(57)【要約】  本開示は、対象に、幹細胞の集団および／またはその子孫および／またはそれに由来する可溶性因子を全身投与することを含む、対象における骨芽細胞機能を増加させる方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象に、幹細胞の集団および／またはその子孫および／またはそれに由来する可溶性因子を全身投与することを含む、対象における骨芽細胞機能を増加させる方法。
【請求項２】
該幹細胞が多能性細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該多能性細胞がＳＴＲＯ−１＋細胞である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該多能性細胞がＳＴＲＯ−１ブライト細胞である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
該幹細胞が対象における骨芽細胞によりオステオカルシンの生産を刺激する請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
該対象が低い骨芽細胞のレベルまたは活性に関連する障害を患っている請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
該障害が代謝性骨障害または男性不妊である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該代謝性骨障害が、骨軟化症、骨粗鬆症、骨化石病、パジェット病およびＸ染色体性低リン酸塩血症性くる病、腎不全−関連骨形成異常症、大理石骨病、嚢胞性線維性骨炎およびグルココルチコイド−誘導骨喪失よりなる群から選択される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該対象が骨粗鬆症を患っており、該方法が骨折の危険性を予防しまたは低下させる請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
該対象が骨折を患っている請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
該方法が骨折の治癒を加速し、および／または遷延治癒骨折を予防し、および／または骨折の癒着不能を予防する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
幹細胞の集団および／またはその子孫および／またはそれに由来する可溶性因子の投与の結果、対象における血漿中オステオカルシンレベルの増大がもたらされる請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
幹細胞の集団および／またはその子孫および／またはそれに由来する可溶性因子の投与の結果、２週間の投与内で血漿中オステオカルシンレベルの少なくとも５倍の増加がもたらされる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
幹細胞の集団および／またはその子孫および／またはそれに由来する可溶性因子の投与の結果、２週間の投与内で血漿中オステオカルシンレベルの少なくとも１０倍の増加がもたらされる請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
幹細胞の集団および／またはその子孫および／またはそれに由来する可溶性因子の投与の結果、２週間の投与内で血漿中オステオカルシンレベルの少なくとも２０倍の増加がもたらされる請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
幹細胞の集団および／またはその子孫および／またはそれに由来する可溶性因子の投与の結果、対象における血漿中アルカリホスファターゼレベルの増加がもたらされる請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
幹細胞の集団および／またはその子孫および／またはそれに由来する可溶性因子の投与の結果、投与前の血漿中アルカリホスファターゼのレベルと比較して、６週間の投与内で血漿中アルカリホスファターゼレベルの少なくとも５パーセント増加がもたらされる請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
幹細胞の集団および／またはその子孫および／またはそれに由来する可溶性因子の投与の結果、投与前の血漿中アルカリホスファターゼのレベルと比較して、６週間の投与内で血漿中アルカリホスファターゼレベルの少なくとも１０パーセント増加がもたらされる請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
幹細胞の該集団および／または該子孫および／または該可溶性因子が対象に複数回投与される請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
該集団および／または該子孫および／または該可溶性因子が１２週間毎に１回、またはそれよりも長い週間毎に１回投与される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ｋｇ当たり、０．１×１０６〜５×１０６の間のＳＴＲＯ−１＋多能性細胞および／またはその子孫を投与することを含む請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ｋｇ当たり、０．３×１０６〜２×１０６の間の多能性ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
低い用量の多能性ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
該低い用量のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫が、ｋｇ当たり、０．１×１０５および０．５×１０６の間のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該低い用量のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫が、ｋｇ当たり、約０．３×１０６のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
幹細胞の該集団および／または子孫細胞が自己または同種異系であり、および／または該可溶性因子が自己または同種異系細胞に由来し得る請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
多能性細胞の該集団および／または子孫細胞が、投与前および／または該可溶性因子を得る前に培養拡大されたものである請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
多能性細胞の該集団が、ＳＴＲＯ−１ブライトである、および／または組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＰ）を発現する、および／または該子孫細胞および／または該可溶性因子が、ＳＴＲＯ−１ブライトである、および／またはＴＮＡＰを発現するＳＴＲＯ−１＋細胞に由来する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
該幹細胞および／またはその子孫および／またはそれに由来する可溶性因子が静脈内投与される請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
該幹細胞および／またはその子孫細胞および／またはそれに由来する可溶性因子が、該幹細胞および／またはその子孫細胞および／またはそれに由来する可溶性因子および担体および／または賦形剤を含む組成物の形態で投与される請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願データ
本開示は、２０１１年９月９日に出願された発明の名称「骨芽細胞機能を増加させる方法」の米国特許出願第６１／５３２，７７２号、および２０１１年９月１６日に出願された発明の名称「骨芽細胞機能を増加させる方法２」の米国特許出願第６１／５３５，４４１号からの優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、それを必要とする対象における骨芽細胞機能を増加させる方法に関する。これらの方法は、骨障害および男性不妊のような骨芽細胞機能によって媒介される障害を治療し、または予防するのに有用である。
【背景技術】
【０００３】
骨芽細胞は、骨の形成を担う細胞である。これらの細胞は、主として、１型コラーゲン、コンドロイチン硫酸およびオステオカルシンから構成される類骨のマトリックスを生じさせる。また、骨芽細胞は、亜鉛、銅およびナトリウムを利用してこのマトリックスを石灰化する。
【０００４】
骨芽細胞は、骨および骨髄の骨膜に位置する骨前駆細胞から生じる。骨前駆細胞は、マスター転写調節因子Ｃｂｆａ１／Ｒｕｎｘ２を発現する未成熟前駆細胞である。骨前駆細胞は、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板−由来成長因子（ＢＤＧＦ）およびトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）を含む種々の成長因子によって線維芽細胞に分化するように誘導される。一旦骨前駆細胞が骨芽細胞に分化するのを開始すれば、それらは、オステリックス（Ｏｓｔｅｒｉｘ）、Ｃｏｌｌ、ＢＳＰ、Ｍ−ＣＳＦ、ＡＬＰ、ならびにオステオカルシン、オステオポンチン、およびオステオネクチンを含む一定範囲の遺伝子マーカーを発現するのを開始する。
【０００５】
オステオカルシン（骨Ｇｌａタンパク質：ＢＧＰ）は、Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ（（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７３：３３７３−５）によって最初に発見された小さなビタミンＫ依存性カルシウム結合タンパク質である。このタンパク質は、主として、骨芽細胞および象牙芽細胞によって合成され、１５〜２０％の骨の非−コラーゲン性タンパク質を含む。Ｐｏｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：８６８５−９１）は、成熟したオステオカルシンが、グルタミン酸残基の翻訳後ビタミンＫ−依存性修飾によって形成された３つのカルボキシグルタミン酸残基を含有することを示した。これらの残基は、さらに、カルシウムイオンに結合するオステオカルシンの能力に関与することが示されている（Ｂｒｏｚｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｂｒｉｔ．Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．３２：９）。
【０００６】
オステオカルシンは、正常な骨石灰化に必要な骨における主たる細胞外マトリックスタンパク質である。正常な骨塩密度は、タンパク質マトリックス内の細胞外カルシウムおよびリン酸塩を含有するヒドロキシアパタイト結晶の結果である。タンパク質マトリックス内でのカルシウム沈積は、骨芽細胞によって生産されたオステオカルシンを含む。タンパク質マトリックス内のリン酸塩沈積は、ヒドロキシアパタイト結晶の天然阻害剤である無機ピロ硫酸塩（ｐｐｉ）の細胞外濃度を調節する組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＰ）を含む。ＴＮＡＰ遺伝子中の突然変異の結果、無機ピロ硫酸塩の上昇した細胞外濃度、貧弱に石灰化された骨、特発性骨折によって特徴付けられる低ホスファターゼ症がもたらされる。
【０００７】
今日、オステオカルシンは、カルシウムの存在下でカルシウム感知受容体２（ＣａＲ２）を相乗的に活性化させることが知られている。従って、オステオカルシンの発現または活性の改変は、ＣａＲ２機能に関連する障害において鍵となる役割を果たす。例えば、オステオカルシンおよびＣａＲ２の相互作用が役割を果たす障害は、限定されるものではないが、精子の運動性および生存能力、および骨粗鬆症のような代謝性骨障害を含む。
【０００８】
