(57)【要約】  本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ−３）を始動させることが可能であり、血清安定性の増大を示し、同時にＤＩＣＥＲ複合体によってプロセシングされ得ない二本鎖構造のリボ核酸（ＲＮＡ）に関する。【選択図】図５
2014532400.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも４５ｂｐの二本鎖構造の少なくとも１つのセグメントを含むリボ核酸であって、前記二本鎖構造の少なくとも１つのセグメントが、該二本鎖構造のそれぞれの末端の最後のｂｐから数えてそれぞれ最後の６ｂｐ〜２０ｂｐに少なくとも３〜１０Ｇ／Ｃｂｐを各々が有する第１及び第２の末端を有し、各末端での最後の６ｂｐ〜２０ｂｐの間のヌクレオチド配列がヘテロポリマーであり、以下の配列を有するリボ核酸は除外される、リボ核酸：
ＧＧＧＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＧＧＧＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＧＧＧＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＧＧＧ（配列番号３）
ＧＧＧＵＵＵＧＧＧＵＵＵＧＧＧＵＵＵＧＧＧＵＵＵＧＧＧＵＵＵＧＧＧＵＵＵＧＧＧＵＵＵＧＧＧＵＵＵＧＧＧ（配列番号４）
ＣＣＣＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＣＣＣＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＣＣＣＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＣＣＣ（配列番号５）
ＣＣＣＵＵＵＣＣＣＵＵＵＣＣＣＵＵＵＣＣＣＵＵＵＣＣＣＵＵＵＣＣＣＵＵＵＣＣＣＵＵＵＣＣＣＵＵＵＣＣＣ（配列番号６）。
【請求項２】
前記二本鎖構造の各末端の少なくとも３〜１０末端ｂｐがＧ／Ｃｂｐである、請求項１に記載のリボ核酸。
【請求項３】
本質的に二本鎖である、請求項１又は２に記載のリボ核酸。
【請求項４】
２つのポリリボヌクレオチド鎖を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のリボ核酸。
【請求項５】
両側が平滑末端である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のリボ核酸。
【請求項６】
前記二本鎖構造の少なくとも１つのセグメントの鎖が以下の配列を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のリボ核酸：
５'−（Ｇ／Ｃ）ｘ（Ｎ）ｙ（Ｇ／Ｃ）ｚ−３'
３'−（Ｇ／Ｃ）ｘ（Ｎ）ｙ（Ｇ／Ｃ）ｚ−５'
（式中、Ｇ／ＣはＧリボヌクレオチド又はＣリボヌクレオチドであるが、但し、Ｇリボヌクレオチドが一方の鎖の或る位置にある場合、他方の鎖が対向する位置にＣリボヌクレオチドを有し、逆の場合も同じであり；Ｎは任意のリボヌクレオチドであるが、但し、両方の鎖の配列が本質的に相補的であり；各々のｘは３〜１０の整数であり、各々のｙは３０〜２００、好ましくは３０〜１５０、より好ましくは３０〜１００、更により好ましくは３０〜５０の整数であり、各々のｚは３〜１０の整数であるが、但し、一方の鎖のｘが他方の鎖のｘに等しく、一方の鎖のｙが他方の鎖のｙに等しく、一方の鎖のｚが他方の鎖のｚに等しく；更には前記二本鎖構造の長さが４５ｂｐ〜２２０ｂｐ、より好ましくは４５ｂｐ〜１５０ｂｐ、特に好ましくは４５ｂｐ〜９０ｂｐ、更により好ましくは４５ｂｐ〜７０ｂｐであることを条件とする）。
【請求項７】
前記二本鎖構造の少なくとも１つのセグメントの鎖が、以下の配列対の１つである、請求項６に記載のリボ核酸：
５'−（Ｇ）５（Ｎ）ｙ（Ｇ）５−３'
３'−（Ｃ）５（Ｎ）ｙ（Ｃ）５−５'又は
５'−（Ｃ）５（Ｎ）ｙ（Ｃ）５−３'
３'−（Ｇ）５（Ｎ）ｙ（Ｇ）５−５'又は
５'−（Ｇ）５（Ｎ）ｙ（Ｃ）５−３'
３'−（Ｃ）５（Ｎ）ｙ（Ｇ）５−５'又は
５'−（Ｃ）５（Ｎ）ｙ（Ｇ）５−３'
３'−（Ｇ）５（Ｎ）ｙ（Ｃ）５−５'
（式中、ｙは３５〜２００、好ましくは３５〜１５０、より好ましくは３５〜１００、特に好ましくは３５〜８０、更により好ましくは３５〜４０の整数である）。
【請求項８】
前記二本鎖構造のＧ／Ｃ含量が少なくとも４５％である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のリボ核酸。
【請求項９】
前記Ｇ／Ｃ含量が４５％〜７０％である、請求項８に記載のリボ核酸。
【請求項１０】
前記Ｇ／Ｃ含量が４８％〜６０％である、請求項９に記載のリボ核酸。
【請求項１１】
前記二本鎖構造のＴｍが６８℃〜８０℃である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のリボ核酸。
【請求項１２】
前記二本鎖構造の少なくとも１つのセグメントの鎖が以下の配列対の１つである、請求項６に記載のリボ核酸：
５'−ＣＣＣＣＣＵＡＡＧＣＡＣＧＡＡＧＣＵＣＡＧＡＧＵＵＡＡＧＣＡＣＧＡＡＧＣＵＣＡＧＡＧＵＣＣＣＣＣ−３'（配列番号８）
５'−ＧＧＧＧＧＡＣＵＣＵＧＡＧＣＵＵＣＧＵＧＣＵＵＡＡＣＵＣＵＧＡＧＣＵＵＣＧＵＧＣＵＵＡＧＧＧＧＧ−３'（配列番号９）
５'−ＣＣＣＣＣＧＡＡＣＧＡＡＵＵＵＡＵＡＡＧＵＧＧＧＡＡＣＧＡＡＵＵＵＡＵＡＡＧＵＧＧＣＣＣＣＣ−３'（配列番号１０）
５'−ＧＧＧＧＧＣＣＡＣＵＵＡＵＡＡＡＵＵＣＧＵＵＣＣＣＡＣＵＵＡＵＡＡＡＵＵＣＧＵＵＣＧＧＧＧＧ−３'（配列番号１１）
５'−ＣＣＣＣＣＡＣＡＡＣＡＵＵＣＡＵＡＵＡＧＣＵＧＡＣＡＡＣＡＵＵＣＡＵＡＵＡＧＣＵＧＣＣＣＣＣ−３'（配列番号１２）
５'−ＧＧＧＧＧＣＡＧＣＵＡＵＡＵＧＡＡＵＧＵＵＧＵＣＡＧＣＵＡＵＡＵＧＡＡＵＧＵＵＧＵＧＧＧＧＧ−３'（配列番号１３）
５'−ＣＣＣＣＣＵＡＡＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＵＣＡＧＣＡＧＣＵＡＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＵＣＡＧＣＡＧＣＵＡＧＣＡＧＣＡＡＧＣＵＣＡＧＣＡＧＣＵＡＡＧＣＣＡＣＧＡＧＣＵＣＡＵＧＣＧＣＣＣＣＣ−３'（配列番号１４）
５'−ＧＧＧＧＧＣＧＣＡＵＧＡＧＣＵＣＧＵＧＧＣＵＵＡＧＣＵＧＣＵＧＡＧＣＵＵＧＣＵＧＣＵＡＧＣＵＧＣＵＧＡＧＧＣＵＧＣＵＧＧＣＵＵＡＧＣＵＧＣＵＧＡＧＧＣＵＵＧＣＵＧＣＵＵＡＧＧＧＧＧ−３'（配列番号１５）。
【請求項１３】
少なくとも一方の鎖の５'末端に遊離三リン酸基を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のリボ核酸。
