(57)【要約】  本開示は、ニューロン結合を強化するための方法及び組成物に関する。本開示は、少なくとも部分的に、ニューロン間の結合を生み出す構造の形成を阻害する「Mirta22」と呼ばれるタンパク質の同定に基づく。さらに本開示は、短いヘアピンRNAによるMirta22活性の阻害がこれらの構造の回復を可能にしたという確認に、部分的に基づく。Mirta22は、統合失調症と関連付けられている22q11微小欠失に関連する実験において同定された。したがって本開示は、Mirta22活性を阻害する作用物質を投与することを含む、統合失調症の治療方法を提供する。学習及び記憶障害を含めた、ニューロン結合の強化が有益であるであろう他の障害の治療において、それを使用することもできる。【選択図】  図１Ａ−Ｂ
2014520811.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューロン間の結合を増大させるための方法であって、有効量のMirta22活性を阻害する作用物質を前記ニューロンに投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
作用物質がmir-185である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
作用物質が、Mirta22のmRNAと相補的な配列を含むアンチセンスRNA、Mirta22のmRNAと相補的な配列を含むRNAi、及びMirta22のmRNAと相補的な配列を含むshRNAからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
作用物質が、抗Mirta22抗体若しくはその断片、Mirta22と特異的に結合する単鎖抗体、又はMirta22と特異的に結合するダイアボディからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ニューロン間の結合を増大させるための方法であって、有効量のmir-185活性を増大させる作用物質を前記ニューロンに投与することを含む、前記方法。
【請求項６】
作用物質がmir-185核酸である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
そのような治療を必要とする対象におけるニューロン間の結合を増大させるための方法であって、有効量のMirta22活性を阻害する作用物質を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項８】
作用物質がmir-185核酸である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
作用物質が、Mirta22のmRNAと相補的な配列を含むアンチセンスRNA、Mirta22のmRNAと相補的な配列を含むRNAi、及びMirta22のmRNAと相補的な配列を含むshRNAからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
作用物質が、抗Mirta22抗体若しくはその断片、Mirta22と特異的に結合する単鎖抗体、又はMirta22と特異的に結合するダイアボディからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
そのような治療を必要とする対象におけるニューロン間の結合を増大させるための方法であって、有効量のmir-185活性を増大させる作用物質を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１２】
作用物質がmir-185核酸である、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
対象における統合失調症又は関連障害を治療する方法であって、有効量のMirta22活性を阻害する作用物質を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１４】
作用物質がmir-185核酸である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
作用物質が、Mirta22のmRNAと相補的な配列を含むアンチセンスRNA、Mirta22のmRNAと相補的な配列を含むRNAi、及びMirta22のmRNAと相補的な配列を含むshRNAからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
対象における統合失調症又は関連障害を治療する方法であって、有効量のmir-185活性を増大させる作用物質を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１７】
作用物質がmir-185核酸である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
対象において記憶力を向上させる方法であって、有効量のMirta22活性を阻害する作用物質を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
作用物質がmir-185核酸である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
作用物質が、Mirta22のmRNAと相補的な配列を含むアンチセンスRNA、Mirta22のmRNAと相補的な配列を含むRNAi、及びMirta22のmRNAと相補的な配列を含むshRNAからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
対象において記憶力を向上させる方法であって、有効量のmir-185活性を増大させる作用物質を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２２】
作用物質がmir-185核酸である、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
認可に関する情報
本発明は、国立精神保健研究所(National Institute of Mental Health)により与えられた認可番号MH067068及びMH077235の下で政府の支援によってなされたものである。政府は本発明において確固たる権利を有するものとする。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、その全容が参照として完全に本明細書に組み込まれる、2011年6月29日に出願された米国仮特許出願第61/502,661号に対する優先権を主張するものである。
【０００３】
技術分野
本発明は、ニューロン結合を強化するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
再発性de novo 22q11.2微小欠失と統合失調症の間の関係は、統合失調症(SCZ)の遺伝子構造に関する本発明者らの理解の変化をもたらし、稀で高浸透率の突然変異がこの疾患リスクにおいて果たす役割が強調された(1、2)。統合失調症及び他の精神障害に対する易罹病性を決定する際に、染色体の微小欠失及び微小複製(コピー数多型又はCNV)の広範囲に及ぶ役割を確認することによって、この考えは近年強まっている(3〜5)。22q11.2微小欠失がある個体は特定の行動障害を有し、注意力指数、ワーキングメモリー及び遂行機能などの海馬及び前頭前皮質の活性と関係がある一定範囲の認知能力の欠陥を示す。微小欠失がある最大三分の一の小児が、思春期又は成人初期に統合失調症又は分裂情動性障害を発症し、散発性統合失調症の症例の1〜2%を占める(2)。この微小欠失によって妨害される遺伝子が、このゲノム不均衡と関係がある精神及び認知に関する表現型の出現にどのように貢献するかを理解することによって、SCZの病因に関する重要な手がかりをもたらす可能性があり、精神障害を引き起こす他のCNVのさらなる分析を手助けすることができる(6、7)。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ニューロン結合を強化するための方法及び組成物に関する。本発明は、少なくとも部分的に、ニューロン間の結合を生み出す構造の形成を阻害する「Mirta22」と呼ばれるタンパク質の発見に基づく。さらに本発明は、短いヘアピンRNAによるMirta22活性の阻害がこれらの構造の回復を可能にしたという発見に、部分的に基づく。Mirta22は、統合失調症と関連付けられている22q11微小欠失に関連する実験において同定された。したがって本発明は、Mirta22活性を阻害する作用物質を投与することを含む、統合失調症の治療方法を提供する。学習及び記憶障害を含めた、ニューロン結合の強化が有益である可能性がある他の障害の治療において、それを使用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ−Ｂ】Df(16)A+/-マウスの作製の図である。(A)ヒト染色体22q11.2領域及び合成マウス領域を示す概略図である。星印はDgcr2とHira、標的欠失の二つの終点を示す。(B)それぞれ5'HPRT及び3'HPRTミニカセットの導入後の、Dgcr2とHiraに関する野生型染色体遺伝子座、及びそれらの対応する標的遺伝子座の図である。(C)in cis loxP部位間のCre誘導型組換えが、マウスにおいて機能性HPRTミニ遺伝子及び1.3Mbの欠失をもたらすことを示す図である。loxP部位を組換えて欠失が生じた後、829-bpのPCR産物を検出することができる。(D)Het欠失マウスのFISH分析の図である。脾臓細胞のメタファーゼ期調製物はHet欠失を実証する。
【図１Ｃ−Ｄ】図１Ａ−Ｂの続きである。
【図２Ａ】Dgcr8欠失マウスにおけるmiRNAの生物学的発生の生成、確認及び分析の図である。(A)Dgcr8遺伝子のゲノム構造及びエクソン8と9の間のイントロン中に位置する遺伝子トラップインサート(図は拡大して描いていない)を示す図である。En2イントロン1:1.5kbのマウスEn2イントロン1;SA:マウスEn2エクソン2のスプライスアクセプター;β-geo:β-ガラクトシダーゼとネオマイシントランスフェラーゼの融合体;pA:SV40ポリアデニル化シグナル。赤い矢印は、遺伝子型決定に使用したPCRプライマーの大まかなゲノム位置を示す。(B)HETDgcr8+/-マウスにおける遺伝子トラップインサートを立証するために設計したPCR遺伝子型決定の図である。(C)Dgcr8+/-マウスにおける野生型4.5kbのDgcr8mRNAのレベルの低下及び予想7.2kbキメラmRNAの生成(矢印)を示す、ノーザンブロット分析の図である。(D)野生型Dgcr8-mRNAのレベルの低下を確認するqRT-PCR分析の図である。(E)120kd野生型Dgcr8タンパク質の減少及び予想約220kDのキメラタンパク質の生成(矢印)を示す、ウエスタンブロット分析の図である。
【図２Ｂ−Ｅ】図２Ａの続きである。
【図３Ａ−Ｄ】mir-185レベルの激烈な低下が、ニューロン結合に影響を与えることを示す図である。(A)アンチセンスmir-185プローブを使用し冠状脳断面においてin situハイブリダイゼーションによって示した、HPC及び皮質におけるmir-185mRNAの発現の図である。アンチセンスU6プローブ及びスクランブルプローブを、それぞれ陽性及び陰性対照として使用した。イメージは4倍(左図)又は10倍(右図)のいずれかの倍率で得た。(B〜D)qRT-PCRによってアッセイした、Df(16)A+/-(突然変異体に関してn=7、野生型同腹子に関してn=9)のHPC(B)又はPFC(C)、及びDgcr8+/-(突然変異体及び野生型同腹子に関してn=10)のHPC(D)におけるmir-185の発現レベルの図である。突然変異体動物における発現レベルをそのそれぞれの野生型同腹子に標準化した。(E)プレ-スクランブル又はプレ-mir-185模倣体でトランスフェクトし可視化のためGFPを増大させたDIV9における、代表的なDf(16)A+/-ニューロンの図である。スケールバー、20μm。(F、G)野生型ニューロンに対するDIV9におけるDf(16)A+/-ニューロン中の一次樹状突起(F)及び分岐点(G)の数の減少は、プレ-スクランブル模倣体(プレ-scr)ではなく、プレ-mir-185のトランスフェクションによって逆行することを示す図である(野生型+プレ-scrに関してn=21、Df(16)A+/-+プレ-scrに関してn=21、Df(16)A+/-+プレ-mir-185に関してn=21)。Df(16)A+/-ニューロンの値は野生型+プレ-scrに標準化した。(H)プレ-スクランブル又はプレ-mir-185模倣体でトランスフェクトしGFPを増大させたDIV19での、Df(16)A+/-ニューロンにおけるスパインの代表的なイメージの図である。スケールバー、5μm。(I)野生型対照ニューロンに対するDIV19Df(16)A+/-ニューロン中の(樹状突起の長さが推定75μmを超える)マッシュルーム型スパインの密度の低下は、Df(16)A+/-ニューロン中への、プレ-スクランブル模倣体ではなく、プレ-mir-185のトランスフェクションによって逆行することを示す図である(野生型+プレ-scrに関してn=23、Df(16)A+/-+プレ-scrに関してn=21、Df(16)A+/-+プレ-mir-185に関してn=23)。Df(16)A+/-ニューロンの値は野生型+プレ-scrに標準化した。(J)プレ-スクランブル対照ではなく、プレ-mir-185のトランスフェクションが、DIV9におけるDf(16)A+/-ニューロンのマッシュルーム型スパインの幅を有意に増大したことを示す図である(P<0.001、コルモゴロフ-スミルノフ検定)(野生型+プレ-scrに関してn=568、Df(16)A+/-+プレ-scrに関してn=339、Df(16)A+/-+プレ-mir-185に関してn=527)。全てのデータに関して、***P<0.001、**P<0.01、*P<0.05(スチューデントのt検定)、エラーバーはs.e.mを示す。
【図３Ｅ−Ｇ】図３Ａ−Ｄの続きである。
【図３Ｈ−Ｊ】図３Ｅ−Ｇの続きである。
【図４Ａ】2310044H10Rik(Mirta22)が、Df(16)A+/-マウスの脳内で強く上方制御されることを示す図である。(A)E16、P6及び成人期でのDf(16)A+/-及び野生型同腹子対照マウスのPFC(上図)又はHPC(下図)における遺伝子発現の変化の図である(各群に関してn=10)。P値及びそれぞれの遺伝子の対応する相対的発現のボルケーノプロット。ライトブルーのドット、Df(16)A欠失内の遺伝子、ライトグリーンのドット、上方制御されたmiRNA含有転写産物、(矢印によって確認される)赤いドットはMirta22を表すプローブセットを示す。(B)E16、P6及び成人期でのDf(16)A+/-及び野生型同腹子マウスのPFC(上図)又はHPC(下図)における有意な上方制御を示す、上位10個のタンパク質コード遺伝子の図である。Mirta22は赤色で強調する(及び「・」で確認する)。(C,D)qRT-PCRによってモニタリングした、Df(16)A+/-及び野生型同腹子マウスのPFC(c)及びHPC(d)における2310044H10Rik(Mirta22)の一時的発現の図である。各群に関してn=9〜10。(E)qRT-PCRによってアッセイした、Df(16)A+/-動物から単離したDIV9海馬ニューロンにおける内生2310044H10Rik(Mirta22)の発現の増大の図である(各遺伝子型に関してn=3)。突然変異体ニューロンにおける発現レベルを野生型ニューロンに標準化した。***P<0.001、**P<0.01、*P<0.05(スチューデントのt検定)、エラーバーはs.e.mを示す。
【図４Ｂ】図４Ａの続きである。
【図４Ｃ−Ｅ】図４Ｂの続きである。
