(57)【要約】本発明は、一般に、配列コンティグをアセンブルするための方法に関する。特定の実施形態において、本発明の方法は、配列コンティグを地図に変換する工程、複数の一分子制限地図を作成する工程、一分子制限地図を上記配列コンティグの地図の末端と整列し、それによって、延長された配列コンティグを生成する工程、および延長した配列コンティグを整列する工程を包含する。配列コンティグをアセンブルするための方法であって、マッピングを使用して、一分子制限地図を作成する工程；一分子制限地図を、配列コンティグの地図の末端と整列することによって配列読み取りを延長し、それによって、延長された配列コンティグを生成する工程；および該延長された配列コンティグを整列する工程、を包含する、方法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列コンティグをアセンブルするための方法であって、該方法は、
配列コンティグを地図に変換する工程；
複数の一分子制限地図を作成する工程；
一分子制限地図を、該配列コンティグの地図の末端と整列し、それによって、延長された配列コンティグを生成する工程；および
延長された配列コンティグを整列する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
作成する工程は、
核酸を荷電した基材に導入して、その結果、該核酸は延長し、該核酸が、酵素反応に利用可能なままである様式で該対象に固定される工程；
該核酸を酵素消化して、１種以上の制限消化物を生成する工程；および
該制限消化物から地図を構築する工程、
を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記基材は、誘導体化ガラスである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ガラスは、シランで誘導体化されている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルは、ヒト組織もしくは体液である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルは、微生物に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物は、細菌、真菌、およびウイルスからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
コンティグの配置を決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
コンティグの向きを決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記配列コンティグにおけるアセンブリの誤りを同定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸は、長さ数百キロベースである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記一分子制限地図は、前記配列コンティグの間のギャップをつなぐ、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
配列コンティグをアセンブルするための方法であって、該方法は、
マッピングを使用して、一分子制限地図を作成する工程；
一分子制限地図を、配列コンティグの地図の末端と整列することによって配列読み取りを延長し、それによって、延長された配列コンティグを生成する工程；および
該延長された配列コンティグを整列する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４】
前記生成する工程は、
前記核酸を荷電した基材に導入して、その結果、該核酸は延長し、該核酸が、酵素反応に利用可能なままである様式において該対象に固定される工程；
該核酸を酵素消化して、１種以上の制限消化物を生成する工程；および
該制限消化物から地図を構築する工程、
を包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記基材は、誘導体化ガラスである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ガラスは、シランで誘導体化されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルは、ヒト組織もしくは体液である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルは、微生物に由来する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記微生物は、細菌、真菌、およびウイルスからなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
コンティグの配置を決定する工程をさらに包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
