(57)【要約】腫瘍関連脈管構造を破壊するためのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチド及びデスレセプターアゴニスト抗体の使用が提供される。哺乳動物における癌の治療法法、キット及び製造品がまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の組織又は細胞における腫瘍関連脈管構造を破壊する方法において、治療的有効量のApo2L/TRAILポリペプチド又はデスレセプターアゴニスト抗体に前記組織又は細胞を曝露することを含む方法。
【請求項２】
腫瘍関連脈管構造を含む内皮細胞がDR5レセプターを発現する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物組織又は細胞が、ＤＲ５レセプターを発現しない腫瘍又は癌細胞を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物組織又は細胞が、ＤＲ５レセプターを発現し、該ＤＲ５レセプターによるアポトーシス誘導に耐性がある腫瘍又は癌細胞を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドが、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのオリゴマー又は架橋形態である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記デスレセプターアゴニスト抗体が抗ＤＲ５モノクローナル抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物の癌を治療する方法において、哺乳動物における腫瘍関連脈管構造を破壊するために治療的有効量のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチド又はデスレセプターアゴニスト抗体を該哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項８】
前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチド又はデスレセプターアゴニスト抗体が前記脈管構造を破壊し、腫瘍への血流を阻害する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
腫瘍関連脈管構造を含む内皮細胞がＤＲ５レセプターを発現する請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物の腫瘍又は癌細胞がＤＲ５レセプターを発現しない請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物の腫瘍又は癌細胞がＤＲ５レセプターを発現し、該ＤＲ５レセプターによるアポトーシス誘導に対して耐性がある請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
一又は複数の化学療法剤又は放射線療法が、前記哺乳動物にさらに施される請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
抗ＶＥＧＦ抗体が前記哺乳動物にさらに投与される請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドがＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのオリゴマー又は架橋形態である請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
前記デスレセプターアゴニスト抗体が抗ＤＲ５モノクローナル抗体である請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
前記癌が肺癌又は膵臓癌である請求項７に記載の方法。
【請求項１８】
腫瘍関連脈管構造の破壊のための又は癌の治療のための医薬の製造におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチド又はデスレセプターアゴニスト抗体の使用。
【請求項１９】
前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドがＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのオリゴマー又は架橋形態である請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記デスレセプターアゴニスト抗体が抗ＤＲ５モノクローナル抗体である請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
癌の治療に使用されるキットの製造におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチド又はデスレセプターアゴニスト抗体の使用。
【請求項２２】
癌の治療に使用されるキットにおいて、（ａ）Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチド又はデスレセプターアゴニスト抗体と薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を中に収容する容器と；（ｂ）癌に罹患しているヒト患者の腫瘍関連脈管構造を破壊するためのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチド又はデスレセプターアゴニスト抗体の投与に対する使用説明書を伴うパッケージ挿入物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポトーシス促進性レセプターアゴニスト（ＰＡＲＡ）と腫瘍関連脈管構造を破壊するためのこのようなＰＡＲＡの使用に関する。特に、本発明は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ組成物と哺乳動物の細胞又は組織の脈管構造、特に哺乳動物の腫瘍関連性脈管構造を破壊するためのこのようなＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ組成物の使用に関する。また本発明は、哺乳動物の脈管構造を破壊する方法と、哺乳動物における癌のような疾患を治療する方法に関する。キット及び製造品もまた含まれる。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーに属する様々なリガンド及びレセプターが当該技術分野で同定されている。このようなリガンドに含まれるものは、腫瘍壊死因子−アルファ（「ＴＮＦ−アルファ」）、腫瘍壊死因子−ベータ（「ＴＮＦ−ベータ」又は「リンホトキシン−アルファ」）、リンホトキシン−ベータ（「ＬＴ−ベータ」）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ−４０リガンド、４−１ＢＢリガンド、ライト、Ａｐｏ−１リガンド（Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される）、Ａｐｏ−２リガンド（Ａｐｏ２Ｌ又はＴＲＡＩＬとも称される）、Ａｐｏ−３リガンド（ＴＷＥＡＫとも称される）、ＡＰＲＩＬ、ＯＰＧリガンド（ＲＡＮＫリガンド、ＯＤＦ又はＴＲＡＮＣＥとも称される）、及びＴＡＬＬ−１（ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦ又はＴＨＡＮＫとも称される）である（例えばAshkenazi, Nature Review, 2:420-430 (2002)；Ashkenazi及びDixit, Science, 281:1305-1308 (1998)；Ashkenazi及びDixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000)；Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000,377-411頁；Locksleyら, Cell, 104:487-501 (2001)を参照。
【０００３】
このようなＴＮＦファミリーリガンドにより媒介される様々な細胞応答の誘導は典型的には特定の細胞レセプターに結合することにより開始される。全てではないがいくつかのＴＮＦファミリーリガンドは、細胞表面「デスレセプター」に結合し、様々な生物活性を誘導し、カスパーゼ、つまり細胞死又はアポトーシス経路を実施する酵素を活性化させる（Salvesenら, Cell, 91:443-446 (1997)。今日までに同定されているＴＮＦレセプタースーパーファミリーのメンバーに含まれるものは、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＡＣＩ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＨＶＥＭ、Ｆａｓ（Ａｐｏ−１又はＣＤ９５とも称される）、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１とも称される）、ＤＲ５（Ａｐｏ−２又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、ＲＡＮＫ及びＡｐｏ−３（ＤＲ３又はＴＲＡＭＰとも称される）である（例えば、Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002); Ashkenazi and Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997); Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, 377-411頁; Locksleyら, Cell, 104:487-501 (2001)を参照）。
【０００４】
これらのＴＮＦレセプターファミリーメンバーのほとんどは、細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む細胞表面レセプターに典型的な構造を共有しており、その他のものは、膜貫通及び細胞内ドメインを欠く可溶性タンパク質として天然に見いだされる。典型的なＴＮＦＲの細胞外部分は、ＮＨ２−末端から始まる複数のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）の反復アミノ酸配列パターンを含んでいる。
【０００５】
Ａｐｏ−２Ｌ又はＴＲＡＩＬと称されるリガンドは、サイトカインのＴＮＦファミリーのメンバーとして過去に同定された（例えば、Wileyら, Immunity, 3:673-682 (1995); Pittiら, J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996)；国際公開第９７／０１６３３号；国際公開第９７／２５４２８号；１９９８年６月９日に発行された米国特許第５７６３２２３号；２００１年９月４日に発行された米国特許第６２８４２３６号）。全長天然配列ヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドは、２８１アミノ酸長のＩＩ型膜貫通タンパク質である。いくつかの細胞は、ポリペプチドの細胞外領域の酵素切断により、ポリペプチドの天然の可溶型を産生しうる（Marianiら, J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)）。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの可溶型の結晶学的研究により、ＴＮＦと他の関連したタンパク質の構造に類似のホモ三量体構造があることが明らかになった（Hymowitzら, Molec. Cell, 4:563-571 (1999)；Chaら, Immunity, 11:253-261 (1999)；Mongkolsapayaら, Nature Structural Biology, 6:1048 (1999)；Hymowitzら, Biochemistry, 39:633-644 (2000)）。しかしながら、他のＴＮＦファミリーメンバーとは異なり、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、３つのシステイン残基（ホモ三量体の各サブユニットの２３０位）が亜鉛原子と配位結合し、亜鉛結合が三量体の安定性及び生物活性にとって重要である、独特の構造的特徴を有していることが見いだされた（上掲のHymowitz ら；Bodmerら, J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)）。
【０００６】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの可溶型は、結腸、肺、乳房、前立腺、膀胱、腎臓、卵巣及び脳の腫瘍、並びにメラノーマ、白血病、多発性骨髄腫を含む様々な癌細胞においてアポトーシスを誘導することもまた報告されている（例えば、上掲のWileyら；上掲のPittiら；２０００年２月２９日に発行された米国特許第６０３０９４５号；２００４年６月８日に発行された米国特許第６７４６６６８号；Riegerら, FEBS Letters, 427:124-128 (1998)；Ashkenaziら, J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999)；Walczakら, Nature Med., 5:157-163 (1999)；Keane ら, Cancer Research, 59:734-741 (1999)；Mizutaniら, Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999)；Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999)；Yuら, Cancer Res., 60:2384-2389 (2000)；Chinnaiyanら, Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)）。マウス腫瘍モデルにおけるインビボ研究は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが、単独で又は化学療法もしくは放射線療法と組合せて、実質的な抗腫瘍効果を奏しうることをさらに示唆している（例えば、上掲のAshkenaziら；上掲のWalzcakら；Gliniakら, Cancer Res., 59:6153-6158 (1999)；上掲のChinnaiyanら；Rothら, Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999)；ＰＣＴ出願ＵＳ／００／１５５１２；ＰＣＴ出願ＵＳ／０１／２３６９１を参照）。多くの種類の癌細胞と対照的に、ほとんどの正常なヒト細胞型は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのある組換え型によりアポトーシス誘導に対する耐性があると思われる（Ashkenaziら, 上掲；Walzcakら, 上掲)。Ｊｏらは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのポリヒスチジンタグ可溶型が、非ヒトではなく正常な単離ヒト肝細胞においてインビトロでアポトーシスを誘導したことを報告している（Joら, Nature Med., 6:564-567 (2000)；また、Nagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)を参照）。Ｌｉらは、ヒトＴＲＡＩＬの組換え調製物が、培養されたヒト内皮細胞においてアポトーシスを惹起させたことを報告している（Li ら, J. Immunol., 171:1526-1533 (2003)）。ある種の組換えＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ調製物は、例えばタグ分子の有無、亜鉛含有量、及び％三量体含有量に応じ、罹患対正常細胞において、生化学的特性及び生物活性に関して変動しうると考えられる（Lawrenceら, Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001)；Qinら, Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)を参照）。
【０００７】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、少なくとも５つの異なるレセプターと結合することが見いだされている。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに結合するレセプターの少なくとも２つは、機能的な細胞質デスドメインを含む。このようなレセプターの一つは「ＤＲ４」(又は、ＴＲ４もしくはＴＲＡＩＬ−Ｒ１と称される（Panら, Science, 276:111-113 (1997)；また１９９８年７月３０日に公開された国際公開第９８／３２８５６号；１９９９年７月２９日に公開された国際公開第９９／３７６８４号；２０００年１２月７日に公開された国際公開第００／７３３４９号；２００２年８月１３日に発行された米国特許第６４３３１４７号；２００２年１０月８日に発行された米国特許第６４６１８２３号、及び２００２年１月２９日に発行された米国特許第６３４２３８３号を参照）。
【０００８】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対する他のこのようなレセプターは、ＤＲ５とも称される(また、別に、Ａｐｏ-２；ＴＲＡＩＬ-Ｒ又はＴＲＡＩＬ-Ｒ２、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ-６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２又はＫＩＬＬＥＲとも称される)(例えば、Sheridanら, Science, 277:818-821 (1997); Panら, Science, 277:815-818 (1997); 1998年11月19日に公開された国際公開第98/51793号；1998年9月24日に公開された国際公開第98/41629号；Screatonら, Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczakら, EMBO J., 16:5386-5387 (1997)；Wuら, Nature Genetics, 17:141-143 (1997)；１９９８年８月２０日に公開された国際公開第９８／３５９８６号；１９９８年１０月１４日に公開された欧州特許出願公開第８７０８２７号；１９９８年１０月２２日に公開された国際公開第９８／４６６４３号；１９９９年１月２１日に公開された国際公開第９９／０２６５３号；１９９９年２月２５日に公開された国際公開第９９／０９１６５号；１９９９年３月１１日に公開された国際公開第９９／１１７９１号；２００２年８月１３日に発行された米国特許第２００２／００７２０９１号；２００１年１２月７日に発行された米国特許第２００２／００９８５５０号；２００１年１２月６日に発行された米国特許第６３１３２６９号；２００１年８月２日に発行された米国特許第２００１／００１０９２４号；２００３年７月３日に発行された米国特許第２００３／０１２５５５４０号；２００２年１０月３１日に発行された米国特許第２００２／０１６０４４６号；２００２年４月２５日に発行された米国特許第２００２／００４８７８５号；２００２年２月に発行された米国特許第６３４２３６９号；２００３年３月２７日に発行された米国特許第６５６９６４２号；２０００年６月６日に発行された米国特許第６０７２０４７号；２００３年１１月４日に発行された米国特許第６６４２３５８号；２００４年６月１日に発行された米国特許第６７４３６２５号を参照）。ＤＲ４と同様、ＤＲ５は細胞質デスドメインを含み、リガンド結合時（又はリガンドの活性を模倣するアゴニスト抗体等の分子への結合時）にアポトーシスをシグナル伝達することができると報告されている。Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬとＤＲ５との間に形成された複合体の結晶構造は、Hymowitzら, Molecular Cell, 4:563-571 (1999)に記載されている。
【０００９】
リガンド結合時に、ＤＲ４とＤＲ５は双方共、ＦＡＤＤ／Ｍｏｒｔ１と称されるデスドメイン含有アダプター分子を通してアポトーシスイニシエーターであるカスパーゼ−８を独立して補充し活性化することによってアポトーシスを惹起しうる［Kischkelら, Immunity, 12:611-620(2000)；Sprickら, Immunity, 12:599-609(2000)；Bodmerら, Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)］。
【００１０】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、シグナル伝達のトランスデューサーというよりはむしろ、インヒビターとして機能すると考えられている、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＯＰＧと称されるレセプターに結合することが報告されている（例えば、ＤＣＲ１（ＴＲＩＤ、ＬＩＴ又はＴＲＡＩＬ−Ｒとも称される）［Panら, Science, 276:111-113 (1997)；Sheridanら, Science, 277:818-821 (1997)；McFarlaneら, J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997)；Schneiderら, FEBS Letters, 416:329-334 (1997)；Degli-Espostiら, J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997)；及び Mongkolsapayaら, J. Immunol., 160:3-6 (1998)；ＤＣＲ２(ＴＲＵＮＤＤ又はＴＲＡＩＬ-Ｒ４とも称される）［Marstersら, Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997)；Panら, FEBS Letters, 424：41-45 (1998)；Degli-Espostiら, Immunity, 7:813-820 (1997)］、及びＯＰＧ［上掲のSimonetら］。ＤＲ４及びＤＲ５とは対照的に、ＤｃＲ１及びＤｃＲ２レセプターはアポトーシスをシグナル伝達しない。
【００１１】
ある種の癌細胞は、デスレセプター活性化に応答してアポトーシスを受けるが、多くは部分的又は全体的耐性を示す。Yangら, Curr. Opin. Cell Biol., (2010)。アポトーシス促進性レセプターアゴニスト（「ＰＡＲＡ」）を用いた多くの前臨床研究は、培養されたヒト癌細胞又はマウスで増殖した異種移植ヒト腫瘍に依存している。しかしながら、自発的又は同系腫瘍におけるアポトーシス促進性レセプター経路の活性化効果については、あまり知られていない。特に、動物モデルにおける腫瘍微小環境に対する効果は、ほとんどのＰＡＲＡがヒトデスレセプターを標的とするが、マウスカウンターパートを標的としないため、十分には理解されていない（Ashkenaziら, Nat. Rev. Drug Disc., 7:1001-1012 (2008)）。以前の研究では、マウスに存在する唯一のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬデスレセプター、マウスＤＲ５に対して産生された抗体（又はＴＲＡＩＬ−Ｒ）のＭＤ５．１を使用している。ＭＤ５．１はインビトロで癌細胞のアポトーシスを誘導することが報告されているが、インビボにおけるその殺腫瘍効果は、自然及び適応免疫の観点で偶発性でありうる（Takedaら, J. Exp. Med., 199:437-448 (2004)；Unoら, Nat. Med., 12:693-698 (2006)；Frewら, Proc. Natl. Acad. Sci., 105:11317-11322 (2008)；Haynesら, J. Immunol., 185:532-541 (2010)）。
【発明の概要】
【００１２】