【図５Ａ】miR-185が2310044H10Rik(Mirta22)を直接標的化し抑制することを示す図である。(A)ターゲットスキャン(TargetScan)又はmirDBによって予想したmiRNA結合部位を示す2310044H10Rik(Mirta22)の3'UTRの構造の図である。ラット及びヒトオルソログにおいて高度に保存されたマウス2310044H10Rik(Mirta22)3'UTR中のブロックは、マウス3'UTRの下に示す。USCSブラウザにおける「30-ウエィマルティズアライメント(way multiz alignment)及び保存分析」によって進化的保存も評価し、保存ブロックは緑色のピークによって示す。保存ブロック内に位置するmir-185及びmir-485結合部位は赤色で示す(及び「・」で確認する)。(B〜C)DIV7海馬ニューロンにおける内生2310044H10Rik(Mirta22)のqRT-PCRによる定量化の図である。抗mir-185治療及びプレ-mir-185治療ニューロンにおける発現レベルを、それぞれの対照下での発現レベルに標準化した。(B)DIV5において抗miR-185でトランスフェクトしたニューロン中のMirta22の増大した発現レベルの図である(各治療に関してn=5)。(C)DIV7においてプレ-miR-185模倣体でトランスフェクトしたDIV9海馬ニューロン中のMirta22の低下した発現レベルの図である(各治療に関してn=3)。(D〜E)N18細胞における内生2310044H10Rik(Mirta22)のqRT-PCRによる定量化の図である。プレ-mir-185治療及び抗mir-185治療細胞における発現レベルを、それぞれの対照下での発現レベルに標準化した。(D)プレ-mir-185模倣体でトランスフェクトした細胞中のMirta22の低下した発現レベルの図である(各治療に関してn=3)。(E)抗mir-185LNAオリゴでトランスフェクトした細胞中の、Mirta22の上方制御の図である(各治療に関してn=3)。(F〜H)Mirta22の3'UTRに対するプレ-mir-185、プレ-mir-485及びプレ-mir-491の抑制効果を、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイによって調べたことを示す図である。野生型又は突然変異体2310044H10Rik(Mirta22)3'UTRの一つのいずれかの制御下でレニラルシフェラーゼ遺伝子を含有するpsiCHECK2プラスミドを、N18神経芽腫細胞株にプレ-miRNA又はプレ-スクランブル模倣体と共にコトランスフェクトした(各条件に関してn=3)。同じプラスミドから発現されたホタルルシフェラーゼは、内部対照として使用した。値はホタルルシフェラーゼレベルに対するレニラルシフェラーゼレベルであり、プレ-スクランブル治療下での相対的発現レベル(F、H)又は3'UTRを含まないプラスミドからの相対的発現レベル(G)に標準化する。プレ-mir-185は、10nM〜0.01nMの濃度範囲にわたり2310044H10Rik(Mirta22)3'UTRレポーター発現を有意に低下させる(F)。2310044H10Rik(Mirta22)3'UTRレポーター発現に対するプレ-mir-185仲介の抑制は保存型miRNA結合部位に依存する(G)。部位1(Mut1)又は部位2(Mut2)又は両部位(Mut1及び2)に突然変異を有する2310044H10Rik(Mirta22)3'UTRルシフェラーゼレポーターを分析した。突然変異2310044H10Rik(Mirta22)3'UTRレポーターは、野生型Mirta22の3'UTRレポーターより有意に高いルシフェラーゼ活性を発現する。プレ-mir-485及びプレ-mir-491は、2310044H10Rik(Mirta22)3'UTRレポーター発現を有意に低下させる(H)。全てのデータに関して、***P<0.001、**P<0.01、*P<0.05(スチューデントのt検定)、エラーバーはs.e.mを示す。
【図５Ｂ−Ｅ】図５Ａの続きである。
【図５Ｆ−Ｈ】図５Ｂ−Ｅの続きである。
【図６Ａ】2310044H10Rik(Mirta22)のゲノム構造、ニューロン発現及び亜細胞局在の図である。(A)上部、2310044H10Rik(Mirta22)のmRNA転写産物及びそのヒトオルソログ、C19orf63の構造の図である。参照配列は、7エクソン(青い長方形)を含む2310044H10Rik(Mirta22)転写産物を報告し、これはシグナルペプチド及び膜貫通型ドメイン(赤い長方形)をコードすると予想される。ポリクローナル抗体を作製するために使用したペプチドエピトープは緑の長方形によって示す。C19orf63に関して、参照配列は二つの可変スプライシング転写産物、予想膜貫通型タンパク質をコードする一つ、及び予想分泌タンパク質をコードする別のエクソンを含む一つを報告する。底部、2310044H10Rik(Mirta22)によってコードされる予想膜貫通型アイソフォームのタンパク質配列アライメント及びそのヒトオルソログの図である。黒いブロックは完全に保存された残基を示し、灰色のブロックは(ボックスシェイド(Boxshade)のデフォルト類似性によって定義される)類似の残基を示し、白いブロックは異なる残基を示す。(B)上部、Df(16)A+/-動物及び野生型同腹子から調製したPFC溶解物における、2310044H10Rik(Mirta22)の代表的なウエスタンブロットアッセイの図である。α-チューブリンを充填対照として使用する。底部、野生型及びDf(16)A+/-動物のPFCにおける2310044H10Rik(Mirta22)タンパク質レベルの定量化の図である(各遺伝子型に関してn=9)。突然変異体マウスにおける発現レベルを野生型同腹子に標準化した。結果は平均±SEMとして表す。**p<0.01(スチューデントのt検定)。(C)野生型及びDf(16)A+/-培養ニューロンにおける2310044H10Rik(Mirta22)免疫細胞化学的シグナルの定量化の図である(野生型に関してn=34、Df(16)A+/-に関してn=31)。突然変異体ニューロンにおける発現レベルを野生型ニューロンに標準化した。結果は平均±SEMとして表す。*p<0.05(スチューデントのt検定)。(D)上図、2310044H10Rik(Mirta22)が、DIV20で培養海馬ニューロンにおいて、グリア特異的マーカーGFAPではなくニューロン特異的マーカーNeuNと同時局在することを示す図である。下図、2310044H10Rik(Mirta22)(緑色)が、体中でゴルジ特異的マーカーGM130(赤色)と同時局在することを示す図である。2310044H10Rik(Mirta22)は、樹状突起マーカーMAP2(青色)によって強調される樹状突起中の、小胞及び管状クラスターにおいても見られる。
【図６Ｂ−Ｃ】図６Ａの続きである。
【図６Ｄ】図６Ｂ−Ｃの続きである。
【図７Ａ−Ｃ】2310044H10Rik(Mirta22)のレベルの上昇が、Df(16)A+/-ニューロンの構造変化に貢献することを示す図である。(A)完全長Mirta22cDNAプラスミドでトランスフェクトしたDIV12海馬培養ニューロンにおいて、Mirta22のmRNAが有意に増大したことを示すqRT-PCRの結果の図である。(B)右、Mirta22のcDNA(レーン2)又は空ベクター(レーン1)でトランスフェクトしたDIV12海馬ニューロンにおける内生Mirta22タンパク質の減少を示す、代表的なウエスタンブロットの図である。α-チューブリンは充填対照である。左、空ベクターでトランスフェクトした細胞と比較した、Mirta22のcDNAでトランスフェクトした細胞におけるMirta22シグナルの58%の増大を示す、ウエスタンブロットの定量化の図である(p<10-4、各条件に関してn=4)。(C〜D)DIV7での野生型ニューロンへの2310044H10Rik(Mirta22)発現構築物のトランスフェクションは、DIV9において一次樹状突起(C)及び分岐点(D)の数の減少をもたらすことを示す図である(空ベクタートランスフェクト細胞に関してn=24、及びMirta22トランスフェクト細胞に関してn=27)。(D)中では、Mirta22過剰発現ニューロンの値は空ベクタートランスフェクトニューロンに標準化した。(E〜F)DIV17での野生型ニューロンへの2310044H10Rik(Mirta22)の導入は、DIV19でのマッシュルーム型スパインの密度(E)及びこれらのスパインの幅(F)の低下をもたらすことを示す図である(P<0.01、コルモゴロフ-スミルノフ検定)[ベクタートランスフェクトニューロンに関してn=16、及びMirta22トランスフェクトニューロンに関してn=17(E)、ベクタートランスフェクトニューロンにおけるスパインに関してn=278、及びMirta22トランスフェクトニューロンにおけるスパインに関してn=231(F)]。Mirta22過剰発現ニューロンの値は空ベクタートランスフェクトニューロンに標準化した。(G)Mirta22shRNAでトランスフェクトしたDIV12海馬培養ニューロンにおいて、内生Mirta22のmRNAが有意に減少したことを示すqRT-PCRの結果の図である。(H)右、Mirta22shRNA(レーン2)又はスクランブルshRNA(レーン1)でトランスフェクトしたDIV12海馬ニューロンにおける内生Mirta22タンパク質の減少を示す、代表的なウエスタンブロットの図である。α-チューブリンは充填対照である。左、スクランブルshRNAでトランスフェクトした細胞と比較した、Mirta22shRNAでトランスフェクトした細胞におけるMirta22レベルの48%の減少を示す、ウエスタンブロットの定量化の図である(p<0.01、各条件に関してn=4)。(I〜J)野生型ニューロンに対するDIV9におけるDf(16)A+/-ニューロン中の、分岐点の数の減少(J)ではなく一次樹状突起の数の減少(I)が、2310044H10Rik(Mirta22)shRNA+/-を発現する構築物のトランスフェクションによって逆行することを示す図である(野生型+scrshRNAに関してn=24、Df(16)A+/-+scrshRNAに関してn=21、Df(16)A+/-+Mirta22shRNAに関してn=25)。ScrshRNA:スクランブルshRNA。N.S.:有意性なし。(J)中では、Df(16)A+/-ニューロンの値を野生型+scrshRNAに標準化した。(K)野生型ニューロンに対するDIV19におけるDf(16)A+/-ニューロン中の(樹状突起の長さが推定75μmを超える)マッシュルーム型スパインの密度の低下は、スクランブルshRNA+/-ではなくMirta22shRNAの導入によって逆行することを示す図である(野生型+scrshRNAに関してn=22、Df(16)A+/-+scrshRNAに関してn=24、Df(16)A+/-+Mirta22shRNAに関してn=15)。Df(16)A+/-ニューロンの値を野生型+scrshRNAに標準化した。(L)Mirta22shRNAのトランスフェクションは、DIV19におけるDf(16)A+/-ニューロンのマッシュルーム型スパインの幅に影響を与えないことを示す図である(p>0.05、コルモゴロフ-スミルノフ検定)。野生型+プレ-scrに関してn=342、Df(16)A+/-+プレ-scrに関してn=289、Df(16)A+/-+プレ-miR-185に関してn=177。(A〜E、G〜K)結果は平均±SEMとして表す。*p<0.05、**p<0.01(スチューデントのt検定)。
【図７Ｄ−Ｆ】図７Ａ−Ｃの続きである。
【図７Ｇ−Ｉ】図７Ｄ−Ｆの続きである。
【図７Ｊ−Ｌ】図７Ｇ−Ｉの続きである。
【図８】脳の発達中のDf(16)A+/-マウスにおけるDgcr8レベルの図である。(A、B)qRT-PCRによってアッセイした、E17(a)及びP6(b)Df(16)A+/-マウス(n=10)並びにそのそれぞれの野生型同腹子対照(n=10)のHPCにおけるDgcr8の発現レベルの図である。突然変異体動物における発現レベルをそのそれぞれの野生型同腹子に標準化した。***P<0.001、**P<0.01(スチューデントのt検定)、エラーバーはs.e.mを示す。
【図９】脳の発達中のDf(16)A+/-マウスにおけるmir-185レベルの図である。(A、B)qRT-PCRによってアッセイした、E17(a)及びP6(b)Df(16)A+/-マウス(HPC又はPFCに関してn=10)並びにそのそれぞれの野生型同腹子対照マウス(HPC又はPFCに関してn=10)のHPC及びPFCにおけるmir-185の発現レベルの図である。突然変異体動物における発現レベルをそのそれぞれの野生型同腹子に標準化した。***P<0.001、**P<0.01(スチューデントのt検定)、エラーバーはs.e.mを示す。
【図１０】Dgcr8+/-マウスの脳内の2310044H10Rik(Mirta22)の発現の図である。qRT-PCRによってアッセイした、成体Dgcr8+/-マウス(HPCに関してn=7、PFCに関してn=10)並びにそのそれぞれの野生型同腹子対照(HPCに関してn=8、PFCに関してn=10)のHPC及びPFCにおける発現レベル。突然変異体動物における発現レベルをそのそれぞれの野生型同腹子に標準化した。*P<0.05(スチューデントのt検定)、エラーバーはs.e.mを示す。
【図１１】Df(16)A+/-マウスにおいてmir-485及びmir-491レベルが低下することを示す図である。(A、B)qRT-PCRによってアッセイした、成体Df(16)A+/-マウス(n=7)並びにそのそれぞれの野生型同腹子対照マウス(n=9)のHPCにおけるmir-485(a)及びmir-491(b)の発現レベル。突然変異体動物における発現レベルをそのそれぞれの野生型同腹子に標準化した。**P<0.01、*P<0.05(スチューデントのt検定)、エラーバーはs.e.mを示す。
【図１２】qRT-PCRによってアッセイした、成体Df(16)A+/-マウス(n=10)並びにそのそれぞれの野生型同腹子マウス(n=10)のHPCにおける、TargetScanとmiRandaの両方によって予想した推定miR-185標的のサンプル(Nptx2、Coro2b、Epb4.1l1、Lpcat3、Gsk3b、Slc6a1、Grin2b及びVipr2)の発現レベルの図である。突然変異体動物における発現レベルをそのそれぞれの野生型同腹子に標準化した。試験した全ての遺伝子に関して、突然変異体動物において発現レベルが著しく変わることはなかった。突然変異体動物における発現レベルをそのそれぞれの野生型同腹子に標準化した。結果は平均±SEMとして表す。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001(スチューデントのt検定)。
【図１３Ａ−Ｂ】2310044H10Rik(Mirta22)抗体の特異性の図である。(A)抗2310044H10Rik(抗Mirta22)抗体、並びにポリクローナル及びモノクローナル抗FLAG抗体は、ウエスタンブロット中で、C末端FLAGタグを有する(「Flagタグ」レーン)完全長2310044H10Rik(Mirta22)cDNAを発現するプラスミドでトランスフェクトした293T細胞の溶解物において、28kDバンドを認識することを示す図である。空ベクターでトランスフェクトした細胞の溶解物は対照として使用した(「対照」レーン)。対照溶解物中に、抗FLAG抗体によってではなく抗2310044H10Rik抗体によって認識された28kDバンドが存在することに留意されたい。これはおそらく、内生ヒト2310044H10Rik(Mirta22)オルソログタンパク質(C19orf63)を表す。(B)上図、スクランブルshRNAトランスフェクト細胞(レーン1)と比較した、2310044H10Rik(Mirta22)shRNAでトランスフェクトしたN18細胞(レーン2)中の内生2310044H10Rik(Mirta22)タンパク質の減少を示す、代表的なウエスタンブロットの図である。α-チューブリンは充填対照である。下図、スクランブルshRNAトランスフェクト細胞と比較した、2310044H10Rik(Mirta22)shRNAトランスフェクト細胞における2310044H10Rik(Mirta22)シグナルの32%の減少を示す、ウエスタンブロットの定量化の図である(p<0.01、各条件に関してn=6)。2310044H10Rik(Mirta22)shRNA操作ニューロン中の発現レベルはそのそれぞれの対照に標準化した。(C)上図、空ベクターでトランスフェクトした細胞(レーン1)と比較した、2310044H10Rik(Mirta22)cDNAでトランスフェクトしたN18細胞(レーン2)における2310044H10Rik(Mirta22)タンパク質レベルの予想された増大を示す、代表的なウエスタンブロットの図である。α-チューブリンは充填対照である。下図、空ベクターでトランスフェクトした細胞と比較した、2310044H10Rik(Mirta22)cDNAトランスフェクト細胞における2310044H10Rik(Mirta22)シグナルの57%の増大を示す、ウエスタンブロットの定量化の図である(p<0.05、各条件に関してn=6)。2310044H10Rik(Mirta22)cDNA操作ニューロン中の発現レベルはそのそれぞれの対照に標準化した。(D)免疫細胞化学によりアッセイした、免疫前血清ではなく抗2310044H10Rik(抗Mirta22)抗血清が、DIV20野生型海馬ニューロンにおいて内生Mirta22タンパク質(緑色シグナル)を認識することを示す図である。(E)ゴルジマーカーGM130(青色)と比較して2310044H10Rik(Mirta22)シグナル(緑色)が、スクランブルshRNAトランスフェクト(RFP+)ニューロン中(上図)ではなく、2310044H10Rik(Mirta22)shRNAトランスフェクト(RFP+)DIV14野生型海馬ニューロン(下図)中で大幅に低減することを示す、代表的な免疫細胞化学的イメージの図である。2310044H10Rik(Mirta22)shRNA治療培養物(下図)において、(白い矢印によって示す)非トランスフェクトニューロン中の2310044H10Rik(Mirta22)シグナル(緑色)は、(上図中に示す)スクランブルshRNAトランスフェクト(RFP+)ニューロンと比較して低減しないことに留意されたい。トランスフェクションはDIV12で実施し、ニューロンは固定し2日後に免疫染色した。(F)(E)中に示したMirta22の免疫細胞化学的シグナルの定量化の図である。2310044H10Rik(Mirta22)shRNA治療ニューロン培養物では、非トランスフェクトニューロン中(RFP-、n=20)と比較して、トランスフェクトニューロン(RFP+、n=20)中において2310044H10Rik(Mirta22)シグナルの64%の減少があることに留意されたい(p<0.001)。スクランブルshRNA治療培養物では、トランスフェクトニューロン(RFP+、n=10)と非トランスフェク��ニューロン(RFP-、n=10)の間で2310044H10Rik(Mirta22)シグナルの差はない。スクランブルshRNA治療培養物中のトランスフェクト(RFP+)ニューロン及び非トランスフェクト(RFP-)ニューロン、並びに2310044H10Rik(Mirta22)shRNAトランスフェクトニューロン(RFP+)におけるMirta22シグナル測定値は、2310044H10Rik(Mirta22)shRNA治療培養物中の非トランスフェクトニューロン(RFP-)に標準化した。(G)免疫前血清ではなく抗Mirta22抗体血清が、海馬タンパク質抽出物のウエスタンブロットアッセイにおいて、内生Mirta22タンパク質を認識することを示す図である。二匹の動物からの代表的なウエスタンブロットイメージを、それぞれの場合において示す。結果は平均±SEMとして表す。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001(スチューデントのt検定)。
