(57)【要約】  本出願は、新規なＥＤＮ３様ポリペプチドを開示する。そのような短いポリペプチドのひとつはＥＤＮ３  ９７−１４０であり、これは、腸細胞におけるＧＬＰ分泌を促進し、肝細胞における糖新生を阻害する、アミノ酸４４個のペプチドである。本明細書中に提示するＥＤＮ３  ９７−１４０および他のＥＤＮ３様ポリペプチドは多数の適応症の研究および処置に使用でき、これには、代謝障害、たとえば肥満症および糖尿病の処置が含まれる。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のものからなる単離されたポリペプチド：
（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRESL（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）、（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１で始まり、位置２７〜３９のいずれか１つで終わるフラグメント、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に述べたアミノ酸配列に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列；
場合により、ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：
肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、
ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または
脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。
【請求項２】
下記のものを含むポリペプチド：
（ａ）下記のものからなる第１ポリペプチド部分：（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRESL（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）、（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１で始まり、位置２７〜３９のいずれか１つで終わるフラグメント、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に述べたアミノ酸配列に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列、および
（ｂ）第２部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスなポリペプチド部分であるかまたは検出可能な標識である第２部分；
場合により、ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：
肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、
ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または
脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。
【請求項３】
置換が保存的置換である、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ポリペプチドが、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRES（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列からなる、請求項１または３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
第１ポリペプチド部分が、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRES（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列からなる、請求項２または３に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１で始まり位置２７で終わる、（ｉ）のフラグメントに対比して、１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列からなる、請求項１または３に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１で始まり位置２７で終わる、（ｉ）のフラグメントからなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
第１ポリペプチド部分が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１で始まり位置２７で終わる、（ｉ）のフラグメントに対比して、１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列からなる、請求項２または３に記載のポリペプチド。
【請求項９】
第１ポリペプチド部分が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１で始まり位置２７で終わる、（ｉ）のフラグメントからなる、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１で始まり位置３１で終わる、（ｉ）のフラグメントに対比して、１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列からなる、請求項１または３に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１で始まり位置３１で終わる、（ｉ）のフラグメントからなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
第１ポリペプチド部分が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１で始まり位置３１で終わる、（ｉ）のフラグメントに対比して、１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列からなる、請求項２または３に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
第１ポリペプチド部分が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１で始まり位置３１で終わる、（ｉ）のフラグメントからなる、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
ポリペプチドが前記の１、２または３つの置換を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
ポリペプチドが前記の１、２または３つの置換を含まない、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１、３、１１および１５がそれぞれＣであり、第１ジスルフィド橋がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１のシステインとＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１５のシステインとを連結し、第２ジスルフィド橋がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置３のシステインとＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１１のシステインとを連結している、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
下記のものからなる単離されたポリペプチド：
（ｉ）アミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）、または（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の位置１で始まり、位置２７〜３９のいずれか１つで終わるフラグメント；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、独立していずれかのアミノ酸から選択され；
場合により、ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：
肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、
ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または
脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。
【請求項１８】
下記のものを含むポリペプチド：
（ａ）下記のものからなる第１ポリペプチド部分：（ｉ）アミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）、または（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の位置１で始まり、位置２７〜３９のいずれか１つで終わるフラグメント、および
（ｂ）第２部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスなポリペプチド部分であるかまたは検出可能な標識であるポリペプチド部分；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、独立していずれかのアミノ酸から選択され；
場合により、ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：
肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、
ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または
脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。
【請求項１９】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７が、独立してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１中の対応する位置またはその保存的置換から選択される、請求項１７または１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
ポリペプチドがアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6S（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７）からなり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６は独立していずれかのアミノ酸から選択される、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
第１ポリペプチド部分がX1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6S（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７）からなり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６は独立していずれかのアミノ酸から選択される、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の位置１で始まり位置２７で終わる、（ｉ）のフラグメントからなる、請求項１７または１９に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
第１ポリペプチド部分が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の位置１で始まり位置２７で終わる、（ｉ）のフラグメントからなる、請求項１８または１９に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の位置１で始まり位置３１で終わる、（ｉ）のフラグメントからなる、請求項１７または１９に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
第１ポリペプチド部分が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の位置１で始まり位置３１で終わる、（ｉ）のフラグメントからなる、請求項１８または１９に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
Ｘ１がＣまたはＳである、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
Ｘ２がＣまたはＳである、請求項１７〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
Ｘ３がＣまたはＳである、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
Ｘ４がＣ、ＳまたはＡである、請求項１７〜２８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
Ｘ５がＷまたはＡである、請求項１７〜２９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
Ｘ６がＧまたはＳである、請求項１７〜３０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
Ｘ７がＬまたはＦである、請求項１７〜３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４がそれぞれＣである、請求項１７〜３２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
第１ジスルフィド橋がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の位置１のシステインとＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の位置１５のシステインとを連結し、第２ジスルフィド橋がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の位置３のシステインとＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の位置１１のシステインとを連結している、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
アミノ酸６０個以下の単離されたポリペプチドであって、アミノ酸配列YYSHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）またはYYAHLDIIAINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）を含むポリペプチド；
場合により、ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：
肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、
ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または
脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。
【請求項３６】
下記のものを含むポリペプチド：
（ａ）アミノ酸配列YYSHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）またはYYAHLDIIAINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）を含む第１ポリペプチド部分であって、ただしアミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および
（ｂ）第２部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスなポリペプチド部分であるかまたは検出可能な標識である第２部分；
場合により、ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：
肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、
ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または
脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。
【請求項３７】
ポリペプチドがアミノ酸配列YYSHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRX6SX7R（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）またはYYAHLDIIAINTPEQTVPYGLSNYRX6SX7R（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６）を含み、Ｘ６およびＸ７は独立していずれかのアミノ酸から選択される、請求項３５に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
ポリペプチドがアミノ酸配列YYSHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRX6SX7RGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２）またはYYAHLDIIAINTPEQTVPYGLSNYRX6SX7RGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３）を含み、Ｘ６およびＸ７は独立していずれかのアミノ酸から選択される、請求項３５に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
第１ポリペプチド部分がアミノ酸配列YYSHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRX6SX7R（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）またはYYAHLDIIAINTPEQTVPYGLSNYRX6SX7R（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６）を含み、Ｘ６およびＸ７は独立していずれかのアミノ酸から選択される、請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
第１ポリペプチド部分がアミノ酸配列YYSHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRX6SX7RGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２）またはYYAHLDIIAINTPEQTVPYGLSNYRX6SX7RGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３）を含み、Ｘ６およびＸ７は独立していずれかのアミノ酸から選択される、請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
Ｘ６がＧまたはＳである、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
Ｘ７がＬまたはＦである、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
下記のものからなる単離されたポリペプチド：
（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９）の２９〜４１個の連続アミノ酸のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９の位置４〜１３のいずれか１つで始まり、位置４１〜４４のいずれか１つで終わるフラグメント、または（ｉｉ）そのフラグメントに対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列；
場合により、ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：
肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、
ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または
脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。
【請求項４４】
下記のものを含むポリペプチド：
（ａ）下記のものからなる第１ポリペプチド部分：（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９）の２９〜４１個の連続アミノ酸のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９の位置４〜１３のいずれか１つで始まり、位置４１〜４４のいずれか１つで終わるフラグメント、または（ｉｉ）そのフラグメントに対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列、および
（ｂ）第２部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスなポリペプチド部分であるかまたは検出可能な標識である第２部分；
場合により、ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：
肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、
ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または
脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。
【請求項４５】
置換が保存的置換である、請求項４３または４４に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
アミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7RGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０）の２９〜４１個の連続アミノ酸のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０の位置４〜１３のいずれか１つで始まり、位置４１〜４４のいずれか１つで終わるフラグメントからなる、単離されたポリペプチド；
Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、独立していずれかのアミノ酸から選択され；
場合により、ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：
肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、
ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または
脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。
【請求項４７】
下記のものを含むポリペプチド：
（ａ）下記のものからなる第１ポリペプチド部分：（ｉ）アミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7RGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０）の２９〜４１個の連続アミノ酸のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０の位置４〜１３のいずれか１つで始まり、位置４１〜４４のいずれか１つで終わるフラグメント；その際、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、独立していずれかのアミノ酸から選択される、および
（ｂ）第２部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスなポリペプチド部分であるかまたは検出可能な標識である第２部分；
場合により、ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：
肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、
ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または
脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。
【請求項４８】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７が、独立してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１中の対応する位置またはその保存的置換から選択される、請求項４６または４７に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
第１ポリペプチド部分が第２ポリペプチド部分に対してＮ末端側にある、請求項２、３、５、８、９、１２〜１６、１８、１９、２１、２３、２５〜３４、３６、３９〜４２、４４、４５、４７または４８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
第１ポリペプチド部分が第２ポリペプチド部分に対してＣ末端側にある、請求項２、３、５、８、９、１２〜１６、１８、１９、２１、２３、２５〜３４、３６、３９〜４２、４４、４５、４７または４８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
−ＯＨのＣ末端部分を有する、請求項１〜５０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
ポリペプチドがＣ末端においてアミド化されている、請求項１〜５０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
アミノ酸６０個未満の長さである、請求項１〜５２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５４】
検出可能な標識に連結した請求項１〜５３のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む化合物。
【請求項５５】
標識が放射性標識、蛍光標識、またはＭＲＩ検出可能な標識である、請求項５４に記載の化合物。
【請求項５６】
放射性標識が、２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、１８Ｆ、３６Ｃｌ、３２Ｐ、３３Ｐ、４３Ｋ、４７Ｓｃ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、６７Ｃｕ、６８Ｇａ、７１Ｇｅ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、７７Ａｓ、７７Ｂｒ、８１Ｒｂ、８１ｍＫｒ、８７ＭＳｒ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１００Ｐｄ、１０１Ｒｈ、１０３Ｐｂ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１９Ｓｂ  １２１Ｓｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｃｓ、１２８Ｂａ、１２９Ｃｓ、１３１Ｉ、１３１Ｃｓ、１４３Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｕ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９１Ｏｓ、１９３Ｐｔ、１９４Ｉｒ、１９７Ｈｇ、１９９Ａｕ、２０３Ｐｂ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉまたは２１３Ｂｉである、請求項５５に記載の化合物。
【請求項５７】
蛍光標識が、テキサスレッド、フィコエリトリン（ＰＥ）、シトクロムｃ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、蛍光性イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、量子ドット色素、フルオレセイン、ローダミン、ウンベリフェロン、ＤＲＡＱ５、アクリドン、キナクリドン、ランタニドキレート、ルテニウム錯体、タルトラジン、フィコシアニン、またはアロフィコシアニンである、請求項５５に記載の化合物。
【請求項５８】
ＭＲＩ検出可能な標識が、常磁性イメージング剤、超常磁性酸化鉄粒子、磁鉄鉱粒子、フルオロカーボンイメージング試薬、Ｇｄキレート、またはＭｎキレートを含む、請求項５５に記載の化合物。
【請求項５９】
第２ポリペプチド部分が、（ｉ）ＩｇＧ重鎖に由来する定常部、（ｉｉ）Ｆｃドメイン、（ｉｉｉ）下記のものから選択される精製用配列：エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列、およびＧＳＴ融合体、または（ｉｖ）シグナル配列を含む、請求項２、３、５、８、９、１２〜１６、１８、１９、２１、２３、２５〜３４、３６、３９〜４２、４４、４５、４７または４８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
第２ポリペプチド部分は、下記のうち１以上のことができるポリペプチドをエンコードしない：
肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、
ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または
脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること
、請求項２、３、５、８、９、１２〜１６、１８、１９、２１、２３、２５〜３４、３６、３９〜４２、４４、４５、４７または４８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
単離されたポリペプチドである、請求項２、３、５、８、９、１２〜１６、１８、１９、２１、２３、２５〜３４、３６、３９〜４２、４４、４５、４７または４８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
第２部分が検出可能な標識である、請求項２、３、５、８、９、１２〜１６、１８、１９、２１、２３、２５〜３４、３６、３９〜４２、４４、４５、４７または４８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
検出可能な標識が放射性標識、蛍光標識、またはＭＲＩ検出可能な標識である、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
放射性標識が、２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、１８Ｆ、および３６Ｃｌ、３２Ｐ、３３Ｐ、４３Ｋ、４７Ｓｃ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、６７Ｃｕ、６８Ｇａ、７１Ｇｅ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、７７Ａｓ、７７Ｂｒ、８１Ｒｂ、８１ｍＫｒ、８７ＭＳｒ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１００Ｐｄ、１０１Ｒｈ、１０３Ｐｂ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１９Ｓｂ  １２１Ｓｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｃｓ、１２８Ｂａ、１２９Ｃｓ、１３１Ｉ、１３１Ｃｓ、１４３Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｕ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９１Ｏｓ、１９３Ｐｔ、１９４Ｉｒ、１９７Ｈｇ、１９９Ａｕ、２０３Ｐｂ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉまたは２１３Ｂｉである、請求項６３に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
蛍光標識が、テキサスレッド、フィコエリトリン（ＰＥ）、シトクロムｃ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、蛍光性イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、量子ドット色素、フルオレセイン、ローダミン、ウンベリフェロン、ＤＲＡＱ５、アクリドン、キナクリドン、ランタニドキレート、ルテニウム錯体、タルトラジン、フィコシアニン、またはアロフィコシアニンである、請求項６３に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
ＭＲＩ検出可能な標識が、常磁性イメージング剤、超常磁性酸化鉄粒子、磁鉄鉱粒子、フルオロカーボンイメージング試薬、Ｇｄキレート、またはＭｎキレートを含む、請求項６３に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
第２ポリペプチド部分が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、Ｖｅｎｕｓ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ｄｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）である、請求項２、３、５、８、９、１２〜１６、１８、１９、２１、２３、２５〜３４、３６、３９〜４２、４４、４５、４７または４８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
ペプチドミメティックである、請求項１〜６７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
エンドセリン受容体Ａ（ＥＴＡ）に結合しない、請求項１〜６８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
エンドセリン受容体Ｂ（ＥＴＢ）に結合しない、請求項１〜６９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
医薬的に許容できるキャリヤーと配合した請求項１〜７０のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項７２】
組成物が実質的に発熱物質を含まない、請求項７１に記載の組成物。
【請求項７３】
ヒトまたは動物対象に投与するのに適した、医薬的に許容できるキャリヤーと配合した、下記のものからなるポリペプチドを含む組成物であって、実質的に非発熱性である組成物：
（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９）、または（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９の位置１で始まり、位置４１〜４３のいずれか１つで終わるフラグメント；
場合により、ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：
肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、
ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または
脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。
【請求項７４】
医薬的に許容できるキャリヤーと配合した、下記のものからなるポリペプチドを含む組成物であって、実質的に非発熱性である組成物：
（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRESLRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１）、または（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１の位置１で始まり、位置４１〜４３のいずれか１つで終わるフラグメント；
場合により、ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：
肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、
ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または
脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。
【請求項７５】
ヒトまたは動物対象に投与するのに適した、医薬的に許容できるキャリヤーと配合した、下記のものからなるポリペプチドを含む組成物であって、実質的に非発熱性である組成物：
（ａ）下記のものからなる第１ポリペプチド部分：（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９）、または（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９の位置１で始まり、位置４１〜４３のいずれか１つで終わるフラグメント、および
（ｂ）第２部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスなポリペプチド部分であるかまたは検出可能な標識である第２部分；
場合により、ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：
肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、
ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または
脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。
【請求項７６】
医薬的に許容できるキャリヤーと配合した、下記のものからなるポリペプチドを含む組成物であって、実質的に非発熱性である組成物：
（ａ）下記のものからなる第１ポリペプチド部分：（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRESLRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１）、または（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１の位置１で始まり、位置４１〜４３のいずれか１つで終わるフラグメント、および
（ｂ）第２部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスなポリペプチド部分であるかまたは検出可能な標識である第２部分；
場合により、ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：
肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、
ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または
脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。
【請求項７７】
下記のものを含む単離された核酸：
（ａ）請求項１、３、６、７、１０、１１、１４〜１６、１７、１９、２０、２２、２４、２４〜３４、３５、３７、３８、４１〜４３、４５、４６または４８のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする配列からなる第１核酸部分、および（ｂ）第２核酸部分であって、第１核酸部分に対してヘテロロガスである第２核酸部分；
場合により、パート（ａ）のアミノ酸配列は下記のうち１以上のことができる：
肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、
ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または
脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。
【請求項７８】
第１核酸部分がアミノ酸４４個を超える長さのアミノ酸配列をコードしない、請求項７７に記載の単離された核酸。
【請求項７９】
アミノ酸６０個を超える長さのポリペプチドをコードしない、請求項７７に記載の単離された核酸。
【請求項８０】
第１核酸部分が第２核酸部分の上流にある、請求項７７〜７９のいずれか１項に記載の単離された核酸。
【請求項８１】
第１核酸部分が第２核酸部分の下流にある、請求項７７〜７９のいずれか１項に記載の単離された核酸。
【請求項８２】
融合タンパク質をコードする、請求項７７〜８１のいずれか１項に記載の単離された核酸。
【請求項８３】
第２核酸部分がプロモーター配列である、請求項７７〜８２のいずれか１項に記載の単離された核酸。
【請求項８４】
第２核酸部分が選択マーカーである、請求項７７〜８２のいずれか１項に記載の単離された核酸。
【請求項８５】
請求項７７〜８４のいずれか１項に記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
【請求項８６】
請求項８５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項８７】
請求項７７〜８４のいずれか１項に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項８８】
核酸が作動可能な状態でヘテロロガスなプロモーター配列に連結している、請求項８６または８７に記載の宿主細胞。
【請求項８９】
請求項２、３、５、８、９、１２〜１６、１８、１９、２１、２３、２５〜３４、３６、３９〜４２、４４、４５、４７または４８のいずれか１項に記載のポリペプチドを調製する方法であって、
（ａ）そのポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を用意し、そして
（ｂ）その細胞を、そのポリペプチドの産生が可能な条件下で培養する
ことを含む方法。
【請求項９０】
さらに、（ｃ）ポリペプチドを単離する段階を含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
請求項１〜７０のいずれか１項に記載のポリペプチドを調製する方法であって、そのポリペプチドを化学合成することを含む方法。
【請求項９２】
さらに、ポリペプチドのＣ末端アミノ酸をアミド化することを含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
代謝性の疾患または障害を処置する方法であって、その必要がある対象に有効量の請求項１〜７０のいずれか１項に記載のポリペプチドを投与することを含む方法。
【請求項９４】
代謝性の疾患または障害を処置する方法であって、その必要がある対象に有効量の請求項７１〜７６のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項９５】
代謝性の疾患または障害を処置する方法であって、その必要がある対象に有効量のアミノ酸６０個以下の長さの単離されたポリペプチドを投与することを含み、その際、ポリペプチドがアミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法。
【請求項９６】
代謝性の疾患または障害を処置する方法であって、その必要がある対象に有効量の下記のものを含むポリペプチドを投与することを含み：（ａ）アミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド部分であって、アミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２ポリペプチド部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスである第２ポリペプチド部分；その際、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法。
【請求項９７】
置換が保存的置換である、請求項９５または９６に記載の方法。