機能的な血管網状構造は、腫瘍及び癌細胞の増殖及び生存に重要であり、腫瘍血管の特徴を標的とする治療剤が、抗癌療法に対する新規アプローチとなる。本開示は、哺乳動物における腫瘍関連内皮細胞区画においてシグナル伝達するデスレセプター５（「ＤＲ５」）を提供し、その新規の役割を記載するものである。以下に記載する実験は、正常な内皮細胞においてではなく腫瘍関連内皮細胞（ＴＥＣ）におけるＤＲ５の発現を明らかにしている。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの架橋型を用いた同系腫瘍担持マウスの治療により、腫瘍脈管構造の急速な崩壊に至り；この応答のタイミング及び出現の双方が、直接の血管破壊と一致していた。アポトーシスマーカーは、ＤＲ５のライゲーション後、２時間程でＴＥＣに現れ、広範囲に及ぶ腫瘍微小出血が続く。血管破壊は、悪性の腫瘍細胞区画においてではなくＴＥＣでＤＲ５発現を必要としたが、悪性細胞における直接的ＤＲ５媒介性アポトーシスが存在しなくても、実質的な抗腫瘍効果を支持していた。よって、実験データは、癌療法の腫瘍選択性血管破壊剤としてアポトーシス促進性レセプターアゴニストを使用することを示唆している。
【００１３】
今日まで、抗癌剤としてのＰＡＲＡの治療的用途は、ＤＲ５及び／又はＤＲ４を介して、癌細胞アポトーシスを誘導するＰＡＲＡの能力に主として基づいている（Johnstoneら, Nat. Rev. Cancer, 8:782-798 (2008)；Ashkenaziら, Nat. Rev. Drug Disc., 7:1001-1012 (2008)）。しかしながら、いくつかの癌は、デスレセプターライゲーションに対する抵抗性が残っており、悪性細胞におけるアポトーシス回避の機構が、これらの薬剤の臨床的有益性を制限するおそれがある（Yangら, Curr. Opin. Cell Biol., (2010)）。本出願に開示されているように、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ等の薬剤は、腫瘍脈管構造を直接標的にすることにより、抗癌効果を達成することができる。重要なことには、ＤＲ５媒介性の血管破壊は、悪性細胞にＤＲ５機能がない場合でさえ殺腫瘍活性を発揮し、そうでなければＰＡＲＡベースの治療に抵抗することが予期される腫瘍の増殖を阻害する可能性を強調する。様々な血管破壊剤が、癌治療のために臨床開発中であるが；これらの薬剤の治療ウインドは有害事象により制限されるかも知れない（Heathら, Nat. Rev. Clin. Oncol., 6:395-404 (2009)；McKeageら, Cancer, 116:1859-1871 (2010)）。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ治療は、一般的に、ここで提供される研究において良好な耐性を示し、今までのＰＡＲＡの臨床的安全性プロファイルに一致する（Ashkenaziら, J. Clin. Invest., 118:1979-1990 (2008)；Ashkenaziら, Nat. Rev. Drug Discov., 7:1001-1012 (2008)；Ashkenaziら, Cytokine Growth Factor Rev., 19:325-331 (2008)）。ＰＡＲＡは、悪性細胞区画が直接のアポトーシス誘導に対して耐性がある腫瘍を治療する能力を有する、腫瘍選択性血管破壊剤の独特のクラスとして作用しうる。
【００１４】
本発明の実施態様は、血管破壊剤を含有する組成物と、腫瘍脈管構造を破壊するためのこのような薬剤の使用を含む。場合によっては、血管破壊剤はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチド又はデスレセプターアゴニスト抗体である。
【００１５】
また本発明の実施態様は、有効量のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプターアゴニスト抗体に組織又は細胞試料を暴露させる工程を含む、哺乳動物組織又は細胞試料における血管破壊方法を含む。場合によっては、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの高度なオリゴマー型又はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの架橋型である。
【００１６】
本発明のさらなる方法は、有効量のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプターアゴニスト抗体を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物の癌治療方法を含む。場合によっては、本方法は、有効量のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及び／又はデスレセプターアゴニスト抗体の投与に加え、化学療法剤、放射線療法、又は他の血管阻害療法を、前記哺乳動物に施すことを含む。場合によっては、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの高度なオリゴマー型又はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの架橋型である。
【００１７】
また本発明は、脈管構造を破壊するか、又は癌を治療する医薬の調製、又は製造における、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプターアゴニスト抗体の使用を提供する。
【００１８】
さらに本発明は、癌の治療に使用されるキットの製造におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプターアゴニスト抗体の使用を提供する。
【００１９】
本発明の特定の実施態様は、次の請求項によりさらに例証される：
１．治療的有効量のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチド又はデスレセプターアゴニスト抗体に組織又は細胞を暴露することを含む、哺乳移動の組織又は細胞における腫瘍関連脈管構造を破壊する方法。
２．腫瘍関連脈管構造を含む内皮細胞がＤＲ５レセプターを発現する請求項１の方法。
３．哺乳動物組織又は細胞が、ＤＲ５レセプターを発現しない腫瘍又は癌細胞を含む請求項１の方法。
４．哺乳動物組織又は細胞が、ＤＲ５レセプターを発現し、該ＤＲ５レセプターによるアポトーシス誘導に耐性がある腫瘍又は癌細胞を含む請求項１の方法。
５．前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドがオリゴマー又はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの架橋型である請求項１の方法。
６．前記デスレセプターアゴニスト抗体が抗ＤＲ５モノクローナル抗体である請求項１の方法。
７．哺乳動物における腫瘍関連脈管構造を破壊するために、治療的有効量のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチド又はデスレセプターアゴニスト抗体を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の癌を治療する方法。
８．前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチド又はデスレセプターアゴニスト抗体が、前記脈管構造を破壊し、腫瘍への血流を阻害する、請求項７の方法。
９．腫瘍関連脈管構造を含む内皮細胞がＤＲ５レセプターを発現する請求項７の方法。
１０．哺乳動物の腫瘍又は癌細胞がＤＲ５レセプターを発現しない請求項７の方法。
１１．哺乳動物の腫瘍又は癌細胞がＤＲ５レセプターを発現し、該ＤＲ５レセプターによるアポトーシス誘導に対して耐性がある、請求項７の方法。
１２．一又は複数の化学療法剤又は放射線療法が前記哺乳動物にさらに施される請求項７の方法。
１３．抗ＶＥＧＦ抗体が前記哺乳動物にさらに投与される請求項７の方法。
１４．前記抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブである請求項１３の方法。
１５．前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドがＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのオリゴマー又は架橋型である請求項７の方法。
１６．前記デスレセプターアゴニスト抗体が抗ＤＲ５モノクローナル抗体である請求項７の方法。
１７．前記癌が肺癌又は膵臓癌である請求項７の方法。
１８．腫瘍関連脈管構造を破壊するか又は癌を治療する医薬の製造におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチド又はデスレセプターアゴニスト抗体の使用。
１９．前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドがＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのオリゴマー又は架橋型である請求項１８の使用。
２０．前記デスレセプターアゴニスト抗体が抗ＤＲ５モノクローナル抗体である請求項１８の使用。
２１．癌の治療に使用されるキットの製造におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチド又はデスレセプターアゴニスト抗体の使用。
２２．（ａ）Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチド又はデスレセプターアゴニスト抗体及び薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を容器内に収容する容器；及び（ｂ）癌に罹患しているヒト患者の腫瘍関連脈管構造を破壊するために前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチド又はデスレセプターアゴニスト抗体を投与するための使用説明書を含むパッケージ挿入物を含む、癌の治療に使用されるキット。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】図１はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬによる腫瘍脈管構造のＤＲ５依存性破壊を示す。（ａ）野生型（ＤＲ５＋／＋）又はＤＲ５欠損（ＤＲ５−／−）マウスにおいて増殖させたルイス肺癌（ＬＬＣ）腫瘍（〜５００ｍｍ３）に１０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（１０ｍｇ／ｋｇのＦｌａｇタグＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬと１０ｍｇ／ｋｇの抗Ｆｌａｇ抗体からなり、連続的に付与）又はＰＢＳを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により投与した。血管破壊の出現について、処理の２４時間後、腫瘍を巨視的に検査した。
【図１Ｂ】（ｂ）野生型又はＤＲ５−／−マウスにおいて増殖させ、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで処置されたＬＬＣ腫瘍からの切片のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色。画像は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで処置されたＤＲ５−／−ではなく野生型のマウスで広範囲の細胞死及び広範囲の出血を示す。
【図１Ｃ】（ｃ）Ｍｅｃａ−３２染色を使用し、腫瘍内皮を可視化した；代表的な画像は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ処置されたＤＲ５−／−ではなく野生型の又は未処置のマウス由来の腫瘍における血管破壊を示している（矢印；上部右挿入図＝拡大図）。
【図１Ｄ】（ｄ）ＬＬＣ腫瘍を有する野生型又はＤＲ５−／−マウス（ｎ＝３−５／グループ)をＰＢＳ又はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで処置した。処置の２時間後、マウスに、蛍光血液プールプローブＡｎｇｉｏＳｅｎｓｅ６８０ＩＶＭを静脈内注射した。腫瘍における蛍光プローブの分布を麻酔マウスで示された回数でモニターした。エラーバーはＳＥＭを示す。図１のデータは２以上の独立した実験を表す。
【図２Ａ−Ｂ】図２は腫瘍関連内皮細胞におけるＤＲ５媒介性アポトーシスを示す。（ａ）野生型又はＤＲ５欠損（ＤＲ５−／−）マウスで増殖させたＬＬＣ腫瘍におけるＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３１ｈｉｇｈ発現腫瘍関連内皮細胞（ＴＥＣ）によるＤＲ５発現の分析。ＤＲ５発現（影付き）対アイソタイプコントロール（白抜き）株は、ｎ＝４の野生型又はＤＲ５−／−ＬＬＣ腫瘍から生成されたプール細胞画分から示す。（ｂ）野生型又はＤＲ５−／−マウスから単離されたＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３１ｈｉｇｈ発現した「正常」な腎臓内皮細胞によるＤＲ５発現の分析。プール腎臓細胞画分は（ａ）で分析された同じマウスから作製した。
【図２Ｃ】（ｃ）ＬＬＣ腫瘍切片におけるＤＲ５の免疫組織化学的分析。赤い矢印は、ＤＲ５−／−ではない野生型マウスからの腫瘍における内皮（Ｅ）細胞でのＤＲ５染色を強調している。ＤＲ５陽性腫瘍（Ｔ）細胞は野生型及びＤＲ５−／−レシピエントの双方で分かる（黒色矢印）。
【図２Ｄ】（ｄ）Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＰＢＳ（コントロール）で２時間処理した野生型又はＤＲ５−／−マウスから収集された一連のＬＬＣ腫瘍切片におけるＭｅｃａ−３２及び活性化カスパーゼ−３（ＣＣ３）染色。病巣領域のＣＣ３陽性腫瘍細胞（Ｔ、黒色矢印）は、未処置又はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ切片の双方でみられるが、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ処理腫瘍のみ、血管構造に、Ｍｅｃａ−３２染色によって明らかにされたアポトーシスの証拠を示している（Ｅ、赤色矢印）。
【図２Ｅ】（ｅ）Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ処置の時間経過からのＬＬ／Ｃ腫瘍切片に対する切断型カスパーゼ−３免疫組織化学染色の定量。各時点でのｎ＝５の腫瘍の平均をプロットした；エラーバーはＳＥＭを示す。スチューデントｔ検定を、統計的有意性を算出するために使用した。
【図２Ｆ】（ｆ）野生型又はＴＮＦＲ１／２欠損（ＴＮＦＲ１／２−／−）マウスにおいて増殖させたＬＬＣ腫瘍（＞５００ｍｍ３）に１０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＰＢＳを腹腔内投与した。腫瘍を、血管破壊の出現について処置の２４時間後に巨視的に検査した。
【図２Ｇ】（ｇ）示された遺伝子型を有するレシピエントマウスにおいて増殖させた腫瘍における血管破壊の発生をまとめた表。図２のデータは２以上の独立した実験を代表する。
【図３Ａ】図３は、腫瘍脈管構造に対するＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ効果が腫瘍細胞ＤＲ５発現と無関係であることを示している。（ａ）メチルコラントレン誘導性（ＭＣＡ）線維肉腫細胞株を、Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＤＲ５＋／＋）又はＤＲ５欠損（ＤＲ５−／−）マウスから派生させ、フローサイトメトリーによりＤＲ５発現について分析した。
【図３Ｂ】（ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６ ＤＲ５＋／＋Ｒａｇ２−／−（上部及び中間部パネル）、又はＣ５７ＢＬ／６ ＤＲ５−／−（底部パネル）、レシピエントにおいて増殖させたＤＲ５＋／＋又はＤＲ５−／−線維肉腫腫瘍の画像。腫瘍を、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬでの処理の２４時間後に収集し、ＰＢＳ処理コントロールと比較した。
【図３Ｃ】（ｃ）ＭＣＡ誘導性腫瘍の腫瘍脈管構造におけるアポトーシス。ＤＲ５＋／＋（ｃ）ＭＣＡ誘導性線維肉腫腫瘍細胞をＣ５７ＢＬ／６ ＤＲ５＋／＋Ｒａｇ２−／−レシピエントに移植し、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（１０ｍｇ／ｋｇ）で４時間処置した。腫瘍からの一連の切片を、Ｍｅｃａ−３２又は活性化（切断型）カスパーゼ−３に対して特異的な抗体で染色し、内皮細胞及びアポトーシス細胞をそれぞれ局在化させた。図３のデータは２以上の独立した実験を代表する。
【図３Ｄ】（ｄ）ＭＣＡ誘導性腫瘍の腫瘍脈管構造におけるアポトーシス。ＤＲ５−／−(ｄ)ＭＣＡ誘導性線維肉腫腫瘍細胞をＣ５７ＢＬ／６ ＤＲ５＋／＋Ｒａｇ２−／−レシピエントに移植し、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（１０ｍｇ／ｋｇ）で４時間処置した。腫瘍からの一連の切片を、Ｍｅｃａ−３２又は活性化（切断型）カスパーゼ−３に対して特異的な抗体で染色し、内皮及びアポトーシス細胞をそれぞれ局在化させた。図３のデータは２以上の独立した実験を代表する。
【図４Ａ】図４は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬによる血管破壊がインビボでの抗腫瘍効果に寄与していることを示す。（ａ）ＤＲ５＋／＋又はＤＲ５−／−線維肉腫細胞株を、用量設定したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを用い、インビトロで処置した。カスパーゼ−８及びカスパーゼ３／７活性を、発光基質アッセイを使用し、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ処置の４時間後に定量した。細胞生存率を、ＡＴＰベースのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイを使用し、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ処置の２４時間後に測定した。
【図４Ｂ−Ｄ】（ｂ）ＤＲ５＋／＋又はＤＲ５−／−線維肉腫細胞株を、ＤＲ５＋／＋Ｒａｇ２−／−レシピエントマウスにおいて増殖させ、単一用量（１０ｍｇ／ｋｇ）のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで処置し、活性化（切断型）カスパーゼ−３に対する抗体で、免疫組織化学（ＩＨＣ）するために収集した。グラフは、コントロール（０時間）又はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで処置された（２４時間）マウスからの腫瘍切片に対する切断型カスパーゼ−３のＩＨＣ染色の定量を示す。各グループについて、ｎ＝５の腫瘍の平均をプロットした；エラーバーはＳＥＭを示す。スチューデントｔ検定を、統計的有意性を算出するために使用した。野生型（ｃ）又はＤＲ５−／−（ｄ）ＭＣＡ誘導性腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６ＤＲ５＋／＋Ｒａｇ２−／−マウスを、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを用いて、２週間、週に５回処置し、腫瘍増殖を未処理コントロールと比較した。エラーバーはＳＥＭを示す（ｎ＝８−１０マウス／グループ）。Ｐ値をスチューデントｔ検定を使用して算出した；星印はｐ＜０．０１を示し；二重星印はｐ＜０．００１を示す。図４のデータは２以上の独立した実験を代表する。
【図５Ａ】補足図１は、マウス腫瘍細胞株（American Type Culture Collection (ATCC)から入手）によるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対するＤＲ５発現及び選択性を示す。（ａ）ＤＲ５発現を、Ｂ１６（メラノーマ）、ＣＴ２６（結腸癌）、４Ｔ−１（乳癌）、ＥＬ４（リンパ腫）、ＬＬＣ（肺癌）、及びＲｅｎｃａ３３１（腎細胞癌）に対するフローサイトメトリーにより評価した。プロファイルは、ＤＲ５発現（影付き）対アイソタイプコントロール抗体（白抜きライン）を示す。
【図５Ｂ】（ｂ）Ｒｅｎｃａ３３１細胞を、用量設定したデュラネルミン又はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのＦｌａｇタグ型で、抗Ｆｌａｇ架橋抗体と組合せたもので処置した。カスパーゼ３／７活性の増加倍数及び細胞生存率の減少パーセントを、カスパーゼ−３／７（４時間）Ｇｌｏ又はＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（２４時間）アッセイ(Promega)により定量した。補足図１のデータは２以上の独立した実験を代表する。
【図５Ｃ】（ｃ）ＬＬＣ細胞を、用量設定したデュラネルミン又はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのＦｌａｇタグ型で、抗Ｆｌａｇ架橋抗体と組合せたもので処置した。カスパーゼ３／７活性の増加倍数及び細胞生存率の減少パーセントを、カスパーゼ−３／７（４時間）Ｇｌｏ又はＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（２４時間）アッセイ(Promega)により定量した。補足図１のデータは２以上の独立した実験を代表する。
【図６】補足図２は、ルイス肺癌腫瘍のインビボ近赤外線蛍光画像を示す。ＬＬＣ腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６野生型（ストローマＤＲ５＋／＋）又はＤＲ５欠損（ストローマＤＲ５−／）マウスを、蛍光血液プールプローブＡｎｇｉｏＳｅｎｓｅ６８０ＩＶＭの注射の２時間前に、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＰＢＳ（コントロール）で処置した。プローブ注射後の時間経過からの代表的画像を示す。
【図７】補足図３は、ＤＲ５発現が、野生型及びでＲ５欠損マウスにおいて増殖させたＬＬＣ腫瘍により発現したことを示す。フローサイトメトリーを使用し、野生型（ＤＲ５＋／＋）又はＤＲ５欠損（ＤＲ５−／−）マウスから収集された腫瘍からの腫瘍関連白血球（ＣＤ４５ｈｉｇｈ、画分Ａ）及びＬＬＣリッチ腫瘍細胞（ＣＤ４５ｌｏｗ ＣＤ３１ｌｏｗ、画分Ｂ）に対するエクスビボのＤＲ５表面発現を評価した。
【図８】補足図４は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが、ＤＲ５欠損ではない野生型マウスで増殖させたＬＬＣ腫瘍においてアポトーシスを誘導することを示している。ＬＬＣ腫瘍細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６ ＤＲ５＋／＋又はＤＲ５−／−レシピエントに移植し、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（１０ｍｇ／ｋｇ）で２４時間処理した。処理された腫瘍からの一連の切片を、Ｍｅｃａ−３２又は切断型（活性型）カスパーゼ−３に対して特異的な抗体で染色し、内皮細胞及びアポトーシス細胞をそれぞれ局在化させた。
【図９】補足図５は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが、ストローマにおけるＴＮＦａシグナル伝達とは無関係に腫瘍細胞アポトーシスを誘導することを示している。ＬＬＣ腫瘍細胞をＣ５７ＢＬ／６野生型又はＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２二重欠損（ＴＮＦＲ１／２−／−）マウスに移植した。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＰＢＳ（コントロール）での処理の２４時間後、腫瘍を収集し、フローサイトメトリーを使用して腫瘍細胞における切断型カスパーゼ−３活性を測定した。カスパーゼ−３活性はコントロール（ＰＢＳ）に対する倍数として表した。
