(57)【要約】  本発明は、骨格筋ミオパチーなどのミオパチーを予防または処置する方法であって、ｍｉＲＮＡのモジュレーターを投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、骨格筋ミオパチーは中心核ミオパチーである。モジュレーターは、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの発現、機能または活性を促進するアゴニストであってもよい。ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーは、ｍｉＲ−１３３ａでも、あるいはｍｉＲ−１３３ｂでもよい。
2014520813.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中心核ミオパチーの予防または処置を必要とする被検体の中心核ミオパチーを予防または処置する方法であって、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのアゴニストを前記被検体に投与することを含む方法。
【請求項２】
骨格筋の構造または機能の維持を必要とする被検体の骨格筋の構造または機能を維持する方法であって、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのアゴニストを前記検体に投与することを含む方法。
【請求項３】
速筋から遅筋への筋線維型変換の阻害を必要とする被検体の速筋から遅筋への筋線維型変換を阻害する方法であって、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのアゴニストを前記被検体に投与することを含む方法。
【請求項４】
ミトコンドリア機能不全の予防または処置を必要とする被検体のミトコンドリア機能不全を予防または処置する方法であって、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのアゴニストを前記被検体に投与することを含む方法。
【請求項５】
前記ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーはｍｉＲ−１３３ａである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーはｍｉＲ−１３３ｂである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記アゴニストはｍｉＲ−１３３ａ配列を含むポリヌクレオチドである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドはｐｒｉ−ｍｉＲ−１３３ａ、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１３３ａまたは成熟ｍｉＲ−１３３ａ配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドは５’−ＵＵＵＧＧＵＣＣＣＣＵＵＣＡＡＣＣＡＧＣＵＧ−３’（配列番号２）の配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アゴニストはｍｉＲ−１３３ｂ配列を含むポリヌクレオチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドはｐｒｉ−ｍｉＲ−１３３ｂ、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１３３ｂ、または成熟ｍｉＲ−１３３ｂ配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドは５’−ＵＵＵＧＧＵＣＣＣＣＵＵＣＡＡＣＣＡＧＣＵＡ−３’（配列番号４）の配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドは脂質送達ビヒクルを用いて製剤化される、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドは発現ベクターによりコードされる、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドは骨格筋プロモーターの制御下にある、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記骨格筋プロモーターは筋クレアチンキナーゼプロモーターである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドは二本鎖である、請求項７〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドはコレステロールにコンジュゲートされる、請求項７〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリヌクレオチドは約７０〜約１００ヌクレオチド長である、請求項７〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチド約１８〜約２５ヌクレオチド長である、請求項７〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記アゴニストは皮下投与経路、静脈内投与経路、筋肉内投与経路または腹腔内投与経路により前記被検体に投与される、請求項７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記被検体はヒトである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記被検体はミオチューブラリン（ＭＴＭ１）遺伝子の突然変異を有する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記被検体はダイナミン２（ＤＮＭ２）遺伝子の突然変異を有する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記被検体はアンフィファイシン２（ＢＩＮ１）遺伝子の突然変異を有する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
骨格筋においてｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）骨格筋細胞を候補化合物と接触させること；
（ｂ）前記ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの活性または発現を評価すること；および
（ｃ）ステップ（ｂ）の活性または発現を前記候補化合物の非存在下での活性または発現と比較することを含み、測定された活性または発現の相違から、前記候補化合物が前記ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのモジュレーターであることが示唆される
方法。
【請求項２７】
前記ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーはｍｉＲ−１３３ａである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーはｍｉＲ−１３３ｂである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞は前記候補化合物とインビトロまたはインビボで接触される、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記候補化合物はペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは小分子である、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記活性の評価はＴ管構造、ミトコンドリア機能、ＤＮＭ２タンパク質もしくは遺伝子の発現またはＩ型筋線維組成を判定することを含む、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体を本明細書に援用する、２０１１年７月１日に出願された米国仮特許出願第６１／５０４，０４８号に対する優先権および利益を主張する。
【０００２】
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本明細書と共に電子的に提出されたテキストファイル、すなわち、コンピュータ読み取り可能な形式による配列表の副本（ファイル名：MIRG_029_01WO_SeqList_ST25.txt、記録日：２０１２年７月２日、ファイルサイズ５．３キロバイト）の内容は、その全体を本明細書に援用する。
【０００３】
本発明の分野
本発明は一般的に、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の発現または活性を調節することにより、骨格筋の異常な活性または機能を予防または処置することに関する。特に、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの活性または発現を調節する。
【背景技術】
【０００４】
本発明の背景
骨格筋ミオパチーは、骨格筋の疾患であり、遺伝性のものもあれば、あるいは後天性のものもある。ヒト中心核ミオパチー（ＣＮＭ）は、筋力低下、および筋肉の筋線維の中心部に異常に核が存在していることを特徴とする先天性ミオパチーの一群である（１、２）。ＣＮＭは、主に３つの型、すなわちミオチューブラリン遺伝子（ＭＴＭ１）の突然変異により引き起こされる重症新生児型のＸ連鎖劣性ミオチュブラーミオパチー（ＸＬＭＴＭ）；ダイナミン２遺伝子（ＤＮＭ２）の突然変異により引き起こされる軽度、中等度または重度の表現型をとる古典的な常染色体優性型；およびアンフィファイシン２遺伝子（ＢＩＮ１）の突然変異により引き起こされる重度および中等度の表現型を呈する常染色体劣性型に分類することができる（１、２）。ＣＮＭの３つの型は、その臨床表現型が異なるにもかかわらず、以下の共通の病理学的特徴を示す：（ａ）Ｉ型筋線維の優性および小さな線維サイズ；（ｂ）ミトコンドリア異常を示唆する異常なＮＡＤＨ−テトラゾリウムレダクーゼ（ＮＡＤＨ−ＴＲ）染色パターン；および（ｃ）壊死、筋線維の死または再生がないこと（２）。
【０００５】
最も重篤で最も多く見られるＣＮＭの形態であるＸＬＭＴＭは、マウスおよびゼブラフィッシュで広く研究されてきた（３〜６）。Ｍｔｍ１遺伝子のホモ接合突然変異を持つマウスは、ヒトのＸＬＭＴＭの病理学的特徴を再現する進行性ＣＮＭを発症する（５）。また、Ｍｔｍ１欠損マウスは、ＸＬＭＴＭの筋機能障害に関わっている可能性がある三つ組の崩壊および興奮収縮連関の障害を示す（３）。
【０００６】
常染色体優性型のＣＮＭは、小児期または青年期に発症するものから新生児期に発症するより重度の散発型まで、緩徐進行性ＣＮＭの広範な臨床スペクトルを示す（７〜９）。近年、ＤＮＭ２遺伝子座において複数のミスセンス変異が同定されており、そのため、常染色体優性ＣＮＭは、ＤＮＭ２関連ＣＮＭとも呼ばれる。ダイナミン２は、エンドサイトーシスおよびメンブレントラフィックなど多くの細胞機能に関与する、広範に発現する大きなＧＴＰａｓｅである（１０、１１）。しかしながら、ＤＮＭ２遺伝子の複数のミスセンス変異がＣＮＭを引き起こす正確なメカニズムは、依然として不明である。さらに、ＤＮＭ２関連ＣＮＭのマウスモデルが存在しないうえ、最も頻度の高いＣＮＭ関連ＤＮＭ２突然変異Ｒ４６５Ｗ  Ｄｎｍ２を発現するノックインマウスモデルは、常染色体優性型のヒトＣＮＭを再現できなかった（９）。Ｒ４６５Ｗ  Ｄｎｍ２突然変異を持つホモ接合マウスは、生後２４時間以内に死亡するのに対し、ヘテロ接合マウスは、ミオパチー、続いて萎縮症、および中心部に移行した核を持たない筋機能障害を発症する（９）。
【０００７】
マイクロＲＮＡは、ｍＲＮＡ標的の発現を阻害することにより細胞の表現型を調節する。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に相補配列を持つ標的ｍＲＮＡの発現を阻害することにより、一連の生物学的プロセスを制御する、高度に保存された小さな非コードＲＮＡである（１２）。ｍｉＲのヌクレオチド２〜８とｍＲＮＡ標的とがワトソン−クリック塩基対合すると、ｍＲＮＡが分解する、および／または翻訳が抑制される。最近の研究から、骨格筋分化の制御におけるｍｉＲＮＡの役割が明らかになったが、ｍｉＲＮＡ発現の変化は、様々な骨格筋障害と関連している（１３〜１５）。しかしながら、ｍｉＲＮＡの骨格筋ミオパチーへの関与は、立証されていない。ミオパチーに関与するｍｉＲＮＡの同定および特徴付けは、ＣＮＭを含む骨格筋ミオパチーなどのミオパチーの処置の新規な治療アプローチの開発にとって重要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の概要
本発明の一部は、ｍｉＲＮＡが骨格筋の構造、機能、生体エネルギーおよび筋線維の種類の維持において不可欠な役割を果たしているという発見に基づく。これを踏まえ、本明細書に開示されるのは、骨格筋ミオパチーを処置または予防する方法および組成物である。特定の一実施形態では、骨格筋ミオパチーは中心核ミオパチー（ＣＮＭ）である。一実施形態では、ＣＮＭの処置または予防を必要とする被検体のＣＮＭを処置または予防する方法は、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのアゴニストを被検体に投与することを含む。さらに本明細書に提供するのは、骨格筋の構造または機能の維持、速筋から遅筋への筋線維型変換の阻害、またはミトコンドリア機能不全の処置または予防を必要とする被検体の骨格筋の構造または機能を維持する方法、速筋から遅筋への筋線維型変換を阻害する方法、またはミトコンドリア機能不全を処置または予防する方法であって、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのアゴニストを被検体に投与することを含む方法である。
【０００９】
ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーは、ｍｉＲ−１３３ａでも、あるいはｍｉＲ−１３３ｂでもよい。たとえば、アゴニストは、ｍｉＲ−１３３ａ配列またはｍｉＲ−１３３ｂ配列を含むポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、ｐｒｉ−ｍｉＲ−１３３ａ配列を含んでも、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１３３ａ配列を含んでも、あるいは成熟ｍｉＲ−１３３ａ配列を含んでもよい。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｐｒｉ−ｍｉＲ−１３３ｂ配列、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１３３ｂ配列、または成熟ｍｉＲ−１３３ｂ配列を含む。たとえば、ポリヌクレオチドは、５’−ＵＵＵＧＧＵＣＣＣＣＵＵＣＡＡＣＣＡＧＣＵＧ−３’（配列番号２）の配列を含んでも、あるいは５’−ＵＵＵＧＧＵＣＣＣＣＵＵＣＡＡＣＣＡＧＣＵＡ−３’（配列番号４）の配列を含んでもよい。
【００１０】
アゴニストは、脂質送達ビヒクルを用いて製剤化されるポリヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現ベクターによりコードされていてもよい。ポリヌクレオチドは、筋クレアチンキナーゼプロモーターなどの骨格筋プロモーターの制御下にあってもよい。一実施形態では、ポリヌクレオチドは二本鎖である。別の実施形態では、ポリヌクレオチドはコレステロールにコンジュゲートされる。ポリヌクレオチドは約７０〜約５００ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは約１８〜約２５ヌクレオチド長である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、アゴニストは、皮下投与経路、静脈内投与経路、筋肉内投与経路または腹腔内投与経路により被検体に投与される。被検体はヒトであってもよい。いくつかの実施形態では、被検体は、ミオチューブラリン（ＭＴＭ１）遺伝子、ダイナミン２（ＤＮＭ２）遺伝子、および／またはアンフィファイシン２（ＢＩＮ１）遺伝子に突然変異を有する。
【００１２】
本発明はまた、骨格筋においてｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのモジュレーターを同定する方法であって、（ａ）骨格筋細胞を候補化合物と接触させること；（ｂ）ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの活性または発現を評価すること；および（ｃ）ステップ（ｂ）の活性または発現を候補化合物の非存在下での活性または発現と比較することを含み、測定された活性または発現の相違から、候補化合物がｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのモジュレーターであることが示唆される、方法を提供する。ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーはｍｉＲ−１３３ａでも、あるいはｍｉＲ−１３３ｂでもよく、細胞は、候補化合物とインビトロで接触させても、あるいはインビボで接触させてもよい。候補化合物は、ペプチドでも、ポリペプチドでも、ポリヌクレオチドでも、あるいは小分子でもよい。ｍｉＲ−１３３ファミリーの活性の評価は、Ｔ管構造、ミトコンドリア機能、ＤＮＭ２発現、またはＩ型筋線維組成を判定することを含んでもよい。
【００１３】
図面の簡単な説明
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある種の態様を詳細に説明するため組み込まれる。本明細書に示した特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１つまたは複数を参照することで、本発明の理解を深めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】骨格筋におけるｍｉＲ−１３３の発現を示す。成体ＷＴマウス組織のｍｉＲ−１３３ａのノーザンブロット解析を示す。ブロットを剥がし、ローディングコントロールとして３２Ｐ標識Ｕ６プローブでリプローブした。Ｓｏｌはヒラメ筋。
【図１Ｂ】骨格筋におけるｍｉＲ−１３３の発現を示す。骨格筋におけるｍｉＲ−１３３の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより検出し、Ｕ６と比較して示した。
【図２Ａ】４週齢のｄＫＯマウスは、見かけは正常な筋肉を有する。４週齢のＷＴマウスおよびｄＫＯマウス由来のヒラメ筋、ＥＤＬ筋、Ｇ／Ｐ筋およびＴＡ筋のＨ＆Ｅ染色を示す。スケールバー＝４０μｍ。
【図２Ｂ】４週齢のｄＫＯマウスは、見かけは正常な筋肉を有する。４週齢のＷＴマウスおよびｄＫＯマウス由来のＴＡ筋を、ラミニンに対する抗体で免疫染色した。ＤＡＰＩ染色を使用して核を検出したが、中心部に移行した核は示されなかった。サイズバー：３０μｍ。
【図２Ｃ】４週齢のｄＫＯマウスは、見かけは正常な筋肉を有する。ImageJプログラムを用いて４週齢のＷＴマウスおよびｄＫＯマウスのＴＡ筋線維の断面積を判定した。ｎ＝３  ＷＴおよびｄＫＯ。各マウス由来の３００を超えるＴＡ線維を調査した。
【図３Ａ】ｄＫＯマウスの特徴付けを示す。６〜８週齢のＷＴマウスおよびｄＫＯマウスの様々な筋肉群における中心核線維の割合を示す。ＷＴはｎ＝３、ｄＫＯはｎ＝６である。エラーバーはＳＥＭを表す。
【図３Ｂ】ｄＫＯマウスの特徴付けを示す。１２週齢のＷＴマウスおよびｄＫＯマウス由来の体重（ＢＷ）および筋肉量と脛骨長（ＴＬ）との比率の測定値を示す。＊＊はｐ＜０．０１を示し；＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図３Ｃ】ｄＫＯマウスの特徴付けを示す。３ヶ月齢のＷＴマウスおよびｄＫＯマウス由来のＴＡ筋線維の断面積を判定した。ＷＴはｎ＝５、ｄＫＯはｎ＝７である。
【図４Ａ】ｄＫＯ骨格筋における中心核筋線維を示す。１２週齢のＷＴマウスおよびｄＫＯマウスのヒラメ筋、ＥＤＬ筋、Ｇ／Ｐ筋およびＴＡ筋のＨ＆Ｅ染色を示す。スケールバー：４０μｍ。
【図４Ｂ】ｄＫＯ骨格筋における中心核筋線維を示す。ラミニンに対するＴＡ筋の免疫染色を示す。核はＤＡＰＩで染色する。ｄＫＯ  ＴＡ筋は中心核を示した。スケールバー：４０μｍ。
【図４Ｃ】ｄＫＯ骨格筋における中心核筋線維を示す。１２週齢のＷＴマウス４匹およびｄＫＯマウス１０匹における中心核筋線維の割合を示す。マウスごとに、ＴＡ筋およびＧ／Ｐ筋では５００を超える筋線維、およびヒラメ筋およびＥＤＬ筋では３００を超える筋線維をカウントした。
【図４Ｄ】ｄＫＯ骨格筋における中心核筋線維を示す。ｄＫＯ  ＴＡ筋のＮＡＤＨ−ＴＲ染色から、分布異常、放射型の筋原線維間網（矢印）および環状線維（アスタリスク）が明らかになった。スケールバー：２０μｍ。
【図４Ｅ】ｄＫＯ骨格筋における中心核筋線維を示す。ＷＴマウス、ｄＫＯマウスおよびｍｄｘマウスのＴＡ筋のＥＢＤ取り込みを示す。ラミニンによる免疫染色（緑色）を示す。ＥＢＤは、蛍光顕微鏡下で赤色シグナルとして検出される。スケールバー：１００μｍ。
【図４Ｆ】ｄＫＯ骨格筋における中心核筋線維を示す。ＷＴおよびｄＫＯのＴＡ筋における筋原性遺伝子と胚型ＭＨＣ（Ｍｙｈ３）および周産期型ＭＨＣ（Ｍｙｈ８）との発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより判定した。ｎ＝３（ＷＴおよびｄＫＯ）。
【図５Ａ】ＮＡＤＨ−ＴＲによるｄＫＯ筋の解析を示す。１２週齢のＷＴマウスおよびｄＫＯマウスのヒラメ筋、ＥＤＬ筋、Ｇ／Ｐ筋およびＴＡ筋のＮＡＤＨ−ＴＲ染色を示す。スケールバー＝４０μｍ。
【図５Ｂ】ＮＡＤＨ−ＴＲによるｄＫＯ筋の解析を示す。４週齢のＷＴマウスおよびｄＫＯマウスのヒラメ筋、ＥＤＬ筋、Ｇ／Ｐ筋およびＴＡ筋のＮＡＤＨ−ＴＲ染色を示す。スケールバー＝４０μｍ。
