(57)【要約】  本発明は、肝細胞癌細胞及び他の癌細胞の特異的標的のためのプロトセルに関し、このプロトセルは、担持された脂質二重層を備えたナノ多孔性のシリカコア、少なくとも１つの薬剤、標的細胞に対するプロトセルの結合を特異的にかつ増強するようにして治療対象の組織中の癌細胞を標的にするターゲティングペプチド、並びにプロトセル及び被包されたＤＮＡのエンドソーム脱出を促進する融合ペプチドを含む。少なくとも１つの薬剤は、癌細胞死を促進する薬剤（従来の小分子、高分子カーゴ（例えばｓｉＲＮＡ又はタンパク質毒素（リシン毒素Ａ鎖若しくはジフテリア毒素Ａ鎖など））、及び／又はナノ多孔性シリカコア中に配置されたヒストンでパッケージングされたプラスミドＤＮＡ（より効率的にＤＮＡをプロトセル中にパッケージングするためには、好ましくは超らせん）であり、ＤＮＡは癌細胞の核内にプロトセルを局在させることを助ける核局在配列及び癌細胞の治療法（アポトーシス／細胞死）に関与するペプチドを発現する能力を助ける核局在配列で任意に修飾される。）又はレポーターとしての薬剤である。本発明のプロトセルは、選択的に肝細胞組織に結合する新規の結合ペプチド（ｃ−ＭＥＴペプチド）を用いて癌（特に肝細胞（肝臓）癌を含む）を治療するために、又は癌の診断、癌治療及び創薬において機能するために用いられることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を標的にする多孔性プロトセルであって、前記プロトセルは、担持された脂質二重層を有するナノ多孔性のシリカコア又は金属酸化物コアと、少なくとも１つの更なる成分とを含み、前記少なくとも１つの更なる成分が、
細胞を標的にする化学種と、
プロトセル及び被包されたＤＮＡのエンドソーム脱出を促進する融合ペプチドと、
二本鎖直鎖ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、薬物、造影剤、短鎖干渉ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つのカーゴ成分を含むその他のカーゴと、
からなる群から選択され、前記カーゴ成分の１つが任意で更に核局在配列でコンジュゲートされる、プロトセル。
【請求項２】
前記シリカコアが球形であり、直径が約１０ｎｍ〜約２５０ｎｍの範囲である、請求項１に記載のプロトセル。
【請求項３】
前記シリカコアが約１５０ｎｍの平均直径を有する、請求項２に記載のプロトセル。
【請求項４】
前記シリカコアが、単分散又は多分散のサイズ分布である、請求項２又は３に記載のプロトセル。
【請求項５】
前記シリカコアが単分散である、請求項２又は３に記載のプロトセル。
【請求項６】
前記シリカコアが多分散である、請求項２又は３に記載のプロトセル。
【請求項７】
前記脂質二重層は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホル−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１８：１のＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１８：１ＰＥＧ−２０００ＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１６：０のＰＥＧ−２０００ＰＥ）、１−オレオイル−２−［１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１〜１２：０のＮＢＤ−ＰＣ）、１−パルミトイル−２−｛１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル｝−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１２：０のＮＢＤ−ＰＣ）、コレステロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される脂質で構成される、請求項１から６のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項８】
前記脂質二重層が、ＤＯＰＣをＤＯＰＥと組み合わせて含む、請求項１から７のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項９】
前記脂質二重層が、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＧ、ＤＯＰＣ、又はそれらの混合物を含む、請求項１から７のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項１０】
前記脂質二重層がＤＯＰＧ及びＤＯＰＣを含む、請求項１から７のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項１１】
前記脂質二重層が更にコレステロールを含む、請求項８から１０のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項１２】
前記脂質二重層が、ＤＯＰＣを約５ｗｔ％のＤＯＰＥ、約３０ｗｔ％のコレステロール、及び約１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００ＰＥ（１８：１）と組み合わせて含む、請求項１から７のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項１３】
脂質二重層が、約５ｗｔ％のＤＯＰＥ、約５ｗｔ％のＰＥＧ、約３０ｗｔ％のコレステロール、約６０ｗｔ％のＤＯＰＣ及び／又はＤＰＰＣを含む、請求項１から７のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項１４】
前記ＰＥＧが前記ＤＯＰＥにコンジュゲートされる、請求項１３に記載のプロトセル。
【請求項１５】
前記細胞を標的にする化学種がターゲティングペプチドである、請求項１から１４のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項１６】
前記ターゲティングペプチドがＳＰ９４ペプチドである、請求項１５に記載のプロトセル。
【請求項１７】
前記ターゲティングペプチドが配列番号６、配列番号７、又は配列番号８である、請求項１６に記載のプロトセル。
【請求項１８】
前記ターゲティングペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５によるＭＥＴ結合ペプチドである、請求項１５に記載のプロトセル。
【請求項１９】
前記融合タンパク質が、Ｈ５ＷＹＧペプチド（配列番号１３）又はポリアルギニンの８ｍｅｒ（配列番号１４）である、請求項１から１８のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項２０】
前記融合ペプチドが配列番号１３である、請求項１９に記載のプロトセル。
【請求項２１】
プラスミドＤＮＡを含み、該プラスミドＤＮＡが核局在配列を発現するために任意で修飾される、請求項１から２０に記載のプロトセル。
【請求項２２】
前記プラスミドＤＮＡが、超らせんプラスミドＤＮＡ又はパッケージングされたプラスミドＤＮＡである、請求項２１に記載のプロトセル。
【請求項２３】
前記ＤＮＡが、超らせん化かつパッケージングされたプラスミドＤＮＡである、請求項２２に記載のプロトセル。
【請求項２４】
前記プラスミドＤＮＡが核局在配列を発現するために修飾される、請求項２０から２３のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項２５】
前記ＤＮＡが、ヒストンでパッケージングされた超らせんプラスミドＤＮＡであって、ヒトのヒストンタンパク質の混合物を含む、請求項２１から２４のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項２６】
ヒストンの前記混合物が、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４からなる、請求項２５に記載のプロトセル。
【請求項２７】
ヒストンの前記混合物が、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４であって１：２：２：２：２の重量比である、請求項２５に記載のプロトセル。
【請求項２８】
前記プラスミドＤＮＡが、ポリペプチド毒素、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、又は短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を発現可能である、請求項１から２７のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項２９】
前記ポリペプチド毒素が、リシン毒素Ａ鎖又はジフテリア毒素Ａ鎖からなる群から選択される、請求項２８に記載のプロトセル。
【請求項３０】
前記短鎖ヘアピンＲＮＡ又は前記短鎖干渉ＲＮＡが、細胞のアポトーシスを誘導する、請求項１又は２８に記載のプロトセル。
【請求項３１】
前記ＤＮＡがレポータータンパク質を発現可能である、請求項１から３０のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項３２】
前記レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質又は赤色蛍光タンパク質である、請求項３１に記載のプロトセル。
【請求項３３】
前記核局在配列が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２のペプチドである、請求項１から３２のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項３４】
前記核局在配列が配列番号９のペプチドである、請求項１から３３のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項３５】
前記薬物として抗癌剤を更に含む、請求項１から３４のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項３６】
前記抗癌剤が、エベロリムス、トラベクテジン、アブラキサン、ＴＬＫ２８６、ＡＶ−２９９、ＤＮ−１０１、パゾパニブ、ＧＳＫ６９０６９３、ＲＴＡ７４４、ＯＮ０９１０．Ｎａ、ＡＺＤ６２４４（ＡＲＲＹ−１４２８８６）、ＡＭＮ−１０７、ＴＫＩ−２５８、ＧＳＫ４６１３６４、ＡＺＤ１１５２、エンザスタウリン、バンデタニブ、ＡＲＱ−１９７、ＭＫ−０４５７、ＭＬＮ８０５４、ＰＨＡ−７３９３５８、Ｒ−７６３、ＡＴ−９２６３、ＦＬＴ−３インヒビター、ＶＥＧＦＲインヒビター、ＥＧＦＲ−ＴＫインヒビター、オーロラキナーゼインヒビター、ＰＩＫ−１修飾剤、Ｂｃｌ−２インヒビター、ＨＤＡＣインヒビター、ｃ−ＭＥＴインヒビター、ＰＡＲＰインヒビター、Ｃｄｋインヒビター、ＥＧＦＲ−ＴＫインヒビター、ＩＧＦＲ−ＴＫインヒビター、抗ＨＧＦ抗体、ＰＩ３キナーゼインヒビター、ＡＫＴインヒビター、ＪＡＫ／ＳＴＡＴインヒビター、チェックポイント−１又は２のインヒビター、接着斑キナーゼインヒビター、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ｍｅｋ）インヒビター、ＶＥＧＦトラップ抗体、ペメトレキセド、エルロチニブ、ダサタニブ（dasatanib）、ニロチニブ、デカタニブ（decatanib）、パニツムマブ、アムルビシン、オレゴボマブ、Ｌｅｐ−ｅｔｕ、ノラトレキシド、ａｚｄ２１７１、バタブリン、オファツムマブ、ザノリムマブ、エドテカリン、テトランドリン、ルビテカン、テスミリフェン、オブリメルセン、チシリムマブ、イピリムマブ、ゴシポール、Ｂｉｏ１１１、１３ｌ−Ｉ−ＴＭ−６０１、ＡＬＴ−１１０、ＢＩＯ１４０、ＣＣ８４９０、シレンギチド、ギマテカン、ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ、ＩＮＯ１００１、ＩＰｄＲ1ＫＲＸ−０４０２、ルカントン、ＬＹ３１７６１５、ノイラジアブ（neuradiab）、ビテスペン、Ｒｔａ７４４、Ｓｄｘ１０２、タランパネル、アトラセンタン、Ｘｒ３１１、ロミデプシン、ＡＤＳ−１００３８０、スニチニブ、５−フルオロウラシル、ボリノスタット、エトポシド、ゲムシタビン、ドキソルビシン、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、ビンクリスチン、テモゾロミド、ＺＫ−３０４７０９、セリシクリブ；ＰＤ０３２５９０１、ＡＺＤ−６２４４、カペシタビン、Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−［４−［２−（２−アミノ−４，７−ジヒドロ−４−オキソ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）エチル］ベンゾイル］−二ナトリウム塩（七水和物）、カンプトテシン、ＰＥＧ標識イリノテカン、タモキシフェン、トレミフェンクエン酸塩、アナストラゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ＤＥＳ（ジエチルスチルベストロール）、エストラジオール、エストロゲン、結合型エストロゲン、ベバシズマブ、ＩＭＣ−１Ｃ１１、ＣＨＩＲ−２５８，）；３−［５−（メチルスルホニルピペラジンメチル）−インドリル−キノロン、バタラニブ、ＡＧ−０１３７３６、ＡＶＥ−０００５、［Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）６，Ａｚｇｌｙ１０］酢酸塩（ピロ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｚｇｌｙ−ＮＨ2酢酸［Ｃ59Ｈ84Ｎ18Ｏｉ4−（Ｃ2Ｈ4Ｏ2）x、ｘ＝１〜２．４］、ゴセレリン酢酸塩、リュープロリド酢酸塩、トリプトレリンパモ酸塩、酢酸メドロキシプロゲステロ��、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ラロキシフェン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、酢酸メゲストロール、ＣＰ−７２４７１４；ＴＡＫ−１６５、ＨＫＩ−２７２、エルロチニブ、ラパタニブ、カネルチニブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ抗体、アービタックス、ＥＫＢ−５６９、ＰＫＩ−１６６、ＧＷ−５７２０１６、ロナファルニブ、ＢＭＳ−２１４６６２、チピファルニブ；アミホスチン、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ヒドロキサミン酸サブエロイルアニリド、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、ＦＫ−２２８、ＳＵ１１２４８、ソラフェニブ、ＫＲＮ９５１、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナグレリド、Ｌ−アスパラギナーゼ、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、エピルビシン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、グリベック（gleevac）、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トレチノイン、ビンデシン、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸、フェニルアラニンマスタード、ウラシルマスタード、エストラムスチン、アルトレタミン、フロクスウリジン、５−デオキシウリジン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン、デオキシコホルマイシン、カルシトリオール、バルルビシン、ミトラマイシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、トポテカン、ラゾキシン、マリマスタット、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンギオスタチン、ビタキシン、ドロロキシフェン、イドキシフェン、スピロノラクトン、フィナステリド、シメチジン、トラスツズマブ、デニロイキンジフチトクス、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、パクリタキセル、クレモホール非含有パクリタキセル、ドセタキセル、エピチロン（epithilone）Ｂ、ＢＭＳ−２４７５５０、ＢＭＳ−３１０７０５、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ピペンドキシフェン、ＥＲＡ−９２３、アルゾキシフェン、フルベストラント、アコルビフェン、ラソフォキシフェン、イドキシフェン、ＴＳＥ−４２４、ＨＭＲ−３３３９、ＺＫ１８６６１９、トポテカン、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、ＶＸ−７４５、ＰＤ１８４３５２、ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３、ＲＡＤ００ｌ、ＡＢＴ−５７８、ＢＣ−２１０、ＬＹ２９４００２、ＬＹ２９２２２３、ＬＹ２９２６９６、ＬＹ２９３６８４、ＬＹ２９３６４６、ワートマニン、ＺＭ３３６３７２、Ｌ−７７９，４５０、ＰＥＧ−フィルグラスチム、ダルベポエチン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、ゾレンドロネート（zolendronate）、プレドニゾン、セツキシマブ、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、ヒストレリン、ＰＥＧ化インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ａ、ＰＥＧ化インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−２ｂ、アザシチジン、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリドマイド、ゲムツズマブ、ヒドロコルチゾン、インターロイキン−１１、デクスラゾキサン、アレムツズマブ、全トランスレチノイン酸、ケトコナゾール、インターロイキン−２、メガストロール、免疫グロブリン、ナイトロジェンマスタード、メチルプレドニゾロン、イブリツモマブチウキセタン、エンドロゲン、デシタビン、ヘキサメチルメラミン、ベキサロテン、トシツモマブ、三酸化ヒ素、コルチゾン、エチドロン酸、ミトタン、シクロスポリン、ダウノルビシンリポソーム、エルウィニア−アスパラギナーゼ、ストロンチウム８９、カソピタント、ネツピタント、ＮＫ−１受容体アンタゴニスト、パロノセトロン、アプレピタント、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、メトクロプラミド、ロラゼパム、アルプラゾラム、ハロペリドール、ドロペリドール、ドロナビノール、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プロクロルペラジン、グラニセトロン、オンダンセトロン、ドラセロトン、トロピセトロン、ペグフィルグラスチム、エリスロポエチン、エポエチンα、ダルベポエチンα、又はそれらの混合物である、請求項３５に記載のプロトセル。
【請求項３７】
前記薬物が抗ウイルス剤を含む、請求項１から３６のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項３８】
前記抗ウイルス剤が、抗ＨＩＶ剤、抗ＨＢＶ剤、又は抗ＨＣＶ剤である、請求項３７に記載のプロトセル。
【請求項３９】
担持された脂質二重層を有するナノ多孔性シリカコアと、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＭＥＴ結合ペプチドとを含む、プロトセル。
【請求項４０】
前記ＭＥＴ結合ペプチドが配列番号１のペプチドである、請求項３１に記載のプロトセル。
【請求項４１】
前記ＭＥＴ結合ペプチドが前記脂質二重層にコンジュゲートされる、請求項３９又は４０に記載のプロトセル。
【請求項４２】
前記プロトセルが、プロトセル及び被包されたＤＮＡのエンドソーム脱出を促進する融合ペプチド、プラスミドＤＮＡ、二本鎖直鎖ＤＮＡ、薬物、造影剤、短鎖干渉ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、及びマイクロＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つの成分を更に含み、前記プラスミドＤＮＡ、前記薬物、前記造影剤、及び／又は前記ＲＮＡが、更に核局在配列とコンジュゲートされる、請求項３９から４１のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項４３】
前記薬物が少なくとも１つの抗癌剤を含む、請求項４２に記載のプロトセル。
【請求項４４】
前記抗癌剤が、エベロリムス、トラベクテジン、アブラキサン、ＴＬＫ２８６、ＡＶ−２９９、ＤＮ−１０１、パゾパニブ、ＧＳＫ６９０６９３、ＲＴＡ７４４、ＯＮ０９１０．Ｎａ、ＡＺＤ６２４４（ＡＲＲＹ−１４２８８６）、ＡＭＮ−１０７、ＴＫＩ−２５８、ＧＳＫ４６１３６４、ＡＺＤ１１５２、エンザスタウリン、バンデタニブ、ＡＲＱ−１９７、ＭＫ−０４５７、ＭＬＮ８０５４、ＰＨＡ−７３９３５８、Ｒ−７６３、ＡＴ−９２６３、ＦＬＴ−３インヒビター、ＶＥＧＦＲインヒビター、ＥＧＦＲ−ＴＫインヒビター、オーロラキナーゼインヒビター、ＰＩＫ−１修飾剤、Ｂｃｌ−２インヒビター、ＨＤＡＣインヒビター、ｃ−ＭＥＴインヒビター、ＰＡＲＰインヒビター、Ｃｄｋインヒビター、ＥＧＦＲ−ＴＫインヒビター、ＩＧＦＲ−ＴＫインヒビター、抗ＨＧＦ抗体、ＰＩ３キナーゼインヒビター、ＡＫＴインヒビター、ＪＡＫ／ＳＴＡＴインヒビター、チェックポイント−１又は２のインヒビター、接着斑キナーゼインヒビター、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ｍｅｋ）インヒビター、ＶＥＧＦトラップ抗体、ペメトレキセド、エルロチニブ、ダサタニブ（dasatanib）、ニロチニブ、デカタニブ（decatanib）、パニツムマブ、アムルビシン、オレゴボマブ、Ｌｅｐ−ｅｔｕ、ノラトレキシド、ａｚｄ２１７１、バタブリン、オファツムマブ、ザノリムマブ、エドテカリン、テトランドリン、ルビテカン、テスミリフェン、オブリメルセン、チシリムマブ、イピリムマブ、ゴシポール、Ｂｉｏ１１１、１３ｌ−Ｉ−ＴＭ−６０１、ＡＬＴ−１１０、ＢＩＯ１４０、ＣＣ８４９０、シレンギチド、ギマテカン、ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ、ＩＮＯ１００１、ＩＰｄＲ1ＫＲＸ−０４０２、ルカントン、ＬＹ３１７６１５、ノイラジアブ（neuradiab）、ビテスペン、Ｒｔａ７４４、Ｓｄｘ１０２、タランパネル、アトラセンタン、Ｘｒ３１１、ロミデプシン、ＡＤＳ−１００３８０、スニチニブ、５−フルオロウラシル、ボリノスタット、エトポシド、ゲムシタビン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、ビンクリスチン、テモゾロミド、ＺＫ−３０４７０９、セリシクリブ；ＰＤ０３２５９０１、ＡＺＤ−６２４４、カペシタビン、Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−［４−［２−（２−アミノ−４，７−ジヒドロ−４−オキソ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）エチル］ベンゾイル］−二ナトリウム塩（七水和物）、カンプトテシン、ＰＥＧ標識イリノテカン、タモキシフェン、トレミフェンクエン酸塩、アナストラゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ＤＥＳ（ジエチルスチルベストロール）、エストラジオール、エストロゲン、結合型エストロゲン、ベバシズマブ、ＩＭＣ−１Ｃ１１、ＣＨＩＲ−２５８，）；３−［５−（メチルスルホニルピペラジンメチル）−インドリル−キノロン、バタラニブ、ＡＧ−０１３７３６、ＡＶＥ−０００５、［Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）６，Ａｚｇｌｙ１０］酢酸塩（ピロ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｚｇｌｙ−ＮＨ2酢酸［Ｃ59Ｈ84Ｎ18Ｏｉ4−（Ｃ2Ｈ4Ｏ2）x、ｘ＝１〜２．４］、ゴセレリン酢酸塩、リュープロリド酢酸塩、トリプトレリンパモ酸塩、��酸メドロキシプロゲステロン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ラロキシフェン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、酢酸メゲストロール、ＣＰ−７２４７１４；ＴＡＫ−１６５、ＨＫＩ−２７２、エルロチニブ、ラパタニブ、カネルチニブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ抗体、アービタックス、ＥＫＢ−５６９、ＰＫＩ−１６６、ＧＷ−５７２０１６、ロナファルニブ、ＢＭＳ−２１４６６２、チピファルニブ；アミホスチン、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ヒドロキサミン酸サブエロイルアニリド、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、ＦＫ−２２８、ＳＵ１１２４８、ソラフェニブ、ＫＲＮ９５１、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナグレリド、Ｌ−アスパラギナーゼ、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、エピルビシン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、グリベック（gleevac）、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トレチノイン、ビンデシン、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸、フェニルアラニンマスタード、ウラシルマスタード、エストラムスチン、アルトレタミン、フロクスウリジン、５−デオキシウリジン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン、デオキシコホルマイシン、カルシトリオール、バルルビシン、ミトラマイシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、トポテカン、ラゾキシン、マリマスタット、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンギオスタチン、ビタキシン、ドロロキシフェン、イドキシフェン、スピロノラクトン、フィナステリド、シメチジン、トラスツズマブ、デニロイキンジフチトクス、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、パクリタキセル、クレモホール非含有パクリタキセル、ドセタキセル、エピチロン（epithilone）Ｂ、ＢＭＳ−２４７５５０、ＢＭＳ−３１０７０５、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ピペンドキシフェン、ＥＲＡ−９２３、アルゾキシフェン、フルベストラント、アコルビフェン、ラソフォキシフェン、イドキシフェン、ＴＳＥ−４２４、ＨＭＲ−３３３９、ＺＫ１８６６１９、トポテカン、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、ＶＸ−７４５、ＰＤ１８４３５２、ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３、ＲＡＤ００ｌ、ＡＢＴ−５７８、ＢＣ−２１０、ＬＹ２９４００２、ＬＹ２９２２２３、ＬＹ２９２６９６、ＬＹ２９３６８４、ＬＹ２９３６４６、ワートマニン、ＺＭ３３６３７２、Ｌ−７７９，４５０、ＰＥＧ−フィルグラスチム、ダルベポエチン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、ゾレンドロネート（zolendronate）、プレドニゾン、セツキシマブ、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、ヒストレリン、ＰＥＧ化インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ａ、ＰＥＧ化インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−２ｂ、アザシチジン、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリドマイド、ゲムツズマブ、ヒドロコルチゾン、インターロイキン−１１、デクスラゾキサン、アレムツズマブ、全トランスレチノイン酸、ケトコナゾール、インターロイキン−２、メガストロール、免疫グロブリン、ナイトロジェンマスタード、メチルプレドニゾロン、イブリツモマブチウキセタン、エンドロゲン、デシタビン、ヘキサメチルメラミン、ベキサロテン、トシツモマブ、三酸化ヒ素、コルチゾン、エチドロン酸、ミトタン、シクロスポリン、ダウノルビシンリポソーム、エルウィニア−アスパラギナーゼ、ストロンチウム８９、カソピタント、ネツピタント、ＮＫ−１受容体アンタゴニスト、パロノセトロン、アプレピタント、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、メトクロプラミド、ロラゼパム、アルプラゾラム、ハロペリドール、ドロペリドール、ドロナビノール、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プロクロルペラジン、グラニセトロン、オンダンセトロン、ドラセロトン、トロピセトロン、ペグフィルグラスチム、エリスロポエチン、エポエチンα、ダルベポエチンα、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項４３に記載のプロトセル。
【請求項４５】
前記薬物が少なくとも１つの抗ウイルス剤を含む、請求項３９から４５のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項４６】
前記抗ウイルス剤が、抗ＨＩＶ剤、抗ＨＢＶ剤、抗ＨＣＶ剤、又はそれらの混合物である、請求項４５に記載のプロトセル。
【請求項４７】
前記ＤＮＡが、少なくとも１つのレポーター分子を発現可能である、請求項３９から４６のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項４８】
プラスミドＤＮＡを含み、前記プラスミドＤＮＡが核局在配列を発現するために任意で修飾される、請求項３９から４７のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項４９】
前記ＤＮＡが、超らせんプラスミドＤＮＡ又はパッケージングされたプラスミドＤＮＡである、請求項４８に記載のプロトセル。
【請求項５０】
前記ＤＮＡが、超らせん化かつパッケージングされたプラスミドＤＮＡである、請求項４９に記載のプロトセル。
【請求項５１】
前記プラスミドＤＮＡが核局在配列を発現するために修飾される、請求項４８から５１のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項５２】
前記ＤＮＡが、ヒストンでパッケージングされた超らせんプラスミドＤＮＡであって、ヒトのヒストンタンパク質の混合物を含む、請求項４７から５１のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項５３】
ヒストンの前記混合物が、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４からなる、請求項５２に記載のプロトセル。
【請求項５４】
ヒストンの前記混合物が、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４であって、１：２：２：２：２の重量比である、請求項５３に記載のプロトセル。
【請求項５５】
前記プラスミドＤＮＡが、ポリペプチド毒素、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、又は短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を発現可能である、請求項４８から５４のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項５６】
前記ポリペプチド毒素が、リシン毒素Ａ鎖又はジフテリア毒素Ａ鎖からなる群から選択される、請求項５５に記載のプロトセル。
【請求項５７】
前記短鎖ヘアピンＲＮＡ又は前記短鎖干渉ＲＮＡが、細胞のアポトーシスを誘導する、請求項５５に記載のプロトセル。
【請求項５８】
前記プラスミドＤＮＡがレポータータンパク質を発現可能である、請求項４８から５７のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項５９】
前記レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質又は赤色蛍光タンパク質である、請求項５８に記載のプロトセル。
【請求項６０】
前記核局在配列が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２のペプチドである、請求項３９から５９のいずれかに記載のプロトセル。
【請求項６１】
前記核局在配列が配列番号９のペプチドである、請求項６０に記載のプロトセル。
【請求項６２】
治療効果を達成するのに有効な量の請求項１から６１のいずれかに記載の一群のプロトセルを、医薬的に許容される担体、添加剤、又は賦形剤と組み合わせて含む、医薬組成物。
【請求項６３】
プロトセル内にカーゴとして配置されない薬物を更に含む、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
前記薬物が、抗癌剤又は抗ウイルス剤である、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
前記抗ウイルス剤が、抗ＨＩＶ剤、抗ＨＢＶ剤、抗ＨＣＶ剤、又はそれらの混合物である、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
非経口剤形である請求項６２から６５のいずれかに記載の組成物。
【請求項６７】
前記剤形が、皮内、筋肉内、骨内、腹腔内、静脈内、皮下、又は髄腔内投与の剤形である、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
局所剤形又は経皮剤形である、請求項６２から６５のいずれかに記載の組成物。
【請求項６９】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＭＥＴ結合ペプチド。
【請求項７０】
請求項６９に記載の配列番号１のＭＥＴ結合ペプチド。
【請求項７１】
請求項６９又は７０に記載のＭＥＴ結合ペプチドを含む医薬組成物。
【請求項７２】
抗癌剤、及び抗ＨＢＶ剤、抗ＨＣＶ剤、又はそれらの混合物と組み合わせて、肝細胞癌の細胞に対してプロトセルが選択的に結合するようにターゲティングペプチドを含む一群のプロトセルを含む、医薬組成物。
【請求項７３】
前記ターゲティングペプチドが、Ｓ９４ペプチド、ＭＥＴ結合ペプチド、又はそれらの混合物からなる群から選択される、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
前記抗癌剤が、ネクサバール（ソラフェニブ）、スニチニブ、ベバシズマブ、タルセバ（エルロチニブ）、タイカーブ（ラパチニブ）、又はそれらの混合物である、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７５】
前記抗ＨＢＶ剤が、ヘプセラ（アデホビルジピボキシル）、ラミブジン、エンテカビル、テルビブジン、テノホビル、エムトリシタビン、クレブジン、バルトリシタビン（valtoricitabine）、アムドキソビル、プラデホビル、ラシビル、ＢＡＭ２０５、ニタゾキサニド、ＵＴ２３１−Ｂ、Ｂａｙ４１−４１０９、ΕＨΤ８９９、ザダキシン（チモシンα−１）、又はそれらの混合物である、請求項７２から７４のいずれかに記載の組成物。
【請求項７６】
前記抗ＨＣＶ剤が、ボセプレビル、ダクラタスビル、アスナプレビル、ＩＮＸ−１８９、ＦＶ−１００、ＮＭ２８３、ＶＸ−９５０（テラプレビル）、ＳＣＨ５０３０４、ＴＭＣ４３５、ＶＸ−５００、ＢＸ−８１３、ＳＣＨ５０３０３４、Ｒ１６２６、ＩＴＭＮ−１９１（Ｒ７２２７）、Ｒ７１２８、ＰＦ−８６８５５４、ＴＴ０３３、ＣＧＨ−７５９、ＧＩ５００５、ＭＫ−７００９、ＳＩＲＮＡ−０３４、ＭＫ−０６０８、Ａ−８３７０９３、ＧＳ９１９０、ＧＳ９２５６、ＧＳ９４５１、ＧＳ５８８５、ＧＳ６６２０、ＧＳ９６２０、ＧＳ９６６９、ＡＣＨ−１０９５、ＡＣＨ−２９２８、ＧＳＫ６２５４３３、ＴＧ４０４０（ＭＶＡ−ＨＣＶ）、Ａ−８３１、Ｆ３５１、ＮＳ５Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＡＮＡ５９８、Ａ−６８９、ＧＮＩ−１０４、ＩＤＸ１０２、ＡＤＸ１８４、ＡＬＳ−２２００、ＡＬＳ−２１５８、ＢＩ２０１３３５、ＢＩ２０７１２７、ＢＩＴ−２２５、ＢＩＴ−８０２０、ＧＬ５９７２８、ＧＬ６０６６７、ＰＳＩ−９３８、ＰＳＩ−７９７７、ＰＳＩ−７８５１、ＳＣＹ−６３５、リバビリン、ＰＥＧ化インターフェロン、ＰＨＸ１７６６、ＳＰ−３０、又はそれらの混合物である、請求項７２から７５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７７】
患者の癌細胞に抗癌剤を送達するように改変された請求項１から６１のいずれかに記載のプロトセルの一群を含む組成物の有効量を、必要とする患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
【請求項７８】
請求項７２から７６のいずれかに記載の組成物の有効量を患者に投与することを含む、肝細胞癌を治療する方法。
【請求項７９】
請求項１から６１のいずれかに記載のプロトセルの一群の有効量を必要とする患者に投与することを含み、前記ＤＮＡプラスミドが超らせんであって抗癌ポリペプチド及び／又は抗癌ＲＮＡを発現するように改変され、任意で前記プロトセル内のカーゴとして処方される更なる抗癌剤の有効量と組み合わされる、癌を治療する方法。
【請求項８０】
前記抗癌ポリペプチドが、リシン毒素Ａ鎖又はジフテリア毒素Ａ鎖である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＲＮＡが、癌細胞のアポトーシスを誘導するｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡである、請求項７９又は８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記ｓｉＲＮＡが、ｓ５６５、ｓ７８２４、又はｓ１０２３４からなる群から選択される、請求項７９から８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
前記ｓｈＲＮＡが、細胞死を誘導するサイクリンＢ１特異的ｓｈＲＮＡである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記抗癌剤が、エベロリムス、トラベクテジン、アブラキサン、ＴＬＫ２８６、ＡＶ−２９９、ＤＮ−１０１、パゾパニブ、ＧＳＫ６９０６９３、ＲＴＡ７４４、ＯＮ０９１０．Ｎａ、ＡＺＤ６２４４（ＡＲＲＹ−１４２８８６）、ＡＭＮ−１０７、ＴＫＩ−２５８、ＧＳＫ４６１３６４、ＡＺＤ１１５２、エンザスタウリン、バンデタニブ、ＡＲＱ−１９７、ＭＫ−０４５７、ＭＬＮ８０５４、ＰＨＡ−７３９３５８、Ｒ−７６３、ＡＴ−９２６３、ＦＬＴ−３インヒビター、ＶＥＧＦＲインヒビター、ＥＧＦＲ−ＴＫインヒビター、オーロラキナーゼインヒビター、ＰＩＫ−１修飾剤、Ｂｃｌ−２インヒビター、ＨＤＡＣインヒビター、ｃ−ＭＥＴインヒビター、ＰＡＲＰインヒビター、Ｃｄｋインヒビター、ＥＧＦＲ−ＴＫインヒビター、ＩＧＦＲ−ＴＫインヒビター、抗ＨＧＦ抗体、ＰＩ３キナーゼインヒビター、ＡＫＴインヒビター、ＪＡＫ／ＳＴＡＴインヒビター、チェックポイント−１又は２のインヒビター、接着斑キナーゼインヒビター、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ｍｅｋ）インヒビター、ＶＥＧＦトラップ抗体、ペメトレキセド、エルロチニブ、ダサタニブ（dasatanib）、ニロチニブ、デカタニブ（decatanib）、パニツムマブ、アムルビシン、オレゴボマブ、Ｌｅｐ−ｅｔｕ、ノラトレキシド、ａｚｄ２１７１、バタブリン、オファツムマブ、ザノリムマブ、エドテカリン、テトランドリン、ルビテカン、テスミリフェン、オブリメルセン、チシリムマブ、イピリムマブ、ゴシポール、Ｂｉｏ１１１、１３ｌ−Ｉ−ＴＭ−６０１、ＡＬＴ−１１０、ＢＩＯ１４０、ＣＣ８４９０、シレンギチド、ギマテカン、ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ、ＩＮＯ１００１、ＩＰｄＲ1ＫＲＸ−０４０２、ルカントン、ＬＹ３１７６１５、ノイラジアブ（neuradiab）、ビテスペン、Ｒｔａ７４４、Ｓｄｘ１０２、タランパネル、アトラセンタン、Ｘｒ３１１、ロミデプシン、ＡＤＳ−１００３８０、スニチニブ、５−フルオロウラシル、ボリノスタット、エトポシド、ゲムシタビン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、ビンクリスチン、テモゾロミド、ＺＫ−３０４７０９、セリシクリブ；ＰＤ０３２５９０１、ＡＺＤ−６２４４、カペシタビン、Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−［４−［２−（２−アミノ−４，７−ジヒドロ−４−オキソ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）エチル］ベンゾイル］−二ナトリウム塩（七水和物）、カンプトテシン、ＰＥＧ標識イリノテカン、タモキシフェン、トレミフェンクエン酸塩、アナストラゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ＤＥＳ（ジエチルスチルベストロール）、エストラジオール、エストロゲン、結合型エストロゲン、ベバシズマブ、ＩＭＣ−１Ｃ１１、ＣＨＩＲ−２５８，）；３−［５−（メチルスルホニルピペラジンメチル）−インドリル−キノロン、バタラニブ、ＡＧ−０１３７３６、ＡＶＥ−０００５、［Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）６，Ａｚｇｌｙ１０］酢酸塩（ピロ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｚｇｌｙ−ＮＨ2酢酸［Ｃ59Ｈ84Ｎ18Ｏｉ4−（Ｃ2Ｈ4Ｏ2）x、ｘ＝１〜２．４］、ゴセレリン酢酸塩、リュープロリド酢酸塩、トリプトレリンパモ酸塩、��酸メドロキシプロゲステロン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ラロキシフェン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、酢酸メゲストロール、ＣＰ−７２４７１４；ＴＡＫ−１６５、ＨＫＩ−２７２、エルロチニブ、ラパタニブ、カネルチニブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ抗体、アービタックス、ＥＫＢ−５６９、ＰＫＩ−１６６、ＧＷ−５７２０１６、ロナファルニブ、ＢＭＳ−２１４６６２、チピファルニブ；アミホスチン、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ヒドロキサミン酸サブエロイルアニリド、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、ＦＫ−２２８、ＳＵ１１２４８、ソラフェニブ、ＫＲＮ９５１、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナグレリド、Ｌ−アスパラギナーゼ、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、エピルビシン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、グリベック（gleevac）、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トレチノイン、ビンデシン、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸、フェニルアラニンマスタード、ウラシルマスタード、エストラムスチン、アルトレタミン、フロクスウリジン、５−デオキシウリジン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン、デオキシコホルマイシン、カルシトリオール、バルルビシン、ミトラマイシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、トポテカン、ラゾキシン、マリマスタット、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンギオスタチン、ビタキシン、ドロロキシフェン、イドキシフェン、スピロノラクトン、フィナステリド、シメチジン、トラスツズマブ、デニロイキンジフチトクス、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、パクリタキセル、クレモホール非含有パクリタキセル、ドセタキセル、エピチロン（epithilone）Ｂ、ＢＭＳ−２４７５５０、ＢＭＳ−３１０７０５、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ピペンドキシフェン、ＥＲＡ−９２３、アルゾキシフェン、フルベストラント、アコルビフェン、ラソフォキシフェン、イドキシフェン、ＴＳＥ−４２４、ＨＭＲ−３３３９、ＺＫ１８６６１９、トポテカン、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、ＶＸ−７４５、ＰＤ１８４３５２、ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３、ＲＡＤ００ｌ、ＡＢＴ−５７８、ＢＣ−２１０、ＬＹ２９４００２、ＬＹ２９２２２３、ＬＹ２９２６９６、ＬＹ２９３６８４、ＬＹ２９３６４６、ワートマニン、ＺＭ３３６３７２、Ｌ−７７９，４５０、ＰＥＧ−フィルグラスチム、ダルベポエチン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、ゾレンドロネート（zolendronate）、プレドニゾン、セツキシマブ、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、ヒストレリン、ＰＥＧ化インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ａ、ＰＥＧ化インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−２ｂ、アザシチジン、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリドマイド、ゲムツズマブ、ヒドロコルチゾン、インターロイキン−１１、デクスラゾキサン、アレムツズマブ、全トランスレチノイン酸、ケトコナゾール、インターロイキン−２、メガストロール、免疫グロブリン、ナイトロジェンマスタード、メチルプレドニゾロン、イブリツモマブチウキセタン、エンドロゲン、デシタビン、ヘキサメチルメラミン、ベキサロテン、トシツモマブ、三酸化ヒ素、コルチゾン、エチドロン酸、ミトタン、シクロスポリン、ダウノルビシンリポソーム、エルウィニア−アスパラギナーゼ、ストロンチウム８９、カソピタント、ネツピタント、ＮＫ−１受容体アンタゴニスト、パロノセトロン、アプレピタント、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、メトクロプラミド、ロラゼパム、アルプラゾラム、ハロペリドール、ドロペリドール、ドロナビノール、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プロクロルペラジン、グラニセトロン、オンダンセトロン、ドラセロトン、トロピセトロン、ペグフィルグラスチム、エリスロポエチン、エポエチンα、ダルベポエチンα、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項７９から８４のいずれかに記載の方法。
【請求項８５】
前記プロトセル又は前記プロトセルの外側の前記組成物が抗ウイルス剤を更に含む、請求項７９から８４のいずれかに記載の方法。
【請求項８６】
前記抗ウイルス剤が抗ＨＢＶ剤又は抗ＨＣＶ剤である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
請求項６２から７６のいずれかに記載の組成物の有効量を必要とする患者に投与することを含む、患者の癌を治療する方法。
【請求項８８】
前記癌が、扁平上皮細胞癌、腺癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱、骨、腸、乳房、子宮頸管、結腸（大腸）、食道、頭部、腎臓、肝臓（肝細胞）、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、膵臓、前立腺、及び胃の癌腫、白血病、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、悪性のメラノーマ、骨髄増殖性疾患、ユーイング肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、筋肉腫、末梢性神経上皮腫、滑膜肉腫、グリオーマ、星状細胞腫、乏突起膠腫、上衣腫、膠芽腫、神経芽細胞腫、神経節神経腫、神経節膠腫、髄芽細胞腫、松果体細胞腫瘍、髄膜腫、髄膜肉腫、神経線維腫、シュヴァン鞘腫、腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸部癌、子宮癌、非小細胞癌、小細胞肺癌、混合の小細胞癌及び非小細胞肺癌、胸膜中皮腫、精巣癌、甲状腺癌、及び星状細胞腫である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
癌のリスクがある患者の癌を診断する方法であって、前記方法は、請求項１から６１のいずれかに記載のプロトセルの一群を含む医薬組成物を前記患者に投与することを含み、前記プロトセルは、癌細胞に対して選択的に結合して前記プロトセルを前記細胞に送達するように改変されたターゲティングペプチドを含み、前記プロトセルは、レポーター分子を発現するように改変されたプラスミドＤＮＡを含み、任意で更なるレポーター分子を含み、前記癌細胞が存在する場合には、前記患者の癌細胞への前記プロトセルの結合によって前記レポーター分子が前記癌細胞内に放出され、前記レポーター分子がシグナルを引き起こし、前記シグナルを標準と比較して前記患者が癌を有するか否かを判定でき、癌を有する場合には、その程度及び／又は癌性腫瘍のサイズを判定することができる、方法。
【請求項９０】
患者の癌治療を観察する方法であって、請求項１から６１のいずれかに記載のプロトセルの一群を前記患者に投与することを含み、前記プロトセルは、癌細胞に対して選択的に結合して前記プロトセルを前記細胞に送達するように改変されたターゲティングペプチドを含み、前記プロトセルは、レポーター分子を発現するように改変されたプラスミドＤＮＡを含み、任意で更なるレポーター分子を含み、前記患者の癌細胞への前記プロトセルの結合によって前記レポーター分子が前記癌細胞内に放出され、前記レポーター分子がシグナルを引き起こし、前記シグナルを治療開始時及び治療中の様々な間隔で標準と比較して患者が前記治療に反応しているか否かを判定でき、反応している場合には前記治療に対する前記反応の程度を判定できる、方法。
【請求項９１】
（ａ）１つ以上の薬学的に活性な薬剤が装填されるとともに（ｂ）脂質二重層によって被包されかつ該脂質二重層を担持する複数の多孔性ナノ粒子を含む経皮プロトセルであって、前記脂質二重層は、一価飽和ω−９脂肪酸、アルコール、ジオール、溶媒、共溶媒、Ｒ８ペプチド、及びエッジアクチベータからなる群から選択される１つ以上の角質層透過性増強剤を含み、約５０ｎｍ?約３００ｎｍの平均直径を有する経皮プロトセル。
【請求項９２】
前記一価飽和ω−９脂肪酸は、オレイン酸、エライジン酸、エイコセン酸、ミード酸、エルカ酸、及びネルボン酸、最も好ましくはオレイン酸、並びにそれらの混合物からなる群から選択される、請求項９１に記載の経皮プロトセル。
【請求項９３】
前記アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、及びそれらの混合物からなる群から選択され、前記溶媒及び前記共溶媒は、ＰＥＧ４００及びＤＭＳＯからなる群から選択される、請求項９１に記載の経皮プロトセル。
【請求項９４】
前記ジオールは、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項９１に記載の経皮プロトセル。
【請求項９５】
前記エッジアクチベータは、胆汁酸塩、ポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンエーテル、一本鎖界面活性剤、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項９１に記載の経皮プロトセル。
【請求項９６】
前記エッジアクチベータはデオキシコール酸ナトリウムである、請求項９１に記載の経皮プロトセル。
【請求項９７】
前記経皮プロトセルは約５０ｎｍ?約３００ｎｍの平均直径を有する、請求項９２に記載の経皮プロトセル。
【請求項９８】
前記経皮プロトセルは約５５ｎｍ?約２７０ｎｍの平均直径を有する、請求項９１に記載の経皮プロトセル。
【請求項９９】
前記経皮プロトセルは約６０ｎｍ?約２４０ｎｍの平均直径を有する、請求項９２に記載の経皮プロトセル。
【請求項１００】
前記経皮プロトセルは約６５ｎｍ?約２１０ｎｍの平均直径を有する、請求項９１に記載の経皮プロトセル。
【請求項１０１】
前記経皮プロトセルは約６５ｎｍ?約１９０ｎｍの平均直径を有する、請求項９１に記載の経皮プロトセル。
【請求項１０２】
前記経皮プロトセルは約６５ｎｍ?約１６０ｎｍの平均直径を有する、請求項９２に記載の経皮プロトセル。
【請求項１０３】
前記経皮プロトセルは約６５ｎｍ?約１３０ｎｍの平均直径を有する、請求項９１に記載の経皮プロトセル。
【請求項１０４】
前記経皮プロトセルは約６５ｎｍ?約１００ｎｍの平均直径を有する、請求項９１に記載の経皮プロトセル。
【請求項１０５】
前記経皮プロトセルは約６５ｎｍ?約９０ｎｍの平均直径を有する、請求項９１に記載の経皮プロトセル。
【請求項１０６】
前記経皮プロトセルは、より好ましくは約６５ｎｍ?約８０ｎｍの平均直径を有する、請求項９１に記載の経皮プロトセル。
【請求項１０７】
前記経皮プロトセルは約６５ｎｍ?約７５ｎｍの平均直径を有する、請求項９１に記載の経皮プロトセル。
【請求項１０８】
前記経皮プロトセルは約６５ｎｍ?約６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、又は７５ｎｍの平均直径を有する、請求項９１に記載の経皮プロトセル。
【請求項１０９】
前記経皮プロトセルは約７０ｎｍの平均直径を有する、請求項９１に記載の経皮プロトセル。
【請求項１１０】
（ａ）前記多孔性ナノ粒子は、シリカ、生分解性ポリマー、ゾルゲル、金属、及び金属酸化物からなる群から選択される１つ以上の組成物からなり、（ｂ）前記経皮プロトセルは、少なくとも１つの抗癌剤を含む、請求項９１から１０９に記載の経皮プロトセル。
【請求項１１１】
（ａ）前記多孔性ナノ粒子は、シリカ、生分解性ポリマー、ゾルゲル、金属、及び金属酸化物からなる群から選択される１つ以上の組成物からなり、（ｂ）前記経皮プロトセルは、少なくとも１つの抗癌剤を含み、該抗癌剤は、エベロリムス、トラベクテジン、アブラキサン、ＴＬＫ２８６、ＡＶ−２９９、ＤＮ−１０１、パゾパニブ、ＧＳＫ６９０６９３、ＲＴＡ７４４、ＯＮ０９１０．Ｎａ、ＡＺＤ６２４４（ＡＲＲＹ−１４２８８６）、ＡＭＮ−１０７、ＴＫＩ−２５８、ＧＳＫ４６１３６４、ＡＺＤ１１５２、エンザスタウリン、バンデタニブ、ＡＲＱ−１９７、ＭＫ−０４５７、ＭＬＮ８０５４、ＰＨＡ−７３９３５８、Ｒ−７６３、ＡＴ−９２６３、ＦＬＴ−３インヒビター、ＶＥＧＦＲインヒビター、ＥＧＦＲ−ＴＫインヒビター、オーロラキナーゼインヒビター、ＰＩＫ−１修飾剤、Ｂｃｌ−２インヒビター、ＨＤＡＣインヒビター、ｃ−ＭＥＴインヒビター、ＰＡＲＰインヒビター、Ｃｄｋインヒビター、ＥＧＦＲ−ＴＫインヒビター、ＩＧＦＲ−ＴＫインヒビター、抗ＨＧＦ抗体、ＰＩ３キナーゼインヒビター、ＡＫＴインヒビター、ＪＡＫ／ＳＴＡＴインヒビター、チェックポイント−１又は２のインヒビター、接着斑キナーゼインヒビター、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ｍｅｋ）インヒビター、ＶＥＧＦトラップ抗体、ペメトレキセド、エルロチニブ、ダサタニブ（dasatanib）、ニロチニブ、デカタニブ（decatanib）、パニツムマブ、アムルビシン、オレゴボマブ、Ｌｅｐ−ｅｔｕ、ノラトレキシド、ａｚｄ２１７１、バタブリン、オファツムマブ、ザノリムマブ、エドテカリン、テトランドリン、ルビテカン、テスミリフェン、オブリメルセン、チシリムマブ、イピリムマブ、ゴシポール、Ｂｉｏ１１１、１３ｌ−Ｉ−ＴＭ−６０１、ＡＬＴ−１１０、ＢＩＯ１４０、ＣＣ８４９０、シレンギチド、ギマテカン、ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ、ＩＮＯ１００１、ＩＰｄＲ1ＫＲＸ−０４０２、ルカントン、ＬＹ３１７６１５、ノイラジアブ（neuradiab）、ビテスペン、Ｒｔａ７４４、Ｓｄｘ１０２、タランパネル、アトラセンタン、Ｘｒ３１１、ロミデプシン、ＡＤＳ−１００３８０、スニチニブ、５−フルオロウラシル、ボリノスタット、エトポシド、ゲムシタビン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、ビンクリスチン、テモゾロミド、ＺＫ−３０４７０９、セリシクリブ；ＰＤ０３２５９０１、ＡＺＤ−６２４４、カペシタビン、Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−［４−［２−（２−アミノ−４，７−ジヒドロ−４−オキソ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）エチル］ベンゾイル］−二ナトリウム塩（七水和物）、カンプトテシン、ＰＥＧ標識イリノテカン、タモキシフェン、トレミフェンクエン酸塩、アナストラゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ＤＥＳ（ジエチルスチルベストロール）、エストラジオール、エストロゲン、結合型エストロゲン、ベバシズマブ、ＩＭＣ−１Ｃ１１、ＣＨＩＲ−２５８，）；３−［５−（メチルスルホニルピペラジンメチル）−インドリル−キノロン、バタラニブ、ＡＧ−０１３７３６、ＡＶＥ−０００５、［Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）６，Ａｚｇｌｙ１０］酢酸塩（ピロ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−��ｙｒ−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｚｇｌｙ−ＮＨ2酢酸［Ｃ59Ｈ84Ｎ18Ｏｉ4−（Ｃ2Ｈ4Ｏ2）x、ｘ＝１〜２．４］、ゴセレリン酢酸塩、リュープロリド酢酸塩、トリプトレリンパモ酸塩、酢酸メドロキシプロゲステロン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ラロキシフェン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、酢酸メゲストロール、ＣＰ−７２４７１４；ＴＡＫ−１６５、ＨＫＩ−２７２、エルロチニブ、ラパタニブ、カネルチニブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ抗体、アービタックス、ＥＫＢ−５６９、ＰＫＩ−１６６、ＧＷ−５７２０１６、ロナファルニブ、ＢＭＳ−２１４６６２、チピファルニブ；アミホスチン、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ヒドロキサミン酸サブエロイルアニリド、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、ＦＫ−２２８、ＳＵ１１２４８、ソラフェニブ、ＫＲＮ９５１、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナグレリド、Ｌ−アスパラギナーゼ、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、エピルビシン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、グリベック（gleevac）、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トレチノイン、ビンデシン、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸、フェニルアラニンマスタード、ウラシルマスタード、エストラムスチン、アルトレタミン、フロクスウリジン、５−デオキシウリジン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン、デオキシコホルマイシン、カルシトリオール、バルルビシン、ミトラマイシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、トポテカン、ラゾキシン、マリマスタット、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンギオスタチン、ビタキシン、ドロロキシフェン、イドキシフェン、スピロノラクトン、フィナステリド、シメチジン、トラスツズマブ、デニロイキンジフチトクス、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、パクリタキセル、クレモホール非含有パクリタキセル、ドセタキセル、エピチロン（epithilone）Ｂ、ＢＭＳ−２４７５５０、ＢＭＳ−３１０７０５、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ピペンドキシフェン、ＥＲＡ−９２３、アルゾキシフェン、フルベストラント、アコルビフェン、ラソフォキシフェン、イドキシフェン、ＴＳＥ−４２４、ＨＭＲ−３３３９、ＺＫ１８６６１９、トポテカン、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、ＶＸ−７４５、ＰＤ１８４３５２、ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３、ＲＡＤ００ｌ、ＡＢＴ−５７８、ＢＣ−２１０、ＬＹ２９４００２、ＬＹ２９２２２３、ＬＹ２９２６９６、ＬＹ２９３６８４、ＬＹ２９３６４６、ワートマニン、ＺＭ３３６３７２、Ｌ−７７９，４５０、ＰＥＧ−フィルグラスチム、ダルベポエチン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、ゾレンドロネート（zolendronate）、プレドニゾン、セツキシマブ、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、ヒストレリン、ＰＥＧ化インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ａ、ＰＥＧ化インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−２ｂ、アザシチジン、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリドマイド、ゲムツズマブ、ヒドロコルチゾン、インターロイキン−１１、デクスラゾキサン、アレムツズマブ、全トランスレチノイン酸、ケトコナゾール、インターロイキン−２、メガストロール、免疫グロブリン、ナイトロジェンマスタード、メチルプレドニゾロン、イブリツモマブチウキセタン、エンドロゲン、デシタビン、ヘキサメチルメラミン、ベキサロテン、トシツモマブ、三酸化ヒ素、コルチゾン、エチドロン酸、ミトタン、シクロスポリン、ダウノルビシンリポソーム、エルウィニア−アスパラギナーゼ、ストロンチウム８９、カソピタント、ネツピタント、ＮＫ−１受容体アンタゴニスト、パロノセトロン、アプレピタント、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、メトクロプラミド、ロラゼパム、アルプラゾラム、ハロペリドール、ドロペリドール、ドロナビノール、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プロクロルペラジン、グラニセトロン、オンダンセトロン、ドラセロトン、トロピセトロン、ペグフィルグラスチム、エリスロポエチン、エポエチンα、ダルベポエチンα、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項９１から１０９に記載の経皮プロトセル。
【請求項１１２】
（ａ）１つ以上の薬学的に活性な量のイマチニブが装填されるとともに（ｂ）脂質二重層によって被包されかつ該脂質二重層を担持する複数の多孔性ナノ粒子を含む経皮プロトセルであって、前記脂質二重層は、ＰＥＧ４００、ＤＭＳＯ、及びエタノール、並びにそれらの混合物からなる群から選択される１つ以上の角質層透過性増強剤を含み、約６５ｎｍ?約６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、又は７５ｎｍの平均直径を有する経皮プロトセル。
【請求項１１３】
前記経皮プロトセルは、約０．２０〜０．３０μｇ／ｃｍ2ｈｒの前記イマチニブの平均流量を有する、請求項１１２に記載の経皮プロトセル。
【請求項１１４】
前記脂質二重層は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホル−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１８：１のＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１８：１ＰＥＧ−２０００ＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１６：０のＰＥＧ−２０００ＰＥ）、１−オレオイル−２−［１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１〜１２：０のＮＢＤ−ＰＣ）、１−パルミトイル−２−｛１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル｝−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１２：０のＮＢＤ−ＰＣ）、コレステロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される脂質で構成される、請求項１１３に記載の経皮プロトセル。
【請求項１１５】
癌に罹患した対象の治療方法であって、請求項１１０から１１４に記載のプロトセルの薬学的有効量を前記対象に経皮投与することを含む方法。
【請求項１１６】
慢性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍、及び急性リンパ性白血病症候群（ＨＥＳ）からなる群から選択される１つ以上の疾患に罹患した対象の治療方法であって、請求項１１２から１１４に記載のプロトセルの薬学的有効量を前記対象に経皮投与することを含む方法。
【請求項１１７】
癌に罹患した対象の治療方法であって、請求項１１１に記載のプロトセルの薬学的有効量を前記対象に経皮投与することを含む方法。
【請求項１１８】
請求項９１から１０９、１１２、１１３、１１４に記載のプロトセルの薬学的有効量を含み、さらに任意で薬学的に許容される賦形剤を含む、経皮医薬組成物。
【請求項１１９】
請求項１１０に記載のプロトセルの薬学的有効量を含み、さらに任意で薬学的に許容される賦形剤を含む、経皮医薬組成物。
【請求項１２０】
請求項１１１に記載のプロトセルの薬学的有効量を含み、さらに任意で薬学的に許容される賦形剤を含む、経皮医薬組成物。
【請求項１２１】
アミン含有シラン（ＡＥＰＴＭＳ）で修飾された複数の負荷電のナノ多孔性のナノ粒子シリカコアを含むプロトセルであって、前記ナノ粒子シリカコアは、（ａ）ｓｉＲＮＡ又はリシン毒素Ａ鎖が装填されるとともに（ｂ）脂質二重層によって被包されかつ該脂質二重層を担持し、前記脂質二重層は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホル−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１８：１−ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１８：１−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１６：０−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ）、１−オレオイル−２−［１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１−１２：０−ＮＢＤ−ＰＣ）、１−パルミトイル−２−｛１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル｝−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１２：０−ＮＢＤ−ＰＣ）、コレステロール、及びそれらの混合物／組み合わせからなる群から選択される１つ以上の脂質を含み、前記脂質二重層は、カチオン性脂質及び１つ以上の双性リン脂質を含む、プロトセル。
【請求項１２２】
前記脂質は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ（１８：１））又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１２１に記載のプロトセル。
【請求項１２３】
前記プロトセルは、約６００ｍ2／ｇよりも大きいＢＥＴ表面積、約６０％?約７０％の細孔容積の割合、約２０ｎｍ?約３０ｎｍの平均直径を有する細孔からなる多峰分布の細孔形態、約５ｎｍ?約１５ｎｍの平均直径を有する細孔によって相互に連結された表面から利用可能な細孔、の特徴のうちの少なくとも１つを有する、請求項１２２に記載のプロトセル。
【請求項１２４】
前記プロトセルは、１０10個の前記ナノ粒子シリカコア当たり約１０ｎＭのｓｉＲＮＡを被包する、請求項１２１又は１２２に記載のプロトセル。
【請求項１２５】
アミン含有シラン（ＡＥＰＴＭＳ）で修飾された複数の負荷電のナノ多孔性のナノ粒子シリカコアを含むプロトセルであって、前記ナノ粒子シリカコアは、（ａ）サイクリンＡ２、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、及びサイクリンＥからなる群から選択されるサイクリンスーパーファミリーのメンバーを標的とする１つ以上のｓｉＲＮＡが装填されるとともに（ｂ）脂質二重層によって被包されかつ該脂質二重層を担持し、前記脂質二重層は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホル−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１８：１−ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１８：１−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１６：０−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ）、１−オレオイル−２−［１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１−１２：０−ＮＢＤ−ＰＣ）、１−パルミトイル−２−｛１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル｝−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１２：０−ＮＢＤ−ＰＣ）、コレステロール、及びそれらの混合物／組み合わせからなる群から選択される１つ以上の脂質を含み、（１）前記脂質二重層はＳＰ９４及びエンドソーム分解性ペプチドを装填され、（２）前記プロトセルは肝細胞癌に選択的に結合する、プロトセル。
【請求項１２６】
前記脂質二重層は、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＰＥＧ−２０００を、およそ５５：５：３０：１０質量比で含む、請求項１２３に記載のプロトセル。
【請求項１２７】
請求項１２１から１２６に記載のプロトセルの薬学的有効量を対象に投与することを含む、癌に罹患した対象の治療方法。
【請求項１２８】
前記対象は肝臓癌に罹患しており、請求項１２３から１２５に記載のプロトセルの薬学的有効量が投与される、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
