(57)【要約】  本発明は、試料ヌクレオチド配列中のシトシン（Ｃ）と区別されるような５−メチルシトシン（５ｍＣ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）及び５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）等の修飾シトシン残基の同定に関する。方法は、試料ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの第１部分を酸化又は還元すること、ポリヌクレオチドの酸化又は還元された第１部分及び第２部分をバイサルファイトで処理すること、工程ｉｉ）及び工程ｉｉｉ）の後に集団の第１部分及び第２部分のポリヌクレオチドの配列決定を行い、第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列をそれぞれ産生すること、並びに試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列中の残基を同定することを含み得る。これらの方法は、例えば、ゲノムＤＮＡ及び／又はＲＮＡの分析において有用であろう。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）試料ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド集団を準備すること、
（ｉｉ）前記集団の第１部分を酸化又は還元すること、
（ｉｉｉ）酸化又は還元された前記集団の第１部分及び該集団の第２部分をバイサルファイトにより処理すること、
（ｉｖ）工程ｉｉ）及び工程ｉｉｉ）の後、前記集団の第１部分及び第２部分中のポリヌクレオチドの配列決定を行い、第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列をそれぞれ産生すること、並びに
（ｖ）試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列中の残基を同定すること、
を含む、試料ヌクレオチド配列中の修飾シトシン残基を同定する方法。
【請求項２】
第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列中の同定された残基が、試料ヌクレオチド配列中の対応する位置における修飾シトシンを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
修飾シトシンが、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）又は５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記集団の第１部分が工程ｉｉ）において酸化される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記酸化が５−ヒドロキシメチルシトシン残基を選択的に酸化する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程ｉｉ）がポリヌクレオチドの第１部分の複数の酸化工程及び精製工程を含む、請求項４又は請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第１部分が化学酸化剤を用いて酸化される、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
第１部分が過ルテニウム酸塩酸化剤を用いて酸化される、請求項４〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
第１部分がＫＲｕＯ４を用いて酸化される、請求項４〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する第１ヌクレオチド配列中の或る位置におけるウラシル、及び第２ヌクレオチド配列中の同一の位置におけるシトシンの同定が、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が５−ヒドロキシルメチルシトシン（５ｈｍＣ）であることを示す、請求項４〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列の両方の配列中の或る位置におけるシトシンの同定が、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が５−メチルシトシン（５ｍＣ）であることを示す、請求項４〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する第１ヌクレオチド配列中の或る位置におけるシトシンの同定が、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が５−メチルシトシン（５ｍＣ）であることを示す、請求項４〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ｖｉ）試料ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド集団の第３部分を還元すること、
ｖｉｉ）集団の還元された第３部分をバイサルファイトで処理すること、
ｖｉｉｉ）工程ｖｉ）及び工程ｖｉｉ）の後に、第３部分中のポリヌクレオチドの配列決定を行い、第３ヌクレオチド配列を産生すること、並びに
ｉｘ）試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する第３ヌクレオチド配列中の残基を同定すること、
を含む、請求項４〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
第１ヌクレオチド配列、第２ヌクレオチド配列、及び第３ヌクレオチド配列中の同定された残基が、試料ヌクレオチド配列中の対応する位置における修飾シトシンを示す、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列中の或る位置におけるウラシル、並びに第３ヌクレオチド配列中のこの位置におけるシトシンの同定が、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が５−ホルミルシトシンであることを示す、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記集団の第１部分が工程ｉｉ）において還元される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記集団の第１部分がＮａＢＨ４を用いて還元される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
試料ヌクレオチド配列中のシトシンに対応する第１ヌクレオチド配列中の或る位置におけるシトシン、及び第２ヌクレオチド配列中の同一の位置におけるウラシルの同定が、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が５−ホルミルシトシンであることを示す、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
試料ヌクレオチド配列中のシトシンに対応する第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列の両方の配列中の或る位置におけるウラシルの同定が、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が非修飾シトシンであることを示す、請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
試料ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド集団の第４部分を準備すること、及び
第４部分中のポリヌクレオチドの配列決定を行うことであって、試料ヌクレオチド配列を産生すること、
を含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
（ｉ）試料ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド集団を準備すること、
（ｉｉ）前記集団を酸化すること、
（ｉｉｉ）酸化された集団をバイサルファイトで処理すること、
（ｉｖ）工程ｉｉ）及び工程ｉｉｉ）の後に集団中のポリヌクレオチドの配列決定を行い、処理されたヌクレオチド配列を産生すること、並びに
（ｖ）試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する、処理されたヌクレオチド配列中の残基を同定すること、
を含み、
処理されたヌクレオチド配列中のシトシンの存在が、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が５−メチルシトシン（５ｍＣ）であることを示す、
試料ヌクレオチド配列中の５−メチルシトシンを同定する方法。
【請求項２２】
ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡである、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
ゲノムＤＮＡが哺乳類ゲノムＤＮＡである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
ＲＮＡがゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ又は非コーディングＲＮＡである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ゲノムＲＮＡが哺乳類、植物又はウイルスのゲノムＲＮＡである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ポリヌクレオチド集団又は集団の第１部分、第２部分、第３部分及び第４部分の１若しくは複数が固定化されている、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
集団の第１部分、第２部分、第３部分及び第４部分の１又は複数が、配列決定の前に増幅される、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
バイサルファイトによる処理の後、集団の第１部分、第２部分、第３部分の１又は複数が増幅される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれかに記載の修飾シトシン残基を同定する方法において使用されるキットであって、
（ｉ）酸化剤及び／又は還元剤、並びに
（ｉｉ）バイサルファイト試薬、
を含む、キット。
【請求項３１】
酸化剤が過ルテニウム酸塩酸化剤である、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
酸化剤が過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）である、請求項３１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾シトシン残基の検出、特に修飾シトシン残基を含む核酸の配列決定に関する。
【背景技術】
【０００２】
５−メチルシトシン（５ｍＣ）は、遺伝子サイレンシング及びゲノム安定性において重要な役割を果たし、ＣｐＧジヌクレオチドに豊富にみられる、よく研究されたエピジェネティックなＤＮＡ指標である（１）。後生動物において、５ｍＣは、ＴＥＴ（Ten-Eleven Translocation）ファミリーの酵素によって５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）に酸化され得る（２、３）。５ｈｍＣの全体的なレベルは、５ｍＣよりもおよそ１０倍低く、組織によって変動する（４）。比較的高い量の５ｈｍＣ（全シトシンの約０．４％）が胚性幹（ＥＳ）細胞に存在し、５ｈｍＣが多能性の確立及び／又は維持に関与していることが示唆されている（２、３、５〜９）。５ｈｍＣは、例えば、脱アミノ化によるか、若しくはＴＥＴ酵素による５ｈｍＣから５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）及び５−カルボキシシトシン（５ｃＣ）への更なる酸化に続く、チミン−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ）が関与する塩基除去修復を介する、活性ＤＮＡ脱メチル化における中間体として、又は複製の間に上記指標を維持することができなかったと説明されてきた（１０）。しかしながら、５ｈｍＣは、前述のエピジェネティック指標も構成し得る。
【０００３】
薄層クロマトグラフィー及びタンデム液体クロマトグラフィー−質量分析法を含む分析方法によって全ゲノムＤＮＡ中に存在する５ｈｍＣを検出し、そのレベルを定量することが可能である（２、１１、１２）。このように、その後配列決定がされるＤＮＡ断片の５ｈｍＣ特異的沈降に化学又は抗体を採用した濃縮方法によって、５ｈｍＣのゲノム配置のマッピングがこれまで達成されてきた（６〜８、１３〜１５）。これらのプルダウンアプローチは、分解能が比較的乏しく（数十〜数百ヌクレオチド）、濃縮の間の分布偏りを受けやすい相対的定量情報を与えるに過ぎない。５ｍＣの定量化可能な１ヌクレオチド配列決定はバイサルファイトシーケンシング（ＢＳ−Ｓｅｑ）を使用して行われており、これは、対応する５ｍＣの転換が非常に遅い、シトシンからウラシルへのバイサルファイト媒介脱アミノ化を利用する（１６）。しかしながら、５ｍＣ及び５ｈｍＣは、バイサルファイト反応において両方とも非常にゆっくりと脱アミノ化され、そのためこれら２種の塩基を区別することはできないとされている（１７、１８）。２つの比較的新しく簡潔な一分子法が、一ヌクレオチド分解能での５ｍＣ及び５ｈｍＣの検出に有望であるとされてきた。一分子リアルタイムシーケンシング（ＳＭＲＴ）は、ゲノムＤＮＡ中の誘導体化された５ｈｍＣを検出することを示した（１９）。しかしながら、５ｈｍＣを含むＤＮＡ断片の濃縮が必要とされ、これは定量情報の喪失を招く（１９）。５ｍＣは、精度がより低いものの、ＳＭＲＴによって検出され得る（１９）。さらに、ＳＭＲＴは比較的高い配列決定エラー率を有し（２０）、修飾のピークコーリングが不正確であり（１９）、このプラットフォームではいまだ全ゲノムの配列決定は行われていない。タンパク質及び固体ナノポアは、５ｈｍＣから５ｍＣを分割することができ、更なる開発によって未増幅のＤＮＡ分子の配列決定をする可能性を有している（２１、２２）。
