(57)【要約】  本発明は、乳がんＨＲ＋患者の診断、治療および予後の確定のための方法であって、対象においてＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１９および／またはＦＧＦＲなどのＦＧＦＲリガンド、例えばＦＧＦＲ１などを含む１種または複数のバイオマーカーの増幅を検出するステップと、対象において前記１種または複数のバイオマーカーの増幅に基づいて対象を治療するためのＦＧＦＲ１阻害剤を決定し、前記ＦＧＦＲ１阻害剤をそれを必要とする対象に投与するステップと、前記ＦＧＦＲ１阻害剤で治療した対象の予後を示す前記１種または複数のバイオマーカーを使用するステップとを含む方法を表す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における乳がんの診断方法であって、乳がんがＨＲ陽性である患者を選択するステップと、対象においてＦＧＦＲリガンドおよび／またはＦＧＦＲならびにそれらの組み合わせから選択された１種または複数のバイオマーカーの増幅を検出するステップとを含む方法。
【請求項２】
対象における乳がんの治療方法であって、（ａ）乳がんがＨＲ陽性である患者を選択するステップと、（ｂ）対象においてＦＧＦＲリガンドおよび／またはＦＧＦＲならびにそれらの組み合わせから選択された１種または複数のバイオマーカーの増幅、存在または量を検出するステップと、（ｃ）対象における前記１種または複数のバイオマーカーの存在または量に基づいて、対象を治療するためのＦＧＦＲ１阻害剤を決定し、前記ＦＧＦＲ１阻害剤をそれを必要とする対象に投与するステップとを含む方法。
【請求項３】
ＨＲ＋乳がんを有し、ＦＧＦＲ１阻害剤で治療された対象の予後の確定方法であって、対象においてＦＧＦＲリガンドおよび／またはＦＧＦＲならびにそれらの組み合わせから選択された１種または複数のバイオマーカーを検出するステップを含み、前記１種または複数のバイオマーカーの増幅がＦＧＦＲ１阻害剤で治療した対象の予後の指標である方法。
【請求項４】
前記ＦＧＦＲ１阻害剤がドビチニブまたはその互変異性体である、請求項１、２および３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＦＧＦＲリガンドバイオマーカーがＦＧＦ３、ＦＧＦ１９およびＦＧＦ４リガンド増幅からなる群から選択され、好ましくはＦＧＦ３リガンド増幅である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記バイオマーカーがＦＧＦＲ１増幅を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記バイオマーカーがＦＧＦＲ２増幅を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
増幅倍数が５〜１０の範囲である、請求項５から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＦＧＦＲ１阻害剤がドビチニブまたはその互変異性体である、請求項１、２および３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマーカーを使用したがん患者の診断および予後の確定に関する。特に、本発明は、ある種の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）リガンド遺伝子座、例えば、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４およびＦＧＦ１９およびＦＧＦ３とＦＧＦ４、ＦＧＦ１９との組み合わせならびにある種の線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、ＦＧＦＲ１をベースにしたバイオマーカーを使用した乳がん患者の診断、治療および予後の確定を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
乳がん治療のための療法の選択肢には、手術、放射線療法、内分泌療法および細胞傷害性化学療法が含まれる。予後に関する情報を提供し、および／または治療の成果を予測することができる分子マーカーを使用する試みが最近開示されているが、限定的である。
【０００３】
米国特許出願公開第２００７／０２１８５１２号Ａ１は、ホルモンをベースにしたエストロゲン受容体（ＥＲ）に関連して乳がんを診断し、予後の確定をするための、ある種のヒトマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＭＭＰ−２６をベースにしたバイオマーカーを開示している。対象においてＭＭＰ−２６が存在することは、早期乳がんにおいて最も好ましいことである。対象が早期乳がんを有する場合、ＭＭＰ−２６が存在すると予後は一般的に良好と見なされる。しかし、この判定を行うとき、臨床情報およびその他のバイオマーカーの有無および発現レベルなどのその他の要素も考慮することができることもさらに開示されている。したがって、特定の治療剤を使用した乳がんの診断および予後の確定のための信頼できる試験が未だに必要とされている。そのような乳がんの診断および予後の確定のための試験は、その他のバイオマーカーの有無および発現レベルの考慮を必要としないだろう。
