(57)【要約】【課題】心筋傷害のマーカーを含む、試料中の分析物のレベルに関して、正確で、半定量的で、簡便で、かつ費用効果的な情報を提供する能力を有する臨床現場即時検査（ポイントオブケア検査）は、大きな要求を満たすはずである。【解決手段】  本発明は、試料中の心筋トロポニンなどの心筋損傷のマーカーを含む、分析物の２つ以上の閾値レベルの存在を検出するための方法及びデバイスを提供する。様々な実施形態では、本発明は、費用効果的な健康管理を導くように、患者の容態を判定するための好都合なポイントオブケア検査を提供する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者試料中の心筋傷害のマーカーの少なくとも２つの閾値レベルを検出するためのデバイスであって、
試料が加えられる区域と、
１つ又は複数の側方流動基板によって形成され、前記試料が加えられる区域と流体連通する１つ又は複数の流体流路と、
単一の流路上に直列にある、又は別々の流路内にある、第１マーカー捕捉区域及び第２マーカー捕捉区域と、
を備え、
前記第１捕捉区域は、第１の閾値レベル以上で試料中に存在するとき、マーカーを検出可能に捕捉するよう構成されており、前記第２捕捉区域は、第２の閾値レベル以上で試料中に存在するとき、前記マーカーを検出可能に捕捉するように構成されている、デバイス。
【請求項２】
前記マーカーが心筋トロポニンである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記心筋トロポニンがｃＴｎＩである、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記第１の閾値レベルが、前記患者試料中において約０．０４ｎｇ／ｍｌのｃＴｎＩに対応する、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
前記第２の閾値レベルが、前記患者試料中において約０．１ｎｇ／ｍｌのｃＴｎＩに対応する、請求項３又は４に記載のデバイス。
【請求項６】
前記流体流路が、１つ又は複数の吸水性又は吸収性の膜によって形成される、請求項１から５のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項７】
試料の流れの指標として、各流路内に制御区域をさらに備える、請求項１から６のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項８】
付加された検出可能な標識を有する第の１マーカー結合部分をさらに備える、請求項１から７のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項９】
それぞれが捕捉区域で固定化された、又は前記捕捉区域によって捕捉可能な部分を有する、少なくとも１つの第２のマーカー結合部分をさらに備える、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの第２の結合部分が、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用、又は抗体−抗原相互作用によって、あるいは相補的若しくは実質的に相補的なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって捕捉可能である、請求項９に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記第１及び第２の結合部分が、抗体又はその抗原結合部分である、請求項８から１０のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記結合部分が、１又は複数の捕捉区域の上流の１又は複数の流路内で拡散的に結合している、請求項７から１１のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記第１捕捉区域及び前記第２捕捉区域が、並行流路又は双方向流路内にある、請求項１から１２のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１４】
それぞれが異なるマーカー閾値レベルを検出するために構成された、３つ以上の流路を備える、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記第１捕捉区域が第１の量の固定化捕捉剤を有し、前記第２捕捉区域が第２の量の前記固定化捕捉剤を有する、請求項１４に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記捕捉剤が、ストレプトアビジン、ビオチン、抗体、又はポリヌクレオチドである、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記第１捕捉区域が、ｃＴｎＩに対する第１の親和性を有する抗体を含み、前記第２ｃＴｎＩ捕捉区域が、ｃＴｎＩに対する第２の親和性を有する抗体を含む、請求項１４に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記第１捕捉区域が、第１の配列を有する一本鎖のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド誘導体を含み、第２捕捉区域が、前記第２の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを含み、
前記第２の結合部分が、高親和性及び低親和の結合部分をそれぞれ前記第１及び第２捕捉区域に固定化するための、付加された相補オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド誘導体を有する、請求項１４に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記第１捕捉区域が、マーカーに対する第１の親和性を有する固定化免疫試薬を含み、前記第２捕捉区域が、固定化ストレプトアビジンを含み、マーカーに対する第２の親和性を有する第２の免疫試薬が、付加されたビオチンを有する、請求項１４に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記第１及び第２捕捉区域が連続的であり、マーカー閾値が、前記連続的な捕捉区域に沿って結合している検出可能マーカーの長さによって規定され、それによってアッセイの範囲を拡張している、請求項１４に記載のデバイス。
【請求項２１】
試料中の心筋傷害のマーカーのレベルを評価するための半定量的方法であって、
請求項１から２０のいずれかに記載の検査デバイスに検査試料を加える工程と、
１又は複数の捕捉区域内で、検出可能な信号の存在又は非存在を検出する工程と
を含む、方法。
【請求項２２】
前記マーカーの前記第１の閾値レベルを示す検出可能な信号が、第１の判断を示唆し、前記第２の閾値レベルを示す検出可能な信号が、第２の判断を示唆する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記患者が、心筋梗塞の１つ又は複数の症状を有する、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
ｃＴｎＩの前記第１の閾値レベルが、前記患者の容態が、１〜１０時間の期間にわたって心筋梗塞の徴候及び症状について監視されるべきであることを示唆する、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
ｃＴｎＩの前記第２の閾値レベルが、前記患者が潜在的な心筋梗塞について治療をされるべきであることを示唆する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ｃＴｎＩの上昇レベルを検出するために、１〜１０時間内に繰り返される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記患者が、慢性心臓病、又は循環ｃＴｎＩの検出可能なレベルと関連した他の容態を有する、請求項２１から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
検査が、家又はポイントオブケアで実施される、請求項２１から２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
検査試料中の分析物の少なくとも２つの閾値レベルを検出するためのデバイスであって、
試料が加えられる区域と、