【請求項１４】
前記少なくとも一方の鎖が以下の配列対から選択される、請求項１３に記載のリボ核酸：
５'−ＣＣＣＣＣＵＡＡＧＣＡＣＧＡＡＧＣＵＣＡＧＡＧＵＵＡＡＧＣＡＣＧＡＡＧＣＵＣＡＧＡＧＵＣＣＣＣＣ−３'（配列番号８）
ｐｐｐ−５'−ＧＧＧＧＧＡＣＵＣＵＧＡＧＣＵＵＣＧＵＧＣＵＵＡＡＣＵＣＵＧＡＧＣＵＵＣＧＵＧＣＵＵＡＧＧＧＧＧ−３'（配列番号９）
５'−ＣＣＣＣＣＵＡＡＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＵＣＡＧＣＡＧＣＵＡＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＵＣＡＧＣＡＧＣＵＡＧＣＡＧＣＡＡＧＣＵＣＡＧＣＡＧＣＵＡＡＧＣＣＡＣＧＡＧＣＵＣＡＵＧＣＧＣＣＣＣＣ−３'（配列番号１４）
ｐｐｐ−５'−ＧＧＧＧＧＣＧＣＡＵＧＡＧＣＵＣＧＵＧＧＣＵＵＡＧＣＵＧＣＵＧＡＧＣＵＵＧＣＵＧＣＵＡＧＣＵＧＣＵＧＡＧＧＣＵＧＣＵＧＧＣＵＵＡＧＣＵＧＣＵＧＡＧＧＣＵＵＧＣＵＧＣＵＵＡＧＧＧＧＧ−３'（配列番号１５）
（式中、ｐｐｐは遊離三リン酸基を表す）。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の少なくとも１つのリボ核酸を、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体と組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項１６】
ワクチンを含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
薬剤として使用される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のリボ核酸。
【請求項１８】
免疫賦活用の請求項１〜１４のいずれか一項に記載のリボ核酸。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のリボ核酸を含むＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ−３）の作動薬。
【請求項２０】
請求項１３又は１４に記載のリボ核酸を含むＴＬＲ−３及びＲＩＧ−Ｉの作動薬。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のリボ核酸を作製する方法であって、
（ｉ）請求項１〜１４のいずれか一項に規定の二本鎖構造を採用するような形態へとフォールディングする配列を有するリボ核酸を合成する工程、又は、
（ｉｉ）第１のリボ核酸鎖及び第２のリボ核酸鎖を合成するとともに、２つの鎖をアニーリングする工程であって、該２つの鎖が請求項１〜１４のいずれか一項に規定の二本鎖構造を形成するのに適切な配列を有する、工程、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ−３）を始動させることが可能であり、血清安定性の増大を示し、同時にＤＩＣＥＲ複合体によってプロセシングされ得ない二本鎖構造のリボ核酸（ＲＮＡ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
二本鎖ＲＮＡが、樹状細胞及び上皮細胞のエンドソームに位置するＴＬＲ−３を介して免疫賦活を引き起こすことが知られている（非特許文献１、非特許文献２を参照されたい）。
【０００３】
特許文献１及び特許文献２は、一般式ＧｌＸｍＧｎ又はＣｌＸｍＣｎ及び（ＮｕＧｌＸｍＧｎＮｖ）ａ又は（ＮｕＣｌＸｍＣｎＮｖ）ａの核酸をそれぞれ開示している。この従来技術によると、かかる核酸は二本鎖ＲＮＡであってもよく、免疫賦活特性を有し得る。しかしながら、特許文献１及び特許文献２に開示される上記の式による分子の具体例は一本鎖であり、以下のように両方の末端にＧヌクレオチド又はＣヌクレオチドのストレッチと、ポリＵストレッチ、又はＣヌクレオチド若しくはＧヌクレオチド及びＣ若しくはＧのそれぞれの末端の間のＵヌクレオチドを含有する反復配列とを含有する極めて人工的な配列を有する：
ＧＧＧＧＧＧＧＧＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号１）；
ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２）；
ＧＧＧＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＧＧＧＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＧＧＧＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＧＧＧ（配列番号３）；
ＧＧＧＵＵＵＧＧＧＵＵＵＧＧＧＵＵＵＧＧＧＵＵＵＧＧＧＵＵＵＧＧＧＵＵＵＧＧＧＵＵＵＧＧＧＵＵＵＧＧＧ（配列番号４）；
ＣＣＣＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＣＣＣＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＣＣＣＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＣＣＣ（配列番号５）；
ＣＣＣＵＵＵＣＣＣＵＵＵＣＣＣＵＵＵＣＣＣＵＵＵＣＣＣＵＵＵＣＣＣＵＵＵＣＣＣＵＵＵＣＣＣＵＵＵＣＣＣ（配列番号６）；及び
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＧＧＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＧＧＧ（配列番号７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００８／０１４９７９号
【特許文献２】国際公開第２００９／０９５２２６号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kucnick et al. (2010) Current Medical Chemistry
【非特許文献２】Coffmann et al. (2010) Immunity
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の根底にある技術的課題は、ＲＮＡ分子を使用する免疫賦活用の改善された系を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の技術的課題に対する解決策は、本明細書及び特許請求の範囲に記載の実施の形態によって提供される。
【０００８】
