(57)【要約】  本発明は、ヒトの消費のために屠殺される動物のための、抗微生物活性及び／又は成長促進活性を有する、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種、好ましくは本明細書におけるパエニバチルス・エルギイ・オウロフィネンシス（ｅｌｇｉｉ  ｏｕｒｏｆｉｎｅｎｓｉｓ）で発酵させた材料の抽出物を提供する。本発明は、パエニバチルス・エルギイ・オウロフィネンシス発酵抽出物の画分から得た新たなペプチドであって、生物、例えば植物及び動物において抗微生物活性及び成長促進活性を有するペプチドを提供する。本発明はまた、ヒトの消費のための動物の成長を促進するための、並びにその予防及び治療のための抗微生物剤としての、この新たな菌株パエニバチルス・エルギイ・オウロフィネンシスの抽出物の使用に関する。
2014513080.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポペプチドを含む抽出物を得る方法であって、以下の化合物：
【化１】
2014513080.tif 000013
のうちの少なくとも１つを、パエニバチルス属（ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）で発酵させた材料中に抽出するステップを含むことを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
前記パエニバチルス属（ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）が、パエニバチルス・エルギイ（ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｌｇｉｉ）及び／又はパエニバチルス・エルギイ・オウロフィネンシス（ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｌｇｉｉ  ｏｕｒｏｆｉｎｅｎｓｉｓ）であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
パエニバチルス属（ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の細菌抽出物であって、以下の化合物：
【化２】
2014513080.tif 000014
のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする、上記細菌抽出物。
【請求項４】
抗微生物活性及び／又は成長促進物質を有する単離されたリポペプチドであって、以下の化合物：
【化３】
2014513080.tif 000015
のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする、上記リポペプチド。
【請求項５】
動物の治療及び／又は予防のための薬剤組成物であって、
（ｉ）治療有効量の以下の化合物：
【化４】
2014513080.tif 000016
のうちの少なくとも１つと、
（ｉｉ）薬学的に許容される担体又は賦形剤と
を含むことを特徴とする、上記薬剤組成物。
【請求項６】
パエニバチルス属（ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）で発酵させた材料の抽出物を含むことを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記パエニバチルス属（ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）が、パエニバチルス・エルギイ（ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｌｇｉｉ）及び／又はパエニバチルス・エルギイ・オウロフィネンシス（ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｌｇｉｉ  ｏｕｒｏｆｉｎｅｎｓｉｓ）であることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
動物の治療及び／又は予防のための薬剤組成物であって、
（ｉ）治療有効量の、以下の化合物：
【化５】
2014513080.tif 000017
のうちの少なくとも１つを含むパエニバチルス属（ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の培養抽出物と、
（ｉｉ）薬学的に許容される担体又は賦形剤と
を含むことを特徴とする、上記薬剤組成物。
【請求項９】
前記パエニバチルス属（ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）が、パエニバチルス・エルギイ（ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｌｇｉｉ）及び／又はパエニバチルス・エルギイ・オウロフィネンシス（ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｌｇｉｉ  ｏｕｒｏｆｉｎｅｎｓｉｓ）であることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
（ｉ）農業有効量の以下の化合物：
【化６】
2014513080.tif 000018
のうちの少なくとも１つと、
（ｉｉ）農学的に許容される担体又は基剤と
を含む、植物の予防及び治療のための組成物。
【請求項１１】