１つ又は複数の側方流動基板によって形成され、前記試料が加えられる区域と流体連通した１つ又は複数の流体流路と、
単一の流路上に直列にある、又は別々の流路内にある、第１の分析物捕捉区域及び第２の分析物捕捉区域と、
を備え、
前記第１の分析物捕捉区域は、第１の閾値レベル以上で試料中に存在するとき、分析物を直接又は間接的に検出可能に捕捉するための量の第１の固定化結合部分を含み、
前記第２の分析物捕捉区域は、第２の閾値レベル以上で試料中に存在するとき、前記分析物を直接又は間接的に検出可能に捕捉するための量の第２の固定化結合部分を含み、前記第１及び第２の固定化結合部分は、同じである、又は異なる、デバイス。
【請求項３０】
前記流体流路が、１つ又は複数の吸水性又は吸収性の膜によって形成される、請求項２９に記載のデバイス。
【請求項３１】
試料の流れの指標として、各流路内に制御区域をさらに備える、請求項２９又は３０に記載のデバイス。
【請求項３２】
第１及び第２の分析物結合部分をさらに備え、第１の分析物結合部分が付加された検出可能な標識を有し、第２の分析物結合部分が前記固定化結合部分によって捕捉可能な部分を有する、請求項２９から３１のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項３３】
前記第２の分析物結合部分が、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用、又は抗体−抗原相互作用によって、あるいは相補的若しくは実質的に相補的なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって捕捉可能である、請求項３２に記載のデバイス。
【請求項３４】
前記分析物結合部分が、抗体又はその抗原結合部分である、請求項３２に記載のデバイス。
【請求項３５】
前記分析物結合部分が、１又は複数の分析物捕捉区域の上流の１つ又は複数の流路内で拡散的に結合している、請求項３２に記載のデバイス。
【請求項３６】
前記第１の分析物捕捉区域及び前記第２の分析物捕捉区域が、並行流路又は双方向流路内にある、請求項２９から３５のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項３７】
前記固定化結合剤が、ストレプトアビジン、ビオチン、抗体、又はポリヌクレオチドである、請求項２９から３６のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項３８】
それぞれが異なる分析物閾値レベルを検出するために構成された、３つ以上の流路を備える、請求項２９から３７のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項３９】
前記分析物がｃＴｎＩ及び／又はＮＴ−ｐｒｏＢＮＰである、請求項３８に記載のデバイス。
【請求項４０】
試料中の分析物のレベルを評価するための半定量的方法であって、
請求項２９から３９のいずれかに記載の検査デバイスに検査試料を加える工程と、
１又は複数の捕捉区域内で、信号の存在又は非存在を検出する工程と
を含む、方法。
【請求項４１】
前記分析物の前記第１の閾値レベルを示す検出可能な信号が、第１の判断を示唆し、前記第２の閾値レベルを示す検出可能な信号が、第２の判断を示唆する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記分析物が、イベント又は容態の指標として、１時間〜１週間の期間にわたって試料中で上昇する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも１回繰り返される、請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
[001]  健康管理従事者が患者の容態を迅速に判定することを可能にするポイントオブケアフォーマットにおけるものを含む、身体試料中の分析物の存在を検出するための検査が開発されている。これらの検査は、一般に、抗原−抗体反応、又はいくつかの他のリガンド−リガンド受容体結合イベントを含み、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、又は他の検出可能な標識を含み得る。多くのこのような検査は、指定したレベル又は濃度以上の試料中の分析物の存在又は非存在を検出することによって定性的判定を行うように設計されている。
【０００２】
[002]  しかし、分析物が検出可能濃度以上で試料中に存在する、又は存在しないことを示すバイナリ検査結果は、臨床医、患者、又は検査を施している人に最も有用な情報を必ずしも提供しない。例えば、患者の血清中の、心筋損傷のマーカーである心筋トロポニン（例えば、cTnI）の存在は、心筋梗塞、並びに二次虚血性及び非虚血性傷害、例えば、冠動脈インターベンション、心筋心膜炎、敗血症、心臓外傷、化学療法、及び腎不全などを含む多数の容態を示すことができ、又はこれらに関連し得る。Ｓｈａｒｍａら、Ｃａｒｄｉａｃ  Ｔｒｏｐｏｎｉｎｓ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．５７：１０２５−１０２６（2004）を参照のこと。したがって、血清中の心筋トロポニンの存在は、患者が急性心イベント（例えば、心筋梗塞又はMI）を経験していることを必ずしも示さない。さらに、このようなレベルが存在しないことによっても、急性心イベント（MIなど）は必ずしも排除されない。その理由は、トロポニンレベルは、このようなイベントの後、約４〜１２時間の過程にわたって血清中で増大するためである。むしろ、トロポニンレベルが急性心イベントと一致する様式で経時的に上昇中であるか否かを判定することが重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
[003]  心筋傷害のマーカーを含む、試料中の分析物のレベルに関して、正確で、半定量的で、簡便で、かつ費用効果的な情報を提供する能力を有する臨床現場即時検査（ポイントオブケア検査）は、大きな要求を満たすはずである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
[004]  本発明は、試料中の分析物の２つ以上の閾値レベルの存在を検出するための方法及びデバイスを提供する。様々な実施形態では、本発明は、費用効果的な健康管理を導くように、患者の容態を判定するための好都合なポイントオブケア検査を提供する。
【０００５】
[005]  一態様では、本発明は、患者試料中の心筋損傷又は傷害のマーカーの少なくとも２つの閾値レベルを検出するためのデバイスを提供する。心筋トロポニン（例えば、cTnT又はcTnI）、ミオグロビン、並びにＣＫ−ＭＢが含まれる心筋傷害又は損傷のこのようなマーカーの上昇レベルは、心筋梗塞及び本明細書に記載の他の急性心イベントを示すことができる。本デバイスは、ポイントオブケア判定に適切であり得る。そして、入院又は救急看護の必要性を判定するために、健康管理従事者によって、又は未熟練者によって施すことができ得る。
【０００６】
[006]  本態様によれば、デバイスは、側方流動膜、並びに心筋傷害又は損傷のマーカー（「バイオマーカー」）の存在下で検出可能な複合体を形成するための結合試薬を含む。デバイスは、試料が加えられる区域、及び試料が加えられる区域と流体連通した１つ又は複数の流体流路を備える。流体流路は、第１バイオマーカー捕捉区域及び第２バイオマーカー捕捉区域を備え、これらは、単一の流路上に直列にあってもよく、又は別々の流路内にあってもよい。第１捕捉区域は、第１の閾値レベル以上で試料中に存在するとき、バイオマーカーを検出可能に捕捉するように構成されており、第２捕捉区域は、第２の閾値レベル以上で試料中に存在するとき、バイオマーカーを検出可能に捕捉するように構成されている。したがって、デバイスは、患者におけるバイオマーカーレベルを判定又は追跡するための半定量的情報を提供し、ポイントオブケアフォーマットで患者の容態を判定するための汎用性の高い情報を提供する。
【０００７】
[007]  例えば、デバイスは、ｃＴｎＩなどの心筋トロポニンの少なくとも２つの閾値レベルを検出するための結合試薬を含有し得る。このような実施形態では、第１の閾値レベルは、血液循環中のｃＴｎＩの存在を示すことができ、約０．０４ｎｇ／ｍＬに対応し、より具体的な臨床評価をもたらすことができ得る。例えば、この閾値より上のｃＴｎＩのレベルは、患者が、潜在的な心イベントを示す上昇中のｃＴｎＩレベルについて監視されるべきであることを示す。第２の閾値レベルは、急性心イベントを示すことができ、循環中の約０．１ｎｇ／ｍＬのｃＴｎＩに対応し得る。第２の閾値レベルより上のｃＴｎＩのレベルは、ＭＩなどの急性心イベントを示す。デバイスは、検査の感度及び／又は特異性及び／又は範囲を向上させ、及び／又はさらにいっそう具体的な臨床評価を提供するために、ある特定の実施形態では、ｃＴｎＩの３つ以上の閾値レベルを判定することもできる。
