(57)【要約】  本発明は、過敏性腸症候群の治療または予防に有用な特定の化学式を有する化合物またはそのプロドラッグ、及びこのような化合物を有効成分として含む組成物に関するものである。本発明はまた、上記化合物または組成物の治療または予防学的に有効な量を過敏性腸症候群の治療または予防が必要な個体に投与することを含む過敏性腸症候群の治療または予防方法に関するものである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１で表示される化合物を有効成分として含む過敏性腸症候群の治療または予防用組成物。
【化１】
2014513718.tif 000010
上記化学式１において、Ｒ１は水素、アセチル、炭素数１〜６のアルキル、炭素数１〜６の置換されたアルキル、フェニルまたは置換されたフェニルであり、
Ｒ２〜Ｒ５は、互いに独立して、水素または水酸基であり、
上記置換されたアルキルまたは置換されたフェニルは、水酸基及び炭素数１〜３のアルキルからなる群より選択された何れか一つ以上の置換基に一つ以上の部分が置換される。
【請求項２】
上記化合物において、Ｒ１はアセチルまたは水素であり、Ｒ３は水酸基であり、Ｒ２、Ｒ４、及びＲ５は水素であることを特徴とする請求項１に記載の過敏性腸症候群の治療または予防用組成物。
【請求項３】
上記化合物において、Ｒ１がアセチルであり、Ｒ３が水酸基であり、Ｒ２、Ｒ４、及びＲ５が水素であることを特徴とする請求項２に記載の過敏性腸症候群の治療または予防用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過敏性腸症候群の治療または予防に有用な化合物、このような化合物を含む薬学組成物、このような薬学組成物の医薬用途、及びこのような化合物を用いて過敏性腸症候群を治療または予防する方法に関する。
【０００２】
本出願は、２０１１年５月１８日出願の韓国特許出願第１０−２０１１-００４６９９９号に基づく優先権を主張し、該当出願の明細書および図面に開示された内容は、すべて本出願に援用される。
【背景技術】
【０００３】
過敏性腸症候群とは、器質的原因なく、長期間にわたって繰り返される腹部膨満感などの腹部不便感及び腹痛と共に、下痢、便秘などの排便習慣の変化を伴う慢性疾患である。過敏性腸症候群の症状は、精神的な要因やストレスによって悪化したりする。症状によって、下痢優位型、便秘優位型、及び痛症優位型に区分して薬物治療されている。韓国の患者の中で、下痢型が３０．８％、便秘型が２４．６％、便秘下痢交代型が４４．６％を占める。
【０００４】
過敏性腸症候群の治療のための薬物療法は、過敏性腸症候群の全般的な症状を改善する薬剤と、単一症状に対する薬剤とに分けられる。腹痛に関連する薬物としては、平滑筋弛緩剤、抗うつ薬、オピオイド作動薬（ｏｐｉｏｉｄ ａｇｏｎｉｓｔ）などが使われ、便秘優位型過敏性腸症候群に関連する薬剤としては、繊維製剤、緩和剤、５‐ＨＴ４作用剤などが使われており、下痢優位型過敏性腸症候群に関連する薬剤としては、下痢止め薬、５‐ＨＴ３拮抗剤などが使われる。しかし、既存の５‐ＨＴ系列薬物は副作用があるためその使用が制限されていることから、現在までの過敏性腸症候群に対する薬物療法は非常に制限的であり、対症療法に対する依存度が高い実情である。
【０００５】
すなわち、過敏性腸症候群は、様々な症状、例えば、腹痛、腹部膨満感などとともに、便秘、下痢などの排便異常が伴われる慢性疾患であるので、単純な腹痛、下痢、便秘などとは差別化される。したがって、過敏性腸症候群の治療効果を評価するためには、上述の多様な症状、すなわち、腸過敏性状態での痛症抑制効果、排便異常の改善効果などが総合的に評価されるべきである。このような過敏性腸症候群の治療効果を評価するために、代表的な評価モデルとしてＣＲＤ（Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｄｉｓｔｅｎｓｉｏｎ）モデルが使われている。
【０００６】
一方、ニューロキニン受容体（Ｎｅｕｒｏｋｉｎｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＮＫ）は、ＮＫ１、ＮＫ２、及びＮＫ３の亜流型（ｓｕｂｔｙｐｅ）に分けられ、中枢神経系と末梢神経系とに作用する神経ペプチドであるＰ物質（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ；ＳＰ）、ニューロキニンＡ、ニューロキニンＢなどのタキキニン（ｔａｃｈｙｋｉｎｉｎ）ファミリーが結合する受容体である。このようなＮＫ受容体は、脳の扁桃、海馬、視床下部、線条体、及び脊髄のような中枢神経系や、皮膚、炎症細胞、消化系、呼吸系、心血管系などの末梢神経系に均一に分布しており、腸運動性及び腸過敏性と密接な関連がある［ＪＨ. Ｌａの外、Ｗｏｒｌｄ Ｊ. Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ., １１（２）, ｐ２３７-２４１, ２００５；ＭＳ Ｋｒａｍｅｒ, Ｓｃｉｅｎｃｅ, ２８１（５３８３） ｐ１６２４-１６２５, １９９８；及びＧ. Ｊ. Ｓａｎｇｅｒ., Ｂｒ. Ｊ. Ｐｈａｒｍａｃｏｌ., １４１, ｐ１３０３-１３１２, ２００４］。