(57)【要約】  第一組成物であって、以下：  標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は生物の異常細胞上にある；および、  非自己エピトープを有するまたは非自己エピトープをコードするエピトープ部分、ここで前記非自己エピトープは前記生物により天然にコードされていないものである；  を含み、  前記標的は、前記組成物と複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示される、第一組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一組成物であって、以下：
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は生物の異常細胞上にある；および、
非自己エピトープを有するまたは非自己エピトープをコードするエピトープ部分、ここで前記非自己エピトープは前記生物により天然にコードされていないものである；
を含み、
前記標的は、前記組成物と複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示される、
第一組成物。
【請求項２】
疾患の治療での使用のための、請求項１に記載の第一組成物であって、
前記第一組成物は、前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物とともに用いるため、または用いられることを特徴とする、
第一組成物。
【請求項３】
疾患の治療のための薬剤の調製で用いるための請求項１に記載の第一組成物であって、
前記第一組成物は、前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物とともに用いられることを特徴とする、
第一組成物。
【請求項４】
疾患を治療する方法であって、
ａ）請求項１に記載の第一組成物、および、
ｂ）前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物を、
生物に投与することによる、
方法。
【請求項５】
請求項１に記載の第一組成物であって、
前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物と組み合わせた、
第一組成物。
【請求項６】
パーツのキットであって、以下：
ａ）請求項１に記載の第一組成物；および
ｂ）前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物
を含む、
キット。
【請求項７】
請求項２から６に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記免疫原性第二組成物は：
請求項１に記載の第一組成物の前に、または
請求項１に記載の第一組成物の後に、または
請求項１に記載の免疫原性第一組成物と同時に、または実質的に同時に、例えば同日に、
送達される、または送達のためであることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第二組成物の前記エピトープに対する既存の免疫を有する個体での使用のためのものである、または前記第二組成物の前記エピトープに対する既存の免疫を有する個体で使用される、
組成物または方法またはキット。
【請求項９】
先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物はリガンド−エピトープコンジュゲートであって、
前記リガンド−エピトープコンジュゲートは、以下：
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は生物の異常細胞上にあり；および、
前記生物により天然にコードされていない非自己エピトープを有するエピトープ部分、
を含み、
前記標的は、前記コンジュゲートと複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示される、
ことを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項１０】
請求項９に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記コンジュゲートの前記リガンド部分は、化学的架橋により前記エピトープ部分に結合されることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記コンジュゲートは、前記リガンド部分および前記エピトープ部分を含む融合タンパク質を発現することにより生産されることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項１２】
請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記エピトープ部分およびリガンド部分は、同一の細胞またはウイルス内に含まれることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項１３】
請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記エピトープ部分は、非自己エピトープをコードする核酸を含むことを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項１４】
先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記標的は、受容体または抗原であることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項１５】
先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記標的は、腫瘍細胞に特異的であり、または、野生型細胞とは異なる発現を有し、例えば過剰発現であることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項１６】
先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記標的は、受容体型チロシンキナーゼであることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記受容体型チロシンキナーゼは、以下：
受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の、ＥｒｂＢまたは上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリー、例えば：ＥＧＦ  Ｒ／ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ１、ＥｒｂＢ２／Ｎｅｕ／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３、およびＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４；
受容体型チロシンキナーゼのＥＰＨファミリー（ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＡ１０；ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６）
ｃ／ＭＥＴファミリー（ＭｅｔおよびＲＯＮ）；
ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）、およびＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ−４）を含む、ＶＥＧＦファミリー
からなる群から選択されることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項１８】
先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記リガンド部分は、抗体、または、抗体の抗原結合フラグメントであることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項１９】
先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記標的は受容体であり、前記組成物の前記リガンド部分は、前記受容体に関するリガンドであることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項２０】
先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記リガンドは、以下：
ｄ）天然リガンドまたはその受容体結合フラグメント；
ｅ）ペプチドまたは合成分子のような、リガンドの模倣物；
ｆ）非天然リガンドおよびその模倣物
から選択されることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項２１】
先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物のリガンドに関する標的が、受容体型チロシンキナーゼであることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項２２】
先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記リガンドは、ＥＧＦ、ＴＧＦ−ａ、ＨＢ−ＥＧＦ、アンフィレギュリン、ベタセルリン、エピジェン、エピレグリン、ニューレグリン１、２、３、４、ＥＦＮＡ１、２、３、４、５、ＥＦＮＢ１、２、３、幹細胞増殖因子（ＨＧＦ）、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄから選択されることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項２３】
先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記異常細胞は、がん細胞であることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項２４】
先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記エピトープは、多糖エピトープ、ペプチドエピトープ、脂質エピトープまたはそれらの任意の組み合わせであることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項２５】
先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記エピトープは、ＭＨＣ分子とともに提示されると、細胞傷害性Ｔ細胞応答などのＴ細胞応答を引き起こすことが可能であることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項２６】
先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記エピトープは、ＭＨＣ分子と共に標的細胞の表面上に提示されることが可能であることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項２７】
先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記エピトープは、ＭＨＣ分子と共に提示されると、エピトープ特異的なＴ細胞を刺激することが可能であることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項２８】
先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記エピトープは、それに対する通常の小児期ワクチン接種が存在する抗原の一部分を形成することを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項２９】
先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記第一組成物の前記エピトープは、リガンド構成要素の一部を形成し、
前記リガンドは非自己抗原であることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項３０】
先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記エピトープ部分は、インフルエンザウイルスエピトープ、ＣＭＶエピトープ、ＥＢＶエピトープ、ＶＺＶエピトープ、ＨＣＶエピトープ、ＨＢＶエピトープ、麻疹ウイルスエピトープ、風疹ウイルスエピトープ、狂犬病ウイルスエピトープ、黄熱病ウイルスエピトープ、疾患と関連しない抗原、例えばオボアルブミン由来のエピトープ、および合成エピトープからなる群から選択される１つまたは複数のエピトープを含むことを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項３１】
先行するいずれかの請求項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記エピトープ部分は、それに対するＴ細胞免疫応答が既に前記生物中に存在するエピトープを含むことを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項３２】
請求項１および請求項９から３１のいずれか一項に記載の組成物または方法またはキットであって、
前記組成物は、前記エピトープに対する既存の免疫応答を有する個体で、同族の免疫原性組成物を使用せずに用いられる、または用いるためであることを特徴とする、
組成物または方法またはキット。
【請求項３３】
疾患の予防または治療の方法であって、
前記方法は、請求項１および請求項９から３１のいずれか一項に記載の第一組成物を、同族の免疫原性第二組成物を使用せずに、前記エピトープに対する既存の免疫応答を有する個体に送達することを含むことを特徴とする、
方法。
【請求項３４】
疾患の治療での使用のための、または疾患の治療のための薬剤の調製での使用のための、請求項１および請求項９から３１のいずれか一項に記載の第一組成物であって、
ここで、前記第一組成物は、提示される非自己エピトープに特異的な作用物質とともに用いられることを特徴とする、
第一組成物。
【請求項３５】
薬物療法の方法であって、
それ必要とする個体に、有効量の請求項１および請求項９から３１のいずれか一項に記載の第一組成物を、提示される非自己エピトープに特異的な作用物質とともに送達するステップを含むことを特徴とする、
方法。
【請求項３６】
請求項３４または３５に記載の第一組成物または方法であって、
前記作用物質は、抗体、または抗体全体と同一の標的に結合するそのフラグメント、または細胞傷害性Ｔ細胞の集団であることを特徴とする、
第一組成物または方法。
【請求項３７】
請求項３４から３５に記載の第一組成物または方法であって、
前記第一組成物および作用物質は、前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物とともに用いられることを特徴とする、
第一組成物または方法。
【請求項３８】
免疫原性組成物であって、
非自己抗原を含むことを特徴とする、非感染性疾患の治療または予防での使用のための、免疫原性組成物。
【請求項３９】
請求項３８に記載の免疫原性組成物であって、
腫瘍関連抗原でない抗原を含むことを特徴とする、がんの治療または予防のための、
免疫原性組成物。
【請求項４０】
請求項３７または３８に記載の免疫原性組成物であって、
前記免疫原性組成物は、腫瘍関連抗原を含まないことを特徴とする、
免疫原性組成物。
【請求項４１】
薬学的に許容できる免疫原性組成物であって、
いかなる疾患とも関連しない非自己抗原を含むことを特徴とする、
免疫原性組成物。
【請求項４２】
請求項２から３１に記載の組成物、キットまたは方法であって、
前記免疫原性第二組成物は、アジュバントをさらに含むことを特徴とする、
組成物、キットまたは方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の組成物、キットまたは方法であって、
前記アジュバントは、細胞傷害性Ｔ細胞応答の促進に効果的であることを特徴とする、
組成物、キットまたは方法。
【請求項４４】
先行するいずれかの請求項に記載の組成物、方法またはキットであって、
自己抗原の異常な発現と関連する疾患の治療での使用のための、
組成物、方法またはキット。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法または使用であって、
前記使用は、固形腫瘍または血液がんの治療のためであることを特徴とする、
方法または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患の予防および治療での使用に適切な組成物およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
序論
がんは、いまだに満たされていない医療の要求がほとんどであり、先進工業国における死亡の主な原因である。免疫系は、適切に活性化されれば、迅速な免疫学的攻撃および拒絶を受ける不適合の移植臓器から明らかなように、非常に大きな可能性を有する。免疫系は、がんの前駆細胞およびがん細胞を認識して殺すことができる。しかしながら、がん治療のための免疫戦略の開発は、これまで成功はあまりしていない。
【０００３】
がんワクチンの開発は、いまだに多くの障害と挑戦で特徴付けられる。がんワクチンは、一般に、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の認識に基づく。
腫瘍抗原は、以下のような分子である。
１）正常組織に比べてがん細胞でより高濃度でしばしば存在し、一般に自己抗原であり；
２）がん細胞の発生、生存または進行において極めて重要な役割を果たす。
現在のがんワクチン候補の作用機序は、以下に基づくものと考えられる：
１）ＴＡＡに対する免疫学的応答の誘導；
２）分子反応の連鎖を引き起こして、がん細胞の死で終わる、腫瘍抗原特異抗体または腫瘍抗原特異的Ｔ細胞とがん細胞との間の相互作用。
【０００４】
