(57)【要約】  カレオシンポリペプチドの発現によりオイル含量が増加した組換え油糧微生物について記載される。本開示発明の組換え油糧微生物は、オイルとしてその乾燥細胞重量の少なくとも２５％を産生し、かつ機能的な多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）生合成経路とカレオシンポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクトとを含む。組換え油糧微生物中のオイル量を増加させる方法についても記載される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥細胞質量の少なくとも２５％をオイルとして産生する組換え油糧微生物であって、
該組換え油糧微生物が、機能的な多価不飽和脂肪酸生合成経路とカレオシンポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクトとを含み；
さらに該組換え油糧微生物が、対応する対照により産生されるオイル量と比較すると、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含むオイルをより多量に産生する、
組換え油糧微生物。
【請求項２】
前記微生物が、酵母、真菌、および藻類からなる群から選択される、請求項１に記載の組換え油糧微生物。
【請求項３】
微生物が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、請求項１に記載の組換え油糧微生物。
【請求項４】
多価不飽和脂肪酸が、オメガ−３多価不飽和脂肪酸およびオメガ−６多価不飽和脂肪酸からなる群から選択される、請求項１に記載の組換え油糧微生物。
【請求項５】
オメガ−３多価不飽和脂肪酸が、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）である、請求項４に記載の組換え油糧微生物。
【請求項６】
カレオシンポリペプチドが、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメント法に基づくと、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、４０、４２、および５１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性があるアミノ酸配列を有し、該カレオシンポリペプチドがカレオシン機能を有する、請求項１に記載の組換え油糧微生物。
【請求項７】
カレオシンポリペプチドが、ジアシルグリセロールのアシル化を触媒する酵素に結合している、請求項１に記載の組換え油糧微生物。
【請求項８】
前記酵素が、リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）である、請求項７に記載の組換え油糧微生物。
【請求項９】
カレオシンポリペプチドが、カレオシンポリペプチドの野生型アミノ酸配列に対して付加されたシステイン残基を含有し、該付加されたシステイン残基が、上記カレオシンポリペプチドのＮ末端およびＣ末端領域内に散在する、請求項１に記載の組換え油糧微生物。
【請求項１０】
組換え油糧微生物に含有されるオイル量を増加させる方法であって、該方法が、
ａ）請求項１に記載の組換え油糧微生物を準備するステップと、
ｂ）少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含むオイルが産生される条件下でステップ（ａ）の組換え油糧微生物を増殖させるステップと、
ｃ）場合によっては、ステップ（ｂ）のオイルを回収するステップと
を含む、上記方法。
【請求項１１】
組換え油糧微生物が、酵母、真菌、および藻類からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
微生物が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
多価不飽和脂肪酸が、オメガ−３多価不飽和脂肪酸およびオメガ−６多価不飽和脂肪酸からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
オメガ−３多価不飽和脂肪酸が、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
カレオシンポリペプチドが、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメント法に基づくと、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性があるアミノ酸配列を有し、該カレオシンポリペプチドがカレオシン機能を有する、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０１１年５月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／４９０，３３７号明細書の利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
本発明はバイオテクノロジーの分野に入る。より具体的には、本発明は、カレオシンポリペプチドの発現により、より多くのオイルを産生することができる組換え油性微生物に関する。
【背景技術】
【０００３】
糸状菌、酵母、および藻類などの微生物は、脂肪酸アシル、グリセロ脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質、ポリケチド、ステロール脂質、およびプレノール（ｐｒｅｎｏｌ）脂質を含む、種々の脂質を産生する。微生物から一般に抽出される脂質の１種として、グリセロールの脂肪酸エステル（「トリアシルグリセロール」または「ＴＡＧ」）を含むグリセロ脂質がある。ＴＡＧは脂肪酸の主要な貯蔵単位であり、したがって、長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）ならびに短鎖飽和および不飽和脂肪酸と長鎖飽和脂肪酸を含有することができる。医薬品およびダイエット食品の中に、エイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」；オメガ−３］およびドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」；オメガ−３］などのＰＵＦＡを含有させることに関心が高まっている。したがって、ＰＵＦＡを含む脂質組成物を効率的かつ費用対効果高く製造するための手段が具体的に望まれている。
【０００４】
ＰＵＦＡの種々の商業的供給源がある。しかしながら、天然供給源を使用するこれらの製造方法にはいくつかの欠点が付随する。第１に、魚類および植物などの天然供給源は、高度に不均一なオイル組成物を有する傾向がある。そのため、これらの供給源から得られるオイルは、１つまたは複数の所望のＰＵＦＡを分離または濃縮するために、広範囲の精製が必要となることがある。魚油には一般に不快な味および臭いがあり、それらを、所望の生成物から経済的に分離することが不可能な場合があり、そのような生成物を食品サプリメントとして受け入れることを困難にさせることがある。不快な味および臭いにより、高用量の摂取に基づく医療レジメンが望ましくないものになる場合があり、患者によるコンプライアンスが阻害されることがある。
【０００５】
魚類は環境汚染物質を蓄積することがあり、栄養補助食品として魚油カプセルを摂取することは、望ましくない汚染物質の摂取をもたらす可能性がある。ＰＵＦＡの天然供給源はまた、入手可能性が制御しがたい変動を受ける（例えば、魚類資源の場合には、天候、病気、または過剰漁獲により）。さらに、ＰＵＦＡを産生する作物は、食糧生産用に開発されたハイブリッド作物と経済的に競合しないことが多い。また、ＰＵＦＡを天然に産生する一部の生物（例えば、ポルフィリディウム属（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）、モルティエラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ））の大規模発酵も、工業規模で培養するには高価かつ／または困難になり得る。これらの制限の結果として、工業規模でＰＵＦＡを効率的かつ経済的に産生することができる組換え油性微生物の開発に向けて広範囲の研究がなされてきた（例えば、特許文献１）。さらに、所望のＰＵＦＡ産生を可能にする、組換え油性微生物中の脂肪酸生合成経路の改変も報告されている（例えば、特許文献２、３、４、および５）。しかしながら、現在公知の株のオイルに対して、オイル含量が増加した組換え油性微生物の必要性が依然として存在する。
【０００６】
特許文献６では、カロテノイドなどの疎水性／親油性化合物を産生するように操作された微生物細胞中の少なくとも１つの植物オレオシン遺伝子の発現が、化合物の全体的な力価を顕著に増加させることを開示している。
【０００７】
Ｆｒｏｉｓｓａｒｄら（ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．９：４２８−４３８，２００９）は、カレオシンポリペプチド（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のカレオシン１、ＡｔＣｌｏ１）をコードする異種遺伝子で形質転換された非油性酵母（サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））が、脂肪体の数およびサイズの増加を示し、親株よりも多くの脂肪酸を蓄積したことを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５−０１３６５１９−Ａ１号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６−０１１０８０６−Ａ１号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書
【特許文献６】米国特許第７，２５６，０１４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、そのような組換え微生物細胞のオイル含量を増加させるために、カレオシンポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換された組換え油性微生物の報告はない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１の実施形態では、本発明は、その乾燥細胞重量の少なくとも２５％をオイルとして産生し、かつ機能的な多価不飽和脂肪酸生合成経路とカレオシンポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクトとを含む組換え油性微生物を提供する。この実施形態の組換え油性微生物は、対応する対照により産生されるオイル量と比較すると、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含む、より大量のオイルを産生する。
【００１１】
第２の実施形態では、組換え油性微生物は、酵母、菌類、または藻類であってもよい。第３の実施形態では、組換え油性微生物は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であってもよい。
【００１２】
第４の実施形態では、組換え油性微生物により産生されるオイル内に含まれる多価不飽和脂肪酸は、オメガ−３多価不飽和脂肪酸であってもオメガ−６多価不飽和脂肪酸であってもよい。第５の実施形態では、オメガ−３多価不飽和脂肪酸はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）である。
【００１３】
第６の実施形態では、遺伝子コンストラクトによりコードされたカレオシンポリペプチドは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメント法に基づくと、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、４０、４２、または５１に対して少なくとも９０％の同一性があるアミノ酸配列を有する。この実施形態のカレオシンポリペプチドにはカレオシン機能がある。
【００１４】
第７の実施形態では、遺伝子コンストラクトによりコードされたカレオシンポリペプチドは、ジアシルグリセロールのアシル化を触媒する酵素に連結している。第８の実施形態では、ジアシルグリセロールのアシル化を触媒する酵素はリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）である。
【００１５】
第９の実施形態では、カレオシンポリペプチドは、カレオシンポリペプチドの野生型アミノ酸配列に対して付加されたシステイン残基を含有する。付加されたシステイン残基は、カレオシンポリペプチドのＮ末端およびＣ末端の領域内に点在することができる。
【００１６】
第１０の実施形態では、本発明は、組換え油性微生物に含有されるオイル量を増加させる方法であって、
ａ）本発明の組換え油性微生物を準備するステップと、
ｂ）少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含むオイルが産生する条件下でステップ（ａ）の組換え油性微生物を増殖させるステップと、
ｃ）場合によっては、ステップ（ｂ）のオイルを回収するステップと
を含む方法を提供する。
【００１７】
この方法の一態様では、組換え油性微生物は、酵母、菌類、または藻類であってもよい。別の態様では、組換え油性微生物はヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であってもよい。
【００１８】
この方法の別の態様では、組換え油性微生物により産生されるオイル内に含まれる多価不飽和脂肪酸は、オメガ−３多価不飽和脂肪酸であってもオメガ−６多価不飽和脂肪酸であってもよい。別の態様では、オメガ−３多価不飽和脂肪酸はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）である。
【００１９】
この方法のさらに別の態様では、遺伝子コンストラクトによりコードされたカレオシンポリペプチドは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメント法に基づくと、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、４０、４２、または５１に対して少なくとも９０％の同一性があるアミノ酸配列を有する。この態様のカレオシンポリペプチドにはカレオシン機能がある。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本明細書の実施例１に記載される、ｐＹＲＨ５５のプラスミドマップを示す図である。
【図２】ＡｔＣｌｏ１ｓとｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓとの間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓを得るためにＡｔＣｌｏ１ｓに付加されたシステイン残基には下線を付す。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
【表２】
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【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書で引用されたすべての特許文献および非特許文献の開示は、それらの内容全体を参照によって本明細書に組み込むものとする。
【００２４】
本開示では、以下の用語および略語を使用する。
「翻訳領域」は「ＯＲＦ」と略す。
「ポリメラーゼ連鎖反応」は「ＰＣＲ」と略す。
「米国培養細胞系統保存機関」は「ＡＴＣＣ」と略す。
「多価不飽和脂肪酸」は「ＰＵＦＡ（ｓ）」または「ＰＵＦＡｓ」と略す。
「トリアシルグリセロール」は「ＴＡＧ」と略す。
「総脂肪酸」は「ＴＦＡ」と略す。
「脂肪酸メチルエステル」は「ＦＡＭＥ」と略す。
「乾燥細胞重量」は「ＤＣＷ」と略す。
【００２５】
本明細書で使用する用語「発明」または「本発明」は、限定することを意図するものではなく、特許請求の範囲に定義されたかまたは本明細書に記載された任意の発明に一般に適用するものである。
【００２６】
本明細書で使用する用語「カレオシン機能」は、脂肪体および／または小胞体（ＥＲ）へのカレオシンの細胞内局在を指す。好ましくは、カレオシンポリペプチドは脂肪体に局在する。免疫蛍光顕微鏡法、電子顕微鏡法、および細胞成分分画（例えば、密度勾配遠心分離）は、カレオシン局在を決定するために使用することができる周知の分析法の例である。カレオシンポリペプチド機能にはまた、その過程が脂肪体融合にある役割を果たすと考えられている、カルシウム陽イオン（Ｃａ２＋）に結合するカレオシンの能力を含めることができる（Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２８：７１０−７１１）。カレオシンポリペプチドによるカルシウム結合は、例えば、ＥＧＴＡなどのカルシウムキレーターがカレオシンの電気泳動度を変化させ得るか否かを決定することを含む、Ｃｈｅｎら（１９９９，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４０：１０７９−１０８６）により記載された方法を使用して決定することができる。あるいは、カレオシン機能には、カレオシンの過剰発現時における、油性の細胞または微生物の総脂質レベルの増加に寄与するカレオシンの能力が含まれる；そのような分析の例が本明細書に提供される。
【００２７】
用語「融合タンパク質」は、少なくとも２つの独立しかつ分離可能な酵素活性、機能性、および／または結合活性を有する単一ポリペプチドを指す。用語「マルチザイム」および「融合タンパク質」は、本明細書において互換的に使用される。好ましくは、マルチザイムは、第２の酵素活性、機能性、または結合活性に連結された第１の酵素活性を含む。
【００２８】
用語「連結（ｌｉｎｋ）」は、独立しかつ分離可能な酵素、機能性、および／または結合活性を有する少なくとも２つのポリペプチドの連結（ｊｏｉｎｉｎｇ）または結合（ｂｏｎｄｉｎｇ）を指す。用語「連結」および「に連結した」は、本明細書において互換的に使用される。
【００２９】
用語「リンカー」は、マルチザイムまたは融合タンパク質における、２つ以上のポリペプチド間の結合または連結を指す。マルチザイムの形成に使用される連結は、単一ポリペプチド結合で最小限構成される。別の態様では、連結は、プロリンなどの１つのアミノ酸残基またはポリペプチドで構成することができる。連結がポリペプチドである場合、連結が少なくとも１つのプロリンアミノ酸残基を有することが望ましいことがある。
【００３０】
用語「油性」は、エネルギー源をオイルの形態で貯蔵する傾向がある生物を指す（Ｗｅｅｔｅ，Ｉｎ：Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ，１９８０）。一般に、油性微生物の細胞オイル含量はシグモイド曲線に従い、脂質濃度は、後期対数増殖期または初期定常増殖期に最大に達するまで増加し、次いで、後期定常期および死滅期の間に徐々に減少する（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７：４１９−２５（１９９１））。油性微生物が乾燥細胞重量の約２５％を超えてオイルを蓄積することはまれではない。用語「油性酵母」は、オイルを生成することができる酵母と分類される微生物を指す。油性酵母の例としては、決してこれらに限定されるものではないが、次の属、すなわちヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコックス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。
【００３１】
用語「ω−３脂肪酸」、「ｎ−３脂肪酸」、および「オメガ−３脂肪酸」は、本明細書で互換的に使用される。
【００３２】
用語「ω−６脂肪酸」、「ｎ−６脂肪酸」、および「オメガ−６脂肪酸」は、本明細書で互換的に使用される。
【００３３】
デサチュラーゼを指す場合、用語「Δ」および「デルタ」は、本明細書で互換的に使用される。
【００３４】
用語「脂質」は、任意の脂溶性（すなわち、親油性）天然分子を指す。脂質の一般的概要は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書（その中の表２を参照のこと）に提供されている。
【００３５】
用語「オイル」は、２５℃で液体であり、通常多価不飽和である脂質物質を指す。油性生物では、オイルは、総脂質の大部分を構成する。「オイル」は主としてトリアシルグリセロールから構成されるが、他の中性脂質、リン脂質、および遊離脂肪酸を含有することもある。オイル中の脂肪酸組成および総脂質の脂肪酸組成は、一般に類似している；したがって、総脂質中のＰＵＦＡ濃度の増加または減少は、オイル中のＰＵＦＡ濃度の増加または減少と対応することになり、その逆も同様である。
【００３６】
本明細書で使用する用語「より大量のオイルを産生する」は、本明細書で開示される組換え油性微生物から回収されたオイルまたは総脂質の量が、対応する野生型微生物またはカレオシンポリペプチドをコードする遺伝子コンストラクトを含まないかもしくはカレオシンポリペプチドをコードする遺伝子コンストラクトを含むが発現しない組換え油性微生物であり得る対応する対照から回収されたオイルまたは総脂質の量よりも大きいことを意味する。例えば、対応する対照は、カレオシンをコードする遺伝子コンストラクトを含有するように改変される前の組換え油性微生物（すなわち、親株）であってもよく、カレオシンをコードする遺伝子コンストラクトを含有するように改変されたが、カレオシンを発現しない組換え油性微生物であってもよい。本明細書に記載の組換え油性微生物により産生されるオイルまたは総脂質の量は、対応する対照組換え油性微生物の総脂質／オイル含量に対して、少なくとも約３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、または２５％増加し得る。
【００３７】
用語「脂肪酸」は、より長い鎖長の酸およびより短い鎖長の酸の両方が知られているが、約Ｃ１２〜Ｃ２２の種々の鎖長の長鎖脂肪酸（アルカン酸）を指す。主な鎖長はＣ１６〜Ｃ２２の間である。脂肪酸の構造は「Ｘ：Ｙ」の単純な表記法で表し、ここで、Ｘは、特定の脂肪酸における炭素原子の総数であり、Ｙは二重結合の数である。「飽和脂肪酸」対「不飽和脂肪酸」、「一価不飽和脂肪酸」対ＰＵＦＡ、および「オメガ−６脂肪酸」対「オメガ−３脂肪酸」の間の差異に関するさらに詳細な説明が、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，２３８，４８２号明細書に提供されている。
【００３８】
本明細書中の用語「総脂肪酸」［「ＴＦＡ」］は、例えばバイオマスまたはオイルのこともある所与の試料において、塩基エステル転移反応法（当技術分野で公知）により脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］に誘導することができる、すべての細胞脂肪酸の合計を指す。したがって、総脂肪酸は、中性脂質分画（ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、およびＴＡＧを含む）由来、および遊離脂肪酸以外の極性脂質分画（例えば、ＰＣおよびＰＥの分画を含む）由来の脂肪酸を含む。
【００３９】