コンティグの向きを決定する工程をさらに包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記配列コンティグにおけるアセンブリの誤りを同定する工程をさらに包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記一分子制限地図は、前記配列コンティグ間のギャップをつなぐ、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２０１１年４月２８日に出願した米国通常出願第１３／０９６，４０８号の利益を受けることおよびその優先権を主張し、この出願は、２０１１年１月１４日に出願した米国仮出願第６１／４３２，８２８号の利益を受けることおよびその優先権を主張する。これらの出願の内容は、その全体が本明細書に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、配列コンティグをアセンブルするための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
ヒトゲノムの顕著な画分およびそれらのセグメント内の遺伝的バリエーションを配列決定し、同定するための方法は、ごく普通のことになりつつある。しかし、あらゆるヒトにおいて見いだされるバリエーションの健康上の意味を理解することには大きな障害があるため、あらゆる個体における全ての配列差異の機能的意味の解明が未だなされていない。全ゲノム配列決定は、遺伝学者および医師がそのデータの完全な機能的理解を進展させることを可能にする重要な第１の工程である。
【０００４】
全ゲノム配列決定は、一般に、ＤＮＡを、配列決定されて読み取りが得られる多くの小さなセグメントに無作為に切断することを包含する。上記標的ＤＮＡについての複数の重なり合う読み取りは、このフラグメント化および配列決定を数回行うことによって得られる。次いで、コンピュータープログラムは、異なる読み取りの重複する末端を使用して、それらを配列コンティグへとアセンブルする。次いで、配列コンティグは、連続する配列を得るためにアセンブルされる。
【０００５】
全ゲノム配列決定プロジェクトは、代表的には、数百もしくは数千の比較的短い配列コンティグを生成する。上記コンティグは、代表的には、生物のゲノムの大部分を網羅するが、それらの相対的順序および向きは、決定しがたい。なぜなら、上記コンティグの間には満たされなければならないギャップが存在するからである。実際に、全ゲノム配列決定は、曖昧さおよび配列決定の誤りに満ちた莫大な量の情報を使用する。複雑なゲノムのアセンブリは、ゲノム中に反復性配列が多量に存在することによってさらに複雑である。このことは、類似の短い配列読み取りが、配列の完全に異なる部分に由来し得ることを意味する。元のＤＮＡの各セグメントについての多くの重なり合う読み取りは、これらの困難を克服し、配列を正確にアセンブルするために必要である。例えば、ヒトゲノムプロジェクトを完了するために、ヒトゲノムの大部分は、その範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）の１２倍以上で配列決定された；すなわち、最終配列中の各塩基は、平均して、１２回分の読み取りに存在する。そうだとしても、現在の方法は、（ユークロマチン）ヒトゲノムのうちの約１％について信頼性のある配列を単離もアセンブルもできなかった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（要旨）
本発明の方法は、配列コンティグアセンブリのプロセス（例えば、コンティグの順序決定および向きの決定）を単純化するために、マッピング（特に、光学マッピング）を使用する。光学マッピングは、蛍光顕微鏡を使用して、個々の標識されたＤＮＡ分子における制限エンドヌクレアーゼ切断事象を可視化することによって、順序が決定された制限地図を生成し得る。本発明の方法は、得られた配列コンティグを地図に変換する工程を包含する。さらに、長い鎖の核酸を、サンプルから抽出し、一分子地図（ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍａｐ）を、上記長い鎖の核酸から作成する。上記一分子地図を、上記配列コンティグの地図の末端と整列させ、それによって、延長された配列コンティグを生成する。一般に、上記延長された配列コンティグは、延長されなかった配列コンティグの中に以前は存在したギャップを橋渡しする。次いで、上記延長された配列コンティグは、互いに整列され、連続配列が生成される。特定の実施形態において、上記地図は、光学地図である。
【０００７】
本発明の方法は、光学マッピングが、長い鎖の核酸（例えば、数百ｋｂ）を使用するという事実を利用する。長い核酸鎖の使用は、短い配列読み取りでは網羅しがたい配列コンティグ間のギャップを光学マッピングがつなぐことを可能にする。従って、本発明の方法は、配列決定反応に関してしばしば困難を示すゲノムの領域においてデータを生成する。このデータは、配列コンティグの間のギャップを橋渡しし得、この配列コンティグの適切な順序決定および向きを確実にするために使用され得る。本発明の方法は、配列決定プロジェクトと関連するコストおよび時間を劇的に減少させる。
【０００８】
本発明の方法は、任意の配列決定プロジェクトで使用され得、ヒトＤＮＡもしくは他の生物（例えば、微生物（例えば、細菌、真菌、もしくはウイルス））に由来するＤＮＡの配列決定と関連して使用され得る。
