(57)【要約】  本発明は、一態様において、ＤＮａｓｅをコードする核酸配列の転写を植物において調節する調節性ヌクレオチド配列の制御下の前記核酸配列を含む核酸コンストラクトにより形質転換された前記植物を成長させることを含む、植物においてＤＮａｓｅを発現する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮａｓｅをコードする核酸配列の転写を植物において調節する調節性ヌクレオチド配列の制御下の前記核酸配列を含む核酸コンストラクトが導入された前記植物をインキュベーションすることを含む、植物においてＤＮａｓｅを発現させる方法。
【請求項２】
前記核酸コンストラクトが、
タンパク質顆粒の形成を植物において誘導する融合タンパク質パートナーをコードし、任意でその中の天然に存在しない反復配列モチーフをコードする１つまたは複数の核酸配列をさらに含む核酸配列を加えて含み；前記核酸配列はＤＮａｓｅをコードし、前記核酸配列はタンパク質顆粒の形成を植物において誘導するタンパク質をコードし、前記調節配列は互いに作動可能に連結される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸コンストラクトが、
タンパク質顆粒の形成を植物において誘導する融合タンパク質パートナーをコードする第１の核酸配列と；
任意でアミノ酸リンカー中のペプチド結合が特異的に切断され得るアミノ酸リンカーをコードする第２の核酸配列と；
ＤＮａｓｅをコードする第３の核酸配列と；
前記核酸配列の転写を前記植物において調節する調節性ヌクレオチド配列とを、
前記核酸配列が互いに作動可能に連結されて、
含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸コンストラクトが、融合タンパク質を植物細胞の小胞体に向けて導くペプチド、好ましくはシグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
タンパク質顆粒の形成を植物において誘導する前記タンパク質が、プロラミンまたはその断片、好ましくはトウモロコシプロラミンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記プロラミンが、γゼインまたはその断片、好ましくはトウモロコシγゼインである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮａｓｅが、ＤＮａｓｅ  Ｉ、好ましくはヒトＤＮａｓｅまたはヒトＤＮａｓｅ  Ｉである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮａｓｅが組換えＤＮａｓｅである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＤＮａｓｅをコードする核酸配列、およびそれへ作動可能に連結された前記ＤＮａｓｅの転写を植物において調節する調節性ヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、または本質的になる核酸コンストラクト。
【請求項１０】
前記核酸コンストラクトが、
タンパク質顆粒の形成を植物において誘導する融合タンパク質パートナーであって、任意で１つまたは複数の天然に存在しない反復配列モチーフを含む前記タンパク質をコードする第１の核酸配列と；
任意でアミノ酸リンカー中のペプチド結合が特異的に切断され得るアミノ酸リンカーをコードする第２の核酸配列と；
ＤＮａｓｅをコードする第３の核酸配列と、
前記第１の核酸配列、第２の核酸配列および第３の核酸配列の転写を植物において調節する調節性ヌクレオチド配列とを；
前記核酸配列が互いに作動可能に連結されて、
含む、請求項９に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１１】
請求項９または請求項１０のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトを含むベクター。
【請求項１２】
（ｉ）タンパク質顆粒の形成を植物において誘導する融合タンパク質パートナーであって、任意で１つまたは複数の天然に存在しない反復配列モチーフをコードするアミノ酸配列をさらに含む前記タンパク質をコードするアミノ酸配列と；
（ｉｉ）任意でリンカー中のペプチド結合が特異的に切断され得るリンカーをコードするアミノ酸配列と；
（ｉｉｉ）ＤＮａｓｅをコードするアミノ酸配列と
を含むか、それからなるか、または本質的になる融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項９もしくは請求項１０のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、または請求項１１に記載のベクター、または請求項１２に記載の融合タンパク質を含む、植物またはそれに由来する植物材料。
【請求項１４】
組換えＤＮａｓｅを産生することができ、好適には前記植物または植物材料が消費可能な産物の中へ取り込まれる、請求項１３に記載の植物または植物材料。
【請求項１５】
請求項１２に記載の融合タンパク質を含む、植物タンパク質顆粒、植物または消費可能な産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物において組換えデオキシリボヌクレアーゼ（好適にはヒトＤＮａｓｅ  Ｉ）の発現のための方法に関する。方法の実行のための核酸配列、核酸コンストラクト、ベクター、発現ベクターおよび同種のものも開示する。
【背景技術】
【０００２】
デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）はポリデオキシリボ核酸を加水分解するホスホジエステラーゼであり、複数の分子形態であることが公知である。それらの生化学的性質および酵素活性に基づいて、ＤＮａｓｅタンパク質は２つのタイプ、ＤＮａｓｅ  ＩおよびＤＮａｓｅ  ＩＩとして分類されている。ＤＮａｓｅ  Ｉタンパク質は中性付近の至適ｐＨを有し、二価陽イオンを必須で要求し、ＤＮＡの加水分解で５’−リン酸クレオチドを産生する。ＤＮａｓｅ  ＩＩタンパク質は酸性ｐＨで至適であり、二価陽イオンによって活性化することができ、ＤＮＡの加水分解で３’−リン酸クレオチドを産生する。
【０００３】
ウシＤＮａｓｅ  ＩおよびブタＤＮａｓｅ  Ｉを含む、様々な種からのＤＮａｓｅタンパク質が記載されている。これらのタンパク質は精製され、これをコードするヌクレオチド配列は配列決定されている。ヒトＤＮａｓｅ  ＩをコードするＤＮＡも単離および配列決定され、哺乳類細胞（ＣＨＯ細胞等）において発現され、それによってヒトＤＮａｓｅの産生が可能になっている。ヒトＤＮａｓｅ  Ｉに対する相同性を有する他のポリペプチドをコードするＤＮＡも同定された。
【０００４】
ＤＮａｓｅ  Ｉは多数の治療法上の目的を有する。治療法上の使用の１つは、疾患（肺炎および嚢胞性繊維症等）に罹患した被験体における肺分泌物（粘液）の粘弾性を減少させ、それによって呼吸気道の清浄化を支援することである。粘液は、慢性気管支炎、喘息性気管支炎、気管支拡張症、肺気腫、急性および慢性の副鼻腔炎、ならびにさらに一般的な風邪の死亡率にも寄与し、したがってＤＮａｓｅ  Ｉはこの疾患における適用も有し得る。
【０００５】
既存の真核生物発現システムに生化学的、技術的および経済的な限定があるため、異種タンパク質のための新規発現システムの開発に実質的な興味が持たれている。その目的のために、植物発現システムを使用して組換えタンパク質を産生することができる。しかしながら、組換えタンパク質が植物において成功して発現しているかまたはしていないかを予測することが可能でないので、植物ベースの発現システムの開発の間に多数の変数を考慮に入れなければならない。したがって、植物ベースの発現システムの開発は簡単ではなく、最終的に開発されたシステムが選択したタンパク質の効果的な発現をもたらすものになるだろうという確実性はない。
【０００６】
ＤＮａｓｅは、特にＤＮＡを加水分解するように機能する酵素の活性に部分的に起因して、異種システムで発現させることが難しい酵素である。さらに、ＤＮａｓｅのための現行の発現システムは発現宿主として哺乳類細胞を利用し、発現させたタンパク質の下流の加工（例えば、精製およびスケールアップ）が商業用レベルへ容易にスケールアップ可能ではないことを意味する。本発明によって提供された方法は、ＤＮａｓｅのための改善された発現システムを提供することを目的とする。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ＤＮａｓｅを、この発現システムが酵素の商業用産生に好適な選択となるレベルで、植物において活性形態で発現させることができるという意外な所見に少なくとも部分的に基づいている。本発明者の知る限りでは、植物におけるＤＮａｓｅの発現は今までに報告されていない。
【０００８】
一実施形態によれば、融合タンパク質ベースの発現システムはＤＮａｓｅの下流の回収（植物材料からの酵素の回収および精製等）を改善することができるので、このシステムが使用される。本発明者は、タンパク質顆粒の形成を植物において誘導する融合タンパク質パートナーは、植物におけるＤＮａｓｅの発現に成功して使用できることを見出した。意外にも、ＤＮａｓｅ、およびタンパク質顆粒の形成を植物において誘導するタンパク質中の１つまたは複数の天然に存在しない反復配列モチーフと協力してタンパク質顆粒の形成を植物において誘導するタンパク質をコードする核酸コンストラクトの使用は、モチーフの非存在と比較して、ＤＮａｓｅの発現量を増加させることができる。
【０００９】
本明細書において記載される発現システムは、酵素の商業用産生のためにスケールアップ可能な方法でのＤＮａｓｅの産生に特に有用である。
【００１０】
一態様によれば、ＤＮａｓｅをコードする核酸配列の転写を植物において調節する調節性ヌクレオチド配列の制御下の前記核酸配列を含む核酸コンストラクトが導入された前記植物をインキュベーションすることを含む、植物においてＤＮａｓｅを発現させる方法が提供される。
【００１１】
さらなる態様において、（ａ）ＤＮａｓｅをコードする核酸配列の転写を植物において調節する調節性ヌクレオチド配列の制御下の前記核酸配列、および任意で植物におけるタンパク質顆粒の形成を誘導するタンパク質をコードする核酸配列を、前記核酸配列が互いに作動可能に連結されて、前記植物の中へ導入する工程と；（ｂ）融合タンパク質としてのＤＮａｓｅの発現を前記植物において可能にする条件下で前記植物をインキュベーションする工程とを含む、植物においてＤＮａｓｅを発現させる方法が提供される。
【００１２】
さらなる態様において、ＤＮａｓｅをコードする核酸配列の転写を植物において調節する調節性ヌクレオチド配列の制御下の前記核酸配列、および任意で植物におけるタンパク質顆粒の形成を誘導するタンパク質をコードする核酸配列を、前記核酸配列が互いに作動可能に連結されて、含むか、それからなるか、または本質的になる核酸コンストラクトの使用を含む、前記植物においてＤＮａｓｅを発現させる方法が提供される。
【００１３】
さらなる態様において、タンパク質顆粒の形成を植物において誘導する融合タンパク質パートナーを含むＤＮａｓｅ融合タンパク質をコードする核酸配列を含むか、それからなるか、または本質的になる核酸コンストラクトが導入またはインフィルトレーションされた植物をインキュベーションまたは成長させることを含む、植物においてＤＮａｓｅを産生する方法が提供される。
【００１４】
一実施形態において、植物に導入またはインフィルトレーションする工程は、インキュベーションまたは成長させる工程の前に実行される。
【００１５】
一実施形態において、前記核酸コンストラクトは、タンパク質顆粒の形成を植物において誘導するタンパク質をコードし、任意でその中の天然に存在しない反復配列モチーフをコードする１つまたは複数の核酸配列をさらに含む核酸配列を加えて含み；前記核酸配列はＤＮａｓｅをコードし、前記核酸配列はタンパク質顆粒の形成を植物において誘導するタンパク質をコードし、前記調節配列は互いに作動可能に連結される。
【００１６】
一実施形態または実施形態の組み合わせにおいて、方法において使用される核酸コンストラクトは、タンパク質顆粒の形成を植物において誘導するタンパク質であって、任意で１つまたは複数の天然に存在しない反復配列モチーフを含む前記タンパク質をコードする第１の核酸配列と；任意でアミノ酸リンカー中のペプチド結合が特異的に切断され得るアミノ酸リンカーをコードする第２の核酸配列と；ＤＮａｓｅをコードする第３の核酸配列と；前記核酸配列の転写を前記植物において調節する調節性ヌクレオチド配列とを、前記核酸配列が互いに作動可能に連結されて、含む。
【００１７】
一実施形態または実施形態の組み合わせにおいて、方法において使用される核酸コンストラクトは、融合タンパク質を植物細胞の小胞体に向けて導くペプチド、好ましくはシグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。
【００１８】
一実施形態または実施形態の組み合わせにおいて、タンパク質顆粒の形成を植物において誘導する前記タンパク質は、プロラミン、好ましくはトウモロコシプロラミンである。
【００１９】
一実施形態または実施形態の組み合わせにおいて、前記プロラミンは、γゼイン、好ましくはトウモロコシγゼインである。
【００２０】
一実施形態または実施形態の組み合わせにおいて、ＤＮａｓｅはＤＮａｓｅ  Ｉである。
【００２１】
一実施形態または実施形態の組み合わせにおいて、ＤＮａｓｅはヒトＤＮａｓｅである。
【００２２】
一実施形態または実施形態の組み合わせにおいて、ＤＮａｓｅは組換えＤＮａｓｅである。
【００２３】
一実施形態または実施形態の組み合わせにおいて、ＤＮａｓｅは植物ＤＮａｓｅではない。
【００２４】
さらなる態様によれば、ＤＮａｓｅをコードする核酸配列、およびそれへ作動可能に連結された前記ＤＮａｓｅの転写を植物において調節する調節性ヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、または本質的になる核酸コンストラクトが提供される。
【００２５】
一実施形態または実施形態の組み合わせにおいて、前記核酸コンストラクトは、タンパク質顆粒の形成を植物において誘導するタンパク質であって、任意で１つまたは複数の天然に存在しない反復配列モチーフを含む前記タンパク質をコードする第１の核酸配列と；任意でアミノ酸リンカー中のペプチド結合が特異的に切断され得るアミノ酸リンカーをコードする第２の核酸配列と；ＤＮａｓｅをコードする第３の核酸配列と、前記第１の核酸配列、第２の核酸配列および第３の核酸配列の転写を植物において調節する調節性ヌクレオチド配列とを；前記核酸配列が互いに作動可能に連結されて、含む。
【００２６】
さらなる態様によれば、本明細書において記載される核酸配列を含む核酸コンストラクトが提供される。
【００２７】
さらなる態様によれば、核酸コンストラクトを含むベクターが提供される。
【００２８】
さらなる態様によれば、（ｉ）タンパク質顆粒の形成を植物において誘導するタンパク質をコードするアミノ酸配列と；（ｉｉ）任意で切断認識部位をコードするアミノ酸配列と；および（ｉｉｉ）ＤＮａｓｅをコードするアミノ酸配列とを含むか、それからなるか、または本質的になる融合タンパク質が提供される。
【００２９】
さらなる態様によれば、核酸コンストラクトまたはベクターまたは融合タンパク質を含む、植物またはそれに由来する植物材料が提供される。好適には、植物または植物材料は、形質転換またはインフィルトレーションされた植物または植物材料である。
【００３０】
さらなる態様によれば、融合タンパク質を含む植物タンパク質顆粒が提供される。
【００３１】
さらなる態様において、植物細胞においてＤＮａｓｅを産生および／または発現させるための、核酸配列または核酸コンストラクトまたはベクターの使用が提供される。
【００３２】
上記の他の態様の実施形態として、植物におけるＤＮａｓｅの産生のための方法（複数可）に関する上記の実施形態および実施形態の組み合わせを開示する。
【００３３】
本明細書において記載される方法を使用して、植物ベースの発現システムが容易にスケールアップ可能であるので、酵素の商業用産生のために特に有用な植物ベースの発現システムにおいてＤＮａｓｅを発現させることができる。
【００３４】
ＤＮａｓｅは融合タンパク質パートナーの使用なしで植物において高いレベルで発現され、したがって植物および植物からの酵素を取り込んだ産物の産生を可能にする。ＤＮａｓｅは、タンパク質顆粒の形成を植物において誘導するタンパク質をコードする核酸配列に融合した場合、効率的に発現される。融合タンパク質ベースの発現システムの使用は、植物材料からのＤＮａｓｅの回収および精製を支援することができるので、酵素の商業用産生のためにも特に有用である。
【００３５】
その中の１つまたは複数の天然に存在しない反復モチーフと協力してタンパク質顆粒の形成を植物において誘導するタンパク質をコードする核酸配列に融合した場合、ＤＮａｓｅはなお高いレベルで発現される。植物におけるＤＮａｓｅの発現量は、天然に存在しない反復モチーフ（複数可）の非存在と比較して、天然に存在しない反復モチーフ（複数可）の存在下において有意により高い。
【００３６】
タンパク質顆粒中での組換えＤＮａｓｅの効果的な発現は、植物において存在し得るタンパク質分解活性および酵素活性からタンパク質を保護する。
【００３７】
下流のＤＮａｓｅの回収および精製は、組換えＤＮａｓｅの調製のための現行のアプローチよりも単純でより低コストであり得る。
【００３８】
組換えＤＮａｓｅのアミノ酸配列は生来のタンパク質と中で実質的に同一であり得、臨床適用における使用に好適である。
【００３９】
定義
本出願の範囲内で使用される専門的な用語および表現は、概して植物生物学および分子生物学の関連技術において一般に適用される意味が与えられるべきである。すべての以下の用語の定義は本出願の内容全てに適用される。単語「含む」は他のエレメントまたは工程を除外せず、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は複数を除外するものではない。単一工程は、請求項中に記載された複数の特徴の機能を満たすことができる。「本質的に」、「約」、「近似的に」という用語および同種のものは、特に属性または値と関連して、正確な属性または正確な値もそれぞれ定義する。「約」という用語は、与えられた数の値または範囲の文脈において、与えられた値または範囲の２０％内、１０％内、または５％内にある値または範囲を指す。
【００４０】