本発明は特に、最低４５ｂｐの二本鎖構造の少なくとも１つのセグメントを有するリボ核酸であって、該二本鎖セグメントがｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡセグメントの両方の末端（又は末端領域）でそれぞれ増大した熱力学的安定性を有する、リボ核酸を提供する。
【０００９】
より具体的には、少なくとも４５ｂｐ、好ましくは少なくとも４８ｂｐ、より好ましくは少なくとも７０ｂｐ、特に好ましくは４５ｂｐ、４６ｂｐ、４７ｂｐ若しくは４８ｂｐ〜２００ｂｐ、又はそれ以上のｂｐの二本鎖構造の少なくとも１つのセグメントを含むリボ核酸であって、上記二本鎖構造の少なくとも１つのセグメントが、二本鎖構造のそれぞれの末端の最後のｂｐから数えてそれぞれ最後の６ｂｐ〜２０ｂｐに（好ましくは連続した）少なくとも３〜１０Ｇ／Ｃｂｐを各々が有する第１及び第２の末端を有する、リボ核酸が提供される。二本鎖構造の両方の末端又は両方の末端領域でのＧ／Ｃ塩基対合の存在の増加のために、本発明のＲＮＡに驚くほど高い血清安定性及びＤＩＣＥＲ等の細胞ＲＮＡ分解酵素に対する安定性を与える熱力学的「クランプ」が生じる。したがって、本発明のＲＮＡはＤＩＣＥＲ複合体等の細胞ＲＮＡｓｅによってプロセシングされ得ない。したがって、本発明のリボ核酸はＴＬＲ−３経路の優れた始動を示し、持続した強力な免疫賦活（先天性免疫応答）をもたらす。
【００１０】
本発明によると、二本鎖リボ核酸又はリボ核酸の二本鎖セグメントの各末端の「最後の６ｂｐ〜２０ｂｐの３〜１０Ｇ／Ｃｂｐ」はそれぞれ、典型的には二本鎖構造の各末端の最後の６ｂｐ〜２０ｂｐの少なくとも５０％がＧ／Ｃ塩基対であり、好ましくはＧ／Ｃ塩基対が連続することを意味する。したがって、例えば少なくとも３Ｇ／Ｃ塩基対が最後の６ｂｐに存在し、少なくとも４Ｇ／Ｃ塩基対が最後の８ｂｐに存在し、少なくとも５Ｇ／Ｃ塩基対が最後の１０ｂｐに存在する。
【００１１】
本発明によるリボ核酸は、各末端での最後の６ｂｐ〜２０ｂｐの間にヘテロポリマーであるヌクレオチド配列を有するが、以下の配列を有するリボ核酸は除外される：
ＧＧＧＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＧＧＧＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＧＧＧＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＧＧＧ（配列番号３）
ＧＧＧＵＵＵＧＧＧＵＵＵＧＧＧＵＵＵＧＧＧＵＵＵＧＧＧＵＵＵＧＧＧＵＵＵＧＧＧＵＵＵＧＧＧＵＵＵＧＧＧ（配列番号４）
ＣＣＣＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＣＣＣＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＣＣＣＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＣＣＣ（配列番号５）
ＣＣＣＵＵＵＣＣＣＵＵＵＣＣＣＵＵＵＣＣＣＵＵＵＣＣＣＵＵＵＣＣＣＵＵＵＣＣＣＵＵＵＣＣＣＵＵＵＣＣＣ（配列番号６）。
【００１２】
本発明のリボ核酸において二本鎖構造の各末端の少なくとも３〜１０末端ｂｐがＧ／Ｃｂｐであるのが好ましい。
【００１３】
このため、言い換えると、本発明のリボ核酸又は核酸の二本鎖セグメントは、以下の一般式（１）：（Ｘ）６〜２０（Ｎ）ａ（Ｘ）６〜２０（式中、Ｘは任意のヌクレオチドであるが、但し、少なくとも３ヌクレオチド〜１０ヌクレオチドがＧヌクレオチド及び／又はＣヌクレオチドであり、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ａはリボ核酸（又はその二本鎖セグメント）が少なくとも４５ｂｐの長さを有するように選択される）によって表すことができるヌクレオチド鎖を有し、ここで、Ｎの配列はヘテロポリマーであり、リボ核酸又はリボ核酸の二本鎖セグメントの他方の鎖が上に規定の配列に相補的な配列を有する。
【００１４】
本発明のリボ核酸は完全に二本鎖である必要はない。しかしながら、典型的には本発明のリボ核酸は本質的に二本鎖であり、すなわち二本鎖構造を形成する鎖の対向する塩基間に規則的な水素結合が存在するが、非相補的な塩基又は化学的修飾によって１つ又は幾つかのミスマッチが存在していてもよい。通常は、かかるミスマッチは二本鎖分子（又は本発明のＲＮＡの二本鎖セグメントのそれぞれ）の１０％、より好ましくは５％、特に好ましくは２％又は更には１％を超えない。
【００１５】
好ましい実施の形態によると、二本鎖構造を含有する本発明のリボ核酸は、二本鎖構造の一方又は両方の末端に様々な長さであり得るが、典型的には１０を超えない一本鎖残基のオーバーハングを有していてもよく、より好ましくは、かかるオーバーハングは１つ、２つ又は３つの残基を有する。これらのオーバーハングは、リボヌクレオチドの代わりにデオキシリボヌクレオチドを含む場合もある。
【００１６】
二本鎖構造を含有する本発明のリボ核酸は、先に規定の二本鎖構造が適切な条件下で構築されるように、ヘアピン構造の形成を可能にする配列を有する１つのポリリボヌクレオチド鎖（polyribonucleic strand）から構成され得る。しかしながら、他の好ましい実施の形態では、本発明によるリボ核酸は２つの別個のポリリボヌクレオチド鎖を有する。
【００１７】
本発明のリボ核酸の好ましい実施の形態によると、二本鎖構造の少なくとも１つのセグメントの鎖は以下の配列を有する：
５'−（Ｇ／Ｃ）ｘ（Ｎ）ｙ（Ｇ／Ｃ）ｚ−３'
３'−（Ｇ／Ｃ）ｘ（Ｎ）ｙ（Ｇ／Ｃ）ｚ−５'
【００１８】
上記の構造において、Ｇ／ＣはＧリボヌクレオチド又はＣリボヌクレオチドであるが、但し、Ｇリボヌクレオチドが一方の鎖の或る位置にある場合、他方の鎖が対向する位置にＣリボヌクレオチドを有し、逆の場合も同じであり；Ｎは任意のリボヌクレオチドであるが、但し、両方の鎖の配列が本質的に相補的であり；各々のｘは３〜１０、特に３、４、５、６、７、８、９又は１０の整数であり、各々のｙは典型的に３０〜２００又はそれ以上、例えば５００若しくは６００、好ましくは３０〜１５０、より好ましくは３０〜１００、更により好ましくは３０〜５０の整数であり、各々のｚは３〜１０の整数であるが、但し、一方の鎖のｘが他方の鎖のｘに等しく、一方の鎖のｙが他方の鎖のｙに等しく、一方の鎖のｚが他方の鎖のｚに等しく；更には上記二本鎖構造の長さが少なくとも４５ｂｐ、典型的には４５ｂｐ〜５２０ｂｐ又はそれ以上、例えば６２０ｂｐ、好ましくは４５ｂｐ〜２２０ｂｐ、より好ましくは４５ｂｐ〜１５０ｂｐ、特に好ましくは４５ｂｐ〜９０ｂｐ、更により好ましくは４５ｂｐ〜７０ｂｐであることを条件とする。
【００１９】
より好ましくは、二本鎖構造の少なくとも１つのセグメントの鎖は、以下の配列対の１つである：
５'−（Ｇ）５（Ｎ）ｙ（Ｇ）５−３'
