(57)【要約】  本発明は、多層細胞を凍結するバイアルおよび当該バイアルの取得方法を提供する。上記取得方法は、凍結防止性の因子を希釈するために、融解された細胞に新鮮な媒体を新たに組み込む必要性を避ける、細胞を凍結融解するプロセスである。本プロセスは、上記凍結防止性の因子を含んでいる凍結細胞の溶液に加えて、培養媒体のさらなる層を予め凍結することによって達成される。融解の際に、上記培養媒体と上記細胞溶液とを混合し、非毒性希釈物に対する上記凍結防止性の因子の濃度を調節し、そして生存細胞から上記凍結防止性の因子を効果的に除去する。
2014502610.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞または細胞様材料または非ヒト胎仔を凍結する方法であって、
（ａ）生物学的に受容可能な液体希釈物の層を容器中にて凍結させる工程；
（ｂ）凍結した上記希釈物の上に、上記細胞または細胞様材料または非ヒト胎仔の溶液の形態の層を添加する工程であって、上記溶液の媒体が、少なくとも１つの凍結防止性の因子を好適な濃度にて含んでいる、工程；および
（ｃ）工程（ｂ）にて得られた生成物を凍結させて、上記細胞または細胞様材料または非ヒト胎仔の凍結した溶液を表面上に有する二重層の凍結物を得る工程
を包含しているか、あるいは
（ａ）細胞または細胞様材料または非ヒト胎仔の溶液の形態の層を容器中にて凍結させる工程であって、上記溶液の媒体が、少なくとも１つの凍結防止性の因子を好適な濃度にて含んでいる、工程；
（ｂ）凍結した上記溶液の上に、生物学的に受容可能な液体希釈物の層を添加する工程；および、
（ｃ）工程（ｂ）にて得られた生成物を凍結して、凍結した上記希釈物を表面上に有する二重層の凍結物を得る工程
を包含している、方法。
【請求項２】
前記細胞または細胞様材料または非ヒト胎仔の前記溶液の前記層の容積が、前記液体希釈物の層の容積の半分以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｃ）前記二重層の凍結物の表面上の、前記細胞または細胞様材料または非ヒト胎仔の凍結した前記溶液の上に、低酸素の生物学的に受容可能な液体希釈物の層を添加する工程；および、
（ｄ）工程（ｃ）にて得られた生成物を凍結させて、三重層の凍結物を得る工程
を包含している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記低酸素の生物学的に受容可能な液体希釈物が、無酸素の生物学的に受容可能な液体希釈物である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的に受容可能な液体希釈物が、細胞培養の完全培地である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞培養の完全培地が、抗生物質および血清の少なくとも１つが補完されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
低温貯蔵用の前記因子が、ＤＭＳＯ、グリセロール、ポリビニル−ピロリドン、エチレングリコール、メタノール、メチルアセトアミドおよび糖類からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が微生物である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が植物細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が動物細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記動物細胞が、腫瘍細胞系、不死化細胞系、連続細胞系、遺伝的に改変された細胞系、分裂停止細胞、幹細胞、誘導された多機能性幹細胞および単離された初代細胞からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記単離された初代細胞が、上皮細胞、内皮細胞、間葉細胞および造血細胞からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記動物細胞が卵母細胞または精子である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記容器が、マルチウエルプレートのウエル、バイアル、ストロー、培養容器、フラスコまたはディッシュである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載された、二重層の凍結物。
【請求項１７】
請求項３に記載された、三重層の凍結物。
【請求項１８】
請求項１に記載された二重層の凍結物のいずれかを含んでいる、容器。
【請求項１９】
請求項３に記載された三重層の凍結物を含んでいる、容器。
【請求項２０】
９６ウエルのマイクロプレートのウエルである、請求項１８または１９に記載の容器。
【請求項２１】
３８４ウエルのマイクロプレートのウエルである、請求項１８または１９に記載の容器。
【請求項２２】
１５３６ウエルのマイクロプレートのウエルである、請求項１８または１９に記載の容器。
