(57)【要約】  本発明は、補体活性化を阻害する、フィコリン−３に対する新規抗体に関する。本発明はさらに、炎症、アポトーシス、自己免疫、凝固、血栓症又は凝固障害関連疾患に関係する症状の処置における抗フィコリン−３抗体の使用、及びバイオマーカーとしての使用に関する。本発明はさらに、抗体の産生において使用される、そのような抗体をコードする核酸分子、ベクター及び宿主細胞に関する。
2014520765.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトフィコリン−３への特異的な結合を示し、且つ、ヒト体液中において補体活性化を阻害する、単離された組み換えヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
前記抗体がフィコリン−３内のエピトープに結合し、前記エピトープが、ヒトフィコリン−３における１６６Ｅ位のアミノ酸を含むエピトープなどの、天然のリガンド結合に直接関係しない、請求項１に記載の抗体又は抗体結合断片。
【請求項３】
前記抗体がＳ１ドメインなどの、天然のリガンド結合に直接関係するドメイン内に結合する、請求項１又は２に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項４】
ヒトフィコリン−３に結合すると、フィコリン−３が天然リガンドに結合する能力を６０％〜９０％低減する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項５】
ヒトフィコリン−３に結合すると、補体因子Ｃ４の沈着を６０％〜９０％低減する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項６】
アセチル化ＢＳＡ上のＣ４、Ｃ３、及び／又はＴＣＣ沈着によって計測した場合に、補体活性化を阻害する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項７】
本明細書中に記載したＢｉｏｃｏｒｅアッセイで測定した場合に、１０ｎＭ以下、例えば５ｎＭ以下、例えば２ｎＭ以下、例えば１ｎＭ以下のＫＤでヒトフィコリン−３に結合する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項８】
ヒトのものであるか、又はヒト化されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項９】
前記抗体がＩｇＧ４抗体などの完全長の抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項１０】
前記抗体が、別の部分、例えば細胞傷害性部分、放射性同位元素又は薬物にコンジュゲートされている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項１１】
配列番号１の１６６Ｅ、２３７Ｄ、２３９Ｄ、２４１Ｓ、２４３Ｓ、２５８Ｃ、２５９Ｙ、２７７Ｙ、２８７Ｖから選択される位置のアミノ酸、又はそれらの任意の組み合わせを含むエピトープに結合する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項１２】
フィコリン−３の天然リガンドに対するフィコリン−３の認識を阻害するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片、或いは他のフィコリン−３阻害剤の使用。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体、又は他のフィコリン−３阻害剤、及び医薬的に許容し得る担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
フィコリン−３の天然リガンドの認識に関連した徴候、病状又は疾患、例えば炎症、及び／又は凝固、及び／又はアポトーシス、及び／又は同種移植片拒絶反応、及び／又は自己免疫に関連する徴候などの処置において薬剤として使用するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体又は他のフィコリン−３阻害剤。
【請求項１５】
対象が、アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、クローン病、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、原発性胆汁性肝硬変、関節リウマチ及びぶどう膜炎、喘息、粥状動脈硬化、1型糖尿病、様々なアレルギー、子癇前症、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎、虚血性大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、食道通過障害、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、腸炎、ウィップル病、アレルギー、免疫複合体病、臓器虚血、再灌流傷害、臓器壊死、枯草熱、敗血症（sepsis）、敗血症（septicemia）、エンドトキシンショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、腟炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺気腫、鼻炎、間質性肺炎、塵肺症（pneumotransmicroscopicsilicovolcanoconiosis）、肺胞炎（alvealitis）、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス感染症、ＨＩＶ感染症、Ｂ型肝炎ウイルス感染症、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、単包虫症、熱傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日光皮膚炎、じん麻疹、疣贅、膨疹、血管炎（ｖａｓｕｌｉｔｉｓ）、血管炎、心内膜炎、動脈炎、血栓性静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、アルツハイマー病、セリアック病、うっ血性心不全、成人呼吸促迫症候群、髄膜炎、脳炎、大脳梗塞、脳塞栓症、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、滑膜炎、甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、ベーチェット病、同種移植片拒絶、移植片対宿主病、強直性脊椎炎，ベルジェ病、ライター症候群及びホジキン病、角膜炎、２型糖尿病、嚢胞性線維症、心筋梗塞、脳卒中、メタボリックシンドローム、全身性炎症反応症候群、複合臓器不全、播種性血管内凝固症候群、アナフィラキシーショック、１型及び／又は２型糖尿病と関連した血管合併症及び腎症、細菌性敗血症、重症マラリア、非典型的溶血性尿毒症症候群、溶血性尿毒症症候群、加齢黄斑変性、発作性夜間血色素尿症、ヘビ毒咬傷、火傷、糖尿病性腎症などの腎症、及び臓器移植への合併症から成る群から選択される徴候又は病状に罹患しているか、又は罹患する危険を有している、請求項１４に記載の抗体又は他のフィコリン−３阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＣＮ３遺伝子由来のフィコリン−３（通称、Ｈ−フィコリン又は博多抗原）に対する新規抗体、並びにフィコリン−３のリガンドへの結合及び下流エフェクター機能、例えば補体活性化及び食作用や炎症プロセスの誘導などを阻害するその他のすべての物質に関する。本発明はさらに、炎症、アポトーシス、同種移植片拒絶反応、自己免疫、凝固、血栓又は凝固障害関連疾病、代謝性疾患、及び癌に関連している病状の処置における抗フィコリン−３抗体及び他の阻害物質の使用、並びにバイオマーカーとしての使用に関する。本発明はさらに、前記抗体の産生に使用される、そのような抗体をコードしている核酸分子、ベクター及び宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
補体系は、病原体の侵入から宿主を保護する先天性免疫反応の不可欠な要素である。３つの個別の経路；古典経路、代替経路、及びレクチン経路が補体系を構成している。Ｃ１複合体は、免疫複合体及び瀕死の宿主細胞の認識時に古典経路を開始する。代替経路はＣ３加水分解によって自発的に活性化されるが、代替経路転換酵素の安定化因子であるプロパージンが補体カスケードを開始することができることもまた報告された。ＭＢＬ／フィコリン関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）に結合したフィコリン、コレクチン−１１、及びマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）が、レクチン経路のイニシエーター分子である。３種類のＭＡＳＰ（−１、−２及び−３）が今までのところ挙げられており、現在の見解では、ＭＡＳＰ−２が主要なレクチン経路活性化因子である。ＭＢＬ及びフィコリンによって病原体関連分子パターン又は変化した自己を認識すると、関連プロテアーゼがＣ４及びＣ２を切断し、これにより補体カスケードを活性化し、そしてそれが最終的に、終末補体複合体（ＴＣＣ）の形成につながる。そのうえ、ＭＡＳＰの活性化は、凝固カスケード及び細胞受容体の別の成分の活性化を開始することが示された。それにもかかわらず、補体及び血液凝固系の不適当且つ無制御な活性化は、多数の疾患に関連しているので、多くの炎症病状の有害転帰における重要な成分になると考えられている。これは、インビトロ及びインビボにおけるデータの両方に基づいている。これにより、補体及び凝固活性化経路の異なったステージでの阻害は、製薬業の主な対象である。フィコリン−３は、補体のレクチン経路における重要な血漿タンパク質であり、補体のレクチン経路のイニシエーターの中で最も強い補体活性化能力を有することが示された。その結合特異性は十分には規定されていないが、それがアポトーシス及び壊死細胞物質、並びにアセチル化アルブミンのような特定の内在性リガンドに結合し、隔離することが十分に実証された。いくつかの試験は、組織内のフィコリン−３の沈着が腎症や子癇前症に関連する可能性があることを示唆している。このため、フィコリン−３が有害な炎症反応を開始する可能性があると考えるのは妥当である。
【０００３】
Ｈ−フィコリンと呼ばれ、以前は博多抗原と呼ばれたヒトフィコリン−３（フィブリノーゲン／コラーゲン様）はまた、レクチン補体活性化経路に属す分泌型パターン認識タンパク質のフィコリンファミリーのメンバーである。フィコリン−３は、胆管上皮細胞及び肝細胞によって発現され、そして、胆汁及び循環中に放出されるが、ここで、その平均は２５μｇ／ｍｌである。それはまた、気管支や肺内の肺胞上皮細胞によっても分泌される。成熟ヒトフィコリン−３は、４６％及び５２％のアミノ酸（ａａ）同一性をそれぞれヒトフィコリン−１及びフィコリン−２と共有している。フィコリン−３は霊長動物と低級種族で同定されたが、齧歯動物のような一部の種では、フィコリン−３遺伝子は擬似遺伝子とされ、そしてそれはまた、おそらく飼育ブタなどの一部のブタの種の状況でも同様である。３５ｋＤａ、２９９ａａのヒトフィコリン−３（アイソフォーム１）は、シグナル配列、Ｎ末端コラーゲンドメイン、及びカルシウム結合部位及び２つの潜在的Ｎグリコシル化部位を含むＣ末端フィブリノーゲンドメインを含んでいる。アイソフォーム２は、コラーゲン様ドメインとフィブリノーゲン様ドメインの間のエクソン４の１１ａａを欠いている変異体である。コラーゲンドメインは、三量体形成を媒介している。フィコリン−３は、Ｎ−アセチル化グルコサミン、ガラクトサミン（ＧｌｃＮＡｃ及びＧａｌＮＡｃ）及びグリシン（ＧｌｙＮＡｃ）、ガラクトース又はＤ−フコースを含めた一連の糖鎖、並びにアセチル化タンパク質に結合する。微生物糖鎖の結合は、フィコリン−３とＭＢＬ／フィコリン関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）複合体とのカルシウム依存性相互作用を伴った免疫応答を開始する。これが、Ｃ４を切断して、補体経路を活性化する。
【０００４】
本発明の目的
本発明の実施形態は、炎症、アポトーシス、自己免疫、内分泌性、凝固、及び/又は血栓性又は凝固障害関連疾患と関連した病状の処置に適したフィコリン−３に対する抗体及び他の阻害分子を提供することを目的とする。本発明の抗体はさらに、これらの徴候の診断及び/又は予後診断、及び癌などの悪性疾患に適したバイオマーカーとなり得る。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者によって、フィコリン−３に対する特定の抗体が免疫系の補体経路を阻害すること、そしてそのため、炎症、アポトーシス、自己免疫、凝固、及び/又は血栓性又は凝固障害関連疾患と関連した特定の病状の処置に使用することができることが見出された。
従って、本発明は、ヒトへの治療的応用に有用な、単離された抗ヒトフィコリン−３モノクローナル抗体を提供する。通常、抗体は、患者に投与されたときに、当該抗体に対する免疫応答の危険を最小限に抑えるため、完全なヒト抗体又はヒト化抗体である。このような抗体から、例えば、抗原結合抗体断片、抗体誘導体、及び多選択性の分子といった他の抗原結合分子を設計又は誘導することができる。一態様では、抗体は、一又は複数の機能的特性により、又は機能的特性の組み合わせにより特徴付けられる。例示的な特性には、例えば、ヒトフィコリン−３への結合において、少なくとも１つの天然ヒトフィコリン−３リガンド、又は複数のリガンドと競合すること、ヒト血漿中のヒトフィコリン−３の量を低減させること、１つのヒトフィコリン−３につき抗体分子が１つだけ結合すること、及び／又は１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でヒトフィコリン−３に結合することなどが含まれる。本発明の特定の抗ヒトフィコリン−３抗体は、更に又は或いは、本明細書中に記載の抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９を含む、本明細書に開示される一又は複数の特定のヒト抗ヒトフィコリン−３抗体とほぼ同じエピトープと競合してこのエピトープに結合するか、或いは本明細書に開示される一又は複数の特定のヒト抗ヒトフィコリン−３抗体と同じか又はそれよりも強い親和性で結合することができる。例えば、一部の実施態様では、抗体は、更に又は或いは、既知の可能性がある抗ヒトフィコリン−３抗体より高い本明細書中に記載の抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９との競合能、或いは本明細書中に記載の抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９の遮断能を有する。一実施態様では、抗体は本明細書中に記載の抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９と同じヒトフィコリン−３エピトープに結合する。別の実施態様では、抗体は、更に又は或いは、本明細書中に記載の抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９と同じエピトープに結合する。別の態様では、抗体は、更に又は或いは、本明細書に記載の抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９のパラトープ及び／又は抗原結合配列と同一又は類似の一又は複数のパラトープ及び／又は抗原結合配列を含む。
【０００６】
従って、第一の広範な態様では、本発明はフィコリン−３の阻害（すなわち、フィコリン−３阻害剤）によって、例えばフィコリン−３が天然リガンドのいずれかと結合する能力を阻害することなどによって、ヒト体液中の補体活性化を阻害するのに好適な方法及び化合物に関する。あらゆる好適な化合物、例えば補体を活性化しないあらゆる可溶性の天然リガンド、他の非天然リガンド又は拮抗薬などが、フィコリン−３を阻害するのに使用され得る。あるいは、フィコリン−３に対する阻害抗体が使用されてもよい。
第二の態様では、本発明は、ヒトフィコリン−３に対して特異的結合を示し、且つ、ヒト体液中で補体活性化を阻害する、単離された組み換えヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合断片に関する。
第三の態様では、本発明は、ヒトフィコリン−３に対して特異的結合を示し、且つ、ヒト体液中で補体活性化を阻害する、単離された組み換えヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、或いは他のフィコリン−３阻害剤を含む組成物に関する。
【０００７】
更なる態様では、本発明は、ヒトフィコリン−３に対して特異的結合を示し、且つ、ヒト体液中で補体活性化を阻害する、単離された組み換えヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
更なる態様では、本発明は、ヒトフィコリン−３に対して特異的結合を示し、且つ、ヒト体液中で補体活性化を阻害する、単離された組み換えヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を産生する組み換え真核又は原核宿主細胞に関する。
更なる態様では、本発明は、ヒトフィコリン−３に対して特異的結合を示し、且つ、ヒト体液中で補体活性化を阻害する、単離された組み換えヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を産生するハイブリドーマに関する。
【０００８】
更なる態様では、本発明は、本発明による抗フィコリン−３抗体又はその抗原結合断片の製造方法であって、好適な条件下で前記抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養し、そして、前記の抗体又はその抗原結合断片を回収することを含む製造方法に関する。
更なる態様では、本発明は、フィコリン−３のその天然リガンドに対する認識の阻害のための、本発明の抗体又はその抗原結合断片、或いは他のフィコリン−３阻害剤の使用に関する。
【０００９】
更なる態様では、本発明は、フィコリン−３リガンド認識に関連している徴候又は病状、例えば炎症、凝固、アポトーシス、及び／又は自己免疫に関連している徴候などの処置方法であって、そのような徴候又は病状に罹患しているか、又は罹患する危険を有しているヒト対象者に対し、本発明による抗体若しくはその抗原結合断片、又は他のフィコリン−３阻害剤を投与することを含む治療方法に関する。
更なる態様では、本発明は、それを必要としている対象における補体活性化の阻害方法であって、それを必要としているヒト対象者に、本発明による抗体若しくはその抗原結合断片、又は他のフィコリン−３阻害剤を投与することを含む阻害方法に関する。
【００１０】
更なる態様では、本発明は、本発明による抗体若しくはその抗原結合断片又は他のフィコリン−３阻害剤、及び医薬的に許容し得る担体を含む医薬組成物に関する。
更なる態様では、本発明は、薬剤としての使用のための本発明による抗体又は他のフィコリン−３阻害剤に関する。一部の実施形態において、前記使用は、徴候、病状又は本明細書中に規定されるような疾患の処置のための使用である。
更なる態様では、本発明は、本明細書中に規定されるような抗体又は他のフィコリン−３阻害剤を含む診断組成物に関する。
【００１１】
更なる態様では、本発明は、サンプル中のヒトフィコリン−３の存在の検出方法であって、以下のステップ：
ａ）前記サンプルを、本明細書中に規定される抗フィコリン−３抗体又は他のフィコリン−３阻害剤と、抗体とヒトフィコリン−３との間の複合体の形成を可能にする条件下で接触させ、そして
ｂ）複合体が形成されたかどうか分析する、
を含む検出方法に関する。
更なる態様では、本発明は、サンプル中のヒトフィコリン−３の存在の検出キットであって：
ａ）本明細書中に規定される抗フィコリン−３抗体又は他のフィコリン−３阻害剤、及び
ｂ）該キットの取扱説明書、
を含む検出キットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】フィコリン−３抗体のパネル。ｒフィコリン−３を、４℃にてマイクロタイタープレート内に直接コートした［１μｇ／ｍｌ］。マウス抗フィコリン−３抗体を含んだ上清を１：１０に希釈し、ウェルに加え、そして、室温にて２時間インキュベートした。抗体結合を、ウサギ抗マウスＨＲＰを用いて室温にて１時間検出し、そしてそのプレートを、ＯＰＤ基質溶液を使用して現像した。光学濃度を４９０ｎｍで評価した。
【図２】組み換えフィコリン−３のリガンド（ａｃＢＳＡ）への結合に対する抗体の効果。フィコリン−３のリガンドとして、ａｃＢＳＡを、４℃にてＰＢＳ中でマイクロタイターウェル内にコートした［５μｇ／ｍｌ］。ｒフィコリン−３［２μｇ／ｍｌ］と２倍希釈した様々な抗体を、ＥＬＩＳＡプレートに加える前に４℃にて３０分間プレインキュベートし、そして３７℃にて２時間インキュベートした。フィコリン−３結合の検出を、ビオチン化ｍＡｂマウスＦＣＮ３３４とそれに続いてｓｔｒｅｐ−ＨＲＰを用いておこなった。すべてのステップの間に、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０含有バルビタールバッファーで洗浄した。グラフは、フィコリン−３結合に対する抗体の用量効果を示している：ＦＣＮ３０４（−|−）（ＦＣＮ３０８（−●−）、ＦＣＮ３１９（−*−）、ＦＣＮ３２９（−ｘ−）、ＦＣＮ３３４（−三角形−）、非特異的アイソタイプ対照Ｃｌｏｎａ ＩｇＧ（−四角形−）、無抗体対照（−−）。
【図３】血清フィコリン−３のリガンド（ａｃＢＳＡ）への結合に対する抗体の効果。ＡｃＢＳＡを、４℃にてＰＢＳ中でマイクロタイターウェル内にコートした［５μｇ／ｍｌ］。血清［１：５０］と２倍希釈した様々な抗体を、ＥＬＩＳＡプレートに加える前に４℃にて３０分間プレインキュベートし、そして、３７℃にて２時間インキュベートした。フィコリン−３結合の検出を、ビオチン化ＦＣＮ３３４とそれに続いてｓｔｒｅｐ−ＨＲＰを用いておこなった。すべてのステップの間に、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０含有バルビタールバッファーで洗浄した。グラフは、フィコリン−３結合に対する抗体の用量効果を示している：ＦＣＮ３０４（−|−）（ＦＣＮ３０８（−●−）、ＦＣＮ３１９（−＊−）、ＦＣＮ３２９（−Ｘ−）、ＦＣＮ３３４（−三角形−）、非特異的アイソタイプ対照Ｃｌｏｎａ ＩｇＧ（−四角形−）、無抗体対照（−−）。
【図４】補体因子Ｃ４の沈着に対する抗体の効果。ＡｃＢＳＡを、４℃にてＰＢＳ中でマイクロタイターウェル内にコートした［５μｇ／ｍｌ］。最初に、全血清をＳＰＳ［０．５ｍｇ／ｍｌ］と氷上で５分間プレインキュベートした。二番目に、血清［１：８０］を抗体と４℃にて３０分間プレインキュベートし、次に、３７℃にて３０分間ＥＬＩＳＡプレートに加えた。ａｃＢＳＡ上へのＣ４沈着を、ｐＡｂウサギ抗ｈｕＣ４（DAKO製）とそれに続いてロバ抗ウサギＨＲＰを用いて検出した。すべてのステップの間に、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０含有バルビタールバッファーで洗浄した。
【図５】補体因子Ｃ３の沈着に対する抗体の効果。ＡｃＢＳＡを、４℃にてＰＢＳ中でマイクロタイターウェル内にコートした［５μｇ／ｍｌ］。最初に、全血清をＳＰＳ［０．５ｍｇ／ｍｌ］と氷上で５分間プレインキュベートした。二番目に、血清［１：８０］を抗体と４℃にて３０分間プレインキュベートし、次に、３７℃にて３０分間ＥＬＩＳＡプレートに加えた。ａｃＢＳＡ上へのＣ３沈着を、ｐＡｂウサギ抗ｈｕＣ３（Dade Behring製）とそれに続いてロバ抗ウサギＨＲＰを用いて検出した。すべてのステップの間に、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０含有バルビタールバッファーで洗浄した。
【図６】終末補体複合体（ＴＣＣ）の沈着に対する抗体の効果。ＡｃＢＳＡを、４℃にてＰＢＳ中でマイクロタイターウェル内にコートした［５μｇ／ｍｌ］。最初に、全血清をＳＰＳ［０．５ｍｇ／ｍｌ］と氷上で５分間プレインキュベートした。二番目に、血清［１：２０］を抗体と４℃にて３０分間プレインキュベートして、次に、３７℃にて４５分間ＥＬＩＳＡプレートに加えた。ａｃＢＳＡ上のＴＣＣ形成を、ビオチン化マウス抗Ｃ５ｂ−９（Bioporto Diagnostic製）とそれに続いてｓｔｒｅｐ−ＨＲＰを用いて検出した。すべてのステップの間に、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０含有バルビタールバッファーで洗浄した。
【図７】腎臓移植片生着に関して１年間追跡調査した５２７人の患者のカプラン−マイヤー生存率プロット。灰色の線が高フィコリン−３レベル（＞０．４６マイクログラム／ｍｌ）を示しているのに対して、黒色の線は低フィコリン−３レベル（＜０．４６マイクログラム／ｍｌ）を示している。
【図８】ＦＣＮ３０８を用いたｒフィコリン−３の壊死細胞への結合の阻害。プロットは、様々な量の抗体ＦＣＮ３０８の存在下での壊死細胞へのフィコリン−３の結合のＦＡＣＳ濃度を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の詳細な開示
本発明の発明者は、リガンドへのフィコリン−３結合の阻害によって補体活性化を阻害することが可能であることを発見した。これは、フィコリン−３に対するモノクローナル抗体を使用することによって実証された。
フィコリン−３遺伝子は、前臨床動物試験に使用された様々な種、及びフィコリン−３媒介効果を試験するために存在していた用をなさない動物モデルにおいて擬似遺伝子である。これは、フィコリン−３の標的への結合と、それに続く下流エフェクター機能の活性化の阻害を達成するために、ヒトフィコリン−３に対するマウス・モノクローナル抗体のパネルを作り出すことによって回避された。本発明の発明者らは、アセチル化アルブミン及び瀕死の宿主細胞へのフィコリン−３の結合を完全に遮断し、且つ、下流の補体沈着を完全に遮断する抗体を得た。
【００１４】
本発明の発明者らは、これにより、ヒトフィコリン−３に対する特定の抗体がそのリガンドに対するフィコリン−３の認識を阻害するのに使用され得ることを発見した。その結果、これらの抗体は、免疫系の補体経路の阻害を含め、下流のフィコリン−３媒介性機能を阻害し得る。従って、本発明による抗体は、炎症や凝固に関連している有害影響の阻害を含め、これに関連した特定の症状の処置に使用され得る。
補体系及び/又は凝固カスケードの無制御の活性化は、全身性炎症及び敗血症から心筋梗塞及び 自己免疫に渡る様々な疾患における致死的な重度の転帰と強く関連する。従って、例えば本発明によるヒトフィコリン−３に対する抗体などの機能阻害剤は、補体系及び凝固カスケードの制御に非常に有用であり得る。凝固及び補体活性化の阻害は、有望な治療ツールになることが示された。
【００１５】
本願発明は、フィコリン−３に対する抗体の、補体の阻害剤及び凝固機能の阻害剤としての新規な使用可能性の双方を説明する。しかしながら、本発明による抗体はまた、例えばスカベンジャー及び／又はシグナル伝達機能などの他の機能のため、又はそのような機能の阻害剤に使用されることもできる。さらに、ヒトフィコリン−３の定量測定を含めたバイオアッセイ、又は、例えば悪性疾患、自己免疫、代謝及び／又は炎症病状を含めた疾患状況の診断などにおける様々な組織内のヒトフィコリン−３の免疫組織学的検出にも使用され得る。
【００１６】
定義
本明細書中に使用される場合、「ヒトフィコリン−３」は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ識別子０７５６３６−１（ＦＣＮ３＿ＨＵＭＡＮ）、配列番号３のｍＲＮＡを有するＮＣＢｉ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰＪ３０３６５６．２（配列番号１）のヒトフィコリン−３アイソフォーム１、又はその天然の変異株及びアイソフォームを指す。一実施形態において、ヒトフィコリン−３は、配列番号１のアイソフォームを指す。
【００１７】
用語「補体活性」とは、本願明細書において、補体系を活性化する能力を意味する。補体活性は、「アッセイ」との見出し部分で説明するアッセイで測定することができる。
本明細書中で使用される場合、「補体活性の阻害」とは、終末補体複合体（ＴＣＣ）の沈着又は上流のフィコリン−３補体依存性沈着及び活性化の、インビトロにおける計測可能なあらゆる減少を指す。補体活性の阻害は、本明細書中に記載したアッセイでも、当業者に知られているその他のアッセイでも評価され得る。
【００１８】