【図５Ｃ】Ｈ＆ＥによるｄＫＯ筋の解析を示す。１２ヶ月齢のＷＴマウスおよびｄＫＯマウスのＴＡ筋のＨ＆Ｅ染色を示す。スケールバー＝４０μｍ。
【図５Ｄ】免疫組織化学によるｄＫＯ筋の解析を示す。Ｔ管分布を検出するための、ＤＨＰＲαに対する抗体を使用した、４週のＷＴマウスおよびｄＫＯマウス由来のＴＡ筋の免疫染色を示す。この年齢のＷＴ筋とｄＫＯ筋とのＴ管染色パターンに明確な差はない。サイズバー：３０μｍ。
【図６Ａ】ｄＫＯマウスにおけるＴＡ筋線維の三つ組の崩壊を示す。１２週齢マウスのＴＡ筋を用いて、Ｔ管およびＳＲの成分をコードするｍＲＮＡ転写物の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより判定した。ｎ＝３（ＷＴおよびｄＫＯ）。
【図６Ｂ】ｄＫＯマウスにおけるＴＡ筋線維の三つ組の崩壊を示す。１２週齢のＷＴマウスおよびｄＫＯマウス由来のＴＡ筋の横断面におけるＴ管およびＳＲの免疫染色を示す。Ｔ管は抗ＤＨＰＲαにより検出し、ＳＲの終末槽は抗ＲｙＲ１により検出した。核はＤＡＰＩにより検出し、筋線維周囲は抗ラミニンにより染色した。複数レベルの断面の画像を撮影し、再構成して３Ｄ効果を得た。スケールバー：３０μｍ。
【図６Ｃ】ｄＫＯマウスにおけるＴＡ筋線維の三つ組の崩壊を示す。ＷＴ筋の電子顕微鏡写真を示す。スケールバー：２μｍ。
【図６Ｄ】ｄＫＯマウスにおけるＴＡ筋線維の三つ組の崩壊を示す。ｄＫＯ筋の電子顕微鏡写真を示す。ｄＫＯ  ＴＡ筋は、ＷＴ  ＴＡ筋（Ｃ）に存在しない電子密度の高い構造の蓄積を示した。スケールバー：２μｍ。
【図６Ｅ】ｄＫＯマウスにおけるＴＡ筋線維の三つ組の崩壊を示す。ｄＫＯ筋の電子顕微鏡写真を示す。ｄＫＯ  ＴＡ筋は、ＷＴ  ＴＡ筋（Ｃ）に存在しない電子密度の高い構造の蓄積を示した。スケールバー：０．５μｍ。
【図６Ｆ】ｄＫＯマウスにおけるＴＡ筋線維の三つ組の崩壊を示す。ｄＫＯ筋の電子顕微鏡写真を示す。ｄＫＯ  ＴＡ筋は、ＷＴ  ＴＡ筋（Ｃ）に存在しない電子密度の高い構造の蓄積を示した。スケールバー：０．５μｍ。
【図６Ｇ】ｄＫＯマウスにおけるＴＡ筋線維の三つ組の崩壊を示す。ＷＴ筋の電子顕微鏡写真を示す。スケールバー：０．５μｍ。
【図６Ｈ】ｄＫＯマウスにおけるＴＡ筋線維の三つ組の崩壊を示す。ｄＫＯ筋の電子顕微鏡写真を示す。ｄＫＯ筋は、ＷＴ筋（ＧおよびＩ）と比較して配向異常のＴ管（矢印）を示した。スケールバー：０．５μｍ。
【図６Ｉ】ｄＫＯマウスにおけるＴＡ筋線維の三つ組の崩壊を示す。ＷＴ筋の電子顕微鏡写真を示す。スケールバー：０．２μｍ。
【図６Ｊ】ｄＫＯマウスにおけるＴＡ筋線維の三つ組の崩壊を示す。ｄＫＯ筋の電子顕微鏡写真を示す。ｄＫＯ筋は、ＷＴ筋（ＧおよびＩ）と比較して配向異常のＴ管（矢印）を示した。スケールバー：０．２μｍ。
【図７】ＳＲおよびＴ管に関連するタンパク質について、ＷＴおよびｄＫＯのＴＡ筋のウエスタンブロット解析を示す。ウエスタンブロット解析は、３ヶ月齢のＷＴ  ｄＫＯのＴＡ筋由来のタンパク質ライセートについて行った。抗体を使用してＲｙＲ１、ＤＰＨＲα、カルセケストリン（Ｃａｓｑ）、ＳＥＲＣＡ２、ホスホランバン（ｐｌｎ）、セリン１６リン酸化ホスホランバン（Ｓｅｒｌ６−ｐｌｎ）、サルコリピン（ｓｌｎ）、ＣａｍＫＩＩおよびリン酸化ＣａｍＫＩＩの発現を検出した。ローディングコントロールとしてα−アクチンを検出した。
【図８Ａ】ｄＫＯ筋におけるミトコンドリア機能不全を示す。ミトコンドリアは、腓腹筋の赤筋および白筋から単離し、ＲＣＲ、ＡＤＰ刺激状態３呼吸（ＡＤＰ）、およびＦＣＣＰ刺激呼吸（ＦＣＣＰ）の酸素消費速度（ＯＣＲ）を測定した。ｎ＝２（ＷＴおよびｄＫＯ）。＊はＷＴに対してＰ＜０．０５。
【図８Ｂ】ｄＫＯ筋におけるミトコンドリア機能不全を示す。脂肪酸酸化は、腓腹筋の赤筋および白筋から単離したミトコンドリアを用いて測定した。クエン酸シンターゼ酵素活性は、赤筋および白筋の四頭筋から単離したミトコンドリアを用いて測定した。ｎ＝６（ＷＴおよびｄＫＯ）。＊はＷＴに対してＰ＜０．０５。
【図９Ａ】ｍｉＲ−１３３ａは、骨格筋においてＤｎｍ２発現を制御する。Ｄｎｍ２の３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−１３３ａの標的部位の位置、およびｍｉＲ−１３３ａの配列アライメント（５’−ＵＵＧＧＵＣＣＣＣＵＵＣＡＡＣＣＡＧＣＵＡ−３’（配列番号２９））と、マウス（５’−ＵＧＣＣＣＵＣＣＡＵＧＣＵＧＧＧＡＣＣＡＧＧＣＵＣＣＣＣＧ−３’（配列番号３０））、ヒト（５’−ＣＧＣＣＣＣＵＡＵＧＣＵＧＧＧＡＣＣＡＧＧＣＵＣＣＣＡＧ−３’（配列番号３１））、およびラット（５’−ＵＧＣＣＣＣＣＣＡＵＧＣＵＧＧＧＡＣＣＡＧＧＣＵＣＣＣＣＧ−３’（配列番号３２））のＤｎｍ２の３’ＵＴＲとを示す。Ｄｎｍ２の３’ＵＴＲにおいて保存されたｍｉＲ−１３３ａ結合部位（５’−ＧＧＧＡＣＣＡ−３’（配列番号３３））を示す。Ｄｎｍ２の３’ＵＴＲに突然変異を導入してｍｉＲ−１３３ａのシード配列（５’−ＵＧＧＵＣＣＣ−３’（配列番号３４））との塩基対合を破壊した。
【図９Ｂ】ｍｉＲ−１３３ａは、骨格筋においてＤｎｍ２発現を制御する。ＷＴ  Ｄｎｍ２の３’ＵＴＲ配列および変異Ｄｎｍ２の３’ＵＴＲ配列を含むルシフェラーゼレポーターコンストラクトを、ｍｉＲ−１３３ａを発現するプラスミドとＣＯＳ−１細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、ルシフェラーゼ活性を測定し、β−ガラクトシダーゼ活性に対して正規化した。
【図９Ｃ】ｍｉＲ−１３３ａは、骨格筋においてＤｎｍ２発現を制御する。ＷＴおよびｄＫＯのＴＡ筋におけるＤｎｍ２のｍＲＮＡの発現を示すリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを示す。ｎ＝３（ＷＴおよびｄＫＯ）。
【図９Ｄ】ｍｉＲ−１３３ａは、骨格筋においてＤｎｍ２発現を制御する。ＷＴマウスおよびｄＫＯマウスのＴＡ筋におけるダイナミン２タンパク質の発現を示すウエスタンブロットを示す。ｎ＝２（ＷＴおよびｄＫＯ）。ブロットを剥がし、ローディングコントロールとしてα−アクチンに対する抗体でリプローブした。さらに、デンシトメトリーにより判定し、α−アクチンに対して正規化したダイナミン２タンパク質の定量も示す。
【図１０Ａ】骨格筋におけるＤｎｍ２の過剰発現は、ＣＮＭを引き起こす。抗ダイナミン２および抗ｍｙｃを用いて導入遺伝子の過剰発現を示した、ＷＴとＭＣＫ−ＤＮＭ２トランスジェニックマウス系統Ｔｇ１およびＴｇ２とに由来するＴＡ筋のウエスタンブロット解析を示す。ローディングコントロールとして抗チューブリンを使用した。また、デンシトメトリーにより判定したタンパク質定量も示す。
【図１０Ｂ】骨格筋におけるＤｎｍ２の過剰発現は、ＣＮＭを引き起こす。６週齢のＷＴマウス、Ｔｇ１マウスおよびＴｇ２マウスのＴＡ筋の横断面をコムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）およびＤＡＰＩで染色して、トランスジェニックマウスの中心核（矢印）を示した。スケールバー：１００μｍ。
【図１０Ｃ】骨格筋におけるＤｎｍ２の過剰発現は、ＣＮＭを引き起こす。７週齢のトランスジェニックマウスにおけるＴＡ筋の中心核筋繊維の割合を示す。
【図１０Ｄ】骨格筋におけるＤｎｍ２の過剰発現は、ＣＮＭを引き起こす。１１週齢のＷＴマウスおよびＴｇ２マウスのＴＡ筋およびヒラメ筋の組織学的解析を示す。ＴＡ筋切片をＨ＆Ｅ、抗ラミニンおよびＤＡＰＩで染色して中心核を示し、ＮＡＤＨ−ＴＲで染色して分布異常および放射型の筋原線維間網（矢印）を明らかにした。スケールバー：４０μｍ。
【図１０Ｅ】骨格筋におけるＤｎｍ２の過剰発現は、ＣＮＭを引き起こす。１０週齢のＷＴマウスおよびＴｇ２マウス（各群ｎ＝３）ならびに３ヶ月齢のＷＴマウスおよびｄＫＯマウス（各群ｎ＝５）に、トレッドミル上で強制ダウンヒルランニングを実施した。筋パフォーマンスを疲労困憊までの時間として測定した。さらに総走行距離も示す。＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊＊はＰ＜０．００１を示す。
【図１１Ａ】ＭＣＫ−Ｄｎｍ２トランスジェニックマウスの解析を示す。１１週齢のＷＴマウスおよびＭＣＫ−Ｄｎｍ２  Ｔｇマウスの体重（ＢＷ）および筋肉量の測定値を示す。＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。ＷＴマウスおよびＴｇ２マウスはｎ＝３。
【図１１Ｂ】ＭＣＫ−Ｄｎｍ２トランスジェニックマウスの解析を示す。Ｔ管分布を検出するためＤＨＰＲαに対する抗体を用いた、１１週齢のＷＴマウスおよびＴｇ２マウス由来のＴＡ筋の免疫染色を示す。サイズバー：３０μｍ。
【図１１Ｃ】ＭＣＫ−Ｄｎｍ２トランスジェニックマウスの解析を示す。上図は、１１週齢のＴｇ２ヒラメ筋および心筋におけるダイナミン２タンパク質の発現を示すウエスタンブロット解析を示す。下図は、１１週齢のＷＴマウスおよびＴｇ２マウスのヒラメ筋の組織学的解析を示す。ヒラメ筋切片をＨ＆Ｅおよび異染性ＡＴＰアーゼで染色してＩ型筋線維（ダークブルー）を示した。
【図１２Ａ】ｄＫＯマウスおよびＭＣＫ−ＤＮＭ２トランスジェニックマウスの筋線維におけるジスフェルリン細胞内蓄積を示す。ダイナミン２およびジスフェルリンを検出するための、ＷＴマウスおよびｄＫＯマウス由来のＴＡ筋の免疫染色を示す。ｄＫＯ筋線維においてジスフェルリン細胞内蓄積が観察された。オーバーレイ画像から、ｄＫＯ筋の細胞内凝集体にダイナミン２およびジスフェルリンが局在していることが示される。スケールバー：３０μｍ。
【図１２Ｂ】ｄＫＯマウスおよびＭＣＫ−ＤＮＭ２トランスジェニックマウスの筋線維におけるジスフェルリン細胞内蓄積を示す。ジスフェルリンを検出するための、ＷＴマウスおよびＴｇ２マウス由来のＴＡ筋の免疫染色を示す。Ｔｇ２筋線維においてジスフェルリンの細胞内蓄積が観察された。スケールバー：３０μｍ。
【図１３Ａ】ｍｉＲ−１３３ａによる骨格筋線維型の制御を示す。１２週齢のＷＴマウスおよびｄＫＯマウス由来のヒラメ筋の異染性ＡＴＰアーゼ染色および抗ＭＨＣ−１免疫染色から、ｄＫＯヒラメ筋においてＩ型筋繊維の増加が示された。さらにヒラメ筋のＨ＆Ｅ染色も示す。スケールバー：１００μｍ。
【図１３Ｂ】ｍｉＲ−１３３ａによる骨格筋線維型の制御を示す。異染性ＡＴＰアーゼ染色により判定した、ヒラメ筋におけるＩ型筋線維の割合を示す。ｎ＝６（ＷＴおよびｄＫＯ）。
【図１３Ｃ】ｍｉＲ−１３３ａによる骨格筋線維型の制御を示す。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより判定した、ヒラメ筋におけるＭＨＣアイソフォームの転写物の発現を示す。ｎ＝３（ＷＴおよびｄＫＯ）。さらに、ＷＴマウスおよびｄＫＯマウス由来のヒラメ筋、ＥＤＬ筋およびＴＡ筋のタンパク質抽出物のＭＨＣアイソフォームの発現も、グリセロールゲル電気泳動に続き、銀染色により判定した。
【図１４Ａ】ＷＴ筋およびｄＫＯ筋の線維型解析を示す。ＭＨＣ−１に対する抗体を用いた、生後１日目のＷＴマウスおよびｄＫＯマウス由来のヒラメ筋およびＥＤＬ筋の免疫組織化学を示す。スケールバー＝１００μｍ。
【図１４Ｂ】ＷＴ筋およびｄＫＯ筋の線維型解析を示す。４週および２週のＷＴマウスおよびｄＫＯマウス由来のヒラメ筋の異染性ＡＴＰアーゼ染色を示す。スケールバー＝１００μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の詳細な説明
本発明の一部は、ｍｉＲＮＡが骨格筋の構造、機能、生体エネルギーおよび筋線維の種類の維持において不可欠な役割を果たしているという発見に基づく。これを踏まえ、本明細書に開示されるのは、骨格筋の異常な機能または活性、たとえば骨格筋ミオパチーを処置または予防する方法および組成物である。本発明者らは、ｍｉＲ−１３３ａ−１およびｍｉＲ−１３３ａ−２の遺伝子を欠損させたマウスの作出により、成体発症型ＣＮＭを発症するＣＮＭのマウスモデルを開発した。このマウスは、ミトコンドリア機能障害、速筋から遅筋への筋線維型変換、および筋三つ組（興奮収縮連関の部位）の崩壊を伴うＩＩ型（速筋）筋線維のＣＮＭを発症した。これらの異常はヒトＣＮＭと類似しており、少なくとも一部は、ヒト中心核ミオパチーに関係するＧＴＰａｓｅであるダイナミン２をコードするｍｉＲ−１３３ａ標的ｍＲＮＡの調節不全に起因する可能性がある。このため、本発明者らは、ｍｉＲ１３３ファミリーメンバー、特に、ｍｉＲ−１３３ａ−１およびｍｉＲ−１３３ａ−２が、骨格筋の機能およびホメオスタシスの様々な面に不可欠であることを証明した。これを踏まえ、本発明は、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの活性または発現を調節することにより骨格筋の異常な機能または活性を処置および予防する新規な治療アプローチを提供する。
【００１６】
ｍｉＲ−１３３ファミリーは、非常に相同的な３つのｍｉＲＮＡ、すなわちｍｉＲ−１３３ａ−１、ｍｉＲ−１３３ａ−２およびｍｉＲ−１３３ｂを含む。ｍｉＲ−１−１／ｍｉＲ−１３３ａ−２およびｍｉＲ−１−２／ｍｉＲ−１３３ａ−１のｍｉＲＮＡクラスターが心筋および骨格筋に発現するのに対し、ｍｉＲ−２０６／ｍｉＲ−１３３ｂクラスターは骨格筋のみに発現する（１６）。マウスでは急性神経損傷後の神経筋シナプスの効率的な再生にはｍｉＲ−２０６が必要であり、ｍｉＲ−２０６が減少すると、筋萎縮性側索硬化症の疾患の進行が加速する（１７）。ｍｉＲ−１およびｍｉＲ−１３３ａは、心臓の発生および機能において重要な役割を果たしており（１８、１９）、インビトロで筋芽細胞の増殖および分化を制御することも明らかになっている（２０）一方で、インビボでの骨格筋の発生または機能におけるこれらのｍｉＲＮＡの潜在的な機能は、研究されていなかった。
【００１７】
ｍｉＲ−１３３ａ−２はヒト２０番染色体からｍｉＲ−１−１と同時に転写されるのに対し、ｍｉＲ−１３３ａ−１はヒト１８番染色体からｍｉＲ−１−２と同時に転写される。ｍｉＲ−１３３ｂは、ヒト６番染色体の遺伝子間領域からのバイシストロニックな転写物からｍｉＲ−２０６と共に産生される。ｍｉＲ−１３３ａ−１およびｍｉＲ−１３３ａ−２は、互いに同一であり、ｍｉＲ−１３３ｂと２ヌクレオチド異なる（１８）。ｍｉＲ−１３３ａ−１およびｍｉＲ−１３３ａ−２は心筋および骨格筋に発現するのに対し、ｍｉＲ−１３３ｂは骨格筋特異的である（１８）。ｍｉＲ−１３３ａおよびｍｉＲ−１３３ｂのステムループおよび成熟配列を下記に示す。
ヒトｍｉＲ−１３３ａステムループ（配列番号１）：
ＡＣＡＡＵＧＣＵＵＵＧＣＵＡＧＡＧＣＵＧＧＵＡＡＡＡＵＧＧＡＡＣＣＡＡＡＵＣＧＣＣＵＣＵＵＣＡＡＵＧＧＡＵＵＵＧＧＵＣＣＣＣＵＵＣＡＡＣＣＡＧＣＵＧＵＡＧＣＵＡＵＧＧＡＵＵＧＡ
ヒト成熟ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号２）：
ＵＵＵＧＧＵＣＣＣＣＵＵＣＡＡＣＣＡＧＣＵＧ
ヒトｍｉＲ−１３３ｂステムループ（配列番号３）：
ＣＣＵＣＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＵＧＣＣＣＣＣＵＧＣＵＣＵＧＧＣＵＧＧＵＣＡＡＡＣＧＧＡＡＣＣＡＡＧＵＣＣＧＵＣＵＵＣＣＵＧＡＧＡＧＧＵＵＵＧＧＵＣＣＣＣＵＵＣＡＡＣＣＡＧＣＵＡＣＡＧＣＡＧＧＧＣＵＧＧＣＡＡＵＧＣＣＣＡＧＵＣＣＵＵＧＧＡＧＡ
ヒト成熟ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号４）：
ＵＵＵＧＧＵＣＣＣＣＵＵＣＡＡＣＣＡＧＣＵＡ
【００１８】
本発明は、中心核ミオパチーの処置または予防を必要とする被検体の中心核ミオパチーを処置または予防する方法であって、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのアゴニストを被検体に投与することを含む方法を提供する。さらに提供するのは、骨格筋の構造または機能の維持、速筋から遅筋への筋線維型変換の阻害、および骨格筋細胞におけるミトコンドリア機能不全の予防または処置を必要とする被検体の骨格筋の構造または機能を維持する方法、速筋から遅筋への筋線維型変換を阻害する方法、および骨格筋細胞におけるミトコンドリア機能不全を予防または処置する方法であって、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのアゴニストを被検体に投与することを含む方法である。
【００１９】
「アゴニスト」は、特定のｍｉＲＮＡの活性または発現を増加させるのであれば、どのような化合物または分子であってもよい。たとえば、ある種の実施形態では、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのアゴニストは、成熟ｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１３３ｂの配列を含むポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２および／または配列番号４の配列を含む。別の実施形態では、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのアゴニストは、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバー、たとえばｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１３３ｂのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列またはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドであってもよい。こうした実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１および／または配列番号３の配列を含んでもよい。ｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１３３ｂの成熟配列、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列もしくはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドは一本鎖でも、あるいは二本鎖でもよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオイドは、ｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１３３ｂの成熟配列、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列もしくはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列と少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％相補的である。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１３３ｂの成熟配列、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列もしくはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列と１００％相補的である配列を含む。
【００２０】
ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の化学修飾、たとえばロックド核酸、ペプチド核酸、糖修飾、たとえば２’−Ｏ−アルキル修飾（たとえば２’−Ｏ−メチル修飾、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾）、２’−フルオロ修飾および４’チオ修飾、ならびに骨格修飾、たとえば１つまたは複数のホスホロチオエート結合、モルホリノ結合またはホスホノカルボキシレート結合、およびこれらを含む組み合わせを含んでもよい。一実施形態では、ｍｉＲ−１３３ａ配列またはｍｉＲ−１３３ｂ配列を含むポリヌクレオチドは、ステロイド、たとえばコレステロール、ビタミン、脂肪酸、炭水化物もしくはグリコシド、ペプチド、または別の小分子リガンドにコンジュゲートされる。別の実施形態では、ｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１３３ｂのアゴニストは、ｍｉＲ−ｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１３３ｂの機能を増強、補完または置換する働きをするｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１３３ｂと異なる作用物質であってもよい。
【００２１】
別の実施形態では、ｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１３３ｂのアゴニストをインビボでベクターから発現させてもよい。「ベクター」は、目的の核酸を細胞の内部に送達するのに使用してもよい組成物である。以下に限定されるものではないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスなど多くのベクターが当該技術分野において公知である。このため、「ベクター」という用語は、自律複製プラスミドまたはウイルスを含む。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよび同種のものがあるが、これに限定されるものではない。発現コンストラクトは、生体細胞内で複製させてもよいし、あるいは、人工的に作製してもよい。本出願において、「発現コンストラクト」、「発現ベクター」および「ベクター」という用語は、一般的な例示的意味での本発明の用途を明らかするため同義で使われるものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
【００２２】
