(57)【要約】  本開示では、哺乳類組織から間質血管画分細胞を単離するための自動化システムを実現する。システムは、緩衝液、組織試料、および消化用緩衝液を保管するための複数の容器を備える。組織処理ユニットは、組織を処理するために容器に流体接続されている。組織処理ユニットは、洗浄過程、消化過程、相分離過程、およびこれらの組み合わせのうちの少なくとも1つを実行して組織の水性画分と脂肪画分とを分離する。細胞濃縮ユニットは、組織処理ユニットから組織の水性画分を受け入れるため組織処理ユニットと流体接続される。細胞濃縮ユニットは、フィルタ振動装置によって濾過アセンブリを振動させることで組織の水性画分を濾過する。廃棄組織を受け入れるために、組織処理ユニットおよび細胞濃縮ユニットに流体接続可能な廃棄物捕集ユニットが設けられる。システムは、システムの動作を制御するため制御ユニットをさらに備える。
2014525260.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織の処理によって細胞を単離するためのシステム(100)であって、
消化および洗浄緩衝液、組織試料、および消化用緩衝液のうちの少なくとも1つをそれぞれが保管するための複数の容器(101a〜101c)と、
前記消化用緩衝液、組織試料、および洗浄緩衝液を受け入れ、前記組織試料を処理するため前記容器(101a〜101c)と流体接続可能である組織処理ユニット(102)であって、洗浄過程、消化過程、相分離過程、およびこれらの組み合わせのうちの少なくとも1つを実行して前記消化された組織試料から水性画分と脂肪画分とを分離する組織処理ユニット(102)と、
前記消化された組織の前記水性画分を濾過するため前記組織処理ユニット(102)と流体接続可能である細胞濃縮ユニット(103)であって、
消化された組織の前記水性画分を篩いにかけて細胞を捕集するための複数のフィルタ室(104a〜104c)を備える濾過アセンブリ(104)、および
前記フィルタ室(104a〜104c)の下に配置され、前記フィルタ室(104a〜104c)を振動させるフィルタ振動装置(105)を備える細胞濃縮ユニット(103)と、
前記組織処理ユニット(102)および前記濾過アセンブリ(104)に、前記組織処理ユニット(102)および前記濾過アセンブリ(104)から組織の水性画分および組織の脂肪画分のうちの少なくとも一方を受け入れるように流体接続可能である廃棄物捕集ユニット(106)と、
前記組織処理ユニット(102)および前記フィルタ振動装置(105)とインターフェースされ、前記組織から前記細胞を得るように前記組織処理ユニット(102)および前記フィルタ振動装置(105)の動作を制御する制御ユニット(107)とを具備するシステム(100)。
【請求項２】
前記組織は、脂肪組織、胎盤組織、および臍帯組織のうちの少なくとも1つから選択された哺乳類組織である請求項1に記載のシステム。
【請求項３】
前記脂肪組織を処理することによって、間質血管画分(SVF)細胞を、また多能性幹細胞/間質細胞を胎盤および臍帯組織から単離する請求項2に記載のシステム。
【請求項４】
組織試料、前記洗浄緩衝液、前記消化用緩衝液、および廃棄物液の流量を制御するため前記容器(101a〜101c)、組織処理ユニット(102)、細胞濃縮ユニット(103)、および廃棄物捕集ユニット(106)に接続可能な複数の蠕動ポンプ(108)および弁(109)を備える請求項1に記載のシステム(100)。
【請求項５】
前記容器(101a〜101c)、前記組織処理ユニット(102)、前記細胞濃縮ユニット(103)、および前記廃棄物捕集ユニット(106)は、チュービングシステム(110)を通じて互いに接続される請求項1に記載のシステム(100)。
【請求項６】
前記システム(100)は、室(111)内に適宜封入される請求項1に記載のシステム(100)。
【請求項７】
前記制御ユニット(107)は、前記組織を処理するために必要なパラメータを供給するディスプレイユニット(112)および入力ボタンを有するユーザインターフェースを備える請求項1に記載のシステム(100)。
【請求項８】
室(111)の温度を測定し、調節するために前記室(111)内に置かれている、少なくとも1つの温度センサ(113)を備え、前記温度センサ(113)は、前記室(111)の前記温度を所定の限界内に維持するために前記制御ユニット(107)とインターフェースする請求項1に記載のシステム(100)。
【請求項９】
前記組織処理ユニット(102)から組織の消化された水性画分を受け入れるため前記濾過アセンブリ(104)の第1の室内に設けられた少なくとも1つの投入ノズル(104f)を備える請求項1に記載のシステム(100)。
【請求項１０】
前記フィルタ室(104a〜104c)の内側の空気が自由に流れるのを容易にするように前記フィルタ室(104a〜104c)のそれぞれに設けられた少なくとも1つの排気ノズルが(104g)を備える請求項1に記載のシステム(100)。
【請求項１１】
前記フィルタ室(104a〜104c)のそれぞれに配置された少なくとも1つのフィルタカートリッジ(104e)を備える請求項1に記載のシステム(100)。
【請求項１２】
前記フィルタカートリッジ(104e)は、ハウジング(B)内に配設された所定の穿孔を有するフィルタエレメント(A)を備え、前記ハウジング(B)は、適宜、その底部に支持部材(C)を備える請求項11に記載のシステム(100)。
【請求項１３】
前記フィルタエレメント(A)の前記穿孔のサイズは、約1μmから約200μmまでの範囲内である請求項11に記載のシステム(100)。
【請求項１４】
所定の形状および所定のサイズの複数のフィルタ室(104a〜104c)、および
前記フィルタ室(104a〜104c)のそれぞれの中に配置された少なくとも1つのフィルタカートリッジ(104e)を備え、フィルタカートリッジ(104e)は、ハウジング(B)内に配設された所定の穿孔を有するフィルタエレメント(A)を備え、前記ハウジング(B)は、適宜、その底部に支持部材(C)を備える濾過アセンブリ(104)と、
濾過用の振動を発生させるために前記フィルタ室(104a〜104c)の下に配置されたフィルタ振動装置(105)とを具備する細胞濃縮ユニット(103)。
【請求項１５】
濾過のため流体を受け入れる前記濾過アセンブリ(104)の第1の前記フィルタ室(104a)内に設けられた少なくとも1つの投入ノズル(104f)を備える請求項14に記載のユニット。
【請求項１６】
前記フィルタ室(104a〜104c)の内側の空気が自由に流れるのを容易にするように前記フィルタ室(104a〜104c)のそれぞれに設けられた少なくとも1つの排気ノズルが(104g)を備える請求項14に記載のユニット。
【請求項１７】
前記フィルタ室(104a〜104c)のうちの少なくとも1つに接続されたフィルタ廃棄物室(104d)を適宜備える請求項14に記載のユニット。
【請求項１８】
前記フィルタ室(104a〜104c)および前記フィルタ廃棄物室(104d)は、上下に重ねて取り付けられる請求項14に記載のユニット。
【請求項１９】
前記フィルタ室(104a〜104c)および前記フィルタ廃棄物室(104d)は、互いに隣接して取り付けられる請求項14に記載のユニット。
【請求項２０】
前記フィルタ室(104a〜104c)および前記フィルタ廃棄物室(104d)のそれぞれは、チュービングシステム(110)を使用して接続される請求項19に記載のユニット。
【請求項２１】
前記フィルタ振動装置(105)は、
前記フィルタ振動装置(105)の基部を形成するように構成された所定の形状の硬質プレート(105a)と、
前記硬質プレート(105a)上の所定の位置に固定された複数のガイドシャフト(105b)であって、前記ガイドシャフト(105b)のそれぞれは前記ガイドシャフト(105b)の自由端のところに頂部ストッパ、および前記頂部ストッパの下の所定の距離ところに底部ストッパを備え、前記ガイドシャフト(105b)は、移動可能なプレート(105d)を通過するように配置構成され、
所定の形状の前記移動可能なプレート(105d)は、前記ガイドシャフト(105b)の底部ストッパ上に摺動可能に取り付けられ、前記移動可能なプレート(105d)は、前記濾過アセンブリ(104)に接続可能である、複数のガイドシャフト(105b)と、
前記ガイドシャフト(105b)の前記頂部ストッパと前記移動可能なプレート(105d)との間に取り付けられた少なくとも1つの圧縮バネ(105e)と、
前記移動可能なプレート(105d)の底部端部に固定され、振幅発生装置(105g)に追随するように構成された少なくとも1つのカム従動子(105f)と、
硬質プレート(105a)上に取り付けられ、前記振幅発生装置(105g)に結合されて、前記カム従動子(105f)を作動させて濾過のための振動を発生する、少なくとも1つのモータ(105h)とを備える請求項14に記載のユニット。
【請求項２２】
硬質プレート(105a)上に取り付けられた一対のロードベアリング(105i)を備え、前記振幅発生装置(105g)に結合される請求項21に記載のユニット。
【請求項２３】
それぞれのガイドシャフト(105b)の前記頂部ストッパと底部ストッパとの間の部分は、ガイドベアリング要素(105c)として構成される請求項21に記載のユニット。
【請求項２４】
請求項1に記載のシステム(100)を使用して脂肪組織から間質血管画分(SVF)細胞を取得する方法であって、
a.組織処理ユニット(102)により所定の量の組織試料および容器(101aおよび101b)内に収容されている洗浄緩衝液を受け入れる段階と、
b.洗浄緩衝液を使って前記組織試料を前記組織処理ユニット(102)内の混合物を撹拌することによって洗浄する段階と、
c.前記混合物の相分離で前記組織処理ユニット(102)内の一次脂肪性上部画分および一次水性下部画分を取得する段階と、
d.段階(c)で取得された前記一次水性下部画分を廃棄物捕集ユニット(106)に配設する段階と、
e.消化用緩衝液容器(101c)に収容されている所定の量の消化用緩衝液を前記組織処理ユニット(102)にポンプで注ぎ込む段階と、
f.所定の時間の間に前記組織処理ユニット(102)内で前記混合物を攪拌することによって前記消化用緩衝液で前記一次脂肪性上部画分を消化させる段階と、
g.所定の量の血清または酵素阻害剤またはこれらの組み合わせをポンプで送り、攪拌で混合することによって前記所定の期間の終わりに適宜消化過程を停止させる段階と、
