(57)【要約】本発明は、分子生物学の分野に関する。本発明は、ＲＮＡ鋳型からの核酸の生成、更に核酸の複製に有用な新規組成物、方法及びキットに関する。具体的には、本発明は、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応による核酸の生成及び増幅に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸ではないアニオン性ポリマー、１種以上のオリゴヌクレオチドプライマー、１種以上のヌクレオチド又はその誘導体のいずれか、及び２種以上の異なるポリメラーゼを含み、該ポリメラーゼの少なくとも１種が逆転写酵素活性を有し、少なくとも１種が核酸ポリメラーゼ活性を有する、ＲＮＡ鋳型から核酸を生成するのに適した組成物。
【請求項２】
緩衝化剤、塩、及び／又はＲＴ−ＰＣＲに有用な添加剤を更に含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記アニオン性ポリマーが、ＲＴ−ＰＣＲで用いられるｐＨで少なくとも−１の正味電荷を有し、等量の対イオンを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記アニオン性ポリマーが、多糖類、ポリペプチド及び無水物からなる群から選択される、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
前記アニオン性ポリマーが、硫酸デキストラン、アルギン酸ナトリウム、ヘパリン、カラギーン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリフロレチンリン酸、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリ（プロピルアクリル酸）、ポリ（メチル−ビニル−エーテル−マレイン酸無水物）からなる群から選択される、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
逆転写酵素活性を示す前記ポリメラーゼが、ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ、ＡＭＶ−ＲＴ、Ｍ−ＭＬＶ−ＲＴ、ＨＩＶ−ＲＴ、ＥＩＡＶ−ＲＴ、ＲＡＶ２−ＲＴ、Ｃ．ハイドロゲノフォルマン（Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、スーパースクリプトＩ、スーパースクリプトＩＩ、スーパースクリプトＩＩＩ、並びに／又はその変異体、変種及び誘導体からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
核酸ポリメラーゼ活性を示す前記ポリメラーゼが、Ｔａｑ、Ｔｂｒ、Ｔｆｌ、Ｔｒｕ、Ｔｔｈ、Ｔｌｉ、Ｔａｃ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｋｏｄ、Ｂｓｔ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、Ｐｏｃ、Ｐａｂ、Ｍｔｈ、Ｐｈｏ、ＥＳ４、ＶＥＮＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ、並びに／又はその変異体、変種及び誘導体からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
下記工程を含む、ＲＮＡ鋳型から核酸を生成する方法：
ａ）少なくとも１種の逆転写酵素並びに／又はその変異体、変種及び誘導体と、少なくとも1種の核酸ポリメラーゼ並びに／又はその変異体、変種及び誘導体と、核酸ではないアニオン性ポリマーと、１種以上のオリゴヌクレオチドプライマーとを含む反応混合物に前記ＲＮＡ鋳型を加える工程、及び
ｂ）前記ＲＮＡ鋳型の一部に対して相補的な核酸分子を重合するのに十分な条件下で前記反応混合物をインキュベートする工程。
【請求項９】
前記アニオン性ポリマーが、ＲＴ−ＰＣＲで用いられるｐＨで少なくとも−１の正味電荷を有し、等量の対イオンを含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記アニオン性ポリマーが、多糖類、ポリペプチド、酸及び無水物からなる群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記アニオン性ポリマーが、硫酸デキストラン、アルギン酸ナトリウム、ヘパリン、カラギーン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリフロレチンリン酸、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリ（プロピルアクリル酸）、ポリ（メチル−ビニル−エーテル−マレイン酸無水物）からなる群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸がＤＮＡであり、かつ前記ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである、請求項８記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ、Ｔｂｒ、Ｔｆｌ、Ｔｒｕ、Ｔｔｈ、Ｔｌｉ、Ｔａｃ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｋｏｄ、Ｂｓｔ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、Ｐｏｃ、Ｐａｂ、Ｍｔｈ、Ｐｈｏ、ＥＳ４、ＶＥＮＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ、並びに／又はその変異体、変種及び誘導体からなる群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１４】
前記逆転写酵素が、ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ、ＡＭＶ−ＲＴ、Ｍ−ＭＬＶ−ＲＴ、ＨＩＶ−ＲＴ、ＥＩＡＶ−ＲＴ、ＲＡＶ２−ＲＴ、Ｃ．ハイドロゲノフォルマン（Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、スーパースクリプトＩ、スーパースクリプトＩＩ、スーパースクリプトＩＩＩ、並びに／又はその変異体、変種及び誘導体からなる群から選択される、請求項８記載の組成物。
【請求項１５】
少なくとも1種の逆転写酵素、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、及び少なくとも1種の核酸ではないアニオン性ポリマーを含む、請求項６〜１０のいずれか１項記載の連結ＲＴ−ＰＣＲを実施するためのキット。
【請求項１６】
更にｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの２種以上の混合物、並びに／又はＲＴ−ＰＣＲに有用な１種以上の添加剤、並びに／又は緩衝化剤を含む、請求項１１記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学の分野に関する。本発明は、ＲＮＡ鋳型からの核酸の生成、更に核酸の複製に有用な新規組成物、方法及びキットに関する。具体的には、本発明は、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による核酸の生成及び増幅に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の検出、分析、転写及び増幅は、近代分子生物学において最も重要な手段である。ＲＮＡ分析のためのこれらの手段の適用は、ほんの数例を挙げれば、遺伝子発現、感染性因子又は遺伝病の診断、ｃＤＮＡの生成及びレトロウイルスの分析の研究において特に重要である。一般にＲＴ−ＰＣＲと呼ばれる、ＲＮＡの逆転写に続くポリメラーゼ連鎖反応増幅は、ＲＮＡの検出及び定量のために広く用いられるようになってきた。
【０００３】
ＲＴ−ＰＣＲ法は、２種の別個の分子の合成：第一に、ＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡの合成と；第二に、ＰＣＲ増幅による、新規に合成されたｃＤＮＡの複製を必要とする。ＲＴ−ＰＣＲは、以下の３つの一般プロトコルによって実施することができる；
１）２ステップＲＴ−ＰＣＲとも呼ばれる、非連結（ｕｎｃｏｕｐｌｅｄ）ＲＴ−ＰＣＲ；
２）単一のポリメラーゼが、ＲＮＡからのｃＤＮＡ生成と、それに続くＤＮＡ増幅の両方で用いられる、単一酵素連結（ｃｏｕｐｌｅｄ）ＲＴ−ＰＣＲ（１ステップＲＴ−ＰＣＲ又は連続ＲＴ−ＰＣＲとも呼ばれる）；
３）少なくとも２種の別個のポリメラーゼが、初期のｃＤＮＡ合成と、それに続く複製で用いられる、２種（又はそれ以上）の酵素連結ＲＴ−ＰＣＲ。この方法は、１ステップＲＴ−ＰＣＲ、又はワンチューブＲＴ−ＰＣＲと呼ばれることもある。