最近、このような生理学的機能に基づいて、過敏性腸症候群治療剤を開発するための手段としてＮＫ受容体拮抗薬に対する研究が活発に行われている［Ｒ. Ａ. Ｄｕｆｆｙ, Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ. Ｅｍｅｒｇ. Ｄｒｕｇｓ, ９（１）, ２００４；Ｍ. Ｃａｍｉｌｌｅｒｉ, Ｂｒ. Ｊ. Ｐｈａｒｍａｃｏｌ., １４１, ｐ１２３７-１２４８, ２００４；Ｇ. Ｊ. Ｓａｎｇｅｒ., Ｂｒ. Ｊ. Ｐｈａｒｍａｃｏｌ., １４１, ｐ１３０３-１３１２, ２００４；及びＡ. Ｌｅｃｃｉの外、Ｂｒ. Ｊ. Ｐｈａｒｍａｃｏｌ., １４１, ｐ１２４９-１２６３, ２００４］。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明が解決しようとする技術的課題は、過敏性腸症候群の治療または予防に有用な化合物、このような化合物を含む薬学組成物、このような薬学組成物の医薬用途、及びこのような化合物を用いて過敏性腸症候群を治療または予防する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記技術的課題を達成するために、本発明は、下記化学式１で表示される化合物を有効成分として含む過敏性腸症候群の治療または予防用組成物、望ましくは、薬学組成物を提供する。
【０００９】
【化１】
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【００１０】
上記化学式１において、Ｒ１は水素、アセチル、炭素数１〜６のアルキル、炭素数１〜６の置換されたアルキル、フェニルまたは置換されたフェニルであり、
Ｒ２〜Ｒ５は、互いに独立して、水素または水酸基であり、
上記置換されたアルキルまたは置換されたフェニルは、水酸基及び炭素数１〜３のアルキルからなる群より選択された何れか一つ以上の置換基に一つ以上の部分が置換される。
【００１１】
より望ましくは、上記Ｒ１は水素、アセチル、または炭素数１〜６のアルキルであり、Ｒ２〜Ｒ５は、互いに独立して、水素または水酸基である。
【００１２】
さらに望ましくは、上記Ｒ１はアセチルまたは水素であり、Ｒ３は水酸基であり、Ｒ２、Ｒ４、及びＲ５は水素である。
【００１３】
最も望ましくは、本発明は、上記Ｒ１がアセチルであり、Ｒ３が水酸基であり、Ｒ２、Ｒ４、及びＲ５が水素である、（６Ｅ,１２Ｅ）‐３‐ヒドロキシテトラデカ‐６,１２‐ジエン‐８,１０‐ジイン‐１‐イルアセテート（（６Ｅ,１２Ｅ）‐３‐ｈｙｄｒｏｘｙｔｅｔｒａｄｅｃａ‐６,１２‐ｄｉｅｎ‐８,１０‐ｄｉｙｎ‐１‐ｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）を有効成分として含む過敏性腸症候群の治療または予防用組成物、望ましくは、薬学組成物を提供する。
【００１４】
本発明者らは、過敏性腸症候群の治療または予防に有用な物質を探索した結果、上記化学式１の化合物が、過敏性腸症候群と関連のあるＮＫ２受容体、モチリン受容体、メラノコルチンＭＣ１受容体、カンナビノイドＣＢ２受容体などを阻害するだけでなく、過敏性腸症候群と関連のあるグアニル酸シクラーゼの活性を抑制し、特に、過敏性腸症候群の代表的な評価モデルであるＣＲＤモデルで優れた効能を示すことを確認して本発明を完成した。
【００１５】
過敏性腸症候群患者たちにおいて、セロトニンやＮＫ以外の多様な受容体が研究されており、そのうち腸運動性に関連してモチリン受容体は、非正常な胃腸管運動を改善することで過敏性腸症候群の改善に関与することが報告されている［Ｌ．Ｏｈｍａｎの外、Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌｕｍｅ ３９，Ｉｓｓｕｅ ３，ｐ２０１‐２１５， ２００７］。また、カンナビノイド受容体は、ＣＲＤモデルの主要測定指標である腸過敏性抑制及び痛症減少に関与することが報告されている［Ｇｅｒａｒｄ Ｃｌａｒｋｅの外、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ, Ｖｏｌｕｍｅ １５, Ｉｓｓｕｅ １０, ｐ４７８-４８９, ２００９］。一方、メラノコルチンＭＣ１受容体は、抗炎症効果によって大腸炎及び痛症調節に関与することが知られていることから、過敏性腸症候群の複合的な症状に関与すると推定される［Ｃ Ｍａａｓｅｒの外、Ｇｕｔ. ５５（１０） ｐ１４１５-１４２２． Ｅｐｕｂ, ２００６］。グアニル酸シクラーゼは、腸運動性などに関連するターゲットの１つであって、この酵素の亢進剤（ａｇｏｎｉｓｔ）として知られたリナクロチド（ｌｉｎａｃｌｏｔｉｄｅ）は現在過敏性腸症候群の治療剤として開発されていることから、グアニル酸シクラーゼに対する拮抗または亢進作用を通じて過敏性腸症候群患者の非正常な排便症状に対する改善を期待できると判断される［Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｍ. Ｊｏｈｎｓｔｏｎの外、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ, Ｖｏｌｕｍｅ １３９, Ｉｓｓｕｅ ６, ｐ１８７７-１８８６．ｅ２, ２０１０］。
【００１６】
本発明の過敏性腸症候群治療または予防用組成物に有効成分として含まれる上記化学式１の化合物は、本発明が属する分野でよく知られた化学的合成法を通じて得ることができ、または、オケラ（Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｊａｐｏｎｉｃａ）（望ましくは、根茎）から、本発明が属する分野でよく知られた抽出及び／または精製方法を通じて得ることができる。
【００１７】