h.前記組織処理ユニット(102)内の前記混合物の相分離で二次脂肪性上部画分および二次水性下部画分を取得する段階と、
i.前記二次水性下部画分を細胞濃縮ユニット(103)に送る段階と、
j.適宜前記SVF細胞を取得するために赤血球を除去するともに、フィルタ振動装置(105)による前記細胞濃縮ユニット(103)の濾過アセンブリ(104)を振動させることによって前記細胞濃縮ユニット(103)内で前記二次水性下部画分を濾過する段階とを含む方法。
【請求項２５】
前記段階(b〜d)は、少なくとも1回、好ましくは3〜4回実行される請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
段階(b〜d)は、約5分から約20分までの範囲内、好ましくは約10分の期間にわたって実行される請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
段階(f)は、約15分から約2時間までの範囲内、好ましくは約30分から約1時間までの範囲内の期間にわたって実行される請求項24に記載の方法。
【請求項２８】
前記相分離過程は、約15分から約10分までの範囲内、好ましくは約2分から約5分までの範囲内の期間に実行される請求項24に記載の方法。
【請求項２９】
前記消化用緩衝液は、緩衝液と消化用緩衝液との混合物であり、前記消化用緩衝液は、コラゲナーゼ、ペプシン、トリプシン、およびディスパーゼ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される請求項24に記載の方法。
【請求項３０】
前記洗浄緩衝液は、生理食塩水、リンガー溶液、ハンクス液(HBSS)、ラクトリンゲル液、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される請求項24に記載の方法。
【請求項３１】
段階(h)の前記二次水性下部画分は、SVF細胞、未消化組織廃棄物、RBC、リンパ球、および単球、またはこれらの組み合わせの混合物を含む請求項24に記載の方法。
【請求項３２】
前記洗浄緩衝液で洗浄し、前記消化用緩衝液を約35℃から約38℃までの範囲内、好ましくは約36.5℃から約37.5℃までの範囲内の温度にする請求項24に記載の方法。
【請求項３３】
濾過もしくはアフィニティマトリックスのうちの少なくとも1つまたはこれらの組み合わせによって赤血球の前記除去が適宜実行される請求項24に記載の方法。
【請求項３４】
前記SVFの前記取得が自動化され、過程全体を通して無菌状態を維持する請求項1および請求項24に記載のシステムおよび方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示の実施形態は、生体試料の処理のためのシステムおよび方法に関するものであり、より具体的には、脂肪組織を処理して間質血管画分(stromal vascular fraction)(SVF)細胞を単離するための自動化システムおよび方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞(MSC)は、骨髄、脂肪、胎盤、および臍帯などの複数の成体組織から単離することができ、再生医療にとって非常に有望な手段となっている。骨髄は、MSCのごくふつうの供給源であるが、臨床用途における主要な制限は、骨髄中のMSCの濃度が非常に低いことである。皮下脂肪組織は、MSCの含有量が高いので有望な代替的供給源として浮上しており、脂肪吸引または脂肪組織切除などの方法によって容易に入手できる。
【０００３】
脂肪組織は酵素分解されて、2つの主要な細胞集団、成熟脂肪細胞と間質血管画分(SVF)とを形成することができる。SVFは、前脂肪細胞、成熟内皮細胞(EC)、内皮前駆細胞(EPC)、血管平滑筋細胞(SMC)、周皮細胞、壁細胞、マクロファージ、線維芽細胞、および脂肪由来幹/間質細胞(ASC)からなる異種細胞混合物である。ASCは、含脂肪細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞に容易に分化できる自己更新多能性葉系前駆細胞である。それに加えて、何人かの研究者らが、特定の誘導的条件下でASCから内皮細胞系列、筋肉細胞系列、肝細胞系列、および神経細胞系列も派生させた。その可塑性に加えて、ASCは、免疫調節物質、栄養素、抗アポトーシス因子、抗瘢痕化因子、血管新生因子、および分裂因子などの生物活性分子も分泌する。したがって、脂肪組織からのSVFおよびASCは、細胞に基づいた治療において非常に大きな可能性を有する。
【０００４】
非拡大SVF細胞は自己細胞療法に特に適しており、患者自身の脂肪由来幹細胞の臨床用量を最小限度の操作で移植して戻せる。SVF細胞は、複数の臨床前疾患モデル、さらには、クローン病、移植片対宿主病、多発性硬化症および炎症性腸疾患のような自己免疫およびアレルギー病理、心筋梗塞、肢虚血、難治性創傷、放射線傷害、尿失禁などの兆候に対する臨床試験において治療上有利であることが示されている(Gimbleら、Stem Cell Research & Therapy 2010)。また、これらは、自己脂肪移植片の生存を延長することが示されているので美容および再建医療においても非常に大きな可能性を有している。Yoshimuraらによって実施された臨床研究(Yoshimuraら、Aesth Plast Surg, 2008)では、豊胸のための脂肪移植におけるSVFの強化の有効性を実証した。脂肪移植は、外科手術後乳房再建、美容豊胸、顔面皺の再建、皺矯正、および他の多くの軟組織異常に適用することができる。動物モデルにおける研究結果から、SVF細胞による移植片の強化は、脈管化を改善することによって、さらには含脂肪細胞の代謝回転、および抗アポトーシス因子の分泌を増強することによって、移植を促進することが判明している。実際、SVFの外来組成物、特に内皮前駆細胞の高い含有量は、血管原性細胞療法および血管修復に理想的である。いくつかのグループでは、直接的にまたはIGF-1、HGF、およびVEGFなどの増殖因子の放出を通じて血管形成を刺激することができるSVF中のCD34陽性細胞を識別しており、SVF細胞は、動物モデルにおいて新血管原性の可能を有していることが示されている。
【０００５】
SVFの単離に対する現在の手順は、コラゲナーゼで吸引脂肪組織の酵素消化を伴い、これは間質マトリックスを破壊してSVF細胞を放出する。次いで、SVFを遠心分離によって脂肪性画分から分離する。単離の従来の手順には、臨床用途の状況でいくつかの制限がある。
・  脂肪組織を病院からGMP適合研究所に輸送する必要がある。
・  脂肪組織の保管、取り扱い、および輸送は、SVFに含まれる細胞の収率、生存性、および品質に影響を及ぼしうる。
・  細胞の輸送、単離、および送達に要する時間が非常に長い。
・  患者は、医療行為発生時点に複数回の着座を強いられる。
・  細胞が直ちに必要な緊急状態では使用できない(例えば、創傷治癒、火傷、心筋梗塞など)。
・  ベンチトップオープンシステム処理では、治療薬の厳格な品質管理を要する。
【０００６】
幹細胞を処理するための自動化された閉鎖デバイス/システムを開発する少数のアプローチの環境はすでに整っている。このようなデバイスのいくつかの例として、CytoriのCelution(商標)システムおよびTissue Genesis TGI 1000(商標)があり、これらは現在臨床試験に入っている。
【０００７】
Ariffらは、その米国特許出願公開第20080014181号において、細胞治療に使用する組織試料から細胞を分離することができる自動化細胞分離装置を開示している。細胞分離装置は、さまざまな療法をサポートするために細胞捕集デバイスおよび/または植え付け装置などの補完デバイスと組み合わせて使用されうる。この自動化装置は、培地および組織解離化学薬品貯蔵容器、フィルタ、細胞分離器、および移植片基質または他の血管内デバイスをサポートする移植片室を通る灌流ループを備える。細胞療法においてデバイスによって作製される組織移植片および細胞試料を使用するための方法をさらに開示している。
【０００８】
米国特許第7,514,075号および米国特許出願20050084961号において、Hedrickらは、脂肪組織から、新生細胞、例えば、幹細胞および/または前駆細胞を分離するための自動化されたシステムおよび方法を説明している。本明細書で開示されているシステムおよび方法は、被検体内への再注入に適した新生細胞を分離し、濃縮する高速な信頼性の高い方法を実現する。
【０００９】
従来技術において開示されているデバイスは、細胞分離に遠心力を採用しており、これは細胞にストレスを与える。それに加えて、これらのデバイスは費用がかかり、かさばる。
【００１０】
前記の説明に鑑みて、臨床現場で経済的であり扱いやすい哺乳類組織を処理して間質血管画分(SVF)細胞を単離するためのシステムを開発する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第20080014181号
【特許文献２】米国特許第7,514,075号
【特許文献３】米国特許出願20050084961号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Gimbleら、Stem Cell Research & Therapy 2010
【非特許文献２】Yoshimuraら、Aesth Plast Surg, 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本開示において特許請求されているシステムおよび方法を提供することで、従来技術の欠点を克服し、さらなる利点をもたらす。
【００１４】