【発明の概要】
【０００４】
本発明者らは、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）及び５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）等の修飾シトシン残基を、一ヌクレオチド分解能においてシトシン（Ｃ）と区別することを可能とする方法を考案した。
【０００５】
これらの方法は、全ての配列決定プラットフォームに適用可能であり、例えば、ゲノムＤＮＡ及び／又はＲＮＡの分析に有用であろう。
【０００６】
本発明の一態様は、
（ｉ）試料ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド集団を準備すること、
（ｉｉ）上記集団の第１部分を酸化又は還元すること、
（ｉｉｉ）酸化又は還元された上記集団の第１部分及び上記集団の第２部分をバイサルファイトにより処理すること、
（ｉｖ）工程ｉｉ）及び工程ｉｉｉ）の後、集団の第１部分及び第２部分中のポリヌクレオチドの配列決定を行い、第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列をそれぞれ産生すること、並びに
（ｖ）試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列中の残基を同定すること、
を含む、試料ヌクレオチド配列中の修飾シトシン残基を同定する方法を提供する。
【０００７】
試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列中に同定された残基は、シトシン残基の修飾を示す。
【０００８】
例えば、シトシン残基は、試料核酸配列中の１又は複数の位置に存在し得る。第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列中のこれら１又は複数の位置における残基が同定され得る。試料ヌクレオチド配列中の或る位置における修飾シトシンは、第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列中においてその位置でそれぞれ同定された残基の組み合わせ（すなわち、Ｃ及びＣ、Ｕ及びＵ、Ｃ及びＵ、又はＵ及びＣ）から同定され得る。種々の組み合わせにより示されるシトシン修飾を表１に示す。
【０００９】
修飾シトシン残基は５位における修飾を含んでもよい。好適な修飾シトシンとして、５−置換シトシンが挙げられる。
【００１０】
シトシンの５位において置換され得る基としては、メチル基（ｍ）、ヒドロキシメチル基（ｈｍ）又はホルミル基（ｆ）が挙げられる。
【００１１】
本明細書中に記載される方法は、試料ヌクレオチド配列中のシトシン（Ｃ）、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）及び５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）の同定及び／又は区別に有用であろう。例えば、本明細書に記載される方法は、シトシン（Ｃ）、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）及び５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）からなる群からの１つの残基と、上記群の他の残基との区別に有用であろう。
【００１２】
上記集団中の第１部分における５−ヒドロキシメチルシトシン等の修飾シトシン残基は、工程ｉｉ）の酸化又は還元の前に、例えばグルコース等の置換基で標識化されていないことが好ましい。
【００１３】
本発明のいくつかの実施の形態において、集団に由来するポリヌクレオチドの第１部分は酸化されていてもよい。例えば、ポリヌクレオチドの第１部分中の５−ヒドロキシメチルシトシン残基は、酸化により５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）へと変換され、ポリヌクレオチドの第１部分は、その後、バイサルファイトにより処理されてもよい。
【００１４】
試料ヌクレオチド配列中の修飾シトシン残基を同定する方法は、
（ｉ）試料ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド集団を準備すること、
（ｉｉ）上記集団の第１部分を酸化すること、
（ｉｉｉ）酸化された上記集団の第１部分及び上記集団の第２部分をバイサルファイトにより処理すること、
（ｉｖ）工程ｉｉ）及び工程ｉｉｉ）の後、集団の第１部分及び第２部分中のポリヌクレオチドの配列決定を行い、第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列をそれぞれ産生すること、並びに
（ｖ）試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列中の残基を同定すること、
を含んでもよい。
【００１５】
第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列の一方又は両方の配列中の或る位置における残基の第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列中の一方又は両方におけるシトシンとしての同定は、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が５−メチルシトシン又は５−ヒドロキシメチルシトシンであること示す。
【００１６】
５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）は、試料ヌクレオチド配列中に同定され得る。試料ヌクレオチド配列中のシトシンに対応する第１ヌクレオチド配列中の或る位置におけるウラシル残基、及び第２ヌクレオチド配列中の同一の位置におけるシトシンは、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が５−ヒドロキシルメチルシトシン（５ｈｍＣ）であることを示す。
【００１７】
例えば、試料ヌクレオチド配列中の５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を同定する方法又は試料ヌクレオチド配列中で５−ヒドロキシメチルシトシンをシトシン（Ｃ）、５−メチルシトシン及び５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）と区別する方法は、
（ｉ）試料ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド集団を準備すること、
（ｉｉ）上記集団の第１部分を酸化すること、
（ｉｉｉ）酸化された上記集団の第１部分及び上記集団の第２部分をバイサルファイトで処理すること、
（ｉｖ）工程ｉｉ）及び工程ｉｉｉ）の後に集団の第１部分及び第２部分中のポリヌクレオチドの配列決定を行い、第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列をそれぞれ産生すること、並びに
（ｖ）試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する、第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列中の残基を同定すること、
を含んでもよく、
第１ヌクレオチド配列中のウラシル残基及び第２ヌクレオチド配列中のシトシンの存在が、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が５−ヒドロキシメチルシトシンであることを示す。
【００１８】
５−メチルシトシン（５ｍＣ）は、試料ヌクレオチド配列中に同定され得る。試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列の両方の配列中の或る位置におけるシトシンは、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が５−メチルシトシン（５ｍＣ）であることを示す。
【００１９】
例えば、試料ヌクレオチド配列中の５−メチルシトシンを同定する方法又は試料ヌクレオチド配列中で５−メチルシトシンをシトシン（Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）及び５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）と区別する方法は、
（ｉ）試料ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド集団を準備すること、
（ｉｉ）上記集団の第１部分を酸化すること、
（ｉｉｉ）酸化された上記集団の第１部分及び上記集団の第２部分をバイサルファイトで処理すること、
（ｉｖ）工程ｉｉ）及び工程ｉｉｉ）の後に集団の第１部分及び第２部分中のポリヌクレオチドの配列決定を行い、第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列をそれぞれ産生すること、並びに
（ｖ）試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する、第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列中の残基を同定すること、
を含んでもよく、
第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列の両方の配列中のシトシンの存在が試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が５−メチルシトシン（５ｍＣ）であることを示す。
【００２０】
試料ヌクレオチド配列中のシトシンに対応する第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列の両方の配列中の或る位置におけるウラシル残基は、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が５−メチルシトシン又は５−ヒドロキシメチルシトシンではないこと、すなわち、上記シトシン残基が非修飾シトシン又は５−ホルミルシトシンであることを示す。
【００２１】
第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列中の或る位置におけるシトシン及びウラシルの特定の組み合わせにより示される試料ヌクレオチド配列中のその位置におけるシトシン修飾の要約を表１に示す。
【００２２】
ポリヌクレオチド集団の第１部分及び第２部分は、バイサルファイトで処理されてもよく、及び／又は同時に若しくは逐次に配列決定されてもよい。
【００２３】
第１部分が工程ｉｉ）において酸化されるいくつかの実施の形態において、第２部分の処理は、試料ヌクレオチド配列中の修飾シトシン残基の同定又は区別に必要でなくてもよい。例えば、表１は、試料ヌクレオチド配列中の５−メチルシトシンを同定するためにはポリヌクレオチド集団の第１部分の酸化及びバイサルファイト処理で十分であることを示している。試料ヌクレオチド配列中の５−メチルシトシンを同定する方法又は試料ヌクレオチド配列中で５−メチルシトシンをシトシン（Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）及び５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）と区別する方法は、
（ｉ）試料ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド集団を準備すること、
（ｉｉ）上記集団を酸化すること、
（ｉｉｉ）酸化された集団をバイサルファイトで処理すること、
（ｉｖ）工程ｉｉ）及び工程ｉｉｉ）の後に集団中のポリヌクレオチドの配列決定を行い、処理されたヌクレオチド配列を産生すること、並びに
（ｖ）試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する、処理されたヌクレオチド配列中の残基を同定すること、
を含んでもよく、処理されたヌクレオチド配列中のシトシンの存在が、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が５−メチルシトシン（５ｍＣ）であることを示す。
【００２４】
本発明のいくつかの実施の形態において、集団に由来するポリヌクレオチドの第１部分は、工程ｉｉ）において還元されてもよい。試料ヌクレオチド配列中の修飾シトシン残基を同定する方法は、
（ｉ）試料ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド集団を準備すること、
（ｉｉ）上記集団の第１部分を還元すること、
（ｉｉｉ）還元された上記集団の第１部分及び上記集団の第２部分をバイサルファイトにより処理すること、
（ｉｖ）工程ｉｉ）及び工程ｉｉ）の後、集団の第１部分及び第２部分中のポリヌクレオチドの配列決定を行い、第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列をそれぞれ産生すること、並びに
（ｖ）試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列中の残基を同定すること、
を含んでもよい。
【００２５】
これは、試料ヌクレオチド配列中の５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）の同定及び／又は区別に有用であろう。
【００２６】
第１部分が還元される実施の形態において、試料ヌクレオチド配列中のシトシンに対応する第１ヌクレオチド配列中の或る位置におけるシトシン、及び第２ヌクレオチド配列中のこの位置におけるウラシル残基は、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が５−ホルミルシトシンであることを示し、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列中の或る位置におけるウラシルは、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が非修飾シトシンであることを示し、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列の両方の配列中の或る位置におけるシトシン残基は、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が５−メチルシトシン（５ｍＣ）又は５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）であることを示す。
