(57)【要約】  本発明は、種子が、それらが生じる雄性配偶子と遺伝的に同一である、種子のセットの生成のための方法であって、４集粒または２集粒の形態を有する限られた数の父系配偶子を花の柱頭に配置し、母系卵細胞を受精させ、多数の接合子を取得すること；および前記接合子からの母系染色体の喪失を誘導し、母系染色体が存在しない限られた数の種子を含有する種子セットを取得することを含む、方法に関する。好ましい実施形態では、父植物は減数分裂の間に、染色体組換えの抑制または第２分裂復元（ＳＤＲ）を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
種子が、それらが生じる雄性配偶子と遺伝的に同一である、種子のセットの生成のための方法であって：
ａ）４集粒または２集粒の形態を有する限られた数の父系配偶子を花の柱頭に配置し、母系卵細胞を受精させ、多数の接合子を取得すること；
ｂ）前記接合子からの母系染色体の喪失を誘導し、母系染色体が存在しない限られた数の種子を含有する種子セットを取得すること
を含む、方法。
【請求項２】
限られた数の父系配偶子が、柱頭を担持する母系生殖器官に含有される卵細胞の数と等しいか、それより少ない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
限られた数の父系配偶子が２つまたは４つである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
４集粒または２集粒の形態を有する父系配偶子が、小胞子４集粒分離に対する干渉の結果である、請求項１−３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
小胞子４集粒分離に対する干渉が、単一の減数分裂に由来する小胞子間のペクチン層の破壊に関わる一以上の標的遺伝子に対する干渉を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
一以上の標的遺伝子が、ＱＲＴ１、ＱＲＴ２、ＱＲＴ３またはそれらの機能的ホモログからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
小胞子４集粒分離に対する干渉が、化学的手段によって達成される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
父植物が染色体組換えの抑制を示す、請求項１−７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
父植物が減数分裂の間に第２分裂復元（ＳＤＲ）を示す、請求項１−７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
染色体組換えの抑制が、組換えに関わる一以上の標的遺伝子に干渉することにより達成される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
一以上の標的遺伝子が、ＳＰＯ１１、ＭＥＲ１、ＭＥＲ２、ＭＲＥ２、ＭＥＩ４、ＲＥＣ１０２、ＲＥＣ１０４、ＲＥＣ１１４、ＭＥＫ１／ＭＲＥ４、ＲＥＤ１、ＨＯＰ１、ＲＡＤ５０、ＭＲＥ１１、ＸＲＳ２、またはそれらの機能的ホモログなど、二本鎖切断に関わる、あるいは一以上の標的遺伝子が、ＲＨＤ５４／ＴＩＤ１、ＤＭＣ１、ＳＡＥ３、ＲＥＤ１、ＨＯＰ１、ＨＯＰ２、ＲＥＣ８、ＭＥＲ１、ＭＲＥ２、ＺＩＰ１、ＺＩＰ２、ＭＥＩ５、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＰＡ、ＳＭＣ３、ＳＣＣ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＰＭＳ１、ＳＯＬＯＤＡＮＣＥＲＳ、ＨＩＭ６、ＣＨＫ２、またはそれらの機能的ホモログなど、染色体対合および／または鎖交換に関わる、あるいは一以上の標的遺伝子が、ＳＧＳ１、ＭＳＨ４、ＭＳＨ５、ＺＩＰ１およびＺＩＰ２、またはそれらの機能的ホモログなど、減数分裂組換えプロセスに関わる、あるいは一以上の標的遺伝子が、ＰＲＤ１、ＰＲＤ２、ＰＲＤ３、ＰＨＳ１、ＮＢＳ１、ＣＯＭ１、ＭＮＤ１、ＭＥＲ３／ＲＣＫ、ＺＩＰ３、ＺＩＰ４、ＰＴＤ、ＳＨＯＣ１、ＺＹＰ１、ＭＬＨ１、ＭＬＨ３、またはそれらの機能的ホモログからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
一以上の標的遺伝子に対する干渉が、それらの転写を阻止することからなる、請求項５または１０に記載の方法。
【請求項１３】
転写が、好ましくは、標的遺伝子プロモーターに対して向けられたＲＮＡオリゴヌクレオチド、ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ分子によって阻止される、あるいは転写が、好ましくは、標的遺伝子プロモーターに作用する、負に作用する転写因子の発現によって阻止される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
一以上の標的遺伝子に対する干渉が、好ましくは、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ分子、ウイルス誘導性遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）分子、共抑制因子分子、ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、標的遺伝子のｍＲＮＡまたは転写物に相補的である、核酸分子によって、標的遺伝子のｍＲＮＡまたは転写物を不安定化することからなる、あるいは一以上の標的遺伝子に対する干渉が、好ましくは一以上のドミナントネガティブな核酸構築物の発現産物によって、または好ましくは一以上の化合物によって、標的遺伝子の発現産物を阻害することからなる、請求項５または１０に記載の方法。
【請求項１５】
一以上の標的遺伝子に対する干渉が、その生物学的機能の撹乱につながる、標的遺伝子中への一以上の変異の導入からなり、かつ一以上の変異が、好ましくは、エチルメタンスルホネート、ニトロソメチルウレア、ヒドロキシルアミン、プロフラビン、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−ニトロソグアニジン、ジエチル硫酸、エチレンイミン、アジ化ナトリウム、ホルマリン、ウレタン、フェノールおよびエチレンオキサイドなどの一以上の化合物によって、および／またはＵＶ照射、高速中性子ばく露、Ｘ線、ガンマ線照射などの物理的手段によって、および／またはトランスポゾン、Ｔ−ＤＮＡ、レトロウイルスエレメントなどの遺伝子エレメントの挿入によって、ランダムに導入され、かつ／または一以上の変異が、相同性組換えまたはオリゴヌクレオチドに基づく変異導入によって特異的に導入される、請求項５または１０に記載の方法。
【請求項１６】
第２分裂復元が、特に開始生物に干渉せずに、自然発生的に起こる、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
第２分裂復元が遺伝的改変によって誘導され、遺伝的改変が一過性である、または遺伝的改変が、生物における第２分裂復元事象の数を増加する、遺伝子エレメントのゲノム内への安定な組み込みにより達成される、あるいは第２分裂復元が、温度ストレス、ＮＯ２、亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ）、またはそれらの組み合わせなどの環境ストレスに父植物を供することにより達成される、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
接合子からの母系染色体の喪失が、半数体誘導因子系統を雌株として用いることにより誘導される、請求項１−１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
雌株が異なる種の植物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
雌株が、異種導入遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック植物であり、該異種導入遺伝子発現カセットが、組換え的に改変されたＣＥＮＨ３、ＣＥＮＰＣ、ＭＩＳ１２、ＮＤＣ８０またはＮＵＦ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含み、かつ対応する不活性化された内因性ＣＥＮＨ３、ＣＥＮＰＣ、ＭＩＳ１２、ＮＤＣ８０またはＮＵＦ２遺伝子を有するものである、請求項１−１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
母系染色体が存在しない限られた数の種子を含有する種子のセットであって、そのセットが、該種子から生育した植物が交配される場合、本質的に同じ交配種をもたらす、遺伝的に相補的な種子の対から構成され、かつその種子のセットが、請求項１−２０のいずれか一項に記載の方法により得ることができる、種子のセット。
【請求項２２】
遺伝子構成がその雄性原原種の遺伝子構成と本質的に同一である植物の生成のための、親植物のセットを提供するための方法であって、種子の染色体数の倍加の後または前に、請求項２１に記載の種子のセットの種子から植物を生育させること、および２つの遺伝的に相補的な植物を親植物として同定することを含む、方法。
【請求項２３】
遺伝子構成がその父系祖父の遺伝子構成と本質的に同一である植物を同定するため、かつ遺伝子構成がその父系祖母の遺伝子構成と本質的に同一である別の植物を同定するために、種子のセットまたはそれらから生育した植物が、それらの遺伝子構成についてスクリーニングされる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
遺伝子構成がそれら自身の祖父の遺伝子構成と本質的に同一である子孫植物を取得するために、遺伝子構成がその父系祖父の遺伝子構成と本質的に同一である植物が、遺伝子構成がその父系祖母の遺伝子構成と本質的に同一である別の植物と交配される、請求項２１−２３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種子が、それらが生じる雄性配偶子と遺伝的に同一である、種子のセットの生成のための方法に関する。本発明はさらに、母系染色体が存在しない限られた数の種子を含有する種子のセットであって、そのセットが、該種子から生育した植物が交配される場合、本質的に同じ交配種をもたらす、遺伝的に相補的な種子の対から構成される、種子のセットに関する。本発明はまた、遺伝子構成（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）がその雄性原原種（ｍａｌｅ  ｇｒａｎｄｐａｒｅｎｔ）の遺伝子構成と本質的に同じである植物の生成のための親植物のセットを提供するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物育種は、十分な質と量の食品、飼料および繊維を得る、ヒトの利益のための植物種の栽培化に相当する。植物育種は人類の非常に古い仕事であり、２０世紀の間に科学的根拠を与えられた唯一の実践的知識である。植物育種は本来、地域の選抜場においてより効率が良い植物を選抜し、繁殖させることに基づいていた。遺伝の法則の再発見および統計ツールの開発と共に、植物育種は遺伝学の知識に基づくようになり、倍加半数体（ｄｏｕｂｌｅｄ  ｈａｐｌｏｉｄｓ）などの方法により技術的に支持された−例えば、Ｈａｐｌｏｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｒｏｐ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ＩＩ  ｅｄｓ；  Ｐａｌｍｅｒ  Ｃ，  Ｋｅｌｌｅｒ  Ｗ，  ａｎｄ  Ｋａｓｈａ  Ｋ  （２００５）  ｉｎ：  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｏｒｅｓｔｒｙ  ５６  Ｅｄｓ；  Ｎａｇａｔａ  Ｔ，  Ｌｏｒｚ  Ｈ，  ａｎｄ  Ｗｉｄｈｏｌｍ  Ｊ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＩＳＢＮ  ３−５００−２２２２４−３を参照のこと−および、分子マーカー−例えば、Ｄｅ  Ｖｉｅｎｎｅ  ｅｄ．  （２００３）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．  Ｅｎｆｉｅｌｄ，  ＮＨ  ＵＳＡ．  ＩＳＢＮ  １−５７８０８−２３９−０を参照のこと。
【０００３】
植物育種は、経済的な方法でその利用を可能にする、特定の環境に合わせた遺伝現象（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｃｅｐｔ）を提供する。植物育種のこの目的は、植物種の生殖質内に存在する遺伝的変異（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）の効率的な利用によって達成される。かかる遺伝現象は、特定の環境で所望の表現型をもたらす遺伝子の組み合わせを含む。これは、植物を生育させ、生成物を回収するのに必要な最小限のコストで、収穫される植物部分が収量および品質で最大化されることを意味する。植物育種が商業レベルで適用される場合、種子生成もまた重要な課題である。種子生成は、遺伝子構成が保存されている有性生殖の手段によって植物の繁殖を目指している。
【０００４】
