(57)【要約】本発明は、ポリグルタミン酸、例えば、ポリ−γ−グルタミン酸（γ−ＰＧＡ）で少なくとも部分的に被覆されたプロバイオティック微生物に関する。本発明は、ポリグルタミン酸で少なくとも部分的に被覆されたプロバイオティック微生物を含む摂取可能な生成物、およびポリグルタミン酸で少なくとも部分的に被覆されたプロバイオティック微生物を作製する方法にも関する。本発明は、ポリ−γ−グルタミン酸（γ−ＰＧＡ）を作製する方法にも関する。【選択図】図１
2014525259.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリグルタミン酸で少なくとも部分的に被覆された、プロバイオティック微生物。
【請求項２】
前記ポリグルタミン酸が、ポリ−γ−グルタミン酸（γ−ＰＧＡ）である、請求項１に記載のプロバイオティック微生物。
【請求項３】
前記γ−ＰＧＡが、１０，０００〜１，０００，０００の分子量を有する、請求項２に記載のプロバイオティック微生物。
【請求項４】
前記γ−ＰＧＡが、２０，０００〜８００，０００の分子量を有する、請求項２に記載のプロバイオティック微生物。
【請求項５】
前記γ−ＰＧＡが、１００，０００〜３００，０００の分子量を有する、請求項２に記載のプロバイオティック微生物。
【請求項６】
前記γ−ＰＧＡが、枯草菌またはリケニホルミス菌中で生成され得る、請求項１〜５のいずれかに記載のプロバイオティック微生物。
【請求項７】
前記γ−ＰＧＡが、納豆菌中で生成される、請求項１〜６のいずれかに記載のプロバイオティック微生物。
【請求項８】
前記プロバイオティック微生物が、細菌である、請求項１〜７のいずれかに記載のプロバイオティック微生物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のプロバイオティック微生物を含む、摂取可能な生成物。
【請求項１０】
前記プロバイオティック微生物のいくつかまたはすべての全部または一部が、ポリグルタミン酸で被覆される、請求項９に記載の摂取可能な生成物。
【請求項１１】
前記摂取可能な生成物が、食品または飲料製品である、請求項９または請求項１０に記載の摂取可能な生成物。
【請求項１２】
前記摂取可能な生成物が、乳系である、請求項９〜１１のいずれかに記載の摂取可能な生成物。
【請求項１３】
前記摂取可能な生成物が、乳系でない、請求項９〜１１のいずれかに記載の摂取可能な生成物。
【請求項１４】
プロバイオティック微生物をポリグルタミン酸で少なくとも部分的に被覆する方法であって、前記微生物とポリグルタミン酸の溶液とを混合することを含む、方法。
【請求項１５】
前記ポリグルタミン酸が、２〜１５％（ｗ／ｖ）の濃度で提供される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物が、細胞ペレット形態で提供される、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリグルタミン酸が、ポリ−γ−グルタミン酸（γ−ＰＧＡ）である、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記γ−ＰＧＡが、１０，０００〜１，０００，０００の分子量を有する、請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記γ−ＰＧＡが、２０，０００〜８００，０００の分子量を有する、請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記γ−ＰＧＡが、１００，０００〜３００，０００の分子量を有する、請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記γ−ＰＧＡが、枯草菌またはリケニホルミス菌中で生成される、請求項１４〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記γ−ＰＧＡが、納豆菌中で生成される、請求項１４〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記プロバイオティック微生物が、細菌である、請求項１４〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
ポリ−γ−グルタミン酸（γ−ＰＧＡ）を作製する方法であって、
ａ）発酵ブロス中で適切な細菌コロニーのスターター培養物を調製するステップと、
ｂ）スターター培養物を増殖培地に添加するステップと、
ｃ）前記増殖培地中でγ−ＰＧＡを生成するステップと、
を含む、方法。
【請求項２５】
前記細菌コロニーが、枯草菌またはリケニホルミス菌である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細菌コロニーが、納豆菌である、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記発酵ブロスが、トリプトン大豆ブロス（ＴＳＢ）である、請求項２４〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記増殖培地が、増殖培地Ｅまたは増殖培地ＧＳである、請求項２４〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記細菌コロニーが、高度に粘液性である、請求項２４〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