(57)【要約】  ホスホケトラーゼ活性を有すること、ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化により、または改変されていない微生物と比較してホスホフルクトキナーゼ活性を低減することにより、減少した、または不活性化されたエムデン−マイヤーホフ−パルナス経路（ＥＭＰＰ）を有すること、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化により、または改変されていない微生物と比較してグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減することにより、減少した、もしくは不活性化されたペントースリン酸経路（ＰＰＰ）の酸化分枝を有することを特徴とする組み換え微生物が記述される。これらの微生物は、有用な代謝産物、例えばアセトン、イソブテンまたはプロペンの生産のために用いることができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
ａ）ホスホケトラーゼ活性を有すること；
ｂ）（ｉ）ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化により、もしくは改変されていない微生物と比較してホスホフルクトキナーゼ活性を低減することにより、減少した、もしくは不活性化されたエムデン−マイヤーホフ−パルナス経路（ＥＭＰＰ）を有すること；または
（ｉｉ）ホスホフルクトキナーゼ活性を有しないこと
および
ｃ）（ｉ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化により、もしくは改変されていない微生物と比較してグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減することにより、減少した、もしくは不活性化されたペントースリン酸経路（ＰＰＰ）の酸化分枝を有すること；または
（ｉｉ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有しないこと；
を特徴とする組換え微生物。
【請求項２】
さらに以下：
ｄ）フルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼ活性を有すること
を特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の組換え微生物であって、ＥＭＰＰが、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化により、または改変されていない微生物と比較してグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減することにより、さらに減少している、または不活性化されている、前記組換え微生物。
【請求項４】
増大したホスホケトラーゼ活性を有するように遺伝子改変されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項５】
前記の微生物が真菌である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項６】
前記の微生物が細菌である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項７】
ＰＥＰ依存性ＰＴＳトランスポーターをコードしている遺伝子（単数または複数）が不活性化されている、請求項６に記載の組換え微生物。
【請求項８】
さらにそれが：
ｅ）アセチル−ＣｏＡをアセトンに変換できること；
を特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項９】
さらにそれが：
ｆ）アセトンをイソブテンに変換できること；
を特徴とする、請求項８に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
さらにそれが：
ｇ）アセトンをプロペンに変換できること；
を特徴とする、請求項８に記載の組換え微生物。
【請求項１１】
グルコースのアセチル−ＣｏＡへの変換のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組換え微生物の使用。
【請求項１２】
グルコースのアセトンへの変換のための、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の組換え微生物の使用。
【請求項１３】
グルコースのイソブテンへの変換のための、請求項９に記載の組換え微生物の使用。
【請求項１４】
グルコースのプロペンへの変換のための、請求項１０に記載の組換え微生物の使用。
【請求項１５】
グルコースからアセトンを生成するための方法であって、以下の工程：
請求項８〜１０のいずれか１項に記載の微生物を適切な培地中で培養し；そして
場合により前記のアセトンを培養液から回収する；
を含む、前記方法。
【請求項１６】
グルコースからイソブテンを生成するための方法であって、以下の工程：
請求項９に記載の微生物を適切な培地中で培養し；そして
場合により前記のイソブテンを回収する；
を含む、前記方法。
【請求項１７】
グルコースからプロペンを生成するための方法であって、以下の工程：
請求項１０に記載の微生物を適切な培地中で培養し；そして
場合により前記のプロペンを回収する；
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホケトラーゼ活性を有することを特徴とする組み換え微生物、ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化により、もしくは改変されていない微生物と比較してホスホフルクトキナーゼ活性を低減することにより、減少した、もしくは不活性化されたエムデン−マイヤーホフ−パルナス経路（ＥＭＰＰ）を有することを特徴とする組み換え微生物、またはホスホフルクトキナーゼ活性を有しないことを特徴とする組み換え微生物、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化により、もしくは改変されていない微生物と比較してグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減することにより、減少した、もしくは不活性化されたペントースリン酸経路（ＰＰＰ）の酸化分枝（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｂｒａｎｃｈ）を有することを特徴とする組み換え微生物、またはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有しないことを特徴とする組み換え微生物に関する。そのような微生物は、有用な代謝産物、例えばアセトン、イソブテンまたはプロペンの生産のために用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
過去数十年の間、代謝工学の専門家は化学物質の生産に関する生物学的解決策を提供し、そうしてより伝統的な化学的プロセスに対する代替手段を提供することを試みてきた。一般に、生物学的解決策は再生可能な供給原材（例えば糖類）の利用を可能にし、既存の石油化学に基づくプロセスと競合する。化学物質の生産に関する多工程の生物学的解決策は、典型的には供給原材の標的分子への変換のための触媒として微生物を含む。特定の標的分子の生産に関する一連の酵素反応は、中心炭素経路（ｃｅｎｔｒａｌ  ｃａｒｂｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ）に属する反応および生成物特異的経路に属する反応に分類することができる。中心炭素経路および生成物特異的経路に属する反応は、それぞれおよび全ての酵素反応の酸化還元的（典型的にはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）およびエネルギー的（典型的にはＡＴＰ）制約がそのプロセスの競合性に寄与する全体的な釣り合いにおいて説明されなければならない点でつながっている。歴史的に、糖類で増殖する従属栄養生物の中心炭素経路は、エムデン−マイヤーホフ−パルナス経路（ＥＭＰＰ）、ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）、エントナー−ドゥドロフ経路（ＥＤＰ）、およびホスホケトラーゼ経路（ＰＫＰ）として記述されてきた（Gottschalk (1986), Bacterial Metabolism, 第２版, Springer-Verlag, ニューヨークを参照）。それぞれの中心経路または中心経路の組み合わせは、特定の標的分子に関して利点および欠点を提供する。競争力のあるバイオプロセスを提供するため、ＥＭＰＰ、ＰＰＰおよびＥＤＰを含む改変を有する組み換え微生物が記述されてきた（M. Emmerling et al., Metab. Eng. 1:117 (1999); L. O. Ingram et al., Appl. Environ. Microbiol. 53: 2420 (1987); C. T. Trinh et al., Appl. Environ. Microbiol. 74:3634 (2008)）。より最近になって、ＰＫＰを含む改変を有する組み換え微生物が記述されてきた（Sonderegger et al. Appl. Environ. Microbiol. 70 (2004), 2892-2897、米国特許第７，２５３，００１号、Chinen et al. J. Biosci. Bioeng. 103 (2007), 262-269、米国特許第７，７８５，８５８号; Fleige et al., Appl. Microbiol. Cell Physiol. 91 (2011), 769-776を参照）。
【０００３】
ＥＭＰＰは１ｍｏｌのグルコースを２ｍｏｌのピルベート（ＰＹＲ）に変換する。アセチル−ＣｏＡが望まれる場合、１ｍｏｌのＰＹＲを１ｍｏｌのアセチル−ＣｏＡに変換することができ、同時に１ｍｏｌのＣＯ２および１ｍｏｌのＮＡＤＨが生成する。その反応の合計は式１で示される。
【０００４】
【数１】
2014520539.tif 000002
【０００５】
ＰＰＰは１ｍｏｌのグルコースを１ｍｏｌのＣＯ２および２ｍｏｌのＮＡＤＨに変換する手段を提供し、同時に０．６７ｍｏｌのフルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）および０．３３ｍｏｌのグリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）が生成する。このように形成されたＦ６ＰおよびＧＡＰは他の反応経路により、例えばＥＭＰＰにより代謝されなければならない。ＥＤＰは１ｍｏｌのグルコースを１ｍｏｌのＧＡＰおよび１ｍｏｌのＰＹＲに変換し、同時に１ｍｏｌのＮＡＤＰＨが生成する。ＰＰＰと同様に、このように形成されたＧＡＰは他の反応経路により代謝されなければならない。ＰＫＰは１ｍｏｌのグルコースを１ｍｏｌのＧＡＰおよび１．５ｍｏｌのアセチルリン酸（ＡｃＰ）に変換する手段を提供する。アセチル−ＣｏＡが望まれる場合、ホスホトランスアセチラーゼの作用により１当量のＡｃＰ＋１当量の補酵素Ａ（ＣｏＡ）を１当量のアセチル−ＣｏＡおよび１当量の無機ホスフェート（Ｐｉ）に変換することができる。
【０００６】
ＰＫＰにより生成されたＡｃＣｏＡ部分に由来する特定の標的分子およびＡｃＣｏＡ部分に対する近い酸化還元中立性（ｒｅｄｏｘ  ｎｅｕｔｒａｌｉｔｙ）に関して、全体のエネルギーの釣り合いにおいて欠陥が存在する。ＰＫＰ（ならびに同様にＰＰＰおよびＥＤＰ）はグルコースのグルコース−６−リン酸への変換に関してＡＴＰを生成しない。ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）依存性のグルコース取り込みの場合、ＰＥＰは他の手段により、例えばＥＭＰＰにより生成されなければならない。ＧＡＰをＰＫＰにより再利用することは、特にその生成物特異的経路がほとんどＡＴＰを提供しない場合、その問題を悪化させる。
【０００７】
Sonderegger（同書）および米国特許第７，２５３，００１号は、過剰発現したホスホトランスアセチラーゼと共に天然の、または過剰発現したホスホケトラーゼ活性を含み、グルコース／キシロース混合物のエタノールへの変換における収率を増大させる組み換え出芽酵母（サッカロマイセス  セレビシエ）を開示している。これらの株は、ＥＭＰＰおよびＰＰＰの両方が作用する（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ）ＰＥＰ非依存性のグルコース取り込みを特徴とする。
【０００８】
Chinen（同書）および米国特許第７，７８５，８５８号は、グルコースのＬ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、スクシネートおよびポリヒドロキシブチレートからなる群が含まれる中間体アセチル−ＣｏＡを介して生成される標的分子への変換に関する増大したホスホケトラーゼ活性を含むエンテロバクテリアセエ科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ  ｆａｍｉｌｉｙ）、コリネフォルム（Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ）細菌、およびバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌からなる群から選択される組み換え細菌を開示している。これらの株は、ＥＭＰＰが作用するＰＥＰ依存性のグルコース取り込みを特徴とする。特に、米国特許第７，７８５，８５８号の細菌におけるホスホフルクトキナーゼの活性は、野生型または改変されていない株の活性と比較して低減している（３３ページ参照）。
【０００９】
特定の微生物がＰＥＰ非依存性のグルコース取り込みを利用しているか、またはＰＥＰ依存性のグルコース取り込みを利用しているかは、プロセスの全体的なエネルギーの釣り合いに影響を及ぼす。例えば、出芽酵母（Ｓ．セレビシエ）株は天然にＰＥＰ非依存性のグルコース取り込みを利用しており、一方で大腸菌株は天然にＰＥＰ依存性のグルコース取り込みを利用している。ＰＥＰ依存性のグルコース取り込みがＰＥＰ非依存性のグルコース取り込みで置き換えられた大腸菌株が開示されている。Flores et al. (Metabolic Engineering (2005) 7, 70-87)および米国特許第７，３７１，５５８号。特に、米国特許第７，３７１，５５８号はグルコースの１，３−プロパンジオールへの変換における収率を増大させるためのグルコース取り込みの改変を開示している。その株は、ＥＭＰＰおよびＰＰＰの両方が作用し、特にホスホケトラーゼ活性が存在しない、ＰＥＰ非依存性のグルコース取り込みを特徴とする。
【００１０】
酵素反応の酸化還元およびエネルギー的制約を最高に調整することにより供給原材の生成物への変換を最大化する中心炭素および生成物特異的経路を含む組み換え微生物を開発する必要性が存在する。出願者は、特許請求の範囲において定められるような態様を提供することにより、この必要性に取り組んできた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第７，２５３，００１号
【特許文献２】米国特許第７，７８５，８５８号
【特許文献３】米国特許第７，３７１，５５８号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Gottschalk (1986), Bacterial Metabolism, 第２版, Springer-Verlag, ニューヨーク
【非特許文献２】M. Emmerling et al., Metab. Eng. 1:117 (1999)
【非特許文献３】L. O. Ingram et al., Appl. Environ. Microbiol. 53: 2420 (1987)
【非特許文献４】C. T. Trinh et al., Appl. Environ. Microbiol. 74:3634 (2008)
【非特許文献５】Sonderegger et al. Appl. Environ. Microbiol. 70 (2004), 2892-2897
【非特許文献６】Chinen et al. J. Biosci. Bioeng. 103 (2007), 262-269
【非特許文献７】Fleige et al., Appl. Microbiol. Cell Physiol. 91 (2011), 769-776
【非特許文献８】Flores et al. (Metabolic Engineering (2005) 7, 70-87)
【発明の概要】
【００１３】
従って、本発明は以下：
ａ）ホスホケトラーゼ活性を有すること；
ｂ）（ｉ）ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化により、もしくは改変されていない微生物と比較してホスホフルクトキナーゼ活性を低減することにより、減少した、もしくは不活性化されたエムデン−マイヤーホフ−パルナス経路（ＥＭＰＰ）を有すること；または
（ｉｉ）ホスホフルクトキナーゼ活性を有しないこと
および
ｃ）（ｉ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化により、もしくは改変されていない微生物と比較してグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減することにより、減少した、もしくは不活性化されたペントースリン酸経路（ＰＰＰ）の酸化分枝を有すること；または
（ｉｉ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有しないこと；
を特徴とする組換え微生物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１−１】図１は、ホスホケトラーゼ活性ＥＣ  ４．１．２．９およびＥＣ  ４．１．２．２２のどちらか一方または両方を用いるホスホケトラーゼ経路によるアセチル−ＣｏＡのグルコース−６−リン酸からの生成に関する２つのスキームを示す。
【図１−２】図１は、ホスホケトラーゼ活性ＥＣ  ４．１．２．９およびＥＣ  ４．１．２．２２のどちらか一方または両方を用いるホスホケトラーゼ経路によるアセチル−ＣｏＡのグルコース−６−リン酸からの生成に関する２つのスキームを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に従う微生物は、生成されるアセチル−ＣｏＡの流れ（ｆｌｕｘ）を増大させるためにホスホケトラーゼ活性を有することを特徴とする。通常、微生物はグルコースをエムデン−マイヤーホフ−パルナス経路によりピルベートに変換し、次いでそれを酵素ピルビン酸デヒドロゲナーゼによりアセチル−ＣｏＡに変換することができる。しかし、この変換はＣＯ２の放出を伴い、従って有用な代謝産物の生成において用いられたかもしれない１個の炭素原子が失われる。従って、微生物中のアセチル−ＣｏＡの量を増大させるため、炭素原子の喪失を避けるためにアセチル−ＣｏＡが異なる経路を介して形成されるのが望ましい。ホスホケトラーゼ活性を有する微生物を用いることにより、ホスフェートおよびフルクトース−６−リン酸がエリトロース−４−リン酸およびアセチルリン酸に変換され、ホスホトランスアセチラーゼがさらにアセチルリン酸を炭素原子を失うことなくアセチル−ＣｏＡに変換する。従って、結局、ホスホケトラーゼ活性を有する微生物を用いることによりアセチル−ＣｏＡの収率を増大させることができる。そのような微生物は、炭素原子を失うことなくグルコースをアセチル−ＣｏＡに変換することができる。ホスホケトラーゼが天然に、または異種性に発現される組み換え微生物が米国特許第７，７８５，８５８号および米国特許第７，２５３，００１号において開示されている。
【００１６】
用語“ホスホケトラーゼ活性”は、本発明において用いられる際、以下の反応：
【００１７】
【数２】
2014520539.tif 000003
【００１８】
に従ってＤ−キシルロース−５−リン酸をＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸に変換することができる、または上記で示した反応を触媒することができ、且つ以下の反応：
【００１９】
【数３】
2014520539.tif 000004
【００２０】
に従ってＤ−フルクトース−６−リン酸をＤ−エリトロース−４−リン酸に変換することもできる酵素活性を意味する。
【００２１】
前者のホスホケトラーゼ類は通常ＥＣ  ４．１．２．９に分類され、後者はＥＣ  ４．１．２．２２に分類される。両方のタイプのホスホケトラーゼ類を本発明の範囲において用いることができる。図１は、本明細書で記述されるようなホスホケトラーゼの２つの選択肢を用いる反応全体に関するスキームを示す。
【００２２】
この酵素活性は、当該技術で既知のアッセイにより測定することができる。そのようなアッセイに関する例を下記の実施例の節において示す。
【００２３】
本発明の状況において、ホスホケトラーゼ活性を有する微生物は、例えば天然にホスホケトラーゼ活性を有する微生物、または天然にホスホケトラーゼ活性を有さず、ホスホケトラーゼを発現するように遺伝子改変されている微生物、または天然にホスホケトラーゼ活性を有する微生物であって、前記の微生物におけるホスホケトラーゼ活性を増大させるように遺伝子改変されている、例えばホスホケトラーゼをコードする核酸、例えばベクターを用いて形質転換されている微生物であることができる。
【００２４】
生得的に、すなわち天然にホスホケトラーゼ活性を有する微生物は当該技術で既知であり、そのいずれも本発明の状況において用いることができる。
【００２５】
本発明の状況において、その微生物は、天然にホスホケトラーゼ活性を有しないがホスホケトラーゼの発現を可能にするヌクレオチド配列を含むように遺伝子改変されている微生物であることも可能である。同様に、その微生物は、天然にホスホケトラーゼ活性を有するが、例えばホスホケトラーゼをコードする外来性のヌクレオチド配列の導入によりそのホスホケトラーゼ活性を高めるように遺伝子改変されている微生物であってもよい。
【００２６】
目的の酵素を発現させるための微生物の遺伝子改変は、下記で詳細に記述されるであろう。
【００２７】
本発明に従う微生物中で発現されるホスホケトラーゼは、あらゆるホスホケトラーゼ、特に原核または真核生物からのホスホケトラーゼであることができる。例えばラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からの原核生物のホスホケトラーゼが記述されており、実施例の節において例が示されている。
【００２８】
本発明の好ましい態様において、そのホスホケトラーゼは、実施例の節において示されるＳＱ０００５によりコードされるようなアミノ酸配列またはそのアミノ酸配列に少なくともｎ％同一である配列を含み、且つホスホケトラーゼの活性を有する酵素であり、ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である。
【００２９】
好ましくは、同一性の程度はそれぞれの配列を上記で言及したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのいずれか１つのアミノ酸配列と比較することにより決定される。比較される配列が同じ長さを有しない場合、同一性の程度は好ましくは、より長い配列中のアミノ酸残基と同一であるより短い配列中のアミノ酸残基の百分率またはより短い配列中のアミノ酸残基と同一であるより長い配列中のアミノ酸残基の百分率のどちらかを指す。配列の同一性の程度は、好ましくはＣＬＵＳＴＡＬのような適切なコンピューターアルゴリズムを用いて当該技術で周知の方法に従って決定することができる。
【００３０】
特定の配列が例えば参照配列に対して８０％同一であるかどうかを決定するためにＣｌｕｓｔａｌ分析法を用いる場合、初期設定が用いられてよく、またはその設定はアミノ酸配列の比較に関して好ましくは以下の通りである：マトリックス：ｂｌｏｓｕｍ  ３０；オープンギャップペナルティー：１０．０；エクステンドギャップペナルティー：０．０５；遅延分岐（Ｄｅｌａｙ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）：４０；ギャップ分離距離：８。ヌクレオチド配列の比較に関して、エクステンドギャップペナルティーは好ましくは５．０に設定される。