一実施形態では、ｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１３３ｂのアゴニストを発現する発現ベクターは、ｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−３３ｂ、たとえばｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１３３ｂの成熟配列、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列またはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチドに「作動可能に連結された」プロモーターを含む。「作動可能に連結された」または「転写制御下」という語句は、本明細書で使用する場合、プロモーターがポリヌクレオチドに対して、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するのに正しい位置および方向にあることを意味する。ｍｉＲ−３３ａまたはｍｉＲ−１３３ｂをコードするポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１３３ｂの一次前駆体ｍｉＲＮＡ配列（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）をコードしても、前駆体−ｍｉＲＮＡ配列（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）をコードしても、あるいは成熟ｍｉＲＮＡ配列をコードしてもよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１３３ｂの成熟配列、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列もしくはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列と少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％相補的であるポリヌクレオチドをコードする。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１３３ｂの成熟配列、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列もしくはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列と１００％相補的であるポリヌクレオチドをコードする。
【００２３】
別の実施形態では、発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは配列番号１の配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％相補的である配列を含む。別の実施形態では、発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは配列番号２の配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２と少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％相補的である配列を含む。別の実施形態では、発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは配列番号３の配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３と少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％相補的である配列を含む。別の実施形態では、発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは配列番号４の配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４と少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％相補的である配列を含む。
【００２４】
配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４の配列を含むポリヌクレオチドは、約１８〜約２０００ヌクレオチド長、約７０〜約２００ヌクレオチド長、約２０〜約５０ヌクレオチド長、または約１８〜約２５ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、配列番号１、２、３または４と少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％相補的である配列を含むポリヌクレオチドは、約１８〜約２０００ヌクレオチド長、約７０〜約２００ヌクレオチド長、約２０〜約５０ヌクレオチド長または約１８〜約２５ヌクレオチド長である。
【００２５】
ある種の実施形態では、遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」とは、遺伝子の特定の転写を開始するのに必要とされる、細胞の合成機構、または導入された合成機構により認識されるＤＮＡ配列をいう。本明細書のプロモーターという用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩまたはＩＩＩの開始部位に集まっている転写制御モジュールをいうのに使用される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を得るため、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列、ラットインスリンプロモーターおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを使用してもよい。発現レベルが所定の目的に十分であるならば、目的のポリヌクレオチド配列の発現を達成するため、当該技術分野において公知の他のウイルスプロモーターまたは哺乳動物細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターも同様に意図している。ある種の実施形態では、目的のポリヌクレオチド配列の組織特異的発現を得るため、組織特異的プロモーター、たとえば骨格筋特異的プロモーターを使用してもよい。
【００２７】
よく知られた特性を有するプロモーターを利用することにより、トランスフェクションまたは形質転換後の目的のタンパク質の発現のレベルおよびパターンを最適化することができる。さらに、特異的な生理的シグナルに応じて制御されるプロモーターを選択すると、ポリヌクレオチドの誘導的発現が可能になる。本発明の文脈において、目的のポリヌクレオチド（たとえばｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１３３ｂのアゴニスト）の発現を制御するために複数の調節エレメントを利用してもよい。
【００２８】
ウイルスプロモーター、細胞プロモーター／エンハンサーおよび誘導性プロモーター／エンハンサーを発現コンストラクトの目的のポリヌクレオチドと組み合わせて使用してもよい。加えて、ポリヌクレオチドの発現を誘導するには、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（the Eukaryotic Promoter Data Base EPDBにより）を使用してもよい。適切な細菌ポリメラーゼが送達複合体の一部としてあるいは別の遺伝子発現コンストラクトとして供給されれば、真核細胞は、特定の細菌プロモーターからの細胞質転写を支援することができる。
【００２９】
以下のリストは、目的のポリヌクレオチドの発現の促進に関与し得るすべてのエレメントを網羅することを意図するものではなく、その例示のみを意図するものである。使用してもよいプロモーターまたはエンハンサーの例として、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖、Ｔ細胞受容体、ＨＬＡ  ＤＱ  ａおよび／またはＤＱ  β、β−インターフェロン、インターロイキン−２、インターロイキン−２受容体、ＭＨＣクラスＩＩ  ５、ＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲａ、β−アクチン、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、プレアルブミン（トランスサイレチン）、エラスターゼＩ、メタロチオネイン（ＭＴＩＩ）、コラゲナーゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、ｔ−グロビン、β−グロビン、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ＨＡ−ｒａｓ、インスリン、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、α１−アンチトリパイン、Ｈ２Ｂ（ＴＨ２Ｂ）ヒストン、マウスおよび／またはＩ型コラーゲン、グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ９４およびＧＲＰ７８）、ラット成長ホルモン、ヒト血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、トロポニンＩ（ＴＮ  Ｉ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ＳＶ４０、ポリオーマ、レトロウイルス、パピローマウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、およびテナガザル白血病ウイルス（またはこれらに由来するもの）があるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
使用してもよい誘導エレメント／インデューサーの例には、ＭＴ  ＩＩ／ホルボールエステル（ＴＦＡ）、重金属；ＭＭＴＶ（マウス乳癌ウイルス）／糖質コルチコイド；β−インターフェロン／ポリ（ｒＩ）ｘ、ポリ（ｒｃ）；アデノウイルス５型Ｅ２／ＥＩＡ；コラゲナーゼ／ホルボールエステル（ＴＰＡ）；ストロメライシン／ホルボールエステル（ＴＰＡ）；ＳＶ４０／ホルボールエステル（ＴＰＡ）；マウスＭＸ遺伝子／インターフェロン、ニューカッスル病ウイルス；ＧＲＰ７８遺伝子／Ａ２３１８７；α−２−マクログロブリン／ＩＬ−６；ビメンチン／血清；ＭＨＣクラスＩ遺伝子Η−２κｂ／インターフェロン；ＨＳＰ７０／ＥＩＡ、ＳＶ４０ラージＴ抗原；プロリフェリン／ホルボールエステル−ＴＰＡ；腫瘍壊死因子／ＰＭＡ；および甲状腺刺激ホルモンα遺伝子／甲状腺ホルモン（またはこれらに由来するもの）があるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
特に注目されるのは筋特異的プロモーターであり、これには、ミオシン軽鎖−２プロモーター（Franz et al. (1994) Cardioscience, Vol. 5(4):235-43; Kelly et al. (1995) J. Cell Biol, Vol. 129(2):383-396）、αアクチンプロモーター（Moss et al. (1996) Biol. Chern., Vol. 271(49):31688-31694）、トロポニン１プロモーター（Bhavsar et al. (1996) Genomics, Vol. 35(1): 11-23）；Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体プロモーター（Barnes et al. (1997) J. Biol. Chem., Vol. 272(17): 11510-11517）、ジストロフィンプロモーター（Kimura et al. (1997) Dev. Growth Differ., Vol. 39(3):257-265）、α７インテグリンプロモーター（Ziober and Kramer (1996) J. Bio. Chem., Vol. 271(37):22915-22）、脳ナトリウム利尿ペプチドプロモーター（LaPointe et al. (1996) Hypertension, Vol. 27(3 Pt 2):715-22）、αＢ−クリスタリン／低分子量熱ショックタンパク質プロモーター（Gopal-Srivastava (1995) J. Mol. Cell. Biol., Vol. 15(12):7081-7090）、αミオシン重鎖プロモーター（Yamauchi-Takihara et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86(10):3504-3508）、ＡＮＦプロモーター（LaPointe et al. (1988) J. Biol. Chem., Vol. 263(19):9075-9078）、および筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター（Jaynes et al., Mol. Cell Biol. 6: 2855-2864 (1986); Horliek and Benfield, Mol Cell Biol, 9:2396, 1989; Johnson et al., Mol. Cell Biol, 9, 3393 (1989)）があるが、これに限定されるものではない。
【００３２】
ポリヌクレオチドの適切なポリアデニル化を行うために、望ましいのであればポリアデニル化シグナルを含めてもよい。ヒト成長ホルモンシグナルおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルなど、任意のこうした配列を利用することができる。さらに、発現カセットのエレメントとしてターミネーターも意図している。これらのエレメントは、メッセージレベルを上昇させ、カセットから他の配列へのリードスルーを最小限に抑える働きをすることができる。
【００３３】
本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを細胞に導入することができる多数の方法が存在している。ある種の実施形態では、発現コンストラクトは、ウイルスゲノムに由来するウイルスコンストラクトまたは操作されたコンストラクトを含む。受容体を介したエンドサイトーシスにより、ある種のウイルスは細胞に進入して、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、ウイルス遺伝子を安定かつ効率的に発現することができるため、そうしたウイルスは、外来遺伝子を哺乳動物細胞に導入するのに好ましい候補になっている。
【００３４】
インビボ送達の方法の１つでは、アデノウイルス発現ベクターを使用する。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）コンストラクトのパッケージングを支援し、さらに（ｂ）中にクローニングされているポリヌクレオチドを発現するのに十分なアデノウイルス配列コンストラクトを含むことを意図している。発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝子改変型を含む。３６ｋＢの直鎖二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスの遺伝子構造が分かっているため、大きなアデノウイルスＤＮＡを最大７ｋＢの外来配列で置換することができる。アデノウイルスＤＮＡはレトロウイルスとは異なり、遺伝毒性の可能性がなくエピソーマルに複製することができるため、宿主細胞がアデノウイルス感染しても染色体に組み込まれない。さらに、アデノウイルスは構造的に安定であり、大規模な増幅後にゲノム再構成が検出されていない。アデノウイルスは、細胞周期の段階に関係なくほぼすべての上皮細胞に感染することができる。アデノウイルスは、ゲノムが中型で、操作がしやすく、高力価、標的細胞の範囲が広く、感染力が高いため、遺伝子導入ベクターとして使用するのに特に好適である。ウイルスゲノムの両末端は、ウイルスのＤＮＡ複製およびパッケージングに必要な１００〜２００塩基対の逆方向反復配列（ＩＴＲ）を含む、シスエレメントである。
【００３５】
アデノウイルスベクターが複製欠損であるか、または少なくとも条件的欠損であるという条件以外は、アデノウイルスベクターの性質は、本発明の実施を成功させるのに重要でないと考えられる。アデノウイルスは、４２種の公知の血清型または亜群Ａ〜Ｆのいずれであってもよい。本発明に使用する条件的複製欠損アデノウイルスベクターを得るには、亜群Ｃのアデノウイルス５型が好ましい出発材料である。これは、アデノウイルス５型が、大量の生化学的情報および遺伝情報が知られているヒトアデノウイルスであり、アデノウイルスをベクターとして利用している大部分の構築物に歴史的に使用されてきたためである。
【００３６】
一実施形態では、ベクターは複製欠損であり、アデノウイルスＥ１領域を有さない。このため、Ｅ１コード配列が除去されている位置に、本明細書に開示されたアゴニストをコードするポリヌクレオチドを導入するのに都合がよいことがある。ただし、アデノウイルス配列内のコンストラクトの挿入位置は、本発明にとって重要ではない。また、目的のアゴニストをコードするポリヌクレオチドは、Ｅ３置換ベクターの除去されたＥ３領域の代わりに挿入しても、あるいはヘルパー細胞株またはヘルパーウイルスがＥ４欠損を補うＥ４領域に挿入してもよい。アデノウイルスベクターは、気管内注入、筋肉注射、末梢静脈内注射および定位的な脳への接種などにより様々な組織に投与することができる。
【００３７】
また、レトロウイルスベクターもｍｉＲ−１３３ファミリーメンバー、たとえばｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１３３ｂのアゴニストを細胞内に発現させるのに好適である。レトロウイルスは、感染細胞内で自らのＲＮＡを逆転写プロセスにより二本鎖ＤＮＡに変換することができることを特徴とする一本鎖ＲＮＡウイルスの一群である。その後、得られたＤＮＡは、プロウイルスとして細胞染色体に安定に組み込まれ、ウイルスタンパク質の合成を誘導する。組み込まれた結果、レシピエント細胞およびその子孫細胞においてウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスゲノムは、それぞれカプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素およびエンベロープ成分をコードする３つの遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含む。ｇａｇ遺伝子より上流に見られる配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルを含む。ウイルスゲノムの５’末端および３’末端には、２つの末端反復（ＬＴＲ）配列が存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含み、宿主細胞ゲノムへの組み込みにも必要とされる。
【００３８】
レトロウイルスベクターを構築するには、目的のポリヌクレオチドを特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入して、複製欠損のウイルスを作製する。ビリオンを作製するには、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株を構築する（Mann et al., 1983）。この細胞株に、レトロウイルスのＬＴＲ配列およびパッケージング配列と共にｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを導入する（たとえばリン酸カルシウム沈殿により）と、パッケージング配列により組換えプラスミドのＲＮＡ転写物がウイルス粒子にパッケージングされ得、次いでウイルス粒子が培養基に分泌される（Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983）。その後、組換えレトロウイルスを含む培地を集め、任意に濃縮し、遺伝子導入に使用する。レトロウイルスベクターは、多種多様の細胞型に感染することができる。
【００３９】
本発明の発現コンストラクトとして他のウイルスベクターを利用してもよい。ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターを利用してもよい。これらは、様々な哺乳動物細胞にとっていくつかの好ましい特徴を備えている。
【００４０】
目的のポリヌクレオチド（すなわちｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのアゴニスト）の発現を行うには、発現コンストラクトを細胞に送達する必要がある。この送達は、細胞株を形質転換する実験手順と同様にインビトロで達成してもよいし、あるいはある種の病状の処置と同様にインビボまたはエキソビボで達成してもよい。送達の１つの機構は、発現コンストラクトが感染性ウイルス粒子のカプシドに包まれたウイルス感染によりものである。
【００４１】
また、当該技術分野において公知のように、発現コンストラクトを培養哺乳動物細胞に導入するいくつかの非ウイルス方法も、本発明により意図されている。これらの方法には、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、直接マイクロインジェクション、ＤＮＡ封入リポソームおよびリポフェクタミン−ＤＮＡ複合体、細胞音波処理、高速のマイクロプロジェクタイルを使用した遺伝子銃、および受容体を介したトランスフェクションがある。これらの技術の一部は、インビボまたはエキソビボでの使用にうまく適合させることができる。
【００４２】
