(57)【要約】  短鎖核酸分子からの長鎖核酸分子の大規模、低コスト及び高効率合成方法であって、1)短鎖核酸分子断片の合成;2)終点の化学修飾:長鎖核酸分子の末端位置で小断片核酸分子の終点の化学修飾を実施し、それを「配列の精製」と呼ぶ;3)短鎖核酸分子断片の連結:表面上に化学基及び/又は生体分子を有するバルク固体を調製し、ステップ2で得た精製配列の溶液にバルク固体を加えてインキュベートし、その結果精製配列が固体の表面上に固定化され、溶液中でのバルク固体とステップ1で得た小断片核酸分子の相補対形成を介してギャップを有する二本鎖が形成され、完全な長鎖核酸分子が接合酵素の存在下で形成される;4)精製:バルク固体を単離しすすぐ;並びに5)核酸増幅技法を使用することによる、バルク固体の表面上に固定化された標的長鎖核酸分子の増幅を含む方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
短鎖オリゴヌクレオチドの組み立てを介した長鎖核酸分子の大規模、低コスト及び効率的な合成方法であって、
1)短鎖核酸分子を設計及び合成するステップであって、効率的で低コストで各々の一本鎖短鎖核酸分子が合成可能であるように、組み立てる長鎖ヌクレオチド配列を二本鎖短鎖核酸分子の群に分割するステップ、
2)「精製オリゴヌクレオチド」と呼ぶ化学基で一つ又は二つの短鎖オリゴヌクレオチドを修飾するステップであって、化学基を有するこれらの短鎖オリゴヌクレオチドを固体粒子に固定化するステップ、
3)短鎖オリゴヌクレオチドを組み立てて長鎖ヌクレオチド配列にするステップであって、ステップ1及びステップ2で得た一本鎖短鎖オリゴヌクレオチドを溶液中で混合して粘着性ギャップを有する二本鎖核酸分子を形成し、その結果これらのギャップをリガーゼの作用で連結させて完全な二本鎖長鎖ヌクレオチド配列を形成するステップ、
4)組み立てた長鎖ヌクレオチド配列を精製するステップであって、固体粒子が化学基で修飾されており、その結果「精製オリゴヌクレオチド」がこれらの固体粒子に固定化可能であり、ステップ3で得た長鎖核酸分子を固体粒子とインキュベートし、次いでバッファーで洗浄するステップ、
5)固体粒子に固定化した核酸分子をPCRなどの増幅法の使用によって増幅する増幅ステップ、
6)精製又は増幅用に設計することができる組み立てた長鎖核酸分子の5'又は3'末端を必要な場合酵素の使用により除去する酵素的切断ステップ(任意選択ステップ)、
を含む方法。
【請求項２】
短鎖オリゴヌクレオチドの組み立てを介した長鎖核酸分子の大規模、低コスト及び効率的な合成方法であって、
1)短鎖核酸分子を設計及び合成するステップであって、効率的に低コストで各々の一本鎖短鎖核酸分子が合成可能であるように、組み立てる長鎖ヌクレオチド配列を二本鎖短鎖核酸分子の群に分割するステップ、
2)「精製オリゴヌクレオチド」と呼ぶ化学基で一つ又は二つの短鎖オリゴヌクレオチドを修飾するステップであって、化学基を有するこれらの短鎖オリゴヌクレオチドを固体粒子に固定化するステップ、
3)短鎖オリゴヌクレオチドを組み立てて長鎖ヌクレオチド配列にするステップであって、固体粒子が化学基で修飾されており、その結果「精製オリゴヌクレオチド」がこれらの固体粒子に固定化可能であり、ステップ1で得た一本鎖短鎖オリゴヌクレオチドを、精製オリゴヌクレオチドを固定化した固体粒子と溶液中でインキュベートして粘着性ギャップを有する二本鎖核酸分子を形成し、その結果これらのギャップをリガーゼの作用で連結させて完全な二本鎖長鎖ヌクレオチド配列を形成することが可能であるステップ、
4)組み立てた長鎖ヌクレオチド配列を精製するステップであって、固体粒子が化学基で修飾されており、その結果「精製オリゴヌクレオチド」がこれらの固体粒子に固定化可能であり、ステップ3で得た長鎖核酸分子を固体粒子とインキュベートし、次いでバッファーですすぐステップ、
5)固体粒子に固定化した核酸分子をPCRなどの増幅法の使用によって増幅する増幅ステップ、
6)であって、精製又は増幅用に設計することができる組み立てた長鎖核酸分子の5'又は3'末端を必要な場合酵素の使用により除去する酵素的切断ステップ(任意選択ステップ)
を含む方法。
【請求項３】
長鎖ヌクレオチド配列が、それ自体で合成されると予想されるヌクレオチド配列である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
長鎖ヌクレオチド配列が、合成されると予想されるヌクレオチド配列、並びにPCRプライマー配列及びオリゴヌクレオチドを含有する2つの隣接配列から構成される、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項５】