【００３１】
好ましくは、同一性の程度はその配列の完全な長さにわたって計算される。
【００３２】
本発明に従う微生物中で発現されるホスホケトラーゼは天然に存在するホスホケトラーゼであることができ、またはそれは例えば、例えば酵素活性、安定性等を変化もしくは向上させる変異もしくは他の変化の導入により天然に存在するホスホケトラーゼから派生したホスホケトラーゼであることができる。
【００３３】
タンパク質の所望の酵素活性を改変する、および／または向上させるための方法は当業者に周知であり、それには例えばランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発およびそれに続く所望の特性を有する酵素の選択またはいわゆる“指向性進化”のアプローチが含まれる。
【００３４】
例えば、原核細胞における遺伝子改変に関して、ホスホケトラーゼをコードする核酸分子をＤＮＡ配列の組み換えによる変異誘発または配列改変を可能にするプラスミド中に導入することができる。標準的な方法（Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, 米国、ニューヨークを参照）は、塩基交換を実施することを、または天然もしくは合成の配列を付加することを可能にする。ＤＮＡ断片をその断片に相補的なアダプターおよびリンカーを用いることによりライゲーションすることができる。さらに、適切な制限部位を提供する、または余分なＤＮＡもしくは制限部位を除去する工学的手段を用いることができる。挿入、欠失または置換が可能である場合において、インビトロ変異誘発、“プライマー修復”、制限またはライゲーションを用いることができる。一般に、配列分析、切断解析（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）ならびに生化学および分子生物学の他の方法が分析法として実施される。次いで結果として得られたホスホケトラーゼ変異体を、上記で記述されたようなアッセイにより、所望の活性、例えば酵素活性に関して、特にそれらの増大した酵素活性に関して試験する。
【００３５】
上記で記述されたように、本発明の微生物はホスホケトラーゼをコードする核酸分子の導入により遺伝子改変されている微生物であってよい。従って、好ましい態様において、その組み換え微生物は増大したホスホケトラーゼ活性を有するように遺伝子改変されている組み換え微生物である。これは、例えばその微生物をホスホケトラーゼをコードする核酸を用いて形質転換することにより達成することができる。微生物の遺伝子改変の詳細な記述がさらに下記で与えられるであろう。好ましくは、その微生物中に導入された核酸分子はその微生物に関して異種性である核酸分子であり、すなわちそれは前記の微生物中に天然には存在しない。
【００３６】
本発明の状況において、“増大した活性”は、その遺伝子改変された微生物中の酵素の、特にホスホケトラーゼの発現および／または活性が、対応する改変されていない微生物におけるよりも少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％または５０％、さらにもっと好ましくは少なくとも７０％または８０％、そして特に好ましくは少なくとも９０％または１００％高いことを意味する。さらにもっと好ましい態様において、その発現および／または活性における増大は、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、または少なくとも５００％であってよい。特に好ましい態様において、その発現は対応する改変されていない微生物におけるよりも少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、そしてさらにもっと好ましくは少なくとも１０００倍高い。
【００３７】
用語“増大した”発現／活性は、その対応する改変されていない微生物が対応する酵素、例えばホスホケトラーゼを発現せず、従ってその改変されていない微生物中の対応する発現／活性がゼロである状況も含む。
【００３８】
細胞中の所与のタンパク質の発現のレベルを測定するための方法は当業者には周知である。１態様において、発現のレベルの測定は、対応するタンパク質の量を測定することにより行われる。対応する方法は当業者には周知であり、それにはウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等が含まれる。別の態様において、発現のレベルの測定は、対応するＲＮＡの量を測定することにより行われる。対応する方法は当業者には周知であり、それには例えばノーザンブロットが含まれる。
【００３９】
ホスホケトラーゼの酵素活性を測定するための方法は当該技術で既知であり、既に上記で記述されている。
【００４０】
本発明に従う微生物は、さらにホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化により、もしくは改変されていない微生物と比較してホスホフルクトキナーゼ活性を低減することにより、減少した、もしくは不活性化されたエムデン−マイヤーホフ−パルナス経路（ＥＭＰＰ）を有すること、またはホスホフルクトキナーゼ活性を有しないことを特徴とする。従って、その微生物は、ホスホフルクトキナーゼ活性が含まれるＥＭＰＰを天然に有しているがそのホスホフルクトキナーゼ活性が完全に消滅するように、もしくはそれが対応する改変されていない微生物と比較して低減するように、のいずれかで改変、特に遺伝子改変されている微生物であるか、またはその微生物は、天然にホスホフルクトキナーゼ活性を有しない微生物であるかのどちらかである。
【００４１】
上記で既に言及したように、グルコースがＥＭＰＰにより処理されてアセチル−ＣｏＡになる場合、最後の段階におけるＣＯ２の放出により１個の炭素原子が失われる。ホスホケトラーゼを導入することにより、この喪失を回避することができる。フルクトース−６−リン酸はホスホケトラーゼに関する基質であることから、アセチル−ＣｏＡにおける収率を増大させるためにはフルクトース−６−リン酸のプールが微生物中で高レベルで保たれることが望ましい。フルクトース−６−リン酸はエムデン−マイヤーホフ−パルナス経路の酵素、すなわちホスホフルクトキナーゼ、に関する基質でもあることから、本発明の組み換え微生物は、改変されていない微生物と比較して低減したホスホフルクトキナーゼ活性を有するか、あるいはホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）が不活性化されている。このことは、フルクトース−６−リン酸または多くのフルクトース−６−リン酸がもはやエムデン−マイヤーホフ−パルナス経路により処理され得ないため、フルクトース−６−リン酸の流れがホスホケトラーゼに、そしてＣＯ２の喪失のないアセチル−ＣｏＡの生成に向けられることを確実にする。ホスホケトラーゼが天然に、または異種性に発現され、且つ低減したホスホフルクトキナーゼ活性を有する組み換え微生物が米国特許第７，７８５，８５８号において開示されている。
【００４２】
“ホスホフルクトキナーゼ活性”は、ＡＴＰおよびフルクトース−６−リン酸をＡＤＰおよびフルクトース−１，６−二リン酸に変換する酵素活性（ＥＣ  ２．７．１．１１）を意味する。この酵素活性は、例えばKotlarz et al. (Methods Enzymol. (1982) 90, 60-70)により記述されたような、当該技術で既知のアッセイにより測定することができる。
【００４３】
用語“ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化により、もしくは改変されていない微生物と比較してホスホフルクトキナーゼ活性を低減することにより、減少した、もしくは不活性化されたエムデン−マイヤーホフ−パルナス経路（ＥＭＰＰ）を有することを特徴とする微生物”は、好ましくは、ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化または改変されていない微生物と比較したホスホフルクトキナーゼ活性の低減が、前記の不活性化または低減をもたらす微生物の遺伝子改変によって達成されている微生物を指す。
【００４４】
好ましい態様において、本発明の組み換え微生物は、ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化により不活性化されたエムデン−マイヤーホフ−パルナス経路（ＥＭＰＰ）を有する組み換え微生物である。本発明の状況におけるホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性は、その微生物中に存在するホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）が、それらがもはや発現されない、および／または機能するホスホフルクトキナーゼの合成をもたらさないように不活性化されていることを意味する。不活性化は当該技術で既知の多くの異なる方法により達成することができる。その不活性化は、例えばホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の破壊により、または選択マーカーの導入による前記の遺伝子（単数または複数）の完全な欠失により達成することができる。あるいは、ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）のプロモーターに、その遺伝子がもはやｍＲＮＡに転写されないように変異導入することができる。当該技術で既知のホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）を不活性化するための他の方法は、以下の方法である：ｍＲＮＡがもはやタンパク質に翻訳されることができないように、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子（単数または複数）の転写産物に相補的なヌクレオチド配列を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを発現させること、ＲＮＡｉ作用により前記の遺伝子（単数または複数）の発現を抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを発現させること；前記の遺伝子（単数または複数）の転写産物を特異的に切断する活性を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを発現させること；またはコサプレッション作用により前記の遺伝子（単数または複数）の発現を抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを発現させること。これらのポリヌクレオチドはベクター中に組み込むことができ、それを形質転換により微生物中に導入してホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化を達成することができる。
【００４５】
本発明の状況における用語“不活性化”は、好ましくは完全な不活性化、すなわちその微生物がホスホフルクトキナーゼ活性を示さないことを意味する。これは、特に、用いられる増殖条件とは無関係にその微生物がホスホフルクトキナーゼ活性を示さないことを意味する。好ましくは、“不活性化”は、その微生物中に存在するホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）がその酵素の発現を妨げるように遺伝子改変されていることを意味する。これは、例えば、その遺伝子もしくはその一部の欠失（ここで、その一部の欠失は、酵素の発現を妨げる）により、またはコード領域もしくはプロモーター領域のいずれかにおけるその遺伝子の破壊（ここで、その破壊は、タンパク質が発現しない作用もしくは機能不全のタンパク質が発現する作用を有する）により達成することができる。
【００４６】
好ましい態様において、本発明の組み換え微生物は、改変されていない微生物と比較してホスホフルクトキナーゼ活性を低減することにより減少したエムデン−マイヤーホフ−パルナス経路（ＥＭＰＰ）を有する組み換え微生物である。好ましくは、この低減はその微生物の遺伝子改変により達成される。これは、例えばプロモーターおよび／または酵素のランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発ならびにそれに続く所望の特性を有するプロモーターおよび／または酵素の選択により、または上記で記述されたような相補的核酸配列もしくはＲＮＡｉ作用により達成することができる。微生物の遺伝子改変の詳細な記述がさらに下記で与えられるであろう。
【００４７】
本発明の状況において、“低減した活性”は、遺伝子改変された微生物における酵素の、特にホスホフルクトキナーゼの発現および／または活性が、対応する改変されていない微生物におけるよりも少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％または５０％、さらにもっと好ましくは少なくとも７０％または８０％、そして特に好ましくは少なくとも９０％または１００％低いことを意味する。細胞中の所与のタンパク質の発現のレベルを測定するための方法は、当業者には周知である。ホスホフルクトキナーゼの低減した酵素活性を測定するためのアッセイは当該技術で既知である。
【００４８】
別の態様において、本発明に従う微生物は、ホスホフルクトキナーゼ活性を有しない微生物である。これは好ましくはそのような微生物が天然にホスホフルクトキナーゼ活性を有しないことを意味する。これはそのような微生物が天然にそのゲノム中にホスホフルクトキナーゼ活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列を含有しないことを意味する。そのような微生物の例は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）(J. S. Suo et al., Nat. Biotechnol. 23:63 (2005))およびラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）(C. Fleige et al., Appl. Microb. Cell Physiol. 91:769 (2011))である。
【００４９】
本発明に従う微生物は、さらにグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化により、もしくは改変されていない微生物と比較してグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減することにより減少した、もしくは不活性化されたペントースリン酸経路（ＰＰＰ）の酸化分枝を有すること、またはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有しないことを特徴とする。従って、その微生物は天然にグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性が含まれるＰＰＰを有するがそれがそのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性が完全に消滅するように、もしくはそれが対応する改変されていない微生物と比較して低減するように、のいずれかで改変、特に遺伝子改変されている微生物であるか、またはその微生物は天然にグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有しない微生物であるかのどちらかである。
【００５０】
ペントースリン酸経路の酸化分枝を減少させる、または不活性化することは、グルコース−６−リン酸がもはやそのペントースリン酸回路により引き出されないと考えられるため、アセチル−ＣｏＡにおける収率をさらに増大させる。その微生物における全てまたはほとんど全てのグルコース−６−リン酸がフルクトース−６−リン酸に変換されると考えられ、次いでそれがさらにアセチル−ＣｏＡに変換されるであろう。
【００５１】
“グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性”は、グルコース−６−リン酸およびＮＡＤＰ＋を６−ホスホグルコノ−δ−ラクトンおよびＮＡＤＰＨに変換する酵素活性を意味する（ＥＣ  １．１．１．４９）。この酵素活性は、例えばNoltmann et al. (J. Biol. Chem. (1961) 236, 1225-1230)により記述されたような、当該技術で既知のアッセイにより測定することができる。
【００５２】
用語“グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化により、もしくは改変されていない微生物と比較してグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減することにより、減少した、もしくは不活性化されたペントースリン酸経路（ＰＰＰ）の酸化分枝を有することを特徴とする微生物”は、好ましくは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化または改変されていない微生物と比較したグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性の低減が、前記の不活性化または低減をもたらす微生物の遺伝子改変によって達成されている微生物を指す。
【００５３】
好ましい態様において、本発明の組み換え微生物は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化により不活性化されたペントースリン酸経路（ＰＰＰ）の酸化分枝を有する組み換え微生物である。本発明の状況におけるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化は、その微生物中に存在するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）が、それらがもはや発現されない、および／または機能するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの合成をもたらさないように不活性化されていることを意味する。不活性化は当該技術で既知の多くの異なる方法により達成することができる。その不活性化は、例えばグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の破壊により、または選択マーカーの導入による前記の遺伝子（単数または複数）の完全な欠失により達成することができる。あるいは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）のプロモーターに、その遺伝子がもはやｍＲＮＡに転写されない方法で変異導入することができる。当該技術で既知のホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）を不活性化するための他の方法は、以下の方法である：ｍＲＮＡがもはやタンパク質に翻訳されることができないように、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（単数または複数）の転写産物に相補的なヌクレオチド配列を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを発現させること、ＲＮＡｉ作用により前記の遺伝子（単数または複数）の発現を抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを発現させること；前記の遺伝子（単数または複数）の転写産物を特異的に切断する活性を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを発現させること；またはコサプレッション作用により前記の遺伝子（単数または複数）の発現を抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを発現させること。これらのポリヌクレオチドはベクター中に組み込むことができ、それを形質転換により微生物中に導入してグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化を達成することができる。
【００５４】
本発明の状況における用語“不活性化”は、好ましくは完全な不活性化、すなわちその微生物がグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を示さないことを意味する。これは、特にその微生物が用いられる増殖条件と無関係にグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を示さないことを意味する。
【００５５】
好ましくは、“不活性化”はその微生物中に存在するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）がその酵素の発現を妨げるように遺伝子改変されていることを意味する。これは、例えばその遺伝子もしくはその一部の欠失（ここで、その一部の欠失は、酵素の発現を妨げる）により、またはそのコード領域もしくはプロモーター領域のいずれかにおけるその遺伝子の破壊（ここで、その破壊は、タンパク質が発現しない作用もしくは機能不全のタンパク質が発現する作用を有する）により達成することができる。
【００５６】
好ましい態様において、本発明の組み換え微生物は、改変されていない微生物と比較してグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減することにより減少したペントースリン酸経路（ＰＰＰ）の酸化分枝を有する組み換え微生物である。好ましくは、この低減はその微生物の遺伝子改変により達成される。これは、例えばプロモーターおよび／または酵素のランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発ならびにそれに続く所望の特性を有するプロモーターおよび／または酵素の選択により、または上記で記述されたような相補的核酸配列もしくはＲＮＡｉ作用により達成することができる。微生物の遺伝子改変の詳細な記述がさらに下記で与えられるであろう。
【００５７】
本発明の状況において、“低減した活性”は、遺伝子改変された微生物における酵素の、特にグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの発現および／または活性が、対応する改変されていない微生物におけるよりも少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％または５０％、さらにもっと好ましくは少なくとも７０％または８０％、そして特に好ましくは少なくとも９０％または１００％低いことを意味する。細胞中の所与のタンパク質の発現のレベルを測定するための方法は、当業者には周知である。グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの低減した酵素活性を測定するためのアッセイは当該技術で既知である。
【００５８】
別の態様において、本発明に従う微生物は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有しない微生物である。これは好ましくはそのような微生物が天然にグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有しないことを意味する。これはそのような微生物が天然にそのゲノム中にグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列を含有しないことを意味する。そのような微生物の例は、アシネトバクター・バイリイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉ）(Barbe et al., Nucl. Acids Res. 32 (2004), 5766-5779)、超好熱性の門の古細菌、例えばスルフォロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）(Nunn et al., J. Biol. Chem. 285 (2010), 33701-33709)、サーモプロテウス・テナックス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ  ｔｅｎａｘ）、サーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）およびピクロフィルス・トリリダス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｔｏｒｒｉｄｕｓ）(Reher and Schoenheit, FEBS Lett. 580 (2006), 1198-1204)である。
