(57)【要約】神経筋接合部に治療薬を標的化する組成物および方法を開示する。神経筋接合部に影響を及ぼす疾患および状態を治療する方法も開示する。組成物は、治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドを含む。組成物はさらに、リンカーペプチドを含む。治療薬を神経筋接合部に標的化し、神経筋接合部に影響を及ぼす疾患および状態を治療する方法は、治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物を投与することを含む。
2014520148.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物。
【請求項２】
神経筋接合部標的化ペプチドが、ラミニンペプチド、ヒト免疫不全ウイルスのヌクレオカプシドジンクフィンガードメイン、狂犬病ウイルスの糖タンパク質ペプチド、α−ブンガロトキシンペプチド、アグリンペプチド、アセチルコリンエステラーゼに特異的に結合する１本鎖抗体ペプチドおよびアセチルコリン受容体に特異的に結合する１本鎖抗体ペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
神経筋接合部標的化ペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
治療薬が、補体阻害剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、栄養剤および麻痺剤からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
補体阻害剤が崩壊促進因子、ｒＥＶ、ｒＥＶ５７６、補体調節タンパク質、コンプスタチン、コンプスタチン誘導体、ＰＯＴ−４、Ｃ１阻害剤、Ｃ４ｂ結合タンパク質、Ｈ因子、補体受容体Ｉｇ、ＣＤ５９、クラスタリン、Ｃ３阻害剤、ペプチド２Ｊ、ヒトβ−ディフェンシン２、ＣＲＩＴ−Ｈ１７、Ａｃ−ＳＨＬＧＬＡＲ−Ｈ、Ａｃ−ＲＬＬＬＡＲ−Ｈ、Ｃ１ｓ−ＩＮＨ−２４８、Ｓ−タンパク質、Ｃｒｒｙ、クルクミン、Ｗ−５４０１１、ＮＤＴ９５２０４９２、ＮＧＤ２０００−１、ＣＰ−４４７，６９７、ＮＤＴ９５１３７２７、ＳＢ２９０１５７、ＳＢ２９０１５７（Ａ）、ＳＢ２９０１５７（Ｂ）、ＢＣＸ１４７０、ＰＭＸ５３、ＰＭＸ２０５、Ｃ０８９、およびＪＰＥ１３７５である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
リンカーをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
リンカーが、グルタミン−セリンリンカー、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物を投与すること
を含む、治療薬を神経筋接合部に送達する方法。
【請求項９】
神経筋接合部標的化ペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
治療薬が、補体阻害剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、栄養剤、および麻痺剤からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
組成物が、リンカーをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
リンカーが、グルタミン−セリンリンカー、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
神経筋接合部に関連する疾患または状態の治療を必要とする対象において神経筋接合部に関連する疾患または状態を治療する方法であって、治療有効量の、治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物を該対象に投与することを含む方法。
【請求項１４】
神経筋接合部に関連する疾患または状態が、重症筋無力症、実験的に得られた重症筋無力症、ランバート−イートン症候群、ミラー・フィッシャー症候群、先天性筋無力症症候群、ボツリヌス中毒および有機リン中毒からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
神経筋接合部標的化ペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
治療薬が、補体阻害剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、栄養剤、および麻痺剤からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
補体阻害剤が、ＤＡＦ、ｒＥＶ、ｒＥＶ５７６、補体調節タンパク質、コンプスタチン、コンプスタチン誘導体、ＰＯＴ−４、Ｃ１阻害剤、Ｃ４ｂ結合タンパク質、Ｈ因子、補体受容体Ｉｇ、ＣＤ５９、クラスタリン、Ｃ３阻害剤、ペプチド２Ｊ、ヒトβ−ディフェンシン２、ＣＲＩＴ−Ｈ１７、Ａｃ−ＳＨＬＧＬＡＲ−Ｈ、Ａｃ−ＲＬＬＬＡＲ−Ｈ、Ｃ１ｓ−ＩＮＨ−２４８、Ｓ−タンパク質、Ｃｒｒｙ、クルクミン、Ｗ−５４０１１、ＮＤＴ９５２０４９２、ＮＧＤ２０００−１、ＣＰ−４４７，６９７、ＮＤＴ９５１３７２７、ＳＢ２９０１５７、ＳＢ２９０１５７（Ａ）、ＳＢ２９０１５７（Ｂ）、ＢＣＸ１４７０、ＰＭＸ５３、ＰＭＸ２０５、Ｃ０８９、およびＪＰＥ１３７５からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
投与ステップが、注入、注射、経口、経鼻、局所および皮下投与によるものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
治療有効量が、約０．００１μｇ／ｍｌから約４０μｇ／ｍｌの半数阻害濃度を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
組成物が、約０．５ｎＭから約５０μＭの結合親和性を有する、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、本明細書に参照により全体を組み込んだ、２０１１年６月２０日出願の仮特許出願第６１／４９８，７０７号の優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、国立衛生研究所の国立眼病研究所により付与された助成金第ＥＹ１４８３７号に基づいて政府支援により実施された。政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
【０００３】
配列表の組み込み
「３１０６５−３０＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名前で３２，２０５バイトの大きさ（ＭＳ−ＤＯＳで決定）のファイルを含む配列表のハードコピーおよびコンピュータで読み取り可能な形式の配列が、本明細書で提供され、本明細書に参照により組み込まれている。この配列表は、配列番号１〜３５からなる。
【０００４】
本開示は一般的に治療薬を標的化する組成物および方法に関する。より具体的には、本開示は、神経筋接合部標的化ペプチドを使用した、神経筋接合部への治療薬の標的化に有用な組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
神経筋接合部は、神経が筋肉を収縮させるために信号を送る箇所である。より具体的には、神経筋接合部は、ニューロンの軸索終末と筋繊維細胞膜とのシナプスまたは接合部である。
【０００６】
