(57)【要約】  本開示は、イヌの癌細胞を含めた、癌細胞の同定および／または処置において有用な免疫原およびモノクローナル抗体に関する。１例において、キメラ抗イヌＣＤ２０抗体が提供される。これらの抗体は、イヌにおいてリンパ腫を処置するために治療的に使用できる。
2014532649.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌＣＤ２０に結合する結合剤であって、ＣＤ２０が、少なくとも１つのアミノ酸配列ＬＩＫＡＰＭＰＹＶ（配列番号１）またはＤＩＨＮＣＤ（配列番号２）、またはＮＩＴＩＳＨＦＦＫＭＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭＰＹＶＤＩＨＮＣＤＰＡＮＰＳＥＫＮＳＬＳＩＱＹＣＧＳＩ（配列番号５９）
を含む、結合剤。
【請求項２】
単離されたモノクローナル抗体である、請求項１に記載の結合剤。
【請求項３】
標的に対する結合について請求項２に記載のモノクローナル抗体と競合する結合剤であって、標的が、
ａ）アミノ酸配列ＬＩＫＡＰＭＰＹＶ（配列番号１）
を含むエピトープ；
ｂ）アミノ酸配列ＤＩＨＮＣＤ（配列番号２）
を含むエピトープ；
ｃ）アミノ酸配列
ＮＩＴＩＳＨＦＦＫＭＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭＰＹＶＤＩＨＮＣＤＰＡＮＰＳＥＫＮＳＬＳＩＱＹＣＧＳＩ（配列番号５９）を含むポリペプチド；ならびに
ｄ）ＬＩＫＡＰＭＰＹＶ（配列番号１）、ＤＩＨＮＣＤ（配列番号２）、および
ＮＩＴＩＳＨＦＦＫＭＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭＰＹＶＤＩＨＮＣＤＰＡＮＰＳＥＫＮＳＬＳＩＱＹＣＧＳＩ（配列番号５９）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むイヌＣＤ２０
からなる群より選択される、結合剤。
【請求項４】
請求項２に記載のモノクローナル抗体と実質的に同じＫｄで、アミノ酸配列
ＬＩＫＡＰＭＰＹＶ（配列番号１）、ＤＩＨＮＣＤ（配列番号２）、またはＮＩＴＩＳＨＦＦＫＭＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭＰＹＶＤＩＨＮＣＤＰＡＮＰＳＥＫＮＳＬＳＩＱＹＣＧＳＩ（配列番号５９）を含むエピトープに結合する、結合剤。
【請求項５】
モノクローナル抗体が、
【化１】
2014532649.tif 000028
からなる群より選択されるアミノ酸配列のうち少なくとも１つを含む、請求項２に記載の結合剤。
【請求項６】
ＤＹＧＭＬ（配列番号２０）、ＧＦＴＦＳＤＹ（配列番号２１）、ＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＲＶＫＧ（配列番号２２）、ＳＳＧＳＳＴ（配列番号２３）、ＧＴＦＡＹ（配列番号２４）、ＲＳＳＱＳＬＩＹＮＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号２５）、ＳＱＳＬＩＹＮＮＧＮＴＹ（配列番号２６）、ＲＳＳＱＳＬＩＹＮＫＧＮＴＹＬＨ（配列番号７０）、ＳＱＳＬＩＹＮＫＧＮＴＹ（配列番号７１）、ＲＳＳＱＳＬＩＹＮＮＫＮＴＹＬＨ（配列番号７２）、ＳＱＳＬＩＹＮＮＫＮＴＹ（配列番号７３）、ＲＳＳＱＳＬＩＹＮＮＱＮＴＹＬＨ（配列番号７４）、ＳＱＳＬＩＹＮＮＱＮＴＹ（配列番号７５）、ＲＳＳＱＳＬＩＹＮＮＡＮＴＹＬＨ（配列番号７６）、ＳＱＳＬＩＹＮＮＡＮＴＹ（配列番号７７）、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号２７）、ＫＶＳ（配列番号２８）、ＳＱＳＴＨＶＰＦＴ（配列番号２９）、ＳＴＨＶＰＦ（配列番号３０）、ＤＤＹＭＨ（配列番号３１）、ＧＦＮＩＫＤＤ（配列番号３２）、ＷＩＤＰＥＮＧＨＴＫＹＡＳＫＦＱＧ（配列番号３３）、ＤＰＥＮＧＨ（配列番号３４）、ＬＲＨＹＹＧＳＳＹＶＳＰＨＹＹ（配列番号３５）、ＬＲＨＹＹＧＳＳＹＶＳＰＨＹＹ（配列番号３６）、ＫＡＳＱＮＶＧＰＮＶＡ（配列番号３７）、ＳＱＮＶＧＰＮ（配列番号３８）、ＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号３９）、ＳＡＳ（配列番号４０）、ＱＱＹＮＮＹＰＹＴ（配列番号４１）、ＹＮＮＹＰＹ（配列番号４２）、ＤＹＹＭＮ（配列番号４３）、ＧＹＴＦＴＤＹ（配列番号４４）、ＤＩＮＰＮＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号４５）、ＮＰＮＮＧＤ（配列番号４６）、ＧＧＶＬＲＹＰＹＹＹＶＭＤＹ（配列番号４７）、ＧＧＶＬＲＹＰＹＹＹＶＭＤＹ（配列番号４８）  ＲＳＮＫＳＬＬＨＲＮＧＮＴＹＬＹ（配列番号４９）、ＮＫＳＬＬＨＲＮＧＮＴＹ（配列番号５０）、ＲＭＳＮＬＡＳ（配列番号５１）、ＲＭＳ（配列番号５２）、ＭＱＨＬＥＦＰＦＴ（配列番号５３）、およびＨＬＥＦＰＦ（配列番号５４）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の結合剤。
【請求項７】
任意のヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＡ１、ヒトＩｇＡ２、ヒトＩｇＤ、ヒトＩｇＥ、イヌ抗体、イヌＩｇＧＡ、イヌＩｇＧＢ、イヌＩｇＧＣ、イヌＩｇＧＤ、イヌＩｇＡ、イヌＩｇＤ、イヌＩｇＥ、イヌＩｇＭ、ニワトリ抗体、ニワトリＩｇＡ、ニワトリＩｇＤ、ニワトリＩｇＥ、ニワトリＩｇＧ、ニワトリＩｇＭ、ニワトリＩｇＹ、ヤギ抗体、ヤギＩｇＧ、マウス抗体、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＡ、マウスＩｇＤ、マウスＩｇＥ、マウスＩｇＭ、ブタ抗体、ブタＩｇＧ、ラット抗体、ラットＩｇＧおよびネコ抗体、ネコＩｇＧに由来する抗体である、請求項１から６のいずれか一項に記載の結合剤。
【請求項８】
イヌ抗体である、請求項７に記載の結合剤。
【請求項９】
イヌ抗体が、ＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣおよびＩｇＤからなる群より選択されるアイソタイプを有する、請求項８に記載の結合剤。
【請求項１０】
イヌ抗体がＩｇＧＢアイソタイプを有する、請求項９に記載の結合剤。
【請求項１１】
アミノ酸配列：
【化２】
2014532649.tif 000029
2014532649.tif 000030
のうち少なくとも１つを含む、請求項１０に記載の結合剤。
【請求項１２】
ｉ）Ｎ３３およびＧ３４の一方または両方においてアミノ酸置換を含む配列番号３；
ｉｉ）Ｎ３３およびＧ３４の一方または両方においてアミノ酸置換を含む配列番号９；
ｉｉｉ）Ｎ５５およびＧ５６の一方または両方においてアミノ酸置換を含む配列番号１１；
ｉｖ）Ｎ５５およびＧ５６の一方または両方においてアミノ酸置換を含む配列番号１５；および
ｖ）Ｎ１０３、Ｎ１８３、Ｎ２７０、Ｇ１０４、Ｇ１８４およびＧ２７１のうち１つ以上においてアミノ酸置換を含む配列番号５７、
のうち１つを含む結合剤であって、
置換するために使用されるアミノ酸が、アラニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アルギニン、スレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンである、結合剤。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の結合剤の誘導体。
【請求項１４】
Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’単鎖抗体、Ｆｖ、単鎖、単一特異性抗体、二特異性抗体、トリマー抗体、多特異性抗体、多価抗体、キメラ抗体、イヌ−ヒトキメラ抗体、イヌ−マウスキメラ抗体、イヌＦｃを含む抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、イヌ化抗体、ＣＤＲ移植抗体、サメ抗体、ナノボディ、ラクダ科動物抗体および脱フコシル化抗体からなる群より選択される、請求項１３に記載の誘導体。
【請求項１５】
イヌ化抗体である、請求項１４に記載の誘導体。
【請求項１６】
イヌ動物においてリンパ腫細胞を検出するための方法であって、試験生物学試料を、請求項１から１５のいずれか一項に記載の結合剤または誘導体と接触させる工程、および生物学試料またはその構成成分に結合した結合剤を検出する工程、を含む、方法。
【請求項１７】
イヌ動物においてリンパ腫を処置するための方法であって、請求項１から１５のいずれか一項に記載の結合剤または誘導体の少なくとも１回の有効用量を、動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項１８】
複数回の用量が動物に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
モノクローナル抗体が、約１から５０ｍｇ／ｋｇの投薬量で投与される、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
結合剤または誘導体が、１種以上の化学療法剤と併せて投与される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、特にイヌにおいて、免疫原を含む癌細胞の同定もしくは単離のため、またはこれらの癌細胞を含む癌の処置もしくは予防のための、免疫原、およびモノクローナル抗体など、これらの免疫原に結合する結合剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体などの結合剤は、癌などの疾患の診断および処置において有用である。例えばイヌでは、癌の１つの型は、制御されないＢ細胞増殖が病気および死をもたらし得る、Ｂ細胞リンパ腫である。リンパ腫はヒトにおいても発症し、例えばリツキシマブなどの抗ヒトＣＤ２０抗体で処置することができる。ヒトＣＤ２０と反応するまたは結合するこれらの抗体は、一般にはイヌＣＤ２０には結合しない（Ｊｕｂａｌａら、Ｖｅｔ  Ｐａｔｈｏｌ．、７月；４２巻（４号）：４６８−７６頁、２００５年；Ｉｍｐｅｌｌｉｚｅｒｉら、Ｖｅｔ  Ｊ．、５月；１７１巻（３号）：５５６−８頁、２００６年；Ｇｒａｖａｎｉｓら、Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ、１２月；１５巻：１３３５−１３４３頁、２０１０年）。従って、イヌＢ細胞の表面上のＣＤ２０と相互作用することが可能な結合剤が望まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｊｕｂａｌａら、Ｖｅｔ  Ｐａｔｈｏｌ．、７月；４２巻（４号）：４６８−７６頁、２００５年
【非特許文献２】Ｉｍｐｅｌｌｉｚｅｒｉら、Ｖｅｔ  Ｊ．、５月；１７１巻（３号）：５５６−８頁、２００６年
【非特許文献３】Ｇｒａｖａｎｉｓら、Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ、１２月；１５巻：１３３５−１３４３頁、２０１０年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本明細書に記載される技術は、以下に示すように、これらの試薬および治療剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
特定の実施形態において、本開示は、イヌの疾患状態（例えば、リンパ腫）を予防および／または処置するための試薬および方法に関する。例えば、イヌの血液および／またはＢ細胞リンパ腫細胞の組織を枯渇させるために標的化され得るイヌＣＤ２０のエピトープが同定されている。これらの疾患を予防および／または処置する際の使用に適した、免疫応答（例えば、抗体の産生）を誘導および／または増強するために使用することができる免疫原が、本明細書に記載されるように同定されている。これらの免疫原をコードする核酸およびポリペプチド／ペプチド免疫原自体、ならびにこれらを生成する方法もまた記載されている。特定の実施形態において、これらの免疫原は、ＬＩＫＡＰＭＰＹＶ（配列番号１）および／またはＤＩＨＮＣＤ（配列番号２）などの、目的の特定のエピトープである、またはかかるエピトープを含む。これらの免疫原は、例えばイヌＣＤ２０に対する免疫応答を誘導ならびに／または増強するために、単独でならびに／または他の免疫原および／もしくは「骨格」（例えば、イヌＦｃ）と共に使用され得る。
【０００６】
特定の実施形態において、本開示は、イヌＣＤ２０を発現している細胞もしくはこれらの結合剤と反応する細胞表面タンパク質を含む細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｂリンパ腫細胞、イヌＣＤ２０）の単離および／もしくは同定において、ならびに／または哺乳動物（例えば、イヌ）における癌の処置および予防において有用な結合剤を提供する。特定の実施形態において、この結合剤は、細胞表面に発現されたイヌＣＤ２０に対して反応性の抗体であり得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の結合剤（例えば、モノクローナル抗体などの抗体）は、アミノ酸配列またはエピトープ（複数可）、ＬＩＫＡＰＭＰＹＶ（配列番号１）および／もしくはＤＩＨＮＣＤ（配列番号２）を含むその領域においてイヌＣＤ２０と結合するまたは反応する。
【０００７】
他の実施形態において、これらの結合剤を使用してイヌ細胞を検出する方法が提供される。特定の実施形態において、動物（例えば、イヌ）におけるその細胞表面上にＣＤ２０を発現している細胞（例えば、Ｂ細胞リンパ腫）は、これらの細胞を含む試験生物学試料を結合剤と接触させること、および生物学試料またはその構成成分（例えば、リンパ腫細胞）に結合した結合剤を検出することによって、同定および／または単離され得る。特定の実施形態において、この方法は、試験生物学試料における結合の量を、対照生物学試料における結合の量と比較することを含んでいてもよく、対照生物学試料と比較して試験生物学試料に対する結合の増加は、この試験生物学試料中の１つ以上のリンパ腫細胞の存在を示し得る。いくつかの実施形態において、この生物学試料は、イヌの血液または針吸引物である。これらの方法は、インビボおよび／またはインビトロの形式でも提供される。
