(57)【要約】  式（Ｉ）で表されるイミダゾキノリンは、粘表皮癌細胞の成長又は増殖を阻害するために有用である。本発明によって提供される治療的及び予防的治療は、粘表皮癌細胞の成長又は増殖を阻害するために有効である量の式（Ｉ）の化合物を、それを必要とする患者に投与することによって実行される。【選択図】  図１
2014532057.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式の化合物、又は医薬的の受容可能なこれらの塩を、粘表皮癌細胞の成長又は増殖を阻害するために有効である量で、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、粘表皮癌細胞の成長又は増殖を阻害するための方法：
【化１】
2014532057.tif 000015
式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立にメチル又はエチルであり；
Ｒ３は、低級アルキルであり；そして
Ｒ４は、非置換の、又はハロゲン、シアノ、低級アルキル、低級アルコキシ、又は非置換の若しくは低級アルキルによって置換されたピペラジニルによって、置換されたピリジル；非置換の又は低級アルコキシによって置換されたピリミジニル；非置換の又はハロゲンによって置換されたキノリニル；或いはキノキサリニルである。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、全てメチルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ４がピリジルであって、非置換であるか、又は低級アルキル又は低級アルコキシによって置換されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ４が、非置換の又はハロゲンによって置換されたキノリニルである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記式（Ｉ）の化合物が、２−メチル−２−［４−（３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２，３−ジヒドロイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）−フェニル］プロピオニトリル、又は医薬的に受容可能なその塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記粘表皮癌細胞の成長又は増殖を阻害するために有効である式（Ｉ）の化合物或いは塩の量が、０．００１から１０００ｍｇ／ｋｇまでの範囲の投与される量である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
以下の式の化合物、又は医薬的に受容可能なこれらの塩を、粘表皮癌細胞の成長又は増殖を阻害するために有効である量で、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、粘表皮癌を治療するための方法：
【化２】
2014532057.tif 000016
式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立にメチル又はエチルであり；
Ｒ３は、低級アルキルであり；そして
Ｒ４は、非置換の、又はハロゲン、シアノ、低級アルキル、低級アルコキシ、又は非置換の若しくは低級アルキルによって置換されたピペラジニルによって置換された、ピリジル；非置換の又は低級アルコキシによって置換されたピリミジニル；非置換の又はハロゲンによって置換されたキノリニル；或いはキノキサリニルである。
【請求項８】
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、全てメチルである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｒ４が、非置換の又は低級アルキル又は低級アルコキシによって置換されたピリジルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ４が、非置換の又はハロゲンによって置換されたキノリニルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記式（Ｉ）の化合物が、２−メチル−２−［４−（３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２，３−ジヒドロイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）−フェニル］プロピオニトリル、又は医薬的に受容可能なその塩である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記粘表皮癌細胞の成長又は増殖を阻害するために有効である式（Ｉ）の化合物或いは塩の量が、０．００１から１０００ｍｇ／ｋｇまでの範囲の投与される量である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
以下の式：
【化３】
2014532057.tif 000017
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立にメチル又はエチルであり；
Ｒ３は、低級アルキルであり；そして
Ｒ４は、非置換の、又はハロゲン、シアノ、低級アルキル、低級アルコキシ、或いは非置換の又は低級アルキルによって置換されたピペラジニルによって、置換されたピリジル；非置換の又は低級アルコキシによって置換されたピリミジニル；非置換の又はハロゲンによって置換されたキノリニル；或いはキノキサリニルである］
の化合物、又は医薬的に受容可能なこれらの塩を、粘表皮癌細胞の成長又は増殖を阻害するために有効である量で、
ＰＤＥ４Ｂ阻害剤と組合せて、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、粘表皮癌細胞の成長又は増殖を阻害するための方法。
【請求項１４】
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、全てメチルである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ４が、非置換の又はハロゲンによって置換されたキノリニルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記式（Ｉ）の化合物が、２−メチル−２−［４−（３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２，３−ジヒドロイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）−フェニル］プロピオニトリル又は医薬的に受容可能なその塩である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＤＥ４Ｂ阻害剤が、ロリプラムである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
以下の式：
【化４】
2014532057.tif 000018
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立にメチル又はエチルであり；
Ｒ３は、低級アルキルであり；そして
Ｒ４は、非置換の、又はハロゲン、シアノ、低級アルキル、低級アルコキシ、或いは非置換の又は低級アルキルによって置換されたピペラジニルによって置換された、ピリジル；非置換の又は低級アルコキシによって置換されたピリミジニル；非置換の又はハロゲンによって置換されたキノリニル；或いはキノキサリニルである］
の化合物、又は医薬的に受容可能なこれらの塩を、粘表皮癌細胞の成長又は増殖を阻害するために有効である量で、
ＰＤＥ４Ｂ阻害剤と組合せて、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、粘表皮癌を治療するための方法。
【請求項１９】
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、全てメチルである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｒ４が、非置換の又はハロゲンによって置換されたキノリニルである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記式（Ｉ）の化合物が、２−メチル−２−［４−（３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２，３−ジヒドロイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）−フェニル］プロピオニトリル、又は医薬的に受容可能なその塩である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＰＤＥ４Ｂ阻害剤が、ロリプラムである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
所望によりＰＤＥ４Ｂ阻害剤と組合せて、粘表皮癌の治療において使用するための、以下の式：
【化５】
2014532057.tif 000019
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立にメチル又はエチルであり；
Ｒ３は、低級アルキルであり；そして
Ｒ４は、非置換の、又はハロゲン、シアノ、低級アルキル、低級アルコキシ、或いは非置換の又は低級アルキルによって置換されたピペラジニルによって置換された、ピリジル；非置換の又は低級アルコキシによって置換されたピリミジニル；非置換の又はハロゲンによって置換されたキノリニル；或いはキノキサリニルである；］
による化合物、又は医薬的に受容可能なその塩。
【請求項２４】
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、全てメチルである、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ４が、非置換の又はハロゲンによって置換されたキノリニルである、請求項２３又は２４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２６】
前記式（Ｉ）の化合物が、２−メチル−２−［４−（３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２，３−ジヒドロイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）−フェニル］プロピオニトリル又は医薬的に受容可能なその塩である、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２７】
前記化合物がＰＤＥ４Ｂ阻害剤と組合せて使用され、そして前記ＰＤＥ４Ｂ阻害剤がロリプラムである、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２８】
所望によりＰＤＥ４Ｂ阻害剤と組合せた、粘表皮癌の治療のための医薬の製造のための、以下の式：
【化６】
2014532057.tif 000020
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立にメチル又はエチルであり；
Ｒ３は、低級アルキルであり；そして
Ｒ４は、非置換の、又はハロゲン、シアノ、低級アルキル、低級アルコキシ、或いは非置換の又は低級アルキルによって置換されたピペラジニルによって、置換されたピリジル；非置換の又は低級アルコキシによって置換されたピリミジニル；非置換の又はハロゲンによって置換されたキノリニル；或いはキノキサリニルである］
による化合物、又は医薬的に受容可能なその塩の使用。
【請求項２９】
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、全てメチルである、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
Ｒ４が、非置換の又はハロゲンによって置換されたキノリニルである、請求項２８又は２９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３１】
前記式（Ｉ）の化合物が、２−メチル−２−［４−（３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２，３−ジヒドロイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）−フェニル］プロピオニトリル又は医薬的に受容可能なその塩である、請求項２８に記載の使用。
【請求項３２】
前記ＰＤＥ４Ｂ阻害剤が、ロリプラムである、請求項２８に記載の使用。
【請求項３３】
ＰＤＥ４Ｂ阻害剤、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤又はＰＤＥ４Ｂ阻害剤及びＰＩ３−キナーゼ阻害剤を、粘表皮癌細胞の成長又は増殖を阻害するために有効である量で、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、粘表皮癌細胞の成長又は増殖を阻害するための方法。
【請求項３４】
前記ＰＤＥ４Ｂ阻害剤が、ｓｈＲＮＡ、ロリプラム又はフォルスコリン及びこれらの組合せを含んでなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ｓｈＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及びこれらの組合せを含む群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
更に、以下の式：
【化７】
2014532057.tif 000021
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立にメチル又はエチルであり；
Ｒ３は、低級アルキルであり；そして
Ｒ４は、非置換の、又はハロゲン、シアノ、低級アルキル、低級アルコキシ、或いは非置換の又は低級アルキルによって置換されたピペラジニルによって置換された、ピリジル；非置換の又は低級アルコキシによって置換されたピリミジニル；非置換の又はハロゲンによって置換されたキノリニル；或いはキノキサリニルである］
の化合物、又は医薬的に受容可能なこれらの塩の有効な量を、患者に投与することを含んでなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＰＩ３−キナーゼ阻害剤が、ｓｈＲＮＡを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ｓｈＲＮＡが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及びこれらの組合せを含む、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願
[0001]本出願は、本明細書中に参考文献としてその全てが援用される、次の米国特許仮出願、２０１２年６月１５日に出願された６１／６６０，３７７号及び２０１１年９月３０日に出願された６１／５４１，７５８号の、Ｕ．Ｓ．Ｃ．３５、§１１９（ｅ）下の出願日の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府の支援による研究又は開発
[0002]本発明は、米国立衛生研究所によって授与された連邦認可番号ＣＡ−６６９９６下の政府支援によって行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]粘表皮癌（ＭＥＣ）は、最も普通の悪性唾液腺腫瘍であり、そして気管支腺由来の二番目に頻度の高い肺腫瘍である。更に、ＭＥＣは、気管、食道、乳房、膵臓、子宮頚部、及び甲状腺において起こることが報告されている。転移性ＭＥＣ腫瘍の全身的治療は、失望させるものであった。
【０００４】
[0004]唾液腺のＭＥＣのｔ（１１；１９）（ｑ２１；ｐ  １３）転座に関係する融合癌遺伝子が存在する；Ｔｏｎｏｎ，Ｇ．，Ｍｏｄｉ，Ｓ．，Ｗｕ，Ｌ．，Ｋｕｂｏ，Ａ．，Ｃｏｘｏｎ，Ａ．Ｂ．，Ｋｏｍｉｙａ，Ｔ．，Ｏ’Ｎｅｉｌ，Ｋ．，Ｓｔｏｖｅｒ，Ｋ．，Ｅｌ−Ｎａｇｇａｒ，Ａ．，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｋｉｒｓｃｈ，Ｉ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｋａｙｅ，Ｆ．Ｊ．；粘表皮癌中のｔ（１１；１９）（ｑ２１；ｐ１３）転座は、ノッチシグナル伝達経路を破壊する新規な融合産物を作成する。Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，２００３，３３：２０８−２１３。この転座は、全てのＭＥＣの８０％までにおいて、そして更に、ワルチン腫瘍及び皮膚の明細胞汗腺腫を含む幾つかの良性腫瘍においても検出される。転座は、ＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２と呼ばれる融合タンパク質をコードし、これは、ＣＲＥＢ調節因子ＣＲＴＣ１のＮ末端ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ反応性配列結合タンパク質）結合領域の４２個のアミノ酸、及びノッチ活性化補助因子ＭＡＭＬ２のＣ末端のトランス活性化領域（ＴＡＤ）からの９８１個のアミノ酸からなる。ＭＡＭＬ２は、ノッチ活性化補助因子のマスターマインド（ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ）ファミリータンパク質のメンバーであり、そしてノッチシグナル伝達のために必要である。ＣＲＴＣ１（更にＭＥＣＴ１、ＴＯＲＣ１又はＷＡＭＴＰ１としても知られる）は、保存されたＣＲＥＢ活性化補助因子のファミリーに属する（１４、１５）。ＣＲＴＣ１のＣＲＥＢへの結合は、ＣＲＥＢ複合体に対するＴＡＦＩＩ１３０の補充を向上し、そして従って下流のシグナル伝達を活性化する。
【０００５】