【請求項９８】
ポリペプチドが、アミノ酸配列YKDKECVYYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項９５または９７に記載の方法。
【請求項９９】
第１ポリペプチド部分が、アミノ酸配列YKDKECVYYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項９６または９７に記載の方法。
【請求項１００】
ポリペプチドが、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項９５または９７に記載の方法。
【請求項１０１】
第１ポリペプチド部分が、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項９６または９７に記載の方法。
【請求項１０２】
ポリペプチドが、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPY（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項９５または９７に記載の方法。
【請求項１０３】
第１ポリペプチド部分が、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPY（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項９６または９７に記載の方法。
【請求項１０４】
ポリペプチドが、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項９５または９７に記載の方法。
【請求項１０５】
第１ポリペプチド部分が、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項９６または９７に記載の方法。
【請求項１０６】
ポリペプチドが、アミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項９５または９７に記載の方法。
【請求項１０７】
第１ポリペプチド部分が、アミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項９６または９７に記載の方法。
【請求項１０８】
ポリペプチドが、アミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項９５または９７に記載の方法。
【請求項１０９】
第１ポリペプチド部分が、アミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項９６または９７に記載の方法。
【請求項１１０】
ポリペプチドが、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項９５または９７に記載の方法。
【請求項１１１】
第１ポリペプチド部分が、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項９６または９７に記載の方法。
【請求項１１２】
ポリペプチドが、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGS（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項９５または９７に記載の方法。
【請求項１１３】
第１ポリペプチド部分が、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGS（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項９６または９７に記載の方法。
【請求項１１４】
ポリペプチドが前記の１、２もしくは３つの置換を含む、請求項９５〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
ポリペプチドが前記の１、２もしくは３つの置換を含まない、請求項９５〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１６】
代謝性の疾患または障害を処置する方法であって、その必要がある対象に有効量のアミノ酸６０個以下の長さの単離されたポリペプチドを投与することを含み、その際、ポリペプチドがアミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含み、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法。
【請求項１１７】
代謝性の疾患または障害を処置する方法であって、その必要がある対象に有効量の下記のものを含むポリペプチドを投与することを含み：（ａ）アミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含む第１ポリペプチド部分であって、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、アミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２ポリペプチド部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスである第２ポリペプチド部分；その際、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法。
【請求項１１８】
Ｘ４およびＸ５が、独立してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１中の対応する位置またはその保存的置換から選択される、請求項１１６または１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
ポリペプチドがアミノ酸配列YKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５）を含み、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２０】
第１ポリペプチド部分がアミノ酸配列YKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５）を含み、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２１】
ポリペプチドがアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQT（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３）を含み、その際：
Ｘ１およびＸ４はＣであり、かつＸ２およびＸ３は独立していずれかのアミノ酸から選択されるか、あるいはＸ２およびＸ３はＣであり、かつＸ１およびＸ４は独立していずれかのアミノ酸から選択され、
Ｘ５はいずれかのアミノ酸である、
請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２２】
ポリペプチドがアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7R（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４）を含み、その際：
Ｘ１およびＸ４はＣであり、かつＸ２およびＸ３はＡであるか、あるいはＸ２およびＸ３はＣであり、かつＸ１およびＸ４はＡであり、
Ｘ５はＷ、ＦまたはＹであり、
Ｘ６はＥまたはＧであり、
Ｘ７はＬまたはＦである、
請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
ポリペプチドがアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２４】
第１ポリペプチド部分がアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２５】
ポリペプチドがアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPY（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２６】
第１ポリペプチド部分がアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPY（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２７】
ポリペプチドがアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7R（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は独立していずれかのアミノ酸から選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２８】
第１ポリペプチド部分がアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7R（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は独立していずれかのアミノ酸から選択される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２９】
ポリペプチドがアミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7R（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６）を含み、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は独立していずれかのアミノ酸から選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１３０】
第１ポリペプチド部分がアミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7R（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６）を含み、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は独立していずれかのアミノ酸から選択される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１３１】
ポリペプチドがアミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7RGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８）を含み、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は独立していずれかのアミノ酸から選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１３２】
第１ポリペプチド部分がアミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7RGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８）を含み、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は独立していずれかのアミノ酸から選択される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１３３】
ポリペプチドがアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7RGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は独立していずれかのアミノ酸から選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１３４】
第１ポリペプチド部分がアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7RGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は独立していずれかのアミノ酸から選択される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１３５】
ポリペプチドがアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6S（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６は独立していずれかのアミノ酸から選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１３６】
第１ポリペプチド部分がアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6S（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６は独立していずれかのアミノ酸から選択される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１３７】
Ｘ４がＣ、ＳまたはＡである、請求項１１８〜１３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３８】
Ｘ５がＷまたはＡである、請求項１１８〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３９】
Ｘ１がＳまたはＣである、請求項１２１〜１３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４０】
Ｘ２がＳまたはＣである、請求項１２１〜１３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４１】
Ｘ３がＳまたはＣである、請求項１１８〜１４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４２】
Ｘ６がＧまたはＥである、請求項１２７〜１４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４３】
Ｘ７がＦまたはＬである、請求項１２７〜１３４または１３７〜１４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４４】
代謝性の疾患または障害が肥満症である、請求項９３〜１４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４５】
代謝性の疾患または障害がＩ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病である、請求項９３〜１４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４６】
代謝性の疾患または障害がインスリン抵抗性である、請求項９３〜１４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４７】
代謝性の疾患または障害が脂質代謝障害である、請求項９３〜１４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４８】
代謝性の疾患または障害が高脂血症である、請求項９３〜１４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４９】
代謝性の疾患または障害が高コレステロール血症である、請求項９３〜１４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５０】
代謝性の疾患または障害が脂肪酸代謝障害である、請求項９３〜１４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５１】
深部体温を上昇させる方法であって、その必要がある対象に有効量の請求項１〜７０のいずれか１項に記載のポリペプチドを投与することを含む方法。
【請求項１５２】
深部体温を上昇させる方法であって、その必要がある対象に有効量の請求項７１〜７６のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項１５３】
深部体温を上昇させる方法であって、その必要がある対象に有効量のアミノ酸残基６０個以下の長さの単離されたポリペプチドを投与することを含み、その際、ポリペプチドがアミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法。
【請求項１５４】
深部体温を上昇させる方法であって、その必要がある対象に有効量の下記のものを含むポリペプチドを投与することを含み：（ａ）アミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド部分であって、アミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２ポリペプチド部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスである第２ポリペプチド部分；その際、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法。
【請求項１５５】
深部体温を上昇させる方法であって、その必要がある対象に有効量のアミノ酸残基６０個以下の長さの単離されたポリペプチドを投与することを含み、その際、ポリペプチドがアミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含み、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法。
【請求項１５６】
深部体温を上昇させる方法であって、その必要がある対象に有効量の下記のものを含むポリペプチドを投与することを含み：（ａ）アミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含む第１ポリペプチド部分であって、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、アミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２ポリペプチド部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスである第２ポリペプチド部分；その際、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法。
【請求項１５７】
エネルギー消費を増大させる方法であって、その必要がある対象に有効量の請求項１〜７０のいずれか１項に記載のポリペプチドを投与することを含む方法。
【請求項１５８】
エネルギー消費を増大させる方法であって、その必要がある対象に有効量の請求項７１〜７６のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項１５９】
エネルギー消費を増大させる方法であって、その必要がある対象に有効量のアミノ酸残基６０個以下の長さの単離されたポリペプチドを投与することを含み、その際、ポリペプチドがアミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法。
【請求項１６０】
エネルギー消費を増大させる方法であって、その必要がある対象に有効量の下記のものを含むポリペプチドを投与することを含み：（ａ）アミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド部分であって、アミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２ポリペプチド部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスである第２ポリペプチド部分；その際、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法。
【請求項１６１】
エネルギー消費を増大させる方法であって、その必要がある対象に有効量のアミノ酸残基６０個以下の長さの単離されたポリペプチドを投与することを含み、その際、ポリペプチドがアミノ酸配列YYXHLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含み、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法。
【請求項１６２】
エネルギー消費を増大させる方法であって、その必要がある対象に有効量の下記のものを含むポリペプチドを投与することを含み：（ａ）アミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含む第１ポリペプチド部分であって、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、アミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２ポリペプチド部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスである第２ポリペプチド部分；その際、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法。
【請求項１６３】
ポリペプチドは下記のうち１以上：
肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、
ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、
骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または
脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること
ができる、請求項９３〜１６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６４】
肝細胞におけるグルコース産生を阻害する方法であって、肝細胞を有効量の請求項１〜７０のいずれか１項に記載のポリペプチドと接触させることを含む方法。
【請求項１６５】
肝細胞におけるグルコース産生を阻害する方法であって、肝細胞を有効量の請求項７１〜７６のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを含む方法。
【請求項１６６】
肝細胞におけるグルコース産生を阻害する方法であって、肝細胞を有効量のアミノ酸残基６０個以下の長さの単離されたポリペプチドと接触させることを含み、その際、ポリペプチドがアミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法。
【請求項１６７】
肝細胞におけるグルコース産生を阻害する方法であって、肝細胞を有効量の下記のものを含むポリペプチドと接触させることを含み：（ａ）アミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド部分であって、アミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２ポリペプチド部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスである第２ポリペプチド部分；その際、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法。
【請求項１６８】
肝細胞におけるグルコース産生を阻害する方法であって、肝細胞を有効量のアミノ酸残基６０個以下の長さの単離されたポリペプチドと接触させることを含み、その際、ポリペプチドがアミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含み、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法。
【請求項１６９】
肝細胞におけるグルコース産生を阻害する方法であって、肝細胞を有効量の下記のものを含むポリペプチドと接触させることを含み：（ａ）アミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含む第１ポリペプチド部分であって、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、アミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２ポリペプチド部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスである第２ポリペプチド部分；その際、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法。
【請求項１７０】
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）分泌を促進する方法であって、腸細胞を有効量の請求項１〜７０のいずれか１項に記載のポリペプチドと接触させることを含む方法。
【請求項１７１】
ＧＬＰ−１分泌を促進する方法であって、腸細胞を有効量の請求項７１〜７６のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを含む方法。
【請求項１７２】
ＧＬＰ−１分泌を促進する方法であって、腸細胞を有効量のアミノ酸残基６０個以下の長さの単離されたポリペプチドと接触させることを含み、その際、ポリペプチドがアミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法。
【請求項１７３】
ＧＬＰ−１分泌を促進する方法であって、腸細胞を有効量の下記のものを含むポリペプチドと接触させることを含み：（ａ）アミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド部分であって、アミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２ポリペプチド部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスである第２ポリペプチド部分；その際、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法。
【請求項１７４】
ＧＬＰ−１分泌を促進する方法であって、腸細胞を有効量のアミノ酸残基６０個以下の長さの単離されたポリペプチドと接触させることを含み、その際、ポリペプチドがアミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含み、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法。
【請求項１７５】
ＧＬＰ−１分泌を促進する方法であって、腸細胞を有効量の下記のものを含むポリペプチドと接触させることを含み：（ａ）アミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含む第１ポリペプチド部分であって、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、アミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２ポリペプチド部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスである第２ポリペプチド部分；その際、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法。
【請求項１７６】
腸細胞が結腸細胞またはＧＬＵＴａｇ細胞である、請求項１７０〜１７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７７】
インビトロで実施される、請求項１６４〜１７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７８】
インビボで実施される、請求項１６４〜１７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７９】
ポリペプチドがエンドセリン受容体Ａ（ＥＴＡ）に結合しない、請求項９３〜１７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８０】
ポリペプチドがエンドセリン受容体Ｂ（ＥＴＢ）に結合しない、請求項９３〜１７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８１】
ポリペプチドがペプチドミメティックである、請求項９３〜１８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８２】
ポリペプチドがアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQT（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３）を含み、その際：
Ｘ１およびＸ４はＣであり、かつＸ２およびＸ３は独立していずれかのアミノ酸から選択されるか、あるいはＸ２およびＸ３はＣであり、かつＸ１およびＸ４は独立していずれかのアミノ酸から選択され、
Ｘ５はいずれかのアミノ酸である、
請求項１５５、１６１、１６８および１７４に記載の方法。
【請求項１８３】
ポリペプチドがアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7R（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４）を含み、その際：
Ｘ１およびＸ４はＣであり、かつＸ２およびＸ３はＡであるか、あるいはＸ２およびＸ３はＣであり、かつＸ１およびＸ４はＡであり、
Ｘ５はＷ、ＦまたはＹであり、
Ｘ６はＥまたはＧであり、
Ｘ７はＬまたはＦである、
請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
第１ポリペプチド部分がアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQT（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３）を含み、その際：
Ｘ１およびＸ４はＣであり、かつＸ２およびＸ３は独立していずれかのアミノ酸から選択されるか、あるいはＸ２およびＸ３はＣであり、かつＸ１およびＸ４は独立していずれかのアミノ酸から選択され、
Ｘ５はいずれかのアミノ酸である、
請求項１５６、１６２、１６９および１７５に記載の方法。
【請求項１８５】
ポリペプチドがアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7R（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４）を含み、その際：
Ｘ１およびＸ４はＣであり、かつＸ２およびＸ３はＡであるか、あるいはＸ２およびＸ３はＣであり、かつＸ１およびＸ４はＡであり、
Ｘ５はＷ、ＦまたはＹであり、
Ｘ６はＥまたはＧであり、
Ｘ７はＬまたはＦである、
請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
温感受性ニューロンを同定する方法であって、脳組織試料を、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９）またはCTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRESLRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１）を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体と接触させることを含む方法。
【請求項１８７】
温感受性ニューロンを同定する方法であって、脳組織試料を、アミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）を含むポリペプチドをコードする核酸に緊縮条件下でハイブリダイズする核酸プローブまたはプライマーと接触させることを含む方法。
【請求項１８８】
ＥＤＮ３様受容体を同定する方法であって、
（ａ）被験細胞をＥＤＮ３様ポリペプチドおよび受容体阻害物質と接触させ、
（ｂ）対照細胞をＥＤＮ３様ポリペプチドと接触させ、そして
（ｃ）被験細胞および対照細胞のＥＤＮ３様応答を測定する
ことを含み、その際、被験細胞と比較して対照細胞のＥＤＮ３様応答がより大きいことは、その受容体阻害物質により阻害された受容体がＥＤＮ３様受容体であることの指標となる方法。
【請求項１８９】
ＥＤＮ３様受容体を同定する方法であって、
（ａ）被験細胞をＥＤＮ３様ポリペプチドと接触させ、その際、被験細胞は受容体の活性を低下させる変異を含み、
（ｂ）対照細胞をＥＤＮ３様ポリペプチドと接触させ、その際、対照細胞はその受容体の野生型活性を含み、そして
（ｃ）被験細胞および対照細胞のＥＤＮ３様応答を測定する
ことを含み、その際、被験細胞と比較して対照細胞のＥＤＮ３様応答がより大きいことは、その受容体アンタゴニストにより阻害された受容体がＥＤＮ３様受容体であることの指標となる方法。
【請求項１９０】
推定ＥＤＮ３様受容体を同定する方法であって、細胞溶解物をＥＤＮ３様ポリペプチドと接触させ、そしてＥＤＮ３様ポリペプチドを結合するタンパク質を単離することを含み、その際、ＥＤＮ３様ポリペプチドを結合するタンパク質は推定ＥＤＮ３様受容体である方法。
【請求項１９１】
ＥＤＮ３様受容体を同定する方法であって、ＥＤＮ３様ポリペプチドを候補受容体と接触させ、そしてＥＤＮ３様ポリペプチドが候補受容体を結合するかどうかを判定することを含み、その際、結合することはその候補受容体がＥＤＮ３様受容体であることの指標となる方法。
【請求項１９２】
対象材料のイメージを作成する方法であって、
（ａ）複数の細胞を含む対象材料を用意し、その際、細胞のサブセットは検出可能な量の請求項５４〜５８のいずれか１項に記載の検出可能な状態に標識された化合物を含み；そして
（ｂ）細胞をイメージングする
ことを含む方法。
【請求項１９３】
対象材料のイメージを作成する方法であって、
（ａ）複数の細胞を含む対象材料を用意し、その際、細胞のサブセットは検出可能な量の請求項６２〜６７のいずれか１項に記載の検出可能な状態に標識されたポリペプチドを含み；そして
（ｂ）細胞をイメージングする
ことを含む方法。
【請求項１９４】
受容体を発現する細胞または組織を同定する方法であって、
細胞または組織を、検出可能な量の請求項５４〜５８のいずれか１項に記載の検出可能な状態に標識された化合物と、その化合物がそれの受容体に結合するのに十分な時間、接触させ；そして
検出可能な状態に標識された化合物を検出し、これによりその受容体を発現する細胞または組織を同定する
ことを含む方法。
【請求項１９５】
受容体を発現する細胞または組織を同定する方法であって、
細胞または組織を、検出可能な量の請求項６２〜６７のいずれか１項に記載の検出可能な状態に標識されたポリペプチドと、その化合物がそれの受容体に結合するのに十分な時間、接触させ；そして
検出可能な状態に標識された化合物を検出し、これによりその受容体を発現する細胞または組織を同定する
ことを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引照
本出願は、U.S. Provisional Application No. 61/449,465, 2011年3月4日出願に基づく優先権を主張する。この引用出願の教示内容全体を特に本明細書に援用する。
【０００２】
本出願は、新規なＥＤＮ３様ポリペプチドを開示する。そのような短いポリペプチドのひとつはＥＤＮ３  ９７−１４０であり、これは、腸細胞におけるＧＬＰ分泌を促進し、肝細胞における糖新生を阻害する、アミノ酸４４個のペプチドである。本明細書中に提示するＥＤＮ３  ９７−１４０および他のＥＤＮ３様ポリペプチドは多数の適応症の研究および処置に使用でき、これには、代謝障害、たとえば肥満症および糖尿病の処置が含まれる。
【背景技術】
【０００３】
ペプチドリガンドはより大きなプロペプチドからプロセシングされ、単一遺伝子産物がオルタナティブプロセシングによって多数の生物活性産物を生成することができる。たとえば、グルカゴンは、十分な記載のある種々の機能をもつ８種類のペプチドホルモン(参照：Holst, 2007)、たとえばオキシントモジュリン(oxyntomodulin)、グルカゴン、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２を、種々の組織において生成する。同様に、エンドセリン−３は、より長い前駆物質プレプロエンドセリン−３から誘導される血管作用ペプチドである(Bloch, 1989)。エンドセリン−３は、最初はヒト視床下部からクローニングされたエンドセリンファミリーのメンバーである(Bloch, 1989)。エンドセリン類（１〜３）は、プレプロエンドセリンからプロセシングされた後の十分に特性解明された成熟ペプチドを構成する２１個のアミノ酸にわたって、類似のアミノ酸配列をもつ(Inoue, 1989)。しかし、それらは薬理学的には依然として別個のものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Holst, 2007
【非特許文献２】Bloch, 1989
【非特許文献３】Inoue, 1989
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本出願は、さらに他の別個の活性、すなわち抗−高血糖活性をもつ、新規なポリペプチドを開示する。本発明は、ＥＤＮ３様ポリペプチドと呼ばれるポリペプチドを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＥＤＮ３様ポリペプチドと呼ばれるポリペプチドを提供する。代表的なＥＤＮ３様ポリペプチド、たとえばＥＤＮ３  ９７−１４０を本明細書中に提示する。ＥＤＮ３様ポリペプチドには、本明細書に記載するＥＤＮ３  ９７−１４０のバリアントが含まれる。本発明はまた、適切なＥＤＮ３様ポリペプチドを同定する方法、およびそれらのポリペプチドをインビトロ、エクスビボおよびインビボで使用する方法を提供し、これには疾患の研究および処置が含まれる。本発明はまた、ＥＤＮ３様ポリペプチドの作用を仲介する１以上の受容体を同定する方法を提供する。本発明は、本明細書中に提示されるＥＤＮ３様ポリペプチドのいずれかを含むかまたはそれらからなるポリペプチド（単離または精製されたポリペプチドを含む）、およびそのようないずれかのポリペプチドを使用する方法を考慮する。本発明はＥＤＮ３様ポリペプチドに関する特定の機能的属性を提示するが、そのような機能的属性に言及して、または言及せずに、適切なポリペプチドを記載および提示する場合があることを特筆する。たとえば、特定の態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること；特定の態様において、これらの特徴、またはこれらの特徴を用いたポリペプチドの記述は、任意選択的である。
【０００７】
特定の観点において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜３３のいずれかのアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、単離されたポリペプチドを提供する。特定の態様において、単離されたポリペプチドはアミノ酸残基６０個以下である。特定の態様において、単離されたポリペプチドは他のヘテロロガスなタンパク質または標識との融合タンパク質またはコンジュゲートとして提供される。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜３３のいずれについても、変動が許容されたいずれかの残基（たとえば、Ｘで指示されるもの）は、本明細書に記載したようにまたは実施例により指示されるように変動できると理解される。記載する他のすべてのＥＤＮ３様ポリペプチドについて、本発明はそのようなポリペプチドを本明細書に記載するいずれの方法にも使用できることを考慮する。本発明の他の代表的特徴を以下に記載する。
【０００８】
特定の観点において、本発明は、下記のものからなる単離されたポリペプチドを提供する：（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRESL（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）、（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１で始まり、位置２７〜３９のいずれか１つで終わるフラグメント、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に述べたアミノ酸配列に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。
【０００９】
特定の観点において、本発明はまた、下記のものからなる単離されたポリペプチドを提供する：（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRESL（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）、（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１で始まり、位置２７〜３９のいずれか１つで終わるフラグメント、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に述べたアミノ酸配列に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、またはＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること。
【００１０】
特定の観点において、本発明は、下記のものを含むポリペプチドを提供する：（ａ）下記のものからなる第１ポリペプチド部分：（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRESL（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）、（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１で始まり、位置２７〜３９のいずれか１つで終わるフラグメント、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に述べたアミノ酸配列に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列、および（ｂ）第２部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスなポリペプチド部分であるかまたは検出可能な標識である第２部分；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。
【００１１】
特定の観点において、本発明はまた、下記のものを含むポリペプチドを提供する：（ａ）下記のものからなる第１ポリペプチド部分：（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRESL（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）、（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１で始まり、位置２７〜３９のいずれか１つで終わるフラグメント、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に述べたアミノ酸配列に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列、および（ｂ）第２部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスなポリペプチド部分であるかまたは検出可能な標識である第２部分；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、またはＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること。
【００１２】