転写-逆転写ステップをステップ4とステップ5の間に実施することができる、請求項1から4のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
増幅ステップ(ステップ5)後に追加的精製を実施することができる、請求項1から5のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
組み立てる長鎖ヌクレオチド配列を二本鎖短鎖核酸分子の群に分割し、二本鎖ヌクレオチド配列中の分割地点が少なくとも3ヌクレオチド、好ましくは少なくとも5ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも7ヌクレオチド、又は最も好ましくは少なくとも9ヌクレオチド互いにシフトした、請求項1から6のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
固体粒子が、磁性材料、珪素、二酸化珪素、セラミックス、ポリマー、シリカ又はガラスを含むがそれだけには限られない、請求項1から7のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
精製オリゴヌクレオチドがビオチンで修飾可能であり、固体粒子がストレプトアビジンで修飾されている、請求項1から8のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
精製オリゴヌクレオチドがアミノ基で修飾されていてもよく固体粒子がカルボキシル基で修飾されており、又は精製オリゴヌクレオチドがアジド基で修飾されていてもよく固体粒子がアルキン基で修飾されており、逆の場合も同じである、請求項1から9のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
リガーゼがT4DNAリガーゼ又はTaqリガーゼのいずれか、又はこれらの任意の誘導体である、請求項1から10のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
長鎖ヌクレオチド配列が少なくとも700ヌクレオチドを含み、各々の短鎖核酸分子が150を超えず、又は長鎖ヌクレオチド配列が少なくとも1000ヌクレオチドを含み、各々の短鎖核酸分子が200を超えない、請求項1から11のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
短鎖オリゴヌクレオチドの組み立てを介した長鎖核酸分子の大規模、低コスト及び効率的な合成方法であって、
1)短鎖核酸分子を設計及び合成するステップであって、効率的に低コストで各々の一本鎖短鎖核酸分子が合成可能であるように、組み立てる長鎖ヌクレオチド配列を二本鎖短鎖核酸分子の群に分割するステップ、
2)短鎖オリゴヌクレオチドを組み立てて長鎖ヌクレオチド配列にするステップであって、ステップ1で得た一本鎖短鎖オリゴヌクレオチドを溶液中で混合して粘着性ギャップを有する二本鎖核酸分子を形成し、その結果これらのギャップをリガーゼの作用で連結させて完全な二本鎖長鎖ヌクレオチド配列を形成することが可能であるステップ、
3)組み立てた長鎖ヌクレオチド配列を精製するステップであって、従来型HPLC、PAGE、キャピラリー電気泳動又はゲル電気泳動法を使用することにより、組み立てた核酸分子を精製することができるステップ、
4)固体粒子に固定化した核酸分子をPCRなどの増幅法の使用によって増幅する増幅ステップ
を含む方法。
【請求項１４】
転写-逆転写ステップをステップ3とステップ4の間に実施することができる、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
増幅ステップ(ステップ4)後に追加的精製を実施することができる、請求項13または14に記載の方法。
【請求項１６】
組み立てる長鎖ヌクレオチド配列を二本鎖短鎖核酸分子の群に分割し、二本鎖ヌクレオチド配列中の分割地点が少なくとも3ヌクレオチド、好ましくは少なくとも5ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも7ヌクレオチド、又は最も好ましくは少なくとも9ヌクレオチド互いにシフトした、請求項13から15のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
リガーゼがT4DNAリガーゼ又はTaqリガーゼのいずれか、又はこれらの任意の誘導体である、請求項13から16のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