【０００４】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）およびそれらの受容体（ＦＧＦＲ）は、高度に保存されたタンパク質群で、血管新生、脈管形成および創傷治癒ならびに胚発生における組織パターン形成および四肢形成において有益な働きを果たしている。ＦＧＦおよびＦＧＦＲは、細胞移動、増殖および生存に影響を及ぼし、健康および疾患に広範な衝撃を与える。
【０００５】
ＦＧＦＲファミリーには、主に４種類の受容体、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ４が含まれる。これらの受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質内ドメインを有する膜貫通タンパク質である。細胞外ドメインそれぞれは、２つまたは３つのイムノグロブリン（Ｉｇ）ドメインを含有する。いくつかのＦＧＦＲは、３番目のＩｇドメインのＣ末端領域が異なるＦＧＦＲ−ＩＩＩｂおよびＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃなどの、分子の特定のセグメントが異なる様々なアイソフォームで存在する。膜貫通ＦＧＦＲは、単量体チロシンキナーゼ受容体であり、細胞表面で、ＦＧＦＲ二量体、ＦＧＦリガンドおよびヘパリングリカンまたはプロテオグリカンの複合体中で生じる二量体化によって活性化される。ＦＧＦＲに結合したＦＧＦリガンドによる細胞外ＦＧＦＲの活性化は、受容体チロシンキナーゼ活性によって開始する細胞内部のシグナル伝達事象のカスケードを惹起する。
【０００６】
ＦＧＦＲ１増幅は、腫瘍の８．７％で認められ、５０歳を上回る患者およびＨＥＲ２発現が欠如した腫瘍ではかなりよく見られる。ＦＧＦＲ１遺伝子増幅がＦＧＦ癌遺伝子発現と相関していることが研究によって示唆されてきた。Reis−Filho JS, Simpson PT, Turner NC, Lambros MB, Jones C et al．, in the publication Clin． Cancer Res 12, 6652-6662 (2006)によって記載されたように、ＦＧＦＲ１活性は、ＦＧＦＲ１が増幅した乳がん細胞系が生き残るために必要である。ＦＧＦＲ１増幅は、Elbauomy Elsheikh S, Green AR, Lambros MB, Turner NC, Grainge MJ et al．によって刊行物Breast Cancer Res 9, R23 (2007)に記載されたように、ＨＥＲ２が増幅した乳がんでは一般的ではなく、これはＨＥＲ２およびＦＧＦＲ１の増幅が選択的で相互排他的な、腫瘍増殖および予後不良に至らせる、類似した下流経路の活性化機構である可能性を示唆する。同著者らは、ＦＧＦＲ１増幅は、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性腫瘍を有する患者における予後の悪さと関連していると示唆している。高レベルのＦＧＦＲ１増幅は、Chin K, DeVries S, Fridly and J, Spellman PT, Roydasgupta R et al．によって刊行物Cancer Cell 10, 529-541 (2006)において記載されたように、Courjal F, Theillet C(1997)によって記載されたように、ＥＲ陽性、ルミナールＢ型、予後不良の乳がんにおいて主に発見される。予め決定されたＤＮＡ増幅プロファイルを有する乳がんの比較ゲノムハイブリダイゼーション解析は、Cancer Res 57, 4368-4377に示されており、Reis−Filho JS, Simpson PT, Turner NC, Lambros MB, Jones C et al．によって刊行物Clin. Cancer Res 12, 6652-6662 (2006)においても記載されている。
【０００７】
驚くべきことに、ＦＧＦＲ１の受容体増幅およびＦＧＦ３のリガンド増幅は、ＦＧＦＲ阻害剤によって治療された乳がん（ＦＧＦＲ阻害剤感受性乳がん）の分子マーカーとして有用であり、ＦＧＦＲ阻害剤を使用した乳がんの治療を受けている患者の診断および予後の確定の両方のための信頼できる方法となることが発見された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明はまた、対象におけるＦＧＦリガンド増幅またはＦＧＦＲ増幅に関連したがんの診断方法であって、対象においてＦＧＦリガンドを含むバイオマーカーの増幅を検出するステップを含み、ＦＧＦリガンドの存在または量ががんの指標である方法を提供する。
