(57)【要約】本発明は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ（Ｃｍａｈ）および／または糖タンパク質アルファ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｇｇｔａ１）が欠損している非ヒト哺乳類細胞株を提供する。グリコシル化のヒト様パターンを有する組み換えタンパク質を産生するために、本明細書に開示する細胞を使用するための方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト様グリコシル化パターンを有する組み換えタンパク質を産生するための方法であって、シチジン一リン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（Ｃｍａｈ）および／または糖タンパク質アルファ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ−１（Ｇｇｔａ１）が欠損している、非ヒト哺乳類細胞株内に前記組み換えタンパク質を発現させることを含む、方法。
【請求項２】
前記細胞株は、Ｃｍａｈをコードする不活性化された染色体配列および／またはＧｇｔａ１をコードする不活性化された染色体配列を含み、前記細胞は、低減された量のＣｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１を産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組み換えタンパク質は、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損していない比較細胞株によって産生される同一の組み換えタンパク質と比較して、低減された含有量のＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）残基および／またはガラクトース−アルファ−１，３−ガラクトース（アルファ−Ｇａｌ）残基を有する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１をコードする前記染色体配列の全てのコピーは不活性化され、前記細胞株はＣｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１を産生しない、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記組み換えタンパク質は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸／または（Ｎｅｕ５Ｇｃ）残基およびガラクトース−アルファ−１，３−ガラクトース（アルファ−Ｇａｌ）残基を欠失している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組み換えタンパク質は、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損していない比較細胞株によって産生される同一の組み換えタンパク質に対して、少なくとも１つの改善された特性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記改善された特性は、低減された免疫原生、増大された生物学的利用能、増大された有効性、増大された安定性、増大された可溶性、改善された半減期、改善されたクリアランス、および改善された薬物動態から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組み換えタンパク質は、抗体、抗体フラグメント、成長因子、サイトカイン、ホルモン、および凝固因子から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞株はＣＨＯ細胞株であり、Ｃｍａｈをコードする前記染色体配列の全てのコピーは不活性化され、前記細胞株はＣｍａｈを産生せず、前記組み換えタンパク質は、Ｎｅｕ５Ｇｃ残基を欠失している、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞株はＣＨＯ細胞株であり、Ｇｇｔａ１をコードする前記染色体配列の全てのコピーは不活性化され、前記細胞株はＧｇｔａ１を産生せず、前記組み換えタンパク質は、アルファ−Ｇａｌ残基を欠失している、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞株はＣＨＯ細胞株であり、Ｃｍａｈをコードする前記染色体配列の全てのコピーおよびＧｇｔａ１をコードする前記染色体配列の全てのコピーは不活性化され、前記細胞株はＣｍａｈもＧｇｔａ１も産生せず、前記組み換えタンパク質は、Ｎｅｕ５Ｇｃおよびアルファ−Ｇａｌ残基を欠失している、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
シチジン一リン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（Ｃｍａｈ）が欠損している、非ヒト哺乳類細胞株。
【請求項１４】
前記細胞株は、Ｃｍａｈをコードする不活性化された染色体配列を含む、請求項１３の非ヒト哺乳類細胞株。
【請求項１５】
Ｃｍａｈをコードする前記不活性化された染色体配列は、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１４に記載の非ヒト哺乳類細胞株。
【請求項１６】
前記染色体配列は、標的化エンドヌクレアーゼで不活性化される、請求項１４または請求項１５のいずれかに記載の非ヒト哺乳類細胞株。
【請求項１７】
前記標的化エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項１６に記載の非ヒト哺乳類細胞株。
【請求項１８】
Ｃｍａｈをコードする前記不活性化された染色体配列は、外因的に導入される配列を含まない、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳類細胞株。
【請求項１９】
Ｃｍａｈをコードする前記不活性化された染色体配列は、単一対立遺伝子性であり、前記細胞株は、低減された量のＣｍａｈを産生する、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳類細胞株。
【請求項２０】
Ｃｍａｈをコードする前記不活性化された染色体配列は、二対立遺伝子性であり、前記細胞株は、Ｃｍａｈを産生しない、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳類細胞株。
【請求項２１】
前記細胞株は、低減された含有量のＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）残基を有する、またはＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）残基を有さない少なくとも１つのタンパク質を産生する、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳類細胞株。
【請求項２２】
前記細胞株は、糖タンパク質アルファ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ−１（Ｇｇｔａ１）がさらに欠損している、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳類細胞株。
【請求項２３】
前記細胞株は、Ｇｇｔａ１をコードする不活性化された染色体配列を含む、請求項２２に記載の非ヒト哺乳類細胞株。
【請求項２４】
Ｇｇｔａ１をコードする前記不活性化された染色体配列は、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２３に記載の非ヒト哺乳類細胞株。
【請求項２５】
前記染色体配列は、標的化エンドヌクレアーゼで不活性化される、請求項２３または請求項２４のいずれかに記載の非ヒト哺乳類細胞株。
【請求項２６】
前記標的化エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項２５に記載の非ヒト哺乳類細胞株。
【請求項２７】
Ｇｇｔａ１をコードする前記不活性化された染色体配列は、外因的に導入される配列を含まない、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳類細胞株。
【請求項２８】
Ｇｇｔａ１をコードする前記不活性化された染色体配列は、単一対立遺伝子性であり、前記細胞株は、低減された量のＧｇｔａ１を産生する、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳類細胞株。
【請求項２９】
Ｇｇｔａ１をコードする前記不活性化された染色体配列は、二対立遺伝子性であり、前記細胞株は、Ｇｇｔａ１を産生しない、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳類細胞株。
【請求項３０】
前記細胞株は、低減された含有量のＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）残基を有する、またはＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）残基を有さない少なくとも１つのタンパク質を産生する、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳類細胞株。
【請求項３１】
前記細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である、請求項１３〜３０のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳類細胞株。
【請求項３２】
前記細胞株はＣＨＯ細胞株であり、Ｃｍａｈをコードする前記染色体配列の全てのコピーは不活性化され、前記細胞株は、Ｃｍａｈを産生しない、請求項１３に記載の非ヒト哺乳類細胞株。
【請求項３３】
前記細胞株はＣＨＯ細胞株であり、Ｃｍａｈをコードする前記染色体配列の全てのコピーおよびＧｇｔａ１をコードする前記染色体配列の全てのコピーは不活性化され、前記細胞株は、ＣｍａｈもＧｇｔａ１も産生しない、請求項２２に記載の非ヒト哺乳類細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は概して、タンパク質、および具体的には、治療タンパク質の産生に有用な細胞に関する。より具体的には、本開示は、ある特定のＮ−グリカンプロセシング酵素欠損細胞、該細胞を産生するための方法、および該細胞を使用してある特定のグリコシル化パターンを有するタンパク質を生成するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体、成長因子、サイトカイン、ホルモン、および凝固因子といった、治療タンパク質のおよそ７０％は、糖タンパク質であり、グリカンの付着によって翻訳後に修飾されたタンパク質である。Ｎ−グリカンの場所、数、および構造が、治療糖タンパク質の生体活性、可溶性、安定性、薬物動態、免疫原生、およびクリアランス速度に影響を及ぼすことが示されているため、ほとんどの組み換え治療糖タンパク質は、哺乳類発現系にて産生される。ヒトおよび他の哺乳類のタンパク質グリコシル化機構における２つの差異は、ヒト細胞によって産生される糖タンパク質と、齧歯類細胞といった、他の哺乳類細胞によって産生される糖タンパク質とのグリコシル化パターンにおける差異の主要因である。
【０００３】
第一に、ヒトは、末端ガラクトース−アルファ−１，３−ガラクトース部分（アルファ−Ｇａｌまたはα−Ｇａｌとしても既知である）をＮ−グリカン上に合成できない。酵素糖タンパク質アルファ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｇｇｔａ１）は、ガラクトース残基をα−１，３グリコシド結合（ｇｙｃｏｓｉｄｉｃ  ｂｏｎｄ）を介してＮ−グリカンの末端ガラクトースに連結することによって、α−Ｇａｌ部分を形成する。ヒトは、ＧＧＴＡ１遺伝子を有しているようであるが、それは始めの４つの翻訳されたエクソンを含有するが２つの触媒エクソンを欠いている、非機能性短縮型タンパク質をコードする発現された偽遺伝子である。ヒトは、機能性Ｇｇｔａ１酵素を発現せず、またしたがってα−Ｇａｌ部分を合成しないにもかかわらず、多くのヒトはこの構造に対する抗体を産生する。
【０００４】
第二に、ヒトは、シアル酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）を合成することができない。Ｎｅｕ５Ｇｃは、酵素ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ（Ｃｍａｈ）によるＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）のＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ｇｃへのヒドロキシル化によって産生される。ヒトＣＭＡＨ遺伝子は、不可逆的に突然変異され、Ｎｅｕ５Ａｃの発現を防ぐにもかかわらず、微量のＮｅｕ５Ｇｃがヒト血清中に検出されている。非ヒトＮｅｕ５Ｇｃは、ある特定の哺乳類由来の食物からヒト組織内へと代謝的に組み込まれることができ、本質的に全てのヒトがＮｅｕ５Ｇｃ−特異的抗体を、時として高水準にて、有するようである。
