(57)【要約】  方法は、哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態、例えば、アルツハイマー病の治療における活性について候補化合物をスクリーニングすることを含む。シャペロンタンパク質の三量体／単量体比が候補化合物の存在下で減少するかどうかが測定される。シャペロンタンパク質は、ヒト由来のＢｒｉ２、Ｂｒｉ３またはｐｒｏＳＰ−ＣのＢｒｉｃｈｏｓドメインであるかまたはそれらに対して高い同一性を有する。シャペロンタンパク質の単量体および／またはこれらの単量体の形成を促進する化合物は、該状態の内科的治療に有用である。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療における活性について１種以上の候補化合物をスクリーニングする方法であって、シャペロンタンパク質の三量体／単量体比が前記１種以上の候補化合物の存在下で減少するかどうかを測定することを含み、前記シャペロンタンパク質が、８０個以上のアミノ酸残基を含んでおり、かつヒト由来のＢｒｉ２の残基９０〜２４３（配列番号２）、ヒト由来のＢｒｉ２のＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号３）、ヒト由来のＢｒｉ３の残基９７〜２４２（配列番号５）、ヒト由来のＢｒｉ３のＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号６）、ヒト由来のＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（配列番号８）、およびヒト由来のＣＴｐｒｏＳＰ−ＣのＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいる方法。
【請求項２】
前記シャペロンタンパク質が、２００個以下のアミノ酸残基を含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記シャペロンタンパク質が、１５０個以下のアミノ酸残基を含んでいる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記シャペロンタンパク質が、ヒト由来のＢｒｉ２の残基９０〜２４３（配列番号２）、ヒト由来のＢｒｉ３の残基９７〜２４２（配列番号５）、およびヒト由来のＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（配列番号８）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記シャペロンタンパク質が、ヒト由来のＢｒｉ２（配列番号３）、Ｂｒｉ３（配列番号６）およびＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（配列番号９）のＢｒｉｃｈｏｓドメインからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ａ）前記シャペロンタンパク質の既知の三量体／単量体比を含む水性混合物を準備する工程；
ｂ）前記１種以上の候補化合物を前記混合物に添加する工程；
ｃ）前記１種以上の候補化合物を前記混合物中の前記シャペロンタンパク質と相互作用させる工程；
ｄ）前記混合物中の前記シャペロンタンパク質の三量体／単量体比を測定する工程；および
ｅ）前記１種以上の候補化合物が、
ｅ１）前記シャペロンタンパク質の三量体／単量体比が前記候補化合物の存在下で減少する場合、前記状態の治療において活性である；または
ｅ２）前記シャペロンタンパク質の三量体／単量体比が前記候補化合物の存在下で減少しない場合、前記状態の治療において活性でない
と結論づける工程；
を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記状態に関連するフィブリル化タンパク質のフィブリルの形成が、前記シャペロンタンパク質および前記１種以上の活性候補化合物の存在下で減少するかどうかを測定することをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ｆ）前記フィブリル化タンパク質および前記シャペロンタンパク質を含む第２の水性混合物を準備する工程；
ｇ）工程ｅ１）において活性とみなされた前記１種以上の候補化合物を前記第２の混合物に添加して、前記シャペロンタンパク質の三量体／単量体比を減少させる工程；
ｈ）前記第２の混合物中で前記シャペロンタンパク質を前記１種以上の候補化合物および前記フィブリル化タンパク質と相互作用させる工程；
ｉ）前記第２の混合物中の前記フィブリル化タンパク質のフィブリルの形成を測定する工程；ならびに
ｊ）前記１種以上の候補化合物が、
ｊ１）前記フィブリル化タンパク質のフィブリル形成が前記候補化合物の存在下で減少する場合、前記状態の治療において活性である；または
ｊ２）前記フィブリル化タンパク質のフィブリル形成が前記候補化合物の存在下で減少しない場合、前記状態の治療において活性ではない
と結論づける工程
をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記フィブリル化タンパク質が、Ａβ−ペプチド、ＡＤａｎ、ＡＢｒｉおよびＳＰ−Ｃからなる群から選択される、請求項７および８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記フィブリル化タンパク質が、Ａβ−ペプチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療のための医薬組成物を製造する方法であって、
ａ）ａ１）請求項１〜１０の方法のいずれか一つに従って、活性について１種以上の候補化合物をスクリーニングすること；または
ａ２）請求項１〜１０の方法のいずれか一つに従った以前のスクリーニング手順の結果を利用すること
によって活性化合物を準備する工程；および
ｂ）前記活性化合物を１種以上の適切な医薬成分と製剤化して、医薬組成物を与える工程
を含む方法。
【請求項１２】
前記状態が、アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症および間質性肺疾患からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記状態が、アルツハイマー病である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療のための候補薬のインビトロターゲットとしての、請求項１〜５のいずれか一項に記載のシャペロンタンパク質の三量体の使用。
【請求項１５】
前記候補薬が、前記シャペロンタンパク質の三量体／単量体比の減少における活性についてスクリーニングされる、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記状態が、アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症および間質性肺疾患からなる群から選択される、請求項１４および１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記状態がアルツハイマー病である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
抗体およびアプタマーからなる群から選択される化合物または化合物の組合せであって、前記化合物または組合せが、シャペロンタンパク質の三量体／単量体比を減少させることができ、前記シャペロンタンパク質が、８０個以上のアミノ酸残基を含んでおり、かつヒト由来のＢｒｉ２の残基９０〜２４３（配列番号２）、ヒト由来のＢｒｉ２のＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号３）、ヒト由来のＢｒｉ３の残基９７〜２４２（配列番号５）、ヒト由来のＢｒｉ３のＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号６）、ヒト由来のＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（配列番号８）、およびヒト由来のＣＴｐｒｏＳＰ−ＣのＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいる、医薬品として使用するための化合物または化合物の組合せ。
【請求項１９】
前記シャペロンタンパク質が、ヒト由来のＢｒｉ２の残基９０〜２４３（配列番号２）、ヒト由来のＢｒｉ３の残基９７〜２４２（配列番号５）、およびヒト由来のＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（配列番号８）からなる群から選択される、請求項１８に記載の使用のための化合物または化合物の組合せ。
【請求項２０】
前記シャペロンタンパク質が、ヒト由来のＢｒｉ２（配列番号３）、Ｂｒｉ３（配列番号６）およびＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（配列番号９）のＢｒｉｃｈｏｓドメインからなる群から選択される、請求項１８に記載の使用のための化合物または化合物の組合せ。
【請求項２１】
哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療のためのものである、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の使用のための化合物または化合物の組合せ。
【請求項２２】
前記状態が、アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症および間質性肺疾患からなる群から選択される、請求項２１に記載の使用のための化合物または化合物の組合せ。
【請求項２３】
前記状態がアルツハイマー病である、請求項２２に記載の使用のための化合物または化合物の組合せ。
【請求項２４】
８０個以上のアミノ酸残基を含み、かつヒト由来のＢｒｉ２の残基９０〜２４３（配列番号２）、ヒト由来のＢｒｉ２のＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号３）、ヒト由来のＢｒｉ３の残基９７〜２４２（配列番号５）、ヒト由来のＢｒｉ３のＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号６）、ヒト由来のＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（配列番号８）、およびヒト由来のＣＴｐｒｏＳＰ−ＣのＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、医薬品として使用するためのタンパク質の単量体。
【請求項２５】
哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療において使用するための、請求項２４に記載のタンパク質単量体。
【請求項２６】
前記状態が、アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症および間質性肺疾患からなる群から選択される、請求項２５に記載の使用のためのタンパク質単量体。
【請求項２７】
前記状態がアルツハイマー病である、請求項２６に記載の使用のためのタンパク質単量体。
【請求項２８】
そのアミノ酸配列が、ヒト由来のＢｒｉ２の残基９０〜２４３（配列番号２）、およびヒト由来のＢｒｉ２のＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号３）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％を有し、但し、前記タンパク質が、ヒト由来のＢｒｉ２の残基１〜８９に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでおらず、前記タンパク質が、ヒト由来のＢｒｉ２のヒト残基２４４〜２６６（Ｂｒｉ２３）に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいない、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の使用のためのタンパク質単量体。
【請求項２９】
前記タンパク質単量体が、２００個以下のアミノ酸残基からなっている、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の使用のためのタンパク質単量体。
【請求項３０】
前記タンパク質単量体が、１５０個以下のアミノ酸残基からなっている、請求項２９に記載の使用のためのタンパク質単量体。
【請求項３１】
前記タンパク質が、ヒト由来のＢｒｉ２の残基９０〜２４３（配列番号２）、ヒト由来のＢｒｉ３の残基９７〜２４２（配列番号５）、およびヒト由来のＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（配列番号８）からなる群から選択される、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の使用のためのタンパク質単量体。
【請求項３２】
前記タンパク質が、ヒト由来のＢｒｉ２（配列番号３）、Ｂｒｉ３（配列番号６）およびＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（配列番号９）のＢｒｉｃｈｏｓドメインからなる群から選択される、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の使用のためのタンパク質単量体。
【請求項３３】
治療的有効量の請求項２４〜３２のいずれか一項に記載のタンパク質の単量体およびそれらに適切な医薬担体を含む医薬組成物。
【請求項３４】
前記タンパク質の三量体／単量体比を減少させることができる、治療的有効量の化合物または化合物の組合せをさらに含む、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
治療的有効量の請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の化合物または化合物の組合せ、およびそれらに適切な医薬担体を含む、医薬組成物。
【請求項３６】
医薬品として使用するための、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療において使用するための、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記状態が、アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症および間質性肺疾患からなる群から選択される、請求項３７に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項３９】
前記状態がアルツハイマー病である、請求項３８に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項４０】
治療を必要としている、ヒトを含む哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態を治療する方法であって、治療的有効量の請求項２４〜３２のいずれか一項に記載のタンパク質の単量体を前記哺乳動物へ投与することおよび／またはそれに導入することを含む方法。
【請求項４１】
治療的有効量の請求項２４〜３２のいずれか一項に記載のタンパク質の単量体を前記哺乳動物へ投与することを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
治療的有効量の請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の化合物または化合物の組合せを前記哺乳動物へ投与することを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
治療的有効量の請求項３３〜３９のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記哺乳動物へ投与することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記状態が、アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症および間質性肺疾患からなる群から選択される、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記状態がアルツハイマー病である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記治療が、予防的、緩和的および治癒的治療からなる群から選択される、請求項４０〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療における使用のための、（ｉ）請求項２４〜３２のいずれか一項に記載のシャペロンタンパク質の単量体、および／または（ｉｉ）前記シャペロンタンパク質の三量体／単量体比を減少させることができる、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の化合物もしくは化合物の組合せの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、医学の分野に関する。より具体的には、本発明は、哺乳動物、例えば、ヒトにおけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療のための医薬品および内科的治療に関する。状態としては、アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症および間質性肺疾患（ＩＬＤ）が挙げられる。
【発明の技術的背景】
【０００２】
アルツハイマー病、家族性英国型またはデンマーク型認知症および間質性肺疾患などの神経変性状態の数の増加は、タンパク質の誤った折り畳みおよび凝集に関連している。これらの疾患は、例えば脳実質および大脳動脈におけるタンパク質の沈着を特徴としており、遺伝型または散発型で起こる。これらの疾患は、種々の臨床症状を有するにもかかわらず、それらは、タンパク質凝集体の形成を含むいくつかの共通する病理学的特徴を共有する。生化学的観点から、関与するタンパク質は、β−シート構造を形成する傾向があり、アミロイドフィブリル中に凝集しやすい。アルツハイマー病および家族性英国型またはデンマーク型認知症は、いくつかの類似の神経病理学的特徴を示す。アミロイドプラーク、神経原線維のもつれ、コンゴアミロイド好染血管障害および神経変性が認められる。
【０００３】
アルツハイマー病は、ヒトにおける認知症の最もよく見られる原因の１つである。それは、アミロイドβ−ペプチド（Ａβ−ペプチド）の細胞外沈着からなるアミロイドプラークの存在を特徴とする、罹患した患者の脳の神経細胞変性を伴う慢性的で致死性の疾患である。Ａβ凝集により引き起こされる神経細胞萎縮は、アセチルコリンおよび他のシグナル伝達物質の欠乏をもたらす。４０〜４２個のアミノ酸残基を有するＡβ−ペプチドは、中枢神経系のニューロンにより通常発現されるＩ型膜タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ、６９５〜７７０アミノ酸残基）のプロセシングによって産生されることは公知であるが、このプロセシングの理由は完全に理解されているとは限らない。放出されたＡβペプチドは、ＡＰＰ（Ａβ残基２９〜４０／４２）の膜貫通領域の一部を含み、不一致なヘリックス、すなわち、β−ストランドを形成する高い性向をもつアミノ酸から構成されるヘリックスを含む。Ａβは、その安定化している膜環境から外れると、誤った折り畳みおよび凝集を起こしやすい。
【０００４】
Ｂｒｉ２（配列番号１、膜内在性タンパク質２Ｂ、ＩＴＭ２Ｂとも呼ばれる）は、その機能および折り畳み構造が未知である、偏在発現による２６６−残基ＩＩ型膜タンパク質（図１）である。Ｂｒｉ２は、３箇所でタンパク質分解によって切断され；Ｃ−末端領域におけるフーリンによる切断は、２３−残基ペプチド（Ｂｒｉ２３）を生成し、ＡＤＡＭ１０によるエクトドメインのプロセシングは、膜結合Ｎ−末端部分からＢｒｉｃｈｏｓドメインの放出をもたらし、ＳＰＰＬ２ａ／２ｂによる膜間切断は、細胞内ドメインを遊離させる。家族性英国型およびデンマーク型認知症は、Ｂｒｉ２遺伝子における突然変異に起因し、これは、終始コドンの消失をもたらし、そして次にＣ−末端部分の２つの異なる１１−残基延長、およびフーリン切断後に、正常に放出されるＢｒｉ２３に代わって３４−残基ペプチド（それぞれ、ＡＢｒｉおよびＡＤａｎ）の生成をもたらす。ペプチドが長ければ長いほど、同時に起こるニューロン損失および認知症とともに、アミロイドフィブリル中へ凝集し、および脳組織または大脳血管で沈着する傾向がある。
