(57)【要約】  本発明は、血液試料などの液状生体試料の急速安定化法に関する。より詳細には、本方法は、マトリクスに吸収させた液状生体試料の加熱安定化に基づくものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
液状生体試料の安定化法であって、以下の工程：
（ａ）該液体の試料をマトリクスに含ませる工程；および
（ｂ）該マトリクスに含ませた該試料を急速に加熱する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、さらに以下の工程：
（ｃ）前記マトリクスに含ませた前記試料を乾燥させる工程
を含む、方法。
【請求項３】
前記液状生体試料は、血液、血漿、血清、唾液、尿、滑液および脳脊髄液、ならびに組織破砕物から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記液状生体試料は血液試料である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記マトリクスは、セルロース、セルロース系材料、ガラス繊維媒体、プラスチック重合体、混合重合体、ポリアミド、および金属から選択される材料で構成される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液試料などの液状生体試料の急速安定化法に関する。より詳細には、本方法は、マトリクスに吸収させた液状生体試料の加熱安定化に基づくものである。
【背景技術】
【０００２】
医薬品は、酵素的または非酵素的プロセスを通じて、身体から代謝、すなわち排除される。身体からの代謝／クリアランス速度は、薬物動態（ＰＫ）試験で測定される。
【０００３】
体内での医薬品の代謝は、ほとんどが肝臓で行われる（肝代謝）が、循環系（血液）および他の部位でも行われる。この代謝は、２つの局面に分けることができ、それぞれ関係する酵素に大きく依存する。
第一の局面：酸化、還元、加水分解、環化、および酸素の開環付加または水素除去。
第二の局面：メチル化、硫酸化、アセチル化、グルクロン酸抱合、およびグルタチオン抱合。
【０００４】
多くの医薬品が、活性化するために体内で化学的または酵素的処理を受ける必要があるプロドラッグとして製造されて投与される。世界で認可されている薬のうち約５〜７％が、プロドラッグに分類され得る。２００１年および２００２年に認可された新薬全体では、そのうち約１５％がプロドラッグであった。
【０００５】
プロドラッグは、ｉｎ  ｖｉｖｏで酵素的および／または化学的変換作用を受けて活性な元の薬を放出する、生体可逆的薬分子誘導体である。Ｉ型は、細胞内で活性化されるプロドラッグ、ＩＩ型は、細胞外、特に消化液または体循環中で活性化されるプロドラッグである。
【０００６】
Ｉ型プロドラッグは、血球の細胞内で活性化可能であり、ＩＩ型プロドラッグは、細胞外酵素により血液中で処理され得る。血液試料では、活性化を体外で行うことが可能である。
【０００７】
前臨床開発ならびに臨床開発中の医薬品（プロドラッグを含む）の代謝のＰＫ分析には、休薬および膨大な血液試料分析が含まれる。こうした血液試料は、適正に取り扱って採取後の代謝および分解を回避する必要がある。
【０００８】
乾燥血斑（ＤＢＳ）分析は、製薬業界において急速に拡大してきた。実験動物の減少ならびに生体試料の輸送および貯蔵にかかる費用にまつわる経済的および倫理的問題から、ＤＢＳ分析は魅力的な選択肢となった。
【０００９】
ＤＢＳには、血液試料を濾紙に付着させ、続いてその試料を乾燥させることが含まれる。試料の乾燥は、通常２時間かかる。
【００１０】
試料を濾紙に付着させてから乾燥に追加の時間をかけなければならないことは、ＤＢＳが応用可能な様式にとって深刻な制約となっている。試料が付着した濾紙は、重力の影響を少なくするために、水平な状態で乾燥させなければならず、このため、多数の試料を取り扱うときには広い空間が必要となる。十分に乾燥するまで、試料は湿っており、試料間での汚染ならびに周辺環境からの汚染を防ぐために注意して取り扱う必要がある（ＦＴＡ  ＤＭＰＫ  Ｃａｒｄｓ，  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ，  Ｗｈａｔｍａｎ，  Ｒｅｖ  ＡＢ  ４／２０１１）（非特許文献１）。乾燥時間は、周辺温度および湿度に大きく依存するものであり、再現性の低さは明らかである（Ｄｅｎｎｉｆｆ  ＆  Ｓｐｏｏｎｅｒ，  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ  （２０１０）  ２（１１），  １８１７−１８２２）（非特許文献２）。高い相対湿度および高温の条件に晒すと、ＤＢＳ試料の完全性が損なわれる恐れがある（Ｄｅｎｎｉｆｆ  ＆  Ｓｐｏｏｎｅｒ，  同上）。