[0005]ＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２が癌遺伝子である豊富な証拠が存在する。例えば、ＭＡＭＬ２の過剰発現ではないＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２の異所性発現は、しかし、病巣形成を誘導した。Ｔｏｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，前出。更に、ＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２形質転換ＲＫ３Ｅ細胞のヌードマウスへの注射は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍形成を起こし、そして融合の継続した発現がこれらのマウスにおける腫瘍形成に必要であった。Ｋｏｍｉｙａ，Ｔ．，Ｐａｒｋ，Ｙ．，Ｍｏｄｉ，Ｓ．，Ｃｏｘｏｎ，Ａ．Ｂ．，Ｏｈ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｋａｙｅ，Ｆ．Ｊ．；Ｍｅｃｔｌ−Ｍａｍｌ２の継続した発現は、ｔ（１１；１９）転座を保有する唾液腺癌中の腫瘍細胞増殖のために必須である。Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００６，２５／６１２８−６１３２。ＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２が、恒常的に活性化されたＣＲＥＢシグナル伝達によって、多数のｃＡＭＰ／ＣＲＥＢ遺伝子を活性化することが報告されている。Ｗｕ，Ｌ．，Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｇａｏ，Ｐ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｍ．，Ｃａｏ，Ｙ．，Ｓｈｅｎ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｊ．Ｄ．；ＭＥＣＴ１−ＭＡＭＬ２融合腫瘍性タンパク質の形質転換活性は、恒常的ＣＲＥＢ活性化によって仲介される。Ｅｍｂｏ  Ｊ，２００５，２４：２３９１−２４０２  ａｎｄ  Ｃｏｘｏｎ，Ａ．，Ｒｏｚｅｎｂｌｕｍ，Ｅ．，Ｐａｒｋ，Ｙ．Ｓ．，Ｊｏｓｈｉ，Ｎ．，Ｔｓｕｒｕｔａｎｉ，Ｊ．，Ｄｅｎｎｉｓ，Ｐ．Ａ．，Ｋｉｒｓｃｈ，Ｉ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｋａｙｅ，Ｆ．Ｊ．；サイクリックＡＭＰ／ＣＲＥＢの異常な活性化に関連するＭｅｃｔｌ−Ｍａｍｌ２融合癌遺伝子は、遺伝子を制御する。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５，６５／７１３７−７１４４。この報告は、ＣＲＴＣ１モチーフが、強力な活性化補助因子ＭＡＭＬ２をＣＲＥＢに向け直すモデルと一致する。ＣＲＥＢ結合領域及びＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２のＴＡＤの両方が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの病巣形成を誘導する融合のために必要であることも更に証明されている。Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，前出。ＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２が、ＭＥＣにおいてその高頻度で結合する癌遺伝子である直接の証拠は、このＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２タンパク質又はその下流の標的が、治療的に興味あるものであることを示唆する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｏｎｏｎ，Ｇ．，Ｍｏｄｉ，Ｓ．，Ｗｕ，Ｌ．，Ｋｕｂｏ，Ａ．，Ｃｏｘｏｎ，Ａ．Ｂ．，Ｋｏｍｉｙａ，Ｔ．，Ｏ’Ｎｅｉｌ，Ｋ．，Ｓｔｏｖｅｒ，Ｋ．，Ｅｌ−Ｎａｇｇａｒ，Ａ．，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｋｉｒｓｃｈ，Ｉ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｋａｙｅ，Ｆ．Ｊ．；Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，２００３，３３：２０８−２１３；
【非特許文献２】Ｋｏｍｉｙａ，Ｔ．，Ｐａｒｋ，Ｙ．，Ｍｏｄｉ，Ｓ．，Ｃｏｘｏｎ，Ａ．Ｂ．，Ｏｈ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｋａｙｅ，Ｆ．Ｊ．；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００６，２５／６１２８−６１３２；
【非特許文献３】Ｗｕ，Ｌ．，Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｇａｏ，Ｐ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｍ．，Ｃａｏ，Ｙ．，Ｓｈｅｎ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｊ．Ｄ．；Ｅｍｂｏ  Ｊ，２００５，２４：２３９１−２４０２；
【非特許文献４】Ｃｏｘｏｎ，Ａ．，Ｒｏｚｅｎｂｌｕｍ，Ｅ．，Ｐａｒｋ，Ｙ．Ｓ．，Ｊｏｓｈｉ，Ｎ．，Ｔｓｕｒｕｔａｎｉ，Ｊ．，Ｄｅｎｎｉｓ，Ｐ．Ａ．，Ｋｉｒｓｃｈ，Ｉ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｋａｙｅ，Ｆ．Ｊ．；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５，６５／７１３７−７１４４。
【発明の概要】
【０００７】
[0006]本出願は、粘表皮癌細胞の成長又は増殖を阻害するための方法に関し、該方法は、以下の式（Ｉ）の化合物、又は医薬的に受容可能なこれらの塩を、粘表皮癌細胞の成長又は増殖を阻害するために有効な量で、それを必要とする患者に投与することを含む。
【０００８】
【化１】
2014532057.tif 000003
【０００９】
上記式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立にメチル又はエチルであり；
Ｒ３は、低級アルキルであり；そして
Ｒ４は、ピリジルであって、非置換の、又はハロゲン、シアノ、低級アルキル、低級アルコキシによって置換されたもの、或いは非置換の又は低級アルキルによって置換されたピペラジニル；非置換の又は低級アルコキシによって置換されたピリミジニル；非置換の又はハロゲンによって置換されたキノリニル；或いはキノキサリニルである。
【００１０】
[0007]本発明は、更に、式（Ｉ）の化合物を、粘膜表皮細胞の成長又は増殖を阻害するために有効である量で、それを必要とする患者に投与することを含んでなる粘表皮癌を治療するための方法に関する。
【００１１】
[0008]更なる態様において、本発明は、式（Ｉ）の化合物を、ＰＤＥ４Ｂ阻害剤と組合せて、粘膜表皮細胞の成長又は増殖を阻害するために有効である量で、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、粘表皮癌細胞の成長又は増殖を阻害するための方法に関する。
【００１２】
[0009]なお更なる態様において、本発明は、式（Ｉ）の化合物を、ＰＤＥ４Ｂ阻害剤と組合せて、粘膜表皮細胞の成長又は増殖を阻害するために有効である量で、それを必要とする患者に投与することを含んでなる粘表皮癌を治療するための方法に関する。
【００１３】
[0010]更なる態様において、本発明は、ＰＤＥ４Ｂ阻害剤、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤、又はＰＤＥ４Ｂ阻害剤及びＰＩ３−キナーゼ阻害剤を、粘膜表皮細胞の成長又は増殖を阻害するために有効である量で、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、粘表皮癌細胞の成長又は増殖を阻害するための方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】[0011]図１は、ＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２標的遺伝子の識別を例示する。Ａ．ｑＰＣＲ解析を、ルシフェラーゼ（ｓｈＬＵＣ）対照と比較した、Ｈ２９２及びＨ３１１８細胞中のｓｈＲＮＡ＃Ｄ及び＃Ａで下方制御されたＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２発現を示す。ＲＴ−ｑＰＣＲ実験は、三重で行われた。カラム：平均値、バー：ＳＤ（ｎ＝３）。＊ｓｈＬＵＣ感染細胞からの発現と比較して、ｐ＜０．０５（スチューデントｔ検定）。Ｂ．ＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２で阻害されたＨ３１１８及びＨ２９２細胞増殖の阻害。カラム：平均値、バー：ＳＤ（ｎ＝３）。＊ｓｈＬＵＣと比較して、ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｃ．ｑＰＣＲ解析は、ＰＤＥ４Ｂ発現が、ＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２のノックダウンによるＨ２９２及びＨ３１１８細胞中で下方制御されることを示した。＊ｓｈＲＵＣで感染した細胞からのＲＮＡ発現と比較して、ｐ＜０．０５。カラム：平均値、バー：ＳＤ（ｎ＝３）。Ｄ．ウェスタンブロット解析は、ＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２ノックダウン後のＰＤＥ４Ｂタンパク質の下方制御を示した。＊は、非特異的バンドを示す。画像をフォトショップで収集し、そして自動的にレベルを合わせた。三つの独立の実験の代表である。
【図２】[0012]図２は、融合陽性ＭＥＣ細胞における細胞増殖を防止し、細胞周期の停止を起こし、そしてアポトーシスを誘発する薬理学的阻害剤のロリプラムとフォルスコリンによる、ＰＤＥ４Ｂの阻害を例示する。ロリプラム（Ｒ）、フォルスコリン（ＦＫ）、ロリプラムとフォルスコリン（Ｒ＋ＦＫ）又はＤＭＳＯ。カラム：平均値、バー：ＳＤ（ｎ≧３）。＊ＨＳＹ細胞増殖と比較して、ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｂ．１×１０５細胞を、５０μＭのＲと２０μＭのＦＫ又はＤＭＳＯで２４時間処理した。Ｃ．１×１０５個の細胞を、５０μＭのロリプラムと２０μＭのフォルスコリン又はＤＭＳＯで４８時間処理した。アポトーシスアッセイを、ＰＩ及びアネキシンＶ染色によって行い、そしてフローサイトメトリーによって分析した。カラム：平均値、バー：ＳＤ（ｎ＝３）。＊ＤＭＳＯ処理細胞増殖と比較して、ｐ＜０．０５。
【図３】[0013]図３は、融合陽性ＭＥＣ細胞の増殖を阻害し、細胞周期の停止を起こし、そしてアポトーシスを誘発するＰＤＥ４Ｂのノックダウンを例示する。Ａ．Ｈ３１１８細胞のライセートを形質導入後５日目に調製し、そしてウェスタンブロット解析にかけた。画像をフォトショップで収集し、そして自動的にレベルを合わせた。三つの独立の実験の代表である。Ｂ．１×１０５個のＭＥＣ細胞を、ｓｈＲＮＡ１番及び２番によって二回感染し、そして細胞数を、トリパンブルー排除によって形質移入の５日後に数えた。カラム：平均値、バー：ＳＤ（ｎ≧３）。＊混合対照のウイルスで感染した細胞の増殖と比較して、ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。Ｃ．１×１０５細胞を、ｓｈＲＮＡ２番によって二回感染した。細胞周期を、ＰＩ染色、それに続く形質移入後５日目のＦＡＣＳ解析によって、ｎ＝３で決定した。Ｄ．１×１０５個の細胞を、ｓｈＲＮＡ２番によって二回感染した。アポトーシスアッセイを、ＰＩ及びアネキシンＶ染色によって行い、そして形質移入の５日後にフローサイトメトリーによって分析した。カラム：平均値、バー：ＳＤ（ｎ＝３）。＊対照細胞と比較して、ｐ＜０．０５。
【図４】[0014]図４は、ＰＤＥ４Ｂで阻害されたＭＥＣ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏの増殖のノックダウンを例示する。Ａ．ＳＣＩＤ無毛マウスにおける腫瘍体積。点：５個の腫瘍の平均、バー：ＳＤ（ｎ＝５）。＊＊＊対照腫瘍と比較してｐ＜０．００１。Ｂ．３０日目の犠牲後のマウスから切断された腫瘍の代表的な写真である。５対（ｓｈＰＤＥ４Ｂ対混合対照）の腫瘍を示す（ｎ＝５）。Ｃ．ＳＣＩＤ無毛マウスからの腫瘍重量。腫瘍を３０日目の犠牲において秤量した。カラム：平均値、バー：ＳＤ（ｎ＝５）。＊＊＊対照細胞と比較して、ｐ＜０．００１。Ｄ．腫瘍生検からのＰＤＥ４Ｂ発現のＲＴ−ｑＰＣＲ解析。カラム：平均値、バー：ＳＤ（ｎ＝３）。＊＊＊対照腫瘍と比較して、ｐ＜０．００１。
【図５】[0015]図５は、ＰＤＥ４Ｂで増加された細胞内ｃＡＭＰレベル及び阻害されたＰＩ３−キナーゼシグナル伝達の阻害を例示する。Ａ．薬理学的阻害剤のロリプラムとフォルスコリン処理は、ＭＥＣ細胞中のｃＡＭＰレベルを増加した。カラム：平均値、バー：ＳＤ（ｎ＝３）。Ｂ．ＰＤＥ４Ｂで増加されたＭＥＣ細胞のｃＡＭＰレベルのノックダウン。ｎ＝３。＊＊対照細胞と比較して、ｐ＜０．０１。カラム：平均値、バー：ＳＤ（ｎ＝３）。Ｃ．ウェスタンブロット解析は、Ｈ３１１８細胞中の５０μＭのロリプラムと２０μＭのフォルスコリン処理の３０分後の、ホスホ−ＡＫＴレベル示した。同一ブロットを剥離し、そしてＡＫＴ又はβ−アクチン抗体で探索した。画像をフォトショップで収集し、そして自動的にレベルを合わせた。三つの独立の実験の代表である。Ｄ．ウェスタンブロット解析は、ＰＤＥ４Ｂノックダウン後のホスホ−ＡＫＴレベルを示した。
【図６】[0016]図６は、ＰＩ３−キナーゼシグナル伝達が、ＭＥＣ細胞増殖に寄与することを例示する。Ａ．ＰＩ３−キナーゼ阻害剤のＬＹ−２９４００２又は化合物ＡのＭＥＣ細胞増殖に対する効果。（左）ウェスタンブロット解析は、阻害剤処理の１時間後のＨ３１１８細胞中のホスホ−ＡＫＴレベルを示した。同一ブロットを剥離し、そして抗−ＡＫＴ又は抗−β−アクチン抗体で探索した。画像をフォトショップで収集し、そして自動的にレベルを合わせた。三つの独立の実験の代表である。（右）ＭＥＣ細胞の増殖を、ＬＹ−２９４００２又は化合物Ａ処理の５日目にＭＴＳアッセイによって測定した。点：平均値、バー：ＳＤ（ｎ＝３）。Ｂ．ＭＥＣ細胞の増殖に対するＰＩ３−キナーゼα又はβのノックダウンの効果である。（上）ウェスタンブロット解析は、レンチウイルス感染後のＰＩ３−キナーゼα又はβタンパク質レベルを示す。Ｈ３１１８細胞ライセートを、形質移入後５日目に調製した。画像をフォトショップで収集し、そして自動的にレベルを合わせた。（下）ＭＥＣ細胞の増殖に対するＰＩ３−キナーゼα又はβのノックダウンの効果。１×１０５個の細胞を、ＰＩ３−Ｋα、β又は混合対照を標的とするレンチウイルスを内部に持つｓｈＲＮＡで２回形質移入した。細胞の数を、形質移入後５日目にトリパンブルー排除によって数えた。混合対照ウイルスで感染した細胞の細胞の増殖を１００％に設定した、カラム：平均値、バー：ＳＤ（ｎ＝３）。＊＊対照細胞と比較して、ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｃ．ＭＥＣ細胞の増殖に対するロリプラムとフォルスコリンと組合せた化合物Ａの効果。１×１０５個の細胞を記載した阻害剤の組合せで処理した。細胞の数を、形質移入後５日目にトリパンブルー排除によって数えた。カラム：平均値、バー：ＳＤ（ｎ＝３）。
【図７】[0017]図７は、ｓｈＲＮＡ＃Ａ及び＃Ｄを内部に持つレトロウイルスで感染されたＭＥＣ細胞におけるＭＡＭＬ２発現の下方制御を示すｑＰＣＲ解析を例示する。全ＲＮＡを形質移入後４８時間目に収集し、そして実験を三重で行った。カラム：平均値、バー：ＳＤ（ｎ＝３）。＊ｓｈＬＵＣ処理細胞と比較して、ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図８】[0018]図８は、アレイ解析からのＨ３１１８細胞中のノッチ標的遺伝子ＨＥＳ２及び既知のＣＲＥＢ標的遺伝子の発現の変化のｑＰＣＲ検証を例示する。カラム：平均値、バー：ＳＤ（ｎ＝３）。
【図９−１】[0019]図９は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａ  ｐｌｕｓ＿２マイクロアレイを使用してＨ３１１８細胞中でノックダウンされたＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２によって制御された遺伝子を例示する表である（カットオフ倍率≧３又は≦−３、ｐ≦０．０５）。
【図９−２】同上。
【図９−３】同上。
【図９−４】同上。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
[0020]本発明は、式（Ｉ）に記載されるようなイミダゾキノリンが、粘表皮癌細胞の成長又は増殖を阻害するために有用であることの発見に関する。本発明によって提供される治療的及び予防的治療は、粘表皮癌細胞の成長又は増殖を阻害するために、又は粘表皮癌の治療のために有効である量の式（Ｉ）の化合物を、それを必要とする患者に投与することによって実行される。更なる態様において、イミダゾキノリンは、ＰＥＤ４Ｂ阻害剤との組合せで投与される。更なる態様において、ＰＤＥ４Ｂ阻害剤は、粘表皮癌細胞の成長又は増殖を阻害するために、或いは粘表皮癌の治療のために有効である量で投与される。
【００１６】
[0021]本明細書中で先に及び以下に使用される一般的用語は、好ましくは他に示さない限り、本開示の文脈内で、以下の意味を有する：
[0022]接頭辞“低級”は、７個を含み、そして最大その個数までの炭素原子、好ましくは１から４個までの炭素原子を有するラジカルを意味し、当該ラジカルは直鎖又は分枝鎖の何れかである。
【００１７】
[0023]化合物、塩、等に対して複数の形態が使用された場合、これは、単一の化合物、塩、等も更に意味すると見做される。
【００１８】
[0024]好ましい態様において、“アルキル”は、最大１２個までの炭素原子を有し、そして特に低級アルキルである。
【００１９】
[0025]“低級アルキル”は、好ましくは、１個を含み、そしてその個数から、７個を含みその個数までの炭素原子、好ましくは、１ないし４個の炭素原子を持つ“アルキル”であり、そして直鎖又は分枝鎖である；好ましくは、低級アルキルは、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチルのようなブチル、ｎ−プロピル又はイソプロピルのようなプロピル、エチル或いは好ましくはメチルである。
【００２０】
[0026]“シクロアルキル”は、好ましくは環中に、３個を含み、そしてその個数から６個を含み、そしてその個数までの炭素原子を持つシクロアルキルである；シクロアルキルは、好ましくはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル又はシクロヘキシルである。
【００２１】
[0027]用語“ハロゲン”は、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素を指す。
【００２２】
[0028]ハロゲンで置換された“アルキル”は、好ましくはトリフルオロメチルのようなペルフルオロアルキルである。
【００２３】
[0029]本明細書中で使用される場合、用語、粘表皮癌細胞を“阻害する”、“阻害すること”、又は“成長又は増殖を阻害すること”は、粘表皮細胞増殖を遅延、妨害、抑止又は停止することを指し、そして必ずしも粘表皮癌細胞の増殖の完全な排除を示さない。用語“阻害する”及び“阻害すること”、等は、二つの状態の量的差を意味し、少なくとも二つの状態間の統計的に有意な差を指す。例えば、“粘表皮癌細胞の増殖を阻害するために有効な量”は、細胞の増殖の速度が、未処理の細胞から少なくとも統計的に有意に異なっているものであることを意味する。このような用語は、本明細書中で、例えば細胞増殖の速度に対して適用される。
【００２４】
[0030]本発明の文脈内で、“治療すること”、“治療する”、又は“治療”は、疾患又は疾病に伴う症状の軽減、或いはこれらの症状の更なる進行又は悪化の停止、或いは疾病又は疾患の防止又は予防を意味する。例えば、本発明の文脈内で、好結果な治療は、粘表皮癌に関連する症状の軽減、又はＰＨＴＳのような疾病の進行の停止を含むことができる。
【００２５】
[0031]“粘表皮癌”は、三つの細胞要素：扁平細胞、粘液分泌細胞、及び中間細胞を、変化する比率で含有する腫瘍の特徴的型を指す。粘表皮癌は、最も普通の悪性唾液腺腫瘍であり、そして気管支腺由来の二番目に高頻度の肺腫瘍である。