パエニバチルス属（ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）で発酵させた材料の抽出物を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記パエニバチルス属（ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）が、パエニバチルス・エルギイ（ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｌｇｉｉ）及び／又はパエニバチルス・エルギイ・オウロフィネンシス（ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｌｇｉｉ  ｏｕｒｏｆｉｎｅｎｓｉｓ）であることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
下記に記載されるリポペプチドの少なくとも１つの使用であって：
【化７】
2014513080.tif 000019
ヒトの消費が意図される動物の成長促進物質及びその治療又は予防のための抗微生物剤を調製するためのものであることを特徴とする、上記使用。
【請求項１４】
下記に記載されるリポペプチドの少なくとも１つの使用であって：
【化８】
2014513080.tif 000020
植物における成長促進物質及び植物病原体により引き起こされる感染の治療又は予防のための抗微生物剤を調製するためのものであることを特徴とする、上記使用。
【請求項１５】
下記に記載されるリポペプチドの少なくとも１つの使用であって：
【化９】
2014513080.tif 000021
動物又は植物における成長促進物質及び感染を伴う状態の治療又は予防のための抗微生物剤を調製するためのものであることを特徴とする、上記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物、とりわけ植物及び動物において抗微生物活性及び成長促進活性を有するリポペプチドに関する。本発明のリポペプチドは、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌分離株、より詳細にはパエニバチルス・エルギイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｌｇｉｉ）の分離株の培養物の抽出物から同定された。本発明は、成長促進物質としての、並びに植物及び動物などの生物の治療及び予防における、単離株パエニバチルス属抽出物の使用に更に関する。本発明は、成長促進物質としての、並びに植物及び動物などの生物の治療及び予防における本発明のペプチドの使用に更に関する。加えて、本発明は、動物の治療及び予防のための薬剤組成物であって、治療又は予防有効量の本発明のペプチドを薬学的に許容される担体又は賦形剤と関連して含む薬剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗生物質は、バイオテクノロジー産業において最も利用されている微生物産物である。現在、家畜感染（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の治療及び動物の成長の促進に使用される技術は、従来の抗生物質に基づいている。例えば、ニワトリに感染を引き起こす細菌の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）及び腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）は、テトラサイクリン、ナリジスク酸、アンピリシン及び他などの既知の抗微生物剤に耐性があることが示された（Ｒｉｂｅｉｒｏ，Ａ．Ｒ．、Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ，Ａ．、Ｓａｎｔｏｓ，Ｌ．Ｒ．、Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ  Ｖ．Ｐ．２００８．ブロイラー及びブロイラーブリーダーの臨床及び環境試料から単離された腸炎菌における抗微生物耐性（Ｒｅｓｉｓｔｅｎｃｉａ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｎａ  ｅｍ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ  ｉｓｏｌａｄａｓ  ｄｅ  ａｍｏｓｔｒａｓ  ｃｌｉｎｉｃａｓ  ｅ  ａｍｂｉｅｎｔａｉｓ  ｄｅ  ｆｒａｎｇｏｓ  ｄｅ  ｃｏｒｔｅ  ｅ  ｍａｔｒｉｚｅｓ  ｐｅｓａｄａｓ．）Ａｒｑ．Ｂｒａｓ．Ｍｅｄ．Ｖｅｔ．Ｚｏｏｔｅｃ．６０（５）：１２５９〜１２６２を参照のこと）。そのような従来の抗生物質は、ヒトの感染の治療にも使用される。この重複（ｏｖｅｒｌａｙ）は、耐性菌株出現の大幅な増加をもたらし、このことはヒトの感染治療を複雑にする。したがって、動物専用の抗微生物活性を有する新たな化学実体の単離は、屠殺用の動物を飼育するのに著しい利益をもたらし、前記実体は、成長促進物質として及び家畜感染の治療に使用され、これらの利益により、生産者の収入が増加するだけでなく、ヒトが消費する動物における現在の抗生物質の使用を排除することにもなる。
【０００３】
耐性菌の出現は、ペニシリンのような抗微生物剤の臨床使用から程なくして起こった。それ以来、市販されているそれぞれの新たな抗微生物剤では、これらの新たな作用物質に対する耐性菌が素早く現れ、この耐性が発生する速度は、新たな薬剤の使用の大きさに比例していることが明らかとなった。近年、ヒトへの食料供給に使用される動物における抗微生物薬の使用は、ヒトの感染を治療するために使用される抗生物質に対して耐性がある病原性細菌の出現を引き起こすことが見出された（より詳細には、Ｗｅｇｅｎｅｒ  Ｈ．Ｃ．ら「食用動物における抗微生物薬の使用についての公衆衛生への影響」（Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｍｐａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ａｎｉｍａｌｓ）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＷＢＣ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ、２３ｒｄ  Ｗｏｒｌｄ  Ｂｕｉａｔｒｉｃｓ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ、Ｑｕｅｂｅｃ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｎａｄａ、２００４を参照のこと）。