３'−（Ｃ）５（Ｎ）ｙ（Ｃ）５−５'又は
５'−（Ｃ）５（Ｎ）ｙ（Ｃ）５−３'
３'−（Ｇ）５（Ｎ）ｙ（Ｇ）５−５'又は
５'−（Ｇ）５（Ｎ）ｙ（Ｃ）５−３'
３'−（Ｃ）５（Ｎ）ｙ（Ｇ）５−５'又は
５'−（Ｃ）５（Ｎ）ｙ（Ｇ）５−３'
３'−（Ｇ）５（Ｎ）ｙ（Ｃ）５−５'
（式中、ｙは典型的には３５〜２００又はそれ以上、例えば５００若しくは６００、好ましくは３５〜１５０、より好ましくは３５〜１００、特に好ましくは３５〜８０、更により好ましくは３５〜４０の整数である）。
【００２０】
本発明のリボ核酸のＧ／Ｃ「クランプ」間の二本鎖領域の配列は原則として重要ではないが、リボヌクレオ塩基（ribonucleobases）Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣ、特にＧ又はＣのいずれかのホモポリマーは、その潜在的毒性のために一般に認められていない。配列は通常、特に転写後遺伝子サイレンシング機構による潜在的副作用を回避するために、配列全体が細胞又は生物中の他の既存のＲＮＡ種又はＤＮＡ種に対して明らかな相補性を示さないように選ばれる。しかしながら、両方の末端のＧ／Ｃ塩基対、又は概して上に規定のＧ／Ｃクランプ間の配列が、反復してもよい天然の（部分）配列から組み立てられ得ることが適切な場合もある。一例は、適切な又は所望のそれぞれの長さを有する本発明の分子を提供するために、１回又は数回、例えば２回、３回、４回若しくは５回、若しくはそれ以上の回数で反復する天然の配列、例えばウイルス、微生物又は他の生物の例えば２０ヌクレオチド〜９０ヌクレオチドの或る特定の（部分）配列である。
【００２１】
これとは対照的に、より容易かつより費用のかからない作製に関して、更には特許文献１及び特許文献２に開示されているような極めて人工的かつ潜在的に毒性の配列を回避するためには、Ｇ／Ｃクランプ間の二本鎖領域が５個を超える連続した同一のヌクレオチドのホモポリマーストレッチを含まず、１つのモチーフ当たり３ヌクレオチド〜１０ヌクレオチドの短反復配列モチーフを含まないことが好ましい。
【００２２】
さらに、本発明のＲＮＡの安定性を更に増大するためには、二本鎖構造（Ｇ／Ｃクランプを含む）のＧ／Ｃ含量が少なくとも４５％、より好ましくは４５％〜７０％、特に好ましくは４８％〜６０％である。「クランプ」間の配列がＧ／Ｃ塩基対、例えば３つ、４つ又は５つのＧ／Ｃ塩基対の更なる（短い）ストレッチを含有することも企図される。
【００２３】
本発明のかかる実施の形態では通常、二本鎖構造のＴｍが６８℃〜８０℃である。
【００２４】
ＴＬＲ−３（二量化）の効果的な始動についての生産コストを考慮すると、ｄｓＲＮＡ構造、より好ましくは完全なＲＮＡの好ましい長さは４５ｂｐ〜１５０ｂｐ、特に好ましくは４５ｂｐ〜１００ｂｐ、更により好ましくは４５ｂｐ〜５０ｂｐ、すなわち４５ｂｐ、４６ｂｐ、４７ｂｐ、４８ｂｐ、４９ｂｐ又は５０ｂｐの範囲である。
【００２５】
本発明による二本鎖ＲＮＡの好ましい具体例は以下の（相補的な）配列対で構成される：
Ｒｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−１：
５'−ＣＣＣＣＣＵＡＡＧＣＡＣＧＡＡＧＣＵＣＡＧＡＧＵＵＡＡＧＣＡＣＧＡＡＧＣＵＣＡＧＡＧＵＣＣＣＣＣ−３'（配列番号８）
５'−ＧＧＧＧＧＡＣＵＣＵＧＡＧＣＵＵＣＧＵＧＣＵＵＡＡＣＵＣＵＧＡＧＣＵＵＣＧＵＧＣＵＵＡＧＧＧＧＧ−３'（配列番号９）
Ｒｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−２：
５'−ＣＣＣＣＣＧＡＡＣＧＡＡＵＵＵＡＵＡＡＧＵＧＧＧＡＡＣＧＡＡＵＵＵＡＵＡＡＧＵＧＧＣＣＣＣＣ−３'（配列番号１０）
５'−ＧＧＧＧＧＣＣＡＣＵＵＡＵＡＡＡＵＵＣＧＵＵＣＣＣＡＣＵＵＡＵＡＡＡＵＵＣＧＵＵＣＧＧＧＧＧ−３'（配列番号１１）
Ｒｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−３：
５'−ＣＣＣＣＣＡＣＡＡＣＡＵＵＣＡＵＡＵＡＧＣＵＧＡＣＡＡＣＡＵＵＣＡＵＡＵＡＧＣＵＧＣＣＣＣＣ−３'（配列番号１２）
５'−ＧＧＧＧＧＣＡＧＣＵＡＵＡＵＧＡＡＵＧＵＵＧＵＣＡＧＣＵＡＵＡＵＧＡＡＵＧＵＵＧＵＧＧＧＧＧ−３'（配列番号１３）
ｄｓＲＮＡ−９０：
５'−ＣＣＣＣＣＵＡＡＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＵＣＡＧＣＡＧＣＵＡＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＵＣＡＧＣＡＧＣＵＡＧＣＡＧＣＡＡＧＣＵＣＡＧＣＡＧＣＵＡＡＧＣＣＡＣＧＡＧＣＵＣＡＵＧＣＧＣＣＣＣＣ−３'（配列番号１４）
５'−ＧＧＧＧＧＣＧＣＡＵＧＡＧＣＵＣＧＵＧＧＣＵＵＡＧＣＵＧＣＵＧＡＧＣＵＵＧＣＵＧＣＵＡＧＣＵＧＣＵＧＡＧＧＣＵＧＣＵＧＧＣＵＵＡＧＣＵＧＣＵＧＡＧＧＣＵＵＧＣＵＧＣＵＵＡＧＧＧＧＧ−３'（配列番号１５）。
【００２６】
上述のように、本発明のＲＮＡは片側又は両側にオーバーハングを有し得るが、典型的には二本鎖構造の両側が平滑末端である。
【００２７】
本発明のＲＮＡが免疫賦活特性を改善する更なるエンティティを備えることが企図される。例えば、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ−９）を少なくとも部分的に始動させるために、本発明のリボ核酸（の１つ又は複数）にＣｐＧデオキシリボヌクレオチドモチーフ（の１つ又は複数）を組み込むことが可能であり得る。
【００２８】
さらに、特に好ましい本発明のリボ核酸は少なくとも一方の鎖の５'末端に遊離三リン酸基を有する。本発明のかかる三リン酸含有ＲＮＡは好ましくは完全に二本鎖であり、一方又は両方の５'末端が遊離三リン酸基を含有する。この文脈で「遊離三リン酸基」とは、この三リン酸基が修飾されず、具体的にはそれぞれキャップ構造を含有しない又はその一部ではないことを意味する。本発明のかかる三リン酸含有ＲＮＡは、特に有効な免疫賦活化合物である。三リン酸基を含有する本発明によるリボ核酸のとりわけ好ましい例は以下の配列対である（相補鎖は５'→３'方向に示される）：
Ｒｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−４８：
５'−ＣＣＣＣＣＵＡＡＧＣＡＣＧＡＡＧＣＵＣＡＧＡＧＵＵＡＡＧＣＡＣＧＡＡＧＣＵＣＡＧＡＧＵＣＣＣＣＣ−３'（配列番号８）
ｐｐｐ−５'−ＧＧＧＧＧＡＣＵＣＵＧＡＧＣＵＵＣＧＵＧＣＵＵＡＡＣＵＣＵＧＡＧＣＵＵＣＧＵＧＣＵＵＡＧＧＧＧＧ−３'（配列番号９）
Ｒｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−９０：
５'−ＣＣＣＣＣＵＡＡＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＵＣＡＧＣＡＧＣＵＡＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＵＣＡＧＣＡＧＣＵＡＧＣＡＧＣＡＡＧＣＵＣＡＧＣＡＧＣＵＡＡＧＣＣＡＣＧＡＧＣＵＣＡＵＧＣＧＣＣＣＣＣ−３'（配列番号１４）
ｐｐｐ−５'−ＧＧＧＧＧＣＧＣＡＵＧＡＧＣＵＣＧＵＧＧＣＵＵＡＧＣＵＧＣＵＧＡＧＣＵＵＧＣＵＧＣＵＡＧＣＵＧＣＵＧＡＧＧＣＵＧＣＵＧＧＣＵＵＡＧＣＵＧＣＵＧＡＧＧＣＵＵＧＣＵＧＣＵＵＡＧＧＧＧＧ−３'（配列番号１５）
（式中、ｐｐｐは遊離５'−三リン酸基を表す）。
【００２９】
本発明の遊離三リン酸含有二本鎖リボ核酸は、ＲＩＧ−Ｉ経路（例えば国際公開第２００８／０１７４７３号を参照されたい）及びＴＬＲ−３経路の両方を始動させ、実施例において実証されるように用量依存的な先天性免疫応答をもたらす。
【００３０】
本発明のＲＮＡは、特に安定性の考慮に基づいて１つ又は複数の修飾ヌクレオチド類似体を含有していてもよい。
【００３１】
天然のヌクレオチドと比較したヌクレオチド類似体の化学的修飾は、リボース部分、リン酸部分及び／又は塩基部分に位置し得る。増大した安定性を有する分子、とりわけＲＮＡ分解酵素に対して、主鎖、すなわちリボース部分及び／又はリン酸部分での修飾がとりわけ好ましい。
【００３２】
リボースが修飾されたリボヌクレオチドの好ましい例は、２'−ＯＨ基がＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２若しくはＣＮ（ここで、ＲはＣ１〜Ｃ６アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩである）から選択される基に置換された類似体である。「修飾リボヌクレオチド」という用語が、「デオキシヌクレオチド」と称される場合もある２'−Ｏ−メチル誘導体等の２'−デオキシ誘導体も含むことが当業者には明らかである。
【００３３】
上述のように、少なくとも１つの修飾リボヌクレオチドは、塩基部分に化学的修飾を有する類似体から選択され得る。かかる類似体の例としては、５−アミノアリル−ウリジン、６−アザ−ウリジン、８−アザ−アデノシン、５−ブロモ−ウリジン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−グアニン、Ｎ６−メチル−アデニン、５−メチル−シチジン、シュード−ウリジン及び４−チオ−ウリジンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
隣接したリボヌクレオチド間のリン酸エステル基が修飾されている主鎖が修飾されたリボヌクレオチドの例は、ホスホチオエート基である。
【００３５】
本発明は、本明細書に規定のＲＮＡを作製する方法であって、  （ｉ）上に規定の二本鎖構造を採用するような形態へとフォールディングする配列を有するリボ核酸を合成する工程、又は、  （ｉｉ）第１のリボ核酸鎖及び第２のリボ核酸鎖を合成するとともに、２つの鎖をハイブリダイゼーション条件下でアニーリングする工程であって、鎖が本明細書に規定の二本鎖構造を形成するのに適切な配列を有する、工程、を含む、方法も提供する。
【００３６】
本発明の二本鎖ＲＮＡを提供するポリヌクレオチド分子は、化学的合成法によって若しくは酵素的に、又は化学的工程と酵素的工程との組合せによって調製することができる。本発明の二本鎖ＲＮＡ分子の酵素的調製方法は、国際公開第２００７／０１２３２９号に開示されているようなカリシウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用する方法であるのが好ましい。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用する化学的に修飾されたｄｓＲＮＡの酵素的合成に関しては、国際公開第２００９／１５０１５６号に言及されている方法が好ましい。ＲＮＡ鎖を調製する化学的合成方法も当該技術分野で既知である。
【００３７】
本発明は、本明細書に規定のＲＮＡ種をコードするベクターも企図する。例えば、本明細書に開示の一本鎖ｄｓＲＮＡ含有エンティティは、ｓｈＲＮＡ誘導体の形態で発現させることができる。
【００３８】
適切には、研究用途又は診断用途での検出のために本発明の二本鎖ＲＮＡを標識してもよい（例えば、二本鎖構造の片側にオーバーハングが存在する場合）。「標識」は物理的、化学的及び全ての生物学的な手段による対象のＲＮＡの検出を可能にする任意の化学的エンティティであり得る。１つ又は複数のヌクレオチドに結合する若しくは組み込まれる、又は本明細書に開示の分子の一方の末端に付加する典型的な標識の例は、放射性標識、発色団及びフルオロフォア（例えばフルオレセイン、ＴＡＭ等）である。
【００３９】
本発明のリボ核酸は特にＴＬＲ−３の作動薬として使用される。遊離５'−三リン酸部分を含有する本発明の更に好ましいリボ核酸は、ＲＩＧ−Ｉの作動薬でもある。その機能において、本発明のＲＮＡ分子は細胞又は生物内で免疫賦活効果を示す。したがって、本発明のリボ核酸は薬剤、特に免疫賦活調製物として有用である。本発明のリボ核酸は、免疫賦活用の薬剤の製造も企図される。したがって、本発明は、本明細書に規定の少なくとも１つのリボ核酸を少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤と組み合わせて含む医薬組成物にも関する。本発明における医薬組成物の調製、その投与量及びその投与経路は当業者に既知であり、その指針はRemington's Pharmaceutical Sciences（Mack publishing Co.，Eastern，PA，USA）の最新版に見ることができる。本発明の医薬組成物が本明細書に規定の２つ以上の異なるＲＮＡを含有することも企図される。
【００４０】
本発明のＲＮＡを免疫賦活薬単独として使用する場合、皮膚及び／又は粘膜への適切な調製物（例えば噴霧剤）の局所投与が好ましい。「ＲＮＡ薬」として、本発明のＲＮＡは樹状細胞の刺激及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答の生成をもたらす。本発明のｄｓＲＮＡのかかる適用は、例えばウイルス（ヘルペスウイルス、パピローマウイルス等）による感染性疾患の治療又はがんの治療にとりわけ有用である。
【００４１】
本発明のリボ核酸の免疫賦活効果の改善は、或る特定の疾患を対象とするワクチンと組み合わせても有用である。このため、本発明のＲＮＡは、ワクチン調製物において「ＲＮＡアジュバント」として使用する（又はワクチンとともに異なる調製物で、若しくは順次に投与する）こともできる。ワクチン及び本発明の免疫賦活ＲＮＡの同時又は順次の投与は、可溶性タンパク質（抗原）に対する防御ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生成し、ＤＣ活性化及びＩ型ＩＦＮ産生の誘導を始動させることによってワクチンの抗原に対する免疫応答を改善するものとする。