種々の疾患には、主要な損傷部位として神経筋接合部が関与する。例えば、重症筋無力症は、主に神経筋接合部における骨格筋アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）に対する自己抗体が原因となる自己免疫障害である。この抗体は、神経筋接合部のシナプス後表面に結合し、ＡＣｈＲ数の低下を引き起こし、筋肉終板に損害を与え、結果として筋力低下を生じる神経筋伝達不良を招く。グラビス（ｇｒａｖｉｓ）の別の部類は、神経筋接合部における筋肉特異的キナーゼ（「ＭｕＳＫ」）に対する抗体が原因である。ランバート−イートン症候群は、抗体による神経筋接合部における電位依存性カルシウムチャンネルの攻撃を特徴とするさらに別の障害である。ミラー・フィッシャー症候群は、抗体による神経終末の攻撃が関与する別の障害である。
【０００７】
補体系は、抗体が細胞表面抗原に結合し、膜攻撃複合体を形成することによって開始する抗体媒介免疫の１つのエフェクター機構の発端となり得る。膜攻撃複合体は、細胞溶解および重症筋無力症の場合には神経筋接合部の破壊を引き起こすタンパク質多量体複合体である。抗体によって惹起される補体カスケードの活性化において、新生Ｃ４ｂおよびＣ３ｂ断片は、生体膜上の遊離のヒドロキシル基およびアミノ基と縮合する。一旦結合すると、これらの断片は、カスケードの中心的な増幅酵素であるＣ４ｂ２ａおよびＣ３ｂＢｂがアセンブリーするための部位として機能する。自己補体媒介損傷から宿主組織を防御するこれらの活性は、細胞関連および血清調節タンパク質の系によって制御される。
【０００８】
補体阻害剤は、神経筋疾患の治療に有望な薬物の１種である。補体阻害剤は、身体の免疫応答系が自身を攻撃するのを阻止することができる。例えば、エクリズマブは、発作性夜間ヘモグロビン尿症および重症筋無力症治療の第２相試験における使用が承認されている抗Ｃ５抗体である。エクリズマブは、補体を阻害することによって機能を果たす。投与は注入によって行うので、薬剤は身体全体の補体を阻害し得る。
【０００９】
別の補体阻害剤は、ｒＥＶ５７６（ＯｍＣＩまたはＣｏｎｖｅｒｓｉｎ）である。ｒＥＶ５７６は、マダニ（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ  ｍｏｕｂａｔａ）唾液から得られた、Ｃ５補体を特異的に阻害する１８．５ｋＤａの組換えによって生成されたタンパク質である。ｒＥＶ５７６はＣ５に直接結合して、Ｃ５転換酵素との相互作用を妨害するようである。ｒＥＶ５７６の投与は、血清補体活性を低下(reduce)させ、神経筋接合部でのＣ９沈着を低減(diminish)させ、処置した動物の血清の細胞毒性を低下させることが示された。
【００１０】
重症筋無力症の療法は一般的に、ピリドスチグミンなどの薬剤を使用してコリンエステラーゼを阻害することによって、神経筋伝達を増強することに焦点が当てられる。副腎皮質ステロイド、アザチオプリン、タクロリムス、およびミコフェノール酸塩(mycophenolate)などのその他の治療法は、免疫系の抑制または調節を対象とする。筋力低下の急性増悪は、血漿交換療法または静脈内免疫グロブリン投与によって治療することができる。これらの治療法は、効果的ではあるが高価であり得、神経筋接合部以外に臓器系に影響を及ぼす副作用を伴うことがある。これらの治療法は身体の全体に投与を行うので、結果としてさらに全身の副作用を生じることがある。免疫療法は、重症筋無力症に特異的に焦点を当てたものではなく、むしろＢおよびＴ細胞活性の抑制によって自己抗体レベルを直接的または間接的に低下させて全般的に免疫応答を緩和するものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
治療法は神経筋接合部の損傷から生じる状態に利用できるが、有効性、副作用および／または費用に対する懸念が残っている。さらに、補体阻害剤の戦略は、補体の全身阻害を利用する。したがって、神経筋接合部の損傷から生じる状態を治療するための別の治療法および方法を開発する必要性が依然として存在している。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本開示は一般的に、治療薬を標的化するための組成物および方法に関する。より具体的には、本開示は、神経筋接合部標的化ペプチドを使用した、神経筋接合部への治療薬の標的化に有用な組成物および方法に関する。
【００１３】
一態様では、本開示は、治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物を対象とする。
【００１４】
別の態様では、本開示は、治療薬を神経筋接合部に送達する方法を対象とする。この方法は、治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物を投与することを含む。
【００１５】
別の態様では、本開示は、神経筋接合部に関連する疾患または状態を治療する方法を対象とする。この方法は、治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【００１６】
別の態様では、本開示は、治療ポリペプチドをコードする異種核酸配列に作動可能に連結した、神経筋接合部標的化ペプチドをコードする組換え核酸コンストラクトを対象とする。
【００１７】
以下の詳細な説明を考慮すると、本開示はよりよく理解され、前述したもの以外の特徴、態様および利点が明らかになるだろう。このような詳細な説明は、以下の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、実施例１で記載したラミニン−ｒＥＶポリペプチドのドメイン構造を示す概略図である。
【図２】図２は、ｐＥＴ２８ａ発現ベクターのマップである。
【図３】図３は、実施例１で記載したＢＬ２１におけるラミニン−ｒＥＶポリペプチドの発現を示すＳＤＳゲルである。
【図４】図４は、精製ｒＥＶ、誘導細胞から発現したｒＥＶ、誘導細胞から発現したラミニン−ｒＥＶ（ＬｒＥＶ）、および非誘導細胞のウェスタンブロットである。
【図５】図５は、実施例２で記載したＨＩＶ−ｒＥＶポリペプチドのドメイン構造を示す概略図である。
【図６】図６は、実施例３で記載したＲＶＧ−ｒＥＶポリペプチドのドメイン構造を示す概略図である。
【図７】図７は、実施例４で記載したｐＥＴ１６ｂ−ｓｃＦｖ−ＤＡＦ発現ベクターの組み立てを示す概略図である。
【図８】図８は、実施例４で記載したＩｇＧｓｐ−ＶＨ−ＶＬで遺伝子導入したＢＨＫ−２１細胞におけるＧＦＰ発現を示す顕微鏡写真である。
【図９】図９は、実施例４で記載したｓｃＦｖ−ＤＡＦの発現および精製を示すＳＤＳゲルである。
【図１０】図１０は、実施例５で記載したｓｃＦｖ−ＤＡＦおよびｓｃＦｖ１９５６のｈＡＣｈＲα１−２１０ポリペプチドに対する特異的結合を示すグラフである。
【図１１】図１１は、実施例６で記載したｓｃＦｖ−ＤＡＦでインキュベートしたヒツジ赤血球の補体媒介溶血を示すグラフである。
【図１２】図１２は、実施例７で記載したマウスの隔膜における神経筋接合部に対するｓｃＦｖ−３５−ＤＡＦの局在を示す顕微鏡写真である。
【図１３】図１３は、実施例８で記載したＴＥ６７１細胞上のＣ３沈着のｓｃＦｖ−ＤＡＦによる低下を示す免疫蛍光顕微鏡写真を示す。
【図１４】図１４は、本開示に記載した様々な神経筋接合部標的化コンストラクトのドメイン構造を示す概略図である。
【図１５】図１５は、実施例９で記載したＥＡＭＧマウスにおけるｓｃＦｖおよびｓｃＦｖ−ＤＡＦの治療効果を表すグラフである。