【００２６】
[0032]本明細書中で使用する場合、用語“医薬的に受容可能な塩”は、例えば、好ましくは有機又は無機酸との酸付加塩として、塩基性窒素原子を持つ式Ｉの化合物から形成される塩、特に医薬的に受容可能な塩を含む。適した無機酸は、例えば、塩酸のようなハロゲン酸、硫酸、又はリン酸である。適した有機酸は、例えば、カルボン酸、ホスホン酸、スルホン酸又はスルファミン酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸、グリコール酸、乳酸、フマル酸、コハク酸、マロン酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、グルタミン酸又はアスパラギン酸のようなアミノ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、シクロヘキサンカルボン酸、アダマンタンカルボン酸、安息香酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、フタル酸、フェニル酢酸、マンデリン酸、桂皮酸、メタン又はエタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、１，５−ナフタレン−ジスルホン酸、２−又は３−メチルベンゼンスルホン酸、メチル硫酸、エチル硫酸、ドデシル硫酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸、Ｎ−メチル−、Ｎ−エチル−又はＮ−プロピル−スルファミン酸、或いはアスコルビン酸のような他の有機プロトン酸である。
【００２７】
[0033]用語“ＰＤＥ４Ｂ阻害剤”は、ＰＤＥ４Ｂの発現又は活性を阻害することが可能ないずれもの化合物、即ち、特に遺伝子の転写、ＲＮＡの変異、ｍＲＮＡの翻訳、タンパク質の翻訳後修飾、タンパク質の酵素活性、同一物の基質との相互作用、等を阻害するいずれもの化合物を指す。幾つかの態様において、ＰＤＥ４Ｂ阻害剤は、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列であることができる。用語“低分子ヘアピン型ＲＮＡ”又は“ｓｈＲＮＡ”は、ＲＮＡ干渉により遺伝子発現を発現停止するために使用することができる緊密なヘアピンターンを産生するＲＮＡ配列を有するＲＮＡ分子を指す。ｓｈＲＮＡのヘアピン構造は、細胞機構によってｓｉＲＮＡに開裂され、これは、次いでＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合される。この複合体は、ｍＲＮＡに結合し、そしてそれを開裂し、これは、それに結合するｓｉＲＮＡに適合する。ｓｉＲＮＡの配列は、完全長の標的遺伝子、又はそのサブシーケンスに対応することができる。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの二重鎖部分のヌクレオチド配列が、標的化遺伝子のヌクレオチド配列に実質的に相補的であることにおいて、遺伝子に“標的化”される。ｓｉＲＮＡ配列の二重鎖は、相補的塩基対相互作用によりｓｉＲＮＡ及び標的ＲＮＡを一緒にするために十分な長さである必要がある。本発明のｓｉＲＮＡの長さは、変化することができる。ｓｉＲＮＡの長さは、好ましくは１０個のヌクレオチドに等しいか又はその個数より多く、そして標的ＲＮＡと安定的に相互作用するために十分な長さ；具体的には１０−３０個のヌクレオチド；更に具体的には、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０のような、１０ないし３０個間のいずれもの整数のヌクレオチドである。“十分な長さ”によって、１０個のヌクレオチドと等しいか又はその個数より多いヌクレオチドを意味し、これは、予測される条件下で意図する機能を提供するために十分に大きい長さである。ｓｈＲＮＡは、組換えＤＮＡ技術を使用してベクターにクローン化することができる。
【００２８】
[0034]二つ又はそれより多い核酸或いはポリペプチド配列の文脈における、用語“実質的に同一な”又は“実質的な同一性”は、同一或いは、比較領域或いは次の配列比較アルゴリズムの一つを使用して又は人為的整列及び視覚検査によって測定されるような、指定された領域にわたる最大の一致のために比較され、そして整列された場合に、同一であるか、或いは規定されたパーセントに同一であるアミノ酸残基又はヌクレオチド（即ち、規定された領域にわたって、少なくとも約６０％、好ましくは６５％、７０％、７５％、好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性）を有する、二つ又はそれより多い配列或いは複数の配列を指す。この定義は、文脈が示す場合、更に、ＤＮＡヌクレオチドに対して相補的なＲＮＡヌクレオチドのような配列の補体を類似的に指す。好ましくは、実質的な同一性は、少なくとも約６−７個のアミノ酸又は２５個のヌクレオチドの長さの領域にわたって存在する。
【００２９】
[0035]配列同一性及び配列類似性のパーセントを決定するために適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２中に記載されている。ＢＬＡＳＴは、本発明の核酸及びタンパク質に対する配列同一性のパーセントを決定するために、本明細書中に記載されるパラメーターと共に使用される。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を経由して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、先ず問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを確認することによって高スコアの配列ペア（ＨＳＰ）を確認することを含み、これは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列した場合、幾つかの正の値の閾値スコアＴに合致するか、又はそれを満足するかのいずれかである。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，前出）と呼ばれる。これらの最初の隣接ワードの的中は、それらを含有する更に長いＨＳＰを発見するための検索を開始するための種配列としての役割を果たす。このワードの的中は、累積整列スコアを増加することができる限り、それぞれの配列に沿って両方の方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に対して、パラメータＭ（適合残基のペアに対する報酬スコア；常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基に対する懲罰スコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列に対して、スコアリング行列が、累積スコアを計算するために使用される。ワード的中のそれぞれの方向への延長は、累積整列スコアがその達成される最大値からＸだけの量減少した時に;一つ又はそれより多い負のスコアの残基整列の蓄積のために、累積スコアが０又はそれ以下になった時に;或いはいずれかの配列の末端に達したときに停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、整列の感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に対して）は、デフォルトとして、１１個のワード長（Ｗ）、１０個の（ｏｒ）期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に対して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３個のワード長、１０個の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）を参照されたい）、５０個の整列（Ｂ）、１０個の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。
【００３０】
[0036]ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、更に二つの配列間の類似性の統計的解析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって与えられる類似性の一つの測定値は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、それによって、二つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の適合が、偶然に起きる可能性の指標を与える。例えば、核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小和確率が、約０．２より少ないか、更に好ましくは約０．０１より少ない、そして最も好ましくは約０．００１より少ない場合、参照配列に対して類似であると考えられる。
【００３１】
[0037]特別な態様において、化合物は、ＰＤＥ４Ｂ若しくはＡＫＡＰ１又はＧＡＢＡ（Ａ）ＲＡＰＬ１遺伝子の転写を、或いは対応するメッセンジャーの翻訳を阻害することが可能なアンチセンス核酸である。アンチセンス核酸は、ＰＤＥ４Ｂ若しくはＡＫＡＰ１又はＧＡＢＡ（Ａ）ＲＡＰＬ１遺伝子の配列の全て又は一部、これらの断片、ＰＤＥ４Ｂ若しくはＡＫＡＰ１又はＧＡＢＡ（Ａ）ＲＡＰＬ１メッセンジャー、或いは同一物に対して相補的な配列を含んでなることができる。特に、アンチセンス分子は、ジェンバンク配列番号ＡＦ２０８０２３の２１８−２３８３又はジェンバンク配列番号ＮＭ．ｓｕｂ．−００２６００の７６６−２４６０間で構成される配列に対して相補的な領域を含んでなることができ、そしてタンパク質へのこれらの翻訳を阻害（又は減少）する。アンチセンス分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイム、等であることができる。これは、一本鎖又は二本鎖であることができる。これは、更にアンチセンス遺伝子によってコードされるＲＮＡであることもできる。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、これは、典型的には１００個より少ない塩基、例えば概略１０ないし５０個の塩基を含んでなる。前記のオリゴヌクレオチドは、その安定性、そのヌクレアーゼに対する耐性、その細胞への浸透、等を改良するために修飾することができる。
【００３２】
[0038]幾つかの態様において、本発明の実行は、他に示さない限り、当技術の技能の範囲内の分子生物学、免疫学、微生物学、細胞生物学及び組換えＤＮＡの慣用的な技術を使用するものである。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ））；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ａｎｄ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））．ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ  ＆  ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．Ｉ  ＆  ＩＩ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．）を参照されたい。
【００３３】
[0039]もう一つの態様によれば、化合物は、例えば、ＰＤＥ４Ｂタンパク質の領域を含んでなり、そして同一物の活性と拮抗することが可能なペプチドである。
【００３４】
[0040]もう一つの態様によれば、化合物は、天然又は合成の、特に植物、細菌、ウイルス、動物、真核生物、合成又は半合成起源の有機又は無機分子の、ＰＤＥ４Ｂの発現又は活性を調節することが可能な化学化合物である。ＰＤＥ４Ｂ阻害剤である化学化合物の例は、ロリプラム、エタゾレート、シロミラスト、及びピクラミラスト（ｐｉｃｌａｍｉｌａｓｔ）を含む。
【００３５】
[0041]ＰＤＥ４阻害剤の更なる例は、次を含む：
[0042]アロフィリン；シロミラスト（Ａｒｉｆｌｏ、ＳＢ−２０７，４９９）（気管支収縮、粘液分泌過多、及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に伴う気道再構築を標的とする抗炎症性効果を持つ第二世代のＰＤＥ４阻害剤（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ  Ｂ．；Ｇｕｉｄｅｒ，Ａｉｍｅｅ；Ｆｏｒｓｔｅｒ，Ｃｏｒｎｅｌｉａ  Ｊ．；Ｇｌｅａｓｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｇ．；Ｂｅｎｄｅｒ，Ｐａｕｌ  Ｅ．；Ｋａｒｐｉｎｓｋｉ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｍ．；Ｄｅｗｏｌｆ，，Ｗａｌｔｅｒ  Ｅ．；Ｂａｒｎｅｔｔｅ，Ｍａｒｙ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）“１，４−Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｓ：Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｏｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ４  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｓｔｈｍａ”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１  （６）：８２１）；ＣＰ−８０６３３；Ｄｅｎｂｕｔｙｌｌｉｎｅ；ドロタベリン（Ｄｒｏｔａｖｅｒｉｎｅ）（ＩＮＮ、Ｄｒｏｔａｖｅｒｉｎとしても知られる）（アヘンアルカロイドのパパべリンに構造的に関連する鎮痙剤）；エタゾレート（ＳＱ−２０，００９、ＥＨＴ−０２０２）（抗不安剤；ピラゾロピリジン誘導体（Ｈａｌｌ，Ｊｕｄｉｔｈ  Ａ．；Ｍｏｒｔｏｎ，Ｉａｎ（１９９９）Ｃｏｎｃｉｓｅ  ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｇｅｎｔｓ：ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｓｙｎｏｎｙｍｓ．Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ．ＩＳＢＮ  ０−７５１４−０４９９−３；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｍ  Ｍａｙ  １９８３）“Ａｎｘｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｎｘｉｏｌｙｔｉｃｓ”．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６（５）：６１９−２８．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊｍ００３５９ａ００１．ＰＭＩＤ  ６１３２９９７；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｍ，Ｒｉｓｌｅｙ  ＥＡ（Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９７９）“Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ３Ｈ−ｄｉａｚｅｐａｍ  ｔｏ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＳＱ  ２０００９，Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｘｉｏｌｙｔｉｃ，ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ（ＧＡＢＡ）ａｎｄ  ｍｕｓｃｉｍｏｌ”．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２４（９）：８３３−４１．ｄｏｉ：１０．１０１６／００２４−３２０５（７９）９０３６７−９．ＰＭＩＤ  ４４９６２３）。
【００３６】
エタゾレートは、バルビツール酸結合部位において、ＧＡＢＡＡ受容体の正のアロステリック調節物質として、Ａ１及びＡ２サブタイプのアデノシンアンタゴニストとして、そしてＰＤＥ４アイソフォームに対して選択的なホスホジエステラーゼ阻害剤として作用する（Ｃｈａｓｉｎ  Ｍ，Ｈａｒｒｉｓ  ＤＮ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＭＢ，Ｈｅｓｓ  ＳＭ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９７２）“１−Ｅｔｈｙｌ−４−（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｉｄｅｎｅｈｙｄｒａｚｉｎｏ）−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｏ−（３，４−ｂ）−ｐｙｒｉｄｉｎｅ−５−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ，ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＳＱ  ２０００９）−ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｎｅｗ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｃ  ３’，５’−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅｓ”．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２１（１８）：２４４３−５０．ｄｏｉ：１０．１０１６／０００６−２９５２（７２）９０４１４−５。ＰＭＩＤ  ４３４５８５９；Ｗａｎｇ  Ｐ，Ｍｙｅｒｓ  ＪＧ，Ｗｕ  Ｐ，Ｃｈｅｅｗａｔｒａｋｏｏｌｐｏｎｇ  Ｂ，Ｅｇａｎ  ＲＷ，Ｂｉｌｌａｈ  ＭＭ（Ｍａｙ  １９９７）“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃＡＭＰ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ（ＰＤＥ４）ｓｕｂｔｙｐｅｓ  Ａ，Ｂ，Ｃ，ａｎｄ  Ｄ”．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２３４（２）：３２０−４．ｄｏｉ：１０．１００６／ｂｂｒｃ．１９９７．６６３６。ＰＭＩＤ９１７７２６８；Ｇｒｅｓｅｌｅ，Ｐａｏｌｏ；Ｇｒｅｓｅｌｅ，  Ｐ．（２００２）Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．ＩＳＢＮ  ０−５２１−８０２６１−Ｘ；フィラミナスト（Ｆｉｌａｍｉｎａｓｔ）（主要な適応症は、喘息及びＣＯＰＤ治療である（Ｇｉｅｍｂｙｃｚ，Ｍ  Ａ（２００８）“Ｃａｎ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ＰＤＥ４  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｂｅ  ｒｅａｌｉｚｅｄ：ｇｕａｒｄｅｄ  ｏｐｔｉｍｉｓｍ  ｏｒ  ｗｉｓｈｆｕｌ  ｔｈｉｎｋｉｎｇ？”