【０００９】
他の局面において、本発明は、配列コンティグをアセンブルするための方法を提供し、この方法は、光学マッピングを使用して、一分子制限地図を作成する工程、一分子制限地図を配列コンティグの光学地図の末端と整列することによって、配列コンティグを延長する工程、およびこの延長された配列コンティグを整列する工程を包含する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（詳細な説明）
本発明は、一般に、配列コンティグをアセンブルするための方法に関する。本発明の方法は、得られた配列コンティグを地図に変換する工程を包含する。さらに、長い鎖の核酸は、サンプルから抽出され、一分子地図は、長い鎖の核酸から作成される。上記一分子地図は、上記配列コンティグの上記地図の末端と整列され、それによって、延長された配列コンティグを生成する。一般に、上記延長された配列コンティグは、延長されなかった配列コンティグの間に以前は存在したギャップを橋渡しする。次いで、上記延長された配列コンティグは、互いに整列されて、連続配列を生成する。特定の実施形態において、上記地図は、光学地図である。
【００１１】
以下の節は、サンプル核酸、核酸配列決定、マッピング（特に、光学マッピング）、コンティグ延長および延長された配列コンティグの整列についての一般的考慮事項を考察する。
【００１２】
（サンプル核酸）
核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。核酸は、合成であってもよいし、天然に存在する供給源に由来してもよい。一実施形態において、核酸は、種々の他の成分（例えば、タンパク質、脂質および非サンプル核酸）を含む生物学的サンプルから単離される。核酸は、任意の細胞物質から得られてもよいし、ヒトもしくは他の哺乳動物、植物または微生物（例えば、細菌、真菌、ウイルスもしくは任意の他の細胞性生物）から得られてもよい。特定の実施形態において、上記核酸は、単一細胞から得られる。本発明において使用するための生物学的サンプルは、ウイルス粒子もしくは調製物を含む。核酸は、生物から直接得られてもよいし、生物から得られる生物学的サンプルから（例えば、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、糞便および組織から）得られてもよい。任意の組織もしくは体液の標本は、本発明における使用のための核酸の供給源として使用され得る。核酸はまた、培養細胞（例えば、初代細胞培養物もしくは細胞株）から単離され得る。核酸が得られる上記細胞もしくは組織は、ウイルスもしくは他の細胞内病原体に感染させられ得る。サンプルはまた、生物学的標本から抽出した総ＲＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー、ウイルスＤＮＡ、もしくはゲノムＤＮＡであり得る。
【００１３】
生物学的サンプルから得られる核酸は、代表的には、フラグメント化されて、分析に適したフラグメントを生成する。一実施形態において、生物学的サンプルに由来する核酸は、超音波処理によってフラグメント化される。核酸は、米国特許出願公開番号ＵＳ２００２／０１９０６６３  Ａ１（２００３年１０月９日公開）において記載されるように得られ得る。一般に、核酸は、種々の技術（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２８０−２８１（１９８２）によって記載されるもの）によって、生物学的サンプルから抽出され得る。一般に、個々の核酸は、約５塩基〜約２０ｋｂまでであり得る。核酸分子は、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよいし、一本鎖領域を有する二本鎖であってもよい（例えば、ステムおよびループ構造）。
【００１４】
本明細書に記載される生物学的サンプルは、洗浄剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）または界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）の存在下でホモジナイズされてもよいし、分画されてもよい。緩衝液中の洗浄剤の濃度は、約０．０５％〜約１０．０％であり得る。上記洗浄剤の濃度は、上記洗浄剤が溶液中に可溶性のままである量までであり得る。好ましい実施形態において、上記洗浄剤の濃度は、０．１％〜約２％の間である。上記洗浄剤（特に、非変性性である穏やかなもの）は、上記サンプルを可溶化するように作用し得る。洗浄剤は、イオン性であってもよいし、非イオン性であってもよい。