【０００９】
本発明はまた、対象におけるＦＧＦ３増幅に関連したがんの診断方法であって、対象においてＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１９、ＦＧＦＲ１およびそれらの組み合わせから選択された１種または複数のバイオマーカーの増幅を検出するステップを含み、前記１種または複数のバイオマーカーの増幅ががんの指標である方法を提供する。
【００１０】
本発明はまた、対象におけるＦＧＦＲ１増幅に関連したがんの診断方法であって、対象においてＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１９、ＦＧＦＲ１およびそれらの組み合わせから選択された１種または複数のバイオマーカーの増幅を検出するステップを含み、前記１種または複数のバイオマーカーの増幅ががんの指標である方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、対象におけるがんの治療方法であって、（ａ）対象においてＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１９、ＦＧＦＲ１およびそれらの組み合わせから選択された１種または複数のバイオマーカーの増幅を検出するステップと、（ｂ）対象における前記１種または複数のバイオマーカーの増幅に基づいて、対象を治療するためのＦＧＦＲ１阻害剤を決定し、ＦＧＦＲ阻害剤をそれを必要とする対象に投与するステップとを含む方法を提供する。
【００１２】
本発明はまた、がんを有し、ＦＧＦＲ１阻害剤で治療された対象の予後の確定方法であって、対象においてＦＧＦＲリガンド、例えば、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１９、ＦＧＦＲ、例えば、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２およびそれらの組み合わせから選択された１種または複数のバイオマーカーを検出するステップを含み、前記１種または複数のバイオマーカーの存在または量がＦＧＦＲ１阻害剤で治療された対象の予後の指標である方法を提供する。
【００１３】
本発明はまた、がんを有し、ＦＧＦＲ１阻害剤で治療された対象の予後の確定方法であって、対象においてＦＧＦ３を含むバイオマーカーを検出するステップを含み、ＦＧＦ３の存在または量がＦＧＦＲ１阻害剤で治療された対象の予後の指標である方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、対象におけるＦＧＦ３の存在または量を測定するためのアッセイを含むキットを提供する。
【００１５】
本発明はまた、対象における１種または複数のＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１９、ＦＧＦＲ１およびそれらの組み合わせの存在または量を測定するためのアッセイを含むキットを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書で使用したように、対象にはいかなる哺乳類（例えば、ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長類、ウシ、ネコ、モルモットまたはげっ歯類）も含まれるがそれらだけに限定はしない。用語は特定の歳または性別を示さない。したがって、成体および新生対象ならびに胎児が、雄性であろうと雌性であろうと含まれるものとする。患者とは、疾患または障害に罹患した対象を意味する。患者という用語には、ヒトおよび動物対象が含まれる。
【００１７】
本明細書で使用したように、治療とは、癌の治癒、回復、安定化または予防を企図する患者の医学的管理を意味する。この用語には、関連するがんの原因の除去を目標とする積極的な治療が含まれる。
【００１８】
がんの診断という用語は、対象においてＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１９、ＦＧＦＲ１およびそれらの組み合わせから選択される１種または複数のバイオマーカーの量を検出することであって、前記１種または複数のバイオマーカーの存在または量ががんの指標であることを意味する。予後という用語は、特に寛解、再燃、腫瘍再発、転移および死の可能性に関して、がんのとりうる経過またはがんの進行についての予測を包含する。良好な予後とは、がん、特に乳がんに罹患した患者においてがんのない状態が続く可能性を意味する。不良な予後とは、潜在するがんまたは腫瘍の再燃もしくは再発、転移または死の可能性を意味するものとする。
【００１９】
