(57)【要約】幹細胞に由来する中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞の新規細胞集団を、新規組み合わせマーカーを用いて単離する方法を提供する。パーキンソン病の治療のための細胞療法に、および薬理学的アッセイ法における基質として、該細胞集団を用いることができる。2014516528.tif 000009
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
中脳ドーパミン作動性神経前駆細胞を精製するための方法であって、
（a）中脳ドーパミン作動性（mDA）神経前駆細胞を含む神経前駆細胞集団を細胞培地中に供給する段階；
（b）コリン(Corin)と、オルソデンティクルホメオボックス(orthodenticle homeobox)2（Otx2）およびフリズルド(Frizzled)-5（Fzd5）からなる群より選択される1つまたは複数の追加のマーカーとを発現する神経前駆細胞を、段階（a）の細胞集団から単離する段階
を含み、コリンと1つまたは複数の追加の細胞マーカーとを発現する該神経前駆細胞がmDA神経前駆細胞として同定される、方法。
【請求項２】
mDA神経前駆細胞の単離がフローサイトメトリーを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記神経前駆細胞集団が、
（i）多能性細胞を含む細胞集団を細胞培地中に供給する段階；および
（ii）該多能性細胞の少なくともいくつかを神経前駆細胞に分化させる段階
を含む方法によって生成される、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
前記神経前駆細胞集団が、
（i）多能性細胞の集団を白血球阻止因子（LIF）および血清の存在下で培養する段階；
（ii）段階（i）で生成された細胞をLIFの非存在下で培養する段階；
（iii）段階（ii）で生成された細胞を、血清の非存在下で、かつ、インスリン、トランスフェリン、セレン、およびフィブロネクチンの存在下で培養する段階；ならびに
（iv）段階（iii）で生成されたネスチン陽性細胞を単離し、かつ、該ネスチン陽性細胞を、ラミニンと、線維芽細胞増殖因子8（FGF8）および塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）から選択される1つまたは複数の増殖因子との存在下で培養して、神経前駆細胞の集団を生成させる段階
を含む方法によって生成される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記神経前駆細胞集団が、
（i）多能性細胞の集団を、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）および線維芽細胞増殖因子8（FGF8）から選択される1つまたは複数の増殖因子の存在下で培養する段階；
（ii）段階（i）で生成された細胞を、ソニックヘッジホッグ（sonic hedgehog）（SHH）タンパク質の存在下でかつ血清の非存在下で培養する段階；ならびに
（iii）段階（ii）で得られた細胞をbFGFの存在下で培養して、神経前駆細胞の集団を生成させる段階
を含む方法によって生成される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記神経前駆細胞集団が、
（i）多能性細胞の集団を、線維芽細胞増殖因子8（FGF8）、上皮増殖因子（EGF）、および塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）から選択される1つまたは複数の増殖因子の存在下で培養する段階；
（ii）段階（i）で生成された細胞をbFGFの非存在下で培養する段階；ならびに
（iii）段階（ii）で生成された細胞をbFGFの存在下で培養して、神経前駆細胞の集団を生成させる段階
を含む方法によって生成される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記神経前駆細胞集団が、ネスチン陽性細胞の実質的に均一な細胞集団である、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記mDA神経前駆細胞を、線維芽細胞増殖因子8（FGF8）および塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）からなる群より選択される増殖因子の非存在下で培養することによって、該mDA神経前駆細胞をニューロン分化（ND）細胞の細胞集団にさらに分化させる、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
上皮増殖因子（EGF）を前記培地から除去して、ND細胞の集団を生成させる段階をさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
段階（b）で生成されたmDA神経前駆細胞が、フォークヘッドボックス(forkhead box)A2（FoxA2）；オルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）；LIMホメオボックス転写因子1、α（Lmx1a）；LIMホメオボックス転写因子1、β（Lmx1b）；Glast；ビメンチン；ネスチン；グリア線維酸性タンパク質（GFAP）；およびβ-チューブリンからなる群より選択されるマーカーのうち1つまたは複数をさらに発現する、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
段階（b）で生成されたmDA神経前駆細胞が、オルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）をさらに発現する、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記ND細胞が、
（a）チロシンヒドロキシラーゼ、ドーパミン活性輸送体、およびドーパミンデカルボキシラーゼからなる群より選択される1つまたは複数のマーカー、ならびに
（b）ペアード様ホメオドメイン(paired-like homeodomain)3（Pitx3）；LIMホメオボックス転写因子1、α（Lmx1a）；LIMホメオボックス転写因子1、β（Lmx1b）；フォークヘッドボックスA2（FoxA2）；エングレイルドホメオボックス(engrailed homeobox)1（En-1）；および核内受容体サブファミリー4、A群、メンバー2（Nurr1）からなる群より選択される1つまたは複数のマーカー
を発現する、請求項8記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質である、LIMホメオボックス転写因子1、α（Lmx1a）；フォークヘッドボックスA2（FoxA2）；およびオルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）の発現を誘導することによって前記神経前駆細胞を分化させる段階をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質であるコリンおよびフリズルド-5（Fzd5）の発現を誘導することによって前記神経前駆細胞を分化させる段階をさらに含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
中脳ドーパミン作動性（mDA）神経前駆細胞の実質的に均一な集団
を含む細胞集団であって、該mDA神経前駆細胞が、コリンと、オルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）およびフリズルド-5（Fzd5）からなる群より選択される1つまたは複数の追加のマーカーとを発現する、細胞集団。
【請求項１６】
前記mDA神経前駆細胞が、フォークヘッドボックスA2（FoxA2）；オルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）；LIMホメオボックス転写因子1、α（Lmx1a）；LIMホメオボックス転写因子1、β（Lmx1b）；Glast；ビメンチン；ネスチン；グリア線維酸性タンパク質（GFAP）；およびβ-チューブリンからなる群より選択されるマーカーのうち1つまたは複数をさらに発現する、請求項15記載の細胞集団。
【請求項１７】
前記mDA神経前駆細胞がオルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）をさらに発現する、請求項15記載の細胞集団。
【請求項１８】
前記mDA神経前駆細胞が放射状グリア様形態を有する、請求項15〜17のいずれか一項記載の細胞集団。
【請求項１９】
請求項15〜18のいずれか一項記載の細胞集団を含む、治療用組成物。
【請求項２０】
前記細胞集団が、生理的に適合性のある溶液中に懸濁されている、請求項19記載の治療用組成物。
【請求項２１】
前記細胞集団がカプセル封入されている、請求項20記載の治療用組成物。
【請求項２２】
前記細胞の少なくとも約50％が、コリンと、オルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）およびフリズルド-5（Fzd5）からなる群より選択される1つまたは複数の追加のマーカーとを発現する、請求項15〜18のいずれか一項記載の細胞集団。
【請求項２３】
前記細胞の少なくとも約90％が、コリンと、オルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）およびフリズルド-5（Fzd5）からなる群より選択される1つまたは複数の追加のマーカーとを発現する、請求項15〜18のいずれか一項記載の細胞集団。
【請求項２４】
患者における神経変性疾患を治療するための方法であって、細胞の実質的に均一な集団を該患者の脳に投与する段階を含み、該集団の細胞が、マーカーであるコリンと、オルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）およびフリズルド-5（Fzd5）からなる群より選択される1つまたは複数の追加のマーカーを発現することを特徴とする、方法。
【請求項２５】
前記細胞の集団が中脳ドーパミン作動性（mDA）神経前駆細胞を含む、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が、フォークヘッドボックスA2（FoxA2）；オルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）；LIMホメオボックス転写因子1、α（Lmx1a）；LIMホメオボックス転写因子1、β（Lmx1b）；Glast；ビメンチン；ネスチン；グリア線維酸性タンパク質（GFAP）；およびβ-チューブリンからなる群より選択されるマーカーのうち1つまたは複数をさらに発現する、請求項24または25記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞がオルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）をさらに発現する、請求項24または25記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞の形態が放射状グリア様形態である、請求項24〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が前記患者の尾状核に投与される、請求項24〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が前記患者の黒質に投与される、請求項24〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が前記患者の黒質のA9領域に投与される、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
段階（b）で単離された神経前駆細胞が、オルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）タンパク質およびフリズルド-5（Fzd5）タンパク質のうち1つまたは複数を発現し、かつ、該タンパク質が、タンパク質発現の検出を可能にするタグと結合している、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
前記タグが蛍光によって検出される、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
前記タグが緑色蛍光性タンパク質（GFP）である、請求項32記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条（e）（35 U.S.C. §119（e））の下で、2011年5月20日に出願された米国特許仮出願第61/488,678号の優先権を主張し、その内容の全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられる。
【０００２】
政府の援助
本発明は、米国国立神経疾患・脳卒中研究所（National Institute of Neurological Disorders and Stroke）および米国国立精神衛生研究所（National Institute of Mental Health）によって授与された助成金番号NS070577、MH048866およびMH087903の下で、米国政府の援助を受けて行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本出願は、EFS-Web経由でASCII形式において提出された配列表を含み、この配列表はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。2012年5月17日に作成された該ASCIIコピーは、63476PCT.txtの名称が付けられており、サイズが28,539バイトである。
【０００４】
技術分野
本明細書に記載された技術は、神経前駆細胞の分野に関する。具体的には、本明細書に記載された技術は、ドーパミン作動性分化能を有する神経前駆細胞の精製された集団に関する方法および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００５】
背景
以下の説明は、読み手の理解を手助けするために提供される。提供される情報および引用される参考文献のいかなるものも、本発明に対する先行技術であると認めているわけではない。
【０００６】
ドーパミン（DA）が50年前に脳神経伝達物質として同定されて以来（Carlsson et al., 1957）、数多くの科学者が、正常な脳ならびに罹患した脳におけるその決定的な役割を実証してきた。DAニューロンの大部分は腹側中脳（ventral mesencephanlon）に存在し、中脳DA（mDA）ニューロンを形成する。それらは随意運動、報酬および気分に関係した行動を決定的に制御し、それらの変性／機能不全はパーキンソン病（PD）および統合失調症などの重い脳障害と関連性がある。したがって、増大可能なmDA前駆細胞の精製および性質決定は、これらの疾患に対する有効な治療アプローチの設計のため、ならびにmDAニューロンの発生および生物現象の深い理解を得るために極めて重要である。胚性幹細胞（ESC）および誘導多能性幹細胞（iPSC）などの多能性幹細胞技術の最近の発展により、そのような目的に向けた無限の量の分化細胞の見込みが生まれているが、それは、分化細胞の異種混交的な集団から特定の子孫を単離／精製することのできる信頼性の高い方法がある場合に限られる。
【０００７】
さまざまな研究所による多くの研究にもかかわらず、mDA神経前駆細胞（NP細胞）を精製しうる単一のマーカーはまだ見いだされていない。しかし、本研究所および他の研究所におけるmDAニューロンの発生学的研究から得られた知見に基づいて、mDA NPを同定して精製することができる。mDAニューロンの機能不全は、神経変性および精神障害などのさまざまな脳疾患と関連づけられている。特に、mDAニューロンの選択的変性は、最も頻度の高い神経変性障害の1つであるPDの原因となる。PDは、線条体内のDA神経終末の70〜80％よりも多くが変性した場合に診断されることが多い（Agid, 1991）。このため、PDを治療するための再構成療法の必要性から、胎児細胞移植療法が開発されるに至っている（Lindvall and Bjorklund, 2004）。
【０００８】
胎児DA細胞移植はPDの細胞ベースの療法の原理証明を示してはいるが、標準化された胎児細胞がないこと、および倫理的な議論が理由で、その使用は限られている。代替的に、mDAニューロンを、無限の細胞供給源としてのESCから得られることもできる（Bjorklund et al., 2002；Chung et al., 2002；Kawasaki et al., 2000；Kim et al., 2002；Perrier et al., 2004；Roy et al., 2006）が、ES由来の子孫は異種混交的であり、それ故に移植後にそれらの機能を制御することが困難であり、それがESCの臨床適用にとっての大きな障害の1つとなっている。ESC由来の細胞はしばしば、比較的未熟な細胞や、腫瘍を形成しうる残存性の多能性細胞さえも含む（Chung et al., 2006a；Roy et al., 2006；Schulz et al., 2004；Zeng et al., 2004）。加えて、標準化された細胞供給源がないこと、および不都合な細胞組成（例えば、セロトニン作動性ニューロンが過剰に多い）によって、移植後に移植片誘発性ジスキネジーなどの合併症が引き起こされる恐れもある（Lindvall and Kokaia, 2009；Politis et al, 2010）。