【請求項２３】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法による、二重層の凍結物および三重層の凍結物の少なくとも１つを含んでいる、即時使用可能なＨＴＳ型マルチウエルプレート。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、多層細胞を凍結するバイアルおよび当該バイアルの取得方法を提供する。本発明の方法を行った後、凍結細胞のバイアビリティーおよび耐久性は向上される。バイオテクノロジーおよび製薬の分野における基礎研究、診断学および薬物開発に適用するための細胞ベースのアッセイに有用である。
【０００２】
［背景技術］
哺乳動物細胞を含む、インビトロでの培養された細胞は、細胞生物学の研究において広く用いられている。１９８０年代半ばまで、細胞培養技術は、多大な労力を要し、多数の細胞にまでスケールアップされていなかった。近年、製薬業およびバイオテクノロジー産業において、基礎研究と同様に、細胞ベースのアッセイを用いるハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）が、広く受け入れられており、そして普遍的に適用されている。
【０００３】
ＨＴＳスクリーニングは、マイクロプレートにて行われる。これらのマイクロプレートの表面は、細胞培養に適用するために、一般的には、容易に細胞を付着させるためにプラズマ放電を用いて修飾され得る。これらの細胞培養マイクロプレートは、より大規模な培養を容易にし、創薬および製薬の両方に影響を与えた。創薬の観点から、細胞ベースのアッセイが、高度な内容分析を用いる有効性試験において、また、インビトロのＡＤＭＥＴ（薬物吸収、分布、新陳代謝、排出および毒性）において、薬物標的を検証するために漸増的に用いられている。これらの研究は細胞に対して行われる。なぜなら、細胞は、単純な分子アッセイよりも薬物に対する典型的な応答性を示すからであり、そして細胞が、ハイスループット様式にて用いられることが動物よりも容易なためである。
【０００４】
低温保存は、培養細胞を長期間にわたって保存するための最も標準的な方法である。低温保存は、細胞のバイアビリティーおよび機能に悪影響を及ぼし得るので、培養物中での細胞の正しい構造、機能、挙動および生物学を維持するために、方法論的な凍結手順および融解手順が、高度に発展している。近年、凍結防止剤（グリセロールおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。）を添加することは、腫瘍細胞の保存、および健康的な初代造血性細胞の両方のためにすでに用いられている。一般に、現在の標準は、長期間凍結された細胞が、液体窒素の蒸気相にて−１３０℃以下で保存されて最も高いレベルのバイアビリティーが保証されることを示す。輸送目的に一般的に用いられるより短い期間（通常１〜３日間）のために、凍結細胞は、−７０℃と−８０℃との間にて保存され得る。
【０００５】
凍結細胞は、ストロー中、あるいは、より一般的には、凍結したバイアルまたは凍結したチューブとしても知られている、１０％の低温保存用因子を含む１ｍＬから５ｍＬのアンプル中にて収納され得る。
【０００６】
基本的な融解条件は、細胞の回復に有利な条件が当該分野においてすでに確立されている。これらの融解条件は、依然として現在の標準的なプロトコールであり、これらの融解条件は、融解温度の最適化、血清を含む細胞培養用の媒体（培地）に加えることによる低温保存用溶液の希釈、または、遠心分離による凍結防止剤の完全な除去、を含む。これらの標準的な融解プロトコール（例えば、ＡＴＣＣプロトコール）は、凍結バイアルが３７℃の水槽中に配置されることによって迅速に融解されなければならないこと、および、凍結バイアルの内容物が完全に融解されるまで連続的な攪拌が適用されること、を示す。次いで、上記バイアルは浄化され、そして上記内容物は、１０倍容以下の好適な培養培地を標準的に含んでいる培養容器（ｖｅｓｓｅｌ）へ迅速に移される。この希釈は、浸透圧ショックを可能な限り最小化するために、滴下様式にて行われる。これは、凍結防止剤（通常ＤＭＳＯ）の濃度を、ほとんどの細胞について、迅速かつ完全に除去する必要性がないレベルまで低くする。細胞に対する凍結防止剤の毒作用を最小化するために、融解操作の全体が、可能な限り速やかに行われなければならない。細胞付着の際に、一般に、５％のＣＯ２の雰囲気下にて３７℃でインキュベートした後のさらなる２４時間以内に、上記培地は、新鮮な培地と置き換えられ、上記凍結防止剤の除去を促進させる。上記凍結防止剤に対してより感受性であるタイプの細胞には、毒性因子を完全に除去するために、遠心分離が、細胞を播種する前に行われなければならない。
【０００７】
細胞培養は、典型的には、インビトロにて広げられ、８０％またはそれ以上のコンフルエンシーにて回収される。いくつかの方法（トリプシンおよびＥＤＴＡを用いる酵素的消化、セルスクレイパーを用いる機械的な剥離、または温度応答性表面（すなわちば、ＮｕｎｃからのＵｐＣｅｌｌＴＭ）含む。）が、細胞培養物を回収するために当該分野において用いられている。細胞を回収した後、細胞は、一般に、遠心分離され、希釈され、血球計算機または自動細胞カウンタを用いて計数され、そして再度蒔かれるか、または好適な濃度にて凍結防止剤と懸濁される。
【０００８】
細胞は、正規の細胞培養容器（フラスコともいう。）中に蒔かれ、２〜３日間にわたってインビトロにて増殖され、そしてハイスループットの使用が必要とされる場合、マイクロプレートに再度蒔かれる。この組織培養プロセスは、ハイスループット様式にて細胞を蒔くために、なお現在の標準であり、労力および時間を要する方法であり、適切な細胞培養施設および技術者を必要とする。成果物は、多数の操作手順が含まれていることに起因して、微生物の夾雑および細胞の交差夾雑にさらされる。