【０００８】
[008]  １又は複数の流体流路は一般に、１つ又は複数の吸水性、吸収性、及び／又は多孔質の膜によって形成され、各流路は、試料の流れが順調であることの指標として検出可能な信号を生成する制御区域を含むことができる。いくつかの実施形態では、流体流路は、細胞及び／又はデブリを濾過するために、様々な多孔度の膜又はパッドをさらに含むことができ、これらは一般に、試料が加えられる区域に近接して位置される。これらの実施形態又は他の実施形態では、流体流路は、結合試薬を収容する１つ又は複数の試薬パッドを備えることができる、及び／又は試料の流れの推進に役立つように、末端に吸収パッドを含むことができる。
【０００９】
[009]  バイオマーカー（例えば、cTnI）は、デバイス内（例えば、試薬パッド内）に含められている第１の結合部分及び第２の結合部分で形成され、又は試料に添加される（例えば、プレインキュベーション工程で）捕捉可能で検出可能な複合体を形成することによって、例えば試料中で検出可能である。第１の結合部分及び第２の結合部分は、本明細書に詳細に記載される免疫試薬であり得る。第１の結合部分は、捕捉区域で複合体が固定化されると可視化又は検出され得る、付加された、又は結合した検出可能な標識を有する。様々な適当な標識が本明細書に記載されている。デバイスは、特定の捕捉区域で複合体を捕捉又は固定化させるための１つ又は複数の第２の結合部分を含むことができる。特に、各第２の結合部分は、捕捉区域で固定化されており、又は試料が流れている間に特定の捕捉区域で固定化され得る。例えば、少なくとも１つの第２の結合部分は、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用、抗体−抗原相互作用によって、又は相補的若しくは実質的に相補的なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって捕捉区域で捕捉可能であり得る。第１及び／又は第２の結合部分は、１又は複数のｃＴｎＩ捕捉区域の上流の１又は複数の流路内で拡散的に結合することができ、その結果、試料中のバイオマーカーは、試料が流れている間に、第１及び第２の結合部分と捕捉可能で検出可能な複合体を形成する。
【００１０】
[010]  いくつかの実施形態では、第１捕捉区域及び第２捕捉区域は、試料が加えられる区域と流体連通して、異なる、並列の、又は双方向性の流路内にある。例えば、デバイスは、それぞれが試料中のバイオマーカーの異なる閾値レベルを判定するように構成された、２つ、３つ、又はそれ以上の流路を備えていてもよい。いくつかの実施形態では、デバイスは、上昇中の分析物レベルを検出するためにある時間内に検査を繰り返すための、少なくとも第２の試料が加えられる区域、及び対応する１つ又は複数の流路を備えていてもよい。
【００１１】
[011]  デバイスは一般に、複数の閾値レベルでバイオマーカーを検出するように構成されている。いくつかの実施形態では、各捕捉区域で異なる閾値レベルのマーカーを検出可能に捕捉するように、第１捕捉区域は、第１の量の固定化捕捉剤を有し、第２捕捉区域は、第２の量の前記固定化捕捉剤を有し、追加の捕捉区域について同様である。固定化捕捉剤は、対向する側の結合部分が分析物−特異的結合試薬（「第２の結合部分」）にコンジュゲートされている、例えば、ストレプトアビジン、ビオチン、抗体、又は天然若しくは人工ポリヌクレオチドであり得る。他の実施形態では、異なる閾値レベルでバイオマーカーを検出可能に捕捉するように、第１捕捉区域は、バイオマーカーに対する第１の親和性を有する抗体を含み、第２捕捉区域は、バイオマーカーに対する第２の親和性を有する抗体を含む。低親和性抗体及び高親和性抗体は、それぞれの捕捉区域に非拡散的に結合することができ、又は特定の捕捉剤、例えば、とりわけ、ストレプトアビジン又は１又は複数のポリヌクレオチド捕捉剤などを使用することによって特定の捕捉区域に向けることができる。例えば、異なる配列を有するポリヌクレオチド捕捉剤を使用して、低親和性抗体及び／又は高親和性抗体を特定の捕捉区域に向けることができる。
【００１２】
[012]  さらに他の実施形態では、捕捉区域は連続的であり、閾値レベル又は相対的レベルは、流路に沿って捕捉される検出可能な免疫複合体の相対的長さによって識別される。
【００１３】
[013]  別の態様では、本発明は、心筋トロポニン（例えば、cTnI）などの患者試料中の心筋傷害又は損傷のマーカーのレベルを評価するための半定量的方法を提供する。本方法は、検査試料を本発明のデバイスに加える工程と、捕捉区域内で特定の検出可能な信号の存在又は非存在を検出する工程とを含む。患者は、急性心イベントの１つ若しくは複数の症状を有する場合があり、及び／又は慢性心臓病を有する場合があり、緊急介入の必要性を判断するために、迅速なトロポニン（例えば、cTnI）判定を潜在的に極めて重要にしている。さらに、患者は、腎疾患などのｃＴｎＩの特定の循環レベルと関連した慢性病状、以前の心臓外傷若しくは外科的介入、又は敗血症を有する場合があり、その結果、不要な救急治療の費用を回避するために、潜在的なバックグラウンドレベルに対するｃＴｎＩの上昇レベルを迅速かつ正確に検出するための方法が望ましいはずである。患者試料が第１の閾値レベルであるが、第２の閾値レベル未満のマーカーのレベルを示す場合、マーカーの上昇レベルを検出するために、約１〜約１０時間以内に検査が繰り返される。
【００１４】
[014]  例えば、ｃＴｎＩの第１の閾値レベルを示す検出可能な信号は、患者が心筋梗塞の徴候及び症状について監視されるべきであることを示唆し、いくつかの実施形態では、ｃＴｎＩの上昇レベルを検出するために、ある時間後に検査が繰り返される。ｃＴｎＩの第２の閾値レベルを示す検出可能な信号は、患者がＭＩなどの潜在的な急性心イベントについて治療されるべきであることを示唆する。患者が検査デバイスで検出可能なｃＴｎＩのレベルを有さない場合、患者は、急性心イベントを経験していないと判定され、又は有害な結果のリスクが低い。
【００１５】
[015]  別の態様では、本発明は、検査試料中の分析物の少なくとも２つの閾値レベルを検出するためのデバイス及び方法を提供する。この態様では、分析物は、心筋傷害のマーカーである必要はなく、試料中のレベルが１つを超える医療判断ポイントを示唆することができる任意のマーカーとすることができる。このようなマーカーは、脳卒中若しくは脳外傷、治療剤に対するアレルギー反応（例えば、治療剤に対するＩｇＥ抗体）、又は自己抗体の検出若しくはサイトカインプロファイルの判定による自己免疫疾患を含む特定の疾患活動の尺度を示すことができる。
【００１６】
[016]  この態様では、本デバイスは一般に、試料が加えられる区域、及び試料が加えられる区域と流体連通した１つ又は複数の流体流路を備える。１又は複数の流体流路は、第１の分析物捕捉区域及び第２の分析物捕捉区域を含む。第１及び第２捕捉区域は、単一の流路上に直列にある、又は別々の流路内にある。第１の分析物捕捉区域は、第１の閾値レベル以上で試料中に存在する場合、分析物（例えば、検出可能な複合体中で存在する）を直接又は間接的に検出可能に捕捉するための第１の量の固定化捕捉剤を含む。第２の分析物捕捉区域は、第２の閾値レベル以上で試料中に存在する場合、分析物（例えば、検出可能な複合体中で存在する）を直接又は間接的に検出可能に捕捉するように構成された第２の量の固定化捕捉剤を含む。分析物と検出可能な複合体（例えば、免疫複合体）を形成するための結合試薬は、デバイス中で流体流路中に存在し、又はプレインキュベーション工程で試料と組み合わされる場合がある。
【００１７】
[017]  様々な実施形態では、固定化捕捉剤は、ストレプトアビジン−ビオチン、抗体−抗原、又は対向する側の結合部分が複合体を形成するための結合試薬（例えば、第２の結合部分）の１つにコンジュゲートされた、相補的若しくは実質的に相補的な天然若しくは人工オリゴヌクレオチドから選択される結合対の１つの部分である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】[018]本発明の検査デバイスを例示する図である。検査デバイスは、側方流動膜と流体連通した試料が加えられる区域を含む。図１は、連続的な捕捉区域を使用する実施形態をさらに例示する。