【００２７】
第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列中の或る位置におけるシトシン及びウラシルの特定の組み合わせによって示される試料ヌクレオチド配列中のその位置におけるシトシン修飾の要約を表１に示す。
【００２８】
いくつかの実施の形態において、本発明の方法は、酸化されバイサルファイト処理されたポリヌクレオチドの第１部分、バイサルファイト処理されたポリヌクレオチドの第２部分、及び還元されバイサルファイト処理された集団に由来するポリヌクレオチドの第３部分の配列決定をすることを含んでもよい。例えば、方法は、
（ｉ）試料ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド集団を準備すること、
（ｉｉ）上記集団の第１部分、第２部分及び第３部分を準備すること、
（ｉｉｉ）上記集団の第１部分を酸化すること、
（ｉｖ）上記集団の第３部分を還元すること、
（ｖ）上記集団の第１部分、第２部分及び第３部分をバイサルファイトで処理すること、
（ｖｉ）上記集団の第１部分、第２部分及び第３部分中のポリヌクレオチドを、工程ｉｉｉ）、工程ｉｖ）及び工程ｖ）の後に配列決定を行い、第１ヌクレオチド配列、第２ヌクレオチド配列及び第３ヌクレオチド配列をそれぞれ産生すること、並びに
（ｖｉｉ）試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する第１ヌクレオチド配列、第２ヌクレオチド配列及び第３ヌクレオチド配列中の残基を同定すること、
を含んでもよい。
【００２９】
これは、例えば試料ヌクレオチド配列中の５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）の同定、及び／又はシトシン及び／又はその他の修飾シトシンと５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）との区別に有用であろう。
【００３０】
試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列中の或る位置におけるウラシル、及び第３ヌクレオチド配列中のこの位置におけるシトシンは、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が５−ホルミルシトシンであることを示す。
【００３１】
試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する第１ヌクレオチド配列、第２ヌクレオチド配列及び第３ヌクレオチド配列中の或る位置におけるシトシンは、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が５−メチルシトシン（５ｍＣ）であることを示す。
【００３２】
試料ヌクレオチド配列中のシトシンに対応する第２ヌクレオチド配列及び第３ヌクレオチド配列中の或る位置におけるシトシン、及び第１ヌクレオチド配列中のこの位置におけるウラシル残基は、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が５−ヒドロキシメチルシトシンであることを示す。
【００３３】
試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基に対応する第１ヌクレオチド配列、第２ヌクレオチド配列及び第３ヌクレオチド配列中の或る位置におけるウラシルは、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基が非修飾シトシンであることを示す。
【００３４】
第１ヌクレオチド配列、第２ヌクレオチド配列及び第３ヌクレオチド配列中の或る位置におけるシトシン及びウラシルの特定の組み合わせによって示される試料ヌクレオチド配列中のその位置におけるシトシン修飾の要約を表１に示す。
【００３５】
試料ヌクレオチド配列は、既知であってもよく、又は決定されてもよい。試料ヌクレオチド配列は、集団中の未処理のポリヌクレオチド、すなわち、酸化、還元又はバイサルファイト処理されていないポリヌクレオチドの配列である。試料ヌクレオチド配列において、修飾シトシンはシトシンと区別されない。５−メチルシトシン、５−ホルミルシトシン及び５−ヒドロキシメチルシトシンは、全て、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基として示されるか、又は同定される。例えば、本明細書に記載される任意の方法は、
試料ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド集団の第４部分を準備することと、
第４部分中のポリヌクレオチドを配列決定することであって、試料ヌクレオチド配列を産生することと、
を更に含んでもよい。
【００３６】
第４部分中のポリヌクレオチドの配列は、任意の適切な配列決定手法により決定されてもよい。
【００３７】
試料ヌクレオチド配列中の１又は複数のシトシン残基の位置を決定してもよい。これは、標準的な配列分析により行われ得る。修飾シトシンがシトシンと区別されないため、試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基は、シトシン、５−メチルシトシン、５−ホルミルシトシン、又は５−ヒドロキシメチルシトシンである可能性がある。
【００３８】
第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列、並びに任意に第３ヌクレオチド配列を、試料ヌクレオチド配列と比較してもよい。例えば、試料ヌクレオチド配列中の１又は複数のシトシン残基に対応する第１配列及び第２配列、並びに任意に第３ヌクレオチド配列中の位置における残基が同定されてもよい。
【００３９】
試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基の修飾は、第１ヌクレオチド配列及び第２ヌクレオチド配列中、並びに任意に第３ヌクレオチド配列中の対応する位置におけるヌクレオチドの同一性から決定され得る。
【００４０】
集団中のポリヌクレオチドは全て、同じ試料ヌクレオチド配列を含み、すなわち、上記試料ヌクレオチド配列は集団中の全てのポリヌクレオチドにおいて同一である。
【００４１】
したがって試料ヌクレオチド配列内のシトシン残基に対する異なる処理の効果を、本明細書に記載されるように決定することができる。
【００４２】
試料ヌクレオチド配列はゲノム配列であってもよい。例えば、上記配列は、エキソン、イントロン若しくは上流若しくは下流の調節因子を含む遺伝子配列の全て若しくは一部を含んでもよく、又は上記配列は遺伝子と関連していないゲノム配列を含んでもよい。いくつかの実施の形態において、試料ヌクレオチド配列は１又は複数のＣｐＧアイランドを含んでもよい。
【００４３】
好適なポリヌクレオチドとして、ＤＮＡ、好ましくはゲノムＤＮＡ、及び／又はゲノムＲＮＡ（例えば、哺乳類ゲノムＲＮＡ、植物ゲノムＲＮＡ又はウイルスゲノムＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ及び非コーディングＲＮＡ等のＲＮＡが挙げられる。
【００４４】
試料ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、細胞、例えば、哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞の試料から取得又は単離されてもよい。
【００４５】
好適な試料として、生検材料等の単離細胞及び組織試料が挙げられる。
【００４６】
５ｈｍＣ及び５ｆＣを含む修飾シトシン残基は、胚性幹細胞（ＥＳＣＳ）及び神経細胞を含む細胞種の範囲で検出されている（２、３、１１、３７、３８）。
【００４７】
好適な細胞として、体細胞及び生殖系細胞が挙げられる。
【００４８】
好適な細胞は、完全に若しくは部分的に分化した細胞又は未分化細胞又は成体幹細胞若しくは体性幹細胞、胎児幹細胞若しくは胚性幹細胞等の幹細胞を含む多能性細胞を含む任意の発生段階であってもよい。
【００４９】
また、好適な細胞として、標準的な手法に従って任意の体細胞種から得ることができる人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）も挙げられる。
【００５０】
例えば、試料ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、ニューロン及びグリア細胞を含む神経細胞、収縮筋細胞、平滑筋細胞、肝細胞、ホルモン合成細胞、脂腺細胞、膵島細胞、副腎皮質細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞及び尿路上皮細胞、骨細胞、並びに軟骨細胞から取得又は単離されてもよい。
【００５１】
好適な細胞としては、疾患関連細胞、例えば、癌腫、肉腫、リンパ腫、芽腫又は生殖系腫瘍細胞等のがん細胞が挙げられる。
【００５２】
好適な細胞としては、ハンチントン病、嚢胞性線維症、鎌状赤血球症、フェニルケトン尿症、ダウン症候群又はマルファン症候群等の遺伝性障害の遺伝子型を有する細胞が挙げられる。
【００５３】
細胞試料からゲノムＤＮＡ及びゲノムＲＮＡを抽出及び単離する方法は、当該技術分野において既知である。例えば、ゲノムＤＮＡ又はゲノムＲＮＡは、フェノール／クロロホルム抽出並びにアルコール沈殿、塩化セシウム密度勾配遠心法、固相陰イオン交換クロマトグラフィー及びシリカゲルによる手法等の任意の簡便な単離手法を用いて単離され得る。
【００５４】
いくつかの実施の形態において、細胞から単離された全ゲノムＤＮＡ及び／又は全ゲノムＲＮＡを、単離後に、本明細書に記載されるポリヌクレオチド集団として直接使用してもよい。他の実施の形態において、単離されたゲノムＤＮＡ及び／又はゲノムＲＮＡは、更なる調製工程に供されてもよい。
【００５５】
ゲノムＤＮＡ及び／又はゲノムＲＮＡは、例えば、超音波処理、剪断又はエンドヌクレアーゼ消化により断片化されて、ゲノムＤＮＡ断片を産生してもよい。ゲノムＤＮＡ及び／又はゲノムＲＮＡの画分は、本明細書に記載されるように使用されてもよい。ゲノムＤＮＡ及び／又はゲノムＲＮＡの好適な画分は、サイズ又は他の基準に基づいてもよい。本明細書に記載されるように、いくつかの実施の形態においては、ＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）が豊富なゲノムＤＮＡ断片及び／又はゲノムＲＮＡ断片の画分が使用されてもよい。
【００５６】
ゲノムＤＮＡ及び／又はゲノムＲＮＡは、例えば、加熱又は変性試薬による処理によって変性されてもよい。ゲノムＤＮＡ及びゲノムＲＮＡの好適な変性方法は、当該技術分野において既知である。
【００５７】
いくつかの実施の形態において、ゲノムＤＮＡ及び／又はゲノムＲＮＡは、酸化若しくは還元及びバイサルファイト処理、又はバイサルファイト処理単独の前に配列決定に合わせて適合されてもよい。適合の特質は、採用される配列決定法に依存する。例えば、いくつかの配列決定法については、断片化の後に、ゲノムＤＮＡ断片及び／又はゲノムＲＮＡ断片の遊離末端にプライマーが連結されてもよい。好適なプライマーは、本明細書に記載される酸化若しくは還元及びバイサルファイト処理、又はバイサルファイト処理単独の間の変更からプライマー配列を保護する５ｍＣを含んでもよい。他の実施の形態において、ゲノムＤＮＡ及び／又はゲノムＲＮＡは、本明細書に記載される酸化、還元及び／又はバイサルファイト処理の後に配列決定に合わせて適合されてもよい。
【００５８】
分画工程、変性工程、適合工程及び／又は他の調製工程の後、ゲノムＤＮＡ及び／又はゲノムＲＮＡを任意の簡便な手法により精製してもよい。
【００５９】
調製の後に、ポリヌクレオチド集団は、本明細書に記載される更なる処理に好適な形態で供給されてもよい。例えば、ポリヌクレオチド集団は、本明細書に記載される処理の前に緩衝剤を含まない水溶液中にあってもよい。
【００６０】
本明細書に記載される使用するポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。
【００６１】
ポリヌクレオチド集団は、２、３、４又はそれ以上の別々の部分に分けられてもよく、各々が試料ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含有する。本明細書に記載されるように、これらの部分は独立して処理され、配列決定されてもよい。
【００６２】
ポリヌクレオチドのこれらの部分は、酸化及び／又は還元の前に、試料ヌクレオチド配列中の５−ヒドロキシメチルシトシン残基に標識又はグルコース等の置換基を付加するために処理されないことが好ましい。
【００６３】
試料ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド集団の第１部分が酸化されてもよい。酸化は、試料ヌクレオチド配列中の任意の５−ヒドロキシメチルシトシンを５−ホルミルシトシンへと変換する。酸化は、好ましくは変性条件下で、例えば有機又は無機化学酸化剤を用いる、非酵素媒介酸化であってもよい。
【００６４】
第１部分は、酸化剤による処理によって酸化され得る。酸化剤は、アルコールからアルデヒドを生成するために好適な任意の薬剤である。酸化工程に採用される酸化剤又は条件は、任意の５−ヒドロキシメチルシトシンが選択的に酸化されるように選択され得る。このように、ポリヌクレオチド中の他のいかなる官能性も酸化工程において実質的に酸化されない。したがって、酸化工程は、かかる酸化剤又は条件（such）が存在する場合、結果的にいかなるチミン残基又は５−メチルシトシン残基の反応も生じない。薬剤又は条件は、ポリヌクレオチドのあらゆる分解を最小化する又は防ぐように選択される。
【００６５】
酸化剤の使用は、結果的にいくつかの対応する５−カルボキシシトシン産物の形成を生じ得る。この産物の形成は、本明細書に記載される同定方法に悪影響を与えない。５−ホルミルシトシンをウラシルに変換するために使用されるバイサルファイト反応条件下において、５−カルボキシシトシンもまたウラシルに変換されることが観察される。５−ヒドロキシメチルシトシンの酸化により得られた５−ホルミルシトシンに対する参照は、これもまた上記酸化により得られる５−カルボキシシトシンを含む産物に対する参照となり得ることが理解される。