【００１１】
乾燥中に、試料採取後の代謝および分解が起こる。試料採取後の代謝および分解を制限する目的で、様々な阻害剤および安定剤でコーティングした濾紙が利用される。しかし、コーティングした濾紙の使用は、試料分布が不均一になり例えばハロー効果（ｈａｌｏｅｆｆｅｃｔｓ）などをもたらすだけでなく、阻害剤および／または安定剤がその後の試料分析に干渉するなどのまた別の種類の望ましくない影響をもたらす（Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ  （２０１０）  ２（８），  １４６９−１４７５）（非特許文献３）。
【００１２】
濾紙上での血液試料の濾過による血球と血漿の分離も、乾燥期間中に起こる。乾燥中のこうした望ましくないプロセスにより、ＤＢＳ試料のその後の分析が不正確な結果になる恐れがある。
【００１３】
急速加熱による生体試料の安定化は、国際公開第２００７／０２４１８５号（特許文献１）に記載されている。しかしながら、この方法の使用は、ＤＢＳ試料に適用可能であるとは考えられてこなかった。むしろ、ＤＢＳ試料の取り扱いにおいては試料の加熱を避けることが推奨されており、加熱は、分析物の安定性を低下させる（ＤＢＳ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｔｉｐｓ，  Ｗｈａｔｍａｎ，１５  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１１）（非特許文献４）、または試料が分解する危険性がある（ＣＤＣ，  Ｍｏｄｕｌｅ  １４，  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｌｉｎｇ  −  Ｄｒｉｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｐｏｔｓ）（非特許文献５）と言われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２００７／０２４１８５号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】ＦＴＡ  ＤＭＰＫ  Ｃａｒｄｓ，  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ，  Ｗｈａｔｍａｎ，  Ｒｅｖ  ＡＢ  ４／２０１１
【非特許文献２】Ｄｅｎｎｉｆｆ  ＆  Ｓｐｏｏｎｅｒ，  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ  （２０１０）  ２（１１），  １８１７−１８２２
【非特許文献３】Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ  （２０１０）  ２（８），  １４６９−１４７５
【非特許文献４】ＤＢＳ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｔｉｐｓ，  Ｗｈａｔｍａｎ，１５  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１１
【非特許文献５】ＣＤＣ，  Ｍｏｄｕｌｅ  １４，  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｌｉｎｇ  −  Ｄｒｉｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｐｏｔｓ
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、液状生体試料の安定化法を提供する。本方法は、以下の工程を含む：
（ａ）液体の試料をマトリクスに含ませる工程；および
（ｂ）マトリクスに含ませた液体試料を急速に加熱する工程。
【００１７】
