(57)【要約】  本発明は異なる成分、特に磁性粒子（Ｍ）と磁性粒子で標識された標的（細胞）（Ｃ＋Ｍ）を含む試料流体を処理するための手段に関する。本発明にかかる処理装置１００は、試料流体で満たされ得る、フィルタ要素１４０によって第２区画１３０から分離される第１区画１２０を持つ容器１１０を有する。フィルタ要素１４０は試料の少なくとも一つの選択成分（Ｍ）のみの通過を許可する。さらに、光学面１５０、例えば顕微鏡スライドが区画の一つ１２０に設けられる。この区画１２０にある試料の成分（Ｃ＋Ｍ）は光学面１５０上に集まる。試料成分（Ｍ，Ｃ＋Ｍ）の移動は好適には磁場（Ｂ１，Ｂ２）によって支援される。
2014517318.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学的処理のための試料流体の処理のための方法であって、前記試料流体が磁性粒子とともに異なる成分を有し、
ａ）容器の第１区画へ前記試料流体を導入するステップと、
ｂ）前記試料の少なくとも一つの選択成分を、前記第１区画を第２区画から分離するフィルタ要素を通過させながら、少なくとも一つの他の成分の通過が妨げられる、ステップと、
ｃ）前記容器の前記第１区画若しくは前記第２区画に配置される光学面上に前記試料の少なくとも一つの成分を収集するステップと、
ｄ）前記フィルタ要素にわたる非ゼロ磁場勾配と前記フィルタ要素に垂直な磁力線を持つ磁場を第１フェーズ中に生じるステップと、
ｅ）前記フィルタ要素に平行な磁力線を持つ磁場を前記第１フェーズ後に生じるステップと
を有する方法。
【請求項２】
異なる成分を含む生物試料流体、特に磁性粒子を有する成分を持つ試料流体の処理のための方法であって、
ａ）容器の第１区画へ前記試料を導入するステップと、
ｂ）前記試料の少なくとも一つの選択成分を、前記第１区画を第２区画から分離するフィルタ要素を通過させながら、少なくとも一つの他の成分の通過が妨げられる、ステップと、
ｃ）前記容器の前記第１区画若しくは前記第２区画に配置される光学面上に前記試料の少なくとも一つの成分を収集するステップと
を有する方法。
【請求項３】
異なる成分を含む試料流体、特に磁性粒子を有する成分を持つ試料流体を処理するための処理装置であって、
前記試料流体で満たされ得る第１区画と第２区画を持つ容器と、
前記区画間に配置される、前記試料の少なくとも一つの選択成分の通過を許可しながら少なくとも一つの他の成分の通過が妨げられる、フィルタ要素と、
前記区画の一つに配置される、前記試料の少なくとも一つの成分がその上に収集され得る、光学面と
を有する処理装置。
【請求項４】
前記フィルタ要素が所定サイズ未満の物体を通過させながら大きな物体を遮断することができる構造を有する、請求項１若しくは２に記載の方法又は請求項３に記載の処理装置。
【請求項５】
前記フィルタ要素が前記試料の少なくとも一つの成分を特異的に結合及び／又は反発する、請求項１若しくは２に記載の方法又は請求項３に記載の処理装置。
【請求項６】
前記フィルタ要素にわたって動水圧勾配が生成され得る、請求項１若しくは２に記載の方法又は請求項３に記載の処理装置。
【請求項７】
前記区画の少なくとも一つにおいて及び／又は前記フィルタ要素にわたって磁場が、特に非ゼロ磁場勾配を持つ磁場が生成され得る、請求項１若しくは２に記載の方法又は請求項３に記載の処理装置。
【請求項８】
前記磁場の磁力線が前記フィルタ要素に垂直及び／又は平行である、請求項７に記載の方法又は処理装置。
【請求項９】
前記フィルタ要素にわたる非ゼロ磁場勾配及び前記フィルタ要素に垂直な磁力線を持つ磁場が第１フェーズ中に生成される、請求項２に記載の方法又は請求項３に記載の処理装置。
【請求項１０】
前記フィルタ要素に平行な磁力線を持つ磁場が前記第１フェーズ後に生成される、請求項９に記載の方法又は処理装置。
【請求項１１】
前記光学面が再び取り付けられ得るように前記容器から取り外し可能である、請求項１若しくは２に記載の方法又は請求項３に記載の処理装置。
【請求項１２】