記発酵ステップが、３５〜３９℃の温度で行われる、請求項２４〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記発酵時間が、１８〜３０時間である、請求項２４〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記増殖ステップが、３５〜３９℃の温度、例えば３７℃で行われる、請求項２４〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記増殖時間が、９０〜１００時間である、請求項２４〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記増殖培地中の前記ポリ−γ−グルタミン酸が、遠心分離に供される、請求項２４〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
次にアルコール系溶媒が、遠心分離から生じた前記細胞を含まない上清に添加される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記アルコール／上清混合液が、２〜６℃で７０〜７５時間インキュベートされる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリ−γ−グルタミン酸が、遠心分離および／または濾過によって前記アルコール／上清混合液から除去される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ポリ−γ−グルタミン酸が、凍結乾燥に供される、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロバイオティック微生物の生存率を向上させることにおけるポリ−γ−グルタミン酸（γ−ＰＧＡ）の使用に関する。本発明は、γ−ＰＧＡ、特に特定の特性を持つγ−ＰＧＡを製造する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
プロバイオティクスは、２００２年に世界保健機関（ＷＨＯ）によって、適量で投与されると宿主に健康上の利益を付与する生微生物として定義された。その結果、プロバイオティック微生物は、ヒトまたは動物に投与するために、様々な食品および飲料製品に導入されている。しかしながら、食品および飲料製品に使用されるプロバイオティック微生物の多くは、宿主に健康上の利益を付与するために十分には長く生存しない。それらが食品または飲料製品、およびヒトまたは動物の身体に入るために供されなければならない過程により、それらは任意の方法で宿主に影響を及ぼす機会を有する前に、多くが生存できなくなる。
【０００３】
第１に、プロバイオティック微生物は、凍結乾燥過程に供される。第２に、プロバイオティック微生物は、食品または飲料生成物に組み込まれ、次にそれらが組み込まれた製品に応じて一定期間保管される。最後に、プロバイオティック微生物は、食品または飲料製品によってヒトまたは動物により摂取され、特に口および胃の状態がプロバイオティック微生物の生存に対して有害である。したがって、上記過程のすべてを通過した後、依然として生存可能であり、宿主にある程度の影響を及ぼすことができる微生物はほんのわずかしかない。
【０００４】
さらに、プロバイオティック微生物が導入される食品または飲料製品の性質は、概して、微生物が耐えられる弱酸性環境を維持する乳系製品に限定される。しかしながら、これらの条件下であっても保存可能期間は制限される。
【０００５】
したがって、プロバイオティック微生物が、特に凍結乾燥、保管、および摂取過程を通過する際に、それらの生存率を向上させるための手段の必要性が残る。乳系ではない食品および飲料製品に微生物を入れることができることも有用となる。
【発明の概要】
【０００６】
したがって、本発明は、プロバイオティック微生物およびポリグルタミン酸を含む摂取可能な製品を提供する。
【０００７】
ポリグルタミン酸は、好ましくは、ポリ−γ−グルタミン酸（γ−ＰＧＡ）である。
【０００８】
γ−ＰＧＡは、好ましくは、１０，０００〜１，０００，０００ダルトン（Ｄａ）の分子量を有する。γ−ＰＧＡは、２０，０００〜８００，０００Ｄａ、または２０，０００〜７００，０００Ｄａ、または２０，０００〜６００，０００Ｄａの分子量を有してよい。より好ましくは、γ−ＰＧＡは、５０，０００〜５００，０００Ｄａ、例えば、１００，０００〜３００，０００Ｄａまたは２００，０００〜２６０，０００Ｄａの分子量を有してもよい。
【０００９】
γ−ＰＧＡは、任意の適切な細菌、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびリケニホルミス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）中で生成され得る。一実施形態において、γ−ＰＧＡは、枯草菌、例えば、納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｎａｔｔｏ）中で生成される。
【００１０】
プロバイオティック微生物は、細菌であってよい。可能な細菌の例としては、ビフィドバクテリウムロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウムブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、およびラクトバチルスカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）が挙げられる。