この方法の主な制限は、非自己抗原に対するＴ細胞の認識の、本来備わっている制限と関係がある。エフェクターＴ細胞は、大きい臓器および外来組織の拒絶に効果的であるが、腫瘍抗原は、がんを保持している生物により「コード」されている：つまり自己抗原であるために、がん治療のための腫瘍特異的Ｔ細胞の広い適用は制限される。典型的に、免疫系は、いわゆる「寛容」のため、自己抗原に対しては反応しにくく、自己抗原でのワクチン接種は、通常、抗原に対して低結合性での、または非機能性の表現型での、Ｔ細胞レパートリーの活性化を導く。これは、がんワクチンに対する挑戦を示す［１］。
【０００５】
腫瘍細胞は、その表面上での抗原提示の比率および範囲が人為的に増加されれば、より良いインデューサーになることができ、最終的にはＴ細胞免疫の攻撃の標的となることができることが知られている［２］。
【０００６】
最近の報告は、適応免疫応答の誘導は、がんにおけるハーセプチン（トラスツズマブ）のように、治療的抗体の全体的な有効性に寄与する重要なメカニズムであることを示唆する［３］。腫瘍特異的抗体での治療中の抗腫瘍の適応免疫応答の誘導の原因となるメカニズムは、細胞内プロセシングのメカニズムに基づくと考えられる。ハーセプチン抗体でのＨＥＲ−２陽性腫瘍の治療中、腫瘍細胞は、ＨＥＲ−２特異的Ｔ細胞の標的となる［４−５］。感作抗体の存在下では、健常ドナーおよび乳がん患者から生産されるＨＥＲ２応答性の低結合性Ｔ細胞クローンは、クラスＩ適合、ＨＥＲ−２過剰発現腫瘍細胞を殺すことが示された［６］。さらに、抗−ＨＥＲ−２抗体およびＨＥＲ−２由来ペプチドでのワクチン接種の併用療法が、第Ｉ相臨床試験で試験された［７］。ＥｐｈＡ２陽性腫瘍の、特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の認識の亢進は、ＥｐｈＡ２リガンドアゴニストでの治療後に、インビトロとインビボの両方で生じる。ＳＣＩＤマウスでの腫瘍の完全な根絶は、アゴニストリガンドまたはアゴニスト抗−ＥｐｈＡ２抗体の投与と、わずかな機能活性のＥｐｈＡ２特異的Ｔ細胞の受動伝達とを組み合わせることにより得られた［８］。さらなる免疫原性配列と融合された抗体が、第２４回および第２５回国際バイオセラピー学会の年次集会に開示されている（ＣＤＸ−１３０７およびＣＤＸ−１４０１）［９−１１］。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、制限されないが、がんを含む疾患の治療のための方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下に関する：
第一組成物であって、以下：
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は生物の異常細胞上にある；および、
非自己エピトープを有するまたは非自己エピトープをコードするエピトープ部分、ここで前記非自己エピトープは前記生物により天然にコードされていないものである、
を含み、
前記標的は、前記組成物と複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示される、
第一組成物。
【０００９】
前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物と組み合わせた、本明細書に記載の第一組成物。
【００１０】
疾患の治療での使用のための、または疾患の治療のための薬剤の調製での使用のための、本明細書に記載の第一組成物であって、ここで、前記第一組成物は、前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物とともに用いるためであり、または用いられる。
【００１１】
以下を生物に投与することによる、疾患を治療する方法：
ａ）本明細書に記載の第一組成物、および場合により、
ｂ）前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物。
【００１２】
以下を含む、パーツのキット：
ａ）本明細書に記載の第一組成物；および
ｂ）前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物。
【００１３】
本明細書に記載の第一組成物であって、ここで、前記エピトープ部分およびリガンド部分は、同一の細胞またはウイルス内に含まれる。
【００１４】
本明細書に記載の第一組成物であって、ここで、前記エピトープ部分は、非自己エピトープをコードする核酸を含む。
【００１５】
疾患の治療での使用のための第一組成物であって、ここで、コンジュゲートは、以下：
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は生物の異常細胞上にある；および、
前記生物により天然にコードされていない非自己エピトープを有するエピトープ部分、
を含み、
前記標的は、前記組成物と複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示され、
前記組成物は、提示される非自己エピトープに特異的な作用物質、例えば、抗体またはＴ細胞集団とともに用いられる、
第一組成物。
【００１６】
薬物療法の方法であって、それを必要とする個体に、有効量の本明細書に記載の第一組成物を、提示される非自己エピトープに特異的な作用物質、例えば抗体またはＴ細胞集団とともに送達するステップを含む。
【００１７】
がんの予防または治療での使用のための、非自己抗原を含む免疫原性組成物。
【００１８】
がんの予防または治療のための、腫瘍関連抗原でない抗原を含む免疫原性組成物。
【００１９】
ヒトまたは非ヒト動物の疾患の予防または治療のための、いかなるヒトまたは非ヒト動物の疾患とも関連しない抗原を含む免疫原性組成物。
【００２０】
以下を含むパーツのキット：
ａ）第一組成物であって、以下：
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は、生物の異常細胞上にある；および、
前記生物により天然にコードされていない非自己エピトープを有するエピトープ部分；
を含み、
前記標的は、前記組成物と複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示される、第一組成物；および、
ｂ）前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性第二組成物。
【００２１】
疾患の予防または治療のための薬剤の調製での、または疾患の予防または治療での使用のための、第一組成物の使用であって、ここで前記組成物は、以下：
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は、生物の異常細胞上にある；および、
前記生物により天然にコードされていない非自己エピトープを有するエピトープ部分；
を含み、
前記標的は、前記第一組成物と複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示され、
前記第一組成物は、内部移行後に提示される際の前記エピトープに対する既存の免疫応答を有する個体に送達される。
【００２２】
前記第一組成物は、リガンド−エピトープコンジュゲートであってよく、前記リガンド−エピトープコンジュゲートは、以下：
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は、生物の異常細胞上にある；および、
前記生物により天然にコードされていない非自己エピトープを有するエピトープ部分、
を含み、
ここで前記標的は、前記コンジュゲートと複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】がんにおける、抗原のリガンド誘導性細胞内プロセシングの概略を示す。Ａ）がん細胞での腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）エピトープの提示。Ｂ）ＴＡＡエピトープの提示は、腫瘍抗原の、リガンド誘導性の内部移行により増加され得る。Ｃ）腫瘍細胞による、リガンド誘導性の非自己抗原の提示。
【図２】新規の２つの構成要素による治療の概略：Ａ）ＮＳ−ワクチン接種。Ｂ）ＮＳ−リガンドでの、がん細胞のタグ化。Ｃ）抗ＮＳ−Ｔ細胞による、がん細胞の殺傷。
【図３】還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、精製ｍＡｂの分析。  レーン１：スタンダード、レーン２〜４：精製ｍＡｂ１５、ｍＡｂ１５−ＯＶＡＰｅｐ２およびｍＡｂ１５−ＯＶＡＰｅｐ１。
【図４】ヒトおよびマウスのがん細胞株でのＥｐｈＡ２発現。ＭＣ３８、ＨＣＴ１１６、ＴＵＢＯ、４Ｔ１細胞由来の全細胞溶解物に対する、ＥｐｈＡ２特異抗体でのウエスタンブロット分析。α−アクチン抗体で、タンパク質の等量のローディングを確認した。
【図５】マウスＣ３５  Ｌｕｃ（Ａ）、ＭＣ３８（Ｂ）およびヒト（ＥＢＮＡ−２９３／ＥｐｈＡ２）ＥｐｈＡ２陽性細胞（Ｃ）に対する、精製ｍＡｂ１５（●）、ｍＡｂ１５−ＯＶＡＰｅｐ２（■）およびｍＡｂ１５−ＯＶＡＰｅｐ１（▲）のＥＬＩＳＡ分析により得られた結合曲線。
【図６】腫瘍細胞表面上のＯＶＡ２５７−２６４／Ｋｂ複合体の提示の、フローサイトメトリーによる分析。ＥｐｈＡ２陽性細胞（Ｃ３５  Ｌｕｃ）は、増加する濃度の抗−ＥｐｈＡ２  ｍＡｂで３７℃にて４８時間処理されて、特異的な２５−Ｄ１．１６  ＰＥコンジュゲート化抗体で染色された。ポジティブコントロールとして、細胞は、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（２μＭ）で、３７℃にて１時間パルスされた。
【図７】Ａｄ５ＯＶＡ  ＴＡＧ（１０＾８  ｖｐ）で免疫化されたＣ５７ＢＬ／６マウス由来の脾細胞上のＦＮγ  ＥＬＩｓｐｏｔ。脾細胞は、免疫付与後１０日（Ａ）または２４日（Ｂ）に摘出されて、増加する濃度でのＯＶＡ−ｍＡｂで事前処理した（４８時間）、またはＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドで事前処理（１時間）したＣ３５Ｌｕｃ細胞で再刺激した。応答は、１００万の脾細胞あたりの、抗原特異的なＩＦＮγスポット形成細胞の数として報告される。各棒は、４回測定値の平均を示す。
【図８】還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、精製ｍＡｂの分析。レーン１：スタンダード、レーン２、３：精製ハーセプチンおよびハーセプチン−ＯＶＡＰｅｐ２。
【図９】マウスＣ３５  Ｌｕｃ（Ａ）、ＭＣ３８（Ｂ）およびヒトＳＫＢＲ３（Ｃ）ＥｒｂＢ２陽性細胞に対する、精製ハーセプチン（●）およびハーセプチン−ＯＶＡＰｅｐ２（▲）のＥＬＩＳＡ分析により得られた結合曲線。
【図１０】腫瘍細胞表面上のＯＶＡ２５７−２６４／Ｋｂ複合体の提示の、フローサイトメトリーによる分析。ＥｒｂＢ２陽性細胞Ｃ３５  Ｌｕｃ（Ａ）およびＭＣ３８（Ｂ）は、抗−ＥｒｂＢ２  ｍＡｂ（４μＭ）で、３７℃にて４８時間処理されて、特異的な２５−Ｄ１．１６  ＰＥコンジュゲート化抗体で染色された。ポジティブコントロールとして、細胞はＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（２μＭ）で、３７℃にて１時間パルスされた。
【図１１】Ａｄ５ＯＶＡ  ＴＡＧ（１０＾８  ｖｐ）で免疫化されたＣ５７ＢＬ／６マウス由来の脾細胞上のＦＮγ  ＥＬＩｓｐｏｔ。  脾細胞は、免疫付与後２４日に摘出されて、増加する濃度でのＯＶＡ−ｍＡｂで事前処理した（４８時間）、またはＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドで事前処理（１時間）したＣ３５  Ｌｕｃ細胞で再刺激した。応答は、１００万の脾細胞あたりの、抗原特異的なＩＦＮγスポット形成細胞の数として報告される。各棒は、４回測定値の平均を示す。
【図１２】ＯＶＡエピトープの、ベクター仲介の提示。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、一般に、疾患の予防または治療のための方法に関し、その方法は、寛容非感受性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ−ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）の免疫応答を誘導するための非自己抗原、および特定の受容体に対する特異性を有するリガンドを使用し、後者は、特定の細胞への寛容非感受性の免疫応答の標的化が可能である。
【００２５】
リガンドは関連する（ｃｏｇｎａｔｅ）受容体（Ｒ）に結合して複合体（ＬＲ複合体）を形成し、それは内部移行して細胞内の分解経路に向かうことができて、その複合体はペプチドにフラグメント化されることが知られている。これらのペプチドは、次々に、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩとの複合体で、細胞表面上に提示される。したがって、関連する受容体Ｒを発現する細胞へのリガンドＬの投与は、リガンドのプロテアソームプロセシングの増大をもたらし、その結果として、がん細胞などの細胞の表面上に提示される、ＬＲ由来ペプチドの濃度増加をもたらす。
【００２６】
本発明では、細胞は、リガンド−エピトープコンジュゲートなどの第一組成物を細胞へ送達することにより治療の標的として、コンジュゲートなどの組成物は、取り込まれて、それから、その全てまたは一部がプロセシングされて細胞により提示される。エピトープの提示は、細胞を治療の標的とし、それは、免疫応答、または提示されるエピトープを結合することが可能な他の特定の方法によって達成され得る。特に、リガンドが自己標的に結合して、エピトープが非自己エピトープである場合、提示される非自己エピトープに対して生じる免疫応答は、寛容により影響を受けない。
【００２７】
免疫応答は、非自己抗原、またはそのミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）を含む免疫原性組成物の送達により、提示される非自己のエピトープに対して生じ得る。免疫原性第二組成物が、第一組成物の前に個体に送達される場合、その個体は、提示されるエピトープと反応する準備のできているＴ細胞などの免疫細胞の集団を含み得る。要するに、その個体は、非自己エピトープに対してワクチン接種される。
【００２８】
本発明はまた、本明細書に記載の使用または方法に関し、ここで、免疫原性第二組成物は、第一組成物の後に送達され、または第一組成物は免疫原性第二組成物と同時に、または実質的に同時に、例えば同日に送達される。
【００２９】
本発明では、標的細胞に対する免疫応答の特異性は、リガンド結合により調節され、また、プロセシングされて提示されるエピトープとＴ細胞との相互作用のレベルで調整することができる可能性もある。
【００３０】
本発明は、以下：
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は、生物の異常細胞上にある；および、
非自己エピトープを有するまたは非自己エピトープをコードするエピトープ部分、ここで前記非自己エピトープは生物により天然にコードされていないものである；
を含み、
前記標的は、前記組成物と複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示される、
組成物を開示する。
【００３１】
前記組成物は、本明細書中で、第一組成物とも呼ばれ得る。
【００３２】
前記組成物のリガンド部分およびエピトープ部分は、異常細胞へのリガンドの結合がエピトープ部分を異常細胞中へ内部移行させて、それから、エピトープを細胞表面上に提示させるように、お互いに適切に関連している。
【００３３】
一態様では、前記第一組成物は、リガンドエピトープコンジュゲートを含んでよく、そのコンジュゲートは、リガンド部分およびエピトープを含む。
【００３４】
前記コンジュゲートのリガンド部分は、化学的架橋によりエピトープ部分に結合されてよい。あるいは、前記コンジュゲートは、リガンド部分およびエピトープ部分を含む融合タンパク質であってよい。別の実施態様では、それらの部分は、ロイシンジッパーのようなタンパク質−タンパク質相互作用により関連があってよい。リガンド部分およびエピトープ部分は、直接結合していてよく、またはリンカーを介してもよい。
【００３５】
別の実施態様では、前記コンジュゲートは、単一の分子であってもよく、その場合、エピトープはリガンド全体の一部分を形成し、例えば、リガンドは合成であり、および／または、リガンドは非自己抗原である。このように、本発明のコンジュゲートは、二重機能性、すなわち、標的および標的細胞により提示され得るエピトープに結合する能力を適切に最小限に含むが、いかなる特異的なコンジュゲーション活性、または、コンジュゲートの２つの異なる要素を結合させる、またはさもなければ関連付けるために行われる方法も、必ずしも必要でない。非自己抗原配列に対する適切なリガンドのコンジュゲーションは、受容体結合、内部移行およびプロテアソーム分解を妨げない。
【００３６】
一態様では、前記組成物は、コンジュゲーション以外によって関連付けられるリガンドおよびエピトープを含んでよい、例えば、エピトープ部分およびリガンド部分は、同一の生物、例えば細胞またはウイルス内に含まれてよい。本態様では、ウイルスまたは細胞は、リガンドおよびエピトープ部分の両方を提供する。例えば、リガンドおよびエピトープ部分は、ウイルスの２つの要素を形成してよく、天然起源または遺伝子操作のいずれかであり、ウイルスは異常細胞上の標的に結合することができる。ウイルスは、非自己エピトープを含んでよく、またはそれをコードしてよく、したがって、細胞へのウイルスの結合の結果として、非自己エピトープは、異常細胞の表面上に提示されることができる。一態様では、ウイルスはアデノウイルスであってよい。
【００３７】
したがって、一態様では、リガンド部分は、標的細胞の表面上に存在する標的（例えば受容体）と相互作用可能で内部移行可能な、ペプチド、タンパク質、抗体またはウイルスベクターであってよい。
【００３８】
したがって、一態様では、エピトープ部分は、非自己エピトープをコードするＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸種を含んでよい。この場合、非自己エピトープの提示は、異常細胞内での核酸種の転写および／または翻訳後に適切に生じる。核酸はリガンドに直接結合または結合してよく、または、例えば同一の種または生物の一部であることにより関連付けられてもよい。
【００３９】
一態様では、エピトープ部分は、１つのペプチドまたは一連のペプチド、またはタンパク質である。
【００４０】