【図１０】補足図６は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが、メチルコラントレン誘導性（ＭＣＡ）線維肉腫において出血を誘導することを示している。ＤＲ５＋／＋Ｒａｇ２−／−マウスで増殖させたＤＲ５＋／＋又はＤＲ５−／−ＭＣＡ腫瘍からの切片をＨ＆Ｅ染色し、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＰＢＳで２４時間処理した。
【図１１】補足図７は、腫瘍関連内皮細胞ＤＲ５の発現が、ＭＣＡ誘導性線維肉腫におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬアポトーシス促進性シグナル伝達に必要であることを示している。野生型（ＤＲ５＋／＋）ＭＣＡ誘導性線維肉腫細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＤＲ５＋／＋）又はＤＲ５−／−マウスにおいて増殖させた。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬでの処理の２４時間後、腫瘍を収集し、フローサイトメトリーを使用して腫瘍細胞における切断型カスパーゼ−３活性を測定した。カスパーゼ−３活性はコントロール（０時間）の倍数として表した。
【図１２】補足図８は、腫瘍関連内皮細胞ＤＲ５発現が、ＬＬＣ腫瘍モデルにおいてＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ抗腫瘍活性に必要であることを示している。（ａ）ＬＬＣ腫瘍（＜２００ｍｍ３）を持つＣ５７ＢＬ／６を、ＰＢＳ（コントロール）又はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで、２週間、週５回処置した（ｎ＝１０／群）。エラーバーはＳＥＭを示す。（ｂ）１２日目の腫瘍量の未処理のＬＬＣ腫瘍をＣ５７Ｂ／Ｌ６野生型又はＤＲ５欠損（ＤＲ５−／−）マウスに移植した（ｎ＝１０／群）。（ｃ）Ｃ５７Ｂ／Ｌ６野生型又はＤＲ５−／−マウスにおいて増殖させたＬＬＣ腫瘍細胞を、１０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＰＢＳ（コントロール）で５日間処理した。アイソタイプコントロールで処理されたマウスに対する腫瘍量を、処理の５日目に標示する。エラーバーはＳＥＭを示す。スチューデントｔ検定を、統計的有意性を算出するために使用した。補足図８のデータは２以上の独立した実験を代表する。
【図１３】補足図９は、Ｈ２１２２ヒト肺癌異種移植腫瘍を持つマウスにおけるデュラネルミン及びＡｐｏ２Ｌ．.Ｍ２（Ａｐｏ２Ｌの架橋型）の効果を示す。
【図１４】補足図１０は、膵臓癌のマウスモデルにおけるＡｐｏ２Ｌ．Ｍ２（Ａｐｏ２Ｌの架橋型）の効果を示す。
【図１５】補足図１１は、ヒトＡｐｏ−２リガンド又はＴＲＡＩＬ（「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ」）ポリペプチドに対するコード化ＤＮＡ（配列番号：２）及びアミノ酸配列（配列番号：１）を示す。図中の下線はポリペプチドの推定膜貫通領域を示す。ヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドの配列もまた１９９７年１月１６日に公開の国際公開第９７／０１６３３号と１９９７年７月１７日に公開の国際公開第９７／２５４２８号に提供されている。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
特に別の定義をしない限り、ここで使用される専門用語、表記及び他の科学的な用語のすべては、この発明に関連する当業者に一般的に理解される意味を持つことが意図される。ある場合には、一般的に理解される意味を持つ用語を明確化及び／又は参照を容易にするためにここで定義するが、ここで定義を含めることが、当該技術分野で一般的に理解されていることと実質的に異なることを表すためであると必ずしも解釈されるべきではない。ここに記載され又は参照される技術及び手順は当業者により一般的に十分に理解され、例えばSambrook 等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載された広く利用される分子クローニング方法論などの、一般的な方法論を使用して通常利用されるものである。必要に応じて、市販のキットや試薬の使用を伴う手順は、特に明記しない限り、製造者が定めたプロトコール及び／又はパラメータに従って一般的に実施される。
【００２２】
明細書及び添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでない限り、複数形を含むことに留意されなければならない。
【００２３】
ここに述べられるすべての出版物は出典明示によりここに援用され、該出版物の引用に関連して方法及び／又は材料を開示し記載する。ここで引用される出版物は、本出願の出願日前の開示について引用するものである。発明者が優先日より早い又は発明日より早い出版物によって権利が与えられないことを認めていると決して解釈されてはならない。さらに、実際の出版日は示されているものと異なり、個々に検証を必要とする場合がある。
【００２４】
（定義）
「Ａｐｏ−２リガンド」、「Ａｐｏ−２Ｌ」、「Ａｐｏ２Ｌ」、「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ」、「Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ」及び「ＴＲＡＩＬ」なる用語は、補足図１１に示されたアミノ酸配列のアミノ酸残基１１４−２８１、９５−２８１、残基９２−２８１、残基９１−２８１、残基４１−２８１、残基３９−２８１、残基１５−２８１、又は残基１−２８１、並びに上記配列の生物学的に活性な断片、欠損、挿入、又は置換変異体を含むポリペプチド配列を意味するものとして互換可能に使用される。一実施態様では、ポリペプチド配列は補足図１１の残基１１４−２８１を含む。場合によっては、ポリペプチド配列は補足図１１の残基９２−２８１又は残基９１−２８１を含む。Ａｐｏ−２Ｌポリペプチドは補足図１１に示された天然ヌクレオチド配列によってコードされうる。場合によっては、残基Ｐｒｏ１１９（補足図１１）をコードするコドンは「ＣＣＴ」又は「ＣＣＧ」でありうる。場合によっては、断片又は変異体は生物学的に活性であり、上記の配列の何れか一と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。この定義には、その天然のアミノ酸の少なくとも一がアラニン残基などの他のアミノ酸によって置換されているＡｐｏ−２リガンドの置換変異体が包含される。任意の置換変異体は一又は複数の残基置換を包含する。任意の変異体は、補足図１１の天然配列のＡｐｏ−２リガンドポリペプチド配列と異なるアミノ酸配列を含んでもよく、補足図１１の残基位置での一又は複数の次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｋ１７９Ｃを有する。また、定義には、組換え又は合成法によって調製され、又はＡｐｏ−２リガンド源から単離された天然配列Ａｐｏ−２リガンドもまた包含される。本発明のＡｐｏ−２リガンドは１９９７年１月１６日公開の国際公開第９７／０１６３３号、１９９７年７月１７日公開の国際公開第９７／２５４２８号、１９９９年７月２２日公開の国際公開第９９／３６５３５号、２００１年１月４日公開の国際公開第０１／００８３２号、２００２年２月７日公開の国際公開第０２／０９７５５号、及び２０００年１２月１４日公開の国際公開第００／７５１９１号に開示されたＡｐｏ−２リガンド又はＴＲＡＩＬと称されるポリペプチドを含む。本用語は、一般に、ポリペプチドの単量体、二量体、三量体、六量体又はより高度のオリゴマー形態を含むＡｐｏ−２リガンドの形態を意味するために使用される。Ａｐｏ−２Ｌ配列において言及されているアミノ酸残基の全ての番号付けは、特に他の定義を行わない限り、補足図１１に従った番号付けを使用している。例えば、「Ｄ２０３」又は「Ａｓｐ２０３」は、補足図１１に与えられた配列における位置２０３のアスパラギン酸残基を意味している。
【００２５】
補足図１１のアミノ酸１１４−２８１からなり、大腸菌で産生される組換えヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドの可溶型は、ＵＳＡＮ名「デュラネルミン」が割り当てられており、「デュラネルミン」との記載はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドのこの形態を意味する。デュラネルミンは、２００１年１月４日に公開の国際公開第０１／００８３２号と２００３年５月２２日に公開の国際公開第０３／０４２３４４号に記載されているように、ジェネンテック社（South San Francisco, CA）により製造され、製剤化されている。
【００２６】
ここで使用される「Ａｐｏ−２リガンド選択的変異体」という用語は、天然Ａｐｏ−２リガンド配列において一又は複数のアミノ酸変異を含み、ＤＲ４レセプター又はＤＲ５レセプターに対して選択的な結合親和性を有するＡｐｏ−２リガンドポリペプチドを意味する。一実施形態では、Ａｐｏ−２リガンド変異体はＤＲ４レセプターに対して選択的結合親和性を有し、天然Ａｐｏ−２リガンド配列の位置１８９、１９１、１９３、１９９、２０１又は２０９のいずれか一に一又は複数のアミノ酸置換を含む。別の実施形態では、Ａｐｏ−２リガンド変異体はＤＲ５レセプターに対して選択的結合親和性を有し、天然Ａｐｏ−２リガンド配列の位置１８９、１９１、１９３、２６４、２６６、２６７又は２６９のいずれか一に一又は複数のアミノ酸置換を含む。好ましいＡｐｏ−２リガンド選択的変異体は、一又は複数のアミノ酸変異を含み、ＤＲ４レセプターに対し、天然配列Ａｐｏ−２リガンド結合親和性以上（≧）のＤＲ４レセプターに対する結合親和性を示し、さらに好ましくは、Ａｐｏ−２リガンド変異体は、ＤＲ５レセプターに対し、天然配列Ａｐｏ−２リガンドがＤＲ５に対して示す結合親和性より小さい（＜）結合親和性を示す。このようなＡｐｏ−２リガンド変異体のＤＲ４レセプターに対する結合親和性が、天然配列Ａｐｏ−２リガンドと比較した場合、ほぼ等しい（不変である）か、それよりも大きく（増大している）、Ａｐｏ−２リガンド変異体のＤＲ５レセプターに対する結合親和性が、天然配列Ａｐｏ−２リガンドと比較した場合、小さいか、殆ど消滅している場合、ここでの目的に対して、Ａｐｏ−２リガンド変異体の結合親和性はＤＲ４レセプターに対して「選択性」であると考えられる。本発明の好ましいＤＲ４選択性Ａｐｏ−２リガンド変異体は、ＤＲ５レセプターに対して（天然配列Ａｐｏ−２リガンドと比較した場合）少なくとも１０倍少ない結合親和性を有し、さらに好ましくは、ＤＲ５レセプターに対して（天然配列Ａｐｏ−２リガンドと比較した場合）少なくとも１００倍少ない結合親和性を有する。Ａｐｏ−２リガンド変異体それぞれの結合親和性を測定し、当該技術分野で知られているＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び／又はＢＩＡｃｏｒｅアッセイにより（１１４−２８１形態等の）天然Ａｐｏ−２Ｌの結合特性と比較されうる。本発明の好ましいＤＲ４選択性Ａｐｏ−２リガンド変異体は、少なくとも１種類の哺乳動物細胞（好ましくは癌細胞）にアポトーシスを誘導し、そのようなアポトーシス活性をアラマーブルー又はクリスタルバイオレットアッセイ等の既知の方法により測定することができる。ＤＲ４選択性Ａｐｏ−２リガンド変異体は、Ａｐｏ−２Ｌのデコイレセプターのいずれかに対して変化した結合親和性を有していても有していなくともよく、それらデコイレセプターは当技術分野でＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＯＰＧと称される。
【００２７】
さらなる好ましいＡｐｏ−２リガンド選択的変異体は、一又は複数のアミノ酸変異を含み、ＤＲ５レセプターに対し、天然配列Ａｐｏ−２リガンドの結合親和性に等しいかそれより多い（≧）ＤＲ５レセプターに対する結合親和性を示し、さらに好ましくは、そのようなＡｐｏ−２リガンド変異体は、ＤＲ４レセプターに対し、天然配列Ａｐｏ−２リガンドにより示される結合親和性よりも小さい（＜）結合親和性をＤＲ４に対して示す。このようなＡｐｏ−２リガンド変異体のＤＲ５レセプターに対する結合親和性が、天然配列Ａｐｏ−２リガンドと比較して、ほぼ等しい（不変である）か、それよりも大きく（増大している）、Ａｐｏ−２リガンド変異体のＤＲ４レセプターに対する結合親和性が、天然配列Ａｐｏ−２リガンドと比較して、それより小さいか、殆ど消滅している場合、ここでの目的に対して、Ａｐｏ−２リガンド変異体の結合親和性はＤＲ５レセプターについて「選択性」であると考えられる。本発明の好ましいＤＲ５選択性Ａｐｏ−２リガンド変異体は、ＤＲ４レセプターに対して（天然配列Ａｐｏ−２リガンドと比較した場合）少なくとも１０倍少ない結合親和性を有し、さらに好ましくは、ＤＲ４レセプターに対して（天然配列Ａｐｏ−２リガンドと比較した場合）少なくとも１００倍少ない結合親和性を有する。Ａｐｏ−２リガンド変異体のそれぞれの結合親和性を測定し、当該技術分野で知られているＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び／又はＢＩＡｃｏｒｅアッセイにより（１１４−２８１型等の）天然Ａｐｏ２Ｌの結合特性と比較されうる。本発明の好ましいＤＲ５選択性Ａｐｏ−２リガンド変異体は、少なくとも１種類の哺乳動物細胞（好ましくは癌細胞）にアポトーシスを誘導し、そのようなアポトーシス活性をアラマーブルー又はクリスタルバイオレットアッセイ等の既知の方法により測定することができる。ＤＲ５選択性Ａｐｏ−２リガンド変異体は、Ａｐｏ−２Ｌのデコイレセプターのいずれかに対して変化した結合親和性を有していても有していなくともよく、それらデコイレセプターを当技術分野でＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＯＰＧと称される。
【００２８】
アミノ酸の識別にはアミノ酸の１文字アルファベット又は３文字アルファベットが使用される、すなわち、
Ａｓｐ  Ｄ  アスパラギン酸                  Ｉｌｅ  Ｉ  イソロイシン
Ｔｈｒ  Ｔ  スレオニン                      Ｌｅｕ  Ｌ  ロイシン
Ｓｅｒ  Ｓ  セリン                          Ｔｙｒ  Ｙ  チロシン
Ｇｌｕ  Ｅ  グルタミン酸                    Ｐｈｅ  Ｆ  フェニルアラニン
Ｐｒｏ  Ｐ  プロリン                        Ｈｉｓ  Ｈ  ヒスチジン
Ｇｌｙ  Ｇ  グリシン                        Ｌｙｓ  Ｋ  リジン
Ａｌａ  Ａ  アラニン                        Ａｒｇ  Ｒ  アルギニン
Ｃｙｓ  Ｃ  システイン                      Ｔｒｐ  Ｗ  トリプトファン
Ｖａｌ  Ｖ  バリン                          Ｇｌｎ  Ｑ  グルタミン
Ｍｅｔ  Ｍ  メチオニン                      Ａｓｎ  Ｎ  アスパラギン
【００２９】
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ細胞外ドメイン」又は「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ ＥＣＤ」なる用語は、膜貫通又は細胞質ドメインを本質的に含まない形態のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを意味する。通常、ＥＣＤはこのような膜貫通及び細胞質ドメインを１％未満しか有しておらず、好ましくはこのようなドメインを０．５％未満しか有していない。本発明のポリペプチドに対して同定される任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのタイプを同定するために当該技術分野で常套的に使用される基準に従い同定される。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約５アミノ酸を越えないと思われる。好ましい実施態様では、ＥＣＤは、膜貫通で細胞質又は細胞内ドメインを有さない（及び膜結合していない）ポリペプチドの、可溶性の細胞外ドメイン配列からなる。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの特定の細胞外ドメイン配列は、ＰＣＴ公報ＷＯ９７／０１６３３及びＷＯ９７／２５４２８に開示されている。
【００３０】
ここで使用される「エピトープタグ」なる用語は、「タグポリペプチド」に融合したＡｐｏ−２リガンド又はその一部を含んでなるキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するのに十分な数の残基を有しているが、その長さは、Ａｐｏ−２リガンドの活性を妨害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８から約５０のアミノ酸残基（好ましくは約１０〜約２０のアミノ酸残基）を有する。
【００３１】
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ単量体」又は「Ａｐｏ２Ｌ単量体」なる用語は、Ａｐｏ２Ｌの細胞外ドメイン配列の共有結合鎖を意味する。
【００３２】
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ二量体」又は「Ａｐｏ２Ｌ二量体」なる用語は、ジスルフィド結合を介した共有結合で結合した２つのＡｐｏ２Ｌ単量体を意味する。ここで使用される該用語は、独立のＡｐｏ２Ｌ二量体とＡｐｏ２Ｌの三量体形態内にある（すなわち、他の第３のＡｐｏ２Ｌ単量体と結合している）Ａｐｏ２Ｌ二量体を含む。
【００３３】
「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ三量体」又は「Ａｐｏ２Ｌ三量体」なる用語は、非共有結合的に結合した３つのＡｐｏ２Ｌ単量体を意味する。
【００３４】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの高度なオリゴマー型、例えばＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの六量体型、ナノマー型、及び架橋型も、本発明における使用のために含まれる。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ単量体、二量体、又は三量体（又は、他の高度なオリゴマー型）の存在の決定及び定量は、当該技術分野で知られている方法及びアッセイ、例えば、未変性サイズ排除ＨＰＬＣ（「ＳＥＣ」）、硫酸ドデシルナトリウムを使用する変性サイズ排除クロマトグラフィー（「ＳＤＳ−ＳＣＥ」）、逆相ＨＰＬＣ、及びキャピラリー電気泳動を使用（及び商業的に入手可能な材料を使用）して実施される。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの高度なオリゴマー型は、当該技術分野で知られている方法及び材料、例えば、リンカー又はロイシンジッパー分子を使用することにより実施されうる。
【００３５】
「Ａｐｏ−２リガンドレセプター」には、「ＤＲ４」及び「ＤＲ５」等と当該技術分野で称されるレセプターが含まれる。Ｐａｎらは、「ＤＲ４」と称されるＴＮＦレセプターファミリーメンバーについて記載している（Panら, Science, 276:111-113 (1997)；  また、１９９８年７月３０日に公開された国際公開第９８／３２８５６号；１９９９年７月２９日に公開された国際公開第９９／３７６８４号；２０００年１２月７日に公開された国際公開第００／７３３４９号；２００２年８月１３日に発行された米国特許第６４３３１４７号；２００２年１０月８日に発行された米国特許第６４６１８２３号；及び２００２年１月２９日に発行された米国特許第６３４２３８３号を参照）。Ｓｈｅｒｉｄａｎら（ Science, 277:818-821 (1997)）及びＰａｎら（Science, 277:815-818 (1997)）には、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの他のレセプターが記載されている（また１９９８年１１月１９日に公開された国際公開第９８／５１７９３号；１９９８年９月２４日に公開された国際公開第９８／４１６２９号を参照）。このレセプターはＤＲ５とも称される（該レセプターは、Ａｐｏ−２；ＴＲＡＩＬ−Ｒ、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ−６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２又はＫＩＬＬＥＲとも呼ばれている；Screatonら, Curr. Biol., 7：693-696(1997)；Walczakら, EMBO J., 16：5386-5387(1997)；Wuら, Nature Genetics, 17:141-143 (1997)；１９９８年８月２０日公開の国際公開第９８／３５９８６号；１９９８年１０月１４日公開の欧州特許第８７０，８２７号；１９９８年１０月２２日公開の国際公開第９８／４６６４３号；１９９９年１月２１日公開の国際公開第９９／０２６５３号；１９９９年２月２５日公開の国際公開第９９／０９１６５号；１９９９年３月１１日公開の国際公開第９９／１１７９１号；２００２年８月１３日公開の米国特許出願公開第２００２／００７２０９１号；２００１年１２月７日公開の米国特許出願公開第２００２／００９８５５０号；２００１年１２月６日発行の米国特許第６３１３２６９号；２００１年８月２日公開の米国特許出願公開第２００１／００１０９２４号；２００３年７月３日公開の米国特許出願公開第２００３／０１２５５５４０号；２００２年１０月３１日公開の米国特許出願公開第２００２／０１６０４４６号；２００２年４月２５日公開の米国特許出願公開第２００２／００４８７８５号；２００３年５月２７日発行の米国特許第６５６９６４２号；２０００年６月６日発行の米国特許第６０７２０４７号；２００３年１１月４日発行の米国特許第６６４２３５８号）。上述したように、Ａｐｏ−２Ｌに対する他のレセプターには、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、及びＯＰＧが含まれる（Sheridanら, 上掲；Marstersら, 上掲；及びSimonetら, 上掲を参照）。ここで使用される場合、「Ａｐｏ−２Ｌレセプター」なる用語は、天然配列レセプター及びレセプター変異体を含む。これらの用語は、ヒトを含む多様な哺乳動物において発現されるＡｐｏ−２Ｌレセプターを含む。Ａｐｏ−２Ｌレセプターは多様なヒト組織系統において自然に生じる場合、内因的に発現されてもよいし、又は組換えもしくは合成法により発現されてもよい。「天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプター」は、天然から誘導されるＡｐｏ−２Ｌレセプターと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。よって、天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプターは、任意の哺乳動物からの天然に生じるＡｐｏ−２Ｌレセプターのアミノ酸配列を有することができる。このような天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプターは、自然から単離することもできるし、又は組換えもしくは合成手段により生じさせることもできる。「天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプター」なる用語は、特に、該レセプターの天然に生じた切断又は分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列を含む可溶型）、天然に生じた変異形態（例えば、選択的にスプライシングされた形態）及び天然に生じた対立遺伝子変異体が含まれる。レセプター変異体は、天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプターの断片又は欠失変異体を含む。ヒトＤＲ５の転写スプライシングバリアントは当該技術分野で知られている。このＤＲ５スプライシングバリアントは、ヒトＤＲ５の４４０のアミノ酸配列をコードする。
【００３６】
