(57)【要約】本発明は単離されたペプチド、これを含む組成物およびマクロファージが浸潤した腫瘍、例えば神経膠芽腫を治療するためのその使用方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＭ−ＣＳＦ活性を阻害するための単離されたペプチドであって、前記ペプチドは下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で明記されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で明記されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で明記されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で明記されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で明記されるアミノ酸配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で明記されるアミノ酸配列；前記ペプチドは７−２５のアミノ酸を有する、単離されたペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは７−２０のアミノ酸を有する、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドは環状ペプチドである、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項以上に記載の単離されたペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１１】
前記薬学的に許容される担体は下記からなる群より選択される、請求項１０に記載の医薬組成物：水溶液、植物油、アルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールまたはグリセリン。
【請求項１２】
神経膠腫を治療するための請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記神経膠腫は下記からなる群より選択される、請求項１２に記載の医薬組成物：上衣腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、神経膠芽腫、または混合性神経膠腫。
【請求項１４】
治療の必要な被験体に、治療的有効量の、ＧＭ−ＣＳＦ活性を阻害することができるペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む、神経膠腫を治療する方法であって、前記ペプチドは下記からなる群より選択される配列を含む、方法：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で明記されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で明記されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で明記されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で明記されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で明記されるアミノ酸配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で明記されるアミノ酸配列。
【請求項１５】
前記ペプチドは７−２０のアミノ酸を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で明記される配列またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペプチドは環状ペプチドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記神経膠腫は下記からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法：上衣腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、神経膠芽腫、または混合性神経膠腫。
【請求項２４】
神経膠腫の治療は下記からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法：食作用の低減、運動性の低減、腫瘍促進活性を有する腫瘍浸潤マクロファージの増殖の低減、およびマクロファージによる炎症促進性サイトカインまたはケモカインの分泌の低減。
【請求項２５】
請求項１０〜１３のいずれか一項以上に記載の医薬組成物およびキットを使用するための説明書を含む、神経膠腫の治療のためのキット。
【請求項２６】
ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）モチーフを含む単離されたペプチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７を含む、単離されたペプチド。
【請求項２７】
７−２０のアミノ酸からなる、請求項２６に記載の単離されたペプチド。
【請求項２８】
７−１５のアミノ酸からなる、請求項２６に記載の単離されたペプチド。
【請求項２９】
前記ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項２６に記載の単離されたペプチド。
【請求項３０】
請求項２６〜２９のいずれか一項以上に記載の単離されたペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項３１】
前記薬学的に許容される担体は下記からなる群より選択される、請求項３０に記載の医薬組成物：水溶液、植物油、アルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、またはグリセリン。
【請求項３２】
神経膠腫を治療するための請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記神経膠腫は下記からなる群より選択される、請求項３０に記載の医薬組成物：上衣腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、神経膠芽腫、または混合性神経膠腫。
【請求項３４】
治療の必要な被験体に、治療的有効量の、ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）モチーフを含むペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む、神経膠腫を治療する方法であって、前記ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で明記されるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項３５】
前記ペプチドは７−２０のアミノ酸を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ペプチドは７−１５のアミノ酸を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で明記される配列またはその類似体もしくは誘導体から構成される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記ペプチドは環状ペプチドである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記神経膠腫は下記からなる群より選択される、請求項３４に記載の方法：上衣腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、神経膠芽腫、または混合性神経膠腫
【請求項４０】
神経膠腫の治療は下記からなる群より選択される、請求項３４に記載の方法：食作用の低減、運動性の低減、腫瘍促進活性を有する腫瘍浸潤マクロファージの増殖の低減、およびマクロファージによる炎症促進性サイトカインまたはケモカインの分泌の低減。
【請求項４１】
請求項３０〜３３のいずれか一項以上に記載の医薬組成物およびキットを使用するための説明書を含む、神経膠腫の治療のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は単離されたペプチド、これを含む組成物およびマクロファージが浸潤した腫瘍、例えば神経膠芽腫を治療するためのその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経膠芽腫は、治療が最も困難なヒト悪性腫瘍の１つと考えられる。
【０００３】
臨床および実験研究は脳常在性マクロファージ（ミクログリア）、末梢単球／マクロファージおよび骨髄系由来サプレッサー細胞による悪性神経膠腫組織の浸潤を示している。それらの細胞の腫瘍内密度は、神経膠腫進行中に増加し、器官型脳切片培養物におけるミクログリアの悪性度および消失と相関し、動物神経膠腫モデルは、神経膠腫浸潤のサポートにおけるその重要な役割を証明した（Ｇａｂｒｕｓｉｅｗｉｃｚ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳＯｎｅ；６（８）：ｅ２３９０２，２０１１）。
【０００４】
マクロファージは、腫瘍放出分子により引きつけられ、抗腫瘍応答を開始する代わりに、それらの細胞は異なる型の腫瘍での浸潤、血管新生、細胞外マトリクスリモデリングおよび免疫抑制をサポートすることが示唆される（Ｇａｂｒｕｓｉｅｗｉｃｚ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，同様）。
【０００５】
オステオポンチン（ＯＰＮ）は白血球により発現されるα４β１、α９β１、およびα９β４を含むいくつかのインテグリン受容体に結合することが示されているインテグリン結合リガンドである。ＯＰＮは様々な免疫細胞、例えばマクロファージ、好中球、樹状細胞、ならびにＴおよびＢ細胞において発現される。ＯＰＮは免疫モジュレーターとして作用することが報告されている。それは走化性特性を有し、炎症部位への細胞動員を促進する。それはまた、細胞付着および創傷治癒に関与する接着タンパク質として機能する。加えて、ＯＰＮは細胞活性化およびサイトカイン産生を媒介し、ならびにアポトーシスを制御することにより細胞生存を促進する。
【０００６】
マクロファージの活性化におけるＯＰＮの役割はまた、癌研究において暗示されており、この場合、研究者は、ＯＰＮ産生腫瘍はＯＰＮ欠損腫瘍に比べマクロファージ活性化を誘導することができたことを発見した（Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ＨＣ，ｅｔ  ａｌ．１９９８  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（２２）：５２０６−１５）。
【０００７】
ラクトアドヘリンは、乳脂肪球−上皮成長因子８（ＥＧＦ−８）としても知られており、これは、マクロファージにより分泌される糖タンパク質である。ラクトアドヘリンはアポトーシス細胞、活性化血小板、およびホスファチジルセリン発現赤血球に結合し、それらをマクロファージインテグリンにそのＲＧＤ配列を介して固着する。
【０００８】
顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、マクロファージ、Ｔ細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、内皮細胞および線維芽細胞により分泌されるタンパク質である。ＧＭ−ＣＳＦは白血球増殖因子として機能するサイトカインである。そのため、それは免疫／炎症カスケードの一部であり、これにより、少数のマクロファージの活性化は迅速にそれらの数の増加に至らしめ、感染と闘うための重要な過程である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
神経膠腫などの腫瘍においてマクロファージの腫瘍促進活性を阻害することができる阻害剤を同定するための満たされいていない要求がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
単離されたペプチド、これを含む組成物および、腫瘍促進活性を有し、腫瘍の増殖または維持に寄与するマクロファージが浸潤した腫瘍（「浸潤マクロファージ」）を有する被験体を治療するためのその使用方法が本明細書で提供される。
【００１１】
よって、本発明は初めて、腫瘍促進活性を有するマクロファージを有する腫瘍、例えば、神経膠腫を治療するための手段を提供する。
【００１２】
発明の１つの態様によれば、ＧＭ−ＣＳＦ活性を阻害する単離されたペプチドが提供され、ペプチドは下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で明記されるアミノ酸配列（ＣＧＫＡＳＡＴＫＧＫＧＥＡＴＧＧＣ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で明記されるアミノ酸配列（ＣＧＴＡＥＧＫＧＧＫＧＴＡＳＡＫＧＧＣ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で明記されるアミノ酸配列（ＱＰＷＥＨＶＮＡＩＱＥＲＲＬＬＮＬＳＲ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で明記されるアミノ酸配列（ＫＤＦＬＬＶＩＰＦＤＣＷＥＰＶＱＥ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で明記されるアミノ酸配列（ＦＱＹＱＬＤＶＨＲＫＮ）；およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で明記されるアミノ酸配列（ＡＤＶＲＩＬＮ）。各可能性は別々の実施形態である。
【００１３】
発明の別の態様によれば、ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）モチーフを含む単離されたペプチドが提供され、ここで単離されたペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で明記されるアミノ酸配列（ＤＧＲＧＤＳＶ）を含む。
【００１４】
１つの実施形態によれば、ペプチドは７−２５のアミノ酸を有する。別の実施形態によれば、ペプチドは７−２０のアミノ酸を有する。
【００１５】
さらに別の実施形態によれば、単離されたペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される。あるいは、単離されたペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される。あるいは、単離されたペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される。あるいは、単離されたペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される。あるいは、単離されたペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される。あるいは、単離されたペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される。あるいは、単離されたペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される。
【００１６】
さらに別の実施形態によれば、ペプチドは環状ペプチドである。
【００１７】
発明のさらに別の態様によれば、下記からなる群より選択される単離されたペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で明記されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で明記されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で明記されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で明記されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で明記されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で明記されるアミノ酸配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で明記されるアミノ酸配列（本質的に発明の前の態様において開示される）。
【００１８】
１つの実施形態によれば、薬学的に許容される担体は下記からなる群より選択される：水溶液、植物油、アルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールまたはグリセリン。各可能性は別々の実施形態である。
【００１９】
別の実施形態によれば、医薬組成物は神経膠腫を治療するためのものである。さらに別の実施形態によれば、神経膠腫は下記からなる群より選択される：上衣腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、神経膠芽腫または混合性神経膠腫。各可能性は別々の実施形態である。
【００２０】
発明のさらに別の態様によれば、治療の必要な被験体に、治療的有効量の、ＧＭ−ＣＳＦ活性を阻害することができるペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む神経膠腫を治療するための方法が提供され、ここで前記ペプチドは下記からなる群より選択される配列を含む：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で明記されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で明記されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で明記されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で明記されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で明記されるアミノ酸配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で明記されるアミノ酸配列（本質的に発明の前の態様において開示される）。
【００２１】
発明のさらに別の態様によれば、治療の必要な被験体に治療的有効量の、ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）モチーフを含むペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む神経膠腫を治療するための方法が提供され；前記ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で明記されるアミノ酸配列を含む。
【００２２】
１つの実施形態によれば、ペプチドは７−２５のアミノ酸を有する。別の実施形態によれば、ペプチドは７−２０のアミノ酸を有する。
【００２３】
さらに別の実施形態によれば、ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される。あるいは、単離されたペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される。あるいは、単離されたペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される。あるいは、単離されたペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される。あるいは、単離されたペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される。あるいは、単離されたペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される。あるいは、単離されたペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で明記される配列、またはその類似体もしくは誘導体から構成される。
【００２４】
さらに別の実施形態によれば、ペプチドは環状ペプチドである。
【００２５】
さらに別の実施形態によれば、神経膠腫は下記からなる群より選択される：上衣腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、神経膠芽腫、または混合性神経膠腫。各可能性は別々の実施形態である。さらに別の実施形態によれば、神経膠腫の治療は下記からなる群より選択される：食作用の低減、運動性の低減、腫瘍促進活性を有する腫瘍浸潤マクロファージの増殖の低減、および前記マクロファージによる炎症促進性サイトカインまたはケモカインの分泌の低減。各可能性は別々の実施形態である。
【００２６】
発明の別の態様によれば、下記からなる群より選択される単離されたペプチドを含む医薬組成物およびキットを使用するための説明書を含む神経膠腫の治療のためのキットが提供される：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で明記されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で明記されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で明記されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で明記されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で明記されるアミノ酸配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で明記されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で明記されるアミノ酸配列（本質的に発明の前の態様において開示される）。
【００２７】
本発明の他の目的、特徴および利点は下記記載から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】神経膠腫馴化培地（ＧＣＭ）で処理したミクログリア細胞の誘導されたアメーバ状形質転換および運動性を示す：（Ａ）光学コントラスト顕微鏡法（上パネル）またはＦ−アクチン染色細胞の免疫−蛍光顕微鏡法（下パネル）のいずれかによる、ＧＣＭ馴化培地に曝露させたラット初代ミクログリア培養物の細胞骨格変化の顕微鏡法分析；（Ｂ）ＬＰＳおよびＧＣＭ処理後の免疫ブロットサイクリンＤ１およびｐＲｂ；（Ｃ）ＧＣＭ処理ミクログリア細胞のスクラッチアッセイ；（Ｄ）蛍光標識されたビーズを接種されたＧＣＭ処理ミクログリア細胞の食作用アッセイ。
【図２】ＧＣＭ処理ミクログリア細胞における炎症シグナル伝達の欠如を示す：（Ａ）ＧＣＭおよびＬＰＳ処理ミクログリア細胞におけるリン酸化（ｐ）または総ＭＡＰＫキナーゼに対する抗体を用いたウエスタンブロット；（Ｂ）ＧＣＭおよびＬＰＳ処理ミクログリア細胞におけるＮＦκＢ阻害剤（ＩκＢ）およびそのリン酸化形態（ｐＩκＢ）の免疫ブロッティング；（Ｃ）ＧＣＭおよびＬＰＳ処理ミクログリア細胞におけるリン酸化ＳＴＡＴ転写因子（シグナル伝達性転写因子）の免疫ブロッティング；（Ｄ）ＬＰＳおよびＧＣＭ、刺激ミクログリア細胞における炎症メディエーターｉＮＯＳおよびＣＯＸ２の免疫ブロッティング。
【図３】ＧＣＭおよびＬＰＳ刺激の結果として、ミクログリア細胞において誘導された転写変化の比較を示す。
【図４】ＧＣＭまたはＬＰＳのいずれかで刺激されたミクログリア培養物における選択された遺伝子のリアルタイムＰＣＲを示す。
【図５】ミクログリア活性化画分における神経膠腫由来タンパク質、オステオポンチンおよびラクトアドヘリン；およびオステオポンチンおよびラクトアドヘリンを過剰発現するラットＣ６神経膠腫細胞を示す：（Ａ）ＧＣＭ培地の分画およびミクログリア細胞をアメーバ状細胞に形質転換する能力のスコアリング；（Ｂ）活性化画分のＭＳ／ＭＳ分析；（Ｃ）活性化画分の食作用アッセイ；（Ｄ）非形質転換皮質アストロサイトと比べた、Ｃ６神経膠腫細胞におけるオステオポンチンアイソフォーム（ｓｐｐ１ａおよびｓｐｐ１ｃ）およびラクトアドヘリンのリアルタイムＰＣＲ；およびＣ６神経膠腫細胞によるオステオポンチン分泌のＥＬＩＳＡアッセイ。
【図６】ＲＧＤ含有ペプチドを用いた処理によるインテグリン結合の妨害、ならびに神経膠腫に誘導されたアクチン細胞骨格変化、食作用および細胞運動性のブロッキングを示す：（Ａ）ＲＧＤ阻害剤が補充されたＧＣＭ培地を用いてプレインキュベートしたミクログリア細胞におけるＦ−アクチンの免疫蛍光顕微鏡法；（Ｂ）ＲＧＤ阻害剤が補充されたＧＣＭ培地を用いてプレインキュベートしたミクログリア細胞の食作用アッセイ；（Ｃ）ＲＧＤ阻害剤が補充されたＧＣＭ培地を用いてプレインキュベートしたミクログリア細胞のスクラッチアッセイ；（Ｄ）αｖ、β３（または両方）インテグリンサブユニットに対するｓｉＲＮＡで処理した細胞の食作用アッセイ；（Ｅ）ＲＧＤ阻害剤が補充されたＧＣＭ培地を用いてプレインキュベートしたミクログリア細胞におけるリン酸化ＦＡＫの免疫ブロッティング；（Ｆ）インテグリンリガンド、細胞内経路および動きの速い、アメーバ状マクロファージへの細胞形質転換の間の提示された関係のモデル。
【図７】ＧＣＭに誘導された遺伝子発現およびミクログリア依存性神経膠腫浸潤性に関するラクトアドヘリンおよびオステオポンチンサイレンシングの明白な効果を示す：（Ａ）対照（ｓｈＮｅｇ）、またはラクトアドヘリンｓｈＲＮＡを安定して発現するＣ６神経膠腫細胞におけるラクトアドヘリン（ｍｆｇｅ８）の定量的ＰＣＲ；（Ｂ）ラクトアドヘリン枯渇ＧＣＭ処理神経膠腫細胞における選択された遺伝子の定量的ＰＣＲ；（Ｃ）対照（ｓｈＮｅｇ）またはオステオポンチンｓｈＲＮＡを安定して発現するＣ６神経膠腫細胞におけるオステオポンチン（ｓｐｐ１）の定量的ＰＣＲ；（Ｄ）オステオポンチン枯渇ＧＣＭ処理神経膠腫細胞における選択された遺伝子の定量的ＰＣＲ；（Ｅ）オステオポンチンおよびラクトアドヘリン枯渇ミクログリア細胞の存在または非存在下での神経膠腫細胞のマトリゲルマトリクス浸潤アッセイ。
【図８】組換えオステオポンチンおよびラクトアドヘリンを発現するマウス線維芽細胞由来の培地に曝露したミクログリア細胞の誘導された食作用およびアメーバ状形質転換を示す：（Ａ）オステオポンチンおよび／またはラクトアドヘリンをコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞におけるラクトアドヘリン（ｍｆｇｅ８）およびオステオポンチン（ｓｐｐ１）の定量的ＰＣＲ；（Ｂ）ラットラクトアドヘリン（ｍｆｇｅ８）および／またはオステオポンチン（ｓｐｐ１）を発現する線維芽細胞由来の馴化培地に曝露したミクログリア培養物の食作用アッセイ；（Ｃ）ラクトアドヘリン（ｍｆｇｅ８）、および／またはオステオポンチン（ｓｐｐ１）を発現する線維芽細胞由来の馴化培地に曝露したミクログリア細胞におけるＦ−アクチンの免疫蛍光顕微鏡法。
【図９】組換えオステオポンチンを発現するマウス線維芽細胞由来の培地に曝露したミクログリア細胞におけるＭ２表現型マーカー遺伝子の誘導された発現を示す：（Ａ）組換えオステオポンチンおよび／またはラクトアドヘリンを発現するマウス線維芽細胞由来の培地に曝露したミクログリア細胞におけるリン酸化（ｐ）または総ＩκＢならびにＳＴＡＴ１、３および５に対する抗体を使用したウエスタンブロット；（Ｂ）オステオポンチンおよび／またはラクトアドヘリンを発現する線維芽細胞由来の馴化培地に曝露したミクログリア培養物における選択された遺伝子のリアルタイムＰＣＲ。
