(57)【要約】  電動式注入および吸引システム、並びにその使用方法。電動式注入および吸引システムは、（ａ）針に連結されるとともにプランジャを含む注射器と、（ｂ）カニューレと、（ｃ）針に連結される第１の端部、およびカニューレに連結される第２の端部を有する管と、（ｄ）プランジャを駆動するための注射器駆動部と、（ｅ）少なくとも１つのフットペダルと、（ｆ）ステップモータと、（ｇ）ステップモータ、注射器駆動部、および少なくとも１つのフットペダルと通信する制御ユニットとを備える。
2014516673.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電動式注入および吸引システムであって、
針に連結されるとともにプランジャを含む注射器と、
カニューレと、
前記針に連結される第１の端部および前記カニューレに連結される第２の端部を有する管と、
プランジャを駆動する注射器駆動部と、
少なくとも１つのフットペダルと、
ステップモータと、
同ステップモータ、注射器駆動部、および少なくとも１つのフットペダルと通信する制御ユニットとを備えることを特徴とする電動式注入および吸引システム。
【請求項２】
前記少なくとも１つのフットペダルは、注入モードを制御する第１のフットペダル、および吸引モードを制御する第２のフットペダルを備えることを特徴とする請求項１に記載の電動式注入および吸引システム。
【請求項３】
前記第１のフットペダルは、注入流速を制御するためのポテンショメータを含み、前記第２のフットペダルは、吸引流速を制御するためのポテンショメータを含むことを特徴とする請求項２に記載の電動式注入および吸引システム。
【請求項４】
前記第１のフットペダルの回転の程度は注入流速に比例し、前記第２のフットペダルの回転の程度は吸引流速に比例することを特徴とする請求項３に記載の電動式注入および吸引システム。
【請求項５】
前記少なくとも１つのフットペダルは１つのフットペダルからなり、同１つのフットペダルは、吸引および注入モード間で切り替えるために休止位置から枢動点を中心として前後に回転するレバーを含むことを特徴とする請求項１乃至４のうちのいずれか一項に記載の電動式注入および吸引システム。
【請求項６】
前記１つのフットペダルは、吸引流速を制御する第１のポテンショメータ、および注入流速を制御する第２のポテンショメータを含むことを特徴とする請求項５に記載の電動式注入および吸引システム。
【請求項７】
前記制御ユニットは、注入流速を調整するための第１の制御部、および吸引流速を調整するための第２の制御部をさらに含むことを特徴とする請求項１乃至６のうちのいずれか一項に記載の電動式注入および吸引システム。
【請求項８】
前記注射器駆動部は、前方の安全緩衝器を含むことを特徴とする請求項１乃至７のうちのいずれか一項に記載の電動式注入および吸引システム。
【請求項９】
前記注射器駆動部は、後方の安全緩衝器を含むことを特徴とする請求項１乃至７のうちのいずれか一項に記載の電動式注入および吸引システム。
【請求項１０】
前記注射器駆動部は静止位置に注射器本体を保持するための基部、および注射器プランジャを受承するための移動可能なプラットフォームを含むことを特徴とする請求項１乃至９のうちのいずれか一項に記載の電動式注入および吸引システム。
【請求項１１】
前記注射器は、ルアーロック式注射器からなることを特徴とする請求項１乃至１０のうちのいずれか一項に記載の電動式注入および吸引システム。
【請求項１２】
前記注射器の管に接続される第１の端部、および前記カニューレに接続される第２の端部を有するタンクをさらに備えることを特徴とする請求項１乃至１１のうちのいずれか一項に記載の電動式注入および吸引システム。
【請求項１３】
前記タンクは接続管を介して前記カニューレに接続されることを特徴とする請求項１２に記載の電動式注入および吸引システム。
【請求項１４】
電動式注入および吸引システムを使用する方法であって、
注射器本体、プランジャ、および針を備えるとともに溶液により予め満たされた注射器を、該注射器本体を静止位置に保持するための基部および該プランジャを受承するための可動プラットフォームを備える注射器駆動部に装填する工程と、
第１のフットペダルを休止位置から前方に回転させる工程と、
これに応答して、注入モードにおいて可動プラットフォームを介してプランジャを前方に駆動する工程と、
第２のフットペダルを休止位置から前方に回転させる工程と、
これに応答して、吸引モードにおいて可動プラットフォームを介してプランジャを後方に駆動する工程とを含むことを特徴とする電動式注入および吸引システムの使用方法。
【請求項１５】
管の第１の端部を前記針に、管の第２の端部をカニューレに連結する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のフットペダルの回転の程度を変更することによって注入流速を調整する工程を更に含むことを特徴とする請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２のフットペダルの回転の程度を変更することによって吸引流速を調整する工程を更に含むことを特徴とする請求項１４乃至１６のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
電動式注入および吸引システムを使用する方法であって、
注射器本体、プランジャ、および針を備えるとともに溶液により予め満たされた注射器を、注射器本体を静止位置に保持するための基部および該注射器のプランジャを受承するための可動プラットフォームを備える注射器駆動部に装填する工程と、
１つのフットペダルを休止位置から前方に回転させる工程と、
これに応答して、注入モードにおいて可動プラットフォームを介してプランジャを前方に駆動する工程と、
該１つのフットペダルを休止位置から後方に回転させる工程と、
これに応答して、吸引モードにおいて可動プラットフォームを介してプランジャを後方に駆動する工程とを含むことを特徴とする電動式注入および吸引システムの使用方法。
【請求項１９】
管の第１の端部を前記針に、管の第２の端部をカニューレに連結する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記フットペダルの前方への回転の程度を変更することによって注入流速を調整する工程と、前記フットペダルの後方への回転の程度を変更することによって吸引流速を調整する工程とを更に含むことを特徴とする請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１乃至１３のうちのいずれか一項に記載の電動式注入および吸引システムを使用する方法であって、
注射器本体、プランジャ、および針を備えるとともに溶液により予め満たされた注射器を、注射器本体を静止位置に保持するための基部および該プランジャを受承するための可動プラットフォームを備える注射器駆動部に装填する工程と、
第１のフットペダルを休止位置から前方に回転させる工程と、
これに応答して、注入モードにおいて可動プラットフォームを介してプランジャを前方に駆動する工程と、
第２のフットペダルを休止位置から前方に回転させる工程と、
これに応答して、吸引モードにおいて可動プラットフォームを介してプランジャを後方に駆動する工程とを含むことを特徴とする電動式注入および吸引システムの使用方法。
【請求項２２】
請求項１乃至１３のうちのいずれか一項に記載の電動式注入および吸引システムを使用する方法であって、
注射器本体、プランジャ、および針を備えるとともに溶液により予め満たされた注射器を、注射器本体を静止位置に保持するための基部および該注射器のプランジャを受承するための可動プラットフォームを備える注射器駆動部に装填する工程と、
該１つのフットペダルを休止位置から前方に回転させる工程と、
これに応答して、注入モードにおいて可動プラットフォームを介してプランジャを前方に駆動する工程と、
該１つのフットペダルを休止位置から後方に回転させる工程と、
これに応答して、吸引モードにおいて可動プラットフォームを介してプランジャを後方に駆動する工程とを含むことを特徴とする電動式注入および吸引システムの使用方法。
【請求項２３】
前眼房内に細胞移植をするために、請求項１乃至１３のうちのいずれか一項に記載の電動式注入および吸引システムを使用する方法であって、
注射器本体、プランジャ、および針を備えるとともに溶液により予め満たされた注射器を、注射器本体を静止位置に保持するための基部および該プランジャを受承するための可動プラットフォームを備える注射器駆動部に装填する工程と、
該注射器駆動部を使用して、タンク内に所望量の細胞を吸引する工程と、
接続管を介してタンクにカニューレを接続する工程と、
該細胞をタンクから接続管内に、続いてカニューレ内に押し出すことによって、該細胞をカニューレに装填する工程と、
眼の角膜内において切開口を形成する工程と、
切開口を通してカニューレを挿入する工程と、
第１のフットペダルを休止位置から前方に回転させる工程と、