さらなる特徴および利点は、本開示の技法を通じて実現される。本開示の他の実施形態および態様は、本明細書において詳述されており、また特許請求されている開示の一部と考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本開示の一実施形態は、組織の処理によって細胞を単離するためのシステムに関係する。システムは、消化用緩衝液、組織試料、および洗浄緩衝液のうちの少なくとも1つをそれぞれが保管するための複数の容器を備える。組織処理ユニットは、消化用緩衝液、組織試料、および洗浄緩衝液を受け入れ、組織試料を処理するため容器と流体接続可能である。組織処理ユニットは、洗浄過程、消化過程、相分離過程、およびこれらの組み合わせのうちの少なくとも1つを実行して組織の水性画分と消化された組織試料の脂肪性画分とを分離する。細胞濃縮ユニットは、消化された組織の水性画分を濃縮するため組織処理ユニットと流体接続可能である。細胞濃縮ユニットは、細胞を捕集するために消化された組織の水性画分から細胞を篩いにかけるか、またはサイズに基づく濾過を行う複数のフィルタ室を備える濾過アセンブリを備え、フィルタ振動装置が、フィルタ室を振動させるために濾過アセンブリに取り付けられている。廃棄物捕集ユニットは、組織処理ユニットおよび濾過ユニットに、組織処理ユニットおよび濾過ユニットから消化された組織の水性画分および脂肪画分のうちの少なくとも一方を受け入れるように流体接続可能である。システムは、組織処理ユニットおよびフィルタ振動装置とインターフェースする制御ユニットをさらに備え、これにより、組織から細胞を得るように組織処理ユニットおよびフィルタ振動装置の動作を制御する。
【００１６】
本開示の一実施形態では、組織は、限定はしないが脂肪組織、胎盤組織、および臍帯組織を含む群から選択された哺乳類組織であり、脂肪組織は、間質血管画分(SVF)細胞および多能性幹細胞/間質細胞を胎盤および臍帯組織から単離するために処理される。
【００１７】
本開示の一実施形態において、システムは、組織試料、洗浄緩衝液、消化用緩衝液の流量を制御するため容器、組織処理ユニット、細胞濃縮ユニット、および廃棄物捕集ユニットに接続可能な複数の蠕動ポンプおよび弁を備える。
【００１８】
本開示の一実施形態において、容器、組織処理ユニット、細胞濃縮ユニット、および廃棄物捕集ユニットは、チュービングシステムを通じて互いに接続されている。
【００１９】
本開示の一実施形態において、システムは好ましくは室内に封入され、少なくとも1つの温度センサが室内に置かれ、室の温度を測定し、調節する。温度センサは、室の温度を所定の限界内に維持するために制御ユニットとインターフェースする。
【００２０】
本開示の一実施形態では、制御ユニットは、組織を処理するために必要なパラメータを供給するディスプレイおよび入力ボタンを有するユーザインターフェースを備える。
【００２１】
本開示の一実施形態において、システムは、濾過後に組織の残っている水性画分を捕集するために濾過アセンブリの最終フィルタ室に接続されているフィルタ廃棄物室を適宜備える。
【００２２】
本開示の一実施形態において、組織処理ユニットから消化された組織の水性画分を受け入れるために濾過アセンブリの一番上のフィルタ室に投入ノズルが設けられ、適宜、フィルタ室が上下に重ねて取り付けられているときにそれぞれの室から注目する細胞を捕集するために濾過アセンブリのそれぞれのフィルタ室内に吐出ノズルが設けられる。
【００２３】
本開示の一実施形態において、少なくとも1つの投入ノズルおよび少なくとも1つの吐出ノズルは、濾過ユニットのそれぞれのフィルタ室内に設けられ、第1のフィルタ室内に設けられている投入ノズルは、組織処理ユニットから消化された組織の水性画分を受け入れるように構成され、それぞれのフィルタ室内に設けられている吐出ノズルは、篩いにかけられた水性画分を後続の室にそれぞれ供給するか、または適宜、フィルタ室が互いに隣接して取り付けられているときにSVF細胞を適宜捕集するように構成される。
【００２４】
本開示の一実施形態において、室の内側の空気が自由に流れるのを容易にするように少なくとも1つの排気ノズルがフィルタ室のそれぞれに設けられる。無菌環境を維持するために、0.8μmから0.1μmまでの範囲内、好ましくは0.22μmのサイズの穿孔を有するフィルタで排気ノズルを保護する。排気フィルタ材料は、限定はしないが、PES(ポリエーテルスルホン)、酢酸セルロース、テフロン(PTFE)（登録商標）、または当技術分野で知られている他の材料が挙げられる。
【００２５】
本開示の一実施形態において、フィルタ室およびフィルタ廃棄物室は、上下に重ねて取り付けられる。
【００２６】
本開示の一実施形態において、フィルタ室およびフィルタ廃棄物室は、互いに隣接して取り付けられ、フィルタ室およびフィルタ廃棄物室のそれぞれは、チュービングシステムを使用して接続される。
【００２７】
本開示の一実施形態において、それぞれのフィルタ室は、少なくとも1つのフィルタカートリッジを備える。フィルタカートリッジは、ハウジング内に配設された所定の穿孔を有するフィルタエレメントを備え、ハウジングは、適宜、底部にプレートを備える。フィルタエレメントの穿孔のサイズは、約1μmから約200μmまでの範囲内である。
【００２８】
本開示の別の実施形態は、所定の形状をおよび所定のサイズの複数のフィルタ室を備える濾過アセンブリからなる細胞濃縮ユニットに関係し、適宜、フィルタ廃棄物室は、フィルタ室のうちの1つに接続される。少なくとも1つのフィルタカートリッジがフィルタ室のそれぞれの中に配置され、フィルタカートリッジは、ハウジング内に配設された所定の穿孔を有するフィルタエレメントを備え、ハウジングは、適宜、支持部材を備える。濾過用の振動を発生させるためにフィルタ室の下にフィルタ振動装置が置かれる。
【００２９】
本開示の一実施形態において、フィルタ振動装置は、フィルタ振動装置の基部を形成するように構成された所定の形状の硬質プレートを備える。複数のガイドシャフトが、硬質プレート上の所定の位置に固定され、ガイドシャフトのそれぞれはガイドシャフトの自由端のところに頂部ストッパ、および頂部ストッパの下の所定の距離ところに底部ストッパを備え、ガイドシャフトは、移動可能なプレートを通過するように配置される。所定の形状の移動可能なプレートは、ガイドシャフトの底部ストッパ上に摺動可能に取り付けられ、移動可能なプレートは、濾過ユニットに接続可能である。少なくとも1つの圧縮バネが、ガイドシャフトの頂部ストッパと移動可能なプレートとの間に取り付けられる。移動可能なプレートの底部端部にカム従動子が固定され、カム従動子は、振幅発生装置に追随するように構成される。硬質プレート上にモータが取り付けられ、モータは振幅発生装置に結合されて、カム従動子を作動させて濾過のための振動を発生する。
【００３０】
本開示の一実施形態において、フィルタ振動装置は、硬質プレート上に取り付けられた一対のロードベアリングを備え、振幅発生装置に結合される。
【００３１】
本開示の別の実施形態は、上で説明されているシステムを使用して組織から細胞を、好ましくは脂肪組織から間質血管画分(SVF)細胞を取得する方法に関係する。この方法は、所定の量の組織試料および洗浄緩衝液を容器から組織処理ユニット内に移送する段階を含む。次いで、組織処理ユニット内の混合物を撹拌することによって洗浄緩衝液で組織試料を洗浄し、混合物の相分離で組織処理ユニット内の一次脂肪性上部画分と一次水性下部画分とを取得することができる段階を含む。前の段階で取得された一次水性下部画分は、廃棄物捕集ユニットに配設される。次いで、所定の量の消化用緩衝液を容器からポンプで組織処理ユニットに送り、所定の時間の間に組織処理ユニット内で混合物を攪拌することによって消化用緩衝液で脂肪性上部画分を消化させて、所定の量の血清または酵素阻害剤またはこれらの組み合わせをポンプで送り、攪拌で混合することによって所定の期間の終わりに適宜消化過程を停止させる。あるいは、消化過程は、複数回の洗浄で停止させることもできる。次に、組織処理ユニット内の混合物の相分離で二次脂肪性上部画分および二次水性下部画分を取得することができる。次いで、二次水性下部画分を細胞濃縮ユニットに送る。二次水性画分は、適宜前記SVF細胞を取得するために赤血球を取り除くこととともに、細胞濃縮ユニットの振動支援濾過アセンブリを使用して細胞を濃縮するための細胞濃縮ユニットに供給される。
【００３２】
本開示の一実施形態において、一次水性下部画分過程の洗浄過程、相分離過程、および処分は、少なくとも1回、好ましくは3〜4回実施し、前述の過程に対する期間は、約5分から約20分までの範囲内、好ましくは約10分である。
【００３３】
本開示の一実施形態において、消化過程は、約15分から約2時間までの範囲内、好ましくは約30分から約1時間までの範囲内の期間に実行される。
【００３４】
本開示の一実施形態において、相分離は、約1分から約10分までの範囲内、好ましくは約2分から約5分までの範囲内の期間に行われる。
【００３５】
本開示の一実施形態において、消化用緩衝液は、緩衝液と酵素との混合物であり、酵素は、コラゲナーゼ、ペプシン、トリプシン、ディスパーゼ、およびこの目的のために当技術分野で知られている他のものまたはこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００３６】
本開示の一実施形態において、洗浄緩衝液または緩衝液は、生理食塩水、リンガー溶液、ラクトリンゲル液、ハンクス液(HBSS)、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００３７】
本開示の一実施形態において、第2の水性画分は、SVF細胞、未消化組織廃棄物、ならびにRBC、リンパ球、および単球などの血球、またはこれらの組み合わせの混合物を含む。
【００３８】
本開示の一実施形態において、洗浄緩衝液で洗浄し、約35℃から約38℃までの範囲内、好ましくは約36.5℃から約37.5℃までの範囲内の温度で消化を実行する。
【００３９】
本開示の一実施形態において、濾過もしくはアフィニティマトリックスのうちの少なくとも1つまたはこれらの組み合わせによって赤血球の除去が適宜実行される。
【００４０】
本開示の一実施形態において、SVFの取得は自動化され、過程全体を通して無菌状態を維持する。
【００４１】
前述の説明は、例示的なものにすぎず、決して制限することを意図していない。上述の例示的な態様、実施形態、および特徴に加えて、図面および以下の詳細な説明を参照することによってさらなる態様、実施形態、および特徴も明らかになるであろう。
【００４２】
本開示の新規性のある特徴および特性は、添付の特許請求の範囲において述べられる。しかし、開示それ自体は、好ましい使用法、さらなる目的とその利点と併せて、添付の図面とともに読んだときに例示的な実施形態の以下の詳細な説明を参照することで最もよく理解される。次に、類似の参照番号は類似の要素を表す添付図面を参照しつつ、例としてのみ、1つまたは複数の実施形態を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本開示の哺乳類組織から間質血管画分(SVF)細胞を単離するための自動化システムの斜視図である。