本明細書において、用語「処置」とは、組織損傷を抑制又は最小化することを目的とした、適切な補体活性化に関与する、例えば炎症及び再灌流傷害などの予期病状の予防、及び例えば心筋梗塞及び脳卒中などの既に生じている病状の制御のいずれも含むことを意味する。従って、本発明による抗フィコリン−３抗体の予防投与は、用語「処置」に含まれる。
【００１９】
用語「対象」とは、本願明細書において、任意の動物、特にヒトなどの哺乳類を意味することを目的とし、必要に応じて用語「患者」と互換的に使用することができる。
本明細書中の「抗体」という用語は、最も広義の意味で用いられ、特に、所望の生物学的活性を表す限り、完全長モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、特に断らない限り、抗原結合断片、抗体変異体、及びそれらの多特異性分子を包含する。一般に、完全長抗体は、間をジスルフィド結合又はその抗原結合タンパク質により接続された、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（ここではＶＨと略す）及び重鎖定常領域とからなっている。重鎖定常領域は、３つのドメイン、即ちＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３からなっている。各軽鎖は軽鎖可変領域（ここではＶＬと略す）及び軽鎖定常領域からなっている。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、即ちＣＬからなっている。ＶＨ及びＶＬ領域は更に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる高頻度可変領域に小分割されており、そこにはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるそれよりも保存度の高い領域が散在している。各ＶＨ及びＶＬは３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成されており、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で配置されている。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体分子構造と、抗体作製に関連する種々の技術との一般的な原理は、例えば、Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)に提供されている。
【００２０】
抗体の「抗原結合断片」は、抗原に対して検出可能に結合することができる完全長抗体の一部であり、一般に少なくともＶＨ領域の一又は複数の部分を含んでいる。抗原結合断片は、抗体の、１、２、３、又は４以上の抗原結合部分を含む多価の分子と、ＶＬ及びＶＨ領域、又はその選択された部分が合成リンカーによって、又は組み換え方法によって接合されて機能的な抗原結合分子を形成する一本鎖構造とを包含する。抗体の一部の抗原結合断片は大きな抗体分子を断片化（例えば、酵素的切断）して得られるが、多くは通常組み換え技術により作製される。本明細書では、用語「抗体誘導体」と「イムノコンジュゲート」とは、交換可能に使用され、完全長抗体又はその抗原結合断片を意味するもので、この場合、例えば第二の分子に抗体を連結させるために、例えばアルキル化、ペグ化、アシル化、エステル形成又はアミド形成などによって一又は複数のアミノ酸が化学的に修飾されているものである。例示的な修飾には、ペグ化抗体（例えばシステイン-ペグ化）、ビオチン化、放射標識、及び第２薬剤（細胞障害性剤）との抱合が含まれる。
【００２１】
「多選択性分子」は、抗体又はその抗原結合断片を含み、これは少なくとも１つの他の機能的分子に関連又は連結していることにより、少なくとも２つの異なる結合部位又は標的分子に結合する分子を形成する。例示的な多選択性分子には、二重特異性抗体、及び可溶性レセプター断片又はリガンドに連結された抗体が包含される。
本明細書で使用する「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域が共にヒトの生殖系列の免疫グロブリン配列に由来している（即ち、同一又はほぼ同一である）可変領域を有する抗体を包含する。更に、この抗体が定常領域を含む場合、この定常領域もヒトの生殖系列の免疫グロブリン配列に「由来」している。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含みうる（例えば、無作為又はin vitroでの部位特異性の変異原生によって、或いはin vivoでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）。しかしながら、本明細書で使用する「ヒト抗体」という用語は、マウス又はその他の種のような別の種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトのフレームワーク配列に移植されている抗体は含まない。
【００２２】
「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含むヒト／非ヒトのキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又は実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又は実質的に全てのＦＲ残基がヒト免疫グロブリン配列の残基である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体はまた、場合によって免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。詳しくは、例えばJones et al., Nature 321 : 522-525 (1986) ; Riechmann et al ., Nature 332 : 323-329 ( 1988) ; and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 : 593-596 (1992)、国際公報９２／０２１９０、米国特許公開２００６／００７３１３７及び米国特許第６７５０３２５号、同第６６３２９２７号、同第６６３９０５５号、同第６５４８６４０号、同第６４０７２１３号、同第６１８０３７０号、同第６０５４２９７号、同第５９２９２１２号、同第５８９５２０５号、同第５８８６１５２号、同第５８７７２９３号、同第５８６９６１９号、同第５８２１３３７号、同第５８２１１２３号、同第５７７０１９６号、同第５７７７０８５号、同第５７６６８８６号、同第５７１４３５０号、同第５６９３７６２号、同第５６９３７６１号、同第５５３０１０１号、同第５５８５０８９号及び同第５２２５５３９号を参照のこと。
【００２３】
本明細書中で用いられる「高頻度可変領域」という用語は抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。高頻度可変領域は一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」のアミノ酸残基(軽鎖可変ドメインにおいては残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)、及び重鎖可変ドメインにおいては３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；（Kabat et al., （1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版、米国保健社会福祉省、ＮＩＨ出版番号91-3242)及び／又は「高度可変ループ」の残基(軽鎖可変ドメインにおいては残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)、及び重鎖可変ドメインにおいては２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３);Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含んでなる。一般的に、この領域のアミノ酸残基の番号付けは、上掲のカバットらにおいて記述される方法によって行われる。本明細書中の「カバット位置」、「カバットに記載の可変ドメイン残基番号付け」、及び「カバットによると」などの句は、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインのためのこの番号付けシステムを指す。カバット番号付けシステムを用いて、実際の直鎖状のペプチドのアミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短縮又は挿入に応じてアミノ酸が減っていても又は増えていてもよい。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸挿入(カバットによると残基５２ａ)を含んでいてもよいし、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばカバットによると残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど)を含んでいてもよい。残基のカバット番号付けは、抗体の配列の相同領域に「標準の」カバット番号付けした配列と整列させて所定の抗体について決定してもよい。
【００２４】
本明細書において定められるように、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」残基はＣＤＲ以外のＶＨ又はＶＬ残基である。
「エピトープ」又は「結合部位」とは、抗原結合ペプチド（例えば抗体）が特異的に結合する抗原上の１のエリア又は領域である。タンパク質のエピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優勢成分とも呼ばれる）と、結合に直接的には関与しないアミノ酸残基、例えば特異的に抗原に結合するペプチドによって効果的にブロックされるアミノ酸残基（つまり、このアミノ酸残基は、特異的に抗原に結合するペプチドの「溶媒排除表面」及び／又は「フットプリント」内に位置する）とを含むことができる。本明細書のエピトープという用語は、特に断らない限り、抗ヒトフィコリン−３抗体、又は本発明による他のヒトフィコリン−３特異性薬剤に特に結合するヒトフィコリン−３の任意の特定の領域内の両方の種類のアミノ酸結合部位を包含する（例えば、文脈によっては、本発明は特定のアミノ酸残基に直接結合する抗体に関する）。ヒトフィコリン−３は、多数の異なるエピトープを含むことができ、これには、限定しないが、（１）直鎖ペプチド抗原決定基、（２）成熟ヒトフィコリン−３立体構造中において互いに近接する一又は複数の非隣接アミノ酸からなる立体構造抗原決定基、及び（３）全体又は一部が、ヒトフィコリン−３に共有結合的に付着した分子構造からなる翻訳後抗原決定基、例えば炭水化物基が含まれる。特に断らず、文脈上矛盾しない限り、立体構造抗原決定基は、抗原結合ペプチドの原子から約４Åの距離内にヒトフィコリン−３アミノ酸残基を含む。
【００２５】
「溶媒排除表面」とは、コンピュータの演算において、例えば分子のリガンドへの結合により、どのような水分子も到達し得ない分子の領域である（Lee and Richards, J Mol Biol 1971 ; 55 : 379-400、参照により本明細書に包含する）。
対象とする抗体と「ほぼ同じエピトープ又は決定基に結合する」という表現は、抗体が、対象とする抗体が特異的に結合するヒトフィコリン−３分子について、対象とする抗体と「競合する」ことを意味する。
【００２６】
「パラトープ」とは、抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合部の一エリア又は領域である。特に断らず、文脈上明らかに矛盾しない限り、パラトープは、エピトープ結合に直接関与するアミノ酸残基であって、うち幾つかは通常ＣＤＲ内にあるアミノ酸残基と、結合に直接関与しないアミノ酸残基、例えば特異的に結合した抗原によって効果的に遮断されるアミノ酸残基とを含むことができる（即ち、アミノ酸残基は、特異的に結合した抗原の「溶媒排除表面」及び／又は「フットプリント」内にある）。
抗ヒトフィコリン−３抗体の、天然ヒトフィコリン−３リガンド（例えばＭＩＣＡ）に対するヒトフィコリン−３分子の結合を「遮断」する能力は、この抗体が、可溶性の又は細胞表面に関連するヒトフィコリン−３及びリガンド分子を用いたアッセイにおいて、用量に依存して、リガンドに対するヒトフィコリン−３分子の結合を検出可能に低減することができることを意味し、この場合、ヒトフィコリン−３分子は抗体の不在下においてリガンドに検出可能に結合する。
【００２７】
ポリペプチドの「変異体」は、参照ポリペプチド、一般的に天然又は「親」ポリペプチドと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ポリペプチド変異体は、天然のアミノ酸配列内の特定の位置に一又は複数のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を、及び／又は一方又は両方の末端に追加を有してもよい。
２つのアミノ酸配列の関係において「実質的に同一の」という用語は、例えば初期設定のギャップ加重(default gap weights)を用いたプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって、場合によって整列させた場合に、配列が、少なくともおよそ５０パーセントの配列同一性を共有することを意味する。通常、実質的に同一の配列は、少なくともおよそ６０、少なくともおよそ７０、少なくともおよそ８０、少なくともおよそ９０、少なくともおよそ９５、少なくともおよそ９８又は少なくともおよそ９９パーセントの配列同一性を示す。
【００２８】
２つの実質的に同一のアミノ酸配列の「対応する」アミノ酸位は、本明細書中で言及したいずれかのタンパク質分析ソフトウェアを用いて整列したものである。
他の核酸配列と機能的な関係にある場合、核酸配列は、別の核酸配列（又は要素）と「作用可能に連結して」いる。例えば、プレシーケンス(presequence)又は分泌リーダーのＤＮＡは、あるポリペプチドの分泌に関わる前駆体タンパク質として発現する場合、そのポリペプチドのＤＮＡ（即ち、その発現をコードする）と作用可能に結合している。プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響する場合はコード配列と作用可能に連結している。或いは、リボソーム結合部は、それが翻訳を促す位置にある場合は作用可能にコード配列と連結している。通常、「作用可能に連結した」は、結合したＤＮＡ配列が近接していること、分泌リーダーの場合は近接して読み枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサーのような幾つかの要素は、作用可能に連結するためにコード配列と近接する必要はない。連結は、都合のよい制限部位でライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが、従来の慣行に従って使用される。
【００２９】
「単離される」分子は、属する分子の種類に関して見られる組成物中の主な種である分子である(すなわち、それは、組成物中の分子の種類の少なくともおよそ５０％を占め、一般的に組成物中の分子、例えばペプチドの種類の少なくともおよそ７０％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ８５％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％又はより多くを占める)。一般に、抗体分子の組成物は、組成物中に存在するすべてのペプチド種類の関係において、又は、少なくとも提案された使用の関係において実質的に活性なペプチド種類に関して、抗体分子の９８％、９８％又は９９％の均一性を表すであろう。
【００３０】
本発明の前後関係において、前後関係によって否定されない限り、「処置」又は「処置する」は、疾患又は障害の一又は複数の症状又は臨床的に関連する徴候を予防するか、緩和するか、管理するか、治癒するか、又は低減することを指す。例えば、症状又は疾患ないし障害の臨床的に関連する兆候が同定されていない患者の「処置」は予防又は防止的な治療であるのに対して、症状又は疾患ないし障害の臨床的に関連する兆候が同定されている患者の臨床的、治療的、又は対症的な「処置」は一般的に予防又は防止的な治療を成さない。処置の各形態は、本発明の個別の態様と考えることができる。
【００３１】
本発明は、補体系の阻害を必要としているヒト患者を処置するのに適する特性を有する、抗ヒトフィコリン−３抗体に部分的に基づく。本発明の抗体は、典型的には、患者自身の免疫系による、該抗体に対する免疫応答の危険性を最小化するために、完全なヒト抗体であるか又はヒト化抗体であり、ヒトフィコリン−３に結合する。
一態様において、本発明は、ヒトフィコリン−３媒介性補体活性化を有効に阻止し；ヒトフィコリン−３に対する親和性が１０ｎＭ以下であって；そして、例えば、ＩｇＧ４アイソタイプを有することにより、非枯渇性である、完全ヒト抗体又はその抗原結合断片を提供する。特定の実施態様において、抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプの非枯渇性完全ヒト抗体であり、ヒトフィコリン−３に対する親和性が１ｎＭ以下、好ましくは３００ｐＭ以下であり、内因性ヒトフィコリン−３−リガンド結合の少なくとも５０％、少なくとも７０％、又は少なくとも９０％を遮断し、細胞表面のヒトフィコリン−３量を少なくとも１０％、少なくとも３０％、又は少なくとも５０％低減する。別の特定の実施態様において、抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプの２価非枯渇性完全ヒト抗体であり、１００ｐＭ未満の親和性を有する。
【００３２】
ヒトフィコリン−３に特異的に結合し、これらの特性の一部又は全部を有する抗体の作製、特徴付け、及び使用については、実施例を含む以下の節においてより詳細に説明される。
【００３３】
抗ヒトフィコリン−３抗体
本発明の抗体は、特殊な機能及び／又は構造的な特徴もしくは特性を特徴とする。抗ヒトフィコリン−３抗体の機能活性を評価するアッセイについては実施例で詳細に説明され、例えば、アミノ酸配列などの構造的な特性については以下で説明される。
【００３４】
機能的特性
本発明の抗体は、ヒトフィコリン−３に結合する。一実施態様において、本発明の抗体は、高い親和性で、例えば、１０−７Ｍ以下のＫＤ、１０−８Ｍ以下のＫＤ、１ｎＭ以下のＫＤ、０．３ｎＭ以下のＫＤ、０．２ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０５ｎＭ以下、又は０．０１ｎＭ以下のＫＤでヒトフィコリン−３に結合する。特定の実施態様において、抗体は、０．１ｎＭ以下の親和性でヒトフィコリン−３に結合する。
一態様において、本発明は、また、カニクイザルなどのサルにおける１又は複数の種類のヒトフィコリン−３相同分子種に結合する抗体を提供する。またないし或いは、抗体は、ヒトフィコリン−３に対する親和性の約３０％以上、約５０％以上、約６５％以上、又は約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、もしくは約９０％以上の親和性で、カニクイザル又はアカゲザルのヒトフィコリン−３に結合できる。このような抗体は、ヒトにおいて使用する前に、最も適する動物モデル（又は複数のモデル）における毒性試験が可能であるという利点を有する。
【００３５】
特定の一態様において、本発明の抗体はまた、公知のマウス抗ヒトフィコリン−３抗体が結合しないヒトフィコリン−３の形態にも結合する。
別の実施態様において、本発明は、本明細書中に記載の抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９と競合し、且つ／又はこれらと同じヒトフィコリン−３上のエピトープに結合する抗体を提供する。このような抗体は、本明細書で説明される標準的なヒトフィコリン−３結合アッセイにおいて、抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９と交差競合するそれらの能力に基づき同定することができる。ヒトフィコリン−３に対する抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９の結合を阻害する試験抗体の能力により、該試験抗体が、ヒトフィコリン−３に対する結合について、抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９と競合でき、このため、本明細書中に記載の抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９と同じヒトフィコリン−３上におけるエピトープに結合できることが裏付けられる。好ましい実施態様において、抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９と同じヒトフィコリン−３上のエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体は、本明細書中に記載の実施例で説明されるように調製及び単離することができる。
【００３６】
本明細書で用いられる場合、ヒト抗体が、特殊な生殖細胞系列配列「の」重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域、又は同配列「に由来する」同領域を含むか、又は同配列「の産物」である同領域を含むのは、該抗体の該可変領域が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子を用いる系（以下で説明される）から得られる場合である。このような「系」は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを対象抗原で免疫化すること、又はファージ上において表面提示されるヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーを対象抗原によりスクリーニングすることを含む。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の」ヒト抗体、又は同配列「に由来する」同抗体、又は同配列「の産物」である同抗体は、該ヒト抗体のアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、該ヒト抗体の配列に配列内で最も近接する（すなわち、最大の％同一性）ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列を選択することにより、そのようなものとして同定することができる。特殊なヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の」ヒト抗体、又は同配列「に由来する」同抗体、又は同配列「の産物」である同抗体は、例えば、天然の体細胞突然変異又は（１カ所又は複数カ所の）部位特異的突然変異（置換の選択でありうる）の意図的な導入に起因して、該生殖細胞系列の配列と比較されるアミノ酸の違いを含有する可能性がある。
【００３７】
しかしながら、ヒト抗体は、典型的には、組み換え生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、通常、他の動物種の生殖細胞系列の免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列の配列）と比較した場合にヒト抗体であると同定することができる。特定の場合において、ヒト抗体は、組み換え生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、少なくとも９５％、又はさらに少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する可能性がある。
特殊なヒト生殖細胞系列の配列に由来するヒト抗体は、典型的には、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と１０アミノ酸以下の相違を示す。特定の場合において、該ヒト抗体は、組み換え生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と８つ以下、５つ以下又はさらに４つ、３つ、２つ、又は１つ以下のアミノ酸の相違を示す場合がある。
【００３８】
さらに別の実施態様において、本発明の抗体は、本明細書で説明される好ましい抗体のアミノ酸配列に対して相同的なアミノ酸配列を含み、該抗体が、本発明の抗ヒトフィコリン−３抗体の所望の機能的特性を保持する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。例えば、本発明は、単離された抗体又はその抗原結合断片であって、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、（ａ）該ＶＨ領域が、標準抗体配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含み、（ｂ）該ＶＬ領域が、標準抗体配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含み、（ｃ）ヒトフィコリン−３に結合し、本明細書で説明される機能的特性のうちの少なくとも１つ、好ましくは、本明細書で説明される機能的特性のうちのいくつかを呈示する、単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００３９】
他の実施態様において、ＶＨ及び／又はＶＬのアミノ酸配列は、標準抗体配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の可能性がある。上記の配列のＶＨ領域及びＶＬ領域と高度の（すなわち、８０％以上の）同一性を有するＶＨ領域及びＶＬ領域を有する抗体は、標準抗体配列をコードする核酸分子に対する突然変異誘発（例えば、部位特異的な突然変異誘発又はＰＣＲを介する突然変異誘発）に続き、機能（例えば、ヒトフィコリン−３に対する結合親和性、ヒトフィコリン−３−リガンド間の遮断）の保持についてコードされた改変抗体を調べることにより得ることができる。
【００４０】
２つの配列間における百分率による同一性とは、該配列により共有される同一位置数の関数（すなわち、％同一性＝同一位置数／総位置数×１００）であり、該２つの配列を最適な形で整列するのに導入する必要があるギャップ数、及び各ギャップ長を考慮に入れている。２つの配列間における配列の比較及び百分率による同一性の決定は、配列解析ソフトウェア中の数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む各種の置換、欠失、及び他の修飾に割り当てられる類似性の尺度を用いて類似の配列を整合させる。
【００４１】