【図２】[019]本発明の検査デバイスを例示する図である。検査デバイスは、不透過性バリアによって２つの小区分に分離された、１つの側方流動膜と流体連通した試料が加えられる区域を含む。
【図３】[020]本発明の検査デバイスを例示する図である。検査デバイスは、試料が加えられる区域及び試薬パッドを含み、これらのうちの後者は、バリアによって分離された２つの並列の独立した側方流動膜と流体連通している。各側方流動膜は、捕捉区域及び制御区域を含み、各側方流動膜の下流は、吸収パッドである。
【図４】[021]本発明の検査デバイスを例示する図である。検査デバイスは、単一の試料が加えられる区域と流体連通した２つの独立した側方流動膜を含む。検査デバイスは、双方向流を使用する。
【図５】[022]本発明の検査デバイスを例示する図である。検査デバイスは、それぞれが複数の閾値レベルにある複数の分析物を検出するための、１つの試料が加えられる区域、及び試料が加えられる区域の周りに径方向に配列された複数の側方流動膜を含む。
【図６】[023]支持マトリックスによって支持された、２つの連続的に配向した捕捉区域を含む側方流動膜を備える検査デバイスを例示する図である。２つの捕捉区域は、それぞれ低分析物閾値及び高分析物閾値を検出するために、高親和性抗体及び低親和性抗体を使用する。検査デバイスは、２つの異なる濃度の同じ分析物を検出可能に捕捉するように設計されている。
【図７】[024]２つの異なる濃度の同じ分析物を検出可能に捕捉するように設計された２つの捕捉区域を含む側方流動膜を例示する図である。１つの捕捉区域は、それぞれがビオチンにコンジュゲートされた高親和性抗体を使用する。ビオチンは、高親和性抗体を固定化するために、側方流動膜上でストレプトアビジンに結合している。第２捕捉区域は、側方流動膜に直接結合した低親和性抗体を使用する。
【図８】[025]２つの異なる濃度の同じ分析物、又は２つの異なる分析物を検出可能に捕捉するように設計された２つの捕捉区域を含む側方流動膜を例示する図である。捕捉剤はオリゴヌクレオチドであり、この場合、相補オリゴヌクレオチドが特定の捕捉区域で固定化される。
【図９】[026]本発明の検査デバイスで実行したマルチレベル心筋トロポニンアッセイからの結果を示す図である。例示的な実施形態では、分析物の２つの検出可能な閾値を創製するために、並列の流路、及び捕捉区域で固定化された異なる量のビオチンを使用する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
[027]  本発明は、試料中の分析物の２つ以上の閾値レベルの存在を検出するための方法及びデバイスを提供する。様々な実施形態では、本発明は、費用効果的な健康管理を導くように、患者の容態を判定するための好都合なポイントオブケア検査を提供する。
【００２０】
[028]  体液試料中の分析物濃度は、疾患及び他の臨床症状の診断又は予後のための有用な指標である。本明細書に記載されるように、単一の検査デバイスでの複数の閾値（すなわち、カットオフ）レベルは、検査によってもたらされる情報を高め、医療選択肢を迅速に評価する機会を提供する。さらに、複数の閾値レベルでの１種又は複数の分析物の測定は、ある時間にわたって連続に測定することにより分析物レベルの進展を測定することによって、疾患状態若しくは病状の進行を監視し、又は病状の存在若しくは非存在を判定するのに有用となり得る。
【００２１】
[029]  側方流動検査などの半定量的検査を使用して複数の閾値レベルに対する分析物濃度を測定することは、１つを超える臨床的判断ポイント（それによる、結果として生じる行動方針）を、ポイントオブケア時に単一の評価で扱うことができ、未熟練者によって行うことができるので、特に有用となり得る。
【００２２】
[030]  様々な実施形態では、本発明のデバイス及び方法により、定量分析に必要とされることが多い、扱いにくい、又は不便な器具使用の要件が回避され、本発明が、例えば家、農村地域、救急車、飛行機、及び低開発な地方にとって理想的になる。本発明は、不慣れなユーザーに緊急健康管理の必要性を知らせるのに十分な、容易に解釈可能な検査を提供する。
【００２３】
対象とする分析物及びマーカー
[031]  ある特定の実施形態におけるデバイスは、血清中のその存在が心筋梗塞などの急性心筋イベントを示す、心筋傷害又は損傷に関連した分析物を検出する。このような分析物としては、心筋トロポニン（例えば、cTnT、cTnI、及びcTnC）、ミオグロビン、並びにＣＫ−ＭＢがある。心筋傷害の他のマーカーは、米国特許第６，４６１，８２８号に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。本デバイスは、心筋傷害の少なくとも１種、２種、又は３種のマーカーの複数の閾値レベルを検出するように構成することができる。
【００２４】
[032]  分析物は、少なくとも１種の心筋トロポニン（例えば、cTnI、cTnC、cTnT）であり得る。循環心筋トロポニンのレベルは、心筋損傷に特異的である。さらに、血清中の心筋トロポニンのレベルは、ＭＩの漸進的発達において経時的に変化する。例えば、患者がＭＩ様の症状、例えば、不安定な胸痛及びＥＣＧに対する非特異的変化などを呈しているが、症状が最初に現れたとき通常の９９パーセンタイル未満のｃＴｎＩの血中濃度を有する場合、対象は、６〜９時間内に再び検査されるべきである。経時的にｃＴｎＩが増加すると、心筋壊死のより正確なリスク評価及び特異性がもたらされ、腎損傷などのトロポニン上昇の非特異的原因が排除される。連続した検査でｃＴｎＩが２０％〜３０％に増加すると、有意であるとみなされる。
【００２５】
[033]  ある特定の実施形態では、デバイスは、複数の閾値レベルより上の患者試料中のｃＴｎＩの存在を判定する。心筋トロポニンＩ（cTnI）は、心筋梗塞（MI）後の最初の４〜１２時間にわたって増加する。例えば、対象の循環トロポニンＩレベルが、約０．０４ｎｇ／ｍＬ超であるが、約０．１ｎｇ／ｍＬ未満である場合、心筋梗塞又は急性心イベントの疑いがあるが、このようなトロポニンＩのレベルは、腎疾患などの心筋梗塞以外の原因に起因し得る。したがって、０．０４ｎｇ／ｍＬ超であるが０．１ｎｇ／ｍＬ未満である血中ｃＴｎＩ量を報告する単回の測定は、決定的でない場合がある。しかし、最初の測定から数時間後（例えば、２〜８時間の後）、２回目の測定により、対象のｃＴｎＩレベルが約０．１ｎｇ／ｍＬ超であることが示される場合、それは、対象のトロポニンＩレベルが経時的に増加し、ＭＩの可能性が有意により高いことを示す。
【００２６】
[034]  したがって、ｃＴｎＩに関係する特定の実施形態では、デバイスは、患者の血液又は血清中の低閾値レベルのｃＴｎＩを検出するように構成され、低閾値レベルは、ｃＴｎＩの存在を示す。この閾値は、約０．０１ｎｇ／ｍＬ〜約０．０６ｎｇ／ｍＬであり、又はある特定の実施形態では、約０．０４ｎｇ／ｍＬであり得る。これらの実施形態では、デバイスは、ＭＩなどの急性心イベントを示す、より高い閾値のｃＴｎＩを同時に検出するようにも構成される。ｃＴｎＩのより高い閾値は、患者の血液又は血清中で約０．０８ｎｇ／ｍＬ〜約０．２ｎｇ／ｍＬに、又は特定の実施形態では、約０．１ｎｇ／ｍＬに相関し得る。検査デバイスを用いた初期測定により、約０．１ｎｇ／ｍＬ超のｃＴｎＩレベルが示される場合、ＭＩ又は死などの有害イベントのリスクは、ｃＴｎＩが０．１ｎｇ／ｍＬ未満であった場合と比較して、約２．２〜３．０倍高い。初期測定により、血液又は血清中のｃＴｎＩレベルが約０．０４ｎｇ／ｍＬ未満であることが示される場合、検査がＭＩの発症の非常に早期に実施された場合を除き、ＭＩは非常に考えにくいはずである。
【００２７】
[035]  いくつかの実施形態では、デバイスは、循環ｃＴｎＩの第３の閾値レベルの存在を判定するように構成される。第３の閾値レベルは、約０．２ｎｇ／ｍＬ〜約０．７ｎｇ／ｍＬ（例えば、約０．５ｎｇ／ｍＬ）とすることができる。ｃＴｎＩのレベルが約０．５ｎｇ／ｍＬ以上であると、ＭＩの特異性が高い。血中又は血清ｃＴｎＩレベルが約０．５ｎｇ／ｍＬ以上である対象は、心筋損傷をおそらく経験している。３閾値レベルのこのシステムは、急性及び／若しくは慢性心臓病の履歴を有し、並びに／又はｃＴｎＩが循環中に存在し得る他の病気、例えば、腎疾患、又は前の心臓外傷若しくは介入、又は心臓炎（心膜炎若しくは心内膜炎）などを経験している患者を含めて、急性胸痛又はＭＩの他の症状の開始後に家で検査を実施している個人にとって特に意味があり得る。他の症状又は適応症がない場合、検査結果は、即時の医療的ケアを求める必要性に関する情報をもたらすことができる。