【図１６】図１６は、実施例９で記載したＥＡＭＧルイスラットにおけるｓｃＦｖおよびｓｃＦｖ−ＤＡＦの治療効果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本開示は、様々な改変および代替形態が可能であるが、それらの特定の実施形態を例として図面に示し、本明細書において以下に詳細に記載する。しかし、特定の実施形態の記載は、本開示を制限せず、添付した特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨および範囲内にある改変、同等物および代替物の全てを含むものとする。
【００２０】
他に定義がない限り、本明細書で使用した技術用語および科学用語は全て、本開示が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載したものと類似または同等のいかなる方法および材料も本開示の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に説明する。
【００２１】
本開示により、神経筋接合部への標的化を可能にする組成物および方法を発見した。この組成物および方法は、神経筋接合部への治療薬の標的化送達を可能にするので、顕著な効果を発揮する。この組成物および方法はさらに、例えば、神経筋接合部が影響を受けることがある重症筋無力症、実験的に得られた重症筋無力症、ランバート−イートン症候群およびミラー・フィッシャー症候群などの神経筋接合部に関連する疾患および状態の治療を可能にする。
【００２２】
組成物
一態様では、本開示は、治療薬（「ＴＡ」）に結合した神経筋接合部標的化ペプチド（「ＮＭＪＴＰ」）を含む組成物を対象とする（例えば、図１４参照）。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、特に指示しない限り、本明細書では交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを意味する。
【００２３】
本明細書では、「に結合した」とは、神経筋接合部標的化ペプチドが治療薬に直接的もしくは間接的に付着、融合、合体および／または連結している組成物を意味する。例えば、組成物が公知の組換えタンパク質発現法を使用して調製されるならば、神経筋接合部標的化ペプチドをコードする核酸配列は治療薬をコードする核酸配列に合体していてもよい。このような例では、神経筋接合部標的化ペプチドは治療薬に直接的に結合しているだろう。別の例では、神経筋接合部標的化ペプチドをコードする核酸配列は、神経筋接合部標的化ペプチドと治療薬との間に少なくとも１個のリンカーを含むことによって、治療薬をコードする核酸配列に間接的に合体していてもよい。
【００２４】
本開示の組成物は、神経筋接合部標的化ペプチドが治療薬に結合している最終組成物を生成するために、さらにプロセシングを受けるより大きなコンストラクトの一部として調製してもよい。より大きなコンストラクトのドメイン構造を図１４に例示する。一実施形態では、例えば、このコンストラクトは、治療薬（「ＴＡ」）に結合したリンカーに結合した神経筋接合部標的化ペプチド（「ＮＭＪＴＰ」）に結合したプロテアーゼ切断部位（「プロテアーゼ部位」）に結合した親和性タグに結合したＡＴＧ開始部位を含んでいてもよい（図１４参照）。別の実施形態では、ドメイン構造は、ＴＡに結合したリンカーに結合したＮＭＪＴＰに結合したリンカーに結合したＮＭＪＴＰに結合したプロテアーゼ切断部位に結合した親和性タグに結合したＡＴＧ開始部位を含んでいてもよい（図１４参照）。表１は、図１４で示された神経筋接合部標的化ペプチドおよびそれらの特異性（結合標的）をまとめて示す。
【００２５】
【表１】
2014520148.tif 000003
【００２６】
治療薬は、神経筋接合部標的化ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに結合させることができる。本明細書でさらに記載したようにさらにプロセシングした後、例えば、組成物は、治療薬が神経筋接合部標的化ペプチドのＣ末端に結合したＮＭＪＴＰ−ＴＡ構造を有していてもよい。別の例では、組成物は、さらにプロセシングした後、治療薬が神経筋接合部標的化ペプチドのＮ末端に結合したＴＡ−ＮＭＪＴＰ構造を有していてもよい。同様に、神経筋接合部標的化ペプチドは、神経筋接合部標的化ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方のいずれかでリンカーに結合していてもよい（図１４参照）。リンカーが組成物に含まれる場合、リンカーは、神経筋接合部標的化ペプチドと治療薬との間に位置する。一実施形態では、組成物は、さらにプロセシングした後、ＮＭＪＴＰ−リンカー−ＴＡの構造を有していてもよい。別の実施形態では、組成物は、さらにプロセシングした後、ＴＡ−リンカー−ＮＭＪＴＰの構造を有していてもよい。さらに別の実施形態では、組成物は、さらにプロセシングした後、ＮＭＪＴＰ−リンカー−ＮＭＪＴＰ−リンカー−ＴＡの構造を有していてもよい。さらに別の実施形態では、組成物は、さらにプロセシングした後、ＴＡ−リンカー−ＮＭＪＴＰ−リンカー−ＮＭＪＴＰの構造を有していてもよい。
【００２７】
本明細書で記載したように、組成物はさらにプロセシングを受けることができる。例えば、親和性タグの存在は、当業者に公知で、本明細書に記載した親和性タグと親和性基質との間の相互作用による精製を可能にする。組成物はまた、親和性タグと神経筋接合部標的化ペプチドとの間の位置で組成物を切断するプロテアーゼによる処理を受けることができる。プロテアーゼ処理は、少なくとも１個のリンカーをさらに含み得る神経筋接合部標的化ペプチドおよび治療薬を含む組成物の調製を可能にする。
【００２８】
神経筋接合部標的化ペプチド
本開示の組成物は、神経筋接合部標的化ペプチド（「ＮＭＪＴＰ」）を含む。神経筋接合部標的化ペプチドは、神経筋接合部に位置するかもしくは近くにある分子に結合するかまたは相互作用するペプチド分子であってもよい。例えば、この分子は、神経筋接合部の前シナプス(presynaptic)側かまたは後シナプス(postsynaptic)側に位置していてもよい。適切な神経筋接合部標的化ペプチドは、神経筋接合部のまたはその近くのニューロンに存在する分子に結合するかまたは相互作用してもよい。その他の適切な神経筋接合部標的化ペプチドは、神経筋接合部のまたはその近くの筋肉細胞に存在する分子に結合するかまたは相互作用してもよい。神経筋接合部標的化ペプチドは、約０．５ｎＭから約５０μＭの結合親和性を有する。特に適切な結合親和性は、例えば、約１ｎＭから約４０μＭであり得る。さらにより適切な結合親和性は、例えば、約０．１μＭから約０．７５μＭであり得る。神経筋標的化ペプチドの結合は、当業者に公知の方法によって測定することができる。結合親和性を測定するために適切な方法は、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット分析および免疫染色法であってもよい。単独または治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドはまた、結合が直接的に検出され得るよう、例えば、蛍光タグなどの検出可能な標識をさらに含めるために、例えば、組換えタンパク質発現法を使用して調製することができる。免疫染色したかまたは直接標識した組成物の分析は、例えば結合親和性を測定するために、蛍光ピクセル分析によってさらに分析してもよい。
【００２９】
適切な神経筋接合部標的化ペプチドは、例えば、より大きなタンパク質分子から得られたペプチドであってもよい。その他の適切な神経筋接合部標的化ペプチドは、例えば、抗体分子であってもよい。特に適切な抗体分子は、例えば、抗体可変領域、抗体重鎖、抗体軽鎖、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）および１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり得る。