特定の態様において、置換は保存的置換である。特定の態様において、ポリペプチドは、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRES（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列からなる。特定の態様において、第１ポリペプチド部分は、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRES（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列からなる。特定の態様において、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１で始まり位置２７で終わる、（ｉ）のフラグメントに対比して、１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列からなる。特定の態様において、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１で始まり位置２７で終わる、（ｉ）のフラグメントからなる。特定の態様において、第１ポリペプチド部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１で始まり位置２７で終わる、（ｉ）のフラグメントに対比して、１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列からなる。特定の態様において、第１ポリペプチド部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１で始まり位置２７で終わる、（ｉ）のフラグメントからなる。特定の態様において、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１で始まり位置３１で終わる、（ｉ）のフラグメントに対比して、１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列からなる。特定の態様において、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１で始まり位置３１で終わる、（ｉ）のフラグメントからなる。特定の態様において、第１ポリペプチド部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１で始まり位置３１で終わる、（ｉ）のフラグメントに対比して、１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列からなる。特定の態様において、第１ポリペプチド部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１で始まり位置３１で終わる、（ｉ）のフラグメントからなる。特定の態様において、ポリペプチドは前記の１、２または３つの置換を含む。特定の態様において、ポリペプチドは前記の１、２または３つの置換を含まない。特定の態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１、３、１１および１５がそれぞれＣであり、第１ジスルフィド橋がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１のシステインとＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１５のシステインとを連結し、第２ジスルフィド橋がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置３のシステインとＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１１のシステインとを連結している。
【００１３】
特定の観点において、本発明はまた、下記のものからなる単離されたポリペプチドを提供する：（ｉ）アミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）、または（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の位置１で始まり、位置２７〜３９のいずれか１つで終わるフラグメント；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、独立していずれかのアミノ酸から選択され；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。
【００１４】
特定の他の観点において、本発明はまた、下記のものからなる単離されたポリペプチドを提供する：（ｉ）アミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）、または（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の位置１で始まり、位置２７〜３９のいずれか１つで終わるフラグメント；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、独立していずれかのアミノ酸から選択され；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、またはＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること。
【００１５】
特定の観点において、本発明はまた、下記のものを含むポリペプチドを提供する：（ａ）下記のものからなる第１ポリペプチド部分：（ｉ）アミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）、または（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の位置１で始まり、位置２７〜３９のいずれか１つで終わるフラグメント、および（ｂ）第２部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスなポリペプチド部分であるかまたは検出可能な標識であるポリペプチド部分；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、独立していずれかのアミノ酸から選択され；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。
【００１６】
特定の観点において、本発明はまた、下記のものを含むポリペプチドを提供する：（ａ）下記のものからなる第１ポリペプチド部分：（ｉ）アミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）、または（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の位置１で始まり、位置２７〜３９のいずれか１つで終わるフラグメント、および（ｂ）第２部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスなポリペプチド部分であるかまたは検出可能な標識であるポリペプチド部分；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、独立していずれかのアミノ酸から選択され；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、またはＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること。
【００１７】
ある態様において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、独立してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１中の対応する位置またはその保存的置換から選択される。ある態様において、ポリペプチドはアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6S（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７）からなり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６は独立していずれかのアミノ酸から選択される。ある態様において、第１ポリペプチド部分はX1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6S（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７）からなり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６は独立していずれかのアミノ酸から選択される。ある態様において、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の位置１で始まり位置２７で終わる、（ｉ）のフラグメントからなる。ある態様において、第１ポリペプチド部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の位置１で始まり位置２７で終わる、（ｉ）のフラグメントからなる。ある態様において、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の位置１で始まり位置３１で終わる、（ｉ）のフラグメントからなる。ある態様において、第１ポリペプチド部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の位置１で始まり位置３１で終わる、（ｉ）のフラグメントからなる。
【００１８】
ある態様において、Ｘ１はＣまたはＳである。ある態様において、Ｘ２はＣまたはＳである。ある態様において、Ｘ３はＣまたはＳである。ある態様において、Ｘ４はＣ、ＳまたはＡである。ある態様において、Ｘ５はＷまたはＡである。ある態様において、Ｘ６はＧまたはＳである。ある態様において、Ｘ７はＬまたはＦである。ある態様において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれＣである。ある態様において、第１ジスルフィド橋がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の位置１のシステインとＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の位置１５のシステインとを連結し、第２ジスルフィド橋がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の位置３のシステインとＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の位置１１のシステインとを連結している。
【００１９】
ある観点において、本発明は、アミノ酸６０個以下の単離されたポリペプチドであって、アミノ酸配列YYSHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）またはYYAHLDIIAINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）を含むポリペプチドを提供する；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。ある観点において、本発明は、アミノ酸６０個以下の単離されたポリペプチドであって、アミノ酸配列YYSHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）またはYYAHLDIIAINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）を含むポリペプチドを提供する；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、またはＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること。
【００２０】
ある観点において、本発明は、下記のものを含むポリペプチドを提供する：（ａ）アミノ酸配列YYSHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）またはYYAHLDIIAINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）を含む第１ポリペプチド部分であって、ただしアミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスなポリペプチド部分であるかまたは検出可能な標識である第２部分；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。ある観点において、本発明は、下記のものを含むポリペプチドを提供する：（ａ）アミノ酸配列YYSHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）またはYYAHLDIIAINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）を含む第１ポリペプチド部分であって、ただしアミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスなポリペプチド部分であるかまたは検出可能な標識である第２部分；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、またはＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること。
【００２１】
ある態様において、ポリペプチドはアミノ酸配列YYSHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRX6SX7R（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）またはYYAHLDIIAINTPEQTVPYGLSNYRX6SX7R（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６）を含み、Ｘ６およびＸ７は独立していずれかのアミノ酸から選択される。ある態様において、ポリペプチドはアミノ酸配列YYSHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRX6SX7RGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２）またはYYAHLDIIAINTPEQTVPYGLSNYRX6SX7RGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３）を含み、Ｘ６およびＸ７は独立していずれかのアミノ酸から選択される。ある態様において、第１ポリペプチド部分はアミノ酸配列YYSHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRX6SX7R（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）またはYYAHLDIIAINTPEQTVPYGLSNYRX6SX7R（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６）を含み、Ｘ６およびＸ７は独立していずれかのアミノ酸から選択される。ある態様において、第１ポリペプチド部分はアミノ酸配列YYSHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRX6SX7RGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２）またはYYAHLDIIAINTPEQTVPYGLSNYRX6SX7RGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３）を含み、Ｘ６およびＸ７は独立していずれかのアミノ酸から選択される。ある態様において、Ｘ６はＧまたはＳである。ある態様において、Ｘ７はＬまたはＦである。
【００２２】
特定の観点において、本発明は、下記のものからなる単離されたポリペプチドを提供する：（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９）の２９〜４１個の連続アミノ酸のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９の位置４〜１３のいずれか１つで始まり、位置４１〜４４のいずれか１つで終わるフラグメント、または（ｉｉ）そのフラグメントに対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。さらに、特定の観点において、本発明は、下記のものを含むポリペプチドを提供する：（ａ）下記のものからなる第１ポリペプチド部分：（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９）の２９〜４１個の連続アミノ酸のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９の位置４〜１３のいずれか１つで始まり、位置４１〜４４のいずれか１つで終わるフラグメント、または（ｉｉ）そのフラグメントに対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列、および（ｂ）第２部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスなポリペプチド部分であるかまたは検出可能な標識である第２部分；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。
【００２３】
ある態様において、置換は保存的置換である。
【００２４】
特定の観点において、本発明は、下記のものからなる単離されたポリペプチドを提供する：（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９）の２９〜４１個の連続アミノ酸のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９の位置４〜１３のいずれか１つで始まり、位置４１〜４４のいずれか１つで終わるフラグメント、または（ｉｉ）そのフラグメントに対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、またはＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること。さらに、特定の観点において、本発明は、下記のものを含むポリペプチドを提供する：（ａ）下記のものからなる第１ポリペプチド部分：（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９）の２９〜４１個の連続アミノ酸のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９の位置４〜１３のいずれか１つで始まり、位置４１〜４４のいずれか１つで終わるフラグメント、または（ｉｉ）そのフラグメントに対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列、および（ｂ）第２部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスなポリペプチド部分であるかまたは検出可能な標識である第２部分；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、またはＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること。
【００２５】
ある観点において、本発明はまた、下記のものからなる単離されたポリペプチドを提供する：アミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7RGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０）の２９〜４１個の連続アミノ酸のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０の位置４〜１３のいずれか１つで始まり、位置４１〜４４のいずれか１つで終わるフラグメント；Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、独立していずれかのアミノ酸から選択され；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。さらに、ある観点において、本発明は、下記のものからなる単離されたポリペプチドを提供する：アミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7RGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０）の２９〜４１個の連続アミノ酸のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０の位置４〜１３のいずれか１つで始まり、位置４１〜４４のいずれか１つで終わるフラグメント；Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、独立していずれかのアミノ酸から選択され；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、またはＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること。
【００２６】
さらに、ある観点において、本発明は、下記のものを含むポリペプチドを提供する：（ａ）下記のものからなる第１ポリペプチド部分：（ｉ）アミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7RGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０）の２９〜４１個の連続アミノ酸のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０の位置４〜１３のいずれか１つで始まり、位置４１〜４４のいずれか１つで終わるフラグメント；その際、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、独立していずれかのアミノ酸から選択される、および（ｂ）第２部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスなポリペプチド部分であるかまたは検出可能な標識である第２部分；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。ある観点において、本発明は、下記のものを含むポリペプチドを提供する：（ａ）下記のものからなる第１ポリペプチド部分：（ｉ）アミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7RGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０）の２９〜４１個の連続アミノ酸のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０の位置４〜１３のいずれか１つで始まり、位置４１〜４４のいずれか１つで終わるフラグメント；その際、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、独立していずれかのアミノ酸から選択される、および（ｂ）第２部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスなポリペプチド部分であるかまたは検出可能な標識である第２部分；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、またはＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること。
【００２７】
特定の態様において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、独立してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１中の対応する位置またはその保存的置換から選択される。特定の態様において、第１ポリペプチド部分は第２ポリペプチド部分に対してＮ末端側にある。特定の態様において、第１ポリペプチド部分は第２ポリペプチド部分に対してＣ末端側にある。特定の態様において、ポリペプチドは−ＯＨのＣ末端部分を有する。特定の態様において、ポリペプチドはＣ末端においてアミド化されている。特定の態様において、ポリペプチドはアミノ酸６０個未満の長さである。
【００２８】
特定の態様において、ポリペプチドは検出可能な標識に連結している。特定の態様において、標識は放射性標識、蛍光標識、またはＭＲＩ検出可能な標識である。特定の態様において、放射性標識は、２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、１８Ｆ、３６Ｃｌ、３２Ｐ、３３Ｐ、４３Ｋ、４７Ｓｃ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、６７Ｃｕ、６８Ｇａ、７１Ｇｅ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、７７Ａｓ、７７Ｂｒ、８１Ｒｂ、８１ｍＫｒ、８７ＭＳｒ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１００Ｐｄ、１０１Ｒｈ、１０３Ｐｂ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１９Ｓｂ  １２１Ｓｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｃｓ、１２８Ｂａ、１２９Ｃｓ、１３１Ｉ、１３１Ｃｓ、１４３Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｕ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９１Ｏｓ、１９３Ｐｔ、１９４Ｉｒ、１９７Ｈｇ、１９９Ａｕ、２０３Ｐｂ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉまたは２１３Ｂｉである。特定の態様において、蛍光標識は、テキサスレッド、フィコエリトリン（ＰＥ）、シトクロムｃ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、蛍光性イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、量子ドット色素、フルオレセイン、ローダミン、ウンベリフェロン、ＤＲＡＱ５、アクリドン、キナクリドン、ランタニドキレート、ルテニウム錯体、タルトラジン、フィコシアニン、またはアロフィコシアニンである。特定の態様において、ＭＲＩ検出可能な標識は、常磁性イメージング剤、超常磁性酸化鉄粒子、磁鉄鉱粒子、フルオロカーボンイメージング試薬、Ｇｄキレート、またはＭｎキレートを含む。
【００２９】
ある観点において、本発明は、検出可能な標識に連結したＥＤＮ３様ポリペプチドを提供する。
【００３０】
特定の態様において、第２ポリペプチド部分は、（ｉ）ＩｇＧ重鎖に由来する定常部、（ｉｉ）Ｆｃドメイン、（ｉｉｉ）下記のものから選択される精製用配列：エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列、およびＧＳＴ融合体、または（ｉｖ）シグナル配列を含む。
【００３１】
特定の態様において、第２ポリペプチド部分は、下記のうち１以上のことができるポリペプチドをエンコードしない：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。
【００３２】
特定の態様において、ポリペプチドは単離されたポリペプチドである。特定の態様において、第２部分は検出可能な標識である。
【００３３】
特定の態様において、ポリペプチドはペプチドミメティックである。
【００３４】
特定の態様において、ポリペプチドはエンドセリン受容体Ａ（ＥＴＡ）に結合しない。特定の態様において、ポリペプチドはエンドセリン受容体Ｂ（ＥＴＢ）に結合しない。
【００３５】
特定の観点において、本発明は、医薬的に許容できるキャリヤーと配合した本発明のいずれかのポリペプチドを含む組成物を提供する。ある態様において、組成物は実質的に発熱物質を含まない。
【００３６】
特定の観点において、本発明は、ヒトまたは動物対象に投与するのに適した、医薬的に許容できるキャリヤーと配合した、下記のものからなる単離されたポリペプチドを含む組成物であって、実質的に非発熱性である組成物を提供する：（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９）、または（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９の位置１で始まり、位置４１〜４３のいずれか１つで終わるフラグメント；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。特定の観点において、本発明は、ヒトまたは動物対象に投与するのに適した、医薬的に許容できるキャリヤーと配合した、下記のものからなる単離されたポリペプチドを含む組成物であって、実質的に非発熱性である組成物を提供する：（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９）、または（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９の位置１で始まり、位置４１〜４３のいずれか１つで終わるフラグメント；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、またはＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること。
【００３７】
特定の観点において、本発明は、医薬的に許容できるキャリヤーと配合した、下記のものからなる単離されたポリペプチドを含む組成物であって、実質的に非発熱性である組成物を提供する：（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRESLRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１）、または（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１の位置１で始まり、位置４１〜４３のいずれか１つで終わるフラグメント；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。特定の観点において、本発明は、医薬的に許容できるキャリヤーと配合した、下記のものからなる単離されたポリペプチドを含む組成物であって、実質的に非発熱性である組成物を提供する：（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRESLRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１）、または（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１の位置１で始まり、位置４１〜４３のいずれか１つで終わるフラグメント；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、またはＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること。
【００３８】
特定の観点において、本発明は、ヒトまたは動物対象に投与するのに適した、医薬的に許容できるキャリヤーと配合した、下記のものからなるポリペプチドを含む組成物であって、実質的に非発熱性である組成物を提供する：（ａ）下記のものからなる第１ポリペプチド部分：（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９）、または（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９の位置１で始まり、位置４１〜４３のいずれか１つで終わるフラグメント、および（ｂ）第２部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスなポリペプチド部分であるかまたは検出可能な標識である第２部分；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。特定の観点において、本発明は、ヒトまたは動物対象に投与するのに適した、医薬的に許容できるキャリヤーと配合した、下記のものからなるポリペプチドを含む組成物であって、実質的に非発熱性である組成物を提供する：（ａ）下記のものからなる第１ポリペプチド部分：（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９）、または（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９の位置１で始まり、位置４１〜４３のいずれか１つで終わるフラグメント、および（ｂ）第２部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスなポリペプチド部分であるかまたは検出可能な標識である第２部分；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、またはＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること。
【００３９】
特定の観点において、本発明は、医薬的に許容できるキャリヤーと配合した、下記のものからなるポリペプチドを含む組成物であって、実質的に非発熱性である組成物を提供する：（ａ）下記のものからなる第１ポリペプチド部分：（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRESLRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１）、または（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１の位置１で始まり、位置４１〜４３のいずれか１つで終わるフラグメント、および（ｂ）第２部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスなポリペプチド部分であるかまたは検出可能な標識である第２部分；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。特定の観点において、本発明は、医薬的に許容できるキャリヤーと配合した、下記のものからなるポリペプチドを含む組成物であって、実質的に非発熱性である組成物を提供する：（ａ）下記のものからなる第１ポリペプチド部分：（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRESLRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１）、または（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１の位置１で始まり、位置４１〜４３のいずれか１つで終わるフラグメント、および（ｂ）第２部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスなポリペプチド部分であるかまたは検出可能な標識である第２部分；ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、またはＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること。
【００４０】
ある態様において、組成物はさらに抗糖尿病薬を含む。ある態様において、組成物はさらに抗肥満症薬を含む。
【００４１】
特定の観点において、本発明は、下記のものを含む単離された核酸を提供する：（ａ）本明細書に記載するＥＤＮ３様ポリペプチドをコードする配列からなる第１核酸部分、および（ｂ）第２核酸部分であって、第１核酸部分に対してヘテロロガスである第２核酸部分；パート（ａ）のアミノ酸配列は下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。特定の観点において、本発明は、下記のものを含む単離された核酸を提供する：（ａ）本明細書に記載するＥＤＮ３様ポリペプチドをコードする配列からなる第１核酸部分、および（ｂ）第２核酸部分であって、第１核酸部分に対してヘテロロガスである第２核酸部分；パート（ａ）のアミノ酸配列は下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、またはＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること。
【００４２】
ある態様において、第１核酸部分はアミノ酸４４個を超える長さのアミノ酸配列をコードしない。ある態様において、単離された核酸はアミノ酸６０個を超える長さのポリペプチドをコードしない。ある態様において、第１核酸部分は第２核酸部分の上流にある。ある態様において、第１核酸部分は第２核酸部分の下流にある。ある態様において、単離された核酸は融合タンパク質をコードする。ある態様において、第２核酸部分はプロモーター配列である。ある態様において、第２核酸部分は選択マーカーである。
【００４３】
特定の観点において、本発明はまた、本明細書に記載するＥＤＮ３様ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む発現ベクターを提供する。ある態様において、核酸は作動可能な状態でヘテロロガスなプロモーター配列に連結している。
【００４４】
特定の観点において、本発明はまた、本明細書に記載するＥＤＮ３様ポリペプチドをコードする発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。特定の観点において、本発明はまた、本明細書に記載する核酸を含む宿主細胞を提供する。
【００４５】
特定の観点において、本発明は、本明細書に記載するＥＤＮ３様ポリペプチドを調製する方法であって、（ａ）そのポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を用意し、そして（ｂ）その細胞を、そのポリペプチドの産生が可能な条件下で培養することを含む方法を提供する。ある態様において、この方法はさらに、（ｃ）ポリペプチドを単離する段階を含む。
【００４６】
特定の観点において、本発明は、本明細書に記載するＥＤＮ３様ポリペプチドを調製する方法であって、そのポリペプチドを化学合成することを含む方法を提供する。ある態様において、この方法はさらに、ポリペプチドのＣ末端アミノ酸をアミド化することを含む。
【００４７】
特定の観点において、本発明は、代謝性の疾患または障害を処置する方法であって、その必要がある対象に有効量のＥＤＮ３様ポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。
【００４８】
特定の観点において、本発明は、代謝性の疾患または障害を処置する方法であって、その必要がある対象に有効量のＥＤＮ３様ポリペプチドを含む組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００４９】
特定の観点において、本発明は、代謝性の疾患または障害を処置する方法であって、その必要がある対象に有効量のアミノ酸６０個以下の長さの単離されたポリペプチドを投与することを含み、その際、ポリペプチドがアミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００５０】
特定の観点において、本発明は、代謝性の疾患または障害を処置する方法であって、その必要がある対象に有効量の下記のものを含むポリペプチドを投与することを含み：（ａ）アミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド部分であって、アミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２ポリペプチド部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスである第２ポリペプチド部分；その際、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００５１】
ある態様において、置換は保存的置換である。ある態様において、ポリペプチドは、アミノ酸配列YKDKECVYYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、第１ポリペプチド部分は、アミノ酸配列YKDKECVYYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、ポリペプチドは、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、第１ポリペプチド部分は、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む。
【００５２】
ある態様において、ポリペプチドは、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPY（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、第１ポリペプチド部分は、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPY（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、ポリペプチドは、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、第１ポリペプチド部分は、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む。
【００５３】
ある態様において、ポリペプチドは、アミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、第１ポリペプチド部分は、アミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、ポリペプチドは、アミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、第１ポリペプチド部分は、アミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む。
【００５４】
ある態様において、ポリペプチドは、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、第１ポリペプチド部分は、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、ポリペプチドは、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGS（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、第１ポリペプチド部分は、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGS（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、ポリペプチドは前記の１、２もしくは３つの置換を含む。ある態様において、ポリペプチドは前記の１、２もしくは３つの置換を含まない。
【００５５】
特定の観点において、本発明は、代謝性の疾患または障害を処置する方法であって、その必要がある対象に有効量のアミノ酸６０個以下の長さの単離されたポリペプチドを投与することを含み、その際、ポリペプチドがアミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含み、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００５６】
特定の観点において、本発明は、代謝性の疾患または障害を処置する方法であって、その必要がある対象に有効量の下記のものを含むポリペプチドを投与することを含み：（ａ）アミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含む第１ポリペプチド部分であって、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、アミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２ポリペプチド部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスである第２ポリペプチド部分；その際、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００５７】
ある態様において、Ｘ４およびＸ５は、独立してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１中の対応する位置またはその保存的置換から選択される。ある態様において、ポリペプチドはアミノ酸配列YKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５）を含み、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択される。ある態様において、第１ポリペプチド部分はアミノ酸配列YKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５）を含み、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択される。ある態様において、ポリペプチドはアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQT（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３）を含み、その際：Ｘ１およびＸ４はＣであり、かつＸ２およびＸ３は独立していずれかのアミノ酸から選択されるか、あるいはＸ２およびＸ３はＣであり、かつＸ１およびＸ４は独立していずれかのアミノ酸から選択され、Ｘ５はいずれかのアミノ酸である。ある態様において、ポリペプチドはアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7R（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４）を含み、その際：Ｘ１およびＸ４はＣであり、かつＸ２およびＸ３はＡであるか、あるいはＸ２およびＸ３はＣであり、かつＸ１およびＸ４はＡであり、Ｘ５はＷ、ＦまたはＹであり、Ｘ６はＥまたはＧであり、Ｘ７はＬまたはＦである。ある態様において、ポリペプチドはアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択される。ある態様において、第１ポリペプチド部分はアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択される。
