(57)【要約】CD4受容体を標的とする抗原結合部位およびHIVエンベロープを標的とする抗原結合部位の両方を提供するように作り出された融合抗体が、本明細書において開示される。本明細書において開示される融合抗体は、単一特異性抗体と比較して、HIVに対する改善された効力および範囲を提供し、ウイルス耐性に対する高い障壁をさらに提供する。このような融合タンパク質を利用する薬学的製剤および治療方法も開示される。2014502262.tif 000007
2014502262.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD4受容体に結合する第1の抗原結合部位を含み、HIVエンベロープに結合する第2の抗原結合部位と連結されている、融合抗体。
【請求項２】
前記第1の抗原結合部位を提供するインタクトな抗CD4抗体を含み、前記第2の抗原結合部位を提供する抗HIV抗体の抗原結合断片と連結されている、請求項1記載の融合抗体。
【請求項３】
前記第1の抗原結合部位がCD4受容体のD2ドメインに結合する、請求項2記載の融合抗体。
【請求項４】
前記抗CD4抗体がヒト化またはサル化されている、請求項3記載の融合抗体。
【請求項５】
前記抗CD4抗体がイバリズマブまたはそのサル化誘導体である、請求項4記載の融合抗体。
【請求項６】
前記抗CD4抗体が、CD4に対してイバリズマブより高い結合親和性を有する親和性成熟抗体である、請求項2記載の融合抗体。
【請求項７】
前記抗HIV抗体が強力かつ広範囲の中和抗体である、請求項2記載の融合抗体。
【請求項８】
前記抗HIV抗体がHIVエンベロープタンパク質に結合する、請求項7記載の融合抗体。
【請求項９】
前記抗HIV抗体がHIVエンベロープ三量体上にある四次エピトープに結合する、請求項8記載の融合抗体。
【請求項１０】
前記四次エピトープがHIVエンベロープ三量体のV1/V2領域およびV3領域を含む、請求項9記載の融合抗体。
【請求項１１】
前記抗HIV抗体がPG9である、請求項10記載の融合抗体。
【請求項１２】
前記抗HIV抗体がHIV gp120タンパク質におけるCD4誘導性エピトープに結合する、請求項8記載の融合抗体。
【請求項１３】
前記抗HIV抗体がm36である、請求項12記載の融合抗体。
【請求項１４】
前記抗HIV抗体が、前記HIVエンベロープにおけるCD4との結合に関与するエピトープに結合する、請求項8記載の融合抗体。
【請求項１５】
前記抗HIV抗体がVRC01である、請求項14記載の融合抗体。
【請求項１６】
Fc領域が、LALA変異を含有する、ヒトIgG1またはIgG4のFc断片である、請求項1記載の融合抗体。
【請求項１７】
Fc領域が、前記抗体の再利用を改善する1つまたは複数の変異を含むようにさらに改変されている、請求項16記載の融合抗体。
【請求項１８】
HIVに感染した対象を治療する方法であって、治療的有効量の請求項1〜17のいずれか一項記載の融合タンパク質を該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項１９】
HIV感染の予防を必要とする対象においてHIV感染を予防する方法であって、治療的有効量の請求項1〜17のいずれか一項記載の融合タンパク質を該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項２０】
HIV陽性の妊娠対象がHIVウイルスを子供に伝染させるのを予防する方法であって、治療的有効量の請求項1〜17のいずれか一項記載の融合タンパク質を該対象に投与する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2010年11月12日に出願された米国特許仮出願第61/413,178号からの優先権の恩典を請求する。米国特許仮出願第61/413,178号の全ての内容は参照により組み入れられる。
【０００２】
開示の分野
本開示は、概して、CD4受容体のエピトープに結合する抗原結合部位およびHIVエピトープに結合する別の抗原結合部位からなる融合タンパク質に関する。融合タンパク質は、対象におけるHIV感染の治療、患者におけるHIVウイルス量の減少、および/または対象へのHIVの伝染の予防に有用である。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
HIV-1侵入は、ウイルスエンベロープ(Env)糖タンパク質gp120とT細胞受容体CD4のドメイン1(D1)との相互作用によって誘発される。gp120がCD4に結合すると、gp120の大規模なコンホメーション変化が誘導され、gp120タンパク質の中にCD4誘導性(CD4i)エピトープとも知られるコレセプター(coR)結合部位と呼ばれる構造が形成し、曝露される(Moore et al., Proc Natl Acad Sci USA 100 (19): 10598-602, 2003（非特許文献1）)。gp120のブリッジングシートは、異なるクレードに由来する遺伝的に多様なHIV-1分離株にわたって高度に保存されているcoR結合部位の重要な成分である(Huang et al., Proc Natl Acad Sci USA 101 (9):2706-11, 2004（非特許文献2）)。典型的に、coR結合部位は、(CD4に結合していない)遊離gp120上では形成されない。CD4への結合を介してウイルスが標的細胞に付着した後に、coR結合部位が形成される。ブリッジングシートは高免疫原性であり、インビボでは、CD4誘導性(CD4i)抗体として知られる抗体クラスを誘発する。しかしながら、ウイルスが細胞に侵入している間、ほぼ間違いなく、大きなサイズのAbが、ブリッジングシートがあるgp120の中の非常に狭い小さなくぼみに到達できないという理由で、CD4iエピトープ(ブリッジングシート)へのフルサイズAbの到達は立体的に制限される。従って、最も知られているフルサイズCD4i Abは強力な抗ウイルス活性を有さない。サイズがより小さなCD4i Ab断片はウイルス侵入中にCD4iエピトープに到達できる可能性がある。例えば、FabおよびscFvとして知られる、公知のCD4i Abの2種類のAb断片は、フルサイズAbより強力にHIV侵入を有意に阻害することが示されている(Labrijn et al., J. Virol. 77: 10557-10565, 2003（非特許文献3）)。
【０００４】
イバリズマブ(iMab)は強力かつ広範囲のHIV-1中和Abである(Jacobson et al., Antimicrob. Agents Chemother. 53:450-457, 2009（非特許文献4）; Kuritzkes et al., J. Infect. Dis. 189:286-291, 2004（非特許文献5）)。iMabは、主に、宿主T細胞上にあるCD4受容体ドメイン2(D2)に結合し、従って、HIVがこれらのCD4受容体を利用してT細胞に侵入して、感染する能力を防ぐことによってHIVを中和する(Burkly et al., J. Immunol. 149: 1779-178,1992（非特許文献6）)。最近試験された一次分離株(100種類超のウイルス)の大きなパネルにおいて、iMabは、50％感染阻害によって規定され時に全ウイルスの92％、90％感染阻害によって規定され時にウイルスの47.4％を中和した(図1)。これらのデータは有望ではあるが、iMabの効力および範囲をさらに改善する必要が依然としてあることを示している。
【０００５】
HIV Env上にあるエピトープを標的とする、いくつかの抗体が報告されている。m36ポリペプチドは、HIV Env上にある、高度に保存されているが、立体的に制限されているCD4iエピトープを標的とするヒト重鎖ドメインAb断片である。m36は、インビトロでCD4i Ab活性を有する強力かつ広範囲の交差反応性HIV-1阻害剤であり、平均IC50は数百ナノモル範囲である(Chen et al., Proc Natl Acad Sci USA 105(44): 17121-6, 2008（非特許文献7）)。しかしながら、他の小型の抗体断片と同様に、m36ポリペプチドは血中半減期が短いと予測されている。長い半減期は、持続性の抗ウイルス活性に重要な指標である。PG9は、HIVエンベロープ三量体の四次エピトープを標的とする別の強力かつ広範囲の抗HIV-1抗体である(Walker et al., Science 326, 285-289(2009)（非特許文献8）)。VRCO1もまた、HIVエンベロープ上のCD4結合部位エピトープを標的とする強力かつ広範囲の抗HIV-1抗体である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Moore et al., Proc Natl Acad Sci USA 100 (19): 10598-602, 2003
【非特許文献２】Huang et al., Proc Natl Acad Sci USA 101 (9):2706-11, 2004
【非特許文献３】Labrijn et al., J. Virol. 77: 10557-10565, 2003
【非特許文献４】Jacobson et al., Antimicrob. Agents Chemother. 53:450-457, 2009
【非特許文献５】Kuritzkes et al., J. Infect. Dis. 189:286-291, 2004
【非特許文献６】Burkly et al., J. Immunol. 149: 1779-178,1992
【非特許文献７】Chen et al., Proc Natl Acad Sci USA 105(44): 17121-6, 2008
【非特許文献８】Walker et al., Science 326, 285-289(2009)
【発明の概要】
【０００７】
開示の概要
CD4受容体を標的とする抗原結合部位およびHIVエンベロープを標的とする抗原結合部位を提供するように作り出された融合抗体が本明細書において開示される。本明細書において開示される融合抗体は、単一特異性抗体と比較して、HIVに対する改善した効力および範囲を提供し、ウイルス耐性に対する高い障壁をさらに提供する。
【０００８】
ある態様において、融合タンパク質は、第1の抗原に対するインタクトなIgG分子(任意のアイソタイプ、すなわち、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4でよい)の重鎖または軽鎖のC末端またはN末端に、第2の抗原に対する第2の抗体の抗原結合ドメインが、リンカーを介してつながっている立体配置をとる。