【０００９】
したがって、分化したESCから移植前に所望の細胞種を精製することが、移植片の安全性および効率的な機能のために決定的に重要である。さらに、ESC由来の子孫からの、機能的に検証されたmDA細胞の単離は、PDの病因のさらなる解明および有効な治療アプローチの設計のために極めて重要であり、mDA NP細胞およびmDAニューロンの生物現象を研究するための有益な資源をもたらす可能性がある。その上、それはバイオアッセイ法および薬物スクリーニングのツールとしても役立ち、それにより、PDの治療のための薬理学的介入を容易にすると考えられる。最近開発されたiPSC技術（Takahashi and Yamanaka, 2006）は、疾患特異的または患者特異的な幹細胞を作製する可能性を提供し、それは、シャーレ（dish）の中で疾患をモデル化するため、または非自己性細胞療法によって引き起こされる免疫拒絶を回避するための、1つの方策をもたらしうると考えられる。しかし、これらの多能性細胞（例えば、ESCおよびiPSC）の転換能（translational potential）のすべてを現実のものにするためには、特異的な細胞集団を同定して精製するための、信頼性が高くかつ最適な方法を開発することが決定的に重要である。さらに、インビトロおよびインビボで最終分化したニューロンが極めて脆弱で生存性が乏しいことを考慮すれば、増大可能であり、かつより優れた生存能力がある、特異的な神経前駆細胞を同定して単離することが重要である。
【発明の概要】
【００１０】
概要
本方法および本組成物は、ヒト胚性幹細胞（hESC）を含む多能性細胞からインビトロで得られた特異的な神経前駆細胞集団の発見、単離および性質決定、ならびにその作製および使用のための方法に基づく。具体的に同定されたのは、コリン(Corin)およびフリズルド(Frizzled)-5（Fzd5）を発現する中脳ドーパミン作動性神経前駆細胞の集団である。
【００１１】
1つの局面において、本技術は、中脳ドーパミン作動性神経前駆細胞を精製するための方法であって、（a）中脳ドーパミン作動性（mDA）神経前駆細胞を含む神経前駆細胞集団を細胞培地中に供給する段階、ならびに（b）コリンと、Otx2およびフリズルド-5（Fzd5）からなる群より選択される1つまたは複数の追加のマーカーとを発現する神経前駆細胞を、段階（a）の細胞集団から単離する段階を含む、方法を含む。コリンと1つまたは複数の追加の細胞マーカーとを発現する神経前駆細胞は、mDA神経前駆細胞として同定される。
【００１２】
いくつかの態様において、mDA神経前駆細胞を単離することは、フローサイトメトリーを含む。いくつかの態様において、神経前駆細胞集団は、（i）多能性細胞を含む細胞集団を細胞培地中に供給する段階；および（ii）該多能性細胞の少なくともいくつかを神経前駆細胞に分化させる段階を含む方法によって、生成される。
【００１３】
いくつかの態様において、神経前駆細胞集団は、（i）多能性細胞の集団を白血球阻止因子（LIF）および血清の存在下で培養する段階、（ii）段階（i）で生成された細胞をLIFの存在下で培養する段階、（iii）段階（ii）で生成された細胞を、血清の非存在下で、かつ、インスリン、トランスフェリン、セレン、およびフィブロネクチンの存在下で培養する段階；ならびに（iv）段階（iii）で生成されたネスチン陽性細胞を単離し、かつ、該ネスチン陽性細胞をラミニンの存在下で培養する段階を含む方法によって生成される。段階（iv）の細胞を、線維芽細胞増殖因子8（FGF8）および塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）から選択される1つまたは複数の増殖因子の存在下で培養して、神経前駆細胞の集団を生成させる。
【００１４】
いくつかの態様において、神経前駆細胞集団は、（i）多能性細胞の集団を、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）および線維芽細胞増殖因子8（FGF8）から選択される1つまたは複数の増殖因子の存在下で培養する段階、（ii）段階（i）で生成された細胞を、ソニックヘッジホッグ（SHH）タンパク質の存在下でかつ血清の非存在下で培養する段階、ならびに（iii）段階（ii）で得られた細胞をbFGFの存在下で培養して、神経前駆細胞の集団を生成させる段階を含む方法によって生成される。
【００１５】
いくつかの態様において、神経前駆細胞集団は、（i）多能性細胞の集団を、線維芽細胞増殖因子8（FGF8）、上皮増殖因子（EGF）、および塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）から選択される1つまたは複数の増殖因子の存在下で培養する段階、（ii）段階（i）で生成された細胞をbFGFの非存在下で培養する段階、ならびに（iii）段階（ii）で生成された細胞をbFGFの存在下で培養して、神経前駆細胞の集団を生成させる段階を含む方法によって生成される。
【００１６】
いくつかの態様において、神経前駆細胞集団は、ネスチン陽性細胞の実質的に均一な細胞集団である。いくつかの態様において、mDA神経前駆細胞は、mDA神経前駆細胞を、線維芽細胞増殖因子8（FGF8）および塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）からなる群より選択される増殖因子の非存在下で培養することによって、ニューロン分化（ND）細胞の細胞集団へとさらに分化させられる。いくつかの態様においては、上皮増殖因子（EGF）を培地から除去して、ND細胞の集団を生成させる。
【００１７】
いくつかの態様において、単離されたmDA神経前駆細胞は、FoxA2、Otx2、Lmx1a、Lmx1b、Glast、ビメンチン、ネスチン、GFAP、およびβ-チューブリンからなる群より選択されるマーカーのうち1つまたは複数をさらに発現する。いくつかの態様において、単離されたmDA神経前駆細胞はOtx2をさらに発現する。
【００１８】
方法のいくつかの態様において、ND細胞は、（a）チロシンヒドロキシラーゼ、ドーパミン活性輸送体およびドーパミンデカルボキシラーゼからなる群より選択される、1つまたは複数のマーカー、ならびに（b）Pitx3、Lmx1a、Lmx1b、FoxA2、En-1、およびNurr1からなる群より選択される、1つまたは複数のマーカーを発現する。方法のいくつかの態様においては、神経前駆細胞を、タンパク質である、Lmx1a、FoxA2、およびOtx2の発現を誘導することによって分化させる。方法のいくつかの態様においては、神経前駆細胞を、タンパク質であるコリンおよびFzd5の発現を誘導することによって分化させる。
【００１９】
いくつかの態様において、段階（b）で単離された神経前駆細胞は、Otx2タンパク質およびFzd5タンパク質のうち1つまたは複数を発現し、該タンパク質は、タンパク質発現の検出を可能にするタグと結合している。いくつかの態様において、タグは蛍光性である。いくつかの態様において、タグは緑色蛍光タンパク質（GFP）である。
【００２０】
本技術の別の局面は、中脳ドーパミン作動性（mDA）神経前駆細胞の実質的に均一な集団を含む細胞集団であって、mDA神経前駆細胞が、コリンと、Otx2およびフリズルド-5（Fzd5）からなる群より選択される1つまたは複数の追加のマーカーとを発現する、細胞集団を提供する。いくつかの態様において、mDA神経前駆細胞は、FoxA2、Otx2、Lmx1a、Lmx1b、Glast、ビメンチン、ネスチン、GFAP、およびβ-チューブリンからなる群より選択されるマーカーのうち1つまたは複数をさらに発現する。いくつかの態様において、mDA神経前駆細胞はOtx2をさらに発現する。いくつかの態様において、mDA神経前駆細胞は放射状グリア様形態を有する。いくつかの態様において、細胞集団における、コリンと、Otx2およびFzd5からなる群より選択される1つまたは複数の追加のマーカーとを発現する細胞のパーセンテージは、約50％であり、約60％であり、約70％であり、約80％であり、約90％である。
【００２１】
本技術の別の局面は、中脳ドーパミン作動性（mDA）神経前駆細胞の実質的に均一な集団を含む細胞集団を含む治療用組成物であって、mDA神経前駆細胞が、コリンと、Otx2およびフリズルド-5（Fzd5）からなる群より選択される1つまたは複数の追加のマーカーとを発現する、治療用組成物を提供する。いくつかの態様において、治療用組成物の細胞集団は、生理的に適合性のある溶液中に懸濁されている。いくつかの態様において、治療用組成物の細胞集団はカプセル封入されている。
【００２２】
本技術の別の局面は、患者における神経変性疾患を治療するための方法であって、細胞の実質的に均一な集団を該患者の脳に投与する段階を含み、該集団の該細胞が、マーカーであるコリンと、Otx2およびフリズルド-5（Fzd5）からなる群より選択される1つまたは複数の追加のマーカーを発現することを特徴とする、方法を提供する。いくつかの態様において、細胞の集団は、中脳ドーパミン作動性（mDA）神経前駆細胞を含む。いくつかの態様において、細胞は、FoxA2、Otx2、Lmx1a、Lmx1b、Glast、ビメンチン、ネスチン、GFAP、およびβ-チューブリンからなる群より選択されるマーカーのうち1つまたは複数をさらに発現する。いくつかの態様において、細胞はOtx2をさらに発現する。いくつかの態様において、細胞の形態は放射状グリア様形態である。
【００２３】
いくつかの態様において、細胞は患者の尾状核に投与される。いくつかの態様において、細胞は患者の黒質に投与される。いくつかの態様において、細胞は患者の黒質のA9領域に投与される。
【００２４】
いくつかの態様において、神経前駆細胞集団は、（i）多能性細胞の集団をTGF-β阻害物質およびNogginタンパク質の存在下で培養する段階；（ii）段階（i）で生成された細胞をTGF-β阻害物質の非存在下で培養する段階；（iii）段階（ii）で生成された細胞を塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）の存在下で培養して、神経前駆細胞の集団を生成させる段階を含む方法によって生成される。
【００２５】
別の局面において、本明細書に記載された技術は、フリズルド-5受容体の細胞外エピトープを特異的に認識し、かつ神経前駆細胞と結合する抗体を提供する。ある態様において、抗体は胚性幹細胞と結合しない。いくつかの態様において、抗体はマウスまたはウサギに由来する。いくつかの態様において、抗体はフローサイトメトリーに用いるのに適している。
【００２６】
「フリズルド-5」または「Fzd5」という用語は、Wnt5Aリガンドの受容体であると考えられておりかつ中脳吻側底板細胞で発現される、7回膜貫通ドメインタンパク質のことを指す（Summerhurst et al., 2008）。Fzd5のゲノムヌクレオチド配列はSEQ ID NO：1に列記されている（図5）。
【００２７】
「コリン」という用語は、神経発生の間の吻側および尾側中脳底板細胞のマーカーである細胞表面プロテアーゼのことを指す（Ono et al., 2007）。コリンのヒトmRNAヌクレオチド配列はSEQ ID NO：2に列記されている（図6）。
【００２８】
「Otx2」（オルソデンティクルホメオボックス(orthodenticle homeobox)2）とは、前脳および中脳の神経前駆体ドメインで特異的に発現される転写因子のことを指す。尾側底板細胞におけるOtx2の異所性発現により、中脳底板表現型を誘導することができる（Ono et al.，2007）。ヒトOtx2のゲノムヌクレオチド配列はSEQ ID NO：3に列記されている（図7）。
【００２９】
「胚性幹細胞」（ESC）という用語は、胚盤胞の内部細胞塊、割球または桑実胚に由来し、未分化状態を維持しながら細胞株として連続継代された細胞のことを指す（例えば、TERT、OCT4、および／またはTRA抗原を発現する）。ES細胞は、精子もしくはDNAによる卵細胞の受精、核移植、単為生殖、またはMHC領域にヘミ接合性もしくはホモ接合性を有するhES細胞を作製するための手段によって得られることができる。
【００３０】
本明細書で用いる場合、「多能性細胞」とは、3つの生殖系列の任意のものに由来する細胞種に分化することができ、さらに適切な条件下では事実上無期限の期間にわたって、娘細胞が親細胞の未分化（多能性）特性を保っているようなインビトロ自己複製を行うこともできる細胞のことを指す。多能性細胞にはESCが含まれるが、ESCのように全能性である必要は必ずしもない。多能性細胞の他の例には、誘導多能性細胞（例えば、Takahashi et al., Cell, 126: 663-676, 2006；Cell, 131: 861-872, 2007；およびNakagawa et al., Nat. Biotechnol. 26: 101-106, 2008）、核移植によって得られた多能性細胞、および臍帯血または成体血から単離された多能性細胞が含まれる。
【００３１】
「誘導多能性幹細胞」（iPS細胞）という用語は、1つまたは複数の転写因子の過剰発現によって、間葉細胞（例えば、線維芽細胞および肝細胞）から得られる多能性細胞のことを指す。1つの具体的な態様において、iPS細胞は、例えば、Takahashi et al.（Cell, 126: 663-676, 2006）に記載された方法に従って、Oct4、Sox2、c-MycおよびKlf4の過剰発現によって線維芽細胞から得られる。iPS細胞を生成させるための他の方法は、例えば、Takahashi et al. (Cell, 131 : 861-872, 2007）およびNakagawa et al.（Nat. Biotechnol. 26: 101-106, 2008）に記載されている。本明細書に記載された技術のiPS細胞は、細胞分裂も行いうる。
【００３２】
本明細書で用いる場合、「神経前駆細胞」とは、神経前駆細胞経路に沿って部分的に分化しており、かつ、例えばネスチンを含むいくつかの神経マーカーを発現する、多能性細胞のサブセットのことを指す。神経前駆細胞は、ニューロンまたはグリア細胞（例えば、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト）に分化することができる。したがって、「iPS細胞に由来する神経前駆細胞」とは、多能性であるが神経前駆細胞経路に沿って部分的に分化しており（すなわち、いくつかの神経前駆細胞マーカーを発現する）、かつそれ自体がiPS細胞のインビトロまたはインビボ分化の結果である細胞のことを指す。
【００３３】
本明細書で用いる場合、「中脳ドーパミン作動性神経前駆細胞」または「mDA神経前駆細胞」とは、単離された場合に中脳ドーパミン作動性ニューロンの実質的に均一な細胞集団を形成することのできる、神経前駆細胞の部分集団のことを指す。
【００３４】
本明細書で用いる場合、「実質的に均一な細胞集団」とは、関心対象の形質を有する細胞を過半数（すなわち、少なくとも50％）含む、細胞の集団または試料のことを指す。好ましい態様において、実質的に均一な集団は、関心対象の形質を有する細胞を少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれよりも多く含む。
【００３５】
本明細書で用いる場合、「生理的に適合性のある溶液」とは、ある所与の細胞種が体内にある場合にそれを通常取り囲んでいると考えられる液体環境を少なくとも部分的に模倣した溶液のことを指す。そのような溶液は、細胞が体外または培養用培養環境から取り出された場合に障害を受けるのを防ぐことができる。生理的に適合性のある溶液は、塩の組成および濃度、ならびに増殖因子などのタンパク質を模倣することができる。生理的に適合性のある溶液には、例えば、細胞培地（例えば、イーグル最小必須培地）、リン酸緩衝食塩水、ハンクス平衡塩類溶液または人工脳脊髄液（aCSF）が含まれる。
【００３６】
本明細書で用いる場合、「タグと結合している」タンパク質とは、そのタンパク質にタグが共有結合的に付着していること、例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）がタンパク質と融合していること、またはタンパク質がタンパク質と共有結合的に付着していることを意味する。この結合が、例えば受容体／リガンド相互作用で見られるように、非共有結合性であってもよい。
【００３７】
「ベクター」とは、例えば形質転換の過程によって細胞内に置かれた場合にベクターが複製しうるように無傷のレプリコンを含む、非染色体性の核酸のことを意味する。ベクターはウイルス性であってもまたは非ウイルス性であってもよい。ウイルス性ベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルス、または他の改変された天然ウイルスが含まれる。核酸を送達するための例示的な非ウイルス性ベクターには、裸のDNA；カチオン性脂質と単独で、またはカチオン性ポリマーとの組み合わせで複合体化されたDNA；アニオン性およびカチオン性のリポソーム；場合によってはリポソーム中に含有された、DNA-タンパク質複合体、ならびに、異種混合ポリリジン、規定長のオリゴペプチドおよびポリエチレンイミンといったカチオン性ポリマーとともに凝縮されたDNAを含む粒子；ならびにウイルスおよびポリリジン-DNAを含む三元複合体の使用が含まれる。
