレセイン-3’;
ｄ）  5’-フルオレセイン-(ベータL AGT CTA TTA ATG CTT CTG C)-(スペーサーC3)3-C7アミノリンカー-;（ベータLはこれがＬ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドであることを示す）および
ｅ）  5’-アミノリンカー-(スペーサーC3)3-(ベータL-AGT TCT ATC GTC GTC CA)-フルオレセイン-3’（ベータLはこれがＬ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドであることを示す）。
【０１９３】
合成はＡＢＩ  ３９４合成装置上で１０μｍｏｌスケールで、（５’アミノ修飾に関して）トリチルオンまたは（３’アミノ修飾に関して）トリチルオフモードで、固体支持体として商業的に入手可能なＣＰＧを、ならびに標準的なｄＡ（ｂｚ）、ｄＴ、ｄＧ（ｉＢｕ）およびｄＣ（Ｂｚ）ホスホラミダイト（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて実施された。
【０１９４】
オリゴヌクレオチド合成の間に以下のアミダイト類、アミノ修飾剤およびＣＰＧ支持体を用いてＣ３スペーサー、色素およびアミノ部分をそれぞれ導入した：
スペーサーホスホラミダイトC3(3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research);
5’アミノ修飾剤は、5’-アミノ-修飾剤C6(6-(4-モノメトキシトリチルアミノ)ヘキシル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト(Glen Research)を用いることにより導入する;
5’-フルオレセインホスホラミダイト  6-(3',6'-ジピバロイルフルオレセイニル-6-カルボキサミド)-ヘキシル-1-O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト(Glen Research);
Cy5（商標）ホスホラミダイト  1-[3-(4-モノメトキシトリチルオキシ)プロピル]-1'-[3-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピルホスホラミジチル]プロピル]-3,3,3',3'-テトラメチルインドジカルボシアニンクロリド(1-[3-(4-monomethoxytrityloxy)propyl]-1'-[3-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl phosphoramidityl]propyl]-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanine chloride)(Glen Research);
LightCyclerフルオレセインCPG 500 A (Roche Applied Science);および
3’-アミノ修飾剤TFAアミノC-6 lcaa CPG 500 A (Chemgenes)。
【０１９５】
Cy5標識されたオリゴヌクレオチドに関して、dA(tac)、dT、dG(tac)、dC(tac)ホスホラミダイト(Sigma Aldrich)を用いて、３３％アンモニアによる脱保護を室温で２時間実施した。
【０１９６】
Ｌ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ベータ-L-dA(bz)、dT、dG(iBu)およびdC(Bz)ホスホラミダイト(Chemgenes)を用いることにより合成された。
フルオレセイン修飾されたハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの精製は、２工程の手順により実施された：まず、そのオリゴヌクレオチドを逆相HPLC(Merck-Hitachi-HPLC; RP-18カラム;勾配系[A: 0.1 M (Et3NH)OAc (pH 7.0)/MeCN 95:5; B: MeCN]: 3分間のA中20% B、12分間のA中20〜50% Bおよび25分間のA中20% B、1.0 ml/分の流速、260 nmにおいて検出)上で精製した。望まれる生成物を含有する画分（分析的RP HPLCにより監視した）を合わせ、蒸発させて乾燥させた（５’末端においてモノメトキシトリチル保護されたアルキルアミノ基で修飾されたオリゴヌクレオチドは、２０％酢酸と共に２０分間保温することにより脱トリチル化する）。フルオレセインを標識として含有するオリゴマーは、HPLC上でのIEXクロマトグラフィー[Mono Qカラム：緩衝液A：水酸化ナトリウム(10 mM/l; pH約12)；緩衝液B：水酸化ナトリウム(10 mM/l; pH約12)中で溶解させた1M塩化ナトリウム；勾配：３０分間で100%緩衝液Aから100%緩衝液Bまで、流速1 ml/分、260 nmにおいて検出]により再度精製した。その生成物を透析により脱塩した。
【０１９７】
Cy5標識されたオリゴマーは、逆相ＨＰＬＣ上での最初の精製(Merck-Hitachi-HPLC; RP-18カラム;勾配系[A: 0.1 M (Et3NH)OAc (pH 7.0)/MeCN 95:5; B: MeCN]:3分間のA中20% B、12分間のA中20〜50% Bおよび25分間のA中20% B、1.0 ml/分の流速、260 nmにおいて検出)の後に用いられた。そのオリゴマーを透析により脱塩し、Speed-Vacエバポレーター上で凍結乾燥させると固体が得られ、それを-24℃で凍結させた。
【０１９８】
２．３  ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの活性化
実施例２からのアミノ修飾されたオリゴヌクレオチドを0.1 Mホウ酸ナトリウム緩衝液(pH 8.5)中で溶解させ(c= 600 μmol)、DMF中で溶解させた１８倍モル過剰量のThermo ScientificからのスルホSMCC (スルホスクシンイミジル 4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート) (c= 3mg/100μl)と反応させた。その反応生成物を、スルホSMCCの加水分解分解産物である4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレートを除去するために、水に対して完全に透析した。
【０１９９】
その透析物を蒸発により濃縮し、チオール基を含む一価結合剤とのコンジュゲーションのために直接用いた。
２．４  両端においてハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むリンカーオリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドは、標準的な方法により、ＡＢＩ  ３９４合成装置上で１０μｍｏｌスケールで、トリチルオンモードで、固体支持体として商業的に入手可能なｄＴ−ＣＰＧを用いて、標準的なｄＡ（ｂｚ）、ｄＴ、ｄＧ（ｉＢｕ）およびｄＣ（Ｂｚ）ホスホラミダイト（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて合成された。