【０００９】
特定の態様において、融合タンパク質は、抗HIV抗体の抗原結合ドメインと連結された抗CD4抗体からなる。このような融合抗体の例には、m36、PG9scFv、またはVRCO1scFvと連結されたイバリズマブが含まれる。
【００１０】
さらなる態様において、二重特異性融合タンパク質の抗CD4抗体部分は改変されており、CD4に対する改善した親和性を有する融合変種が親和性成熟によって選択されている。
【００１１】
他の態様において、融合タンパク質のFc領域は、(例えば、導入されたLALA変異を介して)改善した安定性および改善した再利用能を含む優れたPKプロファイルを提供するように操作されている。
【００１２】
本明細書において開示される二重特異性融合タンパク質を利用した薬学的製剤および治療方法も開示される。
【００１３】
図面の簡単な説明
この特許書類または出願書類にはカラー図面が含まれる。この特許刊行物または特許出願刊行物とカラー図面のコピーは、請求により、かつ必要な料金を払うことによって特許庁により提供されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Envシュードタイプウイルスの多様なパネルに対するイバリズマブ中和プロファイル。
【図２】iMab-m36融合構築物の模式図。オレンジ色、黄色、および青色は、それぞれ、イバリズマブの可変重鎖、可変軽鎖、および定常鎖を示す。赤色はm36ポリペプチドを示す。
【図３】精製m36、iMab36融合、およびiMabの発現を示すSDS-PAGE。最も左側のレーンはサイズマーカーを含む。
【図４】iMabm36はsCD4に結合する。X軸は、iMab36(ピンク色)、iMab(黒色)、またはm36(緑色)の非標識構築物の漸増レベルを示す。y軸は、HRP標識イバリズマブとsCD4との結合の競合レベルを示す。
【図５】iMab36は、イバリズマブ感受性ウイルスおよびイバリズマブ耐性ウイルスに対して活性があることが示された。iMab感受性ウイルス(左列)またはiMab耐性ウイルス(右の2つの列)を、これらのウイルス活性について中和構築物iMabm36(ピンク色)、iMab(黒色)、またはm36(緑色)の存在下で試験した。
【図６】iMabm36は、iMab単独と比較してiMab耐性ウイルスに対して高い効力を有することが示された。
【図７】m36とiMabとの融合によるm36の細胞表面固定は、その抗ウイルス効力を改善することが示された。
【図８】iMabm36の感受性を、m36に対するiMab耐性ウイルスの感受性によって確かめた。
【図９】iMabm36の抗HIV活性は、そのCD4結合能に依存することが示された。
【図１０】iMabm36融合はインビトロで安定していることが示された。
【図１１】iMabm36融合ペプチドのアミノ酸配列。(A)SEQ ID NO:1:1〜473＝MV1重鎖(SEQ ID NO:2、リーダー配列を構成する最初の19アミノ酸残基)、474〜489＝リンカー(SEQ ID NO:3)、および490〜606＝m36可変重鎖(SEQ ID NO:4)からなる。(B)SEQ ID NO:5:残基1〜19＝リーダー配列(SEQ ID NO:6)、残基20〜131＝MV1可変軽鎖(SEQ ID NO:7)、および残基132〜238＝MV1定常軽鎖(SEQ ID NO:8)からなる。
【図１２】C末端イバリズマブ-PG9二重特異性抗体およびN末端イバリズマブ-PG9二重特異性抗体の模式図。
【図１３】イバリズマブ-PG9融合抗体は、ELISAによってヒトCD4およびgp120に結合することが示された。
【図１４】イバリズマブ-PG9融合抗体はイバリズマブ感受性ウイルスおよびイバリズマブ耐性ウイルスに対して活性があることが見出された。イバリズマブ耐性シュードウイルス(上)およびイバリズマブ感受性シュードウイルス(下)に対するイバリズマブ(左列)およびイバリズマブ-PG9(右列)の中和曲線。それぞれの色付き線は個々のウイルスの中和プロファイルを示す。黒色の破線は50％感染阻害を示す。赤色の線は、イバリズマブ-PG9融合抗体の効力を強調することを目的とした、イバリズマブを用いて観察された最も低いIC50を示す。
【図１５】PG9-イバリズマブ融合ペプチドのアミノ酸配列。(A)SEQ ID NO:9:残基1〜19(紫色)＝シグナルペプチド配列(SEQ ID NO:10)、残基20〜155(黒色)＝PG9可変重鎖配列(SEQ ID NO:11)、残基156〜175(緑色)＝リンカー(SEQ ID NO:12)、残基176〜285(赤色)＝PG9可変軽鎖配列(SEQ ID NO:13)、残基286〜301(青色)＝リンカー(SEQ ID NO:14)、残基302〜423(下線、黒色＝イバリズマブ可変重鎖配列(SEQ ID NO:15)、および残基424〜756(オレンジ色)＝Fc配列(SEQ ID NO:16)からなる。(B)SEQ ID NO:17:残基1〜20＝シグナルペプチド配列(SEQ ID NO:18)、残基21〜133＝イバリズマブ可変軽鎖(SEQ ID NO:19)、および残基134〜236＝イバリズマブ定常軽鎖(SEQ ID NO:20)からなる。
【図１６】C末端イバリズマブ-VRCO1二重特異性抗体およびN末端イバリズマブ-VRCO1二重特異性抗体の模式図。
【図１７】イバリズマブ-VRCO1融合抗体はELISAによってヒトCD4およびgp120に結合することが示された。
【図１８】イバリズマブ-VRCO1融合抗体はイバリズマブ耐性ウイルス対して活性があることが見出された。イバリズマブ耐性シュードウイルスに対するイバリズマブ(左列)およびイバリズマブ-VRCO1(右列)の中和曲線。それぞれの色付き線は個々のウイルスの中和プロファイルを示す。黒色の破線は100％感染阻害を示す。
【図１９】VRCO1-イバリズマブ融合ペプチドのアミノ酸配列。(A)SEQ ID NO:21:残基1〜121(黒色)＝VRCO1可変重鎖配列(SEQ ID NO:22)、残基122〜141(緑色)＝リンカー(SEQ ID NO:23)、残基142〜245(赤色)＝VRCO1可変軽鎖配列(SEQ ID NO:24)、残基246〜255(青色)＝リンカー(SEQ ID NO:23)、残基256〜387(下線、黒色)＝イバリズマブ可変重鎖配列(SEQ ID NO:15)、および残基388〜720(オレンジ色)＝Fc配列(SEQ ID NO:16)からなる。(B)SEQ ID NO:17:残基1〜20＝シグナルペプチド配列(SEQ ID NO:18)、残基21〜133＝イバリズマブ可変軽鎖(SEQ ID NO:19)、および残基134〜236(イバリズマブ定常軽鎖)(SEQ ID NO:20)からなる。
【図２０】最大パーセント阻害(MPI灰色)およびIC50(赤色)によって示された、118種類のHIV分離株のパネルに対するイバリズマブおよび3種類の二重特異性融合抗体のHIV中和特性。
【図２１】選択された二重特異性構築物の抗ウイルス範囲および効力とこれらの親mAbとの比較。
【図２２】最も右側の列におけるPG9-iMab融合構築物の高い効力。赤色のバーは、試験された全ウイルスのIC50中央値±四分位数間範囲を示す。
【図２３】サルにおけるイバリズマブ-G1LALAの安定性はオリジナルのイバリズマブより優れていることが示された。
【図２４】ヒトFcRnを導入したトランスジェニックマウスにおけるイバリズマブ428/434変種の改善したPKプロファイル。AbはIgG1-LALAバージョンのイバリズマブを指す。TgはヒトFcRnを導入したトランスジェニックマウスを指すのに対して、Wtは野生型マウスを指す。
【図２５】(A)2段階で、イバリズマブのマウス前駆体である5A8(黄色)をヒト特異的配列(緑色)でヒト化してイバリズマブ(iMab)を作り出し、次いで、イバリズマブ(iMab)をアカゲザル特異的配列(青色)で「サル化」してRhiMabを得た。(B)RhiMabを使用し、(B)scFv融合アプローチを用いて、アカゲザル二重特異性抗体を構築した。追加の抗原結合Fvにあるヒト残基もアカゲザル対応物によって置換されることに留意のこと。
【図２６】(A)アカゲザルイバリズマブ(RhiMab)の軽鎖(SEQ ID NO:25)および重鎖(SEQ ID NO:26)のアミノ酸配列。(B)アカゲザルPG9 scFv(SEQ ID NO:27)のアミノ酸配列:残基1〜137＝重鎖(SEQ ID NO:28)、残基138〜157＝リンカー(SEQ ID NO:12)、および残基158〜267＝軽鎖(SEQ ID NO:29)。
【図２７】「インビトロ親和性成熟」を実施するために使用した方法の図による概要。ここに示した例はCDR-H1に対する変異を対象とするが、他のCDRについては類似の手法を採用した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
CD4受容体(例えば、CD4受容体のドメイン2)を標的とする抗原結合部位と、HIVエンベロープ(例えば、糖タンパク質gp120またはgp41)を標的とする抗原結合部位を両方とも含むように作り出された融合抗体が、単一特異性抗体と比較してHIVに対して改善した効力および範囲を提供することが本発明によって特定されている。このような融合抗体はまたウイルス耐性に対する高い障壁も提供する。本明細書において開示される融合タンパク質の基本構造は、典型的には、第1の抗原に対するIgG分子全体の重鎖または軽鎖のC末端またはN末端に、第2の抗原に対する抗原結合ドメインまたは単鎖抗体(scFv)が、リンカーを介してつながったものである。これらの二重特異性融合抗体の特徴および適用は以下に詳述される。
【００１６】
定義
【００１７】
「抗原」は、1つまたは複数のエピトープを含有し、免疫学的応答を誘発することができる分子を指す。「抗原性分子」もまた、本明細書において開示される融合タンパク質の結合標的である分子を指すために一般的な意味で用いられる。
【００１８】
「エピトープ」は抗原決定基とも知られ、免疫系、すなわち、B細胞、T細胞、または抗体によって認識される抗原性分子の一部である。エピトープはコンホメーションエピトープまたはリニアエピトープでもよい。コンホメーションエピトープは抗原性分子の不連続部分によって形成される、または複数の分子によって形成される。抗原がタンパク質である場合、コンホメーションエピトープは、同じタンパク質分子の不連続アミノ酸残基によって形成されてもよく、タンパク質の異なる分子のアミノ酸残基によって形成されてもよい(例えば、タンパク質多量体によって形成される四次エピトープ)。リニアエピトープは、抗原の連続部分、例えば、タンパク質抗原の連続したアミノ酸配列によって形成される。
