(57)【要約】  本発明は、植物中の生存可能な内生菌の存在を検出するための方法および組成物を提供し、方法は、植物からの幼葉およびその抽出物中で、内生菌の存在を検出するステップを含み、幼葉または抽出物中における内生菌の存在の検出は、植物中の生存可能な内生菌の存在を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物中で生存可能な内生菌の存在を検出する方法であって、当該方法は前記植物からの幼葉またはその抽出物中の内生菌の存在を検出するステップを含んでなり、前記幼葉または前記抽出物内の生菌の存在の検出が、前記植物中の生存可能な内生菌の存在を示す、方法。
【請求項２】
前記幼葉が、前記植物種子の発芽後に、前記植物から生じる最初の５葉の内の１枚である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幼葉が、前記植物種子の発芽後に、前記植物から生じる第１葉である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記幼葉が、前記植物種子の発芽後４週間以内に生じる、植物苗からの葉である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記幼葉が、前記植物種子の発芽後約１０日目に生じる、植物苗からのものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記幼葉が、前記葉を子葉鞘から分離するのに十分に成長した苗からのものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法で使用する前に、前記幼葉を切除して、それを前記植物のその他の組織または器官から実質的に分離する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記方法で使用する前に、前記幼葉を切除して、それを前記植物の子葉鞘から、ならびにその他の組織または器官から、実質的に分離する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記方法で使用する前に、前記幼葉を切除して、それを前記植物の子葉鞘およびあらゆる付着種子から、ならびにその他の組織または器官から、実質的に分離する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記内生菌が、光学顕微鏡、染色および光学顕微鏡、電子顕微鏡、抗体ベースの方法、モノクローナル抗体ベースの方法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、近赤外線分光法、イソ酵素ベースの方法、核酸ベースの方法、核酸プローブベースの方法、核酸プライマーベースの方法、ＰＣＲベースの方法のいずれか１つによって前記幼葉中で検出される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記内生菌が、特定の内生菌種または株の存在を同定する方法によって検出される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記内生菌が、抗体ベースの方法、モノクローナル抗体ベースの方法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、核酸ベースの方法、核酸プローブベースの方法、核酸プライマーベースの方法、およびＰＣＲベースの方法のいずれか１つによって検出される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記内生菌が、核酸ベースの方法によって検出される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記内生菌が、ＰＣＲベースの方法によって検出される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＣＲベースの方法が、定量的ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＣＲベースの方法が、高分解能融解（ＨＲＭ）リアルタイムＰＣＲである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＣＲが、前記内生菌中の核酸とハイブリダイズするプライマーを使用して実施される、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記プライマーが、前記内生菌中の多コピー遺伝子にハイブリダイズする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記プライマーが、前記内生菌のリボソーム反復領域の遺伝子間領域（ＩＧＳ）にハイブリダイズする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記検出が、前記特定の内生菌種または株に対して特異的である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＰＣＲベースの方法で使用される前記プライマーが、前記検出される株に対して特異的であり、増幅産物の存在または不在が、前記内生菌の存在または不在を示す、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
特異性が、前記増幅産物の性質によって定まる、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記検出が、前記検出される種または株に対して特異的であり、特性が、前記増幅産物のサイズによって定まる、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記検出が、前記検出される種または株に対して特異的であり、特異性が、前記増幅産物生成の動態によって定まる、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記特異性が、前記増幅産物の融解プロファイルによって定まる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
異なる内生菌種または株中において前記プライマーがハイブリダイズする配列の違いの結果として、異なる融解プロファイルが異なる種および株中で生じる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記植物を前記方法で使用する前に、前記幼葉中の菌糸生体量を最大化する条件下で、前記植物の種子を発芽させる、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記植物を前記方法で使用する前に、最初の出葉の中の前記種子中の菌糸生体量を最大化する条件下で、前記種子を発芽させる、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記種子を１８〜２６℃の温度範囲で発芽させる、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記種子を約２２℃で発芽させる、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記種子を１６／８時間の明／暗周期で発芽させる、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３２】
種子を１２／１２時間の明／暗周期で発芽させる、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記内生菌の存在が、前記幼葉からの抽出物中で検出される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記方法が、前記幼葉から抽出物を調製するステップを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記方法が、前記幼葉を切除するステップを含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記幼葉を切除するステップと、抽出物を作成するステップとを含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記方法が、前記種子を発芽させるステップと、前記幼葉を切除するステップとを含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記方法が、前記種子を発芽させるステップと、前記幼葉を切除するステップと、抽出物を作成するステップとを含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
種子バッチをスクリーニングして、前記バッチ中にどの内生菌種、株(strain)、または株(strains)が存在するかを評価するために使用される、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
より大きなバッチから小さな種子サンプルを取り、前記小さなサンプルからの前記種子の発芽後に、幼葉に前記方法を実施する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記大きなバッチ中の生存可能な内生菌を含有する種子の割合または百分率を推定するために、前記方法を使用して、前記小さなサンプル中の特定種または株の生存可能な内生菌を含有する種子の割合または百分率を測定する、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記大きなバッチ中の生存可能な汚染内生菌を含有する種子の割合または百分率を推定するために、前記方法を使用して、前記小さなサンプル中の生存可能な汚染内生菌を含有する種子の割合または百分率を測定する、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも１つのステップが自動化されている、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
内生菌のリボソーム反復領域の遺伝子間領域（ＩＧＳ）にハイブリダイズする、プライマー。
【請求項４５】
前記内生菌のリボソーム反復領域の遺伝子間領域（ＩＧＳ）の種特異的または株特異的領域とハイブリダイズする、請求項４４に記載のプライマー。
【請求項４６】
配列番号１〜配列番号８のいずれか１つの配列と、少なくとも７０％の同一性を有する、請求項４４または４５に記載のプライマー。
【請求項４７】
配列番号１〜配列番号８のいずれか１つの配列を有する、請求項４４または４５に記載のプライマー。
【請求項４８】
請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのプライマーが、前記内生菌の存在を検出するＰＣＲ−ベースの方法で使用される、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、牧畜農業の分野にある。本発明は、草本植物中の生存可能な内生菌を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
真菌類の内生菌は、いくつかの温帯気候草種に感染する。内生菌はアルカロイド類を産生し得て、アルカロイド類は、植物であってそれらがその中で天然に産生される植物に、ある程度の害虫防除と、場合によっては病害防除をもたらすと考えられている（Rowan and Latch, 1994）。さらに少なくともいくつかの内生菌の存在は、牧草地における選択された牧草の競合的持続性に不可欠なこともある（Fletcher and Easton, 2000）。
【０００３】