これに応答して、注入モードにおいて可動プラットフォームを介してプランジャを前方に駆動し、該細胞をカニューレから取り出し、該細胞を虹彩に載置する工程と、
必要に応じて第２のフットペダルを休止位置から前方に回転させる工程と、
これに応答して、吸引モードにおいて可動プラットフォームを介してプランジャを後方に駆動し、細胞をカニューレ内に引き戻す工程と、
カニューレを切開口から後退させる工程とを含むことを特徴とする電動式注入および吸引システムを使用する方法。
【請求項２４】
前記方法は眼の中への細胞の移植に使用されることを特徴とする請求項１４乃至２２のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞は膵臓のβ細胞を含み、前記方法は１型糖尿病の治療に使用されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は電動式注入および吸引用システムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロサージェリーやマイクロ操作のような微細な処置においては、時々実験および／または臨床設定において、流体または溶液の注入および吸引の両者が要求される。現在市場にて入手可能なシリンジポンプは、注入モードまたは吸引モードのいずれか単一のモードで作動する。これらのシステムでは、モードを切り換えるべく制御ユニットを再プログラムするために、ユーザは不可能または望ましくない場合であっても、処置の最中に停止または休止し、標本や動物を放置することを要求される。さらに、術者の手は通常自由ではないので、処置の最中に制御ユニットを再プログラムすることは非実用的である。さらに、これらのシステムは予め設定された流速で予め設定された量を輸送可能であるが、これらのパラメータは注入または吸引中にリアルタイムに変更することができない。
【０００３】
付加的に、いくつかの電流方式により、２つの切開口あるいは入口／出口点が要求される２つのターミナル（即ち２本の針、２つのカニューレ等…）を使用する吸引および注入モードの両者が可能となる。手術において、単一モードが望ましいか要求される場合でさえ、注入および吸引モードの両者が同時に行われる。その結果、これらのシステムによっては、同じ組織または液体の吸引および／または輸送をすることができない。また、予め設定された量および流速は、同様に注入または吸引中に変更することができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、操作中のいかなる時においても中断することなく、１つの進入点を通して注入および吸引の作用間を、１つ以上のフットペダルを使用することにより要求に応じてできるだけ多くの回数迅速に推移させることのできる電動式注入および吸引システムを提供する。電動式注入および吸引システムは、同じ１つ以上のフットペダルにより、吸引または注入される作動流体の流速および量を調整する付加的な効果を有する。このシステムにより、乱流および物理的な障害を最小限にした制限空間内への大型粒子および微粒子の溶液の制御された正確な吸引および輸送が行われ、これにより、貴重かつ高価な試薬の浪費が低減される。システムのさらなる別の改善は、標本および溶液に接する要素に対する無菌の応用における汚染を防止することにオートクレーブ滅菌が可能であるということにある。システムのさらなる効果は、操作において、操作者は移植のような通常２人で行う処置を単独で手を使わないで行うことができることにある。
【０００５】
本発明の応用例は、移植の領域における実験的マイクロサージェリーやマイクロ操作（生物すなわち哺乳動物の異なる部位に、ランゲルハンス島および膵臓の胚芽、および細胞懸濁液を注入すること）、蝸牛の潅流（薬物を輸送し、蝸牛の流体（例えば外リンパ）を吸引すること）、カテーテルやラインのような移植可能なマイクロデバイスの洗い流し、脳内における１つのカニューレによる定位輸送および吸引、並びに培養基における溶液および細胞または組織の注入および取り出しを含む。臨床設定において、微細な処置は、１つのカニューレによる眼内の輸送および取り出し、臨床のランゲルハンス島注入、１つのカニューレを使用した中耳および他の頭蓋腔の洗い流し、およびこれらからの取り出しを含む。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、第１の態様において、本発明は以下を備える電動式注入および吸引システムを提供する。（ａ）針に連結されるとともにプランジャを含む注射器と、（ｂ）カニューレと、（ｃ）針に連結される第１の端部、およびカニューレに連結される第２の端部を有する管と、（ｄ）プランジャを駆動するための注射器駆動部と、（ｅ）少なくとも１つのフットペダルと、（ｆ）ステップモータと、（ｇ）ステップモータ、注射器駆動部、および少なくとも１つのフットペダルと通信する制御ユニットとを備える。
【０００７】
本発明の一実施例において、少なくとも１つのフットペダルは、注入モードを制御する第１のフットペダルと、吸引モードを制御する第２のフットペダルとを含む。
さらなる実施例において、第１のフットペダルは、注入流速を制御するためのポテンショメータを含み、第２のフットペダルは、吸引流速を制御するためのポテンショメータを含む。
【０００８】
第２の態様において、本発明は電動式注入および吸引システムを使用する方法をさらに提供する。方法は、（ａ）注射器本体、プランジャ、および針を備えるとともに溶液により予め満たされた注射器を、（ｉ）注射器本体を静止位置に保持する基部および（ｉｉ）プランジャを受承するための可動プラットフォームを備える注射器駆動部に装填する工程と、（ｂ）第１のフットペダルを休止位置から前方に回転させる工程と、（ｃ）これに応答して、注入モードにおいて可動プラットフォームを介してプランジャを前方に駆動する工程と、（ｄ）第２のフットペダルを休止位置から前方に回転させる工程と、（ｅ）これに応答して、吸引モードにおいて可動プラットフォームを介してプランジャを後方に駆動する工程とを含む。
【０００９】
一実施例において、方法は、管の第１の端部を針に、管の第２の端部をカニューレに連結する工程をさらに含む。
別例において、方法は、第１のフットペダルの回転の程度を変更することによって、注入流速を調整する工程をさらに含む。
【００１０】
さらなる実施例において、方法は、第２のフットペダルの回転の程度を変更することによって、吸引流速を調整する工程をさらに含む。
第３の態様において、本発明は電動式注入および吸引システムを使用する方法を提供する。方法は、（ａ）注射器本体、プランジャ、および針を備えるとともに溶液により予め満たされた注射器を、（ｉ）注射器本体を静止位置に保持するための基部および（ｉｉ）注射器プランジャを受承するための可動プラットフォームを備える注射器駆動部に装填する工程と、（ｂ）１つのフットペダルを休止位置から前方に回転させる工程と、（ｃ）これに応答して、注入モードにおいて可動プラットフォームを介してプランジャを前方に駆動する工程と、（ｄ）１つのフットペダルを休止位置から後方に回転させる工程と、（ｅ）これに応答して、吸引モードにおいて可動プラットフォームを介してプランジャを後方に駆動する工程とを含む。
【００１１】
一実施例において、方法は、フットペダルの前方への回転の程度を変更することによって注入流速を調整する工程と、フットペダルの後方への回転の程度を変更することによって吸引流速を調整する工程とを更に含む。
【００１２】
第４の態様において、本発明は電動式注入および吸引システムを使用する方法を提供する。方法は、（ａ）注射器本体、プランジャ、および針を備えるとともに溶液により予め満たされた注射器を、（ｉ）注射器本体を静止位置に保持する基部および（ｉｉ）プランジャを受承するための可動プラットフォームを備える注射器駆動部に装填する工程と、（ｂ）第１のフットペダルを休止位置から前方に回転させる工程と、（ｃ）これに応答して、注入モードにおいて可動プラットフォームを介してプランジャを前方に駆動する工程と、（ｄ）第２のフットペダルを休止位置から前方に回転させる工程と、（ｅ）これに応答して、吸引モードにおいて可動プラットフォームを介してプランジャを後方に駆動する工程とを含む。
【００１３】
第５の態様において、本発明は電動式注入および吸引システムを使用する方法を提供する。方法は、（ａ）注射器本体、プランジャ、および針を備えるとともに溶液により予め満たされた注射器を、（ｉ）注射器本体を静止位置に保持するための基部および（ｉｉ）注射器プランジャを受承するための可動プラットフォームを備える注射器駆動部に装填する工程と、（ｂ）１つのフットペダルを休止位置から前方に回転させる工程と、（ｃ）これに応答して、注入モードにおいて可動プラットフォームを介してプランジャを前方に駆動する工程と、（ｄ）１つのフットペダルを休止位置から後方に回転させる工程と、（ｅ）これに応答して、吸引モードにおいて可動プラットフォームを介してプランジャを後方に駆動する工程とを含む。
【００１４】