【００６６】
酸化剤は、例えば、有機又は無機化合物の非酵素酸化剤であってもよい。
【００６７】
好適な酸化剤は当該技術分野において既知であり、ＫＲｕＯ４、ＭｎＯ２及びＫＭｎＯ４等の金属酸化物が挙げられる。特に有用な酸化剤は、それ自身がポリヌクレオチドの取り扱いに最も都合のよい、水性条件において使用され得るものである。しかしながら、有機溶媒中での使用に好適な酸化剤も実施可能な場合には採用されてもよい。
【００６８】
いくつかの実施の形態において、酸化剤は、過ルテニウム酸陰イオン（ＲｕＯ４−）を含んでもよい。好適な過ルテニウム酸塩酸化剤として、過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）等の有機及び無機過ルテニウム酸塩及び他の金属過ルテニウム酸塩；過ルテニウム酸テトラプロピルアンモニウム（ＴＰＡＰ）及び過ルテニウム酸テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＰ）等の過ルテニウム酸テトラアルキルアンモニウム；重合体担持過ルテニウム酸塩（ＰＳＰ）及びルテニウム酸テトラフェニルホスホニウムが挙げられる。
【００６９】
また、有利には、酸化剤又は酸化条件は、変性状態でポリヌクレオチドを保存し得る。
【００７０】
酸化剤による処理の後、第１部分中のポリヌクレオチドは精製されてもよい。
【００７１】
精製は、任意の簡便な核酸精製手法を用いて行われてもよい。好適な核酸精製手法として、スピンカラムクロマトグラフィーが挙げられる。
【００７２】
ポリヌクレオチドは、さらに繰り返し酸化工程に供されてもよい。かかる工程は、５−ヒドロキシシトシンの５−ホルミルシトシンへの変換を最大化するために行われる。これは、ポリヌクレオチドが、再アニーリングが十分可能な二次構造を有する場合に必要となるであろう。ポリヌクレオチドの任意のアニーリングされた部分が、上記構造のその部分への酸化剤の接近を制限し又は妨げ、これは５−ヒドロキシシトシンを酸化から保護する効果を有する。
【００７３】
いくつかの実施の形態において、ポリヌクレオチド集団の第１部分は、例えば、複数サイクルの酸化剤による処理に続き、精製に供されてもよい。例えば、１サイクル、２サイクル、３サイクル又は３サイクルを超えて行われてもよい。
【００７４】
いくつかの実施の形態において、試料ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド集団の第１部分が還元され得る。他の実施の形態において、試料ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド集団の第３部分が還元され得る。ポリヌクレオチドの第１部分又は第３部分の還元は、試料ヌクレオチド配列中の５−ホルミルシトシン残基を５−ヒドロキシメチルシトシンへと変換する。
【００７５】
ポリヌクレオチドの第１部分又は第３部分は、還元剤による処理によって還元され得る。還元剤は、アルデヒドからアルコールを生成するために好適な任意の薬剤である。還元工程に採用される還元剤又は条件は、任意の５−ホルミルシトシンが選択的に還元されるように選択され得る（すなわち、還元剤又は還元条件が５−ホルミルシトシンに選択的である）。このように、ポリヌクレオチド中の他のいかなる官能性も還元工程において実質的に還元されない。還元剤又は条件は、ポリヌクレオチドのあらゆる分解を最小化又は防ぐように選択される。
【００７６】
好適な還元剤は当該技術分野において既知であり、ＮａＢＨ４、ＮａＣＮＢＨ４及びＬｉＢＨ４が挙げられる。特に有用な還元剤は、それ自身がポリヌクレオチドの取り扱いに最も都合のよい、水性条件下で使用され得るものである。しかしながら、有機溶媒中での使用に好適な還元剤も実施可能な場合には採用されてもよい。
【００７７】
酸化及び還元の後、それぞれ、集団の第１部分、及び任意に第３部分をバイサルファイトにより処理する。酸化又は還元されていない集団の第２部分も、バイサルファイトで処理する。
【００７８】
バイサルファイト処理は、ポリヌクレオチド中のシトシン残基及び５−ホルミルシトシン残基の両方をウラシルに変換する。上記のように、任意の５−カルボキシシトシンが存在する場合（酸化工程の産物として）、この５−カルボキシシトシンは、バイサルファイト処理においてウラシルへと変換される。理論に拘束されることを望むものではないが、５−ホルミルシトシンの反応はホルミル基を失うことによって進行してシトシンを生じ、続いて、その後の脱アミノ化によりウラシルが得られると考えられる。５−カルボキシシトシンは、一連の脱炭酸工程及び脱アミノ化工程を通してウラシルを生じると考えられる。バイサルファイト処理は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド中のシトシン残基と、５−ホルミルシトシン残基又は５−カルボキシシトシン残基との両方をウラシルへと変換する条件下で行われ得る。
【００７９】
集団のこれらの部分を、亜硫酸水素イオン（ＨＳＯ３２−）と共にインキュベーションすることによってバイサルファイトで処理してもよい。
【００８０】
核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換する亜硫酸水素イオン（ＨＳＯ３２−）の使用は、当該技術分野において標準的であり、好適な試薬及び条件は当業者に既知である（３９〜４２）。また、数多くの好適なプロトコル及び試薬が商業的に入手可能である（例えば、ＥｐｉＴｅｃｔ（商標）（Qiagen NL）、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（商標）（Zymo Research Corp CA）、ＣｐＧｅｎｏｍｅ  Ｔｕｒｂｏ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Millipore））。
【００８１】
本明細書に記載される方法の特徴は、非メチル化シトシン（ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて５−ホルミルシトシン又は５−カルボキシシトシンから生成され得る）のウラシルへの変換である。この反応は、典型的には、バイサルファイトの使用を通して達成される。しかしながら、本発明の一般的な態様において、シトシンのウラシルへの変換をもたらすため、任意の試薬又は反応条件を使用してもよい。５−メチルシトシンがほとんど反応しないか、又は全く反応しないよう、より具体的には５−メチルシトシンが反応してもウラシルがほとんど形成されないか、又は全く形成されないよう、かかる試薬及び条件を選択する。また、この試薬又は任意の更なる試薬が、５−ホルミルシトシン又は５−カルボキシシトシンのシトシン又はウラシルへの変換をもたらしてもよい。
【００８２】
インキュベーションの後、ポリヌクレオチドのこれらの部分は、必要に応じて、固定化され、洗浄され、脱スルホン化され（desulfonated）、溶出され、及び／又はその他の処理が為されてもよい。
【００８３】
いくつかの実施の形態において、集団に由来するポリヌクレオチドの第１部分、第２部分及び第３部分は、上述の処理の後に増幅されてもよい。これは、更なる操作及び／又は配列決定を容易にし得る。ポリヌクレオチドの第１部分、第２部分及び第３部分における配列変化は、増幅の後に保存される。好適なポリヌクレオチド増幅手法は、当該技術分野において既知であり、ＰＣＲが挙げられる。ポリヌクレオチドの第１部分、第２部分及び／又は第３部分中の或る位置におけるウラシル（Ｕ）残基の存在は、対応する増幅されたポリヌクレオチド中のその位置におけるチミン（Ｔ）残基の存在により示され得るか、又は同定され得る。
【００８４】
上述のように、ポリヌクレオチドは、酸化、還元及び／又はバイサルファイト処理の後に配列決定手法又は配列決定プラットフォームと互換性となるように適合されてもよい。適合の特質は、配列決定手法又は配列決定プラットフォームに依存する。例えばソレクサ−イルミナ（Solexa-Illumina）シーケンシングでは、処理されたポリヌクレオチドは、例えば超音波処理又は制限エンドヌクレアーゼ処理によって断片化されていてもよく、必要に応じてポリヌクレオチドの遊離末端が修復されてもよく、また末端にプライマーが連結されてもよい。
【００８５】
ポリヌクレオチドは、サンガーシーケンシング（４３）、ソレクサ−イルミナシーケンシング（４４）、ライゲーションベースシーケンシング（ＳＯＬｉＤ（商標））（４５）、ピロシーケンシング（４６）、ストローブシーケンシング（ＳＭＲＴ（商標））（４７、４８）、及び半導体アレイシーケンシング（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標））（４９）を含む、任意の簡便な低スループット又は高スループットの配列決定手法又は配列決定プラットフォームを用いて配列決定されてもよい。
【００８６】
ポリヌクレオチドの配列決定に好適なプロトコル、試薬及び器具は、当該技術分野において既知であり、商業的に入手可能である。
【００８７】
試料ヌクレオチド配列中のシトシンに対応する第１ヌクレオチド配列、第２ヌクレオチド配列及び／又は第３ヌクレオチド配列中の位置における残基が同定され得る。
【００８８】
上述のように、試料ヌクレオチド配列中の或る位置におけるシトシン残基の修飾が、第１ヌクレオチド配列、第２ヌクレオチド配列、及び任意に第３ヌクレオチド配列中の対応する位置における残基の同一性から決定され得る。
【００８９】
試料ヌクレオチド配列中のシトシン修飾の程度及び量が決定され得る。例えば、非修飾シトシンと比較した試料ヌクレオチド配列中の５−ヒドロキシメチルシトシン及び／又は５−メチルシトシンの割合又は量が決定され得る。
【００９０】
本明細書に記載されるポリヌクレオチド、例えば、ポリヌクレオチド集団、又は集団の第１部分、第２部分、第３部分及び第４部分の１つ、２つ、３つ又は４つ全てが、固形支持体上に固定化されてもよい。
【００９１】
固形支持体は、ポリヌクレオチドが固定化され得る表面を提示する不溶性で非ゼラチン質のボディ（body）である。好適な支持体の例として、ガラススライド、マイクロウェル、メンブレン、又はマイクロビーズが挙げられる。上記支持体は、微粒子形態、又は、例えば、プレート、試験管、ビーズ、ボール、フィルター、織物、ポリマー又はメンブレンを含む固体形態であってもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、不活性ポリマー、９６ウェルプレート、核酸配列決定又は他の調査状況において使用される他の装置、器具又は材料に固定されてもよい。固形支持体表面へのポリヌクレオチドの固定化は、当該技術分野において既知である。いくつかの実施の形態において、固形支持体それ自身が固定化されてもよい。例えば、マイクロビーズは二次固体表面上に固定化されてもよい。
【００９２】
いくつかの実施の形態において、ポリヌクレオチド集団の第１部分、第２部分、第３部分及び／又は第４部分は、配列決定の前に増幅されてもよい。ポリヌクレオチドのこれらの部分は、バイサルファイトによる処理の後に増幅されることが好ましい。
【００９３】
好適なポリヌクレオチドの増幅方法は、当該技術分野において既知である。
【００９４】
増幅の後、ポリヌクレオチド集団の増幅された部分が配列決定され得る。
【００９５】
ヌクレオチド配列が比較されてもよく、また試料ヌクレオチド配列中のシトシンに対応する第１ヌクレオチド配列、第２ヌクレオチド配列及び／又は第３ヌクレオチド配列中の位置における残基が、コンピューターによる（computer-based）配列分析を用いて同定されてもよい。
【００９６】
ＣｐＧアイランド等の閾値よりも大きいシトシン修飾を有するヌクレオチド配列が同定され得る。例えば、１％超、２％超、３％超、４％超、又は５％超のシトシンがヒドロキシメチル化されている１又は複数のヌクレオチド配列が同定され得る。
【００９７】
任意の簡便なコンピューターシステム及びソフトウェアを用いて、コンピューターによる配列分析を行ってもよい。典型的なコンピューターシステムは、中央処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段及びデータ保存手段（ＲＡＭ等）を備える。モニター又は他の画像ディスプレイが設けられることが好ましい。上記コンピューターシステムは、制御可能にＤＮＡ及び／又はＲＮＡシーケンサーに接続されてもよい。
【００９８】
例えば、コンピューターシステムは、本明細書に記載される、第１ヌクレオチド配列、第２ヌクレオチド配列及び／又は第３ヌクレオチド配列との比較により試料ヌクレオチド配列中の修飾シトシンを同定するように適合されたプロセッサーを備えてもよい。例えば、上記プロセッサーは、
（ａ）試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基の位置を同定して、
（ｂ）試料ヌクレオチド配列中のシトシン残基のその位置における第１ヌクレオチド配列、第２ヌクレオチド配列及び／又は第３ヌクレオチド配列中の残基を同定して、
（ｃ）上記残基の同一性から試料ヌクレオチド配列中のその位置におけるシトシン残基の修飾の有無を決定するように適合されてもよい。
【００９９】
試料ヌクレオチド配列、並びに第１ヌクレオチド配列、第２ヌクレオチド配列及び第３ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡシーケンサーから自動的にプロセッサーに入れられてもよい。配列は、例えばモニター上に提示されてもよい。
【０１００】
上記コンピューターシステムは、データを保存する記憶装置を更に備えてもよい。ゲノム配列等のヌクレオチド配列、並びに５ｆＣ、５ｈｍＣ及び他の修飾シトシン残基の位置は、別の又は同一の記憶装置に保存されてもよく、及び／又は出力装置に送られるか、若しくはモニター上に提示されてもよい。これは、ゲノムＤＮＡ中の５ｈｍＣ及び５ｆＣ等の修飾シトシンのマッピングを容易にするであろう。
【０１０１】
ゲノム中の５ｆＣ及び５ｈｍＣ等のシトシン修飾の同定及びマッピングは、神経発達及び機能、並びに細胞分化、分裂及び増殖の研究、また癌等の疾患の予後診断及び診断に有用であろう。
【０１０２】
したがって、本明細書に記載される方法を用いた５ｆＣ及び５ｈｍＣ等の修飾シトシンの同定及び／又はマッピングは、疾患において有用であろう。
【０１０３】
本発明のその他の態様は、上述の試料ヌクレオチド配列中の修飾シトシン残基を同定する方法において使用されるキットであって、