【０００５】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、１つの理由としてヒト様グリコシル化パターンを有するタンパク質を産生すると仮定されていたため、タンパク質治療薬の製造に広く使用されている。例えば、ＣＨＯ細胞は、α−Ｇａｌ部分を有する糖タンパク質を産生するための生合成機構を欠失しているということが、一般に受け入れられた。さらに、ＣＨＯ細胞はＣｍａｈを発現し、またＮｅｕ５Ｇｃ単位を有するタンパク質を産生するにもかかわらず、Ｎｅｕ５ＧｃのＮｅｕ５Ａｃ単位に対する比率は、ＣＨＯ細胞培養条件を変化させることによって低減することができる。ＣＨＯ細胞はα−Ｇａｌ部分を合成することができないという一般的認識にかかわらず、Ｇｇｔａ１のＣＨＯオルソログが近年同定されている（Ｂｏｓｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１０，２８（１１）：１１５３−１１５６）。組み換え治療糖タンパク質に対する過敏性反応の可能性のため、α−Ｇａｌおよび／またはＮｅｕ５Ｇｃ残基のない糖タンパク質を産生する、ＣＨＯ細胞株およびその他の非ヒト哺乳類細胞株への必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
手短に述べると、したがって、本開示の一態様は、シチジン一リン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（Ｃｍａｈ）が欠損している非ヒト哺乳類細胞株を提供する。一実施形態では、細胞株は、Ｃｍａｈをコードする不活性化された染色体配列を含む。ある特定の実施形態では、Ｃｍａｈをコードする不活性化された染色体配列は、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせを含む。一実施形態では、Ｃｍａｈをコードする不活性化された染色体配列は、外因的に導入される配列を含まない。別の実施形態では、Ｃｍａｈをコードする不活性化された染色体配列は、単一対立遺伝子性であり、また細胞株は、低減された量のＣｍａｈを産生する。また別の実施形態では、Ｃｍａｈをコードする不活性化された染色体配列は、二対立遺伝子性であり、また細胞株はＣｍａｈを産生しない。一実施形態では、染色体配列は、例えば、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、部位特異的エンドヌクレアーゼ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼなどの、標的化エンドヌクレアーゼで不活性化される。これらの実施形態のいずれにおいても、細胞株は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）残基を欠失するタンパク質を産生することができる。
【０００７】
本開示の別の態様では、Ｃｍａｈ欠損細胞株は、Ｇｇｔａ１も欠損している。この細胞株の一実施形態では、細胞株は、Ｇｇｔａ１をコードする不活性化された染色体配列を含む。ある特定の実施形態では、Ｇｇｔａ１をコードする不活性化された染色体配列は、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせを含む。一実施形態では、Ｇｇｔａ１をコードする不活性化された染色体配列は、外因的に導入される配列を含まない。一実施形態では、Ｇｇｔａ１をコードする不活性化された染色体配列は、単一対立遺伝子性であり、また細胞株は、低減された量のＧｇｔａ１を産生する。別の実施形態では、Ｇｇｔａ１をコードする不活性化された染色体配列は、二対立遺伝子性であり、また細胞株は、Ｇｇｔａ１を産生しない。別の実施形態では、染色体配列は、例えば、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、部位特異的エンドヌクレアーゼ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼなどの、標的化エンドヌクレアーゼで不活性化される。これらの実施形態のいずれにおいても、非ヒト哺乳類細胞株は、ガラクトース−アルファ−１，３−ガラクトース（アルファ−Ｇａｌ）残基を追加的に欠失するタンパク質を産生することができる。
【０００８】
一実施形態では、細胞株は、Ｃｍａｈをコードする染色体配列の単一対立遺伝子性不活性化およびＧｇｔａ１をコードする染色体配列の単一対立遺伝子性不活性化を含み、また細胞株は、低減された量のＣｍａｈおよび低減された量のＧｇｔａ１を産生する。別の実施形態では、細胞株は、Ｃｍａｈをコードする染色体配列の二対立遺伝子性不活性化およびＧｇｔａ１をコードする染色体配列の二対立遺伝子性不活性化を含み、また細胞株は、ＣｍａｈもＧｇｔａ１も産生しない。具体的実施形態では、非ヒト哺乳類細胞株は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）残基およびガラクトース−アルファ−１，３−ガラクトース（アルファ−Ｇａｌ）残基を欠失するタンパク質を産生する。
【０００９】
本発明の具体的実施形態では、細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。一実施形態では、ＣＨＯ細胞株は、Ｃｍａｈをコードする染色体配列の単一対立遺伝子性不活性化を含み、低減された量のＣｍａｈを産生する。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞株は、Ｃｍａｈをコードする染色体配列の二対立遺伝子性不活性化を含み、Ｃｍａｈを産生しない。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞株は、Ｃｍａｈをコードする染色体配列の単一対立遺伝子性不活性化とＧｇｔａ１をコードする染色体配列の単一対立遺伝子性不活性化とを含み、低減された量のＣｍａｈと低減された量のＧｇｔａ１とを産生する。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞株は、Ｃｍａｈをコードする染色体配列の二対立遺伝子性不活性化とＧｇｔａ１をコードする染色体配列の二対立遺伝子性不活性化とを含み、ＣｍａｈもＧｇｔａ１も産生しない。一実施形態では、ＣＨＯ細胞株は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）残基およびガラクトース−アルファ−１，３−ガラクトース（アルファ−Ｇａｌ）残基を欠失しているタンパク質を産生する。
【００１０】
別の態様では、本開示は、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損している細胞株を産生するための方法を包含する。一実施形態では、方法は、Ｃｍａｈをコードする染色体配列に関する標的化エンドヌクレアーゼまたは標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸を、細胞株内へ導入することを含む。別の実施形態では、方法は、Ｇｇｔａ１をコードする染色体配列に関する標的化エンドヌクレアーゼまたは標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸を、Ｃｍａｈが欠損している細胞株内へ導入することを含む。別の実施形態では、方法は、Ｃｍａｈをコードする染色体配列に関する標的化エンドヌクレアーゼまたは標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸、およびＧｇｔａ１をコードする染色体配列に関する標的化エンドヌクレアーゼまたは標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸を、細胞株内へ導入することを含む。
【００１１】
本開示の別の態様は、ヒト様グリコシル化パターンを有する組み換えタンパク質を産生するための方法を包含する。方法は、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損している非ヒト哺乳類細胞株内にタンパク質を発現させることを含む。１つの特定の実施形態では、細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。一実施形態では、細胞株は、Ｃｍａｈをコードする不活性化された染色体配列および／またはＧｇｔａ１をコードする不活性化された染色体配列を含む。一実施形態では、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１をコードする不活性化された染色体配列は、単一対立遺伝子性であり、細胞株は、低減された量のＣｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１を産生する。別の実施形態では、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１をコードする不活性化された染色体配列は、二対立遺伝子性であり、細胞株は、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１を産生しない。別の実施形態では、組み換えタンパク質は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）残基および／またはガラクトース−アルファ−１，３−ガラクトース（アルファ−Ｇａｌ）残基を欠失している。一実施形態では、組み換えタンパク質は、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１を欠損していない比較細胞株によって産生される類似の組み換えタンパク質に対して、例えば、低減された免疫原生、増大された生物学的利用能、増大された有効性、増大された安定性、増大された可溶性、改善された半減期、改善されたクリアランス、改善された薬物動態、およびそれらの組み合わせなどの、少なくとも１つの改善された特性を有する。組み換えタンパク質は、治療タンパク質を含む、任意のタンパク質であり得る。例示的なタンパク質としては、抗体、抗体フラグメント、成長因子、サイトカイン、ホルモン、凝固因子、および機能性フラグメントまたはその変異体から選択されるものが挙げられる。
【００１２】
本開示の他の態様および反復形態を、以下により詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】は、ＣＨＯ細胞内のＧｇｔａ１遺伝子座のＺＦＮ−媒介切断を例証する。Ｃｅｌ−１サーベイヤーヌクレアーゼ分析の結果が示されている。矢印は、ＺＦＮ  ｍＲＮＡ（１）またはＺＦＮ  ＤＮＡ（２）でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞内の２１５ｂｐおよび１００ｂｐの切断産物を示す。モックトランスフェクト細胞（３）内には、切断産物は検出されなかった。
【００１４】
【図２】は、Ｃｅｌ−１サーベイヤーヌクレアーゼ分析によって検出された、ＣＨＯ細胞内のＣｍａｈ遺伝子座のＺＦＮ−媒介切断を記録する。矢印は、切断産物を示す。
【００１５】
【図３】は、Ｃｅｌ−１サーベイヤーヌクレアーゼ分析によって検出された、Ｃｍａｈ（−／−）細胞内のＧｇｔａ１遺伝子座のＺＦＮ−媒介切断を例証する。ＺＦＮ−トランスフェクト細胞（「＃１」および「＃２」として表示）は、２１５ｂｐおよび１００ｂｐの切断フラグメントを有したが、モックトランスフェクト細胞は有さなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本開示は、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損している非ヒト哺乳類細胞株を提供する。一実施形態では、細胞株は、該細胞株が低減された量のＣｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１を産生するようにＣｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１をコードする、不活性化された染色体配列を含む。別の実施形態では、細胞株は、該細胞株がＣｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１を産生しないように、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１をコードする、不活性化された染色体配列を含む。本明細書に開示する細胞株を作製するための方法、および本明細書に開示する細胞株を使用して、グリコシル化のヒト様パターンを有する組み換えタンパク質を産生するための方法も、本明細書に提供される。細胞株は、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損するため、細胞株は、低減されたＮｅｕ５Ｇｃおよび／またはα−Ｇａｌ含有量を有する組み換え糖タンパク質、または、Ｎｅｕ５Ｇｃおよび／またはα−Ｇａｌを欠失している糖タンパク質を産生する。
【００１７】
（Ｉ）  Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損する細胞株
本開示の一態様は、シチジン一リン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（Ｃｍａｈ）および／または糖タンパク質アルファ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｇｇｔａ１）が欠損している非ヒト哺乳類細胞株を提供する。
【００１８】
（ａ）  ＣｍａｈおよびＧｇｔａ１
ＣｍａｈおよびＧｇｔａ１は、糖タンパク質上のＮ−グリカンの生成に関与する酵素である。Ｃｍａｈは、シアル酸Ｎｅｕ５Ａｃのそのヒドロキシル化誘導体Ｎｅｕ５Ｇｃへの変換を触媒する。Ｇｇｔａ１は、α−１，３グリコシド結合（ｇｙｃｏｓｉｄｉｃ  ｂｏｎｄ）を介してガラクトース残基をＮ−グリカン上のガラクトースへ連結して、末端Ｇａｌ−α−１，３−Ｇａｌ（すなわち、α−Ｇａｌ）部分を形成する。一実施形態では、細胞株はＣｍａｈが欠損する。別の実施形態では、細胞株はＧｇｔａ１が欠損する。また別の実施形態では、細胞株はＣｍａｈおよびＧｇｔａ１の双方が欠損する。
【００１９】