【０００５】
最近の研究では、Ｂｒｉ２および／またはその断片ならびにＡβは、脳実質および脳血管におけるアミロイドプラークに共局在することが示されており、タンパク質が、誤った折り畳みおよび凝集の間のある段階で相互作用することを示唆する。トランスフェクトされた細胞系を用いる場合、Ｂｒｉ２は、ＡＰＰと相互作用し、β−セクレターゼによって生成される断片の増加によってＡＰＰプロセシングを調節することが見出された。Ｂｒｉ２およびＡβ４０を含む融合タンパク質の生成は、Ｂｒｉタンパク質がＡβ凝集性に影響を与え得ることを示し、トランスジェニックマウスモデルを用いる場合、Ｂｒｉ２３が、Ａβ４２と相互作用し、その凝集を妨げると提示されている（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２８：６０３０〜６０３６頁（２００８年）；国際公開第２００９／００９３９６号パンフレット）。Ａβ産生を、Ｂｒｉ２の最初の１０２アミノ酸残基を含むタンパク質によって減少または防止させ得ることも提示されている（国際公開第２００６／１３８３５５号パンフレット）。
【０００６】
アルツハイマー病の治療への現行の治療手法は、その症状の治療に主に向けられており、コリン代償療法、例えば、アセチルコリンエステラーゼの阻害、可溶性Ａβオリゴマーと相互作用する低分子量阻害剤、および既に形成されたβ−シート構造の伸長を妨げるいわゆるβ−シートブレーカーを含む。
【０００７】
Ａβペプチドに対するモノクローナル抗体は、神経毒性フィブリル中への凝集を防止し、既に形成されたアミロイドを溶解する。しかしながら、抗体療法は、非常に高価であり、多様な重篤な副作用を伴う。アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにおけるβ−アミロイドによるワクチン接種は、アミロイドプラークの数および全体的なアミロイド負荷の有意な減少、ならびに認知能力のある程度の改善さえも示した。
【０００８】
凝集を妨げるために提案された別の戦略は、シャペロンと機能的に定義される分子を用いることであった。シャペロンは、複雑な細胞内環境においてタンパク質の正確な折り畳みを助けることによって重要な役割を果たす。多くの分子シャペロン、例えば、ヒートショックタンパク質（Ｈｓｐ）は、折り畳み過程で重要であることが知られており、広範に研究されてきた。これらのシャペロンのいくつかは明らかに、ある種のポリペプチドのアミロイドフィブリル形成と関係を持ち、それに影響を与えることができる。Ａβ1〜42の凝集は、Ｈｓｐ９０または組合せＨｓｐ７０／Ｈｓｐ４０により阻害される（ＣＧ  Ｅｖａｎｓら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：３３１８２〜３３１９１頁、２００６年）。さらに、細胞外シャペロンクラスタリン（アポリポタンパク質Ｊ）は、Ａβを含む多くのポリペプチド（Ｅ  Ｍａｔｓｕｂａｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３１６（Ｐｔ２）：６７１〜６７９頁、１９９６年）およびプリオンタンパク質の断片（Ｓ  ＭｃＨａｔｔｉｅおよびＮ  Ｅｄｉｎｇｔｏｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２５９：３３６〜３４０頁、１９９９年）のフィブリル形成を阻害することが示されている。構造的に多様なシャペロンのアミロイド疾患の予防における役割は、確立されておらず、いくつかの報告は、タンパク質シャペロンがアミロイドフィブリル形成を促進することを示しさえしている（例えば、ＳＫ  ＤｅｂＢｕｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：１３９３８〜１３９４３頁、１９９７年を参照）。分子シャペロンに加えて、化学的および薬理学的シャペロンの作用がミスフォールディング疾患（誤った折り畳みによる疾患）との関連で研究されてきた。
【０００９】
Ｎｅｒｅｌｉｕｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４８：３７７８〜３７８６頁（２００９年）およびＪｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８９（２）：２２７〜２２９頁（２００９年）には、Ａβ−ペプチドアミロイドフィブリルと同様にサーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）の形成も、ＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ、すなわち、ＳＰ−Ｃ前駆体ｐｒｏＳＰ−ＣのＣ−末端断片によって妨げられ得ることが示されている。Ａβ−ペプチドは、ＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ三量体から五量体に結合することが示唆されている。Ｃａｓａｌｓら、ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２７５：５３６〜５４７頁（２００８年）には、三量体のオリゴマーを含めて、いくつかの他のオリゴマー化状態が認められるが、ＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃは、ｐｒｏＳＰ−Ｃの残存部分の不存在下で三量体として大部分は存在することが実証されている。
【００１０】
Ｐｅｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３９３：３５６〜３６１頁（２０１０年）には、Ｂｒｉ２（内在性膜タンパク質２Ｂ、ＩＴＭ２Ｂとも呼ばれる）の細胞外ドメインが、Ａβ−ペプチドに結合し、Ａβ−ペプチドアミロイドフィブリル形成を防止することが示されている。
【００１１】
当技術分野におけるこれらの進歩にもかからず、哺乳動物、例えばヒトにおけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療のための改善されたおよび代替の療法の強い必要性がある。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の目的は、フィブリル化してアミロイドフィブリル中に凝集しやすいタンパク質の性向を低下させ、またはさらにはフィブリル化しやすいタンパク質がアミロイドフィブリル中に凝集するのを防止することである。
【００１３】
本発明の目的はまた、哺乳動物の脳におけるフィブリル化しやすいタンパク質の細胞外沈着からなるアミロイドプラークの形成を減少させることである。
【００１４】
本発明の別の目的は、ヒトを含む哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態に対する新規な治療選択肢を提供することである。
【００１５】
本発明の目的はまた、ヒトを含む哺乳動物におけるアルツハイマー病、家族性デンマーク型および英国型認知症、ならびに間質性肺疾患の治療のための新規な治療選択肢を提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、アミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態に関与する新規なターゲットを提供することであり、このターゲットは、これらの状態の治療において活性である化合物の同定に有用である。
【００１７】
本発明のさらに別の目的は、アミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療のための化合物、化合物の組合せおよびこのような化合物を含む医薬組成物を提供することである。
【００１８】
本発明の目的は、新規なターゲットとの相互作用を含む、アミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態を治療する方法を提供することである。
【００１９】
本発明は、概してヒト由来のＢｒｉ２、Ｂｒｉ３もしくはｐｒｏＳＰ−ＣのＢｒｉｈｏｓドメインと高い同一性を有するシャペロンタンパク質の単量体および／またはこれらの単量体の形成を促進する化合物が、これらの状態の内科的治療に有用であるという洞察に基づく。
【００２０】
したがって、以下の説明から明らかであるこれらおよび他の目的のために、本発明は、第１の側面によって、哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療における活性について１種以上の候補化合物をスクリーニングする方法であって、シャペロンタンパク質の三量体／単量体比が、前記１種以上の候補化合物の存在下で減少するかどうかを測定することを含む方法を提供する。シャペロンタンパク質は、８０個以上のアミノ酸残基を含んでおり、かつヒト由来のＢｒｉ２の残基９０〜２４３（配列番号２）、ヒト由来のＢｒｉ２のＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号３）、ヒト由来のＢｒｉ３の残基９７〜２４２（配列番号４）、ヒト由来のＢｒｉ３のＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号５）、ヒト由来のＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（配列番号８）、およびヒト由来のＣＴｐｒｏＳＰ−ＣのＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいる。
【００２１】
好ましい態様において、スクリーニング方法は、
ａ）シャペロンタンパク質の既知の三量体／単量体比を含む水性混合物を準備する工程；
ｂ）前記１種以上の候補化合物を混合物に添加する工程；
ｃ）前記１種以上の候補化合物を混合物中のシャペロンタンパク質と相互作用させる工程；
ｄ）混合物中のシャペロンタンパク質の三量体／単量体比を測定する工程；および
ｅ）前記１種以上の候補化合物が、
ｅ１）シャペロンタンパク質の三量体／単量体比が候補化合物（複数可）の存在下で減少する場合、状態の治療において活性である；または
ｅ２）シャペロンタンパク質の三量体／単量体比が候補化合物（複数可）の存在下で減少しない場合、状態の治療において活性でない
ということを結論する工程
を含んでいる。
【００２２】
一つの好ましい態様において、スクリーニング方法は、状態に関連するフィブリル化タンパク質のフィブリルの形成がシャペロンタンパク質および前記１種以上の活性候補化合物の存在下で減少する（すなわち、シャペロンタンパク質の存在下、しかし候補化合物（複数可）の不存在下での状況と比較して）かどうかを測定することをさらに含んでいる。好ましい態様において、スクリーニング方法は、
ｆ）フィブリル化タンパク質およびシャペロンタンパク質を含む第２の水性混合物を準備する工程；
ｇ）工程ｅ１）において活性とみなされた前記１種以上の候補化合物を第２の混合物に添加して、シャペロンタンパク質の三量体／単量体比を減少させる工程；
ｈ）第２の混合物中でシャペロンタンパク質を前記１種以上の候補化合物およびフィブリル化タンパク質と相互作用させる工程；
ｉ）第２の混合物中のフィブリル化タンパク質のフィブリルの形成を測定する工程；ならびに
ｊ）前記１種以上の候補化合物が、
ｊ１）フィブリル化タンパク質のフィブリル形成が候補化合物（複数可）の存在下で減少する場合、状態の治療において活性である；または
ｊ２）フィブリル化タンパク質のフィブリ形成が候補化合物（複数可）の存在下で減少しない場合、状態の治療において活性でない
ということを結論する工程
を含んでいる。
【００２３】
第２の側面によれば、本発明は、哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療のための候補薬のためのインビトロターゲットとしての本発明によるシャペロンタンパク質の三量体の使用を提供する。
【００２４】
本発明はさらに、第３の側面によって、本発明によるシャペロンタンパク質の三量体／単量体比を減少させることができる、医薬品として使用するための化合物または化合物の組合せを提供する。
【００２５】
本発明はさらに、第４の側面によって、８０個以上のアミノ酸残基を含み、かつヒト由来のＢｒｉ２の残基９０〜２４３（配列番号２）、ヒト由来のＢｒｉ２のＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号３）、ヒト由来のＢｒｉ３の残基９７〜２４２（配列番号５）、ヒト由来のＢｒｉ３のＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号６）、ヒト由来のＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（配列番号８）、およびヒト由来のＣＴｐｒｏＳＰ−ＣのＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、医薬品として使用するためのタンパク質の単量体を提供する。
【００２６】
第５の側面によれば、本発明は、哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療のための医薬組成物を製造する方法であって、
ａ）
ａ１）本発明によるスクリーニング方法において活性について１種以上の候補化合物をスクリーニングすること；または
ａ２）本発明によるスクリーニング方法を用いて前のスクリーニング手順の結果を利用すること
によって活性化合物を準備する工程；および
ｂ）活性化合物を１種以上の適切な医薬成分と製剤化して、医薬組成物を与える工程
を含む方法を提供する。
【００２７】
本発明は、第６の側面によって、（ｉ）治療的有効量の本発明によるシャペロンタンパク質の単量体および／または（ｉｉ）前記シャペロンタンパク質の三量体／単量体比を減少させることができる治療的有効量の本発明による化合物もしくは化合物の組合せ；ならびにそれらのための適切な医薬担体を含む医薬組成物を提供する。
【００２８】
最後の側面によれば、本発明は、治療を必要としている、ヒトを含む哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態を治療する方法であって、治療的有効量の本発明によるシャペロンタンパク質の単量体を前記哺乳動物へ投与することおよび／またはそれに導入することを含む方法を提供する。
【００２９】
本発明の様々な側面の好ましい態様において、治療することが望ましい状態は、アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症および間質性肺疾患からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】Ｂｒｉ２（配列番号１）プロセシングの概略図を示す図。
【図２】一部の哺乳動物のＢｒｉ２−Ｂｒｉｃｈｏｓアミノ酸配列のアライメントを示す図。
【図３】ｐｒｏＳＰ−Ｃ（配列番号７）プロセシングの概略図および既知の哺乳動物のＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃアミノ酸配列のアライメントを示す図。
【図４】ＩＬＤ患者の肺組織における染色されたアミロイド沈着を示す図。
【図５Ａ】基質様ペプチドの存在下でのＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（ＣＴＣ）およびペプチドそれら自体の質量スペクトルを示す図。
【図５Ｂ】基質様ペプチドの存在下でのＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（ＣＴＣ）およびペプチドそれら自体の質量スペクトルを示す図。
【図６】一つのＣＴＣサブユニットのリボンダイヤグラム表示を示す図。
【図７】ｐｒｏＳＰ−ＣのＢｒｉｃｈｏｓ三量体におけるサブユニットの構成を示すリボンダイヤグラムを示す図。
【図８】ｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳおよびＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳのアミノ酸配列のアライメントを示す図。
【図９】単独でならびにそれぞれｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳおよびＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳと一緒に、それぞれＡβ４０およびＡβ４２のＴｈＴ蛍光強度を記録することによってモニターされた、凝集を示す図。
【図１０】異なる時点で８００ｎＭのＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳを添加することによって、時間の関数としてＴｈＴ蛍光強度を記録することによってモニターされた、８μＭのＡβ４０の凝集を示す図。
【図１１】混合直後およびインキュベーション２０時間後の、Ａβ４０とｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳとの混合物のゲルろ過を示す図。
【図１２Ａ】混合直後およびインキュベーション２０時間後の、それぞれＡβ４０またはＡβ４２と、それぞれｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳまたはＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳとの混合物のゲルろ過を示す図。収集した画分のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルをクロマトグラムの隣に示す。
【図１２Ｂ】混合直後およびインキュベーション２０時間後の、それぞれＡβ４０またはＡβ４２と、それぞれｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳまたはＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳとの混合物のゲルろ過を示す図。収集した画分のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルをクロマトグラムの隣に示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
［添付配列の一覧］
配列番号１    ヒトＢｒｉ２
配列番号２    ヒトＢｒｉ２（９０〜２４３）
配列番号３    ヒトＢｒｉ２Brichos［Ｂｒｉ２（１３７〜２３１）］
配列番号４    ヒトＢｒｉ３
配列番号５    ヒトＢｒｉ３（９７〜２４２）
配列番号６    ヒトＢｒｉ３Brichos［Ｂｒｉ３（１３６〜２３０）］
配列番号７    ヒトｐｒｏＳＰ−Ｃ
配列番号８    ヒトＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ［ＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（５９〜１９７）］
配列番号９    ヒトＣＴｐｒｏＳＰ−ＣBriochos［ＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（９０〜１９７）］
配列番号１０  ヒトＡβ1〜40ペプチド
配列番号１１  ヒトＡβ1〜42ペプチド
［発明の詳細な説明］
Ｂｒｉ２（配列番号１）（内在性膜タンパク質２Ｂ（ＩＴＭ２Ｂ）とも呼ばれる）は、残基１３７〜２３１（配列番号３）にわたる進化的に保存されたＢｒｉｃｈｏｓドメインを含む。本明細書で決定されたＣＴｐｒｏ−ＣのＢｒｉｃｈｏｓドメインによるアライメント（図８）に基づいて、Ｂｒｉ２のＢｒｉｃｈｏｓドメインは、代わりにスパニング残基（spanning residue）１３１〜２３１とみなされてもよい。
【００３２】
Ｂｒｉ２は、Ｃ−末端領域においてフーリンによってプロセスされ、２３−残基ペプチド（Ｂｒｉ２３）を生成し、メタロプロテアーゼＡＤＡＭ１０によってプロセスされ、これは、ＢｒｉのＮ−末端部分からＢｒｉｃｈｏｓ含有細胞外ドメインの放出をもたらす。Ｂｒｉｃｈｏｓドメインは、細胞外空間中に分泌される（Ｌ  Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８３：１６４４〜１６５２頁（２００８年））。したがって、フーリン／ＡＤＡＭ１０切断産物は、内因性種として予測され、本発明に関連してシャペロンタンパク質として有用である。Ｐｅｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３９３：３５６〜３６１頁（２０１０年）において、Ｂｒｉ２スパニング残基９０〜２３６の細胞外ドメインは、Ａβ−ペプチドに結合し、Ａβ−ペプチドアミロイドフィブリル形成を防止する。したがって、Ｂｒｉ２（９０〜２３６）およびＢｒｉ２（９０〜２４３）（配列番号２）のそれぞれは、本発明によるシャペロンタンパク質として有用であることが予測される。