【００３０】
適切な神経筋接合部標的化ペプチドは、例えば、ラミニン、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ヌクレオカプシドタンパク質のジンクフィンガードメイン、狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）、α−ブンガロトキシン、アグリン、アセチルコリン受容体に対する抗体、アセチルコリンエステラーゼ、筋肉特異的キナーゼ、カルシウムチャンネルおよびナトリウムチャンネルに対する抗体などのタンパク質から得てもよい。特に適切な神経筋接合部標的化ペプチドは、例えば、ラミニンペプチド、例えば、ＨＩＶヌクレオカプシドタンパク質のジンクフィンガードメインなどのヒト免疫不全ウイルスペプチド、狂犬病ウイルス糖タンパク質ペプチド、α−ブンガロトキシンペプチド、アグリンペプチド、アセチルコリンエステラーゼに特異的に結合する１本鎖抗体ペプチドおよびアセチルコリン受容体に特異的に結合する１本鎖抗体ペプチドであってもよい。適切な神経筋接合部標的化ペプチドはまた、ニコチンなどの非ペプチド化学物質であってもよい。特に適切な神経筋接合部標的化ペプチドは、例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９のアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。
【００３１】
治療薬
本開示の組成物は、神経筋接合部標的化ペプチドに結合した治療薬を含む。本明細書では、「治療薬」という用語は、疾患または医学的状態を治療、制御または予防するために使用されるいかなる種類の薬物、薬品、医薬品、ホルモン、抗生物質、タンパク質、遺伝子、成長因子、生理活性物質等をも意味する。本明細書では、「誘導体」という用語は、別の化合物（例えば、リードまたは親化合物）から得られた化合物またはペプチドを意味する。治療薬は、治療的ポリペプチドに対応するアミノ酸配列をコードする核酸配列が、神経筋接合部標的化ペプチドに対応するアミノ酸配列をコードする核酸配列および／またはリンカーに対応するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結することができるように組換え発現され得るタンパク質であってもよい。
【００３２】
適切な治療薬は、例えば、補体阻害剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、栄養剤、および麻痺剤（ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）であってもよい。適切な補体阻害剤は、例えば、崩壊促進因子（「ＤＡＦ」；「ＣＤ５５」））、ｒＥＶ５７６、補体受容体１（「ＣＲ１」；「ＣＤ３５」）、補体調節タンパク質（「ＭＣＰ」；「ＣＤ４６」）、コンプスタチン、コンプスタチン誘導体、ＰＯＴ−４、Ｃ１阻害剤、Ｃ４ｂ結合タンパク質（「Ｃ４ＢＰ」）、Ｈ因子（「ＦＨ」）、補体受容体Ｉｇ（「ＣＲＩｇ」）、ＣＤ５９、クラスタリン、Ｃ３阻害剤、ペプチド２Ｊ、ヒトβ−ディフェンシン２、ＣＲＩＴ−Ｈ１７、Ａｃ−ＳＨＬＧＬＡＲ−Ｈ、Ａｃ−ＲＬＬＬＡＲ−Ｈ、Ｃ１ｓ−ＩＮＨ−２４８、Ｓ−タンパク質、およびＣｒｒｙであってもよい。その他の適切な治療薬は、例えば、完全長の補体阻害剤から得られたペプチドであってもよい。例えば、ＤＡＦの制御タンパク質反復は、治療薬として使用することができる。ペプチドではないが、補体を阻害する化学物質およびペプチド模倣薬などのその他の適切な治療薬は、例えば、クルクミン（ｃｉｒｃｕｍｉｎ）、Ｗ−５４０１１、ＮＧＤ２０００−１、ＮＤＴ９５２０４９２、ＣＰ−４４７，６９７、ＮＤＴ９５１３７２７、ＳＢ２９０１５７、ＳＢ２９０１５７（Ａ）、ＳＢ２９０１５７（Ｂ）、ＢＣＸ１４７０、Ｃ１ｓ阻害剤、ＢＣＸ１４７０、ＰＭＸ５３、ＰＭＸ２０５、Ｃ０８９、ＪＰＥ１３７５であってもよい。
【００３３】
特に適切な治療薬は、例えば、配列番号１１および配列番号１２のアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００３４】
リンカー
それに加えて、またはその代わりに、組成物は、神経筋接合部標的化ペプチドが治療薬に間接的に結合するように少なくとも１個のリンカーを含んでいてもよい（図１４参照）。一実施形態では、組成物は、神経筋接合部標的化ペプチド（「ＮＭＪＴＰ」）と治療薬（「ＴＡ」）との間に位置するリンカーを含んでいてもよい（図１４参照）。別の実施形態では、組成物は、例えば組成物が１本鎖抗体を使用し、第１のリンカーが１本鎖抗体のＶＨとＶＬとの間に位置する場合などにおいて、神経筋接合部標的化ペプチドの２個のドメインの間に位置するリンカーを含んでいてもよい（図１４参照）。神経筋接合部標的化ペプチドとして１本鎖抗体を使用する実施形態では、抗体の２個の可変領域は、適当な折り畳み構造が標的タンパク質への結合を生じさせるように、リンカーによって分離されている。例えば、組成物が公知の組換えタンパク質発現法を使用して調製される場合、神経筋接合部標的化ペプチドをコードする核酸配列は、治療薬をコードする核酸配列と結合させ得る、リンカーをコードする核酸配列と結合させることができる。
【００３５】
理論に拘束されることは意図しないが、リンカーは、例えば、普通ならば治療薬の活性または神経筋接合部標的化ペプチドによる標的化を妨害し得る立体的障害の可能性を制限するためにも、神経筋標的化ペプチドと治療薬との間に追加的な距離または分離を提供するものと考えられる。リンカーは、神経筋接合部標的化ペプチドおよび／または治療薬の適当な折り畳み構造をさらに可能にする。特に適切なリンカーをコードするヌクレオチド配列は、例えば、表２に示したものであり得る。
【００３６】
【表２−１】
2014520148.tif 000004
【表２−２】
2014520148.tif 000005
【００３７】
医薬製剤
本開示の組成物はまた、医薬製剤を含んでいてもよい。医薬製剤は、例えば、当業者に公知の医薬上許容される塩、担体、アジュバント、媒体、油および脂質を含んでいてもよい。医薬製剤はまた、例えば、当業者に公知の錠剤、カプセル剤、摂取可能な液体、粉末、リポソーム、ナノ粒子および放出制御製剤であってもよい。
【００３８】
組換えタンパク質、ベクター、宿主細胞および発現
本開示の組成物は、組換えタンパク質発現法を使用して組換えタンパク質として調製してもよい。適切なポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１３（ラミニン−ｒＥＶ）、配列番号１５（ＨＩＶ−ｒＥＶ）、および配列番号１７（ＲＶＧ−ｒＥＶ）であり得る。これらはまた、例えば、遺伝子コードの縮重、ポリペプチドを発現する宿主細胞に有利なコドンの偏り、および生じるタンパク質における保存的アミノ酸置換によって、配列中のある程度の変動を許容する。したがって、本発明のポリペプチドおよびコンストラクトは、前記配列と配列が同一のものだけでなく、実質的に同一のままである構造的および機能的特性を備えたそれらの変異体ポリペプチドも含む。
【００３９】
