(57)【要約】  本発明は、５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤の組合せ、並びにアセチルコリン放出の増加が望まれる１又は複数の障害の予防及び／又は治療、特に消化器障害、泌尿器障害、及び／又は呼吸器障害の予防及び／又は治療における方法及びその使用に関する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセチルコリン放出の増加が望まれる１又は複数の障害の予防及び／又は治療に使用される５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤の組合せ。
【請求項２】
アセチルコリン放出の増加が望まれる１又は複数の障害の予防及び／又は治療に使用される医薬組成物の調製における５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びＰＤＥ４阻害剤の組合せの使用。
【請求項３】
５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を含む組成物。
【請求項４】
アセチルコリン放出の増加が望まれる１又は複数の障害の予防及び／又は治療に使用される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
アセチルコリン放出の増加が望まれる１又は複数の障害を予防及び／又は治療する方法であって、それを必要とする被験体に、請求項１に記載の組合せ又は請求項３に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項６】
胃輪走筋細胞及び／又は結腸輪走筋細胞を神経支配するコリン作動性ニューロンからのアセチルコリンの放出を刺激する方法であって、神経細胞を請求項１に記載の組合せ又は請求項３に記載の組成物に暴露することを含む、方法。
【請求項７】
コリン作動性細胞からのアセチルコリンの放出が、消化器障害、泌尿器障害、若しくは呼吸器障害、又は消化器障害の治療と関連する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
十分な量の請求項１に記載の組合せ又は請求項３に記載の組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、胃及び／又は結腸の運動性の欠如を治療する方法。
【請求項９】
請求項１に記載の組合せを含むキット。
【請求項１０】
アセチルコリン放出の増加が望まれる前記１又は複数の障害が、消化器障害、泌尿器障害、及び呼吸器障害から選択され、又は消化器障害である、請求項１に記載の組合せ、請求項２に記載の使用、請求項４に記載の組成物又は請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
アセチルコリン放出の増加が望まれる前記１又は複数の障害が、過敏性腸症候群、慢性便秘、脊髄損傷又は骨盤隔膜不全によって引き起こされる便秘、腸アトニー、逆流性食道炎、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、バレット症候群、偽性腸イレウス、急性胃炎又は慢性胃炎、胃潰瘍又は十二指腸潰瘍、クローン病、非潰瘍性消化不良、胃不全麻痺、機能性消化不良、潰瘍性大腸炎、胃切除後症候群、術後消化機能不全、胃神経症によって引き起こされる胃排出遅延、及び不消化を含む一覧から選択される消化器障害であり、又は過敏性腸症候群、便秘若しくは腸アトニーである、請求項１に記載の組合せ、請求項２に記載の使用、請求項４に記載の組成物及び請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記５−ＨＴ４受容体アゴニストが、プルカロプリド、シサプリド、ダゾプリド、モサプリド、レンザプリド、ナロナプリド、ザコプリド、ベルセトラグ、テガセロッド、メトクロプラミド、シニタプリド、ＹＭ−５３３８９｛（＋）−（Ｓ）−２−クロロ−５−メトキシ−４−［５−（２−ピペラジルメチル）−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル］アニリンモノヒドロクロリド｝、ＲＳ−６７３３３、５−メトキシトリプタミン（５−ＭＴ）、及びＢＩＭＵ−８を含む一覧から選択され、又はプルカロプリドである、請求項１に記載の組合せ、請求項２に記載の使用、請求項３又は４に記載の組成物、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法、及び請求項９に記載のキット。
【請求項１３】
前記ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤が、ロリプラム、メセンブリン、ドロタベリン、ロフルミラスト、イブジラスト、ピクラミラスト、ルテオリン、シロミラスト、ジアゼパム、アロフィリン、ＣＰ−８０６３３、デンブフィリン、ドロタベリン、エタゾレート、フィラミナスト、グラウシン、ＨＴ−０７１２、ＩＣＩ−６３１９７、イルソグラジン、メセンブリン、Ｒｏ２０−１７２４、ＲＰＬ−５５４、及びＹＭ−９７６を含む一覧から選択され、又はロフルミラストである、請求項１に記載の組合せ、請求項２に記載の使用、請求項３又は４に記載の組成物、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法、及び請求項９に記載のキット。
【請求項１４】
前記５−ＨＴ４受容体アゴニストがプルカロプリドであり、前記ＰＤＥ４阻害剤がロフルミラストである、請求項１に記載の組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤の組合せ、並びにアセチルコリン放出の増加が望まれる１又は複数の障害の予防及び／又は治療、特に消化器障害、泌尿器障害、及び／又は呼吸器障害の治療における方法及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アセチルコリン
アセチルコリン（ＡＣｈ）は、ヒトを含む多くの生物の中枢神経系（ＣＮＳ）並びに末梢神経系（ＰＮＳ）の重要な神経伝達物質である。ＰＮＳは、神経及び脳外の神経節並びに脊椎からなり、身体運動等の意識的な制御下での活動を調節するシステムである体性神経系、また我々の制御を超えて機能する自律神経系に分けられる。自律神経系は、交感神経系、副交感神経系及び腸神経系に更に分けられる。
【０００３】
交感神経系は、終末神経伝達物質としてノルアドレナリンを使用し、心血管系を興奮させ、消化器系を抑制することによって危険を阻止するために応答するシステムである。副交感神経系は、終末神経伝達物質としてアセチルコリンを使用し、例えば、心血管系の抑制（心拍数及び血圧の減少）及び消化器系の興奮といった休息時における生理的応答を担う。
【０００４】
胃腸管は自律神経系からの外因性神経を介したＣＮＳの制御下にあるが、単独で機能することができ、胃腸管のほぼ全ての活動は無意識で自律的に起こる。その機能は、胃腸管自体の壁の細胞体を含む、複雑に体系づけられた内因性神経系である腸神経系（ＥＮＳ）により調節されている。ＥＮＳは、神経節を有する２つの神経叢からなる。アウエルバッハ神経叢又は筋層間神経叢は、消化管を通して縦走筋層及び輪走筋層の間に位置し、食道から直腸まで続く。マイスナー神経叢又は粘膜下神経叢は、粘膜下組織に位置する。ＥＮＳは、アセチルコリンが重要な役割を果たす神経反射を通して、運動性、分泌、血流及び免疫応答を体系化された挙動パターンへと統合する。
【０００５】
このように、アセチルコリンは、一般的にニューロン及び筋肉を活性化する自立神経系／腸神経系における主要な神経伝達物質であり、その的確な応答は標的細胞上に存在する受容体の種類に依存する。アセチルコリン放出の誘発は、消化器障害、及び泌尿器系障害等の平滑筋収縮が望まれる障害に対して有利な効果を有する可能性がある。さらに、例えば、結腸を空にすることが望まれるような術前準備のため、アセチルコリン放出を誘発する組成物が有益である可能性もある。
【０００６】
５−ＨＴ４受容体
アセチルコリン放出を調整する１つの可能性のある方法として、コリン作動性神経上に位置する１又は複数のセロトニン受容体を刺激することが挙げられる。セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン；５−ＨＴ）は、脳及び末梢において多様な機能に関与する遍在性のシグナル伝達分子である。５−ＨＴは、７つの受容体サブタイプ（５−ＨＴ１〜５−ＨＴ７）との相互作用によりその作用を及ぼす。リガンド開口型５−ＨＴ３受容体以外の５−ＨＴ受容体ファミリーの全てのクラスが、７回膜貫通Ｇタンパク質共役受容体ファミリーの一員である。５−ＨＴ６受容体及び５−ＨＴ７受容体と共に、５−ＨＴ４受容体は、ポジティブにＧｓタンパク質に連結してアデニリルシクラーゼを刺激し、細胞ｃＡＭＰの増加を生じる。細胞内ｃＡＭＰレベルの増大は、細胞種特異的な応答を引き起こす。５−ＨＴ４受容体アゴニストに対するかかる細胞種特異的応答は、上記受容体がニューロンに発現されている場合にはアセチルコリン等の神経伝達物質の放出を増大し、それらが平滑筋細胞に発現されている場合には平滑筋を弛緩し、また心房細胞に対しては収縮力を増加することを含む。
【０００７】
５−ＨＴ４受容体は体内において上述の末梢細胞種上に発現されることが確立されており、５−ＨＴ４受容体の活性化が胃腸管、心臓及び膀胱等の種々の器官における多くの応答に関与することが示されている（概要については非特許文献１を参照）。胃腸管における５−ＨＴ４受容体活性化の効果は広く調査されており、ヒト、ラット、マウス及びモルモットにおける５−ＨＴ４受容体の蠕動運動への関与が確立されている。アセチルコリン放出の増大をもたらし、よって筋肉収縮を増加する、遠心性の腸筋層間コリン興奮性ニューロン（蠕動運動反射の遠心脚）に対する５−ＨＴ４受容体の活性化は、おそらく５−ＨＴ４受容体アゴニストが胃腸運動性に影響を与える優勢なメカニズムである。これは、複数の種の多くの胃腸組織標本において示されている（非特許文献２）。
【０００８】
また、５−ＨＴ４受容体は、非常に低い密度ではあるが、ヒト心房筋細胞及び心室筋細胞にも発現している（非特許文献３）。
【０００９】
シサプリド、プルカロプリド（prucalopride）、テガセロッド、レンザプリド、モサプリド及びベルセトラグ等の複数の５−ＨＴ４受容体アゴニストが開発されている／開発中である。例えば、プルカロプリドは、４−アミノ−５−クロロ−２，３−ジ−ヒドロ−Ｎ−［ｒ−（３−メトキシプロピル）−４−ピペリジニル］−７−ベンゾ−フラン−カルボキシアミドの（１：１）コハク酸付加塩の一般名であり、強い胃腸運動促進活性を有することが示されている。
【化１】
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プルカロプリド
【００１０】
胃腸管壁の神経細胞に局在する５−ＨＴ４受容体を活性化することにより、プルカロプリド及びベルセトラグ等の５−ＨＴ４受容体アゴニストは、これらのニューロンからのアセチルコリン等の神経伝達物質の放出を促進する。さらに、例えば、プルカロプリドについては、非アドレナリン性非コリン性（ＮＡＮＣ）興奮性神経伝達の増強に関する証拠も存在する。これらの効果の結果、５−ＨＴ４受容体アゴニストは胃腸運動性を刺激し、圧出を促進する。例えば、プルカロプリドは、５−ＨＴ４受容体を刺激することによって、蠕動波として結腸の長さ全体に亘って伝播する高振幅伝播性収縮を誘発し、したがって、大腸に対して顕著な運動性の増強効果を有する、５−ＨＴ４受容体における強力で選択的なアゴニストである。さらに、プルカロプリドを含む製剤は、例えば、尿失禁又は尿閉等の膀胱が十分に機能しないことに関連する症状の予防及び／又は治療に使用することができる可能性があると考えられている。プルカロプリドは、１９９１年９月１１日付で公開された特許文献１において包括的に記載され、１９９６年５月３０日付で公開された特許文献２において具体的に開示されている。特許文献１及び特許文献２は、両方とも引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００１１】
５−ＨＴ４受容体アゴニストは単独でアセチルコリン放出の増大、及びその後の筋肉収縮の増加に有用であるが、この効果をシナプス前５−ＨＴ４受容体のシグナル伝達を妨げる他の医薬の追加によって相乗的に増強することができれば、より一層有利であり、上記の場所においてより低い用量で同様又は更に高い効果を得ることが可能となる。
【００１２】
ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）
細胞がｃＡＭＰを分解する経路は、特異的な環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）を介する。ホスホジエステル結合を破壊することにより、ＰＤＥはｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ等のセカンドメッセンジャー分子を分解する。したがって、特異的ＰＤＥ酵素の阻害は、結果的にｃＡＭＰ破壊の遅延を生じる。
【００１３】
酵素のＰＤＥスーパーファミリーは１１のファミリー（ＰＤＥ１〜ＰＤＥ１１）に分類され、それらのほとんどがサブファミリーへと更に細分される。例えば、ＰＤＥ４、ＰＤＥ７及びＰＤＥ８は、大部分がｃＡＭＰ加水分解酵素であり、ＰＤＥ５、ＰＤＥ６及びＰＤＥ９は大部分がｃＧＭＰ加水分解酵素であり、またＰＤＥ１、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３、ＰＤＥ１０及びＰＤＥ１１はｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの両方を加水分解し得る。さらに、それらがセカンドメッセンジャー分子の調節に重要であることから、ＰＤＥは、心臓、脳、胃腸管、血液細胞等における発現を含む、様々な組織、細胞種及び細胞内局在において幅広い発現パターンを有する。しかしながら、あらゆる細胞において全てのＰＤＥが存在し機能するというわけではなく、異なる細胞種間でｃＡＭＰ代謝に関与するＰＤＥサブタイプについてはまだあまり知られていない。さらに、ｃＡＭＰ産生が引き起こされるメカニズム／受容体に依存して、上記所定の細胞種において異なるＰＤＥサブタイプがｃＡＭＰ破壊に補充され／関与し得る。したがって、どの細胞種のどの経路にどのＰＤＥが関与するかを予測することは困難である。
【００１４】
また、これは様々な適応症のために開発された利用可能なＰＤＥ阻害剤からも明らかである。
【００１５】
非選択的ＰＤＥ阻害剤：
テオフィリン：気管支拡張剤
ペントキシフィリン：糖尿病及び末梢神経損傷
パラキサンチン：ＣＮＳ障害
【００１６】
ＰＤＥ１阻害剤：
ビンポセチン：脳血管障害
【００１７】
ＰＤＥ２阻害剤：
ＥＨＮＡ：脳血管障害
アナグレリド：本態性血小板増多症
【００１８】
ＰＤＥ３阻害剤：
エノキシモン：心不全
ミルリノン：心不全
レボシメンダン：心不全
【００１９】
ＰＤＥ４阻害剤：
ロフルミラスト：ＣＯＰＤ
ドロタベリン：腎疝痛（renal colicpain）の緩和
ロリプラム：鬱病
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】欧州特許出願公開第０，４４５，８６２号
【特許文献２】国際公開第９６／１６０６０号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Langlois andFischmeister (2003)