また、商業用種子は効率的な発芽を可能にするのに十分な品質である必要がある。有性生殖は、根本的に、対立遺伝子の新しい組み合わせを備える子孫を作成するために存在するので、有性生殖を介する遺伝子構成の保存は、しかしながら、逆である。有性生殖の間に働く遺伝的機構は、変化する環境の中での種の生存の機会を高めるために、遺伝的変異を増加させるよう進化してきた。減数分裂期組換え、独立した染色体組合せ（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）および交配様式（ｍａｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）は、この点での主な要因である。それゆえ、有性生殖を介する子孫の均一性は、親植物が完全にホモ接合である場合にのみ達成することができる。かかる植物の配偶子を組み合わせることにより、各後続世代にける親の遺伝子組成（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）の正確な再生につながる。
【０００５】
多くの作物において、多くの作物では、商業用種子は２つのホモ接合性の親系統の交配から生じる。このアプローチは、Ｆ１交配種が数個の遺伝子座についてヘテロ接合性であることを保証し、雑種強勢（ｈｙｂｒｉｄ  ｖｉｇｏｕｒ）および均一性をもたらすことができる。育種家が既存のＦ１交配品種（ｈｙｂｒｉｄ  ｖａｒｉｅｔｙ）または同系交配品種（ｉｎｂｒｅｄ  ｖａｒｉｅｔｙ）を改善することを望む場合、この目的を達成するために、彼は伝統的に交配を行い、経験的な選抜を数回経る必要があるだろう。
【０００６】
植物の生育と発達に関連した遺伝子機能の知識はまだ限られているため、育種家は未だ表現型の選抜にほとんど依存している。同系交配（ｉｎｂｒｅｅｄｉｎｇ）の間、特に初期の世代の間、多数の遺伝子はヘテロ接合状態にあるため、いくつかの個々の植物に割り当てられた表現型値に関与する遺伝子の対立遺伝子バリアントは、容易に失われ得る。これは有性生殖および同系交配の間に、ヘテロ接合性および特定の遺伝子相互作用が失われているという事実によるものである。そのため、植物の育種において、特に遺伝的にヘテロ接合性の植物が、高い農学的、園芸的または観賞価値を有すると同定されている場合、これらの機構は非生産的に作用し得る。有性生殖は、望ましい対立遺伝子の分離（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）をもたらすだろう。
【０００７】
そのため、高い農学的、園芸的または観賞価値を有する植物の有性生殖の間、遺伝子構成の保存を効率良く可能にする技術が強く求められている。
【０００８】
遺伝子構成を維持しながら、植物を永続化させるための１つの可能性は、栄養繁殖によるものである。繁殖がもっぱら有糸分裂を介して起こるので、これは遺伝子組成の完全な保存を可能にする。植物は、それらが迅速に生育地を占有することを可能にする、栄養繁殖の天然の機構を進化させてきた。例えば、栄養繁殖は塊茎、球根または根茎の形成を介して起こり得る。挿し木を生成するインビトロまたはインビボ培養技術を使用することは、代替案である。種子を介する繁殖と比較した場合、栄養繁殖技術の商業的な欠点は、それが労働集約的であり、従って費用がかかるという事実である。さらにまた、より長い期間植物を保存することは、物流の問題を提起し、困難であり、かつ、ウイルスのような病原体による植物物質の感染のリスクは、種子を介して繁殖される植物物質における状況と比較して、かなり大きい。
【０００９】
あるいは、栄養繁殖は、一般に、無配偶生殖（ａｐｏｍｉｘｉｓ）と呼ばれる無性種子の形成を介して達成してもよい。この現象は多数の種において天然に発生し、かつ、遺伝子工学によって、性的に繁殖する植物種において誘導され得る。理論的には、これは、三つの異なる無配偶生殖の段階、すなわち、アポマイオシス（ａｐｏｍｅｉｏｓｉｓ）、単為生殖（ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）、および自発的な胚乳発生（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）を天然に誘導する、特定の遺伝子を利用することによって達成できる。しかしながら、実際には、種々の異なる段階に関与する遺伝子はまだ同定されておらず、かつ、それらの相互作用は非常に複雑であるだろう。
【００１０】
一方、無配偶生殖成分（ａｐｏｍｉｘｉｓ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）の人工工学はかなり実現可能である。例えば、減数分裂の間の種々の段階を改変することによって、減数分裂が本質的に有糸分裂に変換され得ることが示されている。このいわゆる「ＭｉＭｅアプローチ」は、二本鎖切断の形成を抑制する変異（ｓｐｏ１１−１）、減数分裂第一期（ｍｅｉｏｓｉｓ  Ｉ）の間に姉妹染色分体の分離を誘発する変異（ｒｅｃ８）、および第二減数分裂をスキップする変異（ｏｓｄ１）の組み合わせを使用する。単為生殖および自発的な胚乳形成とこのアプローチを組み合わせることで、操作された無配偶生殖をもたらし得る（ｄ’Ｅｒｆｕｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ：  Ｔｕｒｎｉｎｇ  ｍｅｉｏｓｉｓ  ｉｎｔｏ  ｍｉｔｏｓｉｓ；  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００９；  ＷＯ／２０１０／０７９４３２）。以前から、植物育種のための無配偶生殖技術の可能性は広く認識されてきたが、概念実証はまだ得られていない。
【００１１】
さらに別の代替案として、逆育種技術（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用することができる（ＷＯ０３／０１７７５３）。逆育種は、遺伝子工学または化学干渉を介する減数分裂期組換えの抑制、および非組換え親の染色体を含有する胞子に由来する倍加半数体植物（ＤＨ）の後続の生成に基づく。これらのＤＨは、単に、減数分裂の間に生じる、独立した親染色体組合せ（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｒｅｎｔａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）の結果として、それらの遺伝子組成に関して異なる。それゆえ、ＤＨまたはそれら由来の系統のどれが、元の出発植物の遺伝子組成を再構成するために、交配を介して結合されるべきであるかを決定するため、染色体当たり１つの共優性（ｃｏ−ｄｏｍｉｎａｎｔ）多型マーカーを使用するので十分である。このように、逆育種技術の適用は、その遺伝子組成が不明であっても、種子を介する任意の稔性選抜植物の遺伝的保存を可能にする。
【００１２】
この技術の欠点は、減数分裂期組換えの完全な抑制がキアズマの欠如をもたらす、という事実である。これは、配偶子の異数性を引き起こし、それゆえ配偶子の生存率および性能の低下を引き起こし得る、減数分裂第一期の間の不適切な染色体分離を引き起こし得る。キアズマが減数分裂第一期の間に形成されない場合、全ての染色体は、極のいずれか一つに移動する独立した５０％の可能性を有する。これは、完全な染色体組（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を有する胞子を作る理論的可能性が（１／２）ｎである、ここでｎは半数体染色体数を表す、ことを意味する。均衡のとれた（ｂａｌａｎｃｅｄ）配偶子の頻度は、したがって、半数体染色体数の増加と共に減少する。多くの作物種が比較的少ない染色体数を有するが（例えば、キュウリは半数体ゲノムあたり７染色体を有する；ホウレン草はたった６だけ有する）、比較的多い染色体数を備える経済的に重要な種も存在する。１つの良い例はトマトであり、経済的に最も重要な野菜作物の１つであって、半数体ゲノム当たり１２染色体を有する。この技術的制約が、逆育種技術の効率を著しく低下させる。
【００１３】
別の代替的なアプローチとして、非減数胞子（ｕｎｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｐｏｒｅ）から再生された植物の使用がある。この技術は、近逆育種（Ｎｅａｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）と命名されている（ＷＯ２００６／０９４７７３）。非減数胞子は、第二減数分裂の脱落の結果として、選択的に形成される。この自然発生の現象は、第２分裂復元（ＳＤＲ）と呼ばれ、かつ優性生殖の間、植物において正常の減数分裂事象と同時に発生し得る。
【００１４】
近逆育種技術は、天然または人工ＳＤＲを介して生成された、非減数胞子から植物を再生することにより、ＳＤＲ事象を利用している。ＯＳＤ１およびＴＡＭ１などの−変異させた場合に−ＳＤＲを生じさせる遺伝子が発見されている。結果として生じる植物（ＳＤＲ−０植物と呼ぶ）は、概ねホモ接合性であり、かつ、続いてそれらを用いて、従来のＤＨを生成できる。開始植物の父系ゲノムと母系ゲノムとの間で多型である分子マーカーを用いて、それらの遺伝子組成に関して概ね相補的である、それらＳＤＲ−０植物（およびそれらに由来するＤＨ）を同定できる。
【００１５】
これらの植物の交配は、元の開始植物の遺伝的体質（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｋｅ−ｕｐ）のほぼ完全な再構成をもたらすであろう。しかしながら、ＳＤＲ−０事象の形成の間およびそれらに由来するＤＨの形成の間の減数分裂期組換えに起因して、相補性は完全では無いだろう。再構成された交配種は、遺伝学的にある程度まで、両者互いに、かつ元の開始交配植物とは異なっているだろう。しかしながら、この差異は、ＤＨが正常の減数分裂事象に直接由来する場合と比較すると、著しく減少されるだろう。さらに、これらのＤＨは、さらなる選択の余地が全く無いという意味で、遺伝的に固定されている。
【００１６】
このプロセスにおいてＳＤＲ事象を組み込むことの利点は、遺伝的相補性に関する選択が２段階プロセスにおいて発生することである。第一段階は、染色体の近位領域、すなわち動原体を含む、に集約される。第二段階は、染色体の遠位端、すなわち組換えによって交換されたそれらの領域、に向けられている。この遅発性の遺伝子固定は、特に、分子マーカーが選択のために利用できる場合に、複雑さを減少させ、大部分相補的な遺伝子型を見つける可能性を増加させる。
【００１７】
このアプローチのさらなる利点は、ＳＤＲが有性生殖中に自然に発生し、かつ、有性生殖プロセスへの干渉をさらに必要としないものとして用いることができる、という事実である。ＳＤＲ事象の正常出現率（ｎｏｒｍａｌ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）をさらに増加させる方法は、例えば、Ｎ２Ｏでのストレス処理を介し（ユリにおいて：Ｂａｒｂａ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ  （２００６），  Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  １４８：  ３０３−３０９；およびチューリップにおいて：Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５），  Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  １４３：  １０１−１１４、以前記述されているように）、当技術分野において知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
優れた農学的、園芸的または観賞的特性を備えるヘテロ接合性植物の遺伝子構成を保存するため、上述の方法の効率をさらに増加することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、特定の変異が、花粉形成の間の小胞子の分離の欠陥（ｄｅｆｅｃｔ）につながり得るという観察を利用している。これは、その発達の間中ずっと一緒に物理的に付着したままである４つの花粉粒のクラスターの形成をもたらす。クラスター内の個々の花粉粒は、成熟時に４集粒（ｔｅｔｒａｄ）で一緒に残っているが、それらは稔性（ｆｅｒｔｉｌｅ）であり、それぞれ受精を行い、かつ受粉の際に種子を生成することができる。このいわゆる四分子（ｑｕａｒｔｅｔ）表現型に関する生物学的説明は、花粉発達の初期段階において、小胞子間にだけ通常存在する、ペクチン層を溶解できなかったということである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１：種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の染色体の数に関する、各花粉四分子（ｐｏｌｌｅｎ  ｔｅｔｒａｄ）に関する染色体相補性（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）の具体的な結果を表す、いわゆるパスカルの三角形。上から下まで、半数体染色体の数は増加し、かつ各列上の数の合計は常に、ｎ個の染色体が関わる減数分裂から生じ得る種々の減数分裂生成物の合計数である、２ｎに等しい。例として我々が七番目の列を採用する場合（例えば、７つの半数体染色体を有する、ｎ＝７のキュウリについて）、完全に相補的な事象の数は常に１、すなわち列の最初の数であり、一方で列の二番目の数が半数体染色体の数に対応することが見られる。同じ列の続く数は、それぞれ、４集粒中に２、３、４、５および６つの非相補的染色体を有する減数分裂生成物の予想される数に対応する。１つの非相補的染色体を有する事象の合計数は７＊２であり、２つの非相補的染色体を有する場合は２１＊２である、等。例えば、３つの染色体が非相補的である場合、これは他の４つの染色体が相補的であることを意味する。重要なことに、この文脈における「非相補的」は、実際には、これらの染色体のテロメア末端を指すだけである。我々が、例えば、組換え後に、３つの非相補的な染色体と４０％のみのヘテロ接合性を有する状況にある場合、７つの染色体のうち４つは完全に相補的であり、一方で他の３つの染色体はいまだ６０％相補的である。