長鎖ヌクレオチド配列が少なくとも700ヌクレオチドを含み、各々の短鎖核酸分子が150を超えず、又は長鎖ヌクレオチド配列が少なくとも1000ヌクレオチドを含み、各々の短鎖核酸分子が200を超えない、請求項13から17のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分子の合成手法、特に、短鎖オリゴヌクレオチドの組み立てを介して長鎖核酸分子を生成するための、大規模、低コスト及び効率的な合成法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、合成生物学は急速に発展した。バイオエネルギー又は医薬品と関係がある多くの中間体は、合成バイオテクノロジーの使用により、細菌又は細胞代謝プロセスを変えることにより得ることができる。例えば2006年に、科学者達は遺伝子操作した酵母を使用して、アルテミシニン中間体を合成し、収率を増大させ115mg/mLに達した。2009年にChurchのグループは、一組のオリゴヌクレオチドを導入してそのゲノムを修飾することにより、大腸菌(E.coli)の進化を助長してリコペンの収率を五倍増大させた。
【０００３】
より一層興味深いのは、科学者達が完全なゲノムを合成し始め、したがって新たな生命体の形を構築することである。2008年、科学者達は582kb長のマイコプラズマゲニタリウム(Mycoplasma Genitalium)のゲノムを初めて合成した。2010年、科学者達は修飾されたゲノム(百万塩基対)を組み立て、細菌に移植して自己複製マイコプラズマミコイデス(Mycoplasma Mycoides)を生成した。これらの結果は、近い将来、科学者達が彼らの希望に完全に従い、生命体を再成形することを示す。
【０００４】
合成生物学の発展を急速に誘導した重要なポイントの一つは、遺伝子合成技術の成熟である。特に近年では、DNAマイクロアレイ技術によって遺伝子の大規模な合成が可能になる。現在、一つのマイクロアレイは数百万のオリゴヌクレオチドを合成することができる。しかしながら、これらのオリゴヌクレオチドの長さは一般に60bpと200bpの間の範囲にある。どのようにこれらのオリゴヌクレオチドを組み立てて(1kbを超える長さなどの)十分な長さを有する遺伝子にするか、特にどのように数千の長鎖遺伝子を効率良く得るかは、現在合成生物学の分野において挑戦すべき課題である。
【０００５】
この問題を解決するための二つの戦略が存在する。第一に、各オリゴヌクレオチドの長さを増大するために、合成の改善、又は新たな手法の開発を継続することができる。第二は、平行して数百万個の短鎖オリゴヌクレオチドを組み立てて長鎖遺伝子にするための、効率的な方法の開発である。実際、この二つの戦略を統合することができる可能性は高い。しかしながら、前者の戦略は新たな技術の進歩に依存する。二つの近年の研究は、後者の戦略に基づく開発を例示した。マイクロチップ合成オリゴヌクレオチドの群を選択的に増幅し組み立てること、第一にDNAマイクロチップを作製すること、第二にオリゴヌクレオチドの群を選択的に増幅すること、及び第三に増幅したオリゴヌクレオチドを組み立てて長鎖ヌクレオチド配列にすること、並びにより長鎖のヌクレオチド配列に関して第2及び第3のステップを反復することによって、Churchは47遺伝子(合計:35kb)の合成を実現した。第一にマイクロアレイを幾つかの物理的単位に分割し、次いで平行した合成、増幅及び組み立てを実施することによって、Jindong Tianのグループも74遺伝子(合計:30kb)の合成を実現した。しかしながら、数千個の遺伝子を段階的に実現しなければならないので、Church又はTianのいずれの研究にも合成スループットの制約がある。さらに、これらの方法は非常に高いコストを有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、平行して数千個のオリゴヌクレオチドを組み立てて（アセンブルして）複数のヌクレオチド配列にするための、簡潔でより実現可能な合成法を提案する。
【０００７】
本発明の目的は、前述の問題を解決すること、及びオリゴヌクレオチドを組み立てて長鎖核酸分子にするための新規な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、いわゆる連結精製増幅(LPA)技術、即ち、第一にオリゴヌクレオチド断片(30bp〜200bp)の組み立てによって少なくとも500bp〜1kbpの長さを有するヌクレオチド配列を生成し、第二に精製し、次いで組み立てたヌクレオチド配列を増幅する技術を使用する。この技術はオリゴヌクレオチドの組み立て、精製及び増幅において容易に効率良く使用することができ、これはランダムに組み立てられた産物、不完全に結合した産物又はミスマッチ産物を排除し、したがって同時に3以上のヌクレオチド配列の組み立て及び増幅を実現する。精製を簡潔にするため、本発明は固相連結精製法を取り入れる。即ち、核酸分子をビーズ又は他の固体粒子の表面上に固定して、連結反応から得た産物を迅速且つ簡潔に精製する。