例えば、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ１などのＦＧＦＲリガンドまたはＦＧＦＲの遺伝子座増幅などの増幅の検出方法は、ｉｎ  ｓｉｔｕ  染色体ハイブリダイゼーションなどの方法である。当業者であれば、どれが遺伝子座増幅の量の検出を可能にするｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションの方法であるかわかるであろう。このような方法は、例えば、ＣＩＳＨ、ＳＩＳＨまたはｑ−ＰＣＲである。このような方法は、当業界では周知で、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、サザンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、免疫蛍光法、フローサイトメトリー、免疫組織化学法、核酸ハイブリダイゼーション技術、核酸逆転写法および核酸増幅法が含まれるがそれらだけに限定はしない。「増幅の検出」という用語は、バイオマーカー遺伝子またはタンパク質の存在および量を測定することを意味するものとする。増幅を測定するために、試験する試料を健康なヒトに由来する対応する試料と比較することができ、試料中の遺伝子座のコピー数が健康なヒトに由来する試料中よりも上回っているか、または遺伝子座のコピー数が１よりも上回っている、例えば、遺伝子座が３、５、６、７、８、９、１０、または１０倍を上回って増幅している。
【００２０】
本発明のＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ１バイオマーカーは、対象の試料から得られる。このような試料の例には、血液、リンパ液、尿、婦人科的液体、生検およびスメアが含まれるが、それらだけには限定はしない。本発明において有用な体液には、血液、尿、唾液、乳頭吸引液または任意のその他の体分泌液またはそれらの派生物が含まれる。血液には、全血、血漿、血清または血液の任意の派生物を含めることができる。例示的実施形態では、試料には、生検の乳房組織または乳房腫瘍組織試料を含む乳房細胞が含まれる。しかし、試料は、乳房組織を含む必要はなく、通常の組織、液体または細胞から得ることができる。試料は、様々な技術によって、例えば、部位を掻き取ったり、または拭き取ったりすることによって、体液を吸引するために針を使用することによって、または組織試料を取り出す（すなわち、生検）ことによって、対象から得ることができる。様々な試料を収集するための方法は、当業界では周知である。
【００２１】
本発明の１種または複数のバイオマーカーを使用して診断されるがんには、例えば、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、慢性リンパ球性白血病および慢性骨髄性白血病を含む白血病；ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫およびリンパ節外リンパ腫を含むリンパ腫；プラズマ細胞種を含む骨髄腫；骨および軟部組織の悪性新生物を含む肉腫；脳の悪性新生物を含む神経性がん；女性乳房の悪性新生物を含む乳がん；ファーター膨大部、虫垂、結腸、十二指腸、食道、肝臓、膵臓、腹膜、直腸、小腸および胃の悪性新生物を含む消化管／胃腸がん；副腎、ランゲルハンス島および甲状腺の悪性新生物を含む内分泌性がん；目の悪性新生物を含む眼がん；膀胱、腎臓、前立腺および精巣の悪性新生物を含む尿生殖器がん；子宮頸管、子宮筋、卵巣、子宮、子宮内膜、胎盤および外陰部の悪性新生物を含む婦人科がん；咽頭、唾液腺、鼻腔、口腔、耳下腺および舌の悪性新生物を含む頭部および頸部がん；肺、胸腺および気管の悪性新生物を含む呼吸器／胸部がん；ならびに皮膚がんが含まれる。
【００２２】
一実施形態によれば、対象におけるＦＧＦＲリガンド増幅に関連した乳がんを診断するための方法であって、対象においてＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１９、ＦＧＦＲ１およびそれらの組み合わせから選択された１種または複数のバイオマーカーの増幅を検出するステップを含み、前記１種または複数のバイオマーカーの増幅ががんの指標である方法が提供される。
【００２３】
別の実施形態によれば、対象におけるＨＲ＋、およびＦＧＦＲ増幅および／またはＦＧＦＲリガンド増幅に関連した乳がんを診断するための方法であって、対象においてＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１９、ＦＧＦＲ１およびそれらの組み合わせから選択された１種または複数のバイオマーカーの増幅を検出するステップを含み、この１種または複数のバイオマーカーの存在および増幅ががんの指標である方法が提供される。
【００２４】