「デスレセプター抗体」は、アポトーシスをシグナル伝達することができるデスドメインを含み、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーにおけるレセプターに対して産生される抗体又は抗体群を一般的に意味するためにここで使用され、このような抗体にはＤＲ５抗体及びＤＲ４抗体が含まれる。
【００３７】
「ＤＲ５レセプター抗体」、「ＤＲ５抗体」又は「抗ＤＲ５抗体」は、広義には、ＤＲ５レセプター、例えば１−４１１配列又は１−４４０配列、又はその細胞外ドメインの少なくとも一形態に結合する抗体を指すために使用される。場合によっては、ＤＲ５抗体は異種性配列又は分子に融合又は結合する。好ましくは、異種性配列は抗体がより高次の又はオリゴマー複合体を形成させるか又は形成を補助する。場合によっては、ＤＲ５抗体はＤＲ５レセプターに結合するが、任意の付加的なＡｐｏ−２Ｌレセプター（例えばＤＲ４、ＤｃＲ１又はＤｃＲ２）と結合又は交差反応をしない。場合によっては、抗体はＤＲ５シグナル伝達活性のアゴニストである。
【００３８】
場合によっては、本発明のＤＲ５抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイで測定して約０．１ｎＭから約２０ｍＭの範囲の濃度でＤＲ５レセプターに結合する。場合によっては、本発明のＤＲ５抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイで測定して約０．６ｎＭから約１８ｍＭのＩＣ５０値を示す。
【００３９】
「ＤＲ４レセプター抗体」、「ＤＲ４抗体」又は「抗ＤＲ４抗体」は、広義には、ＤＲ４レセプター又はその細胞外ドメインの少なくとも一形態に結合する抗体を指すために使用される。場合によっては、ＤＲ４抗体は異種性配列又は分子に融合又は結合する。好ましくは、異種性配列は抗体がより高次の又はオリゴマー複合体を形成させるか又は形成を補助する。場合によっては、ＤＲ４抗体はＤＲ４レセプターに結合するが、任意の付加的なＡｐｏ−２Ｌレセプター（例えばＤＲ５、ＤｃＲ１又はＤｃＲ２）と結合又は交差反応をしない。場合によっては、抗体はＤＲ４シグナル伝達活性のアゴニストである。
【００４０】
場合によっては、本発明のＤＲ４抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイで測定して約０．１ｎＭから約２０ｍＭの範囲の濃度でＤＲ４レセプターに結合する。場合によっては、本発明のＤＲ４抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイで測定して約０．６ｎＭから約１８ｍＭのＩＣ５０値を示す。
【００４１】
「アゴニスト」なる用語は広義に用いられ、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４又はＤＲ５のインビトロ、インサイツないしインビボでの一又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に亢進、刺激又は活性化する任意の分子を含む。このような生物学的活性の例は、アポトーシス並びにさらに文献に報告されているものを含む、ＤＲ４又はＤＲ５へのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの結合である。アゴニストは直接的ないし間接的形式で機能しうる。例えば、アゴニストは、レセプター活性化又はシグナル伝達を起こすＤＲ４又はＤＲ５への直接的結合の結果としてのインビトロ、インサイツないしインビボでのＤＲ４又はＤＲ５の一又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に亢進、刺激又は活性化するように機能しうる。また、アゴニストは、例えば、ＤＲ４又はＤＲ５の活性化ないしシグナル伝達を引き起こす他のエフェクター分子を刺激する結果としてのＤＲ４又はＤＲ５のインビトロ、インサイツないしインビボでの一又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に亢進、刺激又は活性化するように間接的に機能しうる。アゴニストは、ＤＲ４又はＤＲ５の活性化又は活性を亢進又は増強するように間接的に機能するエンハンサー分子として働きうることが考えられる。例えば、アゴニストは哺乳動物の内因性のＡｐｏ−２Ｌの活性を亢進しうる。例えば、これはＤＲ４ないしＤＲ５をプレ複合体化することによって、又は、ＤＲ４又はＤＲ５レセプターとのそれぞれのリガンドの複合体を安定化することによって達成することができる（Ａｐｏ−２ＬとＤＲ４又はＤＲ５との間に形成された天然複合体型を安定化するなど）。
【００４２】
ここで使用される「ポリオール」という用語は広く多価アルコール化合物を意味する。ポリオールは例えば任意の水可溶型ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーであり得、直鎖又は分枝鎖を有しうる。好適なポリオールには、一又は複数のヒドロキシル位置に化学基、例えば１から４の炭素を有するアルキル基で置換されているものが含まれる。典型的には、ポリオールはポリ（アルキレングリコール）、好ましくはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。しかし、当業者であれば、他のポリオール、例えばポリ（プロピレングリコール）及びポリエチレン−ポリプロピレングリコールコポリマーを、ここでＰＥＧについて記載したコンジュゲート技術を使用して用いることができることが分かるであろう。本発明のポリオールには当該技術分野でよく知られたもの及び公的に入手可能なもの、例えば商業的に利用可能な供給源からのものが含まれる。
【００４３】
「コンジュゲート」という用語は、ここではその最も広い定義で使用され、互いに接合(joined)又は結合(linked)されていることを意味する。分子は、それらが接合されているように作用又は機能する場合、「コンジュゲート」されている。
【００４４】
「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」という用語は、膜貫通及び細胞質ドメインを本質的に持たないリガンド又はレセプターの形態を意味する。通常、可溶性ＥＣＤは、そのような膜貫通及び細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満だけ有する。
【００４５】
「二価の金属イオン」という用語は、二つの正電荷を有する金属イオンを意味する。本発明において使用される二価金属イオンの例には、限定されるものではないが、亜鉛、コバルト、ニッケル、カドミウム、マグネシウム、及びマンガンが含まれる。かかる金属の特定の形態は塩形態（例えば、製薬剤的に許容可能な塩形態）、例えば、上述の二価の金属イオンの塩化物、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩及び硫酸塩形態を含むものが用いられうる。ここに記載の二価金属イオンは、好ましくは、例えば、（１）所望する期間にわたってＡｐｏ−２Ｌ三量体の貯蔵安定性を高め、（２）組換え細胞培養又は精製法においてＡｐｏ−２Ｌ三量体の生産又は収量を高め、（３）Ａｐｏ−２Ｌ三量体の溶解性を高め（又は凝集性を低下させ）、又は（４）Ａｐｏ−２Ｌ三量体の形成を高めるのに十分な濃度又は量（例えば有効量）で用いられる。
【００４６】
「単離された」とは、ここで開示された様々なタンパク質を記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分とは、タンパク質の診断又は治療的な使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、タンパク質は、（１）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、（２）クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一になるまで充分なほど精製される。タンパク質の自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離されたタンパク質には、組換え細胞内のインサイツでのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたタンパク質は少なくとも一の精製工程により調製される。
【００４７】
「単離された」核酸分子は、同定され、核酸の天然源に通常付随している少なくとも一の汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＡｐｏ−２リガンド核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。よって、単離されたＡｐｏ−２リガンド核酸分子は、天然の細胞中に存在するＡｐｏ−２リガンド核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＡｐｏ−２リガンド核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にあるＡｐｏ−２リガンドを通常発現する細胞に含まれるＡｐｏ−２リガンド核酸分子を含む。
【００４８】
ここで同定されている配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要ならば最大のパーセント配列同一性を得るために間隙を導入し、如何なる同類置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、Ａｐｏ−２リガンド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある様々な方法で達成可能であり、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要なアルゴリズムを割り当てることを含み、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここでの目的のために、パーセントアミノ酸同一性値は、ジェネンテック社によって作成され、ソースコードが米国著作権庁（Washington D.C., 20559）に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはジェネンテック社（South San Francisco, CA）を通して公に入手可能である。全ての配列比較パラメーターはＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変化しない。
【００４９】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に好適なコントロール配列は、例えばプロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００５０】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているならそのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならばコード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるならコード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合する」とは、結合されたＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにある。しかし、エンハンサーは必ずしも近接しているわけではない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法にしたがって、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００５１】
「ＶＥＧＦ」又は「ＶＥＧＦ-Ａ」なる用語は、Ｌｅｕｎｇら（Science, 246:1306 (1989)）、及びＨｏｕｃｋら（Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)）により記載されているように、天然に生じたアレル及びそのプロセシング形態と共に、１６５−アミノ酸ヒト血管内皮細胞増殖因子、及び関連する１２１−、１８９−、及び２０６−アミノ酸ヒト血管内皮細胞増殖因子を指すために使用される。ＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−Ｆ、及びＰｌＧＦを含む遺伝子ファミリーの一部である。ＶＥＧＦ−Ａは、主として、２つの高親和性レセプターチロシンキナーゼ、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）及びＶＥＧＦＲ−２（Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ）に結合し、後者は、ＶＥＧＦ−Ａの血管内皮細胞分裂促進シグナルの主要伝達物質である。さらに、ニューロピリン−１は、ヘパリン−結合ＶＥＧＦ−Ａアイソタイプに対するレセプターとして同定されており、血管発生における役割を担っている。また、「ＶＥＧＦ」又は「ＶＥＧＦ−Ａ」なる用語は、非ヒト種、例えばマウス、ラット又は霊長類からのＶＥＧＦも称する。時折、特定の種からのＶＥＧＦは、例えばヒトＶＥＧＦに対してｈＶＥＧＦ、又はマウスＶＥＧＦに対してｍＶＥＧＦ等の用語で示される。また、「ＶＥＧＦ」なる用語は、１６５−アミノ酸ヒト血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸８〜１０９又は１〜１０９を含有するポリペプチドの切断形態又はフラグメントを指すために使用される。任意のこのような形態のＶＥＧＦに対する参照は、本出願において、例えば「ＶＥＧＦ（８−１０９）」、「ＶＥＧＦ（１−１０９）」又は「ＶＥＧＦ１６５」により同定することができる。「切断された」天然ＶＥＧＦについてのアミノ酸位置は、天然ＶＥＧＦ配列に示されたように番号付けされる。例えば、切断された天然ＶＥＧＦにおけるアミノ酸位置１７（メチオニン）は、天然ＶＥＧＦにおいても１７位（メチオニン）である。切断された天然ＶＥＧＦは、天然ＶＥＧＦに匹敵する、ＫＤＲ及びＦｌｔ−１レセプターに対する結合親和性を有する。
【００５２】
ここで使用される場合、「ＶＥＧＦ変異体」なる用語は、天然ＶＥＧＦ配列において一又は複数のアミノ酸変異を含むＶＥＧＦポリペプチドを意味する。場合によっては、一又は複数のアミノ酸変異は、アミノ酸置換を含む。ここに記載のＶＥＧＦ変異体の省略命名法の目的では、数は、推定天然ＶＥＧＦのアミノ酸配列に沿ったアミノ酸残基の位置を指すことに留意のこと（Leungら, 上掲、及びHouckら, 上掲にて提供)。
【００５３】
ここで「抗体」なる用語は、広い意味で用いられ、特に無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成した多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び所望の生物学的活性を有する限りにおける抗体断片をカバーする。
【００５４】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
【００５５】
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン（ＶＨ）を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
【００５６】
「可変」なる用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabatら, Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞媒介性障害活性(ＡＤＣＣ)への抗体の関与を示す。
【００５７】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ（ａｂ’）２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
【００５８】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つの高頻度可変領域は相互に作用してＶＨ−ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な３つの高頻度可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
【００５９】
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ’に対するここでの命名である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００６０】
任意の脊椎動物種からの抗体(イムノグロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
【００６１】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体は異なるクラスが割り当てられる。無傷の抗体には５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、更にそれらは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２等のサブクラス（アイソタイプ）に分かれる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られている。
【００６２】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説についてはＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)）を参照のこと。
【００６３】
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を称し、その断片は同一のポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成ができないリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディーは、例えば、欧州特許出願公開第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448(1993)に更に詳細に記載されている。
【００６４】
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能性がある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的には含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物に対し、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体はハイブリドーマ培養により合成され、他のイムノグロブリンの混入がないという利点がある。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法による生成を必要として構築したものであることを指すものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒら（Nature, 256:495(1975)）に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる（例えば米国特許第４８１６５６７号を参照のこと）。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（Nature, 352：624-628(1991)）及びＭａｒｋｓら（J. Mol. biol. 222: 581-597(1991)）に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００６５】
ここでモノクローナル抗体は、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列に一致するか又は類似する一方、鎖の残りが、他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列に一致する又は類似する「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、並びに所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片を含む（米国特許第４８１６５６７号；及びMorrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。ここで対象とするキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルなどの旧世界サル）由来の可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む（米国特許第５６９３７８０号）。
【００６６】
非ヒト（例えばマウス）の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも一又は典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、Jonesら, Nature 321:522-525(1986)；Riechmannら, Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。
【００６７】
ここで使用される「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合の原因である抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）、及び重鎖可変ドメインの３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）；Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）；Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917(1987)）を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここで定義するように高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００６８】
関心ある抗原、例えばＶＥＧＦに「結合する」抗体とは、抗体が抗原発現細胞を標的とした治療薬として有用となるように十分な親和性及び／又は結合活性を有して抗原に結合することができるものである。
【００６９】
