(57)【要約】ジュート植物におけるリグニンのための生合成経路を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが開示される。本発明は、概して、植物リグニン生合成遺伝子、このような遺伝子によりコードされるポリペプチド、ならびに植物リグニン産生を制御するためのこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の使用の分野に関する。ジュートにより産生される繊維の品質および量に影響を及ぼすポリヌクレオチドおよびポリペプチドを使用する方法も開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２５、２６、２８、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４０、４２、４４、４５、４７、４９および５１からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する単離された核酸分子。
【請求項２】
前記核酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
前記核酸配列と少なくとも９８％の配列同一性を有する、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
前記核酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
前記核酸配列と１００％の配列同一性を有する、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３および１５からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３および１５からなる群から選択される、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３および１５からなる群から選択される、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３および１５からなる群から選択される、請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３および１５からなる群から選択される、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
配列番号１６、１８および２０からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
配列番号１６、１８および２０からなる群から選択される、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
配列番号１６、１８および２０からなる群から選択される、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項１４】
配列番号１６、１８および２０からなる群から選択される、請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項１５】
配列番号１６、１８および２０からなる群から選択される、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項１６】
配列番号２２、２４、２５、２６、２８および２９からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１７】
配列番号２２、２４、２５、２６、２８および２９からなる群から選択される、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項１８】
配列番号２２、２４、２５、２６、２８および２９からなる群から選択される、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項１９】
配列番号２２、２４、２５、２６、２８および２９からなる群から選択される、請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項２０】
配列番号２２、２４、２５、２６、２８および２９からなる群から選択される、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項２１】
配列番号３１からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項２２】
配列番号３１からなる群から選択される、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項２３】
配列番号３１からなる群から選択される、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項２４】
配列番号３１からなる群から選択される、請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項２５】
配列番号３１からなる群から選択される、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項２６】
配列番号３３からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項２７】
配列番号３３からなる群から選択される、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項２８】
配列番号３３からなる群から選択される、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項２９】
配列番号３３からなる群から選択される、請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項３０】
配列番号３３からなる群から選択される、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項３１】
配列番号３５、３７および３９からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３２】
配列番号３５、３７および３９からなる群から選択される、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項３３】
配列番号３５、３７および３９からなる群から選択される、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項３４】
配列番号３５、３７および３９からなる群から選択される、請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項３５】
配列番号３５、３７および３９からなる群から選択される、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項３６】
配列番号４０および４２からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３７】
配列番号４０および４２からなる群から選択される、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項３８】
配列番号４０および４２からなる群から選択される、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項３９】
配列番号４０および４２からなる群から選択される、請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項４０】
配列番号４０および４２からなる群から選択される、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項４１】
配列番号４４、４５および４７からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４２】
配列番号４４、４５および４７からなる群から選択される、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項４３】
配列番号４４、４５および４７からなる群から選択される、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項４４】
配列番号４４、４５および４７からなる群から選択される、請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項４５】
配列番号４４、４５および４７からなる群から選択される、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項４６】
配列番号４９からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４７】
