(57)【要約】  本発明は、異種タンパク質を発現させるための新規の操作された下等真核宿主細胞およびそのような株の製造方法に関する。【選択図】図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＴ１遺伝子の活性を低減または排除するように修飾されている操作された下等真核宿主細胞。
【請求項２】
（ｉ）ＡＴＴ１遺伝子またはポリペプチドの発現を低減または排除することにより、または（ｉｉ）ＡＴＴ１遺伝子の突然変異形態を発現させることにより、ＡＴＴ１遺伝子の活性が低減または排除されている、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項３】
プロテアーゼ活性、アルファ−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性、アルファ−１，２−マンノシルトランスフェラーゼ活性、マンノシルリン酸トランスフェラーゼ活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ活性、Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）活性および／またはドリコール−Ｐ−Ｍａｎ依存性アルファ（１−３）マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１以上の遺伝子の突然変異、破壊または欠失を更に含む、請求項１または２記載の宿主細胞。
【請求項４】
グリコシダーゼ、マンノシダーゼ、ホスホマンノシダーゼ、ホスファターゼ、ヌクレオチド糖輸送体、ヌクレオチド糖エピメラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸−９−リン酸シンターゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよびオリゴサッカリルトランスフェラーゼからなる群から選択される１以上のグリコシル化酵素をコードする１以上の核酸を更に含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の宿主細胞。
【請求項５】
組換えタンパク質をコードする核酸を更に含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の宿主細胞。
【請求項６】
組換えタンパク質が、抗体（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＥ）、抗体フラグメント、ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメイン、エリスロポエチン、サイトカイン、凝固因子、可溶性ＩｇＥ受容体α鎖、ウロキナーゼ、キマーゼ、尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合性タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮増殖因子−２、骨髄前駆体抑制因子−１、オステオプロテゲリン、α−１アンチトリプシン、ＤＮアーゼＩＩ、α−フェトプロテイン、インスリン、Ｆｃ融合体およびＨＳＡ融合体からなる群から選択されるものである、請求項５記載の宿主細胞。
【請求項７】
細胞が、類似培養条件下のＡＴＴ１ナイーブ親宿主細胞と比較して培養安定性、耐熱性の増強および／または発酵頑強性の改善を示す、請求項１〜６のいずれか１項記載の宿主細胞。
【請求項８】
細胞が、３２℃の培養において少なくとも８０時間の発酵にわたって最小限度の細胞溶解を伴って生存しうる、請求項７記載の宿主細胞。
【請求項９】
宿主細胞が糖操作されている、前記の請求項のいずれか１項記載の宿主細胞。
【請求項１０】
宿主細胞がＯＣＨ１活性を欠いている、前記の請求項のいずれか１項記載の宿主細胞。
【請求項１１】
宿主細胞が真菌宿主細胞である、前記の請求項のいずれか１項記載の宿主細胞。
【請求項１２】
宿主細胞が酵母宿主細胞である、前記の請求項のいずれか１項記載の宿主細胞。
【請求項１３】
宿主細胞がピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）宿主細胞である、前記の請求項のいずれか１項記載の宿主細胞。
【請求項１４】
宿主細胞がピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、請求項１３記載の宿主細胞。
【請求項１５】
ＡＴＴ１遺伝子が、配列番号７に記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの自然変異体（多形）をコードしている、請求項１４記載の宿主細胞。
【請求項１６】
宿主細胞がハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）である、請求項１３記載の宿主細胞。
【請求項１７】
ＡＴＴ１遺伝子が、配列番号２３に記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの自然変異体（多形）をコードしている、請求項１６記載の宿主細胞。
【請求項１８】
宿主細胞が、ＡＴＴ１ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸配列を発現するように更に修飾されている、前記の請求項のいずれか１項記載の宿主細胞。
【請求項１９】
野生型ＡＴＴ１遺伝子をその天然ゲノム状態で有し、ＡＴＴ１ポリペプチドまたはその断片の発現を増強するように修飾されている、操作された下等真核宿主細胞。
【請求項２０】
プロテアーゼ活性、アルファ−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性、アルファ−１，２−マンノシルトランスフェラーゼ活性、マンノシルリン酸トランスフェラーゼ活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ活性、Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）活性および／またはドリコール−Ｐ−Ｍａｎ依存性アルファ（１−３）マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１以上の遺伝子の突然変異、破壊または欠失を更に含む、請求項１９記載の宿主細胞。
【請求項２１】
グリコシダーゼ、マンノシダーゼ、ホスホマンノシダーゼ、ホスファターゼ、ヌクレオチド糖輸送体、マンノシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン輸送体、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよびオリゴサッカリルトランスフェラーゼからなる群から選択される１以上のグリコシル化酵素をコードする１以上の核酸を更に含む、請求項１９または２０のいずれか１項記載の宿主細胞。
【請求項２２】
組換えタンパク質をコードする核酸を更に含む、請求項１９〜２１のいずれか１項記載の宿主細胞。
【請求項２３】
組換えタンパク質が、抗体（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＥ）、抗体フラグメント、ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメイン、エリスロポエチン、サイトカイン、凝固因子、可溶性ＩｇＥ受容体α鎖、ウロキナーゼ、キマーゼ、尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合性タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮増殖因子−２、骨髄前駆体抑制因子−１、オステオプロテゲリン、α−１アンチトリプシン、ＤＮアーゼＩＩ、α−フェトプロテイン、インスリン、Ｆｃ融合体およびＨＳＡ融合体からなる群から選択される、請求項２２記載の宿主細胞。
【請求項２４】
細胞が、類似培養条件下のＡＴＴ１ナイーブ親宿主細胞と比較して培養安定性、耐熱性の増強および／または発酵頑強性の改善を示す、請求項１９〜２３のいずれか１項記載の宿主細胞。
【請求項２５】
細胞が、３２℃の培養において少なくとも８０時間の発酵にわたって最小限度の細胞溶解を伴って生存しうる、請求項２４記載の宿主細胞。
【請求項２６】
宿主細胞が糖操作されている、請求項１９〜２５のいずれか１項記載の宿主細胞。
【請求項２７】
宿主細胞がＯＣＨ１活性を欠いている、請求項１９〜２６のいずれか１項記載の宿主細胞。
【請求項２８】
宿主細胞が酵母宿主細胞である、請求項１９〜２７のいずれか１項記載の宿主細胞。
【請求項２９】
宿主細胞がピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）宿主細胞である、請求項１９〜２８のいずれか１項記載の宿主細胞。
【請求項３０】
宿主細胞がピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、請求項２９記載の宿主細胞。
【請求項３１】
ＡＴＴ１遺伝子が、配列番号７に記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの自然変異体（多形）または該ポリペプチドの断片をコードしている、請求項３０記載の宿主細胞。
【請求項３２】
断片が、配列番号７のアミノ酸１−３１および１−１６４からなる群から選択される、請求項３０記載の宿主細胞。
【請求項３３】
宿主細胞がハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）である、請求項２９記載の宿主細胞。
【請求項３４】
ＡＴＴ１遺伝子が、配列番号２３に記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの自然変異体（多形）をコードしている、請求項３２記載の宿主細胞。
【請求項３５】
（ａ）請求項１〜３４のいずれか１項記載の宿主細胞内に、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入し、（ｂ）異種ポリペプチドの発現に適した条件下、該宿主細胞を培養し、そして、所望により、（ｃ）異種ポリペプチドを該宿主細胞から単離することを含む、操作された下等真核宿主細胞における異種ポリペプチドの製造方法。
【請求項３６】
野生型または突然変異ＡＴＴ１遺伝子またはその断片をコードする単離された核酸。
【請求項３７】
核酸を発現する単離された宿主細胞が、類似条件下のＡＴＴ１ナイーブ親宿主細胞と比較して培養安定性、耐熱性の増強および／または発酵頑強性の改善を示す、請求項３６記載の単離された核酸。
【請求項３８】
ａ．配列番号７またはその断片をコードするヌクレオチド配列、
ｂ．配列番号８またはその断片をコードするヌクレオチド配列、
ｃ．配列番号９またはその断片をコードするヌクレオチド配列、
ｄ．配列番号１０またはその断片をコードするヌクレオチド配列、および
ｅ．配列番号２３またはその断片をコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項３６または３７記載の核酸。
【請求項３９】
断片が配列番号７の残基１−３１または１−１６４を含む、請求項３７記載の核酸。
【請求項４０】
請求項３６〜３９のいずれか１項記載の核酸を含む単離されたベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異種タンパク質を発現させるための新規の操作された下等真核宿主細胞およびそのような株の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
下等真核宿主細胞は、異種タンパク質を産生するように操作されうる。更に、下等真核宿主細胞は、Ｎ−またはＯ−結合グリコシル化がそれらの天然形態から修飾されている糖タンパク質を産生するように糖操作されうる。
【０００３】
操作されたピチア（Ｐｉｃｈｉａ）株は、ヒト様グリコシル化を有する組換え糖タンパク質を製造するための代替宿主系として使用されている。しかし、甚だしい遺伝的修飾は、多数の糖操作酵母株における細胞壁構造の基本的変化をも引き起こしており、発酵中の細胞溶解および細胞頑強性の低減をこれらの株の幾つかが受ける傾向を強めている。ある糖操作株は細胞生存性の相当な低減および発酵ブロス中への細胞内プロテアーゼ漏出の顕著な増加を示し、組換え産物の収率および質の両方における低下を示す。
【０００４】
頑強（ロウバスト）な糖操作産生株を特定するための現在の方法は、大規模（４０Ｌ以上）発酵プロセスに適したクローンを実験的に特定するために９６深ウェルプレート、５ｍｌ小規模発酵槽および１Ｌ規模のバイオリアクターのような種々の形態を使用して多数のクローンをスクリーニングすることに大きく依存している（Ｂａｒｎａｒｄら，２０１０）。１ｇ／Ｌを超える収率で組換えモノクローナル抗体を産生しうる幾つかのピチア（Ｐｉｃｈｉａ）宿主を特定するためにハイスループットスクリーニングが成功裏に用いられているが（Ｐｏｔｇｉｅｔｅｒら，２００９；Ｚｈａｎｇら，２０１１）、これらの大規模スクリーニングアプローチは非常に資源集約的であり、長時間を要し、細胞頑強性の増大を伴うクローンしか特定できないことが多い。
【０００５】
したがって、頑強性の改善およびヒト様グリカンを有する高品質タンパク質を産生する能力を示す下等真核宿主株は貴重であり、当分野において関心が持たれている。本発明において、本発明者らは、適切なバイオプロセス条件下で生存性、安定性およびタンパク質産生の改善を示す、新規遺伝子ＡＴＴ１（耐熱性獲得体）における欠失、トランケート化またはナンセンス突然変異を有する操作されたピチア（Ｐｉｃｈｉａ）宿主株を提供する。驚くべきことに、適切なバイオプロセス条件下でＡＴＴ１またはその断片を過剰発現する操作されたピチア（Ｐｉｃｈｉａ）宿主株は、生存性、安定性およびタンパク質産生の改善をも示す。これらの株は異種遺伝子発現に特に有用である。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概括
本発明は、ＡＴＴ１遺伝子の活性を低減または排除するように修飾されている操作された下等真核宿主細胞に関する。ＡＴＴ１遺伝子の活性は任意の手段により低減されうる。
１つの実施形態においては、ＡＴＴ１遺伝子の活性は、ＡＴＴ１遺伝子の発現を低減または排除することにより（例えば、干渉性ＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを使用することにより）低減または排除される。もう１つの実施形態においては、ＡＴＴ１遺伝子の活性は、ＡＴＴ１遺伝子またはその産物を突然変異させることにより低減または排除される。
もう１つの実施形態においては、ＡＴＴ１遺伝子の活性は、ＡＴＴ１ポリペプチドを分解させることにより低減または排除される。もう１つの実施形態においては、ＡＴＴ１遺伝子の活性は、ＡＴＴ１のインヒビター、例えば小分子インヒビターまたは抗体インヒビターを使用することにより低減または排除される。本発明は、転写、翻訳または翻訳後における手段（例えば、抑制性プロモーター、干渉性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、誘導性タンパク質分解など）を含む、ＡＴＴ１遺伝子またはそのタンパク質を不活性化する任意の手段を含む。１つの実施形態においては、下等真核細胞は、糖操作された下等真核宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核細胞は、ＯＣＨ１活性を欠く下等真核宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は、真菌宿主細胞である。
１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は、ＯＣＨ１活性を欠く真菌宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は、酵母宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は、ＯＣＨ１活性を欠く酵母宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）である。１つの実施形態においては、下等真核細胞は、ＯＣＨ１活性を欠くピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）宿主細胞である。もう１つの実施形態においては、宿主細胞はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり、ＡＴＴ１遺伝子は、配列番号７のアミノ酸を含むポリペプチドまたはその多形をコードしている。もう１つの実施形態においては、宿主細胞はハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）であり、ＡＴＴ１遺伝子は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその多形をコードしている。
【０００７】
他の実施形態においては、本発明は、ＡＴＴ１遺伝子の突然変異形態を発現するように修飾された操作された下等真核宿主細胞に関する。突然変異は単一ヌクレオチド突然変異、フレームシフト突然変異、挿入、トランケート化（末端切断）または１以上のヌクレオチドの欠失でありうるであろう。１つの実施形態においては、突然変異は、全ＡＴＴ１遺伝子の欠失である。もう１つの実施形態においては、突然変異は、ＡＴＴ１遺伝子の断片の欠失である。１つの実施形態においては、下等真核細胞は、糖操作された下等真核宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は、ＯＣＨ１活性を欠く下等真核宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は、真菌宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は、ＯＣＨ１活性を欠く真菌宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は、酵母宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は、ＯＣＨ１活性を欠く酵母宿主細胞である。
１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）である。１つの実施形態においては、下等真核細胞は、ＯＣＨ１活性を欠くピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）宿主細胞である。もう１つの実施形態においては、宿主細胞は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり、ＡＴＴ１遺伝子は、配列番号７のアミノ酸を含むポリペプチドまたはその多形をコードしている。１つの実施形態においては、ＡＴＴ１遺伝子の突然変異形態は、配列番号７のアミノ酸３２−９９５を含む断片の欠失である。１つの実施形態においては、ＡＴＴ１遺伝子の突然変異形態は、配列番号７のアミノ酸１６５−９９５を含む断片の欠失である。もう１つの実施形態においては、ＡＴＴ１遺伝子の突然変異形態は、配列番号７のアミノ酸２７７−９９５を含む断片の欠失である。もう１つの実施形態においては、ＡＴＴ１遺伝子の突然変異形態は、配列番号７のアミノ酸５４０−９９５を含む断片の欠失である。もう１つの実施形態においては、ＡＴＴ１遺伝子の突然変異形態は、配列番号７のアミノ酸７２９−９９５を含む断片の欠失である。もう１つの実施形態においては、ＡＴＴ１遺伝子の突然変異形態は、配列番号７をコードする核酸における挿入またはフレームシフト突然変異である。もう１つの実施形態においては、ＡＴＴ１遺伝子の突然変異形態は、配列番号７をコードする核酸配列における単一ヌクレオチド突然変異である。もう１つの実施形態においては、ＡＴＴ１遺伝子の突然変異形態は、配列番号７における単一アミノ酸変化を引き起こす。もう１つの実施形態においては、宿主細胞は、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）であり、ＡＴＴ１遺伝子は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその多形をコードしている。
【０００８】
幾つかの実施形態においては、本発明の操作された下等真核宿主細胞は、類似培養条件下のＡＴＴ１ナイーブ親宿主細胞と比較して、培養安定性、耐熱性の増強および／または発酵頑強性の改善を示す。１つの実施形態においては、前記の操作された宿主細胞は、少なくとも３２℃の培養において８０時間の発酵にわたって最小限度の細胞溶解を伴って生存しうる。１つの実施形態においては、前記の操作された宿主細胞は、誘導（例えばメタノール誘導）後に、３２℃の培養において少なくとも８０時間の発酵にわたって最小限度の細胞溶解を伴って生存しうる。１つの実施形態においては、前記の操作された宿主細胞は、３２℃の培養において少なくとも１００時間の発酵にわたって最小限度の細胞溶解を伴って生存しうる。１つの実施形態においては、前記の操作された宿主細胞は、誘導後に３２℃の培養において少なくとも１００時間の発酵にわたって最小限度の細胞溶解を伴って生存しうる。
【０００９】
幾つかの実施形態においては、本発明の操作された下等真核宿主細胞は更に、機能的遺伝子産物の１以上の、突然変異、破壊または欠失を含む。１つの実施形態においては、宿主細胞は、プロテアーゼ活性、アルファ−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性、アルファ−１，２−マンノシルトランスフェラーゼ活性、マンノシルリン酸トランスフェラーゼ活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ活性、Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）活性および／またはドリコール−Ｐ−Ｍａｎ依存性アルファ（１−３）マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１以上の遺伝子の突然変異、破壊または欠失を含む。１つの実施形態においては、宿主細胞は、ＯＣＨ１遺伝子における突然変異、破壊または欠失を含む。１つの実施形態においては、宿主細胞は、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４遺伝子における突然変異、破壊または欠失を含む。１つの実施形態においては、宿主細胞は、ＰＮＯ１、ＭＮＮ４およびＭＮＮ４Ｌ１遺伝子における突然変異、破壊または欠失を含む。１つの実施形態においては、宿主細胞は、ＰＥＰ４およびＰＲＢ１遺伝子における突然変異、破壊または欠失を含む。もう１つの実施形態においては、宿主細胞は、ＡＬＧ３遺伝子の突然変異、破壊または欠失を含む（米国特許公開第ＵＳ２００５／０１７０４５２号に記載されているとおり）。１つの実施形態においては、宿主細胞は、以下の遺伝子の全ての突然変異、破壊または欠失を更に含む：ＯＣＨ１、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３、ＢＭＴ４、ＰＮＯ１、ＭＮＮ４およびＭＮＮ４Ｌ１。１つの実施形態においては、宿主細胞は、以下の遺伝子の全ての突然変異、破壊または欠失を更に含む：ＯＣＨ１、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３、ＢＭＴ４、ＰＮＯ１、ＭＮＮ４、ＭＮＮ４Ｌ１、ＰＥＰ４およびＰＲＢ１。１つの実施形態においては、宿主細胞は、以下の遺伝子の全ての突然変異、破壊または欠失を更に含む：ＯＣＨ１、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３、ＢＭＴ４、ＰＮＯ１、ＭＮＮ４、ＭＮＮ４Ｌ１、ＡＬＧ３，ＰＥＰ４およびＰＲＢ１。１つの実施形態においては、本発明の操作された下等真核宿主細胞は、ＳＳＫ２、ＲＲＴ１２、ＳＤＳ２３、ＮＯＴ５、ＤＲＳ１、ＣＲＺ１、ＣＴＫ１、ＲＧＤ２、ＡＶＯ２、ＹＭＲ１９６Ｗ、ＰＥＸ１、ＴＹＷ１、ＰＯＭ１５２、ＹＰＲ８４、ＭＡＫ５、ＡＺＦ１からなる群から選択される遺伝子の突然変異、破壊または欠失を更に含む。