【０００４】
抗微生物剤は、細菌を含む微生物を抑制又は死滅させる天然又は合成物質でありうる。現在、化学構造及び作用機構の異なる１５種類を超える異なる部類の抗微生物物質があり、そのことがそれらを特定の病原体の治療において極めて特定的にしている。抗微生物剤の出現は、治療価値のみならず、治療量以下で使用されたときに植物及び動物の成長を促進する特性によっても、医療、獣医学及び農業の分野における２０世紀の大きな勝利であった（「ヒトの医療以外の抗微生物薬の使用及びその結果としてのヒトにおける抗微生物耐性」（Ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ  ｏｕｔｓｉｄｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｕｌｔａｎｔ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｍｅｄｉａｃｅｎｔｒｅ／ｆａｃｔｓｈｅｅｔｓ／ｆｓ２６８／ｅｎ／のウエブサイトで利用可能なファクトシート番号２６８、０１／２００２を参照のこと）。
【０００５】
ヒト及び動物の治療に抗微生物剤として抗生物質を使用することの問題は、異なる国々の政府当局が、現存の抗生物質に対する病原性細菌の耐性の影響を最小限にする研究を促進するのみならず、とりわけ動物の成長を促進し、食肉生産の収量を向上させるために治療量以下で抗生物質を動物に使用することを低減する目的で、この耐性増加の危険性が増大することを国民に教育する活動も行うような強い姿勢を想定している。これらの政府主導の例は、（１）２００４年に英国で発表された報告書「包括的ＡＭＲ」（Ｏｖｅｒａｒｃｈｉｎｇ  ＡＭＲ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄａｒｄｎｉ．ｇｏｖ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｐｕｂｓ−ｄａｒｄ−ａｎｉｍａｌ−ｈｅａｌｔｈ／ｐｕｂｓ−ｖｅｔ−ｍｅｄｓ．ｈｔｍのウエブサイトで利用可能な「英国における選択されたヒト及び動物の病原体についての抗微生物薬の使用及び細菌耐性の概要：２００４年」（Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｕｓａｇｅ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＫ：２００４）を参照のこと）及び（２）チリ科学技術開発基金（Ｃｈｉｌｅａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｕｎｄ  ｆｏｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）から資金を得たＳａｎ  Ｍａｒｔｉｎ，Ｂ．らにより実施された研究（Ｓａｎ  Ｍａｒｔｉｎ，Ｂ．ら「チリのブタ及びトリから単離された指示菌を使用した抗微生物薬耐性の評価」（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｐｉｇｓ  ａｎｄ  Ｐｏｕｌｔｒｙ  ｉｎ  Ｃｈｉｌｅ）、Ｉｎｔｅｒｎ  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｒｅｓ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ，Ｖｏｌ．３、Ｎｏ．２、１７１〜１７８、２００５を参照のこと）である。
【０００６】
この目標を達成する最も有望な探求経路のうちの１つは、抗微生物剤として、及び動物、とりわけニワトリ及びブタにおける成長促進物質として有効である生物学的材料を使用することである。２００４年には、Ｄａｌ−Ｓｏｏのグループが、広範囲の抗微生物活性を有する新たな胞子形成細菌として分類された２つの菌株（ＳＤ１７及びＳＤ１８）を同定し（Ｄａｌ−Ｓｏｏ，Ｋ．ら「広範囲の抗微生物活性を有する新規パエニバチルス・エルギイ種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｌｇｉｉ  ｓｐ．  ｎｏｖ．，ｗｉｔｈ  ｂｒｏａｄ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５４、２０３１〜２０３５、２００４を参照のこと）、前記菌株は、エゴマ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）の根から単離された。後に、Ｄａｌ−Ｓｏｏ，Ｋ．らは、微生物により引き起こされる草の病気に対する広スペクトルの抗微生物活性を菌株ＳＤ１７において同定した（Ｄａｌ−Ｓｏｏ，Ｋ．ら「土壌伝播性芝生病に対する生物防除剤としてのパエニバチルス・エルギイＳＤ１７」（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｌｇｉｉ  ＳＤ１７  ａｓ  ａ  Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ  Ａｇｅｎｔ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｏｉｌ−ｂｏｒｎｅ  Ｔｕｒｆ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ．Ｊ．２１（４）：３２８〜３３３、２００５を参照のこと）。パエニバチルス・エルギイＳＤ１７の発酵ブロスにより調製された顆粒状製剤で実施した実験室試験は、市販の殺真菌薬と同様の効能を示したが、同じ製剤による野外試験は、市販の殺真菌薬よりも低い効能を示した。野外におけるこれらの結果にもかかわらず、著者らは、パエニバチルス・エルギイＳＤ１７から作製された顆粒状製剤が適切な生物防除剤であると考えた。