．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １５５（３）：２８８．ｄｏｉ：１０．０３８／ｂｊｐ．２００８．２９７。ＰＭＣ  ２５６７８８９。ＰＭＩＤ  １８６６０８３２）；グラウシン（幾つかの異なった植物種中に見出されるアルカロイド；気管支拡張及び抗炎症効果を有し、ＰＤＥ４阻害剤及びカルシウムチャンネル遮断剤として作用し、そして幾つかの国では鎮咳剤として医薬的に使用される（Ｒｕｈｌｅ  ＫＨ，Ｃｒｉｓｃｕｏｌｏ  Ｄ，Ｄｉｅｔｅｒｉｃｈ  ＨＡ，Ｋｏｈｌｅｒ  Ｄ，Ｒｉｅｄｅｌ  Ｇ．Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｘｔｒｏｍｅｔｈｏｒｐｈａｎ  ａｎｄ  ｇｌａｕ��ｉｎｅ  ａｓ  ａｎｔｉｔｕｓｓｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．１９８４  Ｍａｙ；１７（５）：５２１−４．ＰＭＩＤ  ６３７５７０９）；ＨＴ−０７１２（実験的な認知向上剤（向知性剤））；ＩＣＩ−６３１９７；イブジラスト（現時点の開発コード：ＡＶ−４１１又はＭＮ−１６６）  は、日本において主として使用されている抗炎症剤である；喘息及び脳卒中の治療において主として使用される神経保護及び気管支拡張剤。その阻害作用は、ＰＤＥ４に対して最大であるが、然しながら、これは更に、他のＰＤＥサブタイプに対しても有意な阻害剤活性を示す。投与量によるが、これは、ＰＤＥ４を選択的に阻害することができるか、又はこれは、非選択的ホスホジエステラーゼ阻害剤として作用することができる）（Ｈｕａｎｇ  Ｚ，Ｌｉｕ  Ｓ，Ｚｈａｎｇ  Ｌ，Ｓａｌｅｍ  Ｍ，Ｇｒｅｉｇ  ＧＭ，Ｃｈａｎ  ＣＣ，Ｎａｔｓｕｍｅｄａ  Ｙ，Ｎｏｇｕｃｈｉ  Ｋ．Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ４  ｂｙ  ｉｂｕｄｉｌａｓｔ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．２００６  Ｍａｙ  １；７８（２３）：２６６３−８．）；イルソグラジン；ルテオリン（フラボノイド；ピーナッツ抽出サプリメント；ＩＧＦ−１特性も同様に保有する）（Ｙｕ  ＭＣ，Ｃｈｅｎ  ＪＨ，Ｌａｉ  ＣＹ，Ｈａｎ  ＣＹ，Ｋｏ  ＷＣ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１０）“Ｌｕｔｅｏｌｉｎ，ａ  ｎｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅｓ  １−５，ｄｉｓｐｌａｃｅｄ  ３Ｈ−ｒｏｌｉｐｒａｍ  ｆｒｏｍ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｏｌｉｐｒａｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｘｙｌａｚｉｎｅ／ｋｅｔａｍｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ”］．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６２７（１−３）：２６９−７５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｊｐｈａｒ．２００９．１０．０３１．ＰＭＩＤ  １９８５３５９６）；メセンブリン（ハーブＳｃｅｌｅｔｉｕｍ  ｔｏｒｔｕｏｓｕｍからのアルカロイド）；ピクラミスト（ロリプラムより強力）（ｄｅ  Ｖｉｓｓｅｒ  ＹＰ，Ｗａｌｔｈｅｒ  ＦＪ，Ｌａｇｈｍａｎｉ  ＥＨ，ｖａｎ  Ｗｉｊｎｇａａｒｄｅｎ  Ｓ，Ｎｉｅｕｗｌａｎｄ  Ｋ，Ｗａｇｅｎａａｒ  ＧＴ（２００８）“Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ−４  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ．”Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ  ３１（３）：６３３−６４４）；ロフルミラスト（商標名ダクサス（Ｄａｘａｓ）、ダリレスプ）（ダクサスの商標名を使用してＭｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ  ＆  ＤｏｈｍｅによってＥＵ中で重度の慢性閉塞性肺疾患の治療のために認可）（ｈｔｔｐ：／／ｅｍｃ．ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｍｅｄｉｃｉｎｅ／２３４１６／ＳＰＣ／ダクサス；５００マイクログラムのフィルム包装錠剤）；  Ｒｏ２０−１７２４；ロリプラム（薬理学的探求における調査ツールとして使用される；；現時点の抗鬱剤に対する可能性のある代替物として研究されている（Ｂｏｂｏｎ  Ｄ，Ｂｒｅｕｌｅｔ  Ｍ，Ｇｅｒａｒｄ−Ｖａｎｄｅｎｈｏｖｅ  ＭＡ，Ｇｕｉｏｔ−Ｇｏｆｆｉｏｕｌ  Ｆ，Ｐｌｏｍｔｅｕｘ  Ｇ，Ｓａｓｔｒｅ−ｙ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｍ，Ｓｃｈｒａｔｚｅｒ  Ｍ，Ｔｒｏｉｓｆｏｎｔａｉｎｅｓ  Ｂ，ｖｏｎ  Ｆｒｅｎｃｋｅｌｌ  Ｒ，Ｗａｃｈｔｅｌ  Ｈ．（１９８８）“Ｉｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａ  ｎｅｗ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ  ａｃｔｉｏｎ？  Ａ  ｄｏｕｂｌｅ  ｂｌｉｎｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｄｕｍｍｙ  ｓｔｕｄｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｒｏｌｉｐｒａｍ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｐｒａｍｉｎｅ  ｉｎ  ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ  ｍａｊｏｒ  ａｎｄ／ｏｒ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｖｅｓ”．Ｅｕｒ  Ａｒｃｈ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ  ２３８（１）：２−６。ＰＭＩＤ  ３０６３５３４；Ｗａｃｈｔｅｌ  Ｈ．（１９８３）“Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｒｏｌｉｐｒａｍ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｙｃｌｉｃ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ３’，５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２２  （３）：２６７−７２．ｄｏｉ：１０．１０１６／００２８−３９０８（８３）９０２３９−３．ＰＭＩＤ  ６３０２５５０）。最近の研究は、ロリプラムが抗精神病効果を有することができることを示している（Ｍａｘｗｅｌｌ  ＣＲ，Ｋａｎｅｓ  ＳＪ，Ａｂｅｌ  Ｔ，Ｓｉｅｇｅｌ  ＳＪ．（２００４）“Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｔｉｐｓｙｃｈｏｔｉｃ  ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ”．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １２９（１）：１０１−７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２００４．０７．０３８。ＰＭＩＤ  １５４８９０３３；Ｋａｎｅｓ  ＳＪ，Ｔｏｋａｒｃｚｙｋ  Ｊ，Ｓｉｅｇｅｌ  ＳＪ，Ｂｉｌｋｅｒ  Ｗ，Ａｂｅｌ  Ｔ，Ｋｅｌｌｙ  ＭＰ．（２００６）“Ｒｏｌｉｐｒａｍ：Ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ４  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｔｉｐｓｙｃｈｏｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １４４（１）：２３９−４６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２００６．０９．０２６．ＰＭＩＤ  １７０８１６９８）。ロリプラムは、アルツハイマー病を回復することにおいて（Ｓｍｉｔｈ，Ｄｏｎｎａ  Ｌ；Ｐｏｚｕｅｔａ  Ｊ，Ｇｏｎｇ  Ｂ，Ａｒａｎｃｉｏ  Ｏ，Ｓｈｅｌａｎｓｋｉ  Ｍ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １４，  ２００９）“Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｓｐｉｎｅ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ”．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  １０６（３９）：１６８７７���１６８８２．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０９０８７０６１０６．ＰＭＣ  ２７４３７２６．ＰＭＩＤ  １９８０５３８９），Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ（ＭＦ，Ｂｅａｌ；Ｃｌｅｒｅｎ  Ｃ，Ｃａｌｉｎｇａｓａｎ  ＮＹ，Ｙａｎｇ  Ｌ，Ｋｌｉｖｅｎｙｉ  Ｐ，Ｌｏｒｅｎｚｌ  Ｓ（２００５．“Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ”．  Ｕ．Ｓ．Ａｒｍｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉｅｌ  ＣｏｍｍａｎｄＦｏｒｔ  Ｄｅｔｒｉｃｋ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２１７０２−５０１２）、及び切断された脊髄軸索体の再生において（Ｎｉｋｕｌｉｎａ，Ｅ．（Ｊｕｎｅ  ８，２００４）“Ｔｈｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｒｏｌｉｐｒａｍ  Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ａｆｔｅｒ  ａ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｌｅｓｉｏｎ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ａｘｏｎａｌ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ”．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  １０１：８７８６．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０４０２５９５１０１）有望性を示す。ロリプラムは、脊髄損傷の治療のための臨床前研究中である；ＲＰＬ−５５４（ＬＳ−１９３，８５５）（ホスホジエステラーゼ酵素ＰＤＥ−３及びＰＤＥ−４の長時間作用阻害剤として作用し、気管支拡張及び抗炎症効果の両方を産生する（Ｂｏｓｗｅｌｌ−Ｓｍｉｔｈ  Ｖ，Ｓｐｉｎａ  Ｄ，Ｏｘｆｏｒｄ  ＡＷ，Ｃｏｍｅｒ  ＭＢ，Ｓｅｅｄｓ  ＥＡ，Ｐａｇｅ  ＣＰ．Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｎｏｖｅｌ  Ｌｏｎｇ−Ａｃｔｉｎｇ  Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ３／４  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ＲＰＬ５５４（９，１０−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−２−（２，４，６−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌｉｍｉｎｏ）−３−（Ｎ−ｃａｒｂａｍｏｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−３，４，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｐｙｒｉｍｉｄｏ（６，１−ａ）ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎ−４−ｏ
ｎｅ）ａｎｄ  ＲＰＬ５６５（６，７−Ｄｉｈｙｄｒｏ−２−（２，６−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）−９，１０−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−４Ｈ−ｐｙｒｉｍｉｄｏ（６，１−ａ）ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎ−４−ｏｎｅ）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２００６；３１８（２）：８４０−８４８）．；ＹＭ−９７６。
【００３７】
[0043]臨床試験で試験された又は現時点で臨床試験中のＰＤＥ４Ｂ阻害剤の例は、以下を含む：
[0044]シロミラスト（Ａｒｉｆｌｏ，ＳＢ−２０７，４９９）は、現時点でＣＯＰＤ治療のためにＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅによって臨床開発中である；ドロタベリン（Ｄｒｏｔａｖｅｒｉｎｅ）（ＩＮＮ、更にドロタベリン（ｄｒｏｔａｖｅｒｉｎ）としても知られる）２００３年の僅かな小さい研究において、ドロタベリンが、腎臓の疝痛を治療することにおいて殆ど８０％有効であることが見いだされた（Ｒｏｍｉｃｓ  Ｉ，Ｍｏｌｎａｒ  ＤＬ，Ｔｉｍｂｅｒｇ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．（Ｊｕｌｙ  ２００３）“Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｒｏｔａｖｅｒｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｃｏｌｉｃｋｙ  ｐａｉｎ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｒｅｎａｌ  ａｎｄ  ｕｒｅｔｅｒｉｃ  ｓｔｏｎｅｓ”．ＢＪＵ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ９２（１）：９２−６．ｄｏｉ：１０．１０４６／ｊ．１４６４−４１０Ｘ．２００３．０４２６２．ｘ。ＰＭＩＤ  １２８２３３８９；Ｇａｒｍｉｓｈ  ＯＳ，Ｚａｂａｓｈｎｙｉ  ＳＩ，Ｓｍｉｒｎｏｖａ  ＥＶ，Ｋｏｂｅｌｉａｔｓｋｉｉ  ＩｕＩｕ（Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００３）“［Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｎｏ−ｓｈｐａ  ｆｏｒｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｎａｌ  ｃｏｌｉｃ］”（ｉｎ  Ｒｕｓｓｉａｎ）．Ｋｌｉｎｉｃｈｎａ  Ｋｈｉｒｕｒｈｉｉａ（２）：４７−５０．ＰＭＩＤ  １２７８４４３７）、ドロタベリンは、更に頸管拡張を早めることにより分娩を促進することにおいて研究されているが、しかし結果は相反するものである（Ｓｉｎｇｈ  ＫＣ，Ｊａｉｎ  Ｐ，Ｇｏｅｌ  Ｎ，Ｓａｘｅｎａ  Ａ（Ｊａｎｕａｒｙ  ２００４）“Ｄｒｏｔａｖｅｒｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｆｏｒ  ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｂｏｒ”．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ８４（１）：１７−２２．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ００２０−７２９２（０３）００２７６−５。ＰＭＩＤ  １４６９８８２５；Ｍａｄｈｕ  Ｃ，Ｍａｈａｖａｒｋａｒ  Ｓ，Ｂｈａｖｅ  Ｓ  Ｊｕｌｙ  ２００９）“Ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｔｕｄｙ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  Ｄｒｏｔａｖｅｒｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  ａｎｄ  Ｖａｌｅｔｈａｍａｔｅ  ｂｒｏｍｉｄｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｂｏｕｒ”．Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ２８２（１）：１１−５．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００４０４−００９−１１８８−８。ＰＭＩＤ  １９６４４６９７；Ｇｕｐｔａ  Ｂ，Ｎｅｌｌｏｒｅ  Ｖ，Ｍｉｔｔａｌ  Ｓ  （Ｍａｒｃｈ  ２００８）“Ｄｒｏｔａｖｅｒｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｖｅｒｓｕｓ  ｈｙｏｓｃｉｎｅ−Ｎ−ｂｕｔｙｌｂｒｏｍｉｄｅ  ｉｎ  ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｂｏｒ”．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  １００（３）：２４４−７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｊｇｏ．２００７．０８．０２０．ＰＭＩＤ  １８０３１７４５）。ドロタベリンは、メフェナム酸と一緒に投与された場合、子宮鏡検査及び子宮内膜生検中の疼痛を管理する傍頸椎ブロックにおいて有効であることを示している（Ｓｈａｒｍａ  ＪＢ，Ａｒｕｎａ  Ｊ，Ｋｕｍａｒ  Ｐ，Ｒｏｙ  ＫＫ，Ｍａｌｈｏｔｒａ  Ｎ，Ｋｕｍａｒ  Ｓ（Ｊｕｎｅ  ２００９）“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｏｒａｌ  ｄｒｏｔａｖｅｒｉｎｅ  ｐｌｕｓ  ｍｅｆｅｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｗｉｔｈ  ｐａｒａｃｅｒｖｉｃａｌ  ｂｌｏｃｋ  ａｎｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｓｅｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐａｉｎ  ｒｅｌｉｅｆ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｙｓｔｅｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｂｉｏｐｓｙ”．