(57)【要約】  本発明は、神経変性疾患の治療に使用するための医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性疾患の予防または／および治療における使用のための医薬組成物であって、ｄｅｓＰｒｏ36エキセンジン−４（１−３９）−Ｌｙｓ6−ＮＨ2または／およびその薬学的に許容しうる塩、ならびに場合により薬学的に許容しうる担体、補助剤または／および補助物質を含む組成物。
【請求項２】
ｄｅｓＰｒｏ36エキセンジン−４（１−３９）−Ｌｙｓ6−ＮＨ2または／およびその薬学的に許容しうる塩が非経口投与のために製造された、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項３】
神経変性疾患が、酸化的ストレス、神経突起完全性の喪失、アポトーシス、ニューロン喪失または／および炎症反応を含む、請求項１または２に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項４】
神経変性疾患が認知障害と関連する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、レビー小体型認知症、パーキンソン病認知症てんかん、脳卒中、ハンチントン舞踏病、脳低酸素、多発性硬化症および末梢ニューロパシーからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項６】
末梢ニューロパシーが真性糖尿病と関連している、請求項５に記載の使用のための組成物。
【請求項７】
神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病および脳卒中からなる群から選択される、請求項５に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
アルツハイマー病が初期段階のアルツハイマー病である、請求項５に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
パーキンソン病が初期段階のパーキンソン病である、請求項５に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
ｄｅｓＰｒｏ36エキセンジン−４（１−３９）−Ｌｙｓ6−ＮＨ2または／およびその薬学的に許容しうる塩が１０μｇ〜２０μｇの範囲から選択される日用量で投与するために製造される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
神経変性疾患を予防または／および治療する方法であって、それを必要とする患者に請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項１２】
神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病および脳卒中からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
組成物が疾患修飾性反応を誘発する、請求項１１または１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は神経変性疾患の予防または／および治療に使用するための医薬組成物であって、ｄｅｓＰｒｏ36エキセンジン−４（１−３９）−Ｌｙｓ6−ＮＨ2または／およびその薬学的に許容しうる塩、および場合により薬学的に許容しうる担体、補助剤（adjuvant）または／および補助物質（auxiliary substance）を含む組成物である。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病
アルツハイマー病（ＡＤ）は、特に連合新皮質（associative neocortex）および海馬における皮質ニューロンの喪失を生じ、これにより、次に認知機能の遅延および進行性喪失をもたらし、最終的に認知症および死に至る神経変性障害である。この疾患の主な特徴は、誤って折り畳まれたタンパク質の凝集および沈着（非特許文献１；非特許文献２）：（１）細胞外の老人性または神経炎の「斑（plaques）」としての凝集ベータアミロイド（Ａβ）ペプチド、および（２）細胞内の神経原線維の「もつれ（tangles）」（ＮＦＴ）としての過リン酸化タウタンパク質である。
【０００３】
ＡＤは、遺伝子的に２つの形態：（１）早発性家族性アルツハイマー病（＜６０歳）、および（２）遅発性散発性ＡＤ（＞６０歳）に分けられる。アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、プレセニリン１（ＰＳＥＮ１）およびプレセニリン２（ＰＳＥＮ２）遺伝子に突然変異を起こすまれな疾患は、早発性家族性アルツハイマー病を生じることが知られており、さらに、ＡＰＯＥ（対立遺伝子４）は、遅発性ＡＤにとって一つの最も重要な危険因子である（非特許文献１）。
【０００４】
タンパク質酸化および脂質過酸化によって示されるミトコンドリアの機能障害および酸化的ストレスは、ＡＤ脳の特徴である。活性酸素種（ＲＯＳ）の生成と、抗酸化剤による化学活性種の分解との不均衡が、酸化的ストレスをもたらす。Ａβは、直接的な酸化効果を有するだけなく、ミトコンドリア酸化還元活性を阻害してフリーラジカルを増加させることもできる。ニューロンは、哺乳動物の他の細胞タイプと比較して抗酸化剤のレベルが低いので酸化的ストレスに対して非常に影響を受けやすいと考えられるため、ＲＯＳの増加をあまり防ぐことができない。初代ニューロン培養物にＡβを添加すると、ＡＴＰアーゼの阻害、細胞電位の変化、およびＣａ2+流入を生じる（非特許文献３；非特許文献４）。
【０００５】
今のところ、この深刻な疾患については治癒することがなく、米国食品医薬品局（US Food and Drug Administration）（ＦＤＡ）によって承認されたわずかな処置は、ＡＤの進行を停止しないというよりも、むしろ症状の改善に部分的に有効なだけである（非特許文献５、非特許文献６）。現在、ＡＤに対して認可された薬学的療法は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、たとえばタクリン、ドネピジル（Donepizil）、リバスチグミン、ガランタミンおよびＮＭＤＡ受容体アンタゴニストメマンチンである。これらの薬物の効果は非常に限定されており、主な作用は、疾患の発生を予防するというよりも、むしろ症状を軽減することである。他の薬物は、スタチン（コレステロールレベル低下剤）、降圧剤、抗炎症剤、またはその他のように「認可外」で得てもよい。これらの薬物は、いずれもＡＤの進行を遅らせることが立証されているわけではない（非特許文献７；非特許文献８）。ＡＤを治療するための他の戦略は、研究中である。ニューロン成長因子α（Neuronal Growth Factor α）（ＮＧＦ）は、老人斑を減らし、認知機能を改善できることがわかっている（非特許文献９）。
【０００６】
インスリン抵抗性は、現在、ＡＤの主要問題の１つとして知られている（非特許文献１０）ため、インスリン自体の代わりに、インクレチンホルモングルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）のような他の成長因子が、前臨床研究において良好な効果を示している。ＧＬＰ−１インクレチン類似体リラグルチドは、ＡＤのトランスジェニックマウスモデルの脳においてアミロイド斑の数を低減し、ベータアミロイドレベルを低下させ、認知障害およびシナプス機能障害を予防し、炎症反応を軽減し、かつシナプス成長および神経発生を増強した（非特許文献１２）。脳内のアミロイド斑および関連する炎症反応は、ＡＤの鍵となる特徴である。類似の保護効果は、ＡＤのトランスジェニックマウスモデルにおいて別のＧＬＰ−１類似体受容体アゴニストで見いだされた（非特許文献１３）。
【０００７】
パーキンソン病
パーキンソン病（ＰＤ）は、一般に黒色線条体ニューロンの選択的変性、ドーパミン合成能の大幅な低下およびそれに伴う線条体ドーパミン受容体との係合不全を特徴とする、筋運動の慢性神経変性障害である（非特許文献１５）。この疾患が臨床的に明らかになる前には、おそらく、アポトーシス、興奮毒性、フリーラジカルが介在する神経炎症性事象が同時発生的に起こる結果として、黒質緻密部（ＳＮｃ）では黒色線条体ニューロンが静かに死に至る。ＰＤの病理を停止するための治癒をもたらす治療戦略、またはそのための手段は、依然としてわかっていない。確立された薬物療法は本質的に待期的であり、すべての患者において有効なわけではない。アポトーシス細胞死は、選択的黒色線条体ニューロン死の中心となる構成要素の１つであるため（非特許文献１６）、将来の治療戦略は、抗アポトーシス性を有する生体分子の標的設定された使用を含むことがありうる。別法として、神経栄養性またはドーパミン作動性表現型を有する細胞の神経発生を刺激する能力を有する分子によってプラスの治療効果を生じることがありうる。最近、興奮毒性ストレスにかけたＰＣ１２細胞の培養液中で、グルカゴン様ペプチド−１受容体（ＧＬＰ−１）アゴニストエキセンジン−４が神経栄養的（neurotrophic）（非特許文献１７）および神経保護的（neuroprotective）（非特許文献１８）性質を示すことが観察されている。近年では、２つのＰＤマウスモデルで確立されると、エキセンジン−４は、黒質病変の進行を停止するか、または回復させることさえあることが示されている（非特許文献１９）。さらに、エキセンジン−４処置は、ＰＤの１−メチル−４−フェニル−１,２,３,６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）マウスモデルにおいて、ドーパミン作動性ニューロンを変性に対して保護し、ドーパミンレベルを保ち、かつ運動機能を改善したことが示されている（非特許文献２０）。
【０００８】
ハンチントン病
ハンチントン病（ＨＤ）は、不随意の身体運動、ならびに精神医学的異常および認知異常を特徴とする遺伝性の神経変性障害である。ＨＤの原因となる遺伝的欠陥としては、ＨＤ遺伝子のエキソン１中のＣＡＧトリヌクレオチドリピートの伸長によりハンチンチン（ｈｔｔ）タンパク質中のポリグルタミン伸長を生じることが挙げられる。これにより異常処理および有害な細胞内凝集に至る。最近、エキセンジン−４処置は、膵臓および脳における突然変異体（ｈｔｔ）包含物（inclusions）の発生を抑制し、代謝効果および運動機能障害を改善し、かつＨＤマウスの生存を延長することが示されている（非特許文献２１）。
【０００９】
脳卒中
脳卒中の病態生理学としては、アポトーシスを経た皮質および線条体ニューロンの死が挙げられる（非特許文献２２）。最近、エキセンジン−４の投与は、一過性中大脳動脈閉塞脳卒中マウスモデルにおいて脳損傷を軽減し、かつ機能性結果を改善したことが示されている（非特許文献２０）。スナネズミにおける脳虚血モデルでは、エキセンジン−４を用いたＧＬＰ−１受容体刺激は、一過性脳虚血性損傷に対してミクログリアの活性化を妨げることによって虚血関連のニューロン死を弱めたことがさらに示されている（非特許文献２３）。非特許文献２４は、エキセンジン−４が脳虚血再灌流障害マウスモデルにおいて有効であることを示した。エキセンジン−４処置は、梗塞体積を著しく低減し、かつ機能障害を改善した。