【００５９】
さらなる態様において、本発明に従う微生物はさらに、フルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼ活性を有すること、好ましくはグルコースで増殖させた際にフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼ活性を有することを特徴とする。フルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼは、フルクトース−１，６−二リン酸をフルクトース−６−リン酸および遊離のホスフェートに加水分解する糖新生に関与している酵素である。しかし、基本的に全ての生物において、グルコースの存在下ではフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼ活性は抑制されており、グルコースはＥＭＰＰにより処理される（解糖）。ホスホケトラーゼ活性を有し、且つホスホフルクトキナーゼ活性を有しない、またはホスホフルクトキナーゼ活性が低減している、もしくはそのホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子が不活性化されている本発明の微生物では、ホスホケトラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．９またはＥＣ  ４．１．２．２２）によるフルクトース−６−リン酸の変換によるアセチル−ＣｏＡの収率を、フルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼ活性の存在を確実にすることにより、例えばグルコースの存在下でのフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼの抑制解除により高めることができる。フルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼ活性の存在は、結果としてフルクトース−１，６−二リン酸アルドラーゼにより生成されたフルクトース−１，６−二リン酸のフルクトース−６−リン酸への再利用をもたらし、次いでそれをホスホケトラーゼ経路により再度アセチル−ＣｏＡに変換することができる。実際、ホスホケトラーゼの産物アセチルリン酸は酵素リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．３．１．８）の作用によりアセチル−ＣｏＡに相互変換する。従って、本発明の組み換え微生物はアセチル−ＣｏＡをグルコースから３：１に近い化学量論で生成することができる。その反応の合計は式２で示される：
【００６０】
【数４】
2014520539.tif 000005
【００６１】
用語“フルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼ活性”は、フルクトース−１，６−二リン酸およびＨ２Ｏをフルクトース−６−リン酸およびホスフェートに変換する酵素活性を意味する（ＥＣ  ３．１．３．１１）。この酵素活性は、例えばHines et al. (J. Biol. Chem. (2007) 282, 11696-11704)により記述されたような当該技術で既知のアッセイにより測定することができる。用語“フルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼ活性”および“フルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼ”は、それらがフルクトース−１，６−二リン酸アルドラーゼ／ホスファターゼ活性を示すという意味で二機能性である酵素も含む。そのような二機能性酵素はほとんどの古細菌および深く分岐している細菌系統において発現しており、ほとんどの場合で熱安定性である。そのような酵素は、例えばサーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）、サルフォロバス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ）、イグニコックス・ホスピタリス（Ｉｇｎｉｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｓｐｉｔａｌｉｓ）、センアーケウム・シンビオサム（Ｃｅｎａｒｃｈａｅｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ）、サルフォロバス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃａｓ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモプロテウス・ニュートロフィラス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｕｓ）、ムーレラ・サーモアセチカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）および多くの他の細菌に関して報告されている（例えばSay and Fuchs (Nature 464 (2010), 1077); Fushinobu et al. (Nature 478 (2011), 538; Du et al. (Nature 478 (2011), 534を参照）。
【００６２】
用語“グルコースで増殖させた際のフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼ活性”は、その微生物が、その微生物をグルコースで増殖させた際にフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼ活性を有する酵素を発現することを意味する。“グルコースで増殖させた”は、その微生物を炭素源として特にグルコースを含有する培地中で増殖させることを意味する。好ましくは、この用語はその微生物を唯一の炭素源としてグルコースを含有する培地中で増殖させることを意味する。
【００６３】
本発明の状況において、特にグルコースで増殖させた際にフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼ活性を有する微生物は、例えば特にグルコースで増殖させた際に天然にフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼ活性を有する微生物、または特にグルコースで増殖させた際に天然にフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼ活性を有さず、かつ特にグルコースで増殖させた際にフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼを発現するように遺伝子改変されている微生物であることができる。それは、特にグルコースで増殖させた際に天然にフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼ活性を有する微生物であって、前記の微生物におけるホスホケトラーゼ活性を増大させるために遺伝子改変されている、例えばフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼをコードする核酸、例えばベクターを用いて形質転換されている微生物であることもできる。
【００６４】
特にグルコースで増殖させた際に、生得的に、すなわち天然にフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼ活性を有する微生物は当該技術で既知であり、そのいずれも本発明の状況において用いることができる。
【００６５】
本発明の状況において、その微生物は、特にグルコースで増殖させた際に天然にフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼ活性を有しないが特にグルコースで増殖させた際にフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼを発現することができるように遺伝子改変されている微生物であることも可能である。これは、例えばフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼをコードする遺伝子のプロモーターに、その微生物をグルコースで増殖させた際にもはやその遺伝子が抑制されない方法で変異導入することにより達成することができ、またはそのプロモーターをその微生物をグルコースで増殖させた際に制御されない別のプロモーター、例えば構成的プロモーターで置き換えることができる。
【００６６】
同様に、その微生物は、特にグルコースで増殖させた際に天然にフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼ活性を有するが、例えばフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼをコードする外来性のヌクレオチド配列の導入により特にグルコースで増殖させた際のそのフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼ活性を高める／増大させるように遺伝子改変されている微生物であってもよい。
【００６７】
目的の酵素を発現させるための微生物の遺伝子改変は、下記で詳細に記述されるであろう。
【００６８】
本発明に従うフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼは天然に存在するフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼであることができ、またはそれは例えば、例えば酵素活性、安定性等を変化もしくは向上させる変異もしくは他の変化の導入により天然に存在するフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼから派生したフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼであることができる。タンパク質の所望の酵素活性を改変する、および／または向上させるための方法は当業者に周知であり、上記で記述されている。次いで結果として得られたフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼ変異体をそれらの特性、例えば酵素活性または制御に関して試験する。フルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼの酵素活性を測定するためのアッセイは当該技術で既知である。１態様において、そのフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼはフィードバック阻害により制御されない酵素である。
【００６９】
好ましい態様において、その組み換え微生物は増大したフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼ活性を有するように遺伝子改変されている。これは例えばその微生物をフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼをコードする核酸を用いて形質転換することにより達成することができる。微生物の遺伝子改変の詳細な記述がさらに下記で与えられるであろう。
【００７０】
本発明の状況において、“増大した活性”は、グルコースで増殖させた際のその遺伝子改変された微生物中の酵素の、特にフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼの発現および／または活性が、グルコースで増殖させた際の対応する改変されていない微生物におけるよりも少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％または５０％、さらにもっと好ましくは少なくとも７０％または８０％、そして特に好ましくは少なくとも９０％または１００％高いことを意味する。さらにもっと好ましい態様において、その発現および／または活性における増大は、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、または少なくとも５００％であってよい。特に好ましい態様において、その発現は特にグルコースで増殖させた際の対応する改変されていない微生物におけるよりも少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、そしてさらにもっと好ましくは少なくとも１０００倍高い。
【００７１】
細胞中の所与のタンパク質の発現のレベルを測定するための方法は当業者には周知である。１態様において、発現のレベルの測定は、対応するタンパク質の量を測定することにより行われる。対応する方法は当業者には周知であり、それにはウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等が含まれる。別の態様において、発現のレベルの測定は、対応するＲＮＡの量を測定することにより行われる。対応する方法は当業者には周知であり、それには例えばノーザンブロットが含まれる。
【００７２】
フルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼの酵素活性を測定するための方法は当該技術で既知である。
【００７３】
別の態様において、本発明に従う微生物は、さらにＥＭＰＰがグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化により、または改変されていない微生物と比較してグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減することによりさらに減少している、または不活性化されていることを特徴とする。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼを減少させる、または不活性化することによりＥＭＰＰをさらに下流の段階においてさらに減少させることは、微生物において生成され得るグリセルアルデヒド３−リン酸の解糖を通じてのアセチル−ＣｏＡへの処理（それによりピルビン酸デヒドロゲナーゼにより触媒される最後の段階におけるＣＯ２の放出により１個の炭素原子が失われるであろう）が行われない、またはほとんど行われないであろうことを確実にする。従って、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を減少させる、または不活性化することによりＥＭＰＰを遮断することは、全体的な流れがホスホケトラーゼに向けられることをさらに確実にする。
【００７４】
“グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性”は、グリセルアルデヒド３−リン酸、ホスフェートおよびＮＡＤ＋を３−ホスホ−Ｄ−グリセロイルリン酸およびＮＡＤＨ＋Ｈ＋に変換する酵素活性を意味する（ＥＣ  １．２．１．１２）。この活性は、例えばD’Alessio et al. (J. Biol. Chem. (1971) 246, 4326-4333)により記述されたような、当該技術で既知のアッセイにより測定することができる。
【００７５】
用語“グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化により、または改変されていない微生物と比較してグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減することにより減少した、または不活性化されたエムデン−マイヤーホフ−パルナス経路（ＥＭＰＰ）を有することを特徴とする微生物”は、好ましくはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化または改変されていない微生物と比較したグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性の低減が、前記の不活性化または低減をもたらす微生物の遺伝子改変によって達成されている微生物を指す。
【００７６】
好ましい態様において、本発明の組み換え微生物は、ＥＭＰＰがグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化により、または改変されていない微生物と比較してグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減することによりさらに減少している、または不活性化されている組み換え微生物である。本発明の状況におけるグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性は、その微生物中に存在するグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）が、それらがもはや発現されない、および／または機能するグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの合成をもたらさないように不活性化されていることを意味する。不活性化は当該技術で既知の多くの異なる方法により達成することができる。その不活性化は、例えばグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の破壊により、または選択マーカーの導入による前記の遺伝子（単数または複数）の完全な欠失により達成することができる。あるいは、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のプロモーターに、その遺伝子（単数または複数）がもはやｍＲＮＡに転写されない方法で変異導入することができる。当該技術で既知のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）を不活性化するための他の方法は、以下の方法である：ｍＲＮＡがもはやタンパク質に翻訳されることができないように、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（単数または複数）の転写産物に相補的なヌクレオチド配列を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを発現させること、ＲＮＡｉ作用により前記の遺伝子（単数または複数）の発現を抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを発現させること；前記の遺伝子（単数または複数）の転写産物を特異的に切断する活性を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを発現させること；またはコサプレッション作用により前記の遺伝子（単数または複数）の発現を抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを発現させること。これらのポリヌクレオチドはベクター中に組み込むことができ、それを形質転換により微生物中に導入してグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化を達成することができる。
【００７７】
本発明の状況における用語“不活性化”は、好ましくは完全な不活性化、すなわちその微生物がグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を示さないことを意味する。これは、特にその微生物が用いられる増殖条件と無関係にグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を示さないことを意味する。
【００７８】
好ましくは、“不活性化”はその微生物中に存在するグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）がその酵素の発現を妨げるように遺伝子改変されていることを意味する。これは、例えばその遺伝子もしくはその一部の欠失（ここで、その一部の欠失は、酵素の発現を妨げる）により、またはそのコード領域もしくはプロモーター領域のいずれかにおけるその遺伝子の破壊（ここで、その破壊は、タンパク質が発現しない作用もしくは機能不全のタンパク質が発現する作用を有する）により達成することができる。
【００７９】
好ましい態様において、本発明の組み換え微生物は、改変されていない微生物と比較してグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減することにより減少したＥＭＰＰを有する組み換え微生物である。好ましくは、この低減はその微生物の遺伝子改変により達成される。これは、例えばプロモーターおよび／または酵素のランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発ならびにそれに続く所望の特性を有するプロモーターおよび／または酵素の選択により、または上記で記述されたような相補的核酸配列もしくはＲＮＡｉ作用により達成することができる。微生物の遺伝子改変の詳細な記述がさらに下記で与えられるであろう。
【００８０】
本発明の状況において、“低減した活性”は、遺伝子改変された微生物における酵素の、特にグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの発現および／または活性が、対応する改変されていない微生物におけるよりも少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％または５０％、さらにもっと好ましくは少なくとも７０％または８０％、そして特に好ましくは少なくとも９０％または１００％低いことを意味する。細胞中の所与のタンパク質の発現のレベルを測定するための方法は、当業者には周知である。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの低減した酵素活性を測定するためのアッセイは当該技術で既知である。
【００８１】
本発明の状況における用語“微生物”は、細菌を、ならびに真菌、例えば酵母を、そして藻類および古細菌をも指す。１つの好ましい態様において、その微生物は細菌である。原則としてあらゆる細菌を用いることができる。本発明に従うプロセスにおいて用いられるために好ましい細菌は、バシラス、クロストリジウム、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ザイモモナスまたはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の細菌である。特に好ましい態様において、その細菌はエシェリキア属に属し、さらにもっと好ましくは大腸菌種に属する。別の好ましい態様において、その細菌はシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）種に、またはザイモモナス・モビリス種に、またはコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）種に属する。
【００８２】
