(57)【要約】  本発明は、合成オリゴ価又は多価β−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物、並びにＴヘルパー（Ｔｈ）及び制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞によって媒介される免疫応答を制御するためのそれらの使用に関する。
2014520136.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2014520136.tif 000009
の免疫賦活性のオリゴ価又は多価β−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物
（式中、ｎは０から６であり、ｍは３から５であり、各Ｒは、アセチル（ＣＯＣＨ３）、水素（Ｈ）、トリフルオロアセチル（ＣＯＣＦ３）、スルホネート基又は他のエステル基から独立して選択され、β−１，２−結合マンノオリゴ糖は、リンカー基（Ｂ）によって中心のコアユニット又は担体（Ａ）に連結されている）。
【請求項２】
リンカー基Ｂが、
−Ｘ−Ｙ−Ｚ、又は−Ｘ−Ｙ’−Ｚ
（式中、Ｘは、０である、又は基−ＣＨ２−又は原子Ｏ、Ｓ、若しくはＮを表し；
Ｙは、１から８個の炭素原子からなる骨格を有する炭素鎖を表し、場合により置換されていてもよく、最も好ましくは、４又は６個の炭素原子からなる直鎖骨格を有する脂肪族炭素鎖であり；
Ｙ’は、トリアゾール部分を表し、前記トリアゾールの１位の窒素から基−（ＣＨ２）ｐ−によってＸと結合しており（ここで、ｐは１から６である）、前記トリアゾール基の４位の炭素から基−（ＣＨ２）ｑ−によってＺと結合しており（ここで、ｑは１から６である）；
Ｚは、ゼロである、又はＯ、Ｓ、若しくはＮから選択される原子を表す）
からなる、請求項１に記載の免疫賦活化合物。
【請求項３】
ＸがＯであり、
Ｙ’が、トリアゾール部分を表し、前記トリアゾールの１位の窒素から基−（ＣＨ２）ｐ−によってＸと結合しており、ｐが１から３であり、前記トリアゾール基の４位の炭素から基−（ＣＨ２）ｑ−によってＺと結合しており、ｑが１又は２であり、
ＺがＯである、
請求項２に記載の免疫賦活化合物。
【請求項４】
コアユニット又は担体（Ａ）が、非置換又は置換の脂肪族、芳香族又は環状部分である、請求項１又は２に記載の免疫賦活化合物。
【請求項５】
式（ＩＩ）
【化２】
2014520136.tif 000010
に従う請求項１から４までのいずれか一項に記載の免疫賦活化合物
（式中、各Ｒは、アセチル（ＣＯＣＨ３）、水素（Ｈ）、トリフルオロアセチル（ＣＯＣＦ３）又はスルホネート基若しくは他のエステル基から独立して選択される）。
【請求項６】
各Ｒがアセチル（ＣＯＣＨ３）である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の免疫賦活化合物。
【請求項７】
医薬品として使用するための、請求項１から６までのいずれか一項に記載の免疫賦活化合物。
【請求項８】
ワクチンのアジュバントとして使用するための、請求項１から６までのいずれか一項に記載の免疫賦活化合物。
【請求項９】
Ｔｒｅｇ及び／若しくはＴｈ１型を誘導すること、並びに／又はＴｈ２型免疫応答を阻害することによって予防又は処置できる状態の処置に使用するための、請求項１から６までのいずれか一項に記載の免疫賦活化合物、又はそれらの組合せ。
【請求項１０】
状態が、Ｉ型即時型アトピー性アレルギーである、請求項９に記載の使用のための免疫賦活化合物。
【請求項１１】
状態が、
ａ）アトピー性湿疹／アトピー性皮膚炎症候群（ＡＥＤＳ）、
ｂ）アレルギー性喘息、
ｃ）アレルギー性鼻炎、
ｄ）アレルギー性蕁麻疹、
ｅ）食物アレルギー、
ｆ）毒物アレルギー、及び
ｇ）アレルギー性鼻結膜炎
からなる群から選択される、請求項９又は１０に記載の使用のための免疫賦活化合物。
【請求項１２】
状態が、感染性疾患である、請求項９に記載の免疫賦活化合物。
【請求項１３】
請求項１から６までのいずれか一項に記載の免疫賦活化合物の少なくとも１つ、又はそれらの混合物、及び医薬として許容できる担体を含む、免疫賦活組成物。
【請求項１４】
医薬として許容できる担体が、経皮担体、経粘膜担体、経口担体、非経口担体、デポー製剤用担体、及び徐放性製剤用担体からなる群から選択される、請求項１３に記載の免疫賦活組成物。
【請求項１５】
担体が、舌下及び／又はバッカル投与のための経粘膜担体である、請求項１３又は１４に記載の免疫賦活組成物。
【請求項１６】
特異的アレルゲン免疫療法のためのアレルゲン調製物；及び／又は追加的なアレルギー薬又は喘息薬をさらに含む、請求項１３から１５までのいずれか一項に記載の免疫賦活組成物。
【請求項１７】
感染性疾患に対するワクチン接種のための微生物特異的抗原；及び／又は抗微生物剤をさらに含む、請求項１３から１５までのいずれか一項に記載の免疫賦活組成物。
【請求項１８】
食品添加剤、又は栄養調製物としての、請求項１から６までのいずれか一項に記載の免疫賦活化合物、又はそれらの組合せの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫賦活化合物、並びにＴヘルパー（Ｔｈ）及び制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞によって媒介される免疫応答を制御するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｉ型即時型アトピー性アレルギーは、西洋社会において最も一般的な健康問題の１つであり、罹患率は常に上昇し続けている（ＩＳＡＡＣ  １９９８）。この上昇は、先進諸国において微生物負荷が低下したことに関連すると推測されており、本来の制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）及び１型Ｔｈ（Ｔｈ１）細胞の反応が低下して、アトピー性疾患を特徴とするＴｈ２反応の増強へと移行する。
【０００３】
ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、Ｔｈ１及びＴｈ２）は、アレルギー性免疫応答の主な調節因子である。ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３などのサイトカインを分泌するＴｈ２細胞は、Ｂ細胞によるＩｇＥ産生、肥満細胞の脱顆粒及び好酸球動員を誘導することから、アレルギー性炎症の発症に重要である。制御性Ｔ細胞及びそのサイトカインＩＬ−１０は、アレルゲンに対するＴｈ２型反応の下方調節における重要な役割も果たす。Ｔｈ１細胞は、細胞傷害性Ｔ（Ｔｃ）細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化を誘導することによる、微生物、特に細胞内病原体、並びに癌に対する防御に不可欠である。さらに、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２及びＩＬ−１８を含めたＴｈ１型サイトカインは、アレルゲンに誘導されるＴｈ２型免疫応答の抑制に関与する。さらに、アレルゲンワクチン接種において、サイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０及びＩＬ−１８の上方調節が生じ、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても、アレルギー性炎症の抑制に重大な役割を示す。
【０００４】
最近の研究により、Ｔｈ１又はＴｈ２型免疫の発現に重大な時期は、幼年期であることが示されている。出生時にはＴｈ２型免疫は弱く、健常者においては、これがＴｈ１型応答へと転換する。環境中の微生物成分及び腸内微生物相（内毒素、乳酸菌、ミコバクテリア）による免疫系の刺激は、この転換に不可欠と考えられている。
【０００５】
Ｔｈ１−Ｔｈ２均衡における微生物成分の効果について研究が行われてきた。感染症に対する免疫付与のためのより効果的で安全なワクチンの開発、並びに自己免疫疾患、アトピー性疾患及び悪性疾患を処置する新規な治療法に使用できる微生物分子を求めて、多くの努力が払われてきた。これらの分子のうちには、３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、サルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）のリポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、及び、一般的に中心の非メチル化ＣＧジヌクレオチドからなる、免疫賦活性の細菌ＤＮＡ塩基配列（ＣｐＧ−ＯＤＮ）がある。これらの分子は、臨床的に試験され、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザＡ型ウイルス、及び熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に対する免疫付与のための多くのワクチン及び処置に、並びに、非ホジキンリンパ腫及び黒色腫などの癌の処置に、有効且つ耐容性が良好なアジュバントであることが示されている。これらの分子は、単球、マクロファージ、及び樹状細胞などの抗原提示細胞の様々なＴｏｌｌ様受容体に対する作用による、Ｔｈ１型パターンのサイトカイン産生を強力に誘導して機能することが示されている。さらに、ミコバクテリア及び細菌のリポ多糖のＴｈ１増強の効果として、Ｔｈ２型反応、アレルギー性炎症、ＩｇＥ反応、及び気管支機能亢進の抑制をその後に伴うことが、いくつかの研究で示されている。さらに、プロバイオティック乳酸菌は、妊娠中及び出生直後に経口投与された場合、２歳でのアトピー性湿疹の罹患率を低下させることが示されている。アレルゲンに共有結合で結び付く、細菌のＣｐＧ−ＯＤＮオリゴヌクレオチドを用いた免疫療法は、アレルギー性鼻炎患者において鼻の炎症反応を緩和することも示されている。ＭＰＬは、アレルギー免疫療法におけるアジュバントとして、試験に成功している。
【０００６】
これらの微生物化合物の治療的使用は、ある問題に直面している。ＬＰＳは毒素であり、それ自体が治療的使用に適さない。ＣｐＧ−ＯＤＮは遺伝子であり、さらに大規模な合成には費用がかかり、潜在的な世論問題（遺伝子組み換え食品など）を意味する。ＭＰＬアジュバントは、単一の化学成分ではなく、脂肪酸鎖の数及び長さを反映した差がある類似体の混合物である。プロバイオティック乳酸菌は、起こり得る感染症に関する安全性の問題を含む、生きている細菌であり、さらに標準化が困難である。ミコバクテリアの溶解物も、生物学的な標準化の範囲を超えた、細菌成分の粗混合物である。アレルギーの処置に理想的な治療成分は、できる限り小さい分子サイズを有し、自然に発生する、非毒性の、安全な、精製された分子であろう。
【０００７】
