(57)【要約】  本発明は、生体適合性ナノおよびマイクロ粒子をコーティングするための安定化剤を提供し、前記安定化剤は、製造時に、保存時に、そして噴霧前に、および噴霧の間に粒子の凝集を抑制し、肺に投与するための製剤を製造するために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺に投与するための製剤を製造するための生体適合性ナノおよびマイクロ粒子をコーティングするために使用される安定化剤の利用において、
前記安定化剤が、非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、ホスホリピド、またはポリマー群から選択されることにより、結果的に、生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の凝集が抑制されることを特徴とする、安定化剤の利用。
【請求項２】
前記ポリマーが、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）であることを特徴とする、請求項１に記載の安定化剤の利用。
【請求項３】
前記ナノおよびマイクロ粒子は、肺に投与するのに適した生体適合性ポリマーまたは脂質および活性成分からなることを特徴とする、請求項１または２に記載の安定化剤の利用。
【請求項４】
前記生体適合性ポリマーは、ポリエステル、ポリアンハイドライド、ポリオルトエステル、ポリホスホエステル、ポリカーボネート、ポリケタール、ポリ尿素、ポリウレタン、ブロックコポリマー（ＰＥＧ‐ＰＬＧＡ）、星形ポリマーまたは櫛形ポリマーであることを特徴とする、請求項３に記載の安定化剤の利用。
【請求項５】
前記生体適合性脂質は、アシルグリセリライドグループから選択されることを特徴とする、請求項３に記載の安定化剤の利用。
【請求項６】
前記生体適合性ナノおよびマイクロ粒子上にある安定化剤は、１〜２００ｎｍの安定化剤層の厚さを有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の安定化剤の利用。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項による安定化剤で生体適合性ナノおよびマイクロ粒子をコーティングするための方法であって、
ａ）有機相を形成し、溶媒内で生体適合性ポリマーまたは脂質および活性成分を溶解させるステップ、
ｂ）安定化剤を含有する水相において有機相を乳化させるステップ、
ｃ）前記ステップａ）の有機相を前記ステップｂ）の水相と混合するステップ、および
ｄ）溶媒を除去し、懸濁液内において粒子を得るステップを含むことを特徴とする、安定化剤により生体適合性ナノおよびマイクロ粒子をコーティングするための方法。
【請求項８】
請求項７による安定化剤により生体適合性ナノおよびマイクロ粒子をコーティングするための方法であって、
前記生体適合性ポリマーは、ポリエステル、ポリアンハイドライド、ポリオルトエステル、ポリホスホエステル、ポリカーボネート、ポリケタール、ポリ尿素、ポリウレタン、ブロックコポリマー（ＰＥＧ‐ＰＬＧＡ）、星形ポリマーまたは櫛形ポリマーであることを特徴とする、安定化剤により生体適合性ナノおよびマイクロ粒子をコーティングするための方法。
【請求項９】
請求項７による安定化剤により生体適合性ナノおよびマイクロ粒子をコーティングするための方法であって、
前記生体適合性脂質をアシルグリセリライドグループから選択することを特徴とする、安定化剤により生体適合性ナノおよびマイクロ粒子をコーティングするための方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、安定化剤でコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子を提供し、このような生体適合性ナノおよびマイクロ粒子は、活性成分を肺に投与するのに適する。前記生体適合性ナノおよびマイクロ粒子を安定化剤でコーティングすることは、噴霧化時に粒子の改善された安定性および完全性をもたらす。
［発明の背景となる技術］
本発明は、内科学、薬理学、ナノ技術および医療工学分野に関する。
［技術水準］
肺に活性成分を投与する一種の選択的な経路としては、吸入が当業者にとって公知となっており、このような吸入によると、望ましくない全身性の副作用が避けられ得る。活性成分を肺に直接的に投与することは、たとえば、肺高血圧症を治療する際にプロスタサイクリンアナログイロプロスト（Ｖｅｎｔａｖｉｓ（登録商標））について示されているように、呼吸器疾患の治療を容易にする。しかし、肺活性成分堆積後の相対的に短い薬理作用期間は、吸入療法による頻繁な活性成分の投与を要求する吸入治療法の一種の大きな短所である。
【０００２】
たとえば、生体適合性ナノおよびマイクロ粒子といったコロイド性物質は、適した肺活性成分伝達システムとして公知となっている。生体適合性ナノおよびマイクロ粒子内部にカプセル化された薬剤を肺内部へ直接伝達することにより、所望の作用場所において薬理作用の延長を引き起こす長期間の、かつ制御された状態の活性成分放出が達成され得る。
【０００３】
生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の製造方法の選択は、実際に、利用されるポリマーまたは脂質の物理化学的なパラメータに、そして、前記生体適合性ナノおよびマイクロ粒子内部に梱包される活性成分に依存する。ポリマーまたは脂質の選択は、生体適合性および生物分解性といった基準によって決定される。また、生体適合性ナノおよびマイクロ粒子は、たとえば、伝達物質と薬剤の十分な連合、そして、噴霧化の場合に発生する力に対する安定性といった他の標準も満たさなければならない。このような厳格な要求条件は、生体適合性ポリマーまたは脂質からなるナノ粒子性活性成分伝達システムによって最大かつ広範囲に満たされる。しかし、従来の剤形においては、懸濁液から噴霧化工程を進行する間に、前記活性成分‐剤形の機能損失を引き起こす生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の不可逆的な凝集現象が発生し得る。
【０００４】
安定化剤が使用された生体適合性ナノおよびマイクロ粒子剤形の物理化学的かつ生物学的な特性を変形させ得るという事実は、当業者にとって公知となっているが、前記粒子の懸濁液を噴霧化する際に生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の安定性および完全性を改善し、それとともに、制御された活性成分放出の期間を延長し得る安定化剤を含有する剤形は、これまでまったく記述されていなかった。
【０００５】
要約して述べると、先行技術は、生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の噴霧化され、かつ吸入可能な剤形の安定性および完全性と関連して、短所を有する。
［課題］
