(57)【要約】  本発明は枯草菌の菌株に関する。本発明は、また、枯草菌の菌株によって生産されたバイオサーファクタントおよびそれらの使用に関する。本発明はまた、前記バイオサーファクタントを含む組成物に関するとともに、前記バイオサーファクタントを生産する方法に関する。本発明はまた、バイオサーファクタントを得るための方法に関するとともに、前記方法を実行するための装置に関する。本発明は、特に、バイオ農薬の生産または植物検疫産業のためのバイオサーファクタントのみならず、食品産業、化粧品産業、製薬産業、および石油産業に用いることができる。【代表図】図７
2014528964.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サーファクチンをコードするためのオペロンsrfAが中断されており、およびミコサブチリンをコードするためのオペロンmycが構成的プロモータＰrepUによって置換されていることを特徴とする、枯草菌ATCC 6633株からなる枯草菌株。
【請求項２】
パスツール研究所（フランス・パリ）の国立培養微生物収集機関(CNCM)に番号CNCM I- 445で2011年3月10日に寄託された枯草菌株からなる、請求項１に記載の枯草菌株。
【請求項３】
ミコサブチリンを得るための方法であって、請求項１または２に記載の枯草菌株を培養するステップと、得られた前記ミコサブチリンを回収するステップと、を有する方法。
【請求項４】
（ａ）有機基材を有する培地のなかで前記枯草菌株を培養するステップであって、前記培養は、空気/液体の膜接触器の表面で行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
さらに、
（ｂ）  前記培地から微生物を分離するために、ステップ（ａ）で得られた培地の精密濾過ステップ、および／または
（ｃ）  ステップ（ａ）または（ｂ）で得られた培地からバイオサーファクタントを分離するために、ステップ（ａ）または（ｂ）で得られた培地の限外濾過ステップを有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記有機基材が、でんぷん、グルコース、サッカロース、キシロース、グリセロール、有機酸、アミノ酸、および、これら有機基材の混合物を含む群から選択される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記空気/液体の膜接触器は、０．０１μｍと２μｍの間の大きさの孔を有する、請求項４から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記精密濾過ステップ（ｂ）で使用される中空糸膜が、０．１マイクロメートルから０．４５マイクロメートルの遮断しきい値を有する、請求項４から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記限外濾過ステップ（ｃ）で使用される膜が、５kDaと２０kDaとの間の遮断しきい値を有する、請求項４から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
１８個の炭素原子を有するミコサブチリンの脂肪酸鎖（mycosubtilin C18）であって、次の式（I）で表されるミコサブチリンの脂肪酸鎖。
2014528964.tif 000017
【請求項１１】
１７個の炭素原子を有するとともに、そのペプチド環における３位のアスパラギン（asparagine）に代えてグルタミン（glutamine）を有するミコサブチリンの脂肪酸鎖（mycosubtilin Gln3 C17）であって、次の式（II）によって示されるミコサブチリンの脂肪酸鎖。
2014528964.tif 000018
【請求項１２】
請求項１０に記載の少なくとも１つのミコサブチリンC18、および／または請求項１１に記載の少なくとも１つのミコサブチリンGln3 C17を有する組成物。
【請求項１３】
さらに、ミコサブチリンiso-C16、ミコサブチリンn-C16、ミコサブチリンanteiso-C17、ミコサブチリンiso-C17、およびこれらの混合物を含む群から選択される少なくとも１つのミコサブチリンを含む、請求項１２に記載の構成物。
【請求項１４】
ミコサブチリンiso-C16を１％から６０％、ミコサブチリンGln3 C17を１％から２０％、ミコサブチリンn-C16を１％から１０％、ミコサブチリンanteiso-C17を２０％から９５％、ミコサブチリンiso-C17を５％から３０％、ミコサブチリンC18を１％から５％含む、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１０または１１に記載のミコサブチリン、または請求項１２から１４に記載の組成物であって、抗真菌薬として使用されるミコサブチリンまたは組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バチルス種（Bacillus sp）の菌株（strain）に関する。
【０００２】
本発明は、また、バチルス種の菌株によって製造されたバイオサーファクタント（biosurfactants）およびその使用に関する。本発明は、また、これらのバイオサーファクタントを有する組成物、およびこれらのバイオサーファクタントを製造するための方法に関する。
【０００３】
本発明は、また、バイオサーファクタントを得る方法、およびこの方法を実行するための装置に関する。
【０００４】
本発明は、特に、植物健康産業のための植物農薬またはバイオサーファクタントの生産における応用の分野を見出し、また、食品産業、化粧品産業、化学産業、薬剤産業および石油産業および自然環境における応用の分野を見出す。
【０００５】
以下の記載において、実施例の末尾（本明細書の末尾）に示されている参照のリストは、[1] など[  ]の間で言及される。
【背景技術】
【０００６】
従来の農業生産システムは、市場の期待、および顧客から受け入れられるコストに従って、量と質の観点から十分な生産を確保するために、農薬のタイプの植物健康製品を使用している。これらの製品の使用は農業システムに対しては利益を与えるとはいうものの、人の健康および自然環境に対しては悪影響を引き起こすだろう。地下水および地表水の品質の劣化、および農業環境における生物多様性の減少は、最も頻繁に指摘されている結論である。
【０００７】
特に細菌を起源とするバイオサーファクタントは、多数の興味深い特性、特に、植物健康分野に利用することができる界面活性剤、抗ウィルス性、抗菌性、および抗真菌性の特性を有していることが知られている。これらのバイオサーファクタントは、単独でも使用でき、またはいくつかのバイオサーファクタントを混合しても使用できる。複数のバイオサーファクタントを混合して使用するときに相乗的な効果が示されている。（参照文献１、参照文献２、参照文献３）
参照文献１：(Ongena and Jacques, 2008 Bacillus lipopeptides: versatile weapons for plant disease biocontrol. Trends Microbiol. 16, 115-125 [1]
参照文献２：チェコ特許公開公報第20011620号（CZ20011620） [2]
参照文献３：ドイツ特許出願第102005050123号（DE 102005050123） [3]
【０００８】
これらのバイオサーファクタントは、化学的起源の農薬に比べてより良い生分解性、低い毒性、およびより高い物理化学的耐性を有している。加えて、化粧品市場は乳化剤のように抗菌作用および物理化学的特性を結合する生物起源の分子に特別な関心を寄せている。
【０００９】
バイオサーファクタントはまた、沈殿物中に含まれる油の回収の支援をするという用途がある。ここでは、バイオサーファクタントの注入が油の粘度を減少させ、実質的に回収油の比率を改善する。それら（バイオサーファクタント）はまた、炭化水素による水の汚染に対処するために用いられ、化学的な界面活性剤よりも格段に有効である。加えて、これらのバイオサーファクタントは処理水の生態系に対する毒性はない。
【００１０】
バイオサーファクタントに対する需要は、従って、特に食品産業、化粧品産業、化学産業、製薬産業および石油産業と自然環境において、ここ数年で増加している。多数の生産方法が研究され使用されており、刊行物または特許出願申告の主題となっている（参照文献４）。
参照文献４：フランス特許公報第２５７８５５２号（FR 2578552） [4]
【００１１】
しかしながら、現在利用できるバイオサーファクタントはあまり有効ではなく、わずかな生物学的特性および／または化学的特性を有するに留まる。
【００１２】
従って、好ましくは先行技術のバイオサーファクタントに比較して改善された特性を有する代替的なバイオサーファクタントを提供する真の必要性が存在する。
【００１３】
加えて、バイオサーファクタントを得るために利用できる有効な手段を持つことへの真の必要性が、現在存在する。
【００１４】
バチルス種によって生産されたバイオサーファクタントを製造する方法が特に研究されている。しかしながら、これらの方法は気泡の形をした酸素の添加によって泡の生成を引き起こす。第１のアプローチは通気した反応装置を用いることである。この反応装置は機械的に撹拌されており、バイオサーファクタントおよびそれを含むものによって生じた気泡を連続的に取り出す。この方法は多くの時間と労力を必要とし、特に大規模生産にはあまり使用されていない（参照文献５）。
参照文献５：(Guez et al., 2007. Setting up and modelling of overflowing fed-batch cultures of Bacillus subtilis for the production and continuous removal of lipopeptides. J Biotechnol, 131, 67-75 [5])
【００１５】
泡の問題を避けるために、嫌気性条件下で働くことおよび最終的な電子受容体として硝酸塩を用いる試みが行われている（参照文献６、７，８）。バイオサーファクタントの生産は、菌株の能力がこれらの窒素代謝に適応しているか、いないかに大きく依存する。工業的な量のバイオサーファクタントを生産することを可能にする有効な解決策は現在に至るまで開発されていない。加えて、化学起源の農薬の使用はますます物議を醸しており、化学起源の農薬を代替するため、および工業的規模における生物起源のこれらの分子の生産方法を開発するために生物起源の分子の研究や使用が必要である。
参照文献６：(Davis, Lynch and Varley. 1999. The production of surfactin in batch culture by Bacillus subtilis ATCC 21332 is strongly influenced by the conditions of nitrogen metabolism. Enzyme Microb. Technol. 25, 322-329. [6]
参照文献７：国際公開０２／２６９６１号公報（WO 0226961）[7]
参照文献８：欧州特許第１３２０５９５号公報（EP 1320595）[8]
【００１６】
従って、バイオサーファクタントを低い生産コストで大量に継続的に生産するための方法を含んで、先行技術の欠陥、欠点および障害を克服することができる方法および装置を開発する真の要求が存在する。
【発明の概要】
【００１７】
発明の開示
本発明は、枯草菌の菌株、ミコサブチリン（mycosubtilins）、これらのミコサブチリンを含む組成物、およびこれらのミコサブチリンを得るための方法を提供することによって、前述の要求を正確に満たす。
【００１８】
本発明は、また、特に泡の生成を撲滅するまたは限定することにより、工業的規模でバイオサーファクタントを生産するための方法および装置を提供する。
【００１９】
本発明の主題は、従って、バイオサーファクタントを得るための方法であり、微生物の培養が空気／液体の膜接触器の表面で行われている、有機基質を含む培地におけるバイオサーファクタントを生産することができる微生物の培養のステップであるステップ（ａ）を含む。
【００２０】
発明者らは、事実、初めにこの方法を開発し、導入していた。驚くことに、空気／液体の膜接触器上での細胞の固定化は、泡の生成を避けてバイオサーファクタントを継続的に生産するために特に好ましい。加えて、本発明による方法は、バイオサーファクタント生産収率を増加する。さらに、本発明による方法における空気／液体の膜接触器の使用は、バイオサーファクタントを継続的に生産することを可能にする。
【００２１】
以下、「バイオサーファクタント」とは、両親媒性であるとともに微生物から生産される界面活性分子を意味する。それは例えば、リポペプチド（lipopeptide）、リン脂質（phospholipid）、糖脂質（glycolipid）、リポタンパク質（lipoprotein）、または脂肪酸エステル（fatty acid ester）から選択される化合物であってもよい。例えば、リポペプチドは、イツリン（iturin）、サーファクチン（surfactin）、ミコサブチリン（mycosubtilin）、シリンゴマイシン（syringomycin）、フェンギシン（fengycin）（または、プリバスタチン（plipastatin））、リチェニシン（lichenysin）、バシロマイシン（bacillomycin）、クルスタキン（kurstakin）、トラシシン（tolaasin）、アルトロファクチン（arthrofactin）、セラウェッチン（serrawettin）、プチソブリン（putisolvin）、およびマッセトリド（massetolide）を含む群から選択されてもよい。リン脂質は、例えば、ホスファチジルコリン（phosphatidylcholine）を含む群から選択されてもよい。エステルは、ソルビタン（sorbitan）または、ラムノース（rhamnose）エステル、モノミスチリン（monomyristin）、モノリノレイン（monolinolein）、およびモノリノレニン（monolinolenin）を含む群から選択されてもよい。糖脂質はたとえばラムノリビド（rhamnolipid）でもよい。
【００２２】
「微生物の培養」とは、微生物を成長させるために用いられる、および／または、それを１またはそれ以上の分子に生産させることができる、全ての技術を意味する。
【００２３】
「バイオサーファクタントを生産することができる微生物」とは、バイオサーファクタントを合成する能力を有し、組織分化を欠いている単細胞または多細胞のあらゆる微細な生物を意味する。それは例えば、細菌（bacterium）、酵母、かび（mould）、または藻類（alga）であってもよい。
【００２４】