【図１３Ｃ−Ｄ】図１３Ａ−Ｂの続きである。
【図１３Ｅ】図１３Ｃ−Ｄの続きである。
【図１３Ｆ−Ｇ】図１３Ｅの続きである。
【図１４】成体脳内の2310044H10Rik(Mirta22)の分布の図である。(A〜C)抗Mirta22抗体を使用し脳切片において、免疫組織化学によりアッセイしたMirta22の分布の図である。イメージはそれぞれ4倍(A)、10倍(B)及び20倍(C)の倍率で得た。4倍及び10倍イメージ中の赤いボックスは、それぞれ10倍及び20倍イメージ中に示す領域を略述する。皮質及び海馬を含めた脳内の、Mirta22免疫反応性の広範囲における分布に留意されたい。突起を有する皮質ニューロンは20倍イメージで明らかに見ることができる(C)。
【図１５】2310044H10Rik(Mirta22)レベルの両方向操作の図である。(A)qRT-PCRによってアッセイした、Mirta22shRNA又はスクランブルshRNAを発現するプラスミドでトランスフェクトしたN18細胞、マウス神経芽腫細胞株におけるMirta22の発現レベルの図である(各治療に関してn=3)。Mirta22shRNA治療細胞における発現レベルはスクランブルshRNA治療細胞に標準化した。(B)qRT-PCRによってアッセイした、Mirta22cDNAを発現するプラスミド又は空ベクターでトランスフェクトしたN18細胞におけるMirta22の発現レベルの図である(各治療に関してn=3)。Mirta22cDNA治療細胞における発現レベルはベクター治療細胞に標準化した。*P<0.05(スチューデントのt検定)、エラーバーはs.e.mを示す。
【図１６Ａ】MirtaコードcDNAの図である。(A)ヒトアイソフォーム1、Genbank受託番号NM_175063(配列番号3)、(B)ヒトアイソフォーム2、Genbank受託番号NM_175063(配列番号5);(C)マウスmirtaコードcDNA、GenBank受託番号NM_197991(配列番号19)。
【図１６Ｂ】図１６Ａの続きである。
【図１６Ｃ】図１６Ｂの続きである。
【図１７Ａ−Ｃ】(A)抗miR対照又は抗miR-185オリゴでトランスフェクトし樹状突起とスパインの可視化を容易にするためGFPを増大させたDIV9における、野生型ニューロンの代表的なイメージの図である。(B〜C)抗miR対照でトランスフェクトした野生型ニューロンに対する、抗miR-185によるトランスフェクション後2日での、DIV9における野生型ニューロン中の一次樹状突起(B)及び分岐点(C)の数の減少を示す図である(野生型+抗miR-185に関してn=21、野生型+抗miR対照に関してn=20)。(C)では、野生型+抗miR-185の値を野生型+抗miR対照に標準化した。(D)抗miR対照又は抗miR-185でトランスフェクトしGFPを増大させたDIV9での野生型ニューロンにおける、スパインの代表的なイメージの図である。(E)抗miR対照でトランスフェクトしたニューロンに対する、抗miR-185でトランスフェクトしたニューロン中の、(75μmを超える樹状突起長を定量化した)マッシュルーム型スパインの密度の低下の図である(野生型+抗miR-185に関してn=20、野生型+抗miR対照に関してn=20)。野生型+抗miR-185の値を野生型+抗miR対照に標準化した。(F)抗miR-185オリゴのトランスフェクションが、DIV19において抗miR対照でトランスフェクトしたニューロンのそれと比較して、マッシュルーム型スパインの幅を有意に増大したことを示す図である(15%、P<0.001、コルモゴロフ-スミルノフ検定)(野生型+抗miR-185に関してn=232、野生型+抗miR対照に関してn=293)。(B、C、E)結果は平均±SEMとして表す。*p<0.05、**p<0.01(スチューデントのt検定)。
【図１７Ｄ−Ｆ】図１７Ａ−Ｃの続きである。
【図１８Ａ−Ｂ】miR-185レベルが、樹状突起及びスパインの発達に影響を与えることを示す図である。(A)体周辺で10μmの同心円を使用した、樹状突起の複雑性のSholl分析の図である。DIV7において抗miR-185(n=21)又は抗miR対照(n=20)のいずれかでトランスフェクトしDIV9で固定した野生型ニューロン。分岐の増大は最も近い樹状突起に隣接して主に見られる。(B)抗mir対照でトランスフェクトしたニューロンと比較した、抗mir-185でトランスフェクトした培養野生型海馬ニューロンにおける(体から75μmを超えて樹状突起長を定量化した以外のマッシュルーム型スパインの)スパイン型態型、及び全突起の分布の図である(野生型+抗mir対照に関してn=20、野生型+抗mir-185に関してn=20)。(C)プレ-スクランブル模倣体(pre-scr)でトランスフェクトした野生型ニューロンに対する、(トランスフェクション後2日での)プレ-mir-185でトランスフェクトしたDIV9の野生型ニューロンにおける一次樹状突起及び分岐点の数の増大を示す図である(野生型+プレ-mir-185に関してn=21、野生型+プレ-scrに関してn=20)。分岐点の数に関して、野生型+プレ-mir-185の値を野生型+プレ-scrに標準化した。(D)左、プレ-scrでトランスフェクトした野生型ニューロンに対する、プレ-mir-185でトランスフェクトしたDIV19野生型ニューロン中の、(75μmを超える樹状突起長を定量化した)マッシュルーム型スパインの密度の増大の図である(野生型+プレ-scrに関してn=23、野生型+プレ-mir-185に関してn=23)。プレ-mir-185でトランスフェクトした野生型ニューロンの値をプレ-scrで野生型に標準化した。右、プレ-スクランブル対照ではなくプレ-mir-185模倣体のトランスフェクションが、DIV19における野生型ニューロンでマッシュルーム型スパインの幅を有意に増大したことを示す図である(18%、P<0.001、コルモゴロフ-スミルノフ検定)(野生型+プレ-scrに関してn=568、野生型+プレ-mir-185に関してn=527)。(E)体周辺で10μmの同心円を使用した、樹状突起の複雑性のSholl分析の図である。DIV7においてプレ-miR-185模倣体(n=21)又はプレ-スクランブル模倣体(n=21)のいずれかでトランスフェクトしDIV9で固定したDf(16)A+/-ニューロン。Df(16)A+/-ニューロンの分岐の減少は、樹状突起樹全体でプレ-miR-185模倣体によって逆行するが、それは最も近い樹状突起に隣接してより顕著である。(F)プレ-スクランブル模倣体でトランスフェクトした野生型ニューロンと比較した、プレ-mir-185又はプレ-スクランブル模倣体でトランスフェクトした培養DIV19Df(16)A+/-海馬ニューロンにおける(体から75μmを超えて樹状突起長を定量化した以外のマッシュルーム型スパインの)スパイン型態型、及び全突起の分布の図である(野生型+プレ-scrに関してn=23、Df(16)A+/-+プレ-scrに関してn=21、Df(16)A+/-+プレ-mir-185に関してn=23)。結果は平均±SEMとして表す。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001(スチューデントのt検定)。
【図１８Ｃ−Ｄ】図１８Ａ−Ｂの続きである。
【図１８Ｅ−Ｆ】図１８Ｃ−Ｄの続きである。
【図１９Ａ】Df(16)B及びDp(16)Bの作製の図である。(A)それぞれ5'HPRT及び3'HPRTミニカセットの導入後の、Dgcr14とHira遺伝子座、及びそれらの対応する標的遺伝子座の図である。(B)Creリコンビナーゼへの露出によって、トランス配向で位置する修飾遺伝子座のLoxP部位間の組換えが、Dgcr14とHiraの間の欠失の発生、及び領域の複製をもたらしたことを示す図である。(C)プローブA及びBを使用した2ES細胞クローンのサザンブロットの図である(図B中に示すプローブの位置、及びKpnIを用いた消化による予想サイズ。E5とE8には、(22.9kbのバンドによって示す)欠失と(16.6kbのバンドによって示す)複製の両方がある)。Wtは野生型ES細胞由来のDNAを含むレーンを示す。Mはマーカーレーン、BstEII切断λDNAを示す。(D)FISHによる立証の図である。上図、複製があるMEFのメタファーゼ期染色体の広がりの図である。わずかに鮮やかな赤いシグナル(矢印)は複製領域を示す。中図、複製の中間期のFISHの図である。複製は第三の別の赤いシグナルによって実証される。下図、欠失があるMEFのメタファーゼ期染色体の広がりの図である。赤いシグナルは欠失領域を示し、緑色のシグナルは、欠失領域の外側に位置する対照プローブからのものである。MEF:マウス胚性線維芽細胞。FISH:蛍光in situハイブリダイゼーション。RP23-420H6:欠失及び複製領域内に位置するマウスBACプローブ。RP23-290E4:欠失及び複製領域外に位置するマウスBACプローブ。
【図１９Ｂ】図１９Ａの続きである。
【図１９Ｃ−Ｄ】図１９Ｂの続きである。
【図２０】PFCとHPCの両方で相互的に著しく誤制御された22q11.2合成領域外の転写産物の一覧の図である。
【図２１】図4と関係があるルシフェラーゼ活性に対するmir-185、mir-485及びmir-491の影響の三因子ANOVAの図である。
【図２２】プレ-miR-185模倣体又はプレ-スクランブル(pre-scr)オリゴでトランスフェクトした293T細胞の図である。C19orf63、2310044H10Rik(Mirta22)のヒトオルソログの発現レベルをqRT-PCRによってアッセイした。プレ-miR-185(n=3)でトランスフェクトした細胞中のC19orf63の発現レベルはプレ-scr対照(n=3)に標準化した。
【図２３Ａ−１】Df(16)A+/-マウスにおけるゴルジ関連推定mir-185標的の調節した軽度の異常制御の図である。(A)TargetScan Mouse v5.2によりmiR-185標的であると予想した2708の遺伝子をDAVIDバイオインフォマティクスリソース6.7(http://david.abcc.ncifcrf.gov)にインポートしたが、2695遺伝子が対応するDAVIDのIDを有する。バックグラウンドを同定したGene Ontology(細胞要素)としてムス・ムスクルス(Mus musculus)遺伝子、最も濃縮された遺伝子クラスター(遺伝子数=159、濃縮スコア=8.56、FDR補正P=2×10-9)として項目「ゴルジ装置」、及びFDR補正P=4×10-3で第二のベストヒットとして項目「ゴルジ装置部分」を使用した機能の注釈分析(左)。同じ遺伝子の一覧は遺伝子セット濃縮分析(GSEA v2.0)にもインポートした。Gene Ontology(細胞要素)、項目「ゴルジ装置部分」(NES=1.35、P=0.1)及び「ゴルジ装置」(NES=1.3、P=0.1)は再度上位濃縮遺伝子セット中に存在した(右)。(B)ゴルジ装置関連機能(GO項目)を果たし成体Df(16)A+/-マウスのHPCと野生型同腹子の間で示差的に発現される(p<0.005)潜在的miR-185標的の、発現ヒートマッププロットの図である。IDはAffymetrixのIDであり(図28参照)、ランクは有意性レベルに従う示差的に発現された全遺伝子の一覧中のランキング位置である。大部分(91%、46中42の)遺伝子が上方制御されることに留意されたい。
【図２３Ａ−２−３】図２３Ａ−１の続きである。
【図２３Ｂ】図２３Ａ−２−３の続きである。
【図２４】miR-185の減少が、図5と関係があるゴルジ関連遺伝子の調節された軽度の年齢特異的異常制御をもたらすことを示す図である。Df(16)A+/-マウス及び野生型同腹子のE17(左図)、P6(中図)及び成体(右図)HPCにおける、ゴルジ装置関連機能(GO項目)を有する全ての潜在的miR-185標的の発現ヒートマッププロット。
【図２５】22q11.2微小欠失、miRNA異常制御、2310044H10Rik(Mirta22)及びニューロン成熟の間で示された関係を略述する概略図である。正常な生後の発育中、その生物学的発生がDgcr8によって制御される(mir-485及びmir-491などの)他のmiRNAと一緒にmir-185がMirta22レベルを抑制し、樹状突起及びスパインの発達を促進する。22q11.2微小欠失担体では、Dgcr8のヘミ接合性が原因であるmiRNAの生物学的発生の欠陥、及びmir-185レベルの激烈な低下はMirta22レベルの長期の上昇をもたらし、したがってそれは樹状突起及びスパインの成長を妨害し、神経回路の形成及び維持に影響を与える可能性がある。
【図２６Ａ−Ｂ】2310044H10Rik(Mirta22)レベルが、図7と関係がある樹状突起及びスパインの発達に影響を与えることを示す図である。(A)(体周辺で10μmの同心円を使用した)、完全長2310044H10Rik(Mirta22)(n=25)があるか又は挿入がない(n=24)プラスミドでDIV7においてトランスフェクトしDIV9で固定した野生型ニューロンの、樹状突起の複雑性のSholl分析の図である。完全長2310044H10Rik(Mirta22)でトランスフェクトした野生型ニューロンにおける分岐の増大は、樹状突起樹全体で主に見られる。(B)(体周辺で10μmの同心円を使用した)、DIV7において2310044H10Rik(Mirta22)shRNA(n=29)又はスクランブルshRNA(n=26)のいずれかでトランスフェクトしDIV9で固定したDf(16)A+/-ニューロンの、樹状突起の複雑性のSholl分析の図である。Df(16)A+/-ニューロンにおける分岐の減少は、特に最も近い樹状突起に隣接して、2310044H10Rik(Mirta22)shRNAによって部分的に逆行する。(C)野生型ニューロンに対するDIV9におけるDf(16)A+/-ニューロン中の一次樹状突起の数の減少は、独立した2310044H10Rik(Mirta22)shRNAを発現する構築物のトランスフェクションによって逆行することを示す図である(野生型+scrshRNAに関してn=16、Df(16)A+/-+scrshRNAに関してn=16、Df(16)A+/-+Mirta22shRNAに関してn=16)。ScrshRNA:スクランブルshRNA。(D)Df(16)A+/-ニューロン中の分岐の減少は、特に最も近い樹状突起に隣接して、2310044H10Rik(Mirta22)shRNAによって部分的に逆行することを示すSholl分析の図である。(E)野生型ニューロンに対するDIV19におけるDf(16)A+/-ニューロン中の(樹状突起の長さが推定75μmを超える)マッシュルーム型スパインの密度の低下は、スクランブルshRNAではなく、2310044H10Rik(Mirta22)shRNAの導入によって逆行することを示す図である(野生型+scrshRNAに関してn=12、Df(16)A+/-+scrshRNAに関してn=12、Df(16)A+/-+Mirta22shRNAに関してn=12)。Df(16)A+/-ニューロンの値を野生型+scrshRNAに標準化した。結果は平均±SEMとして表す。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001(スチューデントのt検定)。
【図２６Ｃ−Ｅ】図２６Ａ−Ｂの続きである。
【図２７−１】図4と関係がある相互的に異常制御された22q11.2合成領域外の転写産物の一覧の図である。
【図２７−２】図２７−１の続きである。
【図２７−３】図２７−２の続きである。
