(57)【要約】  本発明は、リン脂質ゲルの組成物および調製方法を提供する。
2014520112.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲル組成物であって、
プラムリンチド、プラムリンチドアナログ、メトレレプチン、およびメトレレプチンアナログ (API)から選択される少なくともひとつの活性医薬成分、
20から40重量%の以上のリン脂質、
5から30重量%の中鎖トリグリセリド油、および
10から56重量%の水または溶媒
を含み、ここに、90ニュートンを超えない負荷力により、2 cc／分の押出速度にて、1 ccシリンジから25G１/２インチ長の針を通して押出可能である、ゲル組成物。
【請求項２】
チクソトロピー性であって、30ニュートンを超えない負荷力により、2 cc／分の押出速度にて、1 ccシリンジから25G１/２インチ長の針を通して押出可能である、請求項１に記載のゲル組成物。
【請求項３】
プラムリンチドまたはプラムリンチドアナログを含む、請求項１または２に記載のゲル組成物。
【請求項４】
メトレレプチンまたはメトレレプチンアナログを含む、請求項１または２に記載のゲル組成物。
【請求項５】
プラムリンチドおよびメトレレプチンを含む、請求項１または２に記載のゲル組成物。
【請求項６】
ラットにおいて、20 mg/kgのメトレレプチンおよび1.44 mg/kgのプラムリンチドの皮下注射後24時間以内に、メトレレプチンにつき1 ng/mLを超える、プラムリンチドについて10 pg/mLを超える血漿濃度を維持する、請求項５に記載のゲル組成物。
【請求項７】
メトレレプチンが前記ゲルの約2から約4%の濃度範囲にあり、前記プラムリンチドが前記ゲルの約0.14から約0.28重量%の濃度範囲にある、請求項５または６に記載のゲル組成物。
【請求項８】
前記溶媒がグリセリンである、請求項１、３〜５、および７のいずれか１に記載のゲル組成物。
【請求項９】
前記ゲルが無水である、請求項１、３〜５、および７のいずれか１に記載のゲル組成物。
【請求項１０】
前記リン脂質がPOPCである、請求項１〜９のいずれか１に記載のゲル組成物。
【請求項１１】
中鎖トリグリセリド油がMiglyol 812である、請求項１〜１０のいずれか１に記載のゲル組成物。
【請求項１２】
前記ゲルが、スクロース、グルタミン酸塩、EDTA、メチオニン、ポリソルベート、塩化亜鉛、またはそれらの組合せから選択される安定化剤をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１に記載のゲル組成物。
【請求項１３】
前記ゲルが保存剤をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１に記載のゲル組成物。
【請求項１４】
前記保存剤がフェノール、クレゾール、パラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、チメロゾールまたはそれらの組合せよりなる群から選択される、請求項１３に記載のゲル組成物。
【請求項１５】
ゲル組成物の調製方法であって、
前記ゲル組成物は、
プラムリンチド、プラムリンチドアナログ、メトレレプチン、およびメトレレプチンアナログ (API)から選択される少なくともひとつの活性医薬成分、
20から40重量%の以上のリン脂質、
5から22重量%の中鎖トリグリセリド油、および
10から56重量%の溶媒
を含み、ここに、90ニュートンを超えない負荷力により、2 cc／分の押出速度にて、1 ccシリンジから25G１/２インチ長の針を通して押出可能であり、
ステップ１：１以上のリン脂質、中鎖トリグリセリド油、 安定化剤および過剰量の水を含む一次エマルジョンを形成すること；
ステップ２：前記一次エマルジョンを均質化して、直径約30 nmから約200 nmの平均滴径を持つ微細エマルジョンを形成すること；
ステップ３：前記微細エマルジョンを0.2-ミクロンフィルターを通過させること；および
ステップ４：前記過剰水を除去して、最終ゲル組成物を得ること
を含み、ここに、少なくともひとつのAPIがステップ１、２、３または４にて組成物に添加される、方法。
【請求項１６】
ゲル組成物であって、
プラムリンチド、プラムリンチドアナログ、メトレレプチン、およびメトレレプチンアナログ (API)から選択される少なくともひとつの 活性医薬成分、
20から40重量%の１以上のリン脂質、
5から30重量%の中鎖トリグリセリド油、および
10から56重量%の水または溶媒
を含み、前記少なくともひとつのAPIの持続性投与に使用する、組成物。
【請求項１７】
ヒトまたは非ヒト哺乳動物対象を治療する方法であって、請求項１〜１６のいずれか１に記載のゲル組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１８】
糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、過体重、減量の必要、肥満、高血圧およびリポジストロフィーから選択される少なくともひとつの病気を直すために、治療の必要があるヒトまたは非ヒト哺乳動物対象を治療するための、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
F-207、F-209、F-210、F-211、F-216、およびF-217から選択されるゲル組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラムリンチド、プラムリンチドアナログ、メトレレプチン、およびメトレレプチンアナログ (API)から選択される少なくともひとつの活性医薬成分ならびに少なくともひとつのリン脂質を含むゲル組成物に関する。好ましくは、前記ゲル組成物は、毎日１回以下の注射により少なくともひとつのAPIの持続性送達を可能とする。
【背景技術】
【０００２】
レプチンは、主に脂肪細胞によって分泌される神経ホルモンであり、視床下部中の受容体に結合する。レプチンは、長期エネルギーホメオスタシスの調節に重要な役割を演じる。レプチン-欠失ヒトは重篤な過食症および重大な肥満を示し、それらは、レプチン補充によって逆戻りすることがある (Nature. 1997 Jun 26;387 (6636):903-8)。組換えヒトメチオニルレプチンは、メトレレプチンとしても知られ、肥満、２型糖尿病、およびリポジストロフィーの可能性のある治療として研究されている。
【０００３】
アミリンは、栄養素摂取後、膵臓ベータ細胞によりインスリンと共分泌されるペプチドホルモンであり、その主要の生理学的役割は、摂食行動および胃内排出の抑制、ならびに、その後の体重減少と食事関連血中グルコースレベルを低下させることに関わる。食事への応答において膵臓ベータ細胞から分泌される、その全効果は、食事からのアピアランス [appearance] (Ra)の速度を低下させることにあり、それは、食物摂取の調和減少 [coordinate reduction]、胃内排出の緩慢化、および消化液分泌（胃酸、膵臓酵素、および胆汁排出）の抑制により介在される。アミリンアナログ、プラムリンチドは、いくつかの臨床試験で、肥満個体において、満腹感を増進し、食物摂取を低減し、永続的な減量に導くことが知られていた［Am J Physiol Endocrinol Metab. 2007 Aug;293(2):E620-7. Epub 2007 May 15］。
【０００４】
ヒト臨床研究は、メトレレプチンおよびプラムリンチドの組合せが、皮下注射後の肥満患者の減量において、効果的であることを示し、この組合せは将来有望な減量薬剤コンビネーションになる［Obesity (Silver Spring). 2009 September; 17(9)： 1736−1743］。
【０００５】