配列番号４９からなる群から選択される、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項４８】
配列番号４９からなる群から選択される、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項４９】
配列番号４９からなる群から選択される、請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項５０】
配列番号４９からなる群から選択される、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項５１】
配列番号５１からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５２】
配列番号５１からなる群から選択される、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項５３】
配列番号５１からなる群から選択される、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項５４】
配列番号５１からなる群から選択される、請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項５５】
配列番号５１からなる群から選択される、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項５６】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１７、１９、２１、２３、２７、３０、３２、３４、３６、３８、４１、４３、４６、４８、５０および５２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する単離されたポリペプチド分子。
【請求項５７】
前記アミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項３１に記載の単離されたポリペプチド分子。
【請求項５８】
前記アミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性を有する、請求項３１に記載の単離されたポリペプチド分子。
【請求項５９】
前記アミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項３１に記載の単離されたポリペプチド分子。
【請求項６０】
前記アミノ酸配列と１００％の配列同一性を有する、請求項３１に記載の単離されたポリペプチド分子。
【請求項６１】
配列番号５３および配列番号５４；配列番号５５および配列番号５６；配列番号５７および配列番号５８；配列番号５９および配列番号６０；ならびに配列番号６１および配列番号６２からなる群から選択されるｃＤＮＡの増幅に有用な一対の順方向および逆方向プライマー。
【請求項６２】
請求項１に記載の単離された核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項６３】
請求項３１に記載のポリペプチド分子に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６４】
請求項３７に記載のベクターを含む形質移入植物細胞。
【請求項６５】
請求項３９に記載のトランスジェニック植物から得られる材料。
【請求項６６】
請求項３９に記載の形質移入植物の種子。
【請求項６７】
少なくとも１個の植物細胞を請求項３７に記載のベクターで形質移入するステップと；
前記少なくとも１個の植物細胞を植物に成長させるステップと
を含む、トランスジェニック植物を作製する方法。
【請求項６８】
ジュート植物に請求項１に記載の非天然核酸配列を組み込むステップを含む、ジュート植物の成長、繊維収率、繊維強度、耐病性または水利用を改善する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１１年４月２９日出願の米国仮特許出願第６１／４８０６６８号に基づく優先権の利益を請求するものである。
【０００２】
本発明は、ジュートリグニン生合成経路の種々の部分の同定および特徴づけに関する。より具体的には、本発明は、リグニン合成を担当する酵素をコードするジュート植物由来のポリヌクレオチド、ならびに所望のリグニン含量および他の特性を有する繊維を得るためのリグニン産生の遺伝子制御および操作のためにこれらのポリヌクレオチドおよび酵素を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
リグニンは、通常は多段階プロセスでフェニルアラニンから得られる、モノリグノール（ヒドロキシシンナミルアルコール）の複合芳香族ヘテロポリマーの総称である（Ｗｈｅｔｔｅｎ，Ｒ．およびＳｅｄｅｒｏｆｆ，Ｒ．、（１９９５）Ｌｉｇｎｉｎ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、７、１００１〜１０１３頁）。これらのポリマーは、主に細胞壁に堆積しているが、植物茎の必要な機械的強度、および最も重要なことには、植物の維管束組織の疎水性を確保している（Ｖａｎｈｏｌｍｅ，Ｒ．ら（２０１０）Ｌｉｇｎｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、１５３、８９５〜９０５頁）。その疎水性の性質のために、リグニンは、維管束組織の主要成分として役立ち、水の輸送において必須の役割を果たしている。その構造的および輸送指向的役割に加えて、リグニンは植物の防御システムの重要成分である（Ｇｏｕｊｏｎ，Ｔ．ら（２００３）Ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｉｇｎｉｎ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１、６７７〜６８７頁）。当然のことながら、環境条件が堆積リグニン量に影響を及ぼす（Ｂｏｅｒｊａｎ，Ｗ．ら（２００３）Ｌｉｇｎｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ、５４、５１９〜５４６頁）。例えば、リグニン生合成は、創傷、非生物的ストレスおよび病原体感染のような種々のストレス条件に応じて誘導される。リグニンは病原体の侵入を制限し、細胞壁多糖を微生物分解から保護する（Ｖａｎｈｏｌｍｅら、２０１０）。
【０００４】
リグニン生合成についての我々の現在の理解の大部分は、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）およびコットンウッド（Ｐ．ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）におけるこの経路の完全な理解に基づく（Ｇｏｕｊｏｎら、２００３；Ｓｈｉら（２０１０）Ｔｏｗａｒｄｓ  ａ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｌｉｇｎｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｎｏｌｉｇｎｏｌ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅｓ、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、５１、１４４〜１６３頁）。３種の基本的なモノリグノールモノマーが存在する：ｐ−クマリル、コニフェリルおよびシナピルアルコール。これらのモノリグノールは、３種のリグニン単位、または構成要素に組み込まれる：ｐ−ヒドロキシフェニル（Ｈ）、グアヤシル（Ｇ）およびシリンギル（Ｓ）。図１を参照されたい。これらのモノリグノールはメトキシ基の数が異なる。ｐ−ヒドロキシフェニル（Ｈ）はメトキシ基を有さず、グアヤシル（Ｇ）は１個のメトキシ基を有し、シリンギル（Ｓ）は２個のメトキシ基を有する（Ｇｏｕｊｏｎら、２００３）。しかしながら、これら３種のモノリグノールに加えて、ヒドロキシシンナミルアルデヒド、ヒドロキシシンナミルエステルおよびヒドロキシシンナミルアセテートなどの少数の他のフェニルプロパノイドも組み込まれ得る（Ｂｏｅｒｊａｎら、２００３）。
【０００５】
これらの基本的リグニン構成要素の生合成後、これらは木化ゾーンに輸送される。木化ゾーンでは、ペルオキシダーゼまたはラッカーゼによる酸化的フリーラジカルカップリングにより重合が起こり、セルロースとヘミセルロースの架橋結合により網目状構造が形成される（Ｂｏｅｒｊａｎら、２００３；Ｖａｎｈｏｌｍｅ，Ｒ．ら（２００８）Ｌｉｇｎｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ、１１、２７８〜２８５頁）。多糖マトリックス形成が完了すると、木化が細胞壁の二次肥厚中の異なる段階に起こる。リグニン堆積は、多糖マトリックスの性質により影響を受ける。一次細胞壁では、これは球状構造として見られる一方で、二次細胞壁ではこれはラメラを形成する（Ｂｏｅｒｊａｎら、２００３）。
【０００６】