酸化剤及び／又は還元剤、並びに
バイサルファイト試薬、
を含む、キットを提供する。
【０１０４】
好適な酸化剤、還元剤及びバイサルファイト試薬は、上述の通りである。
【０１０５】
キットは、例えば、シトシン（Ｃ）、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）又は５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）の１又は複数の修飾シトシン残基を含むコントロールポリヌクレオチド集団をさらに含んでもよい。いくつかの実施の形態において、コントロールポリヌクレオチド集団は、１又は複数の部分に分けられてもよく、各部分は異なる修飾シトシン残基を含む。
【０１０６】
上記キットは、上述の修飾シトシン残基を同定する方法に使用される指示書を含んでもよい。
【０１０７】
キットは、緩衝溶液、配列決定試薬及びその他の試薬等の上記方法に必要な１又は複数の他の試薬を含んでもよい。修飾シトシンの同定に使用されるキットは、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの単離用試薬及び精製用試薬を含む、試験試料そのものを供給する手段、並びに試料を扱う容器（かかる構成要素は通常滅菌されている）等の上記方法を実施するための１又は複数の物品及び／又は試薬を含んでもよい。
【０１０８】
本明細書の開示を考慮すれば、本発明の様々な更なる態様及び実施形態が当業者に明らかとなるであろう。
【０１０９】
本明細書において言及された全ての文献は、あらゆる目的でそれらの全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０１１０】
「及び／又は」は、本明細書において使用される場合、一方を伴う又は伴わない、２つの特定の特徴又は構成要素の各々の具体的な開示として解釈される。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、本明細書において各々が個別に提示される場合と全く同様に、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の具体的な開示として解釈される。
【０１１１】
文脈により特に指示されない限り、上記特徴の説明及び定義は本発明のいかなる特定の態様又は実施形態にも限定されることはなく、記載される全ての態様及び実施形態に等しく適用される。
【０１１２】
本発明の或る特定の態様及び実施形態を例として添付の図面を参照して以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１Ａ】５ｈｍＣの一塩基分解能配列決定のための方法を示す。異なる時間点においてＮａＯＨによってクエンチされ、その後高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析される、２’−デオキシ−５−ホルミルシチジン（ｄ５ｆＣ）とＮａＨＳＯ３（バイサルファイト）との反応を示す。エラーバーは、３回分析を行った標準偏差である。
【図１Ｂ】５ｈｍＣの一塩基分解能配列決定のための方法を示す。酸化的バイサルファイト反応スキームを示す。すなわち、５ｈｍＣから５ｆＣへの酸化に続くバイサルファイト処理及びＮａＯＨにより５ｆＣをＵに変換する。Ｒ基はＤＮＡである。
【図１Ｃ】５ｈｍＣの一塩基分解能配列決定のための方法を示す。ＢＳ−Ｓｅｑ法及びｏｘＢＳ−Ｓｅｑ法の概要を説明する略図及び表を示す。ＢＳ−Ｓｅｑは、インプットＤＮＡのバイサルファイト処理とその後の増幅、続く配列決定からなる。ｏｘＢＳ−Ｓｅｑは、インプットＤＮＡの酸化、続くバイサルファイト処理及び増幅、その後の配列決定からなる。インプットを比較することにより、ＢＳ−Ｓｅｑアウトプット及びｏｘＢＳ−ＳｅｑアウトプットのＣ、５ｍＣ及び５ｈｍＣを区別し、マッピングし、また定量することができる。
【図２Ａ】全体的な脱カルボニル化に加え、ウラシルへの脱アミノ化を示す２’デオキシ−５−ホルミルシトシンのバイサルファイトプロファイルを示す。
【図２Ｂ】シトシンへの脱炭酸、その後のウラシルへの脱アミノ化を示す、２’デオキシ−５−カルボキシシトシンのバイサルファイトプロファイルを示す。
【図３】図３は、質量分析による酸化の定量（図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｄ）及びイルミナシーケンシング（図３Ｃ）による酸化的バイサルファイト処理を示す。図３Ａは、ＫＲｕＯ４酸化の前後の１５ｍｅｒ  ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド中の５ｈｍＣ及び５ｆＣ（Ｔに正規化されたピーク面積）のレベルを示す。図３Ｂは、２回の連続的なＫＲｕＯ４酸化の前後の１３５ｍｅｒ  ｄｓＤＮＡ断片中の５ｈｍＣ及び５ｆＣのレベル（プライマー配列中の５ｍＣに正規化された濃度）を示す。図３Ｃは、酸化的バイサルファイト処理（１ヌクレオチド当たり少なくとも９５００００のリードが得られた）後の、単一の５ｈｍＣｐＧ（１２２ｍｅｒ）又は複数の５ｈｍＣｐＧ（１３５ｍｅｒ）のいずれかを含む２つのｄｓＤＮＡ断片のイルミナシーケンシングによって決定されたＣからＴへの変換レベルを示す。また、変換率の比較のためにこれらの鎖には、５ｍＣが存在していた。図３Ｄは、ＫＲｕＯ４酸化の前後に測定されたＥＳ細胞ＤＮＡ（Ｊ１）における５ｈｍＣ及び５ｆＣのレベル（プライマー配列中の５ｍＣに正規化された濃度）を示す。エラーバーは全て、標準偏差である。
【図４】図４は、Ｃを含む合成１５ｍｅｒ一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ（３回の反応試験）（図４Ａ）、５ｍＣを含む合成１５ｍｅｒ  ｓｓＤＮＡ（３回の反応試験）（図４Ｂ）、及びゲノムＥＳ細胞Ｊ１  ＤＮＡ（超音波処理された２回の反応試験、及び超音波処理されていない２回の反応試験）（図４Ｃ）に対するＫＲｕＯ４による酸化後の、ヌクレオシド比率の変化を測定することにより決定された、酸化後のシトシン分解の程度を示す。パーセント変化は、酸化後のヌクレオシドピーク面積を、酸化前のヌクレオシドピーク面積で割ることでＨＰＬＣ分析により測定される。エラーバーは標準偏差である。
【図５Ａ】酸化前の５ｈｍＣを含む１４０ｂｐ  ＤＮＡ分子の消化によって得られたヌクレオシドのＨＰＬＣトレースを示す。
【図５Ｂ】酸化後の５ｈｍＣを含む１４０ｂｐ  ＤＮＡ分子の消化によって得られたヌクレオシドのＨＰＬＣトレースを示す。
【図６Ａ】バイサルファイト処理前の５ｆＣを含む１５ｂｐ  ＤＮＡ分子の消化によって得られたヌクレオシドのＨＰＬＣトレースを示す。
【図６Ｂ】バイサルファイト処理後の５ｆＣを含む１５ｂｐ  ＤＮＡ分子の消化によって得られたヌクレオシドのＨＰＬＣトレースを示す。
【図７Ａ】還元前の５ｆＣを含む１４０ｂｐ  ＤＮＡ分子の消化によって得られたヌクレオシドのＨＰＬＣトレースを示す。
【図７Ｂ】還元後の５ｆＣを含む１４０ｂｐ  ＤＮＡ分子の消化によって得られたヌクレオシドのＨＰＬＣトレースを示す。
【図８】ｏｘＢＳ処理後のＣ、５ｍＣ又は５ｈｍＣのいずれかを含むＣｌａＩ部位（ＡＴＣＧＡＴ）を有する１２２ｍｅｒ  ＤＮＡ鎖のサンガーシーケンシングを示す。クロマトグラムは、テンプレート鎖に対する逆配列を示す。Ｃ  ＤＮＡにおいて、逆鎖中のＣは完全にＵに変換され、クロマトグラムにおいてＧの代わりにＡとして示される。５ｍＣ  ＤＮＡは変換されず、クロマトグラムにおいてＧを示す。５ｈｍＣ  ＤＮＡは大部分が変換され、この分析の実行（run）において変換されていないＧのわずかなトレースを伴って、クロマトグラムにおいてＡを示す。
【図９Ａ】ｏｘＲＲＢＳによるＣＧＩにおける５ｍＣレベル及び５ｈｍＣレベルの定量を示す。ＲＲＢＳデータセット及びｏｘＲＲＢＳデータセット間のＣＧＩ当たりの変換されていないシトシン画分の比較を示す。すなわち、ｏｘＲＲＢＳデータセット（赤）における統計学的に有意に低い画分を含むＣＧＩはヒドロキシメチル化ＣＧＩであり、逆パターン（黒）のＣＧＩの数を用いて偽陽性率３．７％と推定した。
【図９Ｂ】ｏｘＲＲＢＳによるＣＧＩにおける５ｍＣレベル及び５ｈｍＣレベルの定量を示す。有意なレベルの各修飾を有するＣＧＩ内の５ｍＣレベル及び５ｈｍＣレベルの分布を示す。
【図９Ｃ】ｏｘＲＲＢＳによるＣＧＩにおける５ｍＣレベル及び５ｈｍＣレベルの定量を示す。（ｈ）ＭｅＤＩＰ−Ｓｅｑプロファイルと重複するゲノムＲＲＢＳプロファイル及びゲノムｏｘＲＲＢＳプロファイルの例を示す（６）。ＣＧＩは緑色のバーによって示され、データを明瞭にするため、外部ＣＧＩをマスクした（灰色領域）。ｏｘＲＲＢＳトラック中の各バーは（いずれかのＤＮＡ鎖における）単一のＣｐＧを表す。パネル下段の拡大領域は、この方法の一ヌクレオチド分解能を強調している。
【図９Ｄ】ｏｘＲＲＢＳによるＣＧＩにおける５ｍＣレベル及び５ｈｍＣレベルの定量を示す。選択されたＣＧＩでの５ｍＣレベル及び５ｈｍＣレベルが、ｇｌｕｃＭＳ−ｑＰＣＲを用いて検証されたことを示す。個々のＭｓｐＩ部位でのｏｘＲＲＢＳからの値を、９５％信頼区間を表すエラーバーと共に表示する。ＧｌｕｃＭＳ−ｑＰＣＲを２回実施し、棒グラフは平均値を表し、黒点は個々の反復測定値を表す。２つの手法が良好な相関を示している。
【図１０Ａ】ヌクレオシドへと消化されたＲＮＡ鎖（配列番号７）のＫＲｕＯ４による酸化の前のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ＤＮＡ酸化と同一の条件を使用した。ヌクレオシドの保持時間は以下の通りであった：Ｃ−１．２分、Ｕ−１．７分、Ｇ−３．５分、Ａ−６．５分。
【図１０Ｂ】ヌクレオシドへと消化されたＲＮＡ鎖（配列番号７）のＫＲｕＯ４による酸化の後のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ＤＮＡ酸化と同一の条件を使用した。ヌクレオシドの保持時間は以下の通りであった：Ｃ−１．２分、Ｕ−１．７分、Ｇ−３．５分、Ａ−６．５分。
【図１１】図１１は、ＮａＢＨ４及びバイサルファイト処理（ｒｅｄＢＳ−Ｓｅｑ）による還元後の５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）（部分配列は、ＡＣＧＧＡ５ｆＣＧＴＡで示される）を含む合成１００ｍｅｒ  ＤＮＡ鎖に対するサンガーシーケンシングのトレースを示す。クロマトグラムは、部分配列（ＴＡＣＧＴＣＣＡＴ−ここで、太字位置は５ｆＣ又はＣ由来である）に対する逆相補配列を示す。５ｆＣ及びＣの位置（括弧書き）は、図１１中のテンプレート鎖上に示される。５ｆＣ及びＣは両方ともバイサルファイト条件下で脱アミノ化する。しかしながら、５ｆＣは還元工程によって５ｈｍＣに変換されて脱アミノ化されないのに対し、Ｃの脱アミノ化は影響を受けない。これは、一塩基分解能での５ｆＣ及びＣの区別を可能とする。
【発明を実施するための形態】
【０１１４】
表１は、様々な処理に供されたシトシン及び修飾シトシンに関する配列決定の結果を示す。
【０１１５】
表２は、シトシン（１ａ）、５−メチルシトシン（５ｍＣ、１ｂ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ、１ｃ）及び５−ホルミルシトシン（５ｆＣ、１ｄ）の構造を示す。
【０１１６】
表３は、いくつかの水溶性酸化剤の例に対するＤＮＡ中の５ｈｍＣの酸化効率の要約を示す。
【０１１７】
表４及び表５は、それぞれ、ＤＮＡ（図４、図５及び図６）及びＲＮＡ（図１０）のＨＰＬＣトレースにおけるピークの保持時間を示す。
【０１１８】
実験
１．方法
１．１  ＭｎＯ２によるｄ５ｆＣＴＰ及びｄ５ｃＣＴＰへのｄ５ｈｍＣＴＰ酸化
ＭｎＯ２  ５１．６ｍｇ（ｄ５ｆＣＴＰに対して）又はＭｎＯ２  ５００ｍｇ（ｄ５ｃＣＴＰに対して）（Alpha Aeser）を含むＨ２Ｏ  ４９７．５μＬ中のｄ５ｈｍＣＴＰ  ２．５μＬ（１００ｍＭ、Bioline）を、５０度で２時間３０分振盪した。その後、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ０．５ｍＬ  １０ｋＤａカラム（Millipore）を用いた濾過によりＭｎＯ２を除去し、試料を凍結乾燥した。ヌクレオチド三リン酸を再懸濁（５ｍＭ）し、アルカリホスファターゼ（New England Biolabs）により３７℃で一晩、脱リン酸化した。
【０１１９】
１．２  ｄ５ｆＣヌクレオシド及びｄ５ｃＣヌクレオシドを用いたバイサルファイト時間的経過
ｄ５ｆＣ又はｄ５ｃＣ  ９μＬ（５ｍＭ）、ｄＡ  ０．５μＬ（０．１Ｍ、Roche）及びＨ２Ｏ  ２．５μＬを混合し、その後、４Ｍ  ＮａＨＳＯ３  ３３μＬ（MP Biochemicals）を添加した。これを３つの１５ｕＬの反応物に分け、５０℃にて暗所で保持した。様々な時間点で画分０．５μＬを取り、Ｈ２Ｏ  ２．５μＬ及びＮａＯＨ  ２μＬ（１Ｍ）中に集成した。室温にて少なくとも３０分保持した後、それらをＨＰＬＣに注入した。ピーク面積を測定し、ｄ５ｆＣ、ｄ５ｃＣ、ｄＣ又はｄＵの検量曲線と相関付けて、クロマトグラムにおけるｄＡレベルに標準化した。
【０１２０】
１．３  ＨＰＬＣ分析のためのＤＮＡ消化
文献プロトコル（３０）のようにしてＤＮＡを消化し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ０．５ｍＬ  １０ｋＤａカラムで精製し、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣを用いて１ｍＬ／分の流量でＥｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８  ３．５μｍ、３．０×１５０ｍｍカラム上でＨＰＬＣにより分析した。カラム温度を４５度に維持した。溶出緩衝液は、緩衝液Ａ（５００ｍＭ酢酸アンモニウム（Fisher）ｐＨ５）、緩衝液Ｂ（アセトニトリル）及び緩衝液Ｃ（Ｈ２Ｏ）であった。全ての分析の実行に亘って緩衝液Ａを１％に保持し、残りの緩衝液に対する勾配を０分−０．５％Ｂ、２分−１％Ｂ、８分−４％Ｂ、１０分−９５％Ｂとした。
【０１２１】
２’−デオキシヌクレオシドの保持時間は以下の通りであった：２’−デオキシ−５−カルボキシシチジン（１．０分）、２’−デオキシシチジン（１．８分）、２’−デオキシ−５−ヒドロキシメチルシチジン（２．１分）、２’−デオキシウリジン（２．７分）、２’−デオキシ−５−メチルシチジン（４．０分）、２’−デオキシグアノシン（４．５分）、２’−デオキシ−５−ホルミルシチジン（５．４分）、２’−デオキシチミジン（５．７分）、２’−デオキシアデノシン（７．４分）。