【図２８−１】図23と関係があるゴルジ関連機能を有する予想mir-185標的の遺伝子発現プロファイルの図である。
【図２８−２】図２８−１の続きである。
【図２８−３】図２８−２の続きである。
【図２８−４】図２８−３の続きである。
【図２８−５】図２８−４の続きである。
【図２８−６】図２８−５の続きである。
【図２８−７】図２８−６の続きである。
【図２８−８】図２８−７の続きである。
【図２８−９】図２８−８の続きである。
【図２８−１０】図２８−９の続きである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下の実施例中で論じるように、22q11.2ヘミ接合体微小欠失の結果は、マイクロRNA、mir-185の発現に関するヘテロ接合性であることを発見した。ヘテロ接合性の結果として生じるmir-185のレベルの低下がMirta22の過剰発現をもたらしたこと、及びMirta22の過剰発現は、一次樹状突起の数の減少、スパインの密度の低下、及びわずかではあるが有意なマッシュルーム型スパイン幅の低下を含めたニューロン形態の変化と関連があり、したがってこれらは全てニューロン結合の低下と関連があることをさらに発見した。本発明によれば、Mirta22の活性を低下させること及び/又はmir-185の活性を増大させることによって、ニューロン結合を増大させることができる。さらに、mir-485とmir-491の両方がMirta22に隣接した結合部位をさらに有するので、本発明は、mir-485及び/又はmir-491の活性を増大させることによってニューロン結合の増大をさらにもたらす。
【０００８】
説明を明解にするため、且つ非制限的に、本発明の詳細な説明を以下の小区分に分ける。
【０００９】
(i)mir-185、mir-485及びmir-491、
(ii)Mirta22、並びに
(iii)治療方法。
【００１０】
5.1 MIR-185、MIR-485及びMIR-491
本発明は、mir-185、mir-485及びmir-491核酸分子を提供する。これらの核酸分子はデオキシリボヌクレオチド及び/又はリボヌクレオチドで構成されてもよく、非天然ヌクレオチド、例えばホスホロチオエート残基を場合によっては含み、安定性を促進することができる。非制限的実施形態では、mir-185、mir-485又はmir-491核酸分子は約15と100の間、若しくは約15と80の間、若しくは約15と70の間、若しくは約15と60の間、若しくは約15と50の間、若しくは約15と40の間、若しくは約15と30の間のヌクレオチド長、又は約22と100の間、若しくは約22と80の間、若しくは約22と70の間、若しくは約22と60の間、若しくは約22と50の間、若しくは約22と40の間、若しくは約22と30の間のヌクレオチド長である。
【００１１】
特定の非制限的実施形態において、本発明は、非制限的な例としてmir-185RNA分子及びその前駆体を含めた、マウスmir-185核酸分子を提供する。特定の非制限的実施形態において、本発明はマウスmir-185核酸分子を提供する。このような分子は、配列、GenBank受託番号NM_029571:agggattggagagaaaggcagttcctgatggtcccctcccagg ggctggctttcctctggtcctt(配列番号6)、又はそれと少なくとも95パーセント相同である配列、又はそれと少なくとも99パーセント相同である配列を含むことができる(本明細書で使用するこの用語、相同性は、BLAST又はFASTAなどの標準ソフトウェアを使用して測定することができる)。関連する非制限的実施形態では、配列番号6中のチミジンの幾つか又は全てをウリジンで置換することができる。例えば、マウスmir-185核酸は配列agggauuggagagaaaggcaguuccugaugguccccucccaggggcuggcuuuccucugguccuu(配列番号7)を含むことができ、又は部分列(miRBase受託番号MIMAT0000214)uggagagaaaggcaguuccuga(配列番号8)を含むことができる。さらなる実施形態では、マウスmir-185核酸は、配列番号6又は配列番号7又は配列番号8の15〜21ヌクレオチド断片を含むことができる。
【００１２】
特定の非制限的実施形態において、本発明は、非制限的な例としてmir-185RNA分子及びその前駆体を含めた、ヒトmir-185核酸分子を提供する。特定の非制限的実施形態において、本発明はヒトmir-185核酸分子を提供する。このような分子は、配列、GenBank受託番号NM_029706:agggggcgagggattggagagaaaggcagttcctgatggtcccctcccca ggggctggctttcctctggtccttccctccca(配列番号9)、又はそれと少なくとも95パーセント相同である配列、又はそれと少なくとも99パーセント相同である配列を含むことができる。関連する非制限的実施形態では、配列番号9中のチミジンの幾つか又は全てをウリジンで置換することができる。例えば、ヒトmir-185核酸は配列agggggcgagggauuggagagaaaggcaguuccugaugguccccuccccaggggcuggcuuuccucugguccuucccuccca(配列番号10)又は配列uggagagaaaggcaguuccuga(配列番号8)を含むことができる。さらなる実施形態では、ヒトmir-185核酸は、配列番号8又は配列番号9又は配列番号10の15〜21ヌクレオチド断片を含むことができる。
【００１３】
特定の非制限的実施形態において、本発明は、非制限的な例としてmir-485RNA分子及びその前駆体を含めた、マウスmir-485核酸分子を提供する。特定の非制限的実施形態において、本発明はマウスmir-485核酸分子を提供する。このような分子は、配列、MiRBase受託番号MI0003492:ACUUGGAGAGAGGCUGGCCGUGAUGAAUUCGAUUCAUCUAAACGAGUCAUACACGGCUCUCCUCUCUUCUAGU(配列番号11)又はMiRBase受託番号MIMAT0003128:AGAGGCUGGCCGUGAUGAAUUC(配列番号12)、又はそれと少なくとも95パーセント相同である配列、又はそれと少なくとも99パーセント相同である配列を含むことができる(本明細書で使用するこの用語、相同性は、BLAST又はFASTAなどの標準ソフトウェアを使用して測定することができる)。さらなる実施形態では、マウスmir-485核酸は、配列番号11又は配列番号12の15〜21ヌクレオチド断片を含むことができる。
【００１４】
特定の非制限的実施形態において、本発明は、非制限的な例としてmir-485RNA分子及びその前駆体を含めた、ヒトmir-485核酸分子を提供する。特定の非制限的実施形態において、本発明はヒトmir-485核酸分子を提供する。このような分子は、配列、MiRBase受託番号MI0002469:ACUUGGAGAGAGGCUGGCCGUGAUGAAUUCGAUUCAUCAAAGCGAGUCAUACACGGCUCUCCUCUCUUUUAGU(配列番号13)又はMiRBase受託番号MIMAT0002175:AGAGGCUGGCCGUGAUGAAUUC(配列番号14)、又はそれと少なくとも95パーセント相同である配列、又はそれと少なくとも99パーセント相同である配列を含むことができる。さらなる実施形態では、ヒトmir-485核酸は、配列番号13又は配列番号14の15〜21ヌクレオチド断片を含むことができる。
【００１５】
特定の非制限的実施形態において、本発明は、非制限的な例としてmir-491RNA分子及びその前駆体を含めた、マウスmir-491核酸分子を提供する。特定の非制限的実施形態において、本発明はマウスmir-491核酸分子を提供する。このような分子は、配列、MiRBase受託番号MI0004680:AAUUGACUUAGCUGGGAAGUGGGGAACCCU UCCAUGAGGAGUAGAACACUCCUUAUGCAAGAUUCCCUUCUACCUGACUGAGUUGA(配列番号15)又はMiRBase受託番号MIMAT0003486:AGUGGGGAACCCUUCCAUGAGG(配列番号16)、又はそれと少なくとも95パーセント相同である配列、又はそれと少なくとも99パーセント相同である配列を含むことができる(本明細書で使用するこの用語、相同性は、BLAST又はFASTAなどの標準ソフトウェアを使用して測定することができる)。さらなる実施形態では、マウスmir-491核酸は、配列番号15又は配列番号16の15〜21ヌクレオチド断片を含むことができる。
【００１６】
特定の非制限的実施形態において、本発明は、非制限的な例としてmir-491RNA分子及びその前駆体を含めた、ヒトmir-491核酸分子を提供する。特定の非制限的実施形態において、本発明はヒトmir-491核酸分子を提供する。このような分子は、配列、MiRBase受託番号MI0003126:UUGACUUAGCUGGGUAGUGGGGAACCCUUCCAUGAGGAGUAGAACACUCCUUAUGCAAGAUUCCCUUCUACCUGGCUGGGUUGG(配列番号17)、又はMiRBase受託番号MIMAT0002807:AGUGGGGAACCCUUCCAUGAGG(配列番号18)、又はそれと少なくとも95パーセント相同である配列、又はそれと少なくとも99パーセント相同である配列を含むことができる。さらなる実施形態では、ヒトmir-491核酸は、配列番号17又は配列番号18の15〜21ヌクレオチド断片を含むことができる。
【００１７】
本発明は、任意の前に記載したヌクレオチド配列(配列番号6〜18)の相補配列であるヌクレオチド配列を含む核酸分子をさらに提供する。
【００１８】
5.2 MIRTA22
本発明は、文献において2310044H10Rik(マウス)及びC19orf63(ヒト)としても知られるMirta22を提供する。
【００１９】
特定の非制限的実施形態において、本発明は、図6A中に示すアミノ酸配列(配列番号1)若しくはアミノ酸11〜269を含むその部分列、若しくはアミノ酸38〜269を含むその部分列を含むマウスMirta22タンパク質、又は完全タンパク質の変異体、又はそれと少なくとも約95パーセント若しくは少なくとも約99パーセント相同である部分列を提供する。
【００２０】
特定の非制限的実施形態において、本発明は、前に記載したマウスMirta22タンパク質をコードする核酸を提供する。例えば前記核酸は、GenBank受託番号NM_197991.2で言及され図16C中に示される配列(配列番号19)を含むことができ、又はそれと少なくとも約95パーセント若しくは少なくとも約99パーセント相同である可能性があり、又はヌクレオチド115〜921のコード配列を含む配列番号19の配列、又はそれと少なくとも約95パーセント若しくは少なくとも約99パーセント相同である配列、又は任意の前述の配列と相補的な核酸を含むことができる。本発明は、約15と35ヌクレオチド間若しくは約15と25ヌクレオチド間の領域にわたり配列番号19の一部分と相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンスRNA又は干渉RNA(「RNAi」)又は短鎖ヘアピンRNA(「shRNA」)をさらに提供し、この場合、5個を超えない、又は4個を超えない、又は3個を超えない、又は2個を超えない、又は1個若しくは0個を超えない相補性のミスマッチが存在し得る。
【００２１】
特定の非制限的実施形態において、本発明は、マウスMirta22タンパク質、例えば配列番号1を有するタンパク質と特異的に結合する、抗体又はその断片(例えば、そのFab若しくはF(ab')2、又は単鎖抗体、又はダイアボディを提供する。抗体又は抗体断片の供給源はポリクローナル又はモノクローナル抗体であってよい。本発明の具体的な非制限的実施形態では、抗体はマウスMirta22のサブフラグメント、EQAQKAKNPQEQKSFFAKY(配列番号20)を対象とすることができる。
【００２２】
特定の非制限的実施形態において、本発明は、図6A(配列番号2)、GenBank受託番号NM_206538.2、MAAASAGATRLLLLLLMAVAAPSRARGSGCRAGTGARGAGAEGREGEACGTVGLLLEHSFEIDDSANFRKRGSLLWNQQDGTLSLSQRQLSEEERGRLRDVAALNGLYRVRIPRRPGALDGLEAGGYVSSFVPACSLVESHLSDQLTLHVDVAGNVVGVSVVTHPGGCRGHEVEDVDLELFNTSVQLQPPTTAPGPETAAFIERLEMEQAQKAKNPQEQKSFFAKYWMYIIPVVLFLMMSGAPDTGGQGGGGGGGGGGGSGR(配列番号2)で示すアミノ酸配列、若しくはアミノ酸28〜263を含むその部分列を含むヒトMirta22タンパク質(アイソタイプ1)、又は完全タンパク質の変異体、又はそれと少なくとも約95パーセント若しくは少なくとも約99パーセント相同である部分列を提供する。
【００２３】
特定の非制限的実施形態において、本発明は、前に記載したヒトMirta22タンパク質(アイソタイプ1)をコードする核酸を提供する。例えば前記核酸は、GenBank受託番号NM_206538.2で言及され図16A中に示される配列(配列番号3)、又はそれと少なくとも約95パーセント若しくは少なくとも約99パーセント相同である配列を含むことができ、又はヌクレオチド67と855を含めたその間のコード配列(他に示されない限り、本文書中に列挙する全ての範囲はその言及する限界を含む)を含む配列番号3の部分列、又はそれと少なくとも約95パーセント若しくは少なくとも約99パーセント相同である配列を含むことができ、又はヌクレオチド148と855の間にシグナルペプチドをコードする部分がないコード配列を含む配列番号3の部分列、又はそれと少なくとも約95パーセント若しくは少なくとも約99パーセント相同である配列、又は任意の前述の配列と相補的な核酸を含むことができる。本発明は、約15と35ヌクレオチド間若しくは約15と25ヌクレオチド間の領域にわたり配列番号3の一部分と相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンスRNA又はRNAi又はshRNAをさらに提供し、この場合、5個を超えない、又は4個を超えない、又は3個を超えない、又は2個を超えない、又は1個若しくは0個を超えない相補性のミスマッチが存在し得る。
【００２４】
特定の非制限的実施形態において、本発明は、ヒトMirta22タンパク質、例えば配列番号2を有するタンパク質と特異的に結合する、抗体又はその断片(例えば、そのFab若しくはF(ab')2、又は単鎖抗体、又はダイアボディを提供する。抗体又は抗体断片の供給源はポリクローナル又はモノクローナル抗体であってよい。本発明の具体的な非制限的実施形態では、抗体は、マウスタンパク質と配列、EQAQKAKNPQEQKSFFAKY(配列番号20)を共有するヒトMirta22のサブフラグメントを対象とすることができる。
【００２５】
特定の非制限的実施形態において、本発明は、GenBank受託番号NM_175063.4、MAAASAGATRLLLLLLMAVAAPSRARGSGCRAGTGARGAGAEGREGEACGTVGLLLEHSFEIDDSANFRKRGSLLWNQQDGTLSLSQRQLSEEERGRLRDVAALNGLYRVRIPRRPGALDGLEAGGYVSSFVPACSLVESHLSDQLTLHVDVAGNVVGVSVVTHPGGCRGHEVEDVDLELFNTSVQLQPPTTAPGPETAAFIERLEMEQAQKAKNPQEQKSFFAKYWHIILGGAVLLTALRPAAPGPAPPPQEA(配列番号4)、で示すアミノ酸配列、若しくはアミノ酸28〜263を含むその部分列を含むヒトMirta22タンパク質(アイソタイプ2)、又は完全タンパク質の変異体、又はそれと少なくとも約95パーセント若しくは少なくとも約99パーセント相同である部分列を提供する。
【００２６】
特定の非制限的実施形態において、本発明は、前に記載したヒトMirta22タンパク質(アイソタイプ2)をコードする核酸を提供する。例えば前記核酸は、GenBank受託番号NM_175063.4で言及され図16B中に示される配列(配列番号5)、又はそれと少なくとも約95パーセント若しくは少なくとも約99パーセント相同である配列を含むことができ、又はヌクレオチド67と831の間のコード配列を含む配列番号5の部分列、又はそれと少なくとも約95パーセント若しくは少なくとも約99パーセント相同である配列を含むことができ、又はヌクレオチド148と831の間にシグナルペプチドをコードする部分がないコード配列を含む配列番号5の部分列、又はそれと少なくとも約95パーセント若しくは少なくとも約99パーセント相同である配列、又は任意の前述の配列と相補的な核酸を含むことができる。本発明は、約15と35ヌクレオチド間若しくは約15と25ヌクレオチド間の領域にわたり配列番号5の一部分と相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンスRNA又はRNAi又はshRNAをさらに提供し、この場合、5個を超えない、又は4個を超えない、又は3個を超えない、又は2個を超えない、又は1個若しくは0個を超えない相補性のミスマッチが存在し得る。