【０００９】
日本国公開特許公報２００２２５３２０５号では、プレートに接着させた細胞を直接的に凍結することによって、上記問題点を解決することが試みられている。米国特許公開第２００２０１２９０１号公報には、接着した凍結細胞にも関連する融解方法について教示されている。しかし、単層にて凍結した細胞が、懸濁物中の細胞よりも、凍結による傷害に感受性であることは、周知である。これは、隣接している細胞間にて氷の広がりを容易にするギャップ結合の存在に起因するかもしれない、ということが報告されている（Armitage et al. Cryobiology 2003; Liu et al. Cryo letters 2003, Acker JP et al., 2001)。日本国公開特許公報２０６９２００号および中国特許公開第２６８９９４６号には、プレート上に接着した凍結細胞について教示されており、細胞内の寄生生物およびウイルスを明らかにするために、診断学的検査にまさに着目されている。これらの方法はいずれも、本発明のようないくつかの層の凍結バイアルについて教示していない。
【００１０】
国際公開公報ＷＯ２００６０７２３３５号および欧州特許第１８６９９７６号は、最も近い先行技術文献であると考えられ、これらには、保管期間を延長するために、細胞を凍結する時点で、大気圧よりも低い酸素分圧にて、凍結した細胞をマルチプレート中にて懸濁することが教示されている。これら２つの刊行物には、高効率の複数の層を凍結バイアルについて教示されておらず、そしてこれらの方法は、本発明と異なり、凍結防止剤（凍結防止性の因子）の毒作用を回避するために、細胞ベースの任意のアッセイを行う前に培養培地を融解した細胞へ添加することによって希釈することが確かに必要とされる。しかし、保管期間についての類似の効果を調べると、上記刊行物の発明の好ましい実施形態に、最後の層が低酸素の媒体であることが記載されている。
【００１１】
次いで、当該分野における課題は、融解後の細胞のバイアビリティーを向上させ、検査に費やす時間を短縮化し、そして、夾雑の危険性を低減させ得る凍結方法を提供することである。本発明によって提供される解決手段は、連続的な凍結方法であり、これは、少なくとも１つの新鮮な希釈物の層を含む、二重層または三重層の凍結物を有する容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）を生成する。本方法は、融解プロセスを単一工程に簡略化し、融解の効率を少なくとも１５％に向上させ、そして、生存可能な細胞を別の容器へ交換することを避け、これにより、夾雑の危険性を低減させる。
【００１２】
［発明の概要］
本発明は、凍結防止剤（凍結防止性の因子）を希釈するために、融解した細胞に新鮮な媒体を新たに組み込む必要性を回避する、細胞を凍結融解する方法である。本方法は、上記凍結防止性の因子を含んでいる凍結細胞溶液に加えて、媒体または希釈物のさらなる層を予め凍結することによって達成される。融解の際に、上記希釈物と細胞溶液とを混合し、非病原性の希釈物に対する上記凍結防止性の因子の濃度を調節し、そして上記凍結防止性の因子を生細胞から効果的に除去することを達成する。これは、上記因子の分子量に依存して（ｄｅｎｄｉｎｇ  ｏｎ）、得られた溶液の底部または表面上へ上記因子を流動させても、混合が進行することに起因する細胞の浸透圧ショックを溶質を用いて最小化しても達成される。このことは、本発明に共通する技術思想である。
【００１３】
少なくとも２つの可能性が上記技術思想に含まれている：１）凍結細胞溶液を凍結した希釈物の上に置く。冷却された凍結防止性の因子を含んでいる、生細胞の層は、１分間あたり１℃以上の温度速度で迅速に凍結される。この場合、上記凍結防止性の因子は、希釈物よりも分子量が大きい分子であるべきである（例えば、ＤＭＳＯまたはグリセロール）。そして、２）上記希釈物よりも分子量が小さい凍結防止性の因子を選択した場合（例えば、メタノール）、凍結した希釈物の下に凍結細胞溶液を置く。融解する際に、上記凍結防止性の因子は、非常に多くの割合にて生存する生細胞から分離された混合液の上方へ流動する。上記技術思想は、融解する際に、新鮮な希釈物と細胞溶液との混合物が凍結防止性の因子を希釈する点で同じである。これにより、当該分野の一般的な手順の後の細胞融解に続く細胞増殖相を回避することができ、任意のアッセイを行う際の時間を大幅に短縮させることができる。
【００１４】
本発明の第１の実施形態は、細胞または細胞様材料または非ヒト胎仔を凍結する方法であって、上記方法は、以下の工程を包含している：（ａ）生物学的に受容可能な液体希釈物の層を容器中にて凍結させる工程；（ｂ）凍結した上記希釈物の上に、上記細胞または細胞様材料または非ヒト胎仔の溶液の形態の層を添加する工程であって、上記溶液の媒体が、少なくとも１つの凍結防止性の因子を好適な濃度にて含んでいる、工程；および、（ｃ）工程（ｂ）にて得られた生成物を凍結させて、上記細胞または細胞様材料または非ヒト胎仔の凍結した溶液を表面上に有する二重層の凍結物を得る工程；あるいは、（ａ）細胞または細胞様材料または非ヒト胎仔の溶液の形態の層を容器中にて凍結させる工程であって、上記溶液の媒体が、少なくとも１つの凍結防止性の因子を好適な濃度にて含んでいる、工程；凍結した上記溶液の上に、生物学的に受容可能な液体希釈物の層を添加する工程；および、（ｃ）工程（ｂ）にて得られた生成物を凍結して、凍結した上記希釈物を表面上に有する二重層の凍結物を得る工程。