【０００７】
微生物により引き起こされる植物の病気を治療する抗微生物剤の探求も、ＷＯ０９０４５０２３に開示されている組成物をもたらし、この組成物は、（ａ）病原体の植物における成長を抑制する有益な微生物及び（ｂ）前記有益な微生物の栄養培地のための支持体としての、高吸収性ポリマーの使用に基づいている。文献ＷＯ０９０４５０２３の１３頁２行目には、パエニバチルス・エルギイＳＤ１７が有益な微生物の１つとして記述されている。
【０００８】
ＥＰ１７８８０７４は、パエニバチルス属に属する新たな菌株及びこれらの使用又は植物の病気を防除するためのこれらの新たな菌株の培養を記載する。これらの新たな菌株は、パエニバチルス属種ＢＳ−００４８、パエニバチルス属種ＢＳ−００７４、パエニバチルス・ポリミキサ（ｐｏｌｙｍｙｘａ）ＢＳ−０１０５及びパエニバチルス属種ＢＳ−０２７７である。この文献は、新たな菌株及び／又は発酵により産生された化合物（そのよう化合物はフサリシジン（Ｆｕｓａｒｉｃｉｄｉｎ）Ａ、フサリシジンＢと呼ばれる）、請求項３に定義されている化学式を有する化合物３及び化合４を使用する、粗発酵抽出物を含む製剤を記載する。
【０００９】
上記に記述された従来技術から分かるように、保護活性を有し、植物成長を促進する、パエニバチルス属種から得たタンパク質又はペプチドの単離についての記述がない。また、ヒトの消費のために屠殺されることが意図される動物において抗微生物活性及び／又は成長促進物質を有する、パエニバチルス属種から得られたタンパク質又はペプチドを得ることについての報告がない。そのようなタンパク質又はペプチドは、ヒトの微生物感染の治療に使用される抗生物質に対する病原性細菌の耐性の増加を低減する代替物の探求において重要な前進をもたらす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、抗微生物活性を有することが従来技術において記載されていない新たなリポペプチドを含む、抗微生物活性及び／又は成長促進物質を有するパエニバチルス属種抽出物を、ヒトの消費のために屠殺されることが意図される動物に提供することが目的である。より詳細には、本発明は、パエニバチルス属抽出物、好ましくはパエニバチルス・エルギイの発酵画分から得られた新たなペプチドであって、植物及び動物などの生物において抗微生物活性を有し、成長を促進するペプチドを提供する。本発明はまた、ヒトの消費が意図される動物の成長促進剤物質としての、並びにその治療及び予防における抗微生物剤としての抽出物の使用に関する。
【００１１】
第１の実施形態において、本発明は、示されている以下の化合物：
【化１】
2014513080.tif 000003
のうちの少なくとも１つを含む抽出物を得る方法であって、
発酵ブロスからパエニバチルス属を抽出する技術を実施するステップを含む方法を含む。
【００１２】
第２の実施形態において、本発明は、以下の化合物：
【化２】
2014513080.tif 000004
のうちの少なくとも１つを含むパエニバチルス属の抽出物を含む。
【００１３】
本発明の第３の実施形態は、下記に表されている、抗微生物活性及び／又は成長促進物質を有するリポペプチドに関する：
【化３】
2014513080.tif 000005
【００１４】
本発明の第４の実施形態は、（ｉ）治療有効量の以下の化合物：
【化４】
2014513080.tif 000006
のうちの少なくとも１つと、
（ｉｉ）場合により治療アジュバントと、（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体又は賦形剤と
を含む、動物の予防及び治療のための薬剤組成物に関する。
【００１５】
本発明の第５の実施形態は、（ｉ）治療有効量の、以下の化合物：
【化５】
2014513080.tif 000007
のうちの少なくとも１つを含むパエニバチルス属の培養抽出物と、
（ｉｉ）薬学的に許容される担体又は賦形剤と
を含む、動物の予防及び治療のための薬剤組成物に関する。
【００１６】
本発明の第６の実施形態は、（ｉ）農業有効量の以下の化合物：
【化６】
2014513080.tif 000008
のうちの少なくとも１つと、
（ｉｉ）農学的に許容される担体又は基剤と
を含む、植物の予防及び治療のための組成物に関する。
【００１７】
本発明の第７の実施形態は、ヒトの消費が意図される動物の成長促進物質としての、及びその治療又は予防のための抗微生物剤としての本発明のリポペプチドの使用に関する。
【００１８】
本発明の第８の実施形態は、植物における成長促進物質としての、及び植物病原体により引き起こされる感染の治療又は予防における、本発明のリポペプチドの使用に関する。
【００１９】
本発明の第９の実施形態は、以下の化合物：
【化７】
2014513080.tif 000009
のうちの少なくとも１つを含むパエニバチルス属培養の抽出物の使用であって、
動物又は植物における成長促進物質としての、及び感染を伴う状態の治療又は予防における使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】パエニバチルス・エルギイにより産生された粗抽出物のＦＴ−ＭＳスペクトルを示す図である。
【図２】ペルメチナ（Ｐｅｒｍｅｔｉｎａ）Ａの式を示す図である。
【図３】ペルメチナＡのｍ／ｚ１１０１．７のイオンのＣＩＤのスペクトルを示す図である。
【図４】ペルメチナＡの提案された切断を示す図である。
【図５】リポペプチドのａ）ＢＭＹ−２８１６０及びｂ）ペルメチナＡの構造式を示す図である。
【図６】ａ）ペルメチナＡ及びｂ）新規化合物１の構造式を示す図である。
【図７】新規化合物１のｍ／ｚ１０６７．７のイオンのＣＩＤのスペクトルを示す図である。
【図８】ａ）化合物１及びｂ）ペルメチナＡのフラグメンテーションパターンの比較研究を示す図である。