骨粗鬆症は、低下した骨塩密度および骨折の増大した危険性によって特徴付けられる全身骨格障害である。骨粗鬆症の２つの主な病因は、破綻する増大した破骨細胞活性および低下した骨芽細胞活性である。これらの特徴は、月経後状態において、および慢性的コルチコステロイド使用の後に、ならびに突発性の場合に起こる。骨粗鬆症に関する現行の治療戦略のほとんどは、破骨細胞の骨再吸収活性を阻害するビスホスホネートのような抗−再吸収剤に焦点を当てている。副甲状腺（ＰＴＨ）の使用のようなある種の戦略は、オステオカルシンおよび骨特異的−アルカリホスファターゼのような増強された骨芽細胞活性についてのバイオマーカーを用いて測定される増大する骨芽細胞活性に焦点を当てている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
非特許文献１：Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ（（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７３：３３７３−５）
非特許文献２：Ｐｏｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：８６８５−９１）
非特許文献３：Ｂｒｏｚｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｂｒｉｔ．Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．３２：９
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、非−ヒト霊長類への多能性細胞調製物の全身投与の結果、例えば、霊長類における循環オステオカルシンおよび／またはアルカリホスファターゼの増大したレベルによって示される、線維芽細胞活性の劇的な増大がもたらされることを見出した。例えば、発明者らは、霊長類へ多能性細胞調製物を全身投与した結果、２週間の投与内で血漿中オステオカルシンレベルの約２０倍の増大がもたらされたことを見出した。発明者らは、また、霊長類へ多能性細胞調製物を全身投与した結果、６週間の投与内で血漿中アルカリホスファターゼレベルの大よその検出可能な増加、例えば、５％または１０％の増加がもたらされたことを見出した。これは、多能性細胞調製物の全身投与は、代謝性骨障害および男性における低い妊性のような、骨芽細胞活性および／または全身オステオカリンおよび／またはアルカリホスファターゼの低いレベルに関連する、または低いレベルによって引き起こされる病気の治療に有用であろうことを示す。
【００１１】
従って、本開示は対象における骨芽細胞機能を増加させる方法を提供し、該方法は、幹細胞の集団および／またはその子孫および／またはそれに由来する可溶性因子を対象に全身投与することを含む。
【００１２】
１つの例において、対象は、低い骨芽細胞のレベルまたは活性に関連する、および／または低いオステオカルシンのレベルまたは活性に関連する障害を患っている。
【００１３】
該障害は代謝性骨障害または男性不妊であってよい。
【００１４】
該代謝性骨障害は骨軟化症、骨粗鬆症、骨化石病、パジェット病およびＸ染色体性低リン酸塩血症性くる病、腎不全−関連骨形成異常症、大理石骨病、嚢胞性線維性骨炎およびグルココルチコイド−誘導骨喪失よりなる群から選択されてよい。
【００１５】
１つの例において、対象は骨粗鬆症を患っている。１つの例において、該方法は骨粗鬆症を患っている対象における骨折の危険性を予防し、または低下させる。
【００１６】
１つの例において、対象は骨折を患っている。１つの例において、該方法は骨折の治癒を加速し、および／または遷延治癒骨折を予防し、および／または骨折の癒着不能を予防する。この点に関して、対象は代謝性骨障害または男性不妊を患っている可能性がある。あるいは、対象は正常な対象であり得る、すなわち、代謝性骨障害または男性不妊を患っていない可能性がある。かくして、対象は骨折を患っているいずれの対象でもあり得る。
【００１７】
１つの例において、幹細胞の集団および／またはその子孫および／またはそれに由来する可溶性因子の投与の結果、対象における血漿中オステオカルシンレベルの増加をもたらす。
【００１８】
１つの例において、幹細胞の投与は、対象における骨芽細胞によりオステオカルシンの生産を刺激する。
【００１９】
１つの例において、幹細胞の集団および／またはその子孫および／またはそれに由来する可溶性因子の投与の結果、２週間（または４週間または６週間）の投与内で血漿中オステオカルシンレベルの少なくとも５倍、または少なくとも１０倍または少なくとも２０倍の増加をもたらす。
【００２０】
１つの例において、幹細胞の集団および／またはその子孫および／またはそれに由来する可溶性因子の投与の結果、対象における血漿中アルカリホスファターゼレベルの増大をもたらす。
【００２１】
１つの例において、幹細胞の投与は、対象における骨芽細胞によるアルカリホスファターゼの生産を刺激する。
【００２２】
１つの例において、幹細胞の集団および／またはその子孫および／またはそれに由来する可溶性因子の投与の結果、投与前の血漿中アルカリホスファターゼのレベルと比較して、６週間の投与内に、血漿中アルカリホスファターゼのレベルの少なくとも５、または１０、または２０、または３０、または４０、または５０、または６０パーセントの増加をもたらす。
【００２３】
１つの例において、幹細胞は多能性細胞である。もう１つの例において、多能性細胞はＳＴＲＯ−１＋細胞である。なおもう１つの例において、多能性細胞はＳＴＲＯ−１ブライト細胞である。なおもう１つの例において、ＳＴＲＯ−１＋細胞はＴＮＡＰマーカーを共発現する。
【００２４】
１つの例において、本明細書中で記載された方法は、ＳＴＲＯ−１ブライト細胞および／またはその子孫および／またはそれに由来する可溶性因子が豊富化された細胞の集団を投与することを含む。
【００２５】
１つの例において、本明細書中で記載された方法は、ＳＴＲＯ−１＋および組織非特異的アルカリホスファターゼ＋（ＴＮＡＰ）＋細胞および／またはその子孫および／またはそれに由来する可溶性因子が豊富化された細胞の集団を投与することを含む。
【００２６】
１つの例において、幹細胞の集団および／または子孫および／または可溶性因子は静脈内投与される。
【００２７】
１つの例において、幹細胞の集団および／または子孫および／または可溶性因子は複数回投与される。
【００２８】
例えば、幹細胞の集団および／または子孫および／または可溶性因子は、４週間毎に１回、またはそれ以上の週間毎に１回投与される。
【００２９】
例えば、幹細胞の集団および／または子孫および／または可溶性因子は８週間またはそれ以上毎に１回投与される。
【００３０】
例えば、幹細胞の集団および／または子孫および／または可溶性因子は、１２週間毎に１回、またはそれ以上の週間毎に１回投与される。
【００３１】
１つの例において、いずれの例による本明細書中で記載された方法も、ｋｇ当たり、０．１×１０６〜５×１０６の間のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む。
【００３２】
１つの例においていずれの例による本明細書中で記載された方法も、ｋｇ当たり、０．３×１０６〜２×１０６の間のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む。例えば、該方法は、ｋｇ当たり、約１×１０６または２×１０６のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む。
【００３３】
１つの例において、いずれの例による本明細書中に記載された方法も、低い用量のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む。例えば、低用量のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫は、ｋｇ当たり、０．１×１０５および０．５×１０６の間のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を含む。例えば、低用量のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫は、ｋｇ当たり、約０．３×１０６のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を含む。
【００３４】
１つの例において、いずれの例による本明細書中に記載された方法も、高用量のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む。
【００３５】
１つの例において、幹細胞の集団および／または子孫細胞は自己または同種異系であり、および／または可溶性因子は自己または同種異系細胞に由来し得る。１つの例において、該集団および／または子孫は同種異系であり、および／または可溶性因子は同種異系細胞からのものである。
【００３６】
前記例によると、該方法は、加えて、幹細胞の集団および／または子孫細胞および／または可溶性因子を得ることを含むことができ、あるいは、加えて、幹細胞の集団および／または子孫細胞および／または可溶性因子を単離することを含むことができる。１つの例において、幹細胞の集団および／または子孫細胞の単離は、ＳＴＲＯ−１および／またはＴＮＡＰの発現に基づく。
【００３７】
１つの例において、幹細胞の集団および／または子孫細胞および／または可溶性因子は治療すべき対象から得られる。もう１つの例において、幹細胞の集団および／または子孫細胞および／または可溶性因子は同一種の異なる対象から得られる。
【００３８】
１つの例において、幹細胞および／または子孫細胞は、投与に先立って、および／または可溶性因子を得るに先立って、培養拡大されている。
【００３９】
前記例によると、いずれの例による本明細書中に記載された方法も、加えて、幹細胞の集団および／または子孫細胞を培養することを含む。
【００４０】
１つの例において、幹細胞および／またはその子孫細胞および／またはそれに由来する可溶性因子は、該幹細胞および／またはその子孫細胞および／またはそれに由来する可溶性因子および担体および／または賦形剤を含む組成物の形態で投与される。
【００４１】
前記例によると、いずれの例による本明細書中に記載された方法も、加えて、該集団および／または子孫および／または可溶性因子を組成物に処方することを含むことができる。
【００４２】
本開示は、いずれかの例による本明細書中に記載された方法での使用説明書を包装した、幹細胞の集団および／またはその子孫および／またはそれに由来する可溶性因子を含むキットも提供する。
【００４３】
例えば、本開示は、いずれかの例による本明細書中に記載された方法における組成物の使用を示す製品の情報を包装した、該集団および／または子孫および／または可溶性因子を含む組成物を含むキットを提供する。
【００４４】
本開示は、対象において、低い骨芽細胞のレベルまたは活性に関連する障害を治療または予防する方法も提供し、該方法は幹細胞の集団および／またはその子孫および／またはそれに由来する可溶性因子を対象に投与することを含む。
【００４５】
１つの例において、対象は骨粗鬆症を患っている。１つの例において、該方法は、骨粗鬆症を患っている対象における骨折の危険性を予防し、または低下させる。
【００４６】
１つの例において、対象は骨折を患っている。１つの例において。該方法は、骨折の治癒を加速し、および／または骨折の遷延治癒骨折を予防し、および／または骨折の癒着不能を予防する。
【００４７】
本開示は、それを必要とする対象におけるオステオカルシンレベル（例えば、血漿中オステオカルシンレベル）を増加させる方法も提供し、該方法は、本明細書中に記載された幹細胞の集団および／または本明細書中に記載されたその子孫および／または本明細書中に記載されたそれに由来する可溶性因子を対象に投与（例えば、全身投与）することを含む。
【００４８】
１つの例において、該細胞または因子は、対象におけるオステオカルシンレベル（例えば、血漿中オステオカルシンレベル）を増加させるのに十分な量で投与される。
【００４９】
１つの例において、必要とする対象は、例えば、正常なおよび／または健康な集団におけるレベルと比較して、オステオカルシン、例えば、血漿中オステオカルシンの低下したレベルを有する。
【００５０】