【０００８】
いくつかの実施形態において、かかる結合剤を使用して、イヌＣＤ２０を発現している細胞を排除する方法もまた提供される。動物（例えば、イヌ）における１つ以上の疾患状態（例えば、リンパ腫）を、結合剤またはその誘導体の少なくとも１回以上の有効用量をこの動物に投与することによって処置する方法もまた、提供される。結合剤がモノクローナル抗体であるいくつかの実施形態において、このモノクローナル抗体は、約１から約５０ｍｇ／動物体重ｋｇ、約１から約３０ｍｇ／ｋｇまたは約５から約３０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１０ｍｇ／ｋｇ）の投薬量で投与され得る。これらの結合剤は、ある期間の時間にわたって１回より多く投与されてもよい。いくつかの実施形態において、この結合剤は、１種以上の他の薬剤（例えば、化学療法剤）と併せて投与されてもよい。
【０００９】
結合剤と反応性のポリペプチドおよび／または細胞を同定または検出するために結合剤を使用するためのキット、ならびに／または疾患（例えば、イヌリンパ腫）を予防および／もしくは処置するためにかかる結合剤を使用するためのキットもまた、提供される。このキットは、例えば、場合によって使用のための指示書と共に、任意の形態で（例えば、溶液中で、凍結乾燥されて）結合剤またはその誘導体を含んでいてもよい。他の実施形態は、本明細書中に提供される説明から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】イヌＢ細胞リンパ腫細胞に対するモノクローナル抗体の結合のＦＡＣＳ親和性分析を示す図である。
【図２】Ａ:ＣＤ２０のイヌおよびヒト細胞外ドメインと、ヒト／イヌハイブリッドバリアントＶ１−Ｖ４とのアラインメントを示す図である。Ｂ:イヌＣＤ２０  ＥＣＤ２およびＶ１−Ｖ４に対するハイブリドーマ抗体１Ｅ４、１Ｇ１および１Ｇ１０のＥＬＩＳＡ結合分析を示す図である。
【図３】イヌ末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に対するハイブリドーマ抗体１Ｅ４の結合のＦＡＣＳ分析を示す図である。
【図４】Ａ:ＣＨＯ細胞から発現された精製されたキメラ抗イヌＣＤ２０抗体１Ｅ４−ｃＩｇＧＢのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。Ｂ:精製された１Ｅ４−ｃＩｇＧＢのサイズ排除クロマトグラフィー分析を示す図である。
【図５】未改変（ＷＴ）１Ｅ４−ｃＩｇＧＢ抗体および１Ｅ４−ｃＩｇＧＢのＶＬ内のＮＧ配列に対する示されたアミノ酸置換を有する抗体の漸増濃度の、ＣＤ２０  ＥＣＤ２ペプチドに対する結合のＥＬＩＳＡ分析を示す図である。
【図６】例示的抗体１Ｅ４−ｃＩｇＧＢを使用したイヌＢ細胞の用量依存的インビボ枯渇を示す図である。リツキサン−ｃＩｇＧＢを陰性（アイソタイプ）対照として含めた。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
結合剤
本開示は、インビトロおよび／またはインビボで細胞の表面上のイヌＣＤ２０に結合する結合剤に関する。これらの結合剤は、単離されたイヌＣＤ２０ポリペプチドならびに／またはその断片および／もしくは誘導体にも結合し得る。イヌＣＤ２０を発現している細胞の存在に関連する１つ以上の疾患を診断、処置および／または予防するための方法もまた提供される。例えば、これらの結合剤は、エピトープ配列番号１および／または２と反応し得るおよび／または結合し得る抗体（例えば、モノクローナル抗体）であり得る。これらのモノクローナル抗体は、例えば表１および４−５に示されるアミノ酸配列（ならびに／または１つ以上のそれらの断片および／もしくは誘導体）のうち任意の１つ以上を含んでいてもよく、これらの表に示されるヌクレオチド配列のうち任意の１つ以上（ならびに／または１つ以上のそれらの断片および／もしくは誘導体）によってコードされ得る。本開示は、動物（例えば、イヌ）における癌の予防および／または処置のための阻害（例えば、細胞傷害性）のためにイヌＣＤ２０を発現している細胞（例えば、イヌＢ細胞リンパ腫細胞）を単離、同定および／または標的化するためのこれらのモノクローナル抗体の使用もまた提供する。特定の実施形態において、これらのモノクローナル抗体は、細胞の表面上に発現されたイヌＣＤ２０に対して反応性であり得る。
【００１２】
結合剤は一般に、標的と相互作用するまたは標的と特異的に結合する。例えば、本明細書に開示される結合剤は一般に、標的としてイヌＣＤ２０の領域と特異的に相互作用する。ＣＤ２０に対して「特異的に」結合するとは、ＣＤ２０に対する結合の量が、非ＣＤ２０標的に対する結合の量よりも多い（即ち、背景の非特異的結合が存在し得る。）ことを意味する。一般に、タンパク質に対する結合剤の特異的結合は、例えば、タンパク質標的内のアミノ酸の特定の配列に対する結合によって達成され得る。これらの配列は、エピトープと呼ばれ得る。エピトープを含む分子は、抗体などの結合剤を刺激するために使用され得、免疫原と呼ばれ得る。これらの結合剤はまた、エピトープの一部として、特異的な２次元構造および／または３次元構造を認識し得る。１例において、本明細書に開示されるモノクローナル抗体は、ＬＩＫＡＰＭＰＹＶ（配列番号１）および／またはＤＩＨＮＣＤ（配列番号２）などの、イヌＣＤ２０のエピトープに結合し得る。
【００１３】
その標的との結合剤の特異的な相互作用または結合は、平衡反応の１つの型であると考えられる。１例において、特異的結合は定量することができる。この定量は、解離定数即ちＫｄを使用し得る。Ｋｄは、この場合、抗体が結合した抗原またはエピトープからこの抗体が分離する傾向を記述する平衡定数の１つの型であることが当該分野で公知である。従って、Ｋｄは、抗体が有するエピトープに対する親和性を記述する。Ｋｄが低くなるほど、その標的に対する結合剤の親和性は高くなる。
【００１４】
特定の実施形態において、この結合剤は、本明細書に記載されるように、１Ｅ４、１Ｇ１０および１Ｇ１からなる群より選択されるモノクローナル抗体である。このモノクローナル抗体は、配列番号３、６、９、１１、１３および／もしくは１５（例えば、表１中など）のうち任意の１つ以上ならびに／または任意の１つ以上のそれらの断片および／もしくは誘導体のアミノ酸配列を含み得る。これらの抗体は、表４に示されるＣＤＲ配列のいずれかを含んでいてもよい。この抗体（例えば、モノクローナル抗体）はまた、任意の適切なアイソタイプまたはアイソタイプサブクラスのものであり得る。特定の実施形態において、この抗体は、Ｔａｎｇら、Ｖｅｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．、８月；８０巻（３−４号）：２５９−７０頁、２００１年に記載されているように、例えばＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ（例えば、配列番号５５もしくは５７；表５）、ＩｇＧＣおよび／またはＩｇＤの、イヌＩｇＧサブクラスを有する。
【００１５】
この結合剤はまた、抗体の（例えば、モノクローナル抗体１Ｅ４、１Ｇ１０および／または１Ｇ１の）誘導体、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’単鎖抗体、Ｆｖ、単鎖、単一特異性抗体、二特異性抗体、三特異性抗体、多価抗体、キメラ抗体、イヌ−ヒトキメラ抗体、イヌ−マウスキメラ抗体、イヌＦｃを含む抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、イヌ化、ＣＤＲ移植抗体、サメ抗体、ナノボディ（例えば、単一モノマー性可変ドメインからなる抗体）、ラクダ科動物抗体（例えば、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）由来）ミクロボディ、イントラボディ（例えば、細胞内抗体）および／または脱フコシル化抗体ならびに／またはそれらの誘導体などであり得る。結合剤および／もしくは抗体の模倣物もまた提供される。この結合剤は、それに固定的に付着された検出可能な標識および／またはエフェクター部分もまた含み得る。
【００１６】
適切な結合剤をコードする単離されたポリヌクレオチドもまた提供される。これらのポリヌクレオチドは、例えば、配列番号４、５、７、８、１０、１２、１４および／もしくは１６（例えば、表１）のうち任意の１つ以上ならびに／または任意の１つ以上のそれらの断片および／または誘導体を含み得る。特定の実施形態において、これらのポリヌクレオチドを含むならびに／またはこれらのポリペプチドをコードするおよび／もしくはこれらのポリペプチド発現する発現ベクターならびに／または宿主細胞もまた提供される。
【００１７】
これらの結合剤、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクターおよび／または宿主細胞を含む組成物もまた、いくつかの実施形態において提供される。特定の実施形態において、これらの組成物は、医薬として許容される担体を含む。
【００１８】
特異的なエピトープ（単数または複数）に結合する本明細書に開示されるモノクローナル抗体（この例について「Ａ」抗体と称する。）は、同一であるもしくは類似であるエピトープを認識するまたは「Ａ」抗体によって認識されるエピトープと近接するエピトープ（例えば、重複しているエピトープ）を認識する他の抗体（この例について「Ｂ」抗体と称する。）と、結合について競合し得る。競合とは、抗体のうち１つが他の抗体を犠牲にして結合すること、または他の抗体の結合を少なくともある程度まで阻害することを意味する。例えば、「Ｂ」抗体の結合を減少させるまたは防止する「Ａ」抗体は、結合について「Ｂ」と競合すると言われる。これらの「Ｂ」抗体もまた、本明細書に開示される発明の一部である抗体の例である。それらのエピトープに対する結合についての「Ａ」抗体と「Ｂ」抗体との間の競合は、いわゆる競合実験を使用して測定することができる。一般に、競合実験において、比較される結合剤は、これらの結合剤が結合することが可能なまたは結合すると疑われる標的に添加される／かかる標的と近接して配置される。実験は、標的に対する個々の結合剤の結合を定量することが可能となるように設計される。競合は、例えば、少なくとも１つの「Ａ」抗体の添加が、「Ａ」抗体が存在しない場合よりもより低い程度までの「Ｂ」抗体の結合を生じる場合に、見出される。１例において、結合剤「Ａ」は、その標的に対する結合について結合剤「Ｂ」と競合する。「Ｂ」もまた「Ａ」と競合し得る。「Ａ」抗体および「Ｂ」抗体は、実質的に類似のＫｄを有していても有していなくてもよい。
【００１９】
結合剤が抗体である場合、この結合剤は、その可変および／または相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と対応するヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を参照して同定され得る。例えば、モノクローナル抗体１Ｅ４、１Ｇ１０もしくは１Ｇ１である、モノクローナル抗体１Ｅ４、１Ｇ１０もしくは１Ｇ１に由来する、またはモノクローナル抗体１Ｅ４、１Ｇ１０もしくは１Ｇ１と関連する例示的な結合剤は、各々が１つ以上の定常領域および／または可変領域を含む重鎖および／または軽鎖を含み得る。可変領域は典型的に、抗体の結合特異性を大きく決定する１つ以上のＣＤＲを含む。これらのモノクローナル抗体は、可変領域をコードするヌクレオチド配列の分析によって同定することができる。モノクローナル抗体は、可変領域のアミノ酸配列（例えば、ヌクレオチド配列によってコードされ得るもの）の分析によっても同定することができる。例えば、１Ｅ４、１Ｇ１０および１Ｇ１の軽鎖および重鎖可変領域の例示的なアミノ酸配列、ならびにこれらをコードする例示的なヌクレオチド配列は、以下に示される：
【００２０】
【表１】
2014532649.tif 000003
2014532649.tif 000004
2014532649.tif 000005
表１に示されるアミノ酸（ならびに／または任意の１つ以上のそれらの断片および／もしくは誘導体）のいずれかは、当業者によって望まれるように、任意の他のアミノ酸によって置換されていてもよい。例えば、当業者は、特定のアミノ酸を以下の表７に示されるように他のアミノ酸で置き換えることによって、保存的置換を行うことができる。置換され得る例示的なアミノ酸には、例えば、以下の表７に示される保存的置換が含まれるがこれらに限定されない任意の他のアミノ酸で置換され得る、配列番号９（１Ｇ１０軽鎖可変領域）の残基２６、２８、３３および／もしくは３４；配列番号１１（１Ｇ１０重鎖可変領域）の残基５５および／もしくは５６；ならびに／または配列番号１５（１Ｇ１重鎖可変領域）の残基５２、５３、５５および／もしくは５６が含まれ得る。保存的アミノ酸置換をコードするヌクレオチド配列は、表６に示される遺伝子コードを使用して設計することができる。かかる置換されたアミノ酸配列の例には、例えば以下が含まれる：
【００２１】
【化１】
2014532649.tif 000006
（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）（配列番号９によって示される１Ｇ１０軽鎖可変領域の改変）；
【００２２】
【化２】
2014532649.tif 000007
（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）（配列番号１１によって示される１Ｇ１０重鎖可変領域の改変；および
【００２３】
【化３】