「相同性、同一性または類似性」は、配列アラインメントによって比較された、２つのポリペプチドの間、または２つのポリヌクレオチド分子の間の配列類似性の程度を指す。比較される２つの個別のポリヌクレオチド配列の間の類似性の程度は、比較可能な位置での同一のヌクレオチドまたはマッチしているヌクレオチドの数の関数である。パーセント同一性の面から表わした類似性の程度は目視検査および数学的計算によって決定することができる。あるいは、２つのポリヌクレオチド配列のパーセント同一性は、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４）によって記載され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から利用可能なＧＡＰコンピュータープログラム（バージョン６．０）を使用して、配列情報を比較することによって決定できる。ＧＡＰプログラムのための典型的なデフォルトパラメータは以下のものを含む。（１）ヌクレオチドについての単項比較マトリックス（同一性について１および非同一性について０の値を含む）、およびＳｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆｆ編、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、３５３−３５８ページ、１９７９年によって記載されるようなＧｒｉｂｓｋｏｖ  ａｎｄ  Ｂｕｒｇｅｓｓ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の重み付き比較マトリックス；（２）各々のギャップについて３．０のペナルティ、および各々のギャップ中の各々のシンボルについて追加の０．１０のペナルティ；ならびに（３）エンドギャップについてのペナルティはない。あるいは配列比較の当業者に公知の様々なプログラムを利用することができる。
【００４１】
「上流」という用語は、直線状ポリヌクレオチド配列に沿った参照エレメントに関する相対的方向／位置を指し、ポリヌクレオチド配列の５’末端に向かう方向／位置を示す。「上流」は「参照エレメントの５’末端」と互換的に使用することができる。
【００４２】
「下流」という用語は、直線状ポリヌクレオチド配列に沿った参照エレメントに関する相対的方向／位置を指し、ポリヌクレオチド配列の３’末端に向かう方向／位置を示す。「下流」は「参照エレメントの３’末端」と互換的に使用することができる。
【００４３】
「断片」または「短縮」（例えば短縮されたタンパク質）は、被験体の翻訳後の酵素またはポリペプチドの少なくとも１つの構造的または機能的特徴を保持するポリペプチドのアミノ酸配列の任意の部分を含む。「融合タンパク質」は、異なるタンパク質からのペプチド配列が１つまたは複数のペプチド結合によってともに共有結合で連結されるタンパク質を含む。
【００４４】
「融合タンパク質パートナー」は、タンパク質顆粒の形成を植物において誘導する融合タンパク質のその部分を指す。
【００４５】
「作動可能に連結された」という用語は、機能的転写単位を産生する別個のＤＮＡエレメント、断片または配列の連結を指す。したがって好適には、前記ＤＮＡエレメント、断片または配列の転写を調節する調節配列は、その上流に配置される。
【００４６】
「精製する」および「単離する」という用語ならびにその文法的な変化形は、少なくとも１つの不純物を完全か部分的かにかかわらず混合物から分離または除去して、それによって組成物中のＤＮａｓｅの純度のレベルを改善することを意味するように使用される。
【００４７】
「形質転換」は、細胞の中への外来性遺伝物質の導入から生じた細胞の遺伝物質の変化を指す。多数の方法は、微粒子銃、遺伝子銃技法、アグロバクテリウム媒介性形質転換、ウイルスベクター媒介性形質転換および電気穿孔を含み、すべて本明細書に包含され、植物細胞の形質転換のための当該技術分野において利用可能である。トランスジェニック植物は、遺伝的に形質転換された植物細胞の再生によって作製することができる。
【００４８】
「アグロインフィルトレーション」または「インフィルトレーション」は、遺伝子の一過性発現を植物において誘導または所望されるタンパク質を産生する方法である。一態様において、技法は、植物葉の下側の中へアグロバクテリウム細胞の懸濁物を注入し、植物細胞へ所望される遺伝子を移行させることを含む。バキュームインフィルトレーションは、植物組織の中へ多数のアグロバクテリウム細胞を導入する他の方法である。この手順において、葉ディスク、葉または植物全体を懸濁物により容器中で沈め、容器を真空チャンバー中に置く。次いで真空を適用し、それにより空気が気孔を介して出る。真空が解放されるとき、圧力差により、懸濁物は気孔を介して植物組織の中へ入る。
【００４９】
「植物」という用語は、その生活環または発生の任意のステージでの任意の植物およびその子孫を指す。植物は、天然に存在する植物、突然変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物であり得るか、またはそれらに由来し得る。
【００５０】
「植物細胞」という用語は、植物の構造的および生理的な単位を指す。植物細胞は、細胞壁のないプロトプラスト、単離された単一細胞、培養された細胞、２つ以上の細胞の塊またはより高度に組織化された単位の一部としての形態（植物組織、植物器官または植物全体等であるがこれらに限定されない）であり得る。
【００５１】
「植物材料」という用語は、葉、茎、根、花もしくは花部、果実、花粉、卵子、接合子、種子、切り枝、分泌物、抽出物、細胞または組織培養を含む、植物または植物の他の部分もしくは産物から得られるかまたは得ることができる任意の固形物もしくは液体の組成物またはその組み合わせを指す。一実施形態において、植物材料は葉（緑色葉等）であるか、またはそれに由来する。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
ＤＮａｓｅをコードする核酸配列は、ＤＮａｓｅ、好ましくはＤＮａｓｅ  Ｉの核酸配列に対する実質的な相同性（すなわち配列類似性）または実質的な同一性を備えた核酸配列を包含する。一実施形態において、ＤＮａｓｅ  ＩはヒトＤＮａｓｅ  Ｉである。ヒトにおいて、ＤＮａｓｅ  Ｉの遺伝子は第１６染色体に位置し、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＧ＿００９２８５を有する。ＤＮａｓｅのバリアントに対する実質的な相同性（すなわち配列類似性）または実質的な同一性を備えたＤＮａｓｅのバリアントも包含される。本明細書において記載されるように、ＤＮａｓｅポリヌクレオチドのバリアントは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＧ＿００９２８５において報告された配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有することができる。ＤＮａｓｅバリアントは、ＤＮａｓｅタンパク質の生物学的および／または免疫学的な活性を提示するＤＮａｓｅ（その断片等）のバリアントであり得る。本明細書において使用される時、「ＤＮａｓｅタンパク質の生物学的活性」という語句は、ＤＮａｓｅ様のポリペプチドが、少なくとも１つの天然に存在するＤＮａｓｅタンパク質と実質的に同じかまたはそれに類似する少なくとも１つの生物学的活性を有することを意味する。本明細書において使用される時、「ＤＮａｓｅタンパク質の免疫学的活性」という語句は、天然に存在するＤＮａｓｅタンパク質に特異的な抗体とＤＮａｓｅ様のポリペプチドが交差反応する能力を指す。かかる抗体は、当該技術分野において容易に利用可能であり、当該技術分野において公知の方法を使用して、容易に調製することができる（例えば、カタログ＃  ＳＣ−３００５８下でＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから利用可能なヒトＤＮａｓｅ  Ｉに対する抗体）。ＤＮａｓｅのバリアントは生来のＤＮａｓｅタンパク質のアミノ酸に加えてアミノ酸を含んでもよいか、または生来のＤＮａｓｅタンパク質のすべてのアミノ酸を含まなくてもよい。バリアントは、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有し、それはサイレントな変化を生み、機能的に等価なタンパク質をもたし得る。物質の二次的結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性における類似性に基づいて、慎重なアミノ酸置換を行なうことができる。例えば、負に荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含み；正に荷電したアミノ酸は、リジンおよびアルギニンを含み；類似の親水性値を有する非荷電性極性頭部基を備えたアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンを含む。保存的置換は、例えば以下の表に従って行なうことができる。第２のカラムにおける同じブロック中のアミノ酸、および好ましくは第３のカラムにおける同じ行中のアミノ酸は、互いに置換することができる。
【００５３】
【表１】
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【００５４】
さらに、ポリペプチドは、成熟タンパク質または未成熟タンパク質または未成熟タンパク質に由来したタンパク質であり得る。かかるポリペプチドの例は、特性の改善（例えば、高保存安定性またはｉｎ  ｖｉｖｏの半減期の増加）を達成するＤＮａｓｅアミノ酸配列の修飾によって調製されているＤＮａｓｅポリペプチドの誘導体である。
【００５５】
一実施形態において、ＤＮａｓｅの核酸配列は植物における発現のために至適化されたコード配列であり、配列番号：１中に記載される配列を含むか、それからなるか、もしくは本質的になるか、またはそのバリアント、断片もしくはホモログである。一実施形態において、ＤＮａｓｅのアミノ酸配列は、配列番号：２中に記載される配列を含むか、それからなるか、もしくは本質的になるか、またはそのバリアント、断片もしくはホモログである。
【００５６】
これらのＤＮａｓｅ配列のバリアント、断片、ホモログおよび突然変異体は、本発明の範囲内に包含される。特に、ＤＮａｓｅのバリアントは当該技術分野において記載されている。一例として、ＤＮａｓｅ  Ｉのバリアントは、生来のヒトＤＮａｓｅ  Ｉと比較して、ＤＮＡ加水分解活性が増加し塩化ナトリウムにより阻害されにくい過活性バリアントを含む（例えば、ＵＳ２００５０１７０３６５を参照されたい）。ＤＮＡ加水分解活性が増加しているので、過活性バリアントは、一般的には、ＤＮＡの分解（消化）において生来のヒトＤＮａｓｅ  Ｉよりも粘液溶解活性が増加しより効果的であり、比較的多量のＤＮＡを含む肺分泌物を有する患者の治療において特に有用であり得る。したがって、活性増加を備えたかかるバリアント、好適には比較可能な条件下で決定されるように生来のヒトＤＮａｓｅ  Ｉよりも高い程度までＤＮＡを加水分解するＤＮａｓｅのバリアントは、本発明によって包含される。例えば、直線状ＤＮＡ消化アッセイを使用して、本明細書において記載されるようなＤＮＡ加水分解活性を決定することができる。かかる活性増加を有するバリアントは、比較可能な条件下で決定されるようなアッセイにおいて、生来のヒトＤＮａｓｅ  Ｉを超える活性を有するバリアントであるだろう。典型的には、過活性バリアントは、生来のヒトＤＮａｓｅよりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％または１００％以上高いＤＮＡ加水分解活性を有するだろう。
【００５７】
一実施形態において、ＤＮａｓｅは、それが発現される細胞とは異なる属または種に由来する。したがって、発現されるＤＮａｓｅおよび前記タンパク質が発現される細胞は異なる属または種からのものである。したがって、一実施形態において、タンパク質はヒトタンパク質であり、それが発現される細胞は植物である。言いかえれば、タンパク質は異なる属または種からのものであるので、通常そのタンパク質を発現しない細胞によって発現される。
【００５８】
本発明は、コードする核酸配列ＤＮａｓｅまたはその断片の使用を包含する。ＤＮａｓｅまたはＤＮａｓｅのバリアントをコードする限り、核酸配列は天然に存在するＤＮａｓｅに同一でなくてもよい。したがって、核酸配列は、ＤＮａｓｅの天然に存在するコード配列と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。好ましい実施形態において、本発明において使用されるＤＮａｓｅをコードする核酸配列は、植物におけるコドン使用に従って特定のコドンを代替のコドンと置換することによって、植物における発現のために至適化されている。
【００５９】
タンパク質顆粒の形成を植物において誘導するタンパク質をコードする核酸配列は、本発明の方法において使用することができる。タンパク質顆粒は、正確な折り畳みおよび生物学的活性を保持しながら真核細胞中で貯蔵タンパク質を細胞内で濃縮するように進化させた、特定の植物種子中に天然に存在する構造である。タンパク質顆粒は、細菌からの封入体の特徴のうちのいくつかを共有する。それらは高密度であり、疎水性相互作用によって緊密に充填された多量の凝集タンパク質を含む。貯蔵タンパク質は、シグナルペプチドを介して小胞体の内腔の中へ挿入することができ、小胞体由来タンパク質顆粒と呼ばれる特異的細胞内小器官を発達させている小胞体中で、またはタンパク質貯蔵液胞中でのいずれかで集合する。タンパク質顆粒の形成を植物において誘導するタンパク質の例は、貯蔵タンパク質または修飾された貯蔵タンパク質（プロラミンまたは修飾されたプロラミンまたはプロラミンドメイン等）を含む。γゼインはトウモロコシ貯蔵タンパク質であり、４つのトウモロコシプロラミンのうちの１つである。他の穀物プロラミンとして、αゼインおよびγゼインは粗面小胞体の細胞質側の膜結合型ポリソーム中で生合成され、内腔内で集合し、次いで小胞体由来タンパク質顆粒の中へ隔離される。
【００６０】
好適なプロラミンは、γゼイン、αグリアジン、コメｒＰ１３タンパク質およびトウモロコシαゼインの２２ｋＤａのＮ末断片を含むが、これらに限定されない。
【００６１】
一実施形態において、タンパク質顆粒の形成を植物において誘導するタンパク質はγゼインであり、以下の４つの特徴的なドメインからなる。ｉ）１９アミノ酸のペプチドシグナル、ｉｉ）８単位のヘキサペプチドＰＰＰＶＨＬを含む反復ドメイン（５３アミノ酸）、ｉｉｉ）プロリン残基が他のアミノ酸と交互にあるＰｒｏＸドメイン（２９アミノ酸）、およびｉｖ）疎水性システインリッチＣ末ドメイン。
【００６２】
１つまたは複数の天然に存在しない反復配列モチーフはγゼインの中へ取り込まれるかまたは置換することができ、植物細胞におけるＤＮａｓｅの発現量を改善することができる。天然に存在しない反復配列モチーフ（複数可）で置換した場合、反復ドメインもしくはＰｒｏＸドメインまたはこれらのドメインの両方が突然変異されて、天然に存在しない配列モチーフを生じる。反復配列は天然に存在しない配列モチーフであるので、生来のγゼイン（例えば生来のトウモロコシγゼイン）配列中に存在しないだろう。一実施形態において、天然に存在しない反復配列モチーフ（複数可）はγゼインの反復ドメインの中へ取り込まれるかまたは置換する。別の実施形態において、天然に存在しない反復配列モチーフ（複数可）はγゼインのＰｒｏＸドメインの中へ取り込まれる。別の実施形態において、天然に存在しない反復配列モチーフ（複数可）はγゼインの反復ドメインおよびＰｒｏＸドメインの中へ取り込まれる。好ましい実施形態において、天然に存在しない反復配列モチーフ（複数可）は、γゼインの反復ドメインおよびＰｒｏＸドメインから本質的になる断片の中で置換する。かかる断片の一例は、γゼインのアミノ酸残基の少なくとも２２〜１０９、２２〜１１０、２２〜１１１、２２〜１１２、２２〜１１３、２２〜１１４または２２〜１１５を含むか、それからなるか、または本質的になる。言いかえれば、融合タンパク質パートナーのＮ末は、γゼインのシグナルペプチドを含んで、前述のものにおいて記載されるような様々な置換を備えたγゼインの最初の１０５〜１１５アミノ酸を含む。
【００６３】
天然に存在しない反復配列モチーフの１つの例はＰＰＰＶＨＬ以外のモチーフである。天然に存在しない反復配列モチーフの他の非限定的例は、（ＰＰＰＶＡＬ）ｎもしくは（Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｌｅｕ）ｎ；（ＰＰＰＶＥＬ）ｎもしくは（Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ）ｎ；（ＰＰＰＡＰＡ）ｎもしくは（Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ）ｎ；および（ＰＰＰＥＰＥ）ｎもしくは（Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ）ｎまたはその２つ以上の組み合わせ、（式中、ｎ＝１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１５、１〜２０または１〜２５など）からなる群から選択される。好ましい実施形態において、ｎ＝７または８である。アラニンおよびグルタミン酸以外に、他のアミノ酸（スレオニン等であるがこれらに限定されない）を、プロリンリッチの天然に存在しない反復配列（例えば（ＰＰＰＶＴＬ））中で使用することができる。
【００６４】
別の実施形態において、２つ以上の異なる天然に存在しない反復配列モチーフの組み合わせを、反復ドメイン、ＰｒｏＸドメインまたは両方中で使用することができ、（ＰＰＰＶＡＬ）ｎおよび（ＰＰＰＶＥＬ）ｎ；または（ＰＰＰＡＰＡ）ｎおよび（ＰＰＰＥＰＥ）ｎ；または（ＰＰＰＶＡＬ）ｎおよび（ＰＰＰＶＥＬ）ｎおよび（ＰＰＰＡＰＡ）ｎ；または（ＰＰＰＶＥＬ）ｎおよび（ＰＰＰＡＰＡ）ｎおよび（ＰＰＰＥＰＥ）ｎ；または（ＰＰＰＶＡＬ）ｎおよび（ＰＰＰＶＥＬ）ｎおよび（ＰＰＰＡＰＡ）ｎおよび（ＰＰＰＥＰＥ）ｎ等である。
【００６５】
一実施形態において、γゼインの反復ドメイン中の（ＰＰＰＡＰＡ）ｎ配列は、配列番号：６中に記載される配列を含むか、それからなるか、または本質的になる。
【００６６】
一実施形態において、γゼインの反復ドメイン中の（ＰＰＰＥＰＥ）ｎ配列は、配列番号：７中に記載される配列を含むか、それからなるか、または本質的になる。
【００６７】
一実施形態において、γゼインの反復ドメイン中の（ＰＰＰＶＥＬ）ｎ配列は、配列番号：８中に記載される配列を含むか、それからなるか、または本質的になる。
【００６８】
一実施形態において、γゼインの反復ドメイン中の（ＰＰＰＶＡＬ）ｎ配列は、配列番号：９中に記載される配列を含むか、それからなるか、または本質的になる。
【００６９】