前記光学面を観察するために顕微鏡対物レンズなどの光学的分析のために必要な特徴が前記容器に配置される、請求項１若しくは２に記載の方法又は請求項３に記載の処理装置。
【請求項１３】
前記光学面が前記試料の少なくとも一つの成分を特異的に結合し得る結合部位を有する、請求項１若しくは２に記載の方法又は請求項３に記載の処理装置。
【請求項１４】
前記第１区画及び／又は前記第２区画が室を通る流体の流れを生じるための少なくとも一つの流体接続を備える、請求項１若しくは２に記載の方法又は請求項３に記載の処理装置。
【請求項１５】
前記第１区画及び／又は前記第２区画が、片側に前記フィルタ要素を持ち、もう片側に前記光学面を持つ単一室を有する、請求項１若しくは２に記載の方法又は請求項３に記載の処理装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は異なる成分を有する、特に磁性粒子で標識された細胞を有する、生物試料流体の処理に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な生物検定においては、試料の特定成分が光学的検査のために調製され、これらの成分は最初に濃縮されるか及び／又は試料の他の部分から分離される必要がある。希少細胞の分析は例えばこれらの細胞が詳細にさらに分析され得る前に濃縮若しくは単離する技術を要する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
光学的に処理若しくは検査されるものとする関心成分を有する生物試料の単純で信頼できる処理を可能にする手段を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
この目的は請求項１及び２に記載の方法並びに請求項３に記載の処理装置によって達成される。好適な実施形態が従属請求項に開示される。
【０００５】
本発明にかかる方法は異なる成分を有する試料流体、特に血液若しくは唾液のような生物由来の試料流体の処理に関する。方法は以下のステップを有する：
ａ）容器の第１区画へ試料を導入するステップ。この導入は、例えばそれによって試料流体が第１区画へ入れられる毛細管力を利用して受動的に起こり得るか、又は流体力若しくは同様のものによって能動的に支援され得る。"区画"という語は、本発明の文脈において、流体によって満たされ得るほぼ任意の形状の空間をいうものとすることが留意されるべきである。区画は特にチャネルによって接続される一つ以上の室（すなわち小型‐例えば立方体状‐形状を持つ開放空洞）から成り得る。
ｂ）試料の少なくとも一つの選択成分を、第１区画を第２区画から分離するフィルタ要素を通過させながら、試料の少なくとも一つの他の成分の通過が妨げられるステップ。フィルタ要素を通る試料成分の通過は、受動的に、すなわち拡散によってのみ駆動されて起こり得るか、又は例えば動水圧若しくは不均一磁場を印加することによって能動的に支援され得る。
ｃ）第１区画若しくは第２区画に配置される光学面上に試料の少なくとも一つの成分を収集するステップ。先と同様に、この収集は受動的に起こり得るか若しくは能動的に支援され得る。フィルタ要素を通過する選択成分が光学処理に関して関心対象でない場合、光学面は第１区画（例えばその室のいずれか若しくは全て）に配置され得る。選択成分が関心対象である場合、光学面は典型的には第２区画に配置される。勿論各々第１及び第２区画に配置される二つの光学面上に試料の（異なる）成分を収集することも可能である。光学面はその上で所望の種類の光学的処理が起こり得る任意の表面、例えばその上で成分が顕微鏡、カメラ若しくは同様のものによって光学的に撮像され得る表面であり得る。
【０００６】
試料流体の成分は好適には磁性粒子で標識された成分であり得、"磁性粒子"という語は永久磁性粒子及び磁化可能粒子の両方、例えば超常磁性ビーズを有するものとする。磁性粒子のサイズは典型的には３ｎｍ乃至５０μｍに及ぶ。
【０００７】
本発明はさらに異なる成分を持つ試料流体を処理するための処理装置に関する。処理装置は以下の構成要素を有する：
