(57)【要約】  本発明は、ヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞及びその分離方法を提供する。また、本発明は、前記ヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞から分化した骨芽細胞または脂肪細胞及びその分化方法を提供する。さらに、前記幹細胞、骨芽細胞または脂肪細胞を含む骨生成用または脂肪生成用組成物を提供する。本発明の分離方法は、皮膚真皮由来成体幹細胞を容易且つ簡単に、高収得率で確保することができるようにすると共に、前記方法にて分離された皮膚真皮由来成体幹細胞から特異的に発現する遺伝子及び成長因子を、後で分離・同定を行って用いることができる。
2014528710.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト皮膚線維芽細胞に比べてＳｏｘ２（ＳＲＹ（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ）−ｂｏｘ  ２）及びＳ１００ｂ（Ｓ１００  ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ）からなる群より選ばれる一つ以上の遺伝子が過発現することを特徴とするヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞。
【請求項２】
前記幹細胞は、
ヒト皮膚線維芽細胞を継代培養してからゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンに反応させ、ゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンに付着する細胞を分離して得られたものであることを特徴とする請求項１に記載のヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞。
【請求項３】
前記幹細胞は、
前記線維芽細胞を１〜５分間ゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンに反応させて得られたものであることを特徴とする請求項２に記載のヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞。
【請求項４】
前記ゼラチンは、蒸留水に０.１〜１重量％の濃度で溶解させてなるものであり、また前記ＩＶ型コラーゲンは、蒸留水に１０〜３０μｇ／ｍｌの含量で溶解させてなるものであることを特徴とする請求項２に記載のヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞。
【請求項５】
前記ゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンは、０〜１０℃の温度で１６〜２４時間基質にコーティングさせてなるものであることを特徴とする請求項２に記載のヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞。
【請求項６】
前記幹細胞は、
ヒト皮膚線維芽細胞に比べてＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ４（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ４）、ＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ）、ＶＥＧＦ  Ｒ２（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）、ＶＥＧＦ  Ｒ３（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３）及びＶＥＧＦ  Ｄ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｄ）からなる群より選ばれる一つ以上の成長因子が過発現することを特徴とする請求項１に記載のヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞。
【請求項７】
前記幹細胞は、
寄託番号ＫＣＴＣ１１９９５ＢＰの幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載のヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞。
【請求項８】
請求項１に記載のヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞から分化した骨芽細胞または脂肪細胞。
【請求項９】
前記骨芽細胞は、
ヒト皮膚線維芽細胞に比べてＯＧＮ（Ｏｓｔｅｏｇｌｙｃｉｎ）及びＡＣＡＮ（Ａｇｇｒｅｃａｎ）からなる群より選ばれる一つ以上の遺伝子が過発現することを特徴とする請求項８に記載の骨芽細胞。
【請求項１０】
前記脂肪細胞は、
ヒト皮膚線維芽細胞に比べてＰＰＡＲＧ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ）、ＬＥＰ（Ｌｅｐｔｉｎ）、ＡｄｉｐｏＱ（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ、Ｃ１Ｑ  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）及びＦＡＢＰ４（Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４、ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）からなる群より選ばれる一つ以上の遺伝子が過発現することを特徴とする請求項８に記載の脂肪細胞。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れかに記載のヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞、骨芽細胞または脂肪細胞を有効成分として含む骨生成用または脂肪生成用組成物。
【請求項１２】
前記組成物は、
骨粗鬆症の予防及び治癒、皮膚老化の予防及び治癒、皮膚傷の治癒、皮膚血行の改善、皮膚のボリューム感の増進、または皮膚成形効能を有することを特徴とする請求項１１に記載の骨生成用または脂肪生成用組成物。
【請求項１３】
ヒト皮膚線維芽細胞を継代培養してからゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンに反応させ、ゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンに付着する細胞を分離することを含むヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞の分離方法。
【請求項１４】
前記分離方法では、
前記線維芽細胞を１〜５分間ゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンに反応させることを特徴とする請求項１３に記載のヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞の分離方法。
【請求項１５】
前記分離方法では、
前記ゼラチンを蒸留水に０.１〜１重量％の濃度で溶解させ、また前記ＩＶ型コラーゲンを蒸留水に１０〜３０μｇ／ｍｌの含量で溶解させて線維芽細胞に反応させることを特徴とする請求項１３に記載のヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞の分離方法。
【請求項１６】
前記分離方法では、
前記ゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンを０〜１０℃の温度で１６〜２４時間基質にコーティングして線維芽細胞に反応させることを特徴とする請求項１３に記載のヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞の分離方法。
【請求項１７】
前記分離方法は、
ヒト皮膚線維芽細胞に比べてＳｏｘ２（ＳＲＹ（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ）−ｂｏｘ  ２）及びＳ１００ｂ（Ｓ１００  ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ）からなる群より選ばれる一つ以上の遺伝子を過発現するか否かを確認することをさらに含む請求項１３に記載のヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞の分離方法。
【請求項１８】
前記分離方法は、
ヒト皮膚線維芽細胞に比べてＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ４（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ４）、ＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ）、ＶＥＧＦ  Ｒ２（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）、ＶＥＧＦ  Ｒ３（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３）及びＶＥＧＦ  Ｄ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｄ）からなる群より選ばれる一つ以上の成長因子を過発現するか否かを確認することを含む請求項１３に記載のヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞の分離方法。