しかし牧畜農業生産で使用される改良牧草栽培品種の、優勢な天然内生菌による感染の多くはまた、このような牧草を食む動物に重大な障害も引き起こす。このような障害の例としては、オニウシノケグサ中毒症（Stuedemann and Hoveland, 1988）およびライグラススタッガー（Fletcher et al., 1999）が挙げられる。これらの病状は、一連の植物成長条件下で生成するアルカロイドに対する、動物の複雑な中毒反応の結果である。このような動物中毒症のために、牧畜農業システムに重大な経済的損失が生じ得る。
【０００４】
牧草系統は、望ましいアルカロイドのみを産生する、選択された有益内生菌によって人工的に感染させ得る。内生菌の純粋培養物を使用して牧草の苗を感染させ、最初は無菌条件下で栽培し、次にそれを望ましい性質について選択し、商業用途のために増殖させ得る。
【０００５】
この技術の３つの顕著な例である、ENDOSAFE（商標）内生菌を用いたGREENSTONE（商標）四倍体交配種ライグラス（ニュージーランド国特許第２３３０８３号）；ＡＲ１内生菌を用いた様々な多年生および交配種ライグラス（Fletcher and Easton, 2000）；およびMaxQ（登録商標）内生菌を用いたオニウシノケグサ栽培品種（米国特許第６，１１１，１７０号）が、AgResearch LtdのGrasslands事業部によって開発されている。
【０００６】
商業生産のために有益内生菌株を用いて種子を調製する場合、種子バッチが、別の混入した潜在的に有害な内生菌株を含有する可能がある。したがってこのような種子バッチおよび／または親材料の内生菌内容（有益および／または非有益）を検査するのに利用できる手段を有することが、重要である。これに加えて、もしあれば存在する内生菌が生存可能であり、植物と共に成長して、安定した共生を形成できるかどうかを知ることも重要である。
【０００７】
内生菌の存在について、植物組織および種子を検査する、様々な方法が開発されている。
【０００８】
アニリンブルーなどの化合物による組織学的染色を用いた顕微鏡検査などのいくつかの方法は、内生菌の存在を検出するだけであり、内生菌種または株を容易に同定せず、確実に同定しない。これに加えて、顕微鏡検査を使用する現行のアプローチは、生存可能な内生菌と生存不能な内生菌とを区別しない。
【０００９】
モノクローナル抗体キットを使用して、どのアルカロイドが生成されているのかを判定することで、存在する内生菌のタイプを肉眼レベルで示し得る。しかしこのようなキットは、実際の菌種または株を判定できない。
【００１０】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、存在する内生菌株と関連付けし得る、内生菌によって産生された毒性アルカロイドを定量化し得る。しかしこの場合もやはり、この方法は、生存可能な内生菌と生存不能な内生菌とを区別しない。
【００１１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸法が、草の種子および植物組織中の特定菌株の存在を検出するのに使用されているが、現行のアプローチは感度を欠いており、内生菌の存在について検査し得る前に、植物を適切な成長段階に栽培するまで、かなり長時間を要する。さらに現行の方法は、生存不能な内生菌と生存可能な内生菌とを区別しない。
【００１２】
イソ酵素を使用して内生菌をプロファイルし得るが、この場合も、この方法は、生存可能な内生菌と生存不能な内生菌とを区別しない。
【００１３】
生存可能な内生菌の存在を検出する現行の業界標準法は、生存度を確認するために、生きた内生菌が宿主植物組織の外まで成長して、純培養培地上に到達することを要する。次に酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）（Enzyme Linked Immunosorbant Assay）が典型的に使用されて、アルカロイドプロファイルに基づいて汚染百分率が測定され、ウエスタンブロット（タンパク質免疫ブロット）解析技術を使用して、内生菌の存在または不在が判定される。この方法は、大きな労働力を要し、時間もかかる。さらにこのような血清学的方法は、類似したアルカロイドプロファイルを生じる内生菌株を区別できないことが多い。
【００１４】
したがって目下利用できる方法の多くは、時間がかかり、費用もかかる。方法のいくつかは感度もまた欠いており、および／または種子から結果までの迅速な所要時間で複数サンプルをスクリーニングするのに適さない。さらに考察されるように、このような方法の多くは、生存可能な内生菌と生存不能な内生菌の存在を区別できない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
先行技術に付随する困難さの１つまたは複数を克服する、植物中の生存可能な内生菌の存在を検出する方法を提供すること、および／または少なくとも有用な選択肢を公共に提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の概要
出願人らは、植物中で生存可能な内生菌の存在を検出する迅速な方法を発明した。本発明の方法を使用して、発芽植物の第１葉中の内生菌の存在を検出することにより、生存不能な内生菌を含有する植物とは対照的に、生存可能な内生菌を含有する植物を迅速に同定することが可能である。方法は、生存可能な有益内生菌と、あらゆる生存可能な汚染内生菌の双方の初期同定を可能にする。
【００１７】
本発明の方法は、種子バッチサンプルからの発芽苗などの植物組織を（手動または自動工程のいずれかで）検査して、特定の生存可能な有益内生菌および／または生存可能な非有益内生菌の菌種と菌株の存在を判定するのに適している。したがって本方法を品質管理で使用して、商業生産用種子バッチ中の生存可能な有益内生菌または生存可能な汚染内生菌の百分率を測定し得る。
【００１８】
生存可能な内生菌検出方法
本発明の第１の態様では、植物中の生存可能な内生菌の存在を検出するための方法が提供され、方法は、植物からの幼葉およびその抽出物中で、内生菌の存在を検出するステップを含み、幼葉または抽出物中における内生菌の存在の検出は、植物中の生存可能な内生菌の存在を示す。
【００１９】
幼葉を葉数によって定義する？
一実施形態では、幼葉は、植物種子の発芽後に、植物から生じる最初の５葉の内の１枚である。好ましくは、幼葉は、植物種子の発芽後に植物から生じる最初の４葉、より好ましくは最初の３葉、より好ましくは最初の２葉の内の１枚である。
【００２０】
好ましい実施形態では、幼葉は、植物種子の発芽後に植物から生じる第１葉である。
【００２１】
より成熟した植物組織とは対照的に、好ましくは第１葉である初期葉を使用して、種子発芽から生存可能な内生菌検出までの時間を顕著に短縮することが可能である。したがって本発明の方法は迅速であり、それは牧畜／種子産業にとって重要な利点である。
【００２２】
幼葉を苗年齢によって定義する？
一実施形態では、幼葉は、植物種子の発芽後、４週間以内、より好ましくは３週間以内、より好ましくは２週間以内に生じる、植物苗からの葉である。
【００２３】
一実施形態では、幼葉は、植物種子の発芽後、１４日未満、好ましくは１３日未満、好ましくは１２日未満、好ましくは１１日未満に生じる、植物苗からのものである。
【００２４】
好ましい実施形態では、幼葉は、植物種子の発芽の約１０日後に生じる植物苗からのものである。より好ましくは、幼葉は、植物種子の発芽の１０日後に生じる植物苗からのものである。
【００２５】
好ましくは、より成熟した植物組織とは対照的に、発芽の約１０日後に生じる植物苗からの幼葉を使用することで、種子発芽から生存可能な内生菌検出までの時間を短縮することが可能である。したがって本発明の方法は迅速であり、それは牧畜／種子産業にとって重要な利点である。
【００２６】
幼葉を成長によって定義する
好ましくは、幼葉は、葉を子葉鞘から分離するのに十分に成長した苗からのものである。
【００２７】
幼葉を切除する
一実施形態では、方法で使用する前に、幼葉を切除して、それを他の植物組織または器官から実質的に分離する。
【００２８】
さらなる実施形態では、方法で使用する前に、幼葉を切除して、それを子葉鞘から、ならびに他の植物組織または器官から実質的に分離する。
【００２９】
さらなる実施形態では、方法で使用する前に、幼葉を切除して、それを子葉鞘およびあらゆる付着種子から、ならびに他の植物組織または器官から、実質的に分離する。
【００３０】
生存可能
「生存可能」という用語は、本明細書の用法では、成長できることを意味する。好ましくは「生存可能」な内生菌は、植物内で増殖して安定した共生を形成できる。
【００３１】
生存可能な内生菌の存在を検出する？
出願人らは、（生存不能な内生菌でなく）生存可能な内生菌のみが、発芽苗の幼葉（特に最初の出葉）中で成長し得ることを発見し、本発明の方法を使用して、生存可能な内生菌を含有する植物と生存可能な内生菌を含有しない植物が、幼葉段階で区別できることを示した。したがって出願人の発明は、生存可能な内生菌の存在を検出することに関する。本発明の方法は、真菌生体量が、典型的に非常に低い場合、幼葉中の生存可能な内生菌を検出して同定するのに十分な感度がある。
【００３２】
本方法の一実施形態では、光学顕微鏡検査、染色および光学顕微鏡検査、電子顕微鏡検査、抗体ベースの方法、モノクローナル抗体ベースの方法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、近赤外線分光法、イソ酵素ベースの方法、核酸ベースの方法、核酸プローブベースの方法、核酸プライマーベースの方法、ＰＣＲベースの方法のアプローチのいずれか１つによって、幼葉中で内生菌が検出される。
【００３３】
好ましくは内生菌は、特定の内生菌種または株の存在を同定する方法によって検出される。
【００３４】
特定種または株の内生菌の存在を検出する好ましい方法としては、抗体ベースの方法、モノクローナル抗体ベースの方法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、核酸ベースの方法、核酸プローブベースの方法、核酸プライマーベースの方法、およびＰＣＲベースの方法が挙げられる。
【００３５】
好ましい実施形態では、内生菌は核酸ベースの方法によって検出される。
【００３６】
好ましい実施形態では、内生菌はＰＣＲベースの方法によって検出される。一実施形態では、ＰＣＲベースの方法は、定量ＰＣＲである。好ましい実施形態では、ＰＣＲベースの方法は、リアルタイムＰＣＲである。
【００３７】
より好ましい実施形態では、ＰＣＲベースの方法は、高分解能融解（ＨＲＭ）リアルタイムＰＣＲである。
【００３８】
本方法で使用されるＰＣＲプライマー
一実施形態ではＰＣＲは、内生菌中の核酸とハイブリダイズするプライマーを使用して実施される。
【００３９】
好ましい実施形態では、プライマーは、内生菌中の多コピー遺伝子とハイブリダイズする。
【００４０】
より好ましい実施形態では、プライマーは、内生菌のリボソーム反復領域の遺伝子間領域（ＩＧＳ）とハイブリダイズする。
【００４１】
検出の特異性
好ましい実施形態では、検出は、特定の内生菌種または株に対して特異的である。
【００４２】
一実施形態では、ＰＣＲベースの方法で使用されるプライマーは、検出される株に対して特異的である。この実施形態では、増幅産物の存在または不在が、内生菌の存在または不在を示す。
【００４３】
代案としては、特異性は、増幅産物の性質によって定まってもよい。一実施形態では、特異性は、増幅産物のサイズによって定まる。この実施形態では、増幅のために同一プライマーを使用して、異なる内生菌種または株から、異なるサイズの産物が生じてもよい。
【００４４】
代案としては特異性は、増幅産物生成の動態によって定まってもよい。一実施形態では、特異性は、融解プロファイルによって定まる。この実施形態では、増幅からの同一プライマーを使用して、異なる内生菌種または株から、異なる融解プロファイルが生じてもよい。
【００４５】