【００１０】
末梢性感覚ニューロパシー
糖尿病の個体の約６０〜７０％は、ある程度の神経学的損傷、特に手および／または足の感覚障害、胃運動性の低下または手根管症候群を生じるニューロパシーを有する。長期にわたる高血糖および関連する代謝性障害によって生じる神経学的損傷を回復させることが立証された療法は、今のところない。ＧＬＰ−１発現は、節状神経節のニューロン中で確認されており、末梢神経伝達におけるＧＬＰ−１の役割が示唆されている（非特許文献２４）。糖尿病にかかっていない齧歯動物においてピリドキシンに誘導された末梢ニューロパシーの齧歯動物モデルでは、ＧＬＰ−１およびｓ．ｃ．エキセンジン−４により、ピリドキシンに誘導されたいくつかの機能的および形態学的欠陥に対して部分的に保護されることと、軸索寸法の正常化を促進することとが示された（非特許文献２６）。
【００１１】
認知機能、気分および記憶：
ＧＬＰ−１受容体アゴニストは、モリス水迷路中の測定のとおり齧歯動物において認知機能を増強することができる。ＧＬＰ−１受容体ノックアウトマウスは、海馬ＧＬＰ−１受容体遺伝子導入後に回復する学習障害（learning deficiency）を特徴とする表現型を有する（非特許文献２７）。近年では、非特許文献２８は、成体齧歯動物における海馬に関連する認知行動および気分関連行動において長期にわたるエキセンジン−４処置の効果を示した。別の研究では、糖尿病のマウスモデルの脊髄神経節に見いだされた多発性ニューロパシーは、エキセンジン−４によって回復した（非特許文献２９）。高脂肪食により誘導された肥満およびインスリン抵抗性を有するマウスの認知機能および海馬シナプス可塑性においては、別のＧＬＰ−１類似体、リラグルチドが有益な効果を及ぼすことが示されている（非特許文献３０）。
【００１２】
グルカゴン様ペプチド１
グルカゴン様ペプチド１、ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１（７−３６）は、プログルカゴン遺伝子中にコードされた３０アミノ酸ペプチドホルモンである。それは主に腸の腸内分泌Ｌ細胞中で産生され、そして脂肪、タンパク質加水分解産物および／またはグルコースを含む食物が十二指腸に入ると血流中に分泌される。ＧＬＰ−１によって活性化される最も広範に研究された細胞は、膵臓のインスリン分泌性ベータ細胞であり、ここで、その決定的な作用は、グルコースに誘導されたインスリン分泌の増大である。ベータ細胞中でＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）が活性化されると、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）が活性化されてｃＡＭＰが産生され、次に、セカンドメッセンジャー経路、たとえばプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）およびＥｐａｃ経路のｃＡＭＰ依存性活性化に至る。グルコースに誘導されたインスリン分泌を増強する短期効果と同様に、持続的なＧＬＰ−１Ｒ活性化もまた、インスリン合成、ベータ細胞増殖および新生を高める（非特許文献３１）。さらにまた、ＧＬＰ−１は、一般にグルカゴンの濃度を調節し、胃排出を遅らせ、（Ｐｒｏ−）インスリンの生合成を刺激し、インスリンに対する感受性を高め、そしてインスリンに依存しないグリコーゲンの生合成を刺激する（非特許文献３２；非特許文献３３；非特許文献３４）。
【００１３】
過去２０年にわたる研究活動から、インスリンおよびグルカゴン分泌におけるＧＬＰ−１の特定の効果によって、現在、天然のＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）アゴニスト、エキセンジン４を用いて２型真性糖尿病（Ｔ２ＤＭ）を治療することになっている（非特許文献３１）。
【００１４】
膵臓とは異なる組織（脳、腎臓、肺、心臓および主要な血管）では、ＧＬＰ−１は、特異的グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇ−タンパク質）結合型受容体を活性化することができる。
【００１５】
ＧＬＰ−１は、成長因子様性質と同様に神経保護的性質を示している（非特許文献３５）。また、ＧＬＰ−１は、海馬ニューロンのアポトーシスの誘導を低減し、かつ空間的および連想的学習を改善する（非特許文献２７）。非特許文献３７は、ＧＬＰ−１が、培養されたラット海馬ニューロンをグルタメートに誘導されたアポトーシスから完全に保護することができたことを報告した。ＧＬＰ−１類似体（Ｖａｌ８）ＧＬＰ−１およびＮ−アセチル−ＧＬＰ−１は、海馬のシナプス伝達（ＬＴＰ）の長期増強における顕著な効果を示している（非特許文献３５）。ＧＬＰ−１類似体リラグルチドは、ＡＤのトランスジェニックマウスモデルの海馬においてアミロイド斑の数を低減し、ベータアミロイドレベルを低下させ、認知欠陥およびＬＴＰうつ病を予防し、炎症反応を軽減し、かつシナプス成長および神経発生を増強した（非特許文献１２）。
【００１６】
ＧＬＰ−１、リラグルチドおよびエキセンジン−４は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することが示されている（非特許文献３６；非特許文献１２）。非特許文献３７は、ＧＬＰ−１およびエキセンジン−４が脳内のベータアミロイドおよびニューロン内のアミロイド前駆体タンパク質のレベルを低下させることを見いだした。エキセンジン−４またはリラグルチドを用いた長期的処置は、成体マウス海馬歯状回において細胞増殖および神経芽細胞分化に影響を及ぼす（非特許文献３８；非特許文献３９）。
【００１７】
リラグルチドは、式Ａｒｇ34，Ｌｙｓ26（Ｎε（γ−グルタミル（Ｎα−ヘキサデカノイル）））ＧＬＰ−１（７−３７）を有するＧＬＰ−１類似体である。リラグルチドは、通常、非経口的に投与される。
【００１８】
化合物ｄｅｓＰｒｏ36エキセンジン−４（１−３９）−Ｌｙｓ6−ＮＨ2（ＡＶＥ００１０、リキシセナチド）は、エキセンジン−４の類似体である。リキシセナチドは、特許文献１に配列番号９３として開示されている：
配列番号：１：リキシセナチド（４４ＡＳ）
Ｈ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｑ−Ｍ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ａ−Ｖ−Ｒ−Ｌ−Ｆ−Ｉ−Ｅ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−ＮＨ2
配列番号：２：エキセンジン−４（３９ＡＳ）
Ｈ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｑ−Ｍ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ａ−Ｖ−Ｒ−Ｌ−Ｆ−Ｉ−Ｅ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｓ−ＮＨ2
配列番号：３：ＧＬＰ−１（７−３６）（３０ＡＳ）
Ｈ−Ａ−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ｅ−Ｇ−Ｑ−Ａ−Ａ−Ｋ−Ｅ−Ｆ−Ｉ−Ａ−Ｗ−Ｌ−Ｖ−Ｋ−Ｇ−Ｒ
【００１９】
エキセンジンは、血中グルコース濃度（blood glucose concentration）を低下させることができるペプチドの一群である。エキセンジンは、ＧＬＰ−１（７−３６）と約５０％のアミノ酸配列同一性を有する。したがって、エキセンジンはＧＬＰ−１類似体として一般にみなされない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】ＷＯ０１／０４１５６
【非特許文献】
【００２１】
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【非特許文献４１】Sherer, T.B. Kim, J.-H, Betarbet, R. and Greenamyre, J.T., Subcutaneous Rotenone Exposure Causes Highly Selective Dopaminergic Degeneration and α-Synuclein Aggregation, 2003, Experimental Neurology, 179: 9-16.
【非特許文献４２】Lotharius, J., Barg, S., Wiekop, P., Lundberg, C., Raymon, H.K., and Brundin, P., Effect of Mutant α-Synuclein on Dopamine Homeostasis in a New Human Mesencephalic Cell Line, 2002, Journal of Biological Chemistry, 277: 38884-38894.
【非特許文献４３】Lotharius, J., Falsig, J., van Beek, J., Payne, S., Dringen, R., Brundin, P., and Leist, M., Progressive Degeneration of Human Mesencephalic Neuron-Derived Cells Triggered by Dopamine-Dependent Oxidative Stress Is Dependent on the Mixed-Lineage Kinase Pathway, 2005, Journal of Neuroscience, 25: 6329-6342.
【非特許文献４４】Tanner, C.M., Kamel, F., Ross, G.W. Hoppin, J.A.,  Goldman, S.M., Korell, M., Marras, C., Bhudhikanok, G.S., Kasten, M.,  Chade, A.R. Comyns, K., Richards, M.B., Meng, C., Priestley, B., Fernandez, H.H.,  Cambi, F., Umbach, D.M., Blair, A., Sandler, D.P., and Langston, J.W., Rotenone, Paraquat, and Parkinson's Disease, 2011, Environmental Health Perspectives, 119: 866-872.
【非特許文献４５】Kim, S., Moon, M. and Park, S., Exendin-4 protects dopaminergic neurons by inhibition of microglial activation and matrix metalloproteinase-3 expression in an animal model of Parkinson's disease, 2009, J. Endocrinology, 202: 431-439.