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６３（６）：２４４−５２．ｄｏｉ：１０．４１０３／００１９−５３５９．５３３９４．ＰＭＩＤ  １９６０２７５８）。優勢な下痢を示すＩＢＳ患者は、ブスコパンからの利益を受けるより大きい可能性がある（Ｋｈａｌｉｆ  ＩＬ，Ｑｕｉｇｌｅｙ  ＥＭ，Ｍａｋａｒｃｈｕｋ  ＰＡ，Ｇｏｌｏｖｅｎｋｏ  ＯＶ，Ｐｏｄｍａｒｅｎｋｏｖａ  ＬＦ，Ｄｚｈａｎａｙｅｖ  ＹＡ（Ｍａｒｃｈ  ２００９）“Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ａｎｄ  ｍｏｔｏｒ  ａｎｄ  ｖｉｓｃｅｒａｌ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｉｒｒｉｔａｂｌｅ  ｂｏｗｅｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｔｏ  ｓｐａｓｍｏｌｙｔｉｃｓ（ａｎｔｉｓｐａｓｍｏｄｉｃｓ）”．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １８（１）：１７−２２．ＰＭＩＤ  １９３３７６２８）。ドロタベリンは、更にＡ及びＢ型インフルエンザに対する抗ウイルス活性のためにリマンタジンとの組合せで試験されている（Ｚｈｉｌｉｎｓｋａｙａ  ＩＮ，Ｋｏｎｏｖａｌｏｖａ  ＮＩ，Ｋｉｓｅｌｅｖ  ＯＩ，Ａｓｈｍａｒｉｎ  ＩＰ  （２００７）“Ｎｏ−Ｓｐａ  ａｎｄ  Ｒｅｍａｎｔａｄｉｎ  ａｒｅ  ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ”．Ｄｏｋｌａｄｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ４１４（１）：２４９−５０．ｄｏｉ：１０．１１３４／Ｓ００１２４９６６０７０３０２３４）。ドロタベリンは、０．９％の有害作用頻度を有し、副作用は比較的珍しい（Ｔａｒ  Ａ，Ｓｉｎｇｅｒ  Ｊ（Ｍａｒｃｈ  ２００２）“［Ｓａｆｅｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ＮＯ−ＳＰＡ］”（ｉｎ  Ｈｕｎｇａｒｉａｎ）．Ｏｒｖｏｓｉ  Ｈｅｔｉｌａｐ  １４３（１１）：５５９−６２．ＰＭＩＤ  １２５８３３２５）．ドロタベリンは、商標名Ｎｏ−Ｓｐａで市販されている（Ｃｈｉｎｏｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｗｏｒｋｓ，Ｈｕｎｇａｒｙ，ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）；アルツハイマー病のためのエタゾレート（ＳＱ−２０，００９，ＥＨＴ−０２０２）。；ＨＴ−０７１２；ロフルミラスト（商標名ダクサス、ダリレスプ）は、臨床試験において有効であることが見いだされているが、然しながら、これは、悪心、下痢及び頭��を含む幾つかの投与を制約する副作用を産生する。これの開発は、臨床効力を維持しながら、副作用の発生率を最小にする試みが続けられている（Ｓｐｉｎａ，Ｄ（Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００８）“ＰＤＥ４  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ”．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １５５（３）：３０８−１５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｂｊｐ．２００８．３０７．ＩＳＳＮ  １４７６−５３８１．ＰＭＣ  ２５６７８９２．ＰＭＩＤ  １８６６０８２５）２０１０年６月、ダクサスは慢性気管支炎に伴う重度のＣＯＰＤに対してＥＵで認可された。２０１１年３月、ダリレスプは、ＣＯＰＤの悪化を減少するために、米国でＦＤＡ認可を得た；ＲＰＬ−５５４（ＬＳ−１９３，８５５）（喘息及び枯草熱に対する潜在的な治療剤としてＶｅｒｏｎａ  Ｐｈａｒｍａにおいて開発されている）。
【００３８】
[0045]ロリプラムは、４−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）ピロリジン−２−オンとしても知られ、以下の構造：
【００３９】
【化２】
2014532057.tif 000004
【００４０】
を有する。ロリプラムの合成は、以下の二つの引用中に記載されている。ロリプラムは、商業的に（即ち、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから）入手可能である。ロリプラムの臨床使用は、その行動的及び他の副作用のために制約され、そしてロリプラムの臨床開発は、その投与に伴う副作用のために断念された。恐らくより高い効力及びより低い毒性を持つ新しく開発された選択的ＰＤＥ  ＩＶ阻害剤は、現時点で調査中である。ロリプラムは、Ｄｅｍｎｉｔｚ，Ｊ．；ＬａＶｅｃｃｈｉａ，Ｌ．；Ｂａｃｈｅｒ，Ｅ．；Ｋｅｌｌｅｒ，Ｔ．Ｈ．；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｔ．；Ｓｃｈｕｒｃｈ，Ｆ．；Ｗｅｂｅｒ，Ｈ．−Ｐ．；Ｐｏｍｂｏ−Ｖｉｌｌａｒ，．Ｅｎａｎｔｉｏｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ（Ｒ）−ａｎｄ（Ｓ）−Ｒｏｌｉｐｒａｍ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １９９８，３，１０７−１１９中に記載されている。ロリプラムは、ＷＯ２００６／１１０５８８中にアルツハイマー病の治療において使用するために記載されている。ロリプラムの合成は、Ｍｅｎｇ−Ｙａｎｇ  Ｃｈａｎｇ，Ｐｅｉ−Ｐｅｉ  Ｓｕｎ，Ｓｈｕｉ−Ｔｅｉｎ  Ｃｈｅｎ，Ｎｅｉｎ−Ｃｈｅｎ  Ｃｈａｎｇ  ＣｈｅｍＩｎｆｏｒｍ，Ｖｏｌｕｍｅ  ３５，Ｉｓｓｕｅ  １９，Ｍａｙ  １１，２００４中に記載されている。
【００４１】
[0046]化合物Ａは、２−メチル−２−［４−（３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２，３−ジヒドロイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）−フェニル］プロピオニトリルという化学名、及び以下の構造を有する式（Ｉ）の化合物：
【００４２】
【化３】
2014532057.tif 000005
【００４３】
又は医薬的に受容可能なその塩である。化合物Ａ及びこの化合物を調製するための方法は、国際特許出願公開ＷＯ２００６／１２２８０６のその実施例７中に開示され、これは、本明細書中に参考文献として援用される。
【００４４】
[0047]式（Ｉ）の化合物は、単独で、或いは医薬的に受容可能な担体又は賦形剤と一緒の組成物中で使用することができる。本発明の医薬組成物は、治療的に有効な量の式（Ｉ）の化合物を、一つ又はそれより多い医薬的に受容可能な担体と一緒に処方されて含んでなる。本明細書中で使用する場合、用語“医薬的に受容可能な担体”は、非毒性の、不活性固体、半固体又は液体充填剤、希釈剤、カプセル化物質、或いはいずれもの種類の処方助剤を意味する。医薬的に受容可能な担体として役立つことができる物質の幾つかの例は、ラクトース、グルコース及びスクロースのような糖；コーンスターチ及びジャガイモデンプンのようなデンプン；ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース及び酢酸セルロースのようなセルロース及びその誘導体；粉末トラガカントゴム；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバター及び座薬ワックスのような賦形剤；ピーナッツ油、綿実油；紅花油；ゴマ油；オリーブ油；コーン油及び大豆油のような油類；ポリエチレングリコール；のようなグリコール；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルのようなエステル；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムのような緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール、及びリン酸緩衝溶液であり、同様にラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムのような他の非毒性の適合性の潤滑剤、並びに着色剤、放出剤、被覆剤、甘味剤、風味及び芳香剤、保存剤及び抗酸化剤も、処方者の判断により更に組成物中に存在することができる。他の適した医薬的に受容可能な賦形剤は、本明細書中に参考文献として援用される、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９１中に記載されている。
【００４５】
[0048]式（Ｉ）の化合物は、経口、非経口、舌下、エアロゾル化又は吸入噴霧、直腸、大槽内、膣内、腹腔内、頬側、或いは局所的に、慣用的な非毒性の医薬的に受容可能な担体、アジュバント、及びベヒクルを適宜含有する投与量単位製剤で、ヒト及び他の動物に投与することができる。局所投与は、更に経皮貼布又はイオン泳動デバイスのような経皮投与の使用を含むことができる。本明細書中で使用するような用語、非経口は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射、又は注入技術を含む。
【００４６】
[0049]処方の方法は、当技術において公知であり、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）中に開示されている。本発明において使用するための医薬組成物は、滅菌の非発熱性液体溶液又は懸濁液、被覆カプセル、座薬、凍結乾燥粉末、経皮貼布の形態又は当技術において既知の他の形態であることができる。
【００４７】
[0050]注射用製剤、例えば、滅菌注射用水性又は油性懸濁液は、適した分散又は湿潤剤及び分散剤を使用して既知の技術によって処方することができる。滅菌注射用製剤は、更に、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤又は溶媒中の、滅菌注射用溶液、懸濁液或いは乳液、例えば、１，３−プロパンジオール又は１，３−ブタンジオール中の溶液としてであることができる。受容可能なベヒクル及び溶媒の中で、使用することができるものは、水、リンゲル溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．及び等張の塩化ナトリウム溶液である。更に、滅菌の固定油は、溶媒又は懸濁媒体として好都合に使用される。この目的のために、合成のモノ又はジグリセリドを含む、いずれもの無刺激性の固定油を使用することができる。更に、オレイン酸のような脂肪酸は、注射用の製剤に用途を見出す。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通す濾過によって、或いは使用前に滅菌水又は他の滅菌注射用媒体中に溶解若しくは分散することができる滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組込むことによって滅菌することができる。
【００４８】
[0051]薬物の効果を延長するために、皮下又は筋肉内注射からの薬物の吸収を遅延することがしばしば好ましい。これは、不良な水溶解性を持つ結晶質又は非結晶質の物質の液体懸濁物の使用によって達成することができる。その結果、薬物の吸収の速度は、その溶解の速度に依存し、これは、次に、結晶サイズ及び結晶形に依存することができる。別の方法として、非経口的に投与された剤形の遅延した吸収は、薬物を油性ベヒクル中に溶解又は懸濁することによって達成することができる。注射可能なデポーの形態は、ポリラクチド−ポリグリコシドのような生分解可能なポリマー中の薬物にマイクロカプセル化基質を形成することによって製造される。薬物とポリマーの比及び使用される特定のポリマーの性質によるが、薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解可能なポリマーの例は、ポリ（オルトエステル）及びポリ（酸無水物）を含む。デポーの注射可能な製剤は、リポソーム又は身体組織と適合性であるマイクロ乳剤中に薬物を封入することによって調製することもできる。
【００４９】
[0052]直腸又は膣投与のための組成物は、好ましくは座薬であり、これは、本発明の化合物を、周囲温度で固体であるが、しかし体温では液体であり、そして従って直腸又は膣空洞で融解し、そして活性化合物を放出するココアバター、ポリエチレングリコール又は座薬用ワックスのような適した非刺激性の賦形剤或いは担体と混合することによって調製することができる。
【００５０】
[0053]経口投与のための固体剤形は、カプセル、錠剤、丸薬、粉末、及び顆粒を含む。このような固体剤形において、活性化合物は、少なくとも一つの、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウムのような不活性な医薬的に受容可能な賦形剤又は担体、及び／又はａ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及びサリチル酸のような充填剤又は増量剤、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、及びアラビアゴムのような結合剤、ｃ）グリセロールのような保水剤、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウムのような崩壊剤、ｅ）パラフィンのような溶液遅延剤、ｆ）第四アンモニウム化合物のような吸収促進剤、ｇ）例えば、アセチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロールのような湿潤剤、ｈ）カオリン及びベントナイト粘土のような吸収剤、並びにｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体のポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びこれらの混合物のような潤滑剤と混合される。カプセル、錠剤及び丸薬の場合、剤形は更に、緩衝剤を含んでなる。
【００５１】
[0054]類似の種類の固体組成物は、更にラクトース又は乳糖、並びに高分子量ポリエチレングリコール等のような賦形剤を使用して、軟質及び硬質充填ゼラチンカプセルの充填剤として使用することができる。
【００５２】
[0055]錠剤、糖衣錠、カプセル、丸薬、及び顆粒の固体剤形は、腸溶性被覆及び医薬処方技術において公知の他の被覆のような被覆並びにシェルを伴って調製することができる。これらは、所望により乳白剤を含有することができ、そして更に、これらは、活性成分（類）のみを、又は優先的に腸管の一定の部分で、所望により遅延した様式で放出する組成物であることができる。使用することができる包埋組成物の例は、ポリマー物質及びワックスを含む。
【００５３】
[0056]活性化合物は、更に一つ又はそれより多い先に記述したような賦形剤を伴うマイクロカプセル化形態であることもできる。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸薬、及び顆粒の固体剤形は、腸溶性被覆、放出制御被覆及び医薬処方技術において公知の他の被覆のような被覆及びシェルを伴って調製することができる。このような固体剤形において、活性化合物は、少なくとも一つのスクロース、ラクトース又はデンプンのような不活性希釈剤と混合することができる。このような剤形は、通常の慣行であるように、更に、不活性希釈剤以外の更なる物質、例えば、ステアリン酸マグネシウム及び微結晶セルロースのような錠剤化潤滑剤及び他の錠剤化助剤を含んでなることができる。カプセル、錠剤及び丸薬の場合、剤形は、更に緩衝剤を含んでなる。これらは、所望により、乳白剤を含有することができ、そして更に、これらが活性成分（類）のみを、又は優先的に腸管の一定の部分で、所望により遅延した様式で放出する組成物であることができる。使用することができる包埋組成物の例は、ポリマー物質及びワックスを含む。
【００５４】
[0057]経口投与のための液体剤形は、医薬的に受容可能な乳剤、マイクロ乳剤、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルを含む。活性化合物に加えて、液体剤形は、例えば、水又は他の溶媒、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、ＥｔＯＡｃ、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油類（特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ひまわり油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにこれらの混合物のような可溶化剤及び乳化剤のような、当技術において普通に使用される不活性希釈剤を含有することができる。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、更に、湿潤剤、乳化及び懸濁剤、甘味剤、風味剤及び芳香剤のようなアジュバントを含むことができる。
【００５５】
[0058]本発明の化合物の局所又は経皮投与のための剤形は、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、噴霧、吸入剤及び貼布を含む。活性成分は、医薬的に受容可能な担体及びいずれもの必要な保存剤又は要求することができる緩衝液と、滅菌条件下で混合される。眼科製剤、点耳剤等も、更に本発明の範囲内であるとして考慮されている。
【００５６】
[0059]軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは、本発明の活性化合物に加えて、動物及び植物性脂肪、油類、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカントゴム、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、サリチル酸、タルク及び酸化亜鉛、或いはこれらの混合物のような賦形剤を含有することができる。
【００５７】
[0060]本発明の組成物は、更に液体エアロゾル又は吸入用乾燥粉末として供給するために処方することができる。液体エアロゾル製剤は、主として終末及び呼吸細気管支に供給することができる粒子サイズで噴霧することができる。
【００５８】
[0061]本発明のエアロゾル化製剤は、好ましくは主として１ないし５μｍ間の質量中間平均直径を有するエアロゾル粒子の形成を可能にするために選択される、ジェット、振動多孔板又は超音波ネブライザーのようなエアロゾル形成デバイスを使用して供給することができる。更に、製剤は、好ましくは、均衡したモル浸透圧濃度イオン強度及び塩化物濃度、並びに感染の部位に有効な投与量の本発明の化合物を供給することを可能にする最小のエアロゾル化可能体積を有する。更に、エアロゾル製剤は、好ましくは、気道の機能性を否定的に損なわず、そして好ましくない副作用を起こさない。