本発明の課題は、生体適合性ナノおよびマイクロ粒子のための安定化剤を提供することにより、前記粒子の懸濁液を噴霧化する際に、粒子の改善された安定性および完全性に到達するようにし、活性成分を人の肺に投与するにあたり、前記粒子をより優れて適するようにすることである。
［課題の解決］
前記課題は、本発明により特許請求の範囲によって、特に、非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、ホスホリピドまたはポリマーグループから選択された安定化剤を提供することにより解決される。
【０００６】
安定化剤の長所は、前記安定化剤が多数のナノおよびマイクロ粒子に使用され得るというものである。安定化剤が生体適合性を有し、粒子から放出される活性成分の放出速度を減速させることにより、結果的に含有されている活性成分は、安定化剤のない粒子と比較した場合、より長時間にわたって作用場所において放出される。
【０００７】
本発明によると、安定化剤は、非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両性界面活性剤、ホスホリピド、またはポリマーグループから選択される。非イオン界面活性剤は、たとえば、―しかし、あらゆるものを網羅するものではない―ＰＥＧ‐ＰＬＧＡ、ポロキサマー、ツイン、スパン、プルロニックである。適したホスホリピドは、たとえば、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、レシチン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）またはジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）である。適したポリマーは、たとえば、天然ポリマー、合成ポリマーまたは半合成ポリマーである。
【０００８】
天然ポリマーには、たとえば、タンパク質（たとえば、アルブミン）、セルロースおよびこれらのエステルおよびエーテル、アミロース、アミロペクチン、キチン、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、グリコーゲン、ポリアミノ酸（たとえば、ポリリシン）、デンプン、デキストランまたはヘパリンが属する。
【０００９】
合成ポリマーには、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルアセテート、ポリビニルブチラール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアクリレート、ポロキサマー、そして、ＰＥＧおよびポリエステルから選ばれた二重ブロックまたは三重ブロックコポリマー（ＰＬＧＡ，ＰＣＬ，ＰＬＡ）（たとえば、ＰＥＧ‐ＰＬＧＡ）が属する。
【００１０】
半合成ポリマーは、たとえば、変形されたデンプン（たとえば、ＨＥＳ）である。
好ましい一実施例において、本発明に係るコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子は、以下において簡略にＰＶＡと称されるポリビニルアルコールを安定化剤として含有する。ＰＶＡは、結晶質の水溶性プラスチック材料である。
【００１１】
安定化剤は、この安定化剤でコーティングされた粒子を、好ましく圧電、ジェット（ｊｅｔ）‐、超音波‐エアロゾル発生器、ソフト‐ミスト‐吸入器（ｓｏｆｔ‐ｍｉｓｔ‐ｉｎｈａｌｅｒ）、または、定量吸入器（ｍｅｔｅｒｅｄ  ｄｏｓｅ  ｉｎｈａｌｅｒ）によって噴霧化するのに特に適するが、言い換えると、肺内部への投与は、噴霧器を利用したエアロゾルの吸入によって行われる。
【００１２】
安定化剤は、コーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子を、たとえば、乳化方法およびその後に続く溶媒蒸発法（ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）を利用して製造するために使用される。界面活性剤、ホスホリピド、または、たとえば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）といったポリマーからなり、本発明に係るコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子上に形成される薄い保護用安定化剤層は、噴霧化の際に前記粒子の安定性を改善する。本発明に係る生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の懸濁液は、肺の呼吸器官内に堆積するのに適したエアロゾルへと変換される。本発明に係るコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の特性は、噴霧化によって影響を受けない。肺活性成分のためのこのような新しい肺活性成分伝達システムによって達成される延長された活性成分放出は、従来に使用された治療剤に対して活性成分投与の頻度を減らし、このような事実は、患者の生活の質および治療に対する信頼性を向上させる。
【００１３】
たとえば、安定化剤は、生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の安定化のために使用される。好ましくは、前記安定化剤は、非水溶性の生体適合性ポリマーまたは非水溶性脂質であり、そして、肺に投与するのに適した安定化剤および活性成分からなる。本発明に係るコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子は、好ましくは、生分解性である。
【００１４】
生体適合性ポリマーは、たとえば、ポリエステル、ポリアンハイドライド、ポリオルトエステル、ポリホスホエステル、ポリカーボネート、ポリケタール、ポリ尿素、ポリウレタン、ブロックコポリマー（ＰＥＧ‐ＰＬＧＡ）、星形ポリマーまたは櫛形ポリマーである。前記ポリエステルは、好ましくは、線形のポリ（ラクチド‐コ‐グリコライド）‐コポリマー（ＰＬＧＡ‐コポリマー）である。
【００１５】