【００３８】
非ウイルス性ベクターには、インビトロ、インビボ、またはエクスビボのいずれかで標的細胞に送達することができる異種混合ポリヌクレオチドを含むプラスミドが含まれうる。異種混合ポリヌクレオチドは、関心対象の配列を含むことができ、1つまたは複数の調節エレメントと機能的に連結されることができ、かつ、関心対象の核酸配列の転写を制御してもよい。本明細書で用いる場合、ベクターは、最終的な標的細胞または対象における複製が可能である必要はない。ベクターという用語には、発現ベクターおよびクローニングベクターが含まれうる。
【００３９】
適した発現ベクターは当技術分野において周知であり、これには、ポリヌクレオチドを発現することができ、そのようなDNAの発現を調節しうるプロモーター領域および／またはエンハンサーといった調節エレメントがそれと機能的に連結しているベクターが含まれる。したがって、発現ベクターとは、適切な宿主細胞に導入された際に挿入されたDNAの発現をもたらす、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターといった組換えDNAまたはRNA構築物のことを指す。適切な発現ベクターには、真核細胞および／もしくは原核細胞において複製可能であるもの、ならびにエピソーム性に保たれるもの、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれるものが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図1Aは、実施例1に記載した通りに、マウスES細胞をND細胞に分化させるための培養ステージの概略図を示している。図1Bは、マウス線条体に移植したコリン-Otx2GFP-細胞およびコリン+Otx2GFP+細胞の顕微鏡写真、ならびに移植片の体積およびDDC染色細胞の密度のグラフを示している。細胞はチロシンヒドロキシラーゼ、Lmx1b、Pitx3およびDDCで染色した。
【図２】Fzd5に関して染色したHepG2細胞およびFS細胞の顕微鏡写真、ならびにコリンおよびFzd5で選別したFACSデータを示している。図2Bはまた、Otx2、FoxA2、Lmx1b、コリン、GLAST、ネスチン、β-チューブリン、チロシンヒドロキシラーゼおよびPitx3で染色したコリン+Fzd+神経前駆細胞の顕微鏡写真も示している。
【図３】図3Aは、ESC由来の細胞を移植して、ビーム歩行試験（challenging beam test）を実施したマウスによる行動データを示している。図3Bは、ESC由来の細胞を移植して、ポール試験（pole test）を実施したマウスによる行動移動時間データを示している。図3Cは、ESC由来の細胞を移植して、ポール試験を実施したマウスによる行動潜時データを示している。
【図４】コリンおよびFzd5の発現部位を詳細に示している、胚齢11.5日のマウス胚による矢状断面の概略図である。
【図５】フリズルド-5（SEQ ID NO：1）のヒトゲノム配列である。配列はGenBankアクセッション番号NC_000002.11のnt 208627310からnt 208634143までにある。
【図６】コリン（SEQ ID NO：2）のヒトmRNA配列である。配列はGenBankアクセッション番号NM_006587.2にある。
【図７】OTX2（SEQ ID NO：3）のヒトゲノム配列である。配列はGenBankアクセッション番号NG_008204.1にある。
【図８】図8A〜8Cは、コリン+Otx2GFP+細胞を移植した無水晶体症マウスによる行動データのグラフを示している。図8Aは、ポール試験に関する頭低位時間を図示している。図8Bは、ポール試験に関する合計時間を図示している。図8Cは、ビーム試験に関する時間を図示している。図8Dおよび8Eは、コリン+Otx2GFP+細胞を移植した6OHDA損傷ラットによる行動データのグラフを示している。
【図９】分化のさまざまな時点での、ソニックヘッジホッグ(sonoic hedgehog)タンパク質（SHH）に対する曝露後のNP細胞におけるFoxA2およびコリン mRNAレベルのグラフを示している。
【図１０】実施例24に記載した種々のタンパク質増殖因子に対するNP細胞の曝露後の細胞数の変化倍数のグラフを示している。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
詳細な説明
本明細書に記載された技術は、中脳ドーパミン作動性神経前駆細胞の新規集団、およびヒト胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞または他の種類の多能性細胞からそれを生成させるための方法を提供する。本発明の細胞集団は、規定された細胞分化ステージに対応する独特な細胞表面マーカープロファイルを有する。
【００４２】
ヒト胚性幹細胞のインビトロ分化
成熟mDAニューロンは、遺伝的に標識付けられたニューロンから精製されているが（Hedlund et al.，2008）、それらはその脆弱性が原因で、移植された宿主脳の中で十分に生存することができていない。精製されたES由来NPも、一般的なNPマーカーであるSox1を用いて精製されている（Chung et al.，2006a）。しかし、mDA細胞の割合は少なく、これはおそらく、一般的なNPというよりはグリア様底板細胞であるというmDA NPの性質に起因する（Ono et al.，2007）。このことは、妥当なNP集団を発生学的研究に基づいて精製することの必要性を物語っている。
【００４３】
最近、底板細胞表面マーカーであるコリンを用いてmDA NPを効率的に濃縮しうることが報告され（Chung et al.，2009；Ono et al.，2007）、これにより、より脆弱性が小さく、かつ増大可能な潜在能力を持つmDA NP集団を精製する新たな可能性が開かれた。しかしながら、コリンは尾側底板細胞、さらには心臓および皮膚の細胞でも発現されるため、mDA NPの精製のためにはそれでは不十分である。mDA NPを精製するための1つのアプローチは、2つの特異的マーカーであるコリンおよびOtx2の組み合わせを用いることである。このアプローチを用いることにより、以前は不可能であった、mDA NPの特異的かつ効率的な精製を達成することができる。コリンおよびOtx2を用いた吻側底板細胞の二重選択により、mDAニューロンと類似したシグナルのセット（例えば、SHHおよびFGF8）によってインビボおよびインビトロで誘導される（Lee et al.，2000；Ye et al.，1998）、ジスキネジー誘発性セロトニン作動性ニューロンが効率的に除去される（Chung et al.，2011a）。
【００４４】
EBに基づくESC分化および間質共培養によるESC分化はいずれも十分に確立されている。その結果得られるESCも、インビトロおよび移植後のインビボのいずれにおいても詳細に研究されている。未分化ESCを6-OHDA損傷ラットの線条体に移植したところ、それらはDAニューロンに分化して、行動症状を改善した（Bjorklund et al.，2002）。加えて、ESCは、重要な転写因子であるNurr1またはPitx3を過剰発現させることによって遺伝的に操作されてもおり、これらはそれぞれ、ESCのmDAニューロン（Chung et al.，2002）またはA9様DAニューロン（Chung et al.，2005）への分化を助長した。さらに最近では、mDA発生の2つの主要経路が同定されており、これらの経路の直接の標的（FoxA2、Lmx1aおよびOtx2）を用いた遺伝的改変により、ESCのmDA分化が相乗的に誘導されることが観察されている（Chung et al.，2009）。ESC由来のNPは系統的に特徴づけられており、ESC由来のNPは長期にわたる増大後にも効率的にDAニューロンを生じるが、一方、胚脳（VM）由来のNPは短期的な増大後であってもDAニューロンを生じる能力を喪失することが示されている（Chung et al.，2006b）。同じく移植後にも、これらのESC由来のNPはDA移植片を効率的に生じたが、このことは、ESC由来のNPの増大を、治療を目的としてESCから無限の細胞供給源を調製するための強力かつおよび効率的な手順として役立てうることを実証している。移植後の腫瘍形成を減らす／回避するために、ESC由来のNPがsox1GFPノックインESCを用いて単離されている（Chung et al.，2006a）。FACSによるNPの精製により、移植片における腫瘍形成を起こさずに、神経集団の濃縮が結果的にもたらされる。
【００４５】
Park et al.（2005）によって以前に記載された手順を改変した上で用いて、数系統のヒト胚性幹細胞（hES）（H1、H9およびHSF-6）をDAニューロンに分化させることに成功するができる。この改変手順では、MS5フィーダー層および誘導シグナルとしてのSHHを用いる。また、mES由来のNPの場合と同じように、hES由来のNPを、増殖能および分化能を喪失させずに凍結および解凍することに成功することもできる。発表されている他のプロトコールを用いてmDA NP（コリン+Otx2+）が生じる効率を、mDA NPの作製をこれらの細胞の精製前に最適化する目的で、より詳細に比較した。
【００４６】
ヒトmDA NPの精製のための1つのアプローチは、コリンおよびFzd5を共発現するNP細胞の精製である。Fzd5は、発生中の胚における前脳および中脳、ならびに眼および肝臓で発現される。Fzd5抗体はヒト肝臓由来HepG2細胞を染色し、対照ES細胞を染色しない。Fzd5はこれまで細胞選別に用いられたことのないマーカーであるが、その発現が発生中のCNSにおける前脳および中脳に限られるため、優れた補完マーカーである。このアプローチにより、あらゆる尾側底板表現型、ならびに心臓および皮膚といった非神経性コリン+細胞が除去される。Fzd5／コリンマーカーの組み合わせには、いくつかの利点がある。例えば、mDA NPが高度の特異性および効率で精製されること；より脆弱性が小さく、かつ増大可能なmDA NP集団の精製が達成されること；遺伝的改変の段階が省かれることにより、挿入突然変異誘発のリスクがなくなり、同時に関心対象の細胞を作製することの効率および容易さが増すこと、ならびにこれらの精製されたmDA NPが増大可能な「吻側底板細胞」であり、移植片誘発性ジスキネジーを引き起こす恐れのあるセロトニン作動性細胞が効率的に除外されること。
【００４７】
後にフローサイトメトリーに用いる抗コリン抗体を試験するために、ヒトコリン-myc組換えタンパク質を発現するレトロウイルスを作製して、細胞をこのレトロウイルスに感染させた。抗コリン抗体染色はmyc染色とよく重なり合い、このことはヒトコリンタンパク質を認識する抗コリン抗体の特異性を示している。加えて、hES細胞のインビトロ分化の後に、コリン+ Fzd5+細胞の小規模な集団も検出された。
【００４８】
コリン／Fzd5を発現する神経前駆細胞の単離
最近の研究により、底板細胞はmDAニューロンを生じるNPであることが示されている（Kittappa et al.，2007；Ono et al.，2007）。mDA NPは、底板細胞表面マーカーであるコリンを用いることによって濃縮されている（Chung et al.，2009；Ono et al.，2007）。しかし、コリンは尾側底板、心臓および皮膚でも発現されることから、第2の独立したマーカーを用いてコリン+細胞をさらに精製する必要性が生じている。最近、前脳-中脳転写因子Otx2が尾側底板を吻側化(rostralize)して、異所性mDAニューロンを生じさせうることが示されている（Ono et al.，2007）。mDA NPは、インビトロで分化したESCから、これらの「吻側底板細胞」を精製することによって単離することができる。そのようなmDA NPが、コリンおよびOtx2を用いて、高い効率および特異性で精製されている。しかし、臨床適用のためには、遺伝的改変ではなく、2つの独立した細胞表面マーカーを用いることがより望ましい。
【００４９】
Wnt5aの受容体であるフリズルド-5（Fzd5）は、発生中のCNSにおいて、前脳、および中脳の脳室帯で吻側発現パターンを示す（Summerhurst et al.，2008）。さらに、Wnt5aがmDA分化の重要な調節物質であることも示されている（Andersson et al.，2008；Parish et al.，2008）。コリンおよびFzd5の発現は、胚発生中にmDAドメインのみで重なり合い、ともに吻側底板を標識付ける。このため、2つの独立した細胞表面マーカー（例えば、コリンおよびFzd5）を用いた「吻側底板細胞」の二重選択により、インビトロで分化したマウスおよびヒトのESCおよびiPSCから、mDA NPが効率的に精製される。
【００５０】
精製されたmDA NPは、それらの増殖能および発生上の能力を喪失することなく、インビトロで増大させることができる。これらのmDA NPは、PDの移植療法のための理想的かつ無限な細胞供給源となる。胚幹細胞由来の子孫の異種混交的な性質により、場合によっては、移植後に、腫瘍形成、または望まれない細胞種を伴う移植片がもたらされる（Zeng et al.，2004；Schulz et al.，2004；Roy et al.，2006）。このため、脳に移植された細胞種を制御するためには、mDAニューロンを生じうる所望の細胞集団のみを移植前に精製することが是非とも必要である。以前の研究では、インビトロで分化したマウスES細胞からNPを精製して、移植後の腫瘍形成を効率的に防いでいた。sox1-GFP+移植片はTH+細胞をある程度含むものの、sox1-GFP+細胞からのTH+細胞作製の全体的効率は高くなく、このことはこれらの細胞が正しい種類のNP細胞ではないことを実証している。このため、mDAニューロンを生じる潜在能力を有するNPを精製することが望ましい。
【００５１】
有糸分裂後のmDAニューロンではなくて精製されたmDA NPの方が好ましいが、これは前者の方が継代、FACS（蛍光活性化細胞選別）、凍結保存および移植といった操作により適しているためである。さらに、mDA NPは成熟mDAニューロンとは異なり、無限の量のmDAニューロンを生じさせるための増大可能な細胞供給源となる可能性もあると考えられる。
【００５２】
mDA NPは中脳底板細胞であることが示されており（Ono et al.，2007；Kittappa et al.，2007）、それらは底板マーカーであるコリンによって標識付けることができる（Ono et al.，2007）。しかし、コリンは尾側底板、ならびに心臓および皮膚でも発現される。このため、コリン抗体単独ではmDA NPおよび非mDA NP細胞の両方が同定されることから、mDA NPの精製のために別の独立したマーカーが必要となる。Fzd5は、mDA NPの精製のために用いうるそのようなマーカーの1つである。Fzd5は発生中の中脳の脳室層のほかに、前脳および眼でも発現され（Summerhurst et al.，2008）、mDA分化の重要な調節物質であるWnt5aの受容体であると考えられている（Castelo-Branco et al.，2003）。すなわち、コリンおよびFzd5の両方を発現する細胞は、中脳底板由来のmDA NPである。
【００５３】
真性のmDA NPである吻側底板細胞は、マウスESC系における二重細胞表面マーカー選択によって単離することができる。しかし、遺伝的改変を伴わずにmDA NPを精製するには、底板マーカーコリンと組み合わせて用いうる細胞表面マーカーが望ましい。受容体分子を最初にスクリーニングしたが、これは、SHH、Wnt1、FGF8およびWnt5aといったいくつかのシグナル伝達分子がmDA NPの特異化／増殖において重要な役割を果たすことが知られているためである。これらの分子のうち、Wnt5aの受容体であるFzd5（Andersson et al.，2008；Castelo-Branco et al.，2006；Castelo-Branco et al.，2003；Parish et al.，2008；Sanchez-Pernaute et al.，2008；Schulte et al.，2005）は、胚CNS発生中の前脳および中脳、特に中脳脳室領域において、さらには肝臓において、吻側発現パターンを示す（Summerhurst et al.，2008）。その発現パターンは、発生中のmDA NPドメインではコリンのみと重なり合う（図4）。この観察所見と、mDA神経発生におけるWnt5aシグナル伝達の重要性をあわせて考慮することにより、Fzd5がmDA NPの二重マーカー選択のための優れた候補であることが示唆された。
【００５４】
細胞移植療法
細胞移植療法は、典型的には、神経系の損傷領域内への、または傷害部位の近傍の部位への、補充細胞集団の実質内（例えば、脳内）移植を伴う。最も一般的には、治療用細胞を定位的注射によって特定の部位に送達する。移植のための従来の手法は、Bjorklund et al.（Neural Grafting in the Mammalian CNS, eds. Elsevier, pp 169-178, 1985）、Leksell et al.（Acta Neurochir., 52:1-7, 1980）およびLeksell et al.（J. Neurosurg., 66:626-629, 1987）に記載されている。注射標的領域の同定および位置決定は、一般に、移植の前に非侵襲的な脳画像化手法（例えば、MRI）を用いて行われる（例えば、Leksell et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 48: 14-18, 1985を参照のこと）。