植物の生命におけるリグニンの不可欠な役割にもかかわらず、リグニンはパルプおよび生物燃料産業における植物材料の費用対効果の高い／効率的使用における主要な制限因子である。リグニンはまた、繊維、化学物質およびエネルギー生産のためのバイオマスの使用を制限する。リグニンの除去は非常に高価なプロセスであり、これらの産業は少ないリグニン、または分解が容易なリグニンを含むバイオマスの利用から利益を得るだろう。この数十年で、そのプロセスの部分は完全には理解されていないが、リグニン生合成経路のいくらかの理解が得られてきた。
【０００７】
ジュート植物の全体的福祉に対するリグニン合成の重要性ならびに繊維品質のいくつかの側面へのその影響にもかかわらず、現時点では、ジュートのリグニン生合成を詳述する入手可能な情報は存在しない。そのため、リグニンの生合成に関与するジュート植物の遺伝子および酵素を同定、単離および利用する必要がある。本発明はこの必要性に対処する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２５、２６、２８、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４０、４２、４４、４５、４７、４９および５１からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する単離された核酸分子である。
【０００９】
一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３および１５からなる群から選択される。
【００１０】
一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号１６、１８および２０からなる群から選択される。
【００１１】
一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号２２、２４、２５、２６、２８および２９からなる群から選択される。
【００１２】
一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号３１からなる群から選択される。
【００１３】
一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号３３からなる群から選択される。
【００１４】
一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号３５、３７および３９からなる群から選択される。
【００１５】
一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号４０および４２からなる群から選択される。
【００１６】
一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号４４、４５および４７からなる群から選択される。
【００１７】
一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号４９からなる群から選択される。
【００１８】
一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号５１からなる群から選択される。
【００１９】
本発明の一態様は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１７、１９、２１、２３、２７、３０、３２、３４、３６、３８、４１、４３、４６、４８、５０および５２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する単離されたポリペプチド分子である。
【００２０】
一実施形態では、配列番号５３および配列番号５４；配列番号５５および配列番号５６；配列番号５７および配列番号５８；配列番号５９および配列番号６０；ならびに配列番号６１および配列番号６２からなる群から選択されるｃＤＮＡの増幅に有用な一対の順方向および逆方向プライマー。
【００２１】
特定の実施形態では、本発明は、配列番号により同定される配列のいずれかと少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する、上記ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のいずれか１つに関する。
【００２２】
本発明の一態様は、本発明の単離された核酸分子を含む発現ベクターである。
【００２３】
本発明の一態様は、本発明のポリペプチド分子に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【００２４】
本発明の一態様は、本発明のベクターに形質移入された形質移入植物細胞である。
【００２５】
本発明の一態様は、本発明のトランスジェニック植物から得られる材料である。
【００２６】
本発明の一態様は、本発明のベクターに形質移入された植物の種子である。
【００２７】
本発明の一態様は、少なくとも１個の植物細胞を本発明のベクターで形質移入するステップと、少なくとも１個の植物細胞を植物に成長させるステップとを含む、トランスジェニック植物を作製する方法である。
【００２８】
本発明の一態様は、ジュート植物に本発明の非天然核酸配列を組み込むステップを含む、ジュート植物の成長、繊維収率、繊維強度、耐病性または水利用を改善する方法である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ジュートの提案されたモノリグノール生合成経路を示す図である。
【図２ａ】植物ＣＡＤタンパク質配列についてのＣｏｌＣＡＤ１、ＣｏｌＣＡＤ２、ＣｏｌＣＡＤ３、ＣｏｌＣＡＤ４、ＣｏｌＣＡＤ５、ＣｏｌＣＡＤ６およびＣｏｌＣＡＤ７のタンパク質配列アラインメントを示す図である。
【図２ｂ】植物ＣＡＤタンパク質配列についてのＣｏｌＣＡＤ１、ＣｏｌＣＡＤ２、ＣｏｌＣＡＤ３、ＣｏｌＣＡＤ４、ＣｏｌＣＡＤ５、ＣｏｌＣＡＤ６およびＣｏｌＣＡＤ７のタンパク質配列アラインメントを示す図である。
【図３】植物ＣＣｏＡＯＭＴタンパク質配列についてのＣｏｌＣＣｏＡＯＭＴ１、ＣｏｌＣＣｏＡＯＭＴ２およびＣｏｌＣＣｏＡＯＭＴ３のタンパク質配列アラインメントを示す図である。
【図４】植物４ＣＬタンパク質配列についてのＣｏｌ４ＣＬ１、Ｃｏｌ４ＣＬ４およびＣｏｌ４ＣＬ６のタンパク質配列アラインメントを示す図である。
【図５】植物６ＨＣＴタンパク質配列についてのＣｏｌ６ＨＣＴ１のタンパク質配列アラインメントを示す図である。
【図６】植物Ｃ３Ｈタンパク質配列についてのＣｏｌＣ３Ｈのタンパク質配列アラインメントを示す図である。
【図７】植物Ｃ４Ｈタンパク質配列についてのＣｏｌＣ４Ｈ１およびＣｏｌＣ４Ｈ２のタンパク質配列アラインメントを示す図である。
【図８】植物ＰＡＬタンパク質配列についてのＣｏｌＰＡＬ１およびＣｏｌＰＡＬ２のタンパク質配列アラインメントを示す図である。
【図９】植物ＣＣＲタンパク質配列についてのＣｏｌＣＣＲ２のタンパク質配列アラインメントを示す図である。
【図１０】植物ＣＣＲタンパク質配列についてのＣｏｌＣＣＲ３のタンパク質配列アラインメントを示す図である。
【図１１】植物Ｆ５Ｈタンパク質配列についてのＣｏｌＦ５Ｈのタンパク質配列アラインメントを示す図である。
【図１２】植物ＣＯＭＴタンパク質配列についてのＣｏｌＣＯＭＴのタンパク質配列アラインメントを示す図である。
【図１３】ＣｏｌＣＡＤ２のＤＮＡゲルを示す図である。
【図１４】ＣｏｌＣＣｏＡＯＭＴ１のＤＮＡゲルを示す図である。
【図１５】Ｃｏｌ４ＣＬ１のＤＮＡゲルを示す図である。
【図１６】ＣｏｌＣＣＲ３のＤＮＡゲルを示す図である。
【図１７】ＣｏｌＦ５ＨのＤＮＡゲルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
既知の酵素ファミリーがモノリグノール生合成に関連している（Ｇｏｕｊｏｎら、２００３）。このファミリーはＰＡＬ（フェニルアラニンアンモニアリアーゼ）、Ｃ４Ｈ（ケイヒ酸−４−ヒドロキシラーゼ）、４ＣＬ（４−クマル酸：ＣｏＡリガーゼ）、ＨＣＴ（ｐ−ヒドロキシシンナモイル−ＣｏＡ：シキミ酸／キナ酸ｐ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ）、Ｃ３Ｈ（４−クマル酸３−ヒドロキシラーゼ）、ＣＣｏＡＯＭＴ（カフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ）、ＣＣＲ（シンナモイル−ＣｏＡレダクターゼ）、Ｆ５Ｈ（フェルラ酸５−ヒドロキシラーゼ）、ＣＯＭＴ（コーヒー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ）およびＣＡＤ（シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ）である。ジュートにおけるモノリグノール生合成経路の提案された概略図を図１に示す。
【００３１】
