(57)【要約】本開示は、拡張期心不全の診断および処置に関する方法を提供する。本明細書において提供するのは、被験体において拡張機能障害または拡張期心不全を診断する方法、心不全を患っている被験体において拡張機能障害と収縮機能障害とを区別する方法、被験体において心不全を拡張期心不全または収縮期心不全として特徴付ける方法、拡張機能障害または拡張期心不全の処置についての被験体の必要性を決定する方法、拡張機能障害または拡張期心不全のリスクがある患者を同定する方法、拡張機能障害または拡張期心不全についての被験体のリスクを低減させる方法、拡張機能障害または拡張期心不全についての被験体のリスクをモニターする方法、拡張機能障害または拡張期心不全を処置する能力について化合物をスクリーニングする方法、拡張機能障害または拡張期心不全の処置の有効性を決定する方法、ならびに他の関連する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において拡張機能障害または拡張期心不全を診断する方法であって、前記方法は、（ｉ）前記被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片のレベルを決定する工程を含む、方法。
【請求項２】
被験体において拡張期心不全を診断する方法であって、前記方法は、（ｉ）前記被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片のレベルを決定する工程を含む、方法。
【請求項３】
前記レベルが、対照レベルと比べて増大しているとき、拡張機能障害または拡張期心不全を診断する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
心不全を患っている被験体において拡張機能障害と収縮機能障害とを区別する方法であって、前記方法は、前記被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片のレベルを決定する工程を含む、方法。
【請求項５】
被験体において心不全を拡張期心不全または収縮期心不全として特徴付ける方法であって、前記方法は、前記被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片のレベルを決定する工程を含む、方法。
【請求項６】
ＭｙＢＰ−Ｃ、前記その翻訳後に修飾された形態、または前記その断片の前記レベルが、対照レベルと比べて増大しているとき、前記被験体において前記心不全を拡張期心不全と特徴付ける工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＭｙＢＰ−Ｃ、前記その翻訳後に修飾された形態、または前記その断片の前記レベルが、心不全を患っていない被験体からのレベルと比べて増大し、かつ拡張期心不全を患っている被験体からのレベルと比べて減少しているとき、前記被験体において前記心不全を収縮期心不全と特徴付ける工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
拡張機能障害または拡張期心不全のための処置についての被験体の必要性を決定する方法であって、前記方法は、前記被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片のレベルを決定する工程を含み、ここで前記被験体は、前記レベルが、対照レベルと比較して増加するとき、拡張機能障害または拡張期心不全のための処置を必要とする、方法。
【請求項９】
拡張機能障害または拡張期心不全のリスクがある患者を同定する方法であって、前記方法は、被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルを決定する工程と、ＭｙＢＰ−Ｃ、または前記その翻訳後に修飾された形態、または前記その断片の前記レベルが、対照レベルと比べて増大しているとき、前記被験体を拡張機能障害または拡張期心不全のリスクがある被験体として同定する工程とを含む、方法。
【請求項１０】
拡張機能障害または拡張期心不全についての被験体のリスクを低減させる方法であって、前記方法は、（ｉ）前記被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルを決定する工程と、（ｉｉ）ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片の前記レベルが、対照レベルと比べて増大しているとき、前記被験体に拡張機能障害または拡張期心不全の処置のための治療剤を投与する工程とを含む、方法。
【請求項１１】
拡張機能障害または拡張期心不全についての被験体のリスクをモニターする方法であって、前記方法は、（ａ）第１の時点において前記被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態またはその断片の第１のレベルを決定する工程と、（ｂ）前記第１の時点の後に起こる第２の時点において前記被験体から得た生物学的試料中で、前記ＭｙＢＰ−Ｃ、または前記その翻訳後に修飾された形態または前記その断片の第２のレベルを決定する工程とを含み、前記第２のレベルが前記第１のレベル未満であるとき、拡張機能障害または拡張期心不全についての前記被験体のリスクが減少する、方法。
【請求項１２】
被験体において拡張機能障害または拡張期心不全を処置する能力について化合物をスクリーニングする方法であって、前記方法は、（ａ）前記化合物の投与の前に前記被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態またはその断片の第１のレベルを決定する工程と、（ｂ）前記化合物の投与の後に前記被験体から得た生物学的試料中で、前記ＭｙＢＰ−Ｃ、または前記その翻訳後に修飾された形態または前記その断片の第２のレベルを決定する工程とを含み、前記第２のレベルが前記第１のレベル未満であるとき、前記化合物は拡張機能障害または拡張期心不全を処置することができる、方法。
【請求項１３】
被験体において拡張機能障害または拡張期心不全の処置の有効性を決定する方法であって、前記方法は、（ａ）処置前の前記被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態またはその断片の第１のレベルを決定する工程と、（ｂ）処置後の前記被験体から得た生物学的試料中で、前記ＭｙＢＰ−Ｃ、または前記その翻訳後に修飾された形態または前記その断片の第２のレベルを決定する工程とを含み、前記第２のレベルが前記第１のレベル未満であるとき、前記処置は前記被験体において拡張機能障害または拡張期心不全を処置するのに有効である、方法。
【請求項１４】
心不全を患っている被験体を処置する方法であって、前記方法は：
ａ．前記被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片のレベルを決定する工程と、
ｂ．ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片の前記レベルが、対照レベルと比べて増大しているとき、前記被験体に拡張機能障害または拡張期心不全の処置のための治療剤を投与する工程と
を含む、方法。
【請求項１５】
ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片のレベルについてアッセイを受けた被験体を処置する方法であって、前記方法は、ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片の前記レベルが、対照レベルと比べて増大しているとき、前記被験体に拡張機能障害または拡張期心不全の処置のための治療剤を投与する工程を含む、方法。
【請求項１６】
前記ＭｙＢＰ−Ｃが、約１４４ｋＤａの分子量を有するか、または完全長ＭｙＢＰ−Ｃであり、任意選択で、前記ＭｙＢＰ−Ｃが、Ｓ−グルタチオン付加されている、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＭｙＢＰ−Ｃの前記断片が、約７５ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、または約１５〜約２０ｋＤａの分子量を有する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＭｙＢＰ−Ｃの前記断片が、Ｓ−グルタチオン付加されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＭｙＢＰ−Ｃの前記レベルが、（ｉ）ＭｙＢＰ−Ｃの１つまたは複数の断片のレベルに対して正規化したＭｙＢＰ−Ｃのレベル、または（ｉｉ）［１４４ｋＤａのＭｙＢＰ−Ｃの濃度］：［ＭｙＢＰ−Ｃ断片の合計濃度］の比である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＭｙＢＰ−Ｃの前記レベルまたはＭｙＢＰ−Ｃ断片の前記レベルが、前記試料中のＭｙＢＰ−Ｃの総レベルに対して正規化される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態の前記レベルが、（ｉ）翻訳後修飾を含まないＭｙＢＰ−Ｃのレベルに対して正規化した前記翻訳後修飾を含むＭｙＢＰ−Ｃのレベル、または（ｉｉ）ＭｙＢＰ−Ｃの総レベルに対して正規化した翻訳後修飾を含むＭｙＢＰ−Ｃのレベルである、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＭｙＢＰ−Ｃの前記翻訳後に修飾された形態が、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−ＣまたはＳ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ断片である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＭｙＢＰ−Ｃまたは前記ＭｙＢＰ−Ｃ断片が、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、および／またはＣｙｓ７１９の１つまたは複数においてＳ−グルタチオン付加されている、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＭｙＢＰ−Ｃまたは前記ＭｙＢＰ−Ｃ断片が、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ６２３、および／またはＣｙｓ６５１の１つまたは複数においてＳ−グルタチオン付加されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片の前記レベルが、質量分析法または免疫測定によって決定される、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫測定が、放射免疫測定、免疫組織化学アッセイ、免疫蛍光アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、アフィニティークロマトグラフィー、またはこれらの組合せを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫測定が、ＥＬＩＳＡ、任意選択で、サンドイッチＥＬＩＳＡを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記免疫測定が、請求項４０から５５のいずれか一項に記載の結合剤の使用を含み、任意選択で、前記結合剤が、抗体、抗体の抗原結合断片、またはアプタマーである、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記生物学的試料が、血液またはその画分である、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記生物学的試料が、血漿である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記被験体が、ヒトである、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記被験体が、息切れを患っている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記被験体が、心不全を患っている、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記被験体が、心筋梗塞を患っていない、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記被験体が、収縮機能障害を患っていない、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記被験体が、収縮機能障害を患っている、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片の前記レベルが、対照レベルと比べて増大しているとき、前記被験体に拡張機能障害または拡張期心不全の前記処置のための治療剤を投与する工程をさらに含む、請求項１から１３および１６から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
（ｉ）前記被験体から得た前記生物学的試料中の非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベル、（ｉｉ）前記被験体から得た前記生物学的試料中の対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）のレベル、（ｉｉｉ）前記被験体から得た前記生物学的試料中のＬ−アルギニンのレベル、または（ｉｖ）これらの組合せを決定する工程をさらに含む、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
［前記生物学的試料中のＬ−アルギニンの前記レベル］と［前記生物学的試料中のＡＤＭＡの前記レベル］の比を決定する工程を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃに特異的に結合する単離された結合剤。
【請求項４１】
前記ＭｙＢＰ−Ｃが、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、および／またはＣｙｓ７１９の１つまたは複数においてＳ−グルタチオン付加されている、請求項４０に記載の単離された結合剤。
【請求項４２】
前記ＭｙＢＰ−Ｃが、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ６２３、および／またはＣｙｓ６５１の１つまたは複数においてＳ−グルタチオン付加されている、請求項４１に記載の単離された結合剤。
【請求項４３】
１つまたは複数のＳ−グルタチオン付加されたＣｙｓ残基を欠いているＭｙＢＰ−Ｃに結合しない、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の単離された結合剤。
【請求項４４】
前記Ｃｙｓ残基がＳ−グルタチオン付加されていないとき、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、および／またはＣｙｓ７１９の１つまたは複数に結合しない、請求項４３に記載の結合剤。
【請求項４５】
前記Ｃｙｓ残基がＳ−グルタチオン付加されていないとき、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ６２３、および／またはＣｙｓ６５１の１つまたは複数に結合しない、請求項４４に記載の結合剤。
【請求項４６】
ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープに特異的に結合する単離された結合剤であって、前記エピトープが、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、および／またはＣｙｓ７１９の１つまたは複数を含む、単離された結合剤。
【請求項４７】
前記エピトープが、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ６２３、および／またはＣｙｓ６５１の１つまたは複数を含む、請求項４６に記載の単離された結合剤。
【請求項４８】
ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基に特異的に結合する単離された結合剤であって、前記Ｃｙｓ残基が、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、および／またはＣｙｓ７１９である、結合剤。
【請求項４９】
前記Ｃｙｓ残基が、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ６２３、および／またはＣｙｓ６５１である、請求項４８に記載の単離された結合剤。
【請求項５０】
前記１つまたは複数のＣｙｓ残基が、Ｓ−グルタチオン付加されている、請求項４６から４９のいずれか一項に記載の単離された結合剤。
【請求項５１】
Ｓ−グルタチオン付加されていないときに、前記１つまたは複数のＣｙｓ残基に結合しない、請求項５０に記載の単離された結合剤。
【請求項５２】
抗体、抗体の抗原結合断片、またはアプタマーである、請求項４０から５１のいずれか一項に記載の単離された結合剤。
【請求項５３】
異種部分にコンジュゲートしている、請求項４０から５２のいずれか一項に記載の単離された結合剤。
【請求項５４】
前記異種部分が、検出可能な標識、酵素、酵素基質、または２つの結合パートナーの間に高親和性結合相互作用を有する結合パートナーである、請求項５３に記載の単離された結合剤。
【請求項５５】
前記異種部分が、アビジンまたはビオチンである、請求項５４に記載の単離された結合剤。
【請求項５６】
請求項４０から５５のいずれか一項に記載の単離された結合剤を含むキット。
【請求項５７】
被験体において拡張機能障害または拡張期心不全を診断する方法であって、前記方法は：（ｉ）前記被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方のレベルを決定する工程と、（ｉｉ）ＡＤＭＡの前記レベルが、対照レベルと比べて増大し、かつＳＤＭＡの前記レベルが、対照レベルと比べて変化しないとき、またはＬ−アルギニンとＡＤＭＡの比が、対照比と比べて減少しているとき、拡張機能障害または拡張期心不全を診断する工程とを含む、方法。
【請求項５８】
被験体において収縮期心不全の非存在下で心不全を拡張期心不全として特徴付ける方法であって、前記方法は：（ｉ）前記被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方のレベルを決定する工程と、（ｉｉ）前記生物学的試料中のＬ−アルギニンの前記レベルと前記生物学的試料中のＡＤＭＡの前記レベルの比が、対照比と比べて減少しているとき、収縮期心不全の非存在下で前記心不全を拡張期心不全と特徴付ける工程とを含む、方法。
【請求項５９】
拡張機能障害または拡張期心不全のための処置についての被験体の必要性を決定する方法であって、前記方法は、前記被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方のレベルを決定する工程を含み、ＡＤＭＡの前記レベルが、対照レベルと比べて増大し、かつＳＤＭＡの前記レベルが、対照レベルと比べて変化しないとき、またはＬ−アルギニンの前記レベルとＡＤＭＡの前記レベルの比が、対照比と比べて減少しているとき、前記被験体は拡張機能障害または拡張期心不全のための処置を必要とする、方法。
【請求項６０】
拡張機能障害または拡張期心不全のリスクがある患者を同定する方法であって、前記方法は、（ｉ）被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方のレベルを決定する工程と、（ｉｉ）ＡＤＭＡの前記レベルが、対照レベルと比べて増大し、かつＳＤＭＡの前記レベルが、対照レベルと比べて変化しないとき、またはＬ−アルギニンの前記レベルとＡＤＭＡの前記レベルの比が、対照比と比べて減少しているとき、前記被験体を拡張機能障害または拡張期心不全のリスクがある被験体と同定する工程とを含む、方法。
【請求項６１】
拡張機能障害または拡張期心不全についての被験体のリスクを低減させる方法であって、前記方法は、（ｉ）前記被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方のレベルを決定する工程と、（ｉｉ）ＡＤＭＡの前記レベルが、対照レベルと比べて増大し、かつＳＤＭＡの前記レベルが、対照レベルと比べて変化しないとき、またはＬ−アルギニンの前記レベルとＡＤＭＡの前記レベルの比が、対照比と比べて減少しているとき、前記被験体に拡張機能障害または拡張期心不全の処置のための治療剤を投与する工程とを含む、方法。
【請求項６２】
拡張機能障害または拡張期心不全についての被験体のリスクをモニターする方法であって、前記方法は、（ａ）第１の時点において前記被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）の第１のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方の第１のレベルを決定する工程と、（ｂ）前記第１の時点の後に起こる第２の時点において前記被験体から得た生物学的試料中で、前記ＡＤＭＡの第２のレベル、およびＡＤＭＡの第２のレベル、ならびにＳＤＭＡおよび／またはＬ−Ａｒｇのいずれかまたは両方の第２のレベルを決定する工程とを含み、ＡＤＭＡの前記第２のレベルが、ＡＤＭＡの前記第１のレベルと比べて減少し、かつＳＤＭＡの前記第２のレベルが、ＳＤＭＡの前記第１のレベルと比べて変化しないとき、またはＬ−アルギニンの前記第２のレベルとＡＤＭＡの前記第２のレベルの比が、Ｌ−アルギニンの前記第１のレベルとＡＤＭＡの前記第１のレベルの比と比べて増大するとき、拡張機能障害または拡張期心不全についての前記被験体のリスクが減少する、方法。
【請求項６３】
被験体において拡張機能障害または拡張期心不全を処置する能力について化合物をスクリーニングする方法であって、前記方法は、（ａ）前記化合物の投与の前に前記被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）の第１のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方の第１のレベルを決定する工程と、（ｂ）前記化合物の投与の後に前記被験体から得た生物学的試料中で、前記ＡＤＭＡの第２のレベル、およびＡＤＭＡの第２のレベル、ならびにＳＤＭＡおよび／またはＬ−Ａｒｇのいずれかまたは両方の第２のレベルを決定する工程とを含み、ＡＤＭＡの前記第２のレベルが、ＡＤＭＡの前記第１のレベルと比べて減少し、かつＳＤＭＡの前記第２のレベルが、ＳＤＭＡの前記第１のレベルと比べて変化しないとき、またはＬ−アルギニンの前記第２のレベルとＡＤＭＡの前記第２のレベルの比が、Ｌ−アルギニンの前記第１のレベルとＡＤＭＡの前記第１のレベルの比と比べて増大するとき、前記化合物は拡張機能障害または拡張期心不全を処置することができる、方法。
【請求項６４】
被験体において拡張機能障害または拡張期心不全の処置の有効性を決定する方法であって、前記方法は、（ａ）処置前の前記被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）の第１のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方の第１のレベルを決定する工程と、（ｂ）処置後の前記被験体から得た生物学的試料中で、前記ＡＤＭＡの第２のレベル、およびＡＤＭＡの第２のレベル、ならびにＳＤＭＡおよび／またはＬ−Ａｒｇのいずれかまたは両方の第２のレベルを決定する工程とを含み、ＡＤＭＡの前記第２のレベルが、ＡＤＭＡの前記第１のレベルと比べて減少し、かつＳＤＭＡの前記第２のレベルが、ＳＤＭＡの前記第１のレベルと比べて変化しないとき、またはＬ−アルギニンの前記第２のレベルとＡＤＭＡの前記第２のレベルの比が、Ｌ−アルギニンの前記第１のレベルとＡＤＭＡの前記第１のレベルの比と比べて増大するとき、前記処置は、拡張機能障害または拡張期心不全を処置するのに有効である、方法。
【請求項６５】
心不全を患っている被験体を処置する方法であって、前記方法は：
ａ．前記被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方のレベルを決定する工程と、
ｂ．ＡＤＭＡの前記レベルが、対照レベルと比べて増大し、かつＳＤＭＡの前記レベルが、対照レベルと比べて変化しないとき、またはＬ−アルギニンの前記レベルとＡＤＭＡの前記レベルの比が、対照比と比べて減少しているとき、前記被験体に拡張機能障害または拡張期心不全の処置のための治療剤を投与する工程と
を含む、方法。
【請求項６６】
非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方のレベルについてアッセイを受けた被験体を処置する方法であって、前記方法は、ＡＤＭＡの前記レベルが、対照レベルと比べて増大し、かつＳＤＭＡの前記レベルが、対照レベルと比べて変化しないとき、またはＬ−アルギニンの前記レベルとＡＤＭＡの前記レベルの比が、対照比と比べて減少しているとき、前記被験体に拡張機能障害または拡張期心不全の処置のための治療剤を投与する工程を含む、方法。
【請求項６７】
前記生物学的試料が、血液またはその画分である、請求項５７から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記生物学的試料が、血漿である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記被験体が、ヒトである、請求項５７から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記被験体が、息切れを患っている、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記被験体が、心不全を患っている、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記被験体が、心筋梗塞を患っていない、請求項５７から７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記被験体が、収縮機能障害を患っていない、請求項５７から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記被験体が、収縮機能障害を患っている、請求項５７から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
ＡＤＭＡの前記レベルが、対照レベルと比較して増加し、かつＳＤＭＡの前記レベルが、対照レベルと比べて変化しないとき、またはＬ−アルギニンとＡＤＭＡの前記比が、対照比と比べて減少しているとき、前記被験体に拡張機能障害または拡張期心不全の前記処置のための治療剤を投与する工程をさらに含む、請求項５７から６４および６７から７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
ＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、またはＬ−アルギニンの前記レベルを、免疫測定または質量分析法によって決定する、請求項５７から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記免疫測定が、放射免疫測定、免疫組織化学アッセイ、免疫蛍光アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、アフィニティークロマトグラフィー、またはこれらの組合せを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記免疫測定が、ＥＬＩＳＡ、任意選択で、サンドイッチＥＬＩＳＡを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７９】
前記被験体から得た前記生物学的試料において、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片のレベルを決定する工程をさらに含む、請求項５７から７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＭｙＢＰ−Ｃまたは前記ＭｙＢＰ−Ｃ断片が、Ｓ−グルタチオン付加されている、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
（ｉ）ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片に対して特異的な結合剤と、（ｉｉ）グルタチオンに対して特異的な結合剤と、任意選択で（ｉｉｉ）生物学的試料を集めるためのユニットとを含む、キット。
【請求項８２】
Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−ＣまたはＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された断片に対して特異的な結合剤を含む、請求項８１に記載のキット。
【請求項８３】
ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基に対して特異的な結合剤を含み、前記Ｃｙｓ残基は、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、および／またはＣｙｓ７１９であり、前記Ｃｙｓ残基は、任意選択でＳ−グルタチオン付加されている、請求項８１または８２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８４】
ＢＮＰのための結合剤を含む、請求項８１から８３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８５】
非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のための結合剤、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）のための結合剤、Ｌ−アルギニンのための結合剤、またはこれらの組合せを含む、請求項８１から８４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８６】
血漿を集めるためのユニットを含む、請求項８１から８６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８７】
プロセッサと、
前記プロセッサにカップリングしている記憶デバイスと、
前記記憶デバイス上に記憶されている機械可読命令と
を含むシステムであって、
前記機械可読命令は、前記プロセッサによって実行されるとき、前記プロセッサが、
（ｉ）被験体から得た生物学的試料から決定した、（ａ）ＭｙＢＰ−Ｃのレベル、（ｂ）ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態のレベル、または（ｃ）ＭｙＢＰ−Ｃ断片のレベルからなる群より選択されるデータ値を受け取り、
（ｉｉ）（ｉ）の前記データ値と対応する対照データ値であって、前記対応する対照データ値は、複数の対照データ値の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定した、（ａ）ＭｙＢＰ−Ｃ、（ｂ）ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態、または（ｃ）ＭｙＢＰ−Ｃ断片のレベルである、対応する対照データ値とを比較し、
（ｉｉｉ）（ｉ）の前記データ値が、前記対応する対照データ値よりも大きいとき、前記被験体における拡張機能障害の出力診断を提供することを引き起こす、システム。
【請求項８８】
前記プロセッサが、複数の対照データ値であって、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定した、（ａ）ＭｙＢＰ−Ｃ、（ｂ）ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態、または（ｃ）ＭｙＢＰ−Ｃ断片のレベルである、複数の対照データ値を受け取り、前記複数の対照データ値の平均値を決定し、前記平均値を前記対応する対照データ値として割り当てることができる、請求項８７に記載のシステム。
【請求項８９】
（ｉ）の前記データ値が、ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態またはＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された断片である、請求項８７または８８に記載のシステム。
【請求項９０】
ＭｙＢＰ−Ｃの前記翻訳後に修飾された形態が、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃであるか、またはＭｙＢＰ−Ｃの前記翻訳後に修飾された断片が、ＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された断片である、請求項８９に記載のシステム。
【請求項９１】
前記プロセッサによって実行されるとき、前記プロセッサが、
（ｉ）第１のデータ値および第２のデータ値であって、前記第１のデータ値は、被験体から得た生物学的試料から決定した非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベルであり、前記第２のデータ値は、前記被験体から得た前記生物学的試料から決定した対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）のレベルである、第１のデータ値および第２のデータ値を受け取り、
（ｉｉ）（ｉ）の前記第１のデータ値と対照ＡＤＭＡデータ値であって、前記対照ＡＤＭＡデータ値は、複数の対照データ値の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＡＤＭＡのレベルである、対照ＡＤＭＡデータ値とを比較し、
（ｉｉｉ）（ｉ）の前記第２のデータ値と対照ＳＤＭＡデータ値であって、前記対照ＳＤＭＡデータ値は、複数の対照データ値の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＳＤＭＡのレベルである、対照ＳＤＭＡデータ値とを比較すること
を引き起こす機械可読命令を含む、請求項８７から９０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項９２】
前記プロセッサによって実行されるとき、前記プロセッサが、
（ｉ）第１のデータ値および第２のデータ値であって、前記第１のデータ値は、被験体から得た生物学的試料から決定した非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベルであり、前記第２のデータ値は、前記被験体から得た前記生物学的試料から決定したＬ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）のレベルである、第１のデータ値および第２のデータ値を受け取り、
（ｉｉ）前記第２のデータ値と前記第１のデータ値の比（Ｒｔ）と、対照比（Ｒｃ）であって、Ｒｃは、複数の対照比の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＬ−アルギニンのレベルと、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＡＤＭＡのレベルの比である、Ｒｃとを比較し、
（ｉｉｉ）Ｒｔが、Ｒｃ未満であるとき、前記被験体における拡張機能障害の出力診断を提供すること
を引き起こす機械可読命令を含む、請求項８７から９１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項９３】
前記被験体における拡張機能障害の出力診断が提供されるとき、前記プロセッサが、（ｉ）の前記データ値を拡張機能障害データ値として割り当て、前記拡張機能障害データ値を前記記憶デバイス上に記憶する、請求項９２に記載のシステム。
【請求項９４】
請求項８７から９３のいずれか一項に記載のシステムの機械可読命令を記憶したコンピュータ可読ストレージ媒体。
【請求項９５】
請求項９３に記載の拡張機能障害データ値を記憶したコンピュータ可読ストレージ媒体。
【請求項９６】
コンピュータ中のプロセッサによって実装される方法であって、前記方法は：
（ｉ）被験体から得た生物学的試料から決定した、（ａ）ＭｙＢＰ−Ｃのレベル、（ｂ）ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態のレベル、または（ｃ）ＭｙＢＰ−Ｃ断片のレベルからなる群より選択されるデータ値を受け取る工程と、
（ｉｉ）（ｉ）の前記データ値と対応する対照データ値であって、前記対応する対照データ値は、複数の対照データ値の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定した、（ａ）ＭｙＢＰ−Ｃ、（ｂ）ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態、または（ｃ）ＭｙＢＰ−Ｃ断片のレベルである、対応する対照データ値とを比較する工程と、
（ｉｉｉ）（ｉ）の前記データ値が、前記対応する対照データ値よりも大きいとき、前記被験体における拡張機能障害の出力診断を提供する工程と
を含む、方法。
【請求項９７】
（ｉ）第１のデータ値および第２のデータ値であって、前記第１のデータ値は、被験体から得た生物学的試料から決定した非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベルであり、前記第２のデータ値は、前記被験体から得た前記生物学的試料から決定した対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）のレベルである、第１のデータ値および第２のデータ値を受け取る工程と、
（ｉｉ）（ｉ）の前記第１のデータ値と対照ＡＤＭＡデータ値であって、前記対照ＡＤＭＡデータ値は、複数の対照データ値の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＡＤＭＡのレベルである、対照ＡＤＭＡデータ値とを比較する工程と、
（ｉｉｉ）（ｉ）の前記第２のデータ値と対照ＳＤＭＡデータ値であって、前記対照ＳＤＭＡデータ値は、複数の対照データ値の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＳＤＭＡのレベルである、対照ＳＤＭＡデータ値とを比較する工程と
をさらに含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
（ｉ）第１のデータ値および第２のデータ値であって、前記第１のデータ値は、被験体から得た生物学的試料から決定した非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベルであり、前記第２のデータ値は、前記被験体から得た前記生物学的試料から決定したＬ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）のレベルである、第１のデータ値および第２のデータ値を受け取る工程と、
（ｉｉ）前記第２のデータ値と前記第１のデータ値の比（Ｒｔ）と、対照比（Ｒｃ）であって、Ｒｃは、複数の対照比の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＬ−アルギニンのレベルと、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＡＤＭＡのレベルの比である、Ｒｃとを比較する工程と、
（ｉｉｉ）Ｒｔが、Ｒｃ未満であるとき、前記被験体における拡張機能障害の出力診断を提供する工程と
をさらに含む、請求項９６または９７に記載の方法。
【請求項９９】
（ｉ）の前記データ値が、ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態またはＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された断片である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