その両方が随意にチャネルによって接続される複数の室から成り得る、第１区画と第２区画を持つ容器、第１区画は試料流体で満たされ得る。
上記第１区画と第２区画の間に配置され、試料の少なくとも一つの選択成分の通過を許可しながら少なくとも一つの他の成分の通過を妨げる、フィルタ要素。
上記室の一つに配置される、その上に試料の少なくとも一つの成分が集まり得る光学面。
【０００８】
処理装置により、上記種類の方法が実行され得る。従って方法について提供された説明と定義は処理装置にも当てはまり、逆もまた同様である。方法と処理装置は生物試料の単純で信頼できる処理、例えば光学処理のための調製を可能にする。これはそれによって試料の異なる成分が二つの区画へ選択的に分離され得るフィルタ要素を持つ容器の提供によって達成される。これはより速く、高濃度で、より高純度な光学面上への関心成分の収集を可能にし、ひいてはその後の光学的処理ステップの精度と効率を高める。
【０００９】
以下、上記種類の方法と処理装置の両方に関する本発明の様々な好適な実施形態が開示される。
【００１０】
第１の好適な実施形態によれば、フィルタ要素は所定サイズ未満の物体を通過させるが大きな物体は遮断することができる構造を有する。かかる構造は特に試料の所定部分（標的）よりも小さい直径を持つ孔を有し得る。従って標的はフィルタ要素を通過することができず、そのサイズに関して試料成分の分離をもたらす。最大直径の適切な閾値が手元の試料流体の組成に応じて選ばれ、典型的な値は大体０．０５μｍ乃至５０μｍに及ぶ。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、フィルタ要素は試料の少なくとも一つの成分を特異的に結合するか、及び／又は試料の少なくとも一つの成分を特異的に反発することができる。試料の成分を結合することによって、フィルタ要素はこの成分がもはや光学面上に集まることができないように効果的に除去する。例えば抗ＣＤ４５でフィルタ要素を被覆することで希少細胞試料の白血球バックグラウンドを軽減することができる。試料の成分をはじくことによって、フィルタ要素はこの成分が第１区画から第２区画へ通過するのを妨げる。結合及び反発の両方は作用する成分に関して非常に特異的であり得る。さらに、これらの過程は粒径以外の特性に基づく分離、例えば電荷、化学組成若しくは同様のものに基づく分離を可能にする。
【００１２】
処理装置若しくは方法はフィルタ要素にわたる動水圧勾配を生じる能力をさらに有し得る。フィルタ要素にわたる動水圧（例えば第２区画よりも第１区画において高い圧力）を生じるために例えば圧力発生器が設けられ得る。かかる動水圧はフィルタ要素を通る試料流体の流れを支援し、従ってフィルタ処理を加速する。圧力発生器は試料流体内の"標準"圧力に対して過大圧力（ｏｖｅｒｐｒｅｓｓｕｒｅ）を発生させる手段及び過小圧力（ｕｎｄｅｒｐｒｅｓｓｕｒｅ）を発生させる手段の両方を有し得る。
【００１３】
本発明の別の実施形態によれば、フィルタ処理を加速し得るフィルタ要素にわたる遠心力を生じるための回転手段が設けられ得る。回転手段は例えばその中に本発明にかかる一つ以上の容器が収容され（共通に）回転され得る装置を有し得る。
【００１４】
本発明の好適な実施形態において、区画の少なくとも一つにおける及び／又はフィルタ要素にわたる磁場、特に非ゼロ磁場勾配を持つ磁場を生じるための少なくとも一つの磁場発生器が設けられる。磁場発生器は特に永久磁石及び／又は電磁石を有し得る。磁場及び特に磁場勾配を利用して、試料内の磁性粒子が駆動され、例えば所望の方向に動かされ得るので、試料内の移動過程を加速する。さらに、磁場発生器は高い（誘導）磁気モーメントを持つ成分を容器の表面のいずれかの上に固定（不動化）しながら、小さい若しくはゼロ磁気モーメントを持つ成分は洗い流されるようにするために使用され得る。
【００１５】