本方法は、さらに、試料を完全に乾燥させるのに十分な時間（少なくとも３０分、４０分、５０分、１時間、２時間、または３時間など）の間、マトリクスに含ませた液体試料を乾燥させる工程を含むことができる。
【００１８】
乾燥は、貯蔵および／または輸送中に、好ましくは、密閉容器に乾燥剤（シリカなど）と一緒に入れて、行うことができる。
【００１９】
液状生体試料は、血液、血漿、血清、唾液、尿、滑液および脳脊髄液、ならびに組織破砕物から選択することができる。
【００２０】
好ましくは、液状生体試料は、血液試料である。
【００２１】
試料の加熱は、１種以上の周知の形式の熱交換（熱伝導、熱対流、または熱放射）、例えばマイクロ波照射などにより行うことができる。
【００２２】
加熱は、好ましくは、熱伝導により行われる。
【００２３】
試料の加熱は、好ましくは、少なくとも８０℃、例えば少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、または少なくとも９５℃の温度、例えば１００℃にして行われる。
【００２４】
試料の加熱は、好ましくは、１００℃を超える温度では行われない。
【００２５】
「急速加熱」により、液状生体試料を加熱しないで乾燥させるのに必要な時間よりも短い時間内（好ましくは、６０分以内、３０分以内、１５分以内、１０分以内、５分以内、２分以内、または１分以内など）で試料の加熱が行われることを意味する。
【００２６】
加熱は、試料中のタンパク質および酵素を変性させるのに十分な長さの時間（少なくとも１秒間、例えば２秒間、５秒間、１０秒間、１５秒間、２０秒間、３０秒間、１分間、２分間、３分間、４分間、または少なくとも５分間など）行われる。
【００２７】
試料の急速加熱には、以下の複数の目的がある、
ｉ）試料を急速に安定させることで、汚染の危険性を最小限にする、
ｉｉ）試料を急速に安定させることで、取り扱いを簡単にし、直ちに貯蔵および／または輸送できるようにする、
ｉｉｉ）試料に含まれる物質および代謝産物の試料採取後の酵素分解および代謝を引き起こす可能性がある酵素を変性させる、
ｉｖ）試料の不均一化を引き起こすことおよび／またはその後の試料分析に干渉することが既知である阻害剤および／または安定剤でコーティングされたマトリクスを使う必要性がなくなること、
ｖ）マトリクスで細胞が濾過されることを減少または防ぐことにより、均一な試料を提供する、および／または
ｖｉ）物質および代謝産物がマトリクス内に拡散するのを防ぐことにより、均一な試料を提供する。
【００２８】
加熱しない場合、試料は完全に乾燥してはじめて安定化する。乾燥時間は周辺温度および湿度に依存するため、試料の乾燥時間は、支配的条件に相当依存して変化し、繰返し再現性の低下をもたらす。
【００２９】
試料を所定の時間で急速加熱することにより、試料採取後、所定の短時間で試料が安定化し、これにより繰返し再現性が高まるとともに、採取時期が異なる試料間および周辺状況が異なる試料間での再現性も高まる。
【００３０】
試料を急速加熱することにより、試料が安定化し、これによりその後の乾燥がそれほど重要ではなくなる。その後の乾燥は、貯蔵および／または輸送中に行ってもかまわなくなり、好ましくは、密閉容器に乾燥剤（シリカなど）と一緒に入れて行われる。
【００３１】
試料を急速加熱することにより、試料が安定化し、これにより、取り扱いが簡単になり、直ちに貯蔵および／または輸送できるようになる。
【００３２】
急速加熱は、実質的に均一な試料をもたらし、これにより、その後試料の一部分をパンチして分析するときの確度が高められる。
【００３３】
以下の実施例に示される結果から実証されるとおり、試料の急速加熱は、乾燥時間全体にはそれほど大きな影響を及ぼさないものの、試料の安定化をもたらし、その結果、試料に含まれる物質の試料採取後の酵素分解および代謝が減少するとともに、試料を直ちに貯蔵および／または輸送できるようになることによって、試料の取り扱いが簡単になる。
【００３４】
したがって、マトリクスに含ませた液体試料の急速加熱は、液体試料の取り扱いに関する既知の技法にまつわる数多くの問題（ＤＢＳ試料の取り扱いに関する現在の技法の問題点など）を解決する。
【００３５】
定義
「マトリクス」により多孔質材料を意味する。
【００３６】
マトリクスは、以下の材料から選択される材料でできたものが可能である；