別の好ましい態様において、その微生物は真菌、より好ましくはサッカロミセス、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属の真菌、そしてさらにもっと好ましくは出芽酵母、分裂酵母、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリベロマイセス・マルキシアナス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クリベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・トルラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｏｒｕｌａ）またはピキア・ユチリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｕｔｉｌｉｓ）種の真菌である。
【００８３】
その組み換え微生物が細菌であるより好ましい態様において、そのＰＥＰ依存性ＰＴＳトランスポーターをコードしている遺伝子（単数または複数）が不活性化されている。本発明の状況において、不活性化は、微生物中に存在するＰＥＰ依存性ＰＴＳトランスポーターをコードする遺伝子（単数または複数）が、それらがもはや機能するＰＥＰ依存性ＰＴＳトランスポーターを発現しない、および／またはその合成をもたらさないように不活性化されていることを意味する。ＰＥＰ依存性ＰＴＳトランスポーターをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化は、その細菌がもはやＰＥＰ依存性ＰＴＳトランスポーターによりグルコースを輸送することができないような不活性化であるべきである。
【００８４】
（例えば大腸菌、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からの）ＰＥＰ依存性ＰＴＳトランスポーターが当該技術で既知である。ＰＥＰ依存性ＰＴＳトランスポーターの不活性化の例が下記の実施例の節において示されている。
【００８５】
不活性化は当該技術で既知の多くの異なる方法により達成することができる。その不活性化は、例えばＰＥＰ依存性ＰＴＳトランスポーターをコードする遺伝子（単数または複数）の破壊により、または選択マーカーの導入による前記の遺伝子（単数または複数）の完全な欠失により達成することができる。あるいは、ＰＥＰ依存性ＰＴＳトランスポーターをコードする遺伝子（単数または複数）のプロモーターに、その遺伝子がもはやｍＲＮＡに転写されない方法で変異導入することができる。当該技術で既知のＰＥＰ依存性ＰＴＳトランスポーターをコードする遺伝子（単数または複数）を不活性化するための他の方法は、以下の方法である：ｍＲＮＡがもはやタンパク質に翻訳されることができないように、ＰＥＰ依存性ＰＴＳトランスポーター遺伝子（単数または複数）の転写産物に相補的なヌクレオチド配列を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを発現させること、ＲＮＡｉ作用により前記の遺伝子（単数または複数）の発現を抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを発現させること；前記の遺伝子（単数または複数）の転写産物を特異的に切断する活性を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを発現させること；またはコサプレッション作用により前記の遺伝子（単数または複数）の発現を抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを発現させること。これらのポリヌクレオチドはベクター中に組み込むことができ、それを形質転換により微生物中に導入してＰＥＰ依存性ＰＴＳトランスポーターをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化を達成することができる。
【００８６】
用語“組み換え”は、本発明の微生物が野生型もしくは改変されていない微生物と比較して上記で定義されたような酵素をコードする核酸分子を含有するように、または野生型もしくは改変されていない微生物と比較して上記で定義されたような酵素をコードする遺伝子が欠失されているように遺伝子改変されていることを意味する。
【００８７】
上記で定義されたような酵素をコードする核酸分子は、単独で、またはベクターの一部として用いることができる。
【００８８】
その核酸分子は、さらにその核酸分子中に含まれるポリヌクレオチドに作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結された発現制御配列を含むことができる。本記述全体を通して用いられる用語“作動的に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結された”または“作動可能に連結された”は、発現がその発現制御配列と適合性の条件下で達成されるような方式で発現させるためのポリヌクレオチド中の１個以上の発現制御配列およびコード領域の間の連結を指す。
【００８９】
発現は、異種性ＤＮＡ配列の、好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。真菌における、ならびに細菌における発現を確実にする調節エレメントは当業者に周知である。それらはプロモーター、エンハンサー、終結シグナル、標的化シグナル等を含む。さらに下記でベクターに関する説明と関連して例が与えられている。
【００９０】
核酸分子と関連する使用のためのプロモーターは、その由来に関して、および／または発現させるべき遺伝子に関して同種または異種であってよい。適切なプロモーターは、例えば構成的発現に適しているプロモーターである。しかし、外的影響により決定される時点においてのみ活性化されるプロモーターを用いることもできる。人工の、または化学的に誘導することができるプロモーターをこの状況において用いることができる。
【００９１】
そのベクターはさらに、そのベクター中に含有される前記のポリヌクレオチドに作動可能に連結された発現制御配列を含むことができる。これらの発現制御配列は、細菌または真菌における翻訳可能なＲＮＡの転写および合成を確実にするのに適していてよい。
【００９２】
加えて、分子生物学において通常の方法（例えばSambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, 米国、ニューヨークを参照）により、改変された生物学的特性を有する可能性のあるポリペプチドの合成をもたらす様々な変異をそのポリヌクレオチド中に挿入することが可能である。アミノ酸配列の改変が例えばそのポリペプチドの生物学的活性または制御に影響を及ぼす位置における点変異の導入が考えられる。
【００９３】
さらに、改変された基質または生成物特異性を有する変異体を調製することができる。好ましくは、そのような変異体は増大した活性を示す。あるいは、基質結合活性を失うことなくその触媒活性が消滅した変異体を調製することができる。
【００９４】
さらに、上記で定義されたような酵素をコードするポリヌクレオチド中への変異の導入は、前記のポリヌクレオチドによりコードされる酵素の遺伝子発現速度および／または活性を低減または増大させることを可能にする。
【００９５】
遺伝子改変された細菌または真菌に関して、上記で定義されたような酵素またはこれらの分子の一部をコードするポリヌクレオチドを、ＤＮＡ配列の組み換えによる変異誘発または配列改変を可能にするプラスミド中に導入することができる。標準的な方法（Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, 米国、ニューヨークを参照）は、塩基の置換を実施することを、または天然もしくは合成の配列を付加することを可能にする。ＤＮＡ断片は、その断片にアダプターおよびリンカーを適用することにより、互いに連結することができる。さらに、適切な制限部位を提供する、または余分なＤＮＡもしくは制限部位を除去する工学的手段を用いることができる。挿入、欠失または置換が可能である場合において、インビトロ変異誘発、“プライマー修復”、制限またはライゲーションを用いることができる。一般に、配列分析、切断解析ならびに生化学および分子生物学の他の方法が分析法として実施される。
【００９６】
従って、本発明によれば、上記のポリヌクレオチド、核酸分子またはベクターを真菌または細菌中に導入することを含め、真菌または細菌を遺伝子改変することにより組み換え微生物を生成することができる。
【００９７】
本発明は、上記のポリヌクレオチド、核酸分子もしくはベクターを用いて遺伝子改変された、または遺伝子改変された細菌もしくは真菌を生成するための上記で言及された方法により得ることができる組み換え微生物、特に細菌および真菌に、ならびにそのような形質転換された細菌もしくは真菌に由来し、上記で定義されたようなポリペプチド、核酸分子もしくはベクターを含有する細胞に関する。好ましい態様において、その宿主細胞は、それがゲノム中に安定に組み込まれたポリヌクレオチドを含有するような方式で遺伝子改変されている。
【００９８】
そのポリヌクレオチドは、上記で記述された活性のいずれかを有するポリペプチドの生成をもたらすように発現される。様々な発現系の概要は、例えばMethods in Enzymology 153 (1987), 385-516に、Bitter et al. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544)に、およびSawers et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1-9)、Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-4)、Hockney (Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463)、Griffiths et al., (Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440)に含まれている。酵母発現系の概要は、例えばHensing et al. (Antonie van Leuwenhoek 67 (1995), 261-279)、Bussineau et al. (Developments in Biological Standardization 83 (1994), 13-19)、Gellissen et al. (Antonie van Leuwenhoek 62 (1992), 79-93)、Fleer (Current Opinion in Biotechnology 3 (1992), 486-496)、Vedvick (Current Opinion in Biotechnology 2 (1991), 742-745)およびBuckholz (Bio/Technology 9 (1991), 1067-1072)により与えられている。
【００９９】
発現ベクターは文献において広く記述されてきた。原則として、それらは選択マーカー遺伝子および選択された宿主中での複製を確実にする複製起点だけでなく、細菌またはウイルスのプロモーター、およびほとんどの場合において転写に関する終結シグナルも含有する。そのプロモーターおよび終結シグナルの間に、一般にコードＤＮＡ配列の挿入を可能にする少なくとも１個の制限部位またはポリリンカーが存在する。対応する遺伝子の転写を天然に制御しているＤＮＡ配列を、それが選択された宿主生物中で活性である場合、プロモーター配列として用いることができる。しかし、この配列を他のプロモーター配列と交換することもできる。その遺伝子の構成的発現を確実にするプロモーターおよびその遺伝子の発現の計画的な制御を可能にする誘導可能なプロモーターを用いることが可能である。これらの特性を有する細菌およびウイルスのプロモーター配列は文献において詳細に記述されている。微生物（例えば大腸菌、出芽酵母）における発現のための制御配列は、その文献において十分に記述されている。下流の配列の特に高い発現を可能にするプロモーターは、例えばＴ７プロモーター(Studier et al., Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89)、ｌａｃＵＶ５、ｔｒｐ、ｔｒｐ−ｌａｃＵＶ５(DeBoer et al., in Rodriguez and Chamberlin (編者), Promoters, Structure and Function; Praeger, ニューヨーク, (1982), 462-481; DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 21-25)、ｌｐ１、ｒａｃ(Boros et al., Gene 42 (1986), 97-100)である。好ましくは誘導可能なプロモーターがポリペプチドの合成に関して用いられる。これらのプロモーターは、しばしば構成的プロモーターよりも高いポリペプチド収量をもたらす。最適なポリペプチドの量を得るため、２段階プロセスがしばしば用いられる。まず、宿主細胞を最適な条件下で比較的高い細胞密度まで培養する。第２段階において、用いられるプロモーターのタイプに応じて転写を誘導する。この点において、ラクトースまたはＩＰＴＧ（＝イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）により誘導することができるｔａｃプロモーターが特に適切である(deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21-25)。転写に関する終結シグナルもその文献において記述されている。
【０１００】
本発明に従うポリヌクレオチドまたはベクターを用いた宿主細胞の形質転換は、例えばSambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, 米国、ニューヨーク；Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990において記述されているような標準的な方法により実施することができる。その宿主細胞を、特にｐＨ値、温度、塩濃度、通気、抗生物質、ビタミン類、微量元素等に関して、用いられるその特定の宿主細胞の要求を満たす栄養培地中で培養する。
【０１０１】
本発明の別の観点において、その組み換え微生物はさらに、それがアセチル−ＣｏＡをアセトンに変換することができることを特徴とする。そのような組み換え微生物を提供するための方法は、例えば欧州特許第２，２９５，５９３号において開示されている。本発明の状況における用語“アセチル−ＣｏＡをアセトンに変換することができる”は、その生物／微生物がアセトンのアセチル−ＣｏＡからの生成を可能にする酵素活性を提供する酵素の存在により細胞内でアセトンを生成する能力を有することを意味する。
【０１０２】
アセトンは特定の微生物、例えばクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、バシラス・ポリミクサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）およびシュードモナス・プチダにより産生される。アセトンの合成はクロストリジウム・アセトブチリカムにおいて最もよく特性付けられている。それは２分子のアセチル−ＣｏＡが縮合されてアセトアセチル−ＣｏＡになる反応（反応段階１）で開始される。この反応はアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．３．１．９）により触媒される。次いでアセトアセチル−ＣｏＡは酢酸または酪酸との反応によりアセトアセテートに変換され、結果としてアセチル−ＣｏＡまたはブチリル−ＣｏＡの生成ももたらされる（反応段階２）。この反応は例えばアセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．８．３．８）により触媒される。アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼは様々な種から、例えばそれがａｔｏＡＤ遺伝子によりコードされている大腸菌から、またはそれがｃｔｆＡＢ遺伝子によりコードされているクロストリジウム・アセトブチリカムから既知である。しかし、他の酵素、例えば３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．８．３．５）またはコハク酸ＣｏＡリガーゼ（ＥＣ  ６．２．１．５）もこの反応を触媒することができる。
【０１０３】
最後に、アセトアセテートはアセトアセテートデカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．４）により触媒される脱炭酸段階（反応段階３）によりアセトンに変換される。
【０１０４】
上記で記述された反応段階１および２ならびにそれらを触媒する酵素はアセトン合成に特徴的なものではなく、様々な生物で見付けることができる。対照的に、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．４）により触媒される反応段階３はアセトンを産生することができる生物においてのみ見付かっている。
【０１０５】
好ましい態様において、本発明の組み換え微生物は、天然にアセトンを産生する能力を有する微生物である。従って、好ましくはその微生物はクロストリジウム、バシラスまたはシュードモナス属に、より好ましくはクロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ、クロストリジウム・セルロリティカム、バシラス・ポリミクサまたはシュードモナス・プチダ種に属する。
【０１０６】
別の好ましい態様において、本発明の組み換え微生物は、天然にアセトンを産生しない生物／微生物に由来するが、アセトンを産生するように、すなわちその微生物におけるアセトンの産生を可能にするために必要な遺伝子（単数または複数）を導入することにより遺伝子改変されている微生物である。原則としてあらゆる微生物をこの方法で遺伝子改変することができる。アセトンの合成の原因である酵素は上記で記述されている。対応する酵素をコードする遺伝子は当該技術で既知であり、所与の微生物をアセトンを産生するように遺伝子改変するために用いることができる。上記で記述されたように、アセトン合成の反応段階１および２はほとんどの生物において天然に起こる。しかし、反応段階３はアセトン合成に特徴的かつ重要である。従って、好ましい態様において、天然にアセトンを産生しない微生物に由来する遺伝子改変された微生物は、脱炭酸によるアセトアセテートのアセトンへの変換を触媒する酵素、例えばアセトアセテートデカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．４）をコードするヌクレオチド配列を含有するように改変されている。この酵素をコードするいくつかの生物からのヌクレオチド配列、例えば以下の生物からのａｄｃ遺伝子が当該技術において既知である：クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ２３６７０およびＰ２３６７３）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（クロストリジウムＭＰ；Ｑ９ＲＰＫ１）、クロストリジウム・パストウリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ８１３３６）、ブラディリゾビウム種（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）（株ＢＴＡｉ１／ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１１８２；Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ａ５ＥＢＵ７）、ブルクホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）（ＡＴＣＣ  １０３９９  Ａ９ＬＢＳ０）、ブルクホルデリア・マレイ（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ａ３ＭＡＥ３）、ブルクホルデリア・マレイ  ＦＭＨ  Ａ５ＸＪＢ２、ブルクホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ａ０Ｂ４７１）、ブルクホルデリア・アンビファリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｍｂｉｆａｒｉａ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｑ０ｂ５Ｐ１）、ブルクホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｂ２Ｔ３１９）、ブルクホルデリア種（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｑ３８ＺＵ０）、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｂ２ＴＬＮ８）、ラルストニア・ピケッティ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｂ２ＵＩＧ７）、ストレプトマイセス・ノガレーター（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｇａｌａｔｅｒ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｑ９ＥＹＩ７）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｑ８２ＮＦ４）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｑ５ＺＸＱ９）、��クトバシラス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｑ１ＷＶＧ５）、ロドコッカス種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃ．）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｑ０Ｓ７Ｗ４）、ラクトバシラス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｑ８９０Ｇ０）、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｑ１Ｍ９１１）、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｑ０３Ｂ６６）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｑ０ＢＬＣ９）、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒｅａｅ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ａ４ＦＫＲ９）、コラルカエウム・クリュプトフィルム（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｕｍ  ｃｒｙｐｔｏｆｉｌｕｍ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｂ１Ｌ３Ｎ６）、バシラス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ａ７Ｚ８Ｋ８）、コクリオボルス・ヘテロストロフス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｑ８ＮＪＱ３）、スルフォロブス・アイランディカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｃ３ＭＬ２２）、およびフランシセラ・ツラレンシス亜種ホラークティカ（ｈｏｌａｒｃｔｉｃａ）（ＯＳＵ１８株）。
【０１０７】
より好ましくは、その微生物は、上記で言及されたアセトン合成の反応段階２、すなわちアセトアセチルＣｏＡのアセトアセテートへの変換を触媒することができる酵素をコードする核酸分子で形質転換されるように遺伝子改変されている。
【０１０８】
さらにもっと好ましくは、その微生物は、上記で言及されたアセトン合成の反応段階１、すなわち２分子のアセチル−ＣｏＡのアセトアセチルＣｏＡへの縮合を触媒することができる酵素をコードする核酸分子で形質転換されるように遺伝子改変されている。