【請求項１９】
請求項１３〜１８の何れかに記載の分離方法により分離されたヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞を骨芽細胞または脂肪細胞に分化させることを含むヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞の分化方法。
【請求項２０】
前記分化方法は、
分離された幹細胞を骨細胞分化培地で分化させた後、
分化された細胞がヒト皮膚線維芽細胞に比べてＯＧＮ（Ｏｓｔｅｏｇｌｙｃｉｎ）及びＡＣＡＮ（Ａｇｇｒｅｃａｎ）からなる群より選ばれる一つ以上の遺伝子を過発現するか否かを確認することを含む請求項１９に記載のヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞の分化方法。
【請求項２１】
前記分化方法は、
分離された細胞を脂肪細胞分化培地で分化させた後、
分化された細胞がヒト皮膚線維芽細胞に比べてＰＰＡＲＧ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ）、ＬＥＰ（Ｌｅｐｔｉｎ）、ＡｄｉｐｏＱ（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ、Ｃ１Ｑ  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）及びＦＡＢＰ４（Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４、ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）からなる群より選ばれる一つ以上の遺伝子を過発現するか否かを確認することを含む請求項１９に記載のヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞の分化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの皮膚真皮由来の成体幹細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
多分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）を有する成体幹細胞を組織から分離しようとする努力がここ数年前から続けられてきた。当該成体幹細胞は、胚性幹細胞の全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）に比べて組織内のすべての細胞に分化することはできないという短所があるが、胚性幹細胞で問題視され得る倫理的な面から自由になれるという点において研究及び活用の意味がある。ただ、胚性幹細胞とは異なり、成体組織から発掘・同定をするには成体幹細胞の数（当該組織の約１〜５％未満と推定）が相当小さいため、その研究には相当な困難が伴うという不具合がある。
【０００３】
究極的に幹細胞に関する研究を通じて得ようとすることは、主に治療の目的のための使用と言えるところ、特定の臓器組織に疾患または疾病を持っている患者らに幹細胞基盤の新規な細胞を供給する一種の細胞移植（ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）または置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）により健康回復についての希望を与えることができると判断している。ヒトの皮膚成体幹細胞もまた、やけどのような皮膚損傷、創傷、潰よう、アトピーなどの皮膚疾患の治療に応用できると判断され、研究が進められてきている。角質層（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）、真皮（ｄｅｒｍｉｓ）、皮下脂肪層（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ａｄｉｐｏｓｅ）、及び付属器（ａｐｐｅｎｄａｇｅ）からなるこれらの皮膚層から、即ち、角質層からは角質幹細胞（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）を、付属器である毛髪からは毛包幹細胞（ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）といった多分化能を有する細胞群を同定した。また、真皮由来成体幹細胞の場合は、げっ歯類やヒトから懸濁培養（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）といった特定の培養システムを用いて同定したが、このようは真皮由来成体幹細胞（Ｓｋｉｎ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ、ＳＫＰｓ）は、脂肪細胞、骨細胞、筋肉細胞などの中胚葉（ｍｅｓｏｄｅｒｍ）形態の細胞に分離できるという程度のことしか観察されていない（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００４】
何よりも、これらの皮膚成体幹細胞が皮膚組織の全体に占める数の割合は極めて低く、角質幹細胞の場合は、角質形成細胞数の１〜５％未満であると推察され、真皮由来幹細胞の場合も２〜３％程度と推察されており、これらの分離には多くの困難が伴い、このため、これらの皮膚成体幹細胞の分離に必要な特異的な標識子（またはバイオマーカー）に関する発見がほとんどない実情である。現在までのところ、角質幹細胞の標識子として明らかにされたものは、α６−インテグリン、ＣＤ７１、β１−インテグリン、ｐ６３（非特許文献３、非特許文献４）程度であり、毛包幹細胞の場合は、ＣＤ２００（非特許文献５）だけが知られている程度である。
【０００５】
近年、ヒト真皮層から正常な真皮線維芽細胞培養システムを用いて分離した真皮由来成体幹細胞の場合、独特に脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などに多分化能をすることが発見され、これらは、特異的にｖｉｍｅｎｔｉｎ＋（発現）、ｎｅｓｔｉｎ−（非発現）することが観察された（非特許文献６）。しかしながら、これらを分離する方法は、正常な線維芽細胞培養システムと特に異なるものではないため、効率よく収率を高めるには問題点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国公開特許第１０−２００６−００１６５４０号公報
【特許文献２】韓国公開特許第１０−２０１０−００６７２７７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Jean G. Toma et. al., “Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin”, Macmillan Magazines Ltd., NATURE CELL BIOLOGY, Vol. 3, September 2001.
【非特許文献２】Jean G. Toma et. al., “Isolation and Characterization of Multipotent Skin-Derived Precursors from Human Skin”, Stem Cells, 2005, 23: 727-737.
【非特許文献３】Angela Webb et. al., “Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin”, International Society of Differentiation, 2004, 72: 387-395.
【非特許文献４】Rui Yi et. al., “A skin microRNA promotes differentiation by repressing ‘stemness’”, Nature Publishing Group, Vol. 452, 2008.
【非特許文献５】Luis A. Garza et. al.,” Bald scalp in men with androgenetic alopecia retains hair follicle stem cells but lacks CD200-rich and CD34-positive hair follicle progenitor cells”, The Journal of Clinical Investigation, Vol. 121, 2011, Page 613-622.
【非特許文献６】Fu Guo Chen et. al.,” Clonal analysis of nestin? vimentin+ multipotent fibroblasts isolated from human dermis”, Journal of Cell Science 120, 2007, Page 2875-2883.