異なる融解プロファイルは、異なる内生菌種または株中で、配列であって詮索する人（prier）がそれにハイブリダイズする配列に見られる、単一ヌクレオチド多形性（ＳＮＰ）、挿入、欠失などの違いの結果として生じてもよい。
【００４６】
種子の発芽
本発明の基本的方法で使用する前に、植物種子を発芽させる。
【００４７】
好ましくは、幼葉中の菌糸生体量を最大化する条件下で、種子を発芽させる。
【００４８】
好ましくは、最初の出葉中の菌糸生体量を最大化する条件下で、種子を発芽させる。
【００４９】
一実施形態では、１８〜２６℃の温度範囲で種子を発芽させる。好ましくは、１９〜２５℃、より好ましくは２０〜２４℃、より好ましくは２１〜２３℃の温度範囲で種子を発芽させる。最も好ましくは、約２２℃で種子を発芽させる。
【００５０】
一実施形態では、１６／８時間の明／暗周期で種子を発芽させる。好ましくは、１４／１０時間の明／暗周期で種子を発芽させる。より好ましくは、約１２／１２時間の明／暗周期で種子を発芽させる。最も好ましくは、１２／１２時間の明／暗周期で種子を発芽させる。
【００５１】
幼葉から抽出物を調製する
内生菌の存在は、幼葉からの抽出物中で検出されてもよい。
【００５２】
植物の幼葉から抽出物を調製するステップを含む発明の方法
本発明の一実施形態では、本方法は、幼葉から抽出物を調製するステップを含む。
【００５３】
したがって一実施形態では、本発明は、
ａ）幼葉を提供するステップと、
ｂ）幼葉から抽出物を調製するステップと、
ｃ）抽出物中の内生菌の存在を検出するステップと
を含んでなる植物中の生存可能な内生菌の存在を検出する方法であって、抽出物中の生菌の存在の検出は、植物中の生存可能な内生菌の存在を示す方法を提供する。
【００５４】
内生菌を検出する前に、幼葉を植物から切除するステップを含む本発明の方法
本発明の一実施形態では、方法は、幼葉を切除するステップを含む。
【００５５】
したがって一実施形態では、本発明は、
ａ）植物を提供するステップと、
ｂ）幼葉を切除するステップと、
ｃ）幼葉中の内生菌の存在を検出するステップと
を含んでなる草本植物中の生存可能な内生菌の存在を検出する方法であって、幼葉または抽出物中の内生菌の存在の検出は、植物中の生存可能な内生菌の存在を示す方法を提供する。
【００５６】
内生菌を検出する前に、植物から幼葉を切除して、幼葉から抽出物を作成するステップを含む本発明の方法
本発明の一実施形態では、方法は、幼葉を切除するステップと、抽出物を作成するステップとを含む。
【００５７】
したがって一実施形態では、本発明は、
ａ）植物を提供するステップと、
ｂ）幼葉を切除するステップと、
ｃ）幼葉から抽出物を作成するステップと、
ｃ）抽出物中の内生菌の存在を検出するステップと
を含んでなる植物中の生存可能な内生菌の存在を検出する方法であって、抽出物中の内生菌の存在の検出は、植物中の生存可能な内生菌の存在を示す方法を提供する。
【００５８】
内生菌検出前に種子を発芽させて、幼葉を切除するステップを含む本発明の方法
本発明の一実施形態では、方法は、種子を発芽させるステップと、幼葉を切除するステップとを含む。
【００５９】
したがって一実施形態では、本発明は、
ａ）種子を発芽させて、少なくとも１枚の幼葉が生じるまで植物を栽培するステップと、
ｂ）幼葉を植物から切除するステップと、
ｃ）幼葉中の内生菌の存在を検出するステップと
を含んでなる植物中の生存可能な内生菌の存在を検出する方法であって、幼葉中の内生菌の存在の検出は、植物中の生存可能な内生菌の存在を示す方法を提供する。
【００６０】
内生菌を検出する前に、種子を発芽させるステップと、幼葉を切除するステップと、抽出物を作成するステップとを含む本発明の方法
本発明の一態様では、方法は、種子を発芽させるステップと、幼葉を切除するステップと、抽出物を作成するステップとを含む。
【００６１】
したがって一態様では、本発明は、
ａ）種子を発芽させて、少なくとも１枚の幼葉が生じるまで植物を栽培するステップと、
ｂ）幼葉を植物から切除するステップと、
ｃ）幼葉から抽出物を作成するステップと、
ｄ）幼葉中の内生菌の存在を検出するステップと
を含んでなる草本植物中の生存可能な内生菌の存在を検出する方法であって、抽出物中の内生菌の存在の検出は、草本植物中の生存可能な内生菌の存在を示す方法を提供する。
【００６２】
種子バッチをスクリーニングする方法の使用
本発明の方法を使用して、種子バッチをスクリーニングして、どの内生菌種、株、または株群が存在するかを評価してもよい。
【００６３】
このアプローチでは、典型的に、より大きなバッチから小さな種子サンプル（例えば５０〜１００個の種子）を取る。次に本明細書に記載されるように、小さなサンプルからの種子の発芽後に、方法を幼葉に実施する。
【００６４】
したがって大きなバッチ中の生存可能な内生菌を含有する種子の割合または百分率を推定するために、本発明の方法を使用して、小さなサンプル中の特定種または株の生存可能な内生菌を含有する種子の割合または百分率を測定する。
【００６５】
また大きなバッチ中の生存可能な汚染内生菌を含有する種子の割合または百分率を推定するために、本発明の方法を使用して、小さなサンプル中の生存可能な汚染内生菌を含有する種子の割合または百分率を測定してもよい。
【００６６】
自動化された実施形態
本発明の方法は、自動工程に適している。ステップのいずれか１つが、自動化されてもよい。自動工程に特に適しているステップとしては、抽出物を調製する工程、および検出段階、特にＰＣＲベースの段階が挙げられる。
【００６７】
一実施形態では、これらの段階の少なくとも１つが、自動化されている。さらなる実施形態では、これらの段階の双方が、自動化されている。
【００６８】
植物
「植物」という用語は、種子および苗、ならびにより成熟した植物を含む。したがって本方法で使用するために提供される「植物」は、苗であってもよい。
【００６９】
さらに、植物中の生存可能な内生菌の存在を検出する本発明の方法はまた、それから植物が生じる種子中で、生存可能な内生菌の存在を検出するための方法とも見なし得る。本明細書で考察されるように、このような種子の発芽後に、このような種子サンプルの方法を実施することで、方法を種子バッチに適用して、このような種子バッチ中の生存可能な内生菌の割合または百分率を評価し得る。
【００７０】
植物源
植物は、内生菌と安定した共生を形成できる、いずれの種からのものであってもよい。
【００７１】
一実施形態では、植物は双子葉種からのものである。
【００７２】
好ましい実施形態では、植物は単子葉植物種からのものである。
【００７３】
好ましい単子葉植物属としては、以下が挙げられる。カモジグサ属（Agropyron）、ネギ属（Allium）、スズメノテッポウ属（Alopecurus）、ウシクサ属（Andropogon）、アルテナルム属（Arrhenatherum）、アスパラガス属（Asparagus）、カラスムギ属（Avena）、ホウライチク属（Bambusa）、ベレバリア属（Bellavalia）、ブリメウラ属（Brimeura）、ブロディアエア属（Brodiaea）、ブルボコディウム属（Bulbocodium）、モンツキガヤ属（Bothrichloa）、ボウテロウア属（Bouteloua）、スズメノチャヒキ属（Bromus）、カラモビルファ属（Calamovilfa）、カマッシア属（Camassia）、クリノイガ属（Cenchrus）、チオノドクサ属（Chionodoxa）、クロリス属（Chloris）、イヌサフラン属（Colchicum）、クロッカス属（Crocus）、オガルカヤ属（Cymbopogon）、シノドン属（Cynodon）、アツモリソウ属（Cypripedium）、カモガヤ属（Dactylis）、オニササガヤ属（Dichanthium）、メヒシバ属（Digitaria）、アブラヤシ属（Elaeis）、オヒシバ属（Eleusine）、スズメガヤ属（Eragrostis）、エレムルス属（Eremurus）、カタクリ属（Erythronium）、ソバ属（Fagopyrum）、フェスツカ属（Festuca）、バイモ属（Fritillaria）、スノードロップ属（Galanthus）、ヒマワリ属（Helianthus）、オオムギ属（Hordeum）、ヒヤシンス属（Hyacinthus）、ヒアキントイデス属（Hyacinthoides）、ハナニラ属（Ipheion）、アヤメ属（Iris）、スノーフレーク属（Leucojum）、リアトリス属（Liatris）、ドクムギ属（Lolium）、ヒガンバナ属（Lycoris）、ススキ属（Miscanthus）、ジャイアントミスカンサス（Miscanthus x giganteus）、ムスカリ属（Muscari）、ギカイソウ属（Ornithogalum）、イネ属（Oryza）、キビ属（Panicum）、パスプルム属（Paspulum）、ペンニセツム属（Pennisetum）、クサヨシ属（Phalaris）、フレウム属（Phleum）、ポア属（Poa）、プスキニア属（Puschkinia）、サトウキビ属（Saccharum）、ライムギ属（Secale）、セタリア属（Setaria）、ソルガストラム属（Sorghastrum）、モロコシ属（Sorghum）、シノピルム属（Thinopyrum）、コムギ属（Triticum）、バニラ属（Vanilla）、ライコムギ（X Triticosecale Triticale）、およびトウモロコシ属（Zea）。
【００７４】
好ましい単子葉植物種としては、以下が挙げられる。フェアウェイホイートグラス（Agropyron cristatum）、クレステッドホイートグラス（Agropyron desertorum）、トールホイートグラス（Agropyron elongatum）、アグロピロン・インターメディウム（Agropyron intermedium）、ウエスタンホイートグラス（Agropyron smithii）、ブルーバンチホイートグラス（Agropyron spicatum）、スレンダーホイートグラス（Agropyron trachycaulum）、プベセントホイートグラス（Agropyron trichophorum）、エシャロット（Allium ascalonicum）、タマネギ（Allium cepa）、ラッキョウ（Allium chinense）、ポロネギ（Allium porrum）、チャイブ（Allium schoenoprasum）、ネギ（Allium fistulosum）、ニンニク（Allium sativum）、オオスズメノテッポウ（Alopecurus pratensis）、ビッグブルーステム（Andropogon gerardi）、ビッグブルーステム（Andropogon gerardii）、ビッグブルーステム（Andropogon scoparious）、オオカニツリ（Arrhenatherum elatius）、アスパラガス（Asparagus officinalis）、ハダカエンバク（Avena nuda）、エンバク（Avena sativa）、ダイサンチク（Bambusa vulgaris）、ターキッシュベレバリア（Bellevalia trifoliate）、ブリメウラ・アメシスティナ（Brimeura amethystina）、カリフォルニアヒアシンス（Brodiaea californica）、ムラサキハナニラ（Brodiaea coronaria）、ブロディアエア・エレガンス（Brodiaea elegans）、ブルボコディウム・ベルシコロル（Bulbocodium versicolor）、ボトリオクロア・バルビノディス（Bothrichloa barbinodis）、カモノハシガヤ（Bothrichloa ischaemum）、ボトリオクロア・サッカロイデス（Bothrichloa saccharoides）、ボウテロウア・クリペンデュラ（Bouteloua curipendula）、ボウテロウア・エリオポダ（Bouteloua eriopoda）、メダカソウ（Bouteloua gracilis）、ブロムス・エレクツス（Bromus