【０２００】
Ｌ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、固体支持体として商業的に入手可能なベータＬ−ｄＴ−ＣＰＧを、ならびにベータ−Ｌ−ｄＡ（ｂｚ）、ｄＴ、ｄＧ（ｉＢｕ）およびｄＣ（Ｂｚ）ホスホラミダイト（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ）を用いることにより合成された。
【０２０１】
オリゴヌクレオチドの精製を、実施例３の下で記述されるように逆相ＨＰＬＣ上で実施した。望まれる生成物を含有する画分（分析的ＲＰ  ＨＰＬＣにより分析／監視した）を合わせ、蒸発させて乾燥させた。脱トリチル化を、８０％酢酸と共に１５分間保温することにより実施した。酢酸を蒸発により除去した。残留物（ｒｅｍｉｎｄｅｒ）を水中で溶解させ、凍結乾燥した。
【０２０２】
オリゴヌクレオチド合成の間に以下のアミダイト類およびＣＰＧ支持体を用いてＣ１８スペーサー、ジゴキシゲニンおよびビオチン基を導入した：
スペーサーホスホラミダイト18  (18-O-ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research);
ビオチン-dT  (5'-ジメトキシトリチルオキシ-5-[N-((4-t-ブチルベンゾイル)-ビオチニル)-アミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン-3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research);
ビオチンホスホラミダイト  1-ジメトキシトリチルオキシ-2-(N-ビオチニル-4-アミノブチル)-プロピル-3-O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイトならびに
ジゴキシゲニン-N-ヒドロキシル-スクシンイミジルエステルによるアミノ修飾および後標識に関して、5'-ジメトキシトリチル-5-[N-(トリフルオロアセチルアミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン、3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト。
【０２０３】
以下の架橋コンストラクトまたはリンカーを合成した：
リンカー1: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー2: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(T40)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー3: 5’-[B-L]G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(ビオチン-dT)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー4: 5’-[B-L]G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T5-(ビオチン-dT)-T5-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー5: 5’-[B-L]G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T20-(ビオチン-dT)-T20-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー6: 5’-[B-L] G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T30-(ビオチン-dT)-T30-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー7: 5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T5-(ビオチン-dT)-T5 TG GAC GAC GAT AGA ACT-3’
リンカー8: 5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T10-(ビオチン-dT)-T10 TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー9: 5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T15-(ビオチン-dT)-T15 TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー10: 5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T20-(ビオチン-dT)-T20 TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー11: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-スペーサーC18-(ビオチン-dT)-スペーサーC18-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー12: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(スペーサーC18)2-(ビオチン-dT)-(スペーサーC18)2-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー13: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(スペーサーC18)3-(ビオチン-dT)-(スペーサーC18)3-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー14: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(スペーサーC18)4-(ビオチン-dT)-(スペーサーC18)4-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー15: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T20-(Dig-dT)-T20-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー16: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(Dig-dT)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー17: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(ビオチン-dT)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’。