・以下に例示するセルロース系材料、ただしそれらに限定されない
−ニトロセルロース
−硝酸セルロース
−酢酸セルロース
−以下のセルロース
・Ｗｈａｔｍａｎ  ＦＴＡ  −  ＤＭＰＫ−Ａ、Ｂ、およびＣカード
・Ｗｈａｔｍａｎ  ＥＴ  ３１Ｃｈｒ
・Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓａｖｅｒ  ＴＭ９０３（登録商標）カード
・Ｗｈａｔｍａｎ  ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ
・Ａｈｌｓｔｒｏｍ  ２２６検体採取用紙
−混合セルロースエステル
・以下に例示するガラス繊維媒体、ただしそれらに限定されない
−Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｄｒｉｅｄ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｐｏｔｔｉｎｇカード
・以下に例示するプラスチック重合体、ただしそれらに限定されない
−ポリエステル
−ポリプロピレン（ＬＤＰＥ、ＨＤＰＥ）
−ポリエーテルスルホン
−アクリル酸重合体
−ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）
・混合重合体
・ポリアミド
−天然物
・羊毛
・絹
−合成物
・アラミド
・ナイロン
・金属
−金属フィルムおよびホイル
−金網
【００３７】
マトリクスは、上記の材料の２種以上の混合物でできていてもよい。
【００３８】
マトリクスは上記の材料がいろいろな種類の形状を取っているものが可能であり、構造を有しても有さなくてもよい。構造は、多孔質でも繊維状でもよく、繊維状の場合は、その秩序は、横方向でも、放射状でも、軸方向でも、垂直でもよい。
【００３９】
好適なマトリクスは、以下のものである：
・Ｗｈａｔｍａｎ  ＤＭＰＫ−Ｃカード
・Ｗｈａｔｍａｎ  ＥＴ  ３１Ｃｈｒ
・Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｄｒｉｅｄ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｐｏｔｔｉｎｇカード
・Ａｈｌｓｔｒｏｍ  ２２６  検体採取用紙
【００４０】
本発明による方法は、液状生体試料の安定化に用いることで以下の種類の化合物の酵素分解または代謝を回避することができる；
・薬学的化合物
・薬
・プロドラッグ
・薬の代謝産物
・代謝産物
・タンパク質
・ペプチド
・脂質
・ＲＮＡ
・ＤＮＡ
【００４１】
本明細書中に記載される方法または組成物のいずれも本明細書中に記載される他の方法または組成物のいずれかに対して実施可能であると考えられる。同様に、本発明の１つの実施形態に対して記載される任意の特徴は、本発明の他の任意の実施形態の背景においても用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、安定化血液試料２５μｌ（◆）および非安定化血液試料２５μｌ（■）を紙に付着させて室温で乾燥させた場合の乾燥時間を示すグラフである。
【図２】図２は、試料に様々な処理を行った後の試料中のオセルタミビルの代謝量を示すグラフである。試料Ａは、使用説明書に従って標準的な手順で処理を行った、すなわち開放空間で２時間乾燥させた。試料Ｂは、密閉した袋にシリカと一緒に入れて乾燥させた。試料Ｃは、加熱安定化を行い、それから開放空間で乾燥させた。試料Ｄは、加熱安定化を行い、それから密閉した袋にシリカと一緒に入れて乾燥させた。図２中の代謝されたオセルタミビルの％を示す値は、３つの試料の平均である。
【実施例１】
【００４３】
血液試料の乾燥時間
安定化血液試料２５μｌ（−◆−）および非安定化血液試料２５μｌ（−■−）を紙に付着させ室温で乾燥させた場合の乾燥時間を、５分ごとに紙の重さを測定することで観測した。安定化は、Ｓｔａｂｉｌｉｚｏｒ（登録商標）システム（Ｄｅｎａｔｏｒ  ＡＢ、Ｇｏｔｅｂｏｒｇ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて３０秒間加熱することで行った。約５０分後には、紙は重量減少を示さなくなった。どちらの試料も、終了時点の血液乾燥物は、初期重量の約２１％であった。結果を図１に示す。
【実施例２】
【００４４】