【００３３】
内在性膜タンパク質２Ｃ（ＩＴＭ２Ｃ）とも呼ばれる、Ｂｒｉ３（配列番号４）は、進化的に保存されたＢｒｉｃｈｏｓドメインスパニング残基１３６〜２３０（配列番号６）を含む。本明細書で決定されたＢｒｉ２およびＣＴｐｒｏＳＰ−ＣのＢｒｉｃｈｏｓドメインによるアライメント（図８）ならびにＢｒｉ２とＢｒｉ３の間のごく近い配列類似性に基づいて、Ｂｒｉ３のＢｒｉｃｈｏｓドメインは、代わりにスパニング残基１３０〜２３０とみなされてもよい。シャペロン活性をもつＰｅｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３９３：３５６〜３６１頁（２０１０年）のＢｒｉ２配列によるアライメントに基づいて、Ｂｒｉ３（９０〜２４３）に対応するＢｒｉ３配列は、スパニング残基９７〜２４２（配列番号５）である。Ｂｒｉ２とＢｒｉ３の両方は、脳を含む中枢神経系で発現される。例えば、成熟Ｂｒｉ２は、メタロプロテアーゼＡＤＡＭ１０によってプロセスされ、これは、Ｎ−末端部分からＢｒｉｃｈｏｓ含有細胞外ドメインの放出をもたらす。Ｂｒｉｃｈｏｓドメインは、細胞外空間中に分泌される（Ｌ  Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８３：１６４４〜１６５２頁（２００８年））。
【００３４】
Ｂｒｉｃｈｏｓドメインは、約１００個のアミノ酸を含み、退行性および増殖性疾患に関連するいくつかのタンパク質、例えば、アミロイド形成ならびに家族性英国型およびデンマーク型認知症に関連するＢｒｉ、胃癌に関連するＣＡ１１、ならびに肺疾患に関連するｐｒｏＳＰ−Ｃに見出される（以下参照）。Ｂｒｉｃｈｏｓという名称は、Ｂｒｉ、軟骨肉腫に関連したコンドロモジュリン−１、および呼吸器疾患に関与する肺サーファクタントタンパク質Ｃ前駆体（ｐｒｏＳＰ−Ｃ）におけるドメインの同定を指す。これまで同定されたＢｒｉｃｈｏｓ含有タンパク質のすべては、ＩＩ型膜タンパク質であり、その場合、Ｂｒｉｃｈｏｓドメインは、Ｃ−末端、ＥＲ管腔領域、またはＥＲ管腔に翻訳される分泌タンパク質に位置する。
【００３５】
肺サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）は、３５個のアミノ酸残基を有する疎水性アシル化膜貫通ペプチドである。それは、１９７アミノ酸残基のプロタンパク質（１９１ａａバリアントがヒトを含む特定の種に存在する）、肺サーファクタントタンパク質Ｃ前駆体（ｐｒｏＳＰ−Ｃ；配列番号７）として合成される。ｐｒｏＳＰ−Ｃは、肺の肺胞ＩＩ型上皮細胞のみで発現され、ＥＲ管腔においてそのＣ−末端で小胞体（ＥＲ）膜タンパク質においてアンカーされる。ｐｒｏＳＰ−Ｃは、タンパク質分解的切断を受け（図３参照）、成熟ＳＰ−Ｃペプチドは、ヒトｐｒｏＳＰ−Ｃの残基２４〜５８に対応する。ＳＰ−Ｃならびに他のタンパク質および脂質成分は、肺胞中に分泌され、気／液界面における表面張力の低下に関与し、それにより、最終呼気における肺胞虚脱を防止する。図３にさらに示されるように、ｐｒｏＳＰ−Ｃのプロセシングは、Ｃ−末端断片、肺サーファクタントタンパク質Ｃ前駆体のＣ−末端ドメイン（ＣＴｐｒｏＳＰ−ＣまたはＣＴＣ；配列番号８）も生成する。成熟ＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃタンパク質は、ヒトｐｒｏＳＰ−Ｃの残基５９〜１９７に対応する。
【００３６】
ＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（配列番号８）、したがってまたｐｒｏＳＰ−Ｃも、ヒトｐｒｏＳＰ−Ｃの残基９０〜１９７に対応する、Ｂｒｉｃｈｏｓドメイン（ＣＴｐｒｏＳＰ−ＣBarichos；配列番号９）として知られるドメインを含む。Ｂｒｉｃｈｏｓドメインにおける変異は、肺疾患、ｐｒｏＳＰ−Ｃのミスフォールディング、および細胞内凝集体の形成に関連している。エクソン４の欠失を有するｐｒｏＳＰ−Ｃ（ｐｒｏＳＰ−ＣΔExon4）の発現上昇は、Ｃ−末端的に短くされたプロタンパク質を生成し、トランスジェニックマウスにおいて肺異形態発生およびトラスフェクトされた細胞においてＥＲストレスをもたらした。プロタンパク質（ｐｒｏＳＰ−ＣL188Q）の位置１８８におけるグルタミンとロイシンの交換をもたらす、Ｂｒｉｃｈｏｓドメインにおける別の変異は、優性遺伝性間質性肺疾患に関連する。肺由来Ａ５４９細胞またはヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞におけるＢｒｉｃｈｏｓ変異体ｐｒｏＳＰ−ＣΔExon4またはｐｒｏＳＰ−ＣL188Qの発現は、アポトーシスに至る不溶性凝集体の形成増加をもたらす。対照的に、Ｂｒｉｃｈｏｓドメインと膜貫通ドメイン（ＳＰ−Ｃ）の間の領域に局在する、２つの他の変異、ｐｒｏＳｐ−Ｃ173TおよびｐｒｏＳＰ−ＣE66Kは、変化した細胞内の、凝集ではないトラフィッキングに関連する。したがって、ｐｒｏＳＰ−ＣおよびＣＴｐｒｏＳＰ−ＣにおけるＢｒｉｃｈｏｓドメインは、（ｐｒｏ）ＳＰ−Ｃ凝集の防止に関与する。一態様において、ヒトｐｒｏＳＰ−Ｃにおけるロイシン−１８８に対応する位置は、グルタミンではない。さらなる態様において、ヒトｐｒｏＳＰ−Ｃにおけるロイシン−１８８に対応する位置は、厳密に保存される。明らかに、ヒトｐｒｏＳＰ−Ｃにおけるロイシン−１８８に対応する位置は、ＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（ヒトにおけるロイシン−１３０）およびＣＴｐｒｏＳＰ−ＣBrichos（ヒトにおけるロイシン−９５）において、ならびに特定の他の種において異なる数字を有する。
【００３７】
Ｂｒｉｃｈｏｓドメインを含むタンパク質は、シャペロンと同定されており、フィブリル化しやすいタンパク質の凝集およびフィブリル化を防止する。ＣＴｐｒｏＳＰ−ＣのＢｒｉｃｈｏｓドメイン（ＣＴｐｒｏＳＰ−ＣBrichos）の構造は、今や決定されている。間質性肺疾患に関連する保存された残基および変異の分布は、分子動的シミュレーションおよび水素−重水素交換質量分析法とともに、どのようにＢｒｉｃｈｏｓドメインがアミロイド形成における共通の中間体に対してシャペロン活性を仲介するかを示唆する。Ｂｒｉｃｈｏｓドメインを含むタンパク質は、生理学的条件下でオリゴマーを形成する傾向があることが知られている一方で、生理学的条件下の優勢なオリゴマー種は三量体であることが今やわかった。三量体において、それぞれのＢｒｉｃｈｏｓドメインにおける推定活性面は、埋め込まれており、その結果として不活性である。要するに、Ｂｒｉｃｈｏｓドメインを含むタンパク質中の活性オリゴマー種は、単量体であること、およびＢｒｉｃｈｏｓドメインを含むタンパク質の三量体形態を上回る単量体形態の促進は、それらのシャペロン活性を改善し、すなわち、アミロイドフィブリルを形成しやすいタンパク質、例えば、Ａβ、ＡＢｒｉ、ＡＤａｎおよびＳＰ−Ｃからの凝集体およびフィブリルの形成を減少させるまたは防止するために有用であることが今や発明的に理解された。したがって、アミロイドフィブリル形成ならびにＡβ−ペプチド、ＡＢｒｉ／ＡＤａｎペプチドおよびＳＰ−Ｃペプチドの凝集を減少させる能力を有するのは、哺乳動物のＢｒｉ２（ＩＴＭ２Ｂ）、Ｂｒｉ３、ＣＴｐｒｏＳＰ−ＣのＢｒｉｃｈｏｓドメインを含むタンパク質および構造的に類似のタンパク質のモノマーである。
【００３８】
本発明は、第１の側面によって、哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成またはアミロイドーシスに関連する状態の治療における活性について１種以上の候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。本開示および本発明の様々な側面を通して、状態は、アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症および間質性肺疾患からなる群から選択されることが一般に好ましい。特に好ましい状態はアルツハイマー病である。スクリーニング方法は、シャペロンタンパク質の三量体／単量体比が、前記１種以上の候補化合物の存在下で減少するかどうかを測定することを含む。
【００３９】
シャペロンタンパク質は、好ましくはＢｒｉｃｈｏｓドメインを含んでいる。シャペロンタンパク質は、典型的には８０個以上のアミノ酸残基を含んでいる。それは、ヒト由来のＢｒｉ２の残基９０〜２４３（配列番号２）、ヒト由来のＢｒｉ２のＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号３）、ヒト由来のＢｒｉ３の残基９７〜２４２（配列番号５）、ヒト由来のＢｒｉ３のＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号６）、ヒト由来のＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（配列番号８）、およびヒト由来のＣＴｐｒｏＳＰ−ＣのＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいる。この群には、Ｂｒｉ２、Ｂｒｉ３およびｐｒｏＳＰ−Ｃ、ならびにそれらのＢｒｉｃｈｏｓドメインからの内因性切断産物が含まれる。
【００４０】
本明細書および特許請求の範囲を通して使用される場合、「％同一性」という用語は、以下のとおりに計算される。クエリー配列を、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＧｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２：４６７３〜４６８０頁（１９９４年））を用いてターゲット配列に対して整列させる。整列した配列の最短に対応するウィンドウにわたって、比較を行う。それぞれの位置におけるアミノ酸残基を比較し、ターゲット配列において同一の対応を有するクエリー配列における場所のパーセンテージが、％同一性として報告される。
【００４１】
本明細書および特許請求の範囲を通して使用される場合、「％類似性」という用語は、疎水性残基Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、ＩＩｅ、Ｔｒｐ、ＭｅｔおよびＣｙｓが類似しており；塩基性残基Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓが類似しており；酸性残基ＧｌｕおよびＡｓｐが類似しており；親水性の無電荷残基Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒが類似していることを除いて、「％同一性」について記載されたとおりに計算される。残りの天然のアミノ酸Ｇｌｙは、この文脈においていずれの他のアミノ酸とも類似しない。
【００４２】
本説明を通して、本発明による代替の態様は、同一性の特定のパーセンテージの代わりに、対応する類似性のパーセンテージを満たす。他の代替の態様は、同一性の特定のパーセンテージ、およびそれぞれの配列について同一性の好ましいパーセンテージの群から選択される、別のより高い類似性のパーセンテージを満たす。例えば、単離されたタンパク質配列は、別のタンパク質配列に対して７０％類似であってもよく；またはそれは、別の配列に対して７０％同一であってもよく；またはそれは、別の配列に対して７０％同一およびさらに９０％類似であってもよい。
【００４３】
疑いを避けるために、シャペロンタンパク質のＢｒｉｃｈｏｓドメインに対して少なくとも所与の同一性を有するアミノ酸配列は、７０を超えるかそれに等しい、例えば、８０を超えるかそれに等しい、例えば、９０を超えるかまたはそれに等しいアミノ酸残基からなる。好ましい大きさの範囲は、７０〜１００アミノ酸残基、例えば、８０〜１００アミノ酸残基、例として、９０〜１００アミノ酸残基である。
【００４４】
ヒト、チンパンジー、ウシ、ブタ、マウスおよびラット由来のＢｒｉ２のＢｒｉｃｈｏｓドメインは、高度に保存されていることが留意され、図２におけるアライメントを参照されたい。いずれの特定の理論にも拘束されることも望まないが、Ｂｒｉｃｈｏｓドメインは、フィブリルが起きやすいペプチドに関して所望の活性を持っていると考えられる。本発明によるシャペロンタンパク質は、ヒト由来のＢｒｉ２（配列番号３）、ヒト由来のＢｒｉ３（配列番号６）およびヒト由来のｐｒｏＳＰ−Ｃ／ＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（配列番号９）のＢｒｉｃｈｏｓドメインのいずれか１つに対して少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質からなる群から選択されることが好ましい。好ましい態様において、本発明によるシャペロンタンパク質は、図２中のヒト、チンパンジー、ウシ、ブタ、マウスおよびラット由来のＢｒｉ２のＢｒｉｃｈｏｓドメインに保存されているアミノ酸残基のすべてを含む。特定の態様において、本発明によるシャペロンタンパク質は、ヒト由来のＢｒｉ２（配列番号３）、ヒト由来のＢｒｉ３（配列番号６）およびヒト由来のｐｒｏＳＰ−Ｃ／ＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（配列番号９）のＢｒｉｃｈｏｓドメインのいずれか１つを含むタンパク質からなる群から選択される。
【００４５】
アルツハイマー病、家族性英国型認知症または家族性デンマーク型認知症に対して活性な化合物を同定するために、本発明によるシャペロンタンパク質は、ヒト由来のＢｒｉ２の残基９０〜２４３（配列番号２）、ヒト由来のＢｒｉ２のＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号３）、ヒト由来のＢｒｉ３の残基９７〜２４２（配列番号５）、およびヒト由来のＢｒｉ３のＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号６）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％またはさらには１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいることが好ましい。
【００４６】
間質性肺疾患に対して活性な化合物を同定するために、本発明によるシャペロンタンパク質は、ヒト由来のＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（配列番号８）、およびヒト由来のＣＴｐｒｏＳＰ−ＣのＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％またはさらには１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいることが好ましい。
【００４７】
従来の教示とは対照的に、本発明による単離タンパク質は、ヒト由来のＢｒｉ２の残基１〜８９またはＢｒｉ３の残基１〜９６に対する少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含まない。ある種の態様において、本発明による単離タンパク質は、ヒト由来のＢｒｉ２の残基１〜８９またはＢｒｉ３の残基１〜９６に対して少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含まない。これは、本発明による単離タンパク質が、ヒト由来のＢｒｉ２の残基９０〜２４３もしくはＢｒｉ３の残基９７〜２４２および／またはヒト由来のＢｒｉ２もしくはＢｒｉ３のＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号２〜３、５〜６）に対して高い類似性または同一性を示すコアアミノ酸配列ならびに場合によって１種以上の他のアミノ酸配列（この他のアミノ酸配列は、ヒト由来のＢｒｉ２またはＢｒｉ３の残基１〜８９に対して高い類似性または同一性を示さなくてもよい）を含むことを意味する。
【００４８】
疑いを避けるために、１０アミノ酸残基より短いアミノ酸配列は、本発明による単離タンパク質から排除されるので、関連性がないと考えられる。したがって、本発明による単離タンパク質は、ヒト由来のＢｒｉ２またはＢｒｉ３の残基１〜８９に対して少なくとも所与の同一性を有する１０を超えるまたはそれに等しいアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含まない。
【００４９】
さらに、本発明による単離タンパク質は、ヒト由来のＢｒｉ２の残基２４４〜２６６、すなわち、ヒトＢｒｉ２３に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含まない。ある種の態様において、本発明による単離タンパク質は、ヒトＢｒｉ２３に対して少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含まない。上に示されたように、これは、本発明による単離タンパク質が、ヒト由来のＢｒｉ２の残基９０〜２４３もしくはＢｒｉ３の残基９７〜２４２および／またはＢｒｉ２もしくはＢｒｉ３のＢｒｉｃｈｏｓドメインに対して高い類似性または同一性を示すコアアミノ酸配列ならびに場合によって１種以上の他のアミノ酸配列（この他のアミノ酸配列は、ヒトＢｒｉ２３に対して高い類似性または同一性を示さなくてもよい）を含むことを意味する。
【００５０】
疑いを避けるために、１０アミノ酸残基より短いアミノ酸配列は、本発明による単離タンパク質から排除されるので、関連性がないと考えられる。したがって、本発明による単離タンパク質は、ヒトＢｒｉ２３に対して少なくとも所与の同一性を有する１０を超えるまたはそれに等しいアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含まない。
【００５１】
上に示されたとおりにＢｒｉ２、Ｂｒｉ３またはＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃターゲット配列との１つ以上の同一性を有するコアアミノ酸配列を含むタンパク質は、コアアミノ酸配列のシャペロン機能、すなわち、フィブリルが起きやすいタンパク質との相互作用に干渉しない追加のアミノ酸配列をさらに含んでもよい。追加のアミノ酸配列は、コアアミノ酸配列のＮ−末端に、コアアミノ酸配列のＣ−末端に、または両方に連結されていてもよい。それは、アミノ酸側鎖を介して、例えば、ジスルフィド結合を介して連結されていてもよい。追加のアミノ酸配列は、本質的に非機能性であっても、得られるタンパク質に追加の機能性、例えば、溶解性、安定性または所望の親和性を与えてもよい。コアアミノ酸配列および任意の追加のアミノ酸配列の両方は、翻訳後化学修飾を含めて、化学修飾されていてもよい。
【００５２】
一態様において、本発明によるシャペロンタンパク質は、上に示された同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質の群から選択される。すなわち、シャペロンタンパク質は、上に示されたとおりのＢｒｉ２、Ｂｒｉ３またはＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃターゲット配列と１つ以上の同一性を有する所望のコアアミノ酸配列からなる。コアアミノ酸配列は、翻訳後化学修飾を含めて、化学修飾されていてもよい。
【００５３】
ある種の態様において、本発明によるシャペロンタンパク質は、５００未満もしくはそれに等しい、例えば、２５０未満もしくはそれに等しい、例えば、２００未満もしくはそれに等しい、例えば、１５０未満もしくはそれに等しい、またはさらには１００アミノ酸残基からなる。ある種の態様において、本発明によるシャペロンタンパク質は、８０を超えるもしくはそれに等しい、例えば、９０を超えるもしくはそれに等しい、例えば、１００を超えるもしくはそれに等しいアミノ酸残基からなる。好ましい大きさの範囲は、８０〜２００アミノ酸残基、例えば、９０〜１５０アミノ酸残基、例として、９０〜１００、１００〜１１０、９０〜１１０、１００〜１２０、１１０〜１２０または９０〜１２０アミノ酸残基である。
【００５４】