請求項１２１から１２６に記載のプロトセルの薬学的有効量を含み、さらに任意で薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１３０】
（ａ）ＮｉＶヌクレオカプシドタンパク質（ＮｉＶ−Ｎ）ｍＲＮＡの配列特異的分解を誘発するｓｉＲＮＡが装填されるとともに（ｂ）脂質二重層によって被包されかつ該脂質二重層を担持する複数のメソ多孔性のナノ粒子シリカコアを含むプロトセルであって、前記脂質二重層は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホル−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１８：１−ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１８：１−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１６：０−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ）、１−オレオイル−２−［１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１−１２：０−ＮＢＤ−ＰＣ）、１−パルミトイル−２−｛１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル｝−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１２：０−ＮＢＤ−ＰＣ）、コレステロール、及びそれらの混合物／組み合わせからなる群から選択される１つ以上の脂質を含む、プロトセル。
【請求項１３１】
前記脂質二重層は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ターゲティングペプチド、及びＲ８を含み、前記メソ多孔性のナノ粒子シリカコアは、（１）それぞれが約１００ｎｍの平均直径、１，０００ｍ2／ｇよりも大きい平均表面積、及び約２０ｎｍ?約２５ｎｍの平均直径を有する表面から利用可能な細孔を有し、（２）１０10個の粒子当たり約１μΜ又はそれ以上のｓｉＲＮＡ装填量を有する、請求項１３０に記載のプロトセル。
【請求項１３２】
前記ターゲティングペプチドは、エフリンＢ２（ＥＢ２）に結合するペプチドである、請求項１３１に記載のプロトセル。
【請求項１３３】
前記ターゲティングペプチドはＴＧＡＩＬＨＰ（配列番号１８）である、請求項１３２に記載のプロトセル。
【請求項１３４】
前記プロトセルは、約０．０１?約０．０２ｗｔ％のＴＧＡＩＬＨＰ（配列番号１８）と、約１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００と、約０．５００ｗｔ％のＲ８とを含む、請求項１３３に記載のプロトセル。
【請求項１３５】
ニパウイルス（ＮｉＶ）に感染した又はその感染のリスクがある対象の治療方法であって、請求項１３０から１３４に記載のプロトセルの薬学的有効量を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項１３６】
請求項１３０から１３４に記載のプロトセルの薬学的有効量を含み、さらに任意で薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１３７】
複数の負荷電のナノ多孔性のナノ粒子シリカコアを含み、該ナノ粒子シリカコアは、
（ａ）（１）それぞれがケイ素原子を用いて機能化された第１級アミン、第２級アミン、第３級アミン、（２）モノアミン又はポリアミン、（３）Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＥＰＴＭＳ）、（４）３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）、（５）３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＳ）、（６）アミノ官能性トリアルコキシシラン、並びに（７）プロトン化された第２級アミン、プロトン化された第３級アルキルアミン、プロトン化されたアミジン、プロトン化されたグアニジン、プロトン化されたピリジン、プロトン化されたピリミジン、プロトン化されたピラジン、プロトン化されたプリン、プロトン化されたイミダゾール、プロトン化されたピロール、及び第４級アルキルアミン、又は（１）〜（７）の組み合わせからなる群から選択されるアミン含有シランで修飾され、
（ｂ）ｓｉＲＮＡ又はリシン毒素Ａ鎖が装填され、かつ
（ｃ）脂質二重層によって被包されかつ該脂質二重層を担持し、該脂質二重層は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホル−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１８：１−ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１８：１−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１６：０−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ）、１−オレオイル−２−［１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１−１２：０−ＮＢＤ−ＰＣ）、１−パルミトイル−２−｛１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル｝−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１２：０−ＮＢＤ−ＰＣ）、コレステロール、及びそれらの混合物／組み合わせからなる群から選択される１つ以上の脂質を含み、前記脂質二重層は、カチオン性脂質及び１つ以上の双性リン脂質を含む、プロトセル。
【請求項１３８】
前記脂質は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ（１８：１））又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１３７に記載のプロトセル。
【請求項１３９】
前記プロトセルは、約６００ｍ2／ｇよりも大きいＢＥＴ表面積、約６０％?約７０％の細孔容積の割合、約２０ｎｍ?約３０ｎｍの平均直径を有する細孔からなる多峰分布の細孔形態、約５ｎｍ?約１５ｎｍの平均直径を有する細孔によって相互に連結された表面から利用可能な細孔、の特徴のうちの少なくとも１つを有する、請求項１３８に記載のプロトセル。
【請求項１４０】
前記プロトセルは、１０10個の前記ナノ粒子シリカコア当たり約１０ｎＭのｓｉＲＮＡを被包する、請求項１３８又は１３９に記載のプロトセル。
【請求項１４１】
複数の負荷電のナノ多孔性のナノ粒子シリカコアを含を含むプロトセルであって、前記ナノ粒子シリカコアは、
（ａ）（１）それぞれがケイ素原子を用いて機能化された第１級アミン、第２級アミン、第３級アミン、（２）モノアミン又はポリアミン、（３）Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＥＰＴＭＳ）、（４）３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）、（５）３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＳ）、（６）アミノ官能性トリアルコキシシラン、並びに（７）プロトン化された第２級アミン、プロトン化された第３級アルキルアミン、プロトン化されたアミジン、プロトン化されたグアニジン、プロトン化されたピリジン、プロトン化されたピリミジン、プロトン化されたピラジン、プロトン化されたプリン、プロトン化されたイミダゾール、プロトン化されたピロール、及び第４級アルキルアミン、又は（１）〜（７）の組み合わせからなる群から選択されるアミン含有シランで修飾され、
（ｂ）サイクリンＡ２、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、及びサイクリンＥからなる群から選択されるサイクリンスーパーファミリーのメンバーを標的とする１つ以上のｓｉＲＮＡが装填され、
（ｃ）脂質二重層によって被包されかつ該脂質二重層を担持し、前記脂質二重層は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホル−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１８：１−ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１８：１−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１６：０−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ）、１−オレオイル−２−［１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１−１２：０−ＮＢＤ−ＰＣ）、１−パルミトイル−２−｛１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル｝−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１２：０−ＮＢＤ−ＰＣ）、コレステロール、及びそれらの混合物／組み合わせからなる群から選択される１つ以上の脂質を含み、
（１）前記脂質二重層はＳＰ９４及びエンドソーム分解性ペプチドを装填され、（２）前記プロトセルは肝細胞癌に選択的に結合する、プロトセル。
【請求項１４２】
前記脂質二重層は、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＰＥＧ−２０００を、およそ５５：５：３０：１０質量比で含む、請求項１４１に記載のプロトセル。
【請求項１４３】
請求項１３７から１４２に記載のプロトセルの薬学的有効量を対象に投与することを含む、癌に罹患した対象の治療方法。
【請求項１４４】
前記対象は肝臓癌に罹患しており、請求項１４１又は１４２に記載のプロトセルの薬学的有効量が投与される、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
請求項１３７から１４２に記載のプロトセルの薬学的有効量を含み、さらに任意で薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願及び政府支援）
本発明は、２０１１年１０月１４日出願の米国仮出願第６１／５４７，４０２号である発明の名称「経皮的カーゴ送達のためのナノ多孔性粒子に担持された脂質二重層（プロトセル）の設計（Engineering Nanoporous Particle-Supported Lipid Bilayers ('Protocells') for Transdermal Cargo Delivery）」、及び２０１１年１２月２１日出願の米国仮出願第６１／５７８，４６３号である発明の名称「経皮的カーゴ送達のためのナノ多孔性粒子に担持された脂質二重層（プロトセル）の設計（Engineering Nanoporous Particle-Supported Lipid Bilayers ('Protocells') for Transdermal Cargo Delivery）」の優先権の利益を主張し、これらの出願の全内容が参照により援用される。
【０００２】
本発明はまた、２０１１年１２月１９日出願の米国仮出願第６１／５７７，４１０号である発明の名称「標的化プロトセルによる治療用高分子カーゴの送達（Delivery of Therapeutic Macromolecular Cargos by Targeted Protocells）」の優先権の利益を主張し、この出願の全内容が参照により援用される。
【０００３】
本発明は、国立衛生研究所の助成金第ＰＨＳ２ＰＮ２ＥＹ０１６５７０Ｂ号、国立癌研究所の１Ｕ０１ＣＡ１５１７９２−０１によって与えられた助成金、空軍科学研究所の助成金第ＦＡ９５５０−０７−１−００５４／９５５０−１０−１−００５４号、ＮＩＥＨＳの１Ｕ１９ＥＳ０１９５２８−０１、国立科学財団のＮＳＦ：ＥＦ−０８２０１１７、及び国立科学財団のＤＧＥ−０５０４２７６による政府支援を受けて行われた。政府は、本発明について一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
本発明の実施形態は、特に肝細胞癌細胞及び他の癌細胞を含めた患者体内の細胞の特異的標的のためのプロトセルに関し、このプロトセルは、１）ナノ多孔性のシリカコア又は金属酸化物コア、２）担持された脂質二重層、３）少なくとも１つの薬剤、標的細胞に対するプロトセルの結合を特異的にかつ増強するようにして治療対象の組織中の癌細胞を標的にするターゲティングペプチド、並びにプロトセル及び被包されたカーゴ（ＤＮＡを含む）のエンドソーム脱出を促進する融合ペプチドを含む。少なくとも１つの薬剤は、癌細胞死を促進する薬剤（従来の小分子、高分子カーゴ（例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、他のマイクロＲＮＡ、又はタンパク質毒素（リシン毒素Ａ鎖若しくはジフテリア毒素Ａ鎖など））、及び／又はＤＮＡ（二本鎖又は直鎖のＤＮＡ、プラスミドＤＮＡなど）などであり、ＤＮＡは超らせん及び／又は例えばヒストンでパッケージングされてナノ多孔性シリカコア中に配置されてもよく（より効率的にＤＮＡをプロトセル中にパッケージングするためには、好ましくは超らせん）であり、ＤＮＡは癌細胞の核内にプロトセルを局在させることを助ける核局在配列及び癌細胞の治療法（アポトーシス／細胞死）に関与するペプチドを発現する能力を助ける核局在配列で任意に修飾される。）又はレポーターとしての薬剤である。本発明のプロトセルは、選択的に肝細胞組織に結合する新規の結合ペプチド（ｃ−ＭＥＴペプチド）を用いて癌（特に肝細胞（肝臓）癌を含む）を治療するために、又は癌の診断（癌治療及び創薬を含む）において機能するために用いられることができる。
【０００５】
一部の実施形態においては、本発明のプロトセルは、多種多様な有効成分の送達を促進する。重要なことに、これらのプロトセルは、角質層透過性を有効に増強し、高分子などの有効成分の経皮送達を可能にする。
【０００６】
別の実施形態においては、本発明は、胃などの環境での多種多様な有効成分の送達に有用な、安定した疎水性の多孔性ナノ粒子及び安定した超疎水性の多孔性ナノ粒子を提供する。
【０００７】
一部の別の実施形態においては、本発明は、多種多様な有効成分を送達するのに有用な経皮プロトセルであって、ＮｉＶヌクレオカプシドタンパク質（ＮｉＶ−Ｎ）ｍＲＮＡの配列特異的分解を誘発するｓｉＲＮＡが装填された複数のメソ多孔性ナノ粒子シリカコアを含むプロトセル、及び胃において多種多様な有効成分の送達を可能にする胃内浮遊プロトセルを提供する。
【０００８】
ナノ担体中に被包された薬物の標的送達は、従来の「遊離した」薬物が示す多数の問題である貧弱な溶解性、限られた安定性、速やかな除去、及び特に選択性の欠如（これは正常細胞に非特異的な毒性をもたらし、疾患細胞を根絶するのに必要な用量の段階的増大を妨げる）などを改善することが可能である。受動的標的のスキームは、腫瘍血管系の亢進した透過性と腫瘍リンパ管の低下した排出効率とに依存して腫瘍部位へのナノ担体の蓄積を導くものであり（いわゆる血管透過性・滞留性亢進効果又はＥＰＲ効果）、これらの問題の多くを克服するが、ナノ担体の内在化を引き起こすのに必要な細胞特異的相互作用の欠如が治療有効性を低下させ、薬物の排除や多剤耐性の誘発をもたらし得る。
【０００９】
ナノメディシンにおける課題の１つは、例えば薬物などのカーゴを高濃度で効率的に被包し、細胞膜を通過し、所定の期間に渡って標的部位に制御可能に薬物を放出できるナノ構造体及び材料を設計することである。最近になって、ナノメディシンにおける新世代の薬物又は治療法の送達媒体として無機ナノ粒子が現れた。更に最近になって、クマリン、アゾベンゼン、ロタキサン、ポリマー、又はナノ粒子を用いるゲーティング（gating）法が、カーゴを粒子中に封入し、光刺激又は電気化学刺激に従って引き起こされる放出を可能にするために開発された。
【００１０】
リポソームは、その低い免疫原性及び低い毒性により薬物送達に広く用いられて来たが、未だいくつかの点について改善される必要がある。第１に、カーゴの装填はリポソームが調製される状況下でのみ成される。従って、カーゴの濃度や種類が制限される可能性がある。第２に、リポソームの安定性は比較的低い。リポソームの脂質二重層は多くの場合に経時劣化して融合しがちであり、それによってサイズやサイズ分布が変化する。第３に、リポソーム中のカーゴの放出はリポソームのバーストの瞬間に起こるため、それが放出を制御することを困難にしている。
【００１１】
ナノ多孔性シリカ粒子へのリポソームの融合によって形成される多孔性ナノ粒子に担持された脂質二重層（プロトセル）は、癌の治療法や診断法の標的送達に伴う多くの課題に対応する新規種類のナノ担体である。リポソームと同様に、プロトセルは生体適合性、生分解性、及び非免疫原性であるが、そのナノ多孔性シリカコアは、同様のサイズのリポソーム送達剤と比較すると大幅に増強されたカーゴ収容能力及び長期の二重層安定性を提供する。コアの多孔性及び表面の化学的性質を更に調節して、例えば薬物、核酸、及びタンパク質毒素などの多様な治療薬の被包を促進することができる。カーゴ放出の速度は、コアの細孔サイズ、化学組成及びシリカ縮合の全体的な程度によって制御可能であるので、プロトセルはバースト放出又は制御型放出のプロファイルが必要な用途に有用である。最後に、プロトセルの担持された脂質二重層（ＳＬＢ）は、選択的送達を促進するためにリガンドで様々に修飾されることができ、更に循環時間を延長するためにＰＥＧで様々に修飾されることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
化学療法薬の活性を改善し、癌治療法を増強する必要性は続いている。プロトセルの使用を、癌を標的とし、癌と結合し、癌への侵入を増強し、そして化学療法薬をその作用部位の近傍に届ける他の方法と組み合わることは、癌治療法の重要な一面である。本発明は、癌治療薬の投与を増強することによって、又は診断における癌の診断及び癌治療観察のための手法を促進するために、癌治療法の技術を向上させること並びに治療結果に影響し得る薬剤の送達を改善することに取り組む。
【００１３】
また、従来は他の効果の低い経路による投与に限定されていた有効成分の送達を可能にするために、角質層を最適に透過するように設計された経皮送達媒体の必要性が存在している。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の目的は、プロトセル技術、プロトセル自体、そのようなプロトセルを含む医薬組成物について改善を提供すること、及び本発明のプロトセル及び医薬組成物を治療法及び診断法（治療の観察を含む）に用いる方法を提供することに関する。
【００１５】
本発明の実施形態の更なる目的は、本発明のその他の実施形態である新規のＭＥＴ結合ペプチド、医薬組成物及び方法におけるそれらの使用に関する。
【００１６】
本発明のこれらの及び／又はその他の目的は、本明細書で与えられる説明の検討により容易に得られる。
【００１７】
本発明の実施形態は、細胞（特定の態様においては肝細胞の癌細胞及び他の癌細胞）の特異的標的のためのプロトセルに関する。
【００１８】
一部の態様においては、本発明は、担持された脂質二重層を有するナノ多孔性のシリカコア又は金属酸化物コアと、次のものからなる群から選択される少なくとも１つの更なる成分とを含む、細胞を標的にする多孔性プロトセルに関する。
・細胞を標的にする化学種
・プロトセル及び被包されたＤＮＡのエンドソーム脱出を促進する融合ペプチド、並びにその他のカーゴ
その他のカーゴは、
・二本鎖直鎖ＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡ
・薬物
・造影剤
・短鎖干渉ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はそれらの混合物
から選択される少なくとも１つのカーゴ成分を含み、このカーゴ成分の１つは、任意で更に核局在配列でコンジュゲートされる。
【００１９】
一部の実施形態においては、本発明の実施形態のプロトセルは、担持された脂質二重層を有するナノ多孔性シリカコアと、少なくとも１つの治療薬からなるカーゴとを含む。少なくとも１つの治療薬は、選択的に癌細胞死を促進する治療薬であり、例えば従来の小分子、高分子カーゴ（例えばｓｉＲＮＡ（特にＳ５６５、Ｓ７８２４、及び／又はｓ１０２３４など）、ｓｈＲＮＡ、又はタンパク質毒素（リシン毒素Ａ鎖又はジフテリア毒素Ａ鎖など））、及び／又はパッケージングされて（一部の実施形態においてはヒストンでパッケージングされて）ナノ多孔性シリカコア中に配置されるプラスミドＤＮＡ（ＤＮＡをカーゴ成分としてプロトセル中により効率的にパッケージングするために、好ましくは本明細書に別に記載のように超らせん）であり、ＤＮＡは癌細胞の核内にプラスミドを局在させること／提示することを助ける核局在配列及び治療（例えば癌細胞のアポトーシス／細胞死）に関与するペプチドを発現する能力を助ける核局在配列で任意に修飾される。または、少なくとも１つの治療薬は、診断用途のレポーターとしての薬剤である（特に本明細書に別に記載の蛍光緑色タンパク質、蛍光赤色タンパク質）。本発明のプロトセルは、標的細胞に対するプロトセルの結合を特異的かつ増強するようにして治療される細胞（例えば、治療対象の組織中の癌細胞）を標的にするターゲティングペプチド、並びにプロトセル及び被包されたＤＮＡのエンドソーム脱出を促進する融合ペプチドを含む。本発明のプロトセルは、治療法又は診断法に用いられることができ、より具体的には癌及びその他の疾患（ウイルス感染を含み、特に肝細胞（肝臓）癌を含む）を治療するために用いられることができる。本発明の他の態様においては、プロトセルは、癌組織（特に肝細胞、卵巣、及び子宮頸部の癌組織を含む）に選択的に結合する新規の結合ペプチド（本明細書に別に記載のＭＥＴ結合ペプチド）を癌の治療及び／又は診断（癌治療の観察及び創薬を含む）のために用いる。
【００２０】
一態様においては、本発明の実施形態のプロトセルは多孔性ナノ粒子プロトセルを含み、多孔性ナノ粒子プロトセルは、担持された脂質二重層を有するナノ多孔性シリカコアを多くの場合に含む。本発明のこの態様においては、プロトセルはターゲティングペプチドを含み、ターゲティングペプチドは多くの場合に本明細書に別に記載のＭＥＴ受容体結合ペプチドであり、多くの場合にプロトセルの表面の融合ペプチドと組み合わされる。プロトセルは、種々の治療用及び／又は診断用のカーゴ（例えば、小分子（治療用及び／又は診断用、特に抗癌剤及び／又は抗ウイルス剤（ＨＢＶ及び／又はＨＣＶの治療用）を含む）、ポリペプチドやヌクレオチドのような高分子（ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ）を含む）、又はプラスミドＤＮＡ（超らせん及びヒストンでパッケージングであって核局在配列を含んでもよい））を装填されて、治療用及び／又は診断用にされることができる（蛍光ペプチド（特に蛍光緑色タンパク質／ＦＧＰ、蛍光赤色タンパク質／ＦＲＰを含む）のようなレポーター分子を含む）。
【００２１】
本発明の経皮的な実施形態は、（ａ）１つ以上の薬学的に活性な薬剤が装填されるとともに（ｂ）脂質二重層によって被包されかつ脂質二重層を担持する多孔性ナノ粒子からなるプロトセルを包含する。ここで脂質二重層は、一価飽和ω−９脂肪酸（オレイン酸、エライジン酸、エイコセン酸、ミード酸、エルカ酸、及びネルボン酸、最も好ましくはオレイン酸）、アルコール、ジオール（最も好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、Ｒ８ペプチド、並びにエッジアクチベータ（edge activator）（胆汁酸塩、ポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンエーテル、一本鎖界面活性剤（例えばデオキシコール酸ナトリウム）など）からなる群から選択される１つ以上の角質層透過性増強剤を含む。ここでプロトセルは、約５０ｎｍ?約３００ｎｍ、より好ましくは約５５ｎｍ?約２７０ｎｍ、より好ましくは約６０ｎｍ?約２４０ｎｍ、より好ましくは約６５ｎｍ?約２１０ｎｍ、より好ましくは約６５ｎｍ?約１９０ｎｍ、より好ましくは約６５ｎｍ?約１６０ｎｍ、より好ましくは約６５ｎｍ?約１３０ｎｍ、より好ましくは約６５ｎｍ?約１００ｎｍ、より好ましくは約６５ｎｍ?約９０ｎｍ、より好ましくは約６５ｎｍ?約８０ｎｍ、より好ましくは約６５ｎｍ?約７５ｎｍ、より好ましくは約６５ｎｍ?約６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、又は７５ｎｍ、最も好ましくは約７０ｎｍの平均直径を有する。
【００２２】
従って本発明は、一態様においては、（ａ）１つ以上の薬学的に活性な薬剤が装填されるとともに（ｂ）脂質二重層によって被包されかつ脂質二重層を担持する複数の多孔性ナノ粒子を含む経皮プロトセルを提供する。ここで脂質二重層は、一価飽和ω−９脂肪酸、アルコール、ジオール、溶媒、共溶媒、透過促進ペプチド及びヌクレオチド、並びにエッジアクチベータからなる群から選択される１つ以上の角質層透過性増強剤を含む。ここでプロトセルは、約５０ｎｍ?約３００ｎｍの平均直径を有する。一価飽和ω−９脂肪酸は、オレイン酸、エライジン酸、エイコセン酸、ミード酸、エルカ酸、及びネルボン酸、最も好ましくはオレイン酸、並びにそれらの混合物からなる群から選択されることができる。アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、及びそれらの混合物からなる群から選択されることができ、溶媒及び共溶媒は、ＰＥＧ４００及びＤＭＳＯからなる群から選択される。ジオールは、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物からなる群から選択されることができる。エッジアクチベータは、胆汁酸塩、ポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンエーテル、一本鎖界面活性剤、及びそれらの混合物からなる群から選択されることができる。好ましい一実施形態においては、エッジアクチベータはデオキシコール酸ナトリウムである。
【００２３】
投与の経皮経路は、経口経路及び注射経路と比較して優れた経路である。経口投与された薬物は初回通過代謝を受けやすく、食物と、そして消化管の広いｐＨ範囲と不利な相互作用を行い得る。注射投与は苦痛を伴い、生物学的有害廃棄物を発生させ、自己投与することができない。経皮的な薬物送達は、経口経路及び注射経路の両方に伴う上記の問題の全てに対処する。さらに、経皮送達方式（ＴＤＤＳ）は、数日間に渡って持続する制御放出プロファイルを可能にする。ただし、経皮的な薬物送達に伴う大きな課題は、上皮の皮膚最外層である角質層にある。「レンガ及びモルタル」に類似するその構造により、皮膚にバリア機能を与える。「レンガ」は、タンパク質、糖タンパク質、脂肪酸、及びコレステロールに富む扁平な角質層細胞からなる。細胞間隙は「モルタル」を含み、セラミド、コレステロール、脂肪酸からなる二重層に富み、ブタノールに類似の極性を示す。過去４０年には３つの世代のＴＤＤＳが開発されている。第１世代の方式は、低分子量の親油性化合物の拡散を利用している。第２世代及び第３世代の方式は、角質層の透過性が重要であることを認識している。これらの方法は、角質層を切除／バイパスするか又は角質層の透過性を増大させるために化学的増強剤、生化学的増強剤、及び起電力を利用する。種々の増強方法の中でも、リポソームは、角質層の高度に規則的な構造を崩壊させ、その後に皮膚の透過性を増大させることが示されている。
【００２４】
一実施形態においては、ＴＤＤＳとして機能するナノ多孔性粒子に担持された脂質二重層（「プロトセル」）の開発について記載する。プロトセルは、静電的にリポソームをナノ多孔性シリカ粒子コアに融合させることによって形成される。それらは、無機ナノ粒子及びリポソームの両方の利点、例えば調整可能な多孔性、異種のカーゴの大容量の装填が可能な大きい表面積、及び様々な分子を用いて改変されることができる調整可能な流動性を有する担持された脂質二重層（ＳＬＢ）を相助作用的に組み合わせている。これらの生物物理学的特性及び生化学的特性は、プロトセルが種々の用途に向けて改変されることを可能にする。予備研究において、誘導結合プラズマ質量分析を用いて、本発明者は、８．１２５ｍｇで投薬された本発明者の標準的なプロトセル組成（５５％ＤＯＰＥ、３０％コレステロール、１５％ＰＥＧ−２０００）の０．１?０．５ｗｔ％が、患者から得られた腹部皮膚の全層を通過することができることを示した。さらに、本発明者は、プロトセルの０．３?２．４ｗｔ％が、角質層が除去された部分的な層の皮膚を通過することができることを明らかにした。
【００２５】
経皮プロトセルのナノ多孔性シリカ粒子コアは、大きい表面積、容易に変えられる多孔性、及び容易に改変される表面の化学的性質を有する。これらの特性は、プロトセルのコアを、多くの異なる種類のカーゴの大容量の装填に適したものにしている。プロトセルの担持された脂質二重層（ＳＬＢ）は、本質的に低い免疫原性を有する。さらに、ＳＬＢは、標的を定められた細胞内取り込みを促進するためにペプチド、ポリマー、及び他の分子がコンジュゲートされることができる流動性表面を提供する。これらの生物物理学的特性及び生化学的特性は、プロトセルが特定の環境に最適化されることを可能にし、角質層への浸透を促進し、それに続いて異種のカーゴを経皮経路によって送達する。癌の治療方法は、治療での本発明の経皮プロトセルの使用の１つの例である。関連する医薬組成物も説明される。
【００２６】
一実施形態においては、本発明は、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＥＰＴＭＳ）などのアミン含有シランで修飾されかつ（ａ）ｓｉＲＮＡ又はリシン毒素Ａ鎖が装填されるとともに（ｂ）脂質二重層によって被包されかつ脂質二重層を担持する複数の負荷電のナノ多孔性のナノ粒子シリカコアを含むプロトセルを提供する。ここで脂質二重層は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホル−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１８：１−ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１８：１−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１６：０−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ）、１−オレオイル−２−［１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１−１２：０−ＮＢＤ−ＰＣ）、１−パルミトイル−２−｛１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル｝−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１２：０−ＮＢＤ−ＰＣ）、コレステロール、及びそれらの混合物／組み合わせからなる群から選択される１つ以上の脂質を含む。ここで脂質二重層は、カチオン性脂質及び１つ以上の双性リン脂質を含む。
【００２７】
前段落の実施形態においては、脂質は、好ましくは１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ（１８：１））又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及びそれらの混合物からなる群から選択され、プロトセルは、約６００ｍ2／ｇよりも大きいＢＥＴ表面積、約６０％?約７０％の細孔容積の割合、約２０ｎｍ?約３０ｎｍの平均直径を有する細孔からなる多峰分布の細孔形態、約５ｎｍ?約１５ｎｍの平均直径を有する細孔によって相互に連結された表面から利用可能な細孔、の特徴のうちの少なくとも１つを有する。好ましくは、プロトセルは、１０10個のナノ粒子シリカコア当たり約１０ｎＭのｓｉＲＮＡを被包する。
【００２８】
また別の一実施形態においては、本発明は、ＡＥＰＴＭＳなどのアミン含有シランで修飾されかつ（ａ）サイクリンＡ２、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、及びサイクリンＥからなる群から選択されるサイクリンスーパーファミリーのメンバーを標的とする１つ以上のｓｉＲＮＡが装填されるとともに（ｂ）脂質二重層によって被包されかつ脂質二重層を担持する複数の負荷電のナノ多孔性のナノ粒子シリカコアを含むプロトセルを提供する。ここで脂質二重層は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホル−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１８：１−ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１８：１−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１６：０−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ）、１−オレオイル−２−［１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１−１２：０−ＮＢＤ−ＰＣ）、１−パルミトイル−２−｛１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル｝−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１２：０−ＮＢＤ−ＰＣ）、コレステロール、及びそれらの混合物／組み合わせからなる群から選択される１つ以上の脂質を含む。ここで（１）脂質二重層は、ＳＰ９４及びエンドソーム分解性ペプチドを装填され、（２）プロトセルは、肝細胞癌に選択的に結合する。
【００２９】
前段落の実施形態においては、脂質二重層は、好ましくはＤＯＰＣ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＰＥＧ−２０００を、およそ５５：５：３０：１０質量比で含む。
【００３０】
肝臓癌などの癌を治療する方法は、治療での本発明のＡＥＰＴＭＳで修飾されたプロトセルの使用の１つの例である。関連する医薬組成物も説明される。
【００３１】
別の実施形態においては、本発明は、（ａ）ニパウイルス（ＮｉＶ）ヌクレオカプシドタンパク質（ＮｉＶ−Ｎ）ｍＲＮＡの配列特異的分解を誘発するｓｉＲＮＡが装填されるとともに（ｂ）脂質二重層によって被包されかつ脂質二重層を担持する複数のメソ多孔性のナノ粒子シリカコアを含むプロトセルを提供する。ここで脂質二重層は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホル−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１８：１−ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１８：１−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１６：０−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ）、１−オレオイル−２−［１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１−１２：０−ＮＢＤ−ＰＣ）、１−パルミトイル−２−｛１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル｝−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１２：０−ＮＢＤ−ＰＣ）、コレステロール、及びそれらの混合物／組み合わせからなる群から選択される１つ以上の脂質を含む。
【００３２】
前段落のプロトセルの一部の実施形態においては、脂質二重層は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ターゲティングペプチド、及びＲ８を含み、メソ多孔性のナノ粒子シリカコアはそれぞれ、約１００ｎｍの平均直径、１，０００ｍ2／ｇよりも大きい平均表面積、及び約２０ｎｍ?約２５ｎｍの平均直径を有する表面から利用可能な細孔を有し、１０10個の粒子当たり約１μΜ又はそれ以上のｓｉＲＮＡ装填量を有する。ターゲティングペプチドは、好ましくはエフリンＢ２（ＥＢ２）に結合するペプチドであり、最も好ましくはＴＧＡＩＬＨＰ（配列番号１８）である。最も好ましくは、プロトセルは、約０．０１?約０．０２ｗｔ％のＴＧＡＩＬＨＰと、約１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００と、約０．５００ｗｔ％のＲ８とを含む。
【００３３】
ニパウイルス（ＮｉＶ）に感染した又はその感染のリスクがある対象の治療方法は、治療でのニパウイルス（ＮｉＶ）ヌクレオカプシドタンパク質（ＮｉＶ−Ｎ）ｍＲＮＡの配列特異的分解を誘発するｓｉＲＮＡを含む本発明のプロトセルの使用の１つの例である。関連する医薬組成物も説明される。
【００３４】
本発明の実施形態のその他の側面は、医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は一群のプロトセルを含むが、これらは同一であっても異なっていてもよく、薬学的に許容される担体、添加剤、又は賦形剤と組み合わせて製剤される。プロトセルは、治療される疾患や投与経路（本明細書に別に記載）に応じて、単独で処方されても又は別の生物活性剤（例えば更なる抗癌剤又は抗ウイルス剤）と組み合わせて処方されてもよい。これらの組成物は、特定の目的（例えば治療（癌治療など）又は診断法（癌治療の観察など））のために改変されたプロトセルを含む。医薬組成物は、特定の目的及び投与経路に有効な一群のプロトセルを、薬学的に許容される担体、添加剤又は賦形剤と組み合わせて含む。
【００３５】
本発明の一実施形態は、本明細書に記載の新規のプロトセルを利用する方法にも関する。そのため別の実施形態においては、本発明は、本明細書に別に記載の医薬組成物の有効量を、必要とする患者若しくは対象に投与することを含む、疾患及び／又は状態を治療する方法に関する。本発明の医薬組成物は、特に癌、及び癌に続発する又は癌の原因となる病態若しくは状態（特にＨＢＶ及び／又はＨＣＶの感染）を含む多数の病態の治療に特に有用である。
【００３６】
更なる別の態様においては、本発明は、癌を診断する方法に関する。この方法は、診断剤又はレポーター造影剤を癌細胞に選択的に送達して患者の癌を特定するために改変された一群のプロトセルを含む医薬組成物を投与することを含む。この方法では、本発明のプロトセルは、ターゲティングペプチドの的であるポリペプチド（より一般的には表面受容体又は細胞膜成分）を発現する癌細胞に結合する少なくとも１つのターゲティングペプチドの含有によって、癌細胞を標的にするために改変されることができる。または、本発明のプロトセルは、癌細胞を標的としたプロトセルのレポーター成分（造影剤を含む）を含有することで、レポーターのシグナルを標準と比較することによって患者又は対象の癌性組織の存在及びサイズを確認するために用いられてもよい。標準は、例えば健康な患者又は診断の対象となる疾患を有することが分かっている患者の集団から得られる。診断されたら、本発明の医薬組成物を用いた適当な治療法又はその他の治療法が施されることができる。
【００３７】
本発明の更に他の態様では、本発明の組成物は、特定の病態及び／又は状態の治療（本発明の組成物を用いた治療を含む）の進行を観察するために使用されることができる。本発明のこの態様では、病態の治療の進行が観察されるように、癌細胞に特異的に結合しかつレポーター成分を含む一群のプロトセルを含む組成物を治療中の患者又は対象に投与することができる。
【００３８】
本発明のその他の態様は、５つの新規のＭＥＴ結合ペプチド（本明細書に別に記載）に関する。それらは、本発明の一部の実施形態のプロトセルでのターゲティングペプチドとして用いられることができる。あるいは、種々の癌細胞（癌性組織の種々の細胞のうち特に肝細胞、子宮頸部、及び卵巣の細胞を含む）のＭＥＴタンパク質に結合する利点のために医薬組成物中において用いられることができる。本発明の一実施形態は、ＭＥＴ受容体（別名では肝細胞増殖因子受容体であり、ｃ−ＭＥＴ遺伝子によって発現される）に対する新規の結合ペプチドとしての活性を示す５つの異なる７ｍｅｒペプチドに関する。これらの５つの７ｍｅｒペプチドは次の通りである。
ＡＳＶＨＦＰＰ（Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）  配列番号１
ＴＡＴＦＷＦＱ（Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ）  配列番号２
ＴＳＰＶＡＬＬ（Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ）  配列番号３
ＩＰＬＫＶＨＰ（Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ）  配列番号４
ＷＰＲＬＴＮＭ（Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ）  配列番号５
【００３９】
これらのペプチドのそれぞれは、単独で用いられても、あるいは上記群のうちの他のＭＥＴ結合ペプチドと組み合わせて用いられても、又は本発明の一実施形態のプロトセルを癌細胞（特に、肝細胞癌細胞、卵巣癌細胞、乳癌細胞、及び子宮頸部癌細胞を含む）に結合させる助けとなり得る一連のその他のターゲティングペプチド（例えば本明細書に記載のＳＰ９４ペプチド）と組み合わせて用いられてもよい。これらの結合ペプチドはまた、癌を治療する又は肝細胞増殖因子結合受容体を阻害するＭＥＴ結合ペプチドとして、単独で医薬化合物に用いられることもできる。これらのペプチドは、意図した結果を提供するために、単独で処方されても又はその他の生物活性剤と組み合わせて処方されてもよい。医薬組成物は、上記５つのＭＥＴ結合ペプチドのうちの少なくとも１つの有効量を薬学的に許容される担体、添加剤、又は賦形剤と組み合わせて含み、任意で更なる生物活性剤、例えば抗癌剤、抗ウイルス剤、又はその他の生物活性剤などと組み合わせて含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】エアロゾルによって支援されるＥＩＳＡプロセスによって調製される本発明で用いられる一実施形態のナノ粒子が、粒子のサイズ及び分布を制御するために変えられ得ることを示す図である。
【図２】一実施形態において、多くの種類のカーゴに合わせて設計されることができる細孔のサイズ及び骨格と、エアロゾル化した補助成分が容易に取り込まれることとを示す。
【図２Ａ】図２のａ、ｂ、ｃ、及びｅが、ＣＴＡＢ、Ｂ５８、Ｐ１２３、及びＰＳ＋Ｂ５６による鋳型であることを示す。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥは、ＣＴＡＰ＋ＮａＣｌ、３ｗｔ％のＰ１２３、３ｗｔ％のＰ１２３＋ポリ（プロピレングリコールアクリレート）、ミクロエマルション、及びＣＴＡＢ（ＮＨ4）2ＳＯ4による鋳型である。
【図３】一実施形態における、同時自己集合又は自己集合後の誘導体化によって細孔表面の化学的性質（即ち電荷及び疎水性）並びに細孔サイズが、有機シランと珪酸との共縮合によって主に制御されることを示す。Linら、Chem. Mater. 15, 4247-56 2003；Liu, J.ら、J. Phys. Chem.,104, 8323-2339, 2000；Fan, H.ら、Nature, 405, 56-60, 2000；Lu, Y.ら、J. Am. Chem. Soc., 122, 5258-5261, 2000参照。
【図４】ヒストンタンパク質によるＣＢ１プラスミドのパッケージングを示す。（Ａ）は、ＣＢ１プラスミド（ｐＣＢ１）を超らせん化し、超らせんｐＣＢ１をヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４でパッケージングし、得られたｐＣＢ１−ヒストン複合体を、核膜孔を通る移行を促進する核局在配列（ＮＬＳ）で修飾するために用いられるプロセスを示す概念図である。（Ｂ）及び（Ｄ）は、ＣＢ１プラスミド（Ｂ）及びヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（Ｄ）の原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）画像である。スケールバー＝１００ｎｍ。（Ｃ）及び（Ｅ）は、それぞれ（Ｂ）及び（Ｄ）での赤線に対応する高さプロファイルを示す。
【図５】ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１が装填され、ＭＣ４０によって標的を定められたメソ多孔性のシリカナノ粒子に担持された脂質二重層（プロトセル）の合成を示す。（Ａ）は、ＤＮＡを装填し、ペプチドで標的を定められたプロトセルを生成するために用いられるプロセスを示す概念図である。プロトセルのコアを形成するメソ多孔性のシリカナノ粒子をｐＣＢ１−ヒストン複合体の溶液中に単純に浸漬することによって、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１をシリカナノ粒子に装填する。次にＰＥＧ化リポソームをＤＮＡが装填されたコアと融合し、ＨＣＣに結合するターゲティングペプチド（ＭＣ４０）と、内在化したプロトセルのエンドソーム脱出を促進するエンドソーム分解性ペプチド（Ｈ５ＷＹＧ）とで更に修飾された、担持された脂質二重層（ＳＬＢ）を形成する。スルフヒドリル−アミン架橋剤（スペーサーアーム＝９．５ｎｍ）を用いて、Ｃ末端システイン残基で修飾したペプチドをＳＬＢ中のＤＯＰＥ成分にコンジュゲートした。（Ｂ）は、プロトセルのコアとして用いられるメソ多孔性のシリカナノ粒子の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像である。スケールバー＝２００ｎｍ。挿入画像＝走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）画像であって、１５〜２５ｎｍの細孔が表面から利用可能であることを示す。挿入画像のスケールバー＝５０ｎｍ。（Ｃ）は、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定されたメソ多孔性のシリカナノ粒子のサイズ分布を示す。（Ｄ、左軸）バレット−ジョイナー−ハレンダ（ＢＪＨ）モデルを用いて図Ｓ−４Ａに示す窒素収着等温線の吸着枝から計算された、メソ多孔性のシリカナノ粒子の累積細孔容積である。（Ｄ、右軸）ＤＬＳにより測定された、ｐＣＢ１−ヒストン複合体のサイズ分布である。
【図６】一実施形態における、メソ多孔性のシリカナノ粒子がヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１について高い収容能力を有し、得られたプロトセルが、エンドソーム環境を模倣する状況下でのみ被包されたＤＮＡを放出することを示す。（Ａ）は、未修飾のメソ多孔性のシリカナノ粒子（ζ＝−３８．５ｍＶ）又はアミン含有シランのＡＰＴＥＳで修飾されたメソ多孔性のシリカナノ粒子（ζ＝＋１１．５ｍＶ）中に被包可能な、ｐＣＢ１又はヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（「複合体」）の濃度を示す。（Ｂ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル（１×１０9個）と共に１×１０6細胞／ｍＬを３７℃で２４時間培養した場合に、ＺｓＧｒｅｅｎ（ｐＣＢ１によりコードされる緑色蛍光タンパク質）に対して陽性となるＨｅｐ３Ｂの割合を示す。ｘ軸は、プロトセルのコアがＡＰＴＥＳで修飾されたか否か及びｐＣＢ１がヒストンで予めパッケージングされたか否かを示す。（Ａ）及び（Ｂ）では、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの混合物（１：１ｗ／ｗ）でパッケージングされたｐＣＢ１を対照として含む。（Ｃ）及び（Ｄ）は、疑似体液（Ｃ）又はｐＨ５緩衝液（Ｄ）に暴露した際の、未修飾のメソ多孔性のシリカナノ粒子及び対応するプロトセルからの、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１の時間に依存した放出を示す。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００を含むＤＯＰＣからなり、（Ｂ）については、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図７】ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルが、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１をＨＣＣまで送達するプロセスを示す概念図である。［１］種々のＨＣＣ株により過剰発現されるＭｅｔへのターゲティングペプチドの動員によって、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞に高親和性で結合する。流動性のＤＯＰＣのＳＬＢはペプチドの流動性を促進し、それにより低いＭＣ４０密度で修飾されたプロトセルがＨｅｐ３Ｂに対して高い特異親和性を保持することを可能にする（図８Ａ参照）。［２］ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルは、受容体依存性エンドサイトーシスを介してＨｅｐ３Ｂによって内在化される（図８Ｂ及び図１５Ａ参照）。［３］エンドソーム条件はＳＬＢを不安定化し（Nature Materialsの参考文献を挿入）、エンドソーム分解性ペプチドＨ５ＷＹＧのプロトン化を引き起こす。これらは何れも、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１がＨｅｐ３Ｂ細胞の細胞質ゾル中に拡散することを可能にする（図１６Ｂ参照）。［４］ｐＣＢ１−ヒストン複合体は、核局在配列（ＮＬＳ）で修飾された場合に、約２４時間以内にＨｅｐ３Ｂ細胞の核内に濃縮される（図１６Ｃ参照）。これによって、分裂中及び非分裂中の癌細胞の両方での効率的なトランスフェクションが可能になる（図１７参照）。
【図８】ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルがＨＣＣに高親和性で結合し、Ｈｅｐ３Ｂによって内在化されるが正常肝細胞によっては内在化されないことを示す。（Ａ）は、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルをＨｅｐ３Ｂ又は肝細胞に暴露した場合の見かけの解離定数（Ｋd）を示す。Ｋd値は、特異親和性に対して逆の関係にあり、飽和結合曲線から求められた（図Ｓ−１１参照）。エラーバーは、ｎ＝５の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。（Ｂ）及び（Ｃ）は、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセル（１０００倍の過剰量）に３７℃で１時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ（Ｂ）及び肝細胞（Ｃ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。ＭｅｔはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識モノクローナル抗体で染色され（緑色）、プロトセルコアはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４で標識され（赤色）、細胞核はヘキスト３３３４２で染色された（青色）。スケールバー＝２０μｍ。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％（Ａ〜Ｃ）又は０．５００ｗｔ％（Ａ）のＭＣ４０ターゲティングペプチドで修飾された。
【図９】ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルは、ピコモル濃度でＨＣＣのアポトーシスを誘導するが、正常肝細胞の生存性に関してはごく小さい影響しか有さないことを示す。ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルに３７℃でＨｅｐ３Ｂを連続して暴露した際の、サイクリンＢ１のｍＲＮＡ及びサイクリンＢ１タンパク質の発現における用量（Ａ）及び時間（Ｂ）に依存した減少を示す。（Ａ）では、細胞を種々のｐＣＢ１濃度に４８時間暴露し、（Ｂ）では、５ｐＭのｐＣＢ１に種々の時間に渡って暴露した。肝細胞でのサイクリンＢ１タンパク質の発現及びＨｅｐ３ＢでのＺｓＧｒｅｅｎの発現が、対照として含まれる。リアルタイムＰＣＲ及び免疫蛍光法を用いて、サイクリンＢ１のｍＲＮＡ及びタンパク質それぞれの濃度を測定した。（Ｃ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル（［ｐＣＢ１］＝５ｐＭ）に３７℃で種々の時間に渡って連続して暴露した後の、Ｇ2／Ｍ期に停止したＨｅｐ３Ｂの割合を示す。Ｇ2／Ｍ期の肝細胞の割合及びＳ期のＨｅｐ３Ｂの割合を比較のために含む。細胞は、細胞周期分析の前にヘキスト３３３４２で染色された。（Ｄ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル（［ｐＣＢ１］＝５ｐＭ）に３７℃で種々の時間に渡って連続して暴露した際に、アポトーシス性になるＨｅｐ３Ｂの割合を示す。アポトーシスのマーカーに陽性である肝細胞の割合を対照として含む。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識アネキシンＶに陽性である細胞は、アポトーシスの初期にあると見なし、アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムの両方に陽性である細胞は、アポトーシスの後期にあると見なした。アポトーシス性細胞の総数は、一方及び両方に陽性である細胞の数を加算して求められた。全ての実験において、プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図１０】ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルが、対応するリポプレックスよりも２５００倍有効にＨＣＣの選択的なアポトーシスを誘導することを示す。（Ａ）は、ＤＯＰＣプロトセル、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）で修飾されたＤＯＰＣプロトセル、ｐＣＢ１とＤＯＴＡＰ及びＤＯＰＥの混合物（１：１ｗ／ｗ）とからなるリポプレックス、並びに１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００で修飾されたＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポプレックスのζ電位の値を示す。全てのζ電位測定は、０．５×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で行われた。（Ｂ、左軸）ＭＣ４０で標的を定められたプロトセル又はリポプレックスによって送達された５ｐＭのｐＣＢ１に３７℃で４８時間連続して暴露した際に、アポトーシス性になるＨｅｐ３Ｂ及び肝細胞の割合である。（Ｂ、右軸）１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ細胞の９０％において３７℃で４８時間以内にアポトーシスを誘導するのに必要な、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル又はリポプレックスの数である。（Ｂ）については、細胞は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムで染色された。一方及び両方に陽性である細胞をアポトーシス性と見なした。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（表示される場合）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポプレックスは、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（表示される場合）、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０、及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。ｐＣＢ１は、全ての実験においてＮＬＳで修飾された。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図１１】ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルが、肝細胞の生存性には影響を与えることなく、高濃度のタキソール、Ｂｃｌ−２特異ｓｉＲＮＡ、及びｐＣＢ１をＨＣＣに選択的に送達することを示す。（Ａ）は、１０12個のプロトセル、リポソーム、又はリポプレックスの中に被包可能な、タキソール、Ｂｃｌ−２の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、及びＣＢ１プラスミドの濃度を示す。赤色のバーは、タキソール及びｐＣＢ１の両方がプロトセルに装填された場合に、タキソール及びｐＣＢ１の濃度がどのように変わるかを示す。青色のバーは、タキソール、ｓｉＲＮＡ、及びｐＣＢ１のすべてがプロトセルに装填された場合又はｓｉＲＮＡ及びｐＣＢ１がリポプレックスに装填された場合に、タキソール、ｓｉＲＮＡ、及びｐＣＢ１の濃度がどのように変わるかを示す。（Ｂ）は、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルによってＨｅｐ３Ｂまで送達された場合の、オレゴングリーン（登録商標）４８８標識タキソール（緑色）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識ｓｉＲＮＡ（赤色）、及びＣｙ５標識ｐＤＮＡ（白色）の細胞内分布を示す共焦点蛍光顕微鏡法画像である。細胞をＭＣ４０で標的を定められたプロトセルの１０００倍の過剰量と共に３７℃で２４時間培養した後に固定して、ヘキスト３３３４２で染色した（青色）。スケールバー＝１０μｍ。（Ｃ）は、１０ｎＭのタキソール及び／又は５ｐＭのｐＣＢ１に３７℃で４８時間暴露した際に、Ｇ2／Ｍ期に停止したＨｅｐ３Ｂ、ＳＮＵ−３９８、及び肝細胞細胞の割合を示す。割合は、Ｇ2／Ｍでの対数増殖細胞の割合に対して正規化された。（Ｄ）は、１０ｎＭのタキソール、２５０ｐＭのＢｃｌ−２特異ｓｉＲＮＡ、及び／又は５ｐＭのｐＣＢ１に３７℃で４８時間暴露した際に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）について陽性になるＨｅｐ３Ｂ、ＳＮＵ−３９８、及び肝細胞の細胞の割合を示す。（Ｃ）及び（Ｄ）において、「ｐＣＢ１」は、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの混合物（１：１ｗ／ｗ）を用いてパッケージングされて細胞まで非特異的に送達されたｐＣＢ１を指す。全ての実験において、プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。リポソームは、５ｗｔ％のＤＭＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１６：０）を含むＤＳＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。リポプレックスは、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ（１：１ｗ／ｗ）混合物からなり、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０、及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。ｐＣＢ１は、全ての実験においてＮＬＳで修飾された。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図１２】ＣＢ１プラスミドのベクターマップを示す。ＣＢ１プラスミド（ｐＣＢ１）は、ＲＮＡｉ−Ｒｅａｄｙ  ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ−ＺｓＧｒｅｅｎベクター（クロンテック・ラボラトリーズ社、カリフォルニア州マウンテンビュー）及びｐＮＥＢ１９３ベクター（ニュー・イングランド・バイオラボ社、マサチューセッツ州イプスウィッチ）から構築された。ｐＣＢ１は、サイクリンＢ１特異的短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及びスナギンチャク種の緑色蛍光タンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎ）をコードする。構成的ｓｈＲＮＡ発現は、ＲＮＡＰｏｌＩＩＩ依存性ヒトＵ６プロモーター（ＰU6）によって駆動され、構成的ＺｓＧｒｅｅｎ発現は、サイトメガロウイルスの最初期プロモーター（ＰCMV IE）によって駆動される。ｏｒｉエレメント及びＡｍｐRエレメントは、大腸菌内におけるプラスミドの増殖を可能にする。サイクリンＢ１特異的ｓｈＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列に下線を付す。ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをｐＳＩＲＥＮベクターに導入するために用いた制限酵素部位（ＢａｍＨＩは赤色、ＥｃｏＲＩは青色）が横にある。
【図１３】ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１の特徴を示す。（Ａ）は、漸増濃度のヒストン（モル比１：２：２：２：２のＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４）に暴露されたｐＣＢ１に関する電気泳動移動度シフトアッセイを示す。ｐＣＢ１：ヒストンのモル比をレーン３〜６に示す。レーン１はＤＮＡラダーを含み、レーン２はｐＣＢ１を含み添加ヒストンを含まない。（Ｂ）は、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（ｐＣＢ１：ヒストンのモル比１：５０）のＴＥＭ画像である。スケールバー＝５０ｎｍ。
【図１４】未装填のメソ多孔性のシリカナノ粒子及びｐＣＢ１が装填されたメソ多孔性のシリカナノ粒子の窒素収着分析を示す。（Ａ）は、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１の装填前後での、メソ多孔性のシリカナノ粒子の窒素収着等温線である。（Ｂ）は、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１の装填前後での、メソ多孔性のシリカナノ粒子のブルナウアー−エメット−テラー（ＢＥＴ）表面積である。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図１５】ＤＯＰＣプロトセルの小角中性子散乱（ＳＡＮＳ）データを示す。フィッティングデータは、一定厚さの共形シェルを有する多分散な多孔性シリカ球のモデルを用いて得られたものであり、シリカ粒子の表面に細孔開口部を覆う３６Åの二重層が存在することを示す。厚さ０、２０、６０Åの二重層についてシミュレーションされたＳＡＮＳデータを比較のために含む。測定された二重層の厚さ３６Åは、平坦な担持された脂質二重層について行われた他の中性子研究（３３〜３８Å）と一致しており、これらの対照条件下では、脂質二重層の水素に富む炭化水素コアからの散乱を主に示す。
【図１６】プロトセルが、被包されたＤＮＡをヌクレアーゼ分解から守ることを示す。ＤＮａｓｅＩ処理したｐＣＢ１（レーン３）、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（レーン５）、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの１：１（ｗ／ｗ）混合物でパッケージングされたｐＣＢ１（レーン７）、カチオン性コアを有するプロトセルに装填されたｐＣＢ１（レーン９）、及びアニオン性コアを有するプロトセルに装填されたヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（レーン１１）のアガロースゲル電気泳動を示す。裸のｐＣＢ１（レーン２）、ヒストンから放出されたｐＣＢ１（レーン４）、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポプレックスから放出されたｐＣＢ１（レーン６）、カチオン性コアを有するプロトセルから放出されたｐＣＢ１（レーン８）、及びアニオン性コアを有するプロトセルから放出されたヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（レーン１０）を比較のために含む。レーン１はＤＮＡラダーを含む。サンプルをＤＮａｓｅ１（５０ｎｇのＤＮＡ当たり１ユニット）と共に室温で３０分培養し、ｐＣＢ１放出は１％ＳＤＳを用いて促進された。
【図１７】メソ多孔性のシリカナノ粒子（「未修飾のコア」）、２０％（ｖ／ｖ）のＡＰＴＥＳ中に室温で１２時間浸漬したメソ多孔性のシリカナノ粒子（「ＡＰＴＥＳ修飾コア」）、ＣＢ１プラスミド（「ｐＣＢ１」）、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（「ｐＣＢ１−ヒストン複合体」）、及びＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの１：１（ｗ／ｗ）混合物でパッケージングされたｐＣＢ１（「ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポプレックス」）のζ電位（ζ）の値を示す。ζ電位測定は、０．５×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で行われた。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図１８】図６及び２４においてＺｓＧｒｅｅｎ発現陽性の細胞の割合を求めるのに用いられた、代表的な前方散乱−側方散乱（ＦＳＣ−ＳＳＣ）プロット図及びＦＬ−１ヒストグラムである。（Ａ）〜（Ｄ）は、ＺｓＧｒｅｅｎ陰性細胞についてのＦＳＣ−ＳＳＣプロット図（Ａ及びＣ）及び対応するＦＬ−１ヒストグラム（それぞれＢ及びＤ）であり、（Ａ）は細胞残屑を除外するためにゲーティングし、（Ｃ）はしていない。ＦＬ−１チャンネルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の値を、（Ｂ）及び（Ｄ）に示す。（Ｅ）〜（Ｈ）は、ＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞についてのＦＳＣ−ＳＳＣプロット図（Ｅ及びＧ）及び対応するＦＬ−１ヒストグラム（それぞれＦ及びＨ）であり、（Ｅ）は細胞残屑を除外するためにゲーティングし、（Ｇ）はしていない。（Ｆ）及び（Ｈ）のゲートは、ＭＦＩ≦２８２、即ちＺｓＧｒｅｅｎ陰性細胞のＭＦＩの１００倍（Ｄ図参照）の細胞の割合に対応する。
【図１９】ＭＣ４０ターゲティングペプチドの識別を示す。図中に示す概念図は、ＭＣ４０ターゲティングペプチドを選択するのに用いられたプロセスを表す。１×１０11ｐｆｕ／ｍＬのペプチドを、ヒトＩｇＧのＦｃドメインに融合された１００ｎＭの組み換えヒトＭｅｔ（ｒｈＭｅｔ）と共に室温で１時間培養した。プロテインＡ又はプロテインＧでコーティングした磁性粒子を用いてＭｅｔ−ファージ複合体を親和性捕捉し、続いてＴＢＳ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で１０回洗浄して未結合のファージを除去した。結合したファージクローンは低ｐＨ緩衝液（０．２Ｍグリシン、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、ｐＨ２．２）で溶出し、溶出物を宿主細菌（大腸菌ＥＲ２７３８）の感染によって増幅した。
【図２０】ＭＣ４０ターゲティングペプチドの特徴を示す。（Ａ）は、５回目の選択ラウンド後のペプチド配列アラインメントである。主配列ＡＳＶＨＦＰＰ（配列番号１）は、以前に確認されていたＭｅｔ特異的な１２ｍｅｒのＹＬＦＳＶＨＷＰＰＬＫＡ（配列番号１５、Zhaoら、ClinCancerRes 2007;13(20 6049-6055)）の下線部分に相似である。標的に無関係のＨＡＩＹＰＲＨペプチド（約１０％）（配列番号１６、Brammerら、Anal.Biochem. 377 (2008) 88-89）を提示するファージクローンは、配列アラインメントから除かれた。（Ｂ）及び（Ｃ）は、親和性選択したファージクローンがｒｈＭｅｔに結合した度合を、酵素結合免疫吸着剤法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。（Ｂ）に示すＥＬＩＳＡのスキームは、材料及び方法の項で説明する。ＥＬＩＳＡの結果を（Ｃ）に示す。（Ｄ）は、Ｍｅｔに結合しないペプチドを除去した後の配列アラインメントである。図Ｓ−９に示す共通配列は、このアラインメントから決定された。（Ｅ）及び（Ｆ）は、（１）Ｍｅｔに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識モノクローナル抗体と、無関係なファージクローン（ＴＰＤＷＬＦＰ）（配列番号１７）と、Ｍ１３ファージに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６標識モノクローナル抗体とに暴露された（青色のドット）、又は（２）Ｍｅｔに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識モノクローナル抗体と、ＭＣ４０クローンと、Ｍ１３ファージに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６標識モノクローナル抗体とに暴露された（橙色のドット）、Ｈｅｐ３Ｂ（Ｅ）及び肝細胞（Ｆ）についてのフローサイトメトリーの散布図である。未処理細胞（赤色のドット）を用いて、ＦＬ−１（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８蛍光）及びＦＬ−２（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６蛍光）のチャンネルについての電圧パラメータを設定した。
【図２１】Ｈｅｐ３Ｂに暴露されたＭＣ４０で標的を定められたプロトセルについての例示の結合曲線である。図５Ａの解離定数を求めるために、１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ又は肝細胞をサイトカラシンＤで前処理してエンドサイトーシスを抑制し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識されＭＣ４０で標的を定められた種々の濃度のプロトセルと共に３７℃で１時間培養した。フローサイトメトリーを用いて得られた細胞群の平均蛍光強度を測定し、プロトセル濃度に対してプロットして全体の結合曲線を得た。非特異的結合は、飽和濃度の非分類の肝細胞増殖因子の存在下において、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識されＭＣ４０で標的を定められたプロトセルと共に細胞を培養することによって求められた。特異的結合曲線は、非特異的結合曲線を全体の結合曲線から引くことによって得られた。Ｋd値は、特異的結合曲線から計算された。この図に示す実験において、プロトセルのＳＬＢは５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％（約６ペプチド／粒子）のＭＣ４０ターゲティングペプチドで修飾された。対応するＫd値は１０５０±１４２ｐＭである。全てのエラーバーは、ｎ＝５の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図２２】ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルが受容体依存性エンドサイトーシスによって内在化され、Ｈ５ＷＹＧペプチドの非存在下でリソソームへ誘導されることを示す。（Ａ）は、Ｈｅｐ３Ｂ又は肝細胞の細胞のそれぞれによって１時間以内に３７℃で内在化された、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルの平均数である。１×１０6個の細胞を飽和濃度（１００μｇ／ｍＬ）のヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の非存在下（−）又は存在下（＋）において種々の濃度のプロトセルと共に培養し、フローサイトメトリーを用いて各細胞に結合した粒子の平均数を求めた。プロトセルをＮＢＤ及びｐＨｒｏｄｏ（商標）で標識して、表面に結合した粒子を酸性細胞内区画に内在化されたものから区別した（それぞれについて）。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。（Ｂ）は、プロトセルと、（１）Ｒａｂ５、（２）Ｒａｂ７、（３）リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ−１）又は（４）Ｒａｂ１１ａとの間のピアソンの相関係数（ｒ値）を示す。Ｈｅｐ３Ｂ細胞を１０００倍の過剰量のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４で標識されたプロトセルと共に３７℃で１時間培養した後、固定して透過処理し、Ｒａｂ５、Ｒａｂ７、ＬＡＭＰ−１、又はＲａｂ１１ａに対してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識抗体と共に培養した。ＳｌｉｄｅＢｏｏｋソフトウェアを用いてｒ値を求めた。ｒ値は、ｎ＝３×５０細胞の平均値±標準偏差として表される。ｒ値計算の際に細胞境界の外のピクセルを無視できるように、微分干渉（ＤＩＣ）画像を用いてＨｅｐ３Ｂ細胞の境界線を定めた。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。