いくつかの例において、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１を欠損する細胞株は、親細胞株に対して低減されたレベルのＣｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１を有してもよい。例えば、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１のレベルは、欠損していないＣｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１親細胞株に対して、約５％〜約１０％、約１０％〜約２０％、約２０％〜約３０％、約３０％〜約４０％、約４０％〜約５０％、約５０％〜約６０％、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約９０％、または約９０％〜約９９．９％低減されてもよい。低減されたレベルのＣｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１を有する細胞株は、概して、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損していない比較細胞によって産生されるタンパク質に対して、低減されたＮｅｕ５Ｇｃおよび／またはα−Ｇａｌ含有量を有するタンパク質を産生するであろう。
【００２０】
他の例において、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損している細胞株は、本質的にＣｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１を産生しないことができる。本明細書で使用するとき、用語「本質的にＣｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１を〜ない」は、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１  ｍＲＮＡまたはタンパク質が、欠損細胞またはそれから誘導された溶解物中に、当該技術分野において既知の手順を用いて検出され得ないことを意味する。ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを決定するための好適な手順の非限定的例としては、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ウエスタンブロット法、およびＥＬＩＳＡ分析が挙げられる。したがって、欠損細胞または溶解物中に検出されるＣｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１  ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルは、背景レベルと本質的に同じである。Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠けている細胞株は概して、Ｎｅｕ５Ｇｃおよび／またはα−Ｇａｌ残基を欠失しているタンパク質を産生するであろう。
【００２１】
いくつかの実施形態では、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損している細胞株のゲノムは、Ｃｍａｈをコードする染色体配列および／またはＧｇｔａ１をコードする染色体配列が不活性化されるように編集されてよい。本明細書で使用するとき、用語「不活性化された染色体配列」は、機能性遺伝子産物を生成することができない染色体配列を指す。細胞株が正倍数性の細胞を含む一実施形態では、不活性化された染色体配列は、細胞が低減されたレベルのＣｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１を産生するように、単一対立遺伝子性であってもよい。細胞株が正倍数性である別の実施形態では、不活性化された染色体配列は、細胞が本質的にＣｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１を産生しないように、二対立遺伝子性であってもよく、またその細胞は「ノックアウト」細胞と称されることもある。別法として、細胞株が異数性である他の実施形態では、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１をコードする染色体配列（単数または複数）の１つ以上のコピーは、不活性化され、低減された量のＣｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１をもたらす。細胞株が異数性である別の実施形態では、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１をコードする染色体配列（単数または複数）の全てのコピーは、不活性化され、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１遺伝子発現の完全な欠落をもたらす。
【００２２】
Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１をコードする不活性化された染色体配列は、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、または少なくとも１つのヌクレオチドの置換を含んでもよい。Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１をコードする染色体配列は、章（ＩＩ）にて後述する通り、標的化エンドヌクレアーゼ媒介ゲノム編集技術を用いて不活性化されてもよい。種々の実施形態において、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１をコードする染色体配列は、全てもしくは一部のエクソンコード領域の欠失、全てもしくは一部の制御領域の欠失、および／またはスプライス部位の欠失によって、細胞株がＣｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１を産生することができないように不活性化されてもよい。他の実施形態では、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１をコードする染色体配列は、未成熟終止コドン、新規のスプライス部位、および／またはＳＮＰを染色体配列へ導入するような欠失、挿入、および／もしくはヌクレオチド置換を介して、細胞株がＣｍａｈおよび／もしくはＧｇｔａ１を産生することができないように不活性化されてもよい。
【００２３】
一実施形態では、細胞株は、Ｃｍａｈをコードする染色体配列内の少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、および／または置換に起因する、Ｃｍａｈをコードする不活性化された染色体配列を含んでもよい。例えば、Ｃｍａｈをコードする染色体配列は、Ｃｍａｈをコードする染色体配列のエクソン５内の少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、および／または置換に起因して不活性化されてもよい。別の実施形態では、細胞株は、Ｇｇｔａ１をコードする染色体配列内の少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、および／または置換に起因する、Ｇｇｔａ１をコードする不活性化された染色体配列を含んでもよい。例えば、Ｇｇｔａ１をコードする染色体配列は、Ｇｇｔａ１をコードする染色体配列のエクソン９内の少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、および／または置換に起因して不活性化されてもよい。
【００２４】
いくつかの実施形態では、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損している細胞株は、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、またはそれらの組み合わせも欠損してもよい。ＧＳ、ＤＨＦＲ、および／またはＨＰＲＴの欠損をさらに含む細胞株は、ＧＳ、ＤＨＦＲ、および／またはＨＰＲＴをコードする不活性化された染色体配列に起因して、ＧＳ、ＤＨＦＲ、および／またはＨＰＲＴを欠損してもよい。
【００２５】
（ｂ）  細胞型
Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損している細胞株の型は、多数の好適な細胞型のうちの任意のものであることができる。概して、細胞株は、非ヒト哺乳類細胞株である。好適な非ヒト哺乳類細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、マウス骨髄腫ＮＳ０細胞、マウス胎仔線維芽細胞３Ｔ３細胞、マウスＢリンパ腫Ａ２０細胞、マウスメラノーマＢ１６細胞、マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞、マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞、マウス胚間葉Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２細胞、マウスカルシノーマＣＴ２６細胞、マウス前立腺ＤｕＣｕＰ細胞、マウス乳房ＥＭＴ６細胞、マウス肝癌Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞、マウス骨髄腫Ｊ５５８２細胞、マウス上皮ＭＴＤ−１Ａ細胞、マウス心筋ＭｙＥｎｄ細胞、マウス腎臓ＲｅｎＣａ細胞、マウス膵臓ＲＩＮ−５Ｆ細胞、マウスメラノーマＸ６４細胞、マウスリンパ腫ＹＡＣ−１細胞、ラット膠芽腫９Ｌ細胞、ラットＢリンパ腫ＲＢＬ細胞、ラット神経芽細胞腫Ｂ３５細胞、ラット肝癌細胞（ＨＴＣ）、バッファローラット肝臓ＢＲＬ３Ａ細胞、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、イヌ乳房（ＣＭＴ）細胞、ラット骨肉腫Ｄ１７細胞、ラット単核／マクロファージＤＨ８２細胞、サル腎臓ＳＶ−４０形質転換線維芽（ＣＯＳ７）細胞、サル腎臓ＣＶＩ−７６細胞、およびアフリカミドリザル腎臓（ＶＥＲＯ−７６）細胞が挙げられるがこれらに限定されない。非ヒト哺乳類細胞株の広範なリストは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎカタログ（ＡＴＣＣ，Ｍａｍａｓｓａｓ，ＶＡ）に見出すことが可能である。一実施形態では、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損している細胞株は、マウス細胞株以外である。また別の実施形態では、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損している細胞株は、ブタ細胞株以外である。
【００２６】
いくつかの実施形態では、細胞株は、組み換えグリコールタンパク質の産生に広範に使用される型のものである。例示的実施形態では、細胞株はＣＨＯ細胞株である。多数のＣＨＯ細胞株が、ＡＴＣＣおよび商業的販売者から入手可能である。好適なＣＨＯ細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびその誘導体、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞、ＣＨＯ  Ｐ１２細胞、ＣＨＯ  ｐｒｏ３−細胞、ＣＨＯ／ＤＨＦＲ−細胞、ＣＨＯ／ＧＳ−、ならびにＣＨＯ  ＤＸＢ１１細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２７】
（ｃ）  任意的な核酸
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される非ヒト哺乳類細胞株は、組み換えタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含んでもよい。組み換えタンパク質は、制限を伴うことなく、抗体、抗体のフラグメント、単クローン性抗体、ヒト化抗体、ヒト化単クローン性抗体、キメラ抗体、ＩｇＧ分子、ＩｇＧ重鎖、ＩｇＧ軽鎖、ＩｇＡ分子、ＩｇＤ分子、ＩｇＥ分子、ＩｇＭ分子、糖タンパク質、成長因子、サイトカイン、インターフェロン、インターロイキン、ホルモン、凝固（もしくは凝集）因子、血液成分、酵素、治療タンパク質、機能性食品タンパク質、ワクチン、前述のもののいずれかの機能性フラグメントもしくは機能性変異体、あるいは前述のタンパク質および／またはその機能性フラグメントもしくは変異体のうちのいずれかを含む融合タンパク質であってもよい。
【００２８】
いくつかの実施形態では、組み換えタンパク質をコードする核酸配列は、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、および／またはグルタミンシンターゼ（ＧＳ）をコードする核酸配列に連結されてもよく、その結果、ＨＰＲＴ、ＤＨＦＲ、および／またはＧＳは増幅可能な選択マーカーとして使用されてもよい。
【００２９】
いくつかの実施形態では、組み換えタンパク質をコードする核酸配列は、染色体外であってもよい。すなわち、組み換えタンパク質をコードする核酸は、プラスミド、コスミド、人工染色体、ミニ染色体などから一時的に発現されてもよい。当業者は、好適な発現構築体、適切な発現制御配列、および該構築体の細胞内への導入方法に通じている。
【００３０】
他の実施形態では、組み換えタンパク質をコードする核酸配列は、組み換えタンパク質が安定して発現するように、細胞のゲノム内に染色体的に統合されてもよい。本実施形態のいくつかの反復形態では、組み換えタンパク質をコードする核酸配列は、適切な異種発現制御配列（すなわち、プロモーター）に操作可能に連結されてよい。他の反復形態では、組み換えタンパク質をコードする核酸配列は、内因性発現制御配列の制御下に置かれてもよい。組み換えタンパク質をコードする核酸配列は、周知の技術を用いて、細胞株のゲノム内へ統合されることができる。
【００３１】
外因性核酸配列（例えば、組み換えタンパク質をコードするもの）を調製および導入するための方法、ベクター、およびクローン化技術は、当該技術分野において周知である（例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００３または「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１を参照）。
【００３２】
（ｄ）  例示的実施形態