erectus）、ブロムス・イネルミス（Bromus inermis）、ブロムス・リパリウス（Bromus riparius）、カラモビルファ・ロンギフォリア（Calamovilfa longifilia）、ワイルドヒヤシンス（Camassia scilloides）、ヒゲクリノイガ（Cenchrus ciliaris）、チオノドクサ・フォーベシー（Chionodoxa forbesii）、アフリカヒゲシバ（Chloris gayana）、イヌサフラン（Colchicum autumnale）、サフラン（Crocus sativus）、コウスイガヤ（Cymbopogon nardus）、ギョウギシバ（Cynodon dactylon）、キプリペディウム・アカウレ（Cypripedium acaule）、カモガヤ（Dactylis glomerata）、ヒメオニササガヤ（Dichanthium annulatum）、オニササガヤ（Dichanthium aristatum）、シラゲオニササガヤ（Dichanthium sericeum）、ジギタリア・デクンベンス（Digitaria decumbens）、トキワメヒシバ（Digitaria smutsii）、ギニアアブラヤシ（Elaeis guineensis）、アメリカアブラヤシ（Elaeis oleifera）、シコクビエ（Eleusine coracan）、エリムス・アングスツス（Elymus angustus）、エリムス・ジュンセウス（Elymus junceus）、シナダレスズメガヤ（Eragrostis curvula）、テフ（Eragrostis tef）、オオキツネオラン（Eremurus robustus）、エリトロニウム・エレガンス（Erythronium elegans）、エリトロニウム・ヘレナ（Erythronium helenae）、ソバ（Fagopyrum esculentum）、ダッタンソバ（Fagopyrum tataricum）、オニウシノケグサ（Festuca arundinacea）、ウシノケグサ（Festuca ovina）、ヒロハノウシノケグサ（Festuca pratensis）、オオウシノケグサ（Festuca rubra）、センバイモ（Fritillaria cirrhosa）、マツユキソウ（Galanthus nivalis）、ヒマワリ（Helianthus annuus sunflower）、二条オオムギ（Hordeum distichum）、オオムギ（Hordeum vulgare）、ヒヤシンス（Hyacinthus orientalis）、スパニッシュ・ブルーベル（Hyacinthoides hispanica）、イングリッシュ・ブルーベル （Hyacinthoides non-scripta）、イフェイオン・セッシレ（Ipheion sessile）、アイリス・コレッティ（Iris collettii）、アイリス・ダンフォルディアエ（Irisdanfordiae）、ミニアイリス（Iris reticulate）、スノーフレーク（Leucojum aestivum）、リアトリス・シリンドラセア（Liatris cylindracea）、リアトリス・エレガンス（Liatris elegans）、オニウシノケグサ（Lolium arundinaceum）、ロリウム・ロンギフロルム（Lolium longiflorum）、ネズミムギ（Lolium multiflorum）、ホソムギ（Lolium perenne）、ロリウム・ウェスターウォルディクム（Lolium westerwoldicum）、ネズミホソムギ（Lolium hybridum）、ヒガンバナ（Lycoris radiata）、ススキ（Miscanthis sinensis）, ジャイアントミスカンサス（Miscanthus ｘ giganteus）、ムスカリ・アルメニアカム（Muscari armeniacum）、ムスカリ・マクロカルプム（Muscari macrocarpum）、ラッパスイセン（Narcissus pseudonarcissus）、オルニトガルム・モンタヌム（Ornithogalum montanum）、イネ（Oryza sativa）、パニクム・イタリシウム（Panicum italicium）、ギネアキビ（Panicum maxymum）、イヌキビ（Panicum miliaceum）、パラグラス（Panicum purpurascens）、スイッチグラス（Panicum virgatum）、シマスズメノヒ（Paspalum dilatatum）、アメリカスズメノヒエ（Paspalum notatum）、キクユグラス（Pennisetum clandestinum）、パールミレット（Pennisetum glaucum）、ネピアグラス（Pennisetum purpureum）、パールミレット（Pennisetum spicatum）、クサヨシ（Phalaris arundinacea）、フレウム・ベルトリニイ（Phleum bertolinii）、オオアワガエリ（Phleum pratense）、ポア・フェンドレリアナ（Poa fendleriana）、ナガハグサ（Poa pratensis）、タチイチゴツナギ（Poa nemoralis）、プスキニア（Puschkinia scilloides）、サトウキビ（Saccharum officinarum）、ロバスタム種サトウキビ（Saccharum robustum）、カラサトウキビ（Saccharum sinense）、ワセオバナ（Saccharum spontaneum）、オータムスキル（Scilla autumnalis）、オオツルボ（Scilla peruviana）、ライムギ（Secale cereale）、アワ（Setaria italica）、アフリカキンエノコロ（Setaria sphacelata）、インディアングラス（Sorghastrum nutans）、モロコシ（Sorghum bicolor）;カザリモロコシ（Sorghum dochna）、セイバンモロコシ（Sorghum halepense）、スーダングラス（Sorghum sudanense）、シノピルム・ポンティクム（Thinopyrum ponticum）、タイリンエンレイソウ（Trillium grandiflorum）、コムギ（Triticum aestivum）、エンマーコムギ（Triticum dicoccum）、デュラムコムギ（Triticum durum）、ヒトツブコムギ（Triticum monococcum）、ツリパ・バタリニー（Tulipa batalinii）、ツリパ・クルシアナ（Tulipa clusiana）、ツリパ・ダシステモン（Tulipa dasystemon）、ツリパ・ゲスネリア（Tulipa gesneriana）、ツリパ・グレイギー（Tulipa greigii）、ツリパ・カウフマニアナ（Tulipa kaufmanniana）、ツリパ・シルベストリス（Tulipa sylvestris）、ツリパ・トルケスタニカ（Tulipa turkestanica）、バニラ（Vanilla fragrans）、ライコムギ（X Triticosecale）、およびトウモロコシ（Zea mays）。
【００７５】
特定の好ましい単子葉植物としては、ライコムギ、オオムギ、コムギ、ソルガム、およびトウモロコシを含むが、これに限定されるものではない、単子葉植物茎葉飼料種からのものが挙げられる。
【００７６】
特に好ましい単子葉植物としては、草本が挙げられる。好ましい草本としては、イネ科（Poaceae）からのものが挙げられる。好ましいイネ科（Poaceae）草本としては、多年生 ライグラス（ホソムギ（Lolium perenne））、イタリアンライグラス（ネズミムギ（Lolium multiflorum））、カモガヤ（カモガヤ（Dactylis glomerata））、およびオニウシノケグサ（オニウシノケグサ（Festuca arundinacea）、オニウシノケグサ（Lolium arundinaceum）のシノニム）が挙げられる。
【００７７】
別の好ましいイネ科草本としては、イチゴツナギ亜科（pooideae）が挙げられる。好ましいイチゴツナギ亜科（pooideae）植物としては、コムギ、オオムギ、オートムギ、スズメノチャヒキ、およびアシが挙げられる
【００７８】
別の好ましいイネ科草本としては、キビ亜科（panicoideae）が挙げられる。好ましいキビ亜科（panicoideae）植物としては、パニックグラス、トウモロコシ、ソルガム、サトウキビ、キビ、フォニオ、およびブルーステムグラスが挙げられる。
【００７９】
特に好ましい草種としては、ロリウム・ロンギフロルム（Lolium longiflorum）、ネズミムギ（Lolium multiflorum）、ホソムギ（Lolium perenne）、ロリウム・ウェスターウォルディクム（Lolium westerwoldicum）、ネズミホソムギ（Lolium hybridum）、オニウシノケグサ（Festuca arundinacea）（オニウシノケグサ（Lolium arundinaceum）のシノニム）、ウシノケグサ（Festuca ovina）、ヒロハノウシノケグサ（Festuca pratensis）、オオウシノケグサ（Festuca rubra）、およびトウモロコシ（Zea mays）挙げられる。
【００８０】
一実施形態では、草はドクムギ属（Lolium）からのものである。好ましいドクムギ属（Lolium）種としては、オニウシノケグサ（Lolium arundinaceum）、ロリウム・ロンギフロルム（Lolium longiflorum）、ネズミムギ（Lolium multiflorum）、ホソムギ（Lolium perenne）、ロリウム・ウェスターウォルディクム（Lolium westerwoldicum）、ネズミホソムギ（Lolium hybridum）が挙げられる。特に好ましいドクムギ属（Lolium）種は、ホソムギ（Lolium perenne）である。
【００８１】
さらなる実施形態では、草は、フェスツカ属（Festuca）からのものである。好ましいフェスツカ属（Festuca）種としては、以下が挙げられる。オニウシノケグサ（Festuca arundinacea）、ウシノケグサ（Festuca ovina）、ヒロハノウシノケグサ（Festuca pratensis）、オオウシノケグサ（Festuca rubra）。特に好ましいフェスツカ属（Festuca）種は、オニウシノケグサ（Festuca arundinacea）（オニウシノケグサ（Lolium arundinaceum）のシノニム）である。
【００８２】
オニウシノケグサ（Lolium arundinaceum）は、オニウシノケグサ（Festuca arundinacea）のシノニムである。２つの名称は、区別なく使用され得る。
【００８３】
内生菌
内生菌は、植物と安定した共生を形成できる、あらゆる種からのものであってもよい。
【００８４】
好ましくは、内生菌は、子嚢菌門（Ascomycota）からの真菌類の内生菌である。好ましくは、内生菌は、バッカクキン科（Clavicipitaceae）からの真菌類の内生菌である。
【００８５】
好ましくは内生菌は、ネオティホディウム属（Neotyphodium）またはエピクロエ属（Epichloe）から選択される。
【００８６】
一実施形態では、内生菌はネオティホディウム属（Neotyphodium）からのものである。
【００８７】