【００２７】
特定の非制限的実施形態において、本発明は、ヒトMirta22タンパク質、例えば配列番号4を有するタンパク質と特異的に結合する、抗体又はその断片(例えば、そのFab若しくはF(ab')2、又は単鎖抗体、又はダイアボディを提供する。抗体又は抗体断片の供給源はポリクローナル又はモノクローナル抗体であってよい。本発明の具体的な非制限的実施形態では、抗体は、マウスタンパク質と配列、EQAQKAKNPQEQKSFFAKY(配列番号20)を共有するヒトMirta22のサブフラグメントを対象とすることができる。
【００２８】
5.3  治療方法
特定の非制限的実施形態において、本発明は、ニューロン間の結合を増大させるための方法であって、有効量のMirta22活性を阻害する作用物質を前記ニューロンに投与することを含む方法を提供する。
【００２９】
「ニューロン間の結合を増大させる」は、一次樹状突起の数の増大、及び/又はスパイン密度の増大、及び/又はマッシュルーム型スパイン幅の増大、及び/又はシナプスの数の増大を含む。
【００３０】
ニューロン間の結合を増大させるための方法はin vitro又はin vivoで実施することができる。
【００３１】
前記方法中のニューロンはヒト又は非ヒトニューロンであってよい。
【００３２】
「Mirta22活性を阻害する」は、Mirta22活性の低下及び/又は拮抗を含む。Mirta22活性を阻害する作用物質は、例えば、転写若しくは翻訳の減少、又はMirta22のプロセシングによって、又はMirta22機能の拮抗によって、例えばその本来の機能の実施を低減若しくは防止するようにMirta22と結合することによって作用し得る。
【００３３】
Mirta22活性を阻害する作用物質には、mir-185、mir-485、mir-491、Mirta22mRNAと相補的な配列を含むアンチセンスRNA、Mirta22mRNAと相補的な配列を含むRNAi、Mirta22mRNAと相補的な配列を含むS shRNA、抗Mirta22抗体若しくはその断片、Mirta22と特異的に結合する単鎖抗体、又はMirta22と特異的に結合するダイアボディがあるが、これらだけには限られない。
【００３４】
特定の非制限的実施形態において、本発明は、ニューロン間の結合を増大させるための方法であって、有効量のmir-185活性を増大させる作用物質を前記ニューロンに投与することを含む方法を提供する。
【００３５】
「mir-185活性を増大させる」は、mir-185の量又は機能の増大を含む。例えば非制限的に、mir-185活性を増大させる作用物質には、mir-185核酸、及びmir-185の機能を促進する作用物質、例えばDgcr8タンパク質又はDgcr8タンパク質をコードする核酸を含めたDgcr8の活性を増大させる作用物質がある。mir-185活性を直接増大させる作用物質にはmir-185核酸がある。mir-185活性を間接的に増大させる作用物質には、Dgcr8の活性を増大させる作用物質がある。
【００３６】
特定の非制限的実施形態において、本発明は、ニューロン間の結合を増大させるための方法であって、有効量のmir-485活性を増大させる作用物質を前記ニューロンに投与することを含む方法を提供する。
【００３７】
「mir-485活性を増大させる」は、mir-485の量又は機能の増大を含む。例えば非制限的に、mir-485活性を増大させる作用物質には、mir-485核酸、及びmir-485の機能を促進する作用物質、例えばDgcr8タンパク質又はDgcr8タンパク質をコードする核酸を含めたDgcr8の活性を増大させる作用物質がある。mir-485活性を直接増大させる作用物質にはmir-485核酸がある。mir-485活性を間接的に増大させる作用物質には、Dgcr8の活性を増大させる作用物質がある。
【００３８】
特定の非制限的実施形態において、本発明は、ニューロン間の結合を増大させるための方法であって、有効量のmir-491活性を増大させる作用物質を前記ニューロンに投与することを含む方法を提供する。
【００３９】
「mir-491活性を増大させる」は、mir-491の量又は機能の増大を含む。例えば非制限的に、mir-491活性を増大させる作用物質には、mir-491核酸、及びmir-491の機能を促進する作用物質、例えばDgcr8タンパク質又はDgcr8タンパク質をコードする核酸を含めたDgcr8の活性を増大させる作用物質がある。mir-491活性を直接増大させる作用物質にはmir-491核酸がある。mir-491活性を間接的に増大させる作用物質には、Dgcr8の活性を増大させる作用物質がある。
【００４０】
関連する非制限的実施形態において、本発明は、そのような治療を必要とする対象におけるニューロン間の結合を増大させるための方法であって、有効量のMirta22活性を阻害する作用物質を前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【００４１】
そのような治療を必要とする対象は、統合失調症若しくは関連障害に罹患した対象、又は記憶若しくは学習の障害を有する対象、又はニューロン結合又は記憶若しくは学習能力の向上が有益であるであろう対象である。対象はヒト又は非ヒト対象であってよい。
【００４２】
統合失調症関連障害には、短期精神病性障害、統合失調症型障害、統合失調感情障害、及び妄想性障害があるが、これらだけには限られない。
【００４３】
記憶の障害には、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、血管性認知症、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルトヤコブ病、前頭側頭型認知症、ハンチントン病、軽度認知障害、進行性核上性麻痺、及びピック病があるが、これらだけには限られない。
【００４４】
学習の障害には、注意力障害、機能亢進症、失読症、計算力障害、非言語性学習障害及び精神遅滞があるが、これらだけには限られない。
【００４５】
本発明による治療が有益であるであろう別の対象には、自閉症、アスペルガー症候群、うつ病、双極性障害、強迫性障害に罹患した対象、及び脳梗塞、脳の外科手術、放射線、若しくは化学療法剤治療、又は外傷に続発する記憶又は学習障害に罹患した対象があるが、これらだけには限られない。本発明は、そのような治療を必要とする対象におけるニューロン間の結合を増大させるための方法であって、有効量の、mir-185、mir-485及び/又はmir-491活性の増大を阻害する及び/又はMirta22活性を阻害する作用物質を前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【００４６】
特定の非制限的実施形態において、本発明は、対象における統合失調症又は関連障害を治療する方法であって、有効量のMirta22活性を阻害する作用物質を前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【００４７】
特定の非制限的実施形態において、本発明は、対象における統合失調症又は関連障害を治療する方法であって、有効量の、mir-185、mir-485及び/又はmir-491活性を増大させる作用物質を前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【００４８】
特定の非制限的実施形態において、本発明は、対象において記憶力を向上させる方法であって、有効量のMirta22活性を阻害する作用物質を前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【００４９】
特定の非制限的実施形態において、本発明は、対象において記憶力を向上させる方法であって、有効量の、mir-185、mir-485及び/又はmir-491活性を増大させる作用物質を前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【００５０】
標準的な試験を使用して、記憶力の向上を決定することができる。例えば非ヒト動物では、迷路を通過する際のパフォーマンスを使用して、記憶力を試験することができる。ヒトでは、例えば非制限的に、ミニメンタルステート検査又はウェクスラーメモリースケールを使用して、記憶力を試験することができる。
【００５１】
前述のいずれにおいても、使用する核酸又は抗体又は関連分子の起源の種類は、治療するニューロン若しくは対象の種類と同一であるか又は密接に関連があることが好ましい。
【００５２】
本発明によれば、くも膜下、静脈内、鼻腔、動脈内、経口、筋肉内、皮下、肺、腹腔内などだけには限られないが、これらを含めた任意の経路によって、作用物質を投与することができる。
【００５３】
本発明は、これらだけには限られないが生理食塩水又は滅菌水などの適切な担体中に、本発明に従い使用するための作用物質を含む医薬組成物を提供する。
【００５４】
本発明は、本発明の別の具体的な非制限的実施形態を述べる以下の実施例によって例示されるが、これによって制限されるわけではない。実施例の内容は、発明の詳細な説明に参照として本明細書に組み込む。
【実施例】
【００５５】
6.  実施例
6.1  材料及び方法
マウス、qRT-PCR及び発現プロファイル。Df(16)A+/-及びDgcr8+/-マウスの作製を(8)において記載する。全てのRNAはmiRNeasyミニキットによって単離した。qRT-PCRは(8)において記載したように実施した。発現プロファイル用に、cDNAを作製し、34,000を超える十分特徴付けしたマウス遺伝子からの45,000プローブセットを含むAffymetrixマウスゲノム430 2.0アレイに施した。GeneChip解析ソフトウェアマイクロアレイスイートバージョン5を使用しデータを得て、バイオコンダクタープロジェクト(www.bioconductor.org)_においてライマパッケージで解析した。
【００５６】
樹状突起の複雑性及びスパイン形態の分析。切開したE17海馬ニューロンを6ウエルプレートにおいて2×105細胞/mlでプレーティングし、実験に応じて9〜19日間培養した。基底樹状突起及び樹状突起スパインのイメージは前に記載したように得た(9)。遺伝子型を知らない実験者がイメージ化及び分析を実施した。ImageJ and NeuroStudioを使用して半自動的トレーシング及び定量化を実施した(30、31)。各治療条件に関する一次樹状突起及び全分岐点の数はL-測定値[バージョン4.0]によって計算した(32)。スチューデントのt検定(一次樹状突起及び分岐点の数、並びにスパイン密度)及びコルモゴロフ-スミルノフ検定(マッシュルーム型スパインの幅)を使用して、統計解析を実施した。
【００５７】
ルシフェラーゼアッセイ。Mirta22の3'UTRをpsiCHECK2にクローニングした。結合部位突然変異クローンをPCRベースの突然変異誘発によって作製した。N18神経芽腫細胞を、他に言及しない限り様々なpsiCHECK2レポーター構築物及びプレ-mir-185模倣体又はプレ-スクランブル対照でトランスフェクトし、Promegaデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを使用してルシフェラーゼアッセイを実施した。全ての実験は少なくとも2回実施し、示した全てのデータは3回の技術反復の平均である。
【００５８】
抗体。20アミノ酸ペプチド([H]-CEQAQKAKNPQEQKSFFAKY-[NH2])を使用してウサギポリクローナル抗体を作製した。抗体の特異性は図11中に記載したように決定した。ウエスタンブロット、免疫組織化学的及び免疫細胞化学的アッセイは前に記載したように実施した(8、9)。
【００５９】
in situハイブリダイゼーション。ジゴキシゲニン尾部標識抗mir-185ロックド核酸(LNA)及びスクランブルLNAオリゴヌクレオチドをExiqonから得た。in situハイブリダイゼーションは前に記載したように実施した(33)。
【００６０】
qRT-PCR及びプライマー。全てのRNAは、製造者の説明書に従いmiRNeasyミニキット(QIAGEN)を使用して脳又は培養細胞から単離した。qRT-PCRは前に詳細に記載したように実施した(8)。使用したプライマーの配列は以下の通りである:
Mirta22:F:CTGCTGTCAATGGCCTCTAC(配列番号1)、
R:GTCCGAAAGGTGCGACTC(配列番号2)
ハイブリダイゼーションプローブ:CATGGCCGCCAGCTTCTGA(配列番号3)
mmu-miR-185:ABI TaqmanアッセイID002271。
【００６１】
ニューロン培養及びトランスフェクション。切開したニューロンをE17マウス胚から単離し、ポリ-D-リシンでコーティングしたカバーガラスを含有する6ウエルプレートにおいて2×105細胞/mlでプレーティングした。実験に応じてニューロンを9〜19日間培養した。pRFP-C-2310044H10RikshRNA及びpRFP-C-スクランブルshRNA対照(Origene)、Mirta22(2310044H10Rik)cDNAクローン(Origene)、並びにプレ-mir-185模倣体及びプレ-スクランブル対照(Ambion)を、前に記載したように高効率のリン酸カルシウム仲介トランスフェクションに使用した(34)。全ての実験に関して、5μgの全プラスミド及び/又は100pmolのプレ-miRNA模倣体をウエル毎に使用した。
【００６２】
樹状突起の複雑性の分析。基底樹状突起のイメージを前に記載したように得た(9)。遺伝子型を知らない実験者が全てのイメージ化及び分析を実施した。基底樹状突起の分岐点を、NeuronStudioを使用してニューロン細胞体から半自動的にトレーシングした(31)。.swcファイルをL-測定値にインポートした(32)。各治療条件に関する一次樹状突起及び全分岐点の数はL-測定値[バージョン4.0]によって計算した。L-測定値で実施したようにスチューデントのt検定を使用して統計解析を実施した。Sholl分析は「Sholl分析」プラグイン(http://biology.ucsd.edu/labs/ghosh/software/ShollAnalysis.pdf)を使用してImageJ(http://rsbweb.nih.gov/ij/)で実施した。結果はMS-エクセルで組合せ、スチューデントのt検定を実施して、実験群と対照の間で各ステップサイズにおける交差数及び有意性を決定した。
【００６３】
スパイン形態の分析。樹状突起スパインのイメージを前に記載したように得た(9)。各実験に関して、全ての遺伝子型にわたるイメージを、類似したレーザーパワー、ディテクターゲイン、及びアンプリファイアオフセットに最適な設定で得た。遺伝子型を知らない実験者が全てのイメージ化及び分析を実施した。スパインの密度、長さ、及び幅の定量化は、ImageJ(http://rsbweb.nih.gov/ij/)及びNeuroStudio30を使用して実施した。第一分岐点からのそれぞれ少なくとも75μm長の1個の基底樹状突起を、ニューロン当たりで分析した。本発明者らは、それぞれの動物から少なくとも4個のニューロンを分析した。スパイン頭部の広範囲にわたり引いた直線の距離として、スパインの幅を測定した。群間のスパイン密度の変化はスチューデントのt検定によって評価した。マッシュルーム型スパインの幅の分布は、コルモゴロフ-スミルノフ検定を使用して比較した。
【００６４】
発現プロファイル。E17及びP6での12匹のDf(16)A+/-突然変異体及び12匹の野生型同腹子対照マウスから合計48のPFCと48のHPCを切開し、Affymetrixによって勧められる標準プロトコールを使用して処理した。RNAの質はバイオアナライザー(Agilent Technologies)で評価し、全てのRNAは7.0を超えるRINを有していた。ハイブリダイゼーション用に、34,000を超える十分特徴付けしたマウス遺伝子からの45,000プローブセットを含むAffymetrixマウスゲノム430 2.0アレイにcDNAを施し、次いでスキャンした(Agilent)。ゲノムリサーチデータベース用にUniGene及びWhitehead Institute Centerから配列クラスターを作製し精製した。
【００６５】
マイクロアレイデータ解析。初期強度ファイル(CELファイル)を、GeneChip(Affymetrix)解析ソフトウェアマイクロアレイスイートバージョン5(Affymetrix)を使用してマイクロアレイイメージから得て、バイオコンダクタープロジェクト(www.bioconductor.org)においてライマパッケージで解析した。E17及びP6でのDf(16)A+/-と野生型同腹子の発現プロファイルのデータ解析は、前に記載したように実施した(8)。簡単に言うと、未処理強度データをRobust Multichip Average(RMA)法によって最初に標準化し、線形モデルを適用し、ライマパッケージにより示差的発現を決定した。遺伝子リストはそれらの正常P値に従いランク付けし、有意性レベルはBenjamini及びHochberg FDR35を使用したP値の調節によって推定し、多数回の試験が原因の偽陽性率を制御した。