【０００４】
非連結ＲＴ−ＰＣＲでは、逆転写は、逆転写酵素活性に最適な緩衝液及び反応条件を用いて、独立した工程として実施される。ｃＤＮＡ合成の後に、ＲＴ反応生成物の一定量を、ＰＣＲ増幅に最適な条件下で、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと共に、ＲＮＡ増幅の鋳型として用いる。
【０００５】
連結ＲＴ−ＰＣＲでは、逆転写及びＰＣＲ増幅は、単一の反応混合物に混合される。単一酵素ＲＴ−ＰＣＲは、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ等の特定のＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性を利用し、一方、２種酵素ＲＴ−ＰＣＲは、通常は、レトロウイルス又は細菌性逆転写酵素（例えば、ＡＭＶ−ＲＴ、ＭＭＬＶ−ＲＴ、ＨＩＶ−ＲＴ、ＥＩＡＶ−ＲＴ、ＲＡＶ２−ＲＴ、カルボキシドサーマス．ハイドロゲノフォルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、又はその変異体、変種もしくは誘導体）、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ、Ｔｂｒ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ、Ｔｆｌ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｋｏｄ、ＶＥＮＴ（登録商標）、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（登録商標）、Ｔｍａ、Ｔｎｅ、Ｂｓｔ、Ｐｈｏ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、ＥＳ４等、又はその変異体、変種もしくは誘導体）を用いる。
【０００６】
連結ＲＴ−ＰＣＲは、非連結ＲＴ−ＰＣＲを超える多数の利点をもたらす。連結ＲＴ−ＰＣＲは、必要な反応混合試薬及び核酸産物の処理が、非連結ＲＴ−ＰＣＲよりも少なく（例えば、２つの反応工程間の、成分又は酵素の添加のための反応チューブの開封等）、そのため労力が少なくなると共に時間がかからなくなり、汚染の危険性が低減する。更に、連結ＲＴ−ＰＤＲは必要な試料が少なく、試料の量が限定される場合（例えば、ＦＦＰＥ、生検、環境試料を用いる場合）に適用するのに特に適している。
【０００７】
単一酵素連結ＲＴ−ＰＣＲは、容易に実施されるが、このシステムは、必要とするＤＮＡポリメラーゼの量のために実施するのに費用がかかる。更に、単一酵素連結ＲＴ−ＰＣＲ法は、非連結ＲＴ−ＰＣＲよりも感度が低く、１キロ塩基対未満の長さの核酸を重合するのには限界があることがわかっている。２種以上の酵素を用いる連結ＲＴ−ＰＣＲシステムは、単一の反応混合物中で連結した場合であっても、一般に単一酵素システムよりも感度が向上することがわかっている。この効果は、ＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性と比較すると、逆転写酵素の効率が高いことに起因すると考えられる（Ｓｅｌｌｎｅｒ及びＴｕｒｂｅｔｔ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２５（２）：２３０−２３４（１９９８）、非特許文献１）。
【０００８】
２種酵素連結ＲＴ−ＰＣＲシステムは、単一酵素システムよりも、より感度が高いが、逆転写酵素は、ｃＤＮＡの複製の際にＤＮＡポリメラーゼを直接阻害することがわかっており、そのためこの方法の感度及び効果を低減させる（Ｓｅｌｌｎｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４０：２５５−２６４（１９９２）、非特許文献２）。ＤＮＡポリメラーゼに対する逆転写酵素の阻害活性を克服するための様々な解決法が試みられている。例えば、鋳型ＲＮＡ量の増加、逆転写酵素に対するＤＮＡポリメラーゼの比率の増加、ＤＮＡポリメラーゼに対する逆転写酵素の阻害活性を低下させる修飾試薬（例えば、非相同ｔＲＮＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、硫黄又はアセテート含有分子）の添加、及びＤＮＡポリメラーゼ添加前の逆転写酵素の熱不活性化が挙げられる。
【０００９】
Ｓｅｌｌｎｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０（７）：１４８７−１４９０、非特許文献３）には、ポリメラーゼ連鎖反応によるウイルスＲＮＡの検出には、ウイルスＲＮＡの事前の逆転写が必要であることが開示されている。多数の試料を処理するために必要な手作業による操作を最小限にするために、Ｓｅｌｌｎｅｒらは、逆転写及び増幅の両方に必要な全ての試薬を１本のチューブに加えることができ、かつ単一の中断されない熱サイクルプログラムを実施することのできるシステムを設計することを試みている。このような、Ｔａｑポリメラーゼ及び鳥類筋芽細胞ウイルスを用いるワンチューブシステムを構成する試みの際に、Ｓｅｌｌｎｅｒらは、ウイルスＲＮＡ検出の感度が相当に低下していることに気づいた。Ｓｅｌｌｎｅｒらは、Ｔａｑポリメラーゼによる逆転写の直接干渉を発見した。
【００１０】
しかし、上記全ての改変ＲＴ−ＰＣＲ法は重大な欠点を有している。鋳型ＲＮＡの増量は、限られた量の試料しか利用できない場合には不可能である。ＤＮＡポリメラーゼに対する逆転写酵素の比率を個別に最適化することは、１ステップＲＴ−ＰＣＲのためのすぐに使用できる試薬キットとしては実用的でない。ＤＮＡ重合に対する逆転写酵素阻害を排除するために現在提案されている修飾試薬の最終的な効果には議論の余地があり、未解決である。上記試薬による正の効果は、ＲＮＡ鋳型の量、ＲＮＡ組成に大きく依存しているか、又は特定の逆転写酵素−ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせが必要である可能性がある（Ｃｈａｎｄｌｅｒら、Ａｐｐｌ．ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４（２）：６６９−６７７（１９９８）、非特許文献４）。最後に、ＤＮＡポリメラーゼの添加前の逆転写酵素の熱不活性化は連結ＲＴ−ＰＣＲの利点を無効にし、既に議論した非連結ＲＴ−ＰＣＲの全ての不利益がもたらされる。たとえ、逆転写酵素を熱不活性化したとしても、おそらくｃＤＮＡ鋳型に対する熱不活性化逆転写酵素の結合により、ＰＣＲの阻害効果を付与する可能性がある。
【００１１】
ポリメラーゼ活性に対する逆転写酵素の阻害効果を低減させるためのいくつかの改良が行われた。
【００１２】
米国特許出願公開第２００９／０１３７００８号Ａ１（特許文献１）では、Ｇｏｎｇ及びＷａｎｇは、Ｓｓｏ７ｄ、Ｓａｃ７ｄ、Ｓａｃ７ｅ又はＳｓｏ７ｅ等の、非特異的方法で二重鎖ＤＮＡと結合するタンパク質、スルホン酸、及びスルホン酸塩により、ＤＮＡポリメラーゼに対する逆転写酵素の阻害効果を低減することを開示している。
【００１３】
欧州特許第１０５０５８７号Ｂ１（特許文献２）では、Ｍｉｓｓｅｌらは、ホモポリマー核酸により、ＤＮＡポリメラーゼに対する逆転写酵素の阻害効果を低減することを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０１３７００８号
【特許文献２】欧州特許第１０５０５８７号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｓｅｌｌｎｅｒ及びＴｕｒｂｅｔｔ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２５（２）：２３０−２３４（１９９８）
【非特許文献２】Ｓｅｌｌｎｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４０：２５５−２６４（１９９２）
【非特許文献３】Ｓｅｌｌｎｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０（７）：１４８７−１４９０）
【非特許文献４】Ｃｈａｎｄｌｅｒら、Ａｐｐｌ．ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４（２）：６６９−６７７（１９９８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
Ｇｏｎｇ及びＷａｎｇ、並びにＭｉｓｓｅｌらにより開示された方法によれば、それぞれ逆転写酵素の阻害効果が著しく低減することに成功したことが開示されているが、逆転写酵素の阻害効果のより効果的な低減によるＲＴ−ＰＣＲの特異性及び感度を更に向上させることが、当該技術分野において、まだ必要とされている。
【００１７】