【００５５】
手短に述べると、患者の脳の選択された領域への細胞の投与は、ドリルで孔を開けて硬膜を貫通し、マイクロシリンジの針を挿入することが可能になるようにすることによって行いうる。あるいは、細胞を脳室内に、または髄腔内へと脊髄領域に注入することもできる。本明細書に記載された細胞調製物は、脳内または脊髄内の任意の所定の部位への細胞の移植を可能にする。また、細胞懸濁液や細胞の混合物を用いて、複数の移植を同時に、いくつかの部位で生じさせることも可能である。
【００５６】
本明細書に記載されたとおりのインビトロ細胞培養および単離に続いて、細胞を移植用に調製する。細胞を、生理的に適合性のある担体、例えば細胞培地（例えば、イーグル最小必須培地）、リン酸緩衝食塩水、ハンクス平衡塩類溶液または人工脳脊髄液（aCSF）などの中に懸濁させる。細胞密度は一般に、細胞約104〜約107個／μl、好ましくは細胞約25,000〜約100,000個／μlである。移植する細胞懸濁液の容積は、移植の部位、治療目標、および溶液中の細胞密度に依存して変化すると考えられる。例えば、細胞を脳実質内に移植する治療のためには（例えば、パーキンソン病の治療で）、各注射において約5〜60μlの細胞懸濁液を投与すると考えられる。損傷された脳領域が広い場合は特に、各宿主に数回の注射を用いてもよい。または、例えば、脳室内注射を介した投与が、比較的大きな体積および多くの細胞数に順応すると考えられる（例えば、Madrazo et al., New Engl. J. Med., 316:831-834, 1987；Penn et al., Neurosurgery, 22:999-1004, 1988を参照のこと）。
【００５７】
いくつかの態様においては、細胞を移植前に透過性膜の内部に封入する。カプセル封入により、宿主の免疫系に対する障壁が与えられ、移植片の拒絶および炎症が阻害される。細胞カプセル封入のいくつかの方法を使用しうる。場合によっては、細胞を個別にカプセル封入することが考えられる。別の場合には、多数の細胞を同一の膜の内部に封入することが考えられる。欧州特許公報第301,777号または米国特許第4,353,888号、同第4,744,933号、同第4,749,620号、同第4,814,274号、同第5,084,350号および同第5,089,272号に記載されたもののように、細胞カプセル封入のいくつかの方法が当技術分野において周知である。
【００５８】
細胞カプセル封入の1つの方法では、単離した細胞をアルギン酸ナトリウムと混合した上で塩化カルシウム中に押し出して、ゲルビーズまたは小滴を形成させる。ゲルビーズを高分子量（例えば、MW 60〜500kDa）の濃度（0.03〜0.1％ w／v）のポリアミノ酸（例えば、ポリ-L-リジン）とともにインキュベートして、膜を形成させる。形成されたカプセルの内部を、クエン酸ナトリウムを用いて再び液化させる。これにより、比較的大型の分子（MW約200〜400kDa）への透過性が高いが、細胞の内側にはとどまる、細胞を取り巻く単層膜が作製される。封入されたアルギン酸ナトリウムを外に拡散させてカプセルを平衡状態に達するまで膨張させる目的で、カプセルを生理的に適合性のある担体中で数時間インキュベートする。その結果得られたアルギン酸除去カプセルを、膜透過性を低下させる低分子量ポリアミノ酸と反応させる（MWカットオフ値、約40〜80kDa）。
【００５９】
フローサイトメトリーおよび蛍光活性化細胞選別（FACS）
フローサイトメトリーは、流体の流れ中に懸濁された細胞（または他の小粒子）の分析および選別のための周知の手法の1つである。この手法により、光学的、電子的または磁気的な検出機器を通って流れる単細胞の物理的および／または化学的特性の同時分析が可能になる。FACSに適用される場合、フローサイトメーターは、単一の縦列の形にある流体の流れの中の細胞を、蛍光標識した検出用マーカー（例えば、抗体）を励起させて細胞の蛍光特性を測定する光源を通過させて移送するフローセルからなる。続いて、流体の流れを加圧下でノズルおよび荷電リング（charging ring）を通して吐出させ、流体を壊して小滴にする。フローセル装置および流体の流れは、個々の細胞の距離が比較的大きくなり、その結果、あらゆる小滴が単細胞よりも多くのものを含む確率が小さくなるように較正される。荷電リングは、小滴を、その中に含有されている細胞の蛍光特性に基づいて荷電させる。荷電した小滴を続いて、小滴の進路をその電荷（細胞の蛍光強度と関係がある）に基づいて変えてさまざまな容器内に入れる、静電荷電偏向システムによって偏向させる。
【００６０】
フローサイトメトリーは、基本的に卵形の形態を有する細胞の選別および性質決定のために特に有用な手法であり、血液細胞はその原型となる候補である。ニューロン細胞は、分化の初期のうちに星状または樹状形態をとり始める。固体培養基質からのニューロン細胞の脱離に続いて、フローサイトメトリーの間に樹状突起が切り取られることは、細胞に大きなストレスを与え、後の科学的手順におけるそれらの信頼性を低下させる。本明細書に記載するように、基本的なフローサイトメトリー方法を、細胞に課せられるストレスを低下させて、それらを後の培養および臨床利用により適用しうるようにする様式で、ニューロン細胞種に特別に順応するように改変することができる。
【００６１】
フローサイトメトリー過程において変化させうる重要なパラメーターには、ノズル直径および流体吐出圧の2つがある。ニューロン細胞に課せられる圧力は、ノズル直径を大きくすること、および／または吐出圧を減じることによって、低下させることができる。これらのパラメーターは、細胞選別方法の精度を維持する目的で、それぞれの特定の星形（例えば、ニューロン）細胞種に対して最適化されなければならない。例えば、流体／吐出圧の過度に大きな低下は、吐出された各流体小滴の中に複数の細胞が捕捉されることを引き起こす恐れがある。これは、標識細胞マーカーの作為的な過大評価をもたらすと考えられる。圧力が十分に低ければ、それもまた、粒子が、各細胞から得られるシグナルではなく各粒子内に捕捉された細胞数によって選別される傾向となる（すなわち、細胞2個は細胞1個の約2倍のシグナル強度を有すると考えられる）、二峰性（または高次）選別分布を不適切にもたらすと考えられる。同様に、各細胞種および各流体圧で用いるのに適したノズル直径も最適化されなければならない。大きなノズル直径は、ニューロンおよびニューロン幹細胞のような大型の星形細胞にとって有益である。しかし、大きなノズル直径と低い流体圧が組み合わされると、過度に大きい小滴が生じるか、または極端な場合には小滴が形成されない。このため、大きな小滴も各流体小滴の中に複数の細胞が捕捉される見込みを高める。
【００６２】
遺伝子送達およびES細胞の改変
コリン、Fzd5またはOtx2などの遺伝子または遺伝子断片をコードする核酸配列を、タグの核酸配列と組み合わせて、タグ標識された融合タンパク質を形成させることができる。核酸配列の非限定的な例には、Hisタグ（ポリヒスチジンの連鎖）、FLAGタグおよび緑色蛍光タンパク質（GFP）が含まれる。HisタグおよびFLAGタグは、それが細胞内にある場合、タンパク質の精製またはタンパク質の検出といった数多くのさまざまな方法に用いることができる。また、抗体認識のための重要な部位としてタグを役立てることもできる。
【００６３】
Otx2GFPなどのタグ標識タンパク質を発現する胚性幹細胞は、ベクターを単独で、または「ノックイン」相同組換え手法と組み合わせて用いて、作製することができる。また、ベクターを、遺伝子または遺伝子断片を除去して、続いて別の遺伝子または遺伝子断片をその場所に挿入するジンクフィンガーヌクレアーゼ技術とともに用いることもできる。ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術は、Hockemeyer et al.（2009）に記載されている。手短に述べると、ある所与の配列に対して特異的なジンクフィンガードメインタンパク質をヌクレアーゼと融合させて、その結果、ジンクフィンガーヌクレアーゼが細胞内で発現されると、ジンクフィンガーヌクレアーゼによって特異的な遺伝子または核酸領域がその細胞の核酸から除去されるようにする。
【００６４】
種々のウイルスベクターを、タグ標識タンパク質によって細胞をトランスフェクトさせるために用いることができる。アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）およびヘルペスウイルスはすべて、タグ標識タンパク質を細胞内で安定的に発現させるためのベクターとして用いうる。単純ヘルペスウイルス（HSV）は上皮細胞内で複製するが、中脳ドーパミン作動性ニューロンなどの非分裂性細胞内に潜伏状態でとどまることもできる。関心対象の遺伝子を、潜伏時に発現される、HSVのLAT領域内に挿入することができる。外因性遺伝子発現に有用なことが示されている他のウイルスには、パラインフルエンザウイルス、ポックスウイルス、およびアルファウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンビス（Sinbis）ウイルスおよびベネズエラウマ脳炎ウイルスが含まれる（Kennedy, Brain. 120: 1245-1259, 1997）。
【００６５】
核酸を送達するための例示的な非ウイルス性ベクターには、裸のDNA；カチオン性脂質と単独で、またはカチオン性ポリマーとの組み合わせで複合体化されたDNA；アニオン性およびカチオン性のリポソーム；場合によってはリポソーム中に含有された、DNA-タンパク質複合体、ならびに、異種混合ポリリジン、規定長のオリゴペプチドおよびポリエチレンイミンといったカチオン性ポリマーとともに凝縮されたDNAを含む粒子；ならびにウイルスおよびポリリジン-DNAを含む三元複合体の使用が含まれる。多種多様な標的部位へのインビボでのDNA媒介性遺伝子移入については詳細に研究されている。裸のDNAは、注射、遺伝子銃または電気穿孔法を用いて投与することができる。裸のDNAは筋肉における長期的発現をもたらすことができる。Wolff, et al., Human Mol. Genet., 1:363-369, 1992；Wolff, et al., Science, 247, 1465-1468, 1990を参照のこと。また、DNA媒介性遺伝子移入は、肝臓細胞、心臓細胞、肺細胞、脳細胞および内皮細胞でも特徴が明らかにされている。Zhu, et al., Science, 261: 209-211, 1993；Nabel, et al., Science, 244:1342-1344, 1989を参照のこと。また、遺伝子移入用のDNAは、さまざまなカチオン性脂質、ポリカチオンおよび他のコンジュゲート性物質と会合させて用いることもできる。Przybylska et al, J. Gene Med., 6: 85-92, 2004；Svahn, et al., J. Gene Med., 6: S36-S44, 2004を参照のこと。
【００６６】
遺伝子、断片、融合物または突然変異体を含有する適切な非ウイルス性発現ベクターがひとたび構築されれば、それらを、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラントランスフェクション、電気穿孔法、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合またはリポソーム媒介性トランスフェクションなどの、ただしこれらには限定されない形質転換手法によって適切な宿主細胞に導入することができる。クローニングされたDNAによってコードされるタンパク質、融合物、ポリペプチド断片または突然変異体のインビトロ発現を用いることもできる。分子生物学の当業者は、組換えタンパク質およびその断片を生産するために、非常にさまざまな発現システムおよび精製システムを用いうることを理解するであろう。
【００６７】
カチオン性リポソームを用いる遺伝子治療の方法も、当技術分野において周知である。本明細書に記載された方法および組成物に用いるための例示的なカチオン性リポソームには、DOTMA、DOPE、DOSPA、DOTAP、DC-Chol、Lipid GL-67.TM.およびEDMPCがある。これらのリポソームを、標的細胞（例えば、多能性幹細胞）への送達用のベクターを封入するためにインビボまたはエクスビボで用いることができる。
【００６８】
本明細書に記載された方法および組成物について、以下の非限定的な例の参照によって、これからさらに詳細に説明する。
【００６９】
本明細書に記載された技術のいくつかの態様は、番号を付した以下の段落のいずれかによって定義することができる。
1.  中脳ドーパミン作動性神経前駆細胞を精製するための方法であって、
（a）中脳ドーパミン作動性（mDA）神経前駆細胞を含む神経前駆細胞集団を細胞培地中に供給する段階；
（b）コリンと、オルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）およびフリズルド-5（Fzd5）からなる群より選択される1つまたは複数の追加のマーカーとを発現する神経前駆細胞を、段階（a）の細胞集団から単離する段階
を含み、コリンと1つまたは複数の追加の細胞マーカーとを発現する該神経前駆細胞がmDA神経前駆細胞として同定される、方法。
2.  mDA神経前駆細胞の単離がフローサイトメトリーを含む、段落1記載の方法。
3.  前記神経前駆細胞集団が、
（i）多能性細胞を含む細胞集団を細胞培地中に供給する段階；および
（ii）該多能性細胞の少なくともいくつかを神経前駆細胞に分化させる段階
を含む方法によって生成される、段落1または2記載の方法。
4.  前記神経前駆細胞集団が、
（i）多能性細胞の集団を白血球阻止因子（LIF）および血清の存在下で培養する段階；
（ii）段階（i）で生成された細胞をLIFの非存在下で培養する段階；
（iii）段階（ii）で生成された細胞を、血清の非存在下で、かつ、インスリン、トランスフェリン、セレン、およびフィブロネクチンの存在下で培養する段階；ならびに
（iv）段階（iii）で生成されたネスチン陽性細胞を単離し、かつ、該ネスチン陽性細胞を、ラミニンと、線維芽細胞増殖因子8（FGF8）および塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）から選択される1つまたは複数の増殖因子との存在下で培養して、神経前駆細胞の集団を生成させる段階
を含む方法によって生成される、段落1〜3のいずれか記載の方法。
5.  前記神経前駆細胞集団が、
（i）多能性細胞の集団を、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）および線維芽細胞増殖因子8（FGF8）から選択される1つまたは複数の増殖因子の存在下で培養する段階；
（ii）段階（i）で生成された細胞を、ソニックヘッジホッグ（sonic hedgehog）（SHH）タンパク質の存在下でかつ血清の非存在下で培養する段階；ならびに
（iii）段階（ii）で得られた細胞をbFGFの存在下で培養して、神経前駆細胞の集団を生成させる段階
を含む方法によって生成される、段落1〜4のいずれか記載の方法。
6.  前記神経前駆細胞集団が、
（i）多能性細胞の集団を、線維芽細胞増殖因子8（FGF8）、上皮増殖因子（EGF）、および塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）から選択される1つまたは複数の増殖因子の存在下で培養する段階；
（ii）段階（i）で生成された細胞をbFGFの非存在下で培養する段階；ならびに
（iii）段階（ii）で生成された細胞をbFGFの存在下で培養して、神経前駆細胞の集団を生成させる段階
を含む方法によって生成される、段落1〜5のいずれか記載の方法。
7.  前記神経前駆細胞集団が、ネスチン陽性細胞の実質的に均一な細胞集団である、段落1〜6のいずれか記載の方法。
8.  前記mDA神経前駆細胞を、線維芽細胞増殖因子8（FGF8）および塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）からなる群より選択される増殖因子の非存在下で培養することによって、該mDA神経前駆細胞をニューロン分化（ND）細胞の細胞集団にさらに分化させる、段落1〜8のいずれか記載の方法。
9.  上皮増殖因子（EGF）を前記培地から除去して、ND細胞の集団を生成させる段階をさらに含む、段落8記載の方法。
10.  段階（b）で生成されたmDA神経前駆細胞が、フォークヘッドボックス(forkhead box)A2（FoxA2）；オルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）；LIMホメオボックス転写因子1、α（Lmx1a）；LIMホメオボックス転写因子1、β（Lmx1b）；Glast；ビメンチン；ネスチン；グリア線維酸性タンパク質（GFAP）；およびβ-チューブリンからなる群より選択されるマーカーのうち1つまたは複数をさらに発現する、段落1〜9のいずれか記載の方法。