【００１９】
「抗体」という用語は本明細書において広範囲に用いられ、インタクトなポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、霊長類化抗体、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、合成抗体、および組換え抗体を含むインタクトな抗体分子、ならびに望ましい活性または機能を有する抗体断片を含む。
【００２０】
「キメラ抗体」という用語は、異なる供給源、例えば、異なる種または異なる抗体クラスもしくはサブクラスに由来するポリペプチドを含有する抗体を指す。キメラ抗体の例には、ヒト免疫グロブリンのFc断片と融合したマウスモノクローナル抗体の抗原結合部分が含まれる。キメラ抗体を作るための方法、例えば、Boss et al.への米国特許第4,816,397号およびCabilly et al.への米国特許第4,816,567号による特許に記載の方法は当技術分野において公知である。
【００２１】
「ヒト化抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリンのバックボーンまたはフレームワークの中に非ヒト配列エレメントを含有する抗体を指す。一般的に、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域(CDR)に由来する残基が、望ましい特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種(ドナー抗体)の超可変領域に由来する残基によって置換されているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基も非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、場合によっては、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られず、抗体の性能をさらに改良するために導入された残基を含有してもよい。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含有し、ここで、超可変領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応し、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域である。ヒト化抗体はまた、任意で、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部も含有する。ヒト化抗体を作るため方法は当技術分野において述べられている。例えば、Winterへの米国特許第5,225,539号およびBoss et al.への米国特許第4,816,397号を参照されたい。
【００２２】
「霊長類化抗体」という用語は、霊長類免疫グロブリンのバックボーンまたはフレームワークの中に非霊長類配列エレメントを含有する抗体を指す。例えば、霊長類化抗体は、レシピエント抗体の超可変領域(CDR)中の残基を、望ましい特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非霊長類種に由来するドナー抗体の超可変領域に由来する残基で置換することによって霊長類免疫グロブリン(レシピエント抗体)から作ることができる。または、非霊長類配列または異なる霊長類種に由来する配列を有するレシピエント免疫グロブリンを使用し、望ましい霊長類に由来するFc断片および/または特にフレームワーク領域残基を含む残基をレシピエント免疫グロブリンに導入することによって、霊長類化抗体を望ましい霊長類種への投与に適したものにすることができる。霊長類化抗体の例には、本明細書中の実施例セクションにおいて開示される「サル化」抗体が含まれる。
【００２３】
「単一特異性抗体」という用語は、1つのエピトープを認識し、これに結合する抗体を指す。
【００２４】
「多特異性抗体」という用語は、少なくとも2つの別々の抗体から形成され、複数の(すなわち、2つ以上の)別々のエピトープに結合する抗体を指す。
【００２５】
前記のように「抗体」という用語はまた、インタクトな抗体の断片、すなわち、特に、インタクトな抗体の抗原結合断片を含む「抗体断片」を含む。抗原結合断片の例には、Fab断片(VL、VH、CL、およびCH1ドメインからなる)、Fab'断片(抗体ヒンジ領域に由来する1つまたは複数のシステインを含む、CH1ドメインのC末端にある数個の追加残基を有することでFab断片とは異なる)、(Fab') 2断片(ヒンジ領域にあるジスルフィド架橋により連結された2つのFab'断片によって形成される)、Fd断片(VHドメインおよびCH1ドメインからなる)、Fv断片(完全な抗原認識・結合部位を含有する、緊密に非共有結合している1つの重鎖可変ドメインおよび1つの軽鎖可変ドメインの二量体を指している)、dAb断片(VHドメインからなる)、シングルドメイン断片(VHドメイン、VLドメイン、VHHドメイン、またはVNARドメイン)、単離されたCDR領域、scFv(または「単鎖Fv」。リンカーを介して連結されて一緒になったVLドメインおよびVHドメインの融合を指している)、ならびに抗原結合機能を保持している他の抗体断片が含まれるが、これに限定されない。
【００２６】
「CDR」または「相補性決定領域」という用語は、抗体の可変ドメインの中にある超可変領域を指す。重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのそれぞれに3つのCDRがあり、抗原結合を担うアミノ酸残基からなる。「フレームワーク領域」または「FR」という用語は、可変ドメインの保存されている部分を指し、超可変領域残基以外の残基からなる。
【００２７】
抗体の「抗原結合部位」という用語は、抗原が結合する抗体のアミノ酸によって形成されるコンホメーションおよび/または立体配置を意味する。例えば、VHドメインおよびVLドメインそれぞれの3つのCDRは相互作用して、VH-VL二量体の表面に抗原結合部位を規定する。6つのCDRは一緒になって抗原結合特異性を抗体に付与する。しかしながら、6つ全てのCDRを有する結合部位全体より有効に結合できない場合が多いが、単一の可変ドメイン(すなわち、VHまたはVL)も抗原を認識および結合できることに留意すべきである。
【００２８】
「中和抗体」という用語は、HIV-1感染を阻害、低減、または完全に予防する抗体を指す。抗体が中和抗体かどうかは、下記の実施例セクションに記載のインビトロアッセイによって確かめることができる。
【００２９】
「強力な中和抗体」という用語は、低濃度で用いられた時に、HIV-1感染を少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％以上、低減する抗体を指す。50μg/ml未満の濃度、1〜50μg/mlの濃度、または1μg/ml未満の濃度でさえも「低濃度」とみなされる。ある態様において、低濃度は、10〜900ng/mlなどのピコモル範囲の濃度であり、この範囲内の任意の濃度、例えば、800ng/ml、700ng/ml、600ng/ml、500ng/ml、400ng/ml、300ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、75ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、10ng/ml、または10ng/ml未満でさえ含む。
【００３０】
「広範囲の中和抗体」という用語は、インビトロでの50％感染阻害によって規定された時に、(100種類を超える)HIV-1エンベロープシュードタイプウイルスおよびウイルス分離株の大きなパネルの50％超、60％、70％、80％、90％、95％、99％以上においてHIV-1感染を阻害する抗体を指す。
【００３１】
本明細書で使用する「断片」という用語は、生体分子の一次構造の物理的に連続した部分を指す。タンパク質の場合、断片は、タンパク質のアミノ酸配列の連続部分によって規定されてもよく、少なくとも3〜5アミノ酸、少なくとも6〜10アミノ酸、少なくとも11〜15アミノ酸、少なくとも16〜24アミノ酸、少なくとも25〜30アミノ酸、少なくとも30〜45アミノ酸、およびタンパク質の完全長から数アミノ酸を除いたものまでであってもよい。例えば、m36断片は117アミノ酸長である。ポリヌクレオチドの場合、断片はポリヌクレオチドの核酸配列の連続部分によって規定され、少なくとも9〜15ヌクレオチド、少なくとも15〜30ヌクレオチド、少なくとも31〜45ヌクレオチド、少なくとも46〜74ヌクレオチド、少なくとも75〜90ヌクレオチド、および少なくとも90〜130ヌクレオチドでもよい。ある態様において、生体分子の断片は免疫原性断片である。
【００３２】
「融合タンパク質」は、リンカーを介して互いにつながっている異なる供給源の2つ以上のペプチドを指す。例えば、融合タンパク質は、抗体と連結されたタンパク質を含んでもよい。他の例には、異なる抗体と連結された抗体またはFab断片と連結された抗体が含まれる。Fab断片は、抗体の重鎖または軽鎖のN末端もしくはC末端、または抗体内の他の領域と連結されてもよい。融合タンパク質および融合構築物という用語は同義に用いられる。
【００３３】
「ペプチド」は、アミド(ペプチド)結合による2個以上のアミノ酸の連結によって形成される任意の化合物、通常、それぞれのアミノ酸残基のα-アミノ基(NH2末端を除く)が直鎖にある次の残基のα-カルボキシル基と連結されているα-アミノ酸重合体である。ペプチド、ポリペプチド、およびポリ(アミノ酸)という用語は、反対のことが示されていない限り、サイズに関して制限無く、このクラスの化合物を指すために本明細書において同義に用いられる。大きなサイズを有する、このクラスのメンバーはタンパク質とも呼ばれ、抗体を含む。
【００３４】
「リンカー」という用語は、あるペプチドと別のペプチドをつなぐ、例えば、ある抗体と別の抗体をつなぐ化学的実体を指す。リンカーはまた、抗体を標識または固体支持体に取り付けるのに使用することもできる。リンカーはアミノ酸を含んでもよい。リンカーは直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和の炭素鎖でもよい。リンカーは鎖内に、または鎖の末端に1つまたは複数のヘテロ原子を含んでもよい。「ヘテロ原子」とは、酸素、窒素、硫黄、リン、ホウ素、およびハロゲンからなる群より選択される炭素以外の原子を意味する。特定の態様において、リンカーはペプチドである。リンカーの使用は、特定の抗体ペアに応じて、有利なまたは必要とされるものでもよく、有利なまたは必要とされるものでなくてもよい。リンカーを抗体に取り付けるための方法および技法は当技術分野において公知である。このテーマに関する論文について、読者はBioconjugate Techniques, G. Hermanson, Academic Press, 1996を参照するように言われる。