溶液配合物において、メトレレプチンおよびプラムリンチドのどちらも、皮下注射後、短い排出半減期を有する。例えば、ラットにおける皮下注射後、約12時間以内に、メトレレプチンの血漿濃度は、1 ng/mL未満まで、プラムリンチドは、1 ピコグラム/mL未満まで、急速に降下し（図３）、かくして、それらの血中濃度を有効なレベルに維持するためには、頻繁な注射、例えば、１日に２〜３回注射が要求される。メトレレプチンおよび／またはプラムリンチドの持続性送達ができ、かくして、毎日１回注射を超えないことを許容する配合物が望まれる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、プラムリンチド、プラムリンチドアナログ、メトレレプチン、およびメトレレプチンアナログ (API)から選択される少なくともひとつの活性医薬成分ならびに少なくともひとつのリン脂質を含むゲル組成物に関し、それらは、皮下注射部位にデポを形成し、その後、時間をかけてゆっくりとデポリザーバから活性剤を周囲組織に放出することによって、その作用を延長可することができる。１日間放出プロファイルまたは７日間デポ放出プロファイルまでのような、毎日未満の放出プロファイルは、それぞれ、１日１回または１週間に１回までの注射スケジュールを可能にするが、それは、便利で、かつ患者の患者コンプライアンスをよりよくするために非常に所望されるであろう。
【０００７】
リン脂質は、人体内で天然に産出する物質であり、細胞膜の主たる構成要素である。これらの分子は、注射薬剤における成分として安全性および生体適合性の記録が確立されている。リン脂質は、また、通常、水や水性体液に不溶である。組織への注射の際、リン脂質は沈殿し、共投与される薬剤を捕捉して、デポとして機能する薬剤-リン脂質共沈殿物を形成する。時間をかけて、この塊は侵食され、ゆっくりと周囲組織に拡散し、および／または、体中に分布し、リン脂質をゆっくりと加水分解する酵素であるホスホリパーゼによって崩壊され、捕捉された薬剤の緩徐放出を生じる。そのような好適な安全性、溶解性および生体適合性により、リン脂質は理想的なデポ材料といえる。しかしながら、今日まで、リン脂質を基礎とする成功したデポ薬剤はあまりない。ひとつの主たる問題は、リン脂質-ベース組成物に関係する低い注射可能性である。
【０００８】
本発明者らは、デポ機能性を許容する塊を形成するためには、概略、高濃度（すなわち、20-40%）のリン脂質が要求されることを見いだした。しかしながら、組成物中のリン脂質濃度が一旦約20%を超えると、その組成物は濃密、粘稠になり、過大な力を使わなければ微細針を通して注射することが困難である。例えば、Phosal 50PG、Phosal 50SA、およびPhosal 50MCT（America Lecithin Company製）は、それぞれ、プロピレングリコール／エタノール、油、および中鎖油に溶解した約50%リン脂質を含有するリポソーム形成組成物である。それらの蜜様粘度により、Phosal組成物は、従来の皮下針およびシリンジを用いて、注射することは非常に困難である。2 cc／分のプランジャースピードにて、1 ccシリンジから25G1／2インチ長の針を通してPhosalを押し出すには、90ニュートン（約20重量ポンドと同等）を超える力が必要である。かくして、非常に強い力を用いたとしても、26G針を通して1 mLのPhosal-ベースデポを手で押し出すには、２〜５分以上かかる。これは、通常の医療用としては非実用的であり、明らかに自己投与には向かない。したがって、微細皮上 [hyperdermic]針を用いる許容できる注射可能性が、リン脂質が有用なデポ材料になることを妨害する主たるハードルである。本発明は、ここで定義するように、許容可能注射性基準 [Acceptable Injectability Criterion]に合致する驚くべき良好な注射可能性を示すリン脂質ゲル組成物を開示する。
【０００９】
リン脂質を取り扱う上でのもう一つの困難性は、リン脂質が、ある種の有機溶媒（例えば、エタノール）または油（例えば、植物油）に溶解するのみで、メトレレプチンまたはプラムリンチドのようなAPIは、水に溶解するのみで、リン脂質を溶解する溶媒や油には溶解しないことである。さらに、タンパク質として、メトレレプチンのようないくつかのAPIは、有機溶媒様エタノールと接触すると即座に損傷を受ける。したがって、従来の溶媒法その他先行技術に開示されるものによって、溶媒-感受性薬剤を沈殿または崩壊させずに、タンパク質薬剤を含有するリン脂質-ベースゲルを製造するのは不可能である（国際公開第2006/002050号、米国特許第5,807,573号、国際公開第1994/008623号、米国特許第5,004,611号およびHarry Tiemesseen, et al. (2004) European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics Volume 58 (2005), pp 587-593を参照せよ）。本発明は、（APIに損害を与え得る溶媒の代わりに）水中油エマルジョンを用いて、リン脂質およびAPIの双方を溶解し、均一ゲルを形成する方法を教示する。
【００１０】
リン脂質デポの製造におけるもう一つのハードルは、注射に適した滅菌デポを調製することの困難性に関する。多くの薬物は感熱性であり、加熱滅菌（例えば、オートクレーブ）や放射滅菌に耐えられない。これは、特に、メトレレプチンおよびプラムリンチドのような生物学的薬剤について真である。多くの場合、タンパク質含有組成物を滅菌する唯一の実用的な方法は、0.2-または0.45-ミクロン孔膜を通してろ過し、いかなる微生物汚染物をも取り除くことである。20-40%リン脂質含量で、濃密粘度のゲル組成物は、ろ過滅菌のいかなる可能性も排除する。したがって、本発明は、ろ過滅菌できるゲルの独特の調製方法も教示する。
【００１１】
本発明は、チクソトロピー性であり、かつ、微細針から注射可能な、プラムリンチド、プラムリンチドアナログ、メトレレプチン、およびメトレレプチンアナログ (API)から選択される少なくともひとつの活性医薬成分のリン脂質-ベースデポゲル組成物であって、本発明は、メトレレプチンまたはプラムリンチドを包含するAPIに損傷を与え得るいかなる溶媒も使用しない滅菌リン脂質-ベースデポゲルを調製する方法も提供する。有利なことに、リン脂質-ベースデポゲル（または「ゲル」）は、皮下注射後、少なくともひとつのAPIについて血漿中で延長した循環時間を提供し、１日１回注射を超えないことを可能とする。
【００１２】
それで、ひとつの具体例において、本発明は、ゲル組成物であって、
プラムリンチド、プラムリンチドアナログ、メトレレプチン、およびメトレレプチンアナログ (API)から選択される少なくともひとつの活性医薬成分、
20から40重量%の１以上のリン脂質、
5から30重量%の中鎖トリグリセリド油、および
10から56重量%の水または溶媒
を含み、ここに、90ニュートンを超えない負荷力により、2 cc／分の押出速度にて、1 ccシリンジから25G1／2インチ長の針を通して押出可能である、ゲル組成物を提供する。
【００１３】
本発明は、前記ゲル組成物を調製する方法も提供する。
【００１４】
本発明は、ここに開示するゲル組成物を皮下注射することによる減量方法も提供する。
【００１５】
本発明は、ここに開示するゲル組成物を、毎日１回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、または１週間に１回の頻度で、皮下注射することによる減量方法も提供する。
【００１６】
ある具体例において、本発明のゲルはチクソトロピー性（図１）であり、微細針を通す良好な押出可能性／注射可能性について、所望の特性である。対照的に、同一組成物は、公知の先行技術方法で調製した場合、微細皮下針を通して注射することが非常に困難か不可能である濃密ペーストを生じる。
【００１７】
これらのまたは他の局面、目的および具体例は、付随する詳細な説明および、以下の図面を参照してより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
図１は、それぞれ、実施例３および４による、F-210（図1A）およびF-211（図1B）ゲル組成物のチクソトロピー特性を示す。
【００１９】
図２は、同一用量のメトレレプチンまたはプラムリンチドを含有する溶液配合物と比較して、それぞれ、実施例８、７および１によるF-27（図２Aおよび2B）、F-107（図２Cおよび2D）およびF-207（図２Eおよび2F）ゲル組成物の皮下注射後、ラットにおけるメトレレプチンおよびプラムリンチドの延長した血漿濃度-対-時間プロファイルをを例示する。この研究の詳細は実施例９にある。
【００２０】