例えば、具体的に、本発明による上記化学式１の化合物の望ましい一例である（６Ｅ,１２Ｅ）‐３‐ヒドロキシテトラデカ‐６,１２‐ジエン‐８,１０‐ジイン‐１‐イルアセテートは、（Ｓ１）Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｊａｐｏｎｉｃａを炭素数１〜３の低級アルコールで抽出し、（Ｓ２）抽出物を水とＥｔＯＡｃとで分画した後、（Ｓ３）ＥｔＯＡｃ分画物をさらにｎ‐ヘキサンと３０％（ｖ／ｖ）メタノールまたはエタノール水溶液とで分画し、（Ｓ４）ｎ‐ヘキサン分画をカラム（シリカカラム及びＣ１８カラム）を用いた液状クロマトグラフィー技術で分離及び精製して得ることができるが、本発明は、このような具体的な製造方法に限定されるのではない。
【００１８】
本発明はまた、上記化学式１の化合物の溶媒化物、特に水化物形態を含み、溶媒化された形態（例えば、水化物）だけでなく、非溶媒化された（ｕｎｓｏｌｖａｔｅｄ）形態も含む。また、本発明の上記化合物は、結晶形または無定形の形態で存在し得、このようなすべての物理的形態は、本発明の範囲に含まれる。また、本発明の化合物は、化合物に応じて光学中心である非対称炭素原子または二重結合を有し、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、幾何異性体などが存在し得、これらも本発明の範囲に含まれる。
【００１９】
また、体内で加水分解などの反応を通じて本発明による化学式１の化合物が生成可能なプロドラッグも本発明の均等な範疇に含まれる。例えば、Ｒ１が‐ＣＯ‐Ｈ、
【００２０】
【化２】
2014513718.tif 000004
【００２１】
、または‐Ｏ‐（Ｃ＝Ｏ）‐Ｒ"に置換されるか（ここで、上記Ｒ"は、炭素数１〜６のアルキル、炭素数１〜６の置換されたアルキル、フェニル、置換されたフェニル、または
【００２２】
【化３】
2014513718.tif 000005
【００２３】
であり、Ｚは、水素、アルカリ金属またはアミンであり、上記置換されたアルキルまたは置換されたフェニルは、水酸基及び炭素数１〜３のアルキルの中で何れか一つ以上の置換基に一つ以上の部分が置換される）、またはＲ２〜Ｒ５の水酸基のＨが‐ＣＯ‐Ｈ、Ｒ′、または‐Ｏ‐（Ｃ＝Ｏ）‐Ｒ"に置換されるか（ここで、上記Ｒ′及びＲ"は、互いに独立して、炭素数１〜６のアルキル、炭素数１〜６の置換されたアルキル、フェニル、置換されたフェニル、または
【００２４】
【化４】
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【００２５】
であり、Ｚは、水素、アルカリ金属またはアミンであり、上記置換されたアルキルまたは置換されたフェニルは、水酸基及び炭素数１〜３のアルキルの中で何れか一つ以上の置換基に一つ以上の部分が置換される）、または‐ＯＲ１とＲ２〜Ｒ５の水酸基の中で２つが‐Ｏ‐Ｘ‐Ｏ‐の形態で連結された環を形成した化合物（ここで、Ｘは、炭素数１〜６のアルキル、炭素数１〜６の置換されたアルキル、Ｃ＝Ｏ、ＮＨ、‐（ＣＨ２）ｎＯ‐Ｃ＝Ｏ-または-Ｃ＝Ｏ‐Ｏ（ＣＨ２）ｎ‐であり、ｎは、１-６の整数であり、置換されたアルキルは、水酸基及び炭素数１〜３のアルキルの中で何れか一つ以上の置換基に一つ以上の部分が置換される）などが本発明の範囲に含まれる本発明化合物のプロドラッグになり得るが、本発明のプロドラッグはこのような具体的構造に限定されるのではない。
【００２６】
また、本発明の化学式１の化合物またはそのプロドラッグは、薬学的に許容可能な塩の形態で投与し得る。「薬学的に許容可能な塩」とは、毒性がないか少ない酸または塩基で製造された塩をいう。本発明の化合物が相対的に酸性である場合、塩基（ｂａｓｅ）付加塩は、十分な量の所望の塩基と適当な非活性（ｉｎｅｒｔ）溶媒とからなる化合物の中性形態を接触することで得られる。薬学的に許容可能な塩基付加塩は、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、マグネシウムまたは有機アミンからなる塩を含むが、これに限定されるのではない。本発明の化合物が相対的に塩基性である場合、酸（ａｃｉｄ）付加塩は、十分な量の所望の酸と適当な非活性溶媒とからなる化合物の中性形態を接触することで得られる。薬学的に許容可能な酸付加塩は、プロピオン酸、イソブチル酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ‐トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸、塩酸、臭素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素、亜リン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ ａｃｉｄ）などで形成された塩を含むが、これに限定されるのではない。また、アルギネート（ａｒｇｉｎａｔｅ）のようなアミノ酸の塩及びグルクロニック（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ）またはガラクツノリック（ｇａｌａｃｔｕｎｏｒｉｃ）酸のような有機酸の類似体を含むが、これに限定されるのではない。
【００２７】
本発明はまた、上記化学式１の化合物、そのプロドラッグ、異性体、溶媒化物、水化物、またはその薬学的に許容可能な塩と、薬剤学的に許容される賦形剤または添加剤を含む過敏性腸症候群の治療または予防用薬学組成物または健康機能食品組成物、望ましくは、薬学組成物を提供する。本発明の化合物などは、単独で、或いは、便利な運搬体、賦形剤などと共に混合して投与し得、そのような投与剤形は、単回投与または反復投与剤形であり得る。
【００２８】