【００３５】
CD4およびHIVを標的とする融合抗体
【００３６】
本開示は、CD4受容体を標的とする抗原結合部位およびHIVエンベロープを標的とする別の抗原結合部位を含有する融合抗体に関する。単に2つの異なる抗原に対して特異性を有する融合抗体も本明細書において二重特異性抗体と呼ばれる。さらなる抗原結合部位を含むように二重特異性融合抗体を改変して、他の多特異性抗体を提供することができる。
【００３７】
概して、本明細書において開示される融合タンパク質の構造は、第1の抗原に対するインタクトなIgG分子の重鎖または軽鎖のC末端またはN末端に、第2の抗原に対する第2の抗体の抗原結合断片が、リンカーを介してつながったものからなる。例えば、CD4受容体およびHIVに対して二重特異性を有する融合抗体は、インタクトな抗CD4抗体を抗HIV抗体の抗原結合断片と連結することによって形成することができる。逆に、CD4受容体およびHIVに対して二重特異性を有する融合抗体は、インタクトな抗HIV抗体を抗CD4抗体の抗原結合断片と連結することによって形成することができる。どちらのシナリオでも、二重特異性融合抗体は、CD4受容体上にあるエピトープに結合する抗原結合部位およびHIVエンベロープ上にあるエピトープに結合する別の抗原結合部位を含有する。
【００３８】
抗CD4抗体は当技術分野において説明されており、CD4受容体のタンパク質配列が当業者に入手可能であるので容易に作製することもできる。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーとして、CD4は、細胞の細胞外表面にある4つの免疫グロブリンドメイン(D1〜D4)を有する。CD4はそのD1ドメインを用いて、MHCクラスII分子のβ2ドメインと相互作用する。
【００３９】
ある態様では、主にCD4受容体の2番目の免疫グロブリン様ドメイン(D2)(アミノ酸位置98〜180)に対する抗体が本明細書における二重特異性融合抗体の形成において用いられる。CD4のD2ドメインに対する抗体には、CD4と主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスII分子との相互作用によって媒介される免疫機能を妨げることなくHIV感染を妨ぐという望ましい特性がある。特定の態様において、二重特異性融合の形成において用いられる抗CD4抗体は、CD4受容体のD1-D2接合部付近にあるD2のBCループ(アミノ酸121〜127)に位置するエピトープに結合する。他の態様において、抗CD4抗体は、D2のFGループ(アミノ酸163〜165)およびD1の一部(アミノ酸77〜96)に結合する。融合タンパク質の形成において用いられる抗CD4抗体は、これらの領域、すなわち、D1、D1-D2接合部、D2、D2のBCループもしくはFGループの1つもしくは複数または全て、あるいはその任意の組み合わせに結合することができる。前記のアミノ酸ナンバリングは成熟型受容体の位置に対応し、シグナルペプチドを含まない。ヒトCD4受容体のアミノ酸配列は、GenBankにおいてアクセッション番号AAA16069.1で入手可能であり、SEQ ID NO:34にも示される。SEQ ID NO:34において、アミノ酸1〜25はシグナルペプチドであり、アミノ酸26〜122はD1を構成し、アミノ酸123〜205はD2を構成する。
【００４０】
二重特異性融合抗体の形成における使用に適した抗CD4抗体の具体例は、ヒト化抗CD4モノクローナル抗体であるイバリズマブ(以前はTNX-355、またはhu5A8として知られていた)である。イバリズマブは広範囲のHIV-1分離株による感染を強力に妨げ、CD4と主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスII分子との相互作用によって媒介される免疫機能を妨げることなく、CD4受容体のD1-D2接合部付近にあるD2のBCループに位置するエピトープを標的とする。
【００４１】
抗HIV Env抗体もまた当技術分野において説明されており、当業者によって容易に作製することもできる。env遺伝子は前駆体タンパク質であるgp160をコードする。HIV複製中に、宿主細胞の内因性酵素はgp160を切断してgp120およびgp41にする。3つのgp120分子は、膜貫通タンパク質であるgp41との非共有結合相互作用を介して、ウイルス膜、すなわち、エンベロープに固定される三量体を形成する。gp120がCD4に結合すると、gp120の大規模なコンホメーション変化が誘導され、gp120タンパク質の中にCD4誘導性(CD4i)エピトープとも知られるコレセプター(coR)結合部位と呼ばれる構造が形成し、曝露される(Moore et al., Proc Natl Acad Sci USA 100(19): 10598-602, 2003)。gp120のブリッジングシートは、異なるクレードに由来する遺伝的に多様なHIV-1分離株にわたって高度に保存されているcoR結合部位の重要な成分である(Huang et al.,  Proc Natl Acad Sci USA 101 (9):2706-11, 2004)。典型的に、coR結合部位は、(CD4に結合していない)遊離gp120上で形成されない。CD4への結合を介してウイルスが標的細胞に付着した後に、coR結合部位が形成される。ブリッジングシートは高免疫原性であり、インビボでは、CD4誘導性(CD4i)抗体として知られる抗体クラスを誘発する。しかしながら、ウイルスが細胞に侵入している間、ほぼ間違いなく、大きなサイズのAbが、ブリッジングシートがあるgp120の中の非常に狭い小さなくぼみに到達できないという理由で、CD4iエピトープ(ブリッジングシート)へのフルサイズAbの到達は立体的に制限される。サイズがより小さなCD4i Ab断片はウイルス侵入中にCD4iエピトープに到達できる可能性がある。例えば、FabおよびscFvとして知られる、公知のCD4i Abの2種類のAb断片は、フルサイズAbより強力にHIV侵入を有意に阻害することが示されている(Labrijn et al., J. Virol. 77: 10557-10565, 2003)。このような抗体断片は、本開示による二重特異性融合抗体の形成における使用に適している。
【００４２】
特定の態様において、二重特異性融合抗体の形成において本明細書において用いられる抗HIV抗体は、HIVのエンベロープタンパク質、例えば、gp120単量体もしくは三量体、またはgp41にあるエピトープに対して作られる。さらに特定の態様において、二重特異性融合の形成において用いられる抗HIV抗体は、HIVエンベロープのアミノ酸279〜460にあるCD4結合部位、HIVエンベロープ三量体のアミノ酸125〜196および296〜331にあるV1/V2領域およびV3領域、ならびに/またはHIVエンベロープのアミノ酸332〜444にあるCD4ブリッジングシート部位に結合してもよい。本明細書における使用に適した抗HIV抗体の例には、m36、PG9、およびVRC01が含まれるが、これに限定されない。HIV gp160のアミノ酸配列は、GenBankにおいてアクセッション番号AAB60578.1により入手可能であり、SEQ ID NO:35にも示される。SEQ ID NO:35において、アミノ酸1〜30はシグナルペプチドであり、アミノ酸31〜509は成熟gp120である。
【００４３】
ある特定の態様において、CD4受容体およびHIVに対する二重特異性を有する融合抗体は、抗HIV抗体の抗原結合断片と連結（すなわち、共有結合）されているインタクトな抗CD4抗体からなる。前記のように、抗HIV抗体の抗原結合断片には、Fab断片、Fab'断片、(Fab') 2断片、Fd断片、Fv断片、dAb断片、シングルドメイン断片、単離されたCDR領域、scFv、および抗HIV抗体のHIV結合機能を保持する他の抗体断片が含まれる。
【００４４】
特定の態様において、抗HIV抗体のシングルドメイン抗体断片、例えば、m36はインタクトな抗CD4抗体と融合される。ある態様において、シングルドメイン抗体断片は抗CD4抗体の重鎖または軽鎖のC末端と融合される。他の態様において、シングルドメイン抗体断片は抗CD4抗体の重鎖または軽鎖のN末端と融合される。
【００４５】
別の特定の態様において、抗HIV抗体の単鎖Fv断片(すなわち、scFv)はインタクトな抗CD4抗体と融合される。同様に、scFv断片は、抗CD4抗体の重鎖または軽鎖のC末端またはN末端と融合することができる。ある態様において、scFv断片は、関連する抗HIV抗体のVLドメインのN末端と連結されたVHドメインの一本鎖であるが、他の態様では、関連する抗HIV抗体のVLドメインのC末端と連結されたVHドメインの一本鎖である。
【００４６】
2つの抗体成分間の連結、すなわち、抗CD4抗体部分と抗HIV抗体部分との連結、およびscFv断片のVHドメインとVLドメインとの連結もペプチドリンカーによって達成される。リンカーの長さは、一般的に、5〜50アミノ酸の範囲内であり、特定の態様において、9〜25アミノ酸、例えば、9、12、16、20、または24アミノ酸の範囲内である。リンカーは合成または天然のヒト抗体由来配列でもよく、両方の組み合わせでもよい。概して、リンカーは、主に、比較的小さな天然のアミノ酸、例えば、グリシン、セリン、アラニンからなり、グリシンおよびセリンに富む配列の複数コピー、例えば、GGGGS(SEQ ID NO:33)の複数コピーを含んでもよい。本明細書における使用に適したリンカーの例には、SEQ ID NO:3、12、14、23、および32に示したリンカーが含まれる。
【００４７】
本明細書において開示される二重特異性融合抗体は、当業者に利用可能な技法を用いて生成することができる。例えば、望ましい二重特異性融合抗体をコードするDNA分子を、分子クローニング法を用いて、融合の2つの抗体成分のコード配列に基づいて構築することができる。結果として生じたDNAを発現ベクターの中に入れ、次いで、これを、免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば、大腸菌(E.coli)細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胚腎臓293細胞、またはマウスミエローマ細胞を含むミエローマ細胞に導入して、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体を合成することができる。例えば、発現のために、抗HIV抗体断片と融合した抗CD4抗体の重鎖をコードする発現ベクターおよび抗CD4抗体の軽鎖をコードする発現ベクターを宿主細胞に同時導入することができる。抗体精製のために、抗体を含有する培養上清を収集することができる。