ＲＴ−ＰＣＲの応用は重要なので、一般化したすぐに使用できる組成物の状態で高い特異性及び感度を示し、少量の初期試料しか必要とせず、実行者の操作量を低減し、汚染の危険性を最小限にし、試薬の費用を最小限にし、特定の反応緩衝液の使用に制限されず、かつ核酸最終産物の量を最大にする、連結ＲＴ−ＰＣＲシステムが、当該技術分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、ＲＮＡ鋳型から核酸を生成するのに有用な新規な組成物及び方法に関し、更に核酸の複製に関する。具体的には、本発明は、核酸ではないアニオン性ポリマーの存在下に、２種以上の異なるポリメラーゼを利用する逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による、核酸の生成及び増幅に関する。アニオン性ポリマーが存在すると、２種以上のポリメラーゼを含み、そのうち少なくとも１種が逆転写酵素活性を有する組成物を用いる場合に発生する、ＤＮＡプライマーアーゼの阻害の効果をなくす役目を果たす。本発明の組成物及び方法は、ＲＮＡ鋳型の一部と相補的なＤＮＡ分子を生成及び複製するために用いられる。
【００１９】
本発明は、概してＲＮＡ鋳型から核酸を生成及び複製するのに用いることのできる、全ての反応混合物に関する。本発明の一実施態様は、核酸ではないアニオン性ポリマー、並びに１種以上の以下の反応成分、すなわち逆転写酵素、核酸ポリメラーゼ、１種以上のオリゴヌクレオチドプライマー、１種以上のヌクレオチド塩基、適切な緩衝化剤、塩溶液、又はＲＴ−ＣＲに有用な他の添加剤を含む組成物に関する。
【００２０】
本発明は、ＲＮＡ標的からｃＤＮＡを生成するための既知の方法と比較し、いくつかの利点を提供する。利点としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：
−１つの反応溶液を含み、試薬及び生成物の取り扱いを低減する連結ＲＴ−ＰＣＲを許容し；
−ＲＮＡ鋳型の初期試料の少量の使用を許容し；
−さまざまな異なる逆転写酵素の使用を許容し；
−さまざまな異なるＤＮＡポリメラーゼの使用を許容し；
−追加の特異的反応添加剤を含有する緩衝液を含む、さまざまな異なる反応混合物緩衝液及び塩溶液の使用を許容し；
−例えば、ｔＲＮＡ添加剤で観察されるように、特異性及び生成物収量における悪影響を低減し；
−市販され、容易に合成でき、かつ安価な試薬で作動する。
【００２１】
したがって、本発明は、リボ核酸（ＲＮＡ）を含む試料からの核酸の迅速かつ効率的な生成、並びにＲＮＡ分子の検出及び定量を容易にする。さらに、本発明は、さまざまな産業、医療及び法医学の目的に用いることのできる、ｃＤＮＡの迅速な産生及び増幅にも有用である。本発明のアニオン性ポリマーは、核酸ではない任意の高分子（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）と定義され、本発明の酵素反応に用いられるｐＨで少なくとも−１の正味電荷を有し、等量の対陽イオンを含む。本発明の一実施態様では、酵素反応に用いられるｐＨにおけるアニオン性ポリマーの正味電荷は、−１〜−１０，００００の範囲であり、好ましくは−５〜−５，０００の範囲であり、更に好ましくは−１０〜−１，０００の範囲であり、最も好ましくは−２０〜−２００の範囲である。全てのケースで、等量の対イオンが存在する。本発明の一実施態様では、アニオン性ポリマーは多糖類である。本発明の他の実施態様では、アニオン性ポリマーはポリペプチドである。本発明の更に他の実施態様では、アニオン性ポリマーは、酸又は無水物である。好ましい実施態様では、アニオン性ポリマーは、硫酸デキストラン、アルギン酸ナトリウム、ヘパリン、カラギーン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリフロレチンリン酸、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリ（プロピルアクリル酸）、ポリ（メチル−ビニル−エーテル−マレイン酸無水物）、又は上記アニオン性ポリマーの２種以上の混合物からなる群から選択される。ＲＴ−ＰＣＲに用いられるアニオン性ポリマーの量は、１ｐｇ／ｍＬより多くてもよく、好ましくは１ｐｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬであり、更に好ましくは１０ｐｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬであり、最も好ましくは１ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬである。用いられるアニオン性ポリマーに応じて、ＲＴ−ＰＣＲに用いられるアニオン性ポリマーの濃度を変えてもよい。
【００２２】
本発明は、上記の好ましい最終濃度より高い濃度でアニオン性ポリマーを含む組成物を包含するが、例えば、反応混合物の追加成分と混合することにより、希釈されて好ましい最終濃度に達することが意図される。
【００２３】
逆転写酵素は、逆転写酵素活性を示す任意のポリメラーゼであることができる。好ましくは、逆転写酵素は、ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、ＡＭＶ−ＲＴ、ＭＭＬＶ−ＲＴ、ＨＩＶ−ＲＴ、ＥＩＡＶ−ＲＴ、ＲＡＶ２−ＲＴ、Ｃ．ハイドロゲノフォルマン（Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、スーパースクリプトＩ（登録商標）、スーパースクリプトＩＩ（登録商標）、スーパースクリプトＩＩＩ（登録商標）、又は逆転写酵素活性を有する、それらの変異体、変種及び誘導体である。
【００２４】
本明細書で用いられる場合、変異体、変種及び誘導体は、化学種の明確な化学的活性をなお残存している、存在し得、又は産生し得る化学種の全ての置換体（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ）を意味する。例としては、検出可能に標識され、又は他の方法で修飾されており、それによって化合物の化学的又は物理学的特性が変化する化合物が挙げられるが、それらに限定されない。
【００２５】
好ましい実施態様では、核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼであることができる。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ分子を複製することのできる任意のポリメラーゼであることができる。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲに有用な熱安定性ポリメラーゼである。更に好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ、Ｔｂｒ、Ｔｔｈ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ、Ｔｆｌ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｋｏｄ、ＶＥＮＴ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ、Ｔｍａ、Ｔｎｅ、Ｂｓｔ、Ｐｈｏ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、Ｐｏｃ、Ｐａｂ、ＥＳ４、又はＤＮＡポリメラーゼ活性を有する、それらの変異体、変種及び誘導体である。
【００２６】
オリゴヌクレオチドプライマーは、２以上のヌクレオチド長の任意のオリゴヌクレオチドであることができる。プライマーは、ランダムプライマー、ホモポリマー又は標的ＲＮＡ鋳型に特異的なプライマー、例えば配列特異的プライマーであってもよい。
【００２７】
更なる組成物の実施態様は、アニオン性ポリマーと、１種以上のヌクレオチド又はその誘導体等の他の反応混合物成分とを含む。好ましくは、ヌクレオチドは、デオキシヌクレオチド三リン酸、ｄＮＴＰ、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、α−チオ−ｄＴＮＰ、ビオチン−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−ｄＵＴＰ、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰである。
【００２８】