【図１０】ＧＬ２６１神経膠腫細胞におけるＧＭ−ＣＳＦサイレンシングおよび細胞生存または増殖を示す：（Ａ）非形質転換アストロサイトと比べた、ＧＭ−ＣＳＦ特異的ｓｈＲＮＡを安定して発現する神経膠腫細胞におけるＧＭ−ＣＳＦのリアルタイムＰＣＲ；（Ｂ）非形質転換アストロサイトと比べた、ＧＭ−ＣＳＦ特異的ｓｈＲＮＡを安定して発現する神経膠腫細胞におけるＧＭ−ＣＳＦタンパク質レベルの定量化；（Ｃ）ｓｈＧＭ−ＣＳＦを安定して発現する神経膠腫細胞のＢｒｄＵ取り込みアッセイ；（Ｄ）ｓｈＧＭ−ＣＳＦを安定して発現する神経膠腫細胞のＭＴＴ生存アッセイ。
【図１１】ＧＭ−ＣＳＦ枯渇神経膠腫における脳マクロファージの動員の障害および腫瘍サイズの低減を示す：（Ａ）ｓｈＮｅｇまたはｓｈＧＭ−ＣＳＦのいずれかを安定して発現する神経膠腫細胞が移植されたマウス脳から抽出されたミクログリア細胞における抗Ｉｂａ−１染色の顕微鏡法分析；（Ｂ）（Ａ）の定量化；（Ｃ）対照と比べた、ＧＭ−ＣＳＦ枯渇神経膠腫細胞が移植された抗ｖＷＦ抗体マウスを用いた血管の染色。ＧＭ−ＣＳＦ枯渇ＥＧＦＰ−ＧＬ２６１神経膠腫細胞における腫瘍サイズ分析；（Ｄ）ＧＭ−ＣＳＦ枯渇神経膠腫細胞が移植されたマウスにおける腫瘍体積の定量化；（Ｅ）対照（ｓｈＮｅｇ）またはＧＭ−ＣＳＦ枯渇ＥＧＦＰ−ＧＬ２６１神経膠腫細胞が移植されたマウスにおける神経膠腫の代表的な画像。
【図１２】ミクログリア細胞存在下でのＧＭ−ＣＳＦ枯渇神経膠腫細胞の浸潤性の低減を示す：（Ａ）ミクログリア細胞の存在／非存在下での対照またはＧＭ−ＣＳＦ枯渇ＥＧＦＰ−ＧＬ２６１神経膠腫細胞が注射されたマウス脳切片培養物におけるＥＧＦＰ−神経膠腫細胞によりカバーされた蛍光面積により腫瘍サイズを測定する浸潤アッセイ；（Ｂ）Ａの定量化。
【図１３】Ｍ−ＣＳＦ欠損、ｏｐ／ｏｐマウスにおけるミクログリア／マクロファージの蓄積の欠如、血管新生の欠如および腫瘍増殖を示す：（Ａ）ＴａｑＭａｎアレル識別方法によるＢ６Ｃ３Ｆｅ  ａ／ａ−Ｃｓｆ１ｏｐ／Ｊマウスの遺伝子型判定；（Ｂ）大理石骨病ｏｐ／ｏｐおよび野生型（ＷＴ）の脳におけるミクログリア細胞、マクロファージおよびリンパ球のパーセンテージを定量するフローサイトメトリー分析；（Ｃ）ｏｐ／ｏｐおよびＷＴマウスの血液における単球、リンパ球および顆粒球のパーセンテージを定量するフローサイトメトリー分析；（Ｄ）ＧＦＰ発現ＧＬ２６１神経膠腫細胞を脳内に接種されたｏｐ／ｏｐおよびＷＴマウスの脳におけるミクログリア細胞、マクロファージおよびリンパ球のパーセンテージを定量するフローサイトメトリー分析；（Ｅ）ＧＦＰ発現ＧＬ２６１神経膠腫細胞を脳内に接種されたｏｐ／ｏｐおよびＷＴマウスの血液における単球、リンパ球および顆粒球のパーセンテージを定量するフローサイトメトリー分析；（Ｆ）ＥＧＦＰ−ＧＬ２６１神経膠腫細胞を接種された大理石骨病およびＷＴマウスのミクログリア細胞の顕微鏡法分析；抗Ｉｂａ−１抗体で染色し、ＤＡＢで可視化；（Ｇ）（Ｆ）の定量化；（Ｈ）ＥＧＦＰ−ＧＬ２６１神経膠腫細胞を接種された大理石骨病およびＷＴマウスにおける腫瘍体積。
【図１４】大理石骨病ｏｐ／ｏｐマウスの脊髄限局性脱髄病変における蓄積されたミクログリア／マクロファージの低減を示す：（Ａ）脊髄病変を有するＷＴおよびｏｐ／ｏｐマウスにおける抗Ｉｂａ−１抗体で染色され、ＤＡＢで可視化されたミクログリア／マクロファージの顕微鏡法分析；（Ｂ）（Ａ）の定量化。
【図１５】ＣＳＦ−２発現、高い腫瘍グレードおよび低い患者生存の間の相関を示す：（Ａ）ヒト神経膠腫生検におけるＣＳＦ−１およびＣＳＦ−２発現の定量分析；（Ｂ）それぞれ、ＣＳＦ−２上方および下方制御を有する患者のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存プロット。
【図１６】対照またはＧＭ−ＣＳＦ特異的ｓｈＲＮＡを発現する頭蓋内神経膠腫を有するマウスに対する生存曲線を示す。
【図１７】ＯＰＮ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦＲのペプチド阻害剤で処理したマウスミクログリア細胞と共にインキュベートしたヒト神経膠腫細胞における別のミクログリア活性化マーカーの減衰した発現を示す：（Ａ）指示されたペプチドが補充されたＧＣＭ中で培養されたＵ８７−ＭＧヒト神経膠腫細胞におけるＡｒｇ１のリアルタイムＰＣＲ；（Ｂ）および（Ｃ）指示されたペプチドが補充されたＧＣＭ中で培養されたＵ８７−ＭＧヒト神経膠腫細胞におけるＩｄ１のリアルタイムＰＣＲ；（Ｄ）指示されたペプチドが補充されたＧＣＭ中で培養されたＵ８７−ＭＧヒト神経膠腫細胞におけるｃ−ＭｙｃのリアルタイムＰＣＲ；（Ｅ）指示されたペプチドが補充されたＧＣＭ中で培養されたＵ８７−ＭＧヒト神経膠腫細胞におけるＭＭＰ−１４のリアルタイムＰＣＲ；（Ｆ）指示されたペプチドが補充されたＧＣＭ中で培養されたＵ８７−ＭＧヒト神経膠腫細胞におけるｉＮＯＳのリアルタイムＰＣＲ。
【図１８】ＧＭ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦＲペプチド阻害剤で処理したミクログリア細胞の存在または非存在下での神経膠腫細胞のマトリゲルマトリクス浸潤アッセイを示す。
【図１９】オステオポンチンのＲＮＡｉ媒介永久サイレンシングを有するインビボラット神経膠腫モデルにおける減衰した腫瘍増殖を示す：（Ａ）オステオポンチンのＲＮＡｉ媒介永久サイレンシングを有するラットＣ６神経膠腫クローンにおけるオステオポンチン（ｓｐｐ１）の定量的ＰＣＲ；（Ｂ）Ｃ６神経膠腫の対照ｓｈＲＮＡ（ｓｈＮｅｇ）またはオステオポンチンｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＰＰ１）を発現するＷｉｓｔａｒラットへの埋め込み後１５日の腫瘍の代表的な画像；（Ｃ）対照ｓｈＲＮＡ（ｓｈＮｅｇ）またはオステオポンチンｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＰＰ１）を発現するＣ６神経膠腫の埋め込み後１５日の腫瘍体積。
【図２０】ＯＰＮ過剰発現と低い患者生存の間の相関を示す。異なるオステオポンチン（ＳＰＰ１）発現を有する患者に対するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存プロット。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
マクロファージが浸潤した腫瘍（「浸潤マクロファージ」）、例えば腫瘍促進活性を有するミクログリアを有する被験体を治療するための方法および組成物が本明細書で提供される。腫瘍促進活性を有する浸潤マクロファージはマトリクスリモデリング、浸潤、血管新生および適応免疫の抑制に関与する可能性があり、増殖し、食作用性および可動性となり得る。浸潤マクロファージは腫瘍促進活性を有し、腫瘍の増殖または維持に寄与する可能性があり、腫瘍、例えば悪性腫瘍、例として、脳腫瘍、例えば神経膠腫中に存在する。
【００３０】
本発明の方法は、腫瘍促進活性を有する浸潤マクロファージを有する腫瘍を有する被験体に、治療的有効量の、インテグリンリガンド、例えば、オステオポンチン（「ＯＰＮ」）またはラクトアドヘリンの阻害剤を投与し、よって、腫瘍促進活性を有する浸潤マクロファージの腫瘍促進活性を低減させることを含む。あるいは、発明の方法は、腫瘍促進活性を有する浸潤マクロファージ腫瘍を有する被験体に治療的有効量のＧＭ−ＣＳＦの阻害剤を投与し、よって腫瘍促進活性を有する浸潤マクロファージの腫瘍促進活性を低減させることを含む。本発明による阻害剤は、ＯＰＮ、ラクトアドヘリンおよび／またはＧＭ−ＣＳＦの産生または合成を阻害し得ることが理解されるべきである。あるいは、阻害剤はＯＰＮ、ラクトアドヘリンおよび／またはＧＭ−ＣＳＦの活性を中和することができる。あるいは、阻害剤はＯＰＮ、ラクトアドヘリンおよび／またはＧＭ−ＣＳＦのそれらの個々の受容体への結合を防止または阻害することができる。あるいは、阻害剤はＯＰＮ、ラクトアドヘリンおよび／またはＧＭ−ＣＳＦのマクロファージまたはミクログリア細胞上のそれらの受容体への結合により活性化されるシグナル伝達経路を阻害することができる。
【００３１】
発明の方法は、腫瘍、例えば、悪性腫瘍の存在により特徴付けられる疾患の治療に関する。限定されない例として、腫瘍は神経膠腫である。
【００３２】
発明は、一部、ＯＰＮ合成またはＯＰＮのミクログリア上のインテグリンとの相互作用の阻害は、ミクログリア、食作用およびインテグリン媒介シグナル伝達（例えば、ＦＡＫおよびＡｋｔキナーゼのリン酸化）の神経膠腫に誘導された活性化を低減させるという驚くべき発見に基づく。加えて、本明細書で例示されるように、組換えＯＰＮは、神経膠腫に誘導された機能的応答のほとんどを模倣し、ミクログリア培養物における推定上の別の表現型マーカーの発現を上方制御した。
【００３３】
さらに、発明は、ＧＭ−ＣＳＦ合成の阻害はマクロファージ／ミクログリアによる神経膠腫の浸潤を低減し、腫瘍サイズ、腫瘍進行および血管新生を低減させるという予想外の所見に基づく。加えて、本明細書で例示されるように、ＧＭ−ＣＳＦレベルは神経膠芽腫多形患者においては著しく上方制御され、高いレベルのＧＭ−ＣＳＦは不良予後と相関する。
【００３４】
ＯＰＮはまた、「分泌されたリン酸化タンパク質１」ＳＰＰ１、ＢＮＳＰ；ＢＳＰＩ；およびＥＴＡ−１と呼ばれ、遺伝子ＩＤ：６６９６を有する。ヒトＯＰＮは、ＯＰＮａ、ＯＰＮｂ、ＯＰＮｃ、ＯＰＮｄおよびＯＰＮｅと呼ばれる５つの異なるバリアントまたはアイソフォームとして存在し、その前駆体タンパク質は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１０３５１４７．１、ＮＰ＿０００５７３．１、ＮＰ＿００１０３５１４９．１、ＮＰ＿００１２３８７５８．１、およびＮＰ＿００１２３８７５９．１で提供されるアミノ酸配列から構成され、それらは、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１０４００５８．１、ＮＭ＿０００５８２．２、ＮＭ＿００１０４００６０．１、ＮＭ＿００１２５１８２９．１およびＮＭ＿００１２５１８３０．１で提供されるヌクレオチド配列によりコードされる。ＯＰＮａ−ＯＰＮｅのアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９−１３として明記される。ＯＰＮａ−ｅはインテグリン、例えばインテグリンαＶβ３およびαｖβ５と相互作用する。
【００３５】
ラクトアドヘリンは「ＭＦＧＥ８乳脂肪球−ＥＧＦ因子８タンパク質」ならびにＭＦＧＥ８、ＢＡ４６；ＨＭＦＧ；ＭＦＧＭ；ＳＥＤ１；ｈＰ４７；ＥＤＩＬ１；ＭＦＧ−Ｅ８；ＳＰＡＧ１０；ＯＡｃＧＤ３Ｓ；およびＨｓＴ１９８８８とも呼ばれ、遺伝子ＩＤ：４２４０を有する。ラクトアドヘリンは、アイソフォームａおよびｂとして存在する。ヒトラクトアドヘリンアイソフォームａプレプロタンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００５９２８．２およびＮＰ＿００５９１９．２で提供され、ヒトラクトアドヘリンアイソフォームｂプレプロタンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１１１４６１４．１およびＮＰ＿００１１０８０８６．１で提供される。ラクトアドヘリンアイソフォームａおよびｂは、インテグリン、例えばインテグリンαＶβ３およびαｖβ５と相互作用する。ラクトアドヘリンアイソフォームａおよびｂのアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４および１５として明記される。
【００３６】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子はまた「ＧＭ−ＣＳＦ」ならびにＣＳＦ２、モルグラモスチン（ｍｏｌｇｒａｍｏｓｔｉｎ）およびサルグラモスチン（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｎ）と呼ばれ、遺伝子ＩＤ：１４３７およびＭＩＭ：１３８９６０を有する。タンパク質の活性型は細胞外でホモ二量体として見出される。ヒトＧＭ−ＣＳＦ前駆体タンパク質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０００７４９．２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）で提供され、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００７５８．２で提供されるヌクレオチド配列によりコードされる。
【００３７】
ＧＭ−ＣＳＦは、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＤ１１６、ＣＤｗ１１６、ＣＳＦ２Ｒ、ＣＳＦ２ＲＡＸ、ＣＳＦ２ＲＡＹ、ＣＳＦ２ＲＸ、ＣＳＦ２ＲＹ、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ−α、ＧＭＣＳＦＲ、ＧＭＲａおよびＳＭＤＰ４とも呼ばれるその受容体「ＧＭＲα」に結合し、遺伝子ＩＤ：１４３０を有する。ヒトアイソフォームの前駆体のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＰ＿００１１５５００１．１、ＮＰ＿００１１５５００２．１、ＮＰ＿００１１５５００３．１、ＮＰ＿００１１５５００４．１、ＮＰ＿００６１３１．２、ＮＰ＿７５８４４８．１、ＮＰ＿７５８４４９．１、ＮＰ＿７５８４５０．１、およびＮＰ＿７５８４５２．１で提供される。
【００３８】
本明細書では、「インテグリンリガンド阻害剤」という用語は、インテグリンリガンドの少なくとも１つの生物活性を阻害する薬剤を示す。例えば、「ＯＰＮ阻害剤」は、ＯＰＮ（アイソフォームａ、ｂ、ｃ、ｄおよび／またはｅ）の少なくとも１つの生物活性を阻害する薬剤を示し、「ラクトアドヘリン阻害剤」は、ラクトアドヘリン（アイソフォームａおよび／またはｂ）の少なくとも１つの生物活性を阻害する薬剤を示す。いくつかの実施形態によれば、ＯＰＮまたはラクトアドヘリン阻害剤は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％だけ、それぞれ、ＯＰＮまたはラクトアドヘリンのマクロファージの腫瘍促進活性を誘導する能力を阻害する、またはマクロファージの腫瘍促進活性を低減させる薬剤である。インテグリンリガンド阻害剤は、例えば、腫瘍促進性マクロファージの増加した食作用、運動性、または増殖を防止または低減する、または腫瘍促進性マクロファージによる炎症促進性サイトカインまたはケモカインの分泌を低減することができる。例示的なインテグリンリガンド阻害剤、例えば、ＯＰＮ阻害剤は、インテグリンリガンド、例えば、ＯＰＮ、と、マクロファージ例えば、ミクログリアの表面上のタンパク質、例えばインテグリンの間の相互作用を阻害または低減する薬剤である。インテグリンリガンド阻害剤は、タンパク質またはペプチドベースとすることができる。インテグリンリガンド阻害剤はまた、インテグリンリガンドタンパク質の発現を阻害する薬剤、例えば、阻害核酸、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス分子、リボザイムまたはアプタマーとすることができる。「薬剤」は、任意の型の分子または分子の複合体、例えば巨大分子または小分子を示す。
【００３９】
いくつかの実施形態によれば、ＯＰＮ阻害剤は、５つ全てのＯＰＮアイソフォームの活性を阻害する。いくつかの実施形態によれば、ＯＰＮ阻害剤は、１、２、３または４つのＯＰＮアイソフォームの活性を阻害する。いくつかの実施形態によれば、ＯＰＮ阻害剤は、ＯＰＮｃの活性を阻害する。
【００４０】
いくつかの実施形態によれば、ラクトアドヘリン阻害剤は、両方のラクトアドヘリンアイソフォームの活性を阻害する。いくつかの実施形態によれば、ラクトアドヘリン阻害剤は、一方のまたは他方のアイソフォームのみの活性を阻害する。
【００４１】
インテグリンリガンド阻害剤は、インテグリンリガンドの生物活性を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％だけ阻害することができる。例えば、インテグリンリガンド阻害剤は、インテグリンリガンドとインテグリンとの間の相互作用を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％だけ低減させることができる。インテグリンリガンド阻害剤はまた、インテグリンリガンドタンパク質の発現をブロックする薬剤であってもよく、例えば、その発現を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％だけ低減させることができる。
【００４２】
本明細書では、「ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤」という用語は、ＧＭ−ＣＳＦの少なくとも１つの生物活性を阻害する薬剤を示す。いくつかの実施形態によれば、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤は、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤がない場合の腫瘍進行と比較して、腫瘍進行を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％だけ減速させることにより、腫瘍、例えば、神経膠腫の進行を阻害する薬剤である。ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤はまた、腫瘍（例えば、神経膠腫）サイズを安定化するまたはそれを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％１００％（２倍）、３倍、５倍以上だけ低減させる阻害剤とすることができる。ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤は、例えば、マクロファージまたはミクログリアによる腫瘍浸潤を低減させる；腫瘍浸潤マクロファージの腫瘍促進活性を有する細胞への刺激および／または形質転換を低減させる；および／または腫瘍における血管新生を低減させることができる。ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤は下記特性の１つを有し得る：（ｉ）例えば、腫瘍細胞によるＧＭ−ＣＳＦ産生または合成をブロックする；（ｉｉ）ＧＭ−ＣＳＦの活性を中和する；（ｉｉｉ）ＧＭ−ＣＳＦのその受容体への結合を防止（または阻害）する；（ｉｖ）ＧＭ−ＣＳＦのマクロファージまたはミクログリア上のその受容体への結合により活性化されるシグナル伝達経路を阻害する、あるいは（ｖ）例えば、マクロファージまたはミクログリアにおけるＧＭ−ＣＳＦ受容体産生または合成を阻害する。ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤はタンパク質またはペプチドベースとすることができる。ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤はまた、ＧＭ−ＣＳＦの発現を阻害する薬剤、例えば、阻害核酸、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス分子、リボザイムまたはアプタマーとすることができる。「薬剤」は、本明細書では、任意の型の分子または分子の複合体、例えば巨大分子または小分子を示す。
【００４３】
ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤は、ＧＭ−ＣＳＦの生物活性を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％だけ阻害することができる。例えば、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤は、ＧＭ−ＣＳＦとその受容体の間の相互作用を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％だけ低減させることができる。ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤はまた、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質またはＧＭ−ＣＳＦ受容体（例えば、α鎖）の発現をブロックする薬剤とすることができ、例えば、その発現を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％だけ低減させることができる。
【００４４】
阻害ペプチドおよびタンパク質
Ａ）インテグリンリガンド阻害ペプチド
いくつかの実施形態によれば、インテグリンリガンド、例えば、ＯＰＮの阻害剤は阻害ペプチドである。インテグリンリガンド阻害ペプチドは、インテグリンリガンドとインテグリン、例えば、インテグリンαＶβ３またはαＶβ５の間の相互作用を阻害するペプチドであってもよい。例示的な実施形態では、インテグリンリガンド阻害剤はＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）モチーフ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）を含む。インテグリンリガンド阻害剤はＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）モチーフを含むペプチドまたはタンパク質であってもよく、ペプチドまたはタンパク質はインテグリンを介するシグナル伝達を誘導しない。
【００４５】
阻害ペプチドは、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９−１６の１つのせいぜい１００、７５、５０、４０、３０、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４または３のアミノ酸を含み得る。阻害ペプチドはまた、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９−１６の１つの３〜２０のアミノ酸；３〜１５のアミノ酸；５〜１５のアミノ酸；５〜１０のアミノ酸；６〜８のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態によれば、阻害ペプチドは、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９−１６の１つの３、４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸を含む、またはから構成される。いくつかの実施形態によれば、阻害ペプチドは、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９−１６の１つの７−２０のアミノ酸を含む、またはから構成される。いくつかの実施形態によれば、阻害ペプチドは、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９−１６の１つの７−１５のアミノ酸を含む、またはから構成される。
【００４６】
いくつかの実施形態によれば、阻害ペプチドは好ましくはＲＧＤモチーフを含み得る。ＲＧＤモチーフは阻害ペプチドの中心に、あるいはペプチドの他端よりも一端により近接して位置し得る。
【００４７】
例示的なラットラクトアドヘリン阻害ペプチドは、アミノ酸配列ＴＱＲＧＤＩＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）から構成される。使用され得る例示的なヒトＯＰＮ  ＲＧＤ阻害ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で明記されるアミノ酸配列−ＤＧＲＧＤＳＶを含む、またはから構成される。任意の他のヒトＯＰＮ  ＲＧＤ阻害ペプチドが使用され得るが、ただし、ＲＧＤモチーフを含むことを条件とする。例えば、ヒトＯＰＮ  ＲＧＤ阻害ペプチドは、ＲＧＤモチーフを含む、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９−１３で明記されるヒトＯＰＮのアミノ酸配列の５〜２０のアミノ酸を含み得る。
【００４８】
本発明の方法において使用され得る例示的なヒトラクトアドヘリンＲＧＤペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で明記されるアミノ酸配列−ＥＶＲＧＤＶＦを含む、から構成される、またはから本質的に構成される。任意の他のヒトラクトアドヘリンＲＧＤ阻害ペプチドが使用され得るが、ただし、ＲＧＤモチーフを含むことを条件とする。例えば、ヒトラクトアドヘリンＲＧＤ阻害ペプチドは、ＲＧＤモチーフを含む、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４−１５で明記されるヒトラクトアドヘリンのアミノ酸配列の５〜２０のアミノ酸を含み得る。
【００４９】
Ｂ）ＧＭ−ＣＳＦ阻害ペプチド
いくつかの実施形態によれば、ＧＭ−ＣＳＦの阻害剤は阻害ペプチドである。ＧＭ−ＣＳＦ阻害ペプチドは、ＧＭ−ＣＳＦとその受容体の間の相互作用を阻害するペプチドであってもよい。いくつかの実施形態によれば、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤は、ＧＭ−ＣＳＦ受容体と相互作用するＧＭ−ＣＳＦの一部と同一または類似する、がＧＭ−ＣＳＦ受容体を介するシグナル伝達を誘導しないアミノ酸配列を含む。さらに以下で記載されるように、ＧＭ−ＣＳＦの残基５４−６１（Ｂヘリックス）および７７−８３（Ｃヘリックス）は、その受容体との相互作用に関与することが示されており；よって、アミノ酸５４−６１または７７−８３と同一、または類似するアミノ酸配列を含むペプチドはＧＭ−ＣＳＦ阻害剤として使用され得る。
【００５０】
いくつかの実施形態によれば、「ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤」はまた、（ｉ）ＧＭ−ＣＳＦ受容体の鎖の一部のものと同一、または類似する、および（ｉｉ）ＧＭ−ＣＳＦと相互作用し、よってＧＭ−ＣＳＦのその受容体への結合を防止するアミノ酸配列を含むペプチドまたはタンパク質であってもよい。
【００５１】
例えば、第１のアミノ酸が第２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一である場合、第１のアミノ酸配列は第２のアミノ酸と類似することが理解されるべきである。例えば、第１のアミノ酸配列はせいぜい１、２、３、４、５、１０以上のアミノ酸において第２のアミノ酸配列と異なっていてもよく、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加である。
【００５２】
いくつかの実施形態によれば、阻害ペプチドは、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のせいぜい１００、７５、５０、４０、３０、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４または３のアミノ酸を含み得る。阻害ペプチドはまた、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の３〜２０のアミノ酸；３〜１５のアミノ酸；５〜１５のアミノ酸；５〜１０のアミノ酸；６〜８のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態によれば、阻害ペプチドは、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の３、４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸を含む、またはから構成される。いくつかの実施形態によれば、阻害ペプチドは、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の１つの７−２０のアミノ酸を含む、またはから構成される。いくつかの実施形態によれば、阻害ペプチドは、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の１つの７−１５のアミノ酸を含む、またはから構成される。阻害ペプチドは好ましくは、ヒトＧＭ−ＣＳＦのその受容体と相互作用するアミノ酸配列（またはこれに類似する配列）、またはＧＭ−ＣＳＦと相互作用する受容体のαまたはβｃ鎖のアミノ酸配列（またはこれに類似する配列）を含む。特定配列は阻害ペプチドの中心に、あるいはペプチドの他端よりも一端より近接して位置してもよい。
