(57)【要約】  本発明は、イソプレンを生産することのできる組み換え微生物、並びにこのような組み換え微生物を利用して、高効率でイソプレンを生産させることに関する。本発明では、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することのできる酵素をコードしているアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子と、アセトアセチルＣｏＡからイソプレンを合成させるイソプレン生合成に関与する１つ以上の遺伝子と、を宿主微生物に組み込む。【選択図】７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレンを生産することのできる組み換え微生物であって、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することのできるポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸、並びに
ａ．イソプレンシンターゼポリペプチドであって、異種核酸によりコードされるイソプレンシンターゼポリペプチド、及び
ｂ．メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１つ以上のポリぺプチド
をコードしている１つ以上の核酸を含み、
前記組み換え微生物を適切な培地で培養することで、前記ポリぺプチドの生産及びイソプレンの合成が提供される、組み換え微生物。
【請求項２】
マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することのできるポリペプチドをコードしている前記１つ以上の核酸が、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子である、請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項３】
前記アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子が放線菌由来の遺伝子である、請求項２に記載の組み換え微生物。
【請求項４】
前記アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子がストレプトミセス（Streptomyces）属由来である、請求項３に記載の組み換え微生物。
【請求項５】
前記アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子が、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている、又は配列番号１のアミノ酸配列に対して８０％以上同一であるアミノ酸配列を有し、かつマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するタンパク質をコードしている、請求項４に記載の組み換え微生物。
【請求項６】
前記イソプレンシンターゼポリペプチドが、植物のイソプレンシンターゼポリペプチドであるか、又はその変異体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項７】
前記イソプレンシンターゼポリペプチドが、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）由来のポリペプチド、又はウラジロハコヤナギ（Populus alba）とヤマナラシ（Populus tremula）の交雑種由来のポリペプチド、又はそれらの変異体由来のポリペプチドである、請求項６に記載の組み換え微生物。
【請求項８】
前記イソプレンシンターゼポリペプチドが、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）又はクズ（Pueraria lobata）、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、セイヨウハコヤナギ（Populus nigra）、及びコットンウッド（Populus trichocarpa）、又はそれらの変異体からなる群から選択される、請求項７に記載の組み換え微生物。
【請求項９】
（ｂ）のＭＶＡ経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている前記１つ以上の核酸が異種核酸である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１０】
（ｂ）のＭＶＡ経路の１つ以上のポリぺプチドをコードしている前記１つ以上の核酸が、内在性核酸のコピーである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１１】
ＭＶＡ経路の前記１つ以上のポリぺプチドが、（ａ）アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを生成する酵素；（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；（ｃ）メバロン酸を５−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素；（ｄ）５−ホスホメバロン酸を５−ジホスホメバロン酸に変換する酵素；及び（ｅ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１２】
前記メバロン酸を５−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素が、Ｍ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼ、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス（Lactobacillus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトミセス（Streptomyces）メバロン酸キナーゼポリペプチド、又はストレプトミセス（Streptomyces）ＣＬ１９０メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１３】
前記メバロン酸を５−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素が、Ｍ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼである、請求項１２に記載の組み換え微生物。
【請求項１４】
イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を更に含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１５】
１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を更に含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項１６】
ＤＸＰ経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている前記１つ以上の核酸が異種核酸である、請求項１５に記載の組み換え微生物。
【請求項１７】
ＤＸＰ経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている前記１つ以上の核酸が内在性核酸のコピーである、請求項１５に記載の組み換え微生物。
【請求項１８】
ＤＸＰ経路の前記１つ以上のポリペプチドポリペプチドが、（ａ）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）、（ｂ）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸リダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）、（ｃ）４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＭＣＴ）、（ｄ）４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＣＭＫ）、（ｅ）２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（ＭＣＳ）、（ｆ）１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸シンターゼ（ＨＤＳ）、及び（ｇ）１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸レダクターゼ（ＨＤＲ）から選択される、請求項１５に記載の組み換え微生物。
【請求項１９】
前記ＤＸＰ経路のポリペプチドがＤＸＳである、請求項１８に記載の組み換え微生物。
【請求項２０】
前記１つ以上の異種核酸が、誘導型プロモーター又は構成型プロモーター下に配置される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項２１】
前記１つ以上の異種核酸が、１つ以上のマルチコピープラスミドにクローン化される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項２２】
前記１つ以上の異種核酸が、細胞の染色体に組み込まれる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項２３】
前記微生物が、バクテリア細胞、藻類細胞、真菌細胞又は酵母細胞である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項２４】
前記微生物がバクテリア細胞である、請求項２３に記載の組み換え微生物。
【請求項２５】
前記バクテリア細胞がグラム陽性バクテリア細胞、又はグラム陰性バクテリア細胞である、請求項２４に記載のバクテリア細胞。
【請求項２６】
前記バクテリア細胞が、大腸菌（E. coli）、Ｌ．アシドフィルス（L. acidophilus）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロデュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｓ．アルバス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．セリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）、及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞からなる群から選択される、請求項２５に記載のバクテリア細胞。
【請求項２７】
前記バクテリア細胞が大腸菌（E. coli）細胞である、請求項２６に記載のバクテリア細胞。
【請求項２８】
前記バクテリア細胞がＬ．アシドフィルス（L. acidophilus）細胞である、請求項２６に記載のバクテリア細胞。
【請求項２９】
前記バクテリア細胞がコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）細胞である、請求項２６に記載のバクテリア細胞。
【請求項３０】
前記微生物が藻類細胞である、請求項２３に記載の組み換え微生物。
【請求項３１】
前記藻類細胞が、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類（chlorarachniophytes）、ミドリムシ類（euglenids）、クロミスタ類（chromista）、又は渦鞭毛藻類からなる群から選択される、請求項３０に記載の藻類細胞。
【請求項３２】
前記微生物が真菌細胞である、請求項２３に記載の組み換え微生物。
【請求項３３】
前記真菌細胞が糸状菌である、請求項３２に記載の真菌細胞。
【請求項３４】
前記微生物が酵母細胞である、請求項２３に記載の組み換え微生物。
【請求項３５】
前記酵母細胞が、サッカロミセス属（Saccharomyces sp.）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア属（Pichia sp.）、又はカンジダ属（Candida sp.）からなる群から選択される、請求項３４に記載の酵母細胞。
【請求項３６】
前記酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞である、請求項３５に記載の酵母細胞。
【請求項３７】
イソプレノイドを生産することのできる組み換え微生物であって、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することのできるポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸、並びに
ａ．ポリプレニルピロリン酸シンターゼ、及び
ｂ．メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１つ以上のポリぺプチド
をコードしている１つ以上核酸を含み、
前記組み換え微生物を適切な培地で培養することで、前記ポリぺプチドの生産及び回収可能な量のイソプレノイドの合成が提供される、組み換え微生物。
【請求項３８】
（ｂ）のＭＶＡ経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている前記１つ以上の核酸が異種核酸である。請求項３７に記載の組み換え微生物。
【請求項３９】
ＭＶＡ経路の前記１つ以上のポリぺプチドが、（ａ）アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを生成する酵素；（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；（ｃ）メバロン酸を５−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素；（ｄ）５−ホスホメバロン酸を５−ジホスホメバロン酸に変換する酵素；及び（ｅ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素からなる群から選択される、請求項３７又は３８のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項４０】
前記メバロン酸を５−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素が、Ｍ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼ、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス（Lactobacillus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトミセス（Streptomyces）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス（Streptomyces）ＣＬ１９０メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項４１】
前記メバロン酸を５−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素が、Ｍ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼである、請求項４０に記載の組み換え微生物。
【請求項４２】
イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を更に含む、請求項３７〜４１のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項４３】
前記１つ以上の異種核酸が、誘導型プロモーター又は構成型プロモーター下に配置される、請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項４４】
前記１つ以上の異種核酸が１つ以上のマルチコピープラスミドにクローン化される、請求項３７〜４３のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項４５】
前記１つ以上の異種核酸が、細胞の染色体に組み込まれる、請求項３７〜４３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４６】
前記微生物がバクテリア細胞、藻類細胞、真菌細胞又は酵母細胞である、請求項３７〜４５のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項４７】
前記微生物がバクテリア細胞である、請求項４６に記載の組み換え微生物。
【請求項４８】
前記バクテリア細胞がグラム陽性バクテリア細胞、又はグラム陰性バクテリア細胞である、請求項４７に記載のバクテリア細胞。
【請求項４９】
前記バクテリア細胞が、大腸菌（E. coli）、Ｌ．アシドフィルス（L. acidophilus）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B.amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロデュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｓ．アルバス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．セリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）、及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞からなる群から選択される、請求項４７に記載のバクテリア細胞。
【請求項５０】
前記バクテリア細胞が大腸菌（E. coli）細胞である、請求項４９に記載のバクテリア細胞。
【請求項５１】
前記バクテリア細胞がＬ．アシドフィルス（L. acidophilus）細胞である、請求項４９に記載のバクテリア細胞。
【請求項５２】
前記バクテリア細胞が、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）細胞である、請求項４９に記載のバクテリア細胞。
【請求項５３】
前記微生物が藻類細胞である、請求項４６に記載の組み換え微生物。
【請求項５４】
前記藻類細胞が、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類（chlorarachniophytes）、ミドリムシ類（euglenids）、クロミスタ類（chromista）、又は渦鞭毛藻類からなる群から選択される、請求項５３に記載の藻類細胞。
【請求項５５】
前記微生物が真菌細胞である、請求項４６に記載の組み換え微生物。
【請求項５６】
前記真菌細胞が糸状菌である、請求項５５に記載の真菌細胞。
【請求項５７】
前記微生物が酵母細胞である、請求項４６に記載の組み換え微生物。
【請求項５８】
前記酵母細胞が、サッカロミセス属（Saccharomyces sp.）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア属（Pichia sp.）、又はカンジダ属（Candida sp.）からなる群から選択される、請求項５７に記載の酵母細胞。
【請求項５９】
前記酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞である、請求項５８に記載の酵母細胞。
【請求項６０】
前記イソプレノイドが、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン、及びポリテルペンからなる群から選択される、請求項３７〜５９のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項６１】
前記イソプレノイドがセスキテルペンである、請求項６０に記載の組み換え微生物。
【請求項６２】
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、ファルネセン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン（terpindene）、及びバレンセンからなる群から選択される、請求項３７〜６１のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
【請求項６３】
イソプレンの生産方法であって、
ａ．
（ｉ）マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することのできるポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸、並びに
（ｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドであって、異種核酸によりコードされるイソプレンシンターゼポリペプチド、及び（ｉｉｉ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１つ以上のポリぺプチド、をコードしている１つ以上の核酸
を含む組み換え微生物を培養する工程と、
ｂ．イソプレンを生産させる工程と
を含む方法。
【請求項６４】
前記組み換え微生物により生産された前記イソプレンを回収する工程を更に含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することのできるポリペプチドをコードしている前記１つ以上の核酸がアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記イソプレンシンターゼポリペプチドが、植物のイソプレンシンターゼポリペプチドである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
ＭＶＡ経路の前記１つ以上のポリぺプチドが、（ａ）アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを生成する酵素；（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；（ｃ）メバロン酸を５−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素；（ｄ）５−ホスホメバロン酸を５−ジホスホメバロン酸に変換する酵素；及び（ｅ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素からなる群から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を更に含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記組み換え微生物が、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を更に含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項７０】
前記微生物がバクテリア細胞、藻類細胞、真菌細胞又は酵母細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項７１】
前記微生物がバクテリア細胞である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記バクテリア細胞がグラム陽性バクテリア細胞、又はグラム陰性バクテリア細胞である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記バクテリア細胞が大腸菌（E. coli）細胞である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記バクテリア細胞がＬ．アシドフィルス（L. acidophilus）細胞である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記バクテリア細胞がコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）細胞である、請求項７２に記載のバクテリア細胞。
【請求項７６】
前記微生物が酵母細胞である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７７】
前記酵母細胞がサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
イソプレノイドの生産方法であって、
ａ．
（ｉ）マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することのできるポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸、並びに
（ｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドであって、異種核酸によりコードされるポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチド、及び（ｉｉｉ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１つ以上のポリぺプチド、をコードしている１つ以上の核酸
を含む組み換え微生物を培養する工程と、
ｂ．前記イソプレノイドを生産させる工程と
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮出願特許第６１／５１５，３００号（２０１１年８月４日出願）の利益を請求するものであり、該開示は、参照によりその全体が本案件に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は全体として、培養細胞及びこれらの培養細胞を含む組成物からの、イソプレン、イソプレノイド前駆体、及び／又はイソプレノイドの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
メバロン酸依存性経路の生成物は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）である。ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰは、イソプレン並びにイソプレノイドの前駆体である。
【０００４】
イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、各種合成ポリマー、中でも注目すべきは合成ゴムの重要な出発物質である。イソプレンは、さまざまな微生物、植物、及び動物種によって天然に生成される。特に、イソプレンの生合成に関しては、メバロン酸（ＭＶＡ）経路と非メバロン酸（ＤＸＰ）経路の２つの経路が特定されている。しかしながら、天然に生じる生物からのイソプレンの収率は商業的には魅力的でない。イソプレンは石油の分留によって得ることもできるが、この材料の精製には費用及び時間がかかる。石油分解生成物中のＣ５留分から生成されるイソプレン量はほんの約１５％にすぎない。イソプレンの重合により、約８００，０００トン／年のｃｉｓ−ポリイソプレンが生産されており、このポリイソプレンのほとんどがタイヤ及びゴム産業で使用されている。また、履き物、機械製品、医療用品、スポーツ用品、及びラテックスなどのその他の製品では、共重合させたイソプレンが合成エラストマーとして使用されている。
【０００５】
イソプレノイドは、イソプレノイド前駆体分子のＩＰＰ及びＤＭＡＰＰから誘導される化合物である。これまでに２９，０００種以上のイソプレノイド化合物が同定されており、かつ毎年新規のイソプレノイドが発見されている。イソプレノイドは、主な構成単位としてイソプレノイド前駆体分子を使用して、より複雑なイソプレノイド構造を形成する、微生物及び植物種などの天然物から単離することができる。イソプレノイドは、細胞膜の流動性及び電子輸送を維持する手だてとなるため、多くの生命体及び細胞にとって非常に重要である。天然では、イソプレノイドは、植物に含まれる天然の駆虫成分として多様な役割を果たし、桂皮、丁子及びショウガには特有の香りをもたらす。更に、製薬及び化学業界では、イソプレノイドを、薬剤、栄養補助剤、矯味矯臭剤、及び病害虫防除剤として使用する。これまでに、生態系における重要性及び広範な用途における有用性が考慮されて、イソプレノイドは、科学者らによる関心を十分に集めている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、イソプレン及び／又はイソプレノイドのより経済的な生産方法が必要とされている。詳細には、安価で再生可能な出発原料から、ロバストな商業プロセスに求められる水準を十分に満たす速度、力価及び純度で、イソプレン及び／又はイソプレノイドを生産する方法が望ましい。
【０００７】
組み換え微生物、並びにイソプレン、イソプレノイド前駆体、及び／又はイソプレノイドの生産方法におけるそれらの使用に関係する本開示では、このような向上が提供される。
【０００８】
本明細書を通じ、各種特許、特許出願及び他の種類の刊行物（例えば、学術論文）を参照する。本明細書に引用する、本開示に関係する全ての特許、特許出願及び刊行物は、すべての目的に関し、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、組み換え微生物の組成物、並びにイソプレン、イソプレノイド前駆体、及び／又はイソプレノイドを生産する際のこれらの組み換え微生物の生産及び使用方法を提供する。組み換え微生物は、イソプレン、イソプレノイド前駆体、及び／又はイソプレノイドの生成に使用することのできるアセトアセチルＣｏＡを、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡから合成することのできる酵素を含む。これらの組み換え微生物は、２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することのできるアセトアセチルＣｏＡチオラーゼ酵素の代わりに、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成して、アセトアセチルＣｏＡを生産することのできる酵素を含む。
【００１０】
したがって、一態様では、本発明は、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することのできるポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸、並びに：（ａ）イソプレンシンターゼポリペプチドであって、異種核酸によりコードされるイソプレンシンターゼポリペプチド；及び（ｂ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１つ以上のポリぺプチドをコードしている１つ以上の核酸を含む、イソプレンを生産することのできる組み換え微生物であって、前記組み換え微生物を適切な培地で培養することにより、前記ポリぺプチドの生産及びイソプレンの合成が提供される、組み換え微生物を提供する。一態様では、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することのできるポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸は、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子である。別の態様では、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は放線菌（actinomycete）由来のものである。別の態様では、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子はストレプトミセス（Streptomyces）属由来のものである。別の態様では、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、アミノ酸配列：ＭＴＤＶＲＦＲＩＩＧＴＧＡＹＶＰＥＲＩＶＳＮＤＥＶＧＡＰＡＧＶＤＤＤＷＩＴＲＫＴＧＩＲＱＲＲＷＡＡＤＤＱＡＴＳＤＬＡＴＡＡＧＲＡＡＬＫＡＡＧＩＴＰＥＱＬＴＶＩＡＶＡＴＳＴＰＤＲＰＱＰＰＴＡＡＹＶＱＨＨＬＧＡＴＧＴＡＡＦＤＶＮＡＶＣＳＧＴＶＦＡＬＳＳＶＡＧＴＬＶＹＲＧＧＹＡＬＶＩＧＡＤＬＹＳＲＩＬＮＰＡＤＲＫＴＶＶＬＦＧＤＧＡＧＡＭＶＬＧＰＴＳＴＧＴＧＰＩＶＲＲＶＡＬＨＴＦＧＧＬＴＤＬＩＲＶＰＡＧＧＳＲＱＰＬＤＴＤＧＬＤＡＧＬＱＹＦＡＭＤＧＲＥＶＲＲＦＶＴＥＨＬＰＱＬＩＫＧＦＬＨＥＡＧＶＤＡＡＤＩＳＨＦＶＰＨＱＡＮＧＶＭＬＤＥＶＦＧＥＬＨＬＰＲＡＴＭＨＲＴＶＥＴＹＧＮＴＧＡＡＳＩＰＩＴＭＤＡＡＶＲＡＧＳＦＲＰＧＥＬＶＬＬＡＧＦＧＧＧＭＡＡＳＦＡＬＩＥＷ（配列番号１）を有するタンパク質をコードする。
【００１１】
別の態様では、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列に対して８０％以上同一であるアミノ酸配列を有し、かつマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するタンパク質をコードする。
【００１２】
本明細書における任意の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。本明細書における任意の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）由来のポリペプチド、又はウラジロハコヤナギ（Populus alba）とヤマナラシ（Populus tremula）交雑種由来のポリペプチドである。本明細書における任意の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）又はクズ（Pueraria lobata）、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、セイヨウハコヤナギ（Populus nigra）、及びコットンウッド（Populus trichocarpa）からなる群から選択される。他の態様では、植物のイソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ（kudzu）イソプレンシンターゼポリペプチドである。
【００１３】
本明細書における任意の態様では、ＭＶＡ経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸は異種核酸である。本明細書における任意の態様では、ＭＶＡ経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸は内在性核酸のコピーである。本明細書における任意の態様では、ＭＶＡ経路の１つ以上のポリペプチドは、（ａ）アセトアセチルＣｏＡをアセチルＣｏＡと縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを生成する酵素（例えば、ＨＭＧシンターゼ）、（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素、（ｃ）メバロン酸リン酸を５−ホスホメバロン酸に変換する酵素、（ｄ）５−ホスホメバロン酸を５−ジホスホメバロン酸に変換する酵素、並びに（ｅ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素、から選択される。
【００１４】
本明細書における任意の態様では、メバロン酸をリン酸化して５−ホスホメバロン酸を生成する酵素は、Ｍ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼ、ラクトバチルス（Lactobacillus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトミセス（Streptomyces）メバロン酸キナーゼポリペプチド、又はストレプトミセス（Streptomyces）ＣＬ１９０メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択できる。本明細書における任意の態様では、メバロン酸を５−ホスホメバロン酸にリン酸化する酵素はＭ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼである。
【００１５】
本明細書における任意の態様では、組み換え微生物は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を更に含み得る。一態様では、ＤＸＰ経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸は、異種核酸である。他の態様では、ＤＸＰ経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸は、内在性核酸の複製である。特定の態様では、ＤＸＰ経路のポリペプチドは、（ａ）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）、（ｂ）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸リダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）、（ｃ）４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＭＣＴ）、（ｄ）４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＣＭＫ）、（ｅ）２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（ＭＣＳ）、（ｆ）１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸シンターゼ（ＨＤＳ）、及び（ｇ）１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸レダクターゼ（ＨＤＲ）からなる群から選択される。他の態様では、ＤＸＰ経路のポリペプチドはＤＸＳである。