【００１５】
本発明の範囲において、「凍結させる」との表現は、上記液体希釈物または細胞溶液の温度を、それぞれの凍結物を形成するためのガラス転移温度よりも低くすることを意味する。
【００１６】
本発明の範囲において、用語「細胞様材料」は、細胞小器官、細胞膜またはリポソームをいう。
【００１７】
本発明の範囲において、用語「生物学的に受容可能な液体希釈物」は、インビトロでの条件下にて正常に生存している細胞に対して適合性である任意の液体希釈物をいう。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、これらの任意の凍結させる系を繰り返し、多層の凍結物を得ることである。上記多層の凍結物の容器はまた、上記容器が、開示された層の配列を含む限り、本発明の好ましい実施形態である。
【００１９】
本発明の多層構造は、凍結防止性の因子の毒作用を低減させ、そして融解プロセス中の細胞に対する浸透圧ショックを低減させることができる。適切な希釈を確実に行うための鍵は、上記細胞を含んでいる層が、希釈物の層の容積の半分以下でなければならないことである。このように、本発明の細胞または細胞様材料または非ヒト胎仔を凍結する方法の特定の実施形態は、上記細胞または細胞様材料または非ヒト胎仔の溶液の上記層の容積が、上記液体希釈物の層の容積の半分以下である。
【００２０】
別の好ましい実施形態は、二重層の凍結物の表面上の、凍結した上記細胞または細胞様材料または非ヒト胎仔の上記溶液の上に、低酸素の生物学的に受容可能な液体希釈物の層を添加する工程、および上記工程にて得られた生成物を凍結させて、三重層の凍結物を得る工程をさらに包含している、細胞または細胞様材料または非ヒト胎仔を凍結する方法である。好ましくは、上記低酸素の生物学的に受容可能な上記液体希釈物は、無酸素の生物学的に受容可能な液体希釈物である。このさらなる低酸素の層はまた、凍結細胞の溶液の層の表面上に０℃に近い温度にて均一に分散され、そして−７０℃以下の温度にて迅速に凍結されなければならない。上記凍結細胞が希釈物によって閉じ込められそして覆われるために、上記液体の量は、上記容器を完全に密封できる量でなければならない。凍結の際に低酸素雰囲気を用いる従来技術によって教示される効果の類似の様式にて、凍結細胞の改善された保存期間は、この低酸素の層の追加によって達成される。三重層の方法の実施形態は、−８０℃で６ヶ月まで容器の保存期間を延長させる。
【００２１】
本発明の範囲において、用語「低酸素」は、希釈物における酸素分圧が細胞の代謝のための最適なレベルよりも低い条件（典型的には、１２０ｍｍＨｇから１５０ｍｍＨｇ）をいう。本発明の範囲内の低酸素溶液の適切な例は、酸素分圧が２０ｍｍＨｇ以下である。
【００２２】
本発明の範囲において、用語「無酸素」は、希釈物における酸素分圧がゼロである条件を意味する。
【００２３】
本発明の方法の非常に好ましい実施形態において、上記生物学的に受容可能な液体希釈物は、細胞培養の完全培地であり、なおさらに好ましくは、抗生物質および血清の少なくとも１つが補完されている。本発明の別の好ましい実施形態において、低温貯蔵用の上記因子は、ＤＭＳＯ、グリセロール、ポリビニル−ピロリドン、エチレングリコール、メタノール、メチルアセトアミドおよび糖類からなる群より選択され、より好ましくは、ＤＭＳＯである。
【００２４】
本発明の別の実施形態において、上記凍結細胞は微生物であり、そして別の実施形態において、上記凍結細胞は植物細胞である。好ましい実施形態において、上記凍結細胞は動物細胞であり、より好ましくは、上記動物細胞は、腫瘍細胞系、不死化細胞系、連続細胞系、遺伝的に改変された細胞系、分裂停止細胞、幹細胞、誘導された多機能性幹細胞および単離された初代細胞からなる群より選択される。なおさらに好ましくは、上記単離された初代細胞は、上皮細胞、内皮細胞、間葉細胞および造血細胞からなる群より選択される。本発明の好ましい実施形態において、上記動物細胞は哺乳動物細胞であり、より好ましくは、卵母細胞または精子である。
【００２５】
本発明の範囲において、用語「腫瘍細胞系」は、インビボの腫瘍に由来する永続的に確立された細胞培養系をいう。
【００２６】
本発明の範囲において、用語「不死化細胞系」は、細胞が永久に再生するように遺伝子学的に操作された細胞系をいう。
【００２７】
本発明の範囲において、用語「連続細胞系」は、インビトロにて永久に再生することができる細胞系をいう。
【００２８】
本発明の範囲において、用語「遺伝的に改変された細胞系」は、典型的には遺伝子工学技術を介して、遺伝物質が改変または変更された細胞系をいう。
【００２９】
本発明の範囲において、用語「分裂停止細胞」は、細胞周期が人為的に停止されている細胞；すなわち、分裂能が起こりえないように変化された細胞をいう。これらは主に、ハイスループットスクリーニングの目的に用いられる。
【００３０】
本発明の範囲において、用語「幹細胞」は、未分化な状態を維持しつつ多く細胞分裂周期を行う能力を有する細胞をいい、同時に、特化した細胞型に分化することができる多能性細胞をいい、ヒト胎仔の幹細胞を除く。
【００３１】
本発明の範囲において、用語「誘導された多機能性幹細胞」は、成人の非多能性体細胞に由来する細胞をいい、そして組織特異的形質を緩和して多機能性とするために遺伝子学的にリプログラミングされた細胞をいう。