【００５３】
いくつかの実施形態によれば、例示的なヒトＧＭ−ＣＳＦ阻害ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で明記されるアミノ酸配列−ＣＧＫＡＳＡＴＫＧＫＧＥＡＴＧＧＣまたはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で明記されるアミノ酸配列−ＣＧＴＡＥＧＫＧＧＫＧＴＡＳＡＫＧＧＣを、ペプチド環化のために導入されるグリシン、アラニン、およびシステインと一緒に含む。ＧＭ−ＣＳＦの直鎖ペプチド類似体である追加の阻害ペプチドとしては、ＶｏｎＦｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．８：２０，１９９５（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））において明記されるペプチドが挙げられるが、それらに限定されない。これらのペプチドは、ＧＭ−ＣＳＦのアミノ酸１７−３１（Ａヘリックス）（高親和性受容体結合を阻害する）およびアミノ酸５４−７８から構成されるペプチド（ＢおよびＣヘリックス）（低親和性受容体結合を阻害する）から構成される（ＶｏｎＦｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，同様）。
【００５４】
さらに、ＧＭ−ＣＳＦの阻害剤であり、ＧＭ−ＣＳＦまたはその受容体または受容体複合体を標的にする短ペプチドが本発明の範囲に含まれる。例えば、阻害剤はヒトＧＭ−ＣＳＦの下記アミノ酸配列を含み、から本質的に構成され、またはから構成され得る：
ＱＰＷＥＨＶＮＡＩＱＥＡＲＲＬＬＮＬＳＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）；および
ＫＤＦＬＬＶＩＰＦＤＣＷＥＰＶＱＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）。
【００５５】
ＧＭ−ＣＳＦ活性の阻害剤はヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体αの下記アミノ酸配列を含み、から本質的に構成され、またはから構成され得る：
ＦＱＹＱＬＤＶＨＲＫＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）；および
ＡＤＶＲＩＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）。
【００５６】
ポリペプチドまたはタンパク質であるＧＭ−ＣＳＦ阻害剤もまた、提供される。例えば、デコイ受容体はＧＭ−ＣＳＦのＧＭ−ＣＳＦ受容体への結合を阻害するために使用することができる。他の実施形態では、デコイＧＭ−ＣＳＦが使用され得る。デコイＧＭ−ＣＳＦは、受容体に結合するが、受容体を活性化せず、および自然発生ＧＭ−ＣＳＦが受容体に結合しないように防止するＧＭ−ＣＳＦ分子である。デコイＧＭ−ＣＳＦ分子は変異ＧＭ−ＣＳＦ分子であってもよい。
【００５７】
ＧＭ−ＣＳＦの第１の（Ａ）ヘリックス上の残基（成熟ヒトＧＭ−ＣＳＦのアミノ酸１１−２３）は、高親和性受容体（ＧＭ−ＣＳＦＲα．βｃ複合体）への結合に関与するが、低親和性受容体（ＧＭ−ＣＳＦＲαのみ）への結合には関与しないことが示されている（例えば、ＶｏｎＦｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．、上記において示される）。これは単一Ｅ２１Ｒ変異を有するＧＭ−ＣＳＦ類似体は高親和性受容体のアンタゴニストであることを示すことにより確認されている。よって、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤はＡヘリックスで変異したＧＭ−ＣＳＦ配列を含み得ることが予測される。
【００５８】
本発明はさらに、例えば、ヒト被験体における、細胞または組織において、インテグリンリガンドを阻害する、および／またはＧＭ−ＣＳＦを阻害する方法を提供し、これは、細胞または組織を治療的有効量の阻害ペプチドに曝露し、よってインテグリンリガンドの活性および／またはＧＭ−ＣＳＦの活性を阻害または減少させることを含む。
【００５９】
いくつかの実施形態によれば、阻害ペプチドはＲＧＤモチーフを含むインテグリンリガンドの配列に対し少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有する配列を含むペプチドであってもよい。阻害ペプチドはヒトＧＭ−ＣＳＦの配列またはヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体の鎖の配列に対し少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有する配列を含むペプチドであってもよい。一般に、そのペプチドの生物活性を実質的に変化させずに、ポリペプチドの構造においていくらかの改変および変化を起こすことが可能であり、機能的に等価のポリペプチドが得られる。よって、本発明は、保存的アミノ酸置換による、インテグリンリガンドのアミノ酸配列の一部と異なる生物学的に等価のポリペプチド、例えば、ＯＰＮまたはラクトアドヘリン、およびその生物活性断片に及ぶ。同様に、本発明は、保存的アミノ酸置換による、ヒトＧＭ−ＣＳＦまたはヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体鎖のアミノ酸配列の一部と異なる生物学的に等価のポリペプチド、およびその生物活性断片に及ぶ。
【００６０】
本明細書では、「保存的アミノ酸置換」という用語は、ペプチドのある位置での１つのアミノ酸の別のものへの置換を示し、ここで、置換は関連する機能の実質的な損失なしでなされ得る。そのような変化を起こす場合、同様のアミノ酸残基の置換が側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、それらのサイズ、電荷、疎水性、親水性、などに基づきなされ得、そのような置換はルーチン試験によりペプチドの機能に関するそれらの効果に対しアッセイされ得る。他の実施形態では、保存されたアミノ酸置換は１つのアミノ酸残基が同じクラスの別のものと置換される場合に行うことができ、この場合、アミノ酸は下記の通り非極性、酸性、塩基性および中性クラスに分けられる：非極性：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；中性：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ。保存的アミノ酸変化としては、Ｌ−アミノ酸の対応するＤ−アミノ酸による、保存的Ｄ−アミノ酸による、または自然発生の、遺伝子組み換えなしでコードされた形態のアミノ酸による置換、ならびにＬ−アミノ酸の保存的置換が挙げられる。自然発生の遺伝子組み換えなしでコードされた形態のアミノ酸としては下記が挙げられる：β−アラニン、３−アミノ−プロピオン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ−酪酸、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、ヒドロキシプロリン、オルニチン、シトルリン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、２−ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸、β−２−チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、ホモアルギニン、Ｎ−アセチルリジン、２−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、２，４，−ジアミノ酪酸、ｐ−アミノフェニルアラニン、Ｎ−メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、システイン酸、ε−アミノヘキサン酸、δ−アミノ吉草酸、および２，３−ジアミノ酪酸。
【００６１】
阻害ペプチドは、タンパク質の安定性を増加させ、標的細胞への送達を支援するために、より大きな融合タンパク質に組み込まれ得る。融合タンパク質は、標的細胞において発現されるプロテアーゼによる認識のための特定のプロテアーゼ切断部位を組み込むように設計することができ、そのため、標的細胞に入ると、ペプチドモジュレーターが融合タンパク質から放出される。阻害ペプチドはまた、血液脳関門（ＢＢＢ）を通る輸送に有利に働くペプチドに連結され得る。例えば、ＲＧＤペプチドはＡｒｍａＧｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの分子トロイの木馬（ＭＴＨ）に融合され得る。融合タンパク質のＭＴＨ部分は内在性受容体介在性輸送系を介してＢＢＢを横切る輸送を引き起こす。
【００６２】
阻害ペプチドは、当技術分野で知られている標準タンパク質合成技術を使用して、例えば固相ペプチド合成を含む化学ペプチドライゲーション法を使用して、ペプチドをＣ末端からＮ末端の方向に合成することにより、例えば、自動ペプチドシンセサイザーを使用することにより合成することができる。あるいは、当技術分野で知られている標準分子生物学技術を使用して、ペプチドモジュレーターをコードする発現カセットを設計するために分子生物学技術が使用され得る。発現カセットは好適な発現系で使用することができる。例えば、カセットは細菌プラスミドに含ませることができ、細菌細胞において発現させることができ、これから、ペプチドモジュレーターを単離および精製させることができる。発現カセットは阻害ペプチドを、任意で完全ペプチドとしてあるいはキメラまたは融合ペプチドまたはタンパク質（そこからペプチドが、例えばプロテアーゼ消化により放出され得る）の一部としてコードする翻訳領域を含む。発現カセットはまた、翻訳領域に作動可能に連結された好適な調節領域、例えばプロモーター領域（誘導性プロモーター領域であってもよい）を含む。
【００６３】
あるいは、阻害ペプチドは、例えば、阻害ペプチドをリポソーム調製物中に封入することにより、阻害ペプチドの細胞による取り込みを増加または誘導する生体材料に含まれ得る。ペプチドおよびタンパク質の細胞へのリポソーム送達は知られており、例えば、米国特許第６，３７２，７２０号およびＵＳ２００３０１０８５９７号（参照により本明細書に組み込まれる）において記載される。
【００６４】
Ｃ）インテグリンリガンド阻害抗体
いくつかの実施形態によれば、インテグリンリガンド、例えばＯＰＮまたはラクトアドヘリンの活性は、インテグリンリガンドに特異的に結合し、よってそのインテグリンとの相互作用を阻害し、インテグリンリガンドとインテグリンの相互作用により開始されるシグナル伝達経路を阻害する抗体、例えばモノクローナル抗体、または抗原結合性フラグメントまたはその誘導体の使用により阻害される。
【００６５】
Ｄ）ＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ受容体を阻害する抗体
いくつかの実施形態によれば、ＧＭ−ＣＳＦの活性は、ＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合し、よって、例えば、そのＧＭ−ＣＳＦ受容体との相互作用を阻害し、ＧＭ−ＣＳＦのその受容体との相互作用により開始されるシグナル伝達経路を阻害する抗体、例えばモノクローナル抗体、または抗原結合性フラグメントまたはその誘導体の使用により阻害される。抗体はまたＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ受容体にコンフォメーション変化を誘導する可能性があり、よって、それぞれ、そのＧＭ−ＣＳＦ受容体またはＧＭ−ＣＳＦとの相互作用を防止する。いくつかの実施形態によれば、ＧＭ−ＣＳＦの活性は、ＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的に結合し、よって受容体を介するシグナル伝達を阻害する抗体または抗原結合性フラグメントまたはその誘導体の使用により阻害される。
【００６６】
本明細書では、「抗体」という用語は、少なくとも１つ、および好ましくは２つの、重（Ｈ）鎖可変部（本明細書ではＶＨと略される）、ならびに少なくとも１つおよび好ましくは２つの軽（Ｌ）鎖可変部（本明細書ではＶＬと略される）を含むタンパク質を示す。ＶＨおよびＶＬ領域は、さらに、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変性を有する領域に分割することができ、より保存された「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる領域が組み入れられている。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで下記の順で配列される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００６７】
抗体はさらに重および軽鎖定常部含むことができ、よって、それぞれ重および軽免疫グロブリン鎖を形成する。１つの実施形態では、抗体は２つの重免疫グロブリン鎖および２つの軽免疫グロブリン鎖の四量体であり、ここで、重および軽免疫グロブリン鎖は、例えば、ジスルフィド結合により相互接続される。重鎖定常部は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。軽鎖定常部は、１つのドメイン、ＣＬから構成される。重および軽鎖の可変部は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常部は典型的には、抗体の宿主組織または因子、例えば免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）への結合を媒介する。
【００６８】
抗体の「抗原結合性フラグメント」（あるいは単に「抗体部分」または「フラグメント」）という用語は、本明細書では、抗原、例えば、ＯＰＮ、ラクトアドヘリンまたはＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合する能力を保持する全長抗体の１つ以上のフラグメントを示す。抗体の「抗原結合性フラグメント」という用語内に含まれる結合フラグメントの例としては、下記が挙げられる：（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）ａＦ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインから構成されるｄＡｂフラグメント；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（ｖｉｉ）ナノボディ。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の核酸によりコードされるが、それらは組換え方法を使用して、合成リンカーにより一緒にすることができ、リンカーは、それらを単一タンパク質鎖とすることができ、この場合、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている）を形成する。そのような単鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合性フラグメント」という用語内に含まれることが意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られている従来技術を用いて得られ、フラグメントは無傷の抗体と同じように有用性に対しスクリーニングされる。「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書では、特定のエピトープと免疫反応することができる唯１つの種の抗原結合部位を含む抗体分子の集団を示す。よって、モノクローナル抗体組成物は典型的には、それが免疫反応する特定のタンパク質に対し単一の結合親和性を示す。
【００６９】
ラクトアドヘリンの活性を阻害するために使用され得る例示的な抗体は、Ａｃｃｅｓｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ＩＮＣ．により製造される、ラクトアドヘリンに結合するＡｎｇｉｏｌｉｘ（ＨｕＭｃ３）、ヒト化（ＨｕＭｃ３）モノクローナル抗体である。Ａｎｇｌｉｏｌｉｘは、内皮細胞上のαＶβ３インテグリンに結合し、よってＶＥＧＦ非依存性インテグリンシグナル伝達を阻害することが報告されている。
【００７０】
使用され得る例示的な抗体は、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓにより製造される、完全ヒト抗ヒトＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体ＭＯＲ１０３である。ヒトＧＭ−ＣＳＦに結合することによりヒトＧＭ−ＣＳＦの活性を阻害するために使用され得る別の例示的な抗体はＢＶＤ２−２１Ｃ１１モノクローナル、中和抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）またはモノクローナル中和マウスＭＡＢ２１５、ＩｇＧ１クローン＃３２０９（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）である。中和量（ＮＤ５０）は典型的には、０．５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの存在下０．３０．５μｇ／ｍＬである。ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体に結合することによりヒトＧＭ−ＣＳＦの活性を阻害するために使用され得る例示的な抗体は、モノクローナル中和抗ＭＧＭ−ＣＳＦ受容体、クローンＫ１２Ｂ７．１７Ａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）または、ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体のα鎖に結合し、天然および組換えＧＭ−ＣＳＦＲを中和するＭＡＢ１０３７（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）である。
【００７１】
本明細書で記載される方法において使用され得る別の抗体はＭａｖｒｉｌｉｍｕｍａｂ（かつてはＣＡＭ−３００１と呼ばれた）であり、これはＧＭ−ＣＳＦ受容体−αを標的にするヒトモノクローナル抗体である。
【００７２】
阻害核酸
いくつかの実施形態によれば、インテグリンリガンド、例えばＯＰＮの発現を低減させる阻害核酸が使用される。いくつかの実施形態によれば、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ受容体の発現を低減させる阻害核酸が使用される。例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンス、モルホリノオリゴ、およびリボザイムは全て使用することができる。有用な阻害核酸としては、阻害核酸に曝露していない細胞または組織に比べ、細胞または組織において、インテグリンリガンドの発現を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％だけ低減させるものが挙げられる。
【００７３】
したがって、治療の必要な被験体に、インテグリンリガンドまたはＧＭ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦ受容体を標的にする１つ以上の阻害核酸分子、例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、リボザイム、ペプチド核酸、およびアプタマーを投与し、よって被験体におけるインテグリンリガンドタンパク質またはＧＭ−ＣＳＦタンパク質のレベルを低減させることを含む方法が本明細書で提供される。
【００７４】
Ａ）ＲＮＡｉに対するインテグリンリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ阻害核酸分子
ＲＮＡｉは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、本明細書ではｓｉＲＮＡとも呼ばれる、または、二本鎖低分子干渉ＲＮＡに対してはｄｓ  ｉＲＮＡ）が動物および植物細胞において相同ｍＲＮＡの配列特異的分解を誘導するプロセスである。哺乳類細胞では、ＲＮＡｉは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の２１−ヌクレオチド（ｎｔ）二本鎖により、あるいはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、機能的低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはインビボでＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと共にＤＮＡテンプレートを用いて発現される他のｄｓＲＮＡにより、引き起こすことができる。
【００７５】
核酸分子またはコンストラクトは各鎖において１６−３０、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ分子を含むことができ、ここで、鎖の１つは、ｍＲＮＡの標的領域に実質的に同一、例えば、少なくとも８０％（またはそれ以上、例えば、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％）同一であり、例えば、３、２、１、または０の不適正ヌクレオチド（複数可）を有し、他の鎖は第１の鎖に相補的である。ｄｓＲＮＡ分子は、化学的に合成することができ、またはインビトロでＤＮＡテンプレートから、またはインビボで、例えば、ｓｈＲＮＡから転写させることができる。ｄｓＲＮＡ分子は、当技術分野で知られている任意の方法を用いて設計することができ；多くのアルゴリズムが知られており、市販されている。遺伝子歩行方法を使用して、ｓｉＲＮＡの阻害活性を最適化することができる。
【００７６】
いくつかの実施形態によれば、ＯＰＮ  ＲＮＡｉ核酸は、５つ全てのＯＰＮアイソフォームの発現を阻害する。いくつかの実施形態によれば、ＯＰＮ  ＲＮＡｉ核酸は、１、２、３または４つのＯＰＮアイソフォームを選択的に阻害する。いくつかの実施形態によれば、ＯＰＮ  ＲＮＡｉ核酸は、ＯＰＮｃを選択的に阻害する。
【００７７】
ラットＯＰＮ  ｍＲＮＡの例示的な標的配列は下記である：５’−ＣＡＡＧＣＴＡＧＴＣＣＴＡＧＡＣＣＣＴＡＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）。ラットラクトアドヘリンｍＲＮＡの例示的な標的配列は下記である：５’−ＣＡＧＧＡＴＧＡＡＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）。ヒト遺伝子における対応する配列が、ヒトタンパク質の発現を阻害するための標的配列として使用され得る。
【００７８】
いくつかの実施形態によれば、ＧＭ−ＣＳＦ受容体を標的にする阻害核酸は、ＩＬ−３およびＩＬ−５に対する受容体の発現に影響しないように、α鎖の発現を阻害する。いくつかの実施形態によれば、ＧＭ−ＣＳＦ受容体を標的にする阻害核酸は、βｃ鎖の発現を阻害する、例えば、また、ＩＬ−３およびＩＬ−５受容体の発現をブロックする。
【００７９】
ＧＭ−ＣＳＦの発現を阻害するためのｓｈＲＮＡを形成する例示的なオリゴヌクレオチドが実施例において提供される。
【００８０】
特定のヒト遺伝子に対するＲＮＡｉ核酸、例えば、ｓｉＲＮＡを構築するための標的配列を選択するためのいくつかのツールがワールドワイドウェブ上で入手可能である。ウェブサイトはまた、他のＲＮＡベース阻害剤分子を設計するためのツールを提供する。そのようなツールは、Ｇ／Ｃのパーセンテージ、ｓｉＲＮＡサイズ、ｓｉＲＮＡの熱力学特性、開始ヌクレオチド、およびゲノムまたはＲＮＡ配列との任意の相同性を考慮に入れることができる。
【００８１】
上記ＯＰＮおよびラクトアドヘリンｓｉＲＮＡ標的配列の各々に対する例示的なヘアピンインサートは下記の通りである：
ラットＯＰＮ  ｓｉＲＮＡ：
センス：５’−ｒ（ＡＧＣ  ＵＡＧ  ＵＣＣ  ＵＡＧ  ＡＣＣ  ＣＵＡ  Ａ）ｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）
アンチセンス：５’−ｒ（ＵＵＡ  ＧＧＧ  ＵＣＵ  ＡＧＧ  ＡＣＵ  ＡＧＣ  Ｕ）ｄＴｄＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）
ラットラクトアドヘリンｓｉＲＮＡ：
センス５’−ｒ（ＧＧＡ  ＵＧＡ  ＡＡＧ  ＣＧＧ  ＡＡＣ  ＣＧＧ  Ａ）ｄＴｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）
アンチセンス５’−ｒ（ＵＣＣ  ＧＧＵ  ＵＣＣ  ＧＣＵ  ＵＵＣ  ＡＵＣ  Ｃ）ｄＴｄＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）
【００８２】
例示的な方法は、例えば、ヒト被験体における細胞または組織において、インテグリンリガンド、例えば、ＯＰＮの発現を阻害することを含み、細胞または組織を有効量の、インテグリンリガンドをコードするヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む阻害核酸、例えばｓｉＲＮＡに曝露する、またはこれと接触させる（あるいは投与する）ことを含む。
【００８３】
ヒトＧＭ−ＣＳＦを阻害するための例示的なヘアピンインサートは下記の通りである：
センス：５’ＧＡＴＣＣＡＡＡＧＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＣＴＴＴＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＴＣＣＴＴＣＡＧＧＴＴＣＴＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ’３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）。
アンチセンス：５’ＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＣＴＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＡＡＧＴＣＣＴＴＣＡＧＧＴＴＣＴＣＴＴＴＧ’３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）
【００８４】
ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体を阻害するための例示的なヘアピンインサートは下記の通りである：
センス：
５’ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＡＣＡＧＣＣＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＡＴＡＧＣＣＡＣＡＧＧＧＣＴＧＴＣＣＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＧ’３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）