発現コンストラクトが細胞に送達されたなら、目的のポリヌクレオチドをコードする核酸は様々な部位に位置し、発現することができる。ある種の実施形態では、目的のポリヌクレオチドをコードする核酸は細胞のゲノムに安定に組み込まれ得る。この組み込みは相同組換え（遺伝子置換）を介したよく似た位置および方向での組み込みあってもよいし、あるいは、核酸はランダムな非特異的位置（遺伝子増強）に組み込まれてもよい。なおさらなる実施形態では、核酸は、エピソーマルな別のＤＮＡセグメントとして細胞内に安定に維持されてもよい。こうした核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期と無関係に、あるいは宿主細胞周期と同調して維持および複製ができるのに十分な配列をコードする。発現コンストラクトをどのように細胞に送達するか、および核酸が細胞のどこにとどまるかは、利用される発現コンストラクトの種類によって異なる。
【００４３】
本発明の更に別の実施形態では、発現コンストラクトは、単に裸の組換えＤＮＡまたはプラスミドからなっていてもよい。このコンストラクトの導入は、物理的または化学的に細胞膜の透過性を高める上述の方法のいずれかにより行うことができる。これは、特にインビトロでの導入に適しているが、インビボでの使用にも同様に応用することができる。たとえば、リン酸カルシウム沈殿物の形態のポリオーマウイルスＤＮＡが、成体マウスおよび新生仔マウスの肝臓および脾臓に送達され、活発なウイルス複製および急性感染を示し、リン酸カルシウム沈殿したプラスミドの直接腹腔内注射により、トランスフェクトされた遺伝子が発現することが示されている。目的のポリヌクレオチド（すなわちｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのアゴニスト）をコードするＤＮＡも、同様にインビボで導入され、発現することができることが想定される。
【００４４】
本発明の更に別の実施形態では、裸のＤＮＡ発現コンストラクトを細胞に導入するのに粒子銃を用いてもよい。この方法は、ＤＮＡをコーティングしたマイクロプロジェクタイルを高速に加速して、細胞膜を貫通させ、細胞を殺すことなく細胞に入り込ませることできることを利用する。小型粒子を加速するいくつかの装置が開発されている。こうした装置の１つは、高圧放電を利用して電流を発生させ、これが輸送力となる。使用されるマイクロプロジェクタイルは、タングステンビーズまたは金ビーズなどの生物学的に不活性な物質からなっている。ラットおよびマウスの肝臓の皮膚および筋肉組織などの選択した器官にインビボで撃ち込まれてきた。これには、ガンと標的器官との間に介在する任意の組織を除去するため、組織または細胞の外科的露出、すなわち、エキソビボ処置が必要となる場合がある。さらに、特定の目的のポリヌクレオチド（すなわちｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのアゴニスト）をコードするＤＮＡは、この方法により送達してもよく、やはり本発明に包含される。
【００４５】
本発明のさらなる実施形態では、発現コンストラクトをリポソームに封入してもよい。リポソームは、リン脂質二分子膜および内部の水性媒体を特徴とする小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒体で隔てられた複数の脂質層を有する。リン脂質を過剰の水溶液に懸濁すると、多重膜リポソームが自然に形成される。脂質成分では閉鎖構造を形成する前に自己再構成が起こり、脂質二重層の間に水と溶解した溶質とが封入される。また、リポフェクタミン−ＤＮＡ複合体も意図している。
【００４６】
本発明のある種の実施形態では、リポソームはセンダイウイルス（ＨＶＪ）と複合体形成してもよい。これにより、細胞膜と融合しやすくなり、リポソームに封入されたＤＮＡが細胞に入るのを促進することが示されている。他の実施形態では、リポソームは、核の非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合体形成しても、あるいは核の非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と一緒に利用してもよい。なおさらなる実施形態では、リポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方と複合体形成しても、あるいはＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方と一緒に利用してもよい。その場合、こうした発現コンストラクトは、インビトロおよびインビボで核酸の導入および発現に利用され成功を収めており、本発明に適している。ＤＮＡコンストラクトに細菌プロモーターを利用する場合、リポソーム内に適切な細菌ポリメラーゼを含めると望ましいことがある。
【００４７】
ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの特定のアゴニストをコードする核酸を細胞に送達するのに利用することができる他の発現コンストラクトとして、受容体を介した送達ビヒクルがある。こうしたビヒクルはほぼすべての真核細胞において、受容体を介したエンドサイトーシスによる巨大分子の選択的な取り込みを活用する。様々な受容体が細胞型特異的に分布しているため、この送達は、非常に特異的であり得る。受容体を介した遺伝子ターゲティングビヒクルは一般に、２つの成分、すなわち細胞受容体特異的リガンドおよびＤＮＡ結合剤からなる。いくつかのリガンドが、受容体を介した遺伝子導入に使用されてきた。広範囲に特性が調べられたリガンドとして、本発明により意図されているアシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）およびトランスフェリンがある。ＡＳＯＲと同じ受容体を認識する合成ネオ糖タンパク質が遺伝子送達ビヒクル使用されて、さらに上皮増殖因子（ＥＧＦ）も遺伝子を扁平上皮癌細胞に送達するのに使用されており、これらも本明細書に使用するのに意図されている。
【００４８】
他の実施形態では、送達ビヒクルはリガンドおよびリポソームを含んでもよい。たとえば、ラクトシルセラミド、ガラクトース末端アシアルガングリオシドをリポソームに組み込むことが行われており、肝実質細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増加が観察された。このため、特定の遺伝子をコードする核酸は、リポソームを用いてあるいは用いずにどのような受容体−リガンド系によっても、ある細胞型に特異的に送達し得ることも実行可能である。
【００４９】
特定の例では、オリゴヌクレオチドをカチオン性脂質と組み合わせて投与してもよい。カチオン性脂質の例としては、リポフェクチン、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＯＴＡＰがあるが、これに限定されるものではない。特に援用する国際公開第００７１０９６号の公報には、遺伝子治療に効率的に使用することができるＤＯＴＡＰ：コレステロールまたはコレステロール誘導体製剤など様々な製剤が記載されている。他の開示にも、ナノ粒子を含む様々な脂質製剤またはリポソーム製剤、および投与方法が考察されている。こうしたものとして、以下に限定されるものではないが、米国特許出願公開第２００３／０２０３８６５号、同第２００２／０１５０６２６号、同第２００３／００３２６１５号および同第２００４／００４８７８７号があり、これらは、製剤、ならびに核酸の投与および送達に関連する他の態様を開示する範囲で特に援用する。粒子の形成に使用する方法も、それぞれその全体を援用する米国特許第５，８４４，１０７号、同第５，８７７，３０２号、同第６，００８，３３６号、同第６，０７７，８３５号、同第５，９７２，９０１号、同第６，２００，８０１号および同第５，９７２，９００号に開示されている。
【００５０】
ある種の実施形態では、送達をエキソビボ条件下でより容易に行うことができる。エキソビボとは、動物から細胞を単離し、細胞にインビトロで核酸を送達してから、改変した細胞を動物に戻すことをいう。これには、動物から組織／器官を外科的に除去すること、または細胞および組織の初代培養を行うことが含まれてもよい。
【００５１】
ある種の実施形態では、本発明の核酸コンストラクトを含む細胞を同定する。細胞は、発現コンストラクトにマーカーを含めることによりインビトロでも、あるいはインビボでも同定することができる。こうしたマーカーを用いれば、細胞に同定可能な変化が生じ、発現コンストラクトを含む細胞を同定しやすくすることができると考えられる。通常、薬剤選択マーカーを組み込むと、クローニングおよび形質転換体の選択を補助する働きをし、たとえば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は、有用な選択可能なマーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの酵素を利用してもよい。また、免疫マーカーを利用してもよい。利用する選択可能なマーカーは、目的のポリヌクレオチド（すなわちｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのアゴニスト）をコードする核酸と同時に発現することができる限り、重要でないと考えられる。選択可能なマーカーの別の例も当業者によく知られている。
【００５２】
一実施形態では、本発明は、被検体の骨格筋ミオパチーを処置または予防する方法を提供する。「骨格筋ミオパチー」とは、骨格筋に神経障害によるものではない疾患がある状態をいう。ミオパチーは、遺伝性遺伝子欠損（たとえば、筋ジストロフィー）により起こることもあるし、あるいは内分泌障害、炎症性障害（たとえば、多発性筋炎）および代謝障害により起こることもある。症状としては、骨格筋、たとえば近位筋または遠位筋の筋力低下および萎縮を挙げることができるが、これに限定されるものではない。ミオパチーの中には、筋ジストロフィーのように若年齢で発症するものあれば、年齢が高くなって発症するものもある。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本発明は、中心核ミオパチー（ＣＮＭ）を処置または予防する方法であって、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのアゴニストを投与することを含む方法を提供する。ＣＮＭは、筋力低下、および筋肉の筋線維の中心部に異常に核が存在していることを特徴とする先天性ミオパチーの一群である（１、２）。ＣＮＭは、主に３つの型、すなわちミオチューブラリン遺伝子（ＭＴＭ１）の突然変異により引き起こされる重症新生児型のＸ連鎖劣性ミオチュブラーミオパチー（ＸＬＭＴＭ）：ダイナミン２遺伝子（ＤＮＭ２）の突然変異により引き起こされる、軽度、中等度または重度の表現型をとる古典的な常染色体優性型；およびアンフィファイシン２遺伝子（ＢＩＮ１）の突然変異により引き起こされる重度および中等度の表現型を呈する常染色体劣性型に分類することができる（１、２）。このため、一実施形態では、本発明は、被検体のＸＬＭＴＭ、古典的な常染色体優性型のＣＮＭ、または常染色体劣性型のＣＮＭを処置または予防する方法を提供する。この方法は、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのアゴニスト、たとえば  ｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１３３ｂのアゴニストを投与することを含んでもよい。別の実施形態では、ＣＮＭを処置または予防する方法は、ＭＴＭ１遺伝子、ＤＮＭ２遺伝子またはＢＩＮ１遺伝子の突然変異を持つ被検体に、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバー、たとえばｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１３３ｂのアゴニストを投与することを含む。
【００５４】
ＣＮＭの特徴として典型的には、以下の共通の病理学的特徴、（ａ）Ｉ型筋線維の優性および小さな線維サイズ；（ｂ）ミトコンドリア異常を示唆する異常なＮＡＤＨ−テトラゾリウムレダクーゼ（ＮＡＤＨ−ＴＲ）染色パターン；および（ｃ）壊死、筋線維の死または再生がないことが挙げられる（２）。このため、本明細書にさらに提供するのは、被検体の骨格筋の構造または機能を維持する方法、速筋から遅筋への筋線維型変換を阻害する方法、またはミトコンドリア機能不全を予防または処置する方法であって、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのアゴニストを投与することを含む方法である。いくつかの実施形態では、被検体は哺乳動物、たとえばヒト、マウス、ウマまたはイヌである。
【００５５】
本発明の別の実施形態では、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのアゴニストを他の治療方式と組み合わせて使用することが想定される。このため、本明細書に記載の本発明のｍｉＲＮＡのアゴニストに加えて、「標準的な」治療法を被検体に施してもよい。こうした標準的な療法は、処置される個々の骨格筋ミオパチーによって異なるが、薬物療法、理学療法、装具療法、手術、マッサージおよび鍼療法を挙げることができる。
【００５６】
組み合わせ療法は、骨格筋細胞を２つの作用物質を含む単一の組成物または薬理製剤と接触させることにより、あるいは細胞を２つの別々の組成物または製剤と同時に接触させることにより、達成することができ、この場合、一方の組成物はｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのアゴニストを含み、他方は第２の作用物質を含む。あるいは、ｍｉＲＮＡのアゴニストを用いた療法は、数分から数週の範囲の間隔で他方の作用物質（単数または複数）の投与の前に投与しても、あるいは後に投与してもよい。他方の作用物質およびｍｉＲＮＡのアゴニストを細胞に別々に導入する実施形態では、作用物質およびｍｉＲＮＡのアゴニストが依然として細胞に対して有利な組み合わせ作用を発揮できるように、一般に各送達期間の間で相当な期間が経過しないようにすると考えられる。こうした例では、典型的には２つの療法剤を互いに約１２〜２４時間以内、一層好ましくは、互いに約６〜１２時間以内に細胞と接触させ、遅延時間は約１２時間にとどめることが最も好ましいであろうことを意図している。一部の状況では、処置の期間を大幅に延長することが望ましい場合があるが、しかしながら、それぞれの投与の間に経過するのは数日間（２日間、３日間、４日間、５日間、６日間または７日間）から数週間（１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間または８週間）とする。
【００５７】
また、ｍｉＲＮＡのアゴニストあるいは他の作用物質を２回以上投与することが望ましいことも考えられる。この場合は、様々な組み合わせを利用してもよい。ｍｉＲＮＡのアゴニストが「Ａ」、他の作用物質／療法が「Ｂ」である例を挙げると、３回および４回の総投与回数に対して以下の順列が例示される：Ａ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ｂ／Ａ、Ａ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ａ／Ａ、Ａ／Ｂ／Ｂ、Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ、Α／Ａ／Β／Β、Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ、Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ、Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ、Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ、Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ、Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ、Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ、Ｂ／Ａ／Ｂ／ＢおよびＢ／Ｂ／Ａ／Ｂ。他の組み合わせも同様に意図している。
【００５８】
また、本発明は、処置後にｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのアゴニストを除去または排除する方法も意図している。一実施形態では、本方法は、筋特異的プロモーターを用いて骨格筋細胞におけるｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの結合部位領域を過剰発現させることを含む。結合部位領域は好ましくは、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのシード領域（ｍｉＲＮＡの２〜８塩基目の５’部分）の配列を含む。いくつかの実施形態では、結合部位は、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの１つまたは複数の標的の３’ＵＴＲを含んでもよい。たとえば、一実施形態では、ｍｉＲ−１３３ａファミリーメンバーの結合部位は、ＤＮＭ２の３’ＵＴＲを含む。別の実施形態では、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのアゴニストの後にｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの阻害剤を投与して、マイクロＲＮＡの機能を減弱または停止させてもよい。こうした阻害剤は、アンタゴミア（antagomir）、アンチセンスまたは阻害性ＲＮＡ分子（たとえばｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）を含んでもよい。
【００５９】
本発明は、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのアゴニストおよび薬学的に許容されるキャリア、たとえばｍｉＲ−１３３ａのアゴニストおよび薬学的に許容されるキャリア、またはｍｉＲ−１３３ｂのアゴニストおよび薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物をさらに包含する。臨床応用を意図する場合、医薬組成物は、所期の応用に適した形態で調製する。一般に、これには、発熱物質のほか、ヒトまたは動物に有害となり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することが必要とされる。
【００６０】
コロイド分散系、たとえば巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズおよび脂質を用いた系、たとえば水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを、本明細書に記載のマイクロＲＮＡ機能のアゴニストの送達ビヒクルとして使用してもよい。本発明の核酸を骨格筋組織などの組織に送達するのに好適な市販されている脂肪乳剤として、Intralipid（商標）、Liposyn（商標）、Liposyn（商標）II、Liposyn（商標）III、Nutrilipidおよび他の同様の脂質乳剤がある。インビボでの送達ビヒクルとして使用されるのに好ましいコロイド系はリポソーム（すなわち、人工膜小胞）である。こうした系の調製および使用については当該技術分野において周知である。例示的な製剤も、その全体を本明細書に援用する米国特許第５，９８１，５０５号；米国特許第６，２１７，９００号；米国特許第６，３８３，５１２号；米国特許第５，７８３，５６５号；米国特許第７，２０２，２２７号；米国特許第６，３７９，９６５号；米国特許第６，１２７，１７０号；米国特許第５，８３７，５３３号；米国特許第６，７４７，０１４号；および国際公開第０３／０９３４４９号に開示されている。
【００６１】
一般に、適切な塩および緩衝液を利用して送達ベクターを安定にし、標的細胞による取り込みを可能にすることが望ましい。組換え細胞を患者に導入するときも、緩衝液を利用する。本発明の水性組成物は、薬学的に許容されるキャリアまたは水性媒体に溶解または分散させた有効量の送達ビヒクルを含む。「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という語句は、分子的実体および組成物を動物またはヒトに投与するとき、有害反応、アレルギー反応または他の有害反応を起こさないことをいう。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容されるキャリア」は、医薬品、たとえばヒトへの投与に好適な医薬品を製剤化するのに許容可能な溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等調剤および吸収遅延剤ならびに同種のものを含む。医薬活性物質のこうした媒体および作用物質の使用は、当該技術分野において周知である。従来の任意の媒体または作用物質が本発明の活性成分との相性が悪い場合を除き、治療用組成物におけるその使用を意図している。さらに、補助的な活性成分が組成物の核酸を不活化しない場合、組成物に補助的な活性成分を含めてもよい。
【００６２】
本発明の活性組成物は、古典的な医薬調製物を含んでもよい。本発明によるこれらの組成物の投与は、その経路により標的組織に達するのであれば、どのような一般的な経路を介してもよい。これには、経口投与、経鼻投与または口腔内投与が含まれる。あるいは、投与は、皮内注射、経皮注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射または静脈内注射による投与でも、あるいは骨格筋組織への直接注射による投与でもよい。こうした組成物は通常、上掲の記載のように薬学的に許容される組成物として投与されると考えられる。
【００６３】