【００３２】
本発明の範囲において、用語「単離された初代細胞」は、被験体の組織から直接的に得られる細胞をいう。
【００３３】
本発明の別の実施形態において、細胞または細胞様材料または非ヒト胎仔を凍結する方法は、好ましくは、マルチウエルプレートのウエル、バイアル、ストロー、培養容器、フラスコまたはディッシュにて行われる。
【００３４】
別の好ましい実施形態は、本発明の二重層の凍結物および上記二重層の凍結物を含んでいる容器の何れかである。そして、さらに別の実施形態は、本発明の三重層の凍結物および当該凍結物を含んでいる容器である。本発明の非常に好ましい実施形態において、上記容器は、９６ウエルのマイクロプレートのウエル、３８４ウエルのマイクロプレートのウエルまたは１５３６ウエルのマイクロプレートのウエルである。最も好ましい実施形態の１つは、本発明の二重層の凍結物および三重層の凍結物の少なくとも１つを含んでいる、即時使用可能なＨＴＳ型マルチウエルプレートである。
【００３５】
本発明の上記容器が暖かい温度雰囲気（典型的には、３７℃でのＣＯ２インキュベータ中）において融解される場合、凍結した層は、連続的な様式にて融解し、その結果、浸透圧ショックが最小化にされ、そして上記細胞が上記希釈物と均一に混合される。この「自発的に播種される」方法は、さらなる細胞操作を避け、接着細胞が落下して重力によって容器の底（マイクロプレートの場合は壁）に付着することを可能にする。同時に、希釈した上記凍結防止性の因子は、上記環境を細胞の速い回復に好適な環境に変化させる。典型的には、インキュベーションの後の２時間の間に、各ウエルの媒体は、３７℃で新鮮な細胞培養の完全培地と置き換えられ、そして上記マイクロプレートは、細胞培養インキュベータ中に戻され得、実験用の使用のために準備される。
【００３６】
本発明は、細胞をＨＴＳマイクロプレート中にて直接的に凍結させることを包含する。この方法は、細胞を融解する工程、細胞を蒔く工程、細胞をフラスコ中にて広げる工程、細胞を持ち上げる工程、および細胞を新しいマイクロプレート中に再び蒔く工程に浪費する時間を回避する。本発明の凍結方法の主要な利点は、処置時間を大幅に短縮することである。当該分野の伝統的な試験手順の後に、細胞は融解され、フラスコ中にて適切な細胞数を有するまで増殖され、９６ウエルプレート中に蒔かれ、次いでアッセイの準備のために２４時間にわたって静置されなければならず、４〜５日間費やす。本発明の方法を用いれば、細胞は、９６ウエルプレート中にて直接的に融解され、融解後の期間に一晩しか必要としない。これらの時間面での有利性の観点から、９６ウエルプレート上における多層細胞を凍結融解する方法の実施形態は、細胞毒性を研究するために、または他の細胞ベースの任意のアッセイのために、速く、安く、丈夫で、そして実現可能な方法である。
【００３７】
時間の短縮以外に、本発明は、細胞の直接的な使用および液体の操作の最小化に起因して、培養物の潜在的な夾雑を回避する。本発明の凍結方法の使用は、新たな任意の試薬の添加に基づくものでないため、細胞に対する未知の薬剤効果として新たなものが見込まれない。マイクロプレートがバッチにて生産され得るので、本発明はまた標準化を可能とする。ここで、各バッチは、同一の凍結マイクロプレートを複数含んでいる。さらに、種々のコンフルエンシーのステージでの接着細胞の使用、または異なる細胞サイクルのステージにて同期化された細胞のいずれかを必要とするアッセイに対して、実用的な溶液は供給される。本発明の方法はまた、商業的な利点を供給する。なぜなら、種々の細胞型が同一のマイクロプレートにて多重化され、単一のアッセイに必要とされる個々に異なる細胞型を購入する費用を削減するからである。この多重化する能力は、予算を大幅に削減することに寄与することと同様に、広範な実験手法に機能的に興味深い。
【００３８】
本明細書中に開示された結果について、本発明の多層凍結方法は、ＨＴ２９ヒト腫瘍細胞およびＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞のための９６ウエルプレートにおいて有効である。実施例における、融解された細胞のバイアビリティー（生存度）は、後述する当該分野のバイアルの標準的な方法に続いて行われる細胞の凍結融解よりも非常に向上した。
【００３９】
本発明の最も好ましい実施形態は、三重層の凍結物を少なくとも１つを含んでいる、即時使用可能なＨＴＳ型マルチウエルプレートであって、以下の工程を含んでいる方法によって上記三重層の凍結物が得られる：上記ウエル内において、抗生物質および血清の少なくとも１つが補完されている完全培養培地の層を凍結させる工程；凍結した上記希釈物の上に、上記細胞の溶液の形態の層を添加する工程であって、上記溶液の媒体が、ＤＭＳＯを好適な濃度にて含んでいる、工程；上記工程にて得られた生成物を凍結させて、二重層の凍結物を得る工程；上記二重層の凍結物の表面上の上記凍結細胞の上に、無酸素の完全培養培地の層を添加し、そして生成物を凍結させて、三重層の凍結物を得る工程。
【００４０】
［図面の簡単な説明］
［図１］図１は、９６ウエルプレートの１つのウエルにおける２工程の凍結プロセス（ＡおよびＢ）、および、引き続く融解プロセス（ＣおよびＤ）を示し、プレートが通常の細胞インキュベータ内で融解されると自動的に細胞が播種されるメカニズムを示す。
Ａ：細胞培養の完全培地の第１層を、９６ウエルのプレートの各ウエルに分散する。次いで、上記プレートを−７０℃以下にて凍結する。
