(57)【要約】液体培地を用いる懸濁培養法において増殖するよう構成したセイヨウスノキ細胞培養物。細胞集団は、セイヨウスノキの１種以上の部位、例えば、植物の可食部（例えば、葉部又は果実部）又は茎部などに由来するものである。細胞集団は、比較的短期間（例えば、約７日）に増殖して高密度になるよう構成されている。更に、細胞集団は、高濃度のポリフェノール及び／又はプロシアニジンを産生し、かつ本質的にアントシアニンは産生しないよう構成されている。セイヨウスノキ細胞集団を懸濁培養法で増殖させて、ポリフェノール及び／又はプロシアニジンを産生する方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養物であって、
細胞懸濁培養液に入っている柔らかいセイヨウスノキ細胞集団を含み、前記細胞集団が：
実生の胚軸、子葉、葉部、茎部、若しくは根部；又は、
ベリー部、節部若しくは節間部を含む茎部、若しくは成葉部；のうちの１つ以上に由来し、
前記セイヨウスノキ細胞集団は、増殖７日目の液中細胞容積を少なくとも５５％にし得るよう選択され、かつ
前記セイヨウスノキ細胞集団の乾燥重量のうち、少なくとも５％がプロシアニジンから構成される、細胞培養物。
【請求項２】
前記ベリーが果皮を含む、請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項３】
前記セイヨウスノキ細胞集団の乾燥重量のうち、少なくとも１０％、１５％、又は２０％がポリフェノールから構成される、請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項４】
前記セイヨウスノキ細胞集団の乾燥重量のうち、少なくとも７．５％がプロシアニジンから構成される、請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項５】
前記セイヨウスノキ細胞集団の乾燥重量のうち、少なくとも１０％がプロシアニジンから構成される、請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項６】
前記セイヨウスノキ細胞集団の乾燥重量のうち、少なくとも１５％がプロシアニジンから構成される、請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項７】
前記セイヨウスノキ細胞集団の乾燥重量のうち、０．５％未満がアントシアニンから構成される、請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項８】
前記セイヨウスノキ細胞集団の乾燥重量のうち、０．１％未満がアントシアニンから構成される、請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項９】
前記セイヨウスノキ細胞集団の乾燥重量のうち、０．０１％未満がアントシアニンから構成される、請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項１０】
前記セイヨウスノキ細胞集団の乾燥重量のうち、０．００１％未満がアントシアニンから構成される、請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項１１】
前記細胞懸濁培養液に含まれる細胞集団が、セイヨウスノキの細胞カルスに由来するものである、請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項１２】
前記細胞懸濁培養が、細胞の粒状懸濁液を含む、請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項１３】
前記細胞懸濁培養が、微細な細胞の懸濁液を含む、請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項１４】
前記細胞懸濁培養における柔らかいセイヨウスノキ細胞集団が、植物の可食部に由来する、請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項１５】
前記植物の可食部が、葉部又はベリー部のうちの１つ以上である、請求項１４に記載の細胞培養物。
【請求項１６】
細胞培養物であって、
細胞懸濁培養液に入っている柔らかいセイヨウスノキ細胞集団を含み、前記細胞集団が、植物の可食部に由来し、
前記セイヨウスノキ細胞集団は、増殖７日目の液中細胞容積を少なくとも５５％にし得るよう選択され、かつ
前記セイヨウスノキ細胞集団の乾燥重量のうち、少なくとも１０％、１５％、又は２０％がポリフェノールから構成され、かつ前記セイヨウスノキ細胞集団のうち、少なくとも５％がプロシアニジンから構成される、細胞培養物。
【請求項１７】
前記植物の可食部が、葉部又はベリー部のうちの１つ以上である、請求項１６に記載の細胞培養物。
【請求項１８】
前記ベリーが果皮を含む、請求項１６に記載の細胞培養物。
【請求項１９】
細胞培養物であって、
細胞懸濁培養液に入っている柔らかいセイヨウスノキ細胞集団を含み、前記細胞集団が、少なくともベリー部に由来し、
前記セイヨウスノキ細胞集団は、増殖７日目の液中細胞容積を少なくとも５５％にし得るよう選択され、かつ
前記セイヨウスノキ細胞集団の乾燥重量のうち、少なくとも１０％、１５％、又は２０％がポリフェノールから構成され、かつ前記セイヨウスノキ細胞集団の乾燥重量のうち、少なくとも５％がプロシアニジンから構成される、細胞培養物。
【請求項２０】
前記ベリーが果皮を含む、請求項１９に記載の細胞培養物。
【請求項２１】
セイヨウスノキ細胞集団の細胞培養物を調製する方法であって、前記方法が：
実生の胚軸、子葉、葉部、茎部、若しくは根部；又は、
ベリー部、節部若しくは節間部を含む茎部、若しくは成葉部；のうちの１つ以上に由来する、セイヨウスノキ細胞集団のカルス細胞を調製する工程と、
カルスに由来する１個以上の細胞を液体培地に導入する工程と、
前記液体培地中で前記１個以上の細胞を撹拌する工程と、
前記液体培地を新鮮な液体培地に置き換え、あるいは前記細胞集団を新鮮な液体培地に移して、セイヨウスノキ細胞懸濁培養を樹立する工程と、
液中細胞容積が少なくとも５５％になるまで前記セイヨウスノキの細胞懸濁培養物を増殖させる工程と、
前記セイヨウスノキ細胞集団の乾燥重量のうち、少なくとも１０％、１５％、又は２０％がポリフェノールから構成され、かつ前記細胞集団の乾燥重量のうち、少なくとも５％がプロシアニジンから構成される、細胞懸濁培養物を選別する工程と、を含む、調製法。
【請求項２２】
前記セイヨウスノキ細胞集団が、植物の可食部に由来する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記植物の可食部が、葉部又はベリー部のうちの１つ以上である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ベリーが果皮を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記セイヨウスノキの細胞懸濁培養物を、７日以内で液中細胞容積が少なくとも５５％になるまで増殖させる工程を更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記セイヨウスノキの細胞懸濁培養物を、７日以内で液中細胞容積が少なくとも６０％になるまで増殖させる工程を更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記セイヨウスノキ細胞集団の乾燥重量のうち、約１０％がプロシアニジンから構成される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記セイヨウスノキ細胞集団が、約０．１％未満のアントシアニンを含有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記セイヨウスノキ細胞集団が、アントシアニンを実質的に含有しない、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記増殖させる工程を、暗条件下で実施する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記増殖させる工程を、室温条件下で実施する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記増殖させる工程を、２３℃＋／−５℃で実施する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