【０００９】
本発明において、用語「ヌクレオチド配列」、「オリゴヌクレオチド」、「オリゴマー」又は「核酸分子」は、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)及びそれらの誘導体など、又はハイブリッドを指す。
【００１０】
「固定化された」(固定化する)は、化学基(例えば、アミノ-NH2)を有する核酸分子と化学基(カルボキシル-COOHなど)を有する固形体の間の共有結合の形成により固形物と核酸分子が密接に結合するプロセスを指し、又は核酸分子と固形体の間、ビオチン分子を有する核酸分子とアビジン若しくはストレプトアビジンを有する固形体の間などでの、非共有結合の形成により、ただし高いアフィニティーで、固形物と核酸分子が密接に結合するプロセスを指す。
【００１１】
核酸増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、転写、等温増幅などを含むがそれだけには限られない、オリゴヌクレオチドを鋳型として使用し直線的又は非直線的に増幅した任意の方法を指す。
【００１２】
in vitro DNA増幅技法としても知られる「ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)」は、変性、アニーリング及び延長の3ステップを含む。
【００１３】
本発明が用いる技術的解決手段を以下に示す。
【００１４】
本発明の方法は、長鎖核酸分子の大規模な合成、即ち、第一に短鎖オリゴヌクレオチドを合成すること、及び次いでこれらの短鎖オリゴヌクレオチドを組み立てて長鎖ヌクレオチド配列にすることを実現することを目的とする。前記長鎖ヌクレオチド配列は短鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも2倍の長さである、
その方法は以下のステップを含む:
1)短鎖核酸分子を設計及び合成するステップ:効率的に低コストで各々の一本鎖短鎖核酸分子が合成可能であるように、組み立てる長鎖ヌクレオチド配列を二本鎖短鎖核酸分子の群に分割する。各々の一本鎖短鎖核酸分子を合成する方法は十分確立しており、コストが非常に低いからである。例えば、60bp長を有する百万個のオリゴヌクレオチドは、米国ドル単位でわずか数百ドルのコストである。即ち、各々の塩基は0.01ドル未満である。
【００１５】
2)「精製オリゴヌクレオチド」と呼ぶ化学基で一つ又は一つの短鎖オリゴヌクレオチドを修飾するステップ。化学基を有するこれらの短鎖オリゴヌクレオチドを固体粒子に固定化する。
【００１６】
3)短鎖オリゴヌクレオチドを組み立てて長鎖ヌクレオチド配列にするステップ:ステップ1及びステップ2で得た一本鎖短鎖オリゴヌクレオチドを溶液中で混合して粘着性ギャップを有する二本鎖核酸分子を形成し、その結果これらのギャップをリガーゼの作用で連結させて完全な二本鎖長鎖ヌクレオチド配列を形成することが可能である。
【００１７】
4)組み立てた長鎖ヌクレオチド配列を精製するステップ。固体粒子が化学基で修飾されており、その結果「精製オリゴヌクレオチド」はこれらの固体粒子に固定化可能である。ステップ3で得た長鎖核酸分子は固体粒子とインキュベートし、次いでバッファーですすぐ。
【００１８】
5)増幅ステップ:固体粒子に固定化した核酸分子をPCRなどの増幅法の使用によって増幅することができる。
【００１９】
6)酵素的切断ステップ(任意選択ステップ)。精製又は増幅用に設計することができる組み立てた長鎖核酸分子の5'又は3'末端は、必要な場合酵素の使用により除去することができる。
【００２０】
従来の方法に優る本発明の利点は、増幅前に組み立てた核酸分子を精製することにある。DNA塩基間の対のミスマッチが原因で、組み立てた長鎖核酸分子は、ランダムに組み立てられた産物、不完全に連結した産物又はミスマッチ産物を含有する可能性がある。精製なしで組み立てステップ後に増幅ステップを実施する場合、より多量の副産物が生成し、したがって多量の原材料を浪費するだけでなく、分離の難度及びコストも大幅に増す。しかしながら、本発明より前に、当技術分野では技術上の偏見があり、研究者には、合成長鎖オリゴヌクレオチドが精製なしで直ぐに増幅されたという固定された考えがあった。したがって彼らは、予想した長鎖核酸分子は少量であり、ただし高コストであったことを後に発見した。
【００２１】
本発明者らは、該研究における制約を考慮に入れている。合成長鎖核酸分子を増幅前に精製したところ、驚くべきことにランダムに組み立てられた産物、不完全に結合した産物又はミスマッチ産物を含めた予想外の核酸分子が劇的に減少し、したがって予想長鎖核酸分子の収率が増大したことが判明した。前述の固体粒子ベースの精製法以外に、従来型HPLC、PAGE、キャピラリー電気泳動又はゲル電気泳動法を使用することにより核酸分子を精製することができる。