【非特許文献２】De Maeyer et al.,2008
【非特許文献３】Kaumann et al.,1996
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
要約すると、アセチルコリンは自律神経系及び腸神経系における主要な神経伝達物質であり、コリン作動性ニューロンからのアセチルコリン放出の誘発は、平滑筋の収縮が望まれる障害に有利な効果を有する可能性がある。本発明は、コリン作動性ニューロンからのアセチルコリン放出を特異的に促進することが可能な組合せを提供しながらも、心血管系等の他の器官における上記組合せの不要な相互作用の促進を回避することを目的とした。さらに、ｃＡＭＰを増加する組合せは、平滑筋細胞におけるｃＡＭＰの増加が反作用的な緩和を生じることから、コリン作動性システムを選択的に標的としなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
これまでに本発明者らは、コリン作動性ニューロンから胃腸（gastrointestinal）輪走筋へのアセチルコリン放出の促進に対する５−ＨＴ４受容体アゴニストとＰＤＥ４阻害剤との間の相乗的な作用を見出した。より重要なことは、この相乗効果が、胃腸コリン作動性神経伝達、及びその後に誘発される平滑筋細胞の収縮に特異的であることが明らかとなったことである。
【００２４】
例えば、心房細胞が５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びＰＤＥ４阻害剤に暴露された場合、心房拍動数（変時性）又は心房収縮（変力性）に対する相乗効果は観察されない。心房筋収縮は、ＰＤＥ３の阻害を必要とする（Galindo-Tovar et al., 2009）。さらに、ＰＤＥ４阻害剤が存在するにもかかわらず、望ましくない胃腸平滑筋弛緩は発生しない。ｃＡＭＰ媒介胃腸平滑筋細胞弛緩を誘発するため、ＰＤＥ３及びＰＤＥ４の同時阻害が必要である。
【００２５】
したがって、５−ＨＴ４受容体アゴニストとＰＤＥ４阻害剤との併用療法は、心房筋細胞における相互作用を回避し、また平滑筋弛緩を生じる平滑筋ｃＡＭＰのＰＤＥ誘発性の不要な増加を回避しつつ、胃腸管におけるコリン作動性神経伝達に対する５−ＨＴ４受容体アゴニストの効果を特異的に高めるための手段である。
【００２６】
それゆえに、上記併用療法は、５−ＨＴ４受容体アゴニストがアセチルコリン放出を増加することが示されている全ての組織である、胃輪走平滑筋、括約筋、膀胱の排尿筋を含む胃腸平滑筋の調節等のアセチルコリン放出が望まれる障害に対して有益な効果を有する。
【００２７】
第１の態様において、本発明は、例えば、消化器障害、泌尿器障害、及び呼吸器障害、特に消化器障害等のアセチルコリン放出の増加が望まれる１又は複数の障害の予防及び／又は治療に使用される５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤の組合せを提供する。
【００２８】
本発明の特定の実施の形態において、５−ＨＴ４受容体アゴニストは、プルカロプリド、シサプリド、ダゾプリド、モサプリド、レンザプリド、ナロナプリド、ザコプリド、ベルセトラグ、テガセロッド、メトクロプラミド、シニタプリド、ＹＭ−５３３８９｛（＋）−（Ｓ）−２−クロロ−５−メトキシ−４−［５−（２−ピペラジルメチル）−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル］アニリンモノヒドロクロリド｝、ＲＳ−６７３３３、５−メトキシトリプタミン（５−ＭＴ）、及びＢＩＭＵ−８を含む一覧から選択され、特にプルカロプリドである。
【００２９】
その他の特定の実施の形態において、ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤は、ロリプラム、メセンブリン、ドロタベリン、ロフルミラスト、イブジラスト、ピクラミラスト、ルテオリン、シロミラスト、ジアゼパム、アロフィリン、ＣＰ−８０６３３、デンブフィリン（denbufylline）、ドロタベリン、エタゾレート、フィラミナスト、グラウシン、ＨＴ−０７１２、ＩＣＩ−６３１９７、イルソグラジン、メセンブリン、Ｒｏ２０−１７２４、ＲＰＬ−５５４、及びＹＭ−９７６を含む一覧から選択され、特にロフルミラストである。
【００３０】
好ましい実施の形態において、本発明は、５−ＨＴ４受容体アゴニストであるプルカロプリド、及びＰＤＥ４阻害剤であるロフルミラストを含む組成物を提供する。
【００３１】
本発明において、消化器障害は、過敏性腸症候群、慢性便秘、脊髄損傷又は骨盤隔膜不全によって引き起こされる便秘、腸アトニー、逆流性食道炎、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、バレット症候群、偽性腸イレウス、急性胃炎又は慢性胃炎、胃潰瘍又は十二指腸潰瘍、クローン病、非潰瘍性消化不良、胃不全麻痺、機能性消化不良、潰瘍性大腸炎、胃切除後症候群、術後消化機能不全、胃神経症によって引き起こされる胃排出遅延、及び不消化を含む一覧から選択され、特に胃不全麻痺、ＧＥＲＤ、過敏性腸症候群、便秘及び腸アトニーである。
【００３２】
更なる態様において、本発明は、例えば、消化器障害、泌尿器障害、及び呼吸器障害から選択され、特に消化器障害等のアセチルコリン放出の増加が望まれる１又は複数の障害の予防及び／又は治療に使用される医薬組成物の調製における、上述の５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びＰＤＥ４阻害剤の組合せの使用を提供する。
【００３３】
本発明の更なる態様は、５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を含む医薬組成物を提供するものである。
【００３４】
特定の実施の形態において、ＰＤＥ４阻害剤は、ロリプラム、メセンブリン、ドロタベリン、ロフルミラスト、イブジラスト、ピクラミラスト、ルテオリン、シロミラスト、ジアゼパム、アロフィリン、ＣＰ−８０６３３、デンブフィリン、ドロタベリン、エタゾレート、フィラミナスト、グラウシン、ＨＴ−０７１２、ＩＣＩ−６３１９７、イルソグラジン、メセンブリン、Ｒｏ２０−１７２４、ＲＰＬ−５５４、及びＹＭ−９７６を含む群から選択され、特にロフルミラストである。
【００３５】
その他の特定の実施の形態において、５−ＨＴ４受容体アゴニストは、プルカロプリド、シサプリド、ダゾプリド、モサプリド、レンザプリド、ナロナプリド、ザコプリド、ベルセトラグ、テガセロッド、メトクロプラミド、シニタプリド、ＹＭ−５３３８９｛（＋）−（Ｓ）−２−クロロ−５−メトキシ−４−［５−（２−ピペラジルメチル）−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル］アニリンモノヒドロクロリド｝、ＲＳ−６７３３３、５−メトキシトリプタミン（５−ＭＴ）、及びＢＩＭＵ−８を含む群から選択され、特にプルカロプリドである。
【００３６】
好ましい実施の形態において、５−ＨＴ４受容体アゴニストはプルカロプリドであり、ＰＤＥ４阻害剤はロフルミラストである。
【００３７】
さらに、本発明は、例えば、消化器障害、泌尿器障害、及び呼吸器障害から選択され、特に消化器障害等のアセチルコリン放出の増加が望まれる１又は複数の障害の予防及び／又は治療のための本発明による医薬組成物の使用を提供する。
【００３８】
更なる態様において、本発明は、例えば、消化器障害、泌尿器障害、及び呼吸器障害から選択され、特に消化器障害等のアセチルコリン放出の増加が望まれる１又は複数の疾患の治療のための方法を提供し、該方法は、５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を含む組合せ、又は該組合せを含む組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む。
【００３９】
上記５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤は、それを必要とする患者に同時に投与されてもよく、順次投与されてもよく、又は別々に投与されてもよい。
【００４０】
更なる態様において、本発明は、胃輪走筋細胞を神経支配するコリン作動性ニューロンからのアセチルコリンの放出を刺激する方法を提供し、該方法は、上記コリン作動性ニューロンを５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤を含む組合せに暴露することを含む。下記の実験部分から明らかなように、上記コリン作動性神経細胞が上記組合せに暴露されると、上記細胞からのアセチルコリンの放出量は、５−ＨＴ４受容体アゴニスト又はＰＤＥ４阻害剤のいずれか単独に暴露された場合に比べて有意かつ特異的に増大する。
【００４１】
本方法は、胃輪走筋細胞を神経支配するコリン作動性ニューロンからの放出が胃腸障害の治療と関連する場合に特に好適である。
【００４２】
また、本発明は、十分な量の５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びＰＤＥ４阻害剤を、それを必要とする患者に投与することを含む、胃運動性の欠如を治療する方法を提供し、ここで、上記５−ＨＴ４受容体アゴニスト及び上記ＰＤＥ４阻害剤を、それを必要とする被験体に同時に、順次に又は別々に投与してもよい。更なる実施の形態において、本発明は、十分な量の５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びＰＤＥ４阻害剤を含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、胃運動性の欠如を治療する方法も提供する。
【００４３】
上述の一般的な説明、並びに以下の図面の簡単な説明及び詳細な説明は、両方が例示的で説明的なものであり、請求項に記載の発明の更なる説明を提供することを意図するものである。他の目的、利点、及び新規な特徴は、以下の本発明の詳細な説明より当業者に容易に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】（Ａ）及び（Ｂ）：電場刺激（ＥＦＳ）によって惹起された胃組織からの総放射能放出のＳ２／Ｓ１比に対するプルカロプリド（Ｐｒｕ；０．０１μＭ、Ａ；０．０３μＭ、Ｂ）、ＩＢＭＸ、及びＩＢＭＸ存在下でのプルカロプリドの影響を示す図である。組織を２度に亘って刺激した（Ｓ１及びＳ２；１５Ｖ、１ｍ秒、４Ｈｚ、２分）；Ｓ２の３６分前にＩＢＭＸを添加し、１５分前にプルカロプリドを添加した。Ｓ２によるベースラインを超える全放射能のＥＦＳ誘発性放出放射束をＳ１によるそれとの比として表す。ｎ＝５〜６組織の平均±ＳＥＭを示す。＊Ｐ＜０．０５：コントロールと有意に異なる；＃Ｐ＜０．０５、＃＃＃Ｐ＜０．００１：プルカロプリド単独と有意に異なる。（Ｃ）：胃組織からのＥＦＳ誘発性全放射能放出（totalradioactivity release）のＳ２／Ｓ１比に対するプルカロプリド０．０１μＭ（Ｐｒｕ）、ロフルミラスト０．３μＭ（Ｒｏｆｌｕ）及びロフルミラスト存在下でのプルカロプリドの影響を示す図である。組織を２度に亘って刺激した（Ｓ１及びＳ２；１５Ｖ、１ｍ秒、４Ｈｚ、２分）。Ｓ２の３６分前にロフルミラストを添加し、１５分前にプルカロプリドを添加した。ｎ＝６組織のＳ２／Ｓ１比の平均±ＳＥＭを示す。＊＊＊ｐ＜０．００１；＊ｐ＜０．０５：コントロール（０．１％ＤＭＳＯ）と有意に異なる。＃＃＃ｐ＜０．００１：プルカロプリド０．０１μＭと有意に異なる。○○○Ｐ＜０．００１：ロフルミラスト０．３μＭと有意に異なる（ＡＮＯＶＡの後、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ多重比較ｔ検定；５つの比較、即ち、ＤＭＳＯ−Ｐｒｕ、Ｒｏｆｌｕ及びＲｏｆｌｕ−Ｐｒｕ対ＤＭＳＯ、Ｒｏｆｌｕ−Ｐｒｕ対ＤＭＳＯ−Ｐｒｕ及びＲｏｆｌｕ−Ｐｒｕ対Ｒｏｆｌｕ）。（Ｄ）：胃組織からの全放射能のＥＦＳ誘発性流出のＳ２／Ｓ１比に対するベルセトラグ０．０１μＭ（Ｖｅｌｕ）、ロリプラム１μＭ（Ｒｏｌｉ）及びロリプラム存在下でのベルセトラグの影響を示す図である。組織を２度に亘って刺激した（Ｓ１及びＳ２；１５Ｖ、１ｍ秒、４Ｈｚ、２分）。Ｓ２の３６分前にロリプラムを添加し、１５分前にベルセトラグを添加した。ｎ＝６〜７組織のＳ２／Ｓ１比の平均±ＳＥＭを示す。＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．０１：コントロール（０．０１％ＤＭＳＯ〜０．１％ＤＭＳＯ）と有意に異なる。＃＃＃ｐ＜０．００１：ロリプラム１μＭと有意に異なる、○○○Ｐ＜０．００１：ベルセトラグ０．０１μＭと有意に異なる。（ＡＮＯＶＡの後、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ多重比較ｔ検定；５つの比較、即ち、ＤＭＳＯ−Ｖｅｌｕ、Ｒｏｌｉ−ＤＭＳＯ及びＲｏｌｉ−Ｖｅｌｕ対ＤＭＳＯ、Ｒｏｌｉ−Ｖｅｌｕ対ＤＭＳＯ−Ｖｅｌｕ及びＲｏｌｉ−Ｖｅｌｕ対Ｒｏｌｉ−ＤＭＳＯ）。
【図２】ＥＦＳにより惹起された胃組織からの総放射能放出のＳ２／Ｓ１比に対するプルカロプリド（Ｐｒｕ、０．０１μＭ）、ロリプラム（Ｒｏｌｉ、１μＭ）及びロリプラム存在下でのプルカロプリドの影響を示す図である。組織を２度に亘って刺激した（Ｓ１及びＳ２；１５Ｖ、１ｍ秒、４Ｈｚ、２分）；Ｓ２の３６分前にロリプラムを添加し、１５分前にプルカロプリドを添加した。Ｓ２によるベースラインを超えるＥＦＳ誘発性の総放射能の放出放射束をＳ１によるそれとの比として表す。ｎ＝６組織の平均±ＳＥＭを示す。＃＃＃Ｐ＜０．００１：プルカロプリド単独より有意に異なる。
【図３】胃筋条片におけるＬ−ＮＡＭＥ３００μＭの存在下での準最大ＥＦＳ誘発性収縮に対するプルカロプリド０．１μＭの促進効果を示す代表的なトレース（増負荷性レジストレーション）を示す図である。
【図４】胃筋条片におけるＥＦＳ誘発性準最大収縮に対するプルカロプリド（Ｐｒｕ）の濃度増加による増強効果を示す図である。応答は、プルカロプリド添加前の５回の収縮の平均の割合として表される。ｎ＝６組織の平均±ＳＥＭを示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５：プルカロプリドを含まないコントロール組織における最終応答に対する最終応答の有意差。
【図５】胃筋条片におけるＥＦＳ誘発性準最大収縮に対するＰＤＥ阻害剤ＩＢＭＸ（Ｂ）、シロスタミド（Ｃ）及びロリプラム（Ｄ）の濃度増加の影響を示す図である。各濃度のＰＤＥ阻害剤の存在下において６トレイン（train）のＥＦＳを適用し、６回目のトレインに対する応答を、最も低い濃度のＰＤＥ阻害剤を添加する前の５回の収縮の平均の割合として表した。コントロール組織（Ａ）を４７回刺激し、トレイン１１（Ｔ１１）から各６回目の応答を測定した。ｎ＝６〜８組織の平均±ＳＥＭを示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５：前の応答に対する有意差。
【図６】準最大ＥＦＳ誘発性収縮に対する影響を示す、胃筋条片におけるロリプラム１μＭ及びシクロスタミド１μＭ（Ａ）の連続投与の代表的なトレース（等尺性レジストレーション）を示す図である。