【００４８】
生成された融合抗体の機能、例えば、CD4受容体との結合、HIVエンベロープとの結合、抗HIV効力および範囲を評価するために、生成された融合抗体をインビトロアッセイにおいて評価することができる。特定の態様において、本開示は強力かつ広範囲の二重特異性融合抗体を提供し、効力および範囲は前記のように規定される。これらの抗体は実施例セクションにおいてさらに詳述される。
【００４９】
抗体に対する改変
ヒト化および霊長類化
融合抗体または二重特異性融合抗体を形成する2つの抗体が非ヒト抗体である場合、ヒトレシピエントに対する免疫原性を弱めるために、抗体は「ヒト化」されてもよい。非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野において説明されている。例えば、Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)、および米国特許第4,816,567号を参照されたい。一般的に、非ヒト抗体の可変ドメインに由来する残基がヒト免疫グロブリン分子に「導入」され、その結果として、ヒト抗体の、一部の超可変領域残基、およびおそらく一部のFR残基が、非ヒト抗体の類似部位に由来する残基によって置換される。抗原に対する高い親和性を保持しながら非ヒト抗体をヒト化することが重要である。このために、一般的に、三次元免疫グロブリンモデルが利用可能であり、親非ヒト抗体と比較した提案されたヒト化配列の分析において使用するのに適している。このような分析によって、抗原の認識および結合に関与する可能性の高い残基の特定が可能になり、従って、抗原に対する特異性および親和性を保持しているヒト化配列の合理的設計が可能になる。
【００５０】
特定の態様において、二重特異性融合抗体は、ヒト化された抗CD4抗体、および抗HIVヒト抗体または抗HIVヒト化抗体から形成される。例えば、イバリズマブはヒト化抗CD4抗体の一例であり、m36はヒト抗HIV抗体の可変ドメインの一例である。
【００５１】
同様に、融合抗体または融合を形成する2つの抗体は、別の霊長類、非ヒトレシピエント、例えば、アカゲザルレシピエントに対する免疫原性を小さくするために「霊長類化」されてもよい。ドナー抗体(例えば、非霊長類抗体またはレシピエント霊長類とは異なる霊長類種の抗体)の可変ドメインに由来する残基が非ヒト霊長類レシピエント免疫グロブリン分子に「導入」され、その結果として、非ヒト霊長類抗体の、一部の超可変領域残基、およびおそらく一部のFR残基がドナー抗体の類似部位に由来する残基によって置換される。または、非霊長類配列または異なる霊長類種に由来する配列を有するレシピエント免疫グロブリンを使用し、望ましい霊長類に由来するFc断片および/または特にフレームワーク領域残基を含む残基をレシピエント免疫グロブリンに導入することによって、望ましい霊長類種において使用するために霊長類化抗体を作ることができる。イバリズマブの「サル化」バージョンおよび抗HIV抗体PG9 scFvのサル化バージョンが下記の実施例に開示される。
【００５２】
親和性成熟
抗体の1つまたは複数の超可変領域残基を置換して、例えば、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイを用いた親和性成熟を使用することによって、親抗体と比べて生物学的特性が改善した変種を選択することができる。例えば、抗CD4抗体または抗HIV抗体のFab領域を、利用可能な構造情報に基づいて選択された、いくつかの部位において、それぞれの部位において可能性のある全てのアミノ置換を生じるように変異することができる。このように作製された抗体変種は、ファージ粒子からまたは酵母細胞表面に一価の様式でディスプレイされる。次いで、ディスプレイされた変種を、これらの生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングする。高親和性を有するイバリズマブ変種の例を本明細書において下記で説明する。これらのイバリズマブ変種を二重特異性融合抗体の形成において使用することができる。
【００５３】
Fc領域に対する改変
融合抗体または融合の形成において用いられるインタクトな抗体は、ヒトを含む任意の霊長類種の任意のIgGアイソタイプの抗体でよく、抗体のある特定の生物学的特性を改善するように、特に、例えば、安定性を改善するように、抗体のエフェクター機能、例えば、抗原依存性細胞傷害(ADCC)および/または補体依存性細胞傷害(CDC)を増強または低減するように、内部移行および/または再利用を改善または減少するように改変することができる。
【００５４】
例えば、イバリズマブ(ヒトIg4に由来する)のFc断片を、(FcRnを除く)FcRによって媒介されるエフェクター機能を低減する、いわゆるLALA変異を有するヒトIgG1で置換することができる。このような改変は、結果として生じた抗体の安定性を約5倍改善することが本明細書において示されている。LALA変異をIgG4バックグラウンドに導入することもできる。別の例では、抗体再利用経路を介した抗体再利用を改善するために、IgG1 Fc断片を一対の変異M428L/N434Sによって改変することができる。この一対の変異をIgG1-LALAバージョンのイバリズマブに導入することによって、結果として生じた抗体のPKがさらに約3倍改善された。
【００５５】
さらに別のタイプの改変は、親抗体において見られる1つもしくは複数の炭水化物部分の欠失、または親抗体には存在しない(1つもしくは複数のグリコシル化部位の付加を介した)1つもしくは複数の炭水化物の付加を含む親抗体のグリコシル化パターンの変化を伴う。
【００５６】
薬学的製剤
開示される融合抗体タンパク質の薬学的製剤は、融合タンパク質を任意の薬学的に許容される担体と混合することによって調製することができる。薬学的に許容される担体には、溶媒、分散媒、等張剤などが含まれる。担体は、液体、半固体、例えば、ペースト、または固体担体でもよい。担体の例には、水、食塩水または他の緩衝液(例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液)、油、アルコール、タンパク質(例えば、血清アルブミン、ゼラチン)、炭水化物(例えば、単糖、二糖、およびグルコース、スクロース、トレハロース、マンノース、マンニトール、ソルビトール、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物)、ゲル、脂質、リポソーム、樹脂、多孔性マトリックス、結合剤、増量剤、コーティング、安定剤、防腐剤、アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質、キレート剤、例えば、EDTA;塩形成対イオン、例えば、ナトリウム;非イオン界面活性剤、例えば、TWEEN(商標)、PLURONICS(商標)、もしくはポリエチレングリコール(PEG)、またはその組み合わせが含まれる。
【００５７】
製剤は、HIV感染を予防または治療するための1種類または複数種のさらなる有益な化合物と組み合わせて、複数種の活性化合物、例えば、1種類または複数種の融合抗体を含有してもよい。
【００５８】
活性成分は、便利かつ現実的な任意のやり方で、例えば、混合物、溶液、懸濁液、乳化、カプセル化、吸収などによって組み合わされてもよく、注射、経口摂取、注入などに適した、錠剤、カプセル、粉末(凍結乾燥粉末を含む)、シロップ、懸濁液などの製剤で作られてもよい。徐放性調製物も調製することができる。
【００５９】
治療および予防の方法
さらなる局面において、本明細書において開示される二重特異性融合抗体は、任意で、薬学的に許容される担体に溶解して提供され、対象におけるHIV感染の治療および予防、ならびにHIV伝染の予防に用いられる。
【００６０】
HIV感染の「治療」という用語は、HIV感染によって引き起こされる、発症を遅延させる、進行を遅らせる、ウイルス量を減らす、および/または症状を寛解させるのに有効なHIV感染阻害を指す。
【００６１】
HIV感染の「予防」という用語は、HIV感染の発症を遅らせる、および/またはHIV感染の発生率もしくは可能性を小さくする、もしくは無くすことを意味する。
【００６２】
HIV伝染の「予防」という用語は、HIVがある個体から別の個体に(例えば、妊娠、出産もしくは分娩、または授乳中にHIV陽性女性から子供に)伝染する発生率または可能性を小さくする、または無くすことを意味する。
【００６３】
「対象」という用語は、ヒトおよびアカゲザル対象を含む任意の霊長類対象を指す。
【００６４】
HIV感染を治療および/または予防するために、本明細書において開示される治療量の融合抗体が、必要とする対象に投与される。
【００６５】
「治療的有効量」という用語は、HIV感染を治療および/または予防するためにHIV感染を阻害するのに必要な用量を意味する。融合抗体の投与量は、対象の疾患状態および他の臨床因子、例えば、体重および状態、療法に対する対象の応答、製剤のタイプ、ならびに投与経路に差有される。治療に有効であり、かつ有害でない正確な投与量は当業者によって決定することができる。一般規則として、成人ヒトに非経口投与するための融合抗体の適切な用量は、1週間に1回または1ヶ月に1回でも約0.1〜20mg/kg患者体重/日の範囲内であり、使用される典型的な初回範囲は約2〜10mg/kgの範囲内である。抗体は最終的に血流から除去されるので、再投与が必要とされる場合がある。または、徐放マトリックスの中に入れられた融合抗体の移植または注射を使用することができる。
【００６６】
経口経路、経皮経路、非経口経路(例えば、静脈内経路、腹腔内経路、皮内経路、皮下経路、または筋肉内経路)を含む標準的な経路によって融合抗体を対象に投与してもよい。さらに、抗体を、注射によって、または十分な量の望ましい抗体が徐放様式で血流に入ることができるように外科的に移植もしくは取り付けることによって体内に導入してもよい。
【００６７】
