(57)【要約】  本明細書は、単糖飢餓条件下で、第１の前処理リグノセルロース系バイオマスを加水分解するために、宿主細胞から少なくとも１つの酵素を生産する方法を開示し、培養環境は、宿主細胞に供給して増殖させるのに使用されるリグノセルロース系バイオマス内に存在するもの以外は、非常にわずかな、好ましくは皆無の添加された単糖類を有する。培養環境は、発酵刺激物質および酵素産生誘導物質を実質的に欠いている。好ましくは、培養環境は、前処理リグノセルロース系バイオマスの高い乾物含量を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の前処理リグノセルロース系バイオマスの加水分解のために、宿主細胞から少なくとも１つの酵素を産生する方法であって、
前記方法が、培養期間にわたって前記少なくとも１つの酵素を産生する能力のある前記宿主細胞を培養するステップを含み、
前記宿主細胞の培養が、前記宿主細胞、複合糖類を含む第２の前処理リグノセルロース系バイオマスを含む培養環境中で行われ、
前記培養が、前記培養期間の少なくとも５０％である培養期間の一部にわたって、乾燥量基準で前記培養環境の０〜１０重量％の範囲の量の任意選択的に添加された、単糖または糖類を有する単糖飢餓条件下で実施され、
前記培養環境が、実質的に追加的ビタミン、および／または追加的ミネラルおよび／または追加的酵素産生誘導物質を欠いている、方法。
【請求項２】
前記培養環境中の前記第２の前処理リグノセルロース系バイオマスの乾物含量が、重量で、２％、４％、６％、８％、１０％、１５％からなる群から選択される値よりも高い、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単糖飢餓条件下の培養期間の部分が、前記培養期間の少なくとも７５％である、請求項１および２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記単糖飢餓条件下の培養期間の部分が、前記培養期間の少なくとも８５％である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記単糖飢餓条件下の培養期間の部分が、前記培養期間の少なくとも９０％である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記単糖飢餓条件下の培養期間の部分が、前記培養期間の少なくとも９５％である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記単糖飢餓条件下の培養期間の部分が、前記培養期間の少なくとも９８％である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記単糖飢餓条件下の培養期間の部分が、前記培養期間と同じである、請求項１および２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
任意選択的に添加された単糖または糖類の量が、乾燥重量基準で、前記培養環境の０〜５重量％の範囲である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記任意選択的に添加された単糖または糖類の量が、乾燥重量基準で、前記培養環境の０〜２．５重量％の範囲である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記任意選択的に添加された単糖または糖類の量が、乾燥重量基準で、前記培養環境の０〜２．０重量％の範囲である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記任意選択の添加された単糖または糖類が、乾燥重量基準で、前記培養環境の０〜１．０重量％の範囲である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記培養環境中に、任意選択の添加された単糖または糖類が存在しない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素を培養環境から取り出すことで、前記酵素が収集される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素がさらに使用されて、前記第１のリグノセルロース系バイオマスが加水分解され、前記第１のリグノセルロース系バイオマスおよび前記第２の前処理リグノセルロース系バイオマスが、どちらも同属の草に由来するリグノセルロース系バイオマスを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記酵素がさらに使用されて、前記第１のリグノセルロース系バイオマスが加水分解され、前記第１のリグノセルロース系バイオマスおよび前記第２の前処理リグノセルロース系バイオマスが、同種の草に由来する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１のリグノセルロース系バイオマスが、酵素加水分解に先だって前処理される、請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法により生成された、酵素混合物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の前記酵素混合物によって加水分解された、加水分解リグノセルロース系バイオマス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
リグノセルロース系原材料からのセルロースおよびヘミセルロースの加水分解には、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、およびキシランとマンナンの側鎖に作用する種々の酵素からなる、良好に均衡のとれた酵素混合物が必要であることが知られている。酵素または酵素混合物の生産と応用は、現在、リグノセルロース材料の利用に向けた、生物学的ベースの経路のためのより高価な加工段階であるので、酵素の生産は、バイオマスからエタノールへの工程の重要なステップである。
【背景技術】
【０００２】
植物分解性真菌トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）の酵素系は、最も広汎に調査されており、商業的酵素混合物を得るために最も幅広く使用される生物であると考えられる。Ｔ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）は、たとえ細胞外β−グルコシダーゼ分泌が少ないにせよ、多数のセルロース−およびヘミセルロース−分解酵素を産生する。良く知られているように、β−グルコシダーゼ活性内容は、高いセルロース転換を得るために重要であり、Ｔ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）酵素溶液には、通常、β−グルコシダーゼが添加されて、良好に均衡のとれた酵素溶液を得て、セルロースの加水分解をさらに進める。他の事例では市販の酵素または酵素混合物溶液はまた、その他の優れたβ−グルコシダーゼ産生真菌によって産生された酵素を使用しても得られる。
【０００３】