また、活性化合物は非経口投与しても、あるいは腹腔内投与してもよい。例を挙げると、遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合した水で調製することができる。さらに、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびこれらの混合物、ならびに油で分散液を調製してもよい。通常の保存条件および使用条件下では、これらの調製物は一般に、微生物の増殖を予防する防腐剤を含む。
【００６４】
注射用途に好適な医薬品形態は、たとえば、滅菌水溶液または分散液、および無菌の注射用溶液または分散液で必要に応じて調製される無菌粉末を含む。一般に、これらの調製物は無菌であり、シリンジ操作が容易である程度の流動性がある。調製物は、製造および保存の条件下で安定である必要があり、混入微生物、たとえば細菌および真菌の作用から保護されていなければならない。適切な溶媒または分散媒は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールおよび同種のもの）、これらの好適な混合物、および植物油を含んでもよい。適切な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合に必要とされる粒度の維持、および界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールおよび同種のものにより行うことができる。多くの場合、等張剤、たとえば、糖またはナトリウム、クロリドを含めると好ましいであろう。注射用組成物の吸収の持続は、吸収を遅延させる作用物質、たとえば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することにより行うことができる。
【００６５】
無菌の注射用溶液は、活性化合物を、望ましいように他の任意の成分（たとえば上記に列挙したもの）と共に適切な量で溶媒に加えてから、濾過滅菌を行うことにより調製することができる。一般に、分散液は、基本的な分散媒および所望の他の成分、たとえば、上記に列挙した成分を含む無菌ビヒクルに、様々な滅菌活性成分を加えることにより調製する。無菌の注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥法およびフリーズドライ法を含み、これにより活性成分（単数または複数）と、前もって滅菌濾過した溶液由来の任意の所望の追加成分との粉末が得られる。
【００６６】
本発明の組成物は一般に、中性型または塩型で製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては、たとえば、無機酸（たとえば、塩酸もしくはリン酸、または有機酸（たとえば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸および同種のもの）から得られる酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とで形成される）がある。タンパク質の遊離カルボキシル基とで形成される塩も、無機塩基（たとえば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムもしくは水酸化第二鉄）または有機塩基（たとえば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインおよび同種のもの）から得ることができる。
【００６７】
製剤化したら、液剤は好ましくは、剤形に適合した形で、かつ治療上有効な量で投与する。製剤は、注射溶液、薬物放出カプセルおよび同種のものなど種々の剤形で容易に投与することができる。水溶液による非経口投与では、たとえば、溶液は一般に、好適に緩衝化し、液体希釈液を最初に、たとえば十分な食塩水またはグルコースで等張にする。こうした水性液剤は、たとえば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与に使用することができる。好ましくは、滅菌水性媒体は、特に本開示に照らして当業者に公知のように利用される。例を挙げると、１回用量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解させ、１０００ｍｌの皮下注入液に加えても、あるいは予定の注入部位に注射してもよい、（たとえば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照されたい）。薬理学的治療薬および投与方法、投薬量等は、当業者によく知られており（たとえば、関連部分を本明細書に援用する「Physicians Desk Reference」、Klaassen's 「The Pharmacological Basis of Therapeutics」、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、および「The Merck Index, Eleventh Edition」を参照されたい）、本開示に照らして本発明と組み合わせてもよい。好適な投薬量として、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ〜約１６０ｍｇ／ｋｇまたは約８０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇが挙げられる。処置される被検体の状態に応じて、投薬量の変更をある程度行う必要があろう。投与担当者は、いかなる場合でも、個々の被検体に適切な用量を決定するものとし、こうした個々の決定については当業者の技術の範囲内である。さらに、ヒト投与では、調製物は、FDA Office of Biologiesの基準の要求する無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度の基準に適合する必要がある。
【００６８】
本明細書に記載の組成物のいずれかは、キットに含まれていてもよい。非限定的な例では、ｍｉＲ−１３３ａおよび／またはｍｉＲ−１３３ｂのアゴニストは、キットに含まれている。キットは、水と、ｍｉＲＮＡの２本鎖のハイブリダイゼーションを促進するハイブリダイゼーション緩衝液とをさらに含んでもよい。また、キットは、ポリヌクレオチドアゴニストの細胞への送達を促進する１つまたは複数のトランスフェクション試薬（単数または複数）をさらに含んでもよい。
【００６９】
キットの成分は、水性媒体で収められていても、あるいは凍結乾燥形態で収められていてもよい。キットの容器手段は一般に、成分を入れられる、好ましくは好適にアリコートに分けられる少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ビン、シリンジまたは他の容器手段を含む。キットに２つ以上の成分（標識試薬および標識が一緒に収められている）が存在する場合、キットは一般に、追加成分を別々に入れることができる第２、第３または他の追加容器をさらに含む。しかしながら、成分の様々な組み合わせが１つのバイアルに含まれていてもよい。さらに、本発明のキットは典型的には、核酸を入れる手段と、市販用の密閉されている他の任意の試薬容器とを含む。こうした容器は、所望のバイアルを保管する射出成形またはブロー成形プラスチック容器を含んでもよい。
【００７０】
キットの成分を１種および／または複数種の液体溶液で提供する場合、液体溶液は水溶液であり、無菌水溶液が特に好ましい。しかしながら、キットの成分は乾燥粉末（単数または複数）として提供してもよい。試薬および／または成分を乾燥粉末として提供する場合、粉末は、好適な溶媒で再溶解してもよい。溶媒は、別の容器手段で提供してもよいことが想定される。
【００７１】
容器手段は一般に、核酸製剤を入れる、好ましくは、好適に分割する少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ビン、シリンジおよび／または他の容器手段を含む。キットは、無菌の薬学的に許容される緩衝液および／または他の希釈液を含む第２の容器手段をさらに含んでもよい。
【００７２】
こうしたキットは、ｍｉＲＮＡ／ポリヌクレオチドを保存または維持する、あるいは、その分解を防止する成分をさらに含んでもよい。こうした成分は、ＲＮＡｓｅフリーであっても、あるいはＲＮＡｓｅを防いでもよい。こうしたキットは一般に、好適な手段で、個々の試薬または溶液ごとに別々の容器を含む。
【００７３】
キットは、キットの成分の利用のほか、キットに含まれていない他の任意の試薬の使用に関する説明書をさらに含む。説明書は、実行できる変更例を含んでもよい。キットは、非経口投与または筋肉内投与など様々な投与経路でｍｉＲＮＡのアゴニストを投与する用具または装置をさらに含んでもよい。
【００７４】
本発明はさらに、被検体の骨格筋ミオパチーを診断する方法も含む。一実施形態では、本方法は、（ａ）被検体由来の骨格筋組織サンプルを入手すること；（ｂ）サンプル中のｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの活性または発現を評価すること；および（ｃ）ステップ（ｂ）の活性または発現を、正常組織サンプル中のｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの活性または発現と比較することを含み、正常組織サンプル中のｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの活性または発現と比較した、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの活性または発現の増加が骨格筋ミオパチーの診断基準となる。ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーは、ｍｉＲ−１３３ａでも、あるいはｍｉＲ−１３３ｂでもよい。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１３３ａおよびｍｉＲ−１３３ｂの両方の活性または発現を評価する。骨格筋ミオパチーはＣＮＭであってもよい。
【００７５】
一実施形態では、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの活性の評価は、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーにより制御される１つまたは複数の遺伝子、たとえばｍｉＲ−１３３ａおよび／またはｍｉＲ−１３３ｂにより制御される１つまたは複数の遺伝子の活性を評価することを含む。たとえば、いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１３３ａにより制御される１つまたは複数の遺伝子はＤＮＭ２である。別の実施形態では、本方法は、骨格筋ミオパチーの療法薬を被検体に投与すること、およびｍｉＲ−１３３ａおよび／またはｍｉＲ−１３３ｂの発現または活性を再評価することをさらに含む。ｍｉＲ−１３３ａおよび／またはｍｉＲ−１３３ｂの発現または活性は、処置後に測定し、正常組織サンプルまたは被検体から以前に（たとえば処置の前に）採取した組織サンプル中のこれらのｍｉＲＮＡの発現と比較する。
【００７６】
本発明は、骨格筋機能のモジュレーターを同定する方法をさらに含む。たとえば、一実施形態では、本発明は、骨格筋においてｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのモジュレーターを同定する方法を提供する。ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの機能の同定されたアゴニストは、ＣＮＭなどの骨格筋ミオパチーの処置または予防に有用である。ｍｉＲ−１３３ａおよび／またはｍｉＲ−１３３ｂのモジュレーター（たとえばアゴニスト）は、本発明の方法により、骨格筋の構造または機能を維持する、速筋から遅筋への筋線維型変換を阻害する、またはミトコンドリア機能不全を予防もしくは処置する、ＣＮＭの処置または予防のための医薬組成物に含めることができる。
【００７７】
モジュレーターを同定するためのアッセイは、候補物質の大きなライブラリーのランダムスクリーニングを含んでもよいし、あるいは、アッセイを使用して、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの活性または発現を阻害または促進する可能性を高くすると考えられる構造的属性を考慮して選択した特定のクラスの化合物に着目してもよい。
【００７８】
ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのモジュレーターを同定するには、一般に候補化合物の存在下および非存在下でｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの機能または活性を判定すればよい。一実施形態では、本方法は、（ａ）骨格筋細胞を候補化合物と接触させること；（ｂ）ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの活性または発現を評価すること；および（ｃ）ステップ（ｂ）の活性または発現を候補化合物の非存在下での活性または発現と比較することを含み、測定された活性または発現の相違から、候補化合物がｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのモジュレーターであり、したがって骨格筋が機能するまたは維持されることが示唆される。また、アッセイは、単離した細胞で行っても、器官で行っても、あるいは生体で行ってもよい。
【００７９】
ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの活性または発現の評価は、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの発現レベル、たとえばｍｉＲ−１３３ａおよび／またはｍｉＲ−１３３ｂの発現レベルを評価することを含んでもよい。当業者であれば、ＲＮＡの発現レベルを評価する種々の方法、たとえば、ノーザンブロッティングまたはＲＴ−ＰＣＲを熟知しているであろう。ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの活性または発現の評価は、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの活性、たとえばｍｉＲ−１３３ａおよび／またはｍｉＲ−１３３ｂの活性を評価することを含んでもよい。他の実施形態では、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの活性の評価は、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーにより制御される、たとえばｍｉＲ−１３３ａおよび／またはｍｉＲ−１３３ｂにより制御される遺伝子、たとえばＤＮＭ２の発現または活性を評価することを含む。当業者であれば、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーにより制御される遺伝子の活性または発現を評価する種々の方法を熟知しているであろう。こうした方法として、たとえば、ノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロッティングが挙げられる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、活性の評価は、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの活性または発現を含み、Ｔ管構造、ミトコンドリア機能、ＤＮＭ２タンパク質もしくは遺伝子の発現、またはＩ型筋線維組成を評価することを含んでもよい。当業者であれば、以下に限定されるものではないが、下記の例に記載された方法など種々の方法を熟知しているであろう。たとえば、Ｔ管構造は、電子顕微鏡観察、免疫組織化学により、および／または、興奮収縮連関に重要なＴ管およびＳＲの成分をコードする遺伝子、たとえば、ジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）のα１、β１およびγ１サブユニット（それぞれＣａｃｎａ１、Ｃａｃｎｂ１およびＣａｃｎｇ１によりコードされる）、リアノジン受容体１（Ｒｙｒ１）、１型および２型ＳＥＲＣＡポンプ（Ａｔｐ２ａ１およびＡｔｐ２ａ２）、サルコリピン、およびカルセケストリン１および２（Ｃａｓｑ１およびＣａｓｑ２）の発現を調査することにより評価することができる。ミトコンドリア機能は、ミトコンドリアの呼吸および／または脂肪酸酸化により評価することができる。ミトコンドリア機能の評価は、以下に限定されるものではないが、（ａ）呼吸調節率（ＲＣＲ）、酸化的リン酸化とＡＴＰ合成との共役；（ｂ）ＡＤＰ刺激状態３呼吸、ミトコンドリアがＡＴＰを作っているときの呼吸数；および（ｃ）カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン刺激（ＦＣＣＰ刺激）呼吸を含んでもよい。線維組成は、異染性ＡＴＰアーゼ染色および／または免疫組織化学により解析することができる。また、線維組成は、個々のＭＨＣアイソフォーム、たとえばＩ型ＭＨＣ（ＭＨＣ−Ｉ）およびＩＩ型ＭＨＣ（ＭＨＣ−ＩＩａ、ＭＨＣ−ＩＩｘ／ｄおよびＭＨＣ−ＩＩｂ）をコードする転写物の発現のリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ解析により評価してもよい。
【００８１】
言うまでもなく、本発明のスクリーニング方法はすべて、有効な候補が見出されない場合でも、それ自体有用であることが理解されよう。本発明は、こうした候補をスクリーニングする方法を提供するものであり、候補を見出す方法のみを提供するものではない。
【００８２】
本明細書で使用する場合、「候補化合物」という用語は、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーにより骨格筋の維持および機能を潜在的に調節することができる任意の分子をいう。有用な化合物の同定を「総当たりで行う（brute force）」こと目的として、有用な薬剤の基本的な基準を満たすと考えられる分子ライブラリーを様々な商業的供給源から取得することができる。コンビナトリアルに作成したライブラリーを含むこうしたライブラリーのスクリーニングは、多くの関連する（および関連しない）化合物の活性をスクリーニングする迅速かつ効率的な方法である。また、コンビナトリアルアプローチは、活性はあるが、その他の点で望ましくない化合物をモデルとした第２、第３および第４世代の化合物を作ることにより有望な薬剤の急速な進化にも役立つ。本発明の方法によりスクリーニングすることができる候補化合物の非限定的な例として、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたは小分子が挙げられる。また、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのモジュレーターは、ｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの上流調節因子のアゴニストでも、あるいは阻害剤でもよい。
【００８３】
迅速かつ安価で実行しやすいアッセイは、インビトロアッセイである。こうしたアッセイは一般に単離した分子を使用し、迅速かつ大量に行うことができ、それにより短期間に取得できる情報の量が増加する。種々の容器、たとえば試験管、プレート、ディッシュおよび他の表面、たとえばディップスティックまたはビーズを使用してアッセイを行うことができる。たとえば、オリゴヌクレオチドと標的ｍｉＲＮＡとのハイブリダイゼーションを評価してもよい。化合物のハイスループットスクリーニング技術については、国際公開第８４／０３５６４号に記載されている。プラスチックピンまたは他の何らかの表面などの固体支持体上で多くの小さな化合物を合成することができる。こうした分子は、ｍｉＲ−１３３ａおよび／またはｍｉＲ−１３３ｂにハイブリダイズできるかどうかを迅速にスクリーニングすることができる。
【００８４】
さらに、本発明は、細胞においてｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーの発現および機能を調節できるかどうかについて化合物をスクリーニングすることも意図している。こうしたスクリーニングアッセイには、この目的のために特に操作された細胞を含め、骨格筋細胞由来のもの（たとえばＣ２Ｃ１２細胞）など様々な細胞株を利用することができる。
【００８５】
インビボアッセイでは、実施例に記載されているようなｍｉＲ−１３３ａ−／−マウスなどの様々な動物モデルを使用する。その大きさ、取り扱いやすさ、ならびにその生理および遺伝子構造に関する情報を理由に、マウスは、特にトランスジェニックに好ましい実施形態である。しかしながら、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、スナネズミ、マーモット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、雌ウシ、ウマおよびサル（チンパンジー、テナガザルおよびヒヒなど）など他の動物も好適である。モジュレーターのアッセイは、骨格筋ミオパチーのモデルとなるように改変されたものを含め、これらの種のどれに由来する動物を用いて行ってもよい。
【００８６】
被検化合物による動物の処置では、適切な形態の化合物を動物に投与する。投与は、臨床目的に利用することができる任意の経路によるものである。インビボでの化合物の有効性の判定には、種々の異なる基準、以下に限定されるものではないが、シナプスの構造またはシグナル伝達の変化を含めてもよい。また、動物を用いれば、毒性および用量反応の測定もインビトロアッセイまたはインサイト（in cyto）アッセイより有効な形で行うことができる。
【００８７】