【００２２】
ステップ1中のいわゆる「長鎖ヌクレオチド配列」が予想されるヌクレオチド配列それ自体である場合、ステップ6は省略することが可能である。或いは、ステップ1中のいわゆる「長鎖ヌクレオチド配列」が、PCRプライマー配列とオリゴヌクレオチドを含有する予想ヌクレオチド配列及び二つの隣接配列から構成される場合、ステップ6は省略することが可能である。この設計の利点は、同じ配列を使用して、ステップ4又はステップ5中で全ての組み立てた長鎖オリゴヌクレオチドを精製及び増幅することである。
【００２３】
好ましくは、精製ステップは、増幅産物の精度を高めるため、又はコストを低減するために、転写ステップをさらに含むことができる。
【００２４】
いわゆる「組み立てる長鎖ヌクレオチド配列を二本鎖短鎖核酸分子の群に分割する」ステップ1では、二本鎖ヌクレオチド配列中の分割地点は少なくとも3ヌクレオチド、好ましくは少なくとも5ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも7ヌクレオチド、又は最も好ましくは少なくとも9ヌクレオチド互いにシフトした（移動した）。移動距離が長くなるほど、ミスマッチの確率は低くなり、したがって合成の精度は高まる。
【００２５】
好ましくは、長鎖ヌクレオチド配列は少なくとも700ヌクレオチドを含み、各々の短鎖核酸分子は150を超えず、又は長鎖ヌクレオチド配列は少なくとも1000ヌクレオチドを含み、各々の短鎖核酸分子は100を超えない。従来法を使用することによって、200ヌクレオチドを超えない長さを有するオリゴマーを合成することは安価で通常のことであり、一方で、最大700、1000以上のヌクレオチド(nt)のオリゴマーを得ることは依然として挑戦すべき課題である。しかしながら、本発明では、短鎖核酸分子を組み立てることにより、700、1000以上のヌクレオチドの長さを有するオリゴマーを合成することは容易な作業となる。
【００２６】
好ましくは、固体粒子は、磁性材料、珪素、二酸化珪素、セラミックス、ポリマー、シリカ又はガラスを含むがそれだけには限られない。実際、任意の知られている固体材料は、その表面を化学的に修飾することができる限り、有機体又は基の結合を使用することができる。
【００２７】
好ましくは、精製オリゴヌクレオチドはビオチンで修飾可能であり、固体粒子はストレプトアビジンで修飾されており、又は精製オリゴヌクレオチドがアミノ基で修飾可能であり固体粒子がカルボキシル基で修飾されており、又は精製オリゴヌクレオチドがアジド基で修飾可能であり固体粒子がアルキン基で修飾されており、逆の場合も同じである。
【００２８】
好ましくは、リガーゼはT4DNAリガーゼ又はTaqリガーゼであってよい。
【００２９】
本発明によって生じる技術効果は非常に有意で興奮するものである。現在まで、(200ヌクレオチド未満の)短鎖核酸分子の合成は容易でありコストが低く、一方で長い核酸分子を得るためのコストは劇的に増大する。研究者らは、一定長の遺伝子を得るための異なる戦略を開発しているが(例えばJindong Tian及び同僚は、合計約30kbの物理的分離によって74の個々の遺伝子を得た)、スループット能力は依然として複雑性とコストの制約に曝される。本発明は、増幅前の精製を利用するため、平行した数百個のヌクレオチド配列の連結、精製及び増幅の実施が実現可能となる。さらにより重要なことに、本発明はコスト及び操作の複雑性を増大させず、したがって大規模レベルで長鎖ヌクレオチド配列を実現する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】複数のオリゴヌクレオチドの合成法を示す概略図である。それは主に、それぞれA、B、及びC中に示すような、3個のステップ、連結、精製及び増幅からなる。A)一組のオリゴマーを混合させリン酸化で処理した。連結産物の精製を容易にするため、オリゴヌクレオチドの一つは5'末端をビオチンで修飾した。これらの短鎖オリゴマーにアニーリング、及び次いでT4リガーゼ又はTaqリガーゼの作用において連結を施し、二本鎖ヌクレオチド配列を最終的に形成した。B)ストレプトアビジンで修飾した磁気ビーズを加え、基質、不完全に結合した産物又はミスマッチ産物を除去した。C)精製産物はPCR又は他の増幅法の使用によって増幅することが可能である。