ジュートのリグニン生合成経路は、一部はいくつかの多機能酵素の存在、およびいくつかの多様な遺伝子ファミリーに及ぶ構成酵素にその複雑さを負っている。フェニルプロパノイド経路の第１の酵素はＰＡＬ（フェニルアラニンアンモニアリアーゼ）であり、これはフェニルアラニンの脱アミノ化を引き起こし、ケイヒ酸を産生する。経路の第２の酵素、Ｃ４Ｈ（ケイヒ酸４−ヒドロキシラーゼ）は、ケイヒ酸を４−ヒドロキシケイヒ酸に転換し、経路が分岐するにつれてその後のヒドロキシル化およびメチル化ステップが続く。酵素４ＣＬはヒドロキシケイヒ酸のＣｏＡ連結を触媒し、リグニン生合成のための活性化フェノール前駆体を産生する（Ｈｕら（１９９９）Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇｎｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔｒｅｅｓ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１７、８０８〜８１２頁）。
【００３２】
モノリグノール経路における次の酵素（ＨＣＴ）は、Ｃ３Ｈの基質であるｐ−クマロイル−シキミ酸／キナ酸エステルの産生を触媒する。ＨＣＴは、ｐ−クマロイル−ＣｏＡのアシル基をシキミ酸またはキナ酸に移すことが示された（Ｈｏｆｆｍａｎら（２００５）Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、第１３９巻、第１号、５０〜５３頁）。Ｃ３およびＣ５のヒドロキシル化ステップは、２種のチトクロムＰ４５０酵素、４−クマル酸３−ヒドロキシラーゼ（Ｃ３Ｈ）およびフェルラ酸５−ヒドロキシラーゼ（Ｆ５Ｈ）によりそれぞれ行われる。メチル化ステップは、ＣＣｏＡＯＭＴ（カフェオイル−補酵素Ａ（ＣｏＡ）  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ）およびＣＯＭＴ（コーヒー酸−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ）により行われる。ＣＣｏＡＯＭＴは、カフェオイル−ＣｏＡをフェルロイル−ＣｏＡに、および５−ヒドロキシフェルロイル−ＣｏＡをシナポイル−ＣｏＡに転換する二機能性酵素であり、フェルロイル化多糖の合成において役割を果たす（Ｉｎｏｕｅら、１９９８）。ＣＣｏＡＯＭＴは、ヒャクニチソウ（Ｚｉｎｎｉａ  ｅｌｅｇａｎｓ）の差示的管状要素においてリグニン生合成に関与することが示された（Ｙｅ，Ｚ．Ｈ．およびＶａｒｎｅｒ  Ｊ．Ｅ．（１９９５）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ｉｎ  ｌｉｇｎｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｚｉｎｎｉａ  ｅｌｅｇａｎｓ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０８  ４５９〜４６７頁）。ＣＣｏＡＯＭＴは、植物細胞壁の強化に関与しており、また細胞壁結合フェルラ酸ポリマーの形成増加による創傷または病原体攻撃への応答にも関与している。
【００３３】
モノリグノール生合成経路に関与する追加の酵素はシンナモイル補酵素Ａレダクターゼ（ＣＣＲ）およびシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）である。ＣＣＲはヒドロキシシンナモイルＣｏＡエステルの還元を触媒してシンナムアルデヒドを産生する一方で、ＣＡＤはシンナミルアルコールへのその還元を触媒する（Ｇｏｕｊｏｎら、２００３）。
【００３４】
モノリグノール経路に関与する最後の酵素の１つはシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）であり、これはコニフェルアルデヒド、５−ヒドロキシ−コニフェルアルデヒドおよびシナプアルデヒドの対応するアルコールへのＮＡＤＰＨ依存性転換を触媒する（Ｋｉｍ，Ｓ．Ｊ．ら（２００４）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｃｉｎｎａｍｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１、１４５５〜６０頁）。シロイヌナズナ属では、ＣＡＤ遺伝子の単一変異体ＡｔＣＡＤ−ＣおよびＡｔＣＡＤ−Ｄがより低いＣＡＤ活性を有することが分かっており、２種の変異体を交配することにより得られる二重変異体は、茎リグニン含量が４０％減少したので、これらの遺伝子が茎リグニン合成に関与する主要ＣＡＤ遺伝子であることが示された（Ｓｉｂｏｕｔ，Ｒ．ら（２００５）Ｃｉｎｎａｍｙｌ  Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ−Ｃ  ａｎｄ  −Ｄ  ａｒｅ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｌｉｇｎｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｌｏｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１７、２０５９〜７６頁）。
【００３５】
２種の酵素がモノリグノール生合成経路に特異的である。これらはコーヒー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）およびシンナモイル補酵素Ａレダクターゼ（ＣＣＲ）である。ＣＯＭＴは被子植物で最初に同定された。ＣＯＭＴは、コーヒー酸をフェルラ酸に転換、ならびに５−ヒドロキシフェルラ酸をシナピン酸に転換することができる（Ｄｉｘｏｎ，Ｒ．Ａ．ら（２００１）Ｔｈｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｌｉｇｎｏｌｓ：ａ  ”ｍｅｔａｂｏｌｏｌｉｃ  ｇｒｉｄ”，  ｏｒ  ｉｎｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｔｏ  ｇｕａｉａｃｙｌ  ａｎｄ  ｓｙｒｉｎｇｙｌ  ｕｎｉｔｓ？  ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５７、１０６９〜１０８４頁）。トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）におけるＣＯＭＴ遺伝子の下方制御が、ＣＯＭＴ活性の有意な低下（７０〜８５％の低下）をもたらし、結果としてリグニン含量および組成の修正をもたらすことが示され、この酵素がリグニン合成の鍵となる酵素であることを示している。
【００３６】
ＣＯＭＴにより産生されるフェルラ酸は、チトクロムＰ４５０依存性モノオキシゲナーゼであるフェルラ酸５−ヒドロキシラーゼ（Ｆ５Ｈ）によりヒドロキシル化されて、５−ヒドロキシ−フェルラ酸を形成することができる。Ｆ５Ｈはまた、コニフェルアルデヒドおよびコニフェリルアルコールをそれぞれヒドロキシル化して５−ヒドロキシ−コニフェルアルデヒドおよび５−ヒドロキシ−コニフェリルアルコールを形成することができる（Ｍｅｙｅｒ，Ｋ．ら（１９９６）Ｆｅｒｕｌａｔｅ−５−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ａ  ｎｅｗ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、６８６９〜７４頁）。Ｆ５Ｈはシリンギルリグニン生合成における律速段階であると考えられており、提案はＦ５Ｈ発現が欠損したシロイヌナズナ属の変異体も長角果および種子におけるシナピン酸エステル蓄積レベルで影響を受けるという所見により支持される（Ｒｕｅｇｇｅｒ，Ｍ．ら（１９９９）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｌｕｒａｔｅ−５−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ｓｉｎａｐａｔｅ  ｅｓｔｅｒ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１１９、１０１〜１０頁）。
【００３７】
リグノール生合成に特異的に関与する第２の酵素、ＣＣＲは、フェルロイルＣｏＡおよび５−ヒドロキシ−フェルロイルＣｏＡのそれぞれコニフェルアルデヒドおよび５−ヒドロキシ−コニフェルアルデヒドへの転換を触媒する。このステップにより、Ｇ（コニフェルアルデヒド）およびＳ（５−ヒドロキシ−コニフェルアルデヒド）リグニン単位の生合成が直接もたらされる（Ｍａら、２００５）。タバコでは、アンチセンス構築物を使用したＣＣＲ遺伝子の下方制御により、異常発育および低成長ならびに異常な葉形態および崩壊した導管の植物が産生された。Ｇリグニン化合物のレベルも関連して低下した（Ｒａｌｐｈ，Ｊ．ら（１９９８）ＮＭＲ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｌｉｇｎｉｎｓ  ｅｘｔｒａｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｐｌａｎｔｓ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  ｌｉｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｃｉｎｎａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ａｎｄ  ｃｉｎｎａｍｏｙｌ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９５、１２８０３〜８頁）。