一態様では、第一組成物は、トランスロケーションドメインを含まない。
【００４１】
リガンドに関する標的は、細胞上の受容体または抗原であってよい。一実施態様では、標的は、腫瘍細胞のような異常細胞に特異的であり、または、野生型細胞とは異なる発現パターンを有し、例えば特定の抗原の過剰発現を有する。
【００４２】
一態様では、受容体は腫瘍特異的である。適切な標的であり得る細胞表面腫瘍抗原の１クラスは、受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のファミリーである［２］。ＲＴＫは、一般に、幅広い範囲のがんタイプにより発現され、疾患の進行に寄与し、増殖性、生存、血管新生および遊走の利益をがん細胞にもたらす。ＲＴＫのがん増強機能を考慮すれば、それは、シグナルカスケードを阻害してその発現レベルを減少させるように設計される抗がん治療のための良く知られた標的である。リガンド／ＲＴＫ結合の通常の条件下では、受容体は細胞膜中で二量体化し、細胞質のチロシン残基を自己リン酸化する。リン酸化ＲＴＫは、その結果、Ｅ３−リガーゼなどのアダプタータンパク質と相互作用することができ、ユビキチン化およびクラスリン被覆ピットを介した内部移行をもたらす。取り込まれたＲＴＫは、プロテアソーム分解の基質になり得る。ＲＴＫの間では、リガンド誘導性の細胞内プロセシングが示されているので、適切な受容体としてＨｅｒ２／ｎｅｕおよびＥｐｈＡ２の選択が実験的データにより支持される。他のＲＴＫ、例えばＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２もまた、がん細胞でのこれらの受容体に関してリガンド誘導性の受容体分解が示されているので、適切な標的である。
【００４３】
リガンドに関する細胞の標的は、したがって、以下からなる群から選択される受容体型チロシンキナーゼを含んでよい：
【００４４】
受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の、ＥｒｂＢまたは上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリー、例えば：ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ１、ＥｒｂＢ２／Ｎｅｕ／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３、およびＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４；
【００４５】
受容体型チロシンキナーゼのＥＰＨファミリー（ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＡ１０；ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６）；
【００４６】
ｃ／ＭＥＴファミリー（ＭｅｔおよびＲＯＮ）およびＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）、ＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ−４）。
【００４７】
さらに、がんなどの疾患で過剰発現して同様の経路の内部移行誘導性の分解を示す他のクラスの受容体もまた、本発明で用いてよい。
【００４８】
標的は、ＭＨＣ分子と共に提示される抗原であってよい。
【００４９】
非自己（ＮＳ）リガンドを結合することが可能で標的細胞へＮＳ−リガンドを送達することが可能な細胞表面分子を同定するために、内部移行および分解の分析を行うことができる。一実施態様では、分析は以下のように行う：受容体を発現する細胞を、異なる濃度（例えば１〜１００μｇ／ｍＬ）で異なる時間（例えば１、２、４および６時間）、コントロールリガンドまたはＮＳ−リガンドとともにインキュベートする。細胞をそれから、４℃で１０分、ＴＰＥＲバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ）中で溶解させる。３０μｇの細胞溶解物をＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上にロードして電気泳動後、タンパク質をニトロセルロース上に移して、標準的な技術を用いて、受容体に対する第一抗体でプローブする。ＨＲＰまたはＡＰに結合した第二抗体を、検出試薬として用いることができる。ＮＳ−リガンド処理時に細胞上に見られる受容体の量を、濃度測定スキャニングにより定量化する。このタイプの分析の例として、図２を参照のこと：Ａｎｓｕｉｎｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉ−ＥｐｈＡ２  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｈａｖｅ  Ｅｑｕａｌ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．２００９；２００９：９５１９１７。
【００５０】
コンジュゲートなどの前記第一組成物のリガンド部分は、目的とする標的に、特異的にコンジュゲートなどの第一組成物を結合させることを指示可能な、任意の構成要素である。それは、抗体、または、特に標的が細胞の表面上の抗原である場合は抗体の抗原結合フラグメントであってよい。
【００５１】
抗体結合フラグメントは、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体および抗原結合性の誘導体またはそれらのフラグメントを含むことができる。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤのような任意のクラスであってよい。よく知られた抗原結合フラグメントは、例えば、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ；単一のＶＬまたはＶＨ抗体ドメインから本質的になる）、単一鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを含むＦｖフラグメントを含む。そのような抗体分子を構築するための方法は、当技術分野でよく知られている。
【００５２】
より詳細には、抗体とは、完全な免疫グロブリン、免疫グロブリンの抗原結合フラグメント、および、免疫グロブリンの抗体結合ドメインを含む抗原結合タンパク質を含む。免疫グロブリンの抗原結合フラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖおよびｄＡｂを含む。修飾抗体型が開発されて、それは結合特異性を維持するが、例えば、生物学的特異性、多価性（２より多い結合部位）、および小さなサイズ（例えば、結合ドメインだけ）を含む、望ましい他の特性を有する。単鎖抗体は、通常、由来した元の抗体全体のいくらかのまたは全ての定常領域が欠如している。したがって、単鎖抗体は、抗体全体の使用と関連するいくつかの問題を克服することができる。例えば、単鎖抗体は、重鎖定常領域と他の生物学的分子との間の、特定の望ましくない相互作用がない傾向がある。さらに、単鎖抗体は、抗体全体よりもかなり小さく、抗体全体よりも高い透過性を有することができ、単鎖抗体を、より効率的に、標的の抗原結合部位に局在および結合させることができる。さらに、比較的小さなサイズの単鎖抗体は、レシピエント内でそれが望まない免疫応答を引き起こす可能性を、抗体全体よりも低くする。
【００５３】
各単鎖が第一ペプチドリンカーにより共有結合された１つのＶＨと１つのＶＬドメインを有する多重単鎖抗体は、少なくとも１つまたは複数のペプチドリンカーにより共有結合して多重単鎖抗体を形成することができ、単一特異性または多重特異性であり得る。多重単鎖抗体の各鎖は、可変の軽鎖フラグメントと可変の重鎖フラグメントを含み、ペプチドリンカーにより、少なくとも１つの他の鎖に結合している。ペプチドリンカーは、少なくとも１５のアミノ酸残基からなる。リンカーアミノ酸残基の最大数は、およそ１００である。２つの単鎖抗体は、組み合わさって、二価の二量体としても知られるダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）を形成することができる。ダイアボディは２つの鎖と２つの結合部位を有し、単一特異性または二重特異性であり得る。ダイアボディの各鎖は、ＶＬドメインに結合されたＶＨドメインを含む。これらのドメインは、同一鎖上のドメイン間でペアになるのを防ぐのに十分短いリンカーで結合されていて、このようにして、異なる鎖上の相補ドメイン間でのペアリングをもたらして、２つの抗原結合部位を作り出す。
【００５４】
３つの単鎖抗体は、組み合わさって、三価の三量体としても知られるトリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）を形成することができる。トリアボディは、ＶＬまたはＶＨドメインのアミノ酸末端が、ＶＬまたはＶＨドメインのカルボキシル末端に直接融合されて、すなわち、いかなるリンカー配列も無く、構築される。トリアボディは、環状にヘッド−トゥ−テイル（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）の形状で配列したポリペプチドを有する３つのＦｖヘッドを持つ。トリアボディの取り得る構造は、３つの結合部位をお互いから１２０度の角度で平面内に位置して平面的である。トリアボディは、単一特異性、二重特異性または三重特異性であることができる。
【００５５】
このように、本明細書に記載の方法で有用な抗体は、限定されないが、天然起源の抗体、（Ｆａｂ’）２のような二価フラグメント、Ｆａｂのような単価フラグメント、単鎖抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、多価単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、抗原に特異的に結合する同様のものを含む。抗体はまた、当業者に知られた方法で、ポリペプチドまたはポリペプチドの部分に対して生じさせることができる。抗体は、遺伝子産物、またはそのフラグメントでの免疫化により、ウサギまたはマウスなどの動物中に容易に生じる。免疫化マウスは、次々培養されて大量のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの製造のためのＢ細胞の元を提供するのに特に有用である。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方とも、本明細書に記載の方法に用いることができるが、特定のタンパク質に対する高い特異性を必要とする条件では、モノクローナル抗体が使用されることが好ましい。
【００５６】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の調製のために、当技術分野で知られている任意の技術を用いることができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ&Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｐｐ．７７−９６  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９８５）を参照）。単鎖抗体の生産のための技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明のポリペプチドに対する抗体を生産するために用いることができる。また、遺伝子導入マウス、または他の生物、例えば他の哺乳類を、ヒト化抗体発現のために用いてもよい。あるいは、ファージディスプレイの技術を、選択された抗原に特異的に結合する抗体および異種Ｆａｂフラグメントを同定するために用いることができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７  Ｏ−７’８３（１９９２）を参照）。
【００５７】
標的が受容体の場合、リガンド部分もまた、その受容体に関する天然リガンドまたはその受容体結合フラグメントであってよく；その受容体に結合することが可能なペプチドまたは合成分子のような天然リガンドの模倣物であってよく；または、その受容体に結合することが可能な非天然リガンドまたはその模倣物であってよい。後者の例は、宿主受容体型チロシンキナーゼＭｅｔに結合する、リステリア由来の細菌性タンパク質インターナリンＢを含む。
【００５８】
第一組成物（例えば、リガンドエピトープコンジュゲート）のリガンド部分は、以下のうちの一つであってよい：ＥＧＦ、ＴＧＦ−ａ、ＨＢ−ＥＧＦ、アンフィレギュリン、ベタセルリン、エピジェン、エピレグリン、ニューレグリン１、２、３、４、ＥＦＮＡ１、２、３、４、５、ＥＦＮＢ１、２、３、幹細胞増殖因子（ＨＧＦ）、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄ。細胞の受容体（特に、がんの表現型と関連するこれらの受容体）に関する他のリガンドはよく知られている。
【００５９】
一実施態様での第一組成物（例えばリガンドエピトープコンジュゲート）のリガンド部分は、本明細書に記載のＲＴＫ受容体、例えば以下のＲＴＫ受容体のうちの一つ：Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｐｈＡ２、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２、または、がんでの過剰発現およびリガンド誘導性の内部移行および分解が立証される任意の他の受容体の、内部移行を誘導することができる。
【００６０】
第一組成物（例えばリガンド−エピトープコンジュゲート）のリガンド部分は、標的に特異的に結合することができる。語句「に特異的に結合する」、「に特異的」または「と特異的に免疫反応性」は、抗体またはリガンドの標的への結合性について言及する場合、一般に、タンパク質および他の生物製剤のような他の可能性のある標的の不均一集団の存在下で、ポリペプチドのような、標的の存在を決定する結合反応を指す。したがって、所定の免疫測定条件下では、特定の結合分子は、特定のペプチドに優先的に結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質には大量には結合しない。そのような条件下でのポリペプチドまたは他の標的への特異的な結合は、特定のタンパク質に対するその特異性に関して選択される結合分子を必要とする。様々な免疫測定の形式を、特定のタンパク質または他の標的と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために用いてよい。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫測定は、タンパク質と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するために日常的に用いられている。免疫測定の形式および特異的な免疫反応性を決定するために用いることができる条件の説明に関しては、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。典型的に、特異的な反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、より典型的には、バックグラウンドの１０倍、２０倍または１００倍よりも多い。
【００６１】
任意の第一組成物（例えばリガンドエピトープコンジュゲート）のリガンド部分は、アンキリンタンパク質、またはアンキリンドメインを含むようなその一部分であってよく、またはそれらを含む。ＡＮＫドメインは、典型的に、短いループにより結合された２つの逆平行のαへリックスを含む３３残基モチーフである。
【００６２】
異常細胞は、野生型の表現型を有さない細胞であり、疾患の表現型と関連する。一態様では、異常細胞はがん細胞である。一態様では、標的細胞は、過剰発現の抗原、例えば、２、３、４、５、１０倍またはそれ以上の過剰発現の抗原、例えば腫瘍関連抗原または他の抗原を有する。
【００６３】
第一組成物（例えば、リガンド−エピトープコンジュゲート）のエピトープ部分は、多糖エピトープ、ペプチドエピトープ、脂質エピトープまたはそれらの任意の組み合わせであってよい。第一組成物（例えばコンジュゲート）の一部分として含まれるエピトープは、天然または合成の非自己配列を含んでよい。一態様では、エピトープは、細胞傷害性Ｔ細胞応答を引き起こすことが可能であってよい。
【００６４】
誤解を避けるために、エピトープ部分内のエピトープは、機能的に、プロセシングおよび提示に対する、Ｔ細胞エピトープのようなエピトープの機能を発揮するためだけに必要とされ、第一組成物（例えばリガンドエピトープコンジュゲート）の形態でのエピトープとして特異的に提示または作用はしなくてよいが、これもまた可能である。一態様では、第一組成物（例えばリガンド−エピトープコンジュゲート）のエピトープは、第一組成物（例えばコンジュゲート）の関連でエピトープとして作用しない。
【００６５】
上記のとおり、エピトープは、リガンド構成要素の一部分を形成することができ、例えばリガンドが非自己抗原である場合、リガンドとエピトープを一緒にコンジュゲート化させるためのいかなる処置も必要ではないが、それらはコンジュゲートとして予め存在する。
【００６６】
エピトープ部分は、ウイルスまたは細菌のエピトープ、例えば、以下からなる群から選択されるエピトープ：マラリアエピトープ、狂犬病エピトープ、黄熱病エピトープ、インフルエンザウイルスエピトープ、ＣＭＶエピトープ、ＥＢＶエピトープ、ＶＺＶエピトープ、ＨＣＶエピトープ、麻疹ウイルスエピトープ、おたふく風邪エピトープ、風疹ウイルスエピトープ、ＨＰＶエピトープ、ＨＢＶエピトープ、または疾患と関係ない抗原由来のエピトープ、例えばオボアルブミンエピトープ、または合成エピトープを含んでよい。一態様では、エピトープは、ＦＤＡまたはＥＭＥＡにより承認されたワクチン中に見られる抗原を含む。
【００６７】
エピトープ部分は、Ｔ細胞免疫応答が生物中に既に存在する１つまたは複数のエピトープを含んでよい。例えば、エピトープは、小児期のワクチン接種の一環として与えられる抗原であってよく、またはそのような抗原の一部であってよい。
【００６８】