【図２】本開示の哺乳類組織から間質血管画分(SVF)細胞を単離するための自動化システムの正面図である。
【図３】本開示の哺乳類組織から間質血管画分(SVF)細胞を単離するためのシステムの線図である。
【図４】本開示の哺乳類組織から間質血管画分(SVF)細胞を単離するためのシステムのブロック図である。
【図５】本開示の哺乳類組織から間質血管画分(SVF)細胞を単離するためのシステムの濾過アセンブリの斜視図および拡大図である。
【図６】本開示の哺乳類組織から間質血管画分(SVF)細胞を単離するためのシステムのフィルタ振動装置の斜視図である。
【図７】本開示の一実施形態としての哺乳類組織から間質血管画分(SVF)細胞を単離するためのシステムの細胞濃縮ユニットの斜視図である。
【図８】本開示の別の実施形態としての哺乳類組織から間質血管画分(SVF)細胞を単離するためのシステムの細胞濃縮ユニットの斜視図である。
【図９】別の実施形態としての濾過アセンブリの下に取り付けられた複数のカム従動子を伴う濾過アセンブリの斜視図および側面図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
これらの図は、例示することのみを目的として開示の実施形態を示している。当業者であれば、本明細書で説明されている開示の原理から逸脱することなく本明細書に示されている構造および方法の代替的実施形態を採用できることを以下の説明から容易に理解するであろう。
【００４５】
前記の説明では、以下の開示の詳細な説明を理解しやすくするために本開示の特徴および技術的利点の概略を述べている。これ以降、本開示の特許請求の範囲の主題を形成する本開示の追加の特徴および利点について説明する。当業者であれば、開示されている概念および特定の実施形態を、本開示の同じ目的を実施するために他の構造物を修正または設計する基盤として容易に利用できることは理解するはずである。添付の特許請求の範囲において規定されているように、当業者には、そのような同等の構造物は本開示の趣旨および範囲から逸脱しないことも理解されるはずである。本開示に特徴的であると考えられる新規性のある特徴は、その編成および動作方法の両方に関して、さらなる目的とその利点と併せて、添付の図面に関連して考察するときに以下の説明からより理解されよう。しかし、これらの特徴のそれぞれは、例示および説明のみを目的として提供されており、本開示の制限の定義として意図されていないことは明確に理解されるべきである。
【００４６】
背景において言及されている欠点を克服するために、吸引脂肪組織から臨床グレードのSVF細胞を単離する医療行為発生時点管理システムを開発する必要がある。したがって、本開示では、脂肪組織を処理してSVFを単離するための自動化ベンチトップ/テーブルトップまたは携帯型医療行為発生時点管理システムを開示しており、これは、ユーザガイドヒューマンインターフェースによって操作するようにプログラムされる。
【００４７】
本開示の目的は、コンパクトな閉鎖型自動化医療行為発生時点管理システム、および脂肪組織、胎盤組織、および臍帯組織、および他の生体組織などの哺乳類組織から臨床グレードの多能性間質/幹細胞を分離して濃縮するための方法を提供することである。
【００４８】
本開示のさらに別の目的は、組織試料を洗浄して消化すること、さらには複数のフィルタ室を備える濾過アセンブリを使用して試料に細胞濃縮ユニット内で濾過を施すことによって生体試料を処理するためのシステムを実現することである。濾過は、限定はしないが、単純濾過、圧力支援濾過、真空支援濾過、および振動支援濾過、またはこれらの組み合わせなどの技法によって実行することができる。好ましい一実施形態において、以下の濾過技法は、振動支援濾過であり、フィルタアセンブリの設計および構造は、フィルタを詰まらせる細胞および廃棄物を除去するための振動機構を組み込んでいる。これらの機構はすべて、それ自体だけで、または組み合わせて、流量を改善し、フィルタ材料の詰まりを防ぎ、細胞濃縮ユニットの効率を高める。
【００４９】
本開示の目的は、脂肪組織からSVFを取得するために遠心力を使用しないシステム、および赤血球を適宜取り除くための手段を実現することである。
【００５０】
本開示のさらなる目的は、組織試料、消化用緩衝液、および洗浄緩衝液のための1つまたは複数の容器、洗浄および消化用の組織処理ユニット、1つまたは複数のフィルタ室を有する濾過アセンブリを備える細胞濃縮ユニット、廃棄物捕集ユニット、ならびにシステムからSVFを捕集するための手段を備える脂肪組織からSVFを分離して濃縮するためのシステムを実現することである。
【００５１】
本開示のさらに別の目的は、ディスポーザブルおよびノンディスポーザブルの要素を有する無菌システムを実現することである。1回だけ使用できるディスポーザブル要素は、試料を処理している間、または取り扱っている最中に汚染を防ぐ。その一方でデバイスの電気的および電子的要素などのノンディスポーザブル要素は、細胞処理領域から分離され、離れた場所に収納される。
【００５２】
簡単に言うと、本開示では、脂肪組織試料から臨床グレードの間質血管画分(SVF)を単離して処理するための閉鎖型自動化医療行為発生時点管理ベンチトップシステム、およびそのシステムを使用することによって脂肪組織試料から間質血管画分(SVF)を単離して処理するための方法を開示しているということである。医療行為発生時点管理システムは、最終細胞産物の処理および送達が最短の時間で行われることを保証し、細胞は患者に単一の着座姿勢で臨床現場における数時間の脂肪吸引手術の範囲内で送達される。システムは、適宜赤血球を取り除くための手段をさらに備える。手順の自動化で、専門要員が不要になり、また最終産物の一貫性が維持される。単離手順全体が、臨床グレードの無菌ディスポーザブルコンポーネントおよびチュービング要素により閉鎖自動化システム内で実行される。
【００５３】
本開示では、脂肪組織または他の組織から幹細胞を単離し、濃縮し、富化する過程を簡素化するために自動化閉鎖システム、医療行為発生時点管理デバイスを実現する。これは、臨床および獣医学用途のためにヒトおよび他の哺乳類から得られた組織試料を処理することができる。このデバイスは、哺乳類組織を処理して臨床グレードの多能性間質/幹細胞を取得するために使用されうる。哺乳類組織は、脂肪組織、胎盤組織、骨髄、および臍帯組織、またはこれらの組み合わせからなる群から選択することができる。このシステムは、研究所において研究用途に使用することができる。
【００５４】
システムは、臨床現場/病院での使用に好都合であるように設計されている。実施形態の1つにおいて、システムは、ベンチトップデバイスとして使用されるようにコンパクト設計であり、別の実施形態では、システム全体がデバイス全体を移動しやすいようにローラ/車輪上に取り付けられ、これにより、組織採取処置が実施される必要な操作場所に都合よく持ってゆくことができる。
【００５５】
この自動化システムは、概して2つのモジュールからなり、モジュール1が組織処理ユニットであり、組織試料が洗浄され、酵素消化を施される。組織処理ユニットは、多平面混合装置システム(MPMS)、電磁混合装置を含む従来の混合装置、モータ駆動混合装置からなる群から選択されるが、これに限定されない。モジュール2は、濾過により濃縮された細胞、好ましくはSVFを取得するための細胞濃縮ユニットである。濾過は、限定はしないが、単純濾過、圧力支援濾過、真空支援濾過、および振動支援濾過、またはこれらの組み合わせなどの技法によって実行することができる。
【００５６】
本開示の実施形態の1つにおいて、間質血管画分(SVF)処理システムは、臨床現場において無菌状態の細胞の哺乳類組織消化、加熱、洗浄、分離、および濃縮に必要なすべての電子コンポーネントおよびコンピュータ化制御システムを有する自動化装置である。好ましい一実施形態において、装置は2つのモジュールからなり、1つのモジュールは捕集された脂肪組織試料の消化および洗浄を行うためのものであり、組織試料、洗浄緩衝液、および消化用緩衝液を注入するための1つまたは複数の入口を備え、第2のモジュールは細胞を濃縮するためのもので、これもまた入口と出口とを備える。所望の臨床用途用の最終処理細胞は、当技術分野で知られているか、またはそのような目的に合わせた特殊設計の好適な細胞捕集装置を使用して出口から捕集される。組織処理ユニット、緩衝液ユニット、細胞濃縮ユニット、廃棄物捕集ユニットなどの装置のコンポーネントは、すべてのユニットを接続するチュービングシステムとともに1回のみ使用するためのものであり、これにより、汚染と感染を防ぐ。
【００５７】
別の実施形態では、SVF処理システムは、システムの操作/監視および診断に必要な電子コンポーネントのすべてを、デバイスの操作のためにユーザインターフェースを制御し、円滑にするコンピュータ化プログラムおよびソフトウェアとともに収納する。別の実施形態では、デバイスは、遠隔操作および遠隔診断用の通信インターフェースも有する。
【００５８】
好ましい実施形態の1つにおいて、ユーザインターフェースは、デバイスの操作に必要な設定を調整するための入力ボタンを備える表示画面を具備する。ユーザインターフェースは、タッチスクリーンディスプレイであってよい。
【００５９】
本開示のさらに別の実施形態において、デバイス全体が、デバイスを組み立てるためにディスポーザブルコンポーネントを接続するメインフレームワークを構成する永久的なノンディスポーザブルハウジングを備える。このフレームワークは、無菌容器、洗浄/消化ニット、細胞濃縮および廃棄物捕集ユニットを組み立てるためにチュービングを接続できるように使用できる接続手段を備える。
【００６０】
デバイスの操作は、モジュールおよび制御機構の精緻なエンジニアリングを通じて自動化される。ユーザ入力キーパッドは、試料の体積、作動される弁の位置、および作動順序のようなさまざまなパラメータを入力するためのオペレータ用のインターフェースとして働く。好ましい実施形態の1つにおいて、すべてのパラメータは、処理される所定の体積の組織について事前に計算されており、表示画面に表示される。しかし、試料の品質および用途に応じて、オペレータは、与えられた過程に対して新しいプログラムを作成するように自動プログラムをオーバーライドすることができる。
【００６１】
次に、脂肪組織からSVFを単離するために使用されるシステムおよび方法について図の助けを借りて説明する。図は、例示することのみを目的として用いられており、配置構成に対する制限として解釈されるべきでない。
【００６２】