【００１１】
プロバイオティック微生物のいくつかまたはすべての全部または一部は、例えば、プロバイオティック微生物をバイオポリマー中に懸濁した後、凍結乾燥させることによって、バイオポリマーで被覆されてよい。
【００１２】
プロバイオティック微生物のいくつかまたはすべての全部または一部は、例えば、プロバイオティック微生物をポリグルタミン酸中に懸濁した後、凍結乾燥させることによって、ポリグルタミン酸で被覆されてもよい。
【００１３】
摂取可能な生成物は、食品または飲料製品であってよい。摂取可能な生成物は、乳系、例えば、ヨーグルトもしくはヨーグルト飲料、または非乳系、例えば、果汁等の果実系であり得る。
【００１４】
少なくとも部分的にポリグルタミン酸で被覆されたプロバイオティック微生物も提供される。
【００１５】
ポリグルタミン酸は、好ましくは、ポリ−γ−グルタミン酸（γ−ＰＧＡ）である。
【００１６】
γ−ＰＧＡは、好ましくは、１０，０００〜１，０００，０００ダルトン（Ｄａ）の分子量を有する。γ−ＰＧＡは、２０，０００〜８００，０００Ｄａ、または２０，０００〜７００，０００Ｄａ、または２０，０００〜６００，０００Ｄａの分子量を有してよい。より好ましくは、γ−ＰＧＡは、５０，０００〜５００，０００Ｄａ、例えば、１００，０００〜３００，０００Ｄａまたは２００，０００〜２６０，０００Ｄａの分子量を有してもよい。
【００１７】
γ−ＰＧＡは、任意の適切な細菌、例えば、枯草菌およびリケニホルミス菌中で生成され得る。一実施形態において、γ−ＰＧＡは、枯草菌、例えば、納豆菌中で生成される。
【００１８】
プロバイオティック微生物は、細菌であってよい。可能な細菌の例としては、ビフィドバクテリウムロンガム、ビフィドバクテリウムブレーベ、およびラクトバチルスカゼイが挙げられる。
【００１９】
微生物をポリグルタミン酸溶液と混合することを含む、プロバイオティック微生物をポリグルタミン酸で少なくとも部分的に被覆する方法も提供される。
【００２０】
ポリグルタミン酸は、２〜１５％（ｗ／ｖ）、例えば、５〜１２％（ｗ／ｖ）、例えば１０％（ｗ／ｖ）の濃度で提供されてよい。
【００２１】
微生物は、細胞ペレット形態で提供されてもよい。
【００２２】
プロバイオティック微生物は、細菌であってよい。可能な細菌の例としては、ビフィドバクテリウムロンガム、ビフィドバクテリウムブレーベ、およびラクトバチルスカゼイが挙げられる。
【００２３】
ポリグルタミン酸は、好ましくは、ポリ−γ−グルタミン酸（γ−ＰＧＡ）である。
【００２４】
γ−ＰＧＡは、好ましくは、１０，０００〜１，０００，０００ダルトン（Ｄａ）の分子量を有する。γ−ＰＧＡは、２０，０００〜８００，０００Ｄａ、または２０，０００〜７００，０００Ｄａ、または２０，０００〜６００，０００Ｄａの分子量を有してよい。より好ましくは、γ−ＰＧＡは、５０，０００〜５００，０００Ｄａ、例えば、１００，０００〜３００，０００Ｄａまたは２００，０００〜２６０，０００Ｄａの分子量を有してもよい。
【００２５】
γ−ＰＧＡは、任意の適切な細菌、例えば、枯草菌およびリケニホルミス菌中で生成され得る。一実施形態において、γ−ＰＧＡは、枯草菌、例えば、納豆菌中で生成される。
【００２６】
ａ）発酵ブロス中で適切な細菌コロニーのスターター培養物を調製するステップと、
ｂ）スターター培養物を増殖培地に添加するステップと、
ｃ）増殖培地中でγ−ＰＧＡを生成するステップと、
を含む、ポリ−γ−グルタミン酸（γ−ＰＧＡ）を作製する方法も提供される。
【００２７】
本発明の文脈において、「スターター培養物」は、細菌の適切な株の１つ以上のコロニー、好ましくは１つ以上の高度に粘液性のコロニーを含み、増殖培地、例えば、ＴＳＢ中に接種され、例えば、３７℃で２４時間インキュベートされる。
【００２８】
細菌コロニーは、枯草菌またはリケニホルミス菌であってよい。細菌コロニーは、好ましくは、納豆菌である。
【００２９】
発酵ブロスは、任意の適切なブロス、例えば、トリプトン大豆ブロス（ＴＳＢ）であってよい。
【００３０】
増殖培地は、任意の適切な増殖培地、例えば、増殖培地Ｅまたは増殖培地ＧＳであってよい。
【００３１】
増殖培地ＧＳは、一般に、増殖培地Ｅよりも高い収率のγ−ＰＧＡを生成する。増殖培地は、非結晶質の培地Ｅ中で生成されるγ−ＰＧＡおよび結晶質である培地ＧＳ中で生成されるγ−ＰＧＡによってγ−ＰＧＡの結晶性に作用し得る。さらに、増殖培地は、γ−ＰＧＡの塩または遊離酸形態の形成に対する影響を有する。増殖培地ＧＳ中、生成されるγ−ＰＧＡの大部分は、ナトリウム塩であったが、増殖培地Ｅ中では、相当量の酸形態が生成された。分子量は、増殖培地および細菌株の両方によって影響を受ける。
【００３２】
細菌コロニーは、高度に粘液性であり得る。
【００３３】
発酵ステップは、３５〜３９℃の温度、例えば、３７℃で行われ得る。
【００３４】
発酵時間は、１８〜３０時間、例えば、２０〜２８時間、例えば、２４時間であり得る。
【００３５】
増殖ステップは、３５〜３９℃の温度、例えば、３７℃で行われ得る。
【００３６】
増殖時間は、９０〜１００時間、例えば、９４〜９８時間、例えば、９４時間であり得る。
【００３７】
増殖ステップは、増殖時間の全部または一部において、任意の適切な発酵容器内で攪拌するステップを含んでよい。
【００３８】
攪拌は、１００ｒｐｍ〜１０００ｒｐｍの範囲であり得る。
【００３９】
例えば、攪拌フラスコ、通気攪拌タンク反応器、および固体発酵槽を含む、任意の適切な発酵容器が使用され得る。