【００５９】
[0062]本発明のエアロゾル製剤の投与のために適したエアロゾル化デバイスは、例えば、本発明の製剤を、主として、１−５μｍのサイズの範囲のエアロゾル粒子サイズに噴霧することが可能である、ジェット、振動多孔板、超音波ネブライザー及び活性化乾燥粉末吸入器を含む。主としては、この適用において、全ての発生されたエアロゾル粒子の少なくとも７０％、しかし好ましくは９０％より多くが、１−５μｍの範囲であることを意味する。ジェットネブライザーは、液体溶液をエアロゾル粒子に破壊するために、空気圧によって作動する。振動多孔板ネブライザーは、多孔板を通る溶媒液滴を押出すために急速に振動する多孔板によって産生される超音波真空を使用することによって作動する。超音波ネブライザーは、液体を小さいエアロゾル液滴に剪断する圧電結晶によって作動する。各種の適したデバイスが、例えば、ＡＥＲＯＮＥＢ及びＡＥＲＯＤＯＳＥ振動多孔板ネブライザー（ＡｅｒｏＧｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＳＩＤＥＳＴＲＥＡＭネブライザー（Ｍｅｄｉｃ−Ａｉｄ  Ｌｔｄ．，Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ，Ｅｎｇｌａｎｄ）、ＰＡＲＩ  ＬＣ及びＰＡＲＩ  ＬＣ  ＳＴＡＲジェットネブライザー（Ｐａｒｉ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）、及びＡＥＲＯＳＯＮＩＣ（ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ  Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ  Ｐｒｏｄｕｋｔｅ（Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、並びにＵＬＴＲＡＡＩＲＥ（Ｏｍｒｏｎ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）超音波ネブライザーを含み、使用可能である。
【００６０】
[0063]本発明の化合物は、更に、局所用粉末及び噴霧として使用するために処方することができ、これは、本発明の化合物に加えて、ラクトース、タルク、サリチル酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末、又はこれらの物質の混合物のような賦形剤を含有することができる。噴霧は、更に、クロロフルオロ炭化水素のような通例の噴射剤を含有することができる。
【００６１】
[0064]経皮貼布は、身体への化合物の制御された供給を提供する更なる利点を有する。このような剤形は、化合物を適切な媒体に溶解又は懸濁することによって製造することができる。吸収向上剤も、更に皮膚を通る化合物の流束を増加するために使用することができる。速度は、速度制御膜を用意するか、又は化合物をポリマー基質又はゲル中に分散するかのいずれかによって制御することができる。本発明の化合物は、更に、リポソームの形態で投与することもできる。当技術において既知であるように、リポソームは、一般的にリン脂質又は他の脂質物質から誘導される。リポソームは、水性媒体中に分散された単層又は多重膜の水和された液晶によって形成される。いずれもの非毒性の生理学的に受容可能な、そしてリポソームを形成することが可能な代謝可能な脂質を使用することができる。リポソームの形態の本発明の組成物は、本発明の化合物に加えて、安定剤、保存剤、賦形剤、等を含有することができる。好ましい脂質は、天然及び合成の両方のリン脂質及びホスファチジルコリン（レシチン）である。リポソームを形成するための方法は、当技術において既知である。例えば、Ｐｒｅｓｃｏｔｔ（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌｕｍｅ  ＸＩＶ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７６，ｐ．３３  ｅｔ  ｓｅｑを参照されたい。
【００６２】
[0065]式（Ｉ）の化合物は、単独で、又はＰＤＥ４Ｂ阻害剤と組合せた固定された組合せの形態をとる可能な組合せ療法で、或いは互いにずらして又は独立して与えられる式（Ｉ）の化合物及びＰＤＥ４Ｂ阻害剤の投与で投与することができる。長期療法は、先に記載したように、他の治療戦略の文脈における補助療法のように同様に可能である。他の可能な治療は、腫瘍の退行後の患者の状態を維持するための治療、又は更に、例えば、危険性のある患者における化学予防療法である。
【００６３】
[0066]本発明の化合物の有効な量は、一般的に、粘表皮癌細胞の成長又は増殖を検出可能な程度阻害するか、或いは粘表皮癌の徴候の阻害又は軽減を検出することによるいずれものために十分な量を含む。単一の剤形を産生するために担体物質と組合せることができる活性成分の量は、治療される宿主及び投与の特定のモードにより変化するものである。然しながら、いずれもの特定の患者に対する具体的な投与量レベルが、使用される具体的な化合物の活性、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与の時間、投与の経路、排出の速度、薬物の組合せ、及び治療を受けている特定の疾病の重篤度を含む各種の因子に依存するものであることは理解されることである。与えられた状況に対する治療的に有効な量は、日常的実験によって容易に決定することができ、そして通常の臨床医の技能及び判断の範囲内である。
【００６４】
[0067]本発明の治療の方法によれば、粘表皮腫瘍の成長は、所望の結果を達成するために必要であるような量及び時間で、式（Ｉ）の化合物の一定の量を患者に投与することによって、ヒト又は下等哺乳動物のような患者において減少又は防止することができる。式（Ｉ）の化合物の“粘表皮癌細胞の成長又は増殖を阻害するために有効である量”は、いずれもの医学的治療に適用可能な妥当な利益／危険性の比で、粘表皮腫瘍の成長を治療するために十分な化合物の量を指す。
【００６５】
[0068]式（Ｉ）の化合物が、ＰＤＥ４Ｂ阻害剤と組合せて投与される場合、“粘表皮癌細胞の成長又は増殖を阻害するために有効である量”は、所望の効果を達成するために、具体的なＰＤＥ４Ｂ阻害剤と組合された式（Ｉ）の化合物の量を意味すると理解される。言い換えれば、本発明による適した組合せ療法は、これらのいずれもが、特定の投与量で単独で与えられた場合、有効な量を構成するものではないが、しかし組合せで投与されたものは、“粘表皮癌細胞の成長又は増殖を阻害するために有効である量”であるものである、式（Ｉ）の化合物の量及びＰＤＥ４Ｂ阻害剤の量を包含する。
【００６６】
[0069]然しながら、本発明の化合物及び組成物の合計の日量は、健全な医学的判断の範囲内で担当医によって決定されるものであることは理解されるものである。いずれもの特定の患者に対する具体的な治療的に有効な投与量レベルは、治療される疾患、及び疾患の重篤度；使用される具体的な化合物の活性；使用される具体的な組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別及び食事；使用される具体的な化合物の投与の時間、投与の経路、及び排出の速度；治療の期間；使用される具体的な化合物と組合せて、又は同時に使用される薬物；及び医学技術において公知の類似の因子を含む各種の因子に依存するものである。
【００６７】
[0070]温血動物、例えば、概略７０ｋｇの体重のヒトに投与される式（Ｉ）の化合物又は医薬的に受容可能なその塩の投与量は、好ましくは、例えば同じサイズであることができる１ないし３回の単一投与に分割された、一日当たり一人当たり、好ましくは、概略３ｍｇから概略５ｇまで、更に好ましくは、概略１０ｍｇから概略１．５ｇまで、最も好ましくは、約１００ｍｇから約１０００ｍｇまでである。通常小児は、成人の投与量の半分を投与される。
【００６８】
[0071]温血動物、例えばヒトに対する組合せ療法において投与されるＰＤＥ４Ｂ阻害剤の投与量は、一日当たり、好ましくは、例えば同じサイズであることができる１ないし３回の単一投与に分割された、好ましくは、概略０．０１ｍｇ／ｋｇから概略１０００ｍｇ／ｋｇまで、更に好ましくは、概略１ｍｇ／ｋｇから概略１００ｍｇ／ｋｇまでである。通常小児は、成人の投与量の半分を投与され、そして従って小児におけるＰＤＥ４Ｂ阻害剤の優先的投与量の範囲は、好ましくは、一日当たり、例えば同じサイズであることができる１ないし３回の単一投与に分割された、０．５ｍｇ／ｋｇないし概略５００ｍｇ／ｋｇである。
【００６９】
[0072]式（Ｉ）の化合物の別の態様を以下に与える：
１）Ｒ１がメチルである化合物；
２）Ｒ２がメチルである化合物；
３）Ｒ３がメチルである化合物；
４）Ｒ４が：
ａ．非置換の又はハロゲン、シアノ、低級アルキル、低級アルコキシによって置換されたピリジル、或いは非置換の又は低級アルキルによって置換されたピペラジニル；
ｂ．非置換の又は低級アルコキシによって置換されたピリミジニル；
ｃ．非置換の又はハロゲンによって置換されたキノリニル；
ｄ．クニオンリニル（Ｑｕｎｉｏｎｌｉｎｙｌ）；又は
ｅ．キノキサリニル；
である化合物。
【００７０】
[0073]式（Ｉ）の化合物の更なる態様を、式（Ｉ）の化合物の上記の態様（１）ないし（４）の一つ又はそれより多くを要求することによって選択することができることは理解されることである。例えば、更なる別の態様は、（１）及び（２）；（１）及び（３）；（２）及び（３）；（１）、（２）、及び（３）；（１）及び（４）（ａ）；（１）及び（４）（ｂ）；（１）及び（４）（ｃ）；（１）及び（４）（ｄ）；（１）及び（４）（ｅ）；（２）及び（４）（ａ）；（２）及び（４）（ｂ）；（２）及び（４）（ｃ）；（２）及び（４）（ｄ）；（２）及び（４）（ｅ）；（３）及び（４）（ａ）；（３）及び（４）（ｂ）；（３）及び（４）（ｃ）；（３）及び（４）（ｄ）；（３）及び（４）（ｅ）；（１）、（２）、及び（４）（ａ）；（１）、（２）、及び（４）（ｂ）；（１）、（２）、及び（４）（ｃ）；（１）、（２）、及び（４）（ｄ）；（１）、（２）、及び（４）（ｅ）；（１）、（３）、及び（４）（ａ）；（１）、（３）、及び（４）（ｂ）；（１）、（３）、及び（４）（ｃ）；（１）、（３）、及び（４）（ｄ）；（１）、（３）、及び（４）（ｅ）；（２）、（３）、及び（４）（ａ）；（２）、（３）、及び（４）（ｂ）；（２）、（３）、  及び（４）（ｃ）；（２）、（３）及び（４）（ｄ）；（２）、（３）、及び（４）（ｅ）；（１）、（２）、（３）、及び（４）（ａ）；（１）、（２）、（３）、及び（４）（ｂ）；（１）、（２）、（３）、及び（４）（ｃ）；（１）、（２）、（３）、及び（４）（ｄ）；並びに（１）、（２）、（３）、及び（４）（ｅ）を組み合わせることによって得ることができる。
【００７１】
[0074]式（Ｉ）の化合物は、本明細書中に参考文献として、あたかも完全に記述されているかのように援用される、２００６年１１月２３日に公開されたＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ２００６／１２２８０６によって調製することができる。
【００７２】
[0075]例えば、式（Ｉ）の化合物は、以下の式（ＩＩ）：
【００７３】
【化４】
2014532057.tif 000006
【００７４】
の化合物［Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、式（Ｉ）の化合物のために定義したとおりである］を、
以下の式（ＩＩＩ）：
Ｒ４−Ｂ（ＯＨ）２    （ＩＩＩ）
又は以下の式（ＩＩＩａ）：
【００７５】
【化５】
2014532057.tif 000007
【００７６】
のボロン酸［Ｒ４は、式（Ｉ）の化合物のために定義したとおりである］と、適した溶媒中の塩基及び触媒の存在中で反応させることによって合成することができる；
ここで、上記の出発化合物（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）は、必要な場合、更に、塩形成基が存在し、そして塩の形態の反応が可能であることを条件として、保護された形態の及び／又は塩の形態の官能基と共に存在することができる；
式（Ｉ）の化合物の保護された誘導体中のいずれもの保護基は除去される；
そして所望する場合、得ることが可能な式（Ｉ）の化合物は、もう一つの式（Ｉ）の化合物に転換され、式（Ｉ）の遊離の化合物は、塩に転換され、式（Ｉ）の化合物の得ることが可能な塩は、遊離の化合物又はもう一つの塩に転換され、及び／又は式（Ｉ）の異性体化合物の混合物は、個々の異性体に分離される。
【００７７】
[0076]方法の詳細な説明：
[0077]以下の方法の更に詳細な説明において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、他に示さない限り、式（Ｉ）の化合物のために定義したとおりである。
【００７８】
[0078]式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物の反応は、好ましくは、Ｓｕｚｕｋｉ反応の条件下で、好ましくは、ＤＭＦのような極性の非プロトン性溶媒及び水の混合物中で、パラジウム（ＩＩ）、好ましくは二塩化ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）のような触媒、特に貴金属触媒の存在中で；炭酸カリウムのような塩基の存在中で行われる。
【００７９】
[0079]保護基
[0080]式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物中の一つ又はそれより多い他の官能基、例えばカルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、又はメルカプトが、これらが反応の一部に加わるべきではないために、保護されるか、又は保護される必要がある場合、これらは、ペプチド化合物、そして更にセファロスポリン及びペニシリン、並びに核酸誘導体及び糖の合成において通常使用される基のようなものである。
【００８０】
[0081]保護基は、前駆体中に既に存在することができ、そしてアシル化、エーテル化、エステル化、酸化、加溶媒分解、及び類似の反応のような、所望しない二次反応に対して、関係する官能基を保護しなければならない。これらが、容易に即ち、所望しない二次反応を伴わずに、典型的には酢化分解、プロトン化分解、加溶媒分解、還元、光分解によって、又は更に酵素活性によって、例えば生理学的条件に類似の条件下で除去するために役立ち、そしてこれらが最終生成物中に存在しないことが保護基の特徴である。専門家は、本明細書中で先に、そして以下に記載される反応に、どの保護基が適しているかを知っているか、又は容易に証明することができる。
【００８１】
[0082]このような保護基によるこのような官能基の保護、保護基それ自体、及びその除去反応は、例えばＪ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７３，ｉｎ  Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８１，ｉｎ“Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”；Ｖｏｌｕｍｅ  ３（ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｅ．Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８１，ｉｎ“Ｍｅｔｈｏｄｅｎ  ｄｅｒ  ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｃｈｅｍｉｅ”（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），Ｈｏｕｂｅｎ  Ｗｅｙｌ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ  １５／Ｉ，Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ  １９７４，ｉｎ  Ｈ．−Ｄ．Ｊａｋｕｂｋｅ  ａｎｄ  Ｈ．Ｊｅｓｃｈｅｉｔ，“Ａｍｉｎｏｓaｕｒｅｎ，Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｐｒｏｔｅｉｎｅ”（Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｐｒｏｔｅｉｎｓ），Ｖｅｒｌａｇ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ  Ｂｅａｃｈ，ａｎｄ  Ｂａｓｅｌ  １９８２，ａｎｄ  ｉｎ  Ｊｏｃｈｅｎ  Ｌｅｈｍａｎｎ，“Ｃｈｅｍｉｅ  ｄｅｒ  Ｋｏｈｌｅｎｈｙｄｒａｔｅ：Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｕｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｅ”（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ：ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ），Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ  １９７４のような標準的な参考文献中に記載されている。
【００８２】
[0083]更なる方法の工程
[0084]所望により行われる更なる方法の工程において、反応に参加すべきではない出発化合物の官能基は、非保護の形態で存在することができるか、又は例えば、“保護基”の下で本明細書中で先に記述した一つ又はそれより多い保護基によって保護されることができる。次いで保護基は、そこに記載された方法の一つによって全て又は部分的に除去される。
【００８３】
[0085]塩形成基を持つ式Ｉの化合物の塩は、それ自体既知の方法で調製することができる。従って、式（Ｉ）の化合物の酸付加塩は、酸又は適したアニオン交換試薬による処理によって得ることができる。二つの酸分子を持つ塩（例えば、式（Ｉ）の化合物のジハロゲン化物）は、更に化合物当たり一つの酸分子を持つ塩（例えば、モノハロゲン化物）に転換することができる；これは、融解物まで加熱することによって、又は例えば、高真空下の固体として高温に、例えば１３０℃から１７０℃までに加熱することによって行われ、式（Ｉ）の化合物の分子当たり１モルの酸を放出することができる。
【００８４】
[0086]塩は、通常、例えば適した塩基性化合物、例えばアルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属炭酸水素塩、或いはアルカリ金属水酸化物、典型的には炭酸カリウム又は水酸化ナトリウムで処理することによって、遊離化合物に転換される。
【００８５】
[0087]立体異性体混合物、例えば、ジアステレオ異性体の混合物は、適した分離法によるそれ自体既知の方法で、その対応する異性体に分離することができる。例えば、ジアステレオ異性体の混合物は、分別結晶化、クロマトグラフィー、溶媒分布、及び類似の方法によって、その個々のジアステレオ異性体に分離することができる。この分離は、出発化合物又は式（Ｉ）の化合物それ自体のいずれかのレベルで起こることができる。鏡像異性体は、例えば、鏡像異性体的に純粋なキラル酸との塩の形成、又はクロマトグラフィーの手段、例えば、キラルリガンドを伴うクロマトグラフ的基質を使用するＨＰＬＣによる、ジアステレオ異性体の塩の形成により分離することができる。