Ｔ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｒｕｔ  Ｃ３０（Ｊｕｈａｓｚ，Ｔ．，Ｓｚｅｎｇｙｅｌ，Ｚ．，Ｒｅｃｚｅｙ，Ｋ．，Ｓｉｉｋａ−Ａｈｏ，Ｍ．，Ｖｉｉｋａｒｉ，Ｌ．（２  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｏｒ  ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｈｅｍｉｅｎｚｙｍｅ  ｏｒ  ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ｏｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｃａｒｂｏｎ  ｓｏｕｒｃｅｓ．Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，４０，３５１９−３５２５を参照されたい）またはペニシリウム・ブラシリアヌム  （Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ    ｂｒａｓｉｌｉａｎｕｍ）（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｈ．，Ｏｌｓｓｏｎ，Ｌ．（２  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｏｒ  ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｂｙ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｂｒａｓｉｌｉａｎｕｍ  ＩＢＴ  ２０８８８：Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｏｎ  ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｔｅｃｈｎｏｌ，３８，３８１−３９０を参照されたい）に関する以前の研究では、培養のために使用される基質と、得られた酵素の特定の基質に対する加水分解能力との間に明らかな関係性が報告されていなくても、多くの研究グループは、いくつかの様式で、バイオエタノール生産に使用されるのと同じ材料を使用して酵素または酵素混合物を生産し、最終的な酵素混合物のコストを削減することを試みている。
【０００４】
このような一方法が、国際公開第２００７／００５９１８号に記載されている。この方法は、生物増殖のための供給物としてグルコースの一定の添加を使用しながら、記載される前処理リグノセルロース系基質を酵素増殖の誘導物質として添加する。記述されるこの技術の目的は、宿主細胞中の酵素または酵素混合物生産のために、今日使用される純粋なセルロースを特に国際公開第２００７／００５９１８号に記載される、前処理ダンチク（Ａｒｕｎｄｏ  Ｄｏｎａｘ）（ＰＣＳ）などの前処理リグノセルロース系材料で置き換えることである。この利点は、容易に入手でき、したがって純粋なセルロースと比べてより安価な誘導物質（リグノセルロース系バイオマス）を使用することで、生産コストが削減されることである。国際公開第２００７／００５９１８号は、誘導物質として少量のバイオマスを使用し、絶えずグルコースを添加して、生物に供給する。
【０００５】
誘導物質としてリグノセルロース系バイオマスを使用しても、酵素のコストは高いままであり、それが酵素技術の拡散を制限する基本要因である。酵素のコスト低減を制限する主な要因は、微生物の増殖を促進するために使用される成分のコストと、操業コストによって代表される。成分中における主要コストは、グルコースと、ビタミンや無機塩類などの発酵刺激物質と、乳糖やイソプロピルβ−Ｄ−ｌ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）などの酵素産生誘導物質とによって代表される。発酵刺激物質および酵素産生誘導物質は、たとえ少量が使用されるとしても高価である。操業コストの面では、発酵培地を撹拌するためにエネルギーが必要であり、総発酵時間が考慮される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって酵素または酵素混合物を生産する安価な方法に対する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書で開示されるのは、第１の前処理リグノセルロース系バイオマスを加水分解するために、宿主細胞から少なくとも１つの酵素を生産する方法であり、前記方法は、培養期間にわたって少なくとも１つの酵素を産生する能力のある宿主細胞を培養するステップを含み、宿主細胞の培養は、宿主細胞と、複合糖類および任意選択的に単糖類を含む第２の前処理リグノセルロース系バイオマスとを含む培養環境中で行われ；培養は、培養期間の少なくとも一部にわたって、乾燥重量基準で培養環境の０〜１０重量％の範囲の任意選択の追加的単糖を有する、単糖飢餓条件下で行われ；培養環境は、実質的に添加されたビタミン、および／または添加されたミネラルおよび／または添加された酵素産生誘導物質を欠いている。
【０００８】
培養環境中の第２の前処理リグノセルロース系バイオマスの乾物含量は、重量で、２％を超え、好ましくは４％を超え、より好ましくは６％を超え、さらにより好ましくは８％を超え、なおもさらにより好ましくは１０％を超え、最も好ましくは１５％を超えてもよいことも開示されている。
【０００９】
単糖飢餓条件下での培養期間の部分が、培養期間の少なくとも５０％、培養期間の少なくとも７５％、培養期間の少なくとも８５％、培養期間の少なくとも９０％、培養期間の少なくとも９８％、および培養期間に等しい期間からなる群から選択されてもよいこともさらに開示されている。
【００１０】
任意選択の添加された単糖が、乾燥量基準で培養環境の０〜５重量％、乾燥量基準で培養環境の０〜２．５重量％、乾燥量基準で培養環境０〜２．０％、乾燥量基準で培養環境の０〜１．０％、および任意選択の単糖が存在しないことからなる群から選択される範囲内でよいこともさらに開示されている。
【００１１】
酵素または酵素混合物は、培養環境から酵素または酵素混合物を取り出すことで採取されてもよく、それをさらに使用して第１のリグノセルロース系バイオマス加水分解してもよく、第１のリグノセルロース系バイオマスおよび第２の前処理リグノセルロース系バイオマスのどちらも、同属の草またはより好ましくは同種の草からなる群に由来する、リグノセルロース系バイオマスを含むこともさらに開示されている。
【００１２】
生産された酵素、単糖飢餓条件下で生産された酵素または酵素混合物による加水分解リグノセルロース系バイオマスが存在することもまた、開示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
最小の培養環境で宿主細胞を培養し、それによって低コストで酵素または酵素混合物を生産する方法を提供することで、宿主細胞から酵素を生産する方法が発見された。
【００１４】
本発明の一態様によれば、伝統的に宿主細胞に供給するのに使用されるグルコースやキシロースなどの単糖を、例えば前処理されたダンチク（Ａｒｕｎｄｏ  Ｄｏｎａｘ）などの前処理リグノセルロース材料によって置換した場合、前処理リグノセルロース系バイオマス材料に対する、宿主細胞から産生される酵素または酵素混合物の活性を高め得ることが発見された。前処理リグノセルロース系材料は、好ましくは熱水中の浸漬と洗浄、および水と水溶性化合物を除去する圧搾によって前処理される。浸漬前処理は、可溶性糖モノマー（キシロースおよびグルコース）を除去する。生産される酵素活性を強化するのに加えて、前処理リグノセルロース系材料は、伝統的に宿主細胞に供給するのに使用される、グルコースおよびキシロース原料と比べて、顕著により安価である。さらに前処理リグノセルロース系材料を一意の炭素源として使用して、培養環境に皆無のまたはわずかな単糖類を添加した場合に、著しい時間短縮が得られる。
【００１５】
本発明の別の態様によると、酵素または酵素混合物を産生する宿主細胞の培養は、ビタミンおよびミネラルまたは無機塩類などの高価な発酵刺激物質の添加および／または乳糖やＩＴＰＧなどの追加的な酵素産生誘導物質を必要としないことが発見され、したがって前処理リグノセルロース系材料を含む培養環境は、添加された発酵刺激物質および添加された酵素産生誘導物質を欠き、または実質的に欠いている。本開示では、「添加された発酵刺激物質を実質的に欠く」という表現は、培養環境中の添加された各発酵刺激物質（ビタミンおよびミネラルの双方）の濃度が、１ｇ／Ｌ未満、より好ましくは５００ｍｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは２００ｍｇ／Ｌ未満、なおもさらにより好ましくは１００ｍｇ／Ｌ未満、なおもさらにより好ましくは５０ｍｇ／Ｌ、なおもさらにより好ましくは１０ｍｇ／Ｌ未満、なおもさらにより好ましくは５ｍｇ／Ｌ未満、最も好ましくは２ｍｇ／Ｌ未満であることを意味する。これらの濃度値は、当該技術分野で公知の同様の工程で通常使用される濃度よりも有意に低い。本開示では、「添加された酵素産生誘導物質を実質的に欠く」という表現は、培養環境中の添加された各酵素産生誘導物質（乳糖およびＩＴＰＧの双方）の濃度が、１００ｍｇ／Ｌ未満、より好ましくは５０ｍｇ／Ｌ未満、さらにより好ましくは２０ｍｇ／Ｌ未満、なおもさらにより好ましくは１０ｍｇ／Ｌ未満、最も好ましくは５ｍｇ／Ｌ未満であることを意味する。これらの濃度値は、当該技術分野で公知の同様の工程で通常使用される濃度よりも有意に低い。