【００４２】
本明細書に開示のリボ核酸又は医薬組成物は、当該技術分野で既知の更なる免疫賦活薬と組み合わせることもできる。
【００４３】
本発明のリボ核酸は、細菌、ウイルス及び真菌等の感染因子に起因する感染性疾患、並びに腫瘍を含む疾患の治療に特に有用である。
【００４４】
本発明は、上述のような疾患、好ましくはウイルス感染症又は腫瘍疾患を治療する方法であって、有効量の本発明の医薬組成物を好ましくはかかる治療を必要とする哺乳動物、特にヒトの患者に投与することを含む、方法も提供する。
【００４５】
本発明は、本明細書に規定の二本鎖ＲＮＡ分子又はそれをコードするベクターを用いてトランスフェクト又は形質転換した細胞又は非ヒト生物にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の例示的なリボ核酸（Ｒｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−１）が８０％ＦＣＳ中、３７℃で少なくとも７２時間安定していることを実証する、反応物（reactions）のエチジウムブロマイド染色後の未変性ポリアクリルアミドゲル（２０％）を示す図である。ＦＣＳを含有しない反応物を陰性対照として使用した。
【図２】本発明のリボ核酸がヒトＤＩＣＥＲに抵抗性を示すことを示す図である。（Ａ）Ｒｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−１、Ｒｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−２及びＲｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−３と呼ばれる本発明の例示的なＲＮＡ中の二本鎖分子の鎖の配列、（塩基対中の）長さ、Ｔｍ及びＧ／Ｃ含量を示す。（Ｂ）３７℃で１２時間インキュベートした１．６μＭのＲｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−１、Ｒｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−２又はＲｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−３及び組み換えヒトＤＩＣＥＲを含有する反応物のエチジウムブロマイド染色後の未変性ポリアクリルアミドゲル（２０％）。Ｒｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−１、Ｒｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−２及びＲｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−３がヒトＤＩＣＥＲによって分解されないことが分かる。１７ｂｐ、２１ｂｐ及び２５ｂｐのｄｓＲＮＡマーカー、並びに２４ｎｔのｓｓＲＮＡマーカーを示す。
【図３】Ｒｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−４８及びＲｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−９０と呼ばれる本発明による一方の５'末端に三リン酸部分を有する二本鎖ＲＮＡ分子の鎖の配列、並びに一方の５'末端に三リン酸部分を有しない二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ−９０）の配列、長さ（塩基対）、Ｔｍ、Ｇ／Ｃ含量及び三リン酸部分の存在を示す図である。
【図４】指定の核酸の長さを示す核酸の電気泳動分離後のエチジウムブロマイド染色した１０％ポリアクリルアミドゲルの写真である。左パネル：１００ｂｐのｄｓＲＮＡに相当するＲＮＡマーカーを左から１番目のレーンに示し、２５ｂｐ、２１ｂｐ及び１７ｂｐのｄｓＲＮＡに相当するＲＮＡマーカーを左から４番目のレーンに示す。本発明によるＲＮＡであるＲｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−９０及びＲｉｂｏｘｘｉｍ（商標）４８を、それぞれ左から２番目及び３番目のレーンに示す。右パネル：左から１番目のレーンにとりわけ指定の１００ｂｐのｄｓＲＮＡに相当するＲＮＡマーカーを示す。左から２番目及び３番目のレーンにそれぞれｄｓＲＮＡ−９０及びＲｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−９０を示す。
【図５】三リン酸部分を有する本発明による二本鎖ＲＮＡであるＲｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−４８（図５Ａ）又はＲｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−９０（図５Ｂ）での刺激後の指定の細胞のサイトカインの分泌による樹状細胞（ｓｌａｎＤＣ、ＣＤ１ｃ＋）及び単球の細胞培養上清中のサイトカインＩＬ−６の濃度を示す２つの図である。
【図６】本発明による二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ−９０）での骨髄樹状細胞（ＣＤ１ｃ＋）及び単球の刺激後の分泌されたＩＬ−６の量を示す図である。
【図７】ポリ（Ｉ：Ｃ）での刺激後の用量非依存的な、概して高いＩＬ−１βの分泌とは対照的なＲｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−９０での刺激後の用量依存的なＩＬ−１βの分泌を示す、ｓｌａｎ樹状細胞（図７Ａ）、骨髄樹状細胞（ＣＤ１ｃ＋、図７Ｂ）及び単球（図７Ｃ）の細胞培養上清中のＩＬ−１βの濃度を示す図である。細胞を６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌのそれぞれの核酸で刺激した。
【図８】ポリ（Ｉ：Ｃ）での刺激後のＩＬ−６の分泌と比較したＲｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−９０での刺激後の用量依存的なＩＬ−６の分泌を示す、ｓｌａｎ樹状細胞（図８Ａ）、骨髄樹状細胞（ＣＤ１ｃ＋、図８Ｂ）及び単球（図８Ｃ）の細胞培養上清中のＩＬ−６の濃度を示す図である。細胞を６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌのそれぞれの核酸で刺激した。