上述の磁場発生器は特にフィルタ要素に垂直な磁力線及び／又はフィルタ要素に平行な磁力線を持つ磁場を生じるように構成され得る。磁場勾配の方向は試料中の磁性粒子に作用する磁力の方向を決定するが、磁力線の方向は磁性粒子のクラスタ若しくは鎖（又は回転非対称磁性粒子）が整列する方向に作用することを可能にする。
【００１６】
本発明の別の実施形態において、フィルタ要素にわたる非ゼロ勾配及びフィルタ要素に（ほぼ）垂直な磁力線を持つ磁場は容器の第１区画への試料の導入後の第１フェーズ中に生成される。磁場勾配のために、試料内の磁性粒子はフィルタ要素にわたるそれらをけん引する力に晒され、それによってかかる粒子の鎖は磁力線と一直線にフィルタ要素に垂直に配向される。結果として、磁性粒子の全鎖がフィルタ要素を通過し得る（その孔が単一磁性粒子を通過させるのに十分なほど大きい場合）。
【００１７】
上述のアプローチのさらなる展開例において、フィルタ要素に平行な磁力線を持つ磁場が第１フェーズ後に生成される。フィルタ要素の領域内で、この磁場は磁性粒子の鎖をフィルタ要素に平行に配向させ、これはそれらがフィルタの孔を通過することを妨げる（孔が鎖の長さよりも小さいという条件で）。従って第１フェーズにおいて、すなわち磁力線がフィルタに垂直だったときにフィルタ要素を通過した磁性粒子は、この後続フェーズ中にそれらが到達した室内に保持される。
【００１８】
本発明の別の実施形態において、光学面は、特にその後の試料処理のために装置全体を変更することなく容易に再び取り付けられ得るような方法で、容器から取り外し可能である。これは試料の処理のための容器の使用を可能にし、光学面上への関心成分の収集をもたらし、そしてこれはさらなる処理のために別の場所へ移動され得る。
【００１９】
意図した光学処理若しくは検査に応じて、光学面は全く異なる、特定設計を持ち得る。好適な実施形態において、光学面は（標準）顕微鏡スライドによって提供され、これは好適には区画の一室において取り外し可能に配置され、例えばその室の壁を形成する。これは多くの異なる光学検査装置における光学面の使用を可能にする。
【００２０】
単レンズ若しくは一つ以上の光ファイバなど、光学的分析に必要な顕微鏡対物レンズ若しくは他の特徴が、光学面の直接観察を可能にするような方法で処理装置の容器において配置され得る。そして試料成分の調製及び光学的評価が一つの同じ装置において実行され得る。
【００２１】
光学面は随意に試料の少なくとも一つの成分を特異的に結合する結合部位を有し得る。従ってこの成分は後の処理のために特異的に不動化され得る。
【００２２】
第１及び／又は第２区画は、この区画を通る流体の流れが生成され得るように、少なくとも一つの流体接続、例えば入口及び出口を設けられ得る。従って新鮮な試料流体が例えば連続的に若しくは間欠的に第１区画へ供給され得る。第２区画において、フィルタ要素を越えた試料の成分は流れとともに除去され得るので、それらが第１区画へ戻ることを防止する。
【００２３】
区画が一つ以上の室を有し得ることは既に述べた。好適な実施形態において、第１区画及び／又は第２区画は片側にフィルタ要素を持ち、もう片側に光学面を持つ単一室を有する。
【００２４】
本発明のこれらの及び他の態様は以下に記載の実施形態から明らかとなり、それらを参照して解明される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】第１及び第２区画が共に入口と出口を持つ、本発明の第１の実施形態にかかる処理装置の略側面図を示す。
【図２】本発明にかかる方法の連続ステップを示す。
【図３】本発明にかかる方法の連続ステップを示す。
【図４】本発明にかかる方法の連続ステップを示す。
【図５】本発明にかかる方法の連続ステップを示す。
【図６】フィルタ要素に垂直な磁力線が生成される、本発明にかかる方法の連続ステップを示す。
【図７】フィルタ要素に平行な磁力線が生成される、本発明にかかる方法の連続ステップを示す。
【図８】一体化顕微鏡対物レンズを持つ処理装置を示す。
【図９】第１区画が、チャネルによって接続される隣接室にわかれる、処理装置の一実施例を示す。