【非特許文献４６】Dubois B. et al. Revising the definition of Alzheimer's disease: a new lexicon. Lancet Neurol. 2010; 9: 1118-27.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
リキシセナチドは、天然のエキセンジン−４配列のＣ末端切断（truncation）を特徴とする。リキシセナチドは、エキセンジン−４に存在しない６個のＣ末端リシン残基を含む。これまで、Ｃ末端リシン残基は薬物が血液脳関門を通過するのを妨げることがあるため、リキシセナチドはＣＮＳ障害、特に神経変性疾患の治療に適した薬物とは考えられていなかった。今のところ、リキシセナチドが、特定のまたは／および調節された機構によって血液脳関門を越えて輸送できることは、示されていない。
【００２３】
本発明の実施例１では、リキシセナチドが、ＧＬＰ−１類似体リラグルチドおよびエキセンジン−４と比較して優れた性質を有することを示しており、これらはいずれも、現在、２型糖尿病の治療剤として用いられている：
（ａ）驚くべきことに、リキシセナチドは血液脳関門を通過することができる。本発明のデータは、高濃度での輸送速度が最大レベルに限定されるため、この輸送が調節されることを示している。さらにまた、リキシセナチドは、リラグルチドと比較してより少ない非経口用量で脳内に取り込まれる。
（ｂ）リキシセナチドは脳においてＧＬＰ−１受容体を活性化するおよびｃＡＭＰ製造を誘導する。驚くべきことに、リキシセナチドは、リラグルチドよりも高いレベルのｃＡＭＰを産生し、同じ用量でＧＬＰ−１受容体を活性化する際により高い有効性を示す。
（ｃ）リキシセナチドは、歯状回において前駆細胞の増殖を誘導することができる。同じ用量で投与した場合、エキセンジン−４またはリラグルチドと比較して、リキシセナチドは増強された効果をもたらす。神経変性疾患において、これらの効果は、疾患修飾性効果（disease-modifying effect）を構成することができる。
（ｄ）リキシセナチドは、リラグルチドと比較したときに、歯状回における優れた神経保護効果（細胞ストレスに対して）を示した。
（ｅ）驚くべきことに、１２００μＭメチルグリオキサールストレスからＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞を保護するには、１０ｎＭリキシセナチドの用量を用いた前処置で十分であった。１２００μＭメチルグリオキサールストレスから細胞を保護するには、２００ｎＭリラグルチドの用量が必要であり、保護を誘導するには、より低用量のリキシセナチドで十分であることを示している（また、ＧＬＰ−１アゴニストを用いた前処置によって得られた実施例２のデータを参照のこと）。
【００２４】
実施例２は、２ｍＭメチルグリオキサールストレスまたは１ｍＭ  Ｈ2Ｏ2ストレスからＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞を保護するには、リキシセナチドを用いた後処置で十分であったことを示している。対照的に、リラグルチドは、ＭｇまたはＨ2Ｏ2によるストレスから細胞を保護しなかった。
【００２５】
実施例３では、リキシセナチドは、ロテノン処置ＬＵＨＭＥＳ細胞において神経変性に対する有意な神経保護効果を示した。リキシセナチドは、他のＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）アゴニストと比較して利点を提供する。ロテノン処置ＬＵＨＭＥＳ細胞において、リキシセナチドは、リラグルチドより３倍低い濃度で有意に活性であり、結果的に実施例１のメチルグリオキサールモデルで見られた予想外の優れた活性効果を支持している。エキセナチドは、０．３および１μＭの濃度で、有意な効果を誘発しなかった。対照的に、リキシセナチドはこれらの濃度で生存率の用量依存的改善をもたらす。
【００２６】
実施例４では、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルの脳においてin vivoリキシセナチド処置によりアミロイド斑負荷（load）が減少することが示されている。したがって、リキシセナチドは、その神経保護性に加えて、アミロイド斑のような脳病理学的病変を縮小することができ、そのためアルツハイマー病にとって魅力的な予防剤または／および治療剤となる。リラグルチド（２５ｎｍｏｌｍ／ｋｇ）についてMcLean et al (2011)によって以前に記載された用量よりも低い用量（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）で活性が観察される。
【００２７】
したがって、リキシセナチドは、本明細書に記載された神経変性疾患、たとえばアルツハイマー病、パーキンソン病または／および脳卒中の治療または／および予防に適している。
【００２８】
本発明の第１の態様は、神経変性疾患の予防または／および治療に使用するための医薬組成物であって、ｄｅｓＰｒｏ36エキセンジン−４（１−３９）−Ｌｙｓ6−ＮＨ2または／およびその薬学的に許容しうる塩、ならびに場合により薬学的に許容しうる担体、補助剤または／および補助物質を含む組成物である。
【００２９】
本発明の別の態様は、神経変性疾患の治療に使用するための医薬組成物であって、ｄｅｓＰｒｏ36エキセンジン−４（１−３９）−Ｌｙｓ6−ＮＨ2または／およびその薬学的に許容しうる塩、ならびに場合により薬学的に許容しうる担体、補助剤または／および補助物質を含む組成物である。
【００３０】
神経変性疾患は、任意の神経変性疾患、特に酸化的ストレス、神経突起の完全性（neurite integrity）の喪失、アポトーシス、ニューロンの喪失または／および炎症反応に関連する神経変性疾患であってもよい。
【００３１】
本発明において、神経突起の完全性の喪失としては、樹状突起棘喪失、シナプス可塑性の喪失、または／および新たな代償性神経突起発芽の喪失が挙げられる。
【００３２】
神経変性疾患は、認知障害と関連することがある。
【００３３】
特に、神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、レビー小体型認知症、パーキンソン病認知症、てんかん、脳卒中、ハンチントン舞踏病、脳低酸素、多発性硬化症および末梢ニューロパシーからなる群から選択される。末梢ニューロパシーは、真性糖尿病に関連していてもよい。
【００３４】
神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソンの疾患および脳卒中からなる基から選択されることが好ましい。
【００３５】
また、神経変性疾患は、進行性核上麻痺、多系統萎縮症、レビー小体型認知症、パーキンソン病およびパーキンソン病認知症からなる群から選択されることが好ましい。これらの疾患のいずれか１つは、パーキンソニズムと関連していてもよい。
【００３６】
進行性核上麻痺および多系統萎縮症は、パーキンソンプラス症候群（Parkinson-plus syndromes）としてまとめて知られている。
【００３７】
本発明において、パーキンソニズムは、振戦、運動機能低下、筋固縮または／および姿勢保持障害といったような特有の症状の組合せを特徴とする神経学的症候群である。
【００３８】
一実施態様において、神経変性疾患はアルツハイマー病である。アルツハイマー病は、酸化的ストレスおよびニューロン喪失と関連していることがある。
【００３９】
別の実施態様において、神経変性疾患はパーキンソン病である。パーキンソン病は、酸化的ストレス、炎症性反応、アポトーシス、ニューロン喪失、特にドーパミン作動性ニューロンの喪失、たとえば、ドーパミンの欠乏を生じる黒質のニューロン喪失と関連していることがある。ニューロン喪失は、アポトーシスによって生じることがある。
【００４０】
別の実施態様において、神経変性疾患は進行性核上麻痺である。進行性核上麻痺は、ニューロン喪失、特にドーパミン作動性ニューロンの喪失と関連していることがある。
【００４１】
別の実施態様において、神経変性疾患は多系統萎縮症である。多系統萎縮症は、ニューロン喪失、特にドーパミン作動性ニューロンの喪失と関連していることがある。
【００４２】
別の実施態様において、神経変性疾患はレビー小体型認知症である。レビー小体型認知症は、ニューロン喪失、特にドーパミン作動性ニューロンの喪失と関連していることがある。レビー小体型認知症は、パーキンソン病と関連していることがある。
【００４３】
別の実施態様において、神経変性疾患はパーキンソン病認知症である。パーキンソン病認知症は、ニューロン喪失、特にドーパミン作動性ニューロンの喪失と関連していることがある。特に、パーキンソン病認知症はパーキンソン病と関連している。
【００４４】
さらに別の実施態様において、神経変性疾患は脳卒中である。脳卒中は、虚血によって生じるニューロン喪失と関連していることがあり、その際、虚血は、閉塞（たとえば血栓症または動脈塞栓症）または出血によって生じることがある。
【００４５】
さらに別の実施態様において、神経変性疾患は多発性硬化症であり、これはＣＮＳの炎症過程と関連していることがある。
【００４６】
本発明のデータは、（ａ）リキシセナチドが、神経保護または／および神経発生（neurogenerative）効果を提供すること、および（ｂ）リキシセナチドが、エキセンジン−４またはリラグルチドのような他のＧＬＰ−１アゴニストと比較して優れていることを示している。したがって、リキシセナチドは、アルツハイマー病、パーキンソン病および脳卒中のような神経変性疾患において疾患修飾性効果を提供することができる。特に、リキシセナチドの投与は、神経保護および神経発生（neurogeneration）により疾患の進行を遅らせ、それによって生活の質を改善することができるため、神経変性疾患の初期段階の治療に適している。
【００４７】