ＷＯ０２／０９７２８において、８０種超の様々な疾患を予防及び処置するために、複合糖質が提示されている。この公報では、糖質は、２つ以上の糖部分を含み、多糖（ムコ多糖及びマンナンを含む）並びにオリゴ糖［乳糖を含めたシアル酸付加糖などの分岐オリゴ糖を含み；一般的な分類の複合糖質に組み込まれる重要な乳糖（ヘキサオースとも呼ばれる）は、ジフコシルラクト−Ｎ−ヘキサオースａ及びｂ、ジシアリル−モノフコシルラクト−Ｎ−ヘキサオース、並びにモノフコシルラクト−Ｎ−ヘキサオースＩ、ＩＩ及びＩＩである］のような分類の化合物を含むあらゆるポリマーと定義される。列挙された疾患には、アレルギーに関連する状態が含まれ；個別には、アレルギーに関連するアナフィラキシー、喘息及び掻痒、並びに、例えば白血球の接着阻害に基づく過敏性反応が挙げられる。
【０００８】
ＵＳ２００２／００５４８８６は、カンジダ症を処置するためのβ−１，２−結合直鎖オリゴ−マンノシル残基を含むワクチンを開示している。カンジダ症に対する防御抗体反応を誘発するため、又はカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）が哺乳類細胞に接着することを予防するために、オリゴ−マンノシル残基をエピトープとして使用している。効果は、微生物成分を模倣した合成物質の使用に基づき、投与されると、その物質に対する特異的な免疫応答を誘導する。
【０００９】
ＷＯ２００６／０９６９７０Ａ１は、カンジダ症を処置する別の適用を開示している。そこでは、リンカーを介してタンパク質担体に結合させた、天然のＯ結合型及びＳ結合型オリゴ糖、より具体的には、β−１，２−結合直鎖オリゴ−マンノシル残基を含むコンジュゲートが提供される。前記コンジュゲートは、タンパク質を常に含む。タンパク質である前記担体が、胸腺依存性免疫応答を誘発することが不可欠である。前記部分を結合するための合成方式も提示されている。リンカーにより共有結合で結合させたオリゴ糖及びタンパク質担体で形成されたコンジュゲートは、それを必要としている対象において、カンジダ種への免疫応答の誘導に使用可能であることが示唆されている。
【００１０】
ＷＯ２００７／０１００８４は、β−１，２−結合鎖及びβ−１，２−（Ｄ）−マンノオリゴ糖を含む、免疫賦活性マンナン多糖、並びにＴヘルパー（Ｔｈ）細胞によって媒介される免疫応答を制御するためのその使用を開示している。しかし、４種類までのオリゴ糖からなる、合成した単純なβ−１，２−結合マンノオリゴ糖鎖の活性は、天然の粗オリゴ糖混合物と比較して劣っていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、これらの合成オリゴ糖鎖には、新規な変更が必要であった。
本発明者らの、継続的な研究努力において、合成オリゴ価又は多価β−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物が、Ｔヘルパー（Ｔｈ）及び制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞によって媒介される免疫応答を制御する優れた特性を有することが見出された。
【００１２】
したがって、本発明の目的の１つは、Ｔヘルパー（Ｔｈ）及び制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞によって媒介される免疫応答を制御する、免疫賦活化合物及び組成物を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、医薬品として使用する免疫賦活化合物を提供することである。さらに、本発明の別の目的は、Ｔｒｅｇ及び／若しくはＴｈ１型を誘導すること、並びに／又はＴｈ２型免疫応答を阻害することにより予防又は処置できる状態になった罹患している、又は罹患しやすい、ヒトを含めた哺乳類を処置するための医薬品として使用する免疫賦活化合物を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、ワクチンのアジュバントとして使用する免疫賦活化合物を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる別の目的は、食品添加剤として使用する免疫賦活化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
これらの目的を達成するために、本発明は、独立請求項で提示されるもので特徴付けられる。
【００１７】
本発明の、いくつかの好ましい実施形態は、他の請求項で記載されるであろう。
【００１８】
典型的には、本発明による免疫賦活化合物は、オリゴ価若しくは多価糖質の集合体又は配置であり、多くのβ−１，２−結合マンノオリゴ糖は、リンカー基によって中心のコアユニット又は担体に連結されている。より詳細には、本発明による免疫賦活化合物は、式（Ｉ）
【化１】
2014520136.tif 000003
のオリゴ価又は多価β−１，２−結合マンノオリゴ糖である（式中、ｎは０から６であり、ｍは３から５であり、各Ｒは、アセチル（ＣＯＣＨ３）、水素（Ｈ）、トリフルオロアセチル（ＣＯＣＦ３）、スルホネート基又は他のエステル基から独立して選択され、β−１，２−結合マンノオリゴ糖は、リンカー基（Ｂ）によって中心のコアユニット又は担体（Ａ）に連結されている）。
【００１９】
上に提示したように、式（Ｉ）の最後の糖質は、リンカー／担体へとα結合している。しかし、別のリード化合物において、この末端結合は、β結合にもできる。言い換えれば、β−１，２−結合マンノオリゴ糖について、ここでは、マンノースユニットがβ−１，２−結合により互いに連結しているが、次いで上記オリゴ糖が、β又はα−位置で、リンカーを介して担体と連結できる化合物を指す。
【００２０】
本発明者らは、免疫賦活化合物により、異なるリンカーを利用した場合でさえ、良好な結果が得られることを見出した。当業者は、本発明の免疫賦活化合物に適切なリンカーを選択できる。しかし、本発明による合成免疫賦活化合物は、実施された実験に基づいて、分子のリンカー基Ｂとして、例えばトリアゾール部分若しくはその誘導体、又は炭素鎖を含むことができる。
【００２１】
前記リンカーＢは、好ましくは、構造
−Ｘ−Ｙ−Ｚ−
からなることができる（式中、Ｘは、ゼロである、又は基−ＣＨ２−、又は原子Ｏ、Ｓ若しくはＮを表し；Ｙは、炭素鎖を表し、場合により置換されていてもよく、１から８個の炭素原子からなる骨格を有し、最も好ましくは、脂肪族Ｃ４〜Ｃ６炭素鎖であり；Ｚは、ゼロである、又はＯ、Ｓ若しくはＮから選択される原子を表す。しかし、リンカー基（Ｂ）は、ｐ−ニトロフェニルアジピン酸ジエステル又はチオアセテートペンタンに由来する部分を含まない。
【００２２】
Ｂがトリアゾール部分を含む場合、上の構造は
−Ｘ−Ｙ’−Ｚ−
として提示できる（式中、Ｘは、ゼロである、又は基−ＣＨ２−、又は原子Ｏ、Ｓ、若しくはＮを表し；Ｙ’は、トリアゾール部分を表し、前記トリアゾールの１位の窒素から基−（ＣＨ２）ｐ−によってＸと結合しており（ここで、ｐは１から１０であり、好ましくは、１から６である）、Ｙ’は、前記トリアゾール基の４位の炭素から基−（ＣＨ２）ｑ−によってＺと結合しており（ここで、ｑは１から６である）；Ｚはゼロである、又はＯ、Ｓ若しくはＮから選択される原子を表す）。実験パートにおいて、Ｘが原子Ｏであり、Ｙ’が基−（ＣＨ２）ｐ−であり、ｐが２又は３であり、ｑが１であり、Ｚがゼロである化合物を合成し、活性について試験した。
【００２３】
中心のコアユニット又は担体Ａは、置換又は非置換の脂肪族構造、芳香族構造若しくは環状構造、又はポリマーであり、好ましくは、置換又は非置換の脂肪族構造、芳香族構造又は環状構造でありうる。前記コアユニットＡを、比較的小さく単純な分子から選択する場合、免疫賦活化合物全体の構造及びサイズは、それぞれ小さいままである。比較的小さく単純な分子については、ここでは、脂肪族構造、芳香族構造、又は環状構造を指し、コアユニットＡは、その骨格構造に、炭素分子を２０個まで含み、好ましくは炭素分子を１０個まで、より好ましくは炭素分子を６個まで、最も好ましくは炭素分子を３個まで含む。当業者には、コアユニットのサイズは、リンカー（Ｂ）を介してそれと付着できるβ−１，２−結合マンノオリゴ糖の数と相関することは容易に理解される。したがって、３つの炭素分子を含むコア化合物は、３つのリンカー（Ｂ）を介して３つのβ−１，２−結合マンノオリゴ糖に結合できる。本発明による結合技術を用いて、図７ｂに例示されているように、５個までのβ−１，２−結合マンノオリゴ糖部分をグルコピラノース環に結合できる。
【００２４】
一実施形態において、β−１，２−結合マンノオリゴ糖部分は、リンカーを介して担体としてケイ素（Ｓｉ）と結び付ける／つなぎ留めることができるので、例えば９個又は１２個の糖質部分を示す。さらなる別の実施形態によれば、チロシンを担体／デポー補助物質として使用できる。
【００２５】
望ましい場合は、前記中心のコアユニット又は担体に対して、１個又は複数の置換基を選択してさらなる官能性を得ることができる。１個又は複数の炭素を、基又は置換基で置換し、前記中心のコア又は担体を、別の類似した化合物又は異なる化合物に固定するために、又はそこへの他の官能性（複数可）を設計するために、結合させる、付着させる、又は結び付けるための結合部位を得ることができる。
【００２６】
オリゴ価又は多価は、本発明の化合物において、リンカーＢを介して、中心のコアユニット又は担体に結合したβ−１，２−結合マンノオリゴ糖の価数を指す。有利なことに、化合物は、オリゴ価であるため、β−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物の価数は、好ましくは３から５であり、言い換えれば、三価、四価及び五価の化合物が好ましい。しかし、中心のコア又は担体ユニットをそれぞれ２個以上含んだ免疫賦活β−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物２個以上を含む集合体として配置する場合、前記集合体は多価構造を形成し得る。
【００２７】
本発明の好ましい一実施形態において、本発明による免疫賦活化合物は、三価β−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物（すなわちｍが３）である。三価β−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物は、３つ（ｍ＝３）のβ−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物が、リンカー基（Ｂ）を介して中心のコアユニット又は担体に連結するオリゴ価糖質分子を意味する。アセチル化した場合、三価二糖は、水性環境において、価数の多い対応する類似体よりも溶解しやすい。
【００２８】