【図９】リポペプチドのａ）ＢＭＹ−２８１６０及びｂ）化合物２の分子式を示す図である。
【図１０】化合物２に対応するｍ／ｚ１０５３．７のイオンのＣＩＤのスペクトルを示す図である。
【図１１】リポペプチドのａ）ＢＭＹ−２８１６０及びｂ）化合物２のフラグメンテーションパターンの比較研究を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の理解をより明確及び完全にするため、本記載に使用される用語を以下に定義する。
−「抗微生物薬」−細菌、真菌、原生動物又は同様の生体などの微生物の増殖又は繁殖を抑制、防止又は破壊するパエニバチルス、好ましくはパエニバチルス・エルギイ、より好ましくはパエニバチルス・エルギイ・オウロフィネンシス由来の抽出物及びペプチドを意味する用語である。
−「成長促進物質」−植物には、葉面若しくは土壌散布により、又はヒト消費用の動物には、経口により（例えば、飼料若しくは水と混合して）若しくは非経口経路により投与されたとき、（ａ）植物では、根の垂直成長、葉の伸長、早期開花、果実の増加を介して、（ｂ）動物では、体重増加の増大、飼料効率の向上、動物が屠殺に理想的な体重に達するのに必要な時間の減少、官能特性の改善及び脂肪の減少、感染又は寄生虫病の予防、死亡率の減少を介して生産性を向上させ、パエニバチルス属由来の非栄養物質である。
−「治療有効量」−この用語は、本発明のペプチド若しくはパエニバチルス属抽出物に感受性のある微生物により引き起こされる感染の確立、増大若しくは蔓延を効果的に抑制若しくは予防するのに十分な抗微生物剤の量又は動物及び植物などの生物の成長及び発育を効果的に促進するのに十分な生体の成長促進剤の量を意味する。
−「植物病原体」−植物に損傷及び／又は病気を引き起こす可能性があり、真菌、原核動物（細菌及びマイコプラズマ）、線虫、原生動物及び同様の生体を含むあらゆる生物を意味する用語である。
−「補助療法」−微生物により引き起こされる感染と戦うため、すなわち、植物及び動物などの生物の成長過程において効果を増大させるため、活性成分の作用を補助若しくは増大させるか、又は活性成分の吸収、作用機構、代謝若しくは排出に影響を与える作用物質に対応する用語であり、追加的には、この用語は、本発明のペプチド又はパエニバチルス属抽出物により発生した免疫応答の上昇における予防活性を含む。
−「添加剤」−適用を促進するか、又はある種の問題を最小化する目的で、製剤の効率を向上させるため、又は活性成分の吸収などのある種の特性を修飾するため、植物の治療のために組成物に添加される物質を意味する用語である。
−「薬学的に許容されるビヒクル又は賦形剤」−治療又は予防活性のある薬剤組成物において、剤形に存在する濃度で薬理学的活性を有さず、安定性、生物学的利用能、許容性及び投与又は適用の容易さを確実にし、標的動物において抗微生物及び／又は成長促進活性を有する活性成分の担体として働く特徴を有する剤形を提供するために組成物に用いられるあらゆる物質を意味する用語である。
−「農学的に許容される担体又は基剤」−植物の治療用の組成物において治療又は予防作用を有さず、標的植物において抗微生物及び／又は成長促進作用を有する活性成分の担体として機能するあらゆる物質を意味する用語である。
【００２２】
本発明は、これらのパエニバチルス属の新たな作用物質の同定及び単離によって、生物において抗微生物及び成長促進活性を有する新たな作用物質を提供する。これらの作用物質の同定は、発酵ブロスの抽出物を得ること、並びに動物及び植物において抗微生物活性及び成長促進物質を有するペプチドの調製をもたらした。重要なことは、この調製により、前記抽出物及びペプチドを、とりわけ、経済的に重要な動物（例えば、ニワトリ及びブタ）の飼育に損失をもたらす細菌及び真菌を制御するために使用することができるという事実にある。この抗微生物活性に加えて、前記抽出物及びペプチドはまた、植物の成長促進物質として、及び植物病原体による植物感染の阻害剤として作用する。
【００２３】
先ず本発明は、細菌単離株抽出物に見出される新たなリポペプチドを得る、単離及び同定する方法に基づいている。これらの新たな細胞化合物は、家畜感染を引き起こす多数の細菌及び真菌に対して抗微生物活性を生じることができ、これらの菌株は現在の抗生物質に対して既に耐性がある。具体的には、本発明は、一つの実施形態において、家畜感染を制御し、動物の成長を促進するための、細菌単離株抽出物に見出される新たなリポペプチドを含む培養物の上清及び／又は抽出物の使用を提供する。
【００２４】
後で詳述されるように、新たな単離株の発酵ブロスの凍結乾燥試料の電気泳動及びクロマトグラフィー分析の後、分離過程は、分析される部分を提供し、抗微生物活性に関与する少なくとも２つのリポペプチドが同定された。この同定は、配列決定により実施され、この分析の結果は、タンパク質及びペプチドのデータベースに本発明のものと同様の配列がないことを実証し、抗微生物活性を有する新たなリポペプチドが単離されたことを示した。
【００２５】
本発明は、第１の実施形態において、動物及び植物に疾患又は障害を引き起こす微生物に関して抗微生物活性のうちの少なくとも１つの生物学的活性を有し、前記動物及び植物の成長促進の活性を有する新たな細菌抽出物を得る方法であって、前記新たな細菌抽出物が、下記に記載される新たな化合物の少なくとも１つを含むことを特徴とする方法に関する。
【化８】
2014513080.tif 000010
【００２６】
用語「化合物」及び「リポタンパク質」は、パエニバチルス属の抽出物、好ましくはパエニバチルス・エルギイの抽出物、より好ましくはパエニバチルス・エルギイ・オウロフィネンシスの抽出物に見出される新たな化学要素を指すように、本発明において交換可能に使用される。
【００２７】
用語「細菌抽出物」は、本記載において、パエニバチルス属、好ましくは発酵パエニバチルス属を処理して得られる抽出物を意味することが意図される。好ましい実施形態において、抽出のための発酵パエニバチルス属の処理は、例えばｎ−ブタノールなどであるがこれに限定されない有機溶媒を使用する液−液抽出又はイオン交換カートリッジによる抽出などの既知の方法により実施される。