【００１０】
更にもう１つの実施形態においては、本発明の操作された下等真核宿主細胞は、関心のある１以上の核酸配列を更に含む。ある実施形態においては、関心のある核酸配列は１以上のグリコシル化酵素をコードしている。ある実施形態においては、グリコシル化酵素は、グリコシダーゼ、マンノシダーゼ、ホスホマンノシダーゼ、ホスファターゼ、ヌクレオチド糖輸送体、ヌクレオチド糖エピメラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸−９−リン酸シンターゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよびオリゴサッカリルトランスフェラーゼからなる群から選択される。更にもう１つの実施形態においては、本発明の操作された下等真核宿主細胞は、１以上の組換えタンパク質をコードする核酸配列を更に含む。１つの実施形態においては、組換えタンパク質は治療用タンパク質である。治療用タンパク質はオリゴ糖を含有すること又は欠いていることが可能である。ある実施形態においては、治療用タンパク質は、抗体（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＥ）、抗体フラグメント、ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメイン、エリスロポエチン、サイトカイン、凝固因子、可溶性ＩｇＥ受容体α鎖、ウロキナーゼ、キマーゼ、尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合性タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮増殖因子−２、骨髄前駆体抑制因子−１、オステオプロテゲリン、α−１アンチトリプシン、ＤＮアーゼＩＩ、α−フェトプロテイン、インスリン、Ｆｃ融合体、ＨＳＡ融合体、ウイルス抗原および細菌抗原からなる群から選択される。１つの実施形態においては、治療用タンパク質は抗体またはそのフラグメントである。１つの実施形態においては、治療用タンパク質は、Ｎ−グリカンを含む抗体または抗体フラグメント（Ｆｃ含有ポリペプチド）である。１つの実施形態においては、Ｎ−グリカンは、ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を主に含む。１つの実施形態においては、Ｎ−グリカンは、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を主に含む。
【００１１】
本発明は更に、ゲノムＤＮＡにおけるＡＴＴ１遺伝子の破壊、欠失または突然変異を含み、そして更に、ＡＴＴ１ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸を含む操作された下等真核宿主細胞を提供する。１つの実施形態においては、下等真核細胞は糖操作されている（ｇｌｙｃｏ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）。１つの実施形態においては、下等真核細胞はＯＣＨ１活性を欠く。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は真菌宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核細胞は、ＯＣＨ１活性を欠く真菌宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は酵母宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核細胞は、ＯＣＨ１活性を欠く酵母宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞はピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）である。１つの実施形態においては、下等真核細胞は、ＯＣＨ１活性を欠くピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）宿主細胞である。１つの実施形態においては、断片はＡＴＴ１の「機能的断片」またはＡＴＴ１の「ドミナントネガティブ断片」である。本明細書中で用いるＡＴＴ１遺伝子またはポリペプチドの「機能的断片」は、ＡＴＴ１活性を有する断片を意味する。ＡＴＴ１遺伝子またはポリペプチドの「ドミナントネガティブ断片」は、内因性ナイーブＡＴＴ１遺伝子の存在下でさえも、そのような断片が、宿主細胞の細胞培養安定性、耐熱性を増強しおよび／または発酵頑強性を改善しうるような、無傷ＡＴＴ１遺伝子またはそのポリペプチド産物の機能に負に干渉する断片（例えば、実施例１１における断片１−３１ａａおよび１−１６４ａａ）を意味する。１つの実施形態においては、宿主細胞はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり、ＡＴＴ１ポリペプチドは配列番号７のアミノ酸またはその多形を含む。１つの実施形態においては、宿主細胞はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり、機能的断片は配列番号７のアミノ酸１−２９６を含むか又はそれからなる。１つの実施形態においては、宿主細胞はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり、ドミナントネガティブ断片は配列番号７のアミノ酸１−３１を含むか又はそれからなる。１つの実施形態においては、宿主細胞はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり、ドミナントネガティブ断片は配列番号７のアミノ酸１−１６４を含むか又はそれからなる。
１つの実施形態においては、宿主細胞はハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）であり、ＡＴＴ１ポリペプチドは配列番号２３のアミノ酸配列またはその多形を含む。幾つかの実施形態においては、前記の操作された宿主細胞は、配列番号７またはポリペプチドの自然変異体（多形）をコードする核酸配列を含む過剰発現カセットを含む。
【００１２】
本発明はまた、宿主細胞がＡＴＴ１ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸配列の発現を増強するように修飾されている、操作された下等真核宿主細胞に関する。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は糖操作されている。１つの実施形態においては、下等真核細胞はＯＣＨ１活性を欠く。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は真菌宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核細胞は、ＯＣＨ１活性を欠く真菌宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は酵母宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核細胞は、ＯＣＨ１活性を欠く酵母宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞はピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）である。１つの実施形態においては、下等真核細胞は、ＯＣＨ１活性を欠くピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）宿主細胞である。１つの実施形態においては、宿主細胞はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり、ＡＴＴ１ポリペプチドは配列番号７のアミノ酸配列またはその多形を含む。１つの実施形態においては、宿主細胞はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり、機能的断片は配列番号７のアミノ酸１−２９６を含むか又はそれからなる。１つの実施形態においては、宿主細胞はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり、ドミナントネガティブ断片は配列番号７のアミノ酸１−３１を含むか又はそれからなる。１つの実施形態においては、宿主細胞はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり、ドミナントネガティブ断片は配列番号７のアミノ酸１−１６４を含むか又はそれからなる。１つの実施形態においては、宿主細胞はハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）であり、ＡＴＴ１ポリペプチドは配列番号２３のアミノ酸配列またはその多形を含む。幾つかの実施形態においては、前記の操作された宿主細胞は、配列番号７またはポリペプチドの自然変異体（多形）をコードする核酸配列を含む過剰発現カセットを含む。
【００１３】
ある実施形態においては、ＡＴＴ１またはその断片の発現を増強するように修飾されている本発明の操作された下等真核宿主細胞は更に、１以上の機能的遺伝子産物の突然変異、破壊または欠失を含む。１つの実施形態においては、宿主細胞は、プロテアーゼ活性、アルファ−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性、アルファ−１，２−マンノシルトランスフェラーゼ活性、マンノシルリン酸トランスフェラーゼ活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ活性、Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）活性および／またはドリコール−Ｐ−Ｍａｎ依存性アルファ（１−３）マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１以上の遺伝子の突然変異、破壊または欠失を含む。１つの実施形態においては、宿主細胞はＯＣＨ１遺伝子における突然変異、破壊または欠失を含む。１つの実施形態においては、宿主細胞は、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４遺伝子における突然変異、破壊または欠失を含む。１つの実施形態においては、宿主細胞は、ＰＮＯ１、ＭＮＮ４およびＭＮＮ４Ｌ１遺伝子における突然変異、破壊または欠失を含む。１つの実施形態においては、宿主細胞は、ＰＥＰ４およびＰＲＢ１遺伝子における突然変異、破壊または欠失を含む。もう１つの実施形態においては、宿主細胞は、ＡＬＧ３遺伝子の突然変異、破壊または欠失を含む（米国特許公開第ＵＳ２００５／０１７０４５２号に記載されているとおり）。１つの実施形態においては、宿主細胞は、以下の遺伝子の全ての突然変異、破壊または欠失を更に含む：ＯＣＨ１、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３、ＢＭＴ４、ＰＮＯ１、ＭＮＮ４およびＭＮＮ４Ｌ１。１つの実施形態においては、宿主細胞は、以下の遺伝子の全ての突然変異、破壊または欠失を更に含む：ＯＣＨ１、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３、ＢＭＴ４、ＰＮＯ１、ＭＮＮ４、ＭＮＮ４Ｌ１、ＰＥＰ４およびＰＲＢ１。１つの実施形態においては、宿主細胞は、以下の遺伝子の全ての突然変異、破壊または欠失を更に含む：ＯＣＨ１、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３、ＢＭＴ４、ＰＮＯ１、ＭＮＮ４、ＭＮＮ４Ｌ１、ＡＬＧ３，ＰＥＰ４およびＰＲＢ１。１つの実施形態においては、本発明の操作された下等真核宿主細胞は、ＳＳＫ２、ＲＲＴ１２、ＳＤＳ２３、ＮＯＴ５、ＤＲＳ１、ＣＲＺ１、ＣＴＫ１、ＲＧＤ２、ＡＶＯ２、ＹＭＲ１９６Ｗ、ＰＥＸ１、ＴＹＷ１、ＰＯＭ１５２、ＹＰＲ８４、ＭＡＫ５、ＡＺＦ１からなる群から選択される遺伝子の突然変異、破壊または欠失を更に含む。更にもう１つの実施形態においては、ＡＴＴ１またはその断片の発現を増強するように修飾されている本発明の操作された下等真核宿主細胞は、関心のある１以上の核酸配列を更に含む。ある実施形態においては、関心のある核酸配列は１以上のグリコシル化酵素をコードしている。更にもう１つの実施形態においては、グリコシル化酵素は、グリコシダーゼ、マンノシダーゼ、ホスホマンノシダーゼ、ホスファターゼ、ヌクレオチド糖輸送体、マンノシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン輸送体、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよびオリゴサッカリルトランスフェ���ーゼからなる群から選択される。
【００１４】
更にもう１つの実施形態においては、関心のある核酸配列は１以上の組換えタンパク質をコードしている。１つの実施形態においては、組換えタンパク質は治療用タンパク質である。ある実施形態においては、治療用タンパク質は、抗体（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＥ）、抗体フラグメント、ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメイン、エリスロポエチン、サイトカイン、凝固因子、可溶性ＩｇＥ受容体α鎖、ウロキナーゼ、キマーゼ、尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合性タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮増殖因子−２、骨髄前駆体抑制因子−１、オステオプロテゲリン、α−１アンチトリプシン、ＤＮアーゼＩＩ、α−フェトプロテイン、インスリン、Ｆｃ融合体、ＨＳＡ融合体、ウイルス抗原および細菌抗原からなる群から選択される。１つの実施形態においては、治療用タンパク質は、抗体またはそのフラグメントである。１つの実施形態においては、治療用タンパク質は、Ｎ−グリカンを含む抗体または抗体フラグメント（Ｆｃ含有ポリペプチド）である。
１つの実施形態においては、Ｎ−グリカンはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を主に含む。１つの実施形態においては、Ｎ−グリカンはＮＡＮＡ２Ｇａｌ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を主に含む。
【００１５】
他の追加的な実施形態においては、ＡＴＴ１またはその断片の発現を増強するように修飾されている本発明の操作された下等真核宿主細胞は、類似培養条件下のＡＴＴ１ナイーブ親宿主細胞と比較して、培養安定性、耐熱性の増強または発酵頑強性の改善を示す。１つの実施形態においては、宿主細胞は３２℃の培養において少なくとも８０時間の発酵にわたって最小限度の細胞溶解を伴って生存しうる。１つの実施形態においては、宿主細胞は、誘導（例えばメタノール誘導）後に３２℃の培養において少なくとも８０時間の発酵にわたって最小限度の細胞溶解を伴って生存しうる。１つの実施形態においては、宿主細胞は、３２℃の培養において少なくとも１００時間の発酵にわたって最小限度の細胞溶解を伴って生存しうる。１つの実施形態においては、宿主細胞は、誘導後に３２℃の培養において少なくとも１００時間の発酵にわたって最小限度の細胞溶解を伴って生存しうる。
【００１６】
本発明はまた、配列番号２３のＡＴＴ１遺伝子の活性を低減または排除するように修飾されている操作されたハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）宿主細胞を提供する。１つの実施形態においては、本発明は、配列番号２３をコードする核酸、その自然変異体またはその断片の発現を低減または排除するように修飾されているハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）宿主細胞を提供する。本発明はまた、配列番号２３をコードするＡＴＴ１遺伝子の突然変異形態を発現するように修飾されているハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）宿主細胞を提供する。
【００１７】
本発明はまた、配列番号２３をコードする核酸、その自然変異体またはその断片の発現を増強するように宿主細胞が修飾されている操作されたハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）宿主細胞を提供する。
【００１８】
ある実施形態においては、本発明はまた、ＡＴＴ１遺伝子のコード配列、ＡＴＴ１遺伝子のプロモーター領域、ＡＴＴ１の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１遺伝子のコード配列の縮重変異体である核酸配列ならびに関連核酸配列および断片からなる群から選択される核酸配列の破壊、欠失または突然変異（例えば、単一ヌクレオチド突然変異、挿入突然変異または欠失突然変異）を含む操作された下等真核宿主細胞を提供し、ここで、宿主細胞は、破壊、欠失または突然変異を伴わない宿主細胞と比較された場合、培養安定性、耐熱性の増強または発酵頑強性の改善を有する。
【００１９】
本発明はまた、異種ポリペプチドおよび他の代謝産物を製造するための、本発明の操作された下等真核宿主細胞の使用方法に関する。１つの実施形態においては、本発明は、前記のピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）宿主細胞のいずれかにおける異種ポリペプチドの製造方法であって、異種ポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、所望により、異種ポリペプチドを宿主細胞から単離することを含む製造方法を提供する。
【００２０】
本発明はまた、（ａ）ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１遺伝子に対するオルソログであるＡＴＴ１遺伝子の活性を低減または排除するように修飾されている操作された宿主細胞内に、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入し、（ｂ）異種ポリペプチドの発現に適した条件下、宿主細胞を培養し、そして、所望により、（ｃ）異種ポリペプチドを宿主細胞から単離することを含む、操作された下等真核宿主細胞における異種ポリペプチドの製造方法を含む。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は糖操作されている。１つの実施形態においては、下等真核細胞はＯＣＨ１活性を欠く。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は真菌宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核細胞は、ＯＣＨ１活性を欠く真菌宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は酵母宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核細胞は、ＯＣＨ１活性を欠く酵母宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞はピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）である。１つの実施形態においては、下等真核細胞は、ＯＣＨ１活性を欠くピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）宿主細胞である。１つの実施形態においては、宿主細胞はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり、ＡＴＴ１遺伝子は、配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその多形をコードしている。もう１つの実施形態においては、宿主細胞はハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）であり、ＡＴＴ１遺伝子は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその多形をコードしている。
【００２１】