本発明の一実施形態によれば、本発明の免疫賦活化合物は、３つのβ−１，２−結合マンノ二糖が中心のコアユニットに結合している、三価糖質誘導体からなる。好ましくは、三価β−１，２−結合マンノ二糖は式（ＩＩ）
【化２】
2014520136.tif 000004
に従い、式中、各Ｒは、アセチル（ＣＯＣＨ３）、水素（Ｈ）、トリフルオロアセチル（ＣＯＣＦ３）、又はスルホネート基若しくは他のエステル基から独立して選択される。
【００２９】
本発明の別の実施形態によれば、三価β−１，２−結合マンノ二糖は、式（ＩＩＩ）
【化３】
2014520136.tif 000005
に従ってもよく、式中、各Ｒは、アセチル（ＣＯＣＨ３）、水素（Ｈ）、トリフルオロアセチル（ＣＯＣＦ３）、又はスルホネート基若しくは他のエステル基から独立して選択され、ｎは、典型的には４又は６である。
【００３０】
トリアゾール部分（式ＩＩの化合物のリンカー基）は、例えば、三価分子におけるトリアゾール架橋と類似した鎖長を提供する、例えば４個又は６個の炭素原子などを含有する単純な炭素鎖（式ＩＩＩの化合物のリンカー基）で置き換えることができる。
【００３１】
本発明による三価免疫賦活化合物の合成は、好ましくは、クリックケミストリープロトコールの使用に基づく。
【００３２】
本発明の実施形態によれば、前記化合物において、式Ｉで表されているすべてのＲは、同一である。好ましい実施形態によれば、本発明による免疫賦活化合物は、式（ＩＩ）に従い、すべてのＲはアセチルである。したがって、本発明による免疫賦活化合物は、好ましくは、式（ＩＶ）
【化４】
2014520136.tif 000006
で示されている、１，２，３−トリス［１−［（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→２）−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシルオキシエチル）］−４−［メチル−１−オキシ］トリアゾリル］プロパンである。
【００３３】
式（ＩＶ）の三価分子は、コアユニットとしてトリアゾール部分及びプロパン誘導体を含むリンカー基を組み込んでおり、その内部で連結した３つのβ−１，２−結合マンノ二糖部分が、免疫系を潜在的に調節するために、サイトカインＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０の産生に最高の活性物質と見出されている。本発明の化合物と比較して価数が減少した分子は、免疫賦活活性を有さず、価数が増えた分子は、小さいサイズゆえに達成されるいくつかの利益を損なう。例えば、本発明のアセチル化した免疫賦活化合物を研究する場合、分子サイズの増大、すなわち三価から五価への増大は、水中における溶解性に問題を引き起こす。したがって、本発明による三価分子は、水性条件で働かせる場合、最も興味深い免疫賦活化合物であることが見出される。しかし、異なるマトリックス又は条件、例えば親油性条件において、他の価は、三価分子と比べて良好な特性を得ることができる。
【００３４】
官能基Ｒは、アセチル（ＣＯＣＨ３）、水素（Ｈ）、トリフルオロアセチル（ＣＯＣＦ３）、又はＮａＳＯ３−などのスルホネート基若しくはいくつかの他の官能基の群から選択される。本発明のいくつかの適用又は実施形態において、免疫賦活化合物の特性、例えば、それを必要とする対象への投与に関しては、代謝における吸収、医薬品の製剤、安定性の問題などを調整する必要が生じることがある。これらの要求に適合させるために官能基Ｒを選択することは、当業者にはごく普通の知識である。
【００３５】
本発明は、医薬品として使用するための、本発明による免疫賦活化合物も提供する。本発明の一実施形態は、ワクチンのアジュバントとして使用するための、本発明による免疫賦活化合物を提供する。
【００３６】
本発明は、Ｔｒｅｇ及び／若しくはＴｈ１型を誘導すること、並びに／又はＴｈ２型免疫応答を阻害することによって予防又は処置できる状態の処置に使用するための、本発明による免疫賦活化合物、又はその組合せも提供する。
【００３７】
Ｔｒｅｇ及び／若しくはＴｈ１型免疫応答は、Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ産生の誘導並びに／又はＴｈ２型Ｔ細胞、肥満細胞、好酸性顆粒球及び／若しくは好塩基性顆粒球の機能の阻害若しくは抑止により誘導される。Ｔｈ２型免疫応答は、Ｔ細胞におけるＩＬ−１０産生の誘導、並びに／又はＴｈ２型Ｔ細胞、肥満細胞、好酸性顆粒球及び／若しくは好塩基性顆粒球の機能の阻害又は抑制によって阻害される。Ｔｈ２型免疫応答の抑制は、アレルゲンに誘導されるＩＬ−５産生の抑制にも基づく。
【００３８】
本発明は、Ｉ型即時型アトピー性アレルギーの処置に使用するための、本発明による免疫賦活化合物も提供する。好ましい実施形態において、Ｉ型即時型アトピー性アレルギーは、アトピー性湿疹／皮膚炎症候群（ＡＥＤＳ）、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性蕁麻疹、食物アレルギー、毒物アレルギー、及びアレルギー性鼻結膜炎の群から選択される。さらなる実施形態において、本発明は、感染性疾患の処置に使用するための、本発明の免疫賦活化合物を提供する。
【００３９】
本発明は、本発明による免疫賦活化合物の少なくとも１種又はそれらの混合物、及び医薬として許容できる担体を含む免疫賦活組成物も対象にする。
【００４０】
本発明は、本発明による免疫賦活化合物、及び／又はそれらのあらゆる組合せの食品添加剤としての使用も提供する。
【００４１】
本発明は、Ｔｒｅｇ及び／又はＴｈ１型免疫応答の誘導に有効な量で、本発明の組成物を対象へ投与することを含む、Ｔｒｅｇ及び／又はＴｈ１型免疫応答を誘導する方法、並びに、Ｔｈ２型免疫応答の発現の部分的又は完全な阻害に有効な量で、本発明の組成物又は本発明の食品を対象へ投与することを含むＴｈ２型免疫応答を阻害する方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】β−１，２−結合マンノオリゴ糖によって媒介されるＴｈ免疫応答の制御を例示する図である。
【図２】本発明の式（ＩＩ）による三価化合物、及びより具体的には化合物（ＩＶ）を含有する、β−１，２−結合マンノ二糖の合成を例示する図である。
【図３】三価化合物を含有する、β−１，２−結合マンノ二糖の官能基の修飾を例示する図である。
【図４】化合物（ＩＶ）のリンカーを含有するトリアゾールに加えられる−ＣＨ２−１個を有する活性β−１，２−結合マンノ二糖化合物の合成を例示する図である。
【図５】Ｌｕｍｉｎｅｘ１００（商標）という計測器を使用してＬＩＮＣＯｐｌｅｘ（商標）キットにより評価された、対象３例のヒトＰＢＭＣにおいて、化学的に合成された、本発明の多価β−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物３種により誘導されるサイトカイン産生（垂直軸）を示す図である。水平軸は濃度を示すので、研究された各化合物の２０及び２００μｇ／ｍｌの濃度を示す。
【図６】Ｌｕｍｉｎｅｘ１００（商標）という計測器を使用してＬＩＮＣＯｐｌｅｘ（商標）キットにより評価された研究対象４例（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）のヒトＰＢＭＣにおいて、化学的に合成された、多価β−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物２種により、アレルゲン（カバノキ、ベツラ・ヴェルコサ（Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ））が誘導したＩＬ−５産生の抑制を示す図である。
【図７ａ】実施例１及び２で使用されるマンノオリゴ糖化合物の化学構造を例示する図である。
【図７ｂ】実施例１及び２で使用されるマンノオリゴ糖化合物の化学構造を例示する図である。
【図７ｃ】実施例１及び２で使用されるマンノオリゴ糖化合物の化学構造を例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明の免疫賦活オリゴ価又は多価β−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物によって得られる機構は、図１で提示した糖質によって媒介されるＴｈ免疫応答の制御であると考えられている。前記糖質部分の不可欠な要素は、β−１，２−結合マンノオリゴ糖である。この適用の文脈において、β−１，２−結合マンノオリゴ糖という用語は、２から８個のマンノピラノース部分からなる糖質部分を指す。オリゴ価化合物も、マンノース部分又は他の単糖部分を組み込むことができる。
【００４４】
アレルギー性炎症は、ＩｇＥ抗体産生、肥満細胞脱顆粒及び好酸球炎症によって特徴付けられる。これらの反応は、ＩＬ−４及びＩＬ−５などのサイトカインを分泌する、アレルゲンに特異的なＴｈ２型免疫細胞によって媒介される。ＩＦＮ−γを含めたサイトカインを分泌するＴｈ１細胞は、アレルゲンに誘導されるＴｈ２型免疫応答の抑制に関与する。調節性サイトカインＩＬ−１０も、Ｔｈ２型免疫応答の下方調節に重要である。実施例に記載された実験に基づいて、本発明による三価β−１，２−結合マンノ二糖が、ヒト白血球においてＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０を刺激するという発見は、これらのサイトカインが、Ｔｈ２細胞反応、ひいてはアレルギー性炎症のβ−１，２−結合マンノオリゴ糖によって媒介される抑制において役割を担うことを示唆する。
【００４５】
本発明は、合成免疫賦活オリゴ価又は多価β−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物と、上に記載したＴｈによって媒介される免疫応答を制御するための、並びに対象におけるＩ型アトピー性アレルギー及び感染性疾患を予防又は処置する医薬品、医薬製剤、及び栄養調製物の製造における、上記分子又はそれらのプロドラッグの使用とについて記載する。
【００４６】
免疫学を論じる場合、免疫原が、該免疫原に対する特異的な免疫応答を刺激するために使用されることは注目に値する。しかし、免疫賦活剤は、併用される免疫原に対する特異的な免疫応答を増強する目的で、免疫系の非特異的な活性化を刺激するために使用される。
【００４７】
免疫賦活剤又は免疫賦活化合物という用語は、生物学的な活性物質を指し、その活性は、Ｔヘルパー１型及び制御性Ｔ細胞反応を刺激することにより、宿主対象の免疫系の機能に影響を与える、又は機能の役割を果たす。対象という用語は、ヒトを含めた哺乳類を指す。免疫賦活剤は、免疫系の非特異的な活性化を誘導する。免疫賦活剤は、免疫賦活化合物と併用されるワクチンの免疫原に対して、特異的な体液性又は細胞性免疫応答を増強するために、とりわけワクチンのアジュバントとしての適用にも使用される。
【００４８】