細胞の「総脂質含量」という用語は、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）のパーセントとしてのＴＦＡの尺度である。ただし、ＤＣＷのパーセントとしてのＦＡＭＥの尺度［「ＦＡＭＥ％ＤＣＷ」］で総脂質含量を近似することができる。したがって、総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］は、例えばＤＣＷ１００ミリグラム当たりの総脂肪酸のミリグラムに等しい。
【００４０】
総脂質中の脂肪酸濃度は、ＴＦＡの重量パーセント［「％ＴＦＡ」］、例えばＴＦＡ１００ミリグラム当たりの所与の脂肪酸のミリグラムとして本明細書では表現する。本明細書の開示に特に記載がない限り、総脂質に対する所与の脂肪酸のパーセントに言及する場合、％ＴＦＡとしての脂肪酸濃度に等しい（例えば、総脂質の％ＥＰＡは、ＥＰＡ％ＴＦＡに等しい）。
【００４１】
一部の場合には、細胞の所与の脂肪酸含量を、乾燥細胞重量［「％ＤＣＷ」］の重量パーセントとして表現することが有用である。したがって、例えば、ＥＰＡ％ＤＣＷは、次式：（ＥＰＡ％ＴＦＡ）＊（ＴＦＡ％ＤＣＷ）］／１００によって決定されよう。しかしながら、乾燥細胞重量［「％ＤＣＷ」］の重量パーセントとしての細胞の所与の脂肪酸含量は、次式：（ＥＰＡ％ＴＦＡ）＊（ＦＡＭＥ％ＤＣＷ）］／１００で近似することができる。
【００４２】
本明細書で使用する用語「多価不飽和脂肪酸」および「ＰＵＦＡ」は、少なくとも１８個の炭素原子および２つ以上の二重結合を有する脂肪酸を指す。
【００４３】
本明細書中でＰＵＦＡを記載するために使用する名称を、表２に示す。「簡便表記」と題された欄には、オメガ参照系を使用して、炭素数、二重結合数、およびオメガ炭素（この目的のために１と番号付けされた）から数えてオメガ炭素に最も近い二重結合の位置を示す。表２の残りの欄には、オメガ−３およびオメガ−６脂肪酸とそれらの前駆体の一般名、本明細書を通して使用される略称、ならびに各化合物の化学名を要約する。
【００４４】
【表３】
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【００４５】
用語「ＰＵＦＡ生合成経路」および「オメガ−３／オメガ−６脂肪酸生合成経路」は、本明細書で互換的に使用され、オレイン酸を、ＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ、およびＤＰＡｎ−６などのオメガ−６脂肪酸に、そしてＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡなどのオメガ−３脂肪酸に変換する代謝過程を指す。この過程は、文献に十分に記載されている（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書を参照のこと）。手短に言えば、この過程には、小胞体膜中に存在する「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」と称される一連の特定の伸長および不飽和化の酵素を介する、炭素原子の付加による炭素鎖の伸長および二重結合の付加による分子の不飽和化が含まれる。より具体的には、「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」は、デルタ−４デサチュラーゼ、デルタ−５デサチュラーゼ、デルタ−６デサチュラーゼ、デルタ−１２デサチュラーゼ、デルタ−１５デサチュラーゼ、デルタ−１７デサチュラーゼ、デルタ−９デサチュラーゼ、デルタ−８デサチュラーゼ、デルタ−９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ（デルタ−６エロンガーゼまたはデルタ−９エロンガーゼ）、および／またはＣ２０／２２エロンガーゼを含む、ＰＵＦＡの生合成に関連した任意の酵素（および前記酵素をコードする遺伝子）を指す。オメガ−３／オメガ−６脂肪酸生合成経路と関連して本明細書で使用する用語「機能的」は、この経路中の遺伝子の一部または全部が活
性酵素を発現することを意味する。「オメガ−３／オメガ−６脂肪酸生合成経路」または「機能的なオメガ−３／オメガ−６脂肪酸生合成経路」は、多くの脂肪酸生成物がこの経路の遺伝子のサブセットの発現を必要とするだけであるので、この段落に記載された遺伝子がすべて必要であることを意味するものではないことを理解されたい。
【００４６】
用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸断片」および「単離核酸断片」は、本明細書において互換的に使用する。これらの用語はヌクレオチド配列等を包含する。ポリヌクレオチドは、合成、非天然または改変のヌクレオチド塩基を場合によっては含有する、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーとすることができる。ＤＮＡポリマーの形態にあるポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはそれらの混合物の１つまたは複数のセグメントから構成することができる。ヌクレオチド（通常、５’−一リン酸形態で見出される）は、次の一文字名により表す。アデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡに対応）に対しては「Ａ」、シチジル酸またはデオキシシチジル酸に対しては「Ｃ」、グアニル酸またはデオキシグアニル酸に対しては「Ｇ」、ウリジル酸に対して「Ｕ」、デオキシチミジル酸に対しては「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）に対しては「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）に対しては「Ｙ」、ＧまたはＴに対しては「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴに対しては「Ｈ」、イノシンに対しては「Ｉ」、任意のヌクレオチドに対しては「Ｎ」である。
【００４７】
一本鎖形態の核酸断片が、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で別の核酸断片にアニールすることができる場合、核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ分子などの別の核酸断片に「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は周知であり、参照によって本明細書に組み込むＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）の特に第１１章および表１１．１に例示されている。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件は、中程度に類似した断片（遠縁の生物からの相同配列など）から高度に類似した断片（機能性酵素を再現する、近縁の生物からの遺伝子など）までスクリーニングするように調整することができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、ストリンジェンシー条件を決定する。好ましい条件の１セットは、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温で１５分間に始まり、次いで２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、４５℃で３０分間を反復し、さらに０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５０℃で３０分間を２回反復する一連の洗浄を使用する。ストリンジェントな条件のより好ましいセットは、より高温を使用するが、その洗浄は、最後の２回の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、３０分間洗浄の温度を６０℃に上昇させることを除いて上記のものと同じである。高度にストリンジェントな条件の別の好ましいセットは、最後の２回に０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃の洗浄を使用する。ストリンジェントな条件のさらなるセットとして、例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーションおよび２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄が挙げられる。
【００４８】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能となるけれども、ハイブリダイゼーションには、２つの核酸が相補的配列を含有することが必要となる。核酸をハイブリダイズさせるための適切なストリンジェンシーは、当技術分野で周知の変数である核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高い程、それらの配列を有する核酸ハイブリッドの熱融解点［「Ｔｍ」または「Ｔｍ」］の値は高くなる。Ｔｍの高さに対応する、核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性は、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順序で低下する。長さが１００超のヌクレオチドのハイブリッドについては、Ｔｍの計算式が誘導されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、９．５０−９．５１を参照のこと）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、１１．７−１１．８を参照のこと）。一実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは、好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであり、最も好ましくは、その長さは少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに、当業者ならば、温度および洗浄液塩濃度は、プローブの長さなどの要因に応じて必要なときに調整することができることを認識されよう。
【００４９】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的な部分」とは、当業者による配列のマニュアル評価またはＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ［「ＢＬＡＳＴ」］（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９３））などのアルゴリズムを使用する、コンピュータによる自動配列比較および同定のいずれかによって、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む部分である。一般に、１０以上の連続したアミノ酸配列または３０以上のヌクレオチド配列が、既知のタンパク質または遺伝子に相同なものとしてポリペプチド配列または核酸配列を推定的に同定するために必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、２０〜３０の連続したヌクレオチドを含む、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを、微生物コロニーまたはバクテリオファージプラークのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなど、遺伝子同定（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離の配列依存的方法に使用することができる。加えて、プライマーを含む特定の核酸断片を得るために、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲの増幅プライマーとして使用することができる。したがって、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、その配列を含む核酸断片を特異的に同定および／または単離するのに十分な配列を含む。本明細書に報告された配列の利益を受ける当業者は、本明細書に記載の方法論に基づいて、当業者に周知の目的のために本開示の配列の全部または実質的な部分を今や使用することができる。
【００５０】
用語「相補的」は、互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基間の関係を記載するために使用する。例えば、ＤＮＡに関しては、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。
【００５１】
用語「相同性」および「相同」は互換的に使用する。これらは、１つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現の媒介または特定の表現型の生成に対する遺伝子断片の能力に影響を及ぼさない核酸断片を指す。これらの用語はまた、最初の未改変断片に比較して、得られる核酸断片の機能特性が実質的に変化しない、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失または挿入などの核酸断片の改変を指す。
【００５２】
さらに、当業者は、相同な核酸配列はまた、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃などの中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書に例示した配列またはその配列と機能的に同等である、本明細書に開示のヌクレオチド配列の任意の部分とハイブリダイズする能力によっても定義されることを認識する。ストリンジェンシー条件は、中程度に類似した断片をスクリーニングするように調整することができる。
【００５３】
用語「パーセント同一性」は、配列の比較により決定される、２つ以上のポリペプチド配列間または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を指す。「パーセント同一性」は、場合によっては、比較配列間のマッチのパーセントにより決定されるポリペプチド配列間またはポリヌクレオチド配列間の配列関連度も意味する。「パーセント同一性」および「パーセント類似性」は、これらに限定されないが、１）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ：ＮＪ（１９９４）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；および５）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）に記載のものを含む、公知の方法によって容易に計算することができる。
【００５４】
パーセント同一性を決定する好ましい方法は、試験配列間に最良のマッチを与えるように設計されている。パーセント同一性およびパーセント類似性を決定する方法は、一般に入手できるコンピュータプログラムの中に成文化されている。配列アラインメントおよびパーセント同一性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムを使用して実施することができる。配列の多重アライメントは、「アライメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法」および「アライメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法」（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２）に記載）を含む数種類のアルゴリズムを包含し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）（バージョン８．０．２）プログラムの中にある「アライメントのＣｌｕｓｔａｌ法」を使用して実施する。いずれかのＣｌｕｓｔａｌプログラムを使用して配列アライメントをした後、プログラム中の「配列距離」表を見ることにより、「パーセント同一性」を得ることができる。
【００５５】
「アライメントのＢＬＡＳＴＮ法」は、デフォルトパラメーターを使用してヌクレオチド配列を比較するための国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）［「ＮＣＢＩ」］により提供されるアルゴリズムであり、一方、「アライメントのＢＬＡＳＴＰ法」は、デフォルトパラメーターを使用して、タンパク質配列を比較するためのＮＣＢＩにより提供されるアルゴリズムである。
【００５６】
同一または類似の機能または活性を有する他種由来のポリペプチドを同定する際に、多くのレベルの配列同一性が有用であることは、当業者は十分理解している。適切な核酸断片、すなわち本明細書に記載の方法および宿主細胞において単離した、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本明細書に報告したアミノ酸配列に対して少なくとも約７０〜８５％同一のポリペプチドをコードし、一方、より好ましい核酸断片は、少なくとも約８５〜９５％同一のアミノ酸配列をコードする。好ましい範囲は上記のとおりであるが、パーセント同一性の有用な例としては、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの５０％〜１００％間の任意の整数パーセントが挙げられる。さらに、この単離したヌクレオチド断片のいずれの全長相補物もまたは部分的相補物も目的のものである。
【００５７】
適切な核酸断片は、上記の相同性を有するだけでなく、典型的には少なくとも５０アミノ酸、好ましくは少なくとも１００アミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００アミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０アミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【００５８】
用語「コドン縮重」は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、ヌクレオチド配列の変異を許容する遺伝暗号における性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を指定するヌクレオチドコドンの使用において特定の宿主細胞が示す「コドンバイアス」について十分承知している。したがって、宿主細胞における発現の改善を目的として遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくように遺伝子を設計することが好ましい。
【００５９】
「合成遺伝子」は、当業者に公知の手順を使用して、化学的に合成されるオリゴヌクレオチドビルディングブロックから組み立てることができる。これらのオリゴヌクレオチドビルディングブロックをアニールし、次いで連結して遺伝子セグメントを形成した後、酵素的に組み立てて全遺伝子を構築する。したがって、宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のための遺伝子を構築することができる。当業者は、宿主が好むコドンの方向へコドン使用をバイアスすると、遺伝子発現が成功する可能性が高まることを認識している。好ましいコドンは、配列情報が利用可能である、宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づいて決定することができる。例えば、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のコドン使用プロフィールは参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，１２５，６７２号明細書に提供されている。
【００６０】
「遺伝子」は、特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、コード領域のみを指すことも、またはコード配列の前（５’非コード配列）およびコード配列の後（３’非コード配列）に調節配列を含むこともある。「天然遺伝子」は、それ自体の調節配列を有する、天然に見出される遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然では一緒に見出されることがない制御配列およびコード配列を含む、天然遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列を含むことも、または同じ供給源に由来するが、天然に見出される様式とは異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含むこともある。「内在性遺伝子」は、生物ゲノム内のその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来」または「異種」遺伝子は、遺伝子移入により宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新たな位置に導入された天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換手順によりゲノムに導入された遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」は、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するように設計された、そのコドン使用頻度を有する遺伝子である。
【００６１】
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部または下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列（例えば、転写開始部位と翻訳開始コドンの間）、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を挙げることができる。
【００６２】
「プロモーター」は、コード配列または機能ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来することも、または天然に見出される様々なプロモーターに由来した様々なエレメントから構成されていることも、または合成ＤＮＡセグメントまで含むこともある。異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発生段階で、または異なる環境もしくは生理学的条件に応答して、異なるプロモーターが遺伝子の発現を指示し得ることを当業者は理解している。ほぼ常に大部分の細胞型で遺伝子の発現を誘導するプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全には画定されていないので、様々な長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター作用を示す可能性があることもまた認識されている。
【００６３】
用語「３’非コード配列」および「転写ターミネーター」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これには、ｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができるポリアデニル化認識配列およびその他の調節配列をコードする配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を及ぼすことにより特徴づけられる。３’領域は、転写、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすことができる。