【００４０】
ポリ−γ−グルタミン酸は、増殖培地から単離されてよい。増殖培地中のポリ−γ−グルタミン酸は、最初に遠心分離に供されてよい。
【００４１】
次に、エタノール等の任意の適切なアルコール系溶媒を、遠心分離から生じる細胞を含まない上清に、例えば２：１〜６：１、例えば４：１のアルコール：上清比で添加されてよい。アルコール／上清混合液は、２〜６℃、例えば、４℃で７０〜７５時間、例えば、７２時間インキュベートされてよい。
【００４２】
ポリ−γ−グルタミン酸は、遠心分離および／または濾過によって、アルコール／上清混合液から除去され得る。
【００４３】
ポリ−γ−グルタミン酸は、凍結乾燥に供され得る。ポリ−γ−グルタミン酸は、凍結乾燥に供される前に凍結されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、ＧＳ培地中のバチルス株の増殖を示す。
【図２】図２は、Ｅ培地中のバチルス株の増殖を示す。
【図３ａ】図３は、市販のγ−ＰＧＡ試料のものと比較して、バチルス株によって生成されるγ−ＰＧＡのＦＴ−ＩＲスペクトルを示す。
【図３ｂ】図３は、市販のγ−ＰＧＡ試料のものと比較して、バチルス株によって生成されるγ−ＰＧＡのＦＴ−ＩＲスペクトルを示す。
【図４】図４は、増殖培地ＥおよびＧＳ中の異なるバチルス株からのγ−ＰＧＡの粗収率を示す。
【図５】図５は、ＧＳおよびＥ培地中の株−枯草菌ＡＴＣＣ  ２３８５６のＸＲＤスペクトルを示す。
【図６】図６は、ＧＳ培地中の異なるバチルス株によって生成されるγ−ＰＧＡの塩組成％を示す、ＩＣＰ−ＡＥＳ結果を示す。
【図７】図７は、Ｅ培地中の異なるバチルス株によって生成されるγ−ＰＧＡの塩組成％を示す、ＩＣＰ−ＡＥＳ結果を示す。
【図８】図８は、凍結乾燥中のプロバイオティック細菌の生存率に対する圧力調理されたγ−ＰＧＡおよびスクロースの影響を示す。
【図９】図９ａおよびｂは、オレンジ果汁中のＢ．ロンガムおよびＢ．ブレーベの生存率に対するγ−ＰＧＡの影響を示す。
【図１０】図１０ａおよびｂは、人工胃液中のＢ．ロンガムおよびＢ．ブレーベの生存率に対するγ−ＰＧＡの影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
ここで、実行された実験作業を参照して、本発明の態様を説明する。実験作業は、単に本発明の態様の例示であり、いかなる方法においても本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００４６】
第１部．８つの異なるバチルス株からのポリ−γ−グルタミン酸の生成
この実験は、攪拌フラスコ中の８つの異なる細菌株−納豆菌、枯草菌ＡＴＣＣ  ２３８５６、枯草菌ＡＴＣＣ  ２３８５７、枯草菌ＡＴＣＣ  ２３８５８、枯草菌ＡＴＣＣ  ２３８５９、リケニホルミス菌  ９９４５ａ、リケニホルミス菌ＮＣＩＭＢ  １５２５、およびリケニホルミス菌ＮＣＩＭＢ  ６８１６を用いたγ−ＰＧＡの生成について説明する。
１．導入
【００４７】
以前の研究から、枯草菌およびリケニホルミス菌は、生成培地から容易に回収され得る細胞外γ−ＰＧＡを生成することができることが知られている。この研究において、５つの枯草菌株−納豆菌、バチルス・サブティリス亜種サブティリスＡＴＣＣ  ２３８５６（バチルス・サブティリス亜種サブティリスＳＢ  １９  ＥＭＧ５０としても知られる）、枯草菌ＡＴＣＣ  ２３８５７（バチルス・サブティリス亜種サブティリス１６８  ＥＭＧ５１としても知られる）、枯草菌ＡＴＣＣ  ２３８５８（バチルス・サブティリス亜種サブティリスＥＭＧ５２としても知られる）、枯草菌ＡＴＣＣ  ２３８５９（バチルス・サブティリス亜種サブティリスＥＭＧ５３としても知られる）、および３つのリケニホルミス菌株−リケニホルミス菌９９４５ａ、リケニホルミス菌ＮＣＩＭＢ  １５２５（リケニホルミス菌１２２９としても知られる）、リケニホルミス菌ＮＣＩＭＢ  ６８１６（リケニホルミス菌Ｇｌａｘｏ４１７としても知られる）を、γ−ＰＧＡの生成について調査した。
【００４８】
結晶性、ペプチドの形態、および分子量に伴う収率等の異なる特性を持つγ−ＰＧＡを得るために、２つの異なる培地を生成に使用した。
２．材料および方法
２．１細菌株
【００４９】
すべての株−納豆菌、枯草菌ＡＴＣＣ  ２３８５６、枯草菌ＡＴＣＣ  ２３８５７、枯草菌ＡＴＣＣ  ２３８５８、枯草菌ＡＴＣＣ  ２３８５９、リケニホルミス菌９９４５ａ、リケニホルミス菌ＮＣＩＭＢ  １５２５、およびリケニホルミス菌ＮＣＩＭＢ  ６８１６は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＮＣＩＭＢ）から入手した。保存培養物を凍結乾燥させ、−２０℃で保管した。使用前に、培養物を無菌で再生させ、汎用微生物培地上で一晩、３７℃で増殖させた。
２．２増殖培地
【００５０】
トリプトン大豆寒天（ＴＳＡ）、トリプトン大豆ブロス（ＴＳＢ）、および４分の１強度のリンガー溶液を、製造者のプロトコルに従って調製した（Ｌａｂ  Ｍ，ＵＫ）。
【００５１】
ＧＳ培地および培地Ｅの組成を以下の表１および２に示した。両培地のｐＨは、３Ｍ  ＮａＯＨおよび１Ｍ  ＨＣｌを用いて７．２に調整した。
【００５２】
脱イオン化水を用いてすべての培地を調製し、１２１℃、１５ｐ．ｓ．ｉ．で２０分間滅菌した。スクロース溶液は、圧力鍋の中で別個に滅菌し（１１０℃、５ｐ．ｓ．ｉ．で３０分間）、ビタミン溶液は、濾過滅菌して（０．２μｍ  Ｍｉｎｉｓｔａｒｔ）、別個にＧＳ培地に添加した。