１つの特定の実施形態では、細胞株は、Ｃｍａｈをコードする染色体配列の単一対立遺伝子性または二対立遺伝子性不活性化を含むＣＨＯ細胞株である。別の特定の実施形態では、細胞株は、Ｇｇｔａ１をコードする染色体配列の単一対立遺伝子性または二対立遺伝子性不活性化を含むＣＨＯ細胞株である。また別の実施形態では、細胞株は、Ｃｍａｈをコードする染色体配列の単一対立遺伝子性または二対立遺伝子性不活性化、およびＧｇｔａ１をコードする染色体配列の単一対立遺伝子性または二対立遺伝子性不活性化を含むＣＨＯ細胞株である。
【００３３】
（ＩＩ）  Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損している細胞株を調製するための方法
Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損している細胞株は、種々の方法によって調製することができる。ある特定の実施形態では、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損している細胞株は、標的化エンドヌクレアーゼ媒介ゲノム編集プロセスによって調製することができる。他の実施形態では、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損している細胞株は、ＲＮＡｉ法、ランダム変異誘発、部位特異的組み換えシステム、または当該技術分野において既知の他の方法によって調製することができる。
【００３４】
（ａ）  標的化エンドヌクレアーゼ媒介ゲノム編集
標的化エンドヌクレアーゼは、特定の染色体配列を編集（すなわち、不活性化または修正）するために使用されることができる。特定の染色体配列は、特定の染色体配列を標的にするように改変される、標的化エンドヌクレアーゼまたは標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸を細胞内に導入することによって不活性化されることができる。一実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼは、特定の染色体配列を認識および結合し、また非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）修復プロセスによって修復される二重鎖切断を導入する。ＮＨＥＪは誤りがちであるため、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、または置換が生じることがあり、それによって染色体配列の読み枠を、タンパク質産物が産生されないように中断する。別の実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼはまた、標的化された染色体配列の一部分と実質的配列同一性を有するポリヌクレオチドを共導入することによって、相同的組み換え反応を介して染色体配列を編集するために使用されることもできる。標的化エンドヌクレアーゼによって導入される二重鎖切断は、相同依存性修復プロセスによって修復され、その結果、染色体配列が、編集される染色体配列をもたらす方法でポリヌクレオチドと交換される。
【００３５】
（ｉ）  標的化エンドヌクレアーゼ
種々の標的化エンドヌクレアーゼを使用して、染色体配列を編集することができる。標的化エンドヌクレアーゼは、天然起源タンパク質であってもよく、または改変タンパク質であってもよい。一実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼであってよい。メガヌクレアーゼは、長い認識配列、すなわち、一般に約１２塩基対〜約４０塩基対の範囲にわたる認識配列によって特徴付けられる、エンドデオキシリボヌクレアーゼである。この要件の結果として、認識配列は一般に、任意の所与のゲノムにおいて一度しか生じない。メガヌクレアーゼの中で、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧという名のホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーは、ゲノム研究およびゲノム工学のための有益なツールとなっている。メガヌクレアーゼは、当業者に周知の技術を用いてその認識配列を修飾することによって、特定の染色体配列に対して標的化されてよい。
【００３６】
別の実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼは、転写活性化物質様エフェクタ（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼであってもよい。ＴＡＬＥは、新規のＤＮＡ標的に結合するように容易に改変されることが可能な植物病原体ザントモナスからの転写因子である。ＴＡＬＥまたはその短縮形は、例えば、ＦｏｋＩといった、エンドヌクレアーゼの触媒ドメインに連結されて、ＴＡＬＥヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮと呼ばれる標的化エンドヌクレアーゼを生成してもよい。
【００３７】
また別の実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼは、部位特異的エンドヌクレアーゼであってもよい。具体的には、部位特異的エンドヌクレアーゼは、その認識配列がゲノム内でほとんど生じない「低頻度切断酵素」エンドヌクレアーゼであってもよい。好ましくは、部位特異的エンドヌクレアーゼの認識配列は、ゲノム内で一度のみ生じる。代替的なさらなる実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼは、人工標的ＤＮＡ二重鎖切断誘発剤であってもよい。
【００３８】
他の実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であってもよい。典型的には、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合ドメイン（すなわち、ジンクフィンガー）と切断ドメイン（すなわち、ヌクレアーゼ）とを含み、そのどちらも後述される。
【００３９】
ジンクフィンガー結合ドメイン  ジンクフィンガー結合ドメインは、任意の選択の核酸配列を認識し、それに結合するように改変することができる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１、Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０、Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０、Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７、Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３８５０−３３８６０、Ｄｏｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：７０２−７０８、およびＳａｎｔｉａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０５：５８０９−５８１４を参照されたい。改変されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然起源ジンクフィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有することがある。改変方法としては、合理的設計および様々な種類の選択が挙げられるが、これらに限定されない。合理的設計は、例えば、各二重、三重、または四重ヌクレオチド配列が特定の三重または四重配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列に関連付けられる、二重、三重、および／または四重ヌクレオチド配列と個々のジンクフィンガーアミノ酸配列とを含むデータベースを使用することを含む。例えば、その開示が参照によりその全体を本明細書に援用される、米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。一例として、米国特許第６，４５３，２４２号に記載されるアルゴリズムを使用して、事前に選択した配列を標的にするようにジンクフィンガー結合ドメインを設計することができる。代替的方法、例えば、非縮重認識コード表を使用する合理的設計も、特定の配列を標的にするようにジンクフィンガー結合ドメインを設計するために使用されてよい（Ｓｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４１：７０７４−７０８１）。ＤＮＡ配列内の潜在的標的部位を同定するための、およびジンクフィンガー結合ドメインを設計するための公的に入手可能なウェブツールが、当該技術分野において既知である。例えば、ＤＮＡ配列内の潜在的標的部位を同定するためのツールは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｔｏｏｌｓ．ｏｒｇに見出すことができる。ジンクフィンガー結合ドメインを設計するためのツールは、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｎｄｒ．ｇｄｃｂ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ＺｉＦｉＴ／に見出すことができる。（Ｍａｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３４：Ｗ５１６−Ｗ５２３、Ｓａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３５：Ｗ５９９−Ｗ６０５も参照されたい。）
【００４０】
ジンクフィンガー結合ドメインは、約３ヌクレオチド〜約２１ヌクレオチドの長さ、または好ましくは約９〜約１８ヌクレオチドの長さにわたるＤＮＡ配列を認識および結合するように、設計されることができる。概して、本明細書に開示されるジンクフィンガーヌクレアーゼのジンクフィンガー結合ドメインは、少なくとも３つのジンクフィンガー認識領域（すなわち、ジンクフィンガー）を含む。一実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、４つのジンクフィンガー認識領域を含む。別の実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、５つのジンクフィンガー認識領域を含む。また別の実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、６つのジンクフィンガー認識領域を含む。ジンクフィンガー結合ドメインは、任意の好適な標的ＤＮＡ配列に結合するように設計されることができる。例えば、その開示が参照によりその全体を本明細書に援用される、米国特許第６，６０７，８８２号、同第６，５３４，２６１号、および同第６，４５３，２４２号を参照されたい。
【００４１】
ジンクフィンガー認識領域を選択する例示的方法としては、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３、４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号、ならびに国際公開第９８／３７１８６号、国際公開第９８／５３０５７号、国際公開第００／２７８７８号、国際公開第０１／８８１９７号、ならびに英国特許第２，３３８，２３７号に開示されるファージディスプレイおよび二重ハイブリッドシステムを挙げることができ、そのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に援用される。それに加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに関する結合特異性の強化は、例えば、国際公開第０２／０７７２２７号に開示されており、その全体の開示は参照により本明細書に援用される。
【００４２】
ジンクフィンガー結合ドメインならびに融合タンパク質（および、同一のものをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に既知であり、例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許第７，８８８，１２１号に詳細に記載される。ジンクフィンガー認識領域および／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、例えば、５つ以上のアミノ酸の長さのリンカーを含む、好適なリンカー配列を用いて、一緒に連結されることができる。６つ以上のアミノ酸の長さのリンカー配列の非限定的例に関しては、その開示が参照によりその全体を本明細書に援用される米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載するジンクフィンガー結合ドメインは、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーの組み合わせを含んでよい。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、核局在シグナルまたは配列（ＮＬＳ）をさらに含む。ＮＬＳは、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質を細胞核内へ標的化することを促進して、染色体内の標的配列において二重鎖切断を導入するアミノ酸配列である。核局在シグナルは、当該技術分野において既知である。例えば、Ｍａｋｋｅｒｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ６：１０２５−１０２７を参照されたい。
【００４４】