2014532649.tif 000008
（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）（配列番号１５によって示される１Ｇ１重鎖可変領域の改変。
【００２４】
表１に示されるアミノ酸配列のうちいずれか、ならびに／またはそれらの任意の断片および／もしくは誘導体はまた、標準的な技術を使用して、任意の順序および／もしくは組み合わせで任意の他の可変領域および／もしくはＣＤＲと組み合わされてハイブリッドおよび／もしくは融合結合剤を形成し得、ならびに／または他の重鎖および／もしくは軽鎖可変領域中に挿入され得る。これらは、任意の定常領域（例えば、表５中など）と併せて使用され得る。
【００２５】
ＣＤＲ（相補性決定領域）は、特異的標的に対する抗体の結合を少なくとも一部担う、抗体由来のアミノ酸配列である。ＣＤＲは、いくつかの技術および／またはスキームのいずれかを使用して同定することができることが、当業者に理解される。本明細書に示される結合剤のＣＤＲは、これらの技術のいずれかを使用して同定することができる。例えば、当業者は、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム、強化Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームおよび／または任意の利用可能なＣＤＲ定義スキーム（例えば、ＡｂＭ、接触定義および／またはＭａｃＣｕｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、．２６２巻（５号）：７３２−７４５頁、１９９６年に記載されるとおり）を使用してＣＤＲを同定できる。例えば、Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２（１９９１年）およびＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、「Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３巻：９２７−９４８頁、１９９７年に一部基づく種々のスキームの概要が、以下の表２に提供される：
【００２６】
【表２】
2014532649.tif 000009
ＣＤＲは、以下の表３に示されるものなどの規則のセットに従って同定することもできる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／＃ｃｄｒｉｄにおいて記載されるとおり）：
【００２７】
【表３】
2014532649.tif 000010
ＣＤＲを同定するためのこれらのシステムは例示に過ぎず、当業者に理解されるように、他のシステムも適切であり得る。こうして同定されたＣＤＲは、適切な結合剤を同定するために使用され得る。例えば、モノクローナル抗体１Ｅ４、１Ｇ１０および／または１Ｇ１のうち１つ以上の等価物は、これらのアミノ酸配列を含む結合剤であり得る。かかるＣＤＲもまた、標準的な技術を使用して、任意の順序および／もしくは組み合わせで互いに組み合わされてハイブリッドおよび／もしくは融合結合剤を形成し得、ならびに／または他の重鎖および／もしくは軽鎖可変領域中に挿入され得る。表１に示されるアミノ酸配列、ならびに／または任意の１つ以上のそれらの断片および／もしくは誘導体は、いくつかの核酸配列のうちいずれかによってコードされ得る。これらの核酸配列は、適切な結合剤を同定および／または調製（例えば、核酸分子として）するためにも使用することができる。例えば、当業者は、本明細書の表１−７のうち任意の１つ以上を参照して、任意のかかるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を考案することができる。１Ｅ４、１Ｇ１０および１Ｇ１の軽鎖可変領域をコードする例示的なヌクレオチド配列は、表１に示されるものであってよい。表１に示されるヌクレオチド配列のいずれか、ならびに／またはそれらの断片および／もしくは誘導体は、ハイブリッドおよび／もしくは融合結合剤をコードするために、任意の順序および／もしくは組み合わせで互いに組み合わされ得、ならびに／または軽鎖および／もしくは重鎖可変領域（ならびに／またはそれらの断片および／もしくは誘導体）をコードする他の核酸配列中に挿入され得る。例示的な断片は、例えば、表１に示されるアミノ酸配列のいずれか、ならびに／またはそれらの任意の断片および／もしくは誘導体（例えば、それらの１つ以上のＣＤＲ）をコードする任意の核酸配列であり得る。モノクローナル抗体１Ｅ４、１Ｇ１０および１Ｇ１の推定ＣＤＲは表４に列挙される。これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２（１９９１年）およびＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、「Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３巻：９２７−９４８頁、１９９７年に示されるスキームを使用して同定した。
【００２８】
【表４】
2014532649.tif 000011
2014532649.tif 000012
いくつかの実施形態において、この結合剤は、上記表４に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。表４に示されるＣＤＲのこれらの組み合わせおよび／または他の組み合わせのサブグループもまた、当業者に理解されるように、適切であり得る。１例において、上記ＣＤＲの種々の組み合わせが、イヌ化抗体を提供するために使用され得る。
【００２９】
表１に示されるアミノ酸配列（ならびに／またはそれらの断片および／もしくは誘導体）および／または表１に示されるヌクレオチド配列（ならびに／またはそれらの断片および／もしくは誘導体）が含まれるがこれらに限定されない本明細書に記載される可変領域配列（これらは、それらの断片および／または誘導体を含み得る。）は、抗体分子の１つ以上の定常鎖（ならびに／またはそれらの断片および／もしくは誘導体）をコードする１つ以上のアミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列と組み合わせて使用され得る。例えば、表１に示される可変領域アミノ酸配列は、その可変領域アミノ酸配列が誘導された種と同一であるまたは異なる種（例えば、ヒト、ヤギ、ラット、ヒツジ、ニワトリ）の任意の抗体分子の定常領域に連結され得る。
【００３０】
アスパラギン酸またはイソアスパラギン酸へのアスパラギン残基の脱アミド化は、タンパク質に対する一般的な翻訳後修飾である。脱アミド化は、アスパラギンがアスパラギン−グリシンジペプチド（Ａｓｐ−ＧｌｙまたはＮ−Ｇ；「ＮＧ」配列）の一部である場合により高い頻度で発生し得る。脱アミド化は、タンパク質に対して有害な影響を有し得る。１例において、脱アミド化は、タンパク質の３次元構造における変化を潜在的に引き起こし得る。別の例において、抗体について、抗原に対する結合に影響を与える領域（例えば、可変領域および／またはＣＤＲ）における脱アミド化は、抗原に対する抗体結合の低下または喪失を潜在的に引き起こし得る。
【００３１】
従って、翻訳後脱アミド化に対して潜在的に感受性のアミノ酸残基を、あまり感受性でないまたは感受性でないアミノ酸残基で置換することは、有益であり得る。１例において、配列番号３（１Ｅ４の軽鎖可変領域（ＶＬ））のアスパラギン３３（Ｎ３３）および／またはグリシン３４（Ｇ３４）は、ＮＧ配列を改変するために置換され得る（例えば、配列番号７１、７３、７５および７７を参照のこと。）。Ｎ３３およびＧ３４（ＮＧ配列）に下線を付した配列番号３が以下に示される：
【００３２】
【化４】
2014532649.tif 000013
Ｎ３３および／またはＧ３４は、例えば、任意の組み合わせで、アラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）および／またはチロシン（Ｙ）などの任意のアミノ酸によって置換され得る。いくつかの実施形態において、Ｎ３３は、例えば、アラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）またはチロシン（Ｙ）によって置換され得る。いくつかの実施形態において、Ｇ３４は、例えば、任意の組み合わせで、アラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）またはチロシン（Ｙ）によって置換され得る。
【００３３】
１実施形態において、Ｎ３３（例えば配列番号９の）は、リジン（Ｋ）によって置換され得る（Ｎ３３Ｋ置換）。特定の実施形態において、Ｇ３４（例えば配列番号９の）は、リジン（Ｋ）（Ｇ３４Ｋ）、グルタミン（Ｑ）（Ｇ３４Ｑ）またはアラニン（Ａ）（Ｇ３４Ａ）によって置換され得る。いくつかの実施形態において、これらの置換は、Ｎ３３Ｋ、およびＧ３４Ｋ、Ｇ３４ＱまたはＧ３４Ａのうちいずれかを含み得る。当業者に理解されるように、他の置換もまた適切であり得る。
【００３４】
他の実施形態において、配列番号９（１Ｇ１０の軽鎖可変領域（ＶＬ））のアスパラギン３３（Ｎ３３）および／またはグリシン３４（Ｇ３４）、配列番号１１（１Ｇ１０の重鎖可変領域（ＶＨ））のアスパラギン５５（Ｎ５５）および／またはグリシン５６（Ｇ５６）、もしくは配列番号１５（１Ｇ１の重鎖可変領域（ＶＨ））のアスパラギン５５（Ｎ５５）および／またはグリシン５６（Ｇ５６）は、任意の適切なアミノ酸によって置換され得る。別の例では、配列番号５７（イヌＩｇＧＢ重鎖定常領域）のアスパラギン１０３（Ｎ１０３）、１８３（Ｎ１８３）および／もしくは２７０（Ｎ２７０）、ならびに／またはグリシン１０４（Ｇ１０４）、１８４（Ｇ１８４）および／もしくは２７１（Ｇ２７１）のうち１つ以上が、任意の適切なアミノ酸によって置換され得る。特定の置換に関するさらなる情報は、実施例において記載され試験される。当業者に決定され得るように、他の置換もまた適切であり得る。
【００３５】
定常領域は、例えば、ヒト（例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ＩｇＤならびにＩｇＥ）、イヌ（例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣ、ＩｇＧＤ）ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭ）、ニワトリ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＹ）、ヤギ（例えば、ＩｇＧ）、マウス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ）、ブタ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ）、ラット（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ）、ネコ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）ならびに／またはそれらの断片および／もしくは誘導体（例えば、キメラ抗体など）のいずれかから誘導され得る。例えば、表１および／または表４のアミノ酸配列のうち１つ以上は、キメラ抗体を生成するために、非イヌ可変領域および／または定常領域（例えば、ヒト）と連結され得るまたは結び付けられ得る。結合剤は、例えば、表１に示されるもののいずれかのアミノ酸配列（ならびに／またはそれらの断片および／もしくは誘導体）および例えばイヌ抗体定常領域を含み得る。本明細書に記載されるように利用することができるイヌＩｇＧＢの軽鎖および重鎖定常領域の例示的なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、以下の表５に示される：
【００３６】
【表５】
2014532649.tif 000014
2014532649.tif 000015
当業者は、抗体である結合剤の定常領域が、配列番号５６および／もしくは５８ならびに／またはそれらの誘導体ヌクレオチド配列によってコードされ得ることを理解している。結合剤の定常領域は、配列番号５５、７８、７９、８０および／もしくは５７のアミノ酸配列、ならびに／またはそれらの誘導体アミノ酸配列を含み得る。１例において、抗体をコードするヌクレオチド配列は、ベクター系へと構築され、次いで宿主細胞において発現される。１例において、これらの宿主細胞は培養細胞である。１例において、このベクター系は、抗体が発現される条件下で哺乳動物培養細胞において使用される。実施例２は、これの１例を記載している。
【００３７】
いくつかの適用において、これらの結合剤は、イヌＣＤ２０に結合し得るが、標準的な結合剤と比較して、Ｆｃレセプター（例えば、ＣＤ１６）に結合する変更された能力を有する。１例において、これらの結合剤は、改変されたグリコシル化パターンを有する抗体である。ＩｇＧ分子は、例えば、Ｎ結合型オリゴ糖を典型的に含む。ある種のＩｇＧ分子は、抗体重鎖に連結された二分岐複合体型オリゴ糖を含む。ヒトＩｇＧでは、このオリゴ糖は、重鎖の２９７位のアスパラギン残基（Ｎ２９７）（抗体重鎖の定常／Ｆｃ領域中）に一般に連結される。一般に、フコースが、Ｎ２９７に最も近い、オリゴ糖中のＧＬｃＮＡＣ残基に付着される。フコースの非存在は、抗体が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する能力を増強し得る。おそらく、フコースの非存在／除去は、抗体がＦｃレセプターと相互作用する能力を増強する。この型の抗体は、「脱フコシル化」と呼ばれ得る。脱フコシル化抗体は、本明細書に記載される技術および／または当該分野で公知であり得る技術を使用して生成することができる。いくつかの実施形態において、抗体をコードする核酸配列は、改変されたグリコシル化能（例えば、欠失した、改変されたまたはより少ない量のフコシルトランスフェラーゼ）を有する、典型的なフコース部分を付加することができない細胞株において発現させることができる。種々のこれらの細胞株が公知である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗体は、イヌＣＤ２０に結合するが、脱フコシル化オリゴ糖を含む。１実施形態において、抗イヌＣＤ２０抗体は、イヌＩｇＧＢ重鎖定常領域を含み得る。いくつかの実施形態において、イヌＩｇＧＢ重鎖定常領域（配列番号５７）中のＮ１８３に最も近いＧＬｃＮＡＣに典型的に付着されるフコース部分は、存在しない。当業者に理解されるように、他の技術もまた、抗体の典型的なフコシル化を変更するために使用され得、適切であり得る。