粒状の細胞集団の懸濁液を生成する工程を更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
微細な細胞集団の懸濁液を生成する工程を更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
前記液体培地が、ＶＭ１７９９、ＶＭ１８３１、ＶＭ１９３３、及びＤＣ１１５１からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
前記撹拌する工程が旋回振盪器によるものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
前記新鮮な液体培地を、１週間毎に添加するか、又は前記細胞集団を、１週間毎に前記新鮮な液体培地に移す、請求項２１に記載の方法。
【請求項３８】
前記懸濁培養時に、前記細胞集団の糖消費速度を測定する工程を更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３９】
前記糖消費速度が、屈折率（ＲＩ）をもとに測定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＲＩが、前記新鮮な培地の初期ＲＩの半分以下である場合に、懸濁培養液に含まれる前記細胞集団に追加で新鮮な培地を与える、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
継代培養後６日目にＲＩ及び細胞重量を測定し、液体培地を交換する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
細胞懸濁培養時のセイヨウスノキ細胞集団の増殖性を増大させる方法であって、前記方法が、
セイヨウスノキ細胞集団の懸濁培養細胞を調製する工程と、
液体培地を用い、前記細胞集団を懸濁培養法により培養する工程と、
液中細胞容積（ＰＣＶ）が４５％以上の細胞懸濁培養物を選別する工程と、を含む方法。
【請求項４３】
前記液体培地中の糖濃度の増大に応じて、ポリフェノール及び／又はプロシアニジンの蓄積量が増大する細胞懸濁培養物を選別する工程を更に含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記液体培地の糖濃度には、スクロースで約３０〜６０ｇ／Ｌが含まれる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
懸濁培養時に、前記細胞集団におけるプロシアニジン蓄積量が、２０ｇ／Ｌスクロース下での１〜２ｇ／Ｌ  ＰＣＶから、３０ｇ／Ｌスクロース下での３〜７ｇ／Ｌ  ＰＣＶへと増大し、懸濁培養時に、前記細胞集団におけるポリフェノール蓄積量が、２０ｇ／Ｌスクロース下での２〜４ｇ／Ｌ  ＰＣＶから、６０ｇ／Ｌスクロース下での５〜１０ｇ／Ｌ  ＰＣＶへと増大する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記培養が約７日間にわたる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞集団の提供が、初期細胞密度１５％  ＰＣＶ〜２５％  ＰＣＶから開始される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞集団の提供が、初期細胞密度２５％  ＰＣＶ以上から開始される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞集団の提供が、初期細胞密度２０％  ＰＣＶ以上から開始される、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
５０％超のＰＣＶの細胞懸濁培養物を選別する工程を更に含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
５５％超のＰＣＶの細胞懸濁培養物を選別する工程を更に含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５２】
６０％超のＰＣＶの細胞懸濁培養物を選別する工程を更に含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５３】
ＰＣＶが４５％に到達するのに８日以上かかった細胞懸濁培養物を廃棄する工程を更に含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５４】
培養時の、セイヨウスノキ細胞集団からのポリフェノール産生量を増大させる方法であって、前記方法が：
実生の胚軸、子葉、葉部、茎部、若しくは根部；又は、
ベリー部、節部若しくは節間部を含む茎部、若しくは成葉部；のうちの１つ以上に由来するセイヨウスノキ細胞集団であり、かつ懸濁培養法で増殖させるのに適した、セイヨウスノキ細胞集団を選別する工程と、
ポリフェノール産生量を増大させるのに十分な量の糖の存在下で、懸濁培養法を用い、前記セイヨウスノキ細胞集団を培養する工程と、を含む、方法。
【請求項５５】
前記セイヨウスノキ細胞集団の乾燥重量のうち、少なくとも１０％、１５％、又は２０％がポリフェノールから構成される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
２０ｇ／Ｌ超の糖を含有する液体培地を用い、細胞懸濁培養法により前記細胞集団を培養する工程を更に含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
２０ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌの糖を含有する液体培地を用い、細胞懸濁培養法により前記細胞集団を培養する工程を更に含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
３０ｇ／Ｌ超の糖を含有する液体培地を用い、細胞懸濁培養法により前記細胞集団を培養する工程を更に含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
前記糖がスクロースである、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
前記糖がグルコースである、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
前記糖が、液中細胞容積（ＰＣＶ）を３ｇ／Ｌ超に増加させるためにポリフェノールを産生させるにあたって十分な量で存在する、請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
前記糖が、液中細胞容積（ＰＣＶ）を少なくとも７ｇ／Ｌに増加させるためにポリフェノールを産生させるにあたって十分な量で存在する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ポリフェノールがプロシアニジンである、請求項５４に記載の方法。
【請求項６４】
暗条件下で前記細胞集団を培養する工程を更に含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６５】
培養物に含まれるセイヨウスノキ細胞集団からポリフェノールを抽出する方法であって、前記方法が、
実生の胚軸、子葉、葉部、茎部、若しくは根部；又は、
ベリー部、節部若しくは節間部を含む茎部、若しくは成葉部；のうちの１つ以上に由来するセイヨウスノキ細胞集団であり、かつ懸濁培養法で増殖させるのに適した、セイヨウスノキ細胞集団を選別する工程と、
溶媒を用い、前記細胞集団からポリフェノールを抽出する工程と、を含み、
前記セイヨウスノキ細胞集団の乾燥重量のうち、少なくとも１０％、１５％、又は２０％がポリフェノールから構成され、かつ前記セイヨウスノキ細胞集団の乾燥重量のうち、少なくとも５％がプロシアニジンから構成される、方法。
【請求項６６】
前記細胞集団がカルス細胞である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記溶媒がアセトンを含有する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記溶媒が酢酸を含有する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記溶媒が７０％アセトン（ｖ／ｖ）及び０．５％酢酸（ｖ／ｖ）を含有する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記溶媒が水を更に含有する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記細胞集団及び前記溶媒を、細胞破砕機で合わせる工程と、