２つのアミノ酸配列間における百分率による同一性は、例えば、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス、並びに１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップの重み及び１、２、３、４、５、又は６の全長の重みを用いるＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（http://www.gcg.comで入手可能）内に組み込まれた、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)）によるアルゴリズムを用いて決定することができる。デフォルト又は推奨のパラメータを適用するＦＡＳＴＡプログラムを用いて、ポリペプチド配列も比較することができる。ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１、ＦＡＳＴＡ中のプログラム（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）では、問い合わせ配列と検索配列との間の最良のオーバーラップ領域に対するアライメント及び百分率による配列同一性が提供される（Pearson, Methods Enzymol. 1990;183:63-98; Pearson, Methods Mol. Biol. 2000;132:185-219）。２つのアミノ酸配列間における百分率による同一性はまた、ＰＡＭ１２０の重み残基表、ギャップ長ペナルティー１２、及びギャップペナルティー４を用いるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）内に組み込まれた、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Comput. Appl. Biosci., 1988;11-17）によるアルゴリズムを用いて決定することもできる。ある配列をデータベース内に包含される他の配列と比較する別のアルゴリズムは、コンピュータプログラムであるＢＬＡＳＴ、とりわけ、デフォルトパラメータを用いるｂｌａｓｔｐである。例えば、Altschul et aL, J . Mol. Bioi. 1990; 215 :403-410; Aitschul et ai ., Nucleic Acids Res. 1997; 25 : 3389-402 (1997)（各々が出典明示によりここに援用される）を参照のこと。該プログラムでは、本発明のタンパク質配列を「問い合わせ配列」として用いて公開されたデータベースに対する検索を実施し、例えば、関連の配列を同定することができる。このような検索は、Altschul, et al. 1990（前掲）によるＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて実施することができる。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３によりＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施して、本発明の抗体分子と相同的なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的としてギャップアライメントを得るためには、Altschulら、1997年（前掲）において説明されるようにして、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを用いることができる。ＢＬＡＳＴプログラム及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータを用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。
【００４２】
特定の実施態様において、本発明の抗体は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含むＶＨ領域並びにＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含むＶＬ領域であって、これらのＣＤＲ配列の１つ又は複数が、本明細書で説明される好ましい標準抗体に基づく指定のアミノ酸配列を含み、１つ又は複数のＣＤＲが、場合によっては、１カ所又は複数カ所の保存的アミノ酸修飾を含有し、該抗体が、本発明の抗ヒトフィコリン−３抗体の所望の機能的特性を保持する、ＶＨ領域及びＶＨ領域を含む。したがって、本発明は、単離された抗体又はその抗原結合断片であって、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域とを含み、（ａ）該ＶＨ領域のＣＤＲ３配列が、標準抗体配列を含み、（ｂ）該ＶＬ領域のＣＤＲ３配列が、標準抗体配列を含み、（ｃ）１つ又は複数のＣＤＲが、場合によって、１カ所又は複数カ所の保存的アミノ酸置換を含有し、（ｄ）ヒトフィコリン−３に結合し、本発明で説明される機能的特性のうちの少なくとも１つを呈する、単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００４３】
さらなる実施態様では、ＶＨ領域のＣＤＲ２配列が標準抗体配列を含み、ＶＬ領域のＣＤＲ２配列が標準抗体配列を含み、１つ又は複数のＣＤＲが、場合によって、１カ所又は複数カ所の保存的アミノ酸修飾を含有する。
さらなる実施態様では、ＶＨ領域のＣＤＲ１配列が標準抗体配列並びにこれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域のＣＤＲ１配列が標準抗体配列を含み、１つ又は複数のＣＤＲが、場合によっては、１カ所又は複数カ所の保存的アミノ酸修飾を含有する。
【００４４】
本明細書で用いられる「保存的アミノ酸修飾」という用語は、該アミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に著明な影響を及ぼすか又はこれを顕著に改変することのないアミノ酸修飾を指す。このような保存的修飾は、アミノ酸の置換、付加、及び欠失を含む。修飾は、例えば、部位特異的な突然変異誘発及びＰＣＲを介する突然変異誘発など、当技術分野で公知の標準的な技法により、本発明の抗体内に導入することができる。親抗体と比較されるアミノ酸修飾を含む抗体配列は、典型的には、該親抗体内における対応するアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、好ましくは少なくとも９５％、９８％、又は９９％同一であり、かつ／又は該親抗体配列と比較して最大で１０カ所、好ましくは最大で５カ所、４カ所、３カ所、２カ所のアミノ酸修飾を含む。
【００４５】
「保存的」アミノ酸置換とは、典型的には、アミノ酸残基が、類似の物理化学的特性を伴う側鎖を有するアミノ酸残基により置換されるアミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝状側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【００４６】
こうして、本発明の抗体のＣＤＲ領域内における１つ又は複数のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーに由来する他のアミノ酸残基により置換することができ、改変抗体を、本明細書で説明される機能の保持について調べることができる。
【００４７】
本発明の抗ヒトフィコリン−３抗体は、完全長抗体又はそれらの抗原結合断片として調製することができる。抗原結合断片の例は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ）３断片、Ｆｖ（典型的には、抗体の１本のアームのＶＬドメイン及びＶＨドメイン）断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ；例えば、Bird et al., Science 1988; 242 :423-426; and Huston et ai. PNAS 1988;85 : 5879-5883を参照のこと）断片、ｄｓＦｖ断片、Ｆｄ（典型的には、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン）断片、及びｄＡｂ（典型的には、ＶＨドメイン）断片；ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ＶｈＨドメイン、及びＶ−ＮＡＲドメイン；１本のＶＨ鎖及び１本のＶＬ鎖を含む１価分子；ミニボディー、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、及びカッパボディー（例えば、Ill et ai., Protein Eng 1997; 10 : 949-57を参照のこと）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲのほか；単離ＣＤＲ又は抗原結合残基もしくは抗原結合ポリペプチドが、機能的な抗体断片を形成するように共に会合するか又は連結されうる、１又は複数の単離ＣＤＲ又は機能的パラトープを含む。例えば、Hoiliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005; 23 : 1126-1136；国際公開第２００５／０４０２１９号、ＵＳ２００５／０２３８６４６号及び同２００２／０１６１２０１号では、各種の抗体断片が説明又は総説されている。抗体断片は、従来の組み換え法又はタンパク質の操作法を用いて得ることができ、該断片は、完全抗体と同じ方法で、抗原結合機能又は他の機能についてスクリーニングすることができる。
【００４８】
抗体断片の作製には、各種の技法が開発されている。従来、これらの断片は、完全長抗体に対するタンパク質分解的な消化により誘導された（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24: 107-117 (1992);及びBrennan et al, Science, 229 : 81 (1985)を参照のこと）。しかし、今日、これらの断片は、組み換え宿主細胞により直接作製することができる。代替的に、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的に連結して、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Carter et al ., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)）。別の手法によれば、組み換え宿主細胞培養物から直接にＦ（ａｂ’）２断片を単離することもできる。他の実施態様において、最適の抗体は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開第１９９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。抗体断片はまた、例えば、米国特許第５６４１８７０号で説明される「直鎖抗体」でもありうる。このような直鎖抗体断片は、単特異性又は二重特異性でありうる。
【００４９】
別の態様において、本発明は、本発明の抗ヒトフィコリン−３抗体又はその抗原結合断片を含む多重特異性分子を対象とする。このような多重特異性分子は、ヒトフィコリン−３に対する少なくとも１つの第１の結合特異性及び第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子を含む。二重特異性分子の１つの種類は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体とは、少なくとも２種の異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。二重特異性抗体を作製する方法は当技術分野において公知であり、在来の全長二重特異性抗体の作製は、通常、２本の鎖が異なる特異性を有する２本の免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づく（Millstein et al., Nature, 305 : 537-539 (1983)）。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）又は本明細書で説明される他の任意の抗原結合断片として調製することができる。
【００５０】
本発明による二重特異性抗体では、少なくとも１つの結合エピトープが、ヒトフィコリン−３タンパク質上にある。補体活性化を阻害するよう、抗ヒトフィコリン−３結合部分を、その他の分子に結合する第２の部分と組み合わせることができる。
他の多重特異性分子は、１又は複数の種類の他の非抗体タンパク質に対するヒトフィコリン−３結合抗体の融合から作製される分子を含む。このような多重特異性タンパク質、及びこれらを構築する方法については、当技術分野で説明されている。例えば、Dreierら、(Bioconjug. Chem. 9(4): 482-489 (1998))；米国特許第６０４６３１０号；米国特許出願公開第２００３０１０３９８４号；欧州特許出願公開第１４１３３１６号；米国特許出願公開第２００４００３８３３９号；von Strandmannら、Blood (2006;107:1955-1962)；及び国際公開第２００４０５６８７３号を参照のこと。
【００５１】
本発明の多重特異性抗体は、当技術分野において公知の方法を用いて、構成要素の結合特異性分子をコンジュゲートすることにより調製することができる。例えば、多重特異性分子の各結合特異性分子を個別に発生させ、次いで、互いに対してコンジュゲートさせることができる。結合特異性分子がタンパク質又はペプチドである場合、各種の連結剤又は架橋剤を、共有結合によるコンジュゲーションに用いることができる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及びスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む（例えば、Karpovsky et al., (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照のこと）。他の方法は、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al., (1985) Science 229:81-83), 及びGlennie et al., (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375)において説明される方法を含む。好ましいコンジュゲーション形成剤は、Pierce Chemical社（Rockford, IL）製のＳＡＴＡ及びスルホＳＭＣＣである。結合特異性分子が抗体である場合、それらは、２本の重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によりコンジュゲートすることができる。特定の好ましい実施態様において、該ヒンジ領域は、コンジュゲーション前に、奇数のスルフヒドリル残基、好ましくは１つのスルフヒドリル残基を含有するように修飾される。
【００５２】
代替的には、両方の結合特異性分子ともに、同じベクター内でコードし、同じ宿主細胞内で発現させて組み立てることもできる。この方法は、該二重特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ融合タンパク質、ｍＡｂ×Ｆａｂ融合タンパク質、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２融合タンパク質、又はリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本発明の二重特異性分子は、１本の単鎖抗体及び結合決定基を含む単鎖分子でもありえ、２つの結合決定基を含む単鎖二重特異性分子でもありうる。二重特異性分子は、少なくとも２つの単鎖分子を含みうる。二重特異性分子を調製する方法は、例えば、米国特許第５２６０２０３号；同第５４５５０３０号；同第４８８１１７５号；同第５１３２４０５号；同第５０９１５１３号；同第５４７６７８６号；同第５０１３６５３号；同第５２５８４９８号；同第５４８２８５８号；米国特許出願公開第２００３００７８３８５号；Kontermann et al., (2005) Acta Pharmacological Sinica 26(1):1-9; Kostelny et al., (1992) J. Immunol. 148(5):1547-1553; Hollinger et al., (1993) PNAS (USA) 90:6444-6448;及びGruber et al., (1994) J. Immunol. 152: 5368に説明又は総説されている。
【００５３】
抗体変異体
本明細書で開示される１又は複数の種類のＶＨ配列及び／又はＶＬ配列を有する抗体を、該親抗体から特性が改変される可能性がある修飾抗体又は抗体「変異体」を操作するための出発材料として用いて、本発明の抗体をさらに調製することもできる。一方又は両方の可変領域（すなわち、ＶＨ及び／又はＶＬ）内、例えば、１又は複数のＣＤＲ領域内及び／又は１又は複数のフレームワーク領域内における１つ又は複数の残基を修飾することにより、抗体を操作することができる。またないし或いは、（１つ又は複数の）定常領域内における残基を修飾することによって抗体を操作して、例えば、該抗体の（１つ又は複数の）エフェクター機能を改変することができる。さらに、抗体の抗原結合部分からは、抗原結合断片、抗体誘導体、免疫コンジュゲート、及び多重特異性分子など、他の構築物も調製することができる。
標準的な生物学的技法を用いて、改変された抗体配列を調製し、発現させることができる。
【００５４】
抗体の変異体又は誘導体は、典型的には、「親」抗体と比較して改変された少なくとも１つの特性を有するが、該抗体の変異体又は誘導体は、本明細書で説明される抗ヒトフィコリン−３抗体の機能的特性の１つ、一部、又は大半を保持することができる。
抗体の変異体及び誘導体の機能的特性は、当技術分野において用いられ、かつ／又は本明細書で説明される標準的なアッセイを用いて評価することができる。例えば、実施例で記載されるアッセイなど、標準的な結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ）を用いて、ヒトフィコリン−３に対する抗体の結合能を決定することができる。
【００５５】
可変領域の修飾
可変領域に対して実施できる操作の１つの種類は、ＣＤＲ移植である。抗体は、主として、６本の重鎖及び軽鎖による相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と接触する。この理由で、ＣＤＲ内におけるアミノ酸配列は、ＣＤＲ以外の配列よりも個々の抗体間で多様である。ＣＤＲ配列が大半の抗体−抗原間相互作用の一因をなすため、異なる特性を有する異なる抗体に由来するフレームワーク配列上に移植された、特異的な天然抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特異的な天然抗体の特性を模倣する組み換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Riechmann, L. et al., (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al., (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033；米国特許第５２２５５３９号；同第５５３０１０１号、同第５５８５０８９号、同第５６９３７６２号、及び同第６１８０３７０号を参照のこと）。したがって、本発明の別の実施態様は、単離抗体又はその抗原結合部分であって、本明細書中に記載の抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９のＶＨ ＣＤＲ配列及びＶＬ ＣＤＲ配列を含有するが、これらの抗体とは異なるフレームワーク配列も含有する可能性がある。
本発明はまた、ヒトフィコリン−３に結合するマウス抗ヒトフィコリン−３モノクローナル抗体もしくはその抗原結合部位のキメラ又はヒト化バージョン、及びこのような抗体の使用（例えば、哺乳動物宿主におけるヒトフィコリン−３媒介性の生理学的過程の調節における）も提供する。一実施態様において、該マウス抗体は、抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９のうちの１つであって、これらの抗体とは異なるフレームワーク配列を含有するものである。一実施態様において、ヒト化抗体は、本明細書中に記載の抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９のヒト化バージョンである。
【００５６】
フレームワーク配列は、生殖細胞系列の抗体遺伝子配列を含む、公開されているＤＮＡデータベース又は公表された参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖可変領域遺伝子及び同軽鎖可変領域遺伝子のための生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「ｄＢａｓｅ」と称するヒト生殖細胞系列の配列データベース（www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseにおいてインターネット上でアクセス可能）のほか、各々の内容が出典明示によりここに援用される、Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al., (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; 及びCox, J. P. L. et al., et al., (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836において見出すことができる。本発明による抗体のＶＨ ＣＤＲ１配列、同ＣＤＲ２配列、及び同ＣＤＲ３配列と、本発明による抗体のＶＬ ＣＤＲ１配列、同ＣＤＲ２配列、及び同ＣＤＲ３配列とを、該フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子内で見出される配列と同じ配列を有するフレームワーク領域上に移植することもでき、又は該ＣＤＲ配列を、該生殖細胞系列の配列と比較して１カ所又は複数カ所の突然変異を含有するフレームワーク領域上に移植することもできる。例えば、特定の場合には、該フレームワーク領域内の残基を突然変異させて、該抗体の抗原結合能を維持又は増強することが有益であることが分かっている（例えば、米国特許第５５３０１０１号、同第５５８５０８９号、同第５６９３７６２号、及び同第６１８０３７０号を参照のこと）。
【００５７】
本発明の別の態様では、本発明の抗ヒトフィコリン−３抗体の構造的特徴を用いて、ヒトフィコリン−３に対する結合など、本発明の抗体の少なくとも１つの機能的特性を保持した構造的関連性を有する抗ヒトフィコリン−３抗体が作成される。例えば、本明細書中に記載の抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９の１又は複数のＣＤＲ領域、又はこれらの変異体を、組み換え法により公知のフレームワーク領域及び／又は他のＣＤＲと組み合わせて、組み換え法により操作された本発明の抗ヒトフィコリン−３抗体をさらに作成することができる。操作法のための出発材料は、本明細書で提供される１又は複数の種類のＶＨ配列及び／又はＶＬ配列、或いはこれらの１つ又は複数のＣＤＲ領域である。操作された抗体を作成するには、本明細書で提供される１又は複数の種類のＶＨ配列及び／又はＶＬ配列、或いはこれらの１つ又は複数のＣＤＲ領域を実際に調製する（すなわち、タンパク質として発現させる）必要はない。そうではなく、（１又は複数の種類の）配列内に含有される情報を出発材料として用いて、（１又は複数の種類の）元の配列に由来する（１又は複数の種類の）「第２世代の」配列を作成し、次いで、（１又は複数の種類の）該「第２世代の」配列を、タンパク質として調製し、発現させる。
【００５８】
可変領域修飾の別の種類は、ＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及び／又はＣＤＲ３領域内におけるアミノ酸残基を突然変異させ、これにより、対象抗体の１つ又は複数の結合特性（例えば、親和性）を改良する修飾である。部位特異的な突然変異誘発又はＰＣＲを介する突然変異誘発を実施して（１カ所又は複数カ所の）突然変異を導入し、抗体結合に対する効果又は他の対象となる機能的特性を、本明細書で説明され、実施例において提供されるインビトロ又はインビボのアッセイにおいて評価することができる。保存的修飾（上記で論じた）を導入することが好ましい。該突然変異は、アミノ酸置換の場合もあり、同付加の場合もあり、同欠失の場合もある。さらに、単一のＣＤＲ領域内では、典型的には８つ以下、より典型的には５つ以下の残基が改変される。
【００５９】
本発明の操作された抗体は、例えば、ＶＨ及び／又はＶＬ内のフレームワーク残基に対して該抗体の特性を改良する修飾が行われた抗体を含む。このようなフレームワーク修飾は、典型的には、該抗体の免疫原性を低下させるために行われる。例えば、１つの手法では、１つ又は複数のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系列の配列へと「復帰突然変異」させる。具体的には、体細胞突然変異を受けた抗体は、該抗体が由来する生殖細胞系列の配列とは異なるフレームワーク残基を含有する可能性がある。このような残基は、該抗体フレームワーク配列を、該抗体が由来する生殖細胞系列の配列と比較することによって同定することができる。
【００６０】
別の種類のフレームワーク修飾は、該フレームワーク領域内、又はさらに１又は複数のＣＤＲ領域内における１つ又は複数の残基を突然変異させてＴ細胞エピトープを除去し、これにより、該抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを伴う。この手法は「脱免疫化」とも称し、米国特許出願公開第２００３／０１５３０４３号においてさらに詳細に説明されている。
【００６１】
Ｆｃ修飾
フレームワーク領域又はＣＤＲ領域内において行われた修飾に加えて、又はこれらの代替として、Ｆｃ領域内における修飾を含むように、典型的には、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、タンパク質の安定性、及び／又は抗原依存性細胞障害性もしくはその欠如などの、本発明の抗体の１つ又は複数の機能的特性を改変するように、該抗体を操作する場合がある。その上、本発明の抗体は、化学修飾（例えば、１つ又は複数の化学的部分を抗体に付着させることができる）する場合もあり、そのグリコシル化を改変し、さらには該抗体の１つ又は複数の機能的特性を改変するように修飾する場合もある。これらの実施態様のそれぞれについて後述でさらに詳細に説明する。Ｆｃ領域内における残基は、Ｋａｂａｔにより番号付けされている。
必要に応じて、公知の技法により、抗体のクラスを「スイッチ」することができる。このような技法は、例えば、直接的な組み換え法（例えば、米国特許第４８１６３９７号を参照のこと）、及び細胞間融合法（例えば、米国特許第５９１６７７１号を参照のこと）の使用を含む。例えば、元はＩｇＭ分子として作製された抗体を、ＩｇＧ抗体へとクラススイッチすることができる。クラススイッチ法はまた、１つのＩｇＧサブクラスから別のサブクラスへ、例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ２へと転換させるのにも用いられる場合がある。こうして、各種の治療的使用に応じて、例えば、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＥ抗体、又はＩｇＭ抗体へのアイソタイプスイッチングにより、本発明の抗体のエフェクター機能を変化させることができる。定常領域に対応する例示的なｃＤＮＡ配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ及び他の公開のウェブサイトによりアクセス可能）により入手可能であり、出典明示により全体がここに援用されるその各々は：ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｊ００２２８号：ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｊ００２３０号：ヒトＩｇＧ３重鎖定常領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｘ０４６４６号：ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｋ０１３１６号：ヒトカッパ軽鎖定常領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｊ００２４１号である。
【００６２】