したがって、本発明の一態様において、神経変性疾患は初期段階にある。たとえば、アルツハイマー病は、初期段階のアルツハイマー病であってもよい。初期段階のアルツハイマー病（ＡＤ）は、前駆期アルツハイマー病（prodromal Alzheimer's disease）または前認知症期アルツハイマー病（predementia Alzheimer's disease）と称することもある（非特許文献４６）。初期段階のアルツハイマー病は、以下のように定義することができる：患者が、裏付けとなるバイオマーカーデータと関連する客観的記憶愁訴（objective memory complaint）またはアルツハイマー病の病理を示す：脳脊髄液（ＣＳＦ）中で、タウタンパク質比率よりも低いレベルのβアミロイド４２（Ａｂ４２）ペプチドが見出されるか、またはE. Lilly (Avid)からのＡｍｙＶｉｄTMのようなａｍｙｏｉｄ ＰＥＴ（ポジトロン放出断層撮影）剤によって脳のアミロイド斑が検出される。
【００４８】
別の例において、パーキンソン病は初期段階のパーキンソン病であってもよい。さらに別の例において、進行性核上麻痺は初期段階の進行性核上麻痺であってもよい。さらに別の例において、多系統萎縮症は初期段階の多系統萎縮症であってもよい。別の例において、レビー小体型認知症は初期段階のレビー小体型認知症であってもよい。さらなる例において、パーキンソン病認知症は初期段階のパーキンソン病認知症であってもよい。
【００４９】
さらにまた、リキシセナチドは、特に明確な診断を有することなく神経変性疾患を患っていることが疑われる患者における神経変性疾患の予防に適している。本発明の別の態様において、本明細書に記載された医薬組成物は、神経変性疾患の予防に使用するためにある。
【００５０】
本発明の文脈において、ｄｅｓＰｒｏ36エキセンジン−４（１−３９）−Ｌｙｓ6−ＮＨ2（リキシセナチド）は、その薬学的に許容しうる塩を包含する。リキシセナチドの薬学的に許容しうる塩は、当業者に知られている。本発明に用いるリキシセナチドの好ましい薬学的に許容しうる塩は、酢酸塩である。
【００５１】
本発明では、ｄｅｓＰｒｏ36エキセンジン−４（１−３９）−Ｌｙｓ6−ＮＨ2または／およびその薬学的に許容しうる塩を、治療効果を誘導するために十分な量で、それを必要とする患者に投与してもよい。
【００５２】
本発明では、ｄｅｓＰｒｏ36エキセンジン−４（１−３９）−Ｌｙｓ6−ＮＨ2または／およびその薬学的に許容しうる塩を、適した薬学的に許容しうる担体、補助剤または／および補助物質と共に処方してもよい。
【００５３】
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載された神経変性疾患において本明細書に記載されたその神経保護および神経発生効果によって疾患修飾性効果を提供する。特に、疾患修飾性反応は、本明細書に記載された神経変性疾患、たとえば、本明細書に記載されたアルツハイマー病、パーキンソン病、進行性核上麻痺、多系統萎縮症、レビー小体型認知症、パーキンソン病認知症、てんかん、脳卒中、ハンチントン舞踏病、脳低酸素、多発性硬化症、および末梢ニューロパシーの治療において得ることができる。
【００５４】
本発明の医薬組成物は、非経口的に、たとえば注射（たとえば、筋肉内または皮下注射によって）によって投与してもよい。適した注射器具、たとえば、活性成分を含むカートリッジと注射針とを含む、いわゆる「ペン」が知られている。化合物ｄｅｓＰｒｏ36エキセンジン−４（１−３９）−Ｌｙｓ6−ＮＨ2または／およびその薬学的に許容しうる塩は、適した量、たとえば用量当たり１〜５０μｇ、用量当たり５〜４０μｇ、用量当たり１０〜３０μｇ、用量当たり１０〜１５μｇ、または用量当たり１５〜２０μｇの範囲の量で投与してもよい。
【００５５】
本発明では、化合物ｄｅｓＰｒｏ36エキセンジン−４（１−３９）−Ｌｙｓ6−ＮＨ2または／およびその薬学的に許容しうる塩は、１〜５０μｇの範囲、５〜４０μｇの範囲、１０〜３０μｇの範囲、１０〜２０μｇの範囲、１０〜１５μｇの範囲、または１５〜２０μｇの範囲の日用量で投与してもよい。本発明の組成物は、１日当たり１回の注射によって投与してもよい。
【００５６】
本発明では、本発明の組成物を液体組成物として提供してもよい。非経口投与に適したリキシセナチドの液体組成物は、当業者に知られている。本発明の液体組成物は、酸性または生理学的ｐＨを有してもよい。酸性ｐＨは、好ましくはｐＨ１〜６．８、ｐＨ３．５〜６．８またはｐＨ３．５〜５の範囲である。生理学的ｐＨは、好ましくはｐＨ２．５〜８．５、ｐＨ４．０〜８．５またはｐＨ６．０〜８．５の範囲である。ｐＨは、薬学的に許容しうる希釈された酸（典型的にＨＣｌ）または薬学的に許容しうる希釈された塩基（典型的にＮａＯＨ）によって調整してもよい。
【００５７】
本発明の液体組成物は、適した防腐剤を含んでもよい。適した防腐剤は、フェノール、ｍ−メタクレゾール、ベンジルアルコールおよびｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルから選択してもよい。好ましい防腐剤は、ｍ−メタクレゾールである。
【００５８】
本発明の液体組成物は、等張化剤を含んでもよい。適した等張化剤は、グリセロール、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、グルコース、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ2のようなカルシウムまたはマグネシウム含有化合物から選択してもよい。グリセロール、ラクトース、ソルビトール、マンニトールおよびグルコースの濃度は、１００〜２５０ｍＭの範囲であってもよい。ＮａＣｌの濃度は、最高１５０ｍＭであってもよい。好ましい等張化剤は、グリセロールである。
【００５９】
本発明の液体組成物は、メチオニン０．５μｇ／ｍＬから２０μｇ／ｍＬまで、好ましくは１μｇ／ｍＬから５μｇ／ｍＬまでを含んでもよい。好ましくは、液体組成物は、Ｌ−メチオニンを含む。
【００６０】
本発明のさらに別の態様は、本明細書に記載された医学的適応症を予防または／および治療する方法に関する。たとえば、本方法は、本明細書に記載された医薬組成物の投与を含んでもよい。本方法は、本明細書に記載された神経変性疾患を予防または／および治療する方法であってもよい。
【００６１】
特に、本明細書に記載された方法は、たとえば神経保護または／および神経発生によって疾患修飾性反応を誘発する。
【００６２】
本発明の方法では、その神経保護および神経発生効果による疾患修飾性療法は、本明細書に記載された神経変性疾患において本明細書に記載された医薬組成物を投与することによって提供される。特に、疾患修飾性反応は、本明細書に記載された神経変性疾患、たとえば、本明細書に記載されたアルツハイマー病、パーキンソン病、進行性核上麻痺、多系統萎縮症、レビー小体型認知症、パーキンソン病認知症、てんかん、脳卒中、ハンチントン舞踏病、脳低酸素、多発性硬化症および末梢ニューロパシーの治療において得ることができる。
【００６３】
本発明の方法では、本明細書に記載された治療有効量の医薬組成物を投与する。
【００６４】
本発明のさらに別の態様は、本明細書に記載された医学的適応症を治療する薬剤を製造するための本明細書に記載された組成物の使用に関する。たとえば、本発明の組成物は、本明細書に記載された神経変性疾患を予防または／および治療する薬剤を製造するために用いることができる。
【００６５】
本発明を、以下の実施例および図によってさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】（Ａ）ｉ．ｐ．生理食塩水ビヒクル（vehicle）（０．９％ｗ，ｖ  ＮａＣｌ）またはｉ．ｐ．リキシセナチド（２．５、２５または２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ体重）注射３０分後に野生型雌マウス（ｎ＝５、平均週齢２４週）の脳で測定した総リキシセナチド濃度（ｐｍｏｌ／ｌ）。値は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。（Ｂ）ｉ．ｐ．生理食塩水ビヒクル（０．９％ｗ，ｖ  ＮａＣｌ）またはｉ．ｐ．リキシセナチド（２．５、２５または２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ体重）注射３時間後に野生型雌マウス（ｎ＝５、平均週齢２４週）の脳で測定した総リキシセナチド濃度（ｐｍｏｌ／ｌ）。値は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。*ｐ＜０．０５。
【図２】（Ａ）ｉ．ｐ．生理食塩水ビヒクル（０．９％ｗ，ｖ  ＮａＣｌ）またはｉ．ｐ．リラグルチド（２．５、２５または２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ体重）注射の３０分後に野生型雌マウス（ｎ＝５）の脳で測定した総リラグルチド濃度（ｐｍｏｌ／ｌ）。値は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。（Ｂ）ｉ．ｐ．生理食塩水ビヒクル（０．９％ｗ，ｖ  ＮａＣｌ）または、ｉ．ｐ．リラグルチド（２．５、２５または２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ体重）注射３時間後に野生型雌マウスの脳で測定した総リラグルチド濃度（ｐｍｏｌ／ｌ）。値は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。*ｐ＜０．０５。
【図３−１】（Ａ）分析３０分前の２５ｎｍｏｌ／ｋｇ ｂｗリラグルチドｉｐの注射は、対照と比較して脳のｃＡＭＰの有意な増加を示した（ｐ＜０．０５；ｔ検定）。（Ｂ）分析３０分前の２５ｎｍｏｌ／ｋｇ ｂｗリキシセナチドｉｐの注射は、対照と比較して脳のｃＡＭＰの有意な増加を示した（ｐ＜０．０１；ｔ検定）。
【図３−２】（Ｃ）リラグルチドの効果をリキシセナチドと直接比較したときに、薬物間の有意差が見いだされた（ｐ＜０．０５；ｔ検定）。