【非特許文献７】TAKAHASHI et al., “Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors”, Cell, vol. 131, pp.1-12 (2007.11.30)
【非特許文献８】PAGE et al., “Induction of Stem Cell Gene Expression in Adult Human Fibroblasts without Transgenes”, Cloning and Stem Cells, Vol.11, No.3, pp.417-426 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記問題点を解決するために、特異的な遺伝子及び成長因子をバイオマーカーとして発現することを特徴とする皮膚から分離されたヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明の一実施例は、ヒト皮膚線維芽細胞に比べてＳｏｘ２（ＳＲＹ（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ）−ｂｏｘ  ２）及びＳ１００ｂ（Ｓ１００  ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ）からなる群より選ばれる一つ以上の遺伝子が過発現することを特徴とするヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞を提供する。
【００１０】
また、本発明の一実施例において、前記幹細胞は、ヒト皮膚線維芽細胞を継代培養してからゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンに反応させ、ゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンに付着する細胞を分離して得られたものであってよい。
【００１１】
また、本発明の一実施例において、前記幹細胞は、前記線維芽細胞を１〜５分間ゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンに反応させて得られたものであってよい。
【００１２】
また、本発明の一実施例において、前記ゼラチンは、蒸留水に０.１〜１重量％の濃度で溶解させてなるものであり、また前記ＩＶ型コラーゲンは、蒸留水に１０〜３０μｇ／ｍｌの含量で溶解させてなるものであってよい。
【００１３】
また、本発明の一実施例において、前記ゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンは、０〜１０℃の温度で１６〜２４時間基質にコーティングさせてなるものであってよい。
【００１４】
また、本発明の一実施例において、前記幹細胞は、ヒト皮膚線維芽細胞に比べてＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ４（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ４）、ＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ）、ＶＥＧＦ  Ｒ２（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）、ＶＥＧＦ  Ｒ３（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３）及びＶＥＧＦ  Ｄ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｄ）からなる群より選ばれる一つ以上の成長因子が過発現するものであってよい。
【００１５】
また、本発明の一実施例において、前記幹細胞は、寄託番号ＫＣＴＣ１１９９５ＢＰの幹細胞である。
【００１６】
また、本発明の一実施例は、ヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞から分化した骨芽細胞または脂肪細胞を提供する。
【００１７】
また、本発明の一実施例において、前記骨芽細胞は、ヒト皮膚線維芽細胞に比べてＯＧＮ（Ｏｓｔｅｏｇｌｙｃｉｎ）及びＡＣＡＮ（Ａｇｇｒｅｃａｎ）からなる群より選ばれる一つ以上の遺伝子が過発現するものであってよい。
【００１８】
また、本発明の一実施例において、前記脂肪細胞は、ヒト皮膚線維芽細胞に比べてＰＰＡＲＧ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ）、ＬＥＰ（Ｌｅｐｔｉｎ）、ＡｄｉｐｏＱ（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ、Ｃ１Ｑ  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）及びＦＡＢＰ４（Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４、ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）からなる群より選ばれる一つ以上の遺伝子が過発現するものであってよい。
【００１９】
また、本発明の一実施例は、ヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞、骨芽細胞または脂肪細胞を有効成分として含む骨生成用または脂肪生成用組成物を提供する。
【００２０】
また、本発明の一実施例において、前記組成物は、骨粗鬆症の予防及び治癒、皮膚老化の予防及び治癒、皮膚傷の治癒、皮膚血行の改善、皮膚のボリューム感の増進、または皮膚成形効能を有するものであってよい。
【００２１】
また、本発明の一実施例は、ヒト皮膚線維芽細胞を継代培養してからゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンに反応させ、ゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンに付着する細胞を分離することを含むヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞の分離方法を提供する。
【００２２】
また、本発明の一実施例において、前記分離方法では、前記線維芽細胞を１〜５分間ゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンに反応させていてよい。
【００２３】
また、本発明の一実施例において、前記分離方法では、前記ゼラチンを蒸留水に０.１〜１重量％の濃度で溶解させ、また前記ＩＶ型コラーゲンを蒸留水に１０〜３０μｇ／ｍｌの含量で溶解させて線維芽細胞に反応させていてよい。
【００２４】
また、本発明の一実施例において、前記分離方法では、前記ゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンを０〜１０℃の温度で１６〜２４時間基質にコーティングして線維芽細胞に反応させていてよい。
【００２５】
また、本発明の一実施例において、前記分離方法は、ヒト皮膚線維芽細胞に比べてＳｏｘ２（ＳＲＹ（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ）−ｂｏｘ  ２）及びＳ１００ｂ（Ｓ１００  ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ）からなる群より選ばれる一つ以上の遺伝子を過発現するか否かを確認することをさらに含んでいてよい。
【００２６】