例えば、細菌は、バチルス属（Bacillus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、セラチア属（Serratia）、バークホルデリア属（Burkholderia）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、ノカルジア属（Nocardia）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、クロストリジウム属（Clostridium）、チオバチルス属（Thiobacillus）、アースロバクター属（Arthrobacter）、アルカニボラックス属（Alcanivorax）、およびパエニバチルス属（Paenibacillus）を含む群から選択される属に属してもよい。例えば、酵母は、カンジダ属（Candida）、シュードザイマ属（Pseudozyma）、ウスチラゴ属（Ustilago）、シチゾネラ属（Schizonella）、クルツマノミセス属（Kurtzmanomyces）、トルロプシス属（Torulopsis）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、およびウィケルハミエラ属（Wickerhamiella）を含む群から選択される属に属してもよい。好ましくは、バイオサーファクタントを生産する微生物はバチルス属に属する。
【００２５】
バイオサーファクタントを生産することができる微生物がバチルス属に属している場合、それは、例えば枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）及びバチルス・モジャンベンシス（Bacillus mojavensis）を含む群から選択されてもよい。それは例えば、枯草菌を含む群から選択された菌株の場合には、パスツール研究所（フランス、パリ）の国立培養微生物収集機関（ＣＮＣＭ）に２０１１年３月１０日にCNCM I-4451の番号のもとで寄託されたような枯草菌でもよい。また、枯草菌BBG125と呼ばれるものだけでなく、枯草菌ATCC 21332 、枯草菌BBG21 、枯草菌ATCC 6633 、枯草菌BBG100 、枯草菌ATCC 9943 、枯草菌S499 、枯草菌BBG116 、枯草菌BBG131、バチルスリケニフォルミスBAS50 、バチルスリケニフォルミスATCC 14580に由来する菌株、およびバチルス・チューリンゲンシスBBG300でもよい。
【００２６】
好ましくは、ミコサブチリン（micosubtilin）を生産するための、バイオサーファクタントを生産することができる微生物は、枯草菌BBG125 、枯草菌BBG100、および、枯草菌BBG1116を含む群から選択されるが、より好ましくは、枯草菌BBG125 、枯草菌BBG100を含む群から選択される。
【００２７】
好ましくは、サーファクチン（surfactin）を生産するための、バイオサーファクタントを生産することができる微生物は、枯草菌BBG131である。
【００２８】
好ましくは、フェンギシン（fengycin）を生産するための、バイオサーファクタントを生産することができる微生物は、枯草菌ATCC 21332、および枯草菌BBG21を含む群から選択される。
【００２９】
好ましくはを繰り返すが、本発明によればバイオサーファクタントを生産するための微生物は、枯草菌BBG125である。
【００３０】
バイオサーファクタントを生産することができる微生物がシュードモナス属に属している場合、それは、例えば、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・シリコイ（Pseudomonas cichorii）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）シュードモナス・スタッツェリ（Pseudomonas stutzeri）、シリンゲ菌（Pseudomonas syringae）およびシュードモナス・トラシイ（Pseudomonas tolaasii）を含む群から選択されてもよい。
【００３１】
以下、「有機基質」とは、微生物を成長させることを可能にする、および／または、１またはそれ以上の分子を生産することを可能にする、あらゆる物質または物質の混合物を意味する。例えば、有機基質は、デンプン、グルコース、グルタミン酸、ショ糖、キシロース、グリセロール、有機酸、アミノ酸、およびこれらの有機基質の混合物を含む群から選択されてもよい。例えば、有機基質は、以下の組成を有するランディ培地（Landy medium）であってもよい。：グルコース２０ｇ／リットル、グルタミン酸５ｇ／リットル、酵母エキス１ｇ／リットル、リン酸水素二カリウム（K2HPO4）１ｇ／リットル、硫酸マグネシウム０．５ｇ／リットル、塩化カリウム０．５ｇ／リットル、硫酸銅(II)（CuSO4）１．６ｇ／リットル、硫酸鉄（III）（Fe2(SO4)3）１．２ｍｇ／リットル、硫酸マンガン（II）（MnSO4）０．４ｍｇ／リットル（参照文献９）。  有機基質は、例えば修正したランディ培地、すなわち例えば、硫酸アンモニウム２．３ｇ／リットル、および／または、グルタミン酸濃度２ｇ／リットルを補充したランディ培地、であってもよい（参照文献１０）。
参照文献９：(Landy et al. 1948. Bacillomycin; an antibiotic from Bacillus subtilis active against pathogenic fungi. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 67, 539-541) [9]
参照文献１０：(Guez et al., 2008. Respiration activity monitoring system (RAMOS), an efficient tool to study the influence of the oxygen transfer rate on the synthesis of lipopeptide by Bacillus subtilis. J. Biotechnol. 134, 121-126 [10])
【００３２】
以下、「空気／液体の接触器」とは、酸素を含む気体を用いて液体培地に酸素を送り込むための装置を意味する。空気／液体の接触器は、特に空気／液体の膜接触器を含む。それは例えば、空気／液体の膜接触器を含む反応装置の場合であってもよい。空気／液体の接触器の例としては、次の接触器が挙げられる。ＣＦＰで始まる参照記号によって定義される型式に従ってＧＥヘルスケア（GE Healthcare）から供給される「中空糸（Hollow fibre）カートリッジ」、ＫＭで始まる参照記号によって定義される型式に従ってスペクトラムラボ（Spectrum Labs）から供給される「中空糸モジュール」。
【００３３】
空気／液体の膜接触器は、また、液相から気相を分離する。これら２つの相が混ざり合うことなく、気相は膜の一方側を循環し、液相は膜の他方側を流れる。（参照文献１１）
参照文献１１：(Remize and Cabassud 2003, A novel bubble-free oxidation reactor: the G/L membrane contactor. Recent progress in method engineering. Integration of membranes in the methods 2. Lavoisier Tec and Doc. [11])
【００３４】
「空気／液体の膜接触器」は、培地内で酸素の拡散を許容する多孔質膜を意味する。
【００３５】
例えば、空気／液体の膜接触器は、中空糸または平膜から作られた膜であってもよい。
【００３６】
空気／液体の膜接触器は、例えば０．０１μｍから２μｍ、例えば０．０１μｍから１μｍ、例えば０．１μｍから０．６５μｍの間の大きさの細孔を有してもよい。
【００３７】
空気／液体の膜接触器は、例えば０．１ｍ2から２０ｍ2の間の表面積を有してもよい。空気／液体の膜接触器の表面積は好ましくは１ｍ2より大きい。
【００３８】
空気／液体の膜接触器は、それら２つの相のより良い分離を保証するために、例えば疎水性膜であってもよい。例えば、空気／液体の膜接触器は、ポリエーテルスルホン（polyethersulfone）、ポリプロピレン（polypropylene）、ポリスルホン（polysulfone）、再生セルロース（regenerated cellulose）及びセルロースエステル（cellulose esters）を含むポリマーの群から選択される材料から製造されてもよい。
【００３９】
空気／液体の膜接触器は、例えば、平坦な形状、円筒形状、円錐形の端部を有する円筒形状、または、微生物の培養および酸素交換に最適化されたいかなる幾何学的な形状であってもよい。
【００４０】
空気／液体の膜接触器の例として、次の膜を特に述べることができる。
−  ＧＥヘルスケアヨーロッパ社(Munich, Germany)からの（CFP-6-D-45）、
−  ＣＦＰで始まる参照記号によって定義される型式に従ってＧＥヘルスケアから供給される中空糸濾過モジュール（中空糸のカテゴリ）
−  ＫＭで始まる参照記号によって定義される型式に従ってスペクトラムラボから供給される中空糸濾過モジュール（中空糸モジュール）。
【００４１】
本発明によれば、バイオサーファクタントを生産することができる微生物は、空気／液体の膜接触器の表面で完全にまたは部分的に活動的に固定化されてもよい。換言すれば、空気／液体の接触器に存在する微生物の主要な部分は、この接触器の膜の表面に固定化されており、他の部分はそれらから解放された後は培地内の懸濁液にいる。
【００４２】
従って、本発明による方法は、有機基質を含む培地においてバイオサーファクタントを生産することができる微生物を培養するステップ（ａ）を含み、微生物は、空気／液体の膜接触器の表面で培養されている。換言すれば、本発明による方法は、好ましくは培養皿や発酵槽をなくしてしまうことができる。本発明による方法は、好ましくはミコサブチリンを継続的にかつ十分に満足できる量で生産することができる。好ましくは、本発明による方法は継続的に実行される。培養皿または発酵槽を任意的に追加しても良いが、それは必須ではない。培養皿または発酵槽の追加はそれらが生産収率を低減させるのでむしろ勧められない。従って、好ましくは本発明による方法は培養皿または発酵槽を含まない装置によって実行される。換言すれば、本発明による方法によれば、バイオサーファクタントを生産することができる微生物の培養は空気／液体の膜接触器の表面だけで行うことができる。
【００４３】
バイオサーファクタントを生産することができる微生物にとって必要な酸素は、前記微生物が固定されている空気／液体の膜接触器の細孔を介した拡散によって移動する。換言すれば、本発明によれば、微生物培地の酸素供給は、反応装置にある泡立ちシステムによってなされるのでも、微生物培養反応器の外側に位置している酸素供給システムによってなされるものでもない。
【００４４】
空気／液体の膜接触器の酸素の流れは、バイオサーファクタントを生産することができる微生物に酸素を送り込むために、いかなる流量にも調整することができる。当業者は、酸素の追加必要量に応じて空気／液体の膜接触器の流量を決定することができる。発明者らは、毎分の液体の体積に対して、０．２から２倍の間の気体の体積（vvm）の通気流が、培地および微生物へ酸素を送り込むためにとりわけ効果的であることを見出している。空気／液体の膜接触器の空気流量は、従って例えば、０．５vvmから２．０vvmの間であることができる。好ましくは、ミコサブチリンを生産するための空気／液体の膜接触器の空気流量は、０．２５vvmである。好ましくは、サーファクチンを生産するための空気／液体の膜接触器の空気流量は、１vvmである。好ましくは、フェンギシンを生産するための空気／液体の膜接触器の空気流量は、０．５vvmである。
【００４５】
本発明の方法によれば、培養ステップ（ａ）は、複数の空気／液体の膜接触器の表面で行うことができる。例えば、培養ステップ（ａ）は、２つの空気／液体の膜接触器の表面で行うことができ、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の空気／液体の膜接触器の表面で行うことができる。当業者は、生産されるべきバイオサーファクタントの量に応じて、空気／液体の膜接触器の数を決定することができる。
【００４６】
本発明の目的の１つは、空気／液体の膜接触器の表面に固定される微生物の量を増加させることである。このことは、空気／液体の膜接触器の表面積、および／または、空気／液体の膜接触器の数を増加させることにより行うことができる。
【００４７】
培養ステップ（ａ）が複数の空気／液体の膜接触器の表面で行われる場合、それらの空気／液体の膜接触器は、例えば、直列または並列に配置されてもよい。培養ステップ（ａ）が複数の空気／液体の膜接触器の表面で行われる場合、好ましくは、それらの空気／液体の膜接触器が並列に配置される。
【００４８】
本発明の方法は、さらに、バイオサーファクタントを含んでいる培地からバイオサーファクタントを分離するステップを含んでもよい。この分離ステップは、バイオサーファクタントを含んでいる液体培地からバイオサーファクタントを分離するための当業者が知っているいかなる手段によって行ってもよい。
【００４９】
例えば、バイオサーファクタントを含んでいる培地からバイオサーファクタントを分離するステップは、精密濾過（microfiltration）、限外濾過（ultrafiltration）、ナノ濾過（nanofiltration）および遠心分離を含む群から選択された１またはそれ以上のステップを含んでもよい。
【００５０】
例えば、バイオサーファクタントを含んでいる培地からバイオサーファクタントを分離するステップは、以下のステップを含む。
（ｂ）  ステップ（ａ）で得られた培地を、その培地から微生物を分離するために精密濾過するステップ、および／または
（ｃ）  ステップ（ａ）または（ｂ）で得られた培地を、ステップ（ａ）または（ｂ）で得られた培地からバイオサーファクタントを分離するために限外濾過するステップ、を含む。
【００５１】
好ましくは、分離ステップは、（ｂ）および（ｃ）の各ステップを含む。
【００５２】
精密濾過ステップ（ｂ）および限外濾過ステップ（ｃ）は、ステップ（ａ）および／またはステップ（ｂ）で得られた培地からバイオサーファクタントを継続的に抽出することができる。
【００５３】
空気／液体の膜接触器と精密濾過（ｂ）ステップおよび限外濾過ステップ（ｃ）を組み合わせることにより、バイオサーファクタントを生産することができる微生物からバイオサーファクタントを継続的に生産するとともに抽出することができる。
【００５４】
精密濾過ステップ（ｂ）は、あらゆる精密濾過手段を用いて微生物を含んでいる培地から微生物を分離することができる。例えば、精密濾過手段は精密濾過膜であってもよい。例えば、精密濾過手段は有機または無機の精密濾過膜であってもよく、例えば中空糸膜（hollow-fibre membrane）であってもよい。
【００５５】
精密濾過ステップ（ｂ）は、例えば、０．１から０．４５マイクロメートル（μｍ）の孔径を持つ中空糸から製造された膜を用いて行ってもよい。好ましくは、ステップ（ｂ）で用いられる中空糸膜は、０．２μｍの孔径を有する。