【００５８】
ある態様において、ポリペプチドはアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPY（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択される。ある態様において、第１ポリペプチド部分はアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPY（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択される。ある態様において、ポリペプチドはアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7R（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は独立していずれかのアミノ酸から選択される。ある態様において、第１ポリペプチド部分はアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7R（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は独立していずれかのアミノ酸から選択される。ある態様において、ポリペプチドはアミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7R（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６）を含み、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は独立していずれかのアミノ酸から選択される。ある態様において、第１ポリペプチド部分はアミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7R（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６）を含み、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は独立していずれかのアミノ酸から選択される。
【００５９】
ある態様において、ポリペプチドはアミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7RGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８）を含み、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は独立していずれかのアミノ酸から選択される。ある態様において、第１ポリペプチド部分はアミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7RGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８）を含み、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は独立していずれかのアミノ酸から選択される。ある態様において、ポリペプチドはアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7RGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は独立していずれかのアミノ酸から選択される。ある態様において、第１ポリペプチド部分はアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7RGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は独立していずれかのアミノ酸から選択される。ある態様において、ポリペプチドはアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6S（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６は独立していずれかのアミノ酸から選択される。ある態様において、第１ポリペプチド部分はアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6S（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６は独立していずれかのアミノ酸から選択される。
【００６０】
ある態様において、Ｘ４はＣ、ＳまたはＡである。ある態様において、Ｘ５はＷまたはＡである。ある態様において、Ｘ１はＳまたはＣである。ある態様において、Ｘ２はＳまたはＣである。ある態様において、Ｘ３はＳまたはＣである。ある態様において、Ｘ６はＧまたはＥである。ある態様において、Ｘ７はＦまたはＬである。
【００６１】
ある態様において、代謝性の疾患または障害は肥満症である。ある態様において、代謝性の疾患または障害はＩ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病である。ある態様において、代謝性の疾患または障害はインスリン抵抗性である。ある態様において、代謝性の疾患または障害は脂質代謝障害である。ある態様において、代謝性の疾患または障害は高脂血症である。ある態様において、代謝性の疾患または障害は高コレステロール血症である。ある態様において、代謝性の疾患または障害は脂肪酸代謝障害である。
【００６２】
特定の観点において、本発明は、深部体温を上昇させる方法であって、その必要がある対象に有効量のＥＤＮ３様ポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。特定の観点において、本発明は、深部体温を上昇させる方法であって、その必要がある対象に有効量のＥＤＮ３様ポリペプチドを含む組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００６３】
特定の観点において、本発明は、深部体温を上昇させる方法であって、その必要がある対象に有効量のアミノ酸残基６０個以下の長さの単離されたポリペプチドを投与することを含み、その際、ポリペプチドがアミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００６４】
特定の観点において、本発明は、深部体温を上昇させる方法であって、その必要がある対象に有効量の下記のものを含むポリペプチドを投与することを含み：（ａ）アミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド部分であって、アミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２ポリペプチド部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスである第２ポリペプチド部分；その際、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００６５】
特定の観点において、本発明は、深部体温を上昇させる方法であって、その必要がある対象に有効量のアミノ酸残基６０個以下の長さの単離されたポリペプチドを投与することを含み、その際、ポリペプチドがアミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含み、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００６６】
特定の観点において、本発明は、深部体温を上昇させる方法であって、その必要がある対象に有効量の下記のものを含むポリペプチドを投与することを含み：（ａ）アミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含む第１ポリペプチド部分であって、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、アミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２ポリペプチド部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスである第２ポリペプチド部分；その際、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００６７】
特定の観点において、本発明は、エネルギー消費を増大させる方法であって、その必要がある対象に有効量のＥＤＮ３様ポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。
【００６８】
特定の観点において、本発明は、エネルギー消費を増大させる方法であって、その必要がある対象に有効量のＥＤＮ３様ポリペプチドを含む組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００６９】
特定の観点において、本発明は、エネルギー消費を増大させる方法であって、その必要がある対象に有効量のアミノ酸残基６０個以下の長さの単離されたポリペプチドを投与することを含み、その際、ポリペプチドがアミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００７０】
特定の観点において、本発明は、エネルギー消費を増大させる方法であって、その必要がある対象に有効量の下記のものを含むポリペプチドを投与することを含み：（ａ）アミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド部分であって、アミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２ポリペプチド部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスである第２ポリペプチド部分；その際、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００７１】
特定の観点において、本発明は、エネルギー消費を増大させる方法であって、その必要がある対象に有効量のアミノ酸残基６０個以下の長さの単離されたポリペプチドを投与することを含み、その際、ポリペプチドがアミノ酸配列YYXHLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含み、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００７２】
特定の観点において、本発明は、エネルギー消費を増大させる方法であって、その必要がある対象に有効量の下記のものを含むポリペプチドを投与することを含み：（ａ）アミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含む第１ポリペプチド部分であって、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、アミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２ポリペプチド部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスである第２ポリペプチド部分；その際、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００７３】
特定の観点において、ポリペプチドは下記のうち１以上のことができる：肝細胞におけるグルコース産生を阻害すること、ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進すること、骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進すること、または脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進すること。
【００７４】
特定の観点において、本発明は、肝細胞におけるグルコース産生を阻害する方法であって、肝細胞を有効量のＥＤＮ３様ポリペプチドと接触させることを含む方法を提供する。特定の観点において、本発明は、肝細胞におけるグルコース産生を阻害する方法であって、肝細胞を有効量のＥＤＮ３様ポリペプチドを含む組成物と接触させることを含む方法を提供する。
【００７５】
特定の観点において、本発明は、肝細胞におけるグルコース産生を阻害する方法であって、肝細胞を有効量のアミノ酸残基６０個以下の長さの単離されたポリペプチドと接触させることを含み、その際、ポリペプチドがアミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００７６】
特定の観点において、本発明は、肝細胞におけるグルコース産生を阻害する方法であって、肝細胞を有効量の下記のものを含むポリペプチドと接触させることを含み：（ａ）アミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド部分であって、アミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２ポリペプチド部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスである第２ポリペプチド部分；その際、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００７７】
特定の観点において、本発明は、肝細胞におけるグルコース産生を阻害する方法であって、肝細胞を有効量のアミノ酸残基６０個以下の長さの単離されたポリペプチドと接触させることを含み、その際、ポリペプチドがアミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含み、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００７８】
特定の観点において、本発明は、肝細胞におけるグルコース産生を阻害する方法であって、肝細胞を有効量の下記のものを含むポリペプチドと接触させることを含み：（ａ）アミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含む第１ポリペプチド部分であって、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、アミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２ポリペプチド部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスである第２ポリペプチド部分；その際、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００７９】
特定の観点において、本発明は、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）分泌を促進する方法であって、腸細胞を有効量のＥＤＮ３様ポリペプチドと接触させることを含む方法を提供する。特定の観点において、本発明は、ＧＬＰ−１分泌を促進する方法であって、腸細胞を有効量のＥＤＮ３様ポリペプチドを含む組成物と接触させることを含む方法を提供する。
【００８０】
特定の観点において、本発明は、ＧＬＰ−１分泌を促進する方法であって、腸細胞を有効量のアミノ酸残基６０個以下の長さの単離されたポリペプチドと接触させることを含み、その際、ポリペプチドがアミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００８１】
特定の観点において、本発明は、ＧＬＰ−１分泌を促進する方法であって、腸細胞を有効量の下記のものを含むポリペプチドと接触させることを含み：（ａ）アミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド部分であって、アミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２ポリペプチド部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスである第２ポリペプチド部分；その際、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００８２】
特定の観点において、本発明は、ＧＬＰ−１分泌を促進する方法であって、腸細胞を有効量のアミノ酸残基６０個以下の長さの単離されたポリペプチドと接触させることを含み、その際、ポリペプチドがアミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含み、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００８３】
特定の観点において、本発明は、ＧＬＰ−１分泌を促進する方法であって、腸細胞を有効量の下記のものを含むポリペプチドと接触させることを含み：（ａ）アミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含む第１ポリペプチド部分であって、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、アミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２ポリペプチド部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスである第２ポリペプチド部分；その際、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００８４】
ある態様において、腸細胞は結腸細胞またはＧＬＵＴａｇ細胞である。
【００８５】
特定の観点において、本発明は、骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進する方法であって、骨格筋細胞を有効量のＥＤＮ３様ポリペプチドと接触させることを含む方法を提供する。特定の観点において、本発明は、骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進するする方法であって、骨格筋細胞を有効量のＥＤＮ３様ポリペプチドを含む組成物と接触させることを含む方法を提供する。
【００８６】
特定の観点において、本発明は、骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進する方法であって、骨格筋細胞を有効量のアミノ酸残基６０個以下の長さの単離されたポリペプチドと接触させることを含み、その際、ポリペプチドがアミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００８７】
特定の観点において、本発明は、骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進する方法であって、骨格筋細胞を有効量のアミノ酸残基６０個以下の長さの単離されたポリペプチドと接触させることを含み、その際、ポリペプチドがアミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含み、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００８８】
特定の観点において、本発明は、骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進する方法であって、骨格筋細胞を有効量の下記のものを含むポリペプチドと接触させることを含み：（ａ）アミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含む第１ポリペプチド部分であって、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、アミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２ポリペプチド部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスである第２ポリペプチド部分；その際、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００８９】
特定の観点において、本発明は、脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進する方法であって、脂肪細胞を有効量のＥＤＮ３様ポリペプチドと接触させることを含む方法を提供する。特定の観点において、本発明は、脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進する方法であって、脂肪細胞を有効量のＥＤＮ３様ポリペプチドを含む組成物と接触させることを含む方法を提供する。
【００９０】
特定の観点において、本発明は、脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進する方法であって、脂肪細胞を有効量のアミノ酸残基６０個以下の長さの単離されたポリペプチドと接触させることを含み、その際、ポリペプチドがアミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００９１】
特定の観点において、本発明は、脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進する方法であって、脂肪細胞を有効量の下記のものを含むポリペプチドと接触させることを含み：（ａ）アミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド部分であって、アミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２ポリペプチド部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスである第２ポリペプチド部分、その際、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００９２】
特定の観点において、本発明は、脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進する方法であって、脂肪細胞を有効量のアミノ酸残基６０個以下の長さの単離されたポリペプチドと接触させることを含み、その際、ポリペプチドがアミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含み、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００９３】
特定の観点において、本発明は、脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進する方法であって、脂肪細胞を有効量の下記のものを含むポリペプチドと接触させることを含み：（ａ）アミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含む第１ポリペプチド部分であって、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、アミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分、および（ｂ）第２ポリペプチド部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスである第２ポリペプチド部分；その際、ポリペプチドが胃抑制ペプチドを含まない方法を提供する。
【００９４】
ある態様において、脂肪細胞はヒトの脂肪幹細胞（ｈＡＳＣ）またはヒトの間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）に由来する。
【００９５】
ある態様において、この方法はインビトロで実施される。ある態様において、この方法はインビボで実施される。ある態様において、ポリペプチドはエンドセリン受容体Ａ（ＥＴＡ）に結合しない。ある態様において、ポリペプチドはエンドセリン受容体Ｂ（ＥＴＢ）に結合しない。ある態様において、ポリペプチドはペプチドミメティックである。
【００９６】
ある態様において、ポリペプチドはアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQT（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３）を含み、その際：Ｘ１およびＸ４はＣであり、かつＸ２およびＸ３は独立していずれかのアミノ酸から選択されるか、あるいはＸ２およびＸ３はＣであり、かつＸ１およびＸ４は独立していずれかのアミノ酸から選択され、Ｘ５はいずれかのアミノ酸である。
【００９７】
ある態様において、ポリペプチドはアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7R（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４）を含み、その際：Ｘ１およびＸ４はＣであり、かつＸ２およびＸ３はＡであるか、あるいはＸ２およびＸ３はＣであり、かつＸ１およびＸ４はＡであり、Ｘ５はＷ、ＦまたはＹであり、Ｘ６はＥまたはＧであり、Ｘ７はＬまたはＦである。
【００９８】
ある態様において、第１ポリペプチド部分はアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQT（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３）を含み、その際：Ｘ１およびＸ４はＣであり、かつＸ２およびＸ３は独立していずれかのアミノ酸から選択されるか、あるいはＸ２およびＸ３はＣであり、かつＸ１およびＸ４は独立していずれかのアミノ酸から選択され、Ｘ５はいずれかのアミノ酸である。
【００９９】
ある態様において、ポリペプチドはアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7R（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４）を含み、その際：Ｘ１およびＸ４はＣであり、かつＸ２およびＸ３はＡであるか、あるいはＸ２およびＸ３はＣであり、かつＸ１およびＸ４はＡであり、Ｘ５はＷ、ＦまたはＹであり、Ｘ６はＥまたはＧであり、Ｘ７はＬまたはＦである。
【０１００】
特定の観点において、本発明は、温感受性ニューロンを同定する方法であって、脳組織試料を、アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９）またはCTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRESLRGKR（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１）を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体と接触させることを含む方法を提供する。
【０１０１】
特定の観点において、本発明は、温感受性ニューロンを同定する方法であって、脳組織試料を、アミノ酸配列YYCHLDIIWINTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）を含むポリペプチドをコードする核酸に緊縮条件下でハイブリダイズする核酸プローブまたはプライマーと接触させることを含む方法を提供する。
【０１０２】
特定の観点において、本発明は、ＥＤＮ３様受容体を同定する方法であって、（ａ）被験細胞をＥＤＮ３様ポリペプチドおよび受容体阻害物質と接触させ、（ｂ）対照細胞をＥＤＮ３様ポリペプチドと接触させ、そして（ｃ）被験細胞および対照細胞のＥＤＮ３様応答を測定することを含む方法を提供し、その際、被験細胞と比較して対照細胞のＥＤＮ３様応答がより大きいことは、その受容体阻害物質により阻害された受容体がＥＤＮ３様受容体であることの指標となる。
【０１０３】
特定の観点において、本発明は、ＥＤＮ３様受容体を同定する方法であって、（ａ）被験細胞をＥＤＮ３様ポリペプチドと接触させ、その際、被験細胞は受容体の活性を低下させる変異を含み、（ｂ）対照細胞をＥＤＮ３様ポリペプチドと接触させ、その際、対照細胞はその受容体の野生型活性を含み、そして（ｃ）被験細胞および対照細胞のＥＤＮ３様応答を測定することを含む方法を提供し、その際、被験細胞と比較して対照細胞のＥＤＮ３様応答がより大きいことは、その受容体アンタゴニストにより阻害された受容体がＥＤＮ３様受容体であることの指標となる。
【０１０４】
特定の観点において、本発明は、推定ＥＤＮ３様受容体を同定する方法であって、細胞溶解物をＥＤＮ３様ポリペプチドと接触させ、そしてＥＤＮ３様ポリペプチドを結合するタンパク質を単離することを含む方法を提供し、その際、ＥＤＮ３様ポリペプチドを結合するタンパク質は推定ＥＤＮ３様受容体である。
【０１０５】
特定の観点において、本発明は、ＥＤＮ３様受容体を同定する方法であって、ＥＤＮ３様ポリペプチドを候補受容体と接触させ、そしてＥＤＮ３様ポリペプチドが候補受容体を結合するかどうかを判定することを含む方法を提供し、その際、結合することはその候補受容体がＥＤＮ３様受容体であることの指標となる。
【０１０６】
特定の観点において、本発明は、対象材料のイメージを作成する方法であって、（ａ）複数の細胞を含む対象材料を用意し、その際、細胞のサブセットは検出可能な量の検出可能な状態に標識されたＥＤＮ３様化合物を含み；そして（ｂ）細胞をイメージングすることを含む方法を提供する。特定の観点において、本発明は、対象材料のイメージを作成する方法であって、（ａ）複数の細胞を含む対象材料を用意し、その際、細胞のサブセットは検出可能な量の検出可能な状態に標識されたＥＤＮ３様ポリペプチドを含み；そして（ｂ）細胞をイメージングすることを含む方法を提供する。検出可能な標識は、たとえば放射性標識、ＭＲＩ検出可能な標識、または蛍光標識であってもよい。細胞は、たとえば放射能の検出（たとえば、ガンマカメラによる）、蛍光の検出（たとえば、ＣＣＤカメラによる）、またはＭＲＩによりイメージングすることができる。このイメージング（またはイメージを作成する）方法は、特定の態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドに対する受容体を発現する細胞および組織を同定するために使用できることを留意されたい。
【０１０７】
前記のいずれか特定の態様において、本発明方法のいずれかに使用するためのＥＤＮ３様ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜３３のいずれかに提示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。特定の態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドはアミノ酸６０個以下のポリペプチドであり、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜３３のいずれかに提示されるアミノ酸配列を含む。他の態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドは、アミノ酸が５０個以下、またはアミノ酸が約４０個、またはアミノ酸が約４４〜６０個のポリペプチドである。そのようなＥＤＮ３様ポリペプチドを、単独で、または第２のヘテロロガスポリペプチド部分（たとえば、Ｆｃドメイン、エピトープタグ、リンカーなど）に融合した融合タンパク質の一部として提供することができる。特に、そのようないずれかのＥＤＮ３様ポリペプチドならびに他のいずれかのＥＤＮ３様ポリペプチドおよびバリアントを、本明細書に記載するいずれかの方法に使用でき、ならびに／あるいは単離されたポリペプチドまたは融合タンパク質として提供できることを考慮する。
【０１０８】
本発明は、前記の観点および／または態様のうち１以上の組合わせ、ならびに発明を実施するための形態および実施例に述べるいずれか１以上の態様との組合わせをすべて考慮する。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、マウス視床下部に由来する長鎖エンドセリン−３の一次配列を示す。アルギニンおよびリジン開裂部位を同定するためにＰｒｏＰ  １．０分析を用いて、エンドセリン−３の２つのプロペプチド開裂部位を同定し、アミノ酸４４個のペプチドが得られた。シグナル配列をＳにより表記する。この分析から推定したペプチドを、対応する開裂部位と共にＰにより注記する。
【図２】図２は、ＥＤＮ３  ９７−１４０がラット大動脈において血管収縮応答を誘発しないことを示す。３ｐＭ〜１０μＭのＥＤＮ３  ９７−１４０は、摘出ラット大動脈輪において収縮応答を誘発しなかった。これに対し、エンドセリン−１（ＥＣ５０  ２．７±１ｎＭ）およびエンドセリン−３（ＥＣ５０  １０２±６３ｎＭ）はこのモデルにおいて濃度依存性収縮を強く誘発した（ｎ＝４〜６；ｐ＞０．０５）。
【図３】図３Ａｉ〜３Ｃは、ＥＤＮ３  ９７−１４０が呼吸交換率（ＲＥＲ）を低下させ、深部体温（ＣＢＴ）を上昇させることを示す。マウス（グループ当たり６匹）を、２．５ｎｍｏｌのＥＤＮ３  ９７−１４０またはビヒクルで視索前野（ＰＯＡ）への直接注射により処理した。ビヒクル処理マウスと比較して、ＥＤＮ３  ９７−１４０注射後にＲＥＲの曲線下面積（ＡＵＣ）は１．４６±０．２５減少し（ｐ＝０．００２；ＡｉおよびＢ）、ＣＢＴのＡＵＣは１４．９７±２．８５増大した（ｐ＝０．００２；ＡｉｉおよびＣ）。結果は平均ＡＵＣ±ＳＥＭである。ＲＥＲおよびＣＢＴに対する持続的効果とは対照的に、ＥＤＮ３  ９７−１４０を投与した時点で一過性の歩行活動亢進スパイクが認められた（Ａｉｉｉ）。
【図４】図４Ａｉ〜Ｂｉｉは、ＥＤＮ３  ９７−１４０がｏｂ／ｏｂおよびＤＩＯマウスにおいてグルコース耐性を改善することを示す。ＥＤＮ３  ９７−１４０の単回ボーラス投与（ｉ．ｐ．）に続いて、一夜絶食した後、ｏｂ／ｏｂまたはＤＩＯマウスにおけるそれぞれ０．６ｍｇ／ｋｇまたは２ｇ／ｋｇのグルコース攻撃（ｉ．ｐ．）に続いて血糖値を測定した。ｏｂ／ｏｂマウスにおいては、１ｍｇ／ｋｇで３５．１±１３％のグルコース減少、および１０ｍｇ／ｋｇで３１．３±６．９％の減少が生じた（Ａｉ）。さらに、１０ｍｇ／ｋｇで３０分目にインスリン分泌増大の傾向がみられたが、これは統計的に有意ではなかった（ｐ＞０．０５；Ａｉｉ）。同様に、ＤＩＯマウスにおいては、０．１ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇでグルコース変動(glucose excursion)がそれぞれ１９±７．２％および２０．７±８．７％低下し（Ｂｉ）、インスリンに対しては影響がなかった（ｐ＞０．０５；Ｂｉｉ）。データを平均±ＳＥＭ（グループ当たりｎ＝８）として提示し、＊はｐ＜０．０５を表わす。
【図５】図５Ａ〜Ｄは、ＥＤＮ３  ９７−１４０が、インビトロでＧＬＵＴａｇ細胞から、およびエクスビボでラット結腸から、ＧＬＰ−１分泌を刺激することを示す。ＥＤＮ３  ９７−１４０は、３つの独立した実験にわたって、ＧＬＵＴａｇ細胞からのＧＬＰ−１分泌を３６９ｎＭ±６８ｎＭのＥＣ５０で刺激する（Ａｉ）。ＧＬＵＴａｇ細胞をビヒクルまたは０．２μｇ／ｍＬのコレラ毒素（ＣＴＸ）で一夜、前処理し、次いでＥＤＮ３  ９７−１４０（１μＭ）またはビヒクル対照で処理した。非−サブタイプ選択的なＥＴＡ／ＥＴＢアンタゴニストであるボセンタン(bosentan)（１μＭ）は、ＥＤＮ３  ９７−１４０刺激によるＧＬＵＴａｇ細胞からのＧＬＰ−１分泌を阻害しなかった（図５Ｂ）。ＥＤＮ３  ９７−１４０（１μＭ）刺激によるＧＬＰ−１分泌はビヒクルの３２７±５９％であり、ＣＴＸによる一夜の前処理はＥＤＮ３  ９７−１４０刺激によるＧＬＰ−１分泌をビヒクルの１３９±１９％に低下させた（ｐ＝０．０１２；図５Ｃ）。ＥＤＮ３  ９７−１４０（２００ｎＭ）は、ラット潅流結腸からのＧＬＰ分泌の５６±１８％増大を誘発した（ｐ＝０．０４３８）。陽性対照ホルスコリン(forskolin)（１μＭ）は、ＧＬＰ−１放出を１７１７±３５０％増大させた（ｐ＝０．０３９８；図５Ｄ）。
【図６】図６は、ＥＤＮ３  ９７−１４０が糖新生を抑制することを示す。Ｈ４ＩＩＥラット肝細胞を１００ｎＭのＥＤＮ３  ９７−１４０で一夜処理すると、基礎グルコース産生がビヒクルと対比して有意に１９．５±７．６％低下した（ｐ＝０．０１）。データを３つの独立した実験の平均±ＳＥＭとしてグラフで示す。
【図７】図７は、ハツカネズミ(Mus musculus)由来のプレプロエンドセリン−３の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１０】
１．ＥＤＮ３様ポリペプチド組成物
本発明は、一部は、本明細書中でＥＤＮ３  ９７−１４０と呼ぶ短いポリペプチドの同定、およびこのポリペプチドがグルコース代謝および体温調節に影響を及ぼすという知見に基づく。ＥＤＮ３  ９７−１４０は、プレプロエンドセリン−３の開裂により体内産生される可能性のある短いポリペプチドである。前駆物質プレプロエンドセリン−３のタンパク質分解性開裂により、エンドセリン−３として知られる異なるペプチドも生成する。ＥＤＮ３  ９７−１４０とエンドセリン−３は共通のＮ末端をもつが、エンドセリン−３はわずかアミノ酸２１個の長さであり、一方、ＥＤＮ３  ９７−１４０はアミノ酸４４個の長さである。これらの構造上の違いのほかに、ＥＤＮ３  ９７−１４０とエンドセリン−３は異なる機能活性をもつ。たとえば、ＥＤＮ３  ９７−１４０は腸内分泌細胞からのＧＬＰ−１放出を促進し、エンドセリン−３は促進しない（実施例６）。逆に、エンドセリン−３は大動脈収縮を促進し、ＥＤＮ３  ９７−１４０は促進しない（実施例２）。さらに、ＥＤＮ３  ９７−１４０とエンドセリン−３の活性は異なる受容体により仲介される。
【０１１１】
本発明は、ＥＤＮ３様ポリペプチドを提供する。本明細書には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３３のいずれかに述べる配列を含むポリペプチドまたはそのバリアントを含有するペプチド療法薬を記載し、これらの配列を後記の表１に挙げる。ある場合にはポリペプチドは短いペプチドフラグメントであり、他の場合にはポリペプチドは他のポリペプチド部分との融合体として提供される。本明細書全体を通して、用語、ＥＤＮ３様ポリペプチドは、目的活性をもつペプチドおよび融合体を表わすために互換性をもって用いられるであろう。表１中の具体的配列のうち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９および２１は、それぞれヒトおよびマウスにおける対応する内因性ペプチドに相当するであろう（参照：実施例１）。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９および２１はプレプロエンドセリン  ３の開裂により生成すると推定されるので、それぞれｈＥＤＮ３  ９７−１４０およびＥＤＮ３  ９７−１４０と命名されている（実施例１）。これらはＥＤＮ３様ポリペプチドの２つの例である。
【０１１２】
ｈＥＤＮ３  ９７−１４０およびＥＤＮ３  ９７−１４０、および表１の他のペプチド、ならびにその融合タンパク質およびバリアントを、本明細書中でＥＤＮ３様ポリペプチドと総称する。しかし、ＥＤＮ３様ポリペプチドはエンドセリン３がもたない活性をもつ。たとえば、実施例５に示すように、ＥＤＮ３  ９７−１４０はＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を刺激し、エンドセリン−３は刺激しない。したがって、ＥＤＮ３様ポリペプチドは下記のものから選択される１以上の活性をもつ：ＧＬＰ−１放出の促進、肝臓における糖新生の阻害、深部体温の上昇、および呼吸交換率の増大。用語“ＥＤＮ３様ポリペプチド”は、エンドセリン−３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）およびプレプロエンドセリン−３を除外する。用語、ポリペプチドとペプチドが全体を通して互換性をもって用いられることを留意されたい。
【０１１３】
ＥＤＮ３様ポリペプチドの活性は、本明細書に開示するアッセイ法のうち１以上により測定できる。たとえば、実施例５は、幾つかのＥＤＮ３様ポリペプチドがＧＬＰ−１放出活性をもつことを示す。さらに、実施例８は、ＥＤＮ３様ポリペプチドが肝細胞における糖新生を阻害する能力をアッセイするための方法を開示する。さらに、実施例３は、マウスにおいて高体温および呼吸交換率をアッセイするための方法を開示する。若干のＥＤＮ３様ポリペプチドは、ＥＤＮ３  ９７−１４０のようにすべてのアッセイにおいて活性をもつ。しかし、本発明は、使用に適した若干のＥＤＮ３様ポリペプチドがサブセットのアッセイ（たとえば、１、２、３など）において活性をもつ可能性があることを考慮する。本明細書に開示するアッセイ法に従って、そのＥＤＮ３様ポリペプチドがどの活性をもつかを判定でき、したがって本発明方法に使用するのに適したポリペプチドを容易に作製、試験および選択することができる。
【０１１４】
ＥＤＮ３様ポリペプチドにはバリアントが含まれる。ＥＤＮ３様アミノ酸配列の若干の位置（たとえば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２残基Ｘ６およびＸ７）において、種間配列比較を考慮に入れてバリアントを設計した；かつ設計することができる。ある例では（たとえば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残基Ｘ５）、実験データに基づいてバリアントを設計した；かつ設計することができる。特定の例、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および３では、特定のトランケーション変異体の活性に基づいてコア領域を同定した。可変残基およびコア領域を同定するために用いた実験をより詳細に実施例６に記載する。
【０１１５】
【表１−１】
2014513923.tif 000003
【０１１６】
【表１−２】
2014513923.tif 000004
【０１１７】
表１のペプチドに対して相同な領域を含むペプチド（たとえば、バリアント）も、本発明の方法および組成物に使用できる。たとえば、ヒトおよびマウスのＥＤＮ３様配列を本明細書に開示しているので、当業者はある生物に由来するアミノ酸配列またはその一部を他の生物に由来する相同アミノ酸配列で容易に置換することができる。特定の観点において、本出願は、表１のペプチドに対比して１、２もしくは３つの置換をもつ領域を含むポリペプチド、またはその活性フラグメントを提供する。置換を含むＥＤＮ３様ポリペプチドについて、その置換は（ある態様において）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９または２１中の対応する残基の保存的置換であってもよいと理解される。表１に挙げるペプチドのうち特定のものは、Ｘで表わされる可変残基を含む。時には、可変残基の素性は、自然界でヒトまたはマウスの配列中のその位置にあるアミノ酸である。特定の観点において、本出願は、表１のペプチドに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を備えた領域をもつポリペプチドを提供する。
【０１１８】
たとえば、ある態様において本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３３のいずれかに述べる配列もしくはそのバリアントを含むかまたはそれからなるＥＤＮ３様ポリペプチドを提供する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３３のいずれかに述べる配列を含む、アミノ酸残基６０個以下の長さをもつＥＤＮ３様ポリペプチドも考慮される（たとえば、そのポリペプチドはその配列を含むが、そのポリペプチドの全長はアミノ酸残基６０個以下である）。その配列が可変残基を含む場合、それぞれの可変アミノ酸は、ある態様においては独立していずれかのアミノ酸から選択される。特定の態様において、１以上の可変アミノ酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９〜２１中の対応するアミノ酸またはその保存的置換から選択される。特定の態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３３のいずれかに述べるアミノ酸配列に対比して１、２または３つの置換をもつ。ある態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３３のいずれかのバリアントは、一方または両方の末端から１または２個のアミノ酸を欠如するポリペプチドである。ある態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドは第１部分および第２部分を含み、第１部分は本明細書に記載するＥＤＮ３様ポリペプチド（たとえば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３３のうちの１つまたはそのバリアント）からなる。第２部分は第１部分に対してヘテロロガスであってもよく、あるいは検出可能な標識であってもよい。
【０１１９】