制御された状態の活性成分放出（“ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ”）のために使用されるコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子を製造するのに適したＰＬＧＡ‐コポリマーがある。前記コポリマーは、たとえば、−しかし、あらゆるものを網羅するものではない−Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）群から選択されたコポリマーを含む。本発明の好ましい一実施例において、生体適合性ナノおよびマイクロ粒子は、次のようなＲｅｓｏｍｅｒ（登録商標）物質、Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）  Ｃｏｎｄｅｎｓａｔｅ  ＲＧ  ５０：５０  Ｍｎ２３００，  Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）  Ｒ２０２Ｓ，  Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）  Ｒ２０２Ｈ，  Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）  Ｒ２０３Ｓ，  Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）  Ｒ２０３Ｈ，  Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）  Ｒ２０７Ｓ，  Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）  ＲＧ５０２Ｈ，  Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）  ＲＧ５０３Ｈ，  Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）  ＲＧ５０４Ｈ，  Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）  ＲＧ５０２，  Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）  ＲＧ５０３，  Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）  ＲＧ５０４，  Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）  ＲＧ６５３Ｈ，  Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）  ＲＧ７５２Ｈ，  Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）  ＲＧ７５２Ｓ，  Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）  ＲＧ７５３Ｓ，  Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）  ＲＧ７５５Ｓ，  Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）  ＲＧ７５６ＳまたはＲｅｓｏｍｅｒ（登録商標）  ＲＧ８５８Ｓのうち一種のＲｅｓｏｍｅｒ（登録商標）物質を含有する。特に好ましい一実施例において、本発明に係るコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子は、ＰＬＧＡ‐コポリマーであるＲｅｓｏｍｅｒ（登録商標）  ＲＧ５０２Ｈを含有する。
【００１６】
前記非水溶性脂質は、たとえば、アシルグリセリド（モノ‐、ジ‐またはトリグリセリド）グループから選択される。アシルグリセリドには、たとえば、グリセロールモノパルミテートが属する。
【００１７】
活性成分としては、好ましくは、食欲抑制剤／脂肪抑制剤、酸性症治療剤、強壮剤／血中酸素減少抑制剤、鎮痛剤、抗リウマチ剤、駆虫剤、抗アレルギー薬、抗貧血剤、抗不整脈薬、抗生剤、抗感染薬、抗認知症剤、糖尿病治療剤、解毒剤、嘔吐剤、抗眩暈剤、抗てんかん薬、抗血友病剤、止血剤、抗高血圧薬、抗低血糖剤、血圧降下剤、血液凝固防止剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗かゆみ症剤、鎮咳剤、去痰剤、 抗動脈硬化剤、β受容体遮断剤、カルシウムチャネル遮断剤、レニン‐アンジオテンシン‐アルドステロン系抑制剤、気管支薬、抗喘息薬、利胆剤、胆管治療薬、コリン作動薬、コルチコイド、診断および診断予備行為のための製剤、利尿薬、循環促進剤、抗中毒剤、酵素抑制剤、酵素活性または刺激剤、酵素欠乏補正剤、受容体拮抗剤、輸送蛋白質、線維素溶解剤、老人病薬、インフルエンザ薬、風邪およびインフルエンザ治療剤、婦人科薬、肝臓薬、催眠薬、鎮静剤、脳下垂体および視床下部ホルモン、調節ペプチド、ホルモン、ペプチド抑制剤、免疫制御剤、心臓薬、冠状動脈剤、緩和剤、脂質低下剤、局所麻酔薬、神経治療剤、胃薬、片頭痛薬、医療用無機質製剤、筋弛緩薬、麻酔剤、向神経性製剤、骨多孔症治療剤、カルシウム／カルシウム物質代謝調節剤、パーキンソン病のための治療剤、向精神薬、副鼻腔炎製剤、強壮剤、甲状腺治療剤、血清、免疫グロブリン、ワクチン、抗体、性ホルモンおよびこれらの抑制剤、鎮痙薬、抗コリン剤、血小板凝集抑制剤、抗結核剤、泌尿器科薬、静脈治療剤、ビタミン、細胞増殖抑制剤、抗新生物剤、ホメオパシー、血管活性成分、遺伝子治療剤（ＤＮＡ／ＲＮＡ誘導体）、転写抑制剤、ビールス増殖阻害剤、ニコチン、勃起不全治療剤、一酸化窒素および／または一酸化窒素解離物質のグループから選択された成分が使用される。
【００１８】
たとえば、診断的なイメージを形成する方法において、しかし、たとえば化学‐および放射線療法および発熱療法といった治療法においても使用される前記のような粒子も、本発明の意味における活性成分である。
【００１９】
診断法という用語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断法だけでなく、ｉｎ  ｖｉｖｏ診断法も意味する。本発明により使用される診断試薬は、たとえば、イメージを形成し、および／または放射性であり、および／または造影剤である。
【００２０】
特に、本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子を、肺胞腔疾患の予防、診断および／または治療のための、そして呼吸器疾患の治療のための治療剤を製造するために使用する利用、そしてコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子を、より大きな安定性によって肺高血圧症の予防、診断および／または治療のための治療剤を製造するために使用される利用は、特に好ましい。
【００２１】
したがって、本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子は、次のような疾病を治療または診断するための製剤を製造するために使用され得る：たとえば、気管支炎、ＣＯＰＤ、喘息、肺炎、結核、肺高血圧症、肺腫瘍、線維症肺疾患といった肺および呼吸器系の炎症性（伝染性、非伝染性）および過増殖性（腫瘍性、非腫瘍性）疾患。または、肺転移、嚢胞性線維症、サルコイドーシス、アスペルギルス症、気管支拡張症、ＡＬＩ、ＩＲＤＳ、ＡＲＤＳ、肺胞タンパク症、肺移植後の免疫抑制および感染予防。
【００２２】