【００１６】
本発明のさらなる態様によると、酵素または酵素混合物を産生する宿主細胞の培養は、前処理リグノセルロース系材料の重量基準で、以前開示された方法よりも実質的により高い乾物含量を有する培養環境中で行ってもよいことが、発見された。培養環境中の前処理リグノセルロース系材料の乾物含量は、重量で、２％を超え、好ましくは４％を超え、より好ましくは６％を超え、さらにより好ましくは８％を超え、なおもさらにより好ましくは１０％を超え、最も好ましくは１５％を超えてもよい。乾物含量の増大は、以前開示された方法と比較して、培養環境を撹拌するのに要する、培養環境のグラムあたりエネルギーを低下させる。さらに一定量の酵素を産生するのに必要な培養環境量が低下し、対応して機器（バイオリアクター）の容量も低下して、その結果、投資費用のさらなる削減が生じる。
【００１７】
本発明のさらなる利点は、宿主細胞由来の酵素混合物を使用して、宿主細胞に供給して増殖させるのに使用されたのと同様の前処理リグノセルロース系材料を加水分解した場合、前処理リグノセルロース系材料に対する、酵素混合物の反応性が、より高いことである。
【００１８】
当業者は、開示された方法の特徴が、酵素の生産コストを顕著に削減することを理解するであろう。
【００１９】
酵素を生産する方法
糸状菌などの真菌起源、または細菌起源の宿主細胞中で、酵素または酵素混合物を生産することは、当該技術分野で周知である。本発明の増殖方法は、純粋グルコースなどの供給物が限定的であり、前処理リグノセルロース系材料が主要供給物であることを除いて、周知の方法であってもよい。
【００２０】
酵素生産手順は、当該技術分野で周知である。本発明に照らして、酵素または酵素混合物は、好ましくは細胞外酵素であり、あるいは宿主細胞によって発酵培地中に分泌される酵素混合物である。あるいは、酵素または酵素混合物は細胞内にある。
【００２１】
酵素または酵素混合物の産生能力のある宿主細胞を、正確な培養条件下において特定の成長速度で増殖させる。宿主細胞培養を発酵培地に導入すると、接種培養はいくつかの段階を通過する。初期には、増殖は起きない。この期間は遅滞期と称され、適応期間と見なされてもよい。「対数期」と称される次の相の間に、宿主細胞培養の増殖速度は徐々に増大する。最大増殖期間後に速度は停止して、培養は定常期に入る。さらなる時間経過後に培養は死滅期に入り、生存細胞数は低下する。増殖期において、対象酵素および宿主細胞次第で、対象酵素または酵素混合物が発現される。一実施形態では、酵素または酵素混合物は、対数期に発現されてもよい。別の実施形態では、酵素または酵素混合物は、対数期と定常期の間の移行相において生成されてもよい。別の実施形態では、酵素または酵素混合物はまた、定常期に発現されおよび／または胞子形成直前に発現されてもよい。本発明によって、酵素または酵素混合物はまた、２つ以上の前述の期内で生産されてもよい。
【００２２】
換言すれば、本発明によって、宿主細胞は、適切な培地中で、少なくとも１つの酵素または酵素混合物が、発現されて、好ましくは分泌され、任意選択的に回収できるようにする条件下で培養される。一方で上述のように、宿主細胞増殖には、本明細書の目的で、多数の技術的な相(phase)があり、これらの相は、培養という用語で一つのグループにまとめられる。宿主細胞培養は、供給物として炭素源および前処理リグノセルロース系材料を含む、発酵培地中で行われる。好ましい実施形態によると、前処理リグノセルロース系材料は、その教示を参照によって援用する、国際公開第２０１０／１１３１２９号に記載されるように、浸漬／洗浄して、次に蒸気爆発させて前処理される。
【００２３】
発酵後、酵素または酵素混合物は、当該技術分野で周知の方法を使用して、任意選択的に回収されてもよい。例えば発酵培地からの細胞外酵素または酵素混合物の回収は、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、または沈殿をはじめとするが、これに限定されるものではない、従来の手順を使用して行われてもよい。細胞内酵素または酵素混合物の回収手順はまた、当該技術分野でも周知である。
【００２４】
少なくとも、本発明に照らして、「培養」および「発酵」という同義用語は、１つまたは複数の宿主細胞からなる大量培養を使用して、酵素または酵素混合物を生産するあらゆる方法を意味する。本発明は、例えば少なくとも５０リットル、好ましくは少なくとも１リットル、より好ましくは少なくとも５リットルの培地を有する、工業規模生産に特に有用である。
【００２５】
酵素または酵素混合物は、エンドグルカナーゼ（エンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ）、セロビオヒドロラーゼまたはエキソグルカナーゼ（エキソ−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ）、β−グルコシダーゼ（１，４−β−Ｄ−グルコシダーゼ）、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、エンド−１，４−β−マンナナーゼ、１，４−β−キシロシダーゼ、１，４−β−マンノシダーゼを含む、酵素または酵素混合物群に属するもののいずれかを含んでもよいが、これに限定されるものではない。
【００２６】
本発明の方法は、バッチ、流加、反復流加または連続工程として実施してもよい。
【００２７】
本発明の方法は、好気的または嫌気的に行われてもよい。いくつかの酵素は液内培養によって、いくつかは表面培養によって生産される。本発明によれば、液内培養が好ましい。
【００２８】
したがって一態様によれば、本発明は、酵素または酵素混合物などの酵素または酵素混合物の生成に導く条件下で、酵素または酵素混合物を産生する能力のある宿主細胞を培養するステップを含む、宿主細胞中で酵素または酵素混合物を生産する方法に関し、前処理リグノセルロース系材料は、単糖飢餓条件下で宿主細胞を増殖させるのに使用される。
【００２９】
より具体的には、記載される方法は、第１の前処理リグノセルロース系バイオマスの加水分解のために、宿主細胞から少なくとも１つの酵素を産生し、前記方法は、最初に、培養期間にわたって少なくとも１つの酵素を産生する能力のある宿主細胞を培養するステップを含み、宿主細胞の培養は、宿主細胞と、複合糖類および任意選択的に単糖類を含む第２の前処理リグノセルロース系バイオマスとを含む培養環境中で行われ；培養は、培養期間の少なくとも一部にわたって、単糖飢餓条件下で行われ、培養環境は、培養環境の乾燥重量基準で０〜１０重量％の範囲の任意選択の添加された単糖をさらに含んでもよい。
【００３０】
培養期間は、前培養容積を宿主細胞培養環境に添加してから、酵素または酵素混合物を培養環境から収穫、除去、または分離するまでの測定時間である。複数回除去の場合、培養期間は、最初の酵素または酵素混合物が培地から採集された時点で終了する。
【００３１】
複合糖類は、単量体糖類でない糖類である。単糖類は単量体糖類であり、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、および果糖からなる群から選択されてもよい。先行する一覧にないその他の単糖類があってもよいことに、留意すべきである。
【００３２】
培養環境中に存在するリグノセルロース系バイオマスの量は、宿主細胞の増殖が、所望量の酵素または酵素混合物を生産するのに十分であるべきである。
【００３３】