本開示は、それを必要とする対象において、アルカリホスファターゼレベル（例えば、血漿中アルカリホスファターゼレベル）を増加させる方法も提供し、該方法は、本明細書中に記載された幹細胞の集団および／または本明細書中に記載されたその子孫および／または本明細書中に記載されたそれに由来する可溶性因子を対象に投与（例えば、全身投与）することを含む。
【００５１】
１つの例において、該細胞または因子は、対象におけるアルカリホスファターゼレベル（例えば、血漿中アルカリホスファターゼレベル）を増加させるのに十分な量で投与される。
【００５２】
１つの例において、必要とする対象は、例えば、正常なおよび／または健康な集団におけるレベルと比較して、アルカリホスファターゼ、例えば、血漿中アルカリホスファターゼの低下したレベルを有する。
【００５３】
本開示は、男性不妊または代謝性骨障害の治療または予防で用いられる幹細胞の集団および／またはその子孫および／またはそれに由来する可溶性因子も提供する。
【００５４】
本開示は、対象における男性不妊または代謝性骨障害を治療または予防するための医薬の製造における、幹細胞の集団および／またはその子孫および／またはそれに由来する可溶性因子の使用も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、成人ヒト骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）によるＴＮＡＰ（ＳＴＲＯ−３）および間葉前駆細胞マーカーＳＴＲＯ−１ブライトの共発現を示す。二色免疫蛍光およびフローサイトメトリーは、ＦＩＴＣに結合したヤギ抗−ネズミＩｇＭ抗体で間接的に標識されたＳＴＲＯ−１  ＭＡＣＳ−選択ＢＭＭＮＣ（ｘ軸）、およびＰＥに結合したヤギ抗−ネズミＩｇＧで間接的に標識されたＳＴＲＯ−３  ｍＡｂ（ネズミＩｇＧ１）（ｙ軸）のインキュベーションによって行った。ドット・プロット・ヒストグラムは、リストモードデータとして収集された５×１０４の事象を表す。垂直および水平線は、同一条件下で処置されたアイソタイプにマッチした対照抗体、１Ｂ５（ＩｇＧ）および１Ａ６．１２（ＩｇＭ）で得られた＜１．０％平均蛍光の反応性レベルに設定された。結果は、ＳＴＲＯ−１ブライト細胞の小さな集団が、ＳＴＲＯ−１＋細胞をＳＴＲＯ−３  ｍＡｂと反応させずに、ＴＮＡＰ（上方右側象限）を共発現したことを示す。
【図２】図２は、ヤギ抗−ネズミＩｇＭまたはＩｇＧがコンジュゲートしたＦＩＴＣ二次抗体を用いて検出されたアイソタイプ（ＩｇＭ、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１陰性対照（点線（ｈａｓｈｅｄ））に対する間葉幹細胞マーカー、ＳＴＲＯ−１、ＳＴＲＯ−４およびＣＤ１４６（実線）の陽性細胞表面発現と共に培養拡大された骨髄由来カニクイザルＭＰＣの単細胞懸濁液を用いて生産された代表的なフロー・サイトメーター・ヒストグラムを示すグラフ表示である。代表的なヒストグラムは、カニクイザルＭＰＣが単球／マクロファージ（ＣＤ１４）、造血幹／先祖細胞（ＣＤ３４）および成熟白血球（ＣＤ４５）のマーカーについての細胞表面発現を欠如することも示す。アイソタイプ対照と比較した１％よりも大きな蛍光のレベルは陽性を示す。
【図３】図３は、個々の動物についての同種異系ＭＰＣのＩＶ注射後の６ヵ月の期間にわたってモニターされた血中オステオカルシン（ｎｇ／ｍｌ）についての絶食プロファイルのグラフ表示である。矢印は、単一用量のＭＰＣの投与の時間を示す。
【図４】図４は、肥満モーリシャスカニクイザルに静脈内投与された２つの単一用量のＭＰＣ後の血漿中オステオカルシンレベルについての平均プロファイルグラフ表示である。
【図５】図５は、処理前のベースラインレベルと比較した、ＭＰＣ処理後のオステオカルシンレベルのパーセンテージ変化を示すグラフ表示である。
【図６】図６は、処理前のベースラインレベルと比較した、ＭＰＣ処理後のオステオカルシンレベルの平均パーセンテージ変化を示すグラフ表示である。
【図７】図７は、４／５動物を示すグラフ表示が、（曲線下面積分析によって測定された）６カ月間のＭＰＣ処理にわたる血漿の総アルカリホスファターゼの漸進的増加を示すことを示す。
【図８】図８は、４／５動物を示すグラフ表示が、（１８〜２４週間−対−０〜６週間の間の曲線下面積分析において％増加によって測定された）６ヵ月のＭＰＣ処理にわたる、血漿の総アルカリホスファターゼの漸進的増加を示すことを示す。
【図９】図９は、個々の動物における処理前のベースラインレベルと比較した、ＭＰＣ処理後のアルカリホスファターゼレベルのパーセンテージ変化を示すグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
一般的な技術および選択された定義
本明細書を通じて、具体的にそうでないことが述べられているのでなければ、または文脈がそうでないことを要求しているのでなければ、単一の工程、組成物、工程の群または組成物の群への言及は、１および複数の（すなわち、１以上の）それらの工程、組成物、工程の群または組成物の群を含むと把握されるべきである。
【００５７】
本明細書中に記載された各具体例または例は、そうでないことが具体的に述べられているのでなければ、各およびあらゆる他の実施態様に対して上記に準じて適用されるべきである。
【００５８】
当業者であれば、本明細書中に記載された開示は、具体的に記載されたもの以外の変形および修飾が可能であることを認識するであろう。開示は全てのそのような変形および修飾を含むと理解される。開示は、本明細書中で言及されたまたは示された工程、特徴、組成物および化合物の全てを個々にまたは集合的に、およびいずれかおよび全ての組合せ、または該工程または特徴のいずれかの２以上も含む。
【００５９】
本開示は、例示の目的のみを意図する、本明細書中に記載された具体的な実施態様によってその範囲が限定されるものではない。機能的に同等な生成物、組成物および方法は、明らかに、本明細書中に記載された開示の範囲内にある。
【００６０】
本開示は、そうでないことが示されているのでなければ、分子生物学、微生物学、ウイルス学、組換えＤＮＡ技術、溶液中でのペプチド合成、固相ペプチド合成、および免疫学の慣用的な技術を用いて過度な実験無くして行われる。そのような手法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第二版（１９８９）、Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ巻の全て；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５）、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，テキストの全て；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，テキストの全て、および特に、Ｇａｉｔによるその中の論文，ｐｐｌ−２２；Ａｔｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，ｐｐ３５−８１；Ｓｐｒｏａｔ  ｅｔ  ａｌ，ｐｐ  ８３−１１５；およびＷｕ  ｅｔ  ａｌ，ｐｐ  １３５−１５１；４．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８５）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，テキストの全て；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８６）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，テキストの全て；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏａｎｉｎｇ（１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），シリーズの全て；Ｊ．Ｆ．Ｒａｍａｌｈｏ  Ｏｒｔｉｇａｏ，“Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｉｎ：Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ａｃｃｅｓｓ  ｔｏ  Ｖｉｒｔｕａｌ  Ｌａｂｒａｔｏｒｙウエブサイト（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖａ，ドイツ国）；Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，Ｄ．，Ｔｅｉｃｈｍａｎ，Ｊ．，Ｌｉｅｎ，Ｅ．Ｌａｎｄ  Ｆｅｎｉｃｈｅｌ，Ｒ．Ｌ．（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７３  ３３６−３４２；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９−２１５４；Ｂａｒａｎｙ，Ｇ．およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９７９）ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．およびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．編），ｖｏｌ．２，ｐｐ．１−２８４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１２．Ｗｕｎｓｃｈ，Ｅ．編（１９７４）Ｓｙｎｔｈｅｓｅ  ｖｏｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｎ  ｉｎ  Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌｓ  Ｍｅｔｏｄｅｎ  ｄｅｒ  Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃ（Ｍｕｌｅｒ，Ｅ．編），ｖｏｌ．１５，４ｔｈ  ｅｄｎ．，Ｐａｒｔ  １および２，Ｔｈｉｅｍｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９８４）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．＆  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ａ．（１９８４）Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９８５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．２５，４４９−４７４；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；およびＡｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第三版（Ｊｏｈｎ  Ｒ．Ｗ．Ｍａｓｔｅｒｓ編，２０００），ＩＳＢＮ  ０１９９６３７９７０，テキストの全てに記載されている
【００６１】
本明細書を通じて、文脈がそうでないことを要求するのでなければ、単語「含む」または「（主語が単数の場合の）含む」または「含んでいる」のような変形は、述べられた工程またはエレメントまたは整数あるいは工程またはエレメントまたは整数の群の包含を意味するが、いずれかの他の工程またはエレメントまたは整数あるいはエレメントまたは整数の群の排除を意味しないと理解されるであろう。
【００６２】
本明細書中で用いるように、用語「に由来する」は、特定の整数が、その源から必ずしも直接的にではないにせよ、特定の源から得られてよいことを示すと把握されるべきである。幹細胞および／またはその子孫細胞に由来する可溶性因子の文脈において、この用語は、幹細胞および／またはその子孫細胞のイン・ビトロ培養の間に生産された１以上の因子、例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物等を意味すると把握されるべきである。
【００６３】