「抗ＶＥＧＦ抗体」は、十分な親和性と特異性で、ＶＥＧＦに結合する抗体である。選択された抗体は、ＶＥＧＦに対して、通常、かなり強い結合親和性を有しており、例えば抗体は、１００ｎＭ−１ｐＭのＫｄ  値でｈＶＥＧＦと結合可能である。抗体親和性は、表面プラズモン共鳴法をベースにしたアッセイ（例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ２００５／０１２３５９に記載されたようなＢＩＡｃｏｒｅアッセイ）；酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）；及び競合アッセイ（例えば、ＲＩＡ）等により測定することができる。好ましくは、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が関与する疾患又は病状を標的とする又は干渉する治療剤として使用することができる。また、抗体は、例えば治療法としての効果を評価するために、他の生物活性アッセイにかけることもできる。このようなアッセイは当該技術分野で公知であり、標的抗原及び抗体の意図する使用に依存する。具体例には、ＨＵＶＥＣ阻害アッセイ；腫瘍細胞増殖阻害アッセイ（例えば、国際公開第８９／０６６９２号に記載）；抗体−依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体−媒介性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ（米国特許第５５００３６２号）；及びアゴニスト活性又は造血アッセイ（国際公開第９５／２７０６２号を参照）が含まれる。抗ＶＥＧＦ抗体は、通常、他のＶＥＧＦホモログ、例えばＶＥＧＦ−Ｂ又はＶＥＧＦ−Ｃにも、又は他の増殖因子、例えばＰｌＧＦ、ＰＤＧＦ又はｂＦＧＦにも結合しない。好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体には、ハイブリドーマＡＴＣＣ  ＨＢ  １０７０９により生成されるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体  Ａ４．６．１と同様のエピトープに結合するモノクローナル抗体；Ｐｒｅｓｔａら（(1997) Cancer Res. 57:4593-4599）に従い産生された組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体が含まれ、限定されるものではないが、ベバシズマブ(ＢＶ：アバスチン(登録商標))として知られている抗体も含む。ベバシズマブは、そのレセプターへのヒトＶＥＧＦの結合をブロックするマウス抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ．４．６．１からの、抗原-結合相補性-決定領域及び変異したヒトＩｇＧ１フレームワーク領域を含む。ほとんどのフレームワーク領域を含む、ベバシズマブのアミノ酸配列の約９３％が、ヒトＩｇＧ１から誘導され、配列の約７％がマウス抗体Ａ４．６．１から誘導され．ベバシズマブは、約１４９０００ダルトンの分子量を有し、グリコシル化されている。ベバシズマブ及び他のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体は、2005年2月26日に発行された米国特許第６８８４８７９号にさらに記載されている。付加的な好ましい抗体には、ＰＣＴ出願２００ＷＯ５／０１２３５９号に記載されるような、Ｇ６又はＢ２０シリーズ抗体（例えば、Ｇ６−３１、Ｂ２０−４．１）が含まれる。付加的な好ましい抗体について、米国特許第７，０６０，２６９号、同６，５８２，９５９号、同６，７０３，０２０号；  同６，０５４，２９７号；  国際公開第９８／４５３３２号；  国際公開第９６／３００４６号；  国際公開第９４／１０２０２号；  欧州特許第０６６６８６８Ｂ１号；  米国特許出願第２００６００９３６０号、同２００５０１８６２０８号、同２００３０２０６８９９号、同２００３０１９０３１７号、同２００３０２０３４０��号、及び同２００５０１１２１２６号；及びPopkovら, Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)を参照。他の好ましい抗体には、残基Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｙ２５、Ｑ８９、Ｉ９１、Ｋ１０１、Ｅ１０３、及びＣ１０４を含有する、又は残基Ｆ１７、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｄ６３、Ｉ８３及びＱ８９を含有する、ヒトＶＥＧＦにおける機能的エピトープに結合するものが含まれる。
【００７０】
この開示の「Ｇ６シリーズ抗体」は、ＰＣＴ出願ＷＯ２００５／０１２３５９の、図７、２４−２６、及び３４−３５の任意の一つのＧ６抗体又はＧ６−誘導抗体の配列から誘導された抗ＶＥＧＦ抗体である。好ましい一実施態様において、Ｇ６シリーズ抗体は、残基Ｆ１７、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｄ６３、Ｉ８３及びＱ８９を含むヒトＶＥＧＦの機能的エピトープに結合する。
【００７１】
この開示の「Ｂ２０シリーズ抗体」は、ＰＣＴ出願ＷＯ２００５／０１２３５９の、図２７−２９の任意の一つのＢ２０抗体又はＢ２０−誘導抗体の配列から誘導された抗ＶＥＧＦ抗体である。一実施態様において、Ｂ２０シリーズ抗体は、残基Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｙ２５、Ｑ８９、Ｉ９１、Ｋ１０１、Ｅ１０３、及びＣ１０４を含むヒトＶＥＧＦの機能的エピトープに結合する。
【００７２】
ここでの目的のための「免疫療法」とは、抗体を用いた哺乳動物（好ましくはヒト患者）の治療方法を称し、この抗体はコンジュゲートされないもの又は「ネイキッド」抗体でもよいし、又は一又は複数の細胞傷害性剤などの薬剤やヘテロ分子とコンジュゲート又は融合して、それによって「免疫コンジュゲート」を生成してもよい。
【００７３】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様においては、抗体は、（１）ローリー（Ｌｏｗｒｙ）法により定量して、抗体が９５重量％より多くなるほど、最も好ましくは９９重量％より多くなるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは、（３）クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性が得られるようになるまで精製される。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程により調製される。
【００７４】
「抗体依存性細胞媒介性障害活性」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)を発現する非特異的細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球、及びマクロファージ)が標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞を溶解する細胞媒介性反応を意味する。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血性細胞でのＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ（Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)）の４６４頁の表３に要約されている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５５００３６２号又は５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ)細胞を含む。あるいは、又は付加的に、対象分子のＡＤＣＣ活性は、例えばＣｌｙｎｅｓら（PNAS(USA), 95:652-656(1998)）に開示されたような動物モデルにおいて、インビボで評価されうる。
【００７５】
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。好ましくは、その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好適である。
【００７６】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するために使用される。好適なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γレセプター）に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲＩＩレセプターは、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害レセプター」）を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有する（Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)参照)。ＦｃＲはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capelら, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haasら, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41(1995)において概説されている。将来同定されるものも含む他のＦｃＲが、ここにおける「ＦｃＲ」なる用語によって包含される。この用語は胎児への母性ＩｇＧの移動の原因である新生児レセプター、ＦｃＲｎもまた含む（Guyerら, J. Immumol. 117:587(1976)及びKimら, J. Immunol. 24:249 (1994))。ここでのＦｃＲはＦｃγＲＩＩＩａをコードする遺伝子内に遺伝的二形性などの多型を含有し、それによってＩｇＧ１に結合するレセプターの領域内に位置するアミノ酸位置１５８がフェニルアラニン（Ｆ）又はバリン（Ｖ）となる。ホモ接合体バリンＦｃγＲＩＩＩａ（ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖ）は、ホモ接合体フェニルアラニンＦｃγＲＩＩＩａ（ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆ）又はヘテロ（ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆ／Ｖ）レセプターと比較してインビトロでのＡＤＣＣ媒介を増加し、ヒトＩｇＧ１に対する親和性も高いことが示された。
【００７７】
「補体依存性細胞傷害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力を意味する。補体活性化経路は補体系（Ｃｌｑ）の第１成分が、同族抗原と結合した分子（例えば、抗体）に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら（J. Immunol. Methods 202:163(1996)）に記載されているように実施することができる。
【００７８】
「治療的有効量」なる用語は、哺乳動物における疾患又は疾病を処置又は予防するための治療剤の量を意味する。癌の場合、治療剤の治療的有効量は、腫瘍関連内皮細胞又は組織の量又は程度を減少させ；癌細胞の数を減少させ；原発性腫瘍サイズを減少させ；周辺器官への癌細胞の浸潤を阻害し（つまり、ある程度まで遅くさせ、好ましくは停止させ）；腫瘍転移を阻害し（つまり、ある程度まで遅くさせ、好ましくは停止させ）；腫瘍増殖をある程度まで阻害し；及び／又は疾患に伴う徴候の一又は複数をある程度軽減しうる。薬剤が増殖を防止し、及び／又は存在する癌細胞を死滅させうる程度まで、それは細胞分裂阻害性及び／又は細胞毒性でありうる。癌治療では、インビボでの効能は、例えば生存期間、無増悪期間（ＴＴＰ）、奏功率（ＲＲ）、反応時間、及び／又は生活の質を評価することにより測定することができる。
【００７９】
ここで使用される場合、「細胞傷害性剤」なる用語は、細胞の機能を阻害又は阻止する、及び／又は細胞破壊をもたらす物質を意味する。この用語は、放射性同位体(例として、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体)、化学療法剤、及び細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素又は小分子毒素などの毒素、又はそれらの断片を含むことを意図する。
【００８０】
「血管破壊剤」又は「ＶＤＡ」なる用語は、広義の意味において、腫瘍又は癌組織に関連した、確立した脈管構造又は血管を破壊することにより、抗血管活性を示す薬剤を意味する。確立した脈管構造におけるこのような破壊は、例えば、腫瘍血流の阻害、及び／又は腫瘍又は癌の細胞又は組織の壊死又は死に影響を与えることができる。
【００８１】
「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」なる用語は広義に使用され、典型的には、細胞質の凝集、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を伴う、哺乳動物における細胞死の規則的又は制御された形態を意味する。この活性は、当該技術分野で公知の、例えば細胞生死判別アッセイ、ＦＡＣＳ分析又はＤＮＡ電気泳動法を用いて、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞断片化、及び／又は膜小胞（アポトーシス体と呼ばれる）の形成を決定して測定することができる。抗体（例えば、リツキシマブ）のアポトーシスを誘導する能力を測定するためのアッセイは、Shanら. Cancer Immunol Immunther 48:673-83 (2000); Pedersenら. Blood 99:1314-9 (2002); Demidemら. Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3):177-186 (1997)に記載されている。
【００８２】
「癌」、「癌性」、「腫瘍」及び「悪性」という用語は、典型的には調節されない細胞増殖を特徴とする、哺乳動物の生理学的状態を指すか記載する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、メラノーマ、肉腫及び白血病などの癌が含まれる。このような癌の特定の例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、膵癌、神経膠芽腫、膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、例えば肝腫瘍及び肝細胞癌(hepatoma)、膀胱癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜上皮癌、骨髄腫（例えば多発性骨髄腫）、唾液腺上皮癌、腎臓癌、例えば腎臓細胞癌及びウィルムス腫瘍、基底細胞癌、メラノーマ、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、及び様々な種類の頭頸部の癌が含まれる。
【００８３】
「前癌」とは、典型的には、癌に先行する又は発育する病状又は成長を意味する。「前癌性」成長は、異常な細胞サイクルの調節、増殖、又は分化により特徴付けられる細胞であり、細胞サイクルの調節、細胞増殖、又は分化のマーカーにより測定可能である。
【００８４】
「異形成」とは、組織、器官、又は細胞の任意の異常な成長又は発育を意味する。好ましくは、異形成は高悪性度又は前癌性である。
【００８５】
「転移」とは、原発部位から、体内の他の場所に癌が広がることを意味する。癌細胞は原発腫瘍から離れ、リンパ管又は血管に浸透し、血流を介して循環し、体内のどこかの正常な組織において遠位病巣で増殖（転移）するおそれがある。転移は局所的又は遠位的である。転移は、原発腫瘍から離れ、血流を通って移動し、遠位位置で停止する、腫瘍細胞に付随する逐次プロセスである。新たな部位で、細胞は血液供給を樹立し、増殖し、生命を危うくする腫瘤を形成する。
【００８６】
腫瘍細胞内における促進及び阻害分子経路の双方が、この行動を調節し、遠位位置にある腫瘍細胞と宿主細胞との間の相互作用もまた著しい。
【００８７】
「非転移」とは、癌が良性であるか、又は原発部位に留まっており、原発部位以外の組織、又はリンパ管又は血管系に浸透しないことを意味する。一般的に、非転移性癌は、０、Ｉ、又はＩＩ段階の癌、時折ＩＩＩ段階の癌である任意の癌である。
【００８８】
「原発腫瘍」又は「原発癌」とは、元の癌を意味し、被験者の体内の他の組織、器官、又は位置に位置する転移性病変ではない。
【００８９】
「良性腫瘍」又は「良性癌」とは、最初の位置に局在化して留まっており、遠位位置に浸潤、侵入、又は転移する能力を有さない腫瘍を意味する。
【００９０】
「腫瘍量」とは、癌細胞の数、腫瘍の大きさ、又は体内の癌の量を意味する。腫瘍量は腫瘍負荷(tumor load)とも称される。
【００９１】
「腫瘍数」とは、腫瘍の数を意味する。
【００９２】
ここで使用する「細胞傷害性剤」なる用語は、細胞の機能を阻害又は阻止する、及び／又は細胞破壊をもたらす物質を意味する。この用語は、放射性同位体(例として、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体)化学療法剤、及び細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素又は小分子毒素などの毒素、それらの断片及び／又は変異体を含むことを意図する。
【００９３】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロスホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパのようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins)(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone))；カンプトセシン(合成類似体トポテカン(topotecan)を含む)；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin)；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin)合成類似体を含む)；クリプトフィシン類(cryptophycins)(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン(dolastatin)；デュオカルマイシン(duocarmycin)(合成類似体、KW-2189及びCBI-TM1を含む)；エレトロビン(eleutherobin)；パンクラチスタチン(pancratistatin)；サルコディクチン(sarcodictyin)；スポンジスタチン(spongistatin)；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、及びラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１、例えば、Agnew  Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと)；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ)を含むダイネミシン(dynemicin)；クロドロネート(clodronate)などのビスホスホネート(bisphosphonates)；エスペラマイシン(esperamicin)；同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン抗生物質発光団)、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン類(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン (モルフォリノ-ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マルセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン類(mitomycins)、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン類(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン���ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン(lonidainine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラエリン(nitraerine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリジンＡ(roridin A)及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ara-C」)；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばタキソール(登録商標)パクリタキセル、(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、ABRAXANETM クレモフォール(Cremophor)を含まない、アルブミン設計のナノ粒子形状のパクリタキセル(American  Pharmaceutical  Partners, Schaumberg, Illinois)及びタキソテア(登録商標)ドキセタキセル、(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；GEMZAR(登録商標)ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；ミトキサントン；ビンクリスチン；NAVELBINE(登録商標)ビノレルビン；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)��イバンドロナート(ibandronate)；ＣＰＴ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン；並びに上述したものの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００９４】
また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、抗エストロゲン及び選択的エストロゲンレセプターモジュレーター(ＳＥＲＭ)など、例えばタモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びFARESTONトレミフェン；アロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼ阻害物質、副腎でのエストロゲン産生を調節するもの、例えば４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)メゲストロールアセテート、AROMASIN(登録商標)エキセメスタン、ホルメスタイン(formestanie)、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標)ゾロゾール(vorozole)、FEMARA(登録商標)レトロゾール及びARIMIDEX(登録商標)アナストロゾール；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に不粘着性細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を抑制するもの、例えばＰＫＣ-アルファ、ラルフ及びＨ-Ｒａｓ；ＶＥＧＦ発現インヒビター(例えばANGIOZYME(登録商標)リボザイム)及びＨＥＲ２発現インヒビターなどのリボザイム；遺伝子治療ワクチンなどのワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン及びVAXID(登録商標)ワクチン；PROLEUKIN(登録商標)ｒＩＬ-２；LURTOTECAN(登録商標)トポイソメラーゼ１インヒビター；ABARELIX(登録商標)rmRH並びに上記のものの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００９５】
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、増殖の増殖をインビトロ又はインビボで阻害する化合物又は組成物を意味する。即ち、増殖阻害剤は、Ｓ期でそのような遺伝子を過剰発現する細胞の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘導する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール、及びトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド及びブレオマイシンを含む。Ｇ１を停止するこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも溢流し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、及びａｒａ−Ｃである。さらなる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel編, Chapter 1, 表題「Cell cycle reguration, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakamiら, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
【００９６】