【００２８】
[036]  いくつかの実施形態では、少なくとも２つの分析物は、単一の検査デバイスによって検出される。２つの分析物は、ＭＩの特異的マーカーとすることができる。例えば、一実施形態では、検査デバイスは、トロポニンＩに特異的な少なくとも１つの捕捉区域、及びトロポニンＴに特異的な少なくとも１つの第２の捕捉区域を備える。各トロポニンの検出可能な閾値は、一方は、ＭＩの「判定を下す」（循環トロポニンの存在を示す低閾値）ように選択され、他方は、ＭＩを「除外する」（ＭＩ又は急性心イベントを示す高閾値）ように選択されているようなものである。トロポニンＩ及びトロポニンＴはともにＭＩに特異的であるが、異なる遺伝子によって遺伝的にコードされるので、一方の分子が側方流動デバイス上のその特異的な捕捉区域によって枯渇しても、他方の分子のレベルがそのデバイス上の他方の分子の特異的捕捉区域によって検出されるのに影響されないはずである。
【００２９】
[037]  デバイスは、心筋傷害又は状態の第２のマーカー、例えば、ミオグロビン又はＣＫ−ＭＢなどの少なくとも１つの、又は複数の閾値レベルを判定するように構成することができる。このようなマーカーは、米国特許第５，２９０，６７８号に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００３０】
[038]  これらの実施形態及び他の実施形態では、デバイスは、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，４６１，８２８号にも記載されているように、心臓状態の追加のマーカー、例えば、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、ＢＮＰ、ｐｒｏＢＮＰ、ＡＮＰ、又はｐｒｏ−ＡＮＰなどの半定量的判定をもたらすことができる。
【００３１】
[039]  他の実施形態では、デバイスは、脳卒中又は他の脳外傷の判定として、脳傷害又は外傷の１種又は複数のマーカーの複数の閾値レベルを判定する。例えば、いくつかの実施形態では、マーカーは、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）、Ｓ１００タンパク質（S100）のβアイソフォーム、神経細胞特異的エノラーゼ（NSE）、トロンボモジュリン、二量体又は四量体形態でのグルコーストランスポーターＩ、ニューロテリン（neurothelin）、γグルタミルトランスペプチダーゼ、及びＰ−糖タンパク質の１種又は複数を含む。これらのマーカー及び他のマーカーは、米国特許第６，７８０，６０６号に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。したがって、本発明は、心臓マーカーについて本明細書に記載及び例示されているように、経時的に循環レベルを追跡するためのデバイス及び方法を提供する。
【００３２】
[040]  さらに他の実施形態では、デバイスは、薬剤、又は潜在的な抗原、又は他の刺激に曝露された際に監視することができる炎症応答マーカー又は免疫応答マーカーの存在を判定する。このようなマーカーは、治療的介入の効力若しくはそれに対する反応を監視するための治療剤に対する抗体とすることができ、又はマーカーは、療法に応答したものを含めて、経時的に疾患活動を監視するための自己免疫疾患を示す自己抗体とすることができる。
【００３３】
[041]  一般に、分析物は、毒素、有機化合物、タンパク質（免疫グロブリンを含む）、ペプチド（例えば、ペプチドホルモン）、微生物若しくはその成分、ビタミン、代謝産物、薬剤（治療目的で投与されるもの、及び違法な目的で摂取されるものを含む）、汚染物質、農薬、又は前述のもののいずれかに対する抗体であり得る。
【００３４】
[042]  一般に、試料は、生体試料又は環境試料を含む、分析物の存在及び／又は濃度について検査されるべき任意の材料であり得る。様々な実施形態では、試料は、体液試料、例えば、全血、血清、血漿、尿、汗、唾液、脳脊髄液、鼻汁などである。デバイスが心筋傷害の１種又は複数のマーカーを検出するように構成されている場合、試料は、いくつかの実施形態では、血液、血清、又は血漿であり得る。
【００３５】
側方流動検査
[043]  本発明のデバイス及び方法は、側方流動検査を使用する。側方流動検査は、周知であり、例えば、米国特許第６，４６１，８２８号、同第６，１７７，２８１号、同第７，３９０，６７４号、及び米国特許第７，４９１，５５１号に記載されており、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。側方流動検査は一般に、試料が加えられる区域（例えば、検査用流体試料を加えるための）、及び試料が加えられる区域と流体連通した１つ又は複数の流体流路を含む。流体流路は、第１バイオマーカー捕捉区域及び第２バイオマーカー捕捉区域を含み、これらは、単一の流路上に直列にあってもよく、又は別々の流路内にあってもよい。用語「流体連通」は、試料が流路の第１のコンポーネントから第２のコンポーネントに流れることができ、逆の場合も同様であることを意味する。第１のコンポーネントは、介入コンポーネントが存在しても、第２のコンポーネントと流体連通している。例えば、試料が加えられる区域、試薬区域（例えば、アッセイ免疫試薬を収容する）、及び１つ又は複数の捕捉区域を含む側方流動膜は、検査デバイス上に連続的に位置していることができ、流体連通していることになる。デバイスは、適切な多孔度のフィルターを含む、血液細胞又は大きい残骸を分離するための１つ又は複数のコンポーネントをさらに備えることができる。
【００３６】
[044]  側方流動検査は、対象とするマーカー又は分析物の存在下で検出可能な複合体を形成するための側方流動膜及び結合試薬を含む。複合体（例えば、免疫複合体）は、分析物に特異的で、付加された、又は結合した標識を有する第１試薬、及び、やはり対象とする分析物に特異的で、固定化され、又は捕捉可能である第２試薬を含む。結合試薬は免疫試薬とすることができ、これは一般に、抗体又はその部分である。様々な実施形態では、免疫試薬は、対象とする分析物に結合する、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性若しくは二重特異性抗体、キメラ抗体、又は抗体部分若しくは断片である。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、並びにこれらのサブタイプを含む任意のアイソタイプのものとすることができる。
【００３７】
[045]  免疫試薬はさらに、抗原結合性抗体部分又は断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片など、単鎖抗体分子、１つ又は複数の抗原結合ドメインを含む免疫グロブリン分子の任意の断片から形成される多重特異性抗体であってもよい。
【００３８】
[046]  結合試薬が免疫試薬である実施形態では、少なくとも１種の免疫試薬（例えば、「第１の免疫試薬」又は「第１の結合部分」）は、視覚的手段又は機器手段によって検出可能な、付加された、又は結合した標識を含有する。例えば、異なる流路内で捕捉区域を視覚的に区別し、又は制御区域を区別するために、１つ又は複数の標識を本発明のデバイス及び方法において使用することができる。他の実施形態では、２つの別個の標識が、異なる分析物を視覚的に見分けるのに使用される。本発明で使用するのに適した様々な標識には、化学的又は物理的手段によって信号を生成する標識が含まれる。このような標識としては、酵素標識（例えば、基質の存在下で検出可能な信号を生成するもの）、色素原、染料、触媒、蛍光又は蛍光様化合物及び／又は粒子、磁性化合物及び／又は粒子、化学発光化合物及び／又は粒子、並びに放射性標識がある。標識は、標的分析物に特異的な第１の免疫試薬に直接又は間接的に、共有結合的又は非共有結合的に結合することができる。ある特定の実施形態では、標識は、検査を行った後、少なくとも２、少なくとも４、少なくとも６、又は少なくとも８時間検出可能なままであり、その結果数時間後の繰り返し検査を、最初の結果と直接比較することができる。
【００３９】