【００６６】
予想miR-185標的の機能及び遺伝子セット濃縮分析。TargetScan Mouse v5.2を使用してmiR-185標的予想因子を得た。遺伝子リストはDAVID遺伝子機能注釈データベースにインポートした。92%(2932中2708)の予想標的遺伝子をDAVIDデータベースにマッピングした。デフォルト設定でのプログラムの機能注釈クラスタリング解析を使用して、機能の注釈付けを実施した。上位クラスターからの遺伝子リスト(「ゴルジ装置」)はDAVID ID変換ツールを使用してAffymetrix IDに変換し、Affymetrixマウス430 2.0チップの対応するIDにさらにマッピングした。この最終プローブセットリストは、下流解析用のユーザ定義遺伝子セットとして使用した。遺伝子セット濃縮分析はErmineJソフトウェアを使用して実施した(38)。p値ランキングに基づくレシーバーオペレーター特性(ROC)解析を使用して、解析を実施した。
【００６７】
ルシフェラーゼアッセイ。Mirta22の3'UTRをpsiCHECK2(Promega)のXhoI及びNotI部位にクローニングした。結合部位突然変異クローンをPCRベースの突然変異誘発によって作製した。部位Mut1配列(3'UTR中の位置289から始まる): GGAgtTTGCCAAGCTCggTaaA(配列番号4;小文字は改変ヌクレオチドを示す)。部位Mut2配列(位置350から始まる):AtTGTCACgCTaaA(配列番号5)。突然変異はRNAhybrid36によって予想し、シード及び二次結合部位におけるmir-185の結合を妨害する。N18神経芽腫細胞を、他に言及しない限り様々なpsiCHECK2レポーター構築物(24ウエルプレートのウエル当たり100ng)及びプレ-mir-185模倣体又はプレ-スクランブル対照(1nM=0.5pmol)でトランスフェクトし、製造者の説明書の下デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム(Promega)を使用して、トランスフェクション後24時間でルシフェラーゼアッセイを実施した。全ての実験は少なくとも2回実施し、示した全てのデータは3回の技術反復の平均である。
【００６８】
抗体産生。20アミノ酸ペプチド([H]-CEQAQKAKNPQEQKSFFAKY-[NH2])を設計、合成し、KLH(キーホールリンペットヘモシアニン)と結合させ、次いでCovanceカスタム抗体産生サービス(Covance)を使用してウサギに注射した。次いで抗体血清を、Melon Gel IgG精製キット(Thermo Scientific)を使用して精製し、精製した抗体はウエスタンブロット(1:50)、免疫組織化学的及び免疫細胞化学的アッセイ(1:25)に使用した。
【００６９】
293T細胞溶解物のウエスタンブロットアッセイにおいて、精製した抗体は、C末端FLAGでタグ化した過剰発現完全長Mirta22(約28kD)を特異的に認識し、これはポリクローナルとモノクローナル抗FLAG抗体両方を使用して個別に立証した(図13A)。抗体の特異性は、2310044H10RikshRNA又は完全長2310044H10RikcDNAプラスミドでトランスフェクトしたN18細胞からのタンパク質抽出物のウエスタンブロットアッセイにおいて試験した。約28kDでのバンドの強度は各操作に関して予想通り変化した(図13B、C)。最後に、培養ニューロンを染色するのに使用すると、抗体は特異的染色パターンをもたらし、一方で免疫前血清はシグナルを示さなかった(図13D)。
【００７０】
ウエスタンブロットアッセイ。ウエスタンブロット手順は前に記載している(8)。簡単に言うと、等量のタンパク質を分離し、次いでECFを含む膜に移した。膜は1:50精製Mirta22抗体、及び次に1:5000ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体でプローブ処理した。洗浄した膜はHRP基質とインキュベートし、化学発光イメージはAlphaイメージングシステムを使用して得た。
【００７１】
免疫組織化学的アッセイ。免疫組織化学的アッセイを(37)に従い実施した。簡単に言うと、新たな脳を切開しOCTで即座に凍結した。次いで脳を15〜20μmの厚さに切り、脳切片は室温で乾燥させ次いで固定した。切片は1個又は2個の一次抗体と一晩インキュベートし、その後Alexa Fluorフルオロクロム(1:1,000、Invitrogen)と結合した二次抗体と1時間インキュベートした。イメージは蛍光顕微鏡(Nikon)の下で調べた。
【００７２】
免疫細胞化学的アッセイ。前に記載したように(9)、細胞はカバーガラス上で培養し、固定し、浸透処理し、次いで一次抗体と二次抗体に曝した。イメージは蛍光顕微鏡(Nikon)の下で調べた。Mirta22シグナルの定量化用に、前に記載したようにイメージを得た(9)。未処理LSMイメージを投影しImageJを使用してエクスポートした。各個別ニューロンの細胞体からのMirta22の免疫細胞化学的シグナルは、一体化した全体密度マイナス細胞体領域のバックグラウンドとして計算した。
【００７３】
6.2  結果
染色体の操作処理を使用して、本発明者らは、22q11.2の1.5-Mb微小欠失とシンテニックであるマウス第16染色体にヘミ接合1.3-Mb染色体欠失を有するマウスモデル[Df(16)A]を作製した(図1A〜D)(8)。Df(16)A+/-マウスの分析は、培養とin vivoの両方で、樹状突起形態の異常及び海馬ピラミッド型ニューロンの樹状突起スパインの形成に関する証拠を与えた(8、9)。このような変化は、少なくとも部分的に、幾つかの22q11.2欠失担体において観察された灰白質体積の局所的減少に原因があり得る(10)。樹状突起及びスパイン形成のわずかな変化でさえ、次善のシナプス結合数、不適切な結合の形成、又はシナプス入力の統合の変化をもたらす可能性があり、情報処理の相当な変化を最終的にもたらす可能性がある(11、12)。
【００７４】
Df(16)A+/-系統は、22q11.2欠失は、脳マイクロRNA(miRNA)、mRNAの安定性及び翻訳を制御するクラスの低分子、非コードRNAの異常なプロセシングをもたらすという強力な証拠も与えた(13〜16)。22q11.2微小欠失によって妨害される1個の遺伝子は、Dgcr8、miRNA生成に必要不可欠な「マイクロプロセッサー」複合体の一成分である(17)。Dgcr8+/-マウスを作製した(図2A〜E)。Dgcr8ハプロ不全は成熟miRNAの特定サブセットの下方制御をもたらし、Df(16)A+/-マウスで見られる幾つかの細胞、シナプス及び挙動変化に貢献する(8、18)。miRNAの異常制御はおそらく、Df(16)A+/-マウスの脳において観察される一部の転写産物誤発現に原因があるが、影響を受けるmiRNAの直接標的はこれまで報告されていない。本発明の実験はこの異常制御の重要成分に焦点を当て、ニューロン成熟及び結合に対する22q11.2微小欠失の影響を仲介する主要なmiRNA転写標的として、以前に特徴付けられなかった遺伝子を同定する。
【００７５】
Df(16)A+/-マウスにおけるmiR-185レベルの激烈な低下。Df(16)A+/-マウス系統における試験は、22q11.2微小欠失が、Dgcr8遺伝子の一コピーの除去が原因である脳miRNAの特定サブセットの異常なプロセシング、並びに成体脳(8)及び発達初期においてその発現の低下をもたらすことを示している(図8)。Dgcr8以外に、22q11.2微小欠失及び同等のマウスにおける欠失が、最小1.5-Mb 22q11.2重要領域内に位置する1個のmiRNA遺伝子(mir-185)を除去することは注目に値する(図1A)。in situハイブリダイゼーションアッセイは、海馬(HPC)及び前頭皮質を含めた皮質などの数箇所の脳領域中でmir-185が発現されることを示した(図3A)。定量リアルタイムPCR(qRT-PCR)分析は、成熟mir-185の発現は、成体Df(16)A+/-マウスのHPC(P<10〜6)と前頭前皮質(PFC、P<10〜11)の両方において約70〜80%劇的に低下することを示した(図3B、C)。この低下はさらに初期の発達段階(E17及びP6)でも観察した(図9A、B)。mir-185はDgcr8+/-マウスにおいてより穏やかな減少を示し(HPCにおいて約20%、P<0.05;図3D)、Df(16)A+/-マウスにおける成熟mir-185発現の重度の低下は、Dgcr8レベルの低下が原因の、mir-185遺伝子のヘミ接合と残りのコピーから生じたpri-mir-185転写産物の成熟阻害の組合せ効果が原因であることを示唆した。これは、50%の遺伝子量減少によって予想されるより相当高い残存遺伝子の発現の低下をもたらす、病原性CNV内の真性遺伝子×遺伝子相互作用を表す。このような相対的発現の大幅な低下は微小欠失によって影響を受ける遺伝子間に特有であり、重要で以前は認められていなかった22q11.2関連miRNA異常制御の成分を表す可能性がある。このように、劇的に低下したmir-185活性は、それ自体で、又はDgcr8欠失が原因で影響を受ける他のmiRNAと併せて、1以上の標的遺伝子の発生段階制御の変化をもたらし、幾つかのニューロンプロセスに影響を与える可能性がある。
【００７６】
miR-185レベルの変化はDf(16)A+/-ニューロンの構造変化に貢献する。miRNAは、樹状突起樹及び樹状突起スパインの発達などの、ニューロン結合の構造指標に影響を与えることが示されている(19〜21)。22q11.2微小欠失は脳における樹状突起樹及び樹状突起スパインの発達の障害をもたらし、これらの欠陥は主要ニューロン培養物で反復される。樹状突起樹及び樹状突起スパインの発達の障害はDgcr8レベルの50%の減少に部分的に原因があり得るが、mir-185レベルの低下も貢献するかどうかは依然知られていない(8、9、18)。ゴルジ装置及び樹状突起シャフト内のMirta22の局在は、Mirta22レベルに対するmiR-185の抑制影響の低下も、これらの欠陥に貢献し得ることを示唆する。
【００７７】
これを調べるため、本発明者らは最初に、mir-185レベルの低下が、Df(16)A+/-ニューロンで観察したのと同様の樹状突起及びスパインの発達の欠陥をもたらすかどうか調べた(9)。本発明者らは、抗miR-185及びスクランブル対照LNAオリゴヌクレオチドを野生型主要海馬ニューロンに導入し、それぞれDIV9及びDIV19で、トランスフェクション後2日で樹状突起及びスパインの形態を測定した。前述のように本発明者らは、抗miR-185LNAオリゴの導入が、抗miR対照トランスフェクト主要ニューロンと比較して、Mirta22mRNAレベルの有意な増大をもたらしたことを確認した(図5C)。樹状突起構造の分析によって、mir-185レベルの低下が、トランスフェクトニューロンにおける一次樹状突起の数の有意な減少(21%、P<0.05;図17B)及び全分岐点の有意な減少(16%、P<0.05;図17C)を含めた、樹状突起の複雑性の欠陥をもたらすことを示した(図17A)。体からの様々な距離で分岐点数を比較するSholl分析によって、この発見を確認した(図18A)。さらに、DIV19ニューロンにおけるmiR-185レベルの低下は、マッシュルーム型スパイン密度の低下(21%、P<0.05;図17D及び17E及び図18B)及びそれらのメジアン幅の有意な減少(15%減少、P<0.001、コルモゴロフ-スミルノフ検定;図17F)をもたらす。これらの構造欠陥はDf(16)A+/-ニューロンで観察されるものにおいて反復される。したがって、Df(16)A+/-マウスにおけるニューロン欠陥は、少なくとも部分的に異常に低いmiR-185レベルに原因がある。一貫して、野生型ニューロンへのプレ-miR-185模倣体の導入によって、一次樹状突起の数、分岐点の数、マッシュルーム型スパインの密度及び頭部幅が増大した(図18C及び18D)。
【００７８】
本発明者らは、miR-185レベルの上昇が、Df(16)A+/-ニューロンで観察した細胞構造変化に少なくとも部分的に逆行し得るかどうかも調べた(9)。本発明者らは、成熟miRNAにプロセシングされるmiRNA前駆体模倣体(「プレ-miR-185」、Ambion)、又は低分子RNA発現の非特異的効果に関する対照として働くマウスゲノムと相同性がないスクランブル前駆体オリゴヌクレオチド(「プレ-スクランブル」)で、Df(16)A+/-マウス及びそれらの野生型同腹子由来の主要海馬ニューロンをトランスフェクトした。コトランスフェクトGFPレポータープラスミドによって、本発明者らは、それぞれDIV9(トランスフェクション後2日)及びDIV19(トランスフェクション後2日)でのGFP陽性ピラミッド型ニューロンの樹状突起構造(図3E)及びスパイン形態(図3H)を分析することができた。対照実験において、本発明者らは、プレ-miR-185の導入が、プレ-スクランブルトランスフェクトニューロンと比較して、Mirta22レベルの有意な増大をもたらしたことを確認した(P<0.01;図4B)。前の結果と一致し、野生型ニューロンと比較して、プレ-スクランブルでトランスフェクトしたDf(16)A+/-ニューロンは、一次樹状突起の数(25%、P<10-10;図3F)及び樹状突起分岐点の数(38%、P<10-4;図3G)の減少によって現れる樹状突起の複雑性の低下を示した。それらは、マッシュルーム型スパインのスパイン密度の低下(38%、P<10-6、図3I)及びわずかではあるが統計学的に有意な頭部幅の減少(8%メジアン幅、P<0.01;図3J)も示した。mir-185活性の増大は、樹状突起の複雑性の欠陥(図3F、G、及び図18E)及びスパイン密度の低下(図3I)と大きく逆行し、Df(16)A+/-海馬ニューロンにおけるマッシュルーム型スパインのスパイン頭部幅を有意に増大した(メジアン幅18%増大、P<0.001、コルモゴロフ-スミルノフ検定;図3J)。したがって、Df(16)A+/-マウス由来の海馬ニューロンへのプレ-mir-185の導入は幾つかの重要な構造結合欠陥と逆行した。
【００７９】
一次転写の22q11.2ゲノム消失の結果。
【００８０】
miRNA生成の障害は標的転写産物の安定性に相当な影響があり得る。成体Df(16)A+/-マウスの以前のマイクロアレイ分析は、22q11.2領域における遺伝子量の減少は、HPC及びPFCにおける転写プログラムのゲノム幅変化をもたらすことを明らかにした(8)。本発明者らは、これら二つの脳領域の分析を、Df(16)A+/-マウス中でmir-185及びおそらく他のmiRNAが既に減少していた、二つの初期発生段階、第17日胚(E17)及び出生後第6日(P6)に広げた。ただ一つの遺伝子、2310044H10Rikが、試験した三つの発生段階の少なくとも二つ及び試験した二つの脳領域の少なくとも一つにおいて、有意に上方制御されたことが一貫して見られた。実際2310044H10Rikは、試験した二つの出生後段階(成体とP6)中の上位上方制御遺伝子、及びP6突然変異マウスの前頭皮質中の上位上方制御転写産物間に存在した(図4A、B)。特に、E17では前頭皮質又は海馬のいずれにおいても、2310044H10Rik発現の有意な差は見られなかった(図4A、B)。
【００８１】
独立した実験において、本発明者らは、この遺伝子座におけるゲノム消失又は獲得の結果として発現が反対方向に変化する遺伝子を検索することにより、22q11.2微小欠失の一次遺伝子標的と二次遺伝子標的の区別を試みた。このような遺伝子はおそらく、一次標的及び根底コピー数不均衡の直接転写読み取り値を表す。対照的に、ゲノム消失に特異的又はゲノム量と無関係な同方向の発現変化は、影響を受ける生理学的プロセス又は機能不全脳領域の第二指標である可能性がより高い(39)。本発明者らは、コピー数が均衡した異種マウスのシンテニックマウス遺伝子座で欠失又は複製を有するマウスにおいて、参照化合物を使用してPFCとHPC遺伝子発現プロファイルを比較した(図19)。本発明者らは、22q11.2領域からの転写産物以外に、PFC又はHPCのいずれかで幾つかの逆に変化した転写産物を同定した(P値<0.001、図27)。同定した大部分の転写産物はpri-miRNA型である。12個の転写産物がPFCとHPCの両方で相互的に著しく誤制御された(図20)。それらの中で、2310044H10Rikはタンパク質コード能力を有する唯一の遺伝子である。
【００８２】
PFCとHPCの両方における上方制御のパターンをTaqMan qRT-PCRによって確認した(PFC:E17、20% P=0.24;P6、59%、P<0.01;成体、76%、P<10-6;HPC:E17、20%、P=0.16;P6、50%、P<0.05;成体、38%、P<0.05;図4C、D)。この分析によって、生後第一週中(E17とP6の間)に2310044H10Rikのレベルが急速に低下しその後一定して低い状態にある一時的制御のプロファイル、並びに2310044H10Rik発現の上昇が出生後及び成体期を通じて続くDf(16)A+/-マウスにおける発現誤制御の対応するパターンを明らかにした。2310044H10Rikの脳における発現の増大はDf(16)A+/-マウス由来の主要海馬ニューロンにおいて反復される(図4E)。重要なことに、2310044H10Rikゲノム遺伝子座内又は周辺には如何なる既知のmiRNAも存在せず、観察した上方制御は重複pri-miRNA転写産物のプロセシング障害によるものではないことが示唆される。