【００５６】
精密濾過ステップ（ｂ）を行うために用いることができる膜の例としては、以下の膜がある。
−  ０．２μｍの孔径を有する中空ポリスルホン糸または中空ポリエーテルスルホン糸、CFP-2-E-4X2MAを参照(GE-Healthcare Europe GmbH, Munich, Germany)、
−  ０．４５μｍの孔径を有する中空ポリスルホン糸または中空ポリエーテルスルホン糸、CFP-4-E-4X2MAを参照、または、０．６５μｍの孔径を有する中空ポリスルホン糸または中空ポリエーテルスルホン糸、CFP-2-E-6X2MAを参照(GE-Healthcare Europe GmbH, Munich, Germany)
−  ＣＦＰで始まる参照記号によって定義される型式に従ってＧＥヘルスケア社から提供される中空糸精密濾過モジュールまたは中空糸限外濾過モジュール（中空糸カテゴリ）、
−  ＫＭで始まる参照記号によって定義される型式に従ってスペクトラムラボ（Spectrum Labs） (Rancho Dominguez, CA, USA)から提供される中空糸濾過モジュール（中空糸モジュール）、
−  ＳＰＣから始まる参照記号によって定義される型式に従ってザルトリウス・ステディム（Sartorius Stedim）(Aubagne, France)から提供されるSartocon精密濾過カセット。
【００５７】
限外濾過ステップ（ｃ）は、あらゆる濾過手段を用いてバイオサーファクタントを含んでいる培地からバイオサーファクタントを分離することができるとともにバイオサーファクタントを濃縮することができる。例えば、限外濾過手段は、限外濾過膜でもよく、例えば、再生セルロースから製造された限外濾過膜でもよい。
【００５８】
限外濾過ステップ（ｃ）は、例えば、５キロダルトン（kDa）と５０キロダルトン（kDa）の間に遮断しきい値を有する膜によって行われてもよく、例えば、５kDaと３０kDaとの間、例えば、５kDaと２０kDaとの間に遮断しきい値を有する膜によって行われてもよい。ステップ（ｃ）で用いられる膜は好ましくは、１０kDaの遮断しきい値を有する。
【００５９】
限外濾過ステップ（ｃ）を行うために用いることができる膜の例としては、以下の膜がある。
−  再生セルロースから製造された１０kDaの遮断しきい値を有する限外濾過膜、3051443901E-SWを参照(Sartorius, Goettingen, Germany),
−  再生セルロースから製造された１０kDaの遮断しきい値を有する限外濾過膜、P2C010C01を参照(Millipore Headquarters, 290 Concord Road, Billerica, MA, USA)。
【００６０】
ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）で用いる膜は、好ましくは１２１℃で２０分間の滅菌に耐える。
【００６１】
本発明による方法がバイオサーファクタントを排出する微生物による有機物の生分解に対する既知の方法と相違する点は、既知の方法では全ての微生物を再利用することが可能か否かが、培地および生産されたバイオサーファクタントからの有機物の残留物を除去した後で分かるという点においてである。このことによって、バイオリアクターにおける微生物の高度な濃縮を得ることが可能になる。
【００６２】
これはまた、生産されたバイオサーファクタントの約９５％がほとんど泡の生成なく培地に留まることで、バイオサーファクタントを排出する微生物による有機物の生分解に対する既知の方法から区別される。約５％のバイオサーファクタントが膜反応器の空気／液体の境界面に吸着される。しかし、膜を洗浄することで、取り除くことができる。
【００６３】
空気／液体の膜接触器は、生産された、および膜反応器の空気／液体の境界面に吸着されているバイオサーファクタントを回収するために、当業者に既知のいかなる手段によっても洗浄することができる。例えば、空気／液体の膜接触器の洗浄は、蒸留水、 水酸化ナトリウム溶液、次亜塩素酸ナトリウム溶液、炭酸水素ナトリウム溶液又は炭酸水素カリウム溶液、または、炭酸ナトリウム溶液又は炭酸カリウム溶液、を含む群から選択された１またはそれ以上の洗浄溶液によって行われてもよい。洗浄溶液は、回収されるバイオサーファクタントの量を増加することができるいかなるｐＨにされてもよい。例えば、洗浄溶液は、ｐＨが１０でもよい。
【００６４】
洗浄溶液は、回収されるバイオサーファクタントの量を増加することができるいかなる温度にされてもよい。例えば、洗浄溶液は、２０℃と５０℃の間の温度にされる。
【００６５】
本発明によれば、培地の温度は、当業者に既知のいかなる加熱手段によって調整されてもよい。例えば、加熱手段は熱交換器であってもよい。例えば、加熱手段は、Ｕ字型熱交換器、水平管式クラスタを有する熱交換器、垂直管式クラスタを有する熱交換器、スパイラル式熱交換器、プレート式熱交換器、ブーイ円柱（Bouhy column）熱交換器、または、ブロック熱交換器を含む群から選択されてもよい。加熱手段は、好ましくは管式熱交換器である。
【００６６】
従って、本発明による方法は、バイオサーファクタントを生産することができる微生物からバイオサーファクタントを生産することができる、いかなる温度でも行うことができる。例えば、本方法は、０℃と７０℃との間の温度で行われてもよいが、好ましくは２０℃と３７℃との間である。好ましくは、本方法は、ミコサブチリンを生産するためには、２２℃の温度で行われてもよい。本方法は、フェンギシンを生産するためには、好ましくは３０℃の温度で行われてもよい。好ましくは、本方法は、サーファクチンを生産するためには、３７℃の温度で行われてもよい。
【００６７】
加えて、本発明による方法は、バイオサーファクタントを生産することができる微生物からバイオサーファクタントを生産することができるいかなるｐＨでも行うことができる。そのｐＨは、培地への基本溶液または酸性溶液の追加を制御することで調整されてもよい。
【００６８】
基本溶液は、例えば、ナトリウム化合物（soda）、カリウム化合物（potash）およびアンモニアを含む群から選択されてもよい。
【００６９】
酸性溶液は、例えば、りん酸、硫酸および硝酸を含む群から選択されてもよい。
【００７０】
そのｐＨは、バイオサーファクタントを生産することができる微生物を生かすことができるいかなる値にも調整されてもよい。それは例えば、ｐＨ６とｐＨ８との間の値、好ましくはｐＨ７に調整されてもよい。当業者は、必要な値にｐＨを調整するための基本溶液および酸性溶液の量を決定することができる。
【００７１】
本発明による方法は、好ましくは継続的に実行される。すなわち、空気／液体の膜接触器の供給および微生物によって生産されたバイオサーファクタントの抽出を、中断することなく行うことができる。本発明による方法はバイオサーファクタントを生産することができる微生物から、いかなる時間当たりの割合でもバイオサーファクタントを抽出することができるように行われてもよい。本方法により行うことができる割合は、すなわち、空気／液体の膜接触器に加えられる培地の流量であり、当業者であれば容易に適合させることができる。発明者らは、０．０５ｈ-1と０．５ｈ-1の間の希釈倍率で継続的な方法で処理することが微生物からバイオサーファクタントを生産するために特に有効であることを見出している。希釈倍率は、供給または取り出す率を培地の体積で割ることにより定義される。本発明による方法は、従って、例えば、０．０５ｈ-1と０．５ｈ-1との間の希釈倍率、好ましくは０．１ｈ-1の希釈倍率に相当する時間当たりの割合で循環的に行うことができる。
【００７２】
本発明の他の主題は、ここに述べた方法を実行するための装置であり、前記装置は空気／液体の膜接触器を備える。例えば、本発明による装置は、少なくとも１つの空気／液体の膜接触器を有する空気／液体の接触器を備える。
【００７３】
空気／液体の接触器および空気／液体の膜接触器は上記に定義されたものでよい。
【００７４】
空気／液体の膜接触器および空気／液体の接触器の数は、上記に定義された通りでよい。
【００７５】
本発明による装置は、膜または、複数の空気／液体の膜接触器以外のいかなる通気手段も有しない。換言すれば、本発明による装置は、反応装置のなかに配置された泡立てシステムを有しない。それはまた、微生物の培養反応装置の外側に配置された酸素供給システムもまた、備えていない。本発明による装置は、さらに、精密濾過手段および／または限外濾過手段を備えてもよい。本発明による装置は、好ましくは、精密濾過手段および限外濾過手段を備える。精密濾過手段および限外濾過手段は、上記に述べたものでよい。
【００７６】
好ましくは、本発明による装置は、本発明による方法を継続的に行うために必要な手段を備える。換言すれば、本装置は好ましくは、培地を導入するための手段および微生物によって生産されたバイオサーファクタントを取り除くための手段を備える。本発明による方法を継続的に実行するための装置を得るために当業者に既知のいかなる導入手段および取除き手段を用いてもよい。
【００７７】
本発明による装置は、さらに、蒸発手段を備えてもよい。以下、「蒸発手段」とは、バイオサーファクタントを含んでいる培地において、バイオサーファクタントを濃縮するためのいかなる手段をも意味する。それは例えば、VV2000型のロータリーエバポレーター（Rotavapor）(Heidolph Instruments GmbH & Co, Schwabach, Germany)の真空蒸着装置を含む群から選択される蒸発手段、および上昇薄膜蒸発器（climbing-film evaporator）であってもよい。本発明による装置は、さらに、培地の温度を調節する加熱手段を備えてもよい。加熱手段は、例えば、その１つを上記に述べている。加熱システムは、パイプシステムを介して空気／液体の膜接触器に接続されてもよい。
【００７８】
「パイプシステム」とは、流体または気体をその中で循環させるいかなる手段をも意味する。例えば、流体は、液体またはゲルでもよい。パイプシステムは、特に、本発明による装置の種々の要素を相互に接続することを可能にする。例えば、パイプシステムは、シリコンタイプの柔軟なまたは堅固な配管(Cole Parmer, Vernon Hills, IL, USA)、または、316Sステンレス鋼から製造された配管(Swagelok Company, Solon, OH, USA)のいかなるタイプでもよい。
【００７９】
パイプシステム内における流体または気体の循環は、１またはそれ以上のポンプおよび／または１またはそれ以上の弁によって調整されてもよい。
【００８０】
本発明による装置は、さらに、少なくとも１つのポンプを備える。
【００８１】
「ポンプ」は、本発明の意味する範囲において、液体に、例えば本発明の装置における培地に、流速を付勢するための手段を意味する。それは例えば、蠕動（peristaltic）ポンプ、ローブポンプ、膜（membrane）ポンプでもよい。例えば、マスターフレックスＬ／Ｓ蠕動ポンプのコンパクト駆動モデル（Masterflex L/S peristaltic pumps compact drive model） (Cole Parmer Vernon Hills, IL, USA)、ミリポア社ポンプ(Millipore, Bedford, MA, USA)、Sartojetポンプ(Sartorius, Sartorius Stedim France SAS, Aubagne)、およびワトソン・マーロー（Watson-Marlow）３２３ポンプ (Watson Marlow, Falmouth, Cornwall, United Kingdom)を挙げることができる。加えて、ポンプは人手でまたは自動で制御されてもよい。
【００８２】
本発明による装置は、さらに、少なくとも１つの弁を備える。
【００８３】
以下、「弁」は、液体の流れ、例えば本発明の装置においては培地の流れ、を止めるため、または調節するための手段を意味する。例えば、調整弁、「２状態」弁、または、ソレノイド弁であってもよい。例えば、ポリフッ化ビニリデン（polyvinylidene fluoride）（PVDF）、ポリプロピレン（PP）、パーフロオロアルコキシ（perfluoroalkoxy）(PFA)、または、ステンレス鋼から製造された調整弁を挙げることができる。加えて、弁は人手でまたは自動で制御されてもよい。
【００８４】
発明者らは、以下に、本発明の方法を行うための、本発明による装置の使用について述べる。
【００８５】
本発明の別の主題は、枯草菌ATTC 6633株から得られた枯草菌の菌株である。それは、シンテサーゼ・サーファクチン（synthetase surfactin）をコードするためのオペロンsrfAがそのなかで切断されており、およびミコサブチリン・シンテターゼ（micosubtilin synthetase）をコードするためのオペロンmycのプロモータが、そこで強力な構成的プロモータ（constitutive promoter）ＰrepUによって置換されている。
【００８６】
好ましくは、この枯草菌の菌株はパスツール研究所（フランス・パリ）の国立培養微生物収集機関(CNCM)に番号CNCM I- 4451で2011年3月10日に寄託された枯草菌の菌株である。この菌株はまた、枯草菌BBG125と呼ばれている。
【００８７】
本発明の別の主題は、本発明による枯草菌の菌株を培養するステップ、および、得られたミコサブチリンを回収するステップを含むミコサブチリンを生産するための方法である。
【００８８】
枯草菌BBG125株は、たとえば、バイオサーファクタントを生産するためのいかなる方法にも用いてよく、特に、上記に述べたミコサブチリンC18およびミコサブチリンGln3 C17を生産するための方法に使用することができる。例えば、バイオサーファクタントを生産するための方法は、枯草菌BBG125菌株を培養するステップおよび得られたバイオサーファクタントを回収するステップを含む。例えば、バイオサーファクタントを生産するための方法は、上記に述べた本発明の１つであってもよい。
【００８９】
発明者らによって開発された枯草菌BBG125株は驚異的である。この菌株は、サーファクチンを生産することなくミコサブチリンを生産することができる。加えて、それは、今までに特徴づけられたことのないミコサブチリンを生産することができる。
【００９０】
従って、本発明は、以下に示すミコサブチリンに関する。
−  ミコサブチリンC18：次の式（I）によって示され、１８個の炭素原子を有するミコサブチリンの脂肪酸鎖。
2014528964.tif 000003
−  ミコサブチリンGln3 C17：次の式（II）によって示され、１７個の炭素原子を有するとともに、そのペプチド環における３位のアスパラギン（asparagine）に代えてグルタミン（glutamine）を有するミコサブチリンの脂肪酸鎖。
2014528964.tif 000004
【００９１】
ミコサブチリンC18およびミコサブチリンGln3 C17は、すでに述べたように抗真菌薬（antifungal agent）として用いることができる。それらは加えて、現在使用されているミコサブチリンに対して同等以上の抗真菌効果を有する。