Ｂ：４℃以下にて凍結防止性の因子を含んでいる細胞または細胞様材料の第２層を、凍結した上記完全培地の層の表面上に添加する。次いで、上記プレートを−７０℃以下にて凍結する。
Ｃ：上記マイクロプレートを３７℃にて融解した結果としての上記２つの層の混合物を示す。ドットは、希釈された凍結防止性の因子中に懸濁された細胞を示す。
Ｄ：重力によって接着細胞を落し、３７℃で簡単にインキュベートした後に、ウエルの底に均一に付着させる。
［図２］ＨＴ２９の検量線を示す。ｆ（ｘ）＝３５７４１５ｘ−３０２１０；Ｒ２＝０．９８。
［図３］ＨＴ２９細胞におけるバイアビリティーを示す。コントロールバイアルからの細胞に対して、多層を凍結融解する方法の細胞の生存数が、明らかに増加していることを示す。８０，０００細胞／ウエルよりも少ない細胞数および８０，０００細胞／ウエルよりも多い細胞数は、それぞれ２４時間のインキュベーションの後の細胞死亡率および細胞増殖率を示す。
［図４］ＮＩＨ３Ｔ３の検量線を示す。ｆ（ｘ）＝４２２１２９ｘ−２４５５４、Ｒ２＝０．９６。
［図５］ＮＩＨ３Ｔ３細胞のバイアビリティーを示す。多層を凍結融解する方法の２４時間のインキュベーションの後の細胞の生存数が、コントロールバイアルの細胞と比較してわずかに増加していることを示す。
［図６］５−フルオロウラシル処理に対するＢＡＬＢ３Ｔ３細胞の濃度依存的な細胞傷害性反応を示す。
［図７］タモキシフェン処理に対するＢＡＬＢ３Ｔ３細胞の濃度依存的な細胞傷害性反応を示す。
［図８］５−フルオロウラシル処理に対するＳｍａｃ細胞の濃度依存的な細胞傷害性反応を示す。
［図９］タモキシフェン処理に対するＳｍａｃ細胞の濃度依存的な細胞傷害性反応を示す。
【００４１】
［特定の実施形態の詳細な説明］
本発明の好ましい特定の実施形態および局面を実証し、さらに例証するために、以下の実施例を提供されるが、その範囲に限定されると解釈されるべきでない。
【００４２】
［実施例１．大腸癌細胞ＨＴ２９に対する二層細胞凍結融解方法］
１０％のＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍＬのペニシリンおよび１００ＩＵ／ｍＬのストレプトマイシンを補完したエンドトキシンフリーのＭｃ  Ｃｏｙ’ｓ  ５Ａの完全培養培地にて培養したＨＴ２９細胞（ＡＴＣＣ、ＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）を、８０％コンフルエンシーまでフラスコ中にて培養し、次いで収集した。０．０５％のＥＤＴＡを含んでいる５ｍＬのＰＢＳを用いて、細胞を２分間インキュベートすることによって収集を行い、０．１％のトリプシンおよび０．０５％のＥＤＴＡを含んでいる５ｍＬのＰＢＳ中にて、さらに５分間インキュベーションすることによって、最終的に脱離させた。細胞を、４００×Ｇで５分間遠心分離した。次いで、８０％のＭｃ  Ｃｏｙ’ｓ、１０％のＦＣＳ、１０％のＤＭＳＯ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）の凍結培地中に５０μＬあたり８０，０００個のＨＴ２９細胞を含んでいる、合計４．８ｍＬの溶液を４℃にて調製し（細胞の密度を血球計算機によって測定した。）、いわゆる凍結溶液を作製した。さらに、１００μＬの完全培養培地を９６ウエルプレートの各ウエルに分散し、−８０℃まで下げて凍結させた。一旦凍結させたら、上記プレートを回収し、５０μＬ／ウエルの上記凍結溶液を、すでに凍結した完全培養培地を１００μＬ含んでいる各ウエルの上に添加した。上記プレートを１０分間ドライアイス雰囲気下にて保存し、次いで−８０℃の冷凍庫へ移動し、５日間にわたって保存した。ネガティブコントロールとして、５０μＬあたり８０，０００個のＨＴ２９細胞の別の溶液を、９６ウエルプレートとともに凍結バイアル中にて凍結させ、次いで、バイアルコントロールとして用いるために−８０℃の冷凍庫へ移した。
【００４３】
５日後、凍結した上記９６ウエルプレートを３７℃のＣＯ２インキュベータへ移した。同時に、穏やかに振盪する３７℃の清浄な水槽中にて、上記バイアルコントロールを迅速に融解した。５０μＬ／ウエルの上記バイアルコントロールを、１００μＬ／ウエルの加温された完全培養培地を含んでいる別の９６ウエルプレート上に蒔いた。融解の１時間後に、全てのプレートからの記培地を、予め加温しておいた新鮮な完全培養培地と取り換えた。２４時間のインキュベート後の細胞全てに対して、ＭＴＴアッセイ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を行った。上記ＭＴＴアッセイは実験室での検査であり、ホルマザンに対するＭＴＴを減少させる酵素の活性を測定するための標準的な比色分析アッセイである。生細胞中において、黄色のＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、テトラゾール）が、紫色のホルマザンに還元される。５ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ  １×を用いてＭＴＴ溶液ストックを調製した。１００μＬ／ウエルのＭＴＴ実験溶液（培養培地中にて１：１００）を、予め融解した細胞上に添加し、ＣＯ２インキュベータ内にてインキュベートした。３時間後、吸引によって、上記ＭＴＴを上記プレートウエルから除去し、紫色の不溶性のホルマザン生成物を着色された溶液に変化させるために、２００μＬ／ウエルのＤＭＳＯを添加した。分光光度計（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）にて５４０ｎｍで、この溶液の吸光度を測定した。