エピトープは、細胞によるエピトープのプロセシングおよび／または提示に役立つと知られている配列と隣り合ってよく、例えば、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．２００４  Ｍａｒ；８５（Ｐｔ  ３）：５６３−７２の、「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ａ  ＣＤ８＋  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」を参照のこと。
【００６９】
一態様では、第一組成物（例えばリガンドエピトープコンジュゲート）は、抗体の重鎖または軽鎖、またはそれらの部分、例えば重鎖、またはその部分、抗体配列または所望の標的に対する結合活性を維持するそれらの部分を有する、融合タンパク質の形態でのインフルエンザエピトープを含む。
【００７０】
融合は、抗体鎖のＣ末端で行われてよい。
【００７１】
抗体鎖に融合されたエピトープ、またはその部分は、配列ＧＧＳＧＳのようなフレキシブルであり得るリンカー配列を介して結合されてよい。
【００７２】
インフルエンザタンパク質は、以下のようなＮＰタンパク質の全てまたは一部であってよい：
2014513072.tif 000002
【００７３】
インフルエンザ核タンパク質由来の、別の第二の、より短いアミノ酸配列は、
2014513072.tif 000003
である。
【００７４】
あるいは、オボアルブミン配列を使用してよく、例えば、配列
2014513072.tif 000004
は、抗体鎖または抗体鎖の一部分のＣ末端に適切に融合される。
【００７５】
オボアルブミン由来の、別の第二の、より短いアミノ酸配列は、
2014513072.tif 000005
である。
【００７６】
本発明はまた、以下に関する：
本明細書に記載の第一組成物であって、前記エピトープは、ＭＨＣ分子と共に前記標的細胞の表面上に提示されることが可能である。
【００７７】
本明細書に記載の第一組成物であって、前記エピトープは、ＭＨＣ分子と共に提示されると、エピトープ特異的なＴ細胞を刺激することが可能である。
【００７８】
本明細書に記載の第一組成物であって、前記エピトープは、ＭＨＣ分子と共に提示されると、Ｔ細胞応答を引き起こすことが可能である。
【００７９】
前記ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラス１またはＭＨＣクラス２分子であってよい。
【００８０】
本発明の第一組成物（例えばリガンドエピトープコンジュゲート）は、本明細書に記載の第一組成物、および免疫原性組成物（前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記リガンド−エピトープコンジュゲートの非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む免疫原性組成物）を、適切に個体に投与することにより、疾患を予防または治療する方法で用いられる。
【００８１】
第一組成物を第二組成物からより明確に区別するために、免疫原性組成物は、本明細書中で免疫原性第二組成物と呼ぶことができる。誤解を避けるために、第一および第二組成物は両方とも免疫原性であってよい。
【００８２】
本発明はまた、疾患の治療での使用のための、本明細書に記載の第一組成物（例えばリガンドエピトープコンジュゲート）に関し、ここで、前記第一組成物は、免疫原性第二組成物とともに使用されて、前記免疫原性第二組成物は、前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含み、または、前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む。
【００８３】
本発明はまた、疾患の治療のための薬剤の調製での使用のための、本明細書に記載の第一組成物（例えばリガンド−エピトープコンジュゲート）に関し、ここで、前記第一組成物は、免疫原性第二組成物とともに使用されて、前記免疫原性第二組成物は、前記第一組成物の非自己エピトープと同一のエピトープを含み、または、前記第一組成物の非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む。
【００８４】
交差反応性とは、前記免疫原性第二組成物の非自己エピトープに対して生じる免疫応答が、リガンド−エピトープコンジュゲートなどの前記第一組成物の、提示された非自己抗原を認識することができることを意味する。
【００８５】
また、そのようなエピトープを共有する、または前記第一組成物（例えばコンジュゲート）とのそのような交差反応性のエピトープを有する免疫原性第二組成物は、第一組成物と「同族の（ｃｏｇｎａｔｅｄ）」または「同族（ｃｏｇｎａｔｅ）」として本明細書に記載されることができ（例えば、同族の免疫コンジュゲート）、すなわち、そのような免疫原性第二組成物は、コンジュゲートなどの特定の第一組成物との使用に適切である。
【００８６】
一態様では、前記免疫原性第二組成物に対して生じる免疫応答は、コンジュゲートなどの前記第一組成物の提示されるエピトープと特異的に反応性のＴ細胞を産生する。
【００８７】
本発明はまた、本明細書に記載の使用または方法に関し、ここで、前記免疫原性第二組成物は：先行するいずれかの請求項に記載の第一組成物の前に、または先行するいずれかの請求項に記載の第一組成物の後に送達され、または；
同時に、または実質的に同時に、例えば前記第一組成物と同日に送達される。
【００８８】
一態様では、非自己エピトープまたはそのミメトープが、前記第一組成物の一部として送達されて細胞により提示されるとすぐに個体の免疫応答が任意の提示される非自己エピトープに対して反応する準備がされているように、前記免疫原性組成物は前記第一組成物の前に送達される。
【００８９】
一態様では、前記第一組成物は、エピトープに対する既存の免疫を有する個体で使用される。そのような態様では、個体は、非自己エピトープの提示に反応するように免疫学的に準備されているので、前記第一組成物を免疫原性第二組成物とともに送達する必要がないであろう。このように、本態様では、前記第一組成物は、本明細書に記載の免疫原性第二組成物無しで用いられる。
【００９０】
提示エピトープに対する免疫応答を産生するために用いられる免疫原性第二組成物は、免疫療法を与える受動的方法により、例えば提示エピトープに特異的な抗体などの提示エピトープに特異的な作用物質をもたらすことにより、または、提示エピトープに特異的なＴ細胞集団をもたらすことにより、または、溶解性のＴ細胞受容体のような身体への送達に適切な形態での提示エピトープに関するＴ細胞受容体をもたらすことにより、補われ、または置き換えることができる（Ｍｏｌｌｏｙ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００５，５：４３８−４４３およびＩｍｍｕｎｏｃｏｒｅ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｃｏｒｅ．ｃｏｍ／を参照）。一態様では、前記作用物質は、異常細胞に対して細胞障害性であり、または、異常細胞に対する細胞傷害性の応答を指示することができる。任意の受動的方法は、リガンドエピトープコンジュゲートなどの前記の第一組成物と同族の、本明細書に記載の免疫原性第二組成物の前、後、同時に、または実質的に同時に、用いることができる。
【００９１】
一態様では、免疫原性第二組成物は、ユニバーサルで、異なる疾患の治療に適用可能なように設計される。免疫原性第二組成物は、適切に、ＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞免疫応答のインデューサーであり、そして非自己免疫原である。第一組成物および免疫原性第二組成物中のエピトープは、一般的な配列を共有してよく、および／または同一であってよく、および／または、同一の抗原由来であってよい。第一組成物中、および免疫原性第二組成物内に含まれる免疫原中のエピトープは、感染因子、例えば、リガンドに関して本明細書に記載の任意のもの由来であってよい。免疫原性第二組成物はインフルエンザ核タンパク質のような感染因子由来であってよく、またはオボアルブミンのような他の非自己タンパク質由来であってよい。生の弱毒化病原体は、ＣＤ８およびＣＤ４免疫応答の優れたインデューサーであると考えられ、生の弱毒化ウイルスに基づく免疫原は、本発明の実施態様を形成し、場合によりＦＤＡまたはＥＭＥＡ承認のワクチンの形態での、生の弱毒化麻疹ウイルス、おたふく風邪ウイルス、風疹ウイルス、水痘ウイルス、黄熱病ウイルスおよび狂犬病ウイルスを含む。
【００９２】
免疫原性第二組成物は、抗原性タンパク質全体または免疫原性エピトープを含むその部分を含むことができる。エピトープとは、免疫応答を刺激することが可能な抗原の一部を指す。
【００９３】
前記免疫原性第二組成物は、ヒト集団での使用について適切に承認されたワクチンであってよい。
【００９４】
前記免疫原性第二組成物は、免疫原だけを含んでよく、または、さらなる構成要素、例えば薬学的に許容できる担体または添加剤を含んでよい。
【００９５】
前記免疫原性第二組成物は、タンパク質またはその部分を含むことができ、組み換えタンパク質を含み、または、タンパク質をコードする核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを含んでよい。
【００９６】
核酸に基づく免疫原性第二組成物に関して、その核酸は、プロモーター、抗原ペプチドをコードする目的の遺伝子およびポリアデニル化／転写終止配列が挿入された細菌プラスミドベクターの形態で送達されてよい。目的の遺伝子は、タンパク質全体、または免疫応答を引き起こすことが意図される抗原ペプチド配列だけをコードしてよい。プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌内で増殖することができ、それから単離されて、宿主へ投与される前に、意図する投与経路に応じた適切な媒体中に調製される。投与に続いて、プラスミドは宿主の細胞により取り込まれ、または、宿主細胞中に直接送達されて、そこで、コードされたペプチドが生産される。プラスミドベクターは、哺乳類の宿主内でのプラスミド複製および関係する動物の染色体ＤＮＡ内での組み込みを避けるために、好ましくは、真核生物細胞内で機能性がある複製起点を伴わずに作成される。ＤＮＡワクチン接種に関する役に立つ背景情報は、Ｄｏｎｎｅｌｌｙらの「ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ」Ａｎｎ．Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  １５：６１７−６４８に示され、その開示は、その全体で参照により本明細書中に含まれる。核酸は、担体としてゴールドビーズ（ｇｏｌｄ  ｂｅａｄｓ）を用いて送達されてよい。
【００９７】
核酸はまた、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスまたはＭＶＡを用いて送達されてもよい。アデノウイルスは、複製欠損アデノウイルスベクター、例えば複製欠損チンパンジーアデノウイルスであってよい。
【００９８】
組み換えウイルスに基づく、免疫原性第二組成物を送達するためのこれらの方法は、現在のところ診療所で試験されており、生の弱毒化の方法よりもさらに強い、ＣＤ８およびＣＤ４免疫応答のインデューサーである見込みがある。アデノウイルスベクターおよびＨＣＶおよびマラリア抗原をコードするＭＶＡは、特に異種のプライム・ブースト法での使用の場合に、非常に強力なＣＤ８およびＣＤ４免疫応答を誘導することが証明されている。多くの他の非自己タンパク質を、そのような方法で用いることができる。特に治療方法に関しては、核酸は、抗原部分、またはＣＭＶ、ＥＢＶまたはインフルエンザ抗原の全部をコードすることができる。これらのウイルスは、ヒト集団においてメモリー型ＣＤ８応答を誘導することが知られている。これらの３つの病原体のうちの１つのような、ヒト集団中に常在する病原体に対する既存のＴ細胞のブーストは、治療用途の一つの選択肢である。
【００９９】
プライム・ブースト法は、免疫原性組成物の送達のために用いてよく、タンパク質またはそのフラグメントが個体へ送達されて、その後に前記タンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸が送達される。あるいは、タンパク質またはそのフラグメントの前に核酸が送達されてよい。構成要素は、それぞれ１回または複数回、送達されてよい。
【０１００】
免疫原性第二組成物は、アジュバントと組み合わせて用いて、所望の抗原に対する免疫応答を高めて、長期にわたる保護的で治療的な免疫を誘導することができる。アジュバントは、一般に、抗原に対する特異的な免疫応答を高める、ワクチンまたは免疫原性組成物中の構成要素を指す（例えば、Ｅｄｅｌｍａｎ，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ８：１４０９−１４１１（１９９２）を参照）。
【０１０１】
アジュバントは、Ｔｈ１タイプおよびＴｈ２タイプ応答の免疫応答を誘導する。Ｔｈ１タイプのサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２）は、投与された抗原に対する細胞性免疫応答の誘導を好む傾向があり、一方でＴｈ２タイプのサイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＩ−６、ＩＬ−１０）は、液性免疫応答の誘導を好む傾向がある。Ｔｈ１細胞性免疫応答の選択的刺激が可能なアジュバントは、ＷＯ９４／００１５３およびＷＯ９５／１７２０９に開示されている。
【０１０２】
適切なアジュバントは、サポニン、例えばＱＳ２１、リピドＡ誘導体、例えばＭＰＬまたは３Ｄ−ＭＰＬ、水中油エマルション、例えばＭＦ５９およびＡＳ０３、アルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、およびそれらの混合物を含んでよい。また、ＡＧＰのような合成アジュバントも用いることができる（Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００８；８（２）：６４−７９，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＴＬＲ４−ａｃｔｉｖｅ  ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  ｓｔａｎｄ−ａｌｏｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＤＡ）。アジュバントは、ＴＬＲアゴニスト、例えばＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９アゴニストであってよい。組み合せは、ＧＳＫ社のアジュバント組み合わせであるＱＳ２１および３Ｄ  ＭＰＬを有するＡＳ０１を含む。
【０１０３】
いくつかのアジュバントの総括が、「Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２００７  Ｏｃｔ；６（５）：７２３−３９．ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｃｏｎｃｅｐｔｓ，ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．Ｇａｒｃｏｎ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．に開示されている。他のアジュバントは、ＶＡＣＣＩＮＥ  ＡＤＪＵＶＡＮＴＳ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，２００６，２３５−２５５，ＤＯＩ：１０．１００７／９７８−１−５９２５９−９７０−７＿１２」に開示されている
【０１０４】
Ｔｈ１タイプ優位の応答を引き起こすのに用いるための好ましいアジュバントは、例えば、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ（登録商標））の組み合わせ、好ましくは３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標））を、場合によりアルミニウム塩とともに含む（例えば、Ｒｉｂｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｌｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏｒｐ．，ＮＹ，ｐｐ．４０７−４１９；ＧＢ２１２２２０４Ｂ；ＧＢ２２２０２１１；およびＵＳ４，９１２，０９４を参照）。３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）の好ましい形態は、直径が０．２ｍｍ未満の小さな粒子サイズを有するエマルションの形態であり、その製造方法はＷＯ９４／２１２９２に開示されている。モノホスホリルリピドＡおよび界面活性剤を含む水性製剤は、ＷＯ９８／４３６７０に記載されている。好ましいアジュバントの例は、ＡＳ０１  Ｂ（リポソーム製剤中のＭＰＬ（登録商標）およびＱＳ２１）、リポソーム製剤中の３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）およびＱＳ２１、ＡＳ０２Ａ（ＭＰＬ（登録商標）およびＱＳ２１および水中油エマルション）、３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）およびＱＳ２１および水中油エマルション、およびＡＳ１５を含み、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅから入手可能である。ＭＰＬ（登録商標）アジュバントは、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅから入手可能である（米国特許第４，４３６，７２７号；第４，８７７，６１１号；第４，８６６，０３４号および第４，９１２，０９４号を参照）。