【００６４】
「ＲＮＡ転写物」は、ＲＮＡポリメラーゼが触媒するＤＮＡ配列の転写により生じる生成物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、その転写物は転写一次産物と呼ばれ、または転写一次産物の転写後プロセシングから生じたＲＮＡ配列である場合は、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」は、イントロンがなく、かつ細胞がタンパク質に翻訳することができるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡに相補的で、それに由来する二本鎖ＤＮＡを指す。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含み、その故細胞がタンパク質に翻訳することができるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的転写一次産物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的で、標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書；国際公開第９９／２８５０８号パンフレット）。
【００６５】
用語「作動可能に連結される」は、一方の機能が他方の機能に影響を及ぼすように、単一核酸断片上で核酸配列が結合していることを指す。例えば、プロモーターがそのコード配列の発現に影響を及ぶすことができる場合、そのプロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。すなわち、そのコード配列はプロモーターの転写制御下にある。コード配列は、センスまたはアンチセンスの方向で調節配列に作動可能に連結することができる。さらに、例えば、コード配列は、３’転写終結配列に作動可能に連結することができる。
【００６６】
用語「組換え体」は、例えば化学合成により、または遺伝子工学技術を用いる核酸の単離セグメントの操作により、さもなければ別々の２つの配列を人為的に組合せたものを指す。
【００６７】
本明細書で使用する用語「発現」は、核酸断片に由来したセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すこともある。したがって、本明細書で使用する用語「発現」は、機能性最終生成物（例えばｍＲＮＡまたはタンパク質［前駆体または成熟のいずれか］）の生成を指す。
【００６８】
用語「導入」は、核酸（例えば、発現コンストラクト）またはタンパク質を細胞の中に供給することを意味する。導入には、核酸が細胞ゲノム中に組み込まれ得る真核生物または原核細胞の中への核酸の組み込みに関するものが含まれ、さらに核酸またはタンパク質の細胞への一過性の供給に関するものが含まれる。導入には、安定なまたは一過性の形質転換法および性的交雑法に関するものが含まれる。したがって、核酸断片（例えば、組換えコンストラクト／発現コンストラクト）の細胞内への挿入に関連した「導入」には、「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」の意味があり、核酸断片が細胞ゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体、またはミトコンドリアＤＮＡ）中に組み込まれるか、自律レプリコンに変換されるか、または一過性に発現され得る（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）真核生物または原核細胞の中への核酸断片の組み込みに関するものが含まれる。
【００６９】
「形質転換」は、遺伝学的に安定な遺伝をもたらす、宿主生物への核酸分子の移入を指す。核酸分子は、例えば自律的に複製するプラスミドである場合も、または宿主生物のゲノムへ組み込まれる場合もある。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」、「組換え」、「形質転換」、または「形質転換体」生物と呼ばれる。
【００７０】
用語「プラスミド」および「ベクター」は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態をとる染色体外エレメントを指す。このようなエレメントは、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたは任意の供給源に由来する一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡの線状もしくは環状のヌクレオチド配列とすることができ、そこでは、いくつかのヌクレオチド配列が連結または組換えされて、細胞に発現カセットを導入することができるユニークな構築物になっている。
【００７１】
用語「発現カセット」は、外来遺伝子を含有し、かつ外来宿主においてその遺伝子の発現を増強させることができるエレメントを、外来遺伝子に加えて有するＤＮＡの断片を指す。一般に、発現カセットは、選択された遺伝子のコード配列ならびに選択された遺伝子生成物の発現に必要とされる、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）の調節配列を含むことになる。したがって、発現カセットは、典型的には、１）プロモーター配列、２）コード配列、すなわち翻訳領域［「ＯＲＦ」］、および３）３’非翻訳領域、例えば真核生物では通常ポリアデニル化部位を含有するターミネーターから構成される。発現カセットは、通常、クローニングおよび形質転換を容易にするためにベクター内に含まれる。それぞれの宿主に対して適正な（適切な）調節配列を使用する限り、様々な発現カセットを、細菌、酵母、植物および哺乳類の細胞を含む様々な生物に形質転換することができる。
【００７２】
用語「組換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」および「コンストラクト」は、本明細書において互換的に使用する。組換えコンストラクトは、例えば天然に一緒に見出すことはない調節配列およびコード配列などの核酸断片の人為的な組合せを含む。例えば、組換えコンストラクトは、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列を含むことも、または同じ供給源に由来するが、天然に見出される様式とは異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含むこともある。このようなコンストラクトは、それ自体で使用することも、またはベクターと共に使用することもできる。ベクターを使用する場合、ベクターの選択は、当業者には周知のように、宿主細胞を形質転換するために使用する方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。当業者は、本明細書に記載の任意の単離核酸断片を含む宿主細胞の形質転換、選択および増殖を成功裡に行うためにベクター上に存在しなければならない遺伝エレメントを十分承知している。当業者はまた、独立した異なる形質転換事象は、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらし（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：２４１１−２４１８（１９８５）；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１８：７８−８６（１９８９））、したがって、所望の発現レベルおよびパターンを示す系統を得るためには多数の事象をスクリーニングしなければならないことも認識している。
【００７３】
用語「配列分析ソフトウェア」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の解析に有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販のものでも、または独立に開発されたものでもよい。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、これらに限定されないが、１）ＧＣＧプログラムスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））、３）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、４）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）、および５）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられる。本記載内では、配列分析ソフトウェアを解析に使用する場合は常に、特に指示がない限り、分析結果は、参照プログラムの「デフォルト値」に基づくものである。本明細書で使用する「デフォルト値」は、ソフトウェアを最初に初期化したときに、初めにロードされる値またはパラメーターの任意のセットを意味する。
【００７４】
オイルとして乾燥細胞重量の少なくとも２５％を産生し、かつ機能的な多価不飽和脂肪酸生合成経路とカレオシンポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクトとを含む組換え油性微生物が本明細書で開示される。本発明の組換え油性微生物は、対応する対照により産生されるオイル量と比較して、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含む、より大量のオイルを産生する。
【００７５】
本明細書に開示された組換え油性微生物の構築に使用される適切な宿主微生物は、オイルの合成および蓄積ができる油性微生物であり、オイルとして乾燥細胞重量の約２５％を超える量が一般に蓄積される。種々の酵母、真菌類、および藻類が油性として分類される。油性酵母がより好ましく、油性酵母として典型的に同定される属としては、これらに限定されないが、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコックス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。より具体的には、例示のオイル合成酵母として、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｎａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プルケリマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランス（Ｔｒｏｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルチヌス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．  ｇｒａｍｉｎｉｓ）およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリティカとして分類された）が挙げられる。最も好ましい油性酵母はヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり、ＡＴＣＣ＃７６９８２、ＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４および／またはＬＧＡＭ  Ｓ（７）１（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｓ．，ａｎｄ  Ａｇｇｅｌｉｓ  Ｇ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，８２（１）：４３−９（２００２））として指定されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株が最も好ましい。代替的実施形態では、非油性微生物、例えばサッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母は、油性になるように遺伝子改変することができる。
【００７６】
例として、いくつかの酵母生物が少なくとも１つのＰＵＦＡを産生するように組換え操作されている。例えば、サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｄｙｅｒ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５９：２２４−２３０（２００２）；Ｄｏｍｅｒｇｕｅ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６９：４１０５−４１１３（２００２）；米国特許第６，１３６，５７４号明細書；米国特許出願公開第２００６−００５１８４７−Ａ１号明細書）および油性酵母のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（米国特許第７，２３８，４８２号明細書；米国特許第７，４６５，５６４号明細書；米国特許第７，５８８，９３１号明細書；米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書；米国特許７，５５０，２８６号明細書；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書；米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書）の研究を参照されたい。
【００７７】
したがって、本明細書に記載されたＰＵＦＡ生合成経路遺伝子および遺伝子産物は、異種微生物の宿主細胞、特に油性酵母（例えば、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））の細胞で産生することができる。組換え微生物宿主における発現は、種々のＰＵＦＡ経路中間体を産生するために、またはその宿主を使用して可能でなかった新しい生成物の合成のためにすでに宿主に存在するＰＵＦＡ経路を調節するために有用となり得る。
【００７８】
上記に引用された教示に基づいて、好ましいオメガ−３／オメガ−６  ＰＵＦＡを産生するために、数多くの油性酵母を操作することが可能であるが、油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の代表的なＰＵＦＡ産生株を、下記の表３に記載する。これらの株は、以下のＰＵＦＡ生合成経路遺伝子の種々の組合せを有する：デルタ−４デサチュラーゼ、デルタ−５デサチュラーゼ、デルタ−６デサチュラーゼ、デルタ−１２デサチュラーゼ、デルタ−１５デサチュラーゼ、デルタ−１７デサチュラーゼ、デルタ−９デサチュラーゼ、デルタ−８デサチュラーゼ、デルタ−９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、およびＣ２０／２２エロンガーゼ。ただし、導入される特定の酵素（およびこれらの酵素をコードする遺伝子）および産生される特定のＰＵＦＡは、本明細書中の本発明を限定するものでは決してないことを認識されたい。
【００７９】
カレオシンは、植物種子中の細胞がその中にトリアシルグリセリドを貯蔵する種子脂肪体に関連したマイナーなタンパク質の１つである。カレオシンは、脂質または油体に関連して最も豊富なタンパク質であるオレオシンに類似の３ドメイン構造、具体的には、両親媒性のＮ末端およびＣ末端領域に挟まれた中央の７０〜８０の非極性残基からなる高度に保存されたドメインを有する。中央疎水性領域の真中には、脂肪体に正確にターゲティングするために必要な、いわゆる「プロリンノット」モチーフが位置する。Ｎ末端およびＣ末端ドメインは、脂肪体の表面にあるリン脂質頭部と相互作用する。カレオシンはまた、カルシウム結合部位に相当するＮ末端領域に位置した、高度に保存されたＥＦハンドループモチーフ（Ｎａｅｓｔｅｄ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４４，４６３−４７６，およびＨａｎａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．２００６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４４，３３１４０−３３１５１）およびＣ末端領域の推定上のリン酸化部位を有する。この単一カルシウム結合ＥＦハンドモチーフは、数百のＥＦハンドタンパク質の中でまれな新規の特徴である。ほとんどの場合、高親和性に２つのカルシウムイオンを協調的に結合するために、ＥＦハンドは対で見出される。Ｎａｅｓｔｅｄら（上記）は、カレオシンの単一ＥＦハンドドメインが、ＥＦハンド対を形成するために脂肪体または細胞小器官の間の膜融合に関与することを提案した。したがって、カレオシンは、ＥＲ（小胞体）と脂肪体の間の脂質輸送過程に関与する可能性がある。この考えを支持して、局在化研究から、脂肪体にまさに関連しているオレオシンと異なり、カレオシンがＥＲ、液胞、および脂肪体に関連していることがわかった（Ｆｒａｎｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，３４３−３４８，Ｎａｅｓｔｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，上記，およびＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｐｌａｎｔａ，２２１，５１３−５２２）。
【００８０】
本発明では使用することができるカレオシンポリペプチドは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、菜種、ゴマ、ヒマワリ、大豆、テーダマツ、米、トマト、トウモロコシ、大麦、およびピーナッツなどの植物の種子、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）およびアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）などの真菌類、ならびにクロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）などの藻類に見出される。したがって、植物カレオシン、真菌カレオシン、および／または藻類カレオシンを本発明で使用することができる。植物カレオシンポリペプチドの他の例としては、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１１５１９０６．１、ＡＡＦ１３７４３．１、ＡＣＪ７００８３．１、ＸＰ＿００３６２６８８７．１、ＡＣＰ２７６２０．１、ＡＢＶ７２２３７．１、ＡＢＹ５６１０３．１、ＡＢＢ０５０５２．１、ＡＡＹ４０８３７．１、ＡＥＥ８５２４７．１、ＮＰ＿１９４４０４．１、ＡＢＫ４０５０８．１、ＡＡＹ８７９０６．１、ＡＢＦ９４７１０．１、ＡＡＱ７４２４０．１、ＡＡＱ７４２３９．１、ＡＡＱ７４２３８．１、ＢＡＤ１６１６１．１、ＮＰ＿１７３７３８．２、ＮＰ＿１７３７３９．４、およびＡＥＣ０８８２５．１が挙げられる。真菌カレオシンポリペプチドの他の例としては、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＡＬ９１２４１．１、ＸＰ＿７５３２７９．１、ＥＨＡ５６２６８．１、ＥＨＡ５１０８５．１、ＥＧＸ８８２５２．１、ＸＰ＿００１８２２３９２．２、ＸＰ＿００１３９７３８４．１、ＧＡＡ８４７１１．１、ＥＧＹ２０８９３．１、ＥＥＤ２３６８５．１、ＥＦＹ８６７４１．１、ＣＢＦ７８３７９．１、ＥＥＤ４７６４４．１、ＥＤＰ５２１１３．１、ＥＡＷ１７４０６．１、ＥＤＵ４１５２３．１、ＸＰ＿００１８２８３７７．２、ＥＡＵ９３３６９．２、ＸＰ＿００２３８２４８６．１、およびＸＰ＿００２３４１０７２．１が挙げられる。藻類カレオシンポリペプチドの他の例としては、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥＢ７７７６３．１、ＥＩＥ１９７６２．１、ＥＩＥ１９７６１．１、ＥＤＰ０９７７８．１、ＥＦＮ５２９９７．１、ＸＰ＿００２９５８３２５．１、ＸＰ＿００２９４５８７０．１、ＥＦＪ５２８６５．１、ＥＦＪ４０６１８．１、ＸＰ＿００１６９６４６３．１、ＸＰ＿００１６９５３６７．１、ＣＡＢ４２５８５．１、およびＥＤＰ０１６２５．１が挙げられる。
【００８１】
さらに、本発明で使用するのに適したカレオシンポリペプチドとして、これらに限定されないが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３８、４０、４２、および５１に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。
【００８２】
カレオシンポリペプチドには上記に定義されたカレオシン機能がある。
【００８３】
一実施形態では、カレオシンポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、４０、４２，および５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、カレオシンポリペプチドは、配列番号２に示されたアミノ酸配列を含む。
【００８４】
当技術分野で周知のように、これらのカレオシンポリペプチド配列は、配列分析ソフトウェアを使用して、同種または他種のカレオシンホモログを簡便に探索するために使用することができる。一般に、このようなコンピュータソフトウェアは、種々の置換、欠失、およびその他の改変に対して相同性の程度を割り当てることにより、類似配列をマッチさせる。タンパク質配列データベースに対してタンパク質配列を比較し、それによって好ましい生物内の類似の公知配列を同定するために、低複雑性フィルター（ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｆｉｌｔｅｒ）および以下のパラメーター：期待値（Ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ）＝１０、マトリックス＝Ｂｌｏｓｕｍ６２を用いるＢＬＡＴＰアライメント法（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））などのソフトウェアアルゴリズムを使用することはよく理解されている。
【００８５】
公知配列のデータベースの中を検索するためのソフトウェアアルゴリズムの使用は、上記に記載されている配列など、公的に利用可能なカレオシンポリペプチド配列に対して比較的低いパーセント同一性を有するホモログの単離に特に適している。公的に利用可能なカレオシン配列に対して少なくとも約７０％〜８５％同一であるカレオシンホモログの単離は比較的容易であると予測できる。さらに、少なくとも約８５％〜９０％同一であるそれらの配列は、単離に特に適しており、少なくとも約９０％〜９５％同一である配列は、最も容易に単離されるであろう。
【００８６】
一実施形態では、カレオシンポリペプチドは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメント法に基づくと、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３８、４０、４２、および５１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％または９５％の配列同一性があり、これらのカレオシンポリペプチドにはカレオシン機能（上記）がある。