また、本発明の一実施例において、前記分離方法は、ヒト皮膚線維芽細胞に比べてＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ４（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ４）、ＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ）、ＶＥＧＦ  Ｒ２（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）、ＶＥＧＦ  Ｒ３（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３）及びＶＥＧＦ  Ｄ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｄ）からなる群より選ばれる一つ以上の成長因子を過発現するか否かを確認することを含んでいてよい。
【００２７】
また、本発明の一実施例は、前記分離方法により分離されたヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞を骨芽細胞または脂肪細胞に分化させることを含むヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞の分化方法を提供する。
【００２８】
また、本発明の一実施例において、前記分化方法は、分離された幹細胞を骨細胞分化培地で分化させた後、分化された細胞がヒト皮膚線維芽細胞に比べてＯＧＮ（Ｏｓｔｅｏｇｌｙｃｉｎ）及びＡＣＡＮ（Ａｇｇｒｅｃａｎ）からなる群より選ばれる一つ以上の遺伝子を過発現するか否かを確認することを含んでいてよい。
【００２９】
また、本発明の一実施例において、前記分化方法は、分離された細胞を脂肪細胞分化培地で分化させた後、分化された細胞がヒト皮膚線維芽細胞に比べてＰＰＡＲＧ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ）、ＬＥＰ（Ｌｅｐｔｉｎ）、ＡｄｉｐｏＱ（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ、Ｃ１Ｑ  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）及びＦＡＢＰ４（Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４、ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）からなる群より選ばれる一つ以上の遺伝子を過発現するか否かを確認することを含んでいてよい。
【発明の効果】
【００３０】
本発明に係るヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞、前記幹細胞から分化した骨芽細胞または前記幹細胞から分化した脂肪細胞を含む組成物は、骨生成用または脂肪生成用組成物として用いることができる。また、本発明に係る分離方法は、皮膚真皮由来成体幹細胞を容易且つ簡単に、高収得率で確保することができるようにすると共に、前記方法にて分離された皮膚真皮由来成体幹細胞から特異的に発現する遺伝子及び成長因子を、後で分離・同定を行って用いることができるようにする効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ゼラチンで分離した皮膚真皮由来成体幹細胞とヒト皮膚線維芽細胞との幹細胞能であるコロニー形成アッセイを比較した結果を示す図である。
【図２】分離した皮膚真皮由来成体幹細胞の方が、ヒト皮膚線維芽細胞に対して、Ｓｏｘ２（イ）及びＳ１００ｂ（ロ）の発現がそれぞれ２倍及び３倍以上も増加した結果を示すグラフである。従来の分離されたＶｉｍｅｎｔｉｎ＋（発現）／Ｎｅｓｔｉｎ−（非発現）を示したヒト真皮由来成体幹細胞と同一または類似するか否かを確認した結果、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ（ハ）、Ｎｅｓｔｉｎ（ニ）はいずれも発現し、ヒト皮膚線維芽細胞に比べて全く差異がなかったため、既存の同定されたヒト真皮由来成体幹細胞（ｖｉｍｅｎｔｉｎ＋（発現）、ｎｅｓｔｉｎ−（非発現）、非特許文献６）と本発明に係るヒト真皮由来成体幹細胞とは相違するものであることを提示する。
【図３】分離した皮膚真皮由来成体幹細胞から骨芽細胞に分化し、骨芽細胞の代表的な標識子（遺伝子マーカー）であるＯＧＮ（イ）、ＡＣＡＮ（ロ）が発現した結果を示すグラフである。
【図４】分離した皮膚真皮由来成体幹細胞から脂肪細胞に分化し、脂肪細胞の代表的な標識子（遺伝子マーカー）であるＰＰＡＲｇ（イ）、ＡｄｉｐｏＱ（ロ）、Ｌｅｐｔｉｎ（ハ）、ＦＡＢＰ４（ニ）が発現した結果を示すグラフである。
【図５】分離した皮膚真皮由来成体幹細胞がヒト皮膚線維芽細胞に比べて細胞成長因子ＥＧＦ（イ）、ＦＧＦ４（ロ）、及び血管生成因子ＰＤＧＦ−Ａ（ハ）、ＶＥＧＦ  Ｒ２（ニ）、ＶＥＧＦ  Ｒ３（ホ）、ＶＥＧＦ−Ｄ（ヘ）が過発現した結果を示すグラフである。
【図６】皮膚真皮中に存在する血管に関する図である。
【図７】血管生成因子の分類体系図を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００３３】
本発明者らは、皮膚組織、特に、角質幹細胞や毛包幹細胞に比べて未だに実体が明らかに究明されていないヒト真皮由来成体幹細胞に対する同定及び収得率を高められる方法を考案する過程で、ゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンの細胞との付着力が経時的に相違することを確認し、これに基づいて本発明を完成するに至った。
【００３４】
本発明は、ヒト皮膚線維芽細胞に比べてＳｏｘ２（ＳＲＹ（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ）−ｂｏｘ  ２）及びＳ１００ｂ（Ｓ１００  ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ）からなる群より選ばれる一つ以上の遺伝子が過発現することを特徴とするヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞を提供する。
【００３５】
前記Ｓｏｘ２（ＳＲＹ（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ）−ｂｏｘ  ２）及びＳ１００ｂ（Ｓ１００  ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ）は、他のヒト組織成体幹細胞の種々の遺伝子マーカーのうち、本発明の皮膚真皮由来成体幹細胞において特異的に発現量が増加したものであって、本発明者らが最初に発明したものである。
【００３６】
従来に知られた皮膚真皮由来成体幹細胞は、Ｎｅｓｔｉｎ−（非発現）、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ＋（発現）と知られている。本発明において分離した皮膚真皮由来成体幹細胞は、ヒト皮膚線維芽細胞と比較してＮｅｓｔｉｎ及びＶｉｍｅｎｔｉｎの発現様相に差異がないことを特徴としていることから、従来の皮膚真皮由来成体幹細胞とは相違する幹細胞である。
【００３７】
従来のＩＶ型コラーゲンを活用して分離した皮膚成体幹細胞としては、種々の皮膚成体幹細胞の中でも角質幹細胞だけが知られている。本発明の皮膚真皮由来成体幹細胞は、従来の皮膚真皮由来成体幹細胞とは相違する新規な幹細胞であって、本発明者らが最初に発明したものである。
【００３８】
また、本発明は、ヒト皮膚線維芽細胞を２回目位または３回目の継代培養をしてからゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンに反応させ、ゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンに付着する細胞を分離することを含む皮膚真皮由来成体幹細胞の分離方法及びその分離方法にて分離されたヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞を提供する。