【０１０９】
特に好ましい態様において、その微生物は、上記で言及されたアセトン合成の反応段階１を触媒することができる酵素をコードする核酸分子および上記で言及されたアセトン合成の反応段階２を触媒することができる酵素をコードする核酸分子で、または上記で言及されたアセトン合成の反応段階１を触媒することができる酵素をコードする核酸分子および上記で言及されたアセトン合成の反応段階３を触媒することができる酵素をコードする核酸分子で、または上記で言及されたアセトン合成の反応段階２を触媒することができる酵素をコードする核酸分子および上記で言及されたアセトン合成の反応段階３を触媒することができる酵素をコードする核酸分子で、または上記で言及されたアセトン合成の反応段階１を触媒することができる酵素をコードする核酸分子および上記で言及されたアセトン合成の反応段階２を触媒することができる酵素をコードする核酸分子および上記で言及されたアセトン合成の反応段階３を触媒することができる酵素をコードする核酸分子で形質転換されるように遺伝子改変されている。
【０１１０】
上記で言及された遺伝子改変された微生物を調製するための方法は、当該技術で周知である。従って、一般に、その微生物はその微生物におけるそれぞれの酵素の発現を可能にするＤＮＡコンストラクトで形質転換される。そのようなコンストラクトは通常、それぞれの宿主細胞中での転写および翻訳を可能にする制御配列、例えばプロモーターおよび／またはエンハンサーおよび／または転写ターミネーターおよび／またはリボソーム結合部位等に連結された問題のコード配列を含む。先行技術は既に、アセトンを産生することができるように遺伝子改変されている微生物を記述している。特に、例えばクロストリジウム・アセトブチリカムからの遺伝子が大腸菌中に導入され、それにより天然にアセトンを産生しない細菌である大腸菌におけるアセトンの合成を可能にしている(Bermejo et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (1998); 1079-1085; Hanai et al., Appl. Environ. Microbiol. 73 (2007), 7814-7818)。特に、Hanai et al.（同書）は、大腸菌におけるアセトン産生を達成するためにはアセトアセテートデカルボキシラーゼ（例えばクロストリジウム・アセトブチリカムからのアセトアセテートデカルボキシラーゼ）をコードする核酸配列を導入すれば十分であることを示しており、これは上記で言及された反応段階１および２を触媒する大腸菌中の内在性の酵素（すなわち大腸菌のａｔｏＢおよびａｔｏＡＤ遺伝子の発現産物）はアセトン産生のための基質を提供するのに十分であることを示している。
【０１１１】
本発明の別の観点において、その組み換え微生物はさらに、それがアセチル−ＣｏＡをアセトンに変換できることおよびアセトンをイソブテンに変換できることを特徴とする。そのような組み換え微生物を提供するための方法は、例えばＥＰ−Ａ  ２，２９５，５９３（欧州特許第０９  １７  ０３１２号）、国際公開第２０１０／００１０７８号および欧州特許第１０  １８  ８００１号において開示されている。
【０１１２】
本発明の別の観点において、その組み換え微生物は、それがアセチル−ＣｏＡをアセトンに変換できることおよびアセトンをプロパンに変換できることを特徴とする。そのような組み換え微生物を提供するための方法は、例えばHanai et al., Appl. Environ. Microbiol. 73 (2007), 7814-7818において開示されている。
【０１１３】
当業者は、本発明の微生物へのさらなる遺伝子改変は本発明の微生物が供給原材を生成物に変換する有効性における向上をもたらし得ることを認識するであろう。例えば、天然の微生物は一般にホルメート、アセテート、ラクテート、スクシネート、エタノール、グリセロール、２，３−ブタンジオール、メチルグリオキサールおよび水素のような生成物を生成し；その全てが糖からの例えばアセトン、イソブテンまたはプロペンの生成に対して有害であろう。そのような望まれない副産物の排除または実質的な低減は、それらの生成をもたらす重要な酵素活性の排除または低減により達成することができる。そのような活性には、以下の活性からなる群が含まれるが、それらに限定されない：
アセチル−ＣｏＡ＋ホルメート  ＝  ＣｏＡ＋ピルベート（例えば、ピルベートホルメートリアーゼ（ＥＣ  ２．３．１．５４）としても知られているホルメート  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼにより触媒される；大腸菌−ｐｆｌＢに関して、ＮＣＢＩ−遺伝子ＩＤ：９４５５１４）；
ＡＴＰ＋アセテート  ＝  ＡＤＰ＋アセチルリン酸（例えば、アセテートキナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．１）により触媒される；大腸菌−ａｃｋＡに関して、ＮＣＢＩ−遺伝子ＩＤ：９４６７７５）；
（Ｒ）−ラクテート＋ＮＡＤ＋  ＝  ピルベート＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋（例えば、Ｌ−ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２８）により触媒される；大腸菌−ｌｄｈＡに関して、ＮＣＢＩ−遺伝子ＩＤ：９４６３１５）；
ホスフェート＋オキサロアセテート  ＝  ホスホエノールピルベート＋ＨＣＯ３−（例えば、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．３１）により触媒される；大腸菌−ｐｐｃに関して、ＮＣＢＩ−遺伝子ＩＤ：９４８４５７）；
ＡＴＰ＋オキサロアセテート  ＝  ＡＤＰ＋ホスホエノールピルベート＋ＣＯ２（例えば、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ（ＡＴＰ）（ＥＣ  ４．１．１．４９）により触媒される；大腸菌−ｐｃｋに関して、ＮＣＢＩ−遺伝子ＩＤ：９４５６６７）；
スクシネート＋アクセプター  ＝  フマレート＋還元されたアクセプター（例えば、スクシネートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．３．９９．１）により触媒される；ｆｒｄＡおよびｆｒｄＢを含む大腸菌に関して、ＮＣＢＩ−遺伝子ＩＤ：それぞれ９４８６６７および９４８６６６）；
２−オキソカルボキシレート（例えばピルベート）  ＝  アルデヒド（例えばアセトアルデヒド）＋ＣＯ２（例えば、ピルベートデカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．１）により触媒される））；
アセトアルデヒド＋ＣｏＡ＋ＮＡＤ＋  ＝  アセチル−ＣｏＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋（例えば、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）（ＥＣ  １．２．１．１０）により触媒される；大腸菌−ａｄｈＥに関して、ＮＣＢＩ−遺伝子ＩＤ：９４５８３７）；
ｓｎ−グリセロール  ３−ホスフェート＋ＮＡＤ（Ｐ）＋  ＝  グリセロンホスフェート（ｇｌｙｃｅｒｏｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ＋（例えば、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ（Ｐ）＋］（ＥＣ  １．１．１．９４）により触媒される；大腸菌−ｇｐｓＡに関して、ＮＣＢＩ−遺伝子ＩＤ：９４８１２５）；
２ピルベート  ＝  ２−アセトラクテート＋ＣＯ２（例えば、アセトラクテートシンターゼ（ＥＣ  ２．２．１．６）により触媒される；大腸菌−ｉｌｖＨおよびｉｌｖＩに関して、ＮＣＢＩ−遺伝子ＩＤ：それぞれ９４７２６７および９４８７９３）；
グリセロンホスフェート  ＝  メチルグリオキサール＋ホスフェート（例えば、メチルグリオキサールシンターゼ（ＥＣ  ４．２．３．３）により触媒される；大腸菌−ｍｇｓＡに関して、ＮＣＢＩ−遺伝子ＩＤ：９４５５７４）；および
ホルメート＋Ｈ＋  ＝  ＣＯ２＋Ｈ２（例えば、ホルメートヒドロゲンリアーゼ（ＥＣ  １．１２．１．２と一緒でのＥＣ  １．２．１．２）により触媒される；大腸菌−ｆｄｈＦ（ＥＣ  １．２．１．２）に関して、ＮＣＢＩ−遺伝子ＩＤ：９４８５８４）。
【０１１４】
従って、好ましい態様において、本発明に従う微生物は、上記で列挙された酵素活性の１種類以上が排除されている、または低減していることを特徴とする。
【０１１５】
当業者はさらに、本発明の微生物における調節エレメントに対する遺伝子改変は本発明の微生物が供給原材を生成物に変換する有効性における向上につながり得ることを認識するであろう。大腸菌内で、そのような遺伝子改変には以下の遺伝子改変からなる群が含まれるが、それらに限定されない：
−嫌気性増殖の全体的な制御因子であるｆｎｒ遺伝子（ＮＣＢＩ−遺伝子ＩＤ：９４５９０８）を欠失させる；および
−ＲＮＡポリメラーゼ、シグマＳ（シグマ３８）因子であるｒｐｏＳ遺伝子（ＮＣＢＩ−遺伝子ＩＤ：９４７２１０）を欠失させる。
【０１１６】
従って、別の好ましい態様において、本発明に従う微生物はこれらの欠失の少なくとも１種類を示す。
【０１１７】
本発明のさらなる観点は、グルコースのアセチル−ＣｏＡへの変換のための本発明の組み換え微生物の使用である。化学構造におけるアセチル−ＣｏＡ（アセチル補酵素Ａとしても知られている）は、補酵素Ａ（チオール）および酢酸の間のチオエステルであり、有用な代謝産物の生成のための重要な前駆体分子である。次いで、アセチル−ＣｏＡはさらに組み換え微生物により有用な代謝産物、例えばＬ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ロイシン、スクシネートおよびポリヒドロキシブチレートに変換されることができる。
【０１１８】
本発明の別の観点は、アセチル−ＣｏＡをアセトンに変換することができる本発明の組換え微生物の、グルコースのアセトンへの変換のための使用である。
【０１１９】
本発明のさらなる観点は、アセチル−ＣｏＡをアセトンに、およびアセトンをイソブテンに変換することができる本発明の組換え微生物の、グルコースのイソブテンへの変換のための使用である。
【０１２０】
また、本発明のさらなる観点は、アセチル−ＣｏＡをアセトンに、およびアセトンをプロペンに変換することができる本発明の組換え微生物の、グルコースのプロペンへの変換のための使用である。
【０１２１】
従って、本発明は、上記で言及された組み換え微生物をアセトンおよび／またはイソブテンおよび／またはプロペンの生成を可能にする条件下で培養し、そのアセトンおよび／またはイソブテンおよび／またはプロペンを単離する、アセトンおよび／またはイソブテンおよび／またはプロペンのグルコースからの生成のための方法にも関する。その微生物を、その酵素反応（単数または複数）が起こるのを可能にする適切な培養条件下で培養する。その特定の培養条件は用いられる特定の微生物に依存するが、当業者には周知である。その培養条件は、一般にそれらがそれぞれの反応のための酵素をコードする遺伝子の発現を可能にするような様式で選択される。化学的誘導物質による、または温度シフトによる遺伝子発現の誘導のような、特定の遺伝子の発現を培養の特定の段階において向上および微調整するための様々な方法が当業者に既知である。
【０１２２】
別の好ましい態様において、本発明に従う方法はさらに、その反応から脱ガスする（ｄｅｇａｓｓｉｎｇ）ガス状の生成物、特にイソブテンまたはプロペンを収集する工程、すなわち例えばその培養物から脱ガスする生成物を回収する工程が含まれる。従って、好ましい態様において、その方法はその反応の間にガス状の形態の下でイソブテンまたはプロペンを収集するための系の存在下で実施される。
【０１２３】
実際、短いアルケン類、例えばイソブテンおよびプロペンは室温および大気圧においてガス状の状態を取っている。従って、本発明に従う方法は、工業的規模で実施される場合常に非常に費用のかかる工程であるその生成物のその液体培養液からの抽出を必要としない。そのガス状炭化水素の排出および貯蔵ならびにそれらの可能性のあるそれに続く物理的分離および化学的変換は、当業者に既知のあらゆる方法に従って実施することができる。
【０１２４】
本発明は、以下の限定的でない図および実施例への参照によりさらに記述される。
【０１２５】
図１は、ホスホケトラーゼ活性ＥＣ  ４．１．２．９およびＥＣ  ４．１．２．２２のどちらか一方または両方を用いるホスホケトラーゼ経路によるアセチル−ＣｏＡのグルコース−６−リン酸からの生成に関する２つのスキームを示す。
【実施例】
【０１２６】
一般的な方法および材料
ライゲーションおよび形質転換に関する手順は当該技術で周知である。以下の実施例における使用に適した技法は、Sambrook J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor, ニューヨーク, 1989、およびSambrook J.（上記）において見付けることができる。
【０１２７】
細菌培養物の維持および増殖に適した材料および方法は当該技術で周知である。以下の実施例における使用に適した技法は、Manual of Methods for General Bacteriology (Philipp Gerhardt, R.G.E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg and G. Briggs Philips, 編者)において見付けることができる。
【０１２８】
細菌細胞の増殖および維持のために用いられる全ての試薬および材料は、別途明記しない限りSigma-Aldrich Company (ミズーリ州セントルイス)から入手した。
【０１２９】
【表１】
2014520539.tif 000006
【０１３０】
【表２−１】
2014520539.tif 000007
【０１３１】
【表２−２】
2014520539.tif 000008
【０１３２】
【表２−３】
2014520539.tif 000009
【０１３３】
【表２−４】
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【０１３４】
【表３−１】
2014520539.tif 000011
【０１３５】
【表３−２】
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【０１３６】
【表３−３】
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【０１３７】
【表４−１】
2014520539.tif 000014
【０１３８】
【表４−２】
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【０１３９】
【表４−３】
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【０１４０】
【表４−４】
2014520539.tif 000017
【０１４１】
遺伝子ノックアウトのための染色体組み込み
ＤＮＡを染色体の特定の領域中に組み込むために、その挿入するＤＮＡの標的となる染色体部位への相同性および選択可能なマーカーが必要とされる。そのマーカーを組み込み後に容易に除去することができるならば好都合である。ＦＲＴ／Ｆｌｐリコンビナーゼ系は、そのマーカーを除去するための機構を提供する。ＦＲＴ部位はＦｌｐリコンビナーゼに関する認識部位である。Ｆｌｐは部位特異的リコンビナーゼであり、直列反復する認識部位から間にあるＤＮＡを切り出す。
【０１４２】
標的となる染色体部位へのホモロジーアームを含有し、且つＦＲＴ(Datsenko KA. And Wanner BL., Proceedings of the National Academy of Sciences, 2000, Vol. 97, No. 12, pp. 6640-6645)部位に隣接される選択可能なマーカーをコードする組み込みカセットを、ｐＫＤ４６(Datsenko KA. And Wanner BL., Proceedings of the National Academy of Sciences, 2000, Vol. 97, No. 12, pp. 6640-6645)を有する標的細胞中に形質転換する。成功した組み込み体を、その細胞のその抗生物質の存在下での増殖により選択する。続いて、ｐＫＤ４６をその細胞からキュアリングし（ｃｕｒｅｄ）、次いで抗生物質遺伝子の除去のためにリコンビナーゼプラスミドをその組み込み体中に導入する。ＦＲＴカセットを含有する株を、ＦｌｐリコンビナーゼをコードするｐＣＰ２０プラスミドを用いて形質転換する(Datsenko KA. And Wanner BL., Proceedings of the National Academy of Sciences, 2000, Vol. 97, No. 12, pp. 6640-6645)。組み込まれたマーカーを除去した後、そのリコンビナーゼプラスミドをその組み込み体からキュアリングする。
【０１４３】
実施例１：株ＧＢＥ１０１４の構築
この節の目的は、ＧＢＥ１０１４と名付けられた大腸菌株の構築を記述することであり、それに関してＰＥＰ依存性のグルコース取り込みがＰＴＳ輸送遺伝子の欠失により不活性化されており、ＡＴＰ依存性のグルコース取り込みが可能になっており、エムデン−マイヤーホフ−パルナス経路（ＥＭＰＰ）がホスホフルクトキナーゼ遺伝子の欠失により不活性化されており、ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）がグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失により不活性化されている。
【０１４４】
構築はＧＢＥ０９０１を用いて開始された。ＧＢＥ０９０１は、ｐｔｓＨおよびｐｔｓＩ遺伝子が含まれるｂｐ２５３１７３６から２５３３８６５まで（ＮＣＢＩゲノムデータベース）の本来のヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＳＱ０００１で置き換えられた大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，（Ｍｉｇｕｌａ）Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ）株ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ  ＃７００９２６）である。この欠失はＰＥＰ依存性ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）に影響を及ぼし、結果として株ＧＢＥ０９０１においてＰＥＰ依存性のグルコース取り込みが不活性化される。ｐｔｓＨＩ遺伝子の欠失はＰＣＲにより検証され、オリゴヌクレオチド０６３５および０６３８（それぞれＳＥＱ  ＲＣ０００１およびＲＣ０００２として示される）がプライマーとして用いられた。結果として得られた０．４ＫｂｐのＰＣＲ産物を同じプライマーを用いて配列決定した。
【０１４５】
株ＧＢＥ０９０１をＬＢ培地中で培養し、ＧＢＥ０９０１細胞をエレクトロコンピテントにした。エレクトロコンピテントなＧＢＥ０９０１細胞をｐＫＤ４６(Datsenko KA. And Wanner BL., Proceedings of the National Academy of Sciences, 2000, Vol. 97, No. 12, pp. 6640-6645)と名付けられたプラスミドを用いて形質転換し、次いでアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔いた。プレートを３０℃で一夜培養した。ＧＢＥ０９０１細胞のプラスミドｐＫＤ４６を用いた形質転換は、株ＧＢＥ０９０２を生成した。プラスミドｐＧＢＥ０６８８はそれ自身のプロモーターの制御下に置かれたスペクチノマイシンに対する耐性遺伝子を与える。この耐性カセットの配列を表３において示す（ＳＥＱ  ＳＱ０００２）。
【０１４６】
プラスミドｐＧＢＥ０６８８を鋳型としてプライマー０６３３および０６３４（それぞれＳＥＱ  ＲＣ０００３およびＲＣ０００４として示される）と共に用いて１．３ＫｂｐのＰＣＲ産物を生成した。この１．３ＫｂｐのＰＣＲ産物をエレクトロコンピテントなＧＢＥ０９０２細菌中に形質転換し、次いでその形質転換混合物をスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔き、３７℃で一夜培養して株ＧＢＥ０９０３を生成した。株ＧＢＥ０９０３において、ｚｗｆ、ｅｄｄ、およびｅｄａ遺伝子により構成されるＤＮＡ配列を欠失させた。これらの遺伝子はそれぞれグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ、および２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコネートアルドラーゼをコードしている。この欠失したｚｗｆ、ｅｄｄ、およびｅｄａ遺伝子を含むＤＮＡ配列はスペクチノマイシン耐性カセットにより置き換えた。ｚｗｆ、ｅｄｄ、およびｅｄａ遺伝子の有効な欠失を確かめるため、プライマー１０３６および１０３７（それぞれＳＥＱ  ＲＣ０００５およびＲＣ０００６として示される）を用いてＰＣＲ増幅を実施した。最終的な１．９ＫｂｐのＰＣＲ産物が得られた。この１．９ＫｂｐのＰＣＲ産物を、同じプライマー１０３６および１０３７を用いて配列決定した。
【０１４７】
次いで株ＧＢＥ０９０３をＬＢプレート上に蒔き、３７℃で培養し、単離されたコロニーをグルコースを炭素源として含む（２ｇ／Ｌ）ＭＳプレート上でスクリーニングした(Richaud C., Mengin-Leucreulx D., Pochet S., Johnson EJ., Cohen GN. and Marliere P; The Journal of Biological Chemistry; 1993; Vol. 268; No. 36; pp. 26827-26835)。３７℃で４８時間の培養後、コロニーが見えるようになり、それをグルコース（２ｇ／Ｌ）を補ったＭＳ液体培地に移した。この３７℃での一夜培養は、ｐＫＤ４６プラスミドの喪失を誘導した。１つの分離株は７時間の倍加時間を有しており、ＧＢＥ１０００と名付けられた。
【０１４８】
株ＧＢＥ１０００をエレクトロコンピテントにした。ＧＢＥ１０００エレクトロコンピテント細胞をプラスミドｐＫＤ４６を用いて形質転換し、次いでアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に蒔いた。プレートを３０℃で一夜培養した。ＧＢＥ１０００細胞のプラスミドｐＫＤ４６を用いた形質転換は、株ＧＢＥ１００１を生成した。
【０１４９】
プラスミドｐＧＢＥ０６８７はそれ自身のプロモーターの制御下に置かれたアプラマイシンに対する耐性遺伝子を与える。この耐性カセットの配列を表３において示す（ＳＥＱ  ＳＱ０００３）。
【０１５０】
プラスミドｐＧＢＥ０６８７を鋳型としてプライマー０６２９および０６３０（それぞれＳＥＱ  ＲＣ０００７およびＲＣ０００８として示される）と共に用いて１．２ＫｂｐのＰＣＲ産物を生成した。結果として得られた１．２ＫｂｐのＰＣＲ産物をエレクトロコンピテントなＧＢＥ１００１細菌中に形質転換し、その形質転換混合物をアプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔いた。次いでプレートを３７℃で一夜培養してＧＢＥ１００５＿ｐＫＤ４６と名付けられた新しい株を生成した。株ＧＢ１００５＿ｐＫＤ４６において、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子ｐｆｋＡを欠失させ、アプラマイシン耐性カセットにより置き換えた。ｐｆｋＡ遺伝子の欠失が起きたことを確かめるため、プライマー０６１９および０６２０（それぞれＳＥＱ  ＲＣ０００９およびＲＣ００１０として示される）を用いてＰＣＲ増幅を実施した。この１．７ＫｂｐのＰＣＲ産物を、同じプライマー０６１９および０６２０を用いて配列決定した。プラスミドｐＫＤ４６の喪失を確かめるため、株ＧＢＥ１００５＿ｐＫＤ４６をＬＢプレート上に蒔き、４２℃で一夜培養した。プラスミドｐＫＤ４６の喪失を、単離されたコロニーをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔いて３０℃で一夜培養し、ＬＢプレート上に蒔いて３７℃で一夜培養することにより検証した。結果として得られた株は３７℃で培養したＬＢプレート上で増殖し、ＧＢＥ１００５と名付けられた。ＧＢＥ１００５細胞はアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上では増殖しなかった。