【図２３】ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１がＮＬＳで修飾され、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルによって送達された場合に、ＨＣＣ細胞の核内で時間に依存して濃縮されることを示す。（Ａ）〜（Ｃ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填された１０００倍の過剰量のプロトセルに３７℃で１５分（Ａ）、１２時間（Ｂ）、又は２４時間（Ｃ）暴露されたＨｅｐ３Ｂ細胞の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。（Ｂ）については、プロトセルのエンドソーム脱出及びｐＣＢ１の細胞質ゾル内分散は、約２時間後までには明白であった。しかし、ＺｓＧｒｅｅｎ発現は１２〜１６時間まで検出可能でなかった。２４時間の時点で、Ｃｙ５標識ｐＣＢ１は細胞内全体に分布したままであった。一方、（Ｃ）において細胞質ゾルの染色が見えないのは、核内に局在したピクセルの飽和を回避するためにＣｙ５チャンネルのゲインを下げたせいである。シリカコアはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４で標識され（赤色）、ｐＣＢ１はＣｙ５で標識され（白色）、細胞核はヘキスト３３３４２で対比染色された（青色）。スケールバー＝２０μｍ。（Ｄ）は、Ｃｙ５で標識したｐＣＢ１及びヘキスト３３３４２で標識したＨｅｐ３Ｂの核についての、時間に対するピアソンの相関係数（ｒ値）である。ＳｌｉｄｅＢｏｏｋソフトウェアを用いてｒ値を求めた。ｒ値は、ｎ＝３×５０個の細胞の平均値±標準偏差として表される。ｒ値計算の際に細胞境界の外のピクセルを無視できるように、微分干渉（ＤＩＣ）画像を用いてＨｅｐ３Ｂ細胞の境界線を定めた。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。
【図２４】ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１がＮＬＳで修飾され、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルによって送達された場合に、分裂中及び非分裂中のＨＣＣ細胞の両方をほぼ１００％の効率で選択的にトランスフェクションすることを示す。（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｅ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填された１０００倍の過剰量のプロトセルに３７℃で２４時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ細胞の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、（Ａ）では分裂中であり、（Ｃ）及び（Ｅ）では約９５％コンフルエントであった。全ての画像においてｐＣＢ１はヒストンで予めパッケージングされており、（Ｅ）において、ｐＣＢ１−ヒストン複合体はＮＬＳで更に修飾された。シリカコアはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４で標識され（赤色）、ｐＣＢ１はＣｙ５で標識され（白色）、細胞核はヘキスト３３３４２で対比染色された（青色）。スケールバー＝２０μｍ。（Ｂ）、（Ｄ）及び（Ｆ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル（「ＰＣ」）１×１０9個に３７℃で２４時間連続して暴露された際に、ＺｓＧｒｅｅｎ発現陽性になる１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ及び肝細胞の割合を示す。細胞は（Ｂ）では分裂中であり、（Ｄ）及び（Ｆ）では約９５％コンフルエントであった。ｘ軸は、ＣＢ１プラスミド（「ｐＣＢ１」）及びｐＣＢ１−ヒストン複合体（「複合体」）がＮＬＳで修飾されていたか否かを示す。ｐＣＢ１単独に加えて、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの１：１（ｗ／ｗ）混合物でパッケージングされたｐＣＢ１も対照として用いられた。細胞を２０ｍｇ／ｍＬの小麦胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）に暴露し、核膜孔複合体を経るＮＬＳ修飾したｐＣＢ１の移行を遮断した。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。（Ｇ）〜（Ｉ）は、それぞれ（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｅ）で用いた細胞の細胞周期のヒストグラムである。Ｇ0／Ｇ1期の細胞の割合を各ヒストグラムについて示す。全ての実験において、プロトセルのＳＬＢは５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。
【図２５】ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルに３７℃で１時間又は７２時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ（Ａ）及び肝細胞（Ｂ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像を示す。ｐＣＢ１濃度は、全ての実験において５ｐＭに維持された。（Ｂ）の矢印は、有糸分裂細胞を示す。サイクリンＢ１はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識モノクローナル抗体で標識され（赤色）、細胞核はヘキスト３３３４２で染色された（青色）。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全てのスケールバー＝２０μｍ。
【図２６】ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルに３７℃で１時間又は７２時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ（Ａ）及び肝細胞（Ｂ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像を示す。ｐＣＢ１濃度は、全ての実験において５ｐＭに維持された。細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識アネキシンＶ（白色）及びヨウ化プロピジウム（赤色）で染色し、それぞれ初期及び後期のアポトーシスを試験した。細胞核はヘキスト３３３４２で対比染色された（青色）。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全てのスケールバー＝２０μｍ。
【図２７】双性イオン性脂質からなるＳＬＢを有するプロトセルが、ごく低い非特異的細胞毒性しか誘導しないことを示す。１×１０9個のＡＰＴＥＳ修飾メソ多孔性のシリカナノ粒子、ＡＰＴＥＳ修飾コアを有するＤＯＰＣプロトセル、スクランブルｓｈＲＮＡ配列をコードするプラスミド（「スクランブルｐＣＢ１」）が装填されたＤＯＰＣプロトセル、又はスクランブルｐＣＢ１が装填されたＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（１：１ｗ／ｗ）リポプレックスに３７℃で４８時間連続して暴露した際に、アポトーシス性になる１×１０6個のＨｅｐ３Ｂの割合を示す。プロトセル及びリポプレックスは、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０、及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。正荷電及び負荷電のポリスチレンナノ粒子（それぞれ「アミン−ＰＳ」及び「カルボキシル−ＰＳ」）を正の対照として用い、一方で１０ｍＭの抗酸化剤Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）又は１ｐｍｏｌの遊離したｐＣＢ１に暴露されたＨｅｐ３Ｂを負の対照として用いた。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図２８】ｐＨの関数としてのイマチニブの水溶性を示す。薬物の溶解度は、化学構造での弱塩基性官能基のイオン化により、ｐＨが減少するに連れて増大した。
【図２９】種々の組成におけるｐＨ７におけるイマチニブの溶解度を示す。１０％エタノールを有する組成は、他の組成と比較して最も高い溶解度を示した。イマチニブは、ＤＭＳＯに非常に可溶であることも見いだされた。
【図３０】溶媒系が２４時間に渡ってイマチニブの透過に及ぼす影響を示す。共溶媒を含有する全ての組成は、対照（水、ｐＨ７）と比較してより高い皮膚透過性を示した。ＤＭＳＯは最大の透過を示した。（N12-186PCT 2012-032-01 Provisional.PDF）。
【図３１】イマチニブの流量（経皮透過の速度）に溶媒系が及ぼす影響を示す。ＤＭＳＯを含有する組成は、調査された組成のうちで最高の流量を示した。
【図３２】ｓｉＲＮＡ又はタンパク質毒素が装填されたナノ多孔性粒子に担持された脂質二重層（プロトセル）を合成するのに用いられるプロセスを示す図である。高分子治療薬が装填された、肝細胞癌（ＨＣＣ）を標的としたプロトセルを形成するために、アミン含有シラン（ＡＥＰＴＭＳ）で修飾されたナノ多孔性シリカコアを、最初に短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又はタンパク質系毒素（例えばリシン毒素Ａ鎖）の溶液中に浸漬した。次に、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及び１８：１−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ（５５：５：３０：１０質量比）からなるリポソームを、カーゴが装填されたコアに融合した。得られた担持された脂質二重層（ＳＬＢ）を、ＨＣＣに結合するターゲティングペプチド（ＳＰ９４）及び内在化されたプロトセルのエンドソーム／リソソーム脱出を促進するエンドソーム分解性ペプチド（Ｈ５ＷＹＧ）を用いて修飾した。グリシン−グリシン（ＧＧ）スペーサー及びＣ末端システイン残基で修飾されたペプチドを、９．５ｎｍのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーを有するヘテロ二官能性の架橋剤（ＳＭ（ＰＥＧ）24）を介して、ＤＯＰＥ成分に存在する１級アミンにコンジュゲートした。実施例３に引用するLoら65及びMooreら66によって報告されたＳＰ９４配列及びＨ５ＷＹＧ配列は赤色で示されている。
【図３３】プロトセルコアを形成するナノ多孔性シリカ粒子の特徴を示す。（Ａ）は、サイズに基づく分離の前後における多峰分布シリカ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）を示す。粒子は、分離後に約１６５ｎｍの平均粒子直径を有する。（Ｂ）は、多峰分布粒子の窒素収着等温線を示す。ヒステリシスの存在は、小さい細孔によって相互に連結された大きい細孔の網状組織と矛盾しない。（Ｃ）は、（ｅ）の吸着等温線から算出された細孔直径対細孔容積のプロットが、大きい（２０?３０ｎｍ）細孔及び小さい（６?１２ｎｍ）細孔の存在を明らかにする。
【図３４】プロトセルはｓｉＲＮＡの高い収容能力を有し、その放出は酸性ｐＨによって引き起こされる。（Ａ）は、１０10個のプロトセル及び１０10個のリポプレックスに装填され得るｓｉＲＮＡ濃度を示す。０．５×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中における未修飾シリカコア及びＡＥＰＴＭＳで修飾されたシリカコアのζ電位値は、それぞれ?３２ｍＶ及び＋１２ｍＶである。（Ｂ）及び（Ｃ）は、３７℃でｐＨ７．４の疑似体液（Ｂ）又はｐＨ５．０の緩衝液（Ｃ）に暴露された際の、ＡＥＰＴＭＳで修飾されたコアを有するＤＯＰＣプロトセル、ＤＯＰＣリポプレックス、及びＤＯＴＡＰリポプレックスからｓｉＲＮＡが放出される速度を示す。ｓｉＲＮＡが装填されたプロトセル、ＤＯＰＣリポプレックス、及びＤＯＴＡＰリポプレックスの平均直径は、それぞれ１７８ｎｍ、１３５ｎｍ、及び１４４ｎｍであった。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図３５】ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルは、様々なサイクリンファミリーのメンバーをＨＣＣにおいて発現抑制するが、肝細胞においては発現抑制しない。（Ａ）及び（Ｂ）は、ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルにＨｅｐ３Ｂを暴露した際の、サイクリンＡ２、Ｂ１、Ｄ１、及びＥタンパク質の発現の用量（Ａ）及び時間（Ｂ）に依存した減少を示す。（Ａ）では１×１０6個の細胞が、様々な濃度のｓｉＲＮＡに４８時間連続して暴露され、（Ｂ）では、１２５ｐＭのｓｉＲＮＡに様々な時間連続して暴露された。（Ｃ、左軸）１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ又は肝細胞を１２５ｐＭのｓｉＲＮＡに４８時間暴露した際に残る、初期サイクリンＡ２タンパク質濃度に対する割合（％）を示す。（Ｃ、右軸）サイクリンＡ２タンパク質発現を初期濃度の１０％まで抑えるために１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ細胞と一緒に培養する必要がある、ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたＤＯＰＣプロトセル、ＤＯＰＣリポプレックス、及びＤＯＴＡＰリポプレックスの数である。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＳＰ９４及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。ＤＯＰＣ（及びＤＯＴＡＰ）リポプレックスは、５５：５：３０：１０の比のＤＯＰＣ（又はＤＯＴＡＰ）：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＰＥＧ−２０００ＰＥを用いて調製され、０．０１５ｗｔ％のＳＰ９４及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全ての実験は、完全増殖培地において３７℃で行われた。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図３６】ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルに３７℃で１時間又は４８時間暴露した後の、Ｈｅｐ３Ｂ（Ａ）及び肝細胞（Ｂ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。細胞を１０倍の過剰量のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７で標識されたプロトセル（白色）と一緒に培養した後に固定して透過処理し、ヘキスト３３３４２（青色）及びサイクリンＡ２、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、又はサイクリンＥに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗体（緑色）で染色した。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％ＳＰ９４及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。スケールバー＝２０μｍ。
【図３７】サイクリン特異的ｓｉＲＮＡ混合物が装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルは、肝細胞の生存性に影響すること無くＨＣＣのアポトーシスを誘発する。（Ａ）は、サイクリン特異的ｓｉＲＮＡ混合物が装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルに様々な時間連続して３７℃で暴露された際に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識アネキシンＶ及び／又はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）に陽性になる１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ及び肝細胞の割合（％）を示す。アネキシンＶに陽性である細胞はアポトーシスの初期にあると見なし、アネキシンＶ及びＰＩの両方に陽性の細胞はアポトーシスの後期にあると見なした。アポトーシス性細胞の総数は、アポトーシスの初期及び後期にある細胞数を加算して求められた。ｓｉＲＮＡの総濃度は、約１２５ｐＭに維持された。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。（Ｂ）及び（Ｃ）は、ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルに３７℃で１時間又は４８時間暴露された後の、Ｈｅｐ３Ｂ（Ｂ）及び肝細胞（Ｃ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。細胞を１０倍の過剰量のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７で標識されたプロトセル（白色）と一緒に培養した後に、ヘキスト３３３４２（青色）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識アネキシンＶ（緑色）、及びヨウ化プロピジウム（赤色）で染色した。細胞の形状を示すために、微分干渉（ＤＩＣ）画像を含む。スケールバー＝２０μｍ。全ての実験において、プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＳＰ９４及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。
【図３８】プロトセルは、高濃度のリシン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ）を被包し、酸性ｐＨにおいてのみそれを放出する。（Ａ）は、１０10個のプロトセル中及び１０10個のリポソーム中に被包され得るＲＴＡの濃度を示す。未修飾シリカコア及びＡＥＰＴＭＳで修飾されたシリカコアの０．５×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）におけるζ電位値は、それぞれ?３２ｍＶ及び＋１２ｍＶである。脱グリコシル化されたＲＴＡの等電点（ｐＩ）は約７である。（Ｂ）及び（Ｃ）は、ＡＥＰＴＭＳで修飾されたコアを有するＤＯＰＣプロトセル、及びＤＯＰＣリポソームをｐＨ７．４の疑似体液（Ｂ）又はｐＨ５．０の緩衝液（Ｃ）に３７℃で暴露した際の、時間に依存したＲＴＡ放出を示す。ＲＴＡが装填されたプロトセル及びリポソームの平均直径は、それぞれ１８４ｎｍ及び１４０ｎｍであった。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図３９】ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルは、タンパク質生合成をＨＣＣにおいて阻害するが、肝細胞においては阻害しない。（Ａ）及び（Ｂ）は、ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルにＨｅｐ３Ｂを暴露した際の、新生タンパク質合成の用量に依存した減少（Ａ）及び時間に依存した減少（Ｂ）を示す。（Ａ）では、１×１０6個の細胞を様々な濃度のＲＴＡに４８時間連続して暴露し、（Ｂ）では、２５ｐＭのＲＴＡに様々な時間連続して暴露した。新生タンパク質合成は、メチオニンのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識誘導体を用いて定量化された。（Ｃ、左軸）１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ又は肝細胞が２５ｐＭのＲＴＡに４８時間連続して暴露された際に残留した、初期の新生タンパク質濃度の割合（％）を示す。（Ｃ、右軸）タンパク質生合成を９０％抑えるために１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ細胞と一緒に培養される必要がある、ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたＤＯＰＣプロトセル及びリポソームの数である。プロトセル及びリポソームの二重層は、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＳＰ９４及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全ての実験は、完全増殖培地において３７℃で行われた。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【図４０】ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルに３７℃で１時間又は４８時間暴露された後の、Ｈｅｐ３Ｂ（Ａ）及び肝細胞（Ｂ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。細胞を１０倍の過剰量のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７で標識されたプロトセル（白色）と一緒に培養した後、ヘキスト３３３４２（青色）及びＣｌｉｃｋ−ｉＴ  ＡＨＡ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８タンパク質合成キット（緑色）で染色した。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＳＰ９４及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。スケールバー＝２０μｍ。
【図４１】ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルは、ＨＣＣの選択的アポトーシスを誘発する。（Ａ）は、ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルに３７℃で様々な時間暴露された際に、カスパーゼ−９活性化又はカスパーゼ−３活性化に陽性になる１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ及び肝細胞の割合（％）を示す。ＲＴＡの総濃度は、約２５ｐＭに維持された。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。（Ｂ）及び（Ｃ）は、ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルに３７℃で１時間又は４８時間暴露された後の、Ｈｅｐ３Ｂ（Ｂ）及び肝細胞（Ｃ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。細胞は、１０倍の過剰量のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７で標識されたプロトセル（白色）と一緒に培養された後に、ヘキスト３３３４２（青色）、ＣａｓｐＧＬＯＷフルオレセイン活性カスパーゼ−９染色キット（緑色）、及びＣａｓｐＧＬＯＷレッド活性カスパーゼ−３染色キット（赤色）で染色された。細胞の形状を示すために、微分干渉（ＤＩＣ）画像を含む。スケールバー＝２０μｍ。全ての実験において、プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＳＰ９４及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。
【図４２】角質層の「レンガ及びモルタル」構造を、受動的な経皮拡散の３つの経路と共に示す図である。経細胞間拡散は主要な経路として広く認められているが、通常は経細胞拡散と並行して起こり、両方とも用いられる透過増強方法によって影響される。汗腺及び毛穴は体表面積の約１％に相当するのみであるので、経付属器官での拡散は多くの場合に無視される。
【図４３】プロトセル、並びに特定の用途に関して最適化するためになされ得るそのコア及びＳＬＢの様々な改変の代表例を説明する図である。先ず左下では、プロトセルは、担持された脂質二重層によって被包されたナノ多孔性シリカコアからなる。コアは、大きい表面積、制御可能な粒子直径、調整可能な細孔サイズ、改変可能な表面の化学的性質を有し、多種類のカーゴ（即ち、ナノ粒子、タンパク質毒素、治療用核酸、薬物）の大容量の装填を促進するように設計されることができる。担持された脂質二重層は、特異的結合、内在化及び透過に作用するように、へテロ二官能性の架橋剤を用いて様々な分子（即ち、ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））がコンジュゲートされることができる流動性表面を提供する。
【図４４】予備試験の結果は、プロトセルが角質層と相互作用し、角質層に浸透し、及び皮膚を通って拡散できること、並びにそれらの相互作用の経皮動力学がＳＬＢの成分及び組成によって影響されることを明らかにする。ａ．）は、ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧで処理された皮膚サンプル（ｎ＝３）の容器中のＳｉＯ2総量（μｇ）を示す、ＩＣＰ−ＭＳの結果である。ここで角質層は、そのままであるか又は除去された。ｂ．）は、フルオロフォアを用いたコアの機能化を、各ステップ後になされるべき必要な特性評価と共に説明する図である。ｃ．）では、ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌから組成されたプロトセルは、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌの組成に対して約２倍量のＳｉＯ2を２４時間後の容器中において示した。ただし、ＰＥＧを用いて組成された同プロトセルは、それらの未ＰＥＧ化組成に対して著しく減少した動力学を示す。
【図４５】見込まれる宿主細胞及び感染細胞への抗ウイルス薬の標的送達用に、本発明者が開発を提案するプロトセルを示す図である。多孔性シリカナノ粒子のコアは青色で示され、ＳＬＢは黄色で示されている。
【図４６】標的を定められていないＰＥＧ化プロトセルの予備試験のインビボでの特性評価を示す。（Ａ）は、プロトセル又は食塩水が注射されたＢａｌｂ／ｃマウスの時間に依存した体重を示す。（Ｂ）は、ＤｙＬｉｇｈｔ６３３標識プロトセル又は１００μＬの食塩水（対照）が注射され、ＩＶＩＳ−ＬｕｍｉｎａＩＩを用いてイメージングされたＢａｌｂ／ｃマウスである。全ての実験において、プロトセルは１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００で修飾され、尾静脈に注射された。
【図４７】インビボにおけるプロトセルのおおまかな生体内分布及び毒性を示す。（Ａ）は、静注直後の粒子の体循環を示し、（Ｂ）は、注射後４８時間での肝臓及び骨への局在を示す。（Ｃ）では、週３回のプロトセル投与は、動物の全体重などの全体的な毒性徴候をもたらさなかった。（Ｄ）では、粒子の蛍光は、肝臓の解剖学的構造に影響を及ぼすこと無く、プロトセルが注射されたマウスの肝臓に蓄積することが観察される（Ｄ１、Ｄ３、Ｄ４。４週間で計３０ｍｇ）。
【図４８】肝臓の厚い切片中の粒子分布の３Ｄレンダリングを示す。粒子は、決まってはいるが現時点では特定されていない肝臓の部分に経時的に蓄積することが分かった。全体的な毒性及び組織学的毒性は、最大３０ｍｇ／マウスの用量で４週間に渡って観察されなかった。スケール＝２０μｍ。
【図４９】実施例８の実験で測定された、皮膚の全層及び部分的な層を通過してのプロトセルの拡散を示す。
【図５０】実施例８の実験で測定された、皮膚の全層及び部分的な層を通過してのプロトセルの拡散を示す。
【図５１】実施例８の実験で測定された、皮膚の全層及び部分的な層を通過してのプロトセルの拡散を示す。
【図５２】実施例８の実験で測定された、ドナーキャップサンプルのＩＣＰ質量分析を示す。
【図５３】実施例８の実験で測定されたコアの機能化を示す。
【図５４】実施例８の実験で測定された、容器液中のＳｉＯ2濃度を測定するために用いられた蛍光分光分析を示す。
【図５５】実施例８の実験で測定された、容器液中のＳｉＯ2濃度を測定するために用いられた蛍光分光分析を示す。
【図５６】実施例８の実験で測定された、容器液中のＳｉＯ2濃度を測定するために用いられた蛍光分光分析を示す。
【図５７】実施例８の実験で測定された、容器液中のＳｉＯ2濃度を測定するために用いられた蛍光分光分析を示す。
【図５８】実施例８の実験で測定されたように、正の対照は、皮膚の自己蛍光を利用しながら、皮膚中の蛍光標識された粒子がイメージングされることができることを示した。
【図５９】様々なプロトセルの組成が、それぞれの組成についてｎ＝４で投与された（０．５×ＰＢＳ中１６ｍｇ／ｍｌを５００μＬ）。各実験につき１つの皮膚（Ｓ１）が、０．５×ＰＢＳで処理された。標準曲線は、実施例９の実験で測定されたように、Ｓ１の２４時間の容器液の１：２希釈を用いて濃度範囲０．１６ｍｇ／ｍｌ?１．９５３１２５Ｅ?５ｍｇ／ｍｌについて作成された。
【図６０】実施例９の実験で測定された蛍光分光分析と関連した線形回帰分析を示す。
【図６１】ＳＬＢの組成は、実施例９の実験で測定されたように経皮拡散に大きく影響し得る。
【図６２】ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌの組成へのＰＥＧの添加及びＤＳＰＣ／ｃｈｏｌの組成へのＰＥＧの添加は、実施例９の実験で測定されたように経皮拡散を著しく減少させた。
【図６３】実施例９の実験で測定された、時間の関数としての補正後の平均蛍光強度における個々の増大を示す。
【図６４】実施例９の実験で測定された、時間の関数としての補正後の平均蛍光強度における個々の増大を示す。
【図６５】実施例９の実験で測定された動力学に関する組成の影響を示す。
【図６６】実施例９の実験で測定された動力学に関する組成の影響を示す。
【図６７】実施例９の実験で測定された動力学に関する組成の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
次の用語は、本明細書において本発明を説明するために用いられる。用語が本明細書で特に定義されない場合には、その用語は当業者による使用と一致した方法で用いられるものと理解される。
【００４２】
ある数値の範囲が与えられた場合には、その範囲の上限値と下限値との間にある各値は、文中に別に明記しない限り下限値の単位の１０分の１まで、及びその記載された範囲におけるいずれかの他の記載された値又は介在値は、本発明に包含されるものと理解される。これらのより狭い範囲の上限値及び下限値は、そのより狭い範囲に独立して含まれてもよく、同様に本発明に包含され、記載された範囲でのいずれかの具体的に除外された限界値に従う。記載された範囲が限界値の一方又は両方を含む場合には、それらの限界値の一方又は両方を除外した範囲も本発明に含まれる。ある置換基が１つ以上のマーカッシュ群で可能であるものである場合には、安定した結合を形成する置換基のみが用いられるものと理解される。
【００４３】
別に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者よって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等のいずれかの方法及び材料も本発明の実施又は試験に用いることができるが、ここでは好ましい方法及び材料を説明する。
【００４４】
本明細書及び特許請求の範囲で用いられる場合、単数形の「ある」（a、an）、及び「その（前記）」（the）には、文脈において明白に別に指示がない限り、複数への言及が包含されることに留意しなければならない。
【００４５】
更に、次の用語は以下に示す定義を有する。
【００４６】
用語「患者」又は「対象」は、本明細書全体にわたって、文脈により動物、通常は哺乳動物（特に家畜及び好ましくはヒトを含む）を記すために用いられ、本発明の化合物又は組成物を用いた治療（予防的治療（予防）を含む）が提供される。ヒト患者などの特定の動物に特異的な感染、状態又は病態の治療については、用語「患者」はその特定の動物を指す。殆どの場合、本発明の患者又は対象は、一方又は両方の性別のヒト患者である。
【００４７】
用語「有効（な）」は、別に示されない限り、その結果が感染及び／又は病態の予防及び／又は治療法に関するか、あるいは本明細書に別に記載の予防及び／又は治療法に関するかを問わず、その使用の文脈において用いられる場合に所期の結果を生じる又はもたらす量の化合物又は成分を記すために用いられる。用語「有効（な）」は、本出願において別に記載される又は使用される全てのその他の有効量又は有効濃度の用語（用語「治療的に有効」を含む）を包含する。
【００４８】
用語「化合物」は、本明細書で開示されるいずれかの特定の化合物又は生物活性剤を記すために用いられ、いずれか及び全ての立体異性体（ジアステレオマーを含む）、個々の光学異性体（エナンチオマー）又はラセミ混合物、薬学的に許容される塩、並びにプロドラッグの形態を含む。用語「化合物」は、本明細書においては安定した化合物を指す。文脈におけるその使用の範囲内で、用語「化合物」は本明細書に別に記載の単一の化合物又は化合物の混合物を指し得る。
【００４９】
用語「生物活性剤」は、本発明の実施形態における使用のために処方可能ないずれかの生理的に活性な化合物又は薬物を指す。生物活性剤の例としては、癌又は癌に続発する病態若しくは状態を治療するために用いられる本発明の化合物を含み、抗ウイルス剤、特に抗ＨＩＶ剤、抗ＨＢＶ剤、及び／又は抗ＨＣＶ剤（特に肝細胞癌を治療する場合）並びに本明細書に別に記載するその他の化合物又は薬剤が含まれてもよい。
【００５０】
用語「治療する」（treat）、「治療すること」（treating）、及び「治療」（treatment）は、疾患のリスクがある又は疾患に罹患した患者に利益を提供するいずれかの行為を指すために同義的に用いられ、少なくとも１つの症状の緩和、抑制、鎮静又は除去による状態の改善、疾患の進行の遅延、疾患の発症の予防、遅延又はその可能性の抑制などが含まれる。ウイルス感染の場合には、これらの用語はウイルス感染にも適用され、好ましくは一部の特に好ましい実施形態においては感染の病原体であるウイルスの根絶又は除去（診断法の限界によって規定される）を含む。
【００５１】
「治療」は、本明細書で用いる場合、主に癌の予防的及び治癒的な治療の両方を包含するが、その他の病態、例えばウイルス感染、特にＨＢＶ及び／又はＨＣＶも包含する。本発明の化合物は、例えば疾患発生の前に哺乳動物に予防的に投与して、その疾患の可能性を低減することができる。予防的な投与は、哺乳動物での疾患のその後の発生の可能性を低減若しくは減少させ、又はその後に発生する疾患（特に癌の転移を含む）の重症度を減少させる（抑制する）のに有効である。あるいは、本発明の化合物は、例えば既に疾患に罹患している哺乳動物に治療的に投与できる。治療的な投与の一実施形態においては、本発明の化合物の投与は疾患を除去し、及び癌の緩解をもたらし又はその転移の可能性を実質的に除去するのに有効である。本発明の化合物の投与は、癌の場合のように疾患の重症度を減少させるのに又は罹患した哺乳動物の寿命を延ばすのに、あるいはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及び／又はＣ型肝炎ウイルス感染（ＨＣＶ）の感染の場合のように疾患の病原体を抑制する若しくは場合によっては除去するのに有効である。
【００５２】
用語「薬学的に許容される」は、本明細書で用いる場合、本明細書に記載の治療を達成するために化合物又は組成物が対象（ヒト患者を含む）への投与に適し、疾患の重症度及び治療の必要性に照らして不当に有害な副作用を有さないことを意味する。
【００５３】
用語「抑制（阻害）」は、本明細書で用いる場合、起こり得る結果の部分的又は完全な除去を指す。「抑制（阻害）剤（インヒビター）」は、抑制（阻害）する能力を有する化合物／組成物である。
【００５４】
用語「予防」は、文脈で用いられる場合、本発明の１つ以上の化合物若しくは組成物の単独又は別の薬剤との組み合わせての投与又は同時投与の結果として、「可能性を低減すること」又は疾患、状態若しくは病態が起こることを予防することを意味する。「予防」が１００％有効であることは、ほとんどないことに注意されたい。従って用語「予防」及び「可能性を低減すること」は、患者又は対象の一定の集団において、本発明の化合物の投与が特定の状態若しくは病態（特に癌の増殖若しくは転移のような病態の悪化）又は疾患進行のその他の一般に認められた指標が起こる可能性を低減する、あるいはそれらが起こることを抑制するという事実を示すために用いられる。
【００５５】
用語「プロトセル」は、シリカ、ポリスチレン、アルミナ、チタニア、ジルコニア、又は一般的に金属酸化物、有機金属塩、有機珪酸塩、又はそれらの混合物を含む材料からなる多孔性ナノ粒子を記すために用いられる。
【００５６】
本発明のプロトセルに用いられる多孔性ナノ粒子としては、メソ多孔性シリカナノ粒子及びコアシェルナノ粒子が含まれる。
【００５７】
多孔性ナノ粒子はまた、脂肪族ポリエステル、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、乳酸とグリコール酸とのコポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリウレタン、ポリ酪酸、ポリ吉草酸、ポリラクチド−ｃｏ−カプロラクトン、アルギン酸塩及びその他の多糖、コラーゲン及びその化学誘導体、アルブミン、親水性蛋白質、ゼイン、プロラミン、疎水性蛋白質、コポリマー、並びにそれらの混合物からなる群から選択される１つ以上の組成物を含む生分解性ポリマーナノ粒子であってもよい。
【００５８】
多孔性球形シリカナノ粒子は好ましいプロトセルのために用いられ、担持された脂質又はポリマーの二重層又は多分子層によって囲まれる。本発明の種々の実施形態においては、本発明のナノ構造体、ナノ構造体を構築及び使用する方法、並びにプロトセルを提供する方法を提供する。最も基本的な形態であるプロトセルの多くは、当分野で公知である。５ｎｍ未満〜２００ｎｍ若しくは５００ｎｍ以上のサイズ（直径）に渡る種々のサイズ範囲の多孔性シリカ粒子は当分野において容易に入手可能であり、又は当分野で公知の方法を用いて容易に調製できる（実施例の項参照）。あるいはその代わりに、SkySpring Nanomaterials, Inc.（米国, Texas, Houston）又はDiscovery Scientific, Inc.（British Colombia, Vancouver）から購入できる。多様なシリカナノ粒子は、Carollらの手順（Langmuir, 25, 13540-13544 (2009)）を用いて容易に調製できる。プロトセルは、当分野で公知の方法を用いて容易に得られる。本出願の実施例の項では、本発明に有用なプロトセルを得るための特定の方法を提供する。本発明のプロトセルは容易に調製でき、シリカナノ粒子の表面に融合した脂質を含むプロトセルを含む。例えば、Liuら, Chem. Comm., 5100-5102 (2009）、Liuら, J. Amer. Chem. Soc, 131, 7567-7569 (2009)、Luら, Nature, 398, 223-226 (1999)参照。本発明での使用のための好ましいプロトセルは、Ashleyら, Nature Materials, 2011, May;10 (5): 389-97、Luら, Nature, 398, 223-226 (1999)、Carollら, Langmuir, 25, 13540-13544 (2009)、及び以下の実験の項に別途示す手順に従って調製される。
【００５９】
用語「ナノ粒子」及び「多孔性ナノ粒子」は、本明細書においては交換可能に用いられ、そのような粒子は、結晶相、アモルファス相、準結晶相、準アモルファス相、又はそれらの混在で存在し得る。
【００６０】
ナノ粒子は、様々な形状及び断面形状を有することができ、それらは部分的に、その粒子を生成するために用いるプロセスに依存する。一実施形態においては、ナノ粒子は、球体、棒状、筒状、薄片状、繊維状、平板状、ワイヤー状、立方体、又は髭結晶の形態を有することができる。１つのナノ粒子が、前記形態の２つ以上を有する複数の粒子を含んでもよい。一実施形態においては、粒子の断面形状は、円形、楕円形、三角形、長方形、又は多角形の１つ以上であり得る。一実施形態においては、ナノ粒子は、本質的に非球体の粒子からなってもよい。例えば、そのような粒子は３主軸全てが異なる長さを有する楕円形状を有してもよく、又は偏球若しくは扁長の回転楕円であってもよい。非球体のナノ粒子は、形状が薄板状であってもよい。ここで「薄板状」は、１つの軸に沿った最大寸法が他の２軸のそれぞれに沿った最大寸法よりもかなり小さい粒子を指す。非球体のナノ粒子は、角錐若しくは円錐の錐台又は細長い棒の形状を有してもよい。一実施形態においては、ナノ粒子は形状が不規則であってもよい。一実施形態においては、複数のナノ粒子が本質的に球体のナノ粒子からなってもよい。
【００６１】
マルチ粒子（例えば多孔性ナノ粒子）を説明するために本明細書において用いられる用語「有効平均粒子サイズ」は、その中の複数粒子のうちの少なくとも５０％が規定のサイズであることを意味する。従って「直径約２，０００ｎｍ未満の有効平均粒子サイズ」は、その中の複数粒子のうちの少なくとも５０％が直径約２，０００ｎｍ未満であることを意味する。一部の実施形態においては、ナノ粒子は、光散乱法、顕微鏡法、又はその他の適当な方法で測定して、約２，０００ｎｍ（即ち２ミクロン）未満、約１，９００ｎｍ未満、約１，８００ｎｍ未満、約１，７００ｎｍ未満、約１，６００ｎｍ未満、約１，５００ｎｍ未満、約１，４００ｎｍ未満、約１，３００ｎｍ未満、約１，２００ｎｍ未満、約１，１００ｎｍ未満、約１，０００ｎｍ未満、約９００ｎｍ未満、約８００ｎｍ未満、約７００ｎｍ未満、約６００ｎｍ未満、約５００ｎｍ未満、約４００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約２５０ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、約１５０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約７５ｎｍ未満、若しくは約５０ｎｍ未満の有効平均粒子サイズを有する。「Ｄ50」は、１つのマルチ粒子中にある複数粒子のうち５０％がそれより小さい粒子サイズを指す。同様に「Ｄ90」は、１つのマルチ粒子中にある複数粒子のうち９０％がそれより小さい粒子サイズを指す。
【００６２】
一部の実施形態においては、多孔性ナノ粒子は、シリカ、生分解性ポリマー、ゾルゲル、金属、及び金属酸化物からなる群から選択される１つ以上の組成物からなる。
【００６３】
本発明の一実施形態においては、ナノ構造体は脂質のシェル（好ましくは二重層だが、場合により単分子層又は多分子層）で囲まれた多孔性粒子コアからなるコア−シェル構造を含む（Liuら, JACS, 2009, 前出参照）。多孔性粒子コアは、例えば上記の無機材料及び／又は有機材料からなる多孔性ナノ粒子を含み、脂質二重層によって囲まれることができる。本発明において、これらの脂質二重層に囲まれたナノ構造体は、担持された脂質二重層の膜構造を有するので、「プロトセル」又は「機能上のプロトセル」と呼ばれる。本発明の複数の実施形態においては、プロトセルの多孔性粒子コアには種々の所望の化学種（「カーゴ」）が充填されることができる。化学種は、小分子（例えば、本明細書に別に記載の抗癌剤）、高分子（特に、ＲＮＡ（例えば短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む）若しくはポリペプチド（リシン毒素Ａ鎖のようなポリペプチド毒素又はジフテリア毒素Ａ鎖ＤＴｘのようなその他の毒性ポリペプチドを含む））、レポーターポリペプチド（例えば、特に蛍光緑色タンパク質）、半導体量子ドット、金属系ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、又はそれらの組み合わせを含む。本発明のいくつかの好ましい態様においては、プロトセルには超らせんプラスミドＤＮＡが装填され、それはタンパク質（例えば増殖因子受容体、又は細胞（特に癌細胞）の増殖の原因となり若しくはそれを助け、癌細胞の増殖停止及びアポトーシスを誘導するその他の受容体。特に上皮増殖因子／ＥＧＦＲ、血管内皮増殖因子受容体／ＶＥＧＦＲ−２、又は血小板由来増殖因子受容体／ＰＤＧＦＲ−αを含む）の発現を抑制するために使用されることができる治療用若しくは／又は診断用のペプチド、並びに短鎖ヘアピンＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ若しくは短鎖干渉ＲＮＡ／ｓｉＲＮＡを送達するために用いられることができる。
【００６４】
一部の実施形態において、カーゴ成分としては、例えば特定の目的（例えば本明細書に開示の治療用途又は診断用途）用の化学的な小分子（特に抗癌剤及び抗ウイルス剤（抗ＨＩＶ剤、抗ＨＢＶ剤、及び／又は抗ＨＣＶ剤を含む）、核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ、並びに細胞への送達後に１つ以上のポリペプチド又はＲＮＡ分子を発現するプラスミド）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
一部の実施形態においては、プロトセルの脂質二重層は生体適合性を提供することができ、かつ標的を定めるための化学種（例えばターゲティングペプチド（抗体を含む）、アプタマー、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール））を有するように修飾されることができ、例えばプロトセルの更なる安定性及び／又は生物活性細胞への標的送達が可能である。
【００６６】
本発明のプロトセル粒子のサイズ分布は、用途に応じて単分散又は多分散にすることができる。シリカコアはある程度まで単分散（即ち、特に溶液法を用いて調製される場合、直径が約５％よりもばらつかない一様なサイズの群、例えば２００ｎｍの直径のプロトセルの場合は±１０ｎｍである）にでき、又はある程度まで多分散（即ち、多分散群は平均（又は中央）直径から大きくばらついてよい。例えばエアロゾルによって調製される場合には、最大±２００ｎｍ以上である）にできる（添付の図１参照）。多分散群を大きさで分けて単分散群にすることができる。これらはいずれもプロトセルの生成に好適である。本発明において好ましいプロトセルは、好ましくは直径約５００ｎｍ以下であり、患者又は対象への送達をもたらして所期の治療効果を生ずるためには好ましくは直径約２００ｎｍ以下である。
【００６７】
一部の実施形態では、本発明のプロトセルは、通常は直径約８〜１０ｎｍ超から約５μｍのサイズの範囲であり、好ましくは直径約２０ｎｍ〜３μｍ、約１０ｎｍ〜約５００ｎｍ、より好ましくは約２０〜２００ｎｍ（約１５０ｎｍを含み、これを平均直径又は直径の中央値のとすることができる）である。上記のように、プロトセルの群はプロトセルの群の平均直径又は直径の中央値に基づいて単分散又は多分散と見なされる。直径約８ｎｍよりも小さい粒子は腎臓を通して排出され、約２００ｎｍよりも大きい粒子は肝臓及び脾臓によって捕捉されるので、サイズは本発明の治療及び診断の態様にとって非常に重要である。従って本発明の一実施形態は、患者又は対象における薬物送達及び診断のためのより小さいサイズのプロトセルに焦点を合わせる。
【００６８】
一部の実施形態では、本発明のプロトセルは、メソ細孔、好ましくはナノ構造体材料に見られる細孔を含むことを特徴とする。それらの細孔（少なくとも１つだが、多くの場合には多数）は、ナノ粒子の表面と交わっていてもよく（ナノ粒子の表面に現れた細孔の一方又は両方の末端が存在することによって）、又はナノ構造体の内部にあって、少なくとも１つ以上のメソ細孔がナノ粒子の表面のメソ細孔と相互に連結していてもよい。より小さいサイズの相互に連結した細孔は、多くの場合に表面のメソ細孔の内側に見られる。メソ細孔の細孔サイズの全範囲は、直径０．０３〜５０ｎｍにすることができる。メソ細孔の好ましい細孔サイズは約２〜３０ｎｍの範囲であり、単一サイズ、二峰性又は傾斜的であってもよく、規則的又は不規則（本質的にランダムな配置若しくは蠕虫状）であってもよい（添付の図２参照）。
【００６９】
メソ細孔（ＩＵＰＡＣ定義では直径２〜５０ｎｍ）は、鋳型剤（界面活性剤、ブロックコポリマー、分子、高分子、エマルション、ラテックスビーズ、又はナノ粒子など）によって「鋳造」される。更に、プロセスによっては約０．０３ｎｍまで小さいミクロ細孔（ＩＵＰＡＣ定義では直径２ｎｍ未満）をもたらすことができる（例えばエアロゾルプロセスの鋳型成分が用いられない場合）。メソ細孔をマクロ細孔、即ち直径５０ｎｍに拡大することもできる。
【００７０】
ナノ粒子材料の細孔表面の化学的性質は非常に多様であり得る。全ての有機シランは、カチオン性、アニオン性、親水性、疎水性、反応性の基をもたらす。細孔表面の化学的性質、特に電荷及び疎水性は、装填容量に影響する（添付の図３参照）。引力静電相互作用又は疎水性相互作用は装填容量を調節／増強し、放出速度を調節する。より大きい表面積は、それらの引力相互作用を介して薬物／カーゴのより多い装填をもたらし得る（以下参照）。
【００７１】
一部の実施形態では、ナノ粒子の表面積は、Ｎ2−ＢＥＴ法による測定によると、約１００ｍ2／ｇ〜＞約１２００ｍ2／ｇの範囲である。通常は、細孔サイズが大きくなると表面積は小さくなる（図２Ａの表参照）。鋳型剤を除かない場合、又は細孔が０．５ｎｍ未満であり、従って動力学効果のせいで７７ＫにおけるＮ2収着法によって測定可能でない場合、表面積は理論上は本質的に０まで減少し得る。しかしながら、この場合にはＣＯ2又は水の収着によって測定可能であるが、恐らく非多孔性と見なされる。これは鋳型を用いずに調製したシリカコア中に生体分子が直接被包される場合に該当すると考えられ、その場合には粒子（内部のカーゴ）は、細胞への送達後のシリカマトリクスの分解によって放出される。
【００７２】
通常、本発明のプロトセルは、最大１００ｗｔ％を超える容量（（カーゴ重量／装填済みのプロトセル重量）×１００として定義される）までカーゴが装填される。カーゴの最適な装填は、多くの場合に約０．０１〜３０％であるが、プロトセル中にカーゴとして組み込まれる薬物又は薬物の組み合わせに依存する。これは通常は１０10個の粒子当たりのμΜとして表され、本発明者は１０10個の粒子当たり２０００〜１００μΜの範囲の値を得ている。本発明の好ましいプロトセルは、ｐＨ約５．５（エンドソームのｐＨ）でカーゴの放出を示すが、生理的ｐＨ７又はより高いｐＨ（７．４）では安定である。
【００７３】
装填用の内部スペースの表面積は、その最適値が約１．１〜０．５立方センチメートル／グラム（ｃｃ／ｇ）の範囲の細孔容積である。ただし、本発明の一実施形態のプロトセルでは、表面積はナノ粒子外部の幾何学的表面積ではなく、主に内部であることに注意されたい。
【００７４】
本発明の一実施形態の多孔性粒子に担持された脂質二重層は、非多孔性支持体に担持された脂質二重層又はリポソームの脂質二重層よりも低い融解転移温度を有する（即ちより流動性である）。二重層の流動性は、側方拡散及び標的細胞表面受容体によるペプチドの動員を可能にするので、これは場合によっては、低ペプチド密度のターゲティングリガンドの高親和性結合を達成するために重要である。一実施形態においてはペプチドにクラスターをもたらし、それは補足的な標的への結合を促進する。
【００７５】
本発明においては、脂質二重層は組成が非常に多様であり得る。通常、リポソームに用いることができるいずれの脂質又はポリマーも、プロトセルに用いることができる。好ましい脂質は本明細書に別に記載する。本発明のプロトセルで使用するための特に好ましい脂質二重層は、脂質の混合物（本明細書に別に記載する）を、重量によって、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、５ｗｔ％のＰＥＧ、３０ｗｔ％のコレステロール、６０ｗｔ％のＤＯＰＣ又はＤＰＰＣの重量比で含む。
【００７６】
ζ電位により測定されるメソ多孔性のシリカＮＰコアの電荷は、アミンシランの２−（アミノエチル）プロピルトリメトキシシラン（ＡＥＰＴＭＳ）又はその他の有機シランによる修飾によって−５０ｍＶから＋５０ｍＶまで単調に変化させられる。更にこの電荷修飾は、プロトセルのカーゴ中の薬物の装填を変化させる。通常、担持された脂質二重層の融合後にζ電位は約−ｌ０ｍＶと＋５ｍＶとの間まで低下するが、これは血中循環時間を最大化し非特異的相互作用を回避するのに重要である。
【００７７】
どのように界面活性剤鋳型が除去されるか（例えば、高温（５００℃）における焼成、酸性エタノールによる抽出）及びシリカの骨格に含まれるＡＥＰＴＭＳの量に依存して、シリカの分解速度は非常に変わり得る。更にこれによって内部のカーゴの放出速度が調節される。これが起こる理由は、細孔の内部表面積に強く引きつけられた分子が粒子コアからゆっくりと拡散するため、粒子コアの分解によって放出速度が部分的に調節されるためである。
【００７８】
本発明の一実施形態のプロトセルの更なる特徴としては、ｐＨ７において安定である、即ちそのカーゴを漏出させないが、ｐＨ５．５（エンドソームのｐＨ）においては脂質又はポリマーの被覆が不安定化してカーゴ放出を開始する。このｐＨ誘発の放出は、エンドサイトーシスによってプロトセルが細胞中に内在化され、そこでｐＨ誘発の複数の事象がエンドソームへの放出をもたらし、その結果として細胞の細胞質ゾルへの放出をもたらす時点まで、プロトセルの安定性を維持するために重要である。プロトセルのコア粒子及び表面はまた、特定の長時間に渡ってカーゴの非特異的放出を提供するように改変されること、並びに局所的炎症部位における活性酸素及び他の因子の増大した存在などの他の生物物理学的変化に際して、カーゴを放出するように改質されることができる。定量的な実験の証拠からは、標的化プロトセルは、高い親和性のＩｇＧに必要なＴ細胞のヘルプを支持しないので、弱い免疫応答しか引き起こさず、好ましい結果が示されている。
【００７９】
本発明のプロトセルは、従来技術のプロトセルから区別される少なくとも１つ又は複数の特徴（実施形態に応じて）を示す。
１）従来技術とは異なり、本発明の一実施形態においては平均サイズ（直径）が約２００ｎｍ未満のナノ粒子を特定する。このサイズは、受容体依存性エンドサイトーシスによる効率的な細胞内取り込みを可能にし、さらに非標的細胞及び器官による結合及び取り込みを最小にするために設計されている。
２）本発明の一実施形態においては、生体内分布の制御を可能にするために、単分散及び／又は多分散のサイズを特定する。
３）本発明の一実施形態は、受容体依存性エンドサイトーシスを誘導する標的化されたナノ粒子に関する。
４）本発明の一実施形態は、融合ペプチド又はエンドソーム分解性ペプチドの含有によって細胞質内へのカーゴの分散を誘導する。
５）本発明の一実施形態は、ｐＨで誘発されるカーゴ放出をする粒子を提供する。
６）本発明の一実施形態では、カーゴの制御された時間依存的放出（シリカナノ粒子マトリクスの熱誘起架橋の程度による）を示す。
７）本発明の一実施形態は、時間依存的でｐＨ誘発の放出を示すことができる。
８）本発明の一実施形態は、複合的な複数のカーゴの細胞送達を包含し、提供することができる。
９）本発明の一実施形態は、標的癌細胞の致死を示す。
１０）本発明の一実施形態は、標的癌細胞の診断を示す。
１１）本発明の一実施形態は、標的細胞への選択的移入を示す。
１２）本発明の一実施形態は、標的でない細胞の選択的除外（選択性）を示す。
１３）本発明の一実施形態は、担持された脂質二重層の増強された流動性を示す。
１４）本発明の一実施形態は、標的細胞に対してサブナノモルの制御された結合親和性を示す。
１５）本発明の一実施形態は、従来技術に見られる濃度よりも低いターゲティングリガンド密度でサブナノモルの結合親和性を示す。
１６）本発明の一実施形態は、従来技術では利用できない細部の微細な程度によって、従来技術から更に区別することができる。
【００８０】
用語「脂質」は、本発明で用いられるナノ粒子の表面に脂質二重層を形成するために用いられる成分を表すのに使用される。種々の実施形態では、脂質二重層を担持するナノ粒子から構築されるナノ構造体を提供する。本発明の複数の実施形態においては、ナノ構造体は、好ましくは例えば脂質二重層のシェルに囲まれた多孔性粒子コアを含むコア−シェル構造を含む。ナノ構造体、好ましくは上記の多孔性シリカナノ構造体は、脂質二重層の膜構造を担持する。本発明の複数の実施形態においては、プロトセルの脂質二重層は生体適合性を提供でき、更に例えばプロトセルの更なる安定性及び／又は生物活性の細胞（特に癌細胞）中への標的送達が可能なように、標的を定めるための化学種（例えば、ターゲティングペプチド、融合ペプチド、抗体、アプタマー、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を含む）を有するように修飾されることができる。ＰＥＧが脂質二重層に含まれる場合、分子量は非常に様々であり得る。ただし約１０〜約１００ユニットのエチレングリコール、約１５〜約５０ユニット、約１５〜約２０ユニット、約１５〜約２５ユニット、約１６〜約１８ユニットなどの範囲のＰＥＧを用いることができ、アミン基を介してリン脂質に通常コンジュゲートされるＰＥＧ成分は、脂質二重層に含まれる脂質のうち、重量で約１％〜約２０％、好ましくは約５ｗｔ％〜約１５ｗｔ％、約１０％を構成する。
【００８１】
リポソーム送達システムに用いられる多くの脂質を用いてナノ粒子上に脂質二重層を形成し、本発明のプロトセルを提供することができる。本発明の一実施形態のプロトセルを生成するために、ナノ粒子を囲む脂質二重層に、リポソーム若しくはポリマーソームを形成するのに用いられる実質的にいかなる脂質又はポリマーを用いてもよい。本発明での使用のための好ましい脂質としては、例えば、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホル−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１８：１のＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１８：１ＰＥＧ−２０００ＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１６：０のＰＥＧ−２０００ＰＥ）、１−オレオイル−２−［１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１〜１２：０のＮＢＤ−ＰＣ）、１−パルミトイル−２−｛１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル｝−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１２：０のＮＢＤ−ＰＣ）、コレステロール、及びそれらの混合物／組み合わせが挙げられる。コレステロールは専門的には脂質ではないが、コレステロールは本発明の一実施形態のプロトセルの脂質二重層の重要な成分であり得るという事実から、本発明の一実施形態のために脂質として提供される。多くの場合、二重層の構造的完全性を増強するために、コレステロールをプロトセルの脂質二重層に含ませる。これらの脂質は全て、Avanti Polar Lipids, Inc.（米国、Alabama、Alabaster）から市販で容易に入手できる。ＤＯＰＥ及びＤＰＰＥは、ペプチド、ポリペプチド（抗体を含む）、ＲＮＡ、及びＤＮＡをアミン基を介して脂質にコンジュゲートする（適当な架橋剤を介して）のに特に有用である。
【００８２】
一部の実施形態では、多孔性ナノ粒子はまた、脂肪族ポリエステル、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、乳酸とグリコール酸とのコポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリウレタン、ポリ酪酸、ポリ吉草酸、ポリラクチド−ｃｏ−カプロラクトン、アルギン酸塩及びその他の多糖、コラーゲン及びその化学誘導体、アルブミン、親水性蛋白質、ゼイン、プロラミン、疎水性蛋白質、コポリマー、並びにそれらの混合物からなる群から選択される１つ以上の組成物を含む生分解性ポリマーナノ粒子であってもよい。
【００８３】
さらに別の実施形態においては、多孔性ナノ粒子はそれぞれ、本質的にシリカを含まないコア表面を有するコアと、コア表面に結合したシェルとを含む。コアは、酸化物、炭化物、硫化物、窒化物、リン化物、ホウ酸化物、ハロゲン化物、セレン化物、テルル化物、酸化タンタル、酸化鉄、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される遷移金属化合物を含む。
【００８４】
本発明で用いられるシリカナノ粒子は、例えばメソ多孔性シリカナノ粒子及びコアシェルナノ粒子とすることができる。このナノ粒子に吸収分子（例えば吸収色素）を組み入れてもよい。適当な条件下において、ナノ粒子は、化学発光から生じる電磁放射線を放射する。更なる造影剤が、ＭＲＩ、ＣＴ、ＰＥＴ、及び／又は超音波イメージングにおけるコントラストを助長するために含まれてもよい。
【００８５】
メソ多孔性シリカナノ粒子は、例えばサイズを約５ｎｍ〜約５００ｎｍ（その間の全ての整数及び範囲が含まれる）にすることができる。このサイズは、粒子の最大軸として測定する。種々の実施形態においては、粒子は、サイズ約１０ｎｍ〜約５００ｎｍ及び約１０ｎｍ〜約１００ｎｍである。メソ多孔性シリカナノ粒子は多孔性構造を有する。細孔は、直径約１〜約２０ｎｍ（その間の全ての整数及び範囲を含む）にすることができる。一実施形態においては、細孔は直径約１〜約１０ｎｍである。一実施形態においては、細孔の約９０％が直径約１〜約２０ｎｍである。別の実施形態においては、細孔の約９５％が直径約１〜約２０ｎｍである。
【００８６】
メソ多孔性ナノ粒子は、当該分野で公知の方法によって合成できる。一実施形態においては、このナノ粒子はゾルゲル法を用いて合成され、１つ又は複数のシリカ前駆体、及び吸収分子にコンジュゲート（即ち共有的に結合）された１つ又は複数のシリカ前駆体を、ミセル形状の鋳型存在下において加水分解する。鋳型は、例えば臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）などの界面活性剤を用いて生成される。ミセルを生成できるいずれの界面活性剤も用いることができると考えられる。
【００８７】
上記のコアシェルナノ粒子は、コア及びシェルからなる。コアは、シリカ及び吸収分子からなる。吸収分子は、吸収分子とシリカネットワークとの間の１つ又は複数の共有結合によってシリカネットワークに組み入れられる。シェルはシリカからなる。
【００８８】
一実施形態においては、コアは公知のゾルゲル化学反応を用いて、例えば１つ又は複数のシリカ前駆体の加水分解によって、独立して合成される。シリカ前駆体は、シリカ前駆体と、吸収分子にコンジュゲートされた（例えば共有結合によって連結された）１つ又は複数のシリカ前駆体（本明細書では「コンジュゲートされたシリカ前駆体」という。）との混合物として存在する。加水分解をアルカリ（塩基性）条件下で行って、シリカコア及び／又はシリカシェルを生成することができる。例えば加水分解は、シリカ前駆体とコンジュゲートされたシリカ前駆体とを含む混合物への水酸化アンモニウムの添加によって行うことができる。
【００８９】
シリカ前駆体は、加水分解条件下でシリカを生成できる化合物である。シリカ前駆体の例としては、限定ではないが、例えばテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）やテトラメトキシシラン（ＴＭＯＳ）などのオルガノシランなどである。
【００９０】
コンジュゲートされたシリカ前駆体を生成するために用いられるシリカ前駆体は、１つ又は複数の吸収分子と反応して１つ又は複数の共有結合を形成可能な、１つ又は複数の官能基を有する。シリカ前駆体の例としては、限定ではないが、イソシアナートプロピルトリエトキシシラン（ＩＣＰＴＳ）、アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＳ）、メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＴＳ）などである。
【００９１】
一実施形態においては、コアを生成するために用いられるオルガノシラン（コンジュゲートされたシリカ前駆体）は、一般式Ｒ4nＳｉＸnを有する。ここでＸは、例えばエトキシ、メトキシ、又は２−メトキシエトキシなどの加水分解可能基である。Ｒは１〜１２炭素原子の一価有機基であり、限定ではないが、例えばメルカプト、エポキシ、アクリリル、メタクリリル、又はアミノなどの有機官能基を任意で含むことができる。ｎは０〜４の整数である。例えばＴＥＯＳやＴＭＯＳなどのシリカ前駆体を用いてコアを形成するために、コンジュゲート可能なシリカ前駆体を吸収分子にコンジュゲートし、続いて共縮合する。シリカシェルを形成するために用いられるシランは、ｎ＝４である。共反応性官能基又はヒドロキシ官能性表面（ガラス表面など）のカップリング及び修飾のために、官能性のモノ、ビス、及びトリスアルコキシシランを用いることも知られている。カーク・オトマー（Kirk-Othmer）著、化学技術事典（Encyclopedia of Chemical Technology）、第２０巻第３版、ジョン・ワイリー社（J. Wiley）、ニューヨーク、及びＥ．プルードマン（Pluedemann）著、シランカップリング剤（Silane Coupling Agents）、プレナム出版社（Plenum Press）、ニューヨーク、１９８２年を参照。オルガノシランはゲルを生じ得るので、アルコール又はその他の公知の安定化剤を用いることが望ましい場合もある。改変したストーバー法を用いてコアシェルナノ粒子を合成するプロセスが、米国特許出願第１０／３０６，６１４号及び第１０／５３６，５６９号明細書に記載されており、それらのプロセスの開示は参照により本明細書に援用される。
【００９２】
「アミン含有シラン」は、これらに限定されないが、ケイ素原子を用いて機能化された第１級アミン、第２級アミン、又は第３級アミンを包含し、モノアミン又はジアミンなどのポリアミンであり得る。好ましくは、アミン含有シランは、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＥＰＴＭＳ）である。アミン含有シランの例は、限定ではないが、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）及び３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＳ）、並びにアミノ官能性トリアルコキシシランも含む。プロトン化された第２級アミン、プロトン化された第３級アルキルアミン、プロトン化されたアミジン、プロトン化されたグアニジン、プロトン化されたピリジン、プロトン化されたピリミジン、プロトン化されたピラジン、プロトン化されたプリン、プロトン化されたイミダゾール、プロトン化されたピロール、第４級アルキルアミン、又はそれらの組み合わせも用いられることができる。
【００９３】
本発明のプロトセルの一部の実施形態においては、脂質二重層は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びコレステロールからなる群から選択される１つ以上の脂質からなる。
【００９４】
一部の実施形態においては、脂質二重層は、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、卵ＰＣ、及び脂質混合物からなる群から選択される１つ以上のホスファチジルコリン（ＰＣ）からなる。脂質混合物は、約５０％〜約７０％、約５１％〜約６９％、約５２％〜約６８％、約５３％〜約６７％、約５４％〜約６６％、約５５％〜約６５％、約５６％〜約６４％、約５７％〜約６３％、約５８％〜約６２％、約５９％〜約６１％、若しくは約６０％の１つ以上の不飽和ホスファチジルコリン、炭素長１４を有し不飽和結合を有さないＤＭＰＣ［１４：０］、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）［１６：０］、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）［１８：０］、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）［１８：１（Δ９−Ｃｉｓ）］、ＰＯＰＣ［１６：０−１８：１］、及びＤＯＴＡＰ［１８：１］を含む。
【００９５】
別の実施形態においては、
（ａ）脂質二重層は、（１）卵ＰＣと（２）１つ以上のホスファチジルコリン（ＰＣ）との混合物からなり、ホスファチジルコリンは、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、及び脂質混合物からなる群から選択され、脂質混合物は、約５０％〜約７０％、約５１％〜約６９％、約５２％〜約６８％、約５３％〜約６７％、約５４％〜約６６％、約５５％〜約６５％、約５６％〜約６４％、約５７％〜約６３％、約５８％〜約６２％、約５９％〜約６１％、又は約６０％の１つ以上の不飽和ホスファチジルコリン、炭素長１４を有し不飽和結合を有さないＤＭＰＣ［１４：０］、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）［１６：０］、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）［１８：０］、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）［１８：１（Δ９−Ｃｉｓ）］、ＰＯＰＣ［１６：０−１８：１］、及びＤＯＴＡＰ［１８：１］を含み、
（ｂ）上記混合物中の卵ＰＣのモル濃度は、約１０％〜約５０％、約１１％〜約４９％、約１２％〜約４８％、約１３％〜約４７％、約１４％〜約４６％、約１５％〜約４５％、約１６％〜約４４％、約１７％〜約４３％、約１８％〜約４２％、約１９％〜約４１％、約２０％〜約４０％、約２１％〜約３９％、約２２％〜約３８％、約２３％〜約３７％、約２４％〜約３６％、約２５％〜約３５％、約２６％〜約３４％、約２７％〜約３３％、約２８％〜約３２％、若しくは約２９％〜約３１％、又は約３０％である。
【００９６】
一部の実施形態においては、脂質二重層は、リン脂質、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルジエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴ脂質、及びエトキシル化ステロール、又はそれらの混合物からなる群から選択される１つ以上の組成物からなる。そのような実施形態の例示の実施例では、リン脂質はレシチンとすることができ、ホスファチジルイノシトールは大豆、アブラナ、綿実、卵、及びそれらの混合物から得ることができ、スフィンゴ脂質はセラミド、セレブロシド、スフィンゴシン、及びスフィンゴミエリン、並びにそれらの混合物とすることができ、エトキシル化ステロールはフィトステロール、ポリエチレングリコール−５−大豆ステロール、及びポリエチレングリコール−５菜種ステロールとすることができる。一部の実施形態においては、フィトステロールは、シトステロール、カンペステロール及びスティグマステロールの組成物のうちの少なくとも２つからなる混合物を含む。
【００９７】
さらに別の例示の実施形態においては、脂質二重層は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルイノシトール、及びリゾホスファチジルイノシトールからなる群から選択される１つ以上のホスファチジル基からなる。
【００９８】
さらに別の例示の実施形態においては、脂質二重層は、モノアシル又はジアシルホスホグリセリドから選択されるリン脂質からなる。
【００９９】
さらに別の例示の実施形態においては、脂質二重層は、ホスファチジルイノシトール−３−リン酸（ＰＩ−３−Ｐ）、ホスファチジルイノシトール−４−リン酸（ＰＩ−４−Ｐ）、ホスファチジルイノシトール−５−リン酸（ＰＩ−５−Ｐ）、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸（ＰＩ−３，４−Ｐ２）、ホスファチジルイノシトール−３，５−二リン酸（ＰＩ−３，５−Ｐ２）、ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸（ＰＩ−４，５−Ｐ２）、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸（ＰＩ−３，４，５−Ｐ３）、リゾホスファチジルイノシトール−３−リン酸（ＬＰＩ−３−Ｐ）、リゾホスファチジルイノシトール−４−リン酸（ＬＰＩ−４−Ｐ）、リゾホスファチジルイノシトール−５−リン酸（ＬＰＩ−５−Ｐ）、リゾホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸（ＬＰＩ−３，４−Ｐ２）、リゾホスファチジルイノシトール−３，５−二リン酸（ＬＰＩ−３，５−Ｐ２）、リゾホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸（ＬＰＩ−４，５−Ｐ２）、リゾホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸（ＬＰＩ−３，４，５−Ｐ３）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、及びリゾホスファチジルイノシトール（ＬＰＩ）からなる群から選択される１つ以上のホスホイノシチドからなる。