したがって、本発明による免疫賦活化合物は、ワクチンのアジュバントとしての使用にも適切である。本発明による免疫賦活化合物又はそれらの混合物は、アジュバントとしてワクチンに加えられて、免疫系の標的抗原への反応を刺激するが、それ自体が免疫を与えるわけではない。特に、本発明による化合物は、減感作の注射剤におけるアジュバントとしての使用に適切である。本発明の化合物は、感染性疾患に対するワクチンにおけるアジュバントとしても使用できる。本発明による免疫賦活化合物は、アジュバントとして使用される場合、好ましくは、主成分である問題の免疫原と併用され得る。しかし、本発明による免疫賦活化合物は、場合により、前記免疫原又はワクチン組成物の別の成分と結合、又はさらに連結するように設計できる。
【００４９】
本発明は、Ｔｒｅｇ及び／又はＴｈ１型免疫応答を誘導する方法も包含する。方法は、Ｔｒｅｇ及び／又はＴｈ１型サイトカイン合成の誘導に有効な量で、本発明による組成物を対象へ投与することに関与する。好ましい実施形態において、方法は、Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ合成の誘導に関与するが、それに限定されない。
【００５０】
本発明は、Ｔｈ２型免疫応答を阻害する方法をさらに含む。方法は、アレルゲンに対するＴｈ２型免疫応答の発現の部分的又は完全な阻害に有効な量で、本発明による組成物を対象へ投与することを含む。好ましい実施形態において、阻害の機構は、Ｔ細胞におけるＩＬ−１０産生の誘導を含むが、それに限定されない。方法は、Ｔｈ２型Ｔ細胞、肥満細胞、好酸性顆粒球及び好塩基性顆粒球の機能を阻害又は抑制することにより、Ｔｈ２型免疫応答の抑制にも関与できる。
【００５１】
より具体的には、本発明による免疫賦活化合物は、
ａ）Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ産生の誘導、並びに／又は
ｂ）Ｔｈ２型Ｔ細胞、肥満細胞、好酸性顆粒球、及び／若しくは好塩基性顆粒球の機能の阻害又は抑制
によってＴｒｅｇ及び／又はＴｈ１型免疫応答が誘導される使用に好ましい。
【００５２】
さらに、本発明による免疫賦活化合物は、
ａ）Ｔ細胞におけるＩＬ−１０産生の誘導、並びに／又は
ｂ）Ｔｈ２型Ｔ細胞、肥満細胞、好酸性顆粒球、及び／若しくは好塩基性顆粒球の機能の阻害又は抑制
によってＴｈ２型免疫応答が阻害される使用に好ましい。
【００５３】
本発明は、Ｔｈによって媒介される免疫応答を制御する方法も提供する。好ましくは、本発明に従って刺激される免疫応答は、Ｔｈ１型反応に偏り、Ｔｈ２型反応に関わらない。一態様において、方法は、Ｔｈ１型サイトカイン産生の刺激に有効な量で、前記組成物を対象へ投与することを含む。好ましい実施形態において、方法は、Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ合成の誘導を含むが、それに限定されない。他の態様において、方法は、アレルゲンに対するＴｈ２型免疫応答の発現の部分的又は完全な阻害に有効な量で、前記組成物を対象へ投与することを含む。好ましい実施形態において、阻害の機構には、Ｔ細胞におけるＩＬ−１０産生の誘導を含むが、それに限定されない。方法は、Ｔｈ２型Ｔ細胞、肥満細胞、並びに好酸性顆粒球及び好塩基性顆粒球の機能を阻害又は抑制することにより、Ｔｈ２型免疫応答の抑制も含むことができる。
【００５４】
本発明はさらに、Ｉ型即時型アトピー性アレルギーを予防又は処置するための医薬品、医薬製剤又は栄養調製物を製造する、本発明による組成物の使用に関する。好ましい実施形態において、Ｉ型即時型アトピー性アレルギーは、アトピー性湿疹／皮膚炎症候群（ＡＥＤＳ）、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性蕁麻疹、食物アレルギー、毒物アレルギー、及びアレルギー性鼻結膜炎からなる群から選択される。さらなる実施形態において、本発明の化合物は、感染性疾患の予防及び処置に使用できる。本明細書で使用される、予防する、予防又は予防することという用語は、障害を有する、又は障害が発症する危険性が高い対象において、前記障害の発症を完全に又は部分的に阻害することを指す。処置する、処置又は処置することという用語は、前記化合物又は組成物を、障害の発症の予防、症状の緩和、進行の停止に有効な量で、対象へ投与することと定義される。本明細書で使用される有効量という用語は、必要な用量及び期間で望ましい治療結果を達成するために有効な量を指す。治療有効量は、組成物、及び特に投与形態に応じて、約１μｇから数ｇの間で変動することが多い。例えば、本発明による三価β−１，２−結合マンノ二糖の非経口投与についての典型的な量は、１μｇから１００μｇ、好ましくは２μｇから３０μｇ、最も好ましくは３μｇから１０μｇであり、経口投与についての典型的な量は、数ｍｇからかなり多く数ｇまでにできる。プロドラッグが投与される場合、有効量は、免疫賦活β−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物、例えば三価β−１，２−結合マンノ二糖の生成可能量、及び前記化合物の実際の放出量に依存する。
【００５５】
さらなる実施形態において、本発明の医薬品又は医薬製剤は、経腸経路、粘膜経路、非経口経路、及び局所経路を含めて、当業界で既知のあらゆる経路で対象に投与される。経腸経路は、経口経路、及び消化管からの吸収に関連するあらゆる経路を含む。粘膜経路は、経口、経鼻、舌下、バッカル、経肺、経皮、及び経眼経路を含むが、それに制限されない。非経口経路は、静脈内、皮内、筋肉内、及び皮下経路を含むが、それらに制限されない。
【００５６】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、医薬として許容できる担体とともに使用される。本発明による免疫賦活組成物は、典型的には、本発明による免疫賦活化合物の少なくとも１種又はその混合物、及び医薬として許容できる担体を含む。医薬として許容できる担体という用語は、有効成分を結合させて対象へ適用しやすくした、受容者が生理学的に許容できる担体物質を指す。医薬として許容できる担体は、経皮担体、経粘膜担体、経口担体、非経口担体、デポー製剤用担体、及び徐放性製剤用担体からなる群から選択されるが、それらに制限されない。
【００５７】
本発明の免疫賦活化合物は、マトリックス内にカプセル化する、組み込む、又は溶解することができ、徐放性の全身送達をもたらす。場合により、限局した組織の領域内、例えば、アレルギー反応の部位内、感染部位内、又はワクチン接種部位内に徐放性の送達をもたらすように使用するために適合できる。この持続放出又は制御放出は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるデポー若しくはその成分の生分解の結果として、又は代謝変換若しくは前記免疫賦活化合物の溶解放出の結果として発生する放出を包含することを指すよう意図されている。例えば、皮下注射において、免疫賦活化合物がアレルゲンとともにアジュバントとして使用される場合、それ自体が、血液／周囲組織へと経時的に漏出することになるデポーとして機能できる。
【００５８】
別の方法として、本発明の免疫賦活化合物は、コアユニット又は担体から、直接脂質基へと共役でき、次いでデポー調製物が得られる。これらの修飾された脂質、又は脂質付加された免疫賦活化合物は、懸濁液の製剤、乳剤、脂質膜、脂質小胞、リポソームなどへの組み込みに使用できる。
【００５９】
さらなる実施形態において、本発明の医薬組成物は、別の治療化合物を含むことができる。本明細書で使用される治療化合物という用語は、優先的にはアレルギー薬、喘息薬又は抗微生物剤である。他の実施形態において、本発明の医薬組成物は、抗原を含む。抗原という用語は、宿主の免疫系により認識され、特異的な免疫応答を誘発できる、あらゆる種類の分子（例えば、タンパク質、ペプチド、多糖、糖タンパク質、核酸、又はそれらの組合せ）を広く含む。いくつかの実施形態において、抗原は、特異的アレルゲン免疫療法（アレルゲンワクチン接種又は舌下免疫療法）のためのアレルゲン調製物である。本明細書で使用されるアレルゲンという用語は、感受性のある対象において、アレルギー反応又は喘息反応を誘導できる物質を指し、花粉、昆虫の毒、動物の鱗屑、真菌胞子及び家塵ダニを含むが、それらに限定されない。アレルゲン免疫療法、減感作療法又は免疫学的減感作療法としても知られる特異的アレルゲン免疫療法という用語は、徐々に量を増やしたアレルゲンを、知られているあらゆる経路で投与することによって、アレルギー性障害を有する対象を処置し、アレルゲンに対する免疫学的耐性を誘導して、さらなるアレルギー反応を予防することを指す。したがって、本発明の組成物は、特異的アレルゲン免疫療法のためのアレルゲン調製物；及び／又は追加のアレルギー薬若しくは喘息薬を含むこともできる。
【００６０】
別の方法として、本発明の医薬組成物は、感染性疾患に対するワクチン接種又は免疫付与のための、微生物特異的な抗原調製物、及び／又は抗微生物剤をさらに含む。感染性疾患という用語は、体内における外来微生物又は感染性病原体の存在に起因する疾患を指す。感染性病原体、すなわち微生物という用語は、ウイルス、細菌及び寄生生物を指す。そのように、感染性病原体という用語は、正常な微生物相も含むことは、望ましくない。一態様において、本発明の医薬組成物及び微生物抗原の併用投与は、悪性細胞及び病原体に対して増強した免疫応答を刺激し、有用である。本明細書で使用される微生物抗原という用語は、無傷の微生物、並びにその天然の分離株、断片又は誘導体を含み、天然の微生物抗原と一致した、又は類似した合成化合物も含む。他のさらなる実施形態において、本発明の医薬組成物は、微生物抗原と特異的に結合又は認識する抗原又は抗体断片を含む。
【００６１】
他のさらなる実施形態において、本発明の化合物は、食品添加剤として使用される。本発明の化合物は、栄養調製物にも製剤できる。栄養調製物は、散剤、錠剤、カプセル剤、液体濃縮物、固形製品、又はそのまま飲める飲料など、選択的に経腸投与し得る。別の方法として、該実施形態の栄養調製物は、一般的な食品の添加剤として適切なマトリックスと結合する。他の実施形態において、本発明の栄養調製物は、特殊調製粉乳及び他の機能性食品の栄養強化に使用される。本組成物を含むさらなる実施形態は、チューインガムにできる。
【００６２】
本発明によるβ−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物の合成