第６の態様において、本発明は、前眼房内に細胞移植をするために、電動式注入および吸引システムを使用する方法を提供する。方法は、（ａ）注射器本体、プランジャ、および針を備えるとともに溶液により予め満たされた注射器を、（ｉ）注射器本体を静止位置に保持するための基部および（ｉｉ）注射器プランジャを受承するための可動プラットフォームを備える注射器駆動部に装填する工程と、（ｂ）注射器駆動部を使用して、タンク内に所望量の細胞を吸引する工程と、（ｃ）接続管を介してタンクにカニューレを接続する工程と、（ｄ）注射器管の第２の端部を針に接続する工程と、（ｅ）細胞をタンクから接続管内に、続いてカニューレ内に押し出すことによって、細胞をカニューレに装填する工程と、（ｆ）対象の眼の角膜内において切開口を形成する工程と、（ｇ）切開口を通してカニューレを挿入する工程と、（ｈ）第１のフットペダルを休止位置から前方に回転させる工程と、（ｉ）これに応答して、注入モードにおいて可動プラットフォームを介してプランジャを前方に駆動し、細胞をカニューレから取り出し、細胞を虹彩に載置する工程と、（ｊ）必要に応じて第２のフットペダルを休止位置から前方に回転させる工程と、（ｋ）必要に応じて、これに応答して、吸引モードにおいて可動プラットフォームを介してプランジャを後方に駆動し、細胞をカニューレ内に引き戻す工程と、（ｌ）カニューレを切開口から後退させる工程とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】無負荷状態における電動式注入および吸引システムを示す正面図。
【図２】無負荷状態における電動式注入および吸引システムを示す側面図。
【図３】負荷状態における電動式注入および吸引システムを示す正面図。
【図４】負荷状態における電動式注入および吸引システムを示す側面図。
【図５】本発明の例示的な装置を示す図において、（ａ）は、管、タンク、およびカニューレを備える組み立てられたガラス注射器を示す図。（ｂ）は、注射器を取り付けた電動注射器駆動部を示す図。（ｃ）は、電動注射器駆動部を操作するための二重フットペダルを示す図。一方のペダルを押すことにより、注射器プランジャを後方へ（吸引）、あるいは前方へ（放出）駆動する。（ｄ）は、カニューレの背面にてパックされた小島（ｉｓｌｅｔｓ）を示す、カニューレおよび接続管材料の拡大図。この構成により、前眼房内に小島を最小容量で輸送可能であり、小島の還流および損失が低減される。
【図６】前眼房（ＡＣＥ）内への輸送工程を説明する図において、（ａ）は、マウスの麻酔マスクを示す図。（ｂ）は、フィルタのない１ｍｌの使い捨てのプラスチックピペット先端から形成される麻酔マスクを示す拡大図。（ｃ）は、よりよいアクセスのために「飛び」出した、移植される眼を示す拡大図。眼は親指と人差し指とを使用して頭部の皮膚を引き延ばすことにより「飛び」出される。（ｄ）は、角膜頂点と縁との間の中間点において切開口の位置を強調して示した移植処置の概略図。カニューレは、ＡＣＥへ小島を輸送するために切開口を通して挿入される。小島は、移植される虹彩の頂部に載置される。
【図７】本発明の方法による移植処置を示す代表的な図において、（ａ）は、切開口の形成中に外科用メス（針）の先端がどれだけ角膜内に押し込まれるかを示す一連の図。小さな切開口は、出血することなく形成される。切開口は、カニューレより僅かに大きい。（ｂ）は、還流を防止するべく気泡を使用する間において、カニューレから取り出される小島を示す一連の図。（ｃ）は、移植直後のＡＣＥの明瞭さを強調して示した移植された眼の代表的な図。（ｄ）は、移植後６週間の時点において、生体内撮像のための好適な位置、並びに切開口がどれだけ治癒したか、および角膜の明瞭さを強調して示す、所定の術後日（ＰＯＤ）に得られた同じ眼を示す一連の図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
第１の態様において、図１乃至４に示すように、本発明は次のものを含む電動式注入および吸引システム１０の形態をとる。電動式注入および吸引システム１０は、（ａ）針２０に連結されるとともにプランジャ２５を含む注射器１５と、（ｂ）カニューレ３０と、（ｃ）針２０に連結される第１の端部、およびカニューレ３０に連結される第２の端部を有する管３５と、（ｄ）プランジャ２５を駆動するための注射器駆動部４０と、（ｅ）少なくとも１つのフットペダル４５と、（ｆ）ステップモータ５０と、（ｇ）ステップモータ５０、注射器駆動部４０、および少なくとも１つのフットペダル４５と通信する制御ユニット５５とを備える。
【００１７】
ここに使用されるように、「注射器」１５は管状体を意味し、この管状体は、一端に配置されたプランジャ２５と、対向端に配置された針２０とを備える。操作において、使い捨て注射器を含む任意のタイプや寸法の注射器を使用可能である。例えば、小さな容量の注射器は、低い流速による少量の注入を行うことに好適であろう。好ましい実施例において、注射器は、ルアー式注射器を含む。二種類のルアーテーパ接続があり、すなわちルアーロックおよびルアースリップである。ルアーロック接続器具は、ルアーロック針上の係合ネジに係合するとともにロックする、ネジの設けられた端部を有する。ルアースリップ接続器具は、単純にルアーテーパ寸法部に整合し、一体的に押圧され、摩擦により保持される（これらはネジを有さない）。
【００１８】
ここに使用されるように、「カニューレ」３０は、例えば、流体、試薬、細胞懸濁液、培養における細胞または組織、ランゲルハンス島、膵臓の胚芽、および／または薬剤の形態の流体を排出または吸引するために、あるいは溶液を輸送または注入するために体内に挿入される狭小な管である。
【００１９】
ここに使用されるように、「管」３５は小径の医療グレード管、例えばＴｙｇｏｎ社の管を示す。注入および／または吸引される溶液と適合する材料から形成される限り、様々な径の任意のタイプの管が使用可能である。
【００２０】
ここに使用されるように、「注射器駆動部」４０は、プラットフォーム６０および基部６５を含む線形台から構成され、プラットフォーム６０および基部６５は、プラットフォーム６０が基部６５に対して線形運動に制限されるように所定の形態の案内またはリニアベアリング７０によって連結される。プラットフォーム６０は、注射器プランジャ２５を受承する寸法および形状に形成される容器７５を形成し、基部６５は、注射器本体１５を受承し、略静止するようにこれを保持する。一実施例において、基部６５は、注射器本体１５を受承するためにチャネル６６を形成する。上板６７は、例えば、適所に注射器１５を保持するために取り付けネジ６８によって基部６５に固定される。
【００２１】
操作において、ステップモータ５０がフットペダル４５によって前方または後方に駆動されると、プラットフォーム６０は、静止した注射器１５に対してプランジャ２５を前後に相対運動させる。ここに使用されるように、「ステップモータ」５０は、完全な回転を多数のステップに分割するように電気的なパルスを個別の機械的動作に変換する電気機械的装置である。これらの個別の動作は、少なくとも１つのフットペダル４５の回転によって生成される電気的な指令パルスによって制御される。具体的には、１つのフットペダルの応用において、ペダルの前方への回転により、注入が生じることが決定され、後方への回転により、吸引が生じることが決定される。その逆も同様である。同様に、前方への回転の程度により、注入の流速が決定され、後方への回転の程度により、吸引の流速が決定される。二重フットペダルの応用において、第１のフットペダル４６の使用により、システムが注入モードで作動することが決定され、第２のフットペダル４７の使用により、システムが吸引モードで作動することが決定される。第１および第２のフットペダル４６および４７の回転の程度により、さらに注入および吸引の流速が管理される。
【００２２】
ここに使用されるように、二重「フットペダル」４６および４７は、好適な実施形態である。しかしながら、同じ効果が、１つのフットペダル４５を使用することによっても得られる。したがって、両者の実施例を後述する。通常、フットペダル４５は、足で操作されるとともに、休止位置から増加するペダルの回転の程度に応じて流速を高める加速装置として作用するポテンショメータを含む回転可能なレバーである。
【００２３】
１つのフットペダル４５の応用において、ペダルは、休止位置を有し、休止位置から前後に回転される。フットペダル４５が前方に押圧されると、例えば注入モードになり、さらに前方に回転されると、流速がさらに高められる。同様に、フットペダル４５が休止位置から後方に回転されると、吸引モードに入り、さらに後方へ回転されると、流速が高められる。
【００２４】
二重フットペダル４６および４７の応用において、両者が休止位置から前方に回転する２つのペダルがある。第１のペダル４６は注入モード専用であり、第２のペダル４７は吸引モード専用である。逆もまた同様である。注入および吸引の両者における流速は、個々のそれぞれのフットペダルの前方への回転の程度によって制御される（すなわち、回転の程度が大きくなるほど、より高い流速となる）。第１および第２のフットペダルの相互に対する位置決めは、交換可能である。すなわち、第１のフットペダル４６は、第２のフットペダル４７の左あるいは右のいずれかに対して配置される。