マウス血液中のオセルタミビルの安定化
オセルタミビルの薬物動態
オセルタミビルは、インフルエンザＡのウイルス性ノイラミニダーゼ糖タンパク質の選択的阻害剤であるオセルタミビルカルボン酸塩の経口プロドラッグである。オセルタミビルは、主にカルボキシルエステラーゼ１（ＣＥＳ１）により速やかに生物変換を受けてオセルタミビルカルボン酸塩になる。
【００４５】
【化１】
2014521084.tif 000002
【００４６】
点線は、ＭＲＭ測定中の化合物の断片を示す。
【００４７】
マウス血液にオセルタミビルを５００ｎｇ／ｍＬ添加した。血液２５μＬをＷｈａｔｍａｎ  ＦＴＡ  ＤＭＰＫ−Ｃカードに点状に付着させた。血の点は、室温に放置して乾燥させるか、またはＳｔａｂｉｌｉｚｏｒ（登録商標）システム（Ｄｅｎａｔｏｒ  ＡＢ、Ｇｏｔｅｂｏｒｇ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて加熱処理してから放置して乾燥させた。
【００４８】
表１
マウス血液中のオセルタミビルの安定化
【００４９】
【表１】
2014521084.tif 000003
【００５０】
結果
紙に付着させた試料の加熱処理は、試料を自然乾燥させただけの場合と比べて、プロドラッグであるオセルタミビルの代謝を大幅に減少させた。
【実施例３】
【００５１】
乾燥条件が異なる場合の影響
マウス血液にオセルタミビルを２０００ｎｇ／ｍＬ添加した。血液２５μＬをＷｈａｔｍａｎ  ＦＴＡ  ＤＭＰＫ−Ｃカードに点状に付着させた。血の点は、予め加熱安定化を行うか行わないかのいずれかで、様々な条件下で乾燥させた。試料Ａは、使用説明書に従って標準的な手順で処理を行った、すなわち開放空間で２時間乾燥させた。試料Ｂは、密閉した袋にシリカと一緒に入れて乾燥させた。試料Ｃは、加熱安定化を行い、それから開放空間で乾燥させた。試料Ｄは、加熱安定化を行い、それから密閉した袋にシリカと一緒に入れて乾燥させた。図２中の代謝されたオセルタミビルの％を示す値は、３つの試料の平均である。
【００５２】
結果
加熱安定化を行った試料では、オセルタミビルの代謝量が明らかに少ない。加熱安定化を行わずに密閉した袋にシリカと一緒に入れて乾燥させた試料では、オセルタミビルの代謝量がかえって増えてしまう。加熱安定化を行った試料では、密閉した袋にシリカと一緒に入れて乾燥させても、開放空間で乾燥させた場合と比較してオセルタミビルの代謝量に違いはない。このことは、加熱安定化を行った試料では、乾燥時間がオセルタミビルの代謝量に影響を及ぼさず、試料を採取して加熱安定化した後に直接シリカと一緒に袋に入れて貯蔵および／または輸送することが可能であることを実証している。
【図２】
2014521084.tif 000004
【図１】
2014521084.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成25年5月13日(2013.5.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液状生体試料の安定化法であって、以下の工程：
（ａ）該液体の試料を多孔質材料製のマトリクスに含ませる工程；および
（ｂ）該マトリクスに含ませた該試料を急速に加熱する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、さらに以下の工程：
（ｃ）前記マトリクスに含ませた前記試料を乾燥させる工程
を含む、方法。
【請求項３】
前記液状生体試料は、血液、血漿、血清、唾液、尿、滑液および脳脊髄液、ならびに組織破砕物から選択される、請求項１から２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記液状生体試料は血液試料である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記マトリクスは、セルロース、セルロース系材料、ガラス繊維媒体、プラスチック重合体、混合重合体、ポリアミド、および金属から選択される材料で構成される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2014521084.tif 000006
2014521084.tif 000007
2014521084.tif 000008
2014521084.tif 000009