好ましいネオティホディウム属（Neotyphodium）種としては、以下が挙げられる。ネオティホディウム・アオテアロアエ（Neotyphodium aotearoae）、ネオティホディウム・アウストラリエンス（Neotyphodium australiense）、ネオティホディウム・チレンス（Neotyphodium chilense）、ネオティホディウム・チソスム（Neotyphodium chisosum）、ネオティホディウム・コエノフィアルム（Neotyphodium coenophialum）、ネオティホディウム・ガンスエンス（Neotyphodium gansuense）、ネオティホディウム・フエルファヌム（Neotyphodium huerfanum）、ネオティホディウム・ロリイ（Neotyphodium lolii）、ネオティホディウム・メリシコラ（Neotyphodium melicicola）、ネオティホディウム・オクルタンス（Neotyphodium occultans）、ネオティホディウム・シエゲリイ（Neotyphodium siegelii）、ネオティホディウム・スタリイ（Neotyphodium starrii）、ネオティホディウム・テンブラデラエ（Neotyphodium tembladerae）、ネオティホディウム・チフィヌム（Neotyphodium typhinum）、ネオティホディウム・ウンシナツム（Neotyphodium uncinatum）、ネオティホディウム・シニクム（Neotyphodium sinicum）、およびネオティホディウム・シノフェスツカエ（Neotyphodium sinofestucae）。
【００８８】
特に好ましいネオティホディウム属（Neotyphodium）種は、ネオティホディウム・ロリイ（Neotyphodium lolii）である。
【００８９】
特に好ましいネオティホディウム・ロリイ（Neotyphodium lolii）株としては、ＡＲ１、ＡＲ５、ＡＲ６、およびＡＲ３７が挙げられる。
【００９０】
特に好ましいネオティホディウム・ロリイ（Neotyphodium lolii）は、ＡＲ１である。
【００９１】
別の特に好ましいネオティホディウム・ロリイ（Neotyphodium lolii）は、ＡＲ３７である。
【００９２】
別の特に好ましいネオティホディウム属（Neotyphodium）種は、ネオティホディウム・コエノフィアルム（Neotyphodium coenophialum）である。
【００９３】
特に好ましいネオティホディウム・コエノフィアルム（Neotyphodium coenophialum）株としては、ＡＲ５４２、ＡＲ５８４、およびＡＲ６０１が挙げられる。
【００９４】
別の特に好ましいネオティホディウム・コエノフィアルム（Neotyphodium coenophialum）株は、ＡＲ５４２である。
【００９５】
別の実施形態では、内生菌は、ピクロエ属（Epichloe）からのものである。
【００９６】
好ましいピクロエ属（Epichloe）種としては、以下が挙げられる。エピクロエ・ブロミコラ（Epichloe bromicola）、エピクロエ・フェスツカエ（Epichloe festucae）、およびエピクエロ・シルバチカ（Epichloe sylvatica）。
【００９７】
特に好ましいピクロエ属（Epichloe）種は、エピクロエ・フェスツカエ（Epichloe festucae）である。
【００９８】
好ましいエピクロエ・フェスツエカ（Epichloe festucae）株は、ＡＲｌ５０１である。
【００９９】
別の好ましい内生菌としては、Ｐ−内生菌が挙げられる。好ましいＰ−内生菌としては、グリオクラジウム属（Gliocladium）様およびフィアロフォラ（Phialophora）様内生菌が挙げられる。
【０１００】
内生菌寄託
ＡＲ１、ＡＲ５、ＡＲ６、ＡＲ３７、ＡＲ４２、ＡＲ５４２、ＡＲ５８４、ＡＲ６０１、およびＡＲ１５０１という用語は、例えばマイクロサテライトパターンなどのそれらの遺伝子型によって他の内生菌と区別され得る、内生菌株を指す。これらの以下の内生菌株は、特許手続きの目的で、ブダペスト条約に準じて、National Measurement Institute（NMI）, Suakin Street, Pymble, New South Wales, Australiaに寄託された。
【０１０１】
【表１】
2014531911.tif 000002
【０１０２】
ＰＣＲプライマー
本発明のさらなる態様では、内生菌のリボソーム反復領域の遺伝子間領域（ＩＧＳ）とハイブリダイズするプライマーが提供される。
【０１０３】
一実施形態ではプライマーは、内生菌のリボソーム反復領域の遺伝子間領域（ＩＧＳ）の菌種特異的または菌株特異的（specificic）領域とハイブリダイズする。
【０１０４】
好ましくは、内生菌は、本明細書に記載されるような内生菌である。
【０１０５】
一実施形態では、プライマーは、配列番号１〜配列番号８の配列のいずれか１つと、少なくとも７０％の同一性を有する。
【０１０６】
さらなる実施形態では、プライマーは、配列番号１〜配列番号８のいずれか１つの配列を有する。
【０１０７】
本発明の方法の一実施形態では、内生菌は、本発明の少なくとも１つのプライマーを使用して、ＰＣＲベースの方法によって検出される。好ましくは、本発明の少なくとも２つのプライマーが、方法で使用される。
【発明を実施するための形態】
【０１０８】
詳細な説明
出願人らは、内生菌が、植物中で、節間伸展によって増殖することに気付いた。出願人らは、発芽苗または植物の幼葉（特に最初の出葉）中に、（生存不能な内生菌でなく）生存可能な内生菌のみが見られることを発見した。出願人の発明は、生存可能な内生菌の存在を検出することに関する。本発明の方法を使用して、出願人らは、以前の方法と比べて迅速に、生存可能な内生菌を含有する植物と、生存可能な内生菌を含有しないまたは生存不能な内生菌のみを含有する植物とを区別できることを示した。本発明の方法は、真菌生体量が典型的に非常に低いとき、幼葉中の内生菌を検出して同定するのに十分な感度がある。
【０１０９】
種子は、生存可能な内生菌および生存不能な内生菌の双方を含有することが多いが、生存可能な内生菌を含有する種子と、内生菌を含有しないまたは生存不能な内生菌のみを含有する種子とを識別する現行のアプローチは、面倒であり時間がかかる。本発明以前は、生存可能な内生菌を検出する標準アプローチでは、生存度を確認するために、生きた内生菌が宿主組織塊の外まで成長して、純培養培地内に到達することが必要であった。このような成長検査では、成長段階に先立って、内生菌の顕微鏡的検出が必要なこともある。
【０１１０】
したがって本発明は、自動化にも適している、迅速で都合良く費用効率が高い代案を提供する。
【０１１１】
生存可能な内生菌の存在を検出する？
抗体ベースの方法
本発明の方法では、抗体を使用して、幼葉中の内生菌の存在を検出してもよい。診断ツールとして抗体を使用する一般方法は、当該技術分野で公知である（Immunoassays: A Practical Approach, Gosling J.P.（Ed） Oxford University Press。酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）モノクローナル抗体、および免疫ブロットアプローチを本発明の方法に応用してもよい。
【０１１２】
内生菌の診断的検出のために、抗体は、真菌菌糸体のホールセル抽出物に対して特異的であってもよい。利用できるその他の抗体は、ペラミン、パキシリン、およびロリンなどの内生菌アルカロイドを検出するものである。
【０１１３】
核酸ベースの方法
診断核酸ベースの方法は、当業者に良く知られている。有用な方法としては、プローブハイブリダイゼーション方法、およびＰＣＲベースの方法が挙げられる。
【０１１４】
プローブベースの方法
本発明の方法において、プローブベースの方法を応用して、生存可能な内生菌を検出してもよい。プローブを標的核酸配列にハイブリダイズする方法は、当業者に良く知られている（Sambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press）。
【０１１５】
「プローブ」という用語は、ハイブリダイゼーション−ベースのアッセイにおいて、プローブと少なくとも部分的に相補的であるポリヌクレオチド配列を検出するのに使用される、短いポリヌクレオチドを指す。プローブは、本明細書で定義されるポリヌクレオチドの「断片」からなってもよい。好ましくはこのようなプローブは、少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも４０、より好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも２００、より好ましくは少なくとも３００、より好ましくは少なくとも４００、および最も好ましくは少なくとも５００ヌクレオチド長である。
【０１１６】
プローブは、標的ＤＮＡ配列と完全に相補的でなくてもよい。同一プローブを使用した際の異なる菌種または株中の標的配列の違いを利用して、菌種または株を区別してもよい。
【０１１７】
ＰＣＲベースの方法
本発明の方法で内生菌を検出するためには、ＰＣＲベースの方法が特に好ましい。
【０１１８】
一般的ＰＣＲアプローチは、当業者に良く知られている（Mullis et al., 1994）。基本的なＰＣＲアプローチの種々のその他の展開もまた、本発明の方法に有利適用してもよい。実施例は、簡潔に考察される。
【０１１９】
対立遺伝子特異的ＰＣＲ
対立遺伝子特異的ＰＣＲは、単一ヌクレオチド多形性（ＳＮＰ）（ＤＮＡ中の単一塩基の違い）に基づく、診断またはクローニング技術である。これには、対立遺伝子の違いを含む、ＤＮＡ配列に関する事前の知識が必要であり、その３’末端がＳＮＰを包含するプライマーを使用する。ストリンジェントな条件下のＰＣＲ増幅は、テンプレートとプライマー間のミスマッチの存在下では、はるかに効率が劣るため、ＳＮＰ特異的プライマーを用いた増幅の成功は、配列中の特定ＳＮＰの存在を示唆する（Newton et al., 1989）。
【０１２０】
配列間特異的ＰＣＲ
配列間特異的ＰＣＲ（ＩＳＳＲ）は、単純な配列反復間の領域を増幅させて、増幅断片長に固有のフィンガープリントを生成する、ＤＮＡフィンガープリント法のためのＰＣＲ法である（Zietkiewicz et al., 1994）。
【０１２１】
マルチプレックスＰＣＲ
マルチプレックスＰＣＲは、単一ＰＣＲ反応内の複数のプライマーセットを利用して、異なる標的ＤＮＡ配列に対して特異的な様々なサイズの増幅産物（アンプリコン）を生成する。同時に複数配列を標的にすることで、さもなければ実施に数倍の試薬とより長時間を要する診断情報が、単一反応から得られてもよい。
【０１２２】
アニーリング温度およびプライマーセットは、単一反応中で機能して、異なるアンプリコンサイズを生じるように、一般に最適化される。すなわちアンプリコンは、ゲル電気泳動によって視覚化した際に、特徴的なバンドを形成すべきである。本発明の方法でマルチプレックスＰＣＲを使用して、単一サンプルまたは反応中の２つ以上の内生菌の存在を検出し得る。
【０１２３】
定量ＰＣＲ
定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を使用して、（通常リアルタイムで）ＰＣＲ産物の量が測定される。Ｑ−ＰＣＲは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡの開始量を定量的に測定する。Ｑ−ＰＣを一般に使用して、ＤＮＡ配列がサンプル中に存在するかどうか、そしてサンプル中のそのコピー数を判定する。定量的リアルタイムＰＣＲは、非常に高い精度を有する。Ｑ−ＰＣＲ法は、Sybr Green、EvaGreenなどの蛍光染料、またはTaqManなどのフルオロフォア含有ＤＮＡプローブを使用して、増幅産物の量をリアルタイムで測定する。Ｑ−ＰＣＲは、時にＲＴ−ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）またはＲＱ−ＰＣＲと略される。ＱＲＴ−ＰＣＲまたはＲＴＱ−ＰＣＲ。
【０１２４】
高分解能融解（ＨＲＭ）リアルタイムＰＣＲ
高分解能融解（ＨＲＭ）分析は、二本鎖ＤＮＡサンプル中の変異、多形性、およびエピジェネティックな違いを検出するための強力な技術である。