【００４４】
参照用の標準曲線を作成した（図２）。ＨＴ２９細胞を最初に０．０５％のＥＤＴＡ中にて２分間インキュベートした。０．１％のトリプシンおよび０．０５％のＥＤＴＡ中にてさらに５分間インキュベートすることによって、最終的な分離を行った。細胞を、４００×Ｇで５分間遠心分離した。血球計算機を用いて細胞数を数えることによって、細胞の密度を測定した。９６ウエルプレートのウエルにて、希釈物のシリーズを作製した。細胞数は、２００μＬの容積中にて１２５０〜１６００００個の範囲であった。細胞が適切に付着するや否や、上述したように上記ＭＴＴアッセイを行った。
【００４５】
［実施例２．マウスの線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３に対する二層細胞凍結融解方法］
１０％のＦＣＳ、１００μｇ／ｍＬのペニシリンおよび１００ＩＵ／ｍＬのストレプトマイシンを補完したエンドトキシンフリーのＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）にて培養したＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ、ＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）を、８０％コンフルエンシーまでフラスコ中にて培養し、次いで収集した。０．０５％のＥＤＴＡを有する５ｍＬのＰＢＳ中にて、細胞を２分間インキュベートすることによって収集を行い、０．１％のトリプシンおよび０．０５％のＥＤＴＡ中にて、さらに５分間インキュベーションすることによって、最終的に脱離させた。細胞を、４００×Ｇで５分間遠心分離した。次いで、８０％のＤＭＥＭ、１０％のＦＣＳ、１０％のＤＭＳＯ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）の凍結培地中に５０μＬあたり８０，０００個のＮＩＨ３Ｔ３細胞を含んでいる、合計４．８ｍＬの溶液を４℃にて調製し（細胞の密度を血球計算機によって測定した。）、いわゆる凍結溶液を作製した。さらに、１００μＬの完全培養培地を９６ウエルプレートの各ウエルに分散し、−８０℃まで下げて凍結させた。一旦凍結させたら、上記プレートを回収し、５０μＬ／ウエルの上記凍結溶液を、すでに凍結した完全培養培地を１００μＬ含んでいる各ウエルの上に添加した。上記プレートを１０分間ドライアイス雰囲気下にて保存し、次いで−８０℃の冷凍庫へ移動し、５日間にわたって保存した。ネガティブコントロールとして、５０μＬあたり８０，０００個のＨＴ２９細胞の別の溶液を、９６ウエルプレートとともに凍結バイアル中にて凍結させ、次いで、バイアルコントロールとして用いるために−８０℃の冷凍庫へ移した。
【００４６】
５日後、凍結した上記９６ウエルプレートを３７℃のＣＯ２インキュベータへ移した。同時に、穏やかに振盪する３７℃の清浄な水槽中にて、上記バイアルコントロールを迅速に融解した。５０μＬ／ウエルの上記バイアルコントロールを、１００μＬ／ウエルの加温された完全培養培地を含んでいる別の９６ウエルプレート上に蒔いた。融解の１時間後に、全てのプレートからの上記培地を、予め加温しておいた新鮮な完全培養培地と取り換えた。２４時間のインキュベート後の細胞全てに対して、ＭＴＴアッセイ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を行った。５ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ  １×を用いてＭＴＴ溶液ストックを調製した。１００μＬ／ウエルのＭＴＴ実験溶液（培養培地中にて１：１００）を、予め融解した細胞上に添加し、ＣＯ２インキュベータ内にてインキュベートした。３時間後、吸引によって、上記ＭＴＴを上記プレートウエルから除去し、紫色の不溶性のホルマザン生成物を着色された溶液に変化させるために、２００μＬ／ウエルのＤＭＳＯを添加した。分光光度計（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）にて５４０ｎｍで、この溶液の吸光度を測定した。
【００４７】
参照用の標準曲線を作成した（図４）。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を最初に０．０５％のＥＤＴＡ中にて２分間インキュベートした。０．１％のトリプシンおよび０．０５％のＥＤＴＡ中にてさらに５分間インキュベートすることによって、最終的な分離を行った。細胞を、４００×Ｇで５分間遠心分離した。血球計算機を用いて細胞数を数えることによって、細胞の密度を測定した。９６ウエルプレートのウエルにて、希釈物のシリーズを作製した。細胞数は、２００μＬの容積中にて１，２５０〜１６０，０００個の範囲であった。細胞が適切に付着するやいなや、上述したように上記ＭＴＴアッセイを行った。
【００４８】
［実施例３．細胞傷害試験］