【００８７】
他の実施形態では、カレオシンポリペプチドは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメント法に基づくと、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、４０、４２、および５１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％または９５％の配列同一性があり、これらのカレオシンポリペプチドにはカレオシン機能（上記）がある。
【００８８】
他の実施形態では、カレオシンポリペプチドは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメント法に基づくと、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％または９５％の配列同一性があり、これらのカレオシンポリペプチドにはカレオシン機能（上記）がある。
【００８９】
加えて、本明細書または公開文献に記載されているカレオシンをコードする任意の核酸断片または同定された任意のホモログを使用して、同種または他種由来のホモログタンパク質をコードする遺伝子を単離することができる。配列依存プロトコールを用いるホモログ遺伝子の単離は当技術分野で周知である。配列依存プロトコールの例としては、これらに限定されないが、１）核酸ハイブリダイゼーション法、２）ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）、リガーゼ連鎖反応（Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：１０７４（１９８５））、または鎖置換増幅（Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３９２（１９９２））などの核酸増幅技術の種々の使用により例示されるＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法、ならびに３）相補性によるライブラリー構築およびスクリーニングの方法が挙げられる。
【００９０】
例えば、公的に利用可能なカレオシン遺伝子またはそれらのモチーフに類似したタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、それらの公的に利用可能な核酸断片の全部または一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして用い、周知の方法によって所望の任意の生物からのライブラリーをスクリーニングすることにより直接単離することができよう。公的に利用可能な核酸配列に基づいた特定のオリゴヌクレオチドプローブは、当技術分野で公知の方法により設計および合成することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ）。さらに、配列全体を直接使用して、ランダムプライマーＤＮＡ標識化、ニックトランスレーション法、もしくは末端標識化手法などの当業者に公知の方法によるＤＮＡプローブ合成、または利用可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写システムを用いるＲＮＡプローブ合成を行うことができる。さらに、特定のプライマーを設計および使用して、公的に利用可能な配列またはそれらのモチーフの一部または全長を増幅することができる。得られた増幅産物は、増幅反応の間に直接標識するか、または増幅反応の後に標識して、適切なストリンジェンシー条件下で全長ＤＮＡ断片を単離するためのプローブとして使用することができる。
【００９１】
まさに議論した周知の方法のいずれかに基づいて、選択した好ましい任意の生物において、カレオシン遺伝子ホモログを同定および／または単離することが可能であろう。
【００９２】
カレオシンポリペプチドをコードする異種遺伝子が、宿主微生物において同じコドン選択性を共有する可能性は低い。したがって、所望の宿主微生物のためにコドン使用頻度を最適化することが望ましいことがある。当技術分野で公知のように、コドン使用頻度は、宿主微生物のコドン使用頻度パターン、「ＡＴＧ」翻訳開始コドン周辺のコンセンサス配列、およびＲＮＡ安定性の一般側（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ，Ｇ．ａｎｄ  Ｊ．Ｂｒｅｗｅｒ，Ｇｅｎｅ，２６５（１−２）：１１−２３（２００１））に従って最適化することができる。例えば、カレオシン遺伝子のコード配列は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）のコドン使用頻度パターン（国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレット）に従って、国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレットおよび米国特許第７，１２５，６７２号明細書に記載の方法でヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現のために最適化することができる。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現のためにコドン最適化されたＡｔＣｌｏ１コード配列（「ＡｔＣｌｏ１ｓ」と命名）を、配列番号３３に示す。
【００９３】
本発明の特定の実施形態は、オイルとしてその乾燥細胞重量の少なくとも２５％を産生し、かつ機能的な多価不飽和脂肪酸生合成経路とジアシルグリセロールのアシル化を触媒する酵素などの別のタンパク質に連結されているカレオシンポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクトとを含む組換え油性微生物に注目する。
【００９４】
ジアシルグリセロールのアシル化を触媒する酵素の例としては、アシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ、ＥＣ  ２．３．１．２０；例えば、アイソフォームＤＧＡＴ−１およびＤＧＡＴ−２）ならびにリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ、Ｅ．Ｃ．２．３．１．１５８）がある。好ましい実施形態では、ジアシルグリセロールのアシル化を触媒する酵素は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＤＧＡＴまたはＰＤＡＴである。本発明で有用なＤＧＡＴおよびＰＤＡＴ酵素の例が、米国特許第７，９０１，９２８号明細書、米国特許第７，２７３，７４６号明細書、および米国特許第７，２６７，９７６号明細書に開示されており、これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれる。ジアシルグリセロールのアシル化を触媒する酵素は、本発明の組換え油性微生物にとって異種または天然の供給源に由来することができる。
【００９５】
本発明の特定の実施形態では、リンカーペプチドは、カレオシンポリペプチドとジアシルグリセロールのアシル化を触媒する酵素との間の融合を媒介する。リンカーペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５以上のアミノ酸残基を含有することができる。本発明では使用することができるリンカーの一例は、２４アミノ酸の配列番号６０である。本明細書で有用なリンカーの他の例が、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書に開示されている。あるいは、ペプチド結合を使用して、ジアシルグリセロールのアシル化を触媒する酵素とカレオシンポリペプチドを連結することができる。
【００９６】
カレオシンポリペプチドは、ジアシルグリセロールのアシル化を触媒する酵素に連結される場合、融合タンパク質のＮ末端終端（すなわち、アミノ末端）またはＣ末端終端（すなわち、カルボキシ末端）に位置させることができる。換言すれば、連結の順序は重要ではない。Ｃ末端タンパク質の最初の１、２、３、４、５、または６アミノ酸残基は、融合の形成に適合するように、それに応じて改変されてもよい。カレオシンポリペプチドには、融合タンパク質として本発明で使用される場合、カレオシン機能（上記）がある。
【００９７】
カレオシンポリペプチドとジアシルグリセロールのアシル化を触媒する酵素とを含有する融合タンパク質の例は、配列番号５３および５５であり、そこでは、特定のシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）由来カレオシンが、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）由来ＰＤＡＴに連結されている。カレオシンは、配列番号５３ではＰＤＡＴに対してＮ末端に位置し、配列番号５５ではＰＤＡＴに対してＣ末端に位置する。特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメント法に基づくと、配列番号５３または５５に対して少なくとも９０％または９５％の配列同一性があり、融合タンパク質のカレオシン部分にはカレオシン機能（上記）がある。
【００９８】
本発明の特定の実施形態では、遺伝子コンストラクトによりコードされたカレオシンポリペプチドは、付加されたシステイン残基を含有する。システイン残基は、カレオシンポリペプチドの野生型アミノ酸配列に対して「付加」される。カレオシンが脂肪体に局在する場合、カレオシンの概して親水性のＮ末端およびＣ末端領域は、脂肪体表面上に局在するが、より疎水性の中間領域は、脂肪体内部に留まる。したがって、付加されたシステイン残基が、カレオシンポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端領域の内部に点在すると、脂肪体表面における、隣接カレオシンポリペプチド間でのジスルフィド結合形成のための部位が形成されると考えられる。カレオシン間のそのようなジスルフィド結合形成により、二量化または重合したカレオシンが生じ得る。
【００９９】
少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のシステイン残基をカレオシンポリペプチドに付加することができる。そのような改変カレオシンまたは「ｃｙｓ−カレオシン」は、天然および付加のシステインの両方をカウントすると、合計３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２のシステインを有することができる。システイン残基は、カレオシンのＮ末端終端およびＣ末端終端の両方に付加することができるが、ここで、Ｎ末端領域はカレオシンの最初の約９０〜１００アミノ酸残基を包含し、Ｃ末端領域は、カレオシンの最後の約１００〜１１０アミノ酸を包含する。一例として、３、４、または５システイン残基を、カレオシンポリペプチドのＮ末端およびＣ末端領域の両方に付加することができる。好ましくは、ｃｙｓ−カレオシンのシステインは、Ｎ末端およびＣ末端領域の内部で、平均間隔が１０アミノ酸になるように、互いに７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸の間隔で配置される。システインは、アミノ酸の変異によって、かつ／または例えばカレオシンをコードするヌクレオチド配列の部位特異的突然変異を使用する挿入によって、本発明のカレオシンに付加することができる。
【０１００】
本発明に有用なｃｙｓ−カレオシンポリペプチドの一例は、配列番号５１である。このポリペプチドは、そのＮ末端およびＣ末端領域にそれぞれ５および３の付加されたシステイン残基を有するように改変された、特定のシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）由来カレオシンである。特定の実施形態では、本発明のｃｙｓ−カレオシンは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメント法に基づくと、配列番号５１に対して少なくとも９０％または９５％の配列同一性があり、ｃｙｓ−カレオシンにはカレオシン機能（上記）がある。
【０１０１】
カレオシンポリペプチドをコードする遺伝子は、当技術分野で公知の方法を使用して、遺伝子コンストラクトの一部として宿主微生物に導入することができる。例えば、この遺伝子をプラスミド上で宿主細胞に導入することができる。加えて、遺伝子を適切な調節配列と共に染色体に組み込むこともできる。遺伝子を、非天然プロモーターまたは改変天然プロモーターの制御下になるように改変することができる。内因性プロモーターは、変異、欠失、および／または置換により、ｉｎ  ｖｉｖｏで改変することができる。カレオシンポリペプチドをコードする遺伝子は、以下に記載の方法を使用して、個別の遺伝子コンストラクト上で、または機能的な多価不飽和脂肪酸生合成経路遺伝子をコードする遺伝子コンストラクトの一部として宿主微生物に導入することができる。
【０１０２】
本発明の組換え油性微生物は、機能的な多価不飽和脂肪酸生合成経路をコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクトを含む。数多くの微生物が、デサチュラーゼ（すなわち、デルタ−１２デサチュラーゼ、デルタ−６デサチュラーゼ、デルタ−８デサチュラーゼ、デルタ−５デサチュラーゼ、デルタ−１７デサチュラーゼ、デルタ−１５デサチュラーゼ、デルタ−９デサチュラーゼ、デルタ−４デサチュラーゼ）遺伝子とエロンガーゼ（すなわち、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Ｃ２０／２２エロンガーゼ、およびデルタ−９エロンガーゼ）遺伝子との適切な組合せの導入により長鎖多価不飽和脂肪酸を産生するように遺伝子操作されてきた。例えば、サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｄｙｅｒ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５９：２２４−２３０（２００２）；Ｄｏｍｅｒｇｕｅ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６９：４１０５−４１１３（２００２）；米国特許第６，１３６，５７４号明細書；米国特許出願公開第２００６−００５１８４７−Ａ１号明細書）、海洋性のシアノバクテリウム・シネココッカス（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）種（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｉｄｓ，３５（１０）：１０６１−１０６４（２００６））、メチロトローフの酵母ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（Ｋａｊｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，５４（３）：３３５−５２（２００４））、およびコケのニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）（Ｋａｅｗｓｕｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１０１（１１）：４０８１−４０８８（２０１０））の研究を参照されたい。
【０１０３】
一部の実施形態では、天然のデサチュラーゼ酵素の発現が、以下の理由で異種の（または「外来の」）酵素よりも好まれる：１）天然の酵素は、細胞内の他の酵素およびタンパク質との相互作用について最適化されている；および２）異種遺伝子は、宿主生物において同じコドン選択性を共有している可能性が低い。加えて、天然遺伝子の配列が知られている場合、内因性遺伝子のダウンレギュレーションが所望により可能になるので、有利性がある。
【０１０４】
しかしながら、多くの実例では、適切なデサチュラーゼおよびエロンガーゼは、所望のＰＵＦＡ生成物の産生を可能にするために選択した宿主微生物の中に存在しない。油性微生物は、デルタ−６デサチュラーゼ／デルタ−６エロンガーゼ経路またはデルタ−９エロンガーゼ／デルタ−８デサチュラーゼ経路のデサチュラーゼおよびエロンガーゼをコードする適切な異種遺伝子を、目的の任意特定のＰＵＦＡ産生用の宿主微生物に組み込むことによりオメガ−３／オメガ−６  ＰＵＦＡを産生するように操作することができる。好ましい遺伝子、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する特定のポリペプチドを選ぶための検討事項、および油性微生物の中にＰＵＦＡ生合成経路を組み込む手段が、米国特許第７，２３８，４８２号明細書、同第７，４６５，５６４号明細書、同第７，５８８，９３１号明細書、および同第７，５５０，２８６号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書および米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に詳述されている。これらの参考文献はまた、以下のことを含む、特定のＰＵＦＡの高レベル産生を可能にするために必要とされ得るさらなる改変に関する詳細についても記載している：１）効率的な生合成および貯蔵脂質プール（すなわち、ＴＡＧ分画）へのオメガ脂肪酸の移行を可能にするアシルトランスフェラーゼ活性の操作；２）強力なプロモーターの使用、多コピーでの発現、および／またはコドン最適化による、デサチュラーゼ、エロンガーゼ、およびジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼの過剰発現；３）所望のＰＵＦＡの全体的な蓄積を増加させる、β酸化に関与するものなど特定遺伝子の発現のダウンレギュレーション；４）所望のＰＵＦＡの産生に影響を及ぼす経路および全体的な調節因子の操作；および５）ＰＵＦＡ生合成経路内の「推進／抑制」。さらに、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書、具体的にはその中の実施例５５および５６は、油性酵母において異種的に発現された場合、個々のデルタ−９エロンガーゼおよび／またはデルタ−８デサチュラーゼに比べて改善された酵素活性を有するＤＧＬＡシンターゼ（マルチザイム）について記載している。驚くべきことに、リンカー領域により分離して、１つの融合タンパク質として２つの独立した酵素を一緒に融合させると、ＬＡからＤＧＬＡへの流れが増加し、デルタ−９エロンガーゼの生成物が融合タンパク質中のデルタ−８デサチュラーゼの基質として直接投入され得ることが示唆された。
【０１０５】
表３に、以下のＰＵＦＡ生合成経路遺伝子の種々の組合せを有するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株について記載する：デルタ−４デサチュラーゼ、デルタ−５デサチュラーゼ、デルタ−６デサチュラーゼ、デルタ−１２デサチュラーゼ、デルタ−１５デサチュラーゼ、デルタ−１７デサチュラーゼ、デルタ−９デサチュラーゼ、デルタ−８デサチュラーゼ、デルタ−９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、およびＣ２０／２２エロンガーゼ。ただし、導入される特定の酵素（およびこれらの酵素をコードする遺伝子）および産生される特定のＰＵＦＡは、本明細書中の本発明を限定するものでは決してない。
【０１０６】
【表４】
2014516537.tif 000006
【０１０７】
【表５】
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【０１０８】
【表６】
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【０１０９】
【表７】
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【０１１０】
当業者は、本発明の方法論が上記のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株に限定されるものではないことを認識するであろう。むしろ、ＰＵＦＡを産生することができるいずれの組換え油性微生物も、本明細書で開示のような使用に等しく適するであろう。
【０１１１】
一部の実施形態では、組換え油性微生物株が「高レベル産生」できることが望ましいことがあり、そこでは、微生物が、所望のＰＵＦＡ（すなわち、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ、ＡＲＡ、ＤＰＡ  ｎ−６、ＥＰＡ、ＤＰＡ  ｎ−３、および／またはＤＨＡ）を総脂質の少なくとも約５〜１０％産生することができる。より好ましくは、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、所望のＰＵＦＡを総脂質の少なくとも約１０〜２５％、より好ましくは所望のＰＵＦＡを総脂質の少なくとも約２５〜３５％、より好ましくは所望のＰＵＦＡを総脂質の少なくとも約３５〜４５％、より好ましくは所望のＰＵＦＡを総脂質の少なくとも約４５〜５５％、最も好ましくは所望のＰＵＦＡを総脂質の少なくとも約５５〜６５％産生する。ＰＵＦＡの構造形態は限定されない；したがって、例えば、ＥＰＡは、遊離脂肪酸として、またはアシルグリセロール、リン脂質、スルホリピド、もしくは糖脂質などのエステル形態で総脂質中に存在してもよい。
【０１１２】
したがって、適切なプロモーターの制御下にある、ＰＵＦＡ生合成経路、すなわち、本明細書に記載のデルタ−９エロンガーゼ／デルタ−８デサチュラーゼ経路もしくはデルタ−６デサチュラーゼ／デルタ−６エロンガーゼ経路、またはその一部をコードするキメラ遺伝子の導入により、オメガ−３および／またはオメガ−６脂肪酸の産生の増加が予測される。宿主微生物の中で、ＰＵＦＡデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の種々の組合せが一緒に発現することが有用になると考えられる。特定の発現カセット内に含まれる特定の遺伝子は、宿主細胞、天然のデサチュラーゼおよびエロンガーゼを使用してＰＵＦＡを合成するその能力、基質の利用可能性、および所望の最終生成物に依存することは、当業者には明らかであろう。例えば、以下の酵素活性の１つまたは複数をコードする遺伝子を含む発現カセットが構築されることが望ましくなり得る：デルタ−４デサチュラーゼ、デルタ−５デサチュラーゼ、デルタ−６デサチュラーゼ、デルタ−１２デサチュラーゼ、デルタ−１５デサチュラーゼ、デルタ−１７デサチュラーゼ、デルタ−９デサチュラーゼ、デルタ−８デサチュラーゼ、デルタ−９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、およびＣ２０／２２エロンガーゼ。そのため、本発明は、本明細書に記載のＰＵＦＡ酵素に脂肪酸基質を曝露して基質を所望の脂肪酸生成物に変換することを含む、ＰＵＦＡの産生方法を包含する。したがって、本明細書に記載の各ＰＵＦＡ遺伝子および対応する酵素生成物（例えば、適切なデサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する、野生型、コドン最適化、合成、および／または変異の酵素）は、ＰＵＦＡ産生のために直接的または間接的に使用することができる。脂肪酸基質が、中間ステップまたは経路中間体を何ら介さずに、所望の脂肪酸生成物に直接変換される場合に、ＰＵＦＡの直接産生が生じる。例えば、ＤＧＬＡを産生するかまたは供給される宿主細胞において、デルタ−５デサチュラーゼ活性を提供する発現カセットを前記細胞に付加または導入することにより、ＡＲＡ産生が生じるであろう。