【０１２５】
ＨＲＭ分析は、二本鎖ＤＮＡサンプル上で実施される。典型的に、使用者は、ＨＲＭ分析に先だって、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、その中に対象変異が存在するＤＮＡ領域を増幅する。増幅されるこの領域は、アンプリコンとして知られている。ＰＣＲ処理後に、ＨＲＭ分析が開始される。処理は、約５０℃から最高約９５℃まで、単にアンプリコンＤＮＡを正確に加温するだけである。この処理中のある時点で、アンプリコンが融解温度に達し、ＤＮＡ二本鎖が分離しまたは「融解」分離する。本発明の方法では、融解プロファイルの違いを使用して、存在する内生菌株を区別し得る。
【０１２６】
遺伝子型同定
挿入または欠失（内生菌株に依存する）を同定することが可能であり、それを使用して異なる内生菌株を区別し得る。（単数または複数の）挿入または欠失の側面に位置して、異なるサイズの特定アンプリコンを生じるように、ＰＣＲプライマーをデザインでき、特定アンプリコンは、従来のゲル電気泳動によって分離され、または異なるサイズのピークを同定して生菌株中の遺伝子型を提供するGenotyper（Life Technologies／Applied Biosystems）を使用して分離され得る。
【０１２７】
ＰＣＲプライマー
「プライマー」という用語は、通常は遊離３’ＯΗ基を有する短いポリヌクレオチドを指し、それはテンプレートとハイブリダイズして、テンプレートに相補的なポリヌクレオチド重合をプライミングするために使用される。このようなプライマーは、好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも６、より好ましくは少なくとも７、より好ましくは少なくとも９、より好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１１、より好ましくは少なくとも１２、より好ましくは少なくとも１３、より好ましくは少なくとも１４、より好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６、より好ましくは少なくとも１７、より好ましくは少なくとも１８、より好ましくは少なくとも１９、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長である。
【０１２８】
好ましくはＰＣＲは、内生菌中の核酸とハイブリダイズする、プライマーを使用して実施される。
【０１２９】
出願人らは、内生菌中で、単一コピー遺伝子でなく、多コピー遺伝子とハイブリダイズするプライマーを使用することで、検出感度を増大できることを示した。したがって好ましい実施形態では、プライマーは、内生菌中の多コピー遺伝子とハイブリダイズする。
【０１３０】
このようなプライマーを用いて、出願人らは、植物の幼葉中で内生菌ＤＮＡを成功裏に増幅し、したがって生存可能な内生菌の存在を検出した。この発達段階では、内生菌生体量は典型的に低く、標準ＰＣＲまたはその他の方法によって検出するのが困難である。
【０１３１】
出願人らは、様々な内生菌について、リボソーム反復領域の遺伝子間領域（ＩＧＳ）を同定し、これらの領域をＰＣＲプライマー結合の標的にし得ることを示して、内生菌を検出する高感度の方法を提供した。
【０１３２】
リボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）は、リボソームのＲＮＡ成分である。リボソームＲＮＡは、大型サブユニット（ＬＳＵ）と小型サブユニット（ＳＳＵ）の２つのサブユニット（図）を形成する。ほとんどの真核生物中の１８Ｓ  ｒＲＮＡは、小型リボソームサブユニット内にあり、大型サブユニットは３種のｒＲＮＡ（５Ｓ、５．８Ｓ、および２８ＳｒＲＮＡ）を含有する。２８Ｓ、５．８Ｓ、および１８Ｓ  ｒＲＮＡは、２つの内部転写されたスペーサー（ＩＴＳ）によって隔てられる単一転写ユニットによってコードされる。各転写ユニットは、遺伝子間配列（ＩＧＳ）によって隔てられる。真核生物は、一般に、タンデム反復に組織化されたｒＲＮＡ遺伝子の多数のコピーを有するので、遺伝子とＩＧＳ配列の双方の複数コピーがある。真菌においては、５Ｓ  ｒＲＮＡは、典型的にゲノム中の他の箇所でコードされるので、５Ｓ遺伝子によって隔てられるより小さな２つの領域ではなく、より大きな１つのＩＧＳ領域がある（図２）。
【０１３３】
好ましい実施形態では、プライマーは、内生菌のリボソーム反復領域の遺伝子間領域（ＩＧＳ）とハイブリダイズする。
【０１３４】
一実施形態では、内生菌のリボソーム反復領域の遺伝子間領域（ＩＧＳ）は、配列番号９〜１６の配列のいずれか１つの少なくとも７０％から一部の配列を含んでなる。
【０１３５】
一実施形態では、内生菌のリボソーム反復領域の遺伝子間領域（ＩＧＳ）は、配列番号９〜１６の配列のいずれか１つの配列を含んでなる。
【０１３６】
さらなる実施形態では、プライマーは、配列番号９〜１６の配列の配列のいずれか１つの少なくとも７０％から一部を有する。
【０１３７】
本発明の一実施形態では、方法で使用されるプライマーは、配列番号１〜８の配列のいずれか１つの配列と少なくとも７０％の同一性を有する。
【０１３８】
さらなる実施形態では、プライマーは、配列番号１〜配列番号８のいずれか１つの配列を有する。
【０１３９】
％同一性
変異ポリヌクレオチド配列は、特定のポリヌクレオチド配列に対して、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７１％、より好ましくは少なくとも７２％、より好ましくは少なくとも７３％、より好ましくは少なくとも７４％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも７６％、より好ましくは少なくとも７７％、より好ましくは少なくとも７８％、より好ましくは少なくとも７９％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、および最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を示す。同一性は、少なくとも１０ヌクレオチド配列部位、より好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド配列部位、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド配列部位、より好ましくは少なくとも１３ヌクレオチド配列部位、より好ましくは少なくとも１４ヌクレオチド配列部位、より好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド配列部位、より好ましくは少なくとも１６ヌクレオチド配列部位、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチド配列部位、より好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド配列部位、より好ましくは少なくとも１９ヌクレオチド配列部位、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド配列部位、より好ましくは少なくとも２１ヌクレオチド配列部位であり、最も好ましくは特定のポリヌクレオチド配列の全長に及ぶ、比較ウィンドウにわたって見出される。
【０１４０】
ポリヌクレオチド配列同一性は、以下の様式で判定し得る。対象ポリヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/BLAST/）から公的に入手可能である、b12seq中のＢＬＡＳＴＮ（プログラムのＢＬＡＳＴスイートから、バージョン２．２．５［２００２年１１月］）を使用して、候補ポリヌクレオチド配列と比較される（Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden（1999）, “Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250）。低複雑度部分の選別が、オフであるべきことを除いて、b12seqのデフォルトパラメータが使用される。
【０１４１】
ポリヌクレオチド配列の同一性は、以下のunixコマンド系統のパラメータを使用して検査してもよい。
b12seq -i nucleotideseq1 -j nucleotideseq2 -F F -pblastn
パラメータ-FFは、低複雑度部分の選別をオフにする。パラメータ−pは、配列対の適切なアルゴリズムを選択する。b12seqプログラムは、行”同一性＝”中の同一ヌクレオチドの数および百分率の双方として、配列同一性を報告する。
【０１４２】
ポリヌクレオチド配列同一性はまた、全体的配列アラインメントプログラムを使用して、候補と対象ポリヌクレオチド配列の重なりの全長にわたって計算してもよい（例えばNeedleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453）。Needleman−Wunsch大域アラインメントアルゴリズムの完全な実装は、http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/から入手し得るEMBOSSパッケージ中のneedleプログラム（Rice,P. Longden,I. and Bleasby,A. EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Trends in Genetics June 2000, vol 16, No 6. pp.276-277）にある。欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute）もまた、オンラインで２つの配列間のEMBOSS-needle大域アラインメントを実施する便宜をhttp:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/で提供する。
【０１４３】
代案としては、末端ギャップのペナルティーを科すことなく、２つの配列の最適大域アラインメントを計算するGAPプログラムを使用して、配列同一性を計算してもよい。GAPは、論文Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235に記載される。
【０１４４】
配列同一性はまた、比較される配列をClustalWアルゴリズム（Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 24, 4876-4882）を使用するVector NTIバージョン９．０を使用して配列し、次に整合配列間の配列同一性の百分率をVector NTIバージョン９．０（２００３年９月２日著作権1994-2003 InforMax、Invitrogenの商標）を使用して計算することで、計算してもよい。
【０１４５】
生存可能
「生存可能」という用語は、内生菌に関して本明細書の用法では、成長能力があることを意味する。好ましくは「生存可能」な内生菌は、植物内で増殖して安定した共生を形成できる。
【０１４６】
種子の発芽
当業者は、種子発芽のための材料と方法を十分知っている。出願人らは、種子発芽条件を最適化して、幼葉中の内生菌生体量最大化した。
【０１４７】
したがって一実施形態では、１８〜２６℃の温度範囲で種子を発芽させる。好ましくは、１９〜２５℃、より好ましくは２０〜２４℃、より好ましくは２１〜２３℃の温度範囲で種子を発芽させる。最も好ましくは、約２２℃で種子を発芽させる。
【０１４８】
さらなる実施形態では、１６／８時間の明／暗周期で種子を発芽させる。好ましくは、１４／１０時間の明／暗周期で種子を発芽させる。より好ましくは、約１２／１２時間の明／暗周期で種子を発芽させる。最も好ましくは、１２／１２時間の明／暗周期で種子を発芽させる。