本発明の緩衝化剤、塩溶液及び他の添加剤は、ＲＴ−ＰＣＲに有用な溶液を含む。好ましい緩衝化剤としては、例えば、ＴＲＩＳ、ＴＲＩＣＩＮＥ、ＢＩＳＴＲＩＣＩＮＥ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＴＡＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＣＡＰＳが挙げられる。好ましい塩溶液としては、例えば、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、及び酢酸リチウムが挙げられる。好ましい添加剤としては、例えば、ＤＭＳＯ、グリセロール、ホルムアミド、ベタイン、塩化テトラメチルアンモニウム、ＰＥＧ、Ｔｗｅｅｎ  ２０、ＮＰ４０、エクトイン、ポリオール、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢタンパク質、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質及びＢＳＡが挙げられる。更なる組成物の実施態様は、ＤＮＡポリメラーゼについての逆転写酵素の阻害効果を低減することがわかっている他の成分、例えば、欧州特許第１０５０５８７号Ｂ１に開示されているホモポリマー核酸を含む。
【００２９】
本発明の更なる実施態様は、ＲＮＡ鋳型からの核酸の生成法、更に核酸の複製に関する。該方法は、ａ）ＲＮＡ鋳型を、少なくとも１種の逆転写酵素並びに／又はその変異体、変種及び誘導体と、少なくとも1種の核酸ポリメラーゼ並びに／又はその変異体、変種及び誘導体と、核酸ではないアニオン性ポリマーと、１種以上のオリゴヌクレオチドプライマーとを含む反応混合物に加える工程、及びｂ）上記ＲＮＡ鋳型の一部と相補的な核酸分子を重合するのに十分な条件下で上記反応混合物をインキュベートする工程を含む。好ましい実施態様では、該方法は、上記ＲＮＡ鋳型の少なくとも一部に相補的なＤＮＡ分子の複製を含む。更に好ましくは、ＤＮＡ複製法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。最も好ましくは、該方法は、連結逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む。
【００３０】
本発明のアニオン性ポリマーは、核酸ではない任意の高分子と定義され、本発明の酵素反応に用いられるｐＨで少なくとも−１の正味電荷を有し、等量の対陽イオンを含む。本発明の一実施態様では、酵素反応に用いられるｐＨにおけるアニオン性ポリマーの正味電荷は、−１〜−１０，００００の範囲であり、好ましくは−５〜−５，０００の範囲であり、更に好ましくは−１０〜−１，０００の範囲であり、最も好ましくは−２０〜−２００の範囲である。全てのケースで、等量の対イオンが存在する。本発明の一実施態様では、アニオン性ポリマーは多糖類である。本発明の他の実施態様では、アニオン性ポリマーはポリペプチドである。本発明の更に他の実施態様では、アニオン性ポリマーは、酸又は無水物である。好ましい実施態様では、アニオン性ポリマーは、硫酸デキストラン、アルギン酸ナトリウム、ヘパリン、カラギーン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリフロレチンリン酸、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリ（プロピルアクリル酸）、ポリ（メチル−ビニル−エーテル−マレイン酸無水物）、又は上記アニオン性ポリマーの２種以上の混合物からなる群から選択される。ＲＴ−ＰＣＲに用いられるアニオン性ポリマーの量は、１ｐｇ／ｍＬより多くてもよく、好ましくは１ｐｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬであり、更に好ましくは１０ｐｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬであり、最も好ましくは１ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬである。用いられるアニオン性ポリマーに応じて、ＲＴ−ＰＣＲに用いられるアニオン性ポリマーの濃度を変えてもよい。
【００３１】
更に具体的な実施態様では、ＲＴ−ＰＣＲは約４℃〜約１００℃で起こる。好ましくは、逆転写が約２５℃〜約７５℃で起こり、次いでＰＣＲが約４０℃〜約９８℃で起こる。最も好ましい条件下で、逆転写が約３７℃〜約６０℃で起こり、変性が約９４℃で起こり、アニーリングが約６０℃で起こり、重合が約７２℃で起こる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】流行性Ｈ１Ｎ１／０９ウイルス由来のウイルスＲＮＡを逆転写し、次いでＡ型インフルエンザウイルスのマトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）遺伝子用の遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。硫酸デキストランが存在しないか（レーン１〜２）、３．２ｎｇ／ｍＬ（レーン３〜４）、３２ｎｇ／ｍＬ（レーン５〜６）、１６０ｎｇ／ｍＬ（レーン７〜８）、３２０ｎｇ／ｍＬ（レーン９〜１０）及び６４０ｎｇ／ｍＬ（レーン１１〜１２）の最終濃度で硫酸デキストランを加えた。
【図２】流行性Ｈ１Ｎ１／０９ウイルス由来のウイルスＲＮＡを逆転写し、次いでマトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）遺伝子用の遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。硫酸デキストランが存在しないか（レーン１〜２）、３２０ｎｇ／ｍＬ（レーン３〜４）、６４０ｎｇ／ｍＬ（レーン５〜６）、１．６μｇ／ｍＬ（レーン７〜８）、３．２μｇ／ｍＬ（レーン９〜１０）、６．４μｇ／ｍＬ（レーン１１〜１２）及び１６μｇ／ｍＬの濃度で硫酸デキストランを加えた。
【図３】流行性Ｈ１Ｎ１／０９ウイルス由来のウイルスＲＮＡを、マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）遺伝子用の遺伝子特異的プライマーを用いて逆転写した。次いで、逆転写混合物をＰＣＲマスターミックスと混合し、マトリックス遺伝子を増幅した。硫酸デキストランの完全非存在下（レーン１〜２）、ＰＣＲでのみ４８０ｎｇ／ｍＬの硫酸デキストランを用い（レーン３〜４）、又は逆転写で硫酸デキストランを用い（レーン５〜６）、反応を二通り（ｉｎ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）行った。
【図４】１０ｎｇのＨｅＬａ細胞からの全ＲＮＡを逆転写し、次いで硫酸デキストランの非存在下（レーン−ＤＳ）又は６４０ｎｇ／ｍＬの硫酸デキストランを用いて（レーン＋ＤＳ）、ラミン（Ｌａｍｉｎ）Ａ／Ｃ用の遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
【図５】１０ｎｇのＨｅＬａ細胞からの全ＲＮＡを逆転写し、次いで硫酸デキストランの非存在下（レーン１〜２）又は６４０ｎｇ／ｍＬの硫酸デキストランを用いて（レーン３〜４）、ＴＮＦＲ１用の遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
【図６】１０ｎｇのＨｅＬａ細胞からの全ＲＮＡを逆転写し、次いでアルギン酸ナトリウムの非存在下で（レーン１〜２）、又は４０ｎｇ／ｍＬ（レーン３〜４）、８ｎｇ／ｍＬ（レーン５〜６）及び４ｎｇ／ｍＬ（レーン７〜８）の最終濃度のアルギン酸ナトリウムを用いて、ＴＮＦＲ１用の遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、ＲＮＡ鋳型からの核酸の生成、具体的には、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）産生及び核酸の分析に使用する組成物及び方法に関する。本発明は、ＲＮＡ鋳型からの核酸の生成に有用な１種以上の成分と一緒に、核酸ではないアニオン性ポリマーを含む組成物を提供する。このような成分としては、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、１種以上のオリゴヌクレオチドプライマー、１種以上の任意のヌクレオチド塩基、適切な緩衝化剤、ＲＴ又はＲＴ−ＰＣＲに有用な塩又は他の添加剤（欧州特許第1050587号Ｂ１に開示されているホモポリマー核酸等の核酸が挙げられる）が挙げられる。本発明の方法は、ＲＮＡ鋳型から核酸を生成するための、また好ましくは新規に合成された核酸を複製するための他の試薬と一緒にアニオン性ポリマーを利用する。核酸分子の生成、複製、分析、定量、及び他の操作に有用な本発明の組成物及び方法は、連結又は非連結ＲＴ−ＰＣＲ手段に最も有用である。
【００３４】
ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡ鋳型に由来する核酸を生成及び複製するために用いられる、１分子操作である。ＲＴ−ＰＣＲは、本明細書で、本発明の組成物及び方法を利用することのできる代表的なプロトコルとして記載されているが、これに限定されない。当業者は、本発明が、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼ活性との組み合わせを必要とする他の方法においても有用であると理解している。ＲＴ−ＰＣＲは、２つの別個の分子合成：１）ＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡ合成；２）ＰＣＲ増幅による、新規に合成されたｃＤＮＡの複製を必要とする。