【０１２２】
同じプロトコルをＨＰＬＣ分析用のＲＮＡの消化に使用した。
【０１２３】
１．４  一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ配列
シトシン、５−メチルシトシン、又は５−ヒドロキシメチルシトシンのいずれかを含む１５ｍｅｒオリゴをIBAから入手した。１２２ｍｅｒ及び１３５ｍｅｒのｄｓＤＮＡテンプレート及びプライマーをBiomersから入手した。プライマー中の全てのＣは５−メチルシトシンであった。ｄ５ｈｍＣＴＰ及びＦｅｒｍｅｎｔａｓ  ＤｒｅａｍＴａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲにより、５−ヒドロキシメチルシトシンを、この鎖の全ての他のシトシン位置に付加した。
【０１２４】
１．５  一般的な還元
ＤＮＡ（およそ１μｇ〜１０μＬ）をＮａＢＨ４  ４０μＬ（１μＬ当たり１００００当量）と共に氷上で５分間インキュベートした。その後、この反応物を２５度にて蓋を開けたまま暗所で１時間振盪した。この反応物をｑｕｉｃｋ  ｓｐｉｎ  ｏｌｉｇｏカラム（Roche）で精製した。
【０１２５】
１．６  酸化
一般的な酸化
氷上でＮａＯＨ（最終濃度０．０５Ｍ）によりＤＮＡを２４μＬ取り、その後、１μＬのＫＲｕＯ４（Alpha Aeser）溶液（０．０５Ｍ  ＮａＯＨ中１５ｍＭ）を添加し、反応物を氷上で時折ボルテックスをしながら１時間保持した。反応物をｍｉｎｉ  ｑｕｉｃｋ  ｓｐｉｎ  ｏｌｉｇｏカラム（Roche）で精製した（Ｈ２Ｏ  ６００μＬで４回洗浄した後）。
【０１２６】
これらの条件をＲＮＡの酸化についても使用した。
【０１２７】
一本鎖ＤＮＡ酸化
上記一般的な酸化に従って１５ｍｅｒ合成ｓｓＤＮＡ  １μｇを酸化した。
【０１２８】
合成二本鎖ＤＮＡ二重酸化
ｄｓＤＮＡをエタノールで沈殿させ、その後、ｍｉｎｉ  ｑｕｉｃｋ  ｓｐｉｎ  ｏｌｉｇｏカラムを通して濾過した（Ｈ２Ｏ  ６００ｕＬで４回洗浄した後）。（ゲノムＤＮＡとは異なり）単一の相同ＤＮＡ断片の溶液でＮａＯＨ変性が１００％有効ではないことから、合成ｄｓＤＮＡについては二重酸化が必要であった。
【０１２９】
ＤＮＡ  １μｇを０．０５Ｍ  ＮａＯＨ（総容量１９μＬ）中で３７℃にて３０分変性させた。その後、反応物を氷上で素早く冷却し（snap cooled）、５分置いた。その後、総容量を２０μＬとする以外は上記一般的な酸化に従って、反応物を酸化した。このＤＮＡを０．０５Ｍ  ＮａＯＨ（総容量２４μＬ）中で３７℃にて３０分間、再度変性させた。反応物を、再び氷上で素早く冷却して５分置き、上記一般的な酸化に従って酸化した。
【０１３０】
ゲノムＤＮＡの一般的な酸化
酸化の前にＤＮＡ（１μｇ以下）をエタノールで沈殿させ、その後ｍｉｎｉ  ｑｕｉｃｋ  ｓｐｉｎ  ｏｌｉｇｏカラムを通して濾過した（Ｈ２Ｏ  ６００μＬで４回洗浄した後）。ＤＮＡを０．０５Ｍ  ＮａＯＨ（総容量２４μＬ又は４０μＬ）中で３７℃にて３０分変性させた。その後、これを氷上で素早く冷却して５分置き、上記一般的な酸化に従って酸化した。
【０１３１】
１．７  酸化的バイサルファイト処理されたｄｓＤＮＡのサンガーシーケンシング及びイルミナシーケンシング
サンガーシーケンシングでは、Ｃ、５ｍＣ及び５ｈｍＣを含む１２２ｍｅｒ  ＤＮＡ  １μｇを、上記ｄｓＤＮＡ二重酸化に従って酸化し、熱サイクルを２回繰り返して行う以外は、ＦＦＰＥ試料に関する製造業者の使用説明書に従ってＱｉａｇｅｎ  Ｅｐｉｔｅｃｔキットを用いてバイサルファイト処理を行った。その後、これらの試料をサンガーシーケンシング（Source Bioscience）に供した。
【０１３２】
イルミナシーケンシングでは、５ｈｍＣを含む１２２ｍｅｒ及び１３５ｍｅｒのＤＮＡ  １μｇをＤｒａＩ（２μＬ、New England Biolabs）及びＳｓｐＩ（１μＬ、New England Biolabs）で一晩消化した。消化されたバンドをＦｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｅｎｅＪＥＴゲル抽出キットでゲル精製し、メチル化アダプター（Illumina）をＮＥＢＮｅｘｔ  ＤＮＡ  ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ  ｓｅｔ  １を用いて連結した。上記のように酸化及びバイサルファイト処理した後、連結された断片をＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  Ｃｘ（Agilent）及びアダプター特異的プライマー（Illumina）を用いて増幅させ（１８サイクル）、続いてＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Agencourt）を用いて精製した。
【０１３３】
１．８  質量分析
製造業者の使用説明書に従ってＤＮＡ  Ｄｅｇｒａｄａｓｅ  Ｐｌｕｓ（Zymo Research）を用いた消化により、ＤＮＡからヌクレオシドを取得し、ナノエレクトロスプレーイオン源（Proxeon）が取り付けられたＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ質量分析計（Thermo Scientific）上でのＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。５ｈｍＣ、５ｆＣ、並びに関連する場合には５ｍＣ及びＴに関する質量スペクトルデータを高分解能フルスキャンモード（プロトン化擬分子イオンについてＲ＞４００００、付随するプロトン化塩基フラグメントイオンについて＞５００００）で取得し、また２５８→１４２．０６１１（５ｈｍＣ）、２５６→１４０．０４５５（５ｆＣ）、２４２→１２６．０６６２（５ｍＣ）及び２４３→１２７．０５０２（Ｔ）の移行をモニタリングする選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）モードでも取得した。４質量単位分離ウインドウ（4 mass unit isolation window）でＳＲＭ用に親イオンを選択し、相対的衝突エネルギー２０％、断片イオンについてＲ＞１４０００でＨＣＤにより断片化した。
【０１３４】
５ｈｍＣ及び５ｆＣに対して関連するイオンの抽出されたイオンクロマトグラムからのピーク面積を、５ｍＣ（存在する場合）又はＴのいずれかからのピーク面積に正規化し、ヌクレオチド三リン酸又はオリゴヌクレオチドの消化によって得られたスタンダードに対する外部キャリブレーションにより定量した。
【０１３５】
１．９  ＥＳ細胞培養及びＤＮＡ抽出
Ｊ１  ＥＳ細胞（１２９Ｓ４／ＳｖＪａｅ）をATCC（カタログ番号ＳＣＲＣ−１０１０）から入手し、完全ＥＳ培地（ＤＭＥＭ  ４５００ｍｇ／Ｌグルコース、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び１１０ｍｇ／Ｌピルビン酸ナトリウム、１５％ウシ胎児血清、培地１００ｍＬ中１００Ｕのペニシリン／１００μｇのストレプトマイシン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、５０μＭ  β−メルカプトエタノール、１０３Ｕ  ＬＩＦ  ＥＳＧＲＯ（商標））中で３７℃、５％ＣＯ２にて、γ線照射ｐＭＥＦフィーダー層上で培養した。Ｑｉａｇｅｎ  Ａｌｌｐｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡミニキットを用い、１４継代目又は２０継代目においてＥＳ細胞からゲノムＤＮＡを調製した。
【０１３６】
１．１０  ｏｘＲＲＢＳ
酸化ＤＮＡ及び非酸化ＤＮＡからのＲＲＢＳライブラリーを以前に公開されているプロトコル（３１）に基づいて調製した。簡潔には、２μｇのゲノムＤＮＡをＭｓｐＩ（Fermentas）で消化し、続いてクレノウ（Fermentas）によるエンドリペア及びＡ−テーリングを行い、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（NEB）によるメチル化アダプター（Illumina）の連結を行った。アダプターが連結されたＭＳｐＩ消化ＤＮＡを３％アガロースゲル上にて泳動し、サイズ選択（１１０ｂｐ〜３８０ｂｐ）を行い、続いてＱｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｑｕｉｃｋによる精製及びエタノール沈殿を行った。
【０１３７】
酸化の前に、サイズ選択されたＤＮＡをｍｉｎｉ  ｑｕｉｃｋ  ｓｐｉｎ  ｏｌｉｇｏカラム（Ｈ２Ｏ  ６００μＬで４回洗浄した後）を通して濾過し、最後に残留するいかなる緩衝液／塩も除去して、最終容量２５μＬに調整した。この溶液５μＬを非酸化ライブラリーの作製のために保管した。上記ゲノムＤＮＡに対する一般的な酸化に従って残りを酸化した。
【０１３８】
酸化ＤＮＡ試料及び非酸化ＤＮＡ試料の両方を、熱サイクルを２回繰り返して行う以外は、ＦＦＰＥ試料に関する製造業者の使用説明書に従ってＱｉａｇｅｎ  Ｅｐｉｔｅｃｔキットを用いてバイサルファイト処理を行った。Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  Ｃｘ（Agilent）及びアダプター特異的プライマー（Illumina）を用いて最終のライブラリー増幅（１８サイクル）を行い、その後、ライブラリーをＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Agencourt）を用いて精製した。
【０１３９】
１．１１  配列決定及びリードアラインメント
配列決定（単一末端、４０ｂｐリード）をIlluminaのＧＡＩＩｘプラットフォームで行った。最初の３塩基対に対してベアバック−プロセシング（bareback-processing）を適用した後、ＯＬＢバージョン１．８を用いて原画像を再加工することにより塩基をコールした（３２）。マウスゲノム（ＮＣＢＩＭ３７に組み込まれている）に対するバイサルファイトリードアラインメントを、−ｎ  １  −ｌ  ４０  −−ｐｈｒｅｄ６４−ｑｕａｌｓ  −−ｖａｎｉｌｌａのオプションを用いるＢｉｓｍａｒｋ  ｖ０．６．４（３３）を用いて実施した。個々のＬＩＮＥ１  ５’モノマー配列に対するＢｉｓｍａｒｋアラインメントを、僅かにストリンジェントに（−ｎ  ０）行った。公開されているコンセンサス配列をＬ１Ａ（３４）、Ｌ１Ｔｆ及びＬ１Ｇｆ（３５）モノマーサブタイプに対するリードのアラインメントに使用した。
【０１４０】
これらの部位を通読するのに十分短い配列決定リードのクレノウが充填された（Klenow-filled in）３’ＭｓｐＩ部位における非変換シトシン数からバイサルファイト変換率を推定した。リードｐｈｒｅｄクオリティは、３’末端で高いまま維持された。推定されたバイサルファイト変換率は、９９．８％〜９９．９％の間で変化した。
【０１４１】
１．１２  ｏｘＲＲＢＳデータ処理
ＣＧＩ（２５）内の変換シトシン及び非変換シトシンの数を、各ＢＳデータセット及びｏｘＢＳデータセットから抽出した。各ＣｐＧ位置について、５ｍＣ量を各ｏｘＢＳデータセットにおける非変換シトシンの割合として取得し、対応するＢＳデータセットにおける非変換シトシンの割合からこの値を引くことにより５ｈｍＣ量を取得した。ＣＧＩ当たりの全体的な値を、各ＣＧＩ内に包含される全てのＣｐＧからのデータを集積することにより算出した。全体的なＣＧＩ  ５ｍＣ値から２０％を超えて逸脱した５ｍＣ推定、又は全体的な値から１０％を超えて逸脱した５ｈｍＣ推定に関するＣｐＧと同様に、１０リード未満のＣｐＧを除外した。この異常値の除外工程（outlier filtration step）の後、５つ以上の代表的なＣｐＧを有するＣＧＩのみを分析した。
【０１４２】
ｏｘＢＳデータセットのバイサルファイト変換エラーを有意に超えるレベルの５ｍＣを含有するＣＧＩについて検定するため、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇで補正されたｐ値カットオフ０．０１を用いて２項検定を適用した。同様に、ＢＳデータセットにおいて有意な量の非変換シトシンを有するＣＧＩを選択するのに２項検定を使用した。これらの中で、Ｆｉｓｈｅｒ検定を適用し、補正ｐ値カットオフ０．０５を用いて、ＢＳデータセットとｏｘＢＳデータセットとの差異を検定した。ｏｘＢＳデータセットにおいて有意に低い非変換シトシン画分を有するＣＧＩを、ヒドロキシメチル化ＣＧＩとして取得した。逆パターンのＣＧＩはアーチファクトと考えられ、偽陽性率を推定するのに使用した。
【０１４３】
１．１３  ＧｌｕｃＭＳ−ｑＰＣＲ
以前に記載されているように（６）ｇｌｕｃＭＳ−ｑＰＣＲによるＭｓｐＩ部位での５ｍＣレベル及び５ｈｍＣレベルの定量を行った。
【０１４４】
２．  結果
本発明者らは、５ｈｍＣに選択的な化学反応性を利用すること、特にヒドロキシメチル基を化学的に除去し、それにより５ｈｍＣをＣに転換し、そうしてバイサルファイト媒介脱アミノ化によって容易にＵへと転換し得ることにより、ＤＮＡ中の５ｍＣと５ｈｍＣとを区別する戦略を追求した。本発明者らによる５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）に関する化学反応性の研究の間、本発明者らは、バイサルファイト条件下において５ｍＣを変化させずに５ｆＣのウラシル（Ｕ）への脱カルボニル化及び脱アミノ化を観察した（図１Ａ）。これまで報告されていないこの転換は、選択的に５ｈｍＣを５ｆＣへと酸化し、その後５ｆＣをＵへと変換することによる、２段階手法により実施され得る５ｈｍＣの配列決定を示した（図１Ｂ）。従来のＢｓ−Ｓｅｑは５ｍＣ及び５ｈｍＣの両方をＣとして検出することをまねくのに対し、この「酸化的バイサルファイト」シーケンシング（ｏｘＢＳ−Ｓｅｑ）アプローチは、５ｍＣ部位のみでＣを生じ、そのためＢＳ-Ｓｅｑ及びｏｘＢＳ−Ｓｅｑから読みだされた情報を比較することによって特定のヌクレオチド位置での５ｈｍＣ量を決定することが可能となった（図１Ｃ）。
【０１４５】
２’デオキシ−５−ホルミルシトシン及び２’デオキシ−５−カルボキシシトシンのバイサルファイトプロファイルを決定した（図２Ａ及び図２Ｂ）。２’デオキシ−５−ホルミルシトシン及び２’デオキシ−５−カルボキシシトシンを２．９Ｍ  ＮａＨＳＯ４と共にインキュベートした。反応物の小量の試料を異なる時間点で取り、０．３Ｍ  ＮａＯＨ中に集成した。これらを、分析のため直接ＨＰＬＣに注入した。ＨＰＬＣプロファイルは、シトシンへの全体的な脱カルボニル化又は脱炭酸に続く急速なウラシルへの脱アミノ化とそれぞれ一致する。