【００１６】
本明細書における任意の態様では、１つ以上の異種核酸は、誘導型プロモーター又は構成型プロモーター下に配置される。本明細書における任意の態様では、１つ以上の異種核酸は、１つ以上のマルチコピープラスミドにクローン化される。本開示の任意の態様では、１つ以上の異種核酸は、細胞の染色体に組み込まれる。
【００１７】
本明細書における任意の態様では、微生物は、バクテリア細胞、藻類細胞、真菌細胞、酵母細胞、又はシアノバクテリア細胞である。一態様では、微生物はバクテリア細胞である。別の態様では、バクテリア細胞はグラム陽性菌細胞又はグラム陰性菌細胞である。別の態様では、バクテリア細胞は、エシェリキア属（Escherichia sp.）（例えば、大腸菌（E. coli））、Ｌ．アシドフィルス（L. acidophilus）、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシィ（B. clausii）、Ｂ．ハロドュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium spp.）（例えば、Ｃ．グルタミクム（C. glutamicum））、Ｓ．デグラダンス（S. degradans）２〜４０、アルギノビブリオ・アクアリティカス（Alginovibrio aqualiticus）、アルテノモナス（Alteromonas sr.）株ＫＬＩＡ、アステロミセス・クルシアタス（Asteromyces cruciatus）、ベネッケア・ペラギア（Beneckea pelagia）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium spp.）、エンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）、ハルモナス・マリーナ（Halmonas marina）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumonia）、フォトバクテリウム属（Photobacterium spp.）（ＡＴＣＣ  ４３３３６７）、シュードアルテロモナス・エルヤコヴィ（Pseudoalteromonas elyakovii）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）（例えば、シュードモナス・アルギノボラ（Pseudomonas alginovora）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・マルトフィリア（Pseudomonas maltophilia）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida））、ビブリオ・アルギノリチカス（Vibrio alginolyticus）、ビブリオ・ハリオチコール（Vibrio halioticol）、及びビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）、Ｓ．アルバス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．セリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞からなる群から選択される。別の態様では、バクテリア細胞は大腸菌（E. coli）細胞である。別の態様では、バクテリア細胞はＬ．アシドフィルス（L. acidophilus）細胞である。別の態様では、微生物は藻類細胞である。別の態様では、藻類細胞は緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類（chlorarachniophytes）、ミドリムシ類（euglenids）、クロミスタ類（chromista）、又は渦鞭毛藻類からなる群から選択される。別の態様では、微生物は真菌細胞である。別の態様では、真菌細胞は糸状菌である。別の態様では、微生物は酵母細胞である。別の態様では、酵母細胞は、サッカロミセス属（Saccharomyces sp.）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア属（Pichia sp.）、又はカンジダ属（Candida sp.）からなる群から選択される。別の態様では、酵母細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞である。
【００１８】
別の態様では、本発明は、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することのできるポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸：並びに（ａ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼ；及び（ｂ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１つ以上のポリぺプチド、をコードしている１つ以上の核酸を含む、イソプレノイドを生産することのできる組み換え微生物であって、前記組み換え微生物を適切な培地で培養することにより、前記ポリぺプチドの生産及び１つ以上のイソプレノイド類の合成が提供される、組み換え微生物提供する。一態様では、（ｂ）のＭＶＡ経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸は異種核酸である。本明細書における任意の態様では、ＭＶＡ経路の１つ以上のポリペプチドは、（ａ）アセトアセチルＣｏＡ−ＣｏＡをアセチルＣｏＡと縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを生成する酵素、（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素、（ｃ）メバロン酸を５−ホスホメバロン酸にリン酸化する酵素、（ｄ）５−ホスホメバロン酸を５−ジホスホメバロン酸に変換する酵素、並びに（ｅ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素、からなる群から選択される。
【００１９】
本明細書における任意の態様では、メバロン酸をリン酸化して５−ホスホメバロン酸を生成する酵素は、Ｍ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼ、ラクトバチルス（Lactobacillus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトミセス（Streptomyces）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス（Streptomyces）ＣＬ１９０メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される。一態様では、メバロン酸を５−ホスホメバロン酸にリン酸化する酵素はＭ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼである。
【００２０】
本明細書における任意の態様では、１つ以上の異種核酸は、誘導型プロモーター又は構成型プロモーター下に配置される。本開示の任意の態様では、１つ以上の異種核酸は、１つ以上のマルチコピープラスミドにクローン化される。本開示の任意の態様では、１つ以上の異種核酸は、細胞の染色体に組み込まれる。
【００２１】
一態様では、微生物は、バクテリア細胞、藻類細胞、真菌細胞、酵母細胞、又はシアノバクテリア細胞である。一態様では、微生物はバクテリア細胞である。別の態様では、バクテリア細胞はグラム陽性菌細胞又はグラム陰性菌細胞である。別の態様では、バクテリア細胞は、エシェリキア属（Escherichia sp.）（例えば、大腸菌（E. coli））、Ｌ．アシドフィルス（L. acidophilus）、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシィ（B. clausii）、Ｂ．ハロドュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium spp.）（例えば、Ｃ．グルタミクム（C. glutamicum））、Ｓ．デグラダンス（S. degradans）２〜４０、アルギノビブリオ・アクアリティカス（Alginovibrio aqualiticus）、アルテノモナス（Alteromonas sr.）株ＫＬＩＡ、アステロミセス・クルシアタス（Asteromyces cruciatus）、ベネッケア・ペラギア（Beneckea pelagia）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium spp.）、エンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）、ハルモナス・マリーナ（Halmonas marina）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumonia）、フォトバクテリウム属（Photobacterium spp.）（ＡＴＣＣ  ４３３３６７）、シュードアルテロモナス・エルヤコヴィ（Pseudoalteromonas elyakovii）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）（例えば、シュードモナス・アルギノボラ（Pseudomonas alginovora）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・マルトフィリア（Pseudomonas maltophilia）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida））、ビブリオ・アルギノリチカス（Vibrio alginolyticus）、ビブリオ・ハリオチコール（Vibrio halioticol）、及びビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）、Ｓ．アルバス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．セリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞からなる群から選択される。別の態様では、バクテリア細胞は大腸菌（E. coli）細胞である。別の態様では、バクテリア細胞はＬ．アシドフィルス（L. acidophilus）細胞である。別の態様では、微生物は藻類細胞である。別の態様では、藻類細胞は緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類（chlorarachniophyte）、ミドリムシ類（euglenids）、クロミスタ類（chromista）、又は渦鞭毛藻類からなる群から選択される。別の態様では、微生物は真菌細胞である。別の態様では、真菌細胞は糸状菌である。別の態様では、微生物は酵母細胞である。別の態様では、酵母細胞は、サッカロミセス属（Saccharomyces sp.）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア属（Pichia sp.）、又はカンジダ属（Candida sp.）からなる群から選択される。別の態様では、酵母細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞である。
【００２２】
本明細書における任意の態様では、イソプレノイドは、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン、及びポリテルペンからなる群から選択される。一態様では、イソプレノイドはセスキテルペンである。別の態様では、イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、ファルネセン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン（terpindene）、及びバレンセンからなる群から選択される。
【００２３】
別の態様では、本発明は、イソプレンの生産方法であって、（ａ）（ｉ）マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することのできるポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸：並びに（ｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドであって、異種核酸によりコードされるイソプレンシンターゼポリペプチド及び（ｉｉｉ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１つ以上のポリぺプチドをコードしている１つ以上の核酸、を含む組み換え微生物を培養する工程と、（ｂ）イソプレンを生産させる工程と、を含む、生産方法を提供する。一態様では、この方法は、組み換え微生物により生産されたイソプレンを回収する工程を更に含む。
【００２４】
別の態様では、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することのできるポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸は、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子である。他の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物のイソプレンシンターゼポリペプチドである。別の態様では、ＭＶＡ経路の１つ以上のポリペプチドは、（ａ）アセトアセチルＣｏＡをアセチルＣｏＡと縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡ−ＣｏＡを生成する酵素、（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素、（ｃ）メバロン酸リン酸を５−ホスホメバロン酸に変換する酵素、（ｄ）５−ホスホメバロン酸を５−ジホスホメバロン酸に変換する酵素、並びに（ｅ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素、からなる群から選択される。別の態様では、組み換え微生物は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を更に含む。
【００２５】
別の態様では、微生物は、バクテリア細胞、藻類細胞、真菌細胞又は酵母細胞である。別の態様では、微生物はバクテリア細胞である。別の態様では、バクテリア細胞はグラム陽性菌細胞又はグラム陰性菌細胞である。別の態様では、バクテリア細胞は大腸菌（E. coli）細胞である。別の態様では、バクテリア細胞はＬ．アシドフィルス（L. acidophilus）細胞である。別の態様では、微生物は酵母細胞である。別の態様では、酵母細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞である。
【００２６】
本開示の別の態様では、イソプレノイドの生産方法が提供され、この方法は、（ｉ）マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することのできるポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸：並びに（ｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドであって、異種核酸によってコードされるポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチド及び（ｉｉｉ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１つ以上のポリぺプチドをコードしている１つ以上の核酸、を含む組み換え微生物を培養する工程と、前記イソプレノイドを生産させる工程と、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】Ｓｔｒｅｐ  ＣＬ１９０  Ｕｐｐｅｒのプラスミドマップ。
【図２】ｐＭＣＭ１１８７のプラスミドマップ。
【図３】株ＭＣＭ１３２０及びＭＣＭ１３２１から単離されたｐＣＬ−Ｐｔｒｃ−ｍｖａＲ−ｍｖａＳ−ｎｐｈＴ７のプラスミドマップ。
【図４】アセトアセチルＣｏＡ（ＮｐｈＴ７）をコードするよう遺伝子操作された株により生産されたイソプレン濃度を示すグラフ。ガスクロマトグラフィー−水素炎イオン化検出器を使用して、イソプレン濃度を検出した。アセトアセチルＣｏＡを介しＭＶＡを生産する株ＭＣＭ１６８４及びＭＣＭ１６８５では、ＤＸＰ経路を介してイソプレンを生産する株ＭＣＭ１６８６と比較してかなり多量のイソプレンが生成された。
【図５】コンストラクトｐＭＣＭ１２２１のベクターマップ。
【図６】Ｓ  ｓｕｉｓ  ＨＭＧＲＳ／ｐＣＬを有するコンストラクトｎｐｈＴ７のベクターマップ。図中では上流ＭＶＡ経路の酵素をコードしている遺伝子に加え、３遺伝子オペロンの発現を支配しているＩＰＴＧ誘導型Ｔｒｃプロモーターをハイライトしている。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）及びＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧＳ）は、ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）由来の遺伝子によりコードされ、ＮｐｈＴ７アセトアセチルＣｏＡシンターゼは、ストレプトミセス属（Streptomyces sp.）株ＣＬ１９０由来のｎｐｈＴ７遺伝子によりコードされる。スペクチノマイシン耐性遺伝子（ａａｄＡ１）、及びプラスミドの複製に必要とされるＲｅｐＡタンパク質（ｒｅｐＡ）をコードしている遺伝子は、ｐＣＬ１９２０ベクター骨格に共通するものであり、コンストラクトに含まれるものの図示しない。
【図７】各試験した培養物についての、黒色及び灰色のバーにより表されるイソプレンの比産生性（単位：ｕｇ／Ｌ  ＯＤ時間）と、黒色のひし形により表される吸光度（ＯＤ  ６００ｎｍ）とを示すグラフ。Ｓ．スイス（S. suis）ＨＭＧＲ及びＨＭＧＳと、ＮｐｈＴ７アセトアセチルＣｏＡシンターゼとから構成される上流ＭＶＡ経路の酵素を保有させた株のイソプレンデータを黒色のバーにより表す（表中、ＮｐｈＴ７  ａ〜ｃの表記は、それぞれＲＥＭ  Ｃ８＿２５、ＲＥＭ  Ｃ９＿２５、及びＲＥＭ  Ｄ１＿２５を表す）；ストレプトミセス属（Streptomyces sp.）株ＣＬ１９０由来のｎｐｈＴ５、ｎｐｈＴ６、及びｎｐｈＴ７遺伝子によりコードされる上流ＭＶＡ経路を保有している株のイソプレンデータは灰色のバーにより表す（ＭＣＭ１６８４及びＭＣＭ１６８５と表記）；異種上流ＭＶＡ経路の系を含まない対照株のイソプレンデータも灰色で示す（ＩｓｐＳとしてのみ表記）。イソプレン比産生性は、左側のｙ軸により表される。ＯＤ値は、関連する遺伝子のＩＰＴＧによる発現誘導から３．５時間後に測定したものを右側のｙ軸に表す。
【図８】連結させたＮｐｈＴ７、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、及びＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの触媒活性アッセイから得られたＮＡＤＰ＋／時間／ＯＤを示すグラフ。株ｎｐｈＴ７試験株１〜３は、それぞれＲＥＭ  Ｃ８＿２５、ＲＥＭ  Ｃ９＿２５、及びＲＥＭ  Ｄ１＿２５に相当する。対照となる親ＩｓｐＳ単独株はＲＥＭ  Ｆ３＿２５である。これらの結果は、ＮｐｈＴ７活性がアセチルＣｏＡ及びマロニルＣｏＡの両方の存在に依存することと一致する。
【図９】株ｎｐｈＴ７試験株１〜３（それぞれＲＥＭ  Ｃ８＿２５、ＲＥＭ  Ｃ９＿２５、及びＲＥＭ  Ｄ１＿２５に相当）を使用する触媒アッセイから得られたＮＡＤＰ＋／時間／ＯＤを示すグラフ。対照となる親ＩｓｐＳ単独株はＲＥＭ  Ｆ３＿２５である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、特に、イソプレン、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産に取り込まれる炭素量を増加させる第一工程として、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することのできる酵素を発現するよう遺伝子操作した組み換え微生物において、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、及び／又はイソプレノイドの生産を向上させる組成物及び方法を提供する。
【００２９】
一般的技術
本発明の実施においては、特に断りのない限り、当業者の技能の範囲内に含まれる従来の分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の技術を用いる。このような技術は、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、２００１年）；「オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．、１９８４年）；「動物細胞培養法：実践的アプローチ（Animal Cell Culture: A practical approach）、第３版（Ｊ．Ｒ．Ｍａｓｔｅｒｓ，ｅｄ．，２０００年）；「酵素学的手法（Methods in Enzymology）」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「分子生物学最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，編、１９８７年、周期的に改訂）；「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（PCR: The Polymerase Chain Reaction）」（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，編、１９９４年）、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、「微生物学及び分子生物学辞典（Dictionary of Microbiology and Molecular Biology）第３版」Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．２００６年）、並びに「マーチ最新有機化学反応、機序及び構造（March’s Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure）第６版」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．２００７年）といった文献中に十分に説明されており、これらの文献は、当業者に対し、本開示に使用される多くの用語について一般的な指針を提供する。
【００３０】
用語の定義
用語「イソプレン」は、２−メチル−１，３−ブタジエン（ＣＡＳ＃  ７８−７９−５）を指す。３，３−ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）からピロリン酸を除去することで、揮発性のＣ５炭化水素を、直接的に及び最終的に生成することができる。ＩＰＰ分子をＤＭＡＰＰ分子に結合又は重合させることは包含しない場合がある。用語「イソプレン」は、概して、本明細書に別途記載のない限り、生産方法を限定されることを意図しない。
【００３１】
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」には、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド断片、及び融合ポリペプチドが含まれる。
【００３２】
本明細書で使用するとき、「単離ポリペプチド」は、２、５、１０、２０、又は５０個以上の異なるポリペプチドのライブラリなどといった、ポリペプチドのライブラリの一部を意味するものではなく、天然に生じる少なくとも１つの成分から分離されたポリペプチドを意味する。例えば、ポリペプチドをコードしている組み換え核酸を発現させることで単離ポリペプチドを得ることができる。
【００３３】
「異種ポリペプチド」は、宿主細胞と異なる生物、種、又は株由来の核酸配列によりコードされるポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、同じ宿主細胞に天然に見られる野生型ポリペプチドと同一ではない。
【００３４】
本明細書で使用するとき、「核酸」は、共有結合により単鎖又は二本鎖のいずれかの形態で連結している、２つ以上のデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドを指す。
【００３５】
「組換え核酸」とは、対象とする核酸が由来する生物において自然に存在するゲノムにおいて、対象とする核酸に隣接する１つ以上の核酸（例えば遺伝子）を含まない、対象とする核酸のことを意味する。したがって、この用語には、例えば、ベクターに組み込まれた、プラスミド又はウィルスに自己複製的に組み込まれた、原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた、又は他の配列とは独立して別個の分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、又はＰＣＲにより生産された若しくは制限エンドヌクレアーゼによる消化により生産されたｃＤＮＡ断片）として存在する、組み換えＤＮＡが包含される。
【００３６】
「異種核酸」は、宿主細胞と異なる生物、種又は株由来の核酸配列を意味する。一部の実施形態では、異種核酸は、同じ宿主細胞に天然に見られる野生型核酸と同一ではない。
【００３７】
本明細書において使用するとき、「発現調節配列」は、対象とする核酸の転写を指示する核酸配列のことを意味する。発現調節配列は、構成型若しくは誘導型のプロモーター、又はエンハンサーなどのプロモーターであり得る。発現調節配列は「ネイティブ」な配列又は異種配列であり得る。ネイティブな発現調節配列は、遺伝子を発現させる生物、種又は株と同じ生物、種又は株に由来する配列である。異種の発現調節配列は、遺伝子を発現させる生物、種又は株とは異なる生物、種又は株に由来する配列である。「誘導型プロモーター」は、環境下、又は発育制限下で活性であるプロモーターである。
【００３８】
「調節可能なように連結された」は、核酸発現調節配列（プロモーターなど）及び第２の核酸配列間の機能的連結を意味し、発現調節配列は、第２の配列に相当する核酸の転写を指示する。
【００３９】
本明細書で使用するとき、用語「最少培地（minimal medium又はminimal media）」は、細胞の生育に必要とされる最低限の栄養素を含有し、概してアミノ酸の存在していない増殖培地を指す。最少培地は、典型的には、（１）細胞生育用の炭素源、（２）宿主細胞種及び生育条件間で変更させ得る各種塩類、及び（３）水、を含有する。炭素源は、グルコースなどの単糖から、本明細書で以下により詳細に記載されるような、他のバイオマスのより複雑な加水分解物、例えば、酵母エキスなどといった多様なものであり得る。塩は、概してマグネシウム、窒素、リン及びイオウなどの必須元素を提供し、細胞がタンパク質及び核酸を合成できるようにする。また、最少培地には、特定のプラスミド及び同様物を維持すべく選別するために、抗菌剤などの選択剤を添加することもできる。例えば、微生物が、例えばアンピシリン又はテトラサイクリンなどの特定の抗菌剤に耐性である場合、耐性を欠く細胞の生育を阻害する目的で培地に抗菌剤を添加することができる。培地には、所望される生理学的又は生化学的特性について選別するのに必要とされる、例えば特定のアミノ酸などといった他の化合物を添加することができる。
【００４０】
本明細書で使用するとき、用語「イソプレノイド」は、２つ以上の炭化水素単位からなり、各単位は、特定の様式で配置された５つの炭素原子からなる、天然に生じる有機化合物類の、広範にわたるかつ多様な部類を指す。本明細書で使用するとき、「イソプレン」は、明らかに「イソプレノイド」の定義から除外される。
【００４１】
本明細書で使用するとき、用語「テルペノイド」は、多様な様式で組み立てられ及び修飾され、構成員として使用されたイソプレノイド単位の数に基づき分類される、炭素数５のイソプレノイド単位に由来する有機分子の、広範にわたるかつ多様な部類を指す。ヘミテルペノイドは、イソプレノイド単位を１つ有する。モノテルペノイドは、イソプレノイド単位を２つ有する。セスキテルペノイドは、イソプレノイド単位を３つ有する。ジテルペノイドは、イソプレン単位を４つ有する。セステルテルペノイドは、イソプレノイド単位を５つ有する。トリテルペノイドは、イソプレノイド単位を６つ有する。テトラテルペノイドは、イソプレノイド単位を８つ有する。ポリテルペノイドは、イソプレノイド単位を８つ超有する。
【００４２】
本明細書で使用するとき、「イソプレノイド前駆体」は、テルペノイド又はイソプレノイドの生合成時に生物により使用される任意の分子を指す。イソプレノイド前駆体分子の非限定例としては、例えば、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）が挙げられる。
【００４３】
本明細書で使用するとき、用語「質量収率」は、宿主細胞により生産される生産物の質量を、宿主細胞により消費されたグルコースの質量より除算し、１００を乗じたものを指す。
【００４４】
「比生産性」は、宿主細胞により生産される生産物の質量を、生産物の生産にかかった時間、宿主細胞の密度及び培養体積により除したものを意味する。
【００４５】
「力価」は、宿主細胞により生産される生産物の質量を、培養体積により除したものを意味する。
【００４６】
本明細書で使用するとき、用語「細胞生産性指数（cell productivity index：ＣＰＩ）」は、宿主細胞により生産される生産物の質量を、培養により生産された宿主細胞の質量により除したものを指す。
【００４７】
本明細書において別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。
【００４８】
本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈に明示されない限り、対象物が複数ある場合をも包含する。
【００４９】
本明細書を通じて与えられるあらゆる最大数の限定は、あらゆるより小さい数値の限定を、あたかもそのようなより小さい数値の限定が明確に書かれているかのように包含するものと理解されることが意図される。本明細書の全体を通じて与えられるすべての最小の数値的限定には、これよりも大きいすべての数値的限定が、あたかもこうしたより大きい数値的限定が本明細書に明確に記載されているものと同様に含まれる。本明細書の全体を通じて与えられるすべての数値的範囲には、これよりも狭い数値的範囲が、あたかもこうしたより狭い数値的範囲がすべて本明細書に明確に記載されているものと同様に含まれる。
【００５０】
イソプレン、イソプレノイド前駆体、又はイソプレノイドを生産することのできる組み換え微生物
メバロン酸依存性生合成経路（ＭＶＡ経路）は、全ての高等真核生物及び特定種の細菌に存在する、重要な代謝経路である。メバロン酸経路は、タンパク質のプレニル化、細胞膜の維持、タンパク質の固定及びＮ−グリコシル化などの、多様な工程において使用される分子の生産に重要であり、並びにテルペン、テルペノイド、イソプレノイド、及びイソプレンの生合成時の主成分として機能するイソプレノイド前駆体分子のＤＭＡＰＰ及びＩＰＰの主要な供給源を提供する。
【００５１】
本明細書に記載されるとおり、上流域のＭＶＡ経路は、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、及びＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を有するポリペプチドの作用によりメバロン酸を生産する際、細胞代謝中に生成されたアセチルＣｏＡ及びマロニルＣｏＡを開始基質として利用する。始めに、アセトアセチルＣｏＡシンターゼの作用により、アセチルＣｏＡ及びマロニルＣｏＡがアセトアセチルＣｏＡに変換される。次に、アセトアセチルＣｏＡは、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの酵素作用により、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）に変換される。このＣｏＡ誘導体をＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼにより還元してメバロン酸を生成する。この反応は、メバロン酸経路によるイソプレノイド生産の律速段階になる。次に、メバロン酸は、メバロン酸キナーゼの作用により５−ホスホメバロン酸に変換され、５−ホスホメバロン酸は、続いてホスホメバロン酸キナーゼの酵素活性により、５−ジホスホメバロン酸に変換される。最後に、酵素の５−ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの活性により、５−ジホスホメバロン酸からＩＰＰが形成される。
【００５２】
したがって、本発明の組み換え微生物は、イソプレン、イソプレノイド前駆体、又はイソプレノイド生産能を有する組み換え微生物であり、組み換え微生物は、宿主微生物においてマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することのできる酵素（例えば、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子、すなわちｎｐｈＴ７）をコードしている遺伝子と、アセトアセチルＣｏＡからのイソプレン又はイソプレノイドの合成を可能にする、イソプレン生合成又はイソプレノイド生合成に関与する遺伝子群のうちの１つ以上の遺伝子とを含む。
【００５３】
アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子
アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子（ｎｐｈＴ７としても知られる）は、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有し、かつ２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性は最小限である（例えば、非活性である）酵素をコードしている遺伝子である。例えば、Ｏｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  Ｖｏｌ  １０７，Ｎｏ．２５，ｐｐ．１１２６５〜１１２７０（２０１０）を参照されたい。この文献中のｎｐｈＴ７に関する教示は、本開示に明確に組み込まれる。日本国特許公開第２００８−６１５０６（Ａ）号及び米国特許出願公開第２０１０／０２８５５４９号には、放線菌（actinomycete）のストレプトミセス（Streptomyces）属ＣＬ１９０株のアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子が記載されている。アセトアセチルＣｏＡシンターゼも、アセチルＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシル基転移酵素として参照され得る。使用することのできる代表的なアセトアセチルＣｏＡシンターゼ（又はアセチルＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシル基転移酵素）としては、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＢ５４０１３１．１が挙げられる。
【００５４】
一実施形態では、本発明のアセトアセチルＣｏＡシンターゼは、不可逆反応を介し、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡから、アセトアセチルＣｏＡを合成する。アセトアセチルＣｏＡシンターゼを使用してアセチルＣｏＡを生成することで、この反応は不可逆的なものであり、かつアセトアセチルＣｏＡチオラーゼ酵素の２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する作用は可逆的なものであるという、更なる利点が提供される。これらを踏まえると、アセトアセチルＣｏＡシンターゼを使用して、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することで、チオラーゼを使用して同様の最終産物を生産した場合と比較して、イソプレン、イソプレノイド前駆体、及び／又はイソプレノイドの生産量において有意な向上が得られる。
【００５５】
これに加え、アセトアセチルＣｏＡシンターゼを使用してイソプレン、イソプレノイド前駆体、及び／又はイソプレノイドを生成した場合には、アセトアセチルＣｏＡシンターゼが、マロニルＣｏＡの脱炭酸によりマロニルＣｏＡをアセチルＣｏＡに変換し得るという更なる利点も提供する。したがって、開始基質の貯蔵量は、アセチルＣｏＡの初期量により律速されない。アセトアセチルＣｏＡシンターゼによるアセトアセチルＣｏＡの合成は、開始基質がマロニルＣｏＡのみである場合にのみ引き続き生じ得る。一実施形態では、開始時のマロニルＣｏＡのプール量は、よりマロニルＣｏＡを有する宿主株を使用することにより増加する。このようなプール量の増加は、天然に生じ得るものであり又は分子操作により設計され得るものである。例えば、Ｆｏｗｌｅｒ，ｅｔ．ａｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７５，Ｎｏ．１８，ｐｐ．５８３１〜５８３９（２００９）、Ｚｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１１：１９２〜１９８（２００９）、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，（２０１１）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｂｅｎ．２０１１．０６．００８、Ｏｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０７：１１２６５〜１１２７０（２０１０）、並びに米国特許第２０１０／０２８５５４９号を参照されたい。これらの非特許文献及び特許文献の内容は、参照によりその全体が本開示に明示的に組み込まれる。