タンパク質−糖質相互作用に関与する様々な因子を理解するために、強力な糖質阻害剤が必要であることから、この分野における合成及び発現が推進されている。構造、形状、サイズ、幾何学的形状及び原子価などの特徴が、糖質リガンドの一般的に弱い結合特性への影響において決定因子になることが証明されている。これらの結合相互作用の弱さを克服するために、クラスター及びオリゴマーから、糖ポリマー及びグリコールデンドリマーなどの高分子の多分散系までの範囲の多価ネオ複合糖質を生成して、親和性が高い抗接着因子を得ている。これらの、多数の多価糖質リガンドは、その動物又は植物の特異的なレクチンに対して試験された際に、強力な阻害特性を実証した。多価の領域において、受容体のクラスター化を通じて、生物学的プロセスのエフェクターとして多価糖質のサイズ変動が発現することは、興味深い話題である。一般的に、結び付きに関与する糖質は、リンカーを介して互いに連結される。Ｈｕｉｓｇｅｎによる、トリアゾールをもたらすためのアジド及びアルキンの１，３−双極子付加環化は、そのような結合において、おそらく最も強力な「クリック」反応である。糖質化学の分野において、クリックケミストリーは、アジドの機能を有する糖質が、糖類、ペプチド又はポリマー鎖に移植される、複合糖質及び糖質の大員環の合成に使用されている。
【００６３】
現在、本発明のβ−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物の合成に適用する手法には利用できるものもある。特に適切なものは、いわゆるクリックケミストリープロトコール（Ｂａｌｌｅｌｌら、２００６；Ｐｅｒｅｚ−Ｂａｌｄｅｒａｓら、２００５）である。
【００６４】
前記クリックケミストリープロトコールは、本発明によるβ−１，２−結合マンノ二糖に基づく三価分子の合成に使用されている。β−１，２−結合マンノ二糖の２−アジドエチルグリコシド及びトリ−Ｏ−プロパルギル化合物に基づくグリセロールの間のＣｕ（Ｉ）によって媒介されるクリック反応により、望ましい三価分子が優れた収率で供給された。
【００６５】
部分的に保護したチオグリコシド１（Ｃｉｒｃｈら、２００６）から、図２に示した最小限のステップ数で、三価化合物９（アセチル体）及び１０（ヒドロキシル体）に基づくβ−１，２−結合マンノ二糖を調製した。化合物９は、本発明の式（ＩＶ）の化合物と合致する。アセチル基を１のＣ−２位に導入して（α−選択的グリコシレーション中の隣接基関与を補助するため）、グリコシル供与体２を得た。Ｎ−ヨードスクシンイミド−ＴＭＳＯＴｆ（Ｏｈｌｓｓｏｎら、２０００）の存在下における、供与体２及び２−アジドエタノール（Ｐｆａｅｎｄｌｅｒら、１９９６）の間のグリコシル化により、１，２−トランス生成物３が６２％収率で得られた。化合物３のＺｅｍｐｌｅｎ脱アセチル化により、グリコシル受容体４（Ａｌｐｅら、２００３）が、定量的収率で得られた。
【００６６】
化合物４及びグリコシル供与体５（Ｃｉｒｃｈら、２００２）のＢＳＰ／Ｔｆ２Ｏによって媒介されるβ−選択的グリコシル化（Ｃｉｒｃｈら、２００１）を使用して、二糖６を６５％収率で得た。β−結合の存在を、δ１００．８で、アノマー炭素の定値１５７．０Ｈｚの１ＪＣＨカップリングによって確認した（Ｂｏｃｋｓら、１９７４）一方で、α−結合の存在を、δ９８．６で、アノマー炭素の定値１６８．２Ｈｚの１ＪＣＨカップリングによって確認した（Ｃｉｒｃｈら、２０００）。グリコシド６のエーテル基すべてのＴＦＡによって媒介される脱保護（Ｃｏｄｅｅら、２００５）に続いて従来のアセチル化を行い、２ステップにわたって、化合物７を収率９１％で得た。２−アジドエチルグリコシド７及びトリ−Ｏ−プロパルギルグリセロール８の間に頑強なクリックカップリングを適用すること（Ｍｏｕｒｅｒら、２００８）により、アセチル化三価化合物９が８７％の収率で供給され、Ｚｅｍｐｌｅｎ脱アセチル化すると、完全に脱保護された三価化合物１０が９３％の収率で得られた（図２）。
【００６７】
本発明によるβ−１，２−結合三価マンノオリゴ糖化合物の官能基修飾
本発明のβ−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物は、式（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）及び図２、３及び４においてＲで表される、いくつかの官能基を含む。これらは、ごく普通の処理により、それらのマンノオリゴ糖誘導体に変換でき、環状ヒドロキシル基の少なくとも１個の水素が別の化学部分に置き換えられる。一実施形態において、アセチル基若しくはＣ２〜Ｃ６アシル基、又はベンジル基若しくはクロロベンジル基などの保護基を使用してマンノピラース誘導体を形成する。これらの位置において、保護基又は他の置換基を使用することは、化合物を合成する間、或いは、本発明のβ−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物を含む医薬品を製剤又は投与する間、有益になり得る。官能基Ｒをそれらの誘導体に変換する場合、Ｒで表される基すべてが同一の反応ステップで変換される可能性があり、又は選択される位置でＲ基への変換が発生する可能性があり、変化できる置換基を有する化合物が生じる。しかし、Ｒ基すべてが反応して、同一の置換基を表すことが好ましい。アセチル及びアシル誘導体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで加水分解でき、マンノピラース複合体を形成する。
【００６８】
これは、図３により具体的に例示されており、三価マンノシド１０を、他の官能基に誘導体化できる程度を示す。無水トリフルオロ酢酸／トリフルオロ酢酸ピリジンが反応すると、三価の１０は１１に変形する一方で、ＳＯ３．Ｐｙ／ピリジン（ｄｅ  Ｐａｚら、２００５）を用いた１０のヒドロキシル基の処理は、より親水性の高い硫酸基に変換できるので、図３に示したように三価の１２を形成できる。望ましい場合は、誘導体化を省くことができ、例えば投与する前に化合物１０を再度得ることができる。
【００６９】
本発明によるβ−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物のリンカー部の構造修飾
本発明者らは、異なるリンカー構造を利用した場合でも、β−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物により、優れた結果が得られることを見出し、実験的に示した。リンカーは、例えば、トリアゾール部分又はその誘導体を含むことができる。
【００７０】
銅によって媒介されるアジド−アルキン付加環化（クリックケミストリー）反応は、付着点でトリアゾール部分を生成する。これらのトリアゾール部分は、水素結合を通じた標的との関連により、分子の生物活性を増強できる。したがって、不活性リンカーだけではないことがある。その影響を十分に理解するために、これらのトリアゾール部分は、類似したスペーサー長さで単純な炭素鎖に置き換えることができる。単純な炭素鎖を有する単糖含有三価分子は、多少類似した方法で合成できる。
【００７１】
β−１，２−結合マンノ二糖含有三価化合物を合成するために、チオグリコシドを、最初のα結合を誘導するためのグリコシル供与体として使用できる。アリルアルコールを用いた、前記チオグリコシドのＮＩＳ／ＴＭＳＯＴｆによって媒介されるα選択的グリコシル化により、アリルグリコシドが供給される。このアリルグリコシドのＺｅｍｐｌｅｎ脱アセチル化により、グリコシル供与体を用いたＢＳＰ／Ｔｆ２Ｏによって媒介されるβ−選択的グリコシル化により二糖が供給できると、グリコシル受容体が得られる。９−ＢＢＮを用いたヒドロホウ素化に続いて、Ｈ２Ｏ２／ＮａＯＨを用いて酸化させ、前記二糖の二重結合を第一級アルコールに変換させ、ひいては２−ヒドロキシエチルグリコシドを形成できる（Ｓｏｄｅｒｑｕｉｓｔら、１９８０）。Ｂｅｎｔｚら、２００６及びＭａｔｓｕｄａら、２００６によればＣＢｒ４／ＰＰｈ３を用いて処理すると、ヒドロキシル基はブロモ基に変化して中間体が供給される。
【００７２】
三価化合物を供給するために、アセチル化陰イオンを用いて、炭素−炭素結合をさらに形成できる。１０％超の水素の存在下で触媒水素化／水素化分解すると、Ｐｄ−Ｃにより完全に脱保護され、飽和されたβ−１，２−結合マンノ二糖含有三価化合物が得られる。従来のそのアセチル化では、アセチル化誘導体が供給できた。さらに、ＳＯ３．Ｐｙ／ピリジンを用いた処理では硫酸化誘導体が供給できた。
【実施例】
【００７３】
β−１，２−結合三価マンノオリゴ糖化合物の実験的合成
β−結合三価マンノシドの実験的合成を、図２の参照番号を使用して、以下に記載した。
【００７４】
フェニル２−Ｏ−アセチル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−α−Ｄ−マンノピラノシド（２）：ピリジン（１０ｍＬ）中の化合物１（１．８５ｇ、３．８５ｍｍｏｌ）の溶液に、無水酢酸（５ｍＬ）を加え、混合物を室温で４時間撹拌した。溶媒を蒸発させて、トルエン（３×１０ｍＬ）と同時蒸発させる。ＳｉＯ２（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ；５：１）上の粗反応混合物を精製して、無色の泡として純粋化合物２（１．９ｇ、９４％）を得た。ESI-HRMS, 計算値 C29H30O7SNa [M+Na]+: 545.1610; 実測値: 545.1622.
【００７５】
２−アジドエチル２−Ｏ−アセチル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−α−Ｄ−マンノピラノシド（３）：ＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）中の化合物２（１．５ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及び２−アジドエタノール（３００ｍｇ、３．４４ｍｍｏｌ）の溶液に、４Åモレキュラーシーブ（１．５ｇ）を加え、アルゴン雰囲気下で、混合物を室温で３０分間撹拌した。ＮＩＳ（７７５ｍｇ、３．４４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を−４０℃まで冷却し、続いてＴＭＳＯＴｆ（３８ｍｇ、３１μｌ、０．１７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、同一温度で２時間撹拌して、Ｅｔ３Ｎ（１００μｌ）を用いてクエンチした。反応混合物をｃｅｌｉｔｅのパッドを通して濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）を用いて洗浄した。合わせた有機層を、水（３０ｍＬ）、飽和水性ＮａＨＣＯ３（２×３０ｍＬ）及びブライン溶液（２×３０ｍＬ）をそれぞれ用いて洗浄した。次いで、有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮し、ＳｉＯ２（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ；７：２）を通して精製して、無色の泡として、純粋な３（８９０ｍｇ、６２％）を得た。ESI-HRMS, 計算値 C25H29N3O8Na [M+Na]+: 522.1852; 実測値: 522.1839.