一実施形態において、γゼインの反復ドメイン中の（ＰＰＰＶＴＬ）ｎ配列は、配列番号：１０中に記載される配列を含むか、それからなるか、または本質的になる。
【００７０】
一実施形態において、γゼインのＰｒｏＸドメイン中の（ＰＰＰＡＰＡ）ｎ配列は、配列番号：１１中に記載される配列を含むか、それからなるか、または本質的になる。
【００７１】
一実施形態において、γゼインのＰｒｏＸドメイン中の（ＰＰＰＥＰＥ）ｎ配列は、配列番号：１２中に記載される配列を含むか、それからなるか、または本質的になる。
【００７２】
天然に存在しない反復配列モチーフ（複数可）は、γゼインの反復ドメインおよび／またはＰｒｏＸドメインの５’末端または３’末端に配置することができる。天然に存在しない反復配列モチーフ（複数可）は、γゼインの反復ドメインおよび／またはＰｒｏＸドメインの５’末端および３’末端に配置することができる。好適な実施形態において、天然に存在しない反復配列モチーフ（複数可）は、γゼインの反復ドメインおよび／または、ＰｒｏＸドメイン内に配置される。好適には、前記植物細胞は、融合タンパク質をコードする核酸の非存在下においてタンパク質顆粒を産生しない。
【００７３】
好適には、タンパク質顆粒誘導配列は、融合タンパク質を植物細胞の小胞体に向けて導くペプチドをコードする配列をさらに含む。ペプチドは多くの場合リーダー配列またはシグナルペプチドと呼ばれ、融合タンパク質が発現される同じ植物または異なる植物からのものであり得る。シグナルペプチドの例は１９残基のγゼインシグナルペプチド配列（ＷＯ２００４００３２０７を参照されたい）；１９残基のαグリアジンのシグナルペプチド配列または２１残基のγグリアジンシグナルペプチド配列（例えば、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（１９９３）５：４４３−４５０およびＥＭＢＯ  Ｊ（１９８４）３（６），１４０９−１１４１５を参照されたい）である。同様に機能する他の植物からのシグナルペプチドも文献中で報告される。シグナルペプチドはγゼインおよび／またはデオキシリボヌクレアーゼに対する天然のシグナルペプチドであり得る。シグナルペプチドをコードする核酸は、タンパク質のＮ末またはＣ末で発現されるように核酸コンストラクト中に配置され得る。一実施形態において、シグナルペプチドはＮ末で発現される。
【００７４】
γゼインに対する実質的な相同性（すなわち配列類似性）または実質的な同一性を備えたバリアントも本明細書中に包含される。γゼインポリヌクレオチドのバリアントは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１１１８８４において報告された配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有することができる。この用語は、γゼインに対する実質的な相同性（すなわち配列類似性）または実質的な同一性を備えたγゼインの断片も包含する。γゼインバリアントは、γゼインの生物学的および／または免疫学的な活性を提示するバリアントであり得る。本明細書において使用される時、「γゼインの生物学的活性」という語句は、γゼインバリアントが、天然に存在するγゼインと実質的に同じかまたはそれに類似する少なくとも１つの生物学的活性を有することを意味する。本明細書において使用される時、「γゼインの免疫学的活性」という語句は、天然に存在するγゼインに特異的な抗体とγゼインバリアントが交差反応する能力を指す。γゼインのバリアントは生来のγゼインタンパク質のアミノ酸に加えてアミノ酸を含んでもよいか、または生来のγゼインタンパク質のすべてのアミノ酸を含まなくてもよい。バリアントは、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有し、それはサイレントな変化を生み、機能的に等価なタンパク質をもたらし得る。物質の二次的結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性における類似性に基づいて、慎重なアミノ酸置換を行なうことができる。例えば、負に荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含み；正に荷電したアミノ酸は、リジンおよびアルギニンを含み；類似の親水性値を有する非荷電性極性頭部基を備えたアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンを含む。保存的置換は、例えば以下の表に従って行なうことができる。第２のカラムにおける同じブロック中のアミノ酸、および好ましくは第３のカラムにおける同じ行中のアミノ酸は、互いに置換することができる。
【００７５】
【表２】
2014502497.tif 000003
【００７６】
γゼインはγゼインタンパク質の断片であり得、前記断片はタンパク質顆粒の形成を植物において誘導するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。したがって、一例として、γゼインは、タンパク質γゼインの反復ドメインのすべてもしくは一部またはＰｒｏＸドメインのすべてもしくは一部をコードし得る。
【００７７】
一実施形態において、タンパク質顆粒の形成を植物において誘導するタンパク質はトウモロコシγゼインである。
【００７８】
別の実施形態において、タンパク質顆粒の形成を植物において誘導するタンパク質は、配列番号：３中に記載される核酸配列を含むか、またはそのバリアント、断片もしくホモログである。
【００７９】
別の実施形態において、タンパク質顆粒の形成を植物において誘導するタンパク質は、配列番号：４中に記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそのバリアント、断片もしくホモログである。
【００８０】
別の実施形態において、γゼインの断片のアミノ酸配列は、配列番号：５中に記載される配列を含むか、またはそのバリアント、断片もしくはホモログである。
【００８１】
好適には、前記植物細胞は、融合タンパク質をコードする核酸の非存在下においてタンパク質顆粒を産生しない。
【００８２】
好適には、核酸配列は、ＤＮａｓｅおよびγゼインを含む融合タンパク質が植物細胞において発現されるように、互いに作動可能に連結される。一実施形態において、核酸分子は、５’末端でＤＮａｓｅおよび３’末端でγゼインを含む。別の実施形態において、核酸分子は、３’末端でＤＮａｓｅおよび５’末端でγゼインを含む。
【００８３】
好適には、核酸分子は、タンパク質顆粒の形成を植物において誘導する核酸配列とＤＮａｓｅをコードする核酸配列との間にリンカー配列を含む。前記リンカー配列はそれに作動可能に連結することができる。一実施形態において、リンカー配列は、アミノ酸リンカー中の１つまたは複数のペプチド結合が特異的に切断され得るアミノ酸リンカーをコードする。したがって、それは、互いから２つのタンパク質を分離することができるように、酵素またはインテインおよび同種のもののための認識部位として機能することができる。リンカーは、１つまたは複数のペプチド結合を切断できる任意の構成要素によって特異的に切断することができる。有利なことには、リンカーは融合タンパク質からのＤＮａｓｅの分離を可能にし、続いて所望されるならばＤＮａｓｅの精製を可能にし、それによって実質的に均質の組換えＤＮａｓｅタンパク質が提供される。好適には、ＤＮａｓｅは内部で切断されず、したがってＤＮａｓｅの所望されない断片は生じない。好適には、ＤＮａｓｅは、３、２または１以下の残存するアミノ酸がＤＮａｓｅのＮ末またはＣ末で残るように切断される。好適には、ＤＮａｓｅは、残存するアミノ酸がＤＮａｓｅのＮ末またはＣ末で残らないように切断される。一実施形態において、エンテロキナーゼはＤＮａｓｅを内部で切断するので、融合タンパク質はエンテロキナーゼで切断されない。
【００８４】
融合タンパク質を切断してＤＮａｓｅを放出する好ましい方法は、融合パートナーのＮ末がアミノ酸リンカーを介してＤＮａｓｅのＣ末へ連結され、アミノ酸リンカー中でその中のペプチド結合は特異的に切断することができ、アミノ酸リンカーは融合タンパク質中の他のところに現われないようなやり方で融合タンパク質をデザインすることである。このアプローチは、特異的アミノ酸配列（特異的認識配列等）への参照によって切断手段を選択することができるという長所を有する。リンカーは、１つまたは複数のペプチド結合の特異的切断を導くのに必要な絶対最小値以上の配列を含むことができる。リンカーは２つの核酸配列の間の結合の結果として生成することができる。この実施形態において、各々の配列は、ライゲーションされて切断可能リンカー（切断可能認識部位等）を形成できる多数のヌクレオチドを含む。
【００８５】
プロテアーゼを使用してリンカー中の１つまたは複数のペプチド結合を特異的に切断することができる。プロテアーゼはＡｌａ−Ｃエンドプロテアーゼであり得る。別の実施形態において、プロテアーゼは黄色ブドウ球菌のプロテアーゼＶ８として公知のＧｌｕ−Ｃエンドプロテアーゼである。このプロテアーゼは、グルタミン酸残基のＣ末ペプチド結合を選択的に切断するセリンプロテアーゼである。プロテアーゼは、グルタミン酸残基よりも１００〜３００倍遅い速度でアスパラギン酸残基で切断する。別の実施形態において、プロテアーゼはＴＥＶプロテアーゼである。ＴＥＶプロテアーゼは、タバコエッチウイルス中で見出される高度に部位特異的システインプロテアーゼである。このプロテアーゼの至適切断認識部位は配列Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）であり、切断はＧｌｎ及びＧｌｙ／Ｓｅｒ残基との間で起こる。
【００８６】
したがって、好適なリンカーの非限定的例は、Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）、（Ｇｌｙ）ｘ（式中ｘは２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上である）、または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｙ（式中ｙは２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上である）を含む。一実施形態において、リンカーは（Ｇｌｙ）４である。別の実施形態において、リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である。さらなる実施形態において、ＤＮａｓｅをコードする配列は、前記リンカーの３’末端に位置する。
【００８７】
他の実施形態によれば、タンパク質分解によらない手段を２つのタンパク質の分離に使用することができる。したがって、例えば、インテインは使用することができる。多様な異なるインテインは当該技術分野において公知であり、切断は定義された条件（還元条件等）下で誘導され得る。したがって一実施形態によれば、アミノ酸リンカーはインテインをコードすることができる。インテインは、例えば様々な細菌種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属の種またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｅｎｏｐｉ等のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の種等）に由来するものであり得る。インテインは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の種から由来する、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの液胞膜ＡＴＰａｓｅインテインであり得る。一実施形態において、インテインはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｅｎｏｐｉジャイレースＡインテインである。化学物質も融合タンパク質からのＤＮａｓｅの分離に使用することができ、その事例においてアミノ酸リンカーは必要とされなくてもよい。
【００８８】
本明細書において記載される核酸およびアミノ酸配列は植物に至適化された配列であり得る。
【００８９】
さらなる実施形態によれば、本発明の方法で使用される核酸コンストラクトは、（ｉ）タンパク質顆粒の形成を植物において誘導するタンパク質であって、任意で１つまたは複数の天然に存在しない反復配列モチーフを含む前記タンパク質をコードする第１の核酸配列と；任意でアミノ酸リンカー中のペプチド結合が特異的に切断され得るアミノ酸リンカーをコードする第２の核酸配列と；ＤＮａｓｅをコードする第３の核酸配列と；（ｉｉ）前記核酸配列の転写を調節する調節性ヌクレオチド配列とを含み、前記配列は互いに任意で作動可能に連結される。
【００９０】
したがって、前記核酸配列の転写を調節する様々な調節性ヌクレオチド配列も含まれ得る。これらは、栄養組織または生殖組織において等の植物発生の間の特異的時間の特定の細胞または組織においてのみ活性のある転写制御エレメントを含む。以下で記載されるように、かかるプロモーターは誘導可能プロモーターであり得る。１つのかかる例は、典型的には上流に配置され、二本鎖ＤＮＡ断片に作動可能に連結されるポリヌクレオチドエレメント／配列を指すプロモーターである。好適なプロモーターは、転写複合体（ＲＮＡポリメラーゼおよび様々な因子を含む）の動員によって核酸配列の転写を活性化してＲＮＡ合成の開始を可能にするだろう。プロモーターは生来の遺伝子に近位の領域に完全に由来し得るか、または異なる生来のプロモーターに由来する異なるエレメントまたは合成ＤＮＡセグメントから構成され得る。一実施形態によれば、組織特異的発現を使用することができ、特定の組織における１つまたは複数のポリヌクレオチドの発現が好ましいとき有利だろう。発生調節下の組織特異的プロモーターの例は、栄養組織（例えば根または葉）または生殖組織（果実、胚珠、種子、花粉、雌蕊、花または任意の胚組織等）等の特定の組織のみ（または主にその組織のみ）における転写を開始することができるプロモーターを含む。生殖組織に特異的プロモーターは、例えば、葯特異的、胚珠特異的、胚特異的、内乳特異的、珠皮特異的、種子および種子外皮特異的、花粉特異的、花弁特異的、萼片特異的、またはその組み合わせであり得る。好適な葉特異的プロモーターは、Ｃ４植物（トウモロコシ）からのピルビン酸正リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）プロモーター、トウモロコシからのｃａｂ−ｍ１Ｃａ＋２プロモーター、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのｍｙｂ関連遺伝子プロモーター（Ａｔｍｙｂ５）、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ（ＲＢＣＳ）プロモーター（例えば、葉および光生育実苗において発現されるトマトＲＢＣＳ  １、ＲＢＣＳ２およびＲＢＣＳ３Ａ遺伝子、発達中のトマト果実において発現されるＲＢＣＳ１およびＲＢＣＳ２また葉身および葉鞘における葉肉細胞においては高いレベルでほとんどもっぱら発現されるリブロース二リン酸カルボキシラーゼプロモーター）を含む。好適な老化特異的プロモーターは、果実の成熟、老化、および葉の離脱の間に活性のあるトマトプロモーター、システインプロテアーゼをコードする遺伝子のトウモロコシプロモーターを含む。好適な葯特異的プロモーターを使用することができる。当業者に公知の好適な根に優先的なプロモーターを選択することができる。好適な種子に優先的なプロモーターは、種子特異的プロモーター（種子貯蔵タンパク質のプロモーター等の種子発生の間に活性のあるそれらのプロモーター）、および種子発芽プロモーター（種子発芽の間に活性のあるそれらのプロモーター）の両方を含む。かかる種子に優先的なプロモーターは、Ｃｉｍ１（サイトカイニン誘導メッセージ）；ｍｉｌｐｓ（ミオイノシトール−１−リン酸シンターゼ）；Ｚｍ−４０としても公知のｍＺＥ４０−２；ｎｕｃｌｃ；およびｃｅｌＡ（セルロース合成酵素）を含むが、これらに限定されない。Ｇｌｏｂ−１は胚特異的プロ��ーターである。双子葉植物については、種子特異的プロモーターは、マメβファセオリン、ナピン、βコングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリンおよび同種のものを含むが、これらに限定されない。単子葉植物については、種子特異的プロモーターは、トウモロコシ１５ｋＤａゼインプロモーター、２２ｋＤａゼインプロモーター、２７ｋＤａゼインプロモーター、ｇゼインプロモーター、２７ｋＤａγゼインプロモーター（ｇｚｗ６４Ａプロモーター等、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｓ７８７８０を参照）、ｗａｘｙプロモーター、シュランケン１プロモーター、シュランケン２プロモーター、グロブリン１プロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｌ２２３４４を参照）、Ｉｔｐ２プロモーター、ｃｉｍ１プロモーター、トウモロコシｅｎｄ１およびｅｎｄ２プロモーター、ｎｕｃ１プロモーター、Ｚｍ４０プロモーター、ｅｅｐ１およびｅｅｐ２；ｌｅｃ１、チオレドキシンＨプロモーター；ｍｌｉｐ１５プロモーター、ＰＣＮＡ２プロモーター；ならびにシュランケン２プロモーターを含むが、これらに限定されない。誘導可能プロモーターの例は、病原体攻撃、嫌気条件、高温、光、渇水、低温または高塩濃度に応答性のプロモーターを含む。病原体誘導可能プロモーターは病原性関連タンパク質（ＰＲタンパク質）からのものを含み、病原体による感染に続いて誘導される（例えばＰＲタンパク質、ＳＡＲタンパク質、β−１，３−グルカナーゼ、キチナーゼ）。
【００９１】
植物プロモーターに加えて、他の好適なプロモーターは、細菌起源（例えば、オクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーターおよびＴｉプラスミドに由来する他のプロモーター）に由来し得るか、またはウイルスプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓおよび１９Ｓ  ＲＮＡプロモーター、タバコモザイクウイルスの構成的プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓおよび３５Ｓプロモーター、またはゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）に由来し得る。調節配列は植物において機能的な転写終結配列も含むことができる。調節配列は植物において機能的な翻訳エンハンサーも含むことができる。エンハンサーは、転写調節タンパク質（転写アクチベーター等）を動員して、プロモーター活性の増加によって転写活性化を促進することができる核酸配列である。好適なエンハンサーは、対象となる生来のプロモーターに近位の領域（相同なソース）に由来することができるか、または非生来のコンテキスト（異種のソース）に由来することができ、対象となる任意のプロモーターに作動可能に連結してプロモーターの活性または組織特異性を促進する。いくつかのエンハンサーは転写単位の向きに関して任意の向きで作動させることができる。例えば、エンハンサーは、プロモーターおよび核酸コンストラクトを含む転写単位の上流または下流に配置することができる。