【００５６】
本開示に記載の任意の態様又は実施例では、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する能力を有する酵素を使用できる。このような酵素の非限定例を本明細書に記載する。本開示に記載の特定の実施形態では、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する能力を有するストレプトミセス属（Streptomyces）の放線菌（actinomycete）から誘導されるアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子を使用できる。
【００５７】
このようなアセトアセチルＣｏＡシンターゼの遺伝子の例としては、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている遺伝子が挙げられる。このような、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質は、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有し、２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性は有さないアセトアセチルＣｏＡシンターゼに相当する。
【００５８】
一実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている遺伝子は、ストレプトミセス属（Streptomyces sp.）の放線菌（actinomycete）ＣＬ１９０株からテンプレートとして得られるゲノムＤＮＡと、日本国特許公開第２００８−６１５０６（Ａ）号を参照して設計することのできるプライマー対と、を使用して核酸増幅法（例えば、ＰＣＲ）により得ることができる。
【００５９】
本明細書に記載するとき、本発明での使用に関し、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、ストレプトミセス属（Streptomyces sp.）ＣＬ１９０株の放線菌（actinomycete）に由来する配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている遺伝子に限定されない。マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することができかつ２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することはできないタンパク質をコードしている任意の遺伝子を本発明に記載の方法に使用することができる。特定の実施形態では、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列と類似性が高く又は実質的に同一であるアミノ酸配列を有し、かつマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するタンパク質をコードしている遺伝子であり得る。表現の「類似性の高い」又は「実質的に同一」とは、例えば、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、及び少なくとも約９９％同一であることを意味する。上記で使用したとおり、同一度の値は、異なるアミノ酸配列及び配列番号１のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基間の同一度（％）に相当するものであり、配列類似性について検索するためのプログラムを使用し、配列番号１のアミノ酸配列と、異なるアミノ酸配列とを整列させることで算出される。
【００６０】
他の実施形態では、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入により、配列番号１のアミノ酸配列由来のアミノ酸配列を有し、かつマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するタンパク質をコードしている遺伝子であってよい。本明細書において、表現「１つ以上のアミノ酸」は、例えば、２〜３０個のアミノ酸、好ましくは２〜２０個のアミノ酸、より好ましくは２〜１０個のアミノ酸及び最も好ましくは２〜５個のアミノ酸を指す。
【００６１】
更に他の実施形態では、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、厳密な条件下で配列番号１のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの一部又は全部とハイブリダイズすることのできる、並びにマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するタンパク質をコードすることのできる、ポリヌクレオチドからなる場合がある。本明細書において、厳密な条件下でのハイブリダイゼーションは、６０℃で２回ＳＳＣで洗浄する条件下で結合を維持させることに相当する。ハイブリダイゼーションは、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１）に記載の手法などの、既知の従来法により実施することができる。
【００６２】
本明細書に記載されるとおり、配列番号１のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するアセトアセチルＣｏＡシンターゼをコードしている遺伝子は、任意の生物から単離できる可能性があり、例えば、ストレプトミセス属（Streptomyces sp.）ＣＬ１９０株ではない放線菌（actinomycete）から得ることもできる。加えて、本明細書で用いるアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチドを、当該技術分野において既知の手法により改変することで得ることもできる。ヌクレオチド配列への変異導入は、Ｋｕｎｋｅｌ法又はｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法あるいはこれらのいずれかに類似の手法などの既知の手法により実施することができる。例えば、変異導入は、部位特異的変異導入については、変異導入キット（例えば、製品名；Ｍｕｔａｎｔ−Ｋ及びＭｕｔａｎｔ−Ｇ（タカラバイオ））及び製品名ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズのキット（タカラバイオ）などを使用することで実施できる。
【００６３】
配列番号１のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するアセトアセチルＣｏＡシンターゼの活性は、以下に記載のとおりに評価することができる。具体的には、評価されることになるタンパク質をコードしている遺伝子は、遺伝子を細胞中で発現させ、続いてクロマトグラフィーなどの手法によりタンパク質を精製することができるような様式で、まずは宿主細胞に導入される。得られた評価すべきタンパク質を含有させた緩衝液に、基質としてマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡを加え、続いて例えば、所望の温度（例えば、１０℃〜６０℃）でインキュベートする。反応の完了後、基質の減少量及び／又は生成物量（アセトアセチルＣｏＡ）を測定する。したがって、試験したタンパク質がマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するか評価すること、並びに合成度を評価することができる。このような場合では、このタンパク質が、２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有しているか否かは、得られた評価すべきタンパク質を含有させた緩衝液に、アセチルＣｏＡのみを基質として加え、基質の減少量及び／又は同様の方法において生産された生産物量を測定することにより、試験することができる。
【００６４】
ＭＶＡ経路の核酸及びポリぺプチド
アセトアセチルＣｏＡシンターゼと合わせて使用することのできるＭＶＡ経路のポリペプチド例としては、限定するものではないが、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド（例えば、ｍｖａＳによりコードされる酵素）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）ポリペプチド（例えば、ｍｖａＲによりコードされる酵素又はチオラーゼは欠損しているものの還元酵素活性は保持するよう改変を受けたｍｖａＥによりコードされる酵素）、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチド、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）ポリペプチド、イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）ポリペプチド、ＩＰＰイソメラーゼポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＭＶＡ経路ポリペプチドに関係する２つ又はそれ以上の活性を有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）、が挙げられる。特に、ＭＶＡ経路ポリペプチドとしては、ＭＶＡ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが挙げられる。ＭＶＡ経路の核酸例としては、ＭＶＡ経路に含まれるポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。ＭＶＡ経路のポリペプチド及び核酸例としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。更に、イソプレンの生産を増大させるような、ＭＶＡ経路のポリペプチド変異体も、良好に使用することができる。
【００６５】
使用することのできるＭＶＡ経路ポリぺプチドの非限定例としては、国際公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、及び同第２０１０／１４８１５０号に記載のものが挙げられ、これらの特許文献の内容は、参照によりその全体が本開示に表される。
【００６６】
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）ポリぺプチド及び核酸の例
ＨＭＧ−ＣｏＡのメバロン酸ポリぺプチドへの変換を触媒する酵素、例えば、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）を使用することができる。チオラーゼを欠損しつつ還元酵素活性は保持するよう改変したｍｖａＥによりコードされる酵素も別の例として挙げられる。ｍｖａＥ遺伝子は、チオラーゼ活性及びＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ活性を両方保有しているポリペプチドをコードするものと報告されている。ｍｖａＥ遺伝子によりコードされているポリペプチドのチオラーゼ活性は、アセチルＣｏＡをアセトアセチルＣｏＡに変換するのに対し、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドの酵素活性は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡをメバロン酸に変換する。本発明に使用することのできるｍｖａＥポリぺプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の微生物資源から天然に又は改変により得られ、チオラーゼ活性は有さないもののＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ活性は有するポリぺプチド及び核酸が挙げられる。
【００６７】
改変ｍｖａＥポリペプチドとしては、１つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸置換されているものの、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ活性は保有しており、かつチオラーゼ活性は最小限に抑えられているか、又は全く有さないものが挙げられる。アミノ酸置換は、保存的なものであっても非保存的なものであってもよく、アミノ酸残基の置換は遺伝子暗号によりコードされていてもコードされていなくてもよい。標準的な２０個のアミノ酸「記号（alphabet）」を、側鎖の類似性に基づき化学的なファミリーに分けた。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、極性無電荷側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸が挙げられる。「保存的アミノ酸置換」では、アミノ酸残基は、化学的に類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸により置換される）。「非保存的アミノ酸置換」では、アミノ酸残基は、化学的に異なる側鎖を有するアミノ酸残基で置換される（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸により置換される）。
【００６８】
ｍｖａＥポリペプチド中にアミノ酸置換を導入することで、分子の官能性を改良することができる。例えば、チオラーゼ欠損型ｍｖａＥポリペプチドには、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡのメバロン酸への変換能を向上させるアミノ酸置換を導入することができる。一部の態様では、チオラーゼ欠損型ｍｖａＥポリペプチド変異体は、１つ以上の保存的なアミノ酸置換を含有する。
【００６９】
一態様では、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを生産させる際には、分解されていない又は分解しにくい、チオラーゼ欠損型ｍｖａＥタンパク質を使用することができる。使用することのできる、分解されていない又は分解しにくいｍｖａＥ遺伝子産物の例としては、限定するものではないが、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カセリフラブス（E. casseliflavus）、Ｅ．フェカリス（E. faecalis）及びＬ．グレイ（L. grayi）に由来するものが挙げられる。当業者は、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）においてｍｖａＥタンパク質を発現させ、任意の標準的な分子生物学手法により断片が存在していないか調べることができる。例えば、Ｈｉｓタグを利用して精製した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをＳａｆｅｓｔａｉｎで染色することにより、又はメバロン酸、イソプレン又イソプレノイドを生産する大腸菌（E. coli）ＢＬ２１において発現させる場合には本明細書に記載の検出法を使用することにより、断片が存在していないことを確認することができる。
【００７０】
Ｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００２，Ａｐｒｉｌ；１８４（８）：２１１６〜２１２２）に記載されるものなどの標準法を使用して、ポリペプチドがチオラーゼ活性を欠損しＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ活性の高いｍｖａＥ活性を有するか、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼの非存在下及び／又はＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ活性の存在下で測定することにより決定することができる。代表的なアッセイでは、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ活性は、アセトアセチルＣｏＡの形成又はチオール基の開裂に伴う吸光度の変化を分光光度計により３０２ｎｍにて監視することで測定できる。アセトアセチルＣｏＡ合成を判定するための各反応に関する標準的なアッセイ条件は、１ｍＭのアセチルＣｏＡ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのトリス（ｐＨ  １０．５）というものであり、反応は酵素の添加により開始される。アッセイは最終用量２００μＬで実施できる。アッセイに関し、１酵素単位（ｅｕ）は、１分間で１μｍｏｌのアセトアセチルＣｏＡを合成すること又はチオール基を開裂させることを意味する。他の代表的なアッセイでは、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ活性は、分光光度計により、３４０ｎｍでのＮＡＤＰ（Ｈ）の出現又は消失をもとに監視することもできる。ＨＭＧ−ＣｏＡのメバロン酸への還元的脱アシル化について測定した各反応の標準的なアッセイ条件は、０．４ｍＭのＮＡＤＰＨ、１．０ｍＭの（Ｒ，Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡ、１００ｍＭのＫＣｌ及び１００ｍＭのＫ  ｘＰＯ４（ｐＨ  ６．５）というものである。アッセイは最終用量２００μＬで実施する。反応は酵素の添加により開始される。アッセイに関し、１ｅｕは、１分間で１μｍｏｌのＮＡＤＰ（Ｈ）が代謝回転されることを意味する。これは、０．５μｍｏｌのＨＭＧ−ＣｏＡ又はメバロン酸が代謝回転することに相当する。
【００７１】
あるいは、宿主細胞におけるメバロン酸の生産量は、限定するものではないが、ガスクロマトグラフィー（米国特許出願公開第２００５／０２８７６５５（Ａ１）号を参照されたい）又はＨＰＬＣ（米国特許出願第１２／９７８，３２４号を参照されたい）で測定することができる。代表的なアッセイの際には、１種以上の抗生物質を添加したＬＢブロスを含有させた振とうチューブに培養物を接種し、３４℃にて、２５０ｒｐｍで１４時間インキュベートする。次に、１％グルコース、０．１％酵母エキス及び２００μＭのＩＰＴＧを添加したＴＭ３培地を入れたウェルプレート中で、最終的なＯＤが０．２になるよう培養物を希釈する。次に、プレートを、Ｂｒｅａｔｈ  Ｅａｓｉｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）でシールし、振とう／恒温器で、３４℃にて、６００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。次に各培養物１ｍＬを３，０００×ｇで５分遠心分離する。次に、上清に２０％硫酸を添加し、氷上で５分インキュベートする。次に、混合物を３０００×ｇで５分遠心分離し、ＨＰＬＣ解析のため上清を回収する。メバロン酸（シグマ）の標準曲線と比較して、試料中のメバロン酸濃度を測定する。更に、当該技術分野において既知の任意の手法によりグルコースオキシダーゼアッセイを実施し、グルコース濃度を測定する。ＨＰＬＣを使用し、各試料により得られた屈折率を、濃度既知の各種メバロン酸溶液のＨＰＬＣをもとに作成した検量線に対し比較して、メバロン酸濃度を定量することができる。
【００７２】
ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、宿主細胞においてマルチコピープラスミドで発現させることができる。プラスミドは高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド又は中程度コピー数プラスミドであってよい。あるいは、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを宿主細胞の染色体に組み込むこともできる。プラスミド上の、あるいは宿主細胞染色体の一部に組み込まれた、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの異種発現に際し、核酸の発現は、誘導型プロモーター又は常時発現型プロモーターのいずれかにより駆動できる。プロモーターは、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの発現を強力に駆動することができ、弱く駆動することができ、あるいは中程度に駆動することができる。
【００７３】
ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼポリぺプチド及び核酸の例
アセトアセチルＣｏＡのＨＭＧ−ＣｏＡ（例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ又はＨＭＧＳ）への変換を触媒する酵素を使用することができる。一実施形態では、ｍｖａＳ遺伝子によりコードされるポリペプチドを使用することができる。ｍｖａＳ遺伝子は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を保有するポリペプチドをコードする。このポリペプチドは、アセトアセチルＣｏＡを、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）に変換させることができる。ｍｖａＳポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びにｍｖａＳポリペプチドの活性を少なくとも１つ有する、本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【００７４】
変異型ｍｖａＳポリペプチドとしては、１つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸置換を受けており、かつｍｖａＳポリペプチド活性（すなわち、アセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡに変換する能力）を保持しているものが挙げられる。ｍｖａＳポリペプチド中にアミノ酸置換を導入することで、分子の官能性を改良することができる。例えば、ｍｖａＳポリペプチドの、基質に対する結合親和性を増加させるアミノ酸置換、あるいはアセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡに変換する能力を向上させるアミノ酸置換を、ｍｖａＳポリペプチドに導入することができる。一部の態様では、ｍｖａＳポリペプチド変異体は、１つ以上の保存的なアミノ酸置換を含有する。
【００７５】
Ｑｕａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，１９８９，２６２：１５９〜１６４）に記載のものなどの標準法を使用して、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの活性を測定することにより、ポリペプチドがｍｖａＳ活性を有するか評価することもできる。代表的なアッセイでは、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの活性は、３０３ｎｍでの吸光度の変化を監視し、エノール形態のアセトアセチルＣｏＡの消失を分光光度をもとに評価することで、検定できる。３０℃下で、５０ｍｍのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．２ｍＭのジチオスレイトールを含有する標準的な１ｍＬのアッセイ系に、５ｍＭのアセチルリン酸、１０，Ｍ−アセトアセチルＣｏＡ及び５ｕＬの抽出試料を加え、続いてアセチルＣｏＡ（１００ｕＭ）及び１０ユニットのＰＴＡを同時に加えることができる。次に、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの活性を、アセチルＣｏＡ添加前及び添加後の変換速度の差として測定する。使用した条件下（ｐＨ  ８．０、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ２）での、アセトアセチルＣｏＡの吸収係数は、１２．２×１０３Ｍ−１  ｃｍ−１である。定義によると、１ユニットの酵素活性により、１分あたり１ｕｍｏｌのアセトアセチルＣｏＡが変換されることになる。
【００７６】
あるいは、宿主細胞におけるメバロン酸の生産量は、限定するものではないが、ガスクロマトグラフィー（米国特許出願公開第２００５／０２８７６５５（Ａ１）号を参照されたい）又はＨＰＬＣ（米国特許出願第１２／９７８，３２４号を参照されたい）で測定することができる。代表的なアッセイの際には、１種以上の抗生物質を添加したＬＢブロスを含有させた振とうチューブに培養物を接種し、３４℃にて、２５０ｒｐｍで１４時間インキュベートする。次に、１％グルコース、０．１％酵母エキス及び２００μＭのＩＰＴＧを添加したＴＭ３培地を入れたウェルプレート中で、最終的なＯＤが０．２になるよう培養物を希釈する。次に、プレートを、Ｂｒｅａｔｈ  Ｅａｓｉｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）でシールし、振とう／恒温器で、３４℃にて、６００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。次に各培養物１ｍＬを３，０００×ｇで５分遠心分離する。次に、上清に２０％硫酸を添加し、氷上で５分インキュベートする。次に、混合物を３０００×ｇで５分遠心分離し、ＨＰＬＣ解析のため上清を回収する。メバロン酸（シグマ）の標準曲線と比較して、試料中のメバロン酸濃度を測定する。更に、当該技術分野において既知の任意の手法によりグルコースオキシダーゼアッセイを実施し、グルコース濃度を測定する。ＨＰＬＣを使用し、各試料により得られた屈折率を、濃度既知の各種メバロン酸溶液のＨＰＬＣをもとに作成した検量線に対し比較して、メバロン酸濃度を定量することができる。
【００７７】
ｍｖａＳ核酸は、宿主細胞において、マルチコピープラスミド上で発現させることができる。プラスミドは高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド又は中程度コピー数プラスミドであってよい。あるいは、ｍｖａＳ核酸は、宿主細胞の染色体に組み込むこともできる。プラスミド上の、あるいは宿主細胞染色体の一部に組み込まれた、ｍｖａＳ核酸の異種発現に際し、核酸の発現は、誘導型プロモーター又は常時発現型プロモーターのいずれかにより駆動できる。プロモーターは、ｍｖａＳ核酸の発現を強力に駆動することができ、弱く駆動することができ、あるいは中程度に駆動することができる。
【００７８】
下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている核酸
本発明の一部の態様では、本明細書に記載の組成物又は方法の任意のものに記載の細胞は、下流メバロン酸（ＭＶＡ）経路のポリペプチドをコードしている核酸を１つ以上更に含む。一部の態様では、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドは内在性ポリペプチドである。一部の態様では、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように構成型プロモーターに連結される。一部の態様では、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように誘導型プロモーターに連結される。一部の態様では、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように高発現型プロモーターに連結される。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性下流ＭＶＡ経路のポリペプチドが過剰発現するよう設計する。一部の態様では、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように低発現型プロモーターに連結される。
【００７９】
下流メバロン酸生合成経路は、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）及びジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）を含む。一部の態様では、下流ＭＶＡ経路は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）を更に含む。本明細書に提供される細胞は、イソプレンシンターゼ、上流ＭＶＡ経路の１つ以上のポリペプチド及び／又は下流ＭＶＡ経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている核酸を含み得る。下流ＭＶＡ経路のポリペプチドは、（ａ）メバロン酸を５−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素、（ｂ）５−ホスホメバロン酸を５−ジホスホメバロン酸に変換する酵素、（ｃ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素、のうちの任意の酵素であり得る。より具体的には、メバロン酸を５−ホスホメバロン酸にリン酸化する酵素は、Ｍ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼ、ラクトバチルス（Lactobacillus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス（Streptomyces）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス（Streptomyces）ＣＬ１９０メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びＭ．バートニィ（M. Burtonii）メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群であってもよい。別の態様では、メバロン酸を５−ホスホメバロン酸にリン酸化する酵素はＭ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼである。
【００８０】
一部の態様では、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドは異種ポリペプチドである。一部の態様では、細胞は、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている異種核酸のコピーを１つ以上含む。一部の態様では、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように構成型プロモーターに連結される。一部の態様では、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように誘導型プロモーターに連結される。一部の態様では、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように高発現型プロモーターに連結される。一部の態様では、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように低発現型プロモーターに連結される。一部の態様では、異種下流ＭＶＡ経路のポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）又はメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のポリペプチドである。
【００８１】
下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている核酸は、細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞で安定的に発現させることができる。下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている核酸は更に、ベクター上に存在させてもよい。
【００８２】
下流ＭＶＡ経路のポリペプチドの例としては、次の（ｉ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｉｉ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；（ｉｉｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）；及び（ｉｖ）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）も挙げられる。詳細には、下流ＭＶＫ経路のポリペプチドは、メタノサルシナ属（Methanosarcina）由来のものであってよく、更に詳細には、下流ＭＶＫ経路のポリペプチドは、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のものであってよい。下流ＭＶＡ経路のポリぺプチドのその他の例は、米国特許出願公開第２０１０／００８６９７８号に見出すことができ、この内容は、下流ＭＶＫ経路のポリペプチド及び下流ＭＶＫ経路のポリペプチド変異体に関し参照によりその全文が明示的に本明細書に組み込まれる。
【００８３】
本明細書に記載の細胞のうち任意のものは、ＩＤＩ核酸（例えば、ＩＤＩをコードしている内在性又は異種核酸）を含み得る。イソペンテニルジホスフェートイソメラーゼポリペプチド（イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ又はＩＤＩ）は、イソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の相互変換を触媒する（例えば、ＩＰＰをＤＭＡＰＰに変換し及び／又はＤＭＡＰＰをＩＰＰに変換する）。ＩＤＩポリペプチド例としては、ＩＤＩポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。標準法（本明細書に記載されるものなど）を用い、生体外で、細胞抽出物中で又は生体内でポリペプチドがＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを相互変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＩＤＩポリペプチド活性を有するか評価することができる。ＩＤＩ核酸の例としては、ＩＤＩポリペプチド活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードしている核酸が挙げられる。ＩＤＩポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【００８４】
特に、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドとしては、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが挙げられる。下流ＭＶＡ経路の核酸の例としては、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。下流ＭＶＡ経路のポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。更に、イソプレンの生産量を増加させるような、下流ＭＶＡ経路のポリペプチド変異体も、良好に使用することができる。
【００８５】
一部の態様では、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）又はメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のポリペプチドである。一部の態様では、ＭＶＫ経路のポリペプチドは、ラクトバチルス（Lactobacillus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス（Streptomyces）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス（Streptomyces）ＣＬ１９０メバロン酸キナーゼポリペプチド及びメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）メバロン酸キナーゼポリペプチド、からなる群から選択される。本開示のプロモーターのうちのいずれか（例えば、本開示に記載され、本開示の実施例において識別される、誘導型プロモーター及び構成型プロモーターなどのプロモーター）を使用して、本開示のいずれかのＭＶＡポリペプチドの発現を駆動させることができる。
【００８６】
イソプレンシンターゼ−核酸及びポリぺプチド