一実施態様では、ヒンジ領域内におけるシステイン残基数が改変される、例えば、増加又は減少するように、ＣＨ１のヒンジ領域を修飾する。この手法は、米国特許第５６７７４２５号においてさらに説明されている。例えば、軽鎖及び重鎖のアセンブリーを容易とするか、又は抗体の安定性を上昇もしくは低下させるように、ＣＨ１のヒンジ領域内におけるシステイン残基数を改変する。別の実施態様では、抗体の生物学的半減期を短縮するように、該抗体のＦｃヒンジ領域を突然変異させる。より具体的に述べると、天然のＦｃヒンジドメインにおけるブドウ球菌（Staphylococcyl）プロテインＡ（ＳｐＡ）結合と比べて該抗体のＳｐＡ結合が損なわれるように、Ｆｃヒンジ断片のＣＨ２ドメイン−ＣＨ３ドメイン間のインターフェース領域内に１カ所又は複数カ所のアミノ酸突然変異が導入される。この手法は、米国特許第６１６５７４５号においてさらに説明されている。別の実施態様では、その生物学的半減期を延長するように抗体が修飾される。各種の手法が可能である。例えば、米国特許第６２７７３７５号において説明される通り、以下の突然変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、及びＴ２５６Ｆのうちの１つ又は複数を導入することができる。代替的に、米国特許第５８６９０４６号及び同第６１２１０２２号において説明される通り、生物学的半減期を延長するため、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから採取されたサルベージ受容体結合エピトープを含有するように、ＣＨ１領域又はＣＬ領域内において抗体を改変することができる。さらに他の実施態様では、抗体の（１つ又は複数の）エフェクター機能を改変するように、少なくとも１つのアミノ酸残基を、異なるアミノ酸残基により置換することにより、Ｆｃ領域を改変する。例えば、エフェクターリガンドに対する抗体の親和性は改変するが、親抗体の抗原結合能は保持するように、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０、及び３２２から選択される１つ又は複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基により置換することができる。それに対する親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体、又は補体のＣ１成分でありうる。この手法は、いずれもが米国特許第５６２４８２１号及び同第５６４８２６０号においてさらに詳細に説明されている。別の例では、抗体のＣ１ｑ結合を改変し、かつ／又は補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）を低下又は消失させるように、アミノ酸残基３２９、３３１、及び３２２から選択される１つ又は複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基により置換することができる。この手法は、米国特許第６１９４５５１号においてさらに説明されている。別の例では、アミノ酸の位置２３１及び２３９内における１つ又は複数のアミノ酸残基を改変し、これにより、抗体の補体結合能を改変する。この手法は、国際公開第９４／２９３５１号においてさらに説明されている。さらに別の例では、以下の位置：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、���０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８、又は４３９における１つ又は複数のアミノ酸を修飾することにより、抗体が抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を媒介する能力を増大させ、かつ／又はＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増大させるように、Ｆｃ領域を修飾する。この手法は、国際公開第００／４２０７２号においてさらに説明されている。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、及びＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位もマップされ、結合が改良された変異体も説明されている（Shields, R.L. et al., (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604）。位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４、及び３３９における具体的な突然変異は、ＦｃＲＩＩＩに対する結合を改良することが示された。加えて、以下の組合せ突然変異：Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４Ａ、及びＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａも、ＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改良することが示された。
【００６３】
抗体を安定化させる、例えば、２価抗体が２つの１価ＶＨ−ＶＬ断片へと分離する危険性を低下させるように、定常領域をさらに修飾する場合がある。例えば、ＩｇＧ４定常領域では、残基Ｓ２４１をプロリン（Ｐ）へと突然変異させて、ヒンジにおける完全なジスルフィド架橋形成を可能とする場合がある（例えば、Angal et al., Mol Immunol. 1993;30:105-8を参照のこと）。
【００６４】
グリコシル化の修飾
さらに別の実施態様では、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、非グリコシル化された抗体（すなわち、グリコシル化を欠く抗体）を作製することができる。例えば、抗原に対する抗体の親和性を増大させるように、グリコシル化を改変することができる。このような炭水化物の修飾は、例えば、抗体配列内における１つ又は複数のグリコシル化部位を改変することによって達成することができる。例えば、１つ又は複数の可変領域フレームワークのグリコシル化部位の除去を結果としてもたらす、１カ所又は複数カ所のアミノ酸置換を作製し、これにより、その部位におけるグリコシル化を除去することができる。このような非グリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性を増大させることができる。このような手法は、米国特許第５７１４３５０号及び同第６３５０８６１号においてさらに詳細に説明されている。またないし或いは、少量のフコース残基を有する低フコシル化抗体又はＧｌｃＮａｃの二分構造を増大させる抗体など、グリコシル化の種類が改変された抗体も作製することができる。このようなグリコシル化パターンの改変は、抗体のＡＤＣＣ能を上昇させることが実証されている。炭水化物のこのような修飾は、例えば、グリコシル化「機構」が改変された宿主細胞内において抗体を発現させることにより達成することができる。このような改変を伴う細胞は当技術分野で開示されており、本発明の組み換え抗体を発現させることにより、グリコシル化が改変された抗体を作製するための宿主細胞として用いることができる。例えば、HanaiらによるＥＰ１１７６１９５は、そこに発現する抗体が低フコシル化を呈するように、フコシルトランスフェラーゼをコードする、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を伴う細胞株について説明している。国際公開第０３／０３５８３５号は、Ａｓｎ（２９７）を連結した炭水化物へとフコースを付着させる能力を低下させ、また、その結果として、その宿主細胞に発現する抗体の低フコシル化ももたらす変異体ＣＨＯ細胞株であるＬｅｃｌ３細胞についても説明している（Shields, R.L. et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照されたい）。国際公開第９９／５４３４２号は、操作された細胞株に発現する抗体が、該抗体のＡＤＣＣ活性の上昇を結果としてもたらすＧｌｃＮａｃの二分構造の増大を呈するよう、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（ｌ，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株について説明している（Umana et al., (1999) Nat. Biotech. 7:176-180も参照されたい）。本発明の抗体を操作する方法に関する特定の実施態様では、抗ヒトフィコリン−３抗体をコードする配列の全部又は一部に沿って無作為に又は選択的に突然変異を導入することができ、本明細書で説明されるように、結合活性及び／又は他の機能的特性について、結果としてもたらされる修飾抗体をスクリーニングすることができる。突然変異法は、当技術分野において説明されている。例えば、国際公開第０２／０９２７８０号は、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリー、又はこれらの組合せを用いる抗体突然変異を作成及びスクリーニングする方法について説明している。
代替的に、国際公開第０３／０７４６７９号は、抗体の物理化学的特性を最適化する、コンピュータによるスクリーニング法を用いる方法についても説明している。
【００６５】
抗体誘導体
本発明の範囲内の抗体誘導体（又はイムノコンジュゲート）には、第二薬剤にコンジュゲートさせた又は共有結合させた抗ヒトフィコリン−３抗体が含まれる。
例えば、一態様では、本発明は、放射性同位体、例えば治療用放射性核種又は検出目的のために適切な放射性核種にコンジュゲートさせた又は共有結合させた抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。多くの適切な放射性同位体の任意のものを使用することができ、限定されるものではないが、インジウム-１１１、ルテチウム-１７１、ビスマス-２１２、ビスマス-２１３、アスタチン-２１１、銅-６２、銅-６４、銅-６７、イットリウム-９０、ヨード-１２５、ヨード-１３１、リン-３２、リン-３３、スカンジウム-４７、銀-１１１、ガリウム-６７、プラセオジミウム-１４２、サマリウム-１５３、テルビウム-１６１、ジスプロシウム-１６６、ホルミウム-１６６、レニウム-１８６、レニウム-１８８、レニウム-１８９、鉛-２１２、ラジウム-２２３、アクチニウム-２２５、鉄-５９、セレン-７５、ヒ素-７７、ストロンチウム-８９、モリブデン-９９、ロジウム-１０５、パラジウム-１０９、プラセオジミウム-１４３、プロメチウム-１４９、エルビウム-１６９、イリジウム-１９４、金-１９８、金-１９９、及び鉛-２１１が含まれる。一般的に、放射性核種は、オージェエミッターで好ましくは２０〜６０００ＫｅＶの範囲、好ましくは６０〜２００ＫｅＶの範囲、ベータエミッターで１００〜２５００ＫｅＶ、アルファエミッターで４０００〜６０００ＫｅＶの崩壊エネルギーを有する。また、アルファ粒子の生成を伴い、実質的に崩壊する放射性核種が好ましい。
【００６６】
本発明の抗体抱合体を使用することにより、所定の生物学的応答を修正することができ、この場合、薬剤成分は、古典的な化学的治療剤に限定されない。例えば、薬剤成分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質又はポリペプチドとすることができる。
第ニ薬剤は、可能な多数の方法のうちのいずれかを使用して、抗体に対して直接的に又は間接的に連結することができる。例えば、１の薬剤を、Ｎ−サクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）などの架橋結合を用いることにより、ジスルフィド結合の形成を介して、或いは、抗体のＦｃ領域の糖鎖を介して、縮小した抗体成分のヒンジ領域に付着させることができる（例えば、Yu et al. (1994) int. J . Cancer 56 : 244; Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking (CRC Press 1991) ; Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in Monoclonal antibodies: principles and applications, Birch et al . (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, inc. 1995) ; Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in Monoclonal antibodies: Production, engineering and clinical application, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995), Cattel et al. (1989) Chemistry today 7: 51-58, Delprino et al. (1993) J . Pharm. Sci 82: 699-704; Arpicco et al. (1997) Bioconjugate Chemistry 8: 3; Reisfeld et al . (1989) Antibody, immunicon. Radiopharm. 2: 217；前記文献のそれぞれの開示全体を参照により本明細書中に援用する)。更には、例えば、Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs in Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, inc. 1985) ; Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al . (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, inc. 1987) ; Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy : A Review", in Monoclonal Antibodies '84 : Biological And Clinical Applications, Pinchera et al . (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et a/, (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62 : 119-58 (1982)なども参照されたい。
【００６７】
他の実施の形態では、第二薬剤は検出可能な部分であり、それは量的ないしは質的に観察されるか又は測定されうる任意の分子であってもよい。本発明のコンジュゲート抗体に有用な検出可能なマーカーの例は、放射性同位体、蛍光色素、又は相補的に結合する対のいずれか、例えば抗原／抗体(ヒトフィコリン−３に対する抗体以外)、レクチン／糖質；アビジン／ビオチン；レセプター／リガンド；又は、分子的にインプリントされたポリマー／プリント分子システムのいずれか１のメンバーである。
またないしは或いは、第二薬剤は、例えば、抗体の循環半減期を増やすことを目的とするポリマーであってもよい。例示的なポリマー及び、該ポリマーをペプチドに接着させる方法は、例えば米国特許第４７６６１０６号；同第４１７９３３７号；同第４４９５２８５号；及び同第４６０９５４６号に例示される。更なる例示的なポリマーには、ポリオキシエチラート化ポリオール及びポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分が含まれる。本明細書で使用される「ポリエチレングリコール」という用語は、他のタンパク質の誘導体化に使用されているＰＥＧのあらゆる形態、例えば、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−又はアリールオキシ−ポリエチレングリコール、或いはポリエチレングリコール−マレイミドを包含する。例えば、完全長抗体ないし抗体断片は、およそ１０００〜およそ４００００、例えばおよそ２０００〜およそ２００００、例としておよそ３０００〜１２０００の間の分子量を有する一又は複数のＰＥＧ分子にコンジュゲートさせてもよい。抗体又はその断片をペグ化するために、通常、抗体又はその断片を、一又は複数のポリエチレングリコール基が抗体又は抗体断片に付着する条件下において、ＰＥＧのアルデヒド誘導体又は反応性エステルといったポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性のＰＥＧ分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を介して起こる。特定の実施態様では、ペグ化対象の抗体は、グリコシル化抗体である。複数のタンパク質のペグ化方法が従来技術に既知であり、本発明の抗体に適用可能である。例えば、ＥＰ１５４３１６、国際特許出願公開第２００４０９９２３１号、及びＥＰ４０１３８４を参照のこと。
【００６８】
核酸
本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関係する。該核酸は、全細胞、細胞溶解物、又は部分的に精製された形態もしくは実質的な純粋形態において存在しうる。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌ分染、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当技術分野で周知の他の方法を含む標準的な技法により他の細胞内成分又は他の夾雑物、例えば、他の細胞内核酸又は細胞内タンパク質から精製される場合に、「単離」されるか又は「実質的に純粋」となる。F. Ausubelら編 (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照のこと。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡでありえ、イントロン配列を含有する場合も、そうでない場合もある。好ましい実施態様において、核酸はｃＤＮＡ分子である。以下の段落ではＤＮＡ配列又はこれらの使用に言及するが、同じ方法又は原理は一般に、ｍＲＮＡ配列にも適用することができる。
本発明の核酸は、標準的な分子生物学の技法を用いて得ることができる。ハイブリドーマにより発現する抗体（例えば、以下でさらに説明される、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから調製されるハイブリドーマ）の場合、ハイブリドーマにより作製される抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅法又はｃＤＮＡクローニング法により得ることができる。免疫グロブリンの遺伝子ライブラリーから得られる（例えば、ファージディスプレイ法を用いる）抗体の場合、該抗体をコードする核酸は、該ライブラリーから回収することができる。
【００６９】
ＶＨセグメント及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られたら、これらのＤＮＡ断片を標準的な組み換えＤＮＡ法によりさらに操作して、例えば、該可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子、又はｓｃＦｖ遺伝子へと転換させることができる。これらの操作において、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体の定常領域又は可撓性リンカーなど、別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に作用可能に連結される。この文脈で用いられる「作用可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列がフレーム内にとどまるよう、該２つのＤＮＡ断片を接合することを意味する。
【００７０】
ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子へと作用可能に連結することにより、ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡを全長重鎖遺伝子へと転換させることができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野において既知であり（例えば、Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、米国保健福祉省、NIH Publication No. 91-3242を参照のこと）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、又はＩｇＤの定常領域でありうるが、ＩｇＧ４の定常領域であることが最も好ましい。Ｆａｂ断片による重鎖遺伝子の場合、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域だけをコードする別のＤＮＡ分子へと作用可能に連結することができる。
ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域であるＣＬをコードする別のＤＮＡ分子へと作用可能に連結することにより、ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡを全長軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）へと転換させることができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野において知られており（例えば、Kabat, E. A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、米国保健福祉省、NIH Publication No. 91-3242を参照のこと）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパ定常領域又はラムダ定常領域でありうるが、カッパ定常領域であることが最も好ましい。ｓｃＦｖ遺伝子を作成するには、ＶＬ領域及びＶＨ領域が可撓性リンカーにより接合される形で、ＶＨ配列及びＶＬ配列が隣接する単鎖タンパク質として発現されうるように、ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ断片が、可撓性リンカーをコードする別の断片、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断片へと作用可能に連結される（例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554を参照のこと）。
【００７１】
抗体の作製
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体法、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）、Kohler及びMilstein (1975) Nature 256: 495による標準的な体細胞ハイブリダイゼーション法を含む各種技法により作製することができる。原則としては、体細胞ハイブリダイゼーション手順が好ましいが、モノクローナル抗体を作製する他の技法、例えば、Ｂリンパ球のウイルス又は癌遺伝子による形質転換も用いることができる。
ハイブリドーマを調製するのに好ましい１つの動物系は、マウス系である。融合のために免疫化された脾臓細胞を単離するための免疫化のプロトコール及び技法は、融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）及び融合手順と同様、当技術分野で既知である。確立された技法を用いると、本発明のキメラ抗体又はヒト化抗体も、マウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。例えば、重鎖免疫グロブリン及び軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、対象のマウスハイブリドーマから得ることができ、標準的な分子生物学の技法を用いて、非マウス（例えば、ヒト）の免疫グロブリン配列を含有するように操作することができる。例えば、キメラ抗体を作成するためには、当技術分野で公知の方法を用いて、マウス可変領域をヒト定常領域へと連結することができる（例えば、米国特許第４８１６５６７号を参照のこと）。ヒト化抗体を作成するためには、当技術分野で公知の方法を用いて、マウスＣＤＲ領域をヒトフレームワーク内へと挿入することができる（例えば、米国特許第５２２５５３９号；同第５５３０１０１号、同第５５８５０８９号、同第５６９３７６２号、及び同第６１８０３７０号を参照のこと）。
【００７２】
好ましい実施態様において、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。ヒトフィコリン−３を対象とするこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなく、ヒト免疫系の一部を保有するトランスジェニックマウス又は導入染色体マウスを用いて発生させることができる。これらのトランスジェニックマウス又は導入染色体マウスは、本明細書でそれぞれＨｕＭＡｂマウス及びＫＭマウスと称するマウスを含め、本明細書では「ヒトＩｇマウス」と総称される。ＨｕＭＡｂマウス（Medarex社製）は、内因性のｕ鎖及びＫ鎖の遺伝子座を不活化する標的となる突然変異と共に、位置変えされないヒト重（ｐ及びｙ）鎖及びＫ軽鎖の免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座を含有する（例えば、Lonberg et al., (1994) Nature 368: 856-859を参照のこと）。したがって、該マウスは、マウスＩｇＭ又は同Ｋ鎖の発現低下を示し、免疫化に対する反応では、導入されたヒト重鎖及び軽鎖の導入遺伝子がクラススイッチング及び体細胞突然変異を受けて、高親和性のヒトＩｇＧＫモノクローナルを発生させる（Lonberg N et al., (1994)、前掲；Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N.及びHuszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93、及びHarding, F.及びLonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546において総括されている)。ＨｕＭＡｂマウスの調製及び使用、並びにこのようなマウスにより保有されるゲノム修飾は、それらすべての全体を出典明記によりここに援用される、Taylor, L. et al., (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al., (1993)International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al., (1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. et al., (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., (1994) J. Immunol. 152:2912 2920; Taylor, L. et al., (1994) International immunology 6: 579-591; 及びFishwild, D. et al., (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851においてさらに説明されている。さらに、米国特許第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号、同第５７８９６５０号、同第５８７７３９７号、同第５６６１０１６号、同第５８１４３１８号、同第５８７４２９９号、及び同第５７７０４２９号；米国特許第５５４５８０７号；国際公開第９２／０３９１８号、同第９３／１２２２７号、同第９４／２５５８５号、同第９７／１３８５２号、同第９８／２４８８４号、及び同第９９／４５９６２号；並びに国際公開第０１／１４４２４号を参照のこと。別の実施態様では、ヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖導入染色体を保有するマウスなど、導入遺伝子及び導入染色体上においてヒト免疫グロブリン配列を保有するマウスを用いて、本発明のヒト抗体を生成することができる。本明細書では「ＫＭマウス」と称するこのようなマウスは、国際公開第０２／４３４７８号において詳細に説明されている。またさらに、当技術分野ではヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替的なトランスジェニック動物も用いられており、これらを用いて本発明の抗ヒトフィコリン−３抗体を使用できる。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Abgenix, Inc.）と呼ばれる代替のトランスジェニックシステムが使用でき；このようなマウスは、例えば米国特許第５９３９５９８号；同第６０７５１８１号；同第６１１４５９８号；同第６��５０５８４号及び同第６１６２９６３号において説明されている。さらに、当該技術分野ではヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランス染色体動物系も用いることができ、本発明の抗ヒトフィコリン−３抗体を作製するのに使用されている。例えば、「ＴＣマウス」と称する、ヒト重鎖導入染色体及びヒト軽鎖導入染色体を保有するマウスも用いることができ、このようなマウスは、例えば、Tomizuka et al.,（2000）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727において説明されている。その上、当技術分野ではヒト重鎖導入染色体及びヒト軽鎖導入染色体を保有するウシも説明されており（Kuroiwa et al.,（2002）、Nature Biotechnology 20:889-894）、これらを用いて本発明の抗ヒトフィコリン−３抗体を生成することができる。