【００９２】
一実施形態において、ＤＮａｓｅは植物の葉において発現される。
【００９３】
別の実施形態において、植物または植物材料（葉等）は、少なくとも導入の５、６または７日後に収穫される。
【００９４】
核酸配列、核酸コンストラクトまたはベクターおよび同種のものは、さらなる実施形態において、例えばウイルス起源の遺伝子サイレンシングの抑制因子をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、遺伝子サイレンシングの抑制因子は、ハーフェル川ウイルス（ＨａＲＶ）、西洋ナシ潜在ウイルス（ＰｅＬＶ）、トルコギキョウ壊死ウイルス、ブドウアルジェリア潜在ウイルス、テンジクアオイ壊死スポットウイルス（ＰｅＮＳＶ）、シンビジウムリングスポットウイルス（ＣｙｍＲＳＶ）、アーティチョークモトルドクリンクルウイルス（ｍｏｔｔｌｅｄ  ｃｒｉｎｋｌｅ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＭＣＶ）、カーネーションイタリアンリングスポットウイルス（ＣＩＲＶ）、レタス壊死スタントウイルス、コメ黄色斑紋ウイルス（ＲＹＭＶ）、ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）、アフリカンキャッサバモザイクウイルス（ＡＣＭＶ）、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）、キュウリ壊死ウイルス（ＣＮＶ）、ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、およびトマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）またはその２つ以上の組み合わせからなる群から選択されるウイルスのものである。本発明において使用することができる遺伝子サイレンシングの抑制因子の例は、コメ黄色斑紋ウイルス（ＲＹＭＶ）のｐ１タンパク質、ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）のｐ２５タンパク質、アフリカンキャッサバモザイクウイルス（ＡＣＭＶ）のＡＣ２タンパク質、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の２ｂタンパク質、キュウリ壊死ウイルス（ＣＮＶ）の１９ｋＤａのｐ１９タンパク質、ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）およびトマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）のヘルパー成分プロテイナーゼ（ＨｃＰｒｏ）を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、遺伝子サイレンシングの抑制因子はタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）のＨｃＰｒｏである。別の実施形態において、遺伝子サイレンシングの抑制因子はトマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）のｐ１９タンパク質である。したがってさらなる実施形態において、タンパク質顆粒の形成を植物において誘導するタンパク質をコードし、任意で天然に存在しない反復配列モチーフをコードする核酸配列をさらに含む第１の核酸配列と；ＤＮａｓｅをコードする第２の核酸配列と；任意でアミノ酸リンカー中のペプチド結合が特異的に切断され得るアミノ酸リンカーをコードする第３の核酸配列とを；前記第１の核酸配列、第２の核酸配列および第３の核酸配列が互いに作動可能に連結されて、含み、任意で前記核酸配列（複数可）の転写を調節する調節性ヌクレオチド配列および任意で好適にはウイルス起源の遺伝子サイレンシングの抑制因子をコードする発現可能な核酸を含む、核酸コンストラクトが提供される。代替の実施形態において、遺伝子サイレンシングの抑制因子をコードする発現可能な核酸は、植物または植物細胞に導入され、ＤＮａｓｅも産生している植物または植物細胞において共発現される、分離した第２の核酸分子または第２の核酸の一部であり得る。
【００９５】
組換えＤＮａｓｅの発現のために使用される植物宿主細胞は、植物に由来または由来可能であり得るか、または植物の外部で培養された培養植物細胞であり得る。したがって一実施形態において、植物は、植物細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長させた植物細胞または細胞のクランプ等の培養でまたは植物の外部で成長させた植物細胞等）である。植物の非限定例は、単子葉植物および双子葉植物（作物植物、観賞植物、および非栽培植物または野生植物等）を含む。さらなる例は、作物植物（特にヒト食品または動物食物のために使用される作物植物）、木材またはパルプを産生する樹木、野菜植物、果実植物および観賞植物等の商業用または農業用に興味を持たれる植物を含む。
【００９６】
植物（単子葉植物および双子葉植物等）の中への１つまたは複数の核酸分子の導入（例えば、形質転換またはインフィルトレーション）のための技法は、当該技術分野において公知である。任意の方法を使用して、植物の中へ核酸分子（複数可）、ベクター、コンストラクトおよび同種のものを導入することができる。一例として、それらは、コンストラクト（複数可）によりコートし微粒子を用いる微粒子銃または遺伝子銃の技法、アグロバクテリウム媒介性形質転換（例えば、Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ、Ａ．ｒｕｂｉまたはＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用して）、ウイルスベクター媒介性形質転換、電気穿孔およびアグロバクテリウム細胞によるインフィルトレーション（アグロインフィルトレーションとも称される）によって植物の中へ導入することができる。一実施形態において、植物細胞のアグロバクテリウム媒介性形質転換が使用される。別の実施形態において、アグロインフィルトレーションを使用して、植物全体、インタクトな植物またはその一部の中へ核酸を導入する。アグロインフィルトレーションは当該技術分野において公知の技法および機器によって減圧または真空下で実行することができる。
【００９７】
植物の中への核酸の導入は、核酸によってコードされたタンパク質の安定した発現を生じ得る。典型的には、安定した発現は、トランスジェニック植物を生じるように宿主ゲノムの中への核酸の組み込みをもたらし、核酸は次世代に受け渡されるだろう。植物の中への核酸の導入は、核酸によってコードされたタンパク質の一過性発現を生じ得る。一過性発現は、必ずしも宿主ゲノムの中への核酸の組み込みに依存しない。典型的には、組換えにより産生されたタンパク質を回収するために植物部分が収穫される前に、アグロバクテリウム細胞によりインフィルトレーションしたタバコ植物を、５、１０、１５、または２０日以上の間インキュベーションする。発現の両方の形態は本発明によって意図される。
【００９８】
任意で選択可能なマーカー遺伝子を用いるならば、核酸が導入された植物をインキュベーションし、選択下で子孫を得ることができる。これらの子孫を使用してトランスジェニック種子を調製するか、またはあるいは他の植物と交配することができる。かかる子孫から得られた種子を、発芽させ、培養し、もともと導入された核酸を含む子孫の後続の世代の調製に使用することができる。植物からの未成熟胚または胚発生カルスを出発材料として使用することができる。これらの技法は当業者にルーチンかつ周知である。一旦植物が成熟すれば、次いでヌクレオチド配列が発現される組織は収穫され、本明細書において記載される方法を使用してそれから回収される。いくつかの実施形態において、植物の中へ核酸を導入する方法は植物をより健全でなくし、その場合にはその生存を延長しようとする条件下で植物をインキュベーションすることが所望され得る。いくつかの実施形態によれば、核酸の導入後の５、１０、１５、または２０日以上後に植物組織を収穫することが所望されるだろう。
【００９９】
例えば、安定した植物形質転換は以下のように実行することができる。ベクターはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの中へ移行される。タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａまたはＮ．ｔａｂａｃｕｍ）の葉片を、Ｄｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｄｒａｐｅｒ，Ｊ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｒ．、Ａｒｍｉｔａｇｅ，Ｐ．およびＷａｌｄｅｎ，Ｒ．編）、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ中の方法に従って形質転換する。再生させた植物を２００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む培地上で選択し、温室へ移行させる。最も高い導入遺伝子産物レベルを有する形質転換されたタバコ植物を培養して、Ｔ１世代を得る。発達した葉（約１２ｃｍ長）を収穫し、直ちに液体窒素により凍結し、追加実験のために−８０℃で保存する。
【０１００】
植物宿主細胞は、穀類作物植物（コムギ、カラスムギ、オオムギ、トウモロコシ、ライムギ、ライコムギ、コメ、キビ、ソルガム、キノア、アマランサスおよびソバ等）；飼料作物植物（アルファルファ、カラスノエンドウ、クローバおよび同種のものを含む飼料用草および飼料用双子葉植物等）；脂肪種子作物植物（綿、ベニバナ、ヒマワリ、ダイズ、キャノーラ、ナタネ、アマ、ピーナッツおよびアブラヤシ等）；樹木の木の実（クルミ、カシュー、ヘーゼルナッツ、ピーカン、アーモンドおよび同種のもの等）；サトウキビ、ココナッツ、ナツメヤシ、オリーブ、テンサイ、茶およびコーヒー；木材またはパルプを産生する樹木；マメ科植物（例えばマメ、エンドウ、ヒラマメ、アルファルファ、ピーナッツ）、レタス、アスパラガス、アーティチョーク、セロリ、ニンジン、ラディッシュ、アブラナ科植物（例えばキャベツ、ケール、カラシナおよび他の葉が多いアブラナ科植物、ブロッコリ、カリフラワー、メキャベツ、カブ、コールラビ）、ウリ科植物（例えばキュウリ、メロン、夏カボチャ、冬カボチャ）、ネギ科植物（例えばタマネギ、ニンニク、リーキ、エシャロット、チャイブ）、ナス科植物のメンバー（例えばトマト、ナス、ジャガイモ、コショウ、ホオズキ）、およびアカザ科の植物のメンバー（例えばビート、フダンソウ、ホウレンソウ、キノア、アマランサス）；リンゴ、西洋ナシ、柑橘類（例えばオレンジ、ライム、レモン、グレープフルーツおよび他のもの）、核果（例えばアプリコット、モモ、プラム、ネクタリン）、バナナ、パイナップル、ブドウ、キーウィフルーツ、パパイア、アボカドおよびベリー等の果実作物植物；ならびに観賞用顕花植物、観賞用樹木および低木、観賞用地被植物ならびに観賞用草を含む観賞用植物であり得る。双子葉植物のさらなる例は、キャノーラ、綿、ジャガイモ、キノア、アマランサス、ソバ、ベニバナ、ダイズ、テンサイおよびヒマワリ、より好適にはダイズ、キャノーラおよび綿を含むが、これらに限定されない。単子葉植物のさらなる例は、コムギ、カラスムギ、オオムギ、トウモロコシ、ライムギ、ライコムギ、コメ、観賞用草および飼料草、ソルガム、キビならびにサトウキビを含むが、これらに限定されない。
【０１０１】
植物宿主細胞は、以下の科のうちの１つからの種を含む単子葉植物もしくは双子葉植物またはそれらの植物細胞システムであり得るかまたはそれらに由来し得る。Ａｃａｎｔｈａｃｅａｅ、Ａｌｌｉａｃｅａｅ、Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａｃｅａｅ、Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ、Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ、Ａｒｅｃａｃｅａｅ、Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ、Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ、Ｂｉｘａｃｅａｅ、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ、Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ、Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ、Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ、Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘａｃｅａｅ、Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ、Ｃｏｌｃｈｉｃａｃｅａｅ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ、Ｅｐｈｅｄｒａｃｅａｅ、Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌａｃｅａｅ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ、Ｆａｂａｃｅａｅ、Ｌａｍｉａｃｅａｅ、Ｌｉｎａｃｅａｅ、Ｌｙｃｏｐｏｄｉａｃｅａｅ、Ｍａｌｖａｃｅａｅ、Ｍｅｌａｎｔｈｉａｃｅａｅ、Ｍｕｓａｃｅａｅ、Ｍｙｒｔａｃｅａｅ、Ｎｙｓｓａｃｅａｅ、Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ、Ｐｉｎａｃｅａｅ、Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｃｅａｅ、Ｐｏａｃｅａｅ、Ｒｏｓａｃｅａｅ、Ｒｕｂｉａｃｅａｅ、Ｓａｌｉｃａｃｅａｅ、Ｓａｐｉｎｄａｃｅａｅ、Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ、Ｔａｘａｃｅａｅ、Ｔｈｅａｃｅａｅ、またはＶｉｔａｃｅａｅ。
【０１０２】
好適な種は、属、Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ、Ａｂｉｅｓ、Ａｃｅｒ、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、Ａｌｌｉｕｍ、Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ、Ａｎａｎａｓ、Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ、Ａｒｕｎｄｏ、Ａｔｒｏｐａ、Ｂｅｒｂｅｒｉｓ、Ｂｅｔａ、Ｂｉｘａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ、Ｃａｍｅｌｌｉａ、Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ、Ｃａｎｎａｂｉｓ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ、Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ、Ｃｉｎｃｈｏｎａ、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ、Ｃｏｆｆｅａ、Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ、Ｃｏｌｅｕｓ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｄａｔｕｒａ、Ｄｉａｎｔｈｕｓ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ、Ｅｌａｅｉｓ、Ｅｐｈｅｄｒａ、Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ、Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｇａｌａｎｔｈｕｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｈｅｖｅａ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、Ｊａｔｒｏｐｈａ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｌｉｎｕｍ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｌｕｐｉｎｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｍｅｎｔｈａ、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ、Ｍｕｓａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｏｒｙｚａ、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐａｐａｖｅｒ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ、Ｐｅｔｕｎｉａ、Ｐｈａｌａｒｉｓ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｉｎｕｓ、Ｐｏａ、Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ、Ｐｏｐｕｌｕｓ、Ｒａｕｗｏｌｆｉａ、Ｒｉｃｉｎｕｓ、Ｒｏｓａ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｓａｌｉｘ、Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ、Ｓｃｏｐｏｌｉａ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｓｐａｒｔｉｎａ、Ｓｐｉｎａｃｅａ、Ｔａｎａｃｅｔｕｍ、Ｔａｘｕｓ、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ、Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｕｎｉｏｌａ、Ｖｅｒａｔｒｕｍ、Ｖｉｎｃａ、Ｖｉｔｉｓ、およびＺｅａのメンバーを含み得る。