このような変異体（または「類似体」）は、基準配列と８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列相同性（「同一性」）を有し得る。この意味において、アミノ酸配列「類似性」を決定するための技術は当技術分野では周知である。一般的に、「類似性」は、適切な位置における２つ以上のポリペプチドの正確なアミノ酸対アミノ酸比較であって、アミノ酸が同一であるか、または類似の化学的および／または物理的特性、例えば電荷もしくは疎水性を有するものを意味する。いわゆる「パーセント類似性」は、その後、比較したポリペプチド配列の間で決定することができる。核酸およびアミノ酸配列の同一性を決定するための技術もまた当技術分野において周知であり、その遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列（通常、ｃＤＮＡ中間体を介する）を決定すること、そこにコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれを第２のアミノ酸配列と比較することを含む。一般的に、「同一性」とは、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、それぞれ正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を意味する。２つ以上のポリヌクレオチド配列は、２つ以上のアミノ酸配列で可能なように、それらの「パーセント同一性」を決定することによって比較することができる。例えば、ＢＬＡＳＴなどの利用可能なプログラムは、２つのポリヌクレオチドの間の同一性と、２つのポリペプチド配列の間の同一性および類似性の両方をそれぞれ計算することができる。配列間の同一性または類似性を計算するためのその他のプログラムは、当技術分野で公知である。
【００４０】
本開示はさらに、神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物をコードする核酸配列を含むベクターを対象とする。本明細書では、「ベクター」という用語は、宿主細胞に異種ＤＮＡを導入するために使用することができるいかなる組換えポリヌクレオチドコンストラクトをも意味する。本開示のベクターはさらに、治療薬をコードする核酸配列に作動可能に連結した神経筋接合部標的化ペプチドをコードする核酸配列を含み得る。本開示のベクターはさらに、治療薬をコードする核酸配列に作動可能に連結しているリンカーをコードする核酸配列に作動可能に連結している、神経筋接合部標的化ペプチドをコードする核酸配列を含み得る。
【００４１】
本開示の組成物は、特定の宿主細胞に適した発現ベクターを使用して原核および真核細胞において産生させることができる。特に適した原核細胞は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種であってもよい。特に適した真核細胞は、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞および酵母細胞であってもよい。
【００４２】
本明細書では、「コンストラクト」という用語は、いかなる組換えポリヌクレオチド分子をも意味する。コンストラクトの例は、任意の原料から得られ、ゲノムへの組み込みまたは自己複製が可能であり、１個または複数個のポリヌクレオチド分子が機能的に作動可能に連結した、すなわち、作動可能に連結したポリヌクレオチド分子を含む、プラスミド、コスミド、ウイルス、自己複製ポリヌクレオチド分子、ファージ、または線状もしくは環状の１本鎖もしくは２本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡポリヌクレオチド分子であり得る。
【００４３】
本明細書では、「作動可能に連結」とは、１つの配列が連結した配列に必要な機能を提供することができるように核酸配列を合体することを意味する。プロモーターの場合、「作動可能に連結」は、関心のある配列の転写がそのプロモーターによって制御され調節されるように、プロモーターが関心のある配列に繋がれることを意味する。関心のある配列がタンパク質をコードするものであってそのタンパク質の発現が所望される場合、「作動可能に連結」は、生じる転写物が効率よく翻訳されるような方法でプロモーターが配列に連結されることを意味する。プロモーターのコーディング配列への連結が転写的融合であり、コードされるタンパク質の発現が所望される場合、生じる転写物の第１の翻訳開始コドンがコーディング配列の開始コドンであるよう連結が行われる。あるいは、プロモーターのコーディング配列への連結が翻訳的融合であり、コードされるタンパク質の発現が所望される場合、５’非翻訳配列に含有される第１の翻訳開始コドンがプロモーターと関連するよう連結が行われ、且つ、生じる翻訳生成物が所望するタンパク質をコードする翻訳オープンリーディングフレームとインフレーム(in frame)であるよう連結が行われる。作動可能に連結できる核酸配列は、例えば、遺伝子発現機能を提供する配列（すなわち、プロモーター、５’非翻訳領域、イントロン、タンパク質コーディング領域、３’非翻訳領域、ポリアデニル化部位、および／または転写終結因子などの遺伝子発現要素）、ＤＮＡ移入および／または組み込み機能を提供する配列、選択機能を提供する配列（すなわち、抗生物質耐性マーカー、生合成遺伝子）、スコア化可能なマーカー機能を提供する配列（すなわち、レポーター遺伝子）、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）またはインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の配列の操作を容易にする配列（すなわち、ポリリンカー配列、部位特異的組換え配列）および複製機能を提供する配列（すなわち、細菌の複製開始点、自己複製配列、セントロメア配列）であってもよい。作動可能に連結してもよい追加的配列は、例えば、親和性タグなどの組換え発現タンパク質の精製を容易にする配列であってもよい。作動可能に連結してもよいその他の追加的配列は、例えば、プロテアーゼ切断部位をコードする配列であってもよい。
【００４４】
「単離された」ポリヌクレオチド（例えば、「単離されたＤＮＡ」または「単離されたＲＮＡ」）とは、天然に生じる(naturally occurring)生物の他の成分、例えば細胞構造成分またはポリヌクレオチドに関連することが通常見出されているその他のポリペプチドもしくは核酸の少なくともいくつかから少なくとも部分的に分離されたポリヌクレオチドを意味する。
【００４５】
「単離された」ポリペプチドとは、天然に生じる生物の他の成分、例えば細胞もしくは構造成分またはポリペプチドに関連することが通常見出されているその他のポリペプチドもしくは核酸の少なくともいくつかから少なくとも部分的に分離されたポリペプチドを意味する。
【００４６】
成分に作動可能に連結することによって一旦ベクターが構築されると、ベクターは宿主細胞に導入することができる。神経筋接合部標的化ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を治療薬および／またはリンカーをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結すると、本開示に示したように、宿主細胞から発現ポリペプチドの産生が生じる。ベクターは、当業者に公知の方法によって宿主細胞に導入することができる。適切な方法は、例えば、遺伝子導入、形質転換およびエレクトロポレーションであり得る。その後、宿主細胞は、組成物の発現を可能にするために適切な条件下で培養して、次いで、組成物は単離および／または精製によって回収される。
【００４７】
本開示による組換え発現組成物は、当業者に公知の方法によってさらに単離し精製することができる。例えば、タンパク質精製は、アフィニティークロマトグラフィー、沈降法、クロマトグラフィー（例えば、アフィニティー、イオン交換、ＨＰＬＣ、ゲル濾過）、抽出、限外濾過、電気泳動、およびそれらの組み合わせによって実施することができる。タンパク質単離および精製は、配列およびアミノ酸モチーフを含めることによって、またはアフィニティー精製のための配列およびアミノ酸モチーフを有するタンパク質発現ベクターの使用によって容易にすることができる。適切な配列およびモチーフは、例えば、ヒスチジンタグ、抗原ペプチドタグ、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよび当業者に公知のその他の適切なタグであってもよい。特に適切な親和性タグは、例えば、図１４で例示したヒスチジンタグ（「Ｈｉｓタグ」）であり得る。当業者に公知なように、親和性タグは、親和性タグを含有するタンパク質の精製の助けとなる。