ＭｙＢＰ−Ｃの前記翻訳後に修飾された形態が、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃであるか、またはＭｙＢＰ−Ｃの前記翻訳後に修飾された断片が、ＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された断片である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記被験体における拡張機能障害の出力診断が提供されるとき、（ｉ）の前記データ値を拡張機能障害データ値として割り当てる工程と、
前記拡張機能障害データ値を記憶デバイス上に記憶する工程と
をさらに含む、請求項９６から１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
プロセッサと、
前記プロセッサにカップリングしている記憶デバイスと、
前記記憶デバイス上に記憶されている機械可読命令と
を含む、システムであって、
前記機械可読命令は、前記プロセッサによって実行されるとき、前記プロセッサが、
（ｉ）第１のデータ値および第２のデータ値であって、前記第１のデータ値は、被験体から得た生物学的試料から決定した非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベルであり、前記第２のデータ値は、前記被験体から得た前記生物学的試料から決定した対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）のレベルである、第１のデータ値および第２のデータ値を受け取り、
（ｉｉ）（ｉ）の前記第１のデータ値と対照ＡＤＭＡデータ値であって、前記対照ＡＤＭＡデータ値は、複数の対照データ値の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＡＤＭＡのレベルである、対照ＡＤＭＡデータ値とを比較し、
（ｉｉｉ）（ｉ）の前記第２のデータ値と対照ＳＤＭＡデータ値であって、前記対照ＳＤＭＡデータ値は、複数の対照データ値の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＳＤＭＡのレベルである、対照ＳＤＭＡデータ値とを比較し、
（ｉｖ）（ｉ）の前記第１のデータ値が、前記対照ＡＤＭＡデータ値よりも大きいとき、および（ｉ）の前記第２のデータ値が、前記対照ＳＤＭＡデータ値と概ね同じであるとき、前記被験体における拡張機能障害の出力診断を提供することを引き起こす、システム。
【請求項１０３】
（ｉ）前記プロセッサが、複数の対照データ値であって、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＡＤＭＡのレベルである、複数の対照データ値を受け取り、前記複数の対照データ値の平均値を決定し、前記平均値を前記対照ＡＤＭＡデータ値として割り当てることができるか、（ｉｉ）前記プロセッサが、複数の対照データ値であって、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＳＤＭＡのレベルである、複数の対照データ値を受け取り、前記複数の対照データ値の平均値を決定し、前記平均値を前記対照ＳＤＭＡデータ値として割り当てることができる、または（ｉｉｉ）これらの組合せを行うことができる、請求項１０２に記載のシステム。
【請求項１０４】
前記プロセッサによって実行されるとき、前記プロセッサが、
（ｉ）前記被験体から得た前記生物学的試料から決定したＬ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）のレベルである第３のデータ値を受け取り、
（ｉｉ）前記第３のデータ値と前記第１のデータ値の比（Ｒｔ）と、対照比（Ｒｃ）であって、Ｒｃは、複数の対照比の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＬ−アルギニンのレベルと、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＡＤＭＡのレベルの比である、Ｒｃとを比較し、
（ｉｉｉ）Ｒｔが、Ｒｃ未満であるとき、前記被験体における拡張機能障害の出力診断を提供すること
を引き起こす機械可読命令を含む、請求項１０２または１０３に記載のシステム。
【請求項１０５】
前記被験体における拡張機能障害の出力診断が提供されるとき、前記プロセッサが、Ｒｔを拡張機能障害の比として割り当て、前記拡張機能障害の比を前記記憶デバイス上に記憶する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
請求項１０２から１０５のいずれか一項に記載のシステムの機械可読命令を記憶したコンピュータ可読ストレージ媒体。
【請求項１０７】
コンピュータ中のプロセッサによって実装される方法であって、前記方法は：
（ｉ）第１のデータ値および第２のデータ値であって、前記第１のデータ値は、被験体から得た生物学的試料から決定した非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベルであり、前記第２のデータ値は、前記被験体から得た前記生物学的試料から決定した対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）のレベルである、第１のデータ値および第２のデータ値を受け取る工程と、
（ｉｉ）（ｉ）の前記第１のデータ値と対照ＡＤＭＡデータ値であって、前記対照ＡＤＭＡデータ値は、複数の対照データ値の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＡＤＭＡのレベルである、対照ＡＤＭＡデータ値とを比較する工程と、
（ｉｉｉ）（ｉ）の前記第２のデータ値と対照ＳＤＭＡデータ値であって、前記対照ＳＤＭＡデータ値は、複数の対照データ値の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＳＤＭＡのレベルである、対照ＳＤＭＡデータ値とを比較する工程と、
（ｉｖ）（ｉ）の前記第１のデータ値が、前記対照ＡＤＭＡデータ値よりも大きいとき、および（ｉ）の前記第２のデータ値が、前記対照ＳＤＭＡデータ値と概ね同じであるとき、前記被験体における拡張機能障害の出力診断を提供する工程と
を含む、方法。
【請求項１０８】
（ｉ）前記被験体から得た前記生物学的試料から決定したＬ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）のレベルである第３のデータ値を受け取る工程と、
（ｉｉ）前記第３のデータ値と前記第１のデータ値の比（Ｒｔ）と、対照比（Ｒｃ）であって、Ｒｃは、複数の対照比の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＬ−アルギニンのレベルと、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＡＤＭＡのレベルの比である、Ｒｃとを比較する工程と、
（ｉｉｉ）Ｒｔが、Ｒｃ未満であるとき、前記被験体における拡張機能障害の出力診断を提供する工程と
をさらに含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記被験体における拡張機能障害の出力診断が提供されるとき、Ｒｔを拡張機能障害の比として割り当てる工程と、前記拡張機能障害の比を記憶デバイス上に記憶する工程とをさらに含む、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
プロセッサと、
前記プロセッサにカップリングしている記憶デバイスと、
前記記憶デバイス上に記憶されている機械可読命令と
を含むシステムであって、
前記機械可読命令は、前記プロセッサによって実行されるとき、前記プロセッサが、
（ｉ）第１のデータ値および第２のデータ値であって、前記第１のデータ値は、被験体から得た生物学的試料から決定した非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベルであり、前記第２のデータ値は、前記被験体から得た前記生物学的試料から決定したＬ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）のレベルである、第１のデータ値および第２のデータ値を受け取り、
（ｉｉ）前記第２のデータ値と前記第１のデータ値の比（Ｒｔ）と、対照比（Ｒｃ）であって、Ｒｃは、複数の対照比の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＬ−アルギニンのレベルと、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＡＤＭＡのレベルの比である、Ｒｃとを比較し、
（ｉｉｉ）Ｒｔが、Ｒｃ未満であるとき、前記被験体における拡張機能障害の出力診断を提供することを引き起こす、システム。
【請求項１１１】
前記プロセッサが、複数の対照比を受け取ることができ、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＬ−アルギニンのレベルと、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＡＤＭＡのレベルの比である、請求項１１０に記載のシステム。
【請求項１１２】
前記被験体における拡張機能障害の出力診断が提供されるとき、前記プロセッサが、Ｒｔを拡張機能障害の比として割り当て、前記拡張機能障害の比を前記記憶デバイス上に記憶する、請求項１１０または１１１に記載のシステム。
【請求項１１３】
請求項１１０から１１２のいずれか一項に記載のシステムの機械可読命令を記憶したコンピュータ可読ストレージ媒体。
【請求項１１４】
コンピュータ中のプロセッサによって実装される方法であって、前記方法は：
（ｉ）第１のデータ値および第２のデータ値であって、前記第１のデータ値は、被験体から得た生物学的試料から決定した非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベルであり、前記第２のデータ値は、前記被験体から得た前記生物学的試料から決定したＬ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）のレベルである、第１のデータ値および第２のデータ値を受け取る工程と、
（ｉｉ）前記第２のデータ値と前記第１のデータ値の比（Ｒｔ）と、対照比（Ｒｃ）であって、Ｒｃは、複数の対照比の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＬ−アルギニンのレベルと、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＡＤＭＡのレベルの比である、Ｒｃとを比較する工程と、
（ｉｉｉ）Ｒｔが、Ｒｃ未満であるとき、前記被験体における拡張機能障害の出力診断を提供する工程と
を含む、方法。
【請求項１１５】
前記被験体における拡張機能障害の出力診断が提供されるとき、Ｒｔを拡張機能障害の比として割り当てる工程と、前記拡張機能障害の比を記憶デバイス上に記憶する工程とをさらに含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
被験体において拡張機能障害または拡張期心不全を処置する能力について化合物をスクリーニングする方法であって、前記方法は：
ａ．前記被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態またはその断片の第１のレベルを決定する工程と、
ｂ．前記被験体に前記化合物を投与する工程と、
ｃ．前記化合物の投与の後に前記被験体から得た生物学的試料中で、前記ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、または前記その翻訳後に修飾された形態または前記その断片の第２のレベルを決定する工程と
を含み、
前記第２のレベルが、前記第１のレベル未満であるとき、前記化合物は拡張機能障害または拡張期心不全を処置することができる、方法。
【請求項１１７】
被験体において拡張機能障害または拡張期心不全を処置する能力について化合物をスクリーニングする方法であって、前記方法は：
ａ．前記化合物の投与の前に前記被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）の第１のレベル、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）の第１のレベル、および任意選択で、Ｌ−アルギニンの第１のレベルを決定する工程と、
ｂ．前記被験体に前記化合物を投与する工程と、
ｃ．前記化合物の投与の後に前記被験体から得た生物学的試料中で、ＡＤＭＡの第２のレベル、ＳＤＭＡの第２のレベル、および任意選択で、Ｌ−アルギニンの第２のレベルを決定する工程と
を含み、
Ｌ−アルギニンの第１のレベルおよびＬ−アルギニンの第２のレベルを決定する場合、前記方法は、Ｌ−アルギニンの前記第１のレベルとＡＤＭＡの前記第１のレベルの第１の比、およびＬ−アルギニンの前記第２のレベルとＡＤＭＡの前記第２のレベルの第２の比を決定する工程を含み、
ＡＤＭＡの前記第２のレベルが、ＡＤＭＡの前記第１のレベル未満であり、かつＳＤＭＡの前記第２のレベルが、ＳＤＭＡの前記第１のレベルから変化しないとき、または前記第１の比が、前記第２の比よりも大きいとき、前記化合物は拡張機能障害または拡張期心不全を処置することができる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１１年１０月６日に出願された米国仮特許出願第６１／５４４，０３０号；２０１２年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，９００号；２０１２年５月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／６５２，７３４号；２０１２年６月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／６５８，５８５号；および２０１２年７月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／６７７，２９２号（これらの各々の出願は、その全体が参考として援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
米国政府の権利についての声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｒｔ，  Ｌｕｎｇ  ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＨＬＢＩ）助成金第２  Ｐ０１  ＨＬ０５８０００号の下、米国政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
電子的に提出された材料の参考としての援用
参照によりその全体が組み込まれているのは、本明細書と併行的に提出され、下記のように同定されたコンピュータ可読ヌクレオチド／アミノ酸配列一覧である。「４７００２＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称の２０１２年１０月５日に作製された２メガバイトＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル。
【背景技術】
【０００４】
現在、米国において約５７０万人が心不全（ＨＦ）を患っており、毎年約６７万人がこの状態であると診断を受ける。ＨＦ患者の５０％までが拡張期心不全を有し、米国において概ね２３０万人の患者集団が生じている。拡張期心不全の臨床所見は、正常な左心室（ＬＶ）拡張末期容量、正常な駆出分画、能動的弛緩の遅延、およびＬＶの受動的スティフネスの増加を示す１（非特許文献１）。
【０００５】
ＨＦを有する５人のうち約１人が診断から１年以内に死亡し、毎年２８万人超が死亡している。拡張期心不全の処置は、収縮期心不全を患っている患者のために使用される処置と非常に異なるため、心不全を患っている患者の処置の成功は、示された心臓の機能障害のタイプによって決まる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｚｉｌｅ  ＭＲら、Ｄｉａｓｔｏｌｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ：ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ．  Ｐｒｏｇ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｉｓ（２００５）；４７（５）：３０７〜１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
拡張機能障害を診断する方法は当技術分野において公知であり、例えば、ドップラー心エコー法、心臓カテーテル、磁気共鳴イメージング、組織ドップラーイメージング、ならびに左心室拡張末期圧および収縮機能の測定が含まれる。しかし、これらの方法は侵襲的で時間がかかり、高価であり得る。したがって、拡張期心不全を正確に診断する非侵襲的で対時間効果が高く、対費用効果の高い方法が当技術分野で必要とされている。
【０００８】
さらに、心不全を診断するための市販されている診断用薬が存在する一方、収縮機能障害と拡張機能障害とを、または収縮期心不全と拡張期心不全とを区別する試験は存在しない。したがって、収縮機能障害と拡張機能障害とを、または収縮期心不全と拡張期心不全とを区別する非侵襲的で対時間効果が高く、対費用効果の高い方法が当技術分野で必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書において提供するのは、被験体において拡張機能障害または拡張期心不全を診断する方法、心不全を患っている被験体において拡張機能障害と収縮機能障害とを区別する方法、被験体において心不全を拡張期心不全または収縮期心不全として特徴付ける方法、拡張機能障害または拡張期心不全の処置についての被験体の必要性を決定する方法、拡張機能障害または拡張期心不全のリスクがある患者を同定する方法、拡張機能障害または拡張期心不全についての被験体のリスクを低減させる方法、拡張機能障害または拡張期心不全についての被験体のリスクをモニターする方法、拡張機能障害または拡張期心不全を処置する能力について化合物をスクリーニングする方法、拡張機能障害または拡張期心不全の処置の有効性を決定する方法、ならびに他の関連する方法である。
【００１０】
例示的な実施形態において、方法のそれぞれは、被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルを決定する工程を含む。ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルが、対照レベルと比べて増大しているとき、被験体は、拡張機能障害もしくは拡張期心不全と診断され、または拡張期心不全もしくは拡張機能障害の処置が必要であると決定される。これらの方法の例示的な態様において、生物学的試料のＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片のレベルが、対照と比べて増大するとき、方法は、被験体に拡張期心不全または拡張機能障害の処置のための治療剤を投与する工程をさらに含む。
【００１１】
代わりのまたはさらなる実施形態において、方法のそれぞれは、被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベル、ならびに対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／またはＬ−アルギニンのいずれかまたは両方のレベルを決定する工程を含む。例示的な態様において、方法は、生物学的試料中のＬ−アルギニンのレベルと生物学的試料中のＡＤＭＡのレベルの比を決定する工程を含む。ＡＤＭＡのレベルが、ＡＤＭＡの対照レベルと比べて増大し、かつＳＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて変化しないとき、またはＬ−アルギニンとＡＤＭＡの比が、対照比と比べて減少しているとき、被験体は、拡張機能障害もしくは拡張期心不全と診断され、または拡張期心不全もしくは拡張機能障害の処置が必要であると決定される。
【００１２】
本発明はまた、被験体において拡張機能障害または拡張期心不全を診断する方法を提供する。方法は、被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルを決定する工程と、被験体から得た生物学的試料中で、Ｂ型ナトリウム利尿タンパク質（ＢＮＰ）のレベルを決定する工程とを含む。
【００１３】
本発明は、被験体を処置する方法をさらに提供する。例示的な実施形態において、被験体は心不全を患っており、方法は、被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片のレベルを決定する工程と、生物学的試料のＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片のレベルが、対照と比べて増大するとき、被験体に拡張期心不全または拡張機能障害の処置のための治療剤を投与する工程とを含む。他の例示的な実施形態において、被験体は、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片のレベルについてアッセイを受けており、方法は、被験体が増加したレベルのＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片を有すると決定されたとき、被験体に拡張期心不全または拡張機能障害の処置のための治療剤を投与する工程を含む。
【００１４】
発明性のある処置方法の代わりのまたはさらなる実施形態において、被験体は心不全を患っており、方法は、被験体から得た生物学的試料中で、ＡＤＭＡのレベル、ならびにＳＤＭＡおよび／またはＬ−アルギニンのいずれかまたは両方のレベルを決定する工程と、生物学的試料のＡＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて増大し、かつ生物学的試料のＳＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて変化しないとき、または生物学的試料のＬ−アルギニンのレベルと生物学的試料のＡＤＭＡのレベルの比が、対照比と比べて減少しているとき、被験体に拡張期心不全または拡張機能障害の処置のための治療剤を投与する工程とを含む。発明性のある処置方法の他のさらなるまたは例示的な実施形態において、被験体は、ＡＤＭＡのレベル、ならびにＳＤＭＡおよび／またはＬ−アルギニンのいずれかまたは両方のレベルについてアッセイを受けており、方法は、生物学的試料のＡＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて増大し、かつ生物学的試料のＳＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて変化しないとき、または生物学的試料のＬ−アルギニンのレベルと生物学的試料のＡＤＭＡのレベルの比が、対照比と比べて減少しているとき、被験体に拡張期心不全または拡張機能障害の処置のための治療剤を投与する工程を含む。
【００１５】
発明性のある方法において有用な単離された結合剤をまた本明細書において提供する。例示的な実施形態において、単離された結合剤は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃに特異的に結合する。例示的な態様において、ＭｙＢＰ−Ｃは、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、および／またはＣｙｓ７１９の１つまたは複数においてＳ−グルタチオン付加されている。例示的な実施形態において、単離された結合剤は、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープに特異的に結合し、エピトープは、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、および／またはＣｙｓ７１９の１つまたは複数を含む。例示的な実施形態において、単離された結合剤は、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基に特異的に結合し、Ｃｙｓ残基は、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、および／またはＣｙｓ７１９である。
【００１６】
被験体において拡張期心不全または拡張機能障害を診断するためのキットをまた本明細書において提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】シャムおよびＤＯＣＡ−塩の心臓からの筋フィラメントの翻訳後修飾における比較。Ａ：シャムおよびＤＯＣＡ−塩で処置された心臓からの筋フィラメント試料を比較するときの、グルタチオン付加されたタンパク質の検出を示すウエスタンブロット分析。ブロットをまた、ミオシン結合タンパク質Ｃについて分析したが、このタンパク質が主要な修飾であったことを示した。一対の比較が、ゲルから除去されたことを留意されたい。Ｂ：シャムおよびＤＯＣＡ−塩筋フィラメントにおけるミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）に対して正規化したグルタチオン付加されたタンパク質（ＧＳＨ）の間の差異の定量化。（＊ｐ＜０．０５、ｎ＝３）。
【図２】ＭｙＢＰ−Ｃのグルタチオン付加レベル。（Ａ）代表的な抗グルタチオンゲル。（Ｂ）代表的なポンソー像。（Ｃ）総レーンに対して正規化したＭｙＢＰ−Ｃのグルタチオン付加レベル。バンドのデンシトメトリーデータは、平均±ＳＥＭとして表した。群毎にＮ＝８匹のマウス。データを、二元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くスチューデントｔ検定によって、ＪＭＰ統計ソフトウェアを使用して統計的に分析した。＊Ｐ＜０．０５。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｆ。ＭｙＢＰ−Ｃのグルタチオン付加、拡張機能障害、および張力損失の間の関係。（Ａ〜Ｂ）心エコーパラメーター、Ｅ／Ｅ’比は、正規化したＭｙＢＰ−Ｃのグルタチオン付加レベルと正相関した。（Ｃ〜Ｄ）心エコーパラメーター、Ｅ’／Ａ’比は、正規化したＭｙＢＰ−Ｃのグルタチオン付加レベルと逆相関した。張力損失に対する正規化したＭｙＢＰ−Ｃのグルタチオン付加レベル（Ｅ）、および張力損失に対する心エコーのＥ／Ｅ’（Ｆ）は、逆相関した。群毎にＮ＝７〜８匹のマウス。＊は、線形回帰を示す（＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図３−２】図３Ｇ〜３Ｍ。ＢＨ４で処置された、または処置されていないＷＴおよびＤＯＣＡ−塩マウスにおける胸部心エコーパラメーター。（Ｇ）駆出分画（％、ＥＦ）および（Ｈ）短縮率（％、ＦＳ）は、短軸Ｍモード像で決定した。（Ｉ）僧帽弁流入パルス波ドプラ比（Ｅ／Ａ）、（Ｊ）僧帽弁組織ドプラ比、Ｅ’／Ａ’、（Ｋ）Ｅ／Ｅ’、（Ｌ＆Ｍ）パルス波（Ｌ）およびＴＤＩ（Ｍ）の心尖部四腔断層像からの代表的像。データは、平均±ＳＥＭとして表した。群毎にＮ＝７〜９匹。＊は、スチューデントｔ検定によって比較した示された群を示す（＊Ｐ＜０．０５’、＊＊Ｐ＜０．０１’、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意差なし）。
【図３−３】図３Ｇ〜３Ｍ。ＢＨ４で処置された、または処置されていないＷＴおよびＤＯＣＡ−塩マウスにおける胸部心エコーパラメーター。（Ｇ）駆出分画（％、ＥＦ）および（Ｈ）短縮率（％、ＦＳ）は、短軸Ｍモード像で決定した。（Ｉ）僧帽弁流入パルス波ドプラ比（Ｅ／Ａ）、（Ｊ）僧帽弁組織ドプラ比、Ｅ’／Ａ’、（Ｋ）Ｅ／Ｅ’、（Ｌ＆Ｍ）パルス波（Ｌ）およびＴＤＩ（Ｍ）の心尖部四腔断層像からの代表的像。データは、平均±ＳＥＭとして表した。群毎にＮ＝７〜９匹。＊は、スチューデントｔ検定によって比較した示された群を示す（＊Ｐ＜０．０５’、＊＊Ｐ＜０．０１’、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意差なし）。
【図４】図４は、ＤＤについてのバイオマーカーとして血清ＭｙＢＰ−Ｃアイソフォームおよび断片を示す像のコレクションを表す。（上）ウエスタンブロッティングは心臓のＭｙＢＰ−Ｃ  Ａｂを検出した。（下）デンシトメトリーの結果。データは、平均±ＳＥＭを表す。Ｎ＝３〜４。シャムに対してＰ＜０．０５、スチューデントｔ検定
【図５】図５（左のパネル）は、ＤＯＣＡ−塩マウスまたはシャム対照マウスから得た血漿試料からのグルタチオン免疫沈降物のＭｙＢＰ−Ｃのウエスタンブロットである。図５（右のパネル）は、左のパネルのウエスタンブロットにおけるバンドの定量化のグラフである。データは、平均±ＳＥ＜として表す。対応のないスチューデントｔ検定においてＰ＜０．０５。
【図６】図６（左上のパネル）は、対照患者または保全された駆出分画を伴う心不全患者（ＨＦｐＥＦ；拡張期心不全）から得た血漿試料の７５ｋＤａのバンドのＭｙＢＰ−Ｃのウエスタンブロットであり、（左下のパネル）は、左上のパネルのウエスタンブロットにおけるバンドの定量化のグラフである。
【図７】図７Ａおよび７Ｂ：ミオシン結合タンパク質−ＣのＳ−グルタチオン付加の変化を示す代表的なゲル（Ａ）、ラノラジンの慢性投与の後、または投与なしのＤＯＣＡ−塩またはシャムマウスからの心臓におけるミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）のＳ−グルタチオン付加の比較（Ｂ）。値は５回の決定についての平均±ＳＥＭとして示す。
【図８】図８Ａ：シャムおよびＤＯＣＡ−塩心臓からの筋フィラメントのリン酸化の代表的な比較。Ａ：シャムおよびＤＯＣＡ−塩心臓からの線維束におけるミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）のリン酸化の比較。有意差は存在しなかった。値は６〜９回の決定についての平均±ＳＥＭとして示す。図８Ｂ：ＰｒｏＱによって評価した、筋フィラメントにおけるＭｙＢＰ−Ｃのリン酸化レベル。
【図９】図９Ａ〜９Ｄ：対照群と比較した、拡張機能障害（ＤＤ）および収縮機能障害（ＳＤ）の患者からのヒト血漿ＡＤＭＡレベル。図９Ａ、ＡＤＭＡ；図９Ｂ、ＳＤＭＳ；図９Ｃ、アルギニン；および図９Ｄ、アルギニン／ＡＤＭＡ比。データは平均±ＳＥＭとして表した。各群における対応のないスチューデントｔ検定で定義した有意性。（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄ：急性および慢性ＨＦ患者群からのＡＤＭＡ（図１０Ａ）、ＳＤＭＡ（図１０Ｂ）、Ｌ−アルギニン（図１０Ｃ）、および［Ｌ−アルギニン／ＡＤＭＡ］の比（図１０Ｄ）のヒト血漿レベル。
【図１１】図１１Ａ：ＡＤＭＡのヒト血漿レベルと患者のＢＭＩとの間の相関のグラフ（勾配＝２４．２７±７．８４、Ｒ２＝０．２０５、Ｐ＝０．００３８）。図１１Ｂ：ＢＭＩとＬ−アルギニン／ＡＤＭＡの比との間の相関のグラフ（勾配＝−２．３８±１．１６、Ｒ２＝０．０９９、Ｐ＝０．０４８）。
【図１２】図１２は、埋め込まれた心臓除細動器（ＩＣＤ）についての被験体の必要性を評価するための、システム１００の例示的な実施形態１０１の略図である。
【図１３】図１３（上のパネル）は、対照患者、拡張機能障害患者、および収縮機能障害患者から得た血漿のＭｙＢＰ−Ｃのウエスタンブロットである。ウエスタンブロットのデータを、下のパネルのグラフにおいて定量化およびプロットした。ＭｙＢＰ−Ｃの７５ｋＤａの断片（左下のパネル）およびＭｙＢＰ−Ｃの総血漿レベル（右下のパネル）。
【図１４】図１４（上のパネル）は、対照患者、拡張機能障害患者、および収縮機能障害患者から得た血漿からのＳ−グルタチオン免疫沈降物のＭｙＢＰ−Ｃのウエスタンブロットである（７５ｋＤａのＭＷを示す）。ウエスタンブロットのデータを、下のグラフにおいて定量化およびプロットした。
【図１５】ＤＤおよびＳＤ患者のヒト血漿からのＳ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ断片（７５ｋＤ）の比、およびＭｙＢＰ−Ｃ（７５ｋＤ）のタンパク質量。Ｓ−グルタチオン付加およびＭｙＢＰ−Ｃの免疫沈降データを、ＭｙＢＰ−Ｃ（７５ｋＤ）を検出する免疫ブロット法データで正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして表した。Ｎ＝８〜２２。ボンフェローニの事後検定と共に一元配置ＡＮＯＶＡは、有意性を定義した。（＊Ｐ＜０．０５）。
【図１６】図１６である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
心不全
心不全（ＨＦ）は、心臓が体の残りに十分な血液をもはやポンピングすることができない状態である。いくつかの実施形態において、心不全の徴候および症状には、呼吸困難（例えば、起座呼吸、発作性夜間呼吸困難）、咳嗽、心臓性喘息、喘鳴、浮動性めまい、混乱、安静時に冷たい四肢、慢性静脈性うっ血、くるぶし腫脹、末梢浮腫もしくは全身浮腫、夜間多尿、腹水、肝腫大（ｈｅｐｔｏｍｅｇａｌｙ）、黄疸、凝固障害、疲労、運動不耐性、頚静脈拡張、肺ラ音、末梢浮腫、肺血管の再分布、間質浮腫、胸水、またはこれらの組合せが含まれる。いくつかの実施形態において、心不全の徴候および症状には、呼吸困難（例えば、起座呼吸、発作性夜間呼吸困難）、疲労、運動不耐性、頚静脈拡張、肺ラ音、末梢浮腫、肺血管の再分布、間質浮腫、胸水、またはこれらの組合せが含まれる。いくつかの実施形態において、心不全の症状は、下記の表において一覧表示した症状の１つである（これはニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）による心不全の分類についての基礎を提供する）。
【００１９】
【表１−１】
2014531605.tif 000002
【００２０】
心不全の徴候および／または症状を示す患者は、収縮機能障害、拡張機能障害、または２つの組合せを患っていてもよい。拡張期心不全の処置は、収縮期心不全、例えば、拡張機能障害の非存在下での収縮期心不全を患っている患者について使用される処置と非常に異なるため、心不全を患っている患者の処置の成功は、示される心臓の機能障害のタイプによって決まる。
【００２１】
拡張機能障害
本明細書において使用する場合、「拡張機能障害」という用語は、機械的機能における異常が拡張期の間に示される状態を指す。拡張機能障害は心不全の存在下または非存在下で起こることがあり、収縮機能の異常を伴って、または伴わずに共存することができる（Ｚｉｌｅら、ＪＡＣＣ、４１巻：１５１９〜１５２２頁（２００３年））。収縮機能障害の非存在下での拡張機能障害は、「保全された駆出分画を伴う拡張機能障害」と称してもよい。本明細書において使用する場合、「保全された駆出分画」という用語は、約４５％以上、例えば、約５０％以上である左室駆出分画を指す。いくつかの態様において、保全された駆出分画は、約５０％以上であるものである。いくつかの実施形態において、拡張機能障害は、拡張早期機能障害である。本明細書において使用する場合、「拡張早期機能障害」という用語は、早期充満の拡張期における僧帽弁を通る血液のピーク速度（Ｅ波）と、心房収縮の間の僧帽弁を通る血液のピーク速度（Ａ波）との比（Ｅ／Ａ比）≦１、ならびに通常のパルス波ドプラ法によって記録される早期ピーク（Ｅ’）および後期ピーク（Ａ’）僧帽弁輪速度（また≦１）によって証明される心室充満が損なわれた医学的状態を指す（Ｖａｓａｎら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ、２６巻：１５６５〜１５７４頁（１９９５年）；Ｘｉｅら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ、２４巻：１３２〜１３９頁（１９９４年）；Ｍｏｌｌｅｒら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ、３５巻：３６３〜３７０頁（２０００年））。
【００２２】
拡張期心不全（ＤＨＦ）は、拡張機能障害によってもたらされる、または拡張機能障害と連結する心不全を指す。ＤＨＦは、拡張機能障害の臨床所見である。
【００２３】
収縮機能障害
簡単に言えば、収縮機能障害は、心臓のポンプ機能または収縮（すなわち、収縮期）が機能しなくなる状態である。収縮機能障害は、駆出分画の減少または低減、例えば、４５％未満である駆出分画、ならびに心室拡張末期圧および容量の増加によって特徴付けてもよい。いくつかの態様において、心室収縮の強度が弱まり、適当な一回拍出量を生じさせるのには不十分であり、より少ない心拍出量がもたらされる。収縮機能障害は、拡張機能障害の存在下または非存在下で起こり得る。
【００２４】
収縮期心不全（ＳＨＦ）は、収縮機能障害によってもたらされる、または収縮機能障害と連結する心不全を指す。
【００２５】
ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）に関する方法
本発明は、被験体において拡張機能障害または拡張期心不全を診断する方法を提供する。例示的な実施形態において、方法は、被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルを決定する工程を含む。例示的な態様において、方法は、ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルが、対照レベルと比べて増大しているとき、拡張機能障害または拡張期心不全を診断する工程をさらに含む。例示的な態様において、方法は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−ＣまたはＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された断片のレベルを決定する工程を含む。例示的な態様において、方法は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃの７５ｋＤａの断片のレベルを決定する工程を含む。
【００２６】
例示的な態様において、発明性のある方法は、被験体において拡張機能障害を診断する方法であり、方法は、被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルを決定する工程を含む。この発明性のある方法の例示的な態様において、方法は、ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルが、対照レベルと比べて増大しているとき、拡張機能障害を診断する工程をさらに含む。例示的な態様において、方法は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−ＣまたはＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された断片のレベルを決定する工程を含む。例示的な態様において、方法は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃの７５ｋＤａの断片のレベルを決定する工程を含む。
【００２７】
代わりの例示的な態様において、発明性のある方法は、被験体において拡張期心不全を診断する方法であり、方法は、被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルを決定する工程を含む。この発明性のある方法の例示的な態様において、方法は、ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルが、対照レベルと比べて増大しているとき、拡張期心不全を診断する工程をさらに含む。例示的な態様において、方法は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−ＣまたはＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された断片のレベルを決定する工程を含む。例示的な態様において、方法は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃの７５ｋＤａの断片のレベルを決定する工程を含む。
【００２８】