本発明は本明細書に記載するいずれか１以上の観点および態様のすべての組合わせおよび一部の組合わせを提供すると理解される。たとえば組成物に関して、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３３のそれぞれおよびその種々の形のバリアントを含むかまたはそれからなるペプチドを提供する：単独で、融合タンパク質の概念で、トランケーションバリアントとして、置換バリアントとして、内部欠失を含むバリアントとして、およびこれらの形の適切な組合わせで。さらに、本発明は、本明細書に開示するいずれかの方法に使用するための、本明細書に記載するいずれかのＥＤＮ３様ペプチド（たとえば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３３のいずれかもしくはそのバリアントを含むかまたはそれからなるポリペプチド）の使用を明らかに考慮する。幾つかの処置方法を後記のセクション５にさらに詳細に記載する。例にすぎないが、ＥＤＮ３様ポリペプチドは代謝性の疾患もしくは障害、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、脂質代謝障害、高脂血症、高コレステロール血症、または脂肪酸代謝障害を処置するために使用できる。
【０１２０】
ある観点において、ＥＤＮ３様ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１またはそのフラグメントに対比して１つの置換をもつ。
【０１２１】
ある態様において、本出願は、ＥＤＮ３様ポリペプチドにサイズが近似するトランケーションバリアントを提供する。たとえば、そのようなバリアントは一方または両方の末端から最大で１、２、３、４または５個のアミノ酸を欠如していてもよい。トランケーション変異体の具体例として、最もＮ末端側にあるアミノ酸はＴ２、Ｃ３、Ｔ４、Ｃ５、Ｆ６、Ｔ７、Ｙ８、Ｋ９、Ｄ１０、Ｋ１１、Ｅ１２、またはＣ１３であってもよい。さらに他の例として、最もＣ末端側にあるアミノ酸はＲ４１、Ｇ４２、またはＫ４３であってもよい。上記２文におけるナンバリング方式はｈＥＤＮ３  ９７−１４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）に由来するが、当業者は他のいずれかのＥＤＮ３様ポリペプチド上の対応するアミノ酸を容易に同定できるであろう。たとえば１、２、３、４または５個のアミノ酸の内部欠失も考慮される。ある態様において、ＥＤＮ３様ペプチドはアミノ酸１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４個の長さである。他の態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドは融合タンパク質であり、それらにおいて第１ポリペプチド部分はアミノ酸１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６，２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７，３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４個のＥＤＮ３様配列である。
【０１２２】
特定の態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドはアミノ酸２０〜６０個の長さである。たとえば、ＥＤＮ３様ポリペプチドはアミノ酸３０〜６０、３０〜５０、３０〜４０、４０〜６０、４０〜５０、または５０〜６０個の長さであってもよい。ＥＤＮ３様ポリペプチドは、アミノ酸２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、または５５〜６０個の長さであってもよい。ＥＤＮ３様ポリペプチドは、アミノ酸２０〜２２、２２〜２４、２４〜２６、２６〜２８、２８〜３０、３０〜３２、３２〜３４、３４〜３６、３６〜３８、３８〜４０、４０〜４２、４２〜４４、４４〜４６、４６〜４８、４８〜５０、５０〜５２、５２〜５４、５４〜５６、５６〜５８、または５８〜６０個の長さであってもよい。ある態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドの第１アミノ酸部分は、アミノ酸２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、２０〜２２、２２〜２４、２４〜２６、２６〜２８、２８〜３０、３０〜３２、３２〜３４、３４〜３６、３６〜３８、３８〜４０、４０〜４２、４２〜４４、４４〜４６、４６〜４８、４８〜５０、５０〜５２、５２〜５４、５４〜５６、５６〜５８、または５８〜６０個の長さである。
【０１２３】
特定の態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドはＸ１〜Ｘ７を含み、その際、それぞれは独立していずれかのアミノ酸から選択される。しかし、ある態様において、Ｘ１〜Ｘ７のうち１以上は、マウス配列ＥＤＮ３  ９７−１４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）またはヒト配列ｈＥＤＮ３  ９７−１４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）中の対応するアミノ酸に対比して保存的置換である。同様に、ある態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドは特定の配列（たとえば、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）に対比して１以上の置換をもつと定義される。特定の態様において、ポリペプチドは１、２、３、４、または５個の置換を含む。そのような置換は、独立して保存的置換または非保存的置換として選択することができる。特定の態様において、すべての置換（たとえば、１、２、３、４、５など）が保存的置換である。
【０１２４】
保存的置換は、類似の電荷、疎水性または芳香族性をもつアミノ酸との置換である。たとえば、Ｗ、Ｆ、およびＹ間の置換は、これら３種類すべてが芳香環であるので保存的である。他の例として、ＤとＥの間の置換は、両方が負に荷電しているので保存的である。同様に、Ｋ、Ｒ、およびＨ間の置換は、これらの残基が正に荷電しているので保存的である。さらに、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、およびＱ間の置換は、これらの残基が疎水性であるので保存的である。さらに、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、およびＷ間の置換は、これらの残基が非極性であるので保存的である。
【０１２５】
ある態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドはアミノ酸残基６０個以下の長さであり、このペプチドはアミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を含み、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択される。特定の態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドは下記のものを含む融合タンパク質である：アミノ酸配列YYX4HLDIIX5INTPEQ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）であって、Ｘ４およびＸ５は独立していずれかのアミノ酸から選択され、アミノ酸残基６０個以下の長さである第１ポリペプチド部分；および（ｂ）第２部分であって、第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスなポリペプチド部分であるかまたは検出可能な標識である第２部分。ある態様において、ポリペプチドは胃抑制ペプチドを含まない。
【０１２６】
ある態様において、Ｘ４およびＸ５のうち一方または両方が、推定される内因性ヒトおよびマウス配列（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１）中の対応する位置に対比して保存的置換である。たとえば、Ｘ４はＣまたはＣの保存的置換であってもよく、Ｘ５はＷまたはＷの保存的置換であってもよい。
【０１２７】
特定の観点において、ＥＤＮ３様ポリペプチドはアミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQT（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３）を含み、その際：Ｘ１およびＸ４はＣであり、かつＸ２およびＸ３は独立していずれかのアミノ酸から選択されるか、あるいはＸ２およびＸ３はＣであり、かつＸ１およびＸ４は独立していずれかのアミノ酸から選択され、Ｘ５はいずれかのアミノ酸である。可変残基を含むＥＤＮ３様ポリペプチドについて、可変残基は（ある態様において）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９または２１中の対応する位置にある残基またはその保存的置換から選択できると理解される。
【０１２８】
特定の観点において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、４つともすべてＣである。他の観点において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のうち２つはＣであり、他の２つの残基は独立していずれかのアミノ酸から選択される；たとえば、両方ともＡであってもよい。たとえば、ある態様において、Ｘ１およびＸ４は両方ともＣであり、Ｘ２およびＸ３は独立していずれかのアミノ酸から選択される；たとえば、両方ともＡであってもよい。特定の態様において、Ｘ２およびＸ３は両方ともＣであり、Ｘ１およびＸ４は独立していずれかのアミノ酸から選択される；たとえば、両方ともＡであってもよい。特定の態様において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のうち１以上がＣである。特定の態様において、Ｘ１は存在しない。２つのシステインが存在すると、システイン残基間にジスルフィド橋の形成が可能になる。
【０１２９】
ある態様において、ポリペプチドは融合タンパク質であり、その際、第１アミノ酸部分はＥＤＮ３様配列を含み、第２ポリペプチド部分は第１ポリペプチド部分に対してＣ末端側にある。そのようなある観点において、第２ポリペプチドはアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５，または１６個の長さである。
【０１３０】
ある態様において、Ｘ５はＷ、Ｆ、またはＹである。特定の態様において、Ｘ５はＷまたはＦである。ある態様において、Ｘ５はＷである。
【０１３１】
ある態様において、Ｘ６はＧまたはＥである。特定の態様において、Ｘ７はＦまたはＬである。特定の態様において、Ｘ６はＧであり、かつＸ７はＦであり、したがってこれらの位置はヒト配列を反映する。他の態様において、Ｘ６はＥであり、かつＸ７はＬであり、したがってこれらの位置はマウス配列を反映する。
【０１３２】
ある態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドは下記のものからなる：（ｉ）アミノ酸配列X1TX2FTYKDKEX3VYYX4HLDIIX5INTPEQTVPYGLSNYRX6SX7（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）、または（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の位置１で始まり、位置２７〜３９のいずれか１つで終わるフラグメント；その際、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、独立していずれかのアミノ酸から選択される。
【０１３３】
ある態様において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７のうち１以上は推定される内因性ヒトおよびマウス配列（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１）中の対応する位置に対比して保存的置換である。たとえば、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４はそれぞれ独立してＣまたはＣの保存的置換であってもよく、Ｘ５はＷまたはＷの保存的置換であってもよく、Ｘ６はＧ、Ｅ、またはＧもしくはＥの保存的置換であってもよく、Ｘ７はＦ、Ｌ、またはＦもしくはＬの保存的置換であってもよい。ある態様において、Ｘ６はＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ，またはＩである。ある態様において、Ｘ６はＤまたはＥである。ある態様において、Ｘ７はＦ、Ｙ、またはＷである。ある態様において、Ｘ７はＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、またはＩである。
【０１３４】
特定の態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドは下記のものからなる：（ｉ）アミノ酸配列CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRESL（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）、（ｉｉ）（ｉ）のフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１で始まり、位置２７〜３９のいずれか１つで終わるフラグメント、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）に述べたアミノ酸配列に対比して１、２もしくは３つの置換を有するアミノ酸配列。場合により、ポリペプチドは上記の文のＥＤＮ３様ポリペプチド、および第２のヘテロロガスペプチド部分を含む。特定の態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の位置１、３、１１および１５の残基は置換されていない（たとえば、４つすべての残基がＣである）。特定の態様において、位置１、３、１１および１５の残基のうち少なくとも２つは置換されていない（たとえば、Ｃである）。ある観点において、これら２つの置換されていない（Ｃ）残基は１および１５である；ある観点において、これら２つの置換されていない（Ｃ）残基は３および１１である。本明細書に開示されるいずれかの配列態様を前記または後記のいずれかの組成物および方法と組み合わせることができると理解される。
【０１３５】
本発明はＥＤＮ３様ポリペプチドを考慮し、これには本明細書に提示する具体例のバリアントが含まれる。そのようなバリアントは容易に作製および試験することができる。適切なアミノ酸置換には、アラニン、グリシン、セリン、トレオニン、ロイシン、およびイソロイシンが含まれる。他の適切な置換には、保存的置換が含まれる。さらに他の置換には、天然ＥＤＮ３  ９７−１４０配列に対比して非保存的な置換が含まれる。
【０１３６】
特定の態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドは２４種類のカノニカル(canonical)アミノ酸から選択されるアミノ酸のみを含む。他の態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドはペプチドミメティックである。たとえば、ペプチドミメティックは野生型ペプチド主鎖をもつが、非天然アミノ酸を含むことができる。他の例において、ペプチドミメティックは人工的主鎖をもつことができる。ペプチドミメティックは、時には対応するカノニカルポリペプチドに対比して改善された安定性、溶解性、生物学的利用能、免疫原プロフィール、または活性を示す。
【０１３７】
ＥＤＮ３様ペプチドミメティックは、ペプチドに望ましい特性を付与するために、Ｄ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の組合わせ、および種々のアミノ酸アナログ（たとえば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、およびＮα−メチルアミノ酸など）を含むことができる。適切なアミノ酸アナログには下記のものが含まれる：１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレート；（２Ｓ，３Ｓ）−メチルフェニルアラニン、（２Ｓ，３Ｒ）−メチル−フェニルアラニン、（２Ｒ，３Ｓ）−メチル−フェニルアラニンおよび（２Ｒ，３Ｒ）−メチル−フェニルアラニン；２−アミノテトラヒドロナフタレン−２−カルボン酸；ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレート；β−カルボリン（ＤおよびＬ）；ＨＩＣ（ヒスチジンイソキノリンカルボン酸）；ＨＩＣ（ヒスチジン環状尿素）；ＬＬ−Ａｃｐ（ＬＬ−３−アミノ−２−プロペニドン−６−カルボン酸）。
【０１３８】
特定の態様において、ＥＤＮ３様ペプチドミメティックは主鎖に構造変化をもつ。たとえば、アミド結合の種々のアイソスター、たとえばスルホン類、トリフルオロエチルアミン類、エステル類、テトラゾール類、またはシス−アミド結合アイソスターを使用できる(Jones et al., Tetrahedron Lett. 29: 3853-3856 (1988), Black et al. “Trifluoroethylamines as amide isosteres in inhibitors of cathepsin K” Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 15: 21, 1  Nov. 2005, p. 4741-4744)。
【０１３９】
ＥＤＮ３様ペプチドは、線状ペプチドとして、または環状ペプチドとして作製できる。線状である場合、ペプチドはＣ末端に遊離酸をもつことができ、あるいはＣ末端がアミド化されていてもよい。
【０１４０】
特定の態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドは、検出可能な標識、たとえば蛍光標識、放射性標識、またはＭＲＩ検出可能な標識に連結している。蛍光標識には、たとえばテキサスレッド、フィコエリトリン（ＰＥ）、シトクロムｃ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、蛍光性イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、量子ドット色素、フルオレセイン、ローダミン、ウンベリフェロン、ＤＲＡＱ５、アクリドン、キナクリドン、ランタニドキレート、ルテニウム錯体、タルトラジン、フィコシアニン、またはアロフィコシアニンが含まれる。ＭＲＩ検出可能な標識には、たとえば常磁性イメージング剤、超常磁性酸化鉄粒子、磁鉄鉱粒子、フルオロカーボンイメージング試薬、Ｇｄキレート、またはＭｎキレートが含まれる。ある具体的なＭＲＩ検出可能な標識は、ガドペンテト酸ジメグルミン(gadopentetate dimeglumine)、ガドテリドール(gadoteridol)、ガドテル酸メグルミン(gadoterate meglumine)、マンガホジピール三ナトリウム(mangafodipir trisodium)、ガドジアミド(gadodiamide)、およびペルフルオロカーボン類である。ＥＤＮ３様ポリペプチドは、放射性標識にコンジュゲートさせることもできる。適切な放射性標識の例には、２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、１８Ｆ、３６Ｃｌ、３２Ｐ、３３Ｐ、４３Ｋ、４７Ｓｃ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、６７Ｃｕ、６８Ｇａ、７１Ｇｅ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、７７Ａｓ、７７Ｂｒ、８１Ｒｂ、８１ｍＫｒ、８７ＭＳｒ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１００Ｐｄ、１０１Ｒｈ、１０３Ｐｂ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１９Ｓｂ  １２１Ｓｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｃｓ、１２８Ｂａ、１２９Ｃｓ、１３１Ｉ、１３１Ｃｓ、１４３Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｕ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９１Ｏｓ、１９３Ｐｔ、１９４Ｉｒ、１９７Ｈｇ、１９９Ａｕ、２０３Ｐｂ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉおよび２１３Ｂｉが含まれる。特定の化合物部分をポリペプチドに連結させるための代表的方法は本明細書に記載され（たとえば、２つのタンパク質を互いに連結させることができるもの）、また当技術分野において周知である。
【０１４１】
ある態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドは同位体標識され、したがってペプチド中の１以上の原子が特定の原子質量または質量数をもつ１以上の原子により置き換えられている。タンパク質に取り込ませることができる同位体の例には、水素、炭素、窒素、酸素、および硫黄の同位体、たとえば２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏが含まれる。特定の同位体標識されたＥＤＮ３様ポリペプチド、たとえば３Ｈおよび１４Ｃなどの放射性同位体を取り込ませたものは、薬物および／または基質の組織分布アッセイに有用である。トリチウム化（すなわち、３Ｈ）、および炭素−１４（すなわち、１４Ｃ）同位体は、それらの調製が容易でありかつ検出可能であるため、特に好ましい。さらに、より重い同位体、たとえばジュウテリウム（すなわち、２Ｈ）による置換は、より大きな代謝安定性から生じる療法上の特定の利点、たとえばインビボ半減期の延長または投与要求量の減少を付与することができ、したがってある状況では好ましい可能性がある。同位体標識したＥＤＮ３様ポリペプチドは、一般に、同位体標識していない試薬の代わりに容易に入手できる同位体標識した試薬を用いることにより調製できる。それを行なう方法には、後記の節に記載する幾つかの化学的連結方法（たとえば、２種類のタンパク質を互いに連結させるために使用できるもの）が含まれ、他の適切な方法は当技術分野で周知である。
【０１４２】
特定の態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドは融合タンパク質である。融合タンパク質は重複しない２以上のポリペプチド部分をもち、それらがしばしばペプチド結合により共有結合している。これら２つの部分は、ペプチド結合以外の結合を用いて化学的に連結させることもできる。特定の態様において、これら２つの部分は互いに直接に連結またはコンジュゲートしている。他の態様において、これら２つの部分はリンカーを介して（化学的に、または組換えにより）結合している。２つのポリペプチドを多数の方法により非ペプチド結合で連結させることができる。たとえば、架橋剤、たとえばヘテロ二官能性架橋剤を使用でき、それらを用いて分子を段階的に連結させることができる。ヘテロ二官能性架橋剤は、タンパク質をコンジュゲートさせるためのより特異的なカップリング方法を設計する可能性を提供し、これによって目的外の副反応、たとえばホモタンパク質ポリマーの発生を減らすことができる。下記を含めた多様なヘテロ二官能性架橋剤が当技術分野で知られている：スクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル  ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）；４−スクシンイミジルオキシカルボニル−ａ−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジル  ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル  ６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分をもつ架橋剤はＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドアナログとして得ることができ、それらは一般に、より大きな水溶性をもつ。さらに、インビボでのリンカー開裂量を減らすように、連結鎖内にジスルフィド橋をもつ架橋剤を、代わりにアルキル誘導体として合成することができる。ヘテロ二官能性架橋剤のほかに、ホモ二官能性架橋剤および光反応性架橋剤を含めた他の多数の架橋剤がある。ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）およびジメチルピメリミデート・２ＨＣｌ（ＤＭＰ）は有用なホモ二官能性架橋剤の例であり、ビス−［Ｂ−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）およびＮ−スクシンイミジル−６（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）は有用な光反応性架橋剤の例である。上記に含まれる有用な１クラスのヘテロ二官能性架橋剤は、第一級アミン反応基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、またはそれの水溶性アナログであるＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）を含む。ヘテロ二官能性架橋剤の一部として有用な他の反応基は、チオール反応基である。タンパク質カップリング方法の総説については、Means et al. (1990) Bioconjugate Chemistry. 1:2-12を参照。
【０１４３】
第１ポリペプチド部分は表１に従ったポリペプチドまたはそのバリアント（ＥＤＮ３様ポリペプチド）であり、第２ポリペプチド部分は自然界では第１ポリペプチド部分に隣接した状態で見出されることがないポリペプチドであろう。第１ポリペプチド部分は第２ポリペプチド部分に対してＮ末端側またはＣ末端側にあってよい。たとえば、時には第２ポリペプチド部分は人工配列または異なる生物中に見出される配列である。融合タンパク質を伴うある態様において、第２ポリペプチド部分は第１ポリペプチド部分に対してヘテロロガスである。一般に、２つの部分がヘテロロガスである場合、これら２つの部分が隣接した状態で自然界に見出されることはない。たとえば、これら２つの部分は異なる生物に由来してもよく、あるいはそれらの部分のうち一方はある生物に由来してもよいのに対し他方は合成によるか、あるいはこれら２つの部分は同一生物に由来するけれどもそのゲノムの異なる部分からのものであってもよい。
【０１４４】
ある例において、融合タンパク質の第２ポリペプチド部分はタグを含む。可能な融合ドメインの周知の例には下記のものが含まれるが、それらに限定されない：ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、および免疫グロブリン重鎖定常部（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＴＡＰ、ＶＳＶ−Ｇ、Ｖ５、アビジン、ストレプトアビジン、ＢＣＣＰ、カルモジュリン、Ｎｕｓ、またはＳタグ；これらは特に融合タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーにより単離するのに有用である。アフィニティー精製の目的には、アフィニティークロマトグラフィーのための関連マトリックス、たとえばグルタチオン−、アミラーゼ−、およびニッケル−またはコバルト−コンジュゲートした樹脂を用いる。融合ドメインには“エピトープタグ”も含まれ、それらは通常は短いペプチド配列であり、それらに対して特異的な抗体を得ることができる。特異的モノクローナル抗体を容易に得ることができる周知のエピトープタグには、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）、およびｃ−ｍｙｃタグが含まれる。ある場合には、融合タンパク質はプロテアーゼ開裂部位をもつ：たとえば、Ｘａ因子またはトロンビン；これらは、関連プロテアーゼが融合タンパク質を部分消化してこれによりそれらから組換えタンパク質を遊離させるのを可能にする。第１ポリペプチド部分を次いで後続のクロマトグラフィー分離により第２ポリペプチド部分から単離することができる。特定の態様において、第２ポリペプチド部分は第１ポリペプチド部分を安定化することができる。たとえば、そのようなポリペプチドは、ポリペプチドのインビトロ半減期を延長し、ポリペプチドの循環半減期を延長し、あるいはポリペプチドのタンパク質分解による分解を減らすことができる。第２ポリペプチド部分は１より多いエピトープタグ、たとえば２つのエピトープタグを含んでもよく、あるいはエピトープタグを含まなくてもよい。
【０１４５】
ある態様において、第２ポリペプチド部分は蛍光タンパク質である。多数の蛍光タンパク質が当技術分野で知られており、若干例は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、Ｖｅｎｕｓ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ｄｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）である。
【０１４６】
第１ポリペプチド部分は第２ポリペプチド部分の官能性ドメインに直接に共有結合していてもよい。しかし、他の態様において、第２ポリペプチド部分は、第１ポリペプチド部分を第２ポリペプチド部分の官能性ドメインに連結させるリンカーを含むことができる。代表的なリンカーのひとつは、（ＧＧＧＧＳ）３リンカー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）である。しかし、他のリンカーも設計できることは理解される。たとえば、フレキシブルタンパク質領域の一般的な表面アミノ酸にはＧ、ＮおよびＳが含まれる。Ｇ、ＮおよびＳを含有させるアミノ酸配列変更は、リンカー配列についての基準（たとえば、疎水性または荷電性が最小の状態でフレキシブル）を満たすと予想される。他のほぼ中性のアミノ酸、たとえばＴおよびＡも、リンカー配列中に使用できる。ある態様において、機能性タンパク質ドメインを適切に隔離するために約１０、１５または２０個のアミノ酸のリンカー配列長さを使用できるが、より長いかまたは短いリンカー配列も使用できる。特定の態様において、第２ポリペプチド部分は１つより多いリンカー、たとえば２つのリンカーを含むことができる。第２ポリペプチド部分が１つより多いリンカーを含む態様について、リンカーは独立して選択され、同一でも異なってもよいと理解される。
【０１４７】
ある態様において、第２ポリペプチド部分は免疫グロブリンのＦｃ領域の全部または一部を含む。特定の態様において、Ｆｃ領域（またはその一部）は、第１ポリペプチド部分を第２ポリペプチド部分中のいずれかの官能性ドメインに連結させるリンカーとして機能する。既知のとおり、それぞれの免疫グロブリン重鎖定常部は４または５つのドメインを含む。それらのドメインは順に下記のように命名されている：ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４）。重鎖ドメインのＤＮＡ配列は免疫グロブリンのクラス間で交差相同性をもつ：たとえば、ＩｇＧのＣＨ２ドメインは、ＩｇＡおよびＩｇＤのＣＨ２ドメインに対して、またＩｇＭおよびＩｇＥのＣＨ３ドメインに対して、相同である。本明細書中で用いるように、用語“免疫グロブリンＦｃ領域”は、免疫グロブリン鎖定常部、たとえば免疫グロブリン重鎖定常部のカルボキシル末端部分またはその一部を意味すると理解される。たとえば、免疫グロブリンＦｃ領域は下記のものを含むことができる：１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、または５）２以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ部の組合わせ。特定の態様において、免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくとも免疫グロブリンヒンジ部、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ１ドメインを欠如していてもよい。ある態様において、重鎖定常部が由来する免疫グロブリンのクラスはＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、２、３、または４）である。免疫グロブリンの他のクラス、ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）およびＩｇＭ（Ｉｇμ）を使用できる。適切な免疫グロブリン重鎖定常部の選択は、U.S. Pat. No. 5,541,087、および5,726,044に詳細に考察されている。特別な結果を達成するために免疫グロブリンの特定のクラスおよびサブクラスから特別な免疫グロブリン重鎖定常部配列を選択することは、当業者が容易になしうる範囲のものであると考えられる。免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡ構築体部分は、少なくともヒンジドメインの一部を含むことができ、かつ少なくともＦｃγのＣＨ３ドメインまたはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはＩｇＭのいずれかの相同ドメインの一部を含むことができる。さらに、免疫グロブリン重鎖定常部内のアミノ酸の置換または欠失は、活性なＥＤＮ３様融合タンパク質を作製するのに有用な可能性があると考えられる。一例は、上部ＣＨ２領域にアミノ酸置換を導入して、Ｆｃ受容体に対する親和性が低下したＦｃバリアントを作製することである(Cole et al. (1997) J. Immunol. 159:3613)。当業者は周知の分子生物学的技術を用いてそのような構築体を作製することができる。
【０１４８】
他の態様において、ポリペプチドはタンパク質精製用タグなどのタグを含まず、精製用タグに対する親和性に依存しない方法により単離される。
【０１４９】
他の態様において、第２ポリペプチド部分は融合タンパク質の分泌を促進するシグナル配列であり、したがってそれは細胞培地から単離することができる。適切なシグナル配列には、Ｂ型肝炎ウイルスＥ抗原シグナル配列、免疫グロブリン重鎖リーダー配列、およびサイトカインリーダー配列が含まれる。
【０１５０】
ある態様において、第２ポリペプチドはターゲティング部分を含む。特定の観点において、ターゲティング部分は抗体、たとえばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、およびヒト化抗体を含むことができる。理論により拘束されるわけではないが、そのような抗体は標的組織の抗原に結合することができ、したがって標的組織（たとえば、肝臓または膵臓）へのＥＤＮ３様ポリペプチドの送達を仲介することができる。ある態様において、ターゲティング部分は抗体フラグメント、その誘導体またはアナログを含むことができ、これには限定ではなく下記のものが含まれる：Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単一ドメイン抗体、ヒト化された抗体および抗体フラグメント、ならびに上記のものの多価バージョン。多価のターゲティング部分には、限定ではなく下記のものが含まれる：一重または二重特異性抗体、たとえばジスルフィド安定化したＦｖフラグメント、ｓｃＦｖ縦列配列（（ｓｃＦｖ）２フラグメント）、ディアボディー、トリアボディーまたはテトラボディー：これらは一般に共有結合するかまたは他の形で安定化した（すなわち、ロイシンジッパーまたはヘリックス安定化した）ｓｃＦｖフラグメントである；希望する標的分子と自然相互作用する受容体分子。特定の態様において、抗体またはそのバリアントを修飾して、対象に投与した際にそれらがより低い免疫原性であるようにすることができる。たとえば、対象がヒトである場合、抗体を“ヒト化”することができ、その際、ハイブリドーマ由来抗体の相補性決定領域（単数または複数）がヒトのモノクローナル抗体中へ移植されている：たとえば、Jones, P. et al. (1986), Nature, 321, 522-525、またはTempest et al. (1991), Biotechnology, 9, 266-273に記載。トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物を用いてヒト化抗体を発現させることもできる。そのようなヒト化は部分的または完全であってよい。特定の態様において、抗体はネズミその他のヒト以外の抗体であるが、それのヒト形スコア(humanness score)はヒト化する必要がないほど十分なものである。さらに他の態様において、抗体または抗原結合フラグメントは完全ヒト形である。
【０１５１】
ある態様において、融合タンパク質は胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）またはＧＩＰの一部を含まない。たとえば、融合タンパク質はＧＩＰの活性フラグメントを含まないであろう。ある態様において、融合タンパク質はＧＩＰの１０、８または６個未満の連続アミノ酸を含む。
【０１５２】
ある態様において、融合タンパク質は短い。したがって、ある例において、融合タンパク質は表１のポリペプチドまたはそのホモログの一方または両方の末端に、１、２、３、４、５、１０または２０個を超えない追加アミノ酸を含む。
【０１５３】
本発明は、ＥＤＮ３様ポリペプチドおよびその融合体を考慮する。そのような化合物はいずれも、たとえば本明細書に記載する１以上のアッセイ法のいずれかを用いて容易に試験することができる。さらに、そのような化合物はいずれも、本明細書に記載するいずれかの方法に使用できる。
【０１５４】
本発明は、本明細書に開示するＥＤＮ３様ポリペプチドはいずれも単離および／または精製できることを考慮する。疑問を避けるために、単離されたという用語は、単にある転写体または他の作用物質がライブラリー中に存在することを含むわけではない−そのライブラリー中の特定の転写体もしくは作用物質の何らかの同定を行わない状態で、または関心のある転写体もしくは作用物質をライブラリーの他の成分から分離するための工程を行わない状態で。精製されたという用語は、たとえば少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらに９９％の純度を超える純度パーセントなどを表わすために使用できる。純度は一般に、組成物中の他の作用物質の存在に対比した純度として表わされる。言い換えると、純度は一般に、存在すれば混在物とみなされる可能性のある他の作用物質が実質的または有意に存在しないこと（単に希釈剤、塩類、緩衝剤、または保存剤の存在ではなく）を示すために用いられる。
【０１５５】
２．ＥＤＮ３様ポリペプチドを含む医薬組成物
ＥＤＮ３様ポリペプチドは有用な薬理学的特性をもつので、本出願はＥＤＮ３様ポリペプチドを含む医薬組成物を調製するための方法を開示する。したがって、特定の態様において、本発明の組成物およびポリペプチドは、医薬的に許容できるキャリヤー中に配合された組成物を含む。特定の態様において、医薬組成物はＥＤＮ３様ポリペプチドおよび下記のうち１以上を含む：安定剤、緩衝剤、界面活性剤、制御放出成分、塩類、および保存剤。本明細書に開示する代表的なＥＤＮ３様ポリペプチドのいずれかを含めて、いずれかのＥＤＮ３様ポリペプチドは医薬的に許容できるキャリヤー中に配合された組成物として提供できる。
【０１５６】
特定の態様において、医薬組成物は１種類以上の安定剤、たとえば下記のものを含有することができる：糖類（たとえば、ショ糖、グルコース、またはフルクトース）、リン酸塩（たとえば、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸カリウム、二塩基性リン酸カリウム、またはリン酸一ナトリウム）、グルタミン酸塩（たとえば、Ｌ−グルタミン酸一ナトリウム）、ゼラチン（たとえば、加工ゼラチン、水解ゼラチン、またはブタゼラチン）、アミノ酸（たとえば、アルギニン、アスパラギン、ヒスチジン、Ｌ−ヒスチジン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、リジン、フェニルアラニン、チロシン、およびそのアルキルエステル）、イノシン、またはホウ酸ナトリウム。
【０１５７】
特定の態様において、医薬組成物は１種類以上の緩衝剤、たとえば炭酸水素ナトリウムとアスコルビン酸の混合物を含有する。ある態様において、配合物は塩類溶液、たとえばリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、または蒸留水中において投与することができる。
【０１５８】
特定の態様において、医薬組成物は１種類以上の界面活性剤を含有する：たとえば、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ポリエチレングリコール  ｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテル  ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール  ４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００）；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート  ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ  ２０）；ならびにホルムアルデヒドおよびオキシランを含む４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノールポリマー（ＴＹＬＯＸＡＰＯＬ）。界面活性剤はイオン性または非イオン性であってよい。
【０１５９】
特定の態様において、医薬組成物は１種類以上の塩類、たとえば塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、塩化カルシウム、または塩化カリウムを含有する。
【０１６０】
特定の態様において、保存剤が医薬組成物に含有される。他の態様においては、保存剤を使用しない。保存剤は多数回投与用の容器に用いられることが最も多く、単回投与用の容器に必要とされることはより少ない。特定の態様において、保存剤は２−フェノキシエタノール、メチルおよびプロピルパラベン、ベンジルアルコール、および／またはソルビン酸である。
【０１６１】
特定の態様において、医薬組成物は制御放出配合物である。
【０１６２】
医薬組成物はヒト患者への投与に適したものであってもよく、医薬組成物製剤はＵＳＦＤＡ指針に従うことができる。ある態様において、医薬組成物はヒト以外の動物に投与するのに適している。ある態様において、医薬組成物は実質的に内毒素または外毒素をいずれも含まない。内毒素には発熱物質、たとえばリポ多糖（ＬＰＳ）分子を含めることができる。医薬組成物は、発熱その他の副作用を引き起こす可能性のある不活性タンパク質フラグメントを実質的に含まないものであってもよい。ある態様において、組成物は１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、０．００１％未満、０．０００１％未満の内毒素または外毒素を含有する。ある態様において、医薬組成物は工業用水、水道水、または蒸留水より低いレベルの発熱物質を含む。他の医薬組成物成分は、当技術分野で既知の方法、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、限外濾過、または蒸留を用いて精製することができる。他の態様において、患者に投与する前に発熱物質をいずれも不活性化または破壊することができる。医薬組成物の原料、たとえば水、緩衝剤、塩類、および他の化学物質も、ふるい分けおよび発熱物質除去処理することができる。医薬組成物中のすべての材料が無菌であってもよく、各ロットを無菌性について検査してもよい。したがって特定の態様において、医薬組成物の内毒素レベルは、ＵＳＦＤＡにより設定された下記のレベルより低い：たとえば、クモ膜下注射用組成物については０．２内毒素（ＥＵ）／ｋｇ製剤、クモ膜下注射用以外の組成物については５ＥＵ／ｋｇ製剤、および無菌水については０．２５〜０．５ＥＵ／ｍＬ。
【０１６３】
特定の観点において、医薬組成物中のＥＤＮ３様ポリペプチドは単離されたタンパク質である。一般に、製剤は５０％、２０％、１０％、または５％（乾燥重量による）未満の混在タンパク質を含むことができる。特定の態様において、所期分子（すなわち、ＥＤＮ３様ポリペプチド）は他の生体高分子、たとえば他のタンパク質（特に、単離された製品としての所期タンパク質の特性または対象となる再構成混合物におけるそれらの機能を実質的に遮蔽、低減、かく乱または変更する、他のタンパク質）が実質的に存在しない状態で存在する。しかし、ある場合には、単離されたタンパク質は所期タンパク質のフラグメント（たとえば、分解生成物または不完全なペプチド合成生成物）を、それらのフラグメントが所期タンパク質の活性を妨害しない限り含有してもよい。特定の態様において、少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、または９９．８％（乾燥重量による）の同じタイプの生体高分子が存在する（ただし、水、緩衝剤、および他の小分子、特に５０００未満の分子量をもつ分子は存在してもよい）。ある態様において、組成物はそのサブユニットタンパク質を発現した宿主細胞に由来するタンパク質を、単離されたサブユニットの量に対比して５％、２％、１％、０．５％、０．２％、０．１％未満、含有する。したがって、ある例において、医薬組成物は細菌、酵母、または昆虫のポリペプチドを実質的に含まない。ある態様において、単離されたタンパク質はＥＤＮ３様ポリペプチド以外の他の哺乳動物ポリペプチドを実質的に含有しない。ある態様において、所期ポリペプチドは核酸および／または炭水化物を実質的に含まない。たとえば、ある態様において、組成物は５％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．２％未満、または０．１％未満の宿主細胞ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含有する。特定の態様において、少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、または９９．８％（乾燥重量による）の同じタイプの生体高分子が製剤中に存在する（ただし、水、緩衝剤、および他の小分子、特に５０００未満の分子量をもつ分子は存在してもよい）。