11.  段階（b）で生成されたmDA神経前駆細胞が、オルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）をさらに発現する、段落1〜9のいずれか記載の方法。
12.  前記ND細胞が、
（a）チロシンヒドロキシラーゼ、ドーパミン活性輸送体、およびドーパミンデカルボキシラーゼからなる群より選択される1つまたは複数のマーカー、ならびに
（b）ペアード様ホメオドメイン(paired-like homeodomain)3（Pitx3）；LIMホメオボックス転写因子1、α（Lmx1a）；LIMホメオボックス転写因子1、β（Lmx1b）；フォークヘッドボックスA2（FoxA2）；エングレイルドホメオボックス(engrailed homeobox)1（En-1）；および核内受容体サブファミリー4、A群、メンバー2（Nurr1）からなる群より選択される1つまたは複数のマーカー
を発現する、段落8記載の方法。
13.  タンパク質である、LIMホメオボックス転写因子1、α（Lmx1a）；フォークヘッドボックスA2（FoxA2）；およびオルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）の発現を誘導することによって前記神経前駆細胞を分化させる段階をさらに含む、段落1〜12のいずれか記載の方法。
14.  タンパク質であるコリンおよびフリズルド-5（Fzd5）の発現を誘導することによって前記神経前駆細胞を分化させる段階をさらに含む、段落1〜13のいずれか記載の方法。
15.  中脳ドーパミン作動性（mDA）神経前駆細胞の実質的に均一な集団
を含む細胞集団であって、該mDA神経前駆細胞が、コリンと、オルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）およびフリズルド-5（Fzd5）からなる群より選択される1つまたは複数の追加のマーカーとを発現する、細胞集団。
16.  前記mDA神経前駆細胞が、フォークヘッドボックスA2（FoxA2）；オルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）；LIMホメオボックス転写因子1、α（Lmx1a）；LIMホメオボックス転写因子1、β（Lmx1b）；Glast；ビメンチン；ネスチン；グリア線維酸性タンパク質（GFAP）；およびβ-チューブリンからなる群より選択されるマーカーのうち1つまたは複数をさらに発現する、段落15記載の細胞集団。
17.  前記mDA神経前駆細胞がオルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）をさらに発現する、段落15記載の細胞集団。
18.  前記mDA神経前駆細胞が放射状グリア様形態を有する、段落15〜17のいずれか記載の細胞集団。
19.  段落15〜18のいずれか記載の細胞集団を含む、治療用組成物。
20.  前記細胞集団が、生理的に適合性のある溶液中に懸濁されている、段落19記載の治療用組成物。
21.  前記細胞集団がカプセル封入されている、段落20記載の治療用組成物。
22.  前記細胞の少なくとも約50％が、コリンと、オルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）およびフリズルド-5（Fzd5）からなる群より選択される1つまたは複数の追加のマーカーとを発現する、段落15〜18のいずれか記載の細胞集団。
23.  前記細胞の少なくとも約90％が、コリンと、オルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）およびフリズルド-5（Fzd5）からなる群より選択される1つまたは複数の追加のマーカーとを発現する、段落15〜18のいずれか記載の細胞集団。
24.  患者における神経変性疾患を治療するための方法であって、細胞の実質的に均一な集団を該患者の脳に投与する段階を含み、該集団の細胞が、マーカーであるコリンと、オルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）およびフリズルド-5（Fzd5）からなる群より選択される1つまたは複数の追加のマーカーを発現することを特徴とする、方法。
25.  前記細胞の集団が中脳ドーパミン作動性（mDA）神経前駆細胞を含む、段落24記載の方法。
26.  前記細胞が、フォークヘッドボックスA2（FoxA2）；オルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）；LIMホメオボックス転写因子1、α（Lmx1a）；LIMホメオボックス転写因子1、β（Lmx1b）；Glast；ビメンチン；ネスチン；グリア線維酸性タンパク質（GFAP）；およびβ-チューブリンからなる群より選択されるマーカーのうち1つまたは複数をさらに発現する、段落24または25記載の方法。
27.  前記細胞がオルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）をさらに発現する、段落24または25記載の方法。
28.  前記細胞の形態が放射状グリア様形態である、段落24〜27のいずれか記載の方法。
29.  前記細胞が前記患者の尾状核に投与される、段落24〜28のいずれか記載の方法。
30.  前記細胞が前記患者の黒質に投与される、段落24〜29のいずれか記載の方法。
31.  前記細胞が前記患者の黒質のA9領域に投与される、段落30記載の方法。
32.  段階（b）で単離された神経前駆細胞が、オルソデンティクルホメオボックス2（Otx2）タンパク質およびフリズルド-5（Fzd5）タンパク質のうち1つまたは複数を発現し、かつ、該タンパク質が、タンパク質発現の検出を可能にするタグと結合している、段落1〜14のいずれか記載の方法。
33.  前記タグが蛍光によって検出される、段落32記載の方法。
34.  前記タグが緑色蛍光性タンパク質（GFP）である、段落32記載の方法。
【実施例】
【００７０】
実施例1‐コリンおよびOTX2を用いたmDA NPの精製、分化、および増大
コリンおよびOTX2を用いたmDA NPの精製
mDA NP細胞に関する精製スキームが、コリンおよびOtx2の共発現を用いて、以前に考案されている。Otx2に基づく精製については、GFPがOtx2 ORFとインフレームにノックインされているOtx2GFPノックインESCを用いた。その結果得られたノックインマウスからのNP細胞を、Chung et al（2006a）の手法を用いて以下の通りに精製した。手短に述べると、第1段階では、未分化ES細胞を、2mM L-グルタミン (Life Technologies）、0.001％β-メルカプトエタノール（Life Technologies）、1×非必須アミノ酸（Life Technologies）、10％ドナーウマ血清（Sigma, St. Louis, MO, USA）および2000U／mLのヒト組換え白血病阻止因子（LIF；R & D Systems, Minneapolis, MN, USA）を加えたダルベッコ変法最小必須培地（DMEM；Life Technologies, Rockville, MD, USA）を入れた、ゼラチンをコーティングした培養皿の上で培養した。第2段階では、非接着性細菌ディッシュ（Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA）の上で、LIFを含めず、ウマ血清の代わりに10％ウシ胎仔血清（Hyclone, Logan, UT, USA）を入れた上記の培地中にて、ES細胞を4日間かけて胚様体（EB）に分化させた。第3段階では、続いてEBを、接着性組織培養面（Fisher Scientific）上にプレーティングした。24時間の培養後に、血清を含まないインスリン、トランスフェリン、セレンおよびフィブロネクチン（ITSFn）培地（Okabe et al. 1996）中で、神経前駆細胞の選択を開始した。第4段階では、10日間の選択後に細胞をトリプシン処理し、ネスチン+神経前駆細胞を、NP培地［NP培地；N2培地（Johe et al. 1996）に1μg／mLラミニン（Sigma）および10ng／mL塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）（R & D Systems）を加えたもの］を入れた、ポリL-オルニチン（PLO；15μg／mL；Sigma）およびフィブロネクチン（FN；1μg／mL；Sigma）をコーティングしたプレート上にプレーティングした。ネスチン+神経前駆細胞の2日間の増大後に、細胞をトリプシン処理して、FACSに供した。その後に、1.5×106個／cm2の選別細胞を、PLO／FNをコーティングした6ウェル上にプレーティングし、500ng／mLのソニックヘッジホッグN末端断片（R & D Systems）および100ng／mLの線維芽細胞増殖因子-8（FGF-8）（R & D Systems）の存在下で4日間かけて増大させた。第5段階では、細胞を移植用に採取するか、または200μMのアスコルビン酸（Sigma）の存在下におけるbFGFの除去によって分化を誘導した（Lee et al. 2000；Chung et al. 2002）。これらの培養段階は図1Aの概略図に表されている。
【００７１】
Otx2GFP+ノックインマウス由来のNP細胞を培養して分化させた後に、コリン+Otx2GFP+ NP細胞の存在が観察された。これらのコリン+Otx2GFP+細胞を、分化させたESCから、抗コリン染色後にFACSを用いて精製した。免疫細胞化学分析により、コリン+Otx2GFP+細胞が効率的に精製されたことが示され（Otx2+／Hoechst+細胞が88.7±9.2％、コリン+／Hoechst+細胞が87.5±7.2％）、それらは成熟マーカーであるGFAPまたはβ-チューブリンに関しては主として陰性であるが、NPマーカーであるネスチンおよび放射状グリアのマーカーであるGLASTに関しては陽性である未熟前駆体からなる（データは図示せず）。加えて、それらはまた、2つの独立したmDA NPマーカーであるFoxA2およびLmx1bも発現し（データは図示せず）、このこともmDA NPとしてのそれらの実体を裏づけている。加えて、この二重マーカー精製戦略により、精製されたOtx2GFP+コリン+細胞集団におけるSSEA1の欠如によって示されるように（FACS分析によれば、非選別物におけるSSEA1+の14.7±2.1％に対して、Otx2GFP+コリン+細胞におけるSSEA1+は0.1％（検出限界）未満）、移植後に奇形腫を引き起こす恐れのある望まれない多能性細胞も効率的に除去された。
【００７２】
コリンおよびOtx2を用いたmDA NPの分化
コリン+OtxGFP+細胞を、7日間のニューロン分化後にさらに分析した。選別後にはTH+ニューロンが有意に濃縮され、一方、GABA+ニューロンは有意に減少した（データは図示せず；非選別細胞と選別細胞との比較で、TH／β-チューブリンは5.6±1.9％に対して80.2±4.9％、GABA／β-チューブリンは36.9±4.9％に対して8.7±0.8％）。選別細胞におけるβ-チューブリン+細胞は83±2.7％であり、GFAP+細胞は7.3±2.0％、ネスチン+細胞は5.3±0.6％であった。コリン+Otx2GFP+細胞に由来するTH+ニューロンの特性を他のmDAマーカーとの共染色によってさらに調べたところ、これらのTH+細胞はPitx3、Lmx1bおよびNurr1も発現することが観察され（データは図示せず；Pitx3／TH細胞が83±6.5％ 、Lmx1b／TH細胞が88.9±1.5％）、このことは2マーカー選別により、mDA NPをあらかじめ同定しうることを裏づけている。それらはまた、機能的DAマーカーであるDATおよびDDCも発現し、カルビンジンおよびGirk2の共標識によって示されるように、A9およびA10 DAニューロンの両方が存在する（データは図示せず）。
【００７３】
コリンおよびOtx2を用いたmDA NPの増大
選別されたコリン+Otx2GFP+細胞の増殖能を試験した。これらの細胞をbFGFの存在下で増大させ、毎週継代した。4週間の期間で約1,000倍の増加がみられた。免疫細胞化学分析により、高度の増大後に、細胞の大部分は依然としてOtx2+FoxA2+ならびにネスチン+GLAST+であることが示された（データは図示せず）。4週間増大させた細胞をbFGFの取り除きよってさらに分化させたところ、それらはTHおよびPitx3の共発現によって示されるように、mDAニューロンを効率的に生じうることが示された（データは図示せず）。
【００７４】
コリン+Otx2GFP+細胞の移植
マウス線条体内への移植後に、コリン-Otx2GFP-細胞はDAニューロンをわずかしか有しない崩壊性移植片を生じたが、一方、コリン+Otx2GFP+細胞は、移植片の画像ならびに移植片体積およびDA密度の定量によって示されるように、DAニューロンを豊富に含む、良好に組み込まれる移植片を生じた（図1B）。移植片の中のDAニューロンは、Lmx1b、Pitx3およびDDCの共発現によって示される機能的な中脳表現型を示した（図1B）。
【００７５】
実施例2‐コリンおよびFzd5抗体の特異性
以前の研究でコリン抗体の特徴は明確にされているとはいえ、FACSに利用しうる市販のFzd5抗体はない。このため、マウスとヒトの間で十分に保存されている細胞外ドメインペプチドを用いて自社内で抗Fzd5抗体を作製した。試みた複数のペプチドのうち、Fzd5抗体の1つは肝臓由来のHepG2細胞ではFzd5の特異的認識を示したが、ESCでは染色がなかった（データは図示せず）。コリンおよびFzd5抗体を用いたFACS選別では、コリン、GLASTおよびネスチンも共発現する（データは図示せず）、FoxA2+Otx2+Lmx1b+細胞の有意な濃縮がもたらされた（Otx2+細胞が74.8±4.9％、FoxA2+細胞が72.8±4.1％）。分化させると、それらはTH+Pitx3+ mDAニューロンを生じた。
【００７６】
抗コリン抗体については、ヒトコリン-myc組換えタンパク質を発現するレトロウイルスを生じさせ、このレトロウイルスに感染させた細胞を、抗コリン抗体の試験に用いた。抗コリン抗体染色はmyc染色と重なり合い、このことはヒトコリンタンパク質を認識する上での抗コリン抗体の特異性を示している（図2）。加えて、本発明者らは、hES細胞のインビトロ分化後に、コリン+ Fzd5+細胞の小集団も検出することができた（図2）。
【００７７】
実施例3‐ヒト胚性幹細胞のインビトロ分化
以前に記載された手順（Hong et al.，2008）に改変を加えて用いたところ、ヒト胚性幹細胞（hESC）ならびにヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）の数系統がmDAニューロンに分化することに成功し、PA6フィーダー層は神経前駆細胞を均一に誘導し、DA分化を伴った（データは図示せず；TH+ニューロンが15.6±1.5％）。hESCをこのプロトコールを用いて分化させたところ、ネスチンおよびGlastの両方を発現する放射状グリア様NP、ならびにOtx2およびFoxA2、またはコリンおよびFzd5の両方を発現する「吻側底板様細胞」といった、mDA NPの特徴を有する細胞が観察された（データは図示せず）。
【００７８】
最近の研究により、mDA発生の際にはマウスとヒトの間には空間的にも時間的にもよく保存された遺伝子発現パターンが示されているが（Hebsgaard et al., 2009；Nelander et al.，2009）、本研究では、底板マーカーコリンおよび吻側マーカーFzd5をヒトシステムにおいて効率的に用いうるか否かを試験した。すなわち、分化中のhESCのNPステージで、3つの重要なmDA転写因子であるLmx1a、FoxA2およびOtx2の共発現によってmDA NP表現型を誘導して（Chung et al.，2009；Chung et al.，2011b）、コリンおよびFzd5の発現について分析した。mDA NPの誘導により、コリン発現も誘導された。これは、ヒト底板細胞の誘導によってコリン発現も誘導されたという別の研究と一致する（Fasano et al.，2010）。コリン発現のほとんどはFoxA2発現と重なり合い、このことはコリンがヒトシステムにおいて底板細胞の有用なマーカーであることを示唆する。加えて、3つの因子の外因性発現によってもFzd5発現が誘導され、それはOtx2発現とよく重なり合い、このことはFzd5が、マウスシステムで観察されたのと同じく、ヒトシステムでも吻側NPの優れたマーカーであることを示唆する。さらに、FACSによるコリン+Fzd5+細胞の精製により、Lmx1a+Lmx1b+FoxA2+Gast+コリン+ mDA NPが有意に濃縮され、このことはヒトmDA NPを精製する上でのこの2マーカーの組み合わせの有用性をさらに裏づけている。
【００７９】
実施例4‐ヒトESCまたはヒトiPSCに由来するmDA神経前駆細胞の精製
PA6間質細胞を用いたNP細胞へのニューロン分化