【００２５】
ここに使用されるように、「制御ユニット」５５は、モータ５０の最大速度を制御する調整可能なポテンショメータを含む。特に、ペダルのポテンショメータは、制御ユニット５５に含まれるステップモータ駆動部に接続する。ステップモータ駆動部は、ポテンショメータによる少なくとも１つのフットペダルの回転角によって生成された電圧を電気的パルスに転換し、電気的パルスは、次に注射器駆動部４０の異なる速度に転換され、注射器の最終的な流速を制御する。少なくとも１つのフットペダルと制御ユニットとの間のインタフェースは、好適に配線により電気的に接続されるが、電気的な接続は、例えば登録商標ブルートゥース技術の無線通信を介してなされてもよい。
【００２６】
一実施例において、少なくとも１つのフットペダル４５は、注入モードを制御する第１のフットペダル４６と、吸引モードを制御する第２のフットペダル４７を含む。第１および第２のフットペダル４６および４７には、好適に相互に隣接し、１本の足によって操作される共通プラットフォームで連結される。これに代えて、第１および第２のフットペダル４６および４７は、第１のフットペダル４６がユーザの左足によって操作され、第２のフットペダル４７が右足によって操作されるように個別に設けられてもよい。
【００２７】
別例において、第１のフットペダル４６は、注入流速を制御するためのポテンショメータを含み、第２のフットペダル４７は、吸引流速を制御するためのポテンショメータを含む。これらのポテンショメータは各フットペダルの回転の変化を反映する同じ差分に対して同様に応答するべく好適に較正される。これにより、吸引速度は、注入速度に確実に近づくか、等しくなる。
【００２８】
さらなる別例において、第１のフットペダルの回転の程度は注入流速に比例し、第２のフットペダルの回転の程度は吸引流速に比例する。
さらなる実施例において、少なくとも１つのフットペダル４５は１つのフットペダル４６からなり、この１つのフットペダル４６は、吸引および注入モード間で切り替えるために休止位置から枢動点を中心として前後に回転するレバーを含む。
【００２９】
別例において、１つのフットペダル４６は、吸引流速を制御する第１のポテンショメータ、および注入流速を制御する第２のポテンショメータを含む。
さらなる別例において、制御ユニット５５は、注入流速を調整するための第１の制御部５６、および吸引流速を調整するための第２の制御部５７をさらに含む。制御部５６および５７は、フットペダル４６および４７からの電圧を制御ユニット５５によって放出される電気的なパルスに転換する転換比を変更することにより、これらの調整を行う。さらなる実施例において、注射器駆動部は前方安全緩衝器８０を備える。ここに使用されるように、「前方安全緩衝器」８０は、プランジャ２５がその前方のストロークの終わりに接近する際に、プランジャ２５を支持する可動プラットフォームが、注射器本体１５を保持する基部６５と接触することを防止する。この前方安全緩衝器８０は、基部６５に担持され、プラットフォーム６０に担持される安全ストッパ８５の第１の端部に接触し、プラットフォーム６０が基部６５に衝突することを防止する。
【００３０】
別例において、注射器駆動部は後方安全緩衝器９０を備える。ここに使用されるように、「後方安全緩衝器」９０は、プラットフォーム６０がその後方へのストロークの終わりに接近する際に、プランジャ２５を支持する可動プラットフォームがリニアベアリング７０の端部におけるステップモータ５０と接触することを防止する。この後方安全緩衝器９０は、ステップモータ５０に担持され、プラットフォーム６０に担持される安全ストッパ８５の第２の端部に接触し、プラットフォーム６０がステップモータ５０に衝突することを防止する。
【００３１】
別例において、図１（ａ）の例に示すように、電動式注入および吸引システムは、注射器管３５に接続される第１の端部、およびカニューレ３０に接続される第２の端部を有するタンク９５をさらに備える。さらなる別例において、タンク９５は、接続管１００を介してカニューレに接続される。
【００３２】
ここに使用されるように、「タンク」は、移植される組織や流体を保持するための管である。一実施例において、タンクは好適に２５０乃至３００マイクロリットルの範囲のピペット先端を備える。タンク９５は、注射器管３５に対してその一端において圧入により好適に接続される。
【００３３】
第２の態様において、本発明は電動式注入および吸引システム１０を使用する方法をさらに提供する。方法は、（ａ）注射器本体、プランジャ２５、および針２０を備えるとともに溶液により予め満たされた注射器１５を、注射器本体を静止位置に保持する基部６５およびプランジャ２５を受承するための可動プラットフォーム６０を備える注射器駆動部４０に装填する工程と、（ｂ）第１のフットペダル４６を休止位置から前方に回転させる工程と、（ｃ）これに応答して、注入モードにおいて可動プラットフォーム６０を介してプランジャ２５を前方に駆動する工程と、（ｄ）第２のフットペダル４７を休止位置から前方に回転させる工程と、（ｅ）これに応答して、吸引モードにおいて可動プラットフォーム６０を介してプランジャ２５を後方に駆動する工程とを含む。
【００３４】
注射器駆動部に装填する工程は、注射器本体１５を基部６５に形成されるチャネル６６に載置する工程と、プランジャ２５をプラットフォーム６０によって形成される容器７５に並べる工程とを含む。上板６７や他の保持手段は、例えば、適所に予め満たされた注射器１５を保持するために取り付けネジ６８によって基部６５に固定される。
【００３５】
ここに使用されるように、フットペダルを「回転させる工程」は、休止位置から移動するのに十分なフットペダル４５の任意のタイプの移動を示す。第１および第２のフットペダルが枢動する枢動点は、足が下方の圧力を作用させるとユーザからもっとも離れた端部が床に向かって下方に回転し、続いて圧力が低減されると上方に回転するように、ユーザのもっとも近傍の端部に好適に配置される。実施において、枢動点は、第１および第２のフットペダル４６および４７に沿った任意の位置に配置される。
【００３６】
ここに使用されるように、可動プラットフォーム６０を介して前後に「プランジャを駆動する工程」は、上述したように、第１および第２のフットペダル４６および４７、制御ユニット５５、ステップモータ５０、および注射器駆動部４０間の伝達により行われる。プラットフォーム６０はリニアベアリング７０に担持され、ステップモータ５０によって駆動される。
【００３７】
一実施例において、方法は、管３５の第１の端部を針２０に、管３５の第２の端部をカニューレ３０に連結する工程をさらに含む。例えば、管３５は、針２０および／またはカニューレ３０の端部を覆って圧着されるか、あるいは管３５は、中空の針２０内、および／または大径のカニューレ３０の受承端部内に圧入されてもよい。これに代えて、管３５は、公知のクランプや任意の他の固定手段によって針２０および／またはカニューレ３０の端部を覆って圧着されてもよい。
【００３８】
別例において、方法は、第１のフットペダル４６の回転の程度を変更することによって、注入流速を調整する工程をさらに含む。さらなる実施例において、方法は、第２のフットペダル４７の回転の程度を変更することによって、吸引流速を調整する工程をさらに含む。詳細には、第１のフットペダル４６または第２のフットペダル４７の回転角度が大きくなるほど、流速が高くなり、その逆もまた同様である。
【００３９】
第３の態様において、本発明は電動式注入および吸引システム１０を使用する方法を提供する。方法は、（ａ）注射器本体、プランジャ２５、および針２０を備えるとともに溶液により予め満たされた注射器１５を、注射器本体を静止位置に保持する基部６５および注射器プランジャ２５を受承するための可動プラットフォーム６０を備える注射器駆動部４０に装填する工程と、（ｂ）１つのフットペダル４５を休止位置から前方に回転させる工程と、（ｃ）これに応答して、注入モードにおいて可動プラットフォーム６０を介してプランジャ２５を前方に駆動する工程と、（ｄ）１つのフットペダル４５を休止位置から後方に回転させる工程と、（ｅ）これに応答して、吸引モードにおいて可動プラットフォーム６０を介してプランジャ２５を後方に駆動する工程とを含む。
【００４０】
一実施例において、方法は、上述したように、管３５の第１の端部を針２０に、管３５の第２の端部をカニューレ３０に連結する工程をさらに含む。
付加的な実施例において、方法は、フットペダルの前方への回転の程度を変更することによって注入流速を調整する工程と、フットペダルの後方への回転の程度を変更することによって吸引流速を調整する工程とを更に含む。
【００４１】