【００８３】
2310044H10RikはmiRNA異常制御の主要下流エフェクターである。前に記載した遺伝子発現プロファイリングは、トランスクリプトームレベルでの22q11.2欠失の主な結果としての、発達段階での2310044H10Rikレベル制御の障害に焦点を当てた。特に、2310044H10RikのmRNAレベルはDgcr8+/-マウスでも上昇し(HPC:30%、P<0.05;PFC:24%、P<0.05;図10)、上方制御はmiRNA異常制御に原因があり得ることを強く示唆した。実際、二つのmiRNA標的部位予想プログラムTargetScan(22)とmirDB(23)は、2310044H10Rikの3''UTRは、マイクロアレイプロファイリング(8)又はqRT-PCR(図11)によって示され、Df(16)A+/-マウスにおいて影響を受けるmiRNAの結合部位を含有することを報告する。具体的にはmirDBは、mir-185及びmir-485を含めた2310044H10Rikの3'UTR中の結合部位を有する五つのこのようなmiRNAを予想し、一方TargetScanは、mir-185、mir-485、mir-491及びmir-224に関する部位を含めた13のmiRNA部位を予想した。特に、両方のプログラムが、2310044H10Rikの3'UTRがmir-185及びmir-485に関する部位を含有することを予想した(図5A)。
【００８４】
2310044H10Rikの脳内発現の増大はDf(16)A+/-マウス由来の主要ニューロンにおいて反復されるので(図4E)、本発明者らは最初に主要ニューロンを使用して、内生2310044H10Rik発現が実際miR-185の制御下にあるかどうか決定した。2310044H10Rikレベルに対するmiR-185過剰発現の影響を調べるため、本発明者らは、成熟miRNAにプロセシングされるmiRNA前駆体模倣体(「プレ-miR-185」)、又は低分子RNA発現の非特異的効果に関する対照として働くマウスゲノムと相同性がないスクランブル前駆体(「プレ-スクランブル」)を主要ニューロン培養物に導入した。トランスフェクション後24時間で、プレ-スクランブルトランスフェクトニューロンと比較したとき、プレ-mir-185トランスフェクトニューロンにおいて2310044H10Rikレベルの54%の低下があった(P<0.01;図5B)。相補的実験では、抗miR-185LNAオリゴ又はスクランブル対照オリゴの導入は、スクランブルトランスフェクト細胞と比較したとき、抗miR-185トランスフェクト細胞において2310044H10RikのmRNAレベルの上昇をもたらした(P<0.05;図5C)。まとめると、これらの結果によって、主要ニューロンにおける2310044H10Rik発現はmiR-185の抑制制御下にあることを確認する。N18細胞における2310044H10Rik発現をアッセイしたとき、ほぼ同一の結果を得た(図5D及び5E)。
【００８５】
2310044H10Rik発現に対するmir-185の阻害性をさらに特徴付けるため、及びTargetScanとmirDB(前を参照)により予想してそれが2310044H10Rik3'UTR依存性であるかどうか試験するために、2310044H10Rik3'UTR融合ルシフェラーゼレポーター遺伝子(詳細に関しては、方法及び図に関する凡例を参照)を、N18細胞、マウス神経芽腫細胞株に、「プレ-mir-185」模倣体又はスクランブル前駆体(「プレ-スクランブル」)のいずれかとコトランスフェクトした。プレ-スクランブルはレポーター活性に影響を与えなかった。プレ-mir-185模倣体の導入は、プレ-スクランブル対照と比較して、ルシフェラーゼ活性の劇的な低下をもたらした(プレ-スクランブル対照と比較して、使用した全てのプレ-mir-185濃度に関してP<0.001、図5F)。mir-185による抑制は103倍範囲で起こり、55%を超える抑制が0.01nMのプレ-mir-185模倣体濃度で依然観察された(図5F)。
【００８６】
mir-185仲介の抑制が特異的であり、TargetScanにより予想した二箇所の結合部位を介して直接作用するかどうか調べるため(図5A)、本発明者らは、個々又は両方のmir-185結合部位が突然変異した突然変異型2310044H10Rik3'UTRを有するルシフェラーゼレポーターを操作処理した(Mut1/部位1突然変異体;Mut2/部位2突然変異体;Mut1&2/部位1及び2突然変異体)。プレ-mir-185模倣体は、3'UTRを含まない対照レポーターと比較して約25%野生型レポーターのルシフェラーゼ活性を有意に低下させ、一方でそれは、野生型2310044H10Rik3'UTR融合レポーターと比較して、Mut1及びMut2レポーターのルシフェラーゼ活性をそれぞれ80%(P<0.01)及び33%(P<0.05)低下させた(図5G)。特に、プレ-mir-185模倣体は、二箇所の結合部位が同時に破壊された突然変異レポーターから誘導されたルシフェラーゼ活性を抑制することはできなかった(図5G)。二箇所のmir-185同種結合部位はMirta22発現の3'UTR仲介制御に対して影響があるが、Mut1レポーターにおいて破壊された部位(部位1)は、mir-185がその抑制効果を直接発揮する主要標的部位であると思われる。
【００８７】
本発明者らはさらに、2310044H10Rik遺伝子の3'UTR中結合部位を標的化するとも予想されるmir-485又はmir-491のレベルに対する、2310044H10Rik3'UTRレポーター抑制の依存性を取り扱った。これらのmiRNAはいずれも22q11.2微小欠失内に位置しないが、Dgcr8のヘミ接合性が原因でDf(16)A+/-マウスのHPCにおいて、両者共わずかに下方制御される(図11)。一方のmiRNAのプレ-miRNA模倣体は、プレ-スクランブル対照と比較して、3'UTR融合レポーターのルシフェラーゼ活性をわずかではあったが有意に低下させた(プレ-mir-485:27%、P<0.05;プレ-mir-491:35%、P<0.05;図5G)。三因子ANOVA分析によって、全3個のmiRNA(miR-185、miR-485及びmiR-491)並びにそれらの相互作用は、miR-485とmiR-491の間の相互作用以外、ルシフェラーゼ活性に対して有意な影響があることを示した(図21)。まとめると、これらの発見は、Df(16)A+/-マウスで観察した2310044H10Rikレベルの一貫した上昇は、おそらくmir-185遺伝子座とDgcr8遺伝子座で併さったヘミ接合性の結果であることを示唆する。2個以上のmiRNAが貢献しているが、主な影響はmir-185の劇的下方制御によるものである。この概念及びDgcr8+/-マウスにおけるmir-185の低度の減少と一致して(図3D)、2310044H10Rikはこの系統で唯一わずかに上方制御される(図10)。確認したmiRNA仲介の制御によって、本発明者らは、この遺伝子をMirta22と再度命名した(22q11.2欠失のmiRNA標的)。
【００８８】
興味深いことに、USCSブラウザにおける「30-ウエィマルティズアライメント及び保存分析」により実施した、ヒトの3'UTRとマウスMirta22オルソログの間の比較によって(図5A)、mir-185同種部位1と1個のmir-485結合部位は高度に保存された領域内に位置することが明らかになり、これらの部位はヒトオルソログ(C19orf63)のレベルを制御する際にも重要な役割を果たし得ることが示唆される。この予想と一致して、ヒト293T細胞へのプレ-miR-185の導入は内生C19orf63レベルの有意な低下をもたらした(図22)。さらに、マウス脳内で観察したパターンと同様に、C19orf63の発現は幼児脳内で低下する(40)。本発明者らの遺伝子発現データベースの調査、及び2個以上の予想プログラムにより同定した可能性の高い8個のmiR-185標的サンプルのqRT-PCR分析は、如何なる他のDf(16)A+/-マウス脳内の転写産物レベルの有意な変化も明らかにしなかったことも注目に値する(図12)。さらに、2310044H10Rikと異なり、他の上位上方制御タンパク質コード遺伝子(図4B中に示す)が、E17、P6及び成体Df(16)A+/-マウスのHPCと前頭皮質の両方で絶えず変わることはなく、それらのただ一つ(B3gat1、以下参照)がその3'UTR内にmiR-185シード部位を含有すると予想された。全体として、特に翻訳のレベルにおいてmiR-185の他の下流標的は存在し得るが、本発明者らの分析は、Mirta22がmiR-185の主要下流エフェクター、及び22q11.2微小欠失によるmiRNA異常制御の主要中心標的となることを示唆する。
【００８９】
Mirta22は、ゴルジ装置内に存在する新規なニューロンタンパク質をコードする。Mirta22は、如何なる既知の配列相同性又は機能性ドメインも含まない28kDタンパク質をコードする(http://www.uniprot.org/uniprot/Q3TAS6)。マウスオルソログはマウス第7染色体上に位置し、7個のコードエクソンを含有する。ヒトオルソログ(C19orf63)は第19q13.33染色体上に位置し、マウスMirta22タンパク質と92.3%の同一性があるタンパク質をコードする(図6A)。1個のマウス参照配列(アイソフォーム1)がGeneBank中で報告され、一方で2個のC19orf63アイソフォーム(アイソフォーム1及び2)がGeneBank中及び文献中で報告される(24)。アイソフォーム1によってコードされるタンパク質は、N末端シグナルペプチド、及び長鎖N末端領域と未知の機能を有する特徴的ポリグリシン尾部を含有する短鎖C末端セグメントを隔てる推定膜貫通型セグメント(図6A、赤い長方形)を含有すると予想される。アイソフォーム2は可変スプライシングによって生成し、エクソン6後に位置する可変スプライシングエクソンによってアイソフォーム1と異なる。アイソフォーム2によってコードされるタンパク質はわずか8アミノ酸短く、膜貫通型セグメントではなくN末端シグナルペプチドを含有し、それは分泌されると予想される(図6A)。
【００９０】
Mirta22の脳内分布、及び亜細胞局在を調べるため、本発明者らは、両アイソフォームで広がるタンパク質セグメントに対するポリクローナル抗体を産生した(アミノ酸207〜226、図6A、緑色の長方形、抗体産生及び特異性に関する、材料及び方法、並びに図13A、B及びGを参照)。免疫組織化学的分析によって、Mirta22は脳内に広く分布することを実証した(図14)。抗体の特異性は、C末端FLAGタグを有する完全長Mirta22cDNAを発現するプラスミドでトランスフェクトした293T細胞(図13A)、又はMirta22shRNA(図13B)若しくは完全長cDNAプラスミド(図13C)のいずれかでトランスフェクトしたマウス神経芽腫細胞株(N18)由来の、タンパク質抽出物に関するウエスタンブロット分析によって確認した。Df(16)A+/-マウス及びそれらの野生型同腹子の脳由来のタンパク質抽出物のウエスタンブロットアッセイによって、突然変異体マウスにおいて予想されたMirta22レベルの増大(25%)を示した(図6B)。Mirta22免疫細胞化学的シグナルの同程度の増大を、野生型ニューロンと比較してDf(16)A+/-培養ニューロンにおいて観察した(図6C)。培養海馬ニューロンの分析によって、Mirta22の免疫反応性は星状細胞特異的マーカーGFAPではなくニューロン特異的マーカーNeuNと同時局在することが明らかになり、Mirta22がニューロンタンパク質であることを示す(図6D、上図)。Mirta22の免疫反応性はいずれも体中で見られ、この場合それは、樹状突起シャフト内で、ゴルジ装置マーカーGM13025、並びに小胞様クラスター及び管状クラスターと同時局在する(図6D、下図)。Mirta22の免疫反応性は免疫前血清で染色した培養物では検出されず(図13D)、Mirta22shRNAトランスフェクトニューロンにおいて64%低下した(RFP+ニューロン、図13E、下図)。
【００９１】
miR-185の低下はゴルジ関連遺伝子の調節された軽度の異常制御をもたらす。累積した証拠は、しばしば発生段階特異的に、miRNAが機能上関連がある遺伝子を標的化し得ることを示唆する(41、42)。この概念と一致して、DAVIDムス・ムスクルス(Mus musculus)遺伝子機能注釈データベース(http://david.abcc.ncifcrf.gov)中に含まれる2708の予想miR-185標的の機能注釈クラスタリング分析(TargetScan Mouse v5.2)は、上位濃縮遺伝子クラスター(遺伝子数=159、濃縮スコア=8.56、FDR補正P=2×10-9)、Gene Ontology(細胞要素)として項目「ゴルジ装置」を同定した(図23A)。Df(16)A+/-マウスの遺伝子発現プロファイルに基づいてランク付けした2708の予想miR-185標的に関する遺伝子セット濃縮分析(GSEA)は、Gene Ontology項目「ゴルジ装置部分」及び「ゴルジ装置」は成体HPC中の上位20遺伝子セットの間に存在したことも示した(図23A)。Df(16)A+/-マウス29中で示差的に発現された遺伝子間のこのmiR-185標的遺伝子セットの濃縮に関する包括的展望は、成体HPC発現プロファイルの有意な濃縮を示し(P=5×10-4)、この場合予想通り、大部分の上位遺伝子が上方制御された(42個の遺伝子が上方制御され、わずか4個の遺伝子が下方制御された、P<0.005、図23B及び図28)。E17(P=0.02)及びP6HPC(P=0.016)プロファイルに関して、より相当適度な濃縮が示唆された(図24)。興味深いことに、試験した全三年齢(E17:P=0.6311;P6:P=0.1326;成体:P=0.244)におけるPFCプロファイル内に有意な濃縮はなかった。発現変化は適度であった、成体HPCにおける上位100プローブセット間に含まれた159個のゴルジ関連プローブセットのわずか4個。全体として、Mirta22の確固たる有力な上方制御以外に、miR-185レベルの低下が、軽度で、年齢及び領域特異的に、一群のゴルジ装置関連遺伝子の発現に影響を与えると思われる。
【００９２】
Mirta22レベルの上昇はDf(16)A+/-ニューロンにおける樹状突起及びスパイン発達を阻害する。Mirta22レベルの低下が、Df(16)A+/-マウスで観察したニューロン結合の欠陥と部分的に逆行するという観察結果は、Mirta22が樹状突起及びスパイン発達の阻害剤であり得ることを強く示唆する。この可能性を試験し、Mirta22レベルの上昇がDf(16)A型の表現型をコピーするかどうか決定するため、本発明者らはMirta22のcDNAを野生型主要海馬ニューロンに導入し、それぞれDIV9とDIV19においてトランスフェクション後2日で樹状突起及びスパイン形態を測定した。qRT-PCR及びウエスタンブロットを使用した対照実験によって、Mirta22コードプラスミドがmRNAレベルとタンパク質レベルの両方でMirta22発現の増大を誘導することを確認した(図7A、B)。樹状突起構造の分析によって、Mirta22レベルの上昇が、一次樹状突起(18%、P<0.001;図7C)及びトランスフェクトニューロン中の全分岐点(41%、P<10-5;図7D)の数の有意な減少をもたらすことを示した。この発見はSholl分析によって確認した(図26A)。さらに、DIV19ニューロンにおけるMirta22レベルの上昇は、スパイン密度の低下(22%、P<0.05;図7E)及びわずかではあるが有意なマッシュルーム型スパイン幅の減少(メジアン幅の8%の減少、P<0.001、コルモゴロフ-スミルノフ検定;図7F)をもたらす。これらの構造欠陥はDf(16)A+/-ニューロンで観察されるものにおいて反復され、Df(16)A+/-マウスにおけるニューロン欠陥は、少なくとも部分的に異常に高いMirta22レベルに原因があると示唆される。
【００９３】