本明細書中で用いるように、用語「骨芽細胞機能」は、細胞外マトリックス、例えば、類骨を生産しおよび／または分泌する骨芽細胞の能力を含むと理解されるであろう。類骨は、１型コラーゲン、コンドロイチン硫酸およびオステオカルシンを含む未石灰化骨マトリックスである。用語「骨芽細胞機能」は、加えて、または別法として、細胞外マトリックス、例えば、類骨を石灰化する細胞の能力を意味する。１つの例において、用語「骨芽細胞機能」は、対象における増加する骨形成を含むと理解されるであろう。
【００６４】
対象における増大する「骨芽細胞機能」は、細胞外マトリックスを生産し、および／または分泌し、および／または細胞外マトリックスを石灰化する骨化細胞の能力を増加させることによって、および／または骨前駆細胞の増殖および／または骨前駆細胞の骨芽細胞への分化を増加させることによって達成することができる。例えば、対象における増加する骨芽細胞機能は、対象における、またはその骨における骨芽細胞の数を増加させることによって達成することができる。
【００６５】
本明細書中で用いるように、用語「有効量」は、骨芽細胞機能および／または骨芽細胞のレベルまたは活性および／または全身オステオカルシンレベルおよび／またはアルカリホスファターゼレベルの対象における有意な増加を達成する幹細胞および／またはその子孫細胞および／またはそれに由来する可溶性因子の十分な量を意味すると把握されるべきである。骨芽細胞機能および／または骨芽細胞のレベルまたは活性および／または全身オステオカルシンレベルおよび／またはアルカリホスファターゼレベルの有意な増加は、例えば、少なくとも２倍の増加、または少なくとも５倍の増加、または少なくとも１０倍の増加、少なくとも２０倍の増加、または少なくとも２５倍の増加であってよい。
【００６６】
本明細書中で用いるように、用語「治療上有効量」は、低い骨芽細胞のレベルまたは活性に関連する障害を治療する幹細胞および／またはその子孫細胞および／またはそれに由来する可溶性因子の十分な量を意味すると把握されるべきである。
【００６７】
本明細書中で用いるように、用語「予防上有効量」は、低い骨芽細胞のレベルまたは活性に関連する障害の開始を予防し、または阻害し、または遅延させる幹細胞および／またはその子孫細胞および／または可溶性因子の十分な量を意味すると把握されるべきである。
【００６８】
本明細書中で用いるように、用語「低用量」は、１×１０６未満の幹細胞および／またはその子孫の量を意味する、本明細書中で定義される「有効量」および／または本明細書中で定義される「治療上有効量」および／または「予防上有効量」であるのがなおさらに十分であると理解されるべきである。例えば、低用量は０．５×１０６またはより少数の細胞または０．４×１０６またはより少数の細胞、または０．３×１０６またはより少数の細胞、または０．１×１０６またはより少数の細胞を含む。
【００６９】
本明細書中で用いるように、用語「高用量」は、１．５×１０６を超える細胞／ｋｇと理解されるべきである。例えば、用量は約１．５×１０６および約４×１０６の間の細胞／ｋｇを含む。例えば、高用量は約１．５×１０６または約２×１０６／ｋｇを含む。
【００７０】
本明細書中で用いるように、用語「治療する」または「治療」または「治療している」は、治療上有効量の可溶性因子および／または細胞を投与すること、および対象がもはや障害を持つと臨床的に診断されないように、低い骨芽細胞のレベルおよび活性に関連する障害の兆候を低下させ、または阻害することを意味すると理解されるべきである。
【００７１】
本明細書中で用いるように、用語「予防する」または「予防している」または「予防」は、予防上有効量の可溶性因子および／または細胞を投与すること、または低い骨芽細胞のレベルまたは活性に関連する障害の発生または進行を停止させ、または妨げ、または遅延させることを意味すると把握されるべきである。
【００７２】
本明細書中で用いるように、用語「可溶性因子」は、水溶性である、幹細胞および／またはその子孫によって生産されたいずれかの分子、例えば、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、炭水化物等を意味すると把握されるべきである。そのような可溶性因子は細胞内のものであるか、および／または細胞によって分泌されてよい。そのような可溶性因子は複合混合物（例えば、上清）および／またはその画分であってよく、および／または精製された因子であってよい。本開示の１つの例において、可溶性因子は上清であるか、または上清内に含有される。従って、１以上の可溶性因子の投与に向けられた本明細書中のいずれの例も、上記に準じて、上清の投与に適用されると把握されるべきである。
【００７３】
本明細書中で用いるように、用語「上清」とは、適当な培地、例えば、液体培地中での幹細胞および／またはその子孫のイン・ビトロ培養に続いて生産された非細胞物質をいう。典型的には、上清は、適当な条件および時間下で培地中にて細胞を培養し、続いて、遠心のようなプロセスによって細胞物質を除去することによって生産される。上清は、投与前にさらなる精製工程に付されたものであってよく、または付されていないものであってもよい。１つの例において、上清は１０５未満の、例えば、１０３未満のような１０４未満の生きた細胞を含み、例えば、生きた細胞を含まない。
【００７４】
本明細書中で用いるように、用語「正常なまたは健康な個体」は、当該分野で公知の、および／または本明細書中で記載されたいずれかの方法によって評価して、低い骨芽細胞活性を有しない対象を意味すると把握されるべきである。１つの例において、「正常なまたは健康な個体」は、低い骨芽細胞のレベルまたは活性に関連する障害の兆候のいずれも患っておらず、および／または低い骨芽細胞のレベルまたは活性に関連する障害を患っていない。
【００７５】
幹細胞または子孫細胞、および上清またはそれに由来する１以上の可溶性因子
本明細書中で用いるように、用語「幹細胞」とは、表現型的におよび遺伝子型的に同一な娘ならびに少なくとも１つの他の最終細胞型（例えば、最後に分化した細胞）を生起させることができる自己−再生性細胞をいう。用語「幹細胞」は、分化全能性、分化多能性および多能性細胞、ならびにその分化から由来する先祖細胞および／または前駆細胞を含む。幹細胞は成体または胚性幹細胞であってよく、または誘導多能性幹（ｉＰＳ）であってよい。
【００７６】
本明細書中で用いるように、用語「全能性細胞」または「分化全能性細胞」とは、完全な胚（例えば、胚盤胞）を形成することができる細胞をいう。
【００７７】
本明細書中で用いるように、用語「多能性細胞」または「分化多能性細胞」とは、完全な分化多能、すなわち、哺乳動物の身体のほぼ２６０の細胞型のいずれかに成長する能力を有する細胞をいう。多能性細胞は自己−再生性であり得、かつ組織内で休眠状態であるか、または休止状態であり得る。
【００７８】
「多能性細胞」または「多分化能細胞」とは、我々は、数個の成熟した細胞型のいずれかを生起させることができる細胞を意味する。本明細書中で用いるように、このフレーズは成体または胚性幹細胞、および間葉前駆細胞（ＭＰＣ）およびこれらの細胞の多能子孫のような先祖細胞を含む。多能性細胞とは異なり、多分化能細胞は細胞型全てを形成する能力を有しない。
【００７９】
本明細書中で用いるように、用語「先祖細胞」とは、特異的な型の細胞への分化が委ねられた、または特異的な型の組織を形成する細胞をいう。
【００８０】
本明細書中で用いるように、フレーズ「ＳＴＲＯ−１＋多能性細胞」は、多能性細胞コロニーを形成することができるＳＴＲＯ−１＋および／またはＴＮＡＰ＋先祖細胞を意味すると把握されるべきである。
【００８１】
ＳＴＲＯ−１＋多能性細胞は骨髄、血液、歯肉細胞、脂肪組織、皮膚、脾臓、膵臓、脳、腎臓、肝臓、心臓、網膜、脳、毛嚢、腸、肺、リンパ節、胸腺、骨、靭帯、腱、骨格筋、真皮および骨膜中に見出される細胞であり；中胚葉および／または内胚葉および／または外胚葉のような生殖細胞系に分化することができる。かくして、ＳＴＲＯ−１＋多能性細胞は、限定されるものではないが、脂肪、骨性、軟骨性、弾性、筋肉、および線維性結合組織を含む非常に多数の細胞型に分化することができる。これらの細胞が入る特異的分化系列決定および分化経路は、機械的な影響および／または成長因子、サイトカインのような内因性生活性因子、および／または宿主組織によって確立された局所的なミクロ環境条件からの種々の影響に依存する。１つの実施態様において、ＳＴＲＯ−１＋多能性細胞は、分裂して、幹細胞または前駆細胞いずれかである娘細胞を生じ、該幹細胞または前駆細胞が、今度は、不可逆的に分化して、表現型細胞を生じる非−造血前先祖胞である。
【００８２】
１つの例において、ＳＴＲＯ−１＋細胞は、対象、例えば、（同一の種または異なる種を問わず）治療すべき対象、または関連する対象または関連しない対象から得られた試料から豊富化される。用語「豊富化された」、「豊富化」またはその変形は、１つの特定の細胞型の割合、または多数の特定の細胞型の割合が、細胞（例えば、それらの天然環境にある細胞）の未処理集団と比較した場合に増加した細胞の割合を記載するために本明細書中で用いられる。１つの例においてＳＴＲＯ−１＋細胞について豊富化された集団は、少なくとも約０．１％または０．５％または１％または２％または５％または１０％または１５％または２０％または２５％または３０％または５０％または７５％ＳＴＲＯ−１＋細胞を含む。この点に関し、用語「ＳＴＲＯ−１＋細胞について豊富化された細胞の集団」は、用語「Ｘ％のＳＴＲＯ１＋細胞を含む細胞の集団」についての明示的な裏付けを提供すると把握され、ここに、Ｘ％は本明細書中で記載されるようにパーセンテージである。ＳＴＲＯ−１＋細胞は、いくつかの例においてクローン原性コロニーを形成でき、例えば、ＣＦＵ−Ｆ（線維芽細胞）またはそのサブセット（例えば、５０％または６０％または７０％または７０％または９０％または９５％）はこの活性を有することができる。
【００８３】
１つの例において、細胞の集団は、選択可能な形態のＳＴＲＯ−１＋細胞を含む細胞調製物から豊富化される。この点に関して、用語「選択可能な形態」は、細胞がＳＴＲＯ−１＋細胞の選択を可能とするマーカー（例えば、細胞表面マーカー）を発現することを意味すると理解されるであろう。マーカーはＳＴＲＯ−１であり得るが、それである必要はない。例えば、本明細書中に記載されおよび／または例示されるように、ＳＴＲＯ−２および／またはＳＴＲＯ−３（ＴＮＡＰ）および／またはＳＴＲＯ−４および／またはＶＣＡＭ−１および／またはＣＤ１４６および／または３Ｇ５を発現する細胞（例えば、ＭＰＣ）はＳＴＲＯ−１も発現し（ＳＴＲＯ−１ブライトであり得る）。従って、細胞がＳＴＲＯ−１＋である表示は、細胞がＳＴＲＯ−１発現によって選択されることを意味しない。１つの例において、細胞は少なくともＳＴＲＯ−３発現に基づいて選択され、例えば、それらはＳＴＲＯ−３＋（ＴＮＡＰ＋）である。
【００８４】
細胞またはその集団の選択への言及は、特異的な組織源からの選択を必要としない。本明細書中に記載されるように、ＳＴＲＯ−１＋細胞は、非常に種々の源から選択でき、または単離でき、または豊富化できる。しかしながら、いくつかの例において、これらの用語はＳＴＲＯ−１＋細胞（例えば、ＭＰＣ）を含むいずれかの組織、または血管新生化組織、または血管周囲細胞（例えば、ＳＴＲＯ−１＋血管周囲細胞）を含む組織、または本明細書中に記載された組織のいずれか１以上からの選択についての裏付けを提供する。
【００８５】
１つの例において、本開示で用いる細胞は、ＴＮＡＰ＋、ＶＣＡＭ−１＋、ＴＨＹ−１＋、ＳＴＲＯ−２＋、ＳＴＲＯ−４＋（ＨＳＰ−９０β）、ＣＤ４５＋、ＣＤ１４６＋、３Ｇ５＋またはそのいずれかの組合せよりなる群から個々にまたは集合的に選択された１以上のマーカーを発現する。
【００８６】
「個々に」とは、開示が記載されたマーカーまたはマーカーの群を別々に含み、かつその個々のマーカーまたはマーカーの群が別々に本明細書中にリストされているとは限らないにも拘わらず、添付の請求の範囲がそのようなマーカーまたはマーカーの群を相互に別々にかつ分割可能に定義してよいことを意味する。
【００８７】
「集合的に」とは、開示が記載されたマーカーまたはペプチドの群のいずれかの数または組合せを含み、マーカーまたはマーカーの群のそのような数または組合せが本明細書中において具体的にリストされているとは限らないにも拘わらず、添付の請求の範囲がマーカーまたはマーカーの群のいずれかの他の組合せとは別々に、かつ分割可能にそのような組合せまたはサブ組合せを定義してもよいことを意味する。
【００８８】