【図７】胃筋条片におけるＥＦＳ誘発性準最大収縮に対するプルカロプリド０．０１μＭ（Ｐｒｕ）の増強効果へのＩＢＭＸ（１μＭ又は３μＭ）の影響を示す図である。応答を、プルカロプリド添加前の５回の収縮の平均の％として表す。ｎ＝６組織の平均±ＳＥＭを示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１：プルカロプリドを含まないコントロール組織における最終応答に対する最終応答の有意差；＃Ｐ＜０．０５：プルカロプリドのみで処理された組織における最終応答に対する最終応答の有意差。
【図８】胃筋条片におけるＥＦＳ誘発性準最大収縮に対するプルカロプリド０．０１μＭ（Ａ）、０．０３μＭ（Ｂ）及び０．１μＭ（Ｃ）の増強効果へのロリプラム１μＭの影響を示す図である。応答を、ロリプラム添加前の５回の収縮の平均の割合として表す。ｎ＝７〜８組織の平均±ＳＥＭを示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５：プルカロプリドを含まないコントロール組織における最終応答に対する最終応答の有意差。
【図９】結腸輪走筋組織におけるＥＦＳ（４Ｈｚ；０．２５ｍ秒；Ｖ５０％で１０秒トレイン）誘発性準最大収縮に対するＰＤＥ阻害剤ＩＢＭＸ（Ｂ）、ビンポセチン（Ｃ）、ＥＨＮＡ（Ｄ）、シロスタミド（Ｅ）及びザプリナスト（Ｆ）の濃度増加の影響を示す図である。６トレインのＥＦＳを、各濃度のＰＤＥ阻害剤の存在下で適用し、６回目のトレインに対する応答を最も低い濃度のＰＤＥ阻害剤を添加する前の５回の収縮の平均の割合として表した。コントロール組織（Ａ）を４１回刺激し、トレイン１１（Ｔ１１）から各６回目の応答を測定した。ｎ＝６〜７の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１：添加前に対する有意差（反復測定ＡＮＯＶＡの後のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正ｔ検定）。
【図１０】図１の説明において記載される通り表される、結腸輪走筋組織におけるＥＦＳ（４Ｈｚ；０．２５ｍ秒；Ｖ５０％で１０トレイン）誘発性準最大収縮に対するＰＤＥ４阻害剤ロリプラム（Ｂ）の濃度増加の影響を示す図である。対応する時間コントロール、即ち薬剤を受けていない（Ａ）、ＩＢＭＸに関して５０％エタノール希釈系列を受ける組織（Ｃ）、並びにロリプラム、シロスタミド及びビンポセチンに関してＤＭＳＯ希釈系列を受ける組織（Ｄ）も示される。ｎ＝４〜６の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１：添加前に対する有意差（反復測定ＡＮＯＶＡの後のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正ｔ検定）
【図１１】ＰＤＥ阻害剤ＩＢＭＸ０．３μＭ（Ａ）若しくは１μＭ（Ｂ）、又はロリプラム３μＭ（Ｃ）の存在下での結腸輪走筋組織におけるＥＦＳ誘発性準最大コリン性収縮に対するプルカロプリド１μＭ（ＰＲＵ）の促進効果を示す図である。ｎ＝５〜８の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１：プルカロプリドを含まないコントロール組織における応答に対する、刺激トレイン１３における応答（プルカロプリド添加後の２回目の刺激トレイン）の有意差（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡの後、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正ｔ検定）。
【図１２】（Ａ）準最大ＥＦＳ誘発性収縮に対する影響を示す、プルカロプリド１μＭ及びロリプラム３μＭの継続的な投与による結腸輪走筋組織の代表的なトレースを示す図である。（Ｂ）パネルＡ及びプルカロプリドのみを受けた、又はいかなる物質も受けていない（時間コントロール）対応する組織に示される平均実験結果（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；ｎ＝８）を示す図である。＊＊Ｐ＜０．０１：プルカロプリドを添加する直前の刺激トレイン３〜５に対する平均応答に対する、刺激トレイン７（プルカロプリド添加後の２回目のトレイン）に対する応答の有意差（対応のあるｔ検定）。∇Ｐ＜０．０１：刺激トレイン１５〜１７に対する平均応答に対する、刺激トレイン１９（ロリプラム添加後の２回目のトレイン）に対する応答の有意差（対応のあるｔ検定）。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
第１の態様において、本発明は、アセチルコリン放出の増加が望まれる１又は複数の障害の予防及び／又は治療に使用される、５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤の組合せを提供する。
【００４６】
下記及び本出願を通して示される幾つかの定義を用いて、ここに、本発明を説明する。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「約」は、当業者によって理解され、それが使用される文脈によって或る程度変化する。この用語の使用が当業者に明確でない場合、それが使用される文脈を前提として、「約」は特定の用語のプラス１０％以内又はマイナス１０％以内を意味する。
【００４８】
「５−ＨＴ４受容体アゴニスト」の用語は、本明細書で使用される場合、セロトニンタイプ４受容体に親和性を有し、例えば、或る特定の消化器疾患の予防及び／又は治療において有用であることから、この具体的な細胞受容体においてセロトニンの刺激効果を模倣することができる任意の薬剤を含むことを意味する。上記５−ＨＴ４受容体アゴニストの例として、プルカロプリド、シサプリド、ダゾプリド、モサプリド、レンザプリド、ナロナプリド、ザコプリド、ベルセトラグ、テガセロッド、メトクロプラミド、シニタプリド、ＹＭ−５３３８９｛（＋）−（Ｓ）−２−クロロ−５−メトキシ−４−［５−（２−ピペラジルメチル）−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル］アニリンモノヒドロクロリド｝、ＲＳ−６７３３３、５−メトキシトリプタミン（５−ＭＴ）、及びＢＩＭＵ−８が挙げられ、特にプルカロプリドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
「ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤」の用語は、本明細書で使用される場合、選択的な方法、即ち、実質的に他のＰＤＥファミリーメンバーのいずれの活性も調整しない方法でＰＤＥ４の活性を阻害する任意の薬剤を含むことを意味する。特に、ＰＤＥ４の阻害は、結果的にｃＡＭＰの加水分解を遮断し、それによって細胞内のｃＡＭＰレベルを増加する。ＰＤＥ４阻害剤の例として、ロリプラム、メセンブリン、ドロタベリン、ロフルミラスト、イブジラスト、ピクラミラスト、ルテオリン、シロミラスト、ジアゼパム、アロフィリン、ＣＰ−８０６３３、デンブフィリン、ドロタベリン、エタゾレート、フィラミナスト、グラウシン、ＨＴ−０７１２、ＩＣＩ−６３１９７、イルソグラジン、メセンブリン、Ｒｏ２０−１７２４、ＲＰＬ−５５４、及びＹＭ−９７６が挙げられ、特にロフルミラストが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
５−ＨＴ４受容体アゴニスト及び／又はＰＤＥ４阻害剤への言及は、常に、それらの遊離形態を含む（例えば、遊離形態及び／又は基本形態）、かかる薬剤の全ての活性形態を含み、また全ての薬学的に許容可能な塩、多形体、水和物、ケイ酸塩、立体異性体等を含むものと理解される。また、形態には活性な代謝産物が含まれることも意味する。
【００５１】
「アセチルコリン放出の増加が望まれる障害」の語句は、基礎（basal）を超えるアセチルコリン放出の増加によって治療及び／又は予防され得る任意の障害を含むことを意味する。上記障害として、消化器障害、泌尿器障害、及び呼吸器障害が挙げられ、特に呼吸器障害が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
特に、本発明は、末梢神経系におけるコリン作動性神経終末からのアセチルコリン放出を相乗的に増加し、それにより、ｃＡＭＰレベルの増加による望ましくない胃腸平滑筋の弛緩及び望ましくない心筋の収縮／弛緩を回避しつつ、胃腸（例えば、胃又は結腸）平滑筋収縮を刺激する新規な組合せを提供することを意図する。両方の治療剤を投与することにより、結果的に５−ＨＴ４受容体アゴニストの効果の増強作用を生じ、したがって、両方の薬剤の投与は、５−ＨＴ４受容体アゴニスト単独又はＰＤＥ４阻害剤単独によるものよりも大きな効果を生み出す。
【００５３】
本発明は、上述の治療薬の各々、即ち５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びＰＤＥ４阻害剤を同一の治療的処置プログラム又は投与計画の一部として投与するために提供する。
【００５４】
したがって、また本発明は、５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びＰＤＥ４阻害剤を含む組成物を提供する。
【００５５】
本発明の組成物は、経口錠剤、分散液、ゲル、エアロゾル、軟膏、クリーム、カプセル、サッシェ、溶液、それらの分散物及び混合物等の任意の薬学的に許容可能な剤形に製剤化され得る。さらに、上記組成物を、放出制御型製剤、即時溶解型製剤、凍結乾燥製剤、遅延放出型製剤、徐放性製剤、パルス放出型製剤、即時放出及び制御放出の混合型製剤等に製剤化することができる。
【００５６】
本発明の組成物は、１又は複数の薬学的に許容可能な賦形剤、担体、又はそれらの組合せをさらに含んでもよい。
【００５７】
５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びＰＤＥ４阻害剤の好適な投与量は、当該技術分野において既知である。５−ＨＴ４受容体アゴニストであるプルカロプリドを含む現在利用可能な医薬組成物は、２ｍｇ又は１ｍｇのプルカロプリドを含有する１日１回の錠剤形態で製剤化される。現在利用可能なＰＤＥ４阻害剤の医薬組成物は、ロフルミラスト５００ｍｇを含有する１日１回の錠剤形態で利用可能なロフルミラストを含む。本発明の１つの実施形態によれば、上記組成物は、５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びＰＤＥ４阻害剤の別々の個別の剤形であるか、又は１つの剤形によるこれらの治療剤の組合せである。
【００５８】
さらに、本発明の組成物の服用は、１日に１回又は複数回であってもよく、１日に２回、３回、４回、若しくは５回又はそれ以上を含む。また、服用は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、又は７日間；１週間、２週間、３週間、４週間、又は５週間；１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、又は１２カ月等、任意の所望のどのような期間であってもよい。本発明は、その組合せの使用を提供する。また、１年又はそれ以上の期間に亘って服用を継続してもよい。
【００５９】
５−ＨＴ４受容体アゴニストは本発明の組成物において薬学的に許容される任意の投与量で用いることができる。投与量としては１日又は１回分の投与量が、下記に限定されないが、約５０ｍｃｇ、約１００ｍｃｇ、約２００ｍｃｇ、約３００ｍｃｇ、約４００ｍｃｇ、約５００ｍｃｇ、約６００ｍｃｇ、約７００ｍｃｇ、約８００ｍｃｇ、約９００ｍｃｇ、若しくは約１０００ｍｃｇ、又は約０．０１ｍｇ、約０．０２ｍｇ、約０．０３ｍｇ、約０．０４ｍｇ、約０．０５ｍｇ、約０．０６ｍｇ、約０．０７ｍｇ、約０．０８ｍｇ、約０．０９ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約１．１ｍｇ、約１．２ｍｇ、約１．３ｍｇ、約１．４ｍｇ、約１．５ｍｇ、約１．６ｍｇ、約１．７ｍｇ、約１．８ｍｇ、約１．９ｍｇ、約２．０ｍｇ、約２．１ｍｇ、約２．２ｍｇ、約２．３ｍｇ、約２．４ｍｇ、約２．５ｍｇ、約２．６ｍｇ、約２．７ｍｇ、約２．８ｍｇ、約２．９ｍｇ、約３．０ｍｇ、約３．１ｍｇ、約３．２ｍｇ、約３．３ｍｇ、約３．４ｍｇ、約３．５ｍｇ、約３．６ｍｇ、約３．７ｍｇ、約３．８ｍｇ、約３．９ｍｇ、約４．０ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約１６ｍｇ、約１７ｍｇ、約１８ｍｇ、約１９ｍｇ、約２０ｍｇ、約２１ｍｇ、約２２ｍｇ、約２３ｍｇ、約２４ｍｇ、約２５ｍｇ、約２６ｍｇ、約２７ｍｇ、約２８ｍｇ、約２９ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１１５ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１３５ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１４５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１５５ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１６５ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１７５ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１８５ｍｇ、約１９０ｍｇ、約１９５ｍｇ、約２００ｍｇ、約２０５ｍｇ、約２１０ｍｇ、約２１５ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２２５ｍｇ、約２３０ｍｇ、約２３５ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２４５ｍｇ、若しくは約２５０ｍｇである。
【００６０】
例えば、成人におけるプロカロプリドの推奨投与量は経口で１日１回の投与で２ｍｇである。この投与量を超えても効果の増大は期待することができない。高齢の患者（＞６５歳）における推奨開始投与量は１日１回の服用で１ｍｇである。その後は、必要であれば、投与量は１日１回の服用で２ｍｇまで増やすことができる。したがって、１日１回又は複数回投与される本発明の組成物中のプロカロプリドの例示投与量は、下記に限定されないが、約０．０１ｍｇ、約０．０２ｍｇ、約０．０３ｍｇ、約０．０４ｍｇ、約０．０５ｍｇ、約０．０６ｍｇ、約０．０７ｍｇ、約０．０８ｍｇ、約０．０９ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約１．１ｍｇ、約１．２ｍｇ、約１．３ｍｇ、約１．４ｍｇ、約１．５ｍｇ、約１．６ｍｇ、約１．７ｍｇ、約１．８ｍｇ、約１．９ｍｇ、約２．０ｍｇ、約２．１ｍｇ、約２．２ｍｇ、約２．３ｍｇ、約２．４ｍｇ、約２．５ｍｇ、約２．６ｍｇ、約２．７ｍｇ、約２．８ｍｇ、約２．９ｍｇ、約３．０ｍｇ、約３．１ｍｇ、約３．２ｍｇ、約３．３ｍｇ、約３．４ｍｇ、約３．５ｍｇ、約３．６ｍｇ、約３．７ｍｇ、約３．８ｍｇ、約３．９ｍｇ、又は約４．０ｍｇである。
【００６１】