【００２１】
【図２】図２：この表は、半数体染色体数に応じて、花粉四分子の４つのメンバーにおいて、ある程度の相補性を見出す確率（パーセント確率）を示す。例えばキュウリ（ｎ＝７である）について、キュウリの花粉四分子内に、０、１、２または３つの非相補的な染色体を有する（かつ、それゆえ、それぞれ７、６、５または４つの相補的な染色体を有する）減数分裂生成物が発生する確率は、それゆえ、それぞれ、１．６％（＝（１＋１）／１２８）、１０．９％（＝（７＋７）／１２８）、３２．８％（＝（２１＋２１）／１２８）および５４．７％（＝（３５＋３５）／１２８）である。
【００２２】
四分子の４つのメンバーにおける、ある程度の相補性を見出す確率（パーセント確率）は、図２の表に示される。キュウリの花粉四分子内に、０、１、２または３つの非相補的な染色体を有する（かつ、それゆえ、それぞれ７、６、５または４つの相補的な染色体を有する）減数分裂生成物が発生する確率は、それゆえ、それぞれ、１．６％（＝（１＋１）／１２８）、１０．９％（＝（７＋７）／１２８）、３２．８％（＝（２１＋２１）／１２８）および５４．７％（＝（３５＋３５）／１２８）である。
【００２３】
【図３】図３：４つの半数体染色体を有する（ｎ＝４）減数分裂事象の図示。交配植物の一方の親は青い染色体に寄与し、一方で、他方の親は交配種への赤い染色体に寄与した。第一の段階では、ゲノムは２ｎから４ｎへ倍加し、続いて、ここに図示されるように、染色体当たり単一のクロスオーバー事象を備え、姉妹染色分体の相同領域間でクロスオーバーが起こり得る。第一減数分裂の間、遺伝的に完全に相補的ある、２つの二倍体娘細胞が生成される（すなわち、それらのゲノムの両方が一緒に取られる場合、分裂前から４ｎのゲノム組成物が得られる）。この図では、減数分裂第一期の結果の起こり得る例が一つだけ示される。第二減数分裂の間、配偶子（この文脈では：小胞子または花粉粒）が生成され、かつ染色体はランダムに娘細胞のいずれかに分配され得る。これは、娘細胞（配偶子）の２ｎ−１個の異なる対をもたらす。左の二倍体細胞について、図は１つの起こり得る配偶子の対を示し、一方、右の二倍体細胞については、全８つの起こり得る配偶子の対が示される（＝２３＝２ｎ−１）。
【００２４】
続いて倍加される半数体植物が異なる配偶子から再生された場合（例えば、本発明の方法によって、半数体植物を生成し、それらのゲノムを倍加することによって）、これらの植物は互いと交配することができる。異なる染色体のセットの真下の数字は、図の左端の染色体セットに相補的な染色体の数に対応する。例えば、左端に示される４つの染色体（すなわち、４つの全体が青い染色体）を含有する植物が、右側の８つの染色体の一番目からの４つの全体が赤い染色体を含有する植物と交配された場合、その結果、４つ全ての染色体が相補的である。この交配は、配偶子を生成した元の交配植物の正確な再構成をもたらす。同様に、４つの青い染色体を有する同じ植物を、右に示される他の可能性のある染色体セット（より正確には：８つの対のそれぞれの左の染色体セット）と交配することにより、元の交配植物の完全な再構成（４つ全ての染色体が完全に相補的である場合）、または元の交配植物のほぼ完全な再構成（４つの染色体の１つまたは２つが完全に相補的ではない場合）のいずれかをもたらす。配偶子が同じ減数分裂事象に由来するので、２より多くの染色体が相補的ではないという状況は存在しない。加えて、「非相補的な」染色体の大部分は、実際には相補的であり、かつ交配が高度にヘテロ接合性である子孫をもたらす：唯一の非相補的な染色体部分は、染色体「テロメア」でのクロスオーバー事象に起因し、そのクロスオーバー領域は生じた子孫においてホモ接合性となる、ということが、図から明らかである。染色体対の下の数字が、左端に示される染色体と比べて０、１または２つの非相補的な染色体を有する事象の群に合計される場合、これは、ｎ＝４について２−８−６分配をもたらし、図１の三角形の四番目の列にも見ることができる（それらは１−４−６−４−１として示される）。
【００２５】
この図の右端には、減数分裂第二期（ｍｅｉｏｓｉｓ  ＩＩ）の間、最も左側の二倍体細胞に由来し得る、第二の起こり得る配偶子の対が示される。図の下部に記載されている数字は、この対からの配偶子の一つが、最も右側の二倍体細胞に由来する１６個の配偶子のいずれかと組み合わされた場合の、相補的な染色体の数を表す。再度、同じ結果を観察することができる：１６個の配偶子のうち、２つは完全に相補的であり（すなわち、４つの相補的な染色体）、８つは１つの非相補的な染色体を有し、かつ６つは２つの非相補的な染色体を有する。単一の減数分裂事象に由来する四つの生成物を一緒に保持することによって、かつこれら四つの減数分裂生成物と遺伝的に同一である子孫植物を取得する手段を提供することによって、本発明は、交配時に元の交配植物、または元の交配種と遺伝的に本質的に同じ交配種を生じさせることができる子孫植物の対を同定する可能性を最大にする。
【００２６】
【図４】図４：組換えが発生しないと仮定した場合の、本発明に係る系図の簡略化された概要。２つの（ホモ接合性の）親系統（それぞれ遺伝子型ＡＡおよびＢＢを有する）から生じる、交配植物は、４集粒の形態の花粉粒を生成する。単一の４集粒を用いて半数体誘導因子（ｈａｐｌｏｉｄ  ｉｎｄｕｃｅｒ）母植物（ランダムな遺伝子型を有する）を受粉する場合、この交配から生じる子孫は４つの半数体種子のセットからなる。遺伝的に、これらの種子は、（組換えの非存在下で）Ａ、Ａ、ＢおよびＢであり、母植物からの遺伝的寄与が存在しない。したがって、これら４つの半数体種子は、２つの原原種（ｇｒａｎｄｐａｒｅｎｔ）、すなわち花粉四分子を生成した交配父植物の親系統しか有していない。ゲノム倍加の後、−組換えの非存在下で−常に遺伝的に完全に相補的に対である、４つの倍加半数体植物を取得することができる。任意の対からの２つの遺伝的に相補的な植物を交配することは、元の交配植物の完全な再構成につながる。図１、図２および図３で示されるように、組換えが起こる場合、状況はより複雑である。組換えが起こる場合、花粉四分子の子孫から完全に相補的な植物の対を見出す可能性は、半数体染色体の数により減少するが、組換えの非存在下では、染色体数は結果に影響を与えない。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明はそれゆえ、種子が、それらが生じる雄性配偶子と遺伝的に同一である、種子のセットの生成のための方法であって：
ａ）４集粒または２集粒（ｄｙａｄ）の形態を有する限られた数の父系配偶子を花の柱頭に配置し、母系卵細胞を受精させ、多数の接合子（ｚｙｇｏｔｅ）を取得すること；
ｂ）前記接合子からの母系染色体の喪失を誘導し、母系染色体が存在しない限られた数の種子を含有する種子セットを取得すること
を含む、方法に関する。
【００２８】
「遺伝的に同一」は、１つの種子の全ての染色体が、対応する配偶子の染色体と同じであり、かつ、種子内の染色体の組み合わせが、対応する配偶子におけるものと同じであることを意味する。
【００２９】
本発明につながる研究では、さらに驚くべきことに、花粉形成の間、小胞子の分離の欠陥をもたらす上記の特定の変異と、従来技術において利用可能な方法を組み合わせることが、交配後に、その父系祖父と本質的に同じ遺伝子構成を有するヘテロ接合性植物を生じさせる、本質的に相補的な遺伝子構成を有する親植物が同定され得る効率の、大幅な増大につながることが見出された。本発明を組み合わせることができるかかる方法は、例えば、逆育種および近逆育種である。
【００３０】
四分子表現型は、例えば、Ｃｏｐｅｎｈａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （２０００）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２４，  ７−１５に説明されていた。種々の非相同遺伝子における変異が、同様の四分子表現型をもたらし得る（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）においてｑｒｔ１、ｑｒｔ２およびｑｒｔ３）。ＱＲＴ３遺伝子（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）において：Ａｔ４ｇ２００５０）は、分子的に特徴付けられており、それは多岐にわたるクラスのポリガラクツロナーゼのメンバーをコードする（Ｒｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３３：  １１７０−１１８０）。これらの変異は、本発明の方法における使用のための４集粒を提供するために有用である。
【００３１】
４つの花粉粒のクラスターにおける個々の花粉は、単一の減数分裂の生成物を含む。個々の花粉四分子（ｐｏｌｌｅｎ  ｑｕａｒｔｅｔ）を用いて植物を受精させる時、受精の効率が１００％である場合、これは理想的には４つの種子の形成をもたらす。４集粒の４つの個々の花粉粒が単一の減数分裂の生成物を提供するという事実は、本発明の主題である技術に興味深い影響を与える。
【００３２】
減数分裂の開始時、最初のプロセスはゲノムＤＮＡの複製である。続いて、前期の間に、相同染色体は整列および接合（ｓｙｎａｐｓ）し、二価を形成する。この段階で、整列された非姉妹染色分体を用いて修復される、二本鎖切断（ＤＳＢ）が形成される。修復の間の染色体相互作用は、分解される、ダブルホリデイ構造（ｄｏｕｂｌｅ  ｈｏｌｉｄａｙ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）と呼ばれる特定の構造の形成をもたらす。これは遺伝子変換またはクロスオーバーのいずれかをもたらす。クロスオーバー（ＣＯ）事象は、キアズマの形態において最終的に見ることができ、減数分裂第一期の間の適切なホモログ分離のために構造的に必要である。本発明に関して、ＣＯの分布に関係なく、減数分裂第一期の生成物が、それらの対立遺伝子構成（ａｌｌｅｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）に関して、互いに完全に相補的であることに留意すべきである。第二減数分裂の間、姉妹染色分体は反対の極に分離し、最終減数分裂生成物、すなわち４つの半数体細胞を生じさせる。通常、これら４つ減数分裂生成物は、それらのさらなる発達の間に互いから分離されるようになり、かつそれらは、同じ葯室内の他の減数分裂事象に由来する花粉粒と入り混じる。しかしながら、母植物が四分子表現型を示す場合、単一減数分裂事象の４つの生成物は、物理的に一緒に残る。
【００３３】
４集粒における４つの花粉粒のセットは、様々な程度の遺伝的相補性を含めることができ、半数体染色体の数の関数である。減数分裂第一期の生成物が互いに完全に相補的であるので、４集粒に一緒に保持される四つの花粉粒は、少なくとも５０％の相補性を含む。各４集粒についての具体的な結果は偶然により決定され、かつ、この可能性はいわゆるパスカルの三角形で与えられる分布に従う（図１）。
【００３４】
例えば、キュウリは７つの半数体染色体を有する。一次減数分裂は、２つの完全に相補的な減数分裂生成物をもたらす。二次減数分裂の間、減数分裂第一期の２つの生成物のそれぞれにおいて、染色体はランダムに分離することができ、２ｎ＝２７＝１２８個の別個の生成物をもたらすことができる。一般に、ｎ個の染色体の場合には、合計２ｎ個の異なる４集粒が、単一の減数分裂事象から得られると言うことができる。完全に相補的な事象の数は常に１、すなわち各列の最初の数（図１）であり、一方で各列の二番目の数は、半数体染色体の数に対応する。同じ列の後続の数は、それぞれ、４集粒における２、３、４、５および６つの非相同的染色体を有する減数分裂生成物の予想される数に対応する。
【００３５】
任意の所与の減数分裂事象に由来する１２８個の異なる減数分裂生成物を有する、キュウリの例では、これらの数はそれぞれ、２１、３５、３５、２１および７である。減数分裂第一期の生成物は互いに完全に相補的であるので、染色体のいずれもが相補的ではないという極端な状況は、４集粒内に存在しない、なぜなら、常に他の減数分裂第一期生成物の染色体への相補性が存在するからである。１つの非相補的な染色体を有する事象の数は、それゆえ７＊２であり、２つの非相補的な染色体では２１＊２である、等。例えば３つの染色体が非相補的である場合、これは他の４つが相補的であることを意味する。花粉四分子の４つのメンバーにおいて、ある程度の相補性を見出す確率（パーセント可能性）は、図２の表に示される。キュウリの花粉四分子内に、０、１、２または３つの非相補的な染色体を有する（かつ、それゆえ、それぞれ７、６、５または４つの相補的な染色体を有する）減数分裂生成物が発生する確率は、それゆえ、それぞれ、１．６％（＝（１＋１）／１２８）、１０．９％（＝（７＋７）／１２８）、３２．８％（＝（２１＋２１）／１２８）および５４．７％（＝（３５＋３５）／１２８）である。
【００３６】