切断ドメイン  ジンクフィンガーヌクレアーゼはまた、切断ドメインを含む。ジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから獲得されてよい。切断ドメインが生じ得るエンドヌクレアーゼの非限定的例としては、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＣａｔａｌｏｇまたはＢｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断する追加の酵素が既知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵ＤＮａｓｅ  Ｉ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ）。同様に、Ｌｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照されたい。これらの酵素（またはその機能性フラグメント）のうちの１つ以上は、切断ドメインの源として使用されてもよい。
【００４５】
切断ドメインはまた、上述の通り、切断活性に対する二量化を必要とする酵素またはその一部から導かれてもよい。各ヌクレアーゼは活性酵素ダイマーのモノマーを含むため、切断のために２つのジンクフィンガーヌクレアーゼを必要とする可能性がある。別法としては、単一のジンクフィンガーヌクレアーゼが、活性酵素ダイマーを生成するための両方のモノマーを含んでもよい。本明細書で使用するとき、「活性酵素ダイマー」は、核酸分子を切断することが可能な酵素ダイマーである。２つの切断モノマーは、同一のエンドヌクレアーゼ（またはその機能性フラグメント）から導かれてもよく、または各モノマーは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能性フラグメント）から導かれてもよい。
【００４６】
２つの切断モノマーを使用して活性酵素ダイマーを形成する場合、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼに対する認識部位は好ましくは、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼのそのぞれぞれの認識部位への結合が、切断モノマーを、切断モノマーが活性酵素ダイマーを、例えば、二量化によって、形成することを可能にする空間的配向に互いに定置するように配置される。その結果、認識部位の近端は、約５〜約１８個のヌクレオチドによって分離されることができる。例えば、近端は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個のヌクレオチドによって分離されることができる。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対（例えば、約２〜約５０個のヌクレオチド対またはそれ以上）が、２つの認識部位間に介在してもよいことが理解されるであろう。例えば、本明細書に詳細に記載するものといった、ジンクフィンガーヌクレアーゼの認識部位の近端は、６個のヌクレオチドによって分離されてもよい。概して、切断の部位は、認識部位間に存在する。
【００４７】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、（認識部位における）ＤＮＡへの配列特異性結合、および結合部位における、または結合部位付近でのＤＮＡ切断を可能にする。ある特定の制限酵素（例えば、Ｔｙｐｅ  ＩＩＳ）は、ＤＮＡを認識部位から除去された部位にて切断し、また分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えば、Ｔｙｐｅ  ＩＩＳ酵素ＦｏｋＩは、１つの鎖上でその認識部位から９ヌクレオチドにおいて、また他の鎖上でその認識部位から１３ヌクレオチドにおいて、ＤＮＡの二重鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、および同第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４２７５−４２７９、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２７６４−２７６８、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：８８３−８８７、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１９７８−３１９８２を参照されたい。したがって、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、少なくとも１つのＴｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素からの切断ドメインと、１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインとを含んでもよく、それは改変されていてもされていなくてもよい。例示的Ｔｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素は、例えば、その開示が参照によりその全体を本明細書に援用される国際公開第０７／０１４，２７５号に記載される。追加の制限酵素も、分離可能な結合および切断ドメインを含有し、これらも同様に本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照されたい。
【００４８】
例示的Ｔｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素であって、その切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的Ｔｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、ダイマーとして活性である（Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１０，５７０−１０，５７５）。したがって、本開示の目的のため、ジンクフィンガーヌクレアーゼ内で使用されるＦｏｋＩ酵素の部分は、切断モノマーとみなされる。それゆえ、ＦｏｋＩ切断ドメインを用いて標的化される二重鎖切断に対して、それぞれＦｏｋＩ切断モノマーを含む２つのジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、活性酵素ダイマーを再構成することができる。別法として、ジンクフィンガー結合ドメインを含有する単一のポリペプチド分子と２つのＦｏｋＩ切断モノマーとを使用することもできる。
【００４９】
ある特定の実施形態では、切断ドメインは、ホモ二量体化を最小にするまたは予防する１つ以上の改変された切断モノマーを含む。非限定的例として、ＦｏｋＩの位置４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８におけるアミノ酸残基は、全てＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量化に影響を及ぼすための標的である。偏性ヘテロダイマーを形成する例示的なＦｏｋＩの改変切断モノマーとしては、第１の切断モノマーがＦｏｋＩのアミノ酸残基位置４９０および５３８にて突然変異を含み、また第２の切断モノマーがアミノ酸残基位置４８６および４９９にて突然変異を含む対が挙げられる。
【００５０】
したがって、一実施形態では、アミノ酸位置４９０における突然変異はＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え、アミノ酸残基５３８における突然変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え、アミノ酸残基４８６における突然変異はＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置き換え、また位置４９９における突然変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換える。特に、改変切断モノマーは、１つの切断モノマーにおいて位置４９０をＥからＫに、また５３８をＩからＫに突然変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と指定される改変切断モノマーを産生することによって、および別の切断モノマーにおいて位置４８６をＱからＥに、また４９９をＩからＬに突然変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と指定される改変切断モノマーを産生することによって、調製することができる。上述の改変切断モノマーは、異常切断が最小化または無効にされる偏性ヘテロダイマー変異である。改変切断モノマーは、例えば、その全体が本明細書に援用される米国特許第７，８８８，１２１号に記載されるように、野生型切断モノマー（ＦｏｋＩ）の部位特異的変異誘発によってなど、好適な方法を用いて調製することができる。
【００５１】
（ｉｉ）  任意的なポリヌクレオチド
標的化ゲノム編集のための方法は、標的化切断部位の少なくとも一方の側上の配列に対して実質的な配列同一性を有する配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを、細胞内に導入することをさらに含んでもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、標的化切断部位の一方の側上の配列に対して実質的な配列同一性を有する第１の配列と、標的化切断部位の他方の側上の配列に対して実質的な配列同一性を有する第２の配列とを含んでもよい。別法としては、ポリヌクレオチドは、標的化切断部位の一方の側上の配列に対して実質的な配列同一性を有する第１の配列と、標的化切断部位から離れて位置する配列に対して実質的な配列同一性を有する第２の配列とを含んでもよい。標的化切断部位から離れて位置する配列は、標的化切断部位の数十、数百、または数千ヌクレオチド上流または下流であってよい。
【００５２】
染色体配列内の配列に対して実質的な配列同一性を有するポリヌクレオチド内の第１および第２の配列の長さは、変動することができ、また変動するであろう。概して、ポリヌクレオチド内の第１および第２の配列のそれぞれは、少なくとも約１０ヌクレオチドの長さである。種々の実施形態において、染色体配列と実質的な配列同一性を有するポリヌクレオチド配列は、約１５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、または１００を超えるヌクレオチドの長さである。
【００５３】
「実質的な配列同一性」というフレーズは、ポリヌクレオチド内の配列が、関心の染色体配列と少なくとも約７５％の配列同一性を有することを意味する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド内の配列は、関心の染色体配列と、約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【００５４】
ポリヌクレオチドの長さは、変動することができ、また変動するであろう。例えば、ポリヌクレオチドは、約２０ヌクレオチドの長さから、最大約２００，０００ヌクレオチドの長さの範囲にわたってもよい。種々の実施形態では、ポリヌクレオチドは、約２０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さ、約１００ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチドの長さ、約１０００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチドの長さ、約１０，０００ヌクレオチド〜約１００，０００ヌクレオチドの長さ、または約１００，０００ヌクレオチド〜約２００，０００ヌクレオチドの長さの範囲にわたる。
【００５５】
典型的には、ポリヌクレオチドはＤＮＡであろう。ＤＮＡは、単一鎖であっても、または二重鎖であってもよい。供与体ポリヌクレオチドは、ＤＮＡプラスミド、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウィルスベクター、ＤＮＡの線形部分、ＰＣＲフラグメント、ネイキッド核酸、または、例えば、リポソームまたはポロキサマといった、送達賦形剤と複合体化された核酸であってもよい。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、マーカーをさらに含んでもよい。好適なマーカーの非限定的例としては、制限部位、蛍光タンパク質、または選択マーカーが挙げられる。かかるマーカーは、標的化された組み込みに関してスクリーニングすることが可能である。
【００５７】
（ｉｉｉ）  細胞内への導入
標的化エンドヌクレアーゼは、タンパク質として、または標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸として、細胞内へ導入することができる。標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡであってもまたはＲＮＡ（すなわち、ｍＲＮＡ）であってもよい。コード核酸がｍＲＮＡである実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップ化および／または３’ポリアデニル化されてもよい。コード核酸がＤＮＡである実施形態では、ＤＮＡは、線形であってもまたは円形であってもよい。ＤＮＡは、ベクターの一部であってもよく、コードＤＮＡは、所望により好適なプロモーターに操作可能に連結される。当業者は、適切なベクター、プロモーター、他の制御要素、および関心の細胞内へベクターを導入する手段に精通している。
【００５８】
上述の標的化エンドヌクレアーゼまたは標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸および任意的なポリヌクレオチドは、種々の手段によって細胞内に導入することができる。好適な送達手段としては、微量注射、エレクトロポレーション、ソノポレーション、遺伝子銃、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、カチオン性トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペールフェクション、光学トランスフェクション、専売薬剤強化性核酸取り込み、およびリポソーム、イムノリポソーム、ビロソーム、または人工ビリオンを介した送達が挙げられる。ある特定の実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼ分子および任意的なポリヌクレオチドは、ヌクレオフェクションまたはエレクトロポレーションによって細胞内に導入される。