本発明の組成物は、固形製剤または液状製剤であり得る。固形製剤は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、坐剤などがあるが、これに限定されるのではない。固形製剤には、賦形剤、着香剤、結合剤、防腐剤、崩壊剤、滑沢剤、充填剤などが含まれ得るが、これに限定されるのではない。液状製剤としては、水、プロピレングリコール溶液のような溶液剤、懸濁液剤、乳剤などがあるが、これに限定されるのではなく、適当な着色剤、着香剤、安定化剤、粘性化剤などを添加して製造し得る。
【００２９】
例えば、散剤は、本発明の化合物と、スクロース、澱粉、微結晶セルロースなど薬剤学的に許容される適当な賦形剤を単純混合することで製造し得る。顆粒剤は、本発明の化合物；薬剤学的に許容される適当な賦形剤；及びポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの薬剤学的に許容される適当な結合剤を混合した後、水、エタノール、イソプロパノールなどの溶媒を用いた湿式顆粒法、または圧縮力を用いた乾式顆粒法を利用して製造し得る。また、錠剤は、上記顆粒剤をステアリン酸マグネシウムなどの薬剤学的に許容される適当な滑沢剤と混合した後、打錠機を利用して打錠することで製造し得る。
【００３０】
本発明の薬学組成物は、治療すべき疾患及び個体の状態に応じて、経口剤、注射剤（例えば、筋肉注射、腹腔注射、静脈注射、注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、皮下注射、インプラント）、吸入剤、鼻腔投与剤、膣剤、直腸投与剤、舌下剤、経皮剤、外用剤などで投与できるが、これに限定されるのではない。投与経路によって通常使われ、非毒性である、薬剤学的に許容される運搬体、添加剤、ビークルを含む適当な投与単位剤形に製剤化できる。一定時間にわたり薬物を持続的に放出することができるデポ（ｄｅｐｏｔ）剤形も本発明の範囲に含まれる。
【００３１】
本発明の組成物において、上記化学式１の化合物またはそのプロドラッグの含量は、組成物の全体重量に対して、０．００００１ないし５０重量％であることが望ましく、０．００１ないし４０重量％であることがさらに望ましく、０．０１ないし３０重量％であることがより一層望ましく、０．１ないし２０重量％であることが最も望ましい。
【００３２】
本発明はまた、上記化学式１で表示される化合物、そのプロドラッグ、異性体、溶媒化物、水化物、またはその薬学的に許容可能な塩の治療または予防学的に有効な量を過敏性腸症候群の治療または予防が必要な個体に投与することを含む過敏性腸症候群の治療または予防方法を提供する。
【００３３】
過敏性腸症候群を治療または予防するために、本発明の化合物、そのプロドラッグ、異性体、溶媒化物、水化物、またはその薬学的に許容可能な塩は、毎日約１ｍｇ／ｋｇないし約１,２００ｍｇ／ｋｇが投与し得、約５０ｍｇ／ｋｇないし約６００ｍｇ／ｋｇの１日投与量が望ましい。しかし、上記投与量は、患者の状態（年齢、性別、体重など）、治療している状態の深刻性、使われた化合物などによって多様である。必要に応じて、便宜を図るために、１日の総投与量を分け、一日に数回に分けて投与し得る。
【００３４】
本発明による化合物、そのプロドラッグ、異性体、溶媒化物、水化物、またはその薬学的に許容可能な塩、またはこのような物質を有効成分として含む組成物によって治療、改善または予防できる過敏性腸症候群は、下痢型過敏性腸症候群、便秘型過敏性腸症候群、または痛症優位型過敏性腸症候群から選択された何れか一つ以上である。
【００３５】
本発明はまた、上記化学式１の化合物、そのプロドラッグ、異性体、溶媒化物、水化物、またはその薬学的に許容可能な塩を人間を含む動物に投与することを特徴とするＮＫ２受容体、モチリン受容体、メラノコルチンＭＣ１受容体、またはカンナビノイドＣＢ２受容体を阻害する方法を提供する。
【００３６】
本発明はまた、上記化学式１の化合物、そのプロドラッグ、異性体、溶媒化物、水化物、またはその薬学的に許容可能な塩を人間を含む動物に投与することを特徴とするグアニル酸シクラーゼの活性を抑制する方法を提供する。
【発明の効果】
【００３７】
本発明は、過敏性腸症候群の治療または予防に有用な成分及びこれを含む組成物を提供する。本発明はまた、本発明による化合物またはこれを含む組成物を、成分の治療学的に有効な量を過敏性腸症候群の治療または予防が必要な個体に投与することを含む過敏性腸症候群の治療または予防方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】カラム精製後の本発明による化合物の望ましい一例である（６Ｅ,１２Ｅ）‐３‐ヒドロキシテトラデカ‐６,１２‐ジエン‐８,１０‐ジイン‐１‐イルアセテートのＵＰＬＣクロマトグラムである。
【図２】本発明化合物の望ましい一例である（６Ｅ,１２Ｅ）‐３‐ヒドロキシテトラデカ‐６,１２‐ジエン‐８,１０‐ジイン‐１‐イルアセテートのＣＲＤモデルでの効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、本発明の理解を助けるために実施例などを挙げて詳しく説明する。しかし、本発明による実施例は多様な形態に変形され得、本発明の範囲が下記実施例に限定されると解釈されてはいけない。本発明の実施例は当業界で平均的な知識を持つ者に本発明をより完全に説明するために提供されるのである。
【００４０】
＜本発明化合物の分離及び精製＞
本発明による化合物の中で一例である（６Ｅ,１２Ｅ）‐３‐ヒドロキシテトラデカ‐６,１２‐ジエン‐８,１０‐ジイン‐１‐イルアセテートを以下のように獲得した。