【００２８】
本発明はまた、下記に記載される化合物１及び／又は２を有する特定のペプチドに関し、
【化９】
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両方とも、植物及び動物、特にニワトリ及びブタなどの動物において、抗微生物活性を有し、及び／又は成長を促進する。
【００２９】
本発明のリポペプチドは、既知の技術により産生し、実質的に純粋な形態で得ることができる。例えば、リポペプチドを、手作業により若しくは自動合成機により合成することができ、又はこれらを、細菌パエニバチルス属の発酵ブロスから単離することができる。
【００３０】
本発明はまた、ヒトの消費が意図される動物のうちの動物の治療及び予防のための薬剤組成物であって、（ｉ）治療有効量の本発明の化合物のうちの少なくとも１つと、（ｉｉ）薬学的に許容される担体又は賦形剤と、（ｉｉｉ）場合により治療アジュバントとを含む組成物に関する。上記に記述されたように、本発明のリポペプチドは、前記動物において抗微生物活性及び／又は成長促進活性を有する
【００３１】
本発明はまた、ヒトの消費が意図される動物の治療及び予防のための薬剤組成物であって、（ｉ）治療有効量の、本発明の化合物のうちの少なくとも１つを有するパエニバチルス属の培養抽出物と、（ｉｉ）薬学的に許容される担体又は賦形剤と、（ｉｉｉ）場合により治療アジュバントとを含む薬剤組成物に関する。前記抽出物は、発酵ブロスから分離された液相（上清）に対応する液体形態であってもよく、又は前記液相を乾燥した、例えば凍結乾燥した後の乾燥状態であってもよい。
【００３２】
本発明の薬剤組成物は、活性成分として本発明のリポペプチドのうちの少なくとも１つ又はその混合物を、薬学的に許容される担体又は希釈剤及び場合により１つ又は複数の治療アジュバントと組み合わせて含有する。したがって、本発明の活性成分を経口又は非経口投与用の任意の通常の剤形／家畜用形態で個別又は一緒に投与することができる。経口投与では、本発明の組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤の形態であり、固体形態は、即時放出、制御放出若しくは遅延放出又はこれらの種類の任意の組み合わせであり、前記形態を動物の水、又は動物の飼料に添加することができる。
【００３３】
錠剤形態は、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムなどの多様な賦形剤を、デンプン又は複合シリケートなどの崩壊剤と共に含有する。この剤形におけるポリビニルピロリドン、スクロース、ゼラチン及びアカシアなどの結合剤、追加的にステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びアカシアなどの滑沢剤の使用も慣用的である。
【００３４】
他の適切な固体の剤形／家畜用形態には、水分散性でありうるか、又は硬質カプセル若しくは軟質カプセルのゼラチンカプセルに封入されうる散剤が含まれる。この場合、賦形剤には、ラクトース又は多様な分子量のポリエチレングリコールが含まれる。
【００３５】
経口投与用の液体剤形の場合、甘味料、風味剤、染料、乳化剤又は懸濁向上剤及び希釈剤を、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン及びこれらの組み合わせなどの賦形剤に使用することができる。
【００３６】
本発明の活性成分を含有する医薬組成物は、通常、従来の方法に従って通常調製され、適切な剤形／家畜用形態で投与される。
【００３７】
例として、経口固体剤形／家畜用形態は、活性成分と共に、希釈剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤及び他を含有することができる。本発明の医薬／家畜用組成物に使用することができる希釈剤の例は、ラクトース、デキストロース、サッカロース、セルロース、トウモロコシデンプン又はジャガイモデンプンである。本発明の医薬／家畜用組成物に使用することができる滑沢剤の例は、シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム若しくはカルシウム及び／又はポリエチレングリコールである。本発明の医薬／家畜用組成物に使用することができる結合剤の例は、デンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルピロリドンである。本発明の医薬／家畜用組成物に使用することができる脱凝集剤の例は、デンプン、アルギン酸、アルギン酸デンプン若しくはナトリウム又はグリコール酸塩；発泡混合物；染料；甘味料である。加えて、本発明の医薬／家畜用組成物は、レクチン、ポリソルベート、ラウリルスルフェート及び医薬／家畜用製剤に慣用的に使用される一般に薬理学的に不活性で非毒性の物質などの湿潤剤を使用することができる。前記本発明の医薬／家畜用組成物の調製は、既知の方法により、例えば混合、造粒、錠剤への加圧成形、糖衣又は膜被覆方法により実施することができる。経口投与用の液体分散剤は、例えばシロップ剤、乳剤及び懸濁剤でありうる。本発明の活性成分に加えて、シロップ剤は、１つ若しくは複数の担体作用物質、例えばサッカロース又はサッカロースとグリセリン及び／若しくはマンニトール及び／若しくはソルビトールを含有することができる。懸濁剤及び乳剤は、担体として、例えば天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルアルコールを含有することができる。非経口投与では、滅菌の薬学的に許容される油を使用することが通常であり、プロピレングリコールを滅菌水溶液と共に用いることもできる。
【００３８】