【００７６】
２−アジドエチル４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−α−Ｄ−マンノピラノシド（４）：ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中の化合物３（７８０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の溶液に、ナトリウムメトキシド（ＭｅＯＨに０．１Ｍ、６００μＬ）を加え、混合物を室温で２時間撹拌した。Ｄｏｗｅｘ（登録商標）５０ＷＸ８−１００（Ｈ＋）を加えて中和した。反応混合物を濾過し、メタノール（３×１０ｍＬ）を用いて洗浄した。合わせた有機層を、減圧下で蒸発乾固させて、無色の油として化合物４（６９０ｍｇ、定量的）を得た。４に対する特性評価データは、文献（Ａｌｐｅら、２００３）に報告されているものに従っている。
【００７７】
２−アジドエチル（４，６−Ｏ−ベンジリデン−２，３−ジ−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−β−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→２）−４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−α−Ｄ−マンノピラノシド（６）：ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中のグリコシル供与体５（１．５ｇ、２．４９ｍｍｏｌ）の溶液に、４Åモレキュラーシーブ（２ｇ）を加え、アルゴン雰囲気下で、混合物を室温で３０分間撹拌した。−６０℃でＢＳＰ（６３０ｍｇ、２．９９ｍｍｏｌ）及びＴＴＢＰ（９３０ｍｇ、３．７４ｍｍｏｌ）を加え、続いてＴｆ２Ｏ（９２０ｍｇ、５５０μｌ、３．２４ｍｍｏｌ）を加え、同一条件下で３０分間撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中の化合物４（９５０ｍｇ、２．０８ｍｍｏｌ）を、−７８℃で反応混合物に加え、Ｅｔ３Ｎ（１ｍＬ）を用いてクエンチする前に、この温度で２時間撹拌した。次いで、反応混合物をｃｅｌｉｔｅのパッドを通して濾過し、続いてＣＨ２Ｃｌ２（６０ｍＬ）を用いて洗浄した。合わせた有機層を、水（２×３０ｍＬ）、ブライン（２０ｍＬ）を用いて洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮し、ＳｉＯ２（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ；５：２）を通して精製して、無色の泡としてβ−異性体６（１．２７ｇ、６５％）を得た。ESI-HRMS, 計算値 C52H57N3O14Na [M+Na]+: 970.3739; 実測値: 970.3717.
【００７８】
２−アジドエチル（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→２）−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（７）：ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中の化合物６（１．０ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）及び１，３−プロパンジチオール（９１５ｍｇ、８５０μＬ、８．４４ｍｍｏｌ）の、撹拌した溶液に、０℃でＴＦＡ−Ｈ２Ｏ（５ｍＬ、４：１）を加え、撹拌を室温で２時間続けた。反応混合物を、水（１５ｍＬ）を用いて希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２（４×１５ｍＬ）を用いて洗浄して、すべての非極性有機物質を除去した。水性相を蒸発させ、続いて減圧下でトルエン（４×２０ｍＬ）と同時蒸発させた。次いで、粗生成物をピリジン（２０ｍＬ）中で溶解し、続いて０℃でＡｃ２Ｏを加え、その後反応混合物を室温で２０時間撹拌した。減圧下で溶媒を蒸発させ、続いてトルエン（３×２０ｍＬ）と同時蒸発させた。次いで、粗生成物を、ＳｉＯ２（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ；１：１）を通して精製して、白色粉末としてアセチル化生成物７（６７５ｍｇ、９１％）を得た。ESI-HRMS, 計算値 C28H39N3O18Na [M+Na]+: 728.2127; 実測値: 728.2112.
【００７９】
１，２，３−トリス［１−［（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→２）−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシルオキシエチル）］−４−［メチル−１−オキシ］トリアゾリル］プロパン（９）、すなわち本発明の式（ＩＶ）による化合物：ｔＢｕＯＨ：Ｈ２Ｏ：ＣＨ２Ｃｌ２（６ｍＬ、１：１：１、ｖ／ｖ／ｖ）中の２−アジドエチルグリコシド７（３００ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）及び８（２６．６ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）の溶液に、硫酸銅（６．２ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）及びアスコルビン酸ナトリウム（１５．３ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をそれぞれ加え、５５℃で１２時間加熱した。飽和ＮＨ４Ｃｌ及び水（２０ｍＬ、１：１）を溶液に注ぎ、続いてＣＨ２Ｃｌ２（３×２０ｍＬ）を用いて抽出した。有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮し、ＳｉＯ２（ＣＨ２Ｃｌ２の４％ＭｅＯＨ）を通して精製して、無色の固体として純粋な標題の化合物９（２６０ｍｇ、８７％）を得た。Ｒｆ：０．４５（ＣＨ２Ｃｌ２に７％ＭｅＯＨ）；［α］Ｄ２５−６７．５°（ｃ１、ＣＨＣｌ３）； 1H NMR(600.13MHz, CDCl3) δ 7.80(s, 1H), 7.73(s, 1H), 7.72(s, 1H), 5.48-5.46(m, 3H), 5.25-5.21(m, 6H), 5.04-5.00(m, 3H), 4.91-4.87(m, 3H), 4.81-4.77(m, 5H), 4.70-4.69(m, 3H), 4.67-4.55(m, 10H), 4.34-4.30(m, 3H), 4.28-4.27(m, 3H), 4.20-4.16(m, 3H), 4.14-4.09(m, 3H), 4.02-3.99(m, 6H), 3.93-3.90(m, 3H), 3.82(五重線, J=5.2Hz, 1H), 3.69-3.54(m, 10H), 2.23(br s, 9H), 2.12(br s, 9H), 2.09(br s, 9H), 2.04(br s, 9H), 2.03(br s, 6H), 2.02(br s, 9H), 2.01(s, 3H), 2.00(brs, 9H); 13C NMR(150.9MHz, CDCl3) δ 170.8(3 C), 170.6, 170.5(2 C), 170.3, 170.2(4 C), 170.1, 169.9, 169.8(2 C), 169.6(3 C), 169.2, 169.1(2 C), 145.5, 145.0, 144.9, 123.8, 123.7(2 C), 97.4(3 C), 96.2(3 C), 77.1, 72.1(2 C), 72.0, 71.9, 71.8(2 C), 70.6, 70.5(2 C), 70.0(4 C), 69.9, 68.9(2 C), 68.8, 68.4(3 C), 66.0(3 C), 65.9(3 C), 64.7(3 C), 64.4(2 C), 63.5, 62.3(3 C), 61.6, 61.5(2 C), 49.7(2 C), 49.6, 20.7(6 C), 20.6(6 C), 20.5(6 C), 20.4(3 C); MALDI-TOF-MS, 計算値 C96H131N9O57Na [M+Na]+: 2344.752; 実測値: 2344.768.
【００８０】
１，２，３−トリス［１−（β−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→２）−（α−Ｄ−マンノピラノシルオキシエチル）］−４−［メチル−１−オキシ］トリアゾリル］プロパン（１０）：ＭｅＯＨ（３ｍＬ）中の化合物９（４７ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）の溶液に、ナトリウムメトキシド（ＭｅＯＨに０．１Ｍ、１００μＬ）を加え、混合物を室温で２時間撹拌した。Ｄｏｗｅｘ（登録商標）５０ＷＸ８−１００（Ｈ＋）を加えて中和した。反応混合物を濾過し、メタノール（３×２０ｍＬ）を用いて洗浄した。合わせた有機層を、減圧下で蒸発乾固させて、白色の泡として純粋な１０（２７ｍｇ、９３％）を得た。［α］Ｄ２５−２．０°（ｃ１、Ｈ２Ｏ）； 1H NMR(600.13MHz, D2O) δ 8.09(br s, 2H), 8.08(s, 1H), 4.92-4.90(m, 3H), 4.74(br s, 2H), 4.70-4.64(m, 13H), 4.14-4.09(m, 3H), 4.08-4.06(m, 3H), 4.00(d, J=3.2Hz, 3H), 3.97-3.87(m, 8H), 3.74-3.61(m, 21H), 3.55(t, J=9.7Hz, 3H), 3.36-3.32(m, 3H), 3.02-2.98(m, 3H); 13C NMR(150.9MHz, D2O) δ 144.0(3 C), 125.6(3 C), 98.5(3 C), 97.3(3 C), 77.0(3 C), 76.8, 76.3(3 C), 72.8(2 C), 72.7(3 C), 70.7(3 C), 69.8(3 C), 69.0(2 C), 66.6(4 C), 66.5(3 C), 65.5(3 C), 63.3(2 C), 62.1, 60.9(3 C), 60.2(3 C), 50.1(3 C); MALDI-TOF-MS, 計算値 C54H89N9O36Na [M+Na]+: 1462.530; 実測値: 1462.548.
【００８１】
本発明の式（ＩＶ）による同一の化合物、すなわち１，２，３−トリス［１−［（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→２）−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシルオキシエチル）］−４−［メチル−１−オキシ］トリアゾリル］プロパン（９）を、別の実験において大規模に生成した。中間体又は最終生成物の合成又は特性評価のすべてはここで示さないが、前記合成により、化合物７及び８から、上に記載した類似方法で、純粋な化合物である１，２，３−トリス［１−［（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→２）−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシルオキシエチル）］−４−［メチル−１−オキシ］トリアゾリル］プロパン（９）（２３０ｍｇ、７４％）が無色の固体として得られた。
【００８２】
長いリンカーを用いた本発明の式（ＩＶ）による免疫賦活化合物の類似体の合成
３−アジドプロピル２−Ｏ−アセチル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−α−Ｄ−マンノピラノシド（１３）：ＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）中の化合物２（２ｇ、３．８２ｍｍｏｌ）及び３−アジド−１−プロパノール（４６４ｍｇ、４．５９ｍｍｏｌ）の溶液に、４Åモレキュラーシーブ（１．５ｇ）を加え、アルゴン雰囲気下で、混合物を室温で３０分間撹拌した。ＮＩＳ（１．０３ｇ、４．５９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を−４０℃まで冷却し、続いてＴＭＳＯＴｆ（４５ｍｇ、３６μｌ、０．２０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、同一温度で２時間撹拌し、Ｅｔ３Ｎ（１００μｌ）を用いてクエンチした。反応混合物をｃｅｌｉｔｅのパッドを通して濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）を用いて洗浄した。合わせた有機層を、水（３０ｍＬ）、飽和水性ＮａＨＣＯ３（２×３０ｍＬ）及びブライン溶液（２×３０ｍＬ）をそれぞれ用いて洗浄した。次いで、有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮し、ＳｉＯ２を通して精製して、無色の泡として、純粋な１３（１．０９ｇ、５６％）を得た。Ｃ２６Ｈ３１Ｎ３Ｏ１８Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値：５３６．２１２７；実測値：５３６．１９５２
【００８３】
３−アジドプロピル４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−α−Ｄ−マンノピラノシド（１４）：ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中の化合物１３（９２０ｍｇ、１．７９ｍｍｏｌ）の溶液にメトキシドナトリウム（ＭｅＯＨに０．１Ｍ、６００μＬ）を加え、混合物を室温で４時間撹拌した。Ｄｏｗｅｘ（登録商標）５０ＷＸ８−１００（Ｈ＋）を加えて中和した。反応混合物を濾過し、メタノール（４×１５ｍＬ）を用いて洗浄した。合わせた有機層を、減圧下で蒸発乾固させて、無色の油として化合物１４（８２７ｍｇ、９６％）を得た。
【００８４】
３−アジドプロピル（４，６−Ｏ−ベンジリデン−２，３−ジ−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−β−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→２）−４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−α−Ｄ−マンノピラノシド（１５）：ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中のグリコシル供与体５（１．２４ｇ、２．０３ｍｍｏｌ）の溶液に、４Åモレキュラーシーブ（２ｇ）を加え、アルゴン雰囲気下で、混合物を室温で３０分間撹拌した。−６０℃でＢＳＰ（５１１ｍｇ、２．４４ｍｍｏｌ）及びＴＴＢＰ（７２７ｍｇ、２．９２ｍｍｏｌ）を加え、続いてＴｆ２Ｏ（６９０ｍｇ、４１２μｌ、２．４４ｍｍｏｌ）を加え、その後反応混合物を同一条件下で３０分間撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中の化合物１４（８００ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）を、−７８℃で反応混合物に加え、Ｅｔ３Ｎ（１ｍＬ）を用いてクエンチする前に、この温度で２時間撹拌した。次いで、反応混合物をｃｅｌｉｔｅのパッドを通して濾過し、続いてＣＨ２Ｃｌ２（６０ｍＬ）を用いて洗浄した。合わせた有機層を、水（２×３０ｍＬ）、ブライン（２０ｍＬ）を用いて洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮し、ＳｉＯ２を通して精製して、無色の泡としてβ−異性体１５（９３０ｍｇ、５７％）を得た。ESI-HRMS, 計算値 C53H59N3O14Na [M+Na]+: 985.0500; 実測値: 984.3821.