５−ＨＴ４受容体アゴニストであるシサプリドの投与量は胃食道逆流症及び胃不全麻痺に対して食事の１５分前及び就寝時に経口、１日４回で１０ｍｇ〜２０ｍｇの範囲であり、消化不良に対して食事の１５分前に経口、１日３回で肝合併症の被験者への投与量の５０％に減らした５ｍｇ〜１０ｍｇの範囲である。１歳を超える子供の場合、投与量は経口で１日３回又は４回で０．２ｍｇ／ｋｇ／回〜０．３ｍｇ／ｋｇ／回であり、最大で１０ｍｇ／回である（例えば胃食道逆流症）。したがって、１日１回又は複数回投与される、本発明の組成物中のシサプリドの例示投与量は、下記に限定されないが、約０．０１ｍｇ、約０．０２ｍｇ、約０．０３ｍｇ、約０．０４ｍｇ、約０．０５ｍｇ、約０．０６ｍｇ、約０．０７ｍｇ、約０．０８ｍｇ、約０．０９ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約１１ｍｇ、約１２ｍｇ、約１３ｍｇ、約１４ｍｇ、約１５ｍｇ、約１６ｍｇ、約１７ｍｇ、約１８ｍｇ、約１９ｍｇ、約２０ｍｇ、約２１ｍｇ、約２２ｍｇ、約２３ｍｇ、約２４ｍｇ、約２５ｍｇ、約２６ｍｇ、約２７ｍｇ、約２８ｍｇ、約２９ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、又は約９０ｍｇである。
【００６２】
５−ＨＴ４受容体アゴニストであるモサプリドの投与量は、通常３回／日で５ｍｇである。したがって、１日１回又は複数回投与される、本発明の組成物中のモサプリドの例示投与量は、下記に限定されないが、約０．０１ｍｇ、約０．０２ｍｇ、約０．０３ｍｇ、約０．０４ｍｇ、約０．０５ｍｇ、約０．０６ｍｇ、約０．０７ｍｇ、約０．０８ｍｇ、約０．０９ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約１１ｍｇ、約１２ｍｇ、約１３ｍｇ、約１４ｍｇ、約１５ｍｇ、約１６ｍｇ、約１７ｍｇ、約１８ｍｇ、約１９ｍｇ、約２０ｍｇ、約２１ｍｇ、約２２ｍｇ、約２３ｍｇ、約２４ｍｇ、約２５ｍｇ、約２６ｍｇ、約２７ｍｇ、約２８ｍｇ、約２９ｍｇ、又は約３０ｍｇである。
【００６３】
便秘型過敏性腸症候群の臨床試験において、５−ＨＴ４受容体アゴニストであるレンザプリドの投与量が４ｍｇ／日のグループは偽薬投与のグループより一貫して数値的に良い結果を示すことが分かっている。したがって、１日１回又は複数回投与される本発明の組成物中のモサプリドの例示投与量は、下記に限定されないが、約０．０１ｍｇ、約０．０２ｍｇ、約０．０３ｍｇ、約０．０４ｍｇ、約０．０５ｍｇ、約０．０６ｍｇ、約０．０７ｍｇ、約０．０８ｍｇ、約０．０９ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約１１ｍｇ、約１２ｍｇ、約１３ｍｇ、約１４ｍｇ、約１５ｍｇ、約１６ｍｇ、約１７ｍｇ、約１８ｍｇ、約１９ｍｇ、又は約２０ｍｇである。
【００６４】
最近の第２相臨床試験に用いられた５−ＨＴ４受容体アゴニストであるナロナプリドの投与量は、健康な成人男性で、１日２回で８０ｍｇであった。したがって、１日１回又は複数回投与される本発明の組成物中のナロナプリドの例示投与量は、下記に限定されないが、約１０ｍｇ、約２０ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１９０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２１０ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２３０ｍｇ、約２４０ｍｇ、又は約２５０ｍｇである。
【００６５】
或る臨床試験において記載されている５−ＨＴ４受容体アゴニストであるベルセトラグの投与量は１日当たり１５ｍｇ〜５０ｍｇであった。したがって、１日１回又は複数回投与される本発明の組成物中のベルセトラグの例示投与量は、下記に限定されないが、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約２０ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１４０ｍｇ、又は約１５０ｍｇである。
【００６６】
５−ＨＴ４受容体アゴニストであるテガセロドの投与量は通常４週間〜６週間、１日２回で６ｍｇである。したがって、１日１回又は複数回投与される本発明の組成物中のテガセロドの例示投与量は、下記に限定されないが、約０．０１ｍｇ、約０．０２ｍｇ、約０．０３ｍｇ、約０．０４ｍｇ、約０．０５ｍｇ、約０．０６ｍｇ、約０．０７ｍｇ、約０．０８ｍｇ、約０．０９ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約１１ｍｇ、約１２ｍｇ、約１３ｍｇ、約１４ｍｇ、約１５ｍｇ、約１６ｍｇ、約１７ｍｇ、約１８ｍｇ、約１９ｍｇ、約２０ｍｇ、約２１ｍｇ、約２２ｍｇ、約２３ｍｇ、約２４ｍｇ、約２５ｍｇ、約２６ｍｇ、約２７ｍｇ、約２８ｍｇ、約２９ｍｇ、又は約３０ｍｇである。
【００６７】
５−ＨＴ４受容体アゴニストであるメトクロプラミドの投与量は１日当たり最大４回で１０ｍｇ〜１５ｍｇの範囲であり（胃食道逆流症における経口成人投与量）、４回に分けての投与で０．４ｍｇ／ｋｇ／日〜０．８ｍｇ／ｋｇ／日（経口、ＩＭ、ＩＶで胃食道逆流症の乳幼児及び子供）である。したがって、１日１回又は複数回投与される本発明の組成物中のメトクロプラミドの例示投与量は、下記に限定されないが、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約１１ｍｇ、約１２ｍｇ、約１３ｍｇ、約１４ｍｇ、約１５ｍｇ、約１６ｍｇ、約１７ｍｇ、約１８ｍｇ、約１９ｍｇ、約２０ｍｇ、約２１ｍｇ、約２２ｍｇ、約２３ｍｇ、約２４ｍｇ、約２５ｍｇ、約２６ｍｇ、約２７ｍｇ、約２８ｍｇ、約２９ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、又は約１００ｍｇである。
【００６８】
５−ＨＴ４受容体アゴニストであるシニタプリドの投与量は通常、成人に対し１日３回、経口で１ｍｇである。したがって、１日１回又は複数回投与される本発明の組成物中のシニタプリドの例示投与量は、下記に限定されないが、約０．０１ｍｇ、約０．０２ｍｇ、約０．０３ｍｇ、約０．０４ｍｇ、約０．０５ｍｇ、約０．０６ｍｇ、約０．０７ｍｇ、約０．０８ｍｇ、約０．０９ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇである。
【００６９】
ＰＤＥ４阻害剤は本発明の組成物において薬学的に許容される任意の投与量で使用することができる。投与量としては１日又は１回分の投与量が、下記に限定されないが、約５０ｍｃｇ、約１００ｍｃｇ、約２００ｍｃｇ、約３００ｍｃｇ、約４００ｍｃｇ、約５００ｍｃｇ、約６００ｍｃｇ、約７００ｍｃｇ、約８００ｍｃｇ、約９００ｍｃｇ、若しくは約１０００ｍｃｇ、又は約０．０１ｍｇ、約０．０２ｍｇ、約０．０３ｍｇ、約０．０４ｍｇ、約０．０５ｍｇ、約０．０６ｍｇ、約０．０７ｍｇ、約０．０８ｍｇ、約０．０９ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約１．１ｍｇ、約１．２ｍｇ、約１．３ｍｇ、約１．４ｍｇ、約１．５ｍｇ、約１．６ｍｇ、約１．７ｍｇ、約１．８ｍｇ、約１．９ｍｇ、約２．０ｍｇ、約２．１ｍｇ、約２．２ｍｇ、約２．３ｍｇ、約２．４ｍｇ、約２．５ｍｇ、約２．６ｍｇ、約２．７ｍｇ、約２．８ｍｇ、約２．９ｍｇ、約３．０ｍｇ、約３．１ｍｇ、約３．２ｍｇ、約３．３ｍｇ、約３．４ｍｇ、約３．５ｍｇ、約３．６ｍｇ、約３．７ｍｇ、約３．８ｍｇ、約３．９ｍｇ、若しくは約４．０ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約１６ｍｇ、約１７ｍｇ、約１８ｍｇ、約１９ｍｇ、約２０ｍｇ、約２１ｍｇ、約２２ｍｇ、約２３ｍｇ、約２４ｍｇ、約２５ｍｇ、約２６ｍｇ、約２７ｍｇ、約２８ｍｇ、約２９ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１１５ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１３５ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１４５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１５５ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１６５ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１７５ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１８５ｍｇ、約１９０ｍｇ、約１９５ｍｇ、約２００ｍｇ、約２０５ｍｇ、約２１０ｍｇ、約２１５ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２２５ｍｇ、約２３０ｍｇ、約２３５ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２４５ｍｇ若しくは約２５０ｍｇである。
【００７０】
ＰＤＥ４阻害剤であるロフルミラストはＣＯＰＤの治療用として現在承認されており、承認されている投与量は１日１回で５００マイクログラム（ｍｃｇ）である。したがって、１日１回又は複数回投与される本発明の組成物中のロフルミラストの例示投与量は、下記に限定されないが、約１００ｍｃｇ、約２００ｍｃｇ、約３００ｍｃｇ、約４００ｍｃｇ、約５００ｍｃｇ、約６００ｍｃｇ、約７００ｍｃｇ、約８００ｍｃｇ、約９００ｍｃｇ、又は約１０００ｍｃｇである。
【００７１】
ＰＤＥ４阻害剤であるドロタベリンの投与量は典型的には１日２回（成人）で４０ｍｇ〜８０ｍｇ、１日３回又は４回（１歳〜６歳の子供）で２０ｍｇ、及び１日２回（６歳を超える子供）で４０ｍｇである。したがって、１日１回又は複数回投与される本発明の組成物中のドロタベリンの例示投与量は、下記に限定されないが、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約１１ｍｇ、約１２ｍｇ、約１３ｍｇ、約１４ｍｇ、約１５ｍｇ、約１６ｍｇ、約１７ｍｇ、約１８ｍｇ、約１９ｍｇ、約２０ｍｇ、約２１ｍｇ、約２２ｍｇ、約２３ｍｇ、約２４ｍｇ、約２５ｍｇ、約２６ｍｇ、約２７ｍｇ、約２８ｍｇ、約２９ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１９０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２１０ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２３０ｍｇ、約２４０ｍｇ、又は約２５０ｍｇである。
【００７２】
本発明の例示的な実施形態は、５−ＨＴ４受容体アゴニストであるプルカロプリド、及びＰＤＥ４阻害剤であるロフルミラストの組合せである。
【００７３】
例えば、５−ＨＴ４受容体アゴニストであるプルカロプリド、及びＰＤＥ４阻害剤であるロフルミラストの組合せは、アセチルコリン放出の増加に関連する消化器障害の予防及び／又は治療に使用され得る。
【００７４】
本発明は、例えば、消化器障害、泌尿器障害、及び呼吸器障害等のアセチルコリン放出の増加が望まれる１又は複数の障害の予防及び／又は治療のための５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びＰＤＥ４阻害剤の組合せの使用を提供する。特に、末梢神経系においてアセチルコリン放出の増加が望まれる１又は複数の障害の予防及び／又は治療のための５−ＨＴ４受容体アゴニスト及び選択的ＰＤＥ４阻害剤の使用を提供する。
【００７５】
例示的な実施形態において、本発明は、アセチルコリン放出の増加が望まれる消化器障害の予防及び／又は治療のための５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びＰＤＥ４阻害剤の組合せの使用を提供する。
【００７６】
アセチルコリン放出の増加が望まれ得る消化器障害としては、過敏性腸症候群、慢性便秘、脊髄損傷又は骨盤隔膜不全によって引き起こされる便秘、腸アトニー、逆流性食道炎、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、バレット症候群、偽性腸イレウス、急性胃炎又は慢性胃炎、胃潰瘍又は十二指腸潰瘍、クローン病、非潰瘍性消化不良、胃不全麻痺、機能性消化不良、潰瘍性大腸炎、胃切除後症候群、術後消化機能不全、胃神経症によって引き起こされる胃排出遅延、及び不消化が挙げられ、特に胃不全麻痺、ＧＥＲＤ、過敏性腸症候群、便秘及び腸アトニーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
また、本発明は、アセチルコリン放出の増加が望まれる１又は複数の障害の予防及び／又は治療のための方法を提供し、該方法は、５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びＰＤＥ４阻害剤の組合せを、それを必要とする被験体に投与することを含む。上記５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びＰＤＥ４阻害剤は、それを必要とする患者に同時に投与されてもよく、順次投与されてもよく、又は別々に投与されてもよい。本発明による例示的な方法は、上述の治療薬、即ち、５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びＰＤＥ４阻害剤の各々を、同一の治療的処置プログラム又は投与計画の一部として投与することを含む。５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びＰＤＥ４阻害剤を、同時又は順次投与してもよい（５−ＨＴ４受容体アゴニスト又はＰＤＥ４阻害剤のいずれかで開始する）。
【００７８】
また、更なる態様において、本発明は、本発明による組合せ、本発明による組成物、又は胃平滑筋細胞及び／又は結腸平滑筋細胞を神経支配するコリン作動性ニューロンからのアセチルコリンの放出を刺激するための方法を提供し、該方法は、組合せ若しくは５−ＨＴ４受容体アゴニスト及びＰＤＥ４阻害剤を含む組成物に上記神経細胞を暴露することを含み、ここで、上記コリン作動性ニューロンが上記組合せ又は組成物に暴露された場合、上記コリン作動性ニューロンから放出されるアセチルコリンの量は、上記コリン作動性ニューロンが上記５−ＨＴ４受容体アゴニスト若しくはＰＤＥ４阻害剤のいずれかに単独で個別に暴露された場合よりも多い。
【００７９】
本発明の治療薬に対する暴露に際して放出されるアセチルコリンの量は、神経細胞が同一条件下にて、単独で同じ時に、同じ５−ＨＴ４受容体アゴニストのみ、又は同じＰＤＥ４阻害剤のみに暴露された後に放出されるアセチルコリンの量の約５パーセント、約１０パーセント、約１５パーセント、約２０パーセント、約２５パーセント、約３０パーセント、約３５パーセント、約４０パーセント、約４５パーセント、約５０パーセント、約６０パーセント、約７０パーセント、約８０パーセント、約９０パーセント、約１００パーセント、約１２５パーセント、約１５０パーセント、約１７５パーセント、約２００パーセント、約２５０パーセント、約３００パーセント、約５００パーセント、約７５０パーセント、及び約１０００パーセントと同等以上である。
【００８０】
本発明の更なる態様は、十分な量の本発明による組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、胃及び／又は結腸の運動性の欠如を治療する方法を提供することである。特に、十分な量の本発明による組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、胃運動性の欠如を治療する方法を提供する。