例えば、ＳＴＲＯ−１＋細胞はＳＴＲＯ−１ブライト（同義語ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ）である。１つの例において、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ細胞はＳＴＲＯ−１ｄｉｍまたはＳＴＲＯ−１インターメディエイト細胞に対して優先的に豊富化される。
【００８９】
例えば、ＳＴＲＯ−１ブライト細胞は、加えて、ＴＮＡＰ＋、ＶＣＡＭ−１＋、ＴＨＹ−１＋、ＳＴＲＯ−２＋、ＳＴＲＯ−４＋（ＨＳＰ−９０β）および／またはＣＤ１４６＋のうちの１以上である。例えば、細胞は、前記マーカーの１以上につき選択され、および／または前記マーカーの１以上を発現することが示される。この点に関して、マーカーを発現することが示された細胞は、具体的にテストされる必要はなく、むしろ従前に豊富化されまたは単離された細胞をテストし、引き続いて用いることができ、単離されたまたは豊富化された細胞は、合理的には、同一のマーカーをやはり発現すると推測することができる。
【００９０】
１つの例において、間葉前駆細胞は、ＷＯ  ２００４／８５６３０において定義された血管周囲間葉前駆細胞である。例えば、間葉前駆細胞は血管周囲細胞のマーカーを発現し、例えば、細胞はＳＴＲＯ−１＋またはＳＴＲＯ−１ブライトおよび／または３Ｇ５＋である。１つの例において、細胞は、血管新生化組織または器官またはその一部から単離された細胞であり、または以前に単離された細胞であり、または該細胞の子孫である。
【００９１】
所与のマーカーにつき「陽性」であるとされる細胞は、マーカーが細胞表面に存在する程度に依存して、低い（低（ｌｏ）または暗（ｄｉｍ））または高い（ブライト、ブライ（ｂｒｉ））レベルいずれかのそのマーカーを発現でき、ここに、該用語は蛍光、または細胞のソーティングプロセスで用いられる他のマーカーの強度に関する。低（またはｄｉｍまたはｄｕｌｌ）およびｂｒｉの区別は、ソーティングすべき特定の細胞集団で用いられるマーカーの文脈において理解されるであろう。所与のマーカーにつき「陰性」であるとされる細胞は、その細胞に必ずしも完全に不在ではない。この用語は、マーカーがその細胞によって比較的非常に低いレベルで発現され、およびそれがバックグラウンドレベル、例えば、アイソタイプ対照抗体を用いて検出されたレベルを超えて検出可能に標識され、または検出できない場合にそれが非常に低いシグナルを生じさせることを意味する。
【００９２】
用語「ブライト（bright）」とは、本明細書中で用いる場合、検出可能に標識されると、比較的高いシグナルを生じさせる細胞表面上のマーカーをいう。理論に拘束されるつもりはないが、「ブライト」細胞は、試料中の他の細胞以外の標的マーカータンパク質（例えば、ＳＴＲＯ−１によって認識される抗原）のより多くを発現すると提案されている。例えば、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ細胞は、非−ブライト細胞（ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌ／ｄｉｍ）よりも、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析によって決定して、ＦＩＴＣがコンジュゲートしたＳＴＲＯ−１抗体で標識した場合により大きな蛍光シグナルを生じさせる。１つの例において、「ブライト」細胞は、出発試料に含有された最も明るく標識された骨髄単核細胞の少なくとも約０．１％を構成する。他の例において、「ブライト」細胞は、出発試料に含有された最も明るく標識された骨髄単核細胞の少なくとも約０．１％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約１．５％、または少なくとも約２％を構成する。ある例において、ＳＴＲＯ−１ブライト細胞は、「バックグラウンド」、すなわち、ＳＴＲＯ−１−である細胞に対してＳＴＲＯ−１表面発現の２ｌｏｇの大きさだけより高い発現を有する。比較によって、ＳＴＲＯ−１ｄｉｍおよび／またはＳＴＲＯ−１インターメディエイト細胞は、ＳＴＲＯ−１表面発現の２ｌｏｇ未満の大きさだけより高い発現、典型的には、約１  ｌｏｇまたは「バックグラウンド」未満を有する。
【００９３】
本明細書中で用いるように、用語「ＴＮＡＰ」は、組織非特異的アルカリホスファターゼの全てのイソ形態を含むことが意図される。例えば、該用語は、肝臓イソ形態（ＬＡＰ）、骨イソ形態（ＢＡＰ）および腎臓イソ形態（ＫＡＰ）を含む。１つの例において、ＴＮＡＰはＢＡＰである。１つの例において、本明細書中で用いるＴＮＡＰとは、受託番号ＰＴＡ−７２８２下で、ブダペスト条約の規定に従って２００５年１２月１９日にＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されたＳＴＲＯ−３抗体に結合することができる分子をいう。
【００９４】
さらに、１つの例において、ＳＴＲＰ−１＋細胞はクローン原性ＣＦＵ−Ｆを生起させることができる。
【００９５】
１つの例において、有意な割合のＳＴＲＯ−１＋多能性細胞は、少なくとも２つの異なる生殖細胞系に分化することができる。多能性細胞を委ねることができる系統の非限定的例は骨前駆細胞；胆管上皮細胞および肝細胞につき多分化能である肝細胞先祖；稀突起神経膠細胞および神経膠星状細胞まで進行するグリア細胞前駆細胞を生じさせることができる神経制限細胞；ニューロンまで進行するニューロン前駆細胞；心筋および心筋細胞、グルコース−応答性インスリン分泌膵臓ベータ細胞系についての前駆細胞を含む。他の系統は、限定されるものではないが、象牙芽細胞、デンチン生産細胞および軟骨細胞、および以下の：網膜色素上皮細胞、線維芽細胞、角質細胞のような皮膚細胞、樹状細胞、毛嚢細胞、腎管上皮細胞、平滑および骨格筋細胞、精巣先祖細胞、血管内皮細胞、腱、靭帯、軟骨、脂肪細胞、線維芽細胞、骨髄間質、心筋、平滑筋、骨格筋、血管周囲細胞、血管、上皮、グリア、ニューロン、神経膠星状細胞および稀突起神経膠細胞の前駆細胞を含む。
【００９６】
もう１つの例において、ＳＴＲＯ−１＋細胞は、培養に際して、造血系細胞を生起させることができる。
【００９７】
１つの例において、細胞は治療すべき対象から採取し、標準的な技術を用いてイン・ビトロで培養し、それを用いて、自己または同種異系組成物としての、対象への投与用の、上清または可溶性因子または拡大培養された細胞を得る。別の例において、１以上の樹立されたヒト細胞系の細胞が用いられる。開示のもう１つの有用な例において、非−ヒト動物の細胞（もし患者がヒトでなければ、もう１つの種からのもの）が用いられる。
【００９８】
本開示では、イン・ビトロ培養物から生産されたＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞（後者は拡大培養された細胞ともいう）から得られた、またはそれに由来する上清または可溶性因子の使用も考えられる。開示の拡大培養された細胞は、（培養基中の刺激因子の数および／またはタイプを含む）培養条件、継代の数等に依存して、広く種々の表現型を有してよい。ある例において、子孫細胞は親集団から約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０継代後に得られる。しかしながら、子孫細胞は親集団からいずれかの数の継代後に得てよい。
【００９９】
子孫細胞は、いずれかの適当な培地中で培養することによって得ることができる。細胞培養への言及で用いられる用語「培地」は、細胞を囲む環境の成分を含む。培地は固体状、液状、気体状、または相および材料の混合物であってよい。培地は、液状成長培地、ならびに細胞の成長を持続しない液状培地を含む。培地は、寒天、アガロース、ゼラチンおよびコラーゲンマトリックスのようなゲル状培地も含む。例示的な気体状培地は、ペトリ皿または他の固体状または半固体状支持体上で成長する培地が暴露される気相を含む。用語「培地」とは、たとえそれが未だ細胞と接触していなくても、細胞培養で用いることが意図された材料もいう。換言すれば、細菌培養のために調製された栄養豊富な液体が培地である。水または他の液体と混合すると、細胞培養に適したものとなる粉末混合物は「粉末化培地」ということもできる。
【０１００】
ある例において、開示の方法で有用な子孫細胞は、ＳＴＲＯ−３抗体で標識された磁性ビーズを用いて骨髄からＴＮＡＰ＋  ＳＴＲＯ−１＋細胞を単離し、次いで、単離された細胞を培養拡大することによって得られる（適当な培養条件の例については、Ｇｒｏｎｔｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ  ８５：９２９−９４０，１９９５参照）。
【０１０１】
１つの例において、（例えば、少なくとも５継代後の）そのような拡大培養された細胞（子孫）はＴＮＡＰ−、ＣＣ９＋、ＨＬＡクラスＩ＋、ＨＬＡクラスＩＩ−、ＣＤ１４−、ＣＤ１９−、ＣＤ３−、ＣＤ１１ａ−ｃ−、ＣＤ３１−、ＣＤ８６−、ＣＤ３４−および／またはＣＤ８０−であり得る。しかしながら、本明細書中に記載されたのと異なる培養条件下で、異なるマーカーの発現を変化させてよい可能性がある。また、これらの表現型の細胞は拡大培養された細胞集団において支配的であるかもしれないが、それは、細胞の小さい割合はこの表現型（類）を有しないことを意味しない（例えば、拡大培養された細胞の小さなパーセンテージはＣＣ９−であってよい）。１つの例において、拡大培養された細胞は、依然として、異なる細胞型に分化する能力を有する。
【０１０２】
１つの例において、上清または可溶性因子、または細胞を得るために用いる拡大培養された細胞集団は、それ自体、細胞を含み、ここに、少なくとも２５％、例えば、少なくとも５０％の細胞はＣＣ９＋である。
【０１０３】
もう１つの例において、上清または可溶性因子、または細胞を得るのに用いられる拡大培養された細胞集団は、それ自体、細胞を含み、ここに、少なくとも４０％、例えば、少なくとも４５％の細胞はＳＴＲＯ−１＋である。
【０１０４】
さらなる例において、拡大培養された細胞は、ＬＦＡ−３、ＴＨＹ−１、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、３Ｇ５、ＣＤ４９ａ／ＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、インテグリンベータ６−１９、トロンボモジュリン、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＥＧＦ−Ｒ、ＩＧＦ１−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ、レプチン−Ｒ（ＳＴＲＯ−２＝レプチン−Ｒ）、ＲＡＮＫＬ、ＳＴＲＯ−４（ＨＳＰ−９０β）、ＳＴＲＯ−１ブライトおよびＣＤ１４６よりなる群から集合的にまたは個々に選択された１以上のマーカー、またはこれらのマーカーのいずれかの組合せを発現することができる
【０１０５】
１つの例において、子孫細胞は、ＷＯ  ２００６／０３２０９２に定義されたおよび／または記載された多能拡大培養ＳＴＲＯ−１＋多能性細胞子孫（ＭＥＭＰ）である。子孫が由来し得るＳＴＲＯ−１＋多能性細胞の豊富化された集団を調製するための方法は、ＷＯ  ０１／０４２６８およびＷＯ  ２００４／０８５６３０に記載されている。イン・ビトロの関係では、ＳＴＲＯ−１＋多能性細胞は、絶対的に純粋な調製物として稀にしか存在せず、一般には、組織特異的委任細胞（ＴＳＣＣ）である他の細胞と共に存在するであろう。ＷＯ  ０１／０４２６８は、約０．１％〜９０％の純度レベルにてそのような細胞を骨髄から収穫することに言及している。子孫が由来するＭＰＣを含む集団は、組織源から直接的に収穫してよく、あるいは別法として、それはエクス・ビボにて既に拡大培養された集団であってよい。
【０１０６】
例えば、子孫は、それらが存在する集団の合計細胞の少なくとも約０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９５％を含む、実質的に精製されたＳＴＲＯ−１＋多能性細胞の収穫された拡大培養されていない集団から得ることができる。このレベルは、例えば、ＴＮＡＰ、ＳＴＲＯ−４（ＨＳＰ−９０β）、ＳＴＲＯ−１ブライト、３Ｇ５＋、ＶＣＡＭ−１、ＴＨＹ−１、ＣＤ１４６およびＳＴＲＯ−２よりなる群から個々にまたは集合的に選択された少なくとも１つのマーカーに対して陽性である細胞につき選択することによって達成することができる。