【００８６】
[0088]本章で記述した転換に類似の反応は、更に適当な中間体のレベルで起こることができることは、強調されるべきである。
【００８７】
[0089]一般的な方法の条件
[0090]本明細書に記載される全ての方法の工程は、既知の反応条件下、好ましくは具体的に記述される条件下で、使用される試薬に対して不活性であり、そしてそれらを溶解することが可能であるような溶媒又は希釈剤の非存在或いは通常は存在中で、触媒、凝縮剤又は中和剤、例えばイオン交換物質、典型的には、例えばＨ＋の形態のカチオン交換物質の非存在又は存在中で、反応の種類及び／又は反応物にもよるが、低い、通常の、又は高い温度、例えば−１００℃から約１９０℃まで、好ましくは約−８０℃から約１５０℃まで、例えば−８０ないし−６０℃、室温、−２０℃ないし４０℃又は使用される溶媒の沸点の範囲で、常圧下、或いは適当な圧力、及び／又は不活性雰囲気下、例えばアルゴン又は窒素下の密閉容器内で行うことができる。
【００８８】
[0091]塩は、これらが塩形成基を含有する場合、全ての出発化合物及び過渡物質中に存在することができる。塩は、反応がこれによって妨害されないことを条件として、更にこのような化合物の反応中に存在することができる。
【００８９】
[0092]全ての反応の段階において、発生する異性体混合物は、その個々の異性体に、例えばジアステレオ異性体又は鏡像異性体、或いは異性体のいずれもの混合物、例えばラセミ体又はジアステレオ異性体の混合物に、典型的には“更なる方法の工程”下に記載されるように分離することができる。
【００９０】
[0093]問題の反応のために適しているとしてものとして選択することができる溶媒は、例えば、水、エステル、典型的には低級アルキル−低級アルカン酸エステル、例えば酢酸エチル、エーテル、典型的には脂肪族エーテル、例えばジエチルエーテル、又は環式エーテル、例えばテトラヒドロフラン、液体芳香族炭化水素、典型的にはベンゼン又はトルエン、アルコール、典型的にはメタノール、エタノール又は１−若しくは２−プロパノール、１−ブタノール、ニトリル、典型的にはアセトニトリル、ハロゲン化炭化水素、典型的にはジクロロメタン、酸アミド、典型的にはジメチルホルムアミド、塩基、典型的には複素環式窒素塩基、例えばピリジン、カルボン酸、典型的には低級アルカンカルボン酸、例えば酢酸、カルボン酸無水物、典型的には低級アルカン酸無水物、例えば無水酢酸、環式、直鎖、又は分枝鎖炭化水素、典型的にはシクロヘキサン、ヘキサン、又はイソペンタン、或いはこれらの溶媒の混合物、例えば水溶液を、方法の説明中に他に記述されない限り含む。このような溶媒の混合物は、更に加工において、例えばクロマトグラフィー又は分布によって使用することができる。
【００９１】
[0094]その塩を含む式（Ｉ）の化合物は、更に水和物の形態で得ることが可能であるか、又はその結晶は、例えば結晶化のために使用された溶媒を含むこともできる（溶媒和物として存在）。
【００９２】
[0095]好ましい態様において、式（Ｉ）の化合物は、実施例中に規定される方法及び方法の工程によって、又はそれに類似して調製される。
【００９３】
[0096]出発物質
[0097]新しい出発物質及び／又は中間体、並びにこれらの調製のための方法は、国際特許出願公開ＷＯ２０６／１２２８０６中に更に開示されている。
【００９４】
[0098]式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の出発物質は、既知であるか、商業的に入手可能であるか、或いは当技術において既知の方法に類似して、又はそれによって合成することができる。
【００９５】
[0099]例えば、式（ＩＩ）の化合物は、以下の式（ＩＶ）のアミノ化合物
【００９６】
【化６】
2014532057.tif 000008
【００９７】
[00100]［式中、Ｒ１及びＲ２は、式（Ｉ）で与えられたとおりの意味を有する］と、以下の式（Ｖ）
Ｒ３−Ｘ    （Ｖ）
[00101]［式中、Ｒ３が、式（Ｉ）で与えられたとおりの意味を有し、そしてＸが、ハロゲン又はもう一つの適した脱離基である］の化合物との、塩基、例えば水酸化ナトリウムの存在中の、適した溶媒、例えばジクロロメタン及び水の混合物中の、好ましくは相転換触媒、例えば臭化テトラブチルアンモニウムの存在中の、０℃ないし５０℃間の温度、好ましくは室温における、アルキル化によって調製することができる。
【００９８】
[00102]式（ＩＶ）の化合物は、以下の式（ＶＩ）のジアミノ化合物と、
【００９９】
【化７】
2014532057.tif 000009
【０１００】
[00103]［式中、Ｒ１及びＲ２は、式（Ｉ）下で与えられたとおりの意味を有する］クロロギ酸トリクロロメチルとの、ジクロロメタンのような適当な溶媒中の、トリエチルアミンのような塩基の存在中の、環化によって調製することができる。
【０１０１】
[00104]式（ＶＩ）の化合物は、以下の式（ＶＩＩ）のニトロ化合物［式中、Ｒ１及びＲ２は、式（Ｉ）で与えられたとおりの意味を有する］の還元によって調製することができる。
【０１０２】
【化８】
2014532057.tif 000010
【０１０３】
[00105]還元は、好ましくは、ラネーニッケルのような適当な触媒の存在中の、水素のような適した還元剤の存在中で、例えば１．１ないし２バールの圧力下で、適当な溶媒、例えばメタノール又はテトラヒドロフラン或いはこれらの混合物のようなアルコール又はエーテル中で行われる。反応温度は、好ましくは０ないし８０℃、特に１５ないし３０℃間である。
【０１０４】
[00106]式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式（ＶＩＩＩ）の化合物：
【０１０５】
【化９】
2014532057.tif 000011
【０１０６】
[00107]［Ｙはハロゲン又は別の適した脱離基である］を、以下の式（ＩＸ）：
【０１０７】
【化１０】
2014532057.tif 000012
【０１０８】
の化合物［Ｒ１及びＲ２は、式（Ｉ）の化合物のために定義されたとおりである］と、
[00108]０℃ないし５０℃間の温度、好ましくは室温で、適した溶媒、即ち酢酸中で反応させる反応によって調製することができる。
【０１０９】
[00109]式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）及び（Ｖ）の出発物質のような全ての残りの出発物質は、既知であり、既知の方法によって調製することが可能であるか、又は商業的に入手可能である；特に、これらは、国際特許出願公開ＷＯ２０６／１２２８０６中に記載されている方法を使用して調製することができる。以下の実施例は、本発明をその範囲に制約することなく、本発明を例示するために役立つ。
【実施例】
【０１１０】
[00110]実施例１
[00111]本実施例において、その発現がＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２によって変更された遺伝子を確認するために、発現アレイを使用し、そして標的遺伝子の一つＰＤＥ４Ｂがｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの融合陽性ＭＥＣ細胞増殖のために必要であることを示した。結果は、ＰＤＥ４Ｂ及びＰＩ３−キナーゼシグナル伝達の組合せ阻害が、ＭＥＣを治療するための治療的戦略であることを証明している。
【０１１１】
[00112]材料及び方法
[00113]細胞株培養：Ｈ２９２、Ｈ３１１８、ＨＳＹ（８）、２９３Ｔ及び２９３ＦＴ細胞（Ｄｒ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｈａｈｎ’ｓ  ｌａｂ，Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｏｓｔｏｎからの寄贈品）を、１０％の熱失活胎児ウシ血清（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及び１％のペニシリンストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）で補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）中で培養した。全ての細胞株を、３７℃の５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０１１２】
[00114]プラスミド及び低分子ヘアピン型ＲＮＡ：ＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２（ｓｈ＃Ａ，ｓｈ＃Ｄ）のＭＡＭＬ２部分又はルシフェラーゼ（ｓｈＬＵＣ）を標的とする低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列を、ｐＳｕｐｅｒＲｅｔｒｏ−ＧＦＰ／Ｎｅｏベクター（Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ  Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）にクローン化した。ＰＤＥ４Ｂ（＃１ＴＲＣＮ０００００４８８２１、＃２ＴＲＣＮ０００００４８８１９）、ＰＩ３−キナーゼα（＃１ＴＲＣＮ００００１９６５８２、＃２ＴＲＣＮ００００１９６７９５）及びＰＩ３−キナーゼβ（＃１ＴＲＣＮ０００００３９９８２、＃２ＴＲＣＮ０００００１００２４）を標的とするｓｈＲＮＡレンチウイルス構築物を、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  ＲＮＡｉＳｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙから入手した。ｐＬＫＯ．１−混合対照ベクターを、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から入手した。ｐＭＤ２−ＶＳＶ−Ｇ及びｐＣＭＶ＿ｄｒ８＿９１は、Ｄｒ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｈａｈｎからの寄贈品である。ｓｈＲＮＡ配列を、表Ｉに示す。
【０１１３】
【表１】
2014532057.tif 000013
【０１１４】
[00115]ウイルスの形質導入及び感染：Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ，１：８２２−８３５（２０１０）中に記載されているように、レトロウイルスを、ｓｈ＃Ａ、ｓｈ＃Ｄ又はｓｈＬＵＣベクターを、パッキングプラスミドｐＭＤ．ＭＬＶ及び偽型エンベロープｐＭＤ２−ＶＳＶ−Ｇと一緒に２９３Ｔ細胞に形質移入することによって産生した。レンチウイルスを産生するために、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＩ３−キナーゼα、ＰＩ３−キナーゼ−β又はＰＬＫＯ．１−混合対照プラスミドを標的とするレンチウイルスベクターを、パッキングプラスミドｐＣＭＶ＿ｄｒ８＿９１及びｐＭＤ２−ＶＳＶ−Ｇと一緒に２９３ＦＴ細胞に形質移入した。ウイルスを、形質移入後４８及び７２時間目に収集した。標的細胞を、ウイルスで二回６時間感染させた。
【０１１５】
[00116]マイクロアレイ実験：Ｈ３１１８又はＨＳＹ細胞を、ｓｈＬＵＣ又はｓｈ＃Ｄを内部に持つレトロウイルスで二回形質導入した。ＧＦＰ陽性細胞を、形質導入後４８時間目に選別した。全ＲＮＡを、トリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して抽出し、そしてＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ）によって精製した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａ  ｐｌｕｓ＿２マイクロアレイチップによるハイブリダイゼーションを行い、そしてＤａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｃｏｒｅにおいて解析した。ｄ−Ｃｈｉｐ解析ソフトウェアを、解析のために使用した；Ｌｉ，Ｃ．ａｎｄ  Ｗｏｎｇ，Ｗ．Ｈ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００９）１０６：２６８−２７３。Ｈ３１１８細胞中の３倍の発現の変化を伴う遺伝子を有意と考えた（ｎ＝３、ｐ≦０．０５）。
【０１１６】
[00117]ウェスタンブロット分析：５０マイクログラムの細胞抽出物を、標準的な方法、例えばＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ，１：８２２−８３５（２０１０）を使用するＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルによって分離し、そして製造業者によって推奨されるような示された抗体で証明した。フィルムを、ＡｒｔｉｘＳｃａｎ  １８００ｆスキャナー（ＭｉｃｒｏＴｅｋ）を使用してＳｃａｎｗｉｚａｒｄ  Ｐｒｏ７ソフトウェアによって走査した。画像を加工し、そしてＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって自動的にレベルを合わせた。
【０１１７】
[00118]抗体及び阻害剤：ＰＤＥ４Ｂ（ＮＢ１００−２５６２，Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ＬＬＣ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ）、ホスホ−ＡＫＴ（＃９２７１，Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ＡＫＴ（＃９２７２，Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＰＩ３−キナーゼα（＃４２４９，Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＰＩ３−キナーゼβ（＃３０１１，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、β−アクチン（Ｓｉｇｍａ）。フォルスコリン（Ｆ３９１７，Ｓｉｇｍａ）、ロリプラム（ＰＤ−１７７，ＥＮＺＯ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）、ＬＹ−２９４００２（＃４４０２０２，ＥＭＢ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、化合物Ａ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）。
【０１１８】
[00119]定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）：全ＲＮＡを、トリゾール法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって単離した。ｑＰＣＲを、ＳＹＢＲ法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７５００配列検出装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して行った。ＳＹＢＲ法は、ＰＣＲ産物を、ＰＣＲサイクル中の蓄積に従って検出するために高度に特異的な、二重鎖ＤＮＡ結合性染料であるＳＹＢＲグリーンＩ染料を使用する。全ての試料を三重で増幅した。転写量の相対的変化は、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現レベルで正規化された（２０）。プライマーの配列を、表ＩＩに記載する。
【０１１９】
【表２】
2014532057.tif 000014
【０１２０】
[00120]細胞増殖、ＭＴＳアッセイ、細胞周期解析及びアポトーシスアッセイ：この方法は、先に記載されている（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ，１：８２２−８３５（２０１０））。細胞増殖：１−２×１０５個の細胞を、特異的ｓｈＲＮＡを内部に持つレンチウイルスで感染した。感染後５日目に、細胞を、トリパンブルー排除によって数えた。ＭＴＳ増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）：１−２×１０３個の細胞を、図６Ａに示すような濃度でＬＹ−２９４００２、化合物Ａ又はＤＭＳＯで処理した。ＭＴＳ活性を、５日目に測定した。細胞周期解析：１×１０５個の細胞を、阻害剤で処理するか、又はウイルスで感染した。ＤＮＡの量を、フローサイトメトリー解析（ＢＤ  ＦＡＣＳｃａｎｓ）によって測定した。アポトーシスアッセイ：１×１０５個の細胞を、阻害剤で処理するか、又はウイルスで感染した。細胞の生存率を、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＦＬＵＯＳ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）使用してフローサイトメトリー解析（ＢＤ  ＦＡＣＳｃａｎｓ）によって測定した。
【０１２１】
[00121]ｃＡＭＰ測定：細胞を、トリプシン化し、そして処理後、１×ＰＢＳで一回洗浄した。細胞のペレットを、１００μｌの０．１ＭのＨＣＬ中に再懸濁した。ｃＡＭＰの量を、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（＃９００−０６６，Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）によって、製造業者のプロトコルによって測定した。
【０１２２】
[00122]Ｉｎ  ｖｉｖｏのマウス異種移植モデル：マウスを、Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓの施設内指針によって維持し、そして処理した。Ｈ３１１８細胞を、ｓｈＰＤＥ４Ｂ−２又は混合対照ウイルスで二回感染させた。伝達後三日目に、５×１０６個のｓｈＰＤＥ４Ｂ細胞を、ＳＣＩＤ無毛（ＳＨＯ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の一つの側腹部に皮下（ｓ．ｃ．）注射し、そして５×１０６個の対照細胞を反対側の側腹部に注射した（Ｄｕｂｒｏｖｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００９，１０６：２６８−２７３；Ｓｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００８，６８：８０２２−８０３０）。合計５匹のマウスを使用した。腫瘍の体積を、１０日目から開始して二日毎に測定した、体積＝（長さ×幅２）×（π／６）。マウスを３０日目に犠牲にした。腫瘍を切除し、そして重量を測定した。
【０１２３】
[00123]統計的解析：値を、平均±ＳＤとして示した。比較は、スチューデントｔ検定を使用して行った（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。有意性のｐ値を、ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、ｐ＜０．００１（＊＊＊）として示した。
【０１２４】
[00124]結果