【００３９】
前記反応時間は、１〜５分、好ましくは４〜５分であってよい。１分未満であると幹細胞の適切な収得率を期待しにくく、また５分以上反応させると他の一般の線維芽細胞が混ざり込むことがある。すなわち、反応時間が５分超過３０分程度になると、５０〜６０％程度の細胞がくっ付くようになり、これは重力によって一般の線維芽細胞がＩＶ型コラーゲンあるいはゼラチンと結合してくっ付いたためである。
【００４０】
前記ゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンは、ゼラチン０．１〜１％（重量／溶媒の体積）またはＩＶ型コラーゲン１０〜３０μｇ／ｍｌの含量で線維芽細胞と反応していてよい。前記溶媒は、蒸留水、具体的には３次蒸留水であってよい。前記コラーゲンは、０．２５％の酢酸に１ｍｇ／ｍｌの濃度で仕込んだ後、３次蒸留水で希釈して用いていてよい。
【００４１】
また、前記ゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンは、０〜１０℃、好ましくは４℃の温度で１６〜２４時間基質にコートさせてなるものであってよい。
【００４２】
前記基質は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン−ポリプロピレン共重合体、金属、シリコン、及びガラスからなる群より選ばれるものであってよいが、必ずしもこれらに限定されるものではない。前記金属は、ニッケル、金、または銀であってよいが、必ずしもこれらに限定されるものではない。具体的に、前記基質は、通常の培養容器であってよい。前記基質の形状は、特に限定されず、球状粒子、プレート、チューブなどであってよい。前記コーティングは、公知の方法に実施していてよい。
【００４３】
前記分離方法は、分離された細胞においてヒト皮膚線維芽細胞に比べてＳｏｘ２（ＳＲＹ（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ）−ｂｏｘ  ２）及びＳ１００ｂ（Ｓ１００  ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ）からなる群より選ばれる一つ以上の遺伝子を過発現するか否かを確認することをさらに含んでいてよい。
【００４４】
前記分離方法は、ヒト皮膚線維芽細胞に比べてＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ４（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ４）、ＰＤＧＦ−ＡＡ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ）、ＶＥＧＦ  Ｒ２（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）、ＶＥＧＦ  Ｒ３（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３）及びＶＥＧＦ  Ｄ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  D）からなる群より選ばれる一つ以上の成長因子を過発現するか否かを確認することをさらに含んでいてよい。また、本発明において分離した皮膚真皮由来成体幹細胞は、ヒト皮膚線維芽細胞に比べてＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ４（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ４）、ＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ）、ＶＥＧＦ  Ｒ２（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）、ＶＥＧＦ  Ｒ３（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３）及びＶＥＧＦ  Ｄ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｄ）からなる群より選ばれる一つ以上の成長因子を過発現することができる。
【００４５】
本発明は、前記分離方法により分離されたヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞を骨芽細胞または脂肪細胞に分化させることを含むヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞の分化方法及びヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞から分化した骨芽細胞または脂肪細胞を提供する。
【００４６】
前記分化方法は、分離された幹細胞を骨芽細胞分化培地（ｈＭＳＣ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｌｏｎｚａ  ＰＴ−３００２）で分化させ、全１４日期間中、２〜３日おきに一回ずつ培地を交換して分化（実施例４参照）させた後、分化された細胞がヒト皮膚線維芽細胞に比べてＯＧＮ（Ｏｓｔｅｏｇｌｙｃｉｎ）及びＡＣＡＮ（Ａｇｇｒｅｃａｎ）からなる群より選ばれる一つ以上の遺伝子を過発現するか否かを確認することをさらに含んでいてよい。また、本発明において分化した骨芽細胞は、ヒト皮膚線維芽細胞に比べてＯＧＮ（Ｏｓｔｅｏｇｌｙｃｉｎ）及びＡＣＡＮ（Ａｇｇｒｅｃａｎ）からなる群より選ばれる一つ以上の遺伝子を過発現することができる。
【００４７】
前記分化方法は、分離された幹細胞を脂肪細胞分化培地、具体的には、ＤＭＥＭ培地、より具体的には１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）と０．１％インシュリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）、１μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、０．５ｍＭのＩＢＭＸ、１μＭのトログリタゾン（Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）が添加されたＤＭＥＭ培地を用いて、７日間２〜３日おきに培地を交換して分化させていてよい（実施例５参照）。分化した細胞がヒト皮膚線維芽細胞に比べてＰＰＡＲＧ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ）、ＬＥＰ（Ｌｅｐｔｉｎ）、ＡｄｉｐｏＱ（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ、Ｃ1Ｑ  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）及びＦＡＢＰ４（Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４、ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）からなる群より選ばれる一つ以上の遺伝子を過発現するか否かを確認することをさらに含んでいてよい。また、本発明において分化した脂肪細胞は、ヒト皮膚線維芽細胞に比べてＰＰＡＲｇ、ＬＥＰ、ＡｄｉｐｏＱ及びＦＡＢＰ４からなる群より選ばれる一つ以上の遺伝子を過発現することができる。
【００４８】
また、本発明の一実施例は、前記皮膚真皮由来成体幹細胞、前記皮膚真皮由来成体幹細胞から分化した骨芽細胞または前記皮膚真皮由来成体幹細胞から分化した脂肪細胞を有効成分として含む骨生成用または脂肪生成用組成物を提供する。
【００４９】