【０１００】
さらに別の例示の実施形態においては、脂質二重層は、ポリエチレングリコール誘導体化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ポリエチレングリコール誘導体化セラミド（ＰＥＧ−ＣＥＲ）、水添大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、モノシアロガングリオシド、スフィンゴミエリン（ＳＰＭ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、及びジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）からなる群から選択される１つ以上のリン脂質からなる。
【０１０１】
本発明のナノ担体の１つの例示の実施形態においては、
（ａ）１つ以上の薬理活性剤は少なくとも１つの抗癌剤を含み、
（ｂ）抗癌剤の約１０％〜約２０％未満が、活性酸素種の非存在下で多孔性ナノ粒子から放出され、
（ｃ）活性酸素種との接触の結果としての脂質二重層の破裂によって、多孔性ナノ粒子は、５％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００を用いて脂質二重層を溶解させた場合に放出される抗癌剤量の約６０％〜約８０％、又は約６１％〜約７９％、又は約６２％〜約７８％、又は約６３％〜約７７％、又は約６４％〜約７７％、又は約６５％〜約７６％、又は約６６％〜約７５％、又は約６６％〜約７４％、又は約６８％〜約７３％、又は約６９％〜約７２％、又は約７０％〜約７１％、又は約７０％におおよそ等しい抗癌剤量を放出する。
【０１０２】
本発明のプロトセルの１つの例示の実施形態は、複数の負荷電のナノ多孔性のナノ粒子シリカコアを含み、そのコアは、
（ａ）（１）それぞれがケイ素原子を用いて機能化された第１級アミン、第２級アミン、第３級アミン、（２）モノアミン又はポリアミン、（３）Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＥＰＴＭＳ）、（４）３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）、（５）３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＳ）、（６）アミノ官能性トリアルコキシシラン、並びに（７）プロトン化された第２級アミン、プロトン化された第３級アルキルアミン、プロトン化されたアミジン、プロトン化されたグアニジン、プロトン化されたピリジン、プロトン化されたピリミジン、プロトン化されたピラジン、プロトン化されたプリン、プロトン化されたイミダゾール、プロトン化されたピロール、及び第４級アルキルアミン、又は（１）〜（７）の組み合わせからなる群から選択されるアミン含有シランで修飾され、
（ｂ）ｓｉＲＮＡ又はリシン毒素Ａ鎖が装填され、かつ
（ｃ）脂質二重層によって被包されかつ脂質二重層を担持し、ここで脂質二重層は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホル−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１８：１−ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１８：１−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１６：０−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ）、１−オレオイル−２−［１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１−１２：０−ＮＢＤ−ＰＣ）、１−パルミトイル−２−｛１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル｝−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−１２：０−ＮＢＤ−ＰＣ）、コレステロール、及びそれらの混合物／組み合わせからなる群から選択される１つ以上の脂質を含む。ここで脂質二重層は、カチオン性脂質及び１つ以上の双性リン脂質を含む。
【０１０３】
本発明のプロトセルは、様々な医薬の有効成分を含むことができる。
【０１０４】
用語「レポーター」は、本発明の一実施形態のプロトセルのリン脂質二重層又はカーゴに含まれて測定可能なシグナルを提供する造影剤又は造影成分を記すために用いられる。この成分は蛍光シグナルを提供してもよく、又は特に放射線検出を可能にする放射性同位体であってもよい。プロトセルに用いる例示の蛍光標識（好ましくは脂質二重層又はシリカコアへのコンジュゲート又は吸着によるが、これらの標識はカーゴ成分（プロトセルによって細胞まで送達されるＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、及び小分子など）に含まれてもよい）としては、ヘキスト３３３４２（３５０／４６１）、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、３５６／４５１）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４０５カルボン酸スクシンイミジルエステル（４０１／４２１）、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）バイオレットＢＭＱＣ（４１５／５１６）、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）グリーンＣＭＦＤＡ（４９２／５１７）、カルセイン（４９５／５１５）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８−アネキシンＶコンジュゲート（４９５／５１９）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（４９５／５１９）、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）ＡＨＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８タンパク質合成ＨＣＳアッセイ（４９５／５１９）、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）フィクサブルグリーン死細胞染色キット（４９５／５１９）、ＳＹＴＯＸ（登録商標）グリーン核酸染色（５０４／５２３）、ＭｉｔｏＳＯＸ（商標）レッドミトコンドリア過酸化物指示薬（５１０／５８０）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２カルボン酸スクシンイミジルエステル（５３２／５５４）、ｐＨｒｏｄｏ（商標）スクシンイミジルエステル（５５８／５７６）、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）レッドＣＭＴＰＸ（５７７／６０２）、テキサスレッド（登録商標）１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（テキサスレッド（登録商標）ＤＨＰＥ、５８３／６０８）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７ヒドラジド（６４９／６６６）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７カルボン酸スクシンイミジルエステル（６５０／６６８）、Ｕｌｙｓｉｓ（商標）ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７核酸標識キット（６５０／６７０）、及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７−アネキシンＶコンジュゲート（６５０／６６５）が挙げられる。蛍光シグナルを増強する又は蛍光の退色を遅らせる成分が含まれてもよく、ＳｌｏｗＦａｄｅ（登録商標）ゴールド・アンチフェード試薬（ＤＡＰＩ含有及び非含有）やイメージｉＴ（登録商標）ＦＸシグナル増強剤などである。これらの全ては当分野において周知である。更なるレポーターとしては、プラスミド（例えば、ヒストンでパッケージングされた超らせんＤＮＡプラスミド）によって発現されるポリペプチドレポーターが含まれ、蛍光緑色タンパク質及び蛍光赤色タンパク質のようなポリペプチドレポーターが含まれる。本発明のレポーターは、患者における癌（癌組織）の存在若しくは進行及び／又は患者若しくは対象における治療の進行の診断を含めて、主に診断用途に用いられる。
【０１０５】
用語「ヒストンでパッケージングされた超らせんプラスミドＤＮＡ」は、「超らせん化」された好ましいプラスミドＤＮＡ（即ち、プロトセル中への効率的なパッケージングのためにより高密度になるように、プラスミド自体を折り畳ませて「超らせん化」させる過飽和塩溶液又はその他のイオン性溶液を用いてそれ自体が折り畳まれたもの）を用いる本発明のプロトセルの好ましい成分を記すために用いられる。プラスミドは、いずれかの数のポリペプチドを発現する、又はＲＮＡ（本明細書に別に記載の短鎖ヘアピンＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ又は短鎖干渉ＲＮＡ／ｓｉＲＮＡを含む）をコードする、実質的にいかなるプラスミドであってよい。超らせん化されたら（高濃度塩溶液又はその他のアニオン性溶液を用いて）、超らせんプラスミドＤＮＡを次にヒストンタンパク質と複合体化して、ヒストンでパッケージングされた「複合体化した」超らせんプラスミドＤＮＡを生じさせる。
【０１０６】
「パッケージングされた」ＤＮＡは、本明細書においてはプロトセル中に装填されたＤＮＡ（細孔中に吸着されたもの又はナノ多孔性シリカコア自体の中に直接閉じ込められたもののいずれか）を指す。ＤＮＡを空間的に最小化するために多くの場合はパッケージングされる。これは、周囲の媒体の電荷を調整してＤＮＡと例えば脂質、タンパク質又はその他のナノ粒子（通常は限定ではないがカチオン性）との小型の複合体を作ることで、複数の異なる方法で達成できる。パッケージングされたＤＮＡは、多くの場合にリポプレックス（即ち、ＤＮＡをカチオン性脂質混合物と複合体化すること）によって得られる。更にＤＮＡは、カチオン性タンパク質（ヒストン以外のタンパク質も含む）や金ナノ粒子（例えばナノフレア−ナノ粒子のコアが金である工学的なＤＮＡと金属との複合体）を用いてもパッケージングされる。
【０１０７】
いずれかの数のヒストンタンパク質に加えて、ＤＮＡをより小さい体積にパッケージングするその他の手段（例えば通常はカチオン性のナノ粒子、脂質、又はタンパク質）も超らせんプラスミドＤＮＡ「ヒストンでパッケージングされた超らせんプラスミドＤＮＡ」をパッケージングするために用いられることができる。しかし、ヒト患者を治療することに関する治療的な態様においては、ヒトのヒストンタンパク質の使用が、好ましくは用いられる。本発明の一部の態様では、ヒトのヒストンタンパク質Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４の好ましい比１：２：２：２：２での組み合わせであるが、他のヒストンタンパク質も、当分野で公知のようにその他の類似の比で用いられることができ、又は本発明の教示に従って容易に実施されることができる。ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡに代えて二本鎖直鎖ＤＮＡでもよく、任意で超らせん化、及び／又はヒストン若しくはその他のパッケージング成分でパッケージングされてもよい。
【０１０８】
本発明のこの態様に用いられることができるその他のヒストンタンパク質は、例えばＨ１Ｆ、Ｈ１Ｆ０、Ｈ１ＦＮＴ、Ｈ１ＦＯＯ、Ｈ１ＦＸ、Ｈ１Ｈ１のＨＩＳＴ１Ｈ１Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｄ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｔ；Ｈ２ＡＦ、Ｈ２ＡＦＢ１、Ｈ２ＡＦＢ２、Ｈ２ＡＦＢ３、Ｈ２ＡＦＪ、Ｈ２ＡＦＶ、Ｈ２ＡＦＸ、Ｈ２ＡＦＹ、Ｈ２ＡＦＹ２、Ｈ２ＡＦＺ、Ｈ２Ａ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＡ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＢ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＤ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＥ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＩ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＫ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＬ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＭ、Ｈ２Ａ２、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＡＡ３、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＡＣ、Ｈ２ＢＦ、Ｈ２ＢＦＭ、ＨＳＢＦＳ、ＨＳＢＦＷＴ、Ｈ２Ｂ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＡ、ＨＩＳＴ１ＨＳＢＢ、ＨＩＳＴ１ＨＳＢＣ、ＨＩＳＴ１ＨＳＢＤ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＥ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＦ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＨ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＩ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＪ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＬ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＭ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＯ、Ｈ２Ｂ２、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ、Ｈ３Ａ１、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｄ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｆ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｇ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｈ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｉ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｊ、Ｈ３Ａ２、ＨＩＳＴ２Ｈ３Ｃ、Ｈ３Ａ３、ＨＩＳＴ３Ｈ３、Ｈ４１、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｄ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｆ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｇ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｈ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｉ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｊ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｌ、Ｈ４４、及びＨＩＳＴ４Ｈ４を含む。
【０１０９】
用語「核局在配列」は、ヒストンでパッケージングされた超らせんプラスミドＤＮＡを構成するヒストンタンパク質中に組み込まれた又は架橋されたペプチド配列を指す。一部の実施形態においては、本発明のプロトセルは、ヒストンでパッケージングされたプラスミドが、発現及び最終的には細胞死を促進するために、細胞の核を通過してその内容物をそこに下ろす能力を増強する核局在配列で修飾（架橋）されたプラスミド（多くの場合、ヒストンでパッケージングされた超らせんプラスミドＤＮＡ）を更に含んでもよい（ただし、ヒストンタンパク質が核局在配列と架橋されても、あるいはプラスミド自体が改変されて核局在配列を発現してもよい。これらのペプチド配列は、ヒストンでパッケージングされたプラスミドＤＮＡ及び会合したヒストンを標的細胞核内に運ぶことを助ける。そこにおいて、治療用及び／又は診断用の分子（ポリペプチド及び／又はヌクレオチド）を標的細胞核内に送達するために、プラスミドは望みのペプチド及び／又はヌクレオチドを発現する。当分野で公知であるいずれかの数の架橋剤を用いて、ヒストンでパッケージングされたプラスミドを細胞核内に導入するのに用いられるヒストンタンパク質に、核局在配列を共有結合することができる（多くの場合、ポリペプチドから突出して露出したアミノ酸側鎖中のリジン基で又は求核性若しくは求電子性の基を有するその他の基の位置で）。あるいは、核局在配列を発現するヌクレオチド配列は、ヒストンタンパク質を発現するヌクレオチド配列の近傍のプラスミドに配置されることができ、それによって核局在配列にコンジュゲートされたヒストンタンパク質の発現が起こって、標的細胞の核内へのプラスミドの運搬を促進する。
【０１１０】
タンパク質は、核膜を通って核内に入ることができる。核膜は、複数の同心膜である外膜及び内膜からなる。これらは核への入り口である。この外被は、孔又は巨大な核複合体からなる。ＮＬＳを持つように翻訳されたタンパク質は、インポーチン（別名カリオフェリン）に強く結合して一体となり、この複合体は核膜孔を通って移動する。いずれかの数の核局在配列を用いて、ヒストンでパッケージングされたプラスミドＤＮＡを細胞の核内に導入することができる。好ましい核局在配列には、Ｈ2Ｎ−ＧＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹＧＧＣ−ＣＯＯＨ（配列番号９）、ＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１０）、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１１）、及びＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫ（配列番号１２）（ヌクレオプラスミンのＮＬＳであり、約１０アミノ酸のスペーサーによって隔てられた塩基性アミノ酸の２つのクラスターからなる原型的な両方向性シグナル）が含まれる。多数のその他の核局在配列が当分野では周知である。例えば、LaCasseら, Nuclear localization signals overlap DNA- or RNA-binding domains in nucleic acid-binding proteins, Nucl. Acids Res., 23, 1647-1656 1995；Weis, K. Importins and exportins: how to get in and out of the nucleus（Trends Biochem Sci 1998 Jul;23 (7): 235に訂正記事あり）. TIBS, 23, 185-9 (1998)；Murat Cokol, Raj Nair & Burkhard Rost, "Finding nuclear localization signals", ウェブサイトubic.bioc.columbia.edu/papers/2000 nls/paper.html#tab2参照。
【０１１１】
用語「癌」は、無秩序な増殖、分化の欠如、局部組織浸潤、及び／又は転移をもたらす、正常な制御の喪失という独特の特質を有する腫瘍細胞（新生物）の増殖を記すために用いられる。本明細書で用いる場合、「新生物」は限定することなく、同種の組織における正常な増殖と比べての、対象又は宿主の組織中の細胞の形態上の異常、及び対象の組織中の細胞の病的増殖を含む。更に、新生物は、良性腫瘍、及び浸潤性又は非浸潤性の悪性腫瘍（例えば結腸腫瘍）を含む。悪性新生物は、より高度の異形成、又は細胞の分化及び配向の喪失を示し、更に浸潤及び転移の性質を有する点において、良性新生物と区別される。用語「癌」は文脈によって、多剤耐性癌を含めた薬物耐性癌も含む。本発明の標的細胞が生じる新生物又は異常増殖の例は、限定ではないがとりわけ、癌腫（例えば扁平上皮細胞癌、腺癌、肝細胞癌、及び腎細胞癌）、特に膀胱、骨、腸、乳房、子宮頸管、結腸（大腸）、食道、頭部、腎臓、肝臓（肝細胞）、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、膵臓、前立腺、及び胃の癌腫；白血病、例えば急性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、急性Ｔ細胞リンパ芽球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、好塩基球性白血病、好酸球性白血病、顆粒球性白血病、有毛細胞白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、好中球性白血病、及び肝細胞性白血病；良性及び悪性のリンパ腫、特にバーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及びＢ細胞リンパ腫；良性及び悪性のメラノーマ；骨髄増殖性疾患；肉腫、特にユーイング肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、筋肉腫、末梢性神経上皮腫、及び滑膜肉腫；中枢神経系の腫瘍（例えば、グリオーマ、星状細胞腫、乏突起膠腫、上衣腫、膠芽腫、神経芽細胞腫、神経節神経腫、神経節膠腫、髄芽細胞腫、松果体細胞腫瘍、髄膜腫、髄膜肉腫、神経線維腫、及びシュヴァン鞘腫）；生殖系列腫瘍（例えば、腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸部癌、子宮癌）、肺癌（例えば、小細胞肺癌、混合の小細胞癌及び非小細胞癌、胸膜中皮腫（転移胸膜中皮腫小細胞肺癌を含む）、及び非小細胞肺癌）、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、星状細胞腫、食道癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、結腸癌、及びメラノーマ；混合型の新生物、特に癌肉腫及びホジキン病；並びに混合起源の腫瘍、例えばウィルムス腫瘍や奇形癌腫を含む。留意すべきことに、いくつかの腫瘍（特に肝細胞及び子宮頸部癌を含む）は、特に癌細胞上のＭＥＴ受容体の上昇したレベルを示すことが証明されており、プロトセルと複合体化したＭＥＴ結合ペプチドを含む本発明の実施形態の組成物及び治療法についての主な標的である。
【０１１２】
用語「共投与する」及び「共投与」は、本発明のプロトセル組成物の少なくとも１つを、少なくとも１つのその他の薬剤（多くの場合、本明細書に具体的に開示される少なくとも１つの更なる抗癌剤（本明細書に別に記載））と組み合わせて、有効量と考えられる量又は濃度で、同時又はほぼ同時に投与することを記すために同義的に用いられる。共投与される組成物／薬剤は同時に投与されることが好ましいが、組成物／薬剤の両方（又はそれ以上）の有効濃度が少なくとも短時間に渡って同時に患者体内に見られるようにして、薬剤が複数の時点で投与されてもよい。あるいは、本発明の一部の態様においては、それぞれの共投与された組成物／薬剤が、癌（特に肝細胞癌又は細胞性癌を含む）の抑制及び治療、並びにその他の病態、状態又は合併症の軽減又は抑制する最終的な成果を伴って、その抑制効果を別々の時点において患者体内で示すようにすることが可能であり得る。当然ながら、複数の病態、感染又はその他の状態が存在する場合には、必要に応じて本発明の化合物をその他の薬剤と組み合わせて、そのような他の感染、疾患又は状態を治療してもよい。
【０１１３】
用語「抗癌剤」は、任意でいずれかの種類の癌、とりわけ特に肝細胞又は子宮頸部癌を治療するために、本発明のプロトセルを含む１つ以上の組成物と組み合わせて処方されることができる化合物を記すために用いられる。本発明の化合物と共に処方可能な抗癌化合物は、例えば本発明に用いられ得る例示の抗癌剤を含み、エベロリムス、トラベクテジン、アブラキサン、ＴＬＫ２８６、ＡＶ−２９９、ＤＮ−１０１、パゾパニブ、ＧＳＫ６９０６９３、ＲＴＡ７４４、ＯＮ０９１０．Ｎａ、ＡＺＤ６２４４（ＡＲＲＹ−１４２８８６）、ＡＭＮ−１０７、ＴＫＩ−２５８、ＧＳＫ４６１３６４、ＡＺＤ１１５２、エンザスタウリン、バンデタニブ、ＡＲＱ−１９７、ＭＫ−０４５７、ＭＬＮ８０５４、ＰＨＡ−７３９３５８、Ｒ−７６３、ＡＴ−９２６３、ＦＬＴ−３インヒビター、ＶＥＧＦＲインヒビター、ＥＧＦＲ−ＴＫインヒビター、オーロラキナーゼインヒビター、ＰＩＫ−１修飾剤、Ｂｃｌ−２インヒビター、ＨＤＡＣインヒビター、ｃ−ＭＥＴインヒビター、ＰＡＲＰインヒビター、Ｃｄｋインヒビター、ＥＧＦＲ−ＴＫインヒビター、ＩＧＦＲ−ＴＫインヒビター、抗ＨＧＦ抗体、ＰＩ３キナーゼインヒビター、ＡＫＴインヒビター、ＪＡＫ／ＳＴＡＴインヒビター、チェックポイント−１又は２のインヒビター、接着斑キナーゼインヒビター、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ｍｅｋ）インヒビター、ＶＥＧＦトラップ抗体、ペメトレキセド、エルロチニブ、ダサタニブ（dasatanib）、ニロチニブ、デカタニブ（decatanib）、パニツムマブ、アムルビシン、オレゴボマブ、Ｌｅｐ−ｅｔｕ、ノラトレキシド、ａｚｄ２１７１、バタブリン、オファツムマブ、ザノリムマブ、エドテカリン、テトランドリン、ルビテカン、テスミリフェン、オブリメルセン、チシリムマブ、イピリムマブ、ゴシポール、Ｂｉｏ１１１、１３ｌ−Ｉ−ＴＭ−６０１、ＡＬＴ−１１０、ＢＩＯ１４０、ＣＣ８４９０、シレンギチド、ギマテカン、ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ、ＩＮＯ１００１、ＩＰｄＲ1ＫＲＸ−０４０２、ルカントン、ＬＹ３１７６１５、ノイラジアブ（neuradiab）、ビテスペン、Ｒｔａ７４４、Ｓｄｘ１０２、タランパネル、アトラセンタン、Ｘｒ３１１、ロミデプシン、ＡＤＳ−１００３８０、スニチニブ、５−フルオロウラシル、ボリノスタット、エトポシド、ゲムシタビン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、ビンクリスチン、テモゾロミド、ＺＫ−３０４７０９、セリシクリブ；ＰＤ０３２５９０１、ＡＺＤ−６２４４、カペシタビン、Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−［４−［２−（２−アミノ−４，７−ジヒドロ−４−オキソ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）エチル］ベンゾイル］−二ナトリウム塩（七水和物）、カンプトテシン、ＰＥＧ標識イリノテカン、タモキシフェン、トレミフェンクエン酸塩、アナストラゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ＤＥＳ（ジエチルスチルベストロール）、エストラジオール、エストロゲン、結合型エストロゲン、ベバシズマブ、ＩＭＣ−１Ｃ１１、ＣＨＩＲ−２５８，）；３−［５−（メチルスルホニルピペラジンメチル）−インドリル−キノロン、バタラニブ、ＡＧ−０１３７３６、ＡＶＥ−０００５、［��−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）６，Ａｚｇｌｙ１０］酢酸塩（ピロ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｚｇｌｙ−ＮＨ2酢酸［Ｃ59Ｈ84Ｎ18Ｏｉ4−（Ｃ2Ｈ4Ｏ2）x、ｘ＝１〜２．４］、ゴセレリン酢酸塩、リュープロリド酢酸塩、トリプトレリンパモ酸塩、酢酸メドロキシプロゲステロン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ラロキシフェン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、酢酸メゲストロール、ＣＰ−７２４７１４；ＴＡＫ−１６５、ＨＫＩ−２７２、エルロチニブ、ラパタニブ、カネルチニブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ抗体、アービタックス、ＥＫＢ−５６９、ＰＫＩ−１６６、ＧＷ−５７２０１６、ロナファルニブ、ＢＭＳ−２１４６６２、チピファルニブ；アミホスチン、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ヒドロキサミン酸サブエロイルアニリド、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、ＦＫ−２２８、ＳＵ１１２４８、ソラフェニブ、ＫＲＮ９５１、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナグレリド、Ｌ−アスパラギナーゼ、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、エピルビシン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、グリベック（gleevac）、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トレチノイン、ビンデシン、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸、フェニルアラニンマスタード、ウラシルマスタード、エストラムスチン、アルトレタミン、フロクスウリジン、５−デオキシウリジン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン、デオキシコホルマイシン、カルシトリオール、バルルビシン、ミトラマイシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、トポテカン、ラゾキシン、マリマスタット、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンギオスタチン、ビタキシン、ドロロキシフェン、イドキシフェン、スピロノラクトン、フィナステリド、シメチジン、トラスツズマブ、デニロイキンジフチトクス、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、パクリタキセル、クレモホール非含有パクリタキセル、ドセタキセル、エピチロン（epithilone）Ｂ、ＢＭＳ−２４７５５０、ＢＭＳ−３１０７０５、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ピペンドキシフェン、ＥＲＡ−９２３、アルゾキシフェン、フルベストラント、アコルビフェン、ラソフォキシフェン、イドキシフェン、ＴＳＥ−４２４、ＨＭＲ−３３３９、ＺＫ１８６６１９、トポテカン、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、ＶＸ−７４５、ＰＤ１８４３５２、ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３、ＲＡＤ００ｌ、ＡＢＴ−５７８、ＢＣ−２１０、ＬＹ２９４００２、ＬＹ２９２２２３、ＬＹ２９２６９６、ＬＹ２９３６８４、ＬＹ２９３６４６、ワートマニン、ＺＭ３３６３７２、Ｌ−７７９，４５０、ＰＥＧ−フィルグラスチム、ダルベポエチン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、ゾレンドロネート（zolendronate）、プレドニゾン、セツキシマブ、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、ヒストレリン、ＰＥＧ化インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ａ、ＰＥＧ化インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−２ｂ、アザシチジン、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリドマイド、ゲムツズマブ、ヒドロコルチゾン、インターロイキン−１１、デクスラゾキサン、アレムツズマブ、全トランスレチノイン酸、ケトコナゾール、インターロイキン−２、メガストロール、免疫グロブリン、ナイトロジェンマスタード、メチルプレドニゾロン、イブリツモマブチウキセタン、エンドロゲン、デシタビン、ヘキサメチルメラミン、ベキサロテン、トシツモマブ、三酸化ヒ素、コルチゾン、エチドロン酸、ミトタン、シクロスポリン、ダウノルビシンリポソーム、エルウィニア−アスパラギナーゼ、ストロンチウム８９、カソピタント、ネツピタント、ＮＫ−１受容体アンタゴニスト、パロノセトロン、アプレピタント、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、メトクロプラミド、ロラゼパム、アルプラゾラム、ハロペリドール、ドロペリドール、ドロナビノール、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プロクロルペラジン、グラニセトロン、オンダンセトロン、ドラセロトン、トロピセトロン、ペグフィルグラスチム、エリスロポエチン、エポエチンα、ダルベポエチンα、及びそれらの混合物を含む。
【０１１４】
用語「抗肝細胞癌剤」は、本明細書において肝細胞癌又はその癌の転移の抑制、治療、その可能性の低減に用いることができる抗癌剤を記すために用いられる。本発明で用いられ得る抗癌剤には、例えばネクサバール（ソラフェニブ）、スニチニブ、ベバシズマブ、タルセバ（エルロチニブ）、タイカーブ（ラパチニブ）、及びそれらの混合物が含まれる。更にその他の抗癌剤が、そのような薬剤が癌、特に肝細胞癌の転移を抑制することが見いだされる場合には本発明で用いられてもよい。
【０１１５】
用語「抗ウイルス剤」は、ウイルス（薬物耐性ウイルス株のような変異株も含む）の増殖及び／又は形成を抑制する生物活性剤／薬物を記すために用いられる。好ましい抗ウイルス剤は、抗ＨＩＶ剤、抗ＨＢＶ剤、及び抗ＨＣＶ剤を含む。本発明の一部の態様においては、特に肝細胞癌の治療が治療の目的である場合には、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及び／又はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が多くの場合に肝細胞癌に関する原発性又は続発性の感染又は病態であることを考えると、治療をもたらすために抗Ｃ型肝炎剤又は抗Ｂ型肝炎剤の含有が、その他の従来の抗癌剤と組み合わされることができる。プロトセル中のカーゴ成分として又は一群のプロトセルを含む医薬組成物中の更なる生物活性剤として本発明に用いられる抗ＨＢＶ剤には、ヘプセラ（アデホビルジピボキシル）、ラミブジン、エンテカビル、テルビブジン、テノホビル、エムトリシタビン、クレブジン、バルトリシタビン（valtoricitabine）、アムドキソビル、プラデホビル、ラシビル、ＢＡＭ２０５、ニタゾキサニド、ＵＴ２３１−Ｂ、Ｂａｙ４１−４１０９、ΕＨΤ８９９、ザダキシン（チモシンα−１）、及びそれらの混合物のような薬剤が含まれる。本発明での使用のための抗ＨＣＶ剤には、ボセプレビル、ダクラタスビル、アスナプレビル、ＩＮＸ−１８９、ＦＶ−１００、ＮＭ２８３、ＶＸ−９５０（テラプレビル）、ＳＣＨ５０３０４、ＴＭＣ４３５、ＶＸ−５００、ＢＸ−８１３、ＳＣＨ５０３０３４、Ｒ１６２６、ＩＴＭＮ−１９１（Ｒ７２２７）、Ｒ７１２８、ＰＦ−８６８５５４、ＴＴ０３３、ＣＧＨ−７５９、ＧＩ５００５、ＭＫ−７００９、ＳＩＲＮＡ−０３４、ＭＫ−０６０８、Ａ−８３７０９３、ＧＳ９１９０、ＧＳ９２５６、ＧＳ９４５１、ＧＳ５８８５、ＧＳ６６２０、ＧＳ９６２０、ＧＳ９６６９、ＡＣＨ−１０９５、ＡＣＨ−２９２８、ＧＳＫ６２５４３３、ＴＧ４０４０（ＭＶＡ−ＨＣＶ）、Ａ−８３１、Ｆ３５１、ＮＳ５Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＡＮＡ５９８、Ａ−６８９、ＧＮＩ−１０４、ＩＤＸ１０２、ＡＤＸ１８４、ＡＬＳ−２２００、ＡＬＳ−２１５８、ＢＩ２０１３３５、ＢＩ２０７１２７、ＢＩＴ−２２５、ＢＩＴ−８０２０、ＧＬ５９７２８、ＧＬ６０６６７、ＰＳＩ−９３８、ＰＳＩ−７９７７、ＰＳＩ−７８５１、ＳＣＹ−６３５、リバビリン、ＰＥＧ化インターフェロン、ＰＨＸ１７６６、ＳＰ−３０、及びそれらの混合物のような薬剤が含まれる。
【０１１６】
用語「抗ＨＩＶ剤」は、ＨＩＶウイルス（Ｉ及び／又はＩＩ）若しくはその変異体の増殖及び／又は形成を抑制する化合物を指す。本発明のプロトセルのカーゴとして含まれることができる本発明での使用のための例示の抗ＨＩＶ剤としては、例えば特にヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（ＮＲＴＩ）、その他の非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（即ち本発明の典型でないもの）、プロテアーゼインヒビター、膜融合阻害剤が含まれる。それらの例示の化合物としては、例えば３ＴＣ（ラミブジン）、ＡＺＴ（ジドブジン）、（−）−ＦＴＣ、ｄｄＩ（ジダノシン）、ｄｄＣ（ザルシタビン）、アバカビル（ＡＢＣ）、テノホビル（ＰＭＰＡ）、Ｄ−Ｄ４ＦＣ（リバーセット（Reverset））、Ｄ４Ｔ（スタブジン）、ラシビル、Ｌ−ＦｄｄＣ、Ｌ−ＦＤ４Ｃ、ＮＶＰ（ネビラピン）、ＤＬＶ（デラビルジン）、ＥＦＶ（エファビレンツ）、ＳＱＶＭ（メシル酸サキナビル）、ＲＴＶ（リトナビル）、ＩＤＶ（インジナビル）、ＳＱＶ（サキナビル）、ＮＦＶ（ネルフィナビル）、ＡＰＶ（アンプレナビル）、ＬＰＶ（ロピナビル）、膜融合阻害剤（特にＴ２０など）、フゼオン（fuseon）、及びそれらの混合物が含まれる。
【０１１７】
用語「ターゲティング活性化学種」は、プロトセルが標的細胞の表面に選択的に結合してその内容物を細胞内に下ろすことができるように、標的細胞の表面の成分に結合する、本発明のプロトセルの表面と複合体化又は好ましくは共有結合される化合物又は部分を記すために用いられる。本発明での使用のためのターゲティング活性化学種は、標的細胞に結合する化学種のうち、特に好ましくは本明細書に別に記載のターゲティングペプチド、ポリペプチド（抗体又は抗体断片を含む）、アプタマー、又は炭水化物である。
【０１１８】
用語「ターゲティングペプチド」は、好ましいターゲティング活性化学種であって、特定の配列のペプチドであり、癌細胞における受容体又はその他のポリペプチドに結合して、ターゲティングペプチドが結合するペプチド（受容体又はその他の機能性ポリペプチド）を発現する特定の細胞へ、本発明のプロトセルが標的を定めることを可能にするものを記すために用いられる。本発明において、例示のターゲティングペプチドは、例えば遊離したＳＰ９４ペプチド（Ｈ2Ｎ−ＳＦＳＩＩＬＴＰＩＬＰＬ−ＣＯＯＨ、配列番号６）、架橋剤とのコンジュゲート用にＣ末端システインで修飾されたＳＰ９４ペプチド（Ｈ2Ｎ−ＧＬＦＨＡＩＡＨＦＩＨＧＧＷＨＧＬＩＨＧＷＹＧＧＣ−ＣＯＯＨ（配列番号１３）又は８ｍｅｒのポリアルギニン（Ｈ2Ｎ−ＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＣＯＯＨ、配列番号１４））、改変されたＳＰ９４ペプチド（Ｈ2Ｎ−ＳＦＳＩＩＬＴＰＩＬＰＬＥＥＥＧＧＣ−ＣＯＯＨ、配列番号８）、又は本明細書に別に記載のＭＥＴ結合ペプチドを含む。その他のターゲティングペプチドも当分野で公知である。ターゲティングペプチドは、脂質二重層と複合体化されても、あるいは好ましくは本明細書に別に記載の架橋剤の使用によって脂質二重層と共有結合されてもよい。
【０１１９】
用語「ＭＥＴ結合ペプチド」又は「ＭＥＴ受容体結合ペプチド」は、増強された結合効率で癌細胞表面上のＭＥＴ受容体に結合することが示された５つの７ｍｅｒペプチドについて用いられる。本発明に従って、異なる特異性レベルでＭＥＴ受容体（別名は肝細胞増殖因子受容体であり、ｃ−ＭＥＴ遺伝子により発現される）に結合し、ＭＥＴ受容体シグナル経路を活性化する様々な程度の能力を有する、異なるアミノ酸配列を有する複数の短鎖ペプチドが確認された。７ｍｅｒペプチドは、ファージディスプレイによるバイオパニングを用いて確認された。ＭＥＴ受容体に対し、及びその結果として例えば高レベルのＭＥＴ受容体を発現する癌細胞（例えば肝細胞、卵巣、及び子宮頸部）などの細胞に対し、増強された結合を示す配列の例を下記に示す。バイオパニングのプロセス中に最も頻繁に現れた配列のうちの幾つかの結合性データは、本出願の実施例の項でも示される。これらのペプチドは、細胞特異的治療法用のターゲティングリガンドとして特に有用である。しかし、受容体経路を活性化する能力を有するペプチドは、それ自体又はその他の治療法との組み合わせで、更なる治療有用性を有し得る。ペプチドの多くは、肝細胞癌腫（本来の所期の標的）に結合するだけでなく、広範な種類のその他の癌腫（卵巣及び子宮頸部の癌を含む）にも結合することが見い出された。これらのペプチドは、種々の癌、並びにＭＥＴ及び関連受容体の発現と関連するその他の生理的問題を標的にするための又は治療するための広範囲の適用性を有すると考えられる。
【０１２０】
次の５つの７ｍｅｒペプチド配列は、ＭＥＴ受容体に対して実質的な結合を示し、本発明のプロトセルに使用するターゲティングペプチドとして特に有用である。
ＡＳＶＨＦＰＰ（Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）  配列番号１
ＴＡＴＦＷＦＱ（Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ）  配列番号２
ＴＳＰＶＡＬＬ（Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ）  配列番号３
ＩＰＬＫＶＨＰ（Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ）  配列番号４
ＷＰＲＬＴＮＭ（Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ）  配列番号５
【０１２１】
これらのペプチドのそれぞれは、単独で用いられても、又は上記群のその他のＭＥＴペプチド若しくは本発明のプロトセルを癌細胞（例えば特に肝細胞癌細胞、卵巣癌細胞、及び子宮頸部癌細胞）に結合させる助けとなり得るその他のターゲティングペプチドと組み合わせて用いられてもよい。これらの結合ペプチドは、癌を治療するために又は肝細胞増殖因子の結合を抑制するために、ＭＥＴ結合ペプチドとして医薬化合物中に単独で用いられることもできる。
【０１２２】
用語「融合ペプチド」及び「エンドソーム分解性ペプチド」は、本発明のプロトセルの脂質二重層表面のペプチド（任意で好ましくは架橋された）を記すために同義的に用いられる。融合ペプチドは、エンドソーム本体からの脱出を促進し又は助け、標的細胞へのプロトセルの導入を促進して所期の結果（本明細書に別に記載の治療用及び／又は診断用の）をもたらすために、プロトセル上に含まれる。本発明のプロトセルで用いられる代表的で好ましい融合ペプチドは、当分野で公知のもののうち特にＨ５ＷＹＧペプチド、Ｈ2Ｎ−ＧＬＦＨＡＩＡＨＦＩＨＧＧＷＨＧＬＩＨＧＷＹＧＧＣ−ＣＯＯＨ（配列番号１３）又は８ｍｅｒのポリアルギニン（Ｈ2Ｎ−ＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＣＯＯＨ、配列番号１４）を含む。
【０１２３】
用語「架橋剤」は、本発明の種々の成分を互いに共有結合するのに使用されることができる、２つの異なる官能基を含む種々の長さの二官能性化合物を記すために用いられる。本発明の架橋剤は２つの求電子性基を含んでもよい（ペプチド（オリゴヌクレオチド）上の求核性基と反応するためには、１個の求電子性基と１個の求核性基又は２個の求核性基）。架橋剤は、連結される成分及び必要な相対的屈曲性に依存しての長さが多様であってよい。架橋剤を用いてターゲティングペプチド及び／又は融合ペプチドをリン脂質二重層上に固定したり、超らせんのプラスミドＤＮＡのパッケージングのために核局在配列をヒストンタンパク質に連結したり、場合によってはプロトセルの脂質二重層中の脂質を架橋したりする。本発明に用いられ得る多数の架橋剤があり、多くは市販されているか又は文献で入手できる。本発明での使用のための好ましい架橋剤には、例えば特に１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド（ＢＭＰＨ）、ＮＨＳ−（ＰＥＧ）n−マレイミド、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラコサエチレングリコール］エステル（ＳＭ（ＰＥＧ）24）、及びスクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）が含まれる。
【０１２４】
詳細に上述したように、本発明の多孔性ナノ粒子コアは少なくとも１つの寸法を有する多孔性ナノ粒子を含んでよい。例えば、幅又は直径約３０００ｎｍ以下、約１０００ｎｍ以下、約５００ｎｍ以下、約２００ｎｍ以下である。好ましくはナノ粒子コアは、約５００ｎｍ以下、より好ましくは約８〜１０ｎｍから約２００ｎｍの好ましい直径を有する球形である。複数の実施形態においては、多孔性粒子コアは、円状、長方形、正方形、又はいずれかのその他の形状などの種々の断面形状を有することができる。一部の実施形態においては、多孔性粒子コアは約２ｎｍ〜約３０ｎｍの範囲の平均細孔サイズの細孔を有することができる。ただし、平均細孔サイズや他の特性（例えば多孔性粒子コアの多孔性）は、本発明の教示の種々の実施形態に従って限定されない。
【０１２５】
通常、本発明のプロトセルは生体適合性である。薬物及びその他のカーゴ成分は、多くの場合には粒子コアの細孔の吸着及び／又は毛細管充填によって、最終的なプロトセル（全成分を含む）の最大約５０ｗｔ％まで装填される。本発明の一部の実施形態においては、装填されたカーゴは粒子コア（メソ細孔）の多孔性表面から放出されることができ、その放出プロファイルは、本明細書において概略的に説明されるように、例えば細孔サイズ、多孔性粒子コア表面の化学的性質、システムのｐＨ値、及び／又は多孔性粒子コアと周囲の脂質二重層との相互作用によって決定若しくは調整されることができる。
【０１２６】
本発明においては、プロトセルを調製するのに使用される多孔性ナノ粒子コアは、本明細書に別に記載されるように、親水性又は次第により疎水性になるように調整されることができ、より親水性の表面を提供するために更に処理されることができる。例えば、メソ多孔性のシリカ粒子を水酸化アンモニウム及び過酸化水素で更に処理して、より高い親水性を提供することができる。本発明の好ましい態様においては、脂質二重層を多孔性粒子コア上に融合してプロトセルを形成する。本発明のプロトセルは様々な脂質を様々な重量比で含むことができ、好ましくは１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホル−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１８：１のＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１８：１のＰＥＧ−２０００ＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１６：０のＰＥＧ−２０００ＰＥ）、１−オレオイル−２−［１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１〜１２：０のＮＢＤ−ＰＣ）、１−パルミトイル−２−｛１２−［（７−ニトロ−２−ｌ，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル｝−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０〜１２：０のＮＢＤ−ＰＣ）、コレステロール、及びそれらの混合物／組み合わせなどである。
【０１２７】
本発明のプロトセルを調製するために用いられる脂質二重層は、例えば約１００ｎｍの細孔サイズを有するフィルターを通した水和した脂質フィルムの押し出しによって、当分野で公知の標準的なプロトコール又は本明細書に別に記載のプロトコールを用いて調製されることができる。フィルターを通された脂質二重層フィルムを、次に例えばピペットで混合することによって、多孔性粒子コアと融合することができる。一部の実施形態においては、プロトセルのコロイド安定性を改善するために、過剰量の脂質二重層又は脂質二重層のフィルムを用いてプロトセルを生成することができる。
【０１２８】
一部の診断用の実施形態においては、種々の色素又は蛍光（レポーター）分子がプロトセルのカーゴ（プラスミドＤＮＡとして発現されるもの）に含まれることができ、あるいは診断目的の多孔性粒子コア及び／又は脂質二重層に取り付けられることができる。例えば、多孔性粒子コアはシリカコア又は脂質二重層であってＦＩＴＣ（緑色蛍光）で共有結合的に標識されることができ、一方で脂質二重層又は粒子コアはＦＩＴＣテキサスレッド（赤色蛍光）で共有結合的に標識されることができる。多孔性粒子コア、脂質二重層、及び生成したプロトセルは、例えば診断用途で使用される共焦点蛍光法によって観察できる。更に、プラスミドが例えば診断用途で用いられ得る蛍光緑色タンパク質又は蛍光赤色タンパク質などの１つ以上の蛍光タンパク質を発現できるようにして、本明細書に記載のようにプラスミドＤＮＡを本発明のプロトセル中のカーゴとして用いることができる。
【０１２９】
種々の実施形態においては、適宜、脂質二重層融合物又はリポソーム融合物（即ち多孔性粒子コア上）が粒子コアの細孔（メソ細孔）の種々のカーゴ成分と共に装填及び封入される相助作用の方法でプロトセルを用い、それにより脂質二重層の細胞膜を横断する又は多孔性ナノ粒子の分解による、カーゴ送達に有用な装填済みプロトセルを作る。一部の実施形態においては、単一の脂質（例えばリン脂質）二重層を融合することに加えて、反対の電荷を有する複数の二重層を多孔性粒子コア上に続けて融合してカーゴの装填及び／又は封入並びに最終的なプロトセルの放出特性に影響を与えることができる。
【０１３０】
融合及び相助作用の装填作用が、カーゴの送達のために含まれることができる。例えば、多孔性粒子へのリポソームの融合によって、カーゴを相助作用的に装填、被包、又は封入できる。カーゴは、例えば小分子薬物（例えば特に抗癌薬物及び／又は抗ウイルス薬物（抗ＨＢＶ薬物若しくは抗ＨＣＶ薬物など）を含む）、ペプチド、タンパク質、抗体、ＤＮＡ（特にプラスミドＤＮＡであり、好適なヒストンでパッケージングされた超らせんプラスミドＤＮＡを含む）、ＲＮＡ（例えばｓｈＲＮＡやｓｉＲＮＡ（プロトセル中にカーゴとして含まれるプラスミドＤＮＡによって発現されてもよい）、蛍光色素（プロトセル中に含まれたプラスミドＤＮＡによって発現可能な蛍光色素ペプチドを含む）などである。
【０１３１】
本発明の実施形態においては、カーゴを多孔性粒子コアの細孔（メソ細孔）中に装填して装填済みプロトセルを形成することができる。種々の実施形態においては、リポソームを用いた薬物送達、例えばＰＥＧ化を用いる標的送達用に開発されるいずれかの従来技術を移転して本発明のプロトセルに適用することができる。
【０１３２】
上記のように、静電的性質及び細孔サイズはカーゴの装填に影響を与え得る。例えば多孔性シリカナノ粒子は負電荷を有することができ、細孔サイズは約２ｎｍから約１０ｎｍ以上まで調整され得る。負荷電ナノ粒子は正荷電分子を吸着する生来の傾向を有することができ、正荷電ナノ粒子は負荷電分子を吸着する生来の傾向を有することができる。種々の実施形態においては、表面湿潤性のようなその他の特性（例えば疎水性）もまた、異なる疎水性を有するカーゴの装填に影響し得る。
【０１３３】
種々の実施形態において、カーゴの装填は、脂質組成物を調整することによって相助作用する脂質で補助される装填となり得る。例えば、カーゴ成分が負荷電分子である場合、負荷電シリカ中へのカーゴの装填は脂質で補助された装填によって達成できる。一部の実施形態においては、例えば、融合及び相助作用の装填メカニズムを示すように脂質二重層をシリカ表面に融合する場合、陰性の化学種をカーゴとして負荷電シリカ粒子の細孔中に装填することができる。この方法においては、負荷電のメソ多孔性粒子上への負荷電でない（即ち正荷電又は中性）脂質二重層又はリポソームの融合が、粒子コアに負荷電のカーゴ成分を装填するのに役立つ。装填されるプロトセル中に負荷電のカーゴ成分を濃縮して、溶液中の荷電カーゴ成分と比べて濃度を約１００倍超にすることができる。その他の実施形態においては、メソ多孔性粒子及び脂質二重層の電荷を変えることによって、正荷電カーゴ成分をプロトセル中に容易に装填できる。
【０１３４】
製造されたら、装填済みプロトセルは、投与後の望ましい部位へのカーゴ送達のために細胞内取り込まれることができる。例えば、カーゴが装填されたプロトセルが患者又は対象に投与されて、ターゲティングペプチドを含んだプロトセルが標的細胞に結合して標的細胞、例えば対象若しくは患者の癌細胞によって内在化又は取り込まれることができる。標的細胞内でのカーゴが装填されたプロトセルの内在化によって、カーゴ成分は次に標的細胞内に送達され得る。一部の実施形態ではカーゴは小分子であり、治療のために標的細胞内に直接送達されることができる。他の実施形態においては、負荷電のＤＮＡ又はＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを含む）（好ましくはヒストンでパッケージングされて好ましくは核局在配列で修飾された超らせんプラスミドＤＮＡとして処方されたＤＮＡプラスミドを特に含む）が直接送達されることができ、標的細胞によって内在化される。そのため、ＤＮＡ又はＲＮＡは先ずプロトセルに装填され、次に装填済みプロトセルの内在化によって標的細胞内に至る。
【０１３５】
上記のように、プロトセルに装填されて標的細胞まで送達されるカーゴとしては、小分子又は薬物（特に、抗癌剤又は抗ＨＢＶ剤及び／若しくは抗ＨＣＶ剤）、生物活性高分子（生物活性ポリペプチド（例えばリシン毒素Ａ鎖又はジフテリア毒素Ａ鎖）又はＲＮＡ分子（例えば本明細書に別に記載のｓｈＲＮＡ及び／又はｓｉＲＮＡ））、あるいは治療用又は診断用のペプチド又は治療用ＲＮＡ分子（例えばｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ）を発現可能なヒストンでパッケージングされた超らせんプラスミドＤＮＡが挙げられる。ヒストンでパッケージングされた超らせんプラスミドＤＮＡは、任意で好ましくは、送達されたプラスミドＤＮＡを標的細胞核内に局在させて濃縮できる核局在配列で修飾される。このように装填済みプロトセルは、治療用又は診断用にそのカーゴを標的細胞中に送達っすることができる。
【０１３６】
本発明の種々の実施形態において、プロトセル及び／又は装填済みプロトセルは、プロトセル又はカーゴ成分を標的細胞（例えば癌細胞）まで選択的に送達するための標的送達方法を提供できる。例えば、脂質二重層の表面を、標的細胞に対応したターゲティング活性化学種によって修飾できる。ターゲティング活性化学種は、本明細書に別に記載のターゲティングペプチド、ポリペプチド（抗体若しくは抗体断片を含む）、アプタマー、炭水化物、又は標的細胞に結合するその他の成分であり得る。本発明の好ましい態様においては、ターゲティング活性化学種は、本明細書に別に記載のターゲティングペプチドである。一部の実施形態においては、好ましいペプチドのターゲティング化学種は本明細書に別に記載のＭＥＴ結合ペプチドを含む。
【０１３７】
例えばターゲティング活性化学種（好ましくはターゲティングペプチド）を装填済みプロトセルの表面に提供することによって、プロトセルは本明細書での教示通りに標的細胞に選択的に結合する。一実施形態においては、癌細胞（癌の肝臓細胞を含む）を標的にする本明細書に別に記載される例示のターゲティングペプチドＳＰ９４若しくは類似体又はＭＥＴ結合ペプチドを脂質二重層にコンジュゲートすることによって、多数のカーゴ装填済みプロトセルが、癌（例えば肝臓）細胞の例示のＳＰ９４又はＭＥＴ結合ペプチドによる特異的標的により、この特定の癌細胞によって認識されて内在化されることができる。殆どの場合、プロトセルがターゲティングペプチドと結合されるなら、プロトセルは癌細胞に選択的に結合し、癌性でない細胞に明らかなほどの結合は起こらないと考えられる。
【０１３８】
標的細胞に結合して取り込まれると、装填済みプロトセルは多孔性粒子からカーゴ成分を放出して、放出されたカーゴ成分を標的細胞中に移送することができる。例えば、多孔性粒子コア上のリポソームの融合二重層によってプロトセル中に封入された場合、カーゴ成分は脂質二重層の細孔から放出され、脂質二重層のプロトセル膜を通って移送され、標的細胞内に送達されることができる。本発明の複数の実施形態においては、プロトセル中のカーゴ成分の放出プロファイルは、従来技術で知られているようなリポソームのみを用いる場合と比べてより制御可能であり得る。カーゴの放出は、例えば多孔性コアと脂質二重層との間の相互作用、及び／又はシステムのｐＨ値などのその他のパラメータによって決まり得る。例えば、カーゴの放出は脂質二重層を通してなされ、多孔性シリカの分解によってなされる。一方で、プロトセルからのカーゴの放出はｐＨ依存的であり得る。
【０１３９】
一部の実施形態においては、カーゴのｐＨ値は多くの場合に７未満、好ましくは約４．５〜約６．０であるが、約ｐＨ１４以下であってもよい。より低いｐＨでは、高いｐＨと比較してカーゴ成分の放出を大きく促進する傾向がある。より低いｐＨが有利な傾向にあるのは、殆どの細胞内のエンドソーム区画が低ｐＨ（約５．５）であるためだが、細胞でのカーゴの送達速度はカーゴのｐＨによって左右され得る。カーゴとカーゴがプロトセルから放出されるｐＨとに依存して、カーゴの放出は比較的短期（２〜３時間から１日程度）であるか、又は数日から約２０〜３０日以上の期間であり得る。従って、本発明はプロトセルそのものからの即放性及び／又は徐放性の適用を提供し得る。
【０１４０】
一部の実施形態においては、界面活性剤の含有を提供して速やかに脂質二重層をバーストさせて、プロトセルの脂質二重層及び標的細胞を通ってカーゴ成分を輸送することができる。一部の実施形態においては、プロトセルのリン脂質二重層を界面活性剤（特にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）など）の添加／放出によってバーストさせて、プロトセルから標的細胞中へのカーゴの速やかな放出を促進することができる。界面活性剤以外では、脂質二重層をバーストさせるために他の物質を含むことができる。１つの例としては、光又は熱を使用して熱を発生させ、それによって脂質二重層をバーストさせることができるであろう金又は磁性のナノ粒子が考えられる。さらに、脂質二重層は、例えば増大した活性酸素種の産生に反応した炎症時などの生物物理学的現象の存在下でバーストするように変えられることができる。一部の実施形態においては、脂質二重層のバーストが、続いてプロトセルの粒子コアの細孔からのカーゴ成分の即時的で完全な放出を誘導できる。この方法では、本発明のプロトセルプラットフォームは、当分野のその他の送達システムに比べてますます多用途の送達システムを提供することができる。例えば、ナノ粒子のみを用いる送達システムと比較した場合、本明細書に開示のプロトセルプラットフォームは単純なシステムを提供して、リポソーム又は脂質二重層の低い毒性及び免疫原性と共にそのＰＥＧ化又はコンジュゲートされる能力を利用して、循環時間を延長して標的化を達成することができる。別の例においては、リポソームのみを用いる送達システムと比較して、本発明のプロトセルプラットフォームはより安定したシステムを提供でき、更にメソ多孔性コアを利用して装填及び／又は放出のプロファイルを制御すること、並びに増大したガーゴ容量を提供することができる。
【０１４１】
更に、脂質二重層及びその多孔性粒子コアとの融合を微調整して装填、放出及び標的化のプロファイルを制御することができ、更に融合ペプチド及び関連ペプチドを含むことで、より大きい治療効果及び／又は診断効果のためにプロトセルの送達を促進することができる。更に、プロトセルの脂質二重層は、リガンド提示及び多価の標的化のために流動性の界面を提供し、これによって流動性脂質の界面上におけるリガンド再編成の能力により、比較的低い表面リガンド密度を用いた特異的標的が可能になる。更に、本明細書に開示のプロトセルは標的細胞中に容易に移入するが、多孔性粒子の支持がない空のリポソームは細胞によって内在化されることができない。
【０１４２】
本発明の医薬組成物は、所期の結果（例えば、治療結果及び／又は診断分析（治療法の観察を含む））を達成するために処方される本明細書に別に記載の有効な一群のプロトセルを含み、薬学的に許容される担体、添加剤、又は賦形剤と組み合わせて製剤される。組成物の群の中のプロトセルは、求められる望ましい結果に依存して同一であっても又は異なってもよい。本発明の医薬組成物は、例えば抗癌剤又は抗ウイルス剤（例えば抗ＨＩＶ剤、抗ＨＢＶ剤、又は抗ＨＣＶ剤）などの更なる生物活性剤又は薬物を含んでもよい。
【０１４３】
通常、上記化合物の投与用量及び投与経路は対象の大きさ及び状態によって決まり、標準的な薬務プラクティスに従って決まる。用いられる用量レベルは非常にさまざまであり、当業者によって容易に決定されることができる。通常、ミリグラム〜グラム量の量が用いられる。組成物は対象に対して種々の経路、例えば特に経口的、経皮的、神経周囲、又は非経口的、即ち静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射、髄腔内注射、又は筋肉内注射によって投与されることができ、口腔、直腸、及び経皮の投与が含まれる。本発明の方法の治療が意図される対象には、ヒト、ペット、実験動物などが含まれる。本発明は即放性及び／又は徐放性／制御型放出の組成物を意図し、即放性及び徐放性の処方の両方を含む組成物も含まれる。これは、プロトセルの異なる個体群を医薬組成物に用いる場合又は更なる生物活性剤を本明細書に別に記載のようにプロトセルの１つ以上の個体群と組み合わせて用いる場合に、特に当てはまる。
【０１４４】
本発明の化合物を含有する製剤は、液体、固体、半固体、又は凍結乾燥粉末の形態、例えば溶液、懸濁液、エマルション、徐放性製剤、錠剤、カプセル剤、粉末剤、座薬、クリーム、軟膏、ローション、エアロゾル、パッチ剤などであり、好ましくは正確な用量の簡単な投与に適した単位剤形である。
【０１４５】
本発明の医薬組成物は、通常は従来の医薬用の担体又は賦形剤を含み、更にその他の医薬品、担体、アジュバント、添加剤などを含んでもよい。好ましくは、組成物は、約０．１ｗｔ％〜約８５ｗｔ％、約０．５ｗｔ％〜約７５ｗｔ％が本発明の１つ又は複数の化合物であり、残りは主として適した医薬品賦形剤からなる。
【０１４６】
非経口投与（例えば静脈内、筋肉内又は髄腔内）のための注射用組成物は、通常は化合物を好適な静脈用溶剤（例えば無菌生理食塩水）中に含む。組成物は、水性エマルションでの懸濁液として製剤されてもよい。
【０１４７】
液体製剤は、プロトセルの一群（約０．５ｗｔ％〜約２０ｗｔ％又はそれ以上）及び任意の医薬用アジュバントを担体（例えば水性生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、又はエタノールなど）中に溶解又は分散して溶液又は懸濁液を作ることによって調製できる。経口液体製剤での使用については、組成物は溶液、懸濁液、エマルション、又はシロップとして調製されることができ、液体形態又は水若しくは通常生理食塩水での水和に適した乾燥形態で供給されることができる。
【０１４８】
経口投与のためには、そのような賦形剤としては製薬等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。必要に応じて、組成物は少量の無毒の補助物質、例えば湿潤剤、乳化剤、又は緩衝剤を含んでもよい。
【０１４９】
組成物を経口投与用の固形製剤の形態で用いる場合、製剤は錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などであってよい。錠剤の場合、組成物は通常は添加剤、例えば賦形剤（糖類又はセルロースの調合剤など）、結合剤（澱粉ペースト又はメチルセルロースなど）、充填剤、崩壊剤、及び医療用製剤の製造に通常用いられるその他の添加剤を用いて製剤される。
【０１５０】
このような剤形を調製する方法は、当業者に公知又は明らかである。例えばレミントンの薬学、第１７版、Mack Pub. Co.、1985年参照）。投与される組成物は、選択した化合物を、生体系（本発明による患者又は対象を含む）の治療での使用のための薬学的有効量で含む。
【０１５１】
特定の病態又は感染（特に、癌及び／又はＨＢＶ、ＨＣＶ、若しくはＨＩＶの感染を含む）について必要とする患者又は対象を治療する方法は、治療用プロトセルと、任意で少なくとも１つの更なる生物活性（例えば抗ウイルス）剤とを含む本発明の医薬組成物の有効量を投与することを含む。
【０１５２】
本発明の診断法は、有効量の一群の診断用プロトセル（例えば、ターゲティング化学種（例えば癌細胞に選択的に結合するターゲティングペプチド）と、癌細胞が存在する場合に癌細胞に対するプロトセルの結合を知らせるレポーター成分とを含むプロトセル）を必要とする患者（癌が疑われる患者）に投与することを含む。レポーター成分（部分）が明示する癌細胞に対するプロトセルの結合によって、患者における癌の存在の診断が可能になる。
【０１５３】
本発明の診断法の代替方法は、患者の癌又はその他の病態の治療を観察するために用いられる。この方法は、有効な一群の診断用プロトセル（例えば、ターゲティング化学種（癌細胞又はその他の標的細胞に対して選択的に結合するターゲティングペプチドなど）と、癌細胞が存在する場合に癌細胞に対するプロトセルの結合を知らせるレポーター成分とを含むプロトセル）を治療前に患者若しくは対象に投与し、この患者での標的細胞に対する診断用プロトセルの結合の程度を治療中及び／又は治療後に測定することを含む。この場合、患者における治療開始前と治療中及び／又は治療後の結合の違いが、患者における治療の有効性（例えば患者が治療を完了したか否か、又は病態が抑制されたか若しくは排除されたか否か（癌の緩解を含む））を明白にする。
【０１５４】
以下の実施例は限定でなく、本発明及びその有利な特性の例示であって、開示又は特許請求の範囲に何ら限定を及ぼすものではない。本出願での実施例及び他の箇所において、全ての割合及び百分率は特に断りがない限り重量に基づく。
【実施例１】
【０１５５】
＜リガンドで標的を定めたプロトセル＞
以下の実施例に示すように、多孔性ナノ粒子に担持された脂質二重層（プロトセル）は、ナノ多孔性シリカ粒子へのリポソームの融合によって形成されるものであり、癌の治療法及び診断法の標的送達に関連する種々の課題に対応する新たな種類のナノ担体である。リポソームと同様にプロトセルは生体適合性、生分解性、及び非免疫原性であるが、そのナノ多孔性シリカコアは同様のサイズのリポソーム送達剤と比較して、大幅に増強されたカーゴ収容能力及び長期の二重層安定性を提供する。コアの多孔性及び表面の化学的性質を更に調節して、例えば薬物、核酸、及びタンパク質毒素などの多様な治療薬の被包を促進することができる。カーゴ放出の速度は細孔サイズ及びシリカ縮合の全体的な程度によって制御可能であるので、プロトセルはバースト放出又は制御型放出のプロファイルが必要な用途に有用である。最後に、プロトセルの担持された脂質二重層（ＳＬＢ）は、選択的送達を促進するためにリガンドで修飾されることができ、更に循環時間を延長するためにＰＥＧで修飾されることができる。実施例において、本発明者は、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするプラスミドの特異性の高い送達を達成するための、ペプチドで標的を定められたプロトセルの使用を報告する。これにより、トランスフェクションした細胞の増殖停止やアポトーシスがサイクリンＢ１を抑制することによって誘導される。下記の実施例の項で示すように、本発明者は２種類の界面活性剤による手法を用いて、ヒストンでパッケージングされたプラスミドを格納するのに十分大きい細孔を有する合成シリカナノ粒子を調製した。非イオン性界面活性剤（プルロニック（登録商標）Ｆ−１２７）を膨張剤（１，３，５−トリメチルベンゼン）と併用した際には、大型の細孔の鋳型として働いた。一方で、フッ化炭素系界面活性剤（ＦＣ−４）はシリカコアの成長を促進した。得られた粒子は１００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲の直径を有し、１７．３ｎｍの細孔入口を有する２０ｎｍの細孔の規則的な網状組織を含んでいた。超らせんプラスミドＤＮＡをヒストンでパッケージングし、得られた複合体（直径約１５ｎｍ）を核局在配列（ＮＬＳ）で修飾した後、シリカコアに装填した。ナノ多孔性コアへのリポソームの融合によって、疑似体液に３７℃で暴露した場合にも被包されたＤＮＡの長期保持（＞１ヶ月）が促進された。ファージディスプレイ法を用いて、本発明者は、種々の種類の肝細胞癌腫（ＨＣＣ）によって過剰発現されることが公知である肝細胞増殖因子受容体ｃ−Ｍｅｔに対してナノモル濃度の親和性を有するターゲティングペプチドを確認した。ＤＮＡ−ヒストン−ＮＬＳ複合体が装填され、“２４０コピーのターゲティングペプチドのそれぞれとプロトセル及び被包されたＤＮＡのエンドソーム脱出を促進する融合ペプチドとで修飾されたプロトセルは、分裂中及び非分裂中のＨＣＣの両方をトランスフェクション可能であった。更に、標的化されたプロトセルはＨＣＣのＧＪＭ停止及びアポトーシス（ＬＣ，，＝２５ｎＭ）を有効に誘導したが、癌性でない細胞（肝細胞、内皮細胞、及び免疫細胞（ＰＢＭＣ、Ｂ細胞、及びＴ細胞）を含む）の生存性には影響しなかった。
【０１５６】
＜方法＞
プロトセルのコアを形成するナノ多孔性シリカ粒子を、前述のように1,2（Ashleyら、Nature Materials, 2011, May;10(5):389-97も参照）水溶性シリカ前駆体と両親媒性界面活性剤との均質混合物から、エアロゾルを使用した蒸発誘起自己組織化（ＥＩＳＡ）又は油中水型エマルション滴中での溶媒抽出による自己組織化を用いて調製した1。溶媒の蒸発又は抽出によってエアロゾル又はエマルション滴が界面活性剤中において濃縮されて周期的な規則構造の形成が誘導され、その周りにシリカが集合して縮合する。界面活性剤を熱焼成によって除去し、良好に定められた均一な細孔サイズ及び形態を有する多孔性ナノ粒子を得る。エアロゾルを使用したＥＩＳＡによって生成された粒子（「単峰分布」の粒子）は、平均直径約１２０ｎｍ（サイズ排除に基づく分離後）、１２００ｍ2／ｇを超えるブルナウアー−エメット−テラー（ＢＥＴ）表面積、細孔容積の割合約５０％、及び単峰分布の細孔直径２．５ｎｍを有する。エマルション滴内に生成した粒子（「多峰分布」の粒子）は、平均直径約１５０ｎｍ（サイズ排除に基づく分離後）、ＢＥＴ表面積＞６００ｍ2／ｇ、細孔容積の割合約６５％、及び表面から利用可能であり６〜１２ｎｍの細孔によって相互に連結した大きな（２０〜３０ｎｍ）細孔からなる多峰分布の細孔形態を有する。エアロゾル又はエマルションの処理（それぞれ）に伴う液−気界面張力又は液−液界面張力によって、ごく小さい表面粗さを有する球形にする。更にどちらの種類の粒子も、窒素収着等温線の解析によって明らかにされるように、十分に利用可能な３次元の細孔の網状組織を有する。
【０１５７】
ナノ多孔性シリカコアの大きい細孔容積、表面積、及び近接性によって高いカーゴ収容能力が得られ、多様な種類の治療剤及び診断剤の速やかな装填が可能になる。単峰分布のナノ多孔性コアは、低分子量の化学療法薬について高い収容能力を有する。一方で多峰分布コアは、ｓｉＲＮＡ、タンパク質毒素、及びその他の高分子量カーゴ（例えばプラスミドＤＮＡ）の被包に必要とされる大きくて表面から利用可能な細孔を有する。カーゴ放出速度は、シリカコアが縮合する度合によって正確に制御できる。ナノ多孔性シリカコアの生成に用いるゾル中に種々の量のＡＥＰＴＭＳ（アミン含有シラン）を含ませることによって、実現可能な縮合の程度が低減され、中性ｐＨ、高イオン強度（即ち細胞質ゾル）の条件下でコアのより速やかな分解が促進される。ＡＥＰＴＭＳを含まない粒子は疑似体液中において２週間掛けて溶解するが、３０ｍｏｌ％のＡＥＰＴＭＳを含む粒子は２４時間以内に溶解する。従って、プロトセルは連続放出又はバースト放出のプロファイルが必要な用途に適合されることができる。
【０１５８】