【０１１３】
さらに、ＰＵＦＡ生合成経路をコードする複数の遺伝子を組み合わせて使用して、所望のＰＵＦＡを産生する一連の反応を生じさせることができる。例えば、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、デルタ−５デサチュラーゼ、およびデルタ−１７デサチュラーゼ活性をコードする発現カセットにより、天然ではＧＬＡを産生する宿主細胞が、その代りにＥＰＡを産生できるようになるであろう（結果として、デルタ−６エロンガーゼなどのＣ１８／２０エロンガーゼによりＧＬＡがＤＧＬＡに変換され；次いで、デルタ−５デサチュラーゼによりＤＧＬＡがＡＲＡに変換可能であり；次いで、デルタ−１７デサチュラーゼによりＡＲＡがＥＰＡに変換される）。Ｃ２０／２２エロンガーゼを加えると、ＥＰＡがＤＰＡに変換され、さらにデルタ−４デサチュラーゼを加えると、ＤＰＡがＤＨＡに変換されるであろう。
【０１１４】
一実施形態では、本明細書に開示の組換え油性微生物により産生される多価不飽和脂肪酸は、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡからなる群から選択されるオメガ−３多価不飽和脂肪酸を含む。好ましい実施形態では、産生されるオメガ−３多価不飽和脂肪酸はＥＰＡである。
【０１１５】
本発明の組換え油性微生物を構築するために、ＰＵＦＡ生合成経路およびカレオシンポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクトを作製し、適切な宿主細胞に導入することが必要である。１つまたは複数のＰＵＦＡ生合成経路酵素およびカレオシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、複数の別々のコンストラクトに配置してもよい。当業者は、１）ＤＮＡ分子、プラスミド等の高分子の構築、操作、および単離のための特定の条件および手順、２）組換えＤＮＡ断片および組換え発現コンストラクトの生成、および３）クローンのスクリーニングおよび単離を記載する標準資料教材について承知している。上記のＭａｎｉａｔｉｓ、Ｓｉｌｈａｖｙら、およびＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたい。
【０１１６】
一般に、コンストラクトに含まれる配列の選択は、所望の発現生成物、宿主細胞の性質および非形質転換細胞に対して形質転換細胞を分離する提案手段に依存する。当業者は、キメラ遺伝子を含有する宿主細胞の形質転換、選択および増殖を成功裡に行うためにプラスミドベクター上に存在しなければならない遺伝エレメントについて承知している。しかしながら、典型的には、ベクター、プラスミドまたはカセットは、関連遺伝子、選択可能マーカー、および自律複製または染色体組込みを可能にする配列の転写および翻訳を指示する配列を含有する。適切なベクターは、転写開始を制御する遺伝子の領域５’（すなわちプロモーター）、遺伝子コード配列および転写終結を制御するＤＮＡ断片の領域３’（すなわちターミネーター）を含む。両方の制御領域が、形質転換された宿主細胞の遺伝子に由来する場合が最も好ましい。両方の制御領域は、産生宿主にとって天然の遺伝子に由来する必要はないが、形質転換された宿主細胞の遺伝子に由来する場合が最も好ましい。
【０１１７】
所望の微生物宿主細胞において、デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼならびにカレオシンポリペプチドコード配列の発現を促進するのに有用な転写開始制御領域（開始制御領域またはプロモーターもまた）は周知である。これらの制御領域は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、イントロン配列、３’ＵＴＲおよび／または５’ＵＴＲ領域、ならびにタンパク質および／またはＲＮＡ安定化エレメントを含むことができる。このようなエレメントはそれらの強度および特異性において異なっていてもよい。実際、選択された宿主細胞において、これらのコード配列の発現を指示できる任意のプロモーター、すなわち天然、合成、またはキメラのいずれのプロモーターも適している。ただし、宿主種由来の転写および翻訳領域は特に有用である。宿主細胞における発現は、誘導様式または構成的様式で達成することができる。誘導発現は、目的の遺伝子に作動可能に連結された調節可能プロモーターの活性を誘導することにより起こるが、一方構成的発現は、構成的プロモーターの使用により起こる。例えば、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）で使用される好ましい転写開始調節領域については、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットに対応する米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。構成的転写または誘導転写のいずれが望ましいか、目的のコード配列を発現する際のプロモーターの効率、構築の容易さ等に応じて、いくつかの調節配列のいずれか１つを使用することができる。翻訳開始コドン「ＡＴＧ」周辺のヌクレオチド配列が、酵母細胞における発現に影響を及ぼすことがわかっている。所望のポリペプチドの発現が酵母では不十分な場合、外来性遺伝子のヌクレオチド配列を効率的な酵母翻訳開始配列を含めるように改変して、最適な遺伝子発現を得ることができる。酵母における発現の場合、非効率的に発現する遺伝子を、内因性酵母遺伝子、好ましくは高度発現する遺伝子にインフレームで融合することによる、この遺伝子の部位特異的突然変異誘発によりこれを行うことができる。あるいは、宿主におけるコンセンサス翻訳開始配列を決定し、目的の宿主における異種遺伝子の最適な発現のために、この配列を異種遺伝子の中に組み込むことができる。
【０１１８】
転写終結領域を含有する３’非コード配列は、組換え体コンストラクト中に備えることができ、開始領域が得られた遺伝子の３’領域に由来してもまたは異なる遺伝子に由来してもよい。多数の終結領域が公知であり、（それらが由来した属および種と同じでも異なっていても使用されると）種々の宿主において満足に機能する。終結領域はまた、好ましい宿主にとって天然の種々の遺伝子に由来してもよい。終結領域は、通常、何らかの特定の性質のためではなく便宜上で選択されることが多い。当業者は、入手可能な情報を利用して、転写ターミネーターとして機能する３’−領域配列を設計し合成することができるので、３’−領域は合成することもできる。終結部位は不必要な場合もあるが、極めて好ましいものである。
【０１１９】
クローニングベクターに遺伝子を挿入するのみでは、所望の率、濃度、量等でのその発現は保証されない。高い発現率の必要性に応じて、多くの特殊化した発現ベクターが、転写、ＲＮＡ安定性、翻訳、タンパク質の安定性および局在、ならびに宿主細胞からの分泌を支配する特定の性質を調整することにより作製されている。これらの性質としては、関連転写プロモーター配列およびターミネーター配列の性質；クローン化遺伝子のコピー数（そこでは、追加のコピーは単一発現コンストラクト内にクローニングされてもよく、かつ／または追加のコピーは、プラスミドコピー数の増加により、もしくはゲノムへのクローン化遺伝子の多重組込みにより宿主細胞に導入されてもよい）；遺伝子がプラスミドに保持されるか宿主細胞ゲノムに組み込まれるか；合成される外来タンパク質の最終的な細胞局在、宿主生物におけるタンパク質の翻訳および正確なフォールディングの効率；宿主細胞内でのクローン化遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質の固有の安定性；ならびに宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近い頻度でのクローン化された遺伝子内のコドン使用が挙げられる。これらの種類の改変それぞれが、ＰＵＦＡ生合成経路酵素およびカレオシンポリペプチドの発現をさらに最適化する手段として本発明に包含される。
【０１２０】
少なくとも１つのプロモーター、機能的なＰＵＦＡ生合成経路およびカレオシンポリペプチドをコードする核酸配列、ならびに少なくとも１つのターミネーターを含む、少なくとも１つの遺伝子コンストラクトを作製した後、そのコンストラクトを宿主細胞において自律複製可能なプラスミドベクターに配置するか、またはキメラ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を宿主細胞ゲノムに直接組み込む。発現カセットの組込みは、宿主ゲノム内でランダムに起こすことができるか、または宿主遺伝子座内での組換えを目的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同領域を含有するコンストラクトを使用することにより標的を設定することができる。コンストラクトの標的を内因性遺伝子座にする場合、転写および翻訳の制御領域の全部または一部を内因性遺伝子座から得ることができる。
【０１２１】
２つ以上の遺伝子が別々の複製ベクターから発現する場合、各ベクターには異なる選択手段があることが望ましく、各ベクターは、安定な発現を維持しかつコンストラクト間のエレメントの再集合を防止するために他のコンストラクトとの相同性を有するべきではない。すべての導入遺伝子が、所望の生成物の合成を実現するのに必要なレベルで発現するように、導入コンストラクトの制御領域、選択手段、および増殖方法の賢明な選択を実験的に決定することができる。
【０１２２】
目的遺伝子を含むコンストラクトは、任意の標準手法により宿主細胞に導入することができる。これらの手法としては、形質転換（例えば、酢酸リチウム形質転換［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：１８６−１８７（１９９１）］）、遺伝子銃衝撃（ｂｏｌｉｓｔｉｃ  ｉｍｐａｃｔ）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、または目的遺伝子を宿主細胞に導入する他の任意の方法が挙げられる。油性酵母（例えば、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））に適用可能なより具体的な教示としては、米国特許第４，８８０，７４１号明細書および米国特許第５，０７１，７６４号明細書、ならびにＣｈｅｎ，Ｄ．Ｃ．ら（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４８（２）：２３２−２３５（１９９７））が挙げられ、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２３】
便宜上、例えば発現カセット中のＤＮＡ配列を取り込む任意の方法により操作された宿主細胞を、本明細書では、「形質転換された」、「形質転換体」、または「組換え体」と呼ぶことにする。形質転換された宿主は、発現コンストラクトの少なくとも１つのコピーを有し、発現カセットがゲノムに組み込まれ、増幅されるか否か、または複数のコピー数を有する染色体外エレメント上に存在するか否かに応じて、２つ以上有することがある。形質転換宿主細胞は、導入コンストラクト上に含有されるマーカーに対する選択により同定することができる。あるいは、多くの形質転換手法が多くのＤＮＡ分子を宿主細胞に導入するので、別個のマーカーコンストラクトを所望のコンストラクトと同時形質転換することができる。
【０１２４】
典型的には、形質転換宿主は、選択培地上で増殖する能力に対して選択され、選択培地は、抗生物質が組み込まれている場合も、または栄養素もしくは増殖因子など非形質転換宿主の増殖に必要な要素が欠損している場合もある。導入マーカー遺伝子は、抗生物質抵抗性を与える場合も、または必須な増殖因子または酵素をコードしている場合もあり、そのため、形質転換宿主で発現すると、選択培地上での増殖が可能になる。発現したマーカータンパク質を直接的または間接的に検出することができると、形質転換宿主の選択も可能になる。さらなる選択手法については、米国特許第７，２３８，４８２号明細書、米国特許第７，２５９，２５５号明細書、および国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットに記載されている。
【０１２５】
形質転換後、組換え型で発現されるデサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼ（ならびに場合によっては、宿主細胞内に発現される他のＰＵＦＡ酵素）に適した基質は、宿主により天然にまたは遺伝子導入的に産生されてもよく（すなわち、基質は内因性である）、外因的に提供されてもよい。
【０１２６】
形質転換された宿主細胞は、キメラ遺伝子（例えば、デサチュラーゼ、エロンガーゼ等をコードする）の発現を最適化する条件下で増殖し、好ましいＰＵＦＡを最大かつ最高経済収率で産生する。一般に、最適化することができる培地条件としては、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素対窒素比、種々のミネラルイオンの量、酸素レベル、増殖温度、ｐＨ、バイオマス生産段階の期間、オイル蓄積段階の期間、ならびに細胞収集の時期および方法が挙げられる。油性酵母は、複合培地（例えば、酵母抽出物−ペプトン−デキストロースブロス（ＹＰＤ））、または増殖に必要な成分が欠損し、それによって所望の発現カセットの選択を引き出す合成（ｄｅｆｉｎｅｄ）最少培地（例えば、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））の中で増殖させることができる。
【０１２７】
本明細書に記載の方法および宿主細胞のための発酵培地は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書および米国特許出願公開第２０１１−００５９２０４Ａ１号明細書に教示されるものなど、適切な炭素源を含有する。本発明で利用される炭素源には、多種多様な炭素含有源が包含され得ると考えられるが、好ましい炭素源は、糖、グリセロール、および／または脂肪酸である。グルコース、スクロース、転化スクロース、フルクトース、および／または１０〜２２の間の炭素を含有する脂肪酸が最も好ましい。
【０１２８】
窒素は、無機（例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機（例えば、尿素、グルタミン酸、または酵母抽出物）の供給源から補充することができる。スクロースおよび窒素源に加えて、発酵培地はまた、微生物の増殖およびＰＵＦＡ産生に必要な酵素経路の促進に適した、当業者に公知の適切なミネラル、塩、補因子、緩衝液、ビタミン、および他の成分を含有する。脂質およびＰＵＦＡの合成を促進するいくつかの金属イオン（例えば、Ｆｅ＋２、Ｃｕ＋２、Ｍｎ＋２、Ｃｏ＋２、Ｚｎ＋２、Ｍｇ＋２）に対しては、特別の考慮が払われる（Ｎａｋａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｏｉｌｓ，Ｋｙｌｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｉｎ，ｅｄｓ．ｐｐ．６１−９７（１９９２））。
【０１２９】
本発明における好ましい増殖培地は、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）などの一般の商業的調製培地である。他の合成（ｄｅｆｉｎｅｄ）増殖培地または合成（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）増殖培地も使用することができ、特定の微生物の増殖に適した培地は、微生物学または発酵科学の当業者には公知である。発酵に適したｐＨ範囲は、典型的には、約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の間であり、その中では初期増殖条件の範囲としてｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が好ましい。発酵は好気性または嫌気性条件下で行うことができ、その中では微好気条件が好ましい。
【０１３０】
典型的には、増殖と脂肪の合成／貯蔵との間で代謝状態の「バランス」を取らなければならないため、油性酵母細胞における高レベルのＰＵＦＡの蓄積には、二段階発酵工程が必要である。したがって、二段階発酵工程を油性酵母におけるＰＵＦＡの産生に使用することが最も好ましい。この方法は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書に、種々の適切な発酵工程設計（すなわち、バッチ、フェドバッチ、および連続）ならびに増殖期間中の検討事項として記載されている。
【０１３１】
本明細書の一部の態様では、一次生成物は油性酵母バイオマスである。そのため、バイオマスからのＰＵＦＡ含有オイルの単離および精製が必要でないこともある（すなわち、そこでは全細胞バイオマスが生成物である）。
【０１３２】
しかしながら、特定の末端使用および／または生成物形態によっては、部分精製バイオマス、精製オイル、および／または精製ＰＵＦＡを得るために、バイオマスからのＰＵＦＡ含有オイルの部分的および／または完全な単離／精製が必要となることがある。ＰＵＦＡは、遊離脂肪酸として、またはアシルグリセロール、リン脂質、スルホリピド、もしくは糖脂質などのエステル形態で宿主微生物中に見出され得るものであり、当技術分野で周知の種々の手段により宿主細胞から抽出することができる。酵母脂質の抽出手法、品質分析、および許容基準についての総説の１つは、Ｊａｃｏｂｓ（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２（５／６）：４６３−４９１（１９９２））のものである。下流工程の簡単な総説も、ＳｉｎｇｈおよびＷａｒｄ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４５：２７１  ３１２（１９９７））により提供されている。
【０１３３】
一般に、微生物バイオマスからＰＵＦＡを回収および精製するための方法としては、有機溶媒による抽出（例えば、米国特許第６，７９７，３０３号明細書および同第５，６４８，５６４号明細書）、超音波処理、超臨界流体抽出（例えば、二酸化炭素を使用する）、けん化、および圧搾、ビーズビータなどの物理的手段、またはそれらの組合せを挙げることができる。さらなる詳細については、米国特許第７，２３８，４８２号明細書の教示を参照されたい。
【０１３４】
カレオシンポリペプチドおよび機能的なＰＵＦＡ生合成経路の１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子コンストラクトを含む組換え油性微生物は、カレオシンポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクトを含まないか、またはカレオシンポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクトを含むが発現しない、対応する対照組換え油性微生物に含有されるオイル量と比較すると、より大量のオイルを含有する。組換え油性微生物に含有されるオイル量は、総脂肪酸として測定される、乾燥細胞重量のパーセントとしての総脂質含量であってもよい。
【０１３５】
オメガ−３および／またはオメガ−６脂肪酸、具体的には、例えばＡＬＡ、ＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡを組み込んだ、おびただしい数の食品および飼料製品がある。長鎖ＰＵＦＡを含む微生物バイオマス、ＰＵＦＡを含む部分精製微生物バイオマス、ＰＵＦＡを含む精製微生物オイル、および／または精製ＰＵＦＡは、食品および飼料製品の中で、現行調製物に健康有益性を付与するように機能すると考えられている。より具体的には、オメガ−３および／またはオメガ−６脂肪酸を含有するオイルは、これらに限定されないが、食品類似品、食肉加工品、穀物製品、ベークト食品、スナック食品、および乳製品を含む種々の食品で使用するのに適する（詳細に関しては、米国特許出願公開第２００６−００９４０９２号明細書を参照されたい）。飼料製品はまた、動物使用に対するものを含む。
【０１３６】
医療栄養物、栄養補助食品、乳児用調製粉乳、および医薬品を含む医療用食品に健康有益性を付与するために、これらの組成物を調製物に使用することができる。食品加工および食品調製の当業者は、本オイルの量および組成を食品または飼料製品にどのように添加できるかを理解していよう。そのような量は、本明細書では「有効」量と称し、食品および飼料製品、その製品を補給する意図がある食餌、または医療用食品または医療栄養物により矯正または治療する意図がある病状に依存することになる。
【０１３７】
別の実施形態では、組換え油性微生物に含有される少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含むオイル量を増加させるための方法が提供される。この方法は、（ａ）本明細書に開示の組換え油性微生物を準備するステップと、（ｂ）少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含むオイルが産生される条件下で組換え油性微生物を増殖させるステップとを含む。本発明の組換え油性微生物は、前記カレオシンポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子コンストラクトを含まない組換え油性微生物に含有されるオイル量と比較して、より大量のオイルを含有する。
【実施例】
【０１３８】
本発明を以下の実施例の中でさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示す一方、例示としてのみ示されることを理解されたい。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的特性を確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および修正をなして、様々な使用および条件にそれを適合させることができる。
【０１３９】
一般的方法
本明細書で使用する標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニングの手法は、当技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１）により；およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）により；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，２００２により記載されている。
【０１４０】
微生物培養の維持および増殖に適した材料および方法は、当技術分野で周知である。以下の実施例における使用に適した手法は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ  ａｎｄ  Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｅｄｓ），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４））；またはＭａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｈ．Ｂａｌｔｚ，Ｊｕｌｉａｎ  Ｅ．Ｄａｖｉｅｓ，ａｎｄ  Ａｒｎｏｌｄ  Ｌ．Ｄｅｍａｉｎ  Ｅｄｓ．），ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，２０１０の記載に見出すことができる。
【０１４１】