本発明の一部の態様では、本開示の組成物又は方法のいずれかに記載の組み換え細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸、又はイソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドを更に含む。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは内在性ポリペプチドである。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、構成型プロモーターに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、誘導型プロモーターに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、高発現型プロモーターに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸を１つ以上使用する（例えば、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸の２、３、又は４つ以上のコピーを使用する）。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性イソプレンシンターゼ経路のポリペプチドが過剰発現するよう設計する。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、低発現型プロモーターに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）由来のポリペプチド、又はウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘヤマナラシ（Populus tremula）などの交雑種由来のポリペプチドである。
【００８７】
一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは異種ポリペプチドである。一部の態様では、細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸のコピーを１つ以上含む。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、構成型プロモーターに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、誘導型プロモーターに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、高発現型プロモーターに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、低発現型プロモーターに調節可能なように連結される。
【００８８】
イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞で安定的に発現させることができる。イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている核酸は、更にベクターに組み込むこともできる。
【００８９】
代表的なイソプレンシンターゼの核酸としては、イソプレンシンターゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。イソプレンシンターゼポリペプチドは、ジメチルアリールジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンに変換する。代表的なイソプレンシンターゼポリペプチドとしては、イソプレンシンターゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、並びに融合ポリペプチドが挙げられる。イソプレンシンターゼポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。加えて、イソプレンシンターゼ変異体は、酵素活性が向上しているなどして、活性が向上されていてよい。一部の態様では、イソプレンシンターゼ変異体は、安定性（例えば、熱安定性）が改良されている、及び／又は溶解性が改良されているなどして、その他の特性が改良されている。
【００９０】
生体外で、細胞抽出物中で又は生体内で、ポリペプチドがＤＭＡＰＰをイソプレンに変換する能力を測定して、ポリペプチドがイソプレンシンターゼポリペプチド活性を有するか評価する際には、標準法を使用できる。細胞抽出物中のイソプレンシンターゼポリペプチド活性は、例えば、Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３０１０〜１３０１６，１９９５に記載のとおりに測定することができる。代表的なアッセイでは、ＤＭＡＰＰ（シグマ）は窒素流下で濃縮させ、乾燥させ、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ８．２）を用い１００ｍＭに再水和し、−２０℃で保存する。アッセイを実施するために、金属製スクリューキャップと、テフロンコーティングのなされたシリコン製隔壁（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とを取り付けた２０ｍＬのヘッドスペースバイアル内で、５μＬの１Ｍ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ（２５０μｇ／ｍＬ）ＤＭＡＰＰ、６５μＬの植物抽出緩衝液（ＰＥＢ）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％グリセロール、及び２ｍＭ  ＤＴＴ）に、２５μＬの細胞抽出物を加え、振とうさせながら３７℃で１５分間培養した。２００μＬの２５０ｍＭ  ＥＤＴＡを加えて反応をクエンチさせ、ＧＣ／ＭＳにより定量することができる。
【００９１】
一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物のイソプレンシンターゼポリペプチド又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（Pueraria）に由来するイソプレンシンターゼ又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ハコヤナギ属（Populus）由来のイソプレンシンターゼ又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ポプラ（poplar）のイソプレンシンターゼポリペプチド又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドはクズ（kudzu）のイソプレンシンターゼポリペプチド又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）由来のポリペプチド、又はウラジロハコヤナギ（Populus alba）とヤマナラシ（Populus tremula）の交雑種由来のポリペプチド、又はそれらの変異体（variant）由来のポリペプチドである。
【００９２】
一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチド又は核酸は、マメ科（Fabaceae）、例えば、マメ亜科（Faboideae）由来のものである。特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチド又は核酸は、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）（クズ（kudzu））（Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３７：７００〜７１２，２００５）、クズ（Pueraria lobata）、ポプラ（poplar）（ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、セイヨウハコヤナギ（Populus nigra）、コットンウッド（Populus trichocarpa）、又はウラジロハコヤナギ（Populus alba）とヤマナラシ（Populus tremula）の交雑種（ＣＡＣ３５６９６）Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔａ  ２１３：４８３〜４８７，２００１）、アスペン（aspen）（アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides）など）（Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ  ２７０（２２）：１３０１０〜１３１６，１９９５）、又はヨーロッパナラ（English oak）（カーカス・ロバー（Quercus robur））（Ｚｉｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、国際公開第９８／０２５５０号）に由来するポリペプチド又は核酸、あるいはそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）、クズ（Pueraria lobata）、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、セイヨウハコヤナギ（Populus nigra）又はコットンウッド（Populus trichocarpa）由来のイソプレンシンターゼであるか、又はこれらの合成酵素の変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来のイソプレンシンターゼであるか、又はこれら合成酵素の変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼ（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来のイソプレンシンターゼ又はそれらの変異体）をコードしている核酸は、コドンを最適化されている。
【００９３】
一部の態様では、イソプレンシンターゼ核酸又はポリペプチドは、天然に生じるポリペプチド又は核酸である（例えば、ハコヤナギ属（Populus）から天然に生じるポリペプチド又は核酸）。一部の態様では、イソプレンシンターゼ核酸又はポリペプチドは、野生型又は天然に生じるポリペプチド又は核酸ではない。一部の態様では、イソプレンシンターゼ核酸又はポリペプチドは、野生型又は天然に生じるポリペプチド又は核酸の変異体である（例えば、ハコヤナギ属（Populus）の野生型又は天然に生じるポリペプチド又は核酸の変異体）。
【００９４】
一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、野生型又は天然型イソプレンシンターゼの変異体である。一部の態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼと比較して触媒活性が向上しているなど、活性が向上している。活性（例えば、触媒活性）の向上は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％のうちのいずれかの程度であり得る。一部の態様では、触媒活性などの活性の向上は、少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、又は１００倍のいずれかである。一部の態様では、触媒活性などの活性の向上は、約１０％〜約１００倍である（例えば、約２０％〜約１００倍、約５０％〜約５０倍、約１倍〜約２５倍、約２倍〜約２０倍、又は約５倍〜約２０倍）。一部の態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼと比較して可溶性が向上している。可溶性の向上は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％のうちのいずれかの程度であり得る。可溶性の向上は、少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、又は１００倍のうちのいずれかの程度であり得る。一部の態様では、溶解性の向上は、約１０％〜約１００倍のうちのいずれかの程度であり得る（例えば、約２０％〜約１００倍、約５０％〜約５０倍、約１倍〜約２５倍、約２倍〜約２０倍、又は約５倍〜約２０倍）。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、天然型イソプレンシンターゼ変異体であり、かつ天然型イソプレンシンターゼと比較して安定性が向上している（熱安定性など）。
【００９５】
一部の態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼの活性の、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％の活性を有する。変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼとの配列類似性を保有し得る。一部の態様では、野生型又は天然型イソプレンシンターゼの変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼのアミノ酸配列と、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％のうちのいずれかの程度で配列相同性を有する。一部の態様では、野生型又は天然型イソプレンシンターゼの変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼのアミノ酸配列と、約７０％〜約９９．９％、約７５％〜約９９％、約８０％〜約９８％、約８５％〜約９７％、又は約９０％〜約９５％のうちのいずれかの程度で配列相同性を有する。
【００９６】
一部の態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼ内に変異を持つ。一部の態様では、変異体は、少なくとも１箇所にアミノ酸置換、少なくとも１箇所にアミノ酸挿入、及び／又は少なくとも１箇所にアミノ酸欠失を有する。一部の態様では、変異体は、少なくとも１箇所にアミノ酸置換を有する。一部の態様では、変異体と、野生型又は天然型イソプレンシンターゼとの間で異なっているアミノ酸残基の数は、１以上であってよく、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、又は５０以上のアミノ酸残基が異なっていてよい。天然型イソプレンシンターゼとしては、植物由来の任意のイソプレンシンターゼを挙げることができ、例えば、クズ（kudzu）イソプレンシンターゼ、ポプラ（poplar）イソプレンシンターゼ、ヨーロッパナラ（English oak）イソプレンシンターゼ、及びヤナギ（willow）イソプレンシンターゼが挙げられる。一部の態様では、変異体は、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来のイソプレンシンターゼの変異体である。一部の態様では、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来のイソプレンシンターゼ変異体は、少なくとも１箇所にアミノ酸置換、少なくとも１箇所にアミノ酸挿入、及び／又は少なくとも１箇所にアミノ酸欠失を有する。一部の態様では、変異体は、切断型のウラジロハコヤナギ（Populus alba）イソプレンシンターゼである。一部の態様では、変異体（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来のイソプレンシンターゼの変異体）をコードしている核酸は、コドンを最適化させたものである（例えば、異種イソプレンシンターゼを発現させる宿主細胞に基づきコドンを最適化している）。
【００９７】
本開示のイソプレンシンターゼポリペプチドは、国際公開第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／１２４１４６号、同第２０１２／０５８４９４号、及び米国特許出願公開第２０１０／００８６９７８号のいずれかに記載のものであってよい。これらの特許文献に記載される、イソプレンシンターゼ及びイソプレンシンターゼ変異体に関係するすべての内容は、参照により本開示に明示的に組み込む。
【００９８】
本開示のプロモーターのうちのいずれか（例えば、本開示に記載され、本開示の実施例において識別される、誘導型プロモーター及び構成型プロモーターなどのプロモーター）を使用して、本開示のいずれかのイソプレンシンターゼの発現を駆動させることができる。
【００９９】
好適なイソプレンシンターゼとしては、限定するものではないが、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ３４１４３１、ＡＹ３１６６９１、ＡＹ２７９３７９、ＡＪ４５７０７０、及びＡＹ１８２２４１として識別されるものが挙げられる。本開示のイソプレンシンターゼをコードしている微生物の生産法を含む組成物又は方法のうちのいずれか１つに使用することのできるイソプレンシンターゼの種類は、国際公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、同第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／０３１０６２号、同第２０１０／０３１０６８号、同第２０１０／０３１０７６号、同第２０１０／０１３０７７号、同第２０１０／０３１０７９号、同第２０１０／１４８１５０同第２０１０／１２４１４６号、同第２０１０／０７８４５７号、同第２０１０／１４８２５６号、及び同第２０１２／０５８４９４号にも記載されている。これらの特許文献に記載される、イソプレンシンターゼ及びイソプレンシンターゼ変異体に関係するすべての内容を、参照により、本開示に明示的に援用する。
【０１００】
ＤＸＰ経路のポリペプチドをコードしている核酸
本発明の一部の態様では、本明細書に記載の任意の組成物又は方法に記載の組み換え細胞は、ＤＸＳポリペプチド又はＤＸＰ経路の他のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を更に含む。一部の態様では、細胞は更に、ＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている内在性核酸の染色体コピーを含む。一部の態様では、大腸菌（E. coli）細胞は更に、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を含む。一部の態様では、核酸は、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている。一部の態様では、１つのプラスミドは、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている。一部の態様では、複数のプラスミド（multiple plasmids）は、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている。
【０１０１】
ＤＸＳポリペプチド例としては、ＤＸＳポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。標準法（本明細書に記載されるものなど）を用い、ポリペプチドが、生体外で、細胞抽出物中で又は生体内でピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸に変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するかを評価することができる。ＤＸＳポリペプチド及び核酸の例並びにＤＸＳ活性の測定法は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に、より詳細に記載される。
【０１０２】
ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチドの例としては、限定するものではないが、次の任意のポリペプチド：ＤＸＳポリペプチド、ＤＸＲポリペプチド、ＭＣＴポリペプチド、ＣＭＫポリペプチド、ＭＣＳポリペプチド、ＨＤＳポリペプチド、ＨＤＲポリペプチド、及びＤＸＰ経路のポリペプチドの活性を１つ、又は２つ以上有するＤＸＰ経路ポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）が挙げられる。特に、ＤＸＰ経路のポリペプチドとしては、ＤＸＰ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが挙げられる。ＤＸＰ経路の核酸の例としては、ＤＸＰ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。ＤＸＰ経路のポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。ＤＸＰ経路のポリペプチド及び核酸の例としては、並びにＤＸＰ経路のポリペプチド活性を測定する方法については、国際公開第２０１０／１４８１５０号に、より詳細に記載されている。
【０１０３】
ＤＸＳポリペプチドの例としては、ＤＸＳポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。標準法（本明細書に記載されるものなど）を用い、ポリペプチドが、生体外で、細胞抽出物中で又は生体内でピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸に変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するか評価することができる。ＤＸＳポリペプチド及び核酸の例並びにＤＸＳ活性の測定法は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に、より詳細に記載される。
【０１０４】
特に、ＤＸＳポリペプチドは、ピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸を１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）に変換する。標準法を用い、生体外で、細胞抽出物中で又は生体内でポリペプチドがピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を変換する能力を測定し、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するか評価することができる。
【０１０５】
ＤＸＲポリペプチドは、１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）に変換する。標準法を用い、生体外で、細胞抽出物中で又は生体内でポリペプチドがＤＸＰを変換する能力を測定し、ポリペプチドがＤＸＲポリペプチド活性を有するか評価することができる。
【０１０６】
ＭＣＴポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）を４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）に変換する。標準法を用い、生体外で、細胞抽出物中で又は生体内でポリペプチドがＭＥＰを変換する能力を測定し、ポリペプチドがＭＣＴポリペプチド活性を有するか評価することができる。
【０１０７】
ＣＭＫポリペプチドは、４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）を２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）に変換する。標準法を用い、生体外で、細胞抽出物中で又は生体内でポリペプチドがＣＤＰ−ＭＥを変換する能力を測定し、ポリペプチドがＣＭＫポリペプチド活性を有するか評価することができる。
【０１０８】
ＭＣＳポリペプチドは、２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェート（ＭＥ−ＣＰＰ又はｃＭＥＰＰ）に変換する。標準法を用い、生体外で、細胞抽出物中で又は生体内でポリペプチドがＣＤＰ−ＭＥＰを変換する能力を測定し、ポリペプチドがＭＣＳポリペプチド活性を有するか評価することができる。
【０１０９】
ＨＤＳポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェートを（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イルジホスフェート（ＨＭＢＰＰ又はＨＤＭＡＰＰ）に変換する。標準法を用い、生体外で、細胞抽出物中で又は生体内でポリペプチドがＭＥ−ＣＰＰを変換する能力を測定し、ポリペプチドがＨＤＳポリペプチド活性を有するか評価することができる。
【０１１０】
ＨＤＲポリペプチドは、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イルジホスフェートをイソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）及びジメチルアリールジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）に変換する。標準法を用い、生体外で、細胞抽出物中で又は生体内でポリペプチドがＨＭＢＰＰを変換する能力を測定し、ポリペプチドがＨＤＲポリペプチド活性を有するか評価することができる。
【０１１１】
ＭＶＡ経路、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ及びＤＸＰ経路のポリペプチドに関する生物資源
イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路、及び／又はＭＶＡ経路核酸（分子のアセトアセチルＣｏＡをアセチルＣｏＡに縮合する、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、すなわちＡＡＣＴなどの酵素は除く）、ＭＶＡ経路ポリぺプチド（２分子のアセトアセチルＣｏＡをアセチルＣｏＡに縮合する、ＡＡＣＴなどの酵素は除く）は、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路、及び／又はＭＶＡ経路核酸を天然に含有する任意の微生物から得ることができる。イソプレンは、バクテリア、酵母、植物及び動物などの様々な生物により天然に生成される。一部の生物は、イソプレンの生産に関係するＭＶＡ経路を含有する。イソプレンシンターゼの核酸は、例えば、イソプレンシンターゼを含有する任意の生物から得ることができる。したがってＭＶＡ経路の核酸は、例えば、ＭＶＡ経路を含有する任意の生物から得ることができる。ＩＤＩ及びＤＸＰ経路の核酸は、例えば、ＩＤＩ及びＤＸＰ経路を含有する任意の生物から得ることができる。
【０１１２】
イソプレンシンターゼ、ＤＸＰ経路、ＩＤＩ、及び／又はＭＶＡ経路の核酸の核酸配列は、細菌、真菌、植物、藻類、又はシアノバクテリアから単離することができる。生物資源の例としては、例えば、酵母、例えばサッカロミセス属（Saccharomyces）（例えば、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae））、バクテリア、例えば、エシェリキア属（Escherichia）（例えば、大腸菌（E. coli））、又はメタノサルシナ属（Methanosarcina）（例えば、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei））、植物、例えばクズ（kudzu）又はポプラ（poplar）（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）又はウラジロハコヤナギ（Populus alba）とヤマナラシ（Populus tremula）の交雑種ＣＡＣ３５６９６（Populus alba x tremula CAC35696））又はアスペン（aspen）（例えば、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides））が挙げられる。イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ及び／又はＭＶＡ経路ポリペプチドに関係し、使用することのできる資源例は、同様に、国際公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、同第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／０３１０６２号、同第２０１０／０３１０６８号、同第２０１０／０３１０７６号、同第２０１０／０１３０７７号、同第２０１０／０３１０７９号、同第２０１０／１４８１５０号、同第２０１０／０７８４５７号、及び同第２０１０／１４８２５６号に記載されている。
【０１１３】
一部の態様では、生物資源はサッカロミセス属（Saccharomyces sp.）であり、例えば、サッカロミセス属（Saccharomyces sp.）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア属（Pichia sp.）又はカンジダ属（Candida sp.）である。
【０１１４】
一部の態様では、宿主生物は、Ｂ．リケノフォルミス（B. lichenoformis）又は枯草菌（B. subtilis）などのバチルス株、Ｐ．シトレア（P. citrea）などのパンテア（Pantoea）株、Ｐ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）などのシュードモナス属（Pseudomonas）株、Ｓ．リビダンス（S. lividans）又はＳ．ルビギノーサス（S. rubiginosus）などのストレプトミセス（Streptomyces）株、大腸菌（E. coli）などのエシェリキア（Escherichia）株、エンテロバクター（Enterobacter）株、ストレプトコッカス（Streptococcus）株、又はメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）などの古細菌（archaea）株である。
【０１１５】
本明細書で使用するとき、「バチルス（Bacillus）」属としては、当業者に既知の「バチルス（Bacillus）属」のすべての種を包含し、限定するものではないが、例えば、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシィ（B. clausii）、Ｂ．ハロドュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、及びＢ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）が挙げられる。バチルス属は分類上の再編成を受け続けるものと認識される。したがって、この属は、再分類された種を包含することを意図し、例えば、限定するものではないが、現在は「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）」と命名されたＢ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）のような生物を包含する。酸素存在下での耐性内生胞子の生成はバチルス属の決定的特徴と考えられるが、この特徴は最近命名されたアリシクロバチルス（Alicyclobacillus）、アムピバチルス（Amphibacillus）、アネウリニバチルス（Aneurinibacillus）、アノキシバチルス（Anoxybacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、フィロバチルス（Filobacillus）、グラシリバチルス（Gracilibacillus）、ハロバチルス（Halobacillus）、パエニバチルス（Paenibacillus）、サリバチルス（Salibacillus）、サーモバチルス（Thermobacillus）、ウレイバチルス（Ureibacillus）、及びビルジバチルス（Virgibacillus）にも当てはまる。
【０１１６】
一部の態様では、生物資源はグラム陽性細菌である。非限定的な例としては、ストレプトミセス（Streptomyces）株（例えば、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．セリカラー（S. coelicolor）、又はＳ．グリセウス（S. griseus））及びバチルス（Bacillus）株が挙げられる。一部の態様では、生物資源は、大腸菌（E. coli）又はシュードモナス属（Pseudomonas sp.）などのグラム陰性細菌である。一部の態様では、生物資源はＬ．アシドフィルス（L. acidophilus）である。
【０１１７】
一部の態様では、生物源は植物であり、例えば、マメ科（Fabaceae）、例えばマメ亜科（Faboideae）などの植物である。一部の態様では、生物資源はクズ（kudzu）、ポプラ（poplar）（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）とヤマナラシ（Populus tremula）の交雑種ＣＡＣ３５６９６など）、アスペン（aspen）（例えば、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides））、又はカーカス・ロバー（Quercus robur））である。
【０１１８】
一部の態様では、微生物源は、藻類、例えば緑藻、紅藻、灰色藻、クロララクニオン藻（chlorarachniophytes）、ミドリムシ類（euglenids）、クロミスタ類（chromista）、又は渦鞭毛藻類である。
【０１１９】
一部の態様では、生物資源は、形態に基づき次の群：クロオコッカス目（Chlorococcales）、プレウロカプサ目（Pleurocapsales）、ユレモ目（Oscillatoriales）、ネンジュモ目（Nostocales）、又はスティゴネマ目（Stigonematales）のいずれかに分類される、ラン藻である。
【０１２０】
例示的な宿主細胞
当業者であれば、具体的な宿主株における遺伝子発現を最適化する特定の配列を含有するよう、発現ベクターが設計されることを認識するであろう。このような最適化配列としては、限定するものではないが、複製起点、プロモーター、及びエンハンサーが挙げられる。本明細書で参照するベクター及び配列は例示目的で記載され、本発明の範囲を狭めることを意味するものではない。
【０１２１】
任意の微生物又はそれらの子孫微生物を使用して、本明細書に記載のいずれかの遺伝子（異種又は同種）を発現させすることができる。グラム陽性又はグラム陰性細菌などの細菌細胞を使用して、本開示に記載の遺伝子のうち任意のものを発現させることができる。詳細には、本開示に記載の遺伝子は、エシェリキア属（Escherichia sp.）（例えば、大腸菌（E. coli））、Ｌ．アシドフィルス（L. acidophilus）、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシィ（B. clausii）、Ｂ．ハロドュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium spp.）（例えば、Ｃ．グルタミクム（C. glutamicum））、Ｓ．デグラダンス（S. degradans）２〜４０、アルギノビブリオ・アクアリティカス（Alginovibrio aqualiticus）、アルテノモナス（Alteromonas sr.）株ＫＬＩＡ、アステロミセス・クルシアタス（Asteromyces cruciatus）、ベネッケア・ペラギア（Beneckea pelagia）、エンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）、ハルモナス・マリーナ（Halmonas marina）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumonia）、フォトバクテリウム属（Photobacterium spp.）（ＡＴＣＣ  ４３３３６７）、シュードアルテロモナス・エルヤコヴィ（Pseudoalteromonas elyakovii）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）（例えば、シュードモナス・アルギノボラ（Pseudomonas alginovora）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・マルトフィリア（Pseudomonas maltophilia）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida））、ビブリオ・アルギノリチカス（Vibrio alginolyticus）、ビブリオ・ハリオチコール（Vibrio halioticol）、及びビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）、Ｓ．アルバス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．セリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞からなる群から選択される任意のもので発現させることができる。一態様では、バクテリア細胞は大腸菌（E. coli）細胞である。別の態様では、バクテリア細胞はＬ．アシドフィルス（L. acidophilus）細胞である。本発明の組成物及び方法には、数多くの種類の嫌気性細胞を宿主細胞として使用することができる。本発明の一態様では、本明細書に記載の任意の組成物又は方法に関し記載される細胞は、絶対嫌気性細胞及びその子孫細胞である。絶対嫌気性菌は、典型的には、条件下に酸素が存在する場合には良好に増殖しない。絶対嫌気性菌が低濃度の酸素に対しある程度の耐性を示す場合には、少量の酸素が存在してもよいことは理解されるであろう。一態様では、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体及びイソプレノイドを生産するよう遺伝子操作を行った絶対嫌気性菌を、本明細書に記載のいずれかの方法及び／又は組成物用の宿主細胞として提供し、実質的に無酸素条件下で増殖させることができる。この場合、存在する酸���量は嫌気性菌の増殖、維持、及び／又は発酵に有害なものではない。
【０１２２】