【０１６４】
医薬組成物は、妥当な損益比で、低い毒性をもつか、あるいは毒性をもたないことが好ましい。医薬組成物の毒性を定量化するために、マウスその他の実験モデル系においてＬＤ５０測定値を求めて、ヒトおよび他の動物に外挿することができる。ラットなどのモデル生物において化合物のＬＤ５０を推定する方法は当技術分野で周知である。医薬組成物、およびそれに含まれるいずれかの成分は、ラットにおいて１００ｇ／ｋｇより大きい、５０ｇ／ｋｇより大きい、２０ｇ／ｋｇより大きい、１０ｇ／ｋｇより大きい、５ｇ／ｋｇより大きい、２ｇ／ｋｇより大きい、１ｇ／ｋｇより大きい、５００ｍｇ／ｋｇより大きい、２００ｍｇ／ｋｇより大きい、１００ｍｇ／ｋｇより大きい、または５０ｍｇ／ｋｇより大きい経口ＬＤ５０値をもつことができる。
【０１６５】
医薬組成物を導入するのに適した配合物は、投与経路に従って異なる。非経口投与、たとえば関節内(intraarticular、in the joints)、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、鼻腔内、および皮下経路によるものに適した配合物には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および配合物を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質を含有することができる水性および非水性の等張無菌液剤、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含有することができる水性および非水性の無菌懸濁液剤が含まれる。配合物は単回または多数回投与用の密閉容器、たとえばアンプルおよびバイアルに入れて提供することができる。
【０１６６】
注射用として適した医薬剤形には、無菌の水性液剤または分散液剤、および無菌の水性液剤または分散液剤を即時調製するための無菌散剤が含まれる。剤形は、無菌であり、かつ注射器導入が容易である程度の流体であるべきである。
【０１６７】
経口投与に適した配合物は、下記のものからなることができる：（ａ）液剤、たとえば有効量のポリペプチドまたはパッケージされた核酸を、希釈剤、たとえば水、塩類溶液またはＰＥＧ４００に懸濁したもの；（ｂ）それぞれ既定量の有効成分を液体、固体、顆粒またはゲルとして収容したカプセル剤、サッシェ剤または錠剤；（ｃ）適切な液体中の懸濁液剤；および（ｄ）適切な乳剤。錠剤形態は、下記のうち１種類以上を含有することができる：乳糖、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、トラガント、微結晶性セルロース、アラビアゴム、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ならびに他の賦形剤、着色剤、増量剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、保湿剤、保存剤、矯味矯臭剤、色素、崩壊剤、および医薬的に適合性のキャリヤー。トローチ剤形態は有効成分を矯味矯臭剤、通常はショ糖およびアラビアゴムまたはトラガント中に含むことができ、香錠(pastille)は有効成分を不活性基剤、たとえばゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖およびアラビアゴム中に含むことができ、乳剤、ゲル剤などは有効成分のほかに当技術分野で既知のキャリヤーを含むことができる。医薬組成物を、たとえばリポソーム内に、または有効成分の徐放をもたらす配合物中に、封入することができる。
【０１６８】
本発明の医薬組成物を、吸入により投与するためのエアゾール配合物にすることができる（すなわち、“噴霧”することができる）。エアゾール配合物を、加圧した許容できる噴射剤、たとえばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などに装入することができる。エアゾール配合物は口腔または鼻腔に送達することができる。
【０１６９】
本発明は、本明細書に開示するいずれかのＥＤＮ３様ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３３のいずれかおよびそのバリアントを含むかまたはそれからなるポリペプチドが含まれる）を、本明細書に記載する医薬的に許容できるいずれかのキャリヤーまたは賦形剤と組み合わせたものを考慮する。
【０１７０】
３．ＥＤＮ３様ポリペプチドを調製する方法
特定の態様において、本出願は固相タンパク質合成によるＥＤＮ３様ポリペプチドの合成を提供する。固相タンパク質合成のための多様な方法およびシステムが当技術分野で知られている。たとえば、１形式がMerrifield (J. Am. Chem. Soc., 1963, 85:2149)により記載されている。より詳細には、この合成は多段階で固相ペプチド合成(Solid Phase Peptide Synthesis)（ＳＰＰＳ）法によりＦｍｏｃ保護アミノ酸を用いて行なわれる。ＳＰＰＳは、保護されたアミノ酸誘導体（側鎖を適宜保護したもの）をポリマー支持体（ビーズ）に逐次付加することに基づく。塩基不安定Ｆｍｏｃ基をＮ−保護のために用いる。保護基を除去（ピペリジン加水分解による）した後、次のアミノ酸混合物をカップリング試薬（ＴＢＴＵ）により付加する。最終アミノ酸をカップリングさせた後、Ｎ末端をアセチル化することができる。得られたペプチド（ポリマー支持体にそれのＣ末端により付着したもの）をＴＦＡで開裂して、粗製ペプチドを得る。この開裂段階で、側鎖保護基もすべて開裂する。ジイソプロピルエーテルで沈降させた後、固体を濾取し、乾燥させる。得られたペプチドを分析し、２〜８℃で保存することができる。
【０１７１】
他の態様、特に、より長いポリペプチドを伴うものにおいて、本出願は組換えによるタンパク質調製方法を提供する。いずれか適切な組換え調製方法を使用でき、幾つかが当技術分野で周知である。簡単に述べると、組換え調製においては、ＥＤＮ３様ポリペプチド（または、適用できる場合はＥＤＮ３様部分を含む融合体）をコードする核酸を宿主細胞が発現する。宿主細胞は、たとえば細菌（たとえば、大腸菌(E. coli)）、酵母、昆虫、または哺乳動物であってもよい。ＥＤＮ３様ポリペプチドをコードする遺伝子は、一般にベクターの環境に配置される。ベクターは、大部分の高コピー数の細菌プラスミドの場合のように宿主のゲノムとは別個に存在してもよく、あるいは宿主のゲノム内へ組み込まれてもよい。多数の発現ベクターが当技術分野で知られており、多くが市販されている。一般的なベクターは、プロモーター配列（誘導性、抑制性、または構成性であってもよい）、多重クローニング部位、複製起点、およびポリアデニル化部位を含む。
【０１７２】
したがって、本発明は、ＥＤＮ３様ポリペプチド（または、適用できる場合はＥＤＮ３様部分を含む融合体）をコードする核酸配列（たとえば、ＤＮＡおよびＲＮＡ配列）を記載する。さらに、本発明は、前記のものに対して相補的である核酸配列、すなわち、同じ長さの核酸配列であってこれら２つの相補配列間で完全に塩基対合しうる核酸配列を提供する。本発明はまた、高緊縮度でそれらの核酸にハイブリダイズする核酸を提供する。高緊縮条件は、６５°Ｃで０．２×ＳＳＣの洗浄段階を含むことができる。前記ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、タンパク質生成物の配列に影響を及ぼさない方法で修飾することができる。たとえば、宿主、たとえば大腸菌、酵母、昆虫細胞系（たとえば、バキュロウイルス発現系を使用）、または哺乳動物（たとえば、ヒトまたはチャイニーズハムスター卵巣）細胞系における発現を改善するために、ＤＮＡ配列をコドン最適化することができる。
【０１７３】
宿主細胞系が樹立すると、ＥＤＮ３様ポリペプチド（または、適用できる場合はＥＤＮ３様部分を含む融合体）を単離することができる。ＥＤＮ３様ポリペプチドが細胞内に蓄積する場合は一般にそのポリペプチドを細胞溶解物から採取し、一方、分泌されたタンパク質は一般にコンディショニングした培地から単離される。タンパク質単離法は当技術分野で周知である。簡単に述べると、そのタンパク質を物理的特性、たとえばサイズ、疎水性、または抗体など特定の結合パートナーに対する親和性に基づいて分離することができる。
【０１７４】
ＥＤＮ３様部分を含む融合体に関して、そのような融合体を同一細胞においてフレーム内融合体として作製できる（介在リンカーの存在下または不存在下で）。あるいは、２つの部分を別個に、たとえば別個のベクターおよび／または細胞において作製し、次いで化学的または組換えにより連結することができる（リンカーの存在下または不存在下で）。
【０１７５】
ある態様において、第１ポリペプチド部分を第２ポリペプチド部分と別個に作製し、次いでこれら２つのポリペプチドを共有結合させる。ヘテロ二官能性架橋剤は、２つのポリペプチド間に非ペプチド結合を形成するのに適した化合物クラスである。ヘテロ二官能性試薬を用いるタンパク質コンジュゲート調製は、アミン反応およびスルフヒドリル反応を伴う２段階法である。第１段階、すなわちアミン反応について、選択するタンパク質は第一級アミンを含むべきである。これは、大部分のタンパク質のＮ末端にみられるリジンイプシロンアミンまたは第一級アルファアミンであってもよい。このタンパク質は遊離スルフヒドリル基を含むべきでない。コンジュゲートさせる予定の両タンパク質がスルフヒドリル基を含む場合、一方のタンパク質をすべてのスルフヒドリルがブロックされるように、たとえばＮ−エチルマレイミドを用いて修飾することができる(Partis et al. (1983) J. Pro. Chem. 2:263を参照)。エルマン試薬(Ellman's Reagent)を用いてそのタンパク質中のスルフヒドリルの量を計算することができる（たとえば、Ellman et al. (1958) Arch. Biochem. Biophys. 74:443、およびRiddles et al. (1979) Anal. Biochem. 94:75を参照)。
【０１７６】
ある態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチド中の特定のシステイン間にジスルフィド橋が形成されている。たとえば、ペプチドＥＤＮ３  ９７−１４０は一般にＣ１とＣ１５の間にシステイン橋、またＣ３とＣ１１の間にもうひとつを含む。あるいは、システイン橋をペプチド内にランダムに形成させることができる。別法として、ペプチドはジスルフィド橋の形成を妨害または阻止する還元条件下に置かれてもよい。
【０１７７】
ある態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドのＣ末端をアミド化し、アミド化によりポリペプチドの安定性を増大させることができる。Ｎ末端アミド化は、たとえば下記により実施できる：パラジウム開裂(U.S. Pat. No. 7,462,690)、ＣｎＢｒ／ｏ−ニトロフェニルグリシンアミド／光分解法(U.S. Pat. No. 6,251,635)、酵素によるペプチジルアルファ−アミド化(Engels, Protein Engineering, 1: 195-199 (1987))、およびペプチジルデヒドロアラニン処理(Patchornik and Sokolovsky, JACS, 86: 1206-1212 (1964))。ペプチドＣ末端アミド化は、ＭＢＨＡ樹脂のＨＦもしくはＴＦＭＳＡによる処理(G. R. Matsueda, et al. (1981) Peptides, 2, 45)、またはＲｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ樹脂のＴＦＡ開裂(US Pat. No. 5124478)により達成することもできる。
【０１７８】
本発明は、本明細書に開示するいずれかのＥＤＮ３様ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３３のいずれかおよびそのバリアントを含むかまたはそれからなるポリペプチドが含まれる）を、本明細書中のいずれかの調製方法で調製することを考慮する。当業者は希望するＥＤＮ３様ポリペプチドの構造に基づいて適切な調製方法を容易に選択できる。
【０１７９】
４．ＥＤＮ３様ポリペプチドに対して特異的な抗体
特定の態様において、本発明は、ＥＤＮ３様ポリペプチドに対して特異的な抗体およびそれらの抗体を使用する方法を提供する。そのような抗体は広範な用途をもつであろうが、特に重要な１用途は、視床下部の温感受性ニューロンを同定するための免疫染色における使用である。温感受性ニューロンは、エネルギー恒常性の維持および代謝の調節において重要である。しかし、これまで、これらのニューロンの同定は電気生理学的に記録する必要がある面倒な方法であった(Tabarean et al. “Electrophysiological properties and thermosensitivity of mouse preoptic and anterior hypothalamic neurons in culture.” Neuroscience. 2005; 135(2): 433-49)。ＥＤＮ３  ９７−１４０は温感受性ニューロンに存在する可能性があり、したがって温感受性ニューロンを迅速かつ効率的に同定するための免疫染色法にＥＤＮ３様−特異的抗体を使用できる。２つのデータが、温感受性ニューロンにＥＤＮ３  ９７−１４０が存在することを示唆する。第１に、ＥＤＮ３  ９７−１４０をコードするｍＲＮＡがそこに検出される（実施例１）。第２に、視床下部に投与した外因性ＥＤＮ３  ９７−１４０はＣＢＴを上昇させ、ＲＥＲを低下させる；これは、それが視床下部の温感受性ニューロンに作用している可能性を示唆する。この結果は、内因性ＥＤＮ３  ９７−１４０が温感受性ニューロンに発現し、したがってこれらのニューロンのマーカーとして役立つというモデルと一致する。
【０１８０】
特定の抗原に対する抗体を産生させるために多数の方法を使用できる。そのような抗体を作製するためにいずれか適切な方法を使用できる。ポリクローナル抗体を作製するために、ＥＤＮ３様ペプチドを（場合により、アジュバント、たとえばフロイント完全アジュバントと共に）宿主動物（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、またはニワトリ）に注射し、次いでその動物から血清を採取することができる。ポリクローナル抗体はアフィニティー精製により精製できる。あるいは、モノクローナル抗体を作製することができる。モノクローナル抗体を得るために、一般にマウスを免疫化する。免疫化したマウスからＢ細胞を採取し、ヒトの癌細胞との融合によって不死化する。次いで、たとえば限界希釈し、続いてたとえばウェスタンブロット法を用いて抗体を試験することにより、希望する特異性を備えた抗体を産生するクローナルハイブリドーマ系列を選択する。得られたハイブリドーマを培養し、培地からモノクローナル抗体を採取することができる。アフィニティー精製はモノクローナル抗体を精製するためにも使用できる。あるいは、ファージディスプレーを用いて抗体を産生させることができる。次いで、上記方法により産生させた抗体を用いてｓｃＦｖ抗体、Ｆａｂフラグメント、または他のタイプの抗体を設計することができ、それを実施する方法は当技術分野で周知である。適切な抗体の配列が同定されると、それを宿主細胞において組換え産生させることができる。同様に考慮されるのは、キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト抗体を作製するための周知の方法の採用である。
【０１８１】
ある態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドに対して特異的な抗体は、ＥＤＮ３  ９７−１４０が由来する全長タンパク質（プレプロエンドセリン−３）を実質的に結合しない。この特異性はＥＤＮ３様ポリペプチドとプレプロエンドセリン−３のタンパク質コンホメーションの何らかの相異により生じる可能性がある。たとえば、ＥＤＮ３様ポリペプチドにおいて利用可能なエピトープがプレプロエンドセリン−３においては立体的に遮蔽されている可能性がある。あるいは、ＥＤＮ３様ポリペプチド中のエピトープがプレプロエンドセリン−３の好ましくないコンホメーションではロックされて、その抗体が全長タンパク質に結合するのを阻止している可能性がある。ある抗体がプレプロエンドセリン−３と比較してＥＤＮ３様ポリペプチドに対して特異的であり、そのＥＤＮ３様ポリペプチドが野生型ＥＤＮ３  ９７−１４０との、したがって野生型プレプロエンドセリン−３の対応する部分とのアミノ酸の相異をもつならば、特異性の相異もＥＤＮ３様ポリペプチドとプレプロエンドセリン−３のアミノ酸配列の相異に起因するであろう。
【０１８２】
他の態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドに対して特異的な抗体はプレプロエンドセリン−３にも特異的に結合する。本発明者らは、本発明に使用するのに適した抗体は、１種類以上のＥＤＮ３様ポリペプチドに、および場合によりプレプロエンドセリン−３に、特異的に結合してもよいことを明記する。複数のＥＤＮ３様ポリペプチドおよび／またはプレプロエンドセリン−３に結合できることは、その抗体が非特異的であることを示すわけではない。
【０１８３】
本発明は、本明細書に開示するいずれかのＥＤＮ３様ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３３のいずれかおよびそのバリアントを含むかまたはそれからなるポリペプチドが含まれる）を、いずれか適切な抗体産生方法により本明細書に記載するいずれかのタイプの抗体の産生に使用することを考慮する。
【０１８４】
５．ＥＤＮ３様ポリペプチドを用いる処置方法
ＥＤＮ３  ９７−１４０は、腸内分泌細胞（実施例６）および肝細胞（実施例８）を含めた多様な細胞タイプに作用する。さらに、ＥＤＮ３  ９７−１４０は、マウスにおいて呼吸交換率（実施例３）およびグルコース耐性（実施例４）に影響を及ぼす。したがって、ＥＤＮ３様ポリペプチドは広範な疾患および障害の処置に使用するのに適切である。温感受性ニューロンの調節におけるＥＤＮ３  ９７−１４０の役割は、深部体温を上昇させるそれの能力にみられる（実施例３）。体温の上昇は代謝の増大（すなわち、追加カロリーの燃焼）により生じさせることができるので、ＥＤＮ３様ポリペプチドは代謝障害、たとえば肥満症を処置するために使用できる。より直接的に、ＥＤＮ３様ポリペプチドの体温調節作用によりそれらを低体温症の処置に使用することができる。
【０１８５】
本発明方法に従って処置できる代表的な代謝性の疾患または障害には、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、脂質代謝障害、高脂血症、高コレステロール血症、および脂肪酸代謝障害が含まれる。特定の障害について、より詳細に以下に考察する。
【０１８６】
糖尿病（真性糖尿病とも呼ばれる）は、高血糖またはケトアシドーシスを特徴とし、しばしば長期的高血糖状態またはグルコース耐性低下から生じる慢性的な全身代謝異常を随伴する。糖尿病はＩ型（インスリン依存型）またはＩＩ型（非インスリン依存型糖尿病またはＮＩＤＤＭ）に分類できる。糖尿病のリスク因子には、下記のものが含まれる：男性について４０インチまたは女性について３５インチより大きいウェストライン、１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧、１５０ｍｇ／ｄｌを上回るトリグリセリド、１００ｍｇ／ｄｌより高い空腹時血糖、または男性において４０ｍｇ／ｄｌ未満もしくは女性において５０ｍｇ／ｄｌ未満の高密度リポタンパク質。
【０１８７】
インスリン抵抗性は、正常な場合はインスリン応答性である組織（一般に、筋組織、脂肪組織、および肝組織）がインスリンに応答して血糖を取り込む能力の不能性または低下を発現した状態である。患者において、インスリン抵抗性は基礎血糖値を測定する空腹時血糖検査により検出できる。インスリン抵抗性患者では１００〜１２５ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖値が一般的である。これに対し、糖尿病患者ではより高い値が一般的である。インスリン抵抗性についての別の診断法は経口グルコース負荷試験であり、この場合はグルコース溶液を患者に経口投与し、短時間後に血糖値を測定する。この診断アッセイ法では、１４０〜１９９ｍｇ／ｄＬの血糖値がインスリン抵抗性患者に一般的である。
【０１８８】
代謝障害の他の例には、下記のものが含まれる：肥満症、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性症候群、Ｘ症候群、インスリン抵抗性、高い血圧、高血圧症、高い血中コレステロール（高コレステロール血症）、異脂肪血症、高脂血症、アテローム硬化性疾患：発作、冠動脈疾患または心筋梗塞を含む、高血糖症、高インスリン血症および／または高プロインスリン血症、グルコース耐性障害、およびインスリン放出遅延、脂肪栄養障害、コレステロール関連障害、たとえば胆石、胆嚢炎および胆石症、ならびに痛風。同様に代謝性の疾患または障害の範囲に含まれるとみなされるのは、糖尿病から生じる合併症であり、これには冠動脈性心疾患、狭心症、うっ血性心不全、発作、認知症における認知機能、網膜障害、末梢神経障害、神経障害、腎炎、糸球体硬化症、ネフローゼ症候群、および高血圧性腎硬化症が含まれる。
【０１８９】
ある態様において、疾患を処置する方法は、療法有効量のＥＤＮ３様ポリペプチドを
その必要がある患者に投与することを含み、その際、疾患、状態または障害は下記のものから選択される：Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、特発性Ｉ型糖尿病（Ｉｂ型）、成人潜在性自己免疫性糖尿病(latent autoimmune diabetes in adults)（ＬＡＤＡ）、早期発症型ＩＩ型糖尿病(early-onset Type 2 diabetes)（ＥＯＤ）、若年発症型非定型糖尿病(youth-onset atypical diabetes)（ＹＯＡＤ）、若年発症成人型糖尿病(maturity onset diabetes of the young)（ＭＯＤＹ）、栄養不良関連糖尿病、妊娠糖尿病、膵臓炎、冠動脈性心疾患、虚血性発作、血管形成術後再狭窄、末梢血管疾患、間欠性跛行、心筋梗塞（たとえば、壊死およびアポトーシス）、異脂肪血症、食後高脂血症、グルコース耐性障害（ＩＧＴ）の状態、空腹時血漿グルコース障害の状態、代謝性アシドーシス、ケトーシス、関節炎、肥満症、骨粗鬆症、高血圧症、うっ血性心不全、左心室肥大、末梢動脈疾患、糖尿病性網膜障害、黄斑変性症、白内障、糖尿病性腎障害、糸球体硬化症、慢性腎不全、糖尿病性神経障害、メタボリックシンドローム、Ｘ症候群、月経前症候群、冠動脈性心疾患、狭心症、血栓症、アテローム硬化症、心筋梗塞、一過性虚血性発作、発作、血管再狭窄、高血糖症、高インスリン血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、インスリン抵抗性、糖代謝障害、グルコース耐性障害の状態、空腹時血漿グルコース障害の状態、肥満症、勃起機能障害、皮膚および結合組織の障害、足潰瘍形成および潰瘍性結腸炎、内皮機能障害および血管伸展性障害、高アポＢリポタンパク血症、アルツハイマー病、統合失調症、認知障害、炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、クローン病、ならびに過敏性腸症候群。
【０１９０】
用語“処置”、“処置すること”などは、本明細書中で一般に、希望する薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するために用いられる。効果は、ある疾患、状態もしくはその症状の重症度軽減または発症遅延という点で予防的であってもよく、ならびに／あるいは疾患もしくは状態および／またはその疾患もしくは状態に起因する有害作用の部分的または完全な治癒という点で治療的であってもよい。ある態様において、予防処置は、その処置を受けている患者が彼または彼女の生涯においてその疾患に罹患しない程に有効である。本明細書中で用いる“処置”は、哺乳動物、特にヒトの疾患または障害のいかなる処置も包含し、下記を含む：（ａ）その疾患または状態に対する素因をもつ可能性があるけれどもまだその疾患または状態を伴うと診断されていない対象において、疾患または状態が起きる可能性を低下させる；（ｂ）疾患または状態を阻止する（たとえば、それの発症を停止させる）；あるいは（ｃ）疾患または状態を軽減する（たとえば、疾患または状態を退行させて、１以上の症状の改善をもたらす）。これらの状態のいずれかにおける改善は、当技術分野で知られている標準法に従って容易に評価することができる。本発明方法により処置した対象の集団には、望ましくない状態または疾患に罹患している対象、およびその状態または疾患を発症するリスクをもつ対象が含まれる。
【０１９１】
用語“療法有効量”または“有効量”は、そのためにそれを投与する所期の効果を生じる用量を意味する。厳密な用量は処置の目的に依存し、当業者が既知の手法を用いて確認できるであろう（たとえば、Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compoundingを参照)。
【０１９２】
特定の態様において、１種類以上のＥＤＮ３様ポリペプチド（融合体を含む）を、一緒に（同時に）または異なる時点で（逐次）投与することができる。１種類のＥＤＮ３様ポリペプチド（融合体を含む）を投与するか、あるいは複数のポリペプチドを投与するかに関係なく、特定の態様において、ポリペプチドを多数回で投与する。たとえば、特定の態様において、処置は計画に従って１回より多い投与を含む（たとえば、必要に応じて１日１回、週１回など）。
【０１９３】
本発明のＥＤＮ３様ポリペプチドは、エネルギー消費を増大させるためにも使用できる。エネルギー消費（ＶＯ２、ＶＣＯ２、および発熱（（３．８１５＋１．２３２＊ＲＥＲ）＊ＶＯ２（リットル））は、実施例３に記載するようにマウスモデルにおいて呼吸チャンバーを用いて測定できる。簡単に述べると、それは身体のすべての随意機能および不随意機能のために生物が１日に使う全エネルギーの測定値（カロリー）である。この測定は、一般に極端な温度を含まない環境で行なわれる。それは、生命器官を支持しかつ正常体温を維持するのに必要なエネルギー量を含む。エネルギー消費は、直接的または間接的な熱量測定法により測定できるが、対象の体表面積（対象の身長と体重から推測できる）を考慮に入れることにより推定値を計算することもできる。ある態様において、本発明のＥＤＮ３様ポリペプチドは呼吸交換率を少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、または２０％低下させる。
【０１９４】
さらに、ＥＤＮ３様ポリペプチドを用いて、インビボまたはインビトロで肝細胞におけるグルコース産生を阻害することができる。インビトロでは、肝細胞におけるグルコース産生を実施例８のアッセイ法に従って測定することができる。インビトロアッセイには、初代または形質転換した肝細胞を使用できる。ある態様において、グルコース産生は少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％低下する。
【０１９５】
ある態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドを用いて、インビボまたはインビトロでＧＬＰ−１分泌を促進することができる。インビトロでは、腸細胞によるＧＬＰ−１産生を実施例５のＧＬＵＴａｇアッセイ法に従って測定することができる。ある態様において、それらのペプチドはＧＬＰ−１分泌を１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、または１０μＭ未満のＥＣ５０で刺激する。
【０１９６】
ある態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドを用いて対象の深部体温を上昇させることができる。ある例において、そのポリペプチドは深部体温を平均で少なくとも０．２５℃、０．５℃、０．７５℃、１℃、１．２５℃、１．５℃、１．７５℃、２℃、２．２５℃、２．５℃、２．７５℃、または３℃、上昇させる。
【０１９７】
本明細書に記載するＥＤＮ３様ポリペプチドは、多様な対象、特にヒト対象を処置するのに有用であるが、これには他の哺乳動物、たとえば愛玩動物（イヌおよびネコを含む）および家畜（ウシおよびブタを含む）も含まれる。ＥＤＮ３様ポリペプチドによる処置を必要とする対象には、前記に挙げた代謝性の疾患または障害を伴う対象が含まれ、そのような疾患または障害を発症するリスクをもつと判定された対象も含まれる。たとえば、代謝性疾患（高コレステロール血症および糖尿病を含む）の家族歴は、ある対象がその疾患を発症するリスクが高いことの指標となる。遺伝子マーカーも代謝性の疾患または障害のリスクが高いことの指標となりうる。特定の態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドの投与は対象における代謝性の疾患または障害のリスクを低下させる。そのようなリスク低下は、たとえばＥＤＮ３様ポリペプチドで処置した対象のグループを対照である対象グループと経時的に比較し、処置した対象グループが対照である対象と比較して代謝性疾患の発症低下を示す場合に分かる。
【０１９８】
ＥＤＮ３様ポリペプチドで対象を処置すると、代謝性の疾患または障害の少なくとも１つの症状を改善することができる。ある例において、症状は高い安静時血糖値である。ある態様において、症状は最適値より高い体重または肥満指数である。
【０１９９】
本発明は、本明細書中に述べるいずれかの適応症の処置に使用するための、いずれかのＥＤＮ３様ポリペプチドの使用を考慮し、これには本明細書に開示するいずれかの代表的ＥＤＮ３様ポリペプチドが含まれる（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３３のいずれかおよびそのバリアントを含むかまたはそれからなるポリペプチド、たとえばアミノ酸残基６０個以下のポリペプチドであってＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３３のいずれかを含むものが含まれる）。
【０２００】
６．ＥＤＮ３様ポリペプチドを含む併用療法
本明細書に開示するＥＤＮ３様ポリペプチドはそれ自体で投与することができ、あるいは追加医薬と一緒に投与することができ、その際、追加医薬はＥＤＮ３様ポリペプチドが同様に処置する１種類以上の疾患を処置する。ある態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドと追加医薬は、同一の症状を処置することによって相加的または相乗的に作用する。ある態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドと追加医薬は、異なる症状を処置することによって相互に補足する。
【０２０１】
したがって、ある態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドを含む医薬組成物は、抗肥満症薬、抗糖尿病薬、抗−高血糖症薬、脂質低下薬、および抗−高血圧症薬からなる群から選択される少なくとも１種類の追加医薬を含有するか、あるいは追加医薬と組み合わせて投与される。他の態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドと追加医薬を同時に、たとえば１つの医薬組成物の一部として投与する。さらに他の態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドと追加医薬をいずれかの順序で逐次投与する。
【０２０２】
脂質低下薬には下記のものが含まれる：リパーゼ阻害薬、ＮＰＹ受容体アンタゴニスト、ＬＤＬ−コレステロール低下薬、トリグリセリド低下薬、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、コレステロール合成阻害薬、コレステロール吸収阻害薬、ＣＥＴＰ阻害薬、ＰＰＡＲ調節薬、または他のコレステロール低下薬、たとえばフィブレート、ナイアシン、イオン交換樹脂、抗酸化薬、ＡＣＡＴ阻害薬、または胆汁酸捕捉薬。本発明の併用療法に有用な他の医薬には下記のものが含まれる：胆汁酸再取込み阻害薬、回腸胆汁酸輸送阻害薬、ＡＣＣ阻害薬、抗−高血圧症薬（たとえばアモルジピン(amlodipine)、たとえばＮｏｒｖａｓｃ（登録商標）)、抗生物質、抗糖尿病薬（たとえば、メトホルミン(metformin)）、ＰＰＡＲ−γ活性化薬、スルホニル尿素、インスリン、アルドースレダクターゼ阻害薬（ＡＲ１）（たとえば、ゾポルレスタット(zopolrestat))、ソルビトールデヒドロゲナーゼ阻害薬（ＳＤＩ））、および抗炎症薬、たとえばアスピリン、または好ましくはそれがシクロオキシゲナーゼ−１（Ｃｏｘ−１）を阻害するより大幅にシクロオキシゲナーゼ−２（Ｃｏｘ−２）を阻害する抗炎症薬、たとえばセレコキシブ(celecoxib) (U.S. Pat. No. 5,466,823)、バルデコキシブ(valdecoxib) (U.S. Pat. No. 5,633,272、パレコキシブ(parecoxib) (U.S. Pat. No. 5,932,598)、デラコキシブ(deracoxib) (CAS RN 169590-41-4)、エトリコキシブ(etoricoxib) (CAS RN 202409-33-4)、もしくはルミラコキシブ(lumiracoxib) (CAS RN 220991-20-8)。
【０２０３】
リパーゼ阻害薬は本発明の併用療法に有用である。リパーゼ阻害薬は、食事トリグリセリドが代謝開裂して遊離脂肪酸およびモノグリセリドになるのを阻害する。正常な生理的条件下で、脂肪分解はリパーゼ酵素の活性セリン部分のアシル化を伴う２段階プロセスで行なわれる。これにより脂肪酸−リパーゼヘミアセタール中間体が生成し、これが次いで開裂してジグリセリドを放出する。さらに脱アシル化された後、リパーゼ−脂肪酸中間体は開裂して遊離リパーゼ、モノグリセリドおよび脂肪酸になる。生成した遊離脂肪酸およびモノグリセリドは胆汁酸−リン脂質ミセルに取り込まれ、それらはその後、小腸の刷子縁レベルで吸収される。これらのミセルは最終的にキロミクロンとして末梢循環に進入する。リパーゼ阻害活性は、当技術分野で周知の標準アッセイ法を用いて容易に測定される。たとえば、Methods Enzymol. 286: 190-231を参照；これを本明細書に援用する。
【０２０４】
膵リパーゼはトリグリセリドから１−および３−炭素位置の脂肪酸が代謝開裂するのを仲介する。摂取した脂肪の主な代謝部位は十二指腸および近位空腸において膵リパーゼによるものであり、これは通常は上部小腸における分解に必要な量より大過剰に分泌される。膵リパーゼは食事トリグリセリドの吸収に必要な主要酵素であるので、このリパーゼの阻害薬は肥満症および関連状態の処置に使用できる。
【０２０５】
胃リパーゼは免疫学的に別個のリパーゼであり、これは食事脂肪の消化の約１０〜４０％に関与する。胃リパーゼは、機械的刺激、食物摂取、脂肪性食事の存在に応答して、または交感神経作動薬により、分泌される。摂取した脂肪の胃リパーゼ分解は、腸における膵リパーゼ活性を誘発するのに必要な脂肪酸の供給において生理的に重要であり、また膵不全関連の多様な生理的および病理的状態における脂肪吸収のためにも重要である。たとえば、C. K. Abrams et al., Gastroenterology, 92, 125 (1987)を参照。
【０２０６】
併用療法に有用である多様な膵リパーゼ阻害薬を以下に記載する。膵リパーゼ阻害薬リプスタチン(lipstatin)、すなわち（２Ｓ，３Ｓ，５Ｓ，７Ｚ，１０Ｚ）−５−［（Ｓ）−２−ホルムアミド−４−メチル−バレリルオキシ］−２−ヘキシル−３−ヒドロキシ−７，１０−ヘキサデカン酸ラクトン、およびテトラヒドロリプスタチン、すなわち（２Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−５−［（Ｓ）−２−ホルムアミド−４−メチル−バレリルオキシ］−２−ヘキシル−３−ヒドロキシ−ヘキサデカン１，３酸ラクトン、ならびにその多様に置換されたＮ−ホルミルロイシン誘導体および立体異性体が、U.S. Pat. No. 4,598,089に開示されている。テトラヒドロリプスタチンは、U.S. Pat. No. 5,274,143; 5,420,305; 5,540,917;および5,643,874の記載に従って製造できる。膵リパーゼ阻害薬ＦＬ−３８６、すなわち１−［４−（２−メチルプロピル）シクロヘキシル］−２−［（フェニルスルホニル）オキシ］−エタノン、およびそれに関連する多様に置換されたスルホネート誘導体が、U.S. Pat. No. 4,452,813に開示されている。膵リパーゼ阻害薬ＷＡＹ−１２１８９８、すなわち４−フェノキシフェニル−４−メチルピペリジン−１−イル−カルボキシレート、ならびにそれに関連する多様なカルバメートエステルおよび医薬的に許容できる塩類が、U.S. Pat. No. 5,512,565、5,391,571、および5,602,151に開示されている。膵リパーゼ阻害薬バリラクトン(valilactone)、およびそれを放線菌(Actinomycetes)株ＭＧ１４７−ＣＦ２の微生物培養により調製する方法が、Kitahara et al., J. Antibiotics, 40 (11), 1647-1650 (1987)に示されている。膵リパーゼ阻害薬エベラクトン(ebelactone)ＡおよびエベラクトンＢ、ならびにそれらを放線菌株ＭＧ７−Ｇ１の微生物培養により調製する方法が、Umezawa et al., J. Antibiotics, 33, 1594-1596 (1980)に示されている。モノグリセリド形成抑制におけるエベラクトンＡおよびエベラクトンＢの使用は、特開平08-143457、1996年6月4日公開、に開示されている。上記に引用したすべての参考文献を本明細書に援用する。
【０２０７】
若干の適切なリパーゼ阻害薬には、リプスタチン、テトラヒドロリプスタチン、バリラクトン、エステラスチン(esterastin)、エベラクトンＡおよびエベラクトンＢ、特にテトラヒドロリプスタチンが含まれる。リパーゼ阻害薬Ｎ−３−トリフルオロメチルフェニル−Ｎ’−３−クロロ−４’−トリフルオロメチルフェニル尿素、およびそれに関連する多様な尿素誘導体が、U.S. Pat. No. 4,405,644に開示されている。エステラシン(Esteracin)が、U.S. Pat. No. 4,189,438および4,242,453に開示されている。リパーゼ阻害薬シクロ−Ｏ，Ｏ’−［（１，６−ヘキサンジイル）−ビス−（イミノカルボニル）］ジオキシムおよびそれに関連する多様なビス（イミノカルボニル）ジオキシム類は、Petersen et al., Liebig's Annalen, 562, 205-229 (1949)の記載に従って調製できる。上記に引用したすべての参考文献を本明細書に援用する。
【０２０８】
好ましいＮＰＹ受容体アンタゴニストには、ＮＰＹ  Ｙ５受容体アンタゴニスト、たとえば下記に記載されているスピロ化合物が含まれる：U.S. Pat. No. 6,566,367; 6,649,624; 6,638,942; 6,605,720; 6,495,559; 6,462,053; 6,388,077; 6,335,345および6,326,375; U.S. Patent Application Publication No. 2002/0151456および2003/036652、ならびにPCT Patent Application Publication No. WO 03/010175; WO 03/082190およびWO 02/048152。
【０２０９】
徐放形態のナイアシンが、Ｎｉａｓｐａｎの商品名で市販されている。ナイアシンは他の療法薬、たとえばロバスタチン(lovastatin)、すなわちＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬と組み合わせることもできる。この組合わせ療法薬は、商標Ａｄｖｉｃｏｒ（登録商標）で販売されている（Ｋｏｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ）。
【０２１０】
いずれかのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬を、本発明の併用療法に追加化合物として使用できる。用語、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬は、酵素ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼにより触媒されるヒドロキシメチルグルタリル−補酵素Ａからメバロン酸への生物変換を阻害する化合物を表わす。測定のためのアッセイ法は当技術分野で知られている（たとえば、Meth. Enzymol. 1981; 71:455-509、およびそこに引用された参考文献)。本発明において関心のあるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬には、下記に開示されるものが含まれる：U.S. Pat. No. 4,231,938 (アスペルギルス属(Aspergillus)に属する微生物の培養後に単離された化合物、たとえばロバスタチン)、U.S. Pat. No. 4,444,784 (前記化合物、たとえばシンバスタチン(simvastatin)の合成誘導体)、U.S. Pat. No. 4,739,073 (置換インドール類、たとえばフルバスタチン(fluvastatin))、U.S. Pat. No. 4,346,227 （ＭＬ−２３６Ｂ誘導体、たとえばプラバスタチン(pravastatin))、European Patent Application Publication No. 491 226 A (ピリジルジヒドロキシヘプテン酸類、たとえばセリバスタチン(cerivastatin))、U.S. Pat. No. 5,273,995 （６−［２−（置換−ピロール−１−イル）アルキル］ピラン−２−オン類、たとえばアトルバスタチン(atorvastatin)およびその医薬的に許容できる形態（すなわち、アトルバスタチン、たとえばＬｉｐｉｔｏｒ（登録商標）））。本発明において関心のある他のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬には、ロスバスタチン(rosuvastatin)およびピタバスタチン(pitavastatin)が含まれる。上記に引用したすべての参考文献を本明細書に援用する。
【０２１１】
好ましいＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬には、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、またはリバスタチン(rivastatin)、より好ましくはアトルバスタチン、特にアトルバスタチンヘミカルシウムが含まれる。
【０２１２】
ＣＥＴＰ阻害薬活性をもついずれかの化合物を、本発明の併用療法に追加化合物として使用できる。用語、ＣＥＴＰ阻害薬は、コレステリルエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）仲介によるＨＤＬからＬＤＬおよびＶＬＤＬへの各種コレステリルエステルおよびトリグリセリドの輸送を阻害する化合物を表わす。そのようなＣＥＴＰ阻害活性は、当業者により標準アッセイ法に従って容易に測定される（たとえば、U.S. Pat. No. 6,140,343)。本発明の併用療法に有用なＣＥＴＰ阻害薬には、U.S. Pat. No. 6,140,343および6,197,786に開示されるものが含まれる。これらの特許に開示されるＣＥＴＰ阻害薬には、［２Ｒ，４Ｓ］４−［（３，５−ビス−トリフルオロメチル−ベンジル）−メトキシカルボニル−アミノ］−２−エチル−６−トリフルオロメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−キノリン−１−カルボン酸エチルエステルなどの化合物が含まれ、これはトルセトラピブ(torcetrapib)としても知られる。同様に関心のあるものは、下記に開示されるＣＥＴＰ阻害薬である：U.S. Patent Application Pub. No. 2004-0204450、2004年3月23日出願、およびそれの優先権文書U.S. Pat. App. Ser. No. 60/458,274、2003年3月28日出願、U.S. Pat. No. 5,512,548 (ポリペプチド誘導体)、J. Antibiot., 49(8): 815-816 (1996)（ロゼノノラクトン(rosenonolactone)誘導体）、ならびにBioorg. Med. Chem. Lett.; 6:1951-1954 (1996) (コレステリルエステルのリン酸含有アナログ)。上記に引用したすべての参考文献を本明細書に援用する。
【０２１３】