別の実施形態によれば、対象におけるＨＲ＋、およびＦＧＦＲ増幅および／またはＦＧＦＲリガンド増幅に関連した乳がんの予後のための方法であって、対象においてＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１９、ＦＧＦＲ１およびそれらの組み合わせから選択された１種または複数のバイオマーカーの増幅を検出するステップを含み、前記１種または複数のバイオマーカーの存在および増幅が、例えば、ドビチニブもしくは互変異性体、またはそれらの薬学的に許容される塩などのＦＧＦＲ１阻害剤による乳がんの治療に応答性のある乳がん疾患の指標である方法が提供される。
【００２５】
一実施形態によれば、ＦＧＦＲ阻害剤、４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンまたはそれらの互変異性体は、ＦＧＦＲ１またはＦＧＦ３バイオマーカーによって測定したように、乳がんならびにＦＧＦＲおよびＦＧＦ経路活性化を有するその他の種類の腫瘍の治療に有用である。
【００２６】
式Ｉの化合物４−アミノ−５−フルオロ−３−[６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル]−１Ｈ−キノリン−２−オン（ドビチニブとも称される）もしくはそれらの互変異性体またはそれらの薬学的に許容される塩
【００２７】
【化１】
2014513930.tif 000002
は、チロシン受容体キナーゼ（ＲＴＫ）などのある種のタンパク質キナーゼを阻害する。この化合物およびモノ乳酸塩を含むその薬学的に許容される塩は、米国特許第６，６０５，６１７号、第６，７７４，２３７号、第７，３３５，７７４号および第７，４７０，７０９号ならびに米国特許出願第１０／９８２，７５７号、第１０／９８２，５４３号および第１０／７０６，３２８号ならびに公開済みＰＣＴ出願国際公開第２００６／１２７９２６号および国際公開第２００９／１１５５６２号に記載されている。
【００２８】
ドビチニブの抗腫瘍活性は、胸腺欠損マウスにおける様々な腫瘍異種移植モデルにおいて評価された。試験したモデル全てにおいて、経口投与したドビチニブは、ドビチニブ標的の変異の活性化によって生じる腫瘍モデルの増殖阻害および停止から退縮までの抗腫瘍応答を引き起こした。さらに、多発性疾患のモデルにおいて、皮下（ＳＣ）異種移植した原発巣からのマウス肝臓内における乳がん細胞のコロニー形成は、ドビチニブを使用する経口治療によって著しく減少した。腫瘍におけるＲＴＫの直接阻害がドビチニブによる異種移植の増殖阻害の主要機構であることを示すために、ＦＧＦＲ下流シグナル伝達タンパク質ＡＫＴ（タンパク質キナーゼＢとしても知られている）およびＥＲＫ（ＭＡＰＫとしても知られている）のチロシンリン酸化がドビチニブの経口単回投与後に阻害されていることが示された。阻害は、特定のモデルにおいて最高２４時間認められた。
【００２９】
一実施形態によれば、対象における乳がんの治療方法であって、（ａ）対象においてＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１９、ＦＧＦＲ１およびそれらの組み合わせから選択された１種または複数のバイオマーカーの存在または量を検出するステップと、（ｂ）対象における前記１種または複数のバイオマーカーの存在または量に基づいて、対象を治療するためのＦＧＦＲ１阻害剤を決定し、ＦＧＦＲ１阻害剤をそれを必要とする対象に投与するステップとを含む方法。
【００３０】
一実施形態によれば、がんを有し、ＦＧＦＲ１阻害剤で治療された対象の予後の確定方法であって、対象においてＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１９、ＦＧＦＲ１およびそれらの組み合わせから選択された１種または複数のバイオマーカーを検出するステップを含み、前記１種または複数のバイオマーカーの存在または量がＦＧＦＲ１阻害剤で治療した対象の予後の指標である方法。
【００３１】
乳がんの治療または予後において使用するためのドビチニブもしくはその互変異性体またはそれらの薬学的に許容される塩などのＦＧＦＲ１阻害剤であって、乳がんがＨＲ＋であり、患者が、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１９などの１種または複数のＦＧＦＲリガンドおよび／またはＦＧＦＲ１もしくはＦＧＦＲ２などのＦＧＦＲの遺伝子座増幅を有するＦＧＦＲ１阻害剤。
【００３２】
本明細書で開示した方法を実施するためのキットをさらに提供する。「キット」によって、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１９およびＦＧＦＲ１の１種または複数の発現を特異的に検出するための少なくとも１種の試薬を含むいかなる製造物（例えば、パッケージまたは容器）も企図される。キットは、本発明の方法を実施するための単位として、宣伝、流通または販売することができる。さらに、キットは、キットおよびその使用方法を説明するパッケージ挿入物を含有することができる。キット試薬のいずれかまたは全ては、密封した容器内などの外部環境から試薬を保護する容器内に供給してもよい。陽性および／または陰性対照は、本発明に従って使用される試薬の活性および正しく使用されていることを実証するためにキットに含めることができる。対照は、関心のあるバイオマーカーの存在について陽性または陰性のいずれかであることが公知の、組織区分、ガラススライドなどに固定された細胞などの試料を含んでいてもよい。