【０２０４】
上記の架橋コンストラクトの実施例は、少なくとも第１のハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドおよび第２のハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含む。リンカー３〜１７は、そのハイブリダイズ可能な核酸の一続きに加えて、中央のそれぞれビオチン化もしくはジゴキシゲニン化されたチミジンまたは上記で示した長さのチミジン単位からなるスペーサーを含む。
【０２０５】
その5’ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドはSEQ ID NO:7に、その3’ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドはSEQ ID NO:8にそれぞれ対応する。SEQ ID NO:7のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:5のオリゴヌクレオチドに容易にハイブリダイズするであろう。SEQ ID NO:8のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:6のオリゴヌクレオチドに容易にハイブリダイズするであろう。
【０２０６】
上記の架橋コンストラクトの実施例において、［Ｂ−Ｌ］はＬ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列が与えられていることを示し；スペーサーＣ１８、ビオチンおよびビオチンｄＴはそれぞれ上記で示した構築ブロックに由来するようなＣ１８スペーサー、ビオチンおよびビオチン−ｄＴを指し；そして数を伴うＴは示した位置においてそのリンカー中に組み込まれたチミジン残基の数を示す。
【０２０７】
２．５  二重結合剤コンストラクトの組み立て
Ａ）ＩｇＧの切断およびＦａｂ’断片のｓｓＤＮＡによる標識
精製したモノクローナル抗体をペプシンプロテアーゼの助けにより切断するとＦ（ａｂ’）２断片が得られ、続いてそれを３７℃での低濃度のシステアミンでの処理により還元するとＦａｂ’断片になる。その反応を、ＰＤ  １０カラム上でのシステアミンの分離により停止する。そのＦａｂ’断片を、実施例３に従って生成されるような活性化されたオリゴヌクレオチドにより標識する。この一本鎖ＤＮＡ（＝ｓｓＤＮＡ）はチオール反応性マレイミド基を有し、それはＦａｂ’のヒンジ領域のシステインと反応する。高い百分率の単一標識されたＦａｂ’断片を得るため、ｓｓＤＮＡのＦａｂ’断片に対する相対的なモル比は低く保たれる。単一標識されたＦａｂ’断片（ｓｓＤＮＡ：Ｆａｂ’＝１：１）の精製は、イオン交換クロマトグラフィー（カラム：Ｓｏｕｒｃｅ  １５  Ｑ  ＰＥ  ４．６／１００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＧＥ）により行われる。効率的な精製の検証は、分析的ゲル濾過およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより達成される。
【０２０８】
Ｂ）抗ｐＩＧＦ−１Ｒ二重結合剤の組み立て
抗ｐＩＧＦ−１Ｒ二重結合剤は、ＩＧＦ−１Ｒの細胞内ドメインの異なるエピトープを標的とする２種類のＦａｂ’断片に基づいている：Ｆａｂ’  ８．１．２は前記の標的タンパク質のリン酸化部位（ｐＴｙｒ  １３４６）を検出し、Ｆａｂ’  １．４．１６８は前記の標的タンパク質の非ホスホ部位を検出する。そのＦａｂ’断片は一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に共有結合的に連結されている：Ｆａｂ’  １．４．１６８はSEQ ID NO:6を含みフルオレセインを蛍光マーカーとして含有する１７塩基長のｓｓＤＮＡに、そしてＦａｂ’  ８．１．２はSEQ ID NO:5を含みＣｙ５を蛍光マーカーとして含有する１９塩基長のｓｓＤＮＡに共有結合的に連結されている。以下、共有結合した１７塩基長または１９塩基長のｓｓＤＮＡを有するこれらのＦａｂ’をそれぞれｓｓＦａｂ’  １．４．１６８およびｓｓＦａｂ’  ８．１．２と呼ぶ。二重結合剤の組み立ては、そのｓｓＦａｂ’断片の対応するｓｓＤＮＡにハイブリダイズする２種類の相補性ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド（それぞれSEQ ID NO:7および8）を含むリンカー（すなわち架橋コンストラクト）により媒介される。その二重結合剤の２個のｓｓＦａｂ’断片の間の距離は、スペーサー、例えばＣ１８スペーサーまたは異なる長さのＤＮＡをそれぞれ用いることにより修正することができる。
【０２０９】
組み立て評価のために、その二重結合剤構成要素ｓｓＦａｂ’  ８．１．２、ｓｓＦａｂ’  １．４．１６８ならびにリンカーコンストラクト（Ｉ）（＝実施例２．４のリンカー１７）5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT T(-Bi)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’および（ＩＩ）（＝実施例２．４のリンカー１０）5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(T20)-T(-Bi)-(T20)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’を室温で等モル量で混合した。１分間の保温工程の後、その反応混合物を分析的ゲル濾過カラム(Superdex（商標）200、10/300 GL、GE Healthcare)上で分析した。単一の二重結合剤構成要素の溶離体積（ＶＥ）のその反応混合物のＶＥとの比較は、その二重結合剤がうまく形成されたことを実証している（図１）。（そのリンカーの両方の中央にあるビオチン化チミジン(T-(Bi))は、これらの実験において機能を有しない。）
２．６  抗ｐＩＧＦ−１Ｒ二重結合剤の固定されたＩＧＦ−１ＲおよびＩＲペプチドへの結合を評価するＢｉａｃｏｒｅ（商標）実験