一部の特定の態様の説明は、一般概念から逸脱することなく、現在の知識を適用することによって、他人が、このような特定の態様を様々な用途に合わせて容易に改変または適合することができる十分な情報を提供する。従って、このような適合および改変は、開示された態様の均等物の意味および範囲の中に含まれるはずであり、開示された態様の均等物の意味および範囲の中に含まれることが意図される。本明細書において用いられる語法または用語は説明を目的とし、限定を目的としないことが理解されるはずである。図面および説明において、例示的な態様が開示された。特定の用語が用いられたのかもしれないが、特に定めのない限り、一般的かつ説明的な意味にしか用いられず、限定を目的とせず、従って、特許請求の範囲は限定されない。さらに、当業者であれば、本明細書において議論された方法の特定の工程を別の順番に並べてもよく、工程を組み合わせてもよいことを理解するだろう。従って、添付の特許請求の範囲は、本明細書において開示される特定の態様に限定されないことが意図される。
【００６８】
本説明は以下の実施例によってさらに例示され、以下の実施例は、いかようにも、限定するものと解釈してはならない。引用された全ての参考文献(本願全体を通じて引用された参考文献、発行された特許、および公開された特許出願を含む)の内容は参照により本明細書に明確に組み入れられる。
【実施例】
【００６９】
実施例-1.iMabm36の構築および試験
本実施例は、iMabm36と名付けた、HIV/AIDSを予防および治療するための新規の二重特異性HIV-1中和抗体(Ab)の構築および試験について述べる。iMabm36は、2コピーの抗CD4誘導性Ab m36と連結された抗CD4 Abイバリズマブ(iMab)からなる。iMabm36は、iMab単独およびm36単独より有意に高い抗ウイルス効力および範囲を有することが本明細書において示された。具体的には、iMabm36は、試験した全てのiMab耐性ウイルスのウイルス侵入を強力に阻害することができる。機構的に、iMabm36活性はCD4結合を必要とし、m36感受性に依存することが本明細書において示された。この二重作用機構の相互依存はiMabm36の高い効力および範囲を可能にする。ほぼ全てのHIV-1分離株は一次侵入受容体としてCD4を使用し、m36標的部位は全てのHIV-1分離株にわたって高度に保存されているので、これらの2つの部位を標的とすることはウイルス耐性に対する高い障壁になると考えられる。iMabm36はインビトロで安定していることが示されており、m36単独と比較して改善した薬物動態を有すると考えられ、免疫原性になる可能性が低い。
【００７０】
iMabm36融合Abの構築および発現。二重特異性融合Abを、MV1およびm36と呼ばれる、iMabの誘導体IgG1バージョンに基づいて構築した。図2の図および図11の配列に示したように、可動性のある(G4S)x3リンカーペプチド
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を介して、m36をMV1重鎖のC末端と連結した。簡単に述べると、融合構築物のcDNA配列をオーバーラップPCRによって作製し、その後に、独特の制限部位によってpVAX発現プラスミドにクローニングした。
【００７１】
iMabm36融合Abは、ヒト胚腎臓293細胞への、1)重鎖iMabm36融合を発現するpVAXベクターおよび2)軽鎖イバリズマブを発現するpVAXベクターの一過的コトランスフェクションによって発現させた。Abを含有する培養上清を濾過し、プロテインA Sepharoseカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製した(図3)。平均収率は培地1mlあたり1〜5μgであった。
【００７２】
iMabm36はインビトロでCD4結合活性を保持する。精製iMabm36を、競合ELISAアッセイにおいて可溶性CD4(sCD4)結合について評価した。簡単に述べると、96ウェルプレートをsCD4でコーティングした。ある決まった濃度のHRP標識iMabを漸増濃度のiMabm36または非標識iMabと混合し、sCD4結合競合について測定した。図4に示したように、iMabm36は、親非標識iMabと比較して同等の効力でCD4結合においてiMab-HRP標識Abと競合した。このことは、iMabm36融合タンパク質の機能的なCD4結合特性を示している。予想通り、m36単独ではsCD4に結合しなかった。
【００７３】
iMabm36融合AbはiMab単独またはm36単独と比較して抗ウイルス効力および範囲を改善する。m36とiMabのC末端が融合することによって、より強力な抗ウイルス活性が生じるかどうか試験するために、iMabm36、iMab、およびm36をそれぞれ、iMab感受性ウイルスおよびiMab耐性ウイルスを含む6種類のウイルスのパネルに対する、TZM-b1をベースとするHIV-1 Envシュードタイプ中和アッセイにおいて調べた。図5に示したように、iMabm36は、iMab単独と比較して、iMab感受性ウイルス(G19およびG23)に対して類似した効力を示した。iMabは、iMab耐性ウイルス(G02、G09、G20、およびB09)に対して25％〜75％の最大阻害パーセント(MPI)にしか達することができず、iMabm36融合は、これらのウイルスの4つ全てを中和することができ、低いナノモル濃度で100％MPIに達した。以前の刊行物と一致して、m36の50％阻害活性は数百ナノモル濃度の範囲内である。
【００７４】
別の実験において、本発明者らのコレクションにある全てのiMab耐性ウイルスに対するiMabm36の活性をさらに調べた(図6)。試験した13種類のiMab耐性ウイルス(100％未満のMPIとして規定された)のうち、iMabm36によって、90％MPIまで中和したウイルスG12を除く全てを100％MPIで中和することができた。iMabm36によって100％ウイルス中和を実現するのに必要な平均濃度は約0.5μg/ml(2.8nM)である。また、iMabm36は、PMBCをベースとする中和アッセイにおいても活性があった(データ示さず)。
【００７５】
iMabおよびm36混合物と比較して高いiMabm36の抗ウイルス効力。図5の結果から、iMabm36の活性がその個々の成分であるiMabおよびm36より高いことが分かった。iMabm36の高い抗ウイルス活性が、単にiMabおよびm36を混合することによっても実現できるかどうか調べるために、1:2のモル比のiMabおよびm36を用いて中和アッセイを行った。なぜなら、iMabm36融合には1個のiMabと2個のm36ペプチドがあるからである。図7aに示したように、iMabおよびm36を混合することによって、それぞれの成分の抗ウイルス活性が改善しただけでなく、試験したiMab耐性ウイルスの100％中和が実現した。これらの結果から、iMabおよびm36は抗ウイルス活性に相加的または相乗的に寄与することが分かる。iMab成分およびm36成分の混合と比較して、iMabm36融合Abは、さらに高い抗ウイルス活性を示し、試験した同じモル濃度で少なくとも10倍増加した。
【００７６】
iMabm36がm36の漸増局所濃度によって作用するという仮説を試験するために、iMabを過剰なm36と1:10のモル比で混合した。図7bに示したように、1:10比でのiMabおよびm36の混合は図7aの1:2比の混合より強力であった。特に、5倍過剰のm36を用いた場合でも、個々の成分を用いた混合はiMabと融合したm36より依然として弱かった。
【００７７】
iMab耐性ウイルスに対するiMabm36融合の効力の改善は、m36に対するウイルスの感受性によって付与される。iMab36融合の状況におけるm36の寄与をさらに理解するために、本発明者らは、m36に対するイバリズマブ耐性ウイルスの感受性とiMabm36との相関関係を分析した。図8に示したように、m36のIC50とiMabm36のIC50との間には強い相関関係が観察された。この結果から、iMab耐性ウイルスの状況において、iMabm36の感受性はm36に対するウイルスの感受性によって決定されるという考えを裏付けられた。
【００７８】
iMabm36の抗ウイルス効力はそのCD4結合に依存する。iMab36融合の抗ウイルス活性機構を理解するために、iMab重鎖可変CDR3領域内にある2つの接触アミノ酸残基をアラニン残基で置換した。iMabの野生型重鎖および変異体重鎖のCDR3領域を、図9aならびにそれぞれSEQ ID NO:35およびSEQ ID NO:36に示した。変異体融合Ab(iMabΔm36)を精製し、インビトロで、そのCD4結合能について試験した。図9aに示したように、iMabΔm36は、sCD4結合においてiMab-HRPともはや競合できなかった。このことから、これらの2つの変異によってiMabm36のCD4結合活性は無くなったことが示唆される。ウイルス中和アッセイにおいて、iMabΔm36はそのウイルス中和活性を失った(図9b)。この結果から、iMabm36の抗ウイルス活性はそのCD4結合に依存することが示唆される。言い換えると、iMabとCD4との結合を介したm36の固定がiMabm36抗ウイルス活性にとって極めて重要である。
【００７９】
iMabm36のインビトロ安定性。iMabm36の安定性を評価するために、本発明者らは、最初に、高力価のウサギ抗m36免疫血清を作製した。これを行うために、0週目に、ウサギを、CFAに溶解した精製m36タンパク質(300μg/用量)で免疫し、その後、4週目および8週目にIFAに溶解して2回、追加免疫した。最後の追加免疫の4週間後に収集した血清試料中の抗m36 Ab力価を求めた。iMabm36融合Abのインビトロ安定性を、PBSに溶解した20％血清中で融合Abを37℃で7日までインキュベートすることによって確かめた。未処理(0日目)および処理済み融合Abのアリコートを、示された時点で採取し、-20℃で保管した。インタクトなiMabm36の存在を、sCD4に対するiMabm36の機能的結合活性によって調べ、それぞれ、抗iMab Fc直接ELISAおよび抗m36サンドイッチELISAによって確かめた。
【００８０】
図10からのデータは、iMab Fcに対する二次Abによって検出された時に、ある期間にわたってCD4結合が消失しなかったことを証明する。このことから、この融合のiMab部分は依然として存在していたことが分かる。抗m36ウサギ免疫血清およびウサギ血清Igに対する二次Abによって検出された時に、この融合のm36部分も依然として存在していた。これらの結果から、iMabm36は、試験された状態で少なくとも7日間まで安定していたことが示唆される。
【００８１】
実施例-2.イバリズマブ-PG9の構築および試験