本発明は、細胞内のＤＮＭ２の発現を制御する方法であって、細胞をｍｉＲ−１３３ファミリーメンバーのモジュレーターと接触させることを含む方法を含む。一実施形態では、細胞内のＤＮＭ２の発現は、ｍｉＲ−１３３（すなわちｍｉＲ−１３３ａ）アゴニストの投与後に減少する。別の実施形態では、細胞内のＤＮＭ２の発現は、ｍｉＲ−１３３（すなわちｍｉＲ−１３３ａ）阻害剤の投与後に増加する。ある種の実施形態では、細胞は骨格筋細胞である。
【００８８】
以下の例は、様々な本発明の態様をさらに説明するために記載する。以下の例に開示される技術は、本発明者により本発明の実施の際に非常に役立つことが分かった技術および／または組成物であり、したがって本発明を実施するための好ましい方法になると考えられることを当業者は理解されたい。一方、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に関して多くの変更をなしても、本発明の精神および範囲を逸脱しない範囲でなお同様または類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
【実施例】
【００８９】
実施例
実施例１．骨格筋におけるｍｉＲ−１３３の発現
ｍｉＲ−１３３ａ−１およびｍｉＲ−１３３ａ−２は、心臓の発生および機能にとって重要である（１８）。ｍｉＲ−１３３ａ−１あるいはｍｉＲ−１３３ａ−２のどちらかを欠損しているマウスは正常であるのに対し、両方のｍｉＲＮＡを欠損しているダブルノックアウト（ｄＫＯ）マウスの約５０％は胎仔期または新生仔期に心室中隔欠損で死亡する（１８）。骨格筋におけるｍｉＲ−１３３ａの機能を調査するため、生存しているｍｉＲ−１３３ａ  ｄＫＯマウスを研究した。
【００９０】
様々な筋線維含量のいくつかの骨格筋を用いてノーザンブロット解析によりｍｉＲ−１３３の発現を判定した。酸化型Ｉ型（遅筋）筋線維はヒラメ筋に豊富であり、解糖型ＩＩ型（速筋）筋線維は腓腹筋および足底筋（Ｇ／Ｐ）、前脛骨（ＴＡ）筋ならびに長指伸筋（ＥＤＬ）筋などの他の筋肉群に豊富である。ｍｉＲ−１３３ａはこれらの筋肉群で同等レベルで発現したから（図１Ａ）、そのレベルはＩ型およびＩＩ型筋線維において同程度であることが示唆された。ｍｉＲ−１３３ｂはｍｉＲ−２０６と同時に転写され、主にＩ型線維を含むヒラメ筋に豊富であった（１７）。
【００９１】
以前記載されたように、ｍｉＲ−１３３ａ−１＋／−ｍｉＲ−１３３ａ２＋／−マウスを異種交配させてｍｉＲ−１３３ａ−／−（すなわち、ｄＫＯ）マウスを作製し（１８）、ｄＫＯ骨格筋におけるｍｉＲ−１３３ａ発現の減少をリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲで確認した（図１Ｂ）。ｄＫＯ骨格筋で検出された低レベルのｍｉＲ−１３３の発現は、ｍｉＲ−１３３ａプローブで検出されるｍｉＲ−１３３ｂの存在を示す。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果に基づき、ＷＴマウスのｍｉＲ−１３３ａとｍｉＲ−１３３ｂとの相対存在量を、ヒラメ筋では約１５：１、Ｇ／Ｐ筋、ＥＤＬ筋およびＴＡ筋では約５０：１と推定した。これにより、ｍｉＲ−１３３ｂが骨格筋においてｍｉＲ−１３３ａより豊富でなく、ヒラメ筋で豊富であることが確認される。
【００９２】
実施例２．ｄＫＯ骨格筋における中心核筋線維の蓄積
ｄＫＯマウスは、運動性において明らかな異常を示さなかった。４週齢で、ｄＫＯ筋は、組織学的解析とラミニンおよびＤＡＰＩの免疫染色とにより正常に見え、筋線維のサイズは、ＷＴ筋の大きさと同程度であった（図２Ａ〜Ｃ）。しかしながら、６週齢では、中心部に移行した核を持つ筋線維がｄＫＯマウスで見られ始め、ＥＤＬ筋、Ｇ／Ｐ筋およびＴＡ筋において中心核を持つ筋線維の割合は、年齢と共に徐々に増加した（図３Ａ）。１２週齢では、ｄＫＯマウスのＴＡ筋における筋線維のほぼ６０％が、中心部に移行した核を持っていた（図４、Ａ〜Ｃ）。一方、ｄＫＯヒラメ筋では、中心部に移行した核が比較的少なかった（図４、ＡおよびＣ）。これらの知見から、ｄＫＯマウスにおいて中心に位置する核の表現型はＩＩ型筋線維に特有であることが示唆される。さらに、脛骨長に対して正規化したところ、１２週齢で、ｄＫＯマウスは体重および様々な筋肉群の質量の両方が有意に小さくなった（図３Ｂ）。この年齢では、ｄＫＯマウスのＴＡ筋線維も直径が通常より小さくなった（図３Ｃ）。
【００９３】
筋異常の次の評価として、１２週のｄＫＯ筋線維のＮＡＤＨ−ＴＲ染色によりミトコンドリアおよび筋小胞体（ＳＲ）の分布を解析した。ｄＫＯ線維はＷＴ筋線維より、Ｇ／Ｐ筋、ＥＤＬ筋およびＴＡ筋において高い酸化酵素活性を示したが（図５Ａ）、これは、これらの筋肉における速筋から遅筋への筋線維型変換（すなわち、ＩＩ型からＩ型）を反映している可能性がある。個々の線維内の酸化酵素活性も不均等に分布し、一部の筋線維は、放射型の筋原線維間網を示した（図４Ｄ）。ＮＡＤＨ−ＴＲ染色すると、環状の線維も観察されることがあった（図４Ｄ）。ｄＫＯおよびＷＴの同腹仔間においてヒラメ筋のＮＡＤＨ−ＴＲ染色に大きな差はなかった（図５Ａ）。興味深いことに、中心に位置する核が存在しない４週齢のｄＫＯ筋では通常のＮＡＤＨ−ＴＲ染色パターンが観察された（図５Ｂ）。
【００９４】
中心部に移行した核の蓄積からは通常、疾患または傷害に反応した筋再生が示唆される（２１〜２３）。このため、４週齢のｄＫＯ筋線維における筋肉の損傷および変性の徴候を調査した。損傷細胞に蓄積するエバンスブルー色素（ＥＢＤ）取り込みによる筋細胞膜の完全性のモニタリングから、色素陽性線維が非常に少ないことが示された（１横断面当たり４未満）（図４Ｅ）。筋ジストロフィーを発症するｍｄｘマウス由来の筋肉を比較のため調査した。これらのマウスは、大量のＥＢＤ取り込みを示した（図４Ｅ）。筋細胞膜の漏出を示唆するクレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性の血清レベルを解析したところ、３ヶ月のｄＫＯマウスにおけるＣＫレベルがごくわずかしか（２倍）上昇しないこと（データ示さず）が観察された。さらに、ｄＫＯ筋線維は、ジストロフィー筋線維に特徴的である炎症、線維症またはアポトーシスの徴候も示さなかった（データ示さず）。１２ヶ月齢で、ｄＫＯ筋線維において筋線維形態の悪化、または炎症、線維症もしくは細胞死の徴候は、観察されなかった（図５Ｃ）。
【００９５】
筋再生をアッセイするため、再生のいくつかの筋原性マーカーをコードするｍＲＮＡの発現を解析した。ｄＫＯ  ＴＡ筋では、Ｍｙｏｇ（ミオゲニンをコードする）の発現が７倍上方制御されたが、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７およびＭｙｏＤなど他の筋原性マーカーの発現レベルに変化はなかった（図４Ｆ）。ＴＡ筋では、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより胚型ＭＨＣ（Ｍｙｈ３）および周産期型ＭＨＣ（Ｍｈｙ８）のｍＲＮＡレベルが共に大きく増加したものの（図４Ｆ）、ｄＫＯ筋線維では、免疫組織化学により胚型ＭＨＣタンパク質はほとんど検出されなかった（データ示さず）。これらのデータから、ｄＫＯマウスでは筋再生が極めて稀であり、これらのマウスで観察された広範囲に及ぶ中心核線維を説明するには不十分であることが示される。このため、明らかな壊死、筋線維の死または顕著な再生が起こらないｄＫＯマウスの中心核筋線維は、病理学的特徴がヒトＣＮＭによく似ている（１、２）。
【００９６】
実施例３．ｄＫＯマウスの筋線維におけるＴ管の崩壊
骨格筋では、横行小管（Ｔ管）およびＳＲの２つの終末槽からなる三つ組で興奮収縮連関が起こる（２４）。Ｍｔｍ１欠損マウスでは、筋線維において三つ組の数が減少し、Ｔ管が異常な構造になる（３）。Ｔ管の崩壊は、ヒトＣＮＭ患者でも報告されてきた（６、２５）。
【００９７】
Ｔ管構造がｄＫＯ筋において影響を受けるかどうかを評価するため、興奮収縮連関に重要なＴ管およびＳＲの成分をコードする遺伝子、たとえばジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）のα１、β１およびγ１サブユニット（それぞれＣａｃｎａ１、Ｃａｃｎｂ１およびＣａｃｎｇ１によりコードされる）、リアノジン受容体１（Ｒｙｒ１）、１型および２型ＳＥＲＣＡポンプ（Ａｔｐ２ａ１およびＡｔｐ２ａ２）、およびカルセケストリン１および２（Ｃａｓｑ１およびＣａｓｑ２）の発現を調べた。ｍＲＮＡレベルでは、Ｃａｎｃｎｇ１が２．５倍増加したのを除いて大部分の遺伝子の発現に変化がなかった（図６Ａ）。タンパク質レベルでのＲｙＲ１、ＤＨＰＲα、カルセケストリンおよびＳＥＲＣＡ２の発現も調べたところ、ほとんど変化が観察されなかった（図７）。一方、ＳｌｎのｍＲＮＡレベルの３５倍増加に伴い、サルコリピンタンパク質の同程度の増加が観察された（図６Ａおよび図７）。サルコリピンのアップレギュレーションは、骨格筋ミオパチーに共通の特徴であるが（２６）、このアップレギュレーションの意義は不明である。ホスホランバンの発現はｄＫＯ筋においてやや上方制御されたが、リン酸化ホスホランバンはタンパク質レベルではやや減少した（図７）。
【００９８】
さらに、Ｔ管のマーカーであるＤＨＰＲα、およびＳＲの終末槽のマーカーであるＲｙＲ１に対する免疫組織化学により三つ組の構造を解析した。ＷＴ筋線維の横断面では、Ｔ管およびＳＲの終末槽がどちらも、筋線維に沿って均等に分布した点状の染色パターンを示し（図６Ｂ）、これは、三つ組がサルコメアに対して直角に向いていることを反映していた。一方、ｄＫＯ筋線維では、Ｔ管およびＳＲがどちらも、染色が凝集し、一部の領域では染色が存在せず、個々の線維で分布が不規則であった（図６Ｂ）。さらに、ＷＴ筋では、隣接する筋線維は同じ染色パターンを示した。一方、ｄＫＯ筋では、隣接する筋線維が異なる染色パターンを示すことが多く（図６Ｂ）、三つ組が隣接する線維で異なる方向を向いていることが示唆された。ｄＫＯマウスがまだＣＮＭを発症していない４週齢では、Ｔ管の構造は、ＤＨＰＲα染色で示されるように正常であった（図５Ｄ）。
【００９９】
電子顕微鏡観察により超微細レベルでの三つ組の形態（図６、Ｃ〜Ｊ）をさらに解析した。成体ｄＫＯ  ＴＡ筋線維では、一部のＴ管（フェリシアン化カリウムにより濃色に染色）が、異常な形態を示し、筋原線維の方向と一致して長軸方向を向いていた。これらが、ＷＴ筋線維で観察されるのは稀であった（図６、Ｇ〜Ｊ）。ｄＫＯ筋線維では筋線維に沿って、さらに三つ組において電子密度の高い膜様構造の蓄積も観察された（図６、Ｄ〜Ｆ）。全体として、これらの知見から、ｍｉＲ−１３３ａがＴ管および三つ組の構造にとって重要であり、ｍｉＲ−１３３ａが存在しないとＴ管が崩壊することが示される。
【０１００】
実施例４．ｄＫＯ骨格筋におけるミトコンドリア機能不全
ｍｉＲ−１３３ａが欠損すると、骨格筋におけるミトコンドリア機能が変化するかどうかを判定するため、ｄＫＯマウスおよびＷＴマウスの腓腹筋の赤筋および白筋部分からミトコンドリアを単離した。単離後すぐに、ミトコンドリアの呼吸および脂肪酸酸化を評価した。ミトコンドリア機能の評価には、（ａ）呼吸調節率（ＲＣＲ）、酸化的リン酸化とＡＴＰ合成との共役；（ｂ）ＡＤＰ刺激状態３呼吸、ミトコンドリアがＡＴＰを作っているときの呼吸数；および（ｃ）カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン刺激（ＦＣＣＰ刺激）呼吸、酸化的リン酸化とＡＴＰ合成とが脱共役したときの最大呼吸数が含まれる。これらの測定値のいずれかが減少すると、電子伝達系、クレブス回路またはＡＴＰシンターゼ活性に欠陥があることが示唆される。ｍｉＲ−１３３ａが存在しないと、赤筋および白筋の両方でＲＣＲ、ＡＤＰ刺激状態３呼吸およびＦＣＣＰ刺激最大呼吸が大きく低下したが、ＦＣＣＰ刺激最大呼吸に対する作用は、赤筋でより顕著のようであった（図８Ａ）。さらに、ｄＫＯ動物の腓腹筋の赤筋部分および白筋部分の両方から単離したミトコンドリアでは、脂肪酸酸化全体も有意に減少した（図８Ｂ）。また、四頭筋の赤筋ではクエン酸シンターゼが減少したが、四頭筋の白筋では減少しなかった（図８Ｂ）。全体として、これらの結果から、ｍｉＲ−１３３ａが存在しないと、骨格筋の赤筋および白筋の両方で内因性のミトコンドリア機能および脂肪酸酸化が低下することが立証される。
【０１０１】
実施例５．ｍｉＲ−１３３αはＣＮＭのレギュレーターであるダイナミン２を標的とする
ｄＫＯマウスにおける骨格筋異常のメカニズムの基礎を調査するため、ＣＮＭに役割を果たしている可能性があるｍｉＲ−１３３ａの標的を探索した。強く予想されるｍｉＲ−１３３ａの標的の中に、エンドサイトーシス、メンブレントラフィック、ならびにアクチンおよび微小管の細胞骨格の制御に関係している大きなＧＴＰａｓｅ、Ｄｎｍ２がある（１１）。ドミナントネガティブに作用すると考えられるヒトＤＮＭ２遺伝子の点突然変異は、常染色体優性型のＣＮＭを引き起こす（７、８、２７、２８）。Ｄｎｍ２のｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、進化的に保存されたｍｉＲ−１３３ａ結合部位を含む（図９Ａ）。ｍｉＲ−１３３ａは、Ｄｎｍ２のｍＲＮＡの３’ＵＴＲに連結したルシフェラーゼレポーター遺伝子を抑制したのに対し、３’ＵＴＲの予想されたｍｉＲ−１３３ａ結合部位の突然変異は、抑制が阻止されたことから（図９Ｂ）、Ｄｎｍ２のｍＲＮＡがｍｉＲ−１３３ａの標的として確認された。さらに、ｄＫＯのＴＡ筋ではＷＴマウスと比較して、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによりＤｎｍ２のｍＲＮＡが２倍増加し、ウエスタンブロット解析によりダイナミン２タンパク質が約７倍増加したことが観察された（図９、ＣおよびＤ）。これらの結果から、ｍｉＲ−１３３がダイナミン２の発現をｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方で抑制することが示唆される。
【０１０２】
実施例６．骨格筋のダイナミン２の過剰発現はＩＩ型筋線維においてＣＮＭを引き起こす
ｄＫＯ筋線維で観察されたダイナミン２の発現増加は、ＣＮＭを引き起こすのに十分であるかどうかを調べるため、ダイナミン２タンパク質（Ｃ末端にｍｙｃ−ｔａｇを付加）を筋ＣＫ（ＭＣＫ）プロモーターの制御下で発現したトランスジェニックマウス（本明細書でＭＣＫ−ＤＹＮ２マウスという）（２９、３０）を作製した。トランスジェニックマウスの骨格筋におけるダイナミン２タンパク質の過剰発現は、ダイナミン２に対する抗体およびｍｙｃエピトープタグを用いたウエスタンブロッティングにより確認された（図１０Ａ）。それぞれＷＴレベルと比較してダイナミン２を３倍および６倍過剰発現した２つのＭＣＫ−ＤＹＮ２トランスジェニックマウス系統、Ｔｇ１およびＴｇ２を観察した。７週齢で、２つのトランスジェニック系は、中心核筋線維の蓄積を示した（図１０Ｂ）。興味深いことに、ｄＫＯマウスのレベルと同等のレベルでダイナミン２を過剰発現したＴｇ２マウスは、ｄＫＯマウスのレベルと同様にＴＡ筋において年齢依存的に中心核筋線維を示した（図１０Ｃ）。
【０１０３】
１１週齢で、Ｔｇ２マウスは筋萎縮症の徴候を示し、ＴＡ筋およびＧ／Ｐ筋の両方で筋肉量が減少した（図１１Ａ）。Ｔｇ２およびＷＴの同腹仔間の体重に差はなかった（図１１Ａ）。Ｔｇ２マウスのＴＡ筋の組織学的解析からは、不均一な線維サイズおよび中心核線維の存在が示された（図１０Ｄ）。この年齢のＴｇ２マウスのＴＡ筋における中心核筋線維の割合は、約２３％であった（データ示さず）。ＮＡＤＨ−ＴＲ染色から、酸化酵素活性および放射型の筋原線維間網の異常凝集が明らかになった（図１０Ｄ）。さらにＴｇ２のＴＡ筋では、ＤＨＰＲαに対する免疫組織化学により検出されたようなＴ管の異常構造も観察された（図１１Ｂ）。
【０１０４】
ダイナミン２タンパク質は、Ｔｇ２マウスのヒラメ筋または心臓では著しく過剰発現せず（図１１Ｃ）、ＩＩ型筋線維におけるＭＣＫプロモーターの優先的発現と一致していた（２９、３０）。したがって、当然のことながら、Ｔｇ２マウスのヒラメ筋または心蔵の機能の異常は、観察されなかった（図１１Ｃおよびデータ示さず）。
【０１０５】
筋パフォーマンスを評価するため、マウスにトレッドミルを用いたダウンヒルランニングを実施し、疲労困憊までの走行時間および距離を解析した。１０週齢で、Ｔｇ２マウスは、ＷＴマウスより走行時間が著しく短くなり（図１０Ｅ）、筋力低下が示唆された。ｄＫＯマウスは、走行能力がより劇的に低下した（図１０Ｅ）。しかしながら、ｄＫＯマウスの心機能の低下も運動能力低下の寄与因子である可能性もある。
【０１０６】
最近、ヒトＤＮＭ２関連ＣＮＭ患者およびＲ４５６Ｗ  Ｄｎｍ２突然変異を持つヘテロ接合マウスで、ジスフェルリンの細胞内蓄積が報告された（９）。さらにｄＫＯ筋およびＴｇ２筋におけるジスフェルリンの局在も解析した。興味深いことに、筋線維内部にジスフェルリンが著しく蓄積することが、ｄＫＯ筋線維およびＴｇ２筋線維の両方で観察された（図１２、ＡおよびＢ）。さらに、ｄＫＯ筋線維では細胞内ジスフェルリンの少なくとも一部がダイナミン２と共局在していた（図１２Ａ）。
【０１０７】
これらの結果から、骨格筋におけるＤｎｍ２の発現増加がｄＫＯ表現型と類似して、主にＩＩ型線維においてＣＮＭを引き起こすことが立証される。したがって、ｄＫＯ筋におけるＣＮＭは、少なくともある程度、Ｄｎｍ２の調節不全により説明することができる。
【０１０８】
実施例８．ｄＫＯマウスはヒラメ筋においてＩ型筋線維の増加を示す
ｄＫＯマウスはＣＮＭに加え、ＣＮＭを示していないヒラメ筋でＩ型線維数の増加を示した。異染性ＡＴＰアーゼ染色、および暗褐色の染色により示されるＩ型ミオシン重鎖（ＭＨＣ）に対する免疫組織化学により成体ｄＫＯマウス由来のヒラメ筋の線維型組成を解析した。ＷＴマウスのヒラメ筋は、約４３％のＩ型線維（図１３、ＡおよびＢ）で構成され、ｄＫＯマウスのヒラメ筋は、Ｉ型線維が２倍増加した（図１３、ＡおよびＢ）。
【０１０９】
個々のＭＨＣアイソフォームをコードする転写物の発現のリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ解析から、ＷＴマウスと比較してｄＫＯのヒラメ筋においてＩ型ＭＨＣ（ＭＨＣ−Ｉ）の増加およびＩＩ型ＭＨＣ（ＭＨＣ−ＩＩａ、ＭＨＣ−ＩＩｘ／ｄ、およびＭＨＣ−ＩＩｂ）の減少が明らかになった（図１３Ｃ）。グリセロールゲルの銀染色によりヒラメ筋、ＥＤＬ筋およびＴＡ筋におけるＭＨＣアイソフォームのタンパク質組成を調べたところ、ＷＴマウスから単離したヒラメ筋のタンパク質抽出物にＭＨＣＩＩａ／ＩＩｘタンパク質、ＭＨＣ−ＩＩｂタンパク質およびＭＨＣ−Ｉタンパク質に対応する３つのバンドが現れ、ＷＴマウス由来のＴＡ筋およびＥＤＬ筋のタンパク質抽出物には、ＭＨＣ−ＩＩｂおよびＭＨＣ−ＩＩａ／ＩＩｘに相当する２つのバンドが現れた（図１３Ｃ）。リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲの結果と一致して、ｄＫＯマウスのヒラメ筋は、ＭＨＣ−Ｉタンパク質の増加およびＭＨＣＩＩａ／ＩＩｘタンパク質の減少を示した。ｄＫＯヒラメ筋ではＭＨＣ−ＩＩｂタンパク質は観察されなかった。興味深いことに、ｄＫＯマウスのＴＡ筋およびＥＤＬ筋ではＷＴマウスと比較して、酸化型ＭＨＣＩＩａ／ＩＩｘタンパク質が増加し、解糖型ＭＨＣ−ＩＩｂタンパク質が減少したことから、これらの筋肉群は、より酸化型（ＩＩａ型）線維への線維型の移行も示した。
【０１１０】
ｍｉＲ−１３３ａの減少が胎仔発生においてＩ型線維の形成に影響を与えるかどうかを判定するため、Ｐ１の免疫組織化学によりＭＨＣ−Ｉ発現を調べた。Ｐ１のｄＫＯマウスのヒラメ筋またはＥＤＬ筋において、ＭＨＣ−Ｉ陽性筋線維の数に明らかな差はなかったことから（図１４Ａ）、ｍｉＲ−１３３ａはＩ型筋線維の胚発生に影響を与えないことが示される。ｄＫＯマウスにおいて線維型の移行がいつ起こるかを判定するため、２週齢マウスおよび４週齢マウスの両方の線維型組成を異染性ＡＴＰアーゼ染色により解析した。どちらの年齢も、ｄＫＯマウスではヒラメ筋におけるＩ型線維の割合がほぼ２倍上昇した（図１４Ｂ）。したがって、ｍｉＲ−１３３ａは胚発生においてＩ型筋線維の構成に影響を与えない。逆に、ｍｉＲ−１３３ａは出生後にＩ型筋線維を抑制するため、ｍｉＲ−１３３ａが存在しないと、成体マウスのＩ型筋線維が増加する。
【０１１１】
こうした例から、ｍｉＲ−１３３ａを欠損している成体マウスは、ミトコンドリア機能不全および速筋から遅筋への筋線維型変換を伴う進行性ＣＮＭを発症したことが示される。このため、ｍｉＲ−１３３ａが存在しないと、ＣＮＭ、ミトコンドリア機能不全、筋三つ組の崩壊、および速筋から遅筋への筋線維型変換（ＩＩ型からＩ型）が起こる。これらの筋異常は、少なくともある程度、ｍｉＲ−１３３ａ−１およびｍｉＲ−１３３ａ−２による抑制の標的であるダイナミン２のアップレギュレーションに起因する可能性がある。このため、本知見から、成体骨格筋の構造および機能の維持における、さらにＣＮＭのモジュレーターとしての、ｍｉＲ−１３３ａの不可欠な役割が説明される。ｍｉＲ−１３３ａは、成体骨格筋の正常な構造および機能の維持に役割を果たしている。
【０１１２】
ｄＫＯマウスの骨格筋異常は、ヒトＣＮＭのそれと非常に類似していることから、本障害の調節におけるこのｍｉＲＮＡの重要な役割が示唆される。中心核線維の存在および壊死または筋線維の死の非存在などｄＫＯ筋の組織学的特徴からは、ヒトＣＮＭとの類似性が立証された。ｄＫＯ線維のＮＡＤＨ−ＴＲ染色パターンは、筋形質ストランドの放射状分布を示すＤＮＭ関連ＣＮＭの典型的なＮＡＤＨ−ＴＲ染色パターンと類似していた（２）。しかしながら、ｄＫＯマウスの中心核線維は、ヒトＣＮＭとは異なり、ＩＩ型線維で観察され、Ｉ型線維では観察されなかった。マウス骨格筋のｍｉＲ−１３３ａが減少すると、ＩＩ型線維のみでＣＮＭが起こるのに対し、ヒトＤＮＭ２関連ＣＮＭ患者ではＩ型線維が圧倒的に多かった。マウスでは、ヒラメ筋が筋損傷から保護されている可能性がある。一方で、我々は、ｍｉＲ−１３３ａに非常に相同的であり、ヒラメ筋に豊富なｍｉＲ−１３３ｂが、ヒラメ筋をＣＮＭから保護しているという可能性を排除することができない。ｄＫＯマウスのヒラメ筋においてＣＮＭ表現型が見られないのは、ヒラメ筋に豊富であったｍｉＲ−１３３ｂの発現による可能性がある。あるいは、中心部に移行した核の筋線維分布がマウスとヒトとの間で違うのは、筋機能の種差を反映しているかもしれない。