この実験に関して、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）２０００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、系の中に取り付けられたＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＳＡセンサーと共にＴ＝２５℃で用いた。前条件付けは１００μｌ／分で５０ｍＭ  ＮａＯＨ中の１Ｍ  ＮａＣｌの３×１分間の注入および１分間の１０ｍＭ  ＨＣｌの注入で行われた。
【０２１０】
ＨＢＳ−ＥＴ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）をシステム緩衝液として用いた。試料緩衝液はシステム緩衝液と同一であった。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）２０００システムは制御ソフトウェアＶ１．１．１の下で運転された。
【０２１１】
続いてビオチン化されたペプチドをそれぞれのフローセル中のＳＡ表面上に捕捉させた。１６ＲＵのＩＧＦ−１Ｒ（１３４０〜１３６６）［１３４６−ｐＴｙｒ；Ｇｌｕ（Ｂｉ−ＰＥＧ−１３４０］アミド（すなわち、１３４６位のチロシンがリン酸化されており、位置１３４０に対応するグルタミン酸を介して結合したＰＥＧリンカーを含み、そのリンカーの他方の末端においてビオチン化されている、SEQ ID NO:11のペプチド）をフローセル２上に捕捉させた。１８ＲＵのＩＧＦ−１Ｒ（１３４０〜１３６６）；Ｇｌｕ（Ｂｉ−ＰＥＧ−１３４０］アミド（すなわち、１３４６位のチロシンがリン酸化されておらず、位置１３４０に対応するグルタミン酸を介して結合したＰＥＧリンカーを含み、そのリンカーの他方の末端においてビオチン化されている、SEQ ID NO:11のペプチド）をフローセル３上に捕捉させた。２０ＲＵのｈＩＲ（１３５５〜１３８２）［１３６１−ｐＴｙｒ；Ｇｌｕ（Ｂｉ−ＰＥＧ−１３５５］アミド（すなわち、１３６１位のチロシンがリン酸化されており、ヒトインスリン受容体の位置１３５５に対応するグルタミン酸を介して結合したＰＥＧリンカーを含み、そのリンカーの他方の末端においてビオチン化されている、SEQ ID NO:12のペプチド）をフローセル４上に捕捉させた。最後に、全てのフローセルをｄ−ビオチンで飽和させた。
【０２１２】
二重結合剤の形成に関して、実施例２．５において記述したような組み立てプロトコルを用いた。２種類のｓｓＦａｂ’の一方のみを用いて個々の運転を実施した際、リンカーＤＮＡの非存在または存在は会合または解離曲線に影響を及ぼさなかった（データは示していない）。
【０２１３】
１００ｎＭの溶液中の分析物（これらの実験では二価二重結合剤）を５０μｌ／分で２４０秒の会合時間の間に注入し、解離を５００秒間監視した。８０ｍＭ  ＮａＯＨを用いた５０μｌ／分での１分間の注入工程を用いることにより、効率的な再生が達成された。フローセル１は基準の役目を果たした。抗原の注入の代わりにブランク緩衝液の注入を用いて、緩衝液のシグナルを引くことによりそのデータを二重に参照した。
【０２１４】
それぞれの測定サイクルにおいて、溶液中の以下の分析物の１つを４つのフローセル全てにわたってそれぞれ注入した：１００ｎＭのｓｓＦａｂ’  ８．１．２、１００ｎＭのｓｓＦａｂ’  １．４．１６８、１００ｎＭのｓｓＦａｂ’  ８．１．２および１００ｎＭのｓｓＦａｂ’の混合物、リンカー（ＩＩＩ）（5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T(20)-T(-Dig)-(T20)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’（＝実施例２．４のリンカー１５））上にハイブリダイズしたｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８からなる１００ｎＭの二価結合剤、ならびにリンカー（ＩＶ）（5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T(-Dig)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’（＝実施例２．４のリンカー１６））上にハイブリダイズしたｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８からなる１００ｎＭの二価結合剤。（上記のリンカー中の中央のチミジンのジゴキシゲニン化(T(-Dig))は、これらの実験に関連しない。）
そのシグナルは、時間依存性Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラムとして監視された。
【０２１５】
報告の時点は、それぞれの相互作用の応答単位シグナルの高さを監視するため、分析物の会合段階の終了時（結合末期（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｌａｔｅ）、ＢＬ）に、および分析物の解離段階の終了時（安定性末期（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｌａｔｅ）、ＳＬ）に設定された。解離速度ｋｄ（１／ｓ）をＢｉａｃｏｒｅ（商標）評価ソフトウェア４．１を用いて線形１：１ラングミュア当てはめに従って計算した。その複合体の分での半減時間を式ｌｎ（２）／（６０＊ｋｄ）に基づいて計算した。
【０２１６】
そのセンサーグラム（図２−５）は、ｓｓＦａｂ’  １．４．１６８およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８が二重結合剤（＝二価結合剤）の形態で用いられた際の、おそらく基礎になっている協同的結合作用による、ｐＩＧＦ−１Ｒ結合における特異性および複合体の安定性の両方における増大を示している。Ｆａｂ’  １．４．１６８単独ではｐＩＲペプチドに関する交差反応性を示さないが、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化型および非リン酸化型を識別しない（両方の場合においてＴ１／２  ｄｉｓ＝３分）。しかし、Ｆａｂ’  ８．１．２はＩＧＦ１−Ｒペプチドのリン酸化版にのみ結合するが、リン酸化されたインスリン受容体とのいくらかの望まれない交差反応性を示す。その二重結合剤はｐＩＧＦ−１Ｒペプチドおよび両方の他のペプチドを十分に識別し（図４参照）、従って非特異的結合の問題の克服を助ける。その特異性における増大は、両方のＦａｂ’がリンカーＤＮＡなしで適用された場合には失われることを特筆する（図５）。その二重結合剤のｐＩＧＦ−１Ｒペプチドに対する親和性における増大は、個々のＦａｂ’およびそのリンカーＤＮＡを抜かしたＦａｂ’混合物と比較して増大した解離半減時間において示される（図３および図５）。試験した２種類の異なるＤＮＡリンカーの長さを有する二重結合剤は標的結合特異性および親和性への全体的なプラスの作用を共有しているが、より長いリンカー（Ｔ４０−Ｔ−Ｄｉｇをスペーサーとして有する（ＩＩＩ））（すなわち実施例２．４のリンカー１５）が両方の基準に関して好都合であるように思われる。
【０２１７】