前記細胞集団から前記ポリフェノールが抽出されるように、前記溶媒の存在下で、前記破砕機において前記細胞集団を破砕させる工程と、を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７２】
前記破砕機がボールミルである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記破砕した細胞集団を遠心分離して、上清画分及び沈殿画分を生成する工程と、
前記上清から、前記ポリフェノール抽出物を得る工程と、を更に含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記細胞集団から抽出した前記ポリフェノールが、プロシアニジンを含有する、請求項６５に記載の方法。
【請求項７５】
前記細胞集団から抽出した前記ポリフェノールが、実質的にアントシアニンを含有していない、請求項６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、セイヨウスノキ細胞培養によるポリフェノール産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
セイヨウスノキ（より一般的にはビルベリーと呼ばれる）の果実由来の抽出物は、長らく治療用途に使用されてきた。ヨーロッパでは、数百年にわたって下痢及び赤痢、並びに肺、肝臓、及び胃疾患の処置に使用されている。更には、第二次世界大戦時には、英国軍操縦士は、暗視能力の改善を助けるとしてビルベリージャムを食べていたものと考えられている。最近では、セイヨウスノキの果実由来の抽出物は、抗がん活性を保有している可能性があることが示されている。セイヨウスノキの臨床効果の、栄養補助及び治療効果のいずれもが、ビルベリーに豊富に含まれるフラボノイド及びアントシアニンによるものである。これらの抗酸化化合物は、フリーラジカルとして知られる、体の損傷をきたす分子を除去し、細胞の損傷を予防する又は損傷から回復させる助けとなる。抗酸化物質は、これまでに、心疾患、がん、及び黄斑変性症などの数多くの長期疾患を予防する助けとなることが示されている。セイヨウスノキの果実は、抗炎症剤及び収れん剤として作用することが知られているタンニンも含有している。
【０００３】
ポリフェノールは、植物、果実、及び野菜に広く含有されており、酸化防止活性、抗変異原性、及びがん予防活性などを示し、ヒト及び動物の健康に対して生理的に作用することから、注目を集めている（Ｓａｌｖｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．３９：１５４９〜１５５２，１９９１；Ｂｏｍｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，１３５：１５１〜１５７，１９９９；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２０：１７３７〜１７４５，１９９９）。疫学試験により、ポリフェノールのうちのフラボノイドは心疾患のリスクを低下させ得ることが示唆されている（Ｈｅｒｔｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ：３４２：１００７〜１０１１，１９９３）。これに加えて、食物由来のフラバン−３−オール及び／又はプロアントシアニジンが、実験動物において、アテローム性動脈硬化症及び冠動脈心疾患の発生率を低下させることも示されている（Ｔｉｊｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｏｒｏｓｉｓ，１３５：３７〜４７，１９９７；Ｙａｍａｋｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１４２：１３９〜１４９，１９９９）。これらの作用に関与している可能性のある機序としては、例えば、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の酸化阻害が挙げられる（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８５：２３３７〜２３４４，１９９２）。
【０００４】
スノキ属のベリーは、酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）、鉄還元／抗酸化力（ＦＲＡＰ）、総酸素除去能（ＴＯＳＣ）、及び２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）ラジカルに対するフリーラジカル除去活性、並びにリノール酸メチル、リポソーム、及びヒト低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）（Ｍａａｔａ−Ｒｉｉｈｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ）の酸化阻害における酸化防止能に関するアッセイを用いる様々なインビトロモデルで、ラジカル除去能を保有していることが示されている。栽培種のクランベリー（Ｖ．ｍａｃｒｏｃａｒｐｏｎ  Ａｉｔ．）、及び（Ｇｕ  ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ．ａｌ．，Ｆｏｏ  ｅｔ．ａｌ．）野生種のコケモモは、Ａ型及びＢ型プロシアニジンの両方を含有している一方で、野生種（Ｖ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ  Ａｉｔ．）及び栽培種のブルーベリー（Ｖ．ｃｏｒｙｍｂｏｓｕｍ  Ｌ．，Ｖ．ａｓｈｅｉ  Ｌ．）では主にＢ型プロシアニジンが同定されている（Ｆｏｏ  ｅｔ．ａｌ．；Ｐｒｉｏｒ  ｅｔ．ａｌ．；Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ．ａｌ．）。野生種のコケモモ、クランベリー、ビルベリー、及びクロマメノキでは、その他の植物で一般的に見られるＢ型プロシアニジンよりも、希少なＡ型低分子量プロシアニジンの方が豊富に検出される（Ｍａａｔａ−Ｒｉｉｈｉｎｅｎ  ｅｔ．ａｌ．）。希少なＡ型プロシアニジンは、内皮層への微生物の繊毛の接着を妨害するよう作用し、尿路感染の予防の助けとなることが知られている（Ｎｏｗａｃｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄｔ；Ｆｏｏ  ｅｔ  ａｌ２；）。ビルベリーに関しては、何十年も前から、腸の炎症を治療するにあたって一般的な抗炎症剤であることが知られている。更に、セイヨウスノキの葉は、３５種の異なるフラボン−３−オール、プロシアニジン、フラボンオール及びこれらのグリコシド、並びに様々なフェノール酸複合体を含有する（Ｈｏｋａｎｎｅｎ  ｅｔ．ａｌ．）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍａａｔｔａ−Ｒｉｉｈｉｎｅｎ，Ｋ；Ｋａｈｋｏｎｅｎ，Ｍ；Ｔｏｒｏｎｎｅｎ，ＡＲ；Ｈａｉｎｏｎｅｎ，ＩＭ；Ｃａｔｅｃｈｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ  ｉｎ  Ｂｅｒｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ  Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００５．５３：８４８５〜８４９１。
【非特許文献２】Ｇｕ，Ｌ；Ｋｅｌｍ，ＭＡ；Ｈａｍｍｅｒｓｔｏｎｅ，ＪＦ；Ｂｅｅｃｈｅｒ，Ｇ；Ｈｏｌｄｅｎ，Ｊ；Ｈａｙｔｏｗｉｔｚ，Ｄ；Ｐｒｉｏｒ，ＲＬ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｆｏｏｄｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ  ａｎｄ  ｔｈｉｏｌｙｔｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００３．５１：７５１３〜７５２１。