【図２】単一の554bpDNA分子の合成の図である。25〜59ヌクレオチド長を有する一組の核酸分子(17)、リンカー配列(1及び2)並びに精製オリゴヌクレオチド(表1)を得て、図1において記載した3個のステップの後に操作を施した。単一の554bpDNA分子を合成し、これはクローニング及び配列決定によって確認した。記すべきは、各々の核酸分子の初期量が0.01fmolほど少ない場合でさえ、予想産物、554bpDNA分子が合成可能であることである。
【図３】単一の731bpDNA分子の合成の図である。25〜60ヌクレオチド長を有する一組の核酸分子(23)、リンカー配列(1及び2)並びに精製オリゴヌクレオチド(表2)を得て、図1において記載した3個のステップの後に操作を施した。単一の731bpDNA分子を合成し、これはクローニング及び配列決定によって確認した。記すべきは、各々の核酸分子の初期量が0.01fmolほど少ない場合でさえ、予想産物、731bpDNA分子が合成可能であることである。
【図４】単一の1026bpDNA分子の合成の図である。25〜60ヌクレオチド長を有する一組の核酸分子(33)、リンカー配列(1及び2)並びに精製オリゴヌクレオチド(表3)を得て、図1において記載した3個のステップの後に操作を施した。単一の1026bpDNA分子を合成し、これはクローニング及び配列決定によって確認した。
【図５】干渉オリゴヌクレオチドの不在下での単一の554bpDNA分子の合成の図である。25〜59ヌクレオチド長を有する一組の核酸分子(17)、リンカー配列(1及び2)、精製オリゴヌクレオチド(表1)、並びに一組の干渉オリゴヌクレオチド(12)(表4)を得て、図1において記載した3個のステップの後に操作を施した。単一の554bpDNA分子を合成し、これはクローニング及び配列決定によって確認した。
【図６】干渉オリゴヌクレオチドの不在下での単一の731bpDNA分子の合成の図である。25〜59ヌクレオチド長を有する一組の核酸分子(23)、リンカー配列(1及び2)、精製オリゴヌクレオチド(表2)、並びに一組の干渉オリゴヌクレオチド(6)(表5)を得て、図1において記載した3個のステップの後に操作を施した。単一の731bpDNA分子を合成し、これはクローニング及び配列決定によって確認した。
【図７】干渉オリゴヌクレオチドの不在下での単一の1026bpDNA分子の合成の図である。25〜60ヌクレオチド長を有する一組の核酸分子(33)、リンカー配列(1及び2)、精製オリゴヌクレオチド(表3)、並びに一組の干渉オリゴヌクレオチド(6)(表3)を得て、図1において記載した3個のステップの後に操作を施した。単一の1026bpDNA分子を合成し、これはクローニング及び配列決定によって確認した。
【図８】干渉オリゴヌクレオチドの不在下での554bp、731bp、又は1026bpDNA分子の合成の図である。25〜60ヌクレオチド長を有する一組の核酸分子(17+23+33=73)、リンカー配列(1及び2)、精製オリゴヌクレオチド(1)、並びに一組の干渉オリゴヌクレオチド(12+6+6=24)(表1〜6)を得て、図1において記載した3個のステップの後に操作を施した。554bp、731bp、又は1026bpを含めた3個のDNA分子をそれぞれ得て、これはクローニング及び配列決定によって確認した。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下の具体的な実施例は本発明を例示し、これらの具体的な実施形態は本発明を制限するものとして理解されず、特定の詳細に対する変更は依然として本発明の範囲内ある。
【００３２】
材料及び方法:
一組のDNAオリゴヌクレオチドを水溶液に溶かし、混合し100fmol/μlの濃度に希釈した。製造要件に従い、T4キナーゼ(ポリヌクレオチドキナーゼ、NEB)を使用することにより、これらのオリゴヌクレオチドにリン酸化を施し、次いで37℃において1時間インキュベートした。リン酸化後、全てのDNAオリゴヌクレオチドを各々1fmolの濃度にさらに希釈した。一方、T1ビーズ(Dynal)は5'末端をビオチンで修飾した精製オリゴヌクレオチドと混合し、室温において15分間インキュベートし、次いでバッファーで三回洗浄した。
【００３３】
リン酸化したDNAオリゴヌクレオチドは、精製オリゴヌクレオチドを固定化したT1ビーズと65℃において2時間インキュベートする。DNAオリゴヌクレオチド間の適切なハイブリダイゼーションを確実にするため、リアクターは220回転/分シェイカーの上部に置く。次いで溶液を室温までゆっくりと冷却し、ビーズは洗浄して過剰なDNAオリゴヌクレオチドを除去した。最後に、T4又はTaqリガーゼを溶液に加え、連結反応が一晩で起こる。
【００３４】
次のステップは、増幅によって連結DNA産物を増大させることである。一般的な方法には、PCR、転写及び他の増幅法がある。又はこれらの方法を、互いに組合せて使用することができる。最後に、増幅産物を精製し、クローニング及び配列決定した。
【００３５】