「サイトカイン」なる用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。このようなサイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のような糖タンパク質ホルモン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）；肝臓増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子−α及び−β；ミュラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経増殖因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−αあるいはＴＧＦ−βのような形質転換増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉ及び−ＩＩ；エリスロポイエチン（ＥＰＯ）；オステオインダクティブ因子；インターフェロン−α、−β、及び−γのようなインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）及び顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２等のインターロイキン（ＩＬ）；ＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
【００９７】
「パッケージ挿入物」は、指示、使用法、用量、投与、禁忌、包装された製品と組合せられる他の治療用製品、及び／又はこのような治療用製品の使用に関する注意についての情報を含む、治療用製品の市販パッケージに常套的に含まれる指示を指すために使用される。
【００９８】
ここで使用される「治療する」、「治療」、及び「療法」とは、治癒的療法、予防的療法及び防護的療法を意味する。
【００９９】
ここで使用される「哺乳動物」なる用語は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコを含む哺乳動物に分類されるあらゆる動物に称する。本発明の好ましい実施態様では、哺乳動物はヒトである。
【０１００】
ＩＩ．本発明の組成物及び方法
ＴＮＦリガンドファミリーに関連したサイトカインであって、ここにおいて「Ａｐｏ−２リガンド」又は「ＴＲＡＩＬ」と同定されたサイトカインが記載されている。ヒト天然Ａｐｏ−２リガンドの予測成熟アミノ酸配列は、２８１のアミノ酸を含み、約３２．５ｋＤａの計算上の分子量を有する。シグナル配列が存在せず内在性疎水性領域が存在することは、Ａｐｏ−２リガンドがＩＩ型膜貫通タンパク質であることを示唆する。また、可溶性細胞外ドメインＡｐｏ−２リガンドポリペプチドが記載されている。例えば１９９７年７月１７日公開の国際公開第号９７／２５４２８を参照のこと。Ａｐｏ−２Ｌ置換変異体がさらに記載されている。アラニンスキャンニング技術が、生物学的活性を有する様々な置換変異体分子を同定するために利用されてきた。Ａｐｏ−２リガンドの特定の置換変異体は、少なくとも一つのアミノ酸がアラニン残基等の別のアミノ酸残基によって置換されているものを含む。これら置換変異体は、例えば「Ｄ２０３Ａ」、「Ｄ２１８Ａ」及び「Ｄ２６９Ａ」として同定されている。この命名法は、位置２０３、２１８、及び／又は２６９（補足図１１に示した番号を使用）のアスパラギン酸残基がアラニン残基によって置換されているＡｐｏ−２リガンド変異体を同定するために使用されている。場合によっては、本発明のＡｐｏ−２Ｌ変異体は一又は複数のアミノ酸置換を含んでもよい。場合によっては、このようなＡｐｏ−２Ｌ変異体はＤＲ４又はＤＲ５レセプター選択的変異体である。
【０１０１】
下記の説明は、核酸をコードするＡｐｏ−２リガンドを含むベクターで形質転換又は形質移入された宿主細胞を培養し、細胞培養物からポリペプチドを回収することによる、Ａｐｏ−２リガンド変異体を含むＡｐｏ−２リガンドを生産する方法に関する。
【０１０２】
Ａｐｏ−２リガンドをコードするＤＮＡは、Ａｐｏ−２リガンドｍＲＮＡを有し、これを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製された任意のｃＤＮＡライブラリーから得ることできる。従って、ヒトＡｐｏ−２リガンドＤＮＡは、国際公開第９７／２５４２８号に記載されているヒト胎盤ｃＤＮＡのバクテリオファージライブラリーのような、ヒト組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることが可能である。また、Ａｐｏ−２リガンドコード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又はオリゴヌクレオチド合成によって得ることもできる。
【０１０３】
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計された（Ａｐｏ−２リガンドに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等の）プローブによってスクリーニングすることができる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばSambrookら, Molecular Cloning：A Laboratory Manual(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。Ａｐｏ−２リガンドをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrookら,上掲；Dieffenbachら, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【０１０４】
Ａｐｏ−２リガンドのアミノ酸配列断片又は変異体は、Ａｐｏ−２リガンドＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入するか、所望のＡｐｏ−２リガンドポリペプチドを合成することにより調製することができる。このような断片又は変異体は、完全長Ａｐｏ−２リガンドについて補足図１１に示したアミノ酸配列の、又は細胞内領域、膜貫通領域、又は細胞外領域の内部あるいは一方又は両方の末端に残基の挿入、置換及び／又は欠損を示す。挿入、置換及び／又は欠損の何れかを組み合わせて、ここに定義するような所望の生物活性、例えばアポトーシス活性を有する最終のコンストラクトに到達するように作製することができる。好ましい実施態様では、断片又は変異体は、Ａｐｏ−２リガンドの細胞内、膜貫通、又は細胞外領域についてここで同定した配列、あるいはＡｐｏ−２リガンドの完全長配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。また、アミノ酸の変化により、グリコシル化部位の数と位置の変化、又は膜係留特性の改変のように、Ａｐｏ−２リガンドの翻訳後プロセスを改変し得る。
【０１０５】
上述したＡｐｏ−２リガンド配列における変異は、米国特許第５，３６４，９３４号に記載された保存的及び非保存的突然変異に関する技術とガイドラインの任意のものを使用して生じさせることができる。これらは、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発を含む。
【０１０６】
近接配列に沿った一又は複数のアミノ酸を同定するために、スキャニングアミノ酸分析法を使用することができる。好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さい中性アミノ酸である。このようなアミノ酸には、アラニン、グリシン、セリン及びシステインが含まれる。変異体の主鎖構造をあまり改変することなく、ベータ炭素を越えた側鎖が除去されるため、典型的にはアラニンがこの群のなかで好ましいスキャニングアミノ酸である［Cunninghamら, Science, 244：1081(1989)］。またアラニンは最も一般的なアミノ酸であることによっても好ましい。さらに、アラニンは埋設及び露出位置の双方に頻繁に見出される［Creighton, The Proteins,(W.H. Freeman ＆ Co., NY)；Chothia, J. Mol. Biol., 150：1(1976)］。
【０１０７】
アミノ酸はその側鎖の性質の類似性に応じて分類される(Biochemistry, 第2版., pp.73-75, Worth Publishers, New York(1975)中のA. L. Lehninger)：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）荷電のない極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
【０１０８】
あるいは、天然に生じる残基は共通の側鎖の性質に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１０９】
【表１】
2014513128.tif 000002
【０１１０】
また、本発明の範囲に含まれるＡｐｏ−２リガンド配列の変異は、アミノ末端誘導体又は修飾形にも関連する。このようなＡｐｏ−２リガンド配列は、ポリペプチド配列のＮ末端にメチオニン又は修飾メチオニン（例えばホルミルメチオニル又は他のブロックされたメチオニル種など）を有するここに記載した任意のＡｐｏ−２リガンドポリペプチドを含む。
【０１１１】
天然又は変異体Ａｐｏ−２リガンドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために、複製可能なベクター内に挿入されてよい。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクター成分としては、一般に制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサー成分、プロモーター、及び転写終結配列であり、それぞれを以下に説明する。用いられるであろう任意のシグナル配列、複製開始点、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント及び転写終結配列は当該技術分野で知られており、国際公開第９７／２５４２８号にさらに詳しく記載されている。
【０１１２】
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、Ａｐｏ−２リガンド核酸配列に作用可能に結合したプロモーターを含む。プロモーターは、作用可能に結合したＡｐｏ−２リガンド核酸配列のような特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する構造遺伝子（一般的に約１００ないし１０００塩基対）の開始コドンの上流側（５’）に位置する未翻訳配列である。このようなプロモーターは典型的には、誘導的及び構成的なクラスの２つのクラスに属する。誘導的なプロモーターは、例えば、栄養分の存在あるいは不存在、温度変化などの培養条件のある変化に対応してその制御の下でＤＮＡからの転写レベルを上昇させるプロモーターである。現時点において多種の可能な宿主細胞により認識される非常に多くのプロモーターがよく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素の消化によって供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、ベクターに単離したプロモーター配列を挿入することで、Ａｐｏ−２リガンドをコードするＤＮＡに作用的に結合している。天然のＡｐｏ−２リガンドプロモーター配列及び多くの異種性プロモーターはいずれもＡｐｏ−２リガンドＤＮＡの直接増幅及び／又は発現に用いることができる。
【０１１３】
原核生物及び真核生物宿主を用いての使用に適したプロモーターは当該技術分野で知られており、国際公開第９７／２５４２８号にさらに詳しく記載されている。
【０１１４】
大腸菌における可溶性Ａｐｏ−２Ｌの生産の好ましい方法には、生産物発現の制御のための誘導的プロモーターが用いられる。制御可能な誘導的なプロモーターの利用は、生産物発現の誘導、及び宿主によってよく耐えることのできないかなりの量の生産物の蓄積の前に、所望する細胞密度への培養成長を可能にする。
【０１１５】
Ａｐｏ−２Ｌ（１１４−２８１形態）の発現のために、いくつかの誘導的なプロモーター系（Ｔ７ポリメラーゼ、ｔｒｐ及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ））が出願人によって評価されている。これら３つのプロモーターのそれぞれの利用は、収集細胞ペーストから回収されたかなりの量の可溶性で生物学的に活性なＡｐｏ−２Ｌ三量体を結果として生じた。しっかりとしたプロモーターコントロール、及び収集細胞ペーストにおいて到達したより高い細胞密度及び力価のために、試験されたこれら３つの誘導的なプロモーター系の中でＡＰプロモーターが好まれている。
【０１１６】
一又は複数の上に列挙した成分を含む適切なベクターの構築には、標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミド又はＤＮＡ断片を開裂させ、整え、そして必要とされるプラスミドの生成のために望ましい形態に再びライゲーションする。
【０１１７】
作成されたプラスミドが正しい配列であることを確認する分析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌Ｋ１２菌株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換し、適当な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、形質転換細胞を好適に選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、及び／又は当該技術分野で知られている標準的技術を利用して配列を決定する［例えば、Messingら,Nucleic Acids Res., 9:309(1981)；Maxamら, Methods in Enzymology, 65：499(1980)を参照のこと］。
【０１１８】
Ａｐｏ−２リガンドをコードしているＤＮＡの哺乳動物細胞における一過性発現をもたらす発現ベクターを使用することができる。一般に、一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次にその発現ベクターによってコードされている所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞中で効果的に複製できる発現ベクターを使用することを含む［Sambrookら, 上掲］。一過性発現系は、適切な発現ベクターと宿主細胞を含むが、クローニングされたＤＮＡによりコードされているポリペプチドの簡便で確実な同定並びに所望の生物学的又は生理学的性質についてのこのようなポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。したがって、一過性発現系は、本発明において、生物学的に活性なＡｐｏ−２リガンドであるＡｐｏ−２リガンドの類似物及び変異体を同定する目的に特に有用である。
【０１１９】
組換え脊椎動物細胞培養でのＡｐｏ−２リガンドの合成に適応化させるのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら, Ｎature, 293：620-625(1981)；Manteiら, Nature, 281：40-46(1979)；欧州特許出願公開第１１７０６０号；及び欧州特許出願公開第１１７０５８号に記載されている。
【０１２０】
ここのベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びにバシラス、例えば枯草菌及びバシラス・リチェフォルミス(licheniformis)（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６７１０に開示されたバシラス・リチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきである。
【０１２１】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、Ａｐｏ−２リガンドをコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。グリコシル化Ａｐｏ−２リガンドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。ＣＨＯ細胞を含むすべてのこのような宿主細胞の例は、さらに国際公開第９７／２５４２８号に記載されている。
【０１２２】
宿主細胞を形質移入し、好ましくはＡｐｏ−２リガンド産生のための上述した発現又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切ならば修飾された栄養培地で培養する。
【０１２３】
形質移入は、如何なるコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。多数の形質移入の方法が当業者に知られており、例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションである。このベクターの操作のあらゆる徴候が宿主細胞内で生じたときに成功した形質移入が一般に認められる。
【０１２４】
形質転換は、染色体外の成分としてであろうと染色体成分によってであろうと、ＤＮＡが複製可能であるように生物体中にＤＮＡを導入することを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のＳａｍｂｒｏｏｋらにより記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して一般的に用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawら, Gene, 23：315(1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際公開第８９／０５８５９号に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。加えて、１９９１年１月１０日に公開された国際公開第９１／００３５８号に記載されているように、超音波処理を用いて植物を形質移入することもできる。
【０１２５】
このような細胞壁のない哺乳動物細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52：456-457(1978)のリン酸カルシウム沈殿法を使用してもよい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な側面は米国特許第４３９９２１６号に記載されている。酵母中の形質転換は、典型的には、Van Solingenら, J. Bact., 130：946(1977)及びHsiaoら, Proc.Ｎatl. Acad. Sci. USA, 76：3829(1979)の方法によって実施する。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための様々な技術については、Keownら, Methods in Enzymology, 185：527-537(1990)及び Mansourら, Nature, 336：348-352(1988)を参照のこと。
【０１２６】
Ａｐｏ-２リガンドを生産するために用いられる原核細胞は、前掲のＳａｍｂｒｏｏｋらにより一般的に記載されているような適切な培地で培養される。大腸菌の培養に用いることができる培養培地の特定の形態は、文献に記載されている。Ａｐｏ−２リガンドを生産するために使用される哺乳動物宿主細胞は、様々な培養培地において培養することができる。
【０１２７】
市販培地の例としては、ハム（Ｈａｍ）のＦ１０(Sigma)、最小必須培地（「ＭＥＭ」、Sigma)、ＲＰＭＩ−１６４０(Sigma)及びダルベッコの改良イーグル培地(「ＤＭＥＭ」、Sigma)が含まれる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮増殖因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシンＴＭ薬）、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１２８】
一般に、哺乳動物の細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコル、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology： A Practical Approach, M. Butler編(IRL Press, 1991)に見出すことができる。
【０１２９】
本発明の一側面では、宿主細胞の培養又は発酵のために、典型的には一又は複数の二価金属イオンが培養培地へ添加されるかあるいは含まれる。二価金属イオンは、好ましくは、貯蔵安定性を増すため、溶解性を増すため、又は一又は複数の亜鉛イオンによって調整される安定なＡｐｏ−２Ｌ三量体の形成を補助するために十分な濃度レベルで培養培地に存在するかあるいは添加される。添加されうる二価金属イオンの量は、一部は培養中の宿主細胞密度又はこのような二価金属イオンへの潜在的な宿主細胞感受性に依存する。培養におけるより高い細胞密度では、二価金属イオンの濃度を増すことは有益である。宿主細胞による生産物の発現中又は発現後に二価金属イオンが添加される場合は、宿主細胞による産物の発現が増加するのに応じて二価金属イオン濃度を調節又は増加させることが望ましい。典型的な普通に入手可能な細胞培養培地に存在しうる微量レベルの二価金属イオンは、安定な三量体形成には十分ではないと一般的に考えられている。従って、ここに開示するように、さらなる量の二価金属イオンの添加が好ましい。
【０１３０】
培養中の宿主増殖の増殖期の間に二価金属イオンが添加される場合は、二価金属イオンは、逆に又は負の方向に宿主細胞成長へ影響しない濃度で培養培地へ添加されるのが好ましい。振盪フラスコ培養では、１ｍＭより高い濃度でのＺｎＳＯ４の添加は、結果として低い宿主細胞密度を生じる可能性があることが観察されている。当業者であれば、細菌細胞は、細胞マトリックスと金属イオン複合体を形成することで、効果的に金属イオンを隔離することが可能であることが分かる。従って、細胞培養では、成長期の後（所望する宿主細胞密度に達した後）又は宿主細胞による生産物発現の直前に、選択された二価金属イオンを培地に添加することが好ましい。十分な量の二価金属イオンが存在していることを確かめるために、さらなる二価金属イオンを、生産物発現期の間に細胞培養培地へ添加又は供給してもよい。
【０１３１】
培養培地の二価金属イオン濃度は、宿主細胞に対して有害又は毒性でありうる濃度を越えてはならない。宿主細胞として大腸菌を用いる方法では、培養培地の二価金属イオンの濃度が約１ｍＭ（好ましくは≦１ｍＭ）を越えないことが好ましい。さらにより好ましくは、培養培地の二価金属イオン濃度は、約５０マイクロモルから約２５０マイクロモルである。最も好ましくは、このような方法で使用される二価金属イオンは硫酸亜鉛である。金属イオン及びＡｐｏ−２リガンド三量体が１対１モル比で存在することが可能である量の二価金属イオンを細胞培養へ添加することが望ましい。
【０１３２】
二価金属イオンは、細胞培養へ如何なる許容可能な形態でも添加が可能である。例えば、金属イオンの溶液は水を使って調製することが可能であり、次に、二価金属イオン溶液は培養培地へ添加又は供給することが可能である。
【０１３３】
Ａｐｏ−２Ｌの発現は、例えば、ここに記載された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、従来からのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法[Thomas, Proc. Ｎatl. Acad. Sci. USA, 77：5201-5205(1980)]、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、又はインサイツハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。様々な標識を用いることができ、最も一般的なものは放射性同位元素、特に３２Ｐである。しかしながら、他の方法、例えばポリヌクレオチド中への導入のためのビオチン修飾ヌクレオチドを用いる方法もまた使用することができる。ついで、このビオチンは、例えば放射性核種、蛍光剤又は酵素等のような広範囲の標識で標識することができるアビジン又は抗体への結合部位となる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ−タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液の検定によって測定することもできる。免疫組織化学的染色技術では、細胞試料を、典型的には脱水と固定によって調製し、結合した遺伝子産物に対し特異的な標識化抗体と反応させるが、この標識は通常は視覚的に検出可能であり、例えば酵素的標識、蛍光標識、ルミネセンス標識等である。