【非特許文献３】Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｓ；Ｎｏｎａｋａ，ＧＩ；Ｎｉｓｈｉｏｋａ，Ｉ  Ｔａｎｎｉｎｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．ＬＸ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｕｎｉｔ  ｆｒｏｍ  Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  Ｖｉｔｉｓ−ｉｄａｅａ  Ｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９８８．３６：３３〜３８。
【非特許文献４】Ｆｏｏ，ＬＹ；Ｌｕ，Ｙ；Ｈｏｗｅｌｌ，ＡＢ；Ｖｏｒｓａ，Ｎ．Ａ−ｔｙｐｅ  ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  ｔｒｉｍｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｃｒａｎｂｅｒｒｙ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｐ−ｆｉｍｂｒｉａｔｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．２０００．６３：１２２５〜１２２８。
【非特許文献５】Ｐｒｉｏｒ，ＲＬ；Ｌａｚａｒｕｓ，ＳＡ；Ｃａｏ，Ｇ；Ｍｕｃｃｉｔｅｌｌｉ，Ｈ；Ｈａｍｍｅｒｓｔｏｎｅ，ＪＦ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ  ａｎｄ  ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓ  ｉｎ  ｂｌｕｅｂｅｒｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｒａｎｂｅｒｒｉｅｓ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｓｐｐ．）ｕｓｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００１．４９：１２７０〜１２７６。
【非特許文献６】Ｓｃｈｍｉｄｔ，ＢＭ．；Ｈｏｗｅｌｌ，ＡＢ．；ＭｃＥｎｉｒｙ，Ｂ；Ｋｎｉｇｈｔ，ＣＴ；Ｓｅｉｇｌｅｒ，Ｄ；Ｅｒｄｍａｎ，ＪＷ，Ｊｒ．；Ｌｉｌａ，ＭＡ．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉａｄｈｅｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｗｉｌｄ  ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ  Ａｉｔ．）ｆｒｕｉｔｓ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００４．５２：６４３３〜６４４２。
【非特許文献７】Ｎｏｗａｃｋ，Ｒ；Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｗ．Ｃｒａｎｂｅｒｒｙ  ｊｕｉｃｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ  ｏｆ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００８．１５（９）：６５３〜６７。
【非特許文献８】Ｆｏｏ，ＬＹ；Ｌｕ，Ｙ；Ｈｏｗｅｌｌ，ＡＢ．；Ｖｏｒｓａ，Ｎ．Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃｒａｎｂｅｒｒｙ  ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ  ｗｈｉｃｈ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｐ−ｆｉｍｂｒｉａｔｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０００．５４：１７３〜８１。
【非特許文献９】Ｍａｄｈａｖｉ，ＤＬ；Ｂｏｍｓｅｒ，Ｊ；Ｓｍｉｔｈ，ＭＡＬ．Ｓｉｎｇｌｅｔａｒｙ  Ｋ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ  ｆｒｕｉｔ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  １９９８．１３１：９５〜１０３。
【非特許文献１０】Ｈｏｋｋａｎｅｎｍ  Ｊ；Ｍａｔｔｉｌａ，Ｓ；Ｊａａｋｏｌａ，Ｌ；Ｐｉｒｔｔｉｌａ，ＡＭ；Ｔｏｌｏｎｅｎ，Ａ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈｅｎｏｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｌｉｎｇｏｎｂｅｒｒｙ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ−ｉｄａｅａ  Ｌ．），Ｂｉｌｂｅｒｒｙ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ  Ｌ．）ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｂｉｌｂｅｒｒｙ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｘ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ  Ｒｕｔｈｅ  Ｌ．）Ｌｅａｖｅｓ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００９．５７：９４３７〜９４４７。
【非特許文献１１】Ｓｌｉｎｋａｒｄ，Ｋ；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ＶＬ．Ｔｏｔａｌ  Ｐｈｅｎｏｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｍａｎｕａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｖｉｔｉｃｕｌｔｕｒｅ  １９７７，２８：４９〜５５。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
セイヨウスノキは育成が難しく、したがってあまり栽培されていない。結果として、果実は一般的に野生種の植物から、その限られた生育期間（５月〜９月）に採取されることになり、この生育期間には、降雨と温暖な気候の両方が満たされる必要がある。すなわち、ベリーの供給は不安定であり、また採取量は限られている。更には、セイヨウスノキの果実は同類のブルーベリーよりも柔らかく、かつ水分を多く含むため、収穫は手で行う必要があり、及び輸送も難しいことから、セイヨウスノキから新鮮な果実を収穫するには費用がかかる。また、熟した果実が必要とされていることから、収穫する際に未熟な果実及び葉は商品にならない。この未熟な果実及び葉は、プロシアニジンの植物体の大部分を占める。セイヨウスノキの有する臨床効果、及びこれらの植物の栽培にまつわる困難さを考慮すると、セイヨウスノキの安定的なインビトロ細胞培養系を開発することが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、液体培地において懸濁培養により生育させるよう構成された、セイヨウスノキの細胞培養に関する。細胞は、セイヨウスノキの１箇所以上の部位、例えば、植物の可食部（例えば、葉部又は果実部）又は茎部などに由来するものである。細胞は、比較的短期間（例えば、約７日）に増殖して高密度になるよう構成されている。更に、細胞は、高濃度のポリフェノール及び／又はプロシアニジンを産生し、かつ本質的にアントシアニンは産生しないよう構成されている。懸濁培養でセイヨウスノキ細胞を増殖させて、ポリフェノール及びプロシアニジンを産生させる方法も開示する。
【０００８】
一実施形態では、細胞培養法を開示する。細胞の懸濁培養には、柔らかいセイヨウスノキ細胞集団を含む。懸濁培養に用いる細胞は：実生の胚軸、子葉、葉部、茎部、又は根部；あるいはベリー部、節部若しくは節間部を含む茎部、又は成葉部；のうちの１つ以上に由来する。一実施形態では、細胞は、植物の可食部、例えば、葉部又はベリー部に由来し得る。細胞は、増殖７日目の液中細胞容積が少なくとも５５％になるよう選別され、この場合、セイヨウスノキ細胞集団の乾燥重量のうち少なくとも１０％がポリフェノールから構成され、セイヨウスノキ細胞集団の乾燥重量のうち少なくとも５％がプロシアニジンから構成される。