hESC株であるH7およびH9（WiCell Research Instituteにより提供）ならびにhiPSC株であるiPS（IMR90）およびiPS-DF4-3（WiCell research Instituteにより提供）を、有糸分裂を失活させたマウス胚線維芽細胞（MEF）の上で、20％ノックアウト血清代替物、ペニシリン（100 IU／mL）、ストレプトマイシン（100g／mL）、1mmol／L L-グルタミン、1％非必須アミノ酸、0.1mmol／L β-メルカプトエタノールおよび4ng／mLの塩基性線維芽細胞増殖因子（すべてInvitrogenによる）を入れたDMEM／F12培地中で培養する。未分化hESCの維持のためには、コラゲナーゼIV（Invitrogen）処理を毎週約1回用い、続いて小さな塊を新たに調製したMEFフィーダーに移して、培養物を継代する。hESCの神経分化は、PA6間質細胞（Kawasaki et al.，2000）またはソニックヘッジホッグを安定して過剰発現するPA6細胞（PA6-SHH）上での共培養によって誘導する。PA6共培養システムを用いるのは、それが効率的に神経前駆細胞を誘導すること、およびFACSの際にそれらを容易に除去しうることが理由である。未分化hESCまたはhiPSCのコロニーを、コラゲナーゼIVとのインキュベーションによって脱離させ、続いて穏やかな解離によって小さな塊にして、N2培地中にてPA6間質細胞の層の上にプレーティングして7日間培養し、続いて、ロゼットが出現するまで約14日間、腹側化用の新たに調製したPA6-SHHフィーダー上で継代する。ロゼットを機械的に単離して、NP細胞を、PLO／FNをコーティングしたプレート上に、さらなる増大のためにプレーティングする。
【００８０】
ニューロン分化のためには、bFGFを取り除くことにより、NP細胞を14日間またはそれ以上培養する。FACS選別のためには、hESC由来またはhiPSC由来のNPステージの細胞（インビトロ分化の第28日）を染色して、FACSに供する。選別画分の純度はすべて、FACSを用いた再分析ならびに免疫細胞化学検査によって決定した。精製された細胞を、分析、さらなる増大または分化のために、NP培地を入れた、PLO／FNをコーティングしたプレート上にプレーティングする。
【００８１】
MS5間質細胞を用いたNP細胞への神経分化
ヒトES（hES）細胞株であるH1、H9（WiCell Research Instituteによって提供）およびHSF-6（University of California, San Francisco, CA, USA）を、有糸分裂を失活させたマウス胚線維芽細胞（MEF）上で、20％ノックアウト血清代替物、ペニシリン（100 IU／mL）、ストレプトマイシン（100 lg／mL）、1mmol／L L-グルタミン、1％非必須アミノ酸、0.1mmol／L b-メルカプトエタノールおよび4ng／mLの塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）（すべてInvitrogen，Carlsbad，CA，USAによる）を入れたDMEM／F12培地中で培養する。未分化hES細胞の維持のためには、毎週約1回の機械的切離を行い、続いて小さな塊を新たに調製したMEFフィーダー上に移すことによって培養物を継代する。
【００８２】
hES細胞の神経分化は、MS5間質細胞またはソニックヘッジホッグを安定して過剰発現するMS5細胞（MS5-SHH）上での共培養によって誘導する。MS5間質フィーダー細胞は、10％ウシ胎仔血清および2mmol／L L-グルタミンを含有する最小必須培地中で維持した（Barberi et al. 2003）。未分化hESコロニーを、200U／mLコラゲナーゼIV（Invitrogen）との37℃での15分間のインキュベーションによってMEFフィーダーから脱離させ、その後にピペットで小さな塊へと穏やかに解離させて、続いて細胞を0.2mmol／Lアスコルビン酸を入れた無血清N2培地（AA；Sigma-Aldrich，New London，NH，USA）中に再懸濁させる。MS5間質細胞の層上の塊を7日間培養し、続いて、新たに調製したMS5-SHHのフィーダー上に継代して、ロゼットが出現するまで約14日間さらに培養する。ロゼットを機械的に、またはディスパーゼを用いて単離する。NP細胞を、10％ジメチルスルホキシドを含有するFBS中の小さな塊の懸濁液により、温度が確実に徐々に低下するように80℃のスチロフォーム容器に入れることによって凍結させる。24時間後に、凍結した細胞を液体窒素タンクに移す。凍結NP細胞は、37℃水浴中で解凍させ、続いて、N2-bFGF培地を入れた、PLO／FNをコーティングしたプレート上にプレーティングする。
【００８３】
ニューロン分化（ND）細胞へのさらなる分化のためには、bFGFを取り除くことにより、NP細胞を14日間またはそれ以上培養する。
【００８４】
bFGFの取り除きおよび胚様体形成を用いた神経分化
胚様体（EB）を形成させることによるhES分化のためには、hES細胞コロニーを、ディスパーゼ（0.2mg／ml）との37℃での30分間のインキュベーションによって無傷のまま脱離させ、bFGFを含まないES細胞培地に移して4日間おいてEBを形成させる。N2-bFGF培地を入れた組織培養プレート上にEBをプレーティングして、ロゼットが出現するまで8〜10日間おく。続いてロゼットを上記の通りに処理する。
【００８５】
TGF-βおよびNogginを用いたNP細胞分化
hES細胞の単層分化のためには、MEFを有しない集密化hES細胞培養物を、培地を10nM TGF-b阻害物質SB431542（Sigma）および500ng／mlのNoggin（R&D systems）を含むノックアウト血清代替培地に変えて、ロゼットが出現するまで約5日間培養下におくことによって分化させた。TGF-β阻害物質を5日後に分化物から取り除き、分化第5日からN2培地を容積を漸増させながら添加した。機械的に単離したロゼットを、SHH（50ng／ml；R&D systems）、Wnt1（50ng／ml；Peperotech）、Wnt5a（50ng／ml；R&D systems）およびFGF8（50ng／ml；R&D systems）といった種々のシグナル伝達分子の存在下におけるさらなる処理および選別のために、N2-bFGF培地を入れたPLO／FNをコーティングしたウェル上にプレーティングした。
【００８６】
実施例5‐ヒトmDA NP細胞のFACS選別
最適化された増殖因子条件下での7日間のロゼットの増大後に、0.05％トリプシン／EDTA（Invitrogen）を用い、穏やかに解離させて単細胞懸濁液にして細胞を採取した上で、20mM D-グルコース（Sigma-Aldrich）、ペニシリン-ストレプトマイシン（Invitrogen）および2％ FBS（Invitrogen）を含有するHBSS（Invitrogen）中に再懸濁させる。試料を細胞ストレーナキャップ（35μmメッシュ；BD Biosciences）に通して濾過し、続いて以下の通りの表面マーカー染色に供する：FITC結合抗Fzd5抗体およびAPC結合抗コリン抗体を添加して30分間おき、続いて細胞を洗浄した上で、FACSAriaセルソーターおよびFACSDivaソフトウェア（BD Biosciences）を用いるFACSに供する。細胞片および死細胞を前方散乱および側方散乱ゲーティングによって除外する。染色を伴わない細胞、または単一の染色を伴う細胞を、ゲーティングを設定するための対照として用いる。選別画分の純度はすべて、FACSを用いた再分析ならびに免疫細胞化学検査および細胞数算定によって決定する。選別した細胞を、さらなる処理、増大、分化または分析のために、N2bFGF培地を入れた、PLO／FNをコーティングしたプレート上にプレーティングする。
【００８７】
実施例6‐ヒトmDA NPの免疫蛍光分析
免疫蛍光染色のためには、カバーグラス上のFACS選別したヒトmDA NP細胞および組織切片をPBSですすぎ洗いして、ブロッキング緩衝液（PBS、10％正常ロバ血清、0.1％ Triton X-100）とともに15分間インキュベートした。続いてカバーグラス／切片を、ブロッキング緩衝液中で一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。以下の一次抗体を用いた：ウサギ抗FoxA2（1：1,000；Abcam）、ヤギ抗Otx2（1：2,000、Neuromics）、ウサギ抗コリン（1：1,000）、モルモット抗Lmx1b（1：10,000、Dr. Carmen Birchmeierにより寄贈）、ウサギ抗Fzd5（1：1,000）、ヒツジ抗TH（1：1,000）、ラット抗DAT（1：1,000；Chemicon）、ウサギ抗小胞モノアミン輸送体2（抗VMAT2；1：1,000；PelFreez）、ウサギ抗Lmx1a（1：1,000；）、ヒツジ抗L-芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（抗AADC；1：200、Chemicon）、ラット抗ドーパミン輸送体（抗DAT；1：1,000）、ウサギ抗Pitx3（1：250；Invitrogen）、ウサギ抗Nurr1（E-20；1：300；Santa Cruz Biotechnology Inc.）、マウス抗engrailed 1（クローン4G11；1：40）、抗HNA（1：400、Chemicon）、マウス抗NeuN（1：200；Chemicon）、ウサギ抗b-チューブリン（1：1,000、Covance）、マウス抗ネスチン（1：100；DSHB）、モルモット抗GLAST（1：1,000、Chemicon）、マウス抗BrdU（1：1,000；Invitrogen）、抗Oct4（1：100、DSHB）、抗nanog、ウサギ抗Ki67（1：2,000；Novocastra Ltd.）。カバーグラス／組織切片をその後に、蛍光標識したAlexa Fluor二次抗体とともに室温で1時間インキュベートした。PBS中でのすすぎ洗いの後、Hoechst 33342（4μg／ml）を対比染色用に用い、カバーグラス／組織切片をスライドにマウントしてMowiol 4-88（Calbiochem）に入れた。
【００８８】
実施例7‐マウスESC由来のmDA NP細胞のFACSによる精製
J1胚性幹細胞（ESC）系統を、Chung et al.（2006a）に記載された手順を用いてインビトロで分化させて、NPステージでChung et al.（2006a）に記載された通りにFACSに供する。手短に述べると、トリプシン処理した細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合抗Fzd5抗体およびアロフィコシアニン（APC）結合抗コリン抗体を用いて染色する。アフィニティー精製した一次抗体を、FACS用の試料調製時間ならびにバックグラウンド染色を少なくするために使用前にFITCまたはAPCで直接標識する。非染色細胞または単一染色細胞を対照として用いる。選別画分の純度はすべて、FACSを用いた再分析ならびに免疫細胞化学検査によって決定する。FACS精製された細胞を、分析、さらなる増大または分化のために、NP培地（N2培地（Johe et al.，1996）にラミニンおよびbFGFを加えたもの）を入れた、ポリ-L-オルニチン（PLO）およびフィブロネクチン（FN）をコーティングしたプレート上にプレーティングする。
【００８９】
実施例8‐NPステージでのマウスコリン+Fzd5+細胞の細胞表現型の分析
さらに精製された細胞の表現型をさらに確認するために、実施例7の通りに調製したマウス細胞をFACSから1時間後または1日後に固定し、FoxA2（abcam）、Otx2（Neuromics）、Lmx1a、Lmx1bおよびEn1（クローン4G11；DSHB）などの他のmDA NPマーカーの共発現に関して、二重陰性細胞およびコリン+OtxGFP+細胞を対照として用いてアッセイする。また、mDA NPの未熟放射状グリア様NPとしての性質を確かめるために、細胞を、GLAST（Chemicon）、ビメンチン（DSHB）、ネスチン、β-チューブリンおよびGFAPに対する抗体を用いて染色する。多能性細胞を除去する効率を、ESCマーカーであるSSEA1、Oct4およびNanogを用いてモニターする。共焦点分析を、Zeiss LSM510／Meta Stationを用いて行う。細胞数算定は、二重陰性細胞およびコリン+OtxGFP+細胞を対照として用いる少なくとも5回の独立したインビトロ分化およびFACS選別実験（n＝5）から、Stereolnvestigator画像取り込み機器およびソフトウェア（Microbright Field，Williston，VT）を用いるランダムサンプリングによって行う。mDA NPの割合（コリン+Otx2+／Hoechst+の％）および未熟多能性細胞の割合（Nanog+／Hoechst+の％）を算定する。予備的データで示されたmDA NPのマーカーとしてのコリン+Otx2+細胞は、二重細胞表面マーカーの組み合わせコリン+Fzd5+よりも、細胞数算定に関してより優れた組み合わせである。ANOVAをStatViewソフトウェアを用いて行い、有意差がある場合には、事後解析を行う。
【００９０】
実施例9‐精製されたマウスコリン+Fzd5+細胞のND細胞ステージでの分化の性質決定
精製されたマウスNPの表現型をひとたび確認すると、マウスNPを、それらが分化後にmDAニューロン表現型（ND細胞；「ニューロン分化ステージ」細胞）を生じうるか否かを明らかにするために分析する。選別細胞を、ND馴化培地（ラミニンを加え、混成NDステージ細胞により馴化させたN2培地）中で7日間分化させ、免疫細胞化学的分析のために固定する。ND馴化培地は、分化中のmDAニューロンの生存を支援することが示されている（Chung et al.，2011a）。抗TH抗体と、Lmx1a、Lmx1b、FoxA2、En-1、Nurr1（SCBT）およびPitx3などの他の公知のmDAニューロンマーカーに対する抗体との共標識によって、mDAニューロンの特徴を分析する。精製された細胞から生じたmDAニューロンの機能性を試験するためには、DAT（Chemicon）およびDDC（Chemicon）などの機能的DA遺伝子に対する抗体を用いて、追加の免疫細胞化学検査を行う。加えて、A9ニューロンとA10ニューロンの存在および割合についても、THと、A9で豊富なマーカーであるGirk2（Alomone Labs）およびA10で豊富なマーカーであるカルビンジン（Swant）との共標識を行い、その後に細胞数算定を行うこと（n＝5）により、対比して分析する。β-チューブリン、GFAP、O4（Chemicon）、GABA（Sigma）、グルタミン酸（Sigma）、ChAT（Chemicon）および5HT（Sigma）といった他の神経マーカーの発現についても分析する。コリン-Fzd5-細胞およびコリン+OtxGFP+細胞を対照として用いて、分化後のDAニューロンの割合（TH+／β-チューブリン+の％およびTH+／Hoechst+の％）およびmDAニューロンの割合（TH+Pitx3+／Hoechst+の％）（n＝5）を明らかにするために、細胞数算定を上記の通りに行った。
【００９１】
実施例10‐精製されたマウスまたはヒトのmDA NDの電気生理学的分析
材料および方法：分化した細胞を、従来の「透析型」ホールセルパッチクランプ手法を用いるホールセル記録構成を用いて調べる。縦引き式マイクロピペット製作機（Narishige）を用いて、ホウケイ酸ガラスキャピラリー（Sutter Instrument Company）からパッチ電極を製作する。パッチ電極の先端熱加工をマイクロフォージ（Narishige）で行い、下記の内液を満たした場合に抵抗が1〜3Mオームになるようにする。パッチクランプ増幅器（Axopatch-200A；Axon Instruments/Molecular Devices Corp）を用いて、細胞膜キャパシタンスおよび直列抵抗を電気的に補償する（典型的には約80％）。電流プロトコール作成およびデータ収集は、アナログデジタル変換器（Digidata 1322A; Axon Instruments/Molecular Devices Corp.）を装備したIBMコンピュータ上でpClamp 8.0ソフトウェアを用いて行った。電圧の軌跡に対して、クランプ増幅器に四極ベッセルフィルターを用いることによって2kHzでフィルター処理を行い、後の分析のためにコンピュータのハードドライブ上に保存した。実験はすべて室温（21℃〜24℃）で行った。電流固定モードでの膜電位の記録の場合、パッチピペット溶液は以下を含有する（mM単位）：KCl 134、MgCl2 1.2、MgATP 1、Na2GTP 0.1、EGTA 10、グルコース14、およびHEPES 10.5（pHはKOHで7.2に調整）。浴用溶液は以下を含有する（mM単位）：NaCl 126、KCl 5、CaCl2 2、MgCl2 1.2、グルコース14、およびHEPES 10.5（pHはNaOHで7.4に調整）。
【００９２】
コリン+Fzd5+細胞に由来するDAニューロンの電気生理学的特性を、上記の電気生理学的方法を用いて調べる。記録用のmDAニューロンを同定するためには、THプロモーター-EGFPレポーターAAVウイルスベクターを、TH陽性DAニューロンを標識付けるために用いる（Oh et al.，2009）。NPステージでAAV-THプロモーター-EGFPに感染させたコリン+Fzd5+細胞を7日間さらに分化させた後に、電気生理学的分析に供する。測定する活動膜特性には以下が含まれる：活動電位を生じさせるために必要な電流（pA単位）、活動電位閾値（mV）、活動電位振幅（mV）、活動電位の持続時間（ms）、緩徐AHP持続時間（ms）および振幅（mV）。加えて、TH-EGFP+ニューロンも、DAニューロンに特徴的なIh電流についてアッセイする。
【００９３】
実施例11‐精製されたヒトmDA ND細胞の生理学的分析