ナノ多孔性シリカ粒子の生成に用いる前駆体ゾル中にＡＥＰＴＭＳを含ませることによって、細胞質ゾル条件下での粒子分解が加速され、単純な拡散で達成されるよりも速やかな被包されたカーゴの放出が促進される。しかし、ＡＥＰＴＭＳ修飾粒子は、弱塩基性の化学療法剤（例えばドキソルビシン）については低下した収容能力も有する。従って収容能力及び細胞内放出の両方を最大化するために、本発明者はζ電位、カーゴ（例えば、化学療法の薬物（ドキソルビシン／ＤＯＸ））の収容能力、シリカの分解速度、及びカーゴ放出速度をＡＥＰＴＭＳ濃度の関数として明らかにした。上述したように、未修飾の単峰分布粒子（ζ＝−１０４．５±５．６）はカーゴの高い収容能力を有するが（ＤＯＸの場合には１０10粒子当たり約１．８ｍＭ）、被包されたカーゴ（薬物）の２０％を２４時間（即ちＨＣＣの典型的な倍加時間）以内に放出するのみである。反対に、３０ｗｔ％のＡＥＰＴＭＳで修飾された単峰分布粒子（ζ＝８８．９±５．５）は、その被包されたカーゴ（薬物）の全てを６時間以内に放出するが、低下した薬物（ＤＯＸ）収容能力を有する（１０10粒子当たり約０．１５ｍＭ）。１５ｗｔ％のＡＥＰＴＭＳ（ζ＝−２１．３±５．１）を含む単峰分布粒子は薬物（ＤＯＸ）の高い収容能力を保持し（１０10粒子当たり約１．１ｍＭ）、疑似体液に暴露されると被包されたカーゴ（薬物）の殆ど全てを２４時間以内に放出する。従って、これらの粒子が、カーゴの送達を含む全ての実験用に選択される。特に留意すべきこととして、単峰分布シリカ粒子のζ電位はＡＥＰＴＭＳ濃度の関数として増大するが、ＡＥＰＴＭＳ修飾粒子の細孔容積の割合（３０ｗｔ％のＡＥＰＴＭＳを含有する粒子では約４５％）は、未修飾の粒子のもの（約５０％）と実質的に異ならない。従って、発明者は、ＡＥＰＴＭＳで修飾された単峰分布粒子の減少したカーゴ収容能力は、減少した細孔容積よりも静電反発力に起因すると考える。カーゴ収容能力及びカーゴ放出の動力学に及ぼす細孔サイズの影響を示すために、多峰分布粒子が対照として含められる。
【０１５９】
＜一般試薬＞
無水エタノール、塩酸（３７％）、オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ、９８％）、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ、≧９８％）、３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピルトリメトキシシラン（ＡＥＰＴＭＳ、工業等級）、２−シアノエチルトリエトキシシラン（ＣＥＴＥＳ、≧９７．０％）、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ、≧９９％）、Ｂｒｉｊ（登録商標）−５６、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、≧９８．５％）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ヘキサデカン（≧９９％）、ドキソルビシン塩酸塩（≧９８％）、５−フルオロウラシル（≧９９％）、ｃｉｓ−ジアンミン白金（ＩＩ）二塩化物（シスプラチン、≧９９．９％）、コリネバクテリウムジフテリア由来のジフテリア毒素、トリポクラジウムインフラタム由来のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ、≧９５％）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ、≧９９％）、ヒト上皮増殖因子、Ｌ−α−ホスファチジルエタノールアミン、チミジン（≧９９％）、ヒポキサンチン（≧９９％）、ウシフィブロネクチン、ウシＩ型コラーゲン、ゼラチン、大豆トリプシンインヒビター（≧９８％）、２−メルカプトエタノール（≧９９．０％）、ＤＬ−ジチオスレイトール（≧９９．５％）、ジメチルスルホキシド（≧９９．９％）、ｐＨ５のクエン酸緩衝液、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ、９９．９９５％））、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ、≧９９．５％）、リン酸水素二アンモニウム（≧９９．９９％）、及びセファロース（登録商標）ＣＬ−４Ｂは、シグマ・アルドリッチ社（ミズーリ州セントルイス）から購入した。ＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０（セチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ジメチコン）は、エボニック・インダストリーズ社（ドイツ、エッセン）から購入した。超高純度のＥＭ等級ホルムアルデヒド（１６％、メタノール非含有）は、ポリサイエンシズ社（ペンシルバニア州ウォリントン）から購入した。Ｈｅｌｌｍａｎｅｘ（登録商標）ＩＩは、ヘルマ社（ドイツ、ミュールハイム）から購入した。
【０１６０】
＜脂質＞
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（１８：１のＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１８：１のＰＥＧ−２０００ＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１６：０のＰＥＧ−２０００ＰＥ）、１−オレオイル−２−［１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：１〜１２：０のＮＢＤ−ＰＣ）、１−パルミトイル−２−｛１２−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ラウロイル｝−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０〜１２：０のＮＢＤ−ＰＣ）、及びコレステロールは、アバンティ・ポーラー・リピッズ社（アラバマ州アラバスター）から購入した。
【０１６１】
＜細胞株及び増殖培地＞
ヒトＨｅｐ３Ｂ（ＨＢ−８０６４）、ヒト肝細胞（ＣＲＬ−１１２３３）、ヒト末梢血単核細胞（ＣＲＬ−９８５５）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＣＲＬ−２８７３）、Ｔリンパ球（ＣＲＬ−８２９３）、Ｂリンパ球（ＣＣＬ−１５６）、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、及び１×トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．２５％トリプシン、０．５３ｍＭのＥＤＴＡ）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；バージニア州マナサス）から購入した。ＢＥＧＭ−Ｂｕｌｌｅｔキットは、ロンザグループ社から購入した（クロネティクス；メリーランド州ウォーカーズビル）。フェノールレッド未添加のＤＭＥＭは、シグマ・アルドリッチ社（ミズーリ州セントルイス）から購入した。
【０１６２】
＜蛍光染色試薬及び顕微鏡試薬＞
ヘキスト３３３４２（３５０／４６１）、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、３５６／４５１）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４０５カルボン酸スクシンイミジルエステル（４０１／４２１）、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）バイオレットＢＭＱＣ（４１５／５１６）、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）グリーンＣＭＦＤＡ（４９２／５１７）、カルセイン（４９５／５１５）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８−アネキシンＶコンジュゲート（４９５／５１９）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（４９５／５１９）、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）ＡＨＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８タンパク質合成ＨＣＳアッセイ（４９５／５１９）、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）フィクサブルグリーン死細胞染色キット（４９５／５１９）、ＳＹＴＯＸ（登録商標）グリーン核酸染色（５０４／５２３）、ＭｉｔｏＳＯＸ（商標）レッドミトコンドリア過酸化物指示薬（５１０／５８０）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２カルボン酸スクシンイミジルエステル（５３２／５５４）、ヨウ化プロピジウム（５３５／６１７）、ｐＨｒｏｄｏ（商標）スクシンイミジルエステル（５５８／５７６）、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）レッドＣＭＴＰＸ（５７７／６０２）、テキサスレッド（登録商標）１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（テキサスレッド（登録商標）ＤＨＰＥ、５８３／６０８）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７ヒドラジド（６４９／６６６）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７カルボン酸−スクシンイミジルエステル（６５０／６６８）、Ｕｌｙｓｉｓ（商標）ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７核酸標識キット（６５０／６７０）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７−アネキシンＶコンジュゲート（６５０／６６５）、ＳｌｏｗＦａｄｅ（登録商標）ゴールド・アンチフェード試薬（ＤＡＰＩ含有及び非含有）、イメージｉＴ（登録商標）ＦＸシグナル増強剤、１×ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）、ウシアルブミン画分Ｖ溶液（ＢＳＡ、７．５％）、及びトランスフェリンは、インビトロジェンライフサイエンシズ社（カリフォリニア州カールスバッド）から購入した。赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ、５５７／５８５）、ＣａｓｐＧＬＯＷ（商標）フルオレセイン活性カスパーゼ−３染色キット（４８５／５３５）、及びＣａｓｐＧＬＯＷ（商標）レッド活性カスパーゼ−８染色キット（５４０／５７０）は、バイオビジョン社（カリフォルニア州マウンテンビュー）から購入した。水溶性ＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドットＣＺＷＤ６４０（６４０／６６０）は、ＮＮ−Ｌａｂｓ社（アーカンサス州ファイエットビル）から購入した。
【０１６３】
＜架橋剤＞
１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド（ＢＭＰＨ）、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラコサエチレングリコール］エステル（ＳＭ（ＰＥＧ）24）、スクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）、及びスルフヒドリル付加キットは、ピアース・プロテインリサーチプロダクツ社（サーモフィッシャーサイエンティフィックＬＳＲ社、イリノイ州ロックフォード）から購入した。
【０１６４】
＜その他のシリカナノ粒子＞
５ｎｍ未満の硅素ナノ粒子は、メロリウムテクノロジーズ社（ニューヨーク州ロチェスター）から購入した。１０〜２０ｎｍの酸化硅素ナノ粒子は、スカイスプリングナノマテリアルズ社（テキサス州ヒューストン）から購入した。３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、及び１０μｍのシリカ粒子は、ディスカバリーサイエンティフィック社（ブリティッシュ・コロンビア州バンクーバー）から購入した。
【０１６５】
＜合成ｓｉＲＮＡ及び合成ペプチド＞
サイレンサーセレクトｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−２、及びＰＤＧＦＲ−ａについてのｓｉＲＮＡのＩＤは、それぞれｓ５６５、ｓ７８２４、及びｓ１０２３４）は、アンビオン社（テキサス州オースティン）から購入した。５’アミノ修飾剤Ｃ１２を備えた二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（５’−ＡＡＡＣＡＴＧＴＧＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣ−３’）は、インテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ社（ＩＤＴ、アイオワ州コーラルビル）から購入した。「遊離した」ＳＰ９４ペプチド（Ｈ2Ｎ−ＳＦＳＩＩＬＴＰＩＬＰＬ−ＣＯＯＨ、配列番号６）、コンジュゲート用にＣ末端Ｃｙｓで修飾されたＳＰ９４ペプチド（Ｈ2Ｎ−ＳＦＳＩＩＬＴＰＩＬＰＬＧＧＣ−ＣＯＯＨ、配列番号７）、及び図２ｄの動員実験に用いたＳＰ９４ペプチド（Ｈ2Ｎ−ＳＦＳＩＩＬＴＰＩＬＰＬＥＥＥＧＧＣ−ＣＯＯＨ、配列番号８）は、ニューイングランドペプチド社（マサチューセッツ州ガードナー）が合成した。Ｈ５ＷＹＧペプチド（Ｈ2Ｎ−ＧＬＦＨＡＩＡＨＦＩＨＧＧＷＨＧＬＩＨＧＷＹＧＧＧＣ−ＣＯＯＨ）及び核局在配列（Ｈ2Ｎ−ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹＧＧＣ−ＣＯＯＨ）は、バイオペプチド社（カリフォルニア州サンディエゴ）が合成した。ペプチドの下線部分は、元々の配列である。追加のアミノ酸残基は、コンジュゲート又は標識の目的で付加された。全ての抗体（ＣＨＡＬＶ−１、抗Ｒａｂ１１ａ、抗ＬＡＭＰ−１、抗ＥＧＦＲ、抗ＶＥＧＦＲ−２、抗ＰＤＧＦＲ−α）は、アブカム社（マサチューセッツ州ケンブリッジ）から購入した。
【０１６６】
＜細胞培養条件＞
Ｈｅｐ３Ｂ、肝細胞、ＰＢＭＣ、Ｔリンパ球、及びＢリンパ球はＡＴＣＣから入手し、製品説明書に従って培養した。簡潔に言えば、Ｈｅｐ３Ｂは１０％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ中に維持された。肝細胞は、ＢＳＡ、フィブロネクチン、及びウシＩ型コラーゲンでコーティングされたフラスコ中で培養した。用いた培地は、５ｎｇ／ｍＬ上皮増殖因子、７０ｎｇ／ｍＬホスファチジルエタノールアミン、及び１０％ＦＢＳを備えたＢＥＧＭ（ゲンタマイシン、アンホテリシン、及びエピネフリンは、ＢＥＧＭ−Ｂｕｌｌｅｔキットから除かれた）であった。ＨＵＶＥＣは、２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養された。ゼラチンでコーティングしたフラスコを用いて接着を促進した。ＰＢＭＣ、Ｔリンパ球、及びＢリンパ球は、浮遊培養用フラスコ（グライナーバイオワン社、ノースカロライナ州モンロー）中で維持された。ＰＢＭＣは、０．０２ｍＭチミジン、０．１ｍＭヒポキサンチン、０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノール、及び１０％ＦＢＳが追加されたＩＭＤＭ中で培養された。Ｔリンパ球及びＢリンパ球はそれぞれ、２０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ中及び２０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中で培養された。全ての細胞は、湿気のある環境（５％ＣＯ2を補充した空気）において３７℃で維持された。接着細胞は０．０５％トリプシンを用いて継代比率１：３で継代され、一方で非接着細胞は２×１０5細胞／ｍＬの密度で播種され、１〜５×１０6細胞／ｍＬで維持された。
【０１６７】
［ナノ多孔性シリカ粒子の合成及び特徴］
＜単峰分布シリカナノ粒子の合成＞
単峰分布の多孔性を有するナノ多孔性シリカ粒子の調製に用いるエアロゾルを使用した蒸発誘起自己組織化法は、Luら2によって記載されている。簡潔に言えば、シリカ前駆体（ＴＥＯＳ）、構造指向性の界面活性剤（ＣＴＡＢ、最初は臨界ミセル濃度よりもかなり低い濃度、又はＣＭＣ）、及びＨＣｌを含有する、水−エタノール溶液に溶解された均質ゾルを、改良型市販アトマイザー（９３０２Ａ型、ＴＳＩ社、ミネソタ州セントポール）を用いてエアロゾル化した。窒素をキャリアガスとして用い、全ての加熱ゾーンを４００℃に維持して溶媒を蒸発させ、有効界面活性剤濃度を増大させた。ピンホールにおける圧力降下は２０ｐｓｉであった。粒子を８０℃に維持したデュラポアメンブレンフィルター（ミリポア社、マサチューセッツ州ビレリカ）上に集めた。代表的な反応混合物は、５５．９ｍＬの脱イオン水、４３ｍＬの２００プルーフエタノール、１．１０ｍＬの１．０規定ＨＣ１、４．０ｇのＣＴＡＢ、及び１０．３２ｇのＴＥＯＳを含んだ。細胞内（中性ｐＨ、比較的高塩濃度）条件下でより速やかに溶解するナノ多孔性シリカ粒子を調製するために、様々な量のＴＥＯＳ及びアミン含有シランＡＥＰＴＭＳを前駆体ゾル中に含ませ、系のｐＨを濃塩酸を用いて２．０に調節した。例えば、１５ｗｔ％のＡＥＰＴＭＳを有する粒子を調製するために、９．３６ｇのＴＥＯＳ及び１．３３ｇのＡＥＰＴＭＳを用いた。
【０１６８】
＜多峰分布シリカナノ粒子の合成＞
多峰分布の多孔性を有するナノ多孔性シリカ粒子を合成するのに用いたエマルションの処理はCarrollら1によって記載されている。簡潔に言えば、１．８２ｇのＣＴＡＢ（水相に可溶）を２０ｇの脱イオン水に加え、溶解するまで４０℃で撹拌し、２５℃まで冷ました。このＣＴＡＢ溶液に０．５７ｇの１．０規定塩酸、５．２ｇのＴＥＯＳ、及び０．２２ｇのＮａＣｌを加え、得られたゾルを１時間撹拌した。３ｗｔ％のＡｂｉｌ−ＥＭ９０（油相中に可溶な非イオン性乳化剤）を含むヘキサデカンからなる油相を調製した。前駆体ゾルを１０００ｍＬの丸底フラスコ中で油相と結合し（ゾル：油の体積比１：３）、２分間激しく撹拌して油中水型エマルションの形成を促進し、ロータリーエバポレーター（Ｒ−２０５、ビュッヒラボラトリーエクイップメント社、スイス）に取り付け、８０℃の水浴中に３０分間置いた。この混合物を次に１２０ｍｂａｒの減圧下で沸騰（３５ｒｐｍ、３時間）させて溶媒を除去した。粒子を３０００ｒｐｍで２０分間遠心し（Ｃｅｎｔｒａ−ＭＰ４Ｒ型、インターナショナル・エクイップメント・カンパニー社、テネシー州チャタヌーガ）、上清を傾瀉した。最後に粒子を５００℃で５時間焼成して界面活性剤及び他の余分な有機物質を除去した。Carrollらによって記載されるように、溶媒除去によって水相にＣＴＡＢ（＞ＣＭＣ）が濃縮され、得られたミセルはシリカ粒子の縮合（水相中での）の際に６〜１２ｎｍの細孔の鋳型となる。更に、水−油界面への２つの界面活性剤（ＣＴＡＢ及びＡｂｉｌ−ＥＭ９０）の吸着によって相助作用で界面張力が減少し、表面から利用可能な大きな細孔の鋳型となる２０〜３０ｎｍのミクロエマルション滴の自発的形成がもたらされる。
【０１６９】
＜シリカナノ粒子の特徴＞
ナノ多孔性シリカ粒子の動的光散乱法は、ゼータサイザーナノ（マルバーン社、英国ウスターシャー州）を用いて行われた。サンプルを、４８μＬのシリカ粒子（２５ｍｇ／ｍＬ）を２．４ｍｌの１×Ｄ−ＰＢＳ中で希釈することによって調製した。溶液を解析のために１ｍＬポリスチレンキュベット（ザルスタット社、ドイツ、ニュームブレヒト）に移した。窒素収着は、ＡＳＡＰ−２０２０比表面積・細孔分布測定装置（マイクロメトリックス・インスツルメント社、ジョージア州ノークロス）を用いて行われた。ζ電位測定は、ゼータサイザーナノ（マルバーン社、英国ウスターシャー州）を用いて行われた。代表的な実験においては、シリカ粒子、リポソーム、又はプロトセルを疑似体液（ｐＨ７．４）又はクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に１：５０で希釈した。これらは何れも１５０ｍＭのＮａＣｌを含むように調節され、解析のために１ｍＬ折り畳みキャピラリーセル（マルバーン社、英国ウスターシャー州）に移された。ＤＬＳ及び窒素収着のデータについては添付の図１、シリカナノ粒子、リポソーム、及びプロトセルのζ電位の値については、添付の図１２を参照。
【０１７０】
［プロトセルの合成、装填、及び表面機能化］
＜ナノ多孔性シリカ粒子へのリポソームの融合＞
プロトセルを合成するのに用いる手順はLiuらによって記載されており25〜27、簡単にのみ言及される。脂質をアバンティ・ポーラー・リピッズ社に注文し、クロロホルム中に予め溶解して−２０℃に保存した。プロトセル合成の直前に、２．５ｍｇの脂質を窒素流のもとで乾燥し、真空オーブン（１４５０Ｍ型、ＶＷＲインターナショナル社、ペンシルバニア州ウエストチェスター）中に一晩置いて残留溶媒を除去した。脂質を０．５×Ｄ−ＰＢＳ中において濃度２．５ｍｇ／ｍＬで再水和し、Ｍｉｎｉ−エクストルーダーセット（アバンティ・ポーラー・リピッズ社、アラバマ州アラバスター市）を用いて１００ｎｍフィルターを少なくとも１０回通した。ＤＰＰＣ及びＤＳＰＣをそれぞれの転移温度（４１℃及び５５℃）まで予熱した０．５×Ｄ−ＰＢＳ中に溶解し、押し出しプロセス中は６０℃に維持した。得られたリポソーム（直径約１２０ｎｍ）を４℃で最大１週間保存した。ナノ多孔性シリカコアを０．５×Ｄ−ＰＢＳ中に溶解し（２５ｍｇ／ｍＬ）、過剰量のリポソーム（脂質：シリカの体積比１：２〜１：４）に室温で３０〜９０分暴露した。プロトセルを過剰な脂質の存在下において４℃で最大３ヶ月間保存した。過剰な脂質を除去するために、プロトセルを１０，０００ｒｐｍで５分間遠心し、２回洗浄し、０．５×Ｄ−ＰＢＳ中に再懸濁した。
【０１７１】
＜担持された脂質二重層の組成物の最適化＞
対照細胞に対する非特異的結合及び毒性を最少にするために、ＳＬＢの組成を最適化した。用いた種々の脂質の構造については添付の図４参照。表面への結合、内在化、及び送達の実験の全てにおいて用いたプロトセルは、５ｗｔ％ＤＯＰＥ（又はＤＰＰＥ）、３０ｗｔ％コレステロール、及び５ｗｔ％の１８：１（又は１６：０）のＰＥＧ−２０００ＰＥを含むＤＯＰＣ（又はＤＰＰＣ）からなるＳＬＢを有した。必要に応じて、蛍光脂質（１８：１〜１２：０のＮＢＤ−ＰＣ、１６：０〜１２：０のＮＢＤ−ＰＣ、又はテキサスレッド（登録商標）ＤＨＰＥ）をＳＬＢ中に１〜５ｗｔ％含ませた。脂質は、再水和及び押し出しの前にまとめて凍結乾燥した。例えば７５μＬのＤＯＰＣ（２５ｍｇ／ｍＬ）、５μＬのＤＯＰＥ（２５ｍｇ／ｍＬ）、１０μＬのコレステロール（７５ｍｇ／ｍＬ）、５μＬの１８：１のＰＥＧ−２０００ＰＥ（２５ｍｇ／ｍＬ）、及び５μＬの１８：１〜１２：０のＮＢＤ−ＰＣ（５ｍｇ／ｍＬ）を組み合わせて乾燥し、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、５ｗｔ％のＰＥＧ−２０００、及び１ｗｔ％のＮＢＤ−ＰＣを含むＤＯＰＣからなるリポソームを生成した。
【０１７２】
＜様々な種類のターゲティングリガンドでの担持された脂質二重層の修飾＞
ＨＣＣに対するプロトセルの特異親和性を、様々な種類のターゲティングリガンドを様々な密度でＳＬＢにコンジュゲートすることによって最適化した。ＳＰ９４及びＨ５ＷＹＧペプチド（Ｃ末端システイン残基を持つように合成した）を、スルフヒドリル部分及びアミン部分に反応性であって長さを変えて特異親和性を最適化できるＰＥＧスペーサーアームを有するヘテロ二官能性架橋剤のＮＨＳ−（ＰＥＧ）n−マレイミドを介して、ＰＥの頭部基中に存在する１級アミンにコンジュゲートした。殆どの実験においてＳＭ（ＰＥＧ）24を用いた（スペーサーアーム＝９．５２ｎｍ）。トランスフェリン、抗ＥＧＦＲ、及びＣＨＡＬＶ−１中に存在するアミン部分を、スルフヒドリル付加キットを用いて遊離したスルフヒドリルに変換した（製品説明書に従った）。機能化されたトランスフェリン及び抗体を、ＳＭ（ＰＥＧ）24を用いてＳＬＢ中のＰＥにコンジュゲートした。リガンド密度を反応化学量論及び培養時間の両方によって調節した。例えば、プロトセルを１０倍モル過剰のＳＰ９４と共に室温で２時間培養し、ペプチド密度０．０１５ｗｔ％（約６ペプチド／プロトセル）を得た。一方、プロトセルを５０００倍モル過剰のＳＰ９４と共に４℃で一晩培養し、ペプチド密度５．００ｗｔ％（約２０４８ペプチド／プロトセル）を得た。平均リガンド密度は、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＰ９４及びＨ５ＷＹＧペプチド）又はレムリ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（トランスフェリン、抗ＥＧＦＲ、及びＣＨＡＬＶ−１）によって測定された28。簡潔に言えば、ＬＣ−ＳＰＤＰ（スペーサーアーム＝１．５７ｎｍ）は、１級アミン部分及びスルフヒドリル部分と反応し、還元によって切断可能なヘテロ二官能性架橋剤であり、これを用いてプロトセルを種々のリガンド密度で修飾した。プロトセルを１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）に３０分間暴露し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した。得られた上清は遊離したリガンドを含み、その濃度をＩｍａｇｅＪ画像処理・解析ソフトウェア（アメリカ国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ）を用いて各サンプルのバンド濃度と標準曲線とを比較することによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した。２０％ゲル（６％ビスアクリルアミド及び６Ｍ尿素を含む）を用いてＳＰ９４及びＨ５ＷＹＧのペプチド密度を解析した。１０％ゲルを用いて抗体（抗ＥＧＦＲ及びＣＨＡＬＶ−１）密度を解析し、１５％ゲルを用いてトランスフェリン密度を解析した。
【０１７３】
＜蛍光標識されたナノ多孔性コアの調製＞
１００μＬの粒子（２５ｍｇ／ｍＬ）を０．５×Ｄ−ＰＢＳ中の９００μＬの２０％ＡＰＴＥＳに添加して、ナノ多孔性コアを蛍光標識した。粒子をＡＰＴＥＳ中において室温で一晩培養し、遠心（１０，０００ｒｐｍ、５分）して未反応のＡＰＴＥＳを除去し、１ｍＬの０．５×Ｄ−ＰＢＳ中に再懸濁した。アミン反応性フルオロフォア（例えばＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７カルボン酸スクシンイミジルエステル、１ｍｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯ中）を添加した（粒子の１ｍＬ当たり色素５μＬ）。粒子を室温に２時間保った後、遠心して未反応の色素を除去した。蛍光標識された粒子を４℃で０．５×Ｄ−ＰＢＳ中に保存した。
【０１７４】
＜単峰分布コア及びリポソームへの化学療法剤の装填＞
リポソームの融合前に、１５ｗｔ％のＡＥＰＴＭＳ（２５ｍｇ／ｍＬ）を含むように修飾した単峰分布ナノ多孔性コアを、ドキソルビシン（５ｍＭ）中、又はドキソルビシン、シスプラチン及び５−フルオロウラシル（各薬物５ｍＭ）の混合物中に室温で１時間浸漬した。過剰な薬物を粒子の遠心（１０，０００ｒｐｍ、５分間）によって除去した。以前に記載されたリン酸アンモニウム勾配に基づく方法を用いて29、１２０ｎｍリポソームにＤＯＸが装填された。簡潔に言えば、脂質膜を３００ｍＭの（ΝΗ4）ΗΡＯ4で再水和し、リポソーム溶液を１００ｎｍ薄膜に少なくとも１０回通した。リポソームを透析（フロート−Ａ−Ｌｙｚｅｒ−Ｇ２透析ユニット、３．５〜５ｋＤａＭＷＣＯ、スペクトラムラボラトリーズ社、カリフォルニア州ランチョドミンゲス）によって等張緩衝溶液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で平衡化し、ドキソルビシンＨＣｌ（薬物：脂質のモル比１：３）と共に４℃で一晩培養した。過剰のＤＯＸをサイズ排除クロマトグラフィー（０．７ｃｍ×１０ｃｍセファロース（登録商標）ＣＬ−４Ｂカラム）によって除去した。以前に記載されたように30、31、リポソームに５−ＦＵ又はシスプラチンが装填された。
【０１７５】
＜多峰分布コアへの多成分混合物、ｓｉＲＮＡ、及びジフテリア毒素Ａ鎖の装填＞
２０ｗｔ％のＡＥＰＴＭＳ（２５ｍｇ／ｍＬ）を含むように修飾した多峰分布ナノ多孔性コアを、カルセイン（５ｍＭ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチド（１００μΜ）、ＲＦＰ（１００μΜ）、及びＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドット（１０μΜ）の溶液中に４時間浸漬した。ハイパースペクトル画像のための最善の蛍光強度を得るために、各カーゴの濃度を変化させた。８５０μＬの１×Ｄ−ＰＢＳ中にカルセイン及びＮＬＳをそれぞれ１ｍｇ溶解することによって、カルセインをＮＬＳ（Ｃ末端システイン残基を含むように合成した）で修飾した。１００μＬのＥＤＣ（１０ｍｇ／ｍＬ、脱イオン水中）及び５０μＬのＢＭＰＨ（１０ｍｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯ中）を添加し、混合物を室温で２時間培養した。過剰のカルセインを透析（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒミニ透析ユニット、２ｋＤａＭＷＣＯ、サーモフィッシャーサイエンティフィックＬＳＲ社、イリノイ州ロックフォード）によって除去した。ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをＵｌｙｓｉｓ（商標）ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７核酸標識キットを用いて標識し（製品説明書に従った）、更に５０μＬのｄｓＤＮＡ（２ｍＭ、脱イオン水中）を５０μＬのＮＬＳ（１ｍＭ、ＤＭＳＯ中）及び１０μＬのＳＭＣＣ（１０ｍｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯ中）と結合することによってＮＬＳで修飾した。混合物を室温で２時間培養し、過剰なＮＬＳを透析（スライド−Ａ−Ｌｙｚｅｒミニ透析ユニット、７ｋＤａ−ＭＷＣＯ、サーモフィッシャーサイエンティフィックＬＳＲ社、イリノイ州ロックフォード）によって除去した。添付の図１３〜１６に記載の送達実験のために、２０ｗｔ％のＡＥＰＴＭＳ（２５ｍｇ／ｍＬ）で修飾した多峰分布のナノ多孔性コアを、ｓｉＲＮＡ（１００μΜ）又はジフテリア毒素Ａ鎖（１００μΜ）中に４℃で２時間浸漬した。被包されていないカーゴを遠心（１０，０００ｒｐｍ、５分間）によって除去し、カーゴ装填済みのコアにリポソームを直ちに融合した。
【０１７６】
＜ヒストンタンパク質によるＣＢ１プラスミドのパッケージング＞
ＣＢ１プラスミド（ｐＣＢ１）の超らせん化に用いたプロセスを図４に示す。概念図には、高度に飽和した塩溶液を用いてＣＢ１プラスミド（ｐＣＢ１）（ＣＢ１プラスミドベクターは以下及び添付の図１２に示される）を超らせん化し、超らせんｐＣＢ１をヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４でパッケージングし、得られたｐＣＢ１−ヒストン複合体をヒストンタンパク質へのコンジュゲートによって核膜孔を通る移行を促進する核局在配列（ＮＬＳ）で修飾するために用いられるプロセスを示す。図４（Ｂ）及び（Ｄ）は、ＣＢ１プラスミド（Ｂ）及びヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（Ｄ）の原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）画像である。スケールバー＝１００ｎｍ。（Ｃ）及び（Ｅ）は、それぞれ（Ｂ）及び（Ｄ）での赤線に対応する高さプロファイルである。
【０１７７】
＜ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１が装填された、ＭＣ４０によって標的を定められたメソ多孔性のシリカナノ粒子に担持された脂質二重層（プロトセル）の合成＞
図５に示すように、図５（Ａ）はＤＮＡを装填し、ペプチドで標的を定められたプロトセルを生成するために用いられるプロセスを示す概念図である。この方法に従って、プロトセルのコアを形成するメソ多孔性のシリカナノ粒子をｐＣＢ１−ヒストン複合体の溶液中に単純に浸漬することによって、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１をシリカナノ粒子に装填する。次にＰＥＧ化リポソームをＤＮＡが装填されたコアと融合し、ＨＣＣに結合するターゲティングペプチド（ＭＣ４０）と、内在化したプロトセルのエンドソーム脱出を促進するエンドソーム分解性ペプチド（Ｈ５ＷＹＧ）とで更に修飾された、担持された脂質二重層（ＳＬＢ）を形成する。スルフヒドリル−アミン架橋剤（スペーサーアーム＝９．５ｎｍ）を用いて、Ｃ末端システイン残基で修飾したペプチドをＳＬＢ中のＤＯＰＥ成分にコンジュゲートした。図５（Ｂ）は、プロトセルのコアとして用いられるメソ多孔性のシリカナノ粒子の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像である。スケールバー＝２００ｎｍ。挿入画像＝走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）画像であって、１５〜２５ｎｍの細孔が表面から利用可能であることを示す。挿入画像のスケールバー＝５０ｎｍ。５（Ｃ）は、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定されたメソ多孔性のシリカナノ粒子についてのサイズ分布を示す。（５Ｄ、左軸）バレット−ジョイナー−ハレンダ（ＢＪＨ）モデルを用いて図Ｓ−４Ａに示す窒素収着等温線の吸着枝から計算された、メソ多孔性のシリカナノ粒子の累積細孔容積の線図である。（５Ｄ、右軸）ＤＬＳにより測定された、ｐＣＢ１−ヒストン複合体のサイズ分布である。
【０１７８】
＜メソ多孔性のシリカナノ粒子はヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１について高い収容能力を有し、得られたプロトセルはエンドソーム環境を模倣する条件下でのみ被包されたＤＮＡを放出する＞
図６（Ａ）は、未修飾のメソ多孔性のシリカナノ粒子（ζ＝−３８．５ｍＶ）又はアミン含有シランのＡＰＴＥＳで修飾されたメソ多孔性のシリカナノ粒子（ζ＝＋１１．５ｍＶ）の中に被包可能なｐＣＢ１又はヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（「複合体」）の濃度を示す。図６（Ｂ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル（１×１０9個）と共に１×１０6細胞／ｍＬを３７℃で２４時間培養した場合に、ＺｓＧｒｅｅｎ（ｐＣＢ１によりコードされる緑色蛍光タンパク質）に対して陽性となるＨｅｐ３Ｂの割合を示す。ｘ軸は、プロトセルのコアがＡＰＴＥＳで修飾されたか否か及びｐＣＢ１がヒストンで予めパッケージングされたか否かを示す。（Ａ）及び（Ｂ）では、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの混合物（１：１ｗ／ｗ）でパッケージングされたｐＣＢ１を対照として含む。図６（Ｃ）及び（Ｄ）は、疑似体液（Ｃ）又はｐＨ５緩衝液（Ｄ）に暴露した際の、未修飾のメソ多孔性のシリカナノ粒子及び対応するプロトセルからの、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１の時間に依存した放出を示す。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００を含むＤＯＰＣからなり、（Ｂ）については、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【０１７９】
＜ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルがヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１をＨＣＣまで送達するプロセス＞
添付の図７に示される概念図に表されるように、［１］種々のＨＣＣ株により過剰発現されるＭｅｔへのターゲティングペプチドの動員によって、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞に高親和性で結合する。流動性のＤＯＰＣのＳＬＢはペプチドの流動性を促進し、それにより低いＭＣ４０密度で修飾されたプロトセルがＨｅｐ３Ｂに対して高い特異親和性を保持することを可能にする（図８Ａ参照）。［２］ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルは、受容体依存性エンドサイトーシスを介してＨｅｐ３Ｂによって内在化される（図８Ｂ及び図１５Ａ参照）。［３］エンドソーム条件はＳＬＢを不安定化し（Nature Materialsの参考文献を挿入）、エンドソーム分解性ペプチドＨ５ＷＹＧのプロトン化を引き起こす。これらは何れも、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１がＨｅｐ３Ｂ細胞の細胞質ゾル中に拡散することを可能にする（図１６Ｂ参照）。［４］ｐＣＢ１−ヒストン複合体は、核局在配列（ＮＬＳ）で修飾された場合に、約２４時間以内にＨｅｐ３Ｂ細胞の核内に濃縮される（図１６Ｃ参照）。これによって、分裂中及び非分裂中の癌細胞の両方での効率的なトランスフェクションが可能になる（図１７参照）。
【０１８０】
＜ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルはＨＣＣに高親和性で結合し、Ｈｅｐ３Ｂによって内在化されるが正常肝細胞によっては内在化されない＞
図８（Ａ）は、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルをＨｅｐ３Ｂ又は肝細胞に暴露した場合の見かけの解離定数（Ｋd）を示す。Ｋd値は、特異親和性に対して逆の関係にあり、飽和結合曲線から求められた（図Ｓ−１１参照）。エラーバーは、ｎ＝５の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。図８（Ｂ）及び（Ｃ）は、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセル（１０００倍の過剰量）に３７℃で１時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ（Ｂ）及び肝細胞（Ｃ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。ＭｅｔはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識モノクローナル抗体で染色され（緑色）、プロトセルコアはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４で標識され（赤色）、細胞核はヘキスト３３３４２で染色された（青色）。スケールバー＝２０μｍ。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％（Ａ〜Ｃ）又は０．５００ｗｔ％（Ａ）のＭＣ４０ターゲティングペプチドで修飾された。
【０１８１】
＜ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルは、ピコモル濃度でＨＣＣのアポトーシスを誘導するが、正常肝細胞の生存性に関してはごく小さい影響しか有さない＞
図９（Ａ）及び（Ｂ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルに３７℃でＨｅｐ３Ｂを連続して暴露した際の、サイクリンＢ１のｍＲＮＡ及びサイクリンＢ１タンパク質の発現における用量（Ａ）及び時間（Ｂ）に依存した減少を示す。（Ａ）では、細胞を種々のｐＣＢ１濃度に４８時間暴露し、（Ｂ）では、５ｐＭのｐＣＢ１に種々の時間に渡って暴露した。肝細胞でのサイクリンＢ１タンパク質の発現及びＨｅｐ３ＢでのＺｓＧｒｅｅｎの発現が、対照として含まれる。リアルタイムＰＣＲ及び免疫蛍光法を用いて、サイクリンＢ１のｍＲＮＡ及びタンパク質それぞれの濃度を測定した。図９（Ｃ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル（［ｐＣＢ１］＝５ｐＭ）に３７℃で種々の時間に渡って連続して暴露した後の、Ｇ2／Ｍ期に停止したＨｅｐ３Ｂの割合を示す。Ｇ2／Ｍ期の肝細胞の割合及びＳ期のＨｅｐ３Ｂの割合を比較のために含む。細胞は、細胞周期分析の前にヘキスト３３３４２で染色された。図９（Ｄ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル（［ｐＣＢ１］＝５ｐＭ）に３７℃で種々の時間に渡って連続して暴露した際に、アポトーシス性になるＨｅｐ３Ｂの割合を示す。アポトーシスのマーカーに陽性である肝細胞の割合を対照として含む。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識アネキシンＶに陽性である細胞は、アポトーシスの初期にあると見なし、アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムの両方に陽性である細胞は、アポトーシスの後期にあると見なした。アポトーシス性細胞の総数は、一方及び両方に陽性である細胞の数を加算して求められた。全ての実験において、プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【０１８２】
＜ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルが、対応するリポプレックスよりも２５００倍有効にＨＣＣの選択的なアポトーシスを誘導する＞
図１０（Ａ）は、ＤＯＰＣプロトセル、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）で修飾されたＤＯＰＣプロトセル、ｐＣＢ１とＤＯＴＡＰ及びＤＯＰＥの混合物（１：１ｗ／ｗ）とからなるリポプレックス、並びに１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００で修飾されたＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポプレックスのζ電位の値を示す。全てのζ電位測定は、０．５×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で行われた。図１０（Ｂ、左軸）は、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセル又はリポプレックスによって送達された５ｐＭのｐＣＢ１に３７℃で４８時間連続して暴露した際に、アポトーシス性になるＨｅｐ３Ｂ及び肝細胞の割合を示す。図１０（Ｂ、右軸）は、１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ細胞の９０％において３７℃で４８時間以内にアポトーシスを誘導するのに必要な、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル又はリポプレックスの数を示す。（Ｂ）については、細胞は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムで染色された。一方及び両方に陽性である細胞をアポトーシス性と見なした。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（表示される場合）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポプレックスは、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（表示される場合）、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０、及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。ｐＣＢ１は、全ての実験においてＮＬＳで修飾された。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【０１８３】
＜ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルが、肝細胞の生存性には影響を与えることなく、高濃度のタキソール、Ｂｃｌ−２特異ｓｉＲＮＡ、及びｐＣＢ１をＨＣＣに選択的に送達する＞
図１１（Ａ）は、１０12個のプロトセル、リポソーム、又はリポプレックスの中に被包可能な、タキソール、Ｂｃｌ−２の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、及びＣＢ１プラスミドの濃度を示す。図１１Ａの赤色のバーは、タキソール及びｐＣＢ１の両方がプロトセルに装填された場合に、タキソール及びｐＣＢ１の濃度がどのように変わるかを示す。青色のバーは、タキソール、ｓｉＲＮＡ、及びｐＣＢ１のすべてがプロトセルに装填された場合又はｓｉＲＮＡ及びｐＣＢ１がリポプレックスに装填された場合に、タキソール、ｓｉＲＮＡ、及びｐＣＢ１の濃度がどのように変わるかを示す。図１１（Ｂ）は、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルによってＨｅｐ３Ｂまで送達された場合の、オレゴングリーン（登録商標）４８８標識タキソール（緑色）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識ｓｉＲＮＡ（赤色）、及びＣｙ５標識ｐＤＮＡ（白色）の細胞内分布を示す共焦点蛍光顕微鏡法画像を提供する。細胞をＭＣ４０で標的を定められたプロトセルの１０００倍の過剰量と共に３７℃で２４時間培養した後に固定して、ヘキスト３３３４２で染色した（青色）。スケールバー＝１０μｍ。図１１（Ｃ）は、１０ｎＭのタキソール及び／又は５ｐＭのｐＣＢ１に３７℃で４８時間暴露した際に、Ｇ2／Ｍ期に停止したＨｅｐ３Ｂ、ＳＮＵ−３９８、及び肝細胞細胞の割合を示す。割合は、Ｇ2／Ｍでの対数増殖細胞の割合に対して正規化された。図１１（Ｄ）は、１０ｎＭのタキソール、２５０ｐＭのＢｃｌ−２特異ｓｉＲＮＡ、及び／又は５ｐＭのｐＣＢ１に３７℃で４８時間暴露した際に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）について陽性になるＨｅｐ３Ｂ、ＳＮＵ−３９８、及び肝細胞の細胞の割合を示す。
（Ｃ）及び（Ｄ）において、「ｐＣＢ１」は、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの混合物（１：１ｗ／ｗ）を用いてパッケージングされて細胞まで非特異的に送達されたｐＣＢ１を指す。全ての実験において、プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。リポソームは、５ｗｔ％のＤＭＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１６：０）を含むＤＳＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。リポプレックスは、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ（１：１ｗ／ｗ）混合物からなり、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０、及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。（Ｃ）及び（Ｄ）において、「ｐＣＢ１」は、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの混合物（１：１ｗ／ｗ）を用いてパッケージングされて細胞まで非特異的に送達されたｐＣＢ１を指す。全ての実験において、プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。リポソームは、５ｗｔ％のＤＭＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１６：０）を含むＤＳＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。リポプレックスは、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ（１：１ｗ／ｗ）混合物からなり、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０、及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。ｐＣＢ１は、全ての実験においてＮＬＳで修飾された。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【０１８４】
＜ＣＢ１プラスミドのベクターマップ＞
ＣＢ１プラスミド（ｐＣＢ１）は、ＲＮＡｉ−Ｒｅａｄｙ  ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ−ＺｓＧｒｅｅｎベクター（クロンテック・ラボラトリーズ社、カリフォルニア州マウンテンビュー）及びｐＮＥＢ１９３ベクター（ニュー・イングランド・バイオラボ社、マサチューセッツ州イプスウィッチ）から構築された。ｐＣＢ１は、サイクリンＢ１特異的短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）（Yuanら、Oncogene (2006) 25, 1753-1762）及びスナギンチャク種の緑色蛍光タンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎ）をコードする。構成的ｓｈＲＮＡ発現は、ＲＮＡＰｏｌＩＩＩ依存性ヒトＵ６プロモーター（ＰU6）によって駆動され、構成的ＺｓＧｒｅｅｎ発現は、サイトメガロウイルスの最初期プロモーター（ＰCMV IE）によって駆動される。ｏｒｉエレメント及びＡｍｐRエレメントは、大腸菌内におけるプラスミドの増殖を可能にする。サイクリンＢ１特異的ｓｈＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列に下線を付す。ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをｐＳＩＲＥＮベクターに導入するために用いた制限酵素部位（ＢａｍＨＩは赤色、ＥｃｏＲＩは青色）が横にある。
【０１８５】
＜ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１の特徴＞
図１３（Ａ）は、漸増濃度のヒストン（モル比１：２：２：２：２のＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４）に暴露されたｐＣＢ１に関する電気泳動移動度シフトアッセイを示す。ｐＣＢ１：ヒストンのモル比をレーン３〜６に示す。レーン１はＤＮＡラダーを含み、レーン２はｐＣＢ１を含み添加ヒストンを含まない。図１３（Ｂ）は、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（ｐＣＢ１：ヒストンのモル比１：５０）のＴＥＭ画像である。スケールバー＝５０ｎｍ。
【０１８６】
＜未装填のメソ多孔性のシリカナノ粒子及びｐＣＢ１が装填されたメソ多孔性のシリカナノ粒子の窒素収着分析＞
図１４（Ａ）は、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１の装填前後での、メソ多孔性のシリカナノ粒子の窒素収着等温線である。図１４（Ｂ）は、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１の装填前後での、メソ多孔性のシリカナノ粒子のブルナウアー−エメット−テラー（ＢＥＴ）表面積を示す。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【０１８７】
＜ＤＯＰＣプロトセルの小角中性子散乱（ＳＡＮＳ）データ＞
図１５は、ＤＯＰＣプロトセルのＳＡＮＳデータを示す。フィッティングデータデータは、一定厚さの共形シェルを有する多分散な多孔性シリカ球のモデルを用いて得られたものであり、シリカ粒子の表面に細孔開口部を覆う３６Åの二重層が存在することを示す。厚さ０、２０、６０Åの二重層についてシミュレーションされたＳＡＮＳデータを比較のために含む。測定された二重層の厚さ３６Åは、平坦な担持された脂質二重層について行われた他の中性子研究（３３〜３８Å）（Ferrari, M. Cancer nanotechnology: Opportunities and challenges. Nature Reviews Cancer 5, 161-171 (2005)参照）と一致しており、これらの対照条件下では、脂質二重層の水素に富む炭化水素コアからの散乱を主に示す。実験データは、２９９．２Åの細孔の存在も示しており、２πを０．０３１５Å-1（即ち、細孔からの散乱により生じる実験データでのピークのｑ値）で割ることによって求められた。ＳＡＮＳデータは、１００％Ｄ2Ｏ／ＰＢＳ緩衝液中の５％（ｖ／ｖ）のプロトセル懸濁液を用いて、ＬＡＮＳＣＥ（ロスアラモス国立研究所）でＬＱＤビームラインで得られた。データは、ＮＣＮＲのＳＡＮＳデータ解析パッケージ（ＮＩＳＴ）を用いて適合された。
【０１８８】
＜プロトセルは被包されたＤＮＡをヌクレアーゼ分解から守る＞
図１６に、ＤＮａｓｅＩ処理したｐＣＢ１（レーン３）、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（レーン５）、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの１：１（ｗ／ｗ）混合物でパッケージングされたｐＣＢ１（レーン７）、カチオン性コアを有するプロトセルに装填されたｐＣＢ１（レーン９）、及びアニオン性コアを有するプロトセルに装填されたヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（レーン１１）のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。裸のｐＣＢ１（レーン２）、ヒストンから放出されたｐＣＢ１（レーン４）、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポプレックスから放出されたｐＣＢ１（レーン６）、カチオン性コアを有するプロトセルから放出されたｐＣＢ１（レーン８）、及びアニオン性コアを有するプロトセルから放出されたヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（レーン１０）を比較のために含む。レーン１はＤＮＡラダーを含む。試料をＤＮａｓｅ１（５０ｎｇのＤＮＡ当たり１ユニット）と共に室温で３０分培養し、ｐＣＢ１放出は１％ＳＤＳを用いて促進された。
【０１８９】
図１７は、メソ多孔性のシリカナノ粒子（「未修飾のコア」）、２０％（ｖ／ｖ）のＡＰＴＥＳ中に室温で１２時間浸漬したメソ多孔性のシリカナノ粒子（「ＡＰＴＥＳ修飾コア」）、ＣＢ１プラスミド（「ｐＣＢ１」）、ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１（「ｐＣＢ１−ヒストン複合体」）、及びＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの１：１（ｗ／ｗ）混合物でパッケージングされたｐＣＢ１（「ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポプレックス」）のζ電位（ζ）の値を示す。ζ電位測定は、０．５×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で行われた。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【０１９０】
＜図６及びＳ−１６（Ａ）〜（Ｄ）においてＺｓＧｒｅｅｎ発現陽性の細胞の割合を求めるのに用いられた、代表的な前方散乱−側方散乱（ＦＳＣ−ＳＳＣ）プロット図及びＦＬ−１ヒストグラム＞
図１８は、ＺｓＧｒｅｅｎ陰性細胞についてのＦＳＣ−ＳＳＣプロット図（Ａ及びＣ）及び対応するＦＬ−１ヒストグラム（それぞれＢ及びＤ）であり、（Ａ）は細胞残屑を除外するためにゲーティングし、（Ｃ）はしていない。ＦＬ−１チャンネルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の値を、（Ｂ）及び（Ｄ）に示す。（Ｅ）〜（Ｈ）は、ＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞についてのＦＳＣ−ＳＳＣプロット図（Ｅ及びＧ）及び対応するＦＬ−１ヒストグラム（それぞれＦ及びＨ）であり、（Ｅ）は細胞残屑を除外するためにゲーティングし、（Ｇ）はしていない。（Ｆ）及び（Ｈ）のゲートは、ＭＦＩ≦２８２、即ちＺｓＧｒｅｅｎ陰性細胞のＭＦＩの１００倍（Ｄ図参照）の細胞の割合に対応する。
【０１９１】
＜ＭＣ４０ターゲティングペプチドの確認＞
図１９は、ＭＣ４０ターゲティングペプチドをＰｈ．Ｄ．（商標）−７ファージディスプレイライブラリ（ニュー・イングランド・バイオラボ社、マサチューセッツ州イプスウィッチ）から選択するのに用いたプロセスを示す概念図である。１×１０11ｐｆｕ／ｍＬのペプチドを、ヒトＩｇＧのＦｃドメインに融合された１００ｎＭの組み換えヒトＭｅｔ（ｒｈＭｅｔ）と共に室温で１時間培養した。プロテインＡ又はプロテインＧでコーティングした磁性粒子を用いてＭｅｔ−ファージ複合体を親和性捕捉し、続いてＴＢＳ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で１０回洗浄して未結合のファージを除去した。結合したファージクローンは低ｐＨ緩衝液（０．２Ｍグリシン、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、ｐＨ２．２）で溶出し、溶出物を宿主細菌（大腸菌ＥＲ２７３８）の感染によって増幅した。概念図に従って、次第に厳くなる条件を用いて５ラウンドの親和性選択を行った。Ｍｅｔ濃度を１００ｎＭから５０ｎＭに、そして１０ｎＭに減らし、培養時間を１時間から３０分に、そして１５分に縮め、洗浄緩衝液に添加したＴｗｅｅｎ−２０の濃度を０％（ｖ／ｖ）から０．１％に、そして０．５％に増やした。プロテインＡ及びプロテインＧに特異的なペプチドは、プロテインＡでコーティングした磁性粒子とプロテインＧでコーティングした磁性粒子との間で選択ラウンドを交互に行うことによって回避された。５回の選択ラウンドの後にＤＮＡを４０個の別個のクローンから回収し、Ｐｈ．Ｄ．（商標）−７キットに添付の９６ｇＩＩＩプライマーを用いて配列を決定した。ＭＥＴ受容体に対して最大の結合活性を有する配列は次の通り表される。
ＡＳＶＨＦＰＰ（Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）  配列番号１
ＴＡＴＦＷＦＱ（Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ）  配列番号２
ＴＳＰＶＡＬＬ（Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ）  配列番号３
ＩＰＬＫＶＨＰ（Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ）  配列番号４
ＷＰＲＬＴＮＭ（Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ）  配列番号５
【０１９２】
＜ＭＣ４０ターゲティングペプチドの特徴＞
図２０（Ａ）は、５回の選択ラウンド後のペプチド配列アラインメントを示す。主配列ＡＳＶＨＦＰＰは以前に確認されていたＭｅｔ特異的な１２ｍｅｒのＹＬＦＳＶＨＷＰＰＬＫＡ（配列番号１５）の下線部分に相似である。標的に無関係のＨＡＩＹＰＲＨペプチド（約１０％）（配列番号１６）を提示するファージクローンは、配列アラインメントから除かれた。図２０（Ｂ）及び（Ｃ）は、親和性選択したファージクローンがｒｈＭｅｔに結合した度合を示し、酵素結合免疫吸着剤法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。（Ｂ）に示すＥＬＩＳＡのスキームは、材料及び方法の項で説明する。ＥＬＩＳＡの結果を（Ｃ）に示す。図２０（Ｄ）は、Ｍｅｔに結合しないペプチドを除去した後の配列アラインメントを示す。図２０に示す共通配列はこのアラインメントから決定された。図２０（Ｅ）及び（Ｆ）は、（１）Ｍｅｔに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識モノクローナル抗体と、無関係なファージクローン（ＴＰＤＷＬＦＰ）（配列番号１７）と、Ｍ１３ファージに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６標識モノクローナル抗体とに暴露された（青色のドット）、又は（２）Ｍｅｔに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識モノクローナル抗体と、ＭＣ４０クローンと、Ｍ１３ファージに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６標識モノクローナル抗体とに暴露された（橙色のドット）、Ｈｅｐ３Ｂ（Ｅ）及び肝細胞（Ｆ）についてのフローサイトメトリーの散布図である。未処理細胞（赤色のドット）を用いて、ＦＬ−１（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８蛍光）及びＦＬ−２（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６蛍光）のチャンネルについての電圧パラメータを設定した。
【０１９３】
＜Ｈｅｐ３Ｂに暴露されたＭＣ４０で標的を定められたプロトセルについての例示の結合曲線＞
図８Ａの解離定数を求めるために、１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ又は肝細胞をサイトカラシンＤで前処理してエンドサイトーシスを抑制し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識されＭＣ４０で標的を定められた種々の濃度のプロトセルと共に３７℃で１時間培養した。フローサイトメトリーを用いて得られた細胞群の平均蛍光強度を測定し、プロトセル濃度に対してプロットして全体の結合曲線を得た。非特異的結合は、飽和濃度の非分類の肝細胞増殖因子の存在下において、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識されＭＣ４０で標的を定められたプロトセルと共に細胞を培養することによって求められた。特異的結合曲線は、非特異的結合曲線を全体の結合曲線から引くことによって得られた。Ｋd値は、特異的結合曲線から計算された。図２１に示す実験において、プロトセルのＳＬＢは５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％（約６ペプチド／粒子）のＭＣ４０ターゲティングペプチドで修飾された。対応するＫd値は１０５０±１４２ｐＭである。全てのエラーバーは、ｎ＝５の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【０１９４】
＜ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルが受容体依存性エンドサイトーシスによって内在化され、Ｈ５ＷＹＧペプチドの非存在下でリソソームへ誘導される＞
図２２（Ａ）は、Ｈｅｐ３Ｂ又は肝細胞の細胞のそれぞれによって１時間以内に３７℃で内在化された、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルの平均数を示す。１×１０6個の細胞を飽和濃度（１００μｇ／ｍＬ）のヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の非存在下（−）又は存在下（＋）において種々の濃度のプロトセルと共に培養し、Ashleyら、Nature Materials, 2011, May;10(5):389-97によって記載されるように、フローサイトメトリーを用いて各細胞に結合した粒子の平均数を求めた。プロトセルをＮＢＤ及びｐＨｒｏｄｏ（商標）で標識して、表面に結合した粒子を酸性細胞内区画に内在化されたものから区別した（それぞれについて）。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。（Ｂ）は、プロトセルと、（１）Ｒａｂ５、（２）Ｒａｂ７、（３）リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ−１）又は（４）Ｒａｂ１１ａとの間のピアソンの相関係数（ｒ値）を示す。Ｈｅｐ３Ｂ細胞を１０００倍の過剰量のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識プロトセルと共に３７℃で１時間培養した後、固定して透過処理し、Ｒａｂ５、Ｒａｂ７、ＬＡＭＰ−１、又はＲａｂ１１ａに対してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識抗体と共に培養した。ＳｌｉｄｅＢｏｏｋソフトウェアを用いてｒ値を求めた。ｒ値は、ｎ＝３×５０細胞の平均値±標準偏差として表される。ｒ値計算の際に細胞境界の外のピクセルを無視できるように、微分干渉（ＤＩＣ）画像を用いてＨｅｐ３Ｂ細胞の境界線を定めた。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。
【０１９５】
＜ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１がＮＬＳで修飾され、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルによって送達された場合に、ＨＣＣ細胞の核内で時間に依存して濃縮される＞
図２３（Ａ）〜（Ｃ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填された１０００倍の過剰量のプロトセルに３７℃で１５分（Ａ）、１２時間（Ｂ）、又は２４時間（Ｃ）暴露されたＨｅｐ３Ｂ細胞の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。（Ｂ）については、プロトセルのエンドソーム脱出及びｐＣＢ１の細胞質ゾル内分散は、約２時間後までには明白であった。しかし、ＺｓＧｒｅｅｎ発現は１２〜１６時間まで検出可能でなかった。２４時間の時点で、Ｃｙ５標識ｐＣＢ１は細胞内全体に分布したままであった。一方、（Ｃ）において細胞質ゾルの染色が見えないのは、核内に局在したピクセルの飽和を回避するためにＣｙ５チャンネルのゲインを下げたせいである。シリカコアはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４で標識され（赤色）、ｐＣＢ１はＣｙ５で標識され（白色）、細胞核はヘキスト３３３４２で対比染色された（青色）。スケールバー＝２０μｍ。図２３（Ｄ）は、Ｃｙ５で標識したｐＣＢ１及びヘキスト３３３４２で標識したＨｅｐ３Ｂの核についての、時間に対するピアソンの相関係数（ｒ値）を示す。ＳｌｉｄｅＢｏｏｋソフトウェアを用いてｒ値を求めた。ｒ値は、ｎ＝３×５０個の細胞の平均値±標準偏差として表される。ｒ値計算の際に細胞境界の外のピクセルを無視できるように、微分干渉（ＤＩＣ）画像を用いてＨｅｐ３Ｂ細胞の境界線を定めた。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。
【０１９６】
＜ヒストンでパッケージングされたｐＣＢ１は、ＮＬＳで修飾され、ＭＣ４０で標的を定められたプロトセルによって送達された場合に、分裂中及び非分裂中のＨＣＣ細胞の両方をほぼ１００％の効率で選択的にトランスフェクションする＞
図２４（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｅ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填された１０００倍の過剰量のプロトセルに３７℃で２４時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ細胞の共焦点蛍光顕微鏡法画像である。Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、（Ａ）では分裂中であり、（Ｃ）及び（Ｅ）では約９５％コンフルエントであった。全ての画像においてｐＣＢ１はヒストンで予めパッケージングされており、（Ｅ）において、ｐＣＢ１−ヒストン複合体はＮＬＳで更に修飾された。シリカコアはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４で標識され（赤色）、ｐＣＢ１はＣｙ５で標識され（白色）、細胞核はヘキスト３３３４２で対比染色された（青色）。スケールバー＝２０μｍ。図２４（Ｂ）、（Ｄ）及び（Ｆ）は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセル（「ＰＣ」）１×１０9個に３７℃で２４時間連続して暴露された際に、ＺｓＧｒｅｅｎ発現陽性になる１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ及び肝細胞の割合を示す。細胞は（Ｂ）では分裂中であり、（Ｄ）及び（Ｆ）では約９５％コンフルエントであった。ｘ軸は、ＣＢ１プラスミド（「ｐＣＢ１」）及びｐＣＢ１−ヒストン複合体（「複合体」）がＮＬＳで修飾されていたか否かを示す。ｐＣＢ１単独に加えて、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥとの１：１（ｗ／ｗ）混合物でパッケージングされたｐＣＢ１も対照として用いられた。細胞を２０ｍｇ／ｍＬの小麦胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）に暴露し、核膜孔複合体を経るＮＬＳ修飾したｐＣＢ１の移行を遮断した。エラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。図２４（Ｇ）〜（Ｉ）は、それぞれ図（Ａ）、（Ｃ）、及び（Ｅ）で用いた細胞の細胞周期のヒストグラムである。Ｇ0／Ｇ1期の細胞の割合を各ヒストグラムについて示す。全ての実験において、プロトセルのＳＬＢは５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。
【０１９７】
図２５は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルに３７℃で１時間又は７２時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ（Ａ）及び肝細胞（Ｂ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像を示す。ｐＣＢ１濃度は、全ての実験において５ｐＭに維持された。（Ｂ）の矢印は、有糸分裂細胞を示す。サイクリンＢ１はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識モノクローナル抗体で標識され（赤色）、細胞核はヘキスト３３３４２で染色された（青色）。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全てのスケールバー＝２０μｍ。
【０１９８】
図２６は、ＭＣ４０で標的を定められ、ｐＣＢ１が装填されたプロトセルに３７℃で１時間又は７２時間暴露されたＨｅｐ３Ｂ（Ａ）及び肝細胞（Ｂ）の共焦点蛍光顕微鏡法画像を示す。ｐＣＢ１濃度は、全ての実験において５ｐＭに維持された。細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識アネキシンＶ（白色）及びヨウ化プロピジウム（赤色）で染色し、それぞれ初期及び後期のアポトーシスを試験した。細胞核はヘキスト３３３４２で対比染色された（青色）。プロトセルのＳＬＢは、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％のコレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（１８：１）を含むＤＯＰＣからなり、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。全てのスケールバー＝２０μｍ。
【０１９９】
＜双性イオン性脂質からなるＳＬＢを有するプロトセルは、ごく低い非特異的細胞毒性しか誘導しない＞
添付の図２７は、１×１０9個のＡＰＴＥＳ修飾メソ多孔性のシリカナノ粒子、ＡＰＴＥＳ修飾コアを有するＤＯＰＣプロトセル、スクランブルｓｈＲＮＡ配列をコードするプラスミド（「スクランブルｐＣＢ１」）が装填されたＤＯＰＣプロトセル、又はスクランブルｐＣＢ１が装填されたＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（１：１ｗ／ｗ）リポプレックスに３７℃で４８時間連続して暴露した際に、アポトーシス性になる１×１０6個のＨｅｐ３Ｂの割合を示す。プロトセル及びリポプレックスは、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００、０．０１５ｗｔ％のＭＣ４０、及び０．５００ｗｔ％のＨ５ＷＹＧで修飾された。正荷電及び負荷電のポリスチレンナノ粒子（それぞれ「アミン−ＰＳ」及び「カルボキシル−ＰＳ」）を正の対照として用い、一方で１０ｍＭの抗酸化剤Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）又は１ｐｍｏｌの遊離したｐＣＢ１に暴露されたＨｅｐ３Ｂを負の対照として用いた。全てのエラーバーは、ｎ＝３の場合の９５％信頼区間を表す（１．９６σ）。
【０２００】
本明細書に開示する全参考文献は、適宜引用により援用される。
【０２０１】
＜実施例１の参考文献＞
１  Carroll, N. J., Pylypenko, S., Atanassov, P. B. & Petsev, D. N. Microparticles with Bimodal Nanoporosity Derived by Microemulsion Templating. Langmuir, doi: 10.1021/la900988j (2009).