【００３３】
本発明の特定の実施形態をここで、以下の実施例を参照することによって示す。これらの実施例は、本発明を例示するためだけに開示されており、本発明の範囲をけっして制限すべきではないことを理解されたい。
【実施例１】
【００３４】
ＦＧＦＲ１が増幅された、および増幅されていない転移性乳がんにおけるドビチニブの有効性を試験するための臨床試験
ドビチニブの多施設共同非盲検第ＩＩ相試験は、ドビチニブの臨床活性を評価し、ＦＧＦＲ１が増幅された、および増幅されていない転移性乳がんにおける臨床効果を評価するために実施した。ドビチニブの有効性および安全性は、４群の転移性乳がん患者（群１：ＦＧＦＲ１＋、ＨＲ＋）、（群２：ＦＧＦＲ１＋、ＨＲ−）（群３：ＦＧＦＲ１−、ＨＲ＋）、（群４：ＦＧＦＲ１−、ＨＲ−）で試験した。患者の選択は、ＦＧＦＲ１のＦＩＳＨ／ＣＩＳＨ（カットオフ≧６遺伝子コピー）に従って実施した。ドビチニブ（５００ｍｇ）を１日１回、５日投薬／２日休薬の計画で投与した。主要評価項目は、外部の放射線学のレビューに基づいた、測定可能な疾患を有する患者におけるＲＥＣＩＳＴ最良奏効率（best overall response rate）であった。
【００３５】
選択基準：
１．患者は、関係する乳房におけるびまん性紅斑および浮腫（ポードレンジ）を含む炎症性の変化の存在に基づいて、乳房の皮膚の大部分に関係する触知可能な塊が下に存在するまたは存在しない、ＩＢＣと臨床的に診断される乳がんであることが組織学的に確認されている。皮膚のリンパ浸潤の病理学的証拠は、注目すべきであるが、診断には不要である。
２．患者は局所的または遠位の再発を有するステージＩＶの疾患を有する。
３．患者はＩＨＣ（０または１＋であることが確定されている）またはＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション）によってＨＥＲ２発現が陰性である。ＨＥＲ２が２＋の場合、ＨＥＲ２発現の陰性がＦＩＳＨによって確認されていなければならない。
４．患者は、経口治療薬を嚥下または保持することができる。
５．患者のＥＣＯＧパフォーマンスステータスは０〜２である。
６．患者は、転移疾患のために最大で３種類の標準的化学療法を受けたことがあり、再発がある。
７．患者は、書面によるインフォームドコンセントに署名する能力および意志を有する。
８．患者は１８歳以上である。
９．妊娠の可能性のある女性患者（無月経が＞２年でない女性または外科的に避妊されていない女性）は、妊娠を防ぐために２種類の適切な避妊方法を使用することを承諾しているか、または試験を通じて異性間の行為を控えることに同意しなければならない。
１０．妊娠の可能性のある女性患者は、血清妊娠検査が陰性でなければならない。
１１．患者がベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ剤で治療を受けたことがあるならば、最後の投与＞４週間でなければならない。
１２．患者の転移疾患（胸壁または所属リンパ節を含む）の生検組織が入手可能で（パラフィンブロックまたは未染色スライド最高２０枚）、生検組織が入手可能でない場合は、転移疾患の生検（または患者が胸水のみを有するならば、胸腔穿刺）を実施して診断の確認をする。
【００３６】
除外基準：
１．患者は、治験薬を摂取している間、併用して抗がん治療（化学療法、免疫療法、放射線療法および生物学的療法）を受けている。
２．以下のａ）血清ビリルビン＞／＝１．５×ＵＬＮ、ｂ）ＡＳＴおよびＡＬＴ＞／＝２．５×ＵＬＮ（肝臓転移がわかっている患者の場合、ＡＳＴおよびＡＬＴ＜／＝５×ＵＬＮが許容される）、ＡＮＣ＜１．５のいずれかからなる肝機能異常。
３．患者は活性のある感染症を有し、ＩＶまたは経口抗生物質を必要としている。
４．以下のいずれかを含む心機能障害または臨床上顕著な心疾患：ａ）重篤な制御不能な心室性不整脈の病歴もしくは存在または心房細動の存在；ｂ）臨床上顕著な安静時徐脈（１分当たり＜５０拍）；ｃ）２−Ｄ心エコー（ＥＣＨＯ）またはＭＵＧＡスキャン（multiple gated acquisition scanning （ＭＵＧＡ））によって評価されたＬＶＥＦ＜４５％；ｄ）試験開始６ヵ月前の範囲内において、以下のいずれか：心筋梗塞（ＭＩ）、重症／不安定狭心症、冠動脈バイパス手術（ＣＡＢＧ）、鬱血性心疾患（ＣＨＦ）、脳血管障害（ＣＶＡ）、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、肺塞栓症（ＰＥ）；ｅ）降圧剤あり、またはなしで、ＳＢＰ＞１５０および／またはＤＢＰ＞１００ｍｍＨｇによって定義される制御不能な高血圧。
５．治験薬の吸収を妨害する可能性のある胃腸障害の病歴（医学的障害または大規模な手術）。