【００３５】
逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＴ−ＰＣＲでは、反応混合物を、最初に、ＲＮＡ鋳型の少なくとも一部と相補的なＤＮＡ分子を合成するのに十分な温度で（適切な緩衝化剤中で）インキュベートする。逆転写反応混合物の成分としては、通常は、そこから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が転写されるＲＮＡ鋳型；逆転写酵素活性を示す核酸ポリメラーゼ；及び核酸合成に必要な適切なヌクレオチド構成要素（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋｓ）が挙げられる。本発明の目的のため、ｃＤＮＡは、その核酸配列がＲＮＡ分子に相補的である、任意のＤＮＡ分子と定義される。ＲＮＡ鋳型は、そこからｃＤＮＡ分子を合成することができる、核酸配列を提供するために用いられる任意のＲＮＡ分子と定義される。ＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡの合成は、通常は、逆転写酵素活性を示す核酸ポリメラーゼを利用することにより達成される。本発明の目的のため、逆転写酵素活性とは、ＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡ分子を重合する酵素の能力を意味し、逆転写酵素は、広く逆転写酵素活性を有する任意の酵素を意味する。逆転写は、通常は、約２０℃〜約７５℃、好ましくは約３５℃〜約７０℃の範囲の温度で起こる。
【００３６】
ｃＤＮＡ分子を生成するためのＲＮＡ鋳型の逆転写後、該ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡ分子の複製に十分な条件下（適切な緩衝剤中で）、インキュベートする。該反応混合物は、連結（連続又は１ステップとも呼ばれる）ＲＴ−ＰＣＲで用いられる、従来の逆転写酵素反応混合物のものと同じであってもよく、又は該反応混合物は、従来の逆転写反応混合物の一定量を含んでもよく、かつ、非連結（又は２ステップ）ＲＴ−ＰＣＲのように、核酸複製を更に修飾してもよい。複製反応混合物の成分としては、通常は、核酸鋳型（この例ではｃＤＮＡ）；核酸ポリメラーゼ；及び核酸の合成に必要な適切なヌクレオチド構成要素が挙げられる。核酸複製とは、その配列が他の核酸により決定され、かつ該他の核酸と相補的である核酸の重合を意味する。本明細書で用いられる場合、ＤＮＡ複製はＤＮＡ増幅と同義語である。好ましくは、ＤＮＡ増幅は、繰り返し起こり、核酸配列の両方の鎖、すなわち、ＲＮＡ鋳型に相補的なＤＮＡと、その核酸配列がＲＮＡ鋳型と実質的に同一であるＤＮＡを複製することである。反復的又は周期的なＤＮＡ複製は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における熱安定性ポリメラーゼを用いて都合よく達成することができる。
【００３７】
ＰＣＲは、当該技術分野で周知の技術である。ＰＣＲは、反応混合物に以下のサイクルを供することにより核酸を増幅するために用いられる。（i）核酸変性、（ii）オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング、及び（iii）核酸重合である。増幅の好ましい反応条件には、熱サイクル、すなわち、ＰＣＲサイクルの各工程を促進するように、反応混合物の温度を変化させることが含まれる。ＰＣＲは、通常は、変性、アニーリング、及び複製の複数サイクルを通じて伸長され、（任意に及び好ましくは）初期の変性工程の延長、及び最後の伸長（重合）ステップの延長で増大される。熱サイクルは、通常は、約２３℃〜約１００℃、好ましくは約３７℃〜約９５℃の範囲の温度で起こる。核酸変性は、通常は、約９０℃〜約１００℃で、好ましくは約９４℃で起こる。アニーリングは、通常は、約３７℃〜約７５℃、好ましくは約５５℃で起こる。重合は、通常は、約５５℃〜約８０℃、好ましくは約７２℃で起こる。熱サイクルの数は、実施者の好み、所望のＤＮＡ産物の量により、大きく変動する。好ましくは、ＰＣＲサイクルの数は、約５〜約９９サイクルの範囲、更に好ましくは約２０サイクル以上、最も好ましくは約４０サイクルである。
【００３８】
鋳型ＲＮＡ
鋳型ＲＮＡは、実施者にとって既知又は未知の、目的の任意のリボ核酸であることができる。鋳型ＲＮＡは、人工的に合成しても、天然供給源から単離してもよい。ある実施態様では、ＲＮＡ鋳型は、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ，ｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡおよびウイルスＲＮＡ等のリボ核酸であることもできる。好ましくは、ＲＮＡはｍＲＮＡである。更に好ましくは、ＲＮＡは生物活性であるか、生物活性ポリペプチドをコードする。
【００３９】
アニオン性ポリマー
本発明は、アニオン性ポリマーが、ＲＴ−ＰＣＲで観察される、逆転写酵素による核酸複製の阻害を抑制又は低減し得る阻害低減剤としての役目を果たすことの発見に関する。
本発明のアニオン性ポリマーは、核酸ではなく、本発明の酵素反応で用いられるｐＨで少なくとも−１の正味電荷を有し、等量の対陽イオンを含む任意の高分子と定義される。本発明の一実施態様では、酵素反応に用いられるｐＨにおけるアニオン性ポリマーの正味電化は、−１〜−１０，００００の範囲であり、好ましくは−５〜−５，０００の範囲であり、更に好ましくは−１０〜−１，０００の範囲であり、最も好ましくは−２０〜−２００の範囲である。全てのケースで、等量の対イオンが存在する。本発明の一実施態様では、アニオン性ポリマーは多糖類である。本発明の他の実施態様では、アニオン性ポリマーはポリペプチドである。本発明の更に他の実施態様では、アニオン性ポリマーは、酸又は無水物である。好ましい実施態様では、アニオン性ポリマーは、硫酸デキストラン、アルギン酸ナトリウム、ヘパリン、カラギーン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリフロレチンリン酸、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリ（プロピルアクリル酸）、ポリ（メチル−ビニル−エーテル−マレイン酸無水物）、又は上記アニオン性ポリマーの２種以上の混合物からなる群から選択される。ＲＴ−ＰＣＲに用いられるアニオン性ポリマーの量は、１ｐｇ／ｍＬより多くてもよく、好ましくは１ｐｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬであり、更に好ましくは１０ｐｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬであり、最も好ましくは１ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬである。用いられるアニオン性ポリマーに応じて、ＲＴ−ＰＣＲに用いられるアニオン性ポリマーの濃度を変えてもよい。
【００４０】
逆転写酵素
本発明で有用な逆転写酵素は、逆転写酵素活性を示す任意のポリメラーゼであることができる。いくつかの逆転写酵素は当該技術分野で既知であり、市販されている。好ましい逆転写酵素としては、ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、ニワトリ骨髄芽球腫ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）、ヒト免疫ウイルス逆転写酵素（ＨＩＶ−ＲＴ）、ＥＩＡＶ−ＲＴ、ＲＡＶ２−ＲＴ、Ｃ．ハイドロゲノフォルマン（Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、スーパースクリプトＩ、スーパースクリプトＩＩ、スーパースクリプトＩＩＩ、並びにその変異体、変種及び誘導体が挙げられる。本発明では、さまざまな逆転写を使用することができ、本発明の範囲又は好ましい実施態様を逸脱しない限り、上記に具体的に記載されていない逆転写酵素が含まれることを理解すべきである。
【００４１】
ＤＮＡポリメラーゼ