本発明の薬剤組成物は、１つ又は複数の治療アジュバントを含有することもできる。そのようなアジュバントの例は、米国特許第５，７８５，９７５号に記載されているホスファチド多糖複合体；家畜用の乳剤に基づいたアジュバント、例えばＭＰＶ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手可能なＥｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）、Ｃａｒｂｉｇｅｎ（登録商標）、Ｐｏｌｙｇｅｎ（登録商標）；アクリルポリマー及びＵＳ２００９／００１７０６７に開示されているジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドなどのアジュバント；Ｎｏｖａｒｔｉｓ社から入手可能な商標名ＭＦ５９（商標）により知られているサブミクロン水中油スクアランエマルション、ポリオキシエチレン、モノオレイン酸ソルビタン及びトリオレイン酸ソルビタンであり、他の例も記述することができる。
【００３９】
加えて、本発明は、（ｉ）治療有効量の本発明のリポペプチドのうちの少なくとも１つと、（ｉｉ）農学的に許容される担体又は基剤と、（ｉｉｉ）場合により少なくとも１つの添加剤とを含む、植物の予防及び治療のための組成物にも関する。
【００４０】
本発明の別の実施形態において、植物の治療及び予防のための前記組成物は、（ｉ）農業有効量の、本発明のリポペプチドを含むパエニバチルス属の培養抽出物と、（ｉｉ）農学的に許容される担体又は基剤と、（ｉｉｉ）場合により少なくとも１つの添加剤とを含む。
【００４１】
本発明の製剤は、液体又は固体の形態、例えば水和剤の形態でありうる。乾燥又は液体の両方の製剤は、容器の中に、活性成分の完全性を保つ条件下で詰められる。液体製剤は短い保存寿命を有するが、乾燥製剤（例えば、水和剤）は、光及び水分のない冷所での保存などのあまり厳格ではない条件を必要とし、冷凍庫又は冷蔵庫に詰められるので、生成物を作物毎に保存することができる。
【００４２】
本発明の製剤は、一般に、植物に有害な微生物を制御し、及び／又は植物の成長を促進するために有効な量の活性成分を含有し、前記活性成分は、下記に記載される本発明のリポペプチド：
【化１０】
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又はその混合物を、固体又は液体、好ましくは固体の希釈剤形態の農学的に許容される担体と組み合わせて含む。使用することができる製剤には、散剤、粒剤、ペレット剤、懸濁剤、乳剤、水和剤、流動性固体などが含まれ、但し、そのような形態は活性成分の物理化学的特性と一致し、本発明のリポペプチド、散布様式、並びに土壌型、湿度及び温度などの環境要因と適合する。噴霧用の製剤を、とりわけ散布領域が大きな場合に使用することもできる。より濃縮された組成物も本発明の保護の範囲内であり、前記組成物は、散布される希釈最終生成物の中間体としての使用に適している。
【００４３】
本発明の製剤は、生成物の所望の特徴を得るために、典型的には、有効量の活性成分、１つ又は複数の希釈剤、１つ又は複数の界面活性剤及び他の適切な添加剤を含有する。更に、本発明に使用される活性成分を、高濃度の本発明の組成物が必要となる特別な用途に単独で使用することもできることは明らかなはずである。
【００４４】
発泡、集塊、腐食、不要な微生物の成長を低減する添加剤及び他の同様な作用物質などの微量で存在する他の処方剤を、本発明の組成物に添加することができる。本発明の製剤の別の本質的な特徴は、組成物における全ての成分が相互に適合し、本発明の活性成分の抗微生物及び／又は成長促進活性の特徴の損失に寄与しないことを確実にする必要性である。
【００４５】
本発明の組成物を、他の農薬、肥料、土壌調整剤、安定剤又は１つ若しくは複数の殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤若しくは他の生物学的に活性な化合物と混合して、多成分製剤を形成することもできる。本発明の製剤の活性成分として、混合することができる農業用の他の保護生成物の例は、殺虫型ナトリウムチャンネルアゴニスト（例えば、ピレスロイド）、ナトリウムチャンネル遮断剤（例えば、ピラゾリン）、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（例えば、有機リン酸塩及びカルバミン酸塩）、ニコチン性アセチルコリン結合剤、ＧＡＢＡ作動性結合剤、ピロール基のオクタピン（ｏｃｔａｐｉｎｅ）（例えば、ホルムアミジン）殺虫剤のアゴニスト又はアンタゴニスト及び他である。
【００４６】
下記に、パエニバチルス属抽出物に含まれる化合物の単離を例として表す。そのなかには、本発明の新規及び発明化合物が記載され、特徴決定されている。しかし、この例は、説明の目的のためだけに提示されていること、及び本明細書に開示されている実施形態に照らして多様な修正又は変更が当業者に示唆され、本開示の精神及び範囲内、並びに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解されるべきである。
【実施例】
【００４７】
ｎ−ブタノールで発酵させたパエニバチルス・エルギイの液−液抽出物から得た有機抽出物は、ペルメチナの部類に属する５つのリポペプチドの混合物を示す。これらのうち、ｍ／ｚ１０６７．７及び１０５３．７の化合物は未発表のものである。ｍ／ｚ１１０１．７のシグナルをペルメチナＡの存在に割り当て、ｍ／ｚ１０８７．７のシグナルを化合物ＢＭＹ−２８１６０の存在に割り当て、ｍ／ｚ１０７３．７のシグナルを化合物ペルギペプチン（Ｐｅｌｇｉｐｅｐｔｉｎ）Ａに割り当てた。これらの化合物は、スペクトロメーターＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳを使用する超分解（ｕｌｔｒａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）質量分析及び衝突誘起解離（ＣＩＤ）実験により特徴決定した。これらの２つの実験は、下記に詳述される、パエニバチルス・エルギイにより産生される有機抽出物に存在する全てのリポペプチドの提案された構造を確認する。
【００４８】