【図１０】第１区画が、弁構造を有するチャネルによって接続される隣接室にわかれる、処理装置の一実施例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
同様の参照数字若しくは１００の整数倍異なる数字は図面において同一若しくは同様の構成要素をあらわす。
【００２７】
以下、希少細胞の処理に関して本発明が記載されるが、これは様々な他の領域においても適用され得る。循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの希少細胞は免疫磁気捕捉法を用いて他の細胞の巨大プールから効果的に濃縮され得る。この方法は超常磁性ビーズに共有結合した抗体（特異的エピトープに対する）を伴う。かかるビーズの細胞への結合はこれら特異的エピトープを発現する細胞に特異的に力を及ぼす方法を提供する。他の細胞を洗い流しながら標識細胞を所定位置に磁気的に固定することによって、非常に高レベルの濃縮が実現され得る。標準病理学診断染色プロトコルをＣＴＣに適用できるようにするために、ＣＴＣは標準顕微鏡スライド上にある必要がある。
【００２８】
希少細胞の効率的な免疫磁気濃縮のために、選択される細胞の表面上で利用可能な空間と比較して大過剰な免疫磁気粒子（ビーズ）が試料に加えられる必要がある。それらの磁気的性質のためにこの過剰なビーズはその後の濃縮プロトコルを通じて細胞にとどまる。従って最終試料は、濃縮細胞は別にして、大量の遊離免疫磁気ビーズも含む。これらのビーズは細胞からとられる蛍光像の質を劣化させる。さらに、通常の顕微鏡検査中、大きなビーズクラスタの存在下で細胞形態学を評価することは困難である。従って細胞／ビーズクラスタを変化させることなく全ての遊離免疫磁気ビーズを効果的に除去することによってこれらの問題を解決する装置を持つことが望ましい。
【００２９】
本発明の一実施形態にかかる処理装置は上記問題に対処し、希少細胞の懸濁液から（過剰）免疫磁気ビーズ又は任意の他の小粒子若しくは細胞（赤血球のような）を除去するための機能を兼ね備える。希少細胞はその後、アッセイの一体部分として、例えば細胞イメージングのための顕微鏡において、光学イメージングに適した光学面上に沈着する。概して、処理装置は以下の特性によって特徴付けられる：
第１区画を持ち、この区画は一つ以上のチャネルによって接続される一つ以上の室から構成され得る。
第１区画の室の少なくとも一つは片側が孔を持つフィルタ要素に隣接する。
第１区画の室の少なくとも一つは片側が光学撮像面に隣接する。
【００３０】
処理装置は以下の方法に従って使用され得る：
試料が第１区画へ導入される。
例えば流体力、遠心力若しくは磁力を加えることによって、小さな試料成分がフィルタ要素を通過する。
例えば磁力、重力及び／又は流体力によって、大きな試料成分が第１区画を通って（場合により別の室へ）光学面へ向かって駆動される。
大きな試料成分が光学面上で光学的に撮像される。
【００３１】
図１は本発明の第１の実施形態にかかる処理装置１００の側面図を概略的に示す。処理装置１００は第１区画１２０と第２区画１３０を持つ容器１１０を有する。描かれた容器は放射対称であり得るが矩形であってもよい。クランプ若しくは接着によって、真空接続を用いて第１区画１２０の底部において標準顕微鏡スライド１５０を取り付け、密封することが可能である。顕微鏡スライド１５０は第１区画１２０の内部に面する光学面を提供する。第１及び第２区画は任意の適切な材料のフィルタ要素１４０によって隔てられる。
【００３２】
さらに、処理装置１００は第２区画１３０付近（上）に配置される第１磁石１６０と、第１区画１２０付近（下）に配置される第２磁石１７０を有する。点線で示す通り、第１磁石１６０はフィルタ要素１４０にほぼ垂直な磁力線を持つ磁場Ｂ１を生じ得るが、第２磁石１７０はフィルタ要素にほぼ平行な磁力線を持つ磁場Ｂ２を生じ得る。両磁石１６０及び１７０はフィルタ要素１４０にわたって非ゼロ磁場勾配を持つ磁場を生じる（第１磁石１６０の勾配は第１区画から第２区画へ向けられ、一方第２磁石１７０の勾配は逆方向である）。下部磁石１７０は好適には磁場が細胞沈着領域にわたって均一であるように設計され、顕微鏡スライド面にわたって細胞の均一な分布を促進する。