２  Lu, Y. F.ら Aerosol-assisted self-assembly of mesostructured spherical nanoparticles. Nature 398, 223-226 (1999).
３  Iler, R. K. The Chemistry of Silica: Solubility, Polymerization, Colloid and Surface Properties, and Biochemistry. (John Wiley and Sons, 1979).
４  Doshi, D. A.ら Neutron Reflectivity Study of Lipid Membranes Assembled on Ordered Nanocomposite and Nanoporous Silica Thin Films. Langmuir 21, 2865-2870, doi: 10.1021/la0471240 (2005).
５  Bernhard, M. I.ら Guinea Pig Line 10 Hepatocarcinoma Model: Characterization of Monoclonal Antibody and in Vivo Effect of Unconjugated Antibody and Antibody Conjugated to Diphtheria Toxin A Chain. Cancer Research 43, 4420-4428 (1983).
６  Lo, A., Lin, C. T. & Wu, H. C. Hepatocellular carcinoma cell-specific peptide ligand for targeted drug delivery. Molecular Cancer Therapeutics 7, 579-589, doi: 10.l158/1535-7163.mct-07-2359 (2008).
７  Sciot, R.ら Transferrin receptor expression in human hepatocellular carcinoma: an immunohistochemical study of 34 cases. Histopathology 12, 53-63 (1988).
８  Kannangai, R., Sahin, F. & Torbenson, M. S. EGFR is phosphorylated at Ty845 in hepatocellular carcinoma. Mod Pathol 19, 1456-1461 (2006).
９  Behr, J. P. The Proton Sponge: a Trick to Enter Cells the Viruses Did Not Exploit. CHIMIA International Journal for Chemistry 51, 34-36 (1997).
１０  Jiang, W., KimBetty, Y. S., Rutka, J. T. & ChanWarren, C. W. Nanoparticle-mediated cellular response is size-dependent. Nat Nano 3, 145-150 (2008).
１１  Zimmermann, R.ら Charging and structure of zwitterionic supported bilayer lipid membranes studied by streaming current measurements, fluorescence microscopy, and attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy. Biointerphases 4, 1-6 (2009).
１２  Ashihara, E., Kawata, E. & Maekawa, T. Future Prospect of RNA Interference for Cancer Therapies. Current Drug Targets 11, 345-360 (2010).
１３  Pawitan, J. A. The possible use of RNA interference in diagnosis and treatment of various diseases. International Journal of Clinical Practice 63, 1378-1385 (2009).
１４  Elbashir, S. M.ら Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411, 494-498 (2001).
１５  Davis, M. E.ら Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature advance online publication (2010).
１６  Oh, Y.-K. & Park, T. G. siRNA delivery systems for cancer treatment. Advanced Drug Delivery Reviews 61, 850-862 (2009).
１７  Sou, K., Endo, T., Takeoka, S. & Tsuchida, E. Poly(ethylene glycol)-Modification of the Phospholipid Vesicles by Using the Spontaneous Incorporation of Poly(ethylene glycol)-Lipid into the Vesicles. Bioconjugate Chemistry 11, 372-379, doi: 10.1021/bc990135y (2000).
１８  Klein, E.ら "HFP" Fluorinated Cationic Lipids for Enhanced Lipoplex Stability and Gene Delivery. Bioconjugate Chemistry 21, 360-371, doi: 10.1021/bc900469z (2010).
１９  Minguez, B., Tovar, V., Chiang, D., Villanueva, A. & Llovet, J. M. Pathogenesis of hepatocellular carcinoma and molecular therapies. Current Opinion in Gastroenterology 25, 186-194 110.1097/MOG.1090bl013e32832962a32832961 (2009).
２０  Li, S.-D., Chen, Y.-C, Hackett, M. J. & Huang, L. Tumor-targeted Delivery of siRNA by Self-assembled Nanoparticles. Mol Ther 16, 163-169, doi:http://www,nature.com/mt/iournal/v16/n1/suppinfb/6300323s1.html (2007).
２１  Landen, C. N.ら Therapeutic EphA2 Gene Targeting In vivo Using Neutral Liposomal Small Interfering RNA Delivery. Cancer Research 65, 6910-6918 (2005).
２２  Honjo, T., Nishizuka, Y., Hayaishi, O. & Kato, I. Diphtheria Toxin-dependent Adenosine Diphosphate Ribosylation of Aminoacyl Transferase II and Inhibition of Protein Synthesis. Journal of Biological Chemistry 243, 3553-3555 (1968).
２３  Uchida, T., Kim, J. H., Yamaizumi, M., Miyake, Y. & Okada, Y. Reconstitution of lipid vesicles associated with HVJ (Sendai virus) spikes. Purification and some properties of vesicles containing non-toxic fragment A of diphtheria toxin. Journal of Cell Biology 80, 10-20 (1979).
２４  Mizuguchi, H.ら Application of fusogenic liposomes containing fragment A of diphtheria toxin to cancer therapy. British Journal of Cancer 73, 472-476 (1997).
２５  Liu, J. W., Jiang, X. M., Ashley, C. & Brinker, C. J. Electrostatically Mediated Liposome Fusion and Lipid Exchange with a Nanoparticle-Supported Bilayer for Control of Surface Charge, Drug Containment, and Delivery. Journal of the American Chemical Society 131, 7567-+, doi: 10.1021/ja902039y (2009).
２６  Liu, J. W., Stace-Naughton, A. & Brinker, C. J. Silica nanoparticle supported lipid bilayers for gene delivery. Chemical Communications, 5100-5102, doi: 10.1039/b91 1472f (2009).
２７  Liu, J. W., Stace-Naughton, A., Jiang, X. M. & Brinker, C. J. Porous Nanoparticle Supported Lipid Bilayers (Protocells) as Delivery Vehicles. Journal of the American Chemical Society 131, 1354-+, doi: 10.1021/ja808018y (2009).
２８  Schagger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nat. Protocols 1, 16-22 (2006).
２９  Fritze, A., Hens, F., Kimpfler, A., Schubert, R. & Peschka-Suss, R. Remote loading of doxorubicin into liposomes driven by a transmembrane phosphate gradient. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 1758, 1633-1640 (2006).
３０  Elorza, B., Elorza, M. A., Frutos, G. & Chantres, J. R. Characterization of 5-fluorouracil loaded liposomes prepared by reverse-phase evaporation or freezing-thawing extrusion methods: study of drug release. Biochimica et Biophysica Acta 1153, 135-142 (1993).
３１  Peleg-Shulman, T., Gibson, D., Cohen, R., Abra, R. & Barenholz, Y. Characterization of sterically stabilized cisplatin liposomes by nuclear magnetic resonance. Biochimica et Biophysica Acta 1510, 278-291 (2001).
３２  Bogush, T., Smirnova, G., Shubina, L., Syrkin, A. & Robert, J. Direct evaluation of intracellular accumulation of free and polymer-bound anthracyclines. Cancer Chemotherapy and Pharmacology 35, 501-505, doi: 10.1007/BF00686835 (1995).
３３  Tong, A. W.ら Chemosensitization of human hepatocellular carcinoma cells with cyclosporin A in post-liver transplant patient plasma. Clin. Cancer Res. 2, 531-539 (1996).
３４  Minko, T., Kopeckova, P. & Kopecek, J. Chronic exposure to HPMA copolymer-bound adriamycin does not induce multidrug resistance in a human ovarian carcinoma cell line. Journal of Controlled Release 59, 133-148 (1999).
【実施例２】
【０２０２】
＜イマチニブの経皮送達＞
上皮は皮膚の最上層であり、さらに４つの層に分解されることができる。上皮の最外層は角質層であって、厚さ約１０?２０ｐｍであり、経皮送達に伴う問題の原因である。上皮の他の３つの層は、まとめて生存上皮として分類されることができる。生存上皮は、厚さ５０?１００ｐｍである。生存上皮は、免疫細胞（ランゲルハンス細胞）、表皮ケラチノサイト、感覚神経（メルケル細胞）、並びに毛細血管床、細静脈及び細動脈の網状組織を含んでいる。真皮は厚さ１?２ｍｍであり、他の種類の免疫細胞（マスト細胞、リンパ球、マクロファージ、好中球、プラズマ細胞）、線維芽細胞、及び様々な線維（神経線維、コラーゲン、弾性線維）を含む疎性組織からなる。さらに１ａは、角質層を通過するカーゴの送達に用いられることができる４種類の主要な手法である、（ａ）経細胞間経路、（ｂ）毛穴経路、（ｃ）経細胞経路、及び（ｄ）角質層除去を説明する。重要なことに、角質層から真皮を通る漸増的な水和の勾配が存在し、この勾配は、生存上皮及び真皮の中への様々な分子の拡散の駆動力を提供することができる。
【０２０３】
角質層は、「レンガ及びモルタル」構造を有する。「レンガ」は、ケラチン、糖、及び脂質で満たされた死んだ表皮ケラチノサイトである。「モルタル」は細胞間隙を表し、セラミド、脂肪酸、及びコレステロールからなる。この脂質組成は、ブタノールに類似の極性を与える。この極性及び全体としての「レンガ及びモルタル」構造により、角質層は、増強無しではほとんどの分子に対して透過性でない。
【０２０４】
従って簡潔に言えば、皮膚は、３つの主要層である上皮、真皮、及び皮下組織からなる。最外層（角質層）は、バリアとしての皮膚の役割における主要な要素である。それは、細胞間隙中に飛び出す結晶ケラチン、ケラトヒアリン、及び様々な脂質で満たされた死んだ表皮ケラチノサイトからなる。これは、ブタノールに類似の極性を与える様々な脂質（即ち、セラミド、脂肪酸、コレステロール）からもなっている。この独特の極性により、角質層の細胞間隙では水素結合が起こり、経皮経路によって送達される分子及び薬物に第２段階の妨害を追加する。現在までに、３つの世代の経皮送達技術が存在する。第１世代の送達方式は、低分子量を有する親油性化合物の受動拡散を利用している。第２世代及び第３世代の送達方式は、角質層の透過性が重要であることを認識している。第２世代及び第３世代の増強方法は、角質層を切除するか、又は角質層の透過性を増大させるために化学的増強剤、生化学的増強剤、及び起電力を利用する。全ての増強方法から生じる課題は、より深部の組織の炎症を回避しながら、角質層の十分な透過性のバランスを見いだすことである。
【０２０５】
投与の経皮経路は、投与の静脈経路及び経口経路に優る複数の利点を提供する。これらは、化学療法薬、チロシンキナーゼインヒビター、及び他の治療薬などの癌患者用のカーゴでのより低い毒性、より良好な忍容性、及びより良好な送達を含むと考えられる。外皮の血液循環は、薬物吸収のために広い面積を提供するとともに、初回通過代謝及び不利な（薬物−食物間、薬物−ｐＨ間の）相互作用を迂回する。
【０２０６】
イマチニブは、最も一般的に処方される市販のチロシンキナーゼインヒビターである。イマチニブは弱塩基であり、比較的低分子量（４９３Ｄａ）であって、１．２のＬｏｇＰを有する。
【０２０７】
本発明者は、イマチニブの溶解度が、ｐＨを低下させることによって容易に増大し得ることを示した。しかし、ｐＨを低下させることは化合物のイオン化を増大させ、イオン化された状態にある分子は皮膚の脂質二重層を容易に透過しない。本来の溶解度（イオン化されていない種の溶解度）を増強するために、本発明者は、いくつかの溶媒系及び共溶媒系を評価した（図２８）。全ての組成は、対照（水、ｐＨ７）よりも薬物の溶解度を増大させることが見いだされた。最高の溶解度は、１０％エタノール組成及びＤＭＳＯ組成であった。
【０２０８】
本発明者の予備研究で、イマチニブが経皮経路によって送達される可能性を調査した。多数の重要な予備実験が、現在までに行われている。先ず本発明者は、水中におけるイマチニブの溶解度を溶媒ｐＨの関数として測定した（図２８）。薬物は、皮膚を透過するためには溶液でなければならない。しかし、イオン化された種は、角質層を容易に透過しない6。イマチニブの溶解度はｐＨを低下させることで増大したが、この溶解度は、薬物の化学構造での弱塩基性官能基のイオン化に起因する。
【０２０９】
次に本発明者は、イマチニブ及びダサチニブの本来の溶解度（イオン化されていない種の溶解度）を増大させるために多数の共溶媒／溶媒系をスクリーニングした。イマチニブのデータは、図２９に示されている。組成へのそのような共溶媒の添加は、難溶性の薬物の溶解度を増大させるために広く用いられている7〜9。本発明者の以前の研究から、エタノール、ＰＥＧ−４００、及びＤＭＳＯが、溶解度増強剤として評価された。これらの共溶媒は、様々な薬物の本来の溶解度を増強することが周知である。全ての共溶媒組成及びＤＭＳＯは、対照（水、ｐＨ７）と比較してイマチニブの溶解度を増大させた。１０％エタノールの組成は、他の組成と比較して最高の溶解度を示した。イマチニブは、ＤＭＳＯに非常に可溶であることも見いだされた。
【０２１０】
最後に、多数のこれらの共溶媒組成について、それらのインビトロにおける経皮透過特性を評価した（図３０）。これらの共溶媒は、一部の組成において透過性増強剤として機能することが公知である10、11。この一連の実験においては、腹部整形術から得られたヒト皮膚が、改変されたフランツ型拡散セル上に載置され、薬物の透過が高速液体クロマトグラフィーを用いて時間の関数として測定された。
【０２１１】
フランツ型拡散セルは、経皮薬物送達の分野において必須の器具である。患者から得られた皮膚は、セルキャップと溶液チャンバーとの間に配置される。セルキャップは周囲に対して暴露されるので、角質層が周囲に暴露されることも可能にする。溶液チャンバーは、等張性の拡散緩衝液で満たされる。さらに溶液チャンバーは、配置を乱すこと無く拡散緩衝液が除去されることを可能にする注入ポートを有する。最後に、溶液チャンバーは、温度制御を可能にする水套によって囲まれている。フランツ型拡散セルは、生理的条件を用いて、経皮送達のインビトロ研究が行われることが可能である。ここで、患者から得られた皮膚を通って拡散緩衝液中へ至るいかなる溶質の透過も、インビボ系においてその溶質が体循環に到達することと同等である。プロトセルはメシル酸イマチニブを装填され、拡散緩衝液中の溶質含有量の特性評価が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いてなされる。皮膚の各層中のシリカ含有量は、酵素による組織消化及び誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ質量分析）を用いて測定される。ＳＬＢ及びナノ多孔性粒子コアの両方が、共焦点顕微鏡法を考慮して蛍光標識されることができる。さらに、皮膚サンプルは、ＴＥＭを用いてイメージング可能なように、プロトセルを用いた処理及び培養の後にミクロトームで切片化されることができる。
【０２１２】
図３０に見られるように、溶媒系として水（ｐＨ７）を用いた場合にはイマチニブは皮膚を透過しなかった。評価された他の共溶媒系では、薬物はある程度皮膚を透過することができた。ＤＭＳＯは、イマチニブの最高の透過性を示した。これらのデータから流量（皮膚透過の速度）が計算された。それらの値を図３１に示す。流量は、対照と比べて全ての組成に関して増大されており、ＤＭＳＯ組成がイマチニブの最大の流量を示した（０．２２５μｇ／ｃｍ2ｈｒ）。
【０２１３】
経皮プロトセルは、従って、（ａ）イマチニブなどの１つ以上の薬学的に活性な薬剤が装填されるとともに（ｂ）脂質二重層によって被包されかつ脂質二重層を担持する多孔性ナノ粒子からなることができる。ここで脂質二重層は、１つ以上の角質層透過性増強剤、例えば一価飽和ω−９脂肪酸（オレイン酸、エライジン酸、エイコセン酸、ミード酸、エルカ酸、及びネルボン酸、最も好ましくはオレイン酸）、アルコール、ジオール（最も好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、Ｒ８ペプチド、並びにエッジアクチベータ（胆汁酸塩、ポリオキシエチレンエステル及びポリオキシエチレンエーテル、一本鎖界面活性剤（例えばデオキシコール酸ナトリウム）など）を含む。プロトセルは、約５０ｎｍ?約３００ｎｍ、好ましくは約６５ｎｍ?約７５ｎｍの平均を有することができる。
【０２１４】
＜実施例２の参考文献＞
１．"FASS.se." Mobil.fass.se. Web. 26 Jan. 2010.
２．Benson, H. 2005. Transdemal Drug Delivery: Penetration Enhancement Techniques. Current Drug Delivery. 2: 23-33.
３．Kear, C, Yang, J., Godwin, D., and Felton, L. 2008. Investigation into the Mechanism by Which Cyclodextrins Influence Transdermal Drug Delivery. Drug development and Industrial Pharmacy. 34:692-697.
４．Bany, B.W. 2001. Novel mechanisms and devices to enable successful transdermal drug delivery. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 14101-114.
５．Maghraby, G., Barry, W., and Williams, A. 2008. Liposomes and skin: From drug delivery to model membranes. European Journal of Pharmaceutical Science. 34203-222.
６．Singh, B., Singh, J. and Singh, B.N. 2005. Effects of ionization and penetration enhancers on the transdermal delivery of 5-fluorouracil through excised human stratum corneum. International Journal of Pharmaceutics. 298:98-107.
７．Douroumis, D., and Fahr, A. 2007. Stable carbamazepine colloidal systems using the cosolvent technique. European Journal of Pharmaceutical Science. 30:367-374.
８．Ni, N., Sanghvi, T., and Yalkowsky, S. 2002. Solubilization and prefomulation of carbendazim. International Journal of Pharmaceutics. 24499-104.
９．Rubino, T. J. and Yalkowsky, H. S. 1987. Cosolvency and Cosolvent Polarity. Pharmaceutical Research. 4220-230.
１０．"Pharmacology of DMSO." Dimethyl Sulfoxide (DMSO) -Dr. Stanley Jacob. Web. 30 Mar. 2010.
１１．Notman, R., Otter, K.W., Noro, G.M., Briels, J.W., and Anwar, J. 2007. The Permeability Enhancing Mechanism of DSMO in Ceramide Bilayers Simulated by Molecular Dynamics. Biophysical Journal. 93:2056-2068.
【実施例３】
【０２１５】
［ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルによって誘発されるアポトーシス］
［結果］
＜ｓｉＲＮＡが装填されたプロトセルの特徴＞
シリカナノ粒子は、Carrollら35によって記載されるように調製され、６００ｍ2／ｇより大きなＢＥＴ表面積、約６５％の細孔容積率、及び６?１２ｎｍの細孔によって相互に連結された、表面から利用可能な大きな（２０?３０ｎｍ）細孔からなる多峰分布の細孔形態を有した（図３３Ｂ、Ｃ参照）。シリカナノ粒子は、方法の項に記載のように、ｓｉＲＮＡ（又はリシン毒素Ａ鎖）を装填される前にサイズによって分けられた（図３３Ａ参照）。一連の方法を用いて構成されたプロトセル又はリポプレックスのｓｉＲＮＡ装填容量が、図３４Ａに示される。双性リン脂質ＤＯＰＣからなるリポプレックスは、１０10個の粒子当たり約１０ｎＭのｓｉＲＮＡを被包した。カチオン性脂質ＤＯＴＡＰからなるリポプレックスの構築物は、恐らくは負荷電のヌクレオチドと正荷電の脂質成分との間の引力的な静電相互作用により、ｓｉＲＮＡカーゴでの５倍の増加をもたらした。双性脂質二重層を備えた負荷電のシリカコアを含有するプロトセルは、カチオン性のリポプレックスとほぼ同等の収容能力を有した。アミン含有シランであるＡＥＰＴＭＳを用いたシリカコアの修飾は、ζ電位を?３２ｍＶから＋１２ｍＶへと増大させ、１０10個の粒子当たり約１μΜのｓｉＲＮＡの収容能力をもたらした。ｓｉＲＮＡを負荷電のコア中に相助作用的に装填するためのＤＯＴＡＰリポソームの使用は36、粒子ベースの治療用途にしばしば用いられる双性リポプレックスよりも１００倍よりも大きな、類似の収容能力を有するプロトセルをもたらした。代用生体液中に分散された際のＤＯＰＣリポプレックス、ＤＯＴＡＰリポプレックス、及びＡＥＰＴＭＳで修飾されたコアを有するＤＯＰＣプロトセルの安定性が、図３４Ｂ、３４Ｃに示される。ＤＯＰＣリポプレックスは、中性ｐＨ条件下及び弱酸性ｐＨ条件下の両方においてそれらの被包されたｓｉＲＮＡを迅速に放出し、４?１２時間以内に含有したヌクレオチドの完全な喪失をもたらす。ＤＯＴＡＰリポプレックスは中性ｐＨ条件下においてＤＯＰＣリポプレックスよりも安定であったが、それらのｓｉＲＮＡ含有量の約５０％は、７２時間の間に失われた。両方のリポプレックスとは極めて対照的に、ＡＥＰＴＭＳで修飾されたコアを有するＤＯＰＣプロトセルは、疑似体液に７２時間暴露された場合に、それらの被包されたＲＮＡの９５％を保持した。エンドソーム／リソソーム経路を反映する弱酸性条件下においては、ｓｉＲＮＡが装填されてＡＥＰＴＭＳで修飾されたコアと、担持された脂質二重層のＰＥ頭部基及びＰＣ頭部基との間での減少した静電相互作用及び双極性相互作用は、膜の不安定化及び酸性媒体へのコアの暴露を引き起こした。膜の不安定化後に、カーゴの拡散とコアの分解とが組み合わされた速度は、図３４Ｃに見られる放出プロファイルをもたらした。従って、ｓｉＲＮＡ装填容量、粒子安定性、及び放出特性の点で、プロトセルは相当するリポプレックスを上回る劇的な改善を示す。
【０２１６】
＜ｓｉＲＮＡが装填されたプロトセルによって媒介される細胞毒性＞
本発明者は、肝細胞癌（ＨＣＣ）には結合するが対照の肝細胞には結合しないターゲティングペプチド（ＳＰ９４）がコンジュゲートされたプロトセルが、多種多様な化学療法剤を送達して、関連する表面マーカーを発現する腫瘍細胞でのアポトーシスを選択的に誘発する能力を最近証明した34。ここで本発明者は、ｓｉＲＮＡ及びタンパク質毒素などの高分子カーゴが装填され、標的を定められたプロトセルの特性を大きく拡張した。本発明者は、ＡＥＰＴＭＳで修飾されたシリカコアと、ＨＣＣに対する選択的結合性を与えるためのＳＰ９４及びエンドソーム／リソソームからの放出を促進するためのエンドソーム分解性ペプチドの両方をコンジュゲートされた、ＤＯＰＣ／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ−２０００（５５：５：３０：１０質量比）である担持された脂質二重層とからなるプロトセルを調製した。プロトセルは、細胞周期横断及び生存性の両方の制御に密接に関与しているタンパク質である37、サイクリンＡ２、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、及びサイクリンＥなどのサイクリンスーパーファミリーのメンバーを標的とするｓｉＲＮＡの等モル混合物を装填された。
【０２１７】
ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められるとともに、ＡＥＰＴＭＳで修飾されたコアを用いて構成されたＤＯＰＣプロトセルによる、ＨＣＣ株Ｈｅｐ３Ｂにおける遺伝子発現抑制の濃度及び時間依存性が、図３５に示される。Ａ図は、プロトセル濃度の増大、従ってｓｉＲＮＡ濃度の増大が、用量に依存したそれぞれの標的遺伝子のタンパク質レベルの減少を４８時間以内に誘発することを明らかにしている。タンパク質発現を９０％抑えるのに必要なｓｉＲＮＡ濃度（ＩＣ90）は、サイクリンＡ２、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、及びサイクリンＥについて（それぞれ）１２５ｐＭ、９２ｐＭ、１４９ｐＭ、及び３７０ｐＭであった。Ｂ図は、標的を定められたプロトセルに装填される１２５ｐＭのｓｉＲＮＡを添加した際に、タンパク質レベルがどのように減少するかを示している。７２時間までに、標的タンパク質のそれぞれのレベルは９０％を超えて抑制された。抑制の程度（サイクリンＥは他のサイクリンよりもやや低い）は、ＩＣ90値の違いを反映している。図３５Ｃは、ＳＰ９４によって標的を定められた様々な種類の粒子を用いて、達成可能な遺伝子発現抑制の選択性を示している。１２５ｐＭのｓｉＲＮＡが装填されたＤＯＰＣプロトセルは、４８時間のＨｅｐ３Ｂとの培養後にサイクリンＡ２タンパク質のほぼ完全な抑制を誘発したが、形質転換していない肝細胞には影響を及ぼさなかった。対照的に、１２５ｐＭのｓｉＲＮＡが装填されたＤＯＰＣリポプレックスは、いずれの細胞株のサイクリンタンパク質レベルにもほとんど影響を及ぼさなかった。１２５ｐＭのｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたＤＯＴＡＰリポプレックスは、Ｈｅｐ３ＢのサイクリンＡ２の発現の約６０％の抑制を誘発したが、肝細胞のサイクリンＡ２レベルもまた減少させた。これは、恐らくそれらの正電荷（ζ＝＋２２ｍＶ）によって引き起こされた影響である。サイクリンＡ２の発現を９０％抑制するのに必要なＳＰ９４によって標的を定められたＤＯＰＣプロトセル、ＤＯＰＣリポプレックス、及びＤＯＴＡＰリポプレックスの個数が、Ｃ図の右軸に示される。必要とされるＤＯＰＣプロトセルは、類似のＤＯＰＣリポプレックスよりも１０4倍少なく、ＤＯＴＡＰリポプレックスよりも３００倍少ない。従って、活性及び特異性の両方の点で、標的を定められたプロトセルは、脂質に基づいたナノ粒子に優る顕著な利点を提供する。
【０２１８】
ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルに暴露された細胞での、プロトセルの分布の時間依存性並びにサイクリンＡ２、Ｂ１、Ｄ１、及びＥの発現を明らかにする共焦点蛍光顕微鏡法画像が、図３６に示される。Ａ図で明示されるように、Ｈｅｐ３Ｂへのプロトセル添加の１時間後において、タンパク質のそれぞれの発現は対照レベルに留まっており、シリカコアは点状の形態で存在しており、エンドソームへの局在を示唆している。４８時間までに、シリカコアはＨｅｐ３Ｂ細胞の細胞質全体に均一に分布しており、標的タンパク質のそれぞれの発現はバックグラウンドレベルまで抑制されている。対照的に、形質転換されていない肝細胞の同じ処理は、プロトセルの細胞内蓄積もタンパク質発現の抑制ももたらさなかった（Ｂ図参照）。
【０２１９】
ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたＤＯＰＣプロトセルがＨＣＣの細胞毒性を選択的に誘発する能力が、図３７に示される。プロトセルは１２５ｐＭのｓｉＲＮＡ混合物を装填され、Ｈｅｐ３Ｂ又は対照の肝細胞に添加された。アポトーシスの初期にある細胞は、アネキシンＶの結合の増大によって識別された。一方で、アポトーシスの後期にある細胞は、アネキシンＶ染色及びヨウ化プロピジウム染色の両方に陽性であった。アポトーシス性のＨｅｐ３Ｂの個数の選択的な増大が、プロトセル添加の早くも１２時間後に観察され（Ａ図）、９０％を超える細胞が７２時間までに両方のアポトーシスマーカーに陽性であった。対照的に、形質転換されていない肝細胞では細胞毒性は見られなかった。それらの観察結果は、図３７Ｂ、３７Ｃに示される代表的な顕微鏡法画像によって裏付けられる。Ｂ図は、Ｈｅｐ３Ｂの集団全体が、表面に結合したアネキシンＶ及び核に結合したヨウ化プロピジウムに４８時間以内に陽性になったことを明示している。一方でＣ図は、対照の肝細胞が両方のアポトーシスマーカーに陰性のままであったことを示す。
【０２２０】
＜毒素が装填されたプロトセルの特徴＞
大きくて（２０?３０ｎｍ）表面から利用可能な細孔の存在により、多峰分布のシリカナノ粒子には、ジフテリア毒素、コレラ毒素、及びリシン毒素などの様々なタンパク質毒素が容易に装填可能である。さらに、低密度（０．０１５ｗｔ％、又は約６ペプチド／プロトセル）のＳＰ９４で修飾されたＤＯＰＣプロトセルによって示された高度の差別的な特異性は、特に癌細胞への細胞毒性な薬剤の選択的送達を可能にする。リシン毒素はヒマ（トウゴマ）の種子中で見つけられ、ジスルフィド結合によって一緒になったＡサブユニット及びＢサブユニットからなるヘテロ二量体で構成される。Ｂサブユニットは、受容体依存性エンドサイトーシスによる細胞内への毒素侵入を媒介し、Ａサブユニットは、２８ＳｒＲＮＡ中の特定のグリコシド結合を切断することによってタンパク質合成を阻害する38。触媒活性のリシン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ）は、多数のモデル系において癌細胞の増殖を阻害するために、腫瘍特異的免疫毒素のサブユニットとして用いられて来た39、40。
【０２２１】
ＲＴＡが装填されたＤＯＰＣプロトセル及びＤＯＰＣリポソームの収容能力及び放出特性が、図３８に示される。Ａ図によって明示されるように、１ｎＭより少ないタンパク質が、１０10個のＤＯＰＣリポソーム中に装填された。対照的に、未修飾シリカコアを備えたＤＯＰＣプロトセルはほぼ１００倍多いＲＴＡを被包し、ＡＥＰＴＭＳでのコアの修飾は、この収容能力をさらに一桁増大させた。ＲＴＡが装填されたＤＯＰＣプロトセル及びＤＯＰＣリポソームのｐＨに依存した安定性が、Ｂ図及びＣ図に示される。ＤＯＰＣプロトセルは、疑似体液中で中性ｐＨにおいて最大７２時間連続して培養された場合に、それらの被包されたカーゴの約５％を放出し、ＲＴＡは弱酸性（即ちエンドソーム）条件下においては粒子から持続的に放出された。対照的に、ＤＯＰＣリポソームは、中性条件下及び酸性条件下の両方において、それらの含有ＲＴＡを急速に失った。
【０２２２】
＜ＲＴＡが装填されたプロトセルによって媒介される細胞毒性＞
図３９に示されるように、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセル中に被包されたＲＴＡは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞において、濃度（Ａ図）及び時間（Ｂ図）に依存した新生タンパク質合成の減少を引き起こした。ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルの添加４８時間後には、タンパク質合成の最大の半分の阻害が約５ｐＭのＲＴＡ濃度で達成され、完全な阻害は約３０ｐＭのＲＴＡの場合に観察された（Ａ図）。ＲＴＡが装填されたプロトセルは、２５ｐＭのＲＴＡ濃度でＨｅｐ３Ｂに添加された場合には、タンパク質合成の５０％の減少を約２４時間以内にもたらし、完全な抑制を６０時間以内にもたらした（Ｂ図）。Ｃ図に示された結果は、ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルは、Ｈｅｐ３Ｂに添加された場合に新生タンパク質合成を効率よく抑制したが、同一条件下において対照の肝細胞にはほとんど影響しなかったことを明示している。対照的に、ＳＰ９４によって標的を定められたＤＯＰＣリポソームは、ＲＴＡの終濃度が２５ｐＭになるように細胞に添加された場合には、Ｈｅｐ３Ｂ及び肝細胞において新生タンパク質合成を阻害しなかった。さらに、Ｃ図の右軸に示されるように、Ｈｅｐ３Ｂ細胞のタンパク質生合成を９０％抑制するには、１０4倍多いＲＴＡが装填されたリポソーム（約６０ｐＭのＲＴＡ）が必要であった。
【０２２３】
新生タンパク質合成及び細胞内プロトセル分布は、（それぞれ）メチオニンのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識誘導体及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識シリカコアを用いて、図４０に示されるように定量化された。ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルのＨｅｐ３Ｂへの添加後１時間では、タンパク質合成は健全であり、プロトセルは細胞質小胞中に局在した（Ａ図）。４８時間の培養後には、プロトセルは細胞質全体に分散しており、タンパク質合成は顕著に抑制されていた。Ｂ図に示されるように、形質転換していない肝細胞への類似のプロトセルの添加は、プロトセルの細胞内蓄積も新生タンパク質合成の抑制ももたらさなかった。
【０２２４】
ＲＴＡが装填されたプロトセルがＨＣＣにおいて細胞毒性を選択的に誘発するが対照の肝細胞では誘発しないという能力は、図４１に示される。ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルは、カスパーゼ−９及び／又はカスパーゼ−３の活性化によって測定された場合、早くも８時間でＨｅｐ３細胞のアポトーシスを誘発し、２０?２８時間までには５０％の細胞が陽性になった（Ａ図）。完全な細胞死が４８時間までに見られた。同等のプロトセル濃度は、７日間の培養後でさえも、肝細胞の生存性を対照レベルより減少させなかった。プロトセル分布及びアポトーシスを示す顕微鏡法画像が、Ｂ図及びＣ図に示される。ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルのＨｅｐ３Ｂへの添加後４８時間では、プロトセルは細胞質に分布し、細胞はカスパーゼ−９活性化及びカスパーゼ−３活性化の両方に陽性であった（Ｂ図）。Ｃ図に示されるように、対照の肝細胞は、同一の実験条件下においてカスパーゼ染色及び粒子蓄積に陰性のままであった。
【０２２５】
［考察］
核酸及び毒素などの高分子治療の十分な可能性は、遺伝子発現の異常なパターンによって媒介される多くの疾患の治療のために広く研究されているが、送達方式の顕著な欠陥により実現されずにいる17、18。本明細書において本発明者は、プロトセルが、ｓｉＲＮＡ及びタンパク質毒素の両方の効率的なパッケージング及び特異的な細胞送達を可能にする特徴を示すことを表す証拠を提示している。
【０２２６】
ｓｉＲＮＡなどの未修飾の核酸は、いくつかの理由により全身投与されることができない。それらは血漿中ヌクレアーゼの影響を受けやすく、効率の良い腎臓濾過により非常に短い循環半減期を有する3。さらに核酸は、それらの正味の負電荷及び大きいサイズにより容易には細胞に取り込まれない41。これらの問題を回避するために、ｓｉＲＮＡは、様々なポリマーにコンジュゲートされたり、リポソームなどのナノ粒子中に被包されたりしている。中性のリポソームへの組み込み又はカチオン性脂質へのコンジュゲートは、安定性及び循環半減期を増大させ、そしてカチオン性複合体の場合には、静電的に行われる細胞への送達を増強した42、43。ｓｉＲＮＡを含んだ生物学的に活性な複合体を形成するために、キトサン44及びシクロデキストラン45などの天然生成物が用いられている。ポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーとのコンジュゲートも、分解を防ぎ送達を増強することを助けることによってｓｉＲＮＡの治療効率を増強することが示されている46。
【０２２７】
ｓｉＲＮＡを全身投与する治療での使用は、有効性を増強しかつ非特異的毒性を減少させるために、特定の器官又は細胞のサブセットへの送達を必要とする。これは抗癌薬の場合に特に当てはまり、その場合には正常細胞を細胞毒性のｓｉＲＮＡの作用から守る必要がある。標的細胞が体内の複数の場所に存在する場合にも複雑な事態が生ずるが、これは血液腫瘍や、新生細胞が広く播種される転移性疾患に当てはまる。この問題に対処するために、標的細胞の表面に特異的に発現された抗原を認識する分子が、ｓｉＲＮＡに直接的にコンジュゲートされており、又はヌクレオチドを被包する粒子にコンジュゲートされている。葉酸47、コレステロール48、及びトランスフェリン13などの受容体リガンドは、それぞれの細胞受容体を過剰発現する細胞へのｓｉＲＮＡ複合体の結合を導くために首尾よく用いられて来た。標的細胞上の適した分子を認識する抗体も、ｓｉＲＮＡ含有粒子の選択的結合を特定の種類の細胞に導くために用いられている49。さらに、所望の細胞エピトープに結合するように多重スクリーニング法によって選択されたペプチド又は核酸のアプタマーが、特定の細胞相互作用を増強するために直接的にｓｉＲＮＡにコンジュゲートされており、又はｓｉＲＮＡ含有粒子にコンジュゲートされている50。
【０２２８】
分解から守るための化学構造の改変又はターゲティング試薬へのコンジュゲートなどの、核酸及びタンパク質の送達方式のいくつかの側面での顕著な進歩にもかかわらず、多くの欠陥が残っている。核酸を静電的に複合体化し、凝縮し、送達するためにカチオン性脂質又はポリマーを用いる多数の試薬が市販されているが、それらの製剤の大多数は真核細胞の非特異的トランスフェクションをもたらす。さらに、カチオン性脂質／核酸複合体（リポプレックス）は細胞毒性であることが分かっており、さらにそれらのトランスフェクション効率及びコロイド安定性は、血清存在下では限定されがちである。逆に、双性脂質は、二価カチオン存在下であっても効率良く核酸を密集させることができない。全てのそのようなナノ粒子の送達方式は、限られたカーゴ収容能力の問題も抱える。
【０２２９】
本発明者の実験結果によって示されるように、プロトセルは、既存の送達方法に優る大きな利点を提供する。本発明者は、低分子治療薬用の標的を定められたナノ担体としてそれらの有用性を以前に記載しており、それらのカーゴ収容能力、安定性、及び細胞特異的細胞毒性が、従来のリポソームよりもはるかに優れていることを証明している。ナノ粒子に基づく高分子の送達は、それらの大きいサイズ、電荷特性、及び細胞内カーゴ放出に伴う潜在的問題により、さらに大きい課題を生じる。本明細書において本発明者は、プロトセルがそれらの適用についても明確な利点を提供することを示した。多峰分布の多孔性シリカナノ粒子は、それらを所望のカーゴの溶液中に浸漬することによって、核酸、毒素、及び高分子混合物を迅速に装填されることができる。カーゴが装填されたコアへのＤＯＰＣリポソームの融合は、中性ｐＨにおいてカーゴを保持し、非特異的結合を減少させ、コロイド安定性を改善し、カチオン性のリポソーム及びリポプレックスに付随する細胞毒性を軽減する、安定して担持された脂質二重層（ＳＬＢ）の形成をもたらす（詳細は参考文献３４を参照）。流動性だが安定であるＳＬＢにコンジュゲートされたターゲティングペプチドは、細胞表面受容体と多価で相互作用し、受容体依存性エンドサイトーシスを誘発する。酸性のエンドソーム環境での、エンドソームの浸透圧膨張及び崩壊（エンドソーム分解性ペプチドのプロトンスポンジ効果によって引き起こされる）に伴うＳＬＢの不安定化は、細胞質中へのシリカコアの分散をもたらす。拡散及びシリカコアの分解の組み合わせは、１２時間を超える制御された持続的なカーゴ放出を可能にする。プロトセルの収容能力、安定性、並びに標的及び内在化効率の組み合わせは、Ｈｅｐ３Ｂについて並外れて低いＩＣ90値をもたらすが、正常肝細胞に対して事実上悪影響が無い。
【０２３０】
１５０ｎｍのコアを有するプロトセルは、粒子当たり（Ｌ当たり）平均で約６×１０7個のｓｉＲＮＡ分子又は約１×１０7個のリシン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ）分子を被包し、疑似体液に７２時間暴露した際にそれらのカーゴの約１００％を保持する。それに比べ、脂質及びポリマーのナノ粒子は、高分子カーゴについて１０?１０００倍低い収容能力を有し、中性ｐＨにおいて実質的により安定でない51、52。さらに、プロトセルは、他のメソ多孔性シリカ粒子よりも核酸カーゴの高い収容能力を有する。ｓｉＲＮＡが装填されたナノリポソームの卵巣癌への持続的送達用にTanakaらによって開発されたＳＩＭＰは、プロトセルとほぼ同量のＲＮＡを被包するものの（２．０ｐｇ／粒子対１．３ｐｇ／粒子）、それらの平均直径は１０倍大きい（１．６μｍ対１５０ｎｍ）53。Xiaらによって開発された、ポリエチレンイミンでコーティングされたメソ多孔性シリカナノ粒子は、１０μｇの粒子当たり約１μｇのｓｉＲＮＡ（１０ｗｔ％）を複合体化する33。それに比べ、１０μｇのプロトセルは、約６．５μｇのｓｉＲＮＡ（６５ｗｔ％）を装填されることができる。収容能力及び安定性の増強は、ｓｉＲＮＡが装填されたプロトセルが標的遺伝子を発現抑制し、文献51、52、54?５８の報告値よりも１０?１０，０００倍低い濃度でＨＣＣのアポトーシスを誘発することを可能にする。ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルは、サイクリンＡ２、Ｂ１、Ｄ１、及びＥの発現の９０％を９０ｐＭ?３７０ｐＭのｓｉＲＮＡ濃度で抑制し（ＩＣ90）、９０％を超えるＨＣＣを４８時間以内に１２５ｐＭのｓｉＲＮＡ濃度で殺す（ＬＣ90）。それに比べて、標的を定められたリポソームは、粒子の種類及び実験が行われた条件に応じて５?５００ｎＭのＩＣ90及びＬＣ90値を有する54?５６、５８?６０。ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルの治療有効性は、ポリマーで被包されたメソ多孔性ナノ粒子も上回る。複数のグループが、ｓｉＲＮＡを複合体化するために、ポリカチオン性ポリマーに被包されたメソ多孔性シリカナノ粒子を用いている。そのような粒子は、レポーター及び内在性遺伝子の発現の３０?６０％のノックダウンを、１０?２０のナノ粒子：ｓｉＲＮＡ（ｗ／ｗ）比で２４?４８時間以内にもたらす33、61。本発明者は、ＡＥＰＴＭＳで修飾されたシリカナノ粒子のナノ細孔中にｓｉＲＮＡを装填するので、プロトセルの収容能力はかなり高く、約８のプロトセル：細胞比でサイクリンＡ２、Ｂ１、Ｄ１、及びＥの発現の完全な抑制をもたらす。結論すると本発明者の発見は、プロトセルが、核酸及び毒素などの多種多様な高分子用の普遍的な標的を定められたナノ担体として機能することを示唆している。ナノ多孔性コアは、テラノスティクス及び個別化医療という急成長分野に必要な造影剤及び診断薬などの他の異なるタイプのカーゴも装填されることができる。
【０２３１】
［材料と方法］
＜材料＞
サイクリンＡ２（マウスｍＡｂ）、サイクリンＢ１（マウスｍＡｂ）、サイクリンＤ１（マウスｍＡｂ）、及びサイクリンＥ（マウスｍＡｂ）に対する抗体は、アブカム社（マサチューセッツ州ケンブリッジ）から購入した。サイレンサーセレクトｓｉＲＮＡ（サイクリンＡ２、Ｂ１、Ｄ１、及びＥのｓｉＲＮＡのＩＤは、それぞれｓ２５１３、ｓ２５１５、ｓ２２９、及びｓ２５２６である。）は、ライフテクノロジーズ社（カリフォルニア州カールスバッド）のアプライドバイオシステムズ（商標）から購入した。ヒトＨｅｐ３Ｂ（ＨＢ−８０６４）、ヒト肝細胞（ＣＲＬ−１１２３３）、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、及び１×トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．２５％トリプシン、０．５３ｍＭＥＤＴＡ）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）から購入した。１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（１８：１−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、及びコレステロールは、アバンティ・ポーラー・リピッズ社（アラバマ州アラバスター）から購入した。ＣａｓｐＧＬＯＷ（商標）フルオレセイン活性カスパーゼ−９染色キット（４８５／５３５）及びＣａｓｐＧＬＯＷ（商標）レッド活性カスパーゼ−３染色キット（５４０／５７０）は、バイオビジョン社（カリフォルニア州マウンテンビュー）から購入した。ＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０（セチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ジメチコン）は、エボニック・インダストリーズ社（ドイツ、エッセン市）から購入した。ヘキスト３３３４２（３５０／４６１）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８抗体標識キット（４９５／５１９）、アネキシンＶのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲート（４９５／５１９）、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ  ＡＨＡ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８タンパク質合成ＨＣＳアッセイ（４９５／５１９）、ヨウ化プロピジウム（５３５／６１７）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７カルボン酸−スクシンイミジルエステル（６５０／６６８）、ＳｌｏｗＦａｄｅ（登録商標）ゴールド・アンチフェード試薬、Ｉｍａｇｅ−ｉＴ（登録商標）ＦＸシグナル増強剤、１×ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）、及びウシアルブミン画分Ｖ溶液（ＢＳＡ、７．５％）は、インビトロジェンライフサイエンシズ（カリフォルニア州カールスバッド）から購入した。ＢＥＧＭ−Ｂｕｌｌｅｔキットは、ロンザグループ社（クロネティクス、メリーランド州ウォーカーズビル）から購入した。アミコン（登録商標）ウルトラ−４遠心濾過ユニット（１０ｋＤａＭＷＣＯ）は、ミリポア社（マサチューセッツ州ビレリカ）から購入した。全てのペプチドは、ニューイングランドペプチド社（マサチューセッツ州ガードナー）によって合成された。スクシンイミ���ル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラコサエチレングリコール］エステル（ＳＭ（ＰＥＧ）24）は、ピアース・プロテインリサーチプロダクツ社（サーモフィッシャーサイエンティフィックＬＳＲ社（イリノイ州ロックフォード））から購入した。超高純度のＥＭ等級ホルムアルデヒド（１６％、メタノール不含）は、ポリサイエンシズ社（ペンシルバニア州ウォリントン）から購入した。無水エタノール、塩酸（３７％）、オルト珪酸テトラエチル（ＴＥＯＳ、９８％）、３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピルトリメトキシシラン（ＡＥＰＴＭＳ、工業等級）、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ、≧９９％）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、≧９８．５％）、トリトン（登録商標）Ｘ−１００、ヘキサデカン（≧９９％）、ｔｅｒｔ−ブタノール（≧９９．５％）、２−メルカプトエタノール（≧９９．０％）、ＤＬ−ジチオトレイトール（≧９９．５％）、ジメチルスルホキシド（≧９９．９％）、ｐＨ５のクエン酸緩衝液、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、９９．９９５％）、ヒト上皮増殖因子、Ｌ−ａ−ホスファチジルエタノールアミン、ウシフィブロネクチン、ウシＩ型コラーゲン、大豆トリプシンインヒビター（≧９８％）、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ、トウゴマ由来の脱グリコシル化されたＡ鎖、及びセファデックス（登録商標）Ｇ−２００は、シグマアルドリッチ社（ミズーリ州セントルイス）から購入した。
【０２３２】
＜細胞培養条件＞
Ｈｅｐ３Ｂ及び肝細胞はＡＴＣＣから入手され、使用説明書に従って培養された。簡潔に言えば、Ｈｅｐ３Ｂは１０％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ中に維持された。肝細胞は、ＢＳＡ、フィブロネクチン、及びウシＩ型コラーゲンでコーティングされたフラスコ中で培養された。用いた培地は、５ｎｇ／ｍＬ上皮増殖因子、７０ｎｇ／ｍＬホスファチジルエタノールアミン、及び１０％ＦＢＳを含むＢＥＧＭ（ゲンタマイシン、アンホテリシン、及びエピネフリンはＢＥＧＭ−Ｂｕｌｌｅｔキットから除かれた）であった。細胞は、湿気のある環境（５％ＣＯ2を補充した空気）中に３７℃で維持され、０．０５％トリプシンを用いて継代比率１：３で継代された。
【０２３３】
＜多峰分布シリカナノ粒子の合成＞
多峰分布の多孔性を有するナノ多孔性シリカ粒子を合成するために用いられたエマルションの処理技術は、Carrollらによって記載されている35。簡潔に言えば、１．８２ｇのＣＴＡＢ（水性相に可溶）を２０ｇの脱イオン水に加え、溶解するまで４０℃で撹拌し、２５℃まで冷ました。このＣＴＡＢ溶液に０．５７ｇの１．０規定塩酸、５．２ｇのＴＥＯＳ、及び０．２２ｇのＮａＣｌを加え、得られたゾルを１時間撹拌した。３ｗｔ％のＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０（油相中に可溶な非イオン性乳化剤）を含むヘキサデカンからなる油相が調製された。前駆体ゾルを１０００ｍＬの丸底フラスコ中で油相と結合し（ゾル：油の体積比１：３）、２分間激しく撹拌して油中水型エマルションの形成を促進し、ロータリーエバポレーター（Ｒ−２０５、ビュッヒラボラトリーエクイップメント社、スイス）に取り付け、８０℃の水浴中に３０分間置いた。この混合物を次に１２０ｍｂａｒの減圧下で沸騰（３５ｒｐｍ、３時間）させて溶媒を除去した。粒子を３０００ｒｐｍで２０分間遠心し（Ｃｅｎｔｒａ−ＭＰ４Ｒ型、インターナショナル・エクイップメント・カンパニー社、テネシー州チャタヌーガ）、上清を傾瀉した。最後に粒子を５００℃で５時間焼成して界面活性剤及び他の余分な有機物質を除去した。
【０２３４】
未修飾粒子をより親水性にするために、（ｉ）４％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム及び４％（ｖ／ｖ）過酸化水素、並びに（ｉｉ）０．４ＭのＨＣｌ及び４％（ｖ／ｖ）過酸化水素を用いて８０℃で１５分間処理した。次に粒子を水で数回洗浄し、終濃度２５ｍｇ／ｍＬで０．５×Ｄ−ＰＢＳに再懸濁した。２５ｍｇの焼成された粒子を無水エタノール中の１ｍＬの２０％ＡＥＰＴＭＳに添加することによって、ナノ多孔性コアをアミン含有シランであるＡＥＰＴＭＳで修飾した。粒子をＡＥＰＴＭＳ中において室温で一晩培養し、遠心して（５，０００ｒｐｍ、１分間）未反応のＡＥＰＴＭＳを除去し、１ｍＬの０．５×Ｄ−ＰＢＳに再懸濁した。ＡＥＰＴＭＳで修飾した粒子を、５μＬのアミン反応性のフルオロフォア（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７カルボン酸−スクシンイミジルエステル、１ｍｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯ中）を１ｍＬの粒子に添加することによって蛍光標識した。粒子を室温に２時間保った後に、未反応の染料を除去するために遠心した。蛍光標識した粒子を、０．５×Ｄ−ＰＢＳ中において４℃で保存した。直径約２００ｎｍよりも大きい粒子を、カーゴ装填及びリポソーム融合前にサイズ排除クロマトグラフィー又は分画遠心によって除去した。
【０２３５】
＜シリカナノ粒子の特徴＞
ナノ多孔性シリカ粒子並びにカーゴが装填されたプロトセル及びリポソームの動的光散乱法は、ゼータサイザーナノ（マルバーン社、英国ウスターシャー州）を用いて行われた。サンプルを、４８μＬのシリカ粒子（２５ｍｇ／ｍＬ）を２．４ｍｌの０．５×Ｄ−ＰＢＳ中で希釈することによって調製した。溶液を解析のために１ｍＬポリスチレンキュベット（ザルスタット社、独国ニュームブレヒト）に移した。窒素収着は、ＡＳＡＰ−２０２０比表面積・細孔分布測定装置（マイクロメトリックス・インスツルメント社、ジョージア州ノークロス）を用いて行われた。ζ電位値測定は、ゼータサイザーナノ（マルバーン社、英国ウスターシャー州）を用いて行われた。シリカ粒子は、０．５×Ｄ−ＰＢＳで１：５０希釈され、解析のために１ｍＬ折り畳みキャピラリーセル（マルバーン社、英国ウスターシャー州）に移された。
【０２３６】
＜ナノ多孔性シリカ粒子へのリポソームの融合＞
プロトセルを合成するのに用いられる手順は以前に記載されており34、36、62、63（ENREF 33）、簡単にのみ言及される。脂質をアバンティ・ポーラー・リピッズ社に注文し、クロロホルム中に予め溶解して−２０℃に保存した。プロトセル合成の直前に、２．５ｍｇの脂質を窒素流のもとで乾燥し、真空オーブン（１４５０Ｍ型、ＶＷＲインターナショナル社、ペンシルバニア州ウエストチェスター）中に一晩置いて残留溶媒を除去した。脂質を０．５×Ｄ−ＰＢＳ中に濃度２．５ｍｇ／ｍＬで再水和し、Ｍｉｎｉ−エクストルーダーセット（アバンティ・ポーラー・リピッズ社、アラバマ州アラバスター市）を用いて１００ｎｍフィルターを少なくとも１０回通した。得られたリポソーム（直径約１２０ｎｍ）を４℃で最大１週間保存した。ナノ多孔性シリカコア（２５ｍｇ／ｍＬ）を２?４倍体積過剰のリポソームと一緒に室温で３０?９０分間培養した。プロトセルを過剰な脂質の存在下において４℃で最大１ヶ月保存した。過剰な脂質を除去するために、プロトセルを５，０００ｒｐｍで１分間遠心し、２回洗浄し、０．５×Ｄ−ＰＢＳに再懸濁した。
【０２３７】
脂質を再水和及び押し出し前にまとめて凍結乾燥した。例えば、７５μＬのＤＯＰＣ（２５ｍｇ／ｍＬ）、５μＬのＤＯＰＥ（２５ｍｇ／ｍＬ）、１０μＬのコレステロール（７５ｍｇ／ｍＬ）、及び１０μＬの１８：１−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ（２５ｍｇ／ｍＬ）を組み合わせて、５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００を含むＤＯＰＣからなるリポソームを形成するために乾燥した。「ＤＯＰＣプロトセル」を合成するために、ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥ：コレステロール：１８：１−ＰＥＧ−２０００−ＰＥの質量比５５：５：３０：１０が用いられ、「ＤＯＴＡＰプロトセル」を合成するために、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：コレステロール：１８：１−ＰＥＧ−２０００−ＰＥの質量比５５：５：３０：１０が用いられた。
【０２３８】
＜担持された脂質二重層へのペプチドのコンジュゲート＞
Ｃ末端システイン残基を持つように合成されたＳＰ９４ペプチド及びＨ５ＷＹＧペプチドを、へテロ二官能性の架橋剤ＳＭ（ＰＥＧ）24を用いて、ＰＥの頭部基中に存在する１級アミンにコンジュゲートした。ＳＭ（ＰＥＧ）24は、スルフヒドリル部分及びアミン部分と反応性であり９．５２ｎｍのＰＥＧスペーサーアームを有する。プロトセルを、先ず１０倍モル過剰のＳＭ（ＰＥＧ）24と一緒に室温で２時間培養し、遠心して（５，０００ｒｐｍ、１分間）未反応の架橋剤を除去した。次に、活性化されたプロトセルを、ペプチド密度０．０１５ｗｔ％（約６個のペプチド／プロトセル）に達するように５倍モル過剰のＳＰ９４と一緒に室温で２時間培養し、ペプチド密度０．５００ｗｔ％（約２４０個のペプチド／プロトセル）に達するように５００倍モル過剰のＨ５ＷＹＧと一緒に室温で４時間培養した。プロトセルを遊離のペプチドを除去するために洗浄し、平均ペプチド密度を以前に記載されたようにトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定した34。
【０２３９】
＜ｓｉＲＮＡが装填されたプロトセル及びリシン毒素Ａ鎖が装填されたプロトセルの合成＞
未修飾コア又はＡＥＰＴＭＳで修飾したコア（２５ｍｇ／ｍＬ）を、ｓｉＲＮＡ（２５０μΜ、１×Ｄ−ＰＢＳ中）中又は脱グリコシル化されたリシン毒素Ａ鎖（１００μΜ、１×Ｄ−ＰＢＳ中）中に４℃で２時間浸漬した。未被包のカーゴを５，０００ｒｐｍでの１分間の遠心によって除去し、ＤＯＰＣリポソームを上記のようにカーゴが装填されたコアに直ちに融合した。未修飾コアは、本発明者が以前に記載した相助作用的な方法によってｓｉＲＮＡを装填された36。簡潔に言えば、２５μＬのｓｉＲＮＡ（１ｍＭ）が、７５μｌのシリカナノ粒子（２５ｍｇ／ｍＬ）に添加された。溶液を静かに渦動させ、そして２００μＬのＤＯＴＡＰリポソームと一緒に４℃で一晩培養した。余分な脂質及び被包されていないｓｉＲＮＡを、使用直前に遠心によって除去した。
【０２４０】
＜ｓｉＲＮＡが装填されたリポプレックスの合成＞
ｓｉＲＮＡが装填されたＤＯＰＣリポプレックスを調製するために、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及び１８：１−ＰＥＧ−２０００−ＰＥを、先ず５５：５：３０：１０の質量比で混合し、窒素流のもとで乾燥し、真空オーブン中に一晩置いて残留クロロホルムを除去した。その脂質フィルムを、次にｔｅｒｔ−ブタノール中に溶解し、最終的なＤＯＰＣ：ｓｉＲＮＡ比が１０：１（ｗ／ｗ）になるように、ｓｉＲＮＡ溶液（０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ及び０．２５Ｍショ糖を含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で希釈したもの）と１：１（ｖ／ｖ）で混合した。混合物を渦動させ、アセトン及びドライアイスの浴槽中で急速冷凍して凍結乾燥させた。使用直前に、リポプレックス調製物を、等張ショ糖溶液（０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ及び０．２５Ｍショ糖を含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））を用いて１００μｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ終濃度に水和した。被包されていないｓｉＲＮＡを遠心濾過（１０ｋＤａＭＷＣＯ）によって除去した。
【０２４１】
本発明者は、軽微な変更を加えて、Wuらによって記載されたようにしてｓｉＲＮＡが装填されたＤＯＴＡＰリポプレックスを調製した64。本発明者はＰＥＧ化セラミドの代わりに１８：１−ＰＥＧ−２０００−ＰＥを用い、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＰＥＧ−２０００−ＰＥ比５５：５：３０：１０を用いた。さらに本発明者は、０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ及び０．２５Ｍショ糖を含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中に凍結乾燥されたリポプレックスを溶解してｓｉＲＮＡ終濃度１００μｇ／ｍＬにし、遠心濾過器具（１０ｋＤａＭＷＣＯ）を用いて被包されていないｓｉＲＮＡを除去した。リポプレックスは、ζ電位分析のために０．５×Ｄ−ＰＢＳ中に溶解された。
【０２４２】
ＤＯＰＣリポプレックス及びＤＯＴＡＰリポプレックスをＳＰ９４及びＨ５ＷＹＧで修飾するために、それらを先ず１０倍モル過剰のＳＭ（ＰＥＧ）24と一緒に室温で２時間培養した。遠心濾過（１０ｋＤａＭＷＣＯ）による未反応の架橋剤の除去後、それらを５倍モル過剰のＳＰ９４及び１０００倍モル過剰のＨ５ＷＹＧと一緒に室温で２時間培養した。遊離のペプチドを遠心濾過器具（１０ｋＤａＭＷＣＯ）を用いて除去した。
【０２４３】
＜ＲＴＡが装填されたリポソームの合成＞
ＲＴＡが装填されたＤＯＰＣリポソームを調製するために、２．５ｍｇの脂質（５５：５：３０：１０の質量比のＤＯＰＣ：ＤＯＰＥ：コレステロール：１８：１−ＰＥＧ−２０００−ＰＥ）を窒素流のもとで乾燥し、真空オーブン（１４５０Ｍ型、ＶＷＲインターナショナル社、ペンシルバニア州ウエストチェスター）中に一晩置いて残留溶媒を除去した。脂質を０．５×Ｄ−ＰＢＳに濃度２．５ｍｇ／ｍＬで再水和し、短時間音波処理し、等体積のＲＴＡ（１００μΜ、０．５×Ｄ−ＰＢＳ中）と混合した。この混合物を渦動させ、アセトン及びドライアイスの浴槽中で急速冷凍して凍結乾燥させた。使用の直前に、リポソーム調製物を上記の等張ショ糖溶液で再水和し、激しく渦動させ、そして室温で２?４時間静置した。次にリポソームを、ミニエクストルーダーセット（アバンティ・ポーラー・リピッズ社、アラバマ州アラバスター）を用いて１００ｎｍフィルターを少なくとも１０回通し、セファデックス（登録商標）Ｇ−２００カラムを通して被包されていないＲＴＡを除去した。ＲＴＡが装填されたリポソームを、上記のようにＳＰ９４及びＨ５ＷＹＧで修飾した。
【０２４４】
＜カーゴ収容能力及び放出速度の測定＞
プロトセル、リポプレックス、及びリポソームのｓｉＲＮＡ及びリシン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ）の収容能力は、１×１０10個の粒子を１ｗｔ％のＳＤＳ（Ｄ−ＰＢＳに溶解したもの）中で２４時間培養し、溶液を遠心してプロトセルコア及び他の破片を除去することによって測定された。上清中のｓｉＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍの吸光度を標準曲線と比較することによって算出された。上清中のＲＴＡ濃度は、ＩｍａｇｅＪ画像処理・解析ソフトウェア（アメリカ国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ）を用いてバンド強度を標準曲線と比較することにより、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって算出された。
【０２４５】
中性ｐＨ条件下及び酸性ｐＨ条件下におけるｓｉＲＮＡ及びＲＴＡの放出速度が、１×１０10個の粒子を１ｍＬの疑似体液（１５０ｍＭのＮａＣｌ及び１０％血清を含むＥＭＥＭ、ｐＨ７．４）又はクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に３７℃で様々な時間懸濁することによって測定された。粒子は、遠心（プロトセルについては５，０００×ｇで５分、リポソームについては１５，０００×ｇで３０分、マイクロフュージ（登録商標）１６遠心機、ベックマンコールター社、カリフォルニア州ブレア）によってペレット化された。上清中のｓｉＲＮＡ濃度及びＲＴＡ濃度は、ＵＶ−可視光分光及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて上記のように算出された。放出されたカーゴの濃度は、１０10個の粒子中に初期に被包されていたカーゴ濃度に対する割合（％）に変換された。
【０２４６】
＜サイクリンＡ２、Ｂ１、Ｄ１、及びＥのタンパク質発現の定量化＞
サイクリンＡ２、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、又はサイクリンＥの発現の９０％を発現抑制するのに必要なｓｉＲＮＡ濃度（ＩＣ90、図３５Ａ参照）を測定するために、１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ細胞を、ＳＰ９４によって標的を定められたＤＯＰＣプロトセルに装填された様々な濃度のｓｉＲＮＡに３７℃で４８時間暴露した。細胞を遠心して（１０００ｒｐｍ、１分間）余分な粒子を除去し、３．７％ホルムアルデヒドで固定し（室温で１５分）、０．２％トリトンＸ−１００を用いて透過処理した（室温で５分）。次に細胞を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８抗体標識キットを用いて標識された１：５００希釈の抗サイクリンＡ２、抗サイクリンＢ１、抗サイクリンＤ１、又は抗サイクリンＥに３７℃で１時間暴露した。細胞をＤ−ＰＢＳで３回洗浄し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）分析のためにＤ−ＰＢＳに再懸濁した。グラフパッドプリズム（グラフパッドソフトウェア社（カリフォルニア州ラホーヤ））を用いて、Ｌｏｇ（ｓｉＲＮＡ濃度）対平均蛍光強度のプロットからＩＣ90値を算出した。初期タンパク質濃度は、ｓｉＲＮＡが装填されたプロトセルに５分間暴露された、抗体で標識された細胞の平均蛍光強度とされた。
【０２４７】
サイクリンＡ２、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、及びサイクリンＥの発現の時間に依存した減少（図３５Ｂ参照）を測定するために、ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたＤＯＰＣプロトセルを、ｓｉＲＮＡ終濃度が１２５ｐＭとなるように１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ細胞と混合した。細胞及びプロトセルを３７℃で様々な時間連続して培養し、生じたタンパク質レベルを上記のように免疫蛍光によって測定した。
【０２４８】
図３５Ｃ（左軸）に示されるデータを取得するために、ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたＤＯＰＣプロトセル、ＤＯＰＣリポプレックス、又はＤＯＴＡＰリポプレックスの十分な量を、ｓｉＲＮＡ終濃度が１２５ｐＭとなるように１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ又は肝細胞に添加した。サンプルを３７℃で４８時間培養し、サイクリンＡ２の発現において生じた減少を上記のように定量化した。図３５Ｃ（右軸）に表示された値を測定するために、１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ細胞を、ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められた様々な濃度（粒子数／ｍＬ）のＤＯＰＣプロトセル、ＤＯＰＣリポプレックス、又はＤＯＴＡＰリポプレックスに３７℃で４８時間暴露した。サイクリンＡ２の発現は、免疫蛍光を用いて定量化された。サイクリンＡ２の発現を９０％抑えるのに必要な粒子数は、粒子濃度対サイクリンＡ２濃度のプロットから算出された。
【０２４９】
図３６に示す細胞は、ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められた、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識されたコアを有する１０倍の過剰量のＤＯＰＣプロトセルに、３７℃で１時間又は４８時間連続して暴露された。細胞をＤ−ＰＢＳで３回洗浄し、ヘキスト３３３４２を用いて使用説明書に従って標識した。３．７％ホルムアルデヒドを用いて固定し（室温で１５分）、０．２％トリトンＸ−１００（室温で５分）を用いて透過処理し、Ｉｍａｇｅ−ｉＴ（登録商標）ＦＸシグナル増強剤でブロッキングした（室温で３０分）。次に細胞を、４℃で一晩、サイクリンＡ２、Ｂ１、Ｄ１、又はＥ（１％ＢＳＡで１：５００希釈したもの）に対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識抗体に暴露し、Ｄ−ＰＢＳで３回洗浄し、ＳｌｏｗＦａｄｅ（登録商標）ゴールドを用いてスライドに載せた。
【０２５０】
＜ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルによって誘発されるアポトーシスの定量化＞
ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルに暴露されたＨｅｐ３Ｂ及び肝細胞の時間に依存した生存性（図３７Ａ参照）を、１×１０6個の細胞を１２５ｐＭのｓｉＲＮＡと一緒に３７℃で様々な時間培養することによって測定した。細胞を遠心して（１０００ｒｐｍ、１分間）余分なプロトセルを除去し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（登録商標）標識アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムを用いて染色した。生存（二重陰性）細胞及び非生存（単独陽性又は二重陽性）細胞の個数は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）によって測定された。
【０２５１】
図３７Ｂ及び３７Ｃに示される細胞は、ｓｉＲＮＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められた、１０倍の過剰量のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識されたコアを有するプロトセルに３７℃で１時間又は４８時間暴露された。次に細胞をＤ−ＰＢＳで３回洗浄し、ヘキスト３３３４２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識アネキシンＶ、及びヨウ化プロピジウムを用いて使用説明書に従って染色し、固定して（３．７％ホルムアルデヒド、室温で１０分間）、ＳｌｏｗＦａｄｅ（登録商標）ゴールドを用いてスライドに載せた。
【０２５２】
＜新生タンパク質合成の定量化＞
ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたＤＯＰＣプロトセルのＩＣ90値（図３９Ａ参照）は、１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度のプロトセルに被包されたＲＴＡと一緒に３７℃で４８時間培養することによって測定された。新生タンパク質合成に生じた減少を、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ  ＡＨＡ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８タンパク質合成ＨＣＳアッセイを用いて検出し（使用説明書に従った）、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）によって定量化した。各サンプルの平均蛍光強度をｌｏｇ（毒素濃度）に対してプロットし、グラフパッドプリズムを用いてＩＣ90値を算出した。
【０２５３】
新生タンパク質合成の時間に依存した低下（図３９Ｂ参照）は、ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセル（［ＲＴＡ］＝２５ｐＭ）を、１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ細胞と一緒に３７℃で様々な時間培養することによって測定された。新生タンパク質合成は、上記のように試験された。
【０２５４】
図３９Ｃ（左軸）に示されるデータを収集するために、ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたＤＯＰＣプロトセル又はリポソームの十分な量が、ＲＴＡ終濃度が２５ｐＭになるように１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ又は肝細胞に添加された。サンプルを３７℃で４８時間培養し、新生タンパク質合成に生じた減少を上記のように定量化した。図３９Ｃ（右軸）に表示された値を測定するために、ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められた様々な濃度（粒子数／ｍＬ）のＤＯＰＣプロトセル又はリポソームに、１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ細胞を３７℃で４８時間暴露した。タンパク質生合成をＣｌｉｃｋ−ｉＴ  ＡＨＡ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８タンパク質合成ＨＣＳアッセイを用いて定量化し、新生タンパク質合成を９０％抑えるのに必要な粒子数を、粒子濃度対新生タンパク質濃度のプロットから算出した。
【０２５５】
図４０に示される細胞は、ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められた、１０倍の過剰量のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識されたコアを有するＤＯＰＣプロトセルに、３７℃で１時間又は４８時間暴露された。新生タンパク質は、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ  ＡＨＡ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８タンパク質合成ＨＣＳアッセイを用いて標識された（使用説明書に従った）。次に細胞を、ヘキスト３３３４２を用いて使用説明書に従って染色し、３．７％ホルムアルデヒドで固定し（室温で１０分間）、ＳｌｏｗＦａｄｅ（登録商標）ゴールドを用いてスライドに載せた。
【０２５６】
＜ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたプロトセルによって誘発されるアポトーシスの定量化＞
カスパーゼ−９及びカスパーゼ−３の時間に依存した活性化（図４１Ａ参照）を、１×１０6個のＨｅｐ３Ｂ及び肝細胞を、ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められたＤＯＰＣプロトセルに３７℃で様々な時間連続して暴露することによって測定した（［ＲＴＡ］＝２５ｐＭ）。カスパーゼ活性化の程度は、ＣａｓｐＧＬＯＷ（商標）フルオレセイン活性カスパーゼ−９染色キット及びＣａｓｐＧＬＯＷ（商標）レッド活性カスパーゼ−３染色キットを用いて定量化された。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）を使用して、緑色蛍光（ＦＬ１）及び／又は赤色蛍光（ＦＬ２）をバックグラウンド（生存Ｈｅｐ３Ｂ細胞）よりも１００倍高いレベルで発現している細胞数を測定した。アポトーシス性細胞は、カスパーゼ−９及び／又はカスパーゼ−３に陽性のものとして定義された。
【０２５７】
図４１Ｂ及び４１Ｃに示される細胞は、ＲＴＡが装填され、ＳＰ９４によって標的を定められた、１０倍の過剰量のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識されたコアを有するＤＯＰＣプロトセルに、３７℃で４８時間暴露された。活性カスパーゼ−９及び活性カスパーゼ−３は、ＣａｓｐＧＬＯＷ（商標）フルオレセイン活性カスパーゼ−９染色キット及びＣａｓｐＧＬＯＷ（商標）レッド活性カスパーゼ−３染色キットを（それぞれ）用いて標識された。次に細胞をＤ−ＰＢＳで３回洗浄し、ヘキスト３３３４２を用いて使用説明書に従って染色し、固定して（３．７％ホルムアルデヒド、室温で１０分間）、ＳｌｏｗＦａｄｅ（登録商標）ゴールドを用いてスライドに載せた。
【０２５８】
＜フローサイトメトリーの装置及び設定＞
図３５Ａ?Ｃ、３６Ｄ、３９Ａ?Ｃ、及び４１Ａでは、細胞サンプルは、ＢＤ−ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）ソフトウェアｖｅｒ．５．２．１を備えたＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータ（ベクトン・ディッキンソン社、ニュージャージー州フランクリンレイクス）を用いて分析された。サンプルは、ＦＳＣチャンネルは線形モード、その他の全チャンネルはＬｏｇモードで取り込まれた。事象は前方散乱光に基づいて起こされ、細胞の破片を除外するゲートを前方散乱−側方散乱プロット上に設定した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８及びフルオレセインを４８８ｎｍレーザー光源を用いて励起し、発光強度をＦＬ１チャンネル（５３０／３０フィルター／バンドパス）で集めた。ヨウ化プロピジウム及びスルホローダミン（ＣａｓｐＧＬＯＷ（商標）レッド活性カスパーゼ−３染色キット）を４８８ｎｍレーザー光源を用いて励起し、発光強度をＦＬ２チャンネル（５８５／４２）で集めた。平均蛍光強度をＦｌｏｗＪｏソフトウェアｖｅｒ．６．４（ＴｒｅｅＳｔａｒ社、オレゴン州アッシュランド）を用いて算出した。全てのプロットは、シグマプロットｖｅｒ．１１．０（シスタットソフトウェア社、カリフォルニア州サンホセ）を用いて作成された。
【０２５９】
＜共焦点蛍光顕微鏡法の装置及び設定＞
３色画像及び４色画像は、ＬＳＭ５１０ソフトウェアのチャンネルモードで操作されたツァイスＬＳＭ５１０−ＭＥＴＡ（カールツァイスマイクロイメージング社、ニューヨーク州ソーンウッド）を用いて得られた。全てのイメージングで、６３倍の１．４−ＮＡ油浸対物レンズを用いた。通常のレーザー出力設定は、４０５ｎｍダイオードレーザーについては３０％透過、４８８ｎｍアルゴンレーザーについては５％透過（６０％出力）、５４３ｎｍのＨｅＮｅレーザーについては１００％透過、６３３ｎｍのＨｅＮｅレーザーについては８５％透過であった。ゲイン及びオフセットは、飽和を回避するために各チャンネルについて調整され、通常はそれぞれが５００?７００及び−０．１に維持された。１０２４×１０２４分解能の８ビットのｚスタックを、０．７?０．９μｍの光学スライスを用いて得た。複数のチャンネルを重ね合わせるため及びｚスタック画像を重ね合わせた投影像を作成するために、ＬＳＭ５１０ソフトウェアを用いた。全ての蛍光画像は、重ね合わされた投射画像である。
【０２６０】
全ての顕微鏡実験に関して、細胞は、培養フラスコ中で７０?８０％コンフルエントになるまで培養され、回収され（０．０５％トリプシン、１０分間）、４０００ｒｐｍで２分間遠心され、そして完全増殖培地に再懸濁された。１×１０4?１×１０6細胞／ｍＬを０．０１％ポリＬ−リジン（１５０?３００ｋＤａ）でコーティングされた無菌カバーガラス（２５ｍｍ、Ｎｏ．１．５）上に播種し、３７℃で４?２４時間接着した後にプロトセルに暴露した。４８時間のサンプルは、Ｃｙｔｏｐｒｏ（登録商標）遠心機７６２０型（Ｗｅｓｃｏｒ社、ユタ州ローガン）を用いてカバーガラス上に再度遠心沈降された。
【０２６１】
＜実施例３の参考文献＞
１．Peer D, Karp JM, Hong S, Farokhzad OC, Margalit R, Langer R. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nat Nano. 2007;2(12):751-760.