本発明はまた、（ａ）配列番号７のピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１遺伝子に対するオルソログであるＡＴＴ１遺伝子を過剰発現するように修飾されている操作された宿主細胞内に、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入し、（ｂ）異種ポリペプチドの発現に適した条件下、宿主細胞を培養し、そして、所望により、（ｃ）異種ポリペプチドを宿主細胞から単離することを含む、操作された下等真核宿主細胞における異種ポリペプチドの製造方法を含む。１つの実施形態においては、異種ポリペプチドはメタノール誘導プロモーターに機能的に連結されることが可能であり、宿主細胞は、メタノール存在下の異種ポリペプチドの発現に適した条件下で培養される。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は糖操作されている。１つの実施形態においては、下等真核細胞は、ＯＣＨ１活性を欠く下等真核宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は真菌宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核細胞は、ＯＣＨ１活性を欠く真菌宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は酵母宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核細胞は、ＯＣＨ１活性を欠く酵母宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞はピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）である。１つの実施形態においては、下等真核細胞は、ＯＣＨ１活性を欠くピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）宿主細胞である。もう１つの実施形態においては、宿主細胞はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり、ＡＴＴ１遺伝子は、配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその多形をコードしている。もう１つの実施形態においては、宿主細胞はハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）であり、ＡＴＴ１遺伝子は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその多形をコードしている。
【００２２】
本発明はまた、（ａ）配列番号２３をコードする核酸、その自然変異体またはその断片の発現を低減または排除するように修飾されている操作されたハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）宿主細胞内に、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入し、（ｂ）異種ポリペプチドの発現に適した条件下、細胞を培養し、そして、所望により、（ｃ）異種ポリペプチドを宿主細胞から単離することを含む、操作されたハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）宿主細胞における異種ポリペプチドの製造方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、（ａ）配列番号２３をコードする核酸、その自然変異体またはその断片の発現を増強するように修飾されている操作されたハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）宿主細胞内に、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入し、（ｂ）異種ポリペプチドの発現に適した条件下、細胞を培養し、そして、所望により、（ｃ）異種ポリペプチドを宿主細胞から単離することを含む、操作されたハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）宿主細胞における異種ポリペプチドの製造方法を提供する。
【００２４】
本発明はまた、内因性ＡＴＴ１遺伝子と相同組換えし、内因性ＡＴＴ１遺伝子を部分的または完全に欠失させ、あるいは内因性ＡＴＴ１遺伝子を破壊する細胞内に異種ポリヌクレオチドを導入することを含む、本発明の宿主細胞のいずれかの製造方法を提供する。
【００２５】
また、本発明は、宿主細胞のゲノムＤＮＡ内のＡＴＴ１遺伝子の破壊、欠失または突然変異を含む、宿主細胞内への異種核酸配列の遺伝的組込みのための方法を提供する。これらの方法は、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１遺伝子のコード配列、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１遺伝子のコード配列の縮重変異体である核酸配列ならびに関連核酸配列および断片からなる群から選択される配列に由来する破壊された、欠失した又は突然変異した核酸配列を含む宿主細胞内に、関心のある配列を導入する工程を含む。
【００２６】
本発明はまた、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１遺伝子またはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１遺伝子の断片またはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１遺伝子のオルソログもしくは多形（自然変異体）をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ＡＴＴ１遺伝子の突然変異体（単一ヌクレオチド突然変異、フレームシフト突然変異、挿入、トランケート化または欠失）をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、これらの単離されたポリヌクレオチドまたはこれらのポリヌクレオチドの断片を含むベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明は更に、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１遺伝子、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１遺伝子の断片またはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１遺伝子のオルソログもしくは多形によりコードされるポリペプチド配列を含むか又はそれらからなる単離されたポリペプチドを提供する。本発明の単離されたポリペプチドに特異的に結合する抗体も本発明に含まれる。
【００２７】
１つの実施形態においては、本発明は、配列番号７またはその断片をコードするヌクレオチド配列、配列番号８またはその断片をコードするヌクレオチド配列、配列番号９またはその断片をコードするヌクレオチド配列、配列番号１０またはその断片をコードするヌクレオチド配列、および配列番号２３またはその断片をコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される野生型または突然変異ＡＴＴ１遺伝子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む。１つの実施形態においては、単離核酸は、配列番号７の残基１−２９６、１−３１または１−１６４を含む又は実質的にそれらからなるポリペプチドをコードしている。１つの実施形態においては、本発明は、配列番号２４またはその断片、配列番号２５またはその断片、配列番号２６またはその断片、配列番号２７またはその断片、配列番号２８またはその断片、配列番号２９またはその断片、配列番号３０またはその断片、配列番号３１またはその断片および配列番号３２またはその断片からなる群から選択される野生型または突然変異ＡＴＴ１遺伝子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む。１つの実施形態においては、核酸を発現する単離された宿主細胞は、類似条件下のＡＡＴ１ナイーブ親宿主細胞と比較された場合、培養安定性、耐熱性の増強および／または発酵頑強性の改善を示す。本発明はまた、本発明の核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびにこれらの核酸によりコードされるポリペプチドを含む。
【００２８】
発明の詳細な説明
分子生物学
本発明においては、当該技術の範囲内の通常の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が用いられうる。本明細書中に特に定められていない限り、本発明に関して用いられている科学技術用語は、当業者に一般に理解されている意味を有する。更に、文脈に矛盾しない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載されている生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物、遺伝学ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関して用いる用語ならびにそれらの技術は、当技術分野においてよく知られており一般に用いられているものである。一般に、本発明の方法および技術は、特に示されていない限り、当技術分野でよく知られている通常の方法に従いならびに本明細書の全体にわたって引用され記載されている種々の全般的およびより具体的な参考文献に記載されているとおりに行われる。例えば、以下のものを参照されたい：Ｊａｍｅｓ  Ｍ．Ｃｒｅｇｇ（編集者），Ｐｉｃｈｉａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２０１０），Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，および２００２に対する補遺）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；ＴａｙｌｏｒおよびＤｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，Ｎ．Ｊ．；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ  Ｉ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ  ＩＩ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９），Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，（１９８６））；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）。
【００２９】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、一本鎖形態、二本鎖形態などのＤＮＡおよびＲＮＡを含む。
【００３０】
「ポリヌクレオチド配列」または「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸における一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも称される）であり、一連の２以上のヌクレオチドを意味する。本明細書に記載されているヌクレオチド配列（例えば、本発明のプロモーター）を含む任意のポリヌクレオチドが本発明の一部を構成する。
【００３１】
「コード配列」または発現産物（例えば、ＲＮＡまたはポリペプチド）を「コードする」配列は、発現されると産物（例えば、配列番号７または配列番号７の断片を含むポリペプチド）の産生をもたらすヌクレオチド配列（例えば、異種ポリヌクレオチド）である。
【００３２】
「タンパク質」、「ペプチド」または「ポリペプチド」（例えば、異種ポリペプチド、例えば、配列番号７、あるいは免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖）は、２以上のアミノ酸の連続鎖を含む。
【００３３】
「タンパク質配列」、「ペプチド配列」または「ポリペプチド配列」または「アミノ酸配列」は、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドにおける一連の２以上のアミノ酸を意味する。
【００３４】
「単離されたポリヌクレオチド」または「単離されたポリペプチド」なる語は、細胞において若しくは組換えＤＮＡ発現系またはいずれかの他の混入物において通常見出される他の成分から部分的または完全に分離された、それぞれポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。これらの成分には、細胞膜、細胞壁、リボソーム、ポリメラーゼ、血清成分および外来性ゲノム配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の範囲は、本明細書に記載されている単離されたポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載されているプロモーター、およびそれに関連した方法（例えば、本明細書に記載されているもの）を含む。
【００３５】
単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、好ましくは、実質的に均一な分子組成物であるが、ある程度の不均一性を伴いうる。
【００３６】
一般に、「プロモーター」または「プロモーター配列」は、細胞内で（例えば、直接的に又は他のプロモーター結合タンパク質もしくは物質を介して）ＲＮＡポリメラーゼに結合し、それが機能的に連結しているコード配列の転写を開始させうるＤＮＡ調節領域である。
【００３７】
コード配列（例えば、異種ポリヌクレオチド、例えばレポーター遺伝子または免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖のコード配列）が転写および翻訳制御配列（例えば、本発明のプロモーター）に、「機能的に連結されている」、「制御下にある」、「機能的に結合されている」または「作動的に結合されている」といえるのは、配列が、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡへのコード配列のＲＮＡポリメラーゼ媒介性転写を導き、ついでＲＮＡが（それがイントロンを含有する場合には）スプライシングされることが可能であり、所望により、コード配列によりコードされるタンパク質へと翻訳されうる場合である。
【００３８】
本発明は、野生型ＡＴＴ１または突然変異ＡＴＴ１コード領域（ＡＴＴ１遺伝子における単一ヌクレオチド突然変異、フレームシフト突然変異、挿入、トランケート化および欠失を含む）をコードする核酸を含むベクターまたはカセットを含む。本発明はまた、過剰発現した場合に培養安定性、耐熱性を増強し及び／又は発酵頑強性を改善しうるＡＴＴ１またはＡＴＴ１の断片の過剰発現を引き起こすベクターを含む。「ベクター」なる語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を宿主細胞内に導入して、該宿主を形質転換し、所望により、導入配列の発現および／または複製を促進しうるビヒクル（例えば、プラスミド）を含む。
本発明で使用される適当なベクターには、プラスミド、組込み可能なＤＮＡ断片、および宿主細胞（例えば、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））のゲノム内への核酸の導入を促進しうる他のビヒクルが含まれる。プラスミドは、最も一般に用いられるベクター形態であるが、類似機能を果たし当技術分野で公知である又は公知となる全ての他のベクター形態が本発明における使用に適している。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら，Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８５および補遺，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，ならびにＲｏｄｒｉｇｕｅｚら（編），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡを参照されたい。
【００３９】
プロモーターに機能的に連結されたポリヌクレオチド（例えば、異種ポリヌクレオチド、例えば、免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖をコードする異種ポリヌクレオチド）は、発現系において発現されうる。「発現系」なる語は、ベクターにより運ばれ宿主細胞に導入されたタンパク質または核酸を適当な条件下で発現しうる宿主細胞および適合性ベクターを意味する。一般的な発現系には、真菌宿主細胞（ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳類宿主細胞およびベクターが含まれる。
【００４０】
一般に、「誘導条件」は、宿主細胞におけるポリヌクレオチド（例えば、異種ポリヌクレオチド）の発現の増強をもたらす成長条件を意味する。メタノール誘導なる語は、宿主細胞をメタノールにさらすことによる、本発明の宿主細胞におけるメタノール誘導性プロモーターに機能的に連結されたポリヌクレオチド（例えば、異種ポリヌクレオチド）の発現の増強を意味する。
【００４１】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムに関する以下の参考文献を参照により本明細書に組み入れることとする：ＢＬＡＳＴアルゴリズム：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．（１９９３）３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９６）２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９７）２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．（１９９７）７：６４９−６５６；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）１７：１４９−１６３；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．ら，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｉ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９４）１０：６７−７０；アライメント・スコアリング・システム：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ら，“Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３４５−３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．ら，“Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ”，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．“Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３５３−３５８，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）２１９：５５５−５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９１）３：６６−７０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１０９１５−１０９１９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．（１９９３）３６：２９０−３００；アライメント統計学：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：２２６４−２２６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：５８７３−５８７７；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．ら，Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．（１９９４）２２：２０２２−２０３９；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．“Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ編），（１９９７）ｐｐ．１−１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。
【００４２】
宿主細胞
本発明は、ＡＴＴ１遺伝子の活性を低減または排除するために修飾されている操作された下等真核宿主細胞に関する。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は糖操作されている。１つの実施形態においては、下等真核細胞はＯＣＨ１活性を欠く。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は真菌宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は、ＯＣＨ１活性を欠く真菌宿主細胞である。もう１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は酵母宿主細胞である。もう１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は、ＯＣＨ１活性を欠く酵母宿主細胞である。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞はピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）である。１つの実施形態においては、下等真核宿主細胞は、ＯＣＨ１活性を欠くピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）である。１つの実施形態においては、真菌宿主細胞は、以下のものからなる群から選択される：ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）（ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  Ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ザイゴサッカロミセス・ロウキシイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）、ザイゴサッカロミセス・バイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ）、シュワンニオマイセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、クライベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アルクスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ウェンティイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｗｅｎｔｉｉ）、アスペルギルス・アウレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、アスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、アシビア・ゴシッピイ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓ��ｙｐｉｉ）、メチロフィルス・メチロトロフス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、カンジダ・ボイディニイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、カンジダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、デバロミセス・ハンゼニイ（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）。もう１つの実施形態においては、真菌宿主細胞はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。もう１つの実施形態においては、真菌宿主細胞はハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）である。