好ましいスクリーニング方法において、本発明によるシャペロンタンパク質の既知の三量体／単量体比を含む水性混合物が準備される。三量体／単量体比は、それぞれのスクリーニング実験の直前に測定されるか、または任意のスクリーニング実験前の所定の条件に対して一度だけ特徴付けられるかのいずれかである。三量体／単量体比を測定するための適切な方法としては、サイズ排除クロマトグラフィー、質量分析法、および超遠心分離が挙げられる。この混合物に、１種以上の候補化合物が添加される。当業者はよく知っているように、シャペロンタンパク質および／または候補化合物（複数可）の濃度は変化させてもよい。候補化合物（複数可）は、混合物中でシャペロンタンパク質と相互作用させる。これは、典型的には適切な条件下、例えば、室温または約３７℃である時間、例えば、１秒間から１０時間、例えば、１〜６０分間成分を相互作用させることを意味する。次いで、混合物中のシャペロンタンパク質の三量体／単量体比が測定され、シャペロンタンパク質の初期の三量体／単量体比と比較される。三量体／単量体比を測定するための適切な方法としては、サイズ排除クロマトグラフィー、質量分析法、および超遠心分離が挙げられる。次いで、１種以上の候補化合物は、シャペロンタンパク質の三量体／ 単量体比が減少した場合、状態の治療において活性であるということが結論される。あるいは、１種以上の候補化合物は、シャペロンタンパク質の三量体／単量体比が減少しなかった場合は、状態の治療において活性でないということが結論される。シャペロンタンパク質の三量体／単量体比の減少が、生じたか否かの測定は、未処理対照、すなわち、いずれの化合物によっても処理されていないか、または候補化合物（複数可）でない化合物で処理されているシャペロンタンパク質と比較した比較を意味する。未処理対照は、同じ実験の組で行われてもよいし、以前の実験、他からの報告書などから集められた、前に測定された基準値であってもよい。
【００５５】
好ましいスクリーニング方法において、シャペロンタンパク質の三量体／単量体比の減少において活性とみなされた化合物は、状態に関連するフィブリル化（またはフィブリルが起きやすい）タンパク質のフィブリルの形成が、シャペロンタンパク質および１種以上の活性候補化合物の存在下で減少するかどうかを測定することを含む、さらなる試験にかけられる。フィブリル化タンパク質のフィブリル形成の減少が生じたか否かの測定は、未処理対照、すなわち、任意のさらなる化合物で処理されていないか、または候補化合物（複数可）でない化合物で処理されているシャペロンタンパク質の存在下でのフィブリル化タンパク質と比較した比較を意味する。未処理対照は、同じ実験の組で行われてもよいし、以前の実験、他からの報告などから集められた、前に測定された基準値であってもよい。
【００５６】
一つの好ましいスクリーニング方法において、フィブリル化タンパク質およびシャペロンタンパク質を含む第２の水性混合物が準備される。当業者はよく知っているように、フィブリル化タンパク質および／またはシャペロンタンパク質の濃度は、変化させてもよい。シャペロンタンパク質の三量体／単量体比の減少において活性と既にみなされた１種以上の候補化合物は、シャペロンタンパク質の三量体／単量体比を減少させるために第２の混合物に添加される。当業者はよく知っているように、候補化合物（複数可）の濃度は変化させてもよい。シャペロンタンパク質は、第２の混合物中で１種以上の候補化合物およびフィブリル化タンパク質と相互作用させる。これは、典型的には適切な条件下、例えば、室温または約３７℃である時間、例えば、１秒間から１０時間、例えば、１〜６０分間成分を相互作用させることを意味する。次いで、第２の混合物中のフィブリル化タンパク質のフィブリルの形成が測定される。フィブリル化度を測定するための適切な方法としては、顕微鏡および／または色素（例えば、コンゴーレッド）、もしくは蛍光化合物（例えば、チフロアビンＴ（ＴｈＴ）による染色が挙げられる。フィブリル化度を測定するための適切な実験は、凝集反応速度論的実験であり、ここで、凝集は、時間経過とともに追跡調査され得る。次いで、１種以上の候補化合物は、フィブリル化タンパク質のフィブリル形成が候補化合物（複数可）の存在下で減少した場合、状態の治療において活性であるということが結論される。あるいは、１種以上の候補化合物は、フィブリル化タンパク質のフィブリル形成が候補化合物（複数可）の存在下で減少しなかった場合、状態の治療において活性でないということが結論される。したがって、フィブリル化減少の測定は、未処理対照との比較、すなわち、シャペロンタンパク質の存在下、しかし候補化合物（複数可）の不存在下でのフィブリル化タンパク質によるフィブリル化度を含む。さらに、フィブリル化減少は、フィブリル化の防止、既に形成されたフィブリルの溶解、開始フィブリル形成の遅延および／またはフィブリル形成の進行の遅延を含み得る。
【００５７】
好ましいスクリーニング方法において、フィブリル化タンパク質は、Ａβ−ペプチド、ＡＤａｎ、ＡＢｒｉおよびＳＰ−Ｃからなる群から選択される。フィブリル化タンパク質は、Ａβ−ペプチドであることが好ましい。
【００５８】
本発明は、第２の側面によって、哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療のための候補薬のためのインビトロターゲットとしての本発明によるシャペロンタンパク質の三量体の新規な使用を提供する。本明細書で上に詳述されたように、適切な候補薬は、本発明によるシャペロンタンパク質の三量体／単量体比を減少させる能力を有する。好ましい態様において、候補薬は、シャペロンタンパク質の三量体／単量体比を減少させる際の活性についてスクリーニングされる。
【００５９】
本発明は、第３の側面によって、医薬品として有用である、化合物または化合物の組合せを提供する。化合物または組合せは、本発明によるスクリーニング方法により容易に検証され得るように、シャペロンタンパク質の三量体／単量体比を減少させることができる。好ましい態様において、化合物（複数可）は、抗体および核酸アプタマーからなる群から選択される。当業者は、シャペロンタンパク質の三量体に向けられた、核酸アプタマーのみならず、抗体を調製する方法についてよく知っている。別の好ましい態様において、化合物は、ビス−ＡＮＳ（１，１’−ビス（４−アニリノ−５，５’−ナフタレンスルホネート））である。好ましい態様において、化合物または化合物の組合せは、哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療に有用であり、好ましくは状態は、アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症および間質性肺疾患からなる群から選択される。特に好ましい状態は、アルツハイマー病である。
【００６０】
本発明は、第４の側面によって、８０個以上のアミノ酸残基を含む、本発明によるシャペロンタンパク質の単量体を提供する。シャペロンタンパク質の単量体は、単独でまたは他の物質と組み合わせて、医薬品として有用である。シャペロンタンパク質は、ヒト由来のＢｒｉ２の残基９０〜２４３（配列番号２）、ヒト由来のＢｒｉ２のＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号３）、ヒト由来のＢｒｉ３の残基９７〜２４２（配列番号５）、ヒト由来のＢｒｉ３のＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号６）、ヒト由来のＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（配列番号８）、およびヒト由来のＣＴｐｒｏＳＰ−ＣのＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号９）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいる。好ましい態様において、シャペロンタンパク質の単量体は、哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療に有用であり、好ましくは、状態は、アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症および間質性肺疾患からなる群から選択される。特に好ましい状態は、アルツハイマー病である。
【００６１】
一つの好ましい態様において、このタンパク質のアミノ酸配列は、ヒト由来のＢｒｉ２の残基９０〜２４３（配列番号２）、およびヒト由来のＢｒｉ２のＢｒｉｃｈｏｓドメイン（配列番号３）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する（但し、前記タンパク質は、ヒト由来のＢｒｉの残基１〜８９に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでおらず；かつ前記タンパク質は、ヒトＢｒｉ２３、すなわち、ヒト由来のＢｒｉ２の残基２４４〜２６６に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいない）。
【００６２】
シャペロンタンパク質は、９０を超えるアミノ酸残基および／または２００未満もしくはそれに等しいアミノ酸残基、例えば、１５０未満もしくはそれに等しいアミノ酸残基からなっていることが好ましい。
【００６３】
好ましい態様において、このタンパク質は、Ｂｒｉ２、Ｂｒｉ３およびｐｒｏＳＰ−Ｃからの内因性切断産物に対応する、ヒト由来のＢｒｉ２の残基９０〜２４３（配列番号２）、ヒト由来のＢｒｉ３の残基９７〜２４２（配列番号５）、およびヒト由来のＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（配列番号８）からなる群から選択される。
【００６４】
一つの好ましい態様において、このタンパク質は、ヒト由来のＢｒｉ２（配列番号３）、Ｂｒｉ３（配列番号６）およびＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（配列番号９）のＢｒｉｃｈｏｓドメインからなる群から選択される。
【００６５】
本発明は、第５の側面によって、哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療のための医薬組成物を製造する方法を提供する。この方法は、活性化合物を準備する工程を含んでいる。これは、本発明によるスクリーニング方法を用いて活性について１種以上の候補化合物をスクリーニングすることによって達成され得る。あるいは、化合物は、本発明によるスクリーニング方法を用いて活性について１種以上の候補化合物を前にスクリーニングした際に既に同定されている。どのようなスクリーニング工程が含まれている／含まれていたかにかかわらず、活性化合物は、本発明によるシャペロンタンパク質の三量体／単量体比を減少させる能力を有する。これは、例えば、単量体形態を安定化させること、三量体形態を破壊すること、またはこれら２つの組合せによって達成され得る。次の工程において、活性化合物は、さらなる活性化合物を場合によって含む、１種以上の適切な医薬成分と製剤化されて、医薬組成物を提供する。特に、この組成物は、本発明によるシャペロンタンパク質も含み得る。あるいは、活性化合物は、関連組織に既に存在しているもの、例えば、ヒト脳組織におけるＢｒｉ２の残基９０〜２４３（配列番号２）もしくはＢｒｉ３の残基９７〜２４２（配列番号５）またはヒト肺組織におけるＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（配列番号８）と類似している本発明によるシャペロンタンパク質の単量体または三量体に向けられてもよい。
【００６６】
本発明は、第６の側面によって、（ｉ）治療的有効量の本発明によるシャペロンタンパク質の単量体および／または（ｉｉ）シャペロンタンパク質の三量体／単量体比を減少させることができる治療的有効量の化合物もしくは化合物の組合せ、ならびにそれらのための適切な医薬担体を含む医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、好ましくは哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療において、医薬品として有用である。好ましい態様において、医薬組成物は、アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症および間質性肺疾患からなる群から選択される状態の治療に有用である。特に好ましい状態は、アルツハイマー病である。
【００６７】
本発明はまた、哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態の治療に使用するための、（ｉ）本発明によるシャペロンタンパク質の単量体、および／または（ｉｉ）シャペロンタンパク質の三量体／単量体比を減少させることができる、本発明による化合物もしくは化合物の組合せの新規な使用を提供する。
【００６８】
本発明によるシャペロンタンパク質および化合物は、医薬組成物中に取り入れることができる。このような組成物は、典型的には、本発明によるシャペロンタンパク質および化合物ならびに適切な薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「適切な薬学的担体」には、医薬投与と適合する、溶媒、分散媒、コーティング剤、等張剤および吸収遅延剤が含まれる。補助的活性化合物も組成物中に取り入れることができる。
【００６９】
医薬組成物は、その意図される投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）、経口、鼻腔内（例えば、吸入）、経皮、経粘膜、髄腔内、脳室内（例えば、その脳槽空間中に外科的に置かれているインラインフィルター付きＯｍａｙａ貯留槽シャントを用いる）、および直腸投与が含まれる。
【００７０】
組成物のための潜在的に有用な非経口送達系には、ゆっくり溶解するポリマー粒子、埋め込み型輸液系、およびリポソームが含まれる。非経口用途に用いられる溶液剤または懸濁液剤には、以下の成分：滅菌希釈液（注射用水など）、生食液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤（ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど）；酸化防止剤（アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸など）；緩衝剤（酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩など）および浸透圧の調整剤（塩化ナトリウムまたはデキストロースなど）が含まれる。ｐＨは、酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムによって調製され得る。非経口製剤は、ガラスもしくはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、または複数回投与用バイアルに封入することができる。
【００７１】
アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症および間質性肺疾患の状態の治療は、関連組織、すなわち、中枢神経系、優先的には脳、または肺組織への本発明によるシャペロンタンパク質および化合物の直接送達によって行うこともできる。
【００７２】
注射可能な使用に適した医薬組成物には、滅菌水性溶液剤（水溶性の場合）または分散液剤、および滅菌注射剤または分散液剤の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与では、好適な担体には、生理学的食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合に、組成物は、滅菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流動的でなければならない。それは、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌および菌類などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、本発明による単離タンパク質の粒子へのコーティング（例えば、レシチン）を用いて、分散の場合には必要な粒径の維持によっておよび界面活性剤を用いて維持され得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤を含むことが好ましい。このような作用剤の例には、糖、多価アルコール（マンニトールおよびソルビトールなど）、および塩化ナトリウムが含まれる。注射可能組成物の遷延性吸収は、組成物中に吸収を遅延させる作用剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを含ませることによって生じさせ得る。
【００７３】
滅菌注射剤は、本発明によるシャペロンタンパク質および／または化合物を、必要に応じて上に列挙された成分の１つまたは組合せとともに適当な溶媒中必要量で取り入れ、続いてろ過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液剤は、本発明によるシャペロンタンパク質および／または化合物を、塩基性分散媒および上に列挙したものから必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中に取り入れることによって調製される。滅菌注射剤の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これらは、本発明によるシャペロンタンパク質および／または化合物に加えてその前もって滅菌ろ過された溶液からの追加の所望の成分からなる散剤を生成させる。
【００７４】
経口組成物は一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口治療投与のために、本発明によるシャペロンタンパク質および／または化合物は、賦形剤と一緒に取り込むことができ、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤、例えば、ゼラチンカプセル剤の形態で用いることができる。
【００７５】
薬学的に適合できる結合剤、および／または補助材料は、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分のいずれか、または類似の性質の化合物、すなわち、結合剤（微結晶セルロース、ガムトラガカントまたはゼラチンなど）；賦形剤（デンプンまたはラクトースなど）；崩壊剤（アルギニン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはトウモロコシデンプンなど）；滑沢剤（ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓなど）；流動促進剤（コロイド状二酸化ケイ素など）；甘味剤（スクロースまたはサッカリンなど）；または芳香剤（ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料など）を含み得る。
【００７６】
例えば、間質性肺疾患の治療のための吸入による投与では、シャペロンタンパク質および／または化合物は、適当な噴射剤、例えば、二酸化炭素などを含む加圧容器もしくは分配器、または噴霧器からエアロゾルスプレー方式で送達される。
【００７７】
全身投与も、経粘膜または経皮手段によることができる。経粘膜または経皮投与では、浸透されるべきバリアに対して適切な浸透剤が製剤中に用いられる。このような浸透剤は一般に当技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与では、界面活性剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐薬を用いることによって行うことができる。経皮投与では、本発明によるシャペロンタンパク質および／または化合物は、当技術分野で一般に知られているように、軟膏剤、膏薬、ゲル剤、またはクリーム剤に製剤化される。
【００７８】
本発明によるシャペロンタンパク質および／または化合物はまた、直腸送達のために坐薬（例えば、従来の坐薬基材、例えば、ココアバターおよび他のグリセリドとともに）または保持浣腸の形態で調製され得る。
【００７９】
一態様において、本発明によるシャペロンタンパク質および／または化合物は、身体からの急速な除去に対してシャペロンタンパク質および／または化合物を保護する担体、例えば、移植片およびマイクロカプセル化送達システムを含む、放出制御製剤とともに調製される。生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、およびポリ乳酸を用いることができる。このような製剤を調製する方法は、当業者に明らかであろう。リポソーム懸濁液（アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症および間質性肺疾患に特異的に侵される組織を、モノクローナル抗体によってターゲットとするリポソームを含む）も、薬学的に許容される担体として使用され得る。これらは、当業者に公知の方法によって調製され得る。