本発明はまた、心不全を患っている被験体において拡張機能障害と収縮機能障害とを区別する方法を提供する。例示的な実施形態において、方法は、被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルを決定する工程を含む。例示的な態様において、方法は、拡張機能障害を収縮機能障害から区別し、方法は、ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルが、対照レベルと比べて増大しているとき、拡張機能障害を患っている被験体として被験体を同定する。例示的な態様において、方法は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−ＣまたはＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された断片、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃの７５ｋＤａの断片のレベルを決定する工程を含む。
【００２９】
本発明は、被験体において心不全を拡張期心不全または収縮期心不全として特徴付ける方法をさらに提供する。例示的な実施形態において、方法は、被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルを決定する工程を含む。例示的な態様において、方法は、ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルが、対照レベルと比べて増大しているとき、被験体において心不全を拡張期心不全として特徴付ける工程を含む。例示的な態様において、方法は、ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルが、心不全を患っていない被験体からのレベルと比べて増大し、かつ拡張期心不全を患っている被験体からのレベルと比べて減少しているとき、被験体において心不全を収縮期心不全と特徴付ける工程を含む。例示的な態様において、方法は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−ＣまたはＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された断片、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃの７５ｋＤａの断片のレベルを決定する工程を含む。
【００３０】
本発明はさらに、拡張機能障害または拡張期心不全の処置についての被験体の必要性を決定する方法を提供する。例示的な実施形態において、方法は、被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルを決定する工程を含む。ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルが、対照レベルと比べて増大しているとき、被験体は、拡張期心不全についての処置が必要であると決定される。例示的な態様において、方法は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−ＣまたはＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された断片、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃの７５ｋＤａの断片のレベルを決定する工程を含む。
【００３１】
本発明はさらに、拡張機能障害の処置についての被験体の必要性を決定する方法を提供する。例示的な実施形態において、方法は、被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルを決定する工程を含む。ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルが、対照レベルと比べて増大しているとき、被験体は、拡張機能障害のための処置が必要であると決定される。例示的な態様において、方法は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−ＣまたはＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された断片、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃの７５ｋＤａの断片のレベルを決定する工程を含む。
【００３２】
本発明はその上、拡張機能障害または拡張期心不全のリスクがある患者を同定する方法を提供する。例示的な実施形態において、方法は、被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルを決定する工程を含む。ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルが、対照レベルと比べて増大しているとき、被験体は、拡張機能障害または拡張期心不全のリスクがある患者として同定される。例示的な態様において、方法は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−ＣまたはＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された断片、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃの７５ｋＤａの断片のレベルを決定する工程を含む。
【００３３】
本発明はさらに、拡張機能障害または拡張期心不全についての被験体のリスクを低減させる方法を提供する。例示的な実施形態において、方法は、（ｉ）被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルを決定する工程と、（ｉｉ）ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片のレベルが、対照レベルと比べて増大しているとき、被験体に拡張機能障害または拡張期心不全の処置のための治療剤を投与する工程とを含む。例示的な態様において、方法は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−ＣまたはＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された断片、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃの７５ｋＤａの断片のレベルを決定する工程を含む。
【００３４】
本発明は、拡張機能障害または拡張期心不全についての被験体のリスクをモニターする方法を提供する。例示的な態様において、方法は、（ａ）被験体から得た生物学的試料中で第１の時点において、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態またはその断片の第１のレベルを決定する工程と、（ｂ）被験体から得た生物学的試料中で第１の時点の後に起こる第２の時点において、ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態またはその断片の第２のレベルを決定する工程とを含み、第２のレベルが第１のレベル未満であるとき、拡張機能障害または拡張期心不全についての被験体のリスクは減少する。例示的な態様において、ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−ＣまたはＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された断片、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃの７５ｋＤａの断片である。
【００３５】
本発明はさらに、被験体において拡張機能障害または拡張期心不全を処置する能力について化合物をスクリーニングする方法を提供する。例示的な態様において、方法は、（ａ）化合物の投与の前に被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態またはその断片の第１のレベルを決定する工程と、（ｂ）化合物の投与の後に被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態またはその断片の第２のレベルを決定する工程とを含み、第２のレベルが第１のレベル未満であるとき、化合物は拡張機能障害または拡張期心不全を処置することができる。例示的な態様において、ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−ＣまたはＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された断片、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃの７５ｋＤａの断片である。
【００３６】
本発明はまた、被験体において拡張機能障害または拡張期心不全の処置の有効性を決定する方法を提供する。例示的な態様において、方法は、（ａ）処置前の被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態またはその断片の第１のレベルを決定する工程と、（ｂ）処置後の被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態またはその断片の第２のレベルを決定する工程とを含み、第２のレベルが第１のレベル未満であるとき、処置は、被験体において拡張機能障害または拡張期心不全を処置するのに有効である。例示的な態様において、ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−ＣまたはＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された断片、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃの７５ｋＤａの断片である。
【００３７】
本発明はその上、心不全を患っている被験体を処置する方法を提供する。例示的な実施形態において、方法は、（ａ）被験体から得た生物学的試料中で、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片のレベルを決定する工程と、（ｂ）ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片のレベルが、対照レベルと比べて増大しているとき、被験体に拡張機能障害または拡張期心不全の処置のための治療剤を投与する工程とを含む。例示的な態様において、ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−ＣまたはＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された断片、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃの７５ｋＤａの断片である。
【００３８】
本発明はまた、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片のレベルについてアッセイを受けた被験体を処置する方法を提供する。例示的な実施形態において、方法は、ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片のレベルが、対照レベルと比べて増大しているとき、被験体に拡張機能障害または拡張期心不全の処置のための治療剤を投与する工程を含む。例示的な態様において、ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−ＣまたはＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された断片、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃの７５ｋＤａの断片である。
【００３９】
発明性のある処置の方法に関して、当技術分野において公知の拡張機能障害または拡張期心不全の処置のための適切な治療剤（これらのいくつかは本明細書に記載されている）を使用し得る。拡張機能障害または拡張期心不全の処置のための治療剤と表題を付けられているサブセクションを参照されたい。例示的な態様において、治療は、ＢＨ４またはラノラジンである。
【００４０】
本明細書において使用する場合、「ミオシン結合タンパク質−Ｃ」または「ＭｙＢＰ−Ｃ」という用語は、脊椎動物心臓の太いフィラメントと関連する心臓型ミオシン結合タンパク質（ｃＭｙＢＰ−Ｃ）を指し、心筋においてもっぱら発現している。ｃＭｙＢＰ−Ｃは、骨格筋においてもっぱら発現している速骨格ＭｙＢＰ−Ｃおよび遅骨格ＭｙＢＰ−Ｃと異なる。心臓のサルコメアにおいて、ｃＭｙＢＰ−Ｃは、Ａバンドの内側の３分の２内、すなわち、Ｃゾーン中に局在化している。ｃＭｙＢＰ−Ｃは、タンパク質の細胞内免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属する。他のサルコメアタンパク質、例えば、タイチン、ミオシン、およびＭ−タンパク質と同様に、ｃＭｙＢＰ−Ｃは、Ｉｇおよびフィブロネクチン３型の繰返しドメインからなる。（ＢａｒｅｆｉｅｌｄおよびＳａｄａｙａｐｐａｎ、Ｊ  Ｍｏｌｅｃ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ、４８巻：８６６〜８７５頁（２０１０年））。参照配列ＮＰ＿０００２４７．２として国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ウェブサイトから公的に入手可能であり、また本明細書において配列番号２１として記載するヒトｃＭｙＢＰ−Ｃの完全長アミノ酸配列は、概ね１４０ｋＤａまたは１４４ｋＤａの分子量を有する１２７４個のアミノ酸のタンパク質をコードする。
【００４１】
特定の条件下で、ｃＭｙＢＰ−Ｃは、翻訳後修飾、例えば、リン酸化、Ｓ−グルタチオン付加を受ける。任意の特定な理論に束縛されるものではないが、ｃＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加は、ストレス、例えば、酸化ストレスの条件下で起こる。例示的な態様において、ＭｙＢＰ−Ｃは、タンパク質、例えば、配列番号２１の最初の７２０個のアミノ酸のＮ末端ポーション内の１つまたは複数のＣｙｓ残基においてＳ−グルタチオン付加されている。例示的な態様において、ＭｙＢＰ−Ｃは、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、および／またはＣｙｓ７１９の１つまたは複数においてＳ−グルタチオン付加されている。例示的な態様において、ｃＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加は、Ｃｙｓ４７５において起こる。例示的な態様において、ｃＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加は、Ｃｙｓ６２３において起こる。例示的な態様において、ｃＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加は、Ｃｙｓ６５１において起こる。例示的な態様において、ｃＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加は、Ｃｙｓ４７５およびＣｙｓ６２３において、またはＣｙｓ４７５およびＣｙｓ６５１において起こる。例示的な態様において、ｃＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加は、Ｃｙｓ６２３およびＣｙｓ６５１において起こる。例示的な態様において、ｃＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加は、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ６２３、およびＣｙｓ６５１において起こる。
【００４２】
特定の条件下で、ｃＭｙＢＰ−Ｃは分解し、または種々のサイズの断片に切断される。任意の特定な理論に束縛されるものではないが、ストレス、例えば、酸化ストレスの条件下で、ｃＭｙＢＰ−Ｃは分解し、または断片に切断され、断片は細胞（例えば、心臓細胞）から血漿中に分泌される。ｃＭｙＢＰ−Ｃ断片は、例示的な態様において、約７０ｋＤａ〜約８０ｋＤａの分子量を有する。ｃＭｙＢＰ−Ｃ断片は、例示的な態様において、約７５ｋＤａまたは約７９ｋＤａの分子量を有する。他の例示的な態様において、ｃＭｙＢＰ−Ｃ断片は、約４０ｋＤａの分子量を有する。他の例示的な態様において、ｃＭｙＢＰ−Ｃ断片は、約２５ｋＤａの分子量を有する。他の例示的な態様において、ｃＭｙＢＰ−Ｃ断片は、約１５〜２０ｋＤａの分子量を有する。例示的な態様において、上記のＭｙＢＰ−Ｃの断片の任意の１つは、Ｓ−グルタチオン付加されている。
【００４３】
発明性のある方法の目的のために、方法が、ミオシン結合タンパク質−Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルを決定する工程を含むとき、方法は、例示的な態様において、完全長またはインタクトなＭｙＢＰ−Ｃのレベルを決定する工程を含み、または約１４０ｋＤａまたは１４４ｋＤａの分子量を有するＭｙＢＰ−Ｃを決定する工程を含む。代わりにまたはさらに、方法は、例示的な態様において、ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態またはＭｙＢＰ−Ｃ断片の翻訳後に修飾された形態を決定する工程を含む。例示的な態様において、方法は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−ＣまたはＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された断片のレベルを決定する工程を含む。代わりのまたはさらなる態様において、方法は、これらに限定されないが、約７５ｋＤａまたは７９ｋＤａの分子量を有するＭｙＢＰ−Ｃ断片、約４０ｋＤａの分子量を有するＭｙＢＰ−Ｃ断片、約２５ｋＤａの分子量を有するＭｙＢＰ−Ｃ断片、約１５〜２０ｋＤａの分子量を有するＭｙＢＰ−Ｃ断片、またはこれらの組合せを含めたＭｙＢＰ−Ｃ断片のレベルを決定する工程を含む。代わりのまたはさらなる態様において、方法は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ断片のレベルを決定する工程を含む。例示的な態様において、方法は、（ａ）完全長もしくはインタクトなＭｙＢＰ−Ｃ、または約１４０ｋＤａもしくは１４４ｋＤａの分子量を有するＭｙＢＰ−Ｃのレベル、（ｂ）ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃのレベル、（ｃ）ＭｙＢＰ−Ｃ断片のレベル（任意選択で、断片は、Ｓ−グルタチオン付加されている）、あるいは（ｄ）これらの組合せを決定する工程を含む。
【００４４】
例示的な態様において、ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルは、絶対レベルである。代わりの態様において、ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルは、正規化されたまたは相対的レベルである。例示的な態様において、ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルは、対照試料のＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルに対するものであり、対照試料は、拡張機能障害または拡張期心不全を有さないことが既知である被験体から得る。例示的な態様において、対照試料のＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルを１に設定し、被験体（試験試料、未知試料、非対照試料）のレベルを、対照試料と比べて表す。相対的レベルが１超であるとき、例えば、相対的レベルが１＋１標準偏差超であるとき、このような態様において、増加したレベルが決定される。
【００４５】
例示的な態様において、ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルを、別のタンパク質、例えば、ハウスキーピング遺伝子の遺伝子産物に対して正規化する。代わりの例示的な態様において、ＭｙＢＰ−Ｃのレベルは、ＭｙＢＰ−Ｃの１つまたは複数の断片のレベルに対して正規化したＭｙＢＰ−Ｃのレベルである。例示的な態様において、ＭｙＢＰ−Ｃのレベルは、［１４４ｋＤａのＭｙＢＰ−Ｃの濃度］：［ＭｙＢＰ−Ｃ断片の合計濃度］の比である。例示的な態様において、ＭｙＢＰ−ＣのレベルまたはＭｙＢＰ−Ｃ断片のレベルは、試料中のＭｙＢＰ−Ｃの総レベルに対して正規化する。本明細書において使用する場合、「ＭｙＢＰ−Ｃの総レベル」という用語は、翻訳後に修飾された完全長ＭｙＢＰ−Ｃのレベル、修飾されていない完全長ＭｙＢＰ−Ｃのレベル、全ての翻訳後に修飾されたＭｙＢＰ−Ｃ断片の合計レベル、および全ての修飾されていないＭｙＢＰ−Ｃ断片の合計レベルの合計を指す。例示的な態様において、ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態のレベルは、翻訳後修飾を含まないＭｙＢＰ−Ｃのレベルに対して正規化した翻訳後修飾を含むＭｙＢＰ−Ｃのレベルであるか、またはＭｙＢＰ−Ｃの総レベルに対して正規化した翻訳後修飾を含むＭｙＢＰ−Ｃのレベルである。さらに他の例示的な態様において、本発明の方法において決定するレベルは、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃの７５ｋＤａの断片のレベルと、インタクトなＳ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃタンパク質およびＳ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ断片の総レベルの比である。
【００４６】
ジメチルアルギニンに関する方法
本発明は、被験体において拡張機能障害または拡張期心不全を診断する方法を提供し、例示的な実施形態において、方法は、被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方のレベルを決定する工程を含む。例示的な態様において、方法は、ＡＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて増大し、かつＳＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて実質的に変化しないとき、またはＬ−アルギニンとＡＤＭＡの比が、対照比と比べて減少しているとき、拡張機能障害または拡張期心不全を診断する工程をさらに含む。特定の態様において、ＡＤＭＡのレベルが、０．６５μＭ超または約０．６５μＭであり、かつＳＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて実質的に変化しないとき、またはＬ−アルギニンとＡＤＭＡの比が、１７０未満であるとき、拡張機能障害または拡張期心不全が診断される。
【００４７】
例示的な態様において、発明性のある方法は、被験体において拡張機能障害を診断する方法であり、方法は、被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方のレベルを決定する工程を含む。例示的な態様において、方法は、ＡＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて増大し、かつＳＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて実質的に変化しないとき、またはＬ−アルギニンとＡＤＭＡの比が、対照比と比べて減少しているとき、拡張機能障害を診断する工程をさらに含む。特定の態様において、ＡＤＭＡのレベルが、０．６５μＭ超または約０．６５μＭであり、かつＳＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて実質的に変化しないとき、またはＬ−アルギニンとＡＤＭＡの比が、１７０未満であるとき、拡張機能障害が診断される。
【００４８】
代わりの例示的な態様において、発明性のある方法は、被験体において拡張期心不全を診断する方法であり、方法は、被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方のレベルを決定する工程を含む。例示的な態様において、方法は、ＡＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて増大し、かつＳＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて実質的に変化しないとき、またはＬ−アルギニンとＡＤＭＡの比が、対照比と比べて減少しているとき、拡張期心不全を診断する工程をさらに含む。特定の態様において、ＡＤＭＡのレベルが、０．６５μＭ超または約０．６５μＭであり、かつＳＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて実質的に変化しないとき、またはＬ−アルギニンとＡＤＭＡの比が、１７０未満であるとき、拡張期心不全が診断される。
【００４９】
本発明はまた、心不全を患っている被験体において拡張機能障害と収縮機能障害とを区別する方法を提供し、例示的な実施形態において、方法は、被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方のレベルを決定する工程を含む。例示的な態様において、方法は、拡張機能障害を収縮機能障害から区別し、方法は、ＡＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて増大し、かつＳＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて実質的に変化しないとき、またはＬ−アルギニンとＡＤＭＡの比が、対照比と比べて減少しているとき、拡張機能障害を患っている被験体として被験体を同定する。特定の態様において、被験体は、ＡＤＭＡのレベルが、０．６５μＭ超または約０．６５μＭであり、かつＳＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて実質的に変化しないとき、またはＬ−アルギニンとＡＤＭＡの比が、１７０未満であるとき、拡張機能障害を患っていると同定される。
【００５０】
本発明はさらに、被験体において心不全を拡張期心不全または収縮期心不全として特徴付ける方法を提供し、例示的な実施形態において、方法は、被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方のレベルを決定する工程を含む。例示的な態様において、方法は、ＡＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて増大し、かつＳＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて実質的に変化しないとき、またはＬ−アルギニンとＡＤＭＡの比が、対照比と比べて減少しているとき、被験体において心不全を拡張期心不全として特徴付ける工程を含む。例示的な態様において、方法は、Ｌ−アルギニンのレベルとＡＤＭＡのレベルの比が、心不全を患っていない被験体からのレベルと比べて低減しないとき、被験体において心不全を収縮期心不全と特徴付ける工程を含む。特定の態様において、ＡＤＭＡのレベルが、０．６５μＭ超または約０．６５μＭであり、かつＳＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて実質的に変化しないとき、またはＬ−アルギニンとＡＤＭＡの比が、１７０未満であるとき、心不全は、拡張期心不全と特徴付けられる。
【００５１】
本発明はさらに、拡張期心不全の処置について被験体の必要性を決定する方法を提供する。例示的な実施形態において、方法は、被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方のレベルを決定する工程を含む。ＡＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて増大し、かつＳＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて実質的に変化しないとき、またはＬ−アルギニンとＡＤＭＡの比が、対照比と比べて減少しているとき、被験体は、拡張期心不全についての処置を必要とすると決定される。特定の態様において、ＡＤＭＡのレベルが、０．６５μＭ超または約０．６５μＭであり、かつＳＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて実質的に変化しないとき、またはＬ−アルギニンとＡＤＭＡの比が、１７０未満であるとき、被験体は、拡張期心不全についての処置を必要とすると決定される。
【００５２】
本発明はさらに、拡張機能障害の処置についての被験体の必要性を決定する方法を提供する。例示的な実施形態において、方法は、被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方のレベルを決定する工程を含む。ＡＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて増大し、かつＳＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて実質的に変化しないとき、またはＬ−アルギニンとＡＤＭＡの比が、対照比と比べて減少しているとき、被験体は、拡張機能障害のための処置を必要とすると決定される。特定の態様において、ＡＤＭＡのレベルが、０．６５μＭ超または約０．６５μＭであり、かつＳＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて実質的に変化しないとき、またはＬ−アルギニンとＡＤＭＡの比が、１７０未満であるとき、被験体は、拡張機能障害のための処置を必要とすると決定される。
【００５３】
本発明はその上、拡張機能障害または拡張期心不全のリスクがある患者を同定する方法を提供する。例示的な実施形態において、方法は、被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方のレベルを決定する工程を含む。ＡＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて増大し、かつＳＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて変化しないとき、被験体は、拡張機能障害または拡張期心不全のリスクがある患者として同定される。代わりに、Ｌ−アルギニンのレベルとＡＤＭＡのレベルの比が、対照比と比べて減少しているとき、被験体は、拡張機能障害または拡張期心不全のリスクがある患者として同定される。特定の態様において、ＡＤＭＡのレベルが、０．６５μＭ超または約０．６５μＭであり、かつＳＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて実質的に変化しないとき、またはＬ−アルギニンとＡＤＭＡの比が、１７０未満であるとき、患者は、拡張機能障害または拡張期心不全のリスクがあると決定される。
【００５４】
本発明はさらに、拡張機能障害または拡張期心不全についての被験体のリスクを低減させる方法を提供する。例示的な実施形態において、方法は、（ｉ）被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方のレベルを決定する工程と、（ｉｉ）ＡＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて増大し、かつＳＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて変化しないとき、またはＬ−アルギニンのレベルとＡＤＭＡのレベルの比が、対照比と比べて減少しているとき、被験体に拡張機能障害または拡張期心不全の処置のための治療剤を投与する工程とを含む。特定の態様において、ＡＤＭＡのレベルが、０．６５μＭ超または約０．６５μＭであり、かつＳＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて実質的に変化しないとき、またはＬ−アルギニンとＡＤＭＡの比が、１７０未満であるとき、拡張機能障害または拡張期心不全の処置のための治療剤を被験体に投与する。
【００５５】
本発明は、拡張機能障害または拡張期心不全についての被験体のリスクをモニターする方法を提供する。例示的な態様において、方法は、（ｉ）被験体から得た生物学的試料中で第１の時点において、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）の第１のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方の第１のレベルを決定する工程と、（ｉｉ）被験体から得た生物学的試料中で第１の時点の後に起こる第２の時点において、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）の第２のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方の第２のレベルを決定する工程とを含み、ＡＤＭＡの第２のレベルが、ＡＤＭＡの第１のレベル超であり、かつＳＤＭＡの第２のレベルが、第１のレベルと比べて実質的に変化しないとき、またはＬ−アルギニンの第２のレベルとＡＤＭＡの第２のレベルの比が、Ｌ−アルギニンの第１のレベルとＡＤＭＡの第１のレベルの比未満であるとき、拡張機能障害または拡張期心不全についての被験体のリスクが増加する。
【００５６】
本発明はさらに、被験体において拡張機能障害または拡張期心不全を処置する能力について化合物をスクリーニングする方法を提供する。例示的な態様において、方法は、（ｉ）化合物の投与の前に被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）の第１のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方の第１のレベルを決定する工程と、（ｉｉ）化合物の投与の後に被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）の第２のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方の第２のレベルを決定する工程とを含み、化合物は、ＡＤＭＡの第２のレベルが、ＡＤＭＡの第１のレベル未満であり、かつＳＤＭＡの第２のレベルが、ＳＤＭＡの第１のレベルから実質的に変化しないとき、またはＬ−アルギニンの第２のレベルとＡＤＭＡの第２のレベルの比が、Ｌ−アルギニンの第１のレベルとＡＤＭＡの第１のレベルの比よりも大きいとき、拡張機能障害または拡張期心不全を処置することができる。特定の態様において、ＡＤＭＡの第１のレベルが、０．６５μＭ超または約０．６５μＭであり、かつＡＤＭＡの第２のレベルが、０．６５μＭ未満であり、かつＳＤＭＡの第２のレベルが、第１のレベルと比べて実質的に変化しないとき、化合物は、拡張機能障害または拡張期心不全を処置することができる。特定の態様において、Ｌ−アルギニンとＡＤＭＡの、Ｌ−アルギニンの第２のレベルとＡＤＭＡの第２のレベルの比が、１７０未満であり、かつＬ−アルギニンの第１のレベルとＡＤＭＡの第１のレベルの比が、１７０超であるとき、化合物は、拡張機能障害または拡張期心不全を処置することができる。
【００５７】
本発明はまた、被験体において拡張機能障害または拡張期心不全の処置の有効性を決定する方法を提供する。例示的な態様において、方法は、（ｉ）処置前の被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）の第１のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方の第１のレベルを決定する工程と、（ｉｉ）処置後の被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）の第２のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方の第２のレベルを決定する工程とを含み、処置は、ＡＤＭＡの第２のレベルが、ＡＤＭＡの第１のレベル未満であり、かつＳＤＭＡの第２のレベルが、ＳＤＭＡの第１のレベルから実質的に変化しないとき、またはＬ−アルギニンの第２のレベルとＡＤＭＡの第２のレベルの比が、Ｌ−アルギニンの第１のレベルとＡＤＭＡの第１のレベルの比よりも大きいとき、被験体において拡張機能障害または拡張期心不全を処置するのに有効である。特定の態様において、ＡＤＭＡの第１のレベルが、０．６５μＭ超または約０．６５μＭであり、かつＡＤＭＡの第２のレベルが、０．６５μＭ未満であり、かつＳＤＭＡの第２のレベルが、第１のレベルと比べて実質的に変化しないとき、化合物は、拡張機能障害または拡張期心不全を処置することができる。特定の態様において、ＡＤＭＡの第１のレベルが、０．６５μＭ超または約０．６５μＭであり、かつＡＤＭＡの第２のレベルが、０．６５μＭ未満であり、かつＳＤＭＡの第２のレベルが、第１のレベルと比べて実質的に変化しないとき、処置は被験体において拡張機能障害または拡張期心不全を処置するのに有効である。特定の態様において、Ｌ−アルギニンとＡＤＭＡの、Ｌ−アルギニンの第２のレベルとＡＤＭＡの第２のレベルの比が、１７０未満であり、かつＬ−アルギニンの第１のレベルとＡＤＭＡの第１のレベルの比が、１７０超であるとき、処置は有効である。
【００５８】
本発明はその上、心不全を患っている被験体を処置する方法を提供し、例示的な実施形態において、方法は、（ａ）被験体から得た生物学的試料中で、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方のレベルを決定する工程と、（ｂ）ＡＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて増大し、かつＳＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて実質的に変化しないとき、またはＬ−アルギニンとＡＤＭＡの比が、対照比と比べて減少しているとき、被験体に拡張機能障害または拡張期心不全の処置のための治療剤を投与する工程とを含む。特定の態様において、ＡＤＭＡのレベルが、０．６５μＭ超であり、かつＳＭＤＡのレベルが、対照と比べて実質的に変化しないとき、またはＬ−アルギニンとＡＤＭＡの比が、１７０未満であるとき、治療剤を被験体に投与する。
【００５９】
本発明はまた、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベル、ならびに（ａ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および／または（ｂ）Ｌ−アルギニンのいずれかまたは両方のレベルについてアッセイを受けた被験体を処置する方法を提供する。例示的な実施形態において、方法は、ＡＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて増大し、かつＳＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて実質的に変化しないとき、またはＬ−アルギニンとＡＤＭＡの比が、対照比と比べて減少しているとき、被験体に拡張機能障害または拡張期心不全の処置のための治療剤を投与する工程を含む。特定の態様において、ＡＤＭＡのレベルが、０．６５μＭ超であり、かつＳＭＤＡのレベルが、対照と比べて実質的に変化しないとき、またはＬ−アルギニンとＡＤＭＡの比が、１７０未満であるとき、治療剤を被験体に投与する。
【００６０】
発明性のある処置の方法に関して、当技術分野において公知の拡張機能障害または拡張期心不全の処置のための適切な治療剤（これらのいくつかは本明細書に記載されている）を使用し得る。拡張機能障害または拡張期心不全の処置のための治療剤と表題を付けられているサブセクションを参照されたい。例示的な態様において、治療は、ＢＨ４またはラノラジンである。
【００６１】