非イオン性洗浄剤の例としては、トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘシリーズ（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｘＯＨ，ｘ＝９〜１０）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００Ｒ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４（ｘ＝７〜８）、オクチルグルコシド、ポリオキシエチレン（９）ドデシルエーテル、ジギトニン、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ６３０オクチルフェニルポリエチレングリコール、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（βＯＧ）、ｎ−ドデシル−β、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート、ポリドカノール、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）、ＮＰ−４０ノニルフェニルポリエチレングリコール、Ｃ１２Ｅ８（オクタエチレングリコールｎ−ドデシルモノエーテル）、ヘキサエチレングリコールモノ−ｎ−テトラデシルエーテル（Ｃ１４ＥＯ６）、オクチル−β−チオグルコピラノシド（オクチルチオグルコシド，ＯＴＧ）、エマルゲン、およびポリオキシエチレン１０ラウリルエーテル（Ｃ１２Ｅ１０）が挙げられる。イオン性洗浄剤（アニオン性もしくはカチオン性）の例としては、デオキシコレート、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ−ラウロイルサルコシン、およびセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）が挙げられる。双性イオン性試薬もまた、本発明の精製スキームにおいて使用され得る（例えば、Ｃｈａｐｓ、双性イオン３−１４（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎ  ３−１４）、および３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）。別の洗浄剤または界面活性剤ありもしくはなしで尿素が添加され得ることもまた、企図される。
【００１５】
溶解もしくは均質化溶液は、他の薬剤（例えば、還元剤）をさらに含み得る。このような還元剤の例としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール、ＤＴＥ、ＧＳＨ、システイン、システアミン、トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）、もしくは亜硫酸の塩が挙げられる。
【００１６】
（核酸配列決定）
当該分野で公知の任意の配列決定法（例えば、アンサンブル配列決定（ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）もしくは一分子配列決定）は、本発明の方法とともに使用され得る。配列決定を行うための１つの従来法は、Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，  ７４（１２）：  ５４６３  ６７  （１９７７）によって記載されるように、鎖終結およびゲル分離によるものである。別の従来の配列決定法は、核酸フラグメントの化学的分解を包含する。Ｍａｘａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ７４：  ５６０  ５６４  （１９７７）を参照のこと。最後に、ハイブリダイゼーションによる配列決定に基づいた方法が、開発された。例えば、Ｄｒｍａｎａｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  １６：  ５４  ５８  （１９９８）を参照のこと。各参考文献の内容は、その全体において本明細書に参考として援用される。
【００１７】
特定の実施形態において、配列決定は、上記Ｓａｎｇｅｒ配列決定技術によって行われる。古典的なＳａｎｇｅｒ配列決定法は、一本鎖ＤＮＡテンプレート、ＤＮＡプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、放射活性もしくは蛍光により標識されたヌクレオチド、およびＤＮＡ鎖延長を終結させる改変ヌクレオチドを要する。上記標識がジデオキシヌクレオチドターミネーター（例えば、標識プライマー）に結合されないか、または単色標識（例えば、放射性同位体）である場合、ＤＮＡサンプルは、４種の標準的デオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）およびＤＮＡポリメラーゼを含む４つの別個の配列決定反応物に分割される。各反応物に、４種のジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、もしくはｄｄＴＴＰ）のうちの１種のみが添加される。これらジデオキシヌクレオチドは、鎖停止ヌクレオチドであり、ＤＮＡ鎖伸長中に２個のヌクレオチドの間でホスホジエステル結合を形成するために必要とされる３’−ＯＨ基を欠いている。しかし、上記ジデオキシヌクレオチドの各々が異なる標識（例えば、４種の異なる蛍光色素）を有する場合、上記配列決定反応は全て、別個の反応の必要性なくして、一緒に行われ得る。
【００１８】