アンチセンス：
５’ＴＣＧＡＣＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＧＧＡＣＡＧＣＣＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＡＴＡＧＣＣＡＣＡＧＧＧＣＴＧＴＣＣＧＧＧ’３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）
Ｓｃｈｅｒｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ；１３（５）：３５３−６３；２００３）において開示される。
【００８５】
例示的な方法は、例えば、ヒト被験体において、細胞または組織において（例えば、ＧＭ−ＣＳＦでは腫瘍において、ＧＭ−ＣＳＦ受容体ではマクロファージまたはミクログリアにおいて）、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ受容体の発現を阻害することを含み、細胞または組織を、有効量の、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ受容体をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む阻害核酸、例えばｓｉＲＮＡに曝露する、またはこれと接触させる（あるいは投与する）ことを含む。
【００８６】
核酸組成物はｓｉＲＮＡおよび修飾ｓｉＲＮＡ誘導体の両方、例えば、特性、例えば組成物の薬物動態を変化させ、例えば、体内での半減期を増加させる、ヌクレアーゼ抵抗性を増加させるように修飾されたｓｉＲＮＡ、ならびに操作されたＲＮＡｉ前駆体を含み得る。様々なｓｉＲＮＡ修飾は、Ｕ．Ｓ．２００５０１７６６６７号（参照により本明細書に組み込まれる）において記載される。
【００８７】
ＲＮＡｉ核酸、例えば、ｓｉＲＮＡは、当技術分野で知られている方法、例えば、カチオン性リポソームトランスフェクションおよび電気穿孔により細胞内に送達させることができる。ｓｉＲＮＡ二本鎖は、操作されたＲＮＡｉ前駆体、例えば、組換えＤＮＡコンストラクト由来の細胞内で、哺乳類Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモータ系（例えば、機能的二本鎖ｓｉＲＮＡを発現することができるＨ１またはＵ６／ｓｎＲＮＡプロモーター系）を用いて発現させることができる。ｓｉＲＮＡは、５’−３’および３’−５’配向において標的遺伝子の配列に相補的であり、ｓｉＲＮＡの２つの鎖は、同じコンストラクトまたは別々のコンストラクトで発現させることができる。Ｔ７プロモーターの制御下でｓｉＲＮＡ配列を含むコンストラクトはまた、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するベクターを用いて細胞にコトランスフェクトされた場合、機能的ｓｉＲＮＡｓを生成することができる。
【００８８】
Ｂ）インテグリンリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ受容体アンチセンス分子
いくつかの実施形態によれば、インテグリンリガンド、例えば、ＯＰＮは、１つ以上のインテグリンリガンドアンチセンス分子により阻害される。
【００８９】
いくつかの実施形態によれば、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ受容体は、それぞれ、１つ以上のＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ受容体アンチセンス分子により阻害される。
【００９０】
「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的な、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的またはインテグリンリガンドｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。アンチセンス核酸は、標的配列、例えば、ｍＲＮＡのコード鎖全体、その一部のみに相補的であり得る。いくつかの実施形態によれば、アンチセンス核酸分子は、ヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」（例えば、５’および３’非翻訳領域）にアンチセンスである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲の領域、例えば、対象となる標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０と＋１０領域の間に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、またはそれ以上のヌクレオチドの長さとすることができる。
【００９１】
アンチセンス核酸は、当技術分野で知られている手順を用いる化学合成および酵素ライゲーション反応を使用して構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は自然発生ヌクレオチドまたは、分子の生物学的安定性を増加させる、またはアンチセンスとセンス核酸の間で形成される二本鎖の物理的安定性を増加させるように設計された様々な修飾ヌクレオチドを使用して化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。アンチセンス核酸はまた、核酸がアンチセンス配向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて生物学的に生成させることができる。
【００９２】
本明細書で開示される配列に基づき、当業者は本発明による使用のために多くの適切なアンチセンス分子のいずれも選択し、合成することができる。例えば、標的核酸の長さに及ぶ１５−３０のヌクレオチドの一連のオリゴヌクレオチドを含む「遺伝子歩行」を調製することができ、続いて、標的遺伝子発現の阻害が試験される。任意で、合成され、試験されるオリゴヌクレオチドの数を低減させるために、５−１０のヌクレオチドのギャップをオリゴヌクレオチド間に残すことができる。
【００９３】
ＲＮＡｉ核酸と同様に、当業者はＯＰＮアイソフォームの全てまたはそのサブセットのみを標的にするアンチセンス分子を設計することができるであろう。
【００９４】
いくつかの実施形態によれば、アンチセンス核酸分子はα−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特定的な二本鎖ハイブリッドを形成し、この場合、通常のβ−ユニットとは対照的に、鎖は互いに平行に走る。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチドまたはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体を含むことができる。
【００９５】
いくつかの実施形態によれば、アンチセンス核酸はモルホリノオリゴヌクレオチドである。
【００９６】
標的遺伝子発現はまた、調節領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的にし、標的細胞においてＳｐｔ５遺伝子の転写を防止する三重らせん構造を形成させることにより、阻害することができる。三重ヘリックス形成のために標的にすることができる可能性のある配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を生成させることにより増加させることができる。スイッチバック分子は、交互の５’−３’、３’−５’様式で合成され、そのため、それらは二本鎖の第１の鎖と、その後、もう一方と塩基対形成し、二本鎖の１つの鎖上に存在するプリンまたはピリミジンのいずれかのかなりのストレッチに対する必要性が排除される。
【００９７】
Ｃ）インテグリンリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ受容体リボザイム
いくつかの実施形態によれば、インテグリンリガンド、例えば、ＯＰＮ、は、１つ以上のインテグリンリガンドリボザイムにより阻害される。
【００９８】
いくつかの実施形態によれば、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ受容体は、それぞれ、１つ以上のＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ受容体リボザイムにより阻害される。
【００９９】
リボザイムは、特異的な配列依存様式で、他のＲＮＡ標的を酵素的に切断し、不活性化するように操作することができるある型のＲＮＡである。標的ＲＮＡを切断することにより、リボザイムは翻訳を阻害し、よって、標的遺伝子の発現を防止する。リボザイムは研究室で化学的に合成することができ、当技術分野で知られている方法を使用して構造的に修飾してそれらの安定性および触媒活性を増加させることができる。あるいは、リボザイム遺伝子は、当技術分野で知られている遺伝子送達メカニズムを介して細胞内に導入することができる。インテグリンリガンド核酸に対し特異性を有するリボザイムはインテグリンリガンド核酸のヌクレオチド配列、例えばインテグリンリガンド遺伝子に相補的な１つ以上の配列、およびｍＲＮＡ切断に関与する公知の触媒配列を有する配列を含むことができる。ＧＭ−ＣＳＦ核酸に対し特異性を有するリボザイムは、ＧＭ−ＣＳＦ核酸のヌクレオチド配列、例えばＧＭ−ＣＳＦ遺伝子に相補的な１つ以上の配列およびｍＲＮＡ切断に関与する公知の触媒配列を有する配列を含むことができる。
【０１００】
ＲＮＡｉおよびアンチセンス核酸と同様に、当業者はＯＰＮアイソフォームの全て、またはそのサブセットのみを標的にするリボザイムを設計することができるであろう。
【０１０１】
Ｄ）インテグリンリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ受容体アプタマー
アプタマーは特定のタンパク質に特異的に結合することができる短いオリゴヌクレオチド配列である。異なるアプタマー配列は異なるタンパク質に特異的に結合することができることが証明されている。そのようなＲＮＡアプタマーの選択および調製方法は当技術分野で知られている。
【０１０２】
Ｅ）インテグリンリガンド、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ受容体を標的にするＤＮＡ酵素
いくつかの実施形態によれば、インテグリンリガンドをコードする核酸の発現は、インテグリンリガンド遺伝子の転写物を標的にするＤＮＡ酵素により阻害または低減される。
【０１０３】
いくつかの実施形態によれば、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ受容体をコードする核酸の発現は、それぞれ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ受容体遺伝子の転写物を標的にするＤＮＡ酵素により阻害または低減される。
【０１０４】
ＤＮＡ酵素はＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成によりＲＮＡ基質に選択的に結合し、任意のプリン−ピリミジン接合点でＲＮＡ基質のバックボーンのリン酸ジエステル結合を潜在的に切断することができるＤＮＡから構成されるマグネシウム依存性触媒核酸である。ＤＮＡ酵素は２つの明白な機能ドメインから構成され：リン酸ジエステル結合切断を実施する１５−ヌクレオチド触媒コア、および触媒コアに隣接する２つのハイブリダイゼーションアーム；アームの配列同一性は標的ＲＮＡ基質との相補的塩基対形成を達成するように調整することができる。
【０１０５】
そのため、ＤＮＡ酵素は、プリン−ピリミジン接合点に隣接するインテグリン遺伝子、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ受容体遺伝子の転写物上の領域とアニールすることができる相補的領域を有し、そのため、ＤＮＡ酵素の触媒コアは接合点で転写物を切断することができ、転写物は翻訳されて、機能性インテグリンリガンドタンパク質／ＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦタンパク質を生成することができなくなる。
【０１０６】
ＤＮＡ酵素は当技術分野で知られている標準技術を使用して合成することができ、例えば、標準ホスホラミダイト化学ライゲーション法を使用して固体サポート上３’〜５’方向でＤＮＡ分子を合成することができ、自動核酸シンセサイザーの使用が挙げられる。あるいは、ＤＮＡ酵素は、ＤＮＡ酵素をコードする核酸分子を転写することにより合成され得る。核酸分子は細胞発現系内に送達するためのＤＮＡまたはＲＮＡベクター、例えば、ウイルスベクター内に含ませることができる。好適なウイルスベクターとしてはワクチニアウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターが挙げられる。
【０１０７】
したがって、インテグリンリガンドまたはＧＭ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦ受容体は、細胞または組織をＤＮＡ酵素に曝露することを含む方法により、細胞または組織において阻害することができ、そのため、ＤＮＡ酵素が細胞により取り込まれ、細胞においてインテグリンリガンドまたはＧＭ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦ受容体転写物を標的にし、切断することができ、細胞または組織における機能性インテグリンリガンドタンパク質の発現が減少し、またはなくなる。細胞はネイキッドＤＮＡをインビボで取り込むことができるので、曝露は細胞をネイキッドＤＮＡ酵素に曝露することを含み得る。あるいは、ＤＮＡ酵素が核酸ベクター、例えばウイルスベクターに含まれる場合、細胞はウイルスベクターに感染され得る。
【０１０８】
小分子インテグリンリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ受容体阻害剤
いくつかの実施形態によれば、腫瘍促進活性を有する浸潤マクロファージを有する腫瘍を治療するための治療薬は小分子または「阻害小分子化合物」である。小分子治療薬はインテグリンリガンドまたはＧＭ−ＣＳＦの発現または活性を阻害または低減させることができる。小分子治療薬はインテグリンリガンドとインテグリンの間の相互作用を阻害または低減させることができ、あるいは、ＧＭ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦ受容体の間の相互作用を低減させることができる。小分子治療薬はまた、インテグリンリガンドのマクロファージまたはミクログリア上のインテグリンへの結合により活性化されるシグナル伝達経路を阻害または低減させることができ、あるいはＧＭ−ＣＳＦのマクロファージまたはミクログリア上のＧＭ−ＣＳＦ受容体への結合により活性化されるシグナル伝達経路を低減させることができる。例えば、ＦＡＫ、ＪＡＫ２およびＡｋｔの公知の阻害剤が、腫瘍促進活性を有する浸潤マクロファージを有する腫瘍を治療するために使用され得る。
【０１０９】
小分子治療薬はまた、例えば、さらに本明細書で記載されるように、スクリーニングアッセイを使用して同定することができる。小分子治療薬は任意の型の分子、例えば、スクリーニングアッセイに関するセクションで記載されるものとすることができる。
【０１１０】
治療的投与および医薬組成物
腫瘍促進活性を有する脳常在性（ミクログリア）および末梢マクロファージが浸潤した腫瘍を有する被験体を治療するための方法が本明細書で提供される。「マクロファージ」という単語は、本明細書では、脳常在性（ミクログリア）および末梢マクロファージを含むように使用される。方法は、治療の必要な被験体に、治療的有効量のインテグリンリガンド阻害剤を投与することを含むことができ、よって被験体の腫瘍におけるマクロファージの腫瘍促進活性が低減される。いくつかの実施形態によれば、インテグリンリガンド阻害剤は、局所的に、例えば、腫瘍に、または全身的に投与される。方法は、腫瘍サイズを維持または安定化させ、あるいは腫瘍サイズを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上だけ低減させることができる。
【０１１１】
「治療する」という用語は、有益なまたは所望の結果、例えば臨床結果を得るためのアプローチを示す。有益なまたは所望の臨床結果としては、１つ以上の症状または病状の軽減または寛解、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化、疾患または病状の伝播または発達の防止、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の寛解または緩和、および緩解（一部かまたは全体かに関係なく）が挙げられるが、それらに限定されない。「治療する」はまた、治療がない場合に予想されるものを超える患者の生存の延長を意味することができる。「治療する」はまた、疾患の進行を阻害すること、疾患の進行を一時的に減速させることを意味することができるが、より好ましくは、疾患の進行を永久的に中止することを含む。
【０１１２】
治療または防止の必要な被験体はヒトであってもよい。被験体は腫瘍を有する被験体、例えば癌を有する被験体であってもよい。本明細書で記載される方法により治療することができる腫瘍としては、腫瘍促進活性を有するマクロファージにより浸潤された腫瘍が挙げられる。マクロファージの「腫瘍促進性」活性は、例えば、抗腫瘍応答を開始するのではなく、マトリクスリモデリング、浸潤、血管新生および適応免疫の抑制への関与により腫瘍の発達に寄与するある一定のマクロファージの能力を示す。腫瘍促進活性を有するマクロファージは時として、「Ｍ２様表現型」を有すると呼ばれる。腫瘍促進活性を有する浸潤マクロファージを含む例示的な腫瘍は脳腫瘍、例えば悪性神経膠腫である。神経膠腫は上衣腫、星状細胞腫（例えば、神経膠芽腫多形）、乏突起神経膠腫またはオリゴ星状細胞腫であり得る。神経膠腫は低悪性度神経膠腫または高悪性度神経膠腫であり得る。神経膠腫はまたテント上神経膠腫、テント下神経膠腫または橋膠腫であり得る。
【０１１３】
いくつかの実施形態によれば、本明細書で記載される方法は、被験体が腫瘍、例えば悪性腫瘍を有するかどうかを決定することを含む。いくつかの実施形態によれば、本明細書で記載される方法は、被験体が腫瘍促進活性を有するマクロファージにより浸潤された腫瘍を有するかどうかを決定することを含む。いくつかの実施形態によれば、方法は最初に被験体が神経膠腫を有するかどうかを決定することを含む。そのような決定がされるとすぐに、本方法はインテグリンリガンド阻害剤、例えばＯＰＮまたはラクトアドヘリン阻害剤を被験体に、例えば、腫瘍を安定化させるまたはそのサイズを低減させることにより被験体を治療するのに治療的に有効な量で投与することを含み得る。
【０１１４】
いくつかの実施形態によれば、本明細書で記載される方法は、被験体が異常に高いレベルのＧＭ−ＣＳＦを分泌する腫瘍を有するかどうかを決定することを含む。これは、腫瘍または腫瘍の周囲の環境が健康な被験体の同じまたは同様の組織において見出されるものより多くのＧＭ−ＣＳＦを含むかどうかを決定することを含み得る。方法は、被験体が、少なくとも４０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも７０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも２００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも３００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも４００ｐｇ／ｍｌまたは少なくとも５００ｐｇ／ｍｌである血清ＧＭ−ＣＳＦレベルを有するかどうかを決定することを含み得る。いくつかの実施形態によれば、方法は最初に、被験体が神経膠腫を有するかどうかを決定することを含む。方法はまた、被験体が高いレベルのＧＭ−ＣＳＦを分泌する神経膠腫を有するかどうかを決定することを含み得る。上記決定の１つ以上がなされるとすぐに、本方法はＧＭ−ＣＳＦ阻害剤を被験体に、例えば、腫瘍を安定化させるまたはそのサイズを低減させることにより被験体を治療するのに治療的に有効な量で投与することを含み得る。
【０１１５】
本明細書で記載される阻害核酸分子は被験体に（例えば、組織部位での直接注射により）投与することができ、またはインサイチューで生成させることができ、そのため、それらは標的タンパク質、例えば、ＯＰＮ、ラクトアドヘリンまたはＧＭ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦ受容体をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズし、またはこれに結合し、よって、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによりタンパク質の発現を阻害する。あるいは、阻害核酸分子は選択された細胞を標的にするように修飾され、その後に全身的に投与することができる。全身投与では、阻害核酸分子は、例えば、阻害核酸核酸分子、またはこれらを含む送達ビヒクル、例えばリポソームを、細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結させることにより、選択された細胞表面上で発現される受容体または抗原に特異的に結合するように修飾することができる。阻害核酸分子はまた、ベクターを用いて細胞に送達させることができる。阻害核酸分子の十分な細胞内濃度を達成するために、阻害核酸核酸分子が強力なプロモーターの制御下に置かれたベクターコンストラクトが使用され得る。担体、例えばリポソームおよびインターナリゼーションを誘導する他のものもまた、使用され得る。
【０１１６】
治療薬、例えば、インテグリンリガンド阻害剤またはＧＭ−ＣＳＦ阻害剤は当技術分野で知られている標準技術を使用して患者に投与することができる。治療薬は、全身的に、または標的細胞が位置する部位、例えば、脳で直接投与することができる。部位への送達は、局所投与、部位への注射、または、例えば白色脂肪組織における外科的埋め込みを含む。
【０１１７】
投与される治療薬の濃度および量は治療される障害、投与される治療薬の型、投与方法、ならびに患者の年齢および健康によって変動するであろう。しかしながら、当業者は適正量を決定することができるであろう。
【０１１８】
投与を助けるために、治療薬は医薬組成物中の材料成分として製剤化され得る。そのため、さらなる実施形態では、治療薬、および薬学的に許容される希釈剤を含む医薬組成物が提供される。そのため、障害、例えば癌を治療するのに使用するための医薬組成物もまた、本明細書で提供される。組成物は、通常、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、保存剤および様々な適合可能な担体を含み得る。全ての型の送達のために、治療薬は生理食塩水中で製剤化され得る。治療薬は治療薬を、それが標的細胞に送達されるまで保護および／または保存するのに有用なリポソームまたは他の生体材料中に組み入れることができる。リポソームはまた、治療薬を所望の位置、例えば、腫瘍に標的させるのを助け得る。
【０１１９】
医薬組成物は、加えて、障害を治療するのに有用な他の治療薬、例えば癌を治療するための他の薬剤を含み得る。いくつかの実施形態によれば、腫瘍促進活性を有する浸潤マクロファージの腫瘍促進活性を阻害するまたは低減させる１つ以上の他の薬剤が投与される。そのような薬剤としては下記が挙げられる：肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の阻害剤；単球走化性タンパク質（ＭＣＰ１）の阻害剤；ＭＣＰ３の阻害剤およびＣＸＣＲＬ１−ＣＸＣＲ１の阻害剤。
【０１２０】
いくつかの実施形態によれば、本発明はインテグリンリガンドの阻害剤の薬学的に許容される製剤の投与に関する。いくつかの実施形態によれば、本発明はＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ受容体の阻害剤の薬学的に許容される製剤の投与に関する。「薬学的に許容される製剤」は、所望の結果を与え、また、患者への潜在的危害が、その患者への潜在的利益より大きいということを医師に納得させるのに十分な有害な副作用を生成させない様式でインテグリンリガンド阻害剤を投与するのに好適なものである。
【０１２１】
いくつかの実施形態によれば、本明細書で記載される方法は、インテグリンリガンド阻害剤をＧＭ−ＣＳＦ阻害剤と一緒に投与することを含む。いくつかの実施形態によれば、方法は、神経膠腫を有する、または神経膠腫を発症する可能性がある被験体に、治療的有効量のインテグリンリガンド阻害剤、例えばオステオポンチン阻害剤またはラクトアドヘリン阻害剤およびＧＭ−ＣＳＦ阻害剤を投与することを含む。いくつかの実施形態によれば、方法は神経膠腫を有する、または神経膠腫を発症する可能性がある被験体に、治療的有効量のオステオポンチン阻害剤およびラクトアドヘリン阻害剤をＧＭ−ＣＳＦ阻害剤と一緒に投与することを含む。方法は最初に、神経膠腫を有する被験体の試料中のＧＭ−ＣＳＦ、オステオポンチンおよび／またはラクトアドヘリンのレベルを決定することを含むことができ、ＧＭ−ＣＳＦ、オステオポンチンおよび／またはラクトアドヘリンのレベルが、神経膠腫、例えば、侵襲性形態の神経膠腫と関連するレベルを超えている場合、その後、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤を、インテグリンリガンド阻害剤、例えばオステオポンチン阻害剤および／またはラクトアドヘリン阻害剤と組み合わせて投与することを含む。
【０１２２】
本発明の医薬組成物は、患者に投与するのに好適な薬学的に許容される組成物の調製のための公知の方法により調製することができ、そのため、有効な量の治療薬、および１つまたは複数の任意の追加の活性物質が混合物中で薬学的に許容されるビヒクルと組み合わされる。これに基づき、医薬組成物は、排他的ではないが、１つ以上の薬学的に許容されるビヒクルまたは希釈剤と関連され、好適なｐＨを有し、生理液と等張である緩衝溶液に含まれる治療薬溶液を含む。
【０１２３】
治療薬と共に使用される薬学的に許容される希釈剤の割合およびアイデンティティは、選択された経路の投与、生細胞との適合性、および標準薬務により決定される。一般に、医薬組成物は、治療薬の生物学的特性を死滅させ、または著しく損なうことはない構成成分と共に製剤化されるであろう。
【０１２４】
本発明の医薬組成物は、当業者に理解されるように、選択された投与経路によって、患者に様々な形態で投与され得る。例えば、組成物は、局所的に、外科的にまたは注射により所望の部位に投与され得る。いくつかの実施形態によれば、治療薬は局所的にまたは注射により（皮下、静脈内、筋肉内に、など）直接所望の部位に投与され、そこでは、標的細胞、例えば、白色脂肪細胞が患者体内に位置する。
【０１２５】
例示的な診断法およびバイオマーカー適用
診断、予後およびバイオマーカーベースの方法および組成物もまた、本明細書で提供される。方法は、インテグリンリガンド、例えば、ＯＰＮまたはラクトアドヘリンのレベルを決定することおよび／またはＧＭ−ＣＳＦのレベルを決定することに基づいてもよい。試料中のインテグリンリガンドおよび／またはＧＭ−ＣＳＦのレベルは、様々な方法、例えばＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットにより、例えば、インテグリンリガンドに特異的に結合する抗体を使用して決定することができる。方法はまた、腫瘍促進活性を有する腫瘍浸潤マクロファージまたはミクログリア細胞のレベルまたは数を決定することに頼ることができる。マクロファージまたはミクログリアは、腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリア上に存在するが、腫瘍促進活性を有さないものの上には存在しない細胞表面マーカーに基づいて単離され同定され得る。例示的なマーカーはさらに本明細書で記載される。