【００７３】
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするファージディスプレイ法を用いて調製することもできる。ヒト抗体を単離するこのようなファージディスプレイ法は、当技術分野で確立されている。例えば、米国特許第５２２３４０９号；同第５４０３４８４号；同第５５７１６９８号；同第５４２７９０８号及び同第５５８０７１７号；同第５９６９１０８号；同第６１７２１９７号；同第５８８５７９３号；同第６５２１４０４号；同第６５４４７３１号；同第６５５５３１３号；同第６５８２９１５号及び同第６５９３０８１号を参照のこと。本発明のヒトモノクローナル抗体は、免疫化時にヒト抗体反応を発生させうるように、その中へとヒト免疫細胞を再構成したＳＣＩＤマウスを用いて調製することもできる。このようなマウスは、例えば、米国特許第５４７６９９６号及び同第５６９８７６７号において説明されている。
【００７４】
ヒトＩｇマウスを用いて本発明のヒト抗体を生成する場合、Lonberg, N. et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al., (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851；及び国際公開第９８／２４８８４号及び同第０１／１４４２４号により説明される通り、精製又は濃縮されたヒトフィコリン−３抗原の調製物、及び／又はヒトフィコリン−３を発現する細胞により、このようなマウスを免疫化することができる。初回の注入時において、マウスは６〜１６週齢であることが好ましい。例えば、精製又は濃縮されたヒトフィコリン−３抗原の調製物（５〜５０μｇ）を用いて、腹腔内を介してヒトＩｇマウスを免疫化することができる。精製又は濃縮されたヒトフィコリン−３抗原の調製物を用いる免疫化の結果として抗体が得られない場合は、ヒトフィコリン−３を発現する細胞、例えば、ヒトＮＫ細胞株もしくはＴ細胞株、又は、ＤＡＰ１０を伴う場合であれ、そうでない場合であれ、組み換えヒトフィコリン−３を発現する哺乳動物細胞によりマウスを免疫化して免疫応答を促進することもできる。
【００７５】
ヒトフィコリン−３に対する完全ヒトモノクローナル抗体を発生させる詳細な手順は、以下の実施例１で説明される。投与される抗原の形態及び量（例えば、ヒトフィコリン−３ポリペプチド又はヒトフィコリン−３を発現する細胞）のほか、投与スケジュール、また、例えば、完全フロイントアジュバント又は不完全フロイントアジュバントなど、アジュバントの可能な使用も、当技術分野で確立された方法により、典型的には各抗原マウス系に応じて最適化される。
後眼窩血を介して得られる血漿試料により免疫化プロトコールの経過に亘って免疫応答をモニタリングすることができ、ＥＬＩＳＡ（以下で説明される）により該血漿及び血清をスクリーニングすることができ、十分な力価の抗ヒトフィコリン−３ヒト免疫グロブリンを伴うマウスを融合に用いることができる。屠殺及び脾臓摘出の３日前に、静脈内を介してマウスに抗原を追加投与することができる。各免疫化につき、２〜３回ずつの融合を実施することが必要な場合があると予測される。
【００７６】
本発明のヒトモノクローナル抗体を作製するハイブリドーマを発生させるために、免疫化したマウスに由来する脾臓細胞及び／又はリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株などの適切な不死化細胞株へと融合することができる。結果として得られるハイブリドーマは、抗原特異的抗体の作製についてスクリーニングすることができる。例えば、免疫化されたマウスに由来する脾臓リンパ球の単細胞懸濁液を、５０％ＰＥＧにより、１／６の個数のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌性マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ １５８０）と融合させることができる。代替的に、該細胞は、電気融合により融合することもできる。平底マイクロ滴定プレート内に約２×１０５個の細胞を播種した後、２０％胎児クローン血清、１８％「６５３」馴化培地、５％オリゲン（IGEN社製）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン及び１倍濃度のＨＡＴを含有する選択培地（Ｓｉｇｍａ社製、融合の２４時間後にＨＡＴを添加する）中で２週間に亘りインキュベートする。約２週間後には、ＨＴによりＨＡＴを置換した培地中で細胞を培養することができる。次いで、ヒトモノクローナルＩｇＭ抗体及び同ＩｇＧ抗体について、ＥＬＩＳＡにより個々のウェルをスクリーニングすることができる。大規模なハイブリドーマ増殖が生じたら、通常、１０〜１４日後に培地を観察することができる。抗体を分泌するハイブリドーマは、再播種し、再度スクリーニングすることができ、ヒトＩｇＧについて依然として陽性である場合、制限的な希釈により、少なくとも２回に亘ってモノクローナル抗体をサブクローニングすることができる。次いで、安定的なサブクローンをインビトロで培養して、組織培地中に少量の抗体を発生させ、特徴付けすることができる。ヒトモノクローナル抗体を精製するには、２リットル容量のスピナーフラスコ内で選択されたハイブリドーマを増殖させ、モノクローナル抗体を精製することができる。上清を濾過及び濃縮した後で、プロテインＡ−セファロース（Pharmacia社製、Piscataway, N.J.）によるアフィニティークロマトグラフィーを行うことができる。ゲル電気泳動及び高速液体クロマトグラフィーにより溶出したＩｇＧを検査して純度を確認することができる。緩衝液をＰＢＳに交換し、分光光度法により濃度を決定することができる。モノクローナル抗体をアリコートし、−８０℃で保存することができる。
本発明の抗体は、例えば、当技術分野で周知の組み換えＤＮＡ法及び遺伝子形質移入法の組合せを用いて、宿主細胞のトランスフェクトーマ内において作製することもできる（例えば、Morrison, S. (1985) Science 229:1202）。
【００７７】
例えば、抗体を発現させるには、標準的な分子生物学的技法（例えば、対象抗体を発現するハイブリドーマを用いるＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング）により、部分又は完全長の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを得ることができ、該遺伝子が転写及び翻訳の制御配列へと作用可能に連結され、該抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節する目的の機能を果たすことが可能であるように、該ＤＮＡを発現ベクター内に挿入することができる。
発現ベクター及び発現制御配列は、用いられる発現宿主細胞に適合するように選択される。抗体の軽鎖遺伝子及び抗体の重鎖遺伝子は、個別のベクターに挿入することもでき、より典型的には、両方の遺伝子を同じ発現ベクターに挿入することもできる。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子の断片及びベクター上における相補的な制限部位のライゲーション、又は制限部位が存在しない場合は、平滑末端のライゲーション）により発現ベクターに挿入することができる。ベクター内における１つ又は複数のＣＨセグメントにＶＨセグメントが作用可能に連結され、ベクター内におけるＣＬセグメントにＶＬセグメントが作用可能に連結されるように、本明細書で説明される抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を用いて、所望のアイソタイプの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を予めコードする発現ベクターにこれらを挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を作製することができる。またないし或いは、組み換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドもコードできる。シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端へとフレーム内で連結されるよう、抗体鎖遺伝子をベクター内にクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドでもありえ、異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質に由来するシグナルペプチド）でもありうる。
【００７８】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞内における抗体鎖遺伝子の発現を制御する制御配列を保有する。「制御配列」という用語は、抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。このような制御配列は、例えば、Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))において説明されている。
【００７９】
当業者であれば、制御配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどの因子に依存する場合があることを理解するであろう。哺乳動物の宿主細胞発現に好ましい制御配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、及びポリオーマウイルスに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーなど、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を導くウイルスエレメントを含む。代替的に、ユビキチンプロモーター又はｐ−グロビンプロモーターなど、ウイルス以外の制御配列も用いる場合がある。またさらに、調節エレメントは、ＳＶ４０初期プロモーターに由来する配列及びヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復配列を含有するＳＲａプロモーターシステム（Takebe, Y. et al., (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472）など、異なる供給源に由来する配列からもなる。抗体鎖遺伝子及び制御配列に加え、本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞内におけるベクターの複製（例えば、複製起点）を調節する配列、及び選択マーカー遺伝子など、さらなる配列を保有する場合がある。選択マーカー遺伝子は、その中にベクターが導入された宿主細胞の選択を容易とする（例えば、米国特許第４３９９２１６号、同第４６３４６６５号、及び同第５１７９０１７号を参照のこと）。例えば、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に対し、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、又はメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサートによる選択／増幅を伴うｄｈｆｒ宿主細胞において用いられる）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８による選択用）を含む。軽鎖及び重鎖を発現するには、標準的な技法により、重鎖及び軽鎖をコードする（１種又は複数種の）発現ベクターを、宿主細胞内に形質移入する。「形質移入」という用語の各種の形態は、外因性ＤＮＡを原核宿主細胞又は真核宿主細胞内へと導入するのに用いられることが通例である多種多様な技法、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラン形質移入などを包含する。本発明の抗体の発現は、原核宿主細胞又は真核宿主細胞のどちらにおいても理論的には可能であるが、真核細胞、また特に、哺乳動物細胞の方が、原核細胞よりも、適正に折りたたまれて免疫学的に活性な抗体を組み立てて分泌する可能性が高いので、このような真核細胞における抗体の発現、また哺乳動物細胞宿主細胞における抗体の発現が最も好ましい。抗体遺伝子の原核細胞による発現は、高収量の活性抗体の作製には有効でないことが報告されている（Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13）。
【００８０】
本発明の組み換え抗体を発現するのに好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）（例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621において説明されるＤＨＦＲ選択マーカーと共に用いられる、Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Nail. Acad. Sci. USA 77:4216-4220において説明されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、及びＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞と共に用いる場合、別の好ましい発現系は、国際公開第８７／０４４６２号、同第８９／０１０３６号、及びＥＰ３３８８４１において開示されるＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞内に導入する場合、該宿主細胞内における該抗体の発現、又はより好ましくは、その中で該宿主細胞が増殖する培地内への抗体の分泌を可能とするのに十分な時間に亘って宿主細胞を培養することにより、該抗体を作製する。標準的なタンパク質精製法を用いて、培地から抗体を回収することができる。
【００８１】
抗体の特徴付け
製造又は精製後、或いはスクリーニング又は選択手順の一部として、本発明の抗ヒトフィコリン−３抗体の機能的特徴を調査することができる。対象の機能的特性には、例えば、ヒトフィコリン−３に対する抗体結合特異性、抗体のヒトフィコリン−３リンガドとの競合、抗体の、標準抗体（例えば、本明細書中に記載の抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９）との競合、抗体が結合するエピトープ、抗体−抗原相互作用の親和性、及び抗体のアンタゴニスト／アゴニスト特性が含まれる。
以下に、抗体の特徴の例示的アッセイについて簡単に説明する。幾つかについては、後述のセクションで更に説明し、及び／又は実施例に記載する。
【００８２】
（１）モノクローナル抗体（又は、動物スクリーニング手順の一部としてのポリクローナル抗体を含む血清）がヒトフィコリン−３のそのリガンドへの結合を遮断することを確認することにより、ヒトフィコリン−３に特異的な抗体を評価することができる。露岩度の結合は、任意の好適な競合アッセイによって評価できる。
（２）Ｂｉａｃｏｒｅマシンで、on-rate及びoff-rateを含む抗体の親和性パラメータを決定することができる。例えば、ヒトフィコリン−３−Ｆｃタンパク質をチップ上に固定化し、抗体をチップに通してからon-rateとoff-rateとを決定し、ＫＤを計算する。
（３）ヒトフィコリン−３リガンド媒介性補体活性化を遮断する抗体の能力
【００８３】
本発明は、ヒトフィコリン−３に結合する抗体、並びに抗原結合断片及びそのイムノコンジュゲートを提供する。多岐に亘るアッセイのいずれかを使用して、ヒトフィコリン−３に対する抗体の結合を評価することができる。特にＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット、ＢＩＡＣＯＲＥ、及びその他競合アッセイに基づくプロトコールが使用に適しており、これらは従来技術に既知である。更に、競合アッセイを含む幾つかの結合アッセイを実施例に記載する。
例えば、単純な結合アッセイを使用することができる。このアッセイでは、標的タンパク質又はエピトープ（例えば、ヒトフィコリン−３又はその一部）の存在下で試験抗体をインキュベートし、結合しなかった抗体を洗浄して、例えば放射標識、質量分析のような物理的方法、或いは、例えば細胞蛍光測定法による分析（例えばＦＡＣＳｃａｎ）を用いて検出される直接的又は間接的蛍光標識を用いることにより、結合した抗体の存在を評価する。このような方法は当業者には周知である。対照である非特異的抗体に見られる量を上回る結合量は、抗体が標的に特異的に結合することを示すものである。
【００８４】
このようなアッセイでは、ヒトヒトフィコリン−３に対する試験抗体の結合能を、対照タンパク質、例えば構造的に関連性の無い抗原に対して産生させた抗体、或いは非Ｉｇペプチド又はタンパク質の、同じ標的に対する結合能と比較することができる。任意の適切なアッセイにより対照タンパク質と比較した場合に２５％、５０％、１００％、２００％、１０００％又はそれよも大きな親和性でヒトフィコリン−３に結合する抗体又は断片は、標的と「特異的に結合する」又は「特異的に相互作用する」と言われ、以下の治療方法に使用するのに適している。ヒトフィコリン−３に対する（ポジティブ）対照抗体、例えば、本明細書中に記載の抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９の、結合に作用する試験抗体の能力も評価することができる。
【００８５】
一態様では、本発明は、生物学的特徴及び／又は実質的なＶＨ及び／又はＶＬ配列同一性を本明細書中に記載の抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９と共有している抗ヒトフィコリン−３を提供する。ある例示的な生物学的特徴は、本明細書中に記載の抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９のエピトープ、すなわちＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及び／又はＦＣＮ３２９抗体が結合するヒトフィコリン−３の、細胞外ドメインの対応する領域への結合である。ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及び／又はＦＣＮ３２９のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、例えばAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載のような常法の交差ブロックアッセイを行うことができる。例示的な交差ブロックないし競合アッセイでは、ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及び／又はＦＣＮ３２９抗体と試験抗体は混合され(又は予め吸着され)、ヒトフィコリン−３を含む試料にアプライされる。特定の実施態様では、ヒトフィコリン−３含有試料にアプライする前の一定時間、対照抗体を様々な量の試験抗体(例えば１：１０又は１：１００)と混合してもよい。他の実施態様では、対照と様々な量の試験抗体は、抗原／標的試料への曝露の間に単に混合されてもよい。遊離した抗体と結合した抗体(例えば、分離法又は洗浄技術を用いて結合していない抗体を取り除くことによって)、そして、対照抗体と試験抗体(例えば、種-ないしはアイソタイプ-特異的な二次抗体を用いることによって、対照抗体を検出可能な標識にて特異的に標識することによって、又は、異なる化合物を区別するための質量分析のような物理的な方法を用いることによって)を区別することができる限りにおいて、試験抗体が抗原への対照抗体の結合を低減するかどうかを決定することができ、この場合に該試験抗体は対照と実質的に同じエピトープを認識することが示されるであろう。このアッセイにおいて、完全に無関係な抗体がある場合で(標識した)対照抗体が結合すると、対照値は高い。低い対照値は、標識した(ポジティブ)対照抗体を標識していない対照抗体とインキュベートし、このとき競合が生じて標識した抗体の結合が低減することによって得られる。
【００８６】
試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下で、標識した抗体の反応が有意に低減した場合、試験抗体が同じエピトープを認識する、すなわち標識した対照抗体と「交差反応する」ことを表す。およそ１：１０からおよそ１：１００の間の対照：試験抗体ないし化合物のいずれかの比率で、抗原／標的への標識した対照の結合を少なくとも５０％又はより好ましくは７０％低減する任意の試験抗体ないし化合物は、対照と実質的に同じエピトープないしは決定基に結合する抗体ないし化合物であると考えられる。好ましくは、このような試験抗体ないし化合物は、抗原／標的への対照の結合を少なくとも９０％低減するであろう。にもかかわらず、対照抗体ないし化合物の結合を測定可能な程度に低減する任意の化合物ないし抗体が、本発明で用いられてもよい。
機能アッセイ
インビトロにおける補体阻害アッセイの記述は、実施例に記載されている。
【００８７】
医薬製剤
一実施態様では、本発明は、一又は複数の担体とともに本明細書中に記載の抗ヒトフィコリン−３抗体を含有してなる医薬組成物又は製剤を提供する。
したがって、本発明の１の例示的態様は、前記の抗体を、１ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在しているものを含有する医薬製剤を提供することであり、該製剤は２．０〜１０．０のｐＨを有する。製剤は、緩衝系、保存料(類)、等張化剤(類)、キレート剤(類)、安定剤及び／又は界面活性剤を更に含有する。一実施態様では、医薬製剤は水性製剤、すなわち水分を含有する製剤である。このような製剤は典型的には溶液又は懸濁液である。本発明のさらなる実施態様では、医薬製剤は水溶液である。「水性製剤」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水分を含有している製剤として定義される。同様に、「水溶液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水分を含有している溶液として定義され、「水性懸濁液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水分を含有している懸濁液として定義される。
【００８８】
他の実施態様では、医薬製剤は凍結乾燥製剤であり、これに医師又は患者が投与前に溶剤及び／又は希釈液を添加することができる。
他の実施態様では、医薬製剤は、何ら事前溶解させることのない使用準備が整った乾燥製剤(例えば、凍結乾燥又は噴霧乾燥されたもの)である。
更なる態様では、医薬製剤は前記抗体の水溶液とバッファーを含み、該抗体は１ｍｇ／ｍｌ又はそれ以上の濃度で存在し、該製剤は約２．０〜約１０．０のｐＨを有する。
【００８９】
他の実施態様では、製剤のｐＨは、およそ２．０からおよそ１０．０、およそ３．０からおよそ９．０、およそ４．０からおよそ８．５、およそ５．０からおよそ８．０、及びおよそ５．５からおよそ７．５からなる列挙から選択される範囲である。
更なる実施態様では、製剤は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シトレート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン(bicine)、トリシン、リンゴ酸、スクシネート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸又はそれらの混合物から選択されるバッファーを含む。これらの特定のバッファーがそれぞれ別の態様を構成する。
【００９０】
更なる実施態様では、製剤は、更にないし或いは製薬的に許容可能な保存料を含有可能である。保存料は、例えばフェノール、ｏ-クレゾール、ｍ-クレゾール、ｐ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ-ヒドロキシ安息香酸プロピル、２-フェノキシエタノール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸ブチル、２-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びチオメロサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(chlorphenesine)(３ｐ-クロルフェノキシプロパン-１,２-ジオール)又はそれらの混合物からなる群から選択されうる。保存料は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ；０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ；５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ；又は１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在してよい。これらの特定の保存料の各一が、本発明の別の実施態様を構成する。製薬用組成物に保存料を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【００９１】
更なる実施態様では、製剤は、更にないし或いは等張化剤を含有しうる。等張化剤は、塩(例えば塩化ナトリウム)、糖又は糖アルコール、アミノ酸(例えば、Ｌ-グリシン、Ｌ-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン)、アルジトール(例えばグリセロール(グリセリン)、１,２-プロパンジオール(プロピレングリコール)、１,３-プロパンジオール、１,３-ブタンジオール)ポリエチレングリコール(例えばＰＥＧ４００)、又はそれらの混合物からなる群から選択してよい。任意の糖、例えば単糖類、二糖類又は多糖類、又は水溶性グルカン類、例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、及びカルボキシメチルセルロース-Ｎａを使用することができる。一実施態様では、糖添加剤はスクロースである。糖アルコールは、少なくとも１の-ＯＨ基を有するＣ４-Ｃ８炭化水素と定義され、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール(galactitol)、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールを含む。一実施態様では、糖アルコール添加剤はマンニトールである。上述した糖又は糖アルコールは、個々に又は組合せて使用されてよい。使用される量は、糖又は糖アルコールが液状調製物に溶解し、本発明の方法を使用して得られた安定化効果に悪影響を与えない限りは、固定された限界値があるものではない。糖又は糖アルコールの濃度は、例えば約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌである。等張化剤は１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ；１ｍｇ／ｍｌ〜７ｍｇ／ｍｌ；８ｍｇ／ｍｌ〜２４ｍｇ／ｍｌ；又は２５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在してよい。これらの特定の等張化剤の各一が本発明の別の実施態様を構成する。製薬用組成物に等張化剤を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【００９２】
更なる実施態様では、製剤は、更にないし或いはキレート剤も含有しうる。キレート剤は、例えばエチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、クエン酸、及びアスパラギン酸の塩、及びそれらの混合物から選択されうる。キレート剤は例えば０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ；０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ；又は２ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。これらの特定のキレート剤の各一が本発明の別の実施態様を構成する。製薬用組成物にキレート剤を使用することは当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【００９３】