【００９２】
以下、「抗真菌薬」は、菌類（fungi）および／または酵母（yeasts）による感染症を治療する、および／または予防する能力を有している物質を意味する。
【００９３】
発明者らは、また、ミコサブチリンの混合物を有する組成物を生産している。
【００９４】
本発明の別の主題は、少なくとも１つのミコサブチリンC18および／または少なくとも１つのミコサブチリンGln3 C17を有する組成物である。
【００９５】
例えば、この組成物は、さらに、ミコサブチリンiso-C16、ミコサブチリンn-C16、ミコサブチリンanteiso-C17、および、ミコサブチリンiso-C17を含む群から選択された１またはそれ以上の別のミコサブチリンを含んでもよい。
【００９６】
ミコサブチリンC18が組成物中に存在している場合、それはその組成物の重量比１％から５％の濃度で存在してもよい。
【００９７】
ミコサブチリンGln3 C17が組成物中に存在している場合、それはその組成物の重量比１％から２０％の濃度で存在してもよい。
【００９８】
ミコサブチリンiso-C16が組成物中に存在している場合、それはその組成物の重量比１％から６０％の濃度で存在してもよい。
【００９９】
ミコサブチリンn-C16が組成物中に存在している場合、それはその組成物の重量比１％から１０％の濃度で存在してもよい。
【０１００】
ミコサブチリンanteiso-C17が組成物中に存在している場合、それはその組成物の重量比２０％から９５％の濃度で存在してもよい。
【０１０１】
ミコサブチリンiso-C17が組成物中に存在している場合、それはその組成物の重量比５０％から３０％の濃度で存在してもよい。
【０１０２】
例えば、本発明による組成物は、その重量％において以下を含んでもよい。ミコサブチリンiso-C16の１％から６０％、ミコサブチリンGln3 C17の１％から２０％、ミコサブチリンn-C16の１％から１０％、ミコサブチリンanteiso-C17の２０％から９５％、ミコサブチリンiso-C17の５％から３０％、および、ミコサブチリンC18の１％から５％。
【０１０３】
この組成物は、好ましくはその重量％において以下を含んでもよい。ミコサブチリンiso-C16の２６％、ミコサブチリンGln3 C17の１％、ミコサブチリンn-C16の２％、ミコサブチリンanteiso-C17の４４％、ミコサブチリンiso-C17の２３％、および、ミコサブチリンC18の１％。
【０１０４】
この組成物は、例えば、抗真菌性の組成物として用いられてもよい。換言すれば、それは抗真菌薬に使用されるための組成物であってもよい。
【０１０５】
本発明によるミコサブチリンの混合物を含む組成物は、４μＭから３２μＭの最小発育阻止濃度の抗真菌性能を有する。
【０１０６】
本発明によるミコサブチリンおよびミコサブチリンの混合物を含む組成物は、水、エタノール、ジメチルスルホキシド（DMSO）、炭酸ナトリウム、トリス塩酸（Tris-HCl）およびこれらの溶液の混合物を含む群から選択された溶液を混合したものであることができる。
【０１０７】
これらの溶液の混合物は、２成分または３成分の混合物であってもよい。混合物が２成分の場合は、その成分は、水／エタノール、水／メタノール、水／ジメチルスルホキシド、水／炭酸ナトリウム、水／トリス塩酸、エタノール／メタノール、エタノール／ジメチルスルホキシド、エタノール／炭酸ナトリウム、エタノール／トリス塩酸、メタノール／ジメチルスルホキシド、メタノール／炭酸ナトリウム、または、メタノール／トリス塩酸であってもよい。それらの比は、例えば、４対１と１対４との間、例えば３対１と１対３との間,例えば２対１と１対２との間、例えば、１対１、２対１、３対１または４対１であってもよい。溶液の混合物が３成分である場合、それらの成分は、水／エタノール／メタノール、水／エタノール／ジメチルスルホキシド 、水／エタノール／炭酸ナトリウム、水／エタノール／トリス塩酸、水／メタノール／ジメチルスルホキシド、水／メタノール／炭酸ナトリウム、水／メタノール／トリス塩酸、エタノール／メタノール／ジメチルスルホキシド、エタノール／メタノール／炭酸ナトリウム、エタノール／メタノール／トリス塩酸、または、ジメチルスルホキシド／炭酸ナトリウム／トリス塩酸であってもよい。また、それらの比は例えば、１対１対１、２対１対１、１対２対１、１対１対２、３対１対１，１対３対１、１対１対３、３対２対１、３対１対２、２対３対１、２対１対３、１対２対３、または、１対３対２であってもよい。
【０１０８】
本発明によるミコサブチリンおよびミコサブチリンの混合物を含む組成物は、抗真菌薬として用いられてもよい。
【０１０９】
本発明は、従ってまた、本発明によるミコサブチリン、または、抗真菌薬として用いられるための本発明による組成物に関する。
【０１１０】
発明者らは、従って、泡の生成を避けてバイオサーファクタントの継続的な生産を可能にする方法および、その生産収率を増加することができる方法を提供する。発明者らはまた、この方法を実行するための装置のみならずそれを顕著に生産することができる枯草菌株を提供している。この方法においては今までに特徴付けられていないミコサブチリンであって、現在抗真菌薬として使用されているミコサブチリンと同等以上の抗真菌効果を有するミコサブチリンを提供する。発明者らはまた、現在使用されているミコサブチリンの効果よりも優れている抗真菌効果を有する組成物を提供している。
【０１１１】
他の利点は、また、参照として与えられる添付図面によって説明されている以下の実施例を読むことで、当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】微生物によって生産されたリポペプチドの抽出を、泡の生成なく継続的に生産するための装置を示す線図である。図中、Ｍ１は区画Ｃ１およびＣ２を有する中空糸から製造された空気／液体の膜接触器を示す。ここで区画Ｃ１は空気が循環する外部の区画であり、区画Ｃ２は培地が循環する内部の区画である。Ｍ２は、区画Ｃ３およびＣ４を有する精密濾過手段である精密濾過部材を示す。Ｍ３は、区画Ｃ５およびＣ６を有する限外濾過濾過手段である限外濾過過膜を示す。Ｂ１、Ｂ２、およびＢ３は、それぞれ計量装置を示す。Ｂは、皿２の撹拌手段を駆動させるモータを示す。Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、およびＰ７は容量ポンプを示す。「Ｍｉ」は「培地」を意味する。「Ｄｅ」は「廃棄物」を意味し、「Ｅｔ」は、「熱交換器」を意味する。
【図２】微生物によって生産されたリポペプチドの抽出および精製を、泡の生成なく継続的に生産するための装置を示す線図である。図中、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、「Ｍｉ」、「Ｄｅ」および「Ｅｔ」は、図１と同じ意味である。Ｍ４は、区画Ｃ７およびＣ８を有する限外濾過手段である限外濾過過膜を示す。Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６およびＢ７はそれぞれ計量装置を示す。Ｂは、皿２または皿４の撹拌手段を駆動させるモータを示す。Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、およびＰ１２は容量ポンプを示す。Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、およびＶ５は弁を示す。「Ｃｏ」は「凝縮器」（condenser）を意味し、「Ｘ」は微生物によって生産されたリポペプチドを含む溶液に対応する。
【図３】図１の装置における代替回路が破線で示されている線図である。Ｐ１３およびＰ１４は容量ポンプを示す。Ｖ６、Ｖ７、およびＶ８は弁を示す。Ｂ７は計量装置を示す。
【図４】図２の装置における代替回路が破線で示されている線図である。Ｐ１３およびＰ１４は容量ポンプを示す。Ｖ６、Ｖ７、およびＶ８は弁を示す。Ｂ７は計量装置を示す。
【図５】図１から図４に示された装置の第１の部分を示す。ここでは、複数の空気／液体の膜接触器が並列に配置されている。この図においては、３つの空気／液体の膜接触器が示されている。
【図６】プラスミドpBG106のεpbp-PrepU-neo-εfenF配列を生成している２．６kbの断片の相同組換えの概略図である。ここで、断片εpbp およびεfenFは、枯草菌ATCC 6633からポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生じており、従って、プラスミドpBG200を形成している。図中、「Sphl」、「Xbal」、「BspEl」、および「Xmal」は、それぞれ名祖となった酵素の制限部位を示す。「εpbp」および「εfenF」は、相同組換えのためのカセット（cassettes）を示す。「pbp」は、ペニシリンに結合しているタンパク質をコードする遺伝子を表す。「Pmyc」は、枯草菌ATCC 6633のオリジナルプロモータを示す。「fenF」、「mycA」、「mycB」、および「mycC」は、ミコサブチリンのオペロンを構成する４つの遺伝子を示す。「yngL」は、未知の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を示す。「PrepU」は、pUB110の複製遺伝子のプロモータを示す。「neo」は、ネオマイシン／カナマイシンへの耐性遺伝子を示す。
【図７】BBG125株を導き出す、BBG116株のsrfAオペロンでのプラスミドpBG144の相同組換えの概略図である。「EcoRI」、「BstEII」、および「Mfel」は、それぞれ名祖となった酵素の制限部位を示す。「εsrfAA」および「εsrfAA'」は、相同組換えのためのカセットを示す。「hxlR」は、srfAオペロンの上流に位置している遺伝子を示す。「PsrfA」は、srfAオペロンの生来のプロモータを示す。「cat」は、クロラムフェニコールへの耐性遺伝子を示す。「tet」は、テトラサイクリンへの耐性遺伝子を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１３】
実施例
実施例１：枯草菌BBG125株の構築
【０１１４】
枯草菌BBG125株は、パスツール研究所（フランス・パリ）の国立培養微生物収集機関(CNCM)に受託番号CNCM I- 4451で2011年3月10日に寄託された。
【０１１５】
それは、以下に述べるプロトコルに従ってATCC 6633野生型の枯草菌株(参照文献１２)から構築されていた。
参照文献１２：(Duitman et al, 1999. The mycosubtilin synthetase of Bacillus subtilis ATCC 6633: a multifunctional hybrid between a peptide synthetase, an amino transferase, and a fatty acid synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 13294-13299 [12])
１．１  εpbp-PrepU-neo-εfenFおよびrep(R6K)を含むハイブリッドプラスミドpBG200を構築するためのプロトコル
プラスミドpBG106（参照文献１３）は、下記（参照文献１４）に述べるプロトコルに従って配列番号１１の塩基配列の２．６キロ塩基対（kb）のεpbp-PrepU-neo-εfenF断片を分離するとともに精製するために、制限酵素SphI(Fermentas, Villebon sur Yvette, France; reference ER0601)および制限酵素SacI（Fermentas, Villebon sur Yvette, France; reference ER1131）によって消化された。
参考文献１３：Lecle're et al, 2005. Mycosubtilin overproduction by Bacillus subtilis BBG100 enhances the organism’s antagonistic and biocontrol activities. Appl. Environ. Microbiol., 71, 4577-4584 [13]
参考文献１４：Sambrook and Russell, 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York [14]。
【０１１６】
この塩基配列は、枯草菌ATCC 6633株の染色体を含む相同組換えのための２つのカセット(εpbpおよびεfenF)を載せている。
【０１１７】
同時に、その配列が分離されて精製されている（参照文献１４）４５１塩基対(pb)のrep(R6K)を載せる断片を含む５つの断片の混合物を生成する制限酵素Nspl(Fermantas, Villebon sur Yvette, France; reference ER1471)および制限酵素SacI (Fermentas, Villebon sur Yvette, France; reference ER1131)によって、プラスポゾン（plasposon） pTnMod-RKm’（参照文献１５）が処理された。
参照文献１４：(Sambrook and Russell, 2001 [14])
参照文献１５：(Dennis and Zylstra, 1998. Plasposons: modular self-cloning minitransposon derivatives for rapid genetic analysis of gram-negative bacterial genomes. Appl. Environ. Microbiol. 64, 2710-2715 [15])
【０１１８】
配列εpbp-PrepU-neo-εfenF およびrep(R6K)を含む断片は、その後、相互に連結された。（参照文献１４）
【０１１９】
それらの制限酵素が用いられた部位は以下であった。
−  Sphl: GCATGC（塩基配列の配列番号１１の１位）
−  Xbal: TCTAGA（塩基配列の配列番号１１の７４３位および２０８８位）
−  Sacl: GAGCTC（塩基配列の配列番号１１の２６３０位）
【０１２０】
カセット、εpbp, PrepU-neo、および εfenFは、以下の方法で構築された。
−  カセットεpbp：Sphl から Xbalへ（配列番号１２）
−  カセットPrepU-neo: Xbal からXbalへ （配列番号１３）
−  カセットεfenF: XbalからSaclへ （配列番号１４）
【０１２１】
得られた結合は、ネオマイシンの20 μg/ml を含むLuria-Bertani培地（またはLB培地、またはLuria Broth培地）（参照文献１７）での選択による大腸菌CC118(λpir)の菌株（参照文献１６）を形質変換するために用いた。
参照文献１６：(Herrero, de Lorenzo and Timmis, 1990. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. J. Bacteriol. 172: 6557-67 [16])