【０１０５】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＣｐＧジヌクレオチドは脱メチル化されている）もまた、Ｔｈ１優位の応答を誘導する。ＣｐＧは、ＤＮＡ中に存在するシトシン−グアノシンジヌクレオチドモチーフの略称である。そのようなオリゴヌクレオチドはよく知られていて、例えば、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８および米国特許第６，００８，２００号および第５，８５６，４６２号に記載されている。免疫刺激ＤＮＡ配列もまた、例えば、Ｓａｔｏらによって、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：３５２（１９９６）に記載されている。ＣｐＧは、免疫原性組成物中に製剤化される場合、一般に、遊離抗原（ｆｒｅｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）とともに自由溶液（ｆｒｅｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で投与されて（上記のＷＯ９６／０２５５５；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅおよびＤａｖｉｓ）、または、抗原に共有結合して（ＷＯ９８／１６２４７）、または、担体、例えば水酸化アルミニウムとともに製剤化される（（肝炎表面抗原）上記のＤａｖｉｓら；Ｂｒａｚｏｌｏｔ−Ｍｉｌｌａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１９９８，９５（２６），１５５５３−８）。ＣｐＧは、全身性および粘膜経路の両方で投与することができるアジュバントとして当技術分野で知られている（ＷＯ９６／０２５５５，ＥＰ４６８５２０、Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９８，１６０（２）：８７０−８７６；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１６１（９）：４４６３−６）。
【０１０６】
別の好ましいアジュバントは、サポニンまたはサポニン模倣物または誘導体、例えばＱｕｉｌ  Ａ、好ましくはＱＳ２１（Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）であり、単独で、または他のアジュバントと組み合わせて用いてよい。例えば、強化されたシステムは、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ（登録商標））とサポニン誘導体の組み合わせ、例えば、ＷＯ９４／００１５３に記載のＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）の組み合わせ、または、ＷＯ９６／３３７３９に記載の、ＱＳ２１がコレステロールでクエンチングされた、より小さい反応原性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）の組成物を含む。他の好ましい製剤は、水中油エマルションおよびトコフェロールを含む。ＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）およびトコフェロールを水中油エマルション中に含む、特に強力なアジュバント製剤が、ＷＯ９５／１７２１０に記載されている。本発明での使用のさらなるサポニンアジュバントは、ＱＳ７（ＷＯ９６／３３７３９およびＷＯ９６／１１７１１に記載）およびＱＳ１７（米国特許第５，０５７，５４０号および欧州特許第０３６２２７９Ｂ１に記載）を含む。
【０１０７】
あるいは、サポニン製剤は、キトサンまたは他のポリカチオン性ポリマーからなるワクチンビヒクル、ポリラクチドおよびポリラクチド−コ−グリコリド（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンベースのポリマーマトリックス、多糖類または化学修飾多糖類からなる粒子、リポソームおよび脂質ベースの粒子、グリセロールモノエステルからなる粒子などと組み合わせてよい。サポニンはまた、コレステロール存在下で製剤化して、微粒子構造、例えばリポソームまたはイスコムの構造（ＩＳＣＯＭ’ｓ）を形成することができる。さらに、サポニンは、非微粒子溶液または懸濁液のいずれかで、または、微粒子構造、例えば小層状（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌａｒ）リポソームまたはイスコム（ＩＳＣＯＭ（登録商標））で、ポリオキシエチレンエーテルまたはエステルとともに製剤化してよい。サポニンはまた、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）のような賦形剤とともに製剤化して粘性を高めてもよく、または、ラクトースのような粉状賦形剤とともに、乾燥パウダー形状で製剤化されてよい。
【０１０８】
一実施態様では、アジュバントシステムは、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体の組み合わせ、例えば、ＷＯ９４／００１５３に記載のＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）アジュバントの組み合わせ、または、ＷＯ９６／３３７３９に記載の、コレステロールを含むリポソームでＱＳ２１がクエンチングされた、より小さい反応原性の組成物を含む。他の適切な製剤は、水中油エマルションおよびトコフェロールを含む。ＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）アジュバントおよびトコフェロールを水中油エマルション中に用いた、別の適切なアジュバント製剤は、ＷＯ９５／１７２１０に記載されている。
【０１０９】
別の、増強されたアジュバントシステムは、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体の組み合わせ、特に、ＷＯ００／０９１５９に記載の、ＣｐＧとＱＳ２１の組み合わせを含む。好ましくは、製剤は、水中油エマルションとトコフェロールをさらに含む。
他の適切なアジュバントは、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（登録商標）ＩＳＡ  ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）、ＩＳＣＯＭＳ（登録商標）（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、アジュバントのＡＳシリーズ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、Ｄｅｔｏｘ（Ｃｏｒｉｘａ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ）および他のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰ）、例えば、係属中の米国特許出願番号０８／８５３，８２６および０９／０７４，７２０に記載のもの、その開示は、その全体で参照により本明細書中に援用され、および、ポリオキシエチレンエーテルアジュバント、例えばＷＯ９９／５２５４９Ａ１に記載のものを含む。Ｃｏｒｉｘａ社は、現在ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅの子会社である。
【０１１０】
他の適切なアジュバントは、以下の一般式（Ｉ）のアジュバント分子を含む：
ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ
ここで、ｎは１〜５０であり、Ａは結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲはＣ１〜５０アルキルまたはフェニルＣ１〜５０アルキルである。
興味深いさらなるアジュバントは、例えばＷＯ２００５／１１２９９１に記載のように用いられる志賀毒素ｂ鎖である。本発明の一実施態様は、一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテルを含む免疫原性組成物からなり、ここで、ｎは１〜５０、好ましくは４〜２４、最も好ましくは９であり；Ｒ構成要素はＣ１〜５０、好ましくはＣ４〜Ｃ２０アルキル、最も好ましくはＣ１２アルキルであり、Ａは結合である。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％の範囲であるべきであり、最も好ましくは０．１〜１％の範囲である。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンエーテルは、Ｍｅｒｃｋ  ｉｎｄｅｘ（第１２版：エントリー７７１７）に記載されている。これらのアジュバント分子は、ＷＯ９９／５２５４９に記載されている。
【０１１１】
一態様では、アジュバントは、標的細胞を殺傷するように細胞傷害性Ｔ細胞応答を促進するのに効果的である。
【０１１２】
核酸の場合、アジュバントは、核酸構成要素自体にコードされた配列であり得る。
【０１１３】
本明細書に記載の免疫原性組成物では、アジュバント組成物は、好ましくは、Ｔｈ１タイプ優位の免疫応答を誘導するように意図されている。本明細書に記載の免疫原性組成物の適用に続いて、患者は、典型的に、Ｔｈ１およびＴｈ２タイプの応答を含む免疫応答をサポートする。好ましい実施態様では、応答がＴｈ１タイプ優位の場合、Ｔｈ１タイプのサイトカインのレベルは、Ｔｈ２タイプのサイトカインのレベルよりも大きな程度までに増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準的な分析を用いて容易に評価され得る。サイトカインファミリーの総説に関しては、Ｊａｎｅｗａｙらの、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１を参照。
【０１１４】
本発明はまた、疾患、例えば非感染性疾患およびがんの治療または予防での使用のための、非自己エピトープを含む免疫原性組成物などの、ある特定の免疫原性組成物、およびその使用に関する。本発明はまた、がんの治療または予防のための、腫瘍関連抗原ではない非自己エピトープを含む免疫原性組成物に関する。一実施態様では、前記組成物は、腫瘍関連抗原またはエピトープを含まない。一態様では、前記免疫原性組成物は、エピトープを発現する細胞を有する個体において用いられてよい。
【０１１５】
本発明はまた、場合により薬学的に許容できる賦形剤と組み合わせて、ヒトまたは動物のいかなる疾患とも関連しない抗原またはエピトープを含む免疫原性組成物に関する。一実施態様では、前記抗原は自己抗原ではない。前記抗原は、例えば合成抗原であってよい。前記抗原またはエピトープは、非ヒト、非細菌、非ウイルスのエピトープまたは抗原であってよい。この意味では、免疫原性組成物は、治療が望まれる疾患が何であろうと、全てのヒトで普遍的に用いることができるように生産され得る。前記免疫原性組成物は、非自己抗原に対する免疫応答を産生することが意図されているが、疾患の特異性は、異なる異常細胞を標的化するように選択することのできる、前記第一組成物の前記リガンド部分により達成される。
【０１１６】
前記免疫原性第二組成物は、ヒトでの使用に適切であり、薬学的に許容できるアジュバントまたは担体または賦形剤を含んでよい。
【０１１７】
細胞によるプロセシングおよび提示は、リガンドエピトープコンジュゲートなどの第一組成物を、前記第一組成物のリガンド部分が標的に結合することを可能にするのに適切な条件下で、細胞に提供することにより、および、同族の免疫原性第二組成物に対して生産された適切なＴ細胞集団との、細胞の反応性を評価することにより、経験的に評価してよい。
【０１１８】
本発明の方法および組成物は、自己抗原の異常な発現と関連する任意の疾患の治療のためであり得ることが理解されよう。本発明の方法および組成物は、固形腫瘍または血液がんであり得るがんの治療のためであってよい。
【０１１９】
本発明はまた、以下を含むパーツのキットに関する：
ａ）リガンド−エピトープコンジュゲートなどの本明細書に記載の第一組成物、および、
ｂ）本明細書に記載の免疫原性第二組成物。
【０１２０】
前記第一組成物に関する濃度範囲は、産物の結合特性およびインビボでの親和性および半減期により変更することができ、例えばハーセプチンは、２〜４ｍｇ／体重ｋｇで投与される。
【０１２１】
本発明の組成物、化合物およびコンジュゲートは、約０．００５ｍｇ〜約１００ｍｇ／動物の体重ｋｇの１日投与量で投与してよく、例えば、単回の１日投与量として、または１日当たり２〜６回の分割した投与量で、または徐放性の形態で与えられる。１日投与量の合計は、約０．０１ｍｇ〜約２０００ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇ／体重ｋｇである。この投与計画は、最適な治療反応を与えるために調節してよい。化合物は、１〜４回／日、好ましくは１回または２回／日の投与計画で投与してよい。
【０１２２】
コンジュゲートなどの第一組成物および免疫原性第二組成物の投与量は、異なってよく、それぞれ同一または異なる投与経路により送達されてよい。
【０１２３】
任意の特定の患者に関する、特定の投与量レベルおよび投与の頻度は、変更してよく、用いられる特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用時間、年齢、体重、健康全般、性別、食事、投与の方法および時間、排泄率、薬の組み合わせ、特定の状態の重症度、および治療を受ける宿主を含む様々な要因に依存することが理解されよう。
【０１２４】
コンジュゲートなどの第一組成物および免疫原性第二組成物は、それを必要とする患者に、制限されないが、静脈内、筋肉内、経口、皮下、皮内、および非経口の送達を含む、任意の従来の投与経路によって投与してよい。
【０１２５】
免疫原性第二組成物の投与は、その組成物中の材料に依存する。例えば、アデノウイルスに基づくワクチンは、１０８〜１０１１ウイルス粒子の範囲での投与量で投与してよく、一方で、ＭＶＡに基づくワクチンは、１０７〜５×１０８プラーク形成単位の範囲での投与量で投与してよい。複合エピトープなどの第一組成物に対応するワクチンが既に存在する場合は（インフルエンザなど）、推奨される濃度／投与量で投与してよい。
【０１２６】
第一組成物または免疫原性第二組成物の各投与量での抗原の量は、典型的な対象で、重大な有害の副作用を起こさずに、免疫防御性の応答を誘導する量として選択される。そのような量は、どの特定の抗原を用いるかによって変化する。一般に、各投与量は、全抗原の１〜１０００μｇ、好ましくは２〜２００μｇを含むことが予想される。特定の第一組成物または免疫原性第二組成物に関する最適量は、抗体価および対象における他の応答の観察を含む標準的な試験によって確認することができる。最初のワクチン接種に続いて、対象は、例えば２か月後および６か月後に、１または複数のブースター投与を受けてよい。
【０１２７】
免疫原性組成物は、ワクチン製剤化（Ｖｏｌｌｅｒらにより編集された（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｒｋ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９７８）、「Ｎｅｗ  Ｔｒｅｎｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」に一般に記載されるワクチン製剤化）に従って調製してよい。
【０１２８】
本発明の特定の態様は以下を含む：
リガンド−エピトープコンジュゲートであって、以下：
標的に特異的に結合することが可能なリガンド部分、ここで前記標的は生物の異常細胞上にあり；および、
前記生物により天然にコードされていない非自己エピトープを有するエピトープ部分、
を含み、
前記標的は、前記コンジュゲートと複合体を形成後に内部移行されて、前記非自己エピトープは、内部移行後に、生物の前記異常細胞の細胞表面上に提示される、
リガンド−エピトープコンジュゲート。
【０１２９】
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記コンジュゲートの前記リガンド部分は、化学的架橋により前記エピトープ部分に結合される。
【０１３０】
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記コンジュゲートは、前記リガンド部分と前記エピトープ部分とを含む融合タンパク質を発現することにより生産される。
【０１３１】
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記標的は、受容体または抗原である。
【０１３２】
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記標的は、腫瘍細胞に特異的であり、または、野生型細胞と異なる発現を有し、例えば過剰発現である。
【０１３３】
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記標的は、受容体型チロシンキナーゼである。
【０１３４】
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記受容体型チロシンキナーゼは、以下からなる群から選択される：
受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の、ＥｒｂＢまたは上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリー、例えば：ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ１、ＥｒｂＢ２／Ｎｅｕ／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３、およびＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４；
受容体型チロシンキナーゼのＥＰＨファミリー（ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＡ１０；ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６）；
ｃ／ＭＥＴファミリー（ＭｅｔおよびＲＯＮ）；
ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）およびＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ−４）を含むＶＥＧＦファミリー。
【０１３５】
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記コンジュゲートの前記リガンド部分は、抗体、または抗体の抗原結合フラグメントである。
【０１３６】