本発明者らは、Df(16)A+/-マウス由来の主要海馬ニューロンにおけるmir-185レベルの上昇は、微小欠失の結果として現れる幾つかの重要な構造結合欠陥と逆行することを示した。本発明者らは、Mirta22がmir-185の主な標的であることも示した。したがって本発明者らは、Mirta22レベルの上昇が、Df(16)A+/-マウス中のニューロン形態に対するmir-185欠陥の影響の少なくとも幾つかに貢献し得る可能性を考えた。この仮説を試験するため、本発明者らは、Mirta22レベルの低下が、Df(16)A+/-マウスで観察したニューロン異常に部分的に逆行し得るかどうか最初に調べた(9)。本発明者らは、turbo RFP(tRFP)を同時発現する構築物、及び内生マウスMirta22の発現をノックダウンするよう操作処理したshRNA又はスクランブル対照shRNA(scrshRNA)のいずれかで、Df(16)A+/-胚及びそれらの野生型同腹子から単離した主要海馬ニューロンをトランスフェクトした。本発明者らは、Mirta22のshRNAが、mRNAとタンパク質レベルの両方でMirta22の発現を効率よくノックダウンすることができることを確認した(図7G、7H及び15A)。本発明者らは、それぞれDIV9及びDIV19において、トランスフェクション後2日で樹状突起構造及びスパイン形態を分析した。以前の報告と一致して、本発明者らは、対照shRNAでトランスフェクトしたDf(16)A+/-ニューロンにおいて有意に低下した樹状突起の複雑性を観察した(図7I、J)。Mirta22のshRNAの導入によって、DIV9におけるDf(16)A+/-ニューロンの一次樹状突起数は野生型レベルに回復した(Mirta22shRNA対scrshRNA、40%増大、P<10-5;図7I)。Df(16)A+/-ニューロンにおける分岐点の合計数の増大も観察したが、有意な状態には達しなかった(25%増大、P=0.16;図7J)。Sholl分析によって、Df(16)A+/-ニューロンにおけるMirta22のshRNAの導入によって、主に体から近辺の樹状突起セグメントにおける分岐点数が増大したことを確認した(図26B)。さらに、対照shRNAでトランスフェクトしたDIV19におけるDf(16)A+/-ニューロンは野生型ニューロンより少数で薄型のマッシュルーム型スパインを有していたが、Df(16)A+/-ニューロンへのMirta22のshRNAの導入はスパイン密度の欠陥と逆行し(Mirta22shRNA対scrshRNA、91%増大、P<10-6;図7K)、一方それはスパイン幅に対して全く影響がなかった(図7L)。Mirta22レベルの低下はDf(16)A+/-マウスで観察した構造欠陥と部分的に逆行するという観察結果を、独立したMirta22のshRNAを使用して確認し(図26C〜E)、樹状突起の構造突然変異及びスパイン増殖の影響を仲介する阻害剤として、Mirta22が作用することを強く示唆する。
【００９４】
6.3  考察
病原性CNVによって影響を受ける生物学的プロセスの解明によって、精神障害及び認知発達障害の病因に対する新規な見識をもたらすことができる(2)。しかしながら、ニューロン構造及び機能に対するCNVの影響を仲介する転写ネットワーク及びシグナル伝達カスケードは、依然大部分が特徴付けられていない。この試験は、統合失調症及び認知機能障害の素因である真正病原性突然変異によって妨害される、このような下流標的及びプロセスを確認するために設計した。一連の形態、分子及び細胞アッセイをこの突然変異のマウスモデルに施すことによって、本発明者らは幾つかの新規な機構見識をもたらす。
【００９５】
第一に、Dgcr8のヘミ接合性の影響に関する前の結果をまとめ(18、8)、本発明者らは、miR-185とDgcr8のヘミ接合性の組合せ(相乗及び追加的)効果によって形成される、22q11.2欠失が原因で生じるmiRNAの異常制御パターンに関する包括的見解を与える(グラフの要約を参照)。本文脈において、本発明者らの結果は、どのようにして病原性CNV内の真正遺伝子×遺伝子相互作用が、遺伝子量の50%の減少によって予想したより大幅に高い残存遺伝子の発現の低下をもたらし得るかを示し、単なるハプロ不全以外の機構が、重要で以前は認められなかったCNV病原性の構成要素となり得ることを示す。これらのラインに沿って、本発明者らの結果は、miRNA機構によって部分的に妨害される22q11.2微小欠失が、miRNAサブセットの発現又は活性に影響を与える有害突然変異の影響を助長する敏感な遺伝的背景を生み出す、より一般的で興味深い可能性をさらにもたらす(43、44)。
【００９６】
第二に、三つの発達段階にわたる遺伝子発現プロファイルと22q11.2遺伝子座における様々なレベルのゲノム量を比較することによって、本発明者らは、22q11.2微小欠失から生じる遺伝子発現の最も確かな変化として、以前に特徴付けされなかった遺伝子、Mirta22のレベルの上昇、及び22q11.2関連miRNA異常制御の主要な下流転写効果を確認した。
【００９７】
第三に、生理学的関連がある細胞モデルを使用して、本発明者らは、Mirta22及びその主要miRNAレギュレーター(miR-185)は、少なくとも部分的に、樹状突起及びスパイン形成に対する22q11.2微小欠失の影響を仲介する明白な証拠を与える。主要ニューロンの一過性トランスフェクションを介した遺伝子発現の急性操作からの結果は定量的に過剰解釈することはできないが、多数の実験操作及び手法から観察したデータの収束及び顕著な一貫性によって、以前に記載したクラスの発生段階モジュレーターのいずれにも属さないニューロン成熟のmiRNA制御阻害因子としてMirta22を確実に同定した。
【００９８】
樹状突起内のゴルジ装置及び小胞及び管状延長部内のMirta22の局在は、ニューロン結合の確定及び維持に必要な、膜並びにタンパク質輸送及び分泌における役割と一致する(28)。Mirta22はおそらく、ゴルジ装置内にも位置し樹状突起及びスパイン発達を調節することが示されているZdhhc8パルミトイルトランスフェラーゼ(9)を含めた、22q11.2欠失(2)内の他の遺伝子と一緒に作用する。miRNA異常制御と改変型ニューロンパルミトイル化の間の潜在的相互作用は以前の発見によって支持され(45、21)、この試験において記載された2個以上の遺伝子から形態表現型への貢献は、22q11.2微小欠失と関係がある精神及び認知症状に関するオリゴ生成基盤と一致する(2)。さらに、Mirta22はmiR-185異常制御の主要下流エフェクターとなるが、ゴルジ装置関連遺伝子の調節されたmiR-185標的化に関する本発明者らの発見は、Mirta22上方制御は、他の適度に改変されたmiR-185標的と一緒に年齢及び脳領域特異的に作用して、ニューロン成熟に必要なゴルジ関連プロセスに干渉し得ることを示唆する。したがって本発明者らの発見は、ゴルジ装置と22q11.2微小欠失と関係があるニューロン表現型の間の関係に焦点を当てる。
【００９９】
出生直後の活発なニューロン成熟及びシナプス生成期中におけるMirta22レベルの低下は、この遺伝子の抑制が、胚形成ニューロンがそれらの最終地点に移動した後、特に出生後脳内の神経回路形成の促進において重要な役割を果たし得ることを示唆する。miRNAはそれらの標的の発現レベルの微調整レギュレーターとして主に働くという考えと一致して(26、27)、miR-185及び低い程度ではあるが22q11.2欠失によって影響を受ける他のmiRNAは、Mirta22発現を制限及び最適化すると思われ、シナプス形成のこの重要段階中の過剰な阻害をおそらく回避する。したがって、22q11.2遺伝子座におけるゲノム消失が原因の遺伝子の持続的機能低下は、発達初期の神経回路の形成、及び成体期中のそれらの維持に対して影響を有し得る。このような構造変化は、認知機能障害、精神機能障害又は両方に貢献し得る、局所及び長区間にわたる神経伝達の妨害をもたらす可能性がある(18、46)。この予想と一致して、Mirta22のヒトオルソログ(C19orf63)の発現は幼児脳において低下し(40)、ニューロリジン(Neuroligin)-3の一つと有意に重複する空間-時間パターンを示し、シナプス及び回路形成及び成熟と関連があるプロセスにおける関与と一致する(47)。さらに、ヒト胎児期と出生後初期発達段階の間の移行中に、多数の遺伝子が子宮内での増加から出生後数ヶ月の減少までそれらの発現方向が逆行すること、及びそれらの約40%はmiRNA標的であると予想されることが示されている(40)。その点でMirta22は、出生後の脳発達中のmiRNA仲介型阻害制御を示すこの主要型の転写過程を表す、疾患関連遺伝子の第一例の一つである。
【０１００】
累積した証拠は、miRNAが精神障害及び認知機能障害の病因と病態生理において重要な役割を果たすことを示唆する(29、14)。本発明者らの実験は、疾患関連miRNA異常制御の主要下流標的を明らかに同定し、その機能を特徴付けた第一例の一つとなる。Mirta22レベルの上昇が、ニューロン構造及び機能の他の態様に影響を与えるかどうか決定することが対象となる。Df(16)AとMirta22の機能消失対立遺伝子がヘテロ接合したマウス群におけるMirta22レベルの標準化を伴う将来の試験も、Df(16)A+/-マウスで観察した様々な行動(8)、認知(48、8)及び回路変化(18、46)のどれが、Mirta22上方制御の阻害影響に起因し得るか確定するはずである。さらに、Mirta22機能の阻害は22q11.2欠失担体におけるニューロン結合の形成を促進すると予想されるので、この分子を標的化する薬剤を使用して、関連する認知及び精神障害の表現型を改善することができる。
【０１０１】
7.  参考文献
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様々な参考文献が本明細書で引用されており、これら参考文献の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ−Ｂ】
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【図１Ｃ−Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−Ｅ】
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【図３Ａ−Ｄ】
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【図３Ｅ−Ｇ】
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【図３Ｈ−Ｊ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ−Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ−Ｅ】
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【図５Ｆ−Ｈ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ−Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ−Ｃ】
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【図７Ｄ−Ｆ】
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【図７Ｇ−Ｉ】
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【図７Ｊ−Ｌ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１３Ｃ−Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ−Ｇ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ−Ｃ】
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【図１７Ｄ−Ｆ】
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【図１８Ａ−Ｂ】
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【図１８Ｃ−Ｄ】
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【図１８Ｅ−Ｆ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ−Ｄ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ−１】
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【図２３Ａ−２−３】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ−Ｂ】
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【図２６Ｃ−Ｅ】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２８−３】
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【図２８−４】
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【図２８−５】
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【図２８−６】
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【図２８−７】
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【図２８−８】
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【図２８−９】
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【図２８−１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年4月22日(2013.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
抗体。20アミノ酸ペプチド([H]-CEQAQKAKNPQEQKSFFAKY-[NH2])(配列番号21)を使用してウサギポリクローナル抗体を作製した。抗体の特異性は図11中に記載したように決定した。ウエスタンブロット、免疫組織化学的及び免疫細胞化学的アッセイは前に記載したように実施した(8、9)。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
qRT-PCR及びプライマー。全てのRNAは、製造者の説明書に従いmiRNeasyミニキット(QIAGEN)を使用して脳又は培養細胞から単離した。qRT-PCRは前に詳細に記載したように実施した(8)。使用したプライマーの配列は以下の通りである:
Mirta22:F:CTGCTGTCAATGGCCTCTAC(配列番号22)、
R:GTCCGAAAGGTGCGACTC(配列番号23)
ハイブリダイゼーションプローブ:CATGGCCGCCAGCTTCTGA(配列番号24)
mmu-miR-185:ABI TaqmanアッセイID002271。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
ルシフェラーゼアッセイ。Mirta22の3'UTRをpsiCHECK2(Promega)のXhoI及びNotI部位にクローニングした。結合部位突然変異クローンをPCRベースの突然変異誘発によって作製した。部位Mut1配列(3'UTR中の位置289から始まる): GGAgtTTGCCAAGCTCggTaaA(配列番号25;小文字は改変ヌクレオチドを示す)。部位Mut2配列(位置350から始まる):AtTGTCACgCTaaA(配列番号26)。突然変異はRNAhybrid36によって予想し、シード及び二次結合部位におけるmir-185の結合を妨害する。N18神経芽腫細胞を、他に言及しない限り様々なpsiCHECK2レポーター構築物(24ウエルプレートのウエル当たり100ng)及びプレ-mir-185模倣体又はプレ-スクランブル対照(1nM=0.5pmol)でトランスフェクトし、製造者の説明書の下デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム(Promega)を使用して、トランスフェクション後24時間でルシフェラーゼアッセイを実施した。全ての実験は少なくとも2回実施し、示した全てのデータは3回の技術反復の平均である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
抗体産生。20アミノ酸ペプチド([H]-CEQAQKAKNPQEQKSFFAKY-[NH2])(配列番号21)を設計、合成し、KLH(キーホールリンペットヘモシアニン)と結合させ、次いでCovanceカスタム抗体産生サービス(Covance)を使用してウサギに注射した。次いで抗体血清を、Melon Gel IgG精製キット(Thermo Scientific)を使用して精製し、精製した抗体はウエスタンブロット(1:50)、免疫組織化学的及び免疫細胞化学的アッセイ(1:25)に使用した。
【国際調査報告】
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