参照文献１７：(Bertani, 2003, Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2 and other experimental systems. J. Bacteriol. 186, 595-600 [17])
【０１２２】
図６にこの構造を模式的に示す。
【０１２３】
１．２  BBG116を得るためのプロトコル
枯草菌RFB102株（枯草菌ATCC 6633に由来する菌株）は、amyEの Pspac-comKカセットの挿入によって得られた。Pspacは、IPTGによって誘導され得るプラスミドpA-spac(Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, OH, USA)に由来するプロモータを指定し、comKはバチルス属の生来のコンピテンスに対して必須の遺伝子を指定する。これはスペクチノマイシンへの耐性遺伝子(Pspac-comk-spc)に関連しており、染色体遺伝子amyEに統合されている。RFB102株は、IPTG (isopropyl-β-D-galactopyranoside)によって誘導される生来のコンピテンスによって、形質変換のための能力が増進されている。それは、プラスミド増幅システムTempliPhi (GE Healthcare)によって前処理されたpBG200によって形質変換され、その後、Dubnauによって 1982年に記述されたプロトコル（参照文献１８）に従ってネオマイシンへの耐性を用いて選択された。
参照文献１８：(Genetic transformation of Bacillus subtilis p148-178. In D. Dubnau (Ed) The molecular biology of the Bacilli, vol. I. Bacillus subtilis. Academic Press, Inc. New York [18])
【０１２４】
Nm-Rクローンの中で、RFB102の染色体におけるカセットεpbp-PrepU-neo-εfenFの二重乗換えによる挿入が、プライマーPBP-FO2:AATAACGGACATGCCGAAGTG （配列番号１）、およびプライマーFENF-REF2: AATAGGCCGACCAAGACGTTC（配列番号２）を用いてＰＣＲによって検証された。
【０１２５】
２２℃でのLandy/MOPS培地におけるミコサブチリンの過剰産生が下記の実施例２に記載されている作業方法に従って検証された。
【０１２６】
枯草菌BBG116株がこのようにして得られた。
【０１２７】
１．３  プラスミドpBG144を構築するためのプロトコル
【０１２８】
枯草菌のsrfAオペロンの挿入不活化（「ノック・アウト」）専用の6.5 kbのプラスミドpBG212が以下のようにして構築された。
プラスミドpGEM-T Easy(Promega Corp, Charbonnie'res, France)に予め挿入された枯草菌168株(Accession NCBI PRJNA76)、すなわち、枯草菌亜種のゲノムDNAから、プライマーSRF-FO ACAGGAATATGCTCAATCGAAG （配列番号３）およびプライマーSRF-REV AAATTCGCTTCCAGGCTTCTG （配列番号４）を用いて、カセットεsrfAA (2.2 kb)がＰＣＲによって生成された。
【０１２９】
このアンプリコンは、ベクターpUC19 (New England Biolabs, Ispwich, MA, USA)の部位EcoRI (Fermentas, Villebon sur Yvette, France; reference ER0271)において引き続きサブクローンされた。
【０１３０】
カセットεsrfAAは従って、遺伝子tetの挿入によって部位MfeI (Fermentas reference ER0751)で切断された。遺伝子tetは、セレウス菌（Bacillus cereus）(Accession: NC_001705.1)のオリジネータであるプラスミドpBC16 (DSMZ GmbH, Brunswick, Germany)から、プライマーTETP1 GTTGTATCGATGATGAAATACTGAATTTTAAACTTAG（配列番号５）およびプライマーTETT1 TTTAATGGATCTAGAAGATTTGAATTCCTGTTAT（配列番号６）を用いて、ＰＣＲによって予め生成されたものである。
【０１３１】
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）(DSMZ GmbH, Brunswick, Germany, Accession: NC_002013.1)に由来するプラスミドpC194のプライマーpC194cmfwd AGAAAGCAGACAGGTAACCCTCCTAA （配列番号７）、およびプライマーpC194cmrev GCAGGTTAGTGACATTAGGTAACCGA （配列番号８）を用いて、ＰＣＲによって予め生成していたcat遺伝子の、ｔet遺伝子の端部に位置する部位BstEII (Fermentas, Villebon sur Yvette, France; reference ER0391)での挿入によってプラスミドpBG144が得られた。
【０１３２】
図７にこの構造を模式的に示す。
【０１３３】
１．４  枯草菌BBG125を得るためのプロトコル
【０１３４】
プラスミドpBG144を有する枯草菌BBG116の新規な形質変換が、Dubnauによって1982年に記載されたプロトコル（参照文献１８）に従ってAatII(Fermentas, Villebon sur Yvette, France; reference ER0991)によって予め直鎖化された。
【０１３５】
６つのCm-R Tc-Rクローンが、好ましい抗生物質を含むゲロース（gelosed）LB培地で分離された。ＰＣＲによる検査が、プライマーSRFAA5-FWD; AAGGAATCTCGCAATCATTTATCG（配列番号９）およびSRFAA5REV; CTTGGTGTAAGCGGAATTTCTGTC （配列番号１０）を用いて行われた。３７℃のLandy/MOPS培地でサーファクチンを生じないことが下記の実施例２に記載された手順によって検証された。
【０１３６】
枯草菌BBG125突然変異株が、ミコサブチリンの単一生産菌株として受け入れられた。
【０１３７】
枯草菌BBG116および枯草菌BBG125の２つの菌株は、５％の血液を含むゲロースでの溶血活性のみならず、PDA培地での酵母およびカビ（糸状菌）に対する抗真菌活性を有する。
【０１３８】
これらの活性は、枯草菌BBG116株の場合には、生産されるサーファクタントとミコサブチリンの過剰産生との間の相互作用によってより注目される。これらの特性は、それらの表面張力の減少という長所によって、ゲロース培地の表面で定住できるそれらの能力が密接な関係を有している。
【０１３９】
枯草菌BBG125およびその親株の概略の特徴を以下の表１に示す。
【０１４０】
（表１）：枯草菌BBG125およびその親株の概略の特徴
2014528964.tif 000005
【０１４１】
表中、Comは形質転換に対する生来のコンピテンスを、Mycはミコサブチリンの生産を、Srfはサーファクチンの生産を、Amyはでんぷん分解活性を、SpcR, NmR, TcR,およびCmRは、スペクチノマイシン、ネオマイシン／カナマイシン、テトラサイクリン、およびクロラムフェニコールへの耐性を、それぞれ示す。
【０１４２】
枯草菌ATCC 6633株に比べて、枯草菌BBG125株は、より大量のミコサブチリンを生産し、いかなるサーファクチンも生産しない。
【０１４３】
実施例２：培地の準備
【０１４４】
２．１  ランディ（Landy）培地
【０１４５】
ランディ培地の組成は以下である。グルコース２０ｇ／ｌ、グルタミン酸５ｇ／ｌ、酵母エキス１ｇ／ｌ、リン酸水素二カリウム1ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／ｌ、塩化カリウム０．５ｇ／ｌ、硫酸銅(II) １．６ｍｇ／ｌ、硫酸鉄（III）１．２ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン（II）０．４ｍｇ／ｌ。
【０１４６】
２．２  菌株の溶液
【０１４７】
培地の組成の再現性を確保するために、滅菌した濃縮溶液が製造された。１０倍のグルコース溶液（２００ｇ／ｌ）が、１２１℃で２０分間の高圧蒸気滅菌法によって滅菌された。４倍のグルタミン酸溶液（２０ｇ／ｌ）が５Ｍ水酸化カリウムの溶液によってｐＨ８に調整され、０．２μｍの多孔性フィルタによる濾過によって滅菌された。２０倍の酵母エキス溶液（２０ｇ／ｌ）が、１２１℃で２０分間の高圧蒸気滅菌法によって滅菌された。４０倍の１規定の無機物（リン酸カリウム４０ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム２０ｇ／ｌ、塩化カリウム２０ｇ／ｌ）が、濃硫酸を用いて塩が全溶解するように酸性にされ、０．２μｍの多孔性フィルタによる濾過によって滅菌された。４０倍の２規定の無機塩類（硫酸銅(II) ６４ｍｇ／ｌ、硫酸鉄（III）４８ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン（II）１６ｍｇ／ｌ）が濃硫酸を用いて塩が全溶解するように酸性にされ、０．２μｍの多孔性フィルタによる濾過によって滅菌された。
【０１４８】
２．３  １リットルのLandy培地の生産
【０１４９】
滅菌されており使い捨てのものであるピペットは別にして、用いられた材料は予め、１２１℃で２０分間の高圧蒸気滅菌法によって滅菌された。グルタミン酸溶液２５０ｍｌが無菌的に取り扱われて三角フラスコに注がれた。グルコース溶液１００ｍｌがそこへ無菌的に加えられ、その後、酵母エキス溶液５０ｍｌ、および最終的にそれぞれの無機溶液２５ｍｌが加えられた。ｐＨは、滅菌された５Ｍ水酸化カリウム溶液によって７．０に調整された。体積が１リットルになるように、滅菌された水が補われた。
【０１５０】
２．４  １００ｍＭ ＭＯＰＳによって緩衝されたランディ培地の生産
【０１５１】
3-[N-Morpholino]propanesulfonic acid (MOPS) (M1254, Sigma, St Louis, MO, USA)２０．９３ｇを５０ｍｌの水に溶解させることによって、２０倍のMOPS緩衝剤（２Ｍ）が生産された。この溶液は層流フードのもとで０．２μｍの多孔性フィルタによる濾過によって滅菌された。１００ ｍＭ MOPSによって緩衝されたランディ培地を１リットル生産するために、２０倍MOPS緩衝剤５０ｍｌが実施例２．３で生産された混合物に加えられた。
【０１５２】
実施例３：三角フラスコにおける枯草菌BBG125の培養
【０１５３】
３．１  菌株採集の準備
【０１５４】
５ｍｌの修正Ｅ培地（modified E medium）を含むねじ式チューブが、枯草菌BBG125のプライマリ菌株収集のコロニーに植え付けられて、３００回転／分（rpm）で３０℃、４８時間、培養された。
（なお、修正Ｅ培地は、Clark E培地におけるグルコース濃度を４０ｇ／ｌから２０ｇ／ｌに減少する修正をしたものである。この（修正Ｅ）培地の組成は以下である。リン酸二水素カリウム（KH2PO4）２．７ｇ／ｌ、リン酸水素二カリウム（K2HPO4）１８．９ｇ／ｌ、酵母エキス０．５ｇ／ｌ、グルコース２０ｇ／ｌ、EDTA０．０５ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム０．６１ｇ／ｌ、硫酸マンガン（II）０．０５６ｇ／ｌ、塩化ナトリウム０．１ｇ／ｌ、塩化カルシウム０．０１２ｇ／ｌ、硫酸亜鉛０．０１８ｇ／ｌ、硫酸鉄(II)（FeSO4）０．０１８ｇ／ｌ、硫酸銅(II)０．００２ｇ／ｌ、モリブデン酸ナトリウム０．００１ｇ／ｌ、ホウ酸０．００１ｇ／ｌ、亜硫酸ナトリウム０．００１ｇ／ｌ、塩化ニッケル（II）０．００３７ｇ／ｌ、硝酸アンモニウム４ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム１ｇ／ｌ。溶液のｐＨは、１０％の塩酸溶液を用いて６．５に調整されている。）
溶液は、その後、渦流によって均質にされた。予め得られた培養液の体積は１．５ｍｌであり、修正Ｅ培地を４８．５ｍｌ含む５００ｍｌの三角フラスコ内に加えられた。全体が温度３０℃で、１２０ｒｐｍの撹拌下で２４時間培養された。この第１の手順Ｐ１は複製であった。
【０１５５】
培養液は、その後、渦流によって均質化され、分光光度計(SECOMAN Prim, SECOMAN, Domont, France)を用いて、DO600nm（波長６００ｎｍでの光学濃度）がその後、枯草菌BBG125株が対数増殖期の開始／中間になるまで測定された。
【０１５６】
前培養Ｐ２は、Ｐ１における最良のフラスコの培養液１．５ｍｌを用いて植え付けられて複製された。最終収容容量としての５００ｍｌ三角フラスコに、５０ｍｌの修正Ｅ培地が、１２０ｒｐｍの撹拌下で３０℃で培養された。分光光度計によるDO600nmが、培養液が指数増殖期の相(1<DO600nm<5)の開始／中間であったと指示していたときに成長は止められた。Ｐ２の純度および品質が顕微鏡による観察によって検査されると共に、nutritive Luria-Bertaniゲロース（gelose）、およびMosselゲロースによる播種、より具体的にはスペクチノマイシンを１００ｕｇ／ｍｌ補った桿菌（bacilli）によって検査された。皿は３０℃で２４時間培養された。
なお、nutritive Luria-Bertaniゲロースは（トリプトン（Tryptone）１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）であり、Mosselゲロースは（肉エキス１ｇ／ｌ、ペプトン１ｇ／ｌ、Ｄ−マンニトール１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／ｌ、フェノールレッド０．０２５ｇ／ｌ、寒天１２ｇ／ｌ、卵黄１０ｍｌ／ｌ、ポリキシミン（polymyxin）５ｍｌ／ｌ、ｐＨ７．１）である。
【０１５７】
枯草菌は、（輪郭（外形）は波打っており、線状を示しうる）不規則な形状で、クリーム状の硬さを有した直径が２ｍｍから４ｍｍであるコロニーを生産することに注記しなければならない。古い培地においては、コロニーは乾燥、荒っぽい外観に適応し、ゲロースの中で硬い層に覆われるようになる。
【０１５８】