図３は、実施例１によるゲル (F-207)についての代表的な射出力対時間プロファイルを示す。この試験では、時間（X-軸、1/10秒）に対して、2 cc／分の速度にて、1 ccシリンジから25G1／2インチ長の針を通してゲルを射出するのに必要な力（Y-軸上に描写され、マイナス値は押す力を示す。）を測定した。測定された最大力は、約12ニュートン（または約2.5重量ポンド）であった。
【００２１】
図４は、水の除去による、微細エマルジョン（左）から本発明のゲル（右）への推測される転換の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
Ｉ．定義
【００２３】
「活性医薬成分」は、患者に対して治療的、予防的、または他の有益な薬理学的および／または生理学的効果を有する生物学的活性化合物である。ここに記載されるゲル組成物において、プラムリンチド、プラムリンチドアナログ、メトレレプチン、およびメトレレプチンアナログ (API)から選択される少なくともひとつの活性医薬成分が提供される。好ましくは、このゲル組成物は、プラムリンチドを含む。いくつかの具体例において、プラムリンチドおよびメトレレプチンが同一ゲル組成物中に提供される。
【００２４】
このゲル組成物は、概略、（組成物の全重量に対して）約0.01% (w/w)から約50% (w/w)の少なくともひとつのAPIを含む。例えば、APIの量は、組成物の全重量の約0.1% (w/w)から約30% (w/w)である。APIの量は、所望の効果、剤の薬効、計画された放出レベル、および薬剤が放出される期間に依存して変化する。ある具体例において、充填の範囲は、約0.1% (w/w)から約10% (w/w)まで、例えば、約0.1% (w/w)から約5% (w/w)まで、または約1%から約5% (w/w)までの間である。
【００２５】
APIがプラムリンチドまたはプラムリンチドアナログである場合、適当な放出プロファイルは、薬剤が、約0.1% (w/w)から約0.3% (w/w)、約0.1% (w/w)、約0.2% (w/w)、約0.3% (w/w)、および、好ましくは、約0.28% (w/w)または約0.14% (w/w)を包含し、約0.1% (w/w)から約0.5% (w/w)にて充填されるときに得られる。APIがメトレレプチンまたはメトレレプチンアナログである場合、適当な放出プロファイルは、APIが約1.0% (w/w)から約5.0% (w/w)、約1.0% (w/w)、約2.0% (w/w)、約3.0% (w/w)、約4.0% (w/w)、および約5.0% (w/w)を包含し、約1.0% (w/w)から約10.0% (w/w)にて充填されるときに得られる。好ましくは、メトレレプチンまたはメトレレプチンアナログは約2.0% (w/w)または約4.0% (w/w)にて充填される。
Ａ．メトレレプチン
【００２６】
ここに開示されるゲル組成物は、メトレレプチンとしても知られる組換えヒトメチオニルレプチンおよびメトレレプチンアナログを包含する。メトレレプチンは、ヒトレプチンのアナログであり、肥満、２型糖尿病、およびリポジストロフィーの可能性のある治療として研究されている。メトレレプチンは以下のアミノ酸配列（配列番号：１）：MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC
を有する。
【００２７】
本発明のゲル組成物で考慮されたメトレレプチンアナログは、配列番号：１に少なくとも80%配列同一性を有し、かつ、レプチン活性を有する化合物を包含する。いくつかの具体例において、配列同一性は80%-100%の範囲内である。いくつかの具体例において、配列同一性は80%-90%の範囲内である。より好ましくは、前記アナログ配列は、配列番号：１と少なくとも80%、90%、または95%アミノ酸配列同一性を有する。メトレレプチンアナログも、保存または非保存アミノ酸置換（非天然アミノ酸ならびにLおよびD体を含む）を包含することができる。
【００２８】
用語「レプチン活性」は、レプチン結合活性およびレプチン機能活性を包含する。当業者は、レプチン結合またはレプチン機能活性を測定するための適当なアッセイを用いて、レプチン活性を持つメトレレプチンアナログ化合物を認識するであろう。メトレレプチンアナログ化合物は、ここで記載されたもののように、レプチン結合アッセイにおいて、約200 nM以下、約100 nM以下、または約50 nM以下、または約5 nM以下、または約1 nM以下のIC50を有する。用語「IC50」は、慣習的な意味で、生物学的または生化学的機能を阻害する化合物の最大半量阻害濃度をいう。よって、受容体結合研究の観点で、IC50は特定受容体からの既知リガンドの半分に匹敵する試験化合物の濃度をいう。メトレレプチンアナログ化合物は、ここに記載されたもののように、レプチン機能アッセイにおいて、約20 nM以下、約10 nM以下、約5 nM以下、約1 nM以下、または約0.1 nM以下のEC50を有する。用語「EC50」は、慣習的な意味で、当該分野で知られているように、ベースライン応答と最大応答との間の半分の応答を誘発する化合物の有効濃度をいう。
【００２９】
代表的なレプチン結合アッセイは以下である：レプチン結合は、32D OBECA細胞系統により提示されるキメラレプチン（Hu）−EPO（Mu）受容体を発現する表面膜から125I-組換え-レプチン（マウス）を除去する試験化合物の効能により測定できる (J Biol Chem 1998; 273(29): 18365-18373)。精製された細胞膜は、32D OBECA細胞の収穫された融合細胞培養からの均質化によって調製できる。膜は、125I-rec-ムリン-レプチンおよび増加した濃度の試験化合物とともに、３時間、環境温度にて、96-ウェルポリスチレンプレート中でインキュベートされた。結合および未結合フラクションは、次いで、0.5% PEI （ポリエチレンイミン）中、少なくとも60について予備ブロックされた96-ウェルGF/Bプレート上に急速ろ過によって分離できる。次いで、ガラスファイバープレートを乾燥し、シンチラント [scintillant]を添加し、放射標識ヨウ素を読み取れるマルチウェルシンチレーションカウンターで読み取ることによってCPMを決定する。
【００３０】
代表的なレプチン機能アッセイは以下である：増加したレベルのリン酸化STAT5 (Signal Transducer and Activator of Transcription 5)は、キメラHu-レプチン/Mu-EPO受容体を異所的に発現する32D-ケプチン細胞の試験化合物での処理後、測定できる。32D-ケプチン細胞（32D-OBECA細胞と同一であるが、培養中、レプチンと維持された）は、一晩、レプチン引離しされ、次いで、96−ウェルプレート中、30分間、37℃にて、試験化合物で処理し、その後、細胞抽出した。細胞溶解物中のpSTAT5レベルは、384-ウェルフォーマット （ProxiplateTM 384 Plus)中でPerkin Elmer AlphaScreenR SureFireR pSTAT5アッセイキットを用いて、決定できる。試験化合物の有効性は、ヒトレプチンで処理した細胞由来の細胞溶解物中の最大信号に対して、決定できる。
Ｂ．プラムリンチド
【００３１】
ここに開示されるゲル組成物は、プラムリンチドおよびプラムリンチドアナログを包含する。プラムリンチドは合成ホルモンであり、ヒトアミリンのアナログである。プラムリンチドは、２００５年３月ににFDAよって承認され、商品名e SYMLINRとして販売される注射可能薬剤として市販されている。プラムリンチドは、血中グルコースレベルを低下させて、１型および２型糖尿病の患者を治療するために用いられる。プラムリンチドは、また、動物および／またはヒトにおいて体重を減少させるとも報告され、かくして、肥満および肥満関連障害を治療することが提唱されている。プラムリンチドは、以下のアミノ酸配列（配列番号：２）：KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY
を有する。
【００３２】
本発明のゲル組成物で考慮されたプラムリンチドアナログは、配列番号：２に少なくとも80%配列同一性を有し、かつ、アミリン活性を有する化合物を包含する。いくつかの具体例において、配列同一性は80%-100%の範囲内である。いくつかの具体例において、配列同一性は80%-90%の範囲内である。より好ましくは、前記アナログ配列は、配列番号：２と少なくとも80%、90%、または95%アミノ酸配列同一性を有する。プラムリンチドアナログも、保存または非保存アミノ酸置換（非天然アミノ酸ならびにLおよびD体を包含する）を含むことができる。