重要なことに、この文脈における「非相補的」は、実際には、これらの染色体のテロメア末端を指すだけである。我々が、例えば、組換え後に、３つの非相補的な染色体と４０％のみのヘテロ接合性を有する状況にある場合、７つの染色体のうち４つは完全に相補的であり、一方で他の３つの染色体はいまだ６０％相補的である。本質的には、４集粒の集まりは、それゆえ、花粉粒が常に染色体の５０％について少なくとも完全に相補的に対になっており、かつ−組換えの結果として−残りの染色体について、いまだ部分的に相補的である状況をもたらす。本発明はそれゆえ、交配植物の遺伝子型のほぼ完全な再構成を達成し、一方で本発明を実施するために花粉四分子が由来する元の交配植物と比較して、いまだ０から５０％の変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を可能にする。
【００３７】
この方法はそれゆえ、交配植物の同一またはほぼ同一の遺伝子構成の再構成を可能にする。対象の交配種の表現型におけるさらなる遺伝的変異の影響の評価を可能にするため、ほぼ同一の再構成は明確な利点を有する。このさらなる遺伝的変異は、交配種の表現型への有利または不利な影響のいずれかを有することが判明してもよく、かつ、これは優れた交配種の表現型の更なる遺伝的改善を可能にする。４つの染色体についての状況は、図３に図示される。
【００３８】
請求項に係る発明の重要な実施態様は、その交配子孫から母系ゲノムを排除する、母植物の受粉のための四分子小胞子の使用である。かかる植物の例は、ＭａｒｕｔｈａｃｈａｌａｍおよびＣｈａｎにより、最近シロイヌナズナにおいて説明されている（Ｈａｐｌｏｉｄ  ｐｌａｎｔｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ；  Ｎａｔｕｒｅ  ４６４  （２０１０），  ６１５−６１９；  ＵＳ  ｐａｔｅｎｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ２０１１００８３２０２；  ＷＯ２０１１０４４１３２）、しかし、本発明はまた、他の半数体誘導因子系を用いて実施できるので、この例は、本発明の適用を限定するものではない。
【００３９】
交配子孫からの母系ゲノムの排除は、それゆえ、改変版による内因性動原体特異的ヒストンタンパク質ＣＥＮＨ３のトランスジェニックな置換によって達成することができる。実際には、ＣＥＮＨ３タンパク質の改変版は、機能的な内因性ＣＥＮＨ３遺伝子を欠く植物において過剰発現している。
【００４０】
あるいは、対応する不活性化された内因性ＣＥＮＰＣ、ＭＩＳ１２、ＮＤＣ８０又はＮＵＦ２遺伝子を有する植物中で過剰発現された場合、ＣＥＮＰＣ、ＭＩＳ１２、ＮＤＣ８０またはＮＵＦ２ポリペプチドも、同じ目的のために使用することができる。適切には、植物の内因性ＣＥＮＨ３、ＣＥＮＰＣ、ＭＩＳ１２、ＮＤＣ８０またはＮＵＦ２ゲノムコード配列の１つまたは２つの対立遺伝子が、不活性化またはノックアウトされており、かつ好ましくは全ての対立遺伝子が不活性化またはノックアウトされている。野生型植物と交配させた場合、該植物は、例えば、少なくとも０．１％の半数体子孫を生成する。
【００４１】
好ましくは、ポリペプチドは、組換え的に改変されたＣＥＮＨ３ポリペプチドである。該ポリペプチドは、アミノ酸配列がＣＥＮＨ３ヒストン−フォールドドメインに対して異種である、ＣＥＮＨ３ヒストン−フォールドドメインを含むタンパク質に結合した、少なくとも５個のアミノ酸（またあるいは少なくとも１０個のアミノ酸）の異種アミノ酸配列を含み得る。適切には、前記異種アミノ酸配列は、ＣＥＮＨ３ヒストン−フォールドドメインに直接連結され、かつ該ポリペプチドはＣＥＮＨ３テールドメインを欠く。あるいは、該異種アミノ酸配列は、介在タンパク質配列を介してＣＥＮＨ３ヒストン−フォールドドメインに連結されてもよい。この介在タンパク質配列はＣＥＮＨ３テールドメインまたは非ＣＥＮＨ３ヒストンＨ３テールドメインを含んでもよい（かつ、該組換えタンパク質は、次いで、ＣＥＮＨ３タンパク質のテール−スワップバージョンに対応する）。
【００４２】
適切には、介在タンパク質がＣＥＮＨ３ヒストンＨ３テールドメインを含む場合、ＣＥＮＨ３テールドメインはＣＥＮＨ３ヒストン−フォールドドメインに対して異種であってもよい。ポリペプチドがＣＥＮＨ３ヒストン−フォールドドメインおよび切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＣＥＮＨ３テールドメインを含む場合には、テールドメインのアミノ末端は、植物の内因性のテールドメインと比べて、切断されている。
【００４３】
このようにトランスジェニックに補完された植物を、野生型の父植物からの花粉と受粉することは、Ｆ１子孫が半数体であるという事実に起因して、不稔の子孫をもたらす。実際、各Ｆ１子孫は、受精（ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）のために使用され、かつそれが由来する花粉粒と、遺伝的に同一である。野生型および改変された染色体は、接合子における動原体アセンブリにおいて、不和合性（ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）であるようだ。染色体の自然発生的または誘導性の倍加（ｄｏｕｂｌｉｎｇ）はＤＨの形成につながる。ＣＥＮＨ３は、植物における、保存的かつおそらく単一コピーの遺伝子であり、かつこのシステムは、それゆえ、作物種に適用することもできる。種子形成が胚乳の不均衡に起因して問題となる場合は、胚救出を行うことができる。
【００４４】
別の実施形態では、母系ゲノムは、他の半数体誘導因子系を用いて、または種間交配を介して（例えば、Ｂａｉｎｓ  ＆  Ｈｏｗａｒｄ  １９５０，  Ｎａｔｕｒｅ  １６６：  ７９５に記載されるような）、Ｆ１子孫から排除できる。
【００４５】
さらなる実施形態において、四分子変異（ｑｕａｒｔｅｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を逆育種技術と組み合わせることもでき（ＷＯ０３／０１７７５３；  Ｄｉｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９，  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｊ  ７：  ８３７−８４５）、それによって大幅に逆育種の効率を向上させる。この実施形態では、四分子表現型は、遺伝子的、トランスジェニックに、または化学的手段によって、父植物における減数分裂染色体組換えの抑制と組み合わされる。四分子変異体は、花粉の成熟で、４集粒おいて単一減数分裂の４つの生成物の物理的付着をもたらすが、組換えの抑制は、これらの花粉粒が非組換え親染色体を含有することを確実にする。本発明はそれゆえ、染色体あたり１つの共優性（ｃｏ−ｄｏｍｉｎａｎｔ）多型マーカーを用い、相補的遺伝子組成を備えるＤＨが、単一減数分裂からの花粉に由来する４つのＤＨから容易に同定できることを確実にする。
【００４６】
逆育種の欠点は、不均衡な（異数性の）胞子の発生である。しかしながら、均衡のとれた４集粒を形態学的に同定すること（例えば、全ての染色体の均等分配を示す、４つの花粉粒の大きさが等しい４集粒を視覚的に選抜することにより、あるいは、例えばフローサイトメトリーによって）は可能であり、かつ、かかる４集粒から再生されたＤＨは、自動的に、相補的に対である。均衡のとれた４集粒が、その交配子孫から母系ゲノムを排除する母植物を受粉するために用いられる場合、これは、それらの遺伝子組成に関して相補的に対である４つの半数体種子を生じさせる。相補的なＤＨまたはそれらに由来する系統の後続の交配は、元の開始植物の遺伝子組成の再構成をもたらす。この交配の四つの子孫植物が、交配の前に遺伝子型判定（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）されない場合、これら４つの植物のうちの２つをランダムに交配することによって元の開始植物の遺伝子組成の再構築を取得する可能性は５０％である。
【００４７】
別の実施形態では、四分子表現型は、近逆育種（Ｎｅａｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）（ＷＯ２００６／０９４７７３）と組み合わせることができる。この実施形態では、四分子表現型を示す植物における第２分裂復元（ＳＤＲ）の発生は、同一の染色体切断点（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）を含む、完全に相補的な遺伝子組成を有する２つの二倍体花粉粒を含む、父植物による、花粉二分子（ｐｏｌｌｅｎ  ｄｙａｄ）の生成につながる。かかる花粉二分子と、その交配子孫から母系ゲノムを排除する母植物を受粉することは、２つの二倍体植物をもたらし、かつ、これら２つの植物を互いに交配することは、元の交配種の遺伝子組成のほぼ完全な再構成をもたらす。
【００４８】
本願において、「ほぼ完全」とは、２つの植物が共にそれらの父植物と同じ遺伝物質を有する（減数分裂の間にＤＮＡが失われたり、または得られたりしないような）が、減数分裂の間のクロスオーバー事象の結果として、染色体セグメントの相対的なゲノム位置が異なっている、という事実を指す。しかしながら、染色体切断点の位置は、それらが単一の減数分裂事象から生じるので、２つの植物において同一である。相補的なＳＤＲ−０株の同定は、それゆえ、四分子表現型を利用することにより、大幅に容易になり、かつ、任意の所与の交配種の遺伝子組成のほぼ完全な再構成が、はるかに簡単かつ効率的になる。
【００４９】
再構成された交配種は、特にＣＯの結果としてテロマー（ｔｅｌｏｍｅｒ）で、互いに、かつ元の開始交配種（父）植物の両方とある程度遺伝的に異なるので、ＳＤＲ−０事象の形成の間の減数分裂組換えに起因して、再構成は１００％完全ではない。この特徴は、それゆえ、元の交配種の構成の大部分を維持しながら、代替的かつわずかに異なるゲノム配列（ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を提供することにより、さらなる遺伝的変異が、事前に選抜された優れた交配植物において構築されているという、さらなる利点を提供する。これは、交配種の表現型のさらなる改善をもたらし得る。
【００５０】
本発明のさらなる目的は、種子のセットを取得するための効率的な方法であって、種子が、それらが生じる雄性配偶子と遺伝的に同一であり、かつ、種子のセットが、それらから生育した植物が交配された場合に本質的に同じ交配植物を生じさせる、遺伝的に本質的に相補的な種子の対から構成される、方法を提供することである。この交配植物は、前記種子のセットが生じた雄性配偶子を生成した植物と、遺伝的に本質的に同一である。
【００５１】
本明細書で用いられる「本質的に」は、上で説明されたように、交配植物のほぼ完全な再構成も望まれ得るため、種子の対の遺伝的相補性が１００％である必要はないことを意味するように意図される（なぜなら、交配種の表現型をさらに改善する可能性を提供し得るので）。このようなほぼ完全に再構成された交配植物は、元の交配植物および本発明により得ることができる他のほぼ完全に再構成された交配植物と本質的に同一なだけである、なぜなら、それは元の交配植物と同じまたは大部分同じであるゲノム物質を有するが、種々のクロスオーバー事象の結果として、それらのゲノムには代替的またはわずかに異なるゲノム配列（ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）が存在し得、あるいは組換えの結果として、いくつかのゲノム領域がホモ接合性であり得るからである。減数分裂クロスオーバーが行われる場合、「本質的に」はそれゆえ、半数体誘導因子の母植物を受粉するために用いられる花粉粒の形成の際に発生した、クロスオーバーの程度に関係する。
【００５２】
別の文脈では、例えば減数分裂組換えの非存在下では、「本質的に」はまた、互いに１００％遺伝的に相補的ではない、（本発明により得られる種子のセットの中からの）種子の対の選択を指し得る。本発明の範囲内にあることも意図されるこの実施形態では、例えば、ｎ−１の染色体について（ｎは種の半数体染色体数である）互いに完全に相補的であり、かつ残りの染色体について同一である、種子の対を選択できる（前記種子のセットから）。この種子の対から生育した植物の交配から生じる交配植物は、そうすると、１つを除く全ての染色体について元の交配植物と遺伝的に同一であり、かつ残りの染色体について異なる（すなわちホモ接合性）である。植物全体は、それゆえ、「本質的に」だけ遺伝的に同一である。かかる植物は、例えば、減数分裂組換えの抑制（「逆育種」）を有する、好ましい実施形態において本発明を実施する場合に、取得することができる。同じ概念が、ｎ−２の染色体、ｎ−３の染色体、等について行うことができることが理解されるべきである。この概念は、例えば、その染色体のサブセットにのみ焦点を当て、かつ交配ゲノムの残りを不変のままにしながら、植物のゲノムおよび表現型分析を可能にする。
【００５３】
本発明はそれゆえ、種子が、それらが生じる雄性配偶子と遺伝的に同一である、種子のセットの生成のための方法であって：
ａ）４集粒または２集粒の形態を有する限られた数の父系配偶子を花の柱頭に配置し、母系卵細胞を受粉させ、多数の接合子を取得すること；
ｂ）前記接合子からの母系染色体の喪失を誘導し、母系染色体が存在しない限られた数の種子を含有する種子セットを取得すること
を含む、方法に関する。
【００５４】
この方法では、４集粒または２集粒に含まれるいくつかの花粉粒が胚珠の受精に失敗することを避けるため、胚珠の受精についての花粉管の中での競争は、好ましくは、最小化または阻止されるべきである。それゆえ、その柱頭上に置かれた花粉粒と、少なくとも同数の胚珠が受粉される花の雌性生殖器官内に存在するように、限られた受粉が好ましい。各花粉粒は次いで、胚珠を受精することができるであろう。