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記標的は受容体であり、前記コンジュゲートの前記リガンド部分は、受容体に関するリガンドである。
【０１３７】
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記リガンドは、以下から選択される：
ａ）天然リガンドまたはその受容体結合フラグメント；
ｂ）リガンドの模倣物、例えばペプチドまたは合成分子；
ｃ）非天然リガンドおよびその模倣物。
【０１３８】
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記リガンドに関する前記標的は、受容体型チロシンキナーゼである。
【０１３９】
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記リガンドは、ＥＧＦ、ＴＧＦ−ａ、ＨＢ−ＥＧＦ、アンフィレギュリン、ベタセルリン、エピジェン、エピレグリン、ニューレグリン１、２、３、４、ＥＦＮＡ１、２、３、４、５、ＥＦＮＢ１、２、３、幹細胞増殖因子（ＨＧＦ）、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄから選択される。
【０１４０】
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記異常細胞は、がん細胞である。
【０１４１】
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記エピトープは、多糖エピトープ、ペプチドエピトープ、脂質エピトープまたはそれらの任意の組み合わせである。
【０１４２】
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記エピトープは、ＭＨＣ分子とともに提示されると、細胞傷害性Ｔ細胞応答を引き起こすことが可能である。
【０１４３】
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記エピトープは、通常の小児期ワクチン接種が存在する抗原の一部を形成する。
【０１４４】
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記エピトープは、リガンド構成要素の一部を形成し、およびここで、前記リガンドは非自己抗原である。
【０１４５】
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記エピトープ部分は、インフルエンザウイルスエピトープ、ＣＭＶエピトープ、ＥＢＶエピトープ、ＶＺＶエピトープ、ＨＣＶエピトープ、ＨＢＶエピトープ、麻疹ウイルスエピトープ、風疹ウイルスエピトープ、狂犬病ウイルスエピトープ、黄熱病ウイルスエピトープ、疾患と関連しない抗原、例えばオボアルブミン由来のエピトープ；および合成エピトープからなる群から選択される１つまたは複数のエピトープを含む。
【０１４６】
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記エピトープ部分は、Ｔ細胞免疫応答が生物中に既に存在するエピトープを含む。
【０１４７】
疾患の治療での使用のための本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記コンジュゲートは、前記リガンド−エピトープコンジュゲートの非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記リガンド−エピトープコンジュゲートの非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性組成物とともに使用される。
【０１４８】
疾患の治療のための薬剤の調製での使用のための、本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記コンジュゲートは、前記リガンド−エピトープコンジュゲートの非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記リガンド−エピトープコンジュゲートの非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性組成物とともに使用される。
【０１４９】
以下を生物に投与することによる、疾患を治療する方法：
ａ）本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲート、および、
ｂ）前記リガンド−エピトープコンジュゲートの非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記リガンド−エピトープコンジュゲートの非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む、免疫原性組成物。
【０１５０】
本明細書に記載のコンジュゲートまたは方法であって、ここで、前記免疫原性組成物は、
先行するいずれかの請求項に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートの前に、または、
先行するいずれかの請求項に記載のリガンドエピトープコンジュゲートの後に、または、
前記免疫原性組成物と同時に、または実質的に同時に、例えば同日に、
送達される。
【０１５１】
前記エピトープに対する既存の免疫応答を有する個体で使用される、本明細書に記載のコンジュゲートまたは方法。
【０１５２】
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記コンジュゲートは、前記エピトープに対する既存の免疫応答を有する個体で使用され、同族の免疫原性組成物を使用しない。
【０１５３】
疾患の予防または治療の方法であって、前記方法は、本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートを、同族の免疫原性組成物を使用せずに、前記エピトープに対する既存の免疫応答を有する個体に送達することを含む。
【０１５４】
疾患の治療での、または疾患の治療のための薬剤の調製での使用のための、本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートであって、ここで、前記コンジュゲートは、提示される非自己エピトープに特異的な作用物質とともに用いられる。
【０１５５】
薬物療法の方法であって、それを必要とする個体に、有効量の本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートを、提示される非自己エピトープに特異的な作用物質とともに送達するステップを含む。
【０１５６】
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートまたは方法であって、ここで、前記作用物質は、抗体、または抗体全体と同一の標的に結合するそのフラグメント、または細胞傷害性Ｔ細胞の集団である。
【０１５７】
本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲートまたは方法であって、ここで、前記コンジュゲートおよび作用物質は、前記リガンド−エピトープコンジュゲートの非自己エピトープと同一のエピトープを含む、または前記リガンド−エピトープコンジュゲートの非自己エピトープと交差反応性の免疫応答を引き起こすエピトープを含む免疫原性組成物とともに用いられる。
【０１５８】
非感染性疾患の治療または予防での使用のための、非自己抗原を含む免疫原性組成物。
【０１５９】
がんの治療または予防のための、腫瘍関連抗原ではない抗原を含む、本明細書に記載の免疫原性組成物。
【０１６０】
本明細書に記載の免疫原性組成物であって、ここで、前記免疫原性組成物は、腫瘍関連抗原を含まない。
【０１６１】
いかなる疾患とも関連しない非自己抗原を含む、薬学的に許容できる免疫原性組成物。
【０１６２】
本明細書に記載の方法またはコンジュゲートまたは免疫原性組成物であって、ここで、前記免疫原性組成物は、さらにアジュバントを含む。
【０１６３】
本明細書に記載の方法または使用または免疫原性組成物であって、ここで、前記アジュバントは、細胞傷害性Ｔ細胞応答を促進するのに効果的である。
【０１６４】
本明細書に記載の方法または使用であって、ここで、前記使用は、自己抗原の異常な発現と関連する疾患のためである。
【０１６５】
本明細書に記載の方法または使用であって、ここで、前記使用は、固形腫瘍または血液がんの治療のためである。
【０１６６】
以下を含むパーツのキット：
ａ）本明細書に記載のリガンド−エピトープコンジュゲート；および、
ｂ）本明細書に記載の免疫原性組成物。
【０１６７】
本特許明細書中に引用された全ての引用文献または特許出願は、本明細書中に参照により援用される。
【０１６８】
本明細書に記載の特定の実施態様は、説明のために示され、本発明の限定としてではないことが理解されよう。本発明の主要な特徴は、様々な実施態様において、本発明の範囲から逸脱することなく用いることができる。当業者であれば、本明細書に記載の特定の方法の非常に多くの同等物を、日常的な試験を超えずに認識し、または確認することが可能であろう。そのような同等物は、本発明の範囲内であると考えられ、請求項により包含される。本明細書で示された全ての刊行物および特許出願は、本発明が関連する当業者の技術水準を示す。全ての刊行物および特許出願は、それぞれの刊行物または特許出願があたかも具体的に個々に示されて参照により援用されるのと同程度まで、本明細書中に参照により援用される。語句「ａ」または「ａｎ」の使用は、請求項および／または明細書で用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とともに使用される場合、「１つの」を意味し得るが、「１つまたは複数の」、「少なくとも１つの」および「１つまたは１より多い」の意味とも一致する。請求項での用語「または」の使用は、明確に代替のみを言及することを指示しない限り、または代替が互いに排他的でない限り、「および／または」を意味するために用いられるが、その開示は、代替のみ、および「および／または」を言及する定義を支持する。本出願全体にわたって、関連のある場合、用語「約」は、ある数値が、デバイス、数値決定に用いられる方法に関する固有の誤差変動、または試験対象間に存在する変動を含むことを示すために用いられる。
【０１６９】
本発明の任意の特徴は、文脈から明らかに別段でない限り、本発明の任意の他の特徴（単数または複数）との慎重な組み合わせとして開示される。
【０１７０】
本明細書および請求項（単数または複数）で用いられる語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（およびｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇの任意の形、例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（およびｈａｖｉｎｇの任意の形、例えば、「ｈａｖｅ」および「ｈａｓ」）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（およびｉｎｃｌｕｄｉｎｇの任意の形、例えば、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｅ」）または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（およびｃｏｎｔａｉｎｉｎｇの任意の形、例えば、「ｃｏｎｔａｉｎｓ」および「ｃｏｎｔａｉｎ」）は、包含的またはオープンエンド型であり、追加の、列挙されない要素または方法ステップを排除しない。
【０１７１】
本明細書において用いられる用語「またはその（それらの）組み合わせ」は、用語の前に挙げられた事項の全ての置換および組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはその（それらの）組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣのうちの少なくとも１つを含むことが意図され、特定の文脈において順番が重要な場合は、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、またはＣＡＢも含むことが意図される。この例で続けて、１つまたは複数の事項または用語の繰り返し、例えば、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどを含む組み合わせが明示的に含まれる。当業者であれば、文脈から明らかに別段でない限り、典型的に、いかなる組み合わせにおいても事項または用語の数に制限はないことを理解するであろう。
【０１７２】
本明細書に開示されて特許請求の範囲に記載される、全ての組成物および／または方法は、本開示に照らして、過度の実験をせずに作成および実行することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい実施態様の観点から記載されているが、そのバリエーションが、本発明の概念、主旨および範囲から逸脱せずに、組成物および／または方法に、および、ステップにおいて、または本明細書に記載の方法の一連のステップにおい、適用され得ることが、当業者にとって明らかであろう。当業者にとって明らかな、全てのそのような同様の代替および修飾は、添付の請求項により定められるように、本発明の主旨、範囲および概念内であると見なされる。
【０１７３】
本発明がより良く理解され得るために、以下の実施例を示す。これらの実施例は説明の目的のみであり、いかなる方法によっても本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
[実施例]
概念は以下の実験により確認される。
【０１７４】
リガンドエピトープコンジュゲートは、内部移行特性に関して良く特徴付けられて非自己ペプチド抗原配列に結合された抗体またはリガンドを含む。
【０１７５】
免疫原性組成物は、よく知られて確立された免疫原性の形式での非自己配列ペプチドを含む。
【０１７６】
インビトロ実験：
非自己リガンドの予備スクリーニングは、インビトロで行うことができる：
腫瘍細胞によってＭＨＣ分子上にロードされた非自己ペプチドの直接の測定は、非自己ペプチドとＭＨＣとで形成されたコンジュゲートを認識する特異的な試薬（可溶性ＴＣＲまたはＴＣＲ模倣抗体）を用いて達成することができる（例えば、非自己エピトープがオボアルブミンポリペプチド内に含まれ、実験がＣ５７Ｂｌ／６マウスで行われる場合、抗体は、マウスＣ５７Ｂｌ／６  ＭＨＣとの関連でｏｖａペプチドを認識し得る）。シンジェニック腫瘍細胞は、リガンド−エピトープコンジュゲートとともにインキュベートされて、細胞表面上のＭＨＣとのペプチド複合体の存在に関して試験される。
【０１７７】
また、腫瘍細胞表面上に非自己（ＮＳ）ペプチドをロードしていることは、適切なＭＨＣとの関連で非自己ペプチドを特異的に認識するＴ細胞の活性化状態をモニタリングすることにより、間接的に測定することができる。インビトロでの、一連のシンジェニック腫瘍細胞と非自己ペプチドに特異的なＴ細胞の共−インキュベーションは、リガンドエピトープコンジュゲートの存在下でのみ、特異的なＴ細胞の機能の活性化をもたらし、その後、適切なプロセシングおよび提示をもたらす。
【０１７８】
ＮＳに特異的なＴ細胞は、シンジェニックマウスを、上述の免疫原性組成物で免疫化することにより得ることができる。
【０１７９】
Ｔ細胞活性化を測定するために、様々な分析を用いることができる。
【０１８０】
関連のあるＩＦＮ−γまたは他のサイトカインは、リガンドエピトープコンジュゲートの存在下でＮＳ特異的Ｔ細胞を標的腫瘍細胞とともにインキュベーションした後に、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）または他の分析により測定することができる。
【０１８１】
標的腫瘍細胞に対する細胞毒性は、リガンドエピトープコンジュゲート存在下で、活性化Ｔ細胞と５１Ｃｒ標識された標的腫瘍細胞を共−インキュベーションした後に、伝統的な５１Ｃｒ放出アッセイにより測定することができる。
【０１８２】
Ｔ細胞増殖は、リガンドエピトープで処理されたシンジェニック腫瘍細胞と、非自己特異的Ｔ細胞をインキュベーションした後に観測することができる。
【０１８３】
インビボ実験：
免疫療法を試験するために、その方法は、確立されたマウスモデルを用いてインビボで最終的に試験することができる。
【０１８４】
２つの構成要素の方法の活性は、自然発生の（すなわちＢＡＬＢ−ｎｅｕＴ）および移植マウス腫瘍で試験することができる。免疫原性組成物は、予防的または治療的方法のいずれかで、良く知られ確立された免疫原性の形式で、マウスに送達される。コンジュゲート（例えば、ｒａｔ−ｎｅｕに対して反応性の抗体または抗−ＥＰＨＡ２抗体）は、それから、注入されて、自然発生の乳腺腫瘍の増殖がモニターされる。移植腫瘍についての概念を試験するために、様々なマウス腫瘍細胞株が利用可能である。移植モデルでは、マウスは、予防的または治療的方法のいずれかで、免疫原性組成物で免疫化されて、それから、リガンドエピトープコンジュゲート（すなわち、ｒａｔ−ｎｅｕに対して反応性の抗体または抗−ＥＰＨＡ２抗体）で処理される。
【０１８５】
また、この方法の有効性は、ヌードマウスに移植されたヒト腫瘍でも試験できる。リガンドエピトープコンジュゲートは、内部移行を誘導することが可能なヒト腫瘍受容体に対する（例えば、ヒトＨＥＲ−２、ＥｐｈＡ２またはその他に対する）、抗体またはリガンドを含んでよい。この実験的な設定では、特異的なＨＬＡとの関連（すなわちＨＬＡ−Ａ２）で非自己ペプチドを認識するＴ細胞クローンは、腫瘍移植マウス内で受動的に移行されて、ＮＳ−ワクチンのサロゲートとしての役割を果たす。
【０１８６】
（実施例１）
ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープを再生するオボアルブミン（ＯＶＡ）ペプチドに融合した抗−ＥｐｈＡ２および抗−ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体の、がん細胞への結合は、ＯＶＡ−特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を刺激する。
【０１８７】
細胞株および抗体