【０１４６】
したがって、本発明者らは、穏やかで、水性培地と相溶性であり、他の塩基及びＤＮＡ骨格に対して選択性である酸化剤を用いた５ｈｍＣから５ｆＣへの特異的酸化を求めた。広範な潜在的に好適な水溶性酸化剤を試験し（表３）、本発明者らは捜し求めていた特性及び変換効率を持つ過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）を見出した。原理的には、ＫＲｕＯ４はアルコール及び炭素−炭素二重結合の両方を酸化することができる（２３）。しかしながら、５ｈｍＣを含む合成１５ｍｅｒ  一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に対する本発明者らの反応性研究において、本発明者らはＫＲｕＯ４反応性が５ｈｍＣの第１級アルコールに対して特異性が高い条件を確立した（質量分析による５ｈｍＣから５ｆＣへの定量的変換、図３Ａ）。５ｈｍＣよりもＣ又は５ｍＣを含む１５ｍｅｒ  ｓｓＤＮＡは、ＫＲｕＯ４による塩基特異的反応を全く示さなかった（図４Ａ、図４Ｂ）。また、本発明者らは、ＫＲｕＯ４酸化がカルボン酸まで進められ得ることにも気付いたが（２３）、ＤＮＡ中の５ｈｍＣに関しては、適度に過剰な酸化剤を用いた場合であってもアルデヒド（５ｆＣ）が観察されたのみであった。また、ＫＲｕＯ４酸化は、酸化剤を添加する前の最初の変性工程により二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）として提示される試料中の５ｈｍＣを酸化することも可能であり、これは、結果的に、質量分析によって判定されるように５ｈｍＣから５ｆＣへの定量的な産生量を生じる（図３Ｂ）。
【０１４７】
５−メチルシトシンプライマー及びｈｍＣＴＰを用いたＰＣＲを通して組み込まれた４５の５ｈｍＣヌクレオシドを含む、１４０ｂｐ  ＤＮＡ分子（配列番号１）を調製した。ＤＮＡを、ＫＲｕＯ４を用いて酸化した。酸化の前及び後に、ベンゾナーゼ、ホスホジエステラーゼＩ及びアルカリホスファターゼでＤＮＡをヌクレオシドまで消化した。その後、この混合物をＨＰＬＣに注入し、図５Ａ（酸化前）及び図５Ｂ（酸化後）に示されるトレースを得た。その他のヌクレオシドに対する活性を伴うことなく、５ｈｍＣから５ｆＣへのほぼ完全な変換が観察された。
【０１４８】
３つの５ｆＣ残基を含む１５ｂｐ  一本鎖ＤＮＡ分子（配列番号２）を、上述のようにバイサルファイトで処理した。バイサルファイト処理の前及び後に、ベンゾナーゼ、ホスホジエステラーゼＩ及びアルカリホスファターゼでＤＮＡをヌクレオシドまで消化した。その後、この混合物をＨＰＬＣに注入し、図６Ａ及び図６Ｂに示されるトレースを得た。
【０１４９】
バイサルファイト処理の後、５ｆＣに対する非常に小さいピークのみが残り、ごく僅かなシトシンが存在する。図６Ｂ中のウラシルピークは、５ｆＣ、及び非修飾Ｃの脱アミノ化から得られた。
【０１５０】
ＰＣＲを通して組み込まれた４５の５ｆＣヌクレオシドを含む１４０ｂｐ  ＤＮＡ分子（配列番号１）を調製した。このＤＮＡを、上述のようにＮａＢＨ４を用いて還元した。還元の前及び後に、ベンゾナーゼ、ホスホジエステラーゼＩ及びアルカリホスファターゼによりＤＮＡ試料をヌクレオシドまで消化した。その後、このヌクレオシドの混合物をＨＰＬＣに注入し、図７Ａ（還元前）及び図７Ｂ（還元後）に示されるトレースを得た。５ｆＣから５ｈｍＣへの完全な変換が観察された。
【０１５１】
酸化的バイサルファイト法の効率及び選択性を試験するため、１２２塩基対の二本鎖ＤＮＡ（配列番号３）におけるＣｌａＩ部位（ＡＴＣＧＡＴ）の酸化バイサルファイト変換を調査した。（ＣｌａＩ  ＡＴＣＧＡＴ制限部位、配列番号３に関して）中央に単一のＣｐＧを有する１２２塩基対の二本鎖ＤＮＡ断片を、５−メチルシトシンプライマーと、ＣＴＰ、５ｍＣＴＰ又は５ｈｍＣＴＰのいずれかとを用いるＰＣＲによって増幅した。増幅産物は、プライマー領域に５−メチルシトシンと、中央ＣｐＧにＣｐＧ、５ｍＣｐＧ、又は５ｈｍＣｐＧとを含んでいた。
【０１５２】
上述の通り、Ｃ、５ｍＣ又は５ｈｍＣのいずれかを含む３つの合成１２２ｍｅｒ  ｄｓＤＮＡを、それぞれＫＲｕＯ４により酸化し、その後、従来のバイサルファイト変換プロトコルに供した。３つの鎖のそれぞれに対してサンガーシーケンシングを実施した（図８）。
【０１５３】
Ｃ含有鎖は完全にＵへと変換され（図８左パネル）、５ｍＣ含有鎖は変換されず（図８真中のパネル）、また５ｈｍＣ含有鎖は僅かな非変換Ｃと共に、ほぼ定量的にＵへと変換された（図８右パネル）。これは、変換された材料からの主なアデニンピークとして現れ、残留グアニンピークは微量の非変換材料に起因する。
【０１５４】
５ｈｍＣからＵへの変換効率を正確に測定するため、酸化的バイサルファイト処理の後に５ｈｍＣを含む合成鎖に対してイルミナシーケンシングを実施した。９４．５％の全体的な５ｈｍＣからＵへの変換レベルが観察された（図３Ｃ）。酸化的バイサルファイトプロトコルを、異なる構成の範囲で複数の５ｈｍＣ残基を含む第２鎖に対しても適用し、これもまた同様に高い５ｈｍＣからＵへの変換効率（９４．７％）を示した（図３Ｃ）。最終的に、ＫＲｕＯ４酸化をゲノムＤＮＡに対して行い、質量分析によって、Ｃの顕著な分解を伴うことなく（図４Ｃ）、５ｈｍＣから５ｆＣへの変換の定量的な産生量が示された（図３Ｄ）。原理実験のこれらの証拠は、酸化的バイサルファイトプロトコルは、Ｃ及び５ｍＣを変化させずに特異的にＤＮＡ中の５ｈｍＣをＵへと変換し、幅広く利用可能なプラットフォーム（ｏｘＢＳ−Ｓｅｑ）に対する定量的な一ヌクレオチド分解能配列決定を可能とすることを実証している。
【０１５５】
その後、本発明者らは、酸化的バイサルファイトの原理を用いて、マウスＥＳ細胞のゲノムＤＮＡにおいて高分解能で５ｈｍＣを定量的にマッピングした。本発明者らは、酸化的バイサルファイトと、ＲＲＢＳ（Reduced Representation Bisulfite Sequencing）（２４）とを組合せることを選択し、これにより、ＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）が非常に豊富なゲノム部分の選択的配列決定を可能とし、それによってこの豊富ではない指標を検出するのに適当なシーケンス深度を確保することを可能とする。したがって、本発明者らは、ＲＲＢＳデータセット及びｏｘＲＲＢＳデータセットを作製し、集積された場合に、ＣＧＩ当たり平均約３３００のメチル化コールを生じる、ＣｐＧ当たり約１２０リードの平均シーケンス深度を達成した。深度カットオフ及び幅カットオフの適用後（材料及び方法を参照）、全ＣＧＩのうち５５％（１２６６０）（２５）が本発明者らのデータセットに含まれていた。本発明者らのＲＲＢＳ（すなわち、非酸化）データは公開されているＲＲＢＳデータセット及びＢＳ−Ｓｅｑデータセットとよく相関する（２４、２６）。
【０１５６】
５ｈｍＣ含有ＣＧＩを同定するため、本発明者らは、ストリンジェントな基準を用いて（材料及び方法を参照）ＲＲＢＳデータセットとｏｘＲＲＢＳデータセットとの差異を調べた。ＲＲＢＳセットと比較した場合、最も有意な差は、ｏｘＲＲＢＳセットにおける非変換シトシンをより低い割合で有するＣＧＩに由来すると予測された。逆の傾向を有するＣＧＩを使用して、３．７％の偽陽性率を推定した（図９Ａ）。本発明者らは、平均３．３％（範囲０．２％〜１８．５％）のＣｐＧヒドロキシメチル化を有する８００の５ｈｍＣ含有ＣＧＩを同定した（図９Ａ及び図９Ｂ）。また、本発明者らは、平均８．１％ＣｐＧメチル化を有する４５７７の５ｍＣ含有ＣＧＩを同定した（図９Ｂ）。本発明者らは、質量分析で５ｈｍＣレベルが減少している（全Ｃ０．１６％に対して０．１０％）同一のＥＳ細胞株であるが異なる継代数の独立した生物学的な２組の試料に対して配列決定を行ったところ、本発明者らは矛盾することなくより少ない５ｈｍＣ含有ＣＧＩを見出した。重要なことに、両方の試料中に存在する５ｈｍＣ含有ＣＧＩが良好な定量的再現性を呈した。
【０１５７】
本発明者らの方法の正当性を確認するため、本発明者らは、ＭｓｐＩ制限部位を含む２１のＣＧＩを選択し、ｇｌｕｃＭＳ−ｑＰＣＲによりこれらのＣｐＧでの５ｈｍＣレベル及び５ｍＣレベルを定量した（２８）（図９Ｄ）。本発明者らは、ｏｘＲＲＢＳ及びｇｌｕｃＭＳ−ｑＰＣＲによる定量の間に良好な相関を見出した（５ｍＣ及び５ｈｍＣについて、それぞれ、ｒ＝０．８６、ｐ＝５Ｅ−７及びｒ＝０．５２、ｐ＝０．０１）。
【０１５８】
５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）を含むＤＮＡ鎖の還元バイサルファイト変換（ｒｅＢＳ−Ｓｅｑ）を調査した。
【０１５９】
配列ＡＣＧＧＡ５ｆＣＧＴＡを含む合成１００ｍｅｒ  ＤＮＡ鎖（配列番号８）をＮａＢＨ４による還元に置き、その後、従来のバイサルファイト変換プロトコルに供した。その後、この鎖に対してサンガーシーケンシングを実施した（図１１）。
【０１６０】
図１１は、逆相補配列（ＴＡＣＧＴＣＣＡＴ）の一部を表す配列決定トレースを示す。図１１中、５ｆＣ及びＣの位置は太字で、テンプレート鎖上に括弧書きで示される。既に示したように、５ｆＣ及びＣは両方ともバイサルファイト条件下で脱アミノ化されてＵを形成し、これは図１１の逆相補配列中、Ａとして示される。しかしながら、ＮａＢＨ４による還元は、５ｆＣを５ｈｍＣに変換し、Ｕへと脱アミノ化せず、図１１の逆相補配列中Ｇとして示される。したがって、還元バイサルファイトシーケンシング（ｒｅｄＢＳ−Ｓｅｑ）は、一塩基分解能での５ｆＣ及びＣの区別を可能とする。
【０１６１】
要約すると、本発明者らは、一ヌクレオチドレベルで５ｍＣ及び５ｈｍＣの両方を確実にマッピングし、定量するｏｘＢＳ−Ｓｅｑ法を示した。また、酸化的バイサルファイトは、本明細書で実証されるようにＳｅｑｕｅｎｏｍ等の非シーケンシング下流アプローチ（non-sequencing downstream approaches）と互換性がある。したがって、バイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡ配列と、酸化及びバイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡ配列を比較することにより、非修飾シトシンと共に、５−メチルシトシン及び５−ヒドロキシメチルシトシンの存在を決定することが可能である。
【０１６２】
例えば、バイサルファイト処理と酸化との両方が為されたゲノムＤＮＡ、及びバイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡの配列中の同一位置におけるウラシル残基は、非修飾シトシンの存在を示す。バイサルファイト処理と酸化との両方が為されたゲノムＤＮＡ、及びバイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡの配列中の同一位置におけるシトシン残基は、５−メチルシトシンの存在を示す。酸化及びバイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡ配列中のシトシン残基もまた、５−メチルシトシンの存在を示す。バイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡ配列中のシトシン残基、並びに酸化及びバイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡ配列中の同一位置におけるウラシル残基は、５−ヒドロキシメチルシトシンの存在を示す。
【０１６３】
また、５−ホルミルシトシンも、一ヌクレオチド分解能まで配列決定され得る。５ｆＣは、（ＨＰＬＣにより示されるように）ＮａＢＨ４を用いてゲノムＤＮＡ中でｈｍＣまで定量的に還元されてもよい。未処理、バイサルファイト処理、酸化及びバイサルファイト処理、並びに還元及びバイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡの配列を比較することにより、３つ全ての既知のシトシン哺乳類修飾である５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン及び５−ホルミルシトシンの存在を、非修飾シトシンと共に決定することができる。例えば、ｉ）バイサルファイト処理、ｉｉ）酸化及びバイサルファイト処理、並びにｉｉｉ）還元及びバイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡ配列中の同一位置におけるウラシル残基（ＵＵＵ）は、非修飾シトシンの存在を示す。
【０１６４】
ｉ）バイサルファイト処理、ｉｉ）酸化及びバイサルファイト処理、並びにｉｉｉ）還元及びバイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡ配列中の同一位置におけるシトシン残基（ＣＣＣ）は、５−メチルシトシンの存在を示す。
【０１６５】
バイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡの配列中のシトシン残基、酸化及びバイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡ配列中の同一位置におけるウラシル残基、並びに任意に、還元及びバイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡ配列中の同一位置におけるシトシン残基（ＣＵＣ）は、５−ヒドロキシメチルシトシンの存在を示す。
【０１６６】
バイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡ配列中のウラシル残基、還元及びバイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡ配列中の同一位置におけるシトシン残基、並びに任意に、酸化及びバイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡ配列中の同一位置におけるウラシル残基（ＵＣＵ）は５−ホルミルシトシンの存在を示す。
【０１６７】
未処理のゲノムＤＮＡを配列決定する場合には、修飾シトシン及び非修飾シトシンは両方ともシトシンとして読まれる。
【０１６８】
図１０に示されるＨＰＬＣクロマトグラムにより、２８ヌクレオチドＲＮＡ鎖（配列番号７）の酸化の後にＲＮＡの顕著な分解は観察されなかったことが確認されている。この結果は、本明細書に記載されるように、上記酸化アプローチが、ＲＮＡ中の５ｈｍＣ等の修飾シトシン残基の配列決定とも互換性があることを意味している。