【００５５】
一実施形態では、したがって、限られた数の父系配偶子は、柱頭を担持する母系生殖器官に含有される卵細胞の数と等しいか、それより少ない。
【００５６】
この方法においてうまく用いることができる父系配偶子の数についての好ましい上限である、花あたりの卵細胞または胚珠の平均数は、具体的な作物に精通した当業者に知られている。それは、一般に、その作物の典型的な果実中に存在する種子の平均数よりもわずかに多い。トマトでは、例えば、花あたりの卵細胞の平均数は約１００であり、アブラナ属種では約３５、シロイヌナズナでは約４０−５０、スイカでは約２００、ブドウでは約４、キュウリでは約２５０−３００、アマトウガラシでは約１００、およびメロンでは約５００である。Ｂｕｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｂｏｔ．  ９６（６），  １１５９−１１６７  （２００９）は、１８７の被子植物における花あたりの胚珠数に関する研究を記載している。
【００５７】
限られた数の父系配偶子は、効率的な方法で本発明の方法を用いることを可能にする、任意の数を適宜含む。これは、雄性配偶子における過剰な遺伝的変異を避けなければならない、すなわち、それらの減数分裂事象が、２集粒または４集粒を構成する個々の配偶子のゲノムにおいて（染色体組換えを介して）、大きな遺伝子再編成（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）をそれぞれ生成した場合、柱頭上に置かれた雄性配偶子を生じさせた減数分裂事象の数が低く保たれるべきである、ということを意味する。
【００５８】
好ましい実施形態では、限られた数の父系配偶子は、２つまたは４つである（それぞれ、単一の花粉二分子または四分子に含まれる配偶子の数に対応し、それゆえ、それぞれ、二次減数分裂の非存在下または存在下で単一の減数分裂に由来する）。この戦略は、単一の減数分裂に由来する花粉粒と遺伝的に同一である、４つの種子（４集粒が受粉のために用いられる場合）または２つの種子（２集粒が受粉のために用いられる場合）の形成につながる。配偶子が２集粒の形態を有する時、効率的な方法で本発明の方法を用いることを可能にする父系配偶子の限られた数は、２よりはるかに多くてもよい、なぜなら、２集粒内に含まれる２つの配偶子は互いに遺伝的に完全に相補的であるので、遺伝的変異の量が大幅に低減されるからである。特に、２集粒の形態を有する配偶子を用いる場合、花あたりの卵細胞または胚珠の平均数よりも少ない任意の数の配偶子を用いることが、それゆえ効率的である。
【００５９】
雄性配偶子の４集粒または２集粒の形態は、父植物における小胞子４集粒分離に対する干渉の結果である。一実施形態では、小胞子４集粒分離に対する干渉は、単一の減数分裂に由来する小胞子間のペクチン層の破壊に関わる一以上の標的遺伝子に対する干渉を含む。一以上の標的遺伝子は、ＱＲＴ１、ＱＲＴ２、ＱＲＴ３またはそれらの機能的ホモログからなる群から選択できる。適切な変異は、標的遺伝子への終止コドンまたはフレームシフトの導入、タンパク質構造および／または機能を破壊するアミノ酸置換、ならびにコード配列、プロモーターまたは遺伝子の他の調節配列中へのＴ−ＤＮＡなどの遺伝子エレメントの挿入である。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）では、ｑｒｔ１−４変異体はＱＲＴ１遺伝子のエクソン内へのＴ−ＤＮＡの挿入に起因し、ｑｒｔ１−５変異体における四分子変異表現型はＱＲＴ１遺伝子のプロモーター中へのＴ−ＤＮＡ挿入によって引き起こされ、また、ｑｒｔ１−６変異体はＱＲＴ１遺伝子のイントロン中へのＴ−ＤＮＡ挿入によって引き起こされる。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）におけるｑｒｔ２−１変異体は、ＱＲＴ２タンパク質中の位置３７２でのバリンからアラニンへのアミノ酸置換（ＧＴＧからＧＣＧへの変異）を含み、これは、この変異株における四分子表現型の根本的な原因である。
【００６０】
別の実施形態では、小胞子４集粒分離に対する干渉は、化学的手段による単一の減数分裂に起因する小胞子間のペクチン層の破壊に対する干渉を含む。ＱＲＴ遺伝子産物は、花粉母細胞の減数分裂から発生する、個々の雄性配偶子（小胞子）間に存在するペクチン性多糖層（ペクチン）の破壊に関与する酵素である。このペクチン層が分解されなければ、４つの雄性配偶子（小胞子）は４集粒形態で互いに物理的に付着したままである。
【００６１】
小胞子４集粒分離に関わる一以上の標的遺伝子に干渉することは、多数の異なるアプローチによって達成することができる。標的遺伝子に対する干渉は、それらの転写を阻止することからなることができる。一実施形態では、標的遺伝子の転写は、標的遺伝子プロモーターに対して向けられたＲＮＡオリゴヌクレオチド、ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ分子によって阻止できる。
【００６２】
別の実施形態では、転写は、標的遺伝子プロモーターに作用する、負に作用する転写因子の発現によって阻止される。さらに、標的遺伝子に対する干渉は、標的遺伝子のｍＲＮＡまたは転写物を不安定化することからなることができる。これは、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ分子、ウイルス誘導性遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）分子、共抑制因子分子、ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、標的遺伝子のｍＲＮＡまたは転写物に相補的である、核酸分子によって達成できる。
【００６３】
標的遺伝子に対する干渉はまた、一以上のドミナントネガティブな核酸構築物によって、または一以上の化合物によって、標的遺伝子発現産物を阻害することからなることができる。
【００６４】
また別の実施形態では、標的遺伝子に対する干渉は、その生物学的機能の撹乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）につながる、標的遺伝子中への一以上の変異の導入からなる。一以上の変異は、ランダムに−一以上の化合物（エチルメタンスルホネート、ニトロソメチルウレア、ヒドロキシルアミン、プロフラビン、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−ニトロソグアニジン、ジエチル硫酸、エチレンイミン、アジ化ナトリウム、ホルマリン、ウレタン、フェノール、エチレンオキサイドなど）および／もしくは物理的手段（ＵＶ照射、高速中性子ばく露、Ｘ線、ガンマ線照射など）および／もしくは遺伝子エレメント（トランスポゾン、Ｔ−ＤＮＡ、レトロウイルスエレメントなど）の挿入によって−または特異的に、相同性組換えもしくはオリゴヌクレオチドに基づく変異導入によって、導入することができる。
【００６５】
小胞子４集粒分離に干渉するための化学的手段は、単一の減数分裂事象に由来する４つの小胞子間のペクチン層の持続性（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ）をもたらす、ＱＲＴ遺伝子産物の活性（もしくは安定性）を低減する化学阻害剤の使用、または、ＱＲＴ遺伝子産物の発現レベルを−直接的もしくは間接的に−低減する化学薬品の使用を含む。ＱＲＴタンパク質の酵素活性は、阻害化学薬品による正常な小胞子分離の段階（もしくは後続する段階）の間の花芽の処置が、単一の減数分裂事象に由来する小胞子間のペクチン層の持続性を引き起こし、かつ、それゆえ後期発生段階の間および開花期で、小胞子４集粒の持続性を引き起こすような、化学抑制剤によって阻害することができる。
【００６６】
好ましい実施形態では、父植物−（４集粒または２集粒の形態の）前記雄性配偶子を生成した−は、−四分子表現型に加えて−染色体クロスオーバー（ｃｒｏｓｓｉｎｇ−ｏｖｅｒ）を廃し、完全な染色体の無傷の（ｉｎｔａｃｔ）伝達につながる、染色体組換えの抑制を示す。この実施形態では、４集粒の個々の花粉粒から、２つの遺伝的に相補的なゲノムを同定する可能性は、５０パーセントである。前記雄性配偶子を生成した父植物が染色体組換えの抑制を示す場合、この染色体組換えの抑制は、組換えに関わる一以上の標的遺伝子に干渉することにより、達成される。
【００６７】
一実施形態では、標的遺伝子は二本鎖切断に関わり、かつ、それはＳＰＯ１１、ＭＥＲ１、ＭＥＲ２、ＭＲＥ２、ＭＥＩ４、ＲＥＣ１０２、ＲＥＣ１０４、ＲＥＣ１１４、ＭＥＫ１／ＭＲＥ４、ＲＥＤ１、ＨＯＰ１、ＲＡＤ５０、ＭＲＥ１１、ＸＲＳ２、またはそれらの機能的ホモログからなる群から選択できる。
【００６８】
別の実施形態では、標的遺伝子は染色体対合および／または鎖交換に関わり、かつ、それはＲＨＤ５４／ＴＩＤ１、ＤＭＣ１、ＳＡＥ３、ＲＥＤ１、ＨＯＰ１、ＨＯＰ２、ＲＥＣ８、ＭＥＲ１、ＭＲＥ２、ＺＩＰ１、ＺＩＰ２、ＭＥＩ５、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＰＡ１、ＳＭＣ３、ＳＣＣ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＰＭＳ１、ＳＯＬＯＤＡＮＣＥＲＳ、ＨＩＭ６、ＣＨＫ２、またはそれらの機能的ホモログからなる群から選択できる。
【００６９】
さらに別の実施形態では、標的遺伝子は減数分裂組換えプロセスに関わり、かつ、それはＳＧＳ１、ＭＳＨ４、ＭＳＨ５、ＺＩＰ１およびＺＩＰ２、またはそれらの機能的ホモログからなる群から選択できる。
【００７０】
別の実施形態では、標的遺伝子はＰＲＤ１、ＰＲＤ２、ＰＲＤ３、ＰＨＳ１、ＮＢＳ１、ＣＯＭ１、ＭＮＤ１、ＭＥＲ３／ＲＣＫ、ＺＩＰ３、ＺＩＰ４、ＰＴＤ、ＳＨＯＣ１、ＺＹＰ１、ＭＬＨ１、ＭＬＨ３、またはそれらの機能的ホモログからなる群から選択される。
【００７１】
組換えに関わる一以上の標的遺伝子に干渉することは、多数の異なるアプローチにより達成できる。標的遺伝子に対する干渉は、それらの転写を阻止することからなることができる。
【００７２】
一実施形態では、標的遺伝子の転写は、標的遺伝子プロモーターに対して向けられたＲＮＡオリゴヌクレオチド、ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ分子によって阻止できる。別の実施形態では、転写は、標的遺伝子プロモーターに作用する、負に作用する転写因子の発現によって阻止される。さらに、標的遺伝子に対する干渉は、標的遺伝子のｍＲＮＡまたは転写物を不安定化することからなることができる。これは、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ分子、ウイルス誘導性遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）分子、共抑制因子分子、ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、標的遺伝子のｍＲＮＡまたは転写物に相補的である、核酸分子によって達成できる。標的遺伝子に対する干渉はまた、一以上のドミナントネガティブな核酸構築物によって、または一以上の化合物によって、標的遺伝子の発現産物を阻害することからなることができる。
【００７３】
また別の実施形態では、標的遺伝子に対する干渉は、その生物学的機能の撹乱につながる、標的遺伝子中への一以上の変異の導入からなる。一以上の変異は、ランダムに−一以上の化合物（エチルメタンスルホネート、ニトロソメチルウレア、ヒドロキシルアミン、プロフラビン、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−ニトロソグアニジン、ジエチル硫酸、エチレンイミン、アジ化ナトリウム、ホルマリン、ウレタン、フェノール、エチレンオキサイドなど）および／または物理的手段（ＵＶ照射、高速中性子ばく露、Ｘ線、ガンマ線照射など）および／または遺伝子エレメントの挿入（トランスポゾン、Ｔ−ＤＮＡ、レトロウイルスエレメントなど）によって−または特異的に、相同性組換えまたはオリゴヌクレオチドに基づく変異導入によって、導入することができる。
【００７４】
別の好ましい実施形態では、前記雄性配偶子を生成した父植物は、−四分子表現型に加えて−減数分裂の間に第２分裂復元（ＳＤＲ）を示す。この実施形態では、第二減数分裂が起こらないので、父植物は２ｎでありかつ２集粒の形態を有する雄性配偶子を生成する。１つの２集粒内に含まれる２つの雄性配偶子は、遺伝的に完全に相補的であり、２集粒の２つの個々の花粉粒のうち、２つの遺伝的に相補的なゲノムを同定する可能性は、それゆえ１００パーセントである。
【００７５】
前記雄性配偶子を生成した父植物が減数分裂の間に第２分裂復元を示す場合、この第２分裂復元は、開始生物に干渉せずに、自然発生的に起こり得る。別の実施形態では、第２分裂復元は遺伝的改変によって誘導される。この遺伝的改変は、一過性とすることができ、また、生物における第２分裂復元事象の数を増加する、遺伝子エレメント（導入遺伝子、変異、トランスポゾン、レトロウイルスエレメント、Ｔ−ＤＮＡなど）のゲノム内への安定な組み込みにより、達成することができる。
【００７６】