[00125]ＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２標的遺伝子の確認
[00126]ＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２標的遺伝子を目標とする以前の研究（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ，２００５，２４：２３９１−２４０２；Ｃｏｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５，６５：７１３７−７１４４）は、融合遺伝子を保持しないＨｅＬａ細胞中でＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２を過剰発現させることに基づいていた。ここでは、融合依存型ＭＥＣ癌細胞中の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）による融合遺伝子発現を、先ず発現停止することによって、これらの標的遺伝子を確認し、次いで全般的遺伝子発現特性を試験する系が使用された。ＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２のＭＡＭＬ２部分を標的とするＧＦＰマーカー及びｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ＃Ａ及び＃Ｂ）を保持する二つのレトロウイルス構築物を使用した。ルシフェラーゼ（ｓｈＬＵＣ）を標的とするｓｈＲＮＡを保持するレトロウイルスを、非サイレンシング対照として使用した。ｓｈＲＮＡ＃Ａ及び＃Ｄは、具体的には、ｓｈＬＵＣと比較して、融合陽性ＭＥＣＨ２９２（耳下腺由来）及びＨ３１１８細胞（肺由来）中のＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２発現の３０％−７０％を阻害した。不死化された耳下腺管細胞株のＨＳＹを、融合陰性対照として使用した（図１Ａ）。ＭＡＭＬ２は、有効なウイルス感染を示唆して、全ての三つの細胞株と同様な程度に下方制御された（図７）。ｓｈＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２の二つの形態（＃Ａ及び＃Ｄ）は、ｓｈＬＵＣ対照レトロウイルスと比較して、Ｈ２９２及びＨ３１１８を含む融合陽性細胞中の細胞増殖を有意に阻害したが、一方融合陰性のＨＳＹ細胞の増殖に対して有意な影響を持たなかった（図１Ｂ）。これらのデータは、使用されたｓｈＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２のこれらの二つの形態が、融合陽性ＭＥＣ細胞における融合発現及び細胞増殖の両方を特異的に阻害することを示す。
【０１２５】
[00127]ＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２標的細胞を確認するために、ｓｈＲＮＡ＃Ｄを、Ｈ３１１８及びＨＹＳ細胞を感染するために使用した。ＧＦＰ陽性細胞を、フローサイトメトリーによって富化し、全ＲＮＡを単離し、そしてマイクロアレイ分析を行った（Ｕ１３３プラス＿２アレイ，Ａｆｆｉｍａｔｒｉｘ）。１２８遺伝子の発現は、それぞれの細胞種におけるＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２ノックダウンとルシフェラーゼノックダウンを比較して、Ｈ３１１８細胞において３倍より大きいか、又はそれに等しく変化しているが、ＨＳＹ細胞においてはそうではないことが見いだされた（図９）。下方制御された遺伝子の一つは、ＳＴＣ１、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３及びＤＵＳＰ１（Ｔｕｌｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００７，２８２：９４８２−９４９１；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，２００５，１０２：４４５９−４４６４）を含む幾つかの既知のＣＲＥＢ標的遺伝子であった。ノッチ標的遺伝子ＨＥＳ２は、ＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２ノックダウンにおいて７倍上方制御された。ｑＰＣＲアッセイを、選択されたＣＲＥＢ及びノッチ標的遺伝子の発現の変化を証明するために行った（図８）。
【０１２６】
[00128]既知のＣＲＥＢ標的遺伝子に加えて、本出願人等は、ホスホジエステラーゼ４Ｂ（ＰＤＥ４Ｂ）の発現が、ＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２欠乏においてＨ３１１８細胞中で１７倍下方調節されたことを見出した。更に、ｓｈＲＮＡ＃Ａ及び＃Ｄの両方は、Ｈ３１１８及びＨ２９２細胞中のＰＤＥ４Ｂ発現を有意に阻害したが、しかし融合陰性ＨＳＹ細胞においてそうではなかった（図１Ｃ）。ＰＤＥ４Ｂのタンパク質レベルは、融合陽性Ｈ３１１８細胞中のＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２欠乏によって減少されたが、しかしＨＳＹ細胞ではそうではなかった（図１Ｄ）。ＰＤＥ４Ｂは、環状ヌクレオチドの細胞内濃度を調節するＩＶ型のサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）特異的ホスホジエステラーゼファミリーのメンバーであり、そしてシグナル伝達に関係している（Ｈｏｕｓｌａｙ，Ｍ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ，３５：９１−１００，（２０１０）；Ｌｙｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ  Ｔｉｐ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ，２００６，７５：２２５−２５９）。ＰＤＥ４Ｂは、白血病及びリンパ腫のような他の癌の腫瘍形成に寄与することが報告されている（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２００５，１０５：３０８−３１６）。ＣＲＥＢシグナル伝達の活性化は、これによりＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２がその発癌性活性を発揮する機構の一つであるため、ＰＤＥ４Ｂが、ＣＲＥＢ依存的様式で制御されるか否かの問題を調査した。ｃＡＭＰ／ＣＲＥＢシグナル伝達誘導因子であるアデニリルシクラーゼ活性化物質のフォルスコリンは、ＭＥＣ細胞中のＰＤＥ４Ｂ発現を変化せず（データは示されていない）、ＰＤＥ４Ｂのプロモーターが、機能的ＣＲＥＢ部位を内部に持たないことを示唆していた。これは、フォルスコリン処理によるＰＥＤ４Ｂの発現が、ＨＥＫ２９３Ｔ及び膵島細胞中で変化しないことを示すＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．による報告と一致する（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００５，１０２：４４５９）。更に、ＨＥＫ２９３Ｔ、肝細胞及び膵島細胞中のＰＤＥ４Ｂのプロモーターに結合する、ＣＨＩＰ分析におけるＣｈＩＰによって検出可能な、ＣＲＥＢ及びホスホ−ＣＢＰ（ＣＲＥＢ結合性タンパク質）は存在しなかった（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００５，１０２：４４５９）。更に、ＰＤＥ４Ｂの発現は、ＭＥＣ細胞中のｓｈＲＮＡで仲介されたＣＲＥＢ欠乏によって影響されなかった（データは示されていない）。これらの結果は、ＰＤＥ４ＢがＣＲＥＢシグナル伝達に関係ないＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２によって制御されていることができることを示唆した。
【０１２７】
[00129]フォルスコリン処理と組合せたロリプラムによるＰＤＥ４Ｂの阻害は、ＭＥＣ細胞中における細胞増殖を阻害し、細胞周期の停止を起こし、そしてアポトーシスを誘発する
[00130]細胞内ｃＡＭＰレベルを制御する機能に加えて、ＭＥＣにおけるＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２仲介の発癌におけるＰＤＥ４Ｂの潜在的役割りを調査した。ＰＤＥ４の薬理学的阻害剤のロリプラムは、ｃＡＭＰ活性化物質のフォルスコリンと一緒に、ＨＳＹ細胞と比較して、Ｈ２９２及びＨ３１１８細胞増殖を５０％−６０％阻害した（図２Ａ）。細胞増殖は、単独のロリプラム処理によって変化しなかったが、しかし阻害効果は、ロリプラム及びフォルスコリンの両方を混合することによって大きく向上され、ＭＥＣ陽性細胞増殖におけるｃＡＭＰシグナル伝達の制御の可能性を示唆した（図２Ａ）。融合陰性のＨＳＹ細胞の増殖は、ＰＤＥ４Ｂ阻害によって影響されず、ＰＤＥ４Ｂの発現レベルは、ＨＳＹ細胞において、Ｈ２９２及びＨ３１１８細胞と比較して類似であるが（データは示されていない）、ＨＳＹ細胞は、最適な増殖のためにＰＤＥ４Ｂに依存しないことを示した（図２Ａ）。細胞増殖の阻害の分子的機構は、更に細胞周期特性及び細胞のアポトーシス速度を解析することによって決定される。２４時間のロリプラムとフォルスコリン処理は、ＤＭＳＯ対照と比較して、Ｈ２９２及びＨ３１１８の細胞周期のＧ１／Ｇ０期における停止を起こした（Ｈ２９２細胞において５８％対３９％、Ｈ３１１８において７４％対３１％）。ＨＳＹの細胞周期は、影響されていないが（５６％対５７％）（図２Ｃ）、ロリプラムとフォルスコリンは、更にＨ２９２及びＨ３１１８細胞におけるアポトーシスを有意に誘発したが、しかしＨＳＹ細胞では、そうではなかった（図２Ｂ）。まとめれば、これらのデータは、ＰＤＥ４Ｂの阻害が、融合陽性のＭＥＣ細胞増殖を、細胞周期の停止及びアポトーシスを誘発することによって防止することを証明した。
【０１２８】
[00131]ｓｈＲＮＡによるＰＤＥ４Ｂの欠乏は、ＭＥＣ細胞における細胞増殖を阻害し、細胞周期の停止を起こし、そしてアポトーシスを誘発する
[00132]更に強力な、そしてＰＤＥ４Ｂアイソフォームに特異的な阻害剤は、なお開発中であるために（Ｐａｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｐａｔ，２００９，１９：１５０１−１５１９；Ｓｒｉｖａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ，２００８，１４：３８５４−３８７２）、二つのｓｈＲＮＡ（＃１及び＃２）が、ＰＤＥ４Ｂを特異的にノックダウンするために使用された（図３Ａ）。ｓｈＲＮＡを内部に持つレンチウイルスにより、細胞を感染することによるＰＤＥ４Ｂの欠乏において、Ｈ２９２及びＨ３１１８細胞の増殖は、非特異的混合対照と比較して、それぞれ７４％及び８３％有意に阻害された（図３Ｂ）。ＰＤＥ４Ｂの下方制御は、ＨＳＹ細胞において、僅かな、しかしＨ２９２及びＨ３１１８細胞と比較して遥かに少ない程度の増殖の減少を起こした。更に、ＰＤＥ４Ｂのノックダウンは、混合対照と比較して、Ｈ２９２及びＨ３１１８細胞周期の停止をＧ０／Ｇ１期で起こし（Ｈ２９２細胞において７８％対５０％、Ｈ３１１８において７９％対５７％）、一方、ＨＳＹ細胞は、はるかに少ない影響を有した（図３Ｃ）。更に、Ｈ２９２及びＨ３１１８細胞は、ＰＤＥ４Ｂ下方制御後に有意なアポトーシスを受け、一方、ＨＳＹ細胞は、有意な影響を持たなかった（図３Ｄ）。これらのデータは、ｓｈＲＮＡによるＰＤＥ４Ｂの特異的下方制御が、細胞周期の停止及びアポトーシスによりＭＥＣ細胞増殖を阻害することを示唆し、これは、ＭＥＣ細胞に対するＰＤＥ４Ｂの薬理学的阻害剤の効果と一致した。
【０１２９】
[00133]ＰＤＥ４Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏのＭＥＣ細胞増殖のために必要である
[00134]Ｉｎ  ｖｉｖｏのＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２仲介の発癌におけるＰＤＥ４Ｂの機能的有意性も更に評価した。ＰＤＥ４Ｂを標的とするｓｈＲＮＡ（ｓｈＰＤＥ４Ｂ）を内部に持つレンチウイルスで感染された５百万個のＨ３１１８細胞を、ＳＣＩＤ無毛マウスの一つの側腹部にｓ．ｃ．注射し、そして５百万個の対照細胞を、反対側の側腹部に注射した。腫瘍体積を二日毎に測定した。ＰＤＥ４Ｂノックダウンを伴う細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏの対照細胞より有意に遅く増殖した（図４Ａ）。マウスを３０日後に犠牲にし、そして腫瘍の重量を測定した。ＰＤＥ４Ｂ下方制御をを伴う腫瘍の平均重量は、対照より８８％少なかった（図４Ｃ）。ＰＤＥ４Ｂの発現は、対照と比較したＰＤＥ４Ｂ下方制御を伴う腫瘍検体において７１％抑圧された（図４Ｄ）。まとめれば、これらのデータは、ＰＤＥ４Ｂが、ｉｎ  ｖｉｖｏの融合陽性ＭＥＣ細胞増殖において重要な役割を有することを証明する。
【０１３０】
[00135]ＰＤＥ４Ｂの阻害は、ＭＥＣ細胞中の細胞内ｃＡＭＰレベルを増加し、そしてＰＩ３−キナーゼシグナル伝達を下方制御する
[00136]ＰＤＥ４Ｂは、ｃＡＭＰを加水分解する酵素であるために、阻害が、ＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２陽性細胞中の細胞内ｃＡＭＰレベルを増加するものであるか否かを決定するために、ＰＤＥ４Ｂの阻害を調査した。決定されたように、ロリプラムとフォルスコリン処理は、Ｈ２９２細胞中のＤＭＳＯ対照と比較して、ｃＡＭＰレベルを７倍増加した。Ｈ３１１８細胞において、単独のフォルスコリン処理は、ｃＡＭＰレベルを７倍増加し、一方、ロリプラム及びフォルスコリンの組合せは、ｃＡＭＰレベルを更に８倍に増加した。これらの阻害剤は、ＨＳＹ細胞に対して効果を持たない（図５Ａ）。ｓｈＲＮＡによるＰＤＥ４Ｂの特異的ノックダウンは、混合対照と比較してＨ２９２及びＨ３１１８細胞中のｃＡＭＰレベルを有意に増加し、一方、ＨＳＹ細胞は、僅かな効果を有していた（図５Ｂ）。これらのデータは、ＰＤＥ４Ｂは、融合陽性ＭＥＣ細胞中のｃＡＭＰレベルを特異的に制御することを示す。
[00137]更に強力なＰＤＥ４Ｂ特異的阻害剤が、更に確認されるものであるために、ＰＤＥ４Ｂの下流にあるシグナル伝達経路を調査し、そしてＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２シグナル伝達に対する更に有効な阻害剤を探求した。Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．は、ＰＩ３−キナーゼ／ＡＫＴシグナル伝達が、ＰＤＥ４Ｂの下流の経路の一つであることを報告した（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２００５，１０５：３０８−３１６）。ロリプラムとフォルスコリン又はｓｈＲＮＡノックダウンによってＰＤＥ４Ｂを阻害した後、減少したホスホ−ＡＫＴレベルが、対照の処理された細胞と比較して、融合陽性ＭＥＣ細胞中で観察され、ＰＤＥ４Ｂの阻害が、ＰＩ３−キナーゼ／ＡＫＴシグナル伝達の下方制御に導くことを示した（図５Ｃ及びＤ）。
【０１３１】
[00138]ＭＥＣ細胞増殖に対するＰＩ３−キナーゼシグナル伝達の寄与
[00139]ＰＩ３−キナーゼ／ＡＫＴシグナル伝達は、細胞増殖及び生存において重要な役割を演じ（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，２８：１０７５−１０８３，２０１０）、そして幾つかの癌においてＰＤＥ４Ｂ依存的様式で細胞増殖を促進することができる（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２００５，１０５：３０８−３１６；ＭｃＥｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００７，６７：５２４８−５２５７）。従って、ＭＥＣにおけるＰＤＥ４Ｂ仲介の腫瘍形成に対する、ＰＩ３−キナーゼシグナル伝達の寄与を調査した。ＰＩ３−キナーゼ阻害剤のＬＹ−２９４００２及び化合物Ａは、Ｈ２９２及びＨ３１１８細胞増殖を用量依存様式で阻害し、ＬＹのＩＣ５０は、概略４−１０μＭ、そして化合物ＡのＩＣ５０は、概略６−２０ｎＭであった（図６Ａ）。ＭＥＣ細胞は、ＰＩ３−キナーゼアイソフォームα、β及びδを発現し、α及びβは、δより５ないし２０倍豊富であった（データは示されていない）。特異的ＰＩ３−キナーゼアイソフォームが、ＭＥＣ細胞増殖の制御において更に重要な役割を演じているか否かを調査するために、ｓｈＲＮＡを、α及びβを特異的にノックダウンし、そしてＭＥＣ細胞に対する増殖阻害効果を調査するために使用した。ＰＩ３−キナーゼの下方制御は、αのノックダウンが、βのタンパク質レベルに対して影響を持たず、そしてその逆も同じであるように、アイソフォーム特異的であった（図６Ｂ）。Ｈ２９２及びＨ３１１８細胞中のＰＩ３−キナーゼαの阻害は、細胞増殖の７０％−９０％を阻害し、一方ＰＩ３−キナーゼβのノックダウンは、細胞増殖の２０％−５０％を減少し（図６Ｂ）、多数のＰＩ３−キナーゼがＭＥＣ細胞増殖に寄与していることを示唆した。更に、第ＩＩ期の臨床試験中のＰＩ３−キナーゼ阻害剤の化合物Ａは、ロリプラム及びフォルスコリンと組合された場合、ＭＥＣ細胞増殖を阻害する相加効果を有していた（図６Ｃ）。これらのデータは、ＰＩ３−キナーゼシグナル伝達が、ＭＥＣ細胞増殖に対して有意に寄与し、そしてＰＤＥ４Ｂ及びＰＩ３−キナーゼ阻害剤の寄与が、ＭＥＣ中で相乗的活性を有することができることを示唆した。
【０１３２】
[00140]要約すれば、ＰＤＥ４Ｂは、新規なＣＲＴＣ１−ＭＡＭＬ２の下流の標的遺伝子である。ＰＤＥ４Ｂの薬理学的阻害剤又はｓｈＲＮＡのいずれかによる阻害は、細胞周期の停止及びアポトーシスを誘導することによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏのＭＥＣ細胞増殖を防止する。更に、ＰＩ３−キナーゼシグナル伝達は、ＭＥＣ細胞増殖に有意の寄与し、式（Ｉ）のＰＩ３−キナーゼ阻害剤が、単独で又はＰＤＥ４Ｂ阻害剤との組合せのいずれかで、ＭＥＣを治療することにおける有望な治療戦略を与えることを証明する。
【０１３３】
[00141]本明細書中に提供される定義及び開示は、参考文献として援用される全ての他のものを支配し、そして優先する。本明細書中の発明は、その好ましい態様に関連して記載されてきたが、具体的に記載されていない付加、改良、置換、及び削除を、付属する特許請求の範囲に定義されるとおりの本発明の思想及び範囲から逸脱することなく行うことができることは当業者によって認識されるものである。従って、前述の詳細な説明は、制約ではなく例示として考慮されることが意図され、そして本発明の思想及び範囲を定義することを意図するものは、全ての等価物を含む以下の特許請求の範囲であることは理解されることである。
【図１】
2014532057.tif 000022
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
2014532057.tif 000031
【図９−３】
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【図９−４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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