【００８１】
更なる実施形態において、本発明は、胃平滑筋細胞及び／又は結腸平滑筋細胞の収縮を選択的に刺激する方法を提供し、該方法は、上記平滑筋細胞を神経支配するコリン作動性ニューロンを、有効量の本発明による組合せ又は組成物に暴露し、実質的にｃＡＭＰ媒介平滑筋弛緩及び／又は心房筋収縮を生じることなく、上記コリン作動性ニューロンから上記細胞へアセチルコリンを放出して収縮を刺激することを含む。
【００８２】
また、本発明による組合せ及び組成物は、例えば、診断手技又は外科手技の前に結腸を空にすることが望まれる、患者の術前準備にも好適である。本発明による利益を受け得るその他の患者集団として、排便に伴ういきみを予防しなければならない患者が挙げられる。加えて、痔及び他の肛門直腸障害を有する患者の軟便を維持するために手術の前及び後の両方において、上記新規の組合せ又は該組合せを含む組成物を示してもよい。さらに、上記新規の組合せ又は該組合せを含む組成物を、腸から薬剤を除去することによる薬物過剰投与及び薬物中毒の治療に使用することもできる。
【００８３】
したがって、本発明のさらなる態様においては、胃平滑筋細胞収縮及び／又は結腸平滑筋細胞収縮を選択的に刺激する方法を提供し、該方法は、上記平滑筋細胞を神経支配するコリン作動性ニューロンを本明細書に記載される有効量の組合せ又は組成物に暴露し、実質的にｃＡＭＰ媒介平滑筋弛緩及び／又は心房筋収縮を生じることなく、上記コリン作動性ニューロンから上記細胞へアセチルコリンを放出して収縮を刺激することを含む。
【００８４】
本発明による組合せは、キットとして製剤化されてもよい。上記キットは、各コンパートメントが、少なくとも１種の５−ＨＴ４受容体アゴニスト又は少なくとも１種のＰＤＥ４阻害剤のいずれかを含む複数の剤形（例えば、錠剤）を収納する、分割されたボトル又は分割されたホイル包等の別々の組成物を収納するための容器を備えてもよい。或いは、活性成分を含有する剤形を分離するよりむしろ、上記キットは別々の組成物を含む全投与量を各々収納する別々のコンパートメントを備えてもよい。このタイプのキットの例として、個々のブリスターの各々が、５−ＨＴ４受容体アゴニストを含む１つの錠剤、ＰＤＥ４阻害剤を含む他の錠剤の２つの錠剤を収納するブリスター包装が挙げられる。典型的には、上記キットは、別々の成分の投与に関する指示書を備える。かかる指示書は、ｉ．上記成分が投与される剤形（例えば、経口及び非経口）、ｉｉ．いつ製品の成分を異なる投薬間隔で投与するのか、又はｉｉｉ．処方する内科医によって上記組合せの各成分の用量設定が望まれる場合、等の状況を対象とする。上記容器は、その内容物及び任意の適切な警告を記載するラベルを有する。本発明の組合せにより患者を治療する更なるその他の方法によれば、上記組合せ、又は該組合せを含む組成物は、例えば、指定された錠剤又はカプセルが摂取される投与計画の日数に対応する、錠剤又はカプセルの横の数字形式のメモリーエイドと共にキットに包装される。かかるメモリーエイドのその他の例として、例えば、「１週目、月曜日、火曜日、水曜日、木曜日、金曜日、土曜日及び日曜日。２週目、月曜日、火曜日、水曜日、木曜日、金曜日、土曜日及び日曜日」のようにカードに印刷されたカレンダーが挙げられる。メモリーエイドの他のバリエーションは容易に明らかであろう。
【００８５】
「１日量」は、所定の１日に摂取される単一の錠剤若しくはカプセル、又は幾つかのピル若しくはカプセルであってもよい。また、第１化合物の１日量は１つの錠剤又はカプセルからなってもよく、一方で第２化合物の１日量が幾つかの錠剤又はカプセルからなってもよく、或いはその逆であってもよい。メモリーエイドはこれを反映するものとする。
【００８６】
本発明は、以下の実験の詳細を参照することでより良く理解されるが、当業者であれば、それらが添付の特許請求の範囲においてより完全に説明される本発明の一例に過ぎないことを容易に認識するであろう。さらに、本願全体を通して様々な刊行物が引用される。これらの刊行物の開示は、本発明が関連する技術分野の現行の技術水準をより完全に説明するために、本願に引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【実施例】
【００８７】
パートＡ：胃輪走筋実験
実施例１：試験動物の準備
実施例５及び８における実験（ＰＤＥ阻害剤を使用しない実験）のため、地元の食肉処理場で解体された、およそ６カ月齢の健康な去勢オスブタから胃を入手した。胃を氷冷生理食塩水中にて実験室まで輸送した。
【００８８】
実施例６、７、９及び１０における実験（ＰＤＥ阻害剤を使用する実験）のため、およそ２カ月齢の雄の仔ブタ（３６系統、体重およそ２０ｋｇ）をRattlerow Seghers（ローケレン、ベルギー）から入手した。実験の日の朝にこれらの２カ月齢の仔ブタをＺｏｌｅｔｉｌ  １００（チレタミン２５０ｍｇ及びゾラゼパム２５０ｍｇを含有する）５ｍｌの筋肉内注射で麻酔した。瀉血の後、胃全体を解剖した。
【００８９】
平滑筋条片の調製のため、胃を小彎に沿って切開し、室温にて生理食塩水（ＰＳＳ）（ｍＭによる組成：Mandrek and Milenov［１９９１；ＰＳＳ  Ｉ］に記載される通り、ＮａＣｌ  １１２、ＫＣｌ  ４．７、ＭｇＣｌ２  １．２、ＫＨ２ＰＯ４  １．２、ＣａＣｌ２  ２．５、グルコース１１．５及びＮａＨＣＯ３  ２５；又はＮａＣｌ  １１８、ＫＣｌ  ４．６９、ＭｇＳＯ４  １．１８、ＫＨ２ＰＯ４  １．１８、ＣａＣｌ２  ２．５１、グルコース１１．１及びＮａＨＣＯ３  ２５［Krebs-Henseleit；ＰＳＳ  ＩＩ］）中に置いた。粘膜を除去した後：
輪走筋層方向に長さおよそ１．５ｃｍ及び幅０．３ｃｍの４条片〜最大１２条片の筋条片を近位胃から調製した；
大彎から小彎に向かって切断して腹側から６条片以下を入手した；
追加の条片を、これらの条片が部分的に腹側由来、また部分的に背側由来となるように、大彎を覆う輪走筋層方向に切断して同じレベルで調製した。
【００９０】
放出実験に使用する条片は、常に腹側から入手した。全ての条片を、調製の日に使用した。収縮性の測定による機能実験のため、条片を２ｇの荷重のもと、３７℃にて、
１０ｍｌのＰＳＳ  Ｉ（ＰＤＥ阻害剤を使用しない実験）、
５ｍｌのＰＳＳ  ＩＩ（ＩＢＭＸ以外のＰＤＥ阻害剤を使用する実験）、
７ｍｌのＰＳＳ  ＩＩ（ＩＢＭＸを使用する実験）、
を含有する古典的な臓器浴中の２枚の白金プレート電極間に固定し、カーボゲン（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２）で通気した（gassed）。調査の第１部においては、Ｇｒａｐｈｔｅｃ  ｌｉｎｅａｒｃｏｒｄｅｒ  Ｆ  ＷＲ３７０１上の１ｇ  ｃｍ−１スプリングと直列に連結されたＧｒａｓｓ力変位変換器ＦＴ０３を介して機械的活動を増負荷的に（auxotonically）記録した。調査の第２部においては、Ｃｈａｒｔソフトウェアを備えたＰｏｗｅｒＬａｂ／８  ｓｐデータ記録システム（ADInstruments）上のＧｒａｓｓ力変位変換器ＦＴ０３（ＩＢＭＸを用いる実験）又はADInstrumentsからのＭＬＴ０５０／Ｄ力変換器（他のＰＤＥ阻害剤を用いる実験）を介して、機械的活動を等尺的に（isometrically）記録した。
【００９１】
放出実験のため、コリン０．００１５ｍＭ及びアスコルビン酸０．０５７ｍＭも添加されたＰＳＳ  Ｉを含有する臓器浴２ｍｌ中で２ｇの荷重のもと、２本の白金ワイヤ電極間に条片を固定した。定電圧ユニットを備えたＧｒａｓｓ  Ｓ８８スティミュレーター又は４チャネルカスタムメイドスティミュレーターを用いて電場刺激を行った。
【００９２】
実施例２：胃筋肉のＥＦＳ誘発性収縮の調査に関する方法論
電気的に誘発される収縮を調査するＰＤＥ阻害剤を用いない全てのシリーズにおいて（実施例８）、ノルアドレナリン性応答及び一酸化炭素性応答をそれぞれ回避するために、ＰＳＳ  Ｉは、継続してグアネチジン４μＭ及びＮＧ−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）３００μＭを含有し、さらに、プロスタグランジンの放出による自発的な漸進性収縮（progressive contraction）を回避するためインドメタシン１０μＭを含有した。１５分毎のすすぎを伴う少なくとも１時間の平衡化の後、組織をカルバコール３μＭで収縮させ、条片の収縮応答性を試験した。その後、３０分間に亘り１０分毎にすすいだ。その後、電場刺激（ＥＦＳ）を、５分間隔で２回適用した（過最大電圧で１０秒トレイン、０．５ｍ秒及び４Ｈｚ）。これにより、再現可能な収縮を生じ、その後、過最大電圧（Ｖ５０％Ｃ）で得られるもののおよそ５０％の収縮幅を生じる電圧に到達するまで、電圧を低下させながら５分間隔で１０秒トレインのＥＦＳを適用した。その後、１０分毎にすすぎながらＥＦＳを３０分間停止した。その後、ＥＦＳを再開し、Ｖ５０％Ｃ、０．５ｍ秒及び４Ｈｚにて、安定化まで５分間隔で１０秒トレイン反復した。更に５トレインの後、プルカロプリド０．０３μＭ、０．１μＭ又は０．３μＭを３つの対応する組織に添加し、更に１０トレインを登録した。４つ目の組織は、プルカロプリドの溶媒を受けた（コントロール）。プルカロプリドの効果に対するアンタゴニストを試験するため、５トレインの後Ｖ５０％Ｃでアンタゴニストを添加した。その後、プルカロプリド０．３μＭを添加する前に、更に６トレインを得て、更に１０トレインを登録した。対応するコントロール条片は、アンタゴニストの溶媒を受けた。ＥＦＳ誘発性収縮の神経原性特性及びコリン作動性特性を判断するため、テトロドトキシン３μＭ及びアトロピン１μＭの影響をそれぞれ試験した。外因性アセチルコリンによって誘発された収縮に対するプルカロプリドの可能性のある影響を試験するため、１ｎＭからの濃度増加を上昇するハーフログ単位（half log unit）により、アセチルコリンに対する累積濃度応答曲線を構築した。１０分間隔で１時間に亘りすすいだ後、プルカロプリド０．０３μＭ、０．１μＭ又は０．３μＭを１５分間インキュベートし、アセチルコリンに対する濃度応答曲線を反復した。
【００９３】
ＰＤＥ阻害剤を用いる実験（実施例９及び１０）において、ＰＳＳ  ＩＩは継続的にＮＧ−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）１００μＭ及びインドメタシン１μＭを含有した。Ｖ５０％Ｃを決定するためのカルバコール及びＥＦＳを用いるプロトコルの最初の部分は、ＥＦＳのトレインを３分毎に投与したこと以外は上記の通りであった。Ｖ５０％Ｃ（０．５ｍ秒、４Ｈｚ、１０秒）においてＥＦＳが再開され、５つの安定した応答が得られた場合に２種類の実験を行った。
【００９４】
１．電気的に誘発された収縮の最大半量に対するＰＤＥ阻害剤ＩＢＭＸ、ビンポセチン、ＥＨＮＡ、シロスタミド及びロリプラムの影響を、５回目のトレインの後、濃度を上昇するハーフログ単位によるＰＤＥ阻害剤の添加を開始し、各濃度の添加後６トレインに対する応答を登録することにより調べた。シロスタミド１μＭを添加して１０トレインを登録し、その後ロリプラム１μＭを添加して更に２０トレインを登録することによって、シロスタミド及びロリプラムの影響を試験した。半分の組織において、投与の順番を逆にした。
【００９５】
２．プルカロプリドに対するＩＢＭＸ及びロリプラムの影響を以下の通り調べた。全部で３３〜３５のトレイン（１０秒、Ｖ５０％Ｃ、０．５ｍ秒、４Ｈｚ）を３分間隔で伝達した。５トレインの後、ＩＢＭＸ１μＭ、３μＭ又は１０μＭを投与し、１５トレインの後、プルカロプリド０．０１μＭを投与した。コントロール組織は、プルカロプリド又は溶媒のみを受けた。同様に、ロリプラム１μＭを５トレインの後に添加し、１５トレインの後、プルカロプリド０．０１μＭ、０．０３μＭ又は０．１μＭを添加した。少数の組織においては、プルカロプリドが既に得られている状況下で、２０トレイン後にロリプラムを添加した。
【００９６】
実施例３：ブタ胃筋肉を神経支配するコリン作動性ニューロンからのＥＦＳ誘発性アセチルコリン放出の分析に関する方法論
以前に記載の通り、同じ方法を使用した（Leclereand Lefebvre, 2001）。２ｍｌ／分でＰＳＳ  Ｉの潅流（Ｇｉｌｓｏｎ  Ｍｉｎｉｐｕｌｓ、フランス）によって１時間に亘って条片を平衡化し、継続的なＥＦＳ（４０Ｖ、１ｍ秒、０．５Ｈｚ）を少なくとも２０分間適用した。潅流を停止し、条片を継続的なＥＦＳ（４０Ｖ、１ｍ秒、２Ｈｚ）の下で［３Ｈ］−コリン（５μＣｉ  ｍｌ−１）と共に３０分間インキュベートした。ＥＦＳを停止し、その後、ここからはコリンの再取込みを防止するためのヘミコリニウム−３  １０μＭ、アセチルコリンの加水分解を防止するためのフィゾスチグミン１０μＭ及びアセチルコリン放出の自己抑制を防止するためのアトロピン１μＭも含有するＰＳＳ  Ｉで組織を９０分に亘って潅流（２ｍｌ／分）し、ゆるく結合した放射能を除去した。洗浄後、臓器浴を１ｍｌのＰＳＳで満たした。これを収集し、合計３７試料について３分間隔で置換した。条片に、洗浄期間終了の１３分後（試料５）及び７３分後（試料２５）に開始する、１５Ｖ、１ｍ秒及び４Ｈｚで２分間に亘る２度（Ｓ１及びＳ２）の刺激を行った。プルカロプリド（０．０３μＭ、０．１μＭ又は０．３μＭ）をＳ２の１５分前（試料２０）に添加した。
【００９７】
５−ＨＴ４受容体アゴニストＧＲ１１３８０８（１ｎＭ、１０ｎＭ又は１００ｎＭ）を、プルカロプリドの２１分前（試料１３）に添加することによって、プルカロプリド０．３μＭに対して試験した。上記調査の第２部において、試料１３以降から添加されたＩＢＭＸ１０μＭの影響を、試料２０以降から添加されたプルカロプリド０．０１μＭ又は０．０３μＭに対して試験した。同一のプロトコルで、ビンポセチン１０μＭ、ＥＨＮＡ１０μＭ、シロスタミド１μＭ及びロリプラム１μＭを、プルカロプリド０．０１μＭに対して試験した。実験の終了時に、上記組織をブロットし計量した。各試料について、０．５ｍｌを２ｍｌのシンチレーター含有溶液Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄ（Perkin Elmer、アメリカ合衆国）と混合した。全ての試料の放射能を液体シンチレーション計数法（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ  ２１００  ＴＲ、Packard Instrument Company、アメリカ合衆国）により測定した。外部標準化を使用して計数効率を補正した。
【００９８】
実施例４：データ収集
本実施例は、実施例１〜３において収集されたデータをどのように分析するかを要約する。収縮性調査において、処置前の５トレインのＥＦＳに対する平均収縮を１００％とし、治療存在下におけるＥＦＳによって誘発される収縮をこの参照値に関連させた。アセチルコリン放出調査において、ＥＦＳは、試料５（Ｓ１）及び２５（Ｓ２）のみならず、最大６つのその後の試料においてもトリチウム流出の増加を惹起した。刺激誘発性のトリチウム流出の増加を伴う期間の基礎トリチウム流出を、刺激直前の４試料及び刺激後に基礎値まで流出が戻ったところから開始する４つの値を通る回帰直線をフィッティングすることによって算出した。その後、トリチウム流出における刺激誘発性の増加を、流出の増加を伴う試料の上記値から基礎トリチウム流出を引くことにより決定した。その後、Ｓ２／Ｓ１比を算出した。
【００９９】