【０１３４】
試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳類において調製することができる。簡便には、抗体は、天然Ａｐｏ−２リガンドポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＡｐｏ−２リガンドＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【０１３５】
Ａｐｏ-２リガンドは、好ましくは培養培地から分泌されたポリペプチドとして回収されるが、分泌シグナル無しで直接産生される場合は宿主細胞溶菌液から回収してもよい。Ａｐｏ−２リガンドが膜結合性である場合は、適切な洗浄液（例えばトリトン−Ｘ１００）を用いて膜から放出させるか、又は酵素的切断によりその細胞外領域を放出させてもよい。
【０１３６】
Ａｐｏ−２リガンドがヒト起源のもの以外の組換え細胞でつくられる場合は、Ａｐｏ−２リガンドはヒト起源のタンパク質又はポリペプチドを含まない。しかしながら、Ａｐｏ−２リガンドに関して実質的に相同である調製物を得るには、組換え細胞タンパク又はポリペプチドからＡｐｏ−２リガンドを回収又は精製することが通常必要である。第一段階として、培地又は溶菌液を遠心分離して粒状の細胞屑を除去することができる。ついで、Ａｐｏ−２リガンドを、汚染した可溶性タンパク質及びポリペプチドから、適切な精製手順の例である次の手順により精製される：イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ又はＣＭにおけるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ−７５を用いるゲル濾過；及びＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラムである。
【０１３７】
好ましい実施態様では、Ａｐｏ−２リガンドはアフィニティークロマトグラフィーによって単離することができる。残基が欠損され、挿入され、又は置換されたＡｐｏ−２リガンド断片又は変異体は、その変異によってしばしば惹起される実質的な性質変化を考慮に入れて、天然Ａｐｏ−２リガンドと同じようにして回収される。例えば、他のタンパク質又はポリペプチド、例えば細菌性もしくはウイルス性抗原とのＡｐｏ−２リガンド融合体の調製は精製を容易にする；抗原に対する抗体を含む免疫アフィニティーカラムを、融合ポリペプチドを吸着させるために使用することができる。
【０１３８】
例えばフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）のようなプロテアーゼインヒビターもまた精製の間のタンパク分解を阻害するのに有用であり、偶発的な汚染物質の成長を防止するために抗生物質を含めることができる。天然Ａｐｏ−２リガンドに適切な精製方法は、組換え細胞培養の発現の際におけるＡｐｏ−２リガンド又はその変異体の特性の変化の起因となる改変が必要となることは、当業者であれば分かるであろう。
【０１３９】
このような任意の精製工程では、回収されたＡｐｏ−２Ｌを二価金属イオン含有溶液又は一又は複数の二価金属イオンを含有する精製物質（例えばクロマトグラフィー媒体又は支持体）へ曝露することが望ましいであろう。好ましい実施態様では、二価金属イオン及び／又は還元剤は、Ａｐｏ−２Ｌの精製又は回収の間に使用される。場合によっては、ＤＴＴ又はＢＭＥのような二価金属イオン及び還元剤の両方を、Ａｐｏ−２Ｌの精製又は回収の間に使用してもよい。精製又は回収の間に二価金属イオンを使用することは、Ａｐｏ−２Ｌ三量体の安定性を提供するか、あるいは細胞培養段階の間に形成されるＡｐｏ−２Ｌ三量体を保存すると考えられる。
【０１４０】
また、以下の記載は一又は複数の化学基に共有的に結合した（以下「コンジュゲートされた」）Ａｐｏ−２リガンドを製造する方法に関する。本発明のＡｐｏ−２Ｌコンジュゲートに使用するのに適した化学基は好ましくは有意に毒性又は免疫原性ではない。化学基は場合によっては保存することができ保存に適した条件下で使用できるＡｐｏ−２Ｌコンジュゲートを製造するために選択される。ポリペプチドにコンジュゲートされうる様々な例示的化学基が当該技術分野で知られており、例えば糖タンパク質に天然に生じる炭水化物のような炭水化物、ポリグルタミン、及び非タンパク様ポリマー、例えばポリオールが含まれる（米国特許第６２４５９０１号を参照）。
【０１４１】
例えばポリオールは、上掲の国際公開第９３／００１０９号に開示されているように、リジン残基を含む一又は複数のアミノ酸残基においてＡｐｏ−２Ｌなどのポリペプチドにコンジュゲートされうる。用いられるポリオールは任意の水溶性ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーとでき、直鎖又は分枝鎖を有しうる。好適なポリオールには一又は複数のヒドロキシル位置で１から４の炭素を有するアルキル基のような化学基が置換されているものが含まれる。典型的には、ポリオールはポリ（アルキレングリコール）、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）であり、よって記載を簡単にするために、以下の議論においては、用いるポリオールがＰＥＧである例示的な実施態様に関するものとし、ポリペプチドにポリオールをコンジュゲートさせる方法を「ペグ化(pegylation)」と称する。しかし、当業者であれば、他のポリオール、例えばポリ（プロピレングリコール）及びポリエチレン−ポリプロピレングリコールコポリマーを、ＰＥＧに対してここに記載したコンジュゲート法を使用して用いることができると認識しているであろう。
【０１４２】
Ａｐｏ−２Ｌのペグ化に用いられるＰＥＧの平均分子量は変動し得、典型的には約５００から約３００００ダルトン（Ｄ）の範囲でありうる。好ましくは、ＰＥＧの平均分子量は約１０００から約２５０００Ｄであり、より好ましくは約１０００から約５０００Ｄである。一実施態様では、ペグ化は約１０００Ｄの平均分子量を持つＰＥＧを用いて実施される。場合によっては、ＰＥＧホモポリマーは未置換であるが、アルキル基で一端が置換されていてもよい。好ましくは、アルキル基はＣ１−Ｃ４アルキル基、最も好ましくはメチル基である。ＰＥＧ調製物は商業的に入手可能であり、典型的には本発明において使用するのに適したＰＥＧ調製物は平均分子量に応じて販売されている非均一調製物である。例えば、市販のＰＥＧ（５０００）調製物は典型的には分子量が僅かに変動し、通常は±５００Ｄの分子を含む。
【０１４３】
本発明のＡｐｏ−２リガンドは単量体形態又は三量体形態（３つの単量体を含む）等、様々な形態でありうる。場合によっては、Ａｐｏ−２Ｌ三量体は、ＰＥＧ分子が三量体Ａｐｏ−２Ｌを構成する三の単量体の一、二、又はそれぞれに結合又はコンジュゲートされるようにペグ化される。そのような実施態様では、用いられるＰＥＧは約１０００から約５０００Ｄの平均分子量を有するのが好ましい。また、Ａｐｏ−２Ｌ三量体は「部分的に」ペグ化され得、つまり、三量体を構成する三の単量体の一又は二だけがＰＥＧに結合又はコンジュゲートされる。
【０１４４】
タンパク質をペグ化するための様々な方法が当該技術分野で知られている。ＰＥＧにコンジュゲートしたタンパク質を製造するための特定の方法には、米国特許第４１７９３３７号、米国特許第４９３５４６５号及び米国特許第５８４９５３５号に記載された方法が含まれる。典型的には、タンパク質は、主に反応条件、ポリマーの分子量等々に応じて、ポリマーの末端反応性基にタンパク質のアミノ酸残基の一又は複数を介して共有的に結合される。反応性基を有するポリマーはここでは活性化ポリマーと命名する。反応性基はタンパク質の遊離のアミノ又は他の反応性基と選択的に反応する。ＰＥＧポリマーは無作為又は部位特異的方式の何れかでタンパク質上のアミノ又は他の反応性基に結合しうる。しかし、最適な結果を得るために、選択される反応性基のタイプと量、並びに用いられるポリマーのタイプは、反応性基がタンパク質上の余りに多くの特に活性な基と反応することを避けるために用いられる特定のタンパク質又はタンパク質変異体に依存するものと理解されるであろう。これは完全に避けることができないであろうため、タンパク質１モル当たり一般に約０．１から１０００モル、好ましくは２から２００モルの活性化ポリマーを、タンパク質濃度に応じて用いることが推奨される。タンパク質１モル当たりの活性化ポリマーの最終量は、最適な活性を維持し、同時に可能ならばタンパク質の循環半減期を最適化するためのバランス量である。
【０１４５】
さらに、ここにに記載のＡｐｏ２Ｌは、当分野に公知の技術を用いてロイシンジッパー配列又はタグ分子とに結合又は融合させてもよいと考えられる。よって、Ａｐｏ−２リガンドは、他の異種ポリペプチドと融合してもよい。一実施態様において、キメラポリペプチドは、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＡｐｏ−２リガンドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＡｐｏ−２リガンドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＡｐｏ−２リガンドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＡｐｏ−２リガンドを容易に精製できるようにする。
【０１４６】
様々なタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、フルＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；ｃ−ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ(gD)タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α−チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。タグポリペプチドが選択されると、そこで抗体を、ここで開示の技術を使用して生じさせることができる。
【０１４７】
一般的に、エピトープタグＡｐｏ−２リガンドは、天然及び変異Ａｐｏ−２リガンドについて上記された方法に従い、構築及び生成されうる。Ａｐｏ−２リガンドタグポリペプチド融合体は、好ましくはＡｐｏ−２リガンド部分をコードするｃＤＮＡ配列をタグポリペプチドＤＮＡ配列にインフレームで融合させ、得られたＤＮＡ融合コンストラクトを適切な宿主細胞において発現させることで構築される。通常、本発明のＡｐｏ−２リガンドタグポリペプチドキメラを調製する場合、Ａｐｏ−２リガンドをコードする核酸は、タグポリペプチドのＮ末端をコードする核酸に、その３’末端で融合するが、５’融合体も可能である。エピトープタグＡｐｏ−２リガンドの例は、以下の実施例にさらに詳細に記載する。
【０１４８】
エピトープタグＡｐｏ−２リガンドは、抗−タグ抗体を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。アフィニティー抗体が結合するマトリックスには、例えばアガロース、調整多孔質ガラス、又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンが含まれる。エピトープタグＡｐｏ−２リガンドは、ついで、当該技術分野で公知の技術を使用し、アフィニティーカラムから溶出させることができる。
【０１４９】
また、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを含有する製剤が、本発明により提供される。このような製剤は、治療的投与のみならず、特に貯蔵に適していると考えられる。製剤は、既知の技術で調製することが可能である。例えば、製剤はゲル濾過カラムでのバッファー交換によって調製することが可能である。
【０１５０】
また、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを含有する製剤が、本発明により提供される。このような製剤は、治療的投与のみならず、特に貯蔵に適していると考えられる。製剤は、既知の技術で調製することが可能である。
【０１５１】
典型的には、適量の許容可能な塩又は担体が、製剤を等浸透圧にするために製剤に使用される。薬学的に許容可能な担体の例は、生理食塩水、リンガー液及びデキストロース液を含む。製剤のｐＨは、好ましくは約６〜約９、さらに好ましくは約７〜約７．５である。例えば薬剤の濃度及び投与経路よっては、ある種の担体がより好ましい場合があることは、当業者には明らかであろう。
【０１５２】
治療用組成物は、凍結乾燥製剤、水溶液又は水性懸濁液の形態で、場合によっては任意成分の担体、賦形剤又は安定剤と、適切な純度を有する所望の分子を混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16版, A. Osol, A.編(1980))調製することができる。許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、好ましくは用いられる投与量及び濃度で受容者に非毒性であり、トリス(Ｔｒｉｓ)、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１５３】
そのような担体の更なる例は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばグリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、及びセルロースベースの物質を含む。局所又はゲルベースの形態用の担体は、多糖類、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース又はメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及びモクロウアルコールを含む。あらゆる投与に対して、一般的なデポー形態が好適に用いられる。このような形態は、例えば、マイクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、硬膏剤、吸入形態、鼻スプレー、舌下錠、及び徐放性製剤を含む。
【０１５４】
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。製剤は凍結乾燥形態又は全身投与される場合には溶液で貯蔵される。凍結乾燥形態にある場合、典型的には使用時に適当な希釈剤と再構成するために他の成分と組み合わせて製剤化される。液体製剤の例は、皮下注射用の単回投与バイアルに充填された無菌の透明な無色の保存料未添加(unpreserved)溶液である。
【０１５５】
治療用製剤は、一般的に無菌のアクセスポート、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で貫通可能なストッパーを備えたバイアルに入れられる。製剤は、好ましくは静脈内(ｉ.ｖ.)、皮下(ｓ.ｃ.)、筋肉内(ｉ.ｍ.)の繰り返し注射又は注入として、あるいは鼻内又は肺内送達に適したエアロゾル製剤として投与される(肺内送達については、例えば欧州特許出願公開第２５７９５６号参照)。
【０１５６】
徐放性調製物の適切な例は、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは、例えばフィルム又はマイクロカプセル等の成形品の形態である。徐放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、Langerら, J. Biomed. Mater. Res. 15：167-277(1981)及びLanger, Chem. Tech. 12：98-105(1982)に記載されたポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号、欧州特許出願公開第５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー(Sidmanら,  Biopolymers 22：547-556(1983))、非分解性エチレン-酢酸ビニル(Langerら, 上掲)、分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばLupron Depot(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第１３３９８８号）を含む。
【０１５７】
ここに記載した様々な病理状態の哺乳動物における診断は、熟練した実務者によって行うことが可能である。例えば、哺乳動物の癌の診断又は検出を可能にする診断技術は、当該技術分野で利用可能である。例えば、癌は、限定されるものではないが、触診(法)、血液分析、Ｘ線、ＮＭＲ等々を含む技術を通して同定され得る。癌ステージ分類システムは、解剖学的に癌が如何に遠くまで広がっているかを記述し、同じステージ群において患者に類似の予後及び治療を付与しようとするものである。幾つかの試験を実施することにより、胸部ｘ線、マンモグラフィー、骨スキャン、ＣＴスキャン、及びＭＲＩスキャンのような所定の画像処理試験及び組織診を含む癌のステージ分類を補助することができる。患者の全体的な健康状態を評価し、癌が特定の器官に広がっているかどうかを検出するために、血液検査及び臨床評価もまた使用される。
【０１５８】
腫瘍は固形腫瘍である場合がある。固形腫瘍は血液、骨髄、又はリンパ系以外の体組織の任意の癌を含む。固形腫瘍は上皮細胞由来のものと非上皮細胞由来のものに更に分類できる。上皮細胞固形腫瘍の例は、消化管、結腸、乳房、前立腺、腎臓、肝臓、膵臓、卵巣、頭頸部、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、肛門、胆嚢、口唇、上咽頭、皮膚、子宮、男性生殖器、泌尿器、膀胱、及び皮膚の腫瘍を含む。非上皮細胞由来の固形腫瘍は肉腫、脳腫瘍、及び骨腫瘍を含む。
【０１５９】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、既知の方法に従い、ボーラスとしての静脈内投与、又は一定期間にわたる連続的な注入、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、骨液内、くも膜腔内、経口、局所的、又は吸入の経路により投与できる。場合によっては、投与は、様々な市販の装置を使用するミニポンプでの注入によって実施することもできる。
【０１６０】
更なる治療法を本方法において使用することも考えられる。一又は複数の他の治療法は、これらに限定されるものではないが、当該技術分野において既知であり、特に前述のセクションＩにおいてさらに詳細に定義された、放射線療法、サイトカイン、増殖阻害剤、化学療法剤、細胞傷害剤、チロシンキナーゼ阻害因子、ラスファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、血管形成阻害剤、及びサイクリン依存性キナーゼ阻害剤の投与を含む。
【０１６１】
化学療法剤の調製物は、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務家により経験的に決定される通りに使用されうる。また、そのような化学療法のための調製物はChemotherapy  Service Ed., M.C. Perry編, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD(1992)にも記載されている。
【０１６２】
本発明の他の実施態様では、癌の治療に有用な材料を含む製造品が提供される。一態様では、製造品は、（ａ）Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを含む容器（好ましくは容器はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬと薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を容器内に含む）と（ｂ）癌を治療するための指示書（説明書）を伴うパッケージ挿入物を含み、ここで、指示書は添付の図面に記載したもののような情報を提供する。場合によっては、パッケージ挿入物は、投与、副作用、及び／又はＦＤＡのような適用可能な規制庁によって記載される注意的警告等々に関する情報を含む。
【０１６３】
これらの態様の全てにおいて、パッケージ挿入物は容器上にあるか又は容器に付随している。適切な容器は、例えばビン、バイアル、シリンジ等を含む。容器は、ガラス又はプラスチックのような様々な材料から形成されうる。容器は、癌の治療に効果的な組成物を収容し又は含み、滅菌のアクセスポートを有しうる（例えば容器は皮下注射針が突き通すことが可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルでありうる）。製造品は、薬学的に許容される希釈剤バッファー、例えば注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及び／又はデキストロース溶液を含む更なる容器を更に具備していてもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を更に含みうる。
【実施例】
【０１６４】
実施例において言及される市販試薬は、特段の記載がない場合は、製造者の説明書に従って使用した。
【０１６５】
方法と材料
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ：  追加の図１１のアミノ酸１１４−２８１（配列番号１）からなる組換えヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（「ｒｈＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ」又はデュラネルミン）は２００１年１月４日公開の国際公開第０１／００８３２号及び２００３年５月２２日公開の国際公開第０３／０４２３４４号に記載された通りにジェネンテック社（South San Francisco, CA）によって製造され製剤化された。組換え可溶型ＦｌａｇタグヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは公開された方法（Ashkenaziら, J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999)；Kischkelら, Immunity, 12:611-620 (2000)）に従って調製した（以下の実施例及び図面においては「Ａｐｏ２Ｌ．Ｍ２」と称する）。
【０１６６】
マウスモデル：Ｃ５７ＢＬ／６（野生型）マウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから取得し、Ｃ５７ＢＬ／６．Ｒａｇ２−／−マウスはＴａｃｏｎｉｃ社から取得した。Ｃ５７ＢＬ／６．ＤＲ５−／−（Diehlら, Immunity, 21:877-889 (2004)）及びＣ５７ＢＬ／６．ＴＮＦＲ１−／−ＴＮＦＲ２−／−マウスは、特定病原体を含まない条件下でジェネンテック社で飼育され維持された。全ての動物実験はジェネンテック社の研究機関の動物管理使用委員会によってレビューされ承認された。
【０１６７】
線維肉腫腫瘍イニシエーション：Ｃ５７ＢＬ／６（野生型）又はＣ５７ＢＬ／６．ＤＲ５−／−マウスの後側腹部に(過去に記載されたように（Koebelら, Nature, 450:903-907 (2007)）０．１ｍＬのトウモロコシ油中２００ｍｇのメチルコラントレン（ＭＣＡ）（Sigma-Aldrich）を皮下的に接種した。ＭＣＡ処置９０日後から腫瘍発生について毎週評価した。
【０１６８】