ジデオキシヌクレオチドを新生（すなわち、伸長しつつある）ＤＮＡ鎖へと組み込むと、ＤＮＡ鎖延長は停止し、種々の長さのＤＮＡフラグメントの入れ子にされたセットが生じる。新たに合成され、標識されたＤＮＡフラグメントは、変性され、鎖長における一塩基差を分離し得る変性ポリアクリルアミド−尿素ゲルにおけるゲル電気泳動を使用して、サイズで分離される。上記４種のＤＮＡ合成反応の各々が、同じ単色標識（例えば、放射性同位体）で標識された場合、それらは、ゲル中の４つの個々の隣り合うレーンのうちの１つにおいて分離され、ここで上記ゲルにおける各レーンは、それぞれの反応において使用されるジデオキシヌクレオチドに従って命名される（すなわち、ゲルレーンＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）。４種の異なる標識を利用した場合、上記反応は、上記ゲル中の単一のレーンにおいて合わされ得る。次いで、ＤＮＡバンドは、オートラジオグラフィーもしくは蛍光によって可視化され、ＤＮＡ配列は、Ｘ線フィルムもしくはゲル画像から直接読み取られ得る。
【００１９】
末端ヌクレオチド塩基は、そのバンドまたはその対応する直接標識を生じる、上記反応において添加されたジデオキシヌクレオチドに従って同定される。次いで、上記ゲルにおける異なるバンドの相対的位置は、示されるように、上記ＤＮＡ配列を（最短から最長まで）読み取るために使用される。上記Ｓａｎｇｅｒ配列決定プロセスは、ＤＮＡ配列決定機（例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなどから市販されているもの）を使用して自動化され得る。
【００２０】
他の実施形態において、上記核酸の配列決定は、合成技術によって一分子配列決定によって達成される。一分子配列決定は、例えば、Ｌａｐｉｄｕｓ  ｅｔ  ａｌ．  （米国特許第７，１６９，５６０号）、Ｑｕａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第６，８１８，３９５号）、Ｈａｒｒｉｓ（米国特許第７，２８２，３３７号）、Ｑｕａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許出願公開番号２００２／０１６４６２９）、およびＢｒａｓｌａｖｓｋｙ，  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  （ＵＳＡ），  １００：  ３９６０−３９６４  （２００３）（これら参考文献の各々の内容は、その全体において本明細書に参考として援用される）に示される。簡潔には、一本鎖核酸（例えば、ＤＮＡもしくはｃＤＮＡ）は、フローセルの表面に結合されるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。上記オリゴヌクレオチドは、表面に共有結合されてもよいし、当業者に公知であるように共有結合以外の種々の結合が使用されてもよい。さらに、上記結合は、例えば、上記表面に直接的にもしくは間接的に結合されたポリメラーゼを介して、間接的であってもよい。上記表面は、平坦であってもよいし、そうでなくてもよく、そして／または多孔性であっても、非多孔性であってもよく、または結合に適切であることが当業者に公知の任意の他のタイプの表面であってもよい。次いで、上記核酸は、成長しつつある鎖表面オリゴヌクレオチドへと組み込まれた蛍光標識されたヌクレオチドのポリメラーゼ媒介性付加を一分子の解像度において画像化することによって、配列決定される。
【００２１】
他の一分子配列決定技術は、ピロリン酸の検出を含む。なぜなら、それは、Ｒｏｔｈｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第７，３３５，７６２号、同第７，２６４，９２９号、同第７，２４４，５５９号、および同第７，２１１，３９０号）およびＬｅａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第７，３２３，３０５）号（これらの各々の内容は、その全体において、本明細書に参考として援用される）に示されるように、ＤＮＡの新生鎖への一ヌクレオチドの組み込みによって切断されるからである。
【００２２】
上記サンプルに由来する核酸が分解されるか、またはわずか最小限の量の核酸が上記サンプルから得られ得る場合、配列決定用の核酸の十分量を得るために、上記核酸に対してＰＣＲが行われ得る（例えば、Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号（その内容は、その全体において本明細書に参考として援用される）を参照のこと）。
【００２３】
（データ分析）
得られる配列結果の整列および／もしくは編集は、市販のソフトウェアプログラムを使用して、当該分野で公知の方法によって行われ得る。例えば、Ｆｌｉｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６：Ｓ６  −  Ｓ１２，  ２００９）は、配列読み取りを配列コンティグへと整列するかまたはアセンブルし、次いで、配列コンティグを整列するいくつかのアルゴリズム的アプローチを記載する。以下もまた参照のこと：
【００２４】
【表１】
2014502514.tif 000002
【００２５】
これら参考文献の各々の内容は、その全体において本明細書に参考として援用される。
【００２６】