本実施例は、HIV/AIDSを予防および治療するための新規の二重特異性HIV-1中和抗体(NAb)であるイバリズマブ-PG9(または「PG9-イバリズマブ」とも呼ばれる)の構築および試験について述べる。イバリズマブ-PG9は、抗HIVエンベロープNAbの単鎖Fv(scFv)バージョンであるPG9と融合した、抗CD4 Abイバリズマブの融合として作り出した。イバリズマブ-PG9は、イバリズマブ単独またはPG9単独より有意に大きな抗ウイルス効力および範囲を示した。具体的には、イバリズマブ-PG9は、試験した全てのイバリズマブ耐性ウイルスのウイルス侵入を強力に阻害した。イバリズマブおよびPG9は2つの別個の機構を用いてHIV侵入を阻害するので、イバリズマブ-PG9融合に対するHIV耐性が現れる可能性はイバリズマブ単独またはPG9単独と比較して小さい。
【００８２】
イバリズマブ-PG9融合抗体の構築および発現。イバリズマブの範囲および効力を改善するために、同時に、宿主T細胞上にあるCD4受容体とHIVエンベロープタンパク質gp120を標的とする二重特異性イバリズマブ-PG9を作り出した。PG9は、現在、HIVエンベロープ三量体の四次エピトープを標的とする、最も強力かつ広範囲の抗HIV-1抗体の1つである(Walker et al., Science 326, 285-289 (2009))。融合抗体を作り出すために、本発明者らは、可動性リンカー(SEQ ID NO:12)を介してPG9の重鎖可変ドメインをPG9の軽鎖可変ドメインと融合して、PG9単鎖可変断片(scFv)を作り出した。次いで、このPG9 scFvを、可動性リンカー(SEQ ID NO:14)を介して、イバリズマブ重鎖のN末端および/またはC末端と融合して、二重特異性イバリズマブ-PG9を作り出した(図12)。PG9 scFvとイバリズマブ重鎖のN末端が融合した二重特異性融合抗体(図15)を以下の実験において使用した。この融合構築物のイバリズマブのFc領域はLALA変異も含有した。LALA変異を下記においてさらに説明する。
【００８３】
イバリズマブ-PG9融合抗体はその結合機能を保持する。融合抗体がそのコグネイト抗原に結合する能力を、ELISAを用いて評価した。図13(左側)に見られるように、融合抗体は、イバリズマブと同等にヒトCD4に結合することができた。Biacore研究からも、PG9 scFvの付加は、抗体がCD4に結合する親和性に影響を及ぼさなかったことが分かる(データ示さず)。イバリズマブ-PG9融合がPG9の固有の結合活性を保持するかどうか確かめるために、本発明者らは、融合抗体が抗gp120抗体F105と同等にgp120に結合できることを示した(図13、右側)。予想通り、イバリズマブは、融合抗体の濃度の10倍の濃度で試験された時でもgp120に結合できなかった。
【００８４】
イバリズマブ-PG9融合抗体はイバリズマブ単独と比較してウイルス中和活性を保持および改善する。イバリズマブ-PG9融合抗体の抗ウイルス効力を評価するために、本発明者らは、標準化された単一サイクルTZM-b1レポーターアッセイを用いてHIV-1中和能を確かめた。イバリズマブ-PG9融合抗体は、9種類のイバリズマブ耐性ウイルスのうち9種類を95％超の阻害まで中和することができた(図14、右上)。イバリズマブの範囲の改善に加えて、融合抗体は、イバリズマブと比較して150倍まで有意に高い効力を示した(p=0.002)。
【００８５】
実施例-3.イバリズマブ-VRCO1の構築および試験
本実施例は、HIV/AIDSを予防および治療するための新規の二重特異性HIV-1中和抗体(NAb)であるイバリズマブ-VRCO1(「VRCO1-イバリズマブ」とも呼ばれる)の作製および試験について述べる。イバリズマブ-VRCO1は、抗CD4 Abイバリズマブと融合した、抗HIVエンベロープNAbの単鎖Fv(scFv)バージョンであるVRCO1の融合として作り出した。イバリズマブ-VRCO1は、イバリズマブ単独またはVRCO1単独より有意に大きな抗ウイルス範囲を示した。具体的には、イバリズマブ-VRCO1は、試験した全てのイバリズマブ耐性ウイルスのウイルス侵入を強力に阻害した。さらに、イバリズマブおよびVRCO1の補完的な耐性は相互排他的な遺伝子型によって生じる。イバリズマブ耐性への主要な経路はV5 N末端の潜在的なN結合型グリコシル化(PNG)の除去を伴う。ウイルスの大きなパネルおよび部位特異的変異体から、V5 N末端PNG部位の存在はイバリズマブに対する感受性を付与するのに十分であることが以前に示されている。対照的に、V5 N末端PNGの存在はVRCO1に対する感受性を大幅に(1/20以下に)弱める。従って、融合抗体としての、または同時投与による、イバリズマブおよびVRCO1を用いた併用療法は、現在まで述べられたHIVに対する他の任意の広範囲のNAbのこのような組み合わせと比較して、耐性に対してかなり高い遺伝的障壁を提供すると考えられている。
【００８６】
イバリズマブ-VRCO1融合抗体の構築および発現。イバリズマブおよびVRCO1の範囲を改善するために、本発明者らは、同時に、宿主T細胞上にあるCD4受容体とHIVエンベロープタンパク質gp120を標的とする二重特異性イバリズマブ-VRC01を作り出した。VRCO1は、現在、HIVエンベロープ三量体のCD4結合部位を標的とする、最も強力かつ広範囲の抗HIV-1抗体の1つである。融合抗体を作り出すために、本発明者らは、可動性(GGGGS)4(SEQ ID NO:22)リンカーを介してVRCO1の重鎖可変ドメインをVRCO1の軽鎖可変ドメインと融合させて、VRCO1単鎖可変断片(scFv)を作り出した。次いで、このVRCO1 scFvを、可動性(GGGGS)4(SEQ ID NO:22)リンカーを介してイバリズマブ重鎖のN末端および/またはC末端と融合させて、二重特異性イバリズマブ-VRCO1を作り出した(図16)。VRCO1 scFvとイバリズマブ重鎖のN末端が融合した二重特異性融合抗体(図19)を以下の実験において使用した。この融合構築物のイバリズマブのFc領域はLALA変異も含有した。LALA変異を下記においてさらに説明する。
【００８７】
イバリズマブ-VRCO1融合抗体はその結合機能を保持する。融合抗体がそのコグネイト抗原に結合する能力を、ELISAを用いて評価した。図17(左側)に示したように、融合抗体はイバリズマブと同じ程度にヒトCD4に結合することができた。イバリズマブ-VRCO1融合がVRCO1の固有の結合活性を保持するかどうか確かめるために、本発明者らは、融合抗体がgp120に結合できることを証明した(図17、右側)。予想通り、イバリズマブ単独ではgp120に結合することができなかった。
【００８８】
イバリズマブ-VRCO1融合抗体はイバリズマブ単独と比較してウイルス中和活性を保持および改善する。イバリズマブ-VRCO1融合抗体の抗ウイルス効力を評価するために、本発明者らは、標準化された単一サイクルTZM-b1レポーターアッセイを用いてHIV-1中和能を確かめた。イバリズマブ-VRCO1融合抗体は、10種類のイバリズマブ耐性ウイルスのうち10種類を100％阻害まで中和することができた(図18、右)。
【００８９】
実施例-4.範囲および効力の点でイバリズマブを上回る二重特異性融合抗体の改善
イバリズマブと比較した本明細書において構築された融合抗体の改善を以下のように例示する。
【００９０】
図20の左上パネルは、118種類のHIV分離株のパネルに対する非改変イバリズマブ(iMab)のインビトロ中和活性を要約したものであり、そのレパートリーの中に「穴」が示される。ウイルスのごく一部については>10ug/mLのIC50が認められたが、さらに多くのウイルスについては高レベルの中和(MPI>80％)に達しなかった。iMab-m36(実施例1)は中程度に範囲が広がった(右上、図20)。VRCO1-iMab(実施例3)はさらに大きな範囲および効力を示し、IC50は一貫して0.01〜0.1μg/mLであった(左下)。最も目についたのは、PG9-iMabによって示された中和活性であり(実施例2)(右下)、(>80％中和によって測定された時に)100％の範囲が観察され、有意な効力増加(IC90によって>200倍)も観察された(IC50、IC90、およびIC99の中央値は、それぞれ、0.005μg/mL、0.028μg/mL、および0.080μg/mLであった)。
【００９１】
融合抗体の抗HIV活性の著しい増大は、ある範囲の濃度にわたって中和されたウイルスのパーセント範囲として示された時に、よりいっそうはっきりと分かる(図21)。具体的には、<0.1μg/mLの濃度のPG9-iMabによってウイルスの99％が中和された。
【００９２】
二重特異性抗体の抗ウイルス効力はまた、散布図においてイバリズマブの結果と比較して二重特異性抗体のIC50を示すことでも示された(図22)。改善は容易に分かる。
【００９３】
実施例-5.イバリズマブバックボーン上でのPK改善
イバリズマブのインビボでの半減期は比較的短い(IV投与の場合、3.5日、SC投与の場合、約10日)。IgG4でヒト化したmAb(例えば、イバリズマブ)は、鎖間ジスルフィド結合を鎖内ジスルフィド結合に切り替えて、抗体を単量体に解離する強い傾向を有することが知られている。安定性を改善するために、いわゆる「LALA」(Leu→AlaおよびLeu→Ala)変異を導入するようにイバリズマブのFc領域を改変した。PG9-イバリズマブのFc領域(図15)およびVRCO1-イバリズマブのFc領域(図19)は、それぞれ、一組のLALA変異((Leu→AlaおよびLeu→Ala)を含有した。さらなる構築物において、Ig4を、FcR(FcRnを除く。以下を参照されたい)によって媒介されるエフェクター機能を低減するLALA変異(L234A/L235A)(Hessell et al., Nature 449(7158): 101-4, 2007)を有するヒトIgG1で置換することによって、イバリズマブバックボーンを改変した。この追加構築物においてなされた特定の「LALA」改変は、L239F、L240Eであり(このナンバリングシステムは19アミノ酸リーダー配列を考慮に入れない)、SEQ ID NO:30の位置258および259に対応する。短期実験においてアカゲザルに注入された時、この新たな変種はイバリズマブと比べて約5倍安定していた(図23)。
【００９４】