いずれかのＰＰＡＲ調節薬を、本発明の併用療法に追加化合物として使用できる。用語、ＰＰＡＲ調節薬は、哺乳動物、特にヒトにおいて、ペルオキシソーム増殖物質アクチベーター受容体(peroxisome proliferator activator receptor)（ＰＰＡＲ）活性を調節する化合物を表わす。そのような調節は、当技術分野で既知の標準アッセイ法によって容易に測定できる。そのような化合物はＰＰＡＲ受容体を調節することにより、脂肪酸酸化に関与する鍵遺伝子および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）アセンブリーに関与する遺伝子の転写（たとえば、アポリポタンパク質Ａｌ遺伝子の転写）を刺激し、したがって全身脂肪を減少させ、ＨＤＬコレステロールを増加させると考えられる。これらの化合物はまた、それらの活性によりトリグリセリド、ＶＬＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、およびそれらに関連する成分の血漿レベルを低下させ、ＨＤＬコレステロールおよびアポリポタンパク質Ａｌを増加させる。したがって、これらの化合物はアテローム硬化症および心血管疾患の発症および発生に関連する種々の異脂肪血症の処置および矯正に有用である；これには、低アルファリポタンパク血症および高トリグリセリド血症が含まれる。本発明において関心のあるＰＰＡＲ−α活性化薬には、PCT Patent Application Publication No. WO 02/064549およびWO 02/064130、ならびにU.S. Patent Application Ser. No. 10/720,942 (2004-0157885として公開), 2003年11月24日出願、に開示されるものが含まれる。上記に引用したすべての参考文献を本明細書に援用する。
【０２１４】
いずれかのＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ阻害薬を、本発明の併用療法に追加化合物として使用できる。用語、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ阻害薬は、酵素ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼにより触媒されるアセチル−補酵素Ａおよびアセトアセチル−補酵素Ａからのヒドロキシメチルグルタリル−補酵素Ａの生合成を阻害する化合物を表わす。そのような阻害は、当技術分野で既知の標準アッセイ法によって容易に測定される(Meth Enzymol. 1975; 35:155-160: Meth. Enzymol. 1985; 110:19-26、およびそれに引用された参考文献)。関心のあるＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ阻害薬には、下記に開示されるものが含まれる：U.S. Pat. No. 5,120,729 (ベータラクタム誘導体)、U.S. Pat. No. 5,064,856 (微生物（ＭＦ５２５３）の培養により調製されたスピロ−ラクトン誘導体)、およびU.S. Pat. No. 4,847,271 (特定のオキセタン化合物、たとえば１１−（３−ヒドロキシメチル−４−オキソ−２−オキセタリル）−３，５，７−トリメチル−２，４−ウンデカ−ジエン酸誘導体)。上記に引用したすべての参考文献を本明細書に援用する。
【０２１５】
ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子発現を低下させるいずれかの化合物を、本発明の併用療法に追加化合物として使用できる。これらの薬剤は、ＤＮＡの転写を遮断するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ転写阻害薬、またはＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードするｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻止もしくは低減する翻訳阻害薬であってもよい。そのような化合物は転写または翻訳に直接に影響を及ぼしてもよく、あるいはコレステロール生合成カスケードにおいて１種類以上の酵素により前記活性をもつ化合物に生物変換されてもよく、あるいは前記活性をもつイソプレン代謝産物の蓄積をもたらしてもよい。そのような調節は、当業者により標準アッセイ法に従って容易に測定される(Meth. Enzymol., 1985; 110:9-19)。 U.S. Pat. No. 5,041,432には、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子発現を低下させる特定の１５−置換ラノステロール誘導体が開示されている。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの合成を抑制する他の酸化ステロール類が、E.I. Mercer (Prog. Lip. Res. 1993; 32: 357-416)により考察されている。上記に引用した参考文献を本明細書に援用する。
【０２１６】
スクアレンシンセターゼ阻害薬も、本発明の併用療法に追加化合物として有用である。そのような化合物は、酵素スクアレンシンセターゼの触媒作用により２分子のファルネシルピロリン酸が縮合してスクアレンを形成するのを阻害する。スクアレンシンセターゼ阻害を測定するための標準アッセイ法は当技術分野で周知である(Meth. Enzymol. 1969; 15: 393-454、およびMeth. Enzymol. 1985; 110:359-373、ならびにそれらに引用された参考文献)。本発明において関心のあるスクアレンシンセターゼ阻害薬には、下記に開示されるものが含まれる：U.S. Pat. No. 5,026,554 (微生物ＭＦ５４６５（ＡＴＣＣ  ７４０１１）の発酵生成物、ザラゴジン酸(zaragozic acid)を含む)、およびCurr. Op. Ther. Patents (1993) 861-4に示される特許されたスクアレンシンセターゼ阻害薬の概要に含まれるもの。上記に引用した参考文献を本明細書に援用する。
【０２１７】
いずれかのスクアレンエポキシダーゼ阻害薬を、本発明の併用療法に追加化合物として使用できる。これらの化合物は、酵素スクアレンエポキシダーゼにより触媒されるスクアレンおよび酸素分子からスクアレン−２，３−エポキシドへの生物変換を阻害する。そのような阻害は、当業者により標準アッセイ法に従って容易に測定される(Biochim. Biophys. Acta 1984; 794:466-471)。本発明において関心のあるスクアレンエポキシダーゼ阻害薬には、下記に開示されるものが含まれる：U.S. Pat. No. 5,011,859および5,064,864 (スクアレンのフルオロアナログ)、 European Patent Application Publication No. 395,768 A (置換アリルアミン誘導体)、PCT Patent Application Publication No. WO 93/12069 A (アミノアルコール誘導体)、ならびにU.S. Pat. No. 5,051,534 (シクロプロピルオキシ−スクアレン誘導体)。上記に引用したすべての参考文献を本明細書に援用する。
【０２１８】
スクアレンシクラーゼ阻害薬も、本発明において本発明の併用療法に使用するための追加医薬として考慮される。これらの化合物は、酵素スクアレンシクラーゼにより触媒されるスクアレン−２，３−エポキシドからラノステロールへの生物変換を阻害する。そのような阻害は、当技術分野で周知の標準アッセイ法によって容易に測定される(FEBS Lett. 1989; 244: 347-350)。関心のあるスクアレンシクラーゼ阻害薬には、下記に開示されるものが含まれる：PCT Patent Application Publication No. WO 94/10150（１，２，３，５，６，７，８，８ａ−オクタヒドロ−５，５，８（ベータ）−トリメチル−６−イソキノリンアミン誘導体、たとえばＮ−トリフルオロアセチル−１，２，３，５，６，７，８，８ａ−オクタヒドロ−２−アリル−５，５，８（ベータ）−トリメチル−６（ベータ）−イソキノリンアミン)およびFrench Patent Application Publication No. 2697250（ベータ，ベータ−ジメチル−４−ピペリジンエタノール誘導体、たとえば１−（１，５，９−トリメチルデシル）−ベータ，ベータ−ジメチル−４−ピペリジンエタノール）。上記に引用した参考文献を本明細書に援用する。
【０２１９】
いずれかの組合わせスクアレンエポキシダーゼ／スクアレンシクラーゼ阻害薬を、本発明の併用療法に追加医薬として使用できる。組合わせスクアレンエポキシダーゼ／スクアレンシクラーゼ阻害薬という用語は、スクアレンがスクアレン−２，３−エポキシド中間体を経てラノステロールに生物変換されるのを阻害する化合物を表わす。組合わせスクアレンエポキシダーゼ／スクアレンシクラーゼ阻害は、スクアレンシクラーゼ阻害薬またはスクアレンエポキシダーゼ阻害薬に関する標準アッセイ法で容易に測定される。本発明の併用療法に有用なスクアレンエポキシダーゼ／スクアレンシクラーゼ阻害薬には、下記に開示されるものが含まれる：U.S. Pat. No. 5,084,461および5,278,171（アザデカリン誘導体）、European Patent Application Publication No. 468,434（ピペリジルエーテルおよびチオ−エーテル誘導体、たとえば２−（１−ピペリジル）ペンチルイソペンチルスルホキシドおよび２−（１−ピペリジル）エチルエチルスルフィド）、PCT Patent Application Publication No. WO 94/01404（アシル−ピペリジン類、たとえば１−（１−オキソペンチル−５−フェニルチオ）−４−（２−ヒドロキシ−１−メチル）−エチル）ピペリジン）、ならびにU.S. Pat. No. 5,102,915（シクロプロピルオキシ−スクアレン誘導体）。上記に引用したすべての参考文献を本明細書に援用する。
【０２２０】
ＥＤＮ３様ポリペプチドは、血漿コレステロールレベルを低下させる作用をする天然物と組み合わせて投与することもできる。これらの天然物は一般に栄養補助食品(nutraceutical)と呼ばれ、これにはたとえばニンニクエキス、フーディア(Hoodia)植物エキスおよびナイアシンが含まれる。
【０２２１】
コレステロール吸収阻害薬も、本発明の併用療法に使用できる。用語、コレステロール吸収阻害は、ある化合物が腸管腔に含まれるコレステロールの腸細胞への進入および／または腸細胞から血流中への通過を阻害する能力を表わす。そのようなコレステロール吸収阻害活性は、標準アッセイ法で容易に測定される（たとえば、J. Lipid Res. (1993) 34: 377-395)。関心のあるコレステロール吸収阻害薬には、PCT Patent Application Publication No. WO 94/00480に開示されるものが含まれる。好ましいコレステロール吸収阻害薬は、エゼチミブ(ezetimibe)、たとえばＺｅｔｉａ（商標）（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）である。上記に引用した参考文献を本明細書に援用する。
【０２２２】
いずれかのＡＣＡＴ阻害薬を、本発明の併用療法に追加医薬として使用できる。用語、ＡＣＡＴ阻害薬は、酵素アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼによる食事コレステロールの細胞内エステル化を阻害する化合物を表わす。そのような阻害は標準アッセイ法、たとえばHeider et al., Journal of Lipid Research., 24:1127 (1983)に記載される方法により測定できる。本発明に有用なＡＣＡＴ阻害薬には、下記に開示されるものが含まれる：U.S. Pat. No. 5,510,379（カルボキシスルホネート類）ならびにPCT Patent Application Publication No. WO 96/26948およびWO 96/10559（両方とも尿素誘導体を開示する）。好ましいＡＣＡＴ阻害薬には、アバシミブ(avasimibe)（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＳ−５０５（三共）およびエフルシミブ(eflucimibe)（Ｅｌｉ  ＬｉｌｌｙおよびＰｉｅｒｒｅ  Ｆａｂｒｅ）。上記に引用したすべての参考文献を本明細書に援用する。
【０２２３】
高コレステロール血症を含めた高脂血症に対して市販されている他の化合物であって、アテローム硬化症の予防または処置を補助するためのものであり、本発明において関心のある化合物には、下記のものが含まれる：胆汁酸捕捉薬、たとえばコレセベラム(Colesevelam)、たとえばＷｅｌｃｈｏｌ（登録商標）、コレスチポール(Colestipol)、たとえばＣｏｌｅｓｔｉｄ（登録商標）、コレスチラミン樹脂(Cholestyramine Resin)、たとえばＬｏＣｈｏｌｅｓｔ（登録商標）、コレスチラミン、たとえばＱｕｅｓｔｒａｎ（登録商標）;ならびにフィブリン酸(fibric acid)誘導体、たとえばクロフィブレート(Clofibrate)、たとえばＡｔｒｏｍｉｄ（登録商標）、ゲムフィブロジル(Gemfibrozil)、たとえばＬｏｐｉｄ（登録商標）、およびフェノフィブレート(Fenofibrate)、たとえばＴｒｉｃｏｒ（登録商標）。
【０２２４】
糖尿病（特に、ＩＩ型）、インスリン抵抗性、グルコース耐性障害など、およびいずれかの糖尿病合併症、たとえば神経障害、腎障害、網膜障害または白内障は、療法有効量のＥＤＮ３様ポリペプチドを、糖尿病の処置に有用な１種類以上の追加医薬（たとえば、インスリン）と組み合わせて投与することにより処置できる。
【０２２５】
いずれかのグリコーゲンホスホリラーゼ阻害薬を追加薬剤としてＥＤＮ３様ポリペプチドと組み合わせて使用できる。用語、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害薬は、酵素グリコーゲンホスホリラーゼにより触媒されるグリコーゲンからグルコース−１−リン酸への生物変換を阻害する化合物を表わす。そのようなグリコーゲンホスホリラーゼ阻害活性は、当技術分野で周知の標準アッセイ法によって容易に測定される（たとえば、J. Med. Chem. 41 (1998) 2934-2938)。本発明において関心のあるグリコーゲンホスホリラーゼ阻害薬には、PCT Patent Application Publication No. WO 96/39384およびWO 96/39385に記載されるものが含まれる。上記に引用した参考文献を本明細書に援用する。
【０２２６】
アルドースレダクターゼ阻害薬も、本発明の併用療法に有用である。これらの化合物は、酵素アルドースレダクターゼにより触媒されるグルコースからソルビトールへの生物変換を阻害する。アルドースレダクターゼ阻害は、標準アッセイ法によって容易に測定される（たとえば、J. Malone, Diabetes, 29:861-864 (1980) “Red Cell Sorbitol, an Indicator of Diabetic Control”、本明細書に援用する)。多様なアルドースレダクターゼ阻害薬が当業者に知られている。上記に引用した参考文献を本明細書に援用する。
【０２２７】
いずれかのソルビトールデヒドロゲナーゼ阻害薬を、ＥＤＮ３様ポリペプチドと組み合わせて使用できる。用語、ソルビトールデヒドロゲナーゼ阻害薬は、酵素ソルビトールデヒドロゲナーゼにより触媒されるソルビトールからフルクトースへの生物変換を阻害する化合物を表わす。そのようなソルビトールデヒドロゲナーゼ阻害薬活性は、当技術分野で周知の標準アッセイ法の使用によって容易に測定される（たとえば、Analyt. Biochem (2000) 280: 329-331)。関心のあるソルビトールデヒドロゲナーゼ阻害薬には、U.S. Pat. No. 5,728,704および5,866,578に開示されるものが含まれる。上記に引用した参考文献を本明細書に援用する。
【０２２８】
いずれかのグルコシダーゼ阻害薬を、本発明の併用療法に使用できる。そのような化合物は、グリコシドヒドロラーゼ、たとえばアミラーゼまたはマルターゼによって複雑な炭水化物が生物利用可能な単純糖類、たとえばグルコースに酵素加水分解されるのを阻害する。グルコシダーゼの急激な代謝作用は、特に高レベルの炭水化物の摂取後に食事性高血糖を生じ、これは脂肪過多または糖尿病の対象においてインスリン分泌の増大、脂肪合成の亢進、および脂肪分解の低下をもたらす。インスリン存在レベルが増強されるため、そのような高血糖に続いてしばしば低血糖が起きる。さらに、胃に残留する粥状液(chyme)が胃液の産生を促進し、これが胃炎または十二指腸潰瘍の発症を開始または助長することが知られている。したがって、グルコシダーゼ阻害薬は炭水化物が胃を通過するのを加速させてグルコースが腸から吸収されるのを阻害するのに利用できることが分かっている。さらに、炭水化物が脂肪組織の脂質に変換され、その後に食事脂肪が脂肪組織沈着物に取り込まれるのが、これによって低減または遅延し、同時に、それから生じる有害な異常が軽減または阻止されるという利点がある。そのようなグルコシダーゼ阻害活性は、当業者により標準アッセイ法に従って容易に測定される（たとえば、Biochemistry (1969)8: 4214)；これを本明細書に援用する。
【０２２９】
グルコシダーゼ阻害薬の適切な１タイプは、アミラーゼ阻害薬である。アミラーゼ阻害薬は、デンプンまたはグリコーゲンがマルトースに酵素分解されるのを阻害するグルコシダーゼ阻害薬である。そのようなアミラーゼ阻害活性は、標準アッセイ法の使用によって容易に測定される（たとえば、Methods Enzymol. (1955)1: 149；本明細書に援用する)。そのような酵素分解の阻害は、グルコースおよびマルトースを含めた生物利用可能な糖類の量を減らし、同時にそれから生じる有害な状態を軽減するのに有益である。
【０２３０】
特定の適切なグルコシダーゼ阻害薬には、アカルボース(acarbose)、アディポシン(adiposine)、ボグリボース(voglibose)、ミグリトール(miglitol)、エミグリテート(emiglitate)、カミグリボース(camiglibose)、テンダミステート(tendamistate)、トレスタチン(trestatin)、プラジミシン−Ｑ(pradimicin-Q)、およびサルボスタチン(salbostatin)が含まれる。グルコシダーゼ阻害薬アカルボースおよびそれに関連する種々のアミノ糖誘導体は、それぞれU.S. Pat. No. 4,062,950および4,174,439に開示されている。グルコシダーゼ阻害薬アディポシンは、U.S. Pat. No. 4,254,256に開示されている。グルコシダーゼ阻害薬ボグリボース、すなわち３，４−ジデオキシ−４−［［２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）エチル］アミノ］−２−Ｃ−（ヒドロキシメチル）−Ｄ−エピ−イノシトール、およびそれに関連する種々のＮ−置換プソイド−アミノ糖は、U.S. Pat. No. 4,701,559に開示されている。グルコシダーゼ阻害薬ミグリトール、すなわち（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−１−（２−ヒドロキシエチル）−２−（ヒドロキシメチル）−３，４，５−ピペリジントリオール、およびそれに関連する種々の３，４，５−トリヒドロキシピペリジン類は、U.S. Pat. No. 4,639,436に開示されている。グルコシダーゼ阻害薬エミグリテート、すなわちｐ［２−［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−３，４，５−トリヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）ピペリジノ］エトキシ］−安息香酸エチル、それに関連する種々の誘導体、およびその医薬的に許容できる酸付加塩は、U.S. Pat. No. 5,192,772に開示されている。グルコシダーゼ阻害薬ＭＤＬ−２５６３７、すなわち２，６−ジデオキシ−７−Ｏ−．ベータ．−Ｄ−グルコピラノシル−２，６−イミノ−Ｄ−グリセロ−Ｌ−グルコ−ヘプチトール、それに関連する種々のホモ二糖類、およびその医薬的に許容できる酸付加塩は、U.S. Pat. No. 4,634,765に開示されている。グルコシダーゼ阻害薬カミグリボース、すなわちメチル  ６−デオキシ−６−［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−３，４，５−トリヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）ピペリジノ］−α−Ｄ−グルコピラノシド・セスキ水和物、それに関連するデオキシ−ノジリマイシン誘導体、その医薬的に許容できる種々の塩類、およびそれらを製造するための合成方法は、U.S. Pat. No. 5,157,116および5,504,078に開示されている。グリコシダーゼ阻害薬サルボスタチン、およびそれに関連する種々のプソイド糖類は、U.S. Pat. No. 5,091,524に開示されている。上記に引用したすべての参考文献を本明細書に援用する。
【０２３１】
本発明において関心のあるアミラーゼ阻害薬は、U.S. Pat. No. 4,451,455、U.S. Pat. No. 4,623,714（Ａｌ−３６８８、およびそれに関連する種々の環状ポリペプチド）およびU.S. Pat. No. 4,273,765 (トレスタチン(trestatin)：これはトレスタチンＡ、トレスタチンＢおよびトレスタチンＣの混合物からなる；ならびにそれに関連する種々のトレハロース含有アミノ糖）に開示されている。上記に引用したすべての参考文献を本明細書に援用する。
【０２３２】
ＥＤＮ３様ポリペプチドと組み合わせて追加医薬として使用できる他の抗糖尿病化合物には、たとえば下記のものが含まれる：ビグアニド類（たとえば、メトホルミン(metformin)、フェンホルミン(pfenformin)、またはブホルミン(buformin))、インスリン分泌促進薬（たとえば、スルホニル尿素およびグリニド類)、グリタゾン類、非グリタゾン系ＰＰＡＲ−γアゴニスト、ＰＰＡＲ−βアゴニスト、ＤＰＰ−ＩＶの阻害薬（すなわち、シタグリプチン(sitagliptin)、ビラグリプチン(vilagliptin)、サクサグリプチン(saxagliptin)、リナグリプチン(linagliptin)、アログリプチン(alogliptin)、およびベルベリン(berberine)）、ＰＤＥ５の阻害薬、ＧＳＫ−３の阻害薬、グルカゴンアンタゴニスト、ｆ−１，６−ＢＰａｓｅの阻害薬（Ｍｅｔａｂａｓｉｓ／三共）、ＧＬＰ−１／アナログ（ＡＣ  ２９９３、エキセンジン−４(exendin-4)としても知られる）、インスリンおよびインスリンミメティック（Ｍｅｒｃｋ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）。他の例には、ＰＫＣ−β阻害薬およびＡＧＥ分解薬が含まれる。
【０２３３】
ＥＤＮ３様ポリペプチドは、抗−高血圧症薬とも組み合わせて使用できる。本発明の併用療法に有用である適切な抗−高血圧症薬には、下記のものが含まれる：カルシウムチャネル遮断薬、たとえばジルチアゼム(Diltiazem)（たとえば、Cardizeme（登録商標）、Dilacor（登録商標）、またはTiazac（登録商標）)、ニフェジピン(Nifedipine)（たとえば、Adalat（登録商標）またはProcardia XL（登録商標）)、ベラパミル(Verapamil)（たとえば、Calan（登録商標）、Verelan（登録商標）、またはIsoptin（登録商標）)、ニカルジピン(Nicardipine)（たとえば、Cardene（登録商標）)、ベラパミル(Verapamil)（たとえば、Covera（登録商標）（たとえば、イスラジピン(Isradipine)（たとえば、DynaCirc（登録商標）)、ニソルジピン(Nisoldipine)（たとえば、Sular（登録商標）)、ベプリジル(Bepridil)（たとえば、Vascor（登録商標）)、ニモジピン(Nimodipine)（たとえば、Nimotop（登録商標）)、アムロジピン(Amlodipine)（たとえば、Norvasc（登録商標）)、およびフェロジピン(Felodipine)（たとえば、Plendil（登録商標）);アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、たとえばキナプリル(Quinapril)（たとえば、Accupril（登録商標）)、ラミプリル(Ramipril)（たとえば、Altace（登録商標）)、カプトプリル(Captopril)（たとえば、Capoten（登録商標）)、ベナゼプリル(Benazepril)（たとえば、Lotensin（登録商標）)、トランドラプリル(Trandolapril)（たとえば、Mavik（登録商標）)、ホシノプリル(Fosinopril)（たとえば、Monopril（登録商標）)、リシノプリル(Lisinopril)（たとえば、Prinivil（登録商標）またはZestril（登録商標）)、メキシプリル(Moexipril)（たとえば、Univasc（登録商標）)、およびエナラプリル(Enalapril)（たとえば、Vasotec（登録商標）)。
【０２３４】
他の追加医薬は、たとえば前記の抗肥満症薬または抗糖尿病薬であってもよく、下記のものであってもよい：ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ阻害薬、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子発現阻害薬、ＣＥＴＰ阻害薬、ＰＰＡＲ調節薬、スクアレンシンセターゼ阻害薬、スクアリンエポキシダーゼ阻害薬、スクアリンシクラーゼ阻害薬、組合わせスクアリンエポキシダーゼ／シクラーゼ阻害薬、コレステロール吸収阻害薬、ＡＣＡＴ阻害薬、膵リパーゼ阻害薬、胃リパーゼ阻害薬、カルシウムチャネル遮断薬、ＡＣＥ阻害薬、ベータ遮断薬、利尿薬、ナイアシン、ニンニクエキス製剤、胆汁酸封鎖剤、フィブリン酸誘導体、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害薬、アルドースレダクターゼ阻害薬、ソルビトールデヒドロゲナーゼ阻害薬、ＳＧＬＴ２阻害薬（すなわち、ダパグリフロジン(dapagliflozin)、ＢＩ−１０７７３、およびWO2010/023594, 2009年8月17日出願、に開示される化合物)、グルコシダーゼ阻害薬、アミラーゼ阻害薬、またはＤＰＰ−ＩＶ阻害薬（すなわち、シタグリプチン、ビラグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチン、アログリプチン、およびベルベリン）。
【０２３５】
追加医薬の投与量は一般に多数の要因に依存し、これには処置される対象の健康状態、希望する処置の程度、併用療法があればその性質および種類、処置の頻度、ならびに希望する効果の性質が含まれる。一般に、追加医薬の投与量範囲は、１日につき個体の体重ｋｇ当たり約０．００１ｍｇから約１００ｍｇまで、たとえば１日につき個体の体重ｋｇ当たり約０．１ｍｇから約１０ｍｇまでの範囲である。しかし、処置される対象の年齢および体重、意図する投与経路、投与される具体的な追加療法薬などに応じて、この一般的投与量を若干変更する必要もありうる。個々の患者についての投与量範囲および最適投与量の決定も、本発明の恩恵を受けた当業者が容易になしうる範囲にある。
【０２３６】
特定の態様において、処置方法は、ＥＤＮ３様ポリペプチドを１種類以上の追加医薬と共に投与する併用療法を含む。本発明の併用療法において、ＥＤＮ３様ポリペプチドおよび少なくとも１種類の他の医薬（たとえば、抗肥満症薬または抗糖尿病薬）を、個別に、または両方を含む医薬組成物中において、投与することができる。ある態様において、投与は経口である。
【０２３７】
ＥＤＮ３様ポリペプチドおよび少なくとも１種類の他の医薬の組合わせを一緒に投与する場合、そのような投与は逐次または同時であってよい。逐次投与について、ＥＤＮ３様ポリペプチドおよび追加医薬をいずれの順序で投与してもよい。ある態様において、投与は経口かつ同時である。ＥＤＮ３様ポリペプチドおよび追加医薬を逐次投与する場合、それぞれの投与は同一または異なる投与経路によることができる。
【０２３８】
本発明は、本明細書に記載する併用療法のいずれかとの組合わせに使用するためのいずれかのＥＤＮ３様ポリペプチドの使用を考慮し、これには本明細書に開示する代表的なＥＤＮ３様ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３３のいずれかおよびそのバリアントを含むかまたはそれからなるポリペプチド、たとえばアミノ酸残基６０個以下のポリペプチドであってＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３３のいずれかを含むものが含まれる）が含まれる。
【０２３９】
７．ＥＤＮ３様ポリペプチドの他の用途
本明細書に開示するＥＤＮ３様ポリペプチドは、疾患の処置だけでなく、多様な研究領域にも有用である。たとえば、体温恒常性の分野では、深部体温が特定の経路またはタンパク質に及ぼす影響を判定するために、研究者は時には実験用生物の深部体温をかく乱することを望む。この目的で深部体温を実験的に操作するために、ＥＤＮ３様ポリペプチドを使用できる。他の例において、ＧＬＰ−１を調べている研究者は、モデル生物において高いＧＬＰ−１レベルが特定の経路またはタンパク質に及ぼす影響を調べたい場合がある。この目的でＧＬＰ−１レベルを実験的に高めるために、ＥＤＮ３様ポリペプチドを使用できる。他の例として、代謝を調べている研究者は、生物または分子のレベルでの影響を観察するために、モデル生物においてエネルギー消費を実験的に増大または抑制したい場合がある。この目的でエネルギー消費を実験的に増大させるために、ＥＤＮ３様ポリペプチドを使用できる。さらに他の状況で、肝細胞の機能を調べている研究者は、これらの細胞におけるグルコース産生の機序を調べるために、グルコース産生を刺激または阻害したい場合がある。この目的でグルコース産生を実験的に阻害するために、ＥＤＮ３様ポリペプチドを使用できる。さらに他の状況で、グルコース代謝を調べている研究者は、グルコース取込みに関与する細胞機構を調べるために、種々の細胞タイプ（たとえば、骨格筋細胞または脂肪細胞）におけるグルコース取込みを促進または阻害したい場合がある。この目的でグルコース取込みを実験的に増大させるために、ＥＤＮ３様ポリペプチドを使用できる。これらの例が示すように、ＥＤＮ３様ポリペプチドの用途は試薬としてのそれらの使用を含む。
【０２４０】
ＥＤＮ３様ポリペプチドは、多様なイメージング法にも有用である。これらのポリペプチドは特定の受容体に対して親和性をもつので、それらを用いて患者の身体におけるそのような受容体の分布を調べることができる。この適用は、腫瘍において予想される可能性のある、受容体の全体的な過剰発現を同定するのに特に有用である。イメージングアッセイに有用であるためには、ＥＤＮ３様ポリペプチドは標識を含むべきである。標識は、たとえば蛍光標識、放射性標識、またはＭＲＩ検出可能な標識であってもよい。蛍光標識は、一般にＣＣＤカメラまたは可視光線を検出する他のカメラで検出される。放射性標識は、たとえばガンマカメラまたは放射能感受性フィルムで検出できる。ＭＲＩ検出可能な標識は、磁気共鳴イメージングまたは他のＮＲＭに基づく機器により検出できる。検出可能な標識の多数の例を本明細書に提示する。
【０２４１】
たとえば、標識したＥＤＮ３様ポリペプチドを対象に投与し、対象におけるその標識したＥＤＮ３様ポリペプチドの分布を検出することができる。他の例として、対象から採取した組織試料を、標識したＥＤＮ３様ポリペプチドとエクスビボで接触させることができる。
【０２４２】
本発明は、このセクションに記載する方法に使用するための、本明細書に開示するいずれかのＥＤＮ３様ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３３のいずれかおよびそのバリアントを含むかまたはそれからなるポリペプチドが含まれる）を考慮すると理解される。
【０２４３】
８．温感受性ニューロンのマーカーとしてのＥＤＮ３様ＲＮＡ
前記のセクション４に述べたように、これまで温感受性ニューロン同定は電気生理学的記録を必要とする面倒な方法であった。温感受性ニューロンの有望なマーカーとしてのＥＤＮ３  ９７−１４０の同定（実施例１および３）は、温感受性ニューロンを迅速かつ効率的に同定するための免疫染色法におけるＥＤＮ３  ９７−１４０特異的抗体の使用を示唆する。したがって本発明は、温感受性ニューロンを同定する方法であって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９または２１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体と脳組織試料を接触させることを含む方法を提供する。
【０２４４】
さらに、ＥＤＮ３  ｍＲＮＡが温感受性ニューロンに発現する（実施例１）という事実により、当業者はＥＤＮ３  ｍＲＮＡに対する核酸プローブとのインサイチュハイブリダイゼーション法を用いて温感受性ニューロンを同定することができる。適切なインサイチュハイブリダイゼーション法には、蛍光標識プローブ、または酵素活性もしくは放射活性で標識したプローブを使用できる。そのような方法は当技術分野で周知である。ＥＤＮ３  ９７−１４０をコードするＲＮＡをターゲティングする適切なプローブは、コード領域、非コード領域、または両方を含むことができる。ＥＤＮ３  ９７−１４０はプレプロエンドセリン−３の開裂生成物である可能性があるので、本発明のハイブリダイゼーション法にはプレプロエンドセリン−３  ｍＲＮＡのいずれかの部分に対するプローブを使用できる。マウスのプレプロエンドセリン−３の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００７９０３で提供され、図７にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５として示される。
【０２４５】
９．ＥＤＮ３様ポリペプチドをアッセイするための動物モデル
実施例５および８に、本発明はＥＤＮ３様ポリペプチド活性に有用な細胞培養モデルを提供する。これらのアッセイ法は多数のポリペプチドの迅速スクリーニングのために優れている。相補的方法として、全身レベルでのＥＤＮ３様活性を調べるために動物モデルを使用できる。本明細書に記載する周知の動物モデル、および当技術分野で知られている他のモデルを用いて、特許請求の範囲に含まれるいずれかのＥＤＮ３様ポリペプチドが代謝性疾患の処置において活性をもつかどうかを当業者は容易に判定できる。
【０２４６】
そのために、本出願は、肥満症および糖尿病のモデルである周知の食事誘導肥満症（ＤＩＯ）マウスを記載する（実施例４）。そのマウスにおいて、実施例３に記載する方法に従って深部体温およびエネルギー消費を測定することができる。
【０２４７】
有用な動物モデルは、他の代謝障害、たとえば高脂血症、高コレステロール血症、および脂肪酸代謝障害についても存在する。これら３つの障害は、しばしば糖尿病により引き起こされ、若干のマウスモデルはこれらの形質のうち１以上を提示する。
【０２４８】
高脂血症は、Ｌｅｐ（ｏｂ）遺伝子を過剰発現するマウスにおいて調べることができる(Soga M, “Insulin resistance, steatohepatitis, and hepatocellular carcinoma in a new congenic strain of Fatty Liver Shionogi (FLS) mice with the Lep(ob) gene.” Exp Anim. 2010;59(4):407-19)。適宜摂食させた場合、このマウスは１２週で重篤な高脂血症を発症する。たとえば栄研化学（日本）が商品名トリグリザイム（ＴＲＩＧＬＹＺＩＭＥ）で製造している比色トリグリセリドアッセイキットを用いて、血清トリグリセリドをアッセイすることができる。
【０２４９】
高コレステロール血症は、ＫＫ−Ａｙマウス、すなわちＩＩ型糖尿病の動物モデルにおいて調べることができる(Takagi S et al., “Effect of corosolic acid on dietary hypercholesterolemia and hepatic steatosis in KK-Ay diabetic mice.” Biomed Res. 2010; 31(4):213-8.)。簡単に述べると、ＫＫ−Ａｙマウスに高コレステロール食を与えることにより、そのマウスは１０週で高コレステロール血症を発症する。このマウスに被験化合物を投与して、平均血中コレステロールレベルに及ぼす効果を判定することができる。
【０２５０】
脂肪酸代謝の異常は、しばしば血清の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）レベルをかく乱する。血清ＦＦＡは液体クロマトグラフィー／質量分析法により検出できる；Le Bouter et al. “Coordinate Transcriptomic and Metabolomic Effects of the Insulin Sensitizer Rosiglitazone on Fundamental Metabolic Pathways in Liver, Soleus Muscle, and Adipose Tissue in Diabetic db/db Mice” PAR Res. 2010; 2010: 679184に記載。ｄｂ／ｄｂマウスは、レプチン受容体遺伝子の損傷の結果としてＩＩ型糖尿病を発症し、それに対応してＦＦＡ異常を伴う。
【０２５１】
本発明は、このセクションに記載する動物モデルに本明細書に開示するいずれかのＥＤＮ３様ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３３のいずれかおよびそのバリアントを含むかまたはそれからなるポリペプチドが含まれる）を投与することを考慮する。
【０２５２】
１０．ＥＤＮ３様ポリペプチドのインビトロおよびエクスビボでのアッセイ
本出願は、ＥＤＮ−３様ポリペプチドの調製方法（発明を実施するための形態のセクション３）だけでなく、それらの活性をインビボで（発明を実施するための形態のセクション９）およびインビトロでアッセイするための方法も当業者に教示する。ＥＤＮ３様活性の特定の有用なインビトロ細胞培養アッセイ法をこのセクションに記載する。
【０２５３】
具体的には、ＥＤＮ３様ポリペプチドは下記のうち１以上の活性をもつ可能性がある：（ａ）肝細胞におけるグルコース産生を阻害する、（ｂ）ラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進する、（ｃ）ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進する、（ｄ）骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進する、または（ｅ）脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進する。ある例において、ＥＤＮ３様ポリペプチドは（ａ）〜（ｅ）の活性のうち１、２、３、４つ、または５つすべてをもつ。ある態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドは（ａ）〜（ｃ）に挙げた活性のうち１、２、または３つをもつ。
【０２５４】
本出願は、活性（ａ）〜（ｅ）それぞれをアッセイするための方法を記載する。たとえば、実施例８は活性（ａ）、すなわち肝細胞におけるグルコース産生をアッセイするのに適切な方法を記載する。実施例８のプロトコルは、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄグルコース／グルコースオキシダーゼアッセイキットを用いて、培養Ｈ４ＩＩＥ細胞により産生されたグルコースの量を測定することを伴う。しかし、他の適切なアッセイ法が当技術分野で知られている。たとえば、Kim SJ et al. (“Ginsenoside Rg1 suppresses hepatic glucose production via AMP-activated protein kinase in HepG2 cells” Biol Pharm Bull. 2010 Feb; 33(2): 325-8)は、ＨｅｐＧ２細胞において類似のアッセイを実施している。したがって当業者は、本出願または他の刊行物に開示されたアッセイ法に従って、そのＥＤＮ３様ポリペプチドが肝細胞における糖新生を阻害するかどうかを判定できる。
【０２５５】
本出願は、活性（ｂ）、すなわちラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌の促進をアッセイするための方法も開示する（実施例７）。簡単に述べると、ラット腸間膜動脈および門脈を採取し、関心のあるＥＤＮ３様ポリペプチドを含む溶液で潅流する。門脈排出液を採集し、分泌された活性ＧＬＰ−１を市販のミリポア(Millipore)キットを用いてアッセイする。ラット潅流結腸モデル系は、たとえばMoro F et al. (“Release of guanylin immunoreactivity from the isolated vascularly perfused rat colon” Endocrinology. 2000 Jul; 141(7): 2594-9)にも記載されている。ＧＬＰ−１は多数の方法で検出できる。ＧＬＰ−１タンパク質レベルは、たとえばウェスタンブロット法またはＥＬＩＳＡにより検出できる。あるいは、ＧＬＰ−１活性は、たとえばＧＬＰ−１含有試料をＩＮＳ−１細胞に投与し、ｃＡＭＰレベルをラジオイムノアッセイにより測定することによって測定できる；Baggio L et al. (“Chronic Exposure to GLP-1R Agonists Promotes Homologous GLP-1 Receptor Desensitization In Vitro but Does Not Attenuate GLP-1R-Dependent Glucose Homeostasis In Vivo”, Diabetes December 2004 Col. 53 Supplement 3 S205-S214)に記載。したがって当業者は、本出願または他の刊行物に開示されたアッセイ法に従って、そのＥＤＮ３様ポリペプチドがたとえばラット潅流結腸アッセイにおけるＧＬＰ−１分泌を促進するかどうかを判定できる。
【０２５６】
本出願は、活性（ｃ）、すなわちＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌の促進をアッセイするための方法も開示する（実施例６）。簡単に述べると、ＧＬＵＴａｇアッセイは、ＧＬＵＴａｇ細胞をＥＤＮ３様ポリペプチドと接触させ、次いで上記の節に記載したＧＬＰ−１アッセイ法を用いて、産生されたＧＬＰ−１を測定することを伴う。したがって当業者は、本出願または他の刊行物に開示されたアッセイ法に従って、そのＥＤＮ３様ポリペプチドがＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１分泌を促進するかどうかを判定できる。
【０２５７】
ある態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドは、（ｄ）骨格筋細胞におけるグルコース取込みを促進し、または（ｅ）脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進する。グルコース取込みアッセイは当業者が容易に利用できる。たとえば、骨格筋細胞を培養し、ＥＤＮ３様ポリペプチドを添加し、そして細胞培養培地中の２−デオキシグルコースの量を蛍光により測定することによって、骨格筋細胞におけるグルコース取込みを測定することができる；Yamamoto N et al. (“Artemisia princeps extract promoted glucose uptake in cultured L6 muscle cells via glucose transporter 4 translocation.” Biosci Biotechnol Biochem. 2010 Oct 23; 74(10): 2036-42. Epub 2010 Oct 7)に記載。脂肪細胞におけるグルコース取込みアッセイは、類似のプロトコルに従って実施できる。たとえば、脂肪細胞（たとえば、３Ｔ３−Ｌ１細胞）を培養し、ＥＤＮ３様ポリペプチドを添加し、そして細胞培養培地中のトリチウム化２−デオキシグルコースの量をシンチレーション計数により測定することによって、脂肪細胞におけるグルコース取込みを測定することができる；Fujita et al. (“Identification of three distinct functional sites of insulin-mediated GLUT4 trafficking in adipocytes using quantitative single molecule imaging.” Mol Biol Cell. 2010 Aug 1; 21(15): 2721-31)に記載。したがって当業者は、そのＥＤＮ３様ポリペプチドが筋細胞または脂肪細胞におけるグルコース取込みを促進するかどうかを判定できる。
【０２５８】
本発明は、ＥＤＮ３様ポリペプチドが他のアッセイ法において追加の機能または活性をもつ可能性があることを認識する。しかし、本明細書に開示するＥＤＮ３様ポリペプチドは、それらが上記のアッセイ法のうち１以上において活性をもつ能力に基づいて容易に同定できる。
【０２５９】
本発明は、このセクションに記載したアッセイ法における、本明細書に開示するいずれかのＥＤＮ３様ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３３のいずれかおよびそのバリアントを含むかまたはそれからなるポリペプチドが含まれる）の使用を考慮する。
【０２６０】
１１．ＥＤＮ３様ポリペプチドに対する受容体