【００８５】
３−アジドプロピル（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→２）−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（１６）：ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中の化合物１５（８００ｍｇ、０．８３２ｍｍｏｌ）及び１，３−プロパンジチオール（９０１ｍｇ、８３５μＬ、８．３２ｍｍｏｌ）の、撹拌した溶液に、０℃でＴＦＡ−Ｈ２Ｏ（５ｍＬ、４：１）を加え、撹拌を室温で２時間続けた。反応混合物を、水（１５ｍＬ）を用いて希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２（４×１５ｍＬ）を用いて洗浄して、すべての非極性有機物質を除去した。水性相を蒸発させ、続いて減圧下でトルエン（４×２０ｍＬ）と同時蒸発させた。次いで、粗生成物をピリジン（１５ｍＬ）中で溶解し、続いて０℃でＡｃ２Ｏ（１０ｍＬ）を加え、その後反応混合物を室温で２０時間撹拌した。減圧下で溶媒を蒸発させ、続いてトルエン（３×２０ｍＬ）と同時蒸発させた。次いで、粗生成物を、ＳｉＯ２（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ；１：１）を通して精製して、白色粉末としてアセチル化生成物１６（３６５ｍｇ、６１％）を得た。ESI-HRMS, 計算値 C29H41N3O18Na [M+Na]+: 742.6507; 実測値: 742.2282.
【００８６】
１，２，３−トリス［１−［（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→２）−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシルオキシプロピル）］−４−［メチル−１−オキシ］トリアゾリル］プロパン（１７）：ｔＢｕＯＨ：Ｈ２Ｏ：ＣＨ２Ｃｌ２（６ｍＬ、１：１：１、ｖ／ｖ／ｖ）中の８（２６．６ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）及び２−アジドプロピルグリコシド１６（３００ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）の溶液に、硫酸銅（６．３ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）及びアスコルビン酸ナトリウム（１５．４ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をそれぞれ加え、混合物を５５℃で１２時間加熱した。飽和ＮＨ４Ｃｌ及び水（２０ｍＬ、１：１）を溶液に注ぎ、続いてＣＨ２Ｃｌ２（３×２０ｍＬ）を用いて抽出した。有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮し、ＳｉＯ２（ＣＨ２Ｃｌ２中の４％ＭｅＯＨ）を通して精製して、無色の固体として純粋な１７（１６０ｍｇ、６２％）を得た。1H NMR(600.13MHz, CDCl3) δ 7.69(s, 1H), 7.63(s, 2H), 5.48-5.47(m, 3H), 5.26-5.21(m, 6H), 5.05-5.03(m, 3H), 4.96-4.93(m, 3H), 4.77-4.73(m, 8H), 4.63(s, 4H), 4.49-4.45(m, 6H), 4.34-4.28(m, 6H), 4.34-4.22(m, 3H), 4.04-4.00(m, 6H), 3.87-3.85(m, 3H), 3.79-3.76(m, 1H), 3.76-3.73(m, 3H), 3.68-3.64(m, 7H), 3.48-3.37(m, 3H), 2.23(brs, 9H), 2.22-2.19(m, 6H), 2.09(br s, 9H), 2.08(br s, 9H), 2.04(br s, 9H), 2.02(br s, 9H), 2.01(br s, 9H), 1.99(br s, 9H); 13C NMR(150.9MHz, CDCl3) δ 170.9(3 C), 170.6(3 C), 170.4(3 C), 170.3(3 C), 169.9(3 C), 169.6(3 C), 169.3(3 C), 145.6, 145.2(2 C), 122.9, 122.7(2 C), 97.8(3 C), 96.3(3 C), 77.3, 72.1(3 C), 72.0(3 C), 70.6(3 C), 70.3(3 C), 70.2(2 C), 68.7(3 C), 68.5(3 C), 66.1(3 C), 65.0(3 C), 64.8(3 C), 64.6(2 C), 63.8, 62.4(3 C), 61.8(3 C), 47.1(3C), 30.0(3 C), 20.8(6 C), 20.7(9 C), 20.6(6 C); ESI-HRMS, 計算値 C99H137N9O57H [M+H]+: 2364.8100; 実測値: 2364.8168.
【００８７】
本発明による合成β−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物の生物学的試験
次に、本発明によるβ−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物を、その免疫学的活性について試験した。免疫学の分野における専門家が試験を行うので、それに合うように試料すべての名前を変更し、文書化し、報告した。先の実験で合成されたβ−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物は、以下の生物学的試験で言及されている。
【００８８】
ＣＭ−Ｃ８−２０１０は、好ましい実施形態によるβ−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物を指し、先に式ＩＶの化合物として記載され、化合物９として図２に示されている。
【００８９】
ＲＰ−Ｉ−８２  ２０１０は、別の好ましい実施形態によるβ−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物を指し、実施例４の生物学的活性について試験される。この化合物の合成スキームは、図４及び最終生成物１５としてのその構造に記載されている。
【００９０】
ＣＭ−Ｃ４−２０１０、ＣＭ−Ｃ７−２０１０及びＣＭ−Ｃ４−２０１１は、図７ａ、図７ｂ、図７ｃでそれぞれ示された構造を指す。
【００９１】
説明で論じられたサイトカインに加えて、腫瘍壊死因子であるＴＮＦに対する効果について、実施例４において細胞培養物をさらに試験した。ＴＮＦは、肥満細胞に発現する多面的炎症性サイトカインであり、喘息患者の気管支肺胞液、特により重篤な喘息患者の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）に高濃度で存在する。これは、難治性喘息において重要な役割を果たすであろうことを示唆している。
【００９２】
ヒトＰＢＭＣ
ヒトＰＢＭＣは、ヘパリン添加血液試料から、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｗｅｄｅｎ）密度勾配遠心法を用いて単離した。ＰＢＭＣを、ハンクス液（ＨＢＳＳ）を用いて２回洗浄し、５％自己血清、Ｌ−グルタミン（Ｆｌｕｋａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）２ｍＭ及びゲンタマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）１００μｇ／ｍｌを添加したＲＰＭＩ媒体中で懸濁した。細胞懸濁液をＲＰＭＩベースの培養物を希釈して１０６細胞／ｍｌとし、４８ウェル培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）に加えた。
【００９３】
（実施例１）
合成β−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物によるサイトカインの誘導
アトピーの対象３例の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料における、サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γの生成について、合成オリゴ糖を試験した。可溶化オリゴ糖を細胞培養物懸濁液に加えることによりＰＢＭＣを刺激した。この例で使用される合成多価β−１，２−結合オリゴ糖は、本発明の式（ＩＶ）の化合物（ＣＭ−Ｃ８−２０１０とコード化されている）、ＣＭ−Ｃ４−２０１０とコード化された三価単糖（Ｒ＝Ｈ）及びＣＭ−Ｃ７−２０１０とコード化された五価二糖（Ｒ＝Ｏ）による分子である。ＣＭ−Ｃ４−２０１０及びＣＭ−Ｃ７−２０１０の化学構造は、図７ａ及び７ｂに示されている。ＰＢＭＣに由来するサイトカイン反応を、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００（商標）という計測器を使用し、高感受性ヒトサイトカインＬＩＮＣＯｐｌｅｘ（商標）キット（ＬＩＮＣＯ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いてサイトカイン分泌を測定することにより、刺激開始から７２時間後に検出した。製造者のプロトコールに従って、Ｌｕｍｉｎｅｘの技術を利用してアッセイを行った。試験したオリゴ糖のうち、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０の高度な誘導因子は、ＣＭ−Ｃ８−２０１０とコード化された本発明の式（ＩＶ）の化合物による分子であり、中等度の誘導因子は、ＣＭ−Ｃ７−２０１０とコード化された分子であり、軽度の誘導因子はＣＭ−Ｃ４−２０１０とコード化された分子であった（図５）。ＩＬ−４及びＩＬ−５の生成は、まったく見られなかった。
【００９４】
（実施例２）
アレルゲン誘導免疫応答に対する合成β−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物の効果
本発明が正当であることを示すために、アレルギー性炎症を促進する主なＴｈ２型サイトカインの１つであるＩＬ−５の産生に対する、ＣＭ−Ｃ８−２０１０とコード化されている本発明の式（ＩＶ）の化合物による合成分子の効果を、アレルギー性鼻炎を有するカバノキアレルギー患者４名（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）の、アレルゲン（カバノキ）で刺激したＰＢＭＣ培養物において研究した。ＣＭ−Ｃ４−２０１１とコード化された三価アセチル化単糖を、陰性対照として使用した。ＣＭ−Ｃ４−２０１１の化学構造は図７ｃに示されている。ＰＢＭＣを、上で記載したように単離し、培養した。カバノキ全体のアレルゲン抽出物を５０μｇ／ｍｌの濃度で、及びＣＭ−Ｃ８−２０１０を２０μｇ／ｍｌの濃度で使用した。培養物を７２時間インキュベートした。続いて刺激を与え、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００（商標）という計測器を使用し、ＬＩＮＣＯｐｌｅｘ（商標）キットを用いてＩＬ−５の生成を測定した。すべての鼻炎患者の培養物において、ＣＭ−Ｃ８−２０１０は、カバノキアレルギーを誘導するＩＬ−５反応を効果的に抑制したが、ＣＭ−Ｃ４−２０１１では抑制が見られなかった（図６）。