２．Petros RA, DeSimone JM. Strategies in the design of nanoparticles for therapeutic applications. Nat Rev Drug Discov. 2010;9(8):615-627.
３．Wang M, Thanou M. Targeting nanoparticles to cancer. Pharmacological Research. 2010;62(2):90-99.
４．Meister G, Tuschl T. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature. 2004;431(7006):343-349.
５．Rana TM. Illuminating the silence: understanding the structure and function of small RNAs. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007;8(l):23-36.
６．Davidson BL, McCray PB. Current prospects for RNA interference-based therapies. Nat Rev Genet. 2011;12(5):329-340.
７．Lares MR, Rossi JJ, Ouellet DL. RNAi and small interfering RNAs in human disease therapeutic applications. Trends in Biotechnology. 2010;28(l l):570-579.
８．Bumcrot D, Manoharan M, Koteliansky V, Sah DWY. RNAi therapeutics: a potential new class of pharmaceutical drugs. Nat Chem Biol. 2006;2(12):711-719.
９．Aagaard L, Rossi JJ. RNAi therapeutics: Principles, prospects and challenges. Advanced Drug Delivery Reviews. 2007;59(2-3):75-86.
１０．Ozpolat B, Sood AK, Lopez-Berestein G. Nanomedicine based approaches for the delivery of siRNA in cancer. Journal of Internal Medicine. 2010;267(l):44-53.
１１．Petrocca F, Lieberman J. Promise and Challenge of RNA Interference-Based Therapy for Cancer. Journal of Clinical Oncology. February 20, 2011 2011;29(6):747-754.
１２．de Fougerolles A, Vornlocher H-P, Maraganore J, Lieberman J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2007;6(6):443-453.
１３．Davis ME, Zuckerman JE, Choi CHJ, et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 2010;464(7291):1067-1070.
１４．Jackson AL, Burchard J, Leake D, et al. Position-specific chemical modification of siRNAs reduces "off-target" transcript silencing. RNA. July 1, 2006 2006;12(7): 1197-1205.
１５．Judge AD, Sood V, Shaw JR, Fang D, McClintock K, MacLachlan I. Sequence-dependent stimulation of the mammalian innate immune response by synthetic siRNA. Nat Biotech. 2005;23(4):457-462.
１６．Soutschek J, Akinc A, Bramlage B, et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 2004;432(7014):173-178.
１７．Pecot CV, Calin GA, Coleman RL, Lopez-Berestein G, Sood AK. RNA interference in the clinic: challenges and future directions. Nat Rev Cancer. 2011;11(l):59-67.
１８．Whitehead KA, Langer R, Anderson DG. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat Rev Drug Discov. 2009;8(2):129-138.
１９．Edbrooke M, Clarke N. RNAi Therapeutics: addressing targets? Eur Pharm Rev. August 2008 2008;4:1 1-17.
２０．Alderson RF, Kreitman RJ, Chen T, et al. CAT-8015: A Second-Generation Pseudomonas Exotoxin A-Based Immunotherapy Targeting CD22-Expressing Hematologic Malignancies. Clinical Cancer Research. February 1, 2009 2009;15(3):832-839.
２１．Wayne AS, Kreitman RJ, Findley HW, et al. Anti-CD22 Immunotoxin RFB4(dsFv)-PE38(BL22) for CD22-Positive Hematologic Malignancies of Childhood: Preclinical Studies and Phase I Clinical Trial. Clinical Cancer Research. March 15, 2010 2010;16(6):1894-1903.
２２．Pastan I, Hassan R, FitzGerald DJ, Kreitman RJ. Immunotoxin therapy of cancer. Nat Rev Cancer. 2006;6(7):559-565.
２３．Cauda V, Argyo C, Bein T. Impact of different PEGylation patterns on the long-term bio-stability of colloidal mesoporous silica nanoparticles. Journal of Materials Chemistry. 2010;20(39):8693-8699.
２４．Cauda V, Argyo C, Schlossbauer A, Bein T. Controlling the delivery kinetics from colloidal mesoporous silica nanoparticles with pH-sensitive gates. Journal of Materials Chemistry. 2010;20(21):4305-4311.
２５．Cauda V, Engelke H, Sauer A, et al. Colchicine-Loaded Lipid Bilayer-Coated 50 nm Mesoporous Nanoparticles Efficiently Induce Microtubule Depolymerization upon Cell Uptake. Nano Letters. 2010/07/14 2010;10(7):2484-2492.
２６．Cauda V, Muehistein L, Onida B, Bein T. Tuning drug uptake and release rates through different morphologies and pore diameters of confined mesoporous silica. Microporous Mesoporous Mater. 2009;118:435-442.
２７．Cauda V, Schlossbauer A, Bein T. Bio-degradation study of colloidal mesoporous silica nanoparticles: Effect of surface functionalization with organo.silanes and poly(ethylene glycol). Microporous Mesoporous Mater. 2010;132:60-71.
２８．Horn C, Lu J, Liong M, et al. Mesoporous Silica Nanoparticles Facilitate Delivery of siRNA to Shutdown Signaling Pathways in Mammalian Cells. Small.
2010;6(11):1185-1190.
２９．Liong M, Lu J, Kovochich M, et al. Multifunctional Inorganic Nanoparticles for Imaging, Targeting, and Drug Delivery. ACS Nano. 2008/05/01 2008;2(5):889-896.
３０．Meng H, Liong M, Xia T, et al. Engineered Design of Mesoporous Silica Nanoparticles to Deliver Doxorubicin and P-Glycoprotein siRNA to Overcome Drug Resistance in a Cancer Cell Line. ACS Nano. 2010/08/24 2010;4(8):4539-4550.
３１．Meng H, Xue M, Xia T, et al. Autonomous in Vitro Anticancer Drug Release from Mesoporous Silica Nanoparticles by pH-Sensitive Nanovalves. Journal of the American Chemical Society. 2010/09/15 2010;132(36):12690-12697.
３２．Sauer AM, Schlossbauer A, Ruthardt N, Cauda V, Bein T, Brauchle C. Role of Endosomal Escape for Disulfide-Based Drug Delivery from Colloidal Mesoporous Silica Evaluated by Live-Cell Imaging. Nano Letters. 2010/09/08 2010;10(9):3684-3691.
３３．Xia T, Kovochich M, Liong M, et al. Polyethyleneimine Coating Enhances the Cellular Uptake of Mesoporous Silica Nanoparticles and Allows Safe Delivery of siRNA and DNA Constructs. ACS Nano. 2009/10/27 2009;3(10):3273-3286.
３４．Ashley CE, Carnes EC, Phillips GK, et al. The targeted delivery of multicomponent cargos to cancer cells by nanoporous particle-supported lipid bilayers. Nat Mater. 2011;10 5):389-397.
３５．Carroll NJ, Pylypenko S, Atanassov PB, Petsev DN. Microparticles with Bimodal Nanoporosity Derived by Microemulsion Templating. Langmuir. 2009;25:13540-13544.
３６．Liu J, Stace-Naughton A, Jiang X, Blinker CJ. Porous Nanoparticle Supported Lipid Bilayers (Protocells) as Delivery Vehicles. Journal of the American Chemical Society. 2009/02/04 2009;131(4):1354-1355.
３７．Pines J. Cyclins: wheels within wheels. Cell Growth Differ. June 1, 1991 1991;2(6):305-310.
３８．Lord MJ, Jolliffe NA, Marsden CJ, et al. Ricin: Mechanisms of Cytotoxicity. Toxicological Reviews. 2003;22(l):53-64.
３９．Herrera L, Bostrom B, Gore L, et al. A Phase 1 Study of Combotox in Pediatric Patients With Refractory B-lineage Acute Lymphoblastic Leukemia. Journal of Pediatric Hematology/Oncology. 2009;31(12):936-941 910.1097/MPH.1090bl013e3181bdfl211.
４０．Herrera L, Yarbrough S, Ghetie V, Aquino DB, Vitetta ES. Treatment ofSCID//human B cell precursor ALL with anti-CD 19 and anti-CD22 immunotoxins. Leukemia. 2003;17(2):334-338.
４１．Grimm D, Kay MA. Therapeutic application of RNAi: is mRNA targeting finally ready for prime time? The Journal of Clinical Investigation. 2007;117(12):3633-3641.
４２．Chen Y, Bathula SR, Li J, Huang L. Multifunctional Nanoparticles Delivering Small Interfering RNA and Doxorubicin Overcome Drug Resistance in Cancer. Journal of Biological Chemistry. July 16, 2010 2010;285(29):22639-22650.
４３．Li S-D, Chen Y-C, Hackett MJ, Huang L. Tumor-targeted Delivery of siRNA by Self-assembled Nanoparticles. Mol Ther. 2007;16(1):163-169.
４４．Howard KA, Rahbek UL, Liu X, et al. RNA Interference in Vitro and in Vivo Using a Chitosan/siRNA Nanoparticle System. Mol Ther. 2006;14(4):476-484.
４５．Hu-Lieskovan S, Heidel JD, Bartlett DW, Davis ME, Triche TJ. Sequence-Specific Knockdown of EWS-FLI1 by Targeted, Nonviral Delivery of Small Interfering RNA Inhibits Tumor Growth in a Murine Model of Metastatic Ewing's Sarcoma. Cancer Research. October 1, 2005 2005;65(19):8984-8992.
４６．Schiffelers RM, Ansari A, Xu J, et al. Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle. Nucleic Acids Research. January 1, 2004 2004;32(19):el49.
４７．Cheng H, Zhu J-L, Zeng X, Jing Y, Zhang X-Z, Zhuo R-X. Targeted Gene Delivery Mediated by Folate-polyethylenimine-block-poly(ethylene glycol) with Receptor Selectivity. Bioconjugate Chemistry. 2009/03/18 2009;20(3):481-487.
４８．DiFiglia M, Sena-Esteves M, Chase K, et al. Therapeutic silencing of mutant huntingtin with siRNA attenuates striatal and cortical neuropathology and behavioral deficits. Proceedings of the National Academy of Sciences. October 23, 2007 2007;104(43): 17204-17209.
４９．Chen Y, Zhu X, Zhang X, Liu B, Huang L. Nanoparticles Modified With Tumor-targeting scFv Deliver siRNA and miRNA for Cancer Therapy. Mol Ther.
2010;18(9):1650-1656.
５０．Orava EW, Cicmil N, Gariepy J. Delivering cargoes into cancer cells using DNA aptamers targeting internalized surface portals. Biochim Biophys Acta. 2010;1798(12):2190-2200.
５１．Becker AL, Orlotti NI, Folini M, et al. Redox-Active Polymer Microcapsules for the Delivery of a Survivin-Specific siRNA in Prostate Cancer Cells. ACS Nano. 2011/02/22 2011;5(2):1335-1344.
５２．MacDiarmid JA, Amaro-Mugridge NB, Madrid-Weiss J, et al. Sequential treatment of drug-resistant tumors with targeted minicells containing siRNA or a cytotoxic drug. Nat Biotech. 2009;27(7):643-651.
５３．Tanaka T, Mangala LS, Vivas-Mejia PE, et al. Sustained Small Interfering RNA Delivery by Mesoporous Silicon Particles. Cancer Research. May 1, 20102010;70(9):3687-3696.
５４．Li J, Chen Y-C, Tseng Y-C, Mozumdar S, Huang L. Biodegradable calcium phosphate nanoparticle with lipid coating for systemic siRNA delivery. Journal of Controlled Release. 2010;142(3):416-421.
５５．Li S-D, Huang L. Targeted Delivery of Antisense Oligodeoxynucleotide and Small Interference RNA into Lung Cancer Cells. Molecular Pharmaceutics. 2006/10/01 2006;3(5):579-588.
５６．Pirollo KF, Rait A, Zhou Q, et al. Materializing the Potential of Small Interfering RNA via a Tumor-Targeting Nanodelivery System. Cancer Research. April 1, 2007 2007;67(7):2938-2943.
５７．Sun T-M, Du J-Z, Yao Y-D, et al. Simultaneous Delivery of siRNA and Paclitaxel via a "Two-in-One" Micelleplex Promotes Synergistic Tumor Suppression. ACS Nano. 2011/02/22 2011;5(2): 1483-1494.
５８．Xiong X-B, Lavasanifar A. Traceable Multifunctional Micellar Nanocarriers for Cancer-Targeted Co-delivery of MDR-1 siRNA and Doxorubicin. ACS Nano.
2011/06/28 2011;5(6):5202-5213.
５９．Chen Y, Bathula SR, Yang Q, Huang L. Targeted Nanoparticles Deliver siRNA to Melanoma. J Invest Dermatol. 2010;130(12):2790-2798.
６０．Chono S, Li S-D, Conwell CC, Huang L. An efficient and low immunostimulatory nanoparticle formulation for systemic siRNA delivery to the tumor. Journal of Controlled Release. 2008;13 l (l):64-69.
６１．Bhattarai S, Muthuswamy E, Wani A, et al. Enhanced Gene and siRNA Delivery by Polycation-Modified Mesoporous Silica Nanoparticles Loaded with Chloroquine. Pharmaceutical Research. 2010;27(12):2556-2568.
６２．Liu JW, Jiang XM, Ashley C, Brinker CJ. Electrostatically Mediated Liposome Fusion and Lipid Exchange with a Nanoparticle-Supported Bilayer for Control of Surface Charge, Drug Containment, and Delivery. Journal of the American Chemical Society. Jun 2009;131(22):7567-7569.
６３．Liu JW, Stace-Naughton A, Brinker CJ. Silica nanoparticle supported lipid bilayers for gene delivery. Chemical Communications. 2009(34):5100-5102.
６４．Wu SY, Singhania A, Burgess M, et al. Systemic delivery of E6/7 siRNA using novel lipidic particles and its application with cisplatin in cervical cancer mouse models. Gene Ther. 2011;18(l):14-22.
６５．Lo A, Lin C-T, Wu H-C. Hepatocellular carcinoma cell-specific peptide ligand for targeted drug delivery. Molecular Cancer Therapeutics. March 1, 20082008;7(3):579-589.
６６．Moore NM, Sheppard CL, Barbour TR, Sakiyama-Elbert SE. The effect of endosomal escape peptides on in vitro gene delivery of polyethylene glycol-based vehicles. The Journal of Gene Medicine. 2008;10(10):1134-1149.
【実施例４】
【０２６２】
［メソ多孔性シリカナノ粒子に担持された脂質二重層（ＭＳＮ−ＳＬＢ）による、ニパウイルスに「感染した」宿主細胞への治療用のＲＮＡ及びＤＮＡの標的送達］
ニパウイルス（ＮｉＶ）は、パラミクソウイルス科の極めて病原性の高いメンバーであり、その多数の伝播経路及び感染に伴う高い致死率によりＢＳＬ−４規制病原体に分類される。しかしながらＮｉＶの細胞指向性の理解での最近の進展にもかかわらず、治療法は主として支持療法に留まっている。この目的のために、本発明者は、ＮｉＶ遺伝子でトランスフェクションされたモデル宿主細胞に高濃度の治療用ＲＮＡ及びＤＮＡを特異的に送達する、メソ多孔性シリカナノ粒子に担持された脂質二重層（ＭＳＮ−ＳＬＢ。ネイチャー・マテリアルズ誌（２０１１年）第１０巻ｐ．３８９−３９７参照）を開発した。ＭＳＮ−ＳＬＢは、１００ｎｍのメソ多孔性シリカナノ粒子へのリポソーム（ペプチド用及びＰＥＧコンジュゲート用の５ｗｔ％のＤＯＰＥを含むＤＯＰＣ）の融合によって形成される。その大きい表面積（＞１０００ｍ2／ｇ）及び表面から利用可能な大きな（２０?２５ｎｍ）細孔により、メソ多孔性シリカコアは、ＮｉＶヌクレオカプシドタンパク質（ＮｉＶ−Ｎ）ｍＲＮＡの配列特異的分解を誘発する高濃度（約１μΜ／１０10個の粒子）のｓｉＲＮＡを迅速に装填されることができる。ｓｉＲＮＡが装填されたコアへのリポソーム融合は、長期的な（＞３ヶ月）カーゴ保持を促進し、かつリガンド提示用の流動性界面を提供する担持された脂質二重層（ＳＬＢ）をもたらす。ＭＳＮ−ＳＬＢの二重層は、モデル宿主細胞へのｓｉＲＮＡの細胞質送達を可能にするために、ターゲティングペプチド、マクロピノサイトーシスを誘発するペプチド（Ｒ８）、及びＰＥＧの複数のコピーで修飾される。
【０２６３】
本発明者は、ファージディスプレイを用いて、エフリンＢ２（ＥＢ２）に結合するペプチドを特定した。エフリンＢ２（ＥＢ２）は、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、及びＥｐｈＢ４チロシンキナーゼの膜貫通アンカー型リガンドであり、ヒト内皮細胞及びニューロンによって発現されてマクロピノサイトーシスによるＮｉＶ感染の主要な受容体として機能する。ＴＧＡＩＬＨＰ（配列番号１８）は、ヒトＥＢ２を発現するようにトランスフェクションされたＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する５ラウンドの親和性選択、並びに親ＣＨＯ−Ｋ１細胞及びヒトエフリンＢ１を発現するようにトランスフェクションされたＣＨＯ−Ｋ１細胞の両方に対するカウンター選択後での主配列であった。本発明者は、フローサイトメトリーを用いて、ＴＧＡＩＬＨＰによって標的を定められたＭＳＮ−ＳＬＢが、高（１．５ｗｔ％又は約５００個のペプチド／粒子）ペプチド価及び低（０．０１５ｗｔ％又は約５個のペプチド／粒子）ペプチド価の両方において、ＥＢ２陽性細胞（ＨＥＫ２９３）に対してナノモルの親和性を有することを見いだした。重要なことに、０．０１５ｗｔ％のＴＧＡＩＬＨＰ（配列番号１８）及び１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００（コロイド安定性を促進し非特異的相互作用を抑える）で修飾されたＭＳＮ−ＳＬＢは、ＥＢ２陰性細胞（親ＣＨＯ−Ｋ１）よりもＨＥＫ２９３細胞に対して１０3倍高い親和性を有する。本発明者は、共焦点蛍光顕微鏡法を用いて、０．０１５ｗｔ％のＴＧＡＩＬＨＰ（配列番号１８）及び０．５００ｗｔ％のＲ８で修飾されたＭＳＮ−ＳＬＢがＨＥＫ２９３によって迅速に（ｔ1/2＝５分）内在化されること、並びに様々なマクロピノサイトーシス阻害剤を用いた細胞の前処理が取り込みを６０?８０％低減することを明らかにした。マクロピノソームの酸性化は、（１）ＳＬＢを不安定化して、被包されたｓｉＲＮＡの放出を引き起こし、（２）Ｒ８ペプチドをプロトン化して、プロトンスポンジ効果によってマクロピノソーム膜を崩壊させる。これらは両方とも、ｓｉＲＮＡの細胞質分布を可能にする。
【０２６４】
選択的結合、内在化、及びそれに続くマクロピノソーム脱出は、ＴＧＡＩＬＨＰによって標的を定められた、ｓｉＲＮＡが装填されたＭＳＮ−ＳＬＢが、親ＣＨＯ−Ｋ１細胞中のＮｉＶ−Ｎレベルに影響を与えることなく、ｓｉＲＮＡ濃度約５ｐＭにおいて、ＨＥＫ２９３のＮｉＶ−ＮのｍＲＮＡの９０％を発現抑制することを可能にする。ただし、ｓｉＲＮＡに媒介されるＲＮＡｉは一時的であり、ＮｉＶ−ＮのｍＲＮＡレベルは処理後５日に増大し始める。そこで本発明者は、ＮｉＶ−Ｎに特異的な低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするプラスミドを設計し、ヒストンによってプラスミドをパッケージングし、得られた１８ｎｍの複合体を核局在配列（ＮＬＳ）で修飾した後にシリカコア中に装填した。ＭＳＮ−ＳＬＢは、５０：５０モル比のＤＯＴＡＰ及びＤＯＰＥから形成された対応するリポプレックスよりも、ヒストンでパッケージングされたプラスミド（４．５ｋｂｐ）に関して１００倍高い収容能力を有する。さらに、０．０１５ｗｔ％のＴＧＡＩＬＨＰ（配列番号１８）及び０．５００ｗｔ％のＲ８で修飾された、プラスミドが装填されたＭＳＮ−ＳＬＢは、粒子：細胞比約１：２０（約１７５０プラスミド／細胞）においてＨＥＫ２９３のＮｉＶ−ＮのｍＲＮＡの９０％を発現抑制し、長期的なＲＮＡｉを誘発する。ＮｉＶ−ＮのｍＲＮＡの濃度は、４週間でその初期値の＜１０％に留まる。それらの非常に大きなカーゴ収容能力並びにそれらの安定性及び特異性により、ＭＳＮ−ＳＬＢは、ウイルス複製及び伝播を防止可能な治療薬の送達媒体として有望である。
【実施例５】
【０２６５】
［経皮プロトセル］
プロトセルが角質層透過増強及び経皮送達を促進するように設計されることができるか否かを試験するために、２つの実験が行われた。第１の実験では、目標は、プロトセルの標準的な組成が、角質層を通過する受動拡散又は皮膚の迂回によって、皮膚を通過することが可能かどうかを明らかにすることであった。これを達成するために、直立型のフランツ型拡散装置、腹部整形術から得た全層の皮膚、及び誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）が用いられた。詳細な実験方法は以下の項に記載されるが、簡潔に言えば、角質層がテープストリッピング法を用いてサンプルの半分から除去され、残りのサンプル上ではそのままにされた。プロトセルは、平均直径９０ｎｍ及び細孔サイズ直径２．５ｎｍを有するシリカ粒子と、５５ｗｔ％のＤＯＰＣ、３０ｗｔ％のＣｈｏｌ、及び１５ｗｔ％のＤＯＰＥ−ＰＥＧ−２０００で調合された二重層構成を有する平均直径１２０ｎｍのリポソームとを用いて作られた。
【０２６６】
表１は、全ての脂質についての名称、略称、及び関係する物理的特性を示す。拡散実験用には改変されたフランツ型拡散セルが、容器を満たし、皮膚サンプルを配置し、ドナーキャップを留めることによって用いられた。各群（角質層そのまま、角質層除去後）の対照は０．５×ＰＢＳを用いて処理され、残りのサンプルは８．１２５ｍｇのプロトセルを用いて２４時間処理された。次に、ドナーキャップ中に残っているサンプル、皮膚サンプル、及び容器液が回収された。サンプルについての高コストにより、容器液のみをＩＣＰ−ＭＳで分析した。図４４ａは容器液中のＳｉＯ2総量を群（ｎ＝３）ごとに示しており、ＩＣＰ−ＭＳによって報告されたように、プロトセルが角質層に浸透して皮膚を通って拡散することが可能であることを明示している。角質層をそのまま有するものと比較して、約４倍量のプロトセルが、角質層が除去された皮膚サンプルを通って拡散できた。しかしながら、各群内の大きな誤差により、これらの値は統計的に有意でなく、従ってこれらのデータは提案された働きの実行可能性を確認するだけである。次の実験は２つの目的を果たす。第１に、サンプルについてのＩＣＰ−ＭＳの高コストにより、経皮流量を定量化する費用効果が高い方法を開発することである。第２に、プロトセルのＳＬＢ成分及び組成が経皮動力学に及ぼす影響を明らかにすることである。蛍光分光分析は、その高感度、蛍光光度計の容易な入手、及びコアが容易に蛍光標識できることにより、流量を定量化するために選択された。図４４ｂは、１級アミン含有有機シランである３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を用いてのコアの機能化と、それに続くアミン反応性フルオロフォアとの培養によって、プロトセルコアがどのように蛍光標識されることができるかを説明する図である。皮膚そのものは全ての可視波長で非常に自己蛍光性だが、長波長の赤色波長は、蛍光分光分析及び共焦点レーザー走査顕微鏡法（ＣＬＳＭ）によって明示されるように最小量の自己蛍光を示す。従って、この実験にはＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ６３３（励起６３２、発光６４７）が選択され、以降の全実験で用いる。容器緩衝液中の６３３で標識されたコアに対する蛍光光度計の感度は、皮膚の自己蛍光の程度に応じて約１９５ｎｇ／ｍｌ?５００ｎｇ／ｍｌの範囲であった。この実験では、蛍光標識されたコアを有するプロトセルが３つの基本的なＳＬＢ成分を用いて構成され、脂質の転移温度、飽和度／不飽和度、及び頭部基の違いに基づいて以下の合計６つの組成を有した。
１）７０ｗｔ％のＤＯＰＣ／３０ｗｔ％のＣｈｏｌ。
２）５５ｗｔ％のＤＯＰＣ／３０ｗｔ％のＣｈｏｌ／１５ｗｔ％のＤＯＰＥ−ＰＥＧ−２０００。
３）７０ｗｔ％のＤＳＰＣ／３０ｗｔ％のＣｈｏｌ。
４）５５ｗｔ％のＤＳＰＣ／３０ｗｔ％のＣｈｏｌ／１５ｗｔ％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００。
５）４５ｗｔ％のＤＯＰＣ／３０ｗｔ％のＣｈｏｌ／２５ｗｔ％のＤＯＰＥ。
６）３０ｗｔ％のＤＯＰＣ／３０ｗｔ％のＣｈｏｌ／２５ｗｔ％のＤＯＰＥ／１５ｗｔ％のＤＯＰＥ。
角質層は全サンプル上にそのまま残され、対照は０．５×ＰＢＳを用いて処理され、各サンプルは８ｍｇのプロトセルを用いて２４時間処理された。図４４ｃは結果をまとめており、ＳＬＢ成分及び組成がプロトセルの経皮動力学に大きく影響を与えることを明らかにする。これは文献と一致しており、より低い転移温度を有する脂質が全層の皮膚中により深く拡散すること、及びより高い転移温度を有する脂質が角質層において局所に留まることを示唆している51。まとめると、予備的なデータは、提案された働きの実行可能性及びその高い成功可能性を明示している。加えて、費用効果が高い蛍光分光プロトコールが、プロトセルの経皮動力学を定量化するために開発された。
【０２６７】
［方法］
＜プロトセルの合成及び特徴＞
ナノ多孔性粒子コアは、コロイド溶液中における又はエアロゾル化による種々の蒸発誘起自己組織化（ＥＩＳＡ）法を用いて合成される。ＥＩＳＡは、単純な溶媒蒸発での高度に規則的な／均一な細孔サイズを備えた球形のナノサイズシリカ（ＳｉＯ2）粒子の自己組織化を促進するために、可溶なゾル−ゲル前駆体（即ち、酸又は塩基、Ｈ2Ｏ又はＥｔＯＨ、及びある種の有機シラン）と併せて構造指向剤としての両親媒性の界面活性剤及びブロックコポリマーを用いる56、57。粒子の合成が完了したら、構造指向剤は溶媒抽出又は５００℃の焼成を用いて除去される。粒子サイズ（３０?１０００ｎｍ）、多孔性、細孔サイズ（２．５?２０ｎｍ）、分解動力学、及び表面の化学的性質は、濃度の調整及び構造指向剤の選択によって制御されることができる。さらに、上記の手順を用いて合成後の機能化が行われることができる（図４４ｂ）。単分散のリポソーム溶液を得るために、均一な細孔を有する多孔性ポリカーボネート膜を水溶性脂質溶液が複数回通過するプロセスである押し出しによって、ＳＬＢが形成される。脂質は、クロロホルム中に保存された２５ｍｇ／ｍｌストック溶液として購入され、従って押し出し前には抽出されて乾燥されなければならない。脂質は、１個のシンチレーション瓶に調合され、最終質量が２．５ｍｇとなるように種々の比で組成される。脂質成分及び組成の選択は、ＳＬＢの物理的特性及び化学的特性に関して、精密な制御の１つの段階を可能にする。制御の別の段階は、コアに融合された後のＳＬＢの修飾に由来する（表１）。クロロホルムは減圧下で除去され、脂質は０．５×ＰＢＳを用いて終濃度２．５ｍｇ／ｍｌに再水和されて押し出しされるか、又は直ちに?２０℃で６ヶ月未満保存される。
【０２６８】
【表１】
2014532071.tif 000002
【０２６９】
ここでリポソームは、全脂質が流動性であるように、組成での最高のＴｍよりも少しだけ高温で押し出される。従って、多くの場合には押し出し機をホットプレート上に設置することが必要である。プロトセルは、３：１（ｖ／ｖ）比を用いた体積過剰でリポソームをコアに添加し、撹拌しながら室温で３０?６０分培養することによって作製される。次に、へテロ二官能性の架橋剤を用いてさらなる二重層修飾が行われ（即ち、ペプチドのコンジュゲート）、そしてプロトセル溶液は所望の使用濃度（＜２０ｍｇ／ｍｌ）まで濃縮される。プロトセル及びそれらの成分の特性評価は、細孔及び粒子の構造を定性的に評価しかつ粒子の直径及び分布を視覚的及び統計的に定量化するための透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、流体力学的半径を得るための動的光散乱（ＤＬＳ）、ブルナウアー−エメット−テラー（ＢＥＴ）表面積及びバレット−ジョイナー−ハレンダ（ＢＪＨ）細孔サイズ分布を定量化するための窒素収着（ＮＳ）、コロイド安定性及び表面電荷を評価するためのζ電位（ζ）、並びにカーゴ装填容量を評価するための吸光又は蛍光からなる9?１１。プロトセルのコアは、何らかの改変がされる前後に上記の全てが課される。リポソーム及びプロトセルは、何らかの改変の前後にζ電位及びＤＬＳのみが課される。
【０２７０】
＜皮膚調製及びフランツ型拡散装置＞
皮膚の調製及び正しい取り扱いは、皮膚の構造に直接的に影響し得るので重要である。腹部整形術から得られた全層のヒト皮膚は、現地法規に従って提供される。皮膚の受け取り時にそれらは二重袋に入れられ、?２０℃で６ヶ月未満保存される。皮膚のバリア機能は、複数回の凍結融解サイクルによっても元のままであることが示されている58、59。必要に応じて、凍結された皮膚は３０℃のオーブンで解凍され、メスを用いて皮下脂肪が除去され、次に皮膚サンプルは１ｃｍ2の細片に切片化される。次にサンプルを脱イオン水でリンスし、角質層側の水分を取って乾かす。場合によっては、角質層は除去又は分離される必要がある。これは、それぞれテープストリッピング又は酵素的な組織消化を用いてすることができる。実験完了時には、皮膚サンプルを１０ｍｌの０．５×ＰＢＳで洗浄し、水分を取って乾かし、個別に二重袋に入れ、ホイル中に包んで解析時まで凍結する。総合実験棟（ＭＲＦ）に位置するLinda Felton教授の研究室は、９個の水套が装着された拡散セル、加熱／冷却循環装置、内蔵型の撹拌プレート、サンプリングポート、ドナー表面積０．６４ｃｍ2、及び容器容積５．１ｍＬを備えた直立型の改変されたフランツ型拡散装置を有している。実験を準備するために、容器を０．５×ＰＢＳ（又は他の等張性の緩衝液）で満たし、温度を３７℃に設定する。次に皮膚を気泡の形成を避けるよう気をつけて容器上に広げ、ドナーキャップを留め、脱水を防ぐためにカバーをする。そして皮膚を１時間平衡化し、容器液を交換し、皮膚をさらに３０分間再平衡化する。実験開始前に、４００μｌの容器液をサンプリングポートから分離し、それが取られた容器の０時間のブランクとして保管する。サンプリングポートから所望の時点において４００μｌの各サンプルが採取され、そして一定体積を維持し皮膚−液間の界面における気泡の形成を避けるために４００μｌの拡散緩衝液が補充される。
【０２７１】
＜蛍光分光分析＞
全ての経皮プロトセルの拡散実験の定量化は、ＦｅｌｉｘＧＸソフトウェア、２つのＰＭＴ検出器、光学フィルター、及び４個のキュベットを収納可能なサンプルカルーセルを備えたＰＴＩ−ＱｕａｎｔａＭａｓｔｅｒ−４０蛍光分光光度計を用いて行われる。皮膚は非常に不均質であるとともに非常に自己蛍光性であり、これらは通常は容器液に移される特徴である。このプロトコールは、それらの問題が分析中に説明されることができるように開発された。標準曲線は、１／２希釈を用い、濃度範囲０．１６?１．９５×１０?５ｍｇ／ｍｌに渡って、対照サンプルの容器液（２４時間の時点）から作成される。さらに、３８０μｌが対照から抽出され、ブランクとしてキュベットに入れられる。このブランクは、実験継続中はカルーセル中にあるため、３つのサンプルのみが一度に解析されることを可能にする。標準は３回測定操作を行い、平均され、９５％信頼区間で報告され、線型方程式を得るためにＬｏｇ−Ｌｏｇ目盛にプロットされる。全てのサンプルは、統計的妥当性のために最低３回、最大９回解析される。全てのサンプルが解析された後、ファイルは保存され、テキストファイルとして書き出され、手作業でＥｘｃｅｌのスプレッドシートに入力される。全ブランクの平均値を平均し、９５％信頼区間を計算する。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、全時点の全サンプルについて個別に算出される。線形回帰分析が、未知の濃度を算出するために用いられる。８サンプルのそれぞれの補正値は、全てを標準曲線に対して正規化するために、ブランクのＭＦＩに対する各０時間のＭＦＩの加算／減算によって算出される。補正値は、補正後のＭＦＩを得るために、次に各時点のＭＦＩに対して加算／減算される。各ＭＦＩのＬｏｇが取られ、標準曲線から得られた方程式を用いて濃度が算出される。最後に、各０時間時点について算出された濃度値が他の各時点から差し引かれて、絶対濃度が得られる。ただし、全ての標準曲線は全濃度範囲に渡って多項傾向に従う。線形曲線を得るために、該当する濃度／強度範囲のみがプロットされて、線形の傾向線に対してフィッティングされる（Ｒ2＞０．９３００）。
【０２７２】
＜具体的目標１−プロトセルの担持された脂質二重層（ＳＬＢ）及びナノ多孔性シリカ粒子コアの、経皮透過の動力学に影響するパラメータをインビトロで研究し、ＳＬＢがコアから解離するかどうかを明らかにする＞
この具体的目標を達成するために、プロトセルの生物物理学的特性及び生化学的特性のそれぞれの系統的操作が行われる。先ず、ＳＬＢのそれぞれの個別の特性が調査された後、コアの特性のそれぞれが個別に評価される。流量を定量化するために蛍光分光分析が用いられ、皮膚をパラフィンワックス中に埋め込み、組織学的に切片化し32、皮膚中に分配されるプロトセルを定性的に評価するためにデュアルチャンネルのＣＬＳＭ23を用いてイメージングする。ＣＬＳＭがこれについて不十分である場合には、ＴＥＭ51又はマルチフォトン顕微鏡法42（ＳＮＬ−ＣＩＮＴ）を用いる。ＳＬＢに関する実験では、全てのコアはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３を用いて蛍光標識され、エアロゾル化によって合成され、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を鋳型にし、標的を定められたプロトセル用に最適化された標準的なコアとなる。これらの粒子は、ζ＝?２０ｍＶ、均一なＢＪＨ細孔サイズ＝２．５ｎｍ、粒子サイズ分布＝９０±６０、及びＢＥＴ表面積＝１０００ｇ／ｍ2を有する。コアに関する実験に関しては、最大の総流量をもたらすことが明らかにされたＳＬＢ組成が用いられ、不変に保たれる。最後に、ＳＬＢ及びコアの特性が最適化されたら、ＳＬＢの結末が明らかにされる。第１の実験は、転移温度／流動性に基づいて、２４時間にどの中性荷電リン脂質（ＤＯＰＣ、ＤＰＰＣ、及びＤＳＰＣ）が単独で最大の総流量をもたらすかを特定する。Van den Berghらは、流動性脂質（Ｔｍ＜３７℃）が皮膚中により深く拡散すること、非流動性脂質（Ｔｍ＞３７℃）が角質層において局所に留まることを示している51。予備試験の結果はこれらの知見を支持しているが、コアによって与えられるナノ多孔性の支持、及び温度に依存したＦＲＡＰによって確認されるＳＬＢ脂質の見かけの転移温度の対応した低下により、プロトセルの革新的な特性は同時にＳＬＢの流動性及び安定性を増強する。この特性は、見かけのＴｍが４１℃から３７℃に低下するＤＰＰＣの場合に特に興味深い9。ＤＰＰＣプロトセルの流量がＤＯＰＣプロトセルとＤＳＰＣプロトセルとの間に来るならば、それらの結果はリポソーム文献と一致しているので、以降のプロトセルの基本成分はＤＯＰＣ及びＤＳＰＣのみを用いて、流動性ＳＬＢを有するプロトセルと非流動性ＳＬＢを有するプロトセルとの比較を行う。しかし、ＳＬＢ−コア間の相互作用によりＤＰＰＣプロトセルの総流量がこの範囲に納まらないならば、これらの相互作用の影響をさらに検討するために、全３種類のＳＬＢ基本成分が以降の実験に用いられる。第２の実験は、コレステロール、コレステロール硫酸、及びセラミドが２４時間の総流量に及ぼす影響を検討する。角質層は、コレステロール、コレステロール硫酸、脂肪酸、及びセラミドからなる1、33、60、61。従って、皮膚中におけるプロトセルの溶解度を増大させる試みでは、透過に及ぼす影響を明らかにするために、これらの角質層脂質をＳＬＢに組み込むことが行われる。それらの脂質のそれぞれの影響は、個別的及び総合的に研究される。予備試験の結果は、ＰＥＧ−２０００が流量に大きい影響を及ぼすことを明示する。さらに、ＰＥＧ−４００は、多くの市販の局所用製剤中及び経皮製剤中の一般的な透過増��剤である62?６４。最適なＰＥＧ組成を特定するために、先ずＰＥＧ−２０００の濃度を変える。その後、一定のＰＥＧ濃度でＰＥＧの長さを変える。第４の実験は、最適化されたＳＬＢ組成をアルギニンに富むペプチド（即ち、Ｒ８）で修飾する。アルギニンに富むペプチドは細胞内在化を増大させることが示されている65。一方、シクロスポリンＡへのヘプタアルギニンペプチドのコンジュゲートは、増強された経皮動力学を示す28。次の作業は、コアの特性がどのように経皮動力学に影響するかを明らかにすることである。ＳＬＢ組成を不変に保って、コアサイズ及び表面の機能化の影響が明らかにされる。Alvarez-Romanらは、ポリスチレンビーズがサイズに依存して皮膚の別々の部位に特異的に蓄積することを明らかにした23。さらにRancanらは、メソ多孔性のストーバーシリカ粒子が、改変された角質層を用いて、皮膚細胞によって取り込まれて皮膚を通って拡散することができるが、共にサイズに依存することを示した66。Vermaらは、変形可能で直径１２０ｎｍを有するリポソームの著しく増強された透過を報告し、直径７０ｎｍを有するリポソームでの角質層の最大の増強を報告した20。これらの研究は、経皮動力学について、化学的及び物理的な表面特性に加えて粒子サイズの重要性を示している。エアロゾルによって支援されるＥＩＳＡによって作られる幅広い分布に加えて、３種類の単分散分布の粒子サイズ（３０ｎｍ、１００ｎｍ、及び２００ｎｍ）が、コロイド合成を用いて合成されて特性評価される。第６の実験は、コアの機能化／コアの電荷の影響を調査する。未修飾シリカは、強い負のζ電位（?４０??１５ｍＶ）を有し、ζ電位を変えるために機能化されることができる56。最適なコアサイズを用いて、粒子は強い正電荷（＞１０ｍＶ）を有するように機能化されるか、又は疎水性を与えるためにメチル化される。第７の実験は、ＳＬＢの結末を明らかにするために、ＳＬＢを蛍光標識して蛍光共局在実験を行う。最後に、最適化された経皮プロトセルを用いて、経時的な流量が測定される。
【０２７３】
＜具体的目標２−ＳＬＢ組成、成分、及び機能化が経皮動力学を変化させる仕組みを解明する＞
フィックの拡散の第１法則の単純な反復は、容器（ＣR）とドナー（ＣD）との間の濃度差及び角質層の厚さに基づいて、経皮流量（Ｊ）を角質層透過性（Ｐ）に関連づけ1、17、全体的な流量及び透過性の変化を通してプロトセルのＳＬＢ組成の直接的な相関を可能にする。透過係数は実験データから算出されるが、流量及び透過性の実験測定は経皮拡散の動力学に関する情報を明らかにするだけであり、経皮プロトセルのカーゴ送達を理解するための重要なパラメータである透過増強の仕組みについては何も明らかにしない17、30。薬剤学において角質層透過を分析する標準的な手段は、ＤＳＣによる角質層脂質のＴｍ低下の解析を用いる17、26、29?３２、３５。ヒト角質層脂質に一般的に関連付けられる３つのＴｍのピークが存在する32、59。第１は７５℃にあり、ラメラ状から不規則状への脂質構造の変化に起因する。９０℃はタンパク質結合脂質のゲル状態から液体状態への転移に関連しており、１２０℃はタンパク質結合脂質が変性したことを示す。様々な透過増強剤で処理された角質層サンプルにおいては、Ｔｍの顕著な減少及び減少したピーク強度が多く報告されている32。しかし、ＤＳＣは角質層の巨視的構造の情報を与えるだけであるので、ＳＬＢがどのように透過を増強するのかを十分に理解するにはさらなる分析が必要である。ＸＲＤは、固定角からのＸ線散乱パターンに基づいて結晶構造の情報を与える材料科学の特性解析技術である。Kimら及びその他多数は、角質層の構造を特性解析するために、以前に小角ＸＲＤ及び広角ＸＲＤを用いている26、32、33。小角ＸＲＤに関しては、２つのピークが、セラミド（ｄ＝６．１３ｎｍ）及び結晶コレステロール（ｄ＝３．３８ｎｍ）による散乱に関連付けられる。広角ＸＲＤに関しては、１６．７Åの１つのピークは、結晶コレステロールに関連付けられる32。ＦＴＩＲ分光を用いて、角質層脂質の伸縮（２８５０ｃｍ?１及び２９２０ｃｍ?１）並びに角質層のケラチン分子の構造変化（１６５０ｃｍ?１）に関連する炭素−水素及び炭素−酸素の伸縮振動数での変化を測定することによって、角質層の構造変化を特性解析することもできる32、35、67。実施される特性解析の最後の方法は、組織学／顕微鏡法である。角質層の構造のいずれかの巨視的変化を調査するために標準的なＨ＆Ｅ染色が用いられ、皮膚中における粒子分布を定性的に評価するために蛍光顕微鏡法が用いられる。この具体的目標の最大の課題は、ＤＳＣ、ＸＲＤ、及びＦＴＩＲ用の角質層サンプルを、その構造を損傷すること無く単離することである。これがなされたら、各ＳＬＢ組成がどのように角質層の構造を変えるかについて相互関係を明らかにするために、具体的目標１で作製された皮膚サンプルが特性解析される。
【０２７４】
＜具体的目標３−経皮拡散に有利又は不利な物理的特性及び化学的特性を有する薬物であるニコチン及びイブプロフェンを用いて、インビトロにおける経皮プロトセルの送達有効性を評価する＞
ニコチンパッチは、我が国において最も広く使用される経皮的パッチの１つである。ニコチンの物理的特性及び化学的特性（Ｋo/w＝１５．８５、Ｈ2Ｏに混和性、１６２．２３４Ｄａ、Ｔｍ＝?７．９℃）は、経皮送達にとって理想的なものである。一方、イブプロフェンの物理的特性及び化学的特性は、Ｋo/w＝９３３２．５４、Ｈ2Ｏに不溶、２０６．２８Ｄａ、Ｔｍ＝７４?７７℃である。その低い水溶性及び極度の親油性Ｋo/wから明らかなように、その経皮動力学は、角質層中に優先的に分配されて、より深部の組織中には拡散しないので、あまり有利でない17。第１の実験は、最適化されたコア粒子を用いて両方の薬物の装填容量を測定し、次に経皮送達のために最適化されたＳＬＢを装填して融合する。装填容量及び薬物放出動力学は、ＵＶ分光を用いて測定される。さらに、プロトセルがどのようにして薬物の明らかな化学的挙動を隠すのかを評価するために、イブプロフェンが装填されたコアの水溶性及びＫo/wが測定される必要がある。第２の実験は、ニコチン及びイブプロフェンを遊離薬物として及びプロトセルを用いて経皮送達する。プロトセルを用いる経皮送達の有効性を明らかにし、皮膚中におけるプロトセルの薬物放出プロファイルを理解するために、次にＨＰＬＣを用いて薬物の流量が算出される58、59。最後の実験は、異なる化学的特性及び物理的特性を有する薬物の組み合わせを送達することが可能であるかどうかを明らかにする。これは、それらの２種類の薬物の種々の比をプロトセルコアに装填することによってなされる。異なる経皮的な挙動をする個別の薬物の組み合わせをナノ粒子を用いて経皮送達する能力は、過去に実証されていない革新的なものである。潜在的に問題となる点は、ほとんどのＨＰＬＣカラムがシリカビーズを使用しており、従ってＨＰＬＣ分析前に、粒子を溶解するためにサンプルのｐＨを漸増しなければならないという事実である。
【０２７５】
＜具体的目標４−ニコチン又はイブプロフェンが装填された経皮プロトセルの基本的な薬理特性を、ＮＵ／ＮＵヌードマウスモデルを用いてインビボにおいて明らかにする＞
このマウスモデルは、無毛、無胸腺であり、従って機能的な適応免疫系を欠いている。しかしながら、それらは機能的なＮＫ自然免疫系を有するため、好適である。これらの予備的なインビボ研究においては、本発明者は、漏れや水分の蒸発を防ぐためのバンドエイドを用いて経皮プロトセルを局所投与する。投与後に、本発明者は、時間の関数としてのニコチン及びイブプロフェンの血清中レベルを監視し、経皮ＰＣの生体内分布、薬物動態、及び排泄を評価する。さらに、本発明者は、刺激又は損傷の徴候について皮膚を検査する。ＨＰＬＣ、蛍光分光イメージング、組織学、及びＩＣＰ−ＭＳを用いて分析が行われる。
【０２７６】
＜実施例５の参考文献＞
引用参考文献
１．Roberts, M. S., Targeted drug delivery to the skin and deeper tissues: role of physiology, solute structure and disease. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 1997, 24, 874-879.