【００４１】
（抽出及び溶媒分画）
Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｊａｐｏｎｉｃａ（オケラ）１ｋｇを５Ｌのメタノールに７２時間にわたって常温で抽出し、濾過紙（Ｗｈａｔｍａｎ １, １１μｍ）で濾過した。その後、５０℃で減圧濃縮してメタノール抽出物（原生薬対比収率約１１．８％）を得た。
【００４２】
濃縮されたメタノール抽出物を５Ｌの蒸溜水に懸濁させた後、同量のエチルアセテートで２回分画して蒸溜水分画（原生薬対比収率約６．７％）は除去し、５０℃で減圧濃縮してエチルアセテート分画（原生薬対比収率約５．１％）を得た。
【００４３】
濃縮されたエチルアセテート分画を５Ｌの３０％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液に懸濁させた後、同量のｎ‐ヘキサン分画で２回分画して３０％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液分画（原生薬対比収率約０．７％）は除去し、５０で減圧濃縮してｎ‐ヘキサン分画（原生薬対比収率約４．４％）を得た。
【００４４】
（カラムを用いた分離及び精製）
上記製造されたｎ‐ヘキサン分画を５０ｍｇ／ｍｌの濃度でｎ‐ヘキサンに溶解させた後、シリカカートリッジ（Ｂｉｏｔａｇｅ, ＨＰ‐Ｓｉｌ ＳＮＡＰ Ｆｌａｓｈ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ １００ｇ, Ｌｏｔ Ｎｏ. １００１１９１０Ｃ）を用いた順相ＭＰＬＣ（Ｂｉｏｔａｇｅ社, Ｉｓｏｌｅｒａ ｏｎｅ）から分画した［分画条件‐流速：５０ｍｌ／ｍｉｎ；ｎ‐ヘキサン／エチル＝１００％／０％〜７０％／３０％〜２０％／８０％〜１０％／９０％〜０％／１００％；Ｍａｘ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ：２４０ｍｌ；ｉｎｉｔｉａｌ ｗａｓｔｅ：５００ｍｌ；ＵＶ ２２０ｎｍ］。６番目分画を５０℃で減圧濃縮して目的とする分画を得た。
【００４５】
収得された濃縮分画をメタノールに５０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させた後、Ｃ１８カートリッジ（Ｂｉｏｔａｇｅ, ＫＰ‐Ｃ１８‐ＨＳ ＳＮＡＰ Ｆｌａｓｈ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ １２０ｇ）を用いた逆相ＭＰＬＣ（Ｂｉｏｔａｇｅ社, Ｉｓｏｌｅｒａ ｏｎｅ）で追加精製して［精製条件‐流速：５０ｍｌ／ｍｉｎ；蒸溜水／メタノール＝５０％／５０％〜３０％／７０％〜０％／１００％；Ｍａｘ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ：２４０ｍｌ；Ｉｎｉｔｉａｌ ｗａｓｔｅ：５００ｍｌ；ＵＶ ２２０ｎｍ］１〜３番目分画を回収した。その後、５０℃で減圧濃縮して目的とする分画を得た。
【００４６】
また収得された濃縮分画をメタノールに５０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させた後、分取用ＨＰＬＣ（Ｈｉｔａｃｈｉ社）でＣ１８カラム（ＹＭＣ‐Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ１８ ＲＳ, ２５０×２０ｍｍ Ｉ．Ｄ．, Ｓ‐５μｍ, ８ｎｍ, Ｎｏ．２０２５０００３１４）を用いて２回精製して（流速：９．５ｍｌ／ｍｉｎ；蒸溜水：アセトニトリル＝３０：７０；ＵＶ ３４０ｎｍ）目的とする本発明の化合物約２００ｍｇ（原生薬対比収率約０．０２％）を得た。図１は、分離及び精製された上記化合物のＵＰＬＣクロマトグラムである。
【００４７】
＜本発明化合物の構造分析＞
最終分離された本発明化合物の構造分析のために、ＵＶ, ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ社, Ａｖａｎｃｅ ６００；１Ｈ‐ＮＭＲ, １３Ｃ‐ＮＭＲ, ＨＭＱＣ, ＨＭＢＣ, ＣＯＳＹ, ＤＥＰＴ, ＴＯＣＳＹ, ＮＯＥＳＹ）と、ＧＣ／ＭＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｃｌａｒｕｓ ６００ ｓｅｒｉｅｓ：カラム Ｅｌｉｔｅ‐５ＭＳ, ３０ｍ, ０．２５ｍｍ ＩＤ, ０．２５μｍ ｄｆ）を使用した。
【００４８】
（ＵＶ及びＮＭＲの分析）
ＵＶスペクトルでλｍａｘ（ｎｍ）：３１２, ２９３, ２７６, ２３１でポリアセチレン系列の特徴的な吸光パターンを示した。
【００４９】
ＮＭＲ分析で１Ｈ‐ＮＭＲ及び１３Ｃ‐ＮＭＲを用い、その結果は次のようである。
【００５０】
１Ｈ‐ＮＭＲ（６００ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３）：δＨ １．５６（２Ｈ, ｄｔ, Ｊ＝８．５, ６．７, ３．１Ｈｚ, Ｈ‐４）, １．６７（１Ｈ, ｄｄｔ, Ｊ＝１４．４, ９．７, ５．０Ｈｚ, Ｈ‐２）, １．７９（１Ｈ, ｍ, Ｈ‐２）, １．８２（３Ｈ, ｄｄ, Ｊ＝６．９, １．６Ｈｚ, Ｈ‐１４）, ２．０７（３Ｈ, ｓ, ａｃｅｔｙｌ Ｍｅ）, ２．２４（１Ｈ, ｄｔ, Ｊ＝１４．９, ７．３Ｈｚ, Ｈ‐５）, ２．３２（１Ｈ, ｄｔ, Ｊ＝１４．８, ７．４Ｈｚ, Ｈ‐５）, ３．６６（１Ｈ, ｄ, Ｊ＝３．２Ｈｚ, Ｈ‐３）, ４．１２（１Ｈ, ｄｔ, Ｊ＝１１．１, ５．４Ｈｚ, Ｈ‐１）, ４．３７（１Ｈ, ｄｄｄ, Ｊ＝１１．３, ８．９, ４．７Ｈｚ, Ｈ‐１）, ５．５６（１Ｈ, ｄ, Ｊ＝１３．６Ｈｚ, Ｈ‐７）, ５．５９（１Ｈ, ｄ, Ｊ＝１４．０Ｈｚ, Ｈ‐１２）, ６．３（２Ｈ, ｍ, Ｈ‐６, Ｈ‐１３）。