【００５３】
表１：ＧＳ培地の組成
【表１】
2014525259.tif 000003
【００５４】
表２：培地Ｅの組成
【表２】
2014525259.tif 000004
２．３γ−ＰＧＡの生成
【００５５】
各細菌株を用いたγ−ＰＧＡの生成は、３回重複して行った。適切な株の高粘液性コロニーを選択し、２５０ｍＬ  ＴＳＢを含有するフラスコ内に播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間の最後に、スターター培養物は、約７ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬの個体群に到達した。この培養物の５％を、２５０ｍＬの生成培地−ＧＳおよびＥに播種した。すべてのフラスコは、回転攪拌器（Ｉｎｎｏｖａ４３）上で１５０ｒｐｍ、３７℃で９６時間インキュベートした。細胞増殖および栄養消費について分析するために、０、２４、４８、７２、および９６時間に試料を採取した。
２．４γ−ＰＧＡの単離
【００５６】
９６時間後、細胞懸濁液を１７０００ｇで３０分間遠心分離した（Ｈｅｒｍｅｌｅ  ２３００Ｋ）。４容積の冷却９０％（ｖ／ｖ）エタノールを、細胞を含まない上清に添加し、４℃で７２時間インキュベートした。湿ったγ−ＰＧＡ粉末を沈殿物として得た。１７０００ｇで３０分間遠心分離することによって、沈殿物を上清から分離した。得られたポリマーは、丸底フラスコ中の１０ｍＬの脱イオン化水に溶解することによって、凍結乾燥のために調製した。次にフラスコを−２０℃の９０％（ｖ／ｖ）エタノールおよびドライアイスの混合物上で静かに回転させて、薄膜形態のバイオポリマーを冷凍した。次に、冷凍したバイオポリマーを凍結乾燥させて、乾燥したγ−ＰＧＡ粉末を得た（Ｅｄｗａｒｄ  Ｍｏｄｕｌｏ）。乾燥粉末を計量して収率（ｇ／Ｌ）を計算し、さらなる分析のためにデシケーター内で保管した。
２．５増殖の測定
【００５７】
細胞増殖を監視するために、試料を０、２４、４８、７２、および９６時間に無菌採取し、細胞増殖を監視した。ミスラ法を使用して、コロニー形成単位／ｍＬ（ＣＦＵ／ｍＬ）を３回重複して計算した。４．５ｍＬの滅菌１／４強度リンガー溶液中の０．５ｍＬの試料を分注することによって、１０−１〜１０−１０の連続希釈を行った。２０μＬの各希釈液を、無菌条件下でＴＳＡプレートの上に分注した。次にプレートを３７℃で２４時間インキュベートした後、２０コロニー未満のプレートを選択して、生菌数測定に使用した。ＣＦＵ／ｍＬは、以下の式：
【数１】
2014525259.tif 000005
を用いて計算し、式中、ｎはコロニーの数であり、Ｄ．Ｆ．は希釈係数である。
２．６化学分析
γ−ＰＧＡの同定
【００５８】
ＯＭＮＩＣソフトウェアと併せて、ＫＢｒペレットを有するＩｍｐａｃｔ  ４０４  Ｎｉｃｏｌｅｔ分光計（ＵＫ）を用いて、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）により単離したバイオポリマーを分析した。生成されたγ−ＰＧＡのＦＴＩＲスペクトルは、市販のγ−ＰＧＡ試料のスペクトルと比較した。
元素分析
【００５９】
単離したポリマーが遊離酸または塩の形態であるかどうかを評価するために、誘導結合プラズマ発光分析法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）を使用し、ＳＰＥＣＴＲＯ  ＣＩＲＯＳｃｃｏを用いて元素分析を行った。分析の前に、６ｍＬ  ＨＮＯ３（７０％）および１ｍＬ  Ｈ２Ｏ２（３０％  ｗ／ｖ）を０．２５ｇの乾燥γ−ＰＧＡに添加し、この溶液をＥＴＨＯＳ  ９００  Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ  Ｌａｂｓｔａｔｉｏｎ−Ｍｉｌｅｓｔｏｎｅ  Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍにより消化させた。
分子重量
【００６０】
水系ゲル透過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）を使用し、ＭＺ  Ｈｅｍａガードプラス２×Ｈｅｍａ  Ｌｉｎｅａｒカラムを用いて、分子量（Ｍｗ）、分子数（Ｍｎ）、および多分散性（Ｓｍｉｔｈｅｒｓ  Ｒａｐｒａ）を測定した。０．２Ｍ  ＮａＮＯ３、０．０１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）を、流量１．０ｍＬ／分、３０℃の溶離剤として、ＲＩ検出器とともに使用した。Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ「Ｃｉｒｒｕｓ」ソフトウェアを用いて、データを収集および分析した。この作業に使用されるＧＰＣシステムは、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手したポリアクリル酸ナトリウム較正液で較正した。
栄養消費分析
【００６１】
栄養消費分析は、高速液体分光法（ＨＰＬＣ）を使用して、ＨＰシリーズ１１００  ＨＰＬＣマシンを用いてレディング大学（ＵＫ）で行った。ＵＶ検出器を備えるＰｒｅｖａｉｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｃｉｄ５ｕカラムを、Ｌ−グルタミン酸およびクエン酸の分析に使用したが、スクロースおよびグリセロール測定にはＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ炭水化物カラム（Ｒｅｚｅｘ  ＲＣＭ−単糖類Ｃａ＋＋  −８％）を使用した。濾過した脱イオン化水を、スクロース分析の溶離剤として使用した。有機酸分析の場合、２５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（リン酸によりｐＨ２．５に調整した）を溶離剤として使用した。負荷する前に、０．４５μｍフィルタを通して試料を濾過し、１０倍に希釈した。