また別の実施形態では、第２分裂復元は、父植物を温度ストレス、ＮＯ２、亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ）、またはそれらの組み合わせなどの環境ストレスに供することにより達成される（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７８：  ８４−８８；  ＷＯ  ２００６／０９４７７３；  Ｂａｒｂａ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６），  Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  １４８：  ３０３−３０９；  Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５），  Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  １４３：  １０１−１１４）。
【００７７】
−母系染色体が存在しない限られた数の種子を含有する種子のセットを取得するための−接合子からの母系染色体の喪失は、種々の方法で達成できる。一実施形態では、半数体誘導因子系統が雌株として用いられ得る。半数体誘導因子系統は、親のうちの１つの染色体が、受粉による卵細胞の受精の後に形成された接合子のゲノムから排除された植物である。例えば、雌株は、例えば、Ｂａｉｎｓ  ＆  Ｈｏｗａｒｄ  １９５０，  Ｎａｔｕｒｅ  １６６：  ７９５によって記載されているように、異なる種の植物とすることができる。別の実施形態では、接合子からの母系染色体の喪失は、母生物としてのトランスジェニック植物の使用であって、トランスジェニック植物が、異種導入遺伝子発現カセットを含み、該異種導入遺伝子発現カセットは、組換え的に改変されたＣＥＮＨ３、ＣＥＮＰＣ、ＭＩＳ１２、ＮＤＣ８０またはＮＵＦ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含み、かつＷＯ２０１１／０４４１３２に記載の対応する不活性化された内因性ＣＥＮＨ３、ＣＥＮＰＣ、ＭＩＳ１２、ＮＤＣ８０またはＮＵＦ２遺伝子を有するものである、使用に由来する。
【００７８】
本発明はまた、母系染色体が存在しない限られた数の種子を含有する種子のセットであって、そのセットが、交配された場合に本質的に同じ交配種をもたらす、本質的に遺伝的に相補的な種子の対から構成され、かつその種子のセットが、本発明の方法により得ることができる、種子のセットに関する。この種子のセットの種子は全て同じ父を有する、なぜなら、それらが、４集粒または２集粒の形態を有する限られた数の父系配偶子での母植物の受粉に由来し、その父系配偶子は単一の父植物から収集されたものであるからである。このため、かつ、接合子からの母系染色体の排除のため、遺伝的観点から、前記種子のセットの種子は、１つの雄性原原種（ｍａｌｅ  ｇｒａｎｄｐａｒｅｎｔ）および１つの雌性原原種（ｆｅｍａｌｅ  ｇｒａｎｄｐａｒｅｎｔ）、すなわちそれらの父の親だけを有する。これは、概略図の形で図４に示されている。
【００７９】
本発明はまた、遺伝子組成がその雄性原原種の遺伝子構成と本質的に同一である植物の生成であって、種子の染色体数の倍加の後または前に、本発明の種子のセットの種子から植物を生育させること、および２つの遺伝的に相補的な植物を親植物として同定することを含む生成のための、親植物のセットに関する。かかる遺伝的に相補的な植物は、分子（遺伝子）マーカーであって、（雄性配偶子を生成した）父植物はそれについてヘテロ接合性であり、かつ２つの父系原原種はそれについて異なるアレルを有していた、マーカーによって同定できる。これらのマーカーは、特定のゲノム領域の直接ＤＮＡシーケンシング、ＡＥＬＰ、ＲＦＬＰ、ＳＳＲ、ＲＡＰＤ、ＫＡＳＰａｒ（ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｉｎｖａｄｅｒ商標またはＩｎｖａｄｅｒ  Ｐｌｕｓ商標（例えば、Ｄｅ  Ｖｉｅｎｎｅ  ｅｄ．  （２００３）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．  Ｅｎｆｉｅｌｄ，  ＮＨ  ＵＳＡ．  ＩＳＢＮ  １−５７８０８−２３９−０を参照のこと）などの多数の異なるアプローチで得ることができる。
【００８０】
本発明はさらに、遺伝子構成がその父系祖父（ｐａｔｅｒｎａｌ  ｇｒａｎｄｆａｔｈｅｒ）の遺伝子構成と本質的に同一である植物を同定するため、かつ遺伝子構成がその父系祖母（ｐａｔｅｒｎａｌ  ｇｒａｎｄｍｏｔｈｅｒ）の遺伝子構成と本質的に同一である別の植物を同定するために、種子のセットまたはそれらから生育した植物を、それらの遺伝子構成についてスクリーニングするための方法に関する。
【００８１】
遺伝子構成がそれら自身の祖父の遺伝子構成と本質的に同一である子孫植物を取得するために、遺伝子構成がその父系祖父の遺伝子構成と本質的に同一である植物は、続いて、遺伝子構成がその父系祖母の遺伝子構成と本質的に同一である別の植物と交配することができる。「それら自身の祖父」について、半数体誘導因子系統の受粉のために用いられた花粉四分子または花粉二分子を生成した（交配）植物が意味される。この系統は、図４に図示され、明確にされている。
【００８２】
本発明はさらに、交配のための親植物としての２つの遺伝的に相補的な植物の同定のための、種子の染色体数の倍加の後または前での、前記種子のセットの使用に関する。
【００８３】
本発明を実施できる作物種には、例えば、タバコ、ポプラ、テンサイ、ナタネ、ダイズ、トマト、キュウリ、ガーキン（ｇｈｅｒｋｉｎ）、コーンサラダ、ホウレンソウ、コショウ、ペチュニア、ジャガイモ、ナス、メロン、スイカ、ニンジン、ダイコン、アブラナ科野菜（キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、コールラビ、芽キャベツ）、豆、エンドウ、タマネギ、イチゴ、テーブルビート、アスパラガス、およびブドウ植物（ｇｒａｐｅ  ｖｉｎｅ）が含まれる。
【００８４】
本発明は以下の項目においてさらに説明される。
項目
本発明は、以下に関する：
１．種子が、それらが生じる雄性配偶子と遺伝的に同一である、種子のセットの生成のための方法であって：
ａ）４集粒または２集粒の形態を有する限られた数の父系配偶子を花の柱頭に配置し、母系卵細胞を受精させ、多数の接合子を取得すること；
ｂ）前記接合子からの母系染色体の喪失を誘導し、母系染色体が存在しない限られた数の種子を含有する種子セットを取得すること
を含む、方法。
２．限られた数の父系配偶子が、柱頭を担持する母系生殖器官に含有される卵細胞の数と等しいか、それより少ない、項目１に記載の方法。
３．限られた数の父系配偶子が２つまたは４つである、項目１または２に記載の方法。
４．４集粒または２集粒の形態を有する父系配偶子が、小胞子４集粒分離に対する干渉の結果である、項目１−３のいずれかの組み合わせに記載の方法。
５．小胞子４集粒分離に対する干渉が、単一の減数分裂に由来する小胞子間のペクチン層の破壊に関わる一以上の標的遺伝子に対する干渉を含む、項目４に記載の方法。
６．一以上の標的遺伝子が、ＱＲＴ１、ＱＲＴ２、ＱＲＴ３またはそれらの機能的ホモログからなる群から選択される、項目５に記載の方法。
７．小胞子４集粒分離に対する干渉が、化学的手段によって達成される、項目４に記載の方法。
８．父植物が染色体組換えの抑制を示す、項目１−７のいずれかの組み合わせに記載の方法。
９．父植物が減数分裂の間に第２分裂復元（ＳＤＲ）を示す、項目１−７のいずれかの組み合わせに記載の方法。
１０．染色体組換えの抑制が、組換えに関わる一以上の標的遺伝子に干渉することにより達成される、項目８に記載の方法。
１１．標的遺伝子が二本鎖切断に関わる、項目１０に記載の方法。
１２．標的遺伝子が、ＳＰＯ１１、ＭＥＲ１、ＭＥＲ２、ＭＲＥ２、ＭＥＩ４、ＲＥＣ１０２、ＲＥＣ１０４、ＲＥＣ１１４、ＭＥＫ１／ＭＲＥ４、ＲＥＤ１、ＨＯＰ１、ＲＡＤ５０、ＭＲＥ１１、ＸＲＳ２、またはそれらの機能的ホモログからなる群から選択される、項目１１に記載の方法。
１３．標的遺伝子が染色体対合および／または鎖交換に関わる、項目１０に記載の方法。
１４．標的遺伝子が、ＲＨＤ５４／ＴＩＤ１、ＤＭＣ１、ＳＡＥ３、ＲＥＤ１、ＨＯＰ１、ＨＯＰ２、ＲＥＣ８、ＭＥＲ１、ＭＲＥ２、ＺＩＰ１、ＺＩＰ２、ＭＥＩ５、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＰＡ、ＳＭＣ３、ＳＣＣ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＰＭＳ１、ＳＯＬＯＤＡＮＣＥＲＳ、ＨＩＭ６、ＣＨＫ２、またはそれらの機能的ホモログからなる群から選択される、項目１３に記載の方法。
１５．標的遺伝子が減数分裂組換えプロセスに関わる、項目１０に記載の方法。
１６．標的遺伝子が、ＳＧＳ１、ＭＳＨ４、ＭＳＨ５、ＺＩＰ１およびＺＩＰ２、またはそれらの機能的ホモログからなる群から選択される、項目１５に記載の方法。
１７．一以上の標的遺伝子に対する干渉が、それらの転写を阻止することからなる、項目５および／または１０に記載の方法。
１８．転写が、標的遺伝子プロモーターに対して向けられたＲＮＡオリゴヌクレオチド、ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ分子によって阻止される、項目１７に記載の方法。
１９．転写が、標的遺伝子プロモーターに作用する、負に作用する転写因子の発現によって阻止される、項目１７に記載の方法。
２０．一以上の標的遺伝子に対する干渉が、標的遺伝子のｍＲＮＡまたは転写物を不安定化することからなる、項目５および／または１０に記載の方法。
２１．標的遺伝子のｍＲＮＡが、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ分子、ウイルス誘導性遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）分子、共抑制因子分子、ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、標的遺伝子のｍＲＮＡまたは転写物に相補的である、核酸分子によって不安定化される、項目２０に記載の方法。
２２．一以上の標的遺伝子に対する干渉が、標的遺伝子の発現産物を阻害することからなる、項目５および／または１０に記載の方法。
２３．標的遺伝子の発現産物が、一以上のドミナントネガティブな核酸構築物の発現産物によって阻害される、項目２２に記載の方法。
２４．標的遺伝子の発現産物が、一以上の化合物によって阻害される、項目２２に記載の方法。
２５．一以上の標的遺伝子に対する干渉が、その生物学的機能の撹乱につながる、標的遺伝子中への一以上の変異の導入からなる、項目５および／または１０に記載の方法。
２６．一以上の変異が、一以上の化合物および／または物理的手段および／または遺伝子エレメントの挿入によってランダムに導入される、項目２５に記載の方法。
２７．一以上の化合物が、エチルメタンスルホネート、ニトロソメチルウレア、ヒドロキシルアミン、プロフラビン、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−ニトロソグアニジン、ジエチル硫酸、エチレンイミン、アジ化ナトリウム、ホルマリン、ウレタン、フェノールおよびエチレンオキサイドからなる群から選択される、項目２６に記載の方法。
２８．物理的手段が、ＵＶ照射、高速中性子ばく露、Ｘ線、ガンマ線照射からなる群から選択される、項目２６に記載の方法。
２９．遺伝子エレメントが、トランスポゾン、Ｔ−ＤＮＡ、レトロウイルスエレメントからなる群から選択される、項目２６に記載の方法。
３０．一以上の変異が、相同性組換えまたはオリゴヌクレオチドに基づく変異導入によって特異的に導入される、項目２５に記載の方法。
３１．第２分裂復元が、特に開始生物に干渉せずに、自然発生的に起こる、項目９に記載の方法。
３２．第２分裂復元が遺伝的改変によって誘導される、項目９に記載の方法。
３３．遺伝的改変が一過性である、項目３２に記載の方法。
３４．遺伝的改変が、生物における第２分裂復元事象の数を増加する、遺伝子エレメントのゲノム内への安定な組み込みにより達成される、項目３２に記載の方法。
３５．第２分裂復元が、父植物を環境ストレスに供することにより達成される、項目９に記載の方法。
３６．環境ストレスが、温度ストレス、ＮＯ２、亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ）、またはそれらの組み合わせから選択される、項目３５に記載の方法。
３７．接合子からの母系染色体の喪失が、半数体誘導因子系統を雌株として用いることにより誘導される、項目１−３６のいずれかの組み合わせに記載の方法。
３８．雌株が異なる種の植物である、項目３７に記載の方法。
３９．雌株が、異種導入遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック植物であり、該異種導入遺伝子発現カセットが、組換え的に改変されたＣＥＮＨ３、ＣＥＮＰＣ、ＭＩＳ１２、ＮＤＣ８０またはＮＵＦ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含み、かつ対応する不活性化された内因性ＣＥＮＨ３、ＣＥＮＰＣ、ＭＩＳ１２、ＮＤＣ８０またはＮＵＦ２遺伝子を有するものである、項目１−３７のいずれかの組み合わせに記載の方法。
４０．母系染色体が存在しない限られた数の種子を含有する種子のセットであって、そのセットが、該種子から生育した植物が交配される場合、本質的に同じ交配種をもたらす、遺伝的に相補的な種子の対から構成され、かつその種子のセットが、項目１−３９のいずれかの組み合わせに記載の方法により得ることができる、種子のセット。