図1および図2は、脂肪組織から間質血管画分(SVF)細胞を単離するための自動化システム(100)の斜視図および正面図を示す本開示の例示的で実施形態である。脂肪組織試料から間質血管画分(SVF)細胞を単離するためのシステム(100)は、組織試料、洗浄緩衝液、および消化用緩衝液を保管するための所定の形状を有する複数の容器(101a〜101c)を備える。組織処理ユニット(102)は、組織試料を処理するためのチュービングシステム(110)を通じて容器(101a〜101c)に流体接続されている洗浄/消化ユニットとも称される。組織処理ユニット(102)は、洗浄過程、消化過程、および相分離過程、ならびにこれらの組み合わせを実行して水性画分と消化された組織の脂肪性画分とを分離するために組織を処理する。細胞濃縮ユニット(103)は、組織の水性画分を濾過するためチュービングシステム(110)を通じて組織処理ユニット(102)に流体接続可能である。細胞濃縮ユニット(103)は、互いに流体接続されている所定の形状の複数のフィルタ室(104a〜104c)を備える濾過ユニット/アセンブリ(104)を具備する。また、濾過支援機構が、濾過アセンブリ(104)に接続されている。濾過アセンブリ(104)は、濾過後に水性画分組織の残っている部分を捕集するためにフィルタ室(104a〜104c)に取り付けられているフィルタ廃棄物室(104d)も適宜備える。さらに、それぞれのフィルタ室(104a〜104c)は、それぞれのフィルタ室(104a〜104c)とフィルタ廃棄物室(104d)との間に置かれている少なくとも1つのフィルタカートリッジ(104e)[図5に示されている]を備える。フィルタカートリッジ(104e)は、ハウジング(B)内に配設された所定のサイズを有するフィルタエレメント(A)を備える。ハウジングは、適宜、支持部材(C)を備える。フィルタカートリッジ(104e)は、組織処理ユニット(102)から受け取った組織の水性画分を濾過して、フィルタ室(104a〜104c)のうちの1つから注目する細胞を取得し、フィルタ廃棄物捕集ユニット(104d)内の廃棄組織を捕集する。本開示の一実施形態において、濾過支援機構は、単純濾過、圧力支援濾過、真空支援濾過、および振動支援濾過、または任意の組み合わせをなどの技法からなる群から選択されるがこれに限定されない。好ましい一実施形態において、以下の濾過技法は、振動支援濾過である。フィルタアセンブリの設計および構造は、フィルタを詰まらせる細胞および廃棄物を除去するための振動機構[図6に示されている]を組み込んでいる。これらの機構はすべて、それ自体だけで、または組み合わせて、流量を改善し、フィルタエレメントの詰まりを防ぎ、濾過により細胞濃縮を可能にする。システム(100)は、チュービングシステム(110)を使用して組織処理ユニット(102)および濾過アセンブリ(104)に流体接続されている所定の形状の廃棄物捕集ユニット(106)をさらに備える。廃棄物捕集ユニット(106)は、洗浄過程の後に組織処理ユニット(102)から組織の水性画分を、消化過程の後に組織処理ユニット(102)から組織の脂肪性画分を、濾過の過程の後に濾過アセンブリ(104)から組織の水性画分の残り部分を捕集するように構成される。さらに、システム(100)は、組織処理ユニット(102)および濾過支援機構/フィルタ振動装置(105)とインターフェースする制御ユニット(107)[図3に示されている]を備え、これにより、脂肪組織から間質血管画分(SVF)細胞を得るように組織処理ユニット(102)およびフィ���タ振動装置(105)の動作を制御する。
【００６３】
本開示の一実施形態において、システム(100)は、複数の蠕動ポンプ(108)を備え、複数のピンチ弁[図4に示されている]は、チュービングシステム(110)を使用して容器(101a-101c)、組織処理ユニット(102)、細胞濃縮ユニット(103)、および廃棄物捕集ユニット(106)の間に接続される。蠕動ポンプ(108)およびピンチ弁は、制御装置(107)とインターフェースし、組織試料、洗浄緩衝液、消化用緩衝液、および廃棄物流体の制御された流れを円滑にする。
【００６４】
本開示の一実施形態において、チュービングシステム(110)は、約0.5〜5cmの範囲内の直径を有する、限定はしないがシリコーンまたはTygonなどの可撓性の非反応性プラスチック材料から作られる。容器(101a〜101c)、組織処理ユニット(102)、細胞濃縮ユニット(103)、および廃棄物捕集ユニット(106)は、限定はしないが、ポリプロピレンまたはポリスチレンからなる群から選択された材料で作られる。組織処理ユニット(102)の幾何学的形状は、最大の表面積を備え、効率的な高率の熱伝達を促進するように設計される。組織処理ユニット(102)の形状は、円筒形、矩形、バッフル/フィンを備える円筒形、複数の積み重ねを使用する、または使用しない平坦な矩形幾何学的形状、ハニカム、および当技術分野で知られている他の好適な幾何学的形状のうちの少なくとも1つから選択される。
【００６５】
処理ユニット(102)は、処理のために最大2000mlの液体を入れられる作業容量を有する。別の実施形態では、組織処理ユニット(102)は、容量1000ml未満の体積を処理するように設計されている。さらに別の実施形態では、組織処理ユニット(102)の容積容量は、Table 1(表1)に示されているように処理される組織の体積の要件に関して設計される。Table 1(表1)に示されている体積は、例示することを目的としており、制限として解釈すべきでない。
【００６６】
【表１】
2014525260.tif 000003
【００６７】
別の実施形態では、デバイスは、大規模処理および小規模処理のために別々の容器を備える。本開示に関して、大規模処理は、300〜1000mlの範囲内の脂肪試料を意味し、小規模処理は50〜300mlの範囲内である。
【００６８】
本開示の一実施形態において、組織容器(101a)、緩衝液容器(101b)、および消化用緩衝液容器(101c)の容積容量は、処理される試料の要件に関して設計されている。一実施形態では、前記容器(101a〜101c)の容量は、300mlから10000mlまでの範囲内である。好ましい一実施形態において、容積容量は5000mlである。容器(101a〜101c)の容積容量は、要件に基づき可変であるものとしてよい。
【００６９】
システム(100)内のディスポーザブル要素は、容器(101a〜101c)、組織処理ユニット(102)、細胞濃縮ユニット(103)、廃棄物捕集ユニット(106)、チュービングシステム(110)、およびコネクタからなる。システム(100)で使用されるすべてのディスポーザブルコンポーネントは、臨床用途を対象とする生体試料を処理するのに適した医療グレードの材料で作られている。すべてのディスポーザブル要素は、γ線照射または当技術分野で知られている任意の他の手段によって殺菌され、1回のみ使用することを意図されており、無菌パッケージとしてシステム(100)に備えられる。別の実施形態では、無菌パッケージは、RFIDタグを使用するデバイスと連動する。チュービングは、最低20psi以上の圧力に耐える定格を有する。
【００７０】
上で説明されているようなシステム(100)は、室(111)内に適宜封入することができる。室(111)は透明または不透明であってよく、容器(101a〜101c)、組織処理ユニット(102)、細胞濃縮ユニット(103)、廃棄物捕集ユニット(106)、蠕動ポンプ(108)、およびシステムのチュービングシステム(110)を含むすべてのコンポーネントを支持するように構成される。本開示の一実施形態において、室の幾何学的形状は、限定はしないが、立方体、正方形、矩形、円筒形、およびこの目的のために使用することができる他の知られている幾何学的形状と、さまざまな形状であってよい。本開示の一実施形態において、制御装置(107)は、室(111)の頂面に取り付けられ、制御装置は、組織を処理するために必要なパラメータを供給するディスプレイ(112)および入力ボタンを有するユーザインターフェースを備える。ディスプレイ(112)は、限定はしないが、LCD(液晶ディスプレイ)ディスプレイ、発光ダイオード(LED)ディスプレイ、陰極線管(CRT)ディスプレイ、および薄膜トランジスタ液晶(TFT-LCD)ディスプレイ、または薄膜トランジスタ(TFT)ディスプレイからなる群から選択されうる。
【００７１】
本開示の一実施形態において、システム(100)は、室(111)の温度を測定し、調節するために室(111)内に置かれている、少なくとも1つの温度センサ(113)[図4に示されている]を備える。温度センサ(113)は、室(111)の温度を所定の限界内に維持するために制御ユニット(107)とインターフェースする。室(111)の温度は、約35℃から約38℃までの範囲内、好ましくは約36.5℃から約37.5℃までの範囲内に維持される。本開示の一実施形態において、室の内側の温度が所定の限界以下に降下したときに室(111)および組織処理ユニット(102)を加熱するため室(111)の所定の場所に複数の加熱パッドが設けられている。加熱バッドは、制御ユニット(107)とインターフェースし、前記制御ユニット(107)は、組織消化過程に必要な室(111)の内側の所定の温度を維持するように加熱パッドの動作を調節する。本開示の別実施形態において、室(111)の内側の温度は、限定はしないが、温風循環、または赤外線加熱機構もしくは当技術分野で知られているそのような他の技術の使用からなる群から選択された方法で維持されうる。
【００７２】
図5は、脂肪組織から間質血管画分(SVF)細胞を単離するためのシステム(100)の細胞濃縮ユニット(103)の濾過アセンブリ(104)の斜視図および拡大図を示す本開示の例示的な一実施形態である。濾過アセンブリ(104)は、所定の形状の複数のフィルタ室(104a〜104c)を備える。また、濾過支援機構/振動機構が、濾過アセンブリ(104)に接続されている。濾過アセンブリ(104)は、濾過後に組織の水性画分の残っている部分を捕集するために最終フィルタ室(104c)に取り付けられているフィルタ廃棄物室(104d)も適宜備える。本開示の一実施形態において、フィルタ室(104a〜104c)およびフィルタ廃棄物室(104d)の形状は、限定はしないが、円筒形、矩形、正方形、三角形、および台形からなる群から選択される。さらに、それぞれのフィルタ室は、少なくとも1つのフィルタカートリッジ(104e)を備える。フィルタカートリッジ(104e)は、ハウジング(B)内に配設された所定のサイズの穿孔を有するフィルタエレメント(A)を備える。ハウジングは、適宜、支持部材(C)を備える。支持部材(C)は、限定はしないが、穿孔してあるプレート、ざるなどからなる群から選択されうる。本開示の一実施形態において、フィルタエレメント(A)の穿孔のサイズは、約1μmから約200μmまでの範囲内である。