【００３３】
処理装置１００の第１区画１２０は入口１２１を通して試料の導入を可能にし、試料は典型的には細胞、免疫磁気ビーズ及びこれら二つの複合体の混合物である。出口１２２の存在は、場合によっては過剰免疫磁気ビーズの除去後、例えば固定剤若しくは他の試薬（抗体、ＦＩＳＨプローブなど）が区画を出入りして流されることを可能にするために、第１区画１２０を通る流れを可能にする。標識細胞は下部磁石１７０を用いてこれらの手順中に所定位置に維持され得る。
【００３４】
第２区画１３０は緩衝水溶液を保持し得る。図１の実施形態においてこの区画も流れを可能にする入口１３１と出口１３２を特徴とする。
【００３５】
第２区画１３０の上部のソレノイド電磁石１６０は第１区画１２０に存在する（超常）磁性粒子に力を及ぼし、それらを可変孔径及び表面を持つフィルタ要素１４０を越えて第２区画１３０へ移動させることができる。ビーズが細胞に結合しているか若しくは十分に大きい場合、磁石はそれらをフィルタ１４０に対して引き寄せる。小さな細胞がビーズで標識されるとき、それらも孔径に応じてフィルタを通って移動し、プロトコルにおいて追加選択ステップを実現する。
【００３６】
フィルタ要素１４０を通過できない大きな試料成分は、試料流体に懸濁した細胞、細胞集合体、若しくはより大きな組織片であり得る。それらは光学面１５０上に結合され得るか（例えば細胞のロバスト追加処理のため）、又は未結合のままであり得る（例えば細胞活性化を最小化するため若しくは追加細胞処理及び輸送を可能にするため）。光学面への細胞の結合は専用表面層（例えばポリエルリジン）によって仲介され得るか、化学的に促進され得るか（例えばタンパク質固定剤によって）、又はカバーマトリクス（例えばパラフィン層）を適用することによってなされ得る。標準顕微鏡スライド１５０の使用は細胞を任意の標準顕微鏡若しくは任意の特注設計染色／固定法に利用しやすいようにする。
【００３７】
規定孔径の多孔質表面を持つフィルタ要素１４０を用いることによって、遊離免疫磁気ビーズ及び／又は他の粒子が試料から選択的に除去され得る。ソレノイド磁石を用いることによって、フィルタに垂直な磁力線をもたらし、ビーズは第１区画から第２区画へ容易に移動する。装置の底部のＵ字型磁石はフィルタに平行な磁力線を持つ磁場を生じ、細胞をカバーガラス上に固定しながらビーズが第１区画に再び入るのを防ぐ。代替的に、装置への一部の変更により、サイズ選択フィルタにわたる駆動力として圧力差が使用され得る。標準顕微鏡スライドを装置に固定するために真空接続を用いることは装置を使いやすくする。
【００３８】
上記処理装置１００は磁石１７０を用いて細胞を標準顕微鏡ガラススライドの方へ引き付けることができるが、細胞結合を促進するために特殊ガラスコーティングと組み合わせて重力が代替的に使用され得る。
【００３９】
図２乃至５は例示的な細胞調製の連続ステップを図示する。この目的で使用される処理装置２００は上記装置１００の若干修正されたバージョンである。
【００４０】
図２は免疫磁気標識された細胞Ｃ＋Ｍと、過剰免疫磁気ビーズＭを含む試料が入口２２１を通して容器２１０の第１区画２２０へロードされる第１ステップを図示する。
【００４１】
図３によれば、磁気ビーズＭは上部磁石２６０を用いてフィルタ要素２４０を通って引き付けられるが、標識細胞Ｃ＋Ｍは試料ロード領域２２０にとどまる。第２区画２３０を通る流れを加え、ビーズＭは第２区画から除去され得る。流れはポンプ２８０で生成され得る。
【００４２】
図４は標識細胞Ｃ＋Ｍをフィルタ２４０から光学面１５０（顕微鏡スライド）上へ引き付ける磁場を生じる下部磁石２７０の駆動を示す。容器内部から、特に第１区画２２０から全液体を除去した後、容器２１０全体が除去され、ユーザに磁気標識細胞のみを含む顕微鏡スライド２５０を残す（図５）。フィルタと顕微鏡スライドは交換性であり、随意に機能化され得る。