【００３８】
結合剤（例えば、抗体）は、Ｆｃレセプター（例えば、ＣＤ１６）との減少した相互作用を生じ得る他の改変も含み得る。例えば、代替的なまたはさらなるアミノ酸置換が、本明細書に記載される抗体分子に対してなされ得る。１実施形態において、イヌＩｇＧＢ重鎖定常領域（例えば、配列番号５７の）は、アミノ酸残基Ｍ１２０およびＬ１２１のうち一方または両方において置換され得る。特定の実施形態において、これらの残基のいずれかまたは両方が、アラニン（Ａ）またはプロリン（Ｐ）によって置換され得る。１実施形態において、以下に示すように、１２０位におけるＭ（メチオニン）をＰ（プロリン）によって置換し、１２１位におけるＬ（ロイシン）をＡ（アラニン）によって置換した：
【００３９】
【化５】
2014532649.tif 000016
Ｍ１２０ＰおよびＬ１２１Ａを含むイヌＩｇＧＢを特徴付けるための研究において、ＣＤ１６ａに対する結合は、置換を含まないイヌＩｇＧＢ（即ち、配列番号５７に示される配列）と比較して低減された。イヌＩｇＧＡ重鎖は、本発明者らの手中では、ＣＤ１６ａに対して最小限に結合するまたは結合しないので、これを陰性対照として使用した。本発明者らは、イヌＩｇＧＤ重鎖もまたＣＤ１６ａに対して最小限に結合するまたは結合しないが、イヌＩｇＧＢおよびＩｇＧＣの重鎖はＣＤ１６ａに結合することもまた見出した（また、Ｂ細胞枯渇実験において、実施例３および図６に記載されるように、１Ｅ４−ｃＩｇＧＢ分子および１Ｅ４−ｃＩｇＧＣ分子はＢ細胞を枯渇させたが、１Ｅ４−ｃＩｇＧＡ分子はしなかった。）。Ｍ１２０ＰおよびＬ１２１Ａを含む分子の測定された結合は、ＩｇＧＡ分子について測定された結合の背景レベルと類似であった。
【００４０】
１実施形態において、１８３位におけるイヌＩｇＧＢ重鎖定常領域（例えば、配列番号５７の）Ｎ（アスパラギン）を、以下に示すようにＡで置換した：
【００４１】
【化６】
2014532649.tif 000017
2014532649.tif 000018
Ｎ１８３Ａ置換を含むイヌＩｇＧＢを特徴付けるための研究において、ＣＤ１６ａに対する結合は、置換を含まないイヌＩｇＧＢ（即ち、配列番号５７に示される配列）と比較して低減された。イヌＩｇＧＡ重鎖を陰性対照として使用した。Ｎ１８３Ａ置換を含む分子のＣＤ１６ａに対する測定された結合は、ＩｇＧＡ分子について測定された結合の背景レベルと類似であった。
【００４２】
１実施形態において、以下に示すように、１２０位におけるイヌＩｇＧＢ重鎖定常領域（例えば、配列番号５７の）ＭをＡによって置換し、１２１位におけるＬをＡによって置換した：
【００４３】
【化７】
2014532649.tif 000019
Ｍ１２０ＡおよびＬ１２１Ａを含むイヌＩｇＧＢを特徴付けるための研究において、ＣＤ１６ａに対する結合は、置換を含まないイヌＩｇＧＢ（即ち、配列番号５７に示される配列）と比較して低減された。イヌＩｇＧＡ重鎖を陰性対照として使用した。Ｍ１２０ＡおよびＬ１２１Ａを含む分子のＣＤ１６ａに対する測定された結合は、置換を含まないＩｇＧＢの結合と比較して減少した。しかし、Ｍ１２０Ａ含有分子およびＬ１２１Ａ含有分子のＣＤ１６Ａに対する結合は、Ｍ１２０ＰおよびＬ１２１Ａ分子の結合と同等には低減されず、Ｎ１８３Ａ分子の結合と同等にも低減されなかった。
【００４４】
上記の分子に加えて、イヌＩｇＧＢ重鎖定常領域（配列番号５７）は、例えばＭ１２０およびＬ１２１の一方または両方において、他のアミノ酸置換を有していてもよい。１実施形態において、この分子はＭ１２０Ａ置換を有し得る。１実施形態において、この分子はＬ１２１Ａ置換を有し得る。Ａおよび／またはＰによるＭ１２０および／またはＬ１２１の他の置換が可能であり得る。さらに、これらの置換のいずれかが、Ｎ１８３Ａ置換と組み合わされ得る。当業者に理解されるように、他の改変もまた適切であり得る。かかる改変のうち１つ以上を有する抗体の混合物もまた、種々の適用に適切であり得る。
【００４５】
上記のように、いくつかの実施形態において、結合剤は抗体であり得る。用語「抗体（単数または複数）」は、未精製の形態もしくは部分的に精製された形態（例えば、ハイブリドーマ上清、腹水、ポリクローナル抗血清）でまたは精製された形態での、抗体全体または断片化された抗体を指し得る。「精製された」抗体は、（例えば、ハイブリドーマ上清または腹水調製物の一部として）最初に見出されるタンパク質の少なくとも約５０％から分離された抗体であり得る。精製された抗体は、最初に見出されるタンパク質の少なくとも約６０％、７５％、９０％または９５％から分離された抗体であり得る。適切な誘導体は、断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２または単鎖抗体、例えばＦｖなど）であってもよい。これらの抗体は、例えば、マウス（例えば、マウスハイブリドーマ細胞によって産生される。）を含む任意の適切な起源もしくは形態のものであり得、またはイヌ化抗体、キメラ抗体、イヌ抗体などとして発現され得る。
【００４６】
種々の型の抗体を調製および利用する方法は、当業者に周知であり、本発明を実施する際に適している（例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年；Ｈａｒｌｏｗら、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  第１巻、１９９８年；ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁、１９７５年；Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２−５２５頁、１９８６年；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３−３２９頁、１９８８年；Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２巻：５９３−５９６頁、１９９２年；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４−１５３６頁、１９８８年；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７巻：３８１頁、１９９１年；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１頁、１９９１年；Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁、１９８５年；Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻（１号）：８６−９５頁、１９９１年；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０巻、７７９−７８３頁、１９９２年；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８巻：８５６−８５９頁、１９９４年；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８巻：８１２−１３頁、１９９４年；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４巻、８４５−５１頁、１９９６年；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４巻、８２６頁、１９９６年；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３巻：６５−９３頁、１９９５年；ならびにＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．４，８１６，５６７、５，５４５，８０７、５，５４５，８０６、５，５６９，８２５、５，６２５，１２６、５，６３３，４２５および５，６６１，０１６を参照のこと。）。特定の適用において、これらの抗体は、ハイブリドーマ上清または腹水内に含まれ得、標準的な技術を使用してそのまま直接または以下の濃度で利用され得る。他の適用において、これらの抗体は、例えば、塩分別およびイオン交換クロマトグラフィー、またはアガロースビーズなどの固体支持体に共有結合したプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇおよび／もしくはプロテインＬリガンドを使用するアフィニティクロマトグラフィー、またはこれらの技術の組み合わせを使用して、さらに精製され得る。抗体は、凍結調製物として（例えば、−２０℃または−７０℃）、凍結乾燥形態で、または通常の冷蔵条件（例えば、４℃）下を含む、任意の適切な形式で保存できる。液体形態で保存する場合、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの適切な緩衝液を使用することができる。
【００４７】
本明細書に記載される結合剤は、決して抗体に限定されない。結合剤は、抗体と類似の結合特性を示す任意の化合物（例えば、模倣物）であり得る。例えば、例示的な結合剤は、配列番号１および／もしくは配列番号２（または配列番号１および／もしくは２を含むポリペプチド）に結合するものであり得、ならびに／またはそれらに結合するモノクローナル抗体（例えば、モノクローナル抗体１Ｅ４、１Ｇ１０および／または１Ｇ１）と競合し得る。いくつかの実施形態において、この結合剤は、結合アッセイにおいて、比較される結合剤（例えば、モノクローナル抗体）と実質的に同じＫｄを示し得る。例えば、特定の結合剤のＫｄは、実施例に記載されるＦＡＣＳアッセイ（例えば、図１）が含まれるがこれに限定されない任意の適切なアッセイによって測定することができる。１つの結合剤は、測定値が互いの約１−２０％、約１−５％、約５−１０％、約１０−１５％または約１５−２０％のいずれか以内である場合、もう１つの結合剤と「実質的に同じＫｄ」を有すると言うことができる。
【００４８】
例示的な模倣物には、例えば、イヌＣＤ２０（例えば、配列番号１、２および／もしくは５９、ならびに／または任意のかかる配列を含むポリペプチド）に特異的に結合する有機化合物が含まれ得る（例えば、Ｇｅｂａｕｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３巻（３号）：２４５−２５５頁、２００９年を参照のこと。）。かかる模倣物は、例えば、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）（Ｎｙｇｒｅｎら、ＦＥＢＳ  Ｊ．２７５巻（１１号）：２６６８−７６頁、２００８年）、アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ）（Ｅｂｅｒｓｂａｃｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７２巻（１号）：１７２−８５頁、２００７年）、アフィチン（ａｆｆｉｔｉｎ）（Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８３巻（５号）：１０５８−６８頁、２００８年）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．、ＦＥＢＳ  Ｊ．２７５巻（１１号）：２６７７−８３頁、２００８年）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３巻（１２号）：１５５６−６１頁、２００５年）、ＤＡＲＰｉｎ（Ｓｔｕｍｐｐら、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  １３巻（１５−１６号）：６９５−７０１頁、２００８年）、Ｆｙｎｏｍｅｒ（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２巻（５号）：３１９６−３２０４頁、２００７年）、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド（Ｎｉｘｏｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．９巻（２号）：２６１−８頁、２００６年）および／またはモノボディ（ｍｏｎｏｂｏｄｙ）（Ｋｏｉｄｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５２巻：９５−１０９頁、２００７年）であり得る。他の模倣物には、例えば、抗体の誘導体（例えば、モノクローナル抗体１Ｅ４、１Ｇ１０および／または１Ｇ１の）、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’単鎖抗体、Ｆｖ、単一ドメイン抗体、単一特異性抗体、二特異性抗体、三特異性抗体、多価抗体、キメラ抗体、イヌ−ヒトキメラ抗体、イヌ−マウスキメラ抗体、イヌＦｃを含む抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、イヌ化、ＣＤＲ移植抗体、サメ抗体、ナノボディ（例えば、単一モノマー性可変ドメインからなる抗体）、ラクダ科動物抗体（例えば、ラクダ科の成員の抗体）、ミクロボディ、イントラボディ（例えば、細胞内抗体）および／または脱フコシル化抗体ならびに／またはそれらの誘導体なども含まれ得る。当業者に理解されるように、他の結合剤もまた本明細書で提供される。