単糖飢餓条件という語句は、一般に５０重量％を超える宿主細胞供給物が、添加された単糖類でなく、前処理リグノセルロース系バイオマスに由来することを意味する。例示的な単糖飢餓条件は、たとえ添加があったとしても、工程に添加される任意選択の単糖類の量が、乾燥重量基準で培養環境の０〜１０重量％の範囲の場合である。より好ましくは、任意選択の添加される単糖類は、乾燥重量基準で培養環境の０〜５重量％の範囲であるべきであり、０〜２．５重量％がさらにより好ましく、０〜２．０％が最も好ましい（たとえ単糖類の添加があったにしても）。最高の条件では、添加される単糖類はなく、それは完璧な単糖飢餓条件である。それに加えて、添加される単糖類という語句は、１つまたは複数の添加される単糖類があることを意味する。
【００３４】
任意選択の添加される単糖類の存在はまた、前処理リグノセルロース系バイオマスに由来する糖類の量に対する、添加される任意選択の単糖類の量との比率として表し得る。最も好ましい比率は０．０であり、これは、あらゆる任意選択の単糖類の不在である。しかし比率は、好ましくは２．０または１．５未満であるべきであり、１．１２未満がより望ましく、０．５３未満がさらにより望ましく、０．３３未満もまた好ましい値である。一実施形態では、任意選択の単糖が存在するが、示される百分率未満であり、あるいは示される比率未満で存在する。
【００３５】
単糖飢餓条件は、培養期間の少なくとも一部にわたって維持されるべきである。定量的に表すと、単糖飢餓条件は、培養期間の少なくとも５０％にわたって維持されるべきであり、７５％がより望ましく、８５％がさらにより望ましく、９５％がなおもさらにより望ましく、培養期間の９９および１００％が最も好ましい。培養期間の１００％は、培養期間の少なくとも一部が、培養期間に等しい場合である。
【００３６】
この様にして、宿主細胞およびその酵素の増殖は、第２のリグノセルロース系バイオマスの前処理リグノセルロース系バイオマス供給によって影響を受け、前処理リグノセルロース系バイオマスをより良く加水分解するように、時間と共に順応する。この様にして、酵素混合物を使用して、リグノセルロース系バイオマス、特に第２の前処理リグノセルロース系バイオマス供給物と同様の組成を有する前処理リグノセルロース系バイオマスを加水分解した場合、前処理リグノセルロース系バイオマスに対する反応性がより高くなる（すなわちより良い酵素加水分解）。
【００３７】
基質および添加剤
本発明の方法で使用される基質は、当該技術分野で公知のあらゆる基質であってもよい。適切な基質は、販売元から入手でき、または（例えば米国微生物系統保存機関(American Type Culture Collection)のカタログで）公表された組成に従って調製されてもよい。
【００３８】
複合糖類の消費量に対するグルコースまたは類似糖類の消費量が、指定された限度内にあれば、酵素または酵素混合物生産のための供給物として通常使用される炭素源基質には、グルコースまたは類似糖類が含まれる。アンモニア（ＮＨ４Ｃｌ）または尿素などの窒素源基質を添加し、培養および酵素または酵素混合物生産を改善してもよい。開示される方法の重要な特徴は、既に前処理リグノセルロース系材料に含まれているものを除いて、発酵刺激物質が培養環境に添加されず、または少量のみ添加されることであり、すなわち培養環境が、添加された発酵刺激物質を含まず、または以前知られている方法と比較してより少量で添加される発酵刺激物質を含むことである。本開示に照らして、増殖のために添加される発酵刺激物質としては、ビタミンおよびミネラルが挙げられる。添加されないまたは少量添加されるビタミン類は、ビオチン、パントテン酸、ニコチン酸、メソイノシトール、チアミン、ピリドキシン、パラアミノ安息香酸、葉酸、リボフラビン、およびビタミンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥからなる群から選択される。添加されないまたは少量添加されるミネラルは、Ｂ、Ｐ、Ｍｇ、Ｓ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｍｏ、およびＣｕからなる群から選択される栄養素を供給する、ミネラルおよび無機塩類である。
【００３９】
開示されている方法の重要な特徴は、既に前処理リグノセルロース系材料に含まれているものを除いて、酵素産生誘導物質が培養環境に添加されず、または少量のみ添加されることであり、すなわち培養環境が、添加された酵素産生誘導物質を含まず、または以前知られている方法と比較してより少量で添加される酵素産生誘導物質を含むことである。本開示に照らして、培養環境に添加されないまたは少量が添加される酵素産生誘導物質は、乳糖およびＩＴＰＧからなる群から選択される。
【００４０】
酵素または酵素混合物の生産工程において、誘導物質（および炭素源）として通常使用される純粋なセルロースは、酸前処理されていれば好ましくは中和された(detoxified)、洗浄前処理リグノセルロース系材料などの前処理リグノセルロース系材料で置換される。
【００４１】
前処理リグノセルロース系材料は炭素源であり、炭素源と一緒に培地に添加してもよいが、炭素源とはまた別に添加してもよい。本発明によれば、宿主細胞培養物の接種前、接種と同時、または接種後のいずれかに、少なくとも宿主細胞を増殖させるのに必要な利用可能複合糖類量に相当する量で、前処理リグノセルロース系材料を培地に添加してもよい。培養期間中にリグノセルロース系バイオマスを添加する場合、任意選択の添加される単糖類の量、またはリグノセルロース系バイオマスに対する任意選択の単糖類の比の新しい計算が行われる。単糖類の量は、培養期間の最初の部分では、十分低くなくてもよい一方で、リグノセルロース系バイオマスを培養環境に追加することにより、任意選択の添加される単糖類の量は、少なくとも培養期間の残りの期間は規定範囲内になる。
【００４２】
当業者は、本発明の酵素または酵素混合物生産工程において、前処理リグノセルロース系材料を添加する時期と、添加量を容易に判定し得る。培養期間中に、前処理リグノセルロース系材料は、好ましくは、細胞宿主によって常態で消費されるグルコース活性に相当する量で添加され、あらかじめ指定された限度内に維持される。
【００４３】
上述したように、前処理リグノセルロース材料は、周知の酵素または酵素混合物生産工程において、グルコースが通常で使用されるのと同様に使用される。
【００４４】
例えば宿主細胞としてペニシリウム・デカンベンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）などのペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）株を使用して、酵素または酵素混合物を生産する場合、前処理リグノセルロース材料中に存在するグルカンおよびキシランは、２．７総グラム／Ｌのレベルで装填された。本発明の方法は、３〜１０日間など、対応する従来の方法と同一期間にわたって持続してもよい。ペニシリウム・デカンベンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）発酵をはじめとするペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）発酵は、一般に３〜９日間持続する。
【００４５】
リグノセルロース系材料
本発明によれば「リグノセルロース系材料」としては、リグノセルロースを含む任意の材料が挙げられる。リグノセルロースは、一般に例えば、植物の茎、葉、殻、穀皮、および穂軸、あるいは樹木の葉、枝、および木材中に見られる。リグノセルロース系材料はまた、草質材料、農業残渣、林業残渣、都市固形廃棄物、古紙、およびパルプおよび製紙工場残渣でもあり得るが、これに限定されるものではない。本明細書では、リグノセルロース系材料は、混合マトリックス中にリグニン、セルロース、およびヘミセルロースを含有する植物細胞壁材料の形態であってもよいものと理解される。
【００４６】
一実施形態では、リグノセルロース系材料は、トウモロコシ繊維、稲藁、松材、木片、ポプラ、麦藁、スイッチグラス、バガス、ダンチク（Ａｒｕｎｄｏ  ｄｏｎａｘ）、ススキ（ｍｙｓｃａｎｔｈｕｓ）、ユーカリノキ、竹、製紙およびパルプ加工廃棄物である。好ましい実施形態では、リグノセルロース系材料はダンチク（Ａｒｕｎｄｏ  ｄｏｎａｘ）である。別の好ましい実施形態では、リグノセルロース系材料は、イネ科草本からなる群から選択される草本植物および木質である。換言すると、好ましいリグノセルロース系バイオマスは、イネ科（ＰｏａｃｅａｅまたはＧｒａｍｉｎｅａｅ）に属する植物からなる群から選択される。デンプンの役割が存在してもよいが、天然存在量である。リグノセルロース系バイオマスは、乾燥重量で好ましくは７０％未満のデンプンを有し、乾燥重量で５０％未満がより望ましく、乾燥重量で２５％未満が最も望ましい。