【０００９】
好ましくは、セイヨウスノキ細胞集団は、乾燥重量で少なくとも１２．５％、１５％、又は２０％以上がポリフェノールから構成される。好ましくは、セイヨウスノキ細胞集団は、乾燥重量で少なくとも７．５％、１０％、１５％、２０％以上がプロシアニジンから構成される。細胞重量には本質的にアントシアニンが含まれないことも好ましい。例えば、セイヨウスノキ細胞の細胞集団に含有されるアントシアニン量は、乾燥重量で０．５％、０．１％、０．０１％、０．００１％未満であることが好ましい。
【００１０】
他の実施形態では、セイヨウスノキ細胞集団の細胞培養物の産生方法を記載する。この方法は、（１）実生の胚軸、子葉、葉部、茎部、又は根部、あるいはベリー部、節部又は節間部を含む茎部、又は成葉部のうちの１つ以上から、セイヨウスノキ細胞のカルス細胞を誘導し、産生する工程、（２）カルスに由来する１個以上の細胞を液体培地に導入する工程、（３）液体培地中で１個以上の細胞を撹拌する工程、（４）液体培地を新鮮な液体培地に置き換え、あるいは細胞を新鮮な液体培地に移して、セイヨウスノキの細胞懸濁培養を樹立する工程、（５）液中細胞容積が少なくとも５５％になるまでセイヨウスノキの細胞懸濁培養物を増殖させる工程、並びに（６）セイヨウスノキ細胞集団の懸濁培養物のうち、乾燥重量の少なくとも１０％がポリフェノールから構成され、及び／又は少なくとも５％がプロシアニジンから構成されている培養物を選別する工程、を包含する。
【００１１】
更に他の実施形態では、細胞懸濁培養時のセイヨウスノキ細胞の増殖性を増大させる方法を記載する。方法は、（１）セイヨウスノキの細胞懸濁培養細胞を用意する工程、（２）細胞を懸濁培養用液体培地で培養する工程、並びに（３）液中細胞容積（ＰＣＶ）が４５％超になるよう細胞懸濁培養物を選別する工程、を包含する。
【００１２】
一実施形態では、細胞懸濁培養時のセイヨウスノキ細胞の増殖性を増大させる方法は、液体培地中の糖濃度の増大に応じて、ポリフェノール及びプロシアニジンの蓄積量が増大した細胞懸濁培養物を選別する工程を更に包含する。一実施形態では、液体培地は、糖濃度約３０〜６０ｇ／Ｌになるようスクロースを含む。一実施形態では、懸濁培養時の細胞のプロシアニジン蓄積量は、スクロース濃度２０ｇ／Ｌ下での約１〜２ｇ／Ｌ  ＰＣＶから、スクロース濃度３０ｇ／Ｌ下での約３〜７ｇ／Ｌ  ＰＣＶにまで上昇する。一実施形態では、懸濁培養時の細胞のポリフェノール蓄積量は、スクロース濃度２０ｇ／Ｌ下の約２〜４ｇ／Ｌ  ＰＣＶから、スクロース濃度６０ｇ／Ｌ下の約５〜１０ｇ／Ｌ  ＰＣＶにまで上昇する。
【００１３】
更に他の実施形態では、培養時の、セイヨウスノキ細胞からのポリフェノール産生量を増大させる方法を記載する。方法は、（１）懸濁培養法で増殖させるのに適したセイヨウスノキ細胞集団を選別する工程、及び（２）ポリフェノール産生量を増大させるのに十分な量の糖の存在下で、細胞懸濁培養法により細胞を培養する工程、を包含する。
【００１４】
一実施形態では、十分な量の糖とは、液体培地の糖含量を２０ｇ／Ｌ超、２０ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌ超、又は３０ｇ／Ｌ超にするのに十分な量の糖である。一実施形態では、糖はスクロースである。他の実施形態では、糖はグルコースである。一実施形態では、糖は、ポリフェノール産生量を、液中細胞容積（ＰＣＶ）で３ｇ／Ｌ超に上昇させるのに十分な量で含ませる。他の実施形態では、糖は、ポリフェノール産生量を、液中細胞容積（ＰＣＶ）で少なくとも７ｇ／Ｌに上昇させるのに十分な量で含ませる。
【００１５】
更に他の実施形態では、培養時の、セイヨウスノキ細胞からポリフェノールを抽出する方法を記載する。この方法は、（１）懸濁培養法で増殖させるのに適したセイヨウスノキ細胞集団を選別する工程、及び（２）溶媒を用い、細胞からポリフェノールを抽出する工程、を含み、ここで、乾燥重量でセイヨウスノキ細胞集団の少なくとも１０％がポリフェノールから構成され、かつ少なくとも５％がプロシアニジンから構成される。
【００１６】
一実施形態では、溶媒は、アセトン、酢酸、及び水を含む。一実施形態では、溶媒は、７０％アセトン（ｖ／ｖ）と、０．５％酢酸（ｖ／ｖ）を含む。
【００１７】
本発明の、これらの及びその他の目的及び特徴は、以降の説明及び添付の特許請求の範囲により完全に明らかになり、あるいは以降に記載の特許請求の範囲を実施することで認識される。
【００１８】
上記の内容並びに本発明のその他の利点及び特徴を更に明確にするために、添付の図面に例示される特異的な実施形態を参照することで、本開示の主題に関係するより詳細な記載を提供する。これらの図面は、本開示の実施例を例示する目的でのみ掲載され、したがって、範囲を制限することを意図するものとは見なされない。本開示の主題は、添付の図面を通して、更に具体的に及び詳細に記載され、説明され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】第一週目の初期バイオマス量を２５％から５０％に増量した場合の糖の消費量。
【図２】異なる撹拌速度下での、（ａ）増殖、（ｂ）ＲＩ、及び（ｃ）産生。すべての５００ｍＬフラスコには２０％  ＰＣＶで細胞を播種し、かつＰＣＶ、ＲＩ及び収率は増殖開始後６日目で測定した。
【図３】茎部、胚軸、葉部及び子葉抽出物由来の細胞懸濁物を抽出し、蛍光検出器モードで検出した、ＨＰＬＣクロマトグラム。表示１〜１２により、プロシアニジンの重合度を示す。それぞれ、１は単量体、２は二量体、３は三量体、４は四量体、５は五量体、６は六量体、７は七量体、８は八量体、９は九量体である。
【図４】ビルベリー及びカカオ細胞懸濁物を抽出し、蛍光検出器モードで検出したＨＰＬＣクロマトグラム。表示１〜１２により、プロシアニジンの重合度を示す。それぞれ、１は単量体、２は二量体、３は三量体、４は四量体、５は五量体、６は六量体、７は七量体、８は八量体、９は九量体である。この図によると、同様の手法でこれら２種の細胞株の細胞を抽出し、同様の条件下でＨＰＬＣを行った場合に、いずれも各オリゴマーについて同様の保持時間を有することから、ビルベリーのピークは、プロシアニジンオリゴマーのものであることが確認される。
【図５】２８０ｎｍでの（ａ）カカオ抽出物及び（ｂ）ビルベリー抽出物のＵＶ吸収パターン。ビルベリーにプロシアニジンの存在及び検出が確認される。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本開示は、液体培地において懸濁培養により生育させるよう構成された、セイヨウスノキの細胞培養に関する。細胞は、セイヨウスノキの１種以上の部位、例えば、植物の可食部（例えば、葉部又は果実部）又は茎部などに由来するものである。細胞は、比較的短期間（例えば、約７日）のうちに増殖して高密度になるよう構成されている。更に、細胞は、高濃度のポリフェノール及び／又はプロシアニジンを産生し、かつ本質的にアントシアニンは産生しないよう構成されている。本開示の主題は、以降の実施例を用いることで、更に具体的に及び詳細に記載し、説明され得る。
【実施例】
【００２１】
（実施例１）表面殺菌及び種子発芽
セイヨウスノキ種子を、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｈｅｒｂｓ（Ｏｒｅｇｏｎ）から得た。本実施例及び以降の実施例で使用した、セイヨウスノキの葉部、茎部、及び未熟なベリー（Ｅｒｉｎのビルベリー）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｌｏｎａｌ  Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ＮＣＧＲ）（Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ、Ｏｒｅｇｏｎ）より収集した。
【００２２】
葉部、茎部、及び未熟なベリーを流水で２０分すすぎ洗いし、７５％エタノールで１分すすいだ。次に茎部を細断した。茎部、葉部、及び未熟なベリーを２５％次亜塩素酸ナトリウム（ｖ／ｖ）で１５分洗浄した後、殺菌蒸留水で５回すすいだ。
【００２３】