最終的に、上記に規定された２００ｍｌの修正Ｅ培地を含む２リットルのフラスコに、Ｐ２での最良のフラスコの５％が植え付けられた。この（２リットルの）フラスコは、１２０ｒｐｍの撹拌下で、３０℃で培養されて、分光光度計によるDO600nmが、培養液が対数増殖期の相(1<DO600nm<5)の開始／中間であったと指示していたときに成長は止められた。培養液の品質および純度は、Ｐ２に対して示したように検査された。培養液は２０００ｇで２５℃１０分間遠心分離された。残留物は、生理的食塩水で無菌的に洗浄され、その後、懸濁液は、２５℃で１０分間、２０００ｇで遠心分離された。残留物は、チューブごとに２５の最終DO600nmを得るために、抗生物質なしにＥ培地の体積に吸い上げられた。懸濁液は、０．９ｍｌの培養液に対しグリセロール０．６ｍｌの割合でクリオチューブ（cryotubes）に分配された。このチューブは、渦によって均質化されており、−８０℃で保存された。このＥ培地には、スペクチノマイシン１００ｕｇ／ｍｌが補充された。
【０１５９】
３．２  接種材料の準備
【０１６０】
４０％のグリセロールに−８０℃で保存された細胞を含む収集菌株から接種材料が準備された。以下に規定する修正Ｅ培地５ｍｌを含むチューブが１０％塩酸溶液（ｖ／ｖ）によってｐＨ７．０に調整され、収集菌株の細菌懸濁液０．５ｍｌによって植え付けられた。全体は３００ｒｐｍの撹拌下で３０℃で１０〜１４時間培養された。チューブはその後、渦動によって均質化され、DO600nmが測定された。前培養Ｐ１は、その後５００ｍｌフラスコ内でｐＨ７．０で修正Ｅ培地の最終体積５０ｍｌで生産された。全体は１４０ｒｐｍの撹拌下で３０℃で培養されるようにセットされた。前培養は、菌株が指数増殖期の相(1<DO600nm<5)の開始／中間でサチュレートしたときに停止された。この最初の前培養Ｐ１は複製された。
【０１６１】
第２の前培養Ｐ２は前培養Ｐ１と同じ方法で生産され、そしてこれはＰ１の最初のフラスコから植え付けられ複製された。フラスコの中で培養を始めるために必要な容量は、その後、２５℃で１０分間、２０００ｇで遠心分離された。残留物は滅菌された生理食塩水の１０ｍｌ懸濁液に戻された。得られた懸濁液はもう一度、１０分間２０００ｇで遠心分離された。残留物は最終的に滅菌された生理食塩水１０ｍｌに取り込まれた。懸濁液はその後接種のために準備された。
【０１６２】
３．３  三角フラスコ内での培養
【０１６３】
実験は、最低７２時間続けられ、いくつかのサンプルがこれらの培養液から取り出された。最初のDO600nmは、０．１から０．４の間であった。三角フラスコの容積は５００ｍｌであった。そして栄養培地の体積は１００ｍｌであった。層流フードのもとで、無菌的に取り出されたサンプルに対して以下の測定が行われた。nutritiveゲロースおよびMosselゲロースにスペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌを加えて分離することによる純度の検査、６００ｎｍでの光学濃度の測定、ｐＨの測定、乾燥重量の測定、取り除いた培養液上清に対するＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）によるリポペプチドの定量分析、が行われた。３ｍｌの培養液が４℃で、１０，０００ｇで１０分間遠心分離され、培養液上清が−２０℃で保存された。
【０１６４】
実施例４：リポペプチドの精製と解析
【０１６５】
４．１  リポペプチドの精製    
【０１６６】
Maxi-clean C18 gel (Grace Davison-Alltech, Deerfield, IL, USA)の１ｇのカートリッジにリポペプチドが抽出された。
【０１６７】
ＯＤＳの１ｇのカートリッジが１００％メタノールを用いて、最初は２０ｍｌを流し、その後８ｍｌで調節された。そのカートリッジは、その後、超純水（milli-Q water (Millipore)）８ｍｌを用いてすすぎ洗いされた。６．５±０．１のｐＨを有する培養液上清１ｍｌをその後、カラムに載せた。カートリッジは、その後、８ｍｌの超純水で洗浄した。カートリッジを２０ｍｌの空気で乾燥した後、リポペプチドは、１００％メタノール４ｍｌに溶出された。その溶出物は減圧濃縮器によって乾燥された。そのサンプルは、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）分析を行えるように、引き続き４℃で１００％メタノール２００μｌに吸い上げられた。
【０１６８】
４．２  高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）による解析
【０１６９】
サンプルは、Ｃ１８カラム(5 μm, 250 × 2.5 mm, VYDAC 218 TP)を用いて、ウオーター（Waters）製の完全な高速液体クロマトグラフィシステム(Online Degasser, 717 Autosampler, 660S Controller, 626 Pump, 2996 PhotoDiodeArray) (Waters SAS, Guyancourt, France)によって解析された。２つの解析が行われた。
【０１７０】
最初の解析は、サンプルのミコサブチリンに対してであった。：精製されたサンプル１０μｌが注入され、イツリンＡ標準５００ｍｇ／ｌ（iturin A standard）(I1774, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)を０．６ｍｌ／分の流量で用いて比較された。溶出は、水／アセトリニトリル／トリフルオロ酢酸溶剤を体積比６０／４０／０．１で用いて、アイソクラテッィクモードで行われた。
【０１７１】
２番目の解析は、サンプルのサーファクチンに対してである。精製されたサンプル１０μｌが注入され、サーファクチン標準５００ｍｇ／ｌ(S3523, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)を０．６ｍｌ／分の流量で用いて比較した。溶解物は、水／アセトリニトリル／トリフルオロ酢酸溶剤を体積比２０／８０／０．１で用いてアイソクラテッィクモードで行われた。
【０１７２】
各ピーク(diode array, PDA 2996, Waters)の２００ｎｍと４００ｎｍの間の保持時間およびスペクトルの２回目の移動は、溶出分子の同定のためのMillenniumソフトウエアによって自動的に解析された。
【０１７３】
４．３  分取用高速液体クロマトグラフィによる解析
【０１７４】
サンプルは、１０ｇのMaxi-clean C18 gel (Grace Davison-Alltech, Deerfield, IL, USA)のカートリッジを用いて、上記の実施例４．１に記載された精製プロトコルを適用して準備された。１０ｇのカートリッジの使用により、前述の１ｍｌの代わりに、培養液上清１０ｍｌを搭載することができる。メタノールの体積以外の全ての体積は１０倍に増やされた。最小の体積のメタノールが、カートリッジを調整するために用いられて、その後、溶出されたリポペプチドは１０ｍｌであった。サンプルはウオーター製の分取用高速液体クロマトグラフィ(660 Controller, 626 Pump, 486 Absorbance Detector)の注入システムのなかに人手で（１００μｌ）搭載された。使用されたカラムは、Ｃ１８(5 μm, 300 × 10 mm, ACE)であった。溶出は、下記の表２に示す勾配に従って３ｍｌ／分で行われた。
【０１７５】
（表２）：緩衝液ＡおよびＢのそれぞれの濃度に従った溶出
2014528964.tif 000006
【０１７６】
用いられた溶剤は以下である。溶剤Ａは、水とトリフルオロ酢酸が体積比で９９．９／０．１から構成されており、溶剤Ｂは、アセトリニトリルとトリフルオロ酢酸が体積比で９９．９／０．１から構成されている。
【０１７７】
４．４  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  質量分析による解析    
【０１７８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計(Bruker Ultaflex)による解析が次の要求に従って行われた。：
培養液上清、または、ＯＤＳカートリッジ(Grace Davison-Alltech, Deerfield, IL USA)で精製されたサンプル、または、ＯＤＳカートリッジおよび分取用高速液体クロマトグラフィによって精製されたサンプルが用いられた。    
ＴＡ緩衝液が、CH3CN／水／トリフルオロ酢酸を体積比３３／６７／０．１で混合することにより製造されて準備された。ＣＨＣＡ緩衝液は、ＴＡ緩衝液におけるα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸（alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid）の飽和溶液である。この緩衝液は、α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸／ＴＡ緩衝液の遠心分離後に上清を回収することにより準備された。解析されるべきサンプルは、サンプル１μｌとＣＨＣＡ緩衝液９μｌを混合させて準備された。サンプルの溶液は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析によって０．５μｌの体積を示して沈殿した。大気中で乾燥が行われた。質量が標準ペプチド類の混合物によって測定された。
【０１７９】
得られたミコサブチリンおよびサーファクチンの種々の相同性を有する[M+H]+ 、[M+Na]+、および[M+K]+イオンの算出された質量を下の表３に明示する。
【０１８０】
（表３）：ミコサブチリンおよびサーファクチンの種々の相同性を有する[M+H]+ 、[M+Na]+、および[M+K]+イオンの算出された質量
2014528964.tif 000007
【０１８１】
高速液体クロマトグラフィ解析が明らかにした１０のピークによって検出された分子の分子質量を下の表４に示す。
【０１８２】
（表４）：高速液体クロマトグラフィ解析により検出された１０のピークの質量
2014528964.tif 000008
【０１８３】
４．５  タンデム質量分析計による新規なミコサブチリンの構造解析  
【０１８４】
BBG125株によって生産されたミコサブチリンの種々の形態の構造を正確に決定するために、精製されたサンプルの解析が、エレクトロスプレータイプのイオン化(Ion Trap Finnigan MAT LCQ)を有するタンデム質量分析計（ＭＳ−ＭＳ）によって、７０％酢酸溶液におけるミコサブチリンと同等の濃度のＮ―ブロモスクシンイミド（N-bromosuccinimide）を用いた処理によってペプチド環の開放後、直接注入モードで行われた。
【０１８５】
最初の解析は、精製されたミコサブチリンanteiso C17（ピーク８）で行われた。得られたスペクトル(MS1)は、臭素の２つの同位体によって複雑である。MS2のスペクトルは、アンモニアの群が失った断片１，２または３の存在、アスパラギン（Asn）およびグルタミン（Gln）のアミノ酸の存在のために、複雑である。開始製品(プロダクト)の質量分析計スペクトルは、1085 [M+H]+, 1107[M+Na]+および1123 [M+K]+にピークを与え、ミコサブチリンC17に明瞭に対応する。
【０１８６】
かなり同様な量である79Brおよび81Brの同位元素の存在のために、事実、期待されるドリフトに相当する１２６０近傍のピークの分布が観察される。例えば、１２５７．４のピークは、２つの79Brを有する[M+H]+に相当し、１２５９．４のピークは、79Brおよび81Brを有する[M+H]+に、または、２つの13Cおよび２つの79Brを有する[M+H]+に相当する。
【０１８７】
１２５７．４でのイオンの断片化から得られた増加質量の水準を下の表５に示す。
【０１８８】
（表５）：１２５７．４でのイオンの断片化から得られた増加質量
2014528964.tif 000009
上記の表で、「m/z」とは、質量と電荷との比である。
【０１８９】
４．６  ピーク６に含まれていた１２７４．４でのピークのタンデム質量分析計解析
処理前の同位体の質量：M=1098.6
79BR2を用いて処理後の同位体の質量：M=1270.4
断片ｙは、ミコサブチリンanteiso C17と同一
断片ｂは、ミコサブチリンanteiso C17の断片ｂに関して14より大きい
このことは、開放配列中の最初の２つのアミノ酸のうちの１つ(NQPSNvNwのうちのNまたはQ)が、修正されていることを高い確率で意味する。
【０１９０】
４．７  ピーク１０に含まれていた１２７４．４でのピークのタンデム質量分析計解析
処理前の同位体の質量：M=1098.6
79Br2を用いて処理後の同位体の質量：M=1270.4
断片ｙは、ミコサブチリンanteiso C17と同一であるが、１４以上を含む。他のサンプル全てが1015のピークであるのに対し、代わりに1029でy6の強烈なピークを含んでいる。
断片ｂは、ミコサブチリンanteiso C17と同一な断片b6より小さい。
断片ｂは、１４またはそれ以上のミコサブチリンと同一のb6に比べて同等以上。
これらの結果は、対象分子は、C18を有するミコサブチリンというよりは、C17脂肪酸を有するミコサブチリンであろうことを示す。
【０１９１】
種々のピークの溶出の順序に基づいて、我々は、５個の新規なミコサブチリンの存在を推測する。すなわちそれらは、Gln3の形態であって、iso C16、nC16、anteiso C17、iso C17 および C18 の形態である。実施例４．５の高速液体クロマトグラフィ解析によって検出された分子の分子質量を有する１０のピークに対応する形態を下の表６に示す。
【０１９２】
（表６）：高速液体クロマトグラフィ解析によって検出された１０のピークの質量とミコサブチリンの形態との間の対応
2014528964.tif 000010
【０１９３】
この新規なミコサブチリンC18の化学式は以下である。
2014528964.tif 000011
【０１９４】
この新規なミコサブチリンGln3 C17の化学式は以下である。
2014528964.tif 000012
【０１９５】
実施例５：ミコサブチリン（ＭＳ）の種々のイソ型それぞれに対する種々の微生物の生物活性
【０１９６】
Bessonらが、記述したプロトコル（参照文献１９）に従って、液体培地中におけるC18イソ型（ミコサブチリンC18）の連続的な希釈物によって抗真菌性活性の試験が行われた。９６ウエルのマイクロプレートでの次に述べる冨栄養培地のなかで培養が行われた。グルコース４０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス２ｇ／ｌ、ｐＨ７．２．。出芽酵母の播種が、（DO600mm）の０．５５で行われ、２４時間後での吸光度が読み取られた。そして、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）が決定された。
参照文献１９：(Besson et al. 1979. Antifungal activity upon Saccharomyces cerevisiae of iturin A, mycosubtilin, bacillomycin L and of their derivatives; inhibition of this antifungal activity by lipid antagonists. J. Antiobiot. (Tokyo) 32, 828-833 [19])。