敗血症、脂肪代謝障害、腫瘍疾患、白血病、先天性代謝障害（たとえば、成長障害、貯蔵障害、鉄代謝の障害）、たとえば、脳下垂体または甲状腺などの内分泌疾患（Ｇｌａｎｄｕｌａ  ｔｈｙｒｅｏｉｄｅａ）、糖尿病、肥満、心理的障害（たとえば、統合失調症、うつ病、躁うつ病、外傷後ストレス症候群、不安および恐慌障害）、ＣＮＳ障害（たとえば、Ｍ．パーキンソン病、多重硬化症、てんかん）、伝染病、リウマチ性疾患、アレルギーおよび自己免疫疾患、勃起不全、心血管系疾病（たとえば、動脈性高血圧、心血管疾患、心不整脈、心不全、血栓症および塞栓症）、腎不全、貧血、抗体欠損、先天性あるいは後天性止血機序の異常、血小板機能疾患またはビタミン欠乏症における使用も考え得る。
【００２３】
本発明に係るコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の特性化
本発明に係るコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子が１０ｎｍ〜１０μｍの幾何学的平均粒度を有することにより、結果的に、前記粒子は、優れて噴霧化され得、安定化剤層の厚さは１〜２００ｎｍである。しかし、このとき、前記安定化剤層の厚さは、コーティングされていない生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の幾何学的平均半径よりも大きくない。好ましい一実施例において、コーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子は、より長期間の活性成分放出を可能するために、５００ｎｍ〜５μｍの幾何学的平均粒度を有するか、または前記粒子が大食細胞内部へ吸収されることを防止するために、５０ｎｍ〜２５０ｎｍの幾何学的平均粒度を有する。
【００２４】
本発明に係るコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子は、肺に投与するのに適した活性成分を０〜５０％（ｗ／ｗ）、そして、好ましい一実施例においては、１〜２０％（ｗ／ｗ）含有する。
【００２５】
本発明に係るコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子は、好ましくは、圧電、ジェット（ｊｅｔ）‐、超音波‐エアロゾル発生器、ソフト‐ミスト‐吸入器（ｓｏｆｔ‐ｍｉｓｔ‐ｉｎｈａｌｅｒ）、定量吸入器（ｍｅｔｅｒｅｄ  ｄｏｓｅ  ｉｎｈａｌｅｒ）、または粉末式吸入器（ｄｒｙ  ｐｏｗｄｅｒ  ｉｎｈａｌｅｒ）によって噴霧化され得るが、言い換えると、肺内部への投与は、噴霧器を利用したエアロゾルの吸入によって行われる。本発明に係るコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の直径は、肺の奥深くまで到達し得るため、前述した噴霧器を利用した噴霧化のために特に好ましい。肺内部へ投与するための一種の他の可能性は、たとえば、カテーテル、気管支鏡、または呼吸器治療装置（たとえば、チューブまたは気管カニューレ）を介した点滴注入方法である。さらに、前記粒子は、疾患の予防、診断および／または治療のための治療剤を製造するためにも使用され得る。
生体適合性ナノおよびマイクロ粒子のコーティング
生体適合性ナノおよびマイクロ粒子は、たとえば、エマルション法、およびその後に続く溶媒蒸発法によって製造される。
【００２６】
たとえば、コーティングされるナノおよびマイクロ粒子は、肺に投与するための非水溶性の生体適合性ポリマーまたは非水溶性脂質および活性成分からなる。前記ポリマーは、たとえば、ポリエステル（ＰＬＧＡ，ＰＬＡ）、ポリアンハイドライド、ポリオルトエステル、ポリホスホエステル、ポリカーボネート、ポリケタール、ポリ尿素、ポリウレタン、ブロックコポリマー（ＰＥＧ‐ＰＬＧＡ）、星形ポリマーまたは櫛形ポリマーである。
【００２７】
非水溶性脂質は、たとえば、アシルグリセリド（モノ‐、ジ‐またはトリグリセリド）グループから選択される。生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の活性成分は、食欲抑制剤／脂肪抑制剤、酸性症治療剤、強壮剤／血中酸素減少抑制剤、鎮痛剤、抗リウマチ剤、駆虫剤、抗アレルギー薬、抗貧血剤、抗不整脈薬、抗生剤、抗高血圧剤、抗動脈硬化剤、糖尿病治療剤、解毒剤、嘔吐防止剤、抗眩暈剤、抗てんかん剤、抗血友病剤、止血剤、抗高血圧剤、抗低血糖剤、血圧降下剤、血液凝固防止剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗かゆみ症剤、鎮咳剤、去痰剤、 抗動脈硬化剤、β遮断剤、カルシウムチャネル遮断剤、レニン‐アンジオテンシン‐アルドステロン系抑制剤、気管支薬、抗喘息薬、利胆剤、胆管治療薬、コリン作動薬、コルチコイド、診断および診断予備行為のための製剤、利尿薬、循環促進剤、抗中毒剤、酵素抑制剤、酵素活性または刺激剤、酵素欠乏補正剤、受容体拮抗剤、輸送蛋白質、線維素溶解剤、老人病薬、インフルエンザ薬、風邪およびインフルエンザ治療剤、婦人科薬、肝臓薬、催眠薬、鎮静剤、脳下垂体および視床下部ホルモン、調節ペプチド、ホルモン、ペプチド抑制剤、免疫制御剤、心臓薬、冠状動脈剤、緩和剤、脂質低下剤、局所麻酔薬、神経治療剤、胃薬、片頭痛薬、医療用無機質製剤、筋弛緩薬、麻酔剤、向神経性製剤、骨多孔症治療剤、カルシウム／カルシウム物質代謝調節剤、パーキンソン病のための治療剤、向精神薬、副鼻腔炎製剤、強壮剤、甲状腺治療剤、血清、免疫グロブリン、ワクチン、抗体、性ホルモンおよびこれらの抑制剤、鎮痙薬、抗コリン剤、血小板凝集抑制剤、抗結核剤、泌尿器科薬、静脈治療剤、ビタミン、細胞増殖抑制剤、抗新生物剤、ホメオパシー、血管活性成分、遺伝子治療剤（ＤＮＡ／ＲＮＡ誘導体）、転写抑制剤、ビールス増殖阻害剤、ニコチン、勃起不全治療剤、一酸化窒素および／または一酸化窒素解離物質のグループから選択される。
【００２８】
たとえば、診断的なイメージを形成する方法において、しかし、また、たとえば化学および放射線療法および発熱療法といった治療法においても使用されている前記のような粒子も、本発明の意味における活性成分である。
【００２９】
代案的に、生体適合性ナノおよびマイクロ粒子はまた、ナノ‐析出法（ｎａｎｏ‐ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、塩析法（ｓａｌｔｉｎｇ‐ｏｕｔ）、重合法によっても製造される。このような製造方法は、当業者にとって公知となっている。
【００３０】
生体適合性ナノおよびマイクロ粒子を安定化剤でコーティングすることは、代案的に、安定化剤とコーティングされていない粒子の混合を利用した将来の非共有コーティングによって、または化学的な気相蒸着を利用した粒子の気相コーティングによって、または粒子のスプレーイングによって、または安定化剤をコーティングされていない粒子に共有結合することにより、または、電気スプレイを利用して行われる。このような方法は、当業者にとって公知となっている。
【００３１】