【０１２６】
アッセイはまた、例えば、腫瘍細胞中のインテグリンリガンドおよび／またはＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡのレベルを決定すること、その代わりに、またはこれに加えて、個々のタンパク質のレベルを決定することに基づいてもよい。
【０１２７】
方法は、被験体から組織試料を取得することを含み得る。組織試料は腫瘍試料、脳または中枢神経系（ＣＮＳ）試料、例えば、神経膠腫腫瘍から得られる試料としてもよい。試料はまた、血液または血清または他の体液の試料であってもよい。
【０１２８】
本発明は、神経膠腫腫瘍を有する被験体が神経膠腫腫瘍を治療するための治療薬に応答するかどうかを決定するための方法を提供し、これは、被験体の神経膠腫腫瘍の試料を提供すること、および被験体の神経膠腫腫瘍におけるＯＰＮまたはラクトアドヘリンのレベルまたは活性を決定することを含み、ここで、
（ｉ）治療薬による治療より以前、または治療薬による治療の開始前の、神経膠腫におけるＯＰＮまたはラクトアドヘリンのレベルまたは活性と比較して試料中のＯＰＮまたはラクトアドヘリンのレベルまたは活性が低いことは、治療が前向きな結果を有することを示し；ならびに
（ｉｉ）治療薬による治療より以前、または治療薬による治療の開始前の、神経膠腫におけるＯＰＮまたはラクトアドヘリンのレベルまたは活性と比較して試料中のＯＰＮまたはラクトアドヘリンのレベルまたは活性が高いことは、治療が前向きな結果を有さないことを示す。
【０１２９】
本発明はさらに神経膠腫腫瘍を有する被験体が神経膠腫腫瘍を治療するための治療薬に応答するかどうかを決定するための方法を提供し、これは、被験体の神経膠腫腫瘍の試料を提供すること、ならびにＯＰＮまたはラクトアドヘリンのマクロファージまたはミクログリア上の受容体への結合によりマクロファージまたはミクログリアにおいて活性化されるシグナル経路における分子のレベルまたは活性を決定することを含み、ここで、
（ｉ）治療薬による治療より以前、または治療薬による治療の開始前の、神経膠腫における分子のレベルまたは活性と比較して、試料中の分子のレベルまたは活性が低いことは治療が前向きな結果を有することを示し；ならびに
（ｉｉ）治療薬による治療より以前、または治療薬による治療の開始前の、神経膠腫における分子のレベルまたは活性と比較して試料中の分子のレベルまたは活性が高いことは治療が前向きな結果を有さないことを示す。
【０１３０】
本発明はさらに神経膠腫腫瘍を有する被験体が神経膠腫腫瘍を治療するための治療薬に応答するかどうかを決定するための方法を提供し、これは被験体の神経膠腫腫瘍の試料を提供すること、ならびに試料中の腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアのレベルを決定することを含み、ここで
（ｉ）治療薬による治療より以前、または治療薬による治療の開始前の、神経膠腫における腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアのレベルと比較して、試料中の腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアのレベルが低いことは治療が前向きな結果を有することを示し；ならびに
（ｉｉ）治療薬による治療より以前、または治療薬による治療の開始前の、神経膠腫における腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアのレベルと比較して、試料中の腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアのレベルが高いことは、治療が否定的な結果を有することを示す。
【０１３１】
治療薬は、例えば、さらに本明細書で記載されるように、インテグリンリガンド阻害剤、例えばＯＰＮまたはラクトアドヘリン阻害剤とすることができる。
【０１３２】
本発明はさらに、神経膠腫腫瘍を有する被験体の予後を決定するための方法を提供し、これは、被験体の神経膠腫腫瘍の試料を提供すること、ならびに被験体の神経膠腫腫瘍におけるＯＰＮまたはラクトアドヘリンのレベルまたは活性を決定することを含み、ここで
（ｉ）以前の神経膠腫におけるＯＰＮまたはラクトアドヘリンのレベルまたは活性と比較して、試料中のＯＰＮまたはラクトアドヘリンのレベルまたは活性が低いことは予後が好ましいことを示し；ならびに
（ｉｉ）以前の神経膠腫におけるＯＰＮまたはラクトアドヘリンのレベルまたは活性と比較して、試料中のＯＰＮまたはラクトアドヘリンのレベルまたは活性が高いことは予後が好ましくないことを示す。
【０１３３】
本発明はさらに、神経膠腫腫瘍を有する被験体の予後を決定するための方法を提供し、これは、被験体の神経膠腫腫瘍の試料を提供すること、ならびにＯＰＮまたはラクトアドヘリンのマクロファージまたはミクログリア上の受容体への結合によりマクロファージまたはミクログリアにおいて活性化されるシグナル経路における分子のレベルまたは活性を決定することを含み、ここで
（ｉ）以前の神経膠腫における分子のレベルまたは活性と比較して、試料中の分子のレベルまたは活性が低いことは予後が好ましいことを示し；ならびに
（ｉｉ）以前の神経膠腫における分子のレベルまたは活性と比較して、試料中の分子のレベルまたは活性が高いことは予後が好ましくないことを示す。
【０１３４】
本発明はさらに、神経膠腫腫瘍を有する被験体の予後を決定するための方法を提供し、これは被験体の神経膠腫腫瘍の試料を提供すること、ならびに試料中の腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアのレベルを決定することを含み、ここで
（ｉ）以前の神経膠腫における腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアのレベルと比較して、試料中の腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアのレベルが低いことは治療が前向きな結果を有することを示し；ならびに
（ｉｉ）以前の神経膠腫における腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアのレベルと比較して、試料中の腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアのレベルが高いことは予後が好ましくないことを示す。
【０１３５】
本発明はさらに、神経膠腫腫瘍を有する被験体の予後を決定するための方法を提供し、これは、被験体の神経膠腫腫瘍の試料を提供すること；ならびに、試料中のＯＰＮまたはラクトアドヘリンのレベルまたは活性を決定することを含み、ここで、対照値より低いＯＰＮまたはラクトアドヘリンのレベルまたは活性（例えば、≦２０ｎｇ／ｍＬ）は、被験体の予後が好ましいことを示し、一方、対照値より高い（例えば、＞２０ｎｇ／ｍＬ）ＯＰＮまたはラクトアドヘリンのレベルまたは活性は予後が好ましくないことを示す。
【０１３６】
本発明はさらに、神経膠腫腫瘍を有する被験体の予後を決定するための方法を提供し、これは、被験体の神経膠腫腫瘍の試料を提供すること；ならびに、ＯＰＮまたはラクトアドヘリンの試料中のマクロファージまたはミクログリア上のインテグリンへの結合により、マクロファージまたはミクログリアにおいて活性化されるシグナル経路における分子のレベルまたは活性を決定することを含み、ここで、対照値より低い分子のレベルまたは活性は被験体の予後が好ましいことを示し、一方、対照値より高い分子のレベルまたは活性は被験体の予後が好ましくないことを示す。
【０１３７】
本発明はさらに、神経膠腫腫瘍を有する被験体の予後を決定するための方法を提供し、これは、被験体の神経膠腫腫瘍の試料を提供すること；ならびに、試料中の腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアのレベルを決定することを含み、ここで、対照値より低い、試料中の腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアのレベルは被験体の予後が好ましいことを示し、一方、対照値より高い、試料中の腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアのレベルは予後が好ましくないことを示す。
【０１３８】
対照値は良好な予後、例えば、安定化され、退行され、または他の神経膠腫と比較して徐々にしか進行しない神経膠腫を有することが見出された被験体における腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアのレベルの平均（例えば、統計的に有意）である値としてもよい。ＯＰＮおよびラクトアドヘリンレベルに対する対照値は２０ｎｇ／ｍＬであってもよい。
【０１３９】
例えば、腫瘍促進活性を有する浸潤マクロファージと関連する腫瘍を同定するための方法もまた、提供される。方法は腫瘍試料、例えば、神経膠腫試料を提供すること、およびそのレベルまたは活性がインテグリンリガンド、例えば、ＯＰＮまたはラクトアドヘリンの受容体、例えば、インテグリンへの結合により調節される、１つ以上のシグナル伝達経路分子のレベルまたは活性（例えば、リン酸化の状態）を決定することを含み得る。そのようなマーカーの上昇したレベルは腫瘍促進活性を有する腫瘍浸潤マクロファージまたはミクログリアの存在を示す。
【０１４０】
さらに、腫瘍促進活性を有する浸潤マクロファージを有する腫瘍の存在を決定するための診断方法が提供される。方法は被験体の組織試料、例えば、脳試料または腫瘍試料を提供すること、およびインテグリンリガンド、例えば、ＯＰＮまたはラクトアドヘリンのレベルを決定することを含み得る。インテグリンリガンドの存在は、腫瘍および不良予後の存在を示し、腫瘍促進活性を有する浸潤マクロファージまたはミクログリアの存在もまた示し得る。いくつかの実施形態によれば、試料中のＯＰＮまたはラクトアドヘリンの存在は、組織、例えば、腫瘍が抗炎症活性ではなく腫瘍促進性（または浸潤促進性）を有するマクロファージまたはミクログリアを含むことを示す。
【０１４１】
被験体の組織試料、例えば脳試料中のＯＰＮまたはラクトアドヘリンの存在はまた、被験体における脳腫瘍、例えば、神経膠腫の存在を示し得る。１つの実施形態では、方法は被験体の脳組織試料を提供すること、および脳組織試料中のＯＰＮまたはラクトアドヘリンのレベルを決定することを含み、神経膠腫を有さない対照被験体と比較して、被験体の脳組織試料中のＯＰＮまたはラクトアドヘリンの統計的に有意に高いレベルは被験体は神経膠腫を有する、またはこれを発症する可能性があることを示す。
【０１４２】
本発明はさらに、腫瘍、例えば、神経膠腫を有する被験体の予後を決定するための方法を提供し、これは腫瘍を有する被験体の試料を提供すること、および試料中のＧＭ−ＣＳＦのレベルを決定することを含み、ここで
（ｉ）腫瘍を有さない被験体のレベルと比較して、腫瘍を有する被験体の試料中のＧＭ−ＣＳＦのレベルが高いことは被験体が不良予後を有することを示し；ならびに
（ｉｉ）腫瘍を有さない被験体のレベルと比較して、腫瘍を有する被験体の試料中のＧＭ−ＣＳＦのレベルが低いことは被験体が良好な予後を有することを示す。
【０１４３】
試料は脳試料、腫瘍試料、腫瘍付近の組織または流体の試料（例えば、頭蓋内流体）、または血液もしくは血清試料であってもよい。腫瘍は神経膠腫、例えば、神経膠腫多形であってもよい。方法はＧＭ−ＣＳＦタンパク質のレベルまたはＧＭ−ＣＳＦ核酸、例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡのレベルを決定することを含み得る。ＧＭ−ＣＳＦタンパク質のレベルは健康な被験体では検出できず；ならびに、４０ｐｇ／ｍｌに等しい、またはこれを超えるＧＭ−ＣＳＦのレベルは異常な状態、例えば、腫瘍、喘息、寄生虫感染または神経修復の存在を示す。よって、腫瘍を有さない被験体におけるＧＭ−ＣＳＦのレベルは＜４０ｐｇ／ｍｌである。健康な対照群（０．０９±０．１１ｐｇ／ｍｌ）と比較したＧＢＭにおけるＧＭ−ＣＳＦ（１．２３±０．３７ｐｇ／ｍｌ；ｐ＜０．０００１）（Ａｆａｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．２０１０、１１２（１）：４３−９）。
【０１４４】
本明細書で記載されるように、ＧＭ−ＣＳＦのレベルは低悪性度神経膠腫において３−５倍、高悪性度神経膠腫において２００倍超上方制御される。したがって、本明細書では、腫瘍、例えば、神経膠腫を有する被験体の予後（または疾患の重症度）を決定するための方法もまた提供され、これは、腫瘍を有する被験体の試料を提供すること、ならびに試料中のＧＭ−ＣＳＦのレベルを決定することを含み、ここで
（ｉ）腫瘍を有さない被験体のレベルと比較して、少なくとも１００倍、１５０倍、または２００倍高い、腫瘍を有する被験体の試料中のＧＭ−ＣＳＦのレベルは、被験体が不良予後を有することを示し；ならびに
（ｉｉ）腫瘍を有さない被験体におけるレベルに類似する、またはこれより低い、腫瘍を有する被験体の試料におけるＧＭ−ＣＳＦのレベルは、被験体が良好な予後を有することを示す。
【０１４５】
本発明はさらに、腫瘍、例えば、神経膠腫を有する被験体の予後を決定するための方法提供し、これは、腫瘍を有する被験体の血清試料を提供すること、ならびに試料中のＧＭ−ＣＳＦのレベルを決定することを含み、ここで
（ｉ）１００ｐｇ／ｍｌ、１５０ｐｇ／ｍｌ、２００ｐｇ／ｍｌ、３００ｐｇ／ｍｌ、４００ｐｇ／ｍｌ、または５００ｐｇ／ｍｌよりも高い、腫瘍を有する被験体の血清試料中のＧＭ−ＣＳＦのレベルは被験体が不良予後を有することを示し；ならびに
（ｉｉ）１００ｐｇ／ｍｌ、７０ｐｇ／ｍｌ、５０ｐｇ／ｍｌ、または４０ｐｇ／ｍｌより低い、腫瘍を有する被験体の血清試料中のＧＭ−ＣＳＦのレベルは、被験体が良好な予後を有することを示す。
【０１４６】
被験体における腫瘍の重症度（または侵襲性）を決定するための方法もまた、本明細書で提供され、これは、腫瘍を有する被験体の血清試料を提供すること、ならびに試料中のＧＭ−ＣＳＦのレベルを決定することを含み、ここで
（ｉ）１００ｐｇ／ｍｌ、１５０ｐｇ／ｍｌ、２００ｐｇ／ｍｌ、３００ｐｇ／ｍｌ、４００ｐｇ／ｍｌ、または５００ｐｇ／ｍｌよりも高い、腫瘍を有する被験体の血清試料中のＧＭ−ＣＳＦのレベルは、被験体が侵襲性腫瘍、例えば、高悪性度神経膠腫を有することを示し；ならびに
（ｉｉ）１００ｐｇ／ｍｌ、７０ｐｇ／ｍｌ、５０ｐｇ／ｍｌ、または４０ｐｇ／ｍｌより低い、腫瘍を有する被験体の血清試料中のＧＭ−ＣＳＦのレベルは、被験体が侵襲性腫瘍を有さない、および、例えば、低悪性度神経膠腫しか有し得ないことを示す。
【０１４７】
発明の方法はまた、ＧＭ−ＣＳＦのレベルを測定する様式として、ＧＭ−ＣＳＦレベルを介するシグナル伝達のレベルを決定することを含み得る。方法はまた、ＧＭ−ＣＳＦのレベルを測定するための手段として、ＧＭ−ＣＳＦのその受容体への結合により活性化されるシグナル伝達分子のレベルを決定することを含み得る。分子はＪＡＫ２、例えば活性化ＪＡＫ２とすることができる。例示的な方法は下記の通りである：
【０１４８】
本発明はさらに、腫瘍、例えば、神経膠腫を有する被験体の予後（または疾患の重症度）を決定するための方法を提供し、これは、腫瘍を有する被験体の試料を提供すること、ならびに試料中の活性化ＧＭ−ＣＳＦシグナル伝達分子（例えば、活性化またはリン酸化ＪＡＫ２）のレベルを決定することを含み、ここで
（ｉ）腫瘍を有さない被験体のレベルと比較して、腫瘍を有する被験体の試料中の活性化ＧＭ−ＣＳＦシグナル伝達分子のレベルが高いことは、被験体が不良予後を有することを示し；ならびに
（ｉｉ）腫瘍を有さない被験体のレベルと比較して、腫瘍を有する被験体の試料中の活性化ＧＭ−ＣＳＦシグナル伝達分子のレベルが低いまたは同様であることは被験体が良好な予後を有することを示す。
【０１４９】
本発明はさらに、神経膠腫腫瘍を有する被験体の予後を決定するための方法を提供し、これは、被験体の神経膠腫腫瘍の試料を提供すること；ならびに試料中のＧＭ−ＣＳＦのレベルを決定することを含み、ここで、対照値より低いＧＭ−ＣＳＦのレベルは被験体の予後が好ましいことを示し、一方、対照値より高いＧＭ−ＣＳＦのレベルは予後が好ましくないことを示す。対照値は良好な予後、例えば、安定化され、退行され、または他の神経膠腫と比較して徐々にしか進行しない神経膠腫を有することが見出された被験体におけるレベルの平均（例えば、統計的に有意）である値とすることができる。ＧＭ−ＣＳＦレベルに対する対照値は５０ｐｇ／ｍｌ、４０ｐｇ／ｍｌ、または１５ｐｇ／ｍＬとすることができる。
【０１５０】
本発明はさらに、腫瘍、例えば、神経膠腫を有する被験体が、腫瘍を治療するための治療薬に応答するかどうかを決定するための方法を提供し、これは、被験体の試料を提供すること、ならびに被験体の試料中のＧＭ−ＣＳＦのレベルまたは活性を決定することを含み、ここで
（ｉｉｉ）治療薬による治療より以前、または治療薬による治療の開始前の試料中のＧＭ−ＣＳＦのレベルまたは活性と比較して、試料中のＧＭ−ＣＳＦのレベルまたは活性が低いことは、治療が前向きな結果を有することを示し；ならびに
（ｉｖ）治療薬による治療より以前、または治療薬による治療の開始前の試料中のＧＭ−ＣＳＦのレベルまたは活性と比較して、試料中のＧＭ−ＣＳＦのレベルまたは活性が高いことは治療が前向きな結果を有さないことを示す。
【０１５１】
本発明はさらに、腫瘍、例えば、神経膠腫を有する被験体が腫瘍を治療するための治療薬に応答するかどうかを決定するための方法を提供し、これは、被験体の腫瘍の試料を提供すること、ならびにＧＭ−ＣＳＦのマクロファージまたはミクログリア上のＧＭ−ＣＳＦ受容体への結合により、マクロファージまたはミクログリアにおいて活性化されるシグナル経路における分子のレベルまたは活性を決定することを含み、ここで
（ｉｉｉ）治療薬による治療より以前、または治療薬による治療の開始前の腫瘍中または腫瘍付近の分子のレベルまたは活性と比較して、試料中の分子のレベルまたは活性が低いことは治療が前向きな結果を有することを示し；ならびに
（ｉｖ）治療薬による治療より以前、または治療薬による治療の開始前の腫瘍中または腫瘍付近の分子のレベルまたは活性と比較して、試料中の分子のレベルまたは活性が高いことは治療が前向きな結果を有さないことを示す。
分子はＪＡＫ２、例えば活性化またはリン酸化ＪＡＫ２とすることができる。
【０１５２】
本明細書で記載されるように、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤の投与により治療され得る被験体を同定するための方法もまた、提供される。そのような被験体を同定するための方法は被験体から試料、例えば、脳試料、例えば、脳腫瘍試料または頭蓋内流体の試料、または血液もしくは血清試料を取得すること、ならびに試料中のＧＭ−ＣＳＦタンパク質のレベルまたは活性を決定すること（例えば、活性が決定され得る）を含むことができ、ここで、対照値より高い、試料中のＧＭ−ＣＳＦのレベルまたは活性の存在は、被験体がＧＭ−ＣＳＦ阻害剤の投与により治療することができることを示し、一方、対照値より低い、試料中のＧＭ−ＣＳＦのレベルまたは活性は、被験体がＧＭ−ＣＳＦ阻害剤による治療に応答する可能性が低いことを示す。対照値は脳腫瘍を有さない被験体、例えば、神経膠腫を有さない被験体におけるＧＭ−ＣＳＦのメジアンまたは平均（統計的に有意な）レベルまたは活性であってもよい。例えば、例として血清試料中の対照値は４０ｐｇ／ｍｌまたは１００ｐｇ／ｍｌとすることができる。よって、例えば、４０ｐｇ／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌ、２５０ｐｇ／ｍｌ、３００ｐｇ／ｍｌ、４００ｐｇ／ｍｌまたは５００ｐｇ／ｍｌよりも高いＧＭ−ＣＳＦの血液もしくは血清レベルを有する被験体はＧＭ−ＣＳＦ阻害剤の投与により治療することができ、一方、１００ｐｇ／ｍｌまたは４０ｐｇ／ｍｌより低いＧＭ−ＣＳＦの血液もしくは血清レベルを有する被験体はＧＭ−ＣＳＦ阻害剤による治療に応答することができない。
【０１５３】
いくつかの実施形態によれば、方法は被験体が神経膠腫を有するかどうかを決定することを含み、被験体が神経膠腫を有する場合、その後、被験体の試料中、例えば、腫瘍試料、脳試料、血清試料のＧＭ−ＣＳＦのレベルまたは活性を決定することを含み、ここで、神経膠腫を有さない被験体と比較して、または対照値（例えば、４０ｐｇ／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌ、２５０ｐｇ／ｍｌ、３００ｐｇ／ｍｌ、４００ｐｇ／ｍｌまたは５００ｐｇ／ｍｌ血清ＧＭ−ＣＳＦ）と比較して、被験体におけるＧＭ−ＣＳＦのレベルまたは活性が高いことは被験体がＧＭ−ＣＳＦ阻害剤による治療に応答する可能性があることを示し、一方、神経膠腫を有さない被験体におけるものに類似する、もしくはこれより低い、あるいは対照値（例えば１００ｐｇ／ｍｌまたは４０ｐｇ／ｍｌ血清ＧＭ−ＣＳＦ）より低い、被験体におけるＧＭ−ＣＳＦのレベルまたは活性は、被験体がＧＭ−ＣＳＦ阻害剤による治療に応答する可能性が低いことを示す。
【０１５４】
被験体がＧＭ−ＣＳＦ阻害剤による治療に応答する可能性があるかどうかを決定するための方法はまた、被験体に（例えば、単回投与の）ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤を投与すること；被験体から試料を取得することおよびＧＭ−ＣＳＦのレベルを決定することを含むことができ、ここで、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤の投与前のそのレベルと比較して被験体の試料中のＧＭ−ＣＳＦのレベルが低いことは、被験体がＧＭ−ＣＳＦ阻害剤による治療に応答する可能性がある、一方、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤の投与前のそのレベルと比較して被験体の試料中のＧＭ−ＣＳＦのレベルが同様か高いことは被験体がＧＭ−ＣＳＦ阻害剤による治療に応答する可能性が低いことを示す。方法はＧＭ−ＣＳＦ阻害剤の投与前に腫瘍試料を取得することを含み得る。
【０１５５】
被験体がＧＭ−ＣＳＦ阻害剤による治療に応答する可能性があるかどうかを決定するための方法はまた、被験体に（例えば、単回投与の）ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤を投与すること；被験体から腫瘍試料を取得すること、ならびに浸潤マクロファージ／ミクログリアのレベルを決定することを含むことができ、ここで、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤の投与前の腫瘍における浸潤マクロファージ／ミクログリアのレベルと比較して被験体の腫瘍試料中の浸潤マクロファージ／ミクログリアのレベルが低いことは、被験体がＧＭ−ＣＳＦ阻害剤による治療に応答する可能性があることを示し、一方、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤の投与前の腫瘍における浸潤マクロファージ／ミクログリアのレベルと比較して、被験体の腫瘍試料中の浸潤マクロファージ／ミクログリアのレベルが同様か高いことは、被験体がＧＭ−ＣＳＦ阻害剤による治療に応答する可能性が低いことを示す。方法は、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤の投与前に腫瘍試料を取得することを含み得る。
【０１５６】
さらに、ＧＭ−ＣＳＦを産生する腫瘍、例えば侵襲性神経膠腫の存在を決定するための診断方法が提供される。方法は、被験体の試料、例えば脳試料または腫瘍試料または血清試料を提供すること、ならびに、ＧＭ−ＣＳＦのレベルまたは活性を決定することを含み得る。神経膠腫を有さない被験体におけるものより少なくとも１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、４００倍または５００倍高いＧＭ−ＣＳＦの存在または活性は、腫瘍の存在および不良予後を示す。
【０１５７】
例えば、ＧＭ−ＣＳＦを検出する画像技術を使用して、被験体の体内のＧＭ−ＣＳＦのレベルを測定することもまた、可能である。そのような場合、被験体から試料を取得する必要はない。
【０１５８】
本発明はさらに、マクロファージの腫瘍促進活性を阻害することができる阻害剤を同定するためのスクリーニングアッセイを提供する。スクリーニングアッセイは下記を含む：ＧＣＭに誘導されたアクチン細胞骨格変化および蛍光ビーズ食作用の分析に基づくアッセイ；例えば、マトリゲルマトリクス浸潤アッセイにおける、ミクログリア細胞の存在または非存在下での神経膠腫細胞の浸潤性の試験に基づくアッセイ、続いてＤＡＰＩ染色およびｉＣｙｓ（商標）Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いた定量化；特異的Ｍ２型遺伝子の発現：Ａｒｇ１、ｍｔ１−ｍｍｐ、ＣＸＣＬ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＳＭＡＤ７。それらはＧＣＭおよびインテグリンリガンドにより選択的に誘導される遺伝子である。
【０１５９】
例示的なスクリーニングアッセイは、腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアをインテグリンリガンド、例えばＯＰＮ（例えば、ヒトＯＰＮ）またはラクトアドヘリン（例えば、ヒトラクトアドヘリン）またはその生物活性フラグメントもしくはバリアント（例えば、ＲＧＤモチーフを含む）と、試験化合物の存在下で接触させること、ならびに、試験薬剤の存在がマクロファージまたはミクログリアの腫瘍促進活性の少なくともいくらかの部分を逆転させるかどうかを決定することを含み得る。これは、例えば、腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアに特異的であり、腫瘍促進活性を有さないマクロファージまたはミクログリア中に存在しない（または異なるレベルで存在する）マーカーを測定することにより決定することができる。このアッセイにおいて使用するためのマクロファージまたはミクログリアは精製された細胞集団（例えば、単離された細胞または細胞集団）とすることができ、またはそれらは他の細胞、例えば、腫瘍細胞と一緒に組成物中に存在してもよい。例えば、細胞集団は１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％未満または超の、腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアを含み得る。マクロファージまたはミクログリアはまた細胞系であってもよい。
【０１６０】
治療化合物はまた、インテグリンリガンド、例えばＯＰＮまたはラクトアドヘリンが、抗腫瘍活性を有するマクロファージまたはミクログリアを、それぞれ、腫瘍促進活性を有するマクロファージまたはミクログリアに変化させるのを媒介する、またはこれに関与するのを防止するそれらの能力により同定することができる。例示的な方法は、抗腫瘍活性を有するマクロファージまたはミクログリアの集団をインテグリンリガンド、例えば、ＯＰＮまたはラクトアドヘリンと、試験化合物の存在または非存在下で接触させること、試験化合物の存在が、抗腫瘍活性を有するマクロファージまたはミクログリアがその抗腫瘍活性を損失し、腫瘍促進活性を得るのを阻害または防止するかどうかを決定することを含み得る。
【０１６１】
このアッセイにおいて使用するためのマクロファージまたはミクログリアは、精製された細胞集団（例えば、単離された細胞または細胞集団）とすることができ、またはそれらは他の細胞、例えば、腫瘍細胞と一緒に組成物中に存在してもよい。例えば、細胞集団は１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％未満または超の、抗腫瘍活性を有するマクロファージまたはミクログリアを含み得る。マクロファージまたはミクログリアはまた細胞系であってもよい。