第４の態様において、本発明は電動式注入および吸引システム１０を使用する方法を提供する。方法は、（ａ）注射器本体、プランジャ２５、および針２０を備えるとともに溶液により予め満たされた注射器１５を、注射器本体１５を静止位置に保持する基部６５およびプランジャ２５を受承するための可動プラットフォーム６０を備える注射器駆動部４０に装填する工程と、（ｂ）第１のフットペダル４６を休止位置から前方に回転させる工程と、（ｃ）これに応答して、注入モードにおいて可動プラットフォーム６０を介してプランジャ２５を前方に駆動する工程と、（ｄ）第２のフットペダル４７を休止位置から前方に回転させる工程と、（ｅ）これに応答して、吸引モードにおいて可動プラットフォーム６０を介してプランジャ２５を後方に駆動する工程とを含む。
【００４２】
第５の態様において、本発明は電動式注入および吸引システム１０を使用する方法を提供する。方法は、（ａ）注射器本体、プランジャ２５、および針２０を備えるとともに溶液により予め満たされた注射器１５を、注射器本体１５を静止位置に保持する基部６５および注射器プランジャ２５を受承するための可動プラットフォーム６０を備える注射器駆動部４０に装填する工程と、（ｂ）１つのフットペダル４５を休止位置から前方に回転させる工程と、（ｃ）これに応答して、注入モードにおいて可動プラットフォーム６０を介してプランジャ２５を前方に駆動する工程と、（ｄ）１つのフットペダル４５を休止位置から後方に回転させる工程と、（ｅ）これに応答して、吸引モードにおいて可動プラットフォーム６０を介してプランジャ２５を後方に駆動する工程とを含む。
【００４３】
第６の態様において、本発明は、前眼房内に細胞移植をするために、電動式注入および吸引システム１０を使用する方法を提供する。方法は、（ａ）注射器本体、プランジャ２５、および針２０を備えるとともに溶液により予め満たされた注射器１５を、注射器本体１５を静止位置に保持する基部６５およびプランジャ２５を受承するための可動プラットフォーム６０を備える注射器駆動部４０に装填する工程と、（ｂ）注射器駆動部４０を使用して、タンク９５内に所望量の小島または細胞を吸引する工程と、（ｃ）接続管１００を介してタンク９５にカニューレ３０を接続する工程と、（ｄ）細胞をタンク９５から接続管１００内に、続いてカニューレ３０内に押し出すことによって、小島または細胞をカニューレ３０に装填する工程と、（ｅ）注射器管３５の第２の端部を針２０に接続する工程と、（ｆ）対象の眼の角膜内において切開口を形成する工程と、（ｇ）切開口を通してカニューレ３０を挿入する工程と、（ｈ）第１のフットペダル４６を休止位置から前方に回転させる工程と、（ｉ）これに応答して、注入モードにおいて可動プラットフォーム６０を介してプランジャ２５を前方に駆動し、小島または細胞をカニューレ３０から取り出し、細胞を虹彩に載置する工程と、（ｊ）必要に応じて第２のフットペダル４７を休止位置から前方に回転させる工程と、（ｋ）必要に応じて、これに応答して、吸引モードにおいて可動プラットフォーム６０を介してプランジャ２５を後方に駆動し、小島または細胞をカニューレ３０内に引き戻す工程と、（ｌ）カニューレ３０を切開口から後退させる工程とを含む。
【００４４】
対象は、小島または細胞を前眼房内に移植可能な任意の好適な対象であり、ハツカネズミ、サル、ウサギ、犬、ラット、ブタ、およびヒト（治療処置のための）を含むが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
本発明の方法は、例えば、米国特許出願公開第２００９−００６０８４３号明細書に開示されるような、例えば疾病治療や、薬剤開発分析を支援する細胞移植に使用され、明細書はその全体がここに開示されたものとする。
【００４６】
任意の好適な細胞のタイプが本発明の方法を使用して眼に移植される。細胞のタイプは、内分泌細胞（膵臓のベータ（β）細胞を含むが、これに限定されない）、胚組織（膵臓の芽）、腎糸球体、並びに脂肪、筋肉、脳、肝臓、腎臓、心臓および肺を含むが、これらに限定されない任意の組織タイプに由来する細胞を含むが、これらに限定されるものではない。移植される細胞は、個別の細胞、同一タイプ、あるいは組織または組織部分のような複数の異なる細胞タイプの複数の細胞であってもよい。
【００４７】
好適な実施例において、組織はランゲルハンス島を含む。さらなる好適な実施例において、ランゲルハンス島はβ細胞を含む。ここに使用されるように、「ランゲルハンス島」はランゲルハンス島β細胞を含む任意の細胞集団である。このようなランゲルハンス島β細胞集団は、膵臓、ランゲルハンス（「ランゲルハンス島」）の隔離されたランゲルハンス島、および分離した膵臓のβ細胞を含む。膵臓の隔離のための方法は公知であり、ランゲルハンス島を隔離する方法は、Ｐｉｌｅｇｇｉ等のＤｉａｂｅｔｅｓ  ５０（９）：  １９８３−１９９１（２００１年）、Ｃｅｊｖａｎ等のＤｉａｂｅｔｅｓ  ５２：  １１７６−１１８１（２００３年）、Ｚａｍｂｒｅ等のＢｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ５７：  １１５９−１１６４（１９９９年）、およびＦａｇａｎ等のＳｕｒｇｅｒｙ  １２４：２５４−２５９（１９９８年）、並びにこれらにおいて引用された文献に見られる。一旦宿主の眼に注入されると、これらの小島のβ細胞は、インシュリンの生成および放出を開始する。さらなる好ましい実施例において、ランゲルハンス島または細胞が、凝縮されるとともに容易にカニューレ３０に装填できるように、培養皿において培養される。一実施例において、ランゲルハンス島または細胞を培養させる工程は、狭小なコンセントリックリングにおいて培養皿を回転させる工程を含む。一実施例において、ランゲルハンス島は、Ｐｉｌｅｇｇｉ等のＤｉａｂｅｔｅｓ  ５０（９）：  １９８３−１９９１（２００１年）に開示されるように、コラゲナーゼ消化を使用して分離され、密度勾配上の精製がこれに続く。分離された小島は、移植前に一晩培養され、これによりランゲルハンス島およびβ細胞が分離工程から回復することを補助される。残存するか健全な小島の移植が促進されるので、糖尿病反転が望ましい場合に、これは特に効果的である。
【００４８】
前眼房は、眼の前方部を含み、角膜、虹彩、毛様体およびレンズの他、ガラス体の前方の構造体も含む。前眼房内への小島または細胞の移植は、これらの前眼房区画のうちの任意の１つ以上の中への小島または細胞の配置を含む。非制限的な一実施例において、目的の細胞は角膜を通して注入により移植され、これにより、虹彩の上に移植される目的の細胞の移植が可能となり、角膜を通した監視および撮像が可能となる。
【００４９】
好適な実施例において、気泡は、第１のフットペダル４６を前方に回転させることによって注射器駆動部４０を前方に駆動することにより、タンク９５から洗い流され、タンク９５内に吸引する際に確実に小島の連続した流れを生じさせる。タンク９５から気泡を洗い流した後に、小島または細胞の吸引は、第２のフットペダル４７を回転させることにより注射器駆動部４０を後方へ駆動することによって行われる。小島がタンク９５へ吸引されると、それらは渦巻く傾向にあり、タンク９５の底部に一体的に残存する。一旦小島がタンク９５に配置されると、カニューレ３０は接続管１００を介してタンク９５に接続される。第１のフットペダル４６を前方に回転させることにより、タンク９５から小島が管３５内に、続いてカニューレ３０内に押し出されることによってカニューレ３０に小島が装填される。
【００５０】
好適な実施例において、移植は麻酔下において、好ましくは全身麻酔下において行われる。対象がマウスである場合に、対象の麻酔は、任意の好適な方法を使用して行われ、方法は、酸素／イソフルラン混合体（１．５乃至３％）の吸入の使用を含むが、これに限定されるものではない。これに代わる麻酔技術は、当業者に周知である。
【００５１】
好適な実施例において、眼のまぶたは、対象がまぶたを有さない場合もあるが、切開口を形成するために後退される。処置のために眼を準備する際に、眼の角膜に切開口（好ましくは１つの切開口）を形成する工程は、角膜内に外科用メスの先端のみを貫通させ、必要に応じて角膜を一面なで切りにする工程を含む。好適な実施例において、切開口の形成工程は角膜の頂点と縁との間の中間点において角膜を横断方向に切開する工程を含む。一実施例において、外科用メスは、インシュリン用使い捨て注射器（２９−３１Ｇ）を備える。外科用の鋭利なメスは、切開口を形成するためになで切りにする工程を要求するものではなく、鋭利な外科用メスの先端を単純に貫通させるのみで十分である。
【００５２】
移植時に、プランジャ２５が前方に駆動され、小島がカニューレ３０から取り出されるとともに虹彩に配置されると、切開口と対向する四半部における注射器駆動部４０を使用したできるだけ少量の僅かな押し出しにより排出を生じさせる必要がある。これにより、過剰な圧力の生成による小島の逆流（還流）を回避することが支援される。一実施例において、僅かな押し出しは、管１００およびカニューレ３０にタンク９５から小島が装填される際に、管１００をフリックまたはタッピングすることにより、確実に小島が接続管１００またはカニューレ３０に一体的に残存するように小島を圧縮することにより行われる。一実施例において、一旦小島に先立って気泡がすべてカニューレ３０の先端を出ると、フリックやタッピングは止められる。別例において、小島がカニューレ３０の後部に進入すると、フリックやタッピングは止められる。小島に先立つ残存する気泡により、前眼房からの小島の還流を防止することが支援され、また、これらは一晩で消失するであろう。さらに、一実施例において、小島がタンク９５からカニューレ３０に装填されている間において、カニューレ３０の先端がカニューレ３０から時期尚早に強制的に押し出される小島を捕捉するために培養皿に入れられてもよい。