【００３８】
遺伝子および転写産物の計算的同定
驚くべきことに、本発明者らは、リグニン生合成に関与するジュート酵素の配列を決定した。リグニン生合成の経路が十分に特徴づけられ、各酵素は植物種の大半の遺伝子ファミリーによりコードされている。シロイヌナズナおよびコットンウッドの全１０６種の遺伝子配列をＮＣＢＩおよびコットンウッドゲノムデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ−ｐｓｆｚ．ｏｒｇ／Ｐｏｐｔｒ１＿１／）から検索した（Ｇｏｕｊｏｎら、２００３；Ｓｈｉら、２０１０）。ジュートモノリグノール生合成遺伝子は、１ｅ−２０のｅ−ｖａｌｕｅカットオフでプログラムＢＬＡＳＴＮを使用して、シマツナソ（Ｃｏｒｃｈｏｒｕｓ  ｏｌｉｔｏｒｉｕｓ）ゲノムアセンブリの遺伝子モデル、ならびにシマツナソおよびコウマ（Ｃ．ｃａｐｓｕｌａｒｉｓ）のトランスクリプトームデータから同定した（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９０）Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２１５、４０３〜４１０頁）。結果として生じるｇＤＮＡコンティグを、ソフトウェアＡＵＧＵＳＴＵＳを使用した遺伝子モデル予測に供した（Ｓｔａｎｋｅ，Ｍ．ら（２００４）ＡＵＧＵＳＴＵＳ：ａ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｆｉｎｄｉｎｇ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３２、Ｗ３０９〜Ｗ３１２）。シマツナソおよびコウマのトランスクリプトームデータからの遺伝子モデルおよびｉｓｏｔｉｇをさらなる確認のためにＮＣＢＩ  ｎｒ（非冗長性）データベースに対して検索した。シマツナソについては、ｉｓｏｔｉｇを、ＧＭＡＰ（９５％カットオフ値を使用）を使用して予測遺伝子モデルにマッピングした（Ｗｕ，Ｔ．Ｄ．およびＷａｔａｎａｂｅ，Ｃ．Ｋ．（２００５）ＧＭＡＰ：ａ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｍａｐｐｉｎｇ  ａｎｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｐｒｏｇａｒａｍ  ｆｏｒ  ｍＲＮＡ  ａｎｄ  ＥＳＴ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２１、１８５９〜１８７５頁）。
【００３９】
ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用した、ＮＣＢＩデータベースで入手可能な他のＣＡＤタンパク質を用いたＣｏｌＣＡＤ遺伝子によりコードされる推定タンパク質のアミノ酸配列アラインメントを図２ａおよび図２ｂに示す。以下は推定ＣｏｌＣＡＤタンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号）と配列比較したタンパク質のリストである：ＰｔｃＣＡＤＬ４（コットンウッドシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ様タンパク質、ＣＡＤＬ４、ｇｉ２２４１３８２２６）；ＲｃｏＣＡＤ（トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）アルコールデヒドロゲナーゼ、推定、ｇｉ２５５５８７０９）；ＦｒａＣＡＤ（イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ×ａｎａｎａｓｓａ）、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ、ｇｉ１３５０７２１０）（Ｃｈａｎｄｌｅｒら（２００２）Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ａ  ｃｉｎｎａｍｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ（Ｆｒａｇａｒｉａ×ａｎａｎａｓｓａ）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．、５３（３７５）、１７２３〜１７３４頁；ＧｈｉＣＡＤ５（ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓａｔｕｍ）、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ５、ｇｉ２６８５２８１２９）；ＰｔｃＣＡＤ（コットンウッド、ｇｉ１８３５８５１６５）（（２０１０）Ｔｏｗａｒｄｓ  ａ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｌｉｇｎｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｎｏｌｉｇｎｏｌ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅｓ、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、５１（１）、１４４〜１６３頁）；ＧｈｉＣＡＤ３（ワタ、ｇｉ２２９３６８４５０）（Ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ  ｐａｔｈｗａｙ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｃｏｔｔｏｎ  ｆｉｂｒｅ）；およびＧｈｉＣＡＤ（ワタ、ｇｉ１６６８６５１２４）（（２００９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｗａｌｌ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｈｅｎｏｌｉｃｓ  ｉｎ  ｃｏｔｔｏｎ  ｆｉｂｅｒｓ、Ｊ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ、５１（７）、６２６〜６３７頁）。
【００４０】
ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用した、ＮＣＢＩデータベースで入手可能な他のＣＣｏＡＯＭＴタンパク質を用いたＣｏｌＣＣｏＡＯＭＴ遺伝子によりコードされる推定タンパク質のアミノ酸配列アラインメントを図３に示す。以下は推定ＣｏｌＣＣｏＡＯＭＴタンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号）と配列比較したタンパク質のリストである：ＰｔｒＣＣｏＡＯＭＴ（ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）、ｇｉ３０２３４３６）；ＧｈｉＣＣｏＡＯＭＴ（ワタ、ｇｉ２２９３６８４６０）；およびＧｈｉＣＣｏＡＯＭＴ１（ワタ、ｇｉ２５３５０９５６７）。
【００４１】
ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用した、ＮＣＢＩデータベースで入手可能な他の４ＣＬタンパク質を用いたＣｏｌ４ＣＬ遺伝子によりコードされる推定タンパク質のアミノ酸配列アラインメントを図４に示す。以下は推定Ｃｏｌ４ＣＬタンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号）と配列比較したタンパク質のリストである：Ｃｃａｐ４ＣＬ１（インドアサ（Ｃｏｒｃｈｏｒｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｒｉｓ）、ｇｉ２９４５１４７１８）；Ｒｃｏ４ＣＬ（トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ、ｇｉ２５５５６５４１５）；およびＰｔｃ４ＣＬ（コットンウッド、ｇｉ２２４０７４４０１）。
【００４２】
ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用した、ＮＣＢＩデータベースで入手可能な他のＣｏｌ６ＨＣＴタンパク質を用いたＣｏｌ６ＨＣＴ遺伝子によりコードされる推定タンパク質のアミノ酸配列アラインメントを図５に示す。以下は推定Ｃｏｌ６ＨＣＴタンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号）と配列比較したタンパク質のリストである：ＣｙｃａｒＨＣＴ（カルドン（Ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ）、ｇｉ：７３６７１２３３）（（２００７）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃＤＮＡ  ｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ、ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．７、１４）；およびＰｔｃＨＣＴ（コットンウッド、ｇｉ１８３５８５１８１）。