本発明の更なる実施態様では、製剤は、更にないし或いは安定剤を含有しうる。製薬用組成物に安定剤を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。より具体的には、本発明の組成物は安定した液状製薬用組成物であり、その治療的活性化合物は、液状医薬製剤の保存中に、凝集体の形成を示す可能性のあるポリペプチドを含む。「凝集体形成」とは、オリゴマーを形成するポリペプチド分子間の物理的相互作用を意図しており、これは、可溶性か、又は溶液から沈殿する大きな可視できる凝集体として残る。「保存中」とは、液状製薬用組成物又は調製されて直ぐの製剤が、被験者に直ぐ投与されるものではないことを意図している。むしろ、調製後に、液状の形態、凍結状態、液状形態に後で再構成される乾燥した形態、又は被験者への投与に適した他の形態で、包装又は保存されている。「乾燥した形態」とは、液状製薬用組成物又は製剤が、フリーズドライ(すなわち凍結乾燥；例えばWilliams and Polli  et al., (1984)J. Parenteral Sci. Technol. 38：48-59を参照)、噴霧乾燥(Masters(1991) Spray-Drying Handbook(第5版；Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp.491-676；Broadhead et al., (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18：1169-1206；及びMumenthaler et al., (1994) Pharm. Res. 11：12-20)、又は空気乾燥(Carpenter及びCrowe (1988) Cryobiology 25：459-470；及びRoser (1991) Biopharm. 4：47-53)により乾燥されることを意図している。液状製薬用組成物の保存中におけるポリペプチドによる凝集体形成は、ポリペプチドの生物活性に悪影響を及ぼすおそれがあり、製薬用組成物の治療効果が損なわれる。更に凝集体形成は、例えばチューブ、膜、又はポリペプチド含有製薬用組成物が注入システムを使用して投与される場合はポンプの閉塞のような、他の問題を生じさせうる。
【００９４】
本発明の製薬用組成物は、更にないし或いは、組成物の保存中、ポリペプチドによる凝集体形成を低減させるのに十分な量のアミノ酸塩基を含有しうる。「アミノ酸塩基」とは、アミノ酸又はアミノ酸の組合せを意図しており、任意の与えられたアミノ酸が、その遊離塩基の形態又はその塩の形態のいずれかで存在している。アミノ酸の組合せを使用する場合、全てのアミノ酸が遊離塩基の形態で存在していてもよく、全てが塩の形態で存在していてもよく、又は幾つかが遊離塩基の形態で存在していてもよく、残りが塩の形態で存在していてもよい。一実施態様では、本発明の組成物の調製に使用されるアミノ酸は、帯電側鎖を担持しているもの、例えばアルギニン、リジン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸である。特定のアミノ酸(例えば、メチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン及びそれらの混合物)の任意の立体異性体(すなわち、Ｌ、Ｄ、又はそれらの混合物)、又はこれらの立体異性体の組合せが、該特定のアミノ酸が遊離塩基の形態又は塩の形態のいずれかで存在している限り、本発明の製薬用組成物中に存在していてもよい。一実施態様では、Ｌ-立体異性体が使用される。また本発明の組成物は、これらのアミノ酸の類似体と共に製剤化されてもよい。「アミノ酸類似体」とは、本発明の液状製薬用組成物の保存中に、ポリペプチドによる凝集体形成を低減させるという所望の効果をもたらす天然に生じるアミノ酸の誘導体を意図している。適切なアルギニン類似体は、例えばアミノグアニジン、オルニチン及びＮ-モノエチル-Ｌ-アルギニンを含み、適切なメチオニン類似体はエチオニン及びブチオニンを含み、適切なシステイン類似体はＳ-メチル-Ｌ-システインを含む。他のアミノ酸と同様、アミノ酸類似体は、遊離塩基の形態又は塩の形態のいずれかで組成物中に導入される。本発明の更なる実施態様では、アミノ酸又はアミノ酸類似体は、タンパク質の凝集を阻止し又は遅延化させるのに十分な濃度で使用される。
【００９５】
本発明の更なる実施態様では、メチオニン(又は他の硫黄含有アミノ酸又はアミノ酸類似体)は、治療剤として作用するポリペプチドが酸化を受けやすい少なくとも１のメチオニン残基を有するポリペプチドである場合、メチオニン残基のメチオニンスルホキシドへの酸化を阻害するために添加されうる。本明細書において「阻害する」という用語は、経時的なメチオニン酸化種の蓄積を最小にすることを意味している。メチオニン酸化を阻害すると、適切な分子形態でのポリペプチドの保持が更に高まる。メチオニン(Ｌ又はＤ)の任意の立体異性体又はそれらの任意の組合せを使用することができる。添加される量は、メチオニンスルホキシドの量が規制機関にとって許容可能であるような、メチオニン残基の酸化を阻害するのに十分な量とするべきである。典型的には、これは、組成物が約１０％〜約３０％を越えるメチオニンスルホキシドを含まないことを意味する。一般的に、これは、メチオニン残基に添加されるメチオニンの比率が、約１：１〜約１０００：１、例えば１０：１〜約１００：１の範囲になるようにメチオニンを添加することで、達成することができる。
【００９６】
更なる実施態様では、本発明の製剤は、更にないし或いは、高分子量ポリマー又は低分子量化合物の群から選択される安定剤を含有する。本発明の更なる実施態様では、安定剤は、ポリエチレングリコール(例えばＰＥＧ３３５０)、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリビニルピロリドン、カルボキシ-/ヒドロキシセルロース又はそれらの誘導体(例えばＨＰＣ、ＨＰＣ-ＳＬ、ＨＰＣ-Ｌ及びＨＰＭＣ)、シクロデキストリン類、硫黄含有物質、例えばモノチオグリセロール、チオグリコール酸及び２-メチルチオエタノール、及び異なった塩(例えば塩化ナトリウム)から選択される。これらの特定の安定剤の各一が本発明の別の実施態様を構成する。
【００９７】
製薬用組成物は、その中の治療的に活性なポリペプチドの安定性を更に高める、付加的な安定剤を、更にないし或いは含有しうる。本発明にとって特に関心のある安定剤は、限定されるものではないが、メチオニンの酸化に対してポリペプチドを保護するＥＤＴＡ及びメチオニン、及び凍結-解凍又は機械的剪断に関連する凝集からポリペプチドを保護する非イオン性界面活性剤を含む。更なる実施態様では、製剤は、更にないし或いは、界面活性剤を含有しうる。界面活性剤は、例えば、洗浄剤、エトキシル化ヒマシ油、ポリグリコール化グリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタンの脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンのブロックポリマー(例えばポロキサマー、例えばプルロニック(Pluronic)（登録商標）Ｆ６８、ポロキサマー１８８及び４０７、トリトンＸ-１００)、ポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン及びポリエチレンの誘導体、例えばアルキル化されアルコキシル化された誘導体(トゥイーン類(tweens)、例えばトゥイーン-２０、トゥイーン-４０、トゥイーン８０及びビリジ(Brij)-３５)、モノグリセリド類又はそのエトキシル化誘導体、ジグリセリド類又はそのポリオキシエチレン誘導体、アルコール、グリセロール、レシチン及びリン脂質(例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール及びスフィンゴミエリン)、リン脂質の誘導体(例えばホスファチジン酸ジパルミトイル)及びリゾリン脂質(例えばパルミトイル-リゾホスファチジル-Ｌ-セリン、及びエタノールアミン、コリン、セリン又はスレオニンの１-アシル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスファートエステル)、及びリゾホスファチジル及びホスファチジルコリンのアルキル、アルコキシル(アルキルエステル)、アルコキシ(アルキルエーテル)-誘導体、例えばリゾホスファチジルコリンのラウロイル及びミリストイル誘導体、ジパルミトイルホスファチジルコリン及び極性頭部基の修飾体、コリン類、エタノールアミン類、ホスファチジン酸、セリン類、スレオニン類、グリセロール、イノシトール、及び正に帯電したＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣＰ、ＢＩＳＨＯＰ、リゾホスファチジルセリン、及びリゾホスファチジルスレオニン、及びグリセロリン脂質(例えばセファリン類)、グリセロ糖脂質(例えばガラクトピラノシド)、スフィンゴ糖脂質(例えばセラミド類、ガングリオシド類)、ドデシルホスホコリン、鶏卵リゾレシチン、フシジン酸誘導体-(例えばタウロ-ジヒドロフジシン酸ナトリウムなど)、長鎖脂肪酸及びそれらのＣ６-Ｃ１２塩(例えばオレイン酸及びカプリル酸)、アシルカルニチン類及び誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンのＮα-アシル化誘導体、又はリジン又はアルギニンの側鎖アシル化誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンと中性又は酸性アミノ酸の任意の組合せを含有するジペプチドのＮα-アシル化誘導体、中性アミノ酸と２つの帯電したアミノ酸の任意の組合せを含有するトリペプチドのＮα-アシル化誘導体、ＤＳＳ(ドキュセートナトリウム、ＣＡＳ登録番号[５７７-１１-７])、ドキュセートカルシウム、ＣＡＳ登録番号[１２８-４９-４])、ドキュセートカリウム、Ｃ���Ｓ登録番号[７４９１-０９-０])、ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム又はラウリル硫酸ナトリウム)、カプリル酸ナトリウム、コール酸又はその誘導体、胆汁酸及びその塩、及びグリシン又はタウリンコンジュゲート、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、Ｎ-ヘキサデシル-Ｎ,Ｎ-ジメチル-３-アンモニオ-１-プロパンスルホナート、アニオン性(アルキル-アリール-スルホナート類)の一価の界面活性剤、双性イオン性界面活性剤(例えば、Ｎ-アルキル-Ｎ,Ｎ-ジメチルアンモニオ-１-プロパンスルホナート、３-コールアミド-１-プロピルジメチルアンモニオ-１-プロパンスルホナート、カチオン性界面活性剤(第４級アンモニウム塩基)(例えばセチル-トリメチルアンモニウムブロミド、セチルピリジニウムクロリド)、非イオン性界面活性剤(例えば、ドデシル-β-Ｄ-グルコピラノシド)、ポロキサミン類(例えばテトロニックス(Tetronic's))で、エチレンジアミンにプロピレンオキシド及びエチレンオキシドを逐次付加することにより誘導された四官能性ブロックコポリマーから選択され、又は界面活性剤は、イミダゾリン誘導体又はそれらの混合物の群から選択されてもよい。これらの特定の界面活性剤の各一が本発明の別の実施態様を構成する。
製薬用組成物に界面活性剤を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【００９８】
更なる実施態様では、製剤は、プロテアーゼインヒビター、例えばＥＤＴＡ(エチレンジアミン四酢酸)及びベンズアミジンＨＣｌを、更にないし或いは含有し、他の商業的に入手可能なプロテアーゼインヒビターを使用することもできる。プロテアーゼインヒビターを使用することは、自己触媒を阻害するため、プロテアーゼのチモーゲンを含有する製薬用組成物に特に有用である。
【００９９】
更にないし或いは他の成分が本発明のペプチド医薬製剤中に存在していてもよい。このような付加的な成分は、湿潤剤、乳化剤、酸化防止剤、増量剤、張力修正剤、キレート剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン又はタンパク質)及び双性イオン(例えばアミノ酸、特にベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジン及びヒスチジン)を含みうる。もちろん、このような付加的な成分は、本発明の医薬製剤の全体的な安定性に悪影響がないようにすべきである。本発明の一又は複数の抗体を含む製薬用組成物は、幾つかの部位、例えば局所的部位、特に皮膚及び粘膜部位、動脈、静脈、心臓への投与など、バイパス吸収がなされる部位、例えば皮膚、皮下、粘膜又は腹部への投与など、吸収に関連する部位において、このような処置が必要とされる患者に投与されうる。
【０１００】
本発明の製薬用組成物は、幾つかの投与経路、例えば、舌、舌下、頬、口、経口、胃、及び腸、鼻、肺を介して、例えば細気管支及び肺胞及び／又はそれらを組合せたもの、表皮、真皮、経皮、膣、直腸、眼球を介して、例えば結膜、尿管、及び非経口を介して、このような処置を必要としている患者に投与されうる。
【０１０１】
本発明の組成物は、幾つかの投与形態、例えば溶液、懸濁液、エマルション、マイクロエマルション、多相エマルション、フォーム、膏薬、ペースト、プラスター、軟膏、錠剤、被覆錠剤、リンス、カプセル、例えば硬質ゼラチンカプセル及び軟質ゼラチンカプセル、坐薬、直腸用カプセル、ドロップ、ゲル、スプレー、パウダー、エアゾール、吸入剤、点眼剤、眼球用軟膏、眼球用リンス、膣用ペッサリー、膣用リング、膣用軟膏、注入溶液、インサイツ形質転換溶液、例えばインサイツゲル化、インサイツセット用、インサイツ沈殿化、インサイツ結晶化のもの、注入液、及び移植片として投与されうる。本発明の組成物は、更に、抗体の安定性を更に高め、生物学的利用能を増加させ、溶解度を高め、副作用を低減させ、当業者によく知られている時間療法を達成し、患者のコンプライアンスを高め、又はそれらの任意の組合せのために、例えば共有的、疎水的及び静電気的相互作用を介して、薬剤担体、薬剤送達系、及び進化した薬剤送達系において配合し、又は付加させてもよい。担体、薬剤送達系及び進化した薬剤送達系の例は、限定されるものではないが、ポリマー、例えばセルロース及び誘導体、多糖類、例えばデキストラン及び誘導体、デンプン及び誘導体、ポリ(ビニルアルコール)、アクリラート及びメタクリラートポリマー、ポリ乳酸及びポリグリコール酸、及びそれらのブロックコ-ポリマー、ポリエチレングリコール、担体タンパク質、例えばアルブミン、ゲル、例えば熱ゲル化系、例えば当業者によく知られているブロックコポリマー系、ミセル、リポソーム、ミクロスフィア、ナノ粒子、液晶、及びそれらの分散液、Ｌ２相、及び脂質-水系における相挙動が当業者によく知られているそこでの分散液、ポリマー性ミセル、多相エマルション、自己乳化剤、自己-マイクロ乳化剤、シクロデキストリン及びそれらの誘導体、及びデンドリマーを含む。本発明の組成物は、全て当業者によく知られたデバイスである、定量吸入器、乾燥パウダー吸入器、及び噴霧器などを使用し、抗体を肺に投与するための、固形、半固形、パウダー及び溶液の製剤に有用である。
【０１０２】
本発明の組成物はまた、制御、徐放性、持続性、遅延性及び低速放出性の薬剤送達系の製剤に特に有用である。特に限定されるものではないが、組成物は、当業者によく知られている非経口用の制御放出性及び徐放性系(双方の系とも、投与の数が何倍も低下する)製剤に有用である。更に好ましいのは、皮下投与される制御放出性及び徐放性系のものである。本発明の範囲を限定することなく、有用な制御放出性及び組成物の例は、ヒドロゲル、油性ゲル、液晶、ポリマー性ミセル、ミクロスフィア、ナノ粒子である。
本発明の組成物に有用な制御放出性系の作製方法は、限定されるものではないが、結晶化、凝縮、共結晶化、沈殿、共沈殿、乳化、分散、高圧ホモジナイズ、カプセル化、噴霧乾燥、マイクロカプセル化、コアセルベーション、相分離、ミクロスフィアを製造するための溶媒蒸発、押出及び超臨界流体プロセスを含む。一般的には、Handbook of Pharmaceutical Controlled Release(Wise, D.L.編. Marcel Dekker, New York, 2000)及びDrug and the Pharmaceutical Sciences vol.99：Protein Formulation and Delivery(MacNally, E.J.編. Marcel Dekker, New York, 2000)を参照。
【０１０３】
非経口投与は、シリンジ、場合によってはペン様シリンジにより、皮下、筋肉内、腹膜内又は静脈内注射によって実施されうる。或いは、非経口投与は、注入ポンプにより実施することもできる。更なる選択肢は、鼻用又は肺用スプレーの形態で抗体化合物を投与するための溶液又は懸濁液であってよい組成物にある。更なる選択肢としては、本発明の抗体を含む製薬用組成物を、例えば針のない注射、又はイオン導入パッチであってよいパッチによる経皮投与用、又は頬などの経粘膜投与用に適合させることもできる。
抗体は、肺薬剤送達系に適した任意の既知のタイプのデバイスを使用し、ビヒクル、例えば溶液、懸濁液又は乾燥パウダーとして、肺経路を介して投与することができる。これらの例には、限定されるものではないが、肺薬剤送達用の３種類のエアゾール発生の一般的タイプが含まれ、ジェット又は超音波噴霧器、定量吸入器、又は乾燥パウダー吸入器が含まれうる(Yu J, Chien YW. Pulmonary drug delivery：Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4)(1997)395-453を参照)。
【０１０４】
標準化された試験法に基づき、粒子の空気動力学的直径(ｄａ)を、単位密度(１ｇ／ｃｍ3)の参照基準球形粒子の幾何学的相当直径として定義する。最も単純な場合、球形粒子に対して、ｄａは以下に記載されるような密度比の平方根の関数として、参照直径(ｄ)に関連している：
【０１０５】
この関係は非球形粒子に対しては修正される(Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385を参照)。「ＭＭＡＤ」及び「ＭＭＥＡＤ」という用語は、詳しく記載されており、当該分野で知られている(Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R、及び空気動力学的粒子径分布の中央値の測定値を表す。Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385を参照)。空気動力学的中央粒子径(ＭＭＡＤ)及び有効空気動力学的中央粒子径(ＭＭＥＡＤ)(mass median effective aerodynamic diameter)は、交換可能に使用され、統計パラメータであり、実際の形状、サイズ又は密度に無関係に、肺中に沈着するそれらの可能性に関連して、エアゾール粒子のサイズが経験的に記載されている(Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385を参照)。通常、ＭＭＡＤは、空気中における粒子の慣性挙動を測定する装置、衝突体を用いてなされる測定から算出される。
【０１０６】
更なる実施態様では、製剤は、１０μｍ、好ましくは１−５μｍ、最も好ましくは１−３μｍ未満のエアゾール粒子のＭＭＡＤを達成するために、任意の既知のエアゾール化技術、例えばネブライゼーションによりエアゾール化することができる。好ましい粒子径は、肺の奥深くまで薬剤を送達せしめるのに最も効果的なサイズに基づいており、タンパク質が最適に吸収されるようになされる (例えば、Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer A, Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385を参照)。
抗体を含有する肺用製剤を肺の奥深くに付着させることは、吸入技術、例えば限定されるものではないが：低吸入速度(例えば３０Ｌ／分)、呼吸停止及び作動のタイミングを修正して最適化されうる。「安定化された製剤」という用語は、物理的安定性が増した、化学的安定性が増した、又は物理的及び化学的安定性が増した製剤を意味する。
【０１０７】
本明細書中で使用される場合、タンパク質製剤の「物理的安定性」という用語は、抗体が熱-機械的ストレスに暴露され、及び／又は不安定な表面及び界面、例えば疎水性表面及び界面と相互作用する結果として、生物学的に不活性な及び／又は不溶性の凝集体を形成するという抗体の傾向を意味する。水性抗体製剤の物理的安定性は、適切な容器(例えばカートリッジ又はバイアル)に充填された製剤を、様々な時間、異なる温度で機械的／物理的ストレス(例えば攪拌)に暴露した後に、視覚検査及び／又は濁度測定することで評価される。製剤の視覚検査は、暗色背景で、鋭く集光されたライト下において実施される。製剤の濁度は、例えば０〜３のスケールで、濁りの程度をランク付けする視覚スコア(濁りのない製剤は視覚スコア０に相当し、日光下で視覚的に濁りのある製剤は視覚スコア３に相当する)により特徴付ける。製剤は、日光下で視覚的濁りを示す場合に、抗体会合に関して物理的に不安定であると分類される。また製剤の濁度は、当業者によく知られている簡単な濁度測定法により評価することもできる。また水性抗体製剤の物理的安定性は、抗体の構造状態のプローブ又は分光剤を使用して評価することもできる。プローブは、好ましくは抗体の非天然配座異性体に結合する小分子である。タンパク質構造の小分子分光プローブの一例はチオフラビンＴである。チオフラビンＴは、アミロイド原繊維の検出に広範囲に使用されている蛍光染料である。原繊維、おそらく他のタンパク質立体配置が存在すると、チオフラビンＴが約４５０ｎｍで新たな励起極大を引き起こし、原繊維タンパク質形態に結合した時に、約４８２ｎｍで増強発光する。未結合のチオフラビンＴは、本質的にはその波長で非蛍光性である。
【０１０８】
天然から非天然状態までのタンパク質構造における変化のプローブとして、他の小分子を使用することができる。例えば、タンパク質の暴露された疎水性パッチに優先的に結合する「疎水性パッチ」プローブである。疎水性パッチは、その天然状態にあるタンパク質の３次構造内に一般的に埋められているが、タンパク質の展開及び変性が始まると、暴露されるようになる。これらの小分子の例、分光プローブは、芳香族の疎水性染料、例えばアントラセン、アクリジン、フェナントロリンなどである。他の分光プローブは金属-アミノ酸錯体、例えば疎水性アミノ酸、例えばフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、及びバリンなどのコバルト金属錯体である。
【０１０９】
本明細書中で使用される場合、抗体製剤の「化学的安定性」という用語は、天然の抗体構造と比較して、免疫原性の潜在的増加及び／又は生物学的有効性の潜在的低下を伴う、化学的な分解産物の形成に至る抗体構造における化学的共有変化を意味する。種々の化学的な分解産物は、天然抗体の性質及び種類、及び抗体が暴露される環境に応じて形成されうる。化学的分解の排除は、多くの場合、完全に回避することはできず、当業者によく知られているように、抗体製剤の保存及び使用中に、化学的な分解産物の量の増加が見られる。殆どのタンパク質は、脱アミド化する傾向にあり、グルタミニル又はアスパラギニル残基の側鎖アミド基が加水分解されて、遊離カルボン酸を形成する。他の分解経路は高分子量の形質転換産物の形成に関与しており、２又はそれ以上のタンパク質分子は、アミド転移及び／又はジスルフィド相互作用を介して互いに共有結合し、共有結合した二量体、オリゴマー及びポリマーの分解産物の形成に至る(Stability of Protein Phramaceuticals, Ahern. T. J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992)。(例えばメチオニン残基の)酸化も、化学的分解の他の変形例として挙げることができる。抗体製剤の化学的安定性は、異なる環境条件に暴露させた後、種々の時点での化学的な分解産物の量を測定することにより評価することができる(分解産物の形成は、多くの場合、例えば温度上昇により促進される)。個々の分解産物の各々の量は、多くの場合、様々なクロマトグラフィー技術(例えばＳＥＣ-ＨＰＬＣ及び／又はＲＰ-ＨＰＬＣ)を使用し、分子サイズ及び／又は電荷に応じて、分解産物を分離することにより測定される。
【０１１０】
よって、上に概要を述べたように、「安定化された製剤」とは、物理的安定性が増加、化学的安定性が増加、又は物理的及び化学的安定性が増加した製剤を意味する。一般的に、製剤は、有効期限に到達するまで、使用及び保存中に(推奨される用途及び保存条件で)安定していなければならない。
【０１１１】
本発明の一実施態様では、抗体を含有する医薬製剤は、６週間以上の使用と、３年以上の保存に対して安定している。
本発明の他の実施態様では、抗体を含有する医薬製剤は、４週間以上の使用と、３年以上の保存に対して安定している。
本発明の更なる実施態様では、抗体を含有する医薬製剤は、４週間以上の使用と、２年以上の保存に対して安定している。
本発明の更なる実施態様では、該化合物を含有する製剤組成物は、２週間以上の使用と、２年以上の保存に対して安定している。
【０１１２】
適した抗体製剤は、他の既に開発されている治療用モノクローナル抗体の場合の経験を調べることによってまた決定できる。例えばリツキサン（リツキシマブ）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、ゾレア（オマリズマブ）、ベキサール（トシツモマブ）、キャンパス（アレムツズマブ）、ゼバリン、オンコリム、ヒュミラ及び類似の製剤のような数種のモノクローナル抗体が臨床現場で効果的なことが証明されており、同様の製剤を本発明の抗体について使用することができる。例えば、モノクローナル抗体は、塩化ナトリウム９．０ｍｇ／ｍＬ、クエン酸ナトリウム二水和物７．３５ｍｇ／ｍＬ、ポリソルベート８０が０．７ｍｇ／ｍＬ、及び注射用滅菌水中に静脈内投与用に処方された１００ｍｇ（１０ｍＬ）又は５００ｍｇ（５０ｍＬ）の使い捨てバイアルのいずれかで１０ｍｇ／ｍＬの濃度で提供されうる。ｐＨは６．５に調整される。あるいは、抗体は、ヒスチジン、スクロース、及びポリソルベート８０を含有する溶液中に処方することができる。
【０１１３】
診断用途
本発明のヒトフィコリン−３抗体は、非治療的用途も有している。例えば、抗ヒトフィコリン−３抗体は、例えば特定の細胞、組織、又は血清中の発現を検出する、ヒトフィコリン−３タンパク質の診断アッセイ、例えばインビトロでの診断アッセイなどにおいても有用である。例えば、抗ヒトフィコリン−３抗体を、抗ヒトフィコリン−３処置のための患者を選択するアッセイに使用することもできた。そのような目的のために、抗ヒトフィコリン−３抗体を使用して、血清又は組織標本中のヒトフィコリン−３の存在について分析するのに使用することができた。
【０１１４】
診断用の使用のために、一般的に抗体を検出可能な成分で標識するであろう。多くの標識が利用可能であり、通常、以下のカテゴリに分類することができる：
（ａ）ラジオアイソトープ、例えば35Ｓ、14Ｃ、125Ｉ、3Ｈ及び131Ｉ。抗体は例えばImmunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに記載される技術を用いて放射性同位体にて標識することができ、放射能はシンチレーション計測器を用いて測定することができる。
（ｂ）希有土類キレート（ユウロピウムキレート）又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ、フィコエリトリン及びテキサス赤のような蛍光性の標識が利用できる。蛍光標識は、例えば、上記のＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙのＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに開示される技術を用いて抗体にコンジュゲートすることができる。蛍光は、蛍光計を用いて定量化することができる。
【０１１５】