【図４】エキセンジン−４、リラグルチドまたはリキシセナチド２５ｎｍｏｌ／ｋｇｂｗのいずれかを１日１回、３週間注射した際の歯状回の細胞増殖における効果（ＢｒｄＵ染色）。値は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。リキシセナチドは、エキセンジン−４およびリラグルチド（ｐ＜０．０５）ならびに対照（ｐ＜０．０１）と比較して増加した細胞増殖性活性を示す。
【図５】リキシセナチドｉｐ．１日１回３週間（２５ｎｍｏｌ／ｋｇ ｂｗ ｉｐ．）の長期的注射の組織学的分析。ＢｒｄＵ免疫組織学的分析では、より新たな細胞が歯状回脳領域において見いだされた。また、より若いニューロンが見いだされた（二重コルチン染色）。値は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。*＝ｐ＜０．０５、**＝ｐ＜０．０１。
【図６Ａ】（Ａ）ＬＤＨアッセイ。リキシセナチドを用いたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の前処置、続いてメチルグリオキサールストレス。（***＜０．０００１）。１２００μＭメチルグリオキサールストレスから細胞を保護するには、１０ｎＭリキシセナチドの用量で十分であった。
【図６Ｂ】（Ｂ）ＬＤＨアッセイ。リラグルチドを用いたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の前処置、続いてメチルグリオキサールストレス。*ｐ＜０．０５。**ｐ＜０．００１、***ｐ＜０．０００１）。１２００μＭメチルグリオキサールストレスから細胞を保護するには、２００ｎＭリラグルチドの用量で十分であった。１０ｎＭまたは１００ｎＭのより低い用量では、効果を示さなかった。
【図７Ａ】メチルグリオキサール（Ｍｇ）および過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）処置後のリキシセナチドまたはリラグルチドを用いたストレス後処置(Post-Stress treatment)。Ｘ軸は種々のアッセイ条件に相当し、Ｙ軸は吸光度を表す。*＝ｐ＜０．０５、**＝ｐ＜０．０１。（Ａ）リキシセナチド後処置。
【図７Ｂ】メチルグリオキサール（Ｍｇ）および過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）処置後のリキシセナチドまたはリラグルチドを用いたストレス後処置(Post-Stress treatment)。Ｘ軸は種々のアッセイ条件に相当し、Ｙ軸は吸光度を表す。*＝ｐ＜０．０５、**＝ｐ＜０．０１。（Ｂ）リラグルチド後処置。
【図８Ａ】リキシセナチドまたはリラグルチドを用いた前処置、続いてメチルグリオキサール（Ｍｇ）ストレス。Ｘ軸は種々のアッセイ条件に相当し、Ｙ軸は吸光度を表す。*＝ｐ＜０．０５、***＝ｐ＜０．００１。（Ａ）リキシセナチドの前処置効果（Pre-treatment effect）
【図８Ｂ】リキシセナチドまたはリラグルチドを用いた前処置、続いてメチルグリオキサール（Ｍｇ）ストレス。Ｘ軸は種々のアッセイ条件に相当し、Ｙ軸は吸光度を表す。*＝ｐ＜０．０５、***＝ｐ＜０．００１。（Ｂ）リラグルチドの前処置効果（Pre-treatment effect）
【図８Ｃ】リキシセナチドまたはリラグルチドを用いた前処置、続いてメチルグリオキサール（Ｍｇ）ストレス。Ｘ軸は種々のアッセイ条件に相当し、Ｙ軸は吸光度を表す。*＝ｐ＜０．０５、***＝ｐ＜０．００１。（Ｃ）エキセンジン−４の前処置効果（Pre-treatment effect）
【図９】さまざまな濃度のリキシセナチドの存在下でのＬＵＨＭＥＳ細胞の神経保護（ロテノン暴露により誘導された標準化細胞生存率減少のパーセンテージ逆転として表した）。Ｒｏｔ．＝ロテノン。ＮＳ＝有意でない；*＝ｐ＜０．０５；***＝ｐ＜０．００１。
【図１０】さまざまな濃度のエキセンジン−４／エキセナチドの存在下でのＬＵＨＭＥＳ細胞の神経保護（ロテノン暴露により誘導された標準化細胞生存率減少のパーセンテージ逆転として表した）。Ｒｏｔ．＝ロテノン。ＮＳ＝有意でない。*＝ｐ＜０．０５。
【図１１】さまざまな濃度のリラグルチドの存在下でのＬＵＨＭＥＳ細胞の神経保護（ロテノン暴露により誘導された標準化細胞生存率減少のパーセンテージ逆転として表した）。Ｒｏｔ．＝ロテノン。ＮＳ＝有意でない。***＝ｐ＜０．００１。
【図１２】リキシセナチド処置は、アルツハイマー病トランスジェニックマウスの脳におけるアミロイド斑負荷を低減する。７ヵ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスにおける７０日間のリキシセナチド処置（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、毎日）は、脳皮質の断面におけるベータアミロイド免疫組織化学およびβアミロイドについて陽性の％領域の測定によって定量化したとおり、脳におけるベータアミロイド斑負荷を低減する。値は、平均＋／−ＳＥＭ（**＝ｐ＜０．０１）である。
【図１３】リキシセナチド処置は、アルツハイマー病トランスジェニックマウスの脳におけるアミロイド斑負荷を低減する。７ヵ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウス（アルツハイマー病モデル）における７０日間のリキシセナチド処置１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、ｉ．ｐ．毎日）は、脳皮質の断面におけるコンゴーレッドを用いた組織学的染色およびコンゴーレッドについて陽性の％領域の測定によって定量化したとおり、脳における成熟したアミロイド斑負荷を低減する。値は、平均＋／−ＳＥＭ（*＝ｐ＜０．０５）である。
【００６７】
〔実施例１〕
リキシセナチドは、通常、非経口的に投与されるペプチド薬物である。アルツハイマー病、パーキンソン病、進行性核上麻痺、多系統萎縮症、レビー小体型認知症、パーキンソン病認知症または脳卒中のような神経変性疾患に対して活性を誘発するためには、リキシセナチドは、血液脳関門を通過しなければならない。リキシセナチドは、特に非経口的に投与したとき、リキシセナチドが、以下の特徴の１つ又はそれ以上を提供する場合、神経変性疾患の治療または／および予防に適している：
（ａ）リキシセナチドが血液脳関門を通過することができる、
（ｂ）リキシセナチドが脳のＧＬＰ−１受容体を活性化し、受容体活性化によって生理学的効果を誘導する、
（ｃ）リキシセナチドが、適したモデルにおいて疾患修飾効果を提供する、
（ｄ）リキシセナチドが、適したモデルにおいて神経保護する、および
（ｅ）リキシセナチドは、リラグルチドまたはエキセナチドのような他のＧＬＰ−１受容体アゴニストを超える利点を提供する。
【００６８】
脳によるリキシセナチド取込み
本実施例では、ＧＬＰ−１受容体アゴニストリキシセナチドが血液脳関門（ＢＢＢ）を通過したかどうかを記述する。３つの用量（２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ ｂｗ、２５ｎｍｏｌ／ｋｇ ｂｗおよび２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ ｂｗ、ｉｐ．）を試験し、注射後３０分および３時間のマウス脳組織中に見いだされたレベルを検査した。リキシセナチドレベルは、すべての用量での送達３０分後に増強され、また、低レベル（２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ ｂｗ）および中レベル（２５ｎｍｏｌ／ｋｇ ｂｗ）の両方では検出されたが、しかし、リキシセナチド２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ ｂｗの高用量では検出されなかった。この違いは、脳へのリキシセナチドの輸送が調節されており、ここで試験した高濃度のリキシセナチドの流入が制限されていることを示唆している（図１）。
【００６９】
脳におけるリキシセナチド取込みとリラグルチド取込みとの比較
リキシセナチドについての上の結果をＧＬＰ−１アゴニスト、リラグルチド（Novo Nordiskによるビクトーザ）についての結果と比較した。上で議論し、図１および２に示すように、リキシセナチドレベルは、２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ ｂｗ ｉｐ．の最も低い用量で脳における有意な増加を示したのに対して、リラグルチドは、この用量で増加を示さず（図２）、リキシセナチドがリラグルチドよりも低い濃度で脳に取り込まれることを示唆している。
【００７０】
この所見から、リキシセナチドでは、リラグルチドと比較して血液脳関門を通過するためにより低い用量のリキシセナチドが必要となり、その結果、リラグルチドと比較してより低い用量で本明細書に記載された神経変性疾患に対して治療効果を発揮することができることが結論付けられる。
【００７１】
脳におけるＧＬＰ−１受容体活性化／ｃＡＭＰの産生
予備的な研究は、リキシセナチドがｃＡＭＰレベルの強化と関連のある膵臓ＧＬＰ−１受容体を活性化することを示している（総説については、たとえば、非特許文献３１を参照のこと）
本実施例では、初めてリキシセナチドのｉ．ｐ．注射が脳のｃＡＭＰの量を高めることを初めて示しており、これはリキシセナチドが脳のＧＬＰ−１受容体を活性化することを示している（図３ｂ）。ＧＬＰ−１受容体におけるリキシセナチド（２５ｎｍｏｌ／ｋｇ ｂｗ ｉ．ｐ．）の効果とリラグルチド（２５ｎｍｏｌ／ｋｇ ｂｗ ｉ．ｐ．、結果については図３ａを参照のこと）の効果との直接比較を図３ｃに示す。リキシセナチドは、同じ用量でリラグルチドよりも有意に高いレベルのｃＡＭＰを産生し（*＝ｐ＜０．０５）、リキシセナチドのより高い有効性を示している。
【００７２】
脳におけるリキシセナチドの神経発生効果／疾患修飾効果