【００４８】
本開示による組換え発現組成物は、他のドメインから組成物をさらに単離するために、プロテアーゼ切断部位をさらに含むことができる。適切なプロテアーゼ切断部位は、当業者に公知のいかなるプロテアーゼ切断部位であってもよい。適切なプロテアーゼは、例えば、第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ＰＲＥＳＣＩＳＳＩＯＮ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ペプシン切断部位、トリプシン切断部位、キモトリプシン切断部位、サーモリシン切断部位、および当業者に公知のその他のプロテアーゼ切断部位であり得る。特に適切なプロテアーゼ切断部位は、例えば、トロンビン切断部位であり得る。
【００４９】
さらに、または代わりに、本開示の組成物は、化学的合成法を使用して調製することができる。適切な化学合成法は当技術分野では周知で、例えば、液相ペプチド合成、固相ペプチド合成、断片縮合、および化学的ライゲーションを含み得る。
【００５０】
治療薬を神経筋接合部に送達する方法
別の態様では、本開示は、治療薬を神経筋接合部に送達する方法を対象とする。この方法は、治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物を投与することを含む。
【００５１】
神経筋接合部標的化ペプチドは、本明細書で記載したいかなる神経筋接合部標的化ペプチドであってもよい。治療薬は、本明細書で記載したいかなる治療薬であってもよい。組成物はさらに、本明細書で記載した少なくとも１つのリンカーを含んでいてもよい。
【００５２】
投与は、対象に対するものであり得る。対象に対する適切な投与方法は、例えば、静脈注射、静脈注入、腹腔内注射、皮内注射、筋肉内注射、皮下注射、経鼻、経口および当業者に公知のその他の方法によるものであり得る。投与はまた、培養細胞に対するものであってもよい。培養細胞に対する適切な投与方法は、例えば、組成物を含有する溶液のピペッティング、灌注(pouring)、および当技術分野で公知のその他の方法によるものであってもよい。
【００５３】
投与する組成物の用量は、当業者によって決定することができる。用量は、例えば、状態または疾患、対象の体重、対象の年齢、投与方法、投与経路、インビボにおける目的のために投与するかどうか、インビトロにおける目的のために投与するかどうか、およびその他の要因などの様々な要因に左右され得る。対象に対する用量は一般的に、対象における少なくとも１つの臨床症状のいくらかの軽減、緩和、または減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）をもたらすために、対象にいくらかの改善または利益をもたらすのに十分な量を含む。この用量はまた、例えば、インビトロにおける補体阻害効果または補体依存細胞溶解の防止をもたらすために十分な量を含んでいてもよい。
【００５４】
適切な用量は、約０．００１μｇ／ｍｌから約４μｇ／ｍｌであり得る。特に適切な用量は、約０．００１μｇ／ｍｌから約０．０２μｇ／ｍｌであり得る。適切な用量は、例えば、抗体感作赤血球の補体溶血活性の阻害を調べることによって、抗体によって惹起される細胞株の補体媒介性損傷のルミネセンスバイオアッセイによって（例えば、Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥから市販されているｔｏｘｉｌｉｇｈｔバイオアッセイ）、インビトロにおいて測定することができる。適切な用量はまた、例えば、神経筋接合部への標的化を分析すること、対象における筋力低下の表れを分析すること、および全身補体活性における変化を測定することによって、インビボにおいて測定することができる。当業者であれば、治療効果は、対象にいくらか利益がもたらされる限り、完全であったり、治癒であったりする必要はないことは理解されよう。
【００５５】
神経筋接合部関連疾患または状態を治療する方法
別の態様では、本開示は、神経筋接合部関連疾患または状態を治療する方法を対象とする。この方法は、治療薬に結合した神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【００５６】
本明細書では、「神経筋接合部関連疾患または状態」とは、神経筋接合部における損傷および／または神経筋接合部に対する損傷から生じる疾患または状態を意味する。神経筋接合部関連疾患または状態は、例えば、重症筋無力症、実験的に得られた重症筋無力症、ランバート−イートン症候群、ミラー・フィッシャー症候群、先天性筋無力症症候群、ボツリヌス中毒、有機リン中毒、および神経筋接合部を損なう(compromise)その他の毒素であってもよい。
【００５７】
この方法には、本明細書で記載した神経筋接合部における損傷および／または神経筋接合部に対する損傷から生じる神経筋接合部関連疾患または状態に罹患した個体を含む、組成物を必要とする対象に対する組成物の投与が含まれる。さらに、組成物を必要とする対象には、神経筋接合部における損傷および／または神経筋合部に対する損傷から生じる疾患または状態を模倣するように実験的に誘導され、したがってこれらの疾患および状態の動物モデルとして役立つ実験動物が含まれる。したがって、本開示のいくつかの実施形態では、一般集団の全てがこれらの方法によって利益を得ることはできないので、本明細書で開示した方法は、一般集団の小集団を対象とする。
【００５８】
適切な対象は哺乳動物であり得る。適切な哺乳動物は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、およびサルであり得る。
【００５９】
神経筋接合部標的化ペプチドは、本明細書で記載したいかなる神経筋接合部標的化ペプチドであってもよい。治療薬は、本明細書で記載したいかなる治療薬であってもよい。組成物はさらに、本明細書で記載した少なくとも１つのリンカーを含んでいてもよい。
【００６０】
適切な投与方法は、例えば、静脈注射、静脈注入、腹腔内注射、皮内注射、筋肉内注射、皮下注射、経鼻、経口、および当業者に公知のその他の方法によるものであり得る。
【００６１】
適切な治療有効量は、例えば、約１ｎｇ／ｋｇから約０．１ｍｇ／ｋｇであり得る。より具体的には、治療有効量は約５ｍｇ／ｋｇであり得る。適切な治療有効量はさらに、約０．００１μｇ／ｍｌから約４０μｇ／ｍｌの半数阻害濃度（ＩＣ５０）を有するように記載されてもよい。特に適切なＩＣ５０は、約１０ｎｇ／ｍｌから約２０μｇ／ｍｌであり得る。治療有効量は、例えば、対象における筋力低下の表れが認められることなく長期の生物学的効果が認められることを特徴とすることができる。対象に投与する組成物の治療有効量は、当業者によって決定することができる。治療有効量は、例えば、状態または疾患、対象の体重、対象の年齢、投与方法、投与経路、およびその他の要因などの様々な要因に左右され得る。一般的に、治療有効量は、対象における少なくとも１つの臨床症状のいくらかの軽減、緩和または減少をもたらすために、対象にいくらかの改善または利益をもたらすのに十分な量を含む。当業者であれば、効果は、対象にいくらか利益がもたらされる限り、完全であったり、治癒であったりする必要はないことは理解されよう。
【００６２】