【０１０７】
ＭＥＭＰは、それらがマーカーＳＴＲＯ−１ｂｒｉに対して陽性であって、マーカーアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）に対して陰性である点において、新たに収穫されたＳＴＲＯ−１＋多能性細胞から区別することができる。対照的に、新たに単離されたＳＴＲＯ−１＋多能性細胞はＳＴＲＯ−１ｂｒｉおよびＡＬＰ双方に対して陽性である。本開示の１つの例において、投与された細胞の少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％は表現型ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ、ＡＬＰ−を有する。さらなる例において、ＭＥＭＰはマーカーＫｉ６７、ＣＤ４４および／またはＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＶＬＡ−３、α３β１のうちの１以上に対して陽性である。なおさらなる例において、ＭＥＮＰはＴＥＲＴ活性を呈さず、および／またはマーカーＣＤ１８に対して陰性である。
【０１０８】
ＳＴＲＯ−１＋細胞の出発集団は、ＷＯ  ０１／０４２６８またはＷＯ  ２００４／０８５６３０に記載されたいずれかの１以上の組織型、すなわち、骨髄、歯髄、脂肪組織および皮膚に由来するものであってよく、あるいは恐らくは、より広く、脂肪組織、歯、歯髄、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、網膜、脳、毛嚢、腸、肺、脾臓、リンパ節、胸腺、膵臓、骨、靭帯、骨髄、腱および骨格筋から由来するものであってよい。
【０１０９】
本開示に記載された方法を実行するにおいて、いずれかの所与の細胞表面マーカーを運ぶ細胞の分離は多数の異なる方法によって行うことができ、しかしながら、いくつかの例示的な方法は、結合剤（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を当該マーカーに結合させ、続いて、高レベルの結合、低レベルの結合、または結合無しのいずれかかである結合を呈するものを分離することに依拠することは理解されるであろう。最も慣用的な結合剤は、これらの後者の剤の特異性のため、抗体または抗体−ベースの分子、例えば、モノクローナル抗体であるか、またはモノクローナル抗体（例えば、その抗原結合断片を含むタンパク質）に基づく。抗体を双方の工程で用いることができ、しかしながら、他の剤を用いてもよく、かくしてこれらのマーカーについてのリガンドを使用して、それらを運ぶ、またはそれらを欠如する細胞を豊富化してもよい。
【０１１０】
抗体またはリガンドを固体支持体に連結させて、粗分離を可能とすることができる。いくつかの例において、分離技術は、収集すべき画分の生存能力の保持を最大化する。異なる効率の種々の技術を使用して、比較的粗い分離を得ることができる。使用される特定の技術は、分離の効率、関連する細胞傷害性、実行の容易性およびスピード、および精巧な機器および／または技術的技量に対する必要性に依存するであろう。分離のための手法は、限定されるものではないが、抗体−被覆磁性ビーズを用いる磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、および固体マトリックスに付着された抗体での「パニング」を含むことができる。正確な分離を提供する技術は、限定されるものではないが、ＦＡＣＳを含む。ＦＡＣＳを行うための方法は当業者に明らかであろう。
【０１１１】
本明細書中に記載されたマーカーの各々に対する抗体は商業的に入手可能であり（例えば、ＳＴＲＯ−１に対するモノクローナル抗体はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡから商業的に入手可能である）、ＡＴＣＣまたは他の寄託機関から入手可能であり、および／または当該分野で認められている技術を用いて生産することができる。
【０１１２】
１つの例において、ＳＴＲＯ−１＋細胞を単離するための方法は、例えば、ＳＴＲＯ−１の高レベルの発現を認識する磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）を利用する固相ソーティング工程である第一の工程を含む。次いで、第二のソーティング工程を続けて、望まれるならば、特許明細書ＷＯ  ０１／１４２６８に記載されたようにより高いレベルの前駆細胞の発現をもたらすことができる。この第二のソーティング工程は、２以上のマーカーの使用を含むであろう。
【０１１３】
ＳＴＲＯ−１＋細胞を得る方法は、公知の技術を用いる第一の豊富化工程前の、細胞の源の収穫も含むであろう。かくして、組織が外科的に取り出されるであろう。次いで、源組織を含む細胞をいわゆる単細胞懸濁液に分離する。この分離は、物理的なおよび／または酵素的な手段によって達成することができる。
【０１１４】
一旦適当なＳＴＲＯ−１＋細胞集団が得られたならば、それを、いずれかの適当な手段によって培養し、または拡大培養して、ＭＥＭＰを得ることができる。
【０１１５】
１つの例において、細胞を治療すべき対象から採取し、標準的な技術を用いてイン・ビトロにて培養し、それを用いて、自己または同種異系組成物としての、対象への投与のための、上清または可溶性因子または拡大培養された細胞を得る。別の例において、１以上の樹立されたヒト細胞系の細胞を用いて、上清または可溶性因子を得る。開示のもう１つの有用な例において、非−ヒト動物の細胞（または、もし患者がヒトでないならば、もう１つの種からのもの）を用いて、上清または可溶性因子を得る。
【０１１６】
本開示の方法および使用は、限定されるものではないが、非−ヒト霊長類細胞、有蹄類、イヌ、ネコ、ウサギ、げっ歯類、鳥類、および魚類細胞を含む、いずれかの非−ヒト動物種からの細胞を用いて実行することができる。それを用いて開示を行うことができる霊長類細胞は、限定されるものではないが、チンパンジー、ヒヒ、カニクイザル、およびいずれかの他の新世界ザル（Ｎｅｗ  Ｗｏｒｌｄ  ｍｏｎｋｅｙ）または旧世界ザル（Ｏｌｄ  Ｗｏｒｌｄ  ｍｏｎｋｅｙ）の細胞を含む。それを用いて開示を実行することができる有蹄類細胞は、限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、バッファローおよびバイソンを含む。それを用いて開示を実行することができるげっ歯類細胞は、限定されるものではないが、ラット、モルモット、ハムスターおよびアレチネズミ細胞を含む。それを用いて開示を実行することができるウサギ種の例は、家畜化ウサギ、ジャックウサギ、ノウサギ、ワタオウサギ、カンジキウサギ、およびナキウサギを含む。ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）は、それを用いて開示を実行することができる鳥類種の例である。
【０１１７】
１つの例において、細胞はヒト細胞である。
【０１１８】
開示の方法で有用な細胞は、使用前、または上清または可溶性因子を得る前に貯蔵してもよい。真核生物細胞、および特に哺乳動物細胞を保存し、および貯蔵するための方法およびプロトコルは当該分野で公知である（例えば、ポーランド国、Ｊ．Ｗ．およびＷａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．（１９９７）Ｂａｓｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，第２版，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（２０００）  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，第４版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．参照）。間葉幹／先祖細胞、またはその子孫のような単離された幹細胞の生物学的活性を維持するいずれの方法も、本開示との関連で利用することができる。１つの例において、細胞は、低温保存によって維持され、貯蔵される。
【０１１９】
遺伝子改変細胞
１つの例において、幹細胞および／またはその子孫細胞を遺伝子改変して、例えば、注目するタンパク質を発現させ、および／または分泌させる。例えば、細胞を操作して、代謝性骨障害または男性不妊の治療で有用なタンパク質を発現させる。
【０１２０】
細胞を遺伝子改変するための方法は当業者に明らかであろう。例えば、細胞中で発現させるべき核酸は、細胞での発現を誘導するためのプロモーターに操作可能に連結させる。例えば、核酸は、例えば、ウイルスプロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター）またはＳＶ−４０プロモーターのような、対象の種々の細胞において操作可能なプロモーターに連結される。さらなる適当なプロモーターは当該分野で公知であって、それに準じて開示の本例に適用されるべきである。
【０１２１】
１つの例において、核酸は発現構築物の形態で提供される。本明細書中で用いるように、用語「発現構築物」とは、細胞において、それに操作可能に連結された核酸（例えば、レポーター遺伝子および／または対立選択可能なレポーター遺伝子）に発現を付与する能力を有する核酸をいう。本開示との関係においては、発現構築物はプラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスサブ−ゲノムまたはゲノム断片、または発現可能な形態の異種ＤＮＡを維持し、および／または複製することができる他の核酸を含んでよい、またはそれらであってよいことが理解されるべきである。
【０１２２】
開示の実行のための適当な発現構築物の構築方法は当業者に明らかであって、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ（Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＩＳＢＮ  ０４７  １５０３３８，１９８７）またはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第三版２００１）に記載されている。例えば、発現構築物の構成要素の各々は、例えば、ＰＣＲを用いて適当な鋳型核酸から増幅され、引き続いて、例えば、プラスミドまたはファージミドのような適当な発現構築物にクローン化する。
【０１２３】
そのような発現構築物に適したベクターは当該分野で公知であり、および／または本明細書中に記載される。例えば、哺乳動物細胞における本開示の方法に適した発現ベクターは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって供給されたｐｃＤＮＡベクタースウィート（ｖｅｃｔｏｒ  ｓｕｉｔｅ）のベクター、ｐＣＩベクタースウィート（ｖｅｃｔｏｒ  ｓｕｉｔｅ）のベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＣＭＶベクタースゥイート（ｖｅｃｔｏｒ  ｓｕｉｔｅ）のベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＭベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＳＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＶＰ１６ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）またはｐｃＤＮＡベクタースウィート（ｖｅｃｔｏｒ  ｓｕｉｔｅ）のベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【０１２４】
当業者であれば、さらなるベクター、および例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣｌｏｎｔｅｃｈまたはＰｒｏｍｅｇａのようなベクターの供給源を知っているであろう。
【０１２５】