【００５１】
１３Ｃ‐ＮＭＲ（６００ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３）：δＣ１８．９３（Ｃ‐１４）, ２１．０１（ａｃｅｔｙｌ Ｍｅ）, ２９．４８（Ｃ‐５）, ３６．０３（Ｃ‐４）, ３６．４７（Ｃ‐２）, ６１．５７（Ｃ‐１）, ６７．７７（Ｃ‐３）, ７２．９４（Ｃ‐９）, ７２．３０（Ｃ‐１０）, ７９．４７（Ｃ‐８）, ７９．９６（Ｃ‐１１）, １０９．３０（Ｃ‐７）, １０９．９０（Ｃ‐１２）, １４３．４８（Ｃ‐１３）, １４７．４１（Ｃ‐６）, １７１．６（ａｃｅｔｙｌ Ｃ＝Ｏ）。
【００５２】
１３Ｃ‐ＮＭＲスペクトラムから総１６個の炭素から構成されていることを確認し、ＤＥＰＴを通じて総５個の４級炭素（ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ｃａｒｂｏｎ；δＣ １７１．６, ７９．９６, ７９．４７, ７３．９４, ７２．３）、５つのメチン炭素（ｍｅｔｈｙｎｅ ｃａｒｂｏｎ；δＣ １４７．４１, １４３．４８, １０９．９, １０９．３, ６７．７７）、４個のメチレン炭素（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｃａｒｂｏｎ；δＣ ６１．５７, ３６．４７, ３６．０３, ２９．４８）、２つのメチル炭素（ｍｅｔｈｙｌ ｃａｒｂｏｎ；δＣ ２１．０１, １８．９３）から構成されていることが分かった。
【００５３】
５個の４級炭素の中で、δＣ １７１．６はカルボニル炭素であり、残りの４個はアセチレン結合からなることが予想された。１Ｈ‐ＮＭＲとＨＭＱＣスペクトラムから１９個のプロトンピークと各炭素ピークとをペアリングした。５個のメチン炭素の中でδＣ ６７．７７の炭素はδＨ ３．６６のプロトンとペアリングされることから、１つの水酸基が結合されていることが確認され、残りはオレフィン系炭素と推定された。
【００５４】
ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、及びＨＭＢＣスペクトラムからアセトキシ基の存在と相対的位置を確認した。アセトキシ基の中で、メチルプロトン（δＨ ２．０７；Ｈ‐２'）が隣接したカルボニル炭素（δＣ １７１．６；Ｃ‐１'）とＨＭＱＣコリレーション（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）することを確認し、１番プロトン（δＨ ４．３７, ４．１２）はカルボニル炭素（δＣ １７１．６；Ｃ‐１'）とＨＭＢＣコリレーションすることを確認した。また、アセトキシ基によって１番位置炭素とプロトンとのシフト値（δＣ ６１．５７, δＨ ４．３７, ４．１２）が相対的にダウンフィールドに現れることを確認した。
【００５５】
ＣＯＳＹスペクトラムで、４番プロトン（δＨ １．５６）は３番プロトン（δＨ ３．６６）及び５番プロトン（δＨ ２．３２, ２．２４）とカップリングし、５番プロトン（δＨ ２．３２, ２．２４）もＨＭＢＣスペクトラムを通じて４番炭素（δＣ ３６．０３）とコリレーションすることを確認した。５番プロトン（δＨ ２．３２, ２．２４）は、ＣＯＳＹスペクトラムで、４番プロトン（δＨ １．５６）が６番プロトン（δＨ ６．３）及び７番プロトン（δＨ ５．５６）とカップリングしたことから、互いに隣接していることが分かる。
【００５６】
（ＧＣ／ＭＳの分析）
ＧＣ／ＭＳを通じて分子イオンピーク（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｏｎ ｐｅａｋ, ｍ／ｚ ２６０）を確認し、基準ピーク（ｂａｓｅ ｐｅａｋ, ｍ／ｚ １２８）で二重結合と三重結合とが含まれた不飽和炭化水素鎖フラグメントを確認した。フラグメンテーションパターン（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ）を下記表１に示した。
【００５７】
【表１】
2014513718.tif 000007
【００５８】
以上の分析結果を総合して、上記分離及び精製された化合物は、本発明による化合物の望ましい一例である、（６Ｅ,１２Ｅ）‐３‐ヒドロキシテトラデカ‐６,１２‐ジエン‐８,１０‐ジイン‐１‐イルアセテートであることを確認した。
【００５９】
＜Ｉｎ ｖｉｔｒｏ機転研究＞
分離された（６Ｅ,１２Ｅ）‐３‐ヒドロキシテトラデカ‐６,１２‐ジエン‐８,１０‐ジイン‐１‐イルアセテートのin vitro機転研究を次のように行った。
【００６０】
（ＮＫ２受容体の阻害活性）
変形（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＨＥＰＥＳ緩衝液を各ウェル（ｗｅｌｌ）に１００μｌずつ入れＤＭＳＯに溶かした上記化合物（５０, ５００, １５００, ５０００, １５０００μＭ）と陽性対照物質であるＭＥＮ‐１０,３７６（０．５, ２．５, ５, ２５, ５０μＭ）をそれぞれ５μｌずつ入れた。これに、ＮＫ２受容体のリガンドである［３Ｈ］ＳＲ‐４８９６８を５０μｌずつ入れ、ヒト来由ニューロキニンＮＫ２受容体が発現された細胞膜が入った変形ＨＥＰＥＳ緩衝液を１００μｌずつ入れた。２５℃で９０分間２００ｒｐｍで撹拌しながら培養した後濾過して３回洗浄した。