実施例1〜7の結果(図1〜8中に示す実験結果)によれば、DNAマイクロアレイから得るDNAオリゴヌクレオチドに非常に重要である、0.01fmolなどの低濃度での初期オリゴヌクレオチドの使用によってさえ、予想連結産物を得ることができる。マイクロアレイで合成されるDNAオリゴヌクレオチドの量は、スポット当たり約1fmolである。従来、連結用にこれらのオリゴヌクレオチドを利用するためには、連結前にこれらのDNAオリゴヌクレオチドの増幅が必要である。しかしながら、従来の手法と異なり、本発明者らは、DNAマイクロアレイで合成したこれらのオリゴヌクレオチドを長鎖オリゴヌクレオチドに直接合成することができる。
【００３６】
さらに、図5〜8中の結果は、本発明中に記載する方法が特に強い抗干渉能力を実証したことを示した。表4〜6中に示すように、幾つかの干渉DNAオリゴヌクレオチドをこれらの実験中に加えた。各々の場合、干渉DNAオリゴヌクレオチドは、5個のランダムなヌクレオチド以外は構築するオリゴヌクレオチドの一つと同じ配列を含有し(NはA、T、G、Cのいずれかを表す)、これが短鎖DNAオリゴヌクレオチド間の相補対形成に一連の干渉をもたらす可能性がある。そうであっても本発明者らは、予想遺伝子を得ることが可能である。したがってこれらの結果は、本発明の方法は非常に強い抗干渉能力を有し、長鎖核酸分子の大規模で、高精度な合成に適していることを示した。
【００３７】
（実施例）
[実施例１]
25〜59ヌクレオチド長を有する一組の核酸分子(17)、リンカー配列(1及び2)並びに精製オリゴヌクレオチド(表1)を最初に混合して、次いでリン酸化を施した。アニーリング後、完全な二本鎖をT4リガーゼの作用で形成することができる。その後、ストレプトアビジンで修飾した磁気ビーズを使用して連結産物を精製し、これによって反応基質、不完全に結合した産物又はミスマッチ産物を効率良く除去することができる。最後に、精製産物はPCRなどの核酸増幅法の使用によって増大することが可能であった。
【００３８】
[実施例２]
最初に、磁気ビーズを精製オリゴヌクレオチドと共に15分間インキュベートし、次いでバッファーで三回洗浄する。次いでビーズを他のDNAオリゴヌクレオチドと混合し、実施例1中に記載したのと同じ、連結、精製及び増幅などの実験手順に従い処理した。
【００３９】
[実施例３]
実施例1中に記載したのと同じ実験手順に従い、磁気ビーズのみをガラス粒子、ポリ(メタ)アクリルアミド、ポリ乳酸(PLA)、ポリ乳酸-グリコール酸ポリマー(PLGA)、ポリアクリル酸(PAA)、2-ヒドロキシエチル(メタ)アクリレートを含むポリメタクリル酸、ポリ-N-イソプロピル(メタ)アクリルアミド、酢酸ビニル又はポリプロピレン、又はポリエチレンアミンなどのポリマー粒子に変更した。
【００４０】
[実施例４]
25〜59ヌクレオチド長を有する一組の核酸分子(17)、リンカー配列(1及び2)並びに精製オリゴヌクレオチド(表1)を最初に混合して、次いでリン酸化を施した。アニーリング後、完全な二本鎖をT4リガーゼの作用で形成することができる。その後、産物をHPLCによって精製し、これによって反応基質、不完全に結合した産物又はミスマッチ産物を効率良く除去することができる。最後に、精製産物はPCRなどの核酸増幅法の使用によって増大することが可能であった。
【００４１】
[実施例５]
実施例1中に記載したのと同じ実験手順に従い、HPLC精製のみを変更して、PAGEゲル、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動又は他の精製法を使用した。
【００４２】
[実施例６]
実施例1中に記載したのと同じ実験手順に従い、25〜59ヌクレオチド長を有する一組の核酸分子(17)、リンカー配列(1及び2)並びに精製オリゴヌクレオチド(表1)以外に、12個の干渉オリゴヌクレオチド(表5)を加えた。精製産物にはクローニング及び配列決定を施した。大部分のクローンは正確な配列、554bpを示した。
【００４３】
[実施例７]
実施例6中に記載したのと同じ実験手順に従い、ただし初期核酸分子のみが、25〜59ヌクレオチド長を有する一組の核酸分子(合計73)、リンカー配列(1及び2)、精製オリゴヌクレオチド(1)及び一組の干渉配列(合計24)(表1〜6)を含む。精製産物にはクローニング及び配列決定を施した。554bp、731bp又は1026bpを含む3個の正確な配列を得た。
【００４４】
補足データ
PCRプライマー
フォワードプライマー  TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT
リバースプライマー  AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年4月16日(2014.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明者らは、該研究における制約を考慮に入れている。合成長鎖核酸分子を増幅前に精製したところ、驚くべきことにランダムに組み立てられた産物、不完全に結合した産物又はミスマッチ産物を含めた予想外の核酸分子が劇的に減少し、したがって予想長鎖核酸分子の収率が増大したことが判明した。核酸分子は、慣用の方法、例えばHPLC、PAGE、キャピラリー電気泳動又はゲル電気泳動法等を用いることにより分子の長さに基づいて精製することができる。あるいは、核酸分子は本明細書に記載の本発明の固相分離方法により精製することができる。簡潔に説明すると、アセンブリされた分子の末端に配置される４つの核酸分子のうちの少なくとも１つを化学基または生物分子で修飾する。修飾された核酸分子を「精製配列（純化配列）」という。次にバルク固体を別の種類の化学基または生物分子で修飾し、これによりそれらが精製配列中の化学基または生物分子と反応して共有結合を形成するか高い親和性を有する物理的吸着が可能となることを保証する。片方の末端に精製配列を有する長鎖核酸分子を次に別の種類の化学基または生物分子で修飾されたバルク固体とインキュベートする。化学反応または物理的吸着後、長鎖核酸分子はバルク固体上に固定化され、他の核酸分子は容易に洗い流される。この固相に基づく精製は、その後の増幅工程の精度と効率を高める。もちろん、アセンブリステップをインキュベーションステップの後に行うこともできる。簡潔に説明すると、精製配列を含む核酸分子はと共にインキュベートして、共有結合または親和性の高い物理吸着を形成することができる。次いで他の核酸分子を加え長鎖核酸分子にアセンブリ（組み立）し、バルク固体に固定する。その後、精製ステップを行った。具体的なステップは以下のとおりである。   
長鎖核酸分子の大規模合成については、本明細書に記載の本発明の方法は、短鎖核酸分子の一群を取得するところから始まり、次いでこれらの短鎖核酸分子を長鎖核酸分子へとライゲーションさせる。長鎖核酸分子の長さは、短鎖分子の１つの少なくとも２倍の長さである。この方法は次のステップを含む。1)短鎖核酸分子を設計し合成すること。組み立てる（アセンブリすべき）長鎖ヌクレオチド配列を二本鎖短鎖核酸分子に分割する。長鎖ヌクレオチド配列は、二本鎖ヌクレオチド配列中の互いに少なくとも３〜９ヌクレオチドシフト（移動）している点において分割される。二本鎖短鎖核酸分子の各鎖は市販されているものを取得することができる。2)長鎖ヌクレオチド配列の１つの末端に配置される４つの核酸分子のうちの少なくとも１つを修飾すること。こうした分子を精製配列と呼び、これらは化学基または生物分子で修飾する。3)長鎖核酸分子を合成すること。バルク固体を別の種類の化学基または生物分子で処置し、これによりそれらが精製配列中の化学基または生物分子と反応して共有結合または親和性の高い物理的吸着を形成しうることを保証する。次いでステップ２に記載の末端に改変を有する短鎖分子を処置済のバルク固体とインキュベートし、これらバルク固体上に固定化する。その後、全ての短鎖核酸分子を加え、リガーゼの作用によりバルク固体上の長鎖核酸分子へとさらにアセンブリさせる。4) 精製。バルク固体を洗浄して長鎖核酸分子を精製する。5) 増幅。バルク固体上に固定化された長鎖核酸分子を増幅手法を用いて増幅する。6) カットオフ(任意的ステップ)。酵素消化によりバルク固体から長鎖核酸分子を分離する。   
慣用の精製手法を用いる場合、次のステップを用いることができる。   
長鎖核酸分子の大規模合成については、本明細書に記載の本発明の方法は、短鎖核酸分子の一群を取得するところから始まり、次いでこれらの短鎖核酸分子を長鎖核酸分子へとライゲーションさせる。長鎖核酸分子の長さは、短鎖分子の１つの少なくとも２倍の長さである。この方法は次のステップを含む。1)短鎖核酸分子を合成すること。アセンブルすべき（組み立てる）長鎖ヌクレオチド配列を二本鎖短鎖核酸分子の群に分割する。長鎖ヌクレオチド配列は、二本鎖ヌクレオチド配列中の互いに少なくとも３〜９ヌクレオチドシフトしている点において分割される。二本鎖短鎖核酸分子の各鎖は市販されているものを取得することができる。2)ライゲーション。ステップ１において合成された短鎖核酸分子をアニーリングさせ、アセンブリさせ、リガーゼの作用により二本鎖核酸分子へとライゲーションさせる。3) 精製。ライゲーションさせた核酸分子をHPLC、PAGE、キャピラリー電気泳動、ゲル電気泳動等により精製した。4)増幅。長鎖核酸分子を増幅手法により増幅する。
【国際調査報告】
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