【００４３】
図６及び７は第２（上部）区画３３０が液体のために閉じられ（ただしベントされる）、ビーズＭと標識細胞Ｃ＋Ｍを分離する唯一のメカニズムとして磁気捕捉（すなわちビーズ鎖がフィルタ面に垂直になる）が使用される、処理装置３００の一実施形態を示す。これは装置構造を単純化する。
【００４４】
図６は第１区画３２０を試料で満たした後の磁気捕捉の手順における第１フェーズを示す。（例えばソレノイド）磁石３６０がフィルタ３４０に（ほぼ）垂直な磁力線Ｂ１を生じる。これらの磁力線は磁力線に整列する傾向があるビーズの鎖の通過を促進する。
【００４５】
図７によれば、第１区画３２０の下の（例えばＵ字型）磁石３７０がその後使用され、免疫磁気標識細胞Ｃ＋Ｍを顕微鏡ガラススライド３５０の方へ引き付け、それらをそこに保持する。Ｕ字型磁石はより急な磁場勾配、従ってビーズ及びビーズ／細胞複合体により強い力を生じる。同時に磁力線Ｂ２はビーズ鎖をフィルタ３４０に平行に配向させ、それによってそれらがフィルタを通過して第１区画へ再び入るのを防ぐ。これは免疫磁気ビーズが試料領域に再び入るのを防ぐためにそれらを洗い流す必要がないため、第２区画３３０がすすぎ若しくは洗いのための接続を必要としないことを意味する。
【００４６】
図８は一体化顕微鏡対物レンズ４９０を有する処理装置４００を図示する。細胞は装置内にとどまりながら可視化されカウントされ得る。
【００４７】
図９は第１区画がチャネルによって接続される隣接室５２０ａ及び５２０ｂにわかれる処理装置５００の一実施例を示す。
【００４８】
図１０は第１区画がチャネルによって接続される隣接室６２０ａ及び６２０ｂにわかれる処理装置６００の別の実施例を示す。弁６９０ａ、６９０ｂ、６９０ｃを有する弁構造は流体の流れを逆転させる前の試料のフィルタリングと、光学検出／分析室６２０ａへ向かう試料のポンプを可能にする。
【００４９】
上記発明の実現はその一部が以下に記載される多くの方法で変更若しくは拡張され得る。
【００５０】
顕微鏡スライドは容器と顕微鏡スライドの間の"粘着性"界面を接着することによって可逆的に取り付けられ得る。界面は粘着性ゴム層若しくは接着剤、例えば両面テープを有し得る。代替的な実施形態において顕微鏡スライドは真空圧を用いてカートリッジに取り付けられる。
【００５１】
処理装置は随意にその全体が逆さまに回転され得る。これは重力がフィルタ要素を越えて粒子を駆動する方向の反転を可能にする。かかるアプローチは細胞に対するせん断応力を最小化する。
【００５２】
別の実施形態において処理装置は、よく標識された細胞を所定位置に固定しながら他の物体を圧力差誘起による流れによって操作することによって、大量の磁気ビーズを結合した細胞からあまり磁気標識されていない物体を分離するために使用される。これは非特異的標識白血球を激減させることによってＣＴＣの濃縮を増すのに役立ち得る。
【００５３】
一実施形態においてフィルタ要素（多孔質材）は細胞の結合を防ぐように機能化され、及び／又は顕微鏡スライド（光学面）は細胞接着を促進する試薬を含む。代替的に、フィルタは非特異的標識された細胞に対する抗体で機能化され、例えばフィルタは白血球をそれに結合するように抗ＣＤ４５抗体で被覆され得る。このようにしてこれらの白血球は撮像されない。
【００５４】
典型的なフィルタ要素は多孔質膜を有し得るが、フィルタ要素は所定サイズ／ボリュームと組み合わせてある程度の柔軟さ（ｆｌｏｐｐｉｎｅｓｓ）を持つ細胞のみを通過させる構造を含む複合フィルタでもあり得る。フィルタ要素に適した物質の典型例は有機若しくは無機物質である。例えば：ポリカーボネート、ナイロン、ニトロセルロース、シリコン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）。
【００５５】
一実施形態において多層のフィルタがフィルタ要素の有効性とスループットを増すために組み合わされる。
【００５６】