（ｃ）様々な酵素基質標識が利用可能であり、米国特許第４,２７５,１４９号にはこの概説がある。一般に、酵素は、様々な技術を用いて測定することができる色素生産性基質の化学変化を触媒する。例えば、酵素は、分光測光法で測定することができる基質の変色を触媒するかもしれない。或いは、酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変えうる。蛍光の変化を定量化する技術は上記の通りである。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起され、測定することができる（例えば化学発光計測器を用いて）か、又はエネルギーを蛍光受容基に与える光を発しうる。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４,７３７,４５６号）、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタルアジネジオン(dihydrophthalazinediones)、リンゴ酸酵素、ウレアーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環のオキシダーゼ（例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが含まれる。抗体に酵素をコンジュゲートする技術は、O'Sullivanら., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)に記載されている。
【０１１６】
酵素基質の組合せの例には、例えば以下のものが含まれる：（ｉ）基質として水素ペルオキシダーゼを有する西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、ここで水素ペルオキシダーゼが染料前駆（例えば、オルソフェニレン(orthophenylene)ジアミン（ＯＰＤ）又は3,3',5,5'テトラメチルのベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する；（ｉｉ）色素生産性基質としてリン酸パラグラフ-ニトロフェニルを有するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）；及び（ｉｉｉ）色素生産性基質（例えばｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ）又は蛍光発生基質４-メチルウンベリフェリル(methylumbelliferyl)-ｐ-β-ガラクトシダーゼを有するβ-Ｄ-ガラクトシダーゼ（β-Ｄ-Ｇａｌ）。
多数の他の酵素基質の組合せは当業者にとって利用可能である。これらの一般的な概要については、米国特許第４２７５１４９号及び４３１８９８０を参照。
【０１１７】
標識は、抗体と間接的にコンジュゲートされることがある。これを行うための様々な技術は当分野の技術者に公知である。例えば、抗体は、ビオチンとコンジュゲートさせることができ、前述した大きな３つの分類のうちのいずれかはアビジンとコンジュゲートさせることができ、その逆もまた可能である。ビオチンは選択的にアビジンと結合し、したがって、標識はこの間接的な方法で抗体にコンジュゲートさせることができる。或いは、抗体と標識を間接的にコンジュゲートさせるために、抗体は小ハプテン（例えばジゴキシン）とコンジュゲートさせ、前述した標識の異なるタイプのうちの１つは抗ハプテン抗体（例えば抗ジゴキシン抗体）とコンジュゲートさせる。したがって、抗体と標識は間接的にコンジュゲートすることができる。本発明の他の実施態様において、抗ヒトフィコリン−３抗体は標識する必要がなく、その存在をヒトフィコリン−３抗体と結合する標識した二次抗体を用いて検出することができる。
本発明の抗体は、任意の公知のアッセイ方法、例えば競合結合アッセイ、直接的及び間接的なサンドイッチアッセイ及び免疫沈降アッセイに用いられうる。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987)。
免疫組織化学において、組織サンプルは新鮮なものでも、凍結されたものでも、パラフィン包埋されていても、防腐剤、例えばホルマリンなどで固定されていてもよい。
【０１１８】
また、抗体はインビボ診断用アッセイにも使用されてよい。一般に、抗体は、例えば核磁気共鳴法ないしは当分野で公知の他の方法によって検出可能な放射性核種ないしは非放射性活性の指標にて標識される。好ましくは、標識は、例えば125Ｉ、131Ｉ、67Ｃｕ、99mＴｃ又は111Ｉｎなどの放射性標識である。標識された抗体は、好ましくは血流を介して宿主に投与され、宿主中の標識した抗体の存在や位置がアッセイされる。腫瘍の検出、ステージ分類及び処置には画像技術が好適に用いられる。放射性同位体は、金属キレート化合物ないしはラクトペルオキシダーゼ、又はヨウ素化のためのｉｏｄｏｇｅｎ技術を含む任意の手段によってタンパク質にコンジュゲートされる。
【０１１９】
便宜上、本発明の抗体は、キット、すなわち診断検査法を実行するための指示書とともに予め定められた総計でパッケージされ組み合わされた試薬で提供することができる。抗体を酵素で標識する場合、キットには、基質と、酵素に必要な補助因子（例えば検出可能な発色基又は蛍光体を提供する基質前駆）が含まれるであろう。加えて、安定剤、緩衝液（例えばブロックバッファー又は溶解緩衝液）などの他の添加物が含まれうる。様々な試薬の相対量は、実質的にアッセイの感受性を最適化する試薬の溶液濃度が得られるように、広範囲に変化していてもよい。特に、溶解して好適な濃度の試薬溶液が得られる賦形剤を含む乾燥粉末、通常は凍結乾燥として試薬が提供されうる。
【０１２０】
治療用途
本明細書で説明されるヒト抗ヒトフィコリン−３抗体又はヒト化抗ヒトフィコリン−３抗体を用いて患者を処置する方法も、本発明により提供される。一実施態様において、本発明は、ヒト患者に対して投与される医薬組成物の調製に、本明細書で説明されるヒト抗体又はヒト化抗体の使用を提供する。典型的に、患者は、炎症、アポトーシス、及び／又は自己免疫に関連した徴候に罹患しているか、又は罹患する危険を有している。
従って、一部の実施形態において、本発明による抗ヒトフィコリン−３抗体は、炎症、アポトーシス及び/又は自己免疫と関連した任意の徴候を処置するためのものである。
【０１２１】
一部の実施形態において、本発明による抗ヒトフィコリン−３抗体は、例えばアジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、クローン病、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、原発性胆汁性肝硬変、関節リウマチ及びぶどう膜炎、喘息、粥状動脈硬化、1型糖尿病、乾癬、様々なアレルギーなどの任意の自己免疫症状を処置するためのものである。
【０１２２】
一部の実施形態において、本発明による抗ヒトフィコリン−３抗体は、子癇前症、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎、虚血性大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、食道通過障害、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ウィップル病、アレルギー、免疫複合体病、臓器虚血、再灌流傷害、臓器壊死、枯草熱、敗血症（sepsis）、敗血症（septicemia）、エンドトキシンショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、腟炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺気腫、鼻炎、間質性肺炎、塵肺症（pneumotransmicroscopicsilicovolcanoconiosis）、肺胞炎（alvealitis）、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス感染症、ＨＩＶ感染症、Ｂ型肝炎ウイルス感染症、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、単包虫症、熱傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日光皮膚炎、じん麻疹、疣贅、膨疹、血管炎（ｖａｓｕｌｉｔｉｓ）、血管炎、心内膜炎、動脈炎、粥状動脈硬化、血栓性静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、アルツハイマー病、セリアック病、うっ血性心不全、成人呼吸促迫症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、大脳梗塞、脳塞栓症、ギラン・バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ぶどう膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、関節リウマチ、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、糸球体腎炎、ベーチェット病、同種移植片拒絶、移植片対宿主病、１型糖尿病、強直性脊椎炎，ベルジェ病、ライター症候群及びホジキン病、角膜炎、２型糖尿病、嚢胞性線維症、心筋梗塞、再灌流傷害、脳卒中、皮膚筋炎、メタボリックシンドローム、全身性炎症反応症候群、敗血症、複合臓器不全、播種性血管内凝固症候群、アナフィラキシーショック、１型及び／又は２型糖尿病と関連した血管合併症及び腎症、髄膜炎、細菌性敗血症、重症マラリア、非典型的溶血性尿毒症症候群、溶血性尿毒症症候群、加齢黄斑変性、発作性夜間血色素尿症、ヘビ毒咬傷、火傷、糖尿病性腎症などの腎症、及び臓器移植への合併症から成る群から選択される任意の炎症性障害又は病状を処置するためのものである。
【０１２３】
一部の実施形態において、本発明による抗ヒトフィコリン−３抗体は、臓器虚血、再灌流傷害、臓器壊死、血管炎、心内膜炎、粥状動脈硬化、血栓性静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、うっ血性心不全、慢性心不全、子癇前症、成人呼吸促迫症候群、大脳梗塞、脳塞栓症、１型及び／又は２型糖尿病と関連した血管合併症及び腎症から成る群から選択される任意の炎症性障害を処置するためのものである。
【０１２４】
一部の実施形態において、本発明による抗ヒトフィコリン−３抗体は、凝固、血栓性又は凝固障害関連疾患と関連した任意の徴候を処置するためのものである。
一部の実施形態において、本発明による抗ヒトフィコリン−３抗体は、胚細胞又は遺伝子標的細胞の移植に使用される。一部の実施形態において、本発明による抗ヒトフィコリン−３抗体は、あらゆるタイプの臓器又は細胞移植に使用される。
【０１２５】
一部の実施形態において、本発明による抗ヒトフィコリン−３抗体は、凝固、血栓又は凝固障害関連疾患、炎症反応を含めた血栓又は凝固障害関連疾患又は障害、及び血管障害、例えば血栓症などを含めたフィブリン形成に関連した慢性血栓梗塞性疾患又は障害に関連したあらゆる徴候、例えば深部静脈血栓症、動脈血栓症、術後血栓症、冠動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）、経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）、血小板沈着性脳卒中、腫瘍増殖、腫瘍転移、血管新生、血栓溶解、粥状動脈硬化、再狭窄、例えば動脈硬化症及び／又は血管形成術後の再狭窄など、急性及び慢性徴候、例えば炎症など、敗血症、敗血症性ショック、敗血症、低血圧症、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、播種性血管内凝固障害（ＤＩＣ）、肺塞栓症、病的血小板沈着、心筋梗塞と関連した徴候の処置、又は血栓症のリスクのある動脈硬化血管、末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ）移植後の静脈閉塞性疾患、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、及び血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）及びリウマチ熱を有する哺乳類を処置するためのものである。
【０１２６】
一部の実施形態において、本発明による抗ヒトフィコリン−３抗体は、例えば手術を受けている又はうっ血性心不全に罹患する患者などの特定のハイリスク患者における血栓塞栓性合併症の発生を予防するためのものである。
【０１２７】
一部の実施形態において、本発明による抗ヒトフィコリン−３抗体は、心臓と関連した病状を処置するためのものである。
一部の実施形態において、本発明による抗ヒトフィコリン−３抗体は、補体活性化に関係するポリペプチドの量の不足若しくは多さ又はレベル異常に関連している病状を処置するためのものである。
【０１２８】
用量
抗体を投与する場合、用量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／宿主体重ｋｇ、さらに一般的には０．０１〜５ｍｇ／宿主体重ｋｇの範囲である。例えば、用量は、約０．３ｍｇ／体重ｋｇ、約１ｍｇ／体重ｋｇ、約３ｍｇ／体重ｋｇ、約５ｍｇ／体重ｋｇ、もしくは約１０ｍｇ／体重ｋｇ、又は１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内でありうる。例示的な処置の投与計画では、毎週２回、毎週１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、１カ月ごとに１回、３カ月ごとに１回、又は３〜６カ月ごとに１回の投与を課す。本発明の抗ヒトフィコリン−３抗体に好ましい投与計画は、静脈内投与又は皮下注射による約１、３、又は１０ｍｇ／体重ｋｇを含め、該抗体は、以下の投与スケジュール：（ｉ）１〜３週間ごと２〜４回にわたる初期投与、次いで、２カ月ごと；（ｉｉ）４週間ごと；（ｉｉｉ）毎週、又は他の任意の最適な投与のうちの１つを用いて施される。一部の方法では、異なる結合特異性を伴う２種以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、この場合、投与される各抗体の用量は、表示された範囲内に収まる。抗体は通常、複数回投与される。各回の投与間の間隔は、例えば、毎週、毎月、３カ月ごと、又は毎年とすることができる。間隔は、患者における標的抗原に対する抗体の血中レベルを測定することにより表示されるように、不規則でもよい。一部の方法では、用量が、約１〜１０００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を実現するように調整され、また一部の方法では、約２５〜３００μｇ／ｍｌに調整される。代替的に、抗体は、持続放出製剤として投与することもでき、この場合、必要とされる頻度は低下する。用量及び頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。一般に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、これに、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び非ヒト抗体が続く。投与の用量及び頻度は、処置が予防的であるか、又は非予防的（例えば、緩和的又は治癒的）であるかに応じて変化しうる。予防的適用の場合、長期間にわたり、比較的低頻度の間隔で比較的低い用量が投与される。一部の患者は、彼らの残りの生涯にわたって処置を受け続ける。緩和的又は治癒的な適用の場合、疾患の進行が軽減されるか又は終結するまで、好ましくは、患者が、疾患症候の部分的又は完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い用量が必要とされることもある。その後、患者には、予防的投与計画を行うことができる。
【０１２９】
製品
本発明の別の実施態様では、上記で説明した障害の処置に有用な物質を含有する製品が提供される。例えば、該製品は、ヒトにおける自己免疫性又は炎症性の疾患又は障害などの障害を、有効量の抗体により処置するように指示する指示書と共に、本明細書で説明されるヒト抗ヒトフィコリン−３抗体又はヒト化抗ヒトフィコリン−３抗体を含有する容器を含みうる。典型的に、該製品は、容器と、該容器上の又は容器に添付されるラベル又は添付文書とを含む。好適な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどを含む。該容器は、ガラス又はプラスチックなど、各種の材料により形成可能である。該容器は、病状を処置するのに有効な組成物を保持し、無菌のアクセスポート（例えば、該容器は、皮下注射針により穿刺可能な栓を有する静脈内溶液用のバッグ又はバイアルの場合もある）。組成物中における少なくとも１種の活性薬剤は、本明細書のヒト抗ヒトフィコリン−３抗体もしくはヒト化抗ヒトフィコリン−３抗体、又はこのような抗体を含む抗原結合断片もしくは抗体誘導体（例えば、免疫コンジュゲート）である。ラベル又は添付文書は、該組成物が、例えば、炎症、アポトーシス、及び／又は自己免疫に関連した徴候など、選択された病状を処置するのに用いられることを表示する。
さらに、該製品は、（ａ）本明細書のヒト抗体又はヒト化抗体を含む組成物をその中に含有する第１の容器と、（ｂ）該ヒト抗体又は該ヒト化抗体以外の治療剤を含む組成物をその中に含有する第２の容器とを含む場合がある。本発明のこの実施態様における製品は、該第１及び第２の組成物を組み合わせて用いて、自己免疫性又は炎症性の疾患又は障害を処置可能であることを表示する添付文書をさらに含む場合がある。このような治療剤は、前出の節で説明した補助療法のうちのいずれかでありうる。またないし或いは、該製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩液、リンゲル液、及びデキストロース液など、医薬に許容される緩衝液を収容する第２（又は第３）の容器をさらに含む場合がある。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、及びシリンジを含む、商品としての観点及び使用者の観点から望ましい他の材料もさらに含む場合がある。
【０１３０】
配列番号ｌ：ヒトフィコリン−３（アイソフォーム１に関する完全な２９９個のアミノ酸配列、下線を引いた配列はアイソフォーム２に関する２８８個のアミノ酸配列では欠けている）：
【０１３１】
【化１】
2014520765.tif 000003
【０１３２】
配列番号２：ヒトフィコリン−３（アイソフォーム２に関する完全な２８８個のアミノ酸配列）：
【０１３３】
【化２】
2014520765.tif 000004
【０１３４】
配列番号３：ホモサピエンス（Homo sapiens）の博多抗原に関するｍＲＮＡ、完全なｃｄｓ
【０１３５】
【化３】
2014520765.tif 000005
【０１３６】
本発明の特定の実施形態
一部の特定の実施形態において、本発明による抗体又は抗原結合断片は、フィコリン−３内のエピトープに結合するが、そのエピトープは、ヒトフィコリン−３内の１６６Ｅ位におけるアミノ酸を含むエピトープなど、天然のリガンド結合に直接関係していない。
一部の特定の実施形態において、本発明による抗体又は抗原結合断片は、例えばＳ１ドメイン内などの、天然のリガンド結合に直接関連しているドメイン内に結合する。
一部の特定の実施形態において、本発明による抗体又は抗原結合断片は、ヒトフィコリン−３に結合すると、フィコリン−３が天然リガンドに結合する能力を６０％〜９０％低減する抗体である。
【０１３７】
一部の特定の実施形態において、本発明による抗体又は抗原結合断片は、ヒトフィコリン−３に結合すると、補体因子Ｃ４の沈着を６０％〜９０％低減する抗体である。
一部の特定の実施形態において、本発明による抗体又は抗原結合断片は、ｒフィコリン−３のアセチル化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）への結合を阻害する抗体である。
一部の特定の実施形態において、本発明による抗体又は抗原結合断片は、アセチル化ＢＳＡ上のＣ４、Ｃ３及び／又はＴＣＣ沈着によって計測した場合に、補体活性化を阻害する抗体である。
【０１３８】
一部の特定の実施形態において、本発明による抗体又は抗原結合断片は、本明細書中に記載したＢｉｏｃｏｒｅアッセイで測定した場合に、１０ｎＭ以下、例えば５ｎＭ以下、例えば２ｎＭ以下など、例えば１ｎＭ以下のＫＤでヒトフィコリン−３に結合する抗体である。
【０１３９】
一部の特定の実施形態において、本発明による抗体又は抗原結合断片は、ヒトフィコリン−３に結合する際に標準抗体と競合する抗体であり、ここで、該標準抗体は：
抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９のいずれか１つの配列に相当する配列を含んでいる重鎖可変領域と、抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９のいずれか１つの配列に相当する配列を含んでいる軽鎖可変領域を含み、各クローンＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、又はＦＣＮ３２９を参照番号：Ｑ９１９０として寄託した。
【０１４０】
ＨＰＡＣＣへのハイブリドーマ細胞の寄託（参照番号：Ｑ９１９０）：
ＰＧ−ＨＹＢ−３０８のバイアル１２本、ＰＧ−ＨＹＢ−３２９のバイアル１２本、ＰＧ−ＨＹＢ−３３４のバイアル１２本、及び試験用培養培地３ｘ１００ｍｌを含めてハイブリドーマ細胞は以下を、Health Protection Agency Culture Collections（HPACC）、Microbiology Services Division, Porton Down, Salisbury Wiltshire SP4 0JG, UKに寄託した、参照番号：Ｑ９１９０：
【０１４１】
【表１】
2014520765.tif 000006
【０１４２】
一部の特定の実施形態において、本発明による抗体又は抗原結合断片は、ヒトフィコリン−３に結合する際に、抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９と競合する抗体であり、各クローンＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、又はＦＣＮ３２９を参照番号：Ｑ９１９０として寄託した。
一部の特定の実施形態において、本発明による抗体又は抗原結合断片は、ヒト抗体の軽鎖、重鎖、又は軽鎖及び重鎖両方の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでいる。
一部の特定の実施形態において、本発明による抗体又は抗原結合断片は、ヒトのものであるか、又はヒト化されている。
【０１４３】
一部の特定の実施形態において、本発明による抗体又は抗原結合断片は、例えばＩｇＧ４抗体などの完全長の抗体である。
一部の特定の実施形態において、本発明による抗体又は抗原結合断片は、抗体断片であるか、又は一本鎖抗体、例えば一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）などである。
一部の特定の実施形態において、本発明による抗体又は抗原結合断片は、別の部分、例えば細胞傷害性部分など、放射性同位元素又は薬物に結合されている。
【０１４４】
一部の特定の実施形態において、本発明による抗体又は抗原結合断片は、配列番号１の１６６Ｅ、２３７Ｄ、２３９Ｄ、２４１、２４３、２５８Ｃ、２５９Ｙ、２７７Ｙ、２８７Ｖから選択される位置のアミノ酸、又はそれらの任意の組み合わせを含むエピトープに結合する。
一部の特定の実施形態において、本発明による抗体又は抗原結合断片は、参照番号：Ｑ９１９０として寄託された抗体から選択されるいずれか１つの抗体のヒトフィコリン−３への結合を拮抗阻害する。
【０１４５】
一部の特定の実施形態において、本発明による抗体又は抗原結合断片は、静脈内注入によってヒト患者に投与されたとき、０．００５ｇ／ｋｇ未満の用量で完全な補体阻害を提供する抗体である。
一部の特定の実施形態において、本発明による抗体又は抗原結合断片は、静脈内注入によってヒト患者に投与されたとき、０．００２ｇ／ｋｇ未満の用量で治療効果を提供する抗体である。
更なる態様において、本発明は、それを必要としている対象の補体活性化の阻害方法であって、本発明による抗体又は抗原結合断片をそれを必要としているヒト対象者に投与することを含む阻害方法に関する。
【０１４６】
一部の特定の実施形態において、対象は、例えば、アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、クローン病、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、原発性胆汁性肝硬変、関節リウマチ及びぶどう膜炎、喘息、粥状動脈硬化、1型糖尿病、乾癬、様々なアレルギーなどの病状から選択される徴候又は病状に罹患しているか、又は罹患する危険を有している。
【０１４７】
一部の特定の実施形態において、対象は、子癇前症、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎、虚血性大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、食道通過障害、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ウィップル病、アレルギー、免疫複合体病、臓器虚血、再灌流傷害、臓器壊死、枯草熱、敗血症（sepsis）、敗血症（septicemia）、エンドトキシンショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、腟炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺気腫、鼻炎、間質性肺炎、塵肺症（pneumotransmicroscopicsilicovolcanoconiosis）、肺胞炎（alvealitis）、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス感染症、ＨＩＶ感染症、Ｂ型肝炎ウイルス感染症、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、単包虫症、熱傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日光皮膚炎、じん麻疹、疣贅、膨疹、血管炎（ｖａｓｕｌｉｔｉｓ）、血管炎、心内膜炎、動脈炎、粥状動脈硬化、血栓性静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、アルツハイマー病、セリアック病、うっ血性心不全、成人呼吸促迫症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、大脳梗塞、脳塞栓症、ギラン・バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ぶどう膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、関節リウマチ、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット病、同種移植片拒絶、移植片対宿主病、１型糖尿病、強直性脊椎炎，ベルジェ病、ライター症候群及びホジキン病、角膜炎、２型糖尿病、嚢胞性線維症、心筋梗塞、再灌流傷害、脳卒中、皮膚筋炎、メタボリックシンドローム、全身性炎症反応症候群、敗血症、複合臓器不全、播種性血管内凝固症候群、アナフィラキシーショック、１型及び／又は２型糖尿病と関連した血管合併症及び腎症、髄膜炎、細菌性敗血症、重症マラリア、非典型的溶血性尿毒症症候群、溶血性尿毒症症候群、加齢黄斑変性、発作性夜間血色素尿症、ヘビ毒咬傷、火傷、糖尿病性腎症などの腎症、及び臓器移植への合併症から成る群から選択される徴候又は病状に罹患しているか、又は罹患する危険を有している。
【０１４８】
一部の特定の実施形態において、対象は、臓器虚血、再灌流傷害、臓器壊死、血管炎、心内膜炎、粥状動脈硬化、血栓性静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、うっ血性心不全、成人呼吸促迫症候群、大脳梗塞、脳塞栓症、１型及び／又は２型糖尿病と関連した血管合併症及び腎症から成る群から選択される徴候又は病状に罹患しているか、又は罹患する危険を有している。
【０１４９】