【０１５１】
スペクチノマイシンカセットはｚｗｆ＿ｅｄｄ＿ｅｄａ遺伝子の対応する座位に位置しており、アプラマイシンカセットはｐｆｋＡ遺伝子の対応する座位に位置していた。スペクチノマイシンおよびアプラマイシン耐性遺伝子を含有する耐性カセットを切り出すため、株ＧＢＥ１００５をプラスミドｐＣＰ２０(Datsenko KA. And Wanner BL., Proceedings of the National Academy of Sciences, 2000, Vol. 97, No. 12, pp. 6640-6645)を用いて形質転換して株ＧＢＥ１００５＿ｐを得た。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上での３０℃における一夜培養の後、単離されたコロニーをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に再度画線し、３０℃で一夜培養した。次いで単離されたコロニーをＬＢプレート上に蒔き、４２℃で一夜培養し、それはｐＣＰ２０プラスミドの喪失を引き起こした。次いで、その２個の耐性カセットの有効な切り出しおよびｐＣＰ２０プラスミドの喪失を確かめるため、単離されたコロニーをスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に画線して３７℃で一夜培養し、アプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に画線して３７℃で一夜培養し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に画線して３０℃で一夜培養し、ＬＢプレート上に画線して３７℃で一夜培養した。結果として得られた株は３７℃で培養したＬＢプレート上で増殖し、ＧＢＥ１００６と名付けられた。ＧＢＥ１００６細胞は、スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上、アプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上、およびアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上では増殖しなかった。
【０１５２】
株ＧＢＥ１００６をエレクトロコンピテントにし、ＧＢＥ１００６エレクトロコンピテント細胞をプラスミドｐＫＤ４６を用いて形質転換した。次いで形質転換体細胞をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔き、プレートを３０℃で一夜培養してＧＢＥ１０１０と名付けられた新しい株を得た。プラスミドｐＧＢＥ０６８８を鋳型として、オリゴヌクレオチド０６３１および０６３２（それぞれＳＥＱ  ＲＣ００１１およびＲＣ００１２として示される）をプライマーとして用いることにより、ＰＣＲ産物を生成した。結果として得られた１．３ＫｂｐのＰＣＲ産物をエレクトロコンピテントなＧＢＥ１０１０細菌中に形質転換し、その形質転換混合物をスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔いた。プレートを３７℃で一夜培養して株ＧＢＥ１０１４＿ｐＫＤ４６を生成した。株ＧＢＥ１０１４＿ｐＫＤ４６において、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子ｐｆｋＢを欠失させ、欠失したＤＮＡ配列はスペクチノマイシン耐性遺伝子を含有するカセットにより置き換えた。ｐｆｋＢ遺伝子の欠失が起きたことを確かめるため、プライマー０６２１および０６２２（それぞれＳＥＱ  ＲＣ００１３およびＲＣ００１４として示される）を用いてＰＣＲ増幅を実施した。この最終的な２．２ＫｂｐのＰＣＲ産物を、同じプライマー０６２１および０６２２を用いることにより配列決定した。
【０１５３】
プラスミドｐＫＤ４６の喪失を誘導するため、株ＧＢＥ１０１４＿ｐＫＤ４６をＬＢプレート上に蒔き、プレートを４２℃で一夜培養した。プラスミドｐＫＤ４６の喪失を、単離されたコロニーをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に蒔いて３０℃で一夜培養し、ＬＢプレート上に蒔いて３７℃で一夜培養することにより確かめた。結果として得られた３７℃で培養したＬＢプレート上で増殖している株をＧＢＥ１０１４と名付けた。ＧＢＥ１０１４細胞はアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上では増殖しなかった。
【０１５４】
実施例２：株ＧＢＥ０９２９の構築
株ＧＢＥ０９０１を３７℃のＬＢプレート上に蒔き、単離されたコロニーをグルコースを炭素源として含む（２ｇ／Ｌ）ＭＳプレート上でスクリーニングした。３７℃で４８時間の培養後、コロニーが見えるようになった。１つの分離株は５時間の倍加時間を有しており、ＧＢＥ０９２９と名付けられた。
【０１５５】
実施例３：株ＧＢＥ１３４４の構築
ＧＢＥ０１２９と名付けられた株を用いて構築を開始した。ＧＢＥ０１２９はＭＧ１６５５大腸菌細菌（ＡＴＣＣ  ＃７００９２６）である。
【０１５６】
株ＧＢＥ０１２９をＬＢ培地中で培養し、ＧＢＥ０１２９細胞をエレクトロコンピテントにした。エレクトロコンピテントなＧＢＥ０１２９細胞をプラスミドｐＫＤ４６を用いて形質転換し、次いで形質転換体をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔いた。プレートを３０℃で一夜培養してＧＢＥ０１７０と名付けられた新しい株を生成した。
【０１５７】
プラスミドｐＧＢＥ０６８７を鋳型として、オリゴヌクレオチド０６３３および０６３４（それぞれＳＥＱ  ＲＣ０００３およびＲＣ０００４として示される）をプライマーとして用いてＰＣＲ産物を生成した。結果として得られた１．２ＫｂｐのＰＣＲ産物をエレクトロコンピテントなＧＢＥ０１７０細菌中に形質転換し、その形質転換混合物をアプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔いた。プレートを３７℃で一夜培養した。この培養はｐＫＤ４６プラスミドの喪失を誘発し、ＧＢＥ１３３９と名付けられた新しい株の作成をもたらした。株ＧＢＥ１３３９において、ｚｗｆ遺伝子によりコードされるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ｅｄｄ遺伝子によりコードされる６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼおよびｅｄａ遺伝子によりコードされる２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコネートアルドラーゼが不活性であった。連続するｚｗｆ、ｅｄｄ、およびｅｄａ遺伝子を欠失させ、アプラマイシン耐性遺伝子を含有するカセットで置き換えた。ｚｗｆ、ｅｄｄ、およびｅｄａ遺伝子の欠失が有効であることを確かめるため、プライマー１０３６および１０３７（それぞれＳＥＱ  ＲＣ０００５およびＲＣ０００６として示される）を用いてＰＣＲ増幅を実施した。この１．８ＫｂｐのＰＣＲ産物を、同じプライマー１０３６および１０３７を用いて配列決定した。
【０１５８】
株ＧＢＥ１３３９をエレクトロコンピテントにし、ＧＢＥ１３３９エレクトロコンピテント細胞をプラスミドｐＫＤ４６を用いて形質転換した。次いで形質転換体をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に蒔いた。プレートを３０℃で一夜培養して株ＧＢＥ１３４０を生成した。プラスミドｐＧＢＥ０６８８を鋳型として、オリゴヌクレオチド０６２９および０６３０（それぞれＳＥＱ  ＲＣ０００７およびＲＣ０００８として示される）をプライマーとして用いることにより、ＰＣＲ産物を生成した。結果として得られた１．３ＫｂｐのＰＣＲ産物をエレクトロコンピテントなＧＢＥ１３４０細菌中に形質転換し、その形質転換混合物をスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔いた。プレートを３７℃で一夜培養して株ＧＢＥ１３４１＿ｐＫＤ４６を生成した。株ＧＢＥ１３４１＿ｐＫＤ４６において、ホスホフルクトキナーゼをコードするｐｆｋａ遺伝子をスペクチノマイシン耐性遺伝子で置き換えた。ｐｆｋａ遺伝子の欠失が有効であることを確かめるため、プライマー０６１９および０６２０（それぞれＳＥＱ  ＲＣ０００９およびＲＣ００１０として示される）を用いてＰＣＲ増幅を実施した。この１．８ＫｂｐのＰＣＲ産物を、同じプライマー０６１９および０６２０を用いて配列決定した。株ＧＢＥ１３４１＿ｐＫＤ４６に関してプラスミドｐＫＤ４６の喪失を誘導するため、ＧＢＥ１３４１＿ｐＫＤ４６細胞をＬＢプレート上に蒔き、４２℃で培養した。プラスミドｐＫＤ４６の喪失を、単離されたコロニーをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に蒔いて３０℃で一夜培養し、ＬＢプレート上に蒔いて３７℃で一夜培養することにより検証した。結果として得られた３７℃で培養したＬＢプレート上で増殖している株はＧＢＥ１３４１であった。ＧＢＥ１３４１はアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上では増殖しなかった。
【０１５９】
それぞれｚｗｆ＿ｅｄｄ＿ｅｄａおよびｐｆｋＡ遺伝子の以前の座位に位置しているアプラマイシンおよびスペクチノマイシン耐性遺伝子を含有する耐性カセットを切り出すため、株ＧＢＥ１３４１をプラスミドｐＣＰ２０を用いて形質転換してＧＢＥ１３４１＿ｐと名付けられた新しい株を得た。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上での３０℃における一夜培養の後、単離されたコロニーを、３０℃でさらに一夜培養するため、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に再度画線した。次いで単離されたコロニーをＬＢプレート上に蒔き、４２℃で一夜培養した。この４２℃での培養はｐＣＰ２０プラスミドの喪失を誘発した。最終的に、その２個の耐性カセットの切り出しおよびｐＣＰ２０プラスミドの喪失を確かめるため、単離されたコロニーをスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に画線して３７℃で一夜培養し、アプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に画線して３７℃で一夜培養し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に画線して３０℃で一夜培養し、ＬＢプレート上に画線して３７℃で一夜培養した。３７℃で培養されたＬＢプレート上で増殖している生成された株を、ＧＢＥ１３４２と名付けた。ＧＢＥ１３４２細胞は、スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上、アプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上、およびアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上では増殖しなかった。
【０１６０】
株ＧＢＥ１３４２をエレクトロコンピテントにし、ＧＢＥ１３４２細胞をプラスミドｐＫＤ４６を用いて形質転換した。次いで形質転換体をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に蒔き、３０℃で一夜培養して株ＧＢＥ１３４３を得た。ＰＣＲ産物を実施し、プラスミドｐＧＢＥ０６８８を鋳型として、オリゴヌクレオチド０６３１および０６３２（それぞれＳＥＱ  ＲＣ００１１およびＲＣ００１２として示される）をプライマーとして用いた。結果として得られた１．３ＫｂｐのＰＣＲ産物をエレクトロコンピテントなＧＢＥ１３４３細菌中に形質転換し、その形質転換混合物をスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔き、続いて３７℃で一夜培養した。新しい株が生成され、ＧＢＥ１３４４＿ｐＫＤ４６と名付けられた。株ＧＢＥ１３４４＿ｐＫＤ４６において、ホスホフルクトキナーゼをコードするｐｆｋｂ遺伝子を欠失させ、スペクチノマイシン耐性カセットで置き換えた。ｐｆｋＢ遺伝子の欠失が有効であることを確かめるため、プライマー０６２１および０６２２（それぞれＳＥＱ  ＲＣ００１３およびＲＣ００１４として示される）を用いてＰＣＲ増幅を実施した。得られた２．２ＫｂｐのＰＣＲ産物を、同じプライマー０６２１および０６２２を用いて配列決定した。
【０１６１】
プラスミドｐＫＤ４６の喪失を誘導するため、株ＧＢＥ１３４４＿ｐＫＤ４６をＬＢプレート上に蒔き、４２℃で一夜培養した。プラスミドｐＫＤ４６の喪失を、単離されたコロニーをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔いて３０℃で一夜培養し、ＬＢプレート上に蒔いて３７℃で一夜培養することにより確かめた。３７℃で培養されたＬＢプレート上で増殖している生成された株をＧＢＥ１３４４と名付けた。ＧＢＥ１３４４細胞はアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上では増殖しなかった。
【０１６２】
実施例４：プラスミドｐＧＢＥ０４５７の構築
この節の目的は、大腸菌株においてラクトコッカス・ラクティスからのホスホケトラーゼＹＰ＿００３３５４０４１．１の発現を可能にするプラスミドの構築を記述することである。
【０１６３】
プラスミドｐＧＢＥ０１２３はプラスミドｐＵＣ１８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の改変版であり、改変されたマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含有する。ｐＵＣ１８からの本来のＭＣＳ（ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位からＥｃｏＲＩ制限部位まで）を、配列ＳＱ０００４で置き換えた（表３）。そのプラスミドｐＧＢ０１２３は、２種類の組み換えタンパク質のＰｌａｃプロモーターの制御下での発現を可能にする。
【０１６４】
【表５】
2014520539.tif 000018
【０１６５】
Ｌ．ラクティスのホスホケトラーゼ遺伝子を、大腸菌中での最適な発現のためにＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりコドン最適化した。加えて、Ｈｉｓタグをその遺伝子の５’位に付加し、追加の停止コドンを３’位に付加した（ＳＱ０００５）。その遺伝子構築はＰａｃＩおよびＮｏｔＩ制限部位により隣接されており、プラスミドｐＧＢＥ０４２１内で提供された。
【０１６６】
クローニング実験のため、ＰＣＲ産物および制限断片をＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製した。制限酵素およびＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，マサチューセッツ州ベヴァリー）を製造業者の推奨に従って用いた。
【０１６７】
プラスミドｐＧＢＥ０４２１を制限酵素ＰａｃＩおよびＮｏｔＩにより消化して２．６Ｋｂｐの生成物を作成した。ｐＧＢ０１２３プラスミドを同様に制限酵素ＰａｃＩおよびＮｏｔＩにより消化してその２．６Ｋｂｐの制限断片にライゲーションした。結果として得られたプラスミド（ｐＧＢＥ０４５７）を、プライマー１０６１、１０６２、１０６３、１０６４および１０６５（それぞれＳＥＱ  ＲＣ００１５、ＲＣ００１６、ＲＣ００１７、ＲＣ００１８およびＲＣ００１９として示される）を用いて配列決定した。
【０１６８】
ラクトコッカス・ラクティスからのホスホケトラーゼの発現を、その組み換えタンパク質のＨｉｓトラップを用いた精製（Ｐｒｏｔｉｎｏ  Ｎｉ−ＩＤＡ  １０００キット、Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ）後にタンパク質ゲル上で確かめた。精製は製造業者の推奨に従って行った。２種類の異なる基質：キシルロース−５−リン酸およびフルクトース−６−リン酸に対するホスホケトラーゼ活性を検出するため、精製された酵素を用いた酵素アッセイも実施した。その実験手順は、溶液のｐＨが７．５であり、１ｍＭのＭｇＣｌ２を添加したことを除いて、Leo Meile et al., (Journal of Bacteriology, May 2001, p.2929-2936)により用いられた実験手順と同じであった。この酵素アッセイに関して、１０μｇの精製されたタンパク質を７５μｌの反応に添加した。特異的な活性（形成されたアセチル−Ｐのμｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質）は、Ｄ−キシルロース−５−リン酸およびＤ−フルクトース−６−リン酸に関してそれぞれ２８１５μｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質および１９４１μｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質であった。
【０１６９】
実施例５：プラスミドｐＧＢＥ００９６の構築
大腸菌におけるアセトン生成の原因となるプラスミドの構築は、Bermejo LL., Welker NE. and Papoutsakis ET., Applied and Environmental Microbiology, 1998, Vol. 64, No. 3, pp. 1076-1085において記述されているプラスミド構築に基づいていた。
【０１７０】
株クロストリジウム・アセトブチリカムを注文した（ＡＴＣＣ  ８２４）。この株からのゲノムＤＮＡは、細菌の染色体およびｐＳＯＬ１と名付けられたプラスミドで構成されている。ｃｔｆＡおよびｃｔｆＢ遺伝子をｐＳＯＬ１プラスミドからプライマー００７０および００７１（それぞれＳＥＱ  ＲＣ００２０およびＲＣ００２１として示される）を用いてＰＣＲ増幅した。そのＰＣＲ産物の５’末端においてＢａｍＨＩ制限部位およびそのＰＣＲ産物の３’末端においてＥｃｏＲＶ制限部位を導入した。結果として得られた１．３ＫｂｐのＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＶを用いて消化し、次いで同様に制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＶを用いて消化したｐＧＢ０６８９（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩファージミド、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とライゲーションした。結果として得られたプラスミド（ｐＧＢＥ０６９０）をプライマー１０６６および１０６７（それぞれＳＥＱ  ＲＣ００２２およびＲＣ００２３として示される）を用いて配列決定した。
【０１７１】
ａｄｃ遺伝子およびその遺伝子のターミネーターをｐＳＯＬ１プラスミドからプライマー００７２および００７３（それぞれＳＥＱ  ＲＣ００２４およびＲＣ００２５として示される）を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅は、５’末端におけるＥｃｏＲＶ制限部位および３’末端におけるＳａｌＩ制限部位の挿入を可能にした。結果として得られた０．８ＫｂｐのＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＳａｌＩを用いて消化した。ｐＧＢＥ０６９０プラスミドを同様に制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＳａｌＩを用いて消化し、次いでその０．８ＫｂｐのＰＣＲ産物とライゲーションした。結果として得られたプラスミド（ｐＧＢＥ０６９１）をプライマー１０６６、１０６７、１０６８および１０６９（それぞれＳＥＱ  ＲＣ００２２、ＲＣ００２３、ＲＣ００２６およびＲＣ００２７として示される）を用いて配列決定した。
【０１７２】
プラスミドｐＧＢＥ０６９１を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩを用いて消化して２．２Ｋｂｐの産物を作成した。その２．２Ｋｂｐの制限断片はｃｆｔＡ、ｃｆｔＢおよびａｄｃ遺伝子を含有していた。ｐＧＢＥ００５１プラスミド（ｐＵＣ１９，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を同様に制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、次いで２．２Ｋｂｐの制限断片とライゲーションした。結果として得られたプラスミド（ｐＧＢＥ０６９２）を、プライマー１０６６、１０６７、１０６８および１０６９（それぞれＳＥＱ  ＲＣ００２２、ＲＣ００２３、ＲＣ００２６およびＲＣ００２７として示される）を用いて配列決定した。
【０１７３】
クロストリジウム・アセトブチリカム（ＡＴＣＣ  ８２４）ゲノムＤＮＡからのｔｈｌ遺伝子およびその対応するｔｈｌプロモーターを、プライマー００７４および００７５（それぞれＳＥＱ  ＲＣ００２８およびＲＣ００２９として示される）を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅は、５’末端におけるＫｐｎＩ制限部位および３’末端におけるＢａｍＨＩ制限部位の挿入を可能にした。結果として得られた１．４ＫｂｐのＰＣＲ産物を制限酵素ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、ｐＧＢＥ０６９２に関しても同様に消化した。消化されたｐＧＢＥ０６９２プラスミドをその１．４ＫｂｐのＰＣＲ産物とライゲーションした。結果として得られたプラスミドｐＧＢＥ０６９３をプライマー１０６６、１０６７、１０６８、１０６９、１０７０、１０７１、１０７２、１０７３および１０７４（それぞれＳＥＱ  ＲＣ００２２、ＲＣ００２３、ＲＣ００２６、ＲＣ００２７、ＲＣ００３０、ＲＣ００３１、ＲＣ００３２、ＲＣ００３３およびＲＣ００３４として示される）を用いて配列決定した。
【０１７４】
プラスミドｐＧＢＥ０１２４はプラスミドｐＳＵ１８(Borja Bartolome, Yolanda Jubete, Eduardo Martinez and Fernando de la Cruz, Gene, 1991, Vol. 102, Issue 1, pp. 75-78)の改変版であり、それは改変されたマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含有する。ｐＳＵ１８からの本来のＭＣＳ（ＥｃｏＲＩ制限部位からＨｉｎｄＩＩＩ制限部位まで）を、配列ＳＥＱ  ＳＱ０００６で置き換えた（表３）。そのプラスミドｐＧＢＥ０１２４は、２種類の組み換えタンパク質のＰｌａｃプロモーターの制御下での発現を可能にする。プラスミドｐＧＢＥ０６９３を制限酵素ＫｐｎＩおよびＳａｌＩを用いて消化して３．５Ｋｂｐの産物を作成した。ｐＧＢＥ０１２４プラスミドを同様に制限酵素ＫｐｎＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、次いで３．５Ｋｂｐの制限断片にライゲーションした。結果として得られたプラスミド（ｐＧＢＥ００９６）をプライマー１０６６、１０６７、１０６８、１０６９、１０７０、１０７１、１０７２、１０７３および１０７４（それぞれＳＥＱ  ＲＣ００２２、ＲＣ００２３、ＲＣ００２６、ＲＣ００２７、ＲＣ００３０、ＲＣ００３１、ＲＣ００３２、ＲＣ００３３およびＲＣ００３４として示される）を用いて配列決定した。