【０１０３】
他の好適な種は、Ｐａｎｉｃｕｍ属の種、Ｓｏｒｇｈｕｍ属の種、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ属の種、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属の種、Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ属の種、Ｐｏｐｕｌｕｓ属の種、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ  ｇｅｒａｒｄｉｉ（ビッグブルーステム）、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ（エレファントグラス）、Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ（クサヨシ）、Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｄａｃｔｙｌｏｎ（バミューダグラス）、Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ（ヒロハノウシノケグサ）、Ｓｐａｒｔｉｎａ  ｐｅｃｔｉｎａｔａ（プレーリーコードグラス）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ（アルファルファ）、Ａｒｕｎｄｏ  ｄｏｎａｘ（ダンチク）、Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ（ライムギ）、Ｓａｌｉｘ属の種（ヤナギ）、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ属の種（ユーカリ）、Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ（コムギ）、タケ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ（ヒマワリ）、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ（ベニバナ）、Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ（ジャトロファ）、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（キャスター）、Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ（ヤシ）、Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ（アマ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（テンサイ）、Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ（キャッサバ）、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（トマト）、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ（レタス）、Ｍｕｓａ  ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ（バナナ）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ジャガイモ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ（ブロッコリ、カリフラワー、メキャベツ）、Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ（茶）、Ｆｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎａｓｓａ（イチゴ）、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ（ココア）、Ｃｏｆｆｅａアラビカ（コーヒー）、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ（ブドウ）、Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ（パイナップル）、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｍ（トウガラシおよび甘トウガラシ）、Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ（タマネギ）、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ（メロン）、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ（キュウリ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａ（西洋カボチャ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ（西洋カボチャ）、Ｓｐｉｎａｃｅａ  ｏｌｅｒａｃｅａ（ホウレンソウ）、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ（スイカ）、Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ（オクラ）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ（ナス）、Ｒｏｓａ属の種（バラ）、Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ（カーネーション）、Ｐｅｔｕｎｉａ属の種（ペチュニア）、Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ（ポインセチア）、Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ（ルピナス）、Ｕｎｉｏｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（カラスムギ）、ベントグラス（Ａｇｒｏｓｔｉｓ属の種）、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ（アスペン）、Ｐｉｎｕｓ属の種（マツ）、Ａｂｉｅｓ属の種（モミ）、Ａｃｅｒ属の種（モミジ）、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ（オオムギ）、Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ（ブルーグラス）、Ｌｏｌｉｕｍ属の種（ライグラス）およびＰｈｌｅｕｍ  ���ｒａｔｅｎｓｅ（オオアワガエリ）、Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ（スイッチグラス）、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ（ソルガム、スーダングラス）、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ（ススキ）、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属の種（エネルギー用サトウキビ）、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ（ポプラ）、Ｚｅａ  ｍａｙｓ（トウモロコシ）、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（ダイズ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（キャノーラ）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ（コムギ）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ（綿）、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（コメ）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ（ヒマワリ）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ（アルファルファ）、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（テンサイ）またはＰｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ（トウジンヒエ）を含み得る。
【０１０４】
特に好適な実施形態において、宿主植物は、天然に存在する植物、突然変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニックタバコ植物であり得るか、またはそれらに由来し得る。タバコ植物は、属Ｎｉｃｏｔｉａｎａの植物、およびＮ．ｒｕｓｔｉｃａおよび／またはＮ．ｔａｂａｃｕｍを含むＮｉｃｏｔｉａｎａ属の様々な種を含む。他の種は、Ｎ．ａｃａｕｌｉｓ、Ｎ．ａｃｕｍｉｎａｔａ、Ｎ．ａｃｕｍｉｎａｔａ多花性変種、Ｎ．ａｆｒｉｃａｎａ、Ｎ．ａｌａｔａ、Ｎ．ａｍｐｌｅｘｉｃａｕｌｉｓ、Ｎ．ａｒｅｎｔｓｉｉ、Ｎ．ａｔｔｅｎｕａｔａ、Ｎ．ｂｅｎａｖｉｄｅｓｉｉ、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ、Ｎ．ｂｉｇｅｌｏｖｉｉ、Ｎ．ｂｏｎａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｎ．ｃａｖｉｃｏｌａ、Ｎ．ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ、Ｎ．ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｃｏｒｙｍｂｏｓａ、Ｎ．ｄｅｂｎｅｙｉ、Ｎ．ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ、Ｎ．ｆｏｒｇｅｔｉａｎａ、Ｎ．ｆｒａｇｒａｎｓ、Ｎ．ｇｌａｕｃａ、Ｎ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、Ｎ．ｇｏｏｄｓｐｅｅｄｉｉ、Ｎ．ｇｏｓｓｅｉ、Ｎ．ｈｙｂｒｉｄ、Ｎ．ｉｎｇｕｌｂａ、Ｎ．ｋａｗａｋａｍｉｉ、Ｎ．ｋｎｉｇｈｔｉａｎａ、Ｎ．ｌａｎｇｓｄｏｒｆｆｉｉ、Ｎ．ｌｉｎｅａｒｉｓ、Ｎ．ｌｏｎｇｉｆｌｏｒａ、Ｎ．ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｎ．ｍｅｇａｌｏｓｉｐｈｏｎ、Ｎ．ｍｉｅｒｓｉｉ、Ｎ．ｎｏｃｔｉｆｌｏｒａ、Ｎ．ｎｕｄｉｃａｕｌｉｓ、Ｎ．ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｎ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ亜種ｈｅｓｐｅｒｉｓ、Ｎ．ｏｔｏｐｈｏｒａ、Ｎ．ｐａｎｉｃｕｌａｔａ、Ｎ．ｐａｕｃｉｆｌｏｒａ、Ｎ．ｐｅｔｕｎｉｏｉｄｅｓ、Ｎ．ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ、Ｎ．ｒａｉｍｏｎｄｉｉ、Ｎ．ｒｅｐａｎｄａ、Ｎ．ｒｏｓｕｌａｔａ、Ｎ．ｒｏｓｕｌａｔａ亜種ｉｎｇｕｌｂａ、Ｎ．ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｓｅｔｃｈｅｌｌｉｉ、Ｎ．ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｎ．ｓｏｌａｎｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｓｐｅｇａｚｚｉｎｉｉ、Ｎ．ｓｔｏｃｋｔｏｎｉｉ、Ｎ．ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ、Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ、Ｎ．ｔｈｙｒｓｉｆｌｏｒａ、Ｎ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａ、Ｎ．ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎ．ｔｒｉｇｏｎｏｐｈｙｌｌａ、Ｎ．ｕｍｂｒａｔｉｃａ、Ｎ．ｕｎｄｕｌａｔａ、Ｎ．ｖｅｌｕｔｉｎａ、Ｎ．ｗｉｇａｎｄｉｏｉｄｅｓ、およびＮ．ｘｓａｎｄｅｒａｅが含まれる。
【０１０５】
栽培品種または選良栽培品種であるかまたはそれらに由来する植物宿主細胞の使用も意図される。品種または栽培品種の非限定例は以下のとおりである。ＢＤ  ６４、ＣＣ  １０１、ＣＣ  ２００、ＣＣ  ２７、ＣＣ  ３０１、ＣＣ  ４００、ＣＣ  ５００、ＣＣ  ６００、ＣＣ  ７００、ＣＣ  ８００、ＣＣ  ９００、Ｃｏｋｅｒ  １７６、Ｃｏｋｅｒ  ３１９、Ｃｏｋｅｒ  ３７１  Ｇｏｌｄ、Ｃｏｋｅｒ  ４８、ＣＤ  ２６３、Ｄｅｎｚｉｚｌｉ、ＤＦ９１１、Ｇａｌｐａｏタバコ、ＧＬ  ２６Ｈ、ＧＬ  ３５０、ＧＬ  ６００、ＧＬ  ７３７、ＧＬ  ９３９、ＧＬ  ９７３、ＨＢ  ０４Ｐ、Ｋ  １４９、Ｋ  ３２６、Ｋ  ３４６、Ｋ  ３５８、Ｋ３９４、Ｋ  ３９９、Ｋ  ７３０、ＫＤＨ  ９５９、ＫＴ  ２００、ＫＴ２０４ＬＣ、ＫＹ１０、ＫＹ１４、ＫＹ  １６０、ＫＹ  １７、ＫＹ  １７１、ＫＹ  ９０７、ＫＹ９０７ＬＣ、ＫＴＹ１４ｘＬ８  ＬＣ、Ｋａｒａｂａｇｌａｒ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ、ＭｃＮａｉｒ  ３７３、ＭｃＮａｉｒ  ９４４、ｍｓＫＹ  １４ｘＬ８、Ｎａｒｒｏｗ  Ｌｅａｆ  Ｍａｄｏｌｅ、ＮＣ  １００、ＮＣ  １０２、ＮＣ  ２０００、ＮＣ  ２９１、ＮＣ  ２９７、ＮＣ  ２９９、ＮＣ  ３、ＮＣ  ４、ＮＣ  ５、ＮＣ  ６、ＮＣ７、ＮＣ  ６０６、ＮＣ  ７１、ＮＣ  ７２、ＮＣ  ８１０、ＮＣ  ＢＨ  １２９、ＮＣ  ２００２、Ｎｅａｌ  Ｓｍｉｔｈ  Ｍａｄｏｌｅ、ＯＸＦＯＲＤ  ２０７、「Ｐｅｒｉｑｕｅ」タバコ、ＰＶＨ０３、ＰＶＨ０９、ＰＶＨ１９、ＰＶＨ５０、ＰＶＨ５１、Ｒ  ６１０、Ｒ  ６３０、Ｒ  ７−１１、Ｒ  ７−１２、ＲＧ  １７、ＲＧ  ８１、ＲＧ  Ｈ５１、ＲＧＨ  ４、ＲＧＨ  ５１、ＲＳ  １４１０、Ｓｐｅｉｇｈｔ  １６８、Ｓｐｅｉｇｈｔ  １７２、Ｓｐｅｉｇｈｔ  １７９、Ｓｐｅｉｇｈｔ  ２１０、Ｓｐｅｉｇｈｔ  ２２０、Ｓｐｅｉｇｈｔ  ２２５、Ｓｐｅｉｇｈｔ  ２２７、Ｓｐｅｉｇｈｔ  ２３４、Ｓｐｅｉｇｈｔ  Ｇ−２８、Ｓｐｅｉｇｈｔ  Ｇ−７０、Ｓｐｅｉｇｈｔ  Ｈ−６、Ｓｐｅｉｇｈｔ  Ｈ２０、Ｓｐｅｉｇｈｔ  ＮＦ３、ＴＩ  １４０６、ＴＩ  １２６９、ＴＮ  ８６、ＴＮ８６ＬＣ、ＴＮ  ９０、ＴＮ  ９７、ＴＮ９７ＬＣ、ＴＮ  Ｄ９４、ＴＮ  Ｄ９５０、ＴＲ（Ｔｏｍ  Ｒｏｓｓｏｎ）Ｍａｄｏｌｅ、Ｔｕｒｋｉｓｈ  Ｓａｍｓｏｎ、ＶＡ  ３０９、ＶＡ３５９、ＤＡＣ、Ｍａｔａ、Ｆｉｎａ、ＰＯ２、ＢＹ−６４、ＡＳ４４、ＲＧ１７、ＲＧ８、ＨＢ０４Ｐ、Ｂａｓｍａ  Ｘａｎｔｈｉ  ＢＸ  ２Ａ、Ｃｏｋｅｒ  ３１９、Ｈｉｃｋｓ、ＭｃＮａｉｒ  ９４４（ＭＮ  ９４４）、Ｂｕｒｌｅｙ  ２１、Ｋ１４９、Ｙａｋａ  ＪＢ  １２５／３、Ｋａｓｔｕｒｉ  Ｍａｗａｒ、ＮＣ  ２９７、Ｃｏｋｅｒ  ３７１  Ｇｏｌｄ、ＰＯ２、Ｗｉｓｌｉｃａ、Ｓｉｍｍａｂａ、Ｔｕｒｋｉｓｈ  Ｓａｍｓｕｎ、ＡＡ３７−１、Ｂ１３Ｐ、ＢＵ２１×Ｈｏｊａ  Ｐａｒａｄｏ系統９７の交配からのＦ４、Ｓａｍｓｕｎ、ＰＯ１、ＬＡ  Ｂ２１、ＬＮ  ＫＹ１７１、ＴＩ  １４０６、Ｂａｓｍａ、Ｇａｌｐａｏ、Ｂｅｉｎｈａｒｔ  １０００−１、またはＰｅｔｉｃｏ。  Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ栽培品種の非限定例は、ＡＡ  ３７−１、Ｂ  １３Ｐ、Ｘａｎｔｈｉ（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ−Ｍｏｒ）、ＫＴＲＤ＃３  Ｈｙｂｒｉｄ  １０７、Ｂｅｌ−Ｗ３、７９−６１５、Ｓａｍｓｕｎ  Ｈｏｌｍｅｓ  ＮＮ、ＫＴＲＤＣ＃２  Ｈｙｂｒｉｄ  ４９、ＫＴＲＤＣ＃４  Ｈｙｂｒｉｄ  １１０、Ｂｕｒｌｅｙ  ２１、ＢＹ−６４、ＫＴＲＤＣ＃５  ＫＹ  １６０  ＳＩ、ＫＴＲＤＣ＃７  ＦＣＡ、ＫＴＲＤＣ＃６  ＴＮ  ８６  ＳＩ、Ｃｏｋｅｒ  ３７１  Ｇｏｌｄ、Ｋ  １４９、Ｋ  ３２６、Ｋ  ３４６、Ｋ  ３５８、Ｋ  ３９４、Ｋ  ３９９、Ｋ  ７３０、ＫＹ  １０、ＫＹ  １４、ＫＹ  １６０、ＫＹ  １７、ＫＹ  ８９５９、ＫＹ  ９、ＫＹ  ９０７、ＭＤ  ６０９、ＭｃＮａｉｒ  ３７３、ＮＣ  ２０００、ＰＧ  ０１、ＰＧ  ０４、Ｍ０６６、ＰＯ１、ＰＯ２、ＰＯ３、ＲＧ  １１、ＲＧ  １７、ＲＧ  ８、Ｓｐｅｉｇｈｔ  Ｇ−２８、ＴＮ  ８６、ＴＮ  ９０、ＶＡ  ５０９、ＡＳ４４、Ｂａｎｋｅｔ  Ａ１、Ｂａｓｍａ  Ｄｒａｍａ  Ｂ８４／３１、Ｂａｓｍａ  Ｉ  Ｚｉｃｈｎａ  ＺＰ４／Ｂ、Ｂａｓｍａ  Ｘａｎｔｈｉ  ＢＸ  ２Ａ、Ｂａｔｅｋ、Ｂｅｓｕｋｉ  Ｊｅｍｂｅｒ、Ｃ１０４、Ｃｏｋｅｒ  ３１９、Ｃｏｋｅｒ  ３４７、Ｃｒｉｏｌｌｏ  Ｍｉｓｉｏｎｅｒｏ、ＤＡＣ  Ｍａｔａ  Ｆｉｎａ、Ｄｅｌｃｒｅｓｔ、Ｄｊｅｂｅｌ  ８１、ＤＶＨ  ４０５、Ｇａｌｐａｏ  Ｃｏｍｕｍ、ＨＢ０４Ｐ、Ｈｉｃｋｓ  Ｂｒｏａｄｌｅａｆ、Ｋａｂａｋｕｌａｋ  Ｅｌａｓｓｏｎａ、Ｋａｓｔｕｒｉ  Ｍａｗａｒ、Ｋｕｔｓａｇｅ  Ｅ１、ＫＹ  １４ｘＬ８、ＫＹ  １７１、ＬＡ  ＢＵ  ２１、ＭｃＮａｉｒ  ９４４、ＮＣ  ２３２６、ＮＣ  ７１、ＮＣ  ２９７、ＮＣ  ３、ＰＶＨ  ０３、ＰＶＨ  ０９、ＰＶＨ  １９、ＰＶＨ  ２１１０、Ｒｅｄ  Ｒｕｓｓｉａｎ、Ｓａｍｓｕｎ、Ｓａｐｌａｋ、Ｓｉｍｍａｂａ、Ｔａｌｇａｒ  ２８、Ｔｕｒｋｉｓｈ  Ｓａｍｓｕｎ、Ｗｉｓｌｉｃａ、Ｙａｙａｌｄａｇ、ＮＣ  ４、ＴＲ  Ｍａｄｏｌｅ、Ｐｒｉｌｅｐ  ＨＣ−７２、Ｐｒｉｌｅｐ  Ｐ２３、Ｐｒｉｌｅｐ  ＰＢ  １５６／１、Ｐｒｉｌｅｐ  Ｐ１２−２／１、Ｙａｋａ  ＪＫ−４８、Ｙａｋａ  ＪＢ  １２５／３、ＴＩ−１０６８、ＫＤＨ−９６０、ＴＩ−１０７０、ＴＷ１３６、Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ、Ｉｚｍｉｒ、Ｂａｓｍａ、ＴＫＦ  ４０２８、Ｌ８、ＴＫＦ  ２００２、ＴＮ９０、ＧＲ１４１、Ｂａｓｍａ  ｘａｎｔｈｉ、ＧＲ１４９、ＧＲ１５３、Ｐｅｔｉｔ  ＨａｖａｎａまたはＸａｎｔｈｉ  ＮＮである。