【００７３】
本開示の一実施形態において、ハウジング(B)は、中空に作られ、支持部材(C)は、適宜穿孔される。支持部材(C)の穿孔のサイズは、約0.2mmから約2mmまでの範囲内である。
【００７４】
本開示の一実施形態において、濾過アセンブリ(104)は、フィルタの第1の室(104a)、組織処理ユニット(102)から流体を受け入れるための投入ノズル(104f)、および排気フィルタによって保護されている排気ノズル(104g)を備える。フィルタの第1の室は、フィルタカートリッジを備える。フィルタカートリッジは、ハウジング(B)、フィルタエレメント(A)、および支持部材(C)からなる。フィルタの第1の室は、フィルタの第2の室(104b)に接続される。フィルタの第2の室(104b)は、排気ノズル(104g)およびフィルタカートリッジからなる。フィルタの第2の室(104b)は、フィルタの第3の室(104c)に接続される。フィルタの第3の室(104c)は、排気ノズル(104g)およびフィルタカートリッジからなる。フィルタの第3の室(104c)は、フィルタ廃棄物室(104d)に接続される。フィルタ廃棄物室(104d)は、廃棄物捕集ユニット(106)[図1に示されている]に接続されている廃棄物吐出ノズルからなる。フィルタ廃棄物室(104d)内に蓄積した廃棄物は、廃棄物捕集ユニット(106)に排出され、注目する細胞(最終産物)が、最終フィルタ室/フィルタの第3の室(104c)内に捕集される。フィルタの第3の室(104c)からの最終産物は、好適な手段により細胞捕集装置内に捕集される。細胞捕集装置としては、限定はしないが、注射器、細胞捕集袋、または当技術分野で知られている他の細胞捕集デバイスが挙げられる。
【００７５】
本開示の一実施形態において、排気ノズルは、無菌環境を確実にするために、0.8μmから0.1μmまでの範囲内、好ましくは0.22μmのサイズの穿孔の排気フィルタエレメントで保護されている。排気フィルタエレメントは、限定はしないが、PES(ポリエーテルスルホン)、酢酸セルロース、テフロン(PTFE)（登録商標）、または当技術分野で知られている他の材料からなる群から選択された材料から作られる。
【００７６】
本開示の一実施形態において、フィルタ室(104a〜104c)およびフィルタ廃棄物室(104d)のサイズは、要件に基づき選択される。実施形態の1つにおいて、フィルタ室(104a〜104c)のサイズは、昇順で徐々に増加する(すなわち、フィルタ室(104c)のサイズはフィルタ室(104b)のサイズより大きく、104aが最も小さくなっており)、細胞分離が効果的に行われる。
【００７７】
一実施形態では、第1のフィルタエレメント(第1の室と第2の室との間にあるもの)の穿孔のサイズは、約50〜500μmまでの範囲内である。好ましい一実施形態において、第1のフィルタエレメントの穿孔のサイズは、100μmである。さらに、第1のフィルタエレメントは、未消化組織などの粗廃棄物を取り除く機能を有する。一実施形態では、第2のフィルタエレメント(第2の室と第3の室との間にあるもの)の穿孔のサイズは、約10〜50μmまでの範囲内である。好ましい一実施形態において、第2のフィルタエレメントの穿孔のサイズは、30μmである。第2のフィルタエレメントは、未消化組織および細胞集合体などの微細廃棄物を取り除く機能を有する。一実施形態では、第3のフィルタエレメント(第3の室とフィルタ廃棄物室(104d)との間にあるもの)の穿孔のサイズは、約1〜10μmまでの範囲内である。好ましい一実施形態において、第3のフィルタエレメントの穿孔のサイズは、5μmである。第3のフィルタエレメントは、SVF細胞画分を保持する。好ましい一実施形態において、第3のフィルタエレメントは、赤血球(RBC)を除いたSVF画分を保持する。より好ましい一実施形態において、第3のフィルタエレメントは、赤血球(RBC)、リンパ球、および単球を除いたSVF画分を保持する機能を有し、前記RBC、リンパ球、および単球は、フィルタを通過して、フィルタ廃棄物室(104d)内に入る。
【００７８】
本開示の一実施形態において、フィルタ室(104a〜104c)のそれぞれは、SVF細胞を捕集するための吐出ノズルを備える。細胞は、注入または移植のため主治医によって使用されるそのような接続用の好適な手段を通じて注射器または任意の他の補機のような細胞捕集装置に確実にSVF細胞を容易に移送できるようにする一組のノズルを通して穏やかな圧力と特定の角度で送達される。
【００７９】
実施形態の1つにおいて、間質血管画分は、細胞サイズに基づき赤血球(RBC)を除去し、穿孔の異なる透過性/サイズを有するフィルタで順次濾過することによって細胞濃縮ユニット(103)内にさらに富化される。別の実施形態では、赤血球は、消化段階において加えられるアフィニティマトリックスを使用して減らされ、穿孔のサイズが異なるフィルタに通して順次濾過することでサイズに基づき取り除かれる。このマトリックスに結合されたRBCは、フィルタを通過せず、フィルタ室(104aまたは104b)内に保持されたままとなり、MCSおよび内皮前駆細胞を含む富化された間質集団は、最終フィルタ室(104c)を通り、捕集される。別の実施形態では、RBCは、濾過時に取り除かれない。
【００８０】
さらに、濾過アセンブリ(104)は、濾過支援機構に結合されうる。濾過支援機構は、限定はしないが、単純濾過、圧力支援濾過、真空支援濾過、振動支援濾過、またはこれらの組み合わせなどの技法によって実行することができる。好ましい一実施形態において、以下の濾過技法は、振動支援濾過である。
【００８１】
図6は、濾過支援機構、脂肪組織から間質血管画分(SVF)細胞を単離するためのシステムのフィルタ振動装置(105)の斜視図を示す本開示の例示的な一実施形態である。濾過を効果的に行い、フィルタエレメントの詰まりを回避するために、フィルタ振動装置が採用される。フィルタ振動装置(105)は、フィルタ振動装置(105)の基部を形成するように構成された所定の形状の硬質プレート(105a)を備える。複数のガイドシャフト(105b)が、硬質プレート(105a)上の所定の位置に固定される。ガイドシャフト(105b)のそれぞれはガイドシャフト(105b)の自由端のところに頂部ストッパ、および頂部ストッパの下の所定の距離ところに底部ストッパを備える。ガイドシャフト(105b)は、所定の形状の移動可能なプレート(105d)を通過するように配置される。移動可能なプレート(105d)は、ガイドシャフト(105b)の底部ストッパ上に摺動可能に取り付けられる。本開示の一実施形態において、頂部ストッパと底部ストッパとの間のシャフト(105b)の部分は、ガイドベアリングとして構成される。さらに、少なくとも1つの圧縮バネ(105e)が、ガイドシャフト(105b)の頂部ストッパと移動可能なプレート(105d)との間に取り付けられる。圧縮バネ(105d)は、移動可能なプレートにかかる張力を維持する。フィルタ振動装置は、移動可能なプレート(105d)の底部端部に固定されたカム従動子(105f)をさらに備え、カム従動子(105f)は、振幅発生装置(105g)に追随するように構成される。さらに、モータ(105h)が、硬質プレート(105a)上に取り付けられ、モータ(105h)は、振幅発生装置(105g)に結合されて、カム従動子(105f)を作動させて濾過のための振動を発生する。本開示の一実施形態において、硬質プレート(105a)および移動可能なプレート(105d)の形状は、限定はしないが、円形、正方形、矩形、三角形、または当技術分野で知られている任意の他の形状からなる群から選択される。
【００８２】
さらに、一対のロードベアリング(105i)およびモータブラケットが基部(105a)に固定される。モータ(105h)は、モータブラケットに固定され、振幅発生装置(105g)は、ロードベアリング(105i)のうちの1つに結合される。振幅発生装置(105g)の設計により、効果的な濾過が行えるように所望の振幅および周波数を定めることができる。カム従動子(105f)は、移動可能なプレート(105d)に固定され、振幅発生装置(105g)に載る。圧縮バネ(105e)を設けることで、カム従動子(105f)は確実に振幅分布発生装置(105g)上に常に載り、その結果、過程全体を通して振幅が等しくなり、移動可能なプレート(105d)をホーム位置に戻せる。モータ(105h)が運転を開始すると、振幅発生装置プロファイルおよびカム従動子(105f)により、衝撃振動がなされ、その結果効果的な濾過が行われる。
【００８３】
図7は、本開示の一実施形態としての脂肪組織から間質血管画分(SVF)細胞を単離するためのシステム(100)の細胞濃縮ユニット(103)の斜視図を示す本開示の例示的な一実施形態である。フィルタ振動装置(105)の移動可能なプレート(105d)は、結合機構を使用して濾過アセンブリ(104)に接続可能である。濾過アセンブリ(104)は、当技術分野で知られている任意の方法を使用してフィルタ振動装置(105)に接続することができる。本開示の一実施形態において、ネジ穴(105j)がフィルタ振動装置(105)の移動可能なプレート(105d)内に設けられ、ネジ山を切ったボルトがフィルタ廃棄物室(104d)の底面に設けられる。濾過アセンブリ(104)は、ネジ山を切ったボルトをネジ穴に差し込んで締め付けることによってフィルタ振動装置(105)に結合される。
【００８４】
図8は、本開示の別の実施形態としての脂肪組織から間質血管画分(SVF)細胞を単離するためのシステムの細胞濃縮ユニットの斜視図を示す例示的な実施形態である。図8に示されているように、フィルタ室(104a〜104c)は、互いに隣接して配置され/取り付けられ、フィルタ廃棄物室(104d)は、廃棄組織を捕集するためにフィルタ室(104c)に適宜接続されるか、または廃棄物ユニット(106)に直接接続される。フィルタ室(104a〜104c)は、一方の室から他方の室へ組織の水性画分を供給するためにチュービングシステム(110)を使用して互いに接続される。フィルタ振動装置(105)をフィルタ室(104a〜104c)のそれぞれの下に位置決めし、フィルタ室(104a〜104c)を振動させてSVF細胞を取得する。フィルタ室(104a〜104c)は、独立したフィルタ振動装置(105)によって振動させられるので、フィルタエレメントのサイズに基づくそれぞれのフィルタ室(104a〜104c)にわたる差動流量のせいで処理時間が短縮される。フィルタ室(104a〜104c)は、SVF細胞を捕集するための吐出ノズル/好適な手段を備える。適宜フィルタ室(104a〜104c)は、SVF細胞を捕集するための吐出ノズル/好適な手段を備える。最終SVF細胞は、注入または移植のため主治医によって使用される注射器または他の補機のような細胞捕集装置インターフェースに確実にSVF細胞を容易に移送できるようにする一組のノズルまたは好適な手段を通して穏やかな圧力と特定の角度で送達される。