【００６１】
β線測定器を用いて同位元素（［３Ｈ］ＳＲ‐４８９６８）が結合された細胞膜を計数した。このとき、試験物質が受容体に強力に結合するほど、リガンド（［３Ｈ］ＳＲ‐４８９６８）が結合できないので、測定値が小さくなる（競争的結合）。リガンドのみを入れたウェルの結果値を０％抑制、リガンドを入れなっかた結果値を１００％抑制にして薬物濃度による抑制率を計算した。
【００６２】
（モチリン（Ｍｏｔｉｌｉｎ）受容体の阻害活性評価）
変形Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ緩衝液を各ウェルに１００μｌずつ入れＤＭＳＯに溶かした本発明化合物（５０, ５００, １５００, ５０００, １５０００μＭ）と陽性対照物質であるモチリン（２．５, ５, ２５, ５０, ２５０ｎＭ）をそれぞれ５μｌずつ入れた。これに、モチリン受容体のリガンドである［３Ｈ］ＳＲ‐４８９６８を５０μｌずつ入れ、ヒト来由モチリン受容体が発現された細胞膜が入った変形Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ緩衝液を１００μｌずつ入れた。２５℃で１５０分間培養した後濾過して３回洗浄した。β線測定器を用いて同位元素が結合された細胞膜を計数した。
【００６３】
（メラノコルチン（ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ）ＭＣ１受容体の阻害活性評価）
変形ＨＥＰＥＳ‐ＫＯＨ緩衝液を各ウェルに１００μｌずつ入れＤＭＳＯに溶かした本発明化合物（５０, ５００, １５００, ５０００, １５０００μＭ）と陽性対照物質であるＮＤＰ‐ａ‐ＭＳＨ（０．２５, ０．５, ２．５, ５, ２５ｎＭ）をそれぞれ５μｌずつ入れた。これに、メラノコルチンＭＣ１受容体のリガンドである［１２５I］ＮＤＰ‐ａ‐ＭＳＨを５０μｌずつ入れ、ヒト来由メラノコルチンＭＣ１受容体が発現された細胞膜が入った変形Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ緩衝液を１００μｌずつ入れた。３７℃で１２０分間培養した後濾過して３回洗浄した。β線測定器を用いて同位元素が結合された細胞膜を計数した。
【００６４】
（カンナビノイド（ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ）ＣＢ２受容体の阻害活性評価）
変形ＨＥＰＥＳ緩衝液を各ウェルに１００μｌずつ入れＤＭＳＯに溶かした 本発明化合物（５０, ５００, １５００, ５０００, １５０００μＭ）と陽性対照物質であるＲ（＋）‐ＷＩＮ‐５５,２１２-２（０．０５, ０．２５, ０．５, ２．５, ５μＭ）をそれぞれ５μｌずつ入れた。これに、カンナビノイドＣＢ２受容体のリガンドである［３Ｈ］ＷＩＮ‐５５,２１２-２を５０μｌずつ入れ、ヒト来由カンナビノイドＣＢ２受容体が発現された細胞膜が入った変形Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ緩衝液を１００μｌずつ入れた。３７℃で９０分間培養した後濾過して３回洗浄した。β線測定器を用いて同位元素が結合された細胞膜を計数した。
【００６５】
（グアニル酸シクラーゼ（ｇｕａｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ）の効能活性及び阻害評価）
ヒト来由グアニル酸シクラーゼが発現されたプラスミドを昆虫Ｓｆ９細胞に形質注入させて細胞を増殖させた後分解した。各ウェルにＤＭＳＯに溶かした本発明化合物（１, １０, ３０, １００, ３００μＭ）と陽性対照物質であるＯＤＱ（１Ｈ‐［１,２,４］ｏｘａｄｉａｚｏｌｏ［４,３‐ａ］ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎ‐１‐ｏｎｅ, ０．５, ０．１, ０．０５, ０．０１, ０．００５μＭ）を入れ、変形Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ緩衝液に混ぜたグアニル酸シクラーゼ（溶菌液）を最終濃度が０．０１３μg／mlになるように入れた。３７℃で２０分間培養した後１Ｎ ＨＣｌを加えて反応を終了させた。
【００６６】
酵素除去後反応を通じて生成されたｃＧＭＰの量をＥＩＡキットを使って定量した。グアニル酸シクラーゼは、ＧＴＰをｃＧＭＰに変形させる酵素であるので、グアニル酸シクラーゼが活性化されるほどｃＧＭＰの量が増加する。活性作用は、グアニル酸シクラーゼの活性物質であるニトロプルシドナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ）（３０μＭ）の結果値を１００％にして換算した。拮抗作用は、３０μＭのニトロプルシドナトリウムを薬物と共に処理した後、ニトロプルシドナトリウム単独処理時の結果値を１００％にして換算した。
【００６７】
それぞれの結果を下記表２に示した。本発明の望ましい化合物である（６Ｅ,１２Ｅ）‐３‐ヒドロキシテトラデカ‐６,１２‐ジエン‐８,１０‐ジイン‐１‐イルアセテートは、腸の感覚機能と関連した受容体であるカンナビノイドＣＢ２、メラノコルチンＭＣ１、ＮＫ２、及び腸の運動機能と関連した受容体であるモチリン、グアニル酸シクラーゼ、ＮＫ２に対して阻害活性を有することを確認した。
【００６８】
【表２】
2014513718.tif 000008
【００６９】
＜ＣＲＤモデルを通じた内臓痛症抑制効果の測定＞