６．患者が、治験参加に適さない疾患もしくは症状を併発している、または患者の安全性を妨害する任意の重篤な医学的障害を有する。
７．転移性疾患の証拠がない局所的または局部的に限定された疾患のみを有する患者。
【００３７】
２０１１年１月現在、８１人の患者が治療を受けており、７７人の患者（群１＝２１人、群３＝３４人、群４＝２２人）のデータが利用可能であった。転移後治療（metastatic setting）における前治療：化学療法系２（全患者）および内分泌療法系２（ＨＲ＋患者）の中央値。全部で患者の５８％（群１：８１％、群３、４：５０％）に肝転移が見られた。最も一般的な有害事象には、嘔吐（７５％；等級３［群３］：６％）、下痢（７２％；群３：６％）、悪心（６２％；群３：５％）および無力症（６１％；群３：１７％）が含まれた。投与期間中央値は、１．７ヵ月（範囲、０〜８．２ヵ月）で、４ヵ月を上回って治療を受けた患者８人も含まれる。ベースラインにおいて測定可能な疾患を有する患者：群１、２（１３％）は不確定部分寛解を有し、７人（４４％）の患者は４ヵ月以上の安定疾患（ＳＤ４）を有し、群３および４のＳＤ４はそれぞれ８人（２９％）および２人（１１％）の患者であることが示された。
【００３８】
ドビチニブは、治療歴のある乳がん集団において、抗腫瘍活性を示した。活性は、ＦＧＦＲ１が増幅した疾患を有するＨＲ＋患者において認められ、その他のサブグループにおいて疾患の安定化が認められた。表１の臨床データを要約すると、ＦＧＦＲ１は乳がんに関連した標的であり、ＦＧＦＲ１増幅がドビチニブ感受性乳がんの分子セグメントを規定する。群１は、ＨＲ＋およびＦＧＦＲ１増幅の両方である患者を包含する。群３は、ＨＲ＋であり、ＦＧＦＲ１は増幅していないが、別のＦＧＦＲおよび／またはＦＧＦリガンドが増幅している可能性がある患者を包含する。
【００３９】
【表１】
2014513930.tif 000003
【実施例２】
【００４０】
ＦＧＦＲ１増幅乳がんの患者におけるＦＧＦＲ１阻害剤（ドビチニブ）の有効性を試験するための臨床試験
患者群１、３および４でのドビチニブの臨床試験の結果を解析した後、他の遺伝子増幅がある腫瘍を有する患者における臨床応答をさらに評価するために、探索的解析も実施した。ＦＧＦリガンド（ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１９）の増幅ならびにＦＧＦＲ２遺伝子の増幅も、プロトコールに予め規定したように実施した。このプロトコールでは、ＡＢＩの設計済みＴａｑＭａｎ（商標）コピー数アッセイを用いたＦＧＦＲ１およびＦＧＦ３遺伝子のコピー数解析に使用した方法を説明している。
【００４１】
方法の概要
ＦＧＦＲ１およびＦＧＦ３のＴａｑＭａｎ（登録商標）コピー数アッセイは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから取り寄せ、デュプレックスリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてＴａｑＭａｎ（登録商標）コピー数リファレンスアッセイと一緒に実施する。コピー数アッセイでは、関心のある標的遺伝子（この場合ＦＧＦＲ１またはＦＧＦ３）を検出し、リファレンスアッセイ（ＲＮアーゼＰ）では、２倍体ゲノムにおいて２つのコピー中に存在することが知られている配列を検出する。相対的定量のこの方法は、ゲノムＤＮＡ試料中の関心のある標的の相対的コピー数を測定するために使用され、リファレンス遺伝子のコピー数に対して正規化される。
【００４２】
各ＴａｑＭａｎ（登録商標）コピー数アッセイは、増幅用に２種類の未標識プライマー、および関心のある標的配列を検出するために１種類のＴａｑＭａｎ（登録標識）ＭＧＢプローブを含有する。プローブは、５’末端にはＦＡＭ（商標）レポーター色素が、３’末端には非蛍光クエンチャー（ＮＦＱ）および副溝結合剤（ＭＧＢ）が付いている。ＭＧＢは、プローブの長さを延長しなくても、融解温度（Ｔｍ）を上昇させる。
【００４３】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）コピー数リファレンスアッセイは、増幅用に２種類の未標識プライマー、ＲＮアーゼＰ遺伝子を検出するために１種類のＴａｑＭａｎ（登録標識）ＭＧＢプローブを含有する。プローブは、５’末端にはＶＩＣ（商標）レポーター色素が、３’末端にはＴＡＭＲＡ（商標）クエンチャーが付いている。
【００４４】
ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲアッセイは、関心のある遺伝子（ＦＧＦＲ１またはＦＧＦ３）およびＲＮアーゼＰについて、ＡＢＩによって供給されたデュプレックスＰＣＲプロトコールによって、ＢｉｏＲａｄ（商標）ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ機器で実施した。コピー数の計算は、未知の試料対正常な対照ＤＮＡの、関心のある遺伝子（ＦＧＦＲ１またはＦＧＦ３）対ＲＮアーゼＰのΔΔＣｔ値に基づいた。正常なＤＮＡ対照は、２倍体ゲノムを有する市販のゲノムＤＮＡ試料である。