【００４３】
本明細書中で用いる低減したＡＴＴ１遺伝子活性を有する又はＡＴＴ１遺伝子活性を欠く宿主細胞は、類似培養条件下のＡＴＴ１ナイーブ親宿主細胞と比較して、培養安定性、耐熱性の増強および／または発酵頑強性の改善を示す細胞を意味する。遺伝子がＡＴＴ１活性を有するかどうかを決定するために、遺伝子を糖操作宿主細胞において欠失させることが可能であり（例えば、ＯＣＨ１マイナス下等真核宿主細胞）、バイオリアクター内の３２℃の培養内で細胞が生存する能力を決定し、もし、細胞がＡＴＴ１ナイーブ細胞と比較して培養安定性、耐熱性の増強および／または頑強性の改善を示した場合には、遺伝子はＡＴＴ１活性を有する。
【００４４】
本明細書中で用いる「ＡＴＴ１ナイーブ宿主細胞」は、野生型ＡＴＴ１遺伝子をその天然ゲノム状態で含む宿主細胞を意味する。例えば、１つの実施形態においては、ＡＴＴ１ナイーブ宿主細胞は、その天然ゲノム状態で配列番号７のポリペプチドまたはその自然変異体（多形）をコードするＡＴＴ１遺伝子を含むピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を意味する。
【００４５】
本明細書中で用いる「操作された細胞」は、遺伝的操作技術を用いて改変されている細胞を意味する。本明細書中で用いる「糖操作された」細胞は、Ｎ−またはＯ−結合グリコシル化が、それらの天然形態から遺伝子の不活性化もしくは欠失によりまたはグリコシルトランスフェラーゼもしくはグリコシダーゼの異種発現により、修飾されている糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された細胞を意味する。
【００４６】
本明細書中で用いる「耐熱性」は、温度抵抗性（すなわち、少なくとも約３２℃の温度までの培養において増殖する能力）の増強を意味する。
【００４７】
本明細書中で用いる「発酵頑強性の改善（改善された発酵頑強性）」は、発酵中の細胞生存性の増加または細胞溶解の低下を意味する。
【００４８】
本発明は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１遺伝子のオルソログであるＡＴＴ１遺伝子の活性を低減または排除するように修飾されている任意の操作された下等真核宿主細胞を含み、ここで、該細胞は、ＡＴＴ１ナイーブ親宿主細胞と比較して培養安定性、耐熱性の増強および／または発酵頑強性の改善を示す。
【００４９】
本発明はまた、（ｉ）ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１遺伝子のオルソログであるＡＴＴ１遺伝子またはポリペプチドの発現を低減または排除するように、（ｉｉ）ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１遺伝子のオルソログであるＡＴＴ１遺伝子の突然変異形態を発現するように、あるいは（ｉｉｉ）ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１遺伝子のオルソログであるＡＴＴ１遺伝子または該遺伝子の断片を過剰発現するように修飾されている操作された下等真核宿主細胞に関するものであり、ここで、該細胞は、ＡＴＴ１ナイーブ親宿主細胞と比較して培養安定性、耐熱性の増強および／または発酵頑強性の改善を示す。１つの実施形態においては、本発明は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１遺伝子のオルソログであるＡＴＴ１遺伝子またはポリペプチドの発現を低減または排除するように、あるいはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１遺伝子のオルソログであるＡＴＴ１遺伝子の突然変異形態を発現するように修飾されている操作された下等真核宿主細胞に関するものであり、ここで、該細胞は、ＡＴＴ１ナイーブ親宿主細胞と比較して培養安定性、耐熱性の増強および／または発酵頑強性の改善を示す。もう１つの実施形態においては、本発明は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１遺伝子のオルソログであるＡＴＴ１遺伝子または該遺伝子の機能的もしくはドミナントネガティブ断片を過剰発現するように修飾されている下等真核宿主細胞に関するものであり、ここで、該細胞は、ＡＴＴ１ナイーブ親宿主細胞と比較して培養安定性、耐熱性の増強および／または発酵頑強性の改善を示す。
【００５０】
本明細書中で用いるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１遺伝子に対するオルソログは、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１遺伝子に対して配列類似性を有しＡＴＴ１活性を有する遺伝子である。１つの実施形態においては、配列類似性は少なくとも２５％である。当業者であれば、単なる通常の実験を用いて、そのようなオルソログを特定することが可能であろう。例えば、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＡＴＴ１オルソログは、実施例９に記載されているとおりに特定された。他の真菌／酵母オルソログは、例えば、相互ＢＬＡＳＴ分析を用いて同様に特定されうるであろう。以下の遺伝子はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１遺伝子の潜在的オルソログとして特定されている。
【００５１】
真菌宿主細胞：配列／ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号
ピチア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）：配列番号２４（ＸＰ ００１３８５０９２．２）
ピチア・グイリエルモンジイ（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）：配列番号２５（ＸＰ ００１４８２３６４．１）
クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）：配列番号２６（ＸＰ ４５３６２７．１）
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）：配列番号２７（ＥＨＡ１９９９９．１）
アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）：配列番号２８（ＣＢＦ７６７８６．１）
アスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）：配列番号２９（ＸＰ ００２３７８６１９．１）
デバリオミセス・ハンゼニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）：配列番号３０（ＸＰ ４５８１７１．２）
ザイゴサッカロミセス・ロウキシイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）：配列番号３１（ＸＰ ００２４９９２８５．１）
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）：配列番号３２（ＣＡＡ９７９６９．１）。
【００５２】
本発明の宿主細胞は、一倍体、二倍体または倍数体状態でありうるであろう。更に、本発明は、ただ１つの内因性染色体ＡＴＴ１遺伝子が突然変異、破壊、トランケート化または欠失している二倍体細胞を含む。
【００５３】
１つの実施形態においては、本発明の操作された下等真核宿主細胞は、以下のものからなる群から選択される：ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）（ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  Ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ザイゴサッカロミセス・ロウキシイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）、ザイゴサッカロミセス・バイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ）、シュワンニオマイセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、クライベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アルクスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ウェンティイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｗｅｎｔｉｉ）、アスペルギルス・アウレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、アスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、アシビア・ゴシッピイ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、メチロフィルス・メチロトロフス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、カンジダ・ボイディニイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、カンジダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）およびデバロミセス・ハンゼニイ（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）。本発明の１つの実施形態においては、宿主細胞は、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）細胞、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）（ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）およびピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）からなる群から選択される。１つの実施形態においては、宿主細胞は、操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞であり、ＡＴＴ１遺伝子は、配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの自然変異体をコードしている。もう１つの実施形態においては、宿主細胞は、操作されたハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）宿主細胞であり、ＡＴＴ１遺伝子は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの自然変異体をコードしている。１つの実施形態においては、宿主細胞は、操作されたピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）宿主細胞であり、ＡＴＴ１遺伝子は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの自然変異体をコードしている。もう１つの実施形態においては、宿主細胞は、操作されたピチア・グイリエルモンジイ（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）宿主細胞であり、ＡＴＴ１遺伝子は、配列番号２５のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの自然変異体をコードしている。もう１つの実施形態においては、宿主細胞は、操作されたクライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）宿主細胞であり、ＡＴＴ１遺伝子は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの自然変異体をコードしている。もう１つの実施形態においては、宿主細胞は、操作されたアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞であり、ＡＴＴ１遺伝子は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの自然変異体をコードしている。もう１つの実施形態においては、宿主細胞は、操作されたアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）宿主細胞であり、ＡＴＴ１遺伝子は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの自然変異体をコードしている。もう１つの実施形態においては、宿主細胞は、操作されたアスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）宿主細胞であり、ＡＴＴ１遺伝子は、配列番号２９のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの自然変異体をコードしている。もう１つの実施形態においては、宿主細胞は、操作されたデバリオミセス・ハンゼニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）宿主細胞であり、ＡＴＴ１遺伝子は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの自然変異体をコードしている。もう１つの実施形態においては、宿主細胞は、操作されたザイゴサッカロミセス・ロウキシイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）宿主細胞であり、ＡＴＴ１遺伝子は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの自然変異体をコードしている。もう１つの実施形態においては、宿主細胞は、操作されたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）宿主細胞であり、ＡＴＴ１遺伝子は、配列番号３２のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの自然変異体をコードしている。
【００５４】
１つの実施形態においては、本発明の操作された下等真核宿主細胞は更に、１以上の遺伝子の突然変異、破壊または欠失を含む。１つの実施形態においては、本発明の操作された下等真核宿主細胞は、プロテアーゼ活性、アルファ−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性、アルファ−１，２−マンノシルトランスフェラーゼ活性、マンノシルリン酸トランスフェラーゼ活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ活性、Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）活性および／またはドリコール−Ｐ−Ｍａｎ依存性アルファ（１−３）マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする１以上の遺伝子の突然変異、破壊または欠失を含む。１つの実施形態においては、本発明の操作された下等真核宿主細胞は、ＯＣＨ１遺伝子における突然変異、破壊または欠失を含む。１つの実施形態においては、本発明の操作された下等真核宿主細胞は、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４遺伝子における突然変異、破壊または欠失を含む。１つの実施形態においては、本発明の操作された下等真核宿主細胞は、ＰＮＯ１、ＭＮＮ４およびＭＮＮ４Ｌ１遺伝子における突然変異、破壊または欠失を含む。１つの実施形態においては、本発明の操作された下等真核宿主細胞は、ＰＥＰ４およびＰＲＢ１遺伝子における突然変異、破壊または欠失を含む。もう１つの実施形態においては、本発明の操作された下等真核宿主細胞は、ＡＬＧ３遺伝子の突然変異、破壊または欠失を含む（米国特許公開第ＵＳ２００５／０１７０４５２号に記載されているとおり）。１つの実施形態においては、本発明の操作された下等真核宿主細胞は、以下の遺伝子の全ての突然変異、破壊または欠失を含む：ＯＣＨ１、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３、ＢＭＴ４、ＰＮＯ１、ＭＮＮ４およびＭＮＮ４Ｌ１。１つの実施形態においては、本発明の操作された下等真核宿主細胞は、以下の遺伝子の全ての突然変異、破壊または欠失を含む：ＯＣＨ１、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３、ＢＭＴ４、ＰＮＯ１、ＭＮＮ４、ＭＮＮ４Ｌ１、ＰＥＰ４およびＰＲＢ１。１つの実施形態においては、本発明の操作された下等真核宿主細胞は、以下の遺伝子の全ての突然変異、破壊または欠失を更に含む：ＯＣＨ１、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３、ＢＭＴ４、ＰＮＯ１、ＭＮＮ４、ＭＮＮ４Ｌ１、ＡＬＧ３，ＰＥＰ４およびＰＲＢ１。幾つかの実施形態においては、本発明の宿主細胞は、１以上のＰｍｔｐインヒビターを含む培地内で培養されうる。Ｐｍｔｐインヒビターには、ベンジリデンチアゾリジンジオンが含まれるが、これに限定されるものではない。ベンジリデンチアゾリジンジオンの例としては、５−［［３，４−ビス（フェニルメトキシ）フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、５−［［３−（１−２５  フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、および５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸が挙げられる。
【００５５】
１つの実施形態においては、本発明の操作された下等真核宿主細胞は、ＯＣＨ１活性を欠く。１つの実施形態においては、本発明は、（ｉ）ＡＴＴ１遺伝子またはポリペプチドの発現を低減または排除するように、（ｉｉ）ＡＴＴ１遺伝子の突然変異形態を発現するように、あるいは（ｉｉｉ）ＡＴＴ１遺伝子または該ＡＴＴ１の断片を過剰発現するように修飾されている下等真核宿主細胞（例えば、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．））を含み、ここで、細胞はＯＣＨ１活性を欠く。ＯＣＨ１活性を欠く下等真核宿主細胞は当分野において記載されており、温度感受性であることが示されている。例えば、Ｃｈｏｉら，２００３；Ｂａｔｅｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（１）：９０−９８（２００６）；Ｗｏｏｇ  Ｋｉｍら，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８１（１０）：６２６１−６２７２（２００６）；Ｙｏｋｏ−ｏら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４８９（ｌ）：７５−８０（２００１）；およびＮａｋａｙａｍａら，ＥＭＢＯ  Ｊ  １１（７）：２５１１−２５１９（１９９２）を参照されたい。したがって、ＯＣＨ１活性を欠く細胞を、それらを耐熱性にするために修飾することが望ましい。
【００５６】
本発明の１つの実施形態においては、本発明の操作された下等真核宿主細胞は更に、アルファ−１，２−マンノシダーゼを分泌へと導くシグナルペプチドを有するアルファ−１，２−マンノシダーゼをコードする核酸を含むように遺伝的に操作される。例えば、本発明の１つの実施形態においては、本発明の宿主細胞は、５．１〜８．０、好ましくは５．９〜７．５の最適ｐＨを有する外因性アルファ−１，２−マンノシダーゼ酵素を発現するように操作される。本発明の１つの実施形態においては、外因性酵素は、宿主細胞の小胞体またはゴルジ装置に標的化され、この部位において、それは例えばＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のようなＮ−グリカンを切断してＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を与える。米国特許第７，０２９，８７２号を参照されたい。そのようなアルファ−１，２−マンノシダーゼ活性を発現する下等真核宿主細胞は当分野において記載されている。例えば、Ｃｈｏｉら，２００３を参照されたい。１つの実施形態においては、本発明の糖操作された下等真核宿主細胞は、ＯＣＨ１活性を欠き、アルファ１，２マンノシダーゼを含む。
【００５７】