本発明に係る前記組成物は、骨粗鬆症の予防及び治癒、皮膚老化の予防及び治癒、皮膚傷の治癒、皮膚のボリューム感の増進、または皮膚成形効能を有する。前記組成物は、一般的に皮膚につける組成物の全般を包括する概念であり、具体的に、皮膚外用剤組成物であってよく、例えば化粧料組成物または薬学組成物であってよい。
【００５０】
化粧料組成物としては、例えば、基礎化粧料、メーキャップ化粧料、毛髪用化粧料、ボディー用化粧料などが挙げられ、その剤形は特に制限されず、目的するところに応じて適宜選択すればよい。
【００５１】
例えば、前記化粧料組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、せっけん、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファウンデーション、乳濁液ファウンデーション、ワックスファウンデーション、及びスプレーなどで剤形化することができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。より詳しくは、柔軟化粧水、栄養化粧水、ローション、ボディーローション、栄養クリーム、マッサージクリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、ゲル、パッチ、水中油（Ｏ／Ｗ）型、油中水（Ｏ／Ｗ）型などの基礎化粧料、リップスティック、メーキャップベースまたはファウンデーションなどのポイントメーキャップ化粧料、シャンプー、リンス、ボディークレンザー、歯磨きまたは口腔洗浄剤などの洗浄料、ヘアトニック、ジェルまたはムースなどの整髪剤、養毛剤または染毛剤などの毛髪用化粧料組成物にて剤形化されていてよい。
【００５２】
前記化粧料組成物は、化粧学的に許容し得る媒質または基剤を含有する。これは、局所適用に適したあらゆる剤形にて提供されていてよく、例えば、溶液、ゲル、固体または練り無水生成物、水状物に油状物を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微細顆粒球またはイオン型（リポソーム）及び／または非イオン型の小胞性分散剤の形態、あるいはクリーム、スキン、ローション、パウダー、軟膏、スプレー、またはコンシーラースティックの形態が挙げられる。また、これらの組成物は、当該分野の通常の方法にて製造されていてよい。
【００５３】
本発明の剤形が溶液または乳濁液の場合は、担体成分として、溶媒、溶解化剤、または乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１,３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルが挙げられる。
【００５４】
本発明の剤形が懸濁液の場合は、担体成分として、水、エタノール、またはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天またはトラガカントなどが用いられていてよい。
【００５５】
本発明の剤形がペースト、クリーム、またはゲルの場合は、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカンド、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、または酸化亜鉛などが用いられていてよい。
【００５６】
本発明の剤形がパウダーまたはスプレーの場合は、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート、またはポリアミドパウダーが用いられていてよく、特にスプレーの場合は、更に、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタン、またはジメチルエーテルのような推進剤を含んでいてよい。
【００５７】
本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングの場合は、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体、またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが用いられていてよい。
【００５８】
本発明の一実施態様において、前記化粧料組成物に、更に粘増剤を含有していてよい。本発明の化粧料組成物に含まれる粘増剤としては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルヒドロキシグアニン、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリクォータニウム、セテアリルアルコール、ステアリン酸、カラギナンなどが用いられていてよく、好ましくは、カルボキシメチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリクォータニウムから選ばれた１種以上が用いられていてよく、より好ましくは、カルボキシビニルポリマーが用いられていてよい。
【００５９】
本発明の一実施態様における前記化粧料組成物は、必要に応じて適切な各種の基剤と添加剤を含有していてよく、これらの成分の種類と量は、発明者によって適宜選定されるものとする。必要に応じて許容し得る添加剤を含有していてよく、例えば、当業界においては通常の防腐剤、色素、添加剤などの成分を更に含んでいてよい。
【００６０】
防腐剤としては、具体的にフェノキシエタノール（Ｐｈｅｎｏｘｙｅｔｈａｎｏｌ）または１,２−ヘキサンジオール（１,２−Ｈｅｘａｎｅｄｉｏｌ）などが挙げられ、香料としては、人工香料などが挙げられる。
【００６１】
また、本発明の一実施態様における化粧料組成物は、水溶性ビタミン、油溶性ビタミン、高分子ペプチド、高分子多糖、スフィンゴ脂質及び海草エキスからなる群より選ばれた組成物を含んでいてよい。その他添加していてよい配合成分としては、油脂成分、保湿剤、エモリエント剤、界面活性剤、有機及び無機顔料、有機粉体、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、植物抽出物、ｐＨ調整剤、アルコール、色素、香料、血行促進剤、冷感剤、制汗剤、精製水などが挙げられる。
【００６２】
なお、その他添加していてもよい配合成分は、これらに限定されるものではなく、また、前記いずれの成分も本発明の目的及び効果を損なわない範囲内で配合可能なものとする。
【００６３】
本発明の一実施例における薬学組成物は、前記皮膚真皮由来成体幹細胞を有効成分として常用される無機または有機の担体、賦形剤、及び希釈剤を加えて、固体、半固体、または液状の非経口投与剤として製剤化することができる。前記非経口投与のための製剤としては、点滴剤、軟膏、ローション、ゲル、クリーム、パッチ、スプレー、懸濁液剤、及び油剤からなる群より選ばれる経皮投与型剤形であってよいが、必ずしもこれらに制限されるものではない。
【００６４】
前記組成物に含まれていてよい担体、賦形剤、及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、ショ糖、オリゴ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムフォスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、オキシ安息香酸メチル、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱物油が挙げられる。
【００６５】
各剤形による組成物において、前記本発明に係る組成物以外の他の成分を、その他の皮膚外用剤の剤形または使用目的などに応じて当業者が難なく適宜選定して配合することができ、このように他の原料と共に適用した場合、相乗効果が生じることがある。
【００６６】
また、本発明に係る組成物が薬学組成物として用いられた場合、防腐剤、安定化剤、水和剤または乳化促進剤、浸透圧の調節のための塩または緩衝剤などの薬学的助剤、及びその他治療的に有用な物質をさらに含んでいてよく、通常の方法により種々の経口または非経口投与形態にて剤形化することができる。