【００４７】
前処理
本発明によれば、リグノセルロース系材料は前処理される。「前処理」という用語は、「処理された」という用語で置換されてもよい。しかし意図される好ましい技術は、以下でさらに詳述されるように、リグノセルロース系材料の「前処理」について、良く知られているものである。
【００４８】
上述したように、処理または前処理は、セルロースの分離および／または放出を促進して、リグノセルロース系材料からのセルロースへのアクセスしやすさを増大する、当該技術分野で公知の従来の方法を使用して行われてもよい。
【００４９】
前処理技術は当該技術分野で周知であり、物理的、化学的、および生物学的前処理、またはそのあらゆる組み合わせが挙げられる。好ましい実施形態では、リグノセルロース系材料の前処理は、バッチまたは連続工程で行われる。
【００５０】
物理的前処理技術としては、前処理リグノセルロース系バイオマスをもたらす、様々なタイプの製粉／粉砕（粒度低下）、照射、蒸煮／蒸気爆発、および熱加水分解、好ましい実施形態では、浸漬、液体からの固体除去、固体の蒸気爆発が挙げられる。
【００５１】
粉砕としては、乾燥、湿潤、および振動ボールミル粉砕が挙げられる。好ましくは物理的前処理は、高圧および／または高温（蒸気爆発）の使用を伴う。本発明に照らして、高圧としては、３〜６ＭＰａ、好ましくは３．１ＭＰａの範囲内の圧力が挙げられる。本発明に照らして、高温としては、約１００〜３００℃、好ましくは約１６０〜２３５℃の範囲の温度が挙げられる。特定の実施形態では含浸は、約３．１ＭＰａの圧力および約２３５℃の温度で行われる。好ましい実施形態では、物理的前処理は、その教示全体を参照によって援用する、国際公開第２０１０／１１３１２９号に記載される方法に従って行われる。
【００５２】
必要でもなくまたは好ましくもないが、化学的前処理技術としては、酸、希酸、塩基、有機溶剤、石灰、アンモニア、二酸化硫黄、二酸化炭素、ｐＨ制御熱加水分解、湿式酸化、および溶媒処理が挙げられる。
【００５３】
化学的処理法が酸処理法であれば、それはより好ましくは、硫酸による、または酢酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸などの別の有機酸による、またはあらゆるその混合物による処理などの連続的な希酸または弱酸処理である。その他の酸もまた使用してもよい。弱酸処理は、少なくとも本発明の文脈では、処理ｐＨが１〜５、好ましくは１〜３の範囲にあることを意味する。
【００５４】
特定の実施形態では、酸濃度は０．１〜２．０重量％の範囲の酸、好ましくは硫酸である。酸は、リグノセルロース系材料に混合され、またはそれと接触されて、混合物は、約１６０〜２２０℃の範囲の温度に、数分から数秒の範囲にわたる時間保持される。具体的には、前処理条件は、次のようであってもよい。１６５〜１８３℃、３〜１２分間、０．５〜１．４％（ｗ／ｗ）の酸濃度、１５〜２５好ましくは約２０％（ｗ／ｗ）の全固形分濃度。その他の検討される方法は、米国特許第４，８８０，４７３号明細書、米国特許第５，３６６，５５８号明細書、米国特許第５，１８８，６７３号明細書、米国特許第５，７０５，３６９号明細書、および米国特許第６，２２８，１７７号明細書に記載される。
【００５５】
湿式酸化技術は、亜硫酸ベースの酸化剤などの酸化剤の使用を伴う。溶媒処理の例としては、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などによる処理が挙げられる。化学的処理法は、一般に約５〜約１０分間行われるが、より短時間またはより長時間にわたって行われてもよい。
【００５６】
生物学的前処理技術としては、リグニン可溶化微生物の適用（例えばＨｓｕ，Ｔ．Ａ．，１９９６，Ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｉｏｍａｓｓ，ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｗｙｍａｎ，Ｃ．Ｅ．，ｅｄ．，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１７９−２１２；Ｇｈｏｓｈ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｓｉｎｇｈ，Ａ．，１９９３，Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ／ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇｎｏ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  ｂｉｏｍａｓｓ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：２９５−３３３；ＭｃＭｉｌｌａｎ，Ｊ．Ｄ．，１９９４，Ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｌｉｇｎｏ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  ｂｉｏｍａｓｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ，ｉｎ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｓｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｅｌｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｈｉｍｍｅｌ，Ｍ．Ｅ．，Ｂａｋｅｒ，Ｊ．Ｏ．，ａｎｄ  Ｏｖｅｒｅｎｄ，Ｒ．Ｐ．，ｅｄｓ．，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５６６，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｃｈａｐｔｅｒ  １５；Ｇｏｎｇ，Ｃ．Ｓ．，Ｃａｏ，Ｎ．Ｊ．，Ｄｕ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｔｓａｏ，Ｇ．Ｔ．，１９９９，Ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｃｈｅｐｅｒ，Ｔ．，ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ，６５：２０７−２４１；Ｏｌｓｓｏｎ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｈａｈｎ−Ｈａｇｅｒｄａｌ，Ｂ．，１９９６，Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｚ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈ．１８：３１２−３３１；および  Ｖａｌｌａｎｄｅｒ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｋ．−Ｅ．Ｌ．，１９９０，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｆｒｏｍ  ｌｉｇｎｏ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ：Ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｔ，Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４２：６３−９５を参照されたい）が挙げられる。
【００５７】
一実施形態では、例えば弱酸処理と、高温高圧処理の双方をはじめとする、化学的および物理的双方の前処理が行われる。化学的および物理処理は、順次または同時に行われてもよい。