４１．遺伝子構成がその雄性原原種の遺伝子構成と本質的に同一である植物の生成のための、親植物のセットを提供するための方法であって、種子の染色体数の倍加の後または前に、項目４０に記載の種子のセットの種子から植物を生育させること、および２つの遺伝的に相補的な植物を親植物として同定することを含む、方法。
４２．遺伝子構成がその父系祖父の遺伝子構成と本質的に同一である植物を同定するため、かつ遺伝子構成がその父系祖母の遺伝子構成と本質的に同一である別の植物を同定するために、種子のセットまたはそれらから生育した植物が、それらの遺伝子構成についてスクリーニングされる、項目４１に記載の方法。
４３．遺伝子構成がそれら自身の祖父の遺伝子構成と本質的に同一である子孫植物を取得するために、遺伝子構成がその父系祖父の遺伝子構成と本質的に同一である植物が、遺伝子構成がその父系祖母の遺伝子構成と本質的に同一である別の植物と交配される、項目４０−４２のいずれかの組み合わせに記載の方法。
【００８５】
本発明は、本発明を決して限定するものではない以下の実施例で、さらに説明される。実施例では、以下の図面が参照される：
実施例
【実施例１】
【００８６】
四分子花粉を飛散させるアブラナ属植物の同定
本発明を実施するための必須の資源は、その花粉粒を４集粒の形態で飛散させ、それによって減数分裂からの４つの生成物を互いに物理的に付着したままにする、対象の種の植物である。そのような植物は、変異体スクリーニングにおいて、あるいはトランスジェニックアプローチを介して、取得することができる。本実施例では第一の選択肢を示すが、後続の実施例では第二の選択肢が説明される。
【００８７】
四分子花粉表現型を示す植物を同定するために、ブラシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）ＥＭＳ−変異体集団を表現型でスクリーニングして、個々の植物の葯における四分子表現型（すなわち花粉四分子）を有する花粉粒の発生を検出した。バルク法では、複数の植物からの花粉が一緒にプールされ、個々の花粉粒が明確に識別できるよう、溶液中に希釈された。これらの花粉粒は、次いで、双眼鏡下、目視でスクリーニングされたが、このスクリーニングはまた代替的に、フローサイトメトリーで、あるいはろ過（個々の花粉粒の直径よりも大きいが、花粉四分子の直径よりも小さい細孔径を有するろ過を用いる）により可能である。花粉プール中に所望の四分子表現型を検出すると、四分子変異植物が確実に同定されるまで、そのプールに花粉を寄与した全ての植物が、個々にスクリーニングされた。次世代で、四分子表現型の伝達率が確認された。
【実施例２】
【００８８】
そのＦ１子孫から母系ゲノムを排除するアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の作成
Ｍａｒｕｔｈａｃｈａｌａｍ  ＆  Ｃｈａｎによる刊行物（Ｎａｔｕｒｅ  ４６４，  ６１５−６１９；  ２０１０）は、ＧＦＰ−ＣＥＮＨ３−ｔａｉｌｓｗａｐタンパク質のための過剰発現構築物での、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ｃｅｎｈ３変異植物の形質転換が、受精に続き、配偶子における異常な有糸分裂をもたらすことを教示している。この異常な有糸分裂の間、母系染色体は選択的に分裂接合子（ｄｉｖｉｄｉｎｇ  ｚｙｇｏｔｅ）から排除される。ＣＥＮＨ３タンパク質は真核生物において普遍的であり、かつその機能は非常に良く保存されているので、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）からのこの方法は、他の植物種において広く適用できる。
【００８９】
Ｆ１子孫において母系ゲノムが選択的に排除されているブラシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）植物を作成するために、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来ＣＥＮＨ３にオルソロガスであるタンパク質の機能的なバージョンを欠く、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物が作成された。これは、ＲＮＡｉ法によって達成された。この植物は続いて、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）感染によって、Ｍａｒｕｔｈａｃｈａｌａｍ  ＆  Ｃｈａｎによって記載された（Ｎａｔｕｒｅ  ４６４，  ６１５−６１９；  ２０１０）ＧＦＰ−ＣＥＮＨ３−ｔａｉｌｓｗａｐ構築物で、遺伝的に形質転換された。ホモ接合性ｃｅｎｈ３変異植物の致死性のため（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の場合のように）、この構築物でヘテロ接合性にサイレンシングされた植物を形質転換する必要があった。形質転換体植物は、続いて、構築物の選択マーカーに基づき選択され、ＧＦＰ−ＣＥＮＨ３−ｔａｉｌｓｗａｐ融合タンパク質の存在および正確な発現が、有糸分裂の間、蛍光顕微鏡観察で検出された。
【実施例３】
【００９０】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）における四分子表現型の母系ゲノム排除との組み合わせ
この実施例は、交配植物の遺伝子型がどのようにして効率良く再構成できるのかを説明する。
【００９１】
ＣａＭＶ  ３５Ｓ構成的プロモーターによって駆動される、ＱＲＴ１遺伝子（Ａｔ５ｇ５５５９０）を標的とするＲＮＡｉ構築物の単コピーを（ホモ接合性状態で）有する、Ｌｅｒ系統種（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）のトランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）植物が作成された。代替的に、人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）などの他の技術をこの目的のために用いることができる。この植物は、次いで、Ｗｓ系統種の野生型シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）植物と交配された。
【００９２】
生じたＦ１世代は、ＲＮＡｉ構築物についてヘミ接合性である、混合性のＬｅｒ／Ｗｓ背景を有する交配植物からなった。ＲＮＡｉ構築物が、胞子体的に（ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｉｃａｌｌｙ）、かつ優性に働くので、全てのＦ１植物は四分子花粉表現型を示した。次いで、−四分子花粉表現型を示す−Ｆ１植物が、父として、Ｍａｒｕｔｈａｃｈａｌａｍ  ＆  Ｃｈａｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ４６４，  ６１５−６１９；  ２０１０）によって報告されたＧＦＰ−ＣＥＮＨ３−ｔａｉｌｓｗａｐ構築物で遺伝的に形質転換された、Ｃｏｌ−０系統種のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ｃｅｎｈ３変異体と交配された。この交配は、配偶子における第一の有糸分裂の間、半数体種子の形成につながる、母系染色体の排除をもたらした。
【００９３】
交配に備えて、個々の成熟した花粉四分子の収集を可能にするために、父植物のほぼ裂開した葯が双眼顕微鏡下で開かれた。まつげまたは細いブラシの毛を用いて、各花粉四分子が、母植物の雌ずい上に注意深く置かれ、４つの花粉粒は４つの胚珠を受精できた。単一の花粉四分子での、この限られた数の受粉から生じる４つの種子は成熟でき、その後回収され、発芽できた。あるいは、１より多い４集粒を母植物の雌ずい上に置くことができるが、花粉粒の数がその種の雌性生殖部分内の胚珠の平均数を超えないように留意すべきである。受粉のための１より多い４集粒の使用は、すなわち、遺伝的に相補的な子孫植物が同定できる効率を減少させる。
【００９４】
トランスジェニックＣｏｌ−０母植物の限られた受粉から生じる実生（ｓｅｅｄｌｉｎｇ）の倍数性を、フローサイトメトリーにより試験した。２ｎへの自然発生的なゲノム倍加がその間に発生した場合を除き、それらの倍数性はｎであった。半数体個体のため、続いて、ゲノム倍加が当業者に知られている標準的な方法（例えばコルヒチン処理）によって達成された。この交配から生じる４つの実生が２ｎであると、それらのゲノムＤＮＡは単離され、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ゲノム全体をカバーする遺伝子マーカーについて遺伝的に解析された。とりわけ、Ｃｏｌ−０とＬｅｒの間、およびＣｏｌ−０とＷｓの間で多型であるマーカーを試験し、４つの子孫植物への両方の親ゲノムの寄与を区別した。配偶子からの母系ゲノムの排除に起因して、４つの子孫植物は、交配父植物由来の組換え染色体だけを含有し、それゆえ、それらは全てのＣｏｌ−０特異的マーカーついて陰性であった。
【００９５】
図２は、花粉四分子内に一定の相補的な染色体を有する子孫植物の発生率が、半数体染色体数（ｎ）に依存することを示す。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）は５つの染色体を有し、かつ元の父植物における四分子花粉表現型により、４つの実生の染色体の集まり（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｉｏｎ）は単一の減数分裂から生じる。これは、単一の花粉四分子中に存在する、２つの完全に相補的なゲノムについて、１６中１（６．３％）の理論的な可能性があることを意味する。可能性は、１つの非相補的な染色体を有する２つのゲノムを有するものについては３１．３％であり、かつ２つの非相補的な染色体を有する２つのゲノムを有するものについては６２．５％である。全ての場合で、４集粒における個々の花粉粒は、それゆえ、互いに少なくとも５０％相補的である。重要なことに、組換えが、例えば４０％のヘテロ接合性をもたらす場合、個々の花粉粒のゲノム間の全体的な相補性は、常に５０％よりも高くなる、なぜなら、「非相補的」染色体はその後依然として互いに６０％相補的であるからである。
【００９６】
それゆえ、理論的には、花粉四分子との１６個の個々の交配だけが、本質的に相補的な染色体のセットを有する２つのシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）実生を同定するために、平均的に必要とされる。実際にはしかしながら、受粉、種子形成、ならびに植物の発芽および生存が、一般に１００パーセント未満であるので、より多くが必要とされる。経験則として、成功の可能性を最大化するために、単一の４集粒で１０倍の交配、すなわちこの場合１６０、を行った。
【００９７】
同定後、２つの遺伝的に本質的に相補的な植物を開花期まで生育し、次いで交配した。この交配から生じるＦ１子孫の遺伝子構成は、その父系原原種、すなわちＬｅｒ／Ｗｓ交配背景を有するｑｒｔ１変異植物、の遺伝子構成と本質的に同一であることが実験的に示された。
【実施例４】
【００９８】
非トランスジェニック子孫を備える、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）における、四分子表現型の母系ゲノム排除との組み合わせ
実施例３において、ＱＲＴ１遺伝子を標的とするＲＮＡｉ構築物を保持し、それゆえ、四分子花粉表現型も保持するので、Ｆ１子孫はトランスジェニックのままであった。しかしながら、成熟花粉粒において緑色蛍光タンパク質を特異的に発現するＧＦＰレポーターカセットが実施例３で用いられたＲＮＡｉ構築物内にインテグレートされる場合、これは、子孫植物がトランスジェニックではない別のアプローチを可能にする。次いで、Ｔ−ＤＮＡ構築物もまた、成熟花粉粒におけるこの構築物の容易な視覚的検出を可能にする、後期花粉特異的プロモーター（ＬＡＴ５２プロモーター；Ｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，  １９９０，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０９：  ７０５−７１３）下の核局在シグナルを有するＧＦＰタンパク質を含有する。
【００９９】
実施例３で記載されたＬｅｒ／Ｗｓ交配植物（ＱＲＴ１を標的とするＲＮＡｉ構築物についてヘミ接合性）の葯をつぶしたもの（ｓｑｕａｓｈ）において、４つの花粉粒のうち２つがそれらの核においてＧＦＰを発現しなかった花粉四分子が、視覚的に（蛍光双眼鏡または顕微鏡を用いて）あるいはＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）により、選択された。それゆえ、４つの花粉粒のうち２つだけが、ＱＲＴ１遺伝子を標的とするＲＮＡｉ構築物を含有した。−配偶子における第一の有糸分裂の間、母系染色体の排除を誘導した−上述したＣｏｌ−０母植物の、かかる花粉四分子での受粉は、（ＲＮＡｉ構築物を有する）２つのトランスジェニック半数体子孫植物および（ＲＮＡｉ構築物を有さない）２つの非トランスジェニック半数体子孫植物を生じさせた。
【０１００】
定義による非トランスジェニック子孫植物は、ＱＲＴ１に対するＲＮＡｉ構築物を有するＬｅｒ染色体フラグメントを欠き、かつ、これら２つの植物の交配は、それゆえ、元のＦ１交配種の正確な再構成をもたらすことは決してできない、なぜなら、再構成された植物が、少なくとも１つのＷｓ染色体領域に関して、すなわち、Ｌｅｒ親植物におけるＱＲＴ１に対するＲＮＡｉ構築物を含有する染色体領域に対応する染色体領域に関して、ホモ接合性であるからである。