【００８０】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、経口または非経口組成物を投与単位形態として製剤化することが有利である。本明細書で使用される場合の投与単位形態は、治療される対象にとって単位投与量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な薬学的担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された、所定量の本発明による単離タンパク質を含む。
【００８１】
本発明によるシャペロンタンパク質および／または化合物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ50（集団の５０％に対して致命的な用量）およびＥＤ50（集団の５０％で治療的に有効な用量）を測定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって測定され得る。好適な動物モデル、例えば、Ｓｔｕｒｃｈｌｅｒ−Ｐｉｅｒｒａｔら、Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１０：１５〜２４頁、１９９９年；Ｓｅａｂｒｏｏｋら、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３８：１〜１７頁、１９９９年；ＤｅＡｒｍｏｎｄら、Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ５：７７〜８９頁、１９９５年；Ｔｅｌｌｉｎｇ、Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ２６：２０９〜２２０頁、２０００年；およびＰｒｉｃｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１０７９〜１０８３頁、１９９８年においてアミロイドーシスについて記載されたものを使用することができる。
【００８２】
毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ50／ＥＤ50比として表され得る。高い治療指数を示すシャペロンタンパク質および／または化合物が好ましい。毒性副作用を示すシャペロンタンパク質および／または化合物が使用され得るが、侵されていない細胞への潜在的な損傷を最小にし、それによって副作用を減少させるために、侵された組織の部位にこのようなタンパク質／化合物をターゲット化する送達系を設計するように注意が払われるべきである。
【００８３】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒトにおける使用のための一連の投与量を製剤化するのに使用され得る。シャペロンタンパク質および／または化合物の投与量は好ましくは、ほとんどまたはまったく毒性を持たずに、ＥＤ50を含む循環濃度の範囲内にある。
【００８４】
投与量は、用いられる剤形および用いられる投与経路に依存してこの範囲内で変わり得る。本発明の方法で使用されるいずれのシャペロンタンパク質および化合物についても、治療有効用量は、例えば、フィブリル形成率または細胞死率が観察される細胞培養アッセイから最初に見積もられ得る。用量は、細胞培養において測定したＩＣ50（すなわち、症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環性血漿濃度範囲を得るように動物モデルで製剤化され得る。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に測定するために使用され得る。血漿中の濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【００８５】
本明細書で定義される場合、本発明によるシャペロンタンパク質の治療的有効量（すなわち、有効投与量）は、約０．１から１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約１から１００ｍｇ／ｋｇ体重、さらにより好ましくは約１から５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。化合物は、対象に長期間にわたって、例えば、対象の生存期間にわたって投与され得る。１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの投与量が通常適切であり、例えば、脳で作用するように指定される抗体の場合などである。
【００８６】
一部の場合では、シャペロンタンパク質および／または化合物は、約１から１０週間、好ましくは２から８週間、より好ましくは約３から７週間、さらにより好ましくは約４、５または６週間の間、１週間毎に１回投与され得る。シャペロンタンパク質および／または化合物はまた、慢性的に投与され得る。疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の一般的健康状態および／または年齢ならびに他の疾患の存在を含む（限定するものではない）特定の因子が、対象を有効に治療するために必要とされる投与量および時期に影響を与え得ることは、当業者にはわかる。さらに、治療的有効量のシャペロンタンパク質および／または化合物による対象の治療は、単回治療を含み得る、または好ましくは一連の治療を含み得る。
【００８７】
ヒトＡＰＰを発現するマウスまたはヒトへの投与のための本発明によるシャペロンタンパク質は、いくつかの仕方で調製され得る。タンパク質が血管脳関門（ＢＢＢ）を通過する可能性を増加させるために、いくつかの方法が想定される。
【００８８】
いくつかの主たる戦略は、ＢＢＢを経る薬物通過について明らかになってきている。それらは、受容体媒介性トランスサイトーシスによって、または例えば、グルコース、アミノ酸もしくはペプチドに対する特異的受容体を用いて内因性輸送系を使用する。ペプチドは、ＢＢＢを越えて多様な積荷を運ぶためのベクターとして特に魅力的である。多くの異なるペプチドは、エンドサイトーシスを引き起こすこと（典型的にはＬＤＬ−受容体によって）、およびＢＢＢを越えて積荷を送達することができることが示された。これらのペプチドのいくつかは、両媒性の正に荷電した細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ、例えば、ペネトラチン、ＡｐｏＥ誘導ペプチドなど）であるが、これらはまた、高用量で高毒性であり得る。ＳｙｎＢファミリーのような他のものも、正に荷電しているが、疎水性部分はもたない。エンドサイトーシストリガー性ペプチドの多くについての欠点は、それらが、効率的であるために、安定なα−ヘリックスを形成するために比較的大きいことを必要とし、これは、効率的な取り込みと相関するように思われることである。トランスサイトーシスによる送達の利点は、積荷が、極めて実質的かつ極めて可変であることである。飽和輸送系によってＢＢＢを越えることが示されている特異的内因性ペプチドが、薬物送達のためのベクターとして作用する経路も、実行可能な代替案である。ＭＩＦ−１（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、オキシトシンに由来）およびペプチドＴ（８残基、ＨＩＶエンベロープに由来）のような、いくつかのこの種の比較的短いペプチドは、ＢＢＢを越えて効率的に輸送されることが示されている。ＢＢＢを越える送達のための方法の説明については、ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ＡＧおよびＧａｉｌｌａｒｄ  ＰＪ、Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．４６：５５３〜７６頁、２００７年；ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ＡＧおよびＧａｉｌｌａｒｄ  ＰＪ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．４７：３２３〜５５頁、２００７年；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  ＷＭ、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ．１２：５４〜６１頁、２００７年を参照されたい。現行の場合において、前記ペプチドまたはタンパク質は、シャペロンタンパク質と混合され得るか、または代替としてそれらは、シャペロンタンパク質に共有結合されて発現され得ることが想定される。
【００８９】
他の製剤では、シャペロンタンパク質は、ＢＢＢを越える送達のためにナノ粒子に連結され得る（Ｌｏｃｋｍａｎ  ＰＲら、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｉｎｄ  Ｐｈａｒｍ．２８：１〜１３頁、２００２年；Ｔｏｓｉ  Ｇら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．５：１５５〜７４頁、２００８年）。
【００９０】
脂質付加などの修飾も、タンパク質を安定化し、取り込みおよび組織浸透（例えば、脳の中へ）を高めるために用いることができる。抗体の脂質付加の方法は、Ｃｒｕｉｋｓｈａｎｋら、Ｊ  Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ  １４：１９３頁、１９９７年に記載されている。
【００９１】
本発明によるシャペロンタンパク質および／または化合物が、アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症または間質性肺疾患を治療するために動物（例えば、ヒト）に投与される場合、医師、獣医師、または研究者は、例えば、最初に比較的低い用量を処方し、その後に適当な応答が得られるまで用量を増加させる。さらに、任意の特定の動物対象のための特定の用量レベルは、用いられる特定のシャペロンタンパク質および／または化合物の活性、対象の年齢、体重、一般的健康状態、性別、および食事、投与時間、投与経路、排泄率、任意の薬物組合せ、ならびに調節されるべき発現または活性の程度を含む様々な因子に依存することが理解される。
【００９２】
本発明の医薬組成物は、投与のための説明書とともに、容器、パック、またはディスペンサー内に含めることができる。例えば、説明書は、アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症または間質性肺疾患を有するまたはこれらの危険がある個体を治療する組成物の使用法を含むことができる。
【００９３】
最後の側面によれば、本発明は、治療を必要としている、ヒトを含む哺乳動物におけるアミロイドタンパク質フィブリルの形成に関連する状態を治療する方法を提供する。この方法は、治療的有効量の本発明によるシャペロンタンパク質の単量体を前記哺乳動物へ投与することおよび／またはそれに導入することを含んでいる。本明細書で上に示されたように、これは、治療的有効量の本発明によるシャペロンタンパク質の単量体を投与することによって達成されてもよい。あるいは、それは、シャペロンタンパク質の三量体／単量体比を減少させることができる、治療的有効量の本発明による化合物または化合物の組合せを投与することによって達成されてもよい。それはまた、治療的有効量の本発明によるシャペロンタンパク質および治療的有効量の本発明による化合物または化合物の組合せを共投与することによって達成されてもよく、化合物（複数可）は、シャペロンタンパク質の三量体／単量体比を減少させることができる。
【００９４】
これらの活性シャペロンタンパク質およびシャペロンタンパク質の三量体／単量体比を減少させることができる化合物（複数可）は、本発明による医薬組成物の形態で送達され得る。
【００９５】
好ましい態様において、医薬組成物は、アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症および間質性肺疾患からなる群から選択される状態の治療に有用である。特に好ましい状態は、アルツハイマー病である。
【００９６】
一つの好ましい態様において、治療は、予防的、緩和的および治癒的治療からなる群から選択される。
【００９７】
本発明は、アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症または間質性肺疾患の危険がある（またはこれらに影響を受けている）対象を治療する予防および治療方法の両方を提供する。本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、本発明によるシャペロンタンパク質および／または化合物の患者への適用もしくは投与、あるいはアルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症もしくは間質性肺疾患、疾患の症状または疾患にかかりやすい素因を有する患者由来の単離組織または細胞系への本発明によるシャペロンタンパク質および／または化合物の適用または投与と定義され、その疾患、疾患の症状または疾患にかかりやすい素因を治療し（ｃｕｒｅ）、治癒し（ｈｅａｌ）、緩和し（ａｌｌｅｖｉａｔｅ）、軽減し（ｒｅｌｉｅｖｅ）、変化させ（ａｌｔｅｒ）、治療し（ｒｅｍｅｄｙ）、改善し（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）、改善し（ｉｍｐｒｏｖｅ）、またはそれらに影響を与える（ａｆｆｅｃｔ）目的を有する。
【００９８】
一側面において、本発明は、ポリペプチドの凝集を減少させる本発明によるシャペロンタンパク質および／または化合物を対象に投与することによって、Ａβペプチドおよび／もしくはＡＢｒｉ／ＡＤａｎペプチドならびに／またはＳＰ−Ｃによって生じるフィブリル形成に関連する疾患または状態を予防する（すなわち、疾患もしくは状態にかかるリスクを低下させる、またはそれに関連している症状が現れる率を低下させる）方法を提供する。アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症または間質性肺疾患の危険がある対象は、例えば、当技術分野で公知の適当な診断または予後アッセイのいずれかまたは組合せによって同定され得る。予防薬の投与は、疾患が予防される、または代替として、その進行を遅延させるように、疾患の特徴を示す症状の顕在化の前に行われ得る。
【００９９】
本発明によるシャペロンタンパク質および／または化合物は、アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症、家族性英国型認知症または間質性肺疾患に関連するフィブリル形成を含む障害を予防、治療または改善するために、治療有効用量で患者に投与され得る。治療有効用量は、障害の症状の改善をもたらすのに十分な化合物のその量を指す。このような化合物の毒性および治療効力は、上記のとおりの標準的な薬学的手順により測定され得る。
【０１００】
本発明によるシャペロンタンパク質は、遺伝子治療によって、例えば、神経系、好ましくは脳における細胞を、タンパク質が中枢神経系におけるこれらの細胞により発現されるように、トランスフェクトするために発現ベクター、プラスミドまたはウイルスを用いることによって投与され得ることも企図される。これは、アルツハイマー病、家族性デンマーク型認知症または家族性英国型認知症の治療に有用である。対応する発現は、間質性肺疾患の場合に肺組織で達成され得る。
【０１０１】
本発明は、これから以下の非限定的な例によってさらに例証される。
【０１０２】
例および図面において、ｐｒｏＳＰ−ＣのＣ−末端部分は、ＣＴｐｒｏＳＰ−ＣまたはＣＴＣ（配列番号８）のいずれかと同義に呼ばれる。
【実施例】
【０１０３】
例１
アミロイド疾患におけるｐｒｏＳＰ−Ｃ変異を有するＩＬＤ
分子シャペロンは、アミロイドーシスを含む、タンパク質ミスフォールディング疾患の強力なモジュレータと思われてきたが、不適切なシャペロン機能が疾患をもたらす例は、記載されていない。組換えＣＴＣ（ＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ）は、ｐｒｏＳＰ−ＣのＴＭ領域に由来するペプチドに結合し、それにより、β−シート凝集およびフィブリル形成を防止する。ｐｒｏＳＰ−Ｃ遺伝子（ＳＦＴＰＣ）中の５０を超える異なる変異が、間質性肺疾患（ＩＬＤ）に罹っている患者で見出されてきた。興味深いことに、これらのうちの５つだけが、成熟ＴＭ  ＳＰ−Ｃヘリックスで見出される一方で、大部分は、リンカーおよびＢＲＩＣＨＯＳドメインに位置している。リンカー領域の最初の半分は、進化を通して高度に保存されているが、その機能は知られていない。
【０１０４】
ＳＦＴＰＣの変異による末期ＩＬＤの小児の肺移植（ｎ＝６）または剖検（ｎ＝１）で得られた肺組織を、アミロイドの存在について組織学的に分析した（表１）。アミロイド疾患は、コンゴーレッドで染まり、偏光下で青リンゴ色の複屈折を示す沈着物の存在によって定義される。一つを除いてすべてのＩＬＤ症例において、典型的な染色特性を有するアミロイド沈着物が同定された（図４および表１）。アミロイドは、最も一般的には間質に、しかし時に肺胞管腔に、小さい不規則な沈着物として現れた。後者の沈着物は、しばしば丸みを帯びていた。
【表１】
2014516407.tif 000003
【０１０５】
フィブリルの組織学的調査ならびに光学および電子顕微鏡検査
１０μｍ厚の肺組織切片を、脱パラフィン化し、コンゴーレッドで染色し、偏光顕微鏡でアミロイドを調べた。非常に顕著な慢性炎症が、観察されたアミロイド沈着物が急性期血清タンパク質Ａ（ＡＡ）起源のものであり得るかどうかの問題を提起し得、したがって、切片をタンパク質ＡＡに対する抗体で免疫標識した。アミロイド沈着物を含む材料すべてからの他の切片を、成熟ＳＰ−Ｃ、ｐｒｏＳＰ−ＣのＮ−末端ペプチドセグメント、またはＣＴＣに対するウサギ抗血清で免疫標識した。３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドによる展開後、免疫標識された切片をアミロイドおよび免疫反応性の同時検出のためにコンゴーレッド溶液で染色した。ヒトｐｒｏＳＰ−Ｃの残基２４〜４５に対応する合成ペプチドを、振とうしながら１０％ギ酸水溶液中２００μＭの濃度において３７℃で７日間インキュベートした。液滴（０．８マイクロリットル）を顕微鏡スライドに塗布し、空気乾燥させ、コンゴーレッドＢ溶液で染色した。カバースリップ下に取り付け後、材料をコンゴーフィリアおよび緑色複屈折について偏光顕微鏡で調べた。電子顕微鏡検査については、２μｌのアリコートを２００メッシュ銅グリッド上で１分間吸着させ、５０％エタノール水溶液中２％酢酸ウラニルで３０秒間染色し、その後、７５ｋＶで操作されたＨｉｔａｃｈｉ  Ｈ７１００顕微鏡を用いて調べ、撮影した。
【０１０６】
免疫標識実験は、ｐｒｏＳＰ−Ｃ変異Ｉ７３ＴおよびΔ９１−９３に関連するアミロイドを有する３つの材料で行った。成熟ＳＰ−Ｃに対する抗体は、肺胞上皮細胞のみではなく、拡散的にであるが不均一に組織を標識した。コンゴーレッドによる二重染色が、小さいアミロイド沈着物を同定するために必要であって、これは、３つの場合すべてについて、明確だがいくらか不均一な免疫標識を示した（図４および表１）。
【０１０７】
図４は、肺組織におけるアミロイドを示す。小さい明確なアミロイド沈着物を、７つのＩＬＤ試験片のうちの６つで同定した。図４Ａに示されるように、アミロイドは、コンゴーレッドで強く染色され、偏光において明るい緑色複屈折を示した（矢印）。図４Ｂにおいて、アミロイド沈着物は、成熟ＳＰ−Ｃに対する抗体で標識し、２，２’−ジアミノベンジジンで可視化し、次いで、コンゴーレッドで染色し、偏光で調べた。コンゴーレッドによる染色は、沈着物の周辺で明らかである（矢印）。図４Ｃは、合成ｐｒｏＳＰ−Ｃ（２４〜４５）のコンゴーレッドで染色されたフィブリルを示す。図４Ｄは、図４Ｃ中のものと同じ材料であるが、直交ポーラー間で可視化されたものを示す。
【０１０８】
ｐｒｏＳＰ−Ｃ残基２４〜４５に対応するペプチドによる前吸収は、免疫反応性をすべて消滅させた。ｐｒｏＳＰ−ＣのＮ−末端セグメントに対する、またはＣＴＣに対する抗体は、肺胞上皮細胞を一部の領域で強く標識したが、アミロイド沈着物は、まったく反応しなかった。急性期血清タンパク質ＡＡ（これは、慢性炎症状態に対して二次性のアミロイドを形成する）に対する抗体とのインキュベーションは、いずれの場合においても免疫反応性を示さなかった。
【０１０９】