【００４９】
特定の実施形態において、結合剤の調製物が提供される。かかる調製物は、例えば、ハイブリドーマ上清もしくは腹水調製物において見出されるような未精製の抗体、部分的に精製された調製物または精製された調製物を含んでいてもよい。従って、約５０％、６０％、７５％、９０％または９５％の純度まで精製された１種以上の結合剤を含む抗体調製物が本明細書で提供される。典型的には、かかる調製物は、リン酸緩衝食塩水またはｔｒｉｓ緩衝食塩水（それぞれＰＢＳまたはＴＢＳ）などの緩衝液を含む。これらの調製物は、例えば安定剤などの賦形剤を含むように製剤化することもできる。これらの調製物は、かかる結合剤の誘導体、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２または単鎖抗体（例えばＦｖ）、イヌ化抗体、キメラ抗体、イヌ抗体などもまた含み得る、またはそれらを代替的に含み得る。結合剤が抗体である場合、それらの可変領域をコードするヌクレオチド配列は、特定の抗体調製物（例えば、イヌ化抗体）を生成するために発現ベクター中にクローニングされたこのヌクレオチド配列を発現するハイブリドーマからも単離することができる。かかる調製物を生成する方法は、当該分野で周知である。
【００５０】
当業者は、本明細書に記載される結合剤に結合するタンパク質を含む生物学試料を同定するために、かかる結合剤（例えば、抗体）を使用するための多くの適切な技術を有している。例えば、抗体は、例えば免疫沈澱または他の捕捉型アッセイを使用して、イヌＣＤ２０タンパク質を単離するために利用することができる。この周知の技術は、固体支持体またはクロマトグラフィー材料（例えば、プロテインＡ、プロテインＧおよび／またはプロテインＬで被覆されたビーズ）に抗体を付着させることによって実施される。次いで、結合した抗体は、ＣＤ２０タンパク質を含んでいる溶液または含むと考えられる溶液のいずれか（例えば、イヌＢ細胞溶解物）中に導入される。次いで、イヌＣＤ２０タンパク質は、抗体に結合し得、非結合材料が、ＣＤ２０タンパク質が抗体に結合したままとなる条件下で洗浄により除かれる。次いで、結合したタンパク質は、抗体から分離され得、所望の場合には分析され得る。抗体を使用してタンパク質を単離するための類似の方法は、当該分野で周知である。これらの結合剤（例えば、抗体）は、生物学試料内のＣＤ２０タンパク質を検出するためにも利用することができる。例えば、抗体は、例えば、フローサイトメトリー分析、ＥＬＩＳＡ、イムノブロッティング（例えば、ウエスタンブロット）、インサイチュ検出、免疫細胞化学および／または免疫組織化学などのアッセイにおいて使用することができる。かかるアッセイを実施する方法は、当該分野で周知である。
【００５１】
本明細書に記載される抗体を使用する際に当業者を補助するために、キット形式で同じものが提供され得る。かかる抗体および場合によってイヌＣＤ２０を発現している細胞を検出するために抗体を使用するのに必要な他の構成成分を含むキットが、提供される。このキットの抗体は、凍結、凍結乾燥またはＴＢＳもしくはＰＢＳなどの医薬として許容される緩衝液中を含む、任意の適切な形態で提供され得る。このキットは、インビトロまたはインビボでの抗体の利用に必要な他の試薬、例えば、緩衝液（例えば、ＴＢＳ、ＰＢＳ）、ブロッキング剤（脱脂粉乳、正常血清、Ｔｗｅｅｎ−２０洗浄剤、ＢＳＡまたはカゼインを含む溶液）、および／または検出試薬（例えば、ヤギ抗マウスＩｇＧビオチン、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート、アロフィコシアニン、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、ペルオキシダーゼ、検出可能な標識（例えば、フルオロセイン（ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ）、例えば、ＤｙＬｉｇｈｔ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７；５−カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、５−ＨＡＴ（ヒドロキシトリプタミン）、５−ヒドロキシトリプタミン（ＨＡＴ）、６−ＪＯＥ；６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、ＦＩＴＣ、６−カルボキシ−１，４−ジクロロ−２’，７’−ジクロロ−フルオレセイン（ＴＥＴ）、６−カルボキシ−１，４−ジクロロ−２’，４’，５’，７’−テトラ−クロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）；Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ、例えば、３５０、４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６３５、６４７、６６０、６８０、７００、７５０；ＢＯＤＩＰＹフルオロフォア、例えば、４９２／５１５、４９３／５０３、５００／５１０、５０５／５１５、５３０／５５０、５４２／５６３、５５８／５６８、５６４／５７０、５７６／５８９、５８１／５９１、６３０／６５０−Ｘ、６５０／６６５−Ｘ、６６５／６７６、ＦＬ、ＦＬ  ＡＴＰ、ＦＩ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ、Ｒ６Ｇ  ＳＥ、ＴＭＲ、ＴＭＲ−Ｘコンジュゲート、ＴＭＲ−Ｘ、ＳＥ、ＴＲ、ＴＲ  ＡＴＰ、ＴＲ−Ｘ  ＳＥ；ローダミン、例えば、１１０、１２３、Ｂ、Ｂ  ２００、ＢＢ、ＢＧ、Ｂ  ｅｘｔｒａ、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、５  ＧＬＤ、６−カルボキシローダミン  ６Ｇ、リサミン、リサミンローダミンＢ、ファリシジン（Ｐｈａｌｌｉｃｉｄｉｎｅ）、ファロイジン、Ｒｅｄ、Ｒｈｏｄ−２、ＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、５−ＲＯＸ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、スルホローダミンＢ  ｃａｎ  Ｃ、スルホローダミンＧ  Ｅｘｔｒａ、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、ＷＴ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘ）ならびに他の標識および／または染色キット（例えば、ＡＢＣ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ）もまた含み得る。これらのキットは、例えば��フローサイトメトリー分析、ＥＬＩＳＡ、イムノブロッティング（例えば、ウエスタンブロット）、インサイチュ検出、免疫細胞化学、免疫組織化学などの上記一般に使用されるアッセイにおいて抗体を使用するための他の試薬および／または指示書もまた含み得る。１実施形態において、これらの検出可能な標識は、結合剤に固定的に付着され得る。１例において、これらの検出可能な標識は、化学結合によって結合剤に固定的に付着される。１例において、これらの化学結合は、共有化学結合である。１例において、これらの検出可能な標識は、結合剤にコンジュゲート化される。
【００５２】
１実施形態において、このキットは、精製された形態のモノクローナル抗体を提供する。別の実施形態において、このモノクローナル抗体は、単独でまたはアビジン−コンジュゲート化検出試薬（例えば、抗体）と共にのいずれかで、ビオチン化形態で提供され得る。別の実施形態において、このキットは、イヌＣＤ２０を直接検出するために使用することができる蛍光標識された抗体を含む。これらのシステムのいずれかを使用するために必要な緩衝液などは、当該分野で周知であり、末端使用者によって調製され得る、またはキットの構成成分として提供され得る。このキットは、陽性対照および陰性対照タンパク質ならびに／または組織試料を含む固体支持体もまた含み得る。例えば、スポッティング型またはウエスタンブロット型のアッセイを実施するためのキットは、実験試料のためのさらなる空間と共に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて使用するための対照細胞もしくは組織溶解物、または予め固定された対照試料を含むナイロンもしくは他のメンブレンを含み得る。スライド上の細胞におけるイヌＣＤ２０の可視化のためのキットは、実験試料のためのさらなる空間と共に、対照細胞または組織試料を含む予め形式設定されたスライドを含み得る。
【００５３】
本明細書に記載される結合剤および／またはそれらの誘導体は、インビトロまたはインビボでの使用のための組成物へと組み込むこともできる。抗体またはそれらの誘導体はまた、とりわけジフテリアＡ鎖、外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）などの細胞傷害薬物もしくは毒素またはそれらの活性断片などの、機能的部分／エフェクター部分に固定的に付着され得る。機能的部分は、放射化学物質もまた含み得る。１実施形態において、これらのエフェクター部分は、結合剤に固定的に付着され得る。１例において、これらの検出可能な標識は、化学結合によって結合剤に固定的に付着され得る。１例において、これらの化学結合は、共有化学結合である。１例において、これらのエフェクター部分は、結合剤にコンジュゲートされる。
【００５４】
これらの結合剤は、単独で、または疾患を予防および／もしくは処置するための別の薬剤と組み合わせて使用することができる。１つのかかる疾患は、特にイヌ動物における、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴ）、小リンパ球性リンパ腫（ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、慢性リンパ球性白血病、マントル（ｍａｎｔｅｌ）細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、脾性辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症など）である。これらの結合剤はまた、（例えば、処置レジメンの一部として）他の抗癌剤、例えば、シクロホスファミド（例えば、Ｃｙｔｏｘａｎ、Ｎｅｏｓａｒ）、アドリアマイシン（例えば、ドキソルビシン／ヒドロキシドキソルビシン）、ビンクリスチン（例えば、Ｏｎｃｏｖｉｎ）、プレドニゾン（例えば、Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ、Ｏｒａｓｏｎｅ）、Ｌ−アスパラギナーゼ、クロラムブシル、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シトシンアラビノシド、ミトキサントロンおよび／またはそれらの組み合わせなどと組み合わされ得るまたはこれらと併せて使用され得る。かかる抗癌剤の組み合わせとは、同時投与および／または連続投与を指し得る。
【００５５】
これらの結合剤は、種々の自己免疫疾患を処置するためにも使用することができる。疾患の例には、自己免疫性溶血性貧血、免疫介在性血小板減少症（ｉｍｍｕｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）、ループス、自己免疫性水疱形成疾患、免疫介在性関節炎およびアトピー性皮膚炎が含まれ得るがこれらに限定されない。
【００５６】
本明細書に記載される抗体および／またはそれらの誘導体は、患者における疾患状態の存在を決定するため、予後を予測するため、または化学療法もしくは他の処置レジメンの有効性を決定するために、アッセイにおいて使用され得る。本明細書に記載されるようにまたは当該分野で別に知られるように実施される発現プロファイルアッセイが、ＣＤ２０の発現の相対的レベルを決定するために使用され得る。次いで、発現のレベルは、特定の疾患が患者内に存在するかどうか、患者の予後、または特定の処置レジメンが有効であるかどうかを決定するために、基礎（例えば、対照）レベルと相関させることができる。例えば、患者が特定の化学療法レジメンで処置されている場合、患者の組織中（例えば、末梢血、乳房組織生検中）の免疫原性標的の減少したレベルの発現は、そのレジメンがその宿主において癌負荷を減少させていることを示し得る。同様に、発現のレベルが増加している場合、これは、そのレジメンが所望の効果を有しておらず、別の治療様式が選択され得ることを示し得る。
【００５７】
本明細書に記載される抗体を、薬物スクリーニングアッセイにおいて試薬として使用することも可能である。これらの試薬は、細胞株、または患者の細胞もしくは組織における免疫原性標的の発現に対する薬物候補の影響を確定するために使用することができる。発現プロファイリング技術は、有用な化合物の迅速な同定を可能にし、薬物候補を用いた処置の有効性をモニタリングするために、高スループットスクリーニング技術と組み合わせることができる（例えば、Ｚｌｏｋａｒｎｉｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９巻：８４−８頁、１９９８年を参照のこと。）。薬物候補は、天然に存在するものであれ合成により誘導されたものであれ、化学化合物、核酸、タンパク質、抗体またはそれらの誘導体であり得る。こうして同定された薬物候補は、他の使用のなかでもとりわけ、患者への投与のための医薬組成物として、またはさらなるスクリーニングアッセイにおける使用のために、利用され得る。
【００５８】