種子（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｈｅｒｂｓ、Ｏｒｅｇｏｎ）は、最初に７５％エタノールで１分すすぎ洗いして表面殺菌した。次に、これらを２５％次亜塩素酸ナトリウム（ｖ／ｖ）で１５分洗浄した後、殺菌蒸留水で５回すすいだ。続いて、種子を０．１％アガロースに懸濁し、１００×２５ｍｍペトリ皿に播種した（プレート１枚あたり種子約１００個）。７ｇ／Ｌ寒天を添加したＭＳ（ムラシゲ・スクーグ）培地（４．４３ｇ／Ｌ）を用い、これらの種子を、２３℃下、明期１６時間、暗期８時間の光サイクルで４週間発芽させた。
【００２４】
（実施例２）インビトロで実生セイヨウスノキを増殖させることによるカルス誘導
カルスの増殖性がより高くかつカルスが柔らかいことが、成功した細胞株の非常に重要な特徴である。本実施例には、インビトロで増殖させた実生セイヨウスノキ由来の各種外植片からカルスを生成及び維持するにあたって最適化した方法及び培地条件を記載する。
【００２５】
カルスは、インビトロで増殖させた実生の胚軸、子葉、葉部、茎部、及び根部から生成した。植物は５ｍｍ大に細断した。すべての培地は、別途記載のない限り、オートクレーブにより１２１℃かつ１０３．４ｋＰａにて２０分間殺菌した（１５ＰＳＩ（平方インチあたりのポンド数））。別途記載のない限り、すべての増殖因子は、オートクレーブ後にろ過殺菌し添加した。別途記載のない限り、すべての培養物は、暗所で２５℃にて維持した。
【００２６】
外植片を各種カルス誘導培地（表１）に配置した。プレートは暗所で２５℃にて維持した。カルス形成の最初の兆候は、ＶＭ１４４５培地、ＶＭ１１９６培地、ＶＭ１２０４培地、及びＶＭ１２３３培地を入れたプレートに外植片を配置してから２週間後に観察された（ＶＭ１２３３はＭａｄｈａｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３１：９５〜１０３，１９９８に記載されている）。カルス誘導率はそれぞれ８３％、８５％、８５％、及び７０％であった。しかしながら、いずれも２４ｍＭ硫酸アンモニウム及び８ｍＭ硝酸カリウムを含有させた培地ＶＭ１１９６及びＶＭ１２０４（基本塩類が異なり、それぞれＭＳ基本塩類（窒素不含）、及びＢ５改変主要塩類を含有；表１）で生成したカルスは、１ｍＭ硫酸アンモニウム及び２４ｍＭ硝酸カリウムを添加した培地（ＶＭ１４４５）で生成したカルスよりも柔らかかった。培地ＶＭ１２３３（Ｍａｄｈａｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３１：９５〜１０３，１９９８）で生成したカルスは非常に小さく、非増殖性であった。Ｍａｄｈａｖｉ  ｅｔ  ａｌ．は、カルスをこの培地で３週間間隔で３回継代培養したと示しているが、この培地でのカルスの品質は参照文献中では議論されていなかった。Ｍａｄｈａｖｉ  ｅｔ  ａｌ．の条件を用い継代培養したカルスでは、参照に記載されているのと同様の初期結果が得られたが、継代培養する毎にカルスは硬質になり、増殖性が低下したことには留意すべきである。すなわち、培地ＶＭ１２３３を用いたカルスの品質は、継代培養毎に低下した。ＶＭ１２３３培地からポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を除去し（ＶＭ１２０４培地）、軟質カルスの生成を補助した。培地ＶＭ１４９１及びＤＣ１１５２において、それぞれ５０％及び１０％の外植片から持続性のカルスを生成した。３週間毎に、外植片及びカルスを新鮮な培地へと移し替えた。カルスを外植片から分離し、非常に増殖性の高いカルスを２週間毎に継代培養した。継代培養には、増殖性の高い細胞株を選別した。連続的に継代培養し、カルスの形態を、より望ましい柔らかい形態を持つものに変化させるよう補助した。
【００２７】
高濃度硫酸アンモニウム及び低濃度硝酸カリウムを添加した培地で持続的に継代培養を行った所、カルスはストレスから濃い褐色に変色し、最終的には増殖を停止した。カルスがストレスを受けたことは、カルスが、硫酸アンモニウム又は硝酸カリウムを無添加の通常濃度のガンボーグＢ５（Ｂ５）培地からなるＶＭ１４４５培地では褐色化せず、死に至らなかったという事実から明白である。カルスに望ましくない褐色化が生じたため、ＶＭ１１９６培地及びＶＭ１２０４培地での培養は９週目に中止した。褐色化及び細胞死を生じさせずにカルスの持続的な増殖を支持し得る培地を特徴づけるため、様々な培地（表１）を試験した。ＭＳ塩をすべて通常濃度で含むＶＭ１５１６培地では、増殖性は高くかつ持続的であった。ＶＭ１４４５及びＶＭ１５１６を比較した場合、ＶＭ１５１６では、カルスの増殖性が非常に高く、かつ形態も、まとまった形状から粒状に変化し、最終的には柔らかいカルスへと変化を遂げるよう働きを受けていた。培地ＶＭ１５１６が、実生セイヨウスノキから誘導したカルスを安定的に維持するのに最も適していることも判明した。ＶＭ１５１６が、様々な実生セイヨウスノキ外植片から新しくカルス生成を開始させるのに最も適した培地であることも判明した（成功率８３％）。
【００２８】
（実施例３）ＮＣＧＲから回収されたセイヨウスノキ組織からのカルス誘導
本実施例は、屋外栽培したセイヨウスノキに由来する様々な外植片（ベリー部、節部、節間部、又は葉部由来）からカルス生成を開始し、及び維持するための方法及び培地の配合を記載する。
【００２９】
成葉部及び茎部、並びに未熟なベリーを上記の通りに表面殺菌した。植物を５ｍｍ大に細断した後、ＶＭ１５１６培地及びＶＭ１４９１培地に外植した。ベリーは滅菌条件下で切り開き、培地を入れた培養プレートに果皮を配置した。果肉は外植前に除去した。
【００３０】
培養プレートを暗所にて２５℃下で保管した。全体的に、植物片を外植し始めてから、ＶＭ１５１６培地では４週間後、ＶＭ１４９１培地では６週間後にカルスが観察された。葉部外植片に関しては、全体のカルス誘導率は５３％であった。葉部外植片からのカルス生成はＶＭ１４９１培地（初期外植片の７３％）及びＶＭ１５１６培地（初期外植片の７６％）で見られ、かつＶＭ１６７２培地及びＴＣ１５９６培地ではカルスは観察されなかった。ＶＭ１５１６では、ＶＭ１４９１よりも活発なカルス生成が観察された。節部に関しては、ＶＭ１５１６において外植片のうちの４７％がカルスを生成した。節間部を異なる３種の培地、ＶＭ１５１６、ＶＭ１４９１、及びＴＣ１５９６に配置した。ＶＭ１５１６では、外植片の５１％がカルスを生成した一方、ＶＭ１４９１では２０％がカルスを生成し、ＴＣ１５９６ではカルスは生成されなかった。ベリー部由来の外植片では、ＶＭ１５１６で５９％がカルスを生成した。
【００３１】
セイヨウスノキの組織由来のカルスを３週間毎にＶＭ１５１６で継代培養した。このカルスは非常に増殖性が高かった。更に維持するために柔らかい株を選別した。これらの組織由来のカルスを８ヶ月以上培地ＶＭ１５１６で維持したところ、カルスの品質は変化せずに一貫して増殖性が維持されることが例証された。
【００３２】
（実施例４）実生セイヨウスノキ由来のカルスの懸濁液の生成
懸濁を開始するにあたって、実施例２に記載の通りに生成した柔らかい細胞株を選別した。滅菌１２５ｍＬ三角フラスコに入れた１５ｍＬの液体培地（ＶＭ１７９９、ＶＭ１８３１又はＤＣ１１５１；表２）に、新鮮な２週齢実生セイヨウスノキカルス（実施例２に記載の通りに調製）（約）１ｇを導入し、細胞懸濁液を生成した。フラスコに滅菌シリコン（発泡体）キャップで蓋をし、施回振盪器において１２０毎分回転（ｒｐｍ）で撹拌した。懸濁液を暗所にて２３℃下で保管した。細胞培養を樹立するため、一週間毎に、使用した培地を除去し新鮮な培地を加えて２回継代培養した。培地の屈折率（ＲＩ）（ＢＲＩＸ度（すなわち、ＢＲＩＸ（％））として測定）の差分を測定し、糖の消費速度をもとに、細胞の増殖率を測定した。ＲＩが培地の初期ＲＩ以下であった場合、新鮮な培地を細胞に加えた。ＲＩが１／２よりも大きかった場合、新鮮な培地は２週間後にのみ添加した。継代培養は、週ごとにあるいは隔週で必要に応じて行った。
【００３３】
粒状の細胞又は微細懸濁物のいずれかを形成した培養物を保持し、懸濁培養物を形成しなかった培養物は廃棄した。懸濁培養が樹立されたならば（３〜４回の継代期間）、毎週２５〜３５％の細胞を、新鮮な培地を入れたフラスコに移した。継代培養毎に液中細胞容積（ＰＣＶ）及びＲＩを記録し、細胞増殖を測定した。
【００３４】
カルスから懸濁液を生成後６回以内の継代培養にて、安定的な持続性懸濁液を得た。
【００３５】
（実施例５）ＮＣＧＲより収集したセイヨウスノキ組織由来のカルスからの懸濁液生成