もう１つの実施形態においては、（ｉ）ＡＴＴ１遺伝子またはポリペプチドの発現を低減または排除するように、（ｉｉ）ＡＴＴ１遺伝子の突然変異形態を発現するように、または（ｉｉｉ）ＡＴＴ１遺伝子または該ＡＴＴ１の断片を過剰発現するように修飾されている本発明の操作された下等真核宿主細胞（例えば、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．））は更に、ベータ−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４）の１以上を欠失させ又は破壊することにより（米国特許第７，４６５，５７７号を参照されたい）、あるいは干渉性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを使用してベータ−マンノシルトランスフェラーゼの１以上をコードするＲＮＡの翻訳を妨げることにより、アルファ−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を排除するために遺伝的に操作される。
【００５８】
幾つかの実施形態においては、（ｉ）ＡＴＴ１遺伝子またはポリペプチドの発現を低減または排除するように、（ｉｉ）ＡＴＴ１遺伝子の突然変異形態を発現するように、または（ｉｉｉ）ＡＴＴ１遺伝子または該ＡＴＴ１の断片を過剰発現するように修飾されている本発明の操作された下等真核宿主細胞（例えば、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．））は更に、例えばホスホマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（すなわち、ＰＮＯ１、ＭＮＮ４およびＭＮＮ４Ｌ１）の１以上を欠失させ又は破壊することにより（例えば、米国特許第７，１９８，９２１号および第７，２５９，００７号を参照されたい）あるいは干渉性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを使用してホスホマンノシルトランスフェラーゼの１以上をコードするＲＮＡの翻訳を妨げることにより、ホスホマンノース残基を有する糖タンパク質を排除するために遺伝的に操作される。
【００５９】
また、（ｉ）ＡＴＴ１遺伝子またはポリペプチドの発現を低減または排除するように、（ｉｉ）ＡＴＴ１遺伝子の突然変異形態を発現するように、または（ｉｉｉ）ＡＴＴ１遺伝子または該ＡＴＴ１の断片を過剰発現するように修飾されている本発明の操作された下等真核宿主細胞（例えば、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．））は更に、リーシュマニア属種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．）単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはそれらの組合せ（例えば、ＷＯ２０１１／０６３８９に記載されているもの）をコードする核酸を含むように遺伝的に操作されうる。
【００６０】
幾つかの実施形態においては、本発明の操作された下等真核宿主細胞は、異種ポリペプチド（例えば、レポーターまたは免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖）をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを更に含む。本発明は更に、本発明の宿主細胞の使用方法、例えば、宿主細胞において異種ポリペプチドを発現させるための方法を含む。本発明の操作された下等真核宿主細胞はまた、そのような細胞内で発現されるポリペプチド上の特定のグリコシル化パターンを発現するように遺伝的に操作されうる。例えば、本発明の宿主細胞は、Ｎ−グリカンを含むポリペプチドを産生するように修飾されうる。１つの実施形態においては、本発明の宿主細胞は、高マンノース、ハイブリッドまたは複合型Ｎ−グリカンを産生するように操作されうる。
【００６１】
本明細書中で用いる「Ｎ−グリカン」および「グリコフォーム（糖形態）」なる語は互換的に用いられ、Ｎ−結合オリゴ糖を意味し、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基にアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合により結合していることを意味する。Ｎ−結合糖タンパク質は、タンパク質中のアスパラギン残基のアミド窒素に結合したＮ−アセチルグルコサミン残基を含有する。糖タンパク質上で見出される主な糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸（例えば、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ＮＡＮＡ））が挙げられる。
【００６２】
Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の共通の五糖コアを有する（「Ｍａｎ」はマンノースを意味し、「Ｇｌｃ」はグルコースを意味し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを意味し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを意味する）。Ｎ−グリカンは、「トリマンノースコア」、「五糖コア」または「小マンノース（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ）コア」とも称されるＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア構造に付加される末梢糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコースおよびシアル酸）を含む分枝（アンテナ）の数に関して異なる。Ｎ−グリカンは、それらの分枝構成に従い分類される（例えば、高マンノース、複合またはハイブリッド）。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは５以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは、典型的には、「トリマンノース」コアの１，３マンノース・アームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ、および１，６マンノース・アームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する。複合Ｎ−グリカンはまた、シアル酸または誘導体（例えば、「ＮＡＮＡ」または「ＮｅｕＡｃ」；ここで、「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を意味し、「Ａｃ」はアセチルを意味する）で修飾されていてもよいガラクトース（「Ｇａｌ」）またはＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基を有しうる。複合Ｎ−グリカンはまた、「二分岐（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）」ＧｌｃＮＡｃおよびコア・フコース（「Ｆｕｃ」）を含む鎖内置換を有しうる。複合Ｎ−グリカンはまた、「トリマンノースコア」上に複数のアンテナを有することが可能であり、これは、しばしば、「多アンテナグリカン」と称される。「ハイブリッド」Ｎ−グリカンは、トリマンノースコアの１，３マンノース・アームの末端に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを、そしてトリマンノースコアの１，６マンノース・アーム上に０個以上のマンノースを有する。これらの種々のＮ−グリカンは「グリコフォーム」とも称される。「ＰＮＧアーゼ」または「グリカナーゼ」はペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＥＣ  ３．２．２．１８）を意味する。
【００６３】
本発明の１つの実施形態においては、（ｉ）ＡＴＴ１遺伝子またはポリペプチドの発現を低減または排除するように、（ｉｉ）ＡＴＴ１遺伝子の突然変異形態を発現するように、あるいは（ｉｉｉ）ＡＴＴ１遺伝子または該ＡＴＴ１の断片を過剰発現するように修飾されている本発明の操作された下等真核宿主細胞（例えば、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．））は更に、複合Ｎ−グリカン、ハイブリッドＮ−グリカンおよび高マンノースＮ−グリカンからなる群から選択されるＮ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に修飾される。１つの実施形態においては、高マンノースＮ−グリカンは、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される。１つの実施形態においては、本発明の宿主細胞は、主にＭａｎ８−１０ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように操作される（実施例１３）。１つの実施形態においては、Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（実施例１３）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される。１つの実施形態においては、Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からからなる群から選択される。１つの実施形態においては、Ｎ−グリカンはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を主に含む。１つの実施形態においては、Ｎ−グリカンはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を主に含む。１つの実施形態においては、Ｎ−グリカンはＮＡＮＡ２Ｇａｌ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を主に含む。１つの実施形態においては、本発明の宿主細胞は、ガラクトシル化Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように操作される（実施例１）。１つの実施形態においては、本発明の宿主細胞は、シアル酸化Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように操作される（実施例２およびＷＯ２０１１／１４９９９９）。
【００６４】
ピチア・パストリスＡＴＴ１の特徴づけ
新規ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）遺伝子ＡＴＴ１（配列番号１；サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＡＬ４転写因子に対してオルソログである耐熱性獲得体（ａｃｑｕｉｒｉｎｇ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ））内の突然変異はＡＴＴ１タンパク質産物の未熟トランケート化をもたらし、耐熱性の増強を示す一組のピチア（Ｐｉｃｈｉａ）突然変異体において特定された。これらの突然変異は、これらの突然変異を含有するピチア（Ｐｉｃｈｉａ）宿主株に関して、温度抵抗性（すなわち、少なくとも約３５℃の温度に対する培養内の安定性）における有意な増強および発酵頑強性の改善をもたらした（すなわち、ＡＴＴ１突然変異ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）株は、細胞溶解の低下、誘導／産生期の延長を示し、タンパク質分解の低下および所望のグリコシル化パターンを伴う異種タンパク質産物を産生した）。
【００６５】
株の質を広範に改善するために、有意に改善した発酵頑強性を有する幾つかの耐熱性ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）突然変異株を一組の耐熱性突然変異体から特定した。未突然変異誘発糖操作親株は、典型的に、ペトリ皿上で培養された場合に温度感受性表現型を示し（Ｃｈｏｉら，２００３）、一般に、バイオリアクター内で培養された場合に３２℃でのＭｅＯＨ誘導の２４時間以内に高レベルの細胞溶解を示すが、本明細書に記載されているＡＴＴ１突然変異株は、細胞溶解の明らかな徴候を示すことなく、バイオリアクター内で培養された場合に３２℃での誘導後に１００時間以上にわたって生存可能である。この延長した誘導期は、複数の組換えタンパク質の収率および質の有意な改善、異種タンパク質（例えば、抗体および非抗体治療用物質）の産生のための望ましい形質を可能にする。
【００６６】
いずれかの酵母宿主株へと改変操作された場合のＡＴＴ１におけるそのような突然変異は、発酵頑強性を改善し、組換えタンパク質収率を改善し、タンパク質産物のタンパク質分解を低減するのに役立ちうるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｂは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＡＬ４およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１アミノ酸配列の間の配列アライメントを示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｂは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＡＬ４およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１アミノ酸配列の間の配列アライメントを示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｄは、４つの株ＹＧＬＹ１７１０８（図２Ａ）、ＹＧＬＹ１７１７７（図２Ｂ）、ＹＧＬＹ２２８３５（図２Ｃ）およびＹＧＬＹ１７１５９（図２Ｄ）からの分泌性および全細胞タンパク質を使用した場合のＮ−グリカンＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析トレースを示す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｄは、４つの株ＹＧＬＹ１７１０８（図２Ａ）、ＹＧＬＹ１７１７７（図２Ｂ）、ＹＧＬＹ２２８３５（図２Ｃ）およびＹＧＬＹ１７１５９（図２Ｄ）からの分泌性および全細胞タンパク質を使用した場合のＮ−グリカンＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析トレースを示す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜Ｄは、４つの株ＹＧＬＹ１７１０８（図２Ａ）、ＹＧＬＹ１７１７７（図２Ｂ）、ＹＧＬＹ２２８３５（図２Ｃ）およびＹＧＬＹ１７１５９（図２Ｄ）からの分泌性および全細胞タンパク質を使用した場合のＮ−グリカンＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析トレースを示す。
【図２Ｄ】図２Ａ〜Ｄは、４つの株ＹＧＬＹ１７１０８（図２Ａ）、ＹＧＬＹ１７１７７（図２Ｂ）、ＹＧＬＹ２２８３５（図２Ｃ）およびＹＧＬＹ１７１５９（図２Ｄ）からの分泌性および全細胞タンパク質を使用した場合のＮ−グリカンＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析トレースを示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜ＢはｐＧＬＹ８０４５およびｐＧＬＹ６３９１のプラスミド地図を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜ＢはｐＧＬＹ８０４５およびｐＧＬＹ６３９１のプラスミド地図を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜ＧはｐＧＬＹ５９３３〜５９３６（それぞれ、図４Ａ〜Ｄ）およびｐＧＬＹ５９４７〜ｐＧＬＹ５９４９（それぞれ、図４Ｅ〜Ｇ）のプラスミド地図を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜ＧはｐＧＬＹ５９３３〜５９３６（それぞれ、図４Ａ〜Ｄ）およびｐＧＬＹ５９４７〜ｐＧＬＹ５９４９（それぞれ、図４Ｅ〜Ｇ）のプラスミド地図を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜ＧはｐＧＬＹ５９３３〜５９３６（それぞれ、図４Ａ〜Ｄ）およびｐＧＬＹ５９４７〜ｐＧＬＹ５９４９（それぞれ、図４Ｅ〜Ｇ）のプラスミド地図を示す。
【図４Ｄ】図４Ａ〜ＧはｐＧＬＹ５９３３〜５９３６（それぞれ、図４Ａ〜Ｄ）およびｐＧＬＹ５９４７〜ｐＧＬＹ５９４９（それぞれ、図４Ｅ〜Ｇ）のプラスミド地図を示す。
【図４Ｅ】図４Ａ〜ＧはｐＧＬＹ５９３３〜５９３６（それぞれ、図４Ａ〜Ｄ）およびｐＧＬＹ５９４７〜ｐＧＬＹ５９４９（それぞれ、図４Ｅ〜Ｇ）のプラスミド地図を示す。
【図４Ｆ】図４Ａ〜ＧはｐＧＬＹ５９３３〜５９３６（それぞれ、図４Ａ〜Ｄ）およびｐＧＬＹ５９４７〜ｐＧＬＹ５９４９（それぞれ、図４Ｅ〜Ｇ）のプラスミド地図を示す。
【図４Ｇ】図４Ａ〜ＧはｐＧＬＹ５９３３〜５９３６（それぞれ、図４Ａ〜Ｄ）およびｐＧＬＹ５９４７〜ｐＧＬＹ５９４９（それぞれ、図４Ｅ〜Ｇ）のプラスミド地図を示す。
【図５】図５は、温度抵抗性および発酵頑強表現型を試験するための非突然変異誘発ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）株における内因性ＡＴＴ１遺伝子を置換するために用いたＤＮＡ構築物および組込み法を示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｃは、対照宿主細胞の増殖と比較した、改善されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１突然変異体の増殖を示す写真（図６Ａ〜Ｂ）および相関表（図６Ｃ）を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｃは、対照宿主細胞の増殖と比較した、改善されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１突然変異体の増殖を示す写真（図６Ａ〜Ｂ）および相関表（図６Ｃ）を示す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜Ｃは、対照宿主細胞の増殖と比較した、改善されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１突然変異体の増殖を示す写真（図６Ａ〜Ｂ）および相関表（図６Ｃ）を示す。
【図７】図７は、ｙＧＬＹ６９０３からｙＧＬＹ１７１０８までの株系列を示す。
【図８】図８は、ｙＧＬＹ１７１０８（ＧＦＩ５．０）バックグラウンドからのＡＴＴ１突然変異体系列を示す。
【図９】図９は、ｙＧＬＹ６９０３からｙＧＬＹ２２８３５およびｙＧＬＹ１７１５９までの株系列を示す。
【図１０】図１０は、ｐＧＬＹ８３６９のプラスミド地図を示す。
【図１１】図１１は、ｐＧＬＹ９９５９のプラスミド地図を示す。
【図１２】図１２は、ｐＧＬＹ５８８３のプラスミド地図を示す。
【図１３】図１３は、ＮＲＲＬ  １１４３０からｙＧＬＹ１３９７９までの株系列を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜Ｈは、プラスミド地図を示す。図Ａ４Ａ〜Ｄは、それぞれ、ｐＧＬＹ９９５５〜ｐＧＬＹ９９５８のプラスミド地図を示す。図１４Ｅ〜Ｈは、それぞれ、ｐＧＬＹ９９６０〜ｐＧＬＹ９９６３のプラスミド地図を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜Ｈは、プラスミド地図を示す。図Ａ４Ａ〜Ｄは、それぞれ、ｐＧＬＹ９９５５〜ｐＧＬＹ９９５８のプラスミド地図を示す。図１４Ｅ〜Ｈは、それぞれ、ｐＧＬＹ９９６０〜ｐＧＬＹ９９６３のプラスミド地図を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜Ｈは、プラスミド地図を示す。図Ａ４Ａ〜Ｄは、それぞれ、ｐＧＬＹ９９５５〜ｐＧＬＹ９９５８のプラスミド地図を示す。図１４Ｅ〜Ｈは、それぞれ、ｐＧＬＹ９９６０〜ｐＧＬＹ９９６３のプラスミド地図を示す。
【図１４Ｄ】図１４Ａ〜Ｈは、プラスミド地図を示す。図Ａ４Ａ〜Ｄは、それぞれ、ｐＧＬＹ９９５５〜ｐＧＬＹ９９５８のプラスミド地図を示す。図１４Ｅ〜Ｈは、それぞれ、ｐＧＬＹ９９６０〜ｐＧＬＹ９９６３のプラスミド地図を示す。
【図１４Ｅ】図１４Ａ〜Ｈは、プラスミド地図を示す。図Ａ４Ａ〜Ｄは、それぞれ、ｐＧＬＹ９９５５〜ｐＧＬＹ９９５８のプラスミド地図を示す。図１４Ｅ〜Ｈは、それぞれ、ｐＧＬＹ９９６０〜ｐＧＬＹ９９６３のプラスミド地図を示す。
【図１４Ｆ】図１４Ａ〜Ｈは、プラスミド地図を示す。図Ａ４Ａ〜Ｄは、それぞれ、ｐＧＬＹ９９５５〜ｐＧＬＹ９９５８のプラスミド地図を示す。図１４Ｅ〜Ｈは、それぞれ、ｐＧＬＹ９９６０〜ｐＧＬＹ９９６３のプラスミド地図を示す。
【図１４Ｇ】図１４Ａ〜Ｈは、プラスミド地図を示す。図Ａ４Ａ〜Ｄは、それぞれ、ｐＧＬＹ９９５５〜ｐＧＬＹ９９５８のプラスミド地図を示す。図１４Ｅ〜Ｈは、それぞれ、ｐＧＬＹ９９６０〜ｐＧＬＹ９９６３のプラスミド地図を示す。
【図１４Ｈ】図１４Ａ〜Ｈは、プラスミド地図を示す。図Ａ４Ａ〜Ｄは、それぞれ、ｐＧＬＹ９９５５〜ｐＧＬＹ９９５８のプラスミド地図を示す。図１４Ｅ〜Ｈは、それぞれ、ｐＧＬＹ９９６０〜ｐＧＬＹ９９６３のプラスミド地図を示す。
【図１５】図１５は、ＡＴＴ１欠失を伴うピチア（Ｐｉｃｈｉａ）株に関する細胞溶解の低減を示すグラフを示す。
【図１６】図１６は、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＡＴＴ１過剰発現株ｙＧＬＹ１３９７９＋  ＴＥＦ−ＡＴＴ１  １−６５５に関するタンパク質力価を示すグラフを示す。
【図１７】図１７は、種々のＡＴＴ１操作ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）宿主株に関する誘導時間、株細胞溶解およびタンパク質力価を示す表を示す。
【図１８−１】図１８は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＡＴＴ１のアライメントを示す。
【図１８−２】図１８は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＡＴＴ１のアライメントを示す。