本開示は、以下の非限定的実施例を考察してより完全に理解されるだろう。
【実施例】
【００６３】
実施例１
Ｌ−ｒＥＶクローニングおよび発現
この実施例では、ｒＥＶ（配列番号１０によってコードされる）に結合したラミニン由来神経筋接合部標的化ペプチド（配列番号１によってコードされる）を含む組成物を組換えタンパク質発現によって調製した。
【００６４】
具体的には、ラミニン神経筋接合部標的化ペプチドをｒＥＶに結合した。図１に示したように、コンストラクトはさらに、リンカー、Ｈｉｓタグおよびトロンビン切断部位を含んだ。コドン最適化は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なコドン最適化プログラムを使用して実施した。
【００６５】
ラミニン−リンカー−ｒＥＶをコードするｃＤＮＡは、原核細胞発現ベクタープラスミドｐＥＴ−２８−ａ（＋）にマルチクローニングサイト内のＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩサイトを介してサブクローニングした。プラスミドは、制限酵素分析およびダイレクトシークエンス法（ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって確認した。プラスミドコンストラクトの概略図を図２に示す。
【００６６】
ラミニン−リンカー−ｒＥＶの組換えタンパク質発現のために、ＢＬ２１大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）を前記で調製したｐＥＴ２８ａ−ラミニン−リンカー−ｒＥＶプラスミドで形質転換し、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で４時間誘導した。細胞は、３．２ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．３ｍＭのＫＣｌ、１３５ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのイミダゾール、リゾチームおよびプロテアーゼ阻害剤錠（Ｒｏｃｈｅ）を含有する溶解緩衝液中で超音波処理によって溶解した。４℃で１３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、可溶性画分をＴａｌｏｎ  ｍｅｔａｌアフィニティーカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に添加し、緩衝液Ａ（３．２ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１．３ｍＭ ＫＣｌ、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４））で洗浄し、異なる濃度のイミダゾール（２０ｍＭから５００ｍＭ）を含有する緩衝液Ａで溶出した。関心のあるタンパク質を含有する画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａ  １０Ｋ  ＭＷＣＯフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。次に、ゲル濾過クロマトグラフィーのために、濃縮したタンパク質をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に添加した。溶出した画分のタンパク質存在を分析し、陽性画分の濃度を確認した。得られたタンパク質を−８０℃で保存するか、またはさらに実験するために使用した。
【００６７】
精製したタンパク質の濃度をブラッドフォードアッセイによって測定した。図３に示したように、誘導されたＢＬ２１細胞は、誘導後１時間以内にラミニン−ｒＥＶの発現を開始し、４時間後に最大発現した。抗ｒＥＶ抗体を使用したウェスタンブロット分析によって、誘導細胞における発現を確認した。図４を参照のこと。
【００６８】
実施例２
ＨＩＶ−ｒＥＶ
この実施例では、ｒＥＶ（配列番号１０によってコードされる）に結合したＨＩＶ由来の神経筋接合部標的化ペプチド（配列番号３によってコードされる）を含む組成物を実施例１で記載したように調製した。
【００６９】
具体的には、ＨＩＶ神経筋接合部標的化ペプチドをｒＥＶに結合した。図５に示したように、コンストラクトはさらに、リンカー、Ｈｉｓタグおよびトロンビン切断部位を含んだ。コドン最適化は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なコドン最適化プログラムを使用して実施した。
【００７０】
ＢＬ２１大腸菌は、ｐＥＴ２８ａ−ＨＩＶ−リンカー−ｒＥＶプラスミドで形質転換し、ＩＰＴＧで４時間誘導した。細胞を溶解し、タンパク質を前記の実施例１で記載したように精製した。得られたタンパク質を−８０℃で保存するか、またはさらに実験するために使用した。
【００７１】
実施例３
ＲＶＧ−ｒＥＶ
この実施例では、ｒＥＶ（配列番号１０によってコードされる）に結合したＲＶＧ由来の神経筋接合部標的化ペプチド（配列番号５によってコードされる）を含む組成物を実施例１で記載したように調製した。
【００７２】
具体的には、ＲＶＧ神経筋接合部標的化ペプチドをｒＥＶに結合した。図６に示したように、コンストラクトはさらに、リンカー、Ｈｉｓタグおよびトロンビン切断部位を含んでいた。コドン最適化は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なコドン最適化プログラムを使用して実施した。
【００７３】
ＢＬ２１大腸菌は、ｐＥＴ２８ａ−ＲＶＧ−リンカー−ｒＥＶプラスミドで形質転換し、ＩＰＴＧで４時間誘導した。細胞を溶解し、タンパク質を前記の実施例１で記載したように精製した。得られたタンパク質を−８０℃で保存するか、またはさらに実験するために使用した。
【００７４】
実施例４
この実施例では、崩壊促進因子（ＤＡＦ）に結合したＭａｂ３５由来の１本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を使用して、神経筋接合部標的化ペプチドを含む組成物を実施例１で記載したように調製した。
【００７５】
具体的には、ｓｃＦｖをＤＡＦに融合させ、図７に概略を示したｐＥＴ１６ｂ発現ベクターに挿入した。ｓｃＦｖのＶＨ−ＶＬ断片を生成するために、Ｍａｂ３５抗体を分泌するＴＩＢ−１７５ハイブリドーマ細胞系（ＡＴＣＣから入手）からＲＮＡを得た。可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）は、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。重複ＰＣＲを使用して、１本鎖ＡＣｈＲ抗体ｓｃＦｖを作製するために（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３４）リンカーを備えたＶＨ−ＶＬ断片を生成した。配列決定によって、クローニングした断片の正体はＶＨおよびＶＬ領域であると確認した。次に、ＣＤ５９断片またはＩｇＧシグナルペプチドを使用して、２種類のシグナルペプチドコンストラクトを作製した。次に、ＣＤ５９ｓｐ−またはＩｇＧｓｐ−シグナルペプチドをＶＨ−ＶＬ断片に融合し、ｐＩＲＥＳ２−ＡｃＧＦＰ１ベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）にクローニングした。ＢＨＫ−２１細胞をこれらのコンストラクトで遺伝子導入した。図８は、ＩｇＧ  ＶＨ−ＶＬ断片で遺伝子導入した遺伝子導入ＢＨＫ−２１細胞によるＧＦＰの発現を示す。
【００７６】