単離された核酸分子またはそれを含む遺伝子構築物を発現のために細胞に導入する手段は当業者に公知である。所与の生物で用いる技術は、公知の成功した技術に依存する。組換えＤＮＡを細胞に導入する手段は、とりわけ、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによって媒介されるトランスフェクション、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ，ＵＳＡ）および／またはコルフェクチン（Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いることによるなどの、リポソームによって媒介されるトランスフェクション、ＰＥＧ−媒介ＤＮＡ摂取、ＤＮＡ−被覆タングステンまたは金粒子（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ  Ｉｎｃ．，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いることによるなどの、エレクトロポレーションおよびミクロ粒子衝撃を含む。
【０１２６】
別法として、開示の発現構築物はウイルスベクターである。適当なウイルスベクターは当該分野で公知であって、商業的に入手可能である。核酸の送達および宿主細胞ゲノムへのその核酸の組込みのための慣用的なウイルスベースのシステムは、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノ−関連ウイルスベクターを含む。別法として、アデノウイルスベクターは、宿主細胞に、エピソームのままである核酸を導入するのに有用である。ウイルスベクーは、標的細胞および組織への遺伝子導入の効果的かつ汎用的な方法である。加えて、高い形質導入効率が多くの異なる細胞型および標的組織で観察されている。
【０１２７】
例えば、レトロウイルスベクターは、一般に、６〜１０ｋｂまでの外来性配列のためのパッケージング能力を備えたシス−作用性ロング・ターミナル・リピート（ＬＴＲ）を含む。最小のシス−ＬＴＲはベクターの複製およびパッケージングに十分であり、それは、次いで、発現構築物を標的細胞に組み込んで、長期間の発現を供するのに用いられる。広く用いられるレトロウイルスベクターは、ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳｒＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびその組合せに基づいたものを含む（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．５６：２７３１−２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．７６：５８−５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２７４−２３１８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００；Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｓｍａｎ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０−９９０，１９８９；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：５−１４，１９９０；Ｓｃａｒｐａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５：８４９−８５２，１９９１；Ｂｕｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：８０３３−８０３７，１９９３参照）。
【０１２８】
種々のアデノ−関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターシステムもまた核酸送達のために開発されてきた。ＡＡＶベクターは当該分野で公知の技術を用いて容易に構築することができる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および第５，１３９，９４１号；国際公開番号ＷＯ  ９２／０１０７０およびＷＯ  ９３／０３７６９；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３９８８−３９９６，１９８８；Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：５３３−５３９，１９９２；Ｍｕｚｙｃｚｋａ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９，１９９２；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１，１９９４；Ｓｈｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１６５−１６９，１９９４；およびＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５，１９９４参照。
【０１２９】
開示の発現構築物を送達するのに有用なさらなるウイルスベクターは、例えば、ワクシニアウイルスおよび鳥類ポックスウイルスまたはアルファウイルスまたはコンジュゲート・ウイルス・ベクターのような、ウイルスのポックス科に由来するもの（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５６：３１７−３２１，１９８９に記載されたもの）を含む。
【０１３０】
細胞および可溶性因子の治療的／予防的潜在能力の検定
低い骨芽細胞のレベルまたは活性に関連する障害の開始または進行を治療し、または予防し、または遅延させる細胞または可溶性因子の能力を決定するための方法は当業者に明らかであろう。
【０１３１】
例えば、細胞または可溶性因子を、骨芽細胞機能を増加させるそれらの能力について評価する。
【０１３２】
１つの例において、（例えば、Ｃｂｆｅ１／ＲｕｎＸ２を発現する）骨先祖細胞を細胞および／または可溶性因子と接触させ、骨芽細胞に分化するそれらの能力についてテストする。例えば、該細胞を、オステリックス（ｏｓｔｅｒｉｘ）および／またはＣｏｌｌおよび／またはＢＳＰおよび／またはＭ−ＣＳＦおよび／またはアルカリホスファターゼの発現の開発のために評価する。
【０１３３】
１つの例において、細胞および／または可溶性因子を骨芽細胞に接触させ、１型コラーゲンおよび／またはオステオカルシンの生産に対するそれらの効果を、例えば、免疫アッセイおよび／または免疫組織化学または免疫蛍光を用いて評価する。
【０１３４】
さらなる例において、細胞および／または可溶性因子を、細胞外マトリックス上で培養された骨芽細胞に接触させ、マトリックスの石灰化を増加させる能力を、例えば、アリザリンレッドまたはフォン・コッサ（ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ）染料で染色することによって評価する。
【０１３５】
例えば、Ｚａｈｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９：１１４８−１１５４，２００１に記載されているように、近赤外蛍光イメージングのようなアッセイを用いて、細胞および／または可溶性因子をイン・ビボでの骨芽細胞活性に対するそれらの効果について評価することもできる。
【０１３６】
例えば、Ｘ−線および／またはデュアルエネルギーＸ−線吸光光度法（ＤＥＸＡ）を用い、骨形成に対するそれらの効果を検出することによって、細胞および／または可溶性因子をイン・ビボでの骨芽細胞活性に対するそれらの効果について評価することもできる。
【０１３７】
例えば、細胞または可溶性因子（例えば、因子の混合物または単一の因子あるいは（例えば、アフィニティー精製またはクロマトグラフィーによって誘導された）因子の画分）を代謝性骨障害のモデルに投与し、１以上の兆候に対する効果を評価する。例示的な非−ヒト動物モデルは卵巣摘出げっ歯類（例えば、ラット）、固定化−誘導骨損失モデルおよび／またはＴｕｒｎｅｒ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１：６６−９１，２００１にレビューされたモデルを含む。
【０１３８】
本開示が、低い骨芽細胞のレベルまたは活性に関連する障害の治療、予防または遅延のために、細胞または可溶性因子を同定または単離する方法も提供するのは前記から当業者に明らかであり、該方法は：
（ｉ）低い骨芽細胞のレベルまたは活性に関連する障害を患っている被験者に細胞または可溶性因子を投与し、該被験者において該障害の兆候を評価し；
（ｉｉ）（ｉ）における被験者の低い骨芽細胞のレベルまたは活性に関連する障害の兆候を、細胞または可溶性因子が投与されていない該障害を患っている対照被験者の低い骨芽細胞のレベルまたは活性に関連する障害の兆候と比較する；
ことを含み、
ここに、対照被験者と比較した被験者における兆候の改善は、該細胞または可溶性因子が該障害を治療することを示す。
【０１３９】
該細胞はいずれかの例による本明細書中に記載されたいずれの細胞であってもよい。
【０１４０】
細胞組成物
本開示の１つの例において、幹細胞および／またはその子孫細胞は組成物の形態で投与される。１つの例において、そのような組成物は医薬上許容される担体および／または賦形剤を含む。
【０１４１】
用語「担体」および「賦形剤」とは、活性な化合物の貯蔵、投与、および／または生物学的活性を促進するために当該分野で慣用的に用いられる組成物をいう（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｍａｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０）参照）。担体は、活性な化合物のいずれの望ましくない副作用も低下させることができる。適当な担体は、例えば、安定であり、例えば、担体中の他の成分と反応できない。１つの例において、担体は、治療のために使用される用量および濃度において、受容者において有意な局所的または全身的有害効果を生じさせない。
【０１４２】
本開示のための適当な担体は慣用的に用いられているものを含み、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、ラクトース、リンゲル液、緩衝化溶液、ヒアルロナンおよびグルコースは、特に（等張である場合）、溶液のための例示的な液体担体である。適当な医薬担体および賦形剤としては、澱粉、セルロース、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、故粉、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等が挙げられる。
【０１４３】
もう１つの例において、担体は、例えば、細胞がそこで成長し、または懸濁する培地組成物である。例えば、そのような培地組成物は、それが投与される対象においていずれの有害な効果も誘導しない。
【０１４４】
例示的な担体および賦形剤は、細胞の生存能力および／または代謝症候群および／または肥満を低下させ、予防し、または遅延させる細胞の能力に悪影響しない。
【０１４５】
１つの例において、担体または賦形剤は、細胞および／または可溶性因子を適当なｐＨに維持して、それにより、生物学的活性を発揮する緩衝活性を供し、例えば、担体または賦形剤はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）である。ＰＢＳは魅力的な担体または賦形剤を表す。なぜならば、それは細胞および因子と最小限しか相互作用せず、細胞および因子の迅速な放出を可能とするからであり、そのような場合において、開示の組成物は、例えば、注射による、血流への、または組織、または組織を囲うまたは組織に隣接する領域への直接的な適用のための液体として生産されてよい。
【０１４６】
幹細胞および／またはその子孫細胞は、受容者−適合性であって、受容者に対して有害でない生成物に分解する足場内に配合し、または包埋することもできる。これらの足場は、受容者対象に移植すべき細胞のための支持および保護を供する。天然および／または合成生分解性足場がそのような足場の例である。
【０１４７】