生体適合性ナノおよびマイクロ粒子が安定化剤とコーティングされていない粒子の混合を利用した将来の非共有コーティングによって製造されると、まず、ポリマーまたは脂質が、活性成分の添加下に溶媒内において溶解される。その後に続いて、このとき生成される分散された有機相が安定化剤を含有する一定の水相に変換される。２つの相を混合し、超音波に露出させた後に続いて、安定化剤を含有する有機溶媒が蒸発により除去され、本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子が懸濁液内で得られる。本発明により使用されるポリマーまたは脂質が、そのうち少なくとも０．１％（ｗ／ｗ）まで溶解され得る適した溶媒は、たとえば、―しかし、あらゆるものを網羅するものではない―ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、ベンジルアルコール、メチルエチルケトン、プロピレンカーボネートである。好ましい一実施例においては、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）が安定化剤として使用される。
【００３２】
好ましい一実施例においては、本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の製造のために１〜１００ｇ／ｌの生体適合性ポリマーおよび０．１〜２５ｇ／ｌの安定化剤が使用される。特に好ましい一実施例において、製造のための生体適合性ポリマーの濃度は５０ｇ／ｌであり、安定化剤の濃度は１０ｇ／ｌである。
【００３３】
本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の利用
本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子は、肺に投与するための治療剤を製造するために使用される。このとき、“生体適合性”という表現は、たとえば、肺のような対象となる場所にある組織および細胞に対する適合性を意味する。
【００３４】
本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の安定性は、製造時に、保存時に、そして噴霧化前に、および噴霧化の間に粒子凝集現象の抑制を土台としている。
【００３５】
処理ステップを含め、特許請求の範囲、詳細な説明および図面において示されるすべての特徴および長所は、単独でのみならず、多様に組み合わされた形態でも、本発明に重要であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】動的光散乱法（ＤＬＳ）によって決定される、本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子のサイズ分布を示す図。黒線は、粒子サイズの密度分布を示し、破線は粒子サイズの累積分布を示す。
【図２】噴霧器Ａｅｒｏｎｅｂ（登録商標）  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌを利用した噴霧時に示された、本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の安定性を示す図。前記安定性は、本発明に係る粒子の最初の特性に対する最後の特性の割合（特性ｆ／特性ｉ）（Ａ）（ＰＤＩ＝多分散指数）として示されている。コーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の懸濁液の部分量は、噴霧工程において安定性分析のための噴霧の間に収集される。値は、平均値±標準偏差として指示された（ｎ＝４）。
【図３Ａ−３Ｂ】本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子上に吸着されたポリビニルアルコール（ＰＶＡ）層の厚さが、ＰＶＡ濃度（ｃＰＶＡ）の関数（Ａ）として示されており、ＰＶＡ溶液内において製造された生体適合性ナノ‐ポリマー粒子のゼータ電位が、電解質‐濃度の関数（Ｂ）として示されている図。
【図３Ｃ−３Ｄ】３．３３＊ｃ１／２（濃度）に対するｌｎ｜ゼータ電位｜の上昇（ｋ）は、吸着されたポリマー層の厚さを指示し（Ｃ）、（Ｂ）および（Ｃ）の白色および黒色の正方形は、製造されたばかりの（Ｂ）あるいは噴霧された（Ｃ）生体適合性ナノ‐ポリマー粒子の特性を示し、（Ｃ）の直線は、実験データの線形フィットを示し（Ｒ２＞０．９９）、前記吸着されたＰＶＡ層は、代表的な伝送電子顕微鏡写真（Ｄ）において見ることができる（尺度＝２０ｎｍ）。値は、平均値±標準偏差として指示された（ｎ＝４）。
【図４】本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の安定性および完全性を示す図。安定化剤（ＰＶＡ）の濃度（ｃＰＶＡ）が多様な溶液からＡｅｒｏｎｅｂ（登録商標）  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ噴霧器を利用して、製造業者の指示に従って、噴霧されたＰＬＧＡ‐ナノ粒子の安定性が例として示されている。前記安定性は、最初（噴霧前）の粒子サイズに対する最終（噴霧後）の粒子サイズの商（Ｓｆ／Ｓｉ）が（Ａ）として指示されており（図４Ａ参照）、多様なナノ粒子濃度のための噴霧後（ＰＤＩｆ）および噴霧前（ＰＤＩｉ）の多分散指数（ＰＤＩ）の商（ＰＤＩｆ／ＰＤＩｉ）が（Ｂ）として指示されている（白色・棒：２ｍｇ／ｍｌ；黄色・棒：５ｍｇ／ｍｌ；黒色・棒：１０ｍｇ／ｍｌ）（図４Ｂ参照）。図４Ｃは、噴霧化後のナノ粒子の代表的な電子顕微鏡写真を示している（尺度＝１μｍ）。値は、平均値±標準偏差として指示された（ｎ＝４）。
【図５】シルデナフィルを本発明に係る生体適合性ナノ‐ポリマー粒子から体外において放出させる放出プロファイルを示す図。白色の円は、製造されたばかりのコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の放出特性を示す一方、黒色の円は、噴霧された粒子の放出特性を示す。前記コーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子懸濁液の部分量は、コーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子からシルデナフィルを放出させる放出プロファイルに及ぼす噴霧化の影響を分析するために噴霧化中に収集される。比較のために、遊離シルデナフィルの溶解プロファイル（黒色・正方形）がともに指示された。値は、平均値±標準偏差として指示された（ｎ＝４）。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
実施例
以下の実施例１および２は、たとえば、コーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子における安定化剤の特性を記述している。安定化剤の使用は、前記粒子に限定されない。実施例においては、たとえば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を安定化剤として使用し、活性成分としては、シルデナフィルを使用した。本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子は、以下において粒子と略称する。ポリ（Ｄ，Ｌ‐ラクチド‐コ‐グリコライド）‐コポリマー（ＰＬＧＡ）は、以下において簡略にポリマーとも称する。