【０１６９】
参考文献
1.    A. M. Deaton et al Genes Dev. 25, 1010 (May 15, 2011).
2.    M. Tahiliani et al. Science 324, 930 (May 15, 2009).
3.    S. Ito et al. Nature 466, 1129 (Aug 26, 2010).
4.    A. Szwagierczak et al Nucleic Acids Res,  (Aug 4, 2010).
5.    K. P. Koh et al. Cell Stem Cell 8, 200 (Feb 4, 2011).
6.    G. Ficz et al., Nature 473, 398 (May 19, 2011).
7.    K. Williams et al. Nature 473, 343 (May 19, 2011).
8.    W. A. Pastor et al. Nature 473, 394 (May 19, 2011).
9.    Y. Xu et al. Mol. Cell 42, 451 (May 20, 2011).
10.   M. R. Branco et al Nat. Rev. Genet. 13, 7 (Jan, 2012).
11.   S. Kriaucionis et al Science 324, 929 (May 15, 2009).
12.   M. Munzel et al. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 5375 (Jul 2010).
13.   H. Wu et al. Genes Dev. 25, 679 (Apr 1, 2011).
14.   S. G. Jin et al Nuc. Acids. Res. 39, 5015 (Jul, 2011).
15.   C. X. Song et al.. Nat. Biotechnol. 29, 68 (Jan, 2011).
16.   M. Frommer et al. PNAS. U.S.A. 89, 1827 (Mar 1992).
17.   Y. Huang et al. PLoS One 5, e8888 (2010).
18.   C. Nestor et al Biotechniques 48, 317 (Apr, 2010).
19.   C. X. Song et al. Nat. Methods,  (Nov 20, 2011).
20.   J. Eid et al. Science 323, 133 (Jan 2, 2009).
21.   E. V. Wallace et al. Chem. Comm. 46, 8195 (Nov 21, 2010).
22.   M. Wanunu et al. J. Am. Chem. Soc.,  (Dec 14, 2010).
23.   G. Green, W et al J Chem Soc Perk T 1, 681 (1984).
24.   A. Meissner et al. Nature 454, 766 (Aug 7, 2008).
25.   R. S. Illingworth et al. PLoS genetics 6,  (Sep, 2010).
26.   M. B. Stadler et al. Nature 480, 490 (Dec 22, 2011).
27.   J. Borgel et al et al Nat. Genet. 42, 1093 (Dec, 2010).
28.   S. M. Kinney et al. J. Biol. Chem. 286, 24685 (Jul 15, 2011).
29.   N. Lane et al. Genesis 35, 88 (Feb, 2003).
30.   E. P. Quinlivan et al 3rd, Anal. Biochem. 373, 383 (Feb 2008).
31.   H. Gu et al. Nat. Protoc. 6, 468 (Apr, 2011).
32.   F. Krueger et al PLoS One 6, e16607 (2011).
33.   F. Krueger et al Bioinformatics 27, 1571 (Jun 1, 2011).
34.   S. A. Schichman et al Mol. Biol. Evol. 10, 552 (May, 1993).
35.   J. L. Goodier et al. Genome research 11, 1677 (Oct, 2001).
36.   C. Qin et al. Mol. Carcinog. 49, 54 (Jan, 2010).
37.   Li et al Nucleic Acids (2011) Article ID 870726
38.   Pfaffeneder, T. et al (2011) Angewandte. 50. 1-6
39.   Lister, R. et al (2008) Cell. 133. 523-536
40.   Wang et al (1980) Nucleic Acids Research. 8 (20), 4777-4790
41.   Hayatsu et al (2004) Nucleic Acids Symposium Series No. 48 (1), 261-262
42.   Lister et al (2009) Nature. 462. 315-22
43.   Sanger, F. et al PNAS USA, 1977, 74, 5463
44.   Bentley et al Nature, 456, 53-59 (2008)
45.   KJ McKernan et al Genome Res. (2009) 19: 1527-1541 
46.   M Ronaghi et al Science (1998) 281 5375 363-365
47.   Eid et al Science (2009) 323 5910 133-138
48.   Korlach et al Methods in Enzymology 472 (2010) 431-455)
49.   Rothberg et al (2011) Nature 475 348-352).
【０１７０】
モデル配列
修飾されたヌクレオチドは太字イタリック体である。
１４０塩基対の二本鎖ＤＮＡモデル（配列番号１）：
ＣＡＣＡＴＣＣＣＡＣＡＣＴＡＴＡＣＡＣＴＣＡＴＡＣＡＴＡＣＣＴＧＣＴＣＡＣＧＡＣＧＡＣＧＣＴＧＴＡＣＡＣＣＴＡＣＧＴＡＣＴＣＧＴＧＣＡＣＧＣＴＣＧＴＣＡＣＧＴＧＡＴＣＧＡＣＣＡＴＧＡＣＴＣＴＧＡＣＧＣＡＣＴＧＡＧＧＴＡＴＧＧＧＡＡＧＴＡＧＴＧＡＧＴＡＧＡＴＴＧＴＡＧＴＡＡＧＧＡＧ
【０１７１】
１５ヌクレオチド長の一本鎖ＤＮＡモデル（配列番号２）：
ＧＡＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＡＧＧ
【０１７２】
１２２塩基対の二本鎖ＤＮＡモデル（配列番号３）：
ＣＡＣＡＴＣＣＣＡＣＡＣＴＡＴＡＣＡＣＴＣＡＴＡＣＡＴＡＣＣＡＴＴＴＡＡＡＴＡＡＡＴＴＡＡＡＴＡＡＴＡＴＴＡＡＴＡＴＡＴＣＧＡＴＴＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＡＴＴＧＧＧＡＡＧＴＡＧＴＧＡＧＴＡＧＡＴＴＧＴＡＧＴＡＡＧＧＡＧ
【０１７３】
１３５塩基対の二本鎖ＤＮＡモデル（配列番号４）：
ＣＡＣＡＴＣＣＣＡＣＡＣＴＡＴＡＣＡＣＴＣＡＴＡＣＡＴＡＣＣＡＴＴＴＡＡＣＧＡＴＡＡＡＴＴＡＣＡＡＴＡＡＣＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＡＴＡＴＣＧＡＴＴＡＡＣＴＡＡＴＣＧＡＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＡＣＧＣＡＴＴＡＡＴＡＴＴＧＧＧＡＡＧＴＡＧＴＧＡＧＴＡＧＡＴＴＧＴＡＧＴＡＡＧＧＡＧ
【０１７４】
ｄｓＤＮＡフォワードプライマー（配列番号５）：
ＣＡＣＡＴＣＣＣＡＣＡＣＴＡＴＡＣＡＣＴＣＡＴＡＣＡＴＡＣＣ
【０１７５】
ｄｓＤＮＡリバースプライマー（配列番号６）：
ＣＴＣＣＴＴＡＣＴＡＣＡＡＴＣＴＡＣＴＣＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣ
【０１７６】
２８ヌクレオチドＲＮＡモデル配列（配列番号７）：
ＵＧＵＧＧＧＧＡＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＵＣＵＧＧＧＧ
【０１７７】
１００ヌクレオチドの５ｆＣ含有配列（配列番号８）
［５ｆＣ位置を太字イタリック体で示す］
ＧＡＣＧＧＡＣＧＴＡＣＧＡＴＣＧＡＧＣＧＡＧＧＴＣＴＴＧＧＧＴＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＧＡＣＴＧＴＴＡＧＣＴＣＡＧＡＴＧＧＣＴＡＧＣＡＡＧＴＧＧＧＴＡＴＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴＡＴＡＧＴＧＴＧＧＧＡＴＧＴＧ
【０１７８】
【表１】
2014521329.tif 000002
【０１７９】
【表２】
2014521329.tif 000003
【０１８０】
【表３】
2014521329.tif 000004
【０１８１】
【表４】
2014521329.tif 000005
【０１８２】
【表５】
2014521329.tif 000006
【配列表フリーテキスト】
【０１８３】
配列番号１  合成配列：１４０塩基対の二重鎖ＤＮＡモデル
配列番号２  合成配列：１５ヌクレオチド長の一本鎖ＤＮＡモデル
配列番号３  合成配列：１２２塩基対の二重鎖ＤＮＡモデル
配列番号４  合成配列：１３５塩基対の二重鎖ＤＮＡモデル
配列番号５  合成配列：ｄｓＤＮＡフォワードプライマー
配列番号６  合成配列：ｄｓＤＮＡリバースプライマー
配列番号７  合成配列：２８ヌクレオチドＲＮＡモデル配列
配列番号８  合成配列：１００ヌクレオチドの５ｆＣ含有配列
【図１Ａ】
2014521329.tif 000007
【図１Ｂ】
2014521329.tif 000008
【図１Ｃ】
2014521329.tif 000009
【図２Ａ】
2014521329.tif 000010
【図２Ｂ】
2014521329.tif 000011
【図３】
2014521329.tif 000012
【図４】
2014521329.tif 000013
【図５Ａ】
2014521329.tif 000014
【図５Ｂ】
2014521329.tif 000015
【図６Ａ】
2014521329.tif 000016
【図６Ｂ】
2014521329.tif 000017
【図７Ａ】
2014521329.tif 000018
【図７Ｂ】
2014521329.tif 000019
【図８】
2014521329.tif 000020
【図９Ａ】
2014521329.tif 000021
【図９Ｂ】
2014521329.tif 000022
【図９Ｃ】
2014521329.tif 000023
【図９Ｄ】
2014521329.tif 000024
【図１０Ａ】
2014521329.tif 000025
【図１０Ｂ】
2014521329.tif 000026
【図１１】
2014521329.tif 000027
【配列表】
2014521329000001.app
【国際調査報告】
2014521329.tif 000028
2014521329.tif 000029