【０１６２】
スクリーニング方法はまた、ＯＰＮまたはラクトアドヘリンまたはその生物活性フラグメントもしくはバリアント（例えば、ＲＧＤモチーフを含む）を、インテグリン、例えば、αＶβ３と、試験化合物の存在または非存在下で接触させること、ならびに、試験化合物が、ＯＰＮまたはラクトアドヘリン、またはそれらのフラグメントもしくはバリアントとインテグリンの間の相互作用を阻害するまたは低減させるかどうかを決定することを含むことができ、ここで、相互作用を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％だけ低減させる試験化合物は、本明細書で記載される方法で使用することができるインテグリンリガンド阻害剤である。
【０１６３】
ＧＭ−ＣＳＦにより誘導された腫瘍進行、血管新生または腫瘍部位へのマクロファージまたはミクログリアの動員を防止することができる薬剤を同定するのに有用なスクリーニングアッセイもまた本明細書で提供される。
【０１６４】
方法は、ＧＭ−ＣＳＦを産生する腫瘍細胞、例えば、神経膠腫細胞を、少なくとも１つのＧＭ−ＣＳＦ生物活性を阻害する試験化合物と接触させること、ならびにマクロファージまたはミクログリアが腫瘍細胞部位に動員されるかどうかを決定すること、または腫瘍進行が減速されるかどうかを決定することを含み得る。１つの実施形態では、アッセイは器官型脳切片培養物を使用し、アッセイは試験化合物、例えば、少なくとも１つのＧＭ−ＣＳＦ生物活性を阻害する試験化合物を培養物に添加することを含む。試験化合物が添加されてない培養物と比較して、腫瘍細胞へのマクロファージ／ミクログリアの移動の量が低減したことは、試験化合物がＧＭ−ＣＳＦ阻害剤であることを示し、これはＧＭ−ＣＳＦを分泌する腫瘍を治療するために使用することができる。
【０１６５】
本明細書で記載される方法において使用するためのＧＭ−ＣＳＦ阻害剤を同定するための方法は、腫瘍細胞、例えば、ＧＭ−ＣＳＦを産生する神経膠腫細胞を試験化合物と接触させること、ならびに腫瘍細胞によるＧＭ−ＣＳＦの産生が減速されるかどうかを決定することを含み得る。腫瘍細胞によるＧＭ−ＣＳＦの産生を減速させる試験化合物は、ＧＭ−ＣＳＦを分泌する腫瘍、および任意で腫瘍浸潤マクロファージまたはミクログリアを有する被験体を治療するための、本明細書で記載される方法で使用することができる化合物である。アッセイにおいて使用するための腫瘍細胞、例えば、神経膠腫細胞は精製された細胞集団（例えば、単離された細胞または細胞集団）であってもよく、または他の細胞、例えば、浸潤マクロファージまたはミクログリアと一緒に組成物中に存在してもよい。例えば、腫瘍細胞の集団は１０％、２０％、３０％、または４０％未満あるいは超のマクロファージまたはミクログリアを含み得る。腫瘍細胞はまた、細胞系の細胞、例えば、実施例で記載されるものであってもよい。
【０１６６】
スクリーニング方法はまたＧＭ−ＣＳＦ（例えば、ヒトＧＭ−ＣＳＦ）またはその生物活性フラグメントもしくはバリアントをＧＭ−ＣＳＦ受容体（可溶性、または細胞膜上）と、試験化合物の存在または非存在下で接触させること、ならびに、試験化合物がＧＭ−ＣＳＦ、またはそれらのフラグメントもしくはバリアントとＧＭ−ＣＳＦ受容体の間の相互作用を阻害するまたは低減させるかどうかを決定することを含むことができ、ここで、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％だけ相互作用を低減させる試験化合物は、本明細書で記載される方法で使用することができるＧＭ−ＣＳＦ阻害剤である。
【０１６７】
方法はさらに、細胞に基づくアッセイまたはインビボアッセイ、例えば試験化合物がマクロファージの腫瘍促進活性を逆転させる、または抗腫瘍活性を有するマクロファージが腫瘍促進活性を有するマクロファージとなるのを防止するかどうかを決定するためのアッセイにおいて、同定された試験化合物を試験することを含み得る。
【０１６８】
いくつかの実施形態によれば、試験化合物は最初、ライブラリ、例えば、無機もしくは有機化学ライブラリ、ペプチドライブラリ、オリゴヌクレオチドライブラリ、または混合分子ライブラリのメンバーである。いくつかの実施形態によれば、方法は、小分子、例えば、天然産物またはコンビナトリアル化学ライブラリのメンバーをスクリーニングすることを含む。
【０１６９】
ある所定のライブラリは、構造的に関連するまたは関連しない試験化合物の組を含み得る。好ましくは、多様な分子の組が様々な機能、例えば電荷、芳香族性、水素結合、可撓性、サイズ、側鎖の長さ、疎水性、および剛性をカバーするために使用されるべきである。ライブラリを作成するために好適なコンビナトリアル技術は当技術分野で知られている。加えて、小分子ライブラリを含む多くのライブラリが市販されている。
【０１７０】
いくつかの実施形態によれば、試験化合物は、下記である：ペプチドまたはペプチド模倣分子、例として、ペプチド類似体、例えば非天然アミノ酸を含むまたは非ペプチド結合を有するペプチド；ペプチド模倣物（例えば、ペプトイドオリゴマー、例えば、ペプトイドアミドまたはエステル類似体、β−ペプチド、Ｄ−ペプチド、Ｌ−ペプチド、オリゴウレアまたはオリゴカルバメート）；小ペプチド（例えば、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、またはそれ以上、例えば、２０マー以上）；環状ペプチド；他の非天然または不自然ペプチド様構造；ならびに無機分子（例えば、複素環分子）。いくつかの実施形態によれば、試験化合物は核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドである。
【０１７１】
いくつかの実施形態によれば、試験化合物およびそのライブラリは第１の試験化合物の構造を系統的に変化させることにより得ることができる。例えば、１つの実施形態では、小分子の一般ライブラリが、例えば、本明細書で記載される方法を使用してスクリーニングされ、第１の試験小分子が選択される。当技術分野で知られている方法を使用して、その小分子の構造が必要に応じて同定され、例えば、構造−活性関係研究により、得られた生物活性に相関させられる。当業者であれば認識するように、そのような構造−活性関係を作成するための様々な標準方法が存在する。よって、いくつかの場合には、研究は主に経験的であり、他の場合には、内在性ポリペプチドまたはその一部の３次元構造を１つまたは複数の小分子化合物の合理的設計のための開始点として使用することができる。
【０１７２】
いくつかの実施形態によれば、第１のスクリーンにおいて「ヒット」（例えば、抗腫瘍マクロファージの腫瘍促進性マクロファージへの形質転換を阻害する、またはマクロファージの腫瘍促進活性を抗腫瘍活性に復帰させることができる試験化合物）として同定された試験化合物が選択され、例えば、結合親和性、結合活性、特異性、または他のパラメータを最適化するために、合理的設計を使用して、系統的に変化させることにより最適化される。そのような潜在的に最適化された構造はまた、本明細書で記載される方法を使用してスクリーニングすることができる。よって、１つの実施形態では、発明は本明細書で記載される方法を使用して試験化合物の第１のライブラリをスクリーニングすること、そのライブラリにおいて１つ以上のヒットを同定すること、それらのヒットを系統的構造変化に供し、ヒットに構造的に関連する１つ以上の第二世代化合物を作成すること、ならびに第二世代化合物をスクリーニングすることを含む。最適化の追加のラウンドを使用して、望ましい治療プロファイルを有する試験化合物を同定することができる。
【０１７３】
ヒットと同定された試験化合物は、本明細書で記載される障害を治療および防止する方法において有用な候補治療化合物と考えることができる。よって、発明はまた、本明細書で記載される方法により「ヒット」として同定される化合物、および本明細書で記載される疾患の治療、防止、またはその発症もしくは進行の遅延におけるそれらの投与および使用のための方法を含む。
【０１７４】
治療するためのキット；診断、予後またはバイオマーカー使用のためのキット、およびスクリーニングアッセイのためのキットもまた、本明細書で提供される。キットは、治療、診断、予後、バイオマーカーアッセイまたはスクリーニングアッセイの方法で使用される少なくとも１つ以上の要素を含み得る。
【０１７５】
下記実施例は発明のある一定の実施形態をより完全に説明するために提供される。しかしながら、それらは決して、発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者は、発明の範囲から逸脱せずに、本明細書で開示される原理の多くの変更および改変を容易に考え出すことができる。
【０１７６】
実施例
実施例１：材料および方法
細胞培養および処理．ラットミクログリアの初代培養物を１日齢Ｗｉｓｔａｒラット子から、前に記載されるように調製した（ＺａｗａｄｚｋａおよびＫａｍｉｎｓｋａ  ２００３）。簡単に言うと、細胞を大脳皮質からトリプシン処理（ｔｒｙｐｓｉｎａｔｉｏｎ）により単離し、機械的に解離させ、ポリ−Ｌ−リジンコート培養７５ｃｍ２フラスコ上の熱失活１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンが補充されたダルベッコ変法イーグル培地（Ｇｌｕｔａｍａｘおよび高グルコース処方４．５ｇ／Ｌを有する、Ｇｉｂｃｏ）中に、３ｘ１０５細胞／ｃｍ２の密度で蒔いた。マウスｐＥＧＦＰ−ＧＬ２６１神経膠腫細胞を、１０％ＦＢＳおよび抗生物質（５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）を有するＤＭＥＭ中で培養した。アストロサイトの初代培養物を、２日齢のＣ５７ＢＬ／６新生仔マウスの大脳皮質から調製した。アストロサイトを高グルコースを有する、１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ培地中で培養した。培地を３日後に、その後、１週間に２回交換した。細胞培養物を３７℃にて、加湿５％ＣＯ２／９５％空気インキュベーター（Ｈｅｒａｅｕｓ、Ｈａｎａｕ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で維持した。２週間後、緩く接着したミクログリア細胞をコンフルエントグリア培養物から弱い振盪および遠心分離（３００ｇで５分）により回収した。いくつかの実験ではミクログリア培養物を、ＲＧＤモチーフを含む７−アミノ酸合成ペプチドまたは対照、スクランブルペプチドで処理した。
【０１７７】
免疫細胞化学．細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２％パラホルムアルデヒドにより指示された時間期間で固定した。固定細胞をファロイジンテトラメチルローダミンＢイソチオシアネートと共に３０分室温でインキュベートした。その後、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、細胞核を、ＤＡＰＩ染色（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ、１０μｇ／ｍＬ）を１０分、続いて３回ＰＢＳで洗浄して可視化した。形態学的変化を、励起４５０−４９０ｎｍを有する蛍光顕微鏡法によりモニタし、２０Ｘ対物レンズを用いて記録した。
【０１７８】
増殖アッセイ．ＢｒｄＵ取り込み試験を使用して、ミクログリア増殖速度を決定した。簡単に言うと、５ｘ１０４ミクログリア細胞を９６−ウェルプレート上に播種し、４８時間培養し、その後ＬＰＳまたはＧＣＭで刺激した。ＢｒｄＵ（１０μＭ）を２４時間後に培地に添加し、細胞を次の６時間放置した。その後、細胞を固定し、ＢｒｄＵ取り込みを製造者プロトコル（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従い決定した。
【０１７９】
細胞運動性および浸潤アッセイ．ミクログリアを３５ｍｍペトリ皿に１．５ｘ１０６細胞の密度で蒔き、４８時間後、培養物をピペットチップを用いて優しくスクラッチし、ミクログリア細胞を様々な実験条件下で培養した（対照、１００ｎｇ／ｍＬ  ＬＰＳまたはＧ−ＣＭ）。ミクログリア細胞の運動性を処理後３時間で決定した。移動細胞を、位相差顕微鏡法により可視化した。
【０１８０】
浸潤アッセイを記載されるように実施した（Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８，Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。簡単に言うと、２４ウェル組織培養インサート（１２μｍ細孔サイズＴｒａｎｓｗｅｌｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）を、増殖因子低減マトリゲル（商標）マトリクス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ．  ＣＡ、ＵＳＡ）でコートした。１００μｌの、蒸留水中で希釈したマトリゲル（商標）マトリクス（１ｍｇ／ｍｌ）を、無菌条件下（３７℃）で５−６時間乾燥させ、３０分、２００μｌの培地で再構成した。Ｃ６神経膠腫細胞（１．５ｘ１０４／インサート）を血清低減培地（２％ＦＢＳ）中のマトリゲルコートメンブレン上に播種し、ミクログリアに曝露し、または未処理のままとした。４８時間後、細胞を固定し、細胞核をＤＡＰＩで染色した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）インサートからのメンブレンを切断し、マトリゲルを通して移動した細胞の総数を、レーザー走査型サイトメトリー（ＬＳＣ、ＣｏｍｐｕＣｙｔｅ）を用いて決定した。全ての実験を３つ組で実施した。３つの独立した実験からのデータをプールし、細胞の平均数±Ｓ．Ｄとして表した。
【０１８１】
インテグリンサイレンシング．ミクログリア細胞（１ｘ１０５）を２４−ウェルプレート上に蒔き、２４時間後、細胞を２５ｎＭの対照ノンターゲティングｓｉＲＮＡ、αｖまたはβ３に対するｓｉＲＮＡ、または２つのｓｉＲＮＡ一緒（ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  ｓｉＲＮＡ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）で、０．２５μｌのＤｈａｒｍａＦＥＣＴ３トランスフェクション試薬を用いて、０．５ｍｌ培地にてトランスフェクトさせた。４８時間後、トランスフェクション培地をＧ−ＣＭにより置換し、ミクログリアの食作用性を記載されるように決定した。サイレンシング効率を推定するために細胞を培養プレートからトリプシン処理（ｔｒｙｐｓｙｎｉｚａｔｉｏｎ）により除去し、ＭＡＣＳ緩衝液中（ＰＢＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０，５％  ＢＳＡ）に最終濃度１ｘ１０５細胞／１００μｌで懸濁させた。インテグリンの細胞表面発現をαｖまたはβ３に対する一次抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および抗マウス−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて分析した。標識細胞の蛍光強度をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。平均蛍光強度を対照ｓｉＲＮＡと比較し、各実験ｓｉＲＮＡのための対照条件に対する相対変化として表した。
【０１８２】
食作用．ミクログリアの食作用性を細胞の２μｍ蛍光ラテックスビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）との９０分のインキュベーションにより決定した。ミクログリアを、３５ｍｍペトリ皿上に、１ｘ１０６細胞の密度で蒔き、４８時間、発現停止させ、その後、２４時間、異なる実験条件（対照、Ｇ−ＣＭ、５００μＭＲＧＤ−ペプチドまたはスクランブルペプチドを有するＧ−ＣＭ）に曝露した。細胞を２回、ＰＢＳで洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、ＦＩＴＣ結合イソレクチンＢ４で染色した。無／低（＜２ビーズ／細胞）、中（≧２＜１０）または高（≧１０ビーズ／細胞）食作用性活性を有する細胞のパーセンテージをカウントした。あるいは、細胞を２４−ウェルプレート上に、１．５ｘ１０５細胞の密度で蒔き、ビーズとのインキュベーション、続いて強力洗浄および固定後、総蛍光をマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を用いて測定した。
【０１８３】
タンパク質単離、電気泳動および検出.全細胞ライセートを、細胞をホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液中に擦り入れることにより調製した（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭ  β−グリセロフォスフェート、２ｍＭピロリン酸ナトリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％グリセロール、５μｇ／ｍｌロイペプチン、５μｇ／ｍｌアプロチニン、２ｍＭベンズアミジン、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）により決定した。タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）により決定した。タンパク質抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、その後、記載されるように、ニトロセルロースメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上に電気泳動転写した（Ｅｌｌｅｒｔ−Ｍｉｋｌａｓｚｅｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００５；Ｓｌｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。５％脱脂乳を含むＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水ｐＨ７．６／０．１５％Ｔｗｅｅｎ２０）でブロックした後、メンブレンをブロッキング緩衝液中で希釈した一次抗体と共に一晩、その後関連二次抗体と１時間インキュベートした。ｐ３８、ＥＲＫ１／２、ＪＮＫ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、ＡＫＴ、ＦＡＫおよびＩκＢならびにＣｏｘ−２（全て１：１０００希釈）のリン酸化および全形態を認識する抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ（１：２０００希釈）をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入し；ｉＮＯＳ（１：２０００希釈）をＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。免疫複合体を、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により可視化した。等量のタンパク質ローディングを立証するために、メンブレンを取り除き、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗β−アクチン抗体（１：１００００希釈、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ製）を用いて再プロービングした。タンパク質の分子量を着色タンパク質マーカー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いて推定した。
【０１８４】
マイクロアレイ遺伝子発現プロファイリング．４から６の独立して誘導される初代グリア培養物から単離されたミクログリアを４８時間インキュベートし、細胞を発現停止させた。培養物を未処理のままとし（対照細胞）、または１００ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）またはＧ−ＣＭで６時間刺激した。全ＲＮＡを、製造者の推奨に従い、試料からＲＮｅａｓｙ全ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して抽出し、続いて、ＤＮａｓｅ処理を実施した。ＲＮＡの量および品質をキャピラリー電気泳動によりＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＢｉｏａｎａｌｙｓｅｒ  ２１００およびＲＮＡ  ６０００  ＬａｂＣｈｉｐキットを用いて決定した。
【０１８５】
マイクロアレイ実験を、Ｍａｒｉａ  Ｓｋｌｏｄｏｗｓｋａ−Ｃｕｒｉｅ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ−Ｇｌｉｗｉｃｅ  Ｂｒａｎｃｈ（Ｇｌｉｗｉｃｅ、Ｐｏｌａｎｄ）のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ参考施設において、５μｇの全ＲＮＡをテンプレートとして使用して実施した。ビオチン標識ｃＲＮＡを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＩＶＴ標識キットを用いて合成した。断片化したｃＲＮＡを最初に対照マイクロアレイにハイブリダイズさせ、その後、試料品質評価後に、ラットゲノム２３０−２．０遺伝子チップ（２８，０００ラット遺伝子を含む３１，０４２プローブセット）にハイブリダイズさせた。
【０１８６】
マイクロアレイデータを、「ａｆｆｙ」Ｒ  Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージ（Ｉｒｉｚａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．２００２）において実装されるように、ＭＡＳ５．０アルゴリズムを用いて前処理した。少なくとも３つのハイブリダイゼーションにおいて検出されたプローブセット（コール：Ｐｒｅｓｅｎｔ）のみを使用した。そのようなプローブセットをＥｎｓｅｍｂｌ  ５６遺伝子識別子にマッピングし、ｌｏｇ２変換し、その後各遺伝子に対し平均値をとった。我々はスチューデントｔ検定を、Ｗｅｌｃｈ近似と共に使用し、著しく変化した発現を有する遺伝子を同定した。統計解析およびデータ可視化をＭａｔｈｅｍａｔｉｃａ（Ｗｏｌｆｒａｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）において実施した。偽発見率（ＦＤＲ）分析では、ｐ値のリストをＲ統計環境（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）にインポートし、ｑ値（Ｓｔｏｒｅｙ  ａｎｄ  Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，２００３）をＲ「ｑ値」パッケージを用いて計算した。
【０１８７】
観察される発現変化と関連する機能性ジーンオントロジーカテゴリを同定するために、著しく変化した発現を有する遺伝子のリスト（ｔ検定ｐ値＜０．００１）を、ｌｏｇ２表示の差に基づきランク付けし、ランク付けしたリストをＲａｎｋ  ＧＯｓｔａｔ（Ｂｅｉｓｓｂａｒｔｈ  ａｎｄ  Ｓｐｅｅｄ，２００４）を使用し、デフォルト・オプションを用いて分析した（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  Ｓｉｇｎｅｄ  Ｒａｎｋテスト、多重検定に対するＢｅｎｊａｍｉｎｉ偽発見率較正）。Ｒａｎｋ  Ｇｏｓｔａｔ出力はヒトにより解析し、編集し、カスタムスクリプトを用いて可視化した。
【０１８８】
ＨＰＬＣ分画、活性化画分の検出、質量分析およびタンパク質同定．神経膠腫馴化培地を一晩、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液に対し透析した。塩および低分子ＤＭＥＭ成分除去後、培地を凍結乾燥した。得られた調製物をアニオン交換体Ｑ（Ｓｈｏｄｅｘ  ＩＥＣ  ＱＡ−８２５ＰＨＭゲル）を用いるＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣ分画後、９０画分を回収した。各画分（培地中１：１０希釈）を、処置後２４時間で、ミクログリアの形態学的形質転換を誘導する能力に対し試験した。形態学的変化を評価し、２人の独立した研究者による１〜６のスケールでスコア化した。
【０１８９】
ＨＰＬＣ画分由来のペプチドをＮａｎｏ−スプレー液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）技術により分析した。ＭＳ／ＭＳスペクトルを含む未処理データファイルを、Ｍａｓｃｏｔデーモンを使用するデータベース検索のためのＭａｓｃｏｔ検索エンジン（ＭａｔｒｉｘＳｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）にかけた。各ペプチドの配列を参照ラットおよびウシタンパク質配列データベース（ＩＰＩ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｄｅｘ）と、これらのオプションと共に実行されるＷＵ−Ｂｌａｓｔ２．０ソフトウェアパッケージ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙからライセンス供与）を使用して比較した：−ｍａｔｒｉｘ  ｂｌｏｓｕｍ８０  −Ｅ１−Ｂ１−ｔｏｐｃｏｍｂｏＮ１−Ｗ２−Ｑ１２−Ｒ１２−ｍｆｏｒｍａｔ２。
【０１９０】
データベースにおいてヒットを有する全てのペプチドに対し、ウシｅ値のラットｅ値に対するｌｏｇ比を計算した。ラット起源まで確実に追跡することができるタンパク質の同定では、下記特徴を有するタンパク質を選択し：１）その確率スコアの各々が統計学的有意性に対し閾値（Ｐ＜０．０５）を満たす、または超える２つ以上の特有のペプチドに対するｂｌａｓｔヒットにより同定される；２）これらの配列全てに対して陽性ｌｏｇ比を有する、ウシ（培地）起源ではなく、それらのラット（Ｃ６細胞）を示す。
【０１９１】
ｓｈＲＮＡ発現ベクターの作成および安定にトランスフェクトされたＣ６神経膠腫クローン．ＢａｍＨ１およびＨｉｎｄＩＩＩオーバーハングを有するｓｐｐ１  ｓｈＲＮＡおよびｍｆｇｅ８  ｓｈＲＮＡをコードする２つの相補的オリゴヌクレオチドを、ラットｓｐｐ１  ｓｈＲＮＡおよびｍｆｇｅ８  ｍＲＮＡの発現を妨害するように設計した。使用した２つのオリゴヌクレオチドは下記であった：
Ｓｐｐ１：順方向５’−
ＧＡＴＣＣＡＧＣＴＡＧＴＣＣＴＡＧＡＣＣＣＴＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＴＡＧＧＧＴＣＴＡＧＧＡＣＴＡＧＣＴＴＧＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）
および逆方向５’−
ＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＣＡＡＧＣＴＡＧＴＣＣＴＡＧＡＣＣＣＴＡＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＴＡＧＧＧＴＣＴＡＧＧＡＣＴＡＧＣＴＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）。
Ｍｆｇｅ８：順方向５’−
ＧＡＴＣＣＧＧＡＴＧＡＡＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＣＣＧＧＴＴＣＣＧＣＴＴＴＣＡＴＣＣＴＧＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）
および逆方向５’−
ＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＴＧＡＡＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＣＣＧＧＴＴＣＣＧＣＴＴＴＣＡＴＣＣＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）
【０１９２】
ＢａｍＨ１およびＨｉｎｄＩＩＩオーバーハングを有するＧＭ−ＣＳＦ  ｓｈＲＮＡをコードする２つの相補的オリゴヌクレオチドを、マウスＧＭ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡの発現を妨害するように設計した。使用した２つのオリゴヌクレオチドは下記であった：
センス：５’−
ＧＡＴＣＣＣＧＧＡＡＡＣＧＧＡＣＴＧＴＧＡＡＡＣＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＧＴＴＴＣＡＣＡＧＴＣＣＧＴＴＴＣＣＧＧＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）および；
アンチセンス：
５’−ＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡ  ＣＣＧＧＡＡＡＣＧＧＡＣＴＧＴＧＡＡＡＣＡ  ＴＣＴＣＴＴＧＡＡ  ＴＧＴＴＴＣＡＣＡＧＴＣＣＧＴＴＴＣＣＧＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）。
【０１９３】
順方向および逆方向オリゴヌクレオチドを０．１Ｍ  ＮａＣｌ中で３分間、９４℃でインキュベートし、続いて、３７℃まで１時間徐々に冷却した。アニールさせたＤＮＡをｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．０−Ｕ６（Ａｍｂｉｏｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位でライゲートさせた。大腸菌に形質転換した後、プラスミドを増幅させ、単離し、配列を配列決定により確認した。ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ｓｐｐ１、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ｍｆｇ８  ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ＧＭ−ＣＳＦおよびｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  ２．０−Ｕ６陰性対照（Ａｍｂｉｏｎ）ベクターを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキットを用いて精製し、１．６μｇの各ＤＮＡを細胞に２μｌリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）を用いてトランスフェクトさせた。トランスフェクション１日後、ハイグロマイシンＢ（２００μｇ／ｍｌ）を添加した。耐性クローンを２週間後に選定し、適切なｍＲＮＡの発現に対しｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した。
【０１９４】
ＲＮＡ単離および遺伝子発現の定量．ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。第１鎖ｃＤＮＡを２０μｌの逆転写酵素反応混合物における２μｇの全ＲＮＡ（ＤＮａｓｅ処理）から合成した。１８ｓ  ｒＲＮＡを内部参照遺伝子として使用した。Ｃ６ラット神経膠腫細胞および初代アストロサイトにおけるオステオポンチン、およびラクトアドヘリンの発現をｑＰＣＲを用いて評価した。ＧＬ２６１神経膠腫細胞および初代アストロサイトにおけるＧＭ−ＣＳＦの発現をｑＰＣＲを用いて評価した。例えば、ＧＭ−ＣＳＦの発現の評価のために下記プライマーを使用した：
順方向：５’ＴＧＣＣＴＧＴＣＡＣＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡＧＡＧＧＴ’３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、逆方向：５’ＧＣＣＣＣＧＴＡＧＡＣＣＣＴＧＣＴＣＧＡ’３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）；
１８ｓ  ＲＮＡでは下記プライマーを使用した：
順方向：５’ＣＧＧＡＣＡＴＣＴＡＡＧＧＧＣＡＴＣＡＡＣＡ’３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）；
逆方向：５’ＡＡＣＧＡＡＣＧＡＧＡＣＴＣＴＧＧＣＡＴＧ’３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）。
【０１９５】
反応体積（２０μｌ）は、５０ｎｇのＲＮＡに等しいｃＤＮＡ、１×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および０．９μＭの各プライマーから構成した。熱サイクル条件は下記の通りとした：５０℃で２分、９５℃で１０分、続いて、変性のために９５℃で１５秒およびアニーリングおよび伸長のために６０℃で１分の４０サイクル。遺伝子発現の相対定量化は、比較ＣＴ法を用いて決定した。
【０１９６】
プラスミド構築、トランスフェクションおよび組換えタンパク質生成．ｓｐｐ１ａおよびｓｐｐ１ｃのコード配列をラット神経膠腫Ｃ６細胞由来のｃＤＮＡテンプレート上でプライマー：５’−ＡＴＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＴＡＴＧＡＧＡＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＴＴＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）および５’−ＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＴＴＧＡＣＣＴＣＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）を用い、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して増幅させた。ｍｆｇｅ８のコード配列を、ラット神経膠腫Ｃ６由来のｃＤＮＡ上で下記プライマーを使用して増幅させた：
５’−ＡＴＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＴＡＴＧＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＧＴＧＴＧＣＴＧＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）および
５’−ＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＡＣＡＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）。
【０１９７】
ｓｐｐ１ａ、ｓｐｐ１ｃおよびｍｆｇｅ８の増幅配列を、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ部位にサブクローニングさせた。得られたプラスミド（ｐＳｐｐ１ａ、ｐＳｐｐ１ｃおよびｐＭＦＧ８と呼ばれる）を配列決定により確認した。
【０１９８】
組換えオステオポンチンおよびラクトアドヘリンタンパク質を、マウス線維芽細胞において、ｐＳｐｐ１ａ、ｐＳｐｐ１ｃおよびｐＭＦＧ８プラスミドの過剰発現により生成させた。線維芽細胞ＮＩＨ  ３Ｔ３（ＡＴＴＣ由来）を２４ウェルプレートに１．７×１０５／ウェルの密度で蒔き、２４時間後、細胞をＮＩＨ／３Ｔ３細胞のためのＡｍａｘａプログラムＵ−３０およびキットＲ（Ａｍａｘａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、１．６μｇのＤＮＡを使用するｐＳｐｐ１ａ、ｐＳｐｐ１ｃおよびｐＭｆｇｅ８プラスミドを用いトランスフェクトし、その後２４時間インキュベートし、回収した。タンパク質生成を、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて決定した。
【０１９９】
リアルタイムＰＣＲ．未処理のまたは６時間ＬＰＳまたはＧ−ＣＭで処理したミクログリア培養物から単離された全ＲＮＡ（２μｇ）をテンプレートとして使用して、ｃＤＮＡを作成した。内在性対照として、１８Ｓ（Ｈｓ９９９９９９０１＿ｓ１）ｒＲＮＡを適用した。遺伝子発現定量をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）を使用して実施した。下記遺伝子に対し、リアルタイム増幅を２つ組で、２ｘＳＹＢＲ  ＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘおよびＰＲＩＭＥＲ  ＥＸＰＲＥＳＳソフトウェアを使用して設計された１組のプライマーを含む２０μｌの反応体積において実施した：ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、Ｉｌ１β、ＴＮＦα、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１４、Ａｒｇ１、Ｉｄ１およびｃ−Ｍｙｃ。標的ｍＲＮＡの量を、最初に１８Ｓ  ＲＮＡ発現レベルに対し、その後対照に対し基準化した。データを相対定量化（ΔΔＣｔ）方法により、７５００Ｓｙｓｔｅｍ  ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析した。各生成物の発現を１８Ｓ  ｒＲＮＡに対し基準化し、２−ΔΔＣｔにより計算される１８Ｓ遺伝子発現に対する標的遺伝子の比として示す。
【０２００】
頭蓋内神経膠腫埋め込みおよび腫瘍サイズの定量化．この研究は、プロトコル８５７／２００８下で実施し、それは動物実験のための地域倫理委員会により承認された。
【０２０１】
成体Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１２−１６ｗｋ）を、ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）およびメデトミジン（１ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．注射で麻酔した。ＥＧＦＰ−ＧＬ２６１神経膠腫細胞、ｓｈＧＭ−ＣＳＦ神経膠腫細胞またはｓｈＮｅｇ神経膠腫細胞（１μｌのＤＭＥＭ中８ｘ１０４細胞）を、定位装置において、座標に従い（＋１．５ｍｍＡＰ、−１．５ＭＬ）、２６−ゲージ針を有する１−μｌシリンジを用いて右線条体に接種した。マウスをアチパマゾール（ａｔｉｐａｍａｚｏｌｅ）のｉ．ｐ．投与を用いて蘇生させ、Ｔｏｌｆｅｄｉｎｅ４％（４ｍｇ／ｋｇｓ．ｃ．）で麻酔した。神経膠腫埋め込み後１５日に、動物を麻酔し、屠殺し、ＰＢＳまたはＰＢＳと４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで灌流させた。脳を取り出し、ミンチにし、または２４時間、同じ固定液中で後固定し、４℃の３０％スクロースを含むＰＢＳ中に入れた。次に、脳をドライＣＯ２で凍結させ、および連続２０μｍ厚の冠状切片をクリオスタットを使用して収集した。Ｌｅｉｃａ  ＤＭ４０００Ｂ顕微鏡を使用して画像を獲得した。
【０２０２】
冠状切片中の腫瘍面積をＩｍａｇｅ  Ｐｒｏ−Ｐｌｕｓソフトウェアを用いて、２つ毎の脳切片において測定し、腫瘍体積をＣａｖａｌｉｅｒｉ原理に従い計算した。
【０２０３】
大理石骨病マウスおよびＣｓｆ１ｏｐ変異の検出のための遺伝子型判定．Ｂ６Ｃ３Ｆｅ  ａ／ａ−Ｃｓｆ１ｏｐ／ＪマウスのつがいをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から入手し、維持し、バリア施設で光（１２Ｌ：１２Ｄ）および温度の制御された条件下で飼育した。１０−１１日齢で、切歯が存在しないことにより、およびリアルタイムＰＣＲに基づく遺伝子型判定方法を用いて、ホモ変異体を野生型およびヘテロ接合体マウスから区別した。ｏｐ／ｏｐ変異マウスを出生後日数（Ｐ）−２１で離乳させ、粉末齧歯類食を与えた。Ｃｓｆ１ｏｐ変異をゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析によりＴａｑＭａｎアレル識別方法およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用して検出した。ＤＮＡ試料を尾先端から４と１０日齢の間に調製した。
【０２０４】
脊髄における限局性脱髄の誘導およびミクログリア密度の定量化．大理石骨病および野生型２月齢マウスを使用した。動物をイソフルランおよび酸素の連続吸入により麻酔した。Ｔ４の位置を同定し、軸上筋系をクリアにした。Ｔ４と５の間の空間を露出させ、顕微鏡の使用によりクリアにした。中心静脈を同定し、硬膜に歯科用針を用いて穴を空けた。脱髄病変は１μｌの１％Ｌα−リゾホスファチジルコリン（Ｓｉｇｍａ）の後索中への２分の期間にわたる、３方向マニピュレーターに取り付けられた細いガラス先端を有するＨａｍｉｌｔｏｎ針を用いた定位注射により誘導させた。毒素の注射は軸索の脱髄を引き起こし、続いて、病変部位へのミクログリア動員が起きた。病変誘導後１０日に、マウスをイソフルランで麻酔し、４％パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で大動脈灌流させた。病変を含む脊髄の部分を切開し、４℃の４％ＰＦＡ中で一晩後固定し、３０％スクロース中で４８時間にわたり４℃で凍結保護し、ＯＣＴ埋め込み化合物中にマウントし、ドライアイス上で凍結させ、クリオスタット上で１２μｍに切断した。断面をポリ−Ｌ−リジン−コートガラススライド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にマウントさせた。Ｉｂａ１染色およびＤＡＢによる可視化を実施した。脊髄病変の画像を、デジタルカメラを備えたＬｅｉｃａ  ＤＭ  ４０００Ｂ顕微鏡で撮った。各動物由来の２つの代表的な病変写真を撮り、病変中のＩｂａ−１−標識ミクログリア細胞の総数をＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用することによりカウントした。
【０２０５】
免疫組織化学．抗Ｉｂａ１および抗ｖＷＦ抗体による染色を実施し、それぞれ、ミクログリア／マクロファージおよび血管を検出した。切片を０．５％Ｈ２Ｏ２を含むＰＢＳと共に３０分、ＲＴにてインキュベートし、透過処理し、０．３％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した１０％ロバ血清を含むＰＢＳを用いてブロックし、その後、一次抗体：抗Ｉｂａ−１（ウサギ、ポリクローナル、ＷＡＫＯ、１：１０００）または抗ｖＷＦ（ウサギ、ポリクローナル、Ａｂｃａｍ、１：１０００）と共に２４ｈ時間４℃で、および二次ヤギ抗ウサギビオチン化ＩｇＧと共に２時間ＲＴでインキュベートした。一次および二次抗体を、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および３％ロバ血清を含むＰＢＳ中で希釈した。切片を、エキストラビジン−ペルオキシダーゼ複合体（１：２００）に１時間、ＲＴで曝露し、ペルオキシダーゼ活性を０．０２％  ３．３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）および０．０１％Ｈ２Ｏ２を含むＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）で可視化した。切片を脱水させ、Ｈｉｓｔｏｆｌｕｉｄ（Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でマウントさせた。
【０２０６】
ＣＤ１１ｂ陽性細胞の単離およびフローサイトメトリー．腫瘍半球を単離し、脳組織を小片に切断し、ミンチにし、単一細胞懸濁液を受理した。細胞をＣＤ１１ｂ−ＰＥおよびＣ４５−ＰｅｒＣＰ抗体で染色し、ミクログリアおよびマクロファージのパーセンテージを決定した（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。染色細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）により評価した。データを獲得しＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析した。
【０２０７】
器官型脳切片培養物における腫瘍浸潤．器官型脳切片培養物を１６日齢雄Ｃ５７／ＢＬ６マウス（動物繁殖施設、Ｓｃｈｏｎｗａｌｄｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。２５０μｍ切片に切断した脳切片を６ウェルプレート内のＴｒａｎｓｗｅｌｌインサート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐａｒｋ、ＮＪ、ＵＳＡ）に移し、１０％  ＦＣＳ（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＵＳＡ）、０．２ｍＭグルタミンおよび抗生物質が補充された１ｍｌのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）中でインキュベートした。一晩平衡化した後、培地を２５％ＦＣＳ、５０ｍＭ重炭酸ナトリウム、２％グルタミン、２５％Ｈａｎｋｓ平衡塩類溶液、１μｇ／ｍｌインスリン（全てＧｉｂｃｏ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ製）、２．４６ｍｇ／ｍｌグルコース（Ｂｒａｕｎ  Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ  ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、０．８μｇ／ｍｌビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、５ｍＭＴｒｉｓおよび抗生物質を含む培養培地と交換した。切片に１０，０００ＧＦＰ−ＧＬ２６１神経膠芽腫細胞（０．５μｌ中）を、マイクロマニピュレーターに取り付けられたシリンジを用いて注射した。ミクログリア枯渇切片を調製するために、器官型脳切片を、２４時間、クロドロネート充填リポソームで処理した。
【０２０８】
ヒト神経膠腫生検および参照正常脳におけるＣＳＦ−１（Ｍ−ＣＳＦ）およびＣＳＦ−２（ＧＭ−ＣＳＦ）発現の定量分析．神経膠腫生検を脳腫瘍組織バンク（ロンドン健康科学センター（Ｌｏｎｄｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ）、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｏｎｔａｒｉｏ、ＣＡ）、および子供メモリアル健康協会（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、Ｗａｒｓａｗ、Ｐｏｌａｎｄから入手した。研究は２４ＧＢＭおよび２０毛様細胞性星状細胞腫（ＷＨＯグレード１）を含む。参照脳ＲＮＡは５つの正常脳由来のＲＮＡの混合物である（Ａｍｂｉｏｎ）。全ＲＮＡを記載されるように（Ｔｙｂｕｒｃｚｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）瞬間凍結組織からＴｒｉ−試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）抽出により調製した。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてきれいにした。全ＲＮＡの品質および量をＡｇｉｌｅｎｔバイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して確認した。リアルタイムＰＣＲ増幅を３つ組で２５ｎｇのＲＮＡに等価のｃＤＮＡに対し、プライマーセットを用いて実施し：ＣＳＦ−１では−Ｈｓ００１７４１６４＿ｍ１；ＣＳＦ−２では−Ｈｓ００９２９３７３＿１；ＧＡＰＤＨ−Ｈｓ０２７５３９９１＿ｇ１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）ＧＡＰＤＨを内部標準参照として使用した。遺伝子発現の相対的定量化をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システムにより、比較ＣＴ法を使用して決定した。値を、参照正常脳における、ある所定の遺伝子の発現と比較した。
【０２０９】
Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存プロット．全てのヒトデータはＲｅｍｂｒａｎｄｔウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｃａｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｍｂｒａｎｄｔ／）において公的に入手可能であった。マイクロアレイ遺伝子発現データおよび臨床データはどちらも分子脳新生物データのためのＮＣＩリポジトリ（ＲＥＭＢＲＡＮＤＴ）データベースから、２０１１年１０月１日に入手可能なデータを用いて入手した。アクセス時に、遺伝子発現データおよび対応する生存時間を有する３４３の神経膠腫患者試料はＲｅｍｂｒａｎｄｔデータベース上で入手可能であった。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ２．０  ＧｅｎｅＣｈｉｐからのプローブに対するＲｅｍｂｒａｎｄｔマイクロアレイデータおよび関連する生存データを使用してグラフを作成した。ＣＳＦ１およびＣＳＦ２上方または下方制御は、ある所定のデータセット内の平均発現レベルからの２倍（またはそれ以上）の差として規定した。
【０２１０】
統計解析．結果を平均±標準偏差（ｓ．ｄ）として表した。統計学的有意性をＵ−Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定およびスチューデントｔ検定により、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａソフトウェア（ｖｅｒ．７．１  ＳｔａｔＳｏｆｔ．Ｉｎｃ、ＯＫ、ＵＳＡ）を用いて決定した。
【０２１１】
実施例２：神経膠腫由来因子により誘導されたミクログリア挙動および細胞内シグナル伝達のキャラクタリゼーション
出生後ラット脳から単離された初代ミクログリア培養物を全ての実験のために使用した。ミクログリア培養物の純度は、ＦＩＴＣ−レクチンＢ４染色により決定すると、常に＞９５％であった。培養物を、各実験前に４８時間放置し、ミクログリアを発現停止させた。ミクログリア培養物を、他の外因性刺激なし、または１００ｎｇ／ｍＬリポ多糖（ＬＰＳ）（古典的炎症活性化を反映する）で刺激した神経膠腫−またはアストロサイト−馴化培地に曝露した。アストロサイト培養物ではなく、神経膠腫細胞（ＧＣＭ）由来の培地のみがミクログリア細胞のアメーバ状細胞への形態学的形質転換を誘導することができ（図１Ａ）、これは、光学コントラスト顕微鏡法（上パネル）およびＦ−アクチンのＦＩＴＣ−ファロイジンによる染色（下パネル）により証明された。培養物の写真を刺激添加後２４時間にとった。同様の形態学的形質転換が古典的炎症誘導物質−リポ多糖（ＬＰＳ、１００ｎｇ／ｍＬ）による処理後に観察された。ＬＰＳは増殖停止を誘導し、サイクリンＤ１およびホスホ−Ｒｂのレベルを低減させ；ＧＣＭ刺激ミクログリア細胞は正常に増殖し、サイクリンＤ１およびホスホ−Ｒｂのレベルは影響されなかった（図１Ｂ）。
【０２１２】
しかしながら、ＧＣＭの存在は、スクラッチアッセイにおいて、ミクログリア細胞の細胞を含まない領域への運動性を強く増加させた（図１Ｃ）。食作用を赤色蛍光ビーズを６時間、対照またはＧＣＭ処理培養物に添加し、２つ以上のビーズを貪食した細胞のパーセンテージを蛍光顕微鏡法により定量することにより評価した。ＧＣＭへの曝露後、対照細胞と比べて、複数のビーズを貪食するミクログリア細胞の数は６０±９％（平均±ｓ．ｄ．）だけ増加した（図１Ｄ）。データを独立して誘導されるミクログリア培養物に関する３つの実験から、平均±ｓ．ｄ．として提示する；＊＊＊ｐ＜０．００５。
【０２１３】
炎症刺激（例えばＬＰＳ）は炎症の開始に重要な一般的なシグナル伝達経路を活性化し、ミクログリア細胞におけるＭＡＰキナーゼおよび転写因子、例えばＮＦκＢ、ＳＴＡＴ１、３および５を含む。リン酸化ＭＡＰＫ、ｐ−ＩκＢおよびホスホ−ＳＴＡＴのレベルは、ＬＰＳ処理後３０分に増加し、６時間上昇したままであった（図２Ａ）。特に、ＧＣＭ処理ミクログリア細胞においていくつかの違いがあった：ＪＮＫは活性化されず、ｐ３８ＭＡＰＫの活性化はＬＰＳ後よりも弱く、一過性であった（図２Ａ）。ＩκＢのリン酸化およびその分解はＧＣＭ処理ミクログリアでは検出されず、ＮＦκＢ活性化の欠如となった（図２Ｂ左パネル）。これはさらに、ＥＬＩＳＡによるＮＦκＢ  ＤＮＡ結合活性の測定により確認された（図２Ｂ−右パネル）。ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３のリン酸化の増加はＬＰＳ処理ミクログリア細胞においてのみ起こり、リン酸化ＳＴＡＴ５の上昇は両城の条件下で起きた（図２Ｃ）。炎症に重要なシグナル伝達経路の活性化の欠如は、炎症メディエーター、例えば誘導性一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）およびシクロオキシゲネーゼ（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎｅｓｅ）２の発現欠如（図２Ｄ）となった。全てのデータはＧＣＭによるミクログリア細胞の非炎症性、Ｍ２様活性化の誘導と一致する。
【０２１４】
実施例３：ＧＣＭにより誘導された転写変化の分析
図３に示されるように、ＧＣＭはミクログリア細胞の発現プロファイルに明白な変化を誘導する。
【０２１５】
ＧＣＭ刺激されたミクログリア培養物におけるゲノム応答の包括的な見解を得るために、全般的遺伝子発現プロファイリングおよびジーンオントロジー分析を、異なって刺激されたミクログリア細胞において実施した。全般的遺伝子発現をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて、ＧＣＭまたはＬＰＳのいずれかによる処理後６時間にプロービングした。別々の統計解析（ｔ検定）を、ＧＣＭ（ｎ＝４）と対照（ＭＧＣＭ、ｎ＝６）の間、およびＬＰＳ（ｎ＝４）と同じ対照の間での比較のために実施した。ｔ検定の均一αレベルｐ＜０．００１を選択して、いずれかの処理により影響を受ける遺伝子を同定した。この選択は、ＬＰＳにより誘導されたよりロバストな変化に対するＦＤＲ＜０．００２、およびＧＣＭにより誘導された相対的に小さな変化に対するＦＤＲ＜０．０４に対応する。ＧＣＭ（Ｇ）および／またはＬＰＳ（Ｌ）により制御される遺伝子の発現の変化を対照ＭＧＣＭ（Ｍ）と比較し、Ｌｏｇ２スケールで互いに対しプロットした。各遺伝子はドットにより表され、そのＸ、Ｙ座標は、それぞれ、ＬＰＳおよびＧＣＭにより引き起こされるその発現の変化を示す。大きな灰色のドットはＬＰＳにより著しく制御される遺伝子をマークする（Ｌ対Ｍ  ｔ検定ｐ＜０．００１）。小さな青いドットはＧＣＭにより著しく制御される遺伝子をマークする（Ｇ対Ｍ  ｔ検定ｐ＜０．００１）。両方の処理により、しかし逆方向で（さらに、ＳＭＡＤ３および７）著しく制御される遺伝子を表すドットは遺伝子記号で注釈がつけられ、個々のミクログリア培養物（番号付けされた）にわたるそれらの発現プロファイルが示される。
【０２１６】
選択されたαレベルでは、ＧＣＭ処理後１７４の遺伝子が発現を変化させ、ＬＰＳ処理後１７９４の遺伝子（灰色ドット）、および両方の処理後６３が変化させた。最後の群のうち、９の遺伝子（８の公知の遺伝子）は、２つの処理において逆に制御した。
【０２１７】