【００５８】
好ましい実施形態では、前処理は、１℃を超える水に浸漬して水からリグノセルロース系バイオマスを取り出すステップと、それに続いて蒸気爆発させるステップとして行われる。
【００５９】
好ましい実施形態では、前処理リグノセルロース材料はグルカンおよびキシラン（セルロースおよびヘミセルロース）、およびリグニンとしてもまた知られている複合糖類から構成される。
【００６０】
酵素または酵素混合物
酵素または酵素混合物は、リグノセルロース系バイオマスを分解できる、セルロース分解酵素または酵素混合物を意味する。記載される方法に従って生産される酵素または酵素混合物は、細菌または真菌起源をはじめとする、あらゆる起源であってもよい。化学修飾またはタンパク質遺伝子操作変異体が含まれる。適切な酵素または酵素混合物としては、例えばフミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、サーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）、セルロモナス・フィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、チエラビア・テルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、クリソスポリウム・ラクノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、ペニシリウム・デカンベンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）、およびトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）によって産生される、真菌酵素または酵素混合物などの一般的セルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、サーモビフィダ（Ｔｈｅｍｏｂｉｆｉｄａ）およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）からの酵素または酵素混合物が挙げられる。
【００６１】
一実施形態では、生産される酵素または酵素混合物は、宿主細胞と同種の酵素または酵素混合物複合体である。一実施形態では、生産される酵素または酵素混合物は、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、好ましくはペニシリウム・デカンベンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）株の宿主細胞と同種の酵素または酵素混合物複合体である。
【００６２】
生産される酵素または酵素混合物は、単成分酵素または酵素混合物であってもよいものと理解され、例えば、適切な宿主細胞中で組換え的に産生される、エンドグルカナーゼ、エキソロビオヒドロラーゼ、グルコヒドロラーゼ、またはβ−グルコシダーゼを含む。適切な宿主細胞については、以下にさらに詳しく説明する。
【００６３】
生産される酵素または酵素混合物はまた、酵素または酵素混合物を天然で産生する宿主細胞からの１つまたは複数の相同的な酵素または酵素混合物成分が、欠失または不活性化されている、酵素または酵素混合物製剤であってもよい。
【００６４】
酵素または酵素混合物産生能力のある宿主細胞
宿主細胞は、あらゆる起源であってもよい。上述したように、酵素または酵素混合物は、酵素または酵素混合物産生能力のある宿主細胞と、同種または異種であってもよい。
【００６５】
「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書の用法では、酵素または酵素混合物をコードする遺伝子（群）を持ち、前記遺伝子（群）を発現する能力があって、酵素または酵素混合物を産生する宿主細胞を意味し、酵素または酵素混合物をコードする遺伝子（群）が、宿主細胞内に、形質転換、形質移入、形質導入などされている。使用される形質転換、形質移入、形質導入などの技術は、当該技術分野で周知であってもよい。好ましい実施形態では、遺伝子は、１つまたは複数のコピーで、組換え宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
【００６６】
酵素または酵素混合物が異種である場合、酵素または酵素混合物産生能力のある組換え宿主細胞は、好ましくは真菌または細菌起源である。組換え宿主細胞の選択は、大体において、酵素または酵素混合物をコードする遺伝子（群）、および酵素または酵素混合物の起源に左右される。
【００６７】
「野生型宿主細胞」という用語は、本明細書の用法では、酵素または酵素混合物をコードする遺伝子（群）を天然で持ち、前記遺伝子（群）を発現する能力がある宿主細胞を指す。酵素または酵素混合物が、同種の製剤または酵素または酵素混合物複合体である場合、酵素または酵素混合物産生能力のある野生型宿主細胞またはその変異株は、好ましくは真菌または細菌起源である。
【００６８】
「その変異株」は、例えば一定成分中の酵素または酵素混合物製剤を濃縮するために、その中で１つまたは複数の遺伝子が欠失または不活性化されている、野生型宿主細胞であってもよい。変異宿主細胞はまた、野生型宿主細胞によって天然で産生される、酵素または酵素混合物複合体または製剤に、１つまたは複数の追加的な酵素活性またはその他の活性を導入するために、追加的な酵素またはタンパク質をコードする１つまたは複数の追加的な遺伝子で形質転換された、野生型宿主細胞であってもよい。追加的な酵素（群）は、同一活性（例えば酵素または酵素混合物活性）を有してもよいが、単に例えば異なる特性がある別の酵素分子であってもよい。変異野生型宿主細胞はまた、遺伝子発現を増大させてより多くの酵素を生産するために、形質転換、形質移入、形質導入などされて、好ましくはゲノムに組み込まれた、追加的な同種酵素コーディング遺伝子を有してもよい。
【００６９】
好ましい実施形態では、組換えまたは野生型宿主細胞は、糸状菌起源である。宿主細胞の例としては、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブジェルカンデラ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、カワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィロバシジウム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、シワタケ（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、スエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、ホウロクタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞を包含する群から選択されるものが挙げられる。
【００７０】
より好ましい実施形態では、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルスフォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）株を含む群から選択される。なおもより望ましい実施形態では、株はペニシリウム・デカンベンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）である。
【００７１】