本明細書において使用する場合、「非対称性ジメチルアルギニン」または「ＡＤＭＡ」という用語は、２−アミノ−５−［（アミノ−ジメチルアミノメチレン）アミノ］ペンタン酸を指す。ＡＤＭＡは、一酸化窒素の産生においてＬ−アルギニンに干渉する血漿中に見出される天然の化学物質である。本明細書において使用する場合、「対称性ジメチルアルギニン」または「ＳＤＭＡ」という用語は、（２Ｓ）−２−アミノ−５−［（Ｎ，Ｎ’−ジメチルカルバムイミドイル）アミノ］ペンタン酸を指す。ＳＤＭＡは内因的に産生され、一酸化窒素シンターゼを阻害する。本明細書において使用する場合、「Ｌ−アルギニン」または「Ｌ−Ａｒｇ」は、化学名２−アミノ−５−グアニジノペンタン酸を有する必須アミノ酸を指す。
【００６２】
本明細書において使用する場合、「実質的に変化しない」という用語は、生物学的試料のＳＤＭＡのレベルが、対照レベルまたはコンパレーターレベルのＳＤＭＡのレベルと統計的に異ならないことを意味する。例示的な態様において、ＳＤＭＡのレベルは、１標準偏差±対照レベルまたはコンパレーターレベル以内である。例示的な態様において、ＳＤＭＡのレベルは、１０％以下±対照レベルまたはコンパレーターレベル以内である。例えば、対照レベルまたはコンパレーターレベルが１０である場合、対照レベルまたはコンパレーターレベルから実質的に未変化であるＳＤＭＡのレベルは、約９および約１１内のレベルである。
【００６３】
例示的な態様において、ＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、および／またはＬ−Ａｒｇのレベルは、絶対レベルである。代わりの態様において、ＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、および／またはＬ−Ａｒｇのレベルは、正規化されたまたは相対的レベルである。例示的な態様において、ＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、および／またはＬ−Ａｒｇのレベルは、対照試料のＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、および／またはＬ−Ａｒｇのレベルに対するものであり、対照試料は、拡張機能障害または拡張期心不全を有さないことが既知である被験体から得る。例示的な態様において、対照試料のＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、および／またはＬ−Ａｒｇのレベルを１に設定し、被験体（試験試料、未知試料、非対照試料）のレベルを、対照試料と比べて表す。相対的レベルが１超であるとき、例えば、相対的レベルが１＋１標準偏差超であるとき、このような態様において、増加したレベルが決定される。
【００６４】
分析物のレベル
発明性のある方法に関して、ＭｙＢＰ−Ｃ、ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態、ＭｙＢＰ−Ｃの断片、ＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、および／またはＬ−アルギニン（本明細書において「分析物」と集合的に称する）のレベル（複数可）は、当技術分野において公知の任意の適切な手段によって、生物学的試料中で決定し得る。
【００６５】
例示的な態様において、分析物のレベルを、生物学的試料からのレベルを測定することによって決定する。タンパク質のレベルを決定する適切な方法は当技術分野において公知であり、免疫測定（例えば、ウエスタンブロッティング、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定（ＲＩＡ）、および免疫組織化学アッセイ）を含む。
【００６６】
例えば、分析物のレベル（複数可）は、これらに限定されないが、免疫測定（例えば、放射免疫測定、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、免疫染色、免疫蛍光、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ、間接的ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ法）、磁気免疫測定など）を含めた任意の公知のタンパク質をベースとする検出法によって決定し得る。ＭｙＢＰ−Ｃ、グルタチオン、ＡＤＭＡ、およびＳＤＭＡに対する抗体は、ベンダー、例えば、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｍａｒｂｌｅｈｅａｄ、ＭＡ）、Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍ（Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）、およびＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から市販されている。例示的な実施形態において、ＭｙＢＰ−Ｃ、ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態、ＭｙＢＰ−Ｃの断片のレベル（複数可）を決定する工程において使用される抗体は、（ａ）Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ、（ｂ）ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープ（エピトープは、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、および／またはＣｙｓ７１９の１つまたは複数を含み、任意選択で、Ｃｙｓ残基は、Ｓ−グルタチオン付加されている）、あるいは（ｃ）ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、および／またはＣｙｓ７１９の１つまたは複数（Ｃｙｓ残基は、Ｓ−グルタチオン付加されている）に特異的に結合する、本明細書に記載されている発明性のある抗体である。例示的な態様において、決定ステップにおいて使用される抗体は、２つの結合パートナーの間に高親和性結合相互作用を有する結合パートナーにコンジュゲートした本発明の結合剤の１つである。例示的な態様において、決定ステップにおいて使用される抗体は、アビジンにコンジュゲートした本発明の結合剤の１つである。ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルは、例えば、免疫沈降、それに続くウエスタンブロッティングの組合せによって決定し得る。例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−ＣまたはＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された断片のレベルは、例えば、抗グルタチオン抗体、それに続くＭｙＢＰ−Ｃ特異的抗体による免疫沈降によって、または抗ＭｙＢＰ−Ｃ抗体、それに続くグルタチオン−特異的抗体による免疫沈降によって決定し得る。インタクトなＭｙＢＰ−Ｃおよび／またはＭｙＢＰ−Ｃ断片のレベルは、抗ＭｙＢＰ−Ｃ抗体による免疫沈降、それに続く免疫沈降物のゲル電気泳動およびこのように得られたゲルの染色によって決定し得る。ゲルのタンパク質染色のためのいくつかのキットは、ベンダー、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａから市販されている。
【００６７】
分析技術、例えば、質量分析法をまた使用して、生物学的試料中の分析物のレベルを決定し得る。ＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、およびＬ−アルギニンのレベルの決定のために利用されるタンデム質量分析法は、当技術分野で記載されている。例えば、Ｔａｎｇら、Ｅｕｒｏ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ、２９巻：２５０６〜２５１３頁（２００８年）を参照されたい。質量分析法をまた使用して、ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態、またはその断片のレベルを決定し得る。
【００６８】
例示的な代わりの態様において、レベルは、医療記録からのレベルを得ることによって決定する。例えば、レベルは、本発明の方法のステップが行われるときの前の時点において測定および記録されていてもよい。例示的な態様において、レベルは、本発明の方法のステップが行われる時点の前の６カ月以下で測定および記録したレベルを含有する被験体の医療記録から得る。例示的な態様において、レベルは、本発明の方法のステップが行われる時点の前５カ月以下または４カ月以下または３カ月以下または２カ月以下で測定および記録したレベルを含有する被験体の医療記録から得る。例示的な態様において、レベルは、本発明の方法のステップが行われる時点の前１カ月以下または３週間以下または２週間以下または１週間以下で測定および記録したレベルを含有する被験体の医療記録から得る。例示的な態様において、レベルのいくつかは、医療記録からのレベルを得ることによって決定し、いくつかは、測定する。例示的な態様において、レベルは、生物学的試料のレベルを測定すること、医療記録から得ることの両方によって決定する。分析物のレベルを医療記録からのレベルを得ることによって決定する例示的な態様において、方法はさらに、本明細書に記載のような生物学的試料からのレベル（複数可）を測定することによって、同じまたは異なる分析物のレベルを決定する工程を含む。
【００６９】
さらなるステップおよび態様
本明細書において提供する方法のいくつかの実施形態において、方法は、さらなるステップを含み、または本明細書において開示する工程の組合せを含む。いくつかの実施形態において、発明性のある方法のステップを、１回または複数回繰り返す。
【００７０】
例示的な態様において、方法は、ＭｙＢＰ−Ｃのレベル、およびＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃのレベルを決定する工程を含む。例示的な態様において、方法は、ＭｙＢＰ−Ｃ、およびＭｙＢＰ−Ｃの１つまたは複数の断片のレベルを決定する工程を含み、任意選択で、ＭｙＢＰ−Ｃおよび／またはＭｙＢＰ−Ｃの１つもしくは複数の断片は、Ｓ−グルタチオン付加されている。
【００７１】
例示的な態様において、方法は、ＢＮＰ、ＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、およびＬ−アルギニンの１つまたは複数のレベルを決定する工程と組み合わせた、ＭｙＢＰ−Ｃ、その翻訳後に修飾された形態、および／またはその断片のレベルを決定することの組合せを含む。例示的な態様において、方法はさらに、ＡＤＭＡおよびＬ−アルギニンのレベルを決定する工程を含む。例示的な態様において、方法はさらに、ＡＤＭＡおよびＳＤＭＡのレベルを決定する工程を含む。例示的な態様において、方法はさらに、ＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、およびＬ−アルギニンのレベルを決定する工程を含む。
【００７２】
例示的な態様において、方法は、１つまたは複数のさらなる診断ステップを含む。例示的な態様において、方法は、国際出願第ＷＯ／２０１１／０５６５７２号として２０１１年５月１２日に公開された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／５４０９６号（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている）において教示されているような、１つまたは複数の拡張機能障害のバイオマーカーの測定を含む。例えば、本明細書において提供する方法は、レニン、アンジオテンシンＩＩ、アルドステロン、アンジオテンシン−変換酵素（ＡＣＥ）、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、活性酸素種、グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）、酸化シスチン（ＣｙｓＳ）、脂質ペルオキシダーゼ、イソプロスタン、ニトリット、ニトレート、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤１（ＰＡＩ−１）、ジヒドロビオプテリン（ＢＨ２）、カップリングされていない一酸化窒素シンターゼ（ｓｙｎｔｈｓｅ）（カップリングされていないＮＯＳ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、システイン（Ｃｙｓ）、一酸化窒素（ＮＯ）、カップリングされている一酸化窒素シンターゼ（カップリングされているＮＯＳ）、テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）、Ｃｙｓ、ＤＲＯＭ、イソプロスタン、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシノーゲン、抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）、レプチン、レジスチン、または上記の２つ以上の組合せの測定を含み得る。
【００７３】
いくつかの実施形態において、方法は、左心室（ＬＶ）圧、容量、および／または壁の厚さを測定する工程を含む。いくつかの実施形態において、方法は、能動的弛緩（等容性ＬＶ圧およびＬＶ充満の速度）の過程を反映する計算、ならびに受動的スティフネス（心室腔コンプライアンスおよび心筋の粘弾性スティフネス）を反映する計算を行う工程を含む（Ｚｉｌｅら、（２０１０年）、前述）。
【００７４】
いくつかの実施形態において、方法は、Ｓｉｌｂｅｒｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１２１巻：５１９〜５２８頁（２０１０年）において記載されているような心エコー法を行う工程を含む。いくつかの態様において、ＬＶ組織ドップラーおよび僧帽弁流入速度を、心エコー法によって測定する。いくつかの態様において、方法は、組織ドップラーイメージング（ＴＤＩ）によって、初期拡張期速度（Ｅ’）より高い後期拡張期速度（Ａ’）についてアッセイを行う工程を含む。
【００７５】
代わりのまたはさらなる実施形態において、方法は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、心臓カテーテル、またはＬＶ拡張末期圧および収縮機能の測定を行う工程を含む。
【００７６】
いくつかの実施形態において、方法は、被験体をさらに特徴付けるさらなるステップを含む。例示的な態様において、方法は、被験体の肥満度指数（ＢＭＩ）を決定すること、身体検査を行うこと、胸部Ｘ線を行うこと、またはこれらの組合せを含む。
【００７７】
例示的な態様において、本発明の方法は、個人（例えば、そこから生物学的試料を得た被験体、医師、医療保険提供者など）に、ＭｙＢＰ−Ｃ、その翻訳後に修飾された形態、またはその断片、またはＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、またはＬ−アルギニンの決定されたレベルを通知するさらなるステップを含む。例示的な態様において、そこから生物学的試料を得た被験体の医師が通知を受け、医師は抗拡張期心不全または抗拡張機能障害剤を被験体に処方する。例示的な態様において、そこから生物学的試料を得た被験体が通知を受け、被験体は拡張機能障害もしくは拡張期心不全処置についてのリスクの定期的モニタリングのルーチンを開始し、かつ／または拡張期心不全もしくは拡張機能障害の処置を開始する。
【００７８】
例示的な態様において、発明性のあるシステム、コンピュータ可読ストレージ媒体、コンピュータ中のプロセッサ、キット、またはこれらの組合せ（これらのそれぞれは下記で記載する）によって実装される方法は、本発明の方法のいずれかにおいて利用し得る。例えば、拡張機能障害または拡張期心不全を診断する発明性のある方法の診断ステップは、発明性のあるシステム、コンピュータ可読ストレージ媒体、コンピュータ中のプロセッサによって実装される方法、キット、またはこれらの組合せの１つの使用によって達成し得る。
【００７９】
発明性のある方法の例示的な態様において、方法は、生物学的試料のＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片のレベルが、対照と比べて増大するとき、被験体に拡張期心不全または拡張機能障害の処置のための治療剤を投与する工程をさらに含む。ＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、および任意選択で、Ｌ−アルギニンのレベルを決定する工程を含む他の発明性のある方法の例示的な態様において、方法は、ＡＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて増大し、かつＳＤＭＡのレベルが、対照レベルと比べて変化しないとき、またはＬ−アルギニンのレベルとＡＤＭＡのレベルの比が、対照比と比べて減少しているとき、被験体に拡張期心不全または拡張機能障害の処置のための治療剤を投与する工程をさらに含む。拡張期心不全または拡張機能障害の処置のための適切な治療剤は、当技術分野において公知であり、これらのいくつかを下記に記載する。
【００８０】
拡張機能障害または拡張期心不全の処置のための治療剤
拡張機能障害を処置する、または拡張期心不全を処置するのに適した治療剤は、収縮機能障害または拡張期心不全の非存在下での拡張機能障害についての任意の標準医療でよい。いくつかの態様において、治療剤は、テトラヒドロビオプテリン、またはその誘導体、例えば、米国特許出願公開第２００８−００７５６６６Ａ１号に記載されているもののいずれかである。いくつかの態様において、治療剤は、被験体においてアディポネクチンのレベルを増加させる薬剤、例えば、本明細書に記載されているもののいずれかである。いくつかの態様において、治療剤は、同時係属中の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４８６５０号（その内容は参照によりその全体が組み込まれている）による心代謝性モディファイヤーである。したがって、治療剤は、いくつかの実施形態において、式Ｉの構造を含み、
【００８１】
【化１】
2014531605.tif 000003
【００８２】
式中、Ａは、１〜８個の原子の主鎖を含み、この各原子は、独立に、Ｃ、Ｏ、Ｎ、またはＳであり、この各原子は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）およびＳＨより選択されるさらなる基に任意選択で結合しており、
Ｒ１は、ＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキルであり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれは、独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、またはＣ１〜Ｃ８アルコキシであり、
Ｂは、Ｈであるか、または１〜８個の原子の主鎖を含み、この各原子は、独立に、Ｃ、Ｏ、Ｎ、またはＳであり、この各原子は、さらなる基に任意選択で結合しており、
Ｒ６は、存在せず、またはフェニルであり、フェニルは、１〜５個の基で任意選択で置換されており、この各基は、独立に、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、またはＯＨである。
【００８３】
本明細書において使用する場合、「アルキル」は、直鎖状および分岐状の飽和炭化水素基を指し、この非限定的例には、示した数の炭素原子を含有するメチル、エチル、ならびに直鎖状および分岐状プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、およびオクチル基が含まれる。Ｃｎという用語は、アルキル基が「ｎ」個の炭素原子を有することを意味する。例えば、Ｃ１〜Ｃ７アルキルは、全範囲を包含するいくつかの炭素原子（すなわち、１〜７個の炭素原子）、ならびに全ての部分群（例えば、１〜６個、２〜７個、１〜５個、３〜６個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、および７個の炭素原子）を有するアルキル基を指す。したがって、Ｃ１〜Ｃ８アルキルは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ７アルキル、またはＣ８アルキルでよく、この中で、プロピル、ブチル、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ７アルキル、またはＣ８アルキルは、直鎖アルキルまたは分岐状アルキルである。
【００８４】
本明細書において使用する場合、「アルコキシ」は、−ＯＲを指し、Ｒは、アルキル（例えば、直鎖または分岐鎖アルキル基）である。アルコキシ基の例には、これらに限定されないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔ−ブトキシなどが含まれる。したがって、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシは、メトキシ、エトキシ、Ｃ３アルコキシ、Ｃ４アルコキシ、Ｃ５アルコキシ、Ｃ６アルコキシ、Ｃ７アルコキシ、またはＣ８アルコキシでよく、この中で、Ｃ３アルコキシ、Ｃ４アルコキシ、Ｃ５アルコキシ、Ｃ６アルコキシ、Ｃ７アルコキシ、またはＣ８アルコキシは、直鎖アルコキシまたは分岐状アルコキシである。
【００８５】
本明細書において使用する場合、「ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）」は、ＨおよびＣ１〜Ｃ４アルキルの両方に結合している窒素を指す。
【００８６】
式Ｉに関して、Ａは、１〜８個の原子の主鎖を含み、この各原子は、独立に、Ｃ、Ｏ、Ｎ、またはＳである。いくつかの態様において、Ａは、Ｃ、Ｏ、Ｎ、およびＳより選択される単一の原子の主鎖を含む。いくつかの態様において、Ａは、２〜８個の原子（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個の原子）の主鎖を含み、この各原子は、独立に、Ｃ、Ｏ、Ｎ、またはＳである。
【００８７】
Ａの主鎖の各原子は、さらなる基に任意選択で結合している。いくつかの態様において、さらなる基は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）およびＳＨより選択される。いくつかの態様において、主鎖の全ての原子は、さらなる基に結合している。他の態様において、主鎖の１個または複数の（しかし全てではない）原子は、さらなる基に結合している。場合によっては、主鎖の１個の原子は、さらなる基に結合している。場合によっては、主鎖の２個、３個、４個、５個、６個、または７個の原子は、さらなる基に結合している。
【００８８】
いくつかの態様において、Ａは、（ＣＨ２）１〜８である。いくつかの態様において、Ａは、（ＣＨ２）１〜６である。いくつかの態様において、Ａは、（ＣＨ２）１〜４である。いくつかの態様において、Ａは、（ＣＨ２）１または（ＣＨ２）２である。いくつかの態様において、Ａは、（ＣＨ２）１である。
【００８９】
他の態様において、Ａは、式ＩＶの構造を含み、
【００９０】
【化２】
2014531605.tif 000004
【００９１】
式中、Ｒ７は、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、ＮＨ２、またはＮＨ（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）であり、Ｒ８は、ＯまたはＮＨである。いくつかの態様において、Ａが式ＩＶの構造を含むとき、Ｒ７は、ＯＨであり、Ｒ８は、ＯまたはＮＨである。いくつかの態様において、Ａが式ＩＶの構造を含むとき、Ｒ７は、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、ＮＨ２、またはＮＨ（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）であり、Ｒ８は、Ｏである。特定の態様において、Ａが式ＩＶの構造を含むとき、Ｒ７は、ＯＨであり、Ｒ８は、Ｏである。いくつかの態様において、Ａは、
【００９２】
【化３】
2014531605.tif 000005
【００９３】
を含む。
【００９４】
式Ｉに関して、Ｒ１は、ＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキルである。特定の態様において、Ｒ１は、ＣＨ３である。
【００９５】
式Ｉに関して、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれは、独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、またはＣ１〜Ｃ８アルコキシである。いくつかの態様において、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれは、独立に、Ｈまたはメトキシである。代わりの実施形態において、Ｒ２およびＲ３のそれぞれは、メトキシであり、Ｒ４およびＲ５のそれぞれは、Ｈである。
【００９６】
式Ｉに関して、Ｂは、Ｈであるか、または１〜８個の原子の主鎖を含み、この各原子は、独立に、Ｃ、Ｏ、Ｎ、またはＳである。いくつかの態様において、Ｂは、Ｃ、Ｏ、Ｎ、およびＳより選択される単一の原子の主鎖を含み、一方、他の態様において、Ｂは、２〜８個の原子（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個の原子）の主鎖を含み、この各原子は、Ｃ、Ｏ、Ｎ、およびＳから独立に選択される。
【００９７】
Ｂの主鎖の各原子は、さらなる基に任意選択で結合している。いくつかの態様において、さらなる基は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）およびＳＨより選択される。いくつかの態様において、主鎖の全ての原子は、さらなる基に結合している。他の態様において、主鎖の１個または複数の（しかし全てではない）原子は、さらなる基に結合している。場合によっては、主鎖の１個の原子は、さらなる基に結合している。場合によっては、主鎖の２個、３個、４個、５個、６個、または７個の原子は、さらなる基に結合している。
【００９８】
いくつかの実施形態において、Ｂは、Ｈを含み、Ｒ６は、存在しない。代わりの実施形態において、Ｂは、式Ｖの構造を含み、
【００９９】
【化４】
2014531605.tif 000006
【０１００】
式中、Ｒ９は、ＮＨまたはＯである。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、Ｂが、式Ｖの構造を含むとき、Ｒ９は、ＮＨである。さらなる態様において、Ｂは、
【０１０２】
【化５】
2014531605.tif 000007
【０１０３】
の構造を含む。
【０１０４】
式Ｉに関して、Ｒ６は、存在せず、またはフェニルであり、フェニルは、１〜５個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個）の基で任意選択で置換されており、この各基は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、およびＯＨから独立に選択される。いくつかの態様において、Ｒ６は、存在しない。代わりの態様において、Ｒ６が存在し、１〜５個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個）のメチル基で置換されているフェニルを含むとき。特定の態様において、Ｒ６は、２個のメチル基（オルト位のそれぞれに１個）で置換されているフェニルを含む。
【０１０５】
いくつかの態様において、心代謝性モディファイヤーは、式ＩＩの化合物、または薬学的に許容されるその塩もしくはそのコンジュゲートを含み、
【０１０６】
【化６】
2014531605.tif 000008
【０１０７】
式中、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１３のそれぞれは、独立に、Ｃ１〜Ｃ３アルキルであり、
Ｘは、ＮＨまたはＯであり、
Ｒ１２は、ＯＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルである。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、式ＩＩの化合物は、下記の構造を含む。
【０１０９】
【化７】
2014531605.tif 000009
【０１１０】
いくつかの態様において、式ＩＩの化合物は、ラノラジン、またはラノラジンの薬学的に許容される塩もしくはコンジュゲートである。
【０１１１】
いくつかの態様において、心代謝性モディファイヤーは、式ＩＩＩの化合物、または薬学的に許容されるその塩もしくはそのコンジュゲートであり、
【０１１２】
【化８】
2014531605.tif 000010
【０１１３】
式中、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、およびＲ１７のそれぞれは、独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルである。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、式ＩＩの化合物は、下記の構造を含む。
【０１１５】
【化９】
2014531605.tif 000011
【０１１６】
いくつかの態様において、式ＩＩＩの化合物は、トリメタジジン、またはトリメタジジンの薬学的に許容される塩もしくはコンジュゲートである。
【０１１７】
処置および予防
「処置する」および「予防する」という用語、ならびにそこに起因する語は、本明細書において使用する場合、１００％または完全な処置または予防を必ずしも意味しない。むしろ、当業者が潜在的な利点または治療効果を有すると認識する、変化する程度の処置または予防が存在する。この点において、発明性のある方法は、哺乳動物において任意の量の任意のレベルの拡張機能障害または心不全の処置または予防を実現することができる。さらに、発明性のある方法によって実現される処置または予防は、処置または予防される疾患、例えば、がんの１つまたは複数の状態または症状の処置または予防を含むことができる。また、本明細書における目的のために、「予防」は、疾患、またはその症状もしくは状態の発症を遅延させることを包含することができる。
【０１１８】
生物学的試料
本明細書において開示されている方法に関して、いくつかの実施形態において、生物学的試料は、これらに限定されないが、被験体から得た全血、またはその画分（例えば、血漿、血清）、リンパ、母乳、唾液、粘膜、精液、膣分泌物、細胞抽出物、炎症液、脳脊髄液、糞便、硝子体液、または尿を含めた体液を含む。いくつかの態様において、試料は、上記の試料の少なくとも２つの複合パネルである。いくつかの態様において、試料は、血液試料、血漿試料、血清試料、および尿試料の少なくとも２つの複合パネルである。例示的な態様において、生物学的試料は、血漿である。
【０１１９】
被験体
本発明のいくつかの実施形態において、被験体は、これらに限定されないが、齧歯目の哺乳動物、例えば、マウスおよびハムスター、ならびにウサギ目の哺乳動物、例えば、ウサギ、食肉目からの哺乳動物（猫（ネコ）および犬（イヌ）を含めた）、偶蹄目からの哺乳動物（牛（ウシ）および豚（ブタ）を含めた）、または奇蹄目の哺乳動物（馬（ウマ）を含めた）を含めた哺乳動物である。いくつかの態様において、哺乳動物は、霊長目、オマキザル、もしくはシモイド（サル）、または真猿目（ヒトおよび類人猿）である。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。特定の態様において、ヒトは、雄のヒトである。さらなるまたは代わりの態様において、ヒトは、約２９以上のＢＭＩを有する。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、被験体は、拡張機能障害の徴候もしくは症状を示し、または提示する。例示的な実施形態において、被験体は、約４５％以上、例えば、約５０％以上、例えば、５０〜７５％である駆出分画を示す。
【０１２１】
いくつかの態様において、被験体は、収縮機能障害の存在下で拡張機能障害を患っている。いくつかの態様において、被験体は、収縮機能障害の非存在下で拡張機能障害を患っている。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、被験体は、心不全の徴候もしくは症状を示し、または提示する。いくつかの態様において、心不全の徴候または症状は、本明細書の上記に記載されているものの１つである。心不全と表題を付けられているセクションを参照されたい。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、被験体は、心不全、例えば、拡張期心不全、本明細書に記載されている心不全のタイプのいずれかを患っている。心不全と表題を付けられているセクションを参照されたい。例示的な態様において、被験体は、心筋梗塞を患っていない。例示的な態様において、被験体は、収縮機能障害または収縮期心不全を患っていない。
【０１２４】
例示的な態様において、被験体は、息切れを患っている。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、被験体は、高血圧を患っている。高血圧は、全身動脈圧が上昇している慢性の医学的状態である。高血圧は、いくつかの実施形態において、医学的原因が見出されない原発性高血圧として分類される。いくつかの実施形態において、高血圧は、腎臓、動脈、心臓、または内分泌系に影響を与える別の状態によってもたらされる二次性高血圧である。
【０１２６】
個人の年齢にしては受け入れられている正常値より高い収縮期または拡張期血圧の測定値は、前高血圧または高血圧と分類される。
【０１２７】
【表１−２】
2014531605.tif 000012
【０１２８】
高血圧は、高血圧ステージＩ、高血圧ステージＩＩ、および孤立性収縮期高血圧を含めたいくつかのサブ分類を有する。孤立性収縮期高血圧は、正常な拡張期血圧を伴う上昇した収縮期血圧を指し、高齢者において一般である。これらの分類は、２回以上の来院において取った患者の安静時血圧の読取り値を平均した後で行われる。５０歳超の個人は、これらの血圧が一貫して少なくとも収縮期に１４０ｍｍＨｇまたは拡張期に９０ｍｍＨｇである場合、高血圧を有すると分類される。真性糖尿病または腎臓疾患が付随して存在する１３０／８０ｍｍＨｇより高い血圧を有する患者は、さらなる処置を必要とする（Ｃｈｏｂａｎｉａｎら（２００３年１２月）、「Ｓｅｖｅｎｔｈ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ」、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、４２巻（６号）：１２０６〜５２頁。）
いくつかの態様において、被験体は、代謝性疾患または代謝症候群を患っている。代謝症候群（代謝症候群Ｘとしてまた公知である）、インスリン抵抗性症候群またはレブン症候群（Ｒｅａｖｅｎ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）は、５千万人超の米国人に影響を与えている障害である。代謝症候群は典型的には、下記の危険因子の少なくとも３つ以上のクラスター化によって特徴付けられる。（１）腹部肥満（腹部中および腹部の周りの過剰な脂肪組織）、（２）アテローム生成的異脂肪血症（動脈壁へのプラークの蓄積を増強させる、高トリグリセリド、低ＨＤＬコレステロールおよび高ＬＤＬコレステロールを含めた血中脂肪障害）、（３）血圧上昇、（４）インスリン抵抗性またはグルコース不耐性、（５）プロトロンビンの状況（例えば、血液中の高フィブリノゲンまたはプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−１）、ならびに（６）炎症誘発性状況（例えば、血液中の上昇したＣ反応性タンパク質）。他の危険因子は、加齢、ホルモンの不均衡および遺伝的素因を含み得る。
【０１２９】
代謝症候群は、冠動脈心疾患、および血管のプラークの蓄積と関連する他の障害、例えば、脳卒中および末梢血管疾患（アテローム動脈硬化性心血管疾患（ＡＳＣＶＤ）と称される）のリスクの増加と関連する。代謝症候群を有する患者は、その初期ステージのインスリン抵抗性状況から、ＡＳＣＶＤのリスクがさらに増加した本格的なＩＩ型糖尿病へと進行し得る。任意の特定な理論に縛られることを意図するものではないが、インスリン抵抗性、代謝症候群および血管性疾患の間の関係は、損なわれたインスリン刺激血管拡張、増強された酸化ストレスによるインスリン抵抗性が関連するＮＯ利用可能性の低減、および脂肪細胞由来ホルモン、例えば、アディポネクチンの異常を含めた１つまたは複数の併行的な発症機序が関与し得る（ＬｔｅｉｆおよびＭａｔｈｅｒ、Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０巻（ｓｕｐｐｌ．  Ｂ）：６６Ｂ〜７６Ｂ頁（２００４年））。
【０１３０】
２００１  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ａｄｕｌｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｐａｎｅｌ（ＡＴＰＩＩＩ）によると、同じ個人における下記の特質の任意の３つは、代謝症候群についての基準に合致する。（ａ）腹部肥満（男性において１０２ｃｍ超の胴囲、および女性において８８ｃｍ超の胴囲）；（ｂ）血清トリグリセリド（１５０ｍｇ／ｄｌ以上）；（ｃ）ＨＤＬコレステロール（男性において４０ｍｇ／ｄｌ以下、および女性において５０ｍｇ／ｄｌ以下）；（ｄ）血圧（１３０／８５以上）；ならびに（ｅ）空腹時血中グルコース（１１０ｍｇ／ｄｌ以上）。世界保健機構（ＷＨＯ）によると、下記の基準の少なくとも２つと共に高インスリン値（上昇した空腹時血中グルコースまたは上昇した食事後グルコース単独）を有する個人は、代謝症候群についての基準に合致する。（ａ）腹部肥満（０．９超のウエストヒップ比、少なくとも３０ｋｇ／ｍ２の肥満度指数、または３７インチ超のウエスト測定値）；（ｂ）少なくとも１５０ｍｇ／ｄｌのトリグリセリドレベル、または３５ｍｇ／ｄｌ未満のＨＤＬコレステロールを示すコレステロールパネル；（ｃ）１４０／９０以上の血圧、または高血圧。（Ｍａｔｈｕｒ、Ｒｕｃｈｉ、「Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ」、編Ｓｈｉｅｌ，  Ｊｒ．、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｃ．、ＭｅｄｉｃｉｎｅＮｅｔ．ｃｏｍ、２００９年５月１１日）。
【０１３１】
本明細書における目的のために、個人が２００１  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ａｄｕｌｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ＰａｎｅｌまたはＷＨＯによって記載された基準のいずれかまたは両方の基準に合致する場合、その個人は代謝症候群に苦しんでいると考えられる。
【０１３２】
本発明の方法に関して、いくつかの実施形態において、被験体は、糖尿病もしくは肥満症を患っており、または糖尿病および肥満症の両方を患っている。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、被験体は、発明性のある方法によって処置または予防または診断される拡張機能障害または心不全以外の心臓傷害または器質的心疾患を患っていない。「心臓傷害」とは、細胞外空間中への損失、または検出可能なレベルの生物活性のある細胞質タンパク質および構造タンパク質（例えば、トロポニン、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、心臓型脂肪酸結合タンパク質、乳酸デヒドロゲナーゼ）を含めた細胞内の構成要素への損失をもたらす、正常な心筋細胞膜の完全性の撹乱を意味する。「器質的心疾患」とは、心筋に影響を与え、または心臓の構造を変化させる任意の疾患を意味する。いくつかの態様において、被験体は、虚血性心疾患、慢性安定狭心症、慢性狭心症を患っていない。いくつかの態様において、被験体は、虚血、虚血再灌流または冠動脈閉塞−再灌流、虚血性心疾患、心筋傷害、心筋毒性、心筋梗塞、先天性の心臓病変、弁膜狭窄または弁膜逆流、冠動脈疾患、慢性狭心症、慢性安定狭心症、不整脈を患っていない。いくつかの態様において、被験体は、心筋外傷、心筋毒性、ウイルス感染、栄養素の欠乏を患っていない。いくつかの態様において、被験体は、心筋炎を患っていない。