微生物細胞の増殖および維持に使用されるすべての試薬、制限酵素および材料は、特に指示がない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ），ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ），Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ），ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ），またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【０１４２】
一般的な分子クローニングは標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔａｌ．、上記）に従って実施した。本明細書において特に指示がない限り、遺伝子配列の比較はＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して行った。
【０１４３】
発現カセットの構造は「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」の単純な表記法により表され、ここでＸはプロモーター断片を記述し、Ｙは遺伝子断片を記述し、Ｚはターミネーター断片を記述し、これらはすべて互いに作動可能に連結されることとする。
【０１４４】
機能的な多価不飽和脂肪酸生合成経路を含有するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株−Ｙ４１８４株、Ｙ４１８４Ｕ株、Ｙ９５０２株、Ｙ９５０２Ｕ株、Ｚ１９７８株、Ｚ１９７８Ｕ株、Ｚ５５６７株、およびＺ５５６７Ｕ株
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットの実施例７に記載されるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来する。Ｙ４１８４株は、デルタ−９エロンガーゼ／デルタ−８デサチュラーゼ経路の発現を介して総脂質に対して約３１％のＥＰＡを産生することができた。
【０１４５】
Ｙ４１８４株と対照的にＵｒａ３−表現型を有するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕも、国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットの実施例７に記載された。
【０１４６】
Ｙ９５０２株の生成が、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載されている。Ｙ９５０２株は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来し、デルタ−９エロンゲース／デルタ−８デサチュラーゼ経路の発現を介して、総脂質に対して約５７．０％のＥＰＡを産生することができた。
【０１４７】
Ｙ９５０２株と対照的にＵｒａ３−表現型を有するＹ９５０２Ｕ株の生成は、米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７Ａ１号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に記載された。
【０１４８】
Ｙ９５０２株からのＺ１９７８株の開発は、米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７Ａ１号明細書（上記）に記載されている。Ｚ１９７８株と対照的にＵｒａ３−表現型を有するＺ１９７８Ｕ株の開発も、米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７Ａ１号明細書に記載された。
【０１４９】
Ｚ１９７８株からのＺ５５６７株の開発は、米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７Ａ１号明細書（上記）に記載されている。Ｚ５５６７株と対照的にＵｒａ３−表現型を有するＺ５５６７Ｕ株の開発も、米国特許出願公開第２０１２−００５２５３７Ａ１号明細書に記載された。
【０１５０】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換および培養
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、下記の処方に従った数種の培地中で３０℃にてルーチン的に増殖させた。
【０１５１】
高グルコース培地［「ＨＧＭ」］（１リットル当たり）：８０ｇのグルコース、２．５８ｇのＫＨ２ＰＯ４、および５．３６ｇのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５（調整の必要なし）。
【０１５２】
合成デキストロース培地［「ＳＤ」］（１リットル当たり）：硫酸アンモニウム含有、アミノ酸非含有の６．７ｇのＹｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅおよび２０ｇのグルコース。
【０１５３】
発酵培地［「ＦＭ」］（１リットル当たり）：硫酸アンモニウム含有かつアミノ酸非含有の６．７ｇのＹｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ、６．０ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．０ｇのＫ２ＨＰＯ４、１．５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｇのグルコース、および５．０ｇの酵母抽出物（ＢＢＬ，ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）。
【０１５４】
Ｙ４１８４株は、ＳＤ培地中で２日間増殖させた後、ＨＧＭ中で５日間増殖させた。Ｙ９５０２株およびＺ１９７８株は、ＦＭ中で２日間増殖させた後、ＨＧＭ中で５日間増殖させた。
【０１５５】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に記載のように実施した。一般に、Ｕｒａ３−細胞の形質転換の場合は、ＵＲＡ３遺伝子を保持するプラスミドまたはその断片を用いて細胞を形質転換し、次いで、ウラシルを欠くプレート上で形質転換に対して選択した。
【０１５６】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析
脂肪酸分析のために、細胞を遠心分離により集め、Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．＆  Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７：９１１−９１７（１９５９））に記載のように脂質を抽出した。ナトリウムメトキシドによる脂質抽出物のエステル転移反応により脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］を調製し（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｉ．，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２７６（１）：３８−４６（１９９０））、次いで、３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）のＳＵＰＥＬＣＯ  Ｏｍｅｇａｗａｘ３２０（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）カラムを装着したＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ６８９０Ｎガスクロマトグラフで分析した。オーブン温度は、３０℃／分で１６０℃から２４０℃に上昇させ、次いで２４０℃に３．８分間保持した。
【０１５７】
直接の塩基エステル転移反応のために、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）培養物（１ｍＬ）を１分間の遠心分離（１３，０００×ｇ）により回収した。ナトリウムメトキシド（５００μＬの１％溶液）を試料に添加し、次いで試料を４５分間攪拌振盪した。次いで、１００μＬの１．０Ｍ  ＮａＣｌおよび５００μＬのヘキサンを添加し、試料を攪拌回転した。上層を取り出し、上記のようにガスクロマトグラフィーにより分析した。
【０１５８】
同等油性条件下における、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の総脂質含量および組成の分析
特定のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の総脂質含量および組成を詳細に分析するために、以下のようにフラスコアッセイを実施した。具体的には、１２５ｍＬフラスコに入れたＳＤ培地２５ｍＬ中で、約０．３のＯＤ６００から出発して４８時間、培養物を増殖させた。５０ｍＬ円錐管において、４３００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を回収した。上清を廃棄して、別の１２５ｍＬフラスコに入れたＨＧＭ２５ｍＬ中に細胞を再懸濁した。２５０ｒｐｍで３０℃の振盪インキュベーター中で５日後、１３，０００ｒｐｍで１分間の遠心分離に続いて、１ｍＬのアリコートを使用して脂肪酸分析（上記）を行い、５ｍＬのアリコートを乾燥させて乾燥細胞重量（ＤＣＷ）を測定した。
【０１５９】
ＤＣＷ測定のために、５ｍＬの培養物を４３００ｒｐｍで５分間遠心分離して回収した。ペレットを１０ｍＬの滅菌水に再懸濁し、上記のように再度回収した。洗浄したペレットを１ｍＬの水に再懸濁し（３回）、予め秤量したアルミニウム皿に移した。細胞懸濁液を真空オーブン中、８０℃で一晩乾燥させた。細胞の重量を測定した（ｇ／Ｌ）。
【０１６０】
細胞の総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を計算し、ＴＦＡの重量パーセントとしての各脂肪酸の濃度［「％ＴＦＡ」］、およびＥＰＡが産生された場合、乾燥細胞重量のパーセントとしてのＥＰＡ含量［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］を表にしたデータと併せて検討した。フラスコアッセイからのデータを、細胞の総ＤＣＷ、細胞の総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ］」、ＴＦＡの重量パーセントとしての各脂肪酸濃度「［％ＴＦＡ］」、および乾燥細胞重量のパーセントとしてのＥＰＡ含量「［ＥＰＡ％ＤＣＷ］」を要約する表形式で提示する。より具体的には、脂肪酸は、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、および２０：５（ＥＰＡ）として同定される。
【０１６１】
実施例１
機能的な多価不飽和脂肪酸生合成経路およびコドン最適化シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）カレオシンＡｔＣｌｏ１ｓコード配列を含有する組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）−Ｙ４１８４Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株
本実施例は、過剰発現コンストラクトｐＹＲＨ５５（図１；配列番号４３）の構築およびＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）−Ｙ４１８４Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株について記載する。
【０１６２】
ＡｔＣｌｏ１遺伝子（ＡＴＳ１またはＡｔ４ｇ２６７４０とも称される）は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）種子脂肪体で見出され、多重遺伝子族に属する（Ｎａｅｓｔｅｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４４：４６３−４７６）。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＡｔＣｌｏ１遺伝子（配列番号１で示すコード配列）のコドン使用頻度を、国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレットおよび米国特許第７，１２５，６７２号明細書に記載のものと同様の方法で、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現用に最適化した。具体的には、コドン最適化ＡｔＣｌｏ１コード配列（「ＡｔＣｌｏ１ｓ」と命名、配列番号３３）を、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン使用頻度パターン（国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレット）、「ＡＴＧ」翻訳開始コドン周辺のコンセンサス配列、およびＲＮＡ安定性の一般則（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ  ａｎｄ  Ｂｒｅｗｅｒ，Ｇｅｎｅ  ２６５（１−２）：１１−２３（２００１））に従い、ＡｔＣｌｏ１遺伝子（配列番号１）のコード配列に基づいて設計した。翻訳開始部位の改変に加えて、７３８ｂｐのコード領域のうちの１７３ｂｐを改変して（２３．４％）、１５３コドンを最適化した（６２％）。ＧＣ含量は、野生型遺伝子（すなわち、ＡｔＣｌｏ１）内の４５．４％から合成遺伝子（すなわち、ＡｔＣｌｏ１ｓ）内の５４．４％に増加した。ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位をそれぞれ、ＡｔＣｌｏ１ｓの翻訳開始コドンの周辺および停止コドンの後に組み込んだ。コドン最適化配列における改変はいずれも、コード化タンパク質（配列番号２）のアミノ酸配列を変化させなかった；すなわち、ＡｔＣｌｏ１コード配列（配列番号１）およびＡｔＣｌｏ１ｓコード配列（配列番号３３）は両方とも、配列番号２をコードする。設計したＡｔＣｌｏ１ｓコード配列（配列番号３３）は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により合成され、ｐＵＣ５７−ＡｔＣｌｏ１ｓとして提供された。
【０１６３】
ｐＹＲＨ５５の構築：プラスミドｐＹＲＨ５５（図１、配列番号４３）は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン最適化ＡｔＣｌｏ１ｓコード配列（配列番号３３）を過剰発現するように構築した。プラスミドｐＹＲＨ５５は、プラスミドｐＺｕＦｍＥａＤ５ｓ（参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８−０２７４５２１−Ａ１号明細書の実施例６に記載される）に由来した。プラスミドｐＺｕＦｍＥａＤ５ｓは、キメラＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ５Ｓ：：ＰＥＸ２０遺伝子を含有し、ここで、ＦＢＡＩＮｍはＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）プロモーター（米国特許第７，２０２，３５６号明細書）であり、ＥａＤ５Ｓは、ユーグレナ・アナバエナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）に由来する、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現用にコドン最適化された、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ制限酵素部位に挟まれた合成デルタ−５デサチュラーゼであり、ＰＥＸ２０はヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＰＥＸ２０遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０５４６１３）由来のターミネーター配列である。
【０１６４】
ｐＵＣ５７−ＡｔＣｌｏ１ｓのコドン最適化ＡｔＣｌｏ１ｓコード配列を、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで消化し、得られた断片を使用してｐＺｕＦｍＥａＤ５ｓのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片と置換して、キメラＦＢＡＩＮｍ：：ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＰＥＸ２０遺伝子を含有するｐＹＲＨ５５（図１）を作製した。
【０１６５】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株の生成：Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕ株においてＡｔＣｌｏ１ｓを過剰発現させるために、ｐＹＲＨ５５をＢｓｉＷＩ／ＰａｃＩで切断し、３．５ｋＢ断片を単離し、それを使用して形質転換し（一般的方法に記載のように）、それによりＹ４１８４Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株を生成した。
【０１６６】
実施例２
機能的な多価不飽和脂肪酸生合成経路およびコドン最適化シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）カレオシンＡｔＣｌｏ１ｓコード配列を含有する組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）−Ｙ９５０２Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株
本実施例は、過剰発現プラスミドｐＹＲＨ５５を含有するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株の構築について記載する。
【０１６７】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２Ｕ株においてＡｔＣｌｏ１ｓを過剰発現させるために、実施例１に記載のプラスミドｐＹＲＨ５５をＢｓｉＷＩ／ＰａｃＩで消化し、３．５ｋＢ断片を単離し、それを使用してＹ９５０２Ｕを形質転換し（一般的方法に記載のように）、それによりＹ９５０２Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株を生成した。
【０１６８】
実施例３
機能的な多価不飽和脂肪酸生合成経路およびコドン最適化シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）カレオシンＡｔＣｌｏ１ｓコード配列を含有する組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）−Ｚ１９７８Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株
本実施例は、過剰発現プラスミドｐＹＲＨ５５を含有するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株の構築について記載する。
【０１６９】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８Ｕ株においてＡｔＣｌｏ１ｓを過剰発現させるために、実施例１に記載のプラスミドｐＹＲＨ５５をＢｓｉＷＩ／ＰａｃＩで消化し、３．５ｋＢ断片を単離し、それを使用して形質転換し（一般的方法に記載のように）、それによりＺ１９７８Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株を生成した。
【０１７０】
実施例４
Ｙ４１８４Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株によるオイル産生
本実施例では、オイル蓄積レベルに対する、Ｙ４１８４Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株におけるＡｔＣｌｏ１ｓ過剰発現の効果を決定し、ＡｔＣｌｏ１ｓ発現を欠く親株で得られたオイルレベルと比較した。ＡｔＣｌｏ１ｓ過剰発現は、ＡｔＣｌｏ１ｓ発現を欠く細胞と比較して、オイル／総脂質含量（総乾燥細胞重量のパーセントとして測定された、［ＴＦＡ％ＤＣＷ］）の増加をもたらした。
【０１７１】
オイル量および脂肪酸（ＦＡ）組成に対する、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＡｔＣｌｏ１ｓ過剰発現の効果を評価および比較するために、Ｙ４１８４株（対照）およびＹ４１８４Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株を、一般的方法に記載のように、同等油性条件下で増殖させた。
【０１７２】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４対照株およびＹ４１８４Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株に対する、ＤＣＷ、細胞の総脂質含量［ＴＦＡ％ＤＣＷ］、およびＴＦＡの重量パーセントとしての各脂肪酸の濃度［％ＴＦＡ］を、一般的方法に記載のように決定した。結果を表４に示す。
【０１７３】
【表８】
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【０１７４】
表４の結果は、Ｙ４１８４ＵにおけるＡｔＣｌｏ１ｓの過剰発現により、総脂質含量として測定されたオイル量［ＴＦＡ％ＤＣＷ］が、対照Ｙ４１８４株の総脂質含量よりも約２４％増加したことを示す。さらに、Ｙ４１８４ＵにおけるＡｔＣｌｏ１ｓ過剰発現により、平均ＥＰＡ力価［ＥＰＡ％ＤＣＷ］が、Ｙ４１８４のＥＰＡ力価と比較して、約２７％増加した。
【０１７５】
したがって、カレオシンポリペプチドの過剰発現により、多価不飽和脂肪酸生合成経路を含む組換え微生物のオイル含量を増加させることができる。この特定の実施例では、カレオシン過剰発現がない場合には、乾燥細胞重量を基準にして約１７％までオイルを蓄積する組換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株（Ｙ４１８４）におけるオイル含量が、カレオシン過剰発現により増加した（ＴＦＡ％ＤＣＷ、表４）。この状況でオイル含量を上昇させるカレオシン過剰発現の能力によれば、より高いオイル含量（例えば、少なくとも２５ＴＦＡ％ＤＣＷ）を有する組換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）でも過剰発現によりオイル含量が上昇することが示唆される。
【０１７６】
実施例５
Ｙ９５０２＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株によるオイル産生
オイル蓄積レベルに対する、Ｙ９５０２Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株におけるＡｔＣｌｏ１ｓ過剰発現の効果を決定し、ＡｔＣｌｏ１ｓ発現を欠く親株で得られたオイルレベルと比較した。ＡｔＣｌｏ１ｓ過剰発現は、ＡｔＣｌｏ１ｓ発現を欠く細胞と比較して、オイル／総脂質含量（総乾燥細胞重量のパーセントとして測定された、［ＴＦＡ％ＤＣＷ］）の増加をもたらした。
【０１７７】