さらに、本発明者らはまた、抗体再利用経路を介したイバリズマブの再利用を高めるためにイバリズマブバックボーンを改変した。FcRn、いわゆる新生児FcRは、上皮を通過するIgGのトランスサイトーシスに関与することが示され、これによって移行抗体は胎児に移行する(Ghetie et al., Immunol. Res. 25(2):97-113, 2002)。循環IgGレベルの調節におけるFcRnのさらなる役割を裏付ける多くの証拠が存在する(Roopenian et al., Nat. Rev. Immunol. 7(9):715-25, 2007)。血清中IgGは、内皮細胞によって液相ピノサイトーシスを介して内皮細胞エンドソームに取り込まれる。典型的に、IgGのFc領域はpH6.0〜6.5(エンドソーム)でしかFcRnに結合しないのに対して、IgG-FcRn複合体の解離はpH7.0〜7.4(細胞表面)で促進される。従って、エンドソーム内が酸性化すると、IgGはFcRnに結合し、次いで、細胞表面まで再循環され、FcRnから放出される。エンドソーム内でFcRnに結合していないIgG分子は分解される。従って、FcRnはサルベージ受容体として機能し、その結果、リソソーム分解経路からIgGを救出する。従って、IgG-FcRn相互作用を増強するように操作すれば、インビボでのmAbのPKを改善することができるだろう。実際に、M428L/N434S変異はPKに対する有益な効果を有すると報告されている(Zalevsky et al., Nat. Biotechnol. 28(2): 157-9, 2010)。この組み合わせの変異により、主としてオフレート(off rate)が遅いために、pH6.0でのFcRnに対する親和性は11倍増加した。ベバシズマブ(アバスチン、IgG1、抗VEGF。結腸癌、肺癌、および乳癌の治療用に認可された)またはセツキシマブ(エルビタックス、IgG1、抗EGFR。結腸癌および頭頚部癌の治療用に認可された)の状況に置かれた時に、両抗体のPKプロファイルはヒトFcRnトランスジェニックマウスにおいて5倍改善し、カニクイザルにおいて3倍改善した。本発明者らは、IgG1-LALAバージョンのイバリズマブにおいて、この変異セット(M433L、N439S)を作った(このナンバリングシステムは19アミノ酸リーダー配列を考慮に入れない)。これらは、それぞれ、SEQ ID NO:30の位置452および458に対応する。この改変によって、野生型マウスに対してヒト-FcRn-トランスジェニックマウスにおけるPKが約3倍改善した(図24)。
【００９５】
SEQ ID NO:30は、前記の改変を加えたiMabm36重鎖のアミノ酸配列を示す。SEQ ID NO:30の残基1〜19はリーダー配列を構成する(SEQ ID NO:10)。残基20〜471は、IgG1-LALA変異およびFcRn変異を有するiMab重鎖である(SEQ ID NO:31)。残基472〜489はリンカーであり(SEQ ID NO:32)、残基490〜606はm36可変重鎖である(SEQ ID NO:4)。
【００９６】
実施例-6.サルにおけるPK評価、免疫原性評価、およびSHIV予防研究
CD4およびgp120に対する結合親和性のインビトロ評価によって確かめられた時に、望ましい抗ウイルス特性およびPK特性があった二重特異性融合抗体候補をアカゲザルにおいてインビボでさらに評価した。しかしながら、サルにおけるヒト化抗体分子の免疫原性を避けるために、二重特異性ヒト化抗体のアカゲザル同等物を作製した。例えば、PK増強変異(G1-LALAおよびM428L/N434S)を含有するイバリズマブの場合、図25Aに示したように、最初に、CH1、CH2、およびCH3ドメインをこれらのアカゲザル対応物で置換した。このようなキメラ構築物は、Fv領域にある「ヒト」フレームワーク残基のために、サルにおいて免疫原性を示す可能性が依然として高いかもしれない。従って、これらのフレームワーク残基を系統的にアカゲザルアミノ酸で置換し、それによって、完全「サル化」バージョンの抗体を作り出した。これをRhiMabと呼んだ(図25Aに図示した)。このプロセス中に、抗体の抗原結合性が消失しないように注意した。より具体的には、iMabと、GenBankより入手可能なアカゲザル配列のIgGとの配列アラインメントに基づいて、iMabの合計8個のアミノ酸残基(重鎖可変領域から3個、軽鎖可変領域から5個)を特定した。8個全てのアミノ酸残基およびその組み合わせを、アカゲザルIgGにおいて保存されているアミノ酸で置換した。結果として生じた抗体(RhiMab)の1つの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を図26Aに示した。RhiMabの機能は、a)sCD4競合結合ELISA、2)BiaCore結合、および3)ウイルス中和活性アッセイによって特徴付けられた。
【００９７】
サルにおけるRhiMabのPKプロファイルは以下の通りに確かめる。ある範囲の用量(1mg/kg〜10mg/kg)のこの抗体をアカゲザルにSC投与する。その後、何ヶ月かの間に、血清中抗体レベルを経時測定するために採血を連続して行う。PBMCを単離して、抗体が結合した、T細胞上のCD4受容体のパーセントを評価する。結果として生じた受容体占有値を血清中抗体濃度と相関付ける。粘膜CD4 T細胞の抗体コーティングの程度を定量するために、RhiMab投与の1週間後に直腸生検材料および頚腟部生検材料(入手可能な場合)を入手する。これらの粘膜部位に抗体を十分に浸透させることが極めて重要である。粘膜部位を通ってHIVは新たな宿主に侵入する。それぞれのサルに、初回注射の1ヶ月後、2ヶ月後、および3ヶ月後に、RhiMabをさらに3回SC投与する。再度、反復投与によって抗体が蓄積したかどうか確かめるために、ならびに慢性投与中のPKプロファイルまたは受容体占有値の変化を評価するために連続血液試料を採取する。この終わりに近い期間の間は、PK知見の求めるところに従って、控えめに粘膜生検のみ行う。
【００９８】
異常に低いPKプロファイルは免疫原性応答の発生を暗示している可能性がある。アカゲザル血清中の抗RhiMab抗体を経時的に検出するアッセイは、現在、開発中である。マイナスの結果になれば、二重特異性構築物を構築するために使用したRhiMabスキャフォールドは実際には非免疫原性だということが裏付けられるだろう。免疫原性が頻繁に発生すれば、抗体応答の誘導を担う、RhiMab上の部位を決定する試みが行われるだろう。規定されたら、免疫原能を無くすことを期待してRhiMab上の部位において置換がなされるだろう。
【００９９】
アカゲザル同等物に変換するためにPG9 scFvを選択した。具体的には、GenBankから発見されたアカゲザル抗体配列のパネルにおける保存アミノ酸の使用頻度に基づいて、ヒトPG9 scFv中のアミノ酸を特定した。合計19個のアミノ酸残基(重鎖から14個、軽鎖から5個)を特定し、変更して、アカゲザルPG9 scFvを作製した。アカゲザルPG9 scFvの重鎖および軽鎖の配列を図26Bに示した。
【０１００】
次いで、図25Bに示したように、アカゲザルPG9 scFvおよびRhiMabを用いて二重特異性融合を作り出した。二重特異性抗体を、既に述べられた試験に類似したサルにおける初期PK試験において試験した。次いで、IC90を上回る血清レベルおよび/または高い受容体占有率が2ヶ月間、維持されることに基づいて、用量を選択する。0週目に、抗体を6匹のアカゲザルにSC投与する。これに対して、6匹のさらなる動物は未処置対照として役立つ。再度、8週間および16週間で、それぞれの抗体を同じ用量でSC投与した。4日目に開始して、全てのサルに低用量SHIVを直腸(IR)投与する。IR接種を、もう11回、毎週、繰り返する。全ての動物を、6ヶ月にわたって頻繁に、セロコンバージョン、血漿ウイルス血症、CD4細胞数、および免疫不全の臨床発現についてモニタリングする。二重特異性抗体によって付与された保護を3つの異なる尺度によってスコア化する。1番目はSHIV感染に対する完全な保護である。2番目は、感染させるのに必要な追加ウイルス接種の回数である。3番目は、少ないウイルス量、多いCD4細胞数、および疾患進行の欠如により反映されるような感染の弱毒化である。
【０１０１】
実施例-7.イバリズマブのFab結合認識領域を変える親和性成熟
イバリズマブ-CD4複合体からの構造情報に基づいて選択されたCDR残基の中にランダム変異を作製した。標準的な酵母ディスプレイスクリーニングシステムを用いて、高親和性または低親和性を有する変種を特定した。構造情報により導かれたランダム変異をCDRの中の特定の位置に導入して、単鎖Fv(scFv)ライブラリーを作製した。次いで、ライブラリー内の変種を形質転換によって酵母に導入し、その後に、細胞表面上に発現させた。ヒト可溶性CD4(sCD4)を用いて、非改変scFvと競合させてscFv発現細胞に結合させた。抗CD4抗体の後に二次検出試薬を用いて染色することによってCD4結合を検出した。結合シグナルをフローサイトメトリーによって測定し、高親和性CD4結合クローンを蛍光標識細胞ソーティングによって単離した。完全長scFv発現クローンが細胞ソーティングによって適切に分離されることを確実なものにするために、scFv上にあるN末端c-mycエピトープタグも抗c-myc抗体を用いて第2の色によって同時に染色した。選択されたクローンを再増殖させ、最も高い親和性の型の増殖を確実なものにするために複数回の選択において高親和性CD4結合について評価した。最終回の選択の後、最も優れた酵母クローンを単離し、存在する変異を特定するために、それぞれのscFvをDNA配列決定に供した。
【０１０２】
図27は、「インビトロ親和性成熟」を実施するために使用した方法の図による概要である。ここに示した例は、CDR-H1に対する変異を対象としたが、他のCDRについては類似の手法を採用した。
【０１０３】
親和性が12.5倍改善(KD 10pM)したイバリズマブのCDR-H1変種を含む高親和性型が作製された(表1)。酵母プラットフォームによって試験されたiMab変異体はCD4に対する親和性を増加または減少した(表2)。親和性が最も高い変種および親和性が最も低い変種がBiacoreによって確かめられた(表3)。
【０１０４】
（表１）2回のスクリーニング後の親和性改善-酵母ディスプレイプラットフォームによって試験した
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【０１０５】
（表２）iMab変異体の増加または減少について酵母プラットフォームによって試験した親和性
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【０１０６】
（表３）iMab変異体の増加または減少についてBiacoreによって試験した親和性
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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