２．１．パエニバチルス・エルギイにより産生されるリポペプチドの構造特徴決定
ｎ−ブタノールで発酵させたパエニバチルス・エルギイの液−液抽出物から得た有機抽出物を、超音波分解質量分析により分析した。得られたスペクトルを図１に示す。
【００４９】
図１の質量スペクトルにおいて観察されたｍ／ｚのシグナルは、ペルメチナの部類に属するものとして特徴決定した。ペルメチナは、６炭素βヒドロキシ酸の脂質鎖に結合した９個のアミノ酸を含有するリポペプチドである。
【００５０】
ｍ／ｚ１１０１．７０２４のシグナルを、ペルメチナＡの存在に割り当てた（図２）。シグナルは、ΔＭＭ＝０．５ｐｐｍの変動で得て、これはペルメチナＡに提案された構造式と一致している。
【００５１】
ｍ／ｚ１１０１．７のシグナルは、フラグメンテーション及び構造特徴決定研究のために、連続質量分析実験（ＭＳ／ＭＳ）に付した。衝突誘起フラグメンテーション（ＩＣＤ）のスペクトルを図３に示す。
【００５２】
図３に示されるｍ／ｚ１１０１．７のイオンで得たＭＳ／ＭＳのスペクトルは、ペルメチナＡの特徴決定研究においてＷｕ及び同僚により得られたスペクトルと同一である。ペルメチナＡの存在を示す主なイオンフラグメントを、図４に示す。
【００５３】
リポペプチドＢＭＹ−２８１６０の存在に属したｍ／ｚ１０８７．６８６８のシグナルは、ペルメチナＡのリポペプチド類似体である。化合物ＢＭＹ−２８１６０において、２位のアミノ酸はバリン（Ｖａｌ）であり、図５に示されているように、この２位のアミノ酸がロイシン／イソロイシン（Ｌｅｕ／Ｉｌｅ）であるペルメチナＡと異なる。
【００５４】
ｍ／ｚ１０７３．６７３４、１０６７．７１９３及び１０５３．７０４２のシグナルも、図１に示されている質量スペクトルで観察された。Ｗｕ及び共同研究者２は、ｍ／ｚ１０７３．６７３４のシグナルを同定し、これを１４Ｄａの差異を有するＢＭＹ−２８１６０のリポペプチド類似体に割り当て、これをメチレン基（−ＣＨ２−）と指定した。
【００５５】
しかし、ｍ／ｚ１０６７．７１９３及び１０５３．７０４２のサイン（ｓｉｇｎ）がこの粗抽出物において最初に同定され、新規リポペプチドと考慮される。
【００５６】
ｍ／ｚ１０６７．７１９３のシグナルは、ペルメチナＡのリポペプチド類似体の存在に属した（図６）。シグナルは、ΔＭＭ＝０．５ｐｐｍの変動で得て、これは化合物１に提案された分子式と一致している。
【００５７】
ＭＳ／ＭＳの実験は、構造特徴決定及び化合物１に存在するアミノ酸の配列決定のために実施した。このＣＩＤ実験から得たスペクトルを図７に示す。
【００５８】
フラグメンテーションパターンに基づいて、化合物１のアミノ酸配列を、ペルメチナＡの４位のアミノ酸フェニルアラニン（Ｐｈｅ）が図６のアミノ酸ロイシン／イソロイシン（Ｌｅｕ／Ｉｌｅ）に代えられているペルメチナＡの類似体として、特徴決定した。
【００５９】
ペルメチナＡと化合物１のフラグメンテーションパターンの比較研究を図８に表す。
【００６０】
化合物１のＣＩＤスペクトル（図７）におけるｍ／ｚ３２７及び４４０のフラグメントイオンの形成は、２及び４位でのアミノ酸ロイシン／イソロイシンの存在を確認する。
【００６１】
粗抽出物の質量スペクトル（図１）で観察されたｍ／ｚ１０５３．７のシグナルを、第２の新規化合物に割り当てた。この化合物を、リポペプチドＢＭＹ−２８１６０のリポペプチド類似体であると特徴決定した。シグナルは、ΔＭＭ＝１．１ｐｐｍの変動で得て、これは化合物２に提案された分子式と一致している。
【００６２】
２つの化合物の構造の差は、図９に示されているように、リポペプチドＢＭＹ−２８１６０では４位のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり、新規化合物では４位のアミノ酸がロイシン／イソロイシン（Ｌｅｕ／Ｉｌｅ）であることである。
【００６３】
ｍ／ｚ１０５３．７のシグナルを、この新たな化合物のアミノ酸配列決定についての情報を得る目的でＣＩＤ実験に付した。得られたフラグメンテーションスペクトルを図１０に示す。
【００６４】
図１０のスペクトルにおいて観察されたｍ／ｚ２２７及び４２６のイオンのフラグメント、並びに図１１に示されたリポペプチドＢＭＹ−２８１６０と化合物２のフラグメンテーションパターンの比較研究は、図９で化合物２を表す構造の指定を確認する。
【００６５】
本明細書に記述されている全ての出版物及び特許出願は、本発明が関連する当業者のレベルを示している。全ての出版物及び特許出願は、それぞれ個別の出版物又はそれぞれの特許出願が明確に及び個別に参照として組み込まれるように示されるのと同じ程度に、参照として本明細書に組み込まれる。
【００６６】
前述の本発明は明確さ及び理解の目的のために例示及び実施例によりいくつかの詳細について記載されてきたが、ある種の変更及び修正を、この記載に添付されている特許請求の範囲内で実施できることが明らかである。
【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８ａ）】
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【図８ｂ）】
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【図１０】
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【図１１ａ）】
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【図１１ｂ）】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【国際調査報告】
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2014513080.tif 000038
2014513080.tif 000039
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