細胞株ＭＣ３８（マウス大腸がん）、Ｃ３５  Ｌｕｃ（マウスＨｅｐａ−１ｃ１ｃ７ルシフェラーゼ発現細胞株の突然変異体）、ＨＣＴ  １１６（ヒト大腸がん）、Ａ５４９（ヒト肺腺がん）およびＨＥＫ−２９３−ＥＢＮＡ（ヒト胚腎臓由来）を、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭｅＭ）（ＧＩＢＣＯ）中で培養した。４Ｔ１（マウス乳がん）、ＳＫＢＲ３（マウス乳がん）およびＴＵＢＯ細胞株（ＢＡＬＢ−ｎｅｕＴマウス由来の乳腺小葉がん）を、ＲＰＭＩ培地（ＧＩＢＣＯ）中で培養した。培地を、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ＴＵＢＯ細胞に関して２０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ｕｎｉｔ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補充した。
【０１８８】
ＤＭＥＭコンプリート培地に加えて、４００μｇ／ｍｌおよび２５０μｇ／ｍＬのＧ４１８を、それぞれＣ３５  ＬｕｃおよびＨＥＫ−２９３−ＥＢＮＡに関して用いて、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ由来のＮＥＡＡ）を、ＨＥＫ−２９３−ＥＢＮＡに関して加えた。
【０１８９】
ＥＢＮＡ−２９３／ＥｐｈＡ２細胞（誘導性プロモーターの制御下で、ヒトＥｐｈＡ２遺伝子で安定的にトランスフェクトされた２９３細胞株）を、Ｇ４１８（２５０μｇ／ｍＬ）、ピューロマイシン０．５μｇ／ｍｌおよびハイグロマイシン５０μｇ／ｍｌを有するコンプリートＤＭＥＭ中で培養した。
全ての細胞株は、５％  ＣＯ２雰囲気中３７℃で培養した。
【０１９０】
使用した抗体は以下であった：
ウサギポリクローナル抗−ＥｐｈＡ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；
ウサギポリクローナル抗−アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；
ヤギ抗−ヒトＩｇＧ１ホースラディッシュ  ペルオキシダーゼ−コンジュゲート；（Ｐｒｏｍｅｇａ）；
抗−マウスＩｇＧホースラディッシュ  ペルオキシダーゼ−コンジュゲート（Ｔｅｃｈｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；
抗−ウサギＩｇＧホースラディッシュ  ペルオキシダーゼ−コンジュゲート（Ｓｉｇｍａ）；
主要組織適合クラスＩとのオボアルブミンのＨ−２Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに特異的な２５  Ｄ１．１６（ＰＥコンジュゲート）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）；
モノクローナル抗−ＥｒｂＢ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｎｏｌｏｇｙ）；
抗−ＥｐｈＡ２抗体：ｍＡｂ１５および結果として生じるＯＶＡペプチド融合抗体、ｍＡｂ１５−ＯＶＡｐｅｐ２およびｍＡｂ１５−ＯＶＡｐｅｐ１［その重鎖は、鶏オボアルブミン由来の、アミノ酸長ペプチド残基２５７−２６４（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）または残基２５３−２６７（ＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷ）に融合している］は、以下のようにして調製された。
抗−ＥｒｂＢ２（ハーセプチン）および結果として生じるＯＶＡペプチド融合抗体、ハーセプチン−ＯＶＡＰｅｐ２［その重鎖は、鶏オボアルブミン由来の、アミノ酸長ペプチド残基２５７−２６４（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に融合している］は、以下のようにして調製された。
【０１９１】
プラスミドおよびアデノウイルスベクター
使用したプラスミドは以下であった：ヒトγ１重鎖に関する発現カセットを含む９．３ｋｂプラスミドであるｐＥＵ  １．２  ｇａｔｅｗａｙ、および、ヒトκ軽鎖に関する発現カセットを含む６．４ｋｂプラスミドであるｐＥＵ  ３．２。
発現カセットは、ＥＦ−１αプロモーター、ＳＶ４０／ポリＡ配列および分泌リーダー配列：ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧを含む。
【０１９２】
これらのプラスミドはまた、遺伝子のコピー数およびＨＥＫ  ２９３−ＥＢＮＡ由来の一過性発現のレベルを増やすための、エプスタイン・バー複製起点（ｏｒｉＰ）も含む。
【０１９３】
ヒト抗−ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ  １５の重鎖可変領域ＶＨおよび軽鎖可変領域ＶＬをコードするＤＮＡフラグメントを、それぞれ、ｐＥＵ  １．２およびｐＥＵ  ３．２プラスミドのポリリンカー領域内に、分泌リーダー配列およびγ１またはκ定常領域配列の間にクローニングした。結果として生じたプラスミドを、ｐＥＵ  １．２  ＶＨ１５およびｐＥＵ  ３．２  ＶＬ１５と命名した。ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡＰｅｐ２）またはペプチドＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷ（ＯＶＡＰｅｐ１）を重鎖のＣ末端にコードするＤＮＡフラグメントをサブクローニング（ＳｆｉＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）するために、プラスミドｐＥＵ  １．２  ＶＨ１５を用いた。前記遺伝子を、ヒト細胞株でのその発現を増やすために、コドン最適化した。結果として生じたプラスミドを、ｐＥＵ  １．２  ＶＨ１５−ＯＶＡＰｅｐ２およびｐＥＵ  １．２  ＶＨ１５−ＯＶＡＰｅｐ１と命名した。
【０１９４】
ヒト抗−ＥｒｂＢ２ハーセプチンの重鎖可変領域ＶＨおよび軽鎖可変領域ＶＬをコードするＤＮＡフラグメントを、それぞれｐＥＵ  １．２およびｐＥＵ  ３．２プラスミドのポリリンカー領域中に、分泌リーダー配列およびγ１またはκ定常領域配列の間にクローニングした。結果として生じたプラスミドを、ｐＥＵ  １．２  ＨＨおよびｐＥＵ  ３．２  ＨＶＬと命名した。ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡＰｅｐ２）をＣＨ３  Ｃ末端配列にコードするＤＮＡをサブクローニング（ＢｓｒＧＩ／ＸｂａＩ）するために、プラスミドｐＥＵ  １．２  ＨＨを用いた。その遺伝子を、ヒト細胞株でのその発現を増やすために、コドン最適化した。結果として生じたプラスミドを、ｐＥＵ  １．２  ＨＨ−ＯＶＡＰｅｐ２と命名した。
【０１９５】
鶏オボアルブミンを発現する組み換えヒトアデノウイルス血清型５（Ａｄ５  ＯＶＡ  ＴＡＧ）を、連続継代により増殖して、前述のようにＣｓＣｌ勾配により精製した。すなわち、１５ｃｍ培養皿上に植え付けられた２，５×１０６  ＨＥＫ  ２９３細胞を、１００ＶＰ／細胞のＭＯＩで、Ａｄ５ＯＶＡ  ＴＡＧで感染させた。完全な細胞変性効果が、感染後約２日で観察された。細胞および上清を回収して、３回凍結融解して、室温（ＲＴ）で２０分間、２，０００ｒｐｍでの遠心分離により浄化した。結果として生じた溶解物を、ＨＥＫ  ２９３細胞上で連続的に継代培養して、レスキューウイルスの力価を増加させた。２つのセルファクトリー（Ｎｕｎｃ）の感染およびＣｓＣｌ勾配での細胞溶解物の精製により、大量調製物を得た。ＣｓＣｌ精製により得られたウイルスを、スライドカセット内に移して、バッファーＡ１９５（１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１０ｍＭ  ヒスチジン、５％スクロース、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０２％  ＰＳ−８０、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（ｖ／ｖ）エタノール）に対して透析した。ウイルス粒子の数（ＶＰ）を決定するために、ＣｓＣｌ精製されたウイルスを、０．１％ナトリウムドデシルサルフェート−リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に、１００分の１に希釈した。コントロールとして、バッファーＡ１９５を用いた。これらの希釈物を、５６℃で１０分間インキュベートした。ＶＰ／ｍＬの数を、ＣＭＶ配列内のプライマー／プローブ（６−ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ）を用いた定量リアルタイム逆転写ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）により計算した。同一配列を含むプラスミドを用いて、検量線を準備した。
【０１９６】
ＤＮＡプラスミド調製
１００ｎｇの各プラスミド（ｐＥＵ１．２  ＶＨ１５、ｐＥＵ  １．２  ＶＨ１５−ＯＶＡＰｅｐ２、ｐＥＵ  １．２  ＶＨ１５  ＯＶＡＰｅｐ１、ｐＥＵ３．２  ＶＬ１５、ｐＥＵ  １．２  ＨＨおよびｐＥＵ  ３．２  ＨＶＬ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ株（ＤＨ５α、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。抗生物質選択培地上にストリーキングしたばかりの細菌からシングルコロニーを採取し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含む５ｍｌのＬＢ培地中でインキュベートした。細胞は、激しく振とうして３７℃でおよそ６時間インキュベートした。スターター培養を、選択を有する（ｗｉｔｈ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）ＬＢ培地１Ｌ中に１：２００希釈して、絶え間なく撹拌して一晩培養した。
真核生物細胞のトランスフェクションに必要な大量のプラスミドを、エンドトキシンフリーのＰｌａｓｍｉｄ  Ｇｉｇａ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によってメーカーの説明書に従って取得した。
【０１９７】
ペプチド
鶏オボアルブミンのアミノ酸配列２５７−２６４（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に対応する合成ペプチド、および関係のないコントロールペプチドＮＳ３  １４８０（ＧＡＵＱＮＥＶＴＬ）を、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｕｎｉｔ  ａｔ  ＩＲＢＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ，Ｉｔａｌｙにより合成した（９５％純度）。ペプチドは、２０ｍｇ／ｍＬで１００％ＤＭＳＯ中に再構成した。
【０１９８】
α−ＥｐｈＡ２およびα−ＥｒｂＢ２  ｍＡｂの生産と精製
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いて、メーカーの説明書に従って、野生型ｍＡｂおよびＯＶＡペプチドへのｍＡｂ融合物をコードする発現プラスミドで、ＨＥＫ  ２９３−ＥＢＮＡ細胞を一過的に共−トランスフェクトした。
【０１９９】
トランスフェクションの２日前に細胞をまいて、およそ９０％の密集度でトランスフェクトした。通常通りに、９０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００および６０μｇの各プラスミドＤＮＡを、２ｍｌずつの最終容量で、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  低血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で別々に希釈した。５分のインキュベーション後、ＤＮＡとリポソーム剤を混合して、リポソーム−ＤＮＡ複合体の形成を可能にするために、一緒に２０分間インキュベートした。この時間の間、細胞を一度ＰＢＳで洗い、そして一度Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地で洗って、血清と抗生物質を除去した。リポソーム−ＤＮＡ混合物を、３７℃で６時間、１６ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地中で細胞に添加した。それから、オーバーレイをＩｇＧ産生培地（ＦＢＳ無しのＣＤ−ＣＨＯ培地）（ＧＩＢＣＯ）で置き換えて、５％のＣＯ２加湿雰囲気中で３７℃にてインキュベートした。培養培地は通常、トランスフェクション後１０〜１２日に回収して、遠心分離（１２００ｒｐｍ、１０分間）により浄化して、４〜１２％の勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いてクーマシー・ブルー染色により、免疫グロブリン（ＩｇＧ）産生に関して検査した。
【０２００】
培地中に分泌されたヒトＩｇＧ全体（見積もりのＩｇＧ濃度が約１００〜１５０ｍｇ／Ｌ）を、以下のようにしてアフィニティクロマトグラフィーにより精製した：浄化した培養培地（５０〜１００ｍＬ）を、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７に平衡化した１ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に、０．５ｍｌ／分でローディングした。６カラムボリューム（ＣＶ）の２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７での洗浄ステップに続いて、結合ＩｇＧを、６ＣＶの０．１Ｍグリシン−ＨＣｌバッファー、ｐＨ２．７で溶出した。溶出物質を直ちに１／５容量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０で中和した。
【０２０１】
製剤の純度を、還元条件下での４〜１２％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続くクーマシー染色により評価した。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイキット（ＰＩＥＲＣＥ）により決定し、プール画分は、使用するまで−８０℃で保管した。
【０２０２】
細胞溶解物およびウエスタンブロット分析
ＭＣ３８、４Ｔ１、ＨＣＴ  １１６およびＴＵＢＯ細胞を、細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いて分離して、ＰＢＳで洗浄した。溶解物は、４×１０＾６の細胞を１５０ｕＬの溶解バッファー［コンプリートプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）を含む、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．５％ＮＰ４０］中に再懸濁することにより調製した。０℃で２０分後、抽出物を１２，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離により浄化した。タンパク質抽出物は、メーカーの説明書に従ってＢＣＡアッセイキットを用いて定量化した。５０μｇの各サンプルを、４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解して、ニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上に電気ブロットして、同等のサンプルローディングを確認するために抗−ＥｐｈＡ２およびα−アクチンでプローブし、続いて抗−ウサギＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲートでプローブした。
【０２０３】
免疫反応性タンパク質を、高化学発光のホスフォイメージャー分析（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ−Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，  Ｐｉｅｒｃｅ）により可視化した。
【０２０４】
ＥｐｈＡ２およびＥｒｂＢ２陽性細胞でのＥＬＩＳＡ分析
ＥｐｈＡ２陽性細胞でのＥＬＩＳＡ分析は、ドキシサイクリン（５０ｕｇ／ｍＬ、１６時間）で処理された、または処理されていない、ＭＣ３８、Ｃ３５  ＬｕｃおよびＥＢＮＡ−２９３／ＥｐｈＡ２について行った。
ＥｒｂＢ２陽性細胞でのＥＬＩＳＡ分析は、ＳＫＢＲ３、ＭＣ３８およびＣ３５  Ｌｕｃについて行った。
【０２０５】
細胞を非酵素的解離溶液中に回収し、洗浄して、Ｕ底９６ウェルマイクロタイタープレート（２×１０５細胞／ウェル）へ移した。６％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッティング後、プレートを洗浄して、精製された抗−ＥｐＨＡ２  ｍＡｂ（ｍＡｂ１５、ｍＡｂ１５−ＯＶＡＰｅｐ２およびｍＡｂ１５−ＯＶＡＰｅｐ１）または抗−ＥｒｂＢ２  ｍＡｂ（ハーセプチンおよびハーセプチン−ＯＶＡＰｅｐ２）を、トリプリケートウェルで、ＥＬＩＳＡバッファー（ＰＢＳ／ＢＳＡ  ３％）中、増加する濃度（０．２〜２μＭ）で添加して、ＰＢＳのブランクコントロールとともに、室温で２時間インキュベートした。インキュベーションと遠心分離と上清の除去後、ペレット細胞をＰＢＳで２度洗浄して、抗体検出のために、ペルオキシダーゼコンジュゲート型抗−ヒトＩｇＧ１（ＥＬＩＳＡバッファー中、１／２５００）とともにインキュベートした。１時間後、プレートを遠心分離して、ＰＢＳで洗浄して、基質として３，３’，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｓｉｇｍａ）を用いて結合抗体を検出した。結合値は、マイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  Ｖｉｃｔｏｒ  ３，  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いた４５０ｎｍでの吸光度から決定し、少なくとも３つの決定の平均として報告した。
【０２０６】
フローサイトメトリーによる抗原提示アッセイ