【００５９】
複数の標的化エンドヌクレアーゼ分子および複数のポリヌクレオチドが細胞内に導入される実施形態では、分子は、同時にまたは順次導入することができる。例えば、それぞれ標的化切断部位に特異的な標的化エンドヌクレアーゼ分子類（および任意的なポリヌクレオチド）を、同時に導入することができる。別法としては、各標的化エンドヌクレアーゼ分子、および任意的なポリヌクレオチド（単数または複数）は、順次導入することができる。
【００６０】
標的化エンドヌクレアーゼ（またはコード核酸）分子の任意的なポリヌクレオチドに対する比率は、変化することができ、また変化するであろう。一般に、標的化エンドヌクレアーゼ分子のポリヌクレオチドに対する比率は、約１：１０〜約１０：１の範囲にわたってよい。種々の実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼ分子のポリヌクレオチドに対する比率は、約１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または１０：１である。一実施形態では、比率は約１：１である。
【００６１】
（ｂ）  ＲＮＡ干渉
別の実施形態では、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損している細胞株は、標的ｍＲＮＡの発現または転写を阻害するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤を使用して調製することができる。ＲＮＡｉ剤は、標的ｍＲＮＡの切断または転写を導くことができる。別法としては、ＲＮＡｉ剤は、タンパク質内への標的ｍＲＮＡの翻訳を阻止または中断することができる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であってよい。概して、ｓｉＲＮＡは、約１５〜約２９ヌクレオチドの長さの範囲にわたる二重鎖ＲＮＡ分子を含む。ｓｉＲＮＡは、約１６〜１８、１７〜１９、２１〜２３、２４〜２７、または２７〜２９ヌクレオチドの長さであってよい。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、約２１ヌクレオチドの長さである。ｓｉＲＮＡは、所望により、一方または両方の末端に、例えば、３’オーバーハングなどの、１つまたは２つの一本鎖オーバーハングをさらに含んでもよい。ｓｉＲＮＡは、一緒にハイブリッド形成する２つのＲＮＡ分子から形成されてもよく、または別法として、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）（後述を参照）から形成されてもよい。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの２本の鎖は、２つの配列間に形成される二本鎖内に不整合またはバルジが全く存在しないように、完全に補足的である。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡの２本の鎖は、実質的に補足的であり、２つの配列間に形成される二本鎖内に１つ以上の不整合および／またはバルジが存在することがある。ある特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡの５’端の一方または両方はリン酸基を有し、それに対して他の実施形態では、５’端の一方または両方はリン酸基を欠失している。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡの３’端の一方または両方は水酸基を有し、それに対して他の実施形態では、５’端の一方または両方は水酸基を欠失している。
【００６３】
「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」と称されるｓｉＲＮＡの１つの鎖は、標的転写とハイブリッド形成する部分を含む。ある特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、標的転写の領域と完全に補足的であり、すなわち約１５〜約２９ヌクレオチドの長さ、好ましくは少なくとも１６ヌクレオチドの長さ、およびより好ましくは約１８〜２０ヌクレオチドの長さの間の標的領域にわたって１つの不整合またはバルジも伴わずに、標的転写にハイブリッド形成する。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、標的領域に実質的に補足的であり、すなわち１つ以上の不整合および／またはバルジが、アンチセンス鎖および標的転写によって形成される二本鎖内に存在する可能性がある。典型的には、ｓｉＲＮＡは、標的転写のエクソン配列に標的化される。当業者は、ｓｉＲＮＡを標的転写のために設計するプログラム、アルゴリズム、および／または市販のサービスに精通している。例示的例は、Ｒｏｓｅｔｔａ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）およびＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）である。ｓｉＲＮＡは、当業者に周知の方法を使用して、生体外で酵素的に合成することができる。別法としては、ｓｉＲＮＡは、当該技術分野において周知のオリゴヌクレオチド合成技術を使用して化学的に合成することができる。
【００６４】
他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であってもよい。概して、ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（上述の通り）を媒介するのに十分に長い二重鎖構造を形成するようにハイブリッド形成される、またはハイブリッド形成することが可能な少なくとも２つの補足的部分と、二本鎖を形成するｓｈＲＮＡの領域を接続するループを形成する少なくとも１つの単一鎖部分と、を含むＲＮＡ分子である。構造はまた、ステムが二本鎖部分であり、ステムループ構造とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、構造の二本鎖部分は、不整合またはバルジがｓｈＲＮＡの二本鎖領域内に全く存在しないように、完全に補足的である。他の実施形態では、構造の二本鎖部分は、実質的に補足的であり、その結果、１つ以上の不整合および／またはバルジがｓｈＲＮＡの二本鎖内に存在する。構造のループは、約１〜約２０ヌクレオチドの長さ、好ましくは約４〜約１０ヌクレオチドの長さ、およびより好ましくは約６〜約９ヌクレオチドの長さであってよい。ループは、標的転写に対して補足的である領域（すなわち、ｓｈＲＮＡのアンチセンス部分）の５’端または３’端のいずれかに位置してもよい。
【００６５】
ｓｈＲＮＡはさらに、５’端または３’端上にオーバーハングを含んでもよい。任意的なオーバーハングは、約１〜約２０ヌクレオチドの長さ、およびより好ましくは約２〜約１５ヌクレオチドの長さであってよい。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、１つ以上のＵ残基、例えば、約１〜約５の間のＵ残基を含む。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡの５’端はリン酸基を有し、一方他の実施形態では有さない。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡの３’端は水酸基を有し、一方他の実施形態では有さない。概して、ｓｈＲＮＡは、保存された細胞ＲＮＡｉ機構によってｓｉＲＮＡへと処理される。したがって、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの前駆体であり、同様にｓｈＲＮＡの一部分（すなわち、ｓｈＲＮＡのアンチセンス部分）に補足的である標的転写の発現を阻害することが可能である。当業者は、（上述に詳細に述べるような）ｓｈＲＮＡの設計および合成のための入手可能なリソースに精通している。例示的例は、ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｓｈＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）である。
【００６６】
また他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ発現ベクターであってもよい。典型的には、ＲＮＡｉ発現ベクターは、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡといった、ＲＮＡｉ剤の細胞内（生体内）合成のために使用される。一実施形態では、２つの分離した補足的ｓｉＲＮＡ鎖が、そのそれぞれが単一ｓｉＲＮＡ鎖の転写を管理する２つのプロモーターを含有する単一ベクターを使用して転写される（すなわち、各プロモーターは、転写が発生することができるように、ｓｉＲＮＡのための鋳型に操作可能に連結される）。２つのプロモーターは、同一配向であってよく、その場合、それぞれは補足的ｓｉＲＮＡ鎖のうちの１つのための鋳型に操作可能に連結される。別法として、２つのプロモーターは、対向する配向であってもよく、プロモーターに対する転写が２つの補足的ｓｉＲＮＡ鎖の合成をもたらすように、単一の鋳型に隣接する。別の実施形態では、ＲＮＡｉ発現ベクターは、転写がｓｈＲＮＡを形成するように、２つの補足的領域を含む単一ＲＮＡ分子の転写を駆動するプロモーターを含有してもよい。
【００６７】
当業者は、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ剤に関して、複数の転写単位の転写を介して生体内で産生することが好ましいことを理解するであろう。一般的に述べると、１つ以上のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ転写単位の生体内発現を管理するために利用されるプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩＩ）のためのプロモーターであってよい。Ｕ６またはＨ１プロモーターといった、ある特定のＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターは、転写される領域内のシス作用調節要素を必要とせず、それゆえある特定の実施形態において好ましい。他の実施形態では、Ｐｏｌ  ＩＩのためのプロモーターは、１つ以上のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ転写単位の発現を駆動するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、組織特異型、細胞特異型、または誘発性Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターが使用されてよい。
【００６８】
ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの合成のための鋳型を提供する構築体は、標準的な組み換えＤＮＡ方法を使用して産生され、また真核細胞内の発現に好適な広範な異なるベクターのうちの任意のものの中へ挿入されてよい。組み換えＤＮＡ技術は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ（上述を参照）、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ（上述を参照）に記載される。当業者はまた、ベクターは、追加の調節配列（例えば、停止配列、翻訳制御配列など）、および選択マーカー配列を含んでもよいことを理解する。ＤＮＡプラスミドは、当該技術分野において既知であり、ｐＢＲ３２２、ＰＵＣをベースにしたものなどが挙げられる。多くの発現ベクターは、好適なプロモーターまたはプロモーター類を既に含有しているため、関心のＲＮＡｉ剤をコードする核酸配列を、プロモーター（単数または複数）に対して適切な場所に挿入するだけでよい。同様に、ウィルスベクターが、ＲＮＡｉ剤の細胞内発現を提供するために使用されてもよい。好適なウィルスベクターとしては、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴性ウィルスベクター、ヘルペスウィルスベクターなどが挙げられる。特定の実施形態では、ＲＮＡｉ発現ベクターは、ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ＴＲＣ  ｓｈＲＮＡ製品（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に提供されるものなどの、ｓｈＲＮＡレンチウィルスベースベクターまたはレンチウィルス粒子である。
【００６９】
ＲＮＡｉ剤またはＲＮＡｉ発現ベクターは、当業者に周知の方法を使用して細胞内へ導入することができる。かかる技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（上述を参照）、またはＳａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ（上述を参照）に記載される。ある特定の実施形態では、ＲＮＡｉ発現ベクター、例えば、ウィルスベクターは、細胞のゲノム内へ安定して統合され、その結果Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１発現がその後の細胞生成にわたって中断される。
【００７０】
（ｃ）  ランダム変異誘発