【０１４９】
幼葉を切除する
本発明の好ましい実施形態では、内生菌検出に先だって、幼葉が苗または植物から切除される。当業の研究者らは、植物組織および器官をどのように切除するかを知っている。好ましくは、切除は無菌的に実施されて、異なる苗または植物間の混入を最小化すべきである。
【０１５０】
好ましくは、方法で使用する前に、幼葉を切除して、それを他の植物組織または器官から実質的に分離する。より好ましくは、方法で使用する前に、幼葉を切除して、それを子葉鞘から、ならびに他の植物組織または器官から実質的に分離する。最も好ましくは、方法で使用する前に、幼葉を切除して、それを子葉鞘およびあらゆる付着種子から、ならびに他の植物組織または器官から、実質的に分離する。
【０１５１】
出願人らは、このような他の組織および器官（特に種皮および子葉鞘が、生存可能な内生菌検出するための本発明の方法に干渉する、生存不能な内生菌を保有し得ることを示した。したがってこのような他の組織は、好ましくは除去される。
【０１５２】
子葉鞘
子葉鞘は、発芽単子葉植物中で、出現する苗条を覆う、先のとがった管状保護鞘である。
【０１５３】
幼葉
本発明の大きな利点は、植物の成長初期段階において、（生存不能な内生菌とは対照的に）生存可能な内生菌の存在を検出することである。したがって本方法は、植物中の生存可能な内生菌を検出する他の既知の方法と比べてより迅速である。
【０１５４】
種子発芽から生存可能な内生菌検出までの時間をできるだけ短縮するために、内生菌は、好ましくは第１葉中で検出される。
【０１５５】
好ましくはないが、より成長した幼葉もまた本発明の方法で使用し得る。
【０１５６】
一実施形態では、幼葉は、植物種子の発芽後に、植物から生じる最初の５葉の内の１枚である。好ましくは、幼葉は、植物種子の発芽後に植物から生じる最初の４葉、より好ましくは最初の３葉、より好ましくは最初の２葉の内の１枚である。
【０１５７】
好ましい実施形態では、幼葉は、植物種子の発芽後に植物から生じる第１葉である。
【０１５８】
第１葉
単子葉植物の第１葉は、子葉、双葉、胚性葉または最初の出葉とも呼ばれ称される。これらは全て、本明細書の用法では、「第１葉」という用語に包含される。
【０１５９】
出願らは、生存可能な内生菌のみが分裂組織の外まで成長して、第１葉原基と、引き続く幼葉に入り得ることを示した。本明細書の用法では、第１葉原基もまた「第１葉」という用語に含まれる。
【０１６０】
幼葉から抽出物を調製する
本発明の方法は、任意選択的に、幼葉の生菌検出前に、幼葉から抽出物を生成するステップを含む。抽出手順は、もちろん抽出物中の内生菌の存在を検出するのに使用される技術に左右される。
【０１６１】
抗体ベースの方法では、タンパク質抽出手順が使用される。植物からタンパク質抽出物を調製するいくつかの方法は、当業者に知られている（参考文献）。
【０１６２】
核ベースの方法では、核酸抽出物手順が使用される。植物から核酸抽出物を調製するいくつかの方法は、当業者に知られている（ワールドワイドウェブwww.protocol-online.org/biology-forums/DNA.htmlで入手可能なProtocol Onlineを参照されたい）。好ましい核酸抽出方法としては、ＤＮＡ抽出法が挙げられる。
【０１６３】
好ましいＤＮＡ抽出法としては、Post法（Post et al., 2003. Euphytica 130: 255-260）、およびHotShot法（ワールドワイドウェブwww.protocol-online.org/biology-forums/DNA.htmlで入手可能なProtocol Onlineを参照されたい）、Genaid Genomic DNA Mini Kit -Plant（Geneaid Biotech Ltd）が挙げられる。特に好ましいＤＮＡ抽出法は、HotShot法である。
【０１６４】
ＤＮＡ抽出手順は、本発明の方法において、有利には自動化されてもよい。自動化に適しているＤＮＡ抽出手順は、当業者に良く知られている。自動化は、ロボット（例えばSlipstream Automation, Palmerston North, New Zealand）の使用を通じてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】は、ユニークな融解プロファイル示す、異なる内生菌株の高分解能融解（ＨＲＭ）曲線を示す。ＡＲ１のＨＲＭ曲線は、点線（ ）で示される。ＡＲ３７のＨＲＭ曲線は、実線（ ）で示される。一般的有毒野性型Ｎ．ロリイ（N. lolii）のＨＲＭ曲線は、破線（ ）で示される。ＡＲ４２のＨＲＭ曲線は、点線／破線（ ）で示される。
【図２】小型（ＳＳＵ）および大型（ＬＳＵ）サブユニットリボソームＲＮＡと、内部転写されたスペーサー（ＩＴＳ）および遺伝子間領域（ＩＧＳ）とを示す、真核生物からの一般的なリボソーム反復構造を示す。
【図３】プライマーＲＪ２４３Ｆ（ＩＧＳＦ、ＬＲ１２Ｒ）およびＲＪ２４３Ｒ（ＩＧＳＲ、ｉｎｖＳＲＩＲ）（配列番号１７および１８）を用いた、ＡＲ１、ＡＲ３７、ＡＲ４２、および一般的有毒野性型Ｎ．ロリイ（N. lolii）から得られるＩＧＳ配列のためのClustalWを使用したＤＮＡ多重配列アラインメントを示す。株間のヌクレオチド多形性、および挿入と欠失が示される。
【図４】この領域を異なる内生菌から増幅するのに使用される、遺伝子間スペーサー配列（ＩＧＳ）の普遍的ＰＣＲプライマーを示す。
【実施例】
【０１６６】
実施例１：ＰＣＲ増幅の標的として内生菌株特異的配列を同定する
材料と方法
普遍的プライマー（下述）は、Duke UniversityからのＩＧＳ配列（図参照）に基づいて合成された（ワールドワイドウェブhttp://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htmで入手可能）。
【０１６７】
ＲＪ２４３Ｆ（ＩＧＳＦ、ＬＲ１２Ｒ）ＧＡＡＣＧＣＣＴＣＴＡＡＧＴＣＡＧＡＡＡＴＣＣ（配列番号１７）
ＲＪ２４３Ｒ（ＩＧＳＲ、ｉｎｖＳＲＩＲ）ＡＣＴＧＧＣＡＧＡＡＴＣＡＡＣＣＡＧＧＴＡ（配列番号１８）
【０１６８】
以下の内生菌株から抽出されたゲノムＤＮＡに対して、ＰＣＲを実施した。
一般的有毒野性型
ＡＲ１
ＡＲ４２（野性型株に類似）
一般的毒性野性型Ｎ．ロリイ（N. lolii）
ＡＲ３７
ＡＲ５４２
ＡＲ５８４
ＡＲ６０１
ＦＬ１
Ｅ．シリアリス（E. ciliarus）
【０１６９】
ＰＣＲ反応およびサイクル条件は次のとおり。
２０μＬ  ５  prime PCR Extenderキットを使用した反応混合物
２μＬ  １０×Tuning緩衝液
０．４μＬ  ２５ｍＭのｄＮＴＰ
０．８μＬ  （各）１０μＭのプライマー
０．２μＬ  ５Ｕ／μＬのPCR Extenderポリメラーゼ
ＭＱ  最高２０μＬの総容積
４０ｎｇ  テンプレートとしてのゲノムＤＮＡ
【０１７０】
ＰＣＲサイクル条件
９３’Ｃ  ３分間
９３’Ｃ  １５秒間｝
６２’Ｃ  ３０秒間｝１０×
６８’Ｃ  ５分間｝
９３’Ｃ  １５秒間｝
６２’Ｃ  ３０秒間｝                  １７×
６８’Ｃ  ５分間＝２０秒間／サイクル｝
ＡＲ３７では、６０℃および５８℃のアニーリング温度も試された。
【０１７１】
結果
ゲルラダーに基づくおよその生成物
ＡＲ１  約２．８Ｋｂ
ＡＲ３７  約１．８Ｋｂ
ＡＲ４２  約１．８Ｋｂ
ＡＲ５４２  約２．２Ｋｂ
ＡＲ５８４  約２．２Ｋｂ
ＡＲ６０１  約２．８Ｋｂ
ＦＬ１  約２．８Ｋｂ
Ｅ．シリアリス（E. ciliarus）  約１．６Ｋｂ
【０１７２】
ＰＣＲ産物をゲル精製して配列決定し、引き続く株間アラインメントのためのＩＧＳ配列を提供した。増幅ＩＧＳ配列の配列は、配列番号９〜１６に示される。
【０１７３】
実施例２：内生菌株間で区別するためのＰＣＲプライマーデザイン、およびＰＣＲの手順と条件の最適化
材料と方法
図３に示されるように、clustalWを使用してＩＧＳ配列を配列比較した。
【０１７４】
特定内生菌株に特有な領域の側面に位置するプライマーをデザインした（表１）
結果
表１に列挙されるプライマー対をＩＧＳ配列に対してデザインして、高分解能融解（ＨＲＭ）ＰＣＲによって試験し、３つの内生菌株（野性型、ＡＲ１、およびＡＲ３７）の特徴的な高分解能融解（ＨＲＭ）プロファイルを提供するのに有用なものを選択した。
【０１７５】
【表２】
2014531911.tif 000003
【０１７６】
予想されたアンプリコン、単一ヌクレオチド多形性（ＳＮＰ）の数、および特定の株ＩＧＳ配列内の欠失の存在もまた、示されるプライマー対について下の表２に列挙される。
【０１７７】
【表３】
2014531911.tif 000004
【０１７８】
培養した内生菌から抽出された対照ＤＮＡを使用して、表２に列挙されるプライマー対についてＨＲＭを実施した。
【０１７９】
図１で示されるように、プライマー対ＤＨ００８Ｆ／ＤＨ００７Ｒは、特徴的なＨＲＭプロファイルを与えることが分かった。
【０１８０】
プライマー対ＤＨ００８Ｆ／ＤＨ００７のＰＣＲ条件は、次のとおりである。
９４℃で４分間
９４℃で３０秒間、５５’Ｃで秒間、７２’Ｃで４５秒間を×４０
７２℃で７分間
使用されたamplitaq Goldポリメラーゼ
２５ｎｇのゲノムＤＮＡ
１０×ＰＣＲ緩衝液gold１．５μＬ／５μＬの反応
５０ｍＭのＭｇＣｌ２  ０．４５μＬ
２５ｍＭのｄＮＴＰ  ０．１２μＬ
１０μＭのＤＨ００８Ｆ／ＤＨ００７Ｒ  ０．７５μＬ
５Ｕ／μＬのAmpli Taq Goldを０．１２μＬ
ＭＱ  ９．０６μＬ
【０１８１】
内生菌は、ピークサイズベースでなく、融解プロファイルベースで区別される
ことに留意されたい。
【０１８２】
実施例３：幼葉中の最大菌糸生体量から苗発芽／成長条件を最適化する
材料と方法
内生菌ＡＲ１を感染させたライグラス栽培品種Samsonについて最適化を実施した。
【０１８３】
（受入番号Ａ１０７３５）。種子サンプルを加熱処理して、生存不能な内生菌感染種子をシミュレートした。内生菌生存度検査は、標準的な技術を使用して、ニトロセルロース膜上に押しつぶした分蘖のウエスタンブロット法によって実施した。ブロッティング検査を実施して、ＰＣＲ結果との比較のために、そして加熱処理種子中の内生菌が生存不能であることを確認するために、受入中のＡＲ１感染種子の％生存度を測定した。
【０１８４】
この受入中の種子は、９５％生存可能な内生菌を含有し、加熱処理種子中の全ての内生菌が、生存不能であることが確認された（図５）。
【０１８５】
植物体中の真菌生体量に対する温度の影響を測定するために、種子を１９、２２、および２８℃で１３日間発芽させて、１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対してデザインされたプライマーを使用して、ＰＣＲによって内生菌感染について苗を評価した。
【０１８６】
ＲＪ２４０Ｆ／１８Ｓ  ｒＲＮＡ（Ｅ．フェスツカエ（E. festucae））：ＡＴＣＴＣＴＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＴＣＧ（配列番号１９）
ＲＪ２４０Ｒ／１８ＳｒＲＮＡ（Ｅ．フェスツカエ（E. festucae））：ＴＧＧＴＴＧＣＧＡＧＧＴＧＧＴＡＴＧＴＴ（配列番号２０）
【０１８７】
結果
ブロッティングによって＞９５％生存度を有することが実証された苗に対するＰＣＲ解析は、１９または２８℃のいずれかで発芽させた種子では、いかなるＰＣＲ産物も得られられなかったことを示した。それとは対照的に、２２℃での発芽種子からの検査された全ての苗は、予想サイズのＰＣＲ産物を増幅した。結果は、植物体中の内生菌生体量が、より低い（１９℃）またはより高い（２８℃）温度のいずれかで成長した苗中では、不十分であることを示す。この結果に基づいて、この先の将来のＤＮＡ抽出と引き続くＰＣＲ（遺伝子型同定またはＨＲＭのいずれか）は、２２℃で成長した苗で実施された。
【０１８８】
実施例４：種子バッチ中の有益内生菌および非有益内生菌の百分率を評価する