本発明の他の態様では、本明細書に記載の組成物又は方法のいずれかにおいて記載され及び／又は使用される宿主細胞は、通性嫌気性細胞及びその子孫細胞である。酸素が存在する場合、通性嫌気性菌は、好気呼吸により（例えば、ＴＣＡサイクルを利用するなどして）細胞ＡＴＰを生成し得る。しかしながら、通性嫌気性菌も、酸素の非存在下で増殖させることができる。絶対嫌気性菌とは対照的に、通性嫌気性菌はより多量の酸素の存在下で死滅し、又は増殖性が乏しくなる。したがって、一態様では、通性嫌気性菌は、本明細書で提供される組成物及び／又は方法のいずれかにおいて、宿主細胞として使用でき、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体及びイソプレノイドを生成するよう遺伝子操作を行うことができる。通性嫌気性の宿主細胞は、実質的に無酸素（存在する酸素量が、増殖、嫌気性菌の維持、及び／又は発酵に有害なものではないことを意味する）条件下で増殖させることができ、あるいは酸素がより多量に存在している場合にも増殖することができる。
【０１２３】
宿主細胞は、糸状真菌細胞及びその子孫細胞であってもよい。（例えば、Ｂｅｒｋａ  ＆  Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ，（１９８９），７（２）：１２７〜１５４を参照されたい）。一部の態様では、糸状菌細胞はトリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、Ｔ．ビリデ（T. viride）、Ｔ．コニンギ（T. koningii）、Ｔ．ハルジアナム（T. harzianum）、ペニシリウム属（Penicillium sp.）、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、ヒュミコラ・ラヌギノス（H. lanuginose）、Ｈ．グリセア（H. grisea）、クリソスポリウム属（Chrysosporium sp.）、Ｃ．ラックノウエンス（C. lucknowense）、グリオクラジウム属（Gliocladium sp.）、アスペルギルス属（Aspergillus sp.）、例えば、Ａ．オリゼ（A. oryzae）、Ａ．ニガー（A. niger）、ショウユコウジカビ（A sojae）、Ａ．ジャポニクス（A. japonicus）、Ａ．ニデュランス（A. nidulans）、又はアワモリコウジカビ（A. awamori）、フザリウム属（Fusarium sp.）、例えばＦ．ロゼウム（F. roseum）、Ｆ．グラミニウム（F. graminum）、Ｆ．セレアリス（F. cerealis）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporuim）、又はＦ．ベネナタム（F. venenatum）、ニューロスポラ属（Neurospora sp.）、例えば、Ｎ．クラッサ（N. crassa）、ヒポクレア属（Hypocrea sp.）、ムコール属（Mucor sp.）、例えば、Ｍ．ミエヘイ（M. miehei）、リゾプス属（Rhizopus sp.）又はエメリセラ属（Emericella sp.）のいずれか由来のものであってよい。一部の態様では、真菌は、Ａ．ニデュランス（A. nidulans）、アワモリコウジカビ（A. awamori）、Ａ．オリゼ（A. oryzae）、Ａ．アクレタス（A. aculeatus）、Ａ．ニガー（A. niger）、Ａ．ジャポニクス（A. japonicus）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）、Ｔ．ビリデ（T. viride）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）又はＦ．ソラニ（F. solani）である。特定の実施形態では、本明細書で使用するためのプラスミド又はプラスミド配列には、米国特許出願公開第２０１１／００４５５６３号に記載のものが包含される。
【０１２４】
宿主細胞は、サッカロミセス属（Saccharomyces sp.）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア属（Pichia sp.）、又はカンジダ属（Candida sp.）などの酵母であってもよい。一部の態様では、サッカロミセス属（Saccharomyces sp.）は、出芽酵母である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，（１９９２），８（６）：４２３〜４８８を参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書で使用するプラスミド又はプラスミド配列には、米国特許第７，６５９，０９７号、及び米国特許出願公開第２０１１／００４５５６３号に記載のものが包含される。
【０１２５】
宿主細胞は、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類（chlorarachniophytes）、ミドリムシ類（euglenids）、クロミスタ類（chromista）、又は渦鞭毛藻類などの藻類であってもよい。（例えば、Ｓａｕｎｄｅｒｓ及びＷａｒｍｂｒｏｄｔ、「藻類及び酵母などの菌類における遺伝子発現（Gene Expression in Algae and Fungi, Including Yeast）」（１９９３年），Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ，Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤを参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書で使用するためのプラスミド又はプラスミド配列には、米国特許出願公開第２０１１／００４５５６３号に記載のものが包含される。一部の態様では、宿主細胞は、形態学に基づき次の群：クロオコッカス目（Chlorococcales）、プレウロカプサ目（Pleurocapsales）、ユレモ目（Oscillatoriales）、ネンジュモ目（Nostocales）、又はスティゴネマ目（Stigonematales）（例えば、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，（２０１０）１２（１）：７０〜７９を参照されたい）のいずれかに分類されるラン藻などのラン藻である。特定の実施形態では、本明細書で使用するプラスミド又はプラスミド配列には、米国特許出願公開第２０１０／０２９７７４９号、同第２００９／０２８２５４５号、及び国際公開第２０１１／０３４８６３号に記載のものが包含される。
【０１２６】
特定の実施形態では、大腸菌（E. coli）宿主細胞を使用して、本明細書に記載のいずれかの遺伝子を発現させることができる。一態様では、宿主細胞は、メバロン酸を生産することができ、アセトアセチルＣｏＡシンターゼをコードしている１つ以上の核酸を発現する大腸菌（E. coli）株組み換え細胞又はそれらの子孫細胞である。大腸菌（E. coli）宿主細胞は、アセトアセチルＣｏＡシンターゼをコードしている１つ以上の核酸の異種発現を行わない同一の細胞を上回る量、最大力価、及び細胞生産性で、イソプレン、イソプレノイド前駆体（例えば、メバロン酸）、及び／又はイソプレノイドを生産することができる。加えて、大腸菌（E. coli）において異種発現させる、アセトアセチルＣｏＡシンターゼをコードしている１つ以上の核酸は、染色体のコピーであってよい（例えば、大腸菌（E. coli）染色体に組み込まれる）。他の態様では、大腸菌（E. coli）細胞は培養物である。
【０１２７】
形質転換法
当業界で知られる任意の技術により、アセトアセチルＣｏＡシンターゼをコードしている核酸、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡシンターゼを生産する酵素、チオラーゼ以外のＭＶＡ経路ポリペプチド、ＤＸＰ経路ポリペプチド、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ、及びイソプレン、イソプレノイド前駆体、及び／又はイソプレノイドの生産に必要とされる任意の酵素を宿主細胞（例えば、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、又はバクテリア細胞）に導入することができる。
【０１２８】
宿主細胞へのＤＮＡコンストラクト又はベクターの導入に一般的な手法、例えば、形質転換、電気穿孔法、核酸のマイクロインジェクション、形質導入、形質移入（例えば、リポフェクションを利用した又はＤＥＡＥ−デキストリンを利用した形質移入、あるいは組み換えファージウイルスを用いた形質移入）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿法を用いるインキュベーション、ＤＮＡコートした微粒子銃による高速導入、及びプロトプラストの融合などの手法を使用することができる。一般的な形質転換法は、当該技術分野で既知である（例えば、分子生物学領域の現行のプロトコル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（編）Ｃｈａｐｔｅｒ  ９，１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，「分子クローニング：実験室マニュアル第３版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed）」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２００１；及びＣａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３〜５６，１９８９を参照されたい）。導入された核酸は、染色体ＤＮＡに組み込むことができ、又は染色体外の複製配列として維持することができる。形質転換体は、当該技術分野において既知の任意の方法により選別することができる。形質転換体の選別に好適な方法は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６に記載される。
【０１２９】
一実施形態では、大腸菌（E. coli）などのバクテリアを宿主として使用する。この実施形態では、発現ベクターは、このようなバクテリアにおいて自己複製させることができるよう選択及び／又は遺伝子操作することができる。本開示に掲載する遺伝子に加え、プロモーター、リボソーム結合配列、転写終結配列も発現ベクターに含有させることができる。所望により、発現ベクターには、プロモーター活性を調節する遺伝子を含有させることもできる。
【０１３０】
大腸菌（E. coli）などの宿主で発現させることができるものであれば、任意のプロモーターを使用することができる。使用することのできるこのようなプロモーターの例としては、大腸菌（E. coli）由来のｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、及びＰＲプロモーター、並びにファージ由来のＴ７プロモーターなどが挙げられる。更に、ｔａｃプロモーターなどの人工的に設計又は改変したプロモーターを使用することもできる。
【０１３１】
その方法によりＤＮＡがバクテリアに導入されるのであれば、発現ベクターの導入方法は特に限定はされない。このような手法の例としては、カルシウムイオンを使用する方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９：２１１０〜２１１４（１９７２））、及び電気穿孔法が挙げられる。
【０１３２】
酵母を宿主として使用する場合、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、又はピキア・パストリス（Pichia pastoris）を使用することができる。この場合、酵母で発現させることができるものであればプロモーターは特に限定はされない。このようなプロモーターの例としては、ｇａｌｌプロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、熱ショックタンパク質プロモーター、ＭＦ．ａｌｐｈａ．１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、及びＡＯＸ１プロモーターが挙げられる。
【０１３３】
その方法により酵母にＤＮＡが導入されるものであれば酵母への組み換えベクターの導入法は特に限定はされない。このような導入法の例としては、電気穿孔法（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：１８２〜１８７（１９９０））、スフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７５：１９２９〜１９３３（１９７８））、及び酢酸リチウム法（Ｉｔｏｈ，Ｈ．：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３：１６３〜１６８（１９８３））が挙げられる。
【０１３４】
詳細には、宿主微生物としては、マロニルＣｏＡ含量が比較的高い微生物を使用することが好ましい。マロニルＣｏＡは、脂肪酸の生合成に使用される物質であり、あらゆる微生物に存在する。上記アセトアセチルＣｏＡシンターゼは、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する。したがって、イソプレン／イソプレノイドの生産性は、マロニルＣｏＡ含量の高い宿主微生物を使用することによって向上させることができる。
【０１３５】
ベクター
本明細書に記載の任意の組成物及び方法には好適なベクターを使用することができる。例えば、適切なベクターを使用して、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、イソプレンシンターゼ、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ、及び／又はチオラーゼ以外の１つ以上のＭＶＡ経路ポリぺプチドをコードしている遺伝子の１つ以上のコピーの発現を最適化することができる。一部の態様では、ベクターには選択マーカーを含有させる。選択可能なマーカーの例としては、これらに限定されるものではないが、抗生物質耐性核酸（例えば、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、フェロマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン又はクロラムフェニコール）、及び／又はホスト細胞に栄養的な利点などの代謝に関係する利点を与える核酸が挙げられる。一部の態様では、選択マーカーは使用せずに、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、イソプレンシンターゼ、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ並びに／又はチオラーゼ以外のＭＶＡ経路ポリペプチドの核酸の１つ以上のコピーを宿主細胞のゲノムに組み込む。本開示の実施例において特徴づけられ又は使用される任意の１つのベクターを使用することができる。
【０１３６】
宿主細胞変異
本発明は、更に、経路を開始させるマロニルＣｏＡの細胞内含量を増加させる変異を有する宿主微生物の使用を目的とする。これらの改変を行った宿主細胞では、アセトアセチルＣｏＡシンターゼによる基質（例えば、マロニルＣｏＡ）利用能が向上していることから、アセトアセチルＣｏＡの生産が増大することになり、イソプレン及び／又はイソプレノイドなどの下流の生成物の生産も増大する。特定の実施形態では、宿主微生物には、クエン酸サイクルの遺伝子のｓｄｈＣＤＡＢ及びｃｉｔＥ、アミノ酸輸送体ｂｒｎＱ、並びにピルビン酸を消費するａｄｈＥの活性を、減弱させるか又は欠失させる遺伝子操作を行うことができる。他の実施形態では、宿主微生物には、限定するものではないが、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤ）及び／又はピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＨ）などの１つ以上の遺伝子を過剰発現させることにより、細胞内マロニルＣｏＡ濃度を上昇させる遺伝子操作を行うことができる。例えば、Ｆｏｗｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７５，Ｎｏ．１８，ｐｐ．５８３１〜５８３９（２００９）、Ｚｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１１：１９２〜１９８（２００９）、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，（２０１１）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｂｅｎ．２０１１．０６．００８、Ｏｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０７：１１２６５〜１１２７０（２０１０）、並びに米国特許出願公開第２０１０／０２８５５４９号を参照されたい。これらの非特許文献及び特許文献の内容は、参照によりその全体が本開示に明示的に組み込まれる。
【０１３７】
本発明は、ＭＶＡ経路に取り込まれる炭素量を増大させる追加の宿主細胞変異も企図する。炭素の取り込み量を増大させることで、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、及び／又はイソプレノイドをより多量に生産できるようになる。本開示に記載する、アセトアセチルＣｏＡシンターゼを含む組み換え細胞には、メバロン酸生産に取り込まれる炭素量を増加させるよう遺伝子操作を行うこともでき、その際、（ａ）クエン酸シンターゼ、（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ、（ｃ）酢酸キナーゼ、（ｄ）乳酸脱水素酵素、（ｅ）ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素、及び（ｆ）ピルビン酸脱水素酵素からなる群から選択される１つ以上の酵素活性が調節される。
【０１３８】
クエン酸シンターゼによる経路
クエン酸シンターゼは、オキサロ酢酸とアセチルＣｏＡを縮合させることによるクエン酸（トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路の代謝生成物）の生成を触媒する（Ｎｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．１９８３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２：５２４３〜５２４９；Ｂｈａｙａｎａ，Ｖ．ａｎｄ  Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ，Ｈ．１９８４．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：２９００〜２９０５）（図５）。大腸菌（E. coli）では、ｇｌｔＡによりコードされたこの酵素は、二量体サブユニットからなる三量体様の挙動を示す。六量体の形成により、酵素はＮＡＤＨによりアロステリックに制御されるようになる。この酵素は、これまでに広く研究されている（Ｗｉｅｇａｎｄ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．１９８６．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１５：９７〜１１７；Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．１９８７．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｓｙｍｐ．５４：８３〜９２；Ｓｔｏｃｋｅｌｌ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３５４３５〜４３；Ｍａｕｒｕｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４２：５５５５〜５５６５）。ＮＡＤＨによるアロステリック阻害を回避するにあたって、これまでに、枯草菌（Bacillus subtilis）ＮＡＤＨ感受性クエン酸シンターゼによる置き換え、又はこの酵素の添加が検討されている（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：１０７１〜１０８１；Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｍｅｔ．Ｅｎｇ．７：２２９〜２３９）。
【０１３９】
クエン酸シンターゼによる触媒反応は、メバロン酸経路の第一工程を触媒し、同様にアセチルＣｏＡを基質として使用するチオラーゼと直接的に競合する（Ｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：２１１６〜２１２２）。したがって、当業者は、クエン酸シンターゼの発現を調節して（例えば、酵素活性を減少させて）、より多量の炭素がメバロン酸経路に取り込まれるようにすることで、メバロン酸、イソプレン及びイソプレノイドの最終的な生産量を増加させることができる。クエン酸シンターゼ活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下させる。一部の態様では、内在性クエン酸シンターゼの遺伝子の活性を減少させることにより、クエン酸シンターゼの活性を調節する。この調節は、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子により、あるいは枯草菌（Bacillus subtilis）から誘導したＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子により、内在性クエン酸シンターゼ遺伝子の染色体を置換することで実施できる。クエン酸シンターゼの活性は、内在性クエン酸シンターゼ遺伝子のプロモーターを、常時低発現型の合成プロモーターと置き換えることによっても調節（例えば、低下させる）できる。クエン酸シンターゼの活性を低下させることで、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素の取り込みを、クエン酸シンターゼの発現を低下させていない微生物と比較して増加させることができる。
【０１４０】
ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの関与する経路
ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．１９６９．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９１：５５０〜５５８）は、アセチルＣｏＡとアセチルリン酸（アセチル−Ｐ）の可逆性の変換を触媒するのに対し、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）（Ｋａｋｕｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：９１６〜９２２）は、アセチル−Ｐと酢酸の可逆性の変換を触媒する。これらの遺伝子は、大腸菌（E. coli）においてオペロンとして転写され得る。これらの遺伝子は共に、ＡＴＰの放出により酢酸の異化を触媒する。したがって、当業者は、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（例えば、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子）及び／又は酢酸キナーゼ遺伝子（例えば、内在性酢酸キナーゼ遺伝子）の活性を減弱させて、利用可能なアセチルＣｏＡを増加させることができる。減弱させる手法の１つとしては、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）及び／又は酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）の欠失が挙げられる。この欠失は、クロラムフェニコールカセットにより片方又はいずれもの遺伝子を置き換え、その後カセットを除去することで導入される。酢酸は多様な理由により大腸菌（E. coli）により生成される（Ｗｏｌｆｅ，Ａ．２００５．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６９：１２〜５０）。理論に束縛されるものではないが、ａｃｋＡ−ｐｔａはアセチルＣｏＡを消費することから、これらの遺伝子を欠失させると、炭素は酢酸に変換されなくなり、メバロン酸、イソプレン又はイソプレノイドの収率が増加することになる。
【０１４１】
一部の態様では、組み換え微生物は、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して、酢酸の生成量が減少している。酢酸生成量の減少は、当業者に既知の所定のアッセイ法により測定できる。酢酸の生成量は、分子的な操作を行なっていない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％減少する。
【０１４２】
ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）及び／又は酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）の活性は、酵素に関係する他の分子的操作によっても低下させることができる。酵素活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下させる。
【０１４３】
一部の場合では、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性生合成経路への炭素原子の取り込みが増加する。
【０１４４】
乳酸脱水素酵素の関与する経路
大腸菌（E. coli）では、Ｄ−乳酸は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ−図５）により、ピルビン酸から生成される（Ｂｕｎｃｈ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４３：１８７〜１９５）。乳酸の生成はＮＡＤＨの酸化によりなされるため、乳酸は、酸素制限下で、かつ還元当量のすべてを収容できない場合に生成されることになる。したがって、乳酸の生成は、炭素消費の原因となり得る。そのため、メバロン酸生産（並びに必要に応じてイソプレン、イソプレノイド前駆体及びイソプレノイドの生産）への炭素の取り込みを向上させるため、当業者は、酵素活性を低下させるなどして乳酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することができる。
【０１４５】
したがって、一態様では、乳酸脱水素酵素の活性は、内在性乳酸脱水素酵素遺伝子の活性を減弱させることで調節できる。このような減弱は、内在性乳酸脱水素酵素遺伝子の欠失により実施できる。当業者に知られている、乳酸脱水素酵素遺伝子の活性を減弱させる他の手法も使用できる。乳酸脱水素酵素の関与する経路を操作することで、組み換え微生物の生成する乳酸量は、内在性乳酸脱水素酵素遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して、減少することになる。乳酸の生成量の減少は、当業者に知られている所定のアッセイ法により測定できる。乳酸の生成量は、分子的な操作を行なっていない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％減少する。
【０１４６】
乳酸脱水素酵素の活性は、酵素に関係するその他の分子操作により低下させることもできる。酵素活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下させる。
【０１４７】
したがって、一部の場合では、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素の取り込みが増加する。
【０１４８】
リンゴ酸酵素の関与する経路
リンゴ酸酵素（大腸菌（E. coli）ではｓｆｃＡ及びｍａｅＢ）は、次式に従いリンゴ酸のピルビン酸への変換を触媒する（ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を用いる）アナプレロティックな酵素である：
【０１４９】
【数１】
2014528705.tif 000003
【０１５０】
したがって、この酵素の２種の基質は（Ｓ）−リンゴ酸及びＮＡＤ（Ｐ）＋であり、これらにより３種の生成物、すなわち、ピルビン酸、ＣＯ２、及びＮＡＤＰＨが生成される。
【０１５１】
ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素（ｍａｅＢ−図５）（Ｉｗｉｋｕｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９７９．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８５：１３５５〜１３６５）を発現させることで、１）ＴＣＡサイクル由来の炭素から、アセチルＣｏＡの直接的な前駆体であり、それ自体がメバロン酸経路の直接的な前駆体となるピルビン酸を再生成し、及び２）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ反応に使用することのできる過剰なＮＡＤＰＨを生産して、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体及びイソプレノイドの収率を増加させる助けとすることができる（Ｏｈ，ＭＫ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１３１７５〜１３１８３；Ｂｏｌｏｇｎａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８９：５９３７〜５９４６）。
【０１５２】
そのため、リンゴ酸酵素の活性及び／又は発現を増加させるなどして調節することにより下流でのメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体及びイソプレノイド生産に関係する開始基質（ピルビン酸又はアセチルＣｏＡ）がより多く得られる。ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素遺伝子は、内在性遺伝子であってよい。非限定的な手法の１つとしては、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素の内在性遺伝子プロモーターを、常時発現型の合成発現プロモーターにより置き換えるというものが挙げられる。酵素活性を増加させる手法のその他の非限定例としては、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素ポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を用いるものが挙げられる。当業者は、容易に利用可能な分子生物学手技を用い、発酵又は培養する際に、ｍａｅＢ  ＲＮＡの発現をモニターすることができる。
【０１５３】
したがって、一部の実施形態では、組み換え微生物は、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素遺伝子の発現を増加させていない微生物と比較して、ピルビン酸の生産量が増加する。一部の態様では、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素遺伝子の活性を増加させることで、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素遺伝子の発現を増加させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素原子の取り込みが増加する。
【０１５４】
ピルビン酸生成量の増加は、当業者に既知の所定のアッセイ法により測定できる。ピルビン酸の生産量は、分子的な操作を行なっていない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％増加する。
【０１５５】
リンゴ酸酵素の活性は、酵素に関係するその他の分子操作により増加させることもできる。酵素活性を増加させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で増加させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％増加させる。
【０１５６】
ピルビン酸脱水素酵素複合体の関与する経路
ピルビン酸のアセチルＣｏＡへの脱炭酸を触媒するピルビン酸脱水素酵素複合体は、遺伝子ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、及びｌｐｄＡによりコードされるタンパク質から構成される。これらの遺伝子の転写は、複数の制御因子により制御される。したがって、当業者は、ピルビン酸脱水素酵素複合体の活性を調節して、アセチルＣｏＡを増加することができる。調節により、ピルビン酸脱水素酵素複合体の活性及び／又は発現（例えば、常時発現）を増加させることができる。このような調節は、異なる手法により、例えば、ＰＬ．６（ａａｔｔｃａｔａｔａａａａａａｃａｔａｃａｇａｔａａｃｃａｔｃｔｇｃｇｇｔｇａｔａａａｔｔａｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｔｔｇａｃａｔａａａｔａｃｃａｃｔｇｇｃｇｇｔｇａｔａｃｔｇａｇｃａｃａｔｃａｇｃａｇｇａｃｇｃａｃｔｇａｃｃａｃｃａｔｇａａｇｇｔｇ−ラムダプロモーター、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＣ＿００１４１６（配列番号２））などの強力な常時発現型プロモーターをオペロンの前に配置することにより、あるいは常時発現型合成プロモーターを１種以上用いることにより行うことができる。
【０１５７】
したがって、一態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性は、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、及び（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼから構成されるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する、１種以上の遺伝子の活性を増加させることで調節される。これらの遺伝子のうちの任意の１つ、２つ、又は３つを操作して、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を増加させることができることは理解される。別の態様では、以降に更に説明するように、ピルビン酸脱水素酵素複合体の活性は、内在性ピルビン酸脱水素酵素複合体のリプレッサー遺伝子の活性を減弱させることで調節できる。内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のリプレッサーの活性は、内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子を欠失させることにより減弱させることができる。
【０１５８】
一部の場合では、ピルビン酸脱水素酵素複合体に関係する遺伝子の１つ以上は内在性遺伝子である。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性を増加させるその他の方法としては、微生物に、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、及び（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼからなる群に由来するポリペプチを１つ以上コードしている異種核酸を１つ以上導入することによるものが挙げられる。
【０１５９】
これらの方法のうち任意のものを用いることで、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の調節されていない微生物と比較して、組み換え微生物によるアセチルＣｏＡの生産量を増加させることができる。ピルビン酸脱水素酵素の活性を調節することで、ピルビン酸脱水素酵素の発現を調節していない微生物と比較して、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素原子の取り込みを増加させることができる。
【０１６０】
変異の組み合わせ
本開示の酵素及び／又は酵素経路のいずれかに関し、本開示の酵素及び／又は酵素経路の任意の組み合わせ（これらのうち２、３、４、５、又は６の組み合わせ）を調節する分子的操作は、明確に企図されることは理解される。組み合わせて詳細説明することを容易にする目的で、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）はＡと表記し、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａＢ）はＢと表記し、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）はＣと表記し、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）はＤと表記し、リンゴ酸酵素（ｓｆｃＡ又はｍａｅＢ）はＥと表記し、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ａｃｅＥ、ａｃｅＦ及び／又はｌｐｄＡ）はＦと表記する。上記のとおり、ピルビン酸脱炭酸酵素複合体のａｃｅＥ、ａｃｅＦ、及び／又はｌｐｄＡ酵素を単独で使用して、又は３つの酵素のうち２つを、又は３つ酵素のうち３つを使用して、ピルビン酸脱炭酸酵素の活性を増加させることができる。