【００３３】
用語「アミリン活性」は、アミリン受容体結合活性およびアミリンアゴニスト活性を包含する。当業者は、適当なアミリン受容体結合アッセイを用いるか、例えば、ヒラメ筋アッセイにおいてアミリンアゴニスト活性を測定することによって、アミリン活性を持つプラムリンチドアナログ化合物を認識するであろう。プラムリンチドアナログ化合物は、ここで記載され、出典明示して、それらの全体および全ての目的について、その開示が本明細書に含まれるとみなされる、米国特許第5,686,411号、および米国特許公開第2008/0176804号に記載されたもののように、アミリン受容体結合アッセイにおいて、約200 nM以下、約100 nM以下または約50 nM以下のIC50を有する。プラムリンチドアナログ化合物は、米国特許第5,686,411号に記載されたもののように、ヒラメ筋アッセイにおいて、約20 nM以下、約15 nM以下、約10 nM以下、または約5 nM以下のEC50を有する。
【００３４】
代表的なアミリン受容体結合アッセイは以下である：RNA膜は、１時間、環境温度にて、例えば、96-ウェルポリスチレンプレート中で、およそ20 pM（最終濃度）の125I-ラットアミリン (Bolton-Hunter labeled, PerkinElmer, Waltham, MA)と、濃度を増やしながら試験化合物とともにインキュベートできる。ウェル内容の結合フラクションは、96-ウェルガラスファイバープレート（少なくとも30分間、0.5% PEI中で予備ブロックされた）上に収集され、Perkin Elmerプレート収穫器を用いて1 X PBSで洗浄した。乾燥したガラスファイバープレートをシンチラントと合わせ、マルチウェルPerkin Elmerシンチレーションカウンターで計数した。
【００３５】
語句「許容可能注射性基準」は、ここで用いるとき、1 ccシリンジから25G1／2インチ長の針を通して、2 cc/分の速度にて、配合物を押し出すために、90ニュートン（または18重量ポンド）を超える負荷力を必要としない配合物を定量的に規定することを包含する。「許容可能注射性基準」は、典型的な皮下注射に許容される最大力を規定する。
【００３６】
用語「酸性化剤」は、塩酸、酢酸、および硫酸などの医薬上許容される酸を包含する。
【００３７】
ここで用いるとき、用語「アルカリ性化剤」は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、リシン、アルギニンなどの医薬上許容される塩基を包含する。
【００３８】
ここで用いるとき、用語「抗菌性保存剤または保存剤」は、注射可能薬理学的活性剤に添加することができ、かつ、細菌および真菌類の増殖を阻害するのに用いることができる医薬添加物を包含する。本発明に有用な抗菌性保存剤は、限定されないが、クレゾール、フェノール、ベンジルアルコール、エタノール、クロロブタノール、パラベン、イミド尿素、塩化ベンザルコニウムを包含する。
【００３９】
ここで用いるとき、用語「無水」は、実質的に水の不存在を意味する。例えば、無水ゲルは、ゲル中の水分量が2%未満、好ましくは1%未満、またはより好ましくは0.5%未満であることを意味する。
【００４０】
ここで用いるとき、用語「抗酸化剤」は、主に還元剤を包含する。本発明に有用な還元剤は、限定されないが、アスコルビン酸もしくはそれらの塩、パルミチン酸アスコルビル、メタ重亜硫酸ナトリウム、没食子酸プロピル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、トコフェロール、メチオニンもしくはそれらの塩、クエン酸もしくはそれらの塩、還元糖、またはそれらの混合物を包含する。
【００４１】
ここで用いるとき、用語「水相」は、酸性化剤、アルカリ性化剤、pH緩衝剤、キレート剤、縮合剤および可溶化剤、抗酸化剤および抗菌性保存剤、等張性／浸透性改善剤、その他生体適合材料または治療的剤のような医薬上許容される添加物を含有する水溶液を包含する。ある具体例において、そのような添加物は、薬理学的活性剤およびデポ組成物を安定化すること、ならびに組成物を生体適合性にすることを支援する。
【００４２】
ここで用いるとき、用語「デポ」は、少なくともひとつのAPIを、ゆっくりとまたは制御された様式で、周囲組織に放出して、APIの水溶液と比較して、延長した作用持続時間を達成することができるリン脂質-ベースゲル組成物をいう。デポ組成物は、注射、点滴、または移植によって軟組織に投与することができ、体腔または、場合によって、血管への微細針を通す注射が好ましい投与の方法である。本発明のデポは、（１）毎日１回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回６日に１回または１週間に１回のような、簡便または頻度の少ない用量、（２）延長された作用、（３）改善された安全性および／または（４）よりよい薬剤効力の提供を意図する。用語「デポ」は、「持続性放出 [sustained-release]」、「緩徐放出 [slow-release]」、「時限放出 [timed-release]」、「延長放出 [extended-release]」、「遅延放出 [delayed-release]」、「長期作用 [long-acting]」、または「制御放出 [controlled-release]」と交換可能に使用できる。
【００４３】
ここで用いるとき、用語「エマルジョン」は、非混和の油相および水相の混合物であって、前記油相が油とリン脂質とを含む小滴の形態（分散相）で、それらが、前記水相（連続相）に懸濁または分散している混合物を包含する。本発明により形成される「一次エマルジョン」は、典型的に、光学的不透明であり、限られた安定性を有する。本発明により形成される「微細エマルジョン」は、典型的に、半透明であり、200 nm未満の平均滴径を有し、0.2ミクロンフィルターでろ過可能である
【００４４】
ここで用いるとき、用語「微細針」または「微細皮下針」は、物質を体内に射出するシリンジと用いる小径、中空針を包含する。その針の外径はニードルゲージシステムで表示される。スタブスニードルゲージシステム [Stubs Needle Guage system]によれば、普通の医療使用で、皮下針は7ゲージ（最大）から33（最少）の範囲である。語句「微細」は、ここで用いるとき、21から33ゲージ(G)、好ましくは、25Gから31Gおよび最も好ましくは、25Gから29Gの範囲の針を包含する。微細皮下針の定義は、再利用タイプおよび使い捨てタイプの双方に適用される。使い捨て針は、押し込みまたはねじ込みすなわち「ルアーロック」接続によって注射筒に取り付けられるか、または、注射筒に恒久的に取り付けられたプラスチック製またはアルミ製ハブに埋め込まれる。
【００４５】
ここで用いるとき、用語「感熱性」は、所与の薬剤が、例えば121℃にて15-20分間のオートクレーブ処理後、その薬効または濃度の3%以上を失うことを意味する。メトレレプチンおよびプラムリンチドはどちらも感熱性である。これらの薬剤について、熱を用いる最終滅菌手順（すなわちオートクレーブ）は実行できない。
【００４６】
ここで用いるとき、用語「注射可能または押出可能」は、すでに上で定義した許容可能注射性基準に合致することを包含する。
【００４７】
ここで用いるとき、用語「金属イオンキレート剤またはキレート剤」は、注射可能製品に用いるのに安全な金属イオンキレート剤を包含する。金属イオンキレート剤は、金属イオンに結合し、それによって、酸化、加水分解または他の分解反応に対する金属イオンの触媒効果を減じることによって、作用する。本発明に有用な金属キレート剤は、エデト酸二ナトリウム (EDTA)、グリシンおよびクエン酸ならびにそれらそれぞれの塩を包含することができる。
【００４８】
ここで用いるとき、用語「中鎖トリグリセリドまたは中鎖トリグリセリド油」は、6から12炭素を有する脂肪酸の天然または合成トリグリセリドを包含する。中鎖トリグリセリドは、式(I)：
【００４９】
【化１】
2014520112.tif 000003