結果を、平均±ＳＥＭとして表し、ｎは異なる動物由来の組織を指す。対応する組織群において得られたデータを対応のないｔ検定（２群）によって比較し、又は２群を超える場合にはＡＮＯＶＡによって比較し、その後、多重比較のために補正されたｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔ検定（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）を行った。電気的に誘発された準最大収縮に対するＰＤＥ阻害剤の濃度増加の影響を、反復測定ＡＮＯＶＡにより評価した。０．０５未満のＰ値を有意とした。
【０１００】
実施例５：コリン作動性神経終末に対する５−ＨＴ４受容体活性化作用の影響
この実施例は、コリン作動性神経終末に対する５−ＨＴ４受容体活性化作用の影響を記載し、特にブタ胃輪走筋を神経支配するコリン作動性神経終末からの電気的に誘発されたアセチルコリン放出に対する５−ＨＴ４受容体活性化作用の効果において記載する。この実施例に関し、３Ｈ−アセチルコリンにおける変化は総トリチウムレベルにおける変化に対応することから（例えば、Leclere and Lefebvre, 2001を参照）、トリチウム流出をアセチルコリン放出のマーカーとした。
【０１０１】
ブタ胃筋条片におけるＥＦＳによるコリン作動性神経の刺激は、基礎を超えるトリチウム流出の明確な増加を生じた。２回目の刺激トレインによって誘発された応答は明白ではなく、Ｓ２／Ｓ１比０．７を生じた（表１）。ＥＦＳの前のプルカロプリド（０．０３μＭ、０．１μＭ及び０．３μＭ）とのインキュベーションは、基礎流出に影響を及ぼさなかったが、２回目の刺激トレインによって誘発されたトリチウム流出を顕著に増大し、プルカロプリド０．３μＭについてＳ２／Ｓ１比１．０５のＳ２／Ｓ１比の濃度依存的増加をもたらした（表１）。追加のシリーズにおいて、プルカロプリド１μＭの影響を試験したが、これはプルカロプリド０．３μＭよりも著しい効果を誘発することはなかった（Ｓ２／Ｓ１比：コントロールに関し０．７４±０．０５，ｎ＝５；プルカロプリド１μＭに関し１．０４±０．０５，ｎ＝６；Ｐ＜０．０１）。
【０１０２】
表１  プルカロプリドとのインキュベーション後の総放射能のＥＦＳ誘発性流出
【表１】
2014525927.tif 000004
【０１０３】
総放射能（トリチウム）をｄｐｍ  ｇ−１組織により表す。Ｓ１及びＳ２について、それぞれ、試料５（Ｓ１）及び試料２５（Ｓ２）におけるベースラインを超える放射能の合計、及びベースラインを超える値を有する以下の試料を提示する。ｎ＝５〜６組織の平均±ＳＥＭを提示する。＊Ｐ＜０．０５対プルカロプリドを含まないコントロール。
【０１０４】
５−ＨＴ４受容体アンタゴニストＧＲ１１３８０８（１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ）は、基礎トリチウム流出に影響を及ぼさなかったが、プルカロプリド０．３μＭの促進効果を濃度依存的に拮抗し、ＥＦＳ誘発性アセチルコリン放出に対するプルカロプリドの効果は５−ＨＴ４受容体により媒介されていることを示している（表２）。
【０１０５】
表２  ＧＲ１１３８０８に続くプルカロプリドとのインキュベーションの後の総放射能のＥＦＳ誘発性流出
【表２】
2014525927.tif 000005
【０１０６】
総放射能（トリチウム）をｄｐｍ  ｇ−１組織により表す。Ｓ１及びＳ２について、それぞれ、試料５（Ｓ１）及び試料２５（Ｓ２）におけるベースラインを超える放射能の合計、及びベースラインを超える値を有する以下の試料を提示する。ｎ＝５〜６組織の平均±ＳＥＭを提示する。＃＃Ｐ＜０．０１対プルカロプリド前にＧＲ１１３８０８を添加しないコントロール。
【０１０７】
実施例６：コリン作動性神経終末に対する５−ＨＴ４受容体アゴニストの効果への非選択的ＰＤＥ阻害剤の影響
非選択的ＰＤＥ阻害剤ＩＢＭＸ（１０μＭ）の影響を、アセチルコリン放出に対して最低有効濃度のプルカロプリド０．０１μＭに対して試験した。実際には、プルカロプリド０．０１μＭは、コントロール組織に対してＥＦＳ誘発性トリチウム流出を有意に増加せず、Ｓ２／Ｓ１比は、プルカロプリド０．０１μＭがＳ２の前に与えられた組織（０．６８±０．０４；ｎ＝６）と、コントロール組織（０．５９±０．０１；ｎ＝６）との間で有意に異ならなかった（図１Ａ）。ＩＢＭＸ（１０μＭ）自体は、基礎に影響することもなく、ＥＦＳ誘発性トリチウム流出にも影響しなかった（図１Ａ）。しかしながら、ＩＢＭＸがプルカロプリド（０．０１μＭ）より前に与えられた場合、ＥＦＳ誘発性トリチウム流出において明確で有意な増加が得られた（図１Ａ）。
【０１０８】
第２シリーズにおいて、プルカロプリド０．０３μＭ単独でＥＦＳ誘発性トリチウム流出を増強した（図１Ｂ）。さらに、ＩＢＭＸ（１０μＭ）単独では、ＥＦＳ誘発性トリチウム流出に有意に影響しなかったが、プルカロプリドの前のＩＭＢＸの投与は、プルカロプリド単独に比べてトリチウム流出を有意に増加した（図１Ｂ）。
【０１０９】
実施例７：アセチルコリン放出に対する５−ＨＴ４受容体アゴニストの効果への選択的ＰＤＥ阻害剤の影響
７Ａ：アセチルコリン放出に対するプルカロプリドの効果への複数の選択的ＰＤＥ阻害剤の影響
本実施例において、複数の特異的ＰＤＥ阻害剤を用いて、どのＰＤＥが観察されたプルカロプリドのアセチルコリン放出に対する促進効果を担っているのかを特定した。
【０１１０】
ＰＤＥ２阻害剤ＥＨＮＡ（１０μＭ）は、基礎にもＥＦＳ誘発性トリチウム流出にも影響を及ぼさなかった。また、プルカロプリド０．０１μＭと組み合わせて投与した場合にも、プルカロプリド単独に起因するトリチウム流出と比較して、トリチウム流出を増加しなかった（コントロール組織におけるＳ２／Ｓ１比：０．５３±０．０２；ＥＨＮＡ１０μＭを使用：０．５１±０．０５；プルカロプリド０．０１μＭを使用：０．６３±０．０４；ＥＨＮＡ及びプルカロプリドを使用：０．５８±０．０３；ｎ＝４〜６）。
【０１１１】
Ｓ２の前に、プルカロプリド０．０１μＭを単独で添加するか、又はプルカロプリド０．０１μＭに先立ってＰＤＥ１阻害剤ビンポセチン（１０μＭ）、ＰＤＥ３阻害剤シロスタミド（１μＭ）又はＰＤＥ４阻害剤ロリプラム（１μＭ）を添加する、小規模な実験シリーズを実施した。これらのＰＤＥ阻害剤はいずれも単独では基礎トリチウム流出に影響を及ぼさなかった。しかしながら、ＰＤＥ４阻害剤ロリプラム及びプルカロプリドの組合せ（Ｓ２／Ｓ１比（０．９８±０．０２））は、ＥＦＳ誘発性トリチウム流出を、プルカロプリド単独の存在下でのそれ（０．７０±０．０３；ｎ＝４）に対して有意に増大した（Ｐ＜０．０１）。対照的に、ＰＤＥ１阻害剤ビンポセチン及びプルカロプリドの組合せ（０．６４±０．０５；ｎ＝４）又はＰＤＥ３阻害剤シロスタミド及びプルカロプリドの組合せ（０．６９±０．０６；ｎ＝４）のいずれもが、プルカロプリド単独（０．７０±０．０３；ｎ＝４）と比べた場合、ＥＦＳ誘発性トリチウム流出を顕著に増加しなかった。
【０１１２】
５−ＨＴ４アゴニスト及びＰＤＥ４阻害剤間の相乗作用を更に確認するため、特異的ＰＤＥ４阻害剤ロリプラムを用いる追加の実験シリーズも実施した。ロリプラム（１μＭ）は単独でＳ２／Ｓ１比を増加したが、これはコントロールと比較して有意ではなかった（図２）。対照的に、ロリプラム及びプルカロプリド０．０１μＭの組合せ（０．９８±０．０７；ｎ＝６）は、プルカロプリド単独（０．６５±０．０３；ｎ＝６）と比較して有意にトリチウム流出を増加し（図２）、非選択的ＰＤＥ阻害剤ＩＢＭＸ及びプルカロプリド０．０１μＭの組合せを使用した場合と同様の結果を生じた（図１Ａ）。
【０１１３】
本発明者らのデータは、プルカロプリドと組み合わされた特異的ＰＤＥ４阻害剤ロリプラムは、ＩＢＭＸ及びプルカロプリドの組合せについて観察されたものと同様に、ＥＦＳ誘発性トリチウム流出を顕著に増加したことを示している。
【０１１４】
７Ｂ：コリン性アセチルコリン放出に対するプルカロプリド（５−ＨＴ４受容体アゴニスト）の効果へのロフルミラスト（ＰＤＥ４阻害剤）の影響
他の選択的ＰＤＥ４阻害剤によって同様の観察がなされるかどうかを更に詳しく説明するため、本発明者らは、同様の設定においてプルカロプリドの効果へのロフルミラストの影響を更に調査した。
【０１１５】
試料１３以降から添加されたロフルミラスト０．３μＭの影響を、それ自身又は試料２０以降から添加されたプルカロプリド０．０１μＭに対して試験した。対応する組織において、ロフルミラストの溶媒（０．１％ＤＭＳＯ）を試験した。電気刺激は、刺激を伴う試料及び次の２つの試料におけるトリチウム流出の増加を誘発した（Ｓ１について試料５、６及び７、Ｓ２について試料２５、２６及び２７）。
【０１１６】
平均Ｓ２／Ｓ１比を図１Ｃに示す。プルカロプリド（０．０１μＭ）及びロフルミラスト（０．３μＭ）は両方とも、コントロール組織と比較して、ＥＦＳ誘発性トリチウム流出に対して穏やかで顕著な効果を惹起した。コントロール条片についての０．６２±０．０２（ｎ＝６）に対し、Ｓ２の１５分前に添加されたプルカロプリドに関するＳ２／Ｓ１比は０．８５±０．０５（ｎ＝６）であり、Ｓ２の３６分前に添加されたロフルミラストに関するものは０．８５±０．０２（ｎ＝６）であった。
【０１１７】
ロフルミラスト（０．３μＭ）をプルカロプリド（０．０１μＭ）の前に投与した場合、プルカロプリド単独又はロフルミラスト単独の存在下でのＥＦＳ誘発性トリチウム流出に対して、明確で顕著なＥＦＳ誘発性トリチウム流出の増加が得られた（Ｓ２／Ｓ１比１．２２±０．０９，ｎ＝６）。
【０１１８】
７Ｃ：アセチルコリン放出に対するベルセトラグ（５−ＨＴ４受容体アゴニスト）の効果へのロリプラム（ＰＤＥ４阻害剤）の影響
上述の調査は、他の選択的ＰＤＥ４阻害剤によっても同様の観察が行われ得ることを実際に示しており、他の５−ＨＴ４受容体アゴニストを使用しても同様の観察がされ得るのかどうかも特定した。したがって、この更なる調査において、上記実施例７Ａに関する同様の設定において、その他の５−ＨＴ４受容体アゴニストを使用した。
【０１１９】
試料１３以降から添加された１μＭのＰＤＥ４阻害剤ロリプラムの影響を、それ自身、又はベルセトラグ０．０１μＭに対して試験した。ロリプラムの溶媒（０．０１％ＤＭＳＯ）及びベルセトラグ（０．１％ＤＭＳＯ）を考慮した。
【０１２０】
平均Ｓ２／Ｓ１比を図１Ｄに示す。ロリプラムの影響を、５ＨＴ４受容体アゴニストベルセトラグに対して試験した。Ｓ２の１５分前に添加されたベルセトラグ（０．０１μΜ；Ｓ２／Ｓ１比０．７±０．０３，ｎ＝６）は、コントロール組織に対し、ＥＦＳ誘発性トリチウム流出に対して最低限の効果を示した（Ｓ２／Ｓ１比０．６±０．０２，ｎ＝７）。
【０１２１】
Ｓ２の３６分前に添加されたロリプラム（１μＭ）は、ＥＦＳ誘発トリチウム流出を顕著に増加した（Ｓ２／Ｓ１：０．８２±０．０３，ｎ＝７）。ロリプラム及びベルセトラグの存在下において、総放射能流出のＳ２／Ｓ１比（１．１７±０．０６，ｎ＝７）は、ベルセトラグ単独又はロリプラム単独の存在下でのそれに比べて顕著に増大した。
【０１２２】
実施例８：胃輪走筋のＥＦＳ誘発性準最大コリン性収縮に対する５−ＨＴ４受容体活性化作用の効果
ブタ近位胃のコントロール輪走筋条片は、自発的な位相性活性を示さず、基礎緊張は実験の経過を通して一定であった。ＥＦＳ誘発に際し、Ｖ５０％Ｃにおける収縮は、実験の開始時にカルバコール３μＭによって誘発された振幅６７±１０％（ｎ＝６）に到達した。これらの収縮は、テトロドトキシン３μＭ（ｎ＝４）及びアトロピン１μＭ（ｎ＝４）によってそれぞれ消失したことから、神経原性及びコリン作動性であった。反復刺激に際し、コントロール組織におけるＶ５０％ＣでのＥＦＳ誘発性収縮の振幅も安定していた。１５回目の刺激トレインによる収縮の振幅は、トレイン１〜５；ｎ＝６に対する平均応答の１００±５％であった。
【０１２３】
５−ＨＴ４受容体アゴニストプルカロプリドとのインキュベーションは、条片の基礎緊張に影響しなかったが、ＥＦＳ誘発性収縮の振幅を次第に増大し（図３）、その存在下での５回目の刺激トレインで所定の濃度に対する最大効果に接近した。プルカロプリドの促進効果は、調査された濃度範囲について濃度依存的であった（０．０３μＭ、０．１μＭ又は０．３μＭ；図４）。
【０１２４】
５−ＨＴ４受容体アゴニストＧＲ１１３８０８（１ｎＭ、１０ｎＭ及び１００ｎＭ）自身は、ＥＦＳ誘発性収縮に影響しなかったが、プルカロプリド０．３μＭの促進効果を濃度依存的に阻害し、プルカロプリドの効果は５−ＨＴ４受容体の活性化により媒介されていることを示している。
【０１２５】
結論として、プルカロプリドは、ＥＦＳ誘発性コリン性収縮の振幅を次第に増強し、該促進効果は５−ＨＴ４受容体アンタゴニストＧＲ１１３８０８の存在下において減弱することから、プルカロプリドによる電気的に誘発された筋肉収縮の調節が５−ＨＴ４受容体を介するアセチルコリン放出に対するプルカロプリドの効果に起因することを示している。
【０１２６】
実施例９：胃輪走筋のＥＦＳ誘発性準最大コリン性収縮に対するＰＤＥ阻害剤の影響
医薬品に関連する共通の問題は、望ましくない副作用を生じる複数の経路及び／又は組織種に対する影響である。例えば、ＰＤＥの非選択的阻害（ＩＢＭＸ）又はＰＤＥ３の選択的阻害（シロスタミド）と５−ＨＴ４刺激の併用は、ＰＤＥ４の選択的阻害（ロリプラム）との併用の有無にかかわらず、心筋梗塞後の心臓に由来する乳頭筋に対する５−ＨＴ４刺激の直接的な変力性効果を増加することが示されている（Afzal et al.，2008）。明らかなように、５−ＨＴ４受容体活性化の運動促進性効果を増加する有効な方法を提供しようとする試みにおいて、アセチルコリン放出の増加に関連しない筋肉組織に対する付加的で直接的な影響を有することは望ましくない。
【０１２７】
胃腸平滑筋において、ｃＡＭＰ等の環状ヌクレオチドは、弛緩に必須のメディエーターであり、それらの細胞内濃度はＰＤＥによって調節されている。非選択的ＰＤＥ阻害剤ＩＢＭＸは、筋肉レベルにおいて放出されたアセチルコリンを機能的に拮抗することによって（アセチルコリンによって誘発された収縮は、平滑筋細胞におけるｃＡＭＰレベルの増加によって誘発される弛緩により相殺される）、３μＭ以上でＥＦＳ誘発性コリン性収縮幅の濃度依存的減少を誘発した。ＩＢＭＸ３０μＭの存在下において、収縮はほぼ消滅した（図５Ｂ）。選択的ＰＤＥ阻害剤は、いずれもＩＢＭＸの効果を模倣することができなかった。ＰＤＥ１阻害剤ビンポセチン（０．０１μＭ〜１０μＭ）及びＰＤＥ２阻害剤ＥＨＮＡ（１μＭ〜３０μＭ）も、ＰＤＥ４阻害剤ロリプラム（１μＭ〜３０μＭ；図５Ｄ）も準最大コリン性収縮に有意に影響しなかった（各薬剤についてｎ＝６；データは示していない）。ＰＤＥ３阻害剤シロスタミド（０．０１〜１０μＭ）は０．１μＭ以上で収縮を減少したが、得られた最大抑制（maximal depression）はＩＢＭＸによるものよりもかなり小さかった（シロスタミド３μＭによる６８±１１％までの低下；図５Ｃ）。
【０１２８】
ＰＤＥ４阻害剤ロリプラム（１μＭ）の後のＰＤＥ３阻害剤シロスタミド（１μＭ）の逐次添加は、電気的に誘発された収縮を実質的に排除した（図６Ａ）。ロリプラム及びシロスタミドが併存する場合、１０回目の刺激トレインに対する応答は、ＰＤＥ阻害剤を添加する前の応答の１３±１％（ｎ＝４）に達したに過ぎなかった。また、投与の順序を逆にした場合でも、電気的に誘発された収縮は実質的に排除された。最初のシロスタミド１μＭの添加の後、その存在下での１０回目の刺激トレインにおいて、収縮は５９±１３％まで減少した。ロリプラム１μＭを更に添加した場合、それらの併存下において１０回目の刺激トレインで、収縮は１０±５％まで更に減少した。
【０１２９】