本明細書に記載される抗体は、非毒性の経口的に許容される希釈剤または溶媒中の懸濁物中などに、注射可能な調製物として調製することができる。利用することができる適切なビヒクルおよび溶媒には、とりわけ、水、リンゲル溶液ならびに等張塩化ナトリウム溶液、ＴＢＳおよびＰＢＳが含まれる。製剤は、例えば安定剤（ｓｔａｂｌｉｚｅｒ）などの賦形剤を含み得る。特定の適用において、これらの抗体はインビトロでの使用に適している。他の適用において、これらの抗体は、インビボでの使用に適している。いずれかの場合に使用するのに適した調製物は、当該分野で周知であり、特定の適用に依存して変動する。
【００５９】
結合剤の調製および免疫
イヌＣＤ２０ポリペプチドならびに／またはそれらの断片および／もしくは誘導体（本明細書で集合的に「イヌＣＤ２０」と呼ぶ。）、ならびにこれらを調製する方法および使用する方法もまた、本明細書で提供される。例示的なイヌＣＤ２０は、以下に示すアミノ酸配列を含み得る：
【００６０】
【化８】
2014532649.tif 000020
配列番号５９の例示的な断片は、配列番号１および／または２であり得る。従って、例示的なイヌＣＤ２０は、配列番号５９、配列番号１および／または配列番号２を含み得る。
【００６１】
イヌＣＤ２０は典型的に、宿主において抗ＣＤ２０抗体を誘導する能力を示す。宿主動物は一般に、マウス、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ヒトなどが含まれるがこれらに限定されない哺乳動物である。１例において、この宿主はマウスであり得る。イヌＣＤ２０（例えば、配列番号１、２および／または５９）の投与は、マウスにおいて抗イヌＣＤ２０抗体の産生を生じる。１例において、この宿主はイヌであり得、イヌＣＤ２０の投与は、ＣＤ２０を発現している細胞に特異的であり得る、イヌにおける免疫応答の生成を生じ得る。これらの抗体は、非保護的および／もしくは非中和性であり得、ならびに／または宿主動物への投与後に、保護的および／もしくは中和抗体であり得る。
【００６２】
特定の実施形態において、これらの抗体は、イヌＣＤ２０を検出および／もしくは単離するため、ならびに／またはイヌＣＤ２０を発現している細胞を検出、単離および／もしくは破壊するために使用され得る。特定の実施形態において、このイヌＣＤ２０は、他のＣＤ２０ポリペプチド（例えば、イヌまたはその他）と、アミノ酸配列同一性（例えば、約９０％、９５％、９８％、９９％または９９．９％のいずれか）を共有していてもよい。ＣＤ２０ポリペプチド間のアミノ酸配列における任意の差異は、典型的には表現型的にサイレントであるが、必ずしも表現型的にサイレントではなく、しかし抗ＣＤ２０免疫を生じさせる（例えば、宿主における抗ＣＤ２０抗体の産生を誘導する。）のに有用でなければならない。
【００６３】
ＣＤ２０をコードする核酸はまた、かかる配列のバリアント（例えば、それらの縮重バリアント）と共に提供される。特定の実施形態において、イヌＣＤ２０をコードする核酸分子は、以下でさらに詳細に議論するように、１つ以上の発現ベクター中に挿入され得る。かかる実施形態において、イヌＣＤ２０は、アミノ酸配列に対応するヌクレオチドによってコードされ得る。種々のアミノ酸をコードするヌクレオチドの特定の組み合わせは、当該分野で周知であり、当業者によって使用される種々の参考文献中に記載されている（例えば、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｖ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４年）。イヌＣＤ２０をコードするヌクレオチド配列は、例えば表６を参照して確定することができる。核酸バリアントは、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチドの任意の組み合わせを使用できる。
【００６４】
【表６】
2014532649.tif 000021
改変されたＣＤ２０は、少なくとも１アミノ酸の置換、挿入および／または欠失を含み得る。改変されたＣＤ２０は典型的に、宿主への投与に際して、実質的に非毒性のままであるおよび／または中和抗体を惹起する。かかる抗体は、宿主への別のＣＤ２０の投与後に惹起される抗体と同じエピトープに結合し得る。本明細書に記載するように、イヌＣＤ２０は、ＣＤ２０を発現している細胞を標的化することが有益である状態（例えば、Ｂ細胞リンパ腫などの癌）の予防および／または処置のための免疫原性組成物またはワクチンにおいて有用であり得る。適切な改変は、イヌＣＤ２０のアミノ酸配列において保存的変化を導入し得る。保存的アミノ酸置換は、その位置におけるアミノ酸残基のサイズ、極性、電荷、疎水性または親水性に対する影響が殆どまたは全くないようにする、特に、減少した免疫原性を生じないようにする、ネイティブのアミノ酸残基の非ネイティブの残基による置換を含み得る。適切な保存的アミノ酸置換を表７に示す。
【００６５】
【表７】
2014532649.tif 000022
選択される特定のアミノ酸置換は、選択される部位の位置に依存し得る。
【００６６】
抗ＣＤ２０抗体は、宿主への投与の前に、１種以上の医薬として許容される担体と組み合わされ得る。医薬として許容される担体は、生物学的にも他の意味でも望ましくないことのない材料であり、例えば、この材料は、任意の望ましくない生物学的影響を引き起こすことも、この材料が含まれる医薬組成物の他の構成成分のいずれかと有害な様式で相互作用することもなしに、被験体に投与することができる。この担体は、当業者に周知のように、活性成分の任意の分解を最小化するため、および被験体における任意の有害副作用を最小化するために、自然に選択される。
【００６７】
適切な医薬担体およびそれらの製剤化は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｄａｖｉｄ  Ｂ．Ｔｒｏｙ編、Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５年）に記載されている。典型的には、適切な量の医薬として許容される塩が、製剤を等張にするために、製剤化において使用される。医薬として許容される担体の例には、無菌水、生理食塩水、リンゲル溶液などの緩衝化溶液、およびデキストロース溶液が含まれるがこれらに限定されない。この溶液のｐＨは一般に、約５から約８または約７から約７．５である。他の担体には、徐放性調製物、例えば、ポリペプチドまたはそれらの断片を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれる。マトリックスは、成形された物品の形態、例えば、フィルム、リポソームまたは微粒子であり得る。特定の担体が、例えば投与経路および投与されている組成物の濃度に依存してより好ましい場合があることは、当業者に明らかである。担体は、ヒトまたは他の被験体へのポリペプチドおよび／またはそれらの断片の投与のために適した担体である。
【００６８】
医薬組成物は、免疫原性ポリペプチドまたは抗ＣＤ２０抗体に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝液、防腐剤、界面活性剤、アジュバント、免疫刺激剤もまた含み得る。医薬組成物は、抗菌剤、抗炎症剤および麻酔剤などの１種以上の活性成分もまた含み得る。
【００６９】
本明細書に記載される組成物は、免疫原（例えば、配列番号１、２および／または５９）に対する免疫応答を生成するため、イヌＣＤ２０を発現している細胞を検出するため、および／またはＣＤ２０を発現している細胞を排除する必要がある場合がある疾患状態（例えば、Ｂ細胞リンパ腫）を処置するために、動物にインビボで投与され得る。特定の実施形態において、本開示は、イヌＣＤ２０もしくはかかる結合剤と反応する細胞表面タンパク質を発現している細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｂリンパ腫細胞、イヌＣＤ２０）の単離および／もしくは同定、ならびに／または哺乳動物（例えば、イヌ）における癌の処置および予防において有用な、抗体（例えば、モノクローナル抗体を含む。）などの結合剤もまた提供する。従って、特定の実施形態において、この結合剤は、細胞表面上に発現されたイヌＣＤ２０に対して反応性の抗体であり得る。いくつかの実施形態において、配列番号１、配列番号２および／または配列番号５９（ならびに／またはそれらの断片および／もしくは誘導体）を含むその領域においてイヌＣＤ２０と結合するまたは反応する１種以上の結合剤（例えば、モノクローナル抗体などの抗体）。
【００７０】
結合剤の使用
いくつかの実施形態において、結合剤を使用してイヌ細胞を検出する方法が提供される。特定の実施形態において、動物（例えば、イヌ）におけるその細胞表面上にＣＤ２０を発現している細胞（例えば、Ｂ細胞リンパ腫）は、試験生物学試料を結合剤またはその誘導体と接触させること、および生物学試料またはその構成成分に結合した結合剤を検出することによって、検出され得る。特定の実施形態において、この方法は、試験生物学試料またはその構成成分に対する結合の量を、対照生物学試料またはその構成成分に対する結合の量と比較することを含んでいてもよく、対照生物学試料またはその構成成分と比較して試験生物学試料またはその構成成分に対する結合の増加は、試験生物学試料中のリンパ腫細胞の存在を示す。いくつかの実施形態において、この生物学試料は、イヌの血液または針吸引物であり得る。かかる方法は、インビボおよび／またはインビトロの形式でも提供される。
【００７１】
いくつかの実施形態において、かかる結合剤を使用して宿主におけるイヌＣＤ２０を発現している細胞の生存および／または数を減少させるための方法もまた、提供される。本明細書に記載される１種以上の結合剤（および／またはそれらの誘導体（複数可））の少なくとも１回以上の有効用量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物宿主において１つ以上の疾患状態（例えば、リンパ腫）を処置する方法もまた、提供される。いくつかの実施形態において、この結合剤は、表１、４および／または５に示されるアミノ酸配列のうち１つ以上を含むモノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体である。この結合剤は、約１から約５０ｍｇ／哺乳動物の体重ｋｇ、約１から約３０ｍｇ／ｋｇまたは約１から約１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５または４０ｍｇ／ｋｇのいずれか）の投薬量で投与することができる。特定の実施形態において、この結合剤は、約１、５または１０ｍｇ／ｋｇで、１回以上、哺乳動物に投与することができる（例えば、皮内、静脈内、経口、直腸）。複数回の用量が投与される場合、これらの用量は、各用量中に約同一であるまたは異なる量の結合剤を含み得る。これらの用量は、同一であるまたは異なる間隔で互いから時間的に分離されていてもよい。例えば、これらの用量は、約６、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４もしくは９６時間、１週間、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１．５年間、２年間、３年間、４年間、５年間またはこれらの時間期間のいずれかの前、後および／もしくは間の任意の時間期間のいずれかによって分離され得る。いくつかの実施形態において、これらの結合剤は、上記のように、他の薬剤（例えば、化学療法剤）と併せて投与することができる。かかる他の薬剤は、結合剤と約同時に、または異なる時間および／もしくは頻度で投与することができる。かかる方法の他の実施形態もまた、当業者によって容易に決定できるように、適切であり得る。
【００７２】
一般に、イヌにおける癌細胞の数、増殖、有害な影響などを減少させる効果を有するモノクローナル抗体の用量は、有効用量と呼ばれる。
【００７３】
場合によって免疫原および／または結合剤を使用するための指示書もまた含む、本明細書に記載されるかかる免疫原および／または結合剤のいずれかを含むキットもまた提供され、これらの方法を容易にし得る。例えば、キットは、結合剤を含む組成物（例えば、マウスモノクローナル抗体またはキメラ抗体調製物）を含んでもよい。この組成物は、医薬として許容される担体（例えば、リン酸緩衝食塩水）をさらに含んでもよく、溶液、凍結、凍結乾燥または他の適切な形態であり得る。このキットはまた、１つ以上の対照結合剤（例えば、キットが設計されるアッセイの標的に結合しない陰性対照、または陽性対照が結合することが既知の試料と共に供給され得る陽性対照）および／または使用のための指示書も含み得る。これらのキットは、インビトロまたはインビボのアッセイおよび／または処置に使用できるので（例えば、哺乳動物への投与のためのキット）、これらの指示書は、このキットが設計される特定の使用に依存して変動し得る。提供され得るかかるキットの他の実施形態は、当業者に容易に明らかである。
【００７４】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数形の指示対象を含むことに留意すべきである。従って、例えば、断片に対する言及は、断片の混合物を含み得、医薬上の担体またはアジュバントに対する言及は、２種以上のかかる担体またはアジュバントの混合物を含み得る。
【００７５】
数値のリストまたは範囲に先行する場合、用語「約」、「およそ」などは、そのリスト中の各個々の値または範囲がこの用語によって直接先行されるかのように、このリスト中の各個々の値または範囲を独立して指す。これらの用語は、これらの用語が指す値が、正確にその値である、その値に近いまたはその値と類似することを意味する。
【００７６】
本明細書で使用する場合、被験体または宿主は、個体を意味する。被験体または宿主は、例えば、ネコおよびイヌなどの飼い慣らされた動物、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジおよびヤギ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット）、鳥類および／またはヒトを含み得る。いくつかの実施形態において、この被験体または宿主は、イヌ動物などの哺乳動物であり得る。