［式中、各xは、独立して、4、6、8、または10である。］の化合物で表される。xが4の場合、前記鎖はC6脂肪酸という。xが6の場合、前記鎖はC8脂肪酸という。xが8の場合、前記鎖はC10脂肪酸という。xが10の場合、前記鎖はC12脂肪酸という。様々な具体例において、各xは同じ整数であるか；２つのxは同じ整数であて、１つのxは異なる整数であるか；または各xは異なる整数である。
【００５０】
当業者は、中鎖トリグリセリドの混合物は、中鎖トリグリセリドを調製するのに用いられるいかなるプロセス（例えば、分取、水素化）によっても生じることを理解するであろう。例えば、分取されたヤシ油から得られた中鎖トリグリセリドの全ては、実質的にC8および／またはC10脂肪酸を含む；しかしながら、C6および／またはC12脂肪酸を含有するいくらかの中鎖トリグリセリドが存在するであろう。
【００５１】
本発明のための好ましい中鎖トリグリセリドは、0から2重量%のC6脂肪酸、50から65重量%のC8脂肪酸、30から45重量%のC10脂肪酸、および0から2重量%のC12脂肪酸を含み、それは、MIGLYOLR 812として市販されている。重量%は、トリグリセリドの総脂肪酸含量に基づく。
【００５２】
用語「リン脂質-ベースゲル」または「ゲル」は、ここで用いるとき、20-40%のリン脂質を含む透明、半透明または不透明の半固体塊を包含し、「許容可能注射性基準」に合致する。ある好ましい具体例において、ゲルはチクソトロピー性である（図１）。
【００５３】
ここで用いるとき、用語「pH緩衝剤」は、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、炭酸水素塩、ヒスチジン、TRISなどのような医薬上許容されるpH緩衝剤を包含する。
【００５４】
ここで用いるとき、用語「リン脂質」は、ある分類の脂質を包含し、全ての細胞膜の主成分であり、ジグリセリド、リン酸塩基および、コリンのような単純な有機分子を含有する。本発明のための好ましいリン脂質はホスファチジルコリンである。最も好ましいリン脂質は1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホクロリンすなわちPOPCである。
【００５５】
ここで用いるとき、用語「溶媒」は、皮下注射に適し、安全な非水性液体をいう。例えば、溶媒は、プロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、ポリエチレングリコール、またはそれらの混合物であり得る。好ましい溶媒はグリセロールまたはグリセリンである。
【００５６】
ここで用いるとき、用語「可溶化剤」は、主に、ポリソルベート80のような、界面活性剤を包含する。
【００５７】
ここで用いるとき、用語「安定化剤」は、（１）溶解性を減じることができるか、（２）放出速度を変化させるか、または（３）APIの安定性を増大する医薬上許容される化学物質を包含する。例えば、塩化亜鉛は、メトレレプチンと不溶性結晶を形成し、メトレレプチンがゆっくりと放出されるようにする。
【００５８】
ここで用いるとき、「糖」は、乾燥中、個別のサブミクロン油滴を維持することによって微細エマルジョンを保護する、安全かつ生体適合する炭化水素剤を包含する。本発明のために有用な糖は、単糖類、二糖類、多糖類、ポリオール、デキストリン、デンプン、セルロースおよびセルロース誘導体、またはそれらの混合物を包含する。例えば、ある具体例において糖は、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、ラクトース、フルクトース、キシロース、スクロース、トレハロース、マンノース、マルトース、デキストロース、デキストラン、またはそれらの組合である。ある具体例において、好ましい糖はスクロースである。
【００５９】
ここで用いるとき、用語「チクソトロピー性」は、正常状態下で濃密（粘稠）であるが、剪断されるか、振盪されるか、または押し出されたとき時間とともに希薄になるまたはあまり粘稠ではなくなる（図１）ゲルの特性をいう。チクソトロピー性ゲルは、安定な静止状態を示すが、押出力に付されたときより注射可能になって、良好な注射可能性を生じる。
ＩＩ．具体例
【００６０】
本発明は、チクソトロピー性ゲル組成物であって、
2から4重量%のメトレレプチン、
0.14から0.28重量%のプラムリンチド、
20から40重量%の１以上のリン脂質、
5から10重量%の中鎖トリグリセリド油、および
47から56重量%の水
を含み、ここに、30ニュートンを超えない負荷力により、2 cc／分の押出速度にて、1 ccシリンジから25G1／2インチ長の針を通して押出可能である、ゲル組成物を提供する。
【００６１】
本発明は、無水ゲル組成物であって、
2から4重量%のメトレレプチン、
0.14から0.28重量%のプラムリンチド、
20から40重量%の１以上のリン脂質、
15から30重量%の中鎖トリグリセリド油、および
25から35重量%のグリセリン
を含み、ここに、90ニュートンを超えない負荷力により、2 cc／分の押出速度にて、1 ccシリンジから25G1／2インチ長の針を通して押出可能である、ゲル組成物を提供する。
【００６２】
本発明は、ゲル組成物であって、
2から4重量%のメトレレプチン、
0.14から0.28重量%のプラムリンチド、
20から40重量%の１以上のリン脂質、
5から10重量%の中鎖トリグリセリド油、および
25から35重量%のグリセリン
を含み、ここに、90ニュートンを超えない負荷力により、2 cc／分の押出速度にて、1 ccシリンジから25G1／2インチ長の針を通して押出可能である、ゲル組成物も提供する。
【００６３】
本発明の実施によれば、デポ組成物中のリン脂質の選択は、（１）水中油エマルジョンを形成し、製造法の間中および貯蔵後、小滴サイズを維持し、（２）薬理学的活性剤に化学的に適合し、ならびに（３）前記薬理学的活性剤に所望のデポまたは持続性放出特性を付与するリン脂質の能力によって決定される。リン脂質のある組合せを用いて、POPCおよびDMPG Naのようなデポを形成できる。デポ組成物に対する任意のリン脂質またはリン脂質コンビネーションは、当業者に公知の物理的および化学的スクリーニング試験方法を用いて選択できる。
【００６４】
もうひとつの具体例において、本発明のゲル組成物は、20-40重量%、22から35重量%、およびより好ましくは、24から30重量%のリン脂質、例えば、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39または40重量%のリン脂質、またはリン脂質の混合物を含む。
【００６５】
ひとつの具体例において、本発明のゲル組成物は10-60重量%の水を含む。
【００６６】
なおもうひとつの具体例において、本発明のゲル組成物は、中鎖トリグリセリド油を含む。中鎖トリグリセリド油の好ましい濃度は5から30%である。代表的な中鎖トリグリセリド油はMIGLYOLR 812である。
【００６７】
好ましい具体例において、糖を本発明のゲル組成物に使用できる。好ましい糖は、スクロースである。スクロースの好ましい濃度は、ゲル重量の0.5から20%、好ましくは、1から15%およびより好ましくは、2から10%、例えば2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%または10%である。
【００６８】
ひとつの具体例において、本発明は、プラムリンチドを含み、許容可能注射性基準を満たし、かつ、皮下注射後、持続性放出プロファイルでプラムリンチドを送達できるゲル組成物を提供する。
【００６９】
ひとつの具体例において、本発明は、メトレレプチンおよびプラムリンチドを含み、許容可能注射性基準を満たし、かつ、皮下注射後、持続性放出プロファイルでメトレレプチンおよびプラムリンチドを送達できるゲル組成物を提供する。
【００７０】
ひとつの具体例において、本発明は、感熱性のメトレレプチンおよびプラムリンチドに適合するゲル組成物を調製し、および、0.2ミクロン孔膜を通すエマルジョン中間体のろ過滅菌を許容し、かくして、加熱または放射を用いる防腐プロセスまたは最終滅菌の必要を除外する方法を提供する。
【００７１】
もうひとつの具体例において、本発明は、損傷を与える量の有機溶媒を使用せず、ゲル組成物のようなゲルを調製する方法を提供する。
【００７２】