結晶性
【００６２】
粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）分析を使用して、結晶性を評価した。Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＰＷ１７００、４０ｋＶ／４０ｍＡ、ＣｕＫαの装置を用いて、データを室温で収集した。
統計解析
【００６３】
すべての結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００３を用いて解析した。二元分散分析を使用して、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００３中のデータを比較した。
３．結果および考察
３．１増殖
【００６４】
図１および２は、ＧＳおよびＥ培地の両方におけるすべての細菌株の増殖を示す。０時間において、すべての株は約５〜６ＣＦＵ／ｍＬの細胞数を有した。ＧＳ培地において、枯草菌２３８５８は、７２時間でｌｏｇ  ９．５８の最大細胞数に達した。培地Ｅにおいて、リケニホルミス菌１５２５は、７２時間でｌｏｇ  ８．５７の最大細胞数に達した。枯草菌株の最大細胞数（約ｌｏｇ  ７．５〜８．１ＣＦＵ／ｍＬ）は、培地Ｅ中のリケニホルミス菌株の最大細胞数（約ｌｏｇ  ８．５ＣＦＵ／ｍＬ）ほどには達しなかった。枯草菌２３８５８および２３８５９、ならびにリケニホルミス菌９９４５ａ、１５２５、および６８１６は、培地ＥよりもＧＳ培地中、９６時間でより高い細胞数を有した。枯草菌２３８５９は、培地Ｅにおいて良好に増殖せず、９６時間の最後の細胞数は−ｌｏｇ  ４．９ＣＦＵ／ｍＬであった。
３．２栄養消費
【００６５】
以下の表３および４は、９６時間後のＧＳおよびＥ培地の両方における細菌株による栄養素の利用を示す。ＧＳ培地において、枯草菌２３８５９（７５．７１％）を除くすべての株は、９６時間の最後に、提供されたスクロースの８５％超を利用していた。対照的に、培地Ｅ中のＣ源、すなわちグリセロールはそれほど消費されなかった（４９．５６〜７０．６７％）。ＧＳ培地において、枯草菌株は、リケニホルミス菌株よりも多くのＬ−グルタミン酸を消費した。納豆菌は、９６時間の最後に、大部分のＬ−グルタミン酸を消費していた（約９５％）。偶然にも、納豆菌は、ＧＳ培地においてγ−ＰＧＡの最高収率も生じた（約１７．７Ｇ／Ｌ）。
【００６６】
対照的に、培地Ｅにおいて、リケニホルミス菌株は、枯草菌株よりも多くのＬ−グルタミン酸を消費した。これは、リケニホルミス菌株が、９６時間の最後に、培地Ｅにおいて、枯草菌株の大部分よりわずかに高いγ−ＰＧＡ収率を生じるという事実に反映され得ると考えられる。
【００６７】
すべての実験は、攪拌フラスコ内で行ったため、培養物のｐＨおよび通気を制御することができず、栄養消費に対していくらかの影響を及ぼした可能性がある。
【００６８】
表３：９６時間後のＧＳ培地における栄養素利用
【表３】
2014525259.tif 000006
【００６９】
表４：９６時間後の培地Ｅにおける栄養素利用
【表４】
2014525259.tif 000007
３．３同定
【００７０】
γ−ＰＧＡの単離後、ＧＳ培地中で増殖した細胞が白色粉末を生成したことが認められた。培地Ｅにおいて、細胞は、第二鉄イオンの存在に起因すると考えられる茶系の生成物を生成した。すべての株によって生成されたγ−ＰＧＡは、ＩＲによって同定された。すべての株は、市販のγ−ＰＧＡ試料と同様の結果を示し、調査下の株によって得られたγ−ＰＧＡのＦＴ−ＩＲスペクトルをそれと十分に比較した（図３参照）。
３．４収率
【００７１】
すべての株は、図４に示されるリケニホルミス菌９９４５ａの場合を除いて、培地ＥよりもＧＳ培地において多くのγ−ＰＧＡを生成した。リケニホルミス菌９９４５ａの場合、両培地中の収率は同等である。納豆菌は、ＧＳ培地中で最大種率を生じた（約１７．７ｇ／Ｌ）。この株は、当研究における任意の他の株（約９５％）より多くのＬ−グルタミン酸を利用し、これが収率に反映され得ると考えられる。しかしながら、他の株の収率は、必ずしも消費されたＬ−グルタミン酸の量に相関するとは限らない。したがって、γ−ＰＧＡの収率は、外因性Ｌ−グルタミン酸の消費のみならず、細菌がγ−ＰＧＡの生成のために外因性Ｌ−グルタミン酸を生成する能力にも依存し得る。培地Ｅは、リケニホルミス９９４５ａによるγ−ＰＧＡの生成に最適であることが知られており、恐らくγ−ＰＧＡの生成について最も研究された株である。すべてのリケニホルミス株は、枯草菌２３８５９を除いて、枯草菌株と比較したときに培地Ｅ中でより多くのγ−ＰＧＡを生成した。枯草菌２３８５９は、他の枯草菌株よりも多くのグリセロールを培地Ｅ中で消費し、これは、そのγ−ＰＧＡ収率がわずかに良好であった理由であり得る。栄養消費は培地のｐＨによって影響され得るため、収率も影響され得る。
３．５結晶性
【００７２】