【０１７５】
実施例６：株ＧＢＥ１３４６およびＧＢＥ１３４７によるアセトン生成
プラスミドの関連する株中への形質転換の記述
株ＧＢＥ０１２９をエレクトロコンピテントにし、ＧＢＥ０１２９エレクトロコンピテント細胞をプラスミドｐＧＢＥ００９６を用いて形質転換した。次いで形質転換体をクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔き、プレートを３０℃で一夜培養して株ＧＢＥ０３２９を生成した。
【０１７６】
株ＧＢＥ１３４４をエレクトロコンピテントにし、ＧＢＥ１３４４エレクトロコンピテント細胞をプラスミドｐＧＢＥ０４５７およびｐＧＢＥ００９６の両方を用いて形質転換した。次いで形質転換体をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に蒔いた。プレートを３０℃で一夜培養して株ＧＢＥ１３４５を得た。
【０１７７】
株ＧＢＥ０３２９およびＧＢＥ１３４５からの単離されたコロニーを、炭素源としてのグルコース（２ｇ／Ｌ）とクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）とを含有するＭＳプレート上でスクリーニングした。これらのプレートを３０℃で培養して、それぞれ株ＧＢＥ１３４６およびＧＢＥ１３４７を得た。３０℃で４日間の培養後、コロニーをグルコース（２ｇ／Ｌ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を含有するＭＳ液体培地に移し、３０℃で３日間培養した。
【０１７８】
フラスコ条件の記述
発酵実験に関して、５０ｍＭリン酸二カリウムの代わりに２００ｍＭのリン酸二カリウムを含むＭＳ培地を用いた。結果として得られた培地をＭＳＰと名付けた。
【０１７９】
グルコース（１０ｇ／Ｌ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を含有する４００ｍｌのＭＳＰ液体培地に、株ＧＢＥ１３４６の前培養物または株ＧＢＥ１３４７の前培養物のどちらかを植え付けた。最初のＯＤ６００は０．１であった。その４００ｍｌの培養物をスクリューキャップで密封された５００ｍｌのボトル中で、３０℃、１７０ｒｐｍの速度で培養した。２ｍｌの分割量（ａｌｉｑｕｏｔｓ）を１日、２日、３日、６日、７日、および８日後に採取した。それぞれの分割量の試料に関して、ボトルを１０秒間開けた。
【０１８０】
分析法の記述
分割量を濾過し、グルコース濃度をグルコース（ＨＫ）アッセイキット（ＧＡＨＫ２０−１ＫＴ，Ｓｉｇｍａ）を製造業者の推奨に従って用いて決定した。アセトン濃度を、ガスクロマトグラフ４５０−ＧＣ（Ｂｒｕｋｅｒ）および以下のプログラムを用いるガスクロマトグラフィーにより決定した：
−カラム：ＤＢ−ＷＡＸ（１２３−７０３３，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
−インジェクタースプリット／スプリットレス：Ｔ°＝２５０℃
−オーブン：
○８０℃で６分間
○２２０℃まで１分ごとに１０℃
○２２０℃で７分間
○カラム流速：１．５ｍｌ／分（窒素）
−検出器ＦＩＤ：Ｔ°＝３００℃
結果
［アセトン］生成（ｍＭ）／［グルコース］消費（ｍＭ）の比率は、株ＧＢＥ１３４７に関して株ＧＢＥ１３４６に関するよりも高い。
【０１８１】
実施例７：株ＧＢＥ１３５０およびＧＢＥ１３５１によるアセトン生成
プラスミドの関連する株中への形質転換の記述
株ＧＢＥ０９２９をエレクトロコンピテントにし、ＧＢＥ０９２９エレクトロコンピテント細胞をｐＧＢＥ００９６と名付けられたプラスミドを用いて形質転換した。次いで形質転換体をクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に蒔き、プレートを３０℃で一夜培養して株ＧＢＥ１３４８を得た。
【０１８２】
株ＧＢＥ１０１４をエレクトロコンピテントにし、プラスミドｐＧＢＥ０４５７およびｐＧＢＥ００９６の両方を用いて形質転換した。次いで形質転換体をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に蒔き、プレートを３０℃で一夜培養して株ＧＢＥ１３４９を得た。
【０１８３】
株ＧＢＥ１３４８およびＧＢＥ１３４９からの単離されたコロニーを、炭素源としてのグルコース（２ｇ／Ｌ）とクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）とを含有するＭＳプレート上でスクリーニングした。これらのプレートを３０℃で４日間培養し、それぞれ株ＧＢＥ１３５０およびＧＢＥ１３５１を得た。次いで単離されたコロニーをグルコース（２ｇ／Ｌ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を含有するＭＳ液体培地に移した。ＧＢＥ１３５０およびＧＢＥ１３５１細胞を３０℃で培養した。
【０１８４】
フラスコ条件の記述
グルコース（１０ｇ／Ｌ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を含有する４００ｍｌのＭＳＰ培地に、株ＧＢＥ１３５０の前培養物または株ＧＢＥ１３５１の前培養物のどちらかを植え付けた。最初のＯＤ６００は０．１であった。その４００ｍｌの培養物をスクリューキャップで密封された５００ｍｌのボトル中で、３０℃、１７０ｒｐｍの速度で培養した。２ｍｌの分割量を１日、２日、３日、６日、７日、および８日後に採取した。それぞれの分割量の試料に関して、ボトルを１０秒間開けた。
【０１８５】
分析法の記述
分割量を濾過し、グルコース濃度をグルコース（ＨＫ）アッセイキット（ＧＡＨＫ２０−１ＫＴ，Ｓｉｇｍａ）を製造業者の推奨に従って用いて決定した。アセトン濃度を、ガスクロマトグラフ４５０−ＧＣ（Ｂｒｕｋｅｒ）および以下のプログラムを用いるガスクロマトグラフィーにより決定した：
−カラム：ＤＢ−ＷＡＸ（１２３−７０３３，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
−インジェクタースプリット／スプリットレス：Ｔ°＝２５０℃
−オーブン：
○８０℃で６分間
○２２０℃まで１分ごとに１０℃
○２２０℃で７分間
○カラム流速：１．５ｍｌ／分（窒素）
−検出器ＦＩＤ：Ｔ°＝３００℃
結果
［アセトン］生成（ｍＭ）／［グルコース］消費（ｍＭ）の比率は、株ＧＢＥ１３５１に関して株ＧＢＥ１３５０に関するよりも高かった。
【０１８６】
【表６】
2014520539.tif 000019
【０１８７】
実施例８：プラスミドｐＧＢＥ１０２０の構築
この節の目的は、大腸菌株においてラクトコッカス・ラクティスからのホスホケトラーゼＹＰ＿００３３５４０４１．１の発現を可能にし、且つアセトンの生成も可能にするプラスミドの構築を記述することである。
【０１８８】
Ｌ．ラクティスのホスホケトラーゼ遺伝子を、ｐＧＢＥ０４２１プラスミドから、プライマー１５１６および１５１７（それぞれＳＥＱ  ＲＣ００３５およびＲＣ００３６として示される）を用いてＰＣＲ増幅した。
【０１８９】
ＰＣＲ増幅は、５’末端におけるＥｃｏＲＩ制限部位およびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）ならびに３’末端におけるＫｐｎＩ制限部位の挿入を可能にした。結果として得られた２．５ＫｂｐのＰＣＲ産物を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩを用いて消化した。ｐＧＢＥ０１２３プラスミドを同様に制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩを用いて消化し、次いでその２．５ＫｂｐのＰＣＲ産物とライゲーションした。結果として得られたプラスミド（ｐＧＢＥ０９２８）をプライマー１０６１、１０６２、１０６３、１０６４および１０６５（それぞれＳＥＱ  ＲＣ００１５、ＲＣ００１６、ＲＣ００１７、ＲＣ００１８およびＲＣ００１９として示される）を用いて配列決定した。
【０１９０】
プラスミドｐＧＢＥ００９６を制限酵素ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩを用いて消化して３．６Ｋｂｐの産物を作成した。ｐＧＢＥ０９２８プラスミドを同様に制限酵素ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し、その３．６Ｋｂｐの制限断片にライゲーションした。結果として得られたプラスミド（ｐＧＢＥ１０２０）を、プライマー１９９４、１９９５、１９９６、１９９７、１９９８、１９９９、２０００、２００１、２００２および２００３（それぞれＳＥＱ  ＲＣ００３７、ＲＣ００３８、ＲＣ００３９、ＲＣ００４０、ＲＣ００４１、ＲＣ００４２、ＲＣ００４３、ＲＣ００４４、ＲＣ００４５およびＲＣ００４６として示される）を用いて配列決定した。
【０１９１】
実施例９：プラスミドｐＧＢＥ１０２１の構築
この節の目的は、大腸菌株においてアセトンの産生を可能にするプラスミドの構築を記述することである。
【０１９２】
プラスミドｐＧＢＥ００９６を制限酵素ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩを用いて消化して３．６Ｋｂｐの産物を作成した。
【０１９３】
ｐＧＢＥ０１２３プラスミドを同様に制限酵素ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し、次いでその３．６ＫｂｐのＰＣＲ産物とライゲーションした。結果として得られたプラスミド（ｐＧＢＥ１０２１）を、プライマー１９９４、１９９５、１９９６、１９９７、１９９８、１９９９、２０００、２００１、２００２および２００３（それぞれＳＥＱ  ＲＣ００３７、ＲＣ００３８、ＲＣ００３９、ＲＣ００４０、ＲＣ００４１、ＲＣ００４２、ＲＣ００４３、ＲＣ００４４、ＲＣ００４５およびＲＣ００４６として示される）を用いて配列決定した。
【０１９４】
実施例１０：株ＧＢＥ２２６４およびＧＢＥ２２６５によるアセトン生成
プラスミドの関連する株中への形質転換の記述
株ＧＢＥ０１２９をエレクトロコンピテントにし、ＧＢＥ０１２９エレクトロコンピテント細胞をプラスミドｐＧＢＥ１０２１を用いて形質転換した。次いで形質転換体をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔き、プレートを３０℃で一夜培養して株ＧＢＥ２２６２を生成した。
【０１９５】
株ＧＢＥ１３４４をエレクトロコンピテントにし、ＧＢＥ１３４４エレクトロコンピテント細胞をプラスミドｐＧＢＥ１０２０を用いて形質転換した。次いで形質転換体をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に蒔いた。プレートを３０℃で一夜培養して株ＧＢＥ２２６３を得た。
【０１９６】
株ＧＢＥ２２６２およびＧＢＥ２２６３からの単離されたコロニーを、炭素源としてのグルコース（２ｇ／Ｌ）とアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）とを含有するＭＳプレート上でスクリーニングした。これらのプレートを３０℃で培養して、それぞれ株ＧＢＥ２２６４およびＧＢＥ２２６５を得た。３０℃で４日間の培養後、コロニーをグルコース（２ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（０．１ｇ／Ｌ）およびアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＭＳ液体培地に移し、３０℃で３日間培養した。
【０１９７】
フラスコ条件の記述
グルコース（１０ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（０．１ｇ／Ｌ）およびアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＭＳＰ液体培地（２００ｍｌ）に、株ＧＢＥ２２６４の前培養物または株ＧＢＥ２２６５の前培養物のどちらかを植え付けた。最初のＯＤ６００は０．１であった。その２００ｍｌの培養物をスクリューキャップで密封された２５０ｍｌのボトル中で、３０℃、１７０ｒｐｍの速度で培養した。分割量（２ｍｌ）を１日、２日、４日、５日、および６日後に採取した。それぞれの分割量の試料に関して、ボトルを１０秒間開けた。
【０１９８】
分析法の記述
分割量を濾過し、グルコース濃度をＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ（１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ）およびガードカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＰＬ  Ｈｉ−Ｐｌｅｘ  Ｈガードカラム，ＰＬ１１７０−１８３０）を伴うＨｉ−Ｐｌｅｘカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＰＬ１１７０−６８３０）を用いたＨＰＬＣ分析により決定した。
【０１９９】
−注入量：２０μｌ
−溶媒組成：［Ｈ２ＳＯ４］：５．５ｍＭ
−カラムの温度：６５℃
−ＲＩＤ（Ｇ１３６２Ａ）：温度設定：３５℃
アセトンを濾過された分割量から酢酸メチルと混合することにより抽出した（２体積の濾過された分割量に関して１体積の酢酸メチル）。アセトン濃度を、ガスクロマトグラフ４５０−ＧＣ（Ｂｒｕｋｅｒ）および以下のプログラムを用いるガスクロマトグラフィーにより決定した：
−カラム：ＤＢ−ＷＡＸ（１２３−７０３３，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
−インジェクター：
○スプリット比：１０
○Ｔ°＝２５０℃
−オーブン：
○５０℃で９分間
○１８０℃まで１分ごとに２０℃
○１８０℃で５分間
○カラム流速：１．５ｍｌ／分（窒素）
−検出器ＦＩＤ：Ｔ°＝３００℃
結果
［アセトン］生成（ｍＭ）／［グルコース］消費（ｍＭ）の比率は、株ＧＢＥ２２６５に関して株ＧＢＥ２２６４に関するよりも高かった。
【０２００】
実施例１１：株ＧＢＥ１２８３の構築
株ＧＢＥ０９２９を、グルコースを炭素源として含有する（２ｇ／Ｌ）ＭＳプレート上に蒔いた。単離されたコロニーをグルコース（２ｇ／Ｌ）を含有するＭＳ液体培地に移し、３０℃で３日間培養した。グルコース（２ｇ／Ｌ）を含有するＭＳ液体培地（１００ｍｌ）に、株ＧＢＥ０９２９の前培養物を植え付けた。最初のＯＤ６００は０．１であった。その１００ｍｌの培養物を１Ｌのエルレンマイヤー中で、３０℃、１７０ｒｐｍの速度で培養した。ＯＤ６００が１を上回った際に、その培養物の分割量を採取し、新しい培養のための種菌として用いた（１００ｍｌの培養物を、１Ｌのエルレンマイヤー中で、３０℃、１７０ｒｐｍの速度で培養した）。株ＧＢＥ０９２９を１０回継代培養して株ＧＢＥ１２８３を得た。
実施例１２：株ＧＢＥ２２５６の構築
株ＧＢＥ１２８３をＬＢ培地中で培養し、ＧＢＥ１２８３細胞をエレクトロコンピテントにした。エレクトロコンピテントなＧＢＥ１２８３細胞をｐＫＤ４６プラスミドを用いて形質転換し、次いでアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔いた。プレートを３０℃で一夜培養した。ＧＢＥ１２８３細胞のプラスミドｐＫＤ４６を用いた形質転換は、株ＧＢＥ１２８４を生成した。
【０２０１】
プラスミドｐＧＢＥ０６８８を鋳型としてプライマー０６２９および０６３０（それぞれＳＥＱ  ＲＣ０００７およびＲＣ０００８として示される）と共に用いて１．２ＫｂｐのＰＣＲ産物を生成した。結果として得られた１．２ＫｂｐのＰＣＲ産物をエレクトロコンピテントなＧＢＥ１２８４細菌中に形質転換し、その形質転換混合物をスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔いた。次いでプレートを３７℃で一夜培養してＧＢＥ２２５２＿ｐＫＤ４６と名付けられた新しい株を生成した。株ＧＢ２２５２＿ｐＫＤ４６において、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子ｐｆｋＡを欠失させ、スペクチノマイシン耐性カセットにより置き換えた。ｐｆｋＡ遺伝子の欠失が起きたことを確かめるため、プライマー０６１９および０６２０（それぞれＳＥＱ  ＲＣ０００９およびＲＣ００１０として示される）を用いてＰＣＲ増幅を実施した。この１．７ＫｂｐのＰＣＲ産物を、同じプライマー０６１９および０６２０を用いて配列決定した。プラスミドｐＫＤ４６の喪失を確かめるため、株ＧＢＥ２２５２＿ｐＫＤ４６をＬＢプレート上に蒔き、４２℃で一夜培養した。プラスミドｐＫＤ４６の喪失を、単離されたコロニーをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔いて３０℃で一夜培養し、ＬＢプレート上に蒔いて３７℃で一夜培養することにより検証した。結果として得られた株は３７℃で培養したＬＢプレート上で増殖し、ＧＢＥ２２５２と名付けられた。ＧＢＥ２２５２細胞はアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上では増殖しなかった。
【０２０２】
株ＧＢＥ２２５２をエレクトロコンピテントにし、ＧＢＥ２２５２エレクトロコンピテント細胞をプラスミドｐＫＤ４６を用いて形質転換した。次いで形質転換体細胞をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔き、プレートを３０℃で一夜培養してＧＢＥ２２５３と名付けられた新しい株を得た。
【０２０３】
プラスミドｐＧＢＥ０６８７を鋳型として、オリゴヌクレオチド０６３１および０６３２（それぞれＳＥＱ  ＲＣ００１１およびＲＣ００１２として示される）をプライマーとして用いることにより、ＰＣＲ産物を生成した。結果として得られた１．３ＫｂｐのＰＣＲ産物をエレクトロコンピテントなＧＢＥ２２５３細菌中に形質転換し、その形質転換混合物をアプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔いた。プレートを３７℃で一夜培養して株ＧＢＥ２２５６＿ｐＫＤ４６を生成した。株ＧＢＥ２２５６＿ｐＫＤ４６において、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子ｐｆｋＢを欠失させ、欠失したＤＮＡ配列はアプラマイシン耐性遺伝子を含有するカセットで置き換えた。ｐｆｋＢ遺伝子の欠失が起きたことを確かめるため、プライマー０６２１および０６２２（それぞれＳＥＱ  ＲＣ００１３およびＲＣ００１４として示される）を用いてＰＣＲ増幅を実施した。この最終的な２．２ＫｂｐのＰＣＲ産物を、同じプライマー０６２１および０６２２を用いて配列決定した。
【０２０４】
プラスミドｐＫＤ４６の喪失を誘導するため、株ＧＢＥ２２５６＿ｐＫＤ４６をＬＢプレート上に蒔き、プレートを４２℃で一夜培養した。プラスミドｐＫＤ４６の喪失を、単離されたコロニーをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に蒔いて３０℃で一夜培養し、ＬＢプレート上に蒔いて３７℃で一夜培養することにより確かめた。結果として得られた３７℃で培養したＬＢプレート上で増殖している株をＧＢＥ２２５６と名付けた。ＧＢＥ２２５６細胞はアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上では増殖しなかった。
【０２０５】
実施例１３：株ＧＢＥ１５１８の構築
プラスミドｐＧＢＥ０６８８を鋳型としてプライマー０６３３および１１０９（それぞれＳＥＱ  ＲＣ０００３およびＲＣ００４７として示される）と共に用いて１．３ＫｂｐのＰＣＲ産物を生成した。この１．３ＫｂｐのＰＣＲ産物をエレクトロコンピテントなＧＢＥ１２８４細菌中に形質転換し、次いでその形質転換混合物をスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔き、３７℃で一夜培養して株ＧＢＥ１４３３を生成した。株ＧＢＥ１４３３において、ｚｗｆ遺伝子により構成されるＤＮＡ配列を欠失させた。この欠失したｚｗｆ遺伝子を含むＤＮＡ配列は、スペクチノマイシン耐性カセットにより置き換えた。ｚｗｆ遺伝子の有効な欠失を確かめるため、プライマー１０３６および１１１０（それぞれＳＥＱ  ＲＣ０００５およびＲＣ００４８として示される）を用いてＰＣＲ増幅を実施した。最終的な１．５ＫｂｐのＰＣＲ産物が得られた。この１．５ＫｂｐのＰＣＲ産物を、同じプライマー１０３６および１１１０を用いて配列決定した。
【０２０６】
株ＧＢＥ１４３３をエレクトロコンピテントにした。ＧＢＥ１４３３エレクトロコンピテント細胞をプラスミドｐＫＤ４６を用いて形質転換し、次いでアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に蒔いた。プレートを３０℃で一夜培養した。ＧＢＥ１４３３細胞のプラスミドｐＫＤ４６による形質転換は、株ＧＢＥ１４３６を生成した。
【０２０７】
プラスミドｐＧＢＥ０６８７を鋳型としてプライマー０６２９および０６３０（それぞれＳＥＱ  ＲＣ０００７およびＲＣ０００８として示される）と共に用いて１．２ＫｂｐのＰＣＲ産物を生成した。結果として得られた１．２ＫｂｐのＰＣＲ産物をエレクトロコンピテントなＧＢＥ１４３６細菌中に形質転換し、その形質転換混合物をアプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔いた。次いでプレートを３７℃で一夜培養してＧＢＥ１４４１＿ｐＫＤ４６と名付けられた新しい株を生成した。株ＧＢ１４４１＿ｐＫＤ４６において、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子ｐｆｋＡを欠失させ、アプラマイシン耐性カセットにより置き換えた。ｐｆｋＡ遺伝子の欠失が起きたことを確かめるため、プライマー０６１９および０６２０（それぞれＳＥＱ  ＲＣ０００９およびＲＣ００１０として示される）を用いてＰＣＲ増幅を実施した。この１．７ＫｂｐのＰＣＲ産物を、同じプライマー０６１９および０６２０を用いて配列決定した。プラスミドｐＫＤ４６の喪失を確かめるため、株ＧＢＥ１４４１＿ｐＫＤ４６をＬＢプレート上に蒔き、４２℃で一夜培養した。プラスミドｐＫＤ４６の喪失を、単離されたコロニーをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔いて３０℃で一夜培養し、ＬＢプレート上に蒔いて３７℃で一夜培養することにより検証した。結果として得られた株は３７℃で培養したＬＢプレート上で増殖し、ＧＢＥ１４４１と名付けられた。ＧＢＥ１４４１細胞はアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上では増殖しなかった。
【０２０８】
スペクチノマイシンカセットはｚｗｆ遺伝子の対応する座位に位置しており、アプラマイシンカセットはｐｆｋＡ遺伝子の対応する座位に位置していた。スペクチノマイシンおよびアプラマイシン耐性遺伝子を含有する耐性カセットを切り出すため、株ＧＢＥ１４４１をプラスミドｐＣＰ２０を用いて形質転換して株ＧＢＥ１４４１＿ｐを得た。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上での３０℃における一夜培養の後、単離されたコロニーをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に再度画線し、３０℃で一夜培養した。次いで単離されたコロニーをＬＢプレート上に蒔き、４２℃で一夜培養し、それはｐＣＰ２０プラスミドの喪失を引き起こした。次いで、その２個の耐性カセットの有効な切り出しおよびｐＣＰ２０プラスミドの喪失を確かめるため、単離されたコロニーをスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に画線して３７℃で一夜培養し、アプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に画線して３７℃で一夜培養し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に画線して３０℃で一夜培養し、ＬＢプレート上に画線して３７℃で一夜培養した。結果として得られた株は３７℃で培養したＬＢプレート上で増殖し、ＧＢＥ１４４８と名付けられた。ＧＢＥ１４４８細胞は、スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上、アプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上、およびアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上では増殖しなかった。