ある具体例において、本発明のゲル組成物は、酸性化剤、アルカリ性化剤、pH緩衝剤、金属イオンキレート剤、抗酸化剤、安定化剤、保存剤、またはそれらの組合せのような機能的医薬賦形剤を含有することができる。ゲル組成物における機能的賦形剤の選択は、当業者に公知の安定性要求または他の医薬上考慮に基づいて行える。
【００７３】
ある具体例において、本発明のゲル組成物は、ラットにおいて、20 mg/kgのメトレレプチンおよび1.44 mg/kgのプラムリンチドの皮下注射の24時間後、メトレレプチンにつき1 ng/mLを超える、プラムリンチドについて10 pg/mLを超える血漿濃度を維持する。
【００７４】
ひとつの具体例において、本発明は、驚くべきことに、許容可能注射性基準を満たすか、それよりも少ない射出力しか要求しないある種のゲル組成物を提供する。
【００７５】
もうひとつの好ましい具体例において、本発明は、注射可能、安定かつ滅菌形態で、少なくとも24時間の延長されたメトレレプチンおよびプラムリンチドについての独特の放出プロファイルを与えるゲル組成物に関する。そのような放出プロファイルは、メトレレプチンおよびプラムリンチドについて非常に望ましく、短い半減期を有し、循環器において、延長された時間、それらが有効濃度レベルに維持されることを可能とする。
【００７６】
好ましい具体例において、前記ゲル組成物は、１日１回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、７日に１回、１０日に１回、１４日に１回、または３０日に１回投与される。
ＩＩＩ．作成方法
【００７７】
驚くべきことに、本発明の調製方法によるゲルは、微細針を通して容易に注射可能である。いくつかのフォーマットにおいて、ゲルは、外観上、部分的に半透明であり、絹のような手触りである。好ましい具体例において、ゲルはチクソトロピー性であり、それは、微細針を通す良好な注射可能性の所望する特性である。
【００７８】
ひとつの具体例において、本発明は、ゲル組成物の調製方法であって、
ａ）プラムリンチド、プラムリンチドアナログ、メトレレプチン、およびメトレレプチンアナログ (API)から選択される少なくともひとつの活性医薬成分を包含する全成分を合わせること；
ｂ）過剰量の水（最終組成物に必要な量を超える）を添加すること；
ｃ）混合して、一次エマルジョンを形成すること；
ｄ）pHを目標pHに調節すること；
ｅ）前記一次エマルジョンを均質化して、直径200 nm未満の平均滴径を持つ微細エマルジョンを形成すること；
ｆ）前記微細エマルジョンを0.2-ミクロンフィルターを通過させること；および
ｇ）前記過剰水を除去して、最終ゲル組成物を得ること
を含む、調製方法を提供する。
【００７９】
ある具体例において、本発明は、チクソトロピー性ゲル組成物の調製方法であって、
ａ）全ての不活性成分（すなわち、APIなし）を合わせること；
ｂ）過剰量の水（最終組成物に必要な量を超える）を添加すること；
ｃ）混合して、一次エマルジョンを形成すること；
ｄ）pHを目標pHに調節すること；
ｅ）前記一次エマルジョンを均質化して、直径200 nm未満の平均滴径を持つ微細エマルジョンを形成すること；
ｆ）前記微細エマルジョンを0.2-ミクロンフィルターに通すこと；
ｇ）少なくともひとつのAPIを添加し、よく混合すること；および
ｈ）前記過剰水を除去して、最終ゲル組成物を得ること
を含む、調製方法を提供する。
【００８０】
好ましい具体例において、高シェアー、高エネルギーまたは高圧ホモゲナイザー（Microfluidics International Corporationのマイクロフルダイザーのような）を用いて、前記一次エマルジョンを200 nm未満、好ましくは100 nm未満および最も好ましくは、50 nm未満の平均直径を持つ微細エマルジョンに転換する。滴の縮小は、0.2-ミクロンフィルターに通す微細エマルジョンのろ過を可能にし、粘度を大きく低下させ、かつ、最終ゲルの注射可能性を増大する。
【００８１】
滴サイズを約50 nmにするためのマイクロフルダイザーでの均質化の後、得られた微細エマルジョンは、顕著に粘度が低下した清澄、ほぼ透明、かつ水様液体である。過剰水を除去した後、最終ゲルは許容可能注射性基準を満たす。微細エマルジョンも0.2-ミクロンフィルター膜を通してろ過することができ、非経口投与前にゲル製剤の滅菌が可能となる。対照的に、この均質化ステップをしない同一のリン脂質-含有組成物は、同じ膜を通してろ過できない。
【００８２】
エマルジョンは熱動力学的に不安定な系である。もし、適切に保持しなければ、そのエマルジョン滴は、凝集し、合体し、サイズが大きくなり、ついには、水相から油相分離（すなわち、クリームアウト [creaming out]）が生じる。これが生じると、微細エマルジョンにより提供される低下した粘度の利益が失われる。驚くべきことに、本発明の実施によれば、ある種の糖の添加が、水除去プロセス中、滴の凝集に対する微細エマルジョンの予期せぬ保護効果を与える。微細エマルジョン中の糖の存在は、かくして、ここに開示する条件下、水除去ステップの間、滴を本質的に変化させないで保つ。対照的に、糖のない組成物はより注射可能性が低い傾向にある。
【００８３】
ある局面において、本発明のゲルは、水に混合する際、微細エマルジョンを再形成でき、ゲルが別個のナノメーターサイズの滴を含むことを示唆する。
【００８４】
本発明の理論や機構に拘泥するつもりはないが、本発明のゲルにより付与される優れた注射可能性は、均質化により作られた極小滴によるものと思われる。本発明者は、微細エマルジョンから水を除去することによって、ナノメーターサイズの滴がくっつき合って、ある種の組織化された構造状の多くの小さな、油で満たされた変形可能な「バルーン」を形成し、間隙の水とくっつき合うと推測する。水が除去されると、間隙は最小化され、前記バルーンは変形されて互いに圧縮して、より剛直な構造、すなわちゲルを形成するが、互いに融合するのではなく、バルーンはゲル相内で別々に残る。外力が印加されると（例えば、シリンジプランジャーから）、ゲルは簡単に変形し、非常に小さくまた別々の滴であることから、針穴に適合し、かくして、優れた注射可能性を可能にする。図４は、水の除去による、微細エマルジョン（左）から本発明のゲル（右）への推測される転換の概略図である。暗点は、微細エマルジョン中のナノサイズの滴を描写し、ドット間の間隔は、糖入りの水で満たされている。水または溶媒が除去されると、滴は、構造的にゲルに組織化される。
【００８５】
もうひとつの具体例において、微細エマルジョンのろ過は、真空ろ過方法、遠心ろ過、または加圧ろ過方法を用いて行うことができる。様々なモデルや作りの0.2-ミクロン孔フィルター膜が利用可能である。例として、サルトポア [Sartopore]、サルトブランＰ [Sartobran P]、ミリポア [Millipore]などが包含される。いくつかの場合、大孔サイズのプレ-フィルターを用いることができる。ろ過ステップの主たる理由は、製剤の滅菌である。
【００８６】
なおもうひとつの具体例において、微細エマルジョンからの水の除去は、様々な乾燥方法によって、例えば、回転真空乾燥法または空気または窒素ガスでナノ分散体に吹き付けること（「風乾」）によって、行うことができる。回転真空乾燥は、Rotavap (Buchi)のような市販の回転エバポレーターを用いて行うことができる。風乾は、機械的にナノ分散体を撹拌しつつ、その表面に空気または窒素ガスの流を吹き付けることによって達成する。空気または窒素ガスは、まず滅菌するために0.2-ミクロン孔フィルターを通してろ過することができる。組成物中のいずれかの成分が酸化され易いなら、窒素ガスが好ましい。
【００８７】
いくつかの具体例において、本発明のゲルをある体積まで、無菌状態でシリンジに充填し、そのシリンジに針を取り付けた後、注射に備える。予備充填されたシリンジフォーマットは、自己投与に便利である。好ましいシリンジサイズは1-10 mLであり、好ましい針サイズは25-29Gである。
【００８８】
ひとつの具体例において、本発明のゲルは、軟組織に注射（例えば、皮下または筋肉内注射）された後、溶液配合物中に与えられた同一用量のメトレレプチンおよびプラムリンチドと比較して、メトレレプチンおよびプラムリンチドの双方について、延長された血漿濃度対時間プロファイルで示されるように、イン・ビボで緩徐薬剤放出を示す（図２）。