オイル量およびＦＡ組成に対する、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＡｔＣｌｏ１ｓ過剰発現の効果を評価および比較するために、Ｙ９５０２株（対照）およびＹ９５０２Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株を、一般的方法に記載のように、同等油性条件下で増殖させた。
【０１７８】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２対照株およびＹ９５０２Ｕ
＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株に対する、ＤＣＷ、細胞の総脂質含量［ＴＦＡ％ＤＣＷ］、およびＴＦＡの重量パーセントとしての各脂肪酸の濃度［％ＴＦＡ］を、一般的方法に記載のように決定した。結果を表５に示す。
【０１７９】
【表９】
2014516537.tif 000011
【０１８０】
表５の結果は、Ｙ９５０２ＵにおけるＡｔＣｌｏ１ｓの過剰発現により、総脂質含量として測定されたオイル量［ＴＦＡ％ＤＣＷ］が、対照Ｙ９５０２株の総脂質含量よりも約１６％増加したことを示す。さらに、Ｙ９５０２ＵにおけるＡｔＣｌｏ１ｓ過剰発現により、平均ＥＰＡ力価［ＥＰＡ％ＤＣＷ］が、Ｙ９５０２のＥＰＡ力価と比較して、約７％増加した。
【０１８１】
こうして、カレオシン過剰発現がない場合には、乾燥細胞重量を基準にして約３４．５％までオイルを蓄積する組換え油性ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株（Ｙ９５０２Ｕ）におけるオイル含量が、カレオシン過剰発現により増加した（ＴＦＡ％ＤＣＷ、表５）。したがって、カレオシンポリペプチドの過剰発現により、多価不飽和脂肪酸生合成経路を含み、かつオイルとしてその乾燥細胞重量の少なくとも２５％を産生する組換え油性微生物のオイル含量を増加させることができる。
【０１８２】
実施例６
Ｚ１９７８Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株によるオイル産生
オイル蓄積レベルに対する、Ｚ１９７８Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株におけるＡｔＣｌｏ１ｓ過剰発現の効果を決定し、ＡｔＣｌｏ１ｓ発現を欠く親株で得られたオイルレベルと比較した。ＡｔＣｌｏ１ｓ過剰発現は、ＡｔＣｌｏ１ｓ発現を欠く細胞と比較して、オイル／総脂質含量（総乾燥細胞重量のパーセントとして測定された、［ＴＦＡ％ＤＣＷ］）の増加をもたらした。
【０１８３】
オイル量およびＦＡ組成に対する、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＡｔＣｌｏ１ｓ過剰発現の効果を評価および比較するために、Ｚ１９７８株（対照）およびＺ１９７８Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株を、一般的方法に記載のように、同等油性条件下で増殖させた。
【０１８４】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８対照株およびＺ１９７８Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株に対する、ＤＣＷ、細胞の総脂質含量［ＴＦＡ％ＤＣＷ］、およびＴＦＡの重量パーセントとしての各脂肪酸の濃度［％ＴＦＡ］を、一般的方法に記載のように決定した。対照Ｚ１９７８株は二つ組でアッセイし、Ｚ１９７８Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株については、２つの分離株を三つ組で試験し、三つ組測定の平均を表６に示す。
【０１８５】
【表１０】
2014516537.tif 000012
【０１８６】
表６の結果は、Ｚ１９７８ＵにおけるＡｔＣｌｏ１ｓの過剰発現により、総脂質含量として測定されたオイル量［ＴＦＡ％ＤＣＷ］が約５％増加したことを示す。したがって、これは、カレオシン過剰発現により、多価不飽和脂肪酸生合成経路を含み、かつオイルとしてその乾燥細胞重量の少なくとも２５％を産生する組換え油性微生物のオイル含量を増加させることができることを示す。
【０１８７】
実施例７
機能的な多価不飽和脂肪酸生合成経路およびコドン最適化カレオシンコード配列を含有する組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）−Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０１ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０２ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０３ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０４ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０５ｓ株、およびＹ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０６ｓ株
本実施例は、過剰発現コンストラクトｐＹＲＨ８４（配列番号４４）、ｐＹＲＨ８５（配列番号４５）、ｐＹＲＨ８６（配列番号４６）、ｐＹＲＨ８８（配列番号４７）、ｐＹＲＨ８９（配列番号４８）、およびｐＹＲＨ９０（配列番号４９）、ならびにＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０１ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０２ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０３ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０４ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０５ｓ株、およびＹ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０６ｓ株の構築について記載する。
【０１８８】
トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿００２５２８３６７）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ７１２２７）、ゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＦ１３７４３）、コイクス・ラクリマ（Ｃｏｉｘ  ｌａｃｒｙｍａ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣＰ２７６２０）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿００１３９７３８４）、およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿９５８９９０）に由来する６種の異なるカレオシンタンパク質の配列（それぞれ「Ｃａｌ０１ｓ」［配列番号４］、「Ｃａｌ０２ｓ」［配列番号６］、「Ｃａｌ０３ｓ」［配列番号８］、「Ｃａｌ０４ｓ」［配列番号３８］、「Ｃａｌ０５ｓ」［配列番号４０］、および「Ｃａｌ０６ｓ」［配列番号４２］と命名）を、実施例１ならびに国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレット（上記）および米国特許第７，１２５，６７２号明細書（上記）に記載のものと同様な方法で、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現用にコドン最適化した。具体的には、各コドン最適化カレオシンコード配列を、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン使用頻度パターン（国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレット）、「ＡＴＧ」翻訳開始コドン周辺のコンセンサス配列、およびＲＮＡ安定性の一般則（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ  ａｎｄ  Ｂｒｅｗｅｒ，２００１，Ｇｅｎｅ  ２６５（１−２）：１１−２３））に従い、対応する野生型カレオシンコード化遺伝子（配列番号３、５、７、９、１１、または１３）のコード配列に基づいて設計した。
【０１８９】
翻訳開始部位の改変に加えて、Ｃａｌ０１ｓについては、７０２ｂｐのコード領域のうちの１６７ｂｐ（２３．８％）を改変して、１５０コドン（６４％）をヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）発現用に最適化した。ＧＣ含量は、野生型遺伝子内の４４．６％から合成遺伝子内の５４．８％に増加した。Ｃａｌ０２ｓについては、７２０ｂｐのコード領域のうちの１８２ｂｐ（２５．３％）を改変して、１６０コドン（６４％）を最適化した。ＧＣ含量は、野生型遺伝子内の４２．５％から合成遺伝子内の５４．２％に増加した。Ｃａｌ０３ｓについては、７３８ｂｐのコード領域のうちの１７５ｂｐ（２３．７％）を改変して、１５７コドン（６７％）を最適化した。ＧＣ含量は、野生型遺伝子内の４９．２％から合成遺伝子内の５４．９％に増加した。Ｃａｌ０４ｓについては、９５４ｂｐのコード領域のうちの１８７ｂｐ（１９．６％）を改変して、１６５コドン（５２％）を最適化した。ＧＣ含量は、野生型遺伝子内の６６．５％から合成遺伝子内の５７．３％に減少した。Ｃａｌ０５ｓについては、８４９ｂｐのコード領域のうちの１９０ｂｐ（２２．４％）を改変して、１７４コドン（６１％）を最適化した。ＧＣ含量は、野生型遺伝子内の５４．０％から合成遺伝子内の５５．２％に若干変化した。Ｃａｌ０６ｓについては、９００ｂｐのコード領域のうちの１８２ｂｐ（２０．２％）を改変して、１５７コドン（５２％）を最適化した。ＧＣ含量は、野生型遺伝子内の５７．８％から合成遺伝子内の５４．３％に減少した。
【０１９０】
ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位をそれぞれ、各合成遺伝子の翻訳開始コドンの周辺および停止コドンの後に組み込んだ。酵素部位の導入により、それぞれの野生型タンパク質アミノ酸配列に対して、Ｃａｌ０４ｓポリペプチド（配列番号３８）はＱ２Ｅ（アミノ酸位置２でのグルタミンからグルタメートへの変化）を有し、Ｃａｌ０５ｓポリペプチド（配列番号４０）はＰ２Ａ（アミノ酸位置２でのプロリンからアラニンへの変化）を有し、Ｃａｌ０６ｓポリペプチド（配列番号４２）はＰ２Ａ（アミノ酸位置２でのプロリンからアラニンへの変化）を有する。これらの変化を除いて、コドン最適化配列の他の改変は、コード化タンパク質のアミノ酸配列を変化させなかった。Ｃａｌ０１コード配列（配列番号３）およびＣａｌ０１ｓコード配列（配列番号３４）は両方とも、配列番号４をコードし、Ｃａｌ０２コード配列（配列番号５）およびＣａｌ０２ｓコード配列（配列番号３５）は両方とも、配列番号６をコードし、Ｃａｌ０３コード配列（配列番号７）およびＣａｌ０３ｓコード配列（配列番号３６）は両方とも、配列番号８をコードする。
【０１９１】
ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位を加えた、設計のＣａｌ０１ｓ、Ｃａｌ０２ｓ、Ｃａｌ０３ｓ、Ｃａｌ０４ｓ、Ｃａｌ０５ｓ、およびＣａｌ０６ｓコード配列（それぞれ配列番号３４、３５、３６、３７、３９、および４１）は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により合成された。ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位は、配列番号３４、３５、３６、３７、３９、および４１には示されていないことに留意されたい。
【０１９２】
カレオシン過剰発現プラスミドの構築：コドン最適化カレオシン過剰発現用プラスミドは、ｐＹＲＨ５５（図１、配列番号４３）に由来した。上記で調製された、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、ゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍ）、コイクス・ラクリマ（Ｃｏｉｘ  ｌａｃｒｙｍａ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）のコドン最適化カレオシンコード配列を、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで消化した。得られた断片を使用してｐＹＲＨ５５から放出されたＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片を置換した（すなわち、ＡｔＣｌｏ１ｓ挿入断片）。得られたコンストラクトのｐＹＲＨ８４（配列番号４４）、ｐＹＲＨ８５（配列番号４５）、ｐＹＲＨ８６（配列番号４６）、ｐＹＲＨ８８（配列番号４７）、ｐＹＲＨ８９（配列番号４８）、およびｐＹＲＨ９０（配列番号４９）はそれぞれ、ＦＢＡＩＮｍプロモーター（上記）およびＰＥＸ２０ターミネーター（上記）と共に、Ｃａｌ０１ｓ、Ｃａｌ０２ｓ、Ｃａｌ０３ｓ、Ｃａｌ０４ｓ、Ｃａｌ０５ｓ、またはＣａｌ０６ｓコード配列を有するキメラ遺伝子を含有した。したがって、ｐＹＲＨ５５、ｐＹＲＨ８４、ｐＹＲＨ８５、ｐＹＲＨ８６、ｐＹＲＨ８８、ｐＹＲＨ８９、およびｐＹＲＨ９０は、各コンストラクトに含有された特定のコドン最適化カレオシンコード配列に関して互いに異なるだけである。
【０１９３】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０１ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０２ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０３ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０４ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０５ｓ株、およびＹ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０６ｓ株の生成：Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２Ｕ株において特定のカレオシンを過剰発現させるために、プラスミドコンストラクトｐＹＲＨ８４、ｐＹＲＨ８５、ｐＹＲＨ８６、ｐＹＲＨ８８、ｐＹＲＨ８９、およびｐＹＲＨ９０を、それぞれ個々にＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、より大きな断片（それぞれの消化から得られた２つの断片のうち）を使用して形質転換し（一般的方法に記載のように）、それにより、それぞれＹ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０１ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０２ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０３ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０４ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０５ｓ株、およびＹ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０６ｓ株を生成した。
【０１９４】
実施例８
Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０１ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０２ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０３ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０４ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０５ｓ株、およびＹ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０６ｓ株によるオイル産生
Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０１ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０２ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０３ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０４ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０５ｓ株、およびＹ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０６ｓ株における、オイル蓄積に対するカレオシン過剰発現の効果を、本明細書で以下に記載のように決定した。種々の供給源に由来するカレオシンの過剰発現は、カレオシン発現を欠く細胞と比較して、オイル／総脂質含量（総乾燥細胞重量のパーセントとして測定された、［ＴＦＡ％ＤＣＷ］）の増加をもたらした。
【０１９５】
オイル量およびＦＡ組成に対する、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるカレオシン過剰発現の効果を評価および比較するために、Ｙ９５０２株（対照）、ならびにＹ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０１ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０２ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０３ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０４ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０５ｓ株、およびＹ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０６ｓ株を、一般的方法に記載のように同等油性条件下で増殖させた。
【０１９６】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２対照、ならびにＹ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０１ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０２ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０３ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０４ｓ株、Ｙ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０５ｓ株、およびＹ９５０２Ｕ＋Ｃａｌ０６ｓ株に対する、ＤＣＷ、細胞の総脂質含量［ＴＦＡ％ＤＣＷ］、およびＴＦＡの重量パーセントとしての各脂肪酸の濃度［％ＴＦＡ］を、一般的方法に記載のように決定した。結果を表７に示す。各カレオシン過剰発現株に対して３つの形質転換体を脂質測定のために選んだ；表７の値は、各株について、３つの形質転換体の独立した２実験の平均である。対照Ｙ９５０２株については、その値は、それぞれ二つ組で分析された、独立した４実験の平均を表す。
【０１９７】
【表１１】
2014516537.tif 000013
【０１９８】
表７の結果は、Ｙ９５０２Ｕにおけるカレオシンの過剰発現により、総脂質含量［ＴＦＡ％ＤＣＷ］として測定されたオイル量が、脂肪酸中のＥＰＡレベル［ＥＰＡ％ＴＦＡ］の顕著な減少を伴わずに、最大１６％増加したことを示す。こうして、平均ＥＰＡ力価［ＥＰＡ％ＤＣＷ］は、対照Ｙ９５０２株と比較して、最大１３％増加した。
【０１９９】
したがって、カレオシン過剰発現がない場合には、乾燥細胞重量を基準にして約３１％までオイルを蓄積する組換え油性ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株（Ｙ９５０２）におけるオイル含量が、ＡｔＣｌｏ１ｓ以外の他の種々のカレオシンの過剰発現により増加した（ＴＦＡ％ＤＣＷ、表７）。これらの結果は、カレオシンポリペプチドの過剰発現により、多価不飽和脂肪酸生合成経路を含み、かつオイルとしてその乾燥細胞重量の少なくとも２５％を産生する組換え油性微生物のオイル含量を増加させることができることをさらに示す。さらに、これらの結果は、カレオシンタンパク質を使用して、一般に（特定の供給源に由来する１つのカレオシンだけでなく）、組換え油性微生物中のオイル含量を増加させることができることを示す。
【０２００】
実施例９
複数のシステイン残基を有するコドン最適化ＡｔＣｌｏ１配列（ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ）およびＰＤＡＴまたはＬＰＣＡＴへの連結
過剰発現コンストラクトｐＹＲＨ９５（配列番号６１）、ｐＹＲＨ９６（配列番号６２）、ｐＹＲＨ９７（配列番号６３）、ｐＹＲＨ９８（配列番号６４）、およびｐＹＲＨ９９（配列番号６５）の構築について記載する。さらに、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２Ｕ＋ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ株、Ｚ５５６７Ｕ＋ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ株、Ｚ５５６７Ｕ＋ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＰＤＡＴ株、Ｚ５５６７Ｕ＋ＰＤＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ株、Ｚ５５６７Ｕ＋ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＬＰＣＡＴ株、およびＺ５５６７Ｕ＋ＬＰＣＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ株の調製について記載する。
【０２０１】