非晶質γ−ＰＧＡは、水に容易に溶解するが、結晶形態のγ−ＰＧＡは、比較的水不溶性である。ＸＲＤ分析は、すべての株が培地Ｅにより非晶質γ−ＰＧＡを生成したことを示した。対照的に、細胞がＧＳ培地中で増殖したとき、結晶性粉末が得られたが、これはスペクトル上の明確なピークの存在によって明白であった。ＧＳおよびＥ培地中のそのような株−枯草菌ＡＴＣＣ  ２３８５６のＸＲＤスペクトルを図５に示した。
３．６元素分析
【００７３】
γ−ＰＧＡの塩または酸形態が生成されたかどうかを同定するために、元素分析を行った。ＩＣＰ−ＡＥＳ分析は、粗ポリマーを分解し、ポリマーを形成する個別の元素の濃度を測定する。したがって、存在する場合、試料中の不純物も検出される。ＩＣＰ−ＡＥＳ結果は、ＧＳ培地中で増殖した細胞を用いて得られたγ−ＰＧＡの大部分が、実際に、γ−ＰＧＡのナトリウム塩（Ｎａ−γ−ＰＧＡ）であり、一部のγ−ＰＧＡはそのＰ、Ｍｇ、およびＫ塩形態でもあったことを示した（図６を参照）。ＧＳ培地中で酸形態のγ−ＰＧＡ（Ｈ＋−γ−ＰＧＡ）を生成した株はなかった。
【００７４】
対照的に、培地Ｅ中で増殖した株は、Ｎａ−γ−ＰＧＡとともに、相当量のＨ＋−γ−ＰＧＡ（３７〜５７％）を生成した（図７を参照）。培地ＥのｐＨは、３Ｍ  ＮａＯＨを用いて調整した。
【００７５】
遊離酸形態のγ−ＰＧＡは、水不溶性であるが、塩形態のγ−ＰＧＡは完全に水溶性である。
３．７分子量
【００７６】
分子量は、水系ＧＰＣを用いて測定した。ＧＳ培地中で増殖されたとき、リケニホルミス菌ＮＣＩＭＢ  １５２５は、分子量８７１０００Ｄａ（多分散性−１．３５）のγ−ＰＧＡを生成したが、リケニホルミス菌ＮＣＩＭＢ  ６８１６は、分子量８５００００Ｄａ（多分散性−１．４５）のγ−ＰＧＡを生成し、納豆菌は、分子量２５７５００Ｄａ（多分散性−４．７５）のγ−ＰＧＡを生成した。他の株は、培地Ｅを用いて低分子量生成物（約３０００Ｄａ）を生成し、リケニホルミス菌ＮＣＩＭＢ  ６８１６は、分子量８５６５００Ｄａ（多分散性−１．２）のγ−ＰＧＡを生成し、リケニホルミス菌９９４５ａは、分子量７６００００Ｄａ（多分散性−１．２）のγ−ＰＧＡを生成したが、他の株は低分子量生成物（約３０００Ｄａ未満）のγ−ＰＧＡを生成した。
【００７７】
ＧＳ培地およびＥ培地の両方において８つのバチルス株を用いて得られたγ−ＰＧＡの特性のまとめを以下の表５および６に示す。
【００７８】
表５：ＧＳ培地中で８つのバチルス株から生成されたγ−ＰＧＡの特性
【表５】
2014525259.tif 000008
【００７９】
表６：培地Ｅ中で８つのバチルス株から生成されたγ−ＰＧＡの特性
【表６】
2014525259.tif 000009
４．結論
【００８０】
本研究は、８つのバチルス株を使用してγ−ＰＧＡを生成し、生成されたγ−ＰＧＡは、異なる特性（高／低分子量、非晶質／結晶性、塩および酸形態）を有した。
細胞がＧＳ培地中で増殖する場合、それらは結晶性塩形態のγ−ＰＧＡを生成する。対照的に、それらが培地Ｅ中で増殖するとき、非晶質酸形態のγ−ＰＧＡが生成される。γ−ＰＧＡの結晶性および形態は、バチルス株から独立していると考えられ、これらの特性は、生成の培地によって操作され得る。
【００８１】
しかしながら、分子量は、生成の株および培地に依存する。これは、リケニホルミス菌６８１６が培地ＥおよびＧＳの両方において極めて高い分子量のγ−ＰＧＡを生成したが、納豆菌は、ＧＳ培地のみにおいて高分子量生成物を生成したという結果から見られる。リケニホルミス菌９９４５ａは、ＧＳ培地ではなく、培地Ｅにおいて高分子量ポリマーを生成した。
第２部．８つのバチルス株を使用したγ−ＰＧＡの生成を調査した後の試験のまとめ
１．導入
【００８２】
８つの異なるバチルス株を使用してγ−ＰＧＡを生成し、様々な分析技法を用いてその特性を特性化した後、プロバイオティック細菌を用いる試験のために、納豆菌を選択してγ−ＰＧＡを生成した。
２．材料および方法
【００８３】
試験のためのγ−ＰＧＡを生成するために、納豆菌のバッチ培養を５リットルの発酵槽内で行った。最初に細菌を２５０ｍＬのトリプトン大豆ブロス中に２４時間３７℃で播種した。５％のこの播種材料を発酵槽に添加した。発酵温度を３７℃に維持し、培養物のｐＨを酸の添加なしに自然に低下させた。ｐＨ６．５が得られたら、３Ｍ  ＮａＯＨまたは３Ｍ  ＨＣｌの自動添加によってｐＨを維持した。発酵開始時の攪拌速度および気流は、それぞれ２５０ｒｐｍおよび１．０Ｌ／分であった。γ−ＰＧＡは細胞外ポリマーであるため、培養培地は、ポリマー生成の増加に伴って高度に粘液性となる。増加した粘液性は、酸素塊移動容量を減少し、酸素制限をもたらす。酸素の供給は、攪拌速度および気流速度を制御することにより４０％以上で維持した。９６時間後、細胞懸濁液を１７０００ｇで３０分間遠心分離した。４容積の冷却９０％（ｖ／ｖ）エタノールを、細胞を含まない上清に添加し、４℃で７２時間インキュベートした。湿ったγ−ＰＧＡ粉末は、沈殿物として得られた。１７０００ｇで３０分間遠心分離することによって、沈殿物を上清から分離した。次に湿った粗ポリマーを水に溶解し、透析して１０，０００Ｄａ未満の不純物を排除した。得られた純粋なポリマーを、丸底フラスコ中で凍結乾燥のために調製した。フラスコを−２０℃の９０％（ｖ／ｖ）エタノールおよびドライアイスの混合物上で静かに回転させて、薄膜形態のバイオポリマーを冷凍した。次に、冷凍したバイオポリマーを凍結乾燥させて、乾燥したγ−ＰＧＡ粉末を得た。純粋な乾燥粉末を計量して収率（ｇ／Ｌ）を計算し、プロバイオティクスを用いた試験のために、デシケーター内で保管した。
３．プロバイオティクスを用いた試験
３．１  抗凍結剤としてのγ−ＰＧＡ
【００８４】