【００８９】
ある局面において、本発明のゲルは、約100、200、500、1000、3000、および5000センチポイズ (cP)の粘度を有する。ある局面において、粘度は、室温にて、約5000、10,000、50,000、75,000、1 x 105、1 x 106、1 x 107、1 x 108または1 x 109 cPである。なお他の局面において、ゲルはチクソトロピー性である（図１）。
【００９０】
ある局面において、本発明のゲル配合物は、酸性ないし中性である。ある局面において、配合物は、pH 2とpH 8.5との間、好ましくは、pH 3とpH 6との間、またはより好ましくは、pH 4とpH 5との間のpHを有する。
【００９１】
これから、以下の非制限的実施例を参照して、本発明をより詳細に説明する。
【００９２】
実施例１ - メトレレプチンおよびプラムリンチドを含有するゲル(F-207)の調製
【００９３】
【表１】
2014520112.tif 000004
*これらの成分は、使用するメトレレプチン母液から配合物へ送られる。
【００９４】
手順
F-207ゲルは以下のように調製した：
１．WFI以外の全ての成分を容器に図り取る。
２．バッチサイズ重量の3.67倍のWFIを添加する。
３．高シェアーミキサーを用いてよく混合して、一次エマルジョンを得る。
４．マイクロフルダイザー (Microfluidics International Corp Model M-110EH)を用いて、前記一次エマルジョンを均質化して、その平均滴サイズを直径で100 nm未満に縮小することによって、微細エマルジョンを得る。
５．HCl/NaOHで、pHを4.6 +/- 0.1に調整する。
６．バイオセイフティーフード内で前記微細エマルジョンを0.2-ミクロン使い捨て真空フィルター (Nalgene)を通してろ過して、そのエマルジョンを滅菌する。
７．水分量がゲル中で最終水分量（すなわち48.19%）になるまで、撹拌しつつ0.2μｍ−ろ過された窒素ガスNFをエマルジョン内に吹き込むことによって、水を無菌で除去する。
８．前記ゲルを無菌でよく混合して、均質化する。
９．ゲルを無菌で遠心して、気泡を除去する。
１０．0.2-0.4 mLゲルを各滅菌シリンジ（例えば、BD 1 mLシリンジルアーロックチップ）に無菌で充填する。
１１．前記シリンジをルアーロックキャップ (Qosina Non-vented FLL Cap w/Internal Pin, P/N 17542)で、無菌で密封する。
１２．前記シリンジを2−8 ℃にて貯蔵する。
【００９５】
F-207はなめらかで不透明なゲルであった。メトレレプチンおよびプラムリンチド濃度は、RP-HPLC分析によって確認した。
F-207の注射可能性は許容可能注射性基準に対して決定された。注射可能性試験の間に要求される最大力は、注射可能性に最も関連する測定パラメータとして記録する。注射可能性試験のため、0.5 mL F-207を１／２”長25G針（EXEL, 皮下針, ref. 26403）が取り付けられた1cc B-Dシリンジ（B-D ルアーロックチップ, ref 309628）に充填した。充填シリンジをプランジャー末端に対抗してフォースメータ (Advanced Precision Instructment Model HP-500)が取り付けられたシリンジポンプに搭載して、シリンジ内容物を押し出すために付加される力を測定する。シリンジポンプを2 cc/分速度および0.4 mL押出体積に設定した。力はニュートンで記録した。「プッシュ」モードにおいて、力は負として記録される。約12ニュートン（２試験の平均）の最大射出力で、F-207は、高度に注射可能であるとみなされ、許容可能注射性基準に合致する。
【００９６】
実施例２ - メトレレプチンおよびプラムリンチドを含有するゲル (F-209)の調製
F-209は、以下の組成で実施例１に記載されたものと同一の方法を用いて調製した。F-209には、新ロットのメトレレプチンを用いた。その新ロットは、スクロース、グリシンまたはポリソルベートを含有しない新母液に供給された。
【００９７】
【表２】
2014520112.tif 000005
【００９８】
F-209はなめらかで不透明なゲルであった。メトレレプチンおよびプラムリンチド濃度は、RP-HPLC分析によって確認した。実施例１に記載されたものと同一の注射可能性試験方法を用いると、F-209は8.1ニュートン（２試験の平均）の最大射出力を有していた。したがって、F-209は高度に注射可能であるとみなされ、許容可能注射性基準に合致する。
【００９９】
実施例３ -より高濃度のメトレレプチンおよびプラムリンチドを含有するゲル (F-210)の調製
F-210は、以下の組成で実施例１に記載されたものと同一の方法を用いて調製した。F-210は30% POPCも含有するが、実施例１組成物と比較して、2X メトレレプチンおよびプラムリンチドを含有する。
【０１００】
【表３】
2014520112.tif 000006
【０１０１】
F-210はなめらかで不透明なゲルであった。メトレレプチンおよびプラムリンチド濃度は、RP-HPLC分析によって確認した。実施例１に記載されたものと同一の注射可能性試験方法を用いると、F-210は13.4ニュートン（２試験の平均）の最大射出力を有していた。したがって、F-210は高度に注射可能であるとみなされ、許容可能注射性基準に合致する。
【０１０２】
実施例４ - メトレレプチンおよびプラムリンチドを含有するゲル (F-211)の調製
F-211は、以下の組成で実施例１に記載されたものと同一の方法を用いて調製した。F-211もF-210と同一の濃度のメトレレプチンおよびプラムリンチドを含有するが、POPC (24%)が少ない。
【０１０３】
【表４】
2014520112.tif 000007
【０１０４】
F-211はなめらかで不透明なゲルであった。メトレレプチンおよびプラムリンチド濃度は、RP-HPLC分析によって確認した。実施例１に記載されたものと同一の注射可能性試験方法を用いると、F-211は8.6ニュートン（２試験の平均）の最大射出力を有していた。したがって、F-211は高度に注射可能であるとみなされ、許容可能注射性基準に合致する。
【０１０５】
実施例５ -メトレレプチンおよびプラムリンチドと共にZnCl2を含有するゲル (F-216)の調製
F-216は、F-210と同一の濃度のメトレレプチンおよびプラムリンチドを含有するが、POPC (28%)が少ない。さらに、製剤を滅菌するために塩化亜鉛を添加した。
【０１０６】
【表５】
2014520112.tif 000008
【０１０７】
F-216は以下のように調製した：
（１）グルタミン酸ナトリウムを含有するメトレレプチン母液にプラムリンチドを溶解する。
（２）その溶液を0.2μｍ滅菌フィルターに通して滅菌する。
（３）ZnCl2をDI-水に溶かす。その溶液を0.2μｍ滅菌フィルターに通して滅菌する。
（４）前記ろ過されたメトレレプチンおよびプラムリンチド溶液をろ過されたZnCl2溶液とともに室温にて３０分間撹拌して無菌で混合する。
（５）実施例１に記載されたものと同一同様の方法を用いて、滅菌微細エマルジョンビヒクル（メトレレプチン、プラムリンチドおよびZnCl2なし）を調製する。
（６）微細エマルジョンビヒクルとステップ４で調製した混合物とを無菌で合わせる。
（７）水分量がゲル中で最終水分量（すなわち47.59%）になるまで、撹拌しつつ0.2μｍ−ろ過された窒素ガスNFをエマルジョン内に吹き込むことによって、水を無菌で除去する。
（８）前記ゲルを無菌でよく混合して、均質化する。
（９）ゲルを無菌で遠心して、気泡を除去する。
（１０）0.2-0.4 mLゲルを各滅菌シリンジ（例えば、BD 1 mLシリンジルアーロックチップ）に無菌で充填する。
（１１）前記シリンジをルアーロックキャップ (Qosina Non-vented FLL Cap w/Internal Pin, P/N 17542)で、無菌で密封する。
（１２）前記シリンジを2−8℃にて貯蔵する。
【０１０８】
F-216はなめらかで白色のゲルであった。メトレレプチンおよびプラムリンチド濃度は、RP-HPLC分析によって確認した。実施例１に記載されたものと同一の注射可能性試験方法を用いると、F-216は19.2ニュートン（２試験の平均）の最大射出力を有していた。したがって、F-216は高度に注射可能であるとみなされ、許容可能注射性基準に合致する。