【００６７】
有効成分の実際の投与量は、症状の重症度や、選択された投与経路、対象の年齢、性別、体重、及び健康状態などの様々な関連因子を考慮して決められるべきものと理解されていてよい。
【００６８】
一般に、有効成分の投与量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜略２０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。より好ましい投与量は、０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜２．５ｍｇ／ｋｇ／日である。外用投与は、一日に一回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。
【００６９】
以下、下記の実施例を通じて本発明をより具体的に説明する。なお、下記の実施例は、本発明についての理解を助けるために例示したものに過ぎず、本発明の範疇及び範囲がこれらに限定されるものではない。
【００７０】
［実施例１］ゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンを用いたヒト皮膚線維芽細胞からＲＡ／ＳＡ細胞の分離
正常ヒト皮膚線維芽細胞（Ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、ＮＨＤＦ）をロンザ社製（Ｌｏｎｚａ、Ｉｎｃ．Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ、ＮＨＤＦ−Ａｄ−Ｄｅｒ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、ＣＣ−２５１１）から購入した。前記ヒト皮膚線維芽細胞を７５ｃｍ２Ｔ−フラスコに継代培養をし、ＣＯ２培養器（ＣＯ２  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で３７℃、５％のＣＯ２条件下で培養をした。通常、２回目または３回目で細胞の継代培養（ｐａｓｓａｇｅ）を行った。
【００７１】
０．１〜１％のゼラチンまたは１０〜３０μｇ／ｍｌのＩＶ型コラーゲンを、１００ｍｍ培養皿に５ｍｌずつ入れ、４℃で１６時間〜２４時間コーティングした。ヒト皮膚線維芽細胞を、０．２５％のトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ）で１００ｍｍ培養皿から分離し、次いで、１２００ｒｐｍで５分間細胞を沈めた後、培養液を除去してから５ｍｌのＤＭＥＭ培地を入れて細胞を懸濁し、その後、ゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンがコーティングされた培養皿で培養を開始し、５分経過した時点で培養皿に付着した細胞（ＲＡ；Ｒａｐｉｄｌｙ  Ａｄｈｅｒｉｎｇ）と初期５分までは培養皿に付着していなかったが４時間が経過した時点で付着した細胞（ＳＡ；Ｓｌｏｗｌｙ  Ａｄｈｅｒｉｎｇ）とにそれぞれ分離した。
【００７２】
［実施例２］分離したＲＡ／ＳＡ細胞のコロニー形成アッセイ（Ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｓｓａｙ）の確認
ゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンで分離されたＲＡ／ＳＡ細胞の幹細胞能（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を比較するために、コロニー形成アッセイを確認した。
【００７３】
分離されたＲＡ／ＳＡ細胞を６ウェル（ｗｅｌｌ）培養皿で１×１０２個の細胞数で１４日間培養した後、１０％エタノールと０．１％クリスタルバイオレット（Ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ）が含有された溶液にて５分間室温で染色してから、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）にて４回の洗浄後、顕微鏡で確認した。
【００７４】
前記実験結果を図１に示した。図１に見られるように、分離されたＲＡ細胞においてコロニー形成アッセイが増加したことを確認することができる（以下、ＲＡをヒト真皮由来成体幹細胞と称し、ＳＡ細胞をヒト皮膚線維芽細胞と称す）。本発明者らは、本発明において分離したヒト真皮由来成体幹細胞を、韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ：Ｋｏｒｅａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）傘下のＫＣＴＣ（微生物資源センター：Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に２０１１年８月８日付にて寄託し、寄託番号はＫＣＴＣ１１９９５ＢＰである。
【００７５】
［実施例３］ｍＲＮＡ発現量の測定によるヒト真皮由来成体幹細胞の特定標識子（遺伝子マーカー）の選定
実施例１で既述のとおり、分離したヒト真皮由来成体幹細胞及びヒト皮膚線維芽細胞とを２ｍｌのＰＢＳにて洗浄した後、次いで、トリゾール試薬（Ｔｒｉｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて細胞内のＲＮＡを分離した。分離されたＲＮＡをキアゲン社製のＲＮＡキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）でさらに一回精製した後、アジレント・テクノロジー社製のＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＲＮＡの質（ｑｕａｌｉｔｙ）を確認した。インビトロジェン社製の逆転写キット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＲＴ）  ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、これをリアルタイム逆転写重合酵素連鎖反応（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）により定量的に分析した。
【００７６】
分離したヒト真皮由来成体幹細胞とヒト皮膚線維芽細胞とにおける、それぞれ異なる成体幹細胞で特徴的な標識子（遺伝子マーカー）として知られたＳｏｘ２、Ｓ１００ｂ遺伝子の発現パターンの変化を、アプライドバイオシステム社製のタックマン遺伝子発現システム（ＴａｑＭａｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）（Ｓｏｘ２遺伝子プライマー：Ｈｓ０１０５３０４９＿ｓ１、Ｓ１００ｂ遺伝子プライマー：Ｈｓ００３８９２１７＿ｍ１）を用いて評価し、その結果を図２のイ、ロに示した。分離したヒト真皮由来成体幹細胞における各遺伝子の発現量がヒト皮膚線維芽細胞に比べて、約２〜３倍程度増加したことを確認した。一方、Ｎｅｓｔｉｎ−（非発現）、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ＋（発現）の特徴を有する既存に知られたヒト真皮由来成体幹細胞と同一または類似か否かを確認するために、Ｎｅｓｔｉｎ（Ｈｓ００７０７１２０＿ｓ１）及びＶｉｍｅｎｔｉｎ（Ｈｓ００１８５５８４＿ｍ１）遺伝子の発現量を調査した。本発明者が分離したヒト真皮由来成体幹細胞では、Ｎｅｓｔｉｎ（Ｈｓ００７０７１２０＿ｓ１）及びＶｉｍｅｎｔｉｎ（Ｈｓ００１８５５８４＿ｍ１）のいずれもが発現し、ヒト皮膚線維芽細胞と比較してみた結果、発現量において全く差異を見せなかった（図２のハ、ニ）。したがって、本発明者が分離したヒト真皮由来成体幹細胞は、既存に同定されなかった、新規な真皮由来成体幹細胞である。