【０１１３】
本発明者らは以前、ＭＥＦ２により制御される筋特異的なセリンアルギニンプロテインキナーゼ（ＳＲＰＫ）をコードするＳｒｐｋ３遺伝子を欠損しているマウスのＩＩ型線維特異的ＣＮＭを報告した（３１）。Ｓｒｐｋ３ヌルマウスと本研究のｄＫＯマウスと骨格筋間の組織学的類似性を考慮すると、ｍｉＲ−１３３ａおよびＳｒｐｋ３が共通のメカニズムを介して作用して筋肉の構造および機能に影響を与える可能性がある。
【０１１４】
ＤＮＭ２遺伝子内の複数のミスセンス変異が常染色体優性ＣＮＭに関係している（７、８、２７、２８）。興味深いことに、これらの突然変異は、ＤＮＭ２転写物レベル、タンパク質発現、または局在に影響を与えないヘテロ接合性ミスセンス変異または小さな欠失である（８、２８）。しかしながら、ＣＮＭ関連突然変異がＤＮＭ２の細胞機能に影響を与えるメカニズムは不明である。
【０１１５】
本例からは、ｍｉＲ−１３３ａがＤｎｍ２のｍＲＮＡおよびダイナミン２のタンパク質発現を直接制御したことが立証される。さらに、ｄＫＯマウスのレベルと同等のレベルで骨格筋のＤｎｍ２の発現が増加すると、ＣＮＭが引き起こされたことから、骨格筋機能が厳密なＤＮＭ２発現レベルに依存することが示される。正確なメカニズムは不明であるが、ダイナミン２タンパク質の増加が異常に強力なダイナミンの組み立てを引き起こし、骨格筋において適切なＤＮＭ２機能に必要な組み立てと分解とのエネルギーバランスを崩す可能性がある。これに関連して、ヒトのＣＮＭ関連ＤＮＭ２突然変異がドミナントネガティブに作用して、メンブレントラフィック、細胞骨格に関連するプロセスおよび中心体機能を妨げると報告されている（８、２８）。
【０１１６】
また、ｄＫＯマウスおよびＭＣＫ−ＤＮＭ２トランスジェニックマウスにおいてＤｎｍ２の機能獲得がどのようにＣＮＭを引き起こすかも不明である。しかしながら、最近の研究から、特定のＣＮＭ関連ＤＮＭ２突然変異によりＧＴＰａｓｅ活性が増強され、脂質結合を変化させることなくダイナミンのオリゴマー化が促進されることが示された（３２）。さらに別の研究では、ＣＮＭ関連ＤＮＭ２ミュータントにより、ダイナミンポリマーのＧＴＰに結合するおよび／または加水分解する能力を障害することなく、ダイナミンポリマーの安定性が高められることも示された（３３）。もう１つの研究では、最も多く見られるＤｎｍ２突然変異Ｒ４５６Ｗを発現するヘテロ接合マウスは、筋萎縮および筋力低下を伴うミオパチーは発症したが、ＣＮＭは発症しなかった（９）。ダイナミン２の収縮性と核の位置決定とに対する作用は独立していることが示唆された。興味深いことに、本例からは、骨格筋におけるＤｎｍ２の過剰発現が、筋機能および核位置の両方に影響を与えることが立証された。これらの表現型の相違は、使用したモデル系が異なる（すなわち、過剰発現とノックイン）によって説明することができる。とはいえ、本例からは、骨格筋がダイナミン２タンパク質レベルに感受性があること、およびダイナミン２発現が増加するとマウスでＣＮＭが起こることが立証された。
【０１１７】
また、ｍｉＲ−１３３ａは、他の遺伝子、たとえばプロフィリン２、カルモジュリン１、ＦＧＦＲ１およびｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ−ｌｉｋｅ  １をコードする遺伝子を標的とすることも予想される。これらのｍＲＮＡの３’ＵＴＲを用いたルシフェラーゼレポーターアッセイから、これらのｍＲＮＡの３’ＵＴＲがインビトロでｍｉＲ−１３３ａの標的となることが確認された。しかしながら、インビボでのｍｉＲ−１３３ａによるこれらのｍＲＮＡの制御は、骨格筋ではさほど顕著ではなかった（データ示さず）。したがって、ｍｉＲ−１３３ａは、骨格筋の複数の遺伝子を標的とするものの、主な作用は、ｍｉＲ−１３３ａのＤＮＭ２制御に由来する。
【０１１８】
骨格筋は、特有の収縮性および代謝性を有する不均一な筋線維からなる（３４）。成熟筋線維は、高度に可塑性を有し、労作負荷、ホルモン刺激および疾患に応じてＩ型表現型とＩＩ型表現型との間を移行することができる。ｄＫＯマウスの表現型から、ｍｉＲ−１３３ａはＩ型筋線維の遺伝子プログラムを抑制するが示される。Ｉ型筋線維は、ＩＩ型線維より疾患または損傷に耐性があると考えられる（３５）。多くの筋疾患、たとえばデュシェンヌ型筋ジストロフィーでは、線維型が、保護メカニズムとして働くことができるＩ型に移行する（３６、３７）。ｄＫＯ筋における線維型の変化は、ＣＮＭ表現型よって二次的に起こる可能性があるかもしれない。
【０１１９】
ミトコンドリア機能不全は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーならびに代謝障害および神経障害などいくつかのミオパチー（３８〜４０）のほか、老化過程（４１、４２）にも関与していると考えられてきた。本例の結果は、ミトコンドリア異常はＤＮＭ２関連ＣＮＭと関係があるという従来の知見と一致している（４３）。ただし、この結果は、Ｉ型線維の方が酸化酵素活性が高いため、ｄＫＯマウスの速筋から遅筋への筋線維型変換と両立しないようである。しかしながら、この矛盾の根底にある正確なメカニズムは不明であり、いくつかの理由が考えられる。Ｉ型線維への移行は、ミトコンドリア量に影響を与えないミオシン組成の変化の結果である可能性がある。さらに、速筋から遅筋への筋線維型変換は、毛細血管およびミトコンドリアの密度とも関連している。これは、個々のミトコンドリアの機能的能力を考慮に入れていない。最後に、ミトコンドリア機能に障害が起こると、筋肉のＡＴＰ利用率が低下する。このため、ｄＫＯ筋における線維型の移行はミトコンドリア機能障害およびＡＴＰ利用率低下に対する保護メカニズムである可能性がある（３５）。
【０１２０】
本例の結果から、心臓および骨格筋の両方で発現するｍｉＲ−１３３ａが、これらの組織で異なる役割を果たしていることが立証された。心臓では、ｍｉＲ−１３３ａは、心臓発生において心筋細胞の増殖を制御し、平滑筋遺伝子プログラムを抑制する（１８）。ｄＫＯマウスが４週齢まで骨格筋異常をまったく示さなかったため、骨格筋発生にとってｍｉＲ−１３３ａは必ずしも必要でなかった。ｄＫＯマウスの骨格筋では４週齢後にＣＮＭを発症したのに対し、心臓では、一部のマウスで心不全および突然死に至る拡張型心筋症をより遅い年齢で発症した（１８）。興味深いことに、ｄＫＯマウスの心臓は４ヶ月齢で、顕著なサルコメア崩壊およびＺディスクの破壊のほか、重度のミトコンドリア異常を示した（１８）。一方、ｄＫＯ骨格筋のサルコメアの構造およびミトコンドリアの形態は、大部分が影響を受けなかった（図３）。逆に、ｍｉＲ−１３３ａは骨格筋繊維の三つ組に特異的に影響を与える。心臓および骨格筋がｍｉＲ−１３３ａの減少に応じて異なる異常を示す理由は不明である。これは、ｍｉＲ−１３３ａが骨格筋（たとえばダイナミン２）および心臓（たとえばサイクリンＤ２およびＳＲＦ）において異なる標的遺伝子を制御することを反映しているかもしれない。別の理由は、ｄＫＯ骨格筋においては、低レベルではあるものの非常に相同的なｍｉＲ−１３３ｂが発現する一方、ｄＫＯ心臓では発現しないことにある可能性がある。ｍｉＲ−１３３ｂはｄＫＯマウスの心筋症の一因である可能性があると考えられるものの、ＣＮＭは心筋症の他のマウスモデルと関係がない。したがって、これらの結果から、ｍｉＲ−１３３ａにより制御されるｄＫＯマウスの骨格筋異常は主に、骨格筋におけるｍｉＲ−１３３ａの細胞自律的な機能により引き起こされると考えられるが示される。
【０１２１】
ｄＫＯマウスおよびヒトＣＮＭ患者の骨格筋の類似性から、ｍｉＲ−１３３ａがヒトミオパチーにおいて調節的な役割を果たしていることが示唆される。この関連で、本発明は、ｍｉＲ−１３３ａアゴニスト、たとえばｍｉＲ−１３３ａポリヌクレオチドを投与することにより、ＤＮＭ２などのｍｉＲ−１３３ａのｍＲＮＡ標的を調節する組成物および方法を提供する。
【０１２２】
方法
ＭＣＫ−ＤＮＭ２トランスジェニックマウスの作製。ＭＣＫ−ＤＮＭ２導入遺伝子は、Ｃ末端にｍｙｃタグを付けたラットＤｎｍ２のｃＤＮＡ（J. Albanesi, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas, USAより提供）を４．８ｋｂのＭＣＫプロモーターの下流に導入して作製した。コンストラクトは、下流にヒト成長ホルモンポリ（Ａ）シグナルを含んでいた。トランスジェニックマウスは、以前記載されたように作製した（４４、４５）。Ｔｇ１およびＴｇ２と名付けた２つのＦ１系を解析した。
【０１２３】
ノーザンブロット解析。miRNeasy mini kit（QIAGEN）を用いてマウス骨格筋組織から全ＲＮＡを単離した。ｍｉＲ−１３３ａおよびＵ６を検出するためのノーザンブロットは、以前記載されたように行った（１８）。ハイブリダイゼーションには、成熟ｍｉＲ−１３３ａに対する３２Ｐ標識Star-Fireオリゴヌクレオチドプローブ（IDT）およびＵ６プローブを使用した。
【０１２４】
ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイム解析。逆転写ステップの前にＲＮＡをTurbo RNase-free DNase（Ambion Inc.）で処理した。ＲＴ−ＰＣＲは、ランダム６量体プライマー（Invitrogen）を使用して行った。リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲは、ＴａｑＭａｎプローブ（ABI）またはサイバーグリーンプローブを使用して行った。図６に使用したサイバーグリーンプライマーは、下記の通りである（（３）に記載されている通り）：
Ｃａｃｎａ１のフォワードプライマー：５’−ｔｃｃａｇｃｔ  ａｃｔｇｃｃａｔｇｃｔｇａｔ−３’（配列番号５）
Ｃａｃｎａ１のリバースプライマー  ５’−ｔｃｇａｃｔｔｃｃｔｃｔｇｇｔｔｃｃａｔ−３’（配列番号６）
Ｃａｃｎｂ１のフォワードプライマー  ５’−ｃｔｔｔｇｃｃｔｔｔｇａｇｃｔａｇａｃｃ−３’（配列番号７）
Ｃａｃｎｂ１のリバースプライマー  ５’−ｇｃａｃｇｔｇｃｔｃｔｇｔｃｔｔｃｔｔａ−３’（配列番号８）
Ｃａｃｎｇ１のフォワードプライマー  ５’−ｃａｔｃｔｇｃｇｃａｔｔｔｃｔｇｔｃｃｔ−３’（配列番号９）
Ｃａｃｎｇ１のリバースプライマー  ５’−ａｔｃａｔ  ａｃｇｃｔｔｃａｃｃｇａｃｔｇ−３’（配列番号１０）
Ｒｙｒ１のフォワードプライマー  ５’−ｇｔｔ  ａｔｃｇｔｃａｔｔｃｔｇｃｔｇｇｃ−３’（配列番号１１）
Ｒｙｒ１のリバースプライマー  ５’−ｇｃｃｔａｔｔｃｃａｃａｇａｔｇａａｇｃ−３’（配列番号１２）
Ａｔｐ２ａ１のフォワードプライマー  ５’−ｔｇｇｃｔｃａｔｇｇｔｃｃｔｃａａｇａｔ−３’（配列番号１３）
Ａｔｐ２ａ１のリバースプライマー  ５’−ｃｃｔｃａｇｃｔｔｔｇｇｃｔｇａａｇａｔ−３’（配列番号１４）
Ａｔｐ２ａ２のフォワードプライマー  ５’−ａｇｃｔｔｇｇａｇｃａｇｇｔｃａａｇａａ−３’（配列番号１５）
Ａｔｐ２ａ２のリバースプライマー  ５’−ｇｃｔｃｔａｃａａａｇｇｃｔｇｔａａｔｃｇ−３’（配列番号１６）
Ｃａｓｑ１のフォワードプライマー  ５’−ａｃｔｃａｇａｇａａｇｇａｔｇｃａｇｃｔ−３’（配列番号１７）
Ｃａｓｑ１のリバースプライマー  ５’−ｃｔｃｔａｃａｇｇｇｔｃｔｔｃｔａｇｇａ−３’（配列番号１８）
Ｃａｓｑ２のフォワードプライマー  ５’−ｇｔｇｔｃｔｔｃａｇａｃａａｇｇｔｃｔｃ−３’（配列番号１９）
Ｃａｓｑ２のリバースプライマー  ５’−ａｃｃｃｔｔｃａｇａａｃａｔａｃａｇｇｃ−３’（配列番号２０）。
図１３に使用したサイバーグリーンプライマーは下記の通りである（（５２）に記載されている通り）：
ＭＨＣ−１のフォワードプライマー  ５’−ＣＣＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＴＧＴＣＣＣＧＧＣＴＣ−３’（配列番号２１）
ＭＨＣ−１のリバースプライマー  ５’−ＧＡＡＧＣＧＣＡＡＴＧＣＡＧＡＧＴＣＧＧＴＧ−３’（配列番号２２）
ＭＨＣ−ＩＩａのフォワードプライマー  ５’−ＡＴＧＡＧＣＴＣＣＧＡＣＧＣＣＧＡＧ−３’（配列番号２３）
ＭＨＣ−ＩＩａのリバースプライマー  ５’−ＴＣＴＧＴＴＡＧＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＧＧＣＧ−３’（配列番号２４）
ＭＨＣ−ＩＩｘのフォワードプライマー  ５’−ＡＡＧＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＣＣＡＧＣＧＣＣＣＡ−３’（配列番号２５）
ＭＨＣ−ＩＩｘのリバースプライマー  ５’−ＡＴＣＴＣＴＴＴＧＧＴＣＡＣＴＴＴＣＣＴＧＣＴ−３’（配列番号２６）
ＭＨＣ−ＩＩｂのフォワードプライマー  ５’−ＧＴＧＡＴＴＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＣＣＴＣＴＣ−３’（配列番号２７）
ＭＨＣ−ＩＩｂのリバースプライマー５’−ＧＧＡＧＧＡＣＣＧＣＡＡＧＡＡＣＧＴＧＣＴＧＡ−３’（配列番号２８）。
ｍｉＲＮＡのリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲは、製造者のプロトコルに従いTaq-Man miRNAアッセイキット（ABI）を使用して行った。
【０１２５】
骨格筋の組織学的解析。様々な筋肉群を採取し、Tissue Freezing Medium（Triangle Biomedical Sciences）とトラガントゴム（Sigma-Aldrich）との３：１混合物を含む包埋剤で急性凍結するかまたは４％パラホルムアルデヒドで固定して、通常のパラフィン組織標本処理を行った。凍結切片をクリオトームで薄切し、以前記載されたようにＨ＆Ｅで染色した（４５）。凍結切片のＮＡＤＨ−ＴＲ染色は、標準的なプロトコルに従い行った。凍結切片の異染性ＡＴＰアーゼ染色は、以前記載されたように行った（４４、４５）。中心部に移行した核を持つ筋線維の数を判定するため、マウスごとにＴＡ筋およびＧ／Ｐ筋の５００を超える筋線維をカウントし、ヒラメ筋およびＥＤＬ筋の３００を超える筋線維をカウントした。筋線維断面積は、ImageJを使用して判定し、１筋切片当たり２００を超える線維を調べた。
【０１２６】
電子顕微鏡観察。マウスを麻酔してから、０．１Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）、続いて２．５％グルタルアルデヒドおよび２％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム緩衝液で経心的に灌流した。ＴＡ筋を切除し、以前記載されたようにＴ管の選択的染色のため処理した（３）。
【０１２７】
ＥＢＤ取り込み。ＥＢＤ取り込みを以前記載されたように行った（４６）。簡単に説明すると、ＥＢＤ（ＰＢＳ中に１０ｍｇ／ｍｌ）をマウスに腹腔内投与した（１０ｇ体重当たり０．１ｍｌ）。回転輪を使用してマウスに一晩運動させ（すべてのマウスが回転輪走行を行った）、約１８時間後に筋肉を採取した。腓腹筋およびＴＡ筋を包埋剤で急性凍結した。凍結切片を一次抗体ウサギ抗ラミニン（Sigma-Aldrich、１：２００）、続いて二次抗体Alexa Fluor 488コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（Invitrogen、１：４００）で免疫染色した。蛍光顕微鏡を用いてＥＢＤを赤色の自家蛍光として検出した。
【０１２８】
免疫組織化学。新たに調製した４％パラホルムアルデヒドで凍結切片を氷上にて２０分間固定し、次いで０．３％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳで室温にて２０分間処理した。切片を、０．０１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳで希釈したM.O.M.キット（Vector Lab）のマウスＩｇＧブロッキング溶液と室温で１時間インキュベートした。次いで切片をM.O.M.タンパク質希釈液中、５％ヤギ血清（Sigma-Aldrich）と３０分間インキュベートした。切片を、M.O.M.タンパク質希釈液で希釈した一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。翌朝、スライドをＰＢＳで洗浄し、M.O.M.タンパク質希釈液で希釈した二次抗体と室温で４５分間インキュベートした。次いで切片を洗浄し、ＤＡＰＩを含むVectoShieid Mounting Mediumで封入した。ツァイス共焦点顕微鏡で写真を撮った。一次抗体および二次抗体は以下の通りであった：ＤＨＰＲα（Thermo Scientific、５：１００）、ＲｙＲ１（クローン３４Ｃ、Sigma-Aldrich、１：１００）、ラミニン（Sigma-Aldrich、１：２００）、ＭＨＣ−Ｉ（クローンＮＯＱ７．５．４Ｄ、Sigma-Aldrich、１：５，０００）、ジスフェルリン（Hamlet、Novocastra、１：４０）、ダイナミン２（Abeam、１：４００）、Alexa Fluor 594−コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ１（Invitrogen、１：４００）、Alexa Fluor 488−コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（Invitrogen、１：４００）。コムギ胚芽凝集素染色は、以前記載されたように行った（４６）。Ｉ型ミオシンの一次検出にはＭＨＣ−Ｉ（クローンＮＯＱ７．５．４Ｄ、Sigma-Aldrich、１：５，０００）を使用し、検出にはＨＲＰコンジュゲート二次抗体（Ａ８９２４、Sigma-Aldrich）、続いてＤＡＢクロモゲン反応（DAKO）を使用した。次いでサンプルをヘマトキシリンで対比染色した。
【０１２９】
ウエスタンブロット解析。骨格筋組織から全細胞ライセートを抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ウエスタンブロッティングは、標準的なプロトコルにより行った。ダイナミン２（Santa Cruz Biotechnology、１：１００）、ｃ−Ｍｙｃ（Santa Cruz Biotechnology、１：１，０００）、ＤＨＰＲａ（Thermo Scientific、１：１００）、ＲｙＲ１（クローン３４Ｃ、Sigma-Aldrich、１：１００）、ＳＥＲＣＡ２（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１：１，０００）、サルコリピン（M. Periasamy, Ohio State University、Columbus, Ohio, USAより提供、１：１，０００）、ホスホランバン（Upstate、１：１，０００）、ホスホ−ホスホランバン（Millipore、１：１，０００）、カルセケストリン２（Santa Cruz、１：１，０００）、チューブリン（Sigma-Aldrich、１：５，０００）およびα−アクチン（Sigma-Aldrich、１：２，０００）に対する抗体を使用した。ウエスタンブロットの定量は、PhosphoImagerを使用してデンシトメトリーにより行った。
【０１３０】
細胞培養、トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ。ｍｉＲ−１３３ａ結合部位を含むＤｎｍ２の３’ＵＴＲの１ｋｂのフラグメントをpMIRREPORTベクター（Ambion）にクローニングした。ｍｉＲ−１３３ａ結合部位の変異誘発、細胞培養物およびルシフェラーゼアッセイを以前記載されたように行った（１８）。
【０１３１】
トレッドミル試験。１５°の下り坂でExer-6M（Columbus Instruments）を使用してトレッドミル試験を行った。マウスは、２日間連続して５ｍ／ｍｉｎで５分間トレッドミルにて訓練した。翌日、マウスをトレッドミル上にて５ｍ／ｍｉｎで２分間、７ｍ／ｍｉｎで２分間、８ｍ／ｍｉｎで２分間、および１０ｍ／ｍｉｎで５分間走らせた。その後、速度を１ｍ／ｍｉｎから２０ｍ／ｍｉｎの最終速度まで上げた。動物が電気刺激を受けてもトレッドミル上にとどまることができない場合を疲労困憊とした。
【０１３２】
ＭＨＣアイソフォームの電気泳動。以前記載されたように、骨格筋からミオシンを単離し、グリセロール−ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により分離した（４７）。ゲルを硝酸銀染色キット（Bio-Rad）で染色した。
【０１３３】
腓腹筋からのミトコンドリアの単離。以前記載されたものを一部改変して、腓腹筋から切除した骨格筋の赤筋および白筋からミトコンドリアを単離した（４８）。６７ｍＭのスクロース、５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣＬ、１０ｍＭのＥＤＴＡ／トリスおよび１０％ウシ血清アルブミンを含む緩衝液中に組織サンプルを採取した。サンプルをミンチ状に処理して０．０５％トリプシンで３０分間消化した。次いでサンプルをホモジナイズし、分画遠心法によりミトコンドリアを単離した。
【０１３４】
単離したミトコンドリアの呼吸。単離したミトコンドリアの呼吸計測は、XF24細胞外フラックスアナライザー（Seahorse Bioscience）を使用して行った。単離およびタンパク質定量の後すぐに、１０ｍＭのピルベートおよび５ｍＭのマラートの存在下でミトコンドリアをSeahorse細胞培養プレートに５μｇ／ウェルで蒔いた。実験は、２５秒間混合および４〜７分間測定のサイクルで構成した。酸素消費量を基本条件下、ＡＤＰ刺激（５ｍＭ）状態３呼吸下、オリゴマイシン誘導（２μΜ）状態４呼吸下、およびＦＣＣＰ（０．３μΜ）の存在下での脱共役呼吸下で測定して最大酸化能を評価した。ＲＣＲを状態３呼吸／状態４呼吸の比として算出した。実験はすべて３７℃で行った。
【０１３５】
脂肪酸代謝。以前記載されたように、単離したミトコンドリアの脂肪酸酸化は、［１−１４Ｃ］−パルミチン酸の酸化に由来する３４ＣＯ２産生および１４Ｃ標識酸可溶性代謝物を測定して合計することにより評価した（４９、５０）。クエン酸シンターゼ活性は、以前記載されたように判定した（５１）。