【００８５】
本開示の一実施形態において、フィルタ室(104a〜104c)のそれぞれをフィルタ振動装置(105)とともに降順に下へ重ねて配置構成し、これにより、重力を用いてフィルタ室(104a〜104c)の間の組織の流れを円滑にすることができる。代替的一実施例では、それぞれのフィルタ室(104a〜104c)の間にモータを備えて、一方のフィルタ室から次のフィルタ室へ組織を供給する。
【００８６】
本開示の一実施形態において、フィルタ振動装置(105)は、振幅発生装置に結合されたモータとフィルタ室(104a〜104c)を水平方向に振動させるように構成されたカム従動子とを備える水平方向振動機構を具備する。好ましい実施形態では、水平方向振動と垂直方向振動(図8に最もよく示されている)の組み合わせを使用して、フィルタ室(104a〜104c)を振動させる。
【００８７】
図9は、複数のカム従動子(105f)が濾過ユニットの下の濾過アセンブリ(104)の中心軸に取り付けられている濾過アセンブリ(104)の斜視図および側面図を示す本開示の例示的な一実施形態である。図9に示されているように、複数のカム従動子(105f)は濾過アセンブリ(104)の下に取り付けられ、濾過アセンブリ(104)の底部室は、カム従動子(105f)と結合して局在振動を濾過アセンブリ(104)の外周にそって発生し、流量を増やすことによってSVF処理の効率を高めるように構成されている。本開示の一実施形態において、底部フィルタ室およびカム従動子(105f)は、ウォーム駆動として構成される。したがって、局在振動は、モータを使用して複数のカム従動子(105f)が高速回転しているときに濾過アセンブリ(104)の外周にそって発生する。
【００８８】
本開示の好ましい一実施形態において、間質血管画分は、以下で述べているような過程の各段階に従うことによって得られる。
a.所定の量の組織試料および容器(101aおよび101b)内に収容されている洗浄緩衝液を組織処理ユニット(102)に供給する。
b.組織試料を洗浄緩衝液を使って組織処理ユニット(102)内の混合物を撹拌することによって洗浄する。洗浄段階を、約1〜6回、好ましくは3〜4回繰り返す。
c.混合物を混合物の相分離を行わせることによって組織処理ユニット(102)内の一次脂肪性上部画分および一次水性下部画分に分離する。
d.前の段階で取得された一次水性下部画分を廃棄物捕集ユニット(106)に配設する。
e.消化用緩衝液容器(101c)に収容されている所定の量の消化用緩衝液を組織処理ユニット(102)に供給する。
f.所定の時間の間に組織処理ユニット(102)内で混合物を攪拌することによって消化用緩衝液で脂肪性上部画分を混合させて消化過程を実行し、所定の量の血清または酵素阻害剤またはこれらの組み合わせをポンプで送り、攪拌で混合することによって所定の期間の終わりに適宜消化過程を停止させる。
g.混合物を組織処理ユニット(102)内で混合物の相分離を行わせることによって二次脂肪性上部画分および二次水性下部画分に分離する。
h.前の段階で取得された二次水性下部画分を細胞濃縮ユニット(103)に送る。
i.適宜前記SVF細胞を取得するために赤血球を取り除くこととともに、濾過アセンブリ(104)からなる、細胞濃縮ユニット(103)内で二次水性画分を濾過する。
【００８９】
本開示の一実施形態において、洗浄緩衝液は、生理食塩水、リンガー溶液、ラクトリンゲル液、ハンクス液、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。洗浄過程は、少なくとも1つの洗浄段階からなる。好ましい一実施形態において、洗浄過程は、3〜4の洗浄段階からなり、完全な洗浄過程が、約5分から約20分までの範囲内、好ましくは約10分の期間にわたって実行される。
【００９０】
本開示の一実施形態において、消化過程は、約15分から約2時間までの範囲内、好ましくは約30分から約1時間までの範囲内の期間に実行される。
【００９１】
本開示の一実施形態において、消化用緩衝液は、緩衝液と消化用緩衝液との混合物であり、消化用緩衝液は、限定はしないがコラゲナーゼ、ペプシン、トリプシン、およびディスパーゼ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００９２】
本開示の一実施形態において、消化過程の終りに、事前計算された体積の約1mlから約300mlまでの範囲内、好ましくは約10mlから100mlまでの範囲内の血清を適宜加えて、消化用緩衝液の酵素を不活性化する。別の実施形態では、酵素阻害剤、限定はしないが、EGTA、システイン、またはN-アセチルシステイン、または類似の化学的に定義されている阻害剤を加えて、酵素を不活性化する。さらに別の実施形態では、酵素は、酵素を完全に取り除くのに消化された細胞の長時間の洗浄で十分であるので不活性化されない。
【００９３】
本開示の一実施形態において、相分離過程は、約1分から約10分までの範囲内、好ましくは約2分から約5分までの範囲内の期間に実行される。
【００９４】
本開示の一実施形態において、洗浄緩衝液で洗浄し、消化用緩衝液を約35℃から約38℃までの範囲内、好ましくは約36.5℃から約37.5℃までの範囲内の温度にする。
【００９５】
本開示の一実施形態において、濾過もしくはアフィニティマトリックスのうちの少なくとも1つまたはこれらの組み合わせによって赤血球の除去が適宜実行される。
【００９６】
本開示の一実施形態において、システム(100)は、限定はしないが脂肪組織、胎盤組織、および臍帯組織を含む群から選択された哺乳類組織から細胞を単離するために使用されうる。
【００９７】
さまざまな処理段階における組織試料の組成は以下のとおりである。
・処理の前の初期組織試料は、血液ならびに食塩液、リドカイン、およびエピネフリンなどの腫脹性液を伴う無傷脂肪組織を含む。
・洗浄過程および相分離の後、保持されている一次脂肪性画分は、血液ならびに食塩液、リドカイン、およびエピネフリンなどの腫脹性液を含まない無傷脂肪組織を含む。
・消化過程の後かつ相分離の前に、組成物は脂肪相および水相を伴う解離された脂肪組織からなる。
・相分離の後、分割された二次水性画分は、未消化組織廃棄物およびRBC、リンパ球および単球などの血球とともに、SVF細胞を含む。
・濾過後、最終組成物(SVF画分)は、間葉系幹細胞、内皮前駆細胞、成熟内皮細胞、ならびに免疫細胞、RBC、および前脂肪細胞の限定された集団、ならびに線維芽細胞および平滑筋細胞の限定された集団を含む。
【００９８】
この過程において使用されるモジュールを除き、デバイスの他のすべての機械的および電子的部分は、試料が偶発的にこぼれたり、デバイスの可動部分が汚染したりすることを防ぐため試料経路から離れている室(111)内に収納される。さらに、デバイスのどの機械的部分も、この過程において試料に曝される、または接触するということがない。処理に使用されるすべてのチュービングシステム(110)および容器(101a〜101c)はディスポーザブルであり、1回のみ使用することを意図されている。このような設計であるため、組織試料の交差汚染のいかなるリスクも負うことなく臨床現場でこのデバイスを使用することができる。ディスプレイ画面は、過程のそれぞれの段階を表示し、後で参照し監査できるようにリアルタイムで操作中に過程のさまざまなパラメータを記録する。
【００９９】
本開示は、以下の例および付随する図の助けを借りてさらに詳しく説明される。しかし、これらの例は、本開示の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１００】
(実施例1)
SVFの処理
吸引脂肪組織から得られた脂肪組織からの間質血管幹細胞の使用は、さまざまな美容用途向けの自己移植において重要な意味を有する。SVFは、前脂肪細胞、成熟内皮細胞(EC)、内皮前駆細胞(EPC)、血管平滑筋細胞(SMC)、周皮細胞、壁細胞、マクロファージ、線維芽細胞、間葉系幹細胞(MSC)、およびこれらの前駆細胞からなる異種細胞混合物である。高い生存性を有する良質の細胞は、反復される相分離および連続濾過の過程により消化された細胞を回収することによって得られる。
【０１０１】
本発明の利点
本開示で開示されているシステム(100)において、脂肪組織からのSVF細胞の医療行為発生時点管理単離のためのコンパクトなベンチトップシステムが説明されている。システム(100)は、電気コンポーネント、電子コンポーネント、ポンプ(108)などを収納する耐久性の高いフレームワーク室(111)を備える。これは、組織処理ユニット(102)および細胞濃縮ユニット(103)を備える組織処理のためのディスポーザブルな閉鎖された無菌流路、容器(101a〜101c)、チュービングシステム(110)、ならびにコネクタをさらに具備する。システム(100)は、遠心分離技法を使用せずに脂肪組織からSVF細胞を単離するための最適化された過程を使用する。かさばる遠心分離器を排除することで、臨床現場に容易に収容できる占有面積の小さいコンパクトなシステムができあがる。この過程によって回収される細胞は、遠心力のストレスも受けない。本開示は、その簡潔さと、使用される材料の性質の点で経済的であり、操作しやすく、最も一般的に使用される吸引脂肪装置から脂肪組織を受け入れる柔軟性を有する。組織処理ユニット(102)および細胞濃縮ユニット(103)の巧妙に設計された幾何学的形状により、最高の効率および細胞生存性をもたらす穏やかな細胞単離が確実に行われる。また、動物由来生成物がいっさい使用されていない異種由来成分不含有単離過程も実現される。濾過アセンブリ(104)は、MSCおよびその前駆細胞、EPC、EC、前脂肪細胞、平滑筋細胞などを含み、RBCなどの汚染細胞を含まない治療上利点を有する細胞について富化された最終細胞産物を生成する。ディスポーザブル品がモジュール性を有しているので、クリニックでは少量のまたは大量の脂肪組織を処理するため異なる容量のユニットを柔軟に使用することができる。