【００７７】
このような増加は統計的に有意であり、統計は両側スチューデントのｔ検定にて検証し、ｐ値が０．０５以下のときに有意な差異があると表示した。
【００７８】
［実施例４］ヒト真皮由来成体幹細胞の分化能の確認
ゼラチンまたはＩＶ型コラーゲンで分離したヒト真皮由来成体幹細胞の分化能を把握するために、骨芽細胞（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）と脂肪細胞（Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）とにそれぞれ分化を誘導した。
【００７９】
骨芽細胞の分化は、ロンザ社製（Ｌｏｎｚａ、Ｉｎｃ．Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）の骨芽細胞分化培地（ｈＭＳＣ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＰＴ−３００２）を用いて誘導した。分離したヒト真皮由来成体幹細胞及びヒト皮膚線維芽細胞は、それぞれ６ウェル（ｗｅｌｌ）培養皿でそれぞれ２０×１０４個ずつ培養した後、骨芽細胞分化培地で１４日間分化を誘導してから遺伝子発現で確認した。
【００８０】
脂肪細胞の分化は、１０％ウシ胎児血清と０．１％インシュリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）、１μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、０．５ｍＭのＩＢＭＸ、１μＭのトログリタゾン（Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）が添加されたＤＭＥＭ培地を用いて誘導された。分離したヒト真皮由来成体幹細胞及びヒト皮膚線維芽細胞は、それぞれ６ウェル（ｗｅｌｌ）培養皿でそれぞれ２０×１０４個ずつ培養した後、脂肪細胞分化培地で７日間分化を誘導してから遺伝子発現で確認した。
【００８１】
［実施例５］分離したヒト真皮由来成体幹細胞及びヒト皮膚線維芽細胞の骨芽細胞と脂肪細胞に分化した細胞の分化バイオマーカーの発現量の測定
分離したヒト真皮由来成体幹細胞及びヒト皮膚線維芽細胞を骨芽細胞と脂肪細胞にそれぞれ分化を誘導した後、前記実施例３と同じ方法にて、骨芽細胞のバイオマーカーであるＯＧＮ、ＡＣＡＮと脂肪細胞のバイオマーカーであるＰＰＡＲＧ、Ｌｅｐｔｉｎ、ＡｄｉｐｏＱ、ＦＡＢＰ４遺伝子の発現パターンの変化をアプライドバイオシステム社のタックマン遺伝子発現システム（ＴａｑＭａｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）（ＯＧＮ遺伝子プライマー：Ｈｓ００２４７９０１＿ｍ１、ＡＣＡＮ遺伝子プライマー：Ｈｓ００１５３９３６＿ｍ１、ＰＰＡＲＧ遺伝子プライマー：Ｈｓ０１１１５５１３＿ｍ１、Ｌｅｐｔｉｎ遺伝子プライマー：Ｈｓ００１７４８７７＿ｍ１、ＡｄｉｐｏＱ遺伝子プライマー：Ｈｓ００６０５９１７＿ｍ１、ＦＡＢＰ４遺伝子プライマー：Ｈｓ０１０８６１７７＿ｍ１）を用いて評価し、その結果を図３及び図４に示した。分離したヒト真皮由来成体幹細胞の各遺伝子の発現量が、ヒト皮膚線維芽細胞に比べて、約２倍以上も増加したことを確認した。このような増加は、統計的に有意であり、統計は両側スチューデントのｔ検定にて検証し、ｐ値が０．０５以下のときに有意な差異があると表示した。
【００８２】
［実施例６］分離したヒト真皮由来成体幹細胞から特異的に分泌する成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）の選定
分離したヒト真皮由来成体幹細胞から培養液に分泌する成長因子の発現様相を把握するために、成長因子アレイ（Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｒｒａｙ、Ｒａｙｂｉｏ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ、ＵＳＡ）を実施した。
【００８３】
分離したヒト真皮由来成体幹細胞及びヒト皮膚線維芽細胞は、６ウェル培養皿でそれぞれ２０×１０４個ずつ培養した後、培養液を収穫して成長因子アレイを実施した。２ｍｌの遮断バッファーを室温で３０分処理した後、１ｍｌの培養液を室温で２時間処理した。次いで、２ｍｌの洗浄バッファーで５分間５回洗浄し、ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）が結合された抗成長因子（ａｎｔｉ−ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）抗体で室温で２時間反応させる。さらに、２ｍｌの洗浄バッファーで５分間５回洗浄し、ＨＲＰが結合したストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ）２ｍｌを処理して２時間反応し、洗浄バッファーで洗浄してから検出（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）バッファーで反応させ、ＬＡＳ−３０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）機器で現像した。
【００８４】
全４１種の成長因子に関して、ヒト真皮由来成体幹細胞の培養液とヒト皮膚線維芽細胞の培養液とを比較しつつ分析してみたとき、ヒト真皮由来成体幹細胞の培養液において成長因子のＥＧＦ、ＦＧＦ４、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＶＥＧＦ  Ｒ２、ＶＥＧＦ  Ｒ３、ＶＥＧＦ  Ｄが１０％以上増加したことが観察された（図５）。特に、ＥＧＦ及びＦＧＦ４は、角質と線維芽細胞の成長に重要な成長因子であって、本発明において発掘したヒト真皮由来成体幹細胞が老化または損傷された真皮層の傷治癒といった回復に役立つことが予測される。また、ＶＥＧＦ  Ｒ２、ＶＥＧＦ  Ｒ３、ＶＥＧＦ  Ｄは、血管生成を誘導する重要な成長因子であって、本発明において発掘したヒト真皮由来成体幹細胞が真皮層へ毛細血管を成長または移動させることで、血液による栄養供給を滑らかにする役割を果たし得ることを提示している（図６、図７）。
【００８５】
このような増加は、統計的に有意であり、統計は両側スチューデントのｔ検定にて検証し、ｐ値が０．０５以下のときに有意な差異があると表示した。
【００８６】
本発明の属する分野における通常の知識を有する者であれば、前記内容を基に本発明の範疇内で種々の応用及び変形を行うことが可能であろう。
【００８７】
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとってかかる具体的な記述は、単に好適な具現例に過ぎず、本発明の範囲がこれらに制限されるものではないことは明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲及びその等価物によって定義されるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明に係るヒトの皮膚真皮由来成体幹細胞、前記幹細胞から分化された骨芽細胞または前記幹細胞から分化した脂肪細胞を含む組成物は、骨生成用または脂肪生成用組成物として用いることができる。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図１】
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【図６】
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【国際調査報告】
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