１．実施例１
１．１  エマルション法および後続する蒸発法を利用した本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の製造
生体適合性ナノおよびマイクロ粒子を安定化剤でコーティングするための方法は、
ａ）有機相を形成し、溶媒のうち生体適合性ポリマーまたは脂質および活性成分を溶解させるステップ、
ｂ）安定化剤を含有す水相において、有機相を乳化させるステップ、
ｃ）ステップａ）の有機相をステップｂ）の水相と混合するステップ、および
ｄ）溶媒を除去し、懸濁液内において粒子を得るステップを含むことを特徴とする。
【００３８】
本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子を、たとえば、室温において当業者にとって公知となっているエマルション法および後続する溶媒蒸発法によって合成した。この目的のために、まず、商業的に入手可能であり、かつ、たとえば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（ドイツ・Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ所在）のＲｅｓｏｍｅｒ（登録商標）  ＲＧ５０２Ｈとして関連され得る１〜１００ｇ／ｌのポリ（Ｄ，Ｌ‐ラクチド‐コ‐グリコライド）‐コポリマー（ＰＬＧＡ）を活性成分、たとえば、ＡＫ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（米国・カリフォルニア州・Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ所在）から、遊離塩基として商業的に入手可能な、たとえば、ＰＤＥ‐５‐抑制剤であるシルデナフィルを１％〜２０％添加した状態で、または添加していない状態で、たとえば、塩化メチレンのように水と混合され得ない溶媒内で溶解させた。その次に、２ｍｌの有機相（分散相）を、たとえば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）である表面安定化剤を０．１〜１５ｇ／ｌ分だけ含有する１０ｍｌの水相（定位相；ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｐｈａｓｅ）に変換させた。ＰＶＡは、通常、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ（ドイツ・Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ所在）から、たとえば、Ｍｏｗｉｏｌ４‐８８（登録商標）として購入することができる。２つの相を混合した後に、乳剤を超音波で処理した。その後に続いて、前記有機相を、回転蒸発器を利用した溶媒蒸発法によって徐々に除去した。粒子を製造直後に使用した。
２．実施例２
本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の特性化
実施例１に従って製造され、コーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子を、下記実施例２のポイント２．１〜２．５に記載された方法および結果を利用して特徴化した。この目的のために、前記ナノ‐ポリマー粒子を製造直後に使用し、または、たとえば、Ａｅｒｏｇｅｎ  （Ｄａｎｇａｎ，  Ｇａｌｗａｙ、アイルランド）のＡｅｒｏｎｅｂ（登録商標）  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌのような噴霧器を利用した噴霧直後に、製造業者の指示に従って使用した。
２．１  本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の直径は、サイズ分布および表面電荷
エマルション法および実施例１以下に記述されたところのような後続の溶媒蒸発法により製造される、製造されたばかりのコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子を、ポリマー濃度（５〜１００ｇ／ｌ）およびＰＶＡ濃度（１〜５０ｇ／ｌ）を多様に組み合わせた状態において、前記粒子の特性である直径、サイズ分布および表面電荷と関連して調査した。コーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の流体力学的な直径およびサイズ分布（多分散性‐ＰＤＩ；ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ）を動的光散乱法（ＤＬＳ；ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）を利用して測定した。表面電荷のための尺度としてのゼータ電位は、たとえば、ゼータサイザーＮａｎｏＺＳ／ＺＥＮ３６００（ドイツ、Ｈｅｒｒｅｎｂｅｒｇ，  Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を利用したレーザードップラー風力測定法（ＬＤＡ；Ｌａｓｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  Ａｎｅｍｏｍｅｔｒｙ）によって決定される。すべての測定は、２５℃の温度において部分標本として実施され、前記部分標本を、ＤＬＳのために濾過され再蒸留された水によって、あるいはＬＤＡのための１．５６ｍＭのＮａＣｌによって希釈した。すべての測定を、生体適合性ナノ‐ポリマー粒子を製造した直後に、少なくとも１０回反復される３回の決定として実施した。この場合、ｎは、以下において決定の回収を指示する。
【００３９】
０．１未満の値を有する粒子サイズ分布、すなわち、多分散指数（ＰＤＩ；ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｉｎｄｉｃｅｓ）は、ＰＬＧＡ濃度が５０ｇ／ｌで一定に維持される状態において、ＰＶＡ濃度が５ｇ／ｌ以上である場合に検出され、またはＰＶＡ濃度が１０ｇ／ｌで一定に維持されている状態において、ＰＬＧＡ濃度が１０〜５０ｇ／ｌである場合に発見された。ＤＬＳを利用して決定される、製造されたばかりの生体適合性ナノ‐ポリマー粒子のサイズ分布は、図１に示されている。コーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の平均サイズは、１００〜４００ｎｍである（図１の黒線）。５０ｇ／ｌのＰＬＧＡ濃度および１０ｇ／ｌのＰＶＡ濃度で製造されるコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子は、１９５．１±９．６ｎｍの平均粒径（平均値±標準偏差、ｎ＝４）、０．０７８±０．００２の狭いサイズ分布、すなわち、狭い多分散指数（ＰＤＩ）（平均値±標準偏差、ｎ＝４）、および５．７±０．８ｍＶの負の表面電荷（平均値±標準偏差、ｎ＝４）、すなわち、負のゼータ電位を有する。