【０１０２】
SVFを処理するために本開示の自動化システム(100)を使用するさらなる利点として、赤血球による最終産物の汚染がないことが挙げられる。これは、間質血管画分(SVF)細胞を脂肪吸引術で採取した脂肪組織から単離するエレガントで、単純で、新規性のある方法である。過程全体が閉鎖された無菌環境で運用されるので、このシステムからの単離細胞は、患者の自己移植に使用することができる。第2に、システム(100)を使用することで、過程全体を通しての細胞の穏やかな取り扱いで細胞を濃縮することができる。第3に、1回のみ使用する補機とともにシステム(100)がモジュール方式を採用しているため、試料の交差汚染が防止され、意図された産物の安全性が高まる。
【０１０３】
この過程は、その望ましい形態において、以下の段階を含む。
・ポンプを使って外科手術用容器からシステムに組織を移送する。
・攪拌、混合、および相分離を通じて組織を繰り返し洗浄する。
・消化用緩衝液で組織を消化し、脂肪組織から関連細胞を放出する。
・相分離によって水媒体中にこうして放出された細胞を回収する。
・細胞を一連の濾過段階によって作業可能な体積に濃縮する。
【０１０４】
この方法によって単離された細胞は、間葉系幹細胞、内皮前駆細胞、成熟内皮細胞、ならびに免疫細胞および前脂肪細胞の限定された集団を含み、これらはすべて脂肪吸引組織から得られたSVF内に存在することが示されている。
【０１０５】
(実施例2)
SVFを処理するための自動化システムの操作
図4は、脂肪組織からのSVF処理の順次過程の各段階を示している。外科手術から得られた組織試料は、システム(100)の組織容器(101a)内に移送される。外科医に対してさまざまな市販の脂肪吸引器具を使用する最大の柔軟性を与えるために、組織処理ユニット内への入口チュービングシステムは、そのような外科手術に現在使用されているさまざまな脂肪吸引容器を受け入れるように設計されている。組織容器(101a)内の組織は、入口ピンチ弁を通る5路多岐管を介して、制御された流れを確実にもたらす蠕動ポンプ(108)を使って組織処理ニット(102)内に注ぎ込まれる。緩衝液容器(101b)内の緩衝液は、入口ピンチ弁を通る5路多岐管を介して、制御された流れを確実にもたらす蠕動ポンプ(108)を使って組織処理ニット(102)内に注ぎ込まれる。組織処理ユニット(102)内の洗浄過程は、攪拌機構を操作することによって実行される。洗浄過程が完了した後、可変である指定された時間の間に相分離が実行される。廃棄物画分は、組織処理ユニット(102)の底部半分で相分離した後に捕集され、蠕動ポンプ(108)を使って制御された流れになるようにして、出口ピンチ弁を介して出口を通し廃棄物捕集室(106)内に注ぎ込まれる。一実施形態では、上記の洗浄過程は、3回実行されるが、これは可変である。洗浄過程の後に消化過程が続き、消化用緩衝液容器(101c)から指定された量の消化用緩衝液がポンプで組織処理ユニット(102)内に注ぎ込まれる。前記消化過程に対する時間は可変である。適宜、所定の量の血清または酵素阻害剤またはこれらの組み合わせをポンプで送り、攪拌/混合によって所定の期間の終わりに消化過程は停止させられる。水性画分は、相分離の後に得られ、これは出口ピンチ弁を介して蠕動ポンプ(108)により細胞濃縮ユニット(103)内に注ぎ込まれる。濾過が実行され濾過過程の後に、濃縮された細胞が吸引され、注射器などの細胞捕集装置内に捕集される。捕集細胞は、自己移植のため患者に直接注入されるか、またはさらに培養して細胞を増殖または分化させるために使用することができる。一実施形態では、洗浄および消化過程において、周囲温度および組織消化緩衝液混合物の温度は、37℃±0.5℃に維持され、前記温度は、加熱装置と温度センサ(113)[図3に示されている
]とによって制御される。
【０１０６】
蠕動ポンプ(108)、濾過アセンブリ(104)、組織処理ユニット(102)、加熱パッド、および組織センサ(113)は、制御装置(107)とインターフェースする[図3に示されているように]。制御装置(107)は、SVF細胞を自動的に単離する過程を実行するようにプログラムされる。
【０１０７】
(実施例3)
さまざまな細胞分離技法の比較研究
SVF収率に対する反復遠心分離の効果
以下の図は、SVF単離の手作業による過程における、すべての遠心分離段階によるSVF細胞の進行性消失を示す。
【０１０８】
【表２】
2014525260.tif 000004
【０１０９】
【表３】
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【０１１０】
【表４】
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【０１１１】
【表５】
2014525260.tif 000007
【０１１２】
均等
本明細書における実質的に複数形および/または単数形の語の使用に関して、当業者であれば、文脈および/または用途に応じて適切に、複数形を単数形に、および/または単数形を複数形に変えることができる。さまざまな単数形/複数形の置き換えは、本明細書ではわかりやすくするために明示的に述べる場合がある。
【０１１３】
当業者であれば、一般に、本明細書で使用されている、また特に添付の特許請求の範囲(例えば、添付の特許請求の範囲の本文)で使用されている用語は、「制約のない」  用語(例えば、「含むこと」という用語は、「限定はしないが、含むこと」と解釈すべきであり、「有する」という用語は、「少なくとも有する」と解釈すべきであり、「含む」という言い回しは、「限定はしないが、含む」と解釈すべきである、など)として一般的に意図されていることを理解されるであろう。さらに、当業者であれば、導入される請求項列挙の特定の数が意図されている場合、そのような意図は、請求項内で明示的に記載され、そのような列挙がない場合は、そのような意図は存在しないことを理解するであろう。例えば、理解の助けとして、添付の請求項に、導入句「少なくとも1つの」および「1つまたは複数の」を入れて請求項列挙を導入するための使用を含むことができる。しかし、英語原文において、このような語句を使用したとしても、不定冠詞「a」または「an」による請求項列挙の導入によって、たとえその請求項が導入句「1つまたは複数の」または「少なくとも1つの」、および「a」または「an」などの不定冠詞を含むとしても、そのような導入される請求項列挙を含むいずれか特定の請求項がそのような列挙を1つしか含まない発明に制限されることを意味すると解釈すべきではなく(例えば、「a」および/または「an」は、典型的には、「少なくとも1つの」または「1つまたは複数の」を意味すると解釈されるべきである)、請求項列挙を導入するために使用される定冠詞の使用についても同じことが成り立つ。それに加えて、特定の数の導入される請求項列挙が明示的に記載されるとしても、当業者であれば、そのような列挙は、典型的には、少なくとも記載されている数を意味するものと解釈すべきであることを理解するであろう(例えば、ほかに修飾子を付けない「2つの列挙」という飾りのない列挙は、典型的には、少なくとも2つの列挙、または2つ以上の列挙を意味する)。さらに、「A、B、およびCなどのうちの少なくとも1つ」に類似の慣例的言い回しが使用される場合、一般的に、このような構文は、当業者がこの慣例的言い回しを理解するという意味で意図されたものである(例えば、「A、B、およびCのうちの少なくとも1つを有するシステム」は、限定はしないが、Aだけ、Bだけ、Cだけ、AおよびBを一緒に、AおよびCを一緒に、BおよびCを一緒に、および/またはA、B、およびCを一緒に、などを有するシステムを含む)。「A、B、またはCなどのうちの少なくとも1つ」に類似の慣例的言い回しが使用される場合、一般的に、このような構文は、当業者がこの慣例的言い回しを理解するという意味で意図されたものである(例えば、「A、B、またはCのうちの少なくとも1つを有するシステム」は、限定はしないが、Aだけ、Bだけ、Cだけ、AおよびBを一緒に、AおよびCを一緒に、BおよびCを一緒に、および/またはA、B、およびCを一緒に、などを有するシステムを含む)。さらに、当業者であれば、説明中であろうと、請求項中であろうと、図面中であろうと2つ以上の代替語を示す実質的に任意の離接語または語句は、複数の語のうちの1つ、複数の語いずれか、または両方の語を含む可能性を企図するものと理解されるべきであることを理解するであろう。例えば、語句「AまたはB」は、「A」または「B」または「AおよびB」の可能性を含むと理解されよう。
【０１１４】
本明細書ではさまざまな態様および実施形態が開示されているが、他の態様および実施形態も当業者には明らかであろう。本明細書で開示されているさまざまな態様および実施形態は、例示することを目的としており、制限することを意図しておらず、真の範囲および趣旨は以下の特許請求の範囲によって示される。
【符号の説明】
【０１１５】
【表６】
2014525260.tif 000008
【図１】
2014525260.tif 000009
【図２】
2014525260.tif 000010
【図３】
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【図５】
2014525260.tif 000013
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【図６】
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2014525260.tif 000016
【図８】
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【図９】
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【図４】
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【図７】
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【国際調査報告】
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2014525260.tif 000022