懸濁液を生成するにあたって、柔らかい細胞株を選別した。滅菌三角フラスコを用い、セイヨウスノキカルス（実施例３に記載の通りに、節部、節間部、葉部、及びベリー部）を液体培地（ＶＭ１９３３；表２）に播種し、細胞懸濁液を生成した。滅菌シリコン（発泡体）キャップでフラスコに蓋をし、施回振盪器において１２０毎分回転（ｒｐｍ）で撹拌した。懸濁液を暗所にて２５℃下で保管した。細胞培養を樹立するにあたって、使用した培地は除去し、新鮮なＶＭ１９３３培地を添加した。培地の屈折率（ＲＩ）の差分を測定し、糖の消費速度をもとに、細胞の増殖率を測定した。ＲＩが培地の初期ＲＩ以下であった場合、新鮮な培地を細胞に加えた。ＲＩが１／２よりも大きかった場合、新鮮な培地は１週間後のみに添加した。
【００３６】
（実施例６）細胞増殖の最適化
本例は、懸濁液の細胞増殖を向上させるために使用した方法を記載する。細胞培養物の生産性は、細胞の増殖速度並びに細胞増殖停止時の密度に応じ上昇する。最適播種密度を決定するため、セイヨウスノキ細胞の初期細胞密度を、液中細胞容積（「ＰＣＶ」）で１５％及び２５％にして懸濁培養を開始し、７日間増殖させた。細胞密度１５％  ＰＣＶで培養を開始したところ、７日目にも最大密度に達しなかった。培地ＶＭ１８３１（表１）を用い、細胞密度２５％  ＰＣＶで培養を開始したところ、７日以内で密度（すなわち、総細胞容積）が２倍になり、最大平均細胞密度は７日以内に４５〜５０％  ＰＣＶに達し、一部の細部株培養物では、７日目に５５〜６０％  ＰＣＶを超過した。細胞選別をし、７日以内に４５％  ＰＣＶ以上に達する（急速に細胞培養物を増殖させる）培地を決定する助けとした。４５％  ＰＣＶに到達するのに８日以上かかる培養物は廃棄した。
【００３７】
糖消費量が大きく、かつ増殖が良好な（図１）細胞を、生成された細胞数をもとに注意深く選別したところ、２５％濃度でフラスコに播種した場合に、７日目の最終細胞密度が非常に高かった（ＰＣＶ約６５．８±０．６３）。これにより、１２５ｍＬフラスコを用いる４０ｍＬ容量での細胞の適切な振盪は阻害された。したがって、接種量を最適化するには、細胞選別過程により再度細胞株を選別し直す必要があった。倍加時間を算出したところ、２０％  ＰＣＶで播種を行った場合、７日目の最終密度は約６０％であった。実験データによりこれが支持され、最終ＰＣＶにおいて有意差（Ｐ＝０．００８）が示されたが（５９．９±０．７７）、生産率又は増殖率に有害な効果は（Ｐ＝０．３９）示されなかった。したがって、播種量を２０％  ＰＣＶに変更した。
【００３８】
（実施例７）細胞懸濁培養に関係する細胞選別及び培地最適化による、ビルベリー懸濁培養物由来のポリフェノール産生の最適化
増殖最適化後、培地組成を変更し、更に細胞選別に関し基準を加え、ポリフェノール産生を実施した。
【００３９】
７日目にＲＩが０〜０．６に到達した培養物では、糖消費が急速であった。糖飢餓のため、ＶＭ１８３１においてポリフェノール及び／又はプロシアニジンが産生される可能性は低かった。培地ＶＭ１８３１のスクロース濃度は２０ｇ／Ｌであった。糖濃度を調節し、液体培地を最適化して、栄養飢餓状態にさせず培養を維持した。３０ｇ／Ｌスクロースを添加した新しい培地ＶＭ１９３３（表１）を配合し、細胞が糖飢餓状態になることを回避した。この培地では、ＲＩは０．８〜１．０に低下した。ポリフェノール産生量は、４継代培養以内に、２０ｇ／Ｌスクロースにて約２〜４ｇ／Ｌ  ＰＣＶから、６０ｇ／Ｌスクロースにて約５〜１０ｇ／Ｌ  ＰＣＶへと増大し、高産生量を維持した。プロシアニジン産生量は、４継代培養以内に、２０ｇ／Ｌスクロースにて約１〜２ｇ／Ｌ  ＰＣＶから、３０ｇ／Ｌスクロースにて約３〜７ｇ／Ｌ  ＰＣＶへと増大し、高産生量を維持した。
【００４０】
各継代培養時に、平均ポリフェノール量がより大きかったフラスコについて、ハイスループットな手法を用い選別する細胞選別工程を行い、ポリフェノール及びプロシアニジン産生量の更なる改善を行った。
【００４１】
（実施例８）実生ビルベリーの各部分に由来する懸濁液におけるポリフェノール及びプロシアニジン産生の検出及び確認
本実施例では、実施例４及び５に記載の通りに植物の各部位（根部、胚軸、ベリー部、子葉、茎部、及び葉部）から調製したすべての懸濁液から、プロシアニジンを製造可能であったことを実証する。図３は、各部分についてのクロマトグラムを示す。確認されているカカオプロシアニジンクロマトグラムと重ねあわせたところ（図４）、示されているクロマトグラムがプロシアニジンのものであること、各オリゴマーの保持時間がカカオにおけるものと同様であること、ビルベリーでも、その他の二量体、三量体、及び四量体の異性体が示されることを更に確認した。２８０ｎｍでのＵＶ吸収でも、パターンがカカオと類似していることが示され、かつプロシアニジンの存在が確認された（図５）。
【００４２】
（実施例９）ビルベリーのカルス培養物及び懸濁培養物からのポリフェノールの抽出
本例は、実施例１〜５で調製したビルベリー培養物のカルス及び細胞懸濁液からポリフェノールを抽出するにあたり開発した手法を記載する。０．４ｍＬの７０％（ｖ／ｖ）アセトン／０．５％酢酸を用い、懸濁液由来の約０．４ｍＬの新鮮な細胞からポリフェノールを抽出した。堅調なハイスループットな手法を次の通りに用いた：解析する細胞培養物を入れた各フラスコについて、試料の液中細胞容積（ＰＣＶ）を記録した後、０．４ｍＬを９６ウェルディープウェルプレートに移した。プラスチック製ピペットを用い、各ウェルから上清を除去し、廃棄した。次に、各ウェルに０．４ｍＬの抽出溶媒（７０％アセトン、２９．５％水、０．５％酢酸）、及びタングステンカーバイドビーズを加え、プレートを混合ミルに設置して、細胞を１８Ｈｚで４分粉砕した。次に、プレートを遠心分離機に配置して、６０００ｒｐｍで４分間遠心処理し、抽出物から細胞を分離した。
【００４３】
（実施例１０）培養時のポリフェノール生産の予備解析
プロシアニジンの反応解析を実施する際に使用した方法は、オリジナルのＳｗａｉｎ及びＨｉｌｌｉｓの手法（Ｊ．ＳＣＩ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．１０：６３，１９５９）並びにＰｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の手法（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５（１）：２２３，１９８６）におおよそ類似するよう設計した。ブタノール−ＨＣｌ抽出アッセイを用い、セイヨウスノキ懸濁細胞の抽出物に含まれるポリフェノールを測定した。アセトン水溶液抽出物０．１ｍＬ及びブタノール−ＨＣｌ試薬（９５：５ｖ／ｖ）１．０ｍＬを組み合わせ、Ｑｉａｇｅｎディープウェルブロック（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いこの溶液を７５℃で６０分加熱し、ポリフェノールを（−）−エピカテキン及びシアニジンのモノマーに加水分解した。桃色の呈色から、加水分解した試料中に含まれるシアニジンの存在を観察した。５２０ｎｍで吸光度を測定し、Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）から購入したプロシアニジンＢ２を様々な濃度で用い作成した検量線から生成されたシアニジン量をもとに、プロシアニジン含量を算出した。定色される桃色が鮮やかである程、懸濁培養物に含まれるプロシアニジン濃度は高くなる。この測定法によると、複数の懸濁培養物に関し、プロシアニジン含量は１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌの範囲であった。
【００４４】
フォリン−シオカルトーアッセイ（Ｓｌｉｎｋａｒｄ，Ｋ．；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，Ｖ．Ｌ．Ｔｏｔａｌ  Ｐｈｅｎｏｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｍａｎｕａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｖｉｔｉｃｕｌｔｕｒｅ  １９７７，２８：４９〜５５）を用い、ビルベリー細胞抽出物の総ポリフェノール含量を測定した。７０％アセトン／０．５％酢酸に含まれる細胞培養抽出物を、総ポリフェノール含量について解析した。この際、抽出物を２５μＬ採取し、水を０．９７５ｍＬ添加して試希釈した後、アッセイを開始した。ポリフェノールを定量するにあたって、０．７９０ｍｌ水及び５０μｌフォリン−シオカルトー試薬の混合物に希釈抽出物２０μｌを加えた。次に１５０μＬ炭酸ナトリウム溶液を添加し、反応を停止させた。細胞抽出物中の総ポリフェノール濃度を測定するために用いたものと同様のアッセイ法を用い、得られた溶液を７６５ｎｍで測定し、没食子酸溶液の各種希釈用液から作成した検量線と比較した。