市販のソフトウェアプログラムとしては、以下が挙げられる：  ＢＬＡＳＴ（迅速なｋタプルでの発見的方法での局所検索（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ））、ＦＡＳＴＡ（迅速なｋタプルでの発見的方法での局所検索）、ＧＧＳＥＡＲＣＨ／ＧＬＳＥＡＲＣＨ（全体：全体（ＧＧ）、全体：局所（ＧＬ）アラインメントと統計学）、ＨＭＭＥＲ（プロフィールＨｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖモデルでの局所および全体の検索）、ＨＨｐｒｅｄ／ＨＨｓｅａｒｃｈ（プロフィールＨｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖモデルの対をなす比較）、ＩＤＦ（Ｉｎｖｅｒｓｅ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（位置特異的反復ＢＬＡＳＴ、位置特異的スコア付けマトリクスでの局所検索）、ＳＡＭ（プロフィールＨｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖモデルでの局所および全体の検索）、ＳＳＥＡＲＣＨ（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ検索）、ＡＣＴ（Ｓｙｎｔｅｎｙおよび比較ゲノミクス）、ＡＶＩＤ（全ゲノムとの対をなす全体アラインメント）、Ｍａｕｖｅ（再配置したゲノムの複数のアラインメント）、ＭＧＡ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｍｕｌａｎ（ゲノム長配列の局所的複数アラインメント）、Ｍｕｌｔｉｚ（ゲノムの複数アラインメント）、Ｓｅｑｕｅｒｏｍｅ（大きなサーバー／サービスでの配列アラインメントデータのプロファイリング）、Ｓｅｑｕｉｌａｂ（大きなサーバー／サービスでのＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ結果からの配列アラインメントデータのプロファイリング）、Ｓｈｕｆｆｌｅ−ＬＡＧＡＮ（完了したゲノム領域の対をなした全体アラインメント）、およびＳＩＢｓｉｍ４／Ｓｉｍ４（発現されたＤＮＡ配列と、ゲノム配列を整列、イントロンを許容）。
【００２７】
（光学マッピング）
配列アセンブリと関連した問題は、配列コンティグの整列および向きである。上記コンティグは、代表的には、生物のゲノムの大部分を網羅するが、それらの相対的順序および向きは、決定しがたい。なぜなら、コンティグの間に埋められなければならないギャップがあるからである。本発明の方法は、光学マッピングを使用して、配列コンティグアセンブリのプロセス（例えば、コンティグの順序決定および向き決定）を単純化する。本発明の方法は、光学マッピングが、長い鎖（例えば、数百ｋｂ）の核酸を使用するという事実を利用する。長い核酸鎖の使用は、短い配列読み取りで網羅することが困難である配列コンティグ間のギャップを光学マッピングがつなぐことを可能にする。従って、本発明の方法は、配列決定反応にしばしば困難を示すゲノムの領域においてデータを生成する。このデータは、配列コンティグの間のギャップを橋渡しし得、上記配列コンティグの適切な順序決定および向き決定を確実にするために使用され得る。
【００２８】
光学マッピングは、単一ＤＮＡ分子から順序決定した制限地図を生成するための一分子技術である（Ｓａｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ５：１−４，  １９９５）。いくつかの適用の間に、個々の蛍光標識されたＤＮＡ分子は伸長され、本発明の方法を使用して、表面に固定される。上記添加されたエンドヌクレアーゼは、特定の点において上記ＤＮＡを切断し、フラグメントが画像化される（同書）。例示的なエンドヌクレアーゼとしては、ＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ、およびＢａｍＨＩが挙げられる。制限酵素の例示的組み合わせとしては、以下が挙げられる：
【００２９】
【表２】
2014502514.tif 000003
【００３０】
制限地図は、消化から生じるフラグメントの数に基づいて構築され得る（同書）。一般に、最終的な地図は、類似の分子に由来するフラグメントサイズの平均である（同書）。
【００３１】
光学マッピングおよび関連方法は、米国特許第５，４０５，５１９号、米国特許第５，５９９，６６４号、米国特許第６，１５０，０８９号、米国特許第６，１４７，１９８号、米国特許第５，７２０，９２８号、米国特許第６，１７４，６７１号、米国特許第６，２９４，１３６号、米国特許第６，３４０，５６７号、米国特許第６，４４８，０１２号、米国特許第６，５０９，１５８号、米国特許第６，６１０，２５６号、および米国特許第６，７１３，２６３号に記載される。引用される特許の全ては、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
【００３２】
光学地図は、Ｒｅｓｌｅｗｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００５  Ｓｅｐ；  ７１  （９）：５５１１−２２（本明細書に参考として援用される）に記載されるとおりに構築される。簡潔には、試験生物に由来する個々の染色体フラグメントは、負に荷電したＤＮＡと正に荷電した表面との間の静電的相互作用によって誘導体化ガラスに固定化され、１種以上の制限エンドヌクレアーゼで消化され、挿入色素（例えば、ＹＯＹＯ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で染色され、画像分析のために自動化蛍光顕微鏡に配置される。上記染色体フラグメントは固定されるので、上記制限エンドヌクレアーゼでの消化によって生成される制限フラグメントは、上記ガラスに結合したままであり、上記挿入色素で染色した後も蛍光顕微鏡によって可視化され得る。染色体ＤＮＡ分子における各制限フラグメントのサイズは、画像分析ソフトウェアを使用して測定され、異なる分子における同一の制限フラグメントパターンは、上記染色体全体を網羅する順序決定された制限地図をアセンブルするために使用される。
【００３３】
本発明の方法は、得られた配列コンティグを光学地図に変換する工程を包含する。さらに、長い鎖の核酸は、サンプルから抽出され、一分子光学地図が、この長い鎖の核酸から作成される。上記一分子光学地図は、上記配列コンティグの光学地図の末端と整列され、それによって、延長された配列コンティグを生成する。一般に、上記延長された配列コンティグは、延長されなかった配列コンティグの中に以前存在したギャップを橋渡しする。上記延長された配列コンティグは、次いで、互いと整列されて、連続配列を生成する。
【００３４】
一分子光学地図と、上記配列コンティグの光学地図との間の地図アラインメントは、フラグメントサイズ決定の誤り（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｓｉｚｉｎｇ  ｅｒｒｏｒｓ）、誤ったおよび失われている切断、ならびに失われている小さなフラグメントを組み込むスコア付けモデルに従って、２つの制限地図の最適アラインメントを見いだすダイナミックプログラミングアルゴリズムを用いて作成される（Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｕｌｌ  Ｍａｔｈ  Ｂｉｏｌ  ５４：５９９−６１８（１９９２）；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｒｏｂａｂ  ３８：３３５−３５６（２００１）；およびＷａｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １２：２３７−２４２を参照のこと）。所定のアラインメントについては、上記スコアは、上記アラインメントの長さの対数に比例し、上記２つの地図の間の違いによってペナルティーが科され（ｐｅｎａｌｉｚｅｄ）、その結果、より長い、より良好なマッチングのアラインメントが、より高いスコアを有する。
【００３５】
延長された配列コンティグを作成するために、各一分子光学地図は、上記配列コンティグの光学地図に対して整列される。これらアラインメントから、対をなしたアラインメント分析が、上記一分子光学地図と、上記配列コンティグの光学地図との間の「不同性％（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｄｉｓｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」（両方の地図におけるマッチしない領域の全長を、両方の地図の合計サイズで割って得られる）を決定するために行われる。これら不同性測定値は、統計パッケージ「Ｒ」において実行されるような、集塊性クラスター化方法（ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｉｖｅ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）「Ａｇｎｅｓ」への入力として使用される。簡潔には、このクラスター化方法は、各エントリーをそれ自体の空間に最初に配置し、次いで、上記一分子光学地図を、その一分子光学地図と最も近くマッチする配列コンティグの光学地図に反復してつなぎ、それによって、延長された配列コンティグを生成することによって機能する。一般に、上記延長された配列コンティグは、延長されなかった配列コンティグの中で以前存在したギャップを橋渡しし、従って、上記延長された配列コンティグの間の重なり合いの領域を作成し、それらのアラインメントおよびつながりを可能にして、連続配列を形成する。次いで、上記プロセスは、上記延長された配列コンティグの整列のために反復される。
【００３６】
（参照による援用）
参考文献および他の文書（例えば、特許、特許出願、特許公報、学術雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツ）に対する引用は、本開示全体を通してなされた。全てのこのような文書は、全ての目的のためにそれらの全体において本明細書に参考として援用される。
【００３７】
（等価物）
本発明は、その趣旨または本質的特徴のいずれからも逸脱することなく、他の具体的形態において具現化され得る。従って、前述の実施形態は、本明細書に記載される発明に対する限定ではなく、全ての局面において例示であるとみなされるべきである。
【国際調査報告】
2014502514.tif 000004