細胞株及び腫瘍移植モデル：線維肉腫細胞株を、Ｌｉｂｅｒａｓｅ Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ２（Roche Applied Biosystems）を含む２．５％の熱失活ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を含む培地中において原発性腫瘍組織を機械的に分離させることによってつくり出した。過去に記載されたようにして（上掲のKoebelら；Wilsonら, Blood, 102:2187-2194 (2003)）室温で２０分組織片をピペッティングすることによってシングル細胞懸濁液を得た。ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）を５分間加えて細胞クラスターを破壊し、酵素活性を阻害した。未消化断片を濾過によって除去した。細胞ペレットを、３７℃、５％ＣＯ２の条件下でＬ−グルタミン及び１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補填したＲＰＭＩ培地に再懸濁させた。同一の培養条件を使用してルイス肺腫瘍細胞（ＡＴＣＣ）を維持した。マウスに５×１０６の癌細胞を皮下的に注射した。ノギスを使用して２次元で腫瘍を測定した。腫瘍体積は式Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（ここで、ａとｂはそれぞれ腫瘍の長径及び短径である）を使用して計算した。抗腫瘍効果の実験では、〜２００ｍｍ３の腫瘍を有するマウスを無作為にグループ分けし、記載された投薬レジメンに従ってＡｐｏ２Ｌ及びＭ２を腹腔内に注射した。腫瘍を有するマウスに１０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏ２Ｌと続いて１０ｍｇ／ｋｇの抗Ｆｌａｇ抗体（Ｍ２）（Sigma）を逐次的に投与した。Ａｐｏ２Ｌ又はＭ２単独は抗腫瘍効果を示さなかった（データは示さず）。
【０１６９】
細胞生存率及びカスパーゼ−３アッセイ：Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ処置後の細胞生存率を、Ｃｅｌｌ−ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ細胞生存率アッセイ（Promega）を使用してインビトロで決定した。カスパーゼ−３／７又は８の活性を、製造者の説明書に従って、カスパーゼ−Ｇｌｏ３／７又はカスパーゼ−Ｇｌｏ８アッセイ（Promega）を使用してインビトロで測定した。カスパーゼアッセイのインビトロ生存率については、Ａｐｏ２Ｌ及びＭ２を１：１のモル比で逐次的に組み合わせた。腫瘍細胞におけるエクスビボカスパーゼ−３プロセシングを、切断型カスパーゼ−３特異的抗体（クローンＣ９２−６０５, BD Pharmingen）を使用するフローサイトメトリーによってモニターした。カスパーゼ−３活性化はコントロール処置マウスに対する増加倍数として表される。
【０１７０】
内皮細胞  ＤＲ５発現解析：  シングル細胞懸濁液をつくるために、野生型又はＤＲ５欠損マウスからルイス肺腫瘍（＜５００ｍｍ３）又は腎臓を解体し、小断片に機械的に分離した。分離した組織を、腫瘍細胞株をつくりだすのに記載したものと同じプロトコルに従って、Ｌｉｂｅｒａｓｅ Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ２（Roche Applied Biosystems）を含む２．５％の熱失活ＦＢＳを含む培地に再懸濁させた。細胞ペレットを、抗Ｆｃγレセプター（Ｆｃγ ＲＩＩＢ／ＩＩＩ（クローン２．４Ｇ２, BD Pharmingen）、抗ＦｃγＲＩＶ（クローン３９Ａ．１，ジェネンテック社）を含む２．５％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中に再懸濁させ、内皮細胞を特徴づけるために使用される抗体：抗ＣＤ４５（クローン１０４, BDPharmingen）、抗ＤＲ５（クローンＭＤ５．１, eBiosciences）及び抗ＣＤ３１  （クローン３９０, BD Pharmingen）に非特異的に結合するＦｃγＲをブロックした。ついで、細胞集団を、死滅細胞を排除するために７ＡＡＤ（BD Pharmingen）を使用するＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson）を使用して分析した。
【０１７１】
免疫組織化学的検査：  免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）をガラススライドに取り付けた５ミクロン厚のホルマリン固定パラフィン包埋組織片で実施した。ＤＲ５及び汎内皮細胞(panendothelial cell）マーカーのスライドをキシレンで脱パラフィンし、等級化アルコールで蒸留水に再水和させた。スライドを９９℃で２０分間、標的賦活液（Dako; Carpinteria, CA）で前処理した。スライドをＫＰＬ遮断液（Kierkegaard and Perry Laboratories; Gaithersburg, MD）及びアビジン／ビオチンブロック（Vector; Burlingame, CA）で処理した。非特異的ＩｇＧ結合を、ＤＲ５ ＩＨＣに対しては、１％のウシ血清アルブミン（Roche; Basel, Switzerland) 及び１０％の正常なヤギ血清を含むＴＢＳＴで、又は汎内皮細胞マーカーＩＨＣに対しては１０％の正常なウサギ血清（Life Technologies; Carlsbad, CA）でブロックした。一次抗体はＤＲ５では１０ｍｇ／ｍｌで（クローンＭＤ５−１, BD Biosciences; Franklin Lakes, NJ）、汎内皮細胞マーカーに対しては２ｍｇ／ｍｌで（クローンMECA-32, BD Biosciences, NJ）使用した。スライドを室温で６０分、一次抗体でインキュベートした。スライドをすすぎ、７．５ｍｇ／ｍｌに希釈したビオチン化ヤギ抗ハムスター又はビオチン化ウサギ抗ラット二次抗体の何れか（Vector, CA）と共に３０分インキュベートした。ついで、スライドをベクタステインＡＢＣエリート試薬（Vector, CA）及びPierce金属増感型DAB（Thermo Scientific; Worcester, MA）で引き続きインキュベートし、対比染色し、脱水し、カバーガラスをつけた。切断型カスパーゼ３ＩＨＣ  （Ａｓｐ１７５）を、細胞コンディショナー１、標準処理を利用するＶｅｎｔａｎａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＸＴ（Ventana Medical Systems; Tucson, AZ）自動染色装置で実施した。一次抗体、切断型カスパーゼ３（Ａｓｐ１７５）（Cell Signaling Technologies; Danvers, MA）を０．０６ｍｇ／ｍｌの濃度で使用し、３７℃で３時間インキュベートした。Ｖｅｎｔａｎａ ＤＡＢＭａｐ（Ventana Medical Systems; AZ）を検出システムとして使用した。
【０１７２】
切断型カスパーゼ−３免疫組織化学的検査の定量： 画像を２００×の最終倍率でオリンパスNanozoomer自動スライドスキャンプラットフォーム（Olympus America, Center Valley, PA）によって獲得した。腫瘍特異的領域を個々の２４ビットＲＧＢ画像としてＭａｔｌａｂソフトウェアパッケージ（Mathworks, Natick, MA）で解析した。褐色のDAB特異的染色を、Breyら, J. Histochem. Cytochem., 51:575-584 (2003)によって記載されているように、ブルー規準化アルゴリズムを使用してヘマトキシリン対比染色から分離した。ＤＡＢとヘマトキシリン双方の陽性領域に対する面積測定値を報告した。
【０１７３】
インビボ近赤外線蛍光イメージング：  Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＰＢＳでの処置の２時間後にマウス（ｎ＝３から５／処置群）に蛍光血液プールマーカーＡｎｇｉｏＳｅｎｓｅ６８０ＩＶＭ（PerkinElmer）を静脈注射した。腫瘍及び近傍の組織内における経時的分布を、Ｋｏｄａｋ４０００ＦＸ Ｐｒｏイメージングシステム（CareStream Health）で蛍光（６５０ｎｍ励起／７００ｎｍ発光）を可視化し、時間＝０に対して規準化した腫瘍又は隣接組織にわたって位置する興味ある領域内の蛍光強度を定量化することによって測定した，（ＩＲＯＩｔ＝ｘ−ＩＢＧ）／（ＩＲＯＩｔ＝０−ＩＢＧ）。それぞれの示された時点において、体温を３７℃に維持してイソフランで動物に痲酔をかけ、画像化した。
【０１７４】
実験結果及びデータ
マウス癌細胞はＤＲ５を発現するが、デュラネルミン、つまりある種の臨床試験において評価されているヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの三量体組換え可溶型（Ashkenaziら, J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999)；Herbstら, J. Clin. Oncol., 2010)）に応答しない（追加の図１ａ、１ｂ、１ｃ）。ここで実施した実験では、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのＦｌａｇ  エピトープタグ型の抗Ｆｌａｇ抗体を伴うオリゴマーへの架橋がある範囲のマウス癌細胞株においてアポトーシス促進性シグナル伝達を可能にしたことが観察された。これらは、膜結合Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに特に感受性である（Sekiら, Cancer Res., 63:207-213 (2003)）Ｒｅｎｃａ３３１細胞（追加の図１ｂ）、並びにルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞（追加の図１ｃ）を含んでいた。
【０１７５】
インビボでのＡｐｏ−２リガンドのこの架橋型の効能を決定するために、マウスＬＬＣ細胞をＣ５７ＢＬ／６野生型レシピエントマウスに移植し、動物を架橋Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの単回用量で処置した。驚いたことに、処置後２４時間以内に腫瘍に著しい出血の出現が観察された（図１ａ）。ＬＬＣ腫瘍が抗血管新生療法に比較的耐性がある（Shojaeiら, Nat. Biotechnol., 25:911-920 (2007)）ことを考えると、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの効果は腫瘍脈管構造に対するより急性的影響を示唆している。組織学的検査により、腫瘍にわたる広範な出血、並びに広範な腫瘍細胞死を確認した（図１ｂ）。
【０１７６】
マウス内皮細胞マーカーＭｅｃａ−３２（Hallmannら, Dev. Dyn., 202:325-332 (1995)）での免疫組織化学的染色は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬによる腫瘍脈管構造 の深刻な破壊を明らかにした（図１ｃ）。これらの組織学的観察を確認するために、血管完全性を長軸方向にモニターする非侵襲的近赤外線蛍光イメージング法を利用した。腫瘍を持つ野生型及びＤＲ５欠損マウスをＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで処置し、血液プールプローブＡｎｇｉｏＳｅｎｓｅ６８０ＩＶＭを静脈内注射し、ついで経時的に画像化した。ＤＲ５欠損ではなく野生型レシピエントマウスにおいて、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬはＬＬＣ腫瘍中へのプローブの迅速な蓄積（３−６時間以内）を誘導したが、これは血管破壊を示している（図１ｄ及び追加の図２）。
【０１７７】
著しいことに、腫瘍脈管構造に対するApo2L/TRAILの効果はDR5欠損マウスにおけるＬＬＣ腫瘍細胞の移植時に完全に抑制された(図1a-d）。この結果が与えられたので、腫瘍関連ストローマ区画に対するApo2L /TRAILの生物学的効果は直接的でありうると思われる。過去の報告は、Apo2L/TRAILが内皮細胞においてアポトーシスを誘導しうることを示唆している。しかしながら、これらの研究の大部分は、培養された内皮細胞を使用して実施され、インビトロでの Apo2L/TRAILの効果に対して矛盾する結論に到達している（Liら, J. Immunol., 171:1526-1533 (2003)；Mariniら, BMC Cancer, 5:5 (2005)；Chanら, Circ. Res., 106:1061-1071 (2010)；Chenら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 391:936-941 (2009)）。ある研究は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの膜結合型を発現するように操作されたアデノウイルス形質導入ヒトＣＤ３４＋細胞を注射されたマウスにおける腫瘍脈管構造の破壊を報告している（Lavazzaら, Blood, 115:2231-2240 (2010)）。しかしながら、この効果が内皮細胞におけるアポトーシス促進性ＤＲ５活性化の直接的結果であったのか、あるいは悪性腫瘍細胞区画におけるＤＲ５のターゲティングの間接的な結果であったのか分からないままである。確かに、マウスへのこれらの改変ヒト細胞の導入は、アポトーシス促進性ＤＲ５シグナル伝達に厳密には起因しない応答を腫瘍微小環境においてまた誘導しうる。
【０１７８】
腫瘍脈管構造に対する観察された効果と腫瘍関連内皮細胞（ＴＥＣ）におけるＤＲ５活性化の間の関係を更に評価するために、野生型又はＤＲ５欠損レシピエントにおいて増殖させたＬＬＣ腫瘍を分離し、単離細胞を３種のマーカーＤＲ５；白血球共通抗原ＣＤ４５；及び内皮細胞関連抗原ＣＤ３１に対する抗体でのフローサイトメトリー分析のために染色した（Tangら, J. Biol. Chem., 268:22883-22894 (1993)）。ＣＤ４５及びＣＤ３１の発現差異を用いて腫瘍関連白血球（ＣＤ４５ｈｉｇｈ）、濃縮腫瘍上皮細胞画分（ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３１ｌｏｗ）、及びＴＥＣｓ  （ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３１ｈｉｇｈ）を広く明確化した。ＤＲ５タンパク質発現は野生型又はＤＲ５欠損マウスにおいて増殖させた腫瘍由来のＣＤ４５ｎｅｇ上皮細胞で検出されたが、何れの株において増殖された腫瘍由来のＣＤ４５ｈｉｇｈ白血球では検出されなかった（追加の図３）（上掲のTangら）。重要なことは、ＤＲ５発現が、ＤＲ５欠損マウスではなく野生型で増殖された腫瘍由来のＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３１ｈｉｇｈ ＴＥＣでもまた観察されたことである（図２ａ）。これに対して、正常なマウス腎臓から単離されたＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３１ｈｉｇｈ内皮細胞には有意なＤＲ５発現は検出されなかった（図２ｂ）。免疫組織化学的検査は、ＤＲ５欠損ではなく野生型マウスの腫瘍ストローマ内の内皮細胞上にＤＲ５発現を確認した（図２ｃ）。注目すべきは、悪性上皮細胞はストローマ区画におけるＤＲ５の状態にかかわらず、ＤＲ５を発現したことである。
【０１７９】
内皮細胞は表現型的にも機能的にも多様であり、組織特異的表面マーカーの差次的発現変動及びギャップ結合を伴う（Dejanaら, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 5:261-270 (2004)；Poberら, Nat. Rev. Immunol., 7:803-815 (2007)）。正常組織中の内皮細胞によるＤＲ５発現の欠如と一致して、Apo2L/TRAIL処置マウスにおける腫瘍微小環境の外側の血管破壊又は出血の証拠は何らなかった。正常内皮細胞と比較したＴＥＣによるＤＲ５発現の明らかな特異性は、例えば低炭素−癌細胞においてＤＲ５発現を調節することが示されている症状（Mahajanら, Carcinogenesis, 29:1734-1741 (2008)）のような腫瘍内の環境条件を反映している場合がある。
【０１８０】
ＴＥＣにおけるアポトーシス促進性シグナル伝達を評価するために、ＬＬＣ腫瘍を持つマウスをＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで処置し、腫瘍内皮におけるアポトーシスマーカーの出現をモニターした。腫瘍組織の一連の切片を、ＴＥＣを局在化させるためにＭｅｃａ−３２  で、又はアポトーシス促進性シグナル伝達のマーカーとして活性型（切断）カスパーゼ−３に特異的な抗体で染色した。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ処置後２時間以内に活性型カスパーゼ−３の速やかな生成がＴＥＣにおいて検出された（図２ｄ）。活性型カスパーゼ−３染色の幾らかの領域が処置にかかわらず腫瘍上皮細胞に出現したが、これは、マウス腫瘍において一般的に発生する自然の限局的アポトーシスを示唆している。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ処置後２４時間までに、広範な活性型カスパーゼ−３染色が腫瘍全体にわたって見ることができた（図２ｅ；追加の図４）。早期の時点では、腫瘍上皮細胞内全体にわたって殆どカスパーゼ−３活性は存在せず（図２ｄ及びｅ）、これは、ＴＥＣにおいてＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスが進行し、悪性細胞区画におけるアポトーシスとは独立していたことを示唆している。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬはＤＲ５欠損マウスにおいて増殖されたＬＬＣ腫瘍においてはＴＥＣアポトーシスを誘導しなかったが（追加の図４）、これはＴＥＣにおけるＤＲ５依存性シグナル伝達を確認するものである。
【０１８１】
アポトーシス促進性シグナル伝達に加えて、ある環境下でのデスレセプターの関与は、核内因子ｋＢ（ＮＦ−ｋＢ）カスケードのような非アポトーシス経路を活性化し得、これが、細胞性効果のなかでもサイトカイン及びケモカイン生産を促進しうる（Wilsonら, Nat. Immunol., 10:348-355 (2009)）。腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）は、しばしばＮＦ−ｋＢ活性化に応答して生産されるが、劇的な腫瘍血管効果を惹起させることが報告されている（Cortiら, Ann. NY Acad. Sci., 1028:104-112 (2004)；ten Hagenら, Immunol. Rev. 222:299-315 (2008)）。腫瘍脈管構造に対するＤＲ５活性化の影響が例えばＴＮＦαを介して間接的に作用させられるかどうかを調べるために、ＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ）１及び２二重欠損マウスにＬＬＣ腫瘍を移植し、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで処置した。ＴＮＦＲ１／２欠損マウスにおいてＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬによって誘導された腫瘍脈管構造の破壊の出現及び発生は野生型マウスのものと区別することができず、ＤＲ５欠損レシピエントにはなかった（図２ｆ及びｇ）。従って、ストローマ区画におけるＴＮＦＲ１／２欠乏は、腫瘍上皮細胞内でのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ誘導性カスパーゼ−３活性化に効果はなかった（追加の図５）。
【０１８２】
メチルコラントレン（ＭＣＡ）誘導線維肉腫を野生型及びＤＲ５欠損マウスで発生させ、腫瘍由来の細胞株を樹立した。これらの腫瘍細胞株のＤＲ５発現状態をフローサイトメトリーによって確認下（図３ａ）。ついで、野生型又はＤＲ５欠損ＭＣＡＭＣＡ腫瘍を、ＤＲ５陽性又はＤＲ５陰性レシピエントマウスにこれらの腫瘍細胞株を移植することによって増殖させた。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬでの処置は、悪性細胞におけるＤＲ５発現とは無関係に２４時間までに有意な腫瘍出血を誘導した（図３ｂ）；これに対して、この表現型はＤＲ５欠損ストローマを持つ腫瘍では完全に存在していなかった。Ｍｅｃａ−３２及び活性型カスパーゼ−３染色は、悪性細胞区画にＤＲ５を発現するか又はＤＲ５を欠く腫瘍内のＴＥＣにおけるアポトーシス促進性シグナル伝達を確認下（図  ３ｃ及び３ｄ）。これらのデータは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬによる腫瘍脈管構造の破壊が悪性細胞中におけるＤＲ５活性化とは独立して生じることを証明している。更に、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ処置は野生型及びＤＲ５欠損腫瘍細胞の双方におけるカスパーゼ−３活性を増加させたが、これは、腫瘍脈管構造の実質的な破壊によって引き起こされる二次的なＤＲ５非依存性アポトーシスをおそらくは反映している。
【０１８３】
野生型又はＤＲ５欠損腫瘍を持つマウスにおけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの抗癌効果を更に評価した。カスパーゼ−８、カスパーゼ−３／７の活性化、又は細胞生存率の喪失についてのインビトロアッセイは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで処置されたＤＲ５欠損ＭＣＡ腫瘍細胞におけるアポトーシス促進性シグナル伝達の欠如を確認した（図４ａ）。しかしながら、ＤＲ５陽性マウスに移植された場合、ＤＲ５欠損線維肉腫は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに応答して有意なカスパーゼ−３活性化を示した（図４ｂ）。更に、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ処置は、野生型又はＤＲ５欠損何れの線維肉腫を移植したマウスにおいても腫瘍増殖を有意に遅延させた（図４ｃ及びｄ）。何れにおいても、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ処置後の広範な出血性腫瘍壊死が注目されるが（追加の図６）、これは、悪性細胞の死が腫瘍血管破壊の間接的な結果として起こったことを示唆している。これらのデータは、ＴＥＣにおけるＤＲ５活性化が、ＤＲ５依存性腫瘍細胞アポトーシスとは区別され分離可能な形で抗腫瘍効果に寄与することを裏付けている。注目すべきは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬがＤＲ５欠損マウスにおける野生型線維肉腫の移植時に癌細胞において有意なアポトーシス促進性シグナル伝達を誘導しなかったことである（追加の図７）。同様の結果がルイス肺癌モデルにおいて見られた。処置がなされない場合における腫瘍イニシエーション及び増殖はレシピエントマウスのＤＲ５状態によって影響を受けなかった（追加の図８）；しかし、線維肉腫モデルにおいて観察されるように、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの抗腫瘍効果は、ストローマＴＥＣにおけるＤＲ５発現に随伴性であった。従って、この研究に使用された線維肉腫及び肺癌モデルにおいては、ＴＥＣでのＤＲ５活性化が  Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬによる腫瘍阻害の主要な機序であるようである。ヒト肺癌移植モデル、並びにヒト膵臓癌のジェネティックマウスモデルにおけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬによる同様の腫瘍脈管構造破壊がまた観察された（追加の図９及び１０）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ−Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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