別の好ましい実施形態では、糸状菌宿主細胞は、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウェレンセ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・カルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レティキュラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サンブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコセキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、またはフザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）株の細胞である。別の好ましい実施形態では、糸状菌宿主細胞は、ブジェルカンデラ・アダスタ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ  ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｒｕｆａ）、またはセリポリオプシス・サブバーミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・ラクノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、コプリナス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、アラゲカワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコーラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミーヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・パルロゼラム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・デカンベンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ���ｅｃｕｍｂｅｎｓ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コガネシワウロコタケ（Ｐｈｌｅｂｉａ  ｒａｄｉａｔａ）、エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビア・テルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビローサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンジブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）株を含む群から選択される。
【００７２】
別の好ましい実施形態では、組換えまたは野生型宿主細胞は、細菌起源である。宿主細胞の例としては、例えばバチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サークランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ラウタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、またはバチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）などのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株などのグラム陽性細菌；または例えばストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）またはストレプトミセス・ムリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ）などのストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株；または例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種などからのグラム陰性細菌を含む群から選択されるものが挙げられる。
【００７３】
用途
別の態様では、方法は、宿主細胞内で酵素または酵素混合物を生産するための炭素源供給物としての前処理リグノセルロース系材料の使用に関する。
【００７４】
方法はまた、酵素または酵素混合物生産工程における、炭素源としての前処理リグノセルロース系材料の使用にも関する。本明細書で開示される特定の実施形態は、本発明のいくつかの態様の例証であることが意図されるので、本明細書で記載され特許請求される本方法の範囲は、これらの実施形態によって限定されない。あらゆる同等の実施形態は、本発明の範囲内であることが意図される。確かに、前述の記述から、当業者には、本明細書に示され記載されるものに加えて、本発明の様々な修正が明白になるであろう。このような修正もまた、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。矛盾がある場合、定義を含めて本開示が優先する。
【００７５】
方法は、第１のリグノセルロース系バイオマスを加水分解するために、工程から回収された酵素がさらに使用される、追加的なステップを有してもよい。好ましくは第１のリグノセルロース系バイオマスおよび第２のリグノセルロース系バイオマスは、同属の草に由来し、より好ましくは同種の草に由来すべきである。それに対して酵素加水分解を実施する第１のリグノセルロース系バイオマスを、酵素加水分解に先だって前処理することもまた好ましい。
【００７６】
記載される方法によって生成された酵素または酵素混合物、ならびに記載される方法に従って生産された酵素または酵素混合物によって加水分解されたリグノセルロース系バイオマスもまた発見された。したがってこの方法は、第１の前処理リグノセルロース系バイオマスの存在下で宿主細胞を培養し、次にそれを使用して第２の前処理リグノセルロース系バイオマスを処理するのに応用可能であり、第１および第２の前処理リグノセルロース系バイオマスは、同一植物属および同一植物種から選択される群に由来し得る。
【００７７】
本発明では、記載される方法に従って生産された酵素、および酵素または記載される方法によって加水分解されたリグノセルロース系バイオマスもまた特許請求される。
【実施例】
【００７８】
実験手順
酵素（群）の生産のための宿主細胞の培養は、以下の実施例で進行する。
【００７９】
最初の例では、宿主細胞としてペニシリウム・デカンベンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）が使用される各宿主細胞培養は、回収の７日前に新鮮(fresh)胞子が接種されたＰＤＡ−プレートから回収された胞子溶液から出発した。
１）特許請求される培養法の一部でない前培養、および
２）宿主細胞が増殖して酵素（群）が産生される、宿主細胞の培養。
【００８０】
前培養：
ＰＤＡプレートへの播種：
１．当該技術分野で公知のように調製されたＰＤＡプレート（３．９％ジャガイモデキストロース寒天培地）内に、あらかじめ採取した５００μＬの胞子溶液を分注した。
２．胞子上に５００μＬの無菌０．９％ＮａＣｌ溶液を分注し、表面が全て液体によって被覆されるまで、フラスコを穏やかに回転させた。
３．フラスコを綿栓で閉じてアルミニウムホイルで覆い、３０℃で７日間培養した。
【００８１】
胞子溶液回収：
４．７日後に、１０ｍＬの０．９％ＮａＣｌ無菌溶液をフラスコ内に分注した。
５．液体が濁るまで、フラスコを穏やかに回転させた。
６．可能な限り多量のＮａＣｌ溶液を吸い上げて、胞子懸濁液を無菌チューブ内に取り出した。
７．胞子溶液は、４℃で無期限に貯蔵し得る。
【００８２】
培養設定ステップ
宿主細胞培養の開始前に、培養を設定することが必要である。
【００８３】
前培養用培地は、容積が宿主細胞培養相の少なくとも１／１０になるように選択して、下で報告されるように調製する。
【００８４】
【表１】
2014528251.tif 000002
【００８５】
１．グルコースおよび胞子溶液を滅菌後に添加する。胞子溶液容積は、５０００ＣＦＵ／ｍＬの最終濃度を得るように選択する。
２．この前培養を３０℃、１７０ｒｐｍで３０時間培養する。
【００８６】
宿主細胞培養および酵素生産：
宿主細胞培養環境を下の表で報告されるように調製する。
【００８７】
【表２】
2014528251.tif 000003
【００８８】