【００９５】
（実施例３）
アレルゲン誘導免疫応答の抑制における合成β−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物と先行技術のアジュバントとの比較
アレルギー性炎症を促進する主なＴｈ２型サイトカインである、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３産生に対する、ＣＭ−Ｃ８−２０１０とコード化された本発明の式（ＩＶ）の化合物による合成分子の効果を、アレルギー性鼻炎を有するカバノキアレルギー患者２６名の、アレルゲン（カバノキ）で刺激したＰＢＭＣ培養物において研究した。効果を、３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、サルモネラ・ミネソタのリポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体及び免疫賦活細菌ＤＮＡ塩基配列（ＣｐＧ−ＯＤＮ−１）の効果と比較した。これらの分子を、アレルゲン免疫療法におけるアジュバントとして、臨床的に試験することに成功した。免疫賦活活性を伴わない、別の細菌ＤＮＡ塩基配列（ＣｐＧ−ＯＤＮ−２）を陰性対照として使用した。カバノキ花粉が多い時期の間に収集したＰＢＭＣを、上で記載したように単離し、培養した。カバノキ全体のアレルゲン抽出物を５０μｇ／ｍｌの濃度で、及びＣＭ−Ｃ８−２０１０を２００及び２０μｇ／ｍｌの濃度で使用した。ＣｐＧ−ＯＤＮ−１及びＣｐＧ−ＯＤＮ−２を５μｇ／ｍｌの濃度で、及びＭＰＬを、先に発表されている実験に基づき１０μｇ／ｍｌの濃度で使用した。培養物を２４時間インキュベートした。刺激後に、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００（商標）という計測器を使用し、ＬＩＮＣＯｐｌｅｘ（商標）キットを用いてＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３の生成を測定した。分析に関しては、高度に誘導されるサイトカイン反応を有する培養物のみが含まれた。ＣＭ−Ｃ８−２０１０は、カバノキアレルギーを誘導するＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３反応をＣｐＧ−ＯＤＮ−１又はＭＰＬよりも効果的に抑制した（表１）。抑制効果は、ＣｐＧ−ＯＤＮ−１又はＭＰＬを用いた対象よりも多くの対象で見られた。
【表１】
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【００９６】
結果により、本発明による化合物が、先行技術のアジュバントと比較して、より良好な抑制をもたらすことが示される。この実験において、結果から、本発明による化合物に対する患者間の変動は、先行技術の化合物に対する差異よりも少ないことをさらに示した。アレルギー反応は、いくつかの反応に依存し、調節因子の数によって影響を受ける。したがって、ＣｐＧ−ＯＤＮ−１が、ＩＬ−５及びＩＬ−１３にそれぞれ僅かな反応しかもたらさない場合、ＩＬ−４の反応は弱くなる。これに比較して、本発明の化合物で得られる結果は、きわめて有望であり、それ自体の特性により、多くの患者に対する治療及び適合性の見込みを改善することが予想される。
【００９７】
（実施例４）
合成オリゴ糖によるサイトカインの誘導
対象３例の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料において、サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＴＮＦ及びＩＦＮ−γの産成について、ＲＰ−Ｉ−８２とコード化された合成オリゴ糖を試験した。細胞培養物懸濁液内に可溶化オリゴ糖を加えることにより、ＰＢＭＣを刺激した。この実施例で使用される合成オリゴ価β−１，２−結合オリゴ糖は、本発明の式（ＩＶ）の化合物（ＲＰ−Ｉ−８２とコード化されている）による分子であった。ＲＰ−Ｉ−８２の合成スキーム及び化学構造は図２に示されている（化合物９）。陽性対照は、酸加水分解したカンジダ・アルビカンスのマンナン（ＣＡＭ）であった。Ｌｕｍｉｎｅｘ１００（商標）という計測器を使用し、高感受性ヒトサイトカインＬＩＮＣＯｐｌｅｘ（商標）キット（ＬＩＮＣＯ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いてサイトカイン分泌を測定することによる刺激開始から２４時間後に、ＰＢＭＣに由来するサイトカイン反応を検出した。製造者のプロトコールに従って、Ｌｕｍｉｎｅｘの技術を利用してアッセイを行った。試験したオリゴ糖は、ＩＬ−１０及びＴＮＦの高度な誘導因子であり、ＩＦＮ−γの中等度の誘導因子であった（表２）。ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３の生成はまったく見られなかった。
【表２】
2014520136.tif 000008
【００９８】
これらの結果から、本発明による化合物（ＲＰ−Ｉ−８２）は、サイトカインの特異的誘導であるＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ生成を細胞培養物懸濁液にもたらすと結論付けることができる。これは、ＩＬ−１０及びＴＮＦに対して、対照であるカンジダ・アルビカンスのマンナン（ＣＡＭ）よりもかなり高かった。前記対照のＣＡＭが、空試料（刺激なし）と比較して、すべてのサイトカインを誘導した一方、本発明による化合物（ＲＰ−Ｉ−８２）が、アレルゲンに対するＴｈ２型免疫応答の下方調節に重要な役割を果たす、選択的な誘導をもたらしたことも注目に値する。
【００９９】
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【図５】
2014520136.tif 000011
【図７ａ】
2014520136.tif 000012
【図７ｂ】
2014520136.tif 000013
【図７ｃ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2014520136.tif 000018
【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年4月18日(2013.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
ＲＰ−Ｉ−８２  ２０１０は、別の好ましい実施形態によるβ−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物を指し、実施例４の生物学的活性について試験される。この化合物の合成スキームは、図４及び最終生成物１７としてのその構造に記載されている。
【手続補正書】
【提出日】平成25年8月29日(2013.8.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2014520136.tif 000020
の免疫賦活性のオリゴ価又は多価β−１，２−結合マンノオリゴ糖化合物
（式中、ｎは０から６であり、ｍは３から５であり、各Ｒは、アセチル（ＣＯＣＨ３）、水素（Ｈ）、トリフルオロアセチル（ＣＯＣＦ３）、スルホネート基又は他のエステル基から独立して選択され、β−１，２−結合マンノオリゴ糖は、リンカー基（Ｂ）によって中心のコアユニット又は担体（Ａ）に連結されており、
前記β−１，２−結合マンノオリゴ糖は、リンカー基（Ｂ）とα結合しており、
リンカー基Ｂが、
−Ｘ−Ｙ−Ｚ、又は−Ｘ−Ｙ’−Ｚ
（式中、Ｘは、０である、又は基−ＣＨ２−又は原子Ｏ、Ｓ、若しくはＮを表し；
Ｙは、１から８個の炭素原子からなる骨格を有する炭素鎖を表し、場合により置換されていてもよく、最も好ましくは、４又は６個の炭素原子からなる直鎖骨格を有する脂肪族炭素鎖であり；
Ｙ’は、トリアゾール部分を表し、前記トリアゾールの１位の窒素から基−（ＣＨ２）ｐ−によってＸと結合しており（ここで、ｐは１から６である）、前記トリアゾール基の４位の炭素から基−（ＣＨ２）ｑ−によってＺと結合しており（ここで、ｑは１から６である）、前記β−１，２−結合マンノオリゴ糖は、リンカー基（Ｂ）とα結合しており；
Ｚは、ゼロである、又はＯ、Ｓ、若しくはＮから選択される原子を表す）
前記中心のコアユニット又は担体（Ａ）は、置換又は非置換の脂肪族部分又は芳香族部分である）。
【請求項２】
ＸがＯであり、
Ｙ’が、トリアゾール部分を表し、前記トリアゾールの１位の窒素から基−（ＣＨ２）ｐ−によってＸと結合しており、ｐが１から３であり、前記トリアゾール基の４位の炭素から基−（ＣＨ２）ｑ−によってＺと結合しており、ｑが１又は２であり、
ＺがＯである、
請求項１に記載の免疫賦活化合物。
【請求項３】
式（ＩＩ）
【化２】
2014520136.tif 000021
に従う請求項１又は２に記載の免疫賦活化合物
（式中、各Ｒは、アセチル（ＣＯＣＨ３）、水素（Ｈ）、トリフルオロアセチル（ＣＯＣＦ３）又はスルホネート基若しくは他のエステル基から独立して選択される）。
【請求項４】
各Ｒがアセチル（ＣＯＣＨ３）である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の免疫賦活化合物。
【請求項５】
医薬品として使用するための、請求項１から４までのいずれか一項に記載の免疫賦活化合物。
【請求項６】
ワクチンのアジュバントとして使用するための、請求項１から４までのいずれか一項に記載の免疫賦活化合物。
【請求項７】
Ｔｒｅｇ及び／若しくはＴｈ１型を誘導すること、並びに／又はＴｈ２型免疫応答を阻害することによって予防又は処置できる状態の処置に使用するための、請求項１から４までのいずれか一項に記載の免疫賦活化合物、又はそれらの組合せ。
【請求項８】
状態が、Ｉ型即時型アトピー性アレルギーである、請求項７に記載の使用のための免疫賦活化合物。
【請求項９】
状態が、
ａ）アトピー性湿疹／アトピー性皮膚炎症候群（ＡＥＤＳ）、
ｂ）アレルギー性喘息、
ｃ）アレルギー性鼻炎、
ｄ）アレルギー性蕁麻疹、
ｅ）食物アレルギー、
ｆ）毒物アレルギー、及び
ｇ）アレルギー性鼻結膜炎
からなる群から選択される、請求項７又は８に記載の使用のための免疫賦活化合物。
【請求項１０】
状態が、感染性疾患である、請求項７に記載の免疫賦活化合物。
【請求項１１】
請求項１から４までのいずれか一項に記載の免疫賦活化合物の少なくとも１つ、又はそれらの混合物、及び医薬として許容できる担体を含み、前記医薬として許容できる担体が、経皮担体、経粘膜担体、経口担体、非経口担体、デポー製剤用担体、及び徐放性製剤用担体からなる群から好ましくは選択される、前記免疫賦活組成物。
【請求項１２】
担体が、舌下及び／又はバッカル投与のための経粘膜担体である、請求項１０又は１１に記載の免疫賦活組成物。
【請求項１３】
特異的アレルゲン免疫療法のためのアレルゲン調製物；及び／又は追加的なアレルギー薬又は喘息薬をさらに含む、請求項１０から１２までのいずれか一項に記載の免疫賦活組成物。
【請求項１４】
感染性疾患に対するワクチン接種のための微生物特異的抗原；及び／又は抗微生物剤をさらに含む、請求項１１から１３までのいずれか一項に記載の免疫賦活組成物。
【請求項１５】
食品添加剤、又は栄養調製物としての、請求項１から４までのいずれか一項に記載の免疫賦活化合物、又はそれらの組合せの使用。
【国際調査報告】
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