Ｂａｌｂ３Ｔ３（ＡＴＣＣ、ＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）の線維芽細胞および平滑筋の大動脈細胞（ＳＭＡＣ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットから新鮮に分離した、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の初代細胞を、１０％のＦＣＳ、１００μｇ／ｍＬのペニシリンおよび１００ＩＵ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補完したエンドトキシンフリーのＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）からなる完全培養培地中にて培養した。ＳＭＡＣ細胞を、１匹のオスのラットの大動脈から分離した：ラットの左心室から腸骨の分岐までの大動脈を注意して切り取り、コラゲナーゼＩＩ型（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を用いて上記組織を酵素的に消化することによって細胞を分離した。低温にて保存するまでの間、得られた細胞を１２日間にわたって増殖させた。両方の細胞型を、８０％コンフルエンシーまでフラスコ中にて培養し、次いで収集した。０．０５％のＥＤＴＡを含んでいる５ｍＬのＰＢＳ中にて、細胞を２分間インキュベートすることによって収集を行い、０．１％のトリプシンおよび０．０５％のＥＤＴＡ中にて、さらに５分間インキュベーションすることによって、最終的に脱離させた。細胞を、４００×Ｇで５分間遠心分離した。次いで、８０％、１０％のＦＣＳ、１０％のＤＭＳＯ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）の凍結培地中に５０μＬあたり５０，０００個の細胞を含んでいる、合計４．８ｍＬの溶液を４℃にて調製し（細胞の密度を血球計算機によって測定した。）、いわゆる凍結溶液を作製した。さらに、１００μＬの完全培養培地を９６ウエルプレートの各ウエルに分散し、−８０℃まで下げて凍結させた。一旦凍結させたら、上記プレートを回収し、５０μＬ／ウエルの上記凍結溶液を、すでに凍結した完全培養培地を１００μＬ含んでいる各ウエルの上に添加した。上記プレートを１０分間ドライアイス雰囲気下にて保存し、次いで−８０℃の冷凍庫へ移動した。５日後、凍結した上記９６ウエルプレートを３７℃のＣＯ２インキュベータへ移した。融解の１時間後に、全てのプレートからの上記培地を、予め加温しておいた新鮮な完全培養培地と取り換えた。融解から２４時間にわたって、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬの５−フルオロウラシル、ならびに、０．６２μＭ、１．２５μＭ、２．５μＭおよび５μＭのタモキシフェンをそれぞれ用いて、Ｂａｌｂ３Ｔ３細胞およびＳＭＡＣ細胞の両方の細胞型をインキュベートした。コントロール細胞は基本培地を受け、コントロール−ＦＢＳ細胞は完全培地を受けた。実験を３連にて行った。２４時間後、ＭＴＴアッセイを行い、細胞傷害性を吸光度の値に従って算出した。
【００４９】
５ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ  １×を用いてＭＴＴ溶液ストックを調製した。次いで、１００μＬ／ウエルのＭＴＴ実験溶液（培養培地中にて１：１００）を、予め融解したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータ内にて３時間にわたってインキュベートした。上記ＭＴＴを上記プレートウエルから除去し、紫色の不溶性のホルマザン生成物を着色された溶液に変化させるために、２００μＬ／ウエルのＤＭＳＯを添加した。分光光度計（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）にて５４０ｎｍで、この溶液の吸光度を測定した。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、９６ウエルプレートの１つのウエルにおける２工程の凍結プロセス（ＡおよびＢ）、および、引き続く融解プロセス（ＣおよびＤ）を示し、プレートが通常の細胞インキュベータ内で融解されると自動的に細胞が播種されるメカニズムを示す。
【図２】ＨＴ２９の検量線を示す。ｆ（ｘ）＝３５７４１５ｘ−３０２１０；Ｒ２＝０．９８。
【図３】ＨＴ２９細胞におけるバイアビリティーを示す。コントロールバイアルからの細胞に対して、多層を凍結融解する方法の細胞の生存数が、明らかに増加していることを示す。
【図４】ＮＩＨ３Ｔ３の検量線を示す。ｆ（ｘ）＝４２２１２９ｘ−２４５５４、Ｒ２＝０．９６。
【図５】ＮＩＨ３Ｔ３細胞のバイアビリティーを示す。多層を凍結融解する方法の２４時間のインキュベーションの後の細胞の生存数が、コントロールバイアルの細胞と比較してわずかに増加していることを示す。
【図６】５−フルオロウラシル処理に対するＢＡＬＢ３Ｔ３細胞の濃度依存的な細胞傷害性反応を示す。
【図７】タモキシフェン処理に対するＢＡＬＢ３Ｔ３細胞の濃度依存的な細胞傷害性反応を示す。
【図８】５−フルオロウラシル処理に対するＳｍａｃ細胞の濃度依存的な細胞傷害性反応を示す。
【図９】タモキシフェン処理に対するＳｍａｃ細胞の濃度依存的な細胞傷害性反応を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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