【０１３４】
本明細書において提供する処置の方法に関して、いくつかの実施形態において、被験体は、それを必要としている被験体である。いくつかの態様において、被験体は、拡張機能障害、例えば、本明細書において「拡張機能障害」と表題を付けられて記載されているセクションにおいて記載されている拡張機能障害の形態のいずれかを患っている被験体である。いくつかの態様において、被験体は、心不全、例えば、拡張期心不全、保全された駆出分画を伴う心不全、本明細書において「心不全」と表題を付けられて記載されているセクションにおいて記載されている心不全のタイプのいずれかを患っている被験体である。
【０１３５】
対照レベル
本発明の方法に関して、被験体から得た生物学的試料の分析物（ＭｙＢＰ−Ｃ、その翻訳後に修飾された形態またはその断片、ＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、および／またはＬ−アルギニン）のレベルを、１つまたは複数の対照レベルと比較する。例示的な態様において、対照レベルは、同じ分析物（複数可）のレベルであるが、これは、対照被験体から得た生物学的試料のレベルである。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、対照被験体は、同じ種、性別、民族性、年齢群、喫煙実態、ＢＭＩ、現在の治療レジメンの実態、病歴、またはこれらの組合せの対応対照であるが、対照は拡張機能障害を患っていないという点で診断される被験体とは異なる。いくつかの実施形態において、対照被験体は、同じ種、性別、民族性、年齢群、喫煙実態、ＢＭＩ、現在の治療レジメンの実態、病歴、またはこれらの組合せの対応対照であるが、対照被験体は拡張機能障害も収縮機能障害も患っていないという点で診断される被験体とは異なる。代わりの態様において、対照被験体は、同じ種、性別、民族性、年齢群、喫煙実態、ＢＭＩ、現在の治療レジメンの実態、病歴、またはこれらの組合せの対応対照であるが、対照は拡張機能障害を患っていないが、収縮機能障害を患っているという点で診断される被験体とは異なる。代わりの態様において、対照被験体は、同じ種、性別、民族性、年齢群、喫煙実態、ＢＭＩ、現在の治療レジメンの実態、病歴、またはこれらの組合せの対応対照であるが、対照は収縮機能障害を患っていないが、拡張機能障害を患っているという点で診断される被験体とは異なる。代わりの態様において、対照被験体は、同じ種、性別、民族性、年齢群、喫煙実態、ＢＭＩ、現在の治療レジメンの実態、病歴、またはこれらの組合せの対応対照であるが、対照は心不全を患っていないという点で診断される被験体とは異なる。
【０１３７】
心不全のタイプを診断する方法に関して、診断される被験体が心不全を患っている被験体であるとき、対照被験体は、いくつかの実施形態において、心不全を患っている対照被験体である。いくつかの態様において、対照被験体は、収縮期心不全または低減した駆出分画を有する心不全を患っている。代わりの態様において、対照被験体は、心不全を患っていない。
【０１３８】
本発明の発明性のある方法に関して、対照レベルは、例示的な態様において、他に示さない限り、心不全を患っていない患者における分析物のレベルである。
【０１３９】
いくつかの態様において、ＡＤＭＡの対照レベルは、生物学的試料が血漿であるとき、０．６５μＭ未満であるレベルであり、この数を超える血漿中のＡＤＭＡのレベルは、拡張機能障害もしくは拡張期心不全の状況、またはそのリスクと考えられる。いくつかの態様において、Ｌ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｇ）とＡＤＭＡの対照比は、１７０超である比であり、１７０未満のＬ−Ａｒｇ：ＡＤＭＡの比は、拡張機能障害もしくは拡張期心不全の状況、またはそのリスクと考えられる。
【０１４０】
対照レベルと比べて、決定される分析物のレベルは、増加したレベルでよい。本明細書において使用する場合、「増加した」という用語は、レベルに関して、対照レベルを超える任意の増加％を指す。増加したレベルは、対照レベルと比べて、少なくとも５％または約５％の増加、少なくとも１０％または約１０％の増加、少なくとも１５％または約１５％の増加、少なくとも２０％または約２０％の増加、少なくとも２５％または約２５％の増加、少なくとも３０％または約３０％の増加、少なくとも３５％または約３５％の増加、少なくとも４０％または約４０％の増加、少なくとも４５％または約４５％の増加、少なくとも５０％または約５０％の増加、少なくとも５５％または約５５％の増加、少なくとも６０％または約６０％の増加、少なくとも６５％または約６５％の増加、少なくとも７０％または約７０％の増加、少なくとも７５％または約７５％の増加、少なくとも８０％または約８０％の増加、少なくとも８５％または約８５％の増加、少なくとも９０％または約９０％の増加、少なくとも９５％または約９５％の増加でよい。例示的な態様において、増加したレベルは、対照レベルを超える少なくとも５０％の増加である。増加したレベルは、対照レベルと比べた、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、６．０倍、７．０倍、８．０倍、９．０倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍またはそれを超える増加でよい。
【０１４１】
対照レベルと比べて、決定されるレベルは、減少したレベルであり得る。本明細書において使用する場合、「減少した」という用語は、レベル（例えば、発現レベル、生物活性レベル）に関して、対照レベル未満の任意の減少％を指す。減少したレベルは、対照レベルと比べて、少なくとも５％または約５％の減少、少なくとも１０％または約１０％の減少、少なくとも１５％または約１５％の減少、少なくとも２０％または約２０％の減少、少なくとも２５％または約２５％の減少、少なくとも３０％または約３０％の減少、少なくとも３５％または約３５％の減少、少なくとも４０％または約４０％の減少、少なくとも４５％または約４５％の減少、少なくとも５０％または約５０％の減少、少なくとも５５％または約５５％の減少、少なくとも６０％または約６０％の減少、少なくとも６５％または約６５％の減少、少なくとも７０％または約７０％の減少、少なくとも７５％または約７５％の減少、少なくとも８０％または約８０％の減少、少なくとも８５％または約８５％の減少、少なくとも９０％または約９０％の減少、少なくとも９５％または約９５％の減少でよい。例示的な態様において、減少したレベルは、対照レベル未満の少なくとも５０％の減少である。減少したレベルは、対照レベルと比べて、１．１分の１、１．２分の１、１．３分の１、１．４分の１、１．５分の１、１．６分の１、１．７分の１、２．０分の１、２．５分の１、３．０分の１、３．５分の１、４．０分の１、４．５分の１、５．０分の１、６．０分の１、７．０分の１、８．０分の１、９．０分の１、１０分の１、１５分の１、２０分の１、３０分の１、４０分の１、５０分の１またはそれを超える減少でよい。
【０１４２】
例示的な態様において、生物学的試料のＬ−アルギニンのレベルと生物学的試料のＡＤＭＡのレベルの比は、対照レベルと比べて減少する。例示的な態様において、比は、対照レベル未満の少なくとも５０％の減少である。
【０１４３】
抗体および他の結合剤
発明性のある方法において有用な単離された結合剤をまた、本明細書において提供する。例示的な実施形態において、単離された結合剤は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃに特異的に結合する。例示的な態様において、ＭｙＢＰ−Ｃは、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、および／またはＣｙｓ７１９の１つまたは複数においてＳ−グルタチオン付加されている。例示的な態様において、ＭｙＢＰ−Ｃは、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ４７５、６２３、および／または６５１の１つまたは複数においてＳ−グルタチオン付加されている。例示的な態様において、結合剤は、１つまたは複数のＳ−グルタチオン付加されたＣｙｓ残基を欠いているＭｙＢＰ−Ｃに結合しない。例示的な態様において、結合剤は、Ｓ−グルタチオン付加されていないＭｙＢＰ−Ｃに結合しない。例示的な態様において、Ｃｙｓ残基がＳ−グルタチオン付加されていないとき、結合剤は、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、Ｃｙｓ７１９の１つまたは複数に結合しない。例示的な態様において、Ｃｙｓ残基がＳ−グルタチオン付加されていないとき、結合剤は、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ６２３、および／またはＣｙｓ６５１の１つまたは複数に結合しない。
【０１４４】
例示的な実施形態において、単離された結合剤は、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープに特異的に結合し、エピトープは、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、Ｃｙｓ７１９の１つまたは複数を含む。例示的な態様において、エピトープは、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ６２３、および／またはＣｙｓ６５１の１つまたは複数を含む。例示的な態様において、１つまたは複数のＣｙｓ残基は、Ｓ−グルタチオン付加されている。例示的な態様において、１つまたは複数のＣｙｓ残基がＳ−グルタチオン付加されていないとき、結合剤は、１つまたは複数のＣｙｓ残基に結合しない。代わりの態様において、１つまたは複数のＣｙｓ残基は、Ｓ−グルタチオン付加されておらず、Ｃｙｓ残基がＳ−グルタチオン付加されていないときのみ、結合剤は１つまたは複数のＣｙｓ残基に結合する。
【０１４５】
例示的な実施形態において、単離された結合剤は、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基に特異的に結合し、Ｃｙｓ残基は、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、Ｃｙｓ７１９である。例示的な態様において、Ｃｙｓ残基は、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ６２３、および／またはＣｙｓ６５１である。例示的な態様において、Ｃｙｓ残基は、Ｓ−グルタチオン付加されている。例示的な態様において、Ｃｙｓ残基がＳ−グルタチオン付加されていないとき、結合剤は、Ｃｙｓ残基に結合しない。代わりの態様において、Ｃｙｓ残基は、Ｓ−グルタチオン付加されておらず、Ｃｙｓ残基がＳ−グルタチオン付加されていないときのみ、結合剤はＣｙｓ残基に結合する。
【０１４６】
本明細書において使用する場合、「結合剤」という用語は、共有結合または非共有結合によって互いに（直接的または間接的に）関連する１つまたは複数の結合ユニットを含む分子を指す。本明細書において使用する場合、「結合ユニット」という用語は、ＭｙＢＰ−Ｃ、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープに特異的に結合する結合剤のポーションを指す。例示的な態様において、結合ユニットは、高親和性を伴って結合する。「高親和性」という用語は、哺乳動物、例えば、臨床検査用動物、飼い慣らされた家畜もしくはペット動物、またはヒトにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの、ＭｙＢＰ−Ｃ、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープに対する結合剤の相対的親和性に関連して、生理学的文脈において使用される。特定の実施形態において、結合ユニットは、ナノモル未満（例えば、ピコモル）、ナノモル範囲、またはマイクロモル範囲である、ＭｙＢＰ−Ｃ、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープについての解離定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態において、ＫＤは、約０．０００１ｎＭ〜約１００ｎＭである。いくつかの実施形態において、ＫＤは、少なくとも０．０００１ｎＭもしくは約０．０００１ｎＭ、少なくとも０．００１ｎＭもしくは約０．００１ｎＭ、少なくとも０．０１ｎＭもしくは約０．０１ｎＭ、少なくとも０．１ｎＭまたは約０．１ｎＭ、少なくとも１ｎＭもしくは約１ｎＭ、または少なくとも１０ｎＭもしくは約１０ｎＭである。いくつかの実施形態において、ＫＤは、１００ｎＭ以下もしくは約１００ｎＭ、７５ｎＭ以下もしくは約７５ｎＭ、５０ｎＭ以下もしくは約５０ｎＭ、または２５ｎＭ以下もしくは約２５ｎＭである。
【０１４７】
特定の態様において、結合剤の各結合ユニットまたは結合ユニットの少なくとも１つは、少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチドを含む。他の態様において、結合ユニットは、共有結合的または非共有結合的に一緒に接合している複数のペプチドまたはポリペプチドを含む。特定の態様において、結合剤が少なくとも１つの抗体、またはその抗原結合断片を含むように、結合ユニットは、少なくとも１つの抗体、またはその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態において、結合剤は、複数の結合ユニットを含み、特定の態様において、結合剤の結合ユニットのいくつかまたは全ては、抗体、またはその抗原結合断片である。このような実施形態のさらなる記載は、本明細書に記載されている。例えば、抗体および抗原結合断片と表題を付けられているセクションを参照されたい。
【０１４８】
特定の態様において、結合剤は、抗体またはその抗原結合断片を含むポリペプチドではない１つまたは複数の結合ユニットを含む。いくつかの実施形態において、結合剤は、抗体またはその抗原結合断片ではない少なくとも１つの結合ユニットを含む。代わりの実施形態において、結合ユニットは、ペプチドでもなく、ポリペプチドでもない。例示的な特定の態様において、結合ユニットは、有機小分子、アプタマー、およびこれらの組合せの１つまたは複数を含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、結合ユニット（例えば、ペプチド、ポリペプチド、またはその他）は、リンカーの非存在下で一緒に直接接合している。代わりの態様において、結合剤の結合ユニットは、１つまたは複数のリンカーを介して間接的に接続している。直接的に一緒に接合していようと、またはリンカーを通して間接的に接合していようと、結合ユニットは、共有結合（例えば、ペプチド、エステル、アミド、もしくはスルフヒドリル結合）、または非共有結合（例えば、疎水的相互作用、水素結合、ファンデルワールス結合、静電気的もしくはイオン相互作用を介した）、またはこれらの組合せによって接続し得る。結合ユニットは、これらに限定されないが、本明細書において第２の部分への結合剤のコンジュゲーションに関して教示されたもののいずれかを含めた当技術分野において公知の任意の手段を介して接続し得る。
【０１５０】
抗体およびその抗原結合断片
本発明のいくつかの態様において、結合剤は、本明細書における開示による、ＭｙＢＰ−Ｃ、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープに特異的に結合する、抗体、またはその抗原結合断片である。抗体は、当技術分野において公知の任意のタイプの免疫グロブリンでよい。例えば、抗体は、任意のアイソタイプのもの、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどでよい。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルでよい。抗体は、天然抗体、例えば、哺乳動物、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター、ヒトなどから単離および／または精製した抗体でよい。これに関しては、抗体は、哺乳動物または鳥の抗体、例えば、マウス抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ウマ抗体、ニワトリ抗体、ハムスター抗体、ヒト抗体などとして考えてもよい。「単離した」という用語は、本明細書において使用する場合、その自然環境から取り出されたことを意味する。「精製した」という用語は、本明細書において使用する場合、未変性または自然環境中の分子または化合物と通常関連する汚染物質が実質的に非含有である形態での分子または化合物の単離に関し、当初の組成物の他の成分から分離された結果として純度が増加していることを意味する。「純度」は相対的用語であり、絶対的純度または絶対的濃縮または絶対的選択と必ずしも解釈されないことが認識される。いくつかの態様において、純度は、少なくとも５０％もしくは約５０％、少なくとも６０％もしくは約６０％、少なくとも７０％もしくは約７０％、少なくとも８０％もしくは約８０％、または少なくとも９０％もしくは約９０％、例えば、少なくとも９１％もしくは約９１％、少なくとも９２％もしくは約９２％、少なくとも９３％もしくは約９３％、少なくとも９４％もしくは約９４％、少なくとも９５％もしくは約９５％、少なくとも９６％もしくは約９６％、少なくとも９７％もしくは約９７％、少なくとも９８％もしくは約９８％、少なくとも９９％もしくは約９９％であるか、または概ね１００％である。
【０１５１】
抗体は、ＭｙＢＰ−Ｃ、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープについての任意のレベルの親和性またはアビディティーを有することができる。解離定数（ＫＤ）は、結合ユニットに関して、本明細書に記載されているそれらの例示的な解離定数のいずれかでよい。解離定数を含めた結合定数は、例えば、表面プラズモン共鳴の原理を利用する方法、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムを利用する方法を含めて当技術分野において公知の方法によって決定し得る。上記によると、いくつかの実施形態において、抗体は、モノマー形態であり、一方他の実施形態において、抗体は、ポリマー形態である。抗体が２つ以上の別個の抗原結合領域断片を含む特定の実施形態において、抗体は、結合剤によって認識および結合される別個のエピトープの数によって、二重特異性、三重特異性もしくは多重特異性、または二価、三価もしくは多価と考えられる。
【０１５２】
結合剤が、ＭｙＢＰ−Ｃ、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープと、結合パートナーとの間の相互作用を低減させる場合、いくつかの実施形態において、抗体は、遮断抗体または中和抗体と考えられる。いくつかの態様において、結合剤のＫＤは、ＭｙＢＰ−Ｃ、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープの結合パートナーのＫＤとほぼ同じである。いくつかの態様において、結合剤のＫＤは、ＭｙＢＰ−Ｃ、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープの結合パートナーのＫＤより低い（例えば、少なくとも０．５分の１低い、少なくとも１分の１低い、少なくとも２分の１低い、少なくとも５分の１低い、少なくとも１０分の１低い、少なくとも２５分の１低い、少なくとも５０分の１低い、少なくとも７５分の１低い、少なくとも１００分の１低い）。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、抗体は、遺伝的に改変された抗体、例えば、単鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体；ＭｙＢＰ−Ｃ、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープなどに対して特異的なＣＤＲ配列のポーションを含む抗体；ヒューマニア化抗体、二重特異性抗体、三重特異的抗体でよい。遺伝子工学技術はまた、非ヒト源において完全ヒト抗体を作製する能力を実現する。
【０１５４】
いくつかの態様において、抗体は、キメラ抗体である。「キメラ抗体」という用語は、本明細書において、１つの種からの定常ドメインおよび第２の種からの可変ドメインを含有するか、またはより一般に、少なくとも２つの種からの一続きのアミノ酸配列を含有する抗体を指すために使用される。
【０１５５】
いくつかの態様において、抗体は、ヒト化抗体である。「ヒト化」という用語は、抗体と関連して使用されるとき、本来の源の抗体より真のヒト抗体により類似した構造および免疫学的機能を有するように改変された、少なくとも非ヒト源からのＣＤＲ領域を有する抗体を指すために使用される。例えば、ヒト化は、非ヒト抗体、例えば、マウス抗体から、ヒト抗体中にＣＤＲをグラフトすることを伴うことができる。ヒト化することはまた、非ヒト配列をよりヒト配列のように見えるようにするためのアミノ酸置換を選択することが関与し得る。
【０１５６】
「キメラまたはヒト化」という用語の使用は、本明細書において、相互排他的であることを意味せず、むしろ、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびさらにヒト化されてきたキメラ抗体を包含することを意味する。文脈が他に示す場合を除いて、本発明のキメラ抗体（の特性、使用、試験など）についての記述は、本開示のヒト化抗体に適用され、本開示のヒト化抗体についての記述はまた、キメラ抗体に関する。同様に、文脈が指示する場合を除いて、このような記述はまた、抗体、および本発明のこのような抗体の抗原結合断片に適用可能であると理解すべきである。
【０１５７】
本発明のいくつかの態様において、結合剤は、本明細書における開示による、ＭｙＢＰ−Ｃ、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープに特異的に結合する、抗体の抗原結合断片である。抗原結合断片（本明細書において、「抗原結合ポーション」とまた称される）は、本明細書に記載されている抗体のいずれかの抗原結合断片でよい。抗原結合断片は、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓＦｖ、ｓＦｖ、二特異性抗体、三特異性抗体、ビス−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ発現ライブラリーによって発現される断片、ドメイン抗体、ＶｈＨドメイン、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＶＨドメイン、ＶＬドメインなどを含めた少なくとも１つの抗原結合部位を有する、抗体の任意のパートでよい。しかし、本発明の抗体断片は、これらの例示的なタイプの抗体断片に限定されない。
【０１５８】
ドメイン抗体は抗体の機能的結合ユニットを含み、抗体の重鎖（ＶＨ）または軽鎖（ＶＬ）の可変領域に対応することができる。ドメイン抗体は、概ね１３ｋＤａ、または完全抗体の概ね１０分の１の分子量を有することができる。ドメイン抗体は、完全抗体、例えば、本明細書に記載されているものから由来し得る。いくつかの実施形態において、抗原結合断片は、モノマーまたはポリマー、二重特異性または三重特異性、二価または三価である。
【０１５９】
抗体分子の、抗原結合性を含有する抗体断片、またはイディオタイプは、当技術分野で公知の技術によって生成し得る。例えば、このような断片は、これらに限定されないが、抗体分子のペプシン消化によって産生し得るＦ（ａｂ’）２断片；Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を低減させることによって生成し得るＦａｂ’断片、および抗体分子をパパインおよび還元剤で処置することによって生成し得る２つのＦａｂ’断片を含む。
【０１６０】
合成ペプチドを介して抗体軽鎖のＶドメインに連結している抗体重鎖の可変（Ｖ）ドメインを含む切断型Ｆａｂ断片からなる単鎖可変領域断片（ｓＦｖ）抗体断片は、通例の組換えＤＮＡテクノロジー技術（例えば、Ｊａｎｅｗａｙら（前述）を参照されたい）を使用して生成することができる。同様に、ジスルフィド−安定化可変領域断片（ｄｓＦｖ）は、組換えＤＮＡテクノロジー（例えば、Ｒｅｉｔｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７巻、６９７〜７０４頁（１９９４年）を参照されたい）によって調製することができる。
【０１６１】
組換え抗体断片、例えば、ｓｃＦｖをまた改変して、異なる標的抗原への高結合アビディティーおよび特異性のある安定的な多量体のオリゴマーに組み立てることができる。このような二特異性抗体（二量体）、三特異性抗体（三量体）または四特異性抗体（四量体）は、当技術分野で周知である。例えば、Ｋｏｒｔｔら、Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ．、２００１年、１８巻：９５〜１０８頁、（２００１年）およびＴｏｄｏｒｏｖｓｋａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．、２４８巻：４７〜６６頁、（２００１年）を参照されたい。
【０１６２】
二重特異性抗体（ｂｓｃＡｂ）は、組換え法を使用してグリシン−セリンリンカーを介した接合している２つの単鎖Ｆｖ断片を含む分子である。例示的な実施形態において、目的の２つの抗体のＶ軽鎖（ＶＬ）およびＶ重鎖（ＶＨ）ドメインを、標準的ＰＣＲ方法を使用して単離する。次いで、各ハイブリドーマから得たＶＬおよびＶＨ  ｃＤＮＡを接合して、２ステップ融合ＰＣＲにおいて単鎖断片を形成させる。二重特異性融合タンパク質を、同様の様式で調製する。二重特異性単鎖抗体および二重特異性融合タンパク質は、本発明の範囲内に含まれる抗体物質である。例示的な二重特異性抗体は、米国特許出願公開第２００５−０２８２２３３Ａ１号および国際出願第ＷＯ２００５／０８７８１２号（この両方の出願は全内容が参照により本明細書中に組み込まれている）に教示されている。
【０１６３】
抗体を作製する適切な方法は、当技術分野において公知である。例えば、標準的ハイブリドーマ方法は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８年）、およびＣＡ．  Ｊａｎｅｗａｙら（編）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第５版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（２００１年））に記載されている。
【０１６４】
手短に言えば、本発明のポリペプチドを含む免疫原で動物を免疫化し、その免疫化された動物からの抗血清を集めることによって、ポリクローナル抗体を調製する。広範囲の動物種を、抗血清の産生のために使用することができる。いくつかの態様において、抗血清の産生のために使用する動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ヒツジ、ブタまたはウマを含めたヒトではない動物である。ウサギの相対的に大量の血液量のために、ウサギは、ポリクローナル抗体の産生のために好ましい選択である。選択したＭｙＢＰ−Ｃ、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープと免疫反応性のポリクローナル抗血清を生成する例示的な方法において、ＭｙＢＰ−Ｃ抗原の２０〜３０個のアミノ酸ポーションを、ウサギの免疫化のためにフロイント完全アジュバントに乳化する。例えば、２１日の間隔で、追加免疫のために、エピトープをフロイント不完全アジュバント中で乳化させる。単純に動物を出血させ、全血からの血清試料を調製することによって、抗体生成のための時間を考慮に入れた後、ポリクローナル抗血清を得てもよい。
【０１６５】
本発明において使用するためのモノクローナル抗体は、培養液中の連続細胞系による抗体分子の産生を実現する任意の技術を使用して調製し得る。これらには、これらに限定されないが、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５〜４９７頁、１９７５年）によって最初に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ、４巻：７２号、１９８３年；Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、８０巻：２０２６〜２０３０頁、１９８３年）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｎ．Ｙ．、７７〜９６頁、（１９８５年）が含まれる。
【０１６６】
手短に言えば、例示的な実施形態において、モノクローナル抗体を生成するために、マウスに、ＭｙＢＰ−Ｃ、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープを周期的に注射し、これに対して抗体が生じる（例えば、１０〜２０μｇ、フロイント完全アジュバントに乳化）。マウスに、ＰＢＳ中のリンパ管内皮細胞の特異的認識を可能とするエピトープを含有する、ＭｙＢＰ−Ｃ、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープの最終的な融合前追加免疫を与え、４日後、マウスを屠殺し、その脾臓を取り出す。脾臓を１０ｍｌの無血清ＲＰＭＩ１６４０中に入れ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＲＰＭＩ）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｎａｄａ）を補充した無血清ＲＰＭＩ１６４０に浸した２つのガラス製顕微鏡用スライドのすり板末端の間で脾臓を粉砕することによって単一の細胞懸濁液を形成させる。細胞懸濁液を無菌の７０メッシュＮｉｔｅｘ細胞ストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）を通して濾過し、２００ｇで５分間遠心分離することによって２回洗浄し、ペレットを２０ｍｌの無血清ＲＰＭＩに再懸濁させる。３匹の未処理Ｂａｌｂ／ｃマウスから採取した脾細胞を同様の様式で調製し、対照として使用する。融合の前３日間、１１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）を有するＲＰＭＩ中で対数期に維持したＮＳ−１骨髄腫細胞を、２００ｇで５分間遠心分離し、ペレットを２回洗浄する。
【０１６７】
脾臓細胞（１×１０８個）を２．０×１０７個のＮＳ−１細胞と合わせ、遠心分離し、上清を吸引する。チューブを軽く叩くことによって細胞ペレットを取り除き、３７℃の１ｍｌのＰＥＧ１５００（７５ｍＭのＨＥＰＥＳ中５０％、ｐＨ８．０）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を１分に亘って撹拌しながら加え、それに続いて７ｍｌの無血清ＲＰＭＩを７分に亘って加える。さらなる８ｍｌのＲＰＭＩを加え、細胞を２００ｇで１０分間遠心分離する。上清を廃棄した後、ペレットを１５％ＦＢＳ、１００μＭのヒポキサンチンナトリウム、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジン（ＨＡＴ）（Ｇｉｂｃｏ）、２５ユニット／ｍｌのＩＬ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および１．５×１０６個の脾細胞／ｍｌを含有する２００ｍｌのＲＰＭＩに再懸濁させ、１０Ｃｏｒｎｉｎｇフラットボトム９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｎ．Ｙ．）中に蒔く。
【０１６８】
融合後２日目、４日目、および６日目に、１００μｌの媒体を融合プレートのウェルから除去し、新鮮な媒体と置き換える。８日目に、ＥＬＩＳＡによって融合物をスクリーニングし、ＭｙＢＰ−Ｃ、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープに結合したマウスＩｇＧの存在について試験する。
【０１６９】
選択した融合ウェルを、９６ウェルプレート中への希釈によって２回クローン化し、５日後のコロニー／ウェルの数の視覚的スコアリングを行う。ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体を、Ｉｓｏｓｔｒｉｐシステム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）を使用してアイソタイプを判定する。
【０１７０】
ハイブリドーマ技術を用いるとき、骨髄腫細胞系を使用し得る。ハイブリドーマ産生融合手順において使用するのに適したこのような細胞系は好ましくは、抗体産生性でなく、高融合の効率性を有し、特定の選択的媒体中で増殖できなくするように酵素が欠損しており、これは細胞系が所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみを増殖することを支持する。例えば、免疫化した動物がマウスである場合、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７およびＳ１９４／１５ＸＸ０Ｂｕｌを使用してもよく、ラットについて、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０を使用してもよく、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６は、細胞融合に関連して全て有用である。モノクローナル抗体を産生するためのこのような技術によって産生されたハイブリドーマおよび細胞系は、本開示の新規な組成物であると意図されることに留意すべきである。
【０１７１】
宿主動物種によって、様々なアジュバントを使用して、免疫反応を増加させ得る。このようなアジュバントには、これらに限定されないが、フロイント、鉱物ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、および表面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールが含まれる。ＢＣＧ（カルメットゲラン菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍは、潜在的に有用なヒトアジュバントである。
【０１７２】
代わりに、他の方法、例えば、ＥＢＶ−ハイブリドーマ方法（ＨａｓｋａｒｄおよびＡｒｃｈｅｒ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、７４巻（２号）、３６１〜６７頁（１９８４年）、およびＲｏｄｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１２１巻、１４０〜６７頁（１９８６年））、およびバクテリオファージベクター発現系（例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻、１２７５〜８１頁（１９８９年）を参照されたい）は、当技術分野において公知である。さらに、ヒトではない動物において抗体を産生する方法は、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、および同第５，７１４，３５２号、ならびに米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６Ａ１号）に記載されている。
【０１７３】
Ｏｒｌａｎｄｉら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、８６巻：３８３３〜３８３７頁；１９８９年）、およびＷｉｎｔｅｒ  ＧおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ（Ｎａｔｕｒｅ、３４９巻：２９３〜２９９頁、１９９１年）に開示されているように、リンパ球集団においてｉｎ  ｖｉｖｏの産生を誘発することによって、または組換え免疫グロブリンライブラリーもしくは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって、抗体をまた産生し得る。
【０１７４】
ファージディスプレイをさらに使用して、本開示の抗体を生成することができる。これに関して、標準的分子生物学および組換えＤＮＡ技術を使用して、抗体の抗原結合性可変（Ｖ）ドメインをコードするファージライブラリーを生成することができ（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１年）を参照されたい）、所望の特異性を有する可変領域をコードするファージを、所望の抗原への特異的結合のために選択し、選択した可変ドメインを含む完全な抗体または部分抗体を再構成する。モノクローナル抗体の特徴を有する抗体が細胞によって分泌されるように、再構成された抗体をコードする核酸配列を、適切な細胞系、例えば、ハイブリドーマの産生のために使用される骨髄腫細胞中に導入する（例えば、Ｊａｎｅｗａｙら（前述）、Ｈｕｓｅら（前述）、および米国特許第６，２６５，１５０号を参照されたい）。関連する方法はまた、米国特許第５，４０３，４８４号；米国特許第５，５７１，６９８号；米国特許第５，８３７，５００号；米国特許第５，７０２，８９２号に記載されている。米国特許第５，７８０，２７９号；米国特許第５，８２１，０４７号；米国特許第５，８２４，５２０号；米国特許第５，８５５，８８５号；米国特許第５，８５８，６５７号；米国特許第５，８７１，９０７号；米国特許第５，９６９，１０８号；米国特許第６，０５７，０９８号；米国特許第６，２２５，４４７号に記載されている技術。
【０１７５】
抗体は、特定の重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックなトランスジェニックマウスによって産生することができる。このような方法は当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号および同第５，５６９，８２５号、およびＪａｎｅｗａｙら（前述）に記載されている。
【０１７６】
ヒト化抗体を生成するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｊａｎｅｗａｙら（前述）、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６１号、欧州特許第０２３９４００Ｂ１号、および英国特許第２１８８６３８号において詳細に記載されている。ヒト化抗体はまた、米国特許第５，６３９，６４１号およびＰｅｄｅｒｓｅｎら、Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ、２３５巻、９５９〜９７３頁（１９９４年）に記載されている抗体リサーフェイシングテクノロジーを使用して生成することができる。
【０１７７】
「キメラ抗体」の産生のために開発された技術である、適当な抗原特異性および生物活性を有する分子を得るためのヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングを使用することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、８１巻：６８５１〜６８５５頁、１９８４年；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３１２巻：６０４〜６０８頁、１９８４年；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４巻：４５２〜４５４頁；１９８５年）。代わりに、単鎖抗体の産生について記載されている技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を適応して、ＶＥＧＦＲ−３−特異的単鎖抗体を産生することができる。
【０１７８】