【図１８−３】図１８は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＡＴＴ１のアライメントを示す。
【図１９Ａ】図１９Ａおよび１９Ｂは、細胞頑強性および産物力価に対する種々のＡＴＴ１トランケート化の効果を示す。
【図１９Ｂ】図１９Ａおよび１９Ｂは、細胞頑強性および産物力価に対する種々のＡＴＴ１トランケート化の効果を示す。
【図２０】図２０は、１５Ｌバイオリアクター内での細胞溶解における種々のＡＴＴ１修飾の効果を示す。
【図２１】図２１は、プラスミドｐＧＬＹ５９５２の制限地図を示す。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）シャトルベクターは、それが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で維持されている場合には、円状で示される。プラスミドは、細菌維持のためのｐＵＣ１９配列、ならびに選択マーカーとしてのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＲ３遺伝子（ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＲＰＬ１０プロモーターにより駆動される）に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１遺伝子の５’および３’領域を含有する。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）内への導入のために、プラスミドを、線状化およびｐＵＣ１９領域の除去のためにＳｆｉＩで消化し、１〜３ｍＭ  亜ヒ酸ナトリウムを含有する培地上で選択して、ＰＣＲにより選別された正しい組込み体（すなわち、ａｔｔ１Δ株）でのＡＴＴ１遺伝子座における置換組込みを促す。
【図２２】図２２は、ＧＦＩ２．０  ＡＴＴ１野生型およびａｔｔ１Δ発酵上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ＧＦＩ２．０  ＡＴＴ１野生型およびａｔｔ１Δ株の発酵サンプルを〜２４時間ごとに採取し、清澄化上清を１３０００×ｇの遠心分離により得た。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ゲルをクーマシーブルーにより染色した。分子量マーカー，Ｂｉｏｒａｄ  Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準。
【図２３】図２３は、ＧＦＩ２．０  ＡＴＴ１野生型およびａｔｔ１Δ発酵上清の上清ＤＮＡ定量を示す。ＧＦＩ２．０  ＡＴＴ１野生型およびａｔｔ１Δ株の発酵サンプルを〜２４時間ごとに採取し、清澄化上清を１３０００×ｇの遠心分離により得た。上清ＤＮＡ負荷を決定することにより、細胞溶解を測定した。サンプルを、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）蛍光ＤＮＡ株を使用して分析し、プレートリーダーを使用して定量した（既に報告されているとおり（Ｂａｒｎａｒｄ，２０１０）に行った）。
【図２４】図２４は、ＧＦＩ２．０  ＡＴＴ１野生型およびａｔｔ１Δ発酵上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ＧＦＩ１．０  ＡＴＴ１野生型およびａｔｔ１Δ株の発酵サンプルを〜２４時間ごとに採取し、清澄化上清を１３０００×ｇの遠心分離により得た。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ゲルをクーマシーブルーにより染色した。分子量マーカー，Ｂｉｏｒａｄ  Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準。
【図２５】図２５は、ＧＦＩ１．０  ＡＴＴ１野生型およびａｔｔ１Δ発酵上清の上清ＤＮＡ定量を示す。ＧＦＩ１．０  ＡＴＴ１野生型およびａｔｔ１Δ株の発酵サンプルを〜２４時間ごとに採取し、清澄化上清を１３０００×ｇの遠心分離により得た。上清ＤＮＡ負荷を決定することにより、細胞溶解を測定した。サンプルを、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）蛍光ＤＮＡ株を使用して分析し、プレートリーダーを使用して定量した（既に報告されているとおり（Ｂａｒｎａｒｄ，２０１０）に行った）。
【００６８】
実験方法
フェッドバッチ発酵、ＩｇＧ精製、Ｎ−グリカンの特徴づけ、および全ての他の分析アッセイは、既に記載されているとおりに行った（Ｂａｒｎａｒｄら，２０１０；Ｊｉａｎｇら，２０１１；Ｐｏｔｇｉｅｔｅｒら，２００９；Ｗｉｎｓｔｏｎ  Ｆ  ２００８）。
特に示されている場合を除き、本出願に記載されている全ての１Ｌバイオリアクター発酵の実施は、１００〜１２０時間のＭｅＯＨ誘導の後に終了するように計画される。しかし、過剰の細胞溶解が観察されれば、発酵の実施はより早く終了するであろう。細胞溶解は、顕微鏡検査により、または上清中に遊離した核ＤＮＡの量を測定することにより判定される（Ｂａｒｎａｒｄ，２０１０）。本出願の場合、過剰な細胞溶解は、８０％を超える細胞が顕微鏡検査により細胞溶解したこと、あるいは上清中で３０マイクログラム／ｍｌを超えるＤＮＡ濃度がピコグリーン（Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ）アッセイにより測定されることにより定義される。Ｗｉｎｓｔｏｎ（Ｗｉｎｓｔｏｎ  ２００８）により記載されているとおりに、ＵＶ突然変異誘発を行った。簡潔に説明すると、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）株を４０ｍｌのＹＳＤ液体培地内で２４℃で一晩増殖させた。５のＯＤ６００に達したら、１０６〜１０７細胞のアリコートを１００ｍｍ  ＹＳＤ寒天ペトリ皿の表面上に移し、蓋を取った状態で、５ｍＪ／ｃｍ２のＵＶ照射で処理した。ＵＶ処理後、ペトリ皿を直ちにアルミホイルで覆い（光誘発性ＤＮＡ修復を防ぐため）、突然変異誘発細胞を暗所にて２４℃で１８時間にわたって回復させた。ついで、これらの回復した細胞を、温度抵抗性突然変異体を選択するために３５℃のインキュベータに移した。３５℃での７〜１０日間のインキュベーションの後、コロニーを拾い、新鮮なＹＳＤプレート上に再ストリークし、３５℃でインキュベートし、再ストリークに際して温度抵抗性表現型を示すクローンのみを温度抵抗性突然変異体として保管した。
【００６９】
実施例１
温度抵抗性突然変異体は発酵頑強性および生産性の実質的な改善を示した
２つの温度感受性糖操作空（ｅｍｐｔｙ）宿主株ＹＧＬＹ１７１０８およびＹＧＬＹ２２８３５を、本明細書に記載されているとおりにＵＶ突然変異誘発に付して、増強した発酵頑強性を有するピチア（Ｐｉｃｈｉａ）宿主株を特定した。宿主株ＹＧＬ１７１０８は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを主に有するガラクトシル化糖タンパク質を産生するように操作されている（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，２００４および米国特許第７，７９５，００２号）。宿主株ＹＧＬ２２８３５は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを主に有するシアル酸化糖タンパク質を産生するように操作されている（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，２００６およびＷＯ２０１２／１１５９０４）。糖操作宿主株ＹＧＬＹ１７１０８は、初めはＷＯ２０１１／０６３８９に記載されている一連の修飾によりＮＲＬ−Ｙ１１４３０株から誘導され、株ＹＧＬＹ７９６５を与える。ＹＧＬＹ６９０３から宿主株ＹＧＬＹ１７１０８までの追加的修飾株に関する遺伝的バックグラウンドおよび株系列を図７に示す。ＹＧＬＹ６９０３からＹＧＬＹ２２８３５およびｙＧＬＹ１７１５９までの遺伝的バックグラウンドおよび株系列を図９に示す。ＵＶ突然変異誘発実験から得られた株の概要を図８に示す。
【００７０】
温度抵抗性コロニーを選択し、１．０Ｌ  ＤａｓＧｉｐバイオリアクターにおける標準的なＭｅＯＨフェッドバッチ法を用いて発酵させて、発酵プロセス中の株の頑強性を評価した（Ｈｏｐｋｉｎｓら，２０１１）。徹底的な発酵スクリーニングの後、劇的に増強した発酵頑強性を示す４つの突然変異体ＹＧＬＹ１７１７２、ＹＧＬＹ１７１７７、ＹＧＬＹ１７１７８およびＹＧＬＹ１７１５９を特定した（表１）。未突然変異誘発親株ＹＧＬＹ１７１０８およびＹＧＬＹ２２８３５は共に、３２℃の誘導の２４時間以内に著しい細胞溶解および細胞生存性の著しい低下を受けた（大量の細胞溶解を示す５の細胞溶解スコアとして表１に示されている）。これとは対照的に、４つの温度抵抗性突然変異体（ＹＧＬＹ１７１７２、ＹＧＬＹ１７１７７、ＹＧＬＹ１７１７８およびＹＧＬＹ１７１５９）は全て、劇的に改善した発酵頑強性を示し、細胞溶解はほとんど観察されず、３２℃での誘導後に１００時間以上にわたって生存可能であった（表１に示されているとおり、５のうちの２未満の細胞溶解スコアを示した）。顕微鏡観察に基づいて、０．５〜５．０の細胞溶解スコアを割り当てた。０．５の細胞溶解スコアは最小細胞溶解（９５％超が無傷細胞）を示し、５の細胞溶解スコアは高い細胞溶解（１０％未満が無傷細胞）を示す。
【表１】
2014532406.tif 000003
【００７１】
実施例２
耐熱性および発酵頑強性の増強を引き起こす原因突然変異を特定するためのゲノム配列決定
耐熱性および発酵頑強性の増強を引き起こす突然変異を特定し特徴づけるために、４つの独立して単離された突然変異体および親株に関してゲノム配列決定を行った。突然変異体およびそれらの対応親体との間のゲノムワイドな比較の後、１〜９個の非同義ヌクレオチド改変（表２において「＋」により示される）を、これらの４つの突然変異体のそれぞれにおいて特定した。これらの非同義突然変異のほとんどは、ＹＧＬＹ１７１５９突然変異体において見出される５ｂｐの挿入の１つの例外を除き、単一ヌクレオチド変異体により引き起こされる。１つの突然変異体ＹＧＬＹ１７１７８はただ１つの非同義ＳＮＶを含有し、これは、ＡＴＴ１（ａｃｑｕｉｒｉｎｇ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）と命名された特徴づけられていない転写因子における単一ナンセンス突然変異である。その他の３つの突然変異体においてもＡＴＴ１遺伝子におけるナンセンスまたはフレームシフト突然変異が特定されており、このことは、この転写因子の突然変異が温度抵抗性および発酵頑強性表現型に関連していることを示している。
【表２】
2014532406.tif 000004
【００７２】
４つ全ての突然変異（３つのナンセンス突然変異および１つのフレームシフト挿入）が、アミノ酸３１、１０７、１６４または６５５の後の未熟遺伝子産物トランケート化を引き起こした（図１Ａ〜Ｂ）。図１Ａ〜ＢはＳｃＧＡＬ４とＰｐＡＴＴ１との間の配列相同性を示す。アミノ酸３１における記号「＃」は、ＹＧＬＹ１７１５９において見出される５ｂｐの挿入の位置を示し、記号「＠」は、ＹＧＬ１７１７８（アミノ酸１０７におけるもの）、ＹＧＬ１７１７７（アミノ酸１６４）およびＹＧＬＹ１７１７２（アミノ酸６５５）から特定された終止コドン突然変異を示す。ＳｃＧＡＬ４は、パン酵母におけるガラクトース代謝酵素の調節に関与する鍵転写因子である（Ｔｒａｖｅｎら，２００６）。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）はガラクトースを代謝せず、したがって、ピチアにおけるこのＡＴＴ１遺伝子の生物学的機能は、本出願が出願された時点では未知であった。
【００７３】
ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＡＴＴ１遺伝子（配列番号１）は９９５アミノ酸のタンパク質産物（配列番号７）をコードしており、これは、図１Ａ〜Ｂにおけるアライメントに示されているとおり、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインに高度に相同であるＮ末端ドメイン（アミノ酸残基３９−１１４）、アミノ酸残基３５１−５１９における保存された真菌特異的転写因子ドメイン、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＡＬ４遺伝子産物のＣ末端に対して低レベルの保存性を共有するＣ末端領域を含有する。
【００７４】
突然変異体ＹＧＬ１７１７２、ＹＧＬ１７１７７およびＹＧＬ１７１７８の３つは、末端ガラクトースを有する複合Ｎ−グリカン形態を産生するように操作されている親宿主株ＹＧＬ１７１０８から誘導される（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，２００４および米国特許第７，７９５，００２号）。第４の突然変異体であるＹＧＬ１７１５９は宿主株ＹＧＬ２２８３５から誘導され、これは完全シアル酸化Ｎ−グリカンを産生しうる（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，２００６および米国特許出願第６１／４４６，８５３号）。単離突然変異体から得られたＮ−グリカンプロファイルの、それらのそれぞれの親のものとの比較は、突然変異体から単離されたＮ−グリカン組成がそれらの未突然変異誘発親株から得られたＮ−グリカンプロファイルとは実質的に区別できないことを示しており、このことは、４つ全ての突然変異体が複合ヒトグリカンを産生するそれらの能力を保有していたことを証明している。ＹＧＬ１７１０８、ＹＧＬ１７１７７、ＹＧＬＹ２２８３５およびＹＧＬＹ１７１５９の代表的なＮ−グリカンＭＡＬＤＩトレースを図２Ａ〜Ｄに示す。突然変異体ＹＧＬＹ１７１７２およびＹＧＬＹ１７１７８のＮ−グリカンプロファイルは突然変異体ＹＧＬ１７１７７のものと区別できない。
【００７５】
実施例３
突然変異体ＹＧＬＹ１７１５９における組換えタンパク質発現
増強した発酵頑強性表現型が組換えタンパク質の製造（例えば、異種タンパク質の製造）中に保有されることを例証するために、２つの異なる組換えタンパク質（ＩｇＧ４  ｍＡｂおよびＦｃ融合タンパク質）を突然変異株ＹＧＬＹ１７１５９内に形質転換した。ＡＯＸ１プロモーターの制御下で、プラスミドｐＧＬＹ８０４５（図３Ａ）を１Ｆ１１  ＩｇＧ４重鎖およびカッパ軽鎖の両方と共にＹＧＬＹ１７１５９のＴＲＰ２遺伝子座内にエレクトロポレーションにより組込むことにより、ｍＡｂ発現株を構築した。同様にして、ＡＯＸ１ｐ駆動性ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合遺伝子を含有するプラスミドｐＧＬＹ６３９１（図３Ｂ）をＹＧＬ１７１５９のＴＨＲ１遺伝子座内に組込むことにより、Ｆｃ融合発現株を作製した。１Ｌ  ＤａｓＧｉｐバイオリアクター内での２４℃および３２℃の標準的なプラットフォーム条件下（Ｈｏｐｋｉｎｓら，２０１１）での発酵後、親体および突然変異体の両方から分泌された組換えタンパク質産物を精製し、評価した。
【表３】
2014532406.tif 000005
【００７６】
表３における結果は、組換えタンパク質を発現する突然変異体が、誘導期中の優れた頑強性および延長した株安定性を保有していたことを示しており、これは、親株におけるこれらの特性と比較された場合、有意な産物収率改善をもたらすものであると解釈される。
２４℃において突然変異株は、類似条件下の親対照細胞における発現と比較して、突然変異株におけるＩｇＧ４抗体に関する約１００％の力価増加およびＦｃ融合体に関する約７０％の力価増加を示した。
【００７７】
実施例４
直接的株操作による表現型の確認
突然変異体のそれぞれにおける同一遺伝子内の独立した突然変異は、このＡＴＴ１転写因子のトランケート化が、観察された温度抵抗性および発酵頑強性表現型をもたらすことを強く示した。この結論を確認するために、ＡＴＴ１  ＯＲＦを完全に欠失させ、あるいは内因性ＡＴＴ１遺伝子を、５ＦＯＡ対抗選択によりＹＧＬＹ１７１０８から誘導された未突然変異誘発ｕｒａ５栄養要求性ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）株であるＹＧＬＹ２１２０３において、図５に示されているトランケート化形態で置換した。
【００７８】
プラスミドｐＧＬＹ５９３３（図４Ａ）を、ＡＬＧ３ターミネーターの前方のＡＴＴ１  ＯＲＦの直上流に２ｋｂのゲノムＤＮＡ断片をクローニングし、ｌａｃＺ−ＵＲＡ５−ｌａｃＺ  ＵＲＡｂｌａｓｔｅｒが続き、そして、ＡＴＴ１  ＯＲＦ（配列番号１）の最後の２８５ｂｐと下流領域の１．６ｋｂとを含有する１．９ｂｐのゲノムＤＮＡ断片に接続することにより構築した。ＳｆｉＩ消化後、このＡＴＴ１−上流−ＵＲＡｂｌａｓｔｅｒ−ＡＴＴ１−下流ＤＮＡ断片を、未突然変異誘発宿主株（例えば、ＹＧＬＹ１７１０８）内に形質転換した。ＡＴＴ１上流および下流領域の両方における相同組換えにより、このＵＲＡｂｌａｓｔｅｒ−カセットが内因性ＡＴＴ１遺伝子に取って代わってＡＴＴ１のコード領域の９０％が欠失して、完全ＡＴＴ１ノックアウト突然変異体を与えた。ＡＴＴ１  ＯＲＦの置換が正しく行われたことを確認するために、以下のオリゴをＰＣＲプライマーとして使用して、ゲノムＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを行った：遺伝子置換の５’結合部を確認するための“ＴＴＴＣＧＡＡＡＧＴＧＧＣＴＴＧＧＡＡＴ”（配列番号１２；ＡＴＴ１開始部位の２３７０ｂｐ上流）および“ＴＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＡＣＣＧＡＡＧ”（配列番号１３；ＡＬＧ３ターミネーターの内部）；遺伝子置換の３’結合部を確認するための“ＣＡＣＴＡＣＧＣＧＴＡＣＴＧＴＧＡＧＣＣ”（配列番号１４；ｌａｃＺ内）および“ＧＣＴＴＧＧＴＡＣＧＧＴＡＧＣＣＴＣＡＡ”（配列番号１５；ＡＴＴ１終止コドンの２０１４ｂｐ下流）；ならびに野生型ＡＴＴ１  ＯＲＦの非存在を確認するための“ＡＧＴＣＴＧＣＧＣＴＴＴＣＣＡＴＧＴＣＴ”（配列番号１６；ＡＴＴ１開始部の３６５ｂｐ上流）および“ＧＧＣＣＴＧＧＡＧＡＴＡＴＴＧＧＧＡＴＴ”（配列番号１７；ＡＴＴ１  ＯＲＦ内、開始部の１０７０ｂｐ後方）。
【００７９】
プラスミドｐＧＬＹ５９４７（図４Ｅ）を、ＡＬＧ３ターミネーター配列の前方に２．３ｋｂ  ＤＮＡ断片（２．０ｋｂ上流領域、ＡＴＴ１  ＯＲＦの最初の３２１ｂｐ、および２つの終止コドン）をクローニングし、ｌａｃＺ−ＵＲＡ５−ｌａｃＺ  ＵＲＡｂｌａｓｔｅｒが続き、そして、ＡＴＴ１  ＯＲＦの最後の２８５ｂｐと下流領域の１．６ｋｂとを含有する１．９ｋｂのゲノムＤＮＡ断片に接続することにより構築した。
【００８０】
ｐＧＬＹ５９４７（図４Ｅ）のＳｆｉＩ断片と染色体ＡＴＴ１領域との間の相同組換え媒介性二重交差は、内因性ＡＴＴ１  ＯＲＦを、最初の１０７アミノ酸残基のみを有するＡＴＴ１のトランケート化形態で置換した。同様に、プラスミドｐＧＬＹ５９４８（図４Ｆ）およびｐＧＬＹ５９４９（図４Ｇ）は、それぞれ、ＡＴＴ１  ＯＲＦ（配列番号１）の最初の４９２ｂｐまたは１９６５ｂｐを含有し、相同組換え媒介性二重交差は、内因性ＡＴＴ１  ＯＲＦを、トランケート化１−１６４（配列番号１０）または１−６５５アミノ酸（配列番号１１）をコードするＡＴＴ１のトランケート化領域で置換するであろう。
【００８１】
プラスミドｐＧＬＹ５９３４（図４Ｂ）は、それがＡＴＴ１  ＯＲＦの第３１アミノ酸残基の後に５ｂｐ（ＴＧＡＡＴＣ；配列番号１８）のフレームシフト挿入をも含有すること以外は、ｐＧＬＹ５９４７とほぼ同一であり、プラスミドｐＧＬＹ５９３５（図４Ｃ）は、それがＡＴＴ１（配列番号７）の第３１アミノ酸の後に同じ５ｂｐ（ＴＧＡＡＴＣ；配列番号１８）のフレームシフト挿入を含有していて配列番号８のＡＴＴ１断片をコードしていること以外は、ｐＧＬ５９４８（図４Ｆ）とほぼ同一である。
【００８２】
ＤＮＡ構築物が内因性ＡＴＴ１遺伝子を対応欠失体またはトランケート化体で正しく置換していることを確認した後、３５℃におけるそれらの増殖能を調べた。これらのＡＴＴ１Δトランケート化および欠失突然変異体は、ＵＶ突然変異誘発により単離された元の突然変異体から観察されたものに非常に類似した温度抵抗性表現型を示すことが確認された（図６Ａ〜Ｃ）。
【００８３】
次に、トランケート化および欠失突然変異体を、標準的なＤａｓＧｉｐ  ＭｅＯＨフェッドバッチ発酵法（Ｈｏｐｋｉｎｓら，２０１１）に付して、それらが発酵頑強性の増強を示すかどうかを決定した。これらの株の発酵頑強性を決定するために、３２℃での一定時間の誘導の後、それらの細胞溶解スコアを測定した。顕微鏡検査に基づいて、０．５〜５．０の細胞溶解スコアを割り当てた。０．５の細胞溶解スコアは最小細胞溶解（９５％超が無傷細胞）を示し、５の細胞溶解スコアは高い細胞溶解（１０％未満が無傷細胞）を示す。既に観察されているとおり、ＹＧＬＹ１７１０８対照株は著しい細胞溶解を示し、３２℃でのＭｅＯＨ誘導の２４時間以内に生存不能になった。これとは対照的に、ＡＴＴ１遺伝子の完全な欠失および種々のトランケート化を含有する株は発酵頑強性の顕著な増強を示し、４日間のＭｅＯＨ誘導を成功裏に完了した（表４）。ＡＴＴ１（１−１６４ａａ、配列番号１０）およびＡＴＴ１（１−６５５ａａ、配列番号１１）トランケート化突然変異体は誘導期の後期段階中に僅かに高い度合の細胞溶解（２．５または３の細胞溶解スコア）を示した（表３を参照されたい）。完全な欠失およびＡＴＴ１フレームシフト（３１ａａにおける５ｂｐの挿入）突然変異体を含有する株は最高レベルの発酵頑強性を示し、４日間の誘導期の全体にわたって０．５の細胞溶解スコアを示した。３１ａａに５ｂｐの挿入を含有する株がＡＴＴ１欠失突然変異体と同じ頑強性を示したという知見は、５ｂｐフレームシフト突然変異がＡＴＴ１遺伝子産物の機能の完全破壊をもたらす可能性があることを示した。一方、ＡＴＴ１トランケート化形態のＡＴＴ１（１−１６４ａａ、配列番号１０；配列番号４によりコードされている）およびＡＴＴ１（１−６５５ａａ、配列番号１１；配列番号５によりコードされている）は、転写活性の幾らかの残留レベルを尚も保有しうるであろう。なぜなら、これらのトランケート化を含有する突然変異体は、中間的な表現型、すなわち親対照より劇的に頑強であるが欠失突然変異体の場合ほど強力ではない表現型を示した。これらの特異的遺伝子置換株により示される表現型は、対応するＵＶ誘導突然変異体により示されるものに酷似していたが（例えば、表４および図６Ａ〜Ｃにおいて、ＹＧＬ２７６０１をＹＧＬ１７１５９と、ＹＧＬＹ２７６０８をＹＧＬ１７１７７と、ＹＧＬＹ２７６１０をＹＧＬＹ１７１７２と比較されたい）、このことは、ＡＴＴ１遺伝子内の突然変異がＵＶ誘導突然変異体から観察された耐熱性および発酵頑強性の改善をもたらしたことを示している。
【表４】
2014532406.tif 000006
【００８４】
実施例５