ＳＰ−Ｃがアミロイドを形成し得るという考えについてのさらなる支持は、成熟ＳＰ−Ｃペプチド（ｐｒｏＳＰ−Ｃにおける残基２４〜５８に対応する）が、電子顕微鏡検査で判断されるようにアミロイド様フィブリルを形成することを示すというインビトロ試験からきている。成熟ＳＰ−Ｃの最初の２１残基（すなわち、ｐｒｏＳＰ−Ｃ残基２４〜４５）に対応する合成ペプチドのインキュベーションは、コンゴーレッドによる染色後の光学顕微鏡検査（図４）、および電子顕微鏡検査（図示せず）で判断されるように、アミロイド様フィブリルの形成をもたらす。
【０１１０】
これらの結果は、ＣＴＣにおける変異によるＩＬＤがアミロイドの形成に関連していること、およびアミロイド沈着物を形成する領域がＣＴＣの外側に局在する成熟ＳＰ−Ｃ領域に由来することを示す。検出された少量のアミロイドは、そのままで病原性でありそうにない。しかしながら、これらの沈着物は、毒性オリゴマーの存在を示し得る。アミロイド疾患における細胞毒性は、主に前フィブリル可溶性オリゴマーによってもたらされ、これは、アミロイド染色手法によって検出されない。
【０１１１】
例２
ＣＴｐｒｏＳＰ−ＣおよびｐｒｏＳＰ−ＣBrichos水素重水素交換（ＨＤＸ）試験
水素重水素交換（ＨＤＸ）
質量分析に接続された水素重水素交換（ＨＤＸ−ＭＳ）は、タンパク質骨格アミド中への重水素取り込みの測定によって構造動力学についての情報を与える。可変性または溶媒に曝露されたセグメントは、急速な交換を可能にするが、一方であまり曝露されていないまたはきつく折り畳まれたセグメントは、より遅く交換する。異なるタンパク質領域における重水素取り込みの様々な度合いは、ペプシン消化およびＬＣ−ＭＳ分析を用いて測定した。
【０１１２】
１Ｍ原液Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８を凍結乾燥すること３回、および２０ｍＭの最終Ｔｒｉｓ濃度に９９．９％Ｄ2Ｏ中で再構成することによって、重水素化緩衝液を調製した。２２℃でインキュベーションを開始するために、０．９ｍＭの濃度のＣＴＣ（ＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ）原液を９２．５％の最終重水素含量まで重水素化Ｔｒｉｓ緩衝液に希釈した。ＣＴＣ／ペプチドおよびｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳ／ペプチドの相互作用試験のために、ＫＫＶ7ＫＫ、ＫＫＶ5ＫＫ、またはＫＫＡ7ＫＫをＴｒｉｓ緩衝液またはタンパク質のいずれかと一緒に２２℃で１０分間プレインキュベートし、その後、重水素化Ｔｒｉｓ緩衝液に希釈した。最終濃度は、ＣＴＣまたはｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳが３０μＭ、ペプチドが４０μＭであった。重水素含量は９２．５％であった。２０μｌのアリコートを３つの別個のインキュベーション１、５、１０、３０、および６０分後から三通りで収集した。ＣＴＣの試料を凍結乾燥させることによって完全に重水素化したタンパク質を調製し、続いて、９９．９％Ｄ2Ｏ中で再構成し、５０℃で４時間インキュベートした。重水素交換は、０．５μＬの５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、独国）を収容する予備冷却したエッペンドルフ管にアリコートを移し、ボルテックスし、液体窒素中で凍結させることによってクエンチした。試料を分析されるまで液体窒素中に保持した。
【０１１３】
質量分析
重水素化ＣＴＣのアリコートを解凍し、予備冷却されたハミルトン注射器を用いてＨＰＬＣシステム中に注入した。システムは、分析の間に氷浴中に沈めた。タンパク質試料は、５μｌの試料ループ中に注入し、０．０５％ＴＦＡ中１７μｌ／分で稼動させた、Ｐｏｒｏｚｙｍｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｐｅｐｓｉｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）においてオンランで消化した。ペプシンペプチドを、Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ18トラップカラムを用いて脱塩し、１７μｌ／分の流量で０．１％ギ酸を含む７０％アセトニトリルを用いて一段階で溶出させた。消化および脱塩は、１０分間行った。試料は、Ｔ−コネクターを介してＨＰＬＣに接続された５０μｍの開口部を有するテーパーチップエミッタを通して質量分析計に送達した。
【０１１４】
スペクトルは、Ｚ−スプレー供給源を備えたＷａｔｅｒｓ  Ｕｌｔｉｍａ  ＡＰＩ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）によって陽イオンモードで取得した。供給源温度は８０℃、キャピラリ電圧は１．７ｋＶ、コーンおよびＲＦレンズ１電位は、それぞれ、１００Ｖおよび３８Ｖであった。質量分析計は、１００００の解像度（半値幅定義）を有する単一反射器モードで操作した。質量尺度は、［Ｇｌｕ１］−フィブリノペプチドＢを用いて較正した。スキャンは、３００〜２０００ｍ／ｚで２秒間当たり１スキャンの速度で５分間得た。Ｗａｔｅｒｓ  ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙシステム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）による自動ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を用いて、ペプシンペプチドをペプシン消化非重水素化タンパク質のマップに基づいて同定した。ペプチド配列は、Ｗａｔｅｒｓ  ＭａｓｓＬｙｎｘおよびＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘソフトウェアパッケージを用いて、衝突誘導解離スペクトルの個々の分析によって同定した。
【０１１５】
重水素化速度は、Ｗａｔｅｒｓ  ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアパッケージを用いて、実験の三通りからの同位元素包絡線質量中心（isotope envelope centroid）のｍ／ｚ値の平均および標準偏差を計算することによって測定した。重水素化曲線は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて、１段階結合（ここでは、最大重水素化は、最初の時点で到達された）または２段階結合（ここでは、時間依存性の増加が見られ得る）に適合させた。
【０１１６】
図５における基質様ペプチドおよびペプチドそれら自体の存在下でのＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ（ＣＴＣ）の質量スペクトルは、リンカー領域がＢＲＩＣＨＯＳに結合した基質を安定化することを示す。図５Ａにおいて、スペクトルは、上から下に、（ｉ）非重水素化、（ｉｉ）１分間重水素化、（ｉｉｉ）Ａ７ペプチドの存在下で重水素化、（ｉｖ）Ｖ５ペプチド、および（ｖ）Ｖ７ペプチドであるＣＴＣに対応する。ＶＬＥＭフラグメント（残基６８〜７１）は、ペプチドリガンドの不存在下で急速に重水素化され、安定な二次構造を示さない。ポリ−バリンペプチドの存在は、重水素標識を低下させるが、一方でポリ−アラニンは、ＶＬＥＭフラグメントを保護することができない。ＱＱＬＬフラグメント（残基１０７〜１１０、黒色）は、ペプチドのいずれの存在によっても影響されない。図５Ｂは、重水素化前（第１列）、それら自体での重水素化後（第２列）、ＣＴＣの存在下での重水素化後（第３列）、およびＢＲＩＣＨＯＳの存在下での重水素化後（最後の列）のＶ７、Ｖ５およびＡ７ペプチドの質量スペクトルを示す。
【０１１７】
興味深いことに、ＢＲＩＣＨＯＳ変異Δ９１〜９３とリンカー変異Ｉ７３Ｔの両方は、同様の免疫反応性を有するアミロイド沈着物を生じさせ（図４）、これらの変異の両方と関連してｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＴＭセグメントの適切なシャペロニングを欠くことを示す。ＣＴＣにおいて、リンカー領域は、可変性であり、ＨＤＸ−ＭＳで判断されるような秩序二次構造を欠く。しかしながら、リンカー領域の一部（残基６８〜７１）は、基質ベプチドＫＫＶＶＶＶＶＶＶＫＫ（Ｖ7と呼ばれる）またはＫＫＶＶＶＶＶＫＫ（Ｖ5）の添加後に骨格アミド水素の重水素化のかなりの減少を示す。このような作用は、非基質ペプチドＫＫＡＡＡＡＡＡＡＫＫ（Ａ7）の存在下で認められない（図５Ａ）。対応して、Ａ7でなく、Ｖ7およびＶ5が、ＣＴＣの存在下でＨＤＸに対して保護されるようになる。しかしながら、ｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳ（これは、ＣＴＣと同様に基質ペプチドに結合する）の存在下で、基質ペプチドの弱い保護が見られるだけである（図５Ｂ）。リンカー領域およびＶ7に対応する遊離ペプチドの共インキュベーションは、ペプチドのいずれの重水素化に対してもまったく影響をもたらさなかった。これらのデータは、リンカー領域がｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳに結合したペプチドと相互作用し、その結果、ｐｒｏＳＰ−Ｃにおいて、リンカー領域が、ＢＲＩＣＨＯＳ結合ＴＭ領域にドッキングし、このようにしてストランド−ループ−ストランド構造を形成することを示す。これは、ＢＲＩＣＨＯＳドメインにおけるだけでなく、リンカー領域における変異がどのようにＩＬＤおよびアミロイド形成と関連し得るかを説明する。
【０１１８】
例３
ｐｒｏＳＰ−ＣのＢｒｉｃｈｏｓドメインの構造
円偏光二色性（ＣＤ）分光法
遠紫外領域（１９０〜２６０ｎｍ）におけるＣＤスペクトルを、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−８１０−１５０Ｓ分光偏光計（Ｊａｓｃｏ、東京、日本）によって、１ｎｍのバンド幅および２秒の応答時間を用いて２２℃で記録し、１０データ点／ｎｍを収集した。示したスペクトルは、３回のスキャンの平均である。スペクトルは、ＣＴＣ（ＣＴｐｒｏＳＰ−Ｃ；１５μＭ）およびトリプシン処理ＣＴＣ（１０μＭ）について記録した。
【０１１９】
トリプシン処理ＣＴＣの質量分光学的分析
トリプシン処理ＣＴＣの切断部位は、タンパク質を３０％アセトニトリル／０．１％ギ酸に溶解させ、続いて、ＭＳ分析によって測定した。１１５４０Ｄａの平均分子量を有するフラグメントが認められ、Ｃｙｓ１２１とＣｙｓ１８９の間のジスルフィド架橋によって連結された、残基８２〜１６０および残基１６８〜１９７を切断タンパク質が包含することを示した（理論的平均分子量：１１５４１Ｄａ）。
【０１２０】
結晶化
構造決定に適切な結晶を、トリプシンによるインサイチューでのタンパク質分解によって数週間以内に得た。ＭＳ分析は、結晶化材料が、ｐｒｏＳＰ−Ｃの残基８２〜１６０および残基１６８〜１９７に対応することを示唆する。本明細書で提示される構造は、０．３〜０．７ｍＭの範囲の様々な濃度において、２９３Ｋおよび２７７Ｋでシッティングドロップ法（sitting-drop method）を用いて得られた、セレノメチオニル化タンパク質の結晶に由来した。空間群Ｃ２に属する単結晶（ａ＝１３２．０５Å、ｂ＝３９．３３Å、ｃ＝１１４．７６Å、β＝９９．６°）を、０．１Ｍ  Ｂｉｓ−Ｔｉｓ  ｐＨ６．５および２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ＭＭＥ  ５Ｋから成長させた。結晶を３０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４００に浸し、液体窒素中で急速冷凍し、データ収集のために用いた。
【０１２１】
データ収集、処理、スケーリングおよび構造決定
２．１Åに対するデータを、ＩＤ２３ｅｈ１ビームラインでＡＤＳＣ  Ｑ３１５検出器を用いて、欧州放射光施設（European Synchrotron Radiation Facility）、仏国において収集した。すべてのデータは、ＭＯＳＦＬＭ１２で処理して、ＳＣＡＬＡ１３でスケーリングした。データは、２．３ÅのＢｒａｇｇ間隔に対して実質的に１００％完全であり、次いで急速に外れ、２．１Åに対して外側分解能シェルにおいて約６０％完全であるのみである。
【０１２２】
構造決定に用いた結晶は、非対称単位当たり２つのｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳ三量体を含有した。それぞれ、セレン原子ピーク、変曲点および高エネルギーリモートに対応する、３つの異なる波長で収集したデータによってＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｎｏｍａｌｏｕｓ  Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ（ＭＡＤ）技術を用いて位相付けした。
【０１２３】
２．９Åに対する初期位相は、ＳＨＡＲＰを用いて推定し、ここで、１８個のセレノメチオニン部位を同定した。密度修正（溶媒平滑化（solvent flattening）、平均化、ヒストグラム適合法）を行うためにｄｍを用いることによって、位相は、その後に改善され、２．１Åに拡張された。平均化のための非結晶学的対称（ＮＣＳ）オペレータおよび単量体エンベロープは、初期２．８Åマップにおいて追跡した予備モデルから得て、タイトな６倍ＮＣＳ拘束（tight 6-fold NCS restraint）を用いて精密化した。
【０１２４】
モデル構築、精密化および妥当性確認
一つのサブ単位のモデルを平均化マップで構築し、他の５つのＮＣＳ関連サブ単位を作成するために用いた。精密化および再構築は、ピーク（ｐｋ）波長データを用いて行い、Ｃｏｏｔ、Ｏ、Ｒｅｆｍａｃ５、Ｂｕｓｔｅｒ、およびＰｈｅｎｉｘの組合せを用いて行った。
【０１２５】
１８個のセレン部位に基づくＭＡＤ位相付けから得られた電子密度マップにより、α１とα２の間に位置し（図６）、かつ結晶化の間にトリプシン切断により除去されたペプチド１６１〜１６７を包含して、ｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳドメインにおけるすべての残基（残基１５２〜１７９を除く）をモデル化することができた。欠損セグメントは、ＨＤＸ−ＭＳにより無秩序（disordered）と同定され、二次構造を欠くことが強く予測される。それはまた、最高の配列可変性および異なる種間の長さの差を有する領域である。総合すれば、これらのデータは、２つのヘリックス間の残基が、タンパク質の構造的完全性に必要とされない生来的に無秩序なセグメントを構成することを示唆する。インタクトなＣＴＣとトリプシン切断ＣＴＣはいずれも、基質ペプチドＶＶＶに等しくよく結合する。したがって、結晶化タンパク質は、ｗｔ材料と構造的および機能的に類似している。
【０１２６】
結晶化タンパク質のＮ−末端部分が構造的に柔軟性であること、およびそれは、これらの２つのコピーで極めて異なる経路をたどることが明らかである。したがって、このｐｒｏＳＰ−Ｃの領域は、我々が残基９０〜１９７と定義する、完全にＢＲＩＣＨＯＳドメインに先行するリンカー領域の一部とみなすべきである。
【０１２７】
最終モデルは、４７０アミノ酸残基（鎖Ａにおける残基８９〜１４９および１８０〜１９７、鎖Ｂにおける８２〜１４９および１８１〜１９７、鎖Ｃにおける８８〜１５１および１８０〜１９７、鎖Ｄにおける８９〜１４８および１８０〜１９７、鎖Ｅにおける８９〜１２５、１３２〜１４９および１８１〜１９７、鎖Ｆにおける８８〜１４８および１８１〜１９７）、および１３７個の水分子からなる。１９個のタンパク質残基を交互配座によってモデル化した。モデル化鎖のすべては、７６個の重ねたＣα原子について０．６±０．１Åのｒ．ｍ．ｓ．ｄ．で、対で重ねることができる。
【０１２８】
本発明者らの結晶の非対称単位における２つの三量体は、本質的に同一である（４６２個の重ねたＣα原子についてｒ．ｍ．ｓ．ｄ．０．５７４Å）。観測された三量体は、中心三回軸の周りのそれぞれのサブ単位からのβ１ストランドの最密充填、およびα１とα２#（＃は、構造要素が、三量体における隣接サブ単位からであることを示す）の間の頭−尾部の相互作用によって形成される。いくつかのサブ単位間の塩橋および水素結合相互作用が、方向特異的相互作用を与える（表２）。
【表２】
2014516407.tif 000004
【０１２９】
三量体界面は、大部分は疎水性であり（埋没表面積の６６％）、全サブ単位の接触可能表面積（サブ単位当たり１１５０Å2）の約２４％は、三量体に埋没されている。これは、多量体タンパク質において観測されるタンパク質−タンパク質相互作用面の十分に範囲内である。
【０１３０】
すべての残基は、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎプロットの許容領域内であり、すなわち、残基の９４％は、好ましい領域にある。寛大に許容される領域における残基の平均よりいくらか大きい分率は、あまり十分に定義されていない電子密度における鎖Ｂにおける８２〜９０領域のモデル化を主に反映する。
【０１３１】
接触可能表面積計算は、１．４Åのプローブ半径を用いてＹａｌｅアルゴリズムに基づくプログラムによって行った。図面は、ＰｙＭｏｌを用いて作成した。
【０１３２】
分子動力学（ＭＤ）シミュレーション
準備およびＭＤシミュレーションは、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  Ｓｕｉｔｅ２００９（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＣＣ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２００９年）に実装されたソフトウェアで行った。Ｍａｅｓｔｒｏソフトウェアを用いて、４つの異なるシステム、それぞれ、野性型単量体および三量体、ならびにＤ１０５Ｎ単量体および三量体変異体を構築し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｗｉｚａｒｄワークフローを用いて水素を加えた。
【０１３３】
ＢＲＩＣＨＯＳドメインの構造
構造決定に適した結晶は、トリプシンによるインサイチュータンパク質分解にかけた組換えＣＴＣから得た。結晶化タンパク質のサイズは、１１５４０Ｄａの平均分子質量に一致するようにＭＳで測定した。予測されたトリプシン切断部位を考慮すると、これは、Ｌ８２〜Ｋ１６０およびＤ１６８〜Ｙ１９７を包含する産物と適合している。トリプシン処理された材料についての円偏光二色性スペクトルは、本質的にＣＴＣについてのものと同じであり、両方ともトリペプチドＶＶＶに結合し、これは、ｐｒｏＳＰ−Ｃ２０のＴＭ部分の代表的な配列である。これは、ＣＴＣのトリプシン処理が、構造部分を有意には変えなかったこと、および可変性部分が、基質結合に重要でないと主張される。
【０１３４】
結晶の非対称単位には２つの三量体がある。ｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳ三量体の構造は、図７に示され、リボンダイヤグラムは、ｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳ三量体におけるサブ単位の構成を示す。三量体サブ単位は、プロペラ羽根（中心から周囲へのストランド順β１、β２、β３、β４、β５）に対応するβ−シートを有する三葉形プロペラ、および各プロペラ羽根の両側の２つのサブ単位からのヘリックスを形成するように配置される。３つのβ１ストランドは、三量体の中心で３回軸の周りに密接に相互作用する。各サブ単位のヘリックスα２は、隣接するサブ単位のα１とともにほとんど頭−尾に充填され、同じ隣接物の２つの内部ストランドとも相互作用する。
【０１３５】
構造的な同族体は、構造データベースには存在せず、ｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳドメインの折り畳みは、今まで観測されたことがない。ドメインは、ｐｒｏＳＰ−Ｃの残基９０〜１９７を包含し、２つのα−ヘリックスが中央の５つのストランド化β−シートを閉囲する全体的構造（overall architecture）を有する。ドメインのＮ−末端半分における４つの連続的なストランドは、上下に逆平行のβ−シートを形成する。５番目のＣ−末端のストランドは、β４に平行な状態にあり、β１〜β４に続く２つのヘリックスは、β−シートのそれぞれの側を対角線上に横切って伸びる。本発明者らは、ヘリックス１に対して充填されるβ−シートの面を意味するために「面Ａ’」を、およびヘリックス２に対する面充填について「面Ｂ’」を使用する。２つのヘリックスは、両親媒性であり、β−シートに対する疎水性側の充填は、疎水性コアに寄与し、第２の側は、主に溶媒接触可能であるか（α１）またはサブ単位間の界面に埋没されている。インタクトなＣＴＣのＨＤＸ−ＭＳによって定義された無秩序領域の一つに対応し、かつタンパク質分解された１６１〜１６７セグメントを包含する残基１４９〜１８０は、本発明者らのマップにおいてあまり可視的な電子密度を有さず、モデル化しなかった。図６は、ＣＴＣサブ単位の一つのリボンダイヤグラムの表示であり、二次構造要素β１−β２−β３−β４−α１−α２−β５は標識されている。破線は、ヘリックスα１とα２の間の欠損領域を示す。