結論として、選択的ＰＤＥ阻害剤は、いずれも単独では、非選択的ＰＤＥ阻害剤ＩＢＭＸと同一レベルまで電気的に誘発された収縮を実質的に排除することはできない。ＰＤＥ３阻害剤及びＰＤＥ４阻害剤の逐次的な添加のみが、ＩＢＭＸと比較して同様の効果を得た。これは、ＰＤＥ３及びＰＤＥ４の両方が、ブタ胃輪状筋の平滑筋細胞におけるｃＡＭＰの濃度の調節に関与し、ＰＤＥ３及びＰＤＥ４の同時阻害が胃輪走筋のＥＦＳ誘発性コリン性収縮に対する阻害効果を得るために必要であることを示している。これらのデータは、ＰＤＥ４阻害剤は、ＰＤＥ３と併用されない場合、筋肉収縮に対する有害効果を有さないことを示している。
【０１３０】
実施例１０：胃輪走筋のＥＦＳ誘発性準最大コリン性収縮に対するプルカロプリドの効果へのＰＤＥ阻害剤の影響
他の実施例に示されるように（図５Ｂを参照）、仔ブタの胃輪走筋条片において、ＩＢＭＸ（１μＭ及び３μＭ）は、濃度依存的にＥＦＳ誘発性収縮を減少した（最大８４±２％まで、ｎ＝６、ＩＢＭＸ３μＭの存在下）。したがって、プルカロプリドの効果を判断するため、プルカロプリド存在下でのＥＦＳ誘発性収縮を、プルカロプリドを添加する直前のＩＢＭＸ存在下での最後の５回のＥＦＳ誘発性収縮の平均の％として表す（図７）。これは、プルカロプリド単独に比べて、ＩＢＭＸ３μＭによるプルカロプリドの促進効果の有意な増強を示した（図７）。追加のシリーズにおいて、ＩＢＭＸ１０μＭの影響を調査した。ＩＢＭＸ１０μＭの存在下で添加された場合、上記増強はプルカロプリド単独の場合よりもより顕著であるが、これは有意には達しない（データは示していない）。これらのデータは、非特異的ＰＤＥ阻害剤が、ＥＦＳ誘発性コリン性収縮（即ち、胃筋肉細胞のコリン性収縮）に対するプルカロプリドの促進効果を増強することを示している。ＰＤＥ４の特異的阻害が、コリン作動性ニューロン終末からのアセチルコリン放出に対するプルカロプリドの促進効果を相乗的に増強する以前の実験の結果に基づいて（図２を参照）、本発明者らは、ＰＤＥ４阻害がＩＢＭＸによるＥＦＳ誘発性収縮に対するプルカロプリドの促進効果の増強を担っているのかどうかを更に試験した。
【０１３１】
プルカロプリド０．０１μＭ、０．０３μＭ及び０．１μＭに対して、ロリプラム（１μＭ）を試験した（図８）。このシリーズにおいて、ロリプラムの存在下での１０回目の刺激トレインに対する平均収縮応答は、その投与前の応答に比べて、下記まで増加した：
１１４±８％（ｎ＝８）プルカロプリド０．０１μΜの前（図８Ａ）
１１５±８％（ｎ＝８）プルカロプリド０．０３μΜの前（図８Ｂ）
１２２±９％（ｎ＝８）プルカロプリド０．１μΜの前（図８Ｃ）
【０１３２】
これは、幾つかの組織におけるロリプラムの存在下での刺激に対する応答の増加によるものである。例えば、プルカロプリド０．０３μＭが添加されようとする組織において、ロリプラムの存在下での１０回目の刺激に対する個々の収縮応答は、９６％、１１１％、１３７％、１５５％、９３％、１０２％、１０１％及び１２８％であった。
【０１３３】
プルカロプリド単独では、電気的に誘発された収縮を下記まで増加した：
１６２±１１％（ｎ＝７；０．０１μΜ；図８Ａ）
１７１±１５％（ｎ＝８；０．０３μΜ；図８Ｂ）
２０６±１０％（ｎ＝７；０．１μΜ；図８Ｃ）
【０１３４】
プルカロプリドの前にロリプラムが添加された場合、上記組合せの促進効果は電気的に誘発された収縮を下記まで増加した：
１８１±７％（ｎ＝８：０．０１μΜ）−図８Ａ
２０６±２４％（ｎ＝８；０．０３μΜ）−図８Ｂ
２４３±２３％（ｎ＝８；０．１μΜ）−図８Ｃ
【０１３５】
結論として、胃輪状筋のＥＦＳ誘発性準最大コリン性収縮のレベルにおいても、特異的ＰＤＥ４阻害剤は、非特異的ＰＤＥ阻害剤ＩＢＭＸの挙動を模倣する。しかしながら、特異的ＰＤＥ４阻害剤と異なり、非特異的ＰＤＥ阻害剤ＩＢＭＸは、胃筋肉収縮に対して望ましくない阻害効果を有する（図５Ｂを参照）。
【０１３６】
本発明者らは、ここに、ＰＤＥ４の特異的阻害と組み合わせた場合に、コリン性アセチルコリン放出及びコリン性胃筋肉収縮に対するプルカロプリドの促進効果の相乗的な結果を明確に示す。さらに、ＰＤＥ４阻害剤自身が胃輪走筋を含む平滑輪走筋に対して阻害効果を有していないことから、ＰＤＥ４阻害と５−ＨＴ４受容体活性化作用の組合せは、ＰＤＥ４阻害剤と併用する場合に、コリン性神経伝達及びアセチルコリン放出を特異的に標的とすることによるプルカロプリドの促進効果を相乗的に増強する手段である。
【０１３７】
パートＢ：結腸輪走筋実験
本調査のこの部分は、試験動物の結腸の平滑筋条片を使用する結腸組織に関する結果を示す。
【０１３８】
実施例１１：試験動物の結腸の平滑筋条片の調製
若い雄ブタ（１０週齢〜１２週齢、１５ｋｇ〜２５ｋｇ、育種系統３６）をRattlerow Seghers、ベルギーから入手した。実験の日の朝、ブタをＺｏｌｅｔｉｌ  １００（チレタミン５０ｍｇ／ｍｌ及びゾラゼパム５０ｍｇ／ｍｌを含有する；Virbac Belgium S.A.、ベルギー）５ｍｌの筋肉内注射によって麻酔した。瀉血の後、下行結腸を肛門の１０ｃｍ上から横行結腸まで切り出し（prelevated）、通気した（５％ＣＯ２／９５％Ｏ２）Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液（ｍＭによる組成：グルコース１１．１；ＮａＨＣＯ３  ２５、ＫＨＰＯ４  １．１８、ＣａＣｌ２  ２．５１、ＭｇＳＯ４  １．１８、ＫＣｌ  ４．６９、ＮａＣｌ  １１８）中に置いた。
【０１３９】
平滑筋条片の調製のため、下行結腸を腸間膜縁に沿って開き、粘膜の除去後、８つの全層輪走筋条片（およそ３×２０ｍｍ）を、遠心端の上２ｃｍから開始する同一のレベルにおいて一対調製した。上記条片を、臓器浴１０ｍｌ中で２ｇの荷重の下、２枚の白金プレート電極間に固定し、４チャネルカスタムメイドスティミュレーターを用いて行われる電場刺激（ＥＦＳ）を可能とした。
【０１４０】
実施例１２：結腸筋の電気的に誘発された収縮の調査に関する方法論
臓器浴中の通気した（５％ＣＯ２／９５％Ｏ２）Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液（実施例１１を参照）は、ノルアドレナリン性応答及び一酸化炭素性応答をそれぞれ回避するため、４μＭのノルアドレナリン作動性ニューロン遮断剤グアネチジン、及び０．３ｍＭのＮＯシンターゼ阻害剤Ｎ−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステルヒドロクロリド（Ｌ−ＮＡＭＥ）を計画的に含有した。
【０１４１】
１５分毎のＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液の交換による６０分の安定化の後、条片をムスカリン受容体アゴニストであるカルバコール（３μＭ）で収縮させた。この手法を２０分の洗浄期間を間に挟んで繰り返した。２度目のカルバコール投与及び洗浄期間の後、小コンダクタンスカルシウム依存性ナトリウムチャネルブロッカーであるアパミン（０．５μＭ）及びタキキニン受容体アンタゴニスト（ＮＫ１；ＦＫ８８８  １０μＭ；ＮＫ２、ＭＥＮ１０６２７  １μＭ；ＮＫ３、ＳＢ２２２２００  ０．３μＭ）の組合せを添加し、最初の電気刺激の前に３０分間インキュベートした。本発明者らは、以前に、グアネチジン、Ｌ−ＮＡＭＥ及びアパミンをも含有する培地へのタキキニン受容体アンタゴニストの添加によって、ＥＦＳによる再現可能なコリン性収縮を得ることができることを示した（Priem and Lefebvre, 2011）。
【０１４２】
その後、条片を過最大電圧（３５Ｖ）（１０秒トレイン；０．２５ｍ秒パルス幅；周波数４Ｈｚ）において５分間隔で１時間に亘り刺激した（１２刺激）。１時間後、ＥＦＳを停止し、筋条片をすすいでアパミン（０．５μＭ）及びタキキニン受容体アンタゴニストの組合せを再度添加し、次の刺激前に３０分間インキュベートした。その後、ＥＦＳ（１０秒；０．２５ｍ秒；４Ｈｚ）を、初期電圧１５Ｖにおいて５分間隔で適用した。３５Ｖで惹起される収縮力のおよそ５０％（Ｖ５０％）まで収縮力を減少するために電圧を更に調整し、Ｖ５０％において５回の再現可能な収縮が得られるまでＥＦＳを繰り返した。その後、実施例１２及び１３に記載されるプロトコルを開始した。時間コントロールにおけるＥＦＳ誘発性準最大収縮が実験の間に２５％を超えて減少する実験は考慮に入れなかった（１４／４８）。
【０１４３】
等尺性張力の変化を、ＭＬＴ  ０５０／Ｄ力変換器（ADInstruments、英国）を使用して測定し、Ｃｈａｒｔ  ｖ５．５．６ソフトウェアを備えたＰｏｗｅｒＬａｂ／８ｓｐデータ記録システム（ADInstruments、英国）に記録した。
【０１４４】
得られたデータを以下の通り分析した。物質（１、２、３、４、５等）を添加する直前の再現可能な収縮を伴うＶ５０％における５回の連続刺激から開始して、刺激トレインに番号を付与した。これらの５回の刺激に対する平均収縮応答を、以下の全ての応答について１００％参照とした。
【０１４５】
結果を平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表し、ｎは別途指示がなければ異なる動物由来の組織を指す。統計学的解析を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ．５．０１  （サンディエゴ、アメリカ合衆国）を使用して行った。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意とした。ＰＤＥ阻害剤を累積的に添加した場合、各濃度の存在下における最後の収縮を反復測定ＡＮＯＶＡの後のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正ｔ検定によって参照と比較した。プルカロプリドがＰＤＥ阻害剤の後に添加される実験において、プルカロプリドの添加後の２回目の刺激に相当する刺激１３によって誘発される応答を、時間コントロール（プルカロプリドを単独で含む組織及びＰＤＥ阻害剤を添加した後のプルカロプリドの添加を伴う組織）の間で、ＯＮＥ−ＷＡＹ  ＡＮＯＶＡの後のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正ｔ検定により比較した。上記実験において、ロリプラムがプルカロプリドの後に添加される場合、刺激７（即ち、プルカロプリド添加後の２回目の刺激）に対する応答を、対応のあるｔ検定によって刺激３〜５に対する平均応答と比較した。同様に、刺激１９（即ち、ロリプラムの添加後の２回目の刺激）による応答を、刺激１５〜１７に対する平均応答と比較した。
【０１４６】
実施例１３：ＥＦＳ誘発性の結腸輪走筋の準最大コリン性収縮に対するＰＤＥ阻害剤自体の影響
非選択的ＰＤＥ阻害剤３−イソブチル−１−メチル−キサンチン（ＩＢＭＸ）及び選択的ＰＤＥ阻害剤ビンポセチン（ＰＤＥ１阻害剤）、ＥＨＮＡ（ＰＤＥ２阻害剤）、シロスタミド（ＰＤＥ３阻害剤）、ロリプラム（ＰＤＥ４阻害剤）及びザプリナスト（ＰＤＥ５阻害剤）の影響を、ＥＦＳにより惹起される準最大（Ｖ５０％）コリン性収縮に対して試験した。濃度を増加するハーフログ単位で種々のＰＤＥ阻害剤を添加し、Ｖ５０％での５回の再現可能な収縮が得られた後に開始し、そして各濃度を添加した後の６トレイン（３０分）に対する応答を記録することによって、種々のＰＤＥ阻害剤に関する累積濃度応答曲線を得た。ロリプラムの累積濃度応答曲線と同様に、３匹の動物における１組織当たりに単一の濃度を添加することによって分離された濃度応答曲線を得た。コントロール組織は、何らの溶媒もＰＤＥ阻害剤も受けなかった。溶媒ＤＭＳＯ及びエタノールを、対応するＰＤＥ阻害剤の累積濃度シリーズに関するマッチング希釈において、それらを累積的に添加することによって別々に試験した。
【０１４７】
図９Ａに示されるコントロール組織において、過最大電圧（３５Ｖ）でのＥＦＳによる収縮応答は、実験開始時のカルバコール３μＭによって誘発されるものの４３±５％（ｎ＝７；６動物）であった。一旦刺激電圧がＶ５０％まで低下されると、これらのコントロール組織におけるＥＦＳ誘発性収縮は、３５Ｖの過最大電圧において誘発されるものの５２±３％（ｎ＝７；６動物）の振幅に到達した。コントロール組織において、Ｖ５０％におけるＥＦＳによる収縮応答幅は反復刺激に対して安定であった（最後の刺激における収縮幅は、刺激トレイン１〜５に対する平均応答の９４±６％であった（ｎ＝７；６動物））。
【０１４８】
ブタ下行結腸の輪走筋において、２つのＰＤＥ阻害剤は濃度依存的にＥＦＳ誘発性コリン性収縮を阻害した：ＩＢＭＸ（図９Ｂ）及びＰＤＥ３選択的阻害剤シロスタミド（図９Ｅ）。ＩＢＭＸがその濃度依存的効果（１μＭ〜３０μＭ）を示した濃度範囲は、この非選択的ＰＤＥ阻害剤のＩＣ５０範囲に相当する（２μＭ〜５０μＭ；Beavo and Reifsnyder, 1990）。ＰＤＥサブタイプ選択的阻害剤のいずれも（図９Ｃ〜Ｆ）は、シロスタミド以外にＩＢＭＸの阻害効果を模倣せず（図９Ｅ）、ＩＢＭＸよりも約１００倍強力であった。ＰＤＥ３におけるシロスタミドについて報告されているＩＣ５０値は、０．００５μＭ及び０．０６４μＭを含む（Elks and Manganiello, 1984；Beavo and Reifsnyder,1990）。この濃度範囲（０．０３μＭ）においてシロスタミドは、既にＥＦＳ誘発性コリン性収縮を７５％まで阻害した。
【０１４９】
これらの結果は、ＥＦＳ誘発性コリン性収縮に対する阻害効果によって示されるように、ＰＤＥ３が下行結腸輪走筋の環状ヌクレオチドレベルの制御における鍵であり、ＰＤＥ３阻害剤の使用が筋肉収縮に対して相殺効果を有することを説明している。これに対し、胃筋肉、また結腸筋肉に関する観察による類推から、ＰＤＥ４阻害剤は胃腸平滑筋の弛緩を引き起こさない。
【０１５０】
ブタ下行結腸輪状筋におけるＰＤＥ３の主な役割は、ブタ胃輪走筋における結果と異なり（実施例のパートＡを参照）、本発明者らは、ＰＤＥ３が優勢な環状ヌクレオチドレベルの制御におけるＰＤＥ３及びＰＤＥ４の重複する役割を観察した。
【０１５１】
また、ＰＤＥ４阻害剤ロリプラム０．１μＭ及び０．３μＭにより、ブタ結腸におけるＥＦＳ誘発性収縮の顕著な増加が見られた（図１０Ｂ）。また、ブタ胃筋肉（実施例のパートＡを参照）において、ロリプラムは電気的に誘発されたアセチルコリン放出及びコリン性収縮を増加する傾向があり、コリン作動性神経からのアセチルコリン放出それ自体のＰＤＥ４による幾らかの根本的な支配を示唆している。
【０１５２】
実施例１４：結腸におけるＥＦＳ誘発性準最大コリン性収縮に対する５−ＨＴ４アゴニストの効果へのＰＤＥ阻害剤の影響
ブタ左心房において、ＰＤＥ３阻害剤及びＰＤＥ４阻害剤の両方が存在しない場合にプルカロプリドが非常に穏やかで減弱する効果を有するにすぎないことから、５−ＨＴ４受容体はＰＤＥ３及びＰＤＥ４の非常に厳密な制御のもとにある(De Maeyer et al., 2006b；Galindo-Tovar etal., 2009；Weninger et al.,2012)。したがって、本発明者らは、筋肉細胞レベルでのその顕著な効果を考慮し、ＰＤＥ３阻害剤シロスタミド以外の、ブタ下行結腸においてプルカロプリドに応答してｃＡＭＰを代謝する、ＰＤＥの阻害剤の影響を試験した。ブタ胃輪走筋と同様に、ＰＤＥ１阻害剤ビンポセチン（データは示していない）及びＰＤＥ２阻害剤ＥＨＮＡ（データは示していない）は、コリン作動性神経伝達に対するプルカロプリドの促進効果に影響を及ぼさなかった。
【０１５３】