【００４０】
噴霧化後にコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の安定性に対する尺度として、直径、サイズ分布および表面電荷を調査するために、活性成分シルデナフィル（遊離塩基）の理論的な含量が５％（ｗ／ｗ）である本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子を実施例１に従って製造し、噴霧器Ａｅｒｏｎｅｂ（登録商標）  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌを利用した噴霧化前に、そして噴霧化後に特徴化した。この目的のために、前記コーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の噴霧化された懸濁液を収集し、Ｄａｉｌｅｙ等（Ｄａｉｌｅｙ  ＬＡ，  Ｋｌｅｅｍａｎｎ  Ｅ，  Ｗｉｔｔｍａｒ  Ｍｅｔａｌ．：Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ‐ｆｒｅｅ，  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ａｅｒｏｓｏｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓ，  ＤＥＡＰＡ‐ＰＶＡＬ‐ｇ‐ＰＬＧＡ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．２０（１２），  ２０１１〜２０２０（２００３）；Ｄａｉｌｅｙ  ＬＡ，  Ｓｃｈｍｅｈｌ  Ｔ，  Ｇｅｓｓｌｅｒ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．：Ｎｅｂｕｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｎ  ａｅｒｏｓｏｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ．  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ．  ８６（１），  １３１〜１４４（２００３））に記述されたところのように、定性的に調査した。前記コーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の懸濁液を５ｌ／ｍｉｎの空気流率で噴霧化し、顕微鏡用スライドガラスを設置することにより、噴霧器のＴ字型マウスピース（ｍｏｕｔｈｐｉｅｃｅ）のすぐ前に収集し、このような状況は、顕微鏡用スライドガラス上におけるエアロゾル液体粒の浸漬を可能にする。このことから、結果的に表示される凝結流体を追加分析の目的で収集した。前記噴霧化された生体適合性ナノ‐ポリマー粒子の安定性を、前述されたところのように、ＤＬＳおよびＬＤＡを利用して調査した。前記噴霧化されたコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の安定性を、前述されたところのようにＤＬＳを利用して調査した。
【００４１】
本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子は、１９７．１±１．７ｎｍの平均サイズ、０．０７４±０．００５のＰＤＩを有する狭いサイズ分布、そして−５．１±０．３ｍＭのゼータ電位を有する負の表面電荷を有する。粒子サイズ、ＰＤＩおよびシルデナフィル含量といったパラメータ（２．３参照）は、図２に噴霧化前および後の値の商として示されている。前記図は、噴霧化が前述したパラメータに対して重大な影響を及ぼさないということを示している。
２．２  本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の安定化剤の層厚
本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の安定化剤としての機能をする吸着されたＰＶＡ層の厚さをＤＬＳおよびゼータ電位測定を利用して、ポイント２．１以下に記述されたところのように、電解質‐濃度の関数として決定した。適した決定方法は、当業者にとって公知となっている。ＤＬＳ測定と関連して、前記吸着されたＰＶＡ層の厚さ（δ）は、下記一般式（１）に基づくコーティングされていない（ｄ０）、およびコーティングされた（ｄａｄｓ）生体適合性ナノ‐ポリマー粒子の粒子サイズの比較から導出した。
【００４２】
【数１】
2014516045.tif 000002
ゼータ電位測定から得られた層厚を、当業者にとって公知となっているＧｏｕｙ‐Ｃｈａｐｍａｎ‐近似式（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ）を利用して計算し、前記近似式は、静電気電位の減少を、下記一般式（２）による表面からの間隔の関数として記述している。
【００４３】
【数２】
2014516045.tif 000003
前記一般式において、ψｘは、表面からの間隔がｘであるときの電位であり、ψ０は、表面電位であり、そしてｋ−１は、デバイ長（Ｄｅｂｙｅ  ｌｅｎｇｔｈ）である。電解質‐濃度（ＮａＣｌ）の増加は、デバイ長を減少させる。ゼータ電位は、滑り面における静電気電位として規定され、前記滑り面における静電気電位からは、ゼータ電位がただ生体適合性ナノ‐ポリマー粒子の固定された水性層外部においてのみ発生するという事実が推定される。方程式（２）から方程式（３）が得られる。
【００４４】
【数３】
2014516045.tif 000004
ゼータ電位（ψｘ）がＮａＣｌの多様な濃度（０，０．１，０．２，０．５，１，２および５ｍＭ）において測定され、ｋに対して３．３３・ｃ１／２に相応するように図示されると（この場合、ｃは電解質のモル濃度である）、濃度上昇は、吸着されたポリマー層の厚さを補償する。
【００４５】