【０１９７】
この実験は、また、次のミコサブチリン（ＭＳ）のイソ型にも行われた。ミコサブチリンiso-C16、ミコサブチリンn-C16、ミコサブチリンanteiso-C17、ミコサブチリンiso-C17。これはまた、以下の組成を有するミコサブチリン組成物(MS comp.)にも行われた。いずれも組成物の重量％として、ミコサブチリンiso-C16２６％、ミコサブチリンGln3 C17１％、ミコサブチリンn-C16２％、ミコサブチリンanteiso-C17４４％、ミコサブチリンiso-C17２３％、および、ミコサブチリンC18１％を含む。
【０１９８】
この実験は次の微生物に対して、前述のミコサブチリンのイソ型および構成物のそれぞれで行われた。灰色カビ病菌（Botrytis cinerea）、クロコウジカビ（Aspergillus niger）、スクレスクロレチオラム（Sclerotinia sclerotium）、カンジタ・アルビカンス（Candida albicans）。
【０１９９】
これらそれぞれの実験で得られた最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を下の表７に示す。
【０２００】
（表７）：種々のミコサブチリンのイソ型および組成物に対する種々の微生物の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）
2014528964.tif 000013
【０２０１】
これらの結果は、ミコサブチリン組成物が現在使用されているミコサブチリンに対して同等以上の効果を有することを示す。
【０２０２】
実施例６：空気/液体の膜接触器上の枯草菌によって生産されたリポペプチドの生産、抽出および濃縮に対する統合的方法の実行
【０２０３】
この実施例の説明は図１から５を参照のこと。
【０２０４】
この実施例中
−  ポンプＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２、Ｐ１３およびＰ１４は、マスターフレックスＬ／Ｓ蠕動ポンプのコンパクト駆動モデル（Masterflex L/S peristaltic pumps compact drive model）、(Cole Parmer, Vernon Hills, IL, U.S.A.)）であった。
−  ポンプＰ１１は、型式N820.3 FT.18のダイヤフラム式真空ポンプ(KNF Neuberger Laboport, Freiburg, Germany)であった。
−  弁Ｖ１、Ｖ４およびＶ５は、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）から作られたストップ弁(W3250Y, Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Germany)であった。
−  弁Ｖ２、Ｖ３、Ｖ６ およびＶ７は、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）から作られた３方向ストップ弁(W3250Z, Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Germany)であった。
−  タンクを構成する、タンク２およびタンク４は、ナルゲン（Nalgene）タンクであり、高密度ポリエチレンから作られたもので有効容積が４リットルであった(2125-4000 Heavy Duty Bottles, Nalgene, Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Germany)。
−  タンクを構成する、タンク１、タンク３、タンク５、タンク６およびタンク７は、ナルゲン（Nalgene）タンクであり、高密度ポリエチレンから作られたもので、有効容積が１０または２０リットルであった(2250 Autoclavable Carboys, Nalgene, Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Germany)。
−  計量装置Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６およびＢ７は、Ohaus 社のCKW-55型であった（Ohaus Corporation, Pine Brook, NJ, U.S.A.)。
−  枯草菌の菌株は、枯草菌BBG125株であった。
【０２０５】
６．１  培養に用いた環境条件および検出器  
【０２０６】
すでに示唆していたこととは逆に、１２１℃で２０分間の高圧蒸気滅菌法によって予め滅菌されていた０．６６Ｍリン酸溶液および３Ｍ水酸化ナトリウムを、それぞれ、ポンプＰ２およびＰ３によって追加制御して用いることにより、ｐＨを７±０．１に調整した。
【０２０７】
ｐＨ４．０およびｐＨ７．０に緩衝化され４℃に保存されていた市販の溶液を用いてタンクを高圧蒸気滅菌する前にｐＨ電極が校正された。この工程は、２２±０．１℃でAlpha Lavalの１ｍ２管状熱交換器（（Alpha Laval 1 m2 tubular heat exchanger）（104878, Alpha Laval Corporate AB, Lund, Sweden)）によって行われた。溶解酸素の濃度である酸素分圧は、酸素センサ(Mettler Toledo, Viroflay, France)を用いて測定した。酸素センサの電極は、実験ごとに更新された。酸素センサは、タンクの高圧蒸気滅菌の後で、培地が実験の設定温度および設定ｐＨに到達したときに校正された。酸素分圧の０％はセンサのケーブルを大地に接続して得られ、酸素分圧の１００％は培地を空気で飽和させて得られた（１０００rpmおよび１vvm）。
【０２０８】
通気速度(Fe)は、毎分の液体の体積に対する気体の体積（vvm）が０．２５に固定された。すなわち、これは３リットルのランディ培地に対して０．７５リットル／分に相当する（実施例２．１参照）。入ってくる空気は、０．２μｍの滅菌フィルタを通して濾過された。
【０２０９】
工程の制御およびデータ収集のために用いたソフトウエアは、AFS Biocommand (New Brunswick Scientific, Edison, NJ, U.S.A.)であった。培地の純度は、４８時間後および培養の終了後に検査された。培養サンプル１０ｍｌが規則的に採取され、遠心分離されて、光学濃度および乾燥重量が決定され、上清が解析の前に保存された。入ってくるガスおよび出ていくガスは、微生物の呼吸に関するデータを得るために分析された。常磁性センサによって酸素の量を解析することができ、赤外線センサによって炭酸ガスの量を解析することができた（Xentra 4400; Servomex Company Inc., Sugar Land, TX, U.S.A.）。解析器は、ナフィオン膜(Naflon membrane (Permapur, Saint-Le'onard, Quebec)でのガスを乾燥させ、６つのチャネルで連続的な解析を行うことができ、自動的に校正される多重化装置に統合されていた。
【０２１０】
６．２  空気/液体の膜接触器
【０２１１】
この実施例に用いられた空気/液体の膜接触器Ｍ１は、GE-Healthcare(GE-Healthcare
Europe GmbH, Munich, Germany)によって供給されている商品コードCFP-6-D-45である。これは、２つの区画Ｃ１およびＣ２を含む外部モジュールを構成する。区画Ｃ１では、酸素を含む滅菌ガスが循環している。区画Ｃ２では、種菌を含む培地が、ポンプＰ４により付勢された膜に対して、２４リットル／ｈ／ｍ2の割合で循環させられている。
【０２１２】
膜Ｍ１は、２．５ｍ２の表面積を有しており、１２１℃で２０分間の高圧蒸気滅菌法によって使用前に滅菌されている（この基準は網羅的ではない）。膜は、０．６５μｍの多孔度を有するホリエーテルサルフォン中空糸のセットから構成されている。
【０２１３】
６．３  枯草菌の連続培養のための装置：空気/液体の膜接触器によるバイオサーファクタントの抽出／濃縮のためのシステムの結合
【０２１４】
６．３．１  空気/液体の膜接触器によるリポペプチドの抽出／濃縮のためのシステムの結合
【０２１５】
枯草菌の連続培養のために用いられる装置は、中空糸から作られてその中に枯草菌BBG125が培養されるランディ培地を有する空気/液体の膜接触器Ｍ１を備える。空気/液体の膜接触器の表面に固定される枯草菌BBG125は、バイオサーファクタントを排出することによって、この基質を劣化させる。この装置は、また、膜Ｍ１を備える生産装置に連続的に前記基質を所定の流量で供給したり、取り除いたりするための手段を備える。
【０２１６】
膜Ｍ１は、その孔を介した酸素の拡散によって、滅菌環境で培地中の微生物の成長に必要な酸素を提供する。
【０２１７】
蠕動ポンプＰ１は、タンク１に蓄えられた新鮮なランディ培地を流量Ｆ１で膜１に連続的に供給する。同様に、蠕動ポンプＰ５は、上記に述べた膜Ｍ１を備える生産装置から流量Ｆ２で培地を取り除く。
【０２１８】
種菌および発酵条件は、前述したものと同等に維持される。環境の滅菌を保持するために、装置の全ての構成要素および使用される種々の膜は、１２１℃で２０分間滅菌された。
【０２１９】
この装置の１つの特徴は、膜Ｍ１を備える生産装置において有機物の残留物およびバイオサーファクタントが取り除かれた後の全ての微生物細胞が、生産装置の中で微生物の高い成長率を得ることを可能にするという事実から、再利用可能か否かが生じているということである。
【０２２０】
加えて、この装置は、気泡または泡の生成なく、培地に酸素を拡散させることができる。
【０２２１】
６．３．２  リポペプチドの抽出および精密濾過による細胞の再利用
【０２２２】
前述の装置は、従って、液体をいくつかの分画に分けるための生産装置から放出される位置に設けられた接線方向の精密濾過手段および限外濾過手段を有するという事実によって特徴づけられる。
【０２２３】
第１の精密濾過ステップは、表面積０．４ｍ2で０．２μｍの孔径(GE Healthcare)を有するポリエーテルスルフォン中空糸から作られた膜Ｍ２で行われた。前述の容量ポンプＰ４によって細胞を含む培地がそのなかを循環しており、また、膜Ｍ２の区画Ｃ３は、残留物として見なされた。容量ポンプＰ５の影響下で、培地は、接線方向の濾過により、膜Ｍ２の孔を通過して膜Ｍ２の区画Ｃ４に移動する。この方法により、バイオサーファクタントを含む培地は、細胞を除去されて抽出され、その後、１６０ｒｐｍの速度で、モータＢまたは磁気攪拌機(magnetic agitator, W10512, Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Germany)によって駆動されるブレードによって撹拌されているタンク２に集められた。
【０２２４】
膜Ｍ１を有する生産装置の培地は、連続的にタンク２へ取り除かれる。この取り除きを補償して膜Ｍ１における一定の体積を保持するために、ポンプＰ１は、タンク１に含まれている新しい培地を有したバイオリアクターを供給する。
【０２２５】
加えて、タンク２およびタンク３は、計量装置Ｂ２およびＢ３の上にそれぞれ配置されている。蠕動ポンプＰ１(CKW-55; Ohaus Corporation, Pine Brook, U.S.A.)の出力を制御するのは後者である。これにより、膜Ｍ１の内側における一定の体積を維持することができ、従って、Ｆ１＝Ｆ２が得られる。行われた各実験において、希釈の程度は、膜Ｍ１を有する少なくとも４つの空気/液体の膜接触器容積を通過した後、変えられる。
【０２２６】
ポンプＰ１およびＰ５の出力は同一であり、膜１を有する装置において、０．１ｈ-1の希釈の程度、すなわち、時間当たりの流量が、膜Ｍ１を有する生産装置に含まれる水溶液相の体積の０．１倍に等しいように調整されている。
【０２２７】
本方法の変形がまた実行された。それは、膜Ｍ１の内側の細胞を再利用するか否かから構成される。それは、その後、図３および４の破線で示される開放連続モードである。弁Ｖ６、Ｖ７、およびＶ８のセットによって再利用しない場合には、培地は、ポンプ１３によって膜Ｍ１から送出されて、タンク７へ集められた。排水弁によって細胞の濃縮を逐次、除去することができる。この場合、膜Ｍ１による精密濾過ステップは、タンク７に含まれている培地で直接的に行える。そして細胞は、その後、膜Ｍ１を有する生産装置というよりはタンク７で濃縮される。
【０２２８】
６．３．３  限外濾過によるリポペプチドの濃縮
【０２２９】
タンク２に含まれているものの濾過が、ステンレス鋼接線方向限外濾過システム(Sartocon 2 plus, 17546---202, Sartorius, Goettingen, Germany)の区画５のなかへ、ポンプＰ６によって最終的に送り込まれる。この限外濾過システムは、再生セルロースから作られた遮断しきい値１０kDaを有する限外濾過膜Ｍ３(Hydrosart Ultrafilter, 3021443930E-BSW, Sartorius, Goettingen, Germany)を備えている。上記の臨界的なミセル濃度で、バイオサーファクタントは、区画Ｃ５で濃縮される。残留物について言えば、タンク２へ戻される。培地は、ポンプＰ７の制御下でポンプＰ５と同じ流量で、限外濾過といわれる区画Ｃ６へ抽出され、タンク３へ集められた。流量は、ポンプＰ７によって付勢された流量に依存し、種々の計量装置Ｂ２、Ｂ３、およびＢ４によって集められた情報によって調整された。
【０２３０】
６．４  リポペプチドの精製
【０２３１】
６．４．１  限外濾過／透析濾過による精製
【０２３２】
本実施例で示されたリポペプチドの精製は、再生セルロースから作られた遮断しきい値１０kDaを有する限外濾過膜Ｍ４(Hydrosart Ultrafilter, 3021443930E-BSW, Sartorius, Goettingen, Germany)を備えるステンレス鋼接線限外濾過システム(Sartocon 2 plus, 17546---202, Sartorius, Goettingen, Germany)の連結に基づいている。このステップは、グルコース、グルタミン酸塩、および種々の主要な代謝物質などのような残留物質の主要な部分を培養液から除去することを目的とする。ミセルおよびミコサブチリンによるミセル複合体の形成、それがその臨界ミセル濃度を上回っているときには、それを保持することができる。従って、限外濾過膜Ｍ４の使用のおかげで、それが残留物に集中する。
【０２３３】
このステップは、２５℃で、０．５バールの圧力下で行われた。この精製ステップは、タンク２内の濃縮されたリポペプチドに対して行われた。弁Ｖ１を開けた後で、ポンプＰ８がタンク４（高密度ポリエチレンから作られた有効容積が４リットルのナルゲン（Nalgene）タンク(2125-4000 Heavy Duty Bottles, Nalgene, Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Germany))へ濃縮物を送り出し、モータＢと同一のモータＣまたは磁気攪拌機によって駆動されるブレードによって撹拌された。