【図９】ポリ（Ｉ：Ｃ）での刺激と比較した三リン酸化Ｒｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−９０又は三リン酸化していないｄｓＲＮＡ９０での刺激後のそれぞれのインターロイキンの用量依存的な分泌を示す、２人の異なるドナーから単離した単球の細胞培養上清中のＩＬ１β（図９Ａ）及びＩＬ−６（図９Ｂ）のそれぞれの濃度を示す図である。１人の血液ドナー当たり少なくとも３回の独立した測定の平均値±ＳＥＭを示す。
【図１０】一方の５'末端に三リン酸部分を有する二本鎖ＲＮＡ分子であるＲｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−４８のエレクトロスプレーイオン化質量分析の結果を示す図である。図１０Ａに示すアンチセンス鎖のＭＳ分析は、以下の配列を有する鎖の算出質量に相当する：  ５'−ＣＣＣＣＣＵＡＡＧＣＡＣＧＡＡＧＣＵＣＡＧＡＧＵＵＡＡＧＣＡＣＧＡＡＧＣＵＣＡＧＡＧＵＣＣＣＣＣ−３'（配列番号８）。  種々のイオン化状態を示す。図１０Ｂに示すセンス鎖のＭＳ分析は、以下の配列を有する鎖の算出質量に相当する：  ｐｐｐ−５'−ＧＧＧＧＧＡＣＵＣＵＧＡＧＣＵＵＣＧＵＧＣＵＵＡＡＣＵＣＵＧＡＧＣＵＵＣＧＵＧＣＵＵＡＧＧＧＧＧ−３'（配列番号９）。  この鎖はその５'末端に三リン酸部分を有する。種々のイオン化状態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明を以下の非限定的な実施例によって更に説明する。
【実施例】
【００４８】
実施例１：本発明のｄｓＲＮＡの血清安定性  総容量５０μｌの反応物は、０．０８ｎｍｏｌの二本鎖ＲＮＡ種（Ｒｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−１、図１Ａを参照されたい；Ｒｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−９０、図１Ｂを参照されたい；任意配列を有する５０ｂｐの対照ｄｓＲＮＡ、図１Ｂを参照されたい）及び８０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するものとした。反応物を３７℃でインキュベートした。図１Ａ及び図１Ｂのそれぞれに示す時点（１５分；１時間；２時間；４時間；６時間；２４時間；４８時間；７２時間）で、５μｌの反応物を各時点で採取し、−８０℃で凍結した。更なる対照として、図１Ｂに指定の時点（１５分及び１時間）でＲＮＡを反応物にスパイクした。上記の時点で反応生成物を未変性２０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、バンドをエチジウムブロマイド染色後のＵＶ透過によって可視化した。
【００４９】
実施例２：ヒトＤＩＣＥＲに対する本発明のｄｓＲＮＡの耐性  図２Ａに示すｄｓＲＮＡ分子を、２５０ｎｇのそれぞれの二本鎖ＲＮＡ（Ｒｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−１、Ｒｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−２又はＲｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−３）、２μｌの組み換えヒトＤＩＣＥＲ酵素（１Ｕ）、４μｌのＤＩＣＥＲ反応緩衝剤、０．５μｌの５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰ及び最終容量１５μｌまでのＲＮＡｓｅ−ＤＮＡｓｅ無含有水を含有する総容量１５μｌでインキュベートした。反応物を３７℃で１２時間インキュベートした後、未変性２０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、エチジウムブロマイド染色後のＵＶ透過によって可視化した。
【００５０】
図２ＢはヒトＤＩＣＥＲ複合体とのインキュベーションの結果を示す。本発明のいずれのリボ核酸もＤＩＣＥＲによってプロセシングされ得ない。
【００５１】
実施例３：一方の５'末端に三リン酸部分を有する本発明による二本鎖ＲＮＡ分子での刺激後のＩＬ−６の分泌  細胞を２人の健常ドナーの血液から単離した。全ての細胞集団を、ａｕｔｏＭＡＣＳシステムにより製造業者（Miltenyi Biotech GmbH、ベルギッシュグラート、ドイツ）の推奨に従って２つのカラムで選別した。６−スルホＬａｃＮＡｃ樹状細胞（ｓｌａｎＤＣ）の単離の詳細なプロトコルは、Schaekel, K. et al. (1998); Eur. J. Immunol. 28, (p. 4084-4093)に記載されている。簡潔に述べると、骨髄樹状細胞（ＣＤ１ｃ＋）をｓｌａｎＤＣの精製後に単離し、単球を陰性選択戦略によって単離した。単離された細胞を、１０％ヒトＡＢ血清（CCPRO、ノイシュタット、ドイツ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Biochrom AG，Berlin，Germany）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地において培養した。次いで、細胞を９６ウェルプレート内の１０％ヒトＡＢ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０に２５０００細胞／ウェルの密度で播種した。樹状細胞又は単球の亜集団を、５０μｇ／ｍｌのＲｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−４８又はＲｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−９０で２４時間〜７２時間刺激した。培養上清中の分泌されたＩＬ−６の濃度を、ＥＬＩＳＡを用いて評価した。
【００５２】
図５は、Ｒｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−４８（図５Ａ）及びＲｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−９０（図５Ｂ）のそれぞれとのインキュベーション後の樹状細胞及び単球の細胞培養上清中の分泌されたＩＬ−６の濃度を示す。どちらの核酸も全ての細胞型においてＩＬ−６の分泌を強く刺激する。示されるデータは、それぞれの標準誤差による３回の独立実験の平均値に相当する。
【００５３】
実施例４：本発明による二本鎖ＲＮＡ分子に応答したＩＬ−６の分泌  実施例３に記載のように骨髄樹状細胞（ＣＤ１ｃ＋）及び単球を単離し、選別し、培養した。次いで、細胞を９６ウェルプレート内の１０％ヒトＡＢ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０に２５０００細胞／ウェルの密度で播種し、５０μｇ／ｍｌの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ−９０）とともに２４時間〜７２時間インキュベートした。培養上清中の分泌されたＩＬ−６の濃度を、ＥＬＩＳＡを用いて分析した。