【００５３】
前房の内部または外部の小島の回復が望ましい場合に、プランジャは、小島を吸引するとともにカニューレ３０内に引き戻すべく後方にのみ駆動される必要がある。回復が望ましい理由として、移植される小島の塊の変化、小島の誤った位置への配置、前房からの還流が挙げられるが、これらに限定されるものではない。小島の還流が回避不能である際に多量の小島を含む媒体が注入された場合に、切開口からカニューレ３０を後退させる工程は有用な工程である。小島の還流を解消し、かつ／または最小限にするために、カニューレ３０は前眼房内の切開口内において徐々に回転され、カニューレ３０の周囲の切開口を通して過剰な圧力を解放する。施術者は、カニューレ３０の後退を試みる間に還流の兆候を確認する必要があり、また、必要に応じて完全にカニューレ３０を後退させる前に前眼房の内部の圧力が弱化するまで、待機する必要がある。
【００５４】
本発明の実施例における電動式注入および吸引システムはすべて、本発明の第２および第６の態様の方法において使用することができる。
特許請求の範囲に記載の発明を実施するために、上述した任意の態様の任意の実施例を組み合わせてもよい。後述する例は、本発明の所定の実施例および様々な用途を例示する。これらは説明の目的のみのために開示され、任意の方法で本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきでない。
（例）
眼内の移植および共焦点顕微鏡法を組み合わせた新規なアプローチを後述する。これにより、生体内の移植された組織内において単細胞の解像度により長期的かつ非侵襲的なリアルタイムの撮像が可能となる。これは、マウスの前眼房内にランゲルハンス島を移植する方法を明示する。
【００５５】
生体内の顕微鏡検査法における進歩は、生体外の研究（Ｗｅｉｇｅｒｔ等、２０１０年）によっては予期されることのなかった生理的現象を明らかにした。これは、生きている動物の内部への従来の生体外の方法によって得られた発見を変える挑戦を強調する。過去十年間において、生きている動物における組織の視覚化は、画像診断療法（  （Ａｓｗａｔｈｙ等、２０１０年；  Ｇｈｏｒｏｇｈｃｈｉａｎ等、２００９年；  Ｌｅｉｂｉｇｅｒ等、２０１１年；  Ｎｔｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓ、２０１０年；  Ｗａｎｇ等、２０１０ｂ）において検討された）での技術的進歩によって相当に改善された。これにより、目的の組織の非侵襲的な視覚化を可能にするために実験動物モデルにおいて実現可能な応用による生体内の撮像アプローチの要求が駆り立てられた。
【００５６】
磁気共鳴映像法、陽電子放射断層撮影法や、生物発光（Ｐｒｅｓｃｈｅｒ等、２０１０年）のような技術により、体内深くの器官または組織を非侵襲的に撮像することができるようになった（Ｌｅｂｌｏｎｄ等、２０１０年；  Ｔｏｓｏ等、２００８年）。しかし、これらの技術は、ハイコントラストな材料や組織特有の発光を使用しても高い背景信号および低い空間分解能により単細胞の解像度を得ることができなかった（ｔｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓ、２０１０年）。これは二光子蛍光共焦点顕微鏡法の出現により、取り組まれた（Ｄｅｎｋ等、１９９０年）。二光子顕微鏡法により、先例がない詳細にわたる細胞的事象の視覚化および定量化のために生体内の撮像の研究が可能となった  （Ｄｅｎｋ等、１９９４年；  Ｗａｎｇ等、２０１０ａ）。これは、健康および疾患において鍵となる生物学的過程の特性化をもたらした（ＣａｈａｌａｎおよびＰａｒｋｅｒ、２００８年；  Ｃｅｌｌｉ等、２０１１年；  Ｋｈｏｒｓｈｉｄｉ等、２０１１年；  Ｍａｔｈｅｕ等、２０１１年）。開発中において、生体内撮像研究は、生存中のイメージング研究は、切除された組織（例えばリンパ節）における生体内の状態を主に「模倣した」。他の研究は、露出した目的の組織を元の位置で撮像するべく侵襲的なアプローチを使用した（Ｃｏｐｐｉｅｔｅｒｓ等、２０１０年；  Ｆａｎ等、２０１０年；  Ｍａｒｔｉｎｉｃおよびｖｏｎ  Ｈｅｒｒａｔｈ、２００８年；  ＭｏｓｔａｎｙおよびＰｏｒｔｅｒａ−Ｃａｉｌｌｉａｕ、２００８年；  Ｓａｂｅｋ等、２０１０年）。
【００５７】
前眼房（ＡＣＥ）内への移植を高解像度の共焦点顕微鏡法と組み合わせることにより、生体内の強力かつ汎用的な撮像プラットフォームが提供されることが最近明示された（Ｓｐｅｉｅｒ等、２００８ａ；  Ｓｐｅｉｅｒ等、２００８ｂ）。このアプローチにより、単細胞解像度によるランゲルハンス島の非侵襲的かつ長期的な生理学の研究が可能となった（Ｓｐｅｉｅｒ等、２００８ａ；  Ｓｐｅｉｅｒ等、２００８ｂ）。このモデルは動物モデルにおける１型糖尿病の進行時に自己免疫反応を研究することに使用された（出版されていないデータ）。さらに、これはＡＣＥ内に個々の糸球体を移植することによる腎臓機能に関する研究の他、膵臓の成長を研究することにも使用された（出版されていないデータ）。このアプローチを使用した最近の報告は、ＡＣＥ内にランゲルハンス島を移植した後の免疫反応を研究することに対するさらなる応用を明示した（Ａｂｄｕｌｒｅｄａ等、２０１１年）。重要なことには、この研究は、以下に列挙することを行うために前眼房内への移植により自然の体の窓が提供されることを示した。（ｉ）生体内の移植される組織の長期的かつ非侵襲的な撮像、（ｉｉ）元の位置におけるに細胞表現型および生存可能性を評価するための生体内の細胞標識化（ｃｙｔｏｌａｂｅｌｉｎｇ）、（ｉｉｉ）目的の組織における免疫細胞に侵入するリアルタイム追跡、および（ｉｖ）局所応用や眼内の注入による局部的な治療介入。
【００５８】
ランゲルハンス島を使用して前眼房内へ移植を行うための例示的な技術を後述する。処置は二工程で立体鏡下にて行われ、第１の工程は、カニューレに小島を装填する工程を含み、第２の工程は、ＡＣＥ内への実際の移植である。
【００５９】
１）移植用カニューレ内への小島の装填
１．１）狭小な同心円において培養皿を回転させることにより、培養皿にて小島を培養する。
【００６０】
１．２）「タンク」からカニューレ（２５Ｇ；  ＢＤ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、参照番号５８５１７）を分離し、清浄な表面にカニューレおよび接続管を配置する。タンクは、３００マイクロリットルの、フィルタのない使い捨てのプラスチックピペット先端から形成可能である（図５ａ）。
【００６１】
１．３）タンク内に吸引する際に確実に小島の連続的な流れを生じさせるようにタンクから（もしあれば）気泡を洗い流す。タンクを洗い流す工程は、フットペダルを使用して、手を使用することなく操作可能な電動注射器駆動部を前方に駆動することにより行われる（図５ｂ、および図５ｃ）。これにより、（予め食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、あるいは培養基のような無菌液が装填された）タンク内に小島を吸引させるために注射器内に空間が形成される。
【００６２】
１．４）タンク内に所望の量の小島を吸引する。小島は、タンクに進入すると渦巻く傾向にあり、タンクの底部に一体的に残存する。吸引は、フットペダルを使用して、電動注射器駆動部を後方に駆動することにより行われる。
【００６３】
１．５）接続管を介してタンクに再びカニューレを接続する。
１．６）培養皿にカニューレ先端を戻し、タンクから小島を管に洗い流し、続いてカニューレに洗い流す。管を徐々に「フリック」（タッピング）することによって管またはカニューレが再び満たされるように、確実に小島を一体的に残存させる（図５ｄ）。小島に先立つ気泡がすべてカニューレから洗い流される前後のいずれにおいても停止する。確かでない場合においては、小島がカニューレの後部に進入する際に停止する。小島に先立つ残存する気泡により、ＡＣＥからの小島の還流（逆流）を防止することが支援され、また、これらは一晩で消失するであろう。
【００６４】
２）前眼房内への小島の移植
２．１）立体鏡下でパッドに麻酔をかけられたマウスを配置する。
２．２）酸素／イソフルラン麻酔器に接続された麻酔「マスク」にマウスの鼻を入れる。マスクは１ミリリットルの使い捨てのプラスチックピペット先端（フィルタのない）で形成され、狭小な端部を通して麻酔管に接続される（図６ａ、および図６ｂ）。
【００６５】