[047]  少なくとも１種の免疫試薬（例えば、「第２の免疫試薬」又は「第２の結合部分」）は、捕捉区域で固定化されており、又は特異的結合対相互作用によって前記捕捉区域で捕捉可能である。例示的な結合対部分としては、相補的若しくは実質的に相補的なオリゴヌクレオチド、リガンド−受容体、抗体−抗原、又はストレプトアビジン−ビオチンがある。この第２の結合部分は、分析物の複数の閾値レベルを検出するための基準を提供することができる。例えば、以下でより詳細に論じるように、捕捉区域は、異なるレベルで第２の免疫試薬を固定化又は捕捉するように、異なる量又は濃度の同じ結合対部分を使用することができる。あるいは、捕捉区域は、対象とする分析物に対して異なる親和性を有する第２の免疫試薬同士間を区別するように、異なる免疫試薬捕捉スキームを使用することができる。特に、低親和性抗体及び高親和性抗体は、コンジュゲートされた捕捉試薬の素性によって認識され得る。
【００４０】
[048]  各流路は、試料の流れが順調であることの指標として、１つ又は複数の捕捉／検出区域の下流に１つ又は複数の制御区域をさらに含むことができる。制御区域は、一実施形態では、流路の末端に非結合標識された結合試薬を捕捉し、又はその存在を検出するための手段を有することができる。例えば、第１結合試薬（例えば、標識免疫試薬）がマウスモノクローナル抗体である場合、制御区域は、固定化抗マウスＩｇＧを含むことができる。他の試料流量制御も当技術分野で公知であり、本発明によって使用され得る。
【００４１】
[049]  検査デバイスは、試料の流れの推進に役立つように、側方流動膜の下流に、かつそれと流体連通して吸収パッドをさらに備えることができる。側方流動アッセイ用のこのようなコンポーネントも周知である。
【００４２】
[050]  さらになお、デバイスに加える前に試料と結合剤を予め混合するために、追加のコンポーネントを使用することができる。この目的のための例示的なコンポーネントは、ＷＯ２００７／０９８１８４、ＷＯ２００９／０１４７８７、及びＷＯ２０１０／１３２４５３に記載されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００４３】
膜基板
[051]  側方流動基板は一般に、例えば、キャピラリー作用によって流体試料の輸送を可能にする多孔質、吸収性、及び／又は吸水性の基板又は膜である。様々な材料を側方流動基板として使用することができ、このような材料として、有機又は無機ポリマー、並びに天然及び合成ポリマーが挙げられ、限定されないが、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、酢酸セルロース、他のセルロース誘導体、デキストラン、デキストラン誘導体及びデキストランコポリマー、他の多糖、ガラス、シリカゲル、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、レーヨン、ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリアミド、ビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリスチレン及びポリスチレンコポリマー、ジビニルベンゼンなどで架橋されたポリスチレン、アクリル樹脂、アクリレート及びアクリル酸、アクリルアミド、ポリアクリルアミド、ポリアクリルアミドブレンド、ビニル及びアクリルアミドのコポリマー、メタクリレート、メタクリレート誘導体及びこれらのコポリマーが含まれる。
【００４４】
[052]  一実施形態では、側方流動基板は、ニトロセルロース、例えば、セルロースの任意の硝酸エステルを含む。ある特定の実施形態では、側方流動基板は、セルロースのカルボン酸エステルと組み合わせたニトロセルロースを含む。
【００４５】
[053]  基板（例えば、ニトロセルロース基板）の孔サイズは変動し得る。例えば、孔サイズは、約１μｍ〜約２０μｍ、約８μｍ〜約１５μｍ、又は約１０μｍ〜約１２μｍであり得る。
【００４６】
[054]  流路の様々なコンポーネントは、流体の流れを制御し、試薬が基板材料に拡散的に結合する能力を制御し、及び／又は残骸の濾過を制御するために、様々な基板材料及び／又は様々な孔サイズを使用することができる。
【００４７】
[055]  流路のコンポーネントを、いくつかの実施形態では、遮断剤、例えば、ウシ血清アルブミン、全動物血清、カゼイン、又は脱脂粉乳などで処理することができる。
【００４８】
[056]  少なくとも１つの流体流路を画定する側方流動基板は、一般に水を通さない層、例えば、Ｍｙｌａｒ（登録商標）で裏打ちし、又はその上に積層することができる。しかし、いくつかの実施形態では、側方流動基板は、自立している場合がある。使用される場合、裏打ちは一般に、接着剤によってマトリックスに固定される。水を通さない裏打ちは一般に、薄い厚さの基板に使用される。
【００４９】
流体流路
[057]  一般に、流体流路は、少なくとも１つの試料が加えられる区域、及び少なくとも１つの側方流動基板によって画定される。複数の側方流動基板が使用される場合、複数の側方流動基板は、同じ又は異なる試料が加えられる区域と流体連通している場合がある。試薬区域又はパッドは、任意選択である。
【００５０】
[058]  一実施形態では、検査デバイスは、単一の試料が加えられる区域と流体連通した１つの側方流動膜を含む（図１）。しかし、本発明は、このようなアーキテクチャに限定されない。例えば、別の実施形態では、検査デバイスは、図２に示した１つの側方流動膜を含む。この実施形態では、側方流動膜は、不透過性バリアが膜を分割して２つの並列の小区分にするので、２つの流体流路を可能にする。
【００５１】
[059]  別の実施形態では、検査デバイスは、それぞれが別々の流体流路を画定する、図３に示したような２つの側方流動膜を含む。この実施形態では、２つの独立したフローストリップが同じ検査デバイス上で並行している。各側方流動膜は、試薬パッド（例えば、免疫試薬を収容している）と流体連通しており、試薬パッドは、単一の試料が加えられる区域の下流にあり、それと流体連通している。一実施形態では、検査デバイスアーキテクチャは、試薬区域がまったく存在しないことを除いて、図３のものと同様であり、各側方流動膜は、試料が加えられる区域と直接流体連通している。
【００５２】
[060]  それぞれが別々の独立した側方流動基板と流体連通した、少なくとも２つの別々の試料が加えられる区域も使用することができ、この場合、各側方流動基板は、別々の流体流路を画定する。別々の流体流路は、別々の試薬区域又はパッドをさらに含むことができる。検査デバイスは、それぞれが別々の側方流動基板上の別々の流体流路に対応し、又は同じ側方流動基板上の別々の流体流路（例えば、１つ若しくは複数の不透過性バリアによって複数の小区分に分割された側方流動膜）に対応する、追加の試料が加えられる区域（例えば、３つ、４つ、又は５つの試料が加えられる区域）を有することができる。使用中に、測定体積の流体試料が各試料が加えられる区域にアプライされる。
【００５３】
[061]  図４に示したように、試料が加えられる区域を適所配置することによって、並列の独立した側方流動基板も、単一の検査デバイス内に使用することができる。この実施形態では、検査デバイスは、双方向性の流体の流れを使用する。同様に、複数の側方流動膜を、単一の試料が加えられる区域の周りに径方向に配列することができる（図５）。この実施形態では、各側方流動膜は、１つの流体流路を画定し、１つ若しくは複数の不透過性バリアを使用することによって複数の流体流路を画定する。
【００５４】
[062]  別の実施形態では、検査デバイスは、複数の側方流動基板に対して１つの試料が加えられる区域を含む。この実施形態では、試料は、検査デバイスに１回アプライされ、試料が加えられる区域は、側方流動基板又は流体流路のそれぞれと流体連通している（図３、図４、図５）。
【００５５】
[063]  ある特定の実施形態では、デバイスは、２回又は３回の検査を可能にする設計を有し、その結果、検査は、増大中の分析物濃度を監視するために、２〜１０時間の過程にわたって行われる場合がある。
【００５６】
捕捉区域
[064]  本明細書に記載のデバイス及び方法は、分析物の２つの閾値レベルを判別するために少なくとも２つの捕捉区域を使用する。この少なくとも２つの捕捉区域は、単一の流路上に連続的に配列することができ、又は別々の流路内にあってもよく、それぞれは、異なる検出可能な閾値濃度の分析物を捕捉するように設計されている。
【００５７】