好ましいキメラまたはヒト化抗体は、ヒト定常領域を有し、一方、抗体の可変領域、または少なくともＣＤＲは、非ヒト種に由来する。非ヒト抗体をヒト化する方法は、当技術分野で周知である。（米国特許第５，５８５，０８９号、および同第５，６９３，７６２号を参照されたい）。一般に、ヒト化抗体は、ヒトではない源からのそのフレームワーク領域中に導入した１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。例えば、Ｊｏｎｅｓら（Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁、１９８６年）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２７頁、１９８８年）およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁、１９８８年）において記載されている方法を使用して、ヒト抗体の対応する領域を、げっ歯類相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくともポーションで置換することによって、ヒト化を行うことができる。改変された抗体を調製するための多数の技術は、例えば、ＯｗｅｎｓおよびＹｏｕｎｇ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．、１６８巻：１４９〜１６５頁（１９９４年）に記載されている。次いで、さらなる変化を、抗体フレームワーク中に導入し、親和性または免疫原性をモジュレートすることができる。
【０１７９】
同様に、ＣＤＲを単離するための当技術分野で公知の技術を使用して、ＣＤＲを含む組成物が生成される。相補性決定領域は、６つのポリペプチドループ（重鎖または軽鎖の可変領域のそれぞれに対して３つのループ）によって特徴付けられる。ＣＤＲ中のアミノ酸の位置は、参照により本明細書中に組み込まれているＫａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、（１９８３年）に定義されている。例えば、ヒト抗体の超可変領域は、重鎖および軽鎖の可変領域の残基２８〜３５、４９〜５９および残基９２〜１０３において見出されると概ね定義される（ＪａｎｅｗａｙおよびＴｒａｖｅｒｓ、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９９６年））。マウスＣＤＲはまた、概ねこれらのアミノ酸残基において見出される。ＣＤＲ領域は、上記に記載されたこれらの接近した残基のいくつかのアミノ酸内に見出し得ることが当技術分野で理解される。免疫グロブリン可変領域はまた、ＣＤＲを取り囲む４つの「フレームワーク」領域（ＦＲ１〜４）からなる。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は種において高度に保存されており、またヒトおよびマウス配列の間で保存されている。
【０１８０】
マウス抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）は、１２００超のヒトＶＨ配列および１０００超のＶＬ配列を含めたヒト抗体の可変配列の大きなデータベースより選択される適合性ヒトフレームワーク領域を置換することによってヒト化される。比較のために使用した抗体配列のデータベースは、Ａｎｄｒｅｗ  Ｃ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ’ｓ  ＫａｂａｔＭａｎウェブページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｕｂｉｃ．ｒｄｇ．ａｃ．ｕｋ／ａｂｓ／）からダウンロードする。ＣＤＲを同定するためのＫａｂａｔ法は、任意のヒト抗体からの概ねのＣＤＲおよびフレームワーク領域を記述し、類似性についてマウス抗体の配列を比較し、ＣＤＲおよびＦＲを決定するための手段を提供する。最良に対応したヒトＶＨおよびＶＬ配列は、高い全体的フレームワークのマッチング、同様のＣＤＲ長、ならびにカノニカルおよびＶＨ／ＶＬ接触残基の最小のミスマッチングに基づいて選択される。マウス配列と最も同様のヒトフレームワーク領域をマウスＣＤＲの間に挿入する。代わりに、マウスフレームワーク領域は、ヒト抗体のフレームワーク領域により密接に似ている未変性フレームワーク領域の全てまたはパートのアミノ酸置換を作製することによって修飾し得る。
【０１８１】
「保存的」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質における類似性に基づいて行われる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、およびメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）が含まれ、極性の中性アミノ酸には、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、およびグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）が含まれ、正に帯電している（塩基性）アミノ酸には、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、およびヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）が含まれ、負に帯電している（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）が含まれる。「挿入」または「欠失」は好ましくは、約１〜２０個のアミノ酸、より好ましくは１〜１０個のアミノ酸の範囲である。組換えＤＮＡ技術を使用してポリペプチド分子中のアミノ酸の置換を系統的に行い、このように得られた組換え変異体を活性についてアッセイすることによって、バリエーションを導入し得る。核酸の変更は、異なる種からの核酸の異なる部位（可変位置）において、または高度に保存領域（定常領域）において行うことができる。本発明において有用なポリペプチド組成物を発現する方法を、下記でより詳細に記載する。
【０１８２】
さらに、本発明において使用するための抗体を生成するための別の有用な技術は、合理的設計タイプのアプローチを使用するものであり得る。合理的設計のゴールは、これらが相互作用する生物活性のあるポリペプチドまたは化合物の構造的類似体（アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、ペプチド模倣物、結合パートナーなど）を産生することである。１つのアプローチにおいて、抗体またはそのエピトープ結合断片についての三次元構造を生成する。これは、Ｘ線結晶構造解析、コンピューターモデリングによって、または両方のアプローチの組合せによって達成することができる。代わりのアプローチである「アラニンスキャン」は、分子の全体に亘る残基をアラニンとランダムに置き換えることが関与し、機能に対する結果として生じた影響を決定する。
【０１８３】
特異的抗体の結晶構造を解析することもまた可能である。原理上は、このアプローチは、ファルマコフォア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を生じさせ、それに続くドラッグデザインはこれに基づくことができる。機能的な薬理学的に活性の抗体に対する抗イディオタイプ抗体を生成することによって、タンパク質結晶学を全体で迂回することが可能である。鏡像の鏡像として、抗イディオタイプの結合部位は、当初の抗原の類似体であると予想される。次いで、抗イディオタイプを使用して、化学的または生物学的に産生されたペプチドのバンクからさらなる抗体を同定および単離することができる。
【０１８４】
化学的に構築された二重特異性抗体は、化学物質、例えば、ヘテロ二官能性試薬スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）−プロピオネート（ＳＰＤＰ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）を用いて、異種ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片を化学的に架橋することによって調製し得る。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、それぞれ、パパインまたはペプシンによりインタクトな抗体を消化することによって、インタクトな抗体から得ることができる（Ｋａｒｐｏｖｓｋｙら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．１６０巻：１６８６〜７０１頁、１９８４年；Ｔｉｔｕｓら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３８巻：４０１８〜２２頁、１９８７年）。
【０１８５】
抗体がどのように産生されたかに関わらず、ＭｙＢＰ−Ｃのエピトープ、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープに結合する能力について抗体を試験する方法は当技術分野において公知であり、任意の抗体−抗原結合アッセイ、例えば、放射免疫測定（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降、および競争的阻害アッセイ（例えば、Ｊａｎｅｗａｙら（下記）、および米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６Ａ１号を参照されたい）を含む。
【０１８６】
アプタマー
例示的な態様において、本発明の結合剤は、アプタマーである。コンビナトリアル科学の分野における最近の進歩によって、所与の標的に対して高親和性および特異性を有する短いポリマー配列（例えば、オリゴ核酸またはペプチド分子）が同定されてきた。例えば、ＳＥＬＥＸテクノロジーを使用して、哺乳動物の抗体に対抗する結合特性を有するＤＮＡおよびＲＮＡアプタマーが同定されてきており、免疫学の分野では、無数の化合物に結合する抗体または抗体断片を生成および単離してきており、ファージディスプレイが利用され、非常に好ましい結合特性を有する新規なペプチド配列が発見されてきた。これらの分子進化技術の成功に基づいて、任意の標的分子に結合する分子を生じさせることができることは確実である。ループ構造は、相補的塩基対形成を伴わない短い領域から生じたヘアピンループを利用することが多いアプタマー、ループ状超可変領域のコンビナトリアル配列を利用する天然由来の抗体、および線形ペプチドファージディスプレイの結果と比較したとき改善された結果を示した環状ペプチドを利用する新規なファージディスプレイライブラリーの場合のように、所望の結合性状を実現することに関与していることが多い。このように、コンビナトリアル分子進化技術によって高親和性リガンドを生じさせ、同定することができることを示唆する十分な証拠が生成されてきた。本開示のために、分子進化技術を使用して、本明細書に記載されているＭｙＢＰ−Ｃ、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープに対して特異的な結合剤を単離することができる。アプタマーについてさらには、一般に、Ｇｏｌｄ，  Ｌ．、Ｓｉｎｇｅｒ，  Ｂ．、Ｈｅ，  Ｙ．  Ｙ．、Ｂｒｏｄｙ．  Ｅ．、「Ａｐｔａｍｅｒｓ  Ａｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ」、Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４巻：５〜１３頁（２０００年）を参照されたい。アプタマーを生成するための関連する技術は、参照によりその全体が組み込まれている米国特許第６，６９９，８４３号において見出し得る。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、アプタマーは、核酸のライブラリーを調製し、核酸のライブラリーと増殖因子とを接触させることによって生成してもよく、増殖因子に対して（他のライブラリー核酸と比べて）より大きな結合親和性を有する核酸を選択および増幅し、増殖因子に結合するための相対的により高い親和性および特異性を有する核酸について濃縮された核酸の混合物が生じる。この工程は繰り返してもよく、選択した核酸を変異させ、再スクリーニングし、それによって増殖因子アプタマーが同定される。核酸をスクリーニングして、複数の標的ＭｙＢＰ−Ｃ、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープに結合する分子を選択し得る。複数の標的ＭｙＢＰ−Ｃ、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープを結合することは、同時にまたは競合的に複数のＭｙＢＰ−Ｃ、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープを結合することを指すことができる。
【０１８８】
エピトープ
例示的な実施形態において、本発明の結合剤は、ＭｙＢＰ−Ｃのエピトープ、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープに結合する。「ＭｙＢＰ−Ｃのエピトープ」とは、本明細書において使用する場合、結合剤の結合ユニット（複数可）が結合するＭｙＢＰ−Ｃの領域またはＭｙＢＰ−Ｃ中の領域を意味する。いくつかの実施形態において、エピトープは、線形エピトープである。「線形エピトープ」とは、本明細書において使用する場合、結合剤の結合ユニット（複数可）が結合するＭｙＢＰ−Ｃの領域またはＭｙＢＰ−Ｃ中の領域を意味し、この領域は、ＭｙＢＰ−Ｃ、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープのアミノ酸配列の近接するアミノ酸からなる。線形エピトープのアミノ酸は、抗原の一次構造、ならびに抗原の二次および／または三次構造（複数可）において互いに極めて接近して配置されている。例えば、抗原、例えば、ＭｙＢＰ−Ｃ、例えば、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープが、その適正に折り畳まれた状況（例えば、その未変性立体構造）にあるとき、線形エピトープの近接するアミノ酸は、互いに極めて接近して配置されている。
【０１８９】
他の例示的な態様において、結合剤のエピトープは、立体構造エピトープである。「立体構造エピトープ」とは、ＭｙＢＰ−Ｃがその適正に折り畳まれた状況にあるときのみに、互いに極めて接近して配置されているが、ＭｙＢＰ−Ｃのアミノ酸配列の近接するアミノ酸ではない、アミノ酸からなるエピトープを意味する。
【０１９０】
例示的な態様において、結合剤は、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープに特異的に結合し、エピトープは、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、および／またはＣｙｓ７１９の１つまたは複数を含む。例示的な態様において、Ｃｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、および／またはＣｙｓ７１９の１つまたは複数は、Ｓ−グルタチオン付加されており、結合剤は、１つまたは複数のＣｙｓ残基を含むＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された形態、またはそのＳ−グルタチオン付加された断片に特異的に結合する。
【０１９１】
例示的な態様において、結合剤は、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープに特異的に結合し、エピトープは、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ６２３、および／またはＣｙｓ６５１の１つまたは複数を含む。例示的な態様において、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ６２３、および／またはＣｙｓ６５１の１つまたは複数は、Ｓ−グルタチオン付加されており、結合剤は、１つまたは複数のＣｙｓ残基を含むＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された形態、またはそのＳ−グルタチオン付加された断片に特異的に結合する。
【０１９２】
例示的な態様において、結合剤は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃに結合する。いくつかの態様において、結合剤は、ＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された形態に特異的に結合し、ＭｙＢＰ−Ｃのグルタチオン付加されていない形態に特異的に結合しない。いくつかの態様において、Ｓ−グルタチオン付加は、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、および／またはＣｙｓ７１９の１つまたは複数において起こり、Ｃｙｓ残基の位置は、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けによる。いくつかの態様において、Ｓ−グルタチオン付加は、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ４７５、Ｃｙｓ６２３、および／またはＣｙｓ６５１の１つまたは複数において起こり、Ｃｙｓ残基の位置は、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けによる。
【０１９３】
例示的な態様において、結合剤は、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、および／またはＣｙｓ７１９の１つに特異的に結合し、Ｃｙｓ残基の位置は、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けによる。例示的な態様において、結合剤は、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ４７５、Ｃｙｓ６２３、および／またはＣｙｓ６５１の１つに特異的に結合し、Ｃｙｓ残基の位置は、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けによる。いくつかの態様において、結合剤は、「部位特異的抗体」と考えられる。例示的な態様において、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、および／またはＣｙｓ７１９の１つまたは複数はＳ−グルタチオン付加されており、結合剤は、１つまたは複数のＣｙｓ残基を含むＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された形態、またはそのＳ−グルタチオン付加された断片に特異的に結合する。例示的な態様において、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ４７５、Ｃｙｓ６２３、および／またはＣｙｓ６５１の１つまたは複数は、Ｓ−グルタチオン付加されており、結合剤は、１つまたは複数のＣｙｓ残基を含むＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された形態、またはそのＳ−グルタチオン付加された断片に特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、ＭｙＢＰ−Ｃの部位特異的およびグルタチオン付加特異的抗体であり、これは、ＭｙＢＰ−Ｃ上の他の部位を認識せず、グルタチオン付加されていない部位を認識しない。
【０１９４】
例示的な態様において、結合剤は、抗体、抗体の抗原結合断片、またはアプタマー、例えば、本明細書に記載されているもののいずれかである。
【０１９５】
コンジュゲート
例示的な実施形態において、結合剤は、第２の部分または異種部分にコンジュゲートしている。本明細書において使用する場合、「異種部分」という用語は「コンジュゲート部分」という用語と同義であり、本明細書に記載されている本発明の結合剤とは異なる、任意の分子（化学的または生化学的、天然またはコードされていない）を指す。本明細書に記載されている結合剤のいずれかに連結することができる例示的なコンジュゲート部分には、これらに限定されないが、異種ペプチドまたはポリペプチド（例えば、酵素、酵素基質、２つの結合パートナーの間に高親和性結合相互作用を有する結合パートナーを含めた）、ターゲティング剤、異種免疫グロブリンまたはそのポーション（例えば、可変領域、ＣＤＲ、またはＦｃ領域）、診断用または検出可能な標識、例えば、放射性同位体、フルオロフォアまたは酵素標識、ポリマー（水溶性ポリマーを含めた）、または他の治療もしくは診断用薬剤が含まれる。いくつかの実施形態において、本発明は、ポリペプチド、核酸分子、抗体またはその断片、ポリマー、量子ドット、小分子、毒素、診断用薬剤、炭水化物、アミノ酸に連結している発明性のある結合剤を含むコンジュゲートを提供する。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、異種部分は、ポリマーである。いくつかの実施形態において、ポリマーは、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレンおよびその誘導体（ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート（ｔｅｒｅｐｔｈａｌａｔｅｓ）を含めた）、アクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステルのポリマー（ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、およびポリ（アクリル酸オクタデシル）を含めた）、ポリビニルポリマー（ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ハロゲン化ポリビニル、ポリ（酢酸ビニル）、およびポリビニルピロリドンを含めた）、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそのコポリマー、セルロース（アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシ−プロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシルエチルセルロース、三酢酸セルロース、および硫酸セルロースナトリウム塩を含めた）、ポリプロピレン、ポリエチレン（ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、およびポリ（エチレンテレフタレート）を含めた）、ならびにポリスチレンからなる群より選択される。
【０１９７】
いくつかの態様において、ポリマーは、合成生分解性ポリマー（例えば、乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸（ｂｕｔｉｃ  ａｃｉｄ））、ポリ（吉草酸）、およびポリ（ラクチド−ｃｏカプロラクトン））、ならびに天然生分解性ポリマー（例えば、アルギネート、ならびにデキストランおよびセルロース、コラーゲン、その化学誘導体（化学基、例えば、アルキル、アルキレンの置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者によって通例行われる他の修飾）、アルブミンおよび他の親水性タンパク質（例えば、ゼインおよび他のプロラミンおよび疎水性タンパク質）を含めた他の多糖類）、ならびに任意のコポリマーまたはその混合物を含めた生分解性ポリマーである。一般に、これらの材料は、酵素加水分解または水へのｉｎ  ｖｉｖｏでの曝露によって、表面またはバルクの侵食によって分解する。
【０１９８】
いくつかの態様において、ポリマーは、生体付着性ポリマー、例えば、生体侵食性ヒドロゲル（その教示が本明細書において組み込まれているＨ．  Ｓ．  Ｓａｗｈｎｅｙ、Ｃ．  Ｐ．  ＰａｔｈａｋおよびＪ．  Ａ．  Ｈｕｂｂｅｌｌ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１９９３年、２６巻、５８１〜５８７頁に記載されている）、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルテン（ｇｌｕｔｉｎ）、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギネート、キトサン、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、およびポリ（アクリル酸オクタデシル）である。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、ポリマーは、水溶性ポリマーまたは親水性ポリマーである。親水性ポリマーは、本明細書の「親水性部分」においてさらに記載されている。適切な水溶性ポリマーは当技術分野において公知であり、例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ；Ｋｌｕｃｅｌ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ；Ｍｅｔｈｏｃｅｌ）、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルブチルセルロース、ヒドロキシプロピルペンチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース（Ｅｔｈｏｃｅｌ）、ヒドロキシエチルセルロース、様々なアルキルセルロースおよびヒドロキシアルキルセルロース、様々なセルロースエーテル、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、酢酸ビニル／クロトン酸コポリマー、ポリ−メタクリル酸ヒドロキシアルキル、メタクリル酸ヒドロキシメチル、メタクリル酸コポリマー、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリレート、無水マレイン酸／メチルビニルエーテルコポリマー、ポリビニルアルコール、ナトリウムおよびカルシウムポリアクリル酸（ｓｏｄｉｕｍ  ａｎｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリアクリル酸、酸性カルボキシポリマー、カルボキシポリメチレン、カルボキシビニルポリマー、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、ポリメチルビニルエーテルｃｏ−無水マレイン酸、カルボキシメチルアミド、メタクリル酸カリウムジビニルベンゼンコポリマー、ポリオキシエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ならびにこれらの誘導体、塩、および組合せが含まれる。
【０２００】
特定の実施形態において、ポリマーは、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含めた）である。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、異種部分は、炭水化物である。いくつかの実施形態において、炭水化物は、単糖類（例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース）、二糖類（例えば、スクロース、ラクトース、マルトース）、オリゴ糖（例えば、ラフィノース、スタキオース）、または多糖類（例えば、デンプン、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、カロース、ラミナリン、キシラン、マンナン、フコイダン、もしくはガラクトマンナン）である。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、異種部分は、脂質である。脂質は、いくつかの実施形態において、脂肪酸、エイコサノイド、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン、Ｎ−アシルエタノールアミン、グリセロ脂質（例えば、モノ−、ジ−、トリ−置換グリセロール）、グリセロリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン）、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴシン、セラミド）、ステロール脂質（例えば、ステロイド、コレステロール）、プレノール脂質（ｐｒｅｎｏｌ  ｌｉｐｉｄ）、サッカロ脂質（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄ）、またはポリケチド、油、ワックス、コレステロール、ステロール、脂溶性ビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質である。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、異種部分は、ポリペプチドまたはペプチド、任意選択で、酵素、酵素基質、または公知の結合相互作用の結合タンパク質である。例示的な態様において、異種部分は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、その基質、アビジン、ビオチン、放射性標識または蛍光標識である。いくつかの態様において、蛍光標識は、イソチオシアネート、フルオレセイン、ローダミン、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ、ｄｙｌｉｇｈｔ  ｆｌｕｏｒ、ＡＴＴＯ染料、ＢＯＤＩＰＹ染料などである。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、異種部分は、本発明の結合剤に非共有結合または共有結合を介して付着している。例示的な態様において、異種部分は、本発明の結合剤にリンカーを介して付着している。連結は、共有化学結合、物理的力、例えば、静電気、水素、イオン、ファンデルワールス、または疎水性もしくは親水性相互作用によって達成することができる。ビオチン−アビジン、リガンド／受容体、酵素／基質、核酸／核酸結合タンパク質、脂質／脂質結合タンパク質、細胞接着分子パートナー；または互いに親和性を有する任意の結合パートナーもしくはその断片を含めた、種々の非共有結合性カップリング系を使用し得る。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、結合剤は、結合剤の標的とされるアミノ酸残基と、これらの標的とされるアミノ酸の選択した側鎖またはＮ−もしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤とを反応させることによって、コンジュゲート部分に直接の共有結合的連結を介して連結している。結合剤またはコンジュゲート部分上の反応性基には、例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミドまたはヒドラジノ基が含まれる。誘導体化剤には、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基によるコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基による）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸または当技術分野において公知の他の薬剤が含まれる。代わりに、コンジュゲート部分は、中間担体、例えば、多糖類またはポリペプチド担体によって結合剤に間接的に連結することができる。多糖類担体の例には、アミノデキストランが含まれる。適切なポリペプチド担体の例には、結果として生じた添加担体に望ましい溶解度特性を与える、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、そのコポリマー、ならびにこれらのアミノ酸およびその他、例えば、セリンの混合ポリマーが含まれる。
【０２０６】
システイニル残基は、α−ハロアセテート（および対応するアミン）、例えば、クロロ酢酸、クロロアセトアミドと最も一般に反応し、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体が得られる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
【０２０７】
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０でのジエチルピロカルボネートとの反応によって誘導体化される（この作用剤がヒスチジル側鎖に対して相対的に特異的であるため）。パラ−ブロモフェナシルブロミドがまた有用である。反応は好ましくは、０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム中でｐＨ６．０にて行う。
【０２０８】
リシニルおよびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応する。これらの作用剤による誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆転させる効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬には、イミドエステル、例えば、ピコリンイミド酸メチル、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロ水素化ホウ素、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、およびグリオキシレートによるトランスアミナーゼ−触媒反応が含まれる。
【０２０９】
アルギニル残基は、１種またはいくつかの通常の試薬（中でも、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリン）との反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高ｐＫａによって、反応がアルカリ性条件において行われることを必要とする。さらに、これらの試薬は、リシン基およびアルギニンε−アミノ基と反応し得る。
【０２１０】
チロシル残基の特異的修飾を行ってもよく、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基中にスペクトル標識を導入することに特別な関心を有する。最も一般に、Ｎ−アセチルイミダゾール（ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）およびテトラニトロメタンを使用して、それぞれ、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体が形成される。
【０２１１】
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾され、ＲおよびＲ’は、異なるアルキル基、例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドである。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【０２１２】
他の修飾には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．  Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、７９〜８６頁（１９８３年））、アスパラギンまたはグルタミンの脱アミド、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに／あるいはＣ末端カルボン酸基のアミド化またはエステル化が含まれる。
【０２１３】
別のタイプの共有結合的修飾は、グリコシドを結合剤に化学的または酵素的にカップリングすることが関与する。糖（複数可）は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えば、システインの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えば、セリン、トレオニン、またはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）芳香族残基、例えば、チロシン、またはトリプトファンの芳香族残基、あるいは（ｆ）グルタミンのアミド基に付着し得る。これらの方法は、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ８７／０５３３０、およびＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５９〜３０６頁（１９８１年）に記載されている。
【０２１４】
多量体
本発明は、ホモ−もしくはヘテロ−多量体またはホモ−もしくはヘテロ−二量体を含めた、本明細書において開示する結合剤の多量体または二量体をさらに提供する。結合剤の２つ以上は、当業者には公知の標準的連結剤および手順を使用して一緒に連結することができる。例えば、二量体は、二官能性チオール架橋剤および二官能性アミン架橋剤の使用によって２つの結合剤（特に、システイン、リシン、オルニチン、ホモシステインまたはアセチルフェニルアラニン残基で置換されている結合剤について）の間に形成することができる。二量体はホモ二量体でよく、または代わりにヘテロ二量体でよい。いくつかの態様において、モノマーは、末端アミノ酸（例えば、Ｎ末端もしくはＣ末端）を介して、内部アミノ酸を介して、または少なくとも１つのモノマーの末端アミノ酸、および少なくとも１つの他のモノマーの内部アミノ酸を介して接続している。特定の態様において、モノマーは、Ｎ末端アミノ酸を介して接続していない。いくつかの態様において、多量体のモノマーは、「尾−対−尾」の配向で一緒に付着しており、各モノマーのＣ末端アミノ酸は、一緒に付着している。
【０２１５】
システム、コンピュータ可読ストレージ媒体、およびコンピュータプロセッサによって実装される方法
図１２は、拡張期心不全の拡張機能障害のための治療剤についての被験体の必要性を評価するためのシステム１００の例示的な実施形態１０１を例示する。一般に、システム１００は、１つまたは複数のクライアントデバイス１０２、ネットワーク１０４、およびデータベース１０８を含み得る。各クライアントデバイス１０２は、１つまたは複数の有線または無線ネットワーク接続１１２（例えば、ＩＥＥＥ８０２．１１規格（「Ｗｉ−Ｆｉ」）の１つ、イーサネット（登録商標）規格などの規格に従った接続、または任意の他の適当なネットワーク接続でよい）を介して通信によってネットワーク１０４へとカップリングし得る。同様に、データベース１０８は、１つまたは複数の接続１１４を介して通信によってネットワーク１０４へとカップリングし得る。（当然ながら、データベースは、代わりに、クライアントデバイス１０２の１つまたは複数の内部でよい。）データベース１０８は、これらに限定されないが、被験体から得た生物学的試料のデータ、対照または試験集団から得た生物学的試料のデータ、生物学的試料のデータと関連するガウス分布のデータ、生物学的試料（複数可）および／またはガウス分布のデータと関連する１つまたは複数の閾値のデータなどを含めた、拡張期心不全の拡張機能障害のための治療剤についての被験体の必要性の決定に関するデータを記憶し得る。生物学的試料のデータは、例えば、下記でより詳細に記載するような、ＭｙＢＰ−Ｃ、その翻訳後に修飾された形態、もしくはその断片のレベル、またはＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、またはＬ−アルギニンなどのレベルの１つまたは複数と関連し得る。
【０２１６】
理解されるように、ネットワーク１０４は、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）または広域ネットワーク（ＷＡＮ）でよい。すなわち、ネットワーク１０４は、ローカル（例えば、組織間）接続のみを含んでもよく、または代わりに、ネットワーク１０４は、組織を超えて拡張する接続、および１つまたは複数の公衆ネットワークへの接続（例えば、インターネット）を含み得る。いくつかの実施形態において、例えば、クライアントデバイス１０２およびデータベース１０８は、単一の会社（会社Ａ）によってオペレーションされるネットワーク内でもよい。他の実施形態において、例えば、クライアントデバイス（複数可）１０２は、会社Ａによってオペレーションされるネットワーク上でよく、一方、データベース１０８は、第２の会社（会社Ｂ）によってオペレーションされるネットワーク上でよく、会社Ａおよび会社Ｂのネットワークは、第３のネットワーク、例えば、インターネットによってカップリングしてもよい。