２．３）自由な手の人差し指および親指を使用して、移植される眼のまぶたを徐々に後退させ、よりよい露出および容易なアクセスのために目を「飛び出させる」（図６ｃ）。これには、首への過剰な圧力や頭部への血流の妨害によってマウスの呼吸を妨害しないように完全に行うために、いくらかの実地の訓練を要する。
【００６６】
２．４）外科用メスとしてインシュリン用使い捨て注射器（２９−３１Ｇ）を使用して、その先端のみを角膜に貫通させ、横断方向に切開口を形成すべく角膜を一面に「なで切りにする」ことにより、角膜に１つの切開口を形成する。ＡＣＥからの小島の還流を最小限にするために角膜の頂点と縁との間の中間点に切開口を形成する（図６ｄ）。
【００６７】
２．５）切開口を通してカニューレ（小島が予め装填された）を注意深く挿入する。
２．６）小島をカニューレから徐々に排出させ、虹彩の頂部に配置する。過剰な圧力の生成による小島の還流を回避するために、小島の還流を最小限にするべく切開口の反対側の四半部にできるだけ少量の小島を僅かに押し出す。これは小島がタンクからカニューレ内に洗い流される際に、管またはカニューレ内の小島を圧縮することにより確実に行われる（工程１．６を参照）。
【００６８】
２．７）前眼房からカニューレを徐々に後退させる。これは、ＡＣＥ内に生じる圧力により小島の還流が回避不能である際に多量の小島を含む媒体が注入された場合に、有用な工程である。小島の還流を解消し、または最小限にするために、カニューレがＡＣＥ内に配置される間に、カニューレを徐々に回転させ、カニューレの周囲の切開口を通して過剰な圧力を解放する。カニューレが後退される際に還流の兆候を確認し、必要に応じて完全にカニューレをＡＣＥから後退させる前に圧力が弱化するまで、待機する。
【００６９】
２．８）必要に応じて、最初の４８時間に鎮痛用のブプレノルフィン（皮下に０．０５乃至０．１ｍｇ／ｋｇ）用を注入する。
２．９）移植された眼に、エリスロマイシン眼科用抗生物質軟膏を塗布する。
【００７０】
２．１０）麻酔から回復させるために暖められたケージに動物を戻す。
（代表的な結果）
「良好な」移植を形成する少数のパラメータがある。良好な移植は切開口を形成する際に、出血することなく進行するものである。出血は、ＡＣＥ内に外科用メス（針）の先端のみを貫通させることによって防止される（図７ａ）。これにより、さらに、虹彩の穿刺を防止することが支援され、また、時間にわたる角膜の雲りを生じさせることなく小さな切開口が非常に良好に確実に治癒する（図７ｃ、および図７ｄ）。成功した移植に対する別の有用な態様は、ＡＣＥからの還流による損失のない所望の総量の小島を移植することができることにある。プロトコル工程１．６において上述したように、これは可能な最小の量の小島を取り出すことにより、また、必要に応じてカニューレを後退させる際に気泡を使用して切開口をシールすることを支援することによって最小限にすることができる（図７ｂ）。さらに、瞳孔の端と縁との間の虹彩に小島を輸送することにより、生体内の撮像に非常に好適な位置に小島が位置決めされる。実地の応用の観点から、この中間位置に小島を有することにより、小島全体のスパンに要求される撮像Ｚ−スタック（ｚ−ｓｔａｃｋｓ）の厚みが低減される。
（ディスカッション）
ネズミ科の動物のランゲルハンス島は、上述したようにコラゲナーゼ消化を使用して隔離され、密度勾配上の精製がこれに続いた（Ｐｉｌｅｇｇｉ等、２００１年）。分離された小島は、移植前に一晩培養された。要求されるものではないが、小島を分離工程から回復させることが推奨される。これは、例えば、移植が糖尿病の被移植者に行われる場合に特に有用である。この理由としてより良好な血糖の制御のために生存するまたは健康な小島の移植が確実に行われることが挙げられる。
【００７１】
移植は、酸素／イソフルラン混合体（１．５乃至３％）吸入による全身麻酔下で行われる。これに代わる吸入あるいは注入麻酔（例えばケタミン）を使用することができる。注射麻酔が使用される場合は、プロトコルの工程２．２を飛ばす。何匹かのハツカネズミにおいて、通常血管がない角膜に切開口を形成する場合に、血管を破壊することは可能である。例えば、ヌードマウスの角膜は、導管化される傾向にある。可能な場合に、導管化された領域を回避する。切開口１つ当たりに新しい注射器を使用する。切開口を形成する場合に針により虹彩を穿刺することを回避する。虹彩との接触の防止は、虹彩に対して針先端の斜状部が面することにより改善される。切開口の形成後は、房水を乾燥または吸引しない。「濡れた」角膜の切開口を通してカニューレを貫通する方がより簡単である。必要に応じて角膜に無菌のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）や培養基を数滴付加する。術後鎮痛法は必要に応じて最初の４８時間ブプレノルフィン（０．０５乃至０．１ｍｇ／ｋｇ）または好適な鎮痛剤を皮下注射することにより行われる。これに代わる眼の抗生物質も使用可能である。
【００７２】
この研究において、カニューレに小島を吸引（装填）し、カニューレからＡＣＥ
内に小島を取り出すために、１００マイクロリットルの注射器を駆動するべくフットペダルによって操作される特注の顕微鏡下注射装置（ハミルトン社（ネバダ州））が使用された（図５）。これは、小島を吸引または取り出しするために手動で操作されるネジ駆動のプランジャを備える任意の１００マイクロリットルの気密なガラス注射器と置き換えることができる。しかしながら、これは、操作するためにもう一人の操作者に、補助を要求するであろう。いずれの場合においても、要求されるものではないが、小島を滑らかに、かつ確実に吸引および排出するために、組み立てられた注射器、管材料およびタンクに無菌液（食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）あるいは培養基）を予め装填することを推奨する。パックされた小島によりカニューレが詰まってしまう場合に、これは特に有用である。
【００７３】
移植処置は、感染の危険のないバイオセイフティ・キャビネット内の清浄条件下において通常行われる。使用済みの溶液、注射器、カニューレ、管、およびガーゼは、すべてオートクレーブ滅菌されるかガス殺菌される。
【００７４】
より少数の小島が移植される必要がある場合における撮像のためのＡＣＥ内にランゲルハンス島を移植する方法がここに明示される。糖尿病反転が移植される動物において望ましい場合に、大量の小島を移植する必要がある。しかしながら、還流により移植された小島が損失することを回避するためにプロトコルの工程２．６および２．７に対して特に注意を払う必要がある。移植処置は、１匹のマウス当たり５分以内に行うことができる。この技術は前眼房内に様々な組織を移植することに使用することができる。上述したように、前眼房内の膵臓の成長を生体内で研究するために胚組織（膵臓の芽）の他腎糸球体も移植された。
【００７５】
【表１】
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（参照文献）
Abdulreda, M.H., Faleo, G., Molano, R.D., Lopez-Cabezas, M., Molina, J., Tan, Y., Echeverria, O.A., Zahr-Akrawi, E., Rodriguez-Diaz, R., Edlund, P.K. 等（2011年）.  High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses.  In Proc Natl Acad Sci U S A.
Aswathy, R.G., Yoshida, Y., Maekawa, T., and Kumar, D.S. (2010年).  Near-infrared quantum dots for deep tissue imaging.  Anal Bioanal Chem 397, 1417-1435.
Cahalan, M.D., and Parker, I. （2008年）.  Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs.  Annu Rev Immunol 26, 585-626.
Celli, S., Albert, M.L., and Bousso, P. （2011年）.  Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy.  Nat Med.
Coppieters, K., Martinic, M.M., Kiosses, W.B., Amirian, N., and von Herrath, M.  （2010年）.  A novel technique for the in vivo imaging of autoimmune diabetes development in the pancreas by two-photon microscopy.  PLoS One 5, el5732.