【０１６１】
したがって、酵素Ａ〜Ｆのうちの任意の２種の組み合わせとしては、限定するものではないが、ＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＢＦ、ＣＤ、ＣＥ、ＣＦ、ＤＥ、ＤＦ及びＥＦを使用できる。酵素Ａ〜Ｆのうちの任意の３種の組み合わせとしては、限定するものではないが、ＡＢＣ、ＡＢＤ、ＡＢＥ、ＡＢＦ、ＢＣＤ、ＢＣＥ、ＢＣＦ、ＣＤＥ、ＣＤＦ、ＤＥＦ、ＡＣＤ、ＡＣＥ、ＡＣＦ、ＡＤＥ、ＡＤＦ、ＡＥＦ、ＢＤＥ、ＢＤＦ、ＢＥＦ及びＣＥＦを使用できる。酵素Ａ〜Ｆのうちの任意の４種の組み合わせとしては、限定するものではないが、ＡＢＣＤ、ＡＢＣＥ、ＡＢＣＦ、ＡＢＤＥ、ＡＢＤＦ、ＡＢＥＦ、ＢＣＤＥ、ＢＣＤＦ、ＣＤＥＦ、ＡＣＤＥ、ＡＣＤＦ、ＡＣＥＦ、ＢＣＥＦ、ＢＤＥＦ及びＡＤＥＦを使用できる。酵素Ａ〜Ｆのうちの任意の５種の組み合わせとしては、限定するものではないが、ＡＢＣＤＥ、ＡＢＣＤＦ、ＡＢＤＥＦ、ＢＣＤＥＦ、ＡＣＤＥＦ及びＡＢＣＥＦを使用できる。別の態様では、６種の全ての酵素：ＡＢＣＤＥＦを使用する。
【０１６２】
したがって、本開示に記載するとおりの組み換え微生物は、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルの活性条件下で増殖しない微生物と比較して、メバロン酸生産を増加させることができ、（ａ）クエン酸シンターゼ、（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼ、（ｃ）乳酸脱水素酵素、（ｄ）リンゴ酸酵素、並びに（Ｅ）ピルビン酸脱炭酸酵素複合体からなる群の１つ以上の酵素の活性を調節することで、組み換え微生物において代謝される炭素が、メバロン酸の生産に取り込まれるようになる。
【０１６３】
生産量の増加に関係する他の制御因子及び要素
他の分子的操作を使用して、メバロン酸生産に取り込まれる炭素量を増加させることができる。このような方法のうちの１つは、メバロン酸経路に合流する経路に対する負の制御効果を減少させ、低下させるか、又は除去するものである。例えば、一部の場合では、遺伝子ａｃｅＥＦ−ｌｐｄＡはオペロンであり、ｐｄｈＲの上流に遺伝子を４つ有する。ｐｄｈＲは、このオペロンの転写に対する負の制御因子である。ｐｄｈＲは、ピルビン酸の非存在下で標的プロモーターに結合し、転写を抑制する。この制御因子は同様の手法でｎｄｈ及びｃｙｏＡＢＣＤも制御する（Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８９：５５３４〜５５４１）。一態様では、ｐｄｈＲ制御因子を欠失させることにより、ピルビン酸の供給及びそれに伴うメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体、及びイソプレノイドの生産を向上させることができる。
【０１６４】
他の態様では、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド及びイソプレノイド前駆体の生産を改良させるために、ＰＧＬを欠損している微生物（各種大腸菌（E. coli）株など）に６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）を導入し、使用することができる。ＰＧＬは、染色体への組み込み、又はプラスミドなどの染色体外のビヒクルを用い、導入することができる。特定の実施形態では、ＰＧＬを発現している微生物（各種大腸菌（E. coli）株など）のゲノムから、内在性ＰＧＬを欠失させて、メバロン酸及び／又はイソプレンの生産を増大させることもできる。
【０１６５】
本発明の一部の態様では、本開示の組成物又は方法のいずれかに記載の組み換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸、又はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドを更に含む。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドは内在性ポリペプチドである。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように構成的プロモーターに連結される。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように誘導型プロモーターに連結される。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように高発現型プロモーターに連結される。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性核酸を１つ以上（例えば、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性核酸の２、３、又は４つ以上のコピー）を使用する。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比べ、内在性ホスホケトラーゼポリペプチドが過剰発現するよう遺伝子操作される。一部の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように低発現型プロモーターに連結される。
【０１６６】
ホスホケトラーゼ酵素は、キシルロース５−リン酸のグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸への変換、並びに／又はフルクトース６−リン酸のエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒する。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼ酵素は、キシルロース５−リン酸のグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒する。他の実施形態では、ホスホケトラーゼ酵素は、フルクトース６−リン酸のエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒する。したがって、理論に束縛されるものではないが、本明細書で説明されるとおりホスホケトラーゼを発現させることにより、炭水化物資源から生成されるアセチルリン酸量を増加させることができる。このアセチルリン酸をアセチルＣｏＡに変換させ、更にこれを利用して、ＭＶＡ経路に関係する酵素活性により、メバロン酸、イソプレノイド前駆体分子、イソプレン及び／又はイソプレノイドを生成させることができる。したがって、炭水化物基質より生成されるこれらの化合物量を増加させることができる。あるいは、細胞内濃度の上昇という形式で生産量の増加が反映されずとも、アセチル−Ｐ及びＡｃＣｏＡの生成量を増加させることができる。特定の実施形態では、細胞内アセチル−Ｐ又はアセチルＣｏＡ濃度は、ホスホケトラーゼによる反応が生じた場合でさえ変化せず一定であり、又は減少する場合すらある。
【０１６７】
ホスホケトラーゼの核酸の例としては、ホスホケトラーゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードしている核酸が挙げられる。ホスホケトラーゼのポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。一部の態様では、ホスホケトラーゼ核酸は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている異種核酸である。
【０１６８】
標準法を使用し、ペプチドがＤ−フルクトース６−リン酸又はＤ−キシルロース５−リン酸をアセチル−Ｐに変換する能力を測定することで、ポリペプチドがホスホケトラーゼペプチド活性を有するかを判断できる。次に、アセチル−Ｐはフェリルアセチルヒドロキサム酸（ferryl acetyl hydroxamate）に変換され得る。この変換は、分光測定により検出可能である（Ｍｅｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔ．１８３：２９２９〜２９３６，２００１）。本発明での使用には、本明細書に記載されるとおりホスホケトラーゼペプチド活性を有するとして判定された任意のポリペプチドが好適である。
【０１６９】
他の態様では、ホスホケトラーゼの核酸の例としては、限定するものではないが、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトミセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルディオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離したホスホケトラーゼが挙げられる。本明細書において使用することのできるホスホケトラーゼ酵素のその他の例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７８５，８５８号に記載されている。
【０１７０】
イソプレンの生産性を向上させることのできる組み換え細胞
イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、多様な用途で使用される重要な有機化合物である。例えば、イソプレンは、合成ゴムの製造時など、数多くの化学組成物及びポリマーの合成時に、中間体又は出発物質として使用される。イソプレンはまた、多くの植物及び動物により天然に合成される重要な生体物質でもある。
【０１７１】
イソプレンは、イソプレンシンターゼの触媒作用によりＤＭＡＰＰから製造される。したがって、理論に束縛されるものではないが、上記の任意の組成物及び方法により、宿主細胞（細菌細胞など）においてメバロン酸生産量を増加させることは、より多量のイソプレンを生産させるのと同様であると考えられる。グルコースからのメバロン酸生産量のモル収率を上昇させ、適切な酵素活性濃度で、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ並びにイソプレン及びイソプレノイド生産に好適な他の酵素と組み合わせると、イソプレノイド前駆体及びイソプレノイド（イソプレンを含む）のモル収率の上昇につながる。
【０１７２】
イソプレンの生産は、本開示に記載の任意の組み換え宿主細胞により実施することができ、この際、ＭＶＡ経路の下流において使用されるアセトアセチルＣｏＡの生成には、アセトアセチルＣｏＡシンターゼを使用する。アセトアセチルＣｏＡシンターゼの使用により、メバロン酸生産量が増加し、次のこのメバロン酸をイソプレン生産に使用することができる。上記の、メバロン酸の生産量を増加させることのできる、上流ＭＶＡ経路のポリペプチド（限定するものではないが、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（例えば、Ｌ．グライ（L. grayi）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）、Ｅ．ガリナラム（E. gallinarum）、Ｅ．カッセリファブス（E. casseliflavus）及び／又はＥ．フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＳポリペプチド））をコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを発現している任意の組み換え宿主細胞は、イソプレンの生産量を増加させることもできる。一部の態様では、これらの細胞は、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、及びイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸を更に含む。
【０１７３】
本開示に記載されるとおりの組み換え細胞の組成は、同様に本発明の範囲内で企図される。組み換え細胞には、同様に後代細胞も包含されることは理解される。
【０１７４】
例示的な細胞培養培地
本明細書で使用するとき、用語「最少培地（minimal medium又はminimal media））」は、概して細胞の生育に必要とされる最低限の栄養素を含有している増殖培地を指すが、常に１種以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０種以上のアミノ酸）が存在していないわけではない。最少培地は、典型的には、（１）宿主細胞生育用の炭素源、（２）宿主細胞種及び生育条件間で変更させ得る各種塩類、及び（３）水、を含有する。炭素源は、グルコースなどの単糖から、本明細書で以下により詳細に記載されるような、他のバイオマスのより複雑な加水分解物、例えば、酵母エキスなどといった多様なものであり得る。塩は、概してマグネシウム、窒素、リン及びイオウなどの必須元素を提供し、細胞がタンパク質及び核酸を合成できるようにする。また、最少培地には、特定のプラスミド及び同様物を維持すべく選別するために、抗菌剤などの選択剤を添加することもできる。例えば、微生物が、例えばアンピシリン又はテトラサイクリンなどの特定の抗菌剤に耐性である場合、耐性を欠く細胞の増殖を阻害する目的で培地に抗菌剤を添加することができる。培地には、所望される生理学的又は生化学的特性について選別するのに必要とされる、例えば特定のアミノ酸などといった他の化合物を添加することができる。
【０１７５】
宿主細胞を培養するにあたり、任意の最少培地処方を使用することができる。最少培地の処方例としては、例えば、Ｍ９最少培地及びＴＭ３最少培地が挙げられる。Ｍ９最少培地は、１Ｌにつき（１）２００ｍＬの滅菌Ｍ９塩類（１Ｌあたり６４ｇのＮａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ、１５ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．５ｇのＮａＣｌ及び５．０ｇのＮＨ４Ｃｌ）；（２）２ｍＬの１ＭのＭｇＳＯ４（滅菌）；（３）２０ｍＬの２０％（重量／体積）グルコース（又は他の炭素源）；及び（４）１００μＬの１ＭのＣａＣｌ２（滅菌）を含有する。ＴＭ３最少培地は、１Ｌ中に（１）Ｋ２ＨＰＯ４（１３．６ｇ）；（２）ＫＨ２ＰＯ４（１３．６ｇ）；（３）ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）；（４）クエン酸一水和物（２ｇ）；（５）クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）；（６）（ＮＨ４）２ＳＯ４（３．２ｇ）；（７）酵母エキス（０．２ｇ）；及び（８）１０００Ｘ微量元素溶液（１ｍＬ）を含有する。ｐＨは約６．８に調整し、溶液は濾過滅菌する。１０００Ｘ微量元素は、１Ｌ中に（１）クエン酸一水和物（４０ｇ）；（２）ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）；（３）ＮａＣｌ（１０ｇ）；（４）ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）；（４）ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）；（５）ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）；（６）ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）；（７）Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）；及び（８）ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）を含有する。ｐＨは約３．０に調節する。
【０１７６】
その他の最少培地の例は、（１）リン酸カリウムＫ２ＨＰＯ４、（２）硫酸マグネシウムＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、（３）クエン酸一水和物Ｃ６Ｈ８Ｏ７＊Ｈ２Ｏ、（４）クエン酸鉄アンモニウムＮＨ４ＦｅＣ６Ｈ５Ｏ７、（５）酵母エキス（ｂｉｏｓｐｒｉｎｇｅｒ）、（６）１０００Ｘ改変微量金属溶液、（７）硫酸５０％（重量／体積）、（８）ｆｏａｍｂｌａｓｔ  ８８２（Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）及び（９）微量塩溶液を３．３６ｍＬ含有する。成分のすべてを一緒に加え、脱イオン水に溶解させ、次に加熱滅菌する。続いて室温に冷却し、水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調節し、用量に調整する。滅菌後にビタミン溶液及びスペクチノマイシンを加え、ｐＨを調整する。
【０１７７】
宿主細胞を培養するにあたり任意の炭素源を使用することができる。用語「炭素源」は、宿主細胞又は微生物により代謝させることのできる、１つ以上の炭素を含有している化合物を指す。例えば、宿主細胞を培養するにあたり使用される細胞培地には、宿主細胞の生存能を維持させる又は宿主細胞を増殖させるのに好適な任意の炭素源を包含させることができる。一部の態様では、炭素源は炭水化物（例えば、単糖、二糖、オリゴ糖、又は多糖など）、又は転化糖（例えば、酵素により処理したスクロースシロップ）である。
【０１７８】
一部の態様では、炭素源としては、酵母エキス又は酵母エキスの１つ以上の成分が挙げられる。一部の態様では、酵母エキスの濃度は、酵母エキスの０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）、又は０．０１％（重量／体積）である。一部の態様では、炭素源には、酵母エキス（又は酵母エキスの１つ以上の成分）及び他の炭素源、例えばグルコースの両方を含む。
【０１７９】
単糖の例としては、グルコース及びフルクトースが挙げられ、オリゴ糖の一例としては、ラクトース及びスクロースが挙げられ、並びに多糖の例としては、デンプン及びセルロースが挙げられる。炭水化物例としては、Ｃ６糖（例えば、フルクトース、マンノース、ガラクトース、又はグルコース）及びＣ５糖（例えば、キシロース又はアラビノース）が挙げられる。
【０１８０】
例示的な細胞培養条件
本発明の組み換え細胞を維持し及び増殖させるのに好適な材料及び方法は、以下、例えば、実施例の節に記載される。細胞培養物の維持及び増殖に好適な他の材料及び方法は当該技術分野において周知である。例示的な手法としては、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（同第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号、Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，編の一般細菌学に関係する手法についてのマニュアル）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）又はＢｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：テキスト「工業微生物学（Industrial Microbiology）」第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）が挙げられる。一部の態様では、細胞は、宿主細胞に挿入する核酸にコードされた、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、イソプレンシンターゼ、ＤＸＰ経路（例えば、ＤＸＳ）、ＩＤＩ、下流ＭＶＡ経路ポリペプチド又はＰＧＬ、のポリペプチドのうちの、１種以上を発現させる条件下で、培地中で培養される。
【０１８１】
細胞を培養するにあたり、標準的な細胞培養条件を使用することができる（例えば、国際公開第２００４／０３３６４６号及び該当特許中に引用される参考文献を参照されたい）。一部の態様では、細胞は適切な温度、気体混合物、及びｐＨ（例えば、約２０℃〜約３７℃、約６％〜約８４％のＣＯ２、及び約５〜約９のｐＨ）で生育及び維持される。一部の態様では、細胞は適切な細胞培地中で３５℃で生育させる。一部の態様では、発酵の際のｐＨ範囲は約ｐＨ  ５．０〜約ｐＨ  ９．０（例えば、約ｐＨ  ６．０〜約ｐＨ  ８．０、又は約６．５〜約７．０）である。細胞は、宿主細胞に必要とされる条件に基づき、好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で生育させることができる。加えて、細胞を培養するにあたり、より特異的な細胞培養条件を使用することができる。例えば一部の実施形態では、高発現型プロモーターの調節下の低〜中間コピー数のプラスミドにおいてＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードしている１つ以上の異種核酸を発現するバクテリア細胞（例えば、大腸菌（E. coli）細胞など）を３４℃で培養する。
【０１８２】
使用することのできる標準的な培養条件、並びに回分式、流加式、又は連続式発酵などの発酵様式は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に記載されている。回分式発酵及び流加式発酵は一般的かつ当該技術分野では周知のものであり、その例は、Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．に見ることができる。
【０１８３】
一部の態様では、細胞はグルコース制限条件下で培養される。「グルコース制限条件」は、添加されるグルコースの量が、細胞により消費されるグルコース量の約１０５％以下（例えば、約１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％）であることを意味する。特定の態様では、培養培地に添加されるグルコース量は、特定の期間中に細胞により消費されるグルコース量とほぼ同様である。一部の態様では、細胞の増殖速度は、細胞培地中のグルコースの量により維持することのできる速度で細胞が増殖するよう、添加するグルコース量を制限することで制御される。一部の態様では、グルコースは細胞培養時に蓄積しない。様々な態様で、細胞はグルコース制限条件下で、約１、２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、又は７０時間以上培養される。様々な態様で、細胞は、細胞を培養する合計時間の長さの約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５又は１００％以上の時間にわたって、グルコース制限条件下で培養される。任意の特定の理論に束縛されることを意図するものではないが、グルコース制限条件は、細胞をより都合よく制御し得るものであると考えられる。
【０１８４】
一部の態様では、宿主細胞は回分式培養で増殖させる。宿主細胞は、流加式培養又は連続式培養により生育させることもできる。加えて、宿主細胞は、限定するものではないが、上記のいずれかの最少培地などの最少培地で培養することができる。最少培地には、更に１．０％（重量／体積）グルコース又は任意の他の６単糖以下の糖などを添加してもよい。具体的には、最少培地には１％（重量／体積）、０．９％（重量／体積）、０．８％（重量／体積）、０．７％（重量／体積）、０．６％（重量／体積）、０．５％（重量／体積）、０．４％（重量／体積）、０．３％（重量／体積）、０．２％（重量／体積）、又は０．１％（重量／体積）のグルコースが添加される。加えて、最少培地には０．１％（重量／体積）以下の酵母エキスを添加してもよい。具体的には、最少培地には０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）又は０．０１％（重量／体積）の酵母エキスを添加してもよい。あるいは、最少培地には１％（重量／体積）、０．９％（重量／体積）、０．８％（重量／体積）、０．７％（重量／体積）、０．６％（重量／体積）、０．５％（重量／体積）、０．４％（重量／体積）、０．３％（重量／体積）、０．２％（重量／体積）又は０．１％（重量／体積）のグルコース及び０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）又は０．０１％（重量／体積）の酵母エキスを添加してもよい。
【０１８５】
組み換え細胞を使用してイソプレンを生産する方法
本開示では、本開示に記載の任意の組み換え微生物を培養する工程を含む、イソプレンの生産方法も提供される。一態様では、イソプレンは、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成（例えば、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ）することのできるポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸：並びに（ａ）イソプレンシンターゼポリペプチド；及び（ｂ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を含む組み換え宿主細胞（例えば、バクテリア細胞）を培養することにより生産することができ、イソプレンシンターゼポリペプチドは、異種核酸によりコードされる。一態様では、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、下流ＭＶＡ経路のポリペプチド、及びイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を使用することができる。別の態様では、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、下流ＭＶＡ経路のポリペプチド、並びにイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を含む組み換え宿主細胞（例えば、バクテリア細胞）を培養することによりイソプレンを生産することができる。イソプレンは、本開示の任意の方法に従い、本明細書に記載の任意の細胞から生産することができる。六炭糖（グルコースなど）などの炭水化物からイソプレンを生産する目的に際し、任意の細胞を使用することができる。
【０１８６】
細胞には、更に、上記の、下流ＭＶＡ経路のポリペプチド（例えば、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ、及び／又はＩＤＩ）及び上記のイソプレンシンターゼポリペプチド（例えば、ウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレンシンターゼ）をコードしている１つ以上の核酸分子を含ませることができる。一部の態様では、宿主細胞は、本明細書に記載の任意の細胞であってよい。本明細書に記載の任意のイソプレンシンターゼ又はそれらの変異体、本明細書に記載の任意の宿主細胞（例えば、細菌株）、本明細書に記載の任意のプロモーター及び／又は本明細書に記載の任意のベクターも、本明細書に記載の任意のエネルギー源（例えば、グルコース又は任意のその他の六炭糖）を使用するイソプレンの生産に使用することができる。一部の態様では、イソプレンの生産方法は、イソプレンを回収する工程を更に含む。
【０１８７】
一部の態様では、生産されるイソプレン量は、各生産時点で測定されたものである。一部の態様では、細胞に関し生産量は、本開示の任意のおよそのイソプレン量を指していうものである。一部の態様では、生産されたイソプレンの総量は累積値として測定される。一部の態様では、細胞の累積生産量は、本明細書で開示される任意のおよそのイソプレン量を指していうものである。
【０１８８】
一部の態様では、本明細書に記載の、任意の細胞（例えば、培養物中の細胞）は、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００又は５，０００以上のうちのいずれかのイソプレン（ｎｍｏｌｅ）／細胞湿潤重量（ｇ）／時間（ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ）値でイソプレンを生産する。一部の態様では、イソプレンの量は約２〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒであり、例えば、約２〜約１００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１００〜約５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１５０〜約５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約５００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１，０００〜約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ又は約２，０００〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒである。一部の態様では、イソプレンの量は約２０〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１００〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約２００〜約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約２００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約３００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ又は約４００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒである。
【０１８９】
一部の態様では、細胞は、培養時に、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００又は１００，０００以上のうちのいずれかのイソプレン（ｎｍｏｌｅ）／細胞湿潤重量（ｇ）／時間（ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈｒ）値でイソプレンを生産する。一部の態様では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈであり、例えば、約２〜約１００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１００〜約５００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約５００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１，０００〜約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ又は約２，０００〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈである。一部の態様では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１００〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約２００〜約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約２００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約３００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ又は約４００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈである。
【０１９０】
一部の態様では、細胞は、培養時に、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００以上のうちのいずれかのイソプレン（ｍｇ）／ブロス（Ｌ）（ｍｇ／Ｌブロス、ブロス体積には、細胞及び細胞培地の体積を含む）値の累積力価（総量）でイソプレンを生産する。一部の態様では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロスであり、例えば、約２〜約１００ｍｇ／Ｌブロス、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌブロス、約５００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス、約１，０００〜約２，０００ｍｇ／Ｌブロス、又は約２，０００〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロスなどである。一部の態様では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロス、約１００〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロス、約２００〜約２，０００ｍｇ／Ｌブロス、約２００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス、約３００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス、又は約４００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロスである。
【０１９１】
一部の態様では、細胞により、培養時に生産されるイソプレンは、発酵時排出気体（fermentation offgas）の体積の少なくとも約１、２、５、１０、１５、２０又は２５％を構成する。一部の態様では、イソプレンは、排出気体の体積の約１〜約２５％を構成し、例えば、約５〜約１５％、約１５〜約２５％、約１０〜約２０％又は約１〜約１０％を構成する。
【０１９２】
イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産量を増加させることのできる組み換え細胞
イソプレノイドは、多くの生物において、ＭＶＡ経路の最終産物であるイソプレノイド前駆体分子の合成をもとに生産させることができる。上記のように、イソプレノイドは、重要な部類の化合物として存在し、例えば、食品及び飼料用サプリメント、風味及び臭気化合物、並びに抗癌、抗マラリア、抗真菌及び抗菌化合物を含む。
【０１９３】
分子の分類としては、イソプレノイドは、化合物を構成しているイソプレン単位の数に基づき分類される。モノテルペンは１０個の炭素原子又は２個のイソプレン単位を含み、セスキテルペンは１５個の炭素原子又は３個のイソプレン単位を含み、ジテルペンは２０個の炭素原子又は４個のイソプレン単位を含み、セステルテルペンは２５個の炭素原子又は５個のイソプレン単位を含む。ステロイド（一般的に、炭素原子を約２７個含む）は、イソプレノイドを分解又は再構成した生成物である。
【０１９４】
イソプレノイドは、イソプレノイド前駆体分子のＩＰＰ及びＤＭＡＰＰから生成することができる。これらの多様な化合物は、これらのより単純で一般的な前駆体から誘導され、及び保存されているポリプレニルピロリン酸シンターゼにより合成される（Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１  Ｍａｒ；１５５（３）：１０７９〜９０）。多様な鎖長を有するこれらの直鎖プレニルピロリン酸はそれぞれに特有の生理機能を示し、及びポリプレニルピロリン酸シンターゼの非常に発達した活性部位により、一般的にアリル基（ジメチルアリル二リン酸（Ｃ５−ＤＭＡＰＰ）、ゲラニルピロリン酸（Ｃ１０−ＧＰＰ）、ファルネシルピロリン酸（Ｃ１５−ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニルピロリン酸（Ｃ２０−ＧＧＰＰ））と、相当する数のイソペンテニルピロリン酸との縮合反応を介し、認識される（Ｃ５−ＩＰＰ）（Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１  Ｍａｒ；１５５（３）：１０７９〜９０）。
【０１９５】
イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産は、アセトアセチルＣｏＡシンターゼを含む任意の組み換え宿主細胞を使用して行うことができる。加えて、これらの細胞には、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産性を向上させるために、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを発現させることができる。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを発現しており、メバロン酸又は上記のイソプレンの生産量を増大させることのできる任意の組み換え宿主細胞では、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産量を増大させることもできる。一部の態様では、これらの細胞は、上記のように、下流ＭＶＡ経路、ＩＤＩ及び／又はＤＸＰ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、並びにポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸を更に含む。理論に束縛されるものではないが、上記の任意の組成物及び方法により、宿主細胞（細菌細胞など）におけるメバロン酸の生産量を増加させることで、同様に、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドなどのより高分子量の生成物の生産量も増加するものと考えられる。グルコースからのメバロン酸生産量のモル収率を上昇させ、適切な酵素活性濃度で、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ並びにイソプレン及びイソプレノイド生産に好適な他の酵素を組み合わせると、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイド（イソプレンを含む）のモル収率の上昇につながる。