【０２１７】
また図１２を参照すると、クライアントデバイス１０２は、プロセッサ１２８（ＣＰＵ）、ＲＡＭ１３０、および不揮発性メモリ１３２を含む。不揮発性メモリ１３２は、限定のためではなく例として、磁気ディスク（例えば、ハードディスクドライブ）、ソリッドステートドライブ（例えば、フラッシュメモリ）などを含めた任意の適当な記憶デバイスでよい。さらに、少なくとも図１２に関して、データベース１０８は、クライアントデバイス１０２から分離する必要はないことが理解される。代わりに、いくつかの実施形態において、データベース１０８は、不揮発性メモリ１３２のパートであり、データ１２２、１２４、１２６は、メモリ１３２内のデータとして記憶し得る。例えば、データ１２２は、データベース１０８中のデータとしての代わりに、メモリ１３２中に記憶されたスプレッドシートファイル中のデータとして含み得る。データベース１０８の記録を記憶することに加えて（いくつかの実施形態において）、メモリ１３２は、プログラムデータ、および１つまたは複数の試料および／または対照集団のデータを分析するのに必要な他のデータを記憶し、データについてのガウスフィットを決定し、被験体のデータを比較し得る閾を決定し、かつ／または拡張期心不全の拡張機能障害のための治療剤についての被験体の必要性を決定する。例えば、一実施形態において、メモリ１３２は、第１のルーチン１３４、第２のルーチン１３６、および第３のルーチン１３８を記憶する。第１のルーチン１３４は、１つまたは複数の試料および／または対照集団に関するデータ値を受け取ってもよく、ルーチン１３４が受け取ったデータ値をガウス分布にフィットさせてもよい。第２のルーチン１３６は、第１のルーチン１３４によって集めたデータの１つまたは複数の統計パラメーターをコンピュータ処理（ガウス分布の平均値、標準偏差値などを決定するなど）し得る。さらにおよび／または代わりに、第２のルーチン１３６は、各被験体が拡張期心不全の拡張機能障害のための治療剤を受け取るべきかどうかを決定するために、１つまたは複数の被験体からのデータを比較し得る第１の閾を設定し得る。第３のルーチン１３８は、例えば、１つまたは複数の被験体についてのデータを受け取り、１つまたは複数の被験体のデータと第２のルーチン１３６が決定した閾値（複数可）とを比較し、かつ／あるいは被験体のデータと閾値との比較によって各被験体が拡張期心不全の拡張機能障害のための治療剤を受け取るべきかどうかを決定し得る。とにかく、ルーチンのそれぞれは、プロセッサ１２８によって実行可能であり、メモリ１３２中に記憶された一連のコンパイルした、またはコンパイル可能な機械可読命令を含む。さらに、メモリ１３２は、生成した報告、またはルーチン１３４もしくは１３６の１つによるデータ出力の記録を記憶し得る。代わりに、報告または記録は、データベース１０８に出力し得る。１つまたは複数のディスプレイ／出力デバイス１４０（例えば、プリンター、ディスプレイなど）および１つまたは複数の入力デバイス１４２（例えば、マウス、キーボード、タブレット、タッチセンシティブインターフェースなど）はまた、一般に公知のように、クライアントデバイス１０２にカップリングし得る。
【０２１８】
理解されるように、１つまたは複数の方法の個々のオペレーションを、別々のオペレーションとして例示および記載するが、個々のオペレーションの１つまたは複数は併行的に行ってもよく、オペレーションが例示した順序で行われる必要はない。環境設定例において別々の成分として示した構造および機能性は、合わせた構造または成分として実装し得る。同様に、単一の成分として示される構造および機能性は、別々の成分として実装し得る。これらおよび他のバリエーション、修飾、付加、および改善は、本明細書において主題の範囲内に入る。
【０２１９】
例えば、ネットワーク１０４は、ＬＡＮ、ＭＡＮ、ＷＡＮ、モバイル、有線もしくは無線ネットワーク、プライベートネットワーク、または仮想プライベートネットワークの任意の組合せを含み得るが、これらに限定されない。その上、記載を単純化および明確化するために２つのクライアント１０２のみが図１２において例示されている一方、任意の数のクライアントコンピュータがサポートされ、１つまたは複数のサーバー（図示せず）と通信することができることが理解される。
【０２２０】
さらに、特定の実施形態は、ロジックまたはいくつかのルーチンを含むと本明細書に記載する。ルーチンは、ソフトウェアルーチン（例えば、機械可読媒体上または伝送信号において具体化されるコード）、またはハードウェアルーチンを構成し得る。ハードウェアルーチンは、特定のオペレーションを行うことができる有体のユニットであり、特定の様式で環境設定または配列し得る。実施形態例において、１つもしくは複数のコンピュータシステム（例えば、スタンドアロン、クライアントもしくはサーバーコンピュータシステム）、またはコンピュータシステムの１つもしくは複数のハードウェアルーチン（例えば、プロセッサもしくはプロセッサの群）は、本明細書に記載のような特定のオペレーションを行うようにオペレーションするハードウェアルーチンとして、ソフトウェア（例えば、アプリケーションまたはアプリケーションのポーション）によって環境設定し得る。
【０２２１】
同様に、本明細書に記載されている方法またはルーチンは、少なくとも部分的にプロセッサにより実装されてよい。例えば、方法のオペレーションの少なくともいくつかは、１つまたは複数のプロセッサ、またはプロセッサにより実装されるハードウェアモジュールによって行い得る。特定のオペレーションの実行は、単一の機械内に帰属するだけでなく、いくつかの機械に亘って配備されている、１つまたは複数のプロセッサの間に分布し得る。いくつかの実施形態例において、プロセッサ（複数可）は、単一の場所（例えば、住居環境、オフィス環境内で、またはサーバーファームとして）に配置してもよく、一方、他の実施形態において、プロセッサは、いくつかの場所に亘って分布させてもよい。
【０２２２】
特定のオペレーションの実行は、単一の機械内に帰属するだけでなく、いくつかの機械に亘って配備されている、１つまたは複数のプロセッサの間で分布し得る。いくつかの実施形態例において、１つまたは複数のプロセッサ、またはプロセッサにより実装されるモジュールは、単一の地理的場所（例えば、住居環境、オフィス環境、またはサーバーファーム内）に配置してもよい。他の実施形態例において、１つまたは複数のプロセッサ、またはプロセッサにより実装されるモジュールは、いくつかの地理的場所に亘って分布させてもよい。
【０２２３】
いくつかの実施形態を、「カップリングした」および「接続した」という表現をそれらの派生語と共に使用して記載し得る。例えば、いくつかの実施形態は、「カップリングした」という用語を使用して記載して、２つ以上の要素が直接物理的接触または電気的接触していることを示し得る。しかし、「カップリングした」という用語はまた、２つ以上の要素が互いに直接接触していないが、さらにまた互いに同時にオペレーションまたは相互作用することを意味し得る。実施形態は、この文脈に限定されない。
【０２２４】
本明細書において使用する場合、「含む」、「含むこと」、「含めた」、「含めて」、「有する」、「有すること」という用語、または任意の他のそのバリエーションは、非排他的に含むことを包含することを意図する。例えば、要素の一覧を含む工程、方法、物品、または器具は、これらの要素のみに必ずしも限定されないが、明らかに一覧表示されていない、あるいはこのような工程、方法、物品、または器具に固有ではない他の要素を含み得る。さらに、他に明白に断りのない限り、「または」とは、包括的な「または」を指し、排他的な「または」を指さない。例えば、条件ＡまたはＢは、下記の任意の１つによって満たされる。Ａは真であり（または存在し）、かつＢは偽であり（または存在せず）、Ａは偽であり（または存在せず）、かつＢは真であり（または存在し）、ＡおよびＢの両方は真である（または存在する）。
【０２２５】
さらに、「ａ」または「ａｎ」の使用を用いて、本明細書における実施形態の要素および成分を記載する。単に便宜のため、および記載の一般的意味を与えるためにこれを行う。この記載は、１つまたは少なくとも１つを含むと読むべきであり、単数はまた、これがそうではないことを意味することが明らかでない限り複数を含む。
【０２２６】
またさらに、例示の目的のみのために、図はマップエディターシステムの好ましい実施形態を示す。本明細書において例示する構造および方法の代わりの実施形態を、本明細書に記載されている趣旨から逸脱することなしに用いてもよいことを、当業者は下記の考察から容易に認識する。
【０２２７】
当業者はこの開示を読んで、本明細書において開示した原理によってターミナルロードセグメントを同定するための、システムおよび工程についてのまたさらなる代わりの構造設計および機能設計を認識する。このように、特定の実施形態および用途を例示および記載してきた一方で、開示された実施形態は、本明細書において開示する正確な構築物および成分に限定されないことを理解すべきである。当業者には明らかであろう様々な修飾、変化およびバリエーションを、添付の特許請求の範囲において定義する精神および範囲から逸脱することなしに、本明細書において開示する方法および器具の、配列、オペレーションおよび詳細において行い得る。
【０２２８】
本発明は、プロセッサ；プロセッサにカップリングしている記憶デバイス、および記憶デバイス上に記憶されている機械可読命令を含むシステムを提供する。例示的な実施形態において、機械可読命令は、プロセッサによって実行されるとき、プロセッサが、
（ｉ）被験体から得た生物学的試料から決定した、（ａ）ＭｙＢＰ−Ｃのレベル、（ｂ）ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態のレベル、または（ｃ）ＭｙＢＰ−Ｃ断片のレベルからなる群より選択されるデータ値を受け取り、
（ｉｉ）（ｉ）のデータ値と対応する対照データ値（対応する対照データ値は、複数の対照データ値の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定した、（ａ）ＭｙＢＰ−Ｃ、（ｂ）ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態、または（ｃ）ＭｙＢＰ−Ｃ断片のレベルである）とを比較し、
（ｉｉｉ）（ｉ）のデータ値が、対応する対照データ値よりも大きいとき、被験体における拡張機能障害または拡張期心不全の出力診断を提供する
ことを引き起こす。
【０２２９】
例示的な態様において、プロセッサは、複数の対照データ値を受け取ることができ、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定した、（ａ）ＭｙＢＰ−Ｃ、（ｂ）ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態、または（ｃ）ＭｙＢＰ−Ｃ断片のレベルである。次いで、プロセッサは、複数の対照データ値の平均値を決定し、平均値を対応する対照データ値として割り当ててもよい。例示的な態様において、プロセッサは、複数の各対照データ値を対照データ値として割り当てる。例示的な態様において、プロセッサは、新規な対照データ値を受け取るたびに、平均値を計算または再計算する。例示的な態様において、プロセッサは、各対照データ値および各平均値を記憶デバイス上に記憶する。
【０２３０】
例示的な態様において、プロセッサは、被験体における拡張機能障害の出力診断が提供されるとき、（ｉ）のデータ値を拡張機能障害データ値として割り当て、拡張機能障害データ値を記憶デバイス上に記憶する。
【０２３１】
代わりのまたはさらなる態様において、本発明のシステムは、プロセッサによって実行されるとき、プロセッサが、
（ｉ）第１のデータ値および第２のデータ値（第１のデータ値は、被験体から得た生物学的試料から決定した非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベルであり、第２のデータ値は、被験体から得た生物学的試料から決定した対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）のレベルである）を受け取り、
（ｉｉ）（ｉ）の第１のデータ値と対照ＡＤＭＡデータ値（対照ＡＤＭＡデータ値は、複数の対照データ値の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＡＤＭＡのレベルである）とを比較し、
（ｉｉｉ）（ｉ）の第２のデータ値と対照ＳＤＭＡデータ値（対照ＳＤＭＡデータ値は、複数の対照データ値の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＳＤＭＡのレベルである）とを比較する
ことを引き起こす、機械可読命令を含む。
【０２３２】
例示的な態様において、（ｉ）プロセッサは、複数の対照データ値であって、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＡＤＭＡのレベルである、複数の対照データ値を受け取り、複数の対照データ値の平均値を決定し、平均値を対照ＡＤＭＡデータ値として割り当てることができ、（ｉｉ）プロセッサは、複数の対照データ値であって、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＳＤＭＡのレベルである、複数の対照データ値を受け取り、複数の対照データ値の平均値を決定し、平均値を対照ＳＤＭＡデータ値として割り当てることができ、または（ｉｉｉ）これらの組合せである。
【０２３３】
例示的な態様において、プロセッサは、複数の各対照データ値（これは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＡＤＭＡのレベルである）を対照データ値（ＡＤＭＡ）として割り当てる。例示的な態様において、プロセッサは、新規な対照データ値（ＡＤＭＡ）を受け取るたびに、平均値を対照ＡＤＭＡデータ値として計算または再計算する。例示的な態様において、プロセッサは、各対照データ値（ＡＤＭＡ）および各平均値（対照ＡＤＭＡデータ値）を記憶デバイス上に記憶する。
【０２３４】
例示的な態様において、プロセッサは、複数の各対照データ値（これは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＳＤＭＡのレベルである）を対照データ値（ＳＤＭＡ）として割り当てる。例示的な態様において、プロセッサは、新規な対照データ値（ＳＤＭＡ）を受け取るたびに、平均値を対照ＡＤＭＡデータ値として計算または再計算する。例示的な態様において、プロセッサは、各対照データ値（ＳＤＭＡ）および各平均値（対照ＳＤＭＡデータ値）を記憶デバイス上に記憶する。
【０２３５】
代わりのまたはさらなる態様において、本発明のシステムは、プロセッサによって実行されるとき、プロセッサが、
（ｉ）第１のデータ値および第２のデータ値（第１のデータ値は、被験体から得た生物学的試料から決定した非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベルであり、第２のデータ値は、被験体から得た生物学的試料から決定したＬ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）のレベルである）を受け取り、
（ｉｉ）第２のデータ値と第１のデータ値の比（Ｒｔ）と、対照比（Ｒｃ）であって、Ｒｃは、複数の対照比の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＬ−アルギニンのレベルと、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＡＤＭＡのレベルの比である、Ｒｃとを比較し、
（ｉｉｉ）Ｒｔが、Ｒｃ未満であるとき、被験体における拡張機能障害または拡張期心不全の出力診断を提供する
ことを引き起こす、機械可読命令を含む。
【０２３６】
例示的な態様において、プロセッサは、複数の対照比を受け取ることができ、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＬ−アルギニンのレベルと、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＡＤＭＡのレベルの比である。例示的な態様において、プロセッサは、各対照比を対照比として割り当てる。例示的な態様において、プロセッサは、新規な対照比を受け取るたびに、平均対照比を計算または再計算する。例示的な態様において、プロセッサは、各対照比および各平均対照比を記憶デバイス上に記憶する。
【０２３７】
例示的な態様において、プロセッサは、被験体における拡張機能障害の出力診断が提供されるとき、Ｒｔを拡張機能障害の比として割り当て、拡張機能障害の比を記憶デバイス上に記憶する。
【０２３８】
本明細書においてまた提供するのは、プロセッサによって実行可能な機械可読命令をその上に記憶したコンピュータ可読ストレージ媒体である。例示的な実施形態において、機械可読命令は、発明性のあるシステムの上記の指示のいずれかである。例示的な実施形態において、指示は、
（ｉ）プロセッサが、被験体から得た生物学的試料から決定した、（ａ）ＭｙＢＰ−Ｃのレベル、（ｂ）ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態のレベル、または（ｃ）ＭｙＢＰ−Ｃ断片のレベルからなる群より選択されるデータ値を受け取ることを引き起こすための指示；
（ｉｉ）プロセッサが、（ｉ）のデータ値と対応する対照データ値（対応する対照データ値は、複数の対照データ値の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定した、（ａ）ＭｙＢＰ−Ｃ、（ｂ）ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態、または（ｃ）ＭｙＢＰ−Ｃ断片のレベルである）とを比較することを引き起こすための指示、ならびに
（ｉｉｉ）プロセッサが、（ｉ）のデータ値が対応する対照データ値よりも大きいとき、被験体において拡張機能障害または拡張期心不全の出力診断を提供することを引き起こすための指示
を含む。
【０２３９】
例示的な態様において、コンピュータ可読ストレージ媒体は、プロセッサが、複数の対照データ値であって、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定した、（ａ）ＭｙＢＰ−Ｃ、（ｂ）ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態、または（ｃ）ＭｙＢＰ−Ｃ断片のレベルである、複数の対照データ値を受け取り、複数の対照データ値の平均値を決定し、平均値を対応する対照データ値として割り当てることを引き起こすための指示を含む。例示的な態様において、コンピュータ可読ストレージ媒体は、プロセッサが、被験体における拡張機能障害の出力診断が提供されるとき、（ｉ）のデータ値を拡張機能障害データ値として割り当て、拡張機能障害データ値を記憶デバイス上に記憶することを引き起こすための指示を含む。
【０２４０】
代わりのまたはさらなる実施形態において、本発明のコンピュータ可読ストレージ媒体は、プロセッサが、
（ｉ）第１のデータ値および第２のデータ値（第１のデータ値は、被験体から得た生物学的試料から決定した非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベルであり、第２のデータ値は、被験体から得た生物学的試料から決定した対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）のレベルである）を受け取り、
（ｉｉ）（ｉ）の第１のデータ値と対照ＡＤＭＡデータ値（対照ＡＤＭＡデータ値は、複数の対照データ値の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＡＤＭＡのレベルである）とを比較し、
（ｉｉｉ）（ｉ）の第２のデータ値と対照ＳＤＭＡデータ値（対照ＳＤＭＡデータ値は、複数の対照データ値の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＳＤＭＡのレベルである）とを比較し、
（ｉｖ）（ｉ）の第１のデータ値が、対照ＡＤＭＡデータ値よりも大きいとき、および（ｉ）の第２のデータ値が、対照ＳＤＭＡデータ値と概ね同じであるとき、被験体における拡張機能障害または拡張期心不全の出力診断を提供する
ことを引き起こすための指示を含む。
【０２４１】
例示的な態様において、コンピュータ可読ストレージ媒体は、プロセッサが、複数の対照データ値を受け取り（これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＡＤＭＡのレベルである）、複数の対照データ値の平均値を決定し、平均値を対照ＡＤＭＡデータ値として割り当てることを引き起こすための指示を含み、（ｉｉ）プロセッサは、複数の対照データ値であって、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＳＤＭＡのレベルである、複数の対照データ値を受け取り、複数の対照データ値の平均値を決定し、平均値を対照ＳＤＭＡデータ値として割り当てることができ、または（ｉｉｉ）これらの組合せである。
【０２４２】
代わりのまたはさらなる実施形態において、コンピュータ可読ストレージ媒体は、プロセッサが、
（ｉ）被験体から得た生物学的試料から決定したＬ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）のレベルである第３のデータ値を受け取り、
（ｉｉ）第３のデータ値と第１のデータ値の比（Ｒｔ）と、対照比（Ｒｃ）であって、Ｒｃは、複数の対照比の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＬ−アルギニンのレベルと、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＡＤＭＡのレベルの比である、Ｒｃとを比較し、
（ｉｉｉ）Ｒｔが、Ｒｃ未満であるとき、被験体における拡張機能障害または拡張期心不全の出力診断を提供する
ことを引き起こすための指示を含む。
【０２４３】
例示的な態様において、コンピュータ可読ストレージ媒体は、プロセッサが、被験体における拡張機能障害の出力診断が提供されるとき、Ｒｔを拡張機能障害の比として割り当て、拡張機能障害の比を記憶デバイス上に記憶することを引き起こすための指示を含む。
【０２４４】
本明細書においてさらに提供するのは、コンピュータ中のプロセッサによって実装される方法である。例示的な実施形態において、方法は、
（ｉ）被験体から得た生物学的試料から決定した、（ａ）ＭｙＢＰ−Ｃのレベル、（ｂ）ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態のレベル、または（ｃ）ＭｙＢＰ−Ｃ断片のレベルからなる群より選択されるデータ値を受け取る工程と、
（ｉｉ）（ｉ）のデータ値と対応する対照データ値（対応する対照データ値は、複数の対照データ値の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定した、（ａ）ＭｙＢＰ−Ｃ、（ｂ）ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態、または（ｃ）ＭｙＢＰ−Ｃ断片のレベルである）とを比較する工程と、
（ｉｉｉ）（ｉ）のデータ値が対応する対照データ値よりも大きいとき、被験体において拡張機能障害または拡張期心不全の出力診断を提供する工程と
を含む。
【０２４５】
例示的な実施形態において、方法は、
（ｉ）第１のデータ値および第２のデータ値（第１のデータ値は、被験体から得た生物学的試料から決定した非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベルであり、第２のデータ値は、被験体から得た生物学的試料から決定した対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）のレベルである）を受け取る工程と、
（ｉｉ）（ｉ）の第１のデータ値と対照ＡＤＭＡデータ値（対照ＡＤＭＡデータ値は、複数の対照データ値の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＡＤＭＡのレベルである）とを比較する工程と、
（ｉｉｉ）（ｉ）の第２のデータ値と対照ＳＤＭＡデータ値（対照ＳＤＭＡデータ値は、複数の対照データ値の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＳＤＭＡのレベルである）とを比較する工程と、
（ｉｖ）（ｉ）の第１のデータ値が、対照ＡＤＭＡデータ値よりも大きいとき、および（ｉ）の第２のデータ値が、対照ＳＤＭＡデータ値と概ね同じであるとき、被験体における拡張機能障害または拡張期心不全の出力診断を提供する工程と
を含む。
【０２４６】
代わりのまたはさらなる実施形態において、方法は、
（ｉ）第１のデータ値および第２のデータ値（第１のデータ値は、被験体から得た生物学的試料から決定した非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベルであり、第２のデータ値は、被験体から得た生物学的試料から決定したＬ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）のレベルである）を受け取る工程と、
（ｉｉ）第２のデータ値と第１のデータ値の比（Ｒｔ）と、対照比（Ｒｃ）であって、Ｒｃは、複数の対照比の平均であり、これらのそれぞれは、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＬ−アルギニンのレベルと、心不全を患っていないことが既知である被験体から得た生物学的試料から決定したＡＤＭＡのレベルの比である、Ｒｃとを比較する工程と、
（ｉｉｉ）Ｒｔが、Ｒｃ未満であるとき、被験体における拡張機能障害または拡張期心不全の出力診断を提供する工程と
を含む。
【０２４７】
発明性のあるシステム、コンピュータ可読ストレージ媒体、およびコンピュータ中のプロセッサによって実装される方法の例示的な態様において、ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−ＣまたはＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された断片である。
【０２４８】
キット
本明細書において提供するのは、ＭｙＢＰ−Ｃ、その翻訳後に修飾された形態または断片に対して特異的な結合剤または基質を含むキット、例えば、診断キットである。例示的な態様において、ＭｙＢＰ−Ｃの翻訳後に修飾された形態は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−ＣまたはＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された断片である。結合剤がＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加された形態またはＳ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ断片を特異的に認識しないいくつかの態様において、キットは、グルタチオン特異的結合剤を含み得る。いくつかの態様において、結合剤は、抗体、抗原結合断片、アプタマー、ペプチド、または核酸プローブである。例示的な態様において、結合剤は、本明細書に記載されている本発明の結合剤の１つである。例示的な態様において、結合剤は、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃに特異的に結合する。例示的な態様において、ＭｙＢＰ−Ｃは、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、および／またはＣｙｓ７１９の１つまたは複数においてＳ−グルタチオン付加されている。例示的な態様において、ＭｙＢＰ−Ｃは、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ６２３、および／またはＣｙｓ６５１の１つまたは複数においてＳ−グルタチオン付加されている。例示的な態様において、結合剤は、１つまたは複数のＳ−グルタチオン付加されたＣｙｓ残基を欠いているＭｙＢＰ−Ｃに結合しない。例示的な態様において、結合剤は、Ｓ−グルタチオン付加されていないＭｙＢＰ−Ｃに結合しない。例示的な態様において、Ｃｙｓ残基がＳ−グルタチオン付加されていないとき、結合剤は、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、および／またはＣｙｓ７１９の１つまたは複数に結合しない。例示的な態様において、Ｃｙｓ残基がＳ−グルタチオン付加されていないとき、結合剤は、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ６２３、および／またはＣｙｓ６５１の１つまたは複数に結合しない。
【０２４９】
例示的な実施形態において、単離された結合剤は、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープに特異的に結合し、エピトープは、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、および／またはＣｙｓ７１９の１つまたは複数を含む。例示的な実施形態において、単離された結合剤は、ＭｙＢＰ−Ｃ内のエピトープに特異的に結合し、エピトープは、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ６２３、および／またはＣｙｓ６５１の１つまたは複数を含む。例示的な態様において、１つまたは複数のＣｙｓ残基は、Ｓ−グルタチオン付加されている。例示的な態様において、１つまたは複数のＣｙｓ残基がＳ−グルタチオン付加されていないとき、結合剤は、１つまたは複数のＣｙｓ残基に結合しない。代わりの態様において、１つまたは複数のＣｙｓ残基は、Ｓ−グルタチオン付加されておらず、Ｃｙｓ残基がＳ−グルタチオン付加されていないときのみ、結合剤は１つまたは複数のＣｙｓ残基に結合する。
【０２５０】
例示的な実施形態において、単離された結合剤は、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基に特異的に結合し、Ｃｙｓ残基は、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ２３９、Ｃｙｓ２４９、Ｃｙｓ４２６、Ｃｙｓ４３６、Ｃｙｓ４４３、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ５２８、Ｃｙｓ５６６、Ｃｙｓ６２３、Ｃｙｓ６５１、および／またはＣｙｓ７１９である。例示的な実施形態において、単離された結合剤は、ＭｙＢＰ−ＣのＣｙｓ残基に特異的に結合し、Ｃｙｓ残基は、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ６２３、および／またはＣｙｓ６５１である。例示的な態様において、Ｃｙｓ残基は、Ｓ−グルタチオン付加されている。例示的な態様において、結合剤は、Ｃｙｓ残基がＳ−グルタチオン付加されていないときにＣｙｓ残基に結合しない。代わりの態様において、Ｃｙｓ残基はＳ−グルタチオン付加されておらず、Ｃｙｓ残基がＳ−グルタチオン付加されていないときのみ、結合剤はＣｙｓ残基に結合する。
【０２５１】
例示的な態様において、結合剤は、検出可能な標識、例えば、フルオロフォア、発色団、放射性同位体などにコンジュゲートしている。例示的な態様において、結合剤は、酵素または酵素基質にコンジュゲートしている。例示的な態様において、結合剤は、２つの結合パートナーの間に高親和性結合相互作用を有する結合パートナーにコンジュゲートしている。例示的な態様において、結合剤は、アビジンまたはビオチンにコンジュゲートしている。
【０２５２】
例示的な態様において、キットは、一次抗体（例示的な態様において、ＭｙＢＰ−Ｃ、その翻訳後に修飾された形態、またはその断片のための、結合剤である）に結合する二次抗体を含む。いくつかの態様における二次抗体は、検出可能な標識（例えば、フルオロフォア、発色団、放射性同位体など）、酵素、酵素基質、２つの結合パートナーの間に高親和性結合相互作用を有する結合パートナー（例えば、アビジン、ビオチン）にコンジュゲートしている。
【０２５３】
例示的な態様において、キットは、免疫測定のためのさらなる成分、例えば、マイクロタイタープレート、ビーズ、ブロッキング溶液、チューブ、フラスコ、膜、フィルター、洗浄溶液、酵素、酵素基質、検出可能な標識を含む。
【０２５４】
例示的な態様において、キットは、ＥＬＩＳＡ、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡのための成分を含む。例えば、キットは、マイクロタイタープレート、ＭｙＢＰ−Ｃ特異的抗体、抗グルタチオン特異的抗体、二次抗体、洗浄溶液、ブロッキング溶液、および増強された化学発光（ＥＣＬ）キットを含み得る。
【０２５５】
発明性のあるキットの代わりのまたはさらなる実施形態において、キットは、ＡＤＭＡのための結合剤および／またはＳＤＭＡのための結合剤を含む。例示的な態様において、ＡＤＭＡに対して特異的な結合剤、および／またはＳＤＭＡのための結合剤は、抗体である。
【０２５６】
いくつかの態様において、結合剤（複数可）は、固体支持体、例えば、ビーズ、ウェル、ディッシュ、チューブ、濾紙、膜などに結合する。他の態様において、結合剤は、溶液で提供される。さらにさらなる態様において、結合剤は、凍結乾燥した形態で提供される。
【０２５７】
いくつかの態様において、キットは、ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその断片をコードする遺伝子またはｍＲＮＡに特異的に結合する核酸プローブのコレクションを含む。いくつかの態様において、核酸プローブのコレクションは、固体支持体、例えば、遺伝子チップ上にアレイでフォーマットされる。
【０２５８】
いくつかの態様において、キットは、使用説明書、例えば、本発明の方法を行うための指示をさらに含む。いくつかの態様において、指示は、指示の紙のコピー、指示の電子コピー、例えば、コンパクトディスク、フラッシュドライブ、または他の電子媒体として提供される。いくつかの態様において、指示は、インターネットサイトへ指図を提供することを通して提供され、ここでユーザーは指示にアクセスし得る。
【０２５９】
いくつかの態様において、指示は、ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片のレベル、データの間の相関データを含有するデータベース、および拡張期心不全の診断に関するデータを、ユーザーが比較する工程を含む。いくつかの態様において、キットは、ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片のレベル、および拡張期心不全の診断に関するデータの間の相関データを含有するデータベースの電子コピーを含む。いくつかの態様において、キットは、ユーザーが、ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片のレベルと、対照被験体のレベルとを比較することを可能とする、コンピュータソフトウェアプログラムの電子コピーを含む。例示的な態様において、キットは、本発明のシステムまたはコンピュータ可読ストレージ媒体を含む。
【０２６０】
代わりの態様において、指示は、ユーザーが、ＭｙＢＰ−Ｃ、またはその翻訳後に修飾された形態もしくは断片のレベルに関するデータをプロバイダーに提供し、プロバイダーが、データを分析した後、診断情報をユーザーに提供する工程を含む。
【０２６１】
いくつかの態様において、キットは、被験体の試料、例えば、本明細書に記載されている試料のいずれかを集めるためのユニットをさらに含む。いくつかの態様において、試料を集めるためのユニットは、バイアル、ビーカー、チューブ、マイクロタイタープレート、ペトリ皿、バッグ、カップなどである。
【０２６２】
決してその範囲を限定するためでなく、本発明を単に例示するため、下記の実施例を提示する。
【実施例】
【０２６３】
（実施例１）
下記の実施例は、拡張機能障害を有する動物におけるミオシン結合タンパク質Ｃのグルタチオン付加における有意な増加を示す。
【０２６４】
ＤＯＣＡ−塩マウスモデルの生成：従前、本発明者らは、このモデルは軽度の高血圧、心筋の酸化ストレス、および拡張機能障害に至ることを示した。血圧の徐々で軽度の上昇は、片側腎摘出術、制御放出の酢酸デオキシコルチコステロン（ＤＯＣＡ）ペレット（０．７ｍｇ／ｄ；Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ）の皮下埋込、および飲料水を１．０５％食塩水で置換することによって誘発された。シャム手術を受けた対照動物は、プラセボペレットの埋込を有し、塩を含まない水を受けた。
【０２６５】
ＤＯＣＡ−塩および対照マウスについて、侵襲的血行動態研究、非侵襲的心エコー法、および筋細胞単離を、術後１４〜１８日目に行った。全ての実験は、イリノイ大学シカゴ校の動物実験委員会によって承認された。
【０２６６】
ラノラジンの慢性投与：５ｍｇのラノラジン、０．３ｍｇのＰ４５０阻害剤、および０．２５ｍｇの赤色食品色素を含有する特別食餌を、１ｇの栄養的に完全な穀物をベースとする錠剤（Ｈａｒｌａｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中にプレスした。対照食餌は、同じタイプの１ｇの錠剤中にプレスした０．３ｍｇのＰ４５０阻害剤および０．２５ｍｇの黄色食品色素を含有した。ＤＯＣＡ−塩およびシャムマウスは、術後１１〜１８日目から約１ｇの特別な食餌を毎日消費した。
【０２６７】
翻訳後修飾の分析：除膜線維を１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と共に、振盪機上での３０分間のインキュベーション、それに続くインキュベーション間に３０秒のボルテックスを伴う超音波処理浴中での２サイクルの１０分のインキュベーションによって、１５μＬの試料緩衝液（８Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、０．０５Ｍのトリス（ｐＨ６．８）、７５ｍＭのＤＴＴ、３％ＳＤＳ、および０．０５％ブロモフェノールブルー）に可溶化した。試料を１００℃で３分間加熱し、１０分のスピン清澄の後に、上清の全てを１２％分解１Ｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に添加した。ゲルを、Ｔｙｐｈｏｏｎ９４１０スキャナー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるイメージングに先行して、メーカーの推奨によってＰｒｏ−Ｑ  Ｄｉａｍｏｎｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色および脱染色した。タンパク質の光学密度をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ソフトウェアを使用して決定し、Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ  Ｒ−２５０染色ゲルを使用して、タンパク質添加をアクチンおよび全レーンの両方に対して正規化した。結果をＥｘｃｅｌにエクスポートし、ＪＭＰ統計ソフトウェア（Ｃａｒｙ、ＮＣ）で分析した。
【０２６８】