DA放出アッセイ法：ドーパミンのHPLC分析を、ニューロン分化ステージの第14日に馴化から24時間後に行う。馴化培地の分析のためには、12ウェルプレートの各ウェルからの培地0.2mlからのタンパク質を、過塩素酸（PCA）およびEDTAをそれぞれ最終濃度0.33Mおよび0.17mMで添加することによって沈殿させる。脱分極誘発性放出に関しては、残留培地（0.6ml）の吸引後に、細胞をN2培地中にて0.2mlの50mM KClにより37℃で30分間処理した。続いて培地を収集し、上記の通りにPCAおよびEDTAの添加によってタンパク質を沈殿させる。この混合物を4℃、14,000gで10分間遠心分離し、上清をHPLC分析に用いる。細胞におけるDA含有量の分析のためには、細胞を新たな培地中で1日間回復させた後、それらを洗浄し、掻き落として収集し、0.33M PCAおよび0.17mM EDTAの0.24mlの冷却（4℃）溶液中でボルテックス処理を行う。14,000gで10分間の遠心分離後に、細胞内画分（上清）および細胞ペレットを、それぞれ細胞内DAおよびタンパク質の分析のために分離する。試料を、Velosep RP-18カラム、および5014分析用セルを装備したCoulochemII（登録商標）電気化学検出器（ESA Biosciences，Inc.，Chelmsford，MA）を用いる逆相HPLCに適用する。移動相（0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 2.65、0.1mM EDTA、0.4mMオクチル硫酸ナトリウムおよび9％メタノール）の流速は0.8ml／分とする。ガードセルならびに分析用セルにおける第1および第2の電極の電位はそれぞれ330、0および310mVに設定する。EZChrom Chromatography Data Systemを用いて、ドーパミンを保持時間によって同定し、ピーク高さに基づいて定量する。
【００９４】
DA再取り込みアッセイ法：細胞をPBSで洗浄して、非特異的取り込みについて判定するために、ドーパミン輸送体（DAT）遮断薬である10□Mノミフェンシン（RBI，Natick，MA，USA）の非存在下または存在下で、50nM ［3H］DAを含むPBS（51Ci／mmol、Amersham Co.，Buckinghamshire，UK）とともにインキュベートする。37℃で10分間のインキュベーション後に、反応溶液の吸引によって取り込み反応を終了させ、氷冷PBSによる洗浄を2回行う。細胞を0.5M NaOH中に溶解させ、液体シンチレーション計数法（MicroBeta TriLux ver.4.4 Wallac）によって放射能を測定した。ノミフェンシンの非存在下での取り込み値から非特異的取り込み（ノミフェンシンの存在下）を差し引くことによって、特異的なDA取り込みを算出する。
【００９５】
実施例12‐精製されたマウスmDA ND細胞の生理学的分析
精製されたマウスNP細胞を、それらが真性のmDAニューロンを生じる能力に関して、シナプス前mDAニューロンにおいて決定的に重要な過程であるDA放出およびDA取り込みによって試験する。第1に、精製されたNP細胞に由来するND細胞（「ニューロン分化ステージ」細胞）を、二重陰性由来のND細胞を対照として用いて、それらが膜脱分極に応答してDAを放出しうるか否かを判定するために試験する。NDステージの第7日に、細胞をND培地中にて50mM KClで30分間処理した。続いて培地を収集し、HPLC分析のために除タンパク質する。HPLCを実施例11に記載した通りに行い、その結果を全タンパク質含有量に対して標準化する（Chung et al.，2002）。
【００９６】
精製されたND細胞についても、それらがドーパミン輸送体（DAT）を用いてDAを特異的に取り込む能力について分析する。NDステージの第7日に、ND細胞を、DAの非特異的取り込みについて判定するために、ドーパミン輸送体（DAT）遮断薬である10□Mノミフェンシン（RBI）の非存在下または存在下で、50nM ［3H］DAを含むPBS（Perkin Elmer）中でインキュベートする。ND細胞を洗浄し、溶解させて、その後に液体シンチレーション計数を行う。非特異的取り込み（ノミフェンシンの存在下）を差し引くことによって、特異的なDA取り込みを算出する。この場合も、二重陰性由来のND細胞を対照として用いる。
【００９７】
実施例13‐精製されたマウスmDA NPの増大および凍結保存
最終分化したニューロンの代わりにNPを単離することの主な利点の1つは、それらの増大可能性である。シグナル伝達分子はmDA NP増殖と関連づけられているが、異なるシステムおよび実験から得られた結果は対立している。mDA NPの精製された集団の使用により、純粋な細胞集団における各シグナル伝達分子の影響を、他の細胞種に影響を及ぼすことなく試験する機会が得られる。シグナル伝達分子に対する細胞の応答性を明らかにすることは、mDA NPの生物学的性質決定のためだけではなく、それらをインビトロで最適に維持するためにも有用である。最近、mESCおよびhESC由来のNP細胞を、それらの増殖能および分化能を喪失することなく、増大させ、凍結させ、かつ再び解凍させることができることが確立されている（Chung et al.，2006b；Hong et al.，2008）。
【００９８】
精製されたmDA NPを、SHH（50ng／ml；R&D systems）、Wnt1（50ng／ml；Peprotech）、Wnt5a（50ng／ml；R&D systems）およびFGF8（50ng／ml；R&D systems）といったmDA NP特異的シグナル伝達分子、さらにはDll4（500ng／ml；R&D systems）およびJag1（500ng／ml；R&D systems）といったより一般的なNP特異的シグナル伝達分子の単独または組み合わせの存在下においてNP培地中で増大させ、さらなる増大または分析のために週1回継代する。シグナル伝達分子に加えて、内皮細胞馴化培地（または挿入共培養）についても試験され、それにより、神経幹細胞のニッチが得られることが示されている（Elkabetz et al.，2008；Shen et al.，2004）。マウスmDA NPの増殖に対するシグナル伝達分子の影響を、5回の独立したFACS選別および増大（n＝5）により、シグナル伝達分子を添加しないNP培地中で増大させた細胞を対照として用いる、増大中の増殖曲線およびKi67+細胞数算定によってアッセイする。特定のシグナル伝達分子により増大させたコリン+Fzd5+細胞の発生能を、実施例6で上述したように、NPステージおよびNDステージでの免疫細胞化学検査によって特徴づける。
【００９９】
実施例14‐精製されたヒトmDA NPの増大および凍結保存
シグナル伝達分子に対するヒトmDA NP細胞の応答性を明らかにすることは、ヒトmDA NPの生物学的性質決定のためだけでなく、ヒトmDA NPをインビトロで最適に維持するためのそれらのより実際的な応用のためにも重要である。最近、mESCおよびhESC由来のNP細胞を、それらの増殖能および分化能を喪失することなく、増大させ、凍結させ、かつ再び解凍させることができることが確立されている（Chung et al.，2006b；Hong et al.，2008）。したがって、このプロトコールを用いて、コリン+Fzd5+細胞を凍結させて、凍結保存から1カ月後、3カ月後および12カ月後に解凍し、凍結保存中のそれらの増殖／発生能の安定性を、上記の通りにNPおよびNDステージで免疫細胞化学検査によって比較する。
【０１００】
実施例15‐コリン+Fzd5+細胞の無水晶体症マウスへの移植
PDに対する細胞補充療法のための動物モデルとしての無水晶体症マウス
無水晶体症マウスのSNcにおけるA9 DAニューロンの選択的喪失という以前の知見に基づいて（Hwang et al.，2003）、無水晶体症マウスをPDの動物モデルとして用いることを調べた。無水晶体症マウスは、L-DOPAによって好転する黒質線条体路特異的な運動障害を呈し、線条体における「DA感受性亢進」の証拠が得られている（Hwang et al.，2005）。無水晶体症マウスはホモ接合体の対として繁殖させることができるため、個体間変動がわずかな、系統だった行動分析のための多数の個体を容易に入手することができ、それ故、ラットにおけるさらなる分析のためのヒトコリン+Fzd5+細胞の最良の移植条件を得るために最適である。このため、無水晶体症マウスは、対症的PD療法の有効性を試験するために有用な遺伝学的モデルである。最近、無水晶体症マウスの運動障害が対照マウスのそれと比較されており、マウスES細胞由来の移植によってこれらの運動症状が好転している（Moon et al., 投稿準備中）。
【０１０１】
ESC由来の細胞をさまざまな分化ステージ（胚様体（EB）、NPおよびND）で移植された無水晶体症マウス、ならびにL-DOPAを投与されたマウスは、食塩水を投与した群に比較して、ビーム歩行での移動時間が有意に速い（図3A）。加えて、垂直ポールの頂部に頭を上向きにして乗せた場合に、無水晶体症マウスが下向きになるまでの時間は、他のいずれの群よりもはるかに長かった（図3B）。下向きに移動するまでの移動潜時の合計も、頭低位に関する測定値と一致する結果を示した（図3C）。盲目のrd1マウスを陽性対照として用いた。
【０１０２】
このように、無水晶体症マウスは、それらと齢数を一致させて移植した対照およびL-DOPA対照よりも、黒質線条体路DA系の欠陥に対する感度が高い一連の行動試験の成績が悪く、かつ、それらの機能を細胞移植によってL-DOPA投与マウスのレベルまで有意に回復させることができる。興味深いことに、これらの試験のすべてにおいて、NP細胞を投与したマウスは最良の行動回復を示し、このことはmDA NPを同定して精製するという長期目標のさらなる裏づけとなる。無水晶体症マウスの同様の行動回復は、コリン+Otx2+細胞の移植後にも観察された（実施例23およびChung et al.，2011a）。
【０１０３】
実施例16‐無水晶体症マウスへのヒトコリン+Fzd5+細胞の移植
無水晶体症マウスへのヒトコリン+Fzd5+細胞の最適な移植条件を、NPステージおよび初期NDステージ（NDステージの第3日）の両方で判定することができる。移植片成熟の経時的推移を観察するために、ヒトコリン+Fzd5+細胞を移植した無水晶体症マウスを移植から1カ月後、2カ月後および4カ月後に屠殺する。移植のためには、コリン+Fzd5+細胞を、FACSのストレスから回復させるためにNP培地中で3日間増大させて、ND馴化培地中での3日間の分化を行うかまたは行わずに移植する。移植の前に、細胞を、DA分化中にNPのサイレンシングを必要とせずに、移植した細胞を追跡するための効率的なシステムであるLenti-EF1a-GFP（Hong et al.，2007）に感染させる。細胞をトリプシン処理し、溶液中に細胞150,000個／μlで懸濁させて、22ゲージの5μl HamiltonシリンジおよびKopf定位フレーム（Kopf Instruments）を用いて、細胞懸濁液2μlを無水晶体症マウスの線条体に両側性に注射する（前頂から：AP +0.05、L +0.18、V -0.30、IB 9）。対照としてコリン-Fzd5-細胞も移植する。外科手術の前に、マウスに対してアセプロマジン（3.3mg／kg）および硫酸アトロピン（0.2mg／kg）の腹腔内注射を行い、その後にケタミン（60mg／kg）およびキシラジン（3mg／kg）の腹腔内注射により麻酔を施す。移植細胞の拒絶反応を予防するために、マウスに対して、外科手術の1日前に2倍用量の注射から始めて毎日、エキストラバージンオリーブ油中に希釈したシクロスポリンA（15mg／kg）の皮下注射によって免疫抑制を施す。
【０１０４】
実施例17‐無水晶体症マウスにおけるヒトコリン+Fzd5+細胞の組織学的分析
コリン+Fzd5+細胞移植片の免疫細胞化学的分析
コリン+Fzd5+細胞のインビボ発生能を、免疫組織化学検査によって分析する。移植から1カ月後、2カ月後または4カ月後に、移植を受けた無水晶体症マウスにペントバルビタールの腹腔内過剰投与（150mg／kg）によって終末麻酔を施した上で、0.1％ヘパリン食塩水、続いて4％パラホルムアルデヒドによる心臓内灌流を行う。屠殺の2時間前に、マウスに対して、移植片の安全性に関する重要な要因である、移植片の中の増殖性細胞を追跡するために、BrdU（100mg／kg）を注射する。脳を取り出して、4％パラホルムアルデヒド中で後固定し、20％スクロース中で平衡化させた上で、凍結ミクロトームで40μm厚の冠状スライスとして切片化する。移植片の表現型発現、形態学的および分化的な特性を免疫蛍光によって分析する。mDAニューロンマーカーの発現を、TH抗体と、mDA特異的転写因子（FoxA2、Lmx1a、Lmx1b、Nurr1）、機能的DA遺伝子（DDC、DAT、VMAT2）およびA9-またはA10に特異的な遺伝子（AHD2、Girk2またはカルビンジン）に対する抗体との共標識によって判定する。移植されたmDAニューロンの宿主神経網へのシナプス組み込みについて分析するために、共標識は、THおよびさまざまなシナプスマーカー（シナプシン、シナプトフィジン、シナプトブレビン）に対する抗体を用いても行う。移植片の安全性を確かめるために、PCNA、Ki67およびBrdUといった増殖性細胞のマーカーを分析し、さらに多分化能マーカーであるSSEA1、Oct4およびNanogについても分析する。共焦点分析を、Zeiss LSM510／Meta Station（Carl Zeiss，Thornwood, NY）を用いて行う。細胞内でのシグナル共存の同定のためには、光学的厚さを最小限に保ち、直交的な再構築物（orthogonal reconstuction）を得る。
【０１０５】
コリン+Fzd5+細胞移植片の立体的分析
立体的分析を用いて、コリン+Fzd5+細胞移植片の全体的構造について調査する。移植片における細胞数算定および全細胞数の推定はすべて、Stereolnvestigator画像取り込み装置およびソフトウェア（MicroBrightField）ならびにZeiss Axioplan I蛍光顕微鏡を用い、切片6枚毎にOptical fractionatorプローブを用いて行う。対照移植片とコリン+Fzd5+移植片からのDAニューロン（TH+）の合計、mDAニューロン（TH+Pitx3+）の合計、増殖性細胞（Ki67+）の合計を算出および推定して、対比する。コリン+Otx2+ mDA NPは、mDAニューロンとは異なり、宿主線条体における著しい遊走機能を有し、線条体全体の中で3.3mmを上回る長さに達するため（Chung et al.，2011a）、移植されたコリン+Fzd5+細胞のAP軸に沿った遊走についても、6枚毎の冠状切片のそれぞれにおけるGFP+TH+細胞数の合計を算定することによって測定する。そのような遊走機能は、細胞補充療法のために最大限の宿主組み込みを達成する上での重要な特性である可能性がある。移植片の総体積も、移植片の生存および移植片の安全性に関する独立した尺度として、6枚毎の切片から、Stereolnvestigator装置およびソフトウェアをCavalieri estimatorプローブとともに用いて測定する。
【０１０６】
実施例18‐無水晶体症マウスに移植したコリン+Fzd5+細胞の行動上の影響
コリン+Fzd5+移植片が無水晶体症マウスで示される機能的欠陥を好転させうるか否かについて試験するために、無水晶体症マウスの別の組に対して、hESC由来またはhiPSC由来のコリン+Fzd5+細胞またはコリン-Fzd5-細胞を、最適化された移植条件を用いて移植する。1つのhESC株および1つのhiPSC株を用いる。二重陰性細胞を移植したマウスを対照として用いて、行動試験を移植前ならびに移植から1カ月後、2カ月後および4カ月後に行う。自発運動活性を、粗大運動機能試験として測定する。続いて、円筒試験、ビーム歩行試験およびポール試験といった、黒質線条体路に対してより感度の高い運動行動試験を行う。
【０１０７】
自発運動活性：マウスを、光ビーム検出器で取り囲まれたポリカーボネート製ケージに入れる。水平方向および垂直方向の光ビーム遮断を自発運動活性の尺度として記録する。光ビームの連続的遮断と定義される自発運動（歩行）活性を、24時間にわたって記録する。
【０１０８】
円筒試験：動物を透明な小型円筒の中に3分間入れることにより、自発的運動を測定する。動物が両方の前肢を基底部から離して垂直運動を行った際に、後肢立ちと算定する。
【０１０９】
ビーム歩行横断試験：ビーム（長さ1m）は、幅3.5cmで始まり、1cm刻みで、0.5cmとなるまで徐々に細くなっている。合計3回の試行により、ビームの全長を横断するように動物を2日間訓練する。各動物が行った歩数および3回の試行全体での横断時間を分析する。
【０１１０】
ポール試験：動物を長さ50cmの垂直な木製ポールの頂部に頭部を上向きにして乗せる。ポールの上に乗せると、動物は下向きになり、ポールに沿って降りる。動物すべてに対して、各セッションが3回の試行からなる2日間の訓練を行う。試験日に、動物に3回の試行を行わせ、下向きになるまでの時間および移動時間の合計を測定する。最後の行動分析の後に、マウスを屠殺して、上記の通りに組織学的に分析する。DAニューロンの総数またはmDAニューロンの総数を、行動分析による結果と相関づける。
【０１１１】
実施例19‐無水晶体症マウスに移植したコリン+Fzd5+細胞の電気生理学的分析