また他の実施形態では、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損している細胞株は、ランダム変異誘発を使用して調製することができる。一実施形態では、ランダム変異は、細胞を、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＮＭＵ）、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、亜硝酸（ＮＡ）、または別の変異原性化学物質といった、化学物質に曝露することによって生成される。別の実施形態では、ランダム変異は、トランスポゾン系システムを使用して、短配列をゲノムにランダムに挿入し、それにより配列が挿入される染色体配列の発現を中断することによって生成される。別の実施形態では、ランダム変異は、電離放射線を使用して生成される。
【００７１】
（ｄ）  部位特異的組み換え  
代替的実施形態では、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損している細胞株は、部位特異的組み換え技術を使用して調製することができる。例えば、部位特異的組み換え技術は、関心の染色体配列の全部または一部を削除する、また一塩基遺伝子多型（ＳＮＰ）を関心の染色体配列内に導入するために使用することができる。一実施形態では、関心の染色体配列は、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ部位特異的組み換えシステム、Ｆｌｐ−ＦＲＴ部位特異的組み換えシステム、またはその変形を使用して標的化される。かかる組み換えシステムは市販されており、これらの技術のための追加の教示は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（上述を参照）に見出される。
【００７２】
（ＩＩＩ）  組み換えタンパク質を産生するための方法
本開示のさらなる態様は、ヒト様グリコシル化パターンを有する組み換えタンパク質を産生するための方法を包括する。概して、ヒト様グリコシル化パターンを有する糖タンパク質は、α−Ｇａｌおよび／またはＮｅｕ５Ｇｃ残基を欠失している。方法は、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損している非ヒト哺乳類細胞株内に組み換えタンパク質を発現することを含む。Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損している細胞株は、章（Ｉ）に上述する。
【００７３】
一例示的実施形態では、細胞株は、細胞株がＣｍａｈを産生せず、また細胞株によって産生される組み換えタンパク質がα−Ｇａｌ部分を欠失するように、Ｃｍａｈをコードする染色体配列の二対立遺伝子性不活性化を含んでもよい。別の例示的実施形態では、細胞株は、細胞株がＧｇｔａ１を産生せず、また細胞株によって産生される組み換えタンパク質がＮｅｕ５Ｇｃ残基を欠失するように、Ｇｇｔａ１をコードする染色体配列の二対立遺伝子性不活性化を含んでもよい。さらなる例示的実施形態では、細胞株は、細胞株がＣｍａｈもＧｇｔａ１も産生せず、また細胞によって産生される組み換えタンパク質がα−ＧａｌおよびＮｅｕ５Ｇｃ残基を欠失するように、ＣｍａｈおよびＧｇｔａ１をコードする染色体配列の二対立遺伝子性不活性化を含んでもよい。細胞株が異数性である別の実施形態では、細胞株がＣｍａｈを産生せず、また細胞株によって産生される組み換えタンパク質がα−Ｇａｌ部分を欠失するように、Ｃｍａｈをコードする染色体配列の全てのコピーは、不活性化される。細胞株が異数性である別の例示的実施形態では、細胞株がＧｇｔａ１を産生せず、また細胞株によって産生される組み換えタンパク質がＮｅｕ５Ｇｃ残基を欠失するように、Ｇｇｔａ１をコードする染色体配列の全てのコピーは不活性化される。細胞株が異数性であるさらなる例示的実施形態では、細胞株がＣｍａｈもＧｇｔａ１も産生せず、また細胞によって産生される組み換えタンパク質がα−ＧａｌおよびＮｅｕ５Ｇｃ残基を欠失するように、Ｃｍａｈをコードする染色体配列の全てのコピーおよびＧｇｔａ１をコードする染色体配列の全てのコピーは不活性化される。
【００７４】
概して、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損している細胞株によって産生される組み換えタンパク質は、Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損していない比較細胞株によって産生される同一のタンパク質に対して、少なくとも１つの改善された特性を有する。改善された特性の非限定的例としては、低減された免疫原生、増大された生物学的利用能、増大された有効性、増大された安定性、増大された可溶性、改善された半減期、改善されたクリアランス、改善された薬物動態、およびこれらの組み合わせが挙げられる。例えば、本明細書に開示する方法によって産生される組み換えタンパク質は、α−Ｇａｌおよび／またはＮｅｕ５Ｇｃ残基を欠失しているため、産生される組み換えタンパク質は、α−Ｇａｌおよび／またはＮｅｕ５Ｇｃ残基を含有する比較タンパク質よりも、低減された免疫原生、およびヒト被験者に過敏性反応を誘発する低減された可能性を有する。
【００７５】
Ｃｍａｈおよび／またはＧｇｔａ１が欠損している細胞株内で産生される組み換えタンパク質は、治療タンパク質およびタンパク質生物製剤を含む、任意の好適なタンパク質であることができる。例えば、組み換えタンパク質は、制限を伴うことなく、抗体、抗体のフラグメント、単クローン性抗体、ヒト化抗体、ヒト化単クローン性抗体、キメラ抗体、ＩｇＧ分子、ＩｇＧ重鎖、ＩｇＧ軽鎖、ＩｇＡ分子、ＩｇＤ分子、ＩｇＥ分子、ＩｇＭ分子、糖タンパク質、成長因子、サイトカイン、インターフェロン、インターロイキン、ホルモン、凝固（もしくは凝集）因子、血液成分、酵素、機能性食品タンパク質、ワクチン、前述のもののいずれかの機能性フラグメントもしくは機能性変異体、あるいは前述のタンパク質および／またはその機能性フラグメントもしくは変異体のうちのいずれかを含む融合タンパク質であってもよい。
【００７６】
組み換えタンパク質を産生するための方法が、当該技術分野において周知であり、また追加の教示はＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（上述を参照）によって提供される。概して、組み換えタンパク質は、外因的に導入される核酸から発現される。章（Ｉ）（ａ）にて詳細に上述する通り、組み換えタンパク質をコードする核酸は、染色体外であってもよく、または組み換えタンパク質をコードする核酸は、ゲノム内に統合されてもよい。
【００７７】
組み換えタンパク質が発現されるように細胞株を培養するための方法は、当該技術分野において周知である。適切な培地および培養システムは、当該技術分野において既知であり、また市販されている。一実施形態では、組み換えタンパク質は、無血清浮遊培養を介して、本明細書に開示される細胞株によって産生される。
定義
【００７８】
別段に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者によって通常理解される意味を有する。以下の参照は、当業者に、本発明において使用する用語のうちの多くの一般的定義を提供する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）、Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）、Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）、およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用するとき、以下の用語は、別段に定めのない限りそれらに与えられた意味を有する。
【００７９】
本開示またはその好ましい実施形態（単数または複数）の要素を導入する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「前記（該）」は、１つ以上の要素があることを意味することを意図する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する」という用語は、包括的であることを意図し、列挙される要素以外の追加的な要素が存在する可能性があることを意味する。
【００８０】
本明細書で使用するとき、「内因性配列」という用語は、細胞に生来備わっている染色体配列を指す。
【００８１】
「外因性配列」という用語は、細胞に生来備わっていない染色体配列、またはその生来の位置が異なる染色体位置にある染色体配列を指す。
【００８２】
「編集」「ゲノム編集」、または「染色体編集」という用語は、ある特定の染色体配列が変化されるプロセスを指す。編集された染色体配列は、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、および／または少なくとも１つのヌクレオチドの置換を含むことができる。
【００８３】
本明細書で使用するとき、「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（エクソンおよびイントロンを含む）、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を指し、かかる調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているかどうかにはかかわらない。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および配列内リボソーム進入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製起点、マトリックス結合部位、および遺伝子座制御領域を含むが、これらに限定される必要はない。
【００８４】
「異種」という用語は、関心の細胞または種原産でない存在物を指す。
【００８５】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、線形または環形構造、および単一鎖または二重鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のため、これらの用語は、ポリマーの長さに対して限定的であるとして解釈されない。本用語は、天然のヌクレオチドの既知の類似体、および塩基、糖、および／またはリン酸部分において修飾されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）を包括することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対合特異性を有し、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合する。
【００８６】
「ヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを指す。ヌクレオチドは、標準的ヌクレオチド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、およびウリジン）またはヌクレオチド類似体であってよい。ヌクレオチド類似体は、修飾されたプリン塩基もしくはピリミジン塩基または修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチド類似体は、天然起源ヌクレオチド（例えば、イノシン）であっても、または非天然起源ヌクレオチドであってもよい。ヌクレオチドの糖または塩基部分上の修飾の非限定的例としては、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、水酸基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の追加（または除去）、ならびに塩基の炭素および窒素原子の他の原子との置換（例えば、７−デアザプリン）が挙げられる。ヌクレオチド類似体としてはまた、ジデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノが挙げられる。
【００８７】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、互換的に使用されて、アミノ酸残基のポリマーを指す。
【００８８】
「組み換え」という用語は、２つのポリヌクレオチド間での遺伝情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のため、「相同的組み換え」は、例えば、細胞内の二重鎖切断の修復中に起こる、かかる交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、２つのポリヌクレオチド間の配列類似性を要し、「標的」分子（すなわち、二重鎖切断を経験したもの）の修復を鋳型にするために「供与体」または「交換」分子を使用し、遺伝情報の供与体から標的への移動をもたらすため、「非交差遺伝子変換（ｎｏｎ−ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）」または「ショートトラクト遺伝子変換（ｓｈｏｒｔ  ｔｒａｃｔ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）」として様々に知られている。いかなる特定の理論によっても拘束されるものではないが、かかる移動は、破壊された標的と供与体との間に形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／または標的の一部になる遺伝情報の再合成のために供与体が使用される「合成依存的鎖アニーリング」、および／または関連プロセスに関与することができる。かかる特殊な相同的組み換えは、しばしば、供与体ポリヌクレオチドの配列の一部または全部が、標的ポリヌクレオチドに組み込まれるような、標的分子の配列の変更をもたらす。
【００８９】
本明細書で使用するとき、「標的部位」または「標的配列」という用語は、編集される染色体配列の部分を画定する核酸配列であって、またそれに対して標的化エンドヌクレアーゼが認識、結合、および切断される、核酸配列を指す。
【００９０】