２．７  Ｍ−１．４．１６８−ＩｇＧおよびＭ−８．１．２−ＩｇＧのＢｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイサンドイッチ
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をシステム中に取り付けられたＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ５センサーと共に用いた。そのセンサーは、０．１％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＮａＯＨ、１０ｍＭ  ＨＣｌおよび１００ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４の１００μｌ／分での１分間の注入により前条件付けされた。
【０２１８】
システム緩衝液はＨＢＳ−ＥＴ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）であった。試料緩衝液はシステム緩衝液であった。
【０２１９】
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００システムは制御ソフトウェアＶ１．１．１の下で運転された。１０ｍＭ酢酸Ｎａ（ｐＨ４．５）中で３０μｇ／ｍｌのポリクローナルウサギＩｇＧ抗体＜ＩｇＧＦＣγＭ＞Ｒ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を、１００００ＲＵでフローセル１、２、３、および４それぞれの上に、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学により、製造業者の説明書に従って固定した。最後に、そのセンサー表面を１Ｍエタノールアミンでブロッキングした。全部の実験を１３℃で運転した。
【０２２０】
５００ｎＭの一次ｍＡｂ  Ｍ−１．００４．１６８−ＩｇＧを＜ＩｇＧＦＣγＭ＞Ｒ表面上に１０μｌ／分で１分間捕捉させた。ブロッキング溶液を含有する３μＭの（ＩｇＧクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３の）ＩｇＧ断片混合物を３０μｌ／分で５分間注入した。ペプチドＩＧＦ−１Ｒ（１３４０〜１３６６）［１３４６−ｐＴｙｒ；Ｇｌｕ（Ｂｉ−ＰＥＧ−１３４０］アミドを３００ｎＭで３０μｌ／分において３分間注入した。３００ｎＭの二次抗体Ｍ−８．１．２−ＩｇＧを３０μｌ／分で注入した。１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．７）を５０μｌ／分で３分間用いてセンサーを再生させた。
【０２２１】
図６はそのアッセイの構成を説明している。図７において、その測定の結果を示す。その測定は、両方のモノクローナル抗体がそれらのそれぞれの標的ペプチド上の２つの別個の無関係なエピトープに同時に結合することができることを明確に示している。これは、協同的結合事象を生じさせる目的を有するあらゆる後の実験のための必要条件である。
【０２２２】
２．８  センサー表面上の二重結合剤のＢｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイ
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をシステム中に取り付けられたＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＳＡセンサーと共にＴ＝２５℃で用いた。そのシステムは、１００μｌ／分での５０ｍＭ  ＮａＯＨ中１Ｍ  ＮａＣｌの３×１分間の注入および１分間の１０ｍＭ  ＨＣｌの注入により前条件付けされた。
【０２２３】
システム緩衝液はＨＢＳ−ＥＴ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）であった。試料緩衝液はシステム緩衝液であった。
【０２２４】
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００システムは制御ソフトウェアＶ４．１の下で運転された。
１２４ＲＵのアミノ−ＰＥＯ−ビオチンを基準フローセル１上に捕捉させた。１５９５ＲＵのビオチン化された１４．６ｋＤａのＴ０−Ｂｉ  ３７塩基長ｓｓＤＮＡ−リンカー（Ｉ）（5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T(-Bi)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’）（＝実施例２．４のリンカー１７）および１０４２ＲＵのビオチン化された２３．７ｋＤａのＴ４０−Ｂｉ  ７７塩基長ｓｓＤＮＡ−リンカー（ＩＩ）（5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T(20)-(ビオチン-dT)-(T20)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’＝実施例２．４のリンカー１０）を、異なるフローセル上に捕捉させた。
【０２２５】
３００ｎＭのｓｓＦａｂ’  ８．１．２および３００ｎＭのｓｓＦａｂ’  １．００４．１６８をそのシステムの中に５０μｌ／分で３分間注入した。それぞれのｓｓＦａｂの速度論的寄与を試験するため、対照として３００ｎＭのｓｓＦａｂ’  ８．１．２または３００ｎＭのｓｓＦａｂ’  １．００４．１６８のみを注入した。対照として、緩衝液をｓｓＦａｂの代わりに注入した。ペプチドｐＩＲ（１３５５〜１３８２）［１３６１−ｐＴｙｒ］アミドおよびＩＧＦ−１Ｒ（１３４０〜１３６６）アミドそれぞれ（溶液中で遊離している（ｆｒｅｅ  ｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ））をシステム中に０ｎＭ、４ｎＭ、１１ｎＭ、３３ｎＭ（２回）、１００ｎＭおよび３００ｎＭの濃度段階で５０μｌ／分で４分間注入した。ペプチドｐＩＧＦ−１Ｒ（１３４０〜１３６６）［１３４６−ｐＴｙｒ］アミドに対する親和性を測定するための実験の別のセットにおいて、０ｎＭ、０．４ｎＭ、１．１ｎＭ、３．３ｎＭ（２回）、１０ｎＭおよび３０ｎＭの濃度段階を用いた。
【０２２６】
解離を５０μｌ／分で５．３分間監視した。それぞれの濃度工程の後、２５０ｍＭのＮａＯＨの１２秒間のパルスによりシステムを再生し、ｓｓＦａｂ’リガンドを再装填した（ｒｅｌｏａｄｅｄ）。
【０２２７】
図８はＢｉａｃｏｒｅ（商標）機器上のアッセイ構成を模式的に説明している。図９で示した表は、このアプローチからの定量の結果を示す。図１０、１１および１２はＴ４０二重結合剤を用いたこのアッセイ構成からの典型的なＢｉａｃｏｒｅ（商標）の結果を示す。
【０２２８】