【００４３】
ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用した、ＮＣＢＩデータベースで入手可能な他のＣ３Ｈタンパク質を用いたＣｏｌＣ３Ｈ遺伝子によりコードされる推定タンパク質のアミノ酸配列アラインメントを図６に示す。以下は推定ＣｏｌＣ３Ｈタンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号）と配列比較したタンパク質のリストである：ＥｇｌＣ３Ｈ（ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｌｏｂｕｌｕｓ）、ｇｉ：２９５４１３８２４ ）；ＰｔｃＣ３Ｈ（コットンウッド、ｇｉ：２２４１３９６６４）；およびＰａｌｘＰｇｒＣ３Ｈ（ギンドロ（Ｐｏｐｌｕｓ  ａｌｂａ）×Ｐｕｐｕｌｕｓ  Ｇｒａｎｄｉｄｅｎｔａｔａ、ｇｉ１６６２０９２９１）。
【００４４】
ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用した、ＮＣＢＩデータベースで入手可能な他のＣ４Ｈタンパク質を用いたＣｏｌＣ４Ｈ遺伝子によりコードされる推定タンパク質のアミノ酸配列アラインメントを図７に示す。以下は推定ＣｏｌＣ４Ｈタンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号）と配列比較したタンパク質のリストである：ＧａｒＣ４Ｈ（ワタ、ｇｉ９９６５８９７）およびＧａｒＣ４Ｈ（ワタ、ｇｉ９９６５８９９）。
【００４５】
ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用した、ＮＣＢＩデータベースで入手可能な他のＰＡＬタンパク質を用いたＣｏｌＰＡＬ遺伝子によりコードされる推定タンパク質のアミノ酸配列アラインメントを図８に示す。以下は推定ＣｏｌＰＡＬタンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号）と配列比較したタンパク質のリストである：ＪｃｏＰＡＬ（ナンヨウアブラギリ（Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ）、ｇｉ１１３２０３７５７）およびＰｔｒＰＡＬ（コットンウッド、ｇｉ：１８３５８５１９５）。
【００４６】
ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用した、ＮＣＢＩデータベースで入手可能な他のＣＣＲタンパク質を用いたＣｏｌＣＣＲ２遺伝子によりコードされる推定タンパク質のアミノ酸配列アラインメントを図９に示す。以下は推定ＣｏｌＣＣＲ２タンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号）と配列比較したタンパク質のリストである：ＡｔｈＣＣＲ（シロイヌナズナ、ｇｉ：１５２３７６７８）；ＣｏｆＣＣＲ（油茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｏｌｅｉｆｅｒａ）  ｇｉ２２８４８０４６４）；ＡｌｙＣＣＲ（ミヤマハタザオ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｌｙｒａｔａ）、ｇｉ：２９７７９３３８５）。
【００４７】
ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用した、ＮＣＢＩデータベースで入手可能な他のＣＣＲタンパク質を用いたＣｏｌＣＣＲ３遺伝子によりコードされる推定タンパク質のアミノ酸配列アラインメントを図１０に示す。以下は推定ＣｏｌＣＣＲ３タンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号）と配列比較したタンパク質のリストである：ＲｃｏＣＣＲ（トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ｇｉ：２５５５５６６８７）およびＡｔｈＣＣＲ（シロイヌナズナ、ｇｉ：１５２２６９５５）。
【００４８】
ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用した、ＮＣＢＩデータベースで入手可能な他のＦ５Ｈタンパク質を用いたＣｏｌＦ５Ｈ遺伝子によりコードされる推定タンパク質のアミノ酸配列アラインメントを図１１に示す。以下は推定ＣｏｌＦ５Ｈタンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号）と配列比較したタンパク質のリストである：ＥｇｌＦ５Ｈ（ユーカリ、ｇｉ：２５５９７０２９９）およびＰｔｃＦ５Ｈ（コットンウッド、ｇｉ：６６８８９３７）。
【００４９】
ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用した、ＮＣＢＩデータベースで入手可能な他のＣＯＭＴタンパク質を用いたＣｏｌＣＯＭＴ遺伝子によりコードされる推定タンパク質のアミノ酸配列アラインメントを図１２に示す。以下は推定ＣｏｌＣＯＭＴタンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号）と配列比較したタンパク質のリストである：ＧｈｉＣＯＭＴ（ワタ、ｇｉ：２５３５０９５６９）およびＥｃａＣＯＭＴ（カマルジュレンシスユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓ）、ｇｉ：２６２４７４８０６）。
【００５０】
プロモーター領域のモチーフ分析
予測遺伝子モデルの各々について、２０００ｂｐの上流領域の両鎖を抽出し、ＰｌａｎｔＣＡＲＥデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｐｓｂ．ｕｇｅｎｔ．ｂｅ／ｗｅｂｔｏｏｌｓ／ｐｌａｎｔｃａｒｅ／ｈｔｍｌ／）に対してシスモチーフ配列を検索した（Ｌｅｓｃｏｔ，Ｍ．ら（２００２）ＰｌａｎｔＣＡＲＥ、ａ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ａ  ｐｏｒｔａｌ  ｔｏ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｔｏｍｏｔｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３０、３２５〜３２７頁）。選択された配列のいずれかの部分が近くの遺伝子と重複していることが分かった場合、その上流領域の部分をさらなる分析から除外した。種々の発達プロセスおよびストレスへの応答に関与することが知られている
重要なモチーフのリストを編集した（表１）。
【表１】
2014513536.tif 000002
【００５１】
本発明のポリヌクレオチドを、シマツナソから回収したジュート植物組織を含むｃＤＮＡライブラリーのハイスループットシークエンシングにより単離した。本発明のポリヌクレオチドのいくつかは部分配列であり得る、すなわち、これらは全長ポリペプチドをコードする全長遺伝子を表さない。このような部分配列は、プライマーおよび／またはプローブを使用して種々のＤＮＡライブラリーを分析および配列決定すること、ならびに周知のハイブリダイゼーションおよび／またはＰＣＲ技術により拡張することができる。部分配列は、ポリペプチド、全長ポリヌクレオチド、ポリペプチドを発現することができる遺伝子またはゲノムの別の有用な部分をコードするオープンリーディングフレームが同定されるまで拡張することができる。
【００５２】
ゲノムＤＮＡおよび異種ＤＮＡの同定は、適当なライブラリーをスクリーニングするためのプローブとしてポリヌクレオチド配列の全部または一部を使用して、適当にストリンジェントな条件下で、標準的ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション技術により達成することができる。あるいは、既知のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはタンパク質配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＰＣＲ技術を使用してゲノムおよびｃＤＮＡ配列を増幅および同定することができる。
【００５３】