【０１３６】
動物管理。動物実験手順はすべてInstitutional Animal Care and Use Committees of University of Texas Southwestern Medical Centerで審査され、承認された。
【０１３７】
統計。データは平均値±ＳＥＭで示す。群間差の統計学的有意性は、対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて検討した。Ｐ値が０．０５未満の場合に有意とした。
【０１３８】
参考文献
1. Jungbluth H, Wallgren-Pettersson C, Laporte J. Centronuclear (myotubular) myopathy. Orphanet J Rare Dis. 2008;3:26.
2. Romero NB. Centronuclear myopathies:a widening concept. Neuromuscul Disord. 2010:20(4):223-228.
3. Al-Qusairi L, et al. T-tubule disorganization and defective excitation-contraction coupling in muscle fibers lacking myotubularin lipid phosphatase. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009:106(44):18763-18768.
4. Buj-Bello A, et al. AAV-mediated intramuscular delivery of myotubularin corrects the myotubular myopathy phenotype in targeted murine muscle and suggests a function in plasma membrane homeostasis. Hum Mol Genet, 2008;17(14):2132-2143.
5. Buj-Bello A, et al. The lipid phosphatase myotubularin is essential for skeletal muscle maintenance but not for myogenesis in mice, Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(23):15060-15065.
6. Dowling JJ, et al. Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 2009;5(2):el000372.
7. Bitoun M, et al. Dynamin 2 mutations cause sporadic centronuclear myopathy with neonatal onset. Ann Neurol. 2007;62(6):666-670.
8. Bitoun M, et al. Mutations in dynamin 2 cause dominant centronuclear myopathy. Nat Genet. 2005;37(11):1207-1209.
9. Durieux AC, et al. A centronuclear myopathy-dynamin 2 mutation impairs skeletal muscle structure and function in mice. Hum Mol Genet. 2010;19(24):4820-4836.
10. Heymann JA, Hinshaw JE. Dynamins at a glance, J Cell Sci. 2009;122(Pt 19):3427-3431.
11. Durieux AC, Prudhon B, Guicheney P, Bitoun M. Dynamin 2 and human diseases. J Mol Med. 2010;88(4):339-350.
12. Filipowicz W, Bhattacharyya SN, Sonenberg N. Mechanisms of post- transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight? Nat Rev Genet. 2008;9(2):102-114.
13. Williams AH, Liu N, van Rooij E, Olson EN. MicroRNA control of muscle development and disease. Curr Opin Cell Biol. 2009;21(3):461-469.
14. Eisenberg I, Alexander MS, Kunkel LM. miRNAS in normal and diseased skeletal muscle. J Cell Mol Med. 2009;13(1):2-11.
15. Eisenberg I, et al. Distinctive patterns of microRNA expression in primary muscular disorders. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(43):17016-17021.
16. Liu N, Olson EN. MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development. Dev Cell. 2010;18(4):510-525.
17. Williams AH, et al. MicroRNA-206 delays ALS progression and promotes regeneration of neuromuscular synapses in mice. Science. 2009;326(5959):1549-1554.
18. Liu N, et al. micro RNA-133a regulates cardiomyocyte proliferation and suppresses smooth muscle gene expression in the heart. Genes Dev. 2008;22(23):3242-3254.
19. Zhao Y, et al. Dysreguiation of cardiogenesis, cardiac conduction, and cell cycle in mice lacking miRNA-1-2. Cell. 2007;129(2):303-317.
20. Chen JF, et al. The role of microRNA-1 and microRNA-133 in skeletal muscle proliferation and differentiation. Nat Genet. 2006;38(2):228-233.
21. Shi X, Garry DJ. Muscle stem cells in development, regeneration, and disease. Genes Dev. 2006;20(13):1692-1708.
22. McNally EM, Pytel P. Muscle diseases: the muscular dystrophies. Annu Rev Pathol. 2007;2:87-109.
23. Tedesco FS, Dellavalle A, Diaz-Manera J, Messina G, Cossu G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. J Clin invest. 2010;120(1):11-19.
24. Franzini-Armstrong C, Jorgensen AO. Structure and development of E-C coupling units in skeletal muscle. Annu Rev Physiol. 1994;56:509-534.
25. Toussaint A, et al. Defects in amphiphysin 2 (BINl) and triads in several forms of centronuclear myopathies. Acta Neuropathol. 2011;121 (2):253-266.
26. Babu GJ, et al. Ablation of sarcolipin enhances sarcoplasmic reticulum calcium transport and atrial contractility. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(45):17867-17872.
27. Bitoun M, et al. A new centronuclear myopathy phenotype due to a novel dynamin 2 mutation. Neurology. 2009;72(1):93-95.
28. Bitoun M, et al. Dynamin 2 mutations associated with human diseases impair clathrin-mediated receptor endocytosis. Hum Mutat. 2009;30(10):1419-1427.
29. Donoviel DB, Shield MA, Buskin JN, Haugen HS, Clegg CH, Hauschka SD. Analysis of muscle creatine kinase gene regulatory elements in skeletal and cardiac muscles of transgenic mice. Mol Cell Biol. 1996;16(4):1649-1658.
30. Shield MA, Haugen HS, Clegg CH, Hauschka SD. E-box sites and a proximal regulatory region of the muscle creatine kinase gene differentially regulate expression in diverse skeletal muscles and cardiac muscle of transgenic mice. Mol Cell Biol. 1996;16(9):5058-5068.
31. Nakagawa O, et al. Centronuclear myopathy in mice lacking a novel muscle-specific protein kinase transcriptionally regulated by MEF2. Genes Dev. 2005:19(17):2066-2077.
32. Kenniston JA, Lemmon MA. Dynamin GTPase regulation is altered by PH domain mutations found in centronuclear myopathy patients. EMBO J, 2010;29(18):3054-3067.
33. Wang L, Barylko B, Byers C, Ross JA, Jameson DM, Albanesi JP. Dynamin 2 mutants linked to centronuclear myopathies form abnormally stable polymers. J Biol Chem. 2010;285(30):22753-22757.
34. Bassel-Duby R, Olson EN. Signaling pathways in skeletal muscle remodeling. Annu Rev Biochem. 2006;75:19-37.
35. Webster C, Silberstein L, Hays AP, Blau HM. Fast muscle fibers are preferentially affected in Duchenne muscular dystrophy. Cell. 1988;52(4):503-513.
36. Wang JF, Forst J, Schroder S, Schroder JM. Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 1999;9(3):150-158.
37. Cros D, Harnden P, Pellissier JF, Serratrice G. Muscle hypertrophy in Duchenne muscular dystrophy. A pathological and morphometric study. J Neurol. 1989;236(1):43-47.
38. Naumann M, et al. Mitochondrial dysfunction in adult-onset myopathies with structural abnormalities. Acta Neuropathol. 1995:89(2):152-157.
39. Kim JA, Wei Y, Sowers JR. Role of mitochondrial dysfunction in insulin resistance. Circ Res. 2008;102(4):401-414.
40. Jongpiputvanich S, Sueblinvong T, Norapucsunton T. Mitochondrial respiratory chain dysfunction in various neuromuscular diseases. J Clin Neurosci. 2005;12(4):426-428.
41. Hebert SL, Lanza IR, Nair KS. Mitochondrial DNA alterations and reduced mitochondrial function in aging. Mech Ageing Dev. 2010;131 (7-8):451-462.
42. Lanza IR, Nair KS. Mitochondrial function as a determinant of life span. Pflugers Arch. 2010;459(2):277--289.
43. Zanoteli E, Vergani N, Campos Y, Vainzof M, Oliveira AS, d'Azzo A. Mitochondrial alterations in dynamin 2 -related centronuclear myopathy. Arq Neuropsiquiatr. 2009;67(1):102-104.
44. Naya FJ, Mercer B, Shelton J, Richardson JA, Williams RS, Olson EN. Stimulation of slow skeletal muscle fiber gene expression by calcineurin in vivo. J Biol Chem. 2000;275(7):4545-4548.
45. Wu H, et al. Regulation of mitochondrial biogenesis in skeletal muscle by CaMK. Science. 2002;296(5566):349-352.
46. Millay DP, et al. Genetic and pharmacologic inhibition of mitochondrial-dependent necrosis attenuates muscular dystrophy. Nat Med. 2008;14(4):442-447.
47. Kim MS, et al. Protein kinase D1 stimulates MEF2 activity in skeletal muscle and enhances muscle performance. Mol Cell Biol. 2008;28(11):3600-3609.
48. Frezza C, Cipolat S, Scorrano L. Organelle isolation:functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2007:2(2):287-295.
49. Frisard MI et al. Toll-like receptor 4 modulates skeletal muscle substrate metabolism. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2010;298(5):E988-E998.
50. Hulver MW, et al. Elevated stearoyl-CoA desaturase- 1 expression in skeletal muscle contributes to abnormal fatty acid partitioning in obese humans. Cell Metab. 2005;2(4):251-261.
51. Heilbronn LK, et al. Glucose tolerance and skeletal muscle gene expression in response to alternate day fasting. Obes Res. 2005:13(3):574-581.
52. Oh, M., et al. Calcineurin is necessary for the maintenance but not embryonic development of slow muscle fibers. Mol Cell Biol. 2005;(25):6629-6638.
【０１３９】
本明細書で考察し、引用した文献、刊行物、特許および特許出願はすべてその全体を本明細書に援用する。個々の方法、プロトコルおよび材料は変更が可能であるため、開示された本発明は、個々の方法、プロトコルおよび材料に限定されるものではないことが理解されよう。また、本明細書に使用した用語は、個々の実施形態の説明のみを目的としており、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されよう。
【０１４０】
当業者であれば、ごく通常の実験を用いるのみで、本明細書に記載した本発明の具体的な実施例に対する等価物を数多く認識するか、あるいは確認することができるであろう。そのような等価物は添付の特許請求の範囲に包含されることを意図している。
【図１Ｂ】
2014520813.tif 000003
【図２Ａ】
2014520813.tif 000004
【図３Ｂ】
2014520813.tif 000005
【図４Ａ】
2014520813.tif 000006
【図４Ｄ】
2014520813.tif 000007
【図５Ａ】
2014520813.tif 000008
【図５Ｂ】
2014520813.tif 000009
【図６Ｃ−Ｊ】
2014520813.tif 000010
【図１０Ｂ】
2014520813.tif 000011
【図１１Ａ】
2014520813.tif 000012
【図１４Ｂ】
2014520813.tif 000013
【図１Ａ】
2014520813.tif 000014
【図２Ｂ】
2014520813.tif 000015
【図２Ｃ】
2014520813.tif 000016
【図３Ａ】
2014520813.tif 000017
【図３Ｃ】
2014520813.tif 000018
【図４Ｂ】
2014520813.tif 000019
【図４Ｃ】
2014520813.tif 000020
【図４Ｅ】
2014520813.tif 000021
【図４Ｆ】
2014520813.tif 000022
【図５Ｃ】
2014520813.tif 000023
【図５Ｄ】
2014520813.tif 000024
【図６Ａ】
2014520813.tif 000025
【図６Ｂ】
2014520813.tif 000026
【図７】
2014520813.tif 000027
【図８Ａ】
2014520813.tif 000028
【図８Ｂ】
2014520813.tif 000029
【図９Ａ】
2014520813.tif 000030
【図９Ｂ】
2014520813.tif 000031
【図９Ｃ】
2014520813.tif 000032
【図９Ｄ】
2014520813.tif 000033
【図１０Ａ】
2014520813.tif 000034
【図１０Ｃ】
2014520813.tif 000035
【図１０Ｄ】
2014520813.tif 000036
【図１０Ｅ】
2014520813.tif 000037
【図１１Ｂ】
2014520813.tif 000038
【図１１Ｃ】
2014520813.tif 000039
【図１２Ａ】
2014520813.tif 000040
【図１２Ｂ】
2014520813.tif 000041
【図１３Ａ】
2014520813.tif 000042
【図１３Ｂ】
2014520813.tif 000043
【図１３Ｃ】
2014520813.tif 000044
【図１４Ａ】
2014520813.tif 000045
【配列表】
2014520813000001.app
【国際調査報告】
2014520813.tif 000046
2014520813.tif 000047
2014520813.tif 000048