材料と方法
新鮮種子を提供して、上述したような堆肥中に播種した。２２℃で１４日間の成長後、９２本の苗の第１葉を採取して、９６ウェルのロボットマイクロタイタートレーに入れた。残りの４つのウェルは対照ＤＮＡを含んでなり、内生菌型（ｗｔ、ＡＲ１、ＡＲ３７）とＰＣＲ条件が評価された。
【０１８９】
Slipstream AutomationによってＤＮＡをロボット制御で抽出し、９６ウェルＨＲＭプレートにロボット制御で移した。上述のプライマーＤＨ００８Ｆ／ＤＨ００７Ｒと条件を使用して、ＨＲＭ  ＰＣＲを実施した。ＨＲＭソフトウェアは、各ウェルについて高分解能融解プロファイルを判定し、生存度状態（検出生成物）と内生菌型（ＡＲ１、ＡＲ３７またはｗｔ）を自動的に割り当てる。生存度百分率および百分率オフタイプ（percent off type）は、９２からの陽性の数に１００を乗じた、直接計算値である。
【０１９０】
最初の概念実証実験は、それから第１葉を採取した元の苗を保持して、苗をさらに４週間（合計６週間）栽培し、次に免疫ブロット分析して、非依存性（非分子）法によって、それらの感染状態を判定した。ブロッティング結果は、同一苗を用いたＨＲＭで得られた結果と比較された。
【０１９１】
さらにＨＲＭによって評価するために、異なるライグラス栽培品種と異なる内生菌株を含んでなる種子系統がＧＴＬによって提供され、これらもまた、ブロッティング結果と比較された（表２）
【０１９２】
結果
下の表３で示されるように、ブロッティング結果とＨＲＭ結果の間には、高い相関があった。
【０１９３】
【表４】
2014531911.tif 000005
【０１９４】
参考文献
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Fletcher, L.R.; Easton, H.S. 2000: Using Endophytes for Pasture Improvement in New Zealand. In Proceedings of The Grassland Conference 2000, 4th International Neotyphodium/Grass Interactions Symposium. Eds. Paul, V. H. ; Dapprich, P. D. Universtat, Paderborn, pp 149-162.
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【０１９５】
【表５】
2014531911.tif 000006
【図１】
2014531911.tif 000007
【図２】
2014531911.tif 000008
【図３】
2014531911.tif 000009
【図４】
2014531911.tif 000010
【配列表】
2014531911000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年11月8日(2013.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物中の生存可能な真菌類の内生菌の存在を検出する方法であって、前記方法は、前記植物由来の幼葉またはその抽出物中で真菌類の内生菌の存在を検出するステップを含んでなり、前記幼葉または抽出物中の前記真菌類の内生菌の存在の検出が、前記植物中の生存可能な真菌類の内生菌の存在を示し、前記内生菌が、特定の内生菌種または株の存在を同定する方法によって検出され、前記真菌類の内生菌のリボソーム反復領域の遺伝子間領域（ＩＧＳ）の種特異的または株特異的部分とハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーが、前記内生菌の保存を検出するＰＣＲベースの方法で使用される、方法。
【請求項２】
前記幼葉が、前記植物種子の発芽後に、前記植物から生じる最初の５葉の内の１枚である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幼葉が、前記植物種子の発芽後に、前記植物から生じる第１葉である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記幼葉が、前記植物種子の発芽後４週間以内に生じる、植物苗由来の葉である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記幼葉が、前記植物種子の発芽後１４日未満に生じる、植物苗由来のものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記幼葉が、前記葉を子葉鞘から分離するのに十分に成長した苗由来のものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法で使用する前に、前記幼葉を切除して、それを前記植物のその他の組織または器官から実質的に分離する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記方法で使用する前に、前記幼葉を切除して、それを前記植物の子葉鞘から、ならびにその他の組織または器官から、実質的に分離する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記方法で使用する前に、前記幼葉を切除して、それを前記植物の子葉鞘およびあらゆる付着種子から、ならびにその他の組織または器官から、実質的に分離する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＣＲベースの方法が、定量的ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＣＲベースの方法が、高分解能融解（ＨＲＭ）リアルタイムＰＣＲである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＰＣＲが、前記内生菌中の核酸とハイブリダイズするプライマーを使用して実施される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出が、前記特定の内生菌種または株に対して特異的である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＣＲベースの方法で使用される１つまたは複数のプライマーが、前記検出される株に対して特異的であり、増幅産物の存在または不在が、前記内生菌の存在または不在を示す、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
特異性が、前記増幅産物の性質によって定まる、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出が、前記検出される種または株に対して特異的であり、特性が、前記増幅産物のサイズによって定まる、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出が、前記検出される種または株に対して特異的であり、特異性が、前記増幅産物生成の動態によって定まる、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記特異性が、前記増幅産物の融解プロファイルによって定まる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
異なる内生菌種または株中において、配列であって前記プライマーがそれにハイブリダイズする配列の違いの結果として、異なる融解プロファイルが異なる種および株中で生じる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記植物を前記方法で使用する前に、前記幼葉中の菌糸生体量を最大化する条件下で、前記植物の種子を発芽させる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記植物を前記方法で使用する前に、最初の出葉の中の前記種子中の菌糸生体量を最大化する条件下で、前記種子を発芽させる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記種子を１８〜２６℃の温度範囲で発芽させる、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記種子を約２２℃で発芽させる、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記種子を１６／８時間の明／暗周期で発芽させる、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２５】
種子を１２／１２時間の明／暗周期で発芽させる、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記内生菌の存在が、前記幼葉の抽出物中で検出される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法が、前記幼葉から抽出物を調製するステップを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法が、前記幼葉を切除するステップを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記幼葉を切除するステップと、抽出物を作成するステップとを含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記方法が、前記種子を発芽させるステップと、前記幼葉を切除するステップとを含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法が、前記種子を発芽させるステップと、前記幼葉を切除するステップと、抽出物を作成するステップとを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
種子バッチをスクリーニングして、前記バッチ中にどの内生菌種、株(strain)、または株(strains)が存在するかを評価するために使用される、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
より大きなバッチから小さな種子サンプルを取り、前記小さなサンプルからの前記種子の発芽後に、幼葉に前記方法を実施する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記大きなバッチ中の生存可能な内生菌を含有する種子の割合または百分率を推定するために、前記方法を使用して、前記小さなサンプル中の特定種または株の生存可能な内生菌を含有する種子の割合または百分率を測定する、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記大きなバッチ中の生存可能な汚染内生菌を含有する種子の割合または百分率を推定するために、前記方法を使用して、前記小さなサンプル中の生存可能な汚染内生菌を含有する種子の割合または百分率を測定する、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも１つのステップが自動化されている、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記真菌類の内生菌のリボソーム反復領域の遺伝子間領域（ＩＧＳ）の種特異的または株特異的部分とハイブリダイズするプライマーであって、配列番号１〜配列番号８のいずれか１つの配列と少なくとも８０％の同一性を有する、プライマー。
【請求項３８】
配列番号１〜配列番号８のいずれか１つの配列を有する、請求項３７に記載のプライマー。
【国際調査報告】
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