本発明のポリペプチドは、所望のポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、適当な宿主でポリペプチドを発現することにより産生することができる。当業者に既知の種々の発現ベクターのいずれかを使用することができるだろう。発現は、組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターを用いて形質転換または形質移入した任意の適当な宿主細胞で達成することができる。適当な宿主細胞としては、原核生物、酵母およびより高等な真核細胞が挙げられる。
【００５４】
ジュートから精製されるまたは組換え法により産生されるリグニン生合成経路を構成するポリペプチドを使用して、既知の方法にしたがって、本明細書に定義されるモノクローナル抗体、抗体断片または誘導体を産生することができる。本発明の生合成経路を構成するポリペプチドの断片を認識し、これに結合する抗体も、リグニン生合成経路を構成するポリペプチドに特異的である限り、熟慮される。
【００５５】
本発明の遺伝子構築物はまた、本発明の構築物を含む形質転換細胞の検出を可能にするための、植物細胞中で有効な選択マーカーを含んでもよい。このようなマーカーは、当技術分野で周知であるが、典型的には、１種または複数の毒素に対する耐性を与える、または蛍光顕微鏡下でその存在についての視覚的シグナルを作り出す。あるいは、形質転換細胞中の所望の構築物の存在は、サザンブロットおよびウエスタンブロットなどの、当技術分野で周知の他の技術を用いて決定することができる。本発明の遺伝子構築物は、少なくとも１個の複製系を有するベクター、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または酵母（出芽酵母（Ｓａｃｃａｒｏｍｔｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））に連結させることができ、それによって各操作後に、結果として生じる構築物をクローニングおよび配列決定することができる。
【００５６】
本発明の遺伝子構築物を使用して、単子葉（例えば、イネ）および双子葉（例えば、ジュート、アラビドプシス属）などの種々の植物を形質転換することができる。好ましい実施形態では、本発明の遺伝子構築物を使用してジュートを形質転換する。上記のように、本発明の遺伝子構築物を用いた植物の形質転換を使用して、植物中のリグニン含量を修正することができる。
【００５７】
遺伝子構築物を標的植物のゲノムに安定的に組み込むための技術は当技術分野で周知であり、これにはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）媒介導入、電気穿孔、分裂組織または生殖器官への注入、未熟胚への注入などが含まれる。技術の選択は、形質転換すべき標的植物／組織／宿主に依存するだろう。
【００５８】
「植物」という用語は、全植物、シュート栄養器官／構造（例えば、葉、茎および塊根）、根、花および花器／構造（例えば、苞葉、萼片、花弁、雄しべ、心皮、葯および胚珠）、種子（胚、胚乳および種皮を含む）および果実（成熟子房）、植物組織（例えば、維管束組織、基本組織など）および細胞（例えば、孔辺細胞、卵細胞、毛茸など）、およびこれらの子孫を含む。本発明の方法に使用することができる植物のクラスは、被子植物（単子葉および双子葉植物）、裸子植物、シダ、コケ植物および多細胞藻類を含む、一般的に形質転換技術を受け入れられる高等および下等植物のクラスと同様である。これには、異数体、倍数体、二倍体、半数体および半接合を含む種々の倍数性レベルの植物が含まれる。
【００５９】
いくつかのジュート酵素についての順方向および逆方向プライマーを使用したＰＣＲ反応のＤＮＡゲルを図１３〜１７に示す。図１３では、ＤＮＡゲルは、シマツナソのＣＡＤ２のものである。１レーンは鋳型としてｃＤＮＡを使用したＣＡＤ２のＰＣＲ産物である。順方向プライマーおよび逆方向プライマーはそれぞれ配列番号５３および５４である。２レーンは１Ｋｂ＋ラダーである。図１４では、ＤＮＡゲルは、シマツナソのＣＣｏＡＯＭＴ１のものである。１レーンは１Ｋｂ＋ラダーであり、２レーンは鋳型としてｃＤＮＡを使用したＣＣｏＡＯＭＴ１のＰＣＲ産物である。順方向プライマーおよび逆方向プライマーはそれぞれ配列番号５５および５６である。図１５では、ＤＮＡゲルはシマツナソの４ＣＬ１のものである。１レーンは１Ｋｂ＋ラダーであり、２レーンは鋳型としてｃＤＮＡを使用した４ＣＬ１のＰＣＲ産物である。順方向プライマーおよび逆方向プライマーはそれぞれ配列番号５７および５８である。図１６では、ＤＮＡゲルはシマツナソのＣＣＲ３のものである。１レーンは１Ｋｂ＋ラダーであり、２レーンは鋳型としてｃＤＮＡを使用したＣＣＲ３のＰＣＲ産物である。順方向プライマーおよび逆方向プライマーはそれぞれ配列番号５９および６０である。図１７では、ＤＮＡゲルはシマツナソのＦ５Ｈのものである。１レーンは１Ｋｂ＋ラダーであり、２レーンは鋳型としてｃＤＮＡを使用したＦ５ＨのＰＣＲ産物である。順方向プライマーおよび逆方向プライマーはそれぞれ配列番号６１および６２である。
【００６０】
定義
外来性または異種ＤＮＡが細胞の内部に導入された場合に、細胞はこのようなＤＮＡにより「形質転換」または「形質移入」されている。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノム中に組み込まれても（共有結合しても）組み込まれなくてもよい。例えば、原核生物、酵母および哺乳動物細胞では、形質転換ＤＮＡはプラスミドなどのエピソーム要素上に維持され得る。真核細胞に関しては、安定的形質転換細胞は、形質転換ＤＮＡが染色体に組み込まれて、結果としてこれが染色体複製を通して娘細胞に受け継がれるものである。本発明の実施は、多種多様な安定的形質転換植物細胞を熟慮する。
【００６１】
「発現カセット」とは、宿主細胞に導入されると、ＲＮＡの転写および／またはポリペプチドの翻訳をもたらす核酸構築物を指す。発現カセットは、ｍＲＮＡポリアデニル化シグナルを含む配列を含むまたは含まないプロモーター配列と、異種遺伝子配列の挿入を可能にするプロモーターの下流に位置する１つまたは複数の制限酵素部位とを含んでもよい。発現カセットは、異種タンパク質をコードする遺伝子が制限部位の１つへの挿入によりプロモーターに機能的に連結した場合に、異種タンパク質の発現を方向づけることを可能にする。組換え発現カセットは、異種タンパク質を含む発現カセットが宿主細胞に導入された場合に、宿主細胞における異種タンパク質の発現を可能にする。発現カセットは、発現のために使用すべき宿主細胞に応じて、種々の供給源から得ることができる。例えば、発現カセットは、ウイルス、細菌、昆虫、植物または哺乳動物供給源から得られる成分を含むことができる。（例えば、アンチセンス、またはセンス抑制による）導入遺伝子の発現と内在遺伝子の阻害の両方の場合には、挿入されるポリヌクレオチド配列は同一である必要はなく、それが得られた遺伝子の配列と「実質的に同一である」ことができる。好ましくは、組換え発現カセットは、感染の初期での発現を可能にする、および／またはこれは植物などの生物の実質的に全ての細胞での発現を可能にする。植物の形質転換に適した発現カセットの例は、その全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５８８０３３３号および第６００２０７２号；国際特許公開第ＷＯ／１９９０／００２１８９号および第ＷＯ／２０００／０２６３８８号ならびにＡｉｎｌｅｙおよびＫｅｙ（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１４、９４９〜９６７頁；ならびにＢｉｒｃｈ（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８、２９７〜３２６頁に見出すことができる。
【００６２】
「宿主細胞」という用語は、任意の生物の細胞を指す。好ましい宿主細胞は、植物、細菌、酵母、真菌、昆虫または他の動物から得られる。「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指す。「宿主細胞」という用語が特定の対象細胞だけでなくこのような細胞の子孫も指すことを意図されていることを理解すべきである。突然変異または環境の影響により特定の修正が後続世代で起こり得るために、このような子孫は、実際には、親細胞と同一ではないことがあり得るが、本明細書で使用する「宿主細胞」という用語の範囲内になお含まれる。ポリヌクレオチド配列を種々の型の宿主細胞に導入する方法は当技術分野で周知である。本発明の組換え発現カセットを用いて形質転換した宿主細胞または宿主細胞の子孫が提供される。宿主細胞は植物細胞であり得る。好ましくは、植物細胞はジュート細胞である。
【００６３】
「機能的に連結した」または「機能的に挿入された」という用語は、コード配列の発現に必要な制御配列が、コード配列の発現を可能にするためにコード配列に対して適当な位置で核酸分子中に位置することを意味する。この同じ定義は、時々、発現カセット中の他の転写制御エレメント（例えば、エンハンサー）の配置に準用される。転写および翻訳制御配列は、宿主細胞中のコード配列の発現をもたらすプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどのＤＮＡ制御配列である。
【００６４】