一部の特定の実施形態において、対象は、凝固、血栓又は凝固障害関連疾患、炎症反応を含めた血栓又は凝固障害関連疾患又は障害、及び血管障害、例えば血栓症などを含めたフィブリン形成に関連した慢性血栓梗塞性疾患又は障害に関連したあらゆる徴候、例えば深部静脈血栓症、動脈血栓症、術後血栓症、冠動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）、経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）、血小板沈着性脳卒中、腫瘍増殖、腫瘍転移、血管新生、血栓溶解、粥状動脈硬化、再狭窄、例えば動脈硬化症及び／又は血管形成術後の再狭窄など、急性及び慢性徴候、例えば炎症など、敗血症、敗血症性ショック、敗血症、低血圧症、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、播種性血管内凝固障害（ＤＩＣ）、肺塞栓症、病的血小板沈着、心筋梗塞と関連した徴候の処置、又は血栓症のリスクのある動脈硬化血管、末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ）移植後の静脈閉塞性疾患、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、及び血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）及びリウマチ熱から選択される徴候又は病状に罹患しているか、又は罹患する危険を有している。
【０１５０】
一部の特定の実施形態において、それを必要としている対象における補体活性化の阻害方法は、手術を受けている又はうっ血性心不全に罹患している患者などの特定のハイリスク患者の血栓塞栓性合併症の発生を予防するためのものである。
一部の特定の実施形態において、それを必要としている対象における補体活性化の阻害方法は、心臓に関連した病状を処置するためのものである。
【０１５１】
一部の特定の実施形態において、それを必要としている対象における補体活性化の阻害方法は、血液学的癌などの癌を処置するためのものである。
一部の特定の実施形態において、それを必要としている対象における補体活性化の阻害方法は、例えばフィコリン−３などの補体活性化に関連しているポリペプチドの量の不足若しくは多さ、又はにレベル異常に関連する病状を処置するためのものである。
【０１５２】
番号を付けた本発明の実施形態：
実施形態１．ヒトフィコリン−３への特異的な結合を示し、且つ、ヒト体液中において補体活性化を阻害する単離された遺伝子組み換えヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
実施形態２．フィコリン−３内の１６６Ｅ位のアミノ酸を含むエピトープなどの、天然のリガンド結合に直接関係しないヒトフィコリン−３内のエピトープに結合する、実施形態１に記載の抗体又は抗原結合断片。
【０１５３】
実施形態３．Ｓ１ドメイン内など、天然のリガンド結合に直接関係しているドメイン内に結合する、実施形態１又は２のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
実施形態４．ヒトフィコリン−３に結合すると、フィコリン−３が天然リガンドに結合する能力を６０％〜９０％低減する、実施形態１〜３のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
実施形態５．ヒトフィコリン−３に結合すると、補体因子Ｃ４の沈着を６０％〜９０％低減する、実施形態１〜４のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
【０１５４】
実施形態６．ｒフィコリン−３のアセチル化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）への結合を阻害する、実施形態１〜５のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
実施形態７．アセチル化ＢＳＡ上のＣ４、Ｃ３、及び／又はＴＣＣ沈着によって計測した場合に、補体活性化を阻害する、実施形態１〜６のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
【０１５５】
実施形態８．本明細書中に記載したＢｉｏｃｏｒｅアッセイで測定した場合に、１０ｎＭ以下、例えば５ｎＭ以下、例えば２ｎＭ以下など、例えば１ｎＭ以下のＫＤでヒトフィコリン−３に結合する、実施形態１〜７のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
実施形態９．ヒトフィコリン−３に結合する際に標準抗体と競合する、実施形態１〜８のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片であり、ここで、該標準抗体は：
抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９のいずれか１つの配列に相当する配列を含んでいる重鎖可変領域と、抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９のいずれか１つの配列に相当する配列を含んでいる軽鎖可変領域を含み、各クローンＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、又はＦＣＮ３２９を参照番号：Ｑ９１９０として寄託した。
【０１５６】
実施形態１０．ヒトフィコリン−３に結合する際に、抗フィコリン−３抗体ＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、及びＦＣＮ３２９と競合する、実施形態１〜９のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片であり、各クローンＦＣＮ３０８、ＦＣＮ３３４、又はＦＣＮ３２９を参照番号：Ｑ９１９０として寄託した。
実施形態１１．ヒト抗体の軽鎖、重鎖、又は軽鎖及び重鎖両方の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含む、実施形態１〜１０のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
実施形態１２．ヒトのものであるか、又はヒト化されている、実施形態１〜１１のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
【０１５７】
実施形態１３．ＩｇＧ４抗体などの完全長の抗体である、実施形態１〜１２のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
実施形態１４．抗体断片であるか、又は一本鎖抗体、例えば一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）などである、実施形態１〜１３のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
実施形態１５．別の部分、例えば細胞傷害性部分など、放射性同位元素又は薬物に結合されている、実施形態１〜１４のいずれか１項に記載の抗体抗原結合断片。
【０１５８】
実施形態１６．配列番号１の１６６Ｅ、２３７Ｄ、２３９Ｄ、２４１、２４３、２５８Ｃ、２５９Ｙ、２７７Ｙ、２８７Ｖから選択される位置のアミノ酸、又はそれらの任意の組み合わせを含むエピトープに結合する、実施形態１〜１５のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
実施形態１７．仮受託番号１１０６２４０１、１１０６２４０２、又は１１０６２４０３としてＨＰＡＣＣに受託された、ヒトフィコリン−３に対する抗体から選択されるいずれか１種類の抗体の結合を拮抗阻害する、実施形態１〜１６のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
実施形態１８．静脈内注入によってヒト患者に投与されたとき、０．００５ｇ／ｋｇ未満の用量で完全な補体阻害を提供する、実施形態１〜１７のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
実施形態１９．静脈内注入によってヒト患者に投与されたとき、０．００２ｇ／ｋｇ未満の用量で治療効果を提供する、実施形態１〜１８のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片。
【０１５９】
実施形態２０．実施形態１〜１９のいずれか１項に記載の抗体を含む組成物。
実施形態２１．実施形態１〜１９のいずれか１項に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
実施形態２２．実施形態１〜１９のいずれか１項に記載の抗体を産生する組み換え真核又は原核宿主細胞。
【０１６０】
実施形態２３．実施形態１〜１９のいずれか１項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
実施形態２４．実施形態１〜１９のいずれか１項に記載の抗フィコリン−３抗体又はその抗原結合断片の製造方法であって、前記抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、好適な条件下で培養し、そして、前記抗体又はその抗原結合断片を回収することを含む製造方法。
実施形態２５．その天然リガンドに対するフィコリン−３の認識の阻害のための、実施形態１〜１９のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片、或いは他のフィコリン−３阻害剤の使用。
【０１６１】
実施形態２６．フィコリン−３天然リガンド認識に関連する徴候又は病状、例えば炎症、凝固、アポトーシス、及び／又は自己免疫に関連する徴候などの治療方法であって、実施形態１〜１９のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片、或いは他のフィコリン−３阻害剤を、そうした徴候又は病状に罹患しているか、又は罹患する危険があるヒト対象者に投与することを含む処置方法。
実施形態２７．それを必要としている対象の補体活性化の阻害方法であって、実施形態１〜１９のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片、或いは他のフィコリン−３阻害剤を、それを必要としているヒト対象者に投与することを含む阻害方法。
【０１６２】
実施形態２８．前記対象が、例えば、アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、クローン病、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、原発性胆汁性肝硬変、関節リウマチ及びぶどう膜炎、喘息、粥状動脈硬化、1型糖尿病、乾癬、様々なアレルギーなどの病状から選択される徴候又は病状に罹患しているか、又は罹患する危険を有している、実施形態２６又は２７に記載の方法。
【０１６３】
実施形態２９．前記対象が、子癇前症、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎、虚血性大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、食道通過障害、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ウィップル病、アレルギー、免疫複合体病、臓器虚血、再灌流傷害、臓器壊死、枯草熱、敗血症（sepsis）、敗血症（septicemia）、エンドトキシンショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、腟炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺気腫、鼻炎、間質性肺炎、塵肺症（pneumotransmicroscopicsilicovolcanoconiosis）、肺胞炎（alvealitis）、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス感染症、ＨＩＶ感染症、Ｂ型肝炎ウイルス感染症、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、単包虫症、熱傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日光皮膚炎、じん麻疹、疣贅、膨疹、血管炎（ｖａｓｕｌｉｔｉｓ）、血管炎、心内膜炎、動脈炎、粥状動脈硬化、血栓性静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、アルツハイマー病、セリアック病、うっ血性心不全、成人呼吸促迫症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、大脳梗塞、脳塞栓症、ギラン・バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ぶどう膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、関節リウマチ、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット病、同種移植片拒絶、移植片対宿主病、１型糖尿病、強直性脊椎炎，ベルジェ病、ライター症候群及びホジキン病、角膜炎、２型糖尿病、嚢胞性線維症、心筋梗塞、再灌流傷害、脳卒中、皮膚筋炎、メタボリックシンドローム、全身性炎症反応症候群、敗血症、複合臓器不全、播種性血管内凝固症候群、アナフィラキシーショック、１型及び／又は２型糖尿病と関連した血管合併症及び腎症、髄膜炎、細菌性敗血症、重症マラリア、非典型的溶血性尿毒症症候群、溶血性尿毒症症候群、加齢黄斑変性、発作性夜間血色素尿症、ヘビ毒咬傷、火傷、糖尿病性腎症などの腎症、及び臓器移植への合併症から成る群から選択される徴候又は病状に罹患しているか、又は罹患する危険を有している、実施形態２６又は２７に記載の方法。
【０１６４】
実施形態３０．前記対象が、臓器虚血、再灌流傷害、臓器壊死、血管炎、心内膜炎、粥状動脈硬化、血栓性静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、うっ血性心不全、成人呼吸促迫症候群、大脳梗塞、脳塞栓症、１型及び／又は２型糖尿病と関連した血管合併症及び腎症から成る群から選択される徴候又は病状に罹患しているか、又は罹患する危険を有している、実施形態２６又は２７に記載の方法。
【０１６５】
実施形態３１．前記対象が、凝固、血栓又は凝固障害関連疾患、炎症反応を含めた血栓又は凝固障害関連疾患又は障害、及び血管障害、例えば血栓症などを含めたフィブリン形成に関連した慢性血栓梗塞性疾患又は障害に関連したあらゆる徴候、例えば深部静脈血栓症、動脈血栓症、術後血栓症、冠動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）、経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）、血小板沈着性脳卒中、腫瘍増殖、腫瘍転移、血管新生、血栓溶解、粥状動脈硬化、再狭窄、例えば動脈硬化症及び／又は血管形成術後の再狭窄など、急性及び慢性徴候、例えば炎症など、敗血症、敗血症性ショック、敗血症、低血圧症、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、播種性血管内凝固障害（ＤＩＣ）、肺塞栓症、病的血小板沈着、心筋梗塞と関連した徴候の処置、又は血栓症のリスクのある動脈硬化血管、末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ）移植後の静脈閉塞性疾患、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、及び血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）及びリウマチ熱から選択される徴候又は病状に罹患しているか、又は罹患する危険を有している、実施形態２６又は２７に記載の方法。
【０１６６】
実施形態３２．手術を受けている又はうっ血性心不全に罹患している患者などの特定のハイリスク患者の血栓塞栓性合併症の発生を予防するための、実施形態２６又は２７に記載の方法。
実施形態３３．心臓に関連した病状を処置するための、実施形態２６又は２７に記載の方法。
実施形態３４．血液学的癌などの癌を処置するための、実施形態２６又は２７に記載の方法。
実施形態３５．フィコリン−３などの補体活性化に関連しているポリペプチドの量の不足若しくは多さ、又はレベル異常に関連する病状を処置するための、実施形態２６又は２７に記載の方法。
【０１６７】
実施形態３６．実施形態１〜１９のいずれか１項に記載の抗体、又は他のフィコリン−３阻害剤、及び医薬的に許容し得る担体を含む医薬組成物。
実施形態３７．薬剤としての使用するための、実施形態１〜１９のいずれか１項に記載の抗体、又は他のフィコリン−３阻害剤。
実施形態３８．前記使用が、実施形態２７〜３５のいずれか１項に記載の徴候、病状又は疾患の処置のためである、実施形態３７に記載の抗体又は他のフィコリン−３阻害剤。
実施形態３９．実施形態１〜１９のいずれか１項に記載の抗体、又は他のフィコリン−３阻害剤を含む診断組成物。
【０１６８】
実施形態４０．サンプル中に存在するヒトフィコリン−３の検出方法であって、以下のステップ：
ａ）サンプルを、実施形態１〜１９のいずれか１項に記載の抗体又は他のフィコリン−３阻害剤と、該抗体とヒトフィコリン−３の間の複合体形成を可能にする条件下で接触させ、そして
ｂ）複合体が形成されたかどうかを分析する、
を含む検出方法。
【０１６９】
実施形態４１．サンプル中のヒトフィコリン−３の存在を検出するためのキットであって：
ａ）実施形態１〜１９のいずれか１項に記載の抗フィコリン−３抗体又は他のフィコリン−３阻害剤、及び
ｂ）該キットの取扱説明書、
を含むキット。
【実施例】
【０１７０】
実施例１
それらの特性を更に知るために、フィコリン−３に対して作製したモノクローナルマウス抗体のパネルを、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で調査した。
フィコリン−３に対する抗体反応性−モノクローナルマウス抗フィコリン−３抗体（ＦＣＮ３）を含む上清をハイブリドーマクローンから回収した。フィコリン−３に対する反応性を試験するために、ｒフィコリン−３（社内で製造）を４℃にて一晩（ＯＮ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でマイクロタイタープレート内に直接コートした［１μｇ／ｍｌ］、簡単なＥＬＩＳＡセットアップを使用した。そのプレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０含有バルビタールバッファー（４ｍＭのＣ8Ｈ11Ｎ2ＮａＯ3、１４５ｍＭのＮａＣｌ、２．６ｍＭのＣａＣｌ2、２．１ｍＭのＭｇＣｌ2、ｐＨ＝７．４）（ＶＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した。ＦＣＮ３抗体上清を、ＶＢＳ−Ｔ中に作製した２倍希釈系列でｒフィコリン−３に加え、そして、振盪しながら室温（ＲＴ）にて２時間インキュベートした。上述のとおり洗浄した後に、抗体結合を室温にて１時間ウサギ抗マウス−ＨＲＰ（DAKO製）［１：２０００］を用いて検出した。そのプレートを洗浄し、そして、Ｈ2Ｏ2含有ＯＰＤ基質を使用して現像した。光学濃度を４９０ｎｍで計測した。
【０１７１】
ＥＬＩＳＡにおけるリガンドへのフィコリン−３結合の阻害−次のステップは、フィコリン−３抗体のいずれかがフィコリン分子のフィブリノーゲン様ドメイン内にエピトープを有し、それにより、タンパク質の結合能を妨げるかどうかを調べるためのものであった。ＥＬＩＳＡにおけるフィコリン−３のリガンドとして、ａｃＢＳＡを、４℃にて一晩、ＰＢＳ中でマイクロタイターウェル内にコートした［５μｇ／ｍｌ］。次に、ｒフィコリン−３［２μｇ／ｍｌ］又は血清［１：５０］と様々なＦＣＮ３抗体を２倍希釈系列で４℃にて３０分間、プレインキュベートした。ヒト特異性のないアイソタイプ対応対照抗体を、同様に加えた。それと同時に、ａｃＢＳＡの入ったプレートをＶＢＳ−Ｔで洗浄し、その後、ＦＣＮ３抗体を含むｒフィコリン−３／血清を、ＥＬＩＳＡプレートに加え、そして、３７℃にて２時間インキュベートした。そのプレートを洗浄し、そして、ａｃＢＳＡへのフィコリン−３結合の検出を、ビオチン化モノクローナルマウス抗フィコリン−３（ＦＣＮ３３４）又はフィコリン−３に対するビオチン化ポリクローナル抗体（R&D Systems製）のいずれかを用いておこない、阻害抗体と検出抗体の間のエピトープのオーバーラップの可能性を回避した。室温にて２時間のインキュベーション後に、プレートを再び洗浄し、そして、先に記載した現像の１時間前にストレプトアビジン−ＨＲＰ［１：２０００］（GE Healthcare製）を加えた。
【０１７２】
ＥＬＩＳＡにおけるフィコリン−３媒介性補体沈着の阻害−ＦＣＮ３抗体のリガンド結合阻害特性がフィコリン−３媒介性補体活性化の阻害をももたらすことを確認するために、ａｃＢＳＡをＥＬＩＳＡプラットフォームのリガンドとして再び使用した。さらに、フィコリン−３の下流効果を評価することによって、ＭＡＳＰ’ｓの結合領域と競合し、その結果、補体活性化を阻害する抗体もまた明らかになる可能性もある。
ＡｃＢＳＡを、４℃にて一晩、ＰＢＳ中でマイクロタイターウェル上にコートした［５μｇ／ｍｌ］。補体アッセイのために、レクチン経路を完全なままで残す、古典経路並びに代替経路の阻害剤として知られているポリアネトールスルホン酸ナトリウム（ＳＰＳ）を使用した［Palarasah et al., 2010］。最初に、全血清をＳＰＳ［０．５ｍｇ／ｍｌ］と共に氷上で５分間プレインキュベートした。二番目に、血清［１：８０］を、様々な抗体と共に４℃にて３０分間プレインキュベートし、次に、２倍希釈系列のａｃＢＳＡが入ったウェルに加え、そして、３７℃にて３０分間インキュベートした。ａｃＢＳＡ上のＣ４及びＣ３沈着を、それぞれｐＡｂウサギ抗ｈｕＣ４（DAKO製）及びｐＡｂウサギ抗ｈｕＣ３（Dahde-Behring製）を用いて検出した。プレートを、室温にて２時間インキュベートし、それに続いて、ロバ抗ウサギＨＲＰ（GE Healthcare製）を、記載したように現像の１時間前に適用した。すべてのステップの間に、プレートをＶＢＳ−Ｔで洗浄した。
【０１７３】
プレートを血清／抗体と共に３７℃にて４５分間インキュベートしたことを除いて、端末の補体経路の評価を上述のとおりおこなった。終末補体複合体（ＴＣＣ）の形成を、マウス抗Ｃ５ｈ−９（Bioporto Diagnostics製）とそれに続いてウサギ抗マウス−ＨＲＰを用いて検出した。
図面に示した結果は、クローンＦＣＮ３０８及びクローンＦＣＮ３３４がａｃＢＳＡへのフィコリン−３の結合を阻害したことを示した。クローンＦＣＮ３０８、クローン３３４、及びＦＣＮ３２９は、Ｃ４、Ｃ３、及びＴＣＣ沈着として評価される更なる下流の補体沈着を阻害した。その一方で、これは、試験した他の抗フィコリン−３クローンに関して当てはまらなかった。
【０１７４】
実施例２
補体活性化と腎移植後の有害転帰との関連性
補体活性化が腎移植後の有害転帰に関連していことは明らかにされている。特に、補体因子Ｃ４ｄの沈着は、液性拒絶反応出現の優れたマーカーであることが明らかにされている。しかしながら、これらの出現に隠れた機構は部分的にしか解明されていない。これにより、本願の発明者らは、他の状況においてＣ４ｄ沈着を開始する因子の１つである高いフィコリン−３血清レベルが、腎臓拒絶反応に対する寄与因子になり得るかどうか推測した。
【０１７５】
患者と方法
我々は、フィコリン−３レベルが腎移植の転帰を決定し得るかどうか調査した。フィコリン−３、補体因子Ｃ４及びＣ３を、移植前並びに対照血清サンプルで評価した。対照では、フィコリン−３、Ｃ４、Ｃ３、及び終末補体複合体（ＴＣＣ）の沈着を、マトリックスとしてのアセチル化アルブミンに基づくアッセイで評価した。試験では、我々は、越えるのにコペンハーゲンの移殖センターにおいて１０年間の間に腎臓を移植された５２７人の患者を組み入れ；９７人の献血者が対照の役割を果たした。
【０１７６】
受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）解析を使用して１年間の経過観察後に患者の移植片生着率を観察し、フィコリン−３の高値と低値を区別するのに最適なカットオフ値として４６μｇ／ｍｌのフィコリン−３を選択した。フィコリン−３の血清レベルを、L. Munthe-Fog et al. Characterization of a polymorphism in the coding sequence of FCN3 resulting in a Ficoiin-3 (Hakata antigen) deficiency state. Mol. Immunol. 45 : 2660-2666, 2008に記載の方法によって評価した。
【０１７７】
結果
低フィコリン−３レベルの患者に比べて、有意に多数の高フィコリン−３レベルの患者が１年の経過観察後に腎臓を喪失した（Ｐ＝０．０１）（図７）。
対照と比較して、患者ではフィコリン−３、Ｃ４及びＣ３濃度が上昇した（ｐ＜０．００１）ことがわかった。フィコリン−３レベルは、患者（それぞれｒｈｏ：０．４４、ｐ＜０．０００１、ｒｈｏ：０．５３、ｐ＜０．０００１）及び対照（それぞれｒｈｏ：０．３０、ｐ＜０．００３８、ｒｈｏ：０．５０、ｐ＜０．０００１）の両者でＣ４及びＣ３血清レベルと相関があった。フィコリン−３の血清レベルは、フィコリン−３（ｒｈｏ０．６６、ｐ＜０．０００１）、Ｃ４（ｒｈｏ０．４５、ｐ＜０．０００１）、Ｃ３（ｒｈｏ０．４６、ｐ＜０．０００１）、及びＴＣＣ（ｒｈｏ０．２４、ｐ＝０．０１９７）沈着と相関があった。交絡因子に関して調整した多変量回帰分析では、高フィコリン−３レベルは、死亡打ち切りまでの移植片生着率の予測因子になったが（ＨＲ＝３．１８、９５％ＣＩ：１．４８〜６．８１）（ｐ＝０．００３）、これはＣ４やＣ３に関して見られなかった。
【０１７８】
結論
高い血清フィコリン−３レベルは、低い腎臓移植片生着率に関連している。これにより、高いフィコリン−３レベルは、腎臓拒絶反応を開始する１つの因子であり得る。
これにより、前記試験では、フィコリン−３が腎臓移植片拒絶反応の病態生理学に関与することを確認した。フィコリン−３レベルは、下流の血清補体成分の濃度及び沈着と密接な相関があり、補体活性化のイニシエーター分子としてのフィコリン−３の重要性を示している。
【０１７９】
実施例３
細胞
ＪｕｒｋａｔＴ細胞（細胞株Ｅ６．１）を、５％のＣＯ2雰囲気及び３７℃にてＲＰＭＩ＋（９０Ｕ／ｍｌのペニシリン、９０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（Η．Ｉ．ＦＣＳ）が補ったＲＰＭＩ−１６４０）中で培養した。
【０１８０】
壊死の誘導
３ｘ１０6個のＪｕｒｋａｔＴ細胞を、ＲＰＭＩ＋で洗浄し、そして１８００ｒｐｍにて遠心分離した。細胞をＴＢＳ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ７．４）＋１ｍＭのＭｇＣｌ2中に再懸濁し、そして、５６℃にて３０分間のインキュベートによってネクローシスを生じさせた。
【０１８１】
壊死ＪｕｒｋａｔＴ細胞へのｒフィコリン−３の結合の阻害
ｒフィコリン−３を、様々な濃度のフィコリン−３阻害抗体ＦＣＮ３０８又はアイソタイプ抗体対照と共に４℃にて３０分間プレインキュベートした。合計０．１ｘ１０6個の細胞／サンプルを、洗浄バッファー（ＴＢＳ＋２．５ｍＭのＣａＣｌ2＋１％のＨ．Ｉ．ＦＣＳ、ｐＨ７．４）で洗浄し、そして、１８００ｒｐｍ、４℃にて５分間遠心分離した。壊死細胞を、ｒフィコリン−３及びＦＣＮ３０８と共に３７℃にて１時間インキュベートした。次に、その細胞を再び洗浄し、そして、ｒフィコリン−３結合の検出を、ビオチン化モノクローナルマウス抗フィコリン−３抗体（ＦＣＮ３３４*ビオチン）を用いて、４℃にて３０分間おこなった。細胞を再び洗浄し、そして、４℃にて１５分間ストレプトアビジン−ＰＥ（BD Biosciences）と共にインキュベートした。この最終ステップで、壊死を、７−ＡＡＤ及びアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（BD Biosciences）を用いて細胞を染色することによって確認した。最後に、細胞へのｒフィコリン−３結合とその阻害をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒによるフローサイトメトリーによって分析した。
【０１８２】
結果
壊死細胞を、７−ＡＡＤ及びアネキシンＶ−ＦＩＴＣ標識によって同定し、次に、前方散乱特性及び側方散乱特性によって選別した。２０μｇ／ｍｌの濃度のｒフィコリン−３は、アイソタイプ対照ナンセンス抗体の存在下、壊死ＪｕｒｋａｔＴ細胞に対して明確な結合を生じた。結合は、図８から明らかであるように、フィコリン−３阻害抗体ＦＣＮ３０８の濃度増大につれて、用量依存的に阻害された。
このことは、壊死／損傷細胞に対するフィコリン−３結合を阻害することが可能であることを実証している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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