ニューロン前駆体幹細胞増殖におけるリキシセナチドｉ．ｐ．エキセンジン−４  ｉ．ｐ．およびリラグルチドｉ．ｐ．の３週間の長期的注射の効果を調べた。歯状回において増強された幹細胞増殖が見いだされた（ＢｒｄＵ染色、図４および５）。驚くべきことに、エキセンジン−４またはリラグルチドと比較したときに、リキシセナチドは細胞増殖（*＝ｐ＜０．０５）を有意に増強し、これは、同じ用量で注射したときに、リキシセナチドが、エキセンジン−４およびリラグルチドよりも脳においてより有効であることを示している。
【００７３】
さらに、リラグルチド（二重コルチン染色、データは示さず）と比較したときに、リキシセナチド注射後、歯状回の若いニューロンの数が増加し、前駆細胞がニューロンに分化することを示している。これは、リキシセナチドが持続的な改善を誘導することを示している。
【００７４】
幹細胞（増殖および分化）におけるリキシセナチドのこれらの効果は、脳修復にとって重要な態様であり、そのため、これらの効果は、アルツハイマー病、パーキンソン病および脳卒中のような神経変性疾患において疾患修飾効果を提供することができる。
【００７５】
脳におけるリキシセナチドの神経保護効果
神経細胞培養研究では、リキシセナチドが細胞ストレス条件で神経保護効果を有するかどうかを調べるため、リキシセナチドを試験してきた。毒性の薬物メチルグリオキサールを用いて細胞生存率を低減させた。リキシセナチドの添加は、用量依存的に神経保護効果を示し（図６ａ）、最も低い濃度のメチルグリオキサールを用いたすべての用量で１００％の保護が得られ、試験した最も高い濃度のメチルグリオキサールででさえ保護が維持された。１２００μＭメチルグリオキサールストレスから細胞を保護するには１０ｎＭリキシセナチドの用量で十分であった。
【００７６】
さらに、リキシセナチドはリラグルチドと比較して優れた保護を示した。図６ｂでは、リラグルチドが１０ｎＭの用量で細胞を保護することができなかったことを示している。１２００μＭメチルグリオキサールストレスから細胞を保護するためには、２００ｎＭリラグルチドの用量が必要であり、１０または１００ｎＭのより低い用量は、効果を示さなかった。
【００７７】
物質および方法
脳におけるｃＡＭＰの測定
動物
一群当たり５匹の雌野生型（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）マウスを用いた。ｃＡＭＰ測定のため、２５ｎｍｏｌ／ｋｇ体重（ｂｗ）のリラグルチド、リキシセナチドまたは２つの別々の実験における対照として生理食塩水（０．９％ｗ．ｖ．）を用いてマウスにｉ．ｐ．注射した。注射後３０分のマウス脳を直ちに摘出し、瞬間凍結した。
【００７８】
ｃＡＭＰの組織抽出
０．１Ｍ ＨＣｌを用いてそれぞれの脳を抽出した。組織１ｇ当たり１０ｍｌの０．１Ｍ ＨＣｌを加えた。試料を超音波処理し、次いで４℃、１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を洗い流し、ダイレクトｃＡＭＰ ＥＬＩＳＡキット（Enzo Life Sciences）による測定に直接用いた。キット中に提供された０．１Ｍ ＨＣｌを用いて希釈液を作った。
【００７９】
免疫組織化学
ペントバルビトン（０．３ｍｌ；Euthanal, Bayer AG, Leverkusen, ドイツ）で麻酔をかける１８時間前に、動物にＢｒｄＵ（１８０ｍｇ／ｋｇ ｂｗ；ｉ．ｐ．）を投与し、ＰＢＳ、続いて４％パラホルムアルデヒドを用いて経心臓的に（transcardially）灌流させた。脳を摘出し、ＰＢＳ中の３０％スクロース中に一夜置いた。ＢｒｄＵまたはダブルコルチン（ＤＣＸ）について免疫組織化学を４５μｍ浮遊性切片（free floating sections）において実施した。３％過酸化水素中の切片のインキュベーションによって内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチした。ＤＮＡの変性には、２Ｎ ＨＣｌ、続いて０．１Ｍホウ砂中の１０分間のインキュベーションが含まれる。切片を、ＢｒｄＵ（１：２００、マウスモノクローナル抗ＢｒｄＵ、Sigma）またはＤＣｘ痛風ポリクローナル抗ダブルコルチン（１：２００、Santa Cruz、米国、ｓｃ−７１０）についての一次抗体中、４℃で一夜インキュベートした。次いで、二次抗体（１：２００、ウマ抗マウス、Vector elite ABCキット、マウス、Vector laboratories）を適用した。切片を、アビジンビオチン酵素試薬中でインキュベートし、そしてベクターＳＧ基質色素原中でインキュベートし、詳細については（Gengler et al. 2010を参照のこと）。
【００８０】
顕微鏡検査
切片は、オリンパスＣＸ４０顕微鏡を用い、立体解析学的技術を用いて分析した。これは、ランダムにセクショニングを開始することと、歯状回（ＤＧ）の顆粒細胞層（ＧＣＬ）を通して第５切片ごとに集めることとを含む。分析は、×４０対物レンズを用いて実施し、５．１ＭＰｉｘデジタルカメラを用いて代表的な画像を撮影した。各薬物群について、４〜６匹のマウス脳を分析した。各脳について８〜１２個の切片を取り出した。分析した脳領域は、ブレグマの−１．３ｍｍから−２．５ｍｍまでの範囲であった。ｌｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨのフリーウェア、http://rsbweb.nih.govl/ij/)を用いてＤＧ中のすべての陽性細胞を計数した。ＧＣＬでは、ＢｒｄＵまたはＤＣＸについて陽性の細胞を計数した。
【００８１】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞系統
ＳＨ−ＳＹ５Ｙは、１９７０年に４歳女児の転移性神経芽細胞腫部位の骨髄生検から樹立された、３回クローニングされたヒト神経芽細胞腫細胞系統である。この細胞は、ドーパミンベータ水酸化酵素活性、アセチルコリン作動性、グルタミン酸作動性かつアデノシン作動性である。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、浮遊細胞と接着細胞との混合物として増殖する他に、多数の短くて細かい細胞突起（cell processes）により神経芽細胞のクラスターを形成する。レチノイン酸およびコレステロール処置は、細胞に樹状突起の成長および分化を強いることができる。
【００８２】
リキシセナチドまたはリラグルチドを用いたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の前処置、続いてメチルグリオキサールストレス
１０％熱不活性化（５６℃で２０分間加熱した）ウシ胎児血清およびペニシリンおよびストレプトマイシンを補充した、Ｆ１２（１：１）およびＧｌｕｔａｍａｘ入りのダルベッコ最少必須培地中でＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を培養し、５％ＣＯ2、３７℃の加湿されたインキュベーター中でインキュベートした。細胞を集密度８０％でトリプシン処理し、トリパンブルー排除方法（Countess, Invitrogen）により細胞を計数した後、ラミニンコートした９６−ウエルプレート（Nunc, Inc）において細胞生存率９５％で２×１０4の細胞を培養した。細胞付着の１２時間後、１０ｎＭ、１００ｎＭおよび２００ｎＭの異なる用量でリキシセナチドまたはリラグルチドを用いて細胞を前処置し、続いて濃度３００μＭ、６００μＭ（および１２００μＭ（図６Ａおよび６Ｂ）。データは、PRISM 5.0C（GraphPad Software, Inc.）によって分析した）で無血清培地中のストレッサーメチルグリオキサールを添加し、有意性は＜０．０５またはそれより小さいｐ値として定義した。
【００８３】
過酸化水素ストレスをかけたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるリキシセナチドまたはリラグルチド前処置の効果
細胞を１０ｎＭおよび１００ｎＭのリラグルチドまたはリキシセナチドで前処置し、続いて濃度２００μＭ、４００μＭおよび８００μＭで無血清培地中のストレッサー過酸化水素を添加した。
【００８４】
ＬＤＨアッセイ
細胞培地は、高感度乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）アッセイ（Sigmaによる）を用いて分析した。ＬＤＨアッセイは、全細胞質ＬＤＨを介して、または培地中に放出された細胞質ＬＤＨの量の関数として膜完全性によって死細胞数の指標を提供する。放出されたＬＤＨの測定は、ＬＤＨの作用によるＮＡＤの還元に基づく。生成した還元されたＮＡＤ（ＮＡＤＨ）は、テトラゾリウム色素の化学量論的変換に用いられる。最終的に着色された化合物を、比色分析によって測定する。
【００８５】
まとめ
本実施例のデータは、リキシセナチドが、アルツハイマー病、パーキンソン病、進行性核上麻痺、多系統萎縮症、レビー小体型認知症、パーキンソン病認知症または脳卒中のような神経変性疾患の治療または／および予防に適していることを示す。さらにまた、リキシセナチドは、いずれも現在２型糖尿病の治療剤として用いられているＧＬＰ−１類似体リラグルチドおよびエキセンジン−４と比較して優れた性質を有する。
【００８６】
特に、本実施例のデータは、以下を示す。
（ａ）驚くべきことに、リキシセナチドは血液脳関門を通過することができる。本発明のデータは、高い濃度での輸送速度が最大レベルに制限されるため、輸送が調節されることを示す。さらにまた、リラグルチドと比較して、リキシセナチドはより低い非経口用量で脳に取り込まれる。
（ｂ）リキシセナチドは、脳においてＧＬＰ−１受容体を活性化し、ｃＡＭＰ産生を誘導する。驚くべきことに、リキシセナチドは、リラグルチドより高いレベルのｃＡＭＰを産生し、同じ用量でＧＬＰ−１受容体を活性化する際により高い有効性を示している。
（ｃ）リキシセナチドは、歯状回において前駆細胞の増殖を誘導することができる。エキセンジン−４またはリラグルチドと比較して、同じ用量で投与したときに、リキシセナチドは驚くべきことに増強された効果を提供する。神経変性疾患において、これらの効果は、疾患修飾効果を構成することができる。