選択的５−ＨＴ４受容体アゴニストプルカロプリド（１μＭ）は、ＥＦＳ誘発性コリン性準最大収縮を体系的に増強し、ブタ下行結腸輪走筋におけるコリン作動性神経終末に対する５−ＨＴ４受容体の促進の存在を確認した(Priem and Lefebvre, 2011)。プルカロプリドの前にロリプラム３μＭを投与した場合には、ＥＦＳ誘発性収縮を増強しなかったが（図１１Ｃ）、プルカロプリドを添加した後のＥＦＳ誘発性収縮はプルカロプリド単独の場合よりも高い値に達した。さらに、プルカロプリドの後にロリプラム３μＭを添加した場合（図１２）には、明確で有意なＥＦＳ誘発性応答の増強を誘発した（図１２Ａ及びＢ）。これにより、結腸において、胃組織において見出されたこと（実施例１０を参照）、即ち、５−ＨＴ４受容体アゴニストとＰＤＥ４阻害剤を併用するとコリン作動性神経伝達の増強が確認された。
【０１５４】
参考文献
Afzal F, Andressen KW,M&oslash;rk HK, Aronsen JM, Sjaastad I, Dahl CP, Skomedal T, Levy FO, Osnes JB,Qvigstad E., 2008. 5-HT4-elicited positive inotropic response is mediated bycAMP and regulated by PDE3 in failing rat and human cardiac ventricles. Br JPharmacol. 155: 1005-14.
Barbier, A.J., Lefebvre,R.A., 1995. Relaxant influence of phosphodiesterase inhibitors in the catgastric fundus. Eur. J. Pharmacol. 276, 41-47
Barnette, M.S., Manning,C.D., Price, W.J., Barone, F.C., 1993. Initial biochemical and functionalcharacterization of cyclic nucleotide phosphodiesterase isozymes in caninecolonic smooth muscle. J Pharmacol Exp Ther. 264(2), 801-812
Beattie DT, Armstrong SR,Vickery RG, Tsuruda PR, Campbell CB, Richardson C, McCullough JL, Daniels O,Kersey K, Li Y-P and Kim KHS. The pharmacology of TD- 8954, a potent andselective 5-HT4 receptor agonist with gastrointestinal prokinetic properties.Frontiers in Pharmacol 2011, 2, article 25, 1-13.
Beavo, J.A., Reifsnyder,D.H., 1990. Primary sequence of cyclic nucleotide phosphodiesterase isozymesand the design of selective inhibitors. Trends. Pharmacol. Sci. 11, 150-155
De Maeyer JH, LefebvreRA, Schuurkes JA., 2008. 5-HT4 receptor agonists: similar but not the same.Neurogastroenterol Motil. 20: 99-112.
De Maeyer JH, Prins NH,Schuurkes JAJ and Lefebvre RA. Differential effects of 5-hydroxytryptamine 4receptor agonists at gastric versus cardiac receptors: An operational frameworkto explain and quantify organ-specific behavior. J Pharmacol Exp Ther 2006,317, 955-964.
De Maeyer, J.H.,Straetemans, R., Schuurkes, J.A., Lefebvre RA., 2006b. Porcine left atrial andsinoatrial 5-HT(4) receptor-induced responses: fading of the response andinfluence of development. Br J Pharmacol. 147, 140-157
Elks, M.L., Manganiello,V.C., 1984. Selective effects of phosphodiesterase inhibitors on differentphosphodiesterases, adenosine 3',5'-monophosphate metabolism, and lipolysis in 3T3-L1adipocytes. Endocrinology 115, 1262-1268
Galindo-Tovar, A.,Vargas, M.L., Escudero, E., Kaumann, A.J., 2009. Ontogenic changes of thecontrol by phosphodiesterase-3 and -4 of 5-HT responses in porcine heart andrelevance to human atrial 5-HT(4) receptors. Br J Pharmacol. 156, 237-249
Hebeiss, K., Kilbinger,H., 1996. Differential effects of nitric oxide donors on basal and electricallyevoked release of acetylcholine from guinea-pig myenteric neurones. Br. J.Pharmacol. 118, 2073-2078
Jones, O.M., Brading,A.F., McC Mortensen, N.J., 2002. Phosphodiesterase inhibitors cause relaxationof the internal anal sphincter in vitro. Dis. Colon Rectum. 45, 530-536
Kaneda, T., Shimizu, K.,Nakajyo, S., Urakawa, N., 1997. Effects of various selective phosphodiesteraseinhibitors on muscle contractility in guinea pig ileal longitudinal smoothmuscle. Jpn. J. Pharmacol. 75, 77-85
Kaumann AJ, Lynham JA,Brown AM., 1996. Comparison of the densities of 5-HT4 receptors, beta 1- andbeta 2-adrenoceptors in human atrium: functional implications. NaunynSchmiedebergs Arch Pharmacol. 353: 592-5
Langlois M, FischmeisterR., 2003. 5-HT4 receptor ligands: applications and new prospects. J Med Chem.46: 319-44
Leclere, P.G., Lefebvre,R.A., 2001. Influence of nitric oxide donors and of the α2-agonist UK-14,304 onacetylcholine release in the pig gastric fundus.  Neuropharmacol. 40, 270-278.
Maurice, D.H., Palmer,D., Tilley, D.G., Dunkerley, H.A., Netherton, S.J., Raymond, D.R., Elbatarny,H.S., Jimmo, S.L., 2003. Cyclic nucleotide phosphodiesterase activity,expression, and targeting in cells of the cardiovascular system. Mol.Pharmacol. 64, 533-546
Murthy, K.S., 2001.Activation of phosphodiesterase 5 and inhibition of guanylate cyclase bycGMP-dependent protein kinase in smooth muscle. Biochem. J. 360, 199-208
Murthy, K.S., Zhou, H.,Makhlouf, G.M., 2002. PKA-dependent activation of PDE3A and PDE4 and inhibitionof adenylyl cyclase V/VI in smooth muscle. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 282,C508-C517
Priem, E.K.V., Lefebvre,R.A., 2011. Investigation of neurogenic excitatory and inhibitory motorresponses and their control by 5-HT4 receptors in circular smooth muscle of pigdescending colon. Eur. J. Pharm. 667, 365-374
Priem,E., Van Colen, I., De Maeyer, J.H., Lefebvre, R.A., 2012. The facilitating effect ofprucalopride on cholinergic neurotransmission in pig gastric muscle isregulated by phosphodiesterase 4. Neuropharmacology 62, 2126-2135
Reese, J.H., Cooper,J.R., 1984. Stimulation of acetylcholine release from guinea-pig ilealsynaptosomes by cyclic nucleotides and forskolin. Biochem. Pharmacol. 33,3007-3011
Stephenson, D.T.,Coskran, T.M., Wilhelms, M.B., Adamowicz, W.O., O'Donnell, M.M., Muravnick,K.B., Menniti, F.S., Kleiman, R.J., Morton, D., 2009. Immunohistochemicallocalization of phosphodiesterase 2A in multiple mammalian species. J.Histochem. Cytochem. 57, 933-949
Tomkinson, A., Raeburn,D., 1996. The effect of isoenzyme-selective PDE inhibitors onmethacholine-induced contraction of guinea-pig and rat ileum. Br. J. Pharmacol.118, 2131-2139
Ward, S.M., Dalziel,H.H., Bradley, M.E., Buxton, I.L., Keef, K., Westfall, D.P., Sanders, K.M.,1992. Involvement of cyclic GMP in non-adrenergic, non-cholinergic inhibitoryneurotransmission in dog proximal colon. Br. J. Pharmacol. 107, 1075-1082
Weninger, S., De Maeyer,J.H., Lefebvre, R.A., 2012. Study of the regulation of the inotropic responseto 5-HT(4) receptor activation via phosphodiesterases and its cross-talk withC-type natriuretic peptide in porcine left atrium. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 385, 565-577
Wohlsen A, Hirrle A,Tenor H, Marx D and Beume R. Effect of cyclic AMP-elevating agents on airwayciliary beat frequency in central and lateral airways in rat precision-cut lungslices. Eur J Pharmacol 2010, 635, 177-183.
Yau, W.M., Dorsett, J.A.,Youther, M.L., 1987. Stimulation of acetylcholine release from myentericneurons of guinea pig small intestine by forskolin and cyclic AMP. J.Pharmacol. Exp. Ther. 243, 507-510
Zhang, X.Y., Robinson,N.E., Zhu, F.X., 1996. Potentiation of acetylcholine release from trachealparasympathetic nerves by cAMP. Am. J. Physiol. 270, L541-L546
【図１】
2014525927.tif 000006
【図２】
2014525927.tif 000007
【図３】
2014525927.tif 000008
【図４】
2014525927.tif 000009
【図５】
2014525927.tif 000010
【図６】
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【図７】
2014525927.tif 000012
【図８】
2014525927.tif 000013
【図９】
2014525927.tif 000014
【図１０】
2014525927.tif 000015
【図１１】
2014525927.tif 000016
【図１２】
2014525927.tif 000017
【国際調査報告】
2014525927.tif 000018
2014525927.tif 000019
2014525927.tif 000020
2014525927.tif 000021