ピチア・パストリスＡＴＴ１  ＯＲＦおよびトランケート化対立遺伝子を過剰発現させるためのプラスミドの構築
ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＥＦプロモーター（配列番号６）を、オリゴヌクレオチドおよびＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により記載されている製造業者の方法を用いて合成し、制限部位ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩを使用してプラスミドｐＧＬＹ８３６９（図１０）内にクローニングして、プラスミドｐＧＬＹ９９５９（図１１）を得た。プラスミドｐＧＬＹ８３６９は、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーターと亜ヒ酸に対する耐性を付与する選択マーカーとしてのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＲ３遺伝子とを含有するロールイン（ｒｏｌｌ−ｉｎ）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）／ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）シャトルプラスミドである。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）野生型ＡＴＴ１オープンリーディングフレーム（Ｐｐ０１ｇ００６８０，配列番号１）を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによるオリゴヌクレオチドおよび製造業者の方法を用いて合成し、制限部位ＥｃｏＲＩ／ＦｓｅＩを使用してｐＧＬＹ８３６９（図１０）およびｐＧＬＹ９９５９（図１１）内に挿入して、それぞれ、プラスミドｐＧＬＹ９９５５（図１４Ａ）およびｐＧＬＹ９９６０（図１４Ｅ）を得た。ついで、配列番号７の最初の１０７アミノ酸（１−１０７ａａ、配列番号３）、配列番号７の最初の１６４アミノ酸（１−１６４ａａ、配列番号４）および配列番号７の最初の６５５アミノ酸（１−６５５ａａ、配列番号５）をコードするＡＴＴ１のトランケート化形態または断片を、それぞれｐＧＬＹ９９５６（図１４Ｂ）、ｐＧＬＹ９９５７（図１４Ｃ）、ｐＧＬＹ９９５８（図１４Ｄ）と称されるＡＯＸ１駆動性ＡＴＴ１トランケート化対立遺伝子含有プラスミドを得るためにｐＧＬＹ９９５５（図１４Ａ）から作製し、そして、それぞれｐＧＬＹ９９６１（図１４Ｆ）、ｐＧＬＹ９９６２（図１４Ｇ）、ｐＧＬＹ９９６３（図１４Ｈ）と称されるＴＥＦ駆動性ＡＴＴ１トランケート化対立遺伝子含有プラスミドを得るためにｐＧＬＹ９９６０（図１４Ｅ）から作製した。
【００８５】
実施例６
糖操作ピチア・パストリスにおける抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体の作製
トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（Ｃａｒｔｅｒ，１９９２）のκおよびγ鎖をコードするＤＮＡ配列をピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーターに個々に融合させることにより、プラスミドｐＧＬＹ５８８３を作製し、それを図１２に示す。このプラスミドからのＤＮＡを、ＤＮＡを線状化するためにＳｐｅＩで消化し、末端β−１，４−ガラクトースを有する複合型ヒトＮ−グリカンを産生するように修飾されているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）糖操作株ＹＧＬＹ８３１６（ＧＦＩ５．０として記載されている；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  米国特許第７，７９５，００２号）（図１３に示されている株系列）内に、標準的なエレクトロポレーション法（Ｐｉｃｈｉａキット，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により形質転換した。クローンをゼオシン含有培地上で選択し、９６深ウェルプレートおよび０．５Ｌ  Ｓｉｘｆｏｒｓ多重発酵（ｍｕｌｔｉｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）発酵槽（ＡＴＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｌａｕｒｅｌ，ＭＤ；Ｂａｒｎａｒｄ，２０１０）内での標準的な培養により更にスクリーニングした。１個の陽性発現クローンを選択し、ＹＧＬＹ１３９７９（図１３に示されている株系列）と命名した。
【００８６】
実施例７
ピチア・パストリスＡＴＴ１オープンリーディングフレームおよびトランケート化対立遺伝子の過剰発現は株生存およびタンパク質力価の改善をもたらす
プラスミドｐＧＬＹ９９５５、ｐＧＬＹ９９５６、ｐＧＬＹ９９５７、ｐＧＬＹ９９５８、ｐＧＬＹ９９６０、ｐＧＬＹ９９６１、ｐＧＬＹ９９６２およびｐＧＬＹ９９６３（それぞれ、図１４Ａ〜Ｈ）をＳｐｅＩで線状化し、エレクトロポレーションにより株ＹＧＬＹ１３９７９内に形質転換し、１ｍＭおよび３ｍＭ  亜ヒ酸ナトリウムを含有するＹＳＤ培地上でクローンを選択した。ＡＴＴ１の完全長および種々のトランケート化形態を過剰発現するクローンをＹＳＤ培地上で更に単離し、ついで、ＡＯＸ１駆動性構築物の場合にはプライマーＲＣＤ１０１９（配列番号１９：５’−ＣＡＧＡＴＣＴＴＣＣＡＡＣＡＴＴＣＧＴＡＣＡＣＧ−３’）およびＡＯＸ１ｓｅｑ（配列番号２０：５’−ＧＣＴＴＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＴＧＣＧＡＣＴＧＧＴＴＣＣ−３’）を、そしてＴＥＦ駆動性構築物の場合にはＲＣＤ１０１９およびＴＥＦｓｅｑ（配列番号２１：５’−ＣＧＣＡＧＴＣＣＣＡＣＡＣＧＣＡＣＴＣＧＴＡＣＡＴＧ−３’）を使用するＰＣＲにより、所望のＡＴＴ１発現構築物を含有することを確認した。
【００８７】
ＰＣＲ陽性クローンを選択し、親株ＹＧＬＹ１３９７９（図１３；同様に同じ抗ＨＥＲ２  ｍＡｂを発現する）と共にＡｐｐｌｉｋｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）マイクロ２４  ５ｍｌ  小型発酵装置の修飾形態において培養した。リン酸カリウムバッファーでｐＨ６．０に緩衝化された３．５ｍｌの４％  ＢＭＧＹ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含有するＷｈａｔｍａｎ  ２４−ウェル  Ｕｎｉｐｌａｔｅ（１０ｍｌ，天然ポリプロピレン）にＹＳＤプレートからの株を接種することにより、種培養を調製した。種培養を２４℃および６５０ｒｐｍの振とうの温度制御シェーカー内で約６５〜７２時間培養した。ついで１ミリリットルの２４ウェルプレート培養種培養および４．０ｍｌの４％  ＢＭＧＹ培地を使用して、Ｍｉｃｒｏ２４プレート（Ｔｙｐｅ：ＲＥＧ２）の各ウェルに接種した。３０マイクロリットルのＡｎｔｉｆｏａｍ  ２０４（１：２５希釈，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を各ウェルに加えた。Ｍｉｃｒｏ２４は微好気性（Ｍｉｃｒｏａｅｒｏｂｉｃ）１モードで使用され、発酵は２００％溶存酸素、６．５のｐＨ、２４℃の温度および８００ｒｐｍの撹拌で制御された。誘導期は、メタノール供給溶液（１００％［ｗ／ｗ］メタノール、５ｍｇ／ｌ  ビオチンおよび１２．５ｍｌ／ｌ  ＰＴＭ２塩）（午前中に５０μｌおよび午後に１２５μｌ）のボーラスショットを加えることにより、増殖期の後の溶存酸素（ＤＯ）スパイクの観察の直後に開始させた。
約７２時間のメタノール誘導の後、無細胞培養上清をベックマン旋回バケツ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ｓｗｉｎｇｉｎｇ  ｂｕｃｋｅｔ）遠心機内での２５００×ｇの遠心分離により回収し、標準方法（Ｊｉａｎｇ，２０１１）によりプロテインＡ精製に付した。抗体を逆相ＨＰＬＣにより定量し、１リットル当たりのものとして計算した。また、上清を、細胞破壊または細胞溶解を定量的に測定するための方法としてのピコグリーン（Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）二重標準ＤＮＡ定量アッセイに付した。
【００８８】
野生型完全長ＡＴＴ１と１−６５５ａａ  ＡＴＴ１トランケート化体との過剰発現を比較する実験において、１−６５５  ＡＴＴ１トランケート化体のＴＥＦおよびＡＯＸ１プロモーター形態を含むそれぞれの６つのクローンを評価した。６つの野生型ＡＴＴ１過剰発現株のうちの２つは、ＹＧＬＹ１３９７９対照株より有意に大量の抗体を産生した（図１６）。対照株は５８７．５＋／−７０ｍｇ／Ｌの抗体を産生し、一方、２つのＡＯＸ１−ＡＴＴ１完全長過剰発現株は、それぞれ、８０６および９３４ｍｇ／Ｌを産生した（図１６）。同様に、ＡＯＸ１−ＡＴＴ  １−６５５過剰発現株の２つも、有意に、より大量の分泌性ｍＡｂ（それぞれ、９０６および１０９８ｍｇ／Ｌ）を産生した。更に、ＡＯＸ１−ＡＴＴ１完全長およびＡＯＸ１−ＡＴＴ  １−６５５過剰発現株の全てにおいて、ピコグリーンアッセイにより決定された細胞溶解は、対照株と比較して低減した（図１５）。最後に、１−６５５  ＡＴＴ１トランケート化体をＴＥＦプロモーターの制御下で発現させたところ、細胞溶解は影響されず、または潜在的に増加し（図１５）、一方、クローンの全ては、増大したレベルの分泌性ｍＡｂを尚も産生した（図１６〜１７）。
【００８９】
実施例８
タンパク質生産性および細胞溶解に対するＡＴＴ１完全長過剰発現の影響は規模拡大性である
抗体生産性に対するＡＴＴ１完全長ＯＲＦの過剰発現の影響は微量発酵（ｍｉｃｒｏｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）モデルにおいて明らかに実証されうる。しかし、これらのモデルは、容器サイズ、細胞に対するせん断および酸化ストレスならびに炭素源供給の方法（ボーラス供給と限定的または過剰な供給との対比）を含む幾つかの重要な点において、完全規模の発酵培養とは異なる。ＡＴＴ１過剰発現の規模拡大性（ｓｃａｌａｂｉｌｉｔｙ）を実証するために、ＡＴＴ１完全長ＯＲＦ（ＦＬと称される）を過剰発現する６つのピチア（Ｐｉｃｈｉａ）株（ＹＧＬＹ２７９２７、ＹＧＬＹ２７９２８、ＹＧＬＹ２７９２９、ＹＧＬＹ２７９３０、ＹＧＬＹ２７９３１およびＹＧＬＹ２７９３２）ならびに親（ＹＧＬＹ１３９７９）およびＡＴＴ１ノックアウト（ＹＧＬＹ２７６３８）対照抗ＨＥＲ２発現株を、グリセロールフィードバッチおよびそれに続く２４℃での限定的メタノール供給誘導プロセス（既に記載されているとおり（Ｈｏｐｋｉｎｓら，２０１１））を用いて、１Ｌ  フェッドバッチ・プロ（Ｆｅｄｂａｔｃｈ  Ｐｒｏ）発酵槽（ＤＡＳＧＩＰ  Ｂｉｏｔｏｏｌｓ，Ｓｈｒｅｗｓｂｕｒｙ，ＭＡ）内で培養した。メタノール誘導を、各株に関して続行できないほどに細胞溶解が激しくなるまで（１１３時間まで）継続し、ついで無細胞培養上清をベックマン旋回バケツ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ｓｗｉｎｇｉｎｇ  ｂｕｃｋｅｔ）遠心機内での２５００×ｇの遠心分離により回収し、標準的な方法（Ｊｉａｎｇ，２０１１）によりプロテインＡ精製に付した。抗体を逆相ＨＰＬＣにより定量し、１リットル当たりのものとして計算した。ＹＧＬＹ１３９７９親対照株は６７１ｍｇ／Ｌの分泌性ｍＡｂを産生したが、６６時間の誘導の後では非常に高い細胞溶解を伴っていた（図１７）。
【００９０】
一方、ＡＴＴ１ノックアウト株は、最小の細胞溶解を伴って、１０６時間の誘導の後、１２５６ｍｇ／Ｌを産生し（図１７）、これは従来の結果に合致していた。同様に、そしてより小規模のマイクロ２４発酵の結果に合致して、２つのＡＯＸ１−ＡＴＴ１過剰発現クローンは、１１２時間の誘導の後、それぞれ、１９７４および１９６０ｍｇ／Ｌを産生したが、これは、驚くべきことに、ＡＴＴ１  ＯＲＦの過剰発現が、より大きな規模において、延長した誘導の後、頑強性および生産性に正の影響を及ぼしうることを示している（図１７）。また、６つのＡＴＴ１過剰発現クローンのうちの３つは、ＹＧＬＹ１３９７９対照と比較して低減した細胞溶解を示し、一方、もう１つのクローンは１００時間以上の誘導の後で細胞溶解を示したに過ぎない（図１７）。これらの結果は、組換えタンパク質を産生するピチア株におけるｍＡｂ生産性に対するＡＴＴ１過剰発現の影響が規模に非依存的なものであり、培養および誘導プロトコールにおける標準的な変動によっては影響されないことを示している。
【００９１】
糖操作株の頑強性に対するＡＯＸ−ＡＴＴ１過剰発現の影響を更に例証するために、２つの高ｍＡｂ発現株ＹＧＬＹ２７９２９およびＹＧＬＹ２７９３０を、２４℃ではなく３２℃で行うこと以外は同じプロトコールを用いて、同じ１Ｌフェッドバッチ・プロ（Ｆｅｄｂａｔｃｈ  Ｐｒｏ）発酵槽内で再び培養した。これまでの実験に基づけば、親株ＹＧＬＹ１３９７９は、典型的には２４〜４８時間のメタノール誘導の後で生じる発泡および激しい細胞溶解による完全な喪失を伴い、高温では発酵不能である。３２℃で５０時間のメタノール誘導の後、２つの過剰発現株ＹＧＬＹ２７９２９およびＹＧＬＹ２７９３０は４７３および４５８ｍｇ／Ｌの抗ＨＥＲ２  ｍＡｂを産生し、一方、ＡＴＴ１ノックアウト株は８４２ｍｇ／Ｌを産生した（７３時間の誘導後）。過剰発現株の細胞溶解は、ＡＴＴ１ノックアウト株と比較して僅かに増加したが、ほどほどの細胞溶解を伴う５０時間の誘導までの生存は親糖操作抗ＨＥＲ２発現株に対する有意な改善を表し、この遺伝子の欠失／トランケート化と共に、ＡＴＴ１の過剰発現の有用性を実証している。
【００９２】
実施例６〜８に記載されている株は全て、尚も無傷であるＡＴＴ１の染色体コピーを有する。内因性ＡＴＴ１  ＯＲＦが欠失している株における完全長ＡＴＴ１またはＡＴＴ１トランケート化体（共にＡＯＸ１−およびＴＥＦ−プロモーター駆動性）の過剰発現は、実施例６〜８に示されているとおり細胞頑強性および生産性における同様の改善をもたらすと予想される。
【００９３】
実施例９
ハンゼヌラ・ポリモルファＡＴＴ１オルソログはピチア・パストリスにおけるＡＴＴ１ヌル突然変異を機能的に相補する
ＧｅｎＢａｎｋ非重複タンパク質データベースに対してＢＬＡＳＴ配列類似性検索を行うことにより、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＡＴＴ１オルソログ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＥＦＷ９８０２２．１）を特定した。図１８はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｇａｌ４、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＴＴ１およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＡＴＴ１のアライメントを示す。
【００９４】
ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）はオガタエア・パラポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ  ｐａｒａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）またはピチア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）としても公知であるが、異種組換えタンパク質を発現させるために一般に使用されるメチロトロフィック酵母である。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）と同様に、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）も、炭素源としてガラクトースを利用するその能力を喪失している。なぜなら、それは、ガラクトース代謝に関与する遺伝子のほとんどを喪失しているからである。本発明者らは、ＢＬＡＳＴによりＧｅｎＢａｎｋ非重複タンパク質データベースを検索した際に、タンパク質の全長に対して４１％のアミノ酸配列同一性を示すハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＡＴＴ１オルソログ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＥＦＷ９８０２２．１）を特定した。ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＡＴＴ１オルソログ（ＨｐＡＴＴ１）がＰｐＡＴＴ１に類似した機能を果たすかどうかを評価するために、天然ＰｐＡＴＴ１プロモーターの下流にＨｐＡＴＴ１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をクローニングし、このＤＮＡ構築物を、内因性ＡＴＴ１が既に欠失しているＹＧＬＹ３０５４７のＵＲＡ６遺伝子座に安定に組込んだ。比較のために、本発明者らは、同様にして、ＹＧＬ３０５４７のＵＲＡ６遺伝子座にサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＴ１オルソログ（ＳｃＧＡＬ４）ＯＲＦをも組込んだ。ＰｐＡＴＴ１遺伝子欠失により引き起こされる温度抵抗性表現型に対してこれらのＡＴＴ１オルソログがどのような影響を及ぼすかを試験するために、本発明者らは、ＨｐＡＴＴ１またはＳｃＧＡＬ４遺伝子のいずれかを含有する独立した形質転換体を無作為に選択し、通常のＹＰＤ寒天プレート上にそれらをパッチ（ｐａｔｃｈ）し、許容性の２４℃および非許容性の３５℃において、それらの増殖をモニターした。
【００９５】
全てのＳｃＧＡＬ４含有クローンは、親ＹＧＬＹ２７６１１の場合と全く同様に温度抵抗性のままであった。これらの結果は、この実験で用いた試験条件下では、ＳｃＧＡＬ４はピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるＰｐＡＴＴ１の機能に取って代わることができないことを示した。これとは対照的に、ＨｐＡＴＴ１含有形質転換体は３５℃では増殖できず、したがって、ＹＧＬＹ３０５４７の温度抵抗性表現型を温度感受性に復帰させた。これらの結果は、ＨｐＡＴＴ１がインビボでＰｐＡＴＴ１の活性に機能的に取って代わることが可能であることを実証した。
【００９６】
実施例１０
発酵頑強性の改善のためのＰｐＡＴＴ１トランケート化体のスクリーニング
細胞頑強性に対するＡＴＴ１トランケート化の効果を更に研究するために、本発明者らは、内因性ＡＴＴ１  ＯＲＦが欠失しており、ＡＴＴ１遺伝子の種々の長さのＮ末端部分をコードするＤＮＡカセットにより置換されている一連の新規株を構築した。ＤＮＡカセットは、配列番号７のＡＴＴ１タンパク質のＮ末端１−１４３ａａ、１−１９６ａａ、１−２１６ａａ、１−２７６ａａ、１−２９６ａａ、１−３４１ａａ、１−５３９ａａ、１−６２２ａａ、１−６５５ａａ、１−７２８ａａ、１−８０２ａａまたは１−８２８ａａをコードするＤＮＡ断片をそれらの５’交差領域にそれらが含有すること以外は実施例４に記載されているｐＧＬＹ５９４８またはｐＧＬＹ５９４９に非常に類似した方法で構築された。比較のために、完全ＡＴＴ１欠失株、およびＡＴＴ１のＮ末端１−３１ａａ、１−１６４ａａ断片を含有する株（実施例４に記載されている）をも試験した。
【００９７】
これらのトランケート化ＡＴＴ１断片が産物力価にどのように影響を及ぼすのかをも調べるために、抗ＨＥＲ２  ｍＡｂを発現する前記のＹＧＬＹ１３９７９株のＵＲＡ５−マイナス誘導体であるＹＧＬＹ１９３１５内に、これらのＤＮＡ構築物を形質転換した。ＡＴＴ１欠失またはトランケート化を含有するこれらの株を、実施例４に記載されているメタノール限定フェッドバッチ発酵法を用いて、３２℃の１Ｌバイオリアクター内で培養した。細胞溶解を顕微鏡検査により、毎日モニターし、過剰の細胞溶解が観察されたら発酵を終了させた。細胞溶解レベルが低い場合、１００〜１２０時間のメタノール誘導まで発酵を行った。各発酵の実施の終了時に、無細胞上清を集め、実施例７に記載されているとおり、プロテインＡに基づくＨＰＬＣ法を用いて、ｍＡｂ力価を決定した。
【００９８】
これらの実験の結果を図１９Ａおよび１９Ｂに示す。対照株は完全長ＡＴＴ１遺伝子を含有するものであるが、３２℃で４０時間までのメタノール誘導を生き延びたに過ぎなかった（図１９Ａ）。ＡＴＴ１欠失株は８０時間を超える誘導を生き延び、このことは、ＡＴＴ１活性の不活性化が発酵中の発酵頑強性を劇的に改善したことを示している。驚くべきことに、ＡＴＴ１（１−２９６ａａ）断片は発酵中の頑強性保護を全くもたらさなかった。全ての他のＡＴＴ１トランケート化体は種々の度合で発酵頑強性を明らかに改善し、１−２１６ａａ、１−３４１ａａ、１−６５５ａａ、１−８０２ａａおよび１−８２８ａａ断片はほどほどのレベルの改善を示し、１−３１ａａ、１−１４３ａａ、１６４ａａ、１−１９６ａａ、１−２７６ａａ、１−５３９ａａ、１−６２２ａａおよび１−７２８ａａ断片は大きな改善を示した。トランケート化体の全てのなかで、ＡＴＴ１（１−１６４ａａ）断片を含有する株がこれらの発酵の実施中で最高レベルの頑強性を示しているようであった。産物力価（図１９Ｂ）に関しては、１−８２８ａａ  ＡＴＴ１断片のみがｍＡｂ力価を〜１００ｍｇ／リットルへと有意に低減し、一方、他のＡＴＴ１断片を含有する株は〜６００から１２００ｍｇ／リットルのｍＡｂを与え、これは、いずれのＡＴＴ１修飾をも有さない株で観察された〜１０００ｍｇ／リットルの力価と有意には異ならない。
【００９９】
実施例１１
ＡＴＴ１（１−３１ａａ）および（１−１６４ａａ）断片は完全長ＡＴＴ１遺伝子の存在下でドミナントである
実施例１０において示されたとおり、ＡＴＴ１（１−１６４ａａ）断片を含有する株は最も頑強な表現型を示した。１−１６４ａａ断片は完全なＤＮＡ結合および二量体形成領域を含有するが、タンパク質のいずれの転写活性化領域をも欠いているため、１−１６４ａａ断片は不活性二量体として標的遺伝子のプロモーターに結合し、これらの標的遺伝子を活性化しうる他の転写因子が結合するのを妨げて転写抑制をもたらしうるであろう。これが事実であれば、１−１６４ａａ  ＡＴＴ１断片はプロモーター結合に関して完全長ＡＴＴ１タンパク質と競合し、ＡＴＴ１の正常な転写活性を妨げるはずだと予想されうるであろう。この仮定を実証するために、本発明者らは、ＡＴＴ１（１−１６４ａａ）含有ＤＮＡ構築物を、完全長ＡＴＴ１遺伝子を含有する株ＹＧＬＹ１３９７９内に導入し、１Ｌバイオリアクターを使用して発酵中の細胞頑強性に対するその効果を調べた。対照として、ＡＴＴ１（１−３１ａａ）含有ＤＮＡ構築物をもＹＧＬＹ１３９７９内に導入した。１−３１ａａ  ＡＴＴ１断片はＤＮＡ結合および二量体形成ドメインの上流に位置する（そしてＳｃＧＡＬ４タンパク質を欠いている）ため、本発明者らは、それが、ＹＧＬＹ１３９７９宿主内に存在する完全長ＡＴＴ１遺伝子のＤＮＡ結合および転写機能を妨げないと予想した。図１９Ａおよび１９Ｂ（下の２つの棒グラフ）に示されているとおり、（１−１６４ａａ断片＋ＡＴＴ１完全長）および（１−３１ａａ断片＋ＡＴＴ１完全長）を含有する株は１００時間を超える３２℃のメタノール誘導を生き延びたが、このことは、１−１６４ａａおよび１−３１ａａ断片が共に、ドミナント様態（すなわち、野生型完全長ＡＴＴ１の存在下）で細胞頑強性保護をもたらしたことを示している。１−１６４ａａ  ＡＴＴ１断片のドミナント性は前記の仮定と合致している。しかし、１−３１ａａ断片も野生型ＡＴＴ１完全長遺伝子に対してドミナントネガティブ効果を示したという観察は驚くべきことであった。