（ｄ）驚くべきことに、リキシセナチドは、リラグルチドと比較したときに歯状回において優れた神経保護の効果（細胞ストレスに対して）を示した。
（ｅ）驚くべきことに、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞を１２００μＭメチルグリオキサールストレスから保護するには、１０ｎＭリキシセナチドの用量を用いた前処置で十分であった。２００ｎＭリラグルチドの用量が必要であり細胞を１２００μＭメチルグリオキサールストレスから保護するには、保護を誘導にはより低い用量のリキシセナチドで十分であることを示している。
【００８７】
〔実施例２〕
メチルグリオキサール（ＭＧ）および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）処置後のリキシセナチドまたはリラグルチドを用いたストレス後処置
ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を９６ウェルプレート中に播種し、血清飢餓１２時間後、６００μＭおよび１ｍＭのＨ2Ｏ2ならびに１ｍＭおよび２ｍＭのＭＧで３時間ストレスをかけた。細胞を、０、１、１０、５０および１００ｎＭのリキシセナチドならびに０、１０、５０、１００および２００ｎＭのリラグルチドで処置した。２４時間後、ＸＴＴ試薬５０μＬを加え、８時間インキュベートした。アッセイ体積は１００μＬであった。
【００８８】
図７は、ＭＧまたはＨ2Ｏ2によるストレスの後、リキシセナチドを用いた後処置が生存細胞数を用量依存的に有意に高めたことを示している（特に図７Ａ中の６００μＭ Ｈ2Ｏ2および２ｍＭ ＭＧで得られたデータを参照のこと）。リラグルチドは、ＭＧまたはＨ2Ｏ2によるストレスから細胞を保護しなかった（図７Ｂ）。
【００８９】
リキシセナチドまたはリラグルチドを用いた前処置、続いてメチルグリオキサール（ＭＧ）ストレス
ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を９６ウェルプレート中に播種し、血清飢餓１２時間後、０、１、１０、５０および１００ｎＭのリキシセナチドならびに０、１０、５０、１００および２００ｎＭのリラグルチドおよびエキセンジン−４で４時間処置し、４００μＭおよび６００μＭのＭＧで１４時間ストレスをかけた後、ＸＴＴ試薬５０μＬを加え、プレートを８時間インキュベートした。
【００９０】
図８は、ＭＧまたはＨ2Ｏ2によるストレス前のリキシセナチドを用いた前処置が生存細胞数を用量依存的に有意に高めることを示しており、１ｎＭの最も低い用量から開始して５０ｎＭで最良の結果であった（図８Ａ）。リラグルチドも細胞を保護したが、１００ｎＭのより高い用量でしか保護しなかった（図８Ｂ）。エキセンジン−４は、ＭＧまたはＨ2Ｏ2によるストレスから細胞を保護しなかった（図８Ｃ）。
【００９１】
物質および方法
ストレッサーとしてメチルグリオキサールを用い、ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を用いた前処置アッセイ
１．ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を、１０％ＦＢＳ（Cat No. 10437, Invitrogen Inc.）および１％Penn Strep（Cat No. 15070063, Invitrogen Inc.）入りのＤＭＥＭ＋Ｆ１２グルタマックス培地（Cat No. 313310, Invitrogen Inc.）中に維持した。
２．０．２５×トリプシンＥＤＴＡ溶液を用いて８０〜９０％集密培養物をトリプシン処理し、ＣＯ2インキュベーター中３７℃で２時間、１μｇ／ｃｍ2の濃度でラミニン（L2020, Sigma）により予めコーティングし、滅菌再蒸留水で２回洗浄した９６ウェルプレート（Cat No. 55301, Orange Scientific）中に播種した。
３．１２〜１５時間後、次の１２時間は、培地を１０％ＦＢＳ含有から無血清培地（ＳＦＭ）に変えた。
４．細胞をインクレチンで４時間前処理し、異なる濃度の１５０μｌの体積フォーマットでアッセイを実施し、対照にはそれぞれ新たなＳＦＭを４時間加えた。
５．ウェルを１×ＨＢＳＳおよび６００μＭメチルグリオキサール（Cat No. M0252, Sigma）１５０μｌで洗浄し、試験ウェルおよび対照のそれぞれにＳＦＭを１２時間加えた。
６．上清を集めてＬＤＨアッセイを実施し、−２０℃で保存した。
７．残っている細胞にＸＴＴ溶液（Cat No. 11465015001, Roche Inc.）（カップリング試薬含有）７５μｌを加え、３７℃で４時間インキュベートした。本アッセイは、テトラゾリウム塩ＸＴＴを着色化合物に還元する代謝活性細胞の能力に基づいており、これは吸光度測定によって決定することができる。増大した吸光度は、代謝活性細胞数の増加を示す。
８．吸光度は、各ウェルについて４９２ｎｍおよび６９０ｎｍで測定し、Ａ492からＡ690を減算することによって得られた。
９．ＬＤＨ（Cat No. G1780, Promega）アッセイでは、基質５０μｌと共に上清５０μｌを９６ウェルプレートに加え、暗所にて室温で６０分間インキュベートした。
１０．停止液５０μｌを加え、吸光度を４９０ｎｍで測定した。
１１．Prism Vを用いてＸＴＴおよびＬＤＨアッセイのデータを分析した。
【００９２】
まとめ
実施例２のデータは、リキシセナチドがアルツハイマー病、パーキンソン病、進行性核上麻痺、多系統萎縮症、レビー小体型認知症、パーキンソン病認知症または脳卒中のような神経変性疾患の治療または／および予防に適していることを示している。さらにまた、リキシセナチドは、ＧＬＰ−１類似体リラグルチドおよびエキセナチドと比較して優れた性質を有する。
【００９３】
６００μＭメチルグリオキサールストレスからＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞を保護するには、１０ｎＭリキシセナチドの用量を用いた前処置で十分であった。６００μＭメチルグリオキサールストレスから細胞を保護するには、１００ｎＭ〜２００ｎＭリラグルチドの用量で十分であり、保護を誘導するにはより低い用量のリキシセナチドで十分であることを示している。したがって、リキシセナチドは、上記のような疾患の予防に適している。これらのデータは、実施例１で得られたデータ（図６ＡおよびＢ）と一致しており、リラグルチドと比較したときに、リキシセナチドがＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞における優れた神経保護効果（細胞ストレスに対して）を示したことを実証している。
【００９４】
さらにまた、２ｍＭメチルグリオキサールストレスまたは１ｍＭ Ｈ2Ｏ2ストレスから後にＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞を保護するにはリキシセナチドを用いた後処置で十分であった。対照的に、リラグルチドは、ＭＧまたはＨ2Ｏ2によるストレスから細胞を保護しなかった。
【００９５】
〔実施例３〕
グルカゴン様ペプチド−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）アゴニストリキシセナチドで治療は、ヒト神経細胞をロテノン毒性から保護する。
本実施例では、細胞モデルの神経保護実験を記述しており、パーキンソン病、パーキンソン病認知症、進行性核上麻痺、多系統萎縮症およびレビー小体型認知症の治療におけるリキシセナチドの使用を支持している。本実施例は、リキシセナチドが、この疾患で傷つきやすいニューロンを保護することによってパーキンソン病、パーキンソン病認知症、進行性核上麻痺、多系統萎縮症およびレビー小体型認知症の進行を遅らせる、停止させる、または逆転させることができることを示している。これらの疾患は、神経伝達物質としてドーパミンを用いるニューロンの喪失と関連している。
【００９６】
本実施例は、ランドヒト中脳ニューロン（Lund Human Mesencephalic neurons）（ＬＵＨＭＥＳ細胞）と称する性質においてドーパミン作動性であるヒト細胞系統を用いるin vitro培養アッセイに相当する。この細胞は、非特許文献４２に記載されている。この細胞からの培養物を、ヒトに対して偶発的または環境的に暴露するとドーパミン作動性細胞を殺し、かつパーキンソン病と関連することが知られているロテノンにin vitro暴露した。ロテノンとパーキンソン病との関連は、非特許文献４１および非特許文献４４に記載されている。ロテノンは、ドーパミン産生ニューロンを殺し、それによりヒトパーキンソン病の主要な特徴を実験的に再現することによってパーキンソン症候群が引き起こすことができる。
【００９７】
本実施例において、グルカゴン様のペプチド−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）アゴニストリキシセナチドは、ロテノンにより誘導された神経変性に対してＬＵＨＭＥＳ細胞における有意な神経保護効果を示す（図９）。リキシセナチドは、他のＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）アゴニストと比較して、利点を提供する。ＬＵＨＭＥＳ細胞におけるロテノンに対するリキシセナチドの神経保護効果は、リラグルチドよりも３倍低い濃度で有意に活性であり（図９および１１）、結果的に実施例１のメチルグリオキサールモデルにおいてすでに見られたリキシセナチドの予想外の優れた活性効果を支持している。
【００９８】
エキセナチドは、０,３μＭまたは１μＭの濃度で生存率の改善を誘導しない。対照的に、リキシセナチドは、これらの濃度で生存率の有意な改善をもたらす（図９および１０）。
【００９９】
物質および方法