【０１３６】
ＢＲＩＣＨＯＳβ−シート面Ａは、ペプチド結合面のようであり、その接触可能性は、厳密に保存されたＡｓｐ１０５によって調節される
ｐｒｏＳＰ−Ｃは、動物界にわたって、特に哺乳動物のうちで高度に保存されている。ｐｒｏＳＰ−ＣのＢＲＩＣＨＯＳドメインにおける保存された残基は、構造的に重要な位置および潜在的なペプチド結合面を同定するために結晶構造上でマップ化した。ループ領域に位置する、いくつかの保存されたＧｌｙおよびＰｒｏ残基は、ドメインの折り畳みおよび動的特性に重要であり得る。Ｃ１２１とＣ１８９の間の保存されたジスルフィド架橋は、β４およびα２を連結し、安定性に重要であり得る。残存する厳密に保存された残基は、主にβ−シートの面Ａおよび面Ｂに位置する。ＩＬＤの患者で同定されたＣＴＣ点変異の多くは、厳密に保存されたアミノ酸部位と一致する。
【０１３７】
β−シートにおける（特に面Ａ上の）疎水性コア残基の多くは、厳密に保存されているが、一方で疎水性コアにおけるヘリックス残基は、このような位置について予想されるように、疎水性側鎖のより広い分布を示す。これは、β−シート側鎖が疎水性コアの形成に厳密に必要とされるからではなく、いくつかの他の機能、例えば、ペプチド結合に関与しているから保存されることを示唆する。しかしながら、これは、構造の実質的な再構成が、β−シート面の片面または両面を溶液に曝露させ、結合を可能にすることを必要とする。
【０１３８】
ｐｒｏＳＰ−Ｃの位置１０５におけるアスパラギン酸残基は、知られたＢＲＩＣＨＯＳ配列のすべての中で唯一厳密に保存された非ジスルフィド残基であり、Ｄ１０５の２つの変異は、ＩＬＤに関連することが知られている。それは、βストランドβ２の最後およびストランドβ３の最初における、長く伸びた４つの保存残基中の最初の残基である。側鎖は、部分的に疎水性の周囲に位置しており、α２のＮ−末端側終端と接触している。本発明者らは、結晶構造（ｗｔ）からの単量体とＤ１０５Ｎ置換（Ｄ１０５Ｎ）を有する単量体の両方ともでＭＤシミュレーションを行うことによって、Ａｓｐ１０５についての構造的役割の可能性について調査した。ＭＤシミュレーションは、連続的により高い温度で行って、構造的安定性をモニターした。単量体ｗｔおよびＤ１０５Ｎは、シミュレーションにおいて非常に異なって挙動する。変異体では小さい配座変化だけがあるが、ｗｔではいくつかの比較的大きい規模の変化が適度に上昇した温度で生じる。α２のＮ−末端部分は、巻き戻され、この領域は、β−シートを介してα１およびストランドβ４からの接続ループと連絡し、これにより、ヘリックス１を面Ａから５〜７Å外に移動させる配座変化が行われる。この再位置調整は、溶媒接触可能になる面Ａ上の多くの疎水性コア残基を伴う。面Ａ上の５００Å2を超える疎水性表面積が、α１がシートから離れる場合に曝露される。したがって、厳密に保存されたＡｓｐ側鎖は、構造の安定性を調整し、それにより、中央のβ−シート、特に高度に保存された面Ａを曝露するための機構を与えるように見え、これは、例えば、ペプチド基質への結合に対して接触可能にする。
【０１３９】
ＢＲＩＣＨＯＳドメインの立体シャペロン機能
リン脂質膜におけるＳＰ−ＣへのＣＴＣの結合に関するデータは、ＳＰ−Ｃの非構造化された合成非ヘリックス形態が認められ、らせん状構造に転換されるが、一方でヘリックスＳＰ−Ｃは、認められない。これは、ＣＴＣが、極めて疎水性でβ−構造になりがちなＴＭｐｒｏＳＰ−Ｃペプチドセグメントのための立体シャペロンとして作用すること、およびそれが、前述のβ−ヘアピン構造における非天然のｐｒｏＳＰ−Ｃを特異的に捕捉することを示唆する。中央のβ−シートの保存された疎水性面は、このような機能に十分に適しているように見える。いくつかの点で、これは、他の立体シャペロンの働き方と同等である。一例は、折り畳み鋳型／足場（scaffold）として作用することによって、疎水性プラットフォームが、非折り畳み構造を捕捉し、特異的構造へのそれらの折り畳みを促進するために用いられるシャペロン／アッシャー（usher）経路の立体シャペロンである。シャペロンは、多かれ少なかれ、基質の不存在下で溶液からそれらの疎水性結合面を遮蔽するために、しばしばそれらの面を埋没させるホモ複合体を形成することによって、ある種の「キャッピング」機構を用いる。出発構造として結晶学的ｗｔとＤ１０５Ｎ変異体三量体のモデルの両方ともを用いるＭＤシミュレーションは、ｗｔ単量体構造において起こる移動のいずれも三量体で起こり得ないことを示す。したがって、三量体は、シャペロンキャッピング機構としてのその役割と一致して、推定結合部位を遮断する配座におけるサブ単位を安定化させる。とりわけ、Δ９１〜９３欠失変異体および点変異の多くは、ＢＲＩＣＨＯＳ三量体界面に位置している。
【０１４０】
最近になって、アルツハイマー病に関連するアミロイドβ−ペプチド（Ａβ）に関して、ストランド−ループ−ストランド構造が細胞毒性オリゴマーおよびフィブリルの形成に必要とされることが示された。ｐｒｏＳＰ−ＣおよびＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳドメインが、大動脈アミロイドと関連して、Ａβおよびｍｅｄｉｎのフィブリル形成を防止するという観察と合わせて、これは、ＢＲＩＣＨＯＳがアミロイド形成において共通の中間モチーフに結合することを示唆する。本発明者らの試験により、アミロイド疾患に対する治療戦略で利用され得るシャペロンドメインのさらなる理解のための重要な足掛かりが提供される。
【０１４１】
例４
Ａβペプチドについての凝集動態
ペプチドおよびタンパク質
Ａβペプチド。Ａβ（Ｍ１〜４０）（配列番号１０）およびＡβ（Ｍ１〜４２）（配列番号１１）を、合成遺伝子由来の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させ、イオン交換およびサイズ排除工程を用いてバッチ形式で精製したが、これは、高度に純粋な単量体ペプチドをもたらす。精製ペプチドを２０〜３０の同一のアリコートに分割し、凍結させた。次いで、それぞれの実験のセットアップ直前に精製ペプチドのアリコートをゲルろ過することによって、単量体を単離し、凍結解凍の間に形成された微量の凝集体を除去し、緩衝液をそれぞれの実験に用いられるものと交換した。単量体ピークの後半部分を、氷上のローバインドエッペンドルフ管（Ａｘｙｇｅｎｅ）に集め、酸加水分解後の吸光度およびアミノ酸分析によって濃度を測定した。この単量体をそれぞれの実験にそのままで、または所望の濃度に希釈して用いた。
【０１４２】
Ｂｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳ。Ｂｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳドメインの発現および精製は、前に記載されている（Ｐｅｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３９３：３５６〜３６１頁（２０１０年））。簡単に言えば、Ｂｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳコンストラクトを、チオレドキシン／Ｈｉｓ6／およびＳ−タグとの融合タンパク質として大腸菌で発現させた。次いで、タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラムクロマトグラフィーを２回用いて精製した。トロンビンを用いて、チオレドキシン−およびＨｉｓ6−タグを除去した。溶出タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび非変性ＰＡＧＥによって分析した。酸化水分解後にアミノ酸分析によって、濃度を測定した。
【０１４３】
ｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳ。ｐｒｏＳＰ−Ｃ  ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１７５（Ｈｉｓ５９）からヌクレオチド５９１（ｌｌｅ１９７）の領域を、ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ  ＰＣＲ−Ｒｅａｄｙヒト肺ｃＤＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ、英国）から増幅した。発現のために、大腸菌株Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを有するＬＢ培地中３０℃で増殖させた。発現は、０．５ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により１．２付近のＯＤ600で誘発し、細菌を２５℃でさらに４時間増殖させた。この細胞を６０００ｇにおいて４℃で１５分間の遠心分離により採取し、ペレットを２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８に再懸濁させ、−２０℃で保存した。細胞をリゾチーム（１ｍｇ／ｍｌ）により３０分間溶解させ、ＤＮａｓｅおよび２ｍＭのＭｇＣｌ2と一緒に氷上で３０分間インキュベートした。細胞溶解物を６０００ｇにおいて２０分間遠心分離にかけ、ペレットを２０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８中２Ｍの尿素に懸濁させ、５分間超音波処理した。６０００ｇにおいて４℃で３０分間遠心分離後、上清を５μｍのフィルターを通してろ過し、２．５ｍｌのＮｉ−アガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｌｔｄ．、Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ、英国）に注いだ。カラムを、２０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８中２Ｍの尿素、１００ｍｌで、次いで、２０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８中１Ｍの尿素、１００ｍｌで、最後に２０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８、１００ｍｌで洗浄した。タンパク質を、２０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８中２００ｍＭのイミダゾールで溶出させ、２０ｍＭのＴｒｉｓ、０．０５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８に対して透析し、トロンビンにより４℃で１６時間切断して（酵素／基質重量比０．００２）、チオレドキシンおよびＨｉｓ6−タグを除去し、次いで、Ｎｉ2+カラムに再適用して、遊離タグを除去した。Ｎｉ2+カラムからの溶出後、タンパク質を、２０ｍＭのＴｒｉｓ、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４で平衡化した、陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ  ＱＦＦ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用し、２０ｍＭから１ＭのＮａＣｌの線形勾配を用いて単一ピークとして溶出させ、最後に２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４に対して透析した。濃度は、酸加水分解後のアミノ酸分析により測定した。
【０１４４】
Ｂｒｉ２  ＢｒｉｃｈｏｓおよびｐｒｏＳＰ−Ｃ  Ｂｒｉｃｈｏｓのアミノ酸配列を図８に提示する。ｐｒｏＳＰ−ＣおよびＢｒｉ２  Ｂｒｉｃｈｏｓドメインのアライメントを、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗで作製し、Ｘ線構造に由来するとおりのｐｒｏＳＰ−Ｃドメインに一致する。星印およびダブルドットは、それぞれ、同一の残基および保存的置換（conservative replacement）に印したものである。
【０１４５】
抗トロンビン。ヒト抗トロンビンは、Ｂａｘｔｅｒ（Ｖｉｅｎｎａ、オーストリア国）から購入した。
【０１４６】
シスタチンＣ。ニワトリのシスタチンＣを卵白から精製した。
【０１４７】
モネリン。正味の電荷−２を有する単鎖モネリン（ｓｃＭＮ−２；５つの置換体Ｃ４１Ｓ、Ｑ１３Ｅ、Ｎ１４Ｄ、Ｑ２８Ｅ、およびＮ５０Ｄを組み込むために突然変異生成により得た）を、合成遺伝子由来の大腸菌で発現させ、イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。
【０１４８】
凝集動態
凝集動態を、プレートリーダ（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｏｆｆｅｎｂｅｒｇ、独国のＦｌｕｏＳｔａｒ  Ｏｍｅｇａ）において時間の関数としてＴｈＴ蛍光強度を記録することにより試験した。４４０ｎｍの励起フィルターおよび４８０ｎｍの発光フィルターを用いて、透明底を有するハーフエリア９６ウェルＰＥＧコート黒ポリスチレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ３８８１）において底部の光学装置を用いて記録した。Ａβ単量体は、２０ｍＭのリン酸Ｎａ、２００μＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＮａＮ3（Ａβ（Ｍ１〜４０）の場合はｐＨ７．４およびＡβ（Ｍ１〜４２）の場合はｐＨ８．０で）中上記のとおりのゲルろ過により単離し、同じ緩衝液中Ａβ（Ｍ１〜４０）の場合は６または８μＭに、およびＡβ（Ｍ１〜４２）の場合は３または６μＭに希釈し、２ｍＭの原液から２０μＭのＴｈＴを補充した。９６ウェルプレートにおいて各ウェルに、最初に緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．４）１０μｌまたはＢＲＩＣＨＯＳタンパク質もしくは対照タンパク質のいずれか１０μｌを２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．４中の所望の最終濃度の１０倍で加えた。次いで、各ウェルに９０μｌの氷冷Ａβ単量体溶液を加え、プレートを３７℃のプレートリーダに直ちに入れ、読み取りの間に１００ｒｐｍで連続的に振とうしながら６分毎に蛍光を読み取った。Ａβ（Ｍ１〜４０）を、単独で、または１７ｎＭから１７μＭの範囲の濃度のｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳもしくは６０ｎＭから６μＭの範囲の濃度のＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳと一緒に試験した。Ａβ（Ｍ１〜４２）を、単独で、または６０ｐＭから１７μＭの範囲の濃度のｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳもしくは２０ｎＭから６μＭの範囲の濃度のＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳと一緒に試験した。ＡβおよびＢＲＩＣＨＯＳタンパク質の濃度は、酸加水分解後のアミノ酸分析により測定した。
【０１４９】
ハーフタイムｔ1/2を、それぞれの動態追跡に対してシグモイド関数
ｙ＝ｙ0＋（ｙmax−ｙ0）／（１＋ｅｘｐ（−ｋ（ｔ−ｔ1/2））
に適合させることによって得て、ラグタイム、ｔlagは、
ｔlag＝ｔ1/2−２／ｋ
のとおりに定義した。
【０１５０】
チオフラビンＴ（ＴｈＴ）は、単独で、または０．００００１から０．６モル当量の範囲の異なる濃度のＢＲＩＣＨＯＳタンパク質と一緒に、本明細書で、それぞれＡβ４０およびＡβ４２と呼ばれる、Ａβ（Ｍ１〜４０）またはＡβ（Ｍ１〜４２）についての動態実験におけるフィブリル形成に対するレポータとして用いた。
【０１５１】
単独での、および０．０１８または０．１８モル当量のｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳと一緒のＡβ４０についての凝集動態の例は、図９Ａに示し、０．０１７および０．０６１モル当量のＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳと一緒の例は、図９Ｂに示す。凝集過程の中間時点（ｔ１／２）およびラグタイムは、データにシグモイド関数を適合させることによってそれぞれの動態追跡から得た。乱さない場合のものと比べたｔ1/2の値を、ＢＲＩＣＨＯＳのモル比に対してプロットした：図９ＣにおけるＡβ４０（ここで、各データ点および誤差バーは、６から８個の反復に基づく平均値および標準偏差を表す）。明らかに、Ａβ４０凝集についてのラグタイムは、ｐｒｏＳＰ−ＣまたはＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳの存在下で大きく増加したが、一方で伸長速度は、大きくは影響されない。ラグタイムに対する非常に大きな効果が、Ａβ４０と比べてｐｒｏＳＰ−ＣまたはＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳのはるかに低い等モル濃度で認められる。Ａβ４０凝集についてのラグタイムの倍加は、約０．０１モル当量のｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳを必要とし、ラグタイムにおける１０倍の増加が、ほぼ０．０１当量のＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳまたは０．０３当量のｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳで見られる。遅延効果は、ＢＲＩＣＨＯＳ濃度の増加とともに増加し、ラグタイムは１週間を超え、０．０２５モル比（４０個のＡβ４０当たり１個のＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳ）または０．０６モル比（１６個のＡβ分子当たり１個のｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳ）を超えて定量することは実際に困難になる。したがって、ＢＲＩＣＨＯＳタンパク質の両方ともは、Ａβ４０凝集の非常に強力な阻害剤であり、最強の効果がＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳについて認められる。
【０１５２】
単独での、ならびに０．１０および０．６２モル当量のｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳと一緒のＡβ４２のＴｈＴ蛍光による動態追跡の例は、図９Ｄに示し、０．１０および０．６１モル当量のＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳと一緒の例は、図９Ｅに示す。各条件で６から８個の反復に基づく、凝集過程の中間時点（ｔ1/2）および誤差バーは、図９Ｆに示す。またＡβ４２について、ｐｒｏＳＰ−ＣとＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳの両方ともは、凝集を著しく遅延させ、半化学量論的量のＢＲＩＣＨＯＳタンパク質が必要とされるのみである。０．０６〜０．１モル比（１０〜１６個のＡβ４２当たり１個のＢＲＩＣＨＯＳタンパク質）において、ラグタイムとハーフタイムの両方ともは、阻害されていない場合と比較して倍加されており、このようにして伸長速度は影響されない。ラグタイムにおける１０倍の増加が、約０．６モル当量のＢＲＩＣＨＯＳタンパク質で見られ、この条件下で伸長速度は、かなり低下していることが見出される。強い効果がＡβ４２凝集動態で見られるが、Ａβ４０凝集に対するのと同じ効果を発揮するためにより高い濃度のＢＲＩＣＨＯＳタンパク質が必要とされることが明らかであり、ｐｒｏＳＰ−ＣおよびＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳの遅延効果は、Ａβ４２の場合において定量的により類似している。