ＥｐｈＡ２およびＥｒｂＢ２陽性細胞に特異的なｍＡｂ−ＯＶＡ融合物によるＯＶＡ２５７−２６４／Ｈ−２Ｋｂ複合体の提示を、以下のようにして決定した。
【０２０７】
マウスのＥｐｈＡ２陽性およびＥｒｂＢ２陽性細胞のＭＣ３８およびＣ３５  Ｌｕｃ（アプロタイプ（ａｐｌｏｔｙｐｅ）Ｈ−２Ｋｂ）を、非酵素的解離溶液中に回収して、洗浄して、６ウェルのマイクロタイタープレート（４×１０５細胞／ウェル）へ移した。細胞を、増加する濃度（５０ｎＭ〜４ｕＭ）の精製された野生型またはＯＶＡ−抗体融合物で、３７℃で４８時間処理した。陽性コントロール細胞として、２μＭのペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ２５７−２６４）で、３７℃で１時間処理した。
インキュベーション後、細胞を回収してＦＡＣＳチューブ内に移して、ＦＡＣＳバッファー（２ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ＢＳＡ  ２％を含むＰＢＳ）で洗浄して、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
【０２０８】
細胞を、ＭＨＣクラスＩとのＯＶＡ２５７−２６４／Ｋｂ複合体に特異的な２５  Ｄ１．１６抗体ＰＥ−コンジュゲートとともにインキュベートした。
【０２０９】
室温で１時間、および、激しく振とうして３７℃で１時間の後、細胞を、ＦＡＣＳバッファーで２度洗浄した。サンプルを２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁して、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｃａｌｉｂｕｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたフローサイトメトリーにより分析した。
【０２１０】
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２Ｋｂ）マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから取得した。全てのマウスは、温度、空気、および光の制御条件下（午前７時〜午後７時に光を当てる）に管理して、適宜、餌と水を与えた。全ての動物は、Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに概説される基準に従った人道的な世話を受けた。
【０２１１】
マウスの免疫化
６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスを、１００μｌの滅菌Ａ１９５バッファー（上記参照）中１０８  ｖｐのＡｄ５ＯＶＡＴＡＧで免疫化した。特に、マウスは、１２５〜２５０ｍｇ／体重ｋｇＩＰ（腹腔内）でのトリブロモエタノール（Ａｖｅｒｔｉｎ）で完全に麻酔して、各後肢の大腿四頭筋へ２回の注射を行った。注射後１０日および２１日にマウスを安楽死させて、脾臓を回収して、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩｓｐｏｔ分析によるＴ細胞応答の検出のために処理した。
【０２１２】
生体外でのＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ
抗原−特異的Ｔ細胞が分泌するＩＦＮ−γを、標準的な酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを用いて検出した。ＰＶＤＦ膜を有する９６ウェルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌに希釈した抗−マウスＩＦＮ−  抗体（Ｕ−Ｃｙｔｅｃｈ）１００μｌ／ウェルでコーティングして、４℃で一晩保管した。翌日、２００μｌ／ウェルのＲ１０培地（１０％熱不活化ＦＢＳ、１：１００に希釈した１Ｍ  ＨＥＰＥＳバッファー、１：１００に希釈した２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１：１００に希釈した１００×ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、１：１０００に希釈した５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（全てＧＩＢＣＯ由来）を有するＲＰＭＩ培地１６４０）でウェルをブロッキングして、３７℃で２時間インキュベートした。
【０２１３】
免疫化されたマウス由来の脾臓をホモジナイズして、ＡＣＫ溶解バッファー（０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１．０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１Ｍ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）（ＧＩＢＣＯ）で赤血球を溶解することにより、単一細胞の懸濁液を調製した。細胞を、コンプリートＲ１０培地中に８×１０６細胞／ｍｌで再懸濁して、２×１０５および４×１０５／細胞に相当する２５または５０μｌ／ウェルを、デュプリケートでウェルに添加した。
【０２１４】
マウス脾細胞由来のＯＶＡ−特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を、以下で刺激した：
増加する濃度（５０ｎＭ〜４μＭ）の精製抗−ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ（ｍＡｂ１５、ｍＡｂ１５−ＯＶＡＰｅｐ２およびｍＡｂ１５−ＯＶＡＰｅｐ１）で３７℃にて４８時間、事前に処理された、または処理されていない、またはポジティブコントロールとして、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（２μＭ）で３７℃にて１時間パルスされた、ＥｐｈＡ２陽性細胞Ｃ３５  Ｌｕｃ（２×１０５）；
精製抗−ＥｒｂＢ２  ＭＡｂ（ハーセプチンおよびハーセプチン−ＯＶＡＰｅｐ２）４μＭで３７℃にて４８時間、事前に処理された、または処理されていない、またはポジティブコントロールとして、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（２μＭ）で３７℃にて１時間パルスされた、ＥｒｂＢ２陽性細胞Ｃ３５  Ｌｕｃ（２×１０５）；
Ｒ１０培地中に希釈された、５０μｌ／ウェルのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドまたは関係のないコントロールペプチド（最終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）もまた、試験ウェルに添加した；５０μｌ／ウェルのＲ１０培地およびＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）コントロールを、ネガティブ無刺激ウェルへ添加して、１０  ｇ／ｍｌでのコンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ）を５０μｌ／ウェル、ポジティブコントロールウェルに添加した。
【０２１５】
加湿インキュベーター中、５％  ＣＯ２、３７℃で１８〜２０時間、プレートをインキュベートした。広範な洗浄（１×ＰＢＳ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ）後、ＰＢＳ中のビオチン化抗−マウスＩＦＮ−  抗体（Ｕ−Ｃｙｔｅｃｈ）を５０ｎｇ／ウェル、添加した。プレートを室温で２時間インキュベートして、洗浄バッファーで６回洗浄した。現像液を添加してスポットを現像した：１００μｌ／ウェルのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）および１ステップＮＢＴ−ＢＣＩＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）。プレートを室温で１時間インキュベートして、再び６回洗浄した。ＥＬＩＳＰＯＴカウンター（ＡＥＬＶＩＳ）を用いて計測された１００万脾細胞あたりのＩＦＮ−γスポット形成単位（ＳＦＵ）として結果を表した。培地のみのウェルでのバックグラウンド応答は、ほとんど常に２０スポット未満であり、刺激されたウェルで測定されたものから差し引かれた。
【０２１６】
結果
抗−ＥｐｈＡ２および抗ＥｒｂＢ２  ＩｇＧ−ＯＶＡ抗体の生産および特性化
抗−ＥｐｈＡ２−ＯＶＡおよび抗−ＥｒｂＢ２−ＯＶＡ融合ｍＡｂを生産するために、鶏オボアルブミンＯＶＡ２５７−２６４（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）または残基ＯＶＡ２５３−２６７（ＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷ）由来のよく特徴付けられたＨ−２Ｋｂ−抑制ＣＤ８＋  Ｔ細胞エピトープをコードするＤＮＡを、抗−ヒトＥｐｈＡ２  ｍＡｂ  １５および抗−ＥｒｂＢ２ハーセプチンのＣＨ３  Ｃ末端配列に遺伝子的に融合した。
【０２１７】
結果として生じた融合タンパク質、ｍＡｂ１５−ＯＶＡＰｅｐ２（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）、ｍＡｂ１５−ＯＶＡＰｅｐ１（ＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷ）およびハーセプチン−ＯＶＡＰｅｐ２（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞株中に一過的に発現させた。野生型ｍＡｂ１５およびハーセプチンもまた、一過的に発現させた。
【０２１８】
培養培地中に分泌産物として発現されるコードタンパク質を回収して、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。ワンステップのプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーは、９９％より高い純度のタンパク質を産出した。野生型およびＯＶＡ−融合抗体は、同程度の発現を示した。およそ５５ｋＤａおよび２７ｋＤａ（図３および図８）の目に見えるタンパク質バンドは、ＩｇＧの重鎖および軽鎖を示す。予想どおり、ＯＶＡ融合抗体の重鎖は、野生型の重鎖に対して遅い移動を示した。
発現されたｍＡｂの収量は、１００〜１５０ｍｇ／Ｌであった。
【０２１９】
がん細胞上のＥｐｈＡ２受容体の発現
異なる腫瘍細胞株で、ウエスタンブロット分析によりＥｐｈＡ２の発現レベルを試験した。高発現レベルの細胞モデルとして２９３／ＥｐｈＡ２を用いた。図４は、異なる細胞株でのＥｐｈＡ２の発現レベルを示す。ヒト（ＨＣＴ  １１６）およびマウス（ＴＵＢＯ、ＭＣ３８および４Ｔ１）ＥｐｈＡ２陽性細胞は、同レベルのＥｐｈＡ２受容体を発現した。
【０２２０】
ＥｐｈＡ２／ＥｒｂＢ２陽性がん細胞株への、抗−ＥｐｈＡ２および抗−ＥｒｂＢ２  ｍＡｂの結合
ヒトＥｐｈＡ２への結合について、および、がん細胞株上に提示されたマウスＥｐｈＡ２との交差反応性について、組み換え抗−ＥｐｈＡ２  ｍＡｂを試験した。同様に、がん細胞株上に提示されたマウスＥｒｂＢ２との交差反応性について、組み換え抗−ヒトＥｒｂＢ２  ｍＡｂを試験した。
【０２２１】
ｍＡｂ１５−ＯＶＡＰｅｐ２およびｗｔ  ｍＡｂ１５は、マウスおよびヒトＥｐｈＡ２過剰発現細胞株に対して同程度の結合を示した（マウスＣ３５ｌｕｃおよびＭＣ３８細胞株での、およびヒトＥＢＮＡ−２９３／ＥｐｈＡ２での細胞ＥＬＩＳＡ）。ｍＡｂ１５−ＯＶＡＰｅｐ１は、野生型ｍＡｂ１５よりも、ＥｐｈＡ２陽性細胞への結合が低かった（図５Ａ〜Ｃ）。
【０２２２】
ハーセプチン−ＯＶＡｐｅｐ２は、マウスおよびヒトＥｒｂＢ２過剰発現細胞株に対する親ハーセプチンの親和性と同程度の親和性を維持することが分かった（マウスＣ３５ｌｕｃ、ＭＣ３８およびヒトＳＫＢＲ３細胞株での細胞ＥＬＩＳＡ）（図９Ａ〜Ｃ参照）。
抗体の結合は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ１ペルオキシダーゼ−コンジュゲート化抗体で検出した。
【０２２３】
ＯＶＡＰｅｐ２は、腫瘍細胞の表面上に、ＭＨＣ−Ｉとの複合体で提示される
抗−ＥｐｈＡ２または抗−ＥｒｂＢ２融合ＯＶＡ  ｍＡｂで処理されたＥｐｈＡ２−またはＥｒｂＢ２−発現細胞がＯＶＡ２５７−２６４／Ｋｂ複合体を細胞表面上に提示することができるかどうか確認するために、増加する濃度の抗体−ＯＶＡ融合物とともに、Ｃ３５  ｌｕｃおよびＭＣ３８細胞をインキュベートした。４８時間後に細胞を収集し、特異的なｍＡｂ  ２５Ｄ１．１６で染色することにより表面ＯＶＡ２５７−２６４／Ｋｂ複合体を検出した。
図６および図１０に示すように、抗体−ＯＶＡ融合物との細胞のインキュベーションは、Ｃ３５  ＬｕｃおよびＭＣ３８細胞における平均蛍光強度（ＭＦＩ）の用量依存的な増加をもたらした。
これらの結果は、抗体−ＯＶＡ融合物は、その標的分子（ＥｐｈＡ２およびＥｒｂＢ２）に結合すると、標的細胞で効率的に内部移行し、プロセシングされて放出されて、ＭＨＣＩとの複合体でのＯＶＡペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）をがん細胞の表面上に提示することを示す。
【０２２４】
腫瘍細胞の表面上のＯｖａＰｅｐ２ペプチド／ＭＨＣ−Ｉ複合体は、遺伝子的ワクチン接種により誘導されたエフェクターＣＤ８  Ｔ細胞により認識される。
【０２２５】
抗体−ＯＶＡ融合物の結合に続く、ＥｐｈＡ２およびＥｒｂＢ２発現腫瘍細胞上の表面上でのＯＶＡ２５７−２６４／Ｋｂ複合体の形成が、遺伝子的ワクチン接種により誘導されたＯＶＡ−特異的ＣＤ８  Ｔ細胞により認識されるかどうか調べた。この目的を達成するために、マウスをＡｄ５ＯＶＡ  ＴＡＧ（ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドをコードする）で免疫化した。ｍＡｂ１５−ＯＶＡＰｅｐ２またはハーセプチン−ＯＶＡＰｅｐ２で処理したＣ３５  Ｌｕｃ細胞でのインキュベーション時のＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴにより、免疫化マウス由来の脾細胞（ワクチン接種から１０日または２４日）を試験した。ワクチン誘導ＯＶＡ−特異的ＣＤ８  Ｔ細胞は、陽性ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより示されるように（図７および図１１）、ｍＡｂ１５−ＯＶＡＰｅｐ２またはハーセプチン−ＯＶＡＰｅｐ２で処理されたＥｐｈＡ２またはＥｒｂＢ２陽性Ｃ３５  Ｌｕｃ細胞により特異的に認識され、そして活性化された。
【０２２６】
結論
結論として、この研究において、本発明者らは、腫瘍特異的な細胞表面受容体を認識するｍＡｂのＣＨ３  Ｃ末端配列に融合したＴ細胞エピトープを用いて、その融合抗体が、露出した腫瘍関連抗原に結合すると標的細胞内に内部移行して、Ｔ細胞エピトープがＭＨＣ−Ｉとの複合体で腫瘍細胞表面上に効率的に提示されて、それはワクチン誘導ＣＤ８  Ｔ細胞の細胞溶解活性の特異的な標的となることを示した。
【０２２７】
（実施例２）ベクター仲介の、ＯＶＡエピトープの提示
本発明者らは、本発明によるＴＭＥＭは、標的化部分がウイルスベクター（本実施例ではアデノウイルス血清型５−Ａｄ５を用いた）でありエピトープ部分が細胞−および受容体−特異的な方法でウイルスベクターにより標的細胞中に送達される核酸（ＤＮＡ）にコードされるものであり得ることを示した。
【０２２８】
ヒトコクサッキーおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）をコードする発現プラスミドで、マウスＪＡＷＳＩＩ細胞（アプロタイプＨ−２Ｋｂ）をトランスフェクトした。プラスミドＤＮＡトランスフェクションは、メーカーにより説明されるとおりに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行なった。トランスフェクションの４８時間後、トランスフェクトされた細胞および模擬的にトランスフェクトされた細胞を計測して、１〜２×１０５細胞を９６ウェルプレートにまいた（平底プレート；ＮＵＮＣ２６０８６０プレートであれば最適である）。細胞をそれから、２００のＭＯＩ（ｉｆｕ／ｍｌで計算されたＭＯＩ）で４８時間、Ａｄ５−ＯＶＡベクターで感染させた。
【０２２９】
感染後、細胞を回収し、ＦＡＣＳチューブ中に移して、ＦＡＣＳバッファー（２ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ＢＳＡ２％を含むＰＢＳ）で洗浄して、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
【０２３０】
ＭＨＣクラスＩとの関連でＯＶＡ２５７−２６４／Ｋｂ複合体に特異的な２５  Ｄ１．１６抗体ＰＥ−複合物とともに、細胞をインキュベートした。
【０２３１】
室温で１時間および３７℃で激しく振とうして１時間後、ＦＡＣＳバッファーで細胞を２度洗浄した。サンプルを２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｃａｌｉｂｕｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたフローサイトメトリーにより分析した。
結果を図１２に示す。
【０２３２】
結果は、ＣＡＲ発現細胞のＡｄ５−ＯＶＡ感染は、ｃａｒ陰性細胞ではそうでないが、ＯＶＡ２５７−２６４の提示のレベルの増大をもたらすことを示した。
［参考文献］
2014513072.tif 000006
2014513072.tif 000007
【図１】
2014513072.tif 000008
【図２】
2014513072.tif 000009
【図３】
2014513072.tif 000010
【図４】
2014513072.tif 000011
【図５Ａ】
2014513072.tif 000012
【図５Ｂ】
2014513072.tif 000013
【図５Ｃ】
2014513072.tif 000014
【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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