ウエスタンブロット分析を使用して、グルタチオン付加されたタンパク質を検出した。筋原線維をＤＯＣＡおよびシャムマウス心臓から調製し、ペレットを非還元性２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．００４％ブロモフェノールブルー、および０．１２５ＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ６．８））に可溶化した。２５ｍＭのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を、標準的硬直緩衝液（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を有する）、標準的硬直洗浄緩衝液および２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に加えた。ＲＣ−ＤＣ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）アッセイから決定したタンパク質濃度を使用して、４０μｇの総タンパク質を１Ｄ１２％分解ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに加え、０．２μＭのポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上に移した。ブロットを２．５ｍＭのＮＥＭを有する５％脱脂粉乳中で１時間ブロックした。１：１００，０００希釈での抗マウスＨＲＰ−コンジュゲート二次抗体（Ｓｉｇｍａ）と共に、抗グルタチオンマウスモノクローナル一次抗体（Ｖｉｒｏｇｅｎ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）を１：１０００希釈で使用し、Ｓ−グルタチオン付加を検出した。バンドの光学密度をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で測定し、さらなる分析のためにＥｘｃｅｌにエクスポートした。ミオシン結合タンパク質Ｃへの抗体を、修飾されていると同定されているバンドの同定のために使用した。
【０２６９】
米国特許仮出願第６１／５４４，０３０号（２０１１年１０月６日に出願）、米国特許仮出願第６１／６１８，９００号（２０１２年４月２日に出願）、およびＬｏｖｅｌｏｃｋら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ、１１０巻（６号）：８４１〜８５０頁（ｅ−ｐｕｂ、２０１２年２月１６日）において報告されているように、本発明者らは、拡張機能障害を有する動物におけるミオシン結合タンパク質Ｃのグルタチオン付加における有意な増加を示した。図１は、シャムおよびＤＯＣＡ−塩心臓からの筋フィラメントの翻訳後修飾を示すこの公開資料からのデータを表す。図１Ａ：シャムおよびＤＯＣＡ−塩で処置された心臓からの筋フィラメント試料を比較したときの、グルタチオン付加されたタンパク質の検出を示すウエスタンブロット分析。ブロットをまたミオシン結合タンパク質Ｃについて分析したが、このタンパク質が主要な修飾であったことを示した。一対の比較が、ゲルから除去されたことを留意されたい。図１Ｂ：シャムおよびＤＯＣＡ−塩筋フィラメントにおけるミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭｙＢＰ−Ｃ）に対して正規化したグルタチオン付加されたタンパク質（ＧＳＨ）の間の差異の定量化。（＊ｐ＜０．０５、ｎ＝３）。
【０２７０】
（実施例２）
ＤＯＣＡ−塩マウスモデルの生成：
従前、本発明者らは、ＤＯＣＡ−塩マウスモデルが、軽度の高血圧、ＮＯＳアンカップリング、心筋の酸化ストレス、および拡張機能障害に至ることを示した［１０］。血圧の徐々で軽度の上昇は、片側腎摘出術、制御放出の酢酸デオキシコルチコステロン（ＤＯＣＡ）ペレット（０．７ｍｇ／ｄ；Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ）の皮下埋込、および飲料水を１．０５％食塩水で置換することによって誘発された。対照動物はシャム手術を受け、プラセボペレットを埋め込まれ、塩を有さない水を受けた。
【０２７１】
ＢＨ４の投与：
マウスを、対照食餌を受ける２つの群（シャム、Ｎ＝７；ＤＯＣＡ−塩、Ｎ＝１０）、および５ｍｇのＢＨ４／日のＢＨ４補充食餌を受ける２つの群に分割した（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｉｎｃ、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ；シャム＋ＢＨ４、Ｎ＝８；ＤＯＣＡ−塩＋ＢＨ４、Ｎ＝８）。補充食餌は手術の１１日後に開始し、１８日目まで継続し、この時点でマウスを分析し、屠殺した。
【０２７２】
ウエスタン免疫ブロット法によるサルコメアタンパク質グルタチオン付加の分析：
筋原線維をＤＯＣＡ−塩およびシャムモデルの心臓から調製し、ペレットを非還元性２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．００４％ブロモフェノールブルー、および０．１２５ＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ６．８））に可溶化した。２５ｍＭのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を、標準的硬直緩衝液（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を有する）、標準的硬直洗浄緩衝液および２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に加えた。［２１］ＲＣ−ＤＣ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）アッセイから決定したタンパク質濃度を使用して、４０ｐｇの総タンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに加え、０．２ｐｍのＰＶＤＦ膜上に移した。ブロットを２．５ｍＭのＮＥＭを有する５％脱脂粉乳中で１時間ブロックした。１：１００，０００希釈での抗マウスＨＲＰコンジュゲート二次抗体（Ｓｉｇｍａ）と共に、抗グルタチオンマウスモノクローナル一次抗体（Ｖｉｒｏｇｅｎ）を１：１０００希釈で使用し、Ｓ−グルタチオン付加を検出した。バンドの光学密度をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で測定し、さらなる分析のためにＥｘｃｅｌにエクスポートした。
【０２７３】
統計解析：
心エコー法、単離した心筋細胞、除膜線維張力、ＡＴＰアーゼ測定、および筋フィラメントタンパク質の翻訳後修飾データを、一元配置または二元配置ＡＮＯＶＡ、それに続いてスチューデントｔ検定を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍまたはＪＭＰ統計ソフトウェアを使用して統計的に分析した。Ｃａ２＋および張力またはＡＴＰアーゼ活性の間の関係の分析を、従前記載した通り修正したヒルの式を使用してフィットさせた。ＭｙＢＰ−Ｃのグルタチオン付加および心エコーのＥ／Ｅ’比の間の関係の分析は、線形回帰分析において相関した。Ｐ＜０．０５の値は、有意に異なると考えられた。データは平均±ＳＥＭとして示す。
【０２７４】
ミオシン結合タンパク質Ｃ翻訳後修飾
ＤＯＣＡ−塩マウスからの心臓の筋フィラメントにおけるＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加の増加を示す本発明者らの以前の知見を考慮して、本発明者らは、ＢＨ４食餌がこの修飾を逆転させることができるかどうかを決定した。代表的なゲルおよび総タンパク質添加量に対して正規化したプロットデータを図２に示す。ＭｙＢＰ−Ｃのグルタチオン付加は、全ての他の群（互いに有意差があるとはいえなかった）と比較して、ＤＯＣＡ−塩群において有意に増加した。
【０２７５】
図３Ａ〜３Ｄにおいて示したデータにおいて、本発明者らは、正規化したＭｙＢＰ−Ｃのグルタチオン付加に応じた、拡張機能パラメーター（Ｅ／Ｅ’またはＥ’／Ａ’比）をプロットした。図３ＡおよびＢに示すように、Ｅ／Ｅ’比は、ＭｙＢＰ−Ｃのグルタチオン付加と有意に正相関した（勾配＝３．２３±０．９０、Ｒ２＝０．３０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。その上、ＴＤＩ  Ｅ’／Ａ’比は、ＭｙＢＰ−Ｃのグルタチオン付加と逆相関した（勾配＝−０．０８±０．０２、Ｒ２＝０．２５７、＊＊Ｐ＜０．０１）。筋フィラメントの張力損失はまた、ＭｙＢＰ−Ｃのグルタチオン付加およびＥ／Ｅ’、心エコーのデータの両方と逆に相関した。
【０２７６】
手術の１０日後に、本発明者らは心エコー法を用い、拡張機能障害を特徴付けた。Ｖｅｖｏ７７０高解像度ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム（Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｏｎｉｃｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、僧帽弁パルス波ドプラ流および組織ドプライメージング（ＴＤＩ）を行った。拡張機能の測定が心拍数および添加量条件に対して感受性であるため、概ね３５０〜３９０拍／分の心拍数が達成されるまでマウスを１〜１．５％イソフルランで麻酔した。乳頭中央レベルにおける傍胸骨長軸像および左心室（ＬＶ）短軸像のＭモード像を取った。測定は、呼気の間の５回の連続した拍動から平均化した。各マウスについての像を、少なくとも５秒間（３０〜４０回の心臓周期）記録し、そこから最も高い質のイメージングの３〜５の代表的な周期を選択した。短縮パーセント（ＦＳ％）は、１００×（ＬＶＥＤｄ）−（ＬＶＥＳｄ）／（ＬＶＥＤｄ）として計算し、ＬＶ駆出分画パーセント（ＥＦ％）は、１００×［（７／２．４＋ＬＶＥＤｄ）×ＬＥＤｄ３］−［（７／２．４＋ＬＶＥＳｄ）×ＬＶＥＳｄ３］／［（７／２．４＋ＬＶＥＤｄ）×ＬＥＤｄ３］として計算した。心尖部四腔断層像における拡張期充満プロファイルのために、ドプラ測定を僧帽弁尖先端において行った。僧帽弁流入速度、早期ピーク（Ｅ）および後期ピーク（Ａ）を、通常のパルス波ドプラによって測定した。ＴＤＩを使用して、僧帽弁輪の縦速度（Ｓｍ、Ｅ’、およびＡ’）を決定した。処置前のベースライン像を得て、ＤＯＣＡ−塩マウスにおける拡張機能障害を確認した。続いて、マウスにＢＨ４を与え、それに続いて１８日目に心エコー法を行った。
【０２７７】
ＢＨ４補充食餌による処置を術後１１日目に開始し、心エコー法を術後１８日目に繰り返した。結果は図３および表１において見ることができる。シャムおよびＤＯＣＡ−塩における７日のＢＨ４投与は、ＬＶ駆出分画（図３Ｇ）または短縮率（図３Ｈ）に影響を与えなかった。
【０２７８】
僧帽弁ドプラ流を、全てのマウスにおいて同程度の心拍数（平均約３７０拍／分）で測定した。本発明者らがこのモデルにおいて報告してきたように、僧帽弁Ｅ速度、Ａ速度、およびＥ／Ａ比は、全ての群において有意に変化しなかった（図３Ｉおよび３Ｌ）。それにも関わらず、僧帽弁組織ドプラＥ’は、ＤＯＣＡ−塩マウスにおいて有意に減少したが、これは準正常拡張機能障害ステージを示す。Ｅ’Ａ’の比は、ＤＯＣＡ−塩マウスにおいて有意に減少し、ＢＨ４処置によって回復した（ＤＯＣＡ−塩＋ＢＨ４、１．１２±１．１０、それに対してＤＯＣＡ−塩、０．７４±０．０５、Ｐ＜０．００１）。シャムおよびシャム＋ＢＨ４群は、Ｅ’／Ａ’において有意差を示さなかった（図３Ｊおよび３Ｍ）。Ｅ／Ｅ’比、左心房圧の測定値は、ＤＯＣＡ−塩マウスにおいて有意に増加し、ＢＨ４投与の後に対照レベルに回復した（図３Ｋ、ＤＯＣＡ−塩＋ＢＨ４、３４．５±２．２、それに対してＤＯＣＡ−塩、４３．７±２．７、Ｐ＜０．０１）。
【０２７９】
（実施例３）
ＤＯＣＡ−塩マウスまたはシャム対照マウス血漿を集め、グルタチオン−特異的抗体を有する試料を免疫沈降させ、それに続くＭｙＢＰ−Ｃ−特異的抗体によるウエスタンブロッティングによって、グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃおよびそのグルタチオン付加された断片のレベルを測定した。図４は、ＭｙＢＰ−Ｃの総血清レベルが増加し、インタクトまたは完全長のグルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ（１４４ｋＤ）がＤＯＣＡ−塩ＤＤマウス（Ｎ＝４）の血漿中で増加したことを示す。ＭｙＢＰ−Ｃのグルタチオン付加された４０ｋＤの断片およびグルタチオン付加された１５〜２０ｋＤａの断片はまた、シャム対照マウスと比較して、ＤＯＣＡ−塩マウスの血漿中で上昇した。
【０２８０】
（実施例４）
合計でＮ＝１２０人の被験体（３群（収縮期ＨＦ、拡張期ＨＦおよび健康な対照患者）のそれぞれにおいてＮ＝４０人）からの血漿を集める。試料が各群において２０人の患者について利用できるときに中間分析を行い、より大きなコホートに継続するかどうかを決定する。潜在的な被験体は、イリノイ大学シカゴ校およびＪｅｓｓｅ  Ｂｒｏｗｎ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｆｆａｉｒｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒによって追跡される数千人の患者のコホートからである。適格性基準には、１）年齢１８歳以上、および２）この１年間心エコー図によって実証されるＳＤまたはＤＤ心不全を有することが含まれる。非適格性基準には、先天性心疾患、先天性不整脈障害の既往、がん処置を受けている患者が含まれる。登録した全ての患者は、書面による同意を提出する。
【０２８１】
データは、被験体の問診、ならびに病院および診療所カルテの調査から集める。得た人口統計データは、年齢、人種、肥満度指数、ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）の機能クラス、および従前の心筋梗塞、高血圧症、糖尿病、喫煙、またはアルコール使用の既往を含む。さらに、登録時に摂取している全ての医薬品、ならびにＥＦ決定のデータおよび方法を記録する。
【０２８２】
単一の採血を、登録の時に行う。ＭｙＢＰ−Ｃのグルタチオン付加を、非還元条件下で測定する。全ての患者試料は、本発明者らの動物試験と同様の様式で加工する。
【０２８３】
０．０５の両側αレベルおよび０．８０の検定検出力で、予備的動物データの平均値および標準偏差に基づいて必要とされる試料サイズは、群毎に約３０人の被験体であることを検出力分析は示す。６つまでの共変数を補正するための十分な数を有するために、４０人の患者が各群にいる。
【０２８４】
血漿ＭｙＢＰ−Ｃのグルタチオン付加の分析：
群からの血漿試料を集め、ウエスタンブロット分析を使用して、ＭｙＢＰ−ＣおよびＳ−グルタチオン付加を以下の通りに検出する。
【０２８５】
血漿ＭｙＢＰ−Ｃのグルタチオン付加の分析：
群からの血漿試料を集め、還元性および非還元性アリコートに分割する。還元性試料は、還元性２×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（２％β−メルカプトエタノール、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．００４％ブロモフェノールブルー、および０．１２５ＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ６．８））中で調製し、５分間９５℃で煮沸する。グルタチオン付加についての非還元性試料は、２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（２５ｍＭのＮ−エチルマレイミド、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．００４％ブロモフェノールブルー、および０．１２５ＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ６．８））中で調製する５。血漿試料を、４〜２０％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、ニトロセルロースブロットに移す。ブロットを、２．５ｍＭのＮＥＭを有する５％脱脂粉乳中で１時間ブロックする。１：２０，０００希釈での抗マウスＨＲＰコンジュゲート二次抗体（Ｓｉｇｍａ）と共に、抗グルタチオンモノクローナル一次抗体（Ｖｉｒｏｇｅｎ）または抗ＭｙＢＰ−Ｃ抗体を１：１０００〜１：５０００希釈で使用し、ＭｙＢＰ−ＣまたはＳ−グルタチオン付加を検出する５。バンドの光学密度を、Ｉｍａｇｅ  Ｊで測定する。
【０２８６】
データ分析および予測結果：
グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃのレベルを、対照、ＤＤ、およびＳＤ患者の間で比較する。グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−ＣはＤＤ患者において最も高いことが予想される。ベースラインデータは、連続変数については平均±ＳＤ、およびカテゴリー変数については度数として表す。群の間のベースライン特性の差異を、それぞれ、カテゴリー変数および連続変数についてのフィッシャー直接検定およびマン−ホイットニー検定の使用によって調査する。回帰を使用して、独立変数について調節し、ここでは分布は群間でバランスを取らない。変数減増手順を使用する。結果を、変数増減手順と比較する。多重共線性の可能性を評価する。線形および非線形条件を考える。モデルの識別を、全体的なＣ指数によって評価し、ブートストラップ方法によって検証する。非線形性が検出される場合、変数の変換または非線形モデルのフィッティングを試み、条件をモデルのこれらの改善について評価する。可変分布の正規性を、正規確率プロットによって、およびシャピロ−ウィルク検定によって検定する。これに関して回帰が違反に対してかなり寛大である一方、変換を必要に応じて調査する。等分散性を、残差対予測値のプロットによって評価する。仮定が破られたように見える場合、ノンパラメトリック法を考える。
【０２８７】
データ分析および予測結果：
グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃのレベルを、上記に記載したような統計解析を使用して、対照、ＤＤ、およびＳＤ患者の間で比較する。グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃは、ＤＤ患者において最も高いことが予測される。
【０２８８】
（実施例５）
この実施例は、ＤＯＣＡ−塩マウス血漿試料中のＳ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃの増加を示す。
【０２８９】
血漿試料を、非還元条件下でシャムまたはＤＯＣＡ−塩マウスから集めた。試料をグルタチオン−特異的抗体で免疫沈降を行い、ＭｙＢＰ−Ｃ−特異的抗体でウエスタンブロットした。
【０２９０】
グルタチオン付加されたインタクトなＭｙＢＰ−Ｃ（１４４ｋＤａ）、およびそのグルタチオン付加された断片（７５ｋＤａおよび２５ｋＤａ）の血漿レベルは、ＤＯＣＡ−塩マウスにおいて有意に増加した。図５に示すように、グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃの７５ｋＤａの断片は、シャム対照マウスと比較してＤＯＣＡ−塩マウスにおいて有意に増加した（３．７±０．６倍、Ｐ＝０．０１１、Ｎ＝３）。データは、平均±ＳＥＭとして表した。対応のないスチューデントｔ検定においてＰ＜０．０５。
【０２９１】
（実施例６）
保全された左心室機能を有する拡張機能障害患者からの血漿を集めた。試料を、ＭｙＢＰ−Ｃ−特異的抗体でウエスタンブロットした。図６Ａに示すように、ＭｙＢＰ−Ｃの７５ｋＤａの断片は、保全された駆出分画を伴う心不全（ＨＦｐＥＦ）患者（すなわち、保全された左心室機能を有する拡張機能障害患者）からの血漿中で有意に上昇した（２．６±０．６倍、Ｐ＜０．０５、Ｎ＝８）。
【０２９２】
健康な患者群またはＨＦｐＥＦ群からの同等の容量の血漿試料を、グルタチオン−特異的抗体で免疫沈降を行い、次いで抗ＭｙＢＰ−Ｃ抗体で免疫ブロットした。図６Ｂに示すように、ＨＦｐＥＦ患者の血漿からのグルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃの７５ｋＤａの断片は、健康な患者と比較して有意に増加した（２．５±０．３倍、Ｐ＜０．０５、Ｎ＝８）。ｉｍａｇｅ  Ｊから取得したデンシトメトリーデータは、平均±ＳＥＭとして表した。対応のないスチューデントｔ検定においてＰ＜０．０５。
【０２９３】
（実施例７）
この実施例は、ＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加の増加が拡張機能障害の代表的なものであることを示し、拡張機能障害の処置がＳ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃレベルの後退をもたらすことを示唆する。
【０２９４】
マウスからのＤＯＣＡ−塩およびシャム心臓におけるＳ−グルタチオン付加レベルは、ラノラジンの慢性投与の後、または慢性投与を伴わずに決定した。ラノラジンのマウスへの投与および翻訳後修飾の分析は、実施例１において本質的に記載したように分析した。
【０２９５】
ＭｙＢＰ−ＣのＳ−グルタチオン付加の変化を示す代表的なゲルを、図７Ａに示す。ＭｙＢＰ−Ｃのグルタチオン付加は、全ての他の群と比較してＤＯＣＡ−塩群において有意に増加した。ラノラジンを投与したときに、ＭｙＢＰ−Ｃのグルタチオン付加の後退したレベルが、ＤＯＣＡ−塩動物において観察された。
【０２９６】
（実施例８）
この実施例は、ＤＯＣＡ−塩マウスにおけるＳ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃの増加が、このタイプの翻訳後修飾に特異的であり、またこのタンパク質に特異的であることを示す。
【０２９７】
それぞれ、実施例１および２において本質的に記載されているように、ＤＯＣＡ−塩またはシャムマウスに、ラノラジンまたはＢＨ４を投与した。Ｐｒｏ−Ｑ  Ｄｉａｍｏｎｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ゲル染色を使用して、ＭｙＢＰ−Ｃのリン酸化状況における変化を検出した。筋原線維は、マウス心臓のＤＯＣＡ−塩およびシャムモデルから調製し、ペレットを非還元性２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．００４％ブロモフェノールブルー、および０．１２５ＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ６．８））に可溶化した。２５ｍＭのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を、標準的硬直緩衝液（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を有する）、標準的硬直洗浄緩衝液、および２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に加えた。ＲＣ−ＤＣアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、タンパク質濃度を決定した。試料を還元性試料緩衝液（８Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、０．０５Ｍのトリス（ｐＨ６．８）、７５ｍＭのＤＴＴ、３％ＳＤＳ、および０．０５％ブロモフェノールブルー）中にて１：１比で希釈し、概ね１０μｇのタンパク質を１２％分解１Ｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に添加した。ゲルを、Ｔｙｐｈｏｏｎ９４１０スキャナー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるイメージングの前に、メーカーの推奨によってＰｒｏ−Ｑ  Ｄｉａｍｏｎｄで染色および脱染色した。クーマシーＲ−２５０染色を使用して、タンパク質添加をアクチンおよび全レーンの両方に対して正規化した。タンパク質の光学密度をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ソフトウェアを使用して決定し、さらなる分析のために結果をＥｘｃｅｌにエクスポートした。
【０２９８】
図８Ａに示すように、シャムおよびＤＯＣＡ−塩マウスにおいてＭｙＢＰ−Ｃのリン酸化のレベルにおいて変化はなかった。ラノラジンまたはＢＨ４によるマウスの処置はまた、ＭｙＢＰ−Ｃのリン酸化レベルに影響を与えなかった（図８Ａおよび８Ｂ）。したがって、ＤＯＣＡ−塩マウスにおいて観察されたＳ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃレベルの増加と対照的に、ＭｙＢＰ−Ｃのリン酸化は、健康な動物および拡張機能障害の動物モデルにおいて変化しない。
【０２９９】
（実施例９）
この実施例は、ＭｙＢＰ−Ｃ上のＳ−グルタチオン付加の部位を示す。
【０３００】
タンデム質量分析法を使用して、１４０ｋＤａのバンドをｃＭｙＢＰ−Ｃとして同定し、グルタチオン付加の部位は、６５５、４７９、および６２７位におけるシステインと決定した。８％非還元性１Ｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを上記のように実施し、メーカーのプロトコルによってＩｍｐｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ）で染色した。１４０ｋＤａ前後のバンド（ＭｙＢＰ−Ｃ）をゲルから切り取り、Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｇｏｌｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によるゲル内消化に供した。還元およびアルキル化ステップを省略し、タンパク質のＳ−グルタチオン付加を保全した。プールした消化抽出物をＳｐｅｅｄ  Ｖａｃによって２０μｌ未満まで濃縮し、移動相溶液（５％ＡＣＮおよび０．１％ギ酸）で４０μｌにした。ペプチドを０．２２μｍのＰＶＤＦ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣスピンフィルターで濾過し、３５μｌの試料をＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＴＱ  ＦＴハイブリッドリニアイオントラップ−Ｄｉｏｎｅｘ  Ｕ３０００ナノＬＣにカップリングしたフーリエ変換ＩＣＲ質量分析計で分析した。Ｄｉｏｎｅｘ  ａｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ１００  Ｃ１８トラッピングカラム（５μｍの１００Ａ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８材料を充填した５００μｍ×５ｍｍのカラム）を使用して５０μｌ／分の流量で試料を濃縮し、０．２５０μｌ／分の流量での分離のためにＡｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ−Ｃ１８Ｎａｎｏｆｌｏｗカラム（３．５μｍのＣ１８材料を充填した７５μｍ×１５０ｍｍのカラム）を使用した。ペプチドを、Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ未コーティングＳｉｌｉｃａＴｉｐｓ（商標）（５ｃｍ長、チュービングＯＤ３６０／７５μｍ、チップＩＤ８μｍ）を通して５〜４５％の溶液Ｂ（９５％ＡＣＮ、０．１％ギ酸）の線形勾配で溶出した。ペプチドを、１．０ｋＶに設定したＬＴＱ電源電圧、および２００℃に設定したキャピラリー温度によるエレクトロスプレーイオン化によってイオン化した。質量スペクトルは、５０，０００の解像度で４００〜１８００のｍ／ｚ範囲に亘り陽イオンモードで得て、１０の最も強力なイオンをタンデムＭＳのために選択した。ＭＳ／ＭＳは、必要とされる最小シグナル５０００、分離幅３、および正規化した衝突エネルギーを伴う衝突誘起解離モードで得た。
【０３０１】
質量分析法データを、生ファイルとしてＸｃａｌｉｂｕｒ２．０．７ソフトウェアで集め、これをＭａｓｓＭａｔｒｉｘ  ＭＳデータファイル変換ツールを使用してｍｚＸＭＬおよびＭＧＦファイルに変換した。Ｍａｓｃｏｔサーチエンジンを使用して、ＭＳ／ＭＳデータを分析した。ＮＣＢＩｎｒ  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓおよびデコイ（自動的に生成される逆のタンパク質配列）データベース（±１５ｐｐｍのペプチド許容誤差を伴う）を使用してサーチを行った。可変修飾をグルタチオン（Ｃ）に設定した。結果は、３回の同様および別々の質量分析法の実施を表す。
【０３０２】
タンデム質量分析法を使用して、グルタチオン付加されたタンパク質を同定し、ｃＭｙＢＰ−Ｃのグルタチオン付加の部位を決定した。約１４０ｋＤａのバンドのＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって生じる質量スペクトルは、４３〜５０％の配列包括度でミオシン結合タンパク質Ｃ、心臓型（ｇｉ｜１３４０３１９４７）を第１番のヒットとして同定した。ｃＭｙＢＰ−Ｃのトリプシンペプチドを、３０５Ｄａの質量シフトについて分析したが、ペプチド残基の１つへのＧＳＨの共有結合的付着を示した。３つの別々のペプチド（６５１ＩＨＬＤＣＰＧＳＴＰＤＴＩＶＶＶＡＧＮＫ６７０、４７５ＶＥＦＥＣＥＶＳＥＥＧＡＱＶＫ４８９、および６０５ＬＴＩＤＤＶＴＰＡＤＥＡＤＹＳＦＶＰＥＧＦＡＣＮＬＳＡＫ６３２）が、グルタチオン付加されていることが見出された（表２）。筋原線維を１ｍＭのＧＳＳＧで処置したとき、ペプチド６５１ＩＨＬＤＣＰＧＳＴＰＤＴＩＶＶＶＡＧＮＫ６７０のみが、ｃｙｓ６５５においてグルタチオン付加されていることが見出された。ｍ／ｚ６７９．３５３＋において観察された修飾されていない前駆体ペプチドと比較して、三重荷電グルタチオン付加されたペプチドについての前駆体イオンは、ｍ／ｚ７８１．０４３＋において観察された。グルタチオン付加されたおよび修飾されていないペプチドの選択したｂおよびｙプロダクトイオンの間の比較は、３０５Ｄａ（単荷電イオン）または１５２．５Ｄａ（二重荷電イオン）の質量シフトを示す。５ｍＭのＧＳＳＧの処置によって、本発明者らは、上記のペプチドの３つ全てが、ｃｙｓ６５５、ｃｙｓ４７９、およびｃｙｓ６２７においてグルタチオン付加されていることを同定した。４７５ＶＥＦＥＣＥＶＳＥＥＧＡＱＶＫ４８９三重荷電グルタチオン付加されたペプチドは、ｍ／ｚ６６３．２８３＋において観察され、６０５ＬＴＩＤＤＶＴＰＡＤＥＡＤＹＳＦＶＰＥＧＦＡＣＮＬＳＡＫ６３２グルタチオン付加された前駆体ペプチドは、ｍ／ｚ１０９８．４９３＋において観察された。０．１未満の予想値は、それぞれの個々のペプチドの有意な同定であると考えた。グルタチオン付加されたｃＭｙＢＰ−Ｃペプチドの有意な同定は、対照の処置されていない筋原線維試料において行われなかった。
【０３０３】
【表２】
2014531605.tif 000013
【０３０４】
心臓のＭｙＢＰ−Ｃ（ＮＣＢＩ参照配列ＣＡＡ５８８８２．１；配列番号２１）のヒト配列への、配列６５１ＩＨＬＤＣＰＧＳＴＰＤＴＩＶＶＶＡＧＮＫ６７０、４７５ＶＥＦＥＣＥＶＳＥＥＧＡＱＶＫ４８９、および６０５ＬＴＩＤＤＶＴＰＡＤＥＡＤＹＳＦＶＰＥＧＦＡＣＮＬＳＡＫ６３２のアラインメントは、ヒト心臓のＭｙＢＰ−ＣにおけるＳ−グルタチオン付加されたＣｙｓ残基が、配列番号２１のアミノ酸位置番号付けにしたがう、Ｃｙｓ４７５、Ｃｙｓ６２３、およびＣｙｓ６５１であることを示唆した。
【０３０５】
（実施例１０）
この実施例は、拡張機能障害の患者における非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のレベルの増加を示す。
【０３０６】
ＮＯＳアンカップリングは、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）によって増強される。本発明者らは、血漿ＡＤＭＡの上昇がＮＯＳ機能障害および拡張期心不全（ＤＨＦ）の一因となることができると仮説を立てた。
【０３０７】
血漿ＡＤＭＡ、Ｌ−アルギニン、および対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）レベルを、ＤＨＦを有する患者、収縮期ＨＦ（ＳＨＦ）を有する患者からの、および健康な対照群からのヒト血漿試料から決定した。レベルはＥＬＩＳＡによって決定した。図９Ａに示すように、血漿ＡＤＭＡレベルは、対照群（０．５７±０．０２μＭ）と比較して、ＤＨＦ患者（０．７７±０．０４μＭ、Ｐ＜０．０５）およびＳＨＦ患者（０．６８±０．０３μＭ、Ｐ＜０．０５）の両方において上昇した。血漿ＳＤＭＡおよびＬ−アルギニンレベルは、任意の群において変化を示さなかった（図９Ｂおよび９Ｃ）。図９Ｄに示すように、Ｌ−アルギニン／ＡＤＭＡの比は、ＤＨＦ群において有意に低減した（１３９．５±９．５、Ｐ＜０．０５）が、ＳＨＦ群において有意に低減しなかった。
【０３０８】
急性ＨＦ患者および慢性ＨＦ患者の血漿を分析した。ＡＤＭＡレベルは、対照と比較して、両方の患者群（急性および慢性ＨＦ患者）の血漿中で増加した（０．７１±０．０３μＭ、Ｐ＜０．０５、急性；０．７４±０．０３μＭ、Ｐ＜０．０５、慢性）（図１０Ａ）が、疾病の急性的をベースとする差異はなかった。血漿ＳＤＭＡ、Ｌ−アルギニン、およびＬ−アルギニン／ＡＤＭＡ比は、急性および慢性群の間で変化しなかった（図１０Ｂ〜１０Ｄ）。
【０３０９】
血漿ＡＤＭＡレベルは、ＢＭＩと有意に相関した（勾配＝２４．２７±７．８４、Ｒ２＝０．２０５、Ｐ＝０．００３８）（図１１Ａ）。その上、図１１Ｂに示すように、Ｌ−アルギニン／ＡＤＭＡ比は、ＢＭＩと逆に相関した（勾配＝−２．３８±１．１６、Ｒ２＝０．０９９、Ｐ＜０．０４８）。
【０３１０】
これらのデータは、ＡＤＭＡがＤＨＦの病態の一因となり得、上昇した血漿ＡＤＭＡレベルまたはＬ−アルギニン／ＡＤＭＡの比が拡張機能障害についてのバイオマーカーとして有用であり得ることを示唆する。
【０３１１】
（実施例１１）
心不全を有さない健康な患者、拡張機能障害（ＤＤ）を有する患者、収縮機能障害（ＳＤ）を有する患者からのヒト血漿を、実施例４において本質的に記載したように集めた。等しい容量の血漿試料を、電気泳動ゲル中に添加し、膜に移し、ＭｙＢＰ−Ｃによってウエスタンブロットした。ＭｙＢＰ−Ｃの総血漿レベルは、ＤＤ患者において最も高く、健康な対照患者について最も低く、ＳＤ患者について中間であった。（図１３、右下のグラフ）。ＭｙＢＰ−Ｃの７５ｋＤａの断片の血漿レベルは、対照と比べてＤＤ患者において最も高かった（図１３、左下のグラフ）。
【０３１２】
等しい容量の血漿試料を、Ｓ−グルタチオン−特異的抗体で免疫沈降を行い、免疫沈降物をＭｙＢＰ−Ｃ−特異的抗体を使用してウエスタンブロットした。図１４の下のグラフに示すように、Ｓ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃの７５ｋＤａの断片のレベルは、ＤＤ患者において最も高く、対照患者において最も低く、ＳＤ患者において中間であった。
【０３１３】
ＤＤおよびＳＤ患者のヒト血漿からのＳ−グルタチオン付加されたＭｙＢＰ−Ｃ断片（７５ｋＤ）の比、およびＭｙＢＰ−Ｃ（７５ｋＤ）のタンパク質量を計算し、図１５に表した。Ｓ−グルタチオン付加およびＭｙＢＰ−Ｃ（７５ｋＤ）の免疫沈降データを、ＭｙＢＰ−Ｃ（７５ｋＤ）を検出する免疫ブロットデータで正規化した。Ｓ−グルタチオン付加の比およびＭｙＢＰ−Ｃ（７５ｋＤ）断片のタンパク質量は、対照群と比較して、ＤＤ患者において有意に増加し、ＳＤ患者において中間であった。
【０３１４】
（実施例１２）
この実施例は、サンドイッチＥＬＩＳＡによってグルタチオン付加されたｃＭｙＢＰ−Ｃのレベルを検出する方法を示す。
【０３１５】
マルチウェルマイクロタイタープレートの表面を、心臓のＭｙＢＰ−Ｃ−特異的抗体で事前コーティングする。この抗体は、捕獲抗体と考えられる。次いで、表面をブロックして、表面への非特異的結合を防止する。次いで、試験または対照試料をプレートに加え、プレートを洗浄し、結合していないＭｙＢＰ−Ｃを除去する。グルタチオン付加された心臓のＭｙＢＰ−Ｃに特異的な抗体（この抗体はビオチンにコンジュゲートしている）（検出抗体）を、次いで、ウェルに加える。アビジンコンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を続いてウェルに加える。ＨＲＰの色素生産性基質を加え、発色を停止させる。増強された化学発光に基づいて色の強度を測定する。
【０３１６】
【化１０】
2014531605.tif 000014
【０３１７】
本明細書において引用した公開資料、特許出願、および特許を含めた全ての参照文献は、あたかも各参照文献が、個々におよび特に参照により組み込まれていることが示され、かつ本明細書においてその全体が記載されているかのように、参照により本明細書に同じ程度に組み込まれている。
【０３１８】
「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語、ならびに同様の指示対象の使用は、本明細書において他に示さない限り、または他に文脈によって明らかに矛盾しない限り、本発明を記載する文脈において（特に、下記の特許請求の範囲の文脈において）、単数および複数の両方を包含すると解釈される。「含むこと」、「有すること」、「含めること」および「含有すること」という用語は、特に断りのない限り、限度を設定しない用語と解釈される（すなわち、「これらに限定されないが、以下を含めた」を意味する）。
【０３１９】
本明細書において値の範囲を列挙することは、本明細書において他に示さない限り、範囲に入るそれぞれの別々の値、およびそれぞれのエンドポイントを個々に言及する省略表現法としての役割を果たすことを単に意図し、それぞれの別々の値およびエンドポイントは、これらが本明細書において個々に列挙されているように明細書に組み込まれる。
【０３２０】
本明細書に記載されている全ての方法は、本明細書において他に示さない限り、または他に文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書において提供するありとあらゆる例、または例示的な言語（例えば、「例えば」）の使用は、他に断らない限り、本発明をよりよく解明することを意図するのみであり、本発明の範囲に対する限定を提起しない。明細書における言語は、本発明の実施にとって不可欠なものとして、任意の特許請求していない要素を示すと解釈されるべきではない。
【０３２１】
本発明の好ましい実施形態は、本発明を実施するために、本発明者らには公知の最良の態様を含めて本明細書に記載されている。上記の記載を読むと、これらの好ましい実施形態のバリエーションが当業者には明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がこのようなバリエーションを必要に応じて用いることを予想し、本発明者らは、本明細書に特に記載されている通りではなく本発明が実施されることを意図する。したがって、本発明は、準拠法によって許容されるように、本明細書に添付の特許請求において詳述する主題の全ての修正形態および同等物を含む。その上、本明細書において他に示さない限り、または他に文脈によって明らかに矛盾しない限り、全ての可能性のあるそのバリエーションにおける上記の要素の任意の組合せは本発明に包含される。
【図１】
2014531605.tif 000015
【図２】
2014531605.tif 000016
【図３−１】
2014531605.tif 000017
【図３−２】
2014531605.tif 000018
【図３−３】
2014531605.tif 000019
【図４】
2014531605.tif 000020
【図５】
2014531605.tif 000021
【図６】
2014531605.tif 000022
【図７】
2014531605.tif 000023
【図８】
2014531605.tif 000024
【図９】
2014531605.tif 000025
【図１０】
2014531605.tif 000026
【図１１】
2014531605.tif 000027
【図１２】
2014531605.tif 000028
【図１３】
2014531605.tif 000029
【図１４】
2014531605.tif 000030
【図１５】
2014531605.tif 000031
【図１６】
2014531605.tif 000032
【配列表】
2014531605000001.app
【国際調査報告】
2014531605.tif 000033
2014531605.tif 000034
2014531605.tif 000035
2014531605.tif 000036
2014531605.tif 000037