「上流」および「下流」という用語は、固定された位置に対する核酸配列内の場所を指す。上流は、位置に対して５’である領域（すなわち、鎖の５’端付近）を指し、また下流は、位置に対して３’である領域（すなわち、鎖の３’端付近）を指す。
【００９１】
核酸およびアミノ酸配列同一性を決定するための技術は、当該技術分野において既知である。典型的には、かかる技術は、遺伝子に関してｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列も同様に、この様式で決定および比較されることが可能である。一般に、同一性は、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、正確なヌクレオチドとヌクレオチドまたはアミノ酸とアミノ酸との一致を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらのパーセント同一性を決定することによって比較することができる。核酸配列かアミノ酸配列かにかかわらず、２つの配列のパーセント同一性は、２つの整列された配列間の正確な整合の数を、より短い方の配列の長さで除して、１００を乗じたものである。核酸配列に関するおよその整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（ｌｏｃａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ２：４８２−４８９（１９８１）によって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄ．，５  ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発されたスコア付けマトリックスを用いて、アミノ酸配列に適用し、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）によって正規化することができる。配列のパーセント同一性を決定するためのこのアルゴリズムの例示的実装は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーション内のＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によって提供される。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するための他の好適なプログラムは、当該技術分野において一般に既知であり、例えば、別の整列プログラムは、デフォルトパラメータと共に使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータを用いて使用することができる。遺伝コード＝標準、フィルタ＝無、鎖＝両方、カットオフ＝６０、予期＝１０、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、記述＝５０配列、ソート順＝ハイスコア、データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、ＧｅｎＢａｎｋウェブサイトに見出すことが可能である。本明細書に説明する配列に関して、配列同一性の所望の度合いの範囲は、約８０％〜１００％、およびこれらの間の任意の整数値である。典型的には、配列間のパーセント同一性は、少なくとも７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、より好ましくは８５〜９０％、さらにより好ましくは９２％、より一層好ましくは９５％、お���び最も好ましくは９８％配列同一性である。
【００９２】
種々の変更が本発明の範囲から逸脱することなく上述の細胞および方法になされることが可能である通り、上述の説明および下記に示す実施例に含まれる全ての事象は、例証的であり、限定的意味ではないと解釈されることが意図される。
実施例
【００９３】
以下の実施例は、本発明のある特定の態様を例証する。
【実施例１】
【００９４】
実施例１：Ｇｇｔａ１遺伝子を含有するＣＨＯ細胞
ＣＨＯ  Ｋ１細胞内のＧｇｔａ１遺伝子の存在を確認するため、プライマーを、Ｇｇｔａ１遺伝子のエクソン８および９の領域を増幅するように設計した。マウス骨髄腫ＮＳ０およびＣＨＯ  Ｋ１細胞由来のＤＮＡを、一対のプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。約３００ｂｐの期待寸法の帯を、ＮＳ０およびＣＨＯ細胞の両方に検出した。ＣＨＯ細胞から単離したＰＣＲフラグメントを、配列化し、マウスＧｇｔａ１遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｐ２３３３６）と整列した。配列同一性は、約８５％であった。
【００９５】
定量的ＰＣＲを使用して、ＣＨＯ細胞内のｍＲＮＡ発現をマウス細胞に対して評価した。アクチンを使用した正規化の後、マウスＮＳ０細胞とＣＨＯ細胞との間の閾値サイクル（Ｃｔ）値の比較は、Ｇｇｔａ１発現が、ＣＨＯ細胞においてＮＳ０細胞より有意に低いことを示唆した。
【実施例２】
【００９６】
実施例２：不活性化されたＧｇｔａ１遺伝子座を含むＣＨＯ細胞の生成
一対のＺＦＮを、ＣＨＯ細胞内のＧｇｔａ１遺伝子のエクソン９内部の領域を標的にするように設計した。Ｇｇｔａ１配列を専売トランスクリプトーム配列から獲得し、ＲＴ−ＰＣＲを使用して検証した。ＺＦＮ標的化遺伝子を、専売アルゴリズムを使用して設計し、その後に試験した。生体外転写およびｍＲＮＡポリアデニル酸化およびキャッピングを、ＣｏｍｐｏＺｒ（登録商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＺＦＮ）製品情報に記載される通りに、ＺＦＮプラスミドＤＮＡから起こした。簡潔に、プラスミドＺＦＮ  ＤＮＡを線形化し、またフェノール／クロロホルムＤＮＡ抽出物を介して精製した。ＭｅｓｓａｇｅＭａｘ（商標）Ｔ７ＡＲＣＡ−Ｃａｐｐｅｄ  Ｍｅｓｓａｇｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ．）を使用して、線形化したＤＮＡをキャップした。Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｔａｉｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＥｐｉＣｅｎｔｅｒ）を使用して、ポリ（Ａ）尾部を追加した。ＺＦＮ  ｍＲＮＡを、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて精製した。
【００９７】
組み換え抗狂犬病ヒト  ＩｇＧを発現するＣＨＯＺＮ（ｇｓ  −／−）細胞株を使用した。使用した全ての細胞培地、補給物、および他の試薬は、別段に定めのない限りＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。トランスフェクションに先行して、細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミンを補給したＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＨＯ  ＣＤ  Ｆｕｓｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）内で浮遊培養として維持した。細胞を、トランスフェクションの１日前に、生物反応器管内に０．５×１０６細胞／ｍＬで種付けした。各トランスフェクションに対して、１５０μＬ増殖培地内の１×１０６細胞、および５μｇの各ＺＦＮ  ｍＲＮＡを使用した。トランスフェクションを、０．２ｃｍキュベット内で１４０Ｖおよび９５０μＦにてエレクトロポレーションによって実行した。エレクトロポレーションした細胞を、６−ウエルプレート静置培養で２ｍＬ増殖培地に定置した。対照細胞を、モックトランスフェクトした。
【００９８】
トランスフェクション後３日目および１０日目に、細胞を培養から除去し、ゲノムＤＮＡを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを使用して単離した。ＺＦＮ−誘発切断は、ＣｏｍｐｏＺｒ（登録商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＺＦＮ製品情報に説明される通り、Ｃｅｌ−１ヌクレアーゼ分析を用いて検証した。この分析は、以前に記載される通り、ＺＦＮ媒介遺伝子変異の効率性を決定するために実行される（Ｍｉｌｌｅｒ  ＪＣ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７，２５：７７８−７８５）。分析は、ＺＦＮ誘発性ＤＮＡ二重鎖切断の非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）に媒介される不完全な修復の結果として野生型から逸脱する、標的化遺伝子座の対立遺伝子を検出する。ＺＦＮ処理した細胞のプールからの標的化領域のＰＣＲ増幅は、野生型（ＷＴ）と変異体アンプリコンとの混合物を発生させる。この混合物の融解および再アニーリングは、ＷＴのヘテロ二本鎖と変異対立遺伝子との間に形成する不整合をもたらす。不整合の部位にて形成されるＤＮＡ「泡」は、サーベイヤーヌクレアーゼＣｅｌ−１によって切断され、また切断産物は、ゲル電気泳動によって消滅させることができる。図１に示すように、約２１５ｂｐおよび１００ｂｐの２つのフラグメントが、ＺＦＮトランスフェクトした細胞に存在した（レーン１および２）が、モックトランスフェクトした対照細胞には存在しなかった。
【実施例３】
【００９９】
実施例３：Ｇｇｔａ１ノックアウト細胞の単一細胞クローン化および遺伝子型判定
Ｃｅｌ１分析を用いたＺＦＮ活性の確認後、Ｇｇｔａ１ＺＦＮトランスフェクトした細胞を、限界希釈法を用いて単一細胞クローン化した。このために、細胞を、８０％のＣＨＯ無血清クローン培地、２０％の馴化培地、および４ｍＭのＬ−グルタミンとの混合物を使用して、０．５細胞／ウエルに蒔いた。クローン性および成長を、プレーティング後７日目および１４日目にそれぞれ顕微鏡で検証した。成長を伴うクローンを拡大し、ＰＣＲおよびシーケンス処理によって遺伝子型付けした。表１に詳細に後述する通り、種々の長さの欠失を有した１つのＧｇｔａ１（−／−）および４つのＧｇｔａ１（＋／−）クローンを単離した。全ての細胞株は、それらが由来する親細胞株と類似の成長特徴を示した。
【表１】
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【実施例４】
【０１００】
実施例４：不活性化されたＣｍａｈ遺伝子座を含むＣＨＯ細胞の生成
一対のＺＦＮを、ＣＨＯ細胞（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９ＷＶ２３、チャイニーズハムスター）内のＣｍａｈ遺伝子座のエクソン５内部の領域を標的にするように設計した。ＣＨＯ  Ｋ１細胞株を、ＺＦＮをコードする２０μｇのＲＮＡで、実施例２に記載するものと同様の標準手順および方法を用いてトランスフェクトした。対照細胞を、ＧＦＰをコードするＲＮＡでトランスフェクトした。
【０１０１】
ＺＦＮ誘発性二重鎖染色体切断の効率性を、Ｃｅｌ−１ヌクレアーゼ分析を用いて決定した。図２に示す通り、Ｃｍａｈ  ＺＦＮは、ＣＨＯ細胞内のＣｍａｈ標的を切断した。ＺＦＮ媒介切断の頻度は、切断産物の相対強度を親帯の相対強度と比較することによって、概算することができる。切断の頻度は、ＩｍａｇｅＪ  ｓｏｆｔｗａｒｅによって約１１％として算出された。
【実施例５】
【０１０２】
実施例５：Ｃｍａｈノックアウト細胞の単一細胞クローン化および遺伝子型判定
Ｃｍａｈ  ＺＦＮ  トランスフェクトした細胞を、限界希釈法（上述の通り）または蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を使用して単一細胞クローン化した。成長を伴うクローンを拡大し、ＰＣＲおよびシーケンス処理によって遺伝子型付けした。遺伝子型判定は、この作業ラウンドからの全２０クローンが、種々の長さの欠失および挿入を有するＣｍａｈ（＋／−）であることを示した。続いて、７つのＣｍａｈ（＋／−）クローンをプールし、Ｃｍａｈ  ＺＦＮ  ＲＮＡで再トランスフェクトし、限界希釈法を使用して単一細胞クローン化した。第２の作業ラウンドからの６つのクローンを、ＰＣＲおよびシーケンス処理によってＣｍａｈ（−／−）であると実証した。不活性化されたＣｍａｈ遺伝子座は、種々の長さの欠失および挿入を有した（表２参照）。これらのＣｍａｈ二対立遺伝子性ノックアウト細胞株の遺伝子型も、表２に列挙する。全ての細胞株は、それらが由来する親細胞株のものと類似の成長特徴を示した。
【表２】
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【実施例６】
【０１０３】
実施例６：Ｃｍａｈ／Ｇｇｔａ１ダブルノックアウト細胞の生成
確認されたＣｍａｈ（−／−）遺伝子型を有するクローン細胞株（すなわち、ＡＢ２）を、ＺＦＮ標的化Ｇｇｔａ１で、本質的に実施例２で上述する通りにトランスフェクトした。ＺＦＮ活性を、Ｃｅｌ−１ヌクレアーゼ分析を用いて確認した。図３に示す通り、切断産物がＺＦＮトランスフェクト細胞内に検出されたが、モックトランスフェクト細胞には検出されなかった。
【０１０４】
細胞を、本質的に実施例３に上述する通りに、限界希釈法を用いて単一細胞クローン化した。ネステッドＰＣＲを１９２個のクローンに実施し、ＰＣＲ産物の寸法に基づいて２６個のクローンを潜在的ダブルノックアウトクローンとして同定した。ゲノムＤＮＡを潜在的ダブルノックアウトクローンから単離し、ＰＣＲ増幅し、配列化した。４個のクローンが、Ｃｍａｈノックアウト背景におけるＧｇｔａ１の二対立遺伝子性欠失を確認する２倍の配列包括度を有した。表３は、Ｃｍａｈ（−／−）／Ｇｇｔａ１（−／−）ダブルノックアウトクローンの遺伝子型を表す。
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2014520533.tif 000009
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