図９における表は、二重結合剤の概念の利益を実証している。Ｔ４０二重結合剤（実施例２．４のリンカー１０、すなわちＴ２０−ビオチン−ｄＴ−Ｔ２０のスペーサーを有するリンカーを有する二重結合剤）は結果として、それぞれ１９２分および３０ｐＭであるＴ０二重結合剤（すなわち実施例２．４のリンカー１６を有する二重結合剤）と比較した場合に、２倍向上した抗原複合体の半減時間（４１４分）および３倍向上した親和性（１０ｐＭ）をもたらす。これは最適な協同的結合作用をもたらすためにリンカーの長さを最適化する必要性を強調する。
【０２２９】
Ｔ４０二重結合剤（すなわちＴ４０−Ｂｉリンカー（実施例２．４のリンカー１０）を含む二重結合剤）は、リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒペプチドに対する１０ｐＭの親和性を示す（図９、図１０における表）。これはリン酸化されたインスリン受容体ペプチド（２４ｎＭ）に対する２４００倍の親和性の向上であり、リン酸化されていないＩＧＦ−１Ｒペプチドに対する１００倍の向上である。
【０２３０】
従って、２種類の別個の分離された結合事象の組み合わせにより特異性および親和性を増大させる目的は達成されている。
協同的結合作用は特にリン酸化されたＩＧＦ−１Ｒペプチドに対する解離速度から明らかになり、ここで二重結合剤は、一価結合剤８．１．２単独による０．５分および一価結合剤１．４．１６８単独による３分それぞれに対して４１４分の抗原複合体半減時間を示す。
【０２３１】
さらに、完全に組み立てられたコンストラクトは、単独でＦａｂ’がハイブリダイズしたコンストラクトと比較した場合に、その解離速度ｋｄ（１／ｓ）をおおよそ掛け合わせる（図１０、１１、１２および図９中の表）。興味深いことに、会合速度ｋａ（１／Ｍｓ）も単独のＦａｂ’の相互作用事象と比較した場合にわずかに増大し、これはそのコンストラクトの分子の柔軟性の増大によるものである可能性がある。
【０２３２】
強い洗浄手順を用いる診断系は、個々の（一価の）Ｆａｂ’分子とは対照的に、そのＴ４０二重結合剤の高い性能を確実に促進するはずである。そのハイブリダイズしたコンストラクト、すなわち本発明に従う二価結合剤は特異的かつ極めて安定な結合事象をもたらすが、一価結合剤はより急速に解離し、例えばそれらはより急速に洗い流される。
【０２３３】
実施例３
ＨＥＲ２に対する二価結合剤
３．１  抗ＨＥＲ２二価結合剤の組み立て
異なる重複しないエピトープＡおよびＢでヒトＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２またはｐ１８５ｎｅｕ）に結合する２種類のモノクローナル抗体を用いた。第１抗体は抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５（ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）またはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）；本明細書にそのまま援用する米国特許第5,821,337号を参照）である。
【０２３４】
“４Ｄ５エピトープ”は、抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４６３）が結合するＥｒｂＢ２の細胞外ドメイン中の領域である。このエピトープは、ＥｒｂＢ２の膜貫通ドメインに近い。
【０２３５】
第２抗体は抗ＨＥＲ２抗体２Ｃ４（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ（登録商標））である。その抗体２Ｃ４および特にそのヒト化変種は、本明細書にそのまま援用する国際公開第01/00245号において詳細に記述されている。２Ｃ４はアメリカ培養細胞系統保存機関（米国バージニア州マナサス）にＡＴＣＣ  ＨＢ−１２６９７の下で寄託されているハイブリドーマ細胞株により産生される。ヒト化２Ｃ４抗体の例が国際公開第01/00245号（本明細書にそのまま援用する）の実施例３において提供されている。そのヒト化抗ＨＥＲ２抗体２Ｃ４はＰｅｒｔｕｚｕｍａｂとも呼ばれる。
【０２３６】
Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ（以前は２Ｃ４）は、ＨＥＲ二量体化阻害剤（ＨＤＩ）として知られる新しいクラスの薬剤の最初のものである。ＰｅｒｔｕｚｕｍａｂはＨＥＲ２にその二量体化ドメインにおいて結合し、それによりその活性な二量体型受容体複合体を形成する能力を阻害し、そうして最終的に結果として細胞増殖および分裂をもたらす下流のシグナルカスケードを遮断する(Franklin, M.C., Cancer Cell 5 (2004) 317-328参照)。ＰｅｒｔｕｚｕｍａｂはＨＥＲ２の細胞外ドメインに対して向けられた完全にヒト化された組み換えモノクローナル抗体である。
【０２３７】
そのモノクローナル抗体の培養上清からの精製は、現状技術のタンパク質化学の方法を用いて実施することができる。
精製したモノクローナル抗体を、予め活性化したパパインまたはペプシンで消化すると、Ｆ（ａｂ’）２断片が得られる。続いてこれらを低濃度のシステアミンを用いて３７℃で還元すると、Ｆａｂ’断片になる。その反応を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でシステアミンをその試料のポリペプチド含有部分から分離することにより停止する。
【０２３８】
得られたＦａｂ’断片を活性化されたｓｓＤＮＡポリヌクレオチドとコンジュゲートする。
ａ）抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５  Ｆａｂ’−ｓｓＤＮＡ−コンジュゲート
抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５  Ｆａｂ’−ｓｓＤＮＡ−コンジュゲートの調製のため、SED ID NO:5の誘導体、すなわち5’-AGT CTA TTA ATG CTT CTG C(=SEQ ID NO:5)-XXX-Y-Z-3’が用いられ、ここでX＝ホスホラミダイトC3 (3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)により導入されたプロピレン−ホスフェートであり、ここでY＝(6-(4-モノメトキシトリチルアミノ)ヘキシル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト(Glen Research)により導入された5'-アミノ-修飾剤C6であり、ここでZ＝スルホスクシンイミジル 4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート(ThermoFischer)により導入された4[N-マレインイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシである。
【０２３９】
ｂ）抗ＨＥＲ２抗体２Ｃ４  Ｆａｂ’−ｓｓＤＮＡ−コンジュゲート