Denk, W., Delaney, K.R., Gelperin, A., Kleinfeld, D., Strowbridge, B.W., Tank, D.W., and Yuste, R.（1994年）.  Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy.  J Neurosci Methods 54, 151-162.
Denk, W., Strickler, J.H., and Webb, W.W. （1990年）.  Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.  Science 248, 73-76.
Fan, Z., Spencer, J., Lu, Y., Pitsillides, C, Singh, G., Kim, P., Yun, S., Toxavidis, V., Strom, T., Lin, C 等（2010年）.  In vivo tracking of 'color-coded' effector, natural and induced regulatory T cells in the allograft response.  Nat Med 16, 718-722.
Ghoroghchian, P.P., Therien, M.J., and Hammer, D.A. （2009年）.  In vivo fluorescence imaging: a personal perspective.  Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol 1, 156-167.
Khorshidi, M.A., Vanherberghen, B., Kowalewski, J.M., Garrod, K.R., Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H., Brismar, H., Cahalan, M.D., and Onfelt, B.（2011年）.  Analysis of transient migration behavior of natural killer cells imaged in situ and in vitro.  Integr Biol (Camb) 3, 770-778.
Leblond, F., Davis, S., Valdes, P., and Pogue, B. （2010年）.  Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications.  J Photochem Photobiol B 98, 77-94. 
Leibiger, LB., Caicedo, A., and Berggren, P.O.（2011年）.  Non-invasive in vivo imaging of pancreatic β-cell function and survival - a perspective.  Acta Physiol (Oxf). 
Martinic, M.M., and von Herrath, M.G. （2008年）.  Real-time imaging of the pancreas during development of diabetes.  Immunol Rev 221, 200-213. 
Matheu, M.P., Cahalan, M.D., and Parker, I. （2011年）.  Immunoimaging: studying immune system dynamics using two-photon microscopy.  Cold Spring Harb Protoc 2011, pdb top99.
Mostany, R., and Portera-Cailliau, C. （2008年）.  A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window.  J Vis Exp. 
Ntziachristos, V. （2010年）.  Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology.  In Nat Methods (United States), pp. 603-614. 
Pileggi, A., Molano, R.D., Berney, T., Cattan, P., Vizzardelli, C, Oliver, R., Fraker, C, Ricordi, C, Pastori, R.L., Bach, F.H. 等（2001年）.  Heme oxygenase-1 induction in islet cells results in protection from apoptosis and improved in vivo function after transplantation.  Diabetes 50, 1983-1991. 
Prescher, A., Mory, C, Martin, M., Fiedler, M., and Uhlmann, D. （2010年）.  Effect of FTY720 treatment on postischemic pancreatic microhemodynamics.  Transplant Proc 42, 3984-3985. 
Sabek, O., Gaber, M.W., Wilson, CM., Zawaski, J.A., Fraga, D.W., and Gaber, O.（2010年）.  Imaging of human islet vascularization using a dorsal window model.  In Transplant Proc (United States: Published by Elsevier Inc.), pp. 21 12-2114.  Speier, S., Nyqvist, D., Cabrera, O., Yu, J., Molano, R.D., Pileggi, A., Moede, T., K5hler, M., Wilbertz, J., Leibiger, B. 等(2008a).  Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.  Nat Med 14, 574-578. 
Speier, S., Nyqvist, D., Kohler, M., Caicedo, A., Leibiger, LB., and Berggren, P.O. (2008b).  Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.  Nat Protoc 3, 1278-1286. 
Toso, C, Vallee, J.P., Morel, P., Ris, F., Demuylder-Mischler, S., Lepetit-Coiffe, M., Marangon, N., Saudek, F., James Shapiro, A.M., Bosco, D. 等  （2008年）.  Clinical magnetic resonance imaging of pancreatic islet grafts after iron nanoparticle labeling.  Am J Transplant 8, 701-706.
Wang, B.G., Konig, K., and Halbhuber, K.J. (2010a).  Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research.  J Microsc 238, 1-20.
Wang, Y., Maslov, K., Kim, C, Hu, S., and Wang, L. (2010b).  Integrated photoacoustic and fluorescence confocal microscopy.  IEEE Trans Biomed Eng 57, 2576-2578. 
Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., and Masedunskas, A.  （2010年）. 
Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals.  Histochem Cell Biol 733, 481-491. 
本発明は様々な実施例の点から開示されたが、当業者は変更および変形を思いつくものといえる。したがって、添付の請求項は、特許請求の範囲に記載の発明の範囲内に相当する等価的変化をすべてカバーすることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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