【０１０６】
植物宿主細胞を修飾して、組換えＤＮａｓｅタンパク質の発現および／または活性を改善することができる。宿主細胞は、例えばＤＮａｓｅの形成をさらに促進するシャペロンタンパク質を含むように修飾され得る。宿主細胞をリプレッサータンパク質を含むように修飾し、ＤＮａｓｅまたはさらにエンハンサータンパク質の発現をより効率的に調節して発現量を改善する。
【０１０７】
植物においてＤＮａｓｅを産生する方法は、本明細書において記載されるようなＤＮａｓｅ（任意で前記植物において融合タンパク質として）の発現を可能にする条件下で前記植物を成長させる第２の工程を含むことができる。したがって、ＤＮａｓｅポリペプチドは、任意で融合タンパク質としてポリペプチドを発現するのに好適な培養条件下で、核酸が導入された植物細胞をインキュベーション（例えば培養）することによって調製される。生じたポリペプチドは、植物細胞の小胞体に向けて導かれるか、その中で集合するか、またはその中に含まれるタンパク質顆粒の形態であり得る。
【０１０８】
ＤＮａｓｅ発現は、細胞中のＤＮａｓｅポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量の検出によって測定することができ、例えばＰＣＲまたはノーザンブロットによって定量化することができる。サンプル中のＤＮａｓｅポリペプチドの量における変化を測定する場合、抗ＤＮａｓｅ抗体の使用によるＤＮａｓｅの検出を使用して、細胞におけるＤＮａｓｅポリペプチドの量を公知の技法を使用して定量化することができる。あるいは、ＤＮａｓｅの生物学的活性を、本明細書において記載されるように測定することができる。
【０１０９】
様々な方法を利用して、融合タンパク質を含むタンパク質顆粒を回収することができる。組換えのタンパク質顆粒様集合体は、特定の融合タンパク質についてあらかじめ決定できる密度を有する。あらかじめ決定される密度は、典型的にはホモジネート中に存在する内在性宿主細胞タンパク質の実質的に全てを超え、典型的には約１．１〜約１．３５ｇ／ｍｌである。タンパク質顆粒の高密度は、組換え融合タンパク質が多量体として集合し、蓄積する一般的な能力のためであり得る。植物において発現される場合、タンパク質顆粒は、約１ミクロンの直径を備えた典型的には球状の形状で、周囲の膜を有する。
【０１１０】
典型的には密度によるタンパク質顆粒の回収は遠心分離機を使用して実行される。遠心分離は、塩（例えば塩化セシウム）または糖（例えばショ糖）等の密度差を提供する溶質の存在下において実行することができる。異なる密度の領域がホモジネート中に形成されて、タンパク質顆粒の比較的増強された濃度を含む領域およびタンパク質顆粒の比較的枯渇した濃度を含む領域を提供する。タンパク質顆粒の比較的増強された濃度の領域からタンパク質顆粒の枯渇した領域を分離し、それによって前記融合タンパク質を回収する。タンパク質顆粒を、回収することができるか、または１つまたは複数の試薬により処理することができるか、または本明細書において記載されるように融合タンパク質を含むタンパク質顆粒の単離の前に１つまたは複数の手順を行なうことができる。いくつかの実施形態において、回収されたタンパク質顆粒は、融合タンパク質を単離する必要性なしに、そのままで使用される。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、ペレットの形態でタンパク質顆粒を回収するのに１つの遠心分離工程で十分であり得る。したがって、一例として、固形物および細胞残屑を取り除くのに約１５００×ｇ〜約４５００×ｇの間の遠心分離工程で十分であり得る。この工程は、例えば約６０００×ｇのより速いスピードの遠心分離工程と組み合わせて、ペレット中の融合タンパク質を回収することができる。遠心分離工程は４℃で約１０分間行なうことができる。遠心分離工程の後に、任意で融合タンパク質を回収する精密濾過等の１つまたは複数のさらなる工程があり得る。
【０１１２】
この遠心分離工程（複数可）およびさらなる任意の工程の後に、界面活性剤を含む溶液中での１つまたは複数の洗浄工程が、融合タンパク質を含むタンパク質顆粒を濃縮および凝縮するさらなる任意の遠心分離工程と共にあり得、その後それらの可溶化がある。さらなる任意の遠心分離工程を洗浄の間に行なうことができる。一実施形態において、トリトンＸ−１００等の非イオン性界面活性剤、好適には約１％のトリトンＸ−１００が使用される。別の実施形態において、さらなる遠心分離工程は４℃で１０分間約６０００×ｇで行なわれ、洗浄の間に起こり得る。
【０１１３】
したがって、本発明の一実施形態に従って、方法は、（ｃ）植物または植物材料から融合タンパク質を含むタンパク質顆粒を回収する追加の工程を含み、好ましくは工程（ｃ）は、（ｉ）植物材料を均質化する工程と；（ｉｉ）均質化された植物材料を遠心分離する工程と；（ｉｖ）ペレットにした画分中の融合タンパク質を含むタンパク質顆粒を回収する工程とを含む。
【０１１４】
ペレットにした画分中に含まれ得る融合タンパク質を可溶化するために、様々なバッファーおよび試薬を使用することができる。一例として、ＤＮａｓｅを含む融合タンパク質は、界面活性剤および／または還元剤を含むバッファー水溶液中での周囲の膜の崩壊によって回収されたタンパク質顆粒から得ることができる。還元剤の例は、２−メルカプトエタノール、チオグリコール酸、チオグリコラート塩、ジチオスレイトール、亜硫酸塩または亜硫酸水素イオンを含む。界面活性剤の例は、ドデシル硫酸ナトリウム、イオン性洗剤（例えばデオキシコール酸塩およびラウロイルサルコシン）、非イオン性界面活性剤（例えばツイーン２０、ノニデットＰ−４０およびオクチルグルコシド）および両性イオン性界面活性剤（例えばＣＨＡＰＳ）を含む。好ましくはＤＮａｓｅタンパク質を破壊せず、折り畳みをほどかないような条件が選択される。
【０１１５】
適切な可溶化条件を同定するために試験できる変数は、ｐＨ、塩、界面活性剤、還元剤に加えて、他の変数（成分の比率、時間および温度等）を含む。様々なバッファーはバッファーの所望されるｐＨに応じて用いることができる。ｐＨ範囲の制御に使用できるバッファー成分の非限定例は、酢酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、アンモニウムバッファー（酢酸アンモニウム等）、コハク酸塩、ＭＥＳ、ＣＨＡＰＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、トリスおよび同種のものに加えて、これらのトリス−リンゴ酸−ＮａＯＨの組み合わせ、マレイン酸塩、クロロ酢酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、プロピオン酸塩、ピリジン、ピペラジン、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、トリシン、ビシン、ＴＡＰＳ、エタノールアミン、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、メチルアミン、ピペリジン、ホウ酸、炭酸、乳酸、ブタンアンジオイック（ｂｕｔａｎｅａｎｄｉｏｉｃ）酸、ジエチルマロン酸、グリシルグリシン、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、イミダゾール、フェノール、ＰＯＰＳＯ、コハク酸塩、ＴＡＰＳ、アミンベースベンジルアミン、トリメチルアミン、ジメチルアミン、エチルアミン、フェニルアミン、エチレンジアミンまたはモルホリンを含む。
【０１１６】
したがって、本発明の方法は、（ｄ）融合タンパク質を含むペレットにした画分を可溶化するさらなる工程を含むことができる。任意で、次の方法工程の前に、調製物を例えば約２００００×ｇで約１０分間等遠心分離することができる。
【０１１７】
ＤＮａｓｅタンパク質を含む分離され可溶化された融合タンパク質を回収することができる。このステージで、ＤＮａｓｅタンパク質はそのままで使用することができる。好ましくは、ＤＮａｓｅタンパク質はさらに加工される。
【０１１８】
したがって、一実施形態において、方法は、前記融合タンパク質からＤＮａｓｅを放出するさらなる工程を含む。融合タンパク質からのＤＮａｓｅの切断は本明細書において記載される。
【０１１９】
切断後に、さらなる実施形態において、方法は、（ｆ）切断／放出されたＤＮａｓｅタンパク質を精製する追加の工程を含む。したがって一実施形態において、このようにして精製された組換えＤＮａｓｅは、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＥＬＩＳＡによって決定されるような他のポリペプチドを実質的に不含有である。別の実施形態において、精製されたＤＮａｓｅは、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＥＬＩＳＡによって決定されるように、１００ｐｐｍ未満の宿主タンパク質、および好適には９０ｐｐｍ未満、８０ｐｐｍ未満、７０ｐｐｍ未満、６０ｐｐｍ未満、５０ｐｐｍ未満、４０ｐｐｍ未満、３０ｐｐｍ未満、２０ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満、または５ｐｐｍ未満の宿主タンパク質を含むＤＮａｓｅ組成物であると判断される。本発明に従って得られるかまたは得ることができるＤＮａｓｅタンパク質は、配列が由来する生来のタンパク質の少なくとも５０％、６０％または７０％、および最も好適には少なくとも８０％、９０％、９５％または１００％の特異的活性を有することができる。
【０１２０】
タンパク質精製は「陽イオン交換樹脂」を利用することができ、それは負に荷電しており、吸着剤または固相の上またはそれらを通って通過される水溶液中の陽イオンとの交換のための遊離陽イオンを有する。陽イオン交換樹脂の形成に好適な任意の負に荷電したリガンド、例えばカルボン酸塩、スルホン酸塩および以下で記載されるような他のものを使用することができる。商業的に入手可能な陽イオン交換樹脂は、例えば、スルホナートベースの基を有するもの（例えばＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＭｏｎｏＳ、ＭｉｎｉＳ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｓおよび３ＯＳ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（商標）、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＴｏｓｏｈからのＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ−６５０ＳおよびＳＰ−６５０Ｍ、ＢｉｏＲａｄからのＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ、Ｐａｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＣｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  Ｓ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  ＭおよびＬＳ  ＳＰおよびＳｐｈｅｒｏｄｅｘ  ＬＳ  ＳＰ）；スルホエチルベースの基を有するもの（例えばＥＭＤからのＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＰｏｒｏｓ  Ｓ−１０およびＳ−２０）；スルホプロピルベースの基を有するもの（例えばＴｏｓｏｈからのＴＳＫ  Ｇｅｌ  ＳＰ  ５ＰＷおよびＳＰ−５ＰＷ−ＨＲ、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＰｏｒｏｓ  ＨＳ−２０およびＨＳ  ５０）；スルホイソブチルベースの基を有するもの（例えばＥＭＤからのＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ3）；スルホキシエチルベースの基を有するもの（例えばＷｈａｔｍａｎからのＳＥ５２およびＳＥ５３およびＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ  Ｓ）、カルボキシメチルベースの基を有するもの（例えばＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．からのＨｙｄｒｏｃｅｌｌ  ＣＭ、ＢｉｏＲａｄからのＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ＣＭ、Ｐａｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＣｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  ＣＭ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  Ｍ  ＣＭ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  ＬＳ  ＣＭ、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＭａｔｒｘ  Ｃｅｌｌｕｆｍｅ  Ｃ５００およびＣ２００、ＷｈａｔｍａｎからのＣＭ５２、ＣＭ３２およびＣＭ２３およびＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ  Ｃ、ＴｏｓｏｈからのＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＣＭ−６５０Ｓ、ＣＭ−６５０ＭおよびＣＭ−６５０Ｃ）；スルホン酸およびカルボン酸ベースの基を有するもの（例えばＪ．Ｔ．ＢａｋｅｒからのＢＡＫＥＰＶＢＯＮＤカルボキシ−スルホン）；カルボン酸ベースの基を有するもの（例えばＪ．Ｔ  ＢａｋｅｒからのＷＰ  ＣＢＸＤｏｗ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓからのＤＯＷＥＸ  ＭＡＣ−３、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈからのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  Ｗｅａｋ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ、ＤＯＷＥＸ  Ｗｅａｋ  Ｃａｔｉｏｎ  ＥｘｃｈａｎｇｅｒおよびＤｉａｉｏｎ  Ｗｅａｋ  Ｃａｔｉｏｎ  ＥｘｃｈａｎｇｅｒｓならびにＥＭＤからのＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＣＯＯ−）；スルホン酸ベースの基を有するもの（例えばＢｉｏｃｈｒｏｍ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．からのＨｙｄｒｏｃｅｌｌ  ＳＰ、Ｄ���ｗ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓからのＤＯＷＥＸ  Ｆｉｎｅ  Ｍｅｓｈ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ａｃｉｄ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｉｎ、Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒからのＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓ、ＷＰ  Ｓｕｌｆｏｎｉｃ、ＳａｒｔｏｒｉｕｓからのＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ膜、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈからのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ、ＤＯＷＥＸ  Ｓｔｒｏｎｇ  ＣａｔｉｏｎおよびＤｉａｉｏｎ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）；およびオルトリン酸塩ベースの基を有するもの（例えばＷｈａｔｍａｎからのＰＩ  １）を含むが、これらに限定されない。
【０１２１】