下部磁石は、派生磁場が顕微鏡スライド上の一つの規定スポットに磁気標識細胞を集中させるような方法で（永久に若しくは動的に）改変され得る。高細胞密度を得ることによってスキャン時間が短縮され、自動焦点顕微鏡に伴う問題（最小試料密度を要する）が回避される。
【００５７】
一実施形態において第１区画は図示よりも小さい場合があり、一方顕微鏡スライドは横方向に動かされ得る。これは一つの顕微鏡ガラススライド上で多試料の沈着を可能にする。
【００５８】
さらなる実施形態において顕微鏡スライドの異なる領域が標的領域における細胞の（部分的）分離を可能にする異なる試薬で機能化される。これは異なる細胞種に対する異なるパターニングをもたらす。パターンは抗体若しくは表面変質化学薬品から構成され得る。
【００５９】
一実施形態において処理装置はサイズ選択装置として使用される。多量の体液がフィルタ要素を通して汲み上げられ、その後フィルタの横断を妨げるサイズと剛性パラメータを持つ細胞が、例えば磁石を用いることによって若しくは（パルス）圧力反転及びその後のガラス表面への沈殿によって、容易に顕微鏡スライドへ移動され得る。
【００６０】
処理装置の変更された実施形態はまた、フィルタ要素にわたって過剰駆動力を生じるために第１及び／又は第２区画を加圧（若しくは真空に）し得る。そして磁石は圧力駆動流とは無関係に標識物体を操作するために使用され得る。フィルタにわたる圧力勾配は所望のビーズ配置（鎖など）のための磁力と適合するように必要な桁まで調節され得る。
【００６１】
要約すると、本発明は懸濁液中の細胞、特に循環腫瘍細胞のガラス顕微鏡スライドへの移動、及び改良された画質のために非結合磁気ビーズの除去を可能にする処理装置を提供する。スライドは固定及び染色ステップのために処理され得るか、若しくはルーチン病理学ワークフローに入るために除去され得る。システムのモジュール性は、磁気標識若しくはサイズ及び剛性に基づく細胞分離の中で、コア装置に顕著な変更なく多数の他の（分子）生物学的機能を可能にする。処理装置のフィルタは交換され、装置は逆流及び／又は洗浄緩衝液を用いることによって洗浄され得る。
【００６２】
本発明のさらなる特徴は：
生物試料と磁気ビーズの混合物から磁気ビーズを分離するためのフィルタ、光学基板及び磁石を持つ装置。
Ｕ字型磁石の適用。
第１磁石と反対の追加磁石の適用。
光学基板が装置から除去可能であること。
フィルタが３Ｄ構造フィルタであること。
光学基板が細胞の特異的結合のため若しくはこの結合を抑制するための層を持つこと。
大量マイクロ流体工学／流体ポンプを可能にする。
染色法が固定後に実行され得る。
顕微鏡スライドが追加染色のために撮像後に再度再接続され得る。
処理装置は特殊用途のために採用された蛍光スキャナでのｉｎ‐ｓｉｔｕスキャンのためにも使用され得る。
【００６３】
本発明は非常に広範に応用され得る。遊離免疫磁気ビーズがビーズ／細胞混合物から分離されることを要する任意の用途が特に本発明の利益を享受し得る。また、試薬が細胞の上を流されながら細胞が表面に磁気的に固定されることを要する任意の用途が本発明を使用し得る。
【００６４】
本発明は図面と上記説明において詳細に図示され記載されているが、かかる図示と記載は例示若しくは説明であって限定ではないとみなされるものとする。本発明は開示の実施形態に限定されない。開示の実施形態への他の変更は、図面、開示及び添付の請求項の考察から請求される発明を実施する上で当業者によって理解されもたらされることができる。請求項において"有する"という語は他の要素若しくはステップを除外せず、不定冠詞"ａ"若しくは"ａｎ"は複数を除外しない。特定の手段が相互に異なる従属請求項に列挙されるという単なる事実はこれら手段の組み合わせが有利に使用されることができないことを示すものではない。請求項における任意の参照符号は範囲を限定するものと解釈されてはならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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