【０２３４】
以下のステップが連続的に行われる。
−  限外濾過：濃縮物はタンク４へ、マスターフレックスＬ／Ｓ蠕動ポンプＰ８のコンパクト駆動モデル(Cole Parmer, Vernon Hills, IL, U.S.A.)の制御下で送られる。その後、マスターフレックスＬ／Ｓ蠕動ポンプＰ９のコンパクト駆動モデル(Cole Parmer, Vernon Hills, IL, U.S.A.)の制御下で、膜Ｍ４で精製され、タンク４に集められた。マスターフレックスＬ／Ｓ蠕動ポンプＰ１０のコンパクト駆動モデル(Cole Parmer, Vernon Hills, IL, U.S.A.)は、培地の構成物の残りを、区画８およびタンク５へ移動可能にする。この工程は、タンク４内の含有体積が、タンク４の初期体積の１０％に減量されるまで継続される。
なお、タンク５は、高密度ポリエチレンから作られた有効容積が１０または２０リットルのナルゲン（Nalgene）タンク(2250 Autoclavable Carboys, Nalgene, Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Germany)であった。
−  透析濾過：このステップは、限外濾過膜Ｍ４を通過する残留物質の通過を容易にするために培養液を希釈する。弁Ｖ２を開けてタンク４に、水がタンク４の初期の水準を取り戻すまで加えられる。それから、上記に説明した限外濾過ステップが引き続く。この透析濾過ステップは、連続的に４回行われる。
−  メタノール(MeOH)の存在下における限外濾過：透析濾過ステップに引き続いて、メタノールが、タンク６からタンク４へマスターフレックスＬ／Ｓ蠕動ポンプＰ１２のコンパクト駆動モデル(Cole Parmer, Vernon Hills, IL, U.S.A.)および弁Ｖ２を介して加えられる。メタノールのこの追加は、この時点でタンク４が７０重量％のメタノールを含むように、計量装置Ｂ４、Ｂ５およびＢ６によって制御される。それから、限外濾過ステップがすでに述べたように続く。このステップは、ミセルを破壊し、膜Ｍ４の孔を通してミコサブチリンのモノマーを通過させるであろう。
なお、タンク６は、高密度ポリエチレンから作られた有効容積が１０または２０リットルのナルゲン（Nalgene）タンク(2250 Autoclavable Carboys, Nalgene, Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Germany)であった。
【０２３５】
濾過後、ミコサブチリンおよびメタノール７０％を含んでいる溶液は、限外濾過側に集められる。しかし、このときには、その限外濾過は、弁Ｖ３およびＶ４のセットによって回転蒸発器である、Rotavapor VV2000 evaporator (Evapo) (Heidolph Instruments GmbH & Co., Schwabach, Germany)の容器に集められる。
【０２３６】
各ステップの終了時に、サンプルは、濾過側と、残留物側に取り出されている。従って、精製のバランスを確立することができる。このため、限外濾過後に得られた濃縮されたミコサブチリンの量に対する、最初にタンク４に存在していたミコサブチリンの量の比を計算することにより、限外濾過ステップおよび透析濾過ステップによる損失を決定することができる。これらのステップの収率は、７０％を超えている。
【０２３７】
６．４．２  蒸発によるリポペプチドの濃縮
【０２３８】
蒸発器(Evapo)は、全てのメタノールおよびいくらかの水を除去することにより、ミコサブチリンを濃縮する。この蒸発は、５０℃で、N820.3 FT.18型(KNF Neuberger Laboport, Freiburg, Germany)真空ポンプＰ１１によって付勢された５０mbarの残留圧力のもとで行われる。このステップの際に、メタノールが蒸発され、その蒸気は凝縮器によって凝縮され、タンク６の中で再利用される。
【０２３９】
６．４．３  リポペプチドの凍結乾燥
【０２４０】
オプショナルな凍結乾燥ステップが、製品の保存を改善するために本方法に追加された。リポペプチドの凍結乾燥は、蒸発器によって流出し、弁Ｖ５によって回収された濃縮された溶液Ｘを用いて直接的に行われる。これは、まず第一に、−２０℃で凍らせて、その後、凍結乾燥機であるHeto Power Dry PL 9000 freeze dryer (Jouan Nordic, Allerod, Denmark)を用いて次のステップに従って凍結乾燥された。−３０℃で１時間、−１０℃で５時間、０℃で５時間、−２０℃で５時間、３５℃で５時間。この凍結乾燥は、残留圧力１５mbarで行われた。
【０２４１】
実施例７：膜の洗浄とリポペプチドの回収
【０２４２】
インタフェースに対するリポペプチドの親和力のために、膜の洗浄のためのプロトコルが研究され、最適化された。それは、膜の性質を考慮すると共に、この課題に対して発行されている最近の研究（参照文献２０および２１）にも配慮している。これらの洗浄はリポペプチドや膜を変性させない。溶剤の使用は禁止されているが、メタノールのようなものはリポペプチドを分離することに対しては大変有効である。ｐＨ感受性に対する試験でｐＨ１０がリポペプチドの分解性の限界であることが決定された。洗浄は、撹拌および発酵条件下で行われた。このプロトコルは、以下に示す７つの水性洗浄ステップによって実行される。
参照文献２０：(Chen, Chen and Juang, 2007. Separation of surfactin from fermentation broths by acid precipitation and two-stage dead-end ultrafiltration processes. J. Membr. Sci. 299, 114-121 [20])
参照文献２１：（Chen, Chen, and Juang, 2008. Flux decline and membrane cleaning in cross-flow ultrafiltration of treated fermentation broths for surfactin recovery. Sep. Purif. Technol. 62, 47-55 [21])
−  ２つの洗浄が、３０℃で３０分間、滅菌水３リットルを用いて行われた。これらは、固定されたバイオマスをわずかに分離した。
−  ３０℃での滅菌水を用いた第２洗浄によって、酸素移動係数を測定することができた。
−  ２つの洗浄が５０℃で１時間、０．１Ｍの水酸化ナトリウムの３リットルを用いて行われた。これらは、強く固定されていたバイオマスを分離し、リポペプチドの大部分が脱着された。
−  膜は、その後、５０℃で０．５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いて１時間、そしてその後、５０℃で１００ppmの次亜塩素酸溶液を用いて１時間、さらに、２５℃で滅菌水を用いて膜の中が中性になるまで洗浄されることにより、再生された。
【０２４３】
上記の述べた方法の全ては、また、それぞれの膜に対しても実行された。この結果、それらは連続的に洗浄され、再生された。このことにより、本方法は中断することなく実行できた。この代替的方法を実行するために、０．１Ｍおよび０．５Ｍのナトリウム化合物溶液を含むタンク（図示せず）が、装置に追加された。
【０２４４】
実施例８：生産されたバイオサーファクタントの定量化
【０２４５】
この実施例において、３リットルの培地、および実施例６で記載された空気／液体の膜接触器を形成する全表面積が２．５ｍ２の空気／液体の膜接触器、を備える生産装置のなかで、２０ｇ／ｌの濃度のグルコースの発酵のもとで枯草菌によってバイオサーファクタントを生産するためのいくつかの実験が行われた。それぞれの実験は２度行われた。それら２度の平均値のみを以下に示す。標準偏差は、５％から１５％の間であった。
【０２４６】
実験条件は、以下のように調整された。
−  ｐＨは７に維持された。
−  空気／液体の膜接触器の空気流量は、１vvmであった。
−  培地の体積は、３リットルであり、前記膜のファイバーのなかを０．０２１ｍ／ｓの速度で循環していた。
−  システムの全体の圧力は、空気入口以外は大気圧であり、空気入口は０．４バール大気圧より高かった。
−  培地の酸化条件は、約４０ｈ-1の酸素輸送容量係数に固定された。
【０２４７】
高速液体クロマトグラフィによるクロマトグラフ解析で種々のタンク内の基質およびバイオサーファクタントが定量化された。
【０２４８】
消費された酸素の分析により、膜に固定された細胞の量を決定することができた。
【０２４９】
膜に固定された細胞の方が懸濁液中の細胞よりも、酸素がより容易に到達できるので、自由な細胞と固定された細胞は異なる特有の酸素消費率を有するということを考慮して、次式が、経時的に膜の上に固定されたバイオマス(g m-2)を決定するために用いられた。
【０２５０】
所定の時間における膜に固定されたバイオマス
（ｇｍ-2）＝(OUR-(X* OURspe cl))*V/(OURspe ci *a)
ここで、
OURは酸素消費率、
OURspe cl は自由細胞に特有の酸素消費率、
OURspe ci は固定された細胞に特有の酸素消費率、
Vは、反応体積、
Xは自由バイオマスの濃度、
aは膜の表面積、をそれぞれ示す。
【０２５１】
これらの実施例に記載された膜を洗浄するステップは、実施例７に記載された方法に従って行われた。
【０２５２】
８．１  バッチモードでの枯草菌BBG125によるミコサブチリンの生産
【０２５３】
本実施例では、枯草菌BBG125株が、空気/液体の膜接触器Ｍ１で３０℃、４８時間、バッチ内で培養された。
【０２５４】
８．１．１  生産されたバイオマスの分析
【０２５５】
この方法では、２つのタイプのバイオマスが観察された、一方は培地内の自由懸濁液内にあるものであり、他方は空気／液体の膜接触器に固定されているものである。
【０２５６】
自由細胞は具体的な成長率として０．２ｈ-1で１８時間、指数関数的に培養された。自由バイオマスは、１日の培養後、最大２．６ｇｌ-1に達し、その後培養の終了まで、一定であった。
【０２５７】
ガスの分析が、膜に固定されたバイオマスの存在を明らかにした。このバイオマスの成長は、１．２ｇｍ-2を達成するために培養の１日目に行われた。１．６１ｇｌ-1ｈ-1のグルコースの消費率が培養の最初の日の際に測定され、その後、これは、培地のなかでグルコースが枯渇されるに従い減少した。
【０２５８】
８．１．２  生産されたミコサブチリンの解析
【０２５９】
ミコサブチリンの生産は、培養の２日後に１０ｍｇｌ-1に達した。２５ｍｇｌ-1の全生産、および０．５ｍｇｌ-1ｈ-1の平均生産性の結果として、４５ｍｇが膜の洗浄の際に脱着された。精密濾過、限外濾過／透析濾過、および乾燥ステップによる精製の後で、ミコサブチリンの新規な形態を含む粉末形状のミコサブチリン混合物が得られた。この混合物の純度は９４％を超えていた。
【０２６０】
８．２  完全に再利用される細胞を有する枯草菌BBG125によるミコサブチリンの連続的な生産、抽出および精製
【０２６１】
この実施例においては、連続的な方法によってミコサブチリンだけを生産することができる枯草菌BBG125株(filed on 10 March 2011 under the number CNCM I-4451 at the National Collection of Microorganism Cultures (CNCM) of the Institut Pasteur (Paris, France))が、空気／液体の膜接触器Ｍ１で、２２℃で７２時間連続的に培養された。
【０２６２】
細胞の成長および固定を可能にする空気/液体の膜接触器に加えて、この実施例に示す方法においては、以下の存在によって特徴付けられる。
−  実施例６に記載された内容に従った、前記基質の所定の流量を前記反応装置のなかで連続的に供給するとともに取り除くための装置、
−  実施例６に記載されたことに従って、０．４５ｍ2の表面積と０．２μｍの孔径を有する精密濾過膜Ｍ２、
−  ３つのタンク：実施例６に記載された内容に従った、供給（タンク１）、濃縮（タンク２）および排出（タンク３）、および
−  実施例６に記載されたことに従った、０．１ｍ2の表面積と１０kDaの遮断しきい値を有する限外濾過膜Ｍ３と、が存在する。
【０２６３】
加えて、この実施例に記載された内容に従ったポンプＰ１およびＰ５の供給率および取り除き率は、等しいとともに約０．１ｈ-1程度の希釈率を得るように調整された。すなわち、これは時間当たりの率が生産装置に含まれている水溶液相の体積の０．１倍に等しい。
【０２６４】
本発明に従った本方法の１つの特徴は、生産装置内の全ての微生物細胞が、有機物質の残留物およびバイオサーファクタントが取り除かれた後で再利用されると言う事実であり、これにより、膜で微生物の非常に高い成長を得ることができる。この連続的な培養は、２０時間のバッチ培養により行われた。
【０２６５】
８．２．１  バイオマスの解析
【０２６６】
希釈率０．１ｈ-1での連続培養の最初の４０時間の際に、自由バイオマスが培養液のなかで継続的に増加し、７．２ｇｌ-1になった。次に、その濃度を一定に維持した。すなわち、阻害物質の存在を確実に明らかにした。他方、ガスの解析によって、３日の培養後に３．１ｇｍ-2に達するという膜上の細胞のかなりの固定化が明らかになった。最初の２日の培養の際、グルコースの濃度は、１．５ｇｌ-1ｈ-1のグルコース消費率で減少した。
【０２６７】
８．２．２  生産されたサーファクチンの解析
【０２６８】
ミコサブチリンはこのようにして精密濾過膜を介して抽出され、事実、１０kDaの限外濾過膜によって濃縮された。中間のタンクにそれら（ミコサブチリン）の蓄積が観察された。ミコサブチリンの生産性は、培養の最初の４０時間の過程で増加し、最大１．５ｍｇｌ-1ｈ-1に達した。この実験の後、膜の洗浄によってミコサブチリン８４ｍｇを回収した。この実験の最後に、連続培養によって溶液中にミコサブチリン８９５ｍｇを生産した。即ち、平均生産濃度４８ｍｇのミコサブチリンが消費培地１リットルに対して生産された。限外濾過／透析濾過ステップで９０％の純度を有する溶液中のサーファクチンが得られた。この連続方法は、実施例８．１で述べたバッチモードで得られたものに対して３倍を超える生産性を示した。
【０２６９】
（参照文献）
2014528964.tif 000014
2014528964.tif 000015
2014528964.tif 000016
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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