タンパク質精製は「陰イオン交換樹脂」を利用することができ、それは正に荷電しており、したがってそれへ付着された１つまたは複数の正に荷電したリガンドを有する。陰イオン交換樹脂の形成に好適な吸着剤または固相に付加された任意の正に荷電したリガンド（四級アミノ基等）を使用することができる。商業的に入手可能な陰イオン交換樹脂は、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＤＥＡＥセルロース、Ｐｏｒｏｓ  ＰＩ  ２０、ＰＩ  ５０、ＨＱ  １０、ＨＱ  ２０、ＨＱ  ５０、Ｄ  ５０、ＳａｒｔｏｒｉｕｓからのＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ、そしてＭｏｎｏＱ、ＭｉｎｉＱ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑおよび３ＯＱ、Ｑ、ＤＥＡＥおよびＡＮＸ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＱＡＥ  ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）およびＦＡＳＴ  Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒからのＷＰ  ＰＥＩ、ＷＰ  ＤＥＡＭ、ＷＰ  ＱＵＡＴ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．からのＨｙｄｒｏｃｅｌｌ  ＤＥＡＥおよびＨｙｄｒｏｃｅｌｌ  ＱＡ、ＢｉｏｒａｄからのＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ＤＥＡＥおよびＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ、Ｐａｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＣｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  Ｑ、Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  ＤＥＡＥ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  ＭおよびＬＳ  ＤＥＡＥ、Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘ  ＬＳ  ＤＥＡＥ、ＱＭＡ  Ｓｐｈｅｒｏｓｉｌ  ＬＳ、ＱＭＡ  Ｓｐｈｅｒｏｓｉｌ  ＭおよびＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ、Ｄｏｗ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓからのＤＯＷＥＸ  Ｆｉｎｅ  Ｍｅｓｈ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｂａｓｅ  Ｔｙｐｅ  ＩおよびＴｙｐｅ  ＩＩ  Ａｎｉｏｎ  Ｒｅｓｉｎｓ、およびＤＯＷＥＸ  ＭＯＮＯＳＰＨＥＲ  Ｅ  ７７（弱塩基陰イオン）、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＩｎｔｅｒｃｅｐｔ  Ｑ膜、Ｍａｔｒｅｘ  Ｃｅｌｌｕｆｍｅ  Ａ２００、Ａ５００、Ｑ５００およびＱ８００、ＥＭＤからのＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＤＥＡＥおよびＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＤＭＡＥ、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈからのＡｍｂｅｒｉｉｔｅ弱および強陰イオン交換体タイプＩおよびＩＩ、ＤＯＷＥＸ弱および強陰イオン交換体タイプＩおよびＩＩ、Ｄｉａｉｏｎの弱および強陰イオン交換体タイプＩおよびＩＩ、Ｄｕｏｌｉｔｅ、ＴｏｓｏｈからのＴＳＫゲルＱおよびＤＥＡＥ  ５ＰＷおよび５ＰＷ−ＨＲ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｓ、６５０Ｍおよび６５０Ｃ、ＱＡＥ−５５０Ｃおよび６５０Ｓ、ＤＥＡＥ−６５０Ｍおよび６５０Ｃ、ＷｈａｔｍａｎからのＱＡ５２、ＤＥ２３、ＤＥ３２、ＤＥ５１、ＤＥ５２、ＤＥ５３、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ  ＤおよびＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ  Ｑを含む。
【０１２２】
「親和性クロマトグラフィー」はタンパク質精製の他の方法であり、タンパク質が、通常、空間的相補性および１つまたは複数のタイプの化学的相互作用（例えば結合部位での静電力、水素結合、疎水性力および分子間力）の組み合わせとして、生物学的に特異的なリガンドに可逆的および特異的に結合される分離技法を指す。これらの相互作用は、分子の一般的特性（等電点、疎水性またはサイズ等）起因するものではないが、タンパク質とリガンドとの間の特異的な相互作用（例えばエピトープに結合する免疫グロブリン、免疫グロブリンに結合するプロテインＡ、生物学的応答修飾因子とその細胞表面受容体との間の相互作用）の結果である。多くの実例において、生物学的に特異的なリガンドはタンパク質またはポリペプチドでもあり、固相（ビーズ等）上に固定化され得る。
【０１２３】
「混合モードイオン交換樹脂」はタンパク質精製の他の方法であり、陽イオン性モイエティ、陰イオン性モイエティまたは疎水性モイエティにより共有結合で修飾される固相を指す。混合モードイオン交換樹脂の例は、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ  ＡＢＸ（商標）（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ；Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）、セラミックハイドロキシアパタイトタイプＩおよびＩＩならびにフッ化物ハイドロキシアパタイト（ＢｉｏＲａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）ならびにＭＥＰおよびＭＢＩ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ）を含む。「疎水性電荷誘導クロマトグラフィー」（または「ＨＣＩＣ」）は、添加塩（例えばリオトロピック塩）の非存在下において穏やかな疎水性相互作用を介してイオン化リガンドに混合物中のタンパク質が結合するタイプのミックストモードクロマトグラフィープロセスである。ミックストモードは、結合のための１つのモードおよび溶出のための他のモードを指す。例えば、ＨＣＩＣにおいて有用な固相は、その分離性能のためにチオフィリック効果（すなわち、チオフィリッククロマトグラフィーの特性を利用する）、疎水性およびイオン化基の組み合わせた特性を有するリガンドを含む。したがって、本発明の方法において使用される吸着剤は、イオン化リガンドを含み、中性（生理的）または弱酸性のｐＨ（例えば約ｐＨ  ５〜１０、好ましくは約ｐＨ  ６〜９．５）で穏やかに疎水性である．このｐＨ範囲で、リガンドの大部分は非荷電であり、穏やかな非特異的疎水性相互作用によってタンパク質を結合する。ｐＨが減少するにつれて、リガンドは電荷を獲得し、疎水性結合はｐＨシフトに起因して溶質への静電荷反発作用によって破壊される。ＨＣＩＣで使用される好適なリガンドの例は、任意のイオン化芳香族または複素環構造（例えば２−アミノメチルピリジン、３−アミノメチルピリジンおよび４−アミノメチルピリジン、２−メルカプトピリジン、４−メルカプトピリジンまたは４−メルカプトエチルピリジン等のピリジン構造を有するもの）、メルカプト酸、メルカプトアルコール、イミダゾリルベースのもの、メルカプトメチルイミダゾール、２−メルカプトベンズイミダゾール、アミノメチルベンズイミダゾール、ヒスタミン、メルカプトベンズイミダゾール、ジエチルアミノプロピルアミン、アミノプロピルモルホリン、アミノプロピルイミダゾール、アミノカプロン酸、ニトロヒドロキシ安息香酸、ニトロチロシン／エタノールアミン、ジクロロサリチル酸、ジブロモチラミン、クロロヒドロキシフェニル酢酸、ヒドロキシフェニル酢酸、チラミン、チオフェノール、グルタチオン、重硫酸塩、および色素を含み、その誘導体を含む。
【０１２４】
当該技術分野において記載されるＤＮａｓｅを精製する方法も使用することができる。一例として、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００６）２８（４）：２１５−２１は、コンカナバリンＡおよびコムギ胚芽凝集素混合物−アガロースカラムを使用するＤＮａｓｅ  Ｉのレクチン親和性および脱グリコシル化分析による単工程精製を記載する。ＤＮａｓｅの精製は、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４８：１４８９−１４９５（１９７３）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９２：６０５−６３２（１９８６）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２１：６４５−６６７（１９９１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１６００６−１６０１１（１９８６）およびＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１６０１２−１６０１７（１９８６）中にも記載されている。
【０１２５】
一実施形態において、植物中のＤＮａｓｅを産生する方法は、（ａ）タンパク質顆粒の形成を植物において誘導するタンパク質をコードする核酸配列を含むか、それからなるか、または本質的になる核酸コンストラクトと；ＤＮａｓｅをコードする核酸配列とが、前記核酸配列が互いに作動可能に連結されて、導入された植物をインキュベーションする工程と；（ｂ）融合タンパク質としてのＤＮａｓｅの発現を前記植物において可能にする条件下で前記植物を成長させる工程と；（ｃ）植物から融合タンパク質を含むタンパク質顆粒を回収する工程と；（ｄ）融合タンパク質を含むペレットにした画分を可溶化する工程と；（ｅ）前記融合タンパク質からＤＮａｓｅを放出する工程と；（ｆ）放出されたＤＮａｓｅタンパク質を精製する工程とを含む。
【０１２６】
さらなる態様は、本明細書において記載されるように、前記核酸配列および前記核酸配列の転写を調節する調節性ヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトに関する。コンストラクトは、１つまたは複数のＤＮａｓｅ核酸を含む二本鎖の組換えＤＮＡ断片であり得る。
【０１２７】
さらなる態様は、核酸配列、核酸分子または核酸コンストラクトを含むベクターに関する。好適なベクターは、染色体外の複製が可能なエピソーム（円形の二本鎖ＤＮＡプラスミド等）；直線状二本鎖ＤＮＡプラスミド；および任意の起源の他のベクターを含むが、これらに限定されない。ベクターは、細菌を形質転換するのにおよび／または植物の中へ核酸を導入するのに好適なベクターを含む。本明細書において記載された核酸配列、核酸分子またはコンストラクトを含むベクターは、細胞の中へ導入された場合、前記細胞のゲノムの中へ組込まれ、それが組込まれた染色体（複数可）と共に複製されるプラスミド、コスミドまたは植物ベクターであり得る。基本的な細菌のベクターまたは植物ベクターは、好適には広範囲の宿主範囲の複製開始点；選択可能なマーカー；およびアグロバクテリウム形質転換のためには植物染色体へのアグロバクテリウム媒介性移行のためのＴ−ＤＮＡ配列を含む。植物ゲノムの中への異種配列の組み込みを可能にするのに好適な配列は、同様に使用することができる。これらは、トランスポゾン配列および同種のもの、相同組換えのためのＣｒｅ／ｌｏｘ配列および宿主ゲノム断片に加えて、植物ゲノムの中へランダム挿入を可能にするＴｉ配列を含み得る。
【０１２８】
プロモーターをベクターの中へ取り込んで、本明細書において記載される融合タンパク質を発現するのに特に有用であり得る発現ベクターを作成することができる。好適な発現ベクターは、染色体外の複製が可能なエピソーム（円形の二本鎖ＤＮＡプラスミド等）；直線状二本鎖ＤＮＡプラスミド；および任意の起源の他の機能的に等価な発現ベクターを含む。発現ベクターは、少なくともＤＮａｓｅ核酸またはＤＮａｓｅ核酸コンストラクトへ作動可能に連結されたプロモーターおよび同種のものを含む。プロモーターは、ＤＮａｓｅ核酸に直接連結されてもよいし、介在する核酸（融合タンパク質の１つまたは複数の成分をコードする核酸等）が中間にあってもよい。
【０１２９】
核酸配列、核酸コンストラクト、核酸ベクターおよび同種のものの調製において、その様々な断片は、異なる加工条件（ライゲーション、制限酵素消化、ＰＣＲ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの突然変異誘発、リンカーおよびアダプター添加ならびに同種のもの等）へかけることができる。したがって、ヌクレオチドのトランジション、トランスバージョン、挿入、欠失または同種のものを、ＤＮａｓｅの発現のためのコンストラクトにおいて用いられるＤＮＡ上で実行することができる。制限消化、クレノウ平滑断端処理、ライゲーションおよび同種のもののための方法は、当業者に周知であり、例えばＭａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．中）によって記載される。
【０１３０】
他の態様において、（ｉ）タンパク質顆粒の形成を植物において誘導するタンパク質をコードするアミノ酸配列と；（ｉｉ）切断認識部位をコードするアミノ酸配列と；（ｉｉｉ）ＤＮａｓｅをコードするアミノ酸配列とを、前記第１のアミノ酸配列、第２のアミノ酸配列および第３のアミノ酸配列が互いに作動可能に連結されて、含む、融合タンパク質が記載される。融合タンパク質は、本明細書において記載される核酸配列または核酸分子の植物細胞における発現産物である。融合タンパク質は、植物細胞において安定して小胞体由来タンパク質顆粒中に蓄積される。
【０１３１】
さらなる態様において、本明細書において記載される核酸配列、核酸コンストラクト、ベクターまたは融合タンパク質を含む植物または植物材料が記載される。
【０１３２】
さらなる態様において、本発明の方法によって、得られるかまたは得ることができるＤＮａｓｅが記載される。
【０１３３】
本発明によって得られるかもしくは得ることができる組換えＤＮａｓｅ、またはＤＮａｓｅを含み所望される純度を有するタンパク質顆粒の処方は、任意の薬学的に許容されるキャリアー、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）を参照）と混合することによって、凍結乾燥処方または水溶液の形態で、保存のために調製することができる。許容可能なキャリアー、賦形剤または安定剤は、用いられた用量および濃度でレシピエントに無毒であり、バッファー（リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸等）；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム等；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン等）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドン等）；アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン等）；単糖、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む）；キレート試薬（ＥＤＴＡ等）；糖（ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール等）；塩形成カウンターイオン（ナトリウム等）；金属錯体；または非イオン性界面活性剤（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等）を含む。
【０１３４】
組換えＤＮａｓｅタンパク質は、ＰＥＧ化または公知の方法を使用してポリエチレングリコールに結合することもできる。ＰＥＧ化ＤＮａｓｅタンパク質はｉｎ  ｖｉｖｏでより安定し、治療を必要とする哺乳動物に投与されたときに身体中で結果としてより長い半減期を有する。一般的には、医薬組成物は、他の薬学的に重要なポリペプチドのために使用されるものに類似する方法を使用して処方および投与することができる。組換えＤＮａｓｅタンパク質は、凍結乾燥された形態で保存し、投与の直前に滅菌水により再構成し、静脈内に投与することができる。好ましくは、医薬処方は、治療される特定の条件のためのルーチンの用量力価測定実験によって決定される投薬量で投与されるだろう。
【０１３５】
本発明のさらなる態様は、組換えＤＮａｓｅを含むかまたは産生する植物または植物材料産物に関する。好適には、前記植物または植物材料は、葉巻き、シガレットおよび無煙タバコ産物（すなわち不燃物）等の様々な喫煙に適した物品等の様々な消費可能な産物の中へ取り込まれる。
【０１３６】
以下の実施例は限定としてではなく例証として提供される。特別の指示の無い限り、本発明は、分子生物学、植物生物学および育種の従来の技法および方法を用いる。
【実施例】
【０１３７】
実施例１−材料および方法
【０１３８】
クローニングおよびインフィルトレーション
γゼイン野生型遺伝子、その断片およびバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトの各々を、ＤＮａｓｅをコードする合成配列にライゲーションする。γゼインの断片またはバリアントが使用される場合、それが断片またはバリアント中に存在するものならば、核酸コンストラクトは、生来のγゼインシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を５’末端でさらに含む。特定の実験については、プロテアーゼ切断部位を含むリンカーをコードする合成核酸配列もコンストラクト中に含まれ、γゼインとＤＮａｓｅコード配列との間に配置される。ＤＮａｓｅのコード配列は植物における発現のために至適化されている。核酸コンストラクトは、ｍｉｎ３５Ｓプロモーターが核酸コンストラクトの発現をタバコ植物細胞において駆動する部位で、ベクターの中へクローン化される。
【０１３９】
クローン化された核酸コンストラクトを含むベクターを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍａｆａｃｉｅｎｓの系統Ａｇｌ１の中へ導入する。アグロバクテリウム細胞を、１．６を超えるＯＤ６００までロータリーシェーカー上で２８℃および２５０ｒｐｍで増殖させる。増殖後に、細菌を８０００ｇおよび４℃で１５分間の遠心分離によって回収し、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2および５ｍＭ（２−（ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ））を含むインフィルトレーション溶液中に、最終的にｐＨ５．６およびＯＤ６００＝２で再懸濁する。
【０１４０】