プログラムＲａｎｋ  ＧＯＳｔａｔを用いた、ＬＰＳにより著しく制御される１７９４の遺伝子の機能性量の分析はＧＯタームを明らかにした：ＬＰＳ処理後の遺伝子上方制御と著しく関連するカテゴリとしての免疫／防御／炎症応答（左上パネル）。特に、それらのカテゴリのいずれもＧＣＭ処理により著しく影響されなかった。免疫応答および炎症遺伝子の上方制御のこの欠如を、ヒートマップ可視化により確認した。その上、ＬＰＳにより最も強く上方制御されたインターフェロン関連遺伝子（Ｂｅｓｔ５、Ｃｘｃｌ１０、Ｉｆｉｔ３、Ｍｘ２）は、好ましくはＧＣＭ処理により下方制御された。
【０２１８】
Ｒａｎｋ  ＧＯＳｔａｔを用いる、ＧＣＭにより著しく制御される１７４の遺伝子の機能性量の分析は、ＧＯカテゴリ「一次代謝プロセス」をＧＣＭによる遺伝子上方制御と関連する最高ランキングカテゴリとして同定した。興味深いことに、これらの遺伝子はＬＰＳ後に下方制御された。
【０２１９】
ｃ−Ｍｙｃ、ＳＭＡＤ７、ｋｌｈｌ６、ｈｌａ−ｄｍｂおよびＣＸ３ＣＲ１などの２〜３の遺伝子は、ＧＣＭ処理ミクログリアにおいて強く誘導されたが、ＬＰＳ処理細胞では下方制御された。ｃ−Ｍｙｃは転写、リボソーム生合成、細胞周期進行、分化、アポトーシス、および細胞運動性に必要とされる遺伝子の発現を管理する多機能性転写因子をコードする。興味深いことに、ＧＣＭ上方制御された遺伝子は転写および翻訳の制御に関与し、Ｇａｒ１、Ｇｔｐｂｐ４、Ｎｏｌ８、Ｄｄｘ５、Ｐｏｌｒ１ｅ、Ｐｏｌｒ１ｂ、Ｅｉｆ４ｅｂｐ１、Ｅｉｆ３ｓ９、Ｎｏｂ１、Ｔｓｅｎ２、Ｎｄｅｌ１、Ｈｎｒｎｐｒ、Ｎｉｐ７、Ｎｕｐ９３、およびいくつかのアミノ酸−ｔＲＮＡシンテターゼが含まれる。ＧＣＭにより誘導される追加の遺伝子としては下記が挙げられる：ＣＤ６９、Ｃ型レクチンＲファミリーのメンバー、樹状細胞成熟に関与する同時刺激分子ＣＤ８６、および組織中へのマクロファージ動員に関与するケモカイン、例えば：ＲＡＮＴＥＳ（ｃｃｌ５）、ＭＣＰ−１（ｃｃｌ２）、およびＣＸＣＬ（ｃｘｃｌ１、２、７）。
【０２２０】
１４の遺伝子の発現を、４の独立ミクログリア培養物上での定量的ＰＣＲにより確認した。Ｑ−ＰＣＲデータは、ＧＣＭ−刺激ミクログリアにおける、炎症およびインターフェロンシグナル伝達関連遺伝子（ＣＯＸ−２、ＩＬ１β、ｉＮＯＳ、ＭＭＰ−９、Ｉｒｆ７、ＳＴＡＴ１、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮβ）の発現がないこと、または弱いこと、およびｃ−Ｍｙｃ、ＳＭＡＤ７、Ａｒｇ−１、ＭＭＰ−１４発現の上方制御を確認した（図４）。我々は、ＧＣＭにより誘導された変化は、ＬＰＳによる「古典的」ミクログリア／マクロファージ活性化に伴う変化とは機能的に異なり、一部逆となる（インターフェロン関連遺伝子では）と結論付ける。
【０２２１】
実施例４：オステオポンチンおよびラクトアドヘリンの腫瘍馴化培地のミクログリアを活性化する活性としての同定
プロテオミクスアプローチを使用して、ミクログリア細胞を活性化する神経膠腫馴化培地の構成成分を同定した。ＧＣＭをＨＰＬＣによりアニオン交換体Ｑ（Ｓｈｏｄｅｘ  ＩＥＣ  ＱＡ−８２５  ＰＨＭゲル）を使用して分画し、ＧＣＭ由来タンパク質を含む９０画分を収集した。各画分（培地中１：１０希釈）を、ミクログリア培養物を活性化する能力に対して評価した。アメーバ状細胞へのミクログリア形質転換を、１〜６の範囲で２人の研究者により、処置後２４時間にスコア化した。刺激活性を有する１６の画分（スコア４−６）対対照（スコア３）およびミクログリアを阻害するいくつかの画分（スコア１−２）が得られた（図５Ａ）。ミクログリア細胞を刺激したタンパク質調製物をＥＳＩ−ＦＴＩＣＲを使用するＭＳ／ＭＳ分析に供した。個々の画分を、それらのミクログリアを刺激して食作用させる能力に対し試験した（図５Ｃ）。ＭＳ／ＭＳスペクトルを含む未処理データファイルを、データベース検索のためにＭａｓｃｏｔ検索エンジンに供した。タンパク質配列を２つ以上の特有のペプチドの質量分析により同定し、それぞれが、少なくとも（ｐ＜０．０５）の確率スコアを有し、偽発見率が低いことが確保された。このプロセスにより、オステオポンチンおよびラクトアドヘリンの同定が得られた（図５Ｂ）。神経膠腫細胞およびアストロサイトによるオステオポンチン産生を、ＥＬＩＳＡ（図５Ｄ−右パネル）により確認し、オステオポンチン（ｓｐｐ１）およびラクトアドヘリンｍＲＮＡのレベルを、ラットＣ６神経膠腫細胞における定量的ＰＣＲにより決定し、ラット皮質アストロサイトに対する倍変化として表した。神経膠腫細胞は２つの型のオステオポンチンを著しく過剰発現することが見出された：非形質転換アストロサイトに比べ、ｓｐｐ１ａ  ｍＲＮＡは３５倍、ｓｐｐ１ｃ  ｍＲＮＡは６００倍高かった（図５Ｄ−左パネル）。データは少なくとも３の独立した実験の平均±ｓ．ｄ．である。
【０２２２】
実施例５：インテグリンに結合するオステオポンチンおよびラクトアドヘリンの妨害は、神経膠腫由来因子により誘導される形態学的形質転換、移動および食作用を無効にした
ラットラクトアドヘリンアミノ酸配列を使用して、７−ａａＲＧＤ含有ペプチド（ＲＧＤ）を、競合的阻害剤として設計した（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８において明記）。スクランブル配列ペプチドを対照（ＳＣＲ）として使用した。ＳＣＲペプチドとではなく、化学的に合成された５００μＭのＲＧＤペプチドとのプレインキュベーションは、ＧＣＭ誘導後のミクログリアのアメーバ状細胞への形質転換を防止した（矢印で示されるアメーバ状細胞）（図６Ａ）。ＲＧＤペプチドはＧＣＭに誘導された食作用（図６Ｂ）およびスクラッチアッセイにおけるミクログリア移動（図６Ｃ）を完全にブロックした。ＧＣＭに誘導された食作用の増加は、インテグリンサブユニットαｖもしくはβ３または両方の特定のｓｉＲＮＡによるサイレンシング後、ミクログリア細胞でかなり低減された（図６Ｄ）。
【０２２３】
インテグリンを介する推定作用様式と一貫して、ＧＣＭ処理はフォーカルアドヒージョンキナーゼ（ＦＡＫ）、インテグリンシグナル伝達の一般的なメディエータのリン酸化を増加させた（図６Ｅ）。ＧＣＭは、ミクログリア細胞におけるリン酸化ＦＡＫおよび他のキナーゼＡｋｔおよびＥＲＫのレベルを増加させ、ＲＧＤペプチドによる前処理は研究した全てのキナーゼの活性化を無効にした（図６Ｅ）．インテグリンリガンド、細胞内経路および動きの速い、アメーバ状マクロファージへの細胞形質転換の間の提案される関係の非結合モデルを図６Ｆで提示する。
【０２２４】
実施例６：ミクログリア細胞におけるオステオポンチンのサイレンシングは、別の表現型の獲得に影響し、その浸潤促進活性を損なう
ミクログリア細胞のＧＣＭに誘導された活性化において同定されたタンパク質の役割を調査するために、オステオポンチンに特異的なｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＰＰ１）、または対照、負のｓｈＲＮＡ（ｓｈＮｅｇ）を発現する安定なＣ６神経膠腫細胞系を作成した。サイレンシング効率はおよそ９８．５％であった（図７ＡおよびＣ）。ラクトアドヘリンのサイレンシングはミクログリア細胞においてＧＣＭに誘導される発現ｃ−Ｍｙｃおよびｓｍａｄ７を阻害した（図７Ｂ）。オステオポンチンのサイレンシングはミクログリア細胞においてＧＣＭに誘導される発現ａｒｇ−１およびｓｍａｄ７を阻害した（図７Ｄ）。さらに、レーザー走査型サイトメトリーにより推定される、マトリゲル充填インサートを通して移動する神経膠腫細胞の数は、神経膠腫細胞におけるオステオポンチンのサイレンシングは、ミクログリア依存性浸潤を強く低減させることを証明した（図７Ｅ）。
【０２２５】
実施例７：オステオポンチンおよびラクトアドヘリンは、ミクログリアのＧＣＭに誘導された活性化において明白な、協調的役割を果たす
組換えタンパク質が神経膠腫馴化培地のミクログリア細胞に対する作用を模倣することができるかどうかを決定するために、オステオポンチンおよびラクトアドヘリンの２つの形態をコードするＤＮＡをマウスＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞においてクローニングし、発現させた。Ａｍａｘａがトランスフェクトされた線維芽細胞におけるラクトアドヘリンおよび／またはオステオポンチンの発現をｑＰＣＲにより確認した（図８Ａ）。食作用を誘導するための組換えラットタンパク質を生成する線維芽細胞由来の馴化培地（ＣＭ）の効力（図８Ｂ）またはミクログリア細胞の形態学的形質転換（図８Ｃ）を決定した。対照（ＧＦＰ）ではなく、オステオポンチンを発現する線維芽細胞由来のＣＭは、ミクログリア食作用を刺激した。オステオポンチンを発現する線維芽細胞由来のＣＭはまた、ミクログリア細胞のアメーバ状形質転換を誘導するのに有効であった。
【０２２６】
組換えタンパク質が、ミクログリア細胞におけるＭ２またはＭ１表現型に特徴的なシグナル伝達および選択された遺伝子の発現へのＧＣＭの作用を模倣することができるかどうかを評価するために、組換えラットタンパク質を産生する線維芽細胞由来の馴化培地のミクログリアに対する効果を試験した；ＬＰＳおよびＧＣＭを対照として使用した（図９）。ＧＣＭと対照的に、オステオポンチンの両方のアイソフォームを発現する線維芽細胞由来のＣＭはＩκＢ、ＳＴＡＴ１、３および５のリン酸化をＬＰＳと同様の程度まで増加させた（図９Ａ）。オステオポンチンを産生する線維芽細胞由来のＣＭはａｒｇ−１およびｓｍａｄ７の発現を増加させた、がまた、ｉｎｏｓおよびｉｒｆ７もそうであったが、ラクトアドヘリンはｓｍａｄ７およびｃ−ｍｙｃ発現を誘導した（図９Ｂ）。
【０２２７】
実施例８：神経膠腫由来ＧＭ−ＣＳＦはミクログリア／マクロファージの神経膠腫への動員および腫瘍進行に関与する
神経膠腫由来ＧＭ−ＣＳＦがミクログリア／マクロファージの神経膠腫への動員および腫瘍増殖に関与するかを確認するために、ＧＭ−ＣＳＦが安定に枯渇したＥＧＦＰ−ＧＬ２６１神経膠腫細胞を、特異的ｓｈＲＮＡをコードする過剰発現プラスミドにより作成した。２つの独立して誘導されるクローンにおけるｍＲＮＡレベルでの（図１０Ａ）およびタンパク質レベルでの（図１０Ｂ）ＧＭ−ＣＳＦ発現のサイレンシングをｑＰＣＲおよびＥＬＩＳＡにより確認した。並行して誘導され、負のｓｈＲＮＡを発現する２つのクローンは対照として機能した。神経膠腫細胞におけるＧＭ−ＣＳＦ発現のサイレンシングは、それぞれ、ＢｒｄＵ取り込みおよびＭＴＴ代謝試験により証明されるようにそれらの増殖および生存に影響しなかった（図１０ＣおよびＤ）。
【０２２８】
ｓｈＮｅｇまたはｓｈＧＭ−ＣＳＦを発現するＥＧＦＰ−ＧＬ２６１神経膠腫細胞の２つのクローンをＣ５７ＢＬ／６マウスの線条体に移植した。抗Ｉｂａ−１抗体による染色は、ＧＭ−ＣＳＦが枯渇した神経膠腫細胞が移植されたマウスでは、対照神経膠腫（ｓｈＮｅｇ）と比べて、ミクログリア／マクロファージの数が低減したことを明らかにした（図１１ＡおよびＢ）。抗ｖＷＦ抗体による血管の染色は、ＧＭ−ＣＳＦ枯渇神経膠腫が移植されたマウスでは、対照と比べて、腫瘍血管の形成が低減したことを明らかにした（図１１Ｃ）。さらに、ＧＭ−ＣＳＦ−枯渇神経膠腫細胞が移植されたマウスの脳において、ｓｈＮｅｇ神経膠腫細胞が移植されたマウスと比べて、腫瘍サイズのかなりの低減（６５％）が観察された（図１１Ｄ−Ｅ）。各ドットは個々の動物を表し、太い線は特定の群における６匹のマウスのメジアンを表す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【０２２９】
これらの結果は、ＧＭ−ＣＳＦが神経膠腫におけるミクログリア／マクロファージ蓄積ならびに神経膠腫浸潤、および血管新生の増加の一因となる主因子であることを証明する。
【０２３０】
実施例９：ＧＭ−ＣＳＦ−枯渇神経膠腫細胞は、脳器官型切片培養物においてミクログリア依存性神経膠腫浸潤を損なった。
ＧＭ−ＣＳＦ発現がミクログリア依存性浸潤に影響するか、または直接神経膠腫浸潤に影響するかどうかを調査するために、器官型脳切片培養物をモデルとして使用した。対照またはＧＭ−ＣＳＦ−枯渇ＥＧＦＰ−ＧＬ２６１神経膠腫細胞を、マウス脳切片に注射し、得られた腫瘍サイズを注射後５日に、切片内のＥＧＦＰ−神経膠腫細胞により被覆された投射蛍光面積を測定することにより定量化した。平均腫瘍サイズは、ＧＭ−ＣＳＦ−枯渇ＥＧＦＰ−神経膠腫細胞が注射された脳切片培養物では、対照と比べて５８％（＊＊＊ｐ＜０．００１）少なかった（図１２ＡおよびＢ）。加えて、クロドロネート充填リポソームとのプレインキュベーショによるミクログリアの枯渇は、ｓｈＮｅｇ発現神経膠腫細胞の浸潤を低減させたが、ＧＭ−ＣＳＦ−枯渇神経膠腫細胞はそうではなかった（図１２ＡおよびＢ）。特に、神経膠腫細胞の脳実質へのミクログリア依存性、長距離浸潤は、神経膠腫由来ＧＭ−ＣＳＦがない場合強く低減された。これにより、ＧＭ−ＣＳＦはミクログリア依存性神経膠腫浸潤に関与することが確認される。
【０２３１】
実施例１０：マクロファージ動員および神経膠腫増殖は大理石骨病ｏｐ／ｏｐマウスにおいて影響されない
大理石骨病ｏｐ／ｏｐマウスはｍ−ｃｓｆ／ｃｓｆ１遺伝子において劣性ｎｕｌｌ変異を有し、Ｍ−ＣＳＦ産生の欠乏および単球／マクロファージ欠損となった。ホモ接合体変異ｏｐ／ｏｐ、ヘテロ接合体および野生型（ＷＴ）マウスを、遺伝子型判定によりＴａｑＭａｎアレル識別方法を用いて同定した（図１３Ａ）。ＣＤ１１ｂ＋細胞の腫瘍組織からの免疫磁気分離法、続いて、フローサイトメトリーにより、２つの集団の区別が可能になった：ミクログリア（ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ４５ｌｏｗ）および血液由来マクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ４５ｈｉｇｈ）。ＷＴマウス（白色バー）とは対照的に、ｏｐ／ｏｐ（灰色バー）の脳におけるＣＤ１１ｂ＋ミクログリアおよびマクロファージの数の低減が確認され（図１３Ｂ）、一方ｏｐ／ｏｐマウス（灰色バー）の血液中の単球数は変化しなかった（図１３Ｃ）。
【０２３２】
ミクログリア／マクロファージ動員および神経膠腫進行におけるＭ−ＣＳＦの役割を決定するために、大理石骨病マウスにシンジェニックＥＧＦＰ−ＧＬ２６１神経膠腫細胞を移植した。フローサイトメトリー分析は、野生型およびｏｐ／ｏｐマウス（灰色バー）の脳における神経膠腫浸潤ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ４５ｌｏｗミクログリアおよびＣＤ１１ｂ＋ＣＤ４５ｈｉｇｈマクロファージのパーセンテージに差を示さなかった（図１３Ｄ）。神経膠腫を有するｏｐ／ｏｐおよび野生型マウスにおける末梢血液単球のパーセンテージは同様であり、顆粒球のパーセンテージは、両方のマウス系統で同様に増加した（図１３Ｅ）。腫瘍保有脳におけるミクログリア／マクロファージを検出するために使用される抗Ｉｂａ１抗体による染色は、野生型およびｏｐ／ｏｐマウスにおいて、神経膠腫浸潤Ｉｂａ１陽性細胞の同様の蓄積および形態を証明した。ほとんどのＩｂａ１陽性細胞は、神経膠腫保有ｏｐ／ｏｐマウスにおいて、活性化マクロファージのアメーバ状形態を獲得した（図１３ＦおよびＧ）。
【０２３３】
神経膠腫保有脳由来の切片上での抗ｖＷＦ（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子）抗体による血管の染色は、ＣＳＦ−１  ｎｕｌｌマウスにおいて、ＷＴ対照と比べて、腫瘍血管ネットワークの同様の形成を示した（データ示さず）。腫瘍体積の定量化は、ｏｐ／ｏｐと野生型マウスの間の腫瘍サイズに差を示さなかった（図１３Ｈ）。これらの結果は、未処置ｏｐ／ｏｐマウスにおけるミクログリア／マクロファージの数の低減に関わらず、腫瘍埋め込みは、同様のミクログリア／マクロファージ浸潤、血管密度および腫瘍進行を誘導し、ＣＳＦ−１は、神経膠腫におけるミクログリア／マクロファージの蓄積に関与するサイトカインではないことが示唆される。
【０２３４】
実施例１１：Ｍ−ＣＳＦ欠損マウスの脊髄脱髄病変におけるミクログリア／マクロファージの蓄積の低減。
Ｍ−ＣＳＦ欠乏が一般にミクログリア／マクロファージの浸潤に影響するかどうかを決定するために、野生型およびｏｐ／ｏｐマウスにおける脊髄損傷に対する応答を試験した。脊髄白質における限局性脱髄病変を誘導させ、１０日後のｐ／ｏｐマウスおよび野生型対照におけるミクログリア／マクロファージの数および形態を調査した。野生型対照と比べて、ｏｐ／ｏｐマウスの病変内でＩｂａ−１陽性細胞の数の著しい低減が観察された（ｏｐ／ｏｐにおいて６７６±９４細胞／ｍｍ２対ＷＴにおいて１３８９±１２９細胞／ｍｍ２；ｐ＜０．００１）（図１４ＡおよびＢ）。
【０２３５】
実施例１２：ＣＳＦ−２は、ＧＢＭにおいて高く発現されるが、低悪性度神経膠腫または正常皮質ではそうではなく、患者生存との相関を示す
インビトロ所見を実際のヒト患者腫瘍標本に関連づけるために、ＧＢＭ、健康な脳、および低悪性度神経膠腫におけるＣＳＦ−１およびＣＳＦ−２発現を定量的ＰＣＲにより評価した。図１５Ａは、低悪性度毛様細胞性神経膠腫（ＷＨＯグレード１）および正常脳と比べて、神経膠芽腫多形（ＧＢＭ、ＷＨＯグレードＩＶ）生検において高く上方制御されたＣＳＦ−２の発現、そうではないＣＳＦ−１を示す。３４３人の神経膠腫患者（そのデータは分子脳新生物データのためのＮＣＩリポジトリ（ＲＥＭＢＲＡＮＤＴ）において公的に入手可能である）の間での異なるＣＳＦ−１およびＣＳＦ−２発現に基づくＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を作成した（図１５Ｂ）。上方および下方制御は、データセット内の平均発現レベルと比べた、ＣＳＦ−１／ＣＳＦ−２発現の２倍増加または減少として規定した。これらの判断基準に基づき、ＣＳＦ−２は、全ての神経膠腫患者のうち１６で上方制御され、２２で下方制御された。ＣＳＦ−２発現の減少した患者の生存時間は、ＣＳＦ−２上方制御を有する患者で観察されるより悪い予後と比べて改善された。そのような相関はＣＳＦ−１発現では観察されなかった。これら２つの極端な患者集団における生存を比較した場合、統計学的有意性に到達した（ｐ＝０．０２１７）。
【０２３６】
実施例１３：ＧＭ−ＣＳＦの阻害は神経膠腫を有する動物の寿命を長くする
マウスをランダムに割り当て、ｓｈＮｅｇまたはｓｈＲＮＡ神経膠腫細胞の頭蓋内埋め込みを受けさせ、瀕死となるまで観察した。ＥＧＦＰ−ＧＬ２６１神経膠腫細胞、ｓｈＧＭ−ＣＳＦ神経膠腫細胞またはｓｈＮｅｇ神経膠腫細胞を定位装置において、座標に従い（＋１．５ｍｍＡＰ、−１．５ＭＬ）、２６−ゲージ針を有するシリンジを用いて、右線条体に接種した。マウスをアチパマゾールのｉ．ｐ．投与を用いて蘇生させ、Ｔｏｌｆｅｄｉｎｅ４％（４ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．）鎮痛薬で処置した。ｓｈＧＭ−ＣＳＦおよびｓｈＮｅｇ神経膠腫細胞が移植されたマウス（ｎ＝１０マウス／群）のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析を実施した。
【０２３７】
対照またはＧＭ−ＣＳＦ特異的ｓｈＲＮＡを発現する頭蓋内神経膠腫を有するマウスに対する生存曲線は、ＧＭ−ＣＳＦ枯渇神経膠腫が移植されたマウスで著しい生存利益を示した（図１６）。ｓｈＧＭ−ＣＳＦ−神経膠腫を有する２匹のマウスは埋め込み後６３日生存した。
【０２３８】
実施例１４：ＯＰＮ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦＲのペプチドを阻害することは、別のミクログリア活性化のマーカーの発現を弱化する（Ｍ２表現型）。
Ｕ８７−ＭＧヒト神経膠腫細胞を、１００ｍｍ培養皿上に、８ｍＬ培地の総体積で、２４時間蒔いた。その後、培地をさらに２４時間神経膠腫細胞により馴化させた（ＧＣＭ、神経膠腫馴化培地）。馴化後、培地を回収し、１０００ｘｇで５分間室温で遠心分離した。５００μＬ培地に、選択されたペプチドを補充し、５００μＭの最終濃度とし、クログリア細胞をペプチドが補充されたＧＣＭで６時間処理した。細胞を溶解させ、全ＲＮＡを単離し、逆転写酵素およびランダム六量体プライマーを使用してｃＤＮＡを合成した。下記阻害ペプチドを使用した。
【表１】
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【０２３９】
Ｍ２ミクログリア／マクロファージ表現型のマーカーとして前に同定された遺伝子（図４を参照されたい）例えば：Ａｒｇ１、Ｉｄ１、ｃ−ＭｙｃおよびＭＭＰ−１４の発現レベルを、リアルタイムＰＣＲを使用して決定した。同様に、免疫応答の誘導を評価するために、ｉＮＯＳの発現レベルを決定した。試験した全ての遺伝子の発現レベルを、対照、ミクログリア馴化培地処理（ＭＧＣＭ）細胞におけるそれらの発現レベルに対し基準化した。
【０２４０】
チャート上の線は対照ペプチドＤＱＩＧＦＲＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）により処理された対照細胞（ＣＴＲＬ１）における遺伝子発現レベルに対する閾値を表す。
【０２４１】
図１７Ａ−Ｂに示されるように、ＯＰＮ阻害ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）は、ミクログリア細胞においてＭ２表現型のほとんどの関連マーカー−Ａｒｇ１およびＩｄ１を下方制御した。同様に、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦＲの両方の阻害剤は、ミクログリア細胞において、Ｍ２表現型のマーカー、例えばＡｒｇ１、Ｉｄ１、ｃ−ＭｙｃおよびＭＭＰ１４を下方制御した（図１７Ａ、Ｃ−Ｅ）。驚いたことに、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦＲを阻害するペプチドはまた、炎症促進性遺伝子ｉＮＯＳの発現を誘導することができた（図１７Ｆ）。
【０２４２】
実施例１５：ＯＰＮ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦＲの阻害ペプチドはＵ８７−ＭＧヒト神経膠腫細胞の浸潤性を弱化する。
ＢＶ２不死化マウスミクログリア細胞を、２４ウェル培養皿上に０．７ｍＬ培地の総体積で２４時間蒔いた。培地をその後、ペプチドが５００μＭの最終濃度で補充された０．７ｍＬの新鮮培地（２％ＦＢＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘを有するＤＭＥＭ、ＰｅｎＳｔｒｅｐ）と１時間置換した。Ｕ８７−ＭＧヒト神経膠腫細胞をマトリゲル−コートインサート上に播種した。１８時間後、マトリゲルをインサートから除去し、細胞を１０％メタノールで固定し、ＤＡＰＩで染色した。マトリゲルを通して移動した細胞の数（浸潤性細胞）を蛍光顕微鏡を用いて計算した。ＢＶ２細胞と共培養されたＵ８７−ＭＧ、（ＮＵＬＬ＋ＢＶ２）は、浸潤性の陽性対照として機能し；ならびにＵ８７−ＭＧ単独（ＮＵＬＬ）は、浸潤性の陰性対照として機能した。
【０２４３】
統計解析を分散分析（ＡＮＯＶＡ：単一因子）を使用して実施した。「Ｐ値」は観察された結果がランダム事象であった確率を規定する。
【０２４４】
チャート上の線は、ＢＶ２／ミクログリア細胞と共に共培養された未処理細胞（ＮＵＬＬ＋ＢＶ２）の浸潤性に対する閾値を表す。
【０２４５】
図１８で示されるように、ＧＭＣＳＦおよびＧＭＣＳＦＲペプチドは、ミクログリア細胞の存在下、神経膠腫細胞の浸潤性を弱化することができた。
【０２４６】
実施例１６：オステオポンチンのＲＮＡｉ媒介永久サイレンシングはインビボでのラット神経膠腫モデルにおける腫瘍増殖を弱化する。
ＲＮＡを、オステオポンチン細胞に対するｓｈＲＮＡを安定して発現するラットＣ６神経膠腫クローンから単離し、ｃＤＮＡを、逆転写酵素およびランダム六量体プライマーを使用して合成した。オステオポンチンのノックダウン効率をリアルタイムＰＣＲにより確認した（図１９Ａ）。対照ｓｈＲＮＡを発現するＣ６神経膠腫細胞（ｓｈＮｅｇ）またはオステオポンチンが枯渇した神経膠腫細胞（ｓｈＳＰＰ１）（５ｘ１０４細胞／２．５μｌのＤＭＥＭ）を８−１０週齢Ｗｉｓｔａｒラットの右線条体に移植した。神経膠腫埋め込み後１５日に、動物を屠殺し、心臓内に４％パラホルムアルデヒドを灌流させた。脳を取り出し、ドライＣＯ２で凍結させ、連続２０または１２μｍ厚の冠状切片をクリオスタットを使用して収集した。腫瘍サイズを定量化するために、２０μｍ厚の切片をトルイジンブルーで染色し、Ｌｅｉｃａ  ＤＭ４０００Ｂ顕微鏡を用いて画像を獲得した。腫瘍面積をＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、４つ毎の脳切片において測定し、腫瘍体積をＣａｖａｌｉｅｒｉ原理（Ｇａｂｒｕｓｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）に従い、計算した。ラット脳のトルイジンブルー染色切片の代表的な顕微鏡写真は、Ｃ６−ｓｈＳＰＰ１細胞が移植された動物は、Ｃ６−ｓｈＮｅｇ細胞が移植された動物に比べ、著しく小さな腫瘍を発症したことを示す（図１９Ｂ）。その上、移植されたＣ６−Ｎｅｇ由来の神経膠腫はＷＴＣ６細胞と同様のサイズを有した（ｎ＝５、２８．３３±１４．５３ｍｍ３）。腫瘍体積の定量化は、オステオポンチン枯渇神経膠腫の腫瘍体積において８８％低減を示した（Ｃ６−Ｎｅｇに対する平均値＝３４．０２ｍｍ３、Ｃ６−ｓｈＳＳＰ１＝６．０３ｍｍ３）（図１９Ｃ）。結果を２つの独立した実験からの平均±ｓ．ｄ．として表す（Ｕ−Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。
【０２４７】
これらのデータは、神経膠腫由来オステオポンチンがインビボでの神経膠腫増殖の一因となることを示す。
【０２４８】
実施例１７：ＯＰＮ発現は、グレードＩＩ−ＩＶ神経膠腫を患う患者の生存の低さと相関する
３４３人の神経膠腫患者（そのデータは分子脳新生物データのためのＮＣＩリポジトリ（ＲＥＭＢＲＡＮＤＴ）において公的に入手可能である）間の異なるＳＰＰ１発現に基づくＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を作成した。曲線は、オステオポンチン発現と予測される生存時間の間の負の相関を示し、≧２倍上方制御されたオステオポンチン発現（ＳＰＰ１）を有する患者、ｎ＝１６２、（悪化予後）対≧２倍下方制御されたオステオポンチン発現（ＳＰＰ１）を有する患者、ｎ＝１３、（良好予後）（図２０）である。
【０２４９】
特定の実施形態の前記説明は発明の一般的性質を完全に明らかにするので、他の者は、現在の知識を適用することにより、様々な適用のために、そのような特定の実施形態を、必要以上の実験をせずに、一般概念から逸脱せずに、容易に改変および／または適合することができ、そのため、そのような適合および改変は、開示される実施形態の等価物の意味および範囲内に含まれるべきであり、意図される。本明細書で使用される表現または専門用語は、説明目的のためのものであり、制限するものではないことが理解されるべきである。様々な開示された機能を実施するための手段、材料および工程は、発明から逸脱せずに、様々な別の形態をとることができる。
【図１Ａ】
2014533681.tif 000003
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
2014533681.tif 000011
【図４】
2014533681.tif 000012
【図５Ａ】
2014533681.tif 000013
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
2014533681.tif 000015
【図５Ｄ】
2014533681.tif 000016
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
2014533681.tif 000033
【図１１Ａ】
2014533681.tif 000034
【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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