【０１０９】
実施例６ -メトレレプチンおよびプラムリンチドと共にDMPG-Naを含有するゲル (F-217)の調製
F-217は、F-216と同一の濃度のメトレレプチンおよびプラムリンチドを含有するが、POPC (26%)が少ない。さらに、製剤を滅菌するためにDMPG-Naを添加した。実施例５に記載されたものと同一の方法を用いて、F-217を調製した。
【０１１０】
【表６】
2014520112.tif 000009
【０１１１】
F-217はなめらかで白色のゲルであった。メトレレプチンおよびプラムリンチド濃度は、RP-HPLC分析によって確認した。実施例１に記載されたものと同一の注射可能性試験方法を用いると、F-217は20.1ニュートン（２試験の平均）の最大射出力を有していた。したがって、F-217は高度に注射可能であるとみなされ、許容可能注射性基準に合致する。
【０１１２】
実施例７ -メトレレプチンおよびプラムリンチドを含有する無水ゲル (F-127)の調製
【０１１３】
【表７】
2014520112.tif 000010
*これらの成分は、使用するメトレレプチン母液から配合物へ送られる。
【０１１４】
手順
F-127ゲルは以下のように調製した：
１．必要量のPOPC、DMPG-Na、中鎖トリグリセリド、グリセリン、メトレレプチン母液、プラムリンチド、EDTA、L-メチオニンおよびベンジルアルコールを容器に図り取る。
２．バッチサイズ重量の4倍のWFIを添加する。
３．高シェアーミキサーを用いてよく混合して、一次エマルジョンを得る。
４．マイクロフルダイザー (Microfluidics International Corp Model M-110EH)を用いて、前記一次エマルジョンを均質化して、その平均油滴サイズを直径で100 nm未満に縮小することによって、微細エマルジョンを得る。
５．HCl/NaOHで、pHを4.6 +/- 0.1に調整する。
６．バイオセイフティーフード内で前記微細エマルジョンを0.2-ミクロン使い捨て真空フィルター (Nalgene)を通してろ過して、そのエマルジョンを滅菌する。
７．水分量が1%未満になるまで、ろ過されたエマルジョンを凍結乾燥することによって水を無菌で除去して、ペーストを得る。
８．必要な滅菌脱水アルコールおよび滅菌プロピレングリコールを前記ペーストに無菌で添加して、ゲルを得る。
９．前記ゲルを無菌でよく混合して、均質化する。
１０．ゲルを無菌で遠心して、気泡を除去する。
１１．ゲルを滅菌シリンジ（例えば、BD 1 mLシリンジルアーロックチップ）に無菌で充填する。
１２．前記シリンジをルアーロックキャップ (Qosina Non-vented FLL Cap w/Internal Pin, P/N 17542)で、無菌で密封する。
１３．前記シリンジを2−8℃にて貯蔵する。
【０１１５】
F-127は不透明ゲルであった。メトレレプチンおよびプラムリンチド濃度は、RP-HPLC分析によって確認した。実施例１に記載されたものと同一の注射可能性試験方法を用いると、F-127は78ニュートン（２試験の平均）の最大射出力を有していた。
【０１１６】
実施例８ -メトレレプチン、プラムリンチドおよびグリセリンを含有するゲル組成物(F-27)の調製
【０１１７】
【表８】
2014520112.tif 000011
*これらの成分は、使用するメトレレプチン母液から配合物へ送られる。
【０１１８】
F-27は、実施例７（WFIは、ステップ８で、脱水アルコールと共に添加された。）に記載されたものと同様の方法を用いて調製した。F-27はわずかに半透明なゲルであった。メトレレプチンおよびプラムリンチド濃度は、RP-HPLC分析によって確認した。実施例１に記載されたものと同一の注射可能性試験方法を用いると、F-27は71ニュートン（２試験の平均）の最大射出力を有していた。
【０１１９】
実施例９ -ラットにおける皮下注射後、F-27、F-127およびF-0207により送達された延長された薬物動態プロファイル
この実験は、それらの血液濃度対時間プロファイル、すなわち、薬物動態プロファイルを、メトレレプチンおよびプラムリンチドが同一用量で水溶液に溶解された参照配合物と比較することによって、ラットにおいてF-27（実施例８に記載される、グリセリンを含有するゲル）、F-127（実施例７に記載される、無水ゲル）およびF-207（実施例１に記載される）を評価するために実行された。ラットを処理群（各群に9匹）に分けた。各配合物をメトレレプチンについて20 mg/kgおよびプラムリンチドについて1.44 mg/kgの用量で、皮下投与した。血液サンプルは、投与前、投与後12、24、48、72、144、および192時間にて、外側尾静脈から採取した。血漿中のメトレレプチンおよびプラムリンチドの濃度は、免疫酵素アッセイ法によって測定した。３つの全てのゲル組成物は、同一用量が与えられた溶液配合物と比較して、メトレレプチンおよびプラムリンチドの双方につき延長した血漿-対-時間プロファイルを示した（図２）。
【０１２０】
ここで言及されるかまたは引用される、記事、特許、および特許出願、ならびに、その他全ての書類および電子的に利用可能な情報は、その全体が同じ程度にまで、あたかも、個別の刊行物が各々、詳しくおよび別個に出典明示して示されているかのように、出典明示して本明細書に含まれるとみなされる。出願人は、そのような記事、特許、特許出願その他の書類のいずれかから由来するいかなるかつ全ての資料および情報を本明細書に物理的に含ませる権利を保有する。
【０１２１】
ここに例示的に記載された本発明は、ここに特に記載されていない、いずれかの要素または複数の要素、限定または複数の限定がなくても、適切に実施することができる。かくして、例えば、用語「含む [comprising]」、「包含する [including]」、「含有する [containing]」などは、広く制限なく読まれるべきである。なお、ここで採用される用語および表現は、説明用の用語として用いられており、制限的ではなく、そのような用語および表現を、ここに示され、説明されている特徴やその部分の等価物を排除する使用を意図しないが、様々な修正が、特許請求される本発明の範囲内で可能であると認識される。かくして、本発明は、好ましい具体例や任意の特徴により特異的に開示されているが、いたるところに開示された本発明の具体例の修正および変形は、当業者により行うことができ、付随する特許請求の範囲により規定された本発明の範囲内であるとみなされる。
【０１２２】
本発明は、ここでは、広く、包括的に記載した。より狭義の種や、一般開示内に属するサブ属分類の各々も本発明の部分を形成する。これは、切り取られた要素がここに特別に言及されているか否かにかかわらず、その属からいずれかの主題を除くただし書きまたは否定的限定とともに本発明の一般説明を包含する。
【０１２３】
さらに、本発明の特徴や局面は、マーカッシュ群で記載され、当業者は、本発明もそれによって、前記マーカッシュ群のいずれかの個別メンバーまたはメンバーのサブ群で記載されると理解するであろう。他の具体例は特許請求の範囲に記載される。
【０１２４】
本願は、ASCIIフォーマットでEFS-Web経由で提出された配列表を含有し、それによって、出典明示して、その全体が本発明に含まれるとみなされる。２０１２年５月１８日に作成された当該ASCIIの写しは、2202USPRO.txtの名称で、サイズは、2,024バイトである。
【図１Ａ】
2014520112.tif 000012
【図１Ｂ】
2014520112.tif 000013
【図２Ａ】
2014520112.tif 000014
【図２Ｂ】
2014520112.tif 000015
【図２Ｃ】
2014520112.tif 000016
【図２Ｄ】
2014520112.tif 000017
【図２Ｅ】
2014520112.tif 000018
【図２Ｆ】
2014520112.tif 000019
【図３】
2014520112.tif 000020
【図４】
2014520112.tif 000021
【配列表】
2014520112000001.app
【国際調査報告】
2014520112.tif 000022
2014520112.tif 000023