ＥＤＮ３様活性を仲介する受容体または受容体類の同定には、かなりの関心がある。実施例５の実験は、ＥＤＮ３  ９７−１４０のＧＬＰ−１放出活性がＧタンパク質共役型受容体により仲介されることを示唆する。視床下部と肝細胞においてＥＤＮ３活性を仲介する受容体は、同一または異なる可能性がある。さらに、ＥＤＮ３様ポリペプチドの異なる機能活性が同一または異なる受容体により仲介される可能性がある。したがって、本出願は、ＥＤＮ３様活性を仲介する１以上の受容体を同定するためにＥＤＮ３様ポリペプチドを使用する方法を開示する。
【０２６１】
実施例３に記載する呼吸交換率（ＲＥＲ）モデルを用いて、視床下部においてＥＤＮ３様ポリペプチドに応答する受容体を同定することができる。実施例３が示すように、ＥＤＮ３  ９７−１４０を視床下部に注射すると、マウスのＲＥＲが低下する。したがって、ＥＤＮ３  ９７−１４０または他のＥＤＮ３様ポリペプチドを特定の受容体の阻害薬の存在下または不存在下で視床下部に注射し、ＲＥＲに及ぼす影響を判定することができる。たとえば、ＣＴＸはＧαｓを阻害するので、特定のクラスのＧタンパク質共役型受容体を介して作用するペプチドの指標となる（実施例５）。他の多数のホルモン受容体阻害薬が知られている。幾つかを挙げると、ラロキシフェン(raloxifene)はエストロゲン受容体アンタゴニストであり、ペグビソマント(pegvisomant)は成長ホルモン受容体アンタゴニストであり、１−８５０は甲状腺ホルモン受容体アンタゴニストであり、ＯＰＣ−３１２６０は抗利尿ホルモンアンタゴニストであり、ＯＰＣ−２１２６８はバソプレッシンＶ１受容体アンタゴニストであり、ＦＲＢＩはＦＳＨ受容体結合阻害薬であり、αｈＣＲＨは副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体アンタゴニストである。別の方法として、ＥＤＮ３様ポリペプチドを、特定の受容体の活性が低下した変異マウス（たとえば、ノックアウトマウス、部分的機能喪失変異を伴うマウス、またはＲＮＡｉ構築体を発現するマウス）に投与してもよい。変異マウスと野生型マウスのＲＥＲの相異は、その変異受容体がＥＤＮ３様経路の一部であるかどうかの指標となるであろう。
【０２６２】
類似の方法を用いて、肝細胞においてＥＤＮ３様の抗−糖新生活性を仲介する受容体を同定することができる。実施例８は、肝細胞の糖新生についての細胞培養アッセイを開示する。ＥＤＮ３  ９７−１４０（または他のＥＤＮ３様ポリペプチド）を、受容体アンタゴニストの存在下または不存在下で肝細胞に添加することができる。いずれか適切な受容体アンタゴニストを使用でき、幾つかの例を先の節に挙げてある。特定の受容体の発現を低下させるＥＤＮ３様ポリペプチドおよび核酸（たとえば、ＲＮＡｉ構築体またはｓｉＲＮＡ）と細胞を接触させることにより受容体を同定することもできる。一般に、受容体アンタゴニストまたは阻害性核酸をＥＤＮ３様ポリペプチドの前に投与する。あるいは、ＥＤＮ３様ポリペプチドを、野生型細胞および関心のある候補受容体を発現しない細胞において試験することにより、受容体を同定することができる。
【０２６３】
類似の方法を用いて、ＥＤＮ３様ＧＬＰ放出活性を仲介する受容体をさらに解明することができる。実施例５のＣＴＸ実験は、ＥＤＮ３  ９７−１４０の  ＧＬＰ−１放出活性がＧタンパク質共役型受容体により仲介されることを示す。Ｇタンパク質共役型受容体により仲介されることを示唆する。Ｇタンパク質共役型受容体は、前記のアンチセンス阻害薬、受容体変異、または受容体アンタゴニスト実験などの実験を用いてさらに解明することができる。
【０２６４】
前記の細胞に基づくアッセイまたは生物に基づくアッセイのほかに、生化学的方法を用いてＥＤＮ３様ポリペプチドに対する受容体を同定することができる。たとえば、ＥＤＮ３様ポリペプチドをアフィニティー精製スキームに使用できる。ＥＤＮ３様ポリペプチドをカラムまたは他の支持体に固定し、それを用いて受容体などの結合パートナーを単離することができる。あるいは、膜貫通受容体の単離を容易にするために、ＥＤＮ３様ポリペプチドに細胞環境で受容体を結合させ、受容体に架橋させ、次いで生化学的に単離することができる。この単離プロトコルは、ＥＤＮ３様ポリペプチドに対して特異的な抗体を使用でき、あるいはＥＤＮ３様ポリペプチドに融合したタンパク質タグを使用できる。あるいは、候補受容体（またはその良溶性フラグメント）をＥＤＮ３様ポリペプチドへの結合について細胞に基づく系または無細胞系で試験することができる。
【０２６５】
したがって、ある態様において、本発明は、ＥＤＮ３様受容体を同定する方法であって、（ａ）被験細胞をＥＤＮ３様ポリペプチドおよび受容体アンタゴニストと接触させ、（ｂ）対照細胞をＥＤＮ３様ポリペプチドと接触させ、そして（ｃ）被験細胞および対照細胞のＥＤＮ３様応答を測定することを含む方法を提供し、その際、被験細胞と比較して対照細胞のＥＤＮ３様応答がより大きいことは、その受容体アンタゴニストにより阻害された受容体がＥＤＮ３様受容体であることの指標となる。本出願はまた、ＥＤＮ３様受容体を同定する方法であって、（ａ）被験細胞をＥＤＮ３様ポリペプチドと接触させ、その際、被験細胞は受容体の活性を低下させる変異を含み、（ｂ）対照細胞をＥＤＮ３様ポリペプチドと接触させ、その際、対照細胞はその受容体の野生型活性を含み、そして（ｃ）被験細胞および対照細胞のＥＤＮ３様応答を測定することを含む方法を提供し、その際、被験細胞と比較して対照細胞のＥＤＮ３様応答がより大きいことは、その受容体アンタゴニストにより阻害された受容体がＥＤＮ３様受容体であることの指標となる。細胞は、たとえば肝細胞、視床下部細胞、または腸内分泌細胞であってもよい。ＥＤＮ３様ポリペプチドは、たとえばＥＤＮ３  ９７−１４０であってもよい。ＥＤＮ３様応答は、たとえばモデル生物におけるＧＬＰ−１放出、糖新生低下、またはＲＥＲ増大であってもよい。受容体阻害物質は、たとえば小分子、ポリペプチド、抗体、またはアンチセンス核酸であってもよい。受容体の活性を低下させる変異は、たとえばヌル変異、部分的機能喪失変異、コード領域における変異、またはプロモーターにおける変異であってもよい。
【０２６６】
特定の態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドはエンドセリン−３受容体を実質的に活性化しない。たとえば、特定の態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドはＥＴＡまたはＥＴＢエンドセリン受容体サブタイプに実質的に結合せず、またはそれを活性化しない。ある態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドは、ＥＴＡまたはＥＴＢをエンドセリン−３で達成される活性の５０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２％，または１％未満、活性化する。ある態様において、ＥＤＮ３様ポリペプチドは、ラット大動脈輪の血管収縮アッセイにおいて実質的に活性をもたない。たとえば、ＥＤＮ３様ポリペプチドは、エンドセリン−３がもつ血管収縮活性の５０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２％，または１％未満をもつ。
【実施例】
【０２６７】
本発明を全般的に記載しているが、本発明は下記の実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう；それらは本発明の特定の観点および態様を説明するために含まれるものにすぎず、本発明を限定するためのものではない。たとえば、そこに開示する具体的な構築体および実験設計は、適正な機能を評価するための代表的なツールおよび方法である。したがって、開示する特定の構築体および実験計画のいずれかを本発明の範囲内で置き換えることができるのは容易に理解されるであろう。
【０２６８】
序
視床下部は、エネルギー収支に関与するペプチドホルモンの豊富な供給源である。エンドセリン−３は、この脳領域に発見された(Bloch, 1989)。本発明者らは、深部体温およびエネルギー代謝を調節する主要部位のひとつである前視床下部のＰＯＡの単一ニューロンから作製したｃＤＮＡライブラリーの配列決定に取り組んだ(Eberwine and Bartfai, 2010)。この配列決定は、マイクロアレイに基づく発現プロファイリングではなく、むしろ個々のニューロンのトランスクリプトームの詳細な分子記述を提供し、稀なｍＲＮＡが同定された；それらは、幾つかの細胞からプールしたｍＲＮＡ中に希釈されることにより、あるいは直線増幅はしばしば３’ＵＴＲ配列の方へ偏ったｃＤＮＡを生成し、一方でマイクロアレイはプローブをコード領域に集中させる傾向があるので、見逃される可能性がある。プレプロエンドセリンをコードするｃＤＮＡが単一の視索前野ニューロンにおいて同定された。本発明者らは、ＧＫＲモチーフにおいて開裂してアミノ酸４４個のＣ末端アミド化されたエンドセリン様ペプチドを生じる長い形態を予測した。この予測ペプチド（ＥＤＮ３  ９７−１４０）を固相合成法により合成し、それがインビボで視床下部（ＰＯＡ）エネルギー収支および末梢グルコース代謝に及ぼす作用を調べた。さらに、ＥＤＮ３  ９７−１４０がエクスビボで摘出潅流ラット結腸に及ぼす作用、およびインビトロで幾つかの細胞系においてグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）および糖新生に及ぼす作用を調べた。このペプチドは、エンドセリンと共通のＮ末端部分であるにもかかわらず、ＥＴＡまたはＥＴＢ受容体に作用せず、血管の血管収縮も仲介しないことを報告する。さらに、ＥＤＮ３  ９７−１４０は、マウスのニューロン、ネズミＧＬＵＴａｇ細胞、ラット結腸、およびラットＨ４ＩＩＥ肝細胞に発現する、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を介して作用する。ＥＤＮ３  ９７−１４０活性ペプチドおよびそれの受容体は、代謝性疾患およびＩＩ型糖尿病の処置のための新規な標的である。さらに、本明細書に詳述するように、新規な活性プロフィールをもつこの新規なＥＤＮ３様ポリペプチドの同定により、他のＥＤＮ３様ポリペプチド、たとえばＥＤＮ３  ９７−１４０のバリアントの設計および使用が可能になった；今後もそれが可能になるであろう。以下の実施例は、主にＥＤＮ３  ９７−１４０と呼ばれるＥＤＮ３様ポリペプチドの機能活性の分析に焦点を当てる。しかし、本明細書に記載する特定のバリアントはいずれも、これらおよび他のアッセイ法で同様に明確に評価または予測できる。
【０２６９】
実施例１．ＥＤＮ３  ９７−１４０、すなわちラットエンドセリン−３から同定されたアミノ酸４４個のペプチド
温感受性の視索前野（ＰＯＡ）ニューロンからの遺伝子発現データをコンピューター処理プラットホームの基礎として用いて、少なくとも１つのニューロンにおいて平均を上回って発現するかまたは有意に発現することが見出されたすべての遺伝子のリストを作製した(Eberwine and Bartfai, 2010)。この発現データセットからの各遺伝子同定子をＮＣＢＩ標準遺伝子同定子（Ｅｎｔｒｅｚ  ＩＤ）に翻訳し、対応するタンパク質をＰｒｏＰ１．０プロタンパク質開裂部位予測により分析して、アミノ酸５０個未満の予測開裂生成物を同定した。プロエンドセリン−３の２つのプロペプチド開裂部位が同定され（図１）、アミノ酸４４個のペプチドが得られた。このペプチドは、アノテートされたタンパク質のUniprot protein knowledge database (Apweiler, 2004)にプロエンドセリン−３の規定生成物として提示されておらず、したがって解明すべき関心のある新規リガンドと推定された。
【０２７０】
ペプチド同定のための材料および方法
マウスのＰＯＡニューロン発現プロファイリングから平均を上回って発現した遺伝子に対応するタンパク質配列は、アレイプローブデータを対応するタンパク質と照合することにより決定された。プロペプチド開裂部位検出アルゴリズムＰｒｏｐ  １．０(Duckert, 2004)を用いて、シグナルペプチドおよび２つの塩基開裂部位(di-basic cleavage sites)をもつすべての配列をコンピーターで調べた。それらの結果をサイズ、アミノ酸含量、および予測二次構造に基づいて手動でキュレーションした。このリストからＥＤＮ３  ９７−１４０を候補として同定した。
【０２７１】
試薬
別途明記しない限り、すべての化学物質および緩衝液をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から得た。ＥＤＮ３  ９７−１４０および関連ペプチドは、Ｂａｃｈｅｍ（ペンシルベニア州キングオブプルシア）、ＣＰＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カリフォルニア州サンノゼ）から購入され、あるいは下記の方法に従って合成された。ＥＤＮ３  ９７−１４０は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ４３３ペプチド合成装置でＲｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ樹脂（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓにより供給）および標準Ｆｍｏｃアミノ酸（ＡＢＩにより供給）を用いて組み立てられた。合成した樹脂は、０．５ｇの合成用樹脂を１０ｍＬのＴＦＡ／水／フェノール／チオアニソール／エタンジチオール混合物（８２．５：５：５：５：２．５）で１時間処理することにより開裂および脱保護された。混合物を濾過し、濾液を１００ｍＬのジエチルエーテル中へ希釈することによりペプチドを沈殿させた。この粗製ペプチド塩を採集し、乾燥させ、逆相ＨＰＬＣによりＷａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８分取カラム（１９ｍｍ×１００ｍｍ）を用いて１７ｍＬ／分の流速で、４０分間かけて０から４０％  Ｂまでの二溶媒勾配で精製した（溶媒Ａ，アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸（２：９７．９：０．１）；溶媒Ｂ，１００％アセトニトリル）。画分をＬＣ−ＭＳにより分析し、適切な画分をプールして、約９５％の純度の線状ペプチドを得た。画分を合わせて凍結乾燥し、乾燥ペプチドを−２０℃で保存した。
【０２７２】
実施例２．ＥＤＮ３  ９７−１４０はＥＴＡ、ＥＴＢに結合せず、あるいはラット大動脈輪において血管収縮を引き起こさない
ＥＤＮ３  ９７−１４０は、最高３μＭの濃度で試験した際にＥＴＡまたはＥＴＢ受容体に結合できず（ｐ＞０．０５）、これに対し陽性対照であるエンドセリン−１およびエンドセリン−３はそれぞれ７０ｐＭおよび１６ｐＭのＩＣ５０で放射性標識薬剤の結合を有効に阻害した。これらの結果は、エンドセリン−１およびエンドセリン−３と対照的にＥＤＮ３  ９７−１４０は１０μＭの最高濃度ですら収縮作用をもたなかったことを示す（ｐ＞０．０５；図２）。これらの実験は、ＥＤＮ３  ９７−１４０活性がエンドセリン−１およびエンドセリン−３の活性と異なることを示す。
【０２７３】
インビトロでＥＴＡおよびＥＴＢ結合を測定するための材料および方法
ヒトのエンドセリンＥＴＡ受容体のアゴニスト部位に対するＥＤＮ３  ９７−１４０の親和性を評価するために、ＥＴＡ受容体でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞との放射性リガンド結合を用いた。細胞膜ホモジェネート（１０μｇのタンパク質）を３７℃で１２０分間、０．０３ｎＭの［１２５Ｉ］エンドセリン−１と共に、被験化合物の不存在下または存在下で、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＭｇＣｌ２および０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する緩衝液中においてインキュベートした。１００ｎＭのエンドセリン−１の存在下で非特異的結合を測定した。インキュベーション後、試料を真空下に、０．１％  ＢＳＡで予備浸漬したガラス繊維フィルター（ＧＦ／Ｂ，Ｐａｃｋａｒｄ）によって速やかに濾過し、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する氷冷緩衝液で９６サンプル型の細胞ハーベスター（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ，Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて数回すすいだ。フィルターを乾燥させ、次いでシンチレーション計数器（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ，Ｐａｃｋａｒｄ）でシンチレーションカクテル（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ  ０，Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて放射能を計数した。結果を対照である放射性リガンドの特異的結合に対する阻害率パーセントとして表わす。基準化合物はエンドセリン−１であり、これを各実験において数種類の濃度で試験して競合曲線を求め、これからＩＣ５０を計算した。
【０２７４】
ヒトのエンドセリンＥＴＢ受容体のアゴニスト部位に対するＥＤＮ３  ９７−１４０の親和性を、トランスフェクションしたＣＨＯ細胞において評価するために、放射性リガンド結合を用いた。細胞膜ホモジェネート（２．４μｇのタンパク質）を３７℃で１２０分間、０．０３ｎＭの［１２５Ｉ］エンドセリン−１と共に、被験化合物の不存在下または存在下で、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍｇ／Ｌのアプロチニンおよび０．１％のＢＳＡを含有する緩衝液中においてインキュベートした。１００ｎＭのエンドセリン−１の存在下で非特異的結合を測定した。インキュベーション後、試料を真空下に、０．１％  ＢＳＡで予備浸漬したガラス繊維フィルター（ＧＦ／Ｂ，Ｐａｃｋａｒｄ）によって速やかに濾過し、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する氷冷緩衝液で９６サンプル型の細胞ハーベスター（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ，Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて数回すすいだ。フィルターを乾燥させ、次いでシンチレーション計数器（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ，Ｐａｃｋａｒｄ）でシンチレーションカクテル（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ  ０，Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて放射能を計数した。結果を対照である放射性リガンドの特異的結合に対する阻害率パーセントとして表わす。基準化合物はエンドセリン−３であり、これを各実験において数種類の濃度で試験して競合曲線を求め、これからＩＣ５０を計算した。
【０２７５】
エクスビボでラット大動脈血管収縮をアッセイするための材料および方法
胸部大動脈を内皮が無傷の状態で雄Ｗｉｓｔａｒラット（３００〜５００ｇ）から摘出し、３ｍｍの輪に切断し、下記のもの（ｍＭ）を含有する酸素添加クレブス−ヘンゼライト(Krebs-Henseleit)緩衝液を含む組織浴に入れた：ＫＣｌ（４．７）、ＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏ（２．５）、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ（１．２）、ＫＨ２ＰＯ４（１．２）、Ｄ−グルコース（１０）、ＮａＨＣＯ３（２５）、ＮａＣｌ（１１８）。組織を３ｇの基礎張力下に置き、３７℃で１時間平衡化させた。組織生存性を確認するために、４０ｍＭ  ＫＣｌを１５分間、続いて１０μＭのカルバコル(carbachol)を３分間適用し、次いで１時間洗浄した後に化合物処理した。ビヒクル（ＭｉｌｌｉＱ）、エンドセリン−１（１０ｐＭ〜３００ｎＭ）、エンドセリン−３（１００ｐＭ〜３μＭ）またはＥＤＮ３  ９７−１４０（１００ｐＭ〜１０μＭ）を用いて、累積濃度−応答曲線を作製した；収縮応答が確実にプラトーに達するように、各濃度を少なくとも１５分間適用した。
【０２７６】
実施例３．ＥＤＮ３  ９７−１４０ペプチドはマウスにおいて高体温を引き起こし、かつ呼吸交換率（ＲＥＲ）を低下させる
温感受性ニューロンにおける同定と一致して、ＥＤＮ３  ９７−１４０はマウスモデルにおいて体温に影響を及ぼす。間接熱量測定法によりＲＥＲの変化を測定した（ＶＣＯ２／ＶＯ２）。ＲＥＲの曲線下面積（ＡＵＣ）および深部体温を関心のある２つの一次エンドポイントとして処理して、ＥＤＮ３  ９７−１４０の作用を評価した（図３）。歩行活動のＡＵＣを二次エンドポイントとして処理した。痩せ形マウスにおいて、ＰＯＡに注射した２．５ｎｍｏｌのＥＤＮ３  ９７−１４０がビヒクル処理マウスと比較してＲＥＲのＡＵＣの持続的低下を誘発した（図３Ａｉおよび３Ｂ）。ＲＥＲの低下はグルコース代謝から脂肪酸利用増大への切換えの指標となる。さらに、ＥＤＮ３  ９７−１４０はビヒクルと比較して高体温を引き起こした（図３Ａｉｉおよび３Ｃ）。ＰＯＡへのＥＤＮ３  ９７−１４０注射で一過性の歩行活動亢進がみられた（図３Ａｉｉｉ）。ＥＤＮ３  ９７−１４０のこの効果は一過性であったのに対し、一過性の歩行効果後にＲＥＲおよびＣＢＴに対する持続的効果がみられたので、単に歩行活動がＣＢＴ上昇に寄与したのではない。したがって、ＰＯＡに投与したＥＤＮ３  ９７−１４０は体温を上昇させ、この効果は歩行活動だけでは説明されない。
【０２７７】
マウスにおける間接熱量測定のための材料および方法
Ｃ５７ＢＬ６Ｊ雄マウス（３〜４か月齢，２５〜３０ｇ，グループ当たり６匹のマウス）をＨａｒｌａｎから購入した。標準食の動物にマウス飼育食を適宜摂取させた（Ｓ−２３３５  Ｍｏｕｓｅ  Ｂｒｅｅｄｅｒ，１７．５０％のタンパク質，１１．７２％の脂肪，３．３６％の繊維，エネルギー３．５２ｋｃａｌ／ｇ；Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ（ワイオミング州マディソン）。遠隔測定および代謝試験のために、ＣＢＴおよび歩行活動の評価のためのラジオテレメトリー装置（ＴＡ−Ｆ２０，Ｄａｔａ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ミネソタ州セントポール）を雄マウスの腹腔内に外科的に埋め込んだ。個別の順化させた透明な呼吸チャンバー（２０×１０×１２．５ｃｍ）に収容した標準食給餌マウスにおいて、一体型Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｌａｂ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＡＭＳ；Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，オハイオ州コロンブス）の一部であるコンピューター制御した開回路システム（Ｏｘｙｍａｘ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、間接熱量測定および遠隔測定を同時に実施した。空気をチャンバーに約０．５Ｌ／分の流速で導通した。各チャンバーからの排出空気を３０分間隔で１分間、サンプリングした。試料空気をＯ２およびＣＯ２の含量測定のためにＯ２およびＣＯ２センサー（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に逐次導通し、それらから酸素消費量（ＶＯ２）および二酸化炭素産生量（ＶＣＯ２）の測定値を推定した。戸外空気基準値を４回毎の測定後にサンプリングした。ガスセンサーは、実験開始前に、既知濃度のＯ２、ＣＯ２およびＮ２を含有する初期ガス基準品（Ａｉｒｇａｓ  Ｐｕｒｉｔａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ，カリフォルニア州オンタリオ）で目盛定めされた。エネルギー消費測定値（ＶＯ２、ＶＣＯ２および発熱（（３．８１５＋１．２３２＊ＲＥＲ）＊ＶＯ２（リットル））をＫｌｅｉｂｅｒの検出力関数(Kleiber, 1947)による推定有効代謝質量に対して補正した。間接熱量測定を受けるマウスを、試験開始前の３〜４日間、呼吸チャンバーに順化させた。データは、２５℃に固定した周囲室温下で、明サイクル（１２：１２時間の明暗サイクル；６：００ａ．ｍ．に点灯）開始から３日間記録された。処置は、ＰＯＡに直接、埋込みカニューレ（プレグマから前方：０．３ｍｍ，正中線，腹側：３．８ｍｍ，カニューレ２６ＧＡ，長さ１０ｍｍ）を介して、プラスチックチューブおよびマイクロシリンジ（１０μＬ）に接続したシンジェクター（３３ＧＡ，カニューレ先端から０．４ｍｍ突出，全長１０．４ｍｍ）により０．５μＬの体積で、拡散させるために５分間かけて施された。各マウスにビヒクルおよびＥＤＮ３  ９７−１４０の両方を連続実験で投与した。試験の時間経過全体にわたる作用の測定のために、曲線下面積（ＡＵＣ）を用いた。Ｈｏｌｍ法により調整された片側ｔ−検定により統計分析を実施した。
【０２７８】
実施例４．ＥＤＮ３  ９７−１４０は糖尿病マウスにおいてグルコース耐性を改善する
視床下部はグルコース恒常性の中枢制御に関与する主要な要素であることを提唱するレポート(Zsombok and Smith, 2009を参照）から、本発明者らはグルコース恒常性に関係するＥＤＮ３  ９７−１４０の末梢活性を調べた。ＥＤＮ３  ９７−１４０の短期末梢投与（０．１、１または１０ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｐ．）は、ｏｂ／ｏｂマウスおよび食事誘発肥満症（ＤＩＯ）マウスの両方において、ＩＰＧＴＴに応答して、インスリンに対し統計的に有意に作用することなくグルコース変動曲線を降下させた（図４）。インスリンレベルに統計的に有意の変化がなかったことは、ＥＤＮ３  ９７−１４０が有効なインスリン増感剤の可能性があることを示唆する。短期投与でインスリン耐性試験に対してＥＤＮ３  ９７−１４０（１および１０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）の影響はなかった（データを示していない）。したがって、ＥＤＮ３  ９７−１４０は視床下部を介して作用してインスリン感受性を増強する可能性がある。
【０２７９】
糖尿病マウスにおいてグルコース耐性をアッセイするための材料および方法
高脂肪食を１４日間与えたＤＩＯマウス、およびｏｂ／ｏｂマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓから購入した。すべての試験に用いたｏｂ／ｏｂおよびＤＩＯマウスは、それぞれ７および１８週齢で用いられた。一夜の絶食後、ｏｂ／ｏｂおよびＤＩＯマウスにビヒクル（２０ｍＭの酢酸Ｎａ／１４０ｍＭのＮａＣｌ）またはＥＤＮ３  ９７−１４０（０．１、１または１０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）を注射し、続いてｏｂ／ｏｂおよびＤＩＯマウスにそれぞれ０．６ｍｇ／Ｋｇ（ｉ．ｐ．）または２ｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）のＤ−グルコース攻撃を施した。化合物注射後０、１５、３０、６０および１２０分目のマウス尾静脈採血から自動グルコメーター（Ａｌｐｈａ−Ｔｒａｋ）を用いて測定した血漿グルコースレベルを決定した。急性インスリン放出を調べるために、ＥＬＩＳＡキットでマウスインスリンを基準として（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）血漿インスリンレベルを測定した。結果をビヒクル濃度に対するパーセントとして表わし、統計的有意性を２元ＡＮＯＶＡ反復測定により判定した。
【０２８０】
実施例５．ＥＤＮ３  ９７−１４０はＧＬＵＴａｇ細胞からのＧＬＰ−１分泌をＧ  ｓ−依存性機序で刺激する
代謝調節におけるＥＤＮ３  ９７−１４０の潜在的役割を理解するために、ＥＤＮ３  ９７−１４０を細胞に基づく幾つかのアッセイ法で試験した。ＥＤＮ３  ９７−１４０（１０μＭ）は３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞の基礎グルコース取込みに対して影響をもたず、グルコース刺激によるＩＮＳ１細胞からのインスリン放出も調節しなかった（データを示していない）。これと対照的に、ＥＤＮ３  ９７−１４０はＧＬＵＴａｇ腸内分泌細胞からのＧＬＰ−１分泌を濃度依存的に３６９±６８ｎＭのＥＣ５０で刺激した（図５Ａ）。エンドセリン−３も試験したが、最高濃度（１０μＭ；表２）でＧＬＵＴａｇのＧＬＰ−１分泌に対して影響をもたなかった；これにより、ＥＤＮ３  ９７−１４０はエンドセリン−３とは異なる活性をもつことが確認された。また、ＥＤＮ３  ９７−１４０刺激によるＧＬＰ−１分泌は、高濃度の非−サブタイプ選択的な効力をもつＥＴＡ／ＥＴＢアンタゴニストであるボセンタン(bosentan)で阻害されなかった（図５Ｂ）。この結果により、ＥＤＮ３  ９７−１４０がＥＴＡ／ＥＴＢ以外の受容体を介して作用することが確認される。しかし、ＥＤＮ３  ９７−１４０（１μＭ）刺激によるＧＬＰ−１分泌は、ＣＴＸによる一夜の前処理により遮断された（図５Ｃ）。ＣＴＸはＧαｓの特異的阻害薬であるので、ＥＤＮ３  ９７−１４０はＧαｓ関連受容体を介して作用する可能性がある。結論として、ＥＤＮ３  ９７−１４０の作用は視床下部に限定されない。むしろ、ＥＤＮ３  ９７−１４０は腸内分泌細胞からのＧＬＰ−１分泌を直接促進することができる。したがってこれらの実験はＥＤＮ３  ９７−１４０が２つの別個の機序で作用することを示唆する。
【０２８１】
ＧＬＰ−１は食物吸収に際して分泌される腸ホルモンであり、正常なグルコース恒常性にとって必須である。ＧＬＰ−１は膵ベータ細胞に直接作用してインスリン分泌を増大させると考えられる。しかし、ＧＬＰ−１の血漿レベルが比較的低くかつ急速に代謝されることは、標的臓器、たとえば膵島細胞に対する直接的な内分泌作用がグルコース耐性に対するそれの効果のすべてを説明するかどうかについて疑問が生じる。幾つかの試験により、インスリン分泌、グルコース産生およびグルコース利用に関する間接的経路を介したグルコース恒常性は、肝門脈センサー迷走神経求心性経路により仲介されることが示唆されている(Nakabayashi, 1996; Balkan, 2000; Burcelin, 2001; Nishizawa, 2003; Dardevet, 2004; Ahren, 2004; Ionut, 2005; Vahl, 2007)。したがって、ＥＤＮ３  ９７−１４０により誘発されたＧＬＰ−１増加は、膵ベータ細胞におけるインスリン分泌を直接増大させる可能性があり、あるいは肝門脈迷走神経求心性回路によりインスリン感受性を改善する可能性がある。理論により拘束されたくはないが、ＥＤＮ３  ９７−１４０はインスリン分泌の増大またはインスリン感受性の改善によりそれの抗糖尿病効果を発揮する可能性がある。
【０２８２】
表２：ＧＬＰ−１放出ＧＬＵＴａｇアッセイにおける活性についての１５種類のトランケート型またはバリアント型ＥＤＮ３様ポリペプチドのＥＤＮ３  ９７−１４０構造活性分析。この分析は、ＥＤＮ３様ポリペプチドとして使用できるバリアントを同定するためのＥＤＮ３  ９７−１４０のバリアント（たとえば、たとえばＥＤＮ３  ９７−１４０の活性を維持するバリアント）の作製および試験の代表例である。この分析は、完全活性に対するタンパク質のフォールディングおよび無傷末端の役割を示唆する。
【０２８３】
【表２】
2014513923.tif 000005
【０２８４】
＊  ポリペプチドＥＤＮ３  １０９−１４０  Ｃ１１１ＳおよびＥＤＮ３  １０９−１４０  Ｃ１１１Ａ  Ｗ１１７Ａは、最高濃度（１０μＭ）で送達した場合に最大活性の約２０％を示した。活性が最大の５０％に達しなかったので、ＥＣ５０を“＞１０μＭ”として表２に挙げる。
【０２８５】
実施例６．ＥＤＮ３  ９７−１４０仲介によるＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１放出活性の構造−機能分析
ＧＬＵＴａｇ細胞におけるＧＬＰ−１放出活性を試験した一連の１５種類のトランケート型ペプチドを用いて、ＥＤＮ３  ９７−１４０活性を探査した（表２）。エンドセリン−３（ＥＤＮ３  ９７−１１７）はＧＬＰ−１放出を誘発するのに十分でなかった。これと対照的に、４４−ｍｅｒ  Ｃ末端アミド化ＥＤＮ３  ９７−１４０は試験したうちで最も有効なペプチドであった。
【０２８６】
エンドセリン−３は４つのシステイン残基をもつ。位置１、３、１１および１５にあるシステインは、エンドセリン−１について報告されたように２つのジスルフィド結合を形成することができる(Janes, 1994)。したがって、システイン置換変異体を合成して、両ジスルフィド橋の形成がフォールディングおよびアゴニスト活性に寄与するかどうかを判定した。ＥＤＮ３  ９８−１４０（第１システインを欠如）およびＥＤＮ３  １００−１４０（最初の２つのシステインを欠如）はＧＬＵＴａｇ細胞からのＧＬＰ−１分泌を測定可能なほどに刺激しない。ＥＤＮ３  ９７−１４０のジスルフィド結合を一度に１つ排除するシステイン変異体は、ＥＤＮ３  ９７−１４０の効力を低下させる；しかし、活性はなおみられる。具体的には、ＥＤＮ３  ９７−１４０  Ｃ９７Ａ，Ｃ１１１Ａは２．７μＭのＥＣ５０値をもち、ＥＤＮ３  ９７−１４０  Ｃ９９Ａ，Ｃ１０７Ａは１．６μＭのＥＣ５０値をもっていた。
【０２８７】
表２に報告した構造活性関係は、インビトロでのＧＬＵＴａｇ細胞のエンドセリン−３処理はＧＬＰ−１分泌をもたらさないことを示唆し、これによりＥＤＮ３  ９７−１４０はエンドセリン−３から明瞭に区別される；機能上の区別も血管収縮アッセイおよびＥＴＡ／ＥＴＢ受容体結合アッセイの両方において確認された。ＥＤＮ３  ９７−１４０のトランケーションおよび点変異を伴う実験は、ＮおよびＣ末端ならびに特定のシステイン残基がＧＬＵＴａｇ細胞からのＧＬＰ−１放出の促進を補助することを示す。エンドセリン−１結晶構造(Janes, 1994)に基づいて、本発明者らはシステイン９７とシステイン１１１、およびシステイン９９とシステイン１０７がジスルフィド結合を形成すると推定する。これら２つのシステイン橋はＮ末端のフォールディングを助ける可能性がある。ＥＤＮ３  ９７−１３７（Ｃ末端ＧＫＲを欠如）についてみられた部分的な活性喪失は、ペプチドの両末端がそれの活性に寄与することを示唆する。この寄与は、たとえば長さ、フォールディング、または電荷に起因する可能性があり、したがって活性ペプチドの末端はアミノ酸置換を受けていないと思われる。たとえば、この分子の他の部分において、保存的置換、たとえばＥＤＮ３  ９７−１４０  Ｗ１１７Ｆは、インビトロでＧＬＰ−１分泌促進機能の喪失を引き起こさず、本明細書に提示するポリペプチドのバリアントを製造することによりさらに他のＥＤＮ３様ポリペプチドを作製する可能性を立証する。
【０２８８】
細胞培養のための材料および方法
細胞培養試薬は、別途明記しない限りＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇａｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入された。ＧＬＵＴａｇ細胞はDr. Daniel Druckerから入手され、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および１０％のウシ胎仔血清を補充した高グルコースＤＭＥＭ培地中、１０％  ＣＯ２、３７℃で培養された。Ｈ４ＩＩＥラット肝癌細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州マナッサス）から購入され、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、および１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清を補充した低グルコースＤＭＥＭ培地中、５％  ＣＯ２、３７℃で培養された。
【０２８９】
インビトロでＧＬＵＴａｇ細胞からのＧＬＰ−１分泌を測定するための材料および方法
ポリ−Ｄ−リジンでコートした９６−ウェルプレートにＧＬＵＴａｇ細胞を接種し、Brubaker, 1998が確立したプロトコルに従って処理した。簡単に述べると、細胞をＤＭＥＭ  ５ｍＭグルコースで２回洗浄し、次いで５ｍＭグルコースを含有するＤＭＥＭ中で２時間、飢餓状態にした。１５ｍＭグルコースをペプチドまたはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と共に含有するＤＭＥＭで、細胞を刺激した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，カリフォルニア州ラホーヤ）を用いてＥＣ５０濃度を計算した。直ちに、または後続測定のために凍結して、活性ＧＬＰ−１（７−３６）アミドについてのＥＬＩＳＡを用いて製造業者のプロトコルに従ってＧＬＰ−１を測定し、アッセイ標準曲線により量を決定した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。コレラ毒素（ＣＴＸ）を用いる試験のために、細胞をＣＴＸ（０．２μｇ／ｍＬ）で一夜、前処理した。ＣＴＸは血清／グルコース飢餓、および１μＭのＥＤＮ３  ９７−１４０またはＤＭＳＯビヒクルとのインキュベーションに際しても存在した。多数の実験にわたって正規化するために、データをビヒクルに対するパーセントとして計算した。ＥＣ５０の推定値に関する標準誤差をデルタ法により概算し、２試料非対合ｔ検定(two sample unpaired t-test)を用いる片側Ｄｕｎｎｅｔｔにより有意性を決定した。２試料不等分散ｔ検定(two sample unequal variance t-test)（Ｓａｔｔｅｒｔｈｗａｉｔｅ検定）を用いて、ＣＴＸデータの統計分析を実施した。多重比較に起因する多重性問題を説明するために、Ｈｏｌｍ試験法を適用した。
【０２９０】
実施例７．ＥＤＮ３  ９７−１４０はラット潅流結腸内でのＧＬＰ−１分泌を刺激する
インビトロでマウスＧＬＵＴａｇ細胞からＥＤＮ３  ９７−１４０が翻訳されて門脈におけるＧＬＰ−１放出を刺激するのを確認するために、エクスビボでラット潅流結腸標本を用いた。上腸間膜動脈に潅流したＥＤＮ３  ９７−１４０（２００ｎＭ）は、ＧＬＰ−１分泌を５６±１８％刺激した；これは１０ｐＭのＧＬＰ−１放出増大と一致する（図５Ｄ）。したがって、ラット潅流結腸アッセイにより、ＥＤＮ３  ９７−１４０がＧＬＰ−１分泌を促進するという実施例６の所見が確認される。
【０２９１】
エクスビボでラット潅流結腸からのＧＬＰ−１分泌をアッセイするための材料および方法
エクスビボでのラット結腸血管潅流実験を先の記載に従って実施した(Plaisancie, 1995)。雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（３００ｇ）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから購入し、Ｐｕｒｉｎａ  Ｌａｂ  Ｃｈｏｗ  ＃５００１（ＷＦ  Ｆｉｓｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎ  Ｉｎｃ，ニュージャージー州サマービル）を適宜摂取させた。ラットを断頭し、正中線切開により開腹した。上腸間膜動脈および門脈に速やかに金属カニューレおよびプラスチックチューブをそれぞれ挿入した。酸素添加クレブス−ヘンゼライト緩衝液を含有する溶液による２ｍＬ／分の速度での動脈潅流を直ちに開始した［溶液：クレブス−ヘンゼライト緩衝液（２５．０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３；１１８ｍＭ  ＮａＣｌ；４．７ｍＭ  ＫＣｌ；１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４；１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）；３％  ＢＳＡ，５ｍＭグルコース，ＭＥＭ必須アミノ酸および非必須アミノ酸を含有（ｐＨ７．４）］。結腸内腔を０．５ｍＬ／分の速度で潅流した。残りの結腸および小腸を、それらのそれぞれの供給血管を結紮した後に摘出した。結腸標本を３７℃の組織浴に移した後、門脈排出液を５分画分で採集した。画分の小部分を後続のＧＬＰ−１測定のために−２０℃で凍結した。ＥＤＮ３  ９７−１４０を血管潅流液に２００ｎＭで溶解し、３０分間のベースライン採集後に動脈内へ潅流した。実験終了時に、陽性対照として用いるためにホルスコリン(forskolin)（１０μＭ）を潅流した。活性ＧＬＰ−１（７−３６）アミドのための市販キットの使用により製造業者の指示（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に従ってＧＬＰ−１検出アッセイを実施した。ベースライン値として処理前に採集した画分の平均を用いて、ＧＬＰ−１放出データおよび各処理に伴うピークデータをベースラインに対する％に正規化した。３つの独立した実験にわたる平均データを、ＥＤＮ３  ９７−１４０と対照（ベースライン）、およびホルスコリンと対照（ベースライン）を比較して報告した。不等分散であるため片側Ｓａｔｔｅｒｗａｉｔｅ検定により統計分析を実施し、多重比較を説明するためにＨｏｌｍ検定を適用した。
【０２９２】
実施例８．ＥＤＮ３  ９７−１４０は肝細胞の糖新生を阻害する
糖新生に対するＥＤＮ３  ９７−１４０の役割を評価するために、ラット肝細胞系Ｈ４ＩＩＥを用いた。Ｈ４ＩＩＥ細胞を飢餓状態にし、乳酸およびピルビン酸を炭素源として補充し、１００ｎＭのＥＤＮ３  ９７−１４０で２４時間処理した。基礎デノボグルコース産生が、ビヒクル処理と比較してＥＤＮ３  ９７−１４０により１９．５±７．６％低下した（図６）。
【０２９３】
ＥＤＮ３  ９７−１４０はラット肝細胞Ｈ４ＩＩＥ細胞系において基礎糖新生を抑制し、これはインスリンとは独立した作用であった。肝臓の糖新生による基礎グルコース産生の増大はＩＩ型糖尿病の既知の結果であり(Rizza, 2010を参照)、ＥＤＮ３  ９７−１４０はグルコース恒常性を肝臓レベルで直接調節して高血糖を調節する能力をもつ。これは、ＥＤＮ３  ９７−１４０が肝臓におけるグルコース産生量を減少させることによって健全なグルコース代謝を促進する活性をもつという結論と一致する。
【０２９４】
ＥＤＮ３  ９７−１４０はマウスＧＬＵＴａｇ細胞において分泌促進活性をもち、ラット潅流結腸においてＧＬＰ−１を分泌させ、ラット肝細胞において糖新生を直接抑制するので、ＥＤＮ３  ９７−１４０は二重の抗−高血糖機序を備えたホルモンである可能性がある。
【０２９５】
インビトロでＨ４ＩＩＥグルコース産生をアッセイするための材料および方法
Ｈ４ＩＩＥ細胞をウェル当たり１２０，０００個で９６ウェルのポリ−Ｄ−リジンコートしたプレートに接種し、先に報告されたプロトコルの改変法を用いて処理した(de Raemy-Schenk, 2006)。簡単に述べると、接種後４時間目に、増殖培地をグルコース産生培地（無グルコースＤＭＥＭ，２ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および２０ｍＭの乳酸ナトリウム）に交換して１８時間おき、次いで細胞を新鮮なグルコース産生培地中でＥＤＮ３  ９７−１４０またはビヒクルにより処理した。２４時間後、培地を採集し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇａｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入したＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄグルコース／グルコースオキシダーゼアッセイキットを用いてグルコースをアッセイした。実験全体にわたって正規化するために、データをビヒクルに対するパーセントとして報告した。処理グループを固定効果とし、データをランダム効果として、混合効果モデルを用いてＨ４ＩＩＥグルコース産生を分析し、片側仮説試験を実施した。
【０２９６】
参考文献
【０２９７】
【表３−１】
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【０２９８】
【表３−２】
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【０２９９】
【表４−１】
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【０３００】
【表４−２】
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【０３０１】
【表４−３】
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【０３０２】
【表４−４】
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【０３０３】
【表４−５】
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【０３０４】
援用
本明細書中に述べたすべての刊行物および特許の全体を、それぞれ個々の刊行物および特許を具体的かつ個別に援用すると指示したと同様に本明細書に援用する。
【０３０５】
本発明の具体的態様を考察したが、前記の詳細は説明であって限定ではない。本明細書および特許請求の範囲を見ることにより本発明の多数の変更が当業者に明らかになるであろう。本発明の全範囲は、特許請求の範囲をそれらの均等物の全範囲と共に、また本明細書をそのような変更と共に参照することにより、決定すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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