「プロモーター」、「プロモーター領域」または「プロモーター配列」という用語は、一般的に、遺伝子の転写制御領域を指し、これはコード領域の５’もしくは３’側、またはコード領域内、またはイントロン内に見出され得る。典型的には、プロモーターは、細胞内のＲＮＡポリメラーゼを結合し、下流（３’方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ制御領域である。典型的な５’プロモーター配列は、転写開始部位によりその３’末端で囲まれており、背景より上の検出可能なレベルでの転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含むよう上流（５’方向）に広がる。プロモーター配列内には、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングにより好都合に定義される）ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担当するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）がある。
【００６５】
「核酸構築物」または「ＤＮＡ構築物」という用語は、時々、細胞を形質転換するために、適当な制御配列に機能的に連結され、発現カセットに挿入されたコード配列（複数可）を指すために使用される。この用語は、「形質転換ＤＮＡ」または「導入遺伝子」という用語と互換的に使用され得る。このような核酸構築物は、選択マーカー遺伝子および／またはレポーター遺伝子と共に、目的の遺伝子産物のためのコード配列を含んでもよい。「選択マーカー遺伝子」という用語は、発現すると、抗生物質耐性などの選択可能な表現型を形質転換細胞に与える産物をコードする遺伝子を指す。「レポーター遺伝子」という用語は、直接的または間接的に、標準的方法により容易に検出可能な産物をコードする遺伝子を指す。
【００６６】
核酸構築物の「異種」領域は、自然ではより大きな分子と会合して見出されないより大きな分子内の核酸分子の同定可能なセグメント（複数可）である。異種領域が植物遺伝子をコードする場合、この遺伝子は通常、供給源生物のゲノム内の植物ゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡに隣接されるだろう。別の例では、異種領域は、コード配列自体が自然では見出されない構築物である（例えば、ゲノムコード配列がイントロンを含むｃＤＮＡ、または天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。対立遺伝子変異または自然発生突然変異イベントは、本明細書に定義されるＤＮＡの異種領域を生じない。「ＤＮＡ構築物」という用語はまた、異種領域、特に細胞の形質転換に使用するための一構築物を指すために使用される。
【００６７】
「ベクター」という用語は、それが連結した別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことを意図したものである。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、これは追加のＤＮＡセグメントを連結することができる円形二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別の型は、ウイルスベクターであり、ここでは追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができる。特定のベクターは、導入された宿主細胞中での自律複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクターは宿主細胞へ導入して宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、機能的に連結した遺伝子の発現を方向づけることができる。このようなベクターは、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と本明細書で呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターは、通常、プラスミドの形態である。本明細書においては、プラスミドが最も一般的に使用される形態のベクターであるので、「プラスミド」および「ベクター」が互換的に使用され得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などの他の形態の発現ベクターを含むことが意図されている。
【００６８】
「配列同一性のパーセント」は、比較窓にわたって２つの最適にアラインメントした配列を比較することにより決定され、ここでは２つの配列の最適アラインメントに関して、比較窓中のポリヌクレオチド配列の一部は、参照配列（付加も欠失も含まない）と比べて付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。パーセントは、同一核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列中に生じて一致した位置の数をもたらす位置の数を決定し、一致した位置の数を比較窓における位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセントを得ることにより計算される。
【００６９】
ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、本明細書に記載されるプログラム、好ましくは、記載される標準的パラメータを用いたＢＬＡＳＴを使用して決定される、参照配列と比べて少なくとも２５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。あるいは、パーセント同一性は、２５％〜１００％の任意の整数であり得る。より好ましい実施形態は、参照配列と比べて少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。これらの値を適当に調節して、コドン縮退、アミノ酸類似性、リーディングフレーム位置決めなどを考慮することにより、２つのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の対応する同一性を決定することができる。
【００７０】
アミノ酸配列（およびこれらのアミノ酸配列を有するポリペプチド）の「実質的同一性」という用語は、通常、本明細書に記載されるプログラム、好ましくは、記載される標準的パラメータを用いたＢＬＡＳＴを使用して決定される、参照配列と比べて少なくとも４０％の配列同一性を意味する。アミノ酸の好ましいパーセント同一性は、４０％〜１００％の任意の整数であり得る。より好ましい実施形態は、参照配列と比べて少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。「実質的に同一」であるポリペプチドは、同一でない残基位置が保存的アミノ酸変化によって異なり得ることを除いて、上記アミノ酸配列を共有する。保存的アミノ酸置換とは、類似側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群はセリンおよびスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群はフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群はリジン、アルギニンおよびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群はバリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、アスパラギン酸−グルタミン酸およびアスパラギン−グルタミンである。
【００７１】
参照による組み込み
本明細書で引用される、米国特許、米国公開特許出願、および米国を指定する公開ＰＣＴ出願の全ては、これにより参照により組み込まれる。
【００７２】
同等物
本発明のいくつかの実施形態が本明細書で記載および説明されてきたが、当業者であれば、本明細書に記載される機能を行うならびに／あるいは結果および／または利点の１つまたは複数を得るための種々の他の手段および／または構造を容易に認識するだろう。そしてこのような変形および／または修正の各々が本発明の範囲内にあるとみなされる。当業者であれば、日常的実験に過ぎないものを使用して、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態との多くの同等物を認識または確認することができるだろう。そのため、前記実施形態は単なる例として提示されていること、および添付の特許請求の範囲およびその同等物の範囲内で、本発明を具体的に記載および請求されているものとは別の方法で実施することができることを理解すべきである。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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