[065]  複数捕捉区域の一実施形態を図６に提示する。図６は、支持マトリックスを有する側方流動膜上の流体流路の側面図を示す。側方流動膜は、２つの連続的に配向した捕捉区域を含み、この場合、１つの捕捉区域は、高親和性捕捉リガンド（例えば、抗体）を使用し、一方、第２捕捉区域は、異なる低親和性捕捉リガンド（例えば、抗体）を使用する。親和性の差異により、同じ検査デバイス上で異なる量の同じ分析物が捕捉され、それによって異なる閾値レベルで分析物を検出することが可能になる。図６に示したように、異なる親和性を有する抗体（これは、第２の免疫試薬に対応する）を、それぞれの捕捉区域で固定化することができる。図６に提示した実施形態は、１つ又は複数の側方流動膜上に存在する複数の流体流路を有する検査デバイスでも実施することができる。例えば、一実施形態では、１つの「高親和性」捕捉区域が１つの流体流路内に存在し、「低親和性」捕捉区域が第２の流体流路内に存在する。この設計により、下流の第２捕捉区域での結果をゆがめ得る、第１捕捉区域での分析物の枯渇の潜在性が回避される。流体流路は、不透過性バリアによって単一の基板上に任意選択により形成されており、及び／又は別々の側方流動基板上に存在し得る。
【００５８】
[066]  高親和性抗体を有する捕捉区域は、より多い量の分析物を捕捉及び保持し、したがって、低親和性捕捉抗体を有する捕捉区域より、低い分析物濃度で可視的な信号を示す。この設計では、捕捉区域の数は、２つ超の抗体親和性を使用することによって、２つ超に容易に拡張することができる。抗体は、直接に、あるいは結合剤、例えば、ＢＳＡ、若しくはＩｇＧ、若しくはアミノデキストラン、又は抗体がコンジュゲートされた他のタンパク質分子などによって固着させることができる。このような結合剤は、結合剤上の抗体の密度が増大するため、又は結合剤がマトリックス材料に対してより強い相互作用を有することができるため、又は連結により「つなぎ鎖」が形成され、立体障害の低減によって抗体のより大きい結合活性又は結合能力が可能になるため、信号の増幅に役立ち得る。
【００５９】
[067]  他の実施形態では、第２の免疫試薬の少なくとも１種は、その捕捉区域で固定化されないが、第２の免疫試薬を特定の捕捉区域に向ける結合部分にコンジュゲートされる。このような結合相互作用は、試料が流れる間に高親和性の免疫試薬と低親和性の免疫試薬を「分類する」ように作用し、このような結合部分には、ビオチン／ストレプトアビジン又は相補オリゴヌクレオチド（若しくはこれらの誘導体）が含まれる。
【００６０】
[068]  例えば、図７に例示したように、低閾値捕捉区域内で固定化される捕捉試薬は、ストレプトアビジンであり、これは、ビオチン結合免疫試薬（例えば、第２の結合部分）を捕捉する。低親和性抗体は、高閾値捕捉区域で直接固定化され得る。図７に例示したストレプトアビジン／ビオチン相互作用は、本明細書に記載の別の結合対、例えば、ｐＲＮＡなどの誘導体を含む相補オリゴヌクレオチド、及び本明細書に記載の他のものなどと任意選択により置換することができる。これらの捕捉区域は、１つの流体流路上で連続的に、又は別々の流体流路上でさらに配向させることができる。
【００６１】
[069]  捕捉区域は、様々な特異的結合相互作用を使用して、分析物を含有する検出可能な免疫複合体を捕捉又は固定化することができ、これらの相互作用としては、抗原／抗体、ビオチン／アビジン、炭水化物／レクチン、相補オリゴヌクレオチド（ピラノシルＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又は他のオリゴヌクレオチド誘導体を含む）、ホルモン／ホルモン受容体を含む受容体／リガンド分子、酵素／補助因子、又は特定のタンパク質相互作用、及び金属／キレーターがある。
【００６２】
[070]  ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１又は複数の捕捉区域で側方流動基板の表面に直接又は間接的に（例えば、化学リンカーによって）結合しており、相補オリゴヌクレオチドは、免疫複合体を捕捉するための免疫試薬にコンジュゲートされている（図８を参照のこと）。このとき異なる捕捉配列は、様々な分析物親和性を有する異なる抗体試薬を判別するための基準を提供する。
【００６３】
[071]  いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ロックされた核酸を含むオリゴヌクレオチド、ピラノシル−ＲＮＡ（pRNA）、ピラノシル−ＤＮＡ（pDNA）、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド、及び５’−５’反転オリゴヌクレオチド（inverted oligonucleotide）から選択される。オリゴヌクレオチドコンジュゲートを捕捉するためのオリゴヌクレオチド剤の使用は、米国特許出願公開第２００５／０２０８５７６号に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれている。
【００６４】
[072]  相補オリゴヌクレオチドは、同じ又は同様のハイブリダイゼーション効率を有し、高親和性抗体及び低親和性抗体にコンジュゲート又は連結されて、それによって分析物の異なる閾値レベルを判別するための基準を提供することができる。図８を参照のこと。より高い親和性の抗体は、分析物とより多くの複合体を形成するので、より高い親和性の抗体が結合した区域は、より多い量の分析物を捕捉及び保持することになり、したがって、より低い親和性の抗体が捕捉されている区域より、低い試料分析物濃度で可視的な信号を示す。
【００６５】
[073]  あるいは、同じ特異的結合対部分の濃度を各捕捉区域内で変更して（例えば固定化して）、異なるレベルの標的分析物の捕捉を可能にすることができる。したがって、相対的により高い濃度の固定化試薬を有する区域は、より多い分析物を捕捉し、より低い分析物濃度で陽性信号を生成する。例えば、０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、又は０．１〜５ｍｇ／ｍＬの濃度で捕捉区域にストレプトアビジンをアプライし、それによって、分析物の存在下で形成されるビオチンがコンジュゲート及び標識された免疫複合体の異なる検出可能な閾値を有する異なる捕捉区域を形成することができる。
【００６６】
[074]  一実施形態では、検査デバイスは、連続捕捉区域を含む単一の流体流路を有する単一の側方流動膜を含む（例えば、図７及び図８を参照のこと）。この実施形態では、第１捕捉区域中の高親和性捕捉結合の場合、特に、分析物が検査試料中に低濃度で存在するとき、試料中の分析物のかなりの部分が第１捕捉区域上で捕捉されることが可能である。例えば、側方流動イムノアッセイでの一般的な捕捉区域は、１ｍｍ×５ｍｍの捕捉区域は、捕捉ＩｇＧ約１μｇ、又は約６ピコモルを保持することができる（Brown（2009）． Antibodies: Key to a Robust Lateral Flow Immunoassay. In Lateral Flow Immunoassay、Wong及びTse編、Humana Press、New York、60頁）。したがって、０．０４ｎｇ／ｍＬの濃度のｃＴｎＩ（１．５×１０−１６モルの分析物）を含む試料１００μＬは、捕捉分子が１０４倍超過剰に存在するので、１つの捕捉区域によって完全に枯渇され得る。
【００６７】
[075]  同様に、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰについて、単一の検査デバイス上の複数のカットオフは、臨床的判断ポイントが約１２５ｐｇ／ｍＬ及び約４５０ｐｇ／ｍＬであるので（これらはそれぞれ、年齢７５歳未満及び７５歳以上の個人について推奨されているＣＨＦ判定閾値である）、有用であるはずである。これらの濃度は、試料１００μＬ中でそれぞれ、１．５×１０−１５及び５．４×１０−１５モルの分析物に対応する。試料中の分析物は、１０−１２モルの程度の分析物分子を保持する捕捉区域によって影響されるはずでる。したがって、この分析物について、側方流動デバイス上の分析物の枯渇の主要因とならない連続捕捉区域は、実用的でないはずである。
【００６８】
[076]  ある特定の実施形態では、デバイスアーキテクチャは、分析物枯渇現象を活用する。側方流動検査デバイスは、一実施形態では、検査膜上に、順次的なライン又は領域として複数の捕捉区域を層形成し、又は堆積した捕捉部分で形成される連続的な範囲として捕捉区域を層形成することによって形成される。分析物及び試薬が、反応し、デバイスに沿って移動し、捕捉分子に結合される際に、分析物が移動中の溶液から取り出される。このとき、検出可能な捕捉領域の数、又は捕捉領域の長さは、試料中に本来存在する分析物分子の量に直接関係し、それによってこれらの実施形態は、デバイスの定量的な範囲を拡張することができる。本実施形態によるデバイスは、分析物レベルを検出する計器のように作用し、アッセイの範囲を拡張するのに特に有用である。