抗ＨＥＲ２抗体２Ｃ４  Ｆａｂ’−ｓｓＤＮＡ−コンジュゲートＢの調製のため、SED ID NO:6の誘導体、すなわち5’-Y-Z-XXX-AGT TCT ATC GTC GTC CA-3’が用いられ、ここでX＝ホスホラミダイトC3 (3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)により導入されたプロピレン−ホスフェートであり、ここでY＝(6-(4-モノメトキシトリチルアミノ)ヘキシル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト(Glen Research)により導入された5'-アミノ-修飾剤C6であり、Z＝スルホスクシンイミジル 4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート(ThermoFischer)により導入された4[N-マレインイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシである。
【０２４０】
SEQ ID NO:5またはSEQ ID NO:6のポリヌクレオチドはそれぞれ現状技術のポリヌクレオチド合成法により合成された。そのマレインイミド基の導入は、Yのアミノ基のZのスクシンイミジル基との反応により行われ、それは固相ポリヌクレオチド合成プロセスの間に組み込まれた。
【０２４１】
その一本鎖ＤＮＡコンストラクト（ｃｏｎｔｒｕｃｔｓ）はチオール反応性マレイミド基を有し、それはシステアミン処理により生成されたＦａｂ’のヒンジ領域のシステインと反応する。高い百分率の単一標識されたＦａｂ’断片を得るため、ｓｓＤＮＡのＦａｂ’断片に対する相対的なモル比は低く保たれる。単一標識されたＦａｂ’断片（ｓｓＤＮＡ：Ｆａｂ’＝１：１）の精製は、陰イオン交換クロマトグラフィー（カラム：ＭｏｎｏＱ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により行われる。効率的な標識および精製の検証は、分析的ゲル濾過クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより達成される。
【０２４２】
３．２  生体分子相互作用分析
この実験に関して、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、系の中に取り付けられたＢｉａｃｏｒｅ  ＳＡセンサーと共にＴ＝２５℃で用いた。前条件付けは、１００μｌ／分で、５０ｍＭ  ＮａＯＨ中の１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ８．０）の３×１分間の注入、続いて１分間の１０ｍＭ  ＨＣｌの注入で行われた。システム緩衝液はＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｐ２０）であった。試料緩衝液は１ｍｇ／ｍｌ  ＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン）を補ったシステム緩衝液であった。
【０２４３】
ビオチン化ｓｓ−Ｌ−ＤＮＡリンカーをそれぞれのフローセル中のＳＡ表面上に捕捉させた。フローセル１をアミノ−ＰＥＯ−ビオチン（ＰＩＥＲＣＥ）で飽和させた。
４０ＲＵのビオチン化３７塩基長オリゴヌクレオチドリンカー（実施例２．４のリンカー３）をフローセル２上に捕捉させた。５５ＲＵのビオチン化７７塩基長オリゴヌクレオチドリンカー（実施例２．４のリンカー５）をフローセル３上に捕捉させた。６０ＲＵのビオチン化９７塩基長オリゴヌクレオチドリンカー（実施例２．４のリンカー６）をフローセル４上に捕捉させた。
【０２４４】
２５０ｎＭの抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５−Ｆａｂ’−ｓｓ−Ｌ−ＤＮＡをシステム中に３分間注入した。３００ｎＭの抗ＨＥＲ２抗体２Ｃ４−Ｆａｂ’−ｓｓ−Ｌ−ＤＮＡをシステム中に２μｌ／分で５分間注入した。そのＤＮＡ標識されたＦａｂ断片は単独または組み合わせで注入された。
【０２４５】
対照として、２５０ｎＭの抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５−Ｆａｂ’−ｓｓ−Ｌ−ＤＮＡおよび３００ｎＭの抗ＨＥＲ２抗体２Ｃ４−Ｆａｂ’−ｓｓ−Ｌ−ＤＮＡのみをシステム中に注入した。さらなる対照として、緩衝液をＤＮＡ標識されたＦａｂ断片の代わりに注入した。そのｓｓ−Ｌ−ＤＮＡ標識されたＦａｂ断片のそれぞれのｓｓ−Ｌ−ＤＮＡ  ｂｉ−リンカー上でのハイブリダイゼーションの後、溶液中の分析物ｈＨＥＲ２−ＥＣＤを、２４ｎＭ、８ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、０．３ｎＭ、０ｎＭからの異なる濃度系列でシステム中に３．５分間の会合段階の間１００μｌ／分で注入した。解離段階を１００μｌ／分で１５分間監視した。その系を、１００ｍＭグリシン緩衝液（グリシンｐＨ１１、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）の２０μｌ／分で３０秒間の注入、続いて２番目の水の３０μｌ／分で１分間の注入により再生させた。
【０２４６】
そのシグナルを、分析物濃度依存性の時間分析したセンサーグラムとして測定した。そのデータをＢｉａｃｏｒｅ  Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア４．１を用いて評価した。当てはめモデルとして標準的なラングミュア２成分結合モデルを用いた。
【０２４７】
結果：
ｓｓ−Ｄ−ＤＮＡ標識されたＦａｂ断片をシステム中に注入した場合、そのｓｓ−Ｄ−ＤＮＡ標識されたＦａｂ断片はそのセンサー表面上に提示されたｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ状ｓｓ−Ｌ−ＤＮＡリンカーとハイブリダイズしなかったため、ＨＥＲ２−ＥＣＤ相互作用を観察することはできなかった。
【０２４８】
表３：その二重結合剤実験の速度論的結果。リンカー：表面に提示されたビオチン化ｓｓ−Ｌ−ＤＮＡポリヌクレオチドリンカー、オリゴ＿３７塩基長−Ｂｉ、オリゴ＿７７塩基長−Ｂｉおよびオリゴ＿９７塩基長−Ｂｉ、上記で記述したようにリンカーの長さが異なる。ｓｓ−Ｌ−ＤＮＡ−Ｆａｂ：２Ｃ４−ｓｓ−Ｌ−ＤＮＡ：１９塩基長−フルオレセインで標識された、抗ＨＥＲ２抗体２Ｃ４−Ｆａｂ’−ｓｓ−Ｌ−ＤＮＡ。４Ｄ５−ｓｓ−Ｌ−ＤＮＡ：１７塩基長−フルオレセインで標識された、抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５−Ｆａｂ’−ｓｓ−Ｌ−ＤＮＡ。４Ｄ５−＋２Ｃ４−ｓｓ−Ｌ−ＤＮＡは、両方の一価抗ＨＥＲ２抗体断片の組み合わせを含む、表面に結合した二重結合剤に関する。
【０２４９】