図３は、製造されたばかりの粒子（白色の正方形）だけでなく、噴霧化された粒子（黒色の正方形）のために、コーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子上に吸着されたＰＶＡ層の厚さを示している。図３Ａにおいて、前記ＰＶＡ層の厚さは、使用されたＰＶＡ濃度に依存して示されている。前記層厚は、製造されたばかりの粒子に対してだけでなく、噴霧化された粒子に対しても、１０〜２０ｎｍに達する。このような結果は、伝送電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ）写真によっても確認される。この目的のために、銅グリッド（たとえば、Ｓ１６０‐３、Ｐｌａｎｏ，  Ｗｅｔｚｌａｒ、ドイツ）をコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の希釈された懸濁液の薄い層でコーティングした。その次に、コーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子を前記グリッド上で乾燥させ、伝送電子顕微鏡（ＴＥＭ、たとえば、ＪＥＭ‐３０２０ＴＥＭ、ＪＥＯＬ、Ｅｃｈｉｎｇ、ドイツ）を利用して３００ｋＶの加速電圧において照射した。図３Ｄは、本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の代表的なＴＥＭ‐写真を示しており、この写真においては、ＰＶＡ層（実施例１による製造時に使用された濃度は１０ｇ／ｌである）を明確に確認することができる。前記粒子のゼータ電位、より詳細に述べると、表面電荷は、テストされたすべてのＮａＣｌ濃度において負であった（図３Ｂ参照）。図３Ｃに示された直線は、実験データの線形フィット（ｌｉｎｅａｒ  ｆｉｔ）を示している。
２．３  噴霧化の際に、本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の安定性と完全性
本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の安定性を調査するために、前記粒子を含有する懸濁液の部分標本を、５ｌ／ｍｉｎの空気流率においてＡｅｒｏｎｅｂ（登録商標）  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ噴霧器を利用して、製造業者の指示に従って噴霧化し、顕微鏡用スライドガラス上においてエアロゾル滴を凝結流体として捕捉した。その後に続いて、前記凝結流体を、ポイント２．１に記述されたところのように、動的光散乱法（ＤＬＳ）および電子顕微鏡を利用して分析した。
【００４６】
図４Ａおよび４Ｂは、粒子サイズおよび多分散指数が噴霧化によってまったく影響を受けないということを示している。粒子の完全性も噴霧化時に保持された（図４Ｃ参照）。
２．４  本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子内に含有された活性成分の含有量
実施例１に従って製造され、コーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の活性成分シルデナフィルの含量を決定するために、たとえば、１ｍｌのコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の懸濁液を１６８７３ｘｇにおいて３０分間、２５℃で遠心分離させた。その後に続いて、上澄み液を慎重に除去し、そのうちカプセルに包まれていないＰＤＥ‐５抑制剤の量を決定した。遠心分離から得られるペレットを冷凍乾燥し、計量した後に続き、たとえば、ＰＬＧＡおよびシルデナフィルのための溶媒として適したクロロホルムの形態で溶解した。溶解されなかった部分（安定化剤）を遠心分離によって分離させた。その後に続いて、カプセルに包まれているシルデナフィルの量を決定するために、有機相から部分標本を除去した。シルデナフィルの濃度を分光光度計（たとえば、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ（登録商標）  ３０００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）を利用するＵＶ／Ｖｉｓ分光学によって決定した。すべての部分標本の吸着を、２９１ｎｍの波長において測定した。コーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子（ＰＬＧＡ‐ＢＮＰ）内に含有されている活性成分（ＷＳＴ）の含量を、検量線を参照して計算し、下記一般式（４）において規定した。
【００４７】
【数４】
2014516045.tif 000005
シルデナフィル含量は、粒子サイズおよびＰＤＩといったパラメータ（２．１参照）とともに、図２に噴霧化前および後の値の商として示されている。前記図は、噴霧化がシルデナフィル含量に対して重大な影響を及ぼさないということを示している。
２．５  本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子からの活性成分の放出
活性成分シルデナフィルをｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出させるための調査を、リン酸緩衝生理食塩水内において、たとえば、７．４のｐＨ値で、５００分間、３７℃で実施した。本研究を、５％（ｗ／ｗ）の理論的な活性成分含量を有するコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子で実施した。前記コーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子の懸濁液の部分標本をガラスチューブへ移し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４＋０．１％ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）からなる媒質で希釈した。後続する培養は、３７℃において、部分標本の攪拌下で行われた。実験的なアッセイに並行して、ＰＤＥ‐５抑制剤を同一条件下で媒質内において単独で培養した。部分量を事前に決定された時点で除去し、遠心分離した。
【００４８】
本発明によりコーティングされた生体適合性ナノおよびマイクロ粒子から体外において活性成分シルデナフィルを放出する過程は、３００分までの時間にわたって行われた（図５参照）。ポリマーＲＧ５０２Ｈを含有する粒子からの放出は、９０分までの時間にわたって行われた。この時間中には、９５％を超過するシルデナフィルが粒子から連続的に放出された。このとき、Ａｅｒｏｎｅｂ（登録商標）  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌを利用した噴霧化は、シルデナフィルの放出率に対して何らの影響も及ぼさなかった。
【図４（Ａ）−４（Ｂ）】
2014516045.tif 000006
【図４（Ｃ）】
2014516045.tif 000007
【図１】
2014516045.tif 000008
【図２】
2014516045.tif 000009
【図３Ａ−３Ｂ】
2014516045.tif 000010
【図３Ｃ−３Ｄ】
2014516045.tif 000011
【図５】
2014516045.tif 000012
【国際調査報告】
2014516045.tif 000013
2014516045.tif 000014
2014516045.tif 000015
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2014516045.tif 000017
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