３つのプロバイオティック細菌、ビフィドバクテリウムロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウムブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、およびラクトバチルスカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）を試験に使用した。凍結乾燥前後の細菌の生存率に対する１０％Ｎａ−γ−ＰＧＡの影響を試験した。凍結乾燥前に細胞を抗凍結剤で被覆するために、ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａをＴＰＹブロス中に播種し（Ｂ．ブレーベの場合２２時間、Ｂ．ロンガムの場合１６時間）、ラクトバチルスカゼイをＭＲＳブロス中に（４８時間）３７℃で嫌気的に播種した。インキュベーション後、生菌数をＴＰＹ寒天（ビフィドバクテリア）およびＭＲＳ寒天（ラクトバチルス）上で取り、凍結乾燥前の生細胞数を決定した。次に培養物を遠心分離し、ＰＢＳで洗浄して細胞ペレットを得た。次に細胞を、１０ｍＬの１０％  Ｎａ−γ−ＰＧＡ、５％  Ｎａ−γ−ＰＧＡ、および１０％スクロース溶液中に完全に混合した。抗凍結剤を用いない細胞の場合、１０ｍＬの水を添加した。次に細胞を−８０℃で２４時間冷凍し、凍結乾燥させて乾燥粉末を得た。凍結乾燥後、１０ｍＬのＰＢＳをすべての細胞に添加し、生存率を測定して凍結乾燥後の生細胞数を決定した。すべての試験は３回重複して行った。図８に示される結果は、３つの細菌すべてについて、抗凍結剤を使用しなかった場合と比較して、Ｎａ−γ−ＰＧＡが生存率を改善できたことを示した。１０％  Ｎａ−γ−ＰＧＡは、Ｌ．カゼイに対して、１０％スクロースよりも良好な抗凍結剤であったが、その抗凍結能力は、両方のビフィドバクテリア株に対する１０％スクロースに相当した。
３．２．果汁および人工胃液中の保護剤としてのＮａ−γ−ＰＧＡ
【００８５】
オレンジ果汁中で３９日間、および人工胃液中で４時間保存したときの２つのビフィドバクテリア株の生存率に対する２．５％  Ｎａ−γ−ＰＧＡの影響を試験した。細胞をＮａ−γ−ＰＧＡで被覆するために、細菌をＴＰＹブロス中に３７℃で播種した（Ｂ．ブレーベの場合２２時間、およびＢ．ロンガムの場合１６時間）。次に培養物を遠心分離し、ＰＢＳで洗浄して細胞ペレットを得た。次に細胞を、１０％  Ｎａ−γ−ＰＧＡ溶液（９ｍＬの脱イオン化水中１ｇｍ  Ｎａ−γ−ＰＧＡ）中に完全に混合した。この混合物を−８０℃で冷凍し、凍結乾燥させて乾燥粉末を得て、細胞をＮａ−γ−ＰＧＡで被覆した。１ｍＬ  ＰＢＳを乾燥細胞に添加し、この溶液を４０ｍＬのオレンジ果汁に移した。果汁中のＮａ−γ−ＰＧＡの最終濃度は、約２．５％であった。γ−ＰＧＡ被覆のない細胞の場合、前述の条件下で細胞をＴＰＹブロス中に播種した。遠心分離およびＰＢＳでの洗浄後、細胞ペレットを得た。１ｍＬのＰＢＳを細胞に添加した。この溶液をオレンジ果汁に添加した。０、２、４、６、８、１１、１３、２０、２８、および３９日目に、ビフィドバクテリア選択培地寒天（ＢＳＭ寒天）上のＮａ−γ−ＰＧＡ被覆された細胞およびそうでない細胞について、生存率を測定した。結果を図９に示す。
【００８６】
Ｎａ−γ−ＰＧＡで被覆されていない細胞は、オレンジ果汁中で２０日間の生存に失敗した。対照的に、Ｎａ−γ−ＰＧＡで被覆された細胞は、３９日間良好に生存し、生存率は、それらの初期数ｌｏｇ８〜９ＣＦＵ／ｍＬと比較して、約ｌｏｇ６〜７ＣＦＵ／ｍＬであった。したがって、Ｎａ−γ−ＰＧＡを使用して、食品プロバイオティック生成物の保存可能期間を顕著に増加させることができる。
【００８７】
同様に、人工胃液中で４時間保存したときの２つのビフィドバクテリア株の生存率に対する２．５％  Ｎａ−γ−ＰＧＡの影響を試験した。胃の環境を模倣するように、ｐＨ２．０の人工胃液を研究室で調製した。前述のプロトコルに従って、細胞をＮａ−γ−ＰＧＡで被覆した。０時間、１時間、２時間、３時間、および４時間において、ＢＳＭ寒天上のＮａ−γ−ＰＧＡ被覆された細胞およびそうでない細胞について、生存率を測定した。結果を図１０に示す。Ｎａ−γ−ＰＧＡで被覆された細胞の場合、生存率の顕著な減少はなかった。しかしながら、Ｎａ−γ−ＰＧＡで被覆されていない細胞は、２時間以内に死滅した。
【図１】
2014525259.tif 000010
【図２】
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【図３ａ】
2014525259.tif 000012
【図３ｂ】
2014525259.tif 000013
【図４】
2014525259.tif 000014
【図５】
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【図６】
2014525259.tif 000016
【図７】
2014525259.tif 000017
【図８】
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【図９】
2014525259.tif 000019
【図１０】
2014525259.tif 000020
【国際調査報告】
2014525259.tif 000021
2014525259.tif 000022
2014525259.tif 000023
2014525259.tif 000024
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