【０１５３】
対照実験を、３つのタンパク質ヒト抗トロンビン（ＨＡＴ）、卵白シスタチンＣおよび単鎖モネリンバリアント（ｓｃＭＮ−２）の存在下でＡβ４０およびＡβ４２の凝集動態を試験するためにセットアップした。ＨＡＴは、セルピンファミリーに属し、それのいくつかのメンバーが抗アミロイド性を有すると報告されていたので、選択した。卵白シスタチンＣは、ＢＲＩＨＯＳドメインとほぼ同じ分子質量を有し、ｓｃＭＮ−２は、ｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳと同じ正味の電荷（−２）を有するので、任意の非特異的タンパク質効果を模倣するために選択した。各対照タンパク質を、Ａβ４０またはＡβ４２に０．０１および０．１モル当量で加え、凝集させ、続いて、ＴｈＴアッセイした。ＨＡＴおよびｓｃＭＮ−２は、Ａβ４０の凝集を阻害することが見出されたが、０．００６モル当量のｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳまたは０．０００６モル当量のＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳと同じ効果をもたらすために、それぞれ、０．０１および０．１モル当量を必要とした。したがって、ｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳは、ＨＡＴおよびｓｃＭＮ−２よりもＡβ４０凝集の１０〜１００倍より有効な阻害剤であること、およびＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳは、これらの対照タンパク質と比べて１００〜１０００倍より有効であることがわかった。ＨＡＴは、０．１モル当量で加えられる場合、Ａβ４２に対する効果も示した。シスタチンＣについて阻害効果は認められなかった。
【０１５４】
２種のヒトタンパク質、Ｂｒｉ２およびｐｒｏＳＰ−ＣからのＢＲＩＣＨＯＳドメインは、濃度依存的仕方でＡβフィブリル形成を防止し得る。より疾患関連のＡβ４２の凝集は、半化学量論的ＢＲＩＣＨＯＳ：Ａβ４２比で遅延され、１０個のＡβ４２当たり１個のＢＲＩＣＨＯＳドメインで凝集ラグタイムの倍加が認められる。これは重要な結果であり、このことは将来のＡＤ療法の設計において利用され得る。
【０１５５】
Ａβ４２と比較してＡβ４０に対する同じ阻害効果に到達するために、より低いＢＲＩＣＨＯＳ濃度が必要とされる。４００個のＡβ４０当たり１個程度に少ないＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳ（または１６０個のＡβ４０分子当たり１個のｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳ）が、ラグタイムの倍加に必要とされる。４０個のＡβ４０当たり１個のＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳ（または１０個のＡβ４０分子当たり１個のｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳ）を超えると、凝集過程は、Ａβ４０単独について数時間と比較して実験の１週間の時間枠内で起こらないほど非常に遅延される。
【０１５６】
例５
Ａβペプチドについての停止実験
進行中の凝集過程の間にＢＲＩＣＨＯＳ添加の効果をモニターするために、８μＭのＡβ４０を有する試料を、時間の関数としてＴｈＴ蛍光強度を記録することによってモニターした。実験の開始直前、または０．３から１１．２時間の範囲の種々の時点で、濃縮原液から８００ｎＭのＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳを加えた。同様の実験を、６から１０９分間の範囲の種々の時点で加えた１．８μＭのＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳを有する３μＭのＡβ４２について行った。図１０に示されるように、凝集過程は、ラグタイム中のどこで添加される場合も、ＢＲＩＣＨＯＳタンパク質によって遅延させ得る。図１０において、８μＭのＡβ４０の凝集を、１００ｒｐｍの振とうとともに、３７℃で、２０ｍＭのリン酸Ｎａ、ｐＨ７．４、２００μＭのＥＤＴＡ、２０μＭのＴｈＴ、０．０２％ＮａＮ3中時間の関数としてＴｈＴ蛍光強度を記録することによりモニターした。垂直の矢印で示されるとおりに実験の開始前（最も上の追跡）または実験開始後の種々の時点（０．３から１１．２時間の範囲）で、８００ｎＭのＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳを濃縮原液から加えた。
【０１５７】
ＢＲＩＣＨＯＳタンパク質が伸長期の早い部分の間に加えられる場合、その過程は、ＴｈＴの正の凝集体のさらなる成長なしに停止するように見える。移行の中間時点近くに加えられる場合、ＢＲＩＣＨＯＳタンパク質は、さらなる進行から過程を停止するか、または過程がその速度を低下し、より低い速度で進行するようにさせるように見える。移行の最後に加えられる場合、効果はまったく見られない。
【０１５８】
本発明者らの動態ＴｈＴ実験（例４参照）における遅延期延長および実質的に影響されない伸長速度は、ＢＲＩＣＨＯＳタンパク質が、遅延期の間に生じる過程を主に妨げることを意味する。これは、ＢＲＩＣＨＯＳが進行中の凝集過程の間に加えられる場合のこれらの停止実験の結果によってさらに説明される。本発明者らは、ＢＲＩＣＨＯＳドメインが遅延期の間に加えられる限り、フィブリル化が強力に遅延され得ることを見出す。この過程は、ＢＲＩＣＨＯＳが伸長過程の中間時点で加えられる場合、一時的に停止されるだけであり、その後では、それは、遅過ぎて、干渉できない。これらの結果は、ＢＲＩＣＨＯＳドメインが、遅延期の間に生じる分子的事象と干渉することを意味する。
【０１５９】
例６
Ａβペプチドの二次構造に対するＢｒｉｃｈｏｓタンパク質の影響
ＣＤ分光法
ＣＤスペクトルを、ＪＡＳＣＯ  Ｊ−Ｂ１５分光偏光計を用いて４ｍｍ石英キュベット中で記録した。遠紫外スペクトルは、２０ｎｍ／分のスキャン速度を用いて１８５〜２５０ｎｍで、１ｎｍ間隔で記録し、応答時間は８秒、および帯域通過は１ｎｍであった。Ａβ（Ｍ１〜４０）単量体を、４０ｍＭのＮａＦおよび２００μＭのＥＤＴＡと一緒の１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４中ゲルろ過によって単離し、氷上で収集し、緩衝液、ｐｒｏＳＰ−ＣまたはＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳで補充された３種の試料中に最終濃度８μＭのＡβ（Ｍ１〜４０）に分割し、添加なしまたは０．８μＭのｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳもしくは０．８μＭのＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳであった。試料を３７℃で加熱し、直接にまたは１００ｒｐｍの振とうとともに３７℃で、最大１８時間までのインキュベーションの異なる時間後に試験した。緩衝液のスペクトルは、同じキュベット中で別個に記録し、全スペクトルから差し引いた。０．８μＭのｐｒｏＳＰ−ＣまたはＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳのスペクトルは、別個に記録した。
【０１６０】
凝集過程の間の構造的移行を、ＣＤ分光法を用いて試験した（データを示さず）。Ａβ４０単独についてのデータは、他の報告と一致し、β−シート構造を示すスペクトルの方向へのランダムコイルペプチドに典型的なスペクトルからの連続的な進行を示す。この構造的移行は進展し始めるが、一方でＴｈＴ蛍光により観測されるとおりの凝集過程は、依然として遅延期にあり、したがって、フィブリル凝集体がＴｈＴ蛍光により検出され得る前にβ−シート構造を有する中間体の出現が報告される。０．１モル当量のｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳまたは０．１モル当量のＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳの存在下で、構造的移行は、２００分間および１８時間のスペクトルから判断されるように遅延されるように見える。これらの時点の両方ともにおけるスペクトルは、主にランダムコイル構造について報告し、したがって、ＢＲＩＣＨＯＳタンパク質の存在が、β−シート構造を有する中間体の濃度を低下させ、延長遅延期の間に主に非構造化状態でＡβを保つことを意味する。１８時間でのＡβ４０に加えてｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳについてのスペクトルは、β−構造に向けて転換し始め、１８時間目のスペクトルが、遅延期の最後付近で取られたことを示す。
【０１６１】
例７
Ｂｒｉｃｈｏｓタンパク質とＡβペプチドの間の相互作用
サイズ排除クロマトグラフィー
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン国）上のサイズ排除クロマトグラフィーを、ＢｉｏＬｏｇｉｃ  ＨＲ  ＦＰＬＣシステム（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて行った。カラムを、脱気した緩衝液（凝集試験のための試料を調製するためのｐＨ７．４またはｐＨ８．０での２０ｍＭのリン酸Ｎａ、２００μＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＮａＮ3、およびＣＤ試験のための試料を調製するための１０ｍＭのリン酸Ｎａ、４０ｍＭのＮａＦ、ｐＨ７．４）中で平衡化および操作した。試料を１ｍＬのループから注入し、クロマトグラムを２８０ｎｍでの吸光度をモニターすることによって記録した。タンパク質相互作用をモニターするために、ＡβとＢＲＩＣＨＯＳドメインの混合物を、混合後に直接に、またはｐＨ７．４もしくはｐＨ８．０で２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２００μＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＮａＮ3中３７℃でインキュベーション２もしくは２０時間後に注入した。画分（０．３〜０．７ｍｌ）をクロマトグラムの間に収集し、凍結乾燥し、１０〜２０％勾配ゲル中ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した。
【０１６２】
ＢＲＩＣＨＯＳタンパク質とＡβの間の相互作用は、ゲルろ過を用いて試験した。８μＭのＡβ４０および０．８μＭのｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳ、または８μＭのＡβ４０および０．８μＭのＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳの試料を、３７℃で２０時間インキュベートし、続いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム上でゲルろ過し、収集した画分をＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析した。
【０１６３】
図１１は、混合直後（上側のクロマトグラム）およびインキュベーション２０時間後（下側）の８μＭのＡβ４０と０．８μＭのｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳの混合物のゲルろ過を示し、収集した画分は垂直線および数字により示す。０時間における８μＭのＡβ４０単独のクロマトグラムも示す（このクロマトグラムは、容積の２倍を注入したので、０．５倍で倍率変更をした）。
【０１６４】
図１２Ａは、混合直後およびインキュベーション２０時間後の８μＭのＡβ４０と０．８μＭのＰｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳの混合物のＳｕｐｅｒ７５カラム上でのゲルろ過を示す（５００μＬ注入）。吸光度は、５ｍｍのセルで測定した。収集し、凍結乾燥し、再懸濁した画分のＳＤＳ  ＰＡＧＥ（１０〜２０％の勾配ゲル）を、クロマトグラムの下に示す。
【０１６５】
図１２Ｂは、混合直後およびインキュベーション２または２０時間後の８μＭのＡβ４０と０．８μＭのＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳの混合物（上側）、８μＭのＡβ４２と０．８μＭのｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳの混合物（中間）、または８μＭのＡβ４２と０．８μＭのＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳの混合物（下側）のＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム上でのゲルろ過を示す。収集し、凍結乾燥し、再懸濁した画分のＳＤＳ  ＰＡＧＥ（１０〜２０％の勾配ゲル）を右側に示す。１５ｋＤａマーカーに近い帯域は、Ａβ４２についてしばしば見られるＳＤＳ所産である。
【０１６６】
２０時間の時点を、ＢＲＩＣＨＯＳタンパク質とＡβの間の潜在的相互作用を調査するために選択したが、この理由は、この時点においてＡβ単独は、フィブリル化されており、平衡平坦域に達したからであり、一方で、０．１モル当量のｐｒｏＳＰ−ＣまたはＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳを含む試料は、依然として遅延期にある（図９参照）。図１１におけるデータは、この時点でほとんどすべてのＡβ４０が単量体であるが、一方で画分２〜６において微量画分がｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳと一緒に溶出する。同様の結果が、８μＭのＡβ４０および０．８μＭのＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳについても認められる（図１２Ｂ）。２０時間後、少量のＡβが、Ｂｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳと一緒に溶出するが、大部分のＡβ４０は依然として単量体であり、Ｂｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳがオリゴマー中間体を不安定化させ、および／またはそれらの形成を阻害することを示す。ＢＲＩＣＨＯＳピークにおける、および中間ピークにおける少量のＡβ４０の観測も、非対称なＡβ４０単量体ピークの一部の反復における所見とともに、ＢＲＩＣＨＯＳタンパク質との相互作用は、ゲルろ過の時間尺度での中間体制（intermediate regime）での交換速度によって、すなわち、０．００１〜０．０１秒-1のオーダーで一定の解離速度によって生じることを示す。８μＭのＡβ４２と０．８μＭのＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳまたはｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳについての０および２時間のインキュベーションでのデータ（図１２）は、これらの所見と一致する。図１２Ａにおけるデータはさらに、０時間でのＢＲＩＣＨＯＳ三量体の存在を示すが、一方でＡβペプチド（画分５〜６）は、２０時間後にＢＲＩＣＨＯＳ単量体と一緒に溶出する。
【０１６７】
例８
リガンドを用いたＡβ動態の実験
実験は、三量体／単量体比を恐らくは減少させる候補化合物の、組換えヒトｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳまたは組換えヒトＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳへの添加が、Ａβフィブリル形成の阻害に関してＢＲＩＣＨＯＳドメインの有効性を増加させ得るかどうか測定するために行った。
【０１６８】
Ａβペプチド調製
Ａβ（Ｍ１〜４０）およびＡβ（Ｍ１〜４２）を合成遺伝子由来の大腸菌で発現させ、記載したとおりのイオン交換およびサイズ排除工程を用いてバッチ形式で精製した。
【０１６９】
凝集動態
凝集動態は、プレートリーダ（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｏｆｆｅｎｂｅｒｇ、独国からのＦｌｕｏＳｔａｒ  Ｏｍｅｇａ）において時間の関数としてチオフラビンＴ（ＴｈＴ）蛍光強度を記録することによって試験した。蛍光は、４４０ｎｍの励起フィルターおよび４８０ｎｍの発光フィルターを用いて、透明底を有するハーフエリア９６ウェルＰＥＧコート黒ポリスチレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ３８８１）において底部の光学装置を用いて記録した。
【０１７０】
２０ｍＭのリン酸Ｎａ、２００μＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＮａＮ3、ｐＨ７．４および２０μＭのＴｈＴ中に６μＭのＡβ（Ｍ１〜４０）を含む各試料（１００μｌ）を、１２０ｎＭのｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳまたは３０ｎＭのＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳタンパク質とともに調製し、１：１または１：１０モル比のアセチル−ＹＹＹ−アミドペプチド、ＶＶＶペプチドまたはビス−ＡＮＳ（１，１’−ビス（４−アニリノ−５，５’−ナフタレンスルホネート））とともに３０分間プレインキュベートした。したがって、ｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳについて、１２０ｎＭまたは１．２μＭのトリペプチドまたはビス−ＡＮＳを用い、Ｂｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳについて、３０ｎＭまたは３００ｎＭのトリペプチドまたはビス−ＡＮＳを用いた。
【０１７１】
Ａβ（Ｍ１〜４０）フィブリル形成は、単独で、またはｐｒｏＳＰ−ＣもしくはＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳの存在下で、トリペプチドもしくはビス−ＡＮＳを用いてまたは用いずに試験した。試料を混合した直後に、９６ウェルプレートを３７℃でプレートリーダに入れ、読み取りの間に１００ｒｐｍで連続的に振とうしながら６分毎に蛍光を読み取った。
【０１７２】
結果
組換えヒトｐｒｏＳＰ−ＣまたはＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳ単独では、Ａβフィブリル形成の開始を遅延させ、すなわち、遅延期を延長させた。ｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳへの１２０ｎＭのビス−ＡＮＳの添加、またはＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳへの３００ｎＭのビス−ＡＮＳの添加は、フィブリル形成の開始の遅延を有意に強めた。ｐｒｏＳＰ−Ｃ  ＢＲＩＣＨＯＳについて、１２０ｎＭのビス−ＡＮＳの添加は、ラグタイムをほぼ倍加したが、一方でＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳへの３００ｎＭのビス−ＡＮＳの添加は、少なくとも３倍ラグタイムを延長させた。トリペプチドの添加は、Ａβフィブリル形成を遅延させるＢＲＩＣＨＯＳドメインの能力に対して検出可能な効果を示さなかった。
【０１７３】
これらの実験は、ヒトｐｒｏＳＰ−ＣまたはＢｒｉ２  ＢＲＩＣＨＯＳ含有タンパク質への特異的リガンドの添加が、Ａβフィブリル形成を遅延させるそれらの能力を増強させ得ること、およびこのようなリガンドは、本明細書で記載された手法を用いてスクリーニングされ得ることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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