【０２０９】
株ＧＢＥ１４４８をエレクトロコンピテントにし、ＧＢＥ１４４８エレクトロコンピテント細胞をプラスミドｐＫＤ４６を用いて形質転換した。次いで形質転換体細胞をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔き、プレートを３０℃で一夜培養してＧＢＥ１４４９と名付けられた新しい株を得た。プラスミドｐＧＢＥ０６８８を鋳型として、オリゴヌクレオチド０６３１および０６３２（それぞれＳＥＱ  ＲＣ００１１およびＲＣ００１２として示される）をプライマーとして用いることにより、ＰＣＲ産物を生成した。結果として得られた１．３ＫｂｐのＰＣＲ産物をエレクトロコンピテントなＧＢＥ１４４９細菌中に形質転換し、その形質転換混合物をスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔いた。プレートを３７℃で一夜培養して株ＧＢＥ１５１８＿ｐＫＤ４６を生成した。株ＧＢＥ１５１８＿ｐＫＤ４６において、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子ｐｆｋＢを欠失させ、欠失したＤＮＡ配列はスペクチノマイシン耐性遺伝子を含有するカセットにより置き換えた。ｐｆｋＢ遺伝子の欠失が起きたことを確かめるため、プライマー０６２１および０６２２（それぞれＳＥＱ  ＲＣ００１３およびＲＣ００１４として示される）を用いてＰＣＲ増幅を実施した。この最終的な２．２ＫｂｐのＰＣＲ産物を、同じプライマー０６２１および０６２２を用いることにより配列決定した。
【０２１０】
プラスミドｐＫＤ４６の喪失を誘導するため、株ＧＢＥ１５１８＿ｐＫＤ４６をＬＢプレート上に蒔き、プレートを４２℃で一夜培養した。プラスミドｐＫＤ４６の喪失を、単離されたコロニーをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に蒔いて３０℃で一夜培養し、ＬＢプレート上に蒔いて３７℃で一夜培養することにより確かめた。結果として得られた３７℃で培養したＬＢプレート上で増殖している株をＧＢＥ１５１８と名付けた。ＧＢＥ１５１８細胞はアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上では増殖しなかった。
【０２１１】
実施例１４：株ＧＢＥ１４２０の構築
プラスミドｐＧＢＥ０６８８を鋳型としてプライマー０６３３および０６３４（それぞれＳＥＱ  ＲＣ０００３およびＲＣ０００４として示される）と共に用いて１．３ＫｂｐのＰＣＲ産物を生成した。この１．３ＫｂｐのＰＣＲ産物をエレクトロコンピテントなＧＢＥ１２８４細菌中に形質転換し、次いでその形質転換混合物をスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔き、３７℃で一夜培養して株ＧＢＥ１２８７を生成した。株ＧＢＥ１２８７において、ｚｗｆ、ｅｄｄ、およびｅｄａ遺伝子により構成されるＤＮＡ配列を欠失させた。この欠失したｚｗｆ、ｅｄｄ、およびｅｄａ遺伝子を含むＤＮＡ配列はスペクチノマイシン耐性カセットにより置き換えた。ｚｗｆ、ｅｄｄ、およびｅｄａ遺伝子の有効な欠失を確かめるため、プライマー１０３６および１０３７（それぞれＳＥＱ  ＲＣ０００５およびＲＣ０００６として示される）を用いてＰＣＲ増幅を実施した。最終的な１．９ＫｂｐのＰＣＲ産物が得られた。この１．９ＫｂｐのＰＣＲ産物を、同じプライマー１０３６および１０３７を用いて配列決定した。
【０２１２】
株ＧＢＥ１２８７をエレクトロコンピテントにした。ＧＢＥ１２８７エレクトロコンピテント細胞をプラスミドｐＫＤ４６を用いて形質転換し、次いでアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に蒔いた。プレートを３０℃で一夜培養した。ＧＢＥ１２８７細胞のプラスミドｐＫＤ４６による形質転換は、株ＧＢＥ１３３７を生成した。
【０２１３】
プラスミドｐＧＢＥ０６８７を鋳型としてプライマー０６２９および０６３０（それぞれＳＥＱ  ＲＣ０００７およびＲＣ０００８として示される）と共に用いて１．２ＫｂｐのＰＣＲ産物を生成した。結果として得られた１．２ＫｂｐのＰＣＲ産物をエレクトロコンピテントなＧＢＥ１３３７細菌中に形質転換し、その形質転換混合物をアプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔いた。次いでプレートを３７℃で一夜培養してＧＢＥ１３５３＿ｐＫＤ４６と名付けられた新しい株を生成した。株ＧＢ１３５３＿ｐＫＤ４６において、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子ｐｆｋＡを欠失させ、アプラマイシン耐性カセットにより置き換えた。ｐｆｋＡ遺伝子の欠失が起きたことを確かめるため、プライマー０６１９および０６２０（それぞれＳＥＱ  ＲＣ０００９およびＲＣ００１０として示される）を用いてＰＣＲ増幅を実施した。この１．７ＫｂｐのＰＣＲ産物を、同じプライマー０６１９および０６２０を用いて配列決定した。プラスミドｐＫＤ４６の喪失を確かめるため、株ＧＢＥ１３５３＿ｐＫＤ４６をＬＢプレート上に蒔き、４２℃で一夜培養した。プラスミドｐＫＤ４６の喪失を、単離されたコロニーをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔いて３０℃で一夜培養し、ＬＢプレート上に蒔いて３７℃で一夜培養することにより検証した。結果として得られた株は３７℃で培養したＬＢプレート上で増殖し、ＧＢＥ１３５３と名付けられた。ＧＢＥ１３５３細胞はアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上では増殖しなかった。
【０２１４】
スペクチノマイシンカセットはｚｗｆ＿ｅｄｄ＿ｅｄａ遺伝子の対応する座位に位置しており、アプラマイシンカセットはｐｆｋＡ遺伝子の対応する座位に位置していた。スペクチノマイシンおよびアプラマイシン耐性遺伝子を含有する耐性カセットを切り出すため、株ＧＢＥ１３５３をプラスミドｐＣＰ２０を用いて形質転換して株ＧＢＥ１３５３＿ｐを得た。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上での３０℃における一夜培養の後、単離されたコロニーをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に再度画線し、３０℃で一夜培養した。次いで単離されたコロニーをＬＢプレート上に蒔き、４２℃で一夜培養し、それはｐＣＰ２０プラスミドの喪失を引き起こした。次いで、その２個の耐性カセットの有効な切り出しおよびｐＣＰ２０プラスミドの喪失を確かめるため、単離されたコロニーをスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に画線して３７℃で一夜培養し、アプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に画線して３７℃で一夜培養し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に画線して３０℃で一夜培養し、ＬＢプレート上に画線して３７℃で一夜培養した。結果として得られた株は３７℃で培養したＬＢプレート上で増殖し、ＧＢＥ１３６８と名付けられた。ＧＢＥ１３６８細胞は、スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上、アプラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上、およびアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上では増殖しなかった。
【０２１５】
株ＧＢＥ１３６８をエレクトロコンピテントにし、ＧＢＥ１３６８エレクトロコンピテント細胞をプラスミドｐＫＤ４６を用いて形質転換した。次いで形質転換体細胞をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔き、プレートを３０℃で一夜培養してＧＢＥ１３７１と名付けられた新しい株を得た。プラスミドｐＧＢＥ０６８８を鋳型として、オリゴヌクレオチド０６３１および０６３２（それぞれＳＥＱ  ＲＣ００１１およびＲＣ００１２として示される）をプライマーとして用いることにより、ＰＣＲ産物を生成した。結果として得られた１．３ＫｂｐのＰＣＲ産物をエレクトロコンピテントなＧＢＥ１３７１細菌中に形質転換し、その形質転換混合物をスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔いた。プレートを３７℃で一夜培養して株ＧＢＥ１４２０＿ｐＫＤ４６を生成した。株ＧＢＥ１４２０＿ｐＫＤ４６において、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子ｐｆｋＢを欠失させ、欠失したＤＮＡ配列はスペクチノマイシン耐性遺伝子を含有するカセットにより置き換えた。ｐｆｋＢ遺伝子の欠失が起きたことを確かめるため、プライマー０６２１および０６２２（それぞれＳＥＱ  ＲＣ００１３およびＲＣ００１４として示される）を用いてＰＣＲ増幅を実施した。この最終的な２．２ＫｂｐのＰＣＲ産物を、同じプライマー０６２１および０６２２を用いることにより配列決定した。
【０２１６】
プラスミドｐＫＤ４６の喪失を誘導するため、株ＧＢＥ１４２０＿ｐＫＤ４６をＬＢプレート上に蒔き、プレートを４２℃で一夜培養した。プラスミドｐＫＤ４６の喪失を、単離されたコロニーをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に蒔いて３０℃で一夜培養し、ＬＢプレート上に蒔いて３７℃で一夜培養することにより確かめた。結果として得られた３７℃で培養したＬＢプレート上で増殖している株をＧＢＥ１４２０と名付けた。ＧＢＥ１４２０細胞はアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上では増殖しなかった。
【０２１７】
実施例１５：株ＧＢＥ２２６８およびＧＢＥ２２６９によるアセトン生成
プラスミドの関連する株中への形質転換の記述
株ＧＢＥ１２８３をエレクトロコンピテントにし、ＧＢＥ１２８３エレクトロコンピテント細胞をプラスミドｐＧＢＥ１０２１を用いて形質転換した。次いで形質転換体をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔き、プレートを３０℃で一夜培養して株ＧＢＥ２２６６を生成した。
【０２１８】
株ＧＢＥ１４２０をエレクトロコンピテントにし、ＧＢＥ１４２０エレクトロコンピテント細胞をプラスミドｐＧＢＥ１０２０を用いて形質転換した。次いで形質転換体をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に蒔いた。プレートを３０℃で一夜培養して株ＧＢＥ２２６７を得た。
【０２１９】
株ＧＢＥ２２６６およびＧＢＥ２２６７からの単離されたコロニーを、炭素源としてのグルコース（２ｇ／Ｌ）とアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）とを含有するＭＳプレート上でスクリーニングした。これらのプレートを３０℃で培養して、それぞれ株ＧＢＥ２２６８およびＧＢＥ２２６９を得た。３０℃で４日間の培養後、コロニーをグルコース（２ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（０．１ｇ／Ｌ）およびアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＭＳ液体培地に移し、３０℃で３日間培養した。
【０２２０】
フラスコ条件の記述
グルコース（１０ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（０．１ｇ／Ｌ）およびアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＭＳＰ液体培地（２００ｍｌ）に、株ＧＢＥ２２６８の前培養物または株ＧＢＥ２２６９の前培養物のどちらかを植え付けた。最初のＯＤ６００は０．１であった。その２００ｍｌの培養物をスクリューキャップで密封された２５０ｍｌのボトル中で、３０℃、１７０ｒｐｍの速度で培養した。分割量（２ｍｌ）を１日、２日、４日、５日、６日、７日および８日後に採取した。それぞれの分割量の試料に関して、ボトルを１０秒間開けた。
【０２２１】
分析法の記述
分割量を濾過し、グルコース濃度をＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ（１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ）およびガードカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＰＬ  Ｈｉ−Ｐｌｅｘ  Ｈガードカラム，ＰＬ１１７０−１８３０）を伴うＨｉ−Ｐｌｅｘカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＰＬ１１７０−６８３０）を用いたＨＰＬＣ分析により決定した。
【０２２２】
−注入量：２０μｌ
−溶媒組成：［Ｈ２ＳＯ４］：５．５ｍＭ
−カラムの温度：６５℃
−ＲＩＤ（Ｇ１３６２Ａ）：温度設定：３５℃
アセトンを濾過された分割量から酢酸メチルと混合することにより抽出した（２体積の濾過された分割量に関して１体積の酢酸メチル）。アセトン濃度を、ガスクロマトグラフ４５０−ＧＣ（Ｂｒｕｋｅｒ）および以下のプログラムを用いるガスクロマトグラフィーにより決定した：
−カラム：ＤＢ−ＷＡＸ（１２３−７０３３，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
−インジェクター：
○スプリット比：１０
○Ｔ°＝２５０℃
−オーブン：
○５０℃で９分間
○１８０℃まで１分ごとに２０℃
○１８０℃で５分間
○カラム流速：１．５ｍｌ／分（窒素）
−検出器ＦＩＤ：Ｔ°＝３００℃
結果
［アセトン］生成（ｍＭ）／［グルコース］消費（ｍＭ）の比率は、株ＧＢＥ２２６９に関して株ＧＢＥ２２６８に関するよりも高かった。
【０２２３】
実施例１６：株ＧＢＥ２２７２およびＧＢＥ２２７３によるアセトン生成
プラスミドの関連する株中への形質転換の記述
株ＧＢＥ２２５６をエレクトロコンピテントにし、ＧＢＥ２２５６エレクトロコンピテント細胞をプラスミドｐＧＢＥ１０２０を用いて形質転換した。次いで形質転換体をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレート上に蒔き、プレートを３０℃で一夜培養して株ＧＢＥ２２７０を生成した。
【０２２４】
株ＧＢＥ１５１８をエレクトロコンピテントにし、ＧＢＥ１５１８エレクトロコンピテント細胞をプラスミドｐＧＢＥ１０２０を用いて形質転換した。次いで形質転換体をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に蒔いた。プレートを３０℃で一夜培養して株ＧＢＥ２２７１を得た。
【０２２５】
株ＧＢＥ２２７０およびＧＢＥ２２７１からの単離されたコロニーを、炭素源としてのグルコース（２ｇ／Ｌ）とアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）とを含有するＭＳプレート上でスクリーニングした。これらのプレートを３０℃で培養して、それぞれ株ＧＢＥ２２７２およびＧＢＥ２２７３を得た。３０℃で４日間の培養後、コロニーをグルコース（２ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（０．１ｇ／Ｌ）およびアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＭＳ液体培地に移し、３０℃で３日間培養した。
【０２２６】
フラスコ条件の記述
グルコース（１０ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（０．１ｇ／Ｌ）およびアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＭＳＰ液体培地（２００ｍｌ）に、株ＧＢＥ２２７２の前培養物または株ＧＢＥ２２７３の前培養物のどちらかを植え付けた。最初のＯＤ６００は０．１であった。その２００ｍｌの培養物をスクリューキャップで密封された２５０ｍｌのボトル中で、３０℃、１７０ｒｐｍの速度で培養した。分割量（２ｍｌ）を１日、２日、４日、５日および６日後に採取した。それぞれの分割量の試料に関して、ボトルを１０秒間開けた。
【０２２７】
分析法の記述
分割量を濾過し、グルコース濃度をＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ（１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ）およびガードカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＰＬ  Ｈｉ−Ｐｌｅｘ  Ｈガードカラム，ＰＬ１１７０−１８３０）を伴うＨｉ−Ｐｌｅｘカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＰＬ１１７０−６８３０）を用いたＨＰＬＣ分析により決定した。
【０２２８】
−注入量：２０μｌ
−溶媒組成：［Ｈ２ＳＯ４］：５．５ｍＭ
−カラムの温度：６５℃
−ＲＩＤ（Ｇ１３６２Ａ）：温度設定：３５℃
アセトンを濾過された分割量から酢酸メチルと混合することにより抽出した（２体積の濾過された分割量に関して１体積の酢酸メチル）。アセトン濃度を、ガスクロマトグラフ４５０−ＧＣ（Ｂｒｕｋｅｒ）および以下のプログラムを用いるガスクロマトグラフィーにより決定した：
−カラム：ＤＢ−ＷＡＸ（１２３−７０３３，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
−インジェクター：
○スプリット比：１０
○Ｔ°＝２５０℃
−オーブン：
○５０℃で９分間
○１８０℃まで１分ごとに２０℃
○１８０℃で５分間
○カラム流速：１．５ｍｌ／分（窒素）
−検出器ＦＩＤ：Ｔ°＝３００℃
結果
［アセトン］生成（ｍＭ）／［グルコース］消費（ｍＭ）の比率は、株ＧＢＥ２２７３に関して株ＧＢＥ２２７２に関するよりも高かった。
【０２２９】
【表７】
2014520539.tif 000020
【図１−１】
2014520539.tif 000021
【図１−２】
2014520539.tif 000022
【配列表】
2014520539000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年3月11日(2014.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
ａ）ホスホケトラーゼ活性を有すること；
ｂ）（ｉ）ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化により、もしくは遺伝子改変されていない微生物と比較してホスホフルクトキナーゼ活性を低減するように遺伝子改変されていることにより、減少した、もしくは不活性化されたエムデン−マイヤーホフ−パルナス経路（ＥＭＰＰ）を有すること；または
（ｉｉ）ホスホフルクトキナーゼ活性を有しないこと
および
ｃ）（ｉ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化により、もしくは遺伝子改変されていない微生物と比較してグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減するように遺伝子改変されていることにより、減少した、もしくは不活性化されたペントースリン酸経路（ＰＰＰ）の酸化分枝を有すること；または
（ｉｉ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有しないこと；
を特徴とする組換え微生物。
【請求項２】
さらに以下：
ｄ）フルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼ活性を有すること
を特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の組換え微生物であって、ＥＭＰＰが、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（単数または複数）の不活性化により、または遺伝子改変されていない微生物と比較してグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減するように遺伝子改変されていることにより、さらに減少している、または不活性化されている、前記組換え微生物。
【請求項４】
増大したホスホケトラーゼ活性を有するように遺伝子改変されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項５】
前記の微生物が真菌である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項６】
前記の微生物が細菌である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項７】
ＰＥＰ依存性ＰＴＳトランスポーターをコードしている遺伝子（単数または複数）が不活性化されている、請求項６に記載の組換え微生物。
【請求項８】
さらにそれが：
ｅ）アセチル−ＣｏＡをアセトンに変換できること；
を特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項９】
さらにそれが：
ｆ）アセトンをイソブテンに変換できること；
を特徴とする、請求項８に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
さらにそれが：
ｇ）アセトンをプロペンに変換できること；
を特徴とする、請求項８に記載の組換え微生物。
【請求項１１】
グルコースのアセチル−ＣｏＡへの変換のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組換え微生物の使用。
【請求項１２】
グルコースのアセトンへの変換のための、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の組換え微生物の使用。
【請求項１３】
グルコースのイソブテンへの変換のための、請求項９に記載の組換え微生物の使用。
【請求項１４】
グルコースのプロペンへの変換のための、請求項１０に記載の組換え微生物の使用。
【請求項１５】
グルコースからアセトンを生成するための方法であって、以下の工程：
請求項８〜１０のいずれか１項に記載の微生物を適切な培地中で培養し；そして
場合により前記のアセトンを培養液から回収する；
を含む、前記方法。
【請求項１６】
グルコースからイソブテンを生成するための方法であって、以下の工程：
請求項９に記載の微生物を適切な培地中で培養し；そして
場合により前記のイソブテンを回収する；
を含む、前記方法。
【請求項１７】
グルコースからプロペンを生成するための方法であって、以下の工程：
請求項１０に記載の微生物を適切な培地中で培養し；そして
場合により前記のプロペンを回収する；
を含む、前記方法。
【国際調査報告】
2014520539.tif 000023
2014520539.tif 000024
2014520539.tif 000025
2014520539.tif 000026
2014520539.tif 000027