【実施例５】
【０１０１】
アマトウガラシ（カプシカム・アンニューム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ））における、四分子花粉表現型の第２分裂復元との組み合わせ
第２分裂復元（ＳＤＲ）が発生する場合、第二減数分裂は発生せず、減数分裂の結果は、４つの半数体花粉粒の代わりに、２つの二倍体花粉粒となる。それゆえ、減数分裂生成物が互いに物理的に付着したままである場合、−四分子花粉表現型を有する場合のように−ＳＤＲが起こる時、植物は花粉二分子を生成するだろう。本発明のこの好ましい実施形態では、２つの二倍体減数分裂生成物が互いに物理的に付着したままであり、それらの染色体は同一の組換え切断点（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｂｒｅａｋ  ｐｏｉｎｔ）を有するので、２つの花粉粒は互いに１００％遺伝的に相補的である。
【０１０２】
四分子花粉表現型を示すアマトウガラシ（カプシカム・アンニューム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ））が、実施例３に記載されるものと同様に、ＲＮＡｉ法によって得られた。それらの子孫植物−四分子表現型についてホモ接合性である−を、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７８：  ８４−８８によって、およびＷＯ２００６／０９４７７３の実施例２に記載されるように、冷却ストレスに供し、非減数小胞子（ｕｎｒｅｄｕｃｅｄ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅ）（配偶子）形成の頻度を増加させた。冷却処置された植物の葯において生成された小胞子および花粉の最大２５％が、２集粒の形態を有していた。単離された小胞子分画を、顕微鏡解析により（あるいは、フローサイトメトリーを用いることができる）、さらに２集粒で豊富にした。この方法を用いて、近逆育種（Ｎｅａｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）（ＷＯ２００６／０９４７７３）と称される適用が、好ましい実施形態で可能となる。
【０１０３】
この目的のため、第一の有糸分裂の間、その配偶子から母系ゲノムを排除する、第二のアマトウガラシ植物が、実施例２で概説される実験方法に続いて作成された。このトランスジェニックアマトウガラシ植物を、上述した冷却処置されたアマトウガラシ植物由来の単一の花粉二分子で受粉し、生じた２つの二倍体種子を回収し、発芽させた。花粉二分子は、非ＳＤＲ減数分裂事象に由来した花粉四分子からの別のつぶしたもの（ｓｑｕａｓｈ）において、手作業で選抜された。
【０１０４】
これらの２つの二倍体の種子から生育した植物が続いて交配され、かつ−遺伝子マーカーを用いて−この交配の子孫植物の遺伝子組成が、我々が受粉のために用いた花粉二分子を生成したアマトウガラシ植物の遺伝子組成と本質的に同一であることが確認できた。しかしながら、花粉二分子の形成の間に発生したクロスオーバー事象に起因して、選抜された交配背景においてさらなる遺伝的変異を提供する、いくつかのテロメア変動（ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）が導入された。
【０１０５】
それゆえ、別のアマトウガラシ植物により生成された花粉二分子で半数体誘導因子母植物を受粉することにより、この実施例で作成されたアマトウガラシ植物は、受粉のための花粉二分子を生成したアマトウガラシ植物と遺伝的に「本質的に同一」なだけであった、なぜなら、さらなる遺伝的変異が、花粉二分子の形成の間に発生したクロスオーバー事象の結果として、テロメアに導入されていたためである。父植物の全ての遺伝物質は維持されていたが、その一部分はクロスオーバー事象により再編されており、かつこの再編はさらなる表現効果（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）の原因となり得る。
【０１０６】
この実施例は、それゆえ、選抜された（精鋭）交配植物におけるさらなる遺伝的変異の導入を可能にする。このさらなる遺伝的変異は、元の交配種の表現型と比べた場合、正または負のさらなる表現効果を有してもよく、かつそれゆえ、それは、元の交配種に含まれる選抜された特徴の組み合わせを失わずに、交配種の表現型をさらに改善する（および／または微調整する）興味深い機会を提供する。
【０１０７】
あるいは、四分子表現型を示すアマトウガラシ植物は、平均以上の程度のＳＤＲを自然に示すアマトウガラシ植物と交配することができる。それらの子孫は、次いで、平均以上のパーセンテージの花粉二分子を自然に生成する。別の方法は、平均以上の程度のＳＤＲを自然に示すアマトウガラシ植物の集団を突然変異させること、および、前述の遺伝的方法において、この変異体集団にて四分子花粉表現型を示す植物についてスクリーニングすることである。
【０１０８】
各々の２集粒において、２つの花粉粒が互いに遺伝的に本質的に相補的である（同一の染色体切断点（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｂｒｅａｋ−ｐｏｉｎｔ）を有する）可能性は、１００％である。２集粒に含まれる２つの小胞子は、定義により、遺伝的に本質的に相補的であり、かつ、これらの２集粒のいずれか１つに由来し得る２つの植物を交配すると、２集粒を生成した元の交配植物と本質的に遺伝的に同一である交配植物を常にもたらす。この実施形態は、それゆえ、近逆育種技術の効率を大幅に改善する。
【０１０９】
一般に、本発明のこの実施形態では、そのＦ１子孫からの母系染色体の排除の原因となる遺伝的特徴を担持する植物が、限られた受粉を介して受粉される。この交配で用いられる花粉は、ＳＤＲと組み合わせて四分子花粉表現型を示す、同じ種の交配植物から得られた単一の花粉二分子である。この花粉二分子は、押しつぶされた葯を視覚的にスクリーニングすることにより、かつ（ＳＤＲが発生しなかった間の減数分裂に由来する）４集粒の集まりから２集粒の集まりを続いて選抜することにより、あるいは、−よりハイスループットな環境で−フローサイトメトリーまたはセルソーティングによって、花粉分画を２集粒で豊富にすることにより得られる。
【０１１０】
そのＦ１子孫からの母系染色体の排除の原因となる遺伝的特徴を担持する植物の受粉の後、２集粒に含まれる２つの二倍体花粉粒のそれぞれが胚珠を受精し、かつ種子が形成され、成熟することが可能となる。成熟の後、この交配に由来する２つの種子を回収し、発芽させる。次いで、生じる実生を、それらの倍数性レベルについてフローサイトメトリーにより試験し、それらが予想された通りに実際に２ｎであることを確認した。
【０１１１】
続いて、ゲノムＤＮＡが２つの実生から単離され、全ゲノムをカバーする遺伝子マーカーが両方の個体において試験される。配偶子からの母系染色体の排除に起因して、両方の実生は、父系染色体だけを有することが予想される。両方の実生由来の染色体が単一の減数分裂に由来したという事実に起因して、全ての染色体切断点（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｂｒｅａｋ  ｐｏｉｎｔ）は同一であり、かつそれらのゲノムは１００％相補的である。これは、ゲノムワイドマーカー解析によって確認される。
【０１１２】
実生は、その後、成熟するまで生育させ、互いに交配させる。それらのＦ１子孫は、ＳＤＲ配偶子の形成の間に起こったクロスオーバー事象以外、第一の交配で父として用いられた元の開始交配植物と遺伝的に本質的に同一である。これらのクロスオーバー事象は、選抜された交配背景においてさらなる遺伝的変異を提供する、いくつかのテロメア変動を導入する。
【０１１３】
父系祖父生物の（交配）遺伝子型のほぼ正確な再構成は、２世代の時間のみにおいて、中間体再生（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）またはゲノム倍加段階または組織培養を必要とせずに、達成された。
【実施例６】
【０１１４】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）における、四分子表現型の染色体組換えの抑制および母系ゲノム排除との組み合わせ
四分子表現型を示すシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物と、（トランスジェニックな、変異的な、または化学的な手法のいずれかにより）染色体組換えが部分的または完全に抑制されている別のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物との交配から、両方の特性が組み合わされているＦ２子孫植物が選抜できる：単一の減数分裂に由来する４つの花粉粒は、開花および花粉飛散の時まで、互いに物理的に付着し、かつ減数分裂の間、相同染色体の組換えは抑制される。
【０１１５】
この子孫植物は、より効率的な方法で、逆育種（ＷＯ  ０３／０１７７５３；  Ｄｉｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ  ２００９）の適用を可能にする。減数分裂生成物が互いに物理的に付着したままであるため、染色体の本質的に相補的なセットを有する２つの花粉粒を同定する機会が大幅に増加する。異なる４集粒の数は、種の染色体数の関数であるが、単一の４集粒内では、しかしながら、４つの花粉粒は相補的に対であるので、２つの花粉粒が完全に相補的な染色体のセットを有する可能性は常に５０％である。各々の４集粒内で、相補的な花粉粒の２つの対を見つける可能性は、それゆえ１００％である。
【０１１６】
実施例３に記載されるように、ＣａＭＶ  ３５Ｓ構成的プロモーターによって駆動される、ＱＲＴ１遺伝子を標的とするＲＮＡｉ構築物の単コピーを（ホモ接合性状態で）有する、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）Ｌｅｒ植物が作成された。この植物は、次いで、ＣａＭＶ  ３５Ｓ構成的プロモーターによって駆動される、ＤＭＣ１遺伝子を標的とするＲＮＡｉ構築物の単コピーを有する、Ｗｓ系統種のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）植物と交配された。
【０１１７】
生じたＦ１世代は、両方のＲＮＡｉ構築物について全てヘミ接合性である、混合性のＬｅｒ／Ｗｓ背景を有する交配植物からなった。ＲＮＡｉ構築物の両方が、胞子体的に、かつ優性に働くので、Ｆ１植物は四分子花粉表現型および減数分裂の間の染色体組換えの抑制を示した。十分に機能的なＤＭＣ１タンパク質の非存在下で、各染色体がランダムに分裂の娘細胞に分配されるので、望ましくない副作用として、染色体組換えの抑制はまた、（均衡のとれた４集粒と同時に）不均衡な花粉四分子の発生をもたらした。しかしながら、均衡のとれた４集粒は、（目視検査および／またはフローサイトメトリーを介して）実験的に葯から選択できた。
【０１１８】
−染色体組換えの抑制と組み合わせて四分子花粉表現型を示し、両方のトランスジェニック構築物についてヘミ接合性である−Ｆ１植物由来の均衡のとれた花粉四分子を用いて、続いて、Ｍａｒｕｔｈａｃｈａｌａｍ  ＆  Ｃｈａｎ，  ２０１０により報告されたＧＦＰ−ＣＥＮＨ３−ｔａｉｌｓｗａｐ構築物で遺伝的に形質転換され、配偶子における第一の有糸分裂の間の母系染色体の排除をもたらす、Ｃｏｌ−０系統種のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ｃｅｎｈ３変異植物（Ｍａｒｕｔｈａｃｈａｌａｍ  ＆  Ｃｈａｎ，  ２０１０により作成され、報告された）を受粉した。
【０１１９】
単一の均衡のとれた花粉四分子が母植物の雌ずいの受粉のために用いられた場合、この交配は、４つの半数体子孫種子を理想的にもたらした。４つの子孫種子は発芽でき、マーカーを用いて実生が遺伝的に試験された。減数分裂の際に、染色体組換えが全く発生しなかったため（ＤＭＣ１を標的とするＲＮＡｉ構築物に起因して、全ての染色体はその全体が次世代に渡された）、それがＬｅｒ原原種から、またはＷｓ原原種から継承されたかどうかを決定するために、ごく少数のマーカーが各染色体について試験されるために必要であった（実際には、染色体当たり単一の多型マーカーで十分であった；我々の実験方法では、我々は染色体腕当たり１つのマーカー、すなわち染色体当たり２つのマーカーを用いた）。
【０１２０】
母系植物が子孫に遺伝的に貢献していないことを確かにするため、Ｃｏｌ−０特異的マーカーも試験されたが、実施例３の場合においてもそうであったように、Ｃｏｌ−０遺伝物質は同定できなかった。
【０１２１】
４つの子孫植物は、完全に遺伝的に相補的に対であることが見出され、遺伝子マーカー解析基づき、これらの対を効率的に同定することができた。このような互いに遺伝的に相補的な子孫植物の対を交配すると、受粉に用いられた花粉四分子を生成した元の交配植物、すなわち、両方のＲＮＡｉ構築物についてヘミ接合性であるＬｅｒ／Ｗｓ交配植物、の効率的な遺伝子再構成（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）をもたらす。図４は、この実験で用いられた植物の系図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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