【００７７】
場合によるまたは場合によってとは、その後に記載された事象または状況が、起き得るまたは起き得ないこと、およびこの記載が、その事象または状況が生じる場合および生じない場合を含むことを意味している。例えば、語句、場合によって組成物がある組み合わせを含み得る、とは、この記載が組み合わせおよび組み合わせ（例えば、組み合わせの個々の成員）の非存在の両方を含むように、その組成物が、異なる分子の組み合わせを含み得るまたは組み合わせを含まない場合があることを意味する。
【００７８】
範囲は、約１つの特定の値からおよび／または約別の特定の値までとして、本明細書で表され得る。かかる範囲が表される場合、別の態様は、１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。同様に、先行詞約またはおよその使用によって、値が近似値として表される場合、特定の値が別の態様を形成することが理解される。各々の範囲の端点は、他方の端点に対しておよび他方の端点とは独立しての両方で有意であることが、さらに理解される。範囲（例えば、９０−１００％）は、その範囲自体、ならびにその範囲内の各個々の値を、各値を独立して列挙したかのように含むことを意味する。
【００７９】
用語予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）、予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）および予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）が、所与の状態のための所与の処置（例えば、ストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）による感染症を予防すること）と関連して本明細書で使用される場合、これは、処置された患者が、その状態の臨床的に観察可能なレベルを全く発症しないこと、またはかかる患者がその処置を有さない場合よりもより遅くおよび／またはより低い程度でその状態を発症することをもたらすという意味である。これらの用語は、患者がいかなる状態の態様も経験しない状況のみに限定されない。例えば、その状態の所与の徴候を生成すると予測されている刺激に対する患者の曝露の間に処置が与えられる場合、および処置が、他の予測よりもその状態のより少ないおよび／またはより穏やかな症状を経験している患者を生じる場合に、この処置は、その状態を予防したと言われる。
【００８０】
本開示内で引用される全ての参考文献は、参照によりその全体を本明細書に組み込む。特定の実施形態が、以下の実施例においてさらに記載される。これらの実施形態は、例のみとして提供され、特許請求の範囲を決して限定しない意図である。本明細書で引用される全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込む。本発明およびその多数の利点のよりよい理解は、例示として与えられた以下の実施例から得られる。
【実施例】
【００８１】
[実施例１]
イヌＣＤ２０に対して反応性のｍＡｂ
Ａ．ハイブリドーマの生成および選択
イヌＣＤ２０に対するマウスモノクローナル抗体を生成するために、イヌＣＤ２０の第２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、イヌＰＢＭＣ  ｃＤＮＡからクローニングし、マウスＦｃ融合タンパク質（「ＥＣＤ２−ｍＦｃ」）として発現させ、免疫原として使用した。イヌＥＣＤ２−ｍＦＣは、以下に示すように、配列番号５９および６０のアミノ酸配列を有する：
【００８２】
【化９】
2014532649.tif 000023
；および
【００８３】
【化１０】
2014532649.tif 000024
この免疫原は、配列番号５９および配列番号６０の直線的配置を含んだものであり、配列番号６１として示される：
【００８４】
【化１１】
2014532649.tif 000025
ハイブリドーマを、配列番号５９／配列番号６０融合タンパク質（配列番号６１）によるマウスの免疫後に生成した。一次ＥＬＩＳＡスクリーニングを、抗原としてＥＣＤ２−ｈＦｃ融合タンパク質を使用して実施した。次いで、陽性ハイブリドーマを、新鮮（ＣＤ２０＋）および培養（ＣＤ２０−）イヌＢ細胞リンパ腫細胞の混合物を使用する二次スクリーニングに供した。二分岐ＦＡＣＳプロファイルを示したクローンを、さらなるスクリーニングのために選択した。このアプローチで生成されたハイブリドーマから発現された３種のｍＡｂ（１Ｅ４、１Ｇ１および１Ｇ１０）を、さらなる特徴付けのために選択した。
【００８５】
イヌＣＤ２０に対する結合についてのマウスモノクローナル抗体１Ｅ４、１Ｇ１および１Ｇ１０の相対的親和性を、イヌＣＤ２０を発現するイヌＢ細胞リンパ腫細胞を使用する蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって決定した。ｍＡｂ  １Ｅ４および１Ｇ１０は、ＣＤ２０に対して最も高い相対的親和性を示すことが見出された：１Ｇ１０（Ｋｄ＝０．２９ｎｍ）＞１Ｅ４（Ｋｄ＝０．９７ｎｍ）＞＞１Ｇ１（Ｋｄ＝１９．７８ｎｍ））（図１）。
【００８６】
マウスモノクローナル抗体１Ｅ４、１Ｇ１および１Ｇ１０（どれもヒトＣＤ２０には結合しない。）によって結合されたイヌＣＤ２０上のエピトープを同定するために、元の免疫原のハイブリッド版（ｃＣＤ２０ＥＣＤ２−ｍＦｃ）をコードするいくつかの発現構築物を生成した（図２Ａ）。ハイブリッドＣＤ２０ポリペプチドのアミノ酸配列もまた以下に示す：
【００８７】
【表８】
2014532649.tif 000026
図２Ａに示すように、これらのベクターから発現されたハイブリッドタンパク質は、細胞外ドメイン２の異なる一部分において、イヌＣＤ２０中に散在したヒトＣＤ２０配列を含んでいた。この戦略は、各ｍＡｂが結合するイヌＣＤ２０中の特異的配列の同定を可能にした。結合を、標準的なＥＬＩＳＡプロトコールを使用して試験した。簡潔に述べると、組換えイヌＣＤ２０  ＥＣＤ２−ｍＦｃ融合タンパク質およびそのヒト／イヌハイブリッドバリアントを、ＰＢＳ中に希釈し、４℃で一晩のインキュベーションによって、２００ｎｇ／ウェルで９６ウェルマイクロタイタープレートに結合させた。このプレートを、ＰＢＳＴ緩衝液で３回リンスし、ＰＢＳ中３％のＢＳＡ溶液で３７℃で１時間ブロッキングし、次いでＰＢＳＴで１回リンスした。マウスモノクローナル抗体１Ｅ４、１Ｇ１および１Ｇ１０を、ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、この希釈物の５０μｌを、室温で１時間プレートに適用した。次いで、このプレートを、ＰＢＳＴで３回リンスし、ＰＢＳ（５０μＬ）中に１：５０００希釈したＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈヤギ抗マウスＩｇＧ軽鎖特異的ＨＲＰコンジュゲート（＃１１５−０３５−１７４）を、各ウェルに添加し、このプレートを、室温で４５分間インキュベートした。このプレートを、ＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで、１００μＬのＳｕｒｅＢｌｕｅＴＭＢ基質（ＫＰＬ  ＃５２−００−０３）を各ウェルに添加し、このプレートを室温で約１０分間インキュベートした。このプレートを、分光光度計で６５０ｎｍで読み取った。
【００８８】
図２Ｂに示されるデータは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、イヌＣＤ２０エピトープＤＩＨＮＣＤ（配列番号２）を含んだｃＣＤ２０  ＥＣＤ２−ｍＦｃのハイブリッド版に対してｍＡｂ  １Ｅ４および１Ｇ１０がよりよく結合したことを実証しており、これらのｍＡｂがアミノ酸配列ＤＩＨＮＣＤ（配列番号２）を含むイヌＣＤ２０の領域に結合することを示している。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ｍＡｂ  １Ｇ１は、イヌＣＤ２０エピトープＬＩＫＡＰＭＰＹＶ（配列番号１）を含んだＣＤ２０タンパク質に対してよりよく結合し、１Ｇ１が、アミノ酸配列ＬＩＫＡＰＭＰＹＶ（配列番号１）を含むイヌＣＤ２０の領域に結合することを示している。
【００８９】
次に、ＦＡＣＳを、精製された１Ｅ４−ｍＡｂを使用して、イヌＰＢＭＣに対して実施した（図３）。イヌＰＢＭＣを、赤血球溶解によって単離し、ヨウ化プロピジウムによって標識し、１Ｅ４抗体（１μｇ抗体／ｍｌ）および二次抗体としてＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃１１５−１３６−１４６からの抗マウスＦａｂ−ＡＰＣ（１／２００）を用いて染色した（二次抗体単独を陰性対照として使用した。）。一次ＦＡＣＳゲートをリンパ球に対して課した（左のパネル）。生きたリンパ球（ヨウ化プロピジウムによって染色されなかったもの）だけを分析に含めた（中央のパネル）。抗体結合について陽性の細胞を、陰性対照試料中に１％未満の陽性を含んだゲートを設定することによって決定した（右上のパネル）。およそ１０％のリンパ球が、この実験において１Ｅ４で染色されたが、これは、イヌＢ細胞の表面上のＣＤ２０に特異的に結合している１Ｅ４と一致している。
【００９０】
Ｂ．１Ｅ４、１Ｇ１および１Ｇ１０の可変領域の配列決定
マウスモノクローナル抗体由来の可変領域ＤＮＡを、標準的な方法を使用して、ハイブリドーマ細胞株から得られたＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。重鎖および軽鎖の可変領域配列を増幅するために使用したフォワードプライマーは、Ｃｈａｒｄｅｓ  Ｔ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．６月１１日；４５２巻（３号）：３８６−９４頁、１９９９年において報告されたものであった。重鎖および軽鎖の可変領域配列を増幅するために使用したリバースプライマーを以下に示す：
５’−ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＡＹＣＴＣＣＡＣＡＣＡＣＡＧＧＲＲＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣ−３’（重鎖定常領域プライマー（配列番号６８））；および
５’−ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧ−３’（軽鎖定常領域プライマー（配列番号６９））。
【００９１】
次いで、重鎖および軽鎖の可変領域増幅産物を、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター中にクローニングし、配列決定した。１Ｅ４、１Ｇ１および１Ｇ１０の可変領域のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を表１に示す。
【００９２】
[実施例２]
Ａ．ＣＨＯ細胞におけるイヌキメラ抗体１Ｅ４−ｃＩｇＧＢおよびリツキサン−ｃＩｇＧＢの発現
キメラ抗体の軽鎖および重鎖をコードする遺伝子を構築した。１Ｅ４抗体の軽鎖可変領域をコードするコドン最適化されたマウスヌクレオチド配列（配列番号５）（表１）を、イヌ由来の軽鎖定常領域をコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列（配列番号５６）（表５）と融合させて、キメラ抗体軽鎖をコードする融合遺伝子を生成した。
【００９３】
さらに、１Ｅ４抗体の重鎖可変領域をコードするコドン最適化されたマウスヌクレオチド配列（配列番号８）（表１）を、イヌＩｇＧＢの重鎖定常領域をコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列（配列番号５８）（表５）と融合させて、イヌキメラ抗体重鎖をコードする融合遺伝子を生成した。
【００９４】
キメラ軽鎖および重鎖の配列を、単一のプラスミド発現ベクターへと構築した。このベクターを、別個の哺乳動物転写単位（５’末端のエンハンサー／プロモーター、３’末端のポリＡ配列）を含むように設計して、キメラ軽鎖および重鎖を発現させた。各転写単位の５’コード領域は、リーダー／シグナル配列もまたコードして、コードされたタンパク質のプロセシングおよびアセンブリ、ならびに１Ｅ４−ｃＩｇＧＢと称する抗イヌＣＤ２０抗体の分泌を提供した。このプラスミド発現ベクターは、哺乳動物細胞において選択可能なタンパク質をコードする別個の転写単位を含んでいた。これらのプラスミド発現ベクターは、ＷＯ  ２００９／０８０７２０（ＵＳ  ２０１１／００４５５３６Ａ１）およびＷＯ  ２０１０／０２２９６１に記載されている。リツキサン−ｃＩｇＧＢと称する抗ヒトＣＤ２０抗体のイヌキメラ版をコードする別個の類似のベクターを、対照として使用した。
【００９５】
１Ｅ４−ｃＩｇＧＢをコードするプラスミドおよび対照リツキサン−ｃＩｇＧＢをコードするプラスミドの両方を、ＣＨＯ細胞中にトランスフェクトし、安定にプールされたトランスフェクタントを、ＷＯ  ２０１０／０２２９６１に記載されるように、各々について選択した。抗体を、標準的な流加培養プロトコールを使用してこれらの安定な抗体発現細胞プールから生成した。これらの細胞から分泌された抗体を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＡＫＴＡ−ＦＰＬＣ液体クロマトグラフィーシステムを使用して、プロテインＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上で精製した。単離された抗体調製物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した（ＣＨＯが生成した１Ｅ４−ｃＩｇＧＢの分析については図４を参照のこと。）。