表３において、次の略語を用いる：ＬＲＵ：応答単位での質量、それはセンサー表面上にハイブリダイズしている。抗原：８７ｋＤａのＨＥＲ２−ＥＣＤを溶液中の分析物として用いた。ｋａ：（１／Ｍｓ）での会合速度。ｋｄ：（１／ｓ）での解離速度。ｔ１／２ｄｉｓｓ：一次速度方程式の解ｌｎ（２）／ｋｄ＊３６００に従って時間（ｈｏｕｒｓ）で計算された抗原複合体半減時間。ＫＤ：モル濃度での親和性。ＫＤ：ピコモル濃度で計算された親和性。Ｒｍａｘ：応答単位（ＲＵ）での飽和時の最大分析物応答シグナル。ＭＲ：モル比、その相互作用の化学量論比を示す。Ｃｈｉ２、Ｕ値：その測定の品質指標。
【０２５０】
【表７】
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【０２５１】
上記の表において、３５塩基長、７５塩基長および９５塩基長それぞれは３７塩基長、７７塩基長および９７塩基長それぞれを読む（ｒｅａｄ）はずである。
３７塩基長二重結合剤ＨＥＲ２−ＥＣＤ相互作用に関する（すなわち、その結合剤に結合したハイブリダイゼーション配列モチーフおよび中央のビオチン化チミジンのみからなるリンカーを有する結合剤に関する）ｂｉａｃｏｒｅデータは、この二重結合剤が速度論的性能において向上を示さないことを示している。これは、不十分なリンカーの長さおよびその３７塩基長のリンカーの柔軟性の不足によるものである可能性が最も高い。
【０２５２】
７７塩基長二重結合剤ＨＥＲ２−ＥＣＤ相互作用に関する（すなわち、リンカーの長さを増大させるために中央のビオチン化チミジンに加えて２回の２０個のチミジンを含むリンカーを有する結合剤に関する）ｂｉａｃｏｒｅデータは、この二重結合剤がその速度論的性能において劇的な向上を示すことを示している。これは、最適なリンカーの長さおよびこの７７塩基長のリンカーの柔軟性によるものである可能性が最も高い。
【０２５３】
９７塩基長二重結合剤ＨＥＲ２−ＥＣＤ相互作用に関する（すなわち、リンカーの長さを増大させるために中央のビオチン化チミジンに加えて２回の３０個のチミジンを含むリンカーを有する結合剤に関する）ｂｉａｃｏｒｅデータは、この二重結合剤がその速度論的性能において劇的な向上を示すことを示している。これは、最適なリンカーの長さおよびこの９７塩基長のリンカーの柔軟性によるものである可能性が最も高い。
【０２５４】
表３におけるデータは、協同的結合事象の存在に関する証拠を提供する。完全に確立された二重結合剤のＲｍａｘ値は単独のＦａｂを備えた（ａｒｍｅｄ）コンストラクトのシグナルの高さのおおよそ２倍であるにも関わらず、モル比の値は正確に１である（ＭＲ＝１）。これは、両方のＦａｂ断片の同時の協同的結合事象の存在に関する明確な証拠である。その二重結合剤の計数は、１：１ラングミュア結合化学量論比を有する単一の分子である。２個の独立して結合するＨＥＲ２接触面を有するにも関わらず、１個の二重結合剤および２個のＨＥＲ２ドメインの間の分子間結合は検出することができない。
【０２５５】
相乗作用を示すモノクローナル抗体の対に関する、または化学的に架橋された二重特異性のＦ（ａｂ’）２に関する結合活性定数は、一般に個々のモノクローナル抗体に関する親和性定数よりも１５倍まで大きいにすぎず、それはその反応物の間の理想的な組み合わせに期待される理論的な結合活性よりも著しく低い(Cheong, H. S., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 173 (1990) 795-800)。この理論により束縛されるわけではないが、これに関する１つの理由は、最適な相乗作用のためには（高い結合活性をもたらす）相乗的結合に関わる個々のエピトープ／パラトープ相互作用が互いに関して特定の方向で配向されていなければならないことである可能性がある。
【０２５６】
さらに、表３で示したデータは、ちょうどｓｓ−Ｌ−ＤＮＡハイブリダイゼーションモチーフのみからなる短い３７塩基長のリンカーは協同的結合作用をもたらすために十分な柔軟性または／およびリンカーの長さを示さないことの証拠を提供している。その３７塩基長のリンカーは堅い二重らせんのＬ−ＤＮＡコンストラクトである。そのハイブリダイゼーションは二重Ｌ−ＤＮＡらせんを生成し、それはそのｓｓ−Ｌ−ＤＮＡ配列よりも短く、柔軟性が低い。そのらせんは低減した程度の自由さを示し、堅いリンカーコンストラクトであると理解することができる。表３は、その３７塩基長のリンカーが協同的結合事象を生成することができないことを示している。その完全に確立された３７塩基長の二重結合剤は、単独でハイブリダイズしたコンストラクトのみと同じ親和性を示す。
【０２５７】
そのリンカーの長さを高度に柔軟なポリＴ  ｓｓ−Ｌ−ＤＮＡにより延長して７７塩基長および９７塩基長をそれぞれ形成することは、親和性における、特に抗原複合体安定性ｋｄ（１／ｓ）における増大を提供する。
【０２５８】
ｃｈｉ２値はその測定の高い品質を示す。全ての測定は極めて小さい誤差を示す。そのデータはラングミュア１：１当てはめモデルに当てはめることができ、余りは＋／−１ＲＵしか逸脱せず、小さいｃｈｉ２値および１０回のみの反復計算しかそのデータを得るために必要でなかった。
【０２５９】
協同的結合作用は、自由結合エネルギーΔＧ１およびΔＧ２が要約する物理法則に従って作用する。その親和性は掛け算である：Ｋｄｃｏｏｐ＝ＫＤ１×ＫＤ２。さらに、その解離速度も掛け算である：ｋｄｃｏｏｐ＝ｋｄ１×ｋｄ２。これは、７７塩基長および９７塩基長のリンカーの実験において正確に観察することができる。これは結果として、それぞれ４１４６時間（１７３日）および３９４２時間（１６４日）の非常に長い複合体半減期をもたらす。その親和性は１００ｆｍｏｌ／ｌの範囲内である。協同的結合事象が起こっていることは明らかである。
【０２６０】
全ての二重結合剤の会合速度は、単独でハイブリダイズしたコンストラクトと比較した場合により速い。より高い分子量を示すにもかかわらず、その会合速度は増大する。
ここで、我々は、本明細書で報告したような複合体中で一緒に連結させたトラスツズマブおよびｐｅｒｔｕｚｕｍａｂはＨＥＲ−２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に同時に結合することを示すことができた。両方のＦａｂ断片はそのＨＥＲ−ＥＣＤ上の本物の（ｇｅｎｕｉｎｅ）エピトープに結合する。加えて、両方のＦａｂ断片はそれらの結合する角度において強く異なっている。最適な７７塩基長のリンカー（長さ約３０ｎｍ）ｓｓ−Ｌ−ＤＮＡならびにその有益な柔軟性および長さの特性を用いることにより、協同的結合事象を示すことができた。
【０２６１】
従って、高度に柔軟なｓｓ−Ｌ−ＤＮＡリンカーを介して一緒に連結させたＨｅｒｃｅｐｔｉｎ−ＦａｂおよびＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ−Ｆａｂの間の協同的結合を示すことができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図６】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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