本発明で有用なＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ分子を複製することができる任意のポリメラーゼであることができる。好ましいＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼであり、これはＰＣＲにとって特に有用である。熱安定性ポリメラーゼは、サーマス・アクティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）、サーマス・ブロキアナス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）（Ｔｂｒ）、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）（Ｔｆｌ）、サーマス・ルベル（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）（Ｔｒｕ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｔｌｉ）、及びサーモコッカス属の他の種、サーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）（Ｔａｃ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）（Ｔｎｅ）、サーモトガ・マリチメ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍｅ）（Ｔｍａ）、及びサーモトガ属の他の種、ピュロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）、ピュロコッカス・ウォエセイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ）（Ｐｗｏ）、及びピュロコッカス属の他の種、バキュラス・ステロサーモフィラス（Ｂａｃｕｌｌｕｓ  ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｂｓｔ）、スルホロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）（Ｓａｃ）、スルホロブス・ソルファタリクス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）（Ｓｓｏ）、ピロジクチウム・オクルタム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍ）（Ｐｏｃ）、ピロジクチウム・アビシ（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ａｂｙｓｓｉ）（Ｐａｂ）、及びメタノバクテリウム・サーモアウトトロフィクス（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（Ｍｔｈ）、及びその変異体、変種若しくは誘導体等の様々な好熱性細菌から単離される。
【００４２】
いくつものＤＮＡポリメラーゼが既知であり、市販されている。好ましい熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ、Ｔｂｒ、Ｔｆｌ、Ｔｒｕ、Ｔｔｈ、Ｔｌｉ、Ｔａｃ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｋｏｄ、Ｂｓｔ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、Ｐｏｃ、Ｐａｂ、Ｍｔｈ、Ｐｈｏ、ＥＳ４、ＶＥＮＴ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ、並びにその変異体、変種及び誘導体からなる群から選択される。本発明では、さまざまなＤＮＡポリメラーゼを使用することができ、本発明の範囲又は好ましい実施態様を逸脱しない限り、上記に具体的に記載されていないＤＮＡポリメラーゼが含まれることを理解すべきである。
【００４３】
オリゴヌクレオチドプライマー
本発明で有用なオリゴヌクレオチドウライマーは、２以上のヌクレオチド長の任意のオリゴヌクレオチドであることができる。好ましくは、ＰＣＲプライマーは、約１５〜約３０塩基長であり、回文構造（自己相補的）又は反応混合物で用いることのできる他のプライマーと相補的ではない。プライマーは、ランダムプライマー、ホモポリマー、又は標的ＲＮＡ鋳型に特異的なプライマー（例えば、配列特異的プライマー）であることができるが、これらに限定されない。オリゴヌクレオチドプライマーは、相補的核酸の重合を促進する、標的核酸の領域とハイブリダイズするために用いられるオリゴヌクレオチドである。好ましいＲＴ−ＰＣＲ法では、プライマーはＲＮＡ鋳型の一部に相補的な第一の核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）の逆転写の促進に役立ち、核酸の複製（例えば、ＤＮＡのＰＣＲ増幅）の促進にも役立つ。任意のプライマーは、当業者により合成することができ、又は任意の多数の供給業者から購入することができる。本発明では、多数のアレイのプライマーを使用することができ、本発明の範囲又は好ましい実施態様を逸脱しない限り、上記に具体的に記載されていないプライマーが含まれることを理解すべきである。
【００４４】
ヌクレオチド塩基
本発明で有用なヌクレオチド塩基は、核酸の重合において有用な任意のヌクレオチドであることができる。ヌクレオチドは、天然に存在する、ありふれていない（ｕｎｕｓｕａｌ）、修飾された、誘導体化された、又は人工的なものであってもよい。ヌクレオチドは、未標識であってもよく、当該技術分野で既知の方法で（例えば、放射性同位体、ビタミン類、蛍光性又は化学発光性部分、ジオキシゲニンを用いて）検出可能に標識してもよい。好ましくは、該ヌクレオチドは、デオキシヌクレオシド３リン酸、ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、α−チオ−ｄＮＴＰｓ、ビオチン−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−ｄＵＴＰ、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ）である。ｄＮＴＰは、当該技術分野で周知であり、市販されている。
【００４５】
緩衝化剤および塩溶液
本発明で有用な緩衝剤及び塩は、核酸合成のため、例えば逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼ活性のために、適切で安定なｐＨ及びイオン条件をもたらす。本発明で有用な、さまざまな緩衝液及び塩溶液及び修正緩衝液が当該技術分野で既知であり、本明細書に具体的に開示されていない物質も含まれる。好ましい緩衝化剤としては、ＴＲＩＳ、ＴＲＩＣＩＮＥ、ＢＩＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＴＡＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＣＡＰＳが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい塩溶液としては、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、及び酢酸リチウムの溶液が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
ＲＴ−ＰＣＲに有用な他の添加剤
逆転写、複製、及び／又は両反応の組み合わせを促進し得る他の添加剤（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ促進のための物質）、本発明により最初に開示されたもの以外の他のものが、当該技術分野で既知である。本発明の組成物及び方法によれば、ＲＮＡ鋳型からの核酸の生成及び複製を最適化するため、１種以上の上記添加剤を本発明の組成物に含有させてもよい。添加剤は、有機又は無機の化合物であることができる。本発明で有用な阻害低減剤としては、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、アルブマックス、カゼイン、ゼラチン、コラーゲン、グロブリン、リゾチーム、トランスフェリン、ミオグロビン、ヘモグロビン、α−ラクトアルブミン、フマラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、アミログルコシダーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、β−ラクトグロブリン、アプロチニン、大豆トリプシン阻害剤、トリプシノーゲン、ホスホリラーゼｂ、ミオシン、アクチン、β−ガラクトシダーゼ、カタラーゼ、大豆トリプシン消化物、トリプトース、レクチン、大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質等のポリペプチド、又はこれらの断片若しくは誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。非ポリペプチド添加剤の例としては、ホモポリマー核酸、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、硫酸含有化合物、酢酸含有化合物、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ホルムアミド、ベタイン、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｔｗｅｅｎ２０、ＮＰ４０、エクトイン、及びポリオールが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい添加剤としては、ホモポリマー核酸、ＤＭＳＯ、グリセロール、ホルムアミド、ベタイン、ＴＭＡＣ、ＰＥＧ、Ｔｗｅｅｎ２０、ＮＰ４０、エクトイン、ポリオール、大腸菌ＳＳＢタンパク質、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質、及びＢＳＡが挙げられる。