ヒトコリン+Fzd5+細胞を、それらが真性のmDAニューロンの電気生理学的特性を完全に示すまでインビボで成熟しうるか否かについて明らかにするための試験も行う。記録用のmDAニューロンを同定するためには、細胞を、移植の前に、TH陽性DAニューロンを効率的に標識付けるAAV-THプロモーター-EGFPに感染させる（Oh et al.，2009）。移植を受けた無水晶体症マウスの独立した1群を移植から1カ月後、2カ月後および4カ月後に行動に関して試験し、その後、移植から4カ月後にイソフルランによって麻酔を施して断頭する。線条体を摘出して、氷冷した人工脳脊髄液（ACSF）中に入れる。傍矢状スライス（350μm厚）をビブラトームで切り出して、32〜34℃のACSF中で少なくとも1時間インキュベートし、その後に記録を行う。スライスを、正立顕微鏡（Nikon E600FN）のステージ上の記録用チャンバーに移す。GFP+ DAニューロン様細胞を蛍光カメラ（CoolSNAP EZ、Photometries）を用いて同定し、その後に赤外線微分干渉コントラスト光学装置を用いて可視化する。測定する活動膜特性には以下が含まれる：活動電位を生じさせるために必要な電流（pA単位）、活動電位閾値（mV）、活動電位振幅（mV）、活動電位の持続時間（ms）、緩徐AHP持続時間（ms）および振幅（mV）。加えて、TH-EGFP+ニューロンも、DAニューロンに特徴的なIh電流についてアッセイする。
【０１１２】
実施例20‐6-OHDA損傷ラットへのマウスまたはヒトのコリン+Fzd5+細胞の移植
材料および方法
損傷および移植：Sprague-Dawleyラット（250〜300g；Taconic）を、6-OHDAを内側前脳束に注射することによって一側性に損傷させる。損傷動物にアンフェタミン（4mg／kg）を投与した後にその回転行動を評価し、90分間の試行において損傷側に500回を上回る同側性回旋がみられたもの（97％を上回る線条体DA損傷を有すると判断される）を移植用に用いる。FACS後に3日間の回復をおいたコリン+Fzd5+細胞を移植に用い、コリン-Fzd5-細胞も陰性対照として用いる。移植の前に、移植した細胞を追跡するために、細胞をLenti-EF1a-GFPに感染させる。各動物に対して、右側線条体の一束への2回の投入（各1μl）による2μl（細胞150,000個／μl）の注射を行う（前頂から：A +0.10、L -0.30、V -0.50および-0.45、IB 0）。移植したマウスNP細胞の拒絶反応を予防するために、ラットに対して、外科手術の1日前に2倍用量の注射から始めて毎日、エキストラバージンオリーブ油中に希釈したシクロスポリンA（15mg／kg）の皮下注射によって免疫抑制を施す。
【０１１３】
別の方法を用いる場合、生存度に関して分析する対照細胞または二重陽性細胞を、20ng／ml BDNF、10ng／ml GDNFおよび20uM Boc-Asp（OMe）フルオロメチルケトン（BAF；Sigma-Aldrich）を含有するN2AA培地中に、1マイクロリットル当たり細胞100,000個の密度で再懸濁させる。一側性6-ヒドロキシドーパミン損傷を有するSprague-Dawleyラットを、Charles River Laboratoriesから入手する（1つの時点当たりn＝16×4つの時点＝ラット64匹＋別のラット16匹；ラット合計70匹）。移植の前に、損傷の重症度を、アンフェタミン（4mg／kg腹腔内）およびアポモルヒネ（0.05mg／kg）に応答した回転行動として測定する。ラットに対して、損傷した線条体の一束への2回の投入により、細胞懸濁液3μl中にある移植片を投与する（前頂からの座標：前後方向0.0、側方-0.3、腹側-0.55および-0.45）。移植したマウスES細胞の拒絶反応を予防するために、ラット宿主（および対照動物）に対して、外科手術の1日前に2倍用量の注射から始めて毎日、エキストラバージンオリーブ油中に希釈したシクロスポリンA（15mg／kg）の皮下注射によって免疫抑制を施す。移植から1カ月後、2カ月後、4カ月後および6カ月後にアンフェタミン誘発性の回転行動を再び測定した。動物を移植から1カ月後、2カ月後、4カ月後および6カ月後に屠殺した。麻酔をペントバルビタールの腹腔内過剰投与（150mg／kg）によって施し、0.1％ヘパリン食塩水、続いて4％パラホルムアルデヒドによる心臓内灌流を行う。脳を取り出して、4％パラホルムアルデヒド中で後固定し、20％スクロース中で平衡化させた上で、凍結ミクロトームで40μm厚の冠状スライスとして切片化する。
【０１１４】
免疫組織化学検査および移植片分析：宿主神経網へのDA移植片の組み込みを分析するために、宿主線条体に対するDA線維の神経支配を測定する。多能性細胞由来の細胞の移植は時に、移植片の内部に多数のTH+細胞が認められるにもかかわらず、宿主線条体との適正な連結性を伴わず機能が最適には及ばない移植片をもたらすことを考慮すれば（Wernig et al.，2008）、これは重要な基準である。6OHDAラットは、無水晶体症マウスと比較して、線条体における内因性DA線維バックグラウンドがより少なく、それ故にこの分析のためにはより優れたシステムである。
【０１１５】
PDのための動物モデルとしての6-OHDA損傷ラット
6OHDA損傷ラットへの低密度ESCの移植は機能的回復を備えるDA移植片を生じさせることが示されており、これはPDの細胞補充療法に対するESC由来の子孫の有用性を例証している（Bjorklund et al.，2002）。さらに、精製されたESC由来のコリン+Otx2+ mDA NPは、6-OHDA損傷ラットにおいて機能的回復を伴うDA移植片を効率的に生じさせることが示されている（Chung et al.，2011a）。
【０１１６】
齧歯動物線条体へのhiPSC由来のNPの移植を最適化した。300,000個のhIPSC-NPの移植後に、最適な移植片サイズ（4.74±1.94mm3）で強固な生存性を備えるmDAニューロン（移植片当たり26,882±9089個のTH+ニューロン）が観察された。成熟mDAニューロンの特徴が、THとVMAT2、Nurr1およびEn1との共発現によって示された（データは図示せず）。
【０１１７】
実施例21‐コリン+／Fzd5+細胞を移植したラットの行動分析
アンフェタミン誘発性回転行動：ES由来のDAニューロンは6OHDA損傷ラットにおける薬物誘発性回転を有意に減少させうることが示されており、そこで回転行動試験を記載の通りに行う（Bjorklund et al.，2002）。各ラットに対してアンフェタミン投与（2.5mg／kg、腹腔内、0.9％滅菌食塩水に溶解）を行い、続いて自動ロトメーターボウルの中に入れる。ラットの回転を、コンピュータによって90分間の期間にわたって記録する。完全（360°）な回旋の数を用いる。
【０１１８】
円筒試験：円筒試験は、ラットの自発的な前肢使用の非対称性に関する運動試験として用いられる（Kim et al.，2002）。ラットを透明なプラスチック製円筒の中に入れ、円筒壁に対して垂直方向に足を20回置くまでビデオ録画する。接触全体に占める損傷した足の使用のパーセンテージを計算する。
【０１１９】
足伸ばし熟練（skilled paw reaching）：一側性6-OHDA損傷によって生み出される運動非対称性は、微細な運動技能を用いる動物の成績に側方向の偏り（side bias）をもたらすと考えられる。絶食により、動物の体重を自由摂餌時の80％にして、その後にそれらを10日連続して試験する。動物を試験ボックスに20分間入れる。最初の5日間は、二重階段の両側に40個の餌ペレットを置いて餌付けを行う。第10日に、左側および右側の階段に別々に40個のペレットを置き（「強制選択」試験）、動物に両側の食餌を5分間取得させる。各試験の後に、取ったペレットの数および食べた数を別々に算定する。
【０１２０】
歩行調整試験（Adjusting Step Test）：歩行調整試験によって前肢無動症を判定する。両方の後肢および一方の前足を拘束して、もう一方の前足がテーブルに乗るようにした；続いてラットをテーブルに沿って5秒以内に0.9m、最初は順手方向に、続いて逆手方向に、横向きに受動的に移動させる。続いて、5回のサイクルでの歩行数の平均を各前足について求める。結果を、非損傷側と比較した損傷側での歩行のパーセンテージとして表す。
【０１２１】
実施例22‐コリン+／Fzd5+細胞を移植したラットにおける線条体ドーパミン分析
mDA NPの真正性に関する別の重要な基準は、それらが宿主線条体においてDAを放出しうるmDAニューロンを生じうるか否かである。このことはまた、移植片の適正な機能のためにも決定的に重要である。6OHDA損傷ラットの独立した1群に対して、宿主線条体におけるDA放出分析のためにコリン+Fzd5+細胞を移植する。それらを移植から1カ月後、2カ月後および4カ月後に行動に関して分析し、続いて屠殺して、DA放出の成績をHPLC分析によって評価する。移植を行っていない線条体の損傷側または非損傷側を陽性対照および陰性対照として用いる。移植から4カ月後に、脳を氷冷プレート上で迅速に取り出し、線条体を抽出してPCAおよびEDTAとともにホモジネート化した上で、14,000gで10分間の遠心分離を行う。上清をHPLCのために用い、細胞ペレットを、HPLCデータを標準化するためのタンパク質分析のために用いる。試料を、記載された通りに分析する（Chung et al.，2002）。
【０１２２】
実施例23‐コリン+Otx2GFP+細胞を移植したラットおよびマウスの行動分析
実施例15に記載した通りに、無水晶体症マウスに対してコリン+Otx2GFP+細胞を移植した。移植されたマウスに対して、モック移植を受けた無水晶体症マウスおよび盲目rd1マウスを対照として用いて、Hwang et al.（2005）ならびに実施例16および18に記載された通りに、黒質線条体路に対する感度の高い運動行動試験を移植から4週後および6週後に行った。行動試験には、円筒試験、ビーム歩行試験およびポール試験を含めた。垂直ポールの頂部に頭を上向きにして乗せた場合に、コリン+Otx2GFP+細胞を移植した無水晶体症マウスは、対照の無水晶体症マウスよりも、下向きになるまでの時間がはるかに短かった（図8A）。下向きに移動するまでの潜時の合計も、頭低位の測定値と一致する結果を示した（図8B）。加えて、コリン+Otx2GFP+細胞を移植した無水晶体症マウスは、モック移植群と比較して、ビーム歩行に要する移動時間が有意に短かった（図8C）。これらの結果は、移植を受けた無水晶体症マウスの成績が、黒質線条体路DA系の欠陥に対する感度の高い一連の行動試験で、それらと齢数を一致させた対照無水晶体症マウスよりも有意に優れることを示している。図8A〜8Cにおける星印は、対照との統計学的な有意差を指し示している。
【０１２３】
実施例20に記載した通りに、6OHDA損傷ラットに対してもコリン+Otx2GFP+細胞を移植した。6OHDA損傷ラットの線条体への移植後のコリン+Otx2GFP+細胞のインビボ機能を、実施例21に記載した通りに行動試験によって調べた。偽手術を受けた対照ラットと比較して、移植を受けたラットは、アンフェタミン誘発性回転（図8D）および円筒試験による損傷した足の使用（図8E）のいずれにおいても、運動性の有意な改善を示した。図8Dおよび8Eにおける星印は、対照との統計学的な有意差を指し示している。
【０１２４】
実施例24‐マウスES細胞におけるコリン発現の最適化
マウスES細胞の分化（腹側化）に際してのコリンの発現を最適化するために、分化中のマウスES細胞（実施例1に記載した通りに調製）を、NP細胞がEBから現れ始めた時点（ステージ3）またはNP細胞がEBからの出現後に十分に樹立した時点（ステージ4；ステージは実施例1および図1Aに記載）のいずれかで、SHH馴化培地で処理した。FoxA2およびコリンの相対的mRNAレベルを、Chung et al. 2009に記載された通りにリアルタイムPCRを用いて分析した。FoxA2およびコリンのいずれのmRNA発現も、細胞をステージ3の時点に馴化培地で処理した場合のみ有意に増加し（図9）、このことは分化中のES細胞がSHH媒介性腹側化に応答する時間枠があることを示している。
【０１２５】
実施例25‐bFGFおよびFGF8はmDA神経前駆細胞の増殖を支援する
さまざまなシグナル伝達分子に応答してのコリン+Otx2GFP+細胞の自己再生性（または増大可能性）について試験した。試験した分子には、mDA NPの調節（例えば、SHH、FGF8、Wnt1およびWnt5a）またはNP全般の増殖（例えば、bFGF、EGF、D114およびJag1）に関連づけられているもの、さらにはmDA生存に関連づけられているFGF20を含めた。NP細胞を取り巻くマイトジェン非含有培地（ND培地）に対して、精製された細胞の増殖を単独では支援しない各候補分子を添加して1週間おいた。50ng／mlの濃度では、bFGF（FGF2）およびFGF8のみがOtx2+コリン+細胞の増殖を支援し、SHH、FGF20、Wnt1、Wnt5a、EGF、Dll4およびJag1はそうではなかった（図10）。Ki67+増殖性細胞を多くの割合で生じさせたのはbFGFおよびFGF8のみであった（データは図示せず）。対照的に、分化したTH+細胞は、他の因子の存在下で大きく増加した（データは図示せず）。これらの結果は、bFGFおよびFGF8がmDA NPの自己再生を支援し、同時にそれらが分化するのを防ぐことを示している。加えて、1週後には、bFGFまたはFGF8で処理した細胞は、濃縮されたネスチン+細胞集団の存在を示し、一方、他の因子で処理した細胞は、ネスチン+細胞と比較して、濃縮されたβ-チューブリン+ニューロンを示した（データは図示せず）。
【０１２６】
引用した参照文献
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【０１２７】
別に定める場合を除き、本明細書で用いた技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
【０１２８】
本明細書で例示的に説明されている本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の1つまたは複数の要素、1つまたは複数の限定の非存在下で好適に実施することができる。したがって、例えば、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含有する（containing）」などの用語は、包括的かつ非限定的に読まれるものとする。さらに、本明細書で使用されている用語および表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、そのような用語および表現の使用においては、示され、記載された特徴の任意の等価物またはその一部を排除するという意図はなく、特許請求される本発明の範囲内でさまざまな改変が可能であることが認識される。
【０１２９】
したがって、本発明は好ましい態様および任意選択的な特徴によって具体的に開示されているものの、当業者が本明細書に開示された具現化された発明の改変、改良および変更を行いうるること、ならびにそのような改変、改良および変更が本発明の範囲内にあると考えられることが理解されるべきである。本明細書において提示された材料、方法および例は、好ましい態様を代表するものであり、例示的なものであり、かつ、本発明の範囲に対する限定であることは意図していない。
【０１３０】
本発明を広範かつ包括的に説明してきた。包括的開示の範囲内にあるそれぞれのより狭義の種および下位の分類も本発明の一部を形成する。これは、任意の素材を部類から削除することを、その削除された材料が本明細書に具体的に列挙されているか否かにかかわらず行うという条件または否定的限定を伴う、本発明の包括的記述を含む。
【０１３１】
さらに、本発明の特徴または局面がマーカッシュ群に関して記述されている場合、当業者は、本発明がマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの部分群に関してもそれによって記載されることを認識するであろう。
【０１３２】
本明細書で言及した刊行物、特許出願、特許および他の参照文献はすべて、それらが個別に参照により組み入れられるのと同程度に、それらの全体が参照により明示的に組み入れられる。矛盾がある場合には、定義を含め、本明細書が優先するものとする。
【０１３３】
他の態様は、添付の特許請求の範囲に記述されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
2014516528.tif 000015
【図５−３】
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【図６−１】
2014516528.tif 000017
【図６−２】
2014516528.tif 000018
【図７−１】
2014516528.tif 000019
【図７−２】
2014516528.tif 000020
【図７−３】
2014516528.tif 000021
【図７−４】
2014516528.tif 000022
【図８】
2014516528.tif 000023
【図９】
2014516528.tif 000024
【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年1月22日(2014.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014516528000001.app
【国際調査報告】
2014516528.tif 000026