ＡｔＣｌｏ１ｓコード配列（配列番号３３）を、ＡｔＣｌｏ１ｓポリペプチドのＮ末端およびＣ末端領域に付加されたシステインコドンをコードするように改変した。複数のシステインを含有する、この変異ポリペプチド（配列番号５１）は、「ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ」と命名され、配列番号５０によりコード化される。図２は、ＡｔＣｌｏ１ｓ（配列番号２）とｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ（配列番号５１）とのアミノ酸配列のアライメントを示す。ＡｔＣｌｏ１ｓのＮ末端およびＣ末端領域にある、それぞれ４つおよび３つの残基をシステイン残基に変異させた。得られたアミノ酸配列（配列番号５１）は、Ｎ末端領域にＤ１１Ｃ、Ｈ２５Ｃ、Ｒ３５Ｃ、およびＱ４６Ｃの変異を、Ｃ末端領域にＧ２００Ｃ、Ｒ２０７Ｃ、およびＤ２４０Ｃの変異を含有する。さらに、１つのシステイン残基をＧｌｙ２とＳｅｒ３との間に挿入した。付加されたシステイン残基には、図２に示すｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ配列で下線を付した。ＡｔＣｌｏ１ｓポリペプチドは、アミノ酸位置２２１および２３０に天然のシステイン残基を含有する。したがって、ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓは、そのＮ末端およびＣ末端領域のそれぞれに５つのシステイン残基を含有する；これらのシステインは、ほぼ１０アミノ酸（７〜１５のアミノ酸）の間隔で互いに配置される。
【０２０２】
次に、４つのヌクレオチド配列を、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ、Ｅ．Ｃ．２．３．１．１５８；参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，９０１，９２８号明細書）またはＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ、Ｅ．Ｃ．２．３．１．２３；参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０−０３１７８８２号明細書）に融合したｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓを発現させるために調製した。コード化融合タンパク質は、（ｉ）ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓがＮ末端にあるＰＤＡＴ（「ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＰＤＡＴ」と命名）（配列番号５３）、（ｉｉ）ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓがＣ末端にあるＰＤＡＴ（「ＰＤＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ」と命名）（配列番号５５）、（ｉｉｉ）ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓがＮ末端にあるＬＰＣＡＴ（「ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＬＰＣＡＴ」と命名）（配列番号５７）、および（ｉｖ）ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓがＣ末端にあるＬＰＣＡＴ（「ＬＰＣＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ」と命名）（配列番号５９）の融合タンパク質であった。各融合配列中には、パートナー間に２４アミノ酸のリンカー配列（ＧＡＧＰＡＲＰＡＧＬＰＰＡＴＹＹＤＳＬＡＶＭＧＳ、配列番号６０）が存在した。各融合物において第１タンパク質の停止コドンは除去した。融合タンパク質ＰＤＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ（配列番号５５）およびＬＰＣＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ（配列番号５９）のそれぞれにおいて、ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓの位置２のグリシン残基は存在しない。さらに、４つの融合配列のそれぞれについて、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位がそれぞれ、第１遺伝子の翻訳開始コドンの周辺および第２遺伝子の停止コドンの後に組み込まれた。各配列はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により合成された。ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位が、上記の融合タンパク質をコードする配列番号５２、５４、５６、および５８に示されていないことに留意されたい。
【０２０３】
ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓの過剰発現用プラスミドの構築およびＰＤＡＴまたはＬＰＣＡＴへの連結：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ、ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＰＤＡＴ、ＰＤＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ、ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＬＰＣＡＴ、およびＬＰＣＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓの過剰発現用プラスミドを、ｐＹＲＨ５５（図１、配列番号４３）を使用して調製した。これらのタンパク質に対する各コード配列をＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで消化し、得られた断片を使用してｐＹＲＨ５５のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片（すなわち、ＡｔＣｌｏ１ｓ挿入断片）を置換した。得られたコンストラクトのｐＹＲＨ９５（配列番号６１）、ｐＹＲＨ９６（配列番号６２）、ｐＹＲＨ９７（配列番号６３）、ｐＹＲＨ９８（配列番号６４）、およびｐＹＲＨ９９（配列番号６５）はそれぞれ、ＦＢＡＩＮｍプロモーター（上記）およびＰＥＸ２０ターミネーター（上記）と共に、ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ、ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＰＤＡＴ、ＰＤＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ、ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＬＰＣＡＴ、またはＬＰＣＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓに対するコード配列を有するキメラ遺伝子を含有した。したがって、ｐＹＲＨ９５、ｐＹＲＨ９６、ｐＹＲＨ９７、ｐＹＲＨ９８、およびｐＹＲＨ９９は、各コンストラクトに含有された特定のシステイン改変カレオシン／融合コード配列に関して互いに異なるだけである。
【０２０４】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２Ｕ＋ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ株、Ｚ５５６７Ｕ＋ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ株、Ｚ５５６７Ｕ＋ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＰＤＡＴ株、Ｚ５５６７Ｕ＋ＰＤＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ株、Ｚ５５６７Ｕ＋ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＬＰＣＡＴ株、およびＺ５５６７Ｕ＋ＬＰＣＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ株の生成：Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ９５０２Ｕ株またはＺ５５６７Ｕ株において、ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ、ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＰＤＡＴ、ＰＤＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ、ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＬＰＣＡＴ、またはＬＰＣＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓを過剰発現させるために、ｐＹＲＨ９５、ｐＹＲＨ９６、ｐＹＲＨ９７、ｐＹＲＨ９８、およびｐＹＲＨ９９をそれぞれ個々に、ＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、より大きな断片（各消化から得られる２つの断片のうち）を使用して形質転換した（一般的方法に記載のように）。それぞれの形質転換から、Ｙ９５０２Ｕ＋ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ株、Ｚ５５６７Ｕ＋ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ株、Ｚ５５６７Ｕ＋ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＰＤＡＴ株、Ｚ５５６７Ｕ＋ＰＤＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ株、Ｚ５５６７Ｕ＋ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＬＰＣＡＴ株、およびＺ５５６７Ｕ＋ＬＰＣＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ株を得た。
【０２０５】
実施例１０
Ｙ９５０２Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株およびＹ９５０２Ｕ＋ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ株によるオイル産生の比較
Ｙ９５０２株におけるオイル蓄積に対する、そのＮ末端およびＣ末端領域（ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ）に複数のシステイン残基を有するカレオシンの過剰発現の効果を決定した。この分析は、Ｙ９５０２Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株とカレオシン発現を欠く親株とで測定されたオイル蓄積の比較でなされた。
【０２０６】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるオイル含量および脂肪酸（ＦＡ）組成に対するＡｔＣｌｏ１ｓおよびｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ過剰発現の効果を評価および比較するために、Ｙ９５０２株（対照）、Ｙ９５０２Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓ株、およびＹ９５０２Ｕ＋ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ株を、同等油性条件下で増殖させた。これらの株それぞれに対する、ＤＣＷ、細胞の総脂質含量［ＴＦＡ％ＤＣＷ］、およびＴＦＡの重量パーセントとしての各脂肪酸の濃度［％ＴＦＡ］を、一般的方法に記載のように決定した。結果を表８に示す。
【０２０７】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムへの過剰発現コンストラクトのランダムな組み込みの位置効果があるため、形質転換株のそれぞれの８つのうちの４つに対するオイル蓄積結果を、分析のために選んだ；形質転換体の各セットの選択は、他の４つの形質転換体と比較して、ＥＰＡ力価［ＥＰＡ％ＤＣＷ］がより高いことに基づいた。
【０２０８】
【表１２】
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【０２０９】
表８の結果は、Ｙ９５０２ＵにおけるＡｔＣｌｏ１ｓの過剰発現により、Ｙ９５０２で測定されたそれぞれの値に比べて、総脂質含量として測定されたオイル量［ＴＦＡ％ＤＣＷ］が約８％増加し、ＥＰＡ力価［ＥＰＡ％ＤＣＷ］が約９％増加したことを示す。これらの結果により、実施例５（表５）において観察されたこと、すなわち、Ｙ９５０２と比較すると、オイル含量およびＥＰＡ力価がＹ９５０２Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓにおいてより高いことが確認された。
【０２１０】
しかしながら、Ｙ９５０２Ｕ＋ＡｔＣｌｏ１ｓと比較すると、ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓを過剰発現するＹ９５０２Ｕは、Ｙ９５０２において測定されたそれぞれの値に対するオイル量（約２．６％）およびＥＰＡ力価（約３．８％）の増加量が少ないことが示された。ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓの過剰発現では、システイン改変のない対応するカレオシンがＹ９５０２Ｕにおいて過剰発現された場合と比較して、オイル量に対する効果が軽度であったが、異なる株（Ｚ５５６７Ｕ）においてまたはＰＤＡＴとの融合タンパク質（下記）として発現された場合には、ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓは、オイル量のより顕著な増加を伴った。
【０２１１】
実施例１１
Ｚ５５６７Ｕ＋ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ株、Ｚ５５６７Ｕ＋ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＰＤＡＴ株、Ｚ５５６７Ｕ＋ＰＤＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ株、Ｚ５５６７Ｕ＋ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＬＰＣＡＴ株、およびＺ５５６７Ｕ＋ＬＰＣＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ株によるオイル産生
Ｚ５５６７株におけるオイル蓄積に対する、複数の付加されたシステイン残基（ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ）を有するカレオシンの過剰発現の効果を試験した。具体的には、Ｚ５５６７Ｕ＋ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ、Ｚ５５６７Ｕ＋ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＰＤＡＴ、Ｚ５５６７Ｕ＋ＰＤＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ、Ｚ５５６７Ｕ＋ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＬＰＣＡＴ、およびＺ５５６７Ｕ＋ＬＰＣＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓにおける蓄積オイルレベルを測定し、カレオシン発現を欠く親株（Ｚ５５６７）のオイルレベルと比較した。ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＰＤＡＴおよびＰＤＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ融合タンパク質の過剰発現は両方とも、カレオシン発現を欠く細胞と比較すると、総乾燥細胞重量のパーセントとして測定されるオイル［ＴＦＡ％ＤＣＷ］の顕著な増加をもたらした。
【０２１２】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるオイル含量および脂肪酸（ＦＡ）組成に対するカレオシン過剰発現の効果を評価および比較するために、Ｚ５５６７株（対照）、Ｚ５５６７Ｕ＋ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ株、Ｚ５５６７Ｕ＋ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＰＤＡＴ株、Ｚ５５６７Ｕ＋ＰＤＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ株、Ｚ５５６７Ｕ＋ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＬＰＣＡＴ株、およびＺ５５６７Ｕ＋ＬＰＣＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ株を同等油性条件下で増殖させた。これらの株それぞれに対する、ＤＣＷ、細胞の総脂質含量［ＴＦＡ％ＤＣＷ］、およびＴＦＡの重量パーセントとしての各脂肪酸の濃度［％ＴＦＡ］を、一般的方法に記載のように決定した。結果を表９および１０に示す。
【０２１３】
各カレオシン過剰発現株について、ウラシルを欠く対照プレート上でのＺ５５６７Ｕのバックグラウンドレベルの増殖に応じて、８つまたは１６の形質転換体を分析した。形質転換株のそれぞれについて、８つのうちの４つまたは１６のうちの５つに関する結果を分析のために選んだ；各セットの形質転換体の選択は、各株について他の形質転換体と比較して総脂質含量またはＥＰＡ力価がより高いことに基づいた。
【０２１４】
【表１３】
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【０２１５】
表９の結果は、Ｚ５５６７Ｕにおけるｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓの過剰発現により、脂質含量として測定されたオイル量［ＴＦＡ％ＤＣＷ］が、対照Ｚ５５６７株の総脂質含量よりも約５％増加したことを示す。さらに、Ｚ５５６７Ｕにおけるｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ過剰発現により、平均ＥＰＡ力価［ＥＰＡ％ＤＣＷ］が、Ｚ５５６７のＥＰＡ力価と比較して、約１０％増加した。
【０２１６】
こうして、カレオシン過剰発現がない場合には、乾燥細胞重量を基準にして約４７．５％までオイルを蓄積する組換え油性ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株（Ｚ５５６７）におけるオイル含量が、付加されたシステインを含有するように改変されたカレオシン（ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ）の過剰発現により増加した（ＴＦＡ％ＤＣＷ、表９）。したがって、これは、カレオシンポリペプチドの過剰発現が、多価不飽和脂肪酸生合成経路を含み、かつオイルとしてその乾燥細胞重量の少なくとも２５％を産生する組換え油性微生物のオイル含量を増加させ得る方法の別の例を表す。
【０２１７】
ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ発現の効果がＺ５５６７Ｕ株とＹ９５０２Ｕ株との間でかなり類似しているのであれば、付加されたシステインを含有するように改変されていない対応するカレオシン（すなわち、ＡｔＣｌｏ１ｓ）の発現は、ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓによる誘導と比較して、Ｚ５５６７Ｕにおいて同等またはより高レベルのオイル蓄積を誘導するであろうと予測することは妥当である。これは、ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ過剰発現により、Ｙ９５０２に比べてＹ９５０２Ｕにおけるオイル含量が約２．６％増加したが、ＡｔＣｌｏ１ｓが過剰発現されたときには、Ｙ９５０２Ｕにおけるオイル含量はそれより高かったからである（約８％、表８）。
【０２１８】
Ｚ５５６７Ｕにおけるｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＰＤＡＴまたはＰＤＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓの過剰発現により、対照Ｚ５５６７株に対して測定されたそれぞれの値と比較して、オイル量が約１４〜１５％、ＥＰＡ力価が約５〜８％増加した。これは、カレオシンをそのＮ末端またはＣ末端で特定の他のタンパク質に融合しても、オイル含量の増加を誘導するその能力を保持することができることを示す例を表す。この例におけるカレオシンはシステイン改変がなされているが、ＰＤＡＴと融合した、システイン改変されていないカレオシンの過剰発現により、オイルおよびＥＰＡ含量を増加させ得ると予測される。これらの結果をまとめると、ＰＤＡＴなど、ジアシルグリセロールのアシル化を触媒する酵素と融合したカレオシンタンパク質を過剰発現させると、多価不飽和脂肪酸生合成経路を含み、かつオイルとしてその乾燥細胞重量の少なくとも２５％を産生する組換え油性微生物中のオイル含量を増加させ得ることが実証される。
【０２１９】
【表１４】
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【０２２０】
表１０の結果は、Ｚ５５６７Ｕにおけるｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＬＰＣＡＴまたはＬＰＣＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓの過剰発現により、対照Ｚ５５６７株のそれぞれの値と比較して、総脂質含量として測定されたオイル量［ＴＦＡ％ＤＣＷ］またはＥＰＡ力価［ＥＰＡ％ＤＣＷ］が増加しないことを示す。
【０２２１】
この結果は、本明細書で試験された特定のｃｙｓ−カレオシン／ＬＰＣＡＴ融合タンパク質（ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＬＰＣＡＴ、配列番号６４；ＬＰＣＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ、配列番号６５）が、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ５５６７株など、多価不飽和脂肪酸生合成経路を含み、かつオイルとしてその乾燥細胞重量の少なくとも２５％を産生する油性微生物中のオイル含量を増加させるために有用ではない可能性があることを示す。この結果は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ５５６７Ｕ株においてオイル含量を最大１５％と顕著に増加させることができた、ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ：：ＰＤＡＴおよびＰＤＡＴ：：ｃｙｓ−ＡｔＣｌｏ１ｓ融合タンパク質を使用して得られた結果（表９）とまったく対照的である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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