【００４７】
連結ＲＴ−ＰＣＲのための試薬キット
本発明の更なる態様は、少なくとも１種の逆転写酵素、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、及び少なくとも１種の核酸ではないアニオン性ポリマーを含む、連結ＲＴ−ＰＣＲのための試薬キットである。このような試薬キットでは、上記逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及びアニオン性ポリマーを、１個の容器内で組合せてもよい。また、上記逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを１個の容器内で組合せ、上記アニオン性ポリマーを第二の容器内に入れてもよい。また、上記逆転写酵素及び上記アニオン性ポリマーを１個の容器内で組合せ、上記ＤＮＡポリメラーゼを第二の容器内に入れてもよい。また、上記ＤＮＡポリメラーゼ及び上記アニオン性ポリマーを１個の容器内で組合せ、上記逆転写酵素を第二の容器内に入れてもよい。また、３種全ての成分を別個の容器に入れてもよい。上記試薬キットは、更に２種以上のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰの混合物、並びに／又は１種以上のＲＴ−ＰＣＲに有用な添加剤、並びに／又は緩衝化剤を含んでいてもよい。上記の全ての成分を別個の容器に入れるか、２種以上の成分を１個の容器内で組合せてもよい。好ましくは、２種の酵素を１個の容器内で組合せ、アニオン性ポリマーを一緒に入れるか、アニオン性ポリマーを別個の容器内に入れ、存在する場合には、緩衝化剤、ｄＮＴＰ混合物、及び１種以上の有用な添加剤を別個の容器内でキットに提供する。
本発明の更なる態様は、連結ＲＴ−ＰＣＲのための、上記組成物又は試薬キットの使用である。
【００４８】
本発明の特定の実施態様は以下の通りである：
核酸ではないアニオン性ポリマー、１種以上のオリゴヌクレオチドプライマー、１種以上のヌクレオチド又はその誘導体のいずれか、及び２種以上の異なるポリメラーゼを含み、該ポリメラーゼの少なくとも１種が逆転写酵素活性を有し、少なくとも１種が核酸ポリメラーゼ活性を有する、ＲＮＡ鋳型から核酸を生成するのに適した組成物。
上記組成物は、更に緩衝化剤、塩、及び／又はＲＴ−ＰＣＲに有用な添加剤を含む。
上記アニオン性ポリマーが核酸ではなく、ＲＴ−ＰＣＲで用いられるｐＨで少なくとも−１の正味電荷を有し、等量の対イオンを含む、上記組成物。
上記アニオン性ポリマーの正味電荷が、−１〜−１０，００００の範囲であり、好ましくは−５〜−５，０００の範囲であり、更に好ましくは−１０〜−１，０００の範囲であり、最も好ましくは−２０〜−２００の範囲である、上記組成物。全てのケースで、等量の対イオンが存在する。
上記アニオン性ポリマーが、多糖類、ポリペプチド、酸又は無水物である、上記組成物。
上記アニオン性ポリマーは、硫酸デキストラン、アルギン酸ナトリウム、ヘパリン、カラギーン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリフロレチンリン酸、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリ（プロピルアクリル酸）、ポリ（メチル−ビニル−エーテル−マレイン酸無水物）、又は上記アニオン性ポリマーの２種以上の混合物からなる群から選択される、上記組成物。
【００４９】
上記逆転写酵素活性を示すポリメラーゼが、ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ、ＡＭＶ−ＲＴ、ＭＭＬＶ−ＲＴ、ＨＩＶ−ＲＴ、ＥＩＡＶ−ＲＴ、ＲＡＶ２−ＲＴ、Ｃ．ハイドロゲノフォルマン（Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、スーパースクリプトＩ、スーパースクリプトＩＩ、スーパースクリプトＩＩＩ、並びに／又はその変異体、変種及び誘導体からなる群から選択される、上記組成物。
【００５０】
上記核酸ポリメラーゼ活性を示すポリメラーゼが、Ｔａｑ、Ｔｂｒ、Ｔｆｌ、Ｔｒｕ、Ｔｔｈ、Ｔｌｉ、Ｔａｃ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｋｏｄ、Ｂｓｔ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、Ｐｏｃ、Ｐａｂ、Ｍｔｈ、Ｐｈｏ、ＥＳ４、ＶＥＮＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ、並びに／又はその変異体、変種及び誘導体からなる群から選択される、上記組成物。
【００５１】
下記工程を含む、ＲＮＡ鋳型から核酸を生成する方法：
ａ）上記ＲＮＡ鋳型を反応混合物に加える工程であって、上記反応混合物が、少なくとも１種の逆転写酵素並びに／又はその変異体、変種及び誘導体と、少なくとも1種の核酸ポリメラーゼ並びに／又はその変異体、変種及び誘導体と、核酸ではないアニオン性ポリマーと、１種以上のオリゴヌクレオチドプライマーとを含む工程、及び
ｂ）上記ＲＮＡ鋳型の一部と相補的な核酸分子を重合するのに十分な条件下で上記反応混合物をインキュベートする工程。
上記アニオン性ポリマーが核酸ではなく、ＲＴ−ＰＣＲで用いられるｐＨで少なくとも−１の正味電荷を有し、等量の対イオンを含む、上記方法。
上記アニオン性ポリマーの正味電荷が、−１〜−１０，００００の範囲であり、好ましくは−５〜−５，０００の範囲であり、更に好ましくは−１０〜−１，０００の範囲であり、最も好ましくは−２０〜−２００の範囲である、上記方法。全てのケースで、等量の対イオンが存在する。
上記アニオン性ポリマーが、多糖類、ポリペプチド、酸又は無水物である、上記方法。
上記アニオン性ポリマーが、硫酸デキストラン、アルギン酸ナトリウム、ヘパリン、カラギーン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリフロレチンリン酸、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリ（プロピルアクリル酸）、ポリ（メチル−ビニル−エーテル−マレイン酸無水物）、又は上記アニオン性ポリマーの２種以上の混合物からなる群から選択される、上記方法。
【００５２】
上記核酸がＤＮＡであり、上記ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである、上記方法。
【００５３】
上記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ、Ｔｂｒ、Ｔｆｌ、Ｔｒｕ、Ｔｔｈ、Ｔｌｉ、Ｔａｃ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｋｏｄ、Ｂｓｔ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、Ｐｏｃ、Ｐａｂ、Ｍｔｈ、Ｐｈｏ、ＥＳ４、ＶＥＮＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ、並びに／又はその変異体、変種及び誘導体からなる群から選択される、上記方法。
【００５４】
上記逆転写酵素が、ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ、ＡＭＶ−ＲＴ、Ｍ−ＭＬＶ−ＲＴ、ＨＩＶ−ＲＴ、ＥＩＡＶ−ＲＴ、ＲＡＶ２−ＲＴ、Ｃ．ハイドロゲノフォルマン（Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、スーパースクリプトＩ、スーパースクリプトＩＩ、スーパースクリプトＩＩＩ、並びに／又はその変異体、変種及び誘導体からなる群から選択される、上記方法。
【００５５】
少なくとも1種の逆転写酵素、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、及び少なくとも1種の核酸ではないアニオン性ポリマーを含む、連結ＲＴ−ＰＣＲを実施するためのキット。
【００５６】
更にｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの２種以上の混合物、並びに／又はＲＴ−ＰＣＲに有用な１種以上の添加剤、並びに／又は緩衝化剤を含む、連結ＲＴ−ＰＣＲを実施するためのキット。
【実施例】
【００５７】
実施例１：
アニオン性ポリマーを使用することによりＲＴ−ＰＣＲの特異性が向上することを証明するために、Ａ型インフルエンザウイルス由来のＲＮＡを含む試料に、硫酸デキストラン８０００（Ｓｉｇｍａ）を、量を少しずつ増やしながら加えた。ＲＴ−ＰＣＲのためのＲＮＡ鋳型として、Ａ型インフルエンザウイルスのマトリックス遺伝子を選択した。
Ａ型インフルエンザウイルスのグループに属する、流行性Ｈ１Ｎ１／０９ウイルス由来のウイルスＲＮＡを、鋳型としての５μＬのウイルスＲＮＡ、逆転写酵素（ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ，ＱＩＡＧＥＮ）、２．５単位のＨｏｔＳｔａｒ  Ｆａｓｔ  Ｔａｑ  １ステップＲＴ−ＰＣＲ緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ）（最終濃度１倍）、各０．４ｍＭのｄＮＴＰ混合物、各０．６μＭの、Ａ型インフルエンザウイルスのマトリックス遺伝子のための順方向プライマー（配列番号：１）及び逆方向プライマー（配列番号：２）、及び３．２ｎｇ／ｍＬ〜６４０ｎｇ／ｍＬの濃度の硫酸デキストランを含む、最終容量２５μＬ中で反応させた。逆転写反応混合物を５０℃で３０分間インキュベートし、次いで９５℃で５分間加熱した。その後、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、及び７２℃で１分からなる４５サイクルを実施した。
試料（二通り）をアガロースゲルで分析した（図１）。硫酸デキストランを加えることにより、効率及び特異性の向上が観察された。硫酸デキストランの量を増やすことにより、ＲＴ−ＰＣＲ産物の収量が著しく増加した。この実験で、３２０及び６４０ｎｇ／ｍＬの硫酸デキストリンによって最善の結果が示され（レーン９〜１２）、非常に低濃度の硫酸デキストラン（３．２ｎｇ／ｍL、レーン３〜４）でさえ、硫酸デキストランをＲＴ−ＰＣＲに加えていない対照の反応（レーン１〜２）と比較して明らかなプラスの影響が示された。
【００５８】
実施例２：
より高濃度の硫酸デキストランがＲＴ−ＰＣＲにおいて悪影響を与えるかどうかを判定するため、より高濃度の硫酸デキストランを用いた。硫酸デキストランの濃度を除き、反応条件は実施例１に記載したのと同じである。本実施例における硫酸デキストランの濃度は、０．３２μｇ／ｍＬ〜１６μｇ／ｍＬである。この場合も同様に、アガロースゲルで試料を分析した（図２）。この場合も同様に、硫酸デキストランを加えていない対照（レーン１〜２）と比較して、硫酸デキストランを加えることによって、効率及び特異性の明らかな改善が観察された（レーン３〜１２）。非常に高濃度（１６μｇ／ｍＬ）の硫酸デキストランでのみ（レーン１３〜１４）、この濃度ではＲＴ−ＰＣＲにおけるいずれの産物も得られず、ＲＴ−ＰＣＲにおける悪影響を検出することができた。しかし、効率及び特異性における硫酸デキストランのプラスの影響は広範囲の濃度（０．３２μｇ／ｍＬ〜６．４μｇ／ｍＬ）にわたってプラスの効果が観察され（レーン３〜１２）、これにより、ＲＴ−ＰＣＲにおけるアニオン性ポリマーのプラスの効果が確かであることが証明された。
【００５９】
実施例３：
ＲＴ−ＰＣＲにおけるアニオン性ポリマーのプラスの影響が、逆転写におけるものか、ｃＤＮＡの複製におけるものか、又は両者におけるものかを判定するため、逆転写工程で、若しくは複製工程でアニオン性ポリマーを加え、又は全く加えずに２ステップＲＴ−ＰＣＲを実施した。
鋳型ＲＮＡ及び他の全ての反応成分は実施例１と同じである。逆転写反応を５０℃で３０分間インキュベートで行った。その後、反応物を氷上で冷却することによって逆転写反応を停止した。逆転写反応物の一定量（１２．５μＬ）を、２．５単位のＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ  Ｐｌｕｓ（ＱＩＡＧＥＮ）、０．６μＭのプライマー（配列番号：１及び２）、０．４ｍＭのｄＮＴＰミックス、及び１倍の（１ｘ）１ステップＲＴ−ＰＣＲ緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ）を含む、１２．５μＬのＰＣＲマスターミックスと混合した。実施例１に示したサイクル条件でＰＣＲを実施した。硫酸デキストラン８０００（Ｓｉｇｍａ）を、最終濃度が４８０ｎｇ／ｍＬになるように、逆転写反応又はＰＣＲ反応のいずれかに加えた。対照反応では、硫酸デキストランを加えなかった。
試料を、二通りアガロースゲルで分析した（図３）。硫酸デキストランを加えなかった反応では、マトリックス遺伝子の産生量は非常に低く、非常に大量の非特異的産物が検出された（レーン１〜２）。ＰＣＲ反応に硫酸デキストランを加えることにより、マトリックス遺伝子の産生量はわずかに改善されるが、特異性の効果はわずかであるか、又は効果はなかった。一方、逆転写反応に硫酸デキストランを加えることにより、反応の効率及び特異性は著しく高くなった。したがって、硫酸デキストランのプラスの効果は、主として逆転写酵素の際の効果によるものであるが、ＰＣＲにおいても、わずかなプラスの効果を検出することができた。
【００６０】
実施例４：
ウイルスＲＮＡだけでなく、ｍＲＮＡも鋳型としての役割を果たすことができるかを証明するため、ＲＴ−ＰＣＲの鋳型としてＨｅｌａ細胞からのｍＲＮＡ（１０ｎｇ）を用いた。鋳型としてＨｅＬａ細胞からのｍＲＮＡを用いた以外、反応条件は実施例１と同じであり、ラミンＡ／Ｃ（配列番号：３及び４）及びＴＮＦＲ１（配列番号：５及び６）の増幅用プライマー対をそれぞれ用い、ＰＣＲのアニーリング温度は５０℃でなく５５℃であった。アニオン性ポリマーとして、６４０ｎｇ／ｍＬの硫酸デキストラン８０００を用いた。この場合も同様に、試料を、二通りアガロースゲルで分析した（図４及び図５）。この場合も同様に、本実施例によって、ＲＴ−ＰＣＲの効率及び特異性においてアニオン性ポリマーのプラスの効果が示される。硫酸デキストランを加えないと、ラミンＡ／Ｃの特異的アプリコンに加え、多くの非特異的アンプリコンを検出することができ（図４、レーン−ＤＳ）、基本的に硫酸デキストランをＲＴ−ＰＣＲに加えたときにのみ、ラミンＡ／Ｃの特異的アンプリコンを検出することができた（図４、レーン＋ＤＳ）。ＴＮＦＲ１を増幅した場合、状況は類似していた。硫酸デキストランを加えないと、ＴＮＦＲ１の特異的アンプリコンに加え、多くの非特異的アンプリコンが検出されたが（図５、レーン−ＤＳ）、硫酸デキストランを加えることにより、特異性及び効率において著しい向上を検出することができた（図５、レーン＋ＤＳ）。
【００６１】
実施例５
硫酸デキストランに加え、他のアニオン性ポリマーが、特異性及び効率の向上に適していることを証明するために、ＲＴ−ＰＣＲにおけるアニオン性ポリマーとして、それぞれ１ｎｇ、２００ｐｇ及び１００ｐｇのアルギン酸ナトリウムを用いた。アニオン性ポリマーとしてアルギン酸ナトリウムを用い、ＴＮＦＲ１の増幅のためのプライマー対（配列番号：５及び６）を用いたことを除き、反応条件は実施例４に記載したものと同様である。この場合も同様に、試料を、二通りアガロースゲルで分析した（図６）。この結果によって、さまざまな量でアルギン酸ナトリウムを加えることによっても、ＲＴ−ＰＣＲにおける効率及び特異性の向上がもたらされることがはっきりと証明された。アニオン性ポリマーといてアルギン酸ナトリウムを用いた結果は、アニオン性ポリマーとして硫酸デキストランを用いて得られた結果と同様であった（図５）。
したがって、２種の化学的に異なるアニオン性ポリマーが同様のプラスの効果を示すように、ＲＴ−ＰＣＲの効率及び特異性の向上は、アニオン性ポリマーの一般的な特徴であることが示された。
【００６２】
実施例で言及された配列
配列番号：１：ＡＴＧＡＧＹＣＴＴＹＴＡＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＡＡＡＣＧ
配列番号：２：ＴＧＧＡＣＡＡＮＣＧＴＣＴＡＣＧＣＴＧＣＡＧ
配列番号：３：ＣＡＴＣＣＴＣＧＣＡＡＡＣＣＡＣＣＣＡＣＴＣＡ
配列番号：４：ＣＡＧＣＧＣＣＣＡＣＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＧ
配列番号：５：ＣＡＧＣＴＣＴＣＣＧＧＣＣＴＣＣＡＧＡＡＧ
配列番号：６：ＴＣＣＴＣＧＧＧＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＧＴ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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