【００９６】
Ｂ．１Ｅ４軽鎖の改変
記載した抗体の改変もまた、上記の手順を使用して行った。１Ｅ４の軽鎖可変領域（ＶＬ）（配列番号３）のアスパラギン−グリシンジペプチド配列（Ａｓｐ−ＧｌｙまたはＮ−Ｇ）中のアスパラギン３３（Ｎ３３）またはグリシン３４（Ｇ３４）を改変して、潜在的な脱アミド化部位を除去した。種々の実施形態において、Ｎ３３を、アラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）またはチロシン（Ｙ）によって置換した。いくつかの実施形態において、Ｇ３４を、アラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、バリン（Ｖ）またはチロシン（Ｙ）によって置換した。上記置換のうち１つを含む抗体全体（重鎖＋軽鎖）を、イヌＣＤ２０  ＥＣＤ２ペプチド（配列番号６２）に結合する能力について、ＥＬＩＳＡアッセイによって試験した。
【００９７】
上記置換のいずれも、ＥＣＤ２ペプチドに対する抗体の結合を排除しなかった、多くの場合、抗原結合に対する置換の影響は少なかった。図５は、これらの抗体のいくつか：Ｎ３３からＫ（リジン）、Ｇ３４からＫ（リジン）、Ｇ３４からＱ（グルタミン）またはＧ３４からＡ（アラニン）の置換のうち１つを含んだ抗体、についての結果を示す。図５に示されるように、これらの置換はいずれも、イヌＣＤ２０に対する結合に有意に影響を与えなかった。
【００９８】
[実施例３]
キメラ抗イヌＣＤ２０抗体１Ｅ４−ｃＩｇＧＢのインビボ活性
Ｂ細胞を枯渇させることにおけるキメラ抗体１Ｅ４−ｃＩｇＧＢの効力を、用量反応研究においてインビボで試験した。抗ヒトＣＤ２０抗体リツキシマブ（リツキサン（登録商標））は、イヌＣＤ２０と交差反応しない／結合しないことが示されている（Ｊｕｂａｌａら、Ｖｅｔ  Ｐａｔｈｏｌ．、７月；４２巻（４号）：４６８−７６頁、２００５年；Ｉｍｐｅｌｌｉｚｅｒｉら、Ｖｅｔ  Ｊ．、５月；１７１巻（３号）：５５６−８頁、２００６年）。このように、イヌＩｇＧＢ  Ｆｃを含むリツキサンのキメラ形態（リツキサン−ｃＩｇＧＢ）をクローニングし、実施例２に上記したように発現させ、本研究において陰性アイソタイプ対照として使用した。薬力学的効果を、ナイーブな健康なオスビーグル犬に単回静脈内（ＩＶ）注射によって投与した場合の、複数の用量レベルの１Ｅ４−ｃＩｇＧＢによる５９日間の処置にわたって測定した。研究前の体重および研究前の臨床病理データ（臨床化学および血液学）を利用して、イヌをそれぞれの処置群へとランダム化した。実験設計を以下に示す：
【００９９】
【表９】
2014532649.tif 000027
研究の１日目に、単回用量（０．１、１、１０または３０ｍｇ／ｋｇ）の１Ｅ４−ｃＩｇＧＢまたはアイソタイプ対照抗体リツキサン−ｃＩｇＧＢ（１０ｍｇ／ｋｇ）を、静脈内ボーラス注射を介して動物に投与した。血液を、０日目（投薬前）、３日目、７日目、１０日目、１４日目、２８日目、４２日目および５９日目に、動物から収集した。これらの血液試料から、臨床病理パラメーターをモニタリングし、各イヌにおけるＣＤ２１陽性リンパ球（Ｂ細胞）のパーセントを、Ｒ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）コンジュゲート化マウス抗イヌＣＤ２１抗体（ＡｂＤｓｅｒｏｔｅｃ、カタログ番号ＭＣＡ１７８１ＰＥ）を使用して全血から単離したＰＢＭＣに対するＦＡＣＳによって、３連で分析した。その時点においてＣＤ２１陽性であったリンパ球の百分率を、０日目（投薬前）においてＣＤ２１陽性であった百分率によって除算することによって、各時点において残存しているＢ細胞の百分率を、各イヌについて計算した。次いで、各処置群について残存しているＢ細胞の百分率の平均を計算し、グラフ化した（図６）。
【０１００】
全ての抗体用量が、イヌにおいて十分に許容された。ＣＤ２１陽性細胞（Ｂ細胞）の百分率において顕著な用量依存的減少が観察され、１、１０または３０ｍｇ／ｋｇの１Ｅ４−ｃＩｇＧＢで処置したビーグルにおいて５９日目まで持続した。７０％より高いＢ細胞の枯渇が、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇのいずれかの１Ｅ４−ｃＩｇＧＢで処置したイヌにおいて、７日目に観察された。ＣＤ２１陽性細胞は、５９日目まで枯渇したままであり、それぞれ１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇの１Ｅ４−ｃＩｇＧＢで処置した動物において３５％および＞５０％の抑制であった。アイソタイプ対照抗体リツキサン−ｃＩｇＧＢ（１０ｍｇ／ｋｇ）または最低用量の１Ｅ４−ｃＩｇＧＢ（０．１ｍｇ／ｋｇ）のいずれかの単回用量を与えたイヌは、研究の間、ＣＤ２１陽性細胞（Ｂ細胞）の百分率における有意な変化を示さなかった。
【０１０１】
[実施例４]
Ｂ細胞リンパ腫を有するイヌの、キメラ抗イヌＣＤ２０抗体１Ｅ４−ｃＩｇＧＢによる処置
上記１Ｅ４キメライヌＩｇＧＢ抗体を、静脈内ボーラス注射を介して、適切な用量（例えば、１０ｍｇ／ｋｇ）で、Ｂ細胞リンパ腫を有するオスビーグル犬に投与する。血液を、０日目（投薬前）、および例えば、１日目、２日目、３日目、４日目、７日目、１０日目、１４日目、２８日目、４２日目および５９日目を含む種々の日において、動物から収集した。これらの血液試料から、臨床病理パラメーターをモニタリングし、各イヌにおけるＣＤ２１陽性リンパ球（Ｂ細胞）のパーセントを、Ｒ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）コンジュゲート化マウス抗イヌＣＤ２１抗体（ＡｂＤｓｅｒｏｔｅｃ、カタログ番号ＭＣＡ１７８１ＰＥ）を使用して全血から単離したＰＢＭＣに対するＦＡＣＳによって、３連で分析する。その時点におけるＣＤ２１陽性リンパ球の百分率を、０日目（投薬前）においてＣＤ２１陽性であった百分率によって除算することによって、各時点において残存しているＢ細胞の百分率を、各イヌについて計算する。次いで、各処置群について残存しているＢ細胞の百分率の平均を計算し、グラフ化して、その処置が有効であることを確認することができる。
【０１０２】
本開示は、好ましい実施形態に関して記載されてきたといえようが、バリエーションおよび改変が当業者に思い浮かぶことが理解される。従って、添付の特許請求の範囲は、特許請求された本発明の範囲内に入る全てのかかる等価なバリエーションをカバーする意図である。
【図１】
2014532649.tif 000031
【図２】
2014532649.tif 000032
【図３】
2014532649.tif 000033
【図４】
2014532649.tif 000034
【図５】
2014532649.tif 000035
【図６】
2014532649.tif 000036
【配列表】
2014532649000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年6月26日(2014.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌＣＤ２０に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、
【化１】
2014532649.tif 000037
2014532649.tif 000038
からなる群より選択される可変領域アミノ酸配列のうち少なくとも１つを含む、抗体。
【請求項２】
可変領域アミノ酸配列のうち少なくとも１つが、
ｉ）Ｎ３３およびＧ３４の一方または両方においてアミノ酸置換を含む配列番号３；
ｉｉ）Ｎ３３およびＧ３４の一方または両方においてアミノ酸置換を含む配列番号９；
ｉｉｉ）Ｎ５５およびＧ５６の一方または両方においてアミノ酸置換を含む配列番号１１；および
ｉｖ）Ｎ５５およびＧ５６の一方または両方においてアミノ酸置換を含む配列番号１５、
のうち１つであり、
置換するために使用されるアミノ酸が、アラニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アルギニン、スレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンである、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
イヌ由来の少なくとも１つの定常領域アミノ酸配列を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
イヌ由来の少なくとも１つの定常領域アミノ酸配列が、
【化２】
2014532649.tif 000039
2014532649.tif 000040
からなる群より選択されるアミノ酸配列のうち少なくとも１つを含む、請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
イヌ由来の少なくとも１つの定常領域アミノ酸配列が、Ｎ１０３、Ｎ１８３、Ｎ２７０、Ｇ１０４、Ｇ１８４およびＧ２７１のうち１つ以上においてアミノ酸置換を含む配列番号５７を含み；
置換するために使用されるアミノ酸が、アラニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アルギニン、スレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンである、請求項４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
イヌＣＤ２０に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、
【化３】
2014532649.tif 000041
2014532649.tif 000042
からなる群より選択されるイヌ由来の少なくとも１つの定常領域アミノ酸配列を含む、抗体。
【請求項７】
イヌ由来の定常領域アミノ酸配列が、Ｎ１０３、Ｎ１８３、Ｎ２７０、Ｇ１０４、Ｇ１８４およびＧ２７１のうち１つ以上においてアミノ酸置換を含む配列番号５７を含み；
置換するために使用されるアミノ酸が、アラニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アルギニン、スレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンである、請求項６に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
ＤＹＧＭＬ（配列番号２０）、ＧＦＴＦＳＤＹ（配列番号２１）、ＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＲＶＫＧ（配列番号２２）、ＳＳＧＳＳＴ（配列番号２３）、ＧＴＦＡＹ（配列番号２４）、ＲＳＳＱＳＬＩＹＮＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号２５）、ＳＱＳＬＩＹＮＮＧＮＴＹ（配列番号２６）、ＲＳＳＱＳＬＩＹＮＫＧＮＴＹＬＨ（配列番号７０）、ＳＱＳＬＩＹＮＫＧＮＴＹ（配列番号７１）、ＲＳＳＱＳＬＩＹＮＮＫＮＴＹＬＨ（配列番号７２）、ＳＱＳＬＩＹＮＮＫＮＴＹ（配列番号７３）、ＲＳＳＱＳＬＩＹＮＮＱＮＴＹＬＨ（配列番号７４）、ＳＱＳＬＩＹＮＮＱＮＴＹ（配列番号７５）、ＲＳＳＱＳＬＩＹＮＮＡＮＴＹＬＨ（配列番号７６）、ＳＱＳＬＩＹＮＮＡＮＴＹ（配列番号７７）、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号２７）、ＫＶＳ（配列番号２８）、ＳＱＳＴＨＶＰＦＴ（配列番号２９）、ＳＴＨＶＰＦ（配列番号３０）、ＤＤＹＭＨ（配列番号３１）、ＧＦＮＩＫＤＤ（配列番号３２）、ＷＩＤＰＥＮＧＨＴＫＹＡＳＫＦＱＧ（配列番号３３）、ＤＰＥＮＧＨ（配列番号３４）、ＬＲＨＹＹＧＳＳＹＶＳＰＨＹＹ（配列番号３５）、ＬＲＨＹＹＧＳＳＹＶＳＰＨＹＹ（配列番号３６）、ＫＡＳＱＮＶＧＰＮＶＡ（配列番号３７）、ＳＱＮＶＧＰＮ（配列番号３８）、ＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号３９）、ＳＡＳ（配列番号４０）、ＱＱＹＮＮＹＰＹＴ（配列番号４１）、ＹＮＮＹＰＹ（配列番号４２）、ＤＹＹＭＮ（配列番号４３）、ＧＹＴＦＴＤＹ（配列番号４４）、ＤＩＮＰＮＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号４５）、ＮＰＮＮＧＤ（配列番号４６）、ＧＧＶＬＲＹＰＹＹＹＶＭＤＹ（配列番号４７）、ＧＧＶＬＲＹＰＹＹＹＶＭＤＹ（配列番号４８）  ＲＳＮＫＳＬＬＨＲＮＧＮＴＹＬＹ（配列番号４９）、ＮＫＳＬＬＨＲＮＧＮＴＹ（配列番号５０）、ＲＭＳＮＬＡＳ（配列番号５１）、ＲＭＳ（配列番号５２）、ＭＱＨＬＥＦＰＦＴ（配列番号５３）、およびＨＬＥＦＰＦ（配列番号５４）からなる群より選択されるアミノ酸配列のうち少なくとも１つを含む、請求項６に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
イヌ動物においてリンパ腫を処置するための方法であって、請求項１に記載のモノクローナル抗体の少なくとも１回の有効用量を、動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項１０】
モノクローナル抗体が、動物の体重の約１から５０ｍｇ／ｋｇの投薬量で投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
複数回の用量が動物に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
モノクローナル抗体が、１種以上の化学療法剤と併せて投与される、請求項９に記載の方法。
【国際調査報告】
2014532649.tif 000043
2014532649.tif 000044
2014532649.tif 000045