２．2010 Census Interactive Population Search.
http://2010.census.gov/2010census/popmap/ipmtext.php?fl=35:3514950.
３．New Mexico Department of Public Health, New Mexico Substance AbuseEpidemiology Profile, http://mhealth.org/erd/HealthData/substance abuse.shtml, 2011.
４．B.W, B., Novel mechanisms and devices to enable successful transdermal drug delivery. European journal of Pharmaceutical Sciences 2001, 14, 101-114.
５．Prausnitz, M. R.; Langer, R., Transdermal drug delivery. Nat Biotech 2008, 26, 1261-1268.
６．Thomas, B. J.; Finnin, B. C, The transdermal revolution. Drug Discovery Today 2004, 9, 697-703.
７．Prausnitz, M. R.; Mitragotri, S.; Langer, R., Current status and future potential of transdermal drug delivery. Nat Rev Drug Discov 2004, 3, 115-124.
８．Brod, J., Characterization and physiological role of epidermal lipids. Int J Dermatol 1991, 30, 84-90.
９．Ashley, C. E.; Carnes, E. C; Phillips, G. K.; Padilla, D.; Durfee, P. N.; Brown, P. A.; Hanna, T. N.; Liu, J. W.; Phillips, B.; Carter, M. B.; Carroll, N. J.; Jiang, X. M.; Dunphy, D. R.; Willman, C. L.; Petsev, D. N.; Evans, D. G.; Parikh, A. INT.; Chackerian, B.; Wharton, W.; Peabody, D. S.; Brinker, C. J., The targeted delivery of multicomponent cargos to cancer cells by nanoporous particle-supported lipid bilayers. Nature Materials 2011, 10, 389-397.
１０．Epler, K.; Padilla, D.; Phillips, G.; Crowder, P.; Castillo, R.; Wilkinson, D.; Wilkinson, B.; Burgard, C; Kalinich, R.; Townson, J.; Chackerian, B.; Willman, C; Peabody, D.; Wharton, W.; Brinker, C. J.; Ashley, C; Carnes, E., Delivery of Ricin Toxin A-Chain by Peptide-Targeted Mesoporous Silica Nanoparticle-Supported Lipid Bilayers. Advanced Healthcare Materials 2012, n/a-n/a.
１１．Ashley, C. E.; Carnes, E. C; Epler, . E.; Padilla, D. P.; Phillips, G. K.; Castillo, R. E.; Wilkinson, D. C; Wilkinson, B. S.; Burgard, C. A.; Kalinich, R. M.; Townson, J. L.; Chackerian, B.; Willman, C. L.; Peabody, D. S.; Wharton, W.; Brinker, C. J., Delivery of Small Interfering RNA by Peptide-Targeted Mesoporous Silica Nanoparticle-Supported Lipid Bilayers. ACS Nano 2012, 6, 2174-2188.
１２．Liu, J. W.; Jiang, X. M.; Ashley, C; Brinker, C. J., Electrostatically Mediated Liposome Fusion and Lipid Exchange with a Nanoparticle-Supported Bilayer for Control of Surface Charge, Drug Containment, and Delivery. Journal of the American Chemical Society 2009, 131, 7567-7570.
１３．Liu, J. W.; Stace-Naughton, A.; Jiang, X. M.; Brinker, C. J., Porous Nanoparticle Supported Lipid Bilayers (Protocells) as Delivery Vehicles. Journal of the American Chemical Society 2009, 131, 1354-1357.
１４．Cevc, G.; Vierl, U., Nanotechnology and the transdermal route: A state of the art review and critical appraisal. Journal of Controlled Release 2010, 141, 277-299.
１５．Kushner, J.; Deen, W.; Blankschtein, D.; Langer, R., First-principles, structure-based transdermal transport model to evaluate lipid partition and diffusion coefficients of hydrophobic permeants solely from stratum corneum permeation experiments. Journal of Pharmaceutical Sciences 2007, 96, 3236-3251.
１６．Marianna, F., Non-invasive administration of drugs through the skin: challenges in delivery system design. Pharmaceutical Science & Technology Today 2000, 3, 417-425.
１７．Barry, B. W., Lipid-Protem-Partitioning theory of skin penetration enhancement. Journal of Controlled Release 1991, 15, 237-248.
１８．Kirjavainen, M.; Monkkonen, J.; Saukkosaari, M.; Valjakka-Koskela, R.; iesvaara, J.; Urtti, A., Phospholipids affect stratum corneum lipid bilayer fluidity and drug partitioning into the bilayers. Journal of Controlled Release 1999, 58, 207-214.
１９．Sinico, C; Manconi, M.; Peppi, M.; Lai, F.; Valenti, D.; Fadda, A. M., Liposomes as carriers for dermal delivery of tretinoin: in vitro evaluation of drug permeation and vesicle-skin interaction. Journal of Controlled Release 2005, 103, 123-136.
２０．Verma, D. D.; Verma, S.; Blume, G.; Fahr, A., Particle size of liposomes influences dermal delivery of substances into skin. International Journal of Pharmaceutics 2003, 258, 141-151.
２１．Kirjavainen, M.; Urtti, A.; Valjakka-Koskela, R.; Kiesvaara, J.; Monkkonen, J., Liposome-skin interactions and their effects on the skin permeation of drugs. European Journal of Pharmaceutical Sciences 1999, 7, 279-286.
２２．Ashley, C.; Carnes, E.; Epler, K.; Padilla, D.; Phillips, G.; Castillo, R.; Wilkinson, D.; Wilkinson, B.; Burgard, C; Sewell, R.; Townson, J.; Chackerian, B.; Willman, C; Peabody, D.; Petsev, D.; Wharton, W.; Brinker, C. J., Delivery of Therapeutic Macromolecular Cargos by Targeted Protocells ACS Nano (In Review), 2011.
２３．Alvarez-Roman, R.; Naik, A.; Kalia, Y. N.; Guy, R. H.; Fessi, H., Skin penetration and distribution of polymeric nanoparticles. Journal of Controlled Release 2004, 99, 53-62.
２４．Williams, A. C; Barry, B. W., Penetration enhancers. In Adv Drug Deliv Rev, Netherlands, 2004; Vol. 56, pp 603-18.
２５．Finnin, B. C; Morgan, T. M., Transdermal penetration enhancers: Applications, limitations, and potential. Journal of Pharmaceutical Sciences 1999, 88, 955-958.
２６．Cornwell, P. A.; Barry, B. W.; Bouwstra, J. A.; Gooris, G. S., Modes of action of terpene penetration enhancers in human skin; Differential scanning calorimetry, small-angle X-ray diffraction and enhancer uptake studies. International Journal of Pharmaceutics 1996, 127, 9-26.
２７．Akimoto, T.; Nagase, Y., Novel transdermal drug penetration enhancer: synthesis and enhancing effect of alkyldisiloxane compounds containing glucopyranosyl group. Journal of Controlled Release 2003, 88, 243-252.
２８．Rothbard, J. B.; Garlington, S.; Lin, Q.; Kirschberg, T.; Kreider, E.; McGrane, P. L.; Wender, P. A.; Khavari, P. A., Conjugation of arginine oligomers to cyclosporin A facilitates topical delivery and inhibition of inflammation. Nat Med 2000, 6, 1253-1257.
２９．Golden, G. M.; Guzek, D. B.; Harris, R. R.; McKie, J. E.; Potts, R. O., Lipid thermotropic transitions in human stratum corneum. J Invest Dermatol 1986, 86, 255-9.
３０．Leopold, C. S.; Lippold, B. C, An attempt to clarify the mechanism of the penetration enhancing effects of lipophilic vehicles with differential scanning calorimetry (DSC). J Pharm Pharmacol 1995, 47, 276-81.
３１．Al-Saidan, S. M.; Barry, B. W.; Williams, A. C, Differential scanning calorimetry of human and animal stratum corneum membranes. International Journal of Pharmaceutics 1998, 168, 17-22.
３２．Kim, Y.-C; Ludovice, P. J.; Prausnitz, M. R., Transdermal delivery enhanced by magainin pore-forming peptide. Journal of Controlled Release 2007, 122, 375-383.
３３．Schreiner, V.; Gooris, G. S.; Pfeiffer, S.; Lanzendorfer, G.; Wenck, H.; Diembeck, W.; Proksch, E.; Bouwstra, J., Barrier characteristics of different human skin types investigated with X-ray diffraction, lipid analysis, and electron microscopy imaging. In J Invest Dermatol, United States, 2000; Vol. 114, pp 654-60.
３４．Guan, T. T.; Miao, Y. Q.; Xu, L. S.; Yang, S. S.; Wang, J.; He, H. B.; Tang, X.; Cai, C. R; Xu, H., Injectable nimodipine-loaded nanoliposomes: Preparation, lyophilization and characteristics. International Journal of Pharmaceutics 2011, 410, 180-187.
３５．Chen, H.-C; Mendelsohn, R.; Rerek, M. E.; Moore, D. J., Fourier transform infrared spectroscopy and differential scanning calorimetry studies of fatty acid homogeneous ceramide 2. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 2000, 1468, 293-303.
３６．Hadgraft, J.; Pugh, W. J., The selection and design of topical and transdermal agents: a review. /. Invest. Dermatol. Sy p. Proc. 1998, 3, 131-135.
３７．Lombry, C; Dujardin, N.; Preat, V., Transdermal Delivery of Macromolecules Using Skin Electroporation. Pharmaceutical Research 2000, 17, 32-37.
３８．Schmook, F. P.; Stutz, A.; Reinhardt, J., Penetration of Sandimmune (cyclosporin A) in rat skin in vitro. Effects of penetration enhancers and solvents. Skin Pharmacol. 1993, 6, 116-124.
３９．Bach, M.; Lippold, B. C, Percutaneous penetration enhancement and itsquantification. Eur. J. Pharm. Biopharm. 1998, 46, 1-13.
４０．Chen, Y.; Shen, Y.; Guo, X.; Zhang, G; Yang, W.; Ma, M.; Liu, S.; Zhang, M.; Wen, L.-P., Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display. Nat Biotech 2006, 24, 455-460.
４１．Mitragotri, S.; Kost, J., Low-frequency sonophoresis: a review. In Adv Drug Deliv Rev, Netherlands, 2004; Vol. 56, pp 589-601.
４２．Kushner, J. I. V.; Kim, D.; So, P. T. C; Blankschtein, D.; Langer, R. S., Dual-Channel Two-Photon Microscopy Study of Transdermal Transport in Skin Treated with Low-Frequency Ultrasound and a Chemical Enhancer. J Invest Dermatol 2007, 127, 2832-2846.
４３．Kushner, J.; Blankschtein, D.; Langer, R., Evaluation of the porosity, the tortuosity, and the hindrance factor for the transdermal delivery of hydrophilic permeants in the context of the aqueous pore pathway hypothesis using dual-radiolabeled permeability experiments. Journal of Pharmaceutical Sciences 2007, 96, 3263-3282.
４４．Kushner, J.; Blankschtein, D.; Langer, R., Evaluation of hydrophilic permeant transport parameters in the localized and non-localized transport regions of skin treated simultaneously with low-frequency ultrasound and sodium lauryl sulfate. Journal of Pharmaceutical Sciences 2008, 97, 906-918.
４５．Kushner, J.; Blankschtein, D.; Langer, R., Heterogeneity in skin treated with low-frequency ultrasound. Journal of Pharmaceutical Sciences 2008, 97, 4119-4128.
４６．Benson, H. A. E.; Namjoshi, S., Proteins and peptides: Strategies for delivery to and across the skin. Journal of Pharmaceutical Sciences 2008, 97, 3591-3610.
４７．Denet, A. R.; Vanbever, R.; Preat, V., Skin electroporation for transdermal and topical delivery. In Adv Drug Deliv Rev, Netherlands, 2004; Vol. 56, pp 659-74.
４８．Prausnitz, M. R., Microneedles for transdermal drug delivery. In Adv Drug Deliv Rev, Netherlands, 2004; Vol. 56, pp 581-7.
４９．Mark, K., Engineering of needle-free physical methods to target epidermal cells for DNA vaccination. Vaccine 2006, 24, 4651-4656.
５０．Oh, J.-H.; Park, H.-H.; Do, K.-Y.; Han, M.; Hyun, D.-H.; Kim, C.-G.; Kim, C.-H.; Lee, S. S.; Hwang, S.-J.; Shin, S.-C; Cho, C.-W., Influence of the delivery systems using a microneedle array on the permeation of a hydrophilic molecule, calcein. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2008, 69, 1040-1045.
５１．van den Bergh, B. A. I.; Salomons-de Vries, I.; Bouwstra, J. A., Interactions between liposomes and human stratum corneum studied by freeze-substitution electron microscopy. International Journal of Pharmaceutics 1998, 167, 57-67.
５２．Wagner, A.; Vorauer-Uhl, K., Liposome Technology for Industrial Purposes. Journal of Drug Delivery 2011, 2011.
５３．Ashley, C. E.; Carnes, E. C; Phillips, G. K.; Durfee, P. N.; Buley, M. D.; Lino, C. A.; Padilla, D. P.; Phillips, B.; Carter, M. B.; Willman, C. L.; Brinker, C. J.; Caldeira, J. D.; Chackerian, B.; Wharton, W.; Peabody, D. S., Cell-Specific Delivery of Diverse Cargos by Bacteriophage MS2 Virus-like Particles. Acs Nano 2011, 5, 5729-5745.
５４．Mei, Z.; Chen, H.; Weng, T.; Yang, Y.; Yang, X., Solid lipid nanoparticle and microemulsion for topical delivery of triptolide. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2003, 56, 189-196.
５５．Santander-Ortega, M. J.; Stauner, T.; Loretz, B.; Ortega-Vinuesa, J. L.; Bastos-Gonzalez, D.; Wenz, G.; Schaefer, U. R; Lehr, C. M., Nanoparticles made from novel starch derivatives for transdermal drug delivery. Journal of Controlled Release 2010, 141, 85-92.
５６．Brinker, C. J.; Scherer, G. W., Sol-Gel Science: the physics and chemistry of sol-gel processing. 1<st> ed.; Gulf Professional Publishing: 1990; p 908.
５７．Zhang, H.; Dunphy, D.; Jiang, X.; Meng, H.; Sun, B.; Tarn, D.; Xue, M.; Wang, X.; Lin, S.; Ji, Z.; Ling, R.; Garcia, F.; Yang, J.; Kirk, M.; Xia, T.; Zink, J.; Nel, A.; Brinker, C. J., Processing pathway dependence of amorphous silica nanoparticle toxicity-colloidal vs. pyrolytic. 2012. MANUSCRIPT IN PREPARATION
５８．Felton, L. A.; Wiley, C. J.; Godwin, D. A., Influence of Hydroxypropyl-[beta]-Cyclodextrin on the Transdermal Permeation and Skin Accumulation of Oxybenzone. Drug Development and Industrial Pharmacy 2002, 28, 1117-1124.
５９．Kear, C. L.; Yang, J.; Godwin, D. A.; Felton, L. A., Investigation into the Mechanism by Which Cyclodextrins Influence Transdermal Drug Delivery. Drug Development and Industrial Pharmacy 2008, 34, 692-697.
６０．Kitagawa, S.; Sawada, M.; Hirata, H., Fluorescence analysis with diphenylhexatriene and its ionic derivatives of the fluidity of liposomes constituted from stratum corneum lipids: Contribution of each lipid component and effects of long-chain unsaturated fatty acids. International Journal of Pharmaceutics 1993, 98, 203-208.
６１．Khazanov, E.; Priev, A.; Shillemans, J. P.; Barenholz, Y., Physicochemical and Biological Characterization of Cerarnide-Containing Liposomes: Paving the Way to Ceramide Therapeutic Application. Langmuir 2008, 24, 6965-6980.
６２．Akimoto, T.; Aoyagi, T.; Minoshima, J.-i.; Nagase, Y., Polymeric percutaneous drug penetration enhancer: Synthesis and enhancing property of PEG/PDMS block copolymer with a cationic end group. Journal of Controlled Release 1997, 49, 229-241.
６３．Mitragotri, S., Synergistic Effect of Enhancers for Transdermal Drug Delivery. Pharmaceutical Research 2000, 17, 1354-1359.
６４．Mura, P.; Faucci, M. T.; Bramanti, G.; Corti, P., Evaluation of transcutol as a clonazepam transdermal permeation enhancer from hydrophilic gel formulations. European Journal of Pharmaceutical Sciences 2000, 9, 365-372.
６５．Suzuki, T.; Futaki, S.; Niwa, M.; Tanaka, S.; Ueda, K.; Sugiura, Y., Possible Existence of Common Internalization Mechanisms among Arginine-rich Peptides. Journal of Biological Chemistry 2002, 277, 2437-2443.
６６．Rancan, F.; Gao, Q.; Graf, C; Troppens, S.; Hadam, S.; Hackbarth, S.; Kembuan, C; Blume-Peytavi, U.; Ruhl, E.; Lademann, J.; Vogt, A., Skin Penetration and Cellular Uptake of Amorphous Silica Nanoparticles with Variable Size, Surface Functionalization, and Colloidal Stability. ACS Nano 2012.
６７．Takeuchi, Y.; Yasukawa, H.; Yamaoka, Y.; Kato, Y.; Morimoto, Y.; Fukumori, Y.; Fukuda, T., Effects of fatty acids, fatty amines and propylene glycol on rat stratum corneum lipids and proteins in vitro measured by fourier transform infrared/attenuated total reflection (FT-IR/ATR) spectroscopy. Chem Pharm Bull (Tokyo) 1992, 40, 1887-92.
【実施例６】
【０２７７】
［エマージングウイルス病原体の治療用のモジュール式ナノ粒子プラットフォーム］
＜１．概要／要約＞
１．１  問題提起
抗ウイルス薬は、エマージングウイルス及び人工ウイルスなどによるウイルス感染を有効に治療するためには、通常は大量に頻繁に投与されなければならない。しかし、高用量は宿主に有害な副作用をもたらす傾向があり、不適切に摂取された場合には薬剤耐性病原体の発生を加速させ得る。従って、治療の回数、頻度、期間、及び用量を減らし、現在の限度よりも治療を延期し、そして再発病を予防するためには、生体適合性のナノ粒子送達媒体を開発する必要性がある。しかし、リポソーム及びポリマー性ナノ粒子などのほとんどの現行のナノ担体は、低い収容能力、低い安定性、及び標的細胞によるごく僅かな取り込みに悩まされている。本提案は、リポソーム及びメソ多孔性シリカナノ粒子の利点を相助作用的に組み合わせた、「プロトセル」と呼ばれるモジュール式の非常に順応性があるナノ担体を設計することによってこれらの限界に対処しようとする7?９。
【０２７８】
１．２．
プロトセルは、担持された脂質二重層に被包されたメソ多孔性シリカナノ粒子コアからなり、そして化学的に異なる治療薬及び診断薬の極めて大きい装填容量（同等のリポソームよりも１０００倍を超えて大きい）、複雑な生体液中における長期的安定性、並びに低いリガンド密度におけるサブナノモルの標的細胞親和性を同時に示す。本発明者の装填、放出、安定性、及び標的特異性を精密に制御する能力、並びに粒子のサイズ、形状、電荷、及び表面の修飾を設計する能力は、用量及び標的外への影響を劇的に減少させ、免疫原性を緩和し、生体適合性及び生分解性を最大化し、生体内分布及び残留性を制御することを可能にする。本発明者がネイチャー・マテリアルズ誌２０１１年５月の表紙記事で報告したように8、プロトセルは、それらの独特の生物物理学的特性により、ヒト肝臓癌の治療において現行のリポソームよりも１００万倍有効である。本提案において、本発明者は、潜在的な生物学的脅威と関連するエマージングウイルスにプロトセルの有用性を拡張することを目指し、従来及び新規の抗ウイルス剤が装填され、可能性のある宿主細胞及び既に感染した細胞の両方に標的を定められたプロトセルの予防能力及び治療能力を評価する。
【０２７９】
＜２．実験方法＞
２．１．技術的アプローチ
ウイルス感染は、感染、融合、複製、又は出芽過程1を阻害する低分子薬を用いて治療され、さらに最近では、特定のウイルス遺伝子の発現を抑制する、又は宿主による忍容性が認められる場合にはウイルス感染に対する細胞受容体の発現を抑制する短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などの治療用の核酸を用いて治療される2、3。しかし、多くの抗ウイルス剤は、それらの治療有効性を限定するあまりに多くの欠点に悩まされている。例えば（１）過敏症、アレルギー反応、及び様々な他の有害な副作用、（２）薬剤耐性病原体の増加する有病率及び人工的な耐性の可能性、（３）感染部位への十分な蓄積を促進するための大量かつ頻繁な投与の必要性であり、これは逆に低いバイオアベイラビリティ、速やかな排除、僅かな溶解度、不完全な吸着、及び標的外への蓄積によって引き起こされる4。治療用のｓｉＲＮＡは、標的外への影響を抑えるようには設計されることができるが、血清中における僅かな安定性、短い半減期、組織中及び細胞中への低い浸透を有し、自然免疫応答を誘発する5。従って、従来及び新規の抗ウイルス剤の薬物動態及び薬力学を改善できる生体適合性のナノ粒子送達方式（「ナノ担体」）の必要性が存在する。リポソーム、ポリマー性ナノ粒子、デンドリマー、カーボンナノチューブ、及び多孔性の無機ナノ粒子などの多数のナノ担体が、様々なインビボ診断用途及び治療用途向けに開発されている6。生体適合性の改善、循環時間の増大、免疫原性の低減、標的外との相互作用の最小化に関してかなりの進展がなされたものの、ほとんどの現行のナノ担体の治療有効性は、小さい装填容量、低い標的特異性、及び生理的条件下における僅かな安定性によって未だに限定されている。この目的のために、本発明者は、２種類の有望なナノ粒子送達媒体、即ちリポソーム及びメソ多孔性シリカナノ粒子（ＭＳＮＰ）の利点を相助作用的に組み合わせた、メソ多孔性シリカナノ粒子に担持された脂質二重層（「プロトセル」）を開発した7~9。
【０２８０】
＜プロトセルはリポソーム及びメソ多孔性シリカナノ粒子の両方の利点を併せ持つ＞
プロトセル（図４５参照）は、担持された脂質二重層（ＳＬＢ）に被包された球形の多孔性シリカナノ粒子のコアからなる。多孔性シリカナノ粒子は極めて大きい表面積（＞１２００ｍ2／ｇ）を有し、従って対象とするカーゴの溶液中にそれらを単純に浸漬することによって、高濃度の様々な治療薬及び診断薬が装填されることができる。さらに、本発明者が多孔性シリカナノ粒子を合成するために用いるエアロゾルによって支援される蒸発誘起自己組織化（ＥＩＳＡ）プロセス10は、幅広い構造指向性の界面活性剤及び得られた粒子の合成後処理と適合性があるので、細孔サイズを２．５ｎｍから２５ｎｍまで変化させることができる。そして、共に様々な化学的に異なるカーゴの簡単な被包を可能にするカチオン性シラン又は疎水性シランを用いて、細孔の壁部を修飾することができる。様々な化学的に異なるカーゴは、所望により、例えば低分子薬（酸性、塩基性、及び疎水性）、薬剤混合物、ｓｉＲＮＡ、タンパク質、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするＤＮＡベクター、並びに必要に応じて、量子ドット及び酸化鉄ナノ粒子などの診断薬である。本発明者は、低分子薬の場合にプロトセルが最大で５０ｗｔ％の装填容量を有することを示しており、これは他の多孔性シリカナノ粒子に基づいた送達媒体よりも５倍大きく、類似のサイズのリポソームよりも１０００倍大きい8。放出速度は、コアのシリカの縮合度、従って生理的条件下におけるその分解速度を制御することによって調整されることができる。熱焼成は縮合を最大化し、持続的な放出プロファイル（最大２週間に渡って７?１０％放出／日）を有する粒子をもたらす。一方で、界面活性剤を抽出するための酸性エタノールの使用は粒子の溶解度を増強し、被包された薬物のバースト放出をもたらす（１２時間以内に１００％放出）。カーゴが装填された多孔性シリカナノ粒子へのリポソーム融合は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びターゲティングリガンドなどの機能分子の提示のために、安定で流動性の生体適合性の界面を提供する密なＳＬＢの形成をもたらす。本発明者は、プロトセルが複雑な生体液（例えば完全増殖培地及び血液）中に分散された場合に、ＳＬＢが体温において流動性の脂質からなるか又は非流動性の脂質からなるかにかかわらず、低分子薬を最大４週間安定して被包することを明らかにした。対照的に、リポソームの二重層が完全飽和した脂質からなり、それが高い包装密度を有して、そのために二重層を通過する薬物の拡散を抑えるはずである場合でさえも、リポソームはそれらの被包された薬物を急速に漏出させる8。流動性だが安定したＳＬＢは、低いリガンド密度で非常に高い標的特異性を達成することを可能にし、それはさらに免疫原性及び非特異的相互作用を減少させる。本発明者は、ＳＬＢが流動性の双性脂質である１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）からなる場合に、平均僅か５個のターゲティングペプチド／粒子で修飾されたプロトセルが、非標的細胞よりも標的細胞に対して１０，０００倍高い親和性を有することを示した8。さらに、本発明者は、エンドサイトーシス及びエンドソーム脱出を引き起こすペプチドをプロトセルのＳＬＢ上に組み込むこと��、被包されたカーゴの細胞質内分散を可能にすることを示し、核局在配列（ＮＬＳ）などのターゲティング部分を用いてカーゴ分子を修飾することによって、特定のオルガネラ内へのカーゴの細胞内蓄積を達成できることを示した8。異種のカーゴに対するそれらの高い収容能力、低いリガンド密度における高い標的特異性、及び長期的な二重層安定性により、化学療法薬混合物が装填されてヒト肝臓癌に標的を定められたプロトセルは、相当するリポソームよりも１００万倍有効である8。提案された研究開発において、本発明者は、遊離薬物や、薬物が装填されたリポソームよりも優れた同様の治療有効性を実現することを目標として、細胞病原体に感染した細胞への治療薬の標的送達のためのプロトセルを設計する。
【０２８１】
＜プロトセルの適応性に富んだモジュール式の性質は、様々なインビボの課題に対処することを可能にする＞
潜在的な感染宿主細胞又は既に感染した宿主細胞中への抗ウイルス薬の蓄積を促進するために、プロトセルは、（１）宿主に対する毒性を引き起こすこと無く十分な時間連続して循環中に存在し、（２）標的組織中に蓄積し、（３）標的細胞に選択的に結合して内在化され、（４）それらの被包された薬物を必要な動力学を以て適切な細胞内区画内に放出し、（５）容易に排泄されることができる生体適合性のモノマーへと分解しなければならない。上記のように、本発明者は、低密度のターゲティングリガンドで修飾されたＰＥＧ化プロトセルが、容易に標的細胞に結合して内在化されること、さらにエンドソームの酸性化がＳＬＢを不安定化することによってコアを暴露して被包された薬物の持続的放出又はバースト放出をさせるまでは（上記ステップ（３）及び（４））、薬物を安定的に被包することを示した8。提案された研究開発の過程において、本発明者は、ウイルス感染細胞に標的を定められて抗ウイルス剤が装填されたプロトセルのインビトロにおける能力を、下記のように再評価する。ただし、マウスモデル及び鳥類胚モデルにおいても、プロトセルの生体内分布、生体適合性、及び生分解性を特性評価する（上記のステップ（１）、（２）、及び（５））。本発明者の予備的なインビボ研究は、プロトセルが高度に生体適合性であり、標的組織への広い分布及び残留性のために設計され得ることを示している。図４６Ａに示されるように、２００ｍｇ／ｋｇ用量のＰＥＧ化プロトセルを週３回で３週間連続して注射されたＢａｌｂ／ｃマウスは、全体的な毒性又は体重低下の徴候を示さない。それらの大きい装填容量を考えると、この結果は、プロトセルが少なくとも９００ｍｇ／ｋｇの低分子薬をバースト放出又は持続的放出の動力学のいずれかによって送達できることを示している。さらに、図４６Ｂによって明示されるように、直径２０?２００ｎｍのＰＥＧ化プロトセルは、用量２００ｍｇ／ｋｇでＢａｌｂ／ｃマウスに注射された場合に、４８時間にわたって広く分布したままである。これは、標的を定められたプロトセルが、標的組織に蓄積するのに十分な時間を提供する。本発明者はまた、サイズ及び表面の修飾を制御することによって、急性のリンパ芽球性白血病及び肝細胞癌のそれぞれの治療のために、Ｂａｌｂ／ｃマウス及びＮｕ／Ｎｕマウスの骨及び肝臓へのプロトセルの蓄積を促進できること、及び治療に適切な用量の化学療法薬ドキソルビシンが装填された場合でも、プロトセルが標的組織中に最大４週間残留し、全体的な毒性及び組織学的毒性の徴候が無いことも示しており、これらは器官重量及び病理のそれぞれによって明らかにされている（未発表データ）。さらに、本発明者とのＵＣＬＡのナノテク環境影響センターの共同研究者は、多孔性シリカナノ粒子が生分解性であり、最終的に珪酸として糞尿中に排泄されることを示している12。最後に、本発明者は、高密度（最大１０ｗｔ％）の長さ７?１２アミノ酸のペプチドで修飾されたプロトセルが、総用量４００ｍｇ／ｋｇでＣ５７Ｂ１／６マウスに注射された場合に、ＩｇＧ応答もＩｇＭ応答も誘発しないことを示している（未発表データ）。具体的な用途に必要な生体内分布に応じて、本発明者は、多孔性シリカナノ粒子���サイズ及び形状（球形、円盤状、及び棒状）並びにＳＬＢの電荷及び表面修飾を制御することができ、このことはプロトセルを、モジュール式の非常に適応性に富んだナノ粒子送達方式にしている。
【０２８２】
＜抗ウイルス剤を装填され、未感染宿主細胞及び感染宿主細胞に標的を定められたプロトセルの合成＞
提案される研究開発において、本発明者は、承認されたワクチンも有効な治療薬も存在しないＢＳＬ−４パラミクソウイルスであるニパウイルス（ＮｉＶ）に感染した細胞への、ｓｉＲＮＡ及び低分子抗ウイルス剤の標的送達のためののプロトセルを設計する。最終目標は、遊離薬物又はリポソーム薬物を用いて達成可能なものと比較した場合に、治療の種類、頻度、期間、及び用量を最小化し、現在の限度よりも治療を延期し、再発病を予防することである。本発明者は、その十分に特徴的な構造及び細胞指向性並びにその生物学的脅威としての重要性により、ＮｉＶをモデルエマージングウイルスとして選択した14。本発明者は、標的細胞の細胞質へのｓｉＲＮＡの送達におけるプロトセルの有用性を以前に報告している7。しかし、本発明者がこれらの研究に用いた多孔性シリカナノ粒子は、粒子のサイズ、サイズ分布及び収率におけるバッチ間変動が高いという問題がある油中水型エマルション技術を用いて合成された15。従って、本発明者は、ｓｉＲＮＡの被包及び送達に好適な多孔性シリカナノ粒子を作製するために、先ずエアロゾルによって支援されるＥＩＳＡプロセスを改変し、再現性ある特性を備えた大量の粒子の製造を可能にすることから始める。これらの多孔性シリカナノ粒子は、負荷電のｓｉＲＮＡ（１３?１５ｋＤａ）を収容するのに十分な、大きい正荷電の細孔を有する必要があり、肝臓及び脾臓中への蓄積を最小化しかつ細網内皮系（ＲＥＳ）の単球／マクロファージによる取り込みを抑えるために、直径＜２００ｎｍでなければならない6。表面積を最大化すること及び細孔の連結を最大化することも、装填容量を最大化するために重要であると考えられる。これらの特性を有する粒子を作製するために、本発明者は２つの合成方法を検討する。第１の方法においては、本発明者は、単相の粒子を作製するために二成分の界面活性剤方式を用いる。具体的には、大きい細孔を形成するプルロニック（登録商標）Ｆ１２７などの界面活性剤を、高度な連結性を備えた高表面積の中間相を通常形成する臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）などの界面活性剤と組み合わせて使用する。これらの界面活性剤の安定した３相混合物をシリカ前駆体ゾル中に形成することができれば、５ｎｍより大きい細孔を有する粒子を作製することが可能である。第２の方法においては、本発明者は、大きい細孔を形成する界面活性剤（例えばＦ１２７）を安息香酸でポリマー化することによって、安定したミミズ状の中間相を予形成する。この混合界面活性剤は、表面から利用可能な、サイズが最大２０ｎｍの細孔を得るために、次にポリマー性の膨潤剤（例えばポリプロピレングリコール）と共にシリカ前駆体ゾルに添加される。細孔のサイズ及び構造が最適化された後は、粒子を３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）などのアミン化シランと反応させ、細孔の構造への影響を最小限にしながら粒子のζ電位を劇的に増大させる。最後に、本発明者は、粒子のサイズ及びサイズ分布を抑えるため、通常は粒子の幅広い分布（５０ｎｍ?＞１μｍ）をもたらすエアロゾルによって支援されるＥＩＳＡプロセスを改変する方法を研究する。加熱又はエタノールを用いた希釈によって前駆体ゾルの粘度をエアロゾル化前に抑えることは、生ずる粒子の分布を＜２００ｎｍまで変えると考えられる。全ての多孔性シリカナノ粒子のサイズ、サイズ分布、ζ電位、表面積、及び細孔サイズ分布は、動的光散乱（ＤＬＳ）、電子顕微鏡法、及び窒素収着を用いて特性評価される。適切な特性を有する多孔性シリカナノ粒子を作製した後に、本発明者は、以前に報告された技術を用いてそれらのｓｉＲＮＡ装填容量及びｐＨに依存した放出速度を試験する7。本発明者は、初期にはバースト放出が可能な粒子を用いるが、下記のエクスオボ研究の結果により放出速度を状況に合わせて変えることができる。本発明者は次に、６５ｗｔ％のＤＯＰＣ、５ｗｔ％の１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及び３０ｗｔ％コレステロールからなるリポソームをｓｉＲＮＡが装填されたコアに融合させ、生じたＳＬＢを、ＤＯＰＥ中の１級アミン部分及びシステイン中のスルフヒドリル部分と反応する市販の架橋剤を用いて、一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）又はペプチド（コンジュゲートを促進するためにＣ末端システイン残基を持つように合成した）で修飾する。本発明者はまた、１０ｗｔ％のＰＥＧ−２０００を用いてＳＬＢを修飾し、質量分析を用いて平均リガンド密度及びＰＥＧ密度を特性評価する。ＰＥＧ−２０００は、インビボにおけるナノ担体表面への血清タンパク質の吸着を低減し、細網内皮系による取り込みを最小化することが示されている6。図４５は、本発明者が開発を提案するプロトセルの概念図を示す。
【０２８３】
＜標的を定められ、薬物が装填されたプロトセルの結合、内在化、及びカーゴ送達特性のインビトロにおける最適化＞
本発明者は、ＮｉＶの感染受容体であるエフリンＢ２に結合するペプチドを特定するためにファージディスプレイを用いた16。ヒトエフリンＢ２を発現させるようにトランスフェクションされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に対してパニングを行い、親ＣＨＯ細胞及びヒトエフリンＢ１を発現させるようにトランスフェクションされたＣＨＯ細胞に対するバイオパニングを行った。５ラウンドの選択の後、主配列は７ｍｅｒのＴＧＡＩＬＨＰ（配列番号１８）であり、酵素結合免疫吸着剤法によって測定したところ複数のエフリンＢ２陽性細胞株に良く結合した（未発表データ）。本発明者は、高密度及び低密度のＴＧＡＩＬＨＰペプチドで修飾されたプロトセルの解離定数（Ｋd）を、フローサイトメトリー又は表面プラズモン共鳴を用いて様々なエフリンＢ２陽性及び陰性の細胞に対して測定する。それらの値を、エフリンＢ２特異的ｓｃＦｖを提示するプロトセルの親和性と比較する17。最大１０ｗｔ％のヘプタペプチドで修飾されたプロトセルが非免疫原性であることを考えると、ターゲティングペプチドはｓｃＦｖより望ましい。本発明者は、宿主細胞（即ち、エフリンＢ２発現細胞）及び感染細胞（即ち、初期研究においてＮｉＶ−Ｇを発現するようにトランスフェクションされた細胞）の両方を標的とするために、感染細胞表面に発現されているＮｉＶ結合糖タンパク質（Ｇ）に結合するｓｃＦｖを用いてもプロトセルを修飾する18。エフリンＢ２又はＮｉＶ−Ｇに結合するリガンドが所望の親和性を達成するには不十分である場合には、本発明者は、さらなるリガンドを特定するためにファージディスプレイを行う。次に、本発明者は、共焦点蛍光顕微鏡法を用いて、ペプチド及びｓｃＦｖによって標的を定められたプロトセルが標的細胞によって内在化されるかどうかを明らかにし、もしそうであるならばそれらの細胞内の結末を評価する。ターゲティングリガンドがそのままでは内在化を引き起こさない場合には、本発明者は、ナノ粒子上に高密度で提示された場合にマクロピノサイトーシス及びマクロピノソーム脱出の両方を引き起こすことが公知であるペプチド（オクタアルギニン又はＲ８）を用いてＳＬＢを修飾する19、20。ｓｉＲＮＡが装填されたプロトセルの治療有効性を評価するために、本発明者は、先ず長波長赤色蛍光レポータータンパク質（ｍＫＡＴＥ）、ＮｉＶヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、及びＮｉＶマトリクスタンパク質（Ｍ）に特異的なｓｉＲＮＡを設計して確認する。本発明者はその後、次の細胞での発現レベルを測定するためにリアルタイムＰＣＲを用いる。（１）ｍＫＡＴＥをコードするＮｉＶ−Ｇ／Ｆシュードタイプの水疱性口内炎ウイルス（ＮｉＶｐｐ18）に予め感染し、そしてｍＫＡＴＥ特異的ｓｉＲＮＡが装填された、エフリンＢ２を標的としたプロトセルに暴露されたＶｅｒｏ細胞及び／又はヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞、（２）ＮｉＶ−Ｎ及びＮｉＶ−Ｍで予めトランスフェクションされ、そしてＮｉＶ−Ｎ及びＭに特異的なｓｉＲＮＡが装填された、エフリンＢ２を標的としたプロトセルに暴露されたＶｅｒｏ細胞及び／又はＨＥＫ細胞、（３）ｍＫＡＴＥ及びＮｉＶ−Ｇの表面発現の両方をコードするＮｉＶｐｐに予め感染し、そしてｍＫＡＴＥ��異的ｓｉＲＮＡが装填された、Ｇを標的としたプロトセルに暴露されたＶｅｒｏ細胞及び／又はＨＥＫ細胞。並行して本発明者は、生ＮｉＶに対して検証するために、ＮｉＶ−Ｎ及びＮｉＶ−ＭのｓｉＲＮＡをテキサス大医学部（ＵＴＭＢ）のA. Freibergに提供する。Ｎ特異的ｓｉＲＮＡ又はＭ特異的ｓｉＲＮＡがウイルス複製をインビトロで阻害した場合には、本発明者は、ｓｉＲＮＡが装填されたエフリンＢ２を標的としたプロトセルの有効性も試験する。ｓｉＲＮＡが標的遺伝子を長い（＞７２時間）時間発現抑制するのに不十分である場合には、本発明者は、ｍＫＡＴＥ、ＮｉＶ−Ｎ、及び／又はＮｉＶ−Ｍに特異的なｓｈＲＮＡをコードするミニサークルＤＮＡベクター21を設計し、装填し、送達する。また、本発明者は、チャネルロドプシン22及び他の光開閉型イオンチャネルが低分子抗ウイルス剤の伝達用に操作可能かどうか、及び誘発された送達を可能にするためにプロトセルのＳＬＢ中に組み込み可能かどうかを明らかにする。
【０２８４】
＜プロトセルのインビボ治療能を評価するための鳥類胚の使用＞
本発明者は、ペプチド又はｓｃＦｖによって標的を定められたプロトセルのインビトロにおける結合、内在化、及びカーゴ送達特性を最適化した後に、それらのインビボにおける治療能を評価する。これを行うために、ＮｉＶは一般的な小動物モデル（即ちマウス及びラット）においては発病しないので、本発明者は鳥類胚をインビボのモデル系として用いる14。さらに、鳥類胚はＮｉＶの発病機序を研究するためにすでに用いられており、そして単一細胞分解能を有する生体イメージング技術に適している23。最後に、鳥類胚は、一般的な小動物モデルの１／１０?１／１００の費用であり、動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）の規制を受けないので、ナノ粒子の費用効果が高いハイスループットスクリーニングに理想的である。本発明者は、先ず、胚に対する毒性を最小化しながらＮｉＶｐｐがコードするタンパク質の発現を最大化するために、胚齢及びＮｉＶｐｐ濃度を最適化する。本発明者は次に、ｍＫＡＴＥをコードしかつ感染細胞にＮｉＶ−Ｇの表面発現を誘発するＮｉＶｐｐに予め感染した胚を用いて、ｍＫＡＴＥ特異的ｓｉＲＮＡが装填され、ＮｉＶ−Ｇに標的を定められたプロトセルの発現抑制有効性を測定する。最後に、本発明者は、ｓｉＲＮＡ（又は必要に応じて、ミニサークルＤＮＡ）、従来の抗ウイルス剤（リバビリンなど）、及び新規の広域スペクトル抗ウイルス剤（例えばＬＪ００１24）などの抗ウイルス剤の複雑な組み合わせを、ヒトエフリンＢ２を発現するようにトランスフェクションされ、ｍＫＡＴＥ及びＮｉＶ−ＧをコードするＮｉＶｐｐに感染した胚に送達するプロトセルの能力を評価する。
【０２８５】
＜実施例６の参考文献＞
１．Clercq, E. D., Nat Rev Drug Discov, 6, 941-941 (2007).
２．Ge, Q., L. Filip, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101, 8676-8681 (2004).
３．Novina, C. D., M. F. Murray, et al., Nature Medicine, 8, 681-686 (2002).
４．Lembo, D., R. Cavalli, Antiviral Chemistry and Chemotherapy, 21, 53-70 (2010).
５．Gavrilov, K., W. M. Saltzman, Yale Journal of Biology and Medicine, 85, 187-200 (2012).
６．Peer, D., J. M. Karp, et al., Nat Nano, 2, 751-760 (2007).
７．Ashley, C. E., E. C. Carnes, et al., ACSNano, 6, 2174-2188 (COVER) (2012).
８．Ashley, C. E., E. C. Carnes, et al., Nat Mater, 10, 389-397 (COVER) (2011).
９．Epler, K., C.E. Ashley, E.C. Carnes, Advanced Healthcare Materials, 1, 241-241 (COVER) (2012).
１０．Lu, Y. F., H. Y. Fan, et al, Nature, 398, 223-226 (1999).
１１．Meng, H., M. Liong, et al., ACSNano, 4, 4539-4550 (2010).
１２．Lu, J., M. Liong, et al., Small, 6, 1794-1805 (2010).
１３．Meng, H, S. Yang, et al., ACSNano, 5, 4434-4447 (2011).
１４．Bossart, K., J. Bingham, D. Middleton, The Open Virology Journal, 1, 14-25 (2007).
１５．Carroll, N. J., S. Pylypenko, P. B. Atanassov, D. N. Petsev, Langmuir, 25, 13540-13544 (2009).
１６．Negrete, O. A., E. L. Levroney, et al., Nature, 436, 401-405 (2005).
１７．Gu, X., Y. Vedvyas, et al., PLoS ONE, 7, e30680 (2012).
１８．Negrete, O. A., D. Chu, H. C. Aguilar, B. Lee, Journal of Virology, 81, 10804-10814 (2007).
１９．Khalil, I. A., K. Kogure, S. Futaki, H. Harashima, Journal of Biological Chemistry, 281, 3544-3551 (2006).
２０．El-Sayed, A., I. A. Khalil, et al, Journal of Biological Chemistry, 283, 23450-23461 (2008).
２１．Chen, Z.-Y., C.-Y. He, A. Ehrhardt, M. A. Kay, Mol Ther, 8, 495-500 (2003).
２２．Kleinlogel, S., K. Feldbauer, et al., Nat Neurosci, 14, 513-518 (2011).
２３．Tanimura, N., T. Imada, Y. Kashiwazaki, S. H. Sharifah, Journal of Comparative Pathology, 135, 74-82 (2006).
２４．Wolf, M. C, A. N. Freiberg, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences (2010).
２５．Gao, F., P. Botella, et al., The Journal of Physical Chemistry B, 113, 1796-1804 (2009).
【実施例７】
【０２８６】
［標的を定められていないプロトセルの生体内分布及び毒性］
標的を定められていないプロトセルの予備的な生体内分布及び毒性が評価された。Ｂｕｌｂ／ｃ又はＮｕ／Ｎｕマウスでの生きた動物の蛍光イメージングを用いて、蛍光コアで修飾された標的を定められていないプロトセルが、最大用量４ｍｇ／マウス（２００ｍｇ／ｋｇ）の静注後に全身に分布することが分かる（図４７Ａ）。この体循環時間は、標的を定められたプロトセルの特定の細胞中への蓄積の時間を、細胞の所在位置にかかわらず提供すると考えられる。２４?４８時間にわたって、残りのプロトセルが肝臓及び脾臓に蓄積することを見ることができる。２００ｍｇ／ｋｇでの３回投与後には、かなりの濃度の粒子が、少なくとも２週間肝臓内に留まる（図４７Ｂ、Ｄ）。肝臓内へのこの蓄積及び滞留は、病理及び肝臓重量によって測定されるようないかなる肝臓全体（図４８）の毒性ももたらさない。従って、標的を定められていないプロトセルは、それらが標的送達に用いられる潜在性に加えて、抗ウイルス剤及びｓｉＲＮＡの大きな持続的用量を送達するための理想的な貯蔵容器として機能し得る。さらに、３週間の週３回の２００ｍｇ／ｋｇ投与（総シリカ用量は３６ｍｇ／マウス）後に、毒性及び体重減少は観察されなかった（図４７Ｃ）。この極めて大用量でさえも、プロトセルは最小の毒性か、毒性が無いようである。
【実施例８】
【０２８７】
［経皮プロトセルの拡散］
＜方法＞
標準的なプロトセル組成（ＤＯＰＣ（Ｔｍ＝?２０℃）５５ｗｔ％、コレステロール３０ｗｔ％、ＤＯＰＥ−ＰＥＧ１５ｗｔ％）を用い、それを角質層がそのまま残された箇所及び角質層が除去された箇所で皮膚サンプルに暴露する。ＩＣＰ質量分析を用いて分析する。
【０２８８】
脂肪組織を皮膚から取り除き、皮膚を０．６４ｃｍ×０．６４ｃｍ平方に切り分けた。皮膚を次にフランツ型拡散セル上に配置し、４５分間平衡化した。平衡化後に、拡散緩衝液を取り除き、未使用の拡散緩衝液に交換した。もう１度、皮膚を４５分間平衡化した。８．１２５ｍｇ（６５０μｌ）のプロトセルをセルキャップに添加した。２４時間後にセルキャップ中の液を回収した。そして皮膚を軽く水分を取ってから洗浄した。レセプター液も回収した。皮膚及びレセプターを、ＩＣＰ質量分析を用いて分析した。角質層は、サンプルのうちの３つについてはそのまま残され、他の３つのサンプルについてはテープを用いて除去された。対照は、角質層が除去された皮膚サンプル及び角質層がそのままの皮膚サンプルであり、０．５×ＰＢＳで処理された。上記のデータは、各サンプルの容器液のＩＣＰ質量分析の結果を示す。容器液のＩＣＰは、２０１１年１０月２７日に行った。このデータは平均され、標準偏差が計算された。図４９、５０、５１。ドナーキャップサンプルのＩＣＰ質量分析を測定した。図５２。
【０２８９】
予備的なデータは、プロトセルの少数が全層の皮膚及び部分的な層の皮膚の両方を通過して拡散できることを示唆した。これは、プロトセル表面の修飾が、皮膚の透過性及びそれに続く皮膚を通過してのプロトセルの拡散に影響を与えるであろうことを示唆している。
【０２９０】
皮膚を通過して拡散するプロトセル量を定量化する迅速な方法を特定するために、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３で蛍光標識されたＳｉＯ2コアが作製される。容器液中のＳｉＯ2濃度を測定するために、蛍光分光分析が用いられる。これは、セルのドナーキャップ中に残ったＳｉＯ2量を測定するためにも拡大適用することができる（図５４、５５、５６、５７参照）。コアの機能化は図５３に示される。
【０２９１】
正の対照は、皮膚の自己蛍光を利用しながら、皮膚中の蛍光標識された粒子がイメージングされ得ることを示した。図５８。
【実施例９】
【０２９２】
［経皮的なＳｉＯ2ナノ粒子］
＜蛍光光度計の設定＞
強度単位＝カウント／秒
励起：６３２ｎｍ
発光スキャン：６４４ｎｍ?６５０ｎｍ（全ての値は６４７ｎｍで算出された）
ステップサイズ＝１ｎｍ
スリットサイズ＝２ｎｍ
測定時間＝１秒
ＡＳＯＣサンプリング頻度＝０．２ｋＨｚ
【０２９３】
＜前提及び公知の変数＞
−全ての粒子は、Ｄｙｌｉｇｈｔ６３３を用いて、ＮＨ2−シリカに対して１０μｇ／ｍｇの染料で蛍光標識された。
−Ｄｙｌｉｇｈｔ６３３の最大発光は６４７ｎｍであり、最大励起は６３２ｎｍである。
−全てのブランクは、容器液からなる同一のストック溶液から取られ、従って値は平均された。
−各サンプルは、最低３回、最大９回の測定操作を行った。
−サンプルは各測定操作前に混合された。
・全てのエラーバーは、９５％信頼区間を表す。平均からの標準偏差が算出された後、標準誤差を算出するのに用いられ、９５％信頼度を得るために１．９６倍された。
・標準曲線は、対照容器（Ｓ１と示す）の２４時間の容器液を用いて作成された。
・標準曲線は、１：２希釈での［開始］の０．１６ｍｇ／ｍｌから始まり、１．９５３１２５Ｅ?５ｍｇ／ｍｌまでであった。
・標準曲線は、２次の多項方程式に従うが（Ｒ2＞０．９９）、該当する濃度範囲に渡って曲線の直線部分を用いて線形回帰分析が適用され得る（Ｒ2＞０．９３）。標準曲線は、Ｌｏｇ平均ＦＩ対Ｌｏｇ［ＳｉＯ2］をプロットした。
・皮膚は自己蛍光での大きな不均質性を示す。従って０時間サンプルは、プロトセルをドナーキャップ中に加える前に抽出され、２４時間のブランク（Ｓ１）との間の自己蛍光の差が確認された。
・次にこの差を、全ての残りの容器液（Ｓ２?Ｓ９）を対照（Ｓ１）に対して標準化するために、補正値として０時間サンプルに対して加算又は減算した。
・０時間、４時間、及び２４時間の時点における補正後の平均蛍光強度から未知濃度を算出するために、曲線の直線部分の方程式を用いた。
・０時間時点から得られた濃度は、容器中の実際のＳｉＯ2含有量を測定するために４時間及び２４時間の時点から減算された。
【０２９４】
改変されたフランツ型拡散セルが、全ての実験で用いられた。皮下組織の除去後に、ドナー提供された腹部皮膚を約２ｃｍ2の細片に切り分け、気泡の形成を避けながら５．１ｍｌの容器上に配置し、６０分間平衡化した。容器液は３７℃に維持した。６０分後に皮膚を取り除き、容器液を交換し、皮膚を３０分間再平衡化した。３０分後に０時間サンプルを抜き取って（約４００μｌ）新しい拡散緩衝液と替えられた。様々なプロトセル組成が、各組成につきｎ＝４で投与された（５００μｌ、０．５×ＰＢＳ中１６ｍｇ／ｍｌ）。各実験につき１つの皮膚（Ｓ１）を０．５×ＰＢＳで処理した。標準曲線は、Ｓ１の２４時間の容器液の１：２希釈を用いて濃度範囲０．１６ｍｇ／ｍｌ?１．９５３１２５Ｅ?５ｍｇ／ｍｌについて作成された。全ての標準曲線は、同一の一般的な２次の多項傾向に従い、Ｌｏｇ対Ｌｏｇ目盛にプロットされた。赤線は、９５％信頼度での平均ブランク値（Ｓ１、２４時間）を示す。図５９。
【０２９５】
４時間及び２４時間の時点における各容器の不明濃度を確認するために、蛍光分光分析と併せて線形回帰分析が用いられた。ｙ＝ｍｘ＋ｂ型の方程式（全てのＲ2＞０．９３００）を得るために、線形の傾向線が該当する濃度範囲／強度範囲に適用された。０時間、４時間及び２４時間の時点における各濃度を得るために、１０のｘについて式を解いた。次にこの値は、各時点におけるＳｉＯ2の総量（ｍｇ）を得るために５．１倍された。最終的な量は、０時間のサンプルから得られた値を減算することによって得られた。図６０。
【０２９６】
９種類の二重層組成のプロトセル及び担持された脂質二重層（ＳＬＢ）を有さないＳｉＯ2コアが調査された。ＳＬＢを有さないＳｉＯ2コアは、最高の蛍光強度を最大の分散と共に示すが、０．５×ＰＢＳ中で投与されたため、観察された強度は、元のままのコアではなく分解事象に起因する可能性が高い。３０ｗｔ％コレステロールを含むＤＯＰＣプロトセルは、最も安定した拡散を最小の変動量で示し、その次は３０ｗｔ％コレステロールを含むＤＳＰＣプロトセルである。２５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、及び４５ｗｔ％のＤＯＰＣを含むプロトセルは、２４時間の時点でμｇ量のＳｉＯ2を示した。最後に、２５ｗｔ％のＤＯＰＥ、３０ｗｔ％コレステロール、３０ｗｔ％のＤＯＰＣ、及び１５ｗｔ％のＰＥＧを含むプロトセルは、ＤＯＰＣ／コレステロールから組成されたプロトセルよりも経皮拡散の著しい増大を示したが、各サンプル間の統計的分散が大きかった。これらの結果は、ＳＬＢ組成が経皮拡散を大幅に変え得ることを示している。さらに、ＰＥＧを含む組成については興味深い傾向が観察された。図６１。
【０２９７】
ＤＯＰＣ（Ｔｍ＝?２０）／コレステロールプロトセルは、ＤＳＰＣ（Ｔｍ＝５５）／コレステロールプロトセルと比較して約２倍の量のＳｉＯ2を２４時間時点で示した。これは、より低い転移温度を有する脂質は全層の皮膚中により深く拡散すること、より高い転移温度を有する脂質は角質層において局所に留まることを提示するリポソーム文献と一致する。ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌ組成及びＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ組成へのＰＥＧ添加は、経皮拡散を著しく減少させた。親水性ポリマーであるＰＥＧは、透過増強剤として従来用いられている。本発明者は、減少した拡散は、細胞間ラメラの水性部分での細胞間構造を崩壊させず、従って拡散を妨げる相互作用に起因するという仮説を立てている。ＤＯＰＣプロトセル組成へのＤＯＰＥの導入は、調査された他の組成よりも増大した拡散を示す（貴重なスライド）。ＤＯＰＥ及びＰＥＧの両方の添加は、経皮拡散の著しい増大を示し（高い統計的分散を有する）、エタノールアミンとＰＥＧとの組み合わせが経皮拡散を好適に増大させ得ることを示唆している。この傾向は、ＤＳＣ、小角ＸＲＤ、共焦点顕微鏡法、及び可能であればＦＴＩＲを用いてさらに検討される。図６２。
【０２９８】
図６３、６４は、時間の関数としての補正後の平均蛍光強度の個別の増大を示す。全てのグラフにおいて、Ｓ１は、０時間、４時間、及び２４時間の時点におけるブランク値を示す。ブランクの自己蛍光は全体にわたって変わり、ほぼ変わらないか又は「２４時間のブランク値」まで経時的に増大するかのいずれかである。一部の文献は、容器液中に見られる自己蛍光が時間の関数として減少することを示唆しているが、今回は観察されなかった。場合によっては、強度対時間の傾きは最初の４時間において格段に急であり、経時的に減少する。他の場合には、傾きは最初の４時間において顕著でなく、時間の進行と共に急になる。場合によっては、傾きは経時的に一定のままである。これは、皮膚の不均質性により意外ではない。図６５、６６、６７は、組成が動力学に及ぼす影響を説明する。
【０２９９】
＜配列＞
ASVHFPP（Ala-Ser-Val-His-Phe-Pro-Pro）  配列番号１
TATFWFQ（Thr-Ala-Thr-Phe-Trp-Phe-Gln）  配列番号２
TSPVALL（Thr-Ser-Pro-Val-Ala-Leu-Leu）  配列番号３
IPLKVHP（Ile-Pro-Leu-Lys-Val-His-Pro）  配列番号４
WPRLTNM（Trp-Pro-Arg-Leu-Thr-Asn-Met）  配列番号５
H2N-SFSIILTPILPL-COOH  配列番号６
H2N-SFSIILTPILPLGGC-COOH  配列番号７
H2N-SFSIILTPILPLEEEGGC-COOH  配列番号８
GNQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQ-GGYGGC-COOH  配列番号９
RRM WKK  配列番号１０
PKKKRKV  配列番号１１
KR[PAATKKAGQA]KKKK  配列番号１２
H2N-GLFHAIAHFIHGGWHGLIHGWYGGC-COOH  配列番号１３
H2N-RRRRRRRR-COOH  配列番号１４
YLFSVHWPPLKA  配列番号１５
HAIYPRH peptide  配列番号１６
TPDWLFP  配列番号１７
TGAILHP  配列番号１８
【図１】
2014532071.tif 000003
【図２】
2014532071.tif 000004
【図２Ａ】
2014532071.tif 000005
【図３】
2014532071.tif 000006
【図４（１）】
2014532071.tif 000007
【図４（２）】
2014532071.tif 000008
【図５（１）】
2014532071.tif 000009
【図５（２）】
2014532071.tif 000010
【図５（３）】
2014532071.tif 000011
【図６】
2014532071.tif 000012
【図７】
2014532071.tif 000013
【図８】
2014532071.tif 000014
【図９】
2014532071.tif 000015
【図１０】
2014532071.tif 000016
【図１１（１）】
2014532071.tif 000017
【図１１（２）】
2014532071.tif 000018
【図１１（３）】
2014532071.tif 000019
【図１１（４）】
2014532071.tif 000020
【図１２】
2014532071.tif 000021
【図１３】
2014532071.tif 000022
【図１４】
2014532071.tif 000023
【図１５】
2014532071.tif 000024
【図１６】
2014532071.tif 000025
【図１７】
2014532071.tif 000026
【図１８】
2014532071.tif 000027
【図１９】
2014532071.tif 000028
【図２０（１）】
2014532071.tif 000029
【図２０（２）】
2014532071.tif 000030
【図２１】
2014532071.tif 000031
【図２２】
2014532071.tif 000032
【図２３】
2014532071.tif 000033
【図２４】
2014532071.tif 000034
【図２５】
2014532071.tif 000035
【図２６】
2014532071.tif 000036
【図２７】
2014532071.tif 000037
【図２８】
2014532071.tif 000038
【図２９】
2014532071.tif 000039
【図３０】
2014532071.tif 000040
【図３１】
2014532071.tif 000041
【図３２】
2014532071.tif 000042
【図３３】
2014532071.tif 000043
【図３４】
2014532071.tif 000044
【図３５】
2014532071.tif 000045
【図３６】
2014532071.tif 000046
【図３７】
2014532071.tif 000047
【図３８】
2014532071.tif 000048
【図３９】
2014532071.tif 000049
【図４０】
2014532071.tif 000050
【図４１】
2014532071.tif 000051
【図４２】
2014532071.tif 000052
【図４３】
2014532071.tif 000053
【図４４】
2014532071.tif 000054
【図４５】
2014532071.tif 000055
【図４６】
2014532071.tif 000056
【図４７】
2014532071.tif 000057
【図４８】
2014532071.tif 000058
【図４９】
2014532071.tif 000059
【図５０】
2014532071.tif 000060
【図５１】
2014532071.tif 000061
【図５２】
2014532071.tif 000062
【図５３】
2014532071.tif 000063
【図５４】
2014532071.tif 000064
【図５５】
2014532071.tif 000065
【図５６】
2014532071.tif 000066
【図５７】
2014532071.tif 000067
【図５８】
2014532071.tif 000068
【図５９】
2014532071.tif 000069
【図６０】
2014532071.tif 000070
【図６１】
2014532071.tif 000071
【図６２】
2014532071.tif 000072
【図６３】
2014532071.tif 000073
【図６４】
2014532071.tif 000074
【図６５】
2014532071.tif 000075
【図６６】
2014532071.tif 000076
【図６７】
2014532071.tif 000077
【配列表】
2014532071000001.xml
【国際調査報告】
2014532071.tif 000079
2014532071.tif 000080
2014532071.tif 000081
2014532071.tif 000082
2014532071.tif 000083