次に、ＤＡＦをＣＤ５９ｓｐ−ＶＨ−ＶＬまたはＩｇＧｓｐ−ＶＨ−ＶＬのいずれかに融合させた。ＣＤ５９ｓｐ−ＶＨ−ＶＬ−ＤＡＦは、５３７アミノ酸ペプチド（配列番号３４）である。ＩｇＧｓｐ−ＶＨ−ＶＬ−ＤＡＦは、５３４アミノ酸ペプチド（配列番号３５）である。
【００７７】
ＢＬ２１細胞は、以前に記載したｓｃＦｖ−ＤＡＦコンストラクトを含有するｐＥＴ１６ｂ発現ベクターで形質転換した。発現したタンパク質は、Ｈｉｔｒａｐ  ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰカラム（製造者）を使用して精製し、尿素勾配透析によってリフォールディングした。発現、精製、およびリフォールディング工程中に採取した試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。図９を参照のこと。列１は、誘導前のｐＥＴ１６ｂ−ｓｃＦｖ−ＤＡＦ／ＢＬ２１の試料である。列２は、誘導後のｐＥＴ１６ｂ−ｓｃＦｖ−ＤＡＦ／ＢＬ２１の試料である。列３および４は、Ｈｉｔｒａｐ  ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰカラムからの融合タンパク質の溶出ピークである。列５および６は、尿素勾配透析後のリフォールディングした融合タンパク質である。列Ｍは分子量マーカーである。
【００７８】
実施例５
ｓｃＦｖ−ＤＡＦ融合タンパク質を、ＥＬＩＳＡによってｈＡＣｈＲα１−２１０ペプチドに対する特異的結合について分析した。
【００７９】
ｈＡＣｈＲα１−２１０ペプチド（２μｇ／ｍｌ）をプレートにコーティングし、連続希釈したｓｃＦｖ−ＤＡＦまたはｓｃＦｖ１９５６と共にインキュベートした。結果はＯＤで表した。結果を図１０に示す。値は、平均±ＳＤで表した。＊Ｐ＜０．０５。
【００８０】
実施例６
ｓｃＦｖ−ＤＡＦ融合タンパク質を、インビトロにおける補体調節機能について分析した。
【００８１】
抗体で感作したヒツジ赤血球を標的として使用した。補体媒介溶血の程度は、ヘモグロビンの上清への放出によって定量し、アッセイ中に存在する阻害剤のモル濃度に対してプロットした。結果は、３連で実施した実験の平均値±ＳＤを表す。結果を図１１に示す。＊Ｐ０．０５。
【００８２】
実施例７
この実施例では、神経筋接合部へのｓｃＦｖ−３５−ＤＡＦの標的化を分析した。
【００８３】
実施例６で調製したｓｃＦｖ−３５−ＤＡＦを、補体損傷に強い感受性のあるＣ５７／Ｂｌａｃｋ６およびＣＤ５９−／−、ＤＡＦ−／−マウスに注射した。２４時間後、体重および筋力低下を評価した。動物には、体重上昇が見出され、強度の損失は示されず、ｓｃＦｖ−３５−ＤＡＦは神経筋接合部伝達を阻害しないことが示唆された。横隔膜は、接合部を同定するための抗ラットＩｇＧおよびブンガロトキシンによってｓｃＦｖ−３５−ＤＡＦの神経筋接合部に対する局在を視覚化するために使用した。図１２に示したように、ｓｃＦｖ−３５−ＤＡＦは、両動物における神経筋接合部に局在し、補体調節因子欠損マウスにおいてさえも組織破壊の証拠はなかった。これらの結果によって、ｓｃＦｖ−３５−ＤＡＦコンストラクトが安全で、神経筋接合部を特異的に標的とすることが確認された。
【００８４】
ｓｃＦｖ−３５−ＤＡＦはまた、ルイスラットに投与した。実験的に重症筋無力症を誘導して２４時間後にアセチルコリン受容体抗体をルイスラットに投与した。４８時間後に、筋力低下の重症度は対照ラットで最大になった。ｓｃＦｖ−３５−ＤＡＦで処置した５匹の動物のうち、全てが生存し、軽度から中程度の筋力低下を示した。ｓｃＦｖ−３５で処置したラットでは、３匹の動物が死亡し、２匹が重度の筋力低下を有した。これらの結果は、ｓｃＦｖ−３５−ＤＡＦが安全であったこと、および着実な防御効果を有することを示唆した。
【００８５】
実施例８
この実施例では、ＴＥ６７１細胞上のＣ３の沈着に対するｓｃＦｖ−３５−ＤＡＦの影響を分析した。
【００８６】
ＴＥ６７１細胞は、ｓｃＦｖ−ＤＡＦ、ｓｃＦｖ１９５６、およびＤＡＦ（１００ｎＭ）を有する正常基礎培地で処置した。陰性対照は、ｍＡｂ３５の代わりにＰＢＳで処置した。細胞は、ＦＩＴＣ結合抗Ｃ３抗体で染色し、対比染色としてエオジン染色溶液で染色した。画像は、２００×（パネルＡ〜Ｅ）、４００×（パネルＦ〜Ｊ）および１０００×（パネルＫ〜Ｏ）で得た。細胞はまた、フローサイトメトリーによって分析した。
【００８７】
結果を図１３に示す。ｓｃＦｖ−ＤＡＦおよびｓｃＦｖ１９５６で処置した細胞上に沈着したＣ３の染色は斑状で中程度であった（パネルＬおよびＭ参照）。ＴＥ６７１細胞周囲のＣ３沈着の染色は拡散していた（パネルＭ、ＮおよびＯ参照）。スケールバー＝１０μｍ。
【００８８】
結果によって、ｓｃＦｖ−ＤＡＦ融合タンパク質はＴＥ６７１細胞表面のＣ３沈着を阻害することが示された。
【００８９】
実施例９
この実施例では、ＥＡＭＧマウスおよびラットにおけるｓｃＦｖ−３５−ＤＡＦの治療効果を分析した。
【００９０】
具体的には、ＥＡＭＧをＤＡＦ−／−、ＣＤ５９ａｂ−／−マウスおよびルイスラットに導入し、その後ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−ＤＡＦ、およびＰＢＳ（対照として）で処置した。マウスは全て疾患の証拠を示さなかったが（図１５参照）、ｓｃＦｖ−ＤＡＦで処置したラットは、ＥＡＭＧからの顕著な保護を示した（図１６）。補体沈着の定量的分析によって、媒体処置およびｓｃＦｖ処置ラットの両方と比較してｓｃＦｖ−Ｄａｆ処置動物の終板におけるＭＡＣ沈着はかなり少ないことが示された。ｓｃＦｖおよび媒体の比較において、ｓｃＦｖは補体沈着の有意傾向な増加を示した。良好な臨床結果と矛盾せず、ＡＣｈＲ密度は、ｓｃＦｖおよび媒体処置ラットよりもｓｃＦｖ−ＤＡＦ処置ラットにおいて顕著に良好であった（示さず）。
【００９１】
前記を考慮して、本開示のいくつかの利点は実現し、その他の有利な結果が達成されることがわかるだろう。本開示の範囲を逸脱せずに前記プロセスおよび複合物(composite)に様々な変更を行うことができるので、前記説明に含まれ、添付の図面に見られる事柄は全て例示として解釈され、制限を意味しない。
【００９２】
本開示の要素またはその様々なバージョン、実施形態もしくは態様を示す場合、冠詞「ある（ａ）」、「ひとつの（ａｎ）」、「該（ｔｈｅ）」および「前記（ｓａｉｄ）」は、１つまたは複数の要素があることを意味するものとする。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、包括的であり、列挙した要素以外の要素を追加してもよいことを意味する。
【図１】
2014520148.tif 000006
【図２】
2014520148.tif 000007
【図３】
2014520148.tif 000008
【図４】
2014520148.tif 000009
【図５】
2014520148.tif 000010
【図６】
2014520148.tif 000011
【図７】
2014520148.tif 000012
【図８】
2014520148.tif 000013
【図９】
2014520148.tif 000014
【図１０】
2014520148.tif 000015
【図１１】
2014520148.tif 000016
【図１２】
2014520148.tif 000017
【図１３】
2014520148.tif 000018
【図１４】
2014520148.tif 000019
【図１５】
2014520148.tif 000020
【図１６】
2014520148.tif 000021
【配列表】
2014520148000001.app
【国際調査報告】
2014520148.tif 000022
2014520148.tif 000023
2014520148.tif 000024