１．滅菌後にｐＨを５．３に補正して、任意選択の単糖（グルコース）および前培養容積を添加した。ｐＨは、異なるタイプの緩衝溶液（例えば０．１Ｍリン酸緩衝液）を使用して、フラスコ内で制御される。
２．宿主細胞培養および酵素生産は、フラスコでは１７０ｒｐｍ、発酵槽では５００ｒｐｍの設定で、３０℃で行われた。発酵槽内への給気は、微生物の要件に基づいて、細胞培養中に修正した。
【００８９】
結果
以下の表は、宿主細胞を供給するのに使用される、前処理リグノセルロース系バイオマスに対する活性を比較する。比較例（ＣＥ１）は、従来の方法によって作成された酵素混合物抽出物であり、宿主細胞への供給物は、全部でないにしても、主にグルコースであった。実施例（ＷＥＩ）は、上述したとおりに生成され、宿主細胞によって消費された糖類の大部分は、前処理リグノセルロース系バイオマスに由来した。リグノセルロース系バイオマスの存在下で宿主細胞が培養された場合、生産された酵素は、グルコースのみを供給された同一宿主細胞株から生産された酵素と比べて、リグノセルロース系バイオマスに対する活性がはるかにより高いことが、データから明らかである。
【００９０】
【表３】
2014528251.tif 000004
【００９１】
表１から、リグノセルロース系バイオマスを供給された宿主細胞に由来する酵素の活性が、比較例に由来するものと比べて５倍高いことも明白である。
【００９２】
表２は、比較例の経時的な活性の発生を示す。容易に分かるように、いずれの時点でも、比較例の活性は実施例の活性に及ばない。
【００９３】
【表４】
2014528251.tif 000005
【００９４】
表３および４は、様々なリグノセルロース系バイオマス（トウモロコシ茎葉、ダンチク、ポプラ属、麦藁、ススキ、およびバガス）に適用され、ならびにダンチクでは２種の別の列挙宿主細胞を用いて適用された、方法の結果を示す。これは、様々なタイプの宿主細胞およびリグノセルロース系バイオマスのための方法を確立する。
【００９５】
【表５】
2014528251.tif 000006
【００９６】
【表６】
2014528251.tif 000007
【００９７】
ＦＰａｓｅは、濾紙上で試験され、次にエキソ−エンド−セルラーゼおよびβ−グルコシダーゼ活性、Ｇｈｏｓｅアッセイと合わせた、酵素活性である。
【００９８】
グルコース添加の効果を実証するために、表５および表６に示される量でグルコースを培養環境に添加した。添加量は、全培養環境に対する重量％である。表から分かるように、酵素活性の量は、グルコースの量が増大するにつれて減少する。比率は、前処理リグノセルロース材料からの糖量に対する、添加された任意選択のグルコース量の比率である。
【００９９】
【表７】
2014528251.tif 000008
【０１００】
【表８】
2014528251.tif 000009
【０１０１】
ＦＰａｓｅ（濾紙）およびキシラナーゼ活性は、酵素活性を測定する業界公知の方法を用いて測定された。違いは、ＦＰａｓｅのための基質が濾紙であり、下述のするキシラン混合物がキシラン基質として使用されたことであった。
【０１０２】
【表９】
2014528251.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成25年12月5日(2013.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の前処理リグノセルロース系バイオマスの加水分解のために、宿主細胞から少なくとも１つの酵素を産生する方法であって、
前記方法が、培養期間にわたって前記少なくとも１つの酵素を産生する能力のある前記宿主細胞を培養するステップを含み、
前記宿主細胞の培養が、ペニシリウム・デカンベンスである前記宿主細胞、複合糖類を含む第２の前処理リグノセルロース系バイオマスを含む培養環境中で行われ、
前記培養が、前記培養期間の少なくとも５０％である培養期間の一部にわたって、乾燥量基準で前記培養環境の０〜１０重量％の範囲の量の任意選択的に添加された、単糖または糖類を有する単糖飢餓条件下で実施され、
前記培養環境が、追加的ビタミン、ミネラル、無機塩類、乳糖およびイソプロピルβ−Ｄ−ｌ−チオガラクトピラノシドを欠いており、
前記培養環境中の前記第２の前処理リグノセルロース系バイオマスの乾物含量が、重量で、４％よりも高い、方法。
【請求項２】
前記培養環境中の前記第２の前処理リグノセルロース系バイオマスの乾物含量が、重量で、６％、８％、１０％、１５％からなる群から選択される値よりも高い、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単糖飢餓条件下の培養期間の部分が、前記培養期間の少なくとも７５％である、請求項１および２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記単糖飢餓条件下の培養期間の部分が、前記培養期間の少なくとも８５％である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記単糖飢餓条件下の培養期間の部分が、前記培養期間の少なくとも９０％である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記単糖飢餓条件下の培養期間の部分が、前記培養期間の少なくとも９５％である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記単糖飢餓条件下の培養期間の部分が、前記培養期間の少なくとも９８％である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記単糖飢餓条件下の培養期間の部分が、前記培養期間と同じである、請求項１および２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
任意選択的に添加された単糖または糖類の量が、乾燥重量基準で、前記培養環境の０〜５重量％の範囲である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記任意選択的に添加された単糖または糖類の量が、乾燥重量基準で、前記培養環境の０〜２．５重量％の範囲である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記任意選択的に添加された単糖または糖類の量が、乾燥重量基準で、前記培養環境の０〜２．０重量％の範囲である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記任意選択の添加された単糖または糖類が、乾燥重量基準で、前記培養環境の０〜１．０重量％の範囲である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記培養環境中に、任意選択の添加された単糖または糖類が存在しない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素を培養環境から取り出すことで、前記酵素が収集される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素がさらに使用されて、前記第１のリグノセルロース系バイオマスが加水分解され、前記第１のリグノセルロース系バイオマスおよび前記第２の前処理リグノセルロース系バイオマスが、どちらも同属の草に由来するリグノセルロース系バイオマスを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記酵素がさらに使用されて、前記第１のリグノセルロース系バイオマスが加水分解され、前記第１のリグノセルロース系バイオマスおよび前記第２の前処理リグノセルロース系バイオマスが、同種の草に由来する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１のリグノセルロース系バイオマスが、酵素加水分解に先だって前処理される、請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
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