【００４５】
（実施例１１）新鮮なビルベリー細胞又は凍結乾燥細胞粉砕物からのポリフェノールの小規模抽出
培養液を除去したビルベリー細胞（０．５ｍＬ）又は５０ｍｇの粉砕ビルベリー細胞を、２．０ｍＬマイクロチューブ又は９６ウェルブロック（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）の１．２ｍＬチューブに採取した。各ビルベリー細胞試料には、酸水溶液（０〜２％クエン酸、酢酸又はアスコルビン酸）抽出溶媒（３０〜８０％のアセトン、エタノール、メタノール）を適量加え、超音波処理機又はビーズミルに配置して、ポリフェノール及び／又はプロシアニジンを抽出した。試料を６０００ｒｐｍ（ＲＣＦ  ５９９６）で４分間遠心分離した。解析前に、上清を０．４５ｕｍ膜フィルタでろ過し、同様の抽出溶媒水溶液で１０倍希釈してもよい（必要に応じて）。更なる解析に備え、残りの抽出物を−２０℃の冷凍庫で保管した。
【００４６】
（実施例１２）ビルベリー培養におけるプロシアニジン産生の解析
ＣＴＣ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ  ＰＡＬオートサンプラー（Ｌｅａｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｒｂｏｒｏ，ＮＣ，ＵＳＡ）、６００Ｓコントローラを備えたＷａｔｅｒｓ  ６２６型ポンプ、並びにＷａｔｅｒｓ  ２９９６光ダイオード−アレイ検出器（ＰＤＡ）を取り付けたＷａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣシステムを用い、ビルベリー細胞抽出物に対しＬＣ解析を実施し、１９０〜７８０ｎｍをスキャンした。０．３ｍＬ／分の一定流量で、水−０．１％ギ酸（溶媒Ａ）及びアセトニトリル−０．１％ギ酸（溶媒Ｂ）を用い、勾配溶出を実施した。溶媒Ｂを次の割合（ｖ／ｖ）で用い直線勾配を適用した（時間（分）、％Ｂ）：（０、７）、（５、１５）、（２０、７５）、（２５、１００）、（３５、１００）、（３５．１、７）、（４５、７）。カラムは、Ｕｌｔｒａ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｃ１８カラム（１００×２．１ｍｍ  ｉ．ｄ．，３．５μｍ）（Ｒｅｓｔｅｋ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ．ＵＳＡ）を使用した。プロシアニジンモノマーの（＋）−カテキン、（−）−エピカテキン、及びプロシアニジンオリゴマー（二量体から六量体）を２８０ｎｍで監視した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｑｕａｔｔｒｏマイクロトリプル四重極型質量検出器（Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）を使用し、ＭＳデータを得、ＭａｓｓＬｙｎｘ（商標）ソフトウェアで解析した。ｍ／ｚ  １５０〜１８００でスキャンを行い、フルスキャンデータを取得した。カテキン、エピカテキンの標準品をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入し、希釈し、代謝産物を検出及び定量するための検量線を作成した。
【００４７】
Ｗａｔｅｒｓ  ２７９５分離モジュール、Ｗａｔｅｒｓ  ９９６  ＰＤＡ検出器及びＷａｔｅｒｓ  ４７４蛍光検出器からなる順相ＨＰＬＣ系により、プロシアニジンの定量的な解析を実施した。極性プロトン性モノマー及び／又はオリゴマーの分離及び単離に関し改良された解析法である、Ｋｅｌｍ  ｅｔ  ａｌ．出典の手法により、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｄｉｏｌ（２５０×４．６ｍｍ  ＩＤ，粒径５μ）を用い、ビルベリー細胞抽出物に含まれるプロシアニジンの特性評価及び分離条件を得た。（米国特許第００７５０２０号）。移動相は、溶媒（Ａ）、アセトニトリル：酢酸（９８：２、ｖ／ｖ）並びに溶媒（Ｂ）、メタノール：水：酢酸（９５：３：２、ｖ／ｖ／ｖ）の二相からなる。３０℃にて、流速０．８ｍＬ／分で次のように直線勾配を用い溶出を実施した：０〜３５分、１００〜６０％  Ａ；３５〜４０分、６０％  Ａ；４０〜４５分、６０〜１００％Ａ。プロシアニジンオリゴマーの分離を、蛍光検出（励起波長２７６ｎｍ、放出波長３１６ｎｍ）、ＵＶ検出２８０ｎｍ（図１０Ａ）（Ｌａｚａｒｕｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４７（１９９９），３６９３）並びにＰＤＡ（図１０Ｂ）により監視した。
【００４８】
この解析手法は、新鮮なビルベリー細胞又は凍結乾燥細胞に含まれる１０種の異なるプロシアニジンをそれぞれ定量することを目的とする。検出することのできるプロシアニジンは、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体及び十量体である。
【００４９】
カカオ豆から調製したプロシアニジンの内部標準を用い、実施例２のＨＰＬＣを実施し、新鮮なビルベリー細胞、凍結乾燥したビルベリー細胞、並びにビルベリー細胞抽出物のそれぞれから調製した試料に含まれるプロシアニジンを定量した。
【００５０】
（実施例１３）ビルベリー懸濁培養のスケールアップ
植物細胞培養物を使用する際、目的生成物を安定的に得るということが共通して問題になる（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．２０（６）１６６６，２００４）。したがって、首尾よく植物細胞を大規模培養するには、安定的に生産性を維持することが重要になる。ビルベリー細胞の懸濁培養を１２５ｍＬのフラスコから２５０ｍＬのフラスコにスケールアップし、次に５００ｍＬのフラスコにスケールアップするという工程を首尾よく実施した。１２５ｍＬフラスコを用いた場合の増殖性及び産生量と同等になるよう、振盪器の速度を５００ｍＬフラスコ用に最適化した。３種の異なる振盪器速度、１００、１１０及び１２０ＲＰＭを試験した。すべての条件に関し、７日目の平均ＰＣＶは５０〜５５％であり、初期ＰＣＶの２０％の約２．５倍以上であった。しかしながら、１００ＲＰＭの場合と比較して、１１０ＲＰＭでの産生収率（ＰＹ）は優位に大きかった（Ｐ値＝０．００５）。しかしながら、１１０ＲＰＭ及び１２０ＲＰＭ間では、ＰＹに有意差は存在せず、１２０ＲＰＭで処理したフラスコでは色味がわずかに暗くなっていたため、５００ｍＬフラスコに好ましい振盪器速度として、１１０ＲＰＭを選択した。培養の７日毎に、培地中のバイオマス濃度、糖濃度、並びにポリフェノール及び／又はプロシアニジン生産性を測定した。
【００５１】
２．８Ｌフラスコへのスケールアップを実施し、振盪速度（ｒｐｍ）及び振盪ストローク幅を最適化した。これにより、１２５ｍＬ及び５００ｍＬフラスコにおいて、首尾よく同様の増殖率及び収率が得られる。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
【表２】
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【００５４】
【表３】
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【００５５】
【表４】
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【００５６】
【表５】
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【００５７】
本開示は、趣旨又は本質的な特徴から逸脱させずに、その他の特定の形態で実施することもできる。記載の実施例は、すべての点において、例示目的のみのものであり、制限を意図したものではないと見なされる。したがって、本開示の範囲は、ここまでに記載した内容ではなく、添付の特許請求の範囲により指定される。特許請求の範囲と同等である及び同等の範囲に含まれるすべての変更は、本発明の範囲内に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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