【００６９】
[077]  連続的な捕捉範囲の場合では、可視的な標識を有する捕捉区域の部分は、試料中に本来存在する分析物の量に直接関係することになる。このようにして、分析物の量を、半定量的な温度計のような様式で測定することができる（図１を参照のこと）。
【００７０】
標識
[078]  少なくとも１種の免疫試薬又は結合部分は、検出可能部分（例えば、標識）を有する。例示的な標識としては、粒子状標識、例えば、金などのコロイド金属粒子、セレン若しくはテルルなどのコロイド非金属粒子、染色されたプラスチック、染色された含浸ラテックス粒子などの染色若しくは着色された粒子、有機ポリマーラテックス粒子、及びリポソームなど、ナノスフェア、着色されたビーズ、ポリマーマイクロカプセル、又は直接可視的な物質を含有する他のベシクルなどがある。
【００７１】
[079]  標識を（例えば、肉眼で）直接検出しないアッセイについては、蛍光標識、例えば、フルオレセイン、ユウロピウム、シアニン、又はアレクサ色素など、化学発光標識、蛍光エネルギー移動標識、蛍光量子ドット、常磁性標識、電流測定（直流印加電圧若しくは振動印加電圧）又はカーボンナノチューブ検出法を使用する電気化学的標識を使用することができる。
【００７２】
[080]  例えば、検出可能な分子には、限定されないが、フルオロフォア、並びに、例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｒ．  Ｌａｋｏｗｉｃｚ（編者）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂ  Ｃｏｒｐ、第２版（1999年7月）、及びＲｉｃｈａｒｄ  Ｐ．ＨｏａｇｌａｎｄによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋの第６版に記載されている当技術分野で公知の他のものが含まれる。
【００７３】
[081]  直接可視的な標識には、染料含浸ラテックス、又は抗体にコンジュゲートするのに金粒子より官能性の基を有し、若しくは金より見やすい他の粒子を組み込むことが含まれる。ある特定の実施形態では、銀被覆金粒子が使用され、これは、信号を１桁又は２桁の大きさで増強することができる。比色標識として量子ドット又はナノスフェアを使用しても、信号を増強するであろう。より大きい金粒子（例えば、標準的な直径４０ｎｍより大きい粒子）を使用しても、感度を増強することができる。
【００７４】
[082]  標識担持特異的結合対部分は、捕捉／検出区域の上流の側方流動膜に拡散的に結合され得る。これらの実施形態では、試料が側方流動膜上の流体流路に沿って移動する際、試料は、標識された１又は複数の特異的結合対部分に遭遇し、試料中に存在する場合、分析物は、標識担持特異的結合対部分に結合する。分析物−特異的結合対部分−標識複合体は、捕捉区域へとさらに移動し、捕捉結合対部分に結合する。次いで過剰の標識を洗い流すことができる。
【００７５】
[083]  本発明は、上述したように、１つの分析物の複数のレベル、複数の分析物、又は複数の分析物の複数のレベルを検出するためのデバイスを提供する。検査分析物の存在を検出するために、分析物は、可視化することができるように標識されていなければならない。可視化は、外部リーダー機器を使用して、又は使用しないで行うことができる。
【００７６】
[084]  ある特定の実施形態では、デバイスは、外部リーダーを使用して客観的な結果を提供する。リーダーは、様々な実施形態では、表示された、印刷可能な、又はダウンロード可能な結果を提供することができる。外部リーダーを使用すると、蛍光標識などのより大きい感度の標識を使用することができるように有利となり得る。
【００７７】
[085]  リーダーは、緊急行動を要求する特定の結果の際に、健康管理若しくは救急健康管理の専門家に自動的に通知するための通信能力（例えば、インターネット、ケーブル、無線、若しくはＧＳＭなどを介した）の選択肢をさらに提供し、又は検査の記録を保管するために、施設の健康記録に接続することができる。リーダーは、詳細な患者履歴のために、オペレーターのＩＤ及び患者のＩＤ、並びに検査結果の日時を（例えば、英数字入力又は自動バーコード読み取りによって）取得するための様々なメモリーの選択肢をさらに提供する。
【実施例】
【００７８】
[086]  本発明を、以下の例示的な実施例を参照することによってさらに例示する。
【００７９】
実施例１  −  心筋トロポニンＩの存在を検出するための２レベル検査デバイスの評価
[087]  ４つの連続捕捉区域を有する側方流動検査デバイスにおいて、ｃＴｎＩ１０ｎｇ／ｍＬを含む試料をアプライした。分析物の半分超を、第１ラインによって枯渇させた（以下の図９及び表１を参照のこと）。
【００８０】
【表１】
2014528067.tif 000002
実施例２  −  心筋トロポニンＩの存在を検出するための２レベル検査デバイスの評価
【００８１】
[088]  以下の試験の目的は、例示的なデバイスが定性的／半定量的様式で心筋トロポニンＩ（cTnI）の２つの濃度を区別する能力を実証することであった。
【００８２】
試薬
[089]着色された微小球に付加されたマウスモノクローナル抗−ｃＴｎＩ抗体、約０．０２％。
【００８３】
[090]  ビオチンにコンジュゲートしたウサギポリクローナル抗ｃＴｎＩ抗体、約１０μｇ／ｍＬ。
【００８４】
[091]  固定化ストレプトアビジン−担体複合体（ＳＡ）を有する側方流動膜。低感度ストリップを、膜にＳＡ約０．５ｍｇ／ｍＬを加えることによって調製し、高感度ストリップを、ＳＡ約２ｍｇ／ｍＬを用いて調製した。
【００８５】
検査した試料
[092]  アッセイによって検査した試料は、（１）プールした正常なＬｉ−ヘパリンヒト血漿（NHP）、及び（２）固定濃度（市販のｃＴｎＩイムノアッセイによって確認された濃度）で、ＮＨＰ中で希釈した組換えｃＴｎＩを有するＮＨＰであった。
【００８６】
検査デバイス及びアッセイ
[093]  検査デバイスは、１つの高感度側方流動膜（「ストリップ」）及び１つの低感度側方流動膜を備える。図３に示したデバイスと同様に、膜を互いに並行に配置する。１つが低感度であり、１つが高感度である２つの側方流動膜を、互いに並列に単一のデバイス内で対にする。デバイスの試料アプリケーションセクションは、試料が両方の膜に向かって自由に流れることを可能にする。側方流動膜同士間に空間があるので、検査デバイスは不透過性バリアを含まない。
【００８７】
[094]  それぞれ三つ組で３つのセットの試料を検査した−（１）ブランクのＮＨＰ（すなわち、組換えcTnIなし）、（２）約５０ｐｇ／ｍＬの組換えｃＴｎＩを有するＮＨＰ、及び（３）約５００ｐｇ／ｍＬの組換えｃＴｎＩを有するＮＨＰ。
【００８８】
[095]  試料を、検査デバイス１つ当たり約２４０μＬでアプライし、周囲条件で約１５分間インキュベートした。次いで各検査デバイスを、視覚的に読み取り、約５５０ｎｍ（例えば、５２０〜５５０ｎｍ）で、ポータブル反射率計で読み取った。
【００８９】
結果
[096]  収集したデータの例を表２及び図１０に示す。これらの結果は、２レベル検査デバイス設計により、高感度ストリップのみで、低濃度、例えば、ｃＴｎＩ／ｍＬの分析物約５０ｐｇを検出し、両ストリップで、高濃度、例えば、分析物約５００ｐｇ／ｍＬを検出することが可能になることを実証する。
【００９０】
[097]  低感度ストリップでの信号の平均値の３標準偏差（SD）範囲内の信号分布の分析により、低濃度で分析物が検出されなかったことが示された。
【００９１】
【表２】
2014528067.tif 000003
【００９２】
[098]  本願全体にわたって引用されている特許、特許出願、刊行物、製品説明書、及びプロトコールは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【図１】
2014528067.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2014528067.tif 000008
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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