植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）を通常の状態下で成長させ、個々の葉を注射器を使用して標準的な技法によってインフィルトレーションする。葉を慎重に裏返し、背軸側を曝露し、細菌懸濁液を含む１ｍＬ無針注射器を使用して、葉の細胞内空間を圧力インフィルトレーションする。インフィルトレーションの６〜１０日後に、葉ディスクをヒートシール可能なパウチ中に回収し、シールし、ドライアイスの層の間に少なくとも１０分間置く。
【０１４１】
組換えタンパク質の抽出およびウエスタンブロット分析
タバコ葉を液体窒素中で粉砕し、１グラムの新鮮葉材料につき抽出バッファー（５０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ８、２００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）および任意のプロテアーゼ阻害剤（アプロチニン、ペプスタチ、ロイペプチン、フッ化フェニルメチルスルホニルおよびＥ６４  ［（Ｎ−（Ｎ−（Ｌ−３−トランス−カルボキシオキシラン−２−カルボニル）−Ｌ−ロイシル）−アグマチン］））を使用してホモジナイズする。ホモジネートを４℃で３０分間撹拌し、次いで（１５０００ｒｐｍ、３０分、４℃）２回遠心分離して不溶性物質を取り除く。Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質分析（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して全可溶性タンパク質を定量化する。タンパク質を１５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、セミドライの装置を使用してニトロセルロース膜（０．２２ｐｔＭ）に移行させた。膜を、γゼイン特異的抗体（Ｌｕｄｅｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．４１：４１−４８．）によりインキュベーションし、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗体によりインキュベーションする。免疫反応性バンドを増感化学発光（ＥＣＬウエスタンブロッティングシステム、Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって検出する。
【０１４２】
ＥＬＩＳＡアッセイ
ＥＬＩＳＡアッセイを、可溶性葉タンパク質抽出物および部分的に精製された融合タンパク質でのヒトＤＮａｓｅ  Ｉ定量化のために行なう。マイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．５（ＰＢＳ）中で希釈した可溶性タンパク質（１００μ）をロードし、４℃で一晩インキュベーションする。ウェルを３回洗浄した後に、特異的結合部位を、ＰＢＳ−Ｔ（０．１％ツイーン２０を含むＰＢＳ）中の３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により室温で１時間ブロックする。プレートをヒトＤＮａｓｅ  Ｉ抗血清により２時間インキュベーションし、ＰＢＳ−Ｔによる４回の洗浄後に、ペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体により２時間インキュベーションする。一次抗体および二次抗体を１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔ中で希釈する。ＰＢＳ−Ｔにより大規模に洗浄した後に、酵素反応を基質バッファーを含む過酸化水素により３７℃で行なう。反応を１０分後に２Ｎ硫酸により停止し、光学的濃度をＭｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸ分光光度計（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して４５０ｎｍで測定する。植物抽出物中の抗原濃度をヒトＤＮａｓｅ  Ｉ抗血清の使用によって得られた標準曲線から推定する。
【０１４３】
融合タンパク質の可溶化
融合タンパク質を可溶化のために選択したバッファー中で室温で一晩インキュベーションする。
【０１４４】
実施例２−γゼイン−ＤＮａｓｅ  Ｉ融合タンパク質の発現レベル
γゼイン−ＤＮａｓｅ  Ｉ融合タンパク質コンストラクト（γゼイン−ＤＮａｓｅ  Ｉ）を上記のように調製し、アグロバクテリウムアグロインフィルトレーションを使用してタバコ植物を形質転換する。全タンパク質を抽出し、γゼイン特異的抗体を使用してウエスタンブロットによって定量化する。γゼインのタグなしで同じ条件下で発現させたＤＮａｓｅ  Ｉを使用する対照実験も実行する（ｈＤＮａｓｅ  Ｉ）。アグロインフィルトレーションイベントからの発現レベルは以下のとおりである。
【０１４５】
【表３】
2014502497.tif 000004
【０１４６】
ＦＷ＝フリーウェイト。これらの結果に基づいて、γゼイン−ｈＤＮａｓｅ  Ｉの発現はγゼインなしのヒトＤＮａｓｅ  Ｉの発現よりも高いと結論される。
【０１４７】
実施例３−γゼイン中の異なる天然に存在しない反復モチーフの分析。
γゼイン中の異なる天然に存在しない反復モチーフを使用して、γゼイン−ＤＮａｓｅ  Ｉ融合コンストラクトを調製する。以下のコンストラクトを使用する。γゼインペプチドのみ（γゼイン−野生型）；γゼイン−（ＰＰＰＶＡＬ）ｎ；γゼイン−（ＰＰＰＶＥＬ）ｎ；γゼイン−（ＰＰＰＡＰＡ）ｎ；およびγゼインなし。
【０１４８】
コンストラクトを、アグロバクテリウムアグロインフィルトレーションを使用して、異なるタバコ植物に別々に形質転換する。３つの独立した形質転換を実行する。全タンパク質を抽出し、γゼイン特異的抗体を使用してウエスタンブロットによって定量化する。３つのアグロインフィルトレーションイベントからの平均発現レベルは以下のとおりである。
【０１４９】
【表４】
2014502497.tif 000005
【０１５０】
結果をγゼイン野生型と比較して相対的定量化として示す。予想外に、ヒトＤＮａｓｅ  Ｉはγゼインなしに発現され、最も高いレベルで発現される。すべての他の天然に存在しない反復モチーフも、γゼイン野生型と比較して、発現上昇をもたらす。
【０１５１】
実施例４−ＤＮａｓｅ酵素アッセイ
植物において発現されるＤＮａｓｅのＤＮＡ加水分解活性を決定するために、２つの異なるプラスミド消化アッセイが使用される。第１のアッセイ（「スーパーコイルＤＮＡ消化アッセイ」）は、スーパーコイルの二本鎖ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡから弛緩（ニックの入った）形態、直線状形態、および分解形態への転換を測定する。第２のアッセイ（「直線状ＤＮＡ消化アッセイ」）は、直線状二本鎖ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡから分解形態への転換を測定する。ＤＮａｓｅ調製物を、スーパーコイルｐＢＲ３２２  ＤＮＡまたはＥｃｏＲＩで消化した直線状ｐＢＲ３２２  ＤＮＡのいずれかを含む溶液に添加し、サンプルを室温でインキュベーションする。様々な時間で、反応混合物のアリコートを取り出し、キシレンシアノール、ブロモフェノールブルーおよびグリセロールと共にＥＤＴＡの添加によってクエンチする。クエンチしたサンプルにおけるｐＢＲ３２２  ＤＮＡの完全性を、０．８％重量／体積アガロースゲル上でのサンプルの電気泳動によって解析する。電気泳動後に、エチジウムブロマイドの溶液によりゲルを染色し、ゲル中のＤＮＡを紫外線によって可視化する。ｐＢＲ３２２  ＤＮＡのスーパーコイル形態、弛緩形態および直線状形態の相対量を決定する。
【０１５２】
本明細書において引用または記載される任意の公開は、本出願の出願日の前に開示される関連情報を提供する。本明細書における記述は、本発明者がかかる開示に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。上記の明細書中で言及された出版物はすべて、参照として本明細書に援用される。本発明の様々な修飾および変形は本発明の範囲および趣旨から逸脱せずに当業者に明らかであろう。本発明は特に好ましい実施形態に関して記載されたが、請求の範囲に記載される本発明は、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことを理解すべきである。実際、細胞生物学、分子的生物学および植物生物学または関連する分野における当業者に明らかな、本発明の実行のために記載されるモードの様々な修飾は、以下の請求項の範囲内であることが意図される。
【０１５３】
配列の要約
配列番号：１
植物に至適化されたヒトＤＮａｓｅ  ＩのＤＮＡ配列
ctcaagattgctgctttcaacatccaaactttcggagagactaagatgtctaacgctactcttgtgtcctacatcgttcagattctctccagatacgatattgctcttgttcaggaagttagggattctcaccttactgctgtgggaaagcttcttgataacctcaatcaggatgctccagatacttaccactacgttgtgtctgaaccacttggaagaaactcctacaaagagcgttacctctttgtttaccgtccagatcaagtttctgctgtggattcctactactacgatgatggatgtgagccatgcggaaacgatactttcaatagagagccagctatcgttcgttttttcagtaggttcactgaagttcgtgagtttgctattgtgccacttcatgctgctccaggtgatgctgttgctgagattgatgctctctacgatgtgtaccttgatgttcaagagaagtggggacttgaggatgttatgctcatgggagatttcaatgctggatgctcttatgttaggccatctcagtggtcatctattaggctttggacttccccaactttccaatggcttatcccagattccgctgatacaactgctactccaactcattgtgcttacgataggattgtggtggctggaatgcttcttagaggtgctgttgttccagattctgctctcccattcaatttccaagctgcttacggactttctgatcaacttgctcaggctatttctgatcactacccagttgaggtgatgcttaagtga
配列番号：２
植物に至適化されたＤＮａｓｅ  Ｉのアミノ酸配列
LKIAAFNIQTFGETKMSNATLVSYIVQILSRYDIALVQEVRDSHLTAVGKLLDNLNQDAPDTYHYVVSEPLGRNSYKERYLFVYRPDQVSAVDSYYYDDGCEPCGNDTFNREPAIVRFFSRFTEVREFAIVPLHAAPGDAVAEIDALYDVYLDVQEKWGLEDVMLMGDFNAGCSYVRPSQWSSIRLWTSPTFQWLIPDSADTTATPTHCAYDRIVVAGMLLRGAVVPDSALPFNFQAAYGLSDQLAQAISDHYPVEVMLK*
配列番号：３
Ｚｅａ  ｍａｙｓ  γゼインのＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１１１８８４）
1 gcaccagttt caacgatcgt cccgcgtcaa tattattaaa aaactcttac atttctttat
61 aatcaacccg cactcttata atctcttctc tactactata ataagagagt ttatgtacaa
121 aataaggtga aattatgtat aagtgttctg gatattggtt gttggctcca tattcacaca
181 acctaatcaa tagaaaacat atgttttatt aaaacaaaat ttatcatata tcatatatat
241 atatatacat atatatatat atatataaac cgtagcaatg cacgggcata taactagtgc
301 aacttaatac atgtgtgtat taagatgaat aagagggtat ccaaataaaa aacttgttcg
361 cttacgtctg gatcgaaagg ggttggaaac gattaaatct cttcctagtc aaaattgaat
421 agaaggagat ttaatctctc ccaatcccct tcgatcatcc aggtgcaacc gtataagtcc
481 taaagtggtg aggaacacga aacaaccatg cattggcatg taaagctcca agaatttgtt
541 gtatccttaa caactcacag aacatcaacc aaaattgcac gtcaagggta ttgggtaaga
601 aacaatcaaa caaatcctct ctgtgtgcaa agaaacacgg tgagtcatgc cgagatcata
661 ctcatctgat atacatgctt acagctcaca agacattaca aacaactcat attgcattac
721 aaagatcgtt tcatgaaaaa taaaataggc cggacaggac aaaaatcctt gacgtgtaaa
781 gtaaatttac aacaaaaaaa aagccatatg tcaagctaaa tctaattcgt tttacgtaga
841 tcaacaacct gtagaaggca acaaaactga gccacgcaga agtacagaat gattccagat
901 gaaccatcga cgtgctacgt aaagagagtg acgagtcata tacatttggc aagaaaccat
961 gaagctgcct acagccgtct cggtggcata agaacacaag aaattgtgtt aattaatcaa
1021 agctataaat aacgctcgca tgcctgtgca cttctccatc accaccactg ggtcttcaga
1081 ccattagctt tatctactcc agagcgcaga agaacccgat cgacaccatg agggtgttgc
1141 tcgttgccct cgctctcctg gctctcgctg cgagcgccac ctccacgcat acaagcggcg
1201 gctgcggctg ccagccaccg ccgccggttc atctaccgcc gccggtgcat ctgccacctc
1261 cggttcacct gccacctccg gtgcatctcc caccgccggt ccacctgccg ccgccggtcc
1321 acctgccacc gccggtccat gtgccgccgc cggttcatct gccgccgcca ccatgccact
1381 accctactca accgccccgg cctcagcctc atccccagcc acacccatgc ccgtgccaac
1441 agccgcatcc aagcccgtgc cagctgcagg gaacctgcgg cgttggcagc accccgatcc
1501 tgggccagtg cgtcgagttc ctgaggcatc agtgcagccc gacggcgacg ccctactgct
1561 cgcctcagtg ccagtcgttg cggcagcagt gttgccagca gctcaggcag gtggagccgc
1621 agcaccggta ccaggcgatc ttcggcttgg tcctccagtc catcctgcag cagcagccgc
1681 aaagcggcca ggtcgcgggg ctgttggcgg cgcagatagc gcagcaactg acggcgatgt
1741 gcggcctgca gcagccgact ccatgcccct acgctgctgc cggcggtgtc ccccactgaa
1801 gaaactatgt gctgtagtat agccgctggc tagctagcta gttgagtcat ttagcggcga
1861 tgattgagta ataatgtgtc acgcatcac
配列番号：４
配列番号：３の翻訳されたアミノ酸配列。
MRVLLVALALLALAASATSTHTSGGCGCQPPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHVPPPVHLPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQLQGTCGVGSTPILGQCVEFLRHQCSPTATPYCSPQCQSLRQQCCQQLRQVEPQHRYQAIFGLVLQSILQQQPQSGQVAGLLAAQIAQQLTAMCGLQQPTPCPYAAAGGVPH
配列番号：５
γゼインの断片のアミノ酸配列
MRVLLVALALLALAASATSTHTSGGCGCQPPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHVPPPVHLPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ
配列番号：６
（ＰＰＰＡＰＡ）ｎのアミノ酸配列
APAPPPAPAPPPAPAPPPAPAPPPAPAPPPAPAPPPAPAPPPA
配列番号：７
（ＰＰＰＥＰＥ）ｎのアミノ酸配列
EPAPPPEPEPPPEPEPPPEPEPPPEPEPPPEPEPPPEPEPPPE
配列番号：８
（ＰＰＰＶＥＬ）ｎのアミノ酸配列
VELPPPVELPPPVELPPPVELPPPVELPPPVELPPPVEVPPPVE
配列番号：９
（ＰＰＰＶＡＬ）ｎのアミノ酸配列
VALPPPVALPPPVALPPPVALPPPVALPPPVALPPPVAVPPPVA
配列番号：１０
（ＰＰＰＶＴＬ）ｎのアミノ酸配列
VTLPPPVTLPPPVTLPPPVTLPPPVTLPPPVTLPPPVTVPPPVT
配列番号：１１
（ＰＰＰＡＰＡ）ｎのアミノ酸配列
PPPAPAPPPAPAPPPAPCPCPAPAPPPCP
配列番号：１２
（ＰＰＰＥＰＥ）ｎのアミノ酸配列
PPPEPEPPPEPEPPPEPCPCPEPEPPPCP
【配列表】
2014502497000001.app
【国際調査報告】
2014502497.tif 000006
2014502497.tif 000007
2014502497.tif 000008
2014502497.tif 000009