【００５４】
図６は、５'末端に三リン酸部分を有しない二本鎖ＲＮＡでの刺激後に樹状細胞及び単球によって分泌されたＩＬ−６の濃度を示す。示されるデータは、それぞれの標準誤差による３回の独立実験の平均値に相当する。
【００５５】
実施例５：一方の５'末端に三リン酸部分を有する本発明による二本鎖ＲＮＡでの刺激後のＩＬ−１βの分泌は用量依存的である  実施例３に記載のように樹状細胞（ｓｌａｎ  ＤＣ及びＣＤ１ｃ＋）及び単球を単離し、選別し、培養した。次いで、細胞を９６ウェルプレート内の１０％ヒトＡＢ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０に２５０００細胞／ウェルの密度で播種し、６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌのＲｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−９０又はポリ（Ｉ：Ｃ）とともに２４時間〜７２時間インキュベートした。培養上清中の分泌されたＩＬ−１βの濃度を、ＥＬＩＳＡを用いて評価した。
【００５６】
図７は、漸増量のＲｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−９０又はポリ（Ｉ：Ｃ）での刺激後にｓｌａｎＤＣ（図７Ａ）、ＣＤ１ｃ＋（図７Ｂ）及び単球（図７Ｃ）によって分泌されたＩＬ−１βの濃度を示す。Ｒｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−９０に応答したＩＬ−１βの分泌が３つ全ての細胞型において用量依存的である一方で、ポリ（Ｉ：Ｃ）は特に樹状細胞において用量非依存的な、概して高いＩＬ−１βの分泌を始動させることが実証される。示されるデータは、それぞれの標準誤差による３回の独立実験の平均値に相当する。
【００５７】
実施例６：一方の５'末端に三リン酸部分を有する本発明による二本鎖ＲＮＡでの刺激後のＩＬ−６の分泌は用量依存的である  実施例３に記載のように樹状細胞（ｓｌａｎ  ＤＣ及びＣＤ１ｃ＋）及び単球を単離し、選別し、培養した。次いで、細胞を９６ウェルプレート内の１０％ヒトＡＢ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０に２５０００細胞／ウェルの密度で播種し、６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌのＲｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−９０又はポリ（Ｉ：Ｃ）とともに２４時間〜７２時間インキュベートした。培養上清中の分泌されたＩＬ−６の濃度を、ＥＬＩＳＡを用いて評価した。
【００５８】
図８は、漸増量のＲｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−９０又はポリ（Ｉ：Ｃ）での刺激後にｓｌａｎＤＣ（図８Ａ）、ＣＤ１ｃ＋（図８Ｂ）及び単球（図８Ｃ）によって分泌されたＩＬ−６の濃度を示す。Ｒｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−９０に応答したＩＬ−６の分泌が３つ全ての細胞型において用量依存的である一方で、ポリ（Ｉ：Ｃ）は特に樹状細胞において用量非依存的な、概して高いＩＬ−６の分泌を始動させることが実証される。示されるデータは、それぞれの標準誤差による３回の独立実験の平均値に相当する。
【００５９】
実施例７：一方の５'末端に三リン酸部分を有する又は有しない本発明による二本鎖ＲＮＡでの刺激後のＩＬ−１β及びＩＬ−６の分泌の比較  実施例３に記載のように２人の異なる健常ドナーに由来する単球を単離し、選別し、培養した。次いで、細胞を９６ウェルプレート内の１０％ヒトＡＢ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０に２５０００細胞／ウェルの密度で播種し、６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌのｄｓＲＮＡ−９０、Ｒｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−９０又はポリ（Ｉ：Ｃ）のそれぞれとともに２４時間〜７２時間インキュベートした。培養上清中の分泌されたＩＬ−１β及びＩＬ−６の濃度を、ＥＬＩＳＡを用いて評価した。結果を図９Ａ（ＩＬ−１β）及び図９Ｂ（ＩＬ−６）に示す。
【００６０】
どちらの本発明のｄｓＲＮＡも用量依存的なＩＬ−１β及びＩＬ−６の分泌を示す。刺激は三リン酸化構築物Ｒｉｂｏｘｘｉｍ（商標）−９０でより高い。ポリ（Ｉ：Ｃ）は用量依存的なＩＬ−６の分泌をもたらさない。
【００６１】
上に記載の実施例から、本発明による二本鎖ＲＮＡ分子が樹状細胞及び単球においてＩＬ−６及びＩＬ−１β等のサイトカインの分泌を始動させることが示される。さらに、遊離５'−三リン酸基を含有する本発明のｄｓＲＮＡは、完全に用量依存的なサイトカイン分泌をもたらす。用量依存的な免疫応答を始動させる能力は、本発明による二本鎖ＲＮＡ分子を免疫賦活用のＲＮＡ薬又はアジュバントとしての利用に極めて好適なものとする。
【図２Ａ】
2014532400.tif 000003
【図２Ｂ】
2014532400.tif 000004
【図３】
2014532400.tif 000005
【図４】
2014532400.tif 000006
【図５Ａ】
2014532400.tif 000007
【図５Ｂ】
2014532400.tif 000008
【図６】
2014532400.tif 000009
【図７Ａ】
2014532400.tif 000010
【図７Ｂ】
2014532400.tif 000011
【図７Ｃ】
2014532400.tif 000012
【図８Ａ】
2014532400.tif 000013
【図８Ｂ】
2014532400.tif 000014
【図８Ｃ】
2014532400.tif 000015
【図９Ａ】
2014532400.tif 000016
【図９Ｂ】
2014532400.tif 000017
【図１０Ａ】
2014532400.tif 000018
【図１０Ｂ】
2014532400.tif 000019
【図１Ａ】
2014532400.tif 000020
【図１Ｂ】
2014532400.tif 000021
【配列表】
2014532400000001.app
【国際調査報告】
2014532400.tif 000022
2014532400.tif 000023
2014532400.tif 000024