【０１９６】
イソプレノイドの種類
本発明の組み換え微生物は、イソプレノイド及びイソプレノイド前駆体分子ＤＭＡＰＰ及びＩＰＰの生産量を増加させる能力がある。イソプレノイドの例としては、限定するものではないが、ヘミテルペノイド、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、セステルテルペノイド、トリテルペノイド、テトラテルペノイド、及びより高分子量のポリテルペノイドが挙げられる。一部の態様では、ヘミテルペノイドは、プレノール（すなわち、３−メチル−２−ブテン−１−オール）、イソプレノール（すなわち、３−メチル−３−ブテン−１−オール）、２−メチル−３−ブテン−２−オール、又はイソ吉草酸である。一部の態様では、モノテルペノイドは、限定するものではないが、ゲラニルピロリン酸、オイカリプトール、リモネン、又はピネンであってよい。一部の態様では、セスキテルペノイドはファルネシルピロリン酸、アルテミシニン、又はビサボロールである。一部の態様では、ジテルペノイドは、限定するものではないが、ゲラニルゲラニルピロリン酸、レチノール、レチナール、フィトール、タキソール、フォルスコリン、又はアフィジコリンであってよい。一部の態様では、トリテルペノイドは、スクアレン又はラノステロールであってよい。イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、ファルネセン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン（Terpindene）、及びバレンセンからなる群から選択することができる。
【０１９７】
一部の態様では、テトラテルペノイドは、リコピン又はカロチン（カロチノイド）である。本明細書で使用するとき、用語「カロテノイド」は、クロロプラスト中で、並びに植物、何らかの他の光合成生物、例えば藻類、ある種の真菌、ある種のバクテリア、のクロロプラスト中で生産される、天然に生じる有機色素群を指す。カロテノイドとしては、酸素を含有しているキサントフィル及び酸素を含有していないカロテンが挙げられる。一部の態様では、カロテノイドはキサントフィル及びカロテンからなる群から選択される。一部の態様では、キサントフィルはルテイン又はゼアキサンチンである。一部の態様では、カロチノイドは、α−カロチン、β−カロチン、γ−カロチン、β−クリプトキサンチン又はリコピンである。
【０１９８】
ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸
本発明の一部の態様では、本明細書において任意の組成物又は方法に記載されるように、アセトアセチルＣｏＡシンターゼを含む組み換え細胞は、更に、上記のとおりにチオラーゼ以外のＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸、並びにポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を更に含む。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、内在性ポリペプチドであってよい。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、構成型プロモーターに調節可能なように連結させてよく、あるいは同様に、調節可能なように誘導型プロモーターに連結させてもよい。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、更に、調節可能なように高発現型プロモーターと連結させてもよい。あるいは、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように低発現型プロモーターと連結させてもよい。詳細には、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドを過剰発現するよう遺伝子操作することができる。
【０１９９】
一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、異種ポリペプチドである。本発明の細胞は、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを含む。一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように構成型プロモーターに連結されている。一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように誘導型プロモーターに連結されている。一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように高発現型プロモーターに連結されている。一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように低発現型プロモーターに連結されている。
【０２００】
ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞で安定的に発現させることができる。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている核酸は、更にベクター上に存在させてもよい。
【０２０１】
ポリプレニルピロリン酸シンターゼの核酸の例としては、ポリプレニルピロリン酸シンターゼの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、イソプレノイド前駆体分子をより複雑なイソプレノイド化合物に変換する。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドの例としては、イソプレンシンターゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、並びに融合ポリペプチドが挙げられる。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。加えて、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ変異体は、酵素活性が向上しているなどして、活性が向上されていてよい。一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ変異体は、安定性（例えば、熱安定性）が改良されている、及び／又は溶解性が改良されているなどして、その他の特性が改良されている。ポリプレニルピロリン酸シンターゼの核酸の例としては、限定するものではないが、ゲラニルジホスフェート（geranyl diphosposphate）（ＧＰＰ）シンターゼ、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）シンターゼ、及びゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）シンターゼ、又はその他の任意の既知のポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドなど、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている核酸を挙げることができる。
【０２０２】
本発明の一部の態様では、本明細書において任意の組成物又は方法に記載されるように、細胞は、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）シンターゼをコードしている１つ以上の核酸を更に含む。ＦＰＰシンターゼポリペプチドは、内在性遺伝子によりコードされている内在性ポリペプチドであってもよい。一部の態様では、ＦＰＰシンターゼポリペプチドは、大腸菌（E. coli）において内在性ｉｓｐＡ遺伝子によりコードされている。ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように構成型プロモーターに連結させることができ、あるいは同様に調節可能なように誘導型プロモーターに連結させることができる。ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、更に、調節可能なように高発現型プロモーターに連結させることができる。特に、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性ＦＰＰシンターゼポリペプチドを過剰発現するよう遺伝子操作することができる。
【０２０３】
一部の態様では、ＦＰＰシンターゼポリペプチドは異種ポリペプチドである。本発明の細胞は、ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸の１つ以上のコピーを含み得る。一部の態様では、ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、構成型プロモーターに調節可能なように連結される。一部の態様では、ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、誘導型プロモーターに調節可能なように連結される。一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように高発現型プロモーターに連結されている。
【０２０４】
ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードしている核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞で安定的に発現させることができる。ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードしている核酸は、更にベクターに組み込むこともできる。
【０２０５】
生体外で、細胞抽出物中で又は生体内で、ポリペプチドがＩＰＰをイソプレノイドに変換する能力を測定して、ポリペプチドがポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチド活性を有するか評価する際には、標準法を使用できる。これらの手法は当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第７，９１５，０２６号；Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１  Ｍａｒ；１５５（３）：１０７９〜９０；Ｄａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１１  Ａｐｒ  １２［印刷物に先駆けたオンライン出版］；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１１  Ｍａｒ  ２４［印刷物に先駆けたオンライン出版］；Ｋｅｅｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．２０１１  Ｍａｒ  ７；１１：４３；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．２０１０  Ｏｃｔ  ２１；１０：２２６；Ｋｕｍｅｔａ  ＆  Ｉｔｏ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１０  Ｄｅｃ；１５４（４）：１９９８〜２００７；ａｎｄ  Ｋｏｌｌｎｅｒ  ＆  Ｂｏｌａｎｄ，Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．２０１０  Ａｕｇ  ２０；７５（１６）：５５９０〜６００に記載されている。
【０２０６】
組み換え細胞を使用してイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体分子を生産する方法
本開示では、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産方法であって、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチド、並びにＭＶＡ経路のポリペプチド、例えば限定するものではないが、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）ポリペプチド、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチド、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）ポリペプチド、イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）ポリペプチド、ＩＰＰイソメラーゼポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＭＶＡ経路ポリペプチドのうち２つ又はそれ以上の活性を有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）などをコードしている１つ以上の核酸を含む組み換え微生物（例えば、組み換えバクテリア細胞）を培養する工程を含む方法も提供する。
【０２０７】
イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドは、本明細書に記載の任意の細胞から、及び本開示の任意の方法に従って、生産することができる。グルコースなどの六炭糖といった炭水化物から、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを生産する目的で、任意の細胞を使用することができる。
【０２０８】
したがって、本明細書では、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産方法であって、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチド、並びにＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードしている１つ以上の異種核酸を含む組み換え宿主細胞を、イソプレン及びイソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを生産させるのに好適な条件下で培養する工程を含む、生産方法が提供される。細胞には、上記の下流ＭＶＡ経路のポリペプチド（例えば、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ及び／又はＩＤＩ）及び上記の任意のポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸分子を更に含ませることができる。一部の態様では、宿主細胞は、本明細書に記載の任意の細胞であってよい。本明細書に記載の任意のポリプレニルピロリン酸シンターゼ又はそれらの変異体、本明細書に記載の任意の宿主細胞株、本明細書に記載の任意のプロモーター及び／又は本明細書に記載の任意のベクターを使用し、本明細書に記載の任意のエネルギー源（例えば、グルコース又は任意の他の六炭糖）を利用して、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを生産することもできる。一部の態様では、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産方法は、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを回収する工程を更に含む。
【０２０９】
イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産方法であって、同様に、（ａ）内在的にＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼを有さない宿主細胞（例えば、限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞などのバクテリア細胞）を培養する工程であって、前記宿主細胞がＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードしている遺伝子の１つ以上のコピーを異種発現する宿主細胞を培養する工程と、（ｂ）イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを生産させる工程とを含み、前記宿主細胞が、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼを含まないイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体産性宿主細胞と比較して、多量にイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを生産する、方法を提供することもできる。特定の実施形態では、宿主細胞は、バクテリア細胞、藻類細胞、真菌細胞（糸状菌を含む）、又は酵母細胞である。
【０２１０】
ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼを含まず、メバロン酸の生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていないイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体産性宿主細胞と比較して、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産に関係する本発明の方法は、少なくとも５％超の量でイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを生産することができる。あるいは、宿主細胞は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％又は１５％超、並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値だけイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを生産することができる。一部の態様では、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産方法は、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを回収する工程を更に含む。
【０２１１】
本開示では、イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体分子の生産量を増加させるために、上記の細胞のいずれかを使用する方法を提供する。細胞によるイソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産量は、アセトアセチルＣｏＡシンターゼと、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードしている１つ以上の異種核酸、下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、並びにポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現させることにより増加させることができる。本明細書で使用するとき、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産量の「増加」は、本明細書に記載の任意の組成物及び方法により記載される細胞によって、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの生産量に関する細胞生産性指数（ＣＰＩ）が上昇していること、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの力価が上昇していること、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの質量収率が上昇していること、並びに／あるいはイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの比生産性が上昇していることを指す。このことは、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチド、下流ＭＶＡ経路のポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド及び／又はＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードしている１つ以上の異種核酸を有しておらずかつメバロン酸生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作されていない細胞と比較してのことである。イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産量は、約５％〜約１，０００，０００倍増加させることができる。イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産量は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードしている１つ以上の異種核酸を発現せず、メバロン酸生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作を受けていない細胞によるイソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産量と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、又は約５０〜約２００倍）向上させることができる。
【０２１２】
イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産量は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの１つ以上の異種核酸を発現せず、メバロン酸生産に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作を受けていない細胞によるイソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイド生産量と比較して、少なくとも、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、又は１，０００，０００倍のうちの任意の割合だけ向上させることもできる。
【０２１３】
加えて、より具体的な細胞培養条件を使用して、本明細書に記載の方法により細胞を培養することができる。例えば、一部の態様では、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの生産方法には、（ａ）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼを内在的に有していない宿主細胞（限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞などのバクテリア細胞）を３４℃で培養する工程であって、前記宿主細胞が、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードしている遺伝子の１つ以上のコピーを低〜通常コピー数のプラスミドにおいて高発現型プロモーターの調節下で異種発現する宿主細胞を培養する工程と、（ｂ）メバロン酸を生産させる工程とを含む。一部の態様では、メバロン酸の生産方法は、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを回収する工程を更に含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、バクテリア細胞、藻類細胞、真菌細胞（糸状菌を含む）、又は酵母細胞である。
【０２１４】
例示的な精製方法
一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、生産された化合物を回収する工程を包含する。一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、イソプレンを回収する工程を包含する。一部の態様では、イソプレンは吸着ストリッピングにより回収される（例えば、米国特許第１２／９６９，４４０号を参照されたい）。一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に異種ポリペプチドを回収する工程を包含する。一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、テルペノイド又はカロテノイドを回収する工程を含む。
【０２１５】
好適な精製方法は、米国特許出願公開第２０１０／０１９６９７７（Ａ１）号により詳細に記載されている。
【０２１６】
本発明は、実例として提供され、制限することを意味するものではない以降の実施例を参照することにより更に理解することができる。
【実施例】
【０２１７】
実施例１：アセトアセチルＣｏＡシンターゼ（ＮｐｈＴ７）によりＭＶＡを生産するため上流ＭＶＡ経路をコードしているプラスミドの作成
それぞれアセトアセチルＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、及びＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを発現するｎｐｈＴ７遺伝子、ｍｖａＳ遺伝子、及びｍｖａＲ遺伝子をコードする発現プラスミドを生成した。簡潔に述べると、順行プライマー及び逆行プライマーを合成して、ストレプトミセスタンパク質をコードしている合成遺伝子から、ｍｖａＳ遺伝子（ＭＣＭ４８９及びＭＣＭ４９０）、ｍｖａＲ遺伝子（ＭＣＭ４９１及びＭＣＭ４９２）、及びｎｐｈＴ７遺伝子（ＭＣＭ４９５及びＭＣＭ４９６）を増幅させた（表１）。ＭＣＭ４８５順行プライマー及びＭＣＭ４８６逆行プライマーを使用して、発現ベクターを増幅させた。ベクターを増幅させるためのＤＮＡテンプレートはｐＭＣＭ１２２５である（表２）。ストレプトミセス（Streptomyces）のｍｖａＳ及びｍｖａＲを増幅させるためのＤＮＡテンプレートは、ｍｖａＳ及びｍｖａＲをコードしている合成オペロンを含有し、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ａｔｏＢ）もコードしているＳｔｒｅｐＣＬ１９０（ＤＮＡ２．０）である。Ｈｉｓタグを付加したＮｐｈＴ７をコードしている合成遺伝子を含むｐＭＣＭ１１８７テンプレートを使用して、ＮｐｈＴ７をコードしている遺伝子を増幅する（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＢＡＪ１００４８）。
【０２１８】
【表１】
2014528705.tif 000004
注意書き：／ｉｄｅｏｘｙＵ／は、プライマー中に存在するデオキシウリジンヌクレオチドを意味する（Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８６：３．２１．１〜３．２１．１６，２００９）。
【０２１９】
【表２】
2014528705.tif 000005
【０２２０】
製造元によるＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号６００４１０）用のプロトコルに従い、テンプレートを増幅させた。反応溶液には、緩衝液５μＬ、１０μＭプライマー各１μＬ、テンプレートプラスミド１μＬ（５０〜２００μｇ／ｕＬ）、１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  １μＬ、ｄｄＨ２Ｏ  ４０μＬ、ＰｆｕＣｘ  １μＬ（表３）を含有させた。続いて、反応液は次のようなサイクルで反応させた：９５℃で２分×１サイクル、加熱及び冷却サイクル×３０サイクル（９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で５分３０秒）、並びに７２℃で１０分×１サイクル。反応物を４℃で一晩置いた。
【０２２１】
【表３】
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【０２２２】
ＰＣＲにより増幅させた後、１０μＬのＰＣＲ反応液を１μＬのＵＳＥＲ  Ｅｎｚｙｍｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＃  Ｍ５５０５Ｓ）及び１μＬのＤｐｎＩ（Ｒｏｃｈｅ）と混合し、次に３７℃で２時間インキュベートした。ｍｖａＲ、ｍｖａＳ、及びＮｐｈＴ７遺伝子を含む上流ＭＶＡ経路をコードしている発現プラスミドを作成するために、２μＬの各試験反応物（USER reaction）と、Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（１１６３５３７９００１）の８μＬのＢｕｆｆｅｒ  １と、１μＬのリガーゼとによりライゲーション反応を行った。室温で１時間半能を行い、−２０℃で一晩保管した。連結させたプラスミドを回収し、３μＬのライゲーション生成物を使用して、製造元の指示に従いケミカルコンピテントセルのＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ｃ４０４００３）に形質移入させた。２５０μＬのＬＢで３７℃で１時間回復させた後、形質転換体をＬＢ／ｓｐｅｃ５０プレートで３７℃で一晩選別した。単一のコロニーを５ｍＬ  ＬＢ／ｓｐｅｃ５０で培養し、−８０℃で保管した。単離したコロニーからＤＮＡを抽出し、ｍｖａＲ、ｍｖａＳ、及びＮｐｈＴ７を含む上流ＭＶＡ経路をコードしているコンストラクトを首尾よく生成し、ＤＮＡ塩基配列決定法により確認した（表４）。これらの株からプラスミドｐＭＣＭ１３２０及びｐＭＣＭ１３２１を単離した。
【０２２３】
【表４】
2014528705.tif 000007
【０２２４】
実施例２：イソプレンシンターゼ及びイソプレンの生産に関係するＭＶＫをコードしているプラスミドの作成
β−ラクタマーゼをコードしているｂｌａ遺伝子を用い、イソプレンシンターゼ及びメバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）発現プラスミドを生成した。簡潔に述べると、ｐＵＣ１９  ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から、プライマーＭＣＭ６９４及びＭＣＭ６９５によりｂｌａ遺伝子を増幅させた（表５）。ｃｍＲマーカー遺伝子を含まない発現プラスミドｐＤｕ６５を、プライマーＭＣＭ６９６及びＭＣＭ６９７により増幅させた。ＧＥＮＥＡＲＴ（登録商標）Ｓｅａｍｌｅｓｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙキット（＃Ａ１３２８８）を使用し、製造元のプロトコルに従い増幅産物を融合させ、続いて生成物によりケミカルコンピテントなＭＤ０９−３１４細胞を形質転換させた。融合させたプラスミドを、ＬＢ／ｃａｒｂ５０プレートで３７℃で一晩選別した。単一のコロニーを採取し、５ｍＬ  ＬＢ／ｃａｒｂ５０で３７℃で生育させた後、−８０℃で保管した。
【０２２５】
【表５】
2014528705.tif 000008
【０２２６】
実施例３：チオラーゼ欠損型大腸菌（E. coli）株ＣＭＰ８６１の作成
アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ａｔｏＢ）欠損株を作成した。簡潔に述べると、カナマイシンマーカーにより破壊されたａｔｏＢ遺伝子を含有しているＤＮＡ断片を、Ｋｅｉｏ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．２：２００６．０００８）の株ＪＷ２２１８をテンプレートとして用い、プライマーａｔｏＢｒｅｃＦ（５’−ＧＣＡＡＴＴＣＣＣＣＴＴＣＴＡＣＧＣＴＧＧＧ−３’（配列番号１５））及びａｔｏＢｒｅｃＲ（５’−ＣＴＣＧＡＣＣＴＴＣＡＣＧＴＴＧＴＴＡＣＧＣＣ−３’（配列番号１６））を使用して、ＰＣＲにより増幅させた。製造元からの取扱説明書に従ってポリメラーゼＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用した。得られたＰＣＲ産物を、製造元（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の推奨するとおりに組み換え反応に使用し、ＣＭＰ４５１株のｌａｔｏＢ座に組み入れた。ＣＭＰ４５１は、ＣＭＰ２５８（米国特許出願第１２／９７８，３２４号を参照されたい）に２つ改変を加えたものである。簡潔に述べると、ＣＭＰ２５８においてクエン酸シンターゼ遺伝子（ｇｌｔＡ）の前にあるプロモーターをＧＩ１．２と置き換えた（米国特許第７，３７１，５５８号）。ｇｌｔＡ（Ｗｉｌｄｅ，Ｒ，ａｎｄ  Ｊ．Ｇｕｅｓｔ．１９８６．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３２３９〜３２５１）に関しては２つの野生型プロモーターが報告されており、遠位プロモーターの−３５領域の直後に合成プロモーターを挿入した。プライマーＵｐｇｌｔＡＣｍ−Ｆ（５’−ＴＡＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡＴＣＡＴＣＴＡＡＴＴＴＧＡＣＡＡＴＣＡＴＴＣＡＡＣＡＡＡＧＴＴＧＴＴＡＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＣＧＧ−３’（配列番号１７））及びＤｎｇｌｔＡ１．ｘｇｉＣｍ−Ｒ（５’−ＴＣＡＡＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＣＣＧＴＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＧＴＡＴＣＡＧＣＣＡＴＡＴＡＴＴＣＣＡＣＣＡＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＴＧＧＴＴＧＡＡＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＡＴＨＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧ−３’（配列番号１８））、並びにテンプレートとしてＧｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−ＦＲＴテンプレートを使用し、ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物を精製し、λ  ｒｅｄを用いる組み換えに製造元（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）による記載のとおりに使用した。更なる評価にあたって、複数種のコロニーを選別した。プロモーター領域は、プライマーｇｌｔＡＰｒｏｍＳｅｑＦ：５’−ＧＧＣＡＧＴＡＴＡＧＧＣＴＧＴＴＣＡＣＡＡＡＡＴＣ−３’（配列番号１９）及びｇｌｔＡｐｒｏｍＳｅｑＲ（５’−ＣＴＴＧＡＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＣＴＴＴＣＡＧＣ−３’（配列番号２０））と、テンプレートとしてコロニーから抽出したＤＮＡ（コロニーを３０μＬのＨ２Ｏに再懸濁し、９５℃で４分加熱し、スピンダウンしたもの。５０μＬのＰＣＲ反応には、この溶液のうち２μＬをテンプレートとして使用する）とを使用しＰＣＲ増幅させた。得られたＰＣＲ産物の配列決定結果を観察した後、プロモーターＧＩ１．２（米国特許第７，３７１，５５８号）を保有しているコロニーを、更なる使用のため保存し、ＣＭＰ１４１と名づけた。ＣＭＰ２５８（米国特許出願第１２／９７８，３２４号を参照されたい）にＭＣＭ５２１株（米国特許出願第１２／９７８，３２４号を参照されたい）のＰ１可溶化液を形質導入し、ＭＤ０９−３１３株を構築し、２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有させたルリア・ベルターニ培地のプレートにてコロニーを選択した。Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．の「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）に記載の方法に従ってＰ１可溶化液を調製した。製造元により推奨されるプロトコルを用い（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）カナマイシンマーカーを除去し、ＭＤ０９−３１４株を作製した。株ＣＭＰ１４１からＰ１可溶化液を作製し、株ＭＤ０９−３１４に形質導入してＣＭＰ４４０を作成するのに使用した。製造元により推奨されるプロトコルを用い（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）クロラムフェニコールマーカーを除去して株ＣＭＰ４５１を作製した。
【０２２７】
ＣＭＰ８６１株を作製するために、ＣＭＰ４５１には、ａｔｏＢ：ＦＲＴ−Ｋａｎ−ＦＲＴ  ＰＣＲ産物により遺伝子組み換えを行い、コロニーをＬＢ＋２０μｇ／ｍＬカナマイシンで選別した。単一のコロニーを採取し、この株をＣＭＰ８５６と名づけた。続いて、プラスミドｐＣＰ２０を用い、ＦＲＴ組み換え（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ．２０００．ＰＮＡＳ  ９７：６６４０〜５）により、ＣＭＰ８５６からカナマイシンマーカーを除去した。３０℃下、ＬＡ＋５０μｇ／ｍＬカルベニシリンで形質転換体を選別した後、２つのコロニーをＬＢプレートに再画線し、４２℃でインキュベートした。これらのプレートからカナマイシン感受性のコロニーを選択し、ＣＭＰ８６１と名づけた。プライマーａｔｏＢｒｅｃＲ及びａｔｏＢｃｈｅｃｋＦ（５’−ＧＣＴＴＡＴＡＴＧＣＧＴＧＣＴＡＴＣＡＧＣＧ−３’（配列番号２１）を用い、変異を確認した。