ロテノンに対する神経保護を評価するため、ＬＵＨＭＥＳ細胞を、標準細胞培地において９５％加湿空気、５％ＣＯ2雰囲気中３７℃で増殖させた。プラスチックフラスコ中で２日培養した後、増殖因子を含む分化培地を加え、細胞をさらに２日間インキュベートした。細胞を解離し、コーティングされたマルチウェルプレートに播種し、さらに４日間、新たな分化培地を加えた。分化６日目に、ロテノン（０．７５μＭ）を用いた処置の１時間前、さまざまな濃度のリキシセナチド、エキセナチド（エキセンジン−４）またはリラグルチドで細胞を処置した。細胞の酸化還元により蛍光生成物を産生する代謝活性細胞の指標、リザズリンベースのアッセイを用いて、７２時間後に神経保護を測定した。産生された蛍光は、培養物中の生細胞の数に比例するため、処置によって提供されたニューロンのＬＵＨＭＥＳ細胞の保護度の尺度となる。ｎ＝１２の測定からのデータは、ロテノンなしの対照に関して細胞生存率読取りの標準化に従って比較した。実験群間の統計的比較にはダネットの試験に従った一元配置分散分析を用いた。ｐ＜０．０５の値を有意であるとみなし、以下のようにアスタリスクを用いてグラフ中に表した：*＝ｐ＜０．０５；**＝ｐ＜０．０１；***＝ｐ＜０．００１；ＮＳ＝有意でない。神経保護は、ロテノンにより誘導された生存率減少のパーセント反転（percent reversal）として表した。
【０１００】
まとめ
実施例３のデータは、リキシセナチドがパーキンソン病、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、レビー小体型認知症、パーキンソン病認知症または脳卒中のような神経変性疾患の治療または／および予防に適していることを示している。さらにまた、リキシセナチドは、ＧＬＰ−１類似体リラグルチドおよびエキセンジン−４と比較して優れた性質を有する。
【０１０１】
本実施例において、リキシセナチドは、ロテノンによる神経変性誘導に対してＬＵＨＭＥＳ細胞における有意な神経保護効果を示す（図９）。リキシセナチドは、他のＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）アゴニストと比較して利点を提供する。ロテノン処置ＬＵＨＭＥＳ細胞において、リキシセナチドは、リラグルチドよりも３倍低い濃度で有意に活性である。０，３μＭまたは１μＭエキセナチドの濃度では、有意な効果を観察できなかった。対照的に、リキシセナチドは、これらの濃度で生存率の用量依存的改善をもたらした。
【０１０２】
〔実施例４〕
ＡＰＰswe／ＰＳ１ΔE9トランスジェニックマウスにおけるリキシセナチドの効果
アルツハイマー病のような神経変性疾患を治療するためのリキシセナチドの重要性をさらに実証するため、本実施例では、脳にアミロイド斑を有するトランスジェニックマウスにおけるリキシセナチド処置の効果を記述する。ＡＰＰswe／ＰＳ１ΔE9トランスジェニックマウスは、アミロイド脳病理を示すアルツハイマー病の十分に特徴づけられたモデルである。アミロイド斑が脳にすでに発生し、７０日間持続したときに、月齢で７ヵ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスにおいて、リキシセナチド処置（毎日１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を開始した。
【０１０３】
トランスジェニック動物
Ｃ５７Ｂｌ／６のバックグラウンドを有するＡＰＰswe／ＰＳ１ΔE9マウスを、Jackson
lab (http://research.jax.org/repository/alzheimers.html)から入手した。ヘテロ接合雄を、地元で購入した野生型Ｃ５７／Ｂｌ６雌（Harlan、英国）と交配させた。子孫に耳パンチし、ＡＰＰ配列に特異的なプライマー（フォワード「ＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＡＴＧＡＣＴＣＡＧＧ、配列番号：４」、リバース：「ＧＴＴＣＴＧＣＴＧＣＡＴＣＴＴＧＧＡＣＡ、配列番号：５」）によるＰＣＲを用いて遺伝子型を決定した。導入遺伝子を発現しないマウスを野生型対照として用いた。すべての研究で雄の動物を用いた。動物を個別にケージに入れ、温度制御室（Ｔ：２１．５℃±１）中で１２／１２明暗サイクル（０８時００に照光、２０時００に消光）を維持した。食物および水は、自由に摂取可能であった。動物は、本研究の開始前の２週間、毎日馴らした。
【０１０４】
リキシセナチドを用いた処置
処置を開始したとき、マウスは７ヵ月齢であった。その時点で、マウスはアミロイド脳病理をすでに示した。マウスに、リキシセナチド（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ体重）または生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ）を１日１回７０日間、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。実験は、１９８６年の動物（科学的処置）法（Animal (scientific procedures) Act）に従って英国内務省（UK home office）により認可された。
【０１０５】
リキシセナチドは、Sanofiによって供給された。凍結乾燥されたペプチドを、１ｍｇ／ｍｌの濃度で、逆浸透水中で再構成した。アリコートを冷凍庫中に保存し、注射用の０．９％生理食塩水中で再構成した。
【０１０６】
組織学的標本
動物に、ＰＢＳ緩衝液、続いてＰＢＳ中の氷冷４％パラホルムアルデヒドを経心臓的に灌流させた。脳を摘出し、４％パラホルムアルデヒド中に少なくとも２４時間固定した後、３０％ショ糖溶液に一夜移した。次いで、EnvirofreezTMを用いて脳を瞬間凍結し、ライカクライオスタットを用いて−２〜−３ブレグマの深さで４０ミクロン厚の冠状切片を切断した。第１の切片をランダムに、その後、第６の切片ごとに取り、立体解析学的規則に従って切片を選択した。
【０１０７】
標準的な方法（詳細については、非特許文献１２を参照のこと）を用い、ウサギポリクローナル抗アミロイドベータペプチド（１：２００，Invitrogen, UK, 71-5800）を用いてベータアミロイドを染色し、コンゴーレッドを用いて密集核斑（dense core plaques）を染色した。切片当たり２画像の皮質を撮影（１０×対物レンズを用いる）することによって（脳当たり７〜１０切片；リキシセナチド１０ｎｍｏｌ／ｋｇ ｂｗについてはｎ＝６、生理食塩水についてはｎ＝１２を用いる）ベータアミロイドおよびコンゴーレッドを分析した。すべての染色を、Axio Scope 1（Zeiss, ドイツ）によって視覚化し、画像Ｊ（ＮＩＨ、米国）による多閾値プラグイン（multi threshold plug-in）を用いて分析した。
【０１０８】
結果
処置開始時にアミロイド脳病理をすでに有するＡＰＰswe／ＰＳ１ΔE9トランスジェニックマウスでは、７０日間のリキシセナチド処置により、ベータアミロイド免疫反応性で測定したベータアミロイド斑負荷が生理食塩水処置マウスと比較して６２％（ｐ＜０．００３９；ｔ検定反復測定値）減少した（図１２）。
【０１０９】
同様に、リキシセナチド処置により、コンゴーレッド組織学的染色によって定量化した密集核アミロイド斑負荷が、それぞれの生理食塩水処置ＡＰＰ／ＰＳ１マウスと比較して５２％（ｐ＝０．０４１９；ｔ検定反復測定値）減少した（図１３）。
【０１１０】
リラグルチドについて以前に記述された（２５ｎｍｏｌｍ／ｋｇ，非特許文献１２）ものよりも低い用量（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）で活性が観察された。
【０１１１】
まとめ
２つの独立した技術を用いたこれらのデータは、アルツハイマー病の動物モデルにおいてリキシセナチドが脳アミロイド病理を低減できることを示している。このデータは、リキシセナチドが、脳アミロイド斑病理を低減することによってアルツハイマー病のような神経変性疾患の治療または／および予防に適していることを示している。したがって、リキシセナチドは、その神経保護的性質に加えて、アミロイド斑のような病理学的病変を低減することができ、したがって、アルツハイマー病にとって魅力的な治療または／および予防となる。さらにまた、実施例１のデータから予想されるように、ＧＬＰ−１類似体リラグルチドについて以前に記述されるものよりも低い用量で活性が達成される。
【０１１２】
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【図１】
2014525430.tif 000002
【図２】
2014525430.tif 000003
【図３−１】
2014525430.tif 000004
【図３−２】
2014525430.tif 000005
【図４】
2014525430.tif 000006
【図５】
2014525430.tif 000007
【図６Ａ】
2014525430.tif 000008
【図６Ｂ】
2014525430.tif 000009
【図７Ａ】
2014525430.tif 000010
【図７Ｂ】
2014525430.tif 000011
【図８Ａ】
2014525430.tif 000012
【図８Ｂ】
2014525430.tif 000013
【図８Ｃ】
2014525430.tif 000014
【図９】
2014525430.tif 000015
【図１０】
2014525430.tif 000016
【図１１】
2014525430.tif 000017
【図１２】
2014525430.tif 000018
【図１３】
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【配列表】
2014525430000001.app
【国際調査報告】
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2014525430.tif 000021
2014525430.tif 000022
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