【００４５】
試薬
【００４６】
【表２】
2014513930.tif 000004
【００４７】
プロトコール
１．マスターミックスは、以下に挙げた量を使用し、ピペット操作の誤差による１０％過剰を考慮に入れ、使用前に各試薬を十分に混合することによって調製した。
【００４８】
【表３】
2014513930.tif 000005
【００４９】
２．マスターミックス９μＬ量をＰＣＲプレートの各ウェルに分注した。
【００５０】
３．鋳型ＤＮＡ（１０ｎｇ／μＬ）１μＬ量をウェルに添加した。ＰＣＲプレートをしっかり密封し、次いでマスターミックスおよび試料がウェルの底に確実に集まるように軽く遠心分離した。
【００５１】
４．反応プレートをＢｉｏＲａｄＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ機器に載せた。
【００５２】
５．反応プレートでのＰＣＲアッセイは、以下の実施パラメータを使用して実施した：９５℃１０分に続いて
９５℃１５秒
６０℃６０秒
を４０サイクル。
【００５３】
６．ＰＣＲアッセイを設定し、ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム取扱説明書に従ってＣＦＸマネージャーソフトウェアの操作を開始した。
【００５４】
データ解析
データ解析は、ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム取扱説明書に従って、遺伝子発現モードを使用して実施した。
【００５５】
遺伝子発現表のデータは、以下の基準に基づいて試料に増幅／非増幅状態を調べ、割り当てた：
発現値＜２は、「非増幅」を示す。
発現値＝または＞２は「増幅」を示す。
【００５６】
関心のある遺伝子のコピー数は、２×発現値である。
【００５７】
参考文献
CFX96 and CFX384 Real-Time PCR Detection Systems Instruction Manual. Bio-Rad Laboratories, 2008
TaqMan Copy Number Assays Protocol. Applied Biosystems. 2010
【００５８】
この解析には、判定者によって決定され、「公知の」ＦＧＦ経路遺伝子状態を有する、測定可能な乳がんを有する患者全てを含めた。
【００５９】
ＦＧＦ経路遺伝子を有する患者全てをプロファイルした後、１８人の患者が、公知のＦＧＦ（ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦ３のいずれか）が増幅していると同定された。
群１＝ＦＧＦＲ１が増幅した患者１６人
群３＝ＦＧＦ３が増幅した患者１人、ＦＧＦＲ２が増幅した患者１人。
群４＝誰もＦＧＦ経路遺伝子は増幅していなかった。
【００６０】
探索バイオマーカー解析によって、表２に概要を示したように、最も腫瘍が縮小した上位２人の患者は、ＦＧＦＲ１遺伝子およびＦＧＦ３遺伝子の両方が増幅していることが明らかになった。最も腫瘍縮小を示した患者（＜−２０％）は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦ３遺伝子増幅と一致していた。
【００６１】
【表４】
2014513930.tif 000006
判定された応答：試験を知らされていない熟練放射線科医によって評価された臨床応答。
ＰＦＳ判定：判定された無増悪生存
ＮｏＰＤ４：最良の総合効果（overall response）として、および少なくとも、治療開始から≧１４週間の安定疾患の２回目の測定で安定疾患を示す患者
ＳＤ：安定疾患
【００６２】
ＦＧＦ経路調節不良、例えば、ＦＧＦが増幅している患者、およびＦＧＦ経路調節不良がない、例えば、ＦＧＦが増幅していない患者を再度グループ分けした後、表３に概要を示したように、ＦＧＦ増幅群では、不確定部分寛解が２人、および安定疾患の患者が５０％で、説得力のある臨床上の利益が認められ、ドビチニブはＦＧＦ経路調節不良、例えば、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦ３遺伝子が増幅した患者においてより有効であることが明らかに示された。
【００６３】
【表５】
2014513930.tif 000007
表３では、ＦＧＦが増幅していない患者群には、ＨＲ＋およびＨＲ−両方の患者が包含される。ＦＧＦが増幅した患者群では、患者は全てＨＲ＋である。
【００６４】
前記の結果は、本発明による診断および予後の方法を支持する。
【国際調査報告】
2014513930.tif 000008
2014513930.tif 000009
2014513930.tif 000010
2014513930.tif 000011