【０２２８】
実施例４：アセトアセチルＣｏＡシンターゼ（ＮｐｈＴ７）によるＭＶＡ生産のための経路をコードしている株の作成
記載のプラスミドを記載の親株に電気穿孔により導入し株ＭＣＭ１３３１、ＭＣＭ１６８１、ＭＣＭ１６８４、ＭＣＭ１６８５、及びＭＣＭ１６８６を作成した（表６）。凍結バイアルから掻きとった抗生物質を添加した５ｍＬ  ＬＢで、３７℃で、２５０ｒｐｍで振とうしながら親細胞を生育させた。細胞密度がＯＤ  ０．５〜０．８に達した時点で、培養物を氷上に置いて冷却し、３ｍＬの培養物サンプルを氷冷再蒸留水で３回洗浄した後、氷冷再蒸留水２００μＬに再懸濁した。エッペンドルフチューブ中で、１００μＬ細胞懸濁液サンプルを１〜３μＬ  ＤＮＡと混合した後、電気穿孔用２ｍｍキュベットに移し、２５ｕＦＤ、２００ｏｈｍ、２．５ｋＶで電気穿孔し、直ちに５００μＬ  ＬＢでクエンチした。３７℃で１時間振とうさせて細胞を回復させ、記載の抗生物質を添加したＬＢプレートで３７℃で形質転換体を選別した。単一のコロニーを５ｍＬ  ＬＢ＋抗生物質に採取し、３７℃で生育させ、１６．５％グリセロールにより−８０℃で保管した。ＭＣＭ１６８６株にはｐＣＬ１９２０の空のプラスミドを含有させたため、上流ＭＶＡ経路は発現されず、ＤＸＰ経路によるイソプレン生産に指向した。
【０２２９】
【表６】
2014528705.tif 000009
【０２３０】
実施例５：遺伝子操作株を用いるアセトアセチルＣｏＡシンターゼ（ＮｐｈＴ７）によるイソプレン生産
株ＭＣＭ１６８４、ＭＣＭ１６８５、及びＭＣＭ１６８６のイソプレンの比生産性を測定した。Ｃａｒｂ５０及びＳｐｅｃ  ５０を含有させたＬＢ培地でＯＤ  １．０付近で生育させた１０ｕＬの細胞培養サンプルを、１％グルコース、０．０２％酵母エキス、並びにｃａｒｂ５０及びｓｐｅｃ５０を含有させたＴＭ３細胞培養培地に播種し、３４℃で一晩培養した。これらの培養物を用い、同様のＴＭ３培地５ｍＬにＯＤ  ０．２で播種し、続いて２５０ｒｐｍで浸透しながら３４℃で２時間４５分生育させた。４００ｕＭ  ＩＰＴＧにより培養物に発現誘導を行い、更に２時間１５分生育させた。ブロスを１：１０希釈して細胞密度を測定した。２ｍＬヘッドスペースバイアルでブロス１００μＬを３４℃で３０分インキュベートした後、７０℃で１２分熱殺菌した。ヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフ（Ｍｏｄｅｌ  Ｇ１５６２Ａ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（Ｍｅｒｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＬＣ  ＧＣ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，２８（７）：５４０〜５４３，２０１０）を連結した水素炎イオン化検出器により測定した。イソプレン生産のデータ解析により、ＤＸＰ経路に加えてＮｐｈＴ７によりイソプレンを生産する経路を含有しているＭＣＭ１６８４及びＭＣＭ１６８５が、それぞれ、ＤＸＰ経路のみを含有させたＭＣＭ１６８６の生産速度と比較して、２．４倍及び２．５倍でイソプレンを生産することが実証される（表７及び図１）。
【０２３１】
【表７】
2014528705.tif 000010
【０２３２】
以降の配列は各種コンストラクトを作成した際の配列である：
Ｓｔｒｅｐ  ＣＬ１９０  Ｕｐｐｅｒ  ＭＶＡ  ｐＴｒｃＨｉｓ２Ａ
【０２３３】
2014528705.tif 000011
【０２３４】
2014528705.tif 000012
【０２３５】
2014528705.tif 000013
【０２３６】
ｐＭＣＭ１１８７−ｐＥＴ１５ｂ−ＮｐｈＴ７（ＧｅｎｅＯｒａｃｌｅ  ＧｃＭＭ１３４）
【０２３７】
2014528705.tif 000014
【０２３８】
2014528705.tif 000015
【０２３９】
2014528705.tif 000016
【０２４０】
ｐＭＣＭ１３２０  ａｎｄ  ｐＭＣＭ１３２１−ｐＣＬ−Ｐｔｒｃ−ｍｖａＲ−ｍｖａＳ−ｎｐｈＴ７＿ＳｔｒｅｐＣＬ１９０
【０２４１】
2014528705.tif 000017
【０２４２】
2014528705.tif 000018
【０２４３】
2014528705.tif 000019
【０２４４】
実施例６：遺伝子操作株を用いるアセトアセチルＣｏＡシンターゼ（ＮｐｈＴ７）によるイソプレノイド生産
（ｉ）材料
ＴＭ３培地の組成（発酵培地１Ｌ当たり）：
Ｋ２ＨＰＯ４を１３．６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１３．６ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏを２ｇ、クエン酸一水和物を２ｇ、クエン酸鉄アンモニウムを０．３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を３．２ｇ、酵母エキスを０．２ｇ、１０００Ｘ微量金属溶液を１ｍＬ。すべての成分を共に加え、ｄｉＨ２Ｏに溶解させる。水酸化アンモニウム（３０％）によりｐＨを６．８に調整し、及び容量を調整する。次に、０．２２μｍのフィルタを用い培地を濾過滅菌した。滅菌及びｐＨ調整後にグルコース１０．０ｇ及び抗菌剤を添加する。
【０２４５】
１０００Ｘ微量金属溶液（発酵培地１Ｌあたり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏを４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏを３０ｇ、ＮａＣｌを１０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏを１ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏを１ｇ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏを１ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏを１００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３を１００ｍｇ、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏを１００ｍｇ。各成分を１成分ずつｄｉＨ２Ｏに溶解する。ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨで３．０に調整した後、溶液を用量に調整し、０．２２μｍフィルタでフィルタ滅菌する。
【０２４６】
（ｉｉ）実験手順
ルリア・ベルターニブロス＋抗生物質で細胞を一晩生育させる。翌日、ＯＤ６００が０．０５になるよう細胞を２０ｍＬのＴＭ３培地（５０ｕｇ／ｍＬのスペクチノマイシン及び５０ｕｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有（２５０ｍＬのバッフル付き三角フラスコ））により希釈し、３４℃かつ２００ｒｐｍでインキュベートする。接種前に、培養フラスコには２０％（ｖ／ｖ）ドデカン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を積層し、これまでに記載のとおり、揮発性セスキテルペン産物を捕捉する（Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９５：６８４〜６９１，２００６）。
【０２４７】
２時間生育させた後、ＯＤ６００を測定し、０．０５〜０．４０ｍＭのイソプロピルβ−ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えた。発酵工程の間、規則的に試料を採取する。各時点でＯＤ６００を測定する。また、積層したドデカンを酢酸エチルに希釈し、有機層中のイソプレノイド濃度を分析する。ドデカン／酢酸エチル抽出物をこれまでに報告されているＧＣ−ＭＳ法により解析する（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３，２１：９６〜８０２）。濃度の判明しているイソプレノイドサンプルを注入し、イソプレノイドの標準曲線を作成した。このイソプレノイドの標準曲線を使用し、サンプルあたりのイソプレノイド量を算出した。
【０２４８】
実施例７：アセトアセチルＣｏＡシンターゼ（ＮｐｈＴ７）活性を有するよう遺伝子操作されたサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）によるイソプレン生産
ｓ．ｃ．ＥａｓｙＣｏｍｐ形質転換キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に記載のプロトコルを用い、上記のプラスミドにより親株を形質転換させ酵母株を作成する。プラスミドを含有している酵母株を、２％グルコースと指定の選択マーカーを添加したＳＣ最少培地で選択及び維持する。プラスミドを含有している単離コロニーを以降の実験に備え選別する。
【０２４９】
遺伝子操作した酵母株からのイソプレンの比生産性を測定する。プラスミドのコードする遺伝子の発現を誘導するため、選択マーカーを添加した液体ＳＣ最少培地で培養物を一晩生育させた。次に培養物のＯＤ６００が約０．２になるよう希釈し、２〜３時間生育させる。１００μＬブロスサンプルを２ｍＬヘッドスペースバイアルで３４℃で３０分インキュベートし、続いて７０℃で１２分熱殺菌する。ヘッドスペース中のイソプレン濃度を、例えば、ガスクロマトグラフ（Ｍｏｄｅｌ  Ｇ１５６２Ａ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（Ｍｅｒｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＬＣ  ＧＣ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，２８（７）：５４０〜５４３，２０１０）を連結した水素炎イオン化検出器により測定する。
【０２５０】
実施例８：ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）に由来する上流ＭＶＡ経路の酵素を大腸菌（E. coli）において用いることによるアセトアセチルＣｏＡシンターゼ（ｎｐｈＴ７）によるイソプレン生産の向上
プラスミドｐＭＣＭ１２２１の作成
以降の設計を用い、上流ＭＶＡ経路をコードしているプラスミドをＧｅｎｅＯｒａｃｌｅ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により作成した。アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ−ＲＢＳ−３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡシンターゼ−ＲＢＳ−ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードしている合成ＤＮＡを作成し、次に、ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩ部位間に存在するオペロンと置き換えてｐＭＣＭ８２（米国特許出願公開第２０１１／０１５９５５７号を参照されたい）にクローン化した。ベクターによりｍｖａＥ用のＲＢＳを提供した。プラスミドマップについては図５を参照されたい。
【０２５１】
【表８】
2014528705.tif 000020
【０２５２】
プラスミドコンストラクトｐＭＣＭ１２２１−ｐＣＬ−Ｐｔｒｃ−Ｕｐｐｅｒ＿ＧｃＭＭ＿１５９（ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis））のＤＮＡ配列
【０２５３】
2014528705.tif 000021
【０２５４】
2014528705.tif 000022
【０２５５】
2014528705.tif 000023
【０２５６】
実施例９：アセトアセチルＣｏＡシンターゼ（ＮｐｈＴ７）を含有しているプラスミドの調製
ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）に由来する上流ＭＶＡ経路の３つの要素をプラスミドコンストラクトｐＭＣＭ１２２１（ｐＣＬ−Ｐｔｒｃ−Ｕｐｐｅｒ＿ＧｃＭＭ＿１５９）に含有させ、使用した。ストレプトミセス属（Streptomyces sp.）株ＣＬ１９０に由来し、プラスミドコンストラクトＭＣＭ１１８７内でｎｐｈＴ７によりコードされるアセトアセチルＣｏＡシンターゼについてはこれまでに記載している（表２を参照されたい）。５’ＢｇｌＩＩ  ｒｂｓ  ｎｐｈＴ７プライマー及び３’ＰｓｔＩ  ｎｐｈＴ７プライマーを使用し、製造元の推奨するプロトコルに従い、ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）により、ＭＣＭ１１８７テンプレートからｎｐｈＴ７遺伝子をＰＣＲ増幅させた。一般的な分子生物学的手法を用い、ｎｐｈＴ７を含有しているＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動（Ｅ−ｇｅｌ  ０．８％（ＧＰ），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により確認し、次にＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）により洗浄し、ＰＣＲ産物及びｐＭＣＭ１２２１の精製アリコートをＢｇｌ  ＩＩ及びＰｓｔ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）により切断し、制限消化産物をＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）により洗浄し、得られた、清浄なＢｇｌ  ＩＩ−Ｐｓｔ  Ｉ断片をＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓのＴ４  ＤＮＡリガーゼにより連結した。次に、Ｂｉｏ−Ｒａｄの０．１ｃｍ電極間隔キュベット及びＢｉｏ−Ｒａｄジーンパルサー・システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を利用し、ライゲーション産物を電気穿孔コンピテントセルＴｏｐ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質移入させた。形質移入させた細胞を、５０ｕｇ／ｍＬスペクチノマイシン（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）を含有させたＬＢ培地で選別した。推奨されるプロトコルに従い、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を使用し、スペクチノマイシン耐性コロニーにより得られた培養物からプラスミドを調製した。続いて、ｎｐｈＴ７（現在、株ＲＥＭ  Ｂ５＿２５と命名されている）を含有するプラスミドコンストラクトを保有している陽性のＴｏｐ１０クローンを、ｎｐｈＴ７  ｔｏｐ  ｓｅｑプライマー、ｎｐｈＴ７  ｂｏｔ  ｓｅｑプライマー、ｐＳＥ３８０３（Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈ  ｉｎ−ｈｏｕｓｅプライマー）、５’ＢｇｌＩＩ  ｒｂｓ  ｎｐｈＴ７プライマー、及び３’ＰｓｔＩ  ｎｐｈＴ７プライマーを使用し、ＤＮＡ配列を解析（Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）することにより確認した。ｎｐｈＴ７を含有しているプラスミドコンストラクトを「ｎｐｈＴ７  ｗｉｔｈ  Ｓ  ｓｕｉｓ  ＨＭＧＲＳ／ｐＣＬ」と名づけ、図６に例示する。
【０２５７】
プラスミドコンストラクトｎｐｈＴ７  ｗｉｔｈ  Ｓ  ｓｕｉｓ  ＨＭＧＲＳ／ｐＣＬの作成及び確認に使用したプライマー配列
５’ＢｇｌＩＩ  ｒｂｓ  ｎｐｈＴ７プライマー：５’−ＧＧＧＣａｇａｔｃｔｃｇｃａｃｔａｇｇａｇｇａｔａｔａｃｃａａｔｇａｃｃｇａｃｇｔｇｃｇｃｔｔｔｃｇｇ（配列番号２６）
３’ＰｓｔＩ  ｎｐｈＴ７プライマー：５’−ＴＡＴＣＣＴＧＣＡＧ  ｔｃａｃｃａｔｔｃａａｔｃａａｃｇｃｇａａｇｇａａｇｃ（配列番号２７）
ｎｐｈＴ７  ｔｏｐ  ｓｅｑプライマー：５’−ＣＧＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣＴＧＣＧＧ（配列番号２８）
ｎｐｈＴ７  ｂｏｔｔｏｍ  ｓｅｑプライマー：５’−ＣＣＧＣＡＧＣＣＴＴＣＡＧＴＧＣＣＧ（配列番号２９）
（ハウスプライマーにおける配列）ｐＳＥ３８０３：５’−ＧＧＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧＧＧ（配列番号３０）
【０２５８】
プラスミドコンストラクトｎｐｈＴ７  ｗｉｔｈ  Ｓ  ｓｕｉｓ  ＨＭＧＲＳ／ｐＣＬのＤＮＡ配列
【０２５９】
2014528705.tif 000024
【０２６０】
2014528705.tif 000025
【０２６１】
2014528705.tif 000026
【０２６２】
実施例１０：上流ＭＶＡ経路株ＲＥＭ  Ｃ８＿２５、ＲＥＭ  Ｃ９＿２５、及びＲＥＭ  Ｄ１＿２５、並びに対照株ＲＥＭ  Ｄ２＿２５、ＲＥＭ  Ｄ３＿２５、及びＲＥＭ  Ｄ４＿２５の作成
ＭＶＡの生産量が高レベルで維持されていることが示された、ａｔｏＢを欠失（内在性チオラーゼ活性を欠損）し、かつこれまでに記載した一連の変異を含有している宿主株ＣＭＰ８６５を使用して、本開示位に記載の試験及び対照株を作成した。ＣＭＰ８６５を作成するため、ＣＭＰ６４６（ＢＬ２１  ｐｇｌ＋ＰＬ．２  ｍＫＫＤｙＩ  ＧＩ  １．２  ｇｌｔＡ  ＭＬ  ａｃｋＡ−ｐｔａ  ｌｄｈＡ  ａｔｔＢ：：Ｃｍを含有）のＰ１可溶化液を作製し、これを使用して株ＣＭＰ８５６に形質導入を行うことにより、株の染色体から下流メバロン酸経路（例えば、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、及びイソペンテニルジホスフェートイソメラーゼ）を除去した。形質導入反応物をＬＢ＋クロラムフェニコール５ｕｇ／ｍＬに播種し、１つのコロニーを選択しＣＭＰ８５９と名づけた。ＣＭＰ８５９にｐＣＰ２０（Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ．２０００年．ＰＮＡＳ  ９７：６６４０〜５）を電気穿孔することによりカナマイシン（ａｔｏＢ座）及びクロラムフェニコールマーカー（ａｔｔＢ座）を同時に除去し、３０℃にてカルベニシリン５０ｍｇ／Ｌ耐性コロニーを選別し、次に４２℃にて２つの形質転換体を画線した。カナマイシン感受性、クロラムフェニコール感受性を選別し、ＣＭＰ８６５（ＢＬ２１  ＰＬ．２ｍＫＫＤｙＩ  ＧＩ  １．２  ｇｌｔＡ  ＭＬ  ａｔｏＢ  ａｔｔＢ）と名づけた。
【０２６３】
標準的な電気穿孔法プロトコルと、上記のＢｉｏ−Ｒａｄジーンパルサーキュベット及び電気穿孔システムを使用し、ｐＭＣＭ１２２１を株ＣＭＰ８６５に導入し、５０ｕｇ／ｍＬスペクチノマイシン（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）を含有させたＬＢ培地で選別して、対照株ＲＥＭ  Ｄ２＿２５、ＲＥＭ  Ｄ３＿２５、Ｄ４＿２５を作製した。更なる解析に備え、得られたスペクチノマイシン耐性コロニーのうち３つを選択し、株ＲＥＭ  Ｄ２＿２５、ＲＥＭ  Ｄ３＿２５、及びＲＥＭ  Ｄ４＿２５と名づけた。プラスミドコンストラクトｎｐｈＴ７  ｗｉｔｈ  Ｓ  ｓｕｉｓ  ＨＭＧＲＳ／ｐＣＬをＣＭＰ８６５宿主に導入したことを除き、対照株に関し記載したものと同一の手法により、上流ＭＶＡに限定した試験株ＲＥＭ  Ｃ８＿２５、ＲＥＭ  Ｃ９＿２５、及びＲＥＭ  Ｄ１＿２５を作成した。
【０２６４】
実施例１１：上流ＭＶＡに限定した株ＲＥＭ  Ｃ８＿２５、ＲＥＭ  Ｃ９＿２５、及びＲＥＭ  Ｄ１＿２５、並びに対照株ＲＥＭ  Ｄ２＿２５、ＲＥＭ  Ｄ３＿２５、及びＲＥＭ  Ｄ４＿２５によるＭＶＡ生産
ＩＰＴＧにより介在される上流ＭＶＡ経路遺伝子の導入後、２２時間の生産期間中に、ＭＶＡに限定した試験株ＲＥＭ  Ｃ８＿２５、ＲＥＭ  Ｃ９＿２５、及びＲＥＭ  Ｄ１＿２５、並びに対照株ＲＥＭ  Ｄ２＿２５、ＲＥＭ  Ｄ３＿２５、Ｄ４＿２５により生産されるＭＶＡ力価。簡潔に述べると、対照及び試験株を、３４℃にて１％グルコース／０．０２５％酵母エキス／ＴＭ３培地４ｍＬで生育させ、２００μＭ  ＩＰＴＧにより発現を誘導させ、誘導した時点を０時とした。細胞を含まない上清のＭＶＡを測定した。ＭＶＡ力価を顕著に示す、ｐＭＣＭ１２２１由来のＭＶＡ経路成分を発現している対照株を、試験株と比較した。３つの試験株中２つの試験株ではＭＶＡの検出濃度は低かった。これらのａｔｏＢ（チオラーゼ）欠失株で顕著にＭＶＡが検出されたことから、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１宿主により、ｎｐｈＴ７の機能性を確認した。
【０２６５】
実施例１２：完全なＭＶＡ経路を作製する、イソプレン生産株ＲＥＭ  Ｆ７＿２５、ＲＥＭ  Ｆ８＿２５、及びＲＥＭ  Ｆ９＿２５、並びにＩｓｐＳのみを含有する対照株ＲＥＭ  Ｆ３＿２５。
大腸菌（E. coli）ＢＬ２１株ＣＭＰ８６１（実施例３を参照されたい）を宿主株として使用した。宿主株ＣＭＰ８６１は、大腸菌（E. coli）の内在性ＤＸＰ経路により得られるものと比べて多量にイソプレンを生産させるために、ストレプトミセス（Streptomyces sp.）株ＣＬ１９０に由来する遺伝子ｎｐｈＴ５、ｎｐｈＴ６、及びｎｐｈＴ７によりコードされる上流ＭＶＡ経路の酵素を利用する上記のＭＣＭ１６８４及びＭＣＭ１６８５株を作製するために使用したものと同様のバックグラウンドをもつ。ＩＰＴＧ誘導性ｉｓｐＳ（イソプレンシンターゼ）変異体及びカルベニシリン耐性遺伝子を保有しているプラスミドコンストラクトｐＤＷ２４０（ｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ  ＩｓｐＳ  ＭＥＡ−ｍＭＶＫ（Ｃａｒｂ５０））は、ＩＰＴＧ誘導性のｉｓｐＳ（イソプレンシンターゼ）対立遺伝子と、カルベニシリン耐性遺伝子とをコードするものである。簡潔に述べると、標準的な電気穿孔プロトコルと、上記Ｂｉｏ−Ｒａｄジーンパルサーキュベット及び電気穿孔システムとを使用し、プラスミドコンストラクトｎｐｈＴ７  ｗｉｔｈ  Ｓ  ｓｕｉｓ  ＨＭＧＲＳ／ｐＣＬと、プラスミドコンストラクトｐＤＷ２４０を、株ＣＭＰ８６１に導入し、５０ｕｇ／ｍＬスペクチノマイシン及び５０ｕｇ／ｍＬカルベニシリン（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）を含有させたＬＢ培地で選別することで、完全なＭＶＡ経路をもつ、イソプレン生産試験株ＲＥＭ  Ｆ７＿２５、ＲＥＭ  Ｆ８＿２５、及びＲＥＭ  Ｆ９＿２５を作成した。更なる解析に備え、得られたスペクチノマイシン及びカルベニシリン耐性コロニーのうち３つを選択し、株ＲＥＭ  Ｆ７＿２５、ＲＥＭ  Ｆ８＿２５、及びＲＥＭ  Ｆ９＿２５と名づけた。同様にして、電気穿孔法により、ｐＤＷ２４０プラスミドコンストラクトのみを株ＣＭＰ８６１に導入し、５０ｕｇ／ｍＬカルベニシリン（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）のみを含有させたＬＢ培地で選別することで、ＩｓｐＳのみの対照株を作成した。以降の実験の対照株としてカルベニシリン耐性コロニーを選別し、ＲＥＭ  Ｆ３＿２５と名づけた。ＩｓｐＳのみの対照株ＲＥＭ  Ｆ３＿２５によるイソプレン産生量は、評価する生育条件下において、大腸菌（E. coli）が維持するＤＸＰ経路のＩｓｐＳ基質（ＤＭＡＰＰ）の内在濃度を反映する。
【０２６６】
実施例１３：完全なＭＶＡ経路のみの試験株ＲＥＭ  Ｆ７＿２５、ＲＥＭ  Ｆ８＿２５、及びＲＥＭ  Ｆ９＿２５、これまでに記載のＭＣＭ１６８４及びＭＣＭ１６８５  ＮｐｈＴ７利用株、並びにＩｓｐＳのみの対照株によるイソプレン生産
図７には、ＩＰＴＧにより、関連する遺伝子発現を誘導した３．５時間後に、完全なＭＶＡ経路のみの試験株ＲＥＭ  Ｆ７＿２５、ＲＥＭ  Ｆ８＿２５、及びＲＥＭ  Ｆ９＿２５（それぞれ図８において株ＮｐｈＴ７  ａ〜ｃとして記載する）、これまでに記載のＭＣＭ１６８４及びＭＣＭ１６８５  ＮｐｈＴ７利用株、並びにＩｓｐＳのみの対照株について測定された吸光度（ＯＤ）及びイソプレン濃度をもとに算出したイソプレンの比生産性（ｕｇ／Ｌ  ＯＤ  Ｈｒ）を示す。簡潔に述べると、対照及び試験株を、１％グルコース／０．０５％酵母エキス／ＴＭ３培地２０ｍＬ中で３４℃にて生育させ、２００ｕＭ  ＩＰＴＧにより発現誘導を行い、誘導を行った時点を０時とした。ほぼ上記のとおりにイソプレン及びＯＤ測定を行い、イソプレンの比生産性を算出した。結果を図７に示す。ＩＰＴＧによる発現誘導の５．５時間後に前述の各１８ｍＬの培養物から細胞ペレットを回収し、続いて、上流ＭＶＡ経路及びＩｓｐＳ活性（下記を参照されたい）について解析した。これまでに観察されたとおり、ストレプトミセス種（Streptomyces sp.）株ＣＬ１９０由来の上流ＭＶＡ経路の３つの成分のすべてを発現しているＭＣＭ１６８４及びＭＣＭ１６８５  ＮｐｈＴ７利用株では、ＩｓｐＳのみの対照株と比較して、イソプレンの比生産性がわずかに高いことが裏付けられる。興味深いことに、本開示において新規に作製した試験株ＲＥＭ  Ｆ７＿２５、ＲＥＭ  Ｆ８＿２５、及びＲＥＭ  Ｆ９＿２５は、これまでに特性の評価されているＭＣＭ１６８４及びＭＣＭ１６８５株と比較しておおよそ３倍も多量にイソプレンを生産した。このデータにより、ＮｐｈＴ７が大腸菌（E. coli）ＢＬ２１宿主内で機能することが裏付られる。このデータにより、ＮｐｈＴ７アセトアセチルＣｏＡシンターゼとストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼとをコードしているプラスミドコンストラクトＳ  ｓｕｉｓ  ＨＭＧＲＳ／ｐＣＬは、株ＭＣＭ１６８４及びＭＣＭ１６８５が発現するストレプトミセス種（Streptomyces sp.）株ＣＬ１９０の遺伝子から、もっぱら経路の（previously described）３つの成分のみを有する株と比較して、より活性な上流ＭＶＡ経路をもたらすことも示唆される。
【０２６７】
実施例１４：アセトアセチルＣｏＡシンターゼ（ＮｐｈＴ７）株の触媒活性の解析
材料：
アセチルＣｏＡ、マロニルＣｏＡ、ＮＡＤＰＨ、ＴＲＩＳ塩類、ＡＥＢＳＦ、ＤＮＡａｓｅ、リゾチーム、塩化ナトリウム、及び塩化マグネシウムはシグマから購入した。ＤＭＡＰＰは化学合成した。
【０２６８】
細胞の生育及び可溶化液の調製
１％グルコース、０．０５％酵母エキス及び２００μＭ  ＩＰＴＧを含有させたＴＭ３培地で、細胞を５．５時間３４℃にて生育させた。次に、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８０４Ｒ遠心機により、細胞を４℃にて５０００ＲＰＭで１５分遠心分離した。１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＡＥＢＳＦ、１ｍｇ／ｍＬリゾチーム、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＤＮＡａｓｅを含有している溶液（ｐＨ  ７．６）に、細胞ペレットを再懸濁した。フレンチプレスセルにより、細胞懸濁液を９６．５ＭＰａ（１４，０００ｐｓｉ）で可溶化した。次に、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８０４Ｒ遠心機により、可溶化液を４℃にて１５，０００ＲＰＭで１０分遠心分離した。酵素活性アッセイに備え、上清を回収した。
【０２６９】
（Ａ）アセトアセチルＣｏＡシンターゼ（ＮｐｈＴ７）、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ触媒活性を組み合わせたアッセイ
１ｍＭアセチルＣｏＡ、１ｍＭマロニルＣｏＡ、又はこれら両方、０．４ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び２０μＬ清澄化細胞可溶化液を用い、ｐＨ  ７．６で、細胞可溶化液のアセチルＣｏＡ及びマロニルＣｏＡ活性アッセイを実施した。アセチルＣｏＡ、マロニルＣｏＡ又はこれら両方を加えて反応を開始した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用し、９６ウェルプレートで、３４０ｎｍにてＮＡＤＰＨの酸化をモニターした。すべての反応は、最終用量１００μＬで２５℃にて実施した。アセチルＣｏＡ、マロニルＣｏＡ、又はこれら両方を存在させた場合の反応速度から、アセチルＣｏＡ又はマロニルＣｏＡの非存在下でＮＡＤＰＨの酸化速度を減算した。
【０２７０】
（Ｂ）イソプレンシンターゼ触媒活性アッセイ
２ｍＬガスタイトバイアル中で、２５μＬ大腸菌（E. coli）可溶化液に、５ｍＭ  ＤＭＡＰＰ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ、（ｐＨ  ７．６）を加え、最終用量１００μＬで、３４℃にて１５分間インキュベートした。２５０ｍＭ  ＥＤＴＡ  １００μＬを加え、反応を停止させた。ＧＣ−ＭＳによりガラスバイアルを解析し、反応により生成されたイソプレン濃度を測定した。
【０２７１】
結果：
これらの試験により、細胞可溶化液と、アセチルＣｏＡ、マロニルＣｏＡ、又はアセチルＣｏＡ及びマロニルＣｏＡの両方の存在下で、ＮＡＤＰＨの酸化を測定した。この結果により、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ（ｎｐｈＴ７）含有株におけるＮＡＤＰＨの酸化速度は、アセチルＣｏＡ及びマロニルＣｏＡの存在下で最も大きくなることが示される（図８を参照されたい）。アセトアセチルＣｏＡシンターゼ（ｎｐｈＴ７）を欠損している対照株におけるＮＡＤＰＨ酸化速度は、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ（ｎｐｈＴ７）含有株と比較して減少し、対照株の酸化速度は、アセチルＣｏＡ又はマロニルＣｏＡの存在に依存するものではなかった（図８）。これらの結果は、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ（ｎｐｈＴ７）、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、及びＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ活性を複合させるには、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡを存在させる必要があることと一致する。ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ触媒活性は、アセチルＣｏＡの存在に依存することから、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ（ｎｐｈＴ７）活性にはマロニルＣｏＡを存在させる必要があるものと結論付けることができる。これらの結果により、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ（ｎｐｈＴ７）は、アセトアセチルＣｏＡ生産時の基質として両方のマロニルＣｏＡを利用することが明瞭に裏付けされる。イソプレンシンターゼ活性を解析して、イソプレン比生産性（図７を参照されたい）における違いを確認したところ、イソプレンシンターゼ活性の差によるものではなかった（図９）。
【０２７２】
実施例１５：アモルファジエン又はファルネセン生産株の構築
ＭＣＭ５２１可溶化液を使用し、下流メバロン酸経路をＭＣＭ１６８４に形質導入させた。製造元に従いカナマイシンマーカーを除去する（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。ＭＣＭ５２１の下流経路は、別の遺伝子を使用することにより各遺伝子の前に位置するｒｂｓを改変し、オペロン上流のプロモーターを変更することで改変することができる。染色体上のプロモーター及び／又はｒｂｓを変更させるか、又はプラスミドから発現させるかのいずれかにより、ファルネシル二リン酸合成酵素（ｉｓｐＡ）を過剰発現させる。多様なプラスミドｐＤＷ３４（米国特許第２０１０／０１９６９７７号；図２を参照されたい）を用い、プラスミドｐＭＣＭ１３２１を同時電気穿孔した。ｐＤＷ３４変異体のプラスミドは、大腸菌（E. coli）用にコドンを最適化させたファルネセンシンターゼ又は大腸菌（E. coli）用にコドンを最適化させたアモルファジエンシンターゼを、イソプレンシンターゼの代わりに含有する。ＬＢ＋スペクチノマイシン５０ｕｇ／ｍＬ＋カルベニシリン５０ｕｇ／ｍＬでコロニーを選択する。
【０２７３】
実施例１６：アセトアセチルＣｏＡシンターゼを有するプラスミドを含む株におけるアモルファジエン又はファルネセンの生産
（ｉ）材料
ＴＭ３培地組成（発酵培地１Ｌ当たり）：Ｋ２ＨＰＯ４（１３．６ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（１３．６ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（３．２ｇ）、酵母エキス（０．２ｇ）、１０００Ｘ微量金属溶液（１ｍＬ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させる。水酸化アンモニウム（３０％）によりｐＨを６．８に調整し、及び容量を調整する。次に、０．２２μｍのフィルタを用い培地を濾過滅菌した。滅菌及びｐＨ調整後にグルコース１０．０ｇ及び抗菌剤を添加する。
【０２７４】
１０００Ｘ微量金属溶液（発酵培地１Ｌ当たり）：クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１成分ずつ脱イオン水に溶解する。ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨで３．０に調整した後、溶液を用量に調整し、０．２２μｍフィルタでフィルタ滅菌する。
【０２７５】
（ｉｉ）実験手順
ルリア・ベルターニブロス＋抗生物質で細胞を一晩生育させる。翌日、ＯＤ６００が０．０５になるよう細胞を２０ｍＬのＴＭ３培地（５０ｕｇ／ｍＬのスペクチノマイシン及び５０ｕｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有（２５０ｍＬのバッフル付き三角フラスコ））により希釈し、３４℃かつ２００ｒｐｍでインキュベートする。接種前に、各培養フラスコには２０％（ｖ／ｖ）ドデカン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を積層し、これまでに記載のとおり、揮発性セスキテルペン産物を捕捉する（Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ．ａｌ．，２００６）。
【０２７６】
２時間生育させた後、ＯＤ６００を測定し、０．０５〜０．４０ｍＭのイソプロピルβ−ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えた。発酵工程の間、規則的に試料を採取する。各時点でＯＤ６００を測定する。また、積層したドデカンを酢酸エチルに希釈し、有機層中のアモルファジエン又はファルネセン濃度を分析する。ドデカン／エチルアセテート抽出物を、従来記載されているとおりの（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３，２１：９６〜８０２）ＧＣ−ＭＳ法により、アモルファジエンの分子イオン（２０４ｍ／ｚ）及び１８９ｍ／ｚフラグメントイオン又はファルネセンの分子イオン（２０４ｍ／ｚ）の観察により解析する。濃度既知のアモルファジエン又はファルネセン試料を装填して、それぞれアモルファジエン又はファルネセンの標準曲線を生成する。試料中のアモルファジエン又はファルネセンの量は、それぞれアモルファジエン又はファルネセンの標準曲線を使用し算出する。
【０２７７】
（ｉｉｉ）結果
ｐＭＣＭ１３２１を含有している株を、同様のバックグラウンドを持つもののアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は含まない株と比較したところ、アモルファジエン又はファルネセンの比生産性、収率、ＣＰＩ及び／又は力価の上昇が観察された。
【０２７８】
（ｉｖ）引用文献：
Ｎｅｗｍａｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｍａｒｓｈａｌ，Ｊ．Ｌ．，Ｃｈａｎｇ，Ｍ．Ｃ．Ｙ．，Ｎｏｗｒｏｏｚｉ，Ｆ．，Ｐａｒａｄｉｓｅ，Ｅ．Ｍ．，Ｐｉｔｅｒａ，Ｄ．Ｊ．，Ｎｅｗｍａｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｋｅａｓｌｉｎｇ，Ｊ．Ｄ．，２００６．Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｏｒｐｈａ−４，１１−ｄｉｅｎｅ  ｉｎ  ａ  ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９５：６８４〜６９１。
【０２７９】
Ｍａｒｔｉｎ，Ｖ．Ｊ．，Ｐｉｔｅｒａ，Ｄ．Ｊ．，Ｗｉｔｈｅｒｓ，Ｓ．Ｔ．，Ｎｅｗｍａｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｋｅａｓｌｉｎｇ，Ｊ．Ｄ．，２００３．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａ  ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７９６〜８０２。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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