分離された成分である（６Ｅ,１２Ｅ）‐３‐ヒドロキシテトラデカ‐６,１２‐ジエン‐８,１０‐ジイン‐１‐イルアセテートの内臓過敏性抑制効果を評価するために、過敏性腸症候群薬物の評価に使われる直腸拡張テスト（Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｄｉｓｔｅｎｓｉｏｎ；ＣＲＤ）［ＪＨ．Ｌａの外、Ｗｏｒｌｄ Ｊ. Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ., Ｄｅｃ., ９（１２）：ｐ２７９１-２７９５, ２００３］を以下のように施した。
【００７０】
体重２５０〜３００ｇのＳｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙ ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）雄を利用した。温図２５℃、湿度５０％、昼‐夜サイクル１２：１２時間に調節された動物室でケージ当たり二匹ずつ飼育した。飲水や飼料は自由に接近できるようにし、５日間適応させた後結腸炎を誘発した。結腸炎誘発２４時間の前に飼料供給を中断し、エーテルを使って呼吸麻酔した後ゴム製のカテーテル（ｒｕｂｂｅｒ ｃａｔｈｅｔｅｒ, ＰＥ ５０）を肛門から内側８ｃｍ長さで直腸を通じて挿入した。
【００７１】
３．５％酢酸（ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ０．９％ ｓａｌｉｎｅ） １ｍｌをカテーテルを通じて結腸のルーメン（ｌｕｍｅｎ）に投与した後溶液が漏れないように肛門を塞いだ。３０秒後に０．９％の生理食塩水 １ｍｌを同一のカテーテルを通じて結腸のルーメンに入れて酢酸溶液を洗い流した。
【００７２】
実験動物の直腸に長さ２ｃｍのゴム風船を挿入した後０．１ｍｌから１．０ｍｌまで段階的に風船内に３７℃の水を入れて脹らまし、このとき現れる動物の痛症反応を測定した。ＣＲＤ時、実験動物が見せる特徴的な行動であるＡＷＲ（ａｂｄｏｍｉｎａｌ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ ｒｅｆｌｅｘ）を間接的に定量化するために、各姿勢ごとに点数が付与されるＡＷＲスコアで内臓痛症反応を確認した。表３によるＡＷＲスコア［Ｅ. Ｄ. Ａｌ‐Ｃｈａｅｒの外、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ, Ｎｏｖ., １１９（５）, ｐ１２７６-１２８５, ２０００］を記録した。
【００７３】
【表３】
2014513718.tif 000009
【００７４】
結腸炎誘発後７日目のラットでＣＲＤを施して内臓過敏性（ｖｉｓｃｅｒａｌ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）有無を確認し、これを通じてＩＢＳ類似症状モデル動物を選別した［ＪＨ. Ｌａの外、Ｗｏｒｌｄ Ｊ. Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ., Ｄｅｃ., ９（１２）：ｐ２７９１-２７９５, ２００３］。本発明による（６Ｅ,１２Ｅ）‐３‐ヒドロキシテトラデカ‐６,１２‐ジエン‐８,１０‐ジイン‐１‐イルアセテートを０．５％ カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）水溶液に溶かしてそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇの濃度で経口投与し、陽性対照群であるアロセトロン（ａｌｏｓｅｔｒｏｎ Ｈｃｌ；Ｊｉａｎｇｙｉｎ Ｙｏｎｇｄａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ., Ｌｔｄ.）は２０ｍｇ／ｋｇで経口投与した。その後、約１時間にわたって安定化させた後、ＣＲＤ実験を行ってＡＷＲスコアを記録した。ビークル投与群、陽性対照群、及び本発明の化合物投与群に対する反応結果を定量化するために、拡張体積（ｄｉｓｔｅｎｓｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ, ｍｌ）によるＡＷＲスコアとそのＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）を求めた。統計処理は、スチューデントのｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ ｔ‐ｔｅｓｔ）を用い、ｐ＜０．０１（＊＊）またはｐ＜０．００１（＊＊＊）レベルで行い、ビークル投与群対比有意性を検定した。その結果を図２に示した（ｍｅａｎ±Ｓ.Ｅ.，ｎ≧３）。
【００７５】
図２において、「ノーマル」は、結腸炎を誘発させない正常群、「ビークル」は、結腸炎を誘発させた実験動物にビークルのみを経口投与した群、「Ｃ１０」、「Ｃ３０」、「Ｃ１００」はそれぞれ本発明による化合物を１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇで経口投与した群を示す。
【００７６】
図２に示すように、本発明による望ましい化合物は、濃度が増加するにつれて腸過敏性状態で現れる内臓痛症に対して抑制効果を奏する傾向を示し、特に１００ｍｇ／ｋｇ群は、ビークルに対して有意義に腸過敏性抑制効果を奏することが確認できた。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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