【０１００】
実施例１２
ＡＴＴ１欠失およびトランケート化は１５Ｌバイオリアクターにおける株頑強性を改善した
これまでの全ての実施例においては、発酵頑強性は全て、１リットルの実験室規模のバイオリアクターを使用して評価された。ＡＴＴ１修飾がより大きなバイオリアクターにおいて同じ頑強性改善をもたらすかどうかを調べるために、完全ＡＴＴ１欠失または異なるＡＴＴ１トランケート化を含有する幾つかの株を選択し、Ｐｏｔｇｉｅｔｅｒら，２００９に記載されているとおりに、２４℃の１５Ｌバイオリアクター内でメタノール限定フェッドバッチ発酵を行った。細胞溶解、細胞増殖および産物力価を発酵プロセスの全体にわたってモニターし、細胞増殖が停止し、細胞溶解が過剰になったら、発酵の実施を終了した。
【０１０１】
図２０に示されているとおり、無傷の野生型ＡＴＴ１遺伝子を含有する対照株（ＹＧＬＹ１３９７９）は、通常、約１２０時間の誘導を生き延び、その約１２０時間の時点で、続行できないほどに細胞溶解が激しくなった。
【０１０２】
ＡＴＴ１（１−１６４ａａ）断片および完全長ＡＴＴ１遺伝子を同時に含有するＹＧＬＹ３０５３９の場合、それは対照株より有意に頑強になり、１５０時間を超える誘導を生き延びることが可能であった。この知見は、１−１６４ａａ断片が完全長ＡＴＴ１遺伝子の存在下であっても細胞頑強性を改善しうることを証明した。
【０１０３】
完全長ＡＴＴ１過剰発現カセットを含有する株もほぼ同じレベルの頑強性改善を示し、誘導後約１７０時間にわたって生存可能であった。
【０１０４】
１−６５５ａａ  ＡＴＴ１断片を含有する株はより顕著な発酵頑強性を示し、誘導後２００時間以上にわたって生存可能であった。
【０１０５】
完全ＡＴＴ１欠失または１−３１ａａ断片を含有する株はより一層の頑強性保護をもたらし、どちらも２５０時間を超える誘導を生き延びた。
【０１０６】
注目すべきことに、１−１６４ａａ断片含有株は最高レベルの細胞頑強性を示し、１５Ｌバイオリアクターにおける２４℃で３４０時間を超える誘導を生き延びた。
【０１０７】
総合すると、これらの結果は、前記のＡＴＴ１欠失、トランケート化、および過剰発現の選択形態が、１Ｌの小規模バイオリアクターにおいてだけではなく１５Ｌの規模のバイオリアクターにおいても、発酵実施中の細胞頑強性を劇的に改善しうることを示した。これらの知見は、細胞頑強性に対するこれらのＡＴＴ１修飾の効果が容易に規模拡大性であり、十中八九、より大きな発酵規模（すなわち、パイロットプラントまたは製造規模）においても同じままであることを強く示唆した。
【０１０８】
実施例１３
ＡＴＴ１欠失は他のピチア株においても細胞頑強性を改善する
ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）糖操作株ＹＧＬＹ２３５０６は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを主に有するタンパク質を分泌するＧＦＩ２．０株である（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を分泌しうる他のピチア株の構築はＣｈｏｉら，２００３において既に記載されている）。この宿主株系列は、酵母ＯＣＨ１遺伝子、ならびに４つのＢＭＴ  β−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子およびホスホマンノシルトランスフェラーゼを含むマンノシルトランスフェラーゼファミリーの幾つかの他のメンバーのノックアウトにより順次修飾されている。この株操作はまた、アルファ−１，２−マンノシダーゼの発現を含み、これは均一なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２形態へのコアＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンの切断をもたらす。この特定の株はまた、ＨＩＶ  ｇｐ１２０のＮ末端Ｈ９Ｇ３ヒスチジンタグ付き可溶性形態を、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ因子プレプロシグナルペプチドに融合したアミノ酸３３−５５６を含有する株ＪＲ−ＦＬ（Ｖａｒａｄａｒａｊａｎ，２００５；Ｐａｎｇ，１９９１；Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＢ０５６０４．１）から分泌するように操作されている。
【０１０９】
ついで株ＹＧＬＹ２３５０６を、標準的なエレクトロポレーションを用いて、Ｐｐａｔｔ１：：ＡｒｓＲノックアウトプラスミドであるプラスミドｐＧＬＹ５９５２（図２１）で形質転換し、クローンを、１ｍＭ  亜ヒ酸ナトリウムを含有するＹＳＤ培地上で選択した。前記のとおりに、ＰＣＲにより陽性ノックアウトクローンを特定した。ＰＣＲは、ＹＧＬＹ３０４４７、ＹＧＬＹ３０４４８、ＹＧＬＹ３０４４９およびＹＧＬＹ３０４５０が、ＹＧＬＹ２３５０６から誘導されたＧＦＩ２．０  ａｔｔ１Δクローンとして保存されたことを証明した。
【０１１０】
ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）糖操作株ＹＧＬＹ２３５１２は、Ｍａｎ８−１０ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンを主に有するタンパク質を分泌するＧＦＩ１．０株である（Ｍａｎ８−１０ＧｌｃＮＡｃ２を分泌しうる他のピチア株の構築はＣｈｏｉら，２００３において既に記載されている）。この宿主株系列は、ＹＧＬＹ２３５０６に類似した酵母Ｎ−グリコシル化装置のノックアウトにより修飾されているが、この株はアルファ−マンノシダーゼを発現しない。この特定の株はまた、株ＹＧＬＹ２３５０６に類似したＨＩＶ  ｇｐ１２０のＮ末端Ｈ９Ｇ３ヒスチジンタグ付き可溶性形態（この場合は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ因子プレシグナルペプチドに融合している）を分泌するように操作されている。株ＹＧＬＹ２３５１２を、標準的なエレクトロポレーションを用いて、Ｐｐａｔｔ１：：ＡｒｓＲノックアウトプラスミドであるプラスミドｐＧＬＹ５９５２（図２１）で形質転換し、クローンを、１ｍＭ  亜ヒ酸ナトリウムを含有するＹＳＤ培地上で選択した。前記のとおりに、ＰＣＲにより陽性ノックアウトクローンを特定した。ＰＣＲは、ＹＧＬＹ３０４５１、ＹＧＬＹ３０４５２、ＹＧＬＹ３０４５３およびＹＧＬＹ３０４５４が、ＹＧＬＹ２３５１２から誘導されたＧＦＩ１．０  ａｔｔ１Δクローンとして保存されたことを証明した。
【０１１１】
株ＹＧＬＹ２３５０６、ＹＧＬＹ２３５１２、およびこれらの株のａｔｔ１Δ形態を１Ｌの発酵において培養して、これらのＧＦＩ２．０およびＧＦＩ１．０糖操作株の頑強性を評価した。
【０１１２】
発酵の実施はＳａｒｔｏｒｉｕｓの１Ｌ（実効体積０．７５Ｌ）バイオリアクターにおいて行った。１Ｌ系は、ｐＨ、温度および溶存酸素濃度の閉ループ制御を伴うＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｑコントローラーにより制御された。振とうフラスコ培養物を４８時間にわたり振とうしながら２４℃にて１．０Ｌ  隔壁付きフラスコ内で４％  ＢＳＧＹ培地内で成長させた。ついで振とうフラスコ培養物を、２までの初期ＯＤ６００で、０．７５ＬのＢＳＧＹ培地を含有する１．０Ｌ  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ容器内に無菌的に移した。既に記載されているとおりに（Ｐｏｔｇｉｅｔｅｒら，２００８）、標準的なピチア培地成分を含む標準的なグリセロール／メタノール  フェッドバッチ法を行った。転移段階の終了時に、２．５ｍｇ／ｍＬ  ペプスタチンＡおよび１．５９ｍｇ／ｍＬ  キモスタチン、０．６４ｍｇ／ｍｌ  ＰＭＴｉ４を含有する１．３３ｍＬ／Ｌの用量のメタノールをメタノール誘導前に加えた。培養温度をｐｔ１００センサーにより測定し、２４±０．５℃に制御した。３０％  ＮＨ４ＯＨを使用して、ｐＨを、バッチおよびフェッドバッチ期には６．０±０．１に、そして誘導期には５．０±０．１に制御した。酸添加は行わず、３０％  ＮＨ４ＯＨを使用して、接種する前にｐＨを設定点に到達させた。気流を１Ｌに関して０．７ｖｖｍに制御した。一定の気流速度となるようにＯ２添加と連携した撹拌速度（４５０〜１２００ｒｐｍ）により、２０％（大気圧条件で空気での飽和に対するもの；１，７ｍｇ／Ｌ）のＤＯ設定点を実施の全体にわたって維持した。初期バッチ培地にける消泡剤（Ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の添加により発泡を制御した。０．１２８ｇ／Ｌの初期仕込み量の消泡剤を、接種前に培地に加えた。転移段階の後、一定の供給速度（１．５ｇ／ｌ／時間）で、ＰＴＭ２およびビオチンを含有する１００％メタノールの一定供給を開始した。ｐＨを１２０分間で６から５へと徐々に減少させた（６０分間で６．５への、そして６０分間で７への直線増加）。温度を２４℃に維持した。２４時間の誘導のたびに、２．５ｍｇ／ｍＬ  ペプスタインＡおよび１．５９ｍｇ／ｍＬのキモスタチンを含有する１．３３ｍＬ／Ｌのメタノールを加えた。誘導の終了時に、全ての制御およびポンプを停止させた。室温で回収を行った。ついで一次清澄化を遠心分離により行った。全細胞ブロスを８００ｍｌの遠心ボトル内に移し、１３，０００×ｇ（８５００ＲＰＭ）で４℃で３０分間遠心分離した。
【０１１３】
５ｍｌのブロスを取り出し、卓上遠心機内で遠心分離し、分析のために上清を取り出すことにより、誘導前から約２４時間ごとに、各発酵槽からサンプルを採取した。
【０１１４】
株ＹＧＬＹ２３５０６、分泌性ＨＩＶ  ｇｐ１２０を発現する親ＡＴＴ１  ＷＴ  ＧＦＩ２．０、ならびに株ＹＧＬＹ３０４４７、ＹＧＬＹ３０４４８、ＹＧＬＹ３０４４９およびＹＧＬＹ３０４５０、ＹＧＬＹ２３５０６のａｔｔ１Δクローンからの発酵培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、標準的な手段によりクーマシー染色した。染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを図２２に示す。１８時間の誘導の後の上清タンパク質の重い負荷から明らかなとおり、親株が激しい細胞溶解を開始した場合に、メタノール誘導を開始した後では特に、ａｔｔ１ノックアウト株において視認可能な上清タンパク質は親ＧＦＩ２．０株と比較して有意に低減している。この発酵は、６６時間の誘導の後で激しい細胞溶解のために終了した。逆に、ａｔｔ１Δ株は、ＹＧＬＹ２３５０６親株の１８時間と比較して、８０時間を超える誘導の後で、ほどほどの上清タンパク質負荷を尚も示したに過
ぎなかった（図２２）。
【０１１５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥに加えて、既に記載されているとおり（Ｂａｒｎａｒｄ，２０１０）、ピコグリーン（Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する上清ＤＮＡの定量により、発酵上清を分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果と同様に、上清ＤＮＡアッセイは、ＹＧＬＹ２３５０６が類似時点においてａｔｔ１Δクローンと比較して有意に大量のＤＮＡを蓄積していることを示した。更に、ａｔｔ１Δクローンは、１９２時間の発酵（１５９時間の誘導）の後、ほどほどの上清ＤＮＡ負荷を維持していたが、このことは、ＧＦＩ２．０においては、ａｔｔ１Δクローンが、標準的なピチア発酵プロセス中に親ＡＴＴ１野生型ＧＦＩ２．０比較対象より有意に頑強であることを示している（図２３）。
【０１１６】
前記のＧＦＩ２．０株と同様に、株ＹＧＬＹ２３５１２、分泌性ＨＩＶ  ｇｐ１２０を発現する親ＡＴＴ１  ＷＴ  ＧＦＩ１．０、ならびにＹＧＬＹ３０４５１、ＹＧＬＹ３０４５２、ＹＧＬＹ３０４５３およびＹＧＬＹ３０４５４、ＹＧＬＹ２３５１２のａｔｔ１Δクローンからの発酵培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、標準的な手段によりクーマシー染色した。染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを図２４に示す。上清タンパク質の重い負荷から明らかなとおり、親株が激しい細胞溶解を開始した場合に、メタノール誘導を開始した後では特に、ａｔｔ１ノックアウト株において視認可能な上清タンパク質は、親ＧＦＩ１．０株と比較して有意に低減している。この発酵は４９時間のメタノール誘導の後で激しい細胞溶解のために終了した。逆に、ａｔｔ１Δ株は、ＹＧＬＹ２３５１２親株が非常に早い誘導時点においてであるのと比べて、９０時間を超える誘導の後で非常に低い乃至ほどほどの上清タンパク質負荷を示し続けた（図２４）。
【０１１７】
ＧＦＩ２．０株の場合と同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに加えて、上清ＤＮＡの定量により、発酵上清を分析した。ピコグリーンアッセイは、親ＡＴＴ１野生型株ＹＧＬＹ２３５１２が、類似時点においてａｔｔ１Δクローンと比較して有意に大量の上清ＤＮＡを蓄積していることを示した（図２５）。更に、ａｔｔ１Δクローンは、１９３時間の発酵（１６５時間の誘導）の後、ほどほどの上清ＤＮＡ負荷を維持していたが、このことは、ＧＦＩ１．０においては、ａｔｔ１Δクローンが標準的なピチア発酵プロセス中に親ＡＴＴ１野生型ＧＦＩ１．０比較対象より有意に頑強であることを示している（図２５）。
【０１１８】
要約
ナイーブ  ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）温度感受性株におけるＡＴＴ１における欠失またはトランケート化は、耐熱性および発酵頑強性の両方における有意な増強をもたらした。実施例１〜４に記載されている結果は、ピチアＡＴＴ１遺伝子の機能喪失が、これらの糖操作ピチア株における耐熱性および発酵頑強性の改善のための遺伝的基礎であることを例証している。ＡＴＴ１遺伝子はいずれのピチア株においても欠失またはトランケート化されることが可能であり、レシピエント株を発酵誘導期中に高度に頑強性にして、所望の属性が発酵中の株頑強性および生存性の増強、産物収率の改善または組換え産物のタンパク質分解の低減を含む任意の異種タンパク質発現ピチア宿主株に関する広範な有用性をもたらしうる。
【０１１９】
驚くべきことに、実施例５〜８および１１は、妥当なバイオプロセス条件下でＡＴＴ１を過剰発現する操作されたピチア宿主株が、生存性、安定性およびタンパク質産生の改善をも示すことを例示している（図１５〜１７）。
【０１２０】
現在、市販の生物学的治療用物質のほとんどは、哺乳類細胞宿主を使用して製造されている。過去３０年間にわたり、バイオテクノロジーおよび生物医薬産業の努力の蓄積により、哺乳類細胞培養の比生産性は、ｍＡｂの製造に関しては、〜５０ｍｇ／リットルから〜５ｇ／リットルの範囲へと、１００倍以上改善している。そのような収率改善の寄与因子は、哺乳類細胞培養を非常に高い細胞密度（１０５〜１０７細胞／ｍｌ）まで増殖させることにおける進歩、そしてより重要なことには、高レベルの細胞生存性を長時間（〜１００時間から〜４００時間）にわたって維持させうることであると考えられている（Ｗｕｒｍ  ２００４）。ＡＴＴ１過剰発現、欠失またはトランケート化を操作することによるピチア宿主株における細胞頑強性および生存性の改善は、組換えタンパク質治療用物質の、より高い製造収率を可能にし、組換えタンパク質製造プラットフォームとしての糖操作ピチアの使用を促進させる。
【０１２１】
用語解説
ＳｃＳＵＣ２：サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼ
ＯＣＨ１：アルファ−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ
Ｋ１ＭＮＮ２−２：クライベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体
ＢＭＴ１：ベータ−マンノース−転移（ベータ−マンノース除去）
ＢＭＴ２：ベータ−マンノース−転移（ベータ−マンノース除去）
ＢＭＴ３：ベータ−マンノース−転移（ベータ−マンノース除去）
ＢＭＴ４：ベータ−マンノース−転移（ベータ−マンノース除去）
ＭＮＮ４Ｌ１：ＭＮＮ４様１（電荷除去）
ＭｍＳＬＣ３５Ａ３：ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体のマウスオルソログ
ＰＮＯ１：Ｎ−結合オリゴ糖のホスホマンノシル化（電荷除去）
ＭＮＮ４：マンノシルトランスフェラーゼ（電荷除去）
ＳｃＧＡＬ１０：ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ
ＸＢ３３：ＳｃＫＲＥ２リーダーに融合したトランケート化ＨｓＧａｌＴ１
ＤｍＵＧＴ：ＵＤＰ−ガラクトース輸送体
ＫＤ５３：ＳｃＭＮＮ２リーダーに融合したトランケート化ＤｍＭＮＳＩＩ
ＴＣ５４：ＳｃＭＮＮ２リーダーに融合したトランケート化ＲｎＧＮＴＩＩ
ＮＡ１０：ＰｐＳＥＣ１２リーダーに融合したトランケート化ＨｓＧＮＴＩ
ＦＢ８：ＳｃＳＥＣ１２リーダーに融合したトランケート化ＭｍＭＮＳ１Ａ
ＣｉＭＮＳ１：分泌性コクシジオイデス・イミチス  マンノシダーゼＩ
ＳＴＥ１３：ゴルジジペプチジルアミノペプチダーゼ
ＤＡＰ２：液胞ジペプチジルアミノペプチダーゼ
ＡＬＧ３：ドリコール−Ｐ−Ｍａｎ依存性アルファ（１−３）マンノシルトランスフェラーゼ
ＰＯＭＧＮＴ１：タンパク質Ｏ−マンノース  ベータ−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ
ＬｍＳＴＴ３Ｄ：リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）オリゴサッカリルトランスフェラーゼサブユニットＤ
【０１２２】
参考文献
【表５】
2014532406.tif 000007
【０１２３】
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【表６】
2014532406.tif 000009
【０１２４】
本出願の全体にわたって特許、特許出願、刊行物、製品説明書およびプロトコールが引用されているが、それらの開示の全体を、あらゆる目的で、参照により本明細書に組み入れることとする。本明細書中に引用されている全ての参考文献を、各個の刊行物、データベースエントリー（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願または特許が参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別に示されているのと同様に、参照により本明細書に組み入れることとする。参照により組み入れるというこの陳述は、そのような引用が、参照により組み入れるという宣誓陳述の直前直後にない場合であっても、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（１）に従い、各個の刊行物、データベースエントリー（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願または特許［それらのそれぞれは３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（２）に従い明らかに特定されるものである］に関連づけることを出願人が意図しているものである。参照により組み入れるという宣誓陳述が明細書中に含まれている場合、それは、参照により組み入れるというこの一般的（ｇｅｎｅｒａｌ）陳述を何ら弱めるものではない。
本明細書における参考文献の引用は、参考文献が関連先行技術であると自認するものではなく、また、それは、これらの刊行物または文書の内容または日付に関して何ら自認するものでもない。
【０１２５】
本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態により範囲において限定されるものではなく、本明細書中に具体的に記載されている実施形態は、必ずしも包括的であるとは意図されない。実際、本明細書に記載されているものに加えて、本発明の種々の修飾が前記説明および添付図面から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は添付の特許請求の範囲の範囲に含まれるものと意図される。
【０１２６】
前記の明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするのに十分なものであるとみなされる。本明細書に示され記載されているものに加えて、本発明の種々の修飾が前記説明から当業者に明らかとなり、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
2014532406.tif 000012
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
2014532406.tif 000014
【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
2014532406.tif 000020
【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
2014532406.tif 000042
【図１４Ｈ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９Ａ】
2014532406.tif 000050
【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2014532406.tif 000057
【配列表】
2014532406000001.app
【国際調査報告】
2014532406.tif 000058
2014532406.tif 000059
2014532406.tif 000060