種々の異なる足場を開示の実施で首尾よく用いることができる。足場の例としては、限定されるものではないが、生物学的分解可能な足場が挙げられる。天然生分解性足場としてはコラーゲン、フィブロネクチン、およびラミニン足場が挙げられる。細胞移植足場のための適当な合成材料は広範な細胞成長および細胞機能を支持することができるべきである。そのような足場は再吸収性であってもよい。適当な足場としては、例えば、Ｖａｃａｎｔｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｅｄ．Ｓｕｒｇ．２３：３−９  １９８８；Ｃｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．３８：１４５  １９９１；Ｖａｃａｎｔｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．８８：７５３−９  １９９１によって記載されたポリグリコール酸足場；またはポリアンヒドリド、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような合成ポリマーが挙げられる。
【０１４８】
もう１つの例において、細胞は（Ｕｐｊｏｈｎ  ＣｏｍｐａｎｙからのＧｅｌｆｏａｍのような）ゲル足場中にて投与してよい。
【０１４９】
本明細書中に記載される方法で有用な細胞組成物は、単独で、または他の細胞との混合物として投与することができる。本開示の組成物と一緒に投与することができる細胞としては、限定されるものではないが、他の多分化能または多能性細胞または幹細胞、または骨髄細胞が挙げられる。異なる型の細胞は、投与直前に、または投与に少し先立って開示の組成物と混合とすることができるか、またはそれらは投与に先立って一定期間一緒に共培養してもよい。
【０１５０】
１つの例において、組成物は有効量または治療上または予防上有効量の細胞を含む。例えば、組成物は、ｋｇ当たり約１×１０５の（ＳＴＲＯ−１＋細胞のような）幹細胞〜ｋｇ当たり約１×１０７の（ＳＴＲＯ−１−細胞のような）幹細胞またはｋｇ当たり約１×１０６の（ＳＴＲＯ−１＋細胞のような）幹細胞〜ｋｇ当たり約５×１０６の（ＳＴＲＯ−１＋細胞のような）幹細胞を含む。投与すべき細胞の正確な量は、患者の年齢、体重および性別、および低い骨芽細胞のレベルまたは活性に関連した障害の程度および重症度を含む種々の因子に依存する。
【０１５１】
１つの例において、低い用量の細胞を対象に投与する。用量の例としては、ｋｇ当たり約０．１×１０４および０．５×１０６細胞の間、例えば、ｋｇ当たり約０．５×１０５および０．５×１０６細胞の間のようなｋｇ当たり約０．１×１０５および０．５×１０６細胞の間、例えば、ｋｇ当たり約０．１×１０６および０．５×１０６細胞の間、例えば、ｋｇ当たり約０．２×１０６または０．３×１０６または０．４×１０６細胞が挙げられる。
【０１５２】
いくつかの例において、細胞は、細胞を対象の循環に入らせないが、細胞によって分泌された因子を循環に入らせるチャンバー内に含有される。このようにして、可溶性因子は、細胞が因子を対象の循環に分泌するのを可能とすることによって対象に投与することができる。そのようなチャンバーは、同様に、対象における部位に移植して、可溶性因子の局所的レベルを増加させることができ、例えば、膵臓に、または膵臓近くに移植してよい。
【０１５３】
開示のいくつかの例において、細胞組成物での療法の開始に先立って患者を免疫抑制する必要はなく、またはそれは望ましくないであろう。従って、同種異系、または異種さえの幹細胞またはその子孫の移植はいくつかの場合において許容されるであろう。
【０１５４】
しかしながら、他の例においては、細胞療法を開始するに先立って患者を薬理学的に免疫抑制し、および／または細胞組成物に対する対象の免疫応答を低下させるのが望ましい、または適切であろう。これは、全身または局所的免疫抑制剤の使用を介して達成することができるか、またはそれは、細胞をカプセル化されたデバイス中に送達することによって達成することができる。細胞は、該細胞が依然として免疫液性因子および細胞に対して不透過性である該細胞が必要とする栄養および酸素、および治療因子に対して透過性であるカプセルに封入してよい。１つの例において、封入材料は低アレルギー性であり、標的組織に容易かつ安定に位置し、移植された構造体に対する付加された保護を提供する。移植された細胞に対する免疫応答を低下させ、またはそれを排除するためのこれらおよび他の手段は当該分野で公知である。別法として、細胞は遺伝子改変して、それらの免疫原性を低下させることができる。
【０１５５】
可溶性因子の組成物
本開示の１つの例において、幹細胞−由来および／または子孫細胞−由来の上清または可溶性因子は、例えば、適当な担体および／または賦形剤を含む組成物の形態で投与される。１つの例において、担体または賦形剤は可溶性因子または上清の生物学的効果に悪影響しない。
【０１５６】
１つの例において、組成物は、可溶性因子、または上清の成分、例えば、プロテアーゼ阻害剤を安定化させるための組成物を含む。１つの例において、プロテアーゼ阻害剤は、対象に対する有害な効果を有するのに十分な量では含ませない。
【０１５７】
幹細胞−由来および／または子孫細胞−由来の上清または可溶性因子を含む組成物は、例えば、培養基中にて、または安定な担体または緩衝溶液、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水中にて、適切な液体懸濁液として調製してよい。適当な担体は本明細書中にて先に記載されている。もう１つの例において、幹細胞−由来および／または子孫細胞−由来の上清または可溶性因子を含む懸濁液は注射用の油性懸濁液である。適当な親油性溶媒またはビークルとしては、ゴマ油のような脂肪油；またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル；またはリポソームが挙げられる。注射で用いるべき懸濁液は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストランのような、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。所望により、懸濁液は、適当な安定化剤、または化合物の溶解性を増加させて、高度に濃縮された溶液の調製を可能とする剤を含有してよい。
【０１５８】
滅菌注射溶液は、上清または可溶性因子を、必要な量にて、前記した成分の１つまたは組合せと共に適切な溶媒に配合し、続いて、濾過滅菌することによって調製することができる。
【０１５９】
一般に、分散液は、上清または可溶性因子を、基本的分散媒体および先に列挙されたものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビークルに配合することによって調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合には、調製法の例は、有効成分と、その従前に滅菌濾過された溶液からのいずれかのさらなる所望の成分との粉末を生じさせる真空乾燥および凍結−乾燥である。開示の別の局面によると、上清または可溶性因子は、その溶解性を高める１以上のさらなる化合物と共に処方してよい。
【０１６０】
他の例示的な担体または賦形剤は、例えば、Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．：Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｙｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。
【０１６１】
治療組成物は、典型的には、滅菌されており、かつ製造および貯蔵の条件下で安定しているべきである。組成物は溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または他の秩序立った構造体として処方することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコール等）、およびその適当な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合における必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。いくつかの場合において、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、または塩化ナトリウムが組成物中に含まれる。注射組成物の延長された吸収は、組成物に、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアレート塩およびゼラチンを含ませることによって実現することができる。さらに、可溶性因子は持続放出製剤中にて、例えば、遅延放出ポリマーを含む組成物中にて投与してよい。活性な化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む、制御放出製剤のような、迅速な放出に対して化合物を保護するであろう担体と共に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、およびポリ乳酸、ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧ）のような生分解性の生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような製剤の調製のための多くの方法は特許されており、または当業者に一般的に公知である。
【０１６２】
上清または可溶性因子を適当なマトリックスと組み合わせて投与して、例えば、可溶性因子の遅延放出を供することができる。
【０１６３】
組成物のさらなる成分
幹細胞−由来の上清または可溶性因子、幹細胞またはその子孫は、他の有益な薬物または生物学的分子（成長因子、栄養因子）と共に投与してよい。他の剤と共に投与する場合、それらは単一の医薬組成物中にて、または別々の医薬組成物中にて、同時に、または他の剤と共に順次に（他の剤の投与の前または後いずれかに）一緒に投与してよい。共投与することができる生物活性因子としては、抗−アポトーシス剤（例えば、ＥＰＯ、ＥＰＯミメティボディ、ＴＰＯ、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ、ＨＧＦ、カスパーゼ阻害剤）；抗−炎症剤（例えば、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、ＴＧＦ−ベータ阻害剤、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１阻害剤、ペミロラスト（ＰＥＭＩＲＯＬＡＳＴ）、トラニラスト（ＴＲＡＮＩＬＡＳＴ）、レミケード（ＲＥＭＩＣＡＤＥ）、シロリムス（ＳＩＲＯＬＩＭＵＳ）、およびＮＳＡＩＤ（非−ステロイド抗−炎症薬物；例えば、テポキサリン（ＴＥＰＯＸＡＬＩＮ）、トルメチン（ＴＯＬＭＥＴＩＮ）、スプロフェン（ＳＵＰＲＯＦＥＮ））；免疫抑制／免疫調節剤（例えば、サイクロスポリン、タクロリムスのようなカルシニューリン阻害剤）；ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムス（ＳＩＲＯＬＩＭＵＳ）、エボロリムス（ＥＶＥＲＯＬＩＭＵＳ））；抗−増殖剤（例えば、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン）；モノクローナル抗−ＩＬ−２Ｒアルファ受容体抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ）、ポリクローナル抗−Ｔ−細胞抗体（例えば、抗−胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）のような抗体；抗−リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）；モノクローナル抗−Ｔ細胞抗体（ＯＫＴ３）；抗−血栓形成性剤（例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、ＰＰａｃｋ（デキストロフェニルアラニンプロリンアルギニンクロロメチルケトン）、抗−トロンビン化合物、血小板受容体アンタゴニスト、抗−トロンビン抗体、抗−血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害剤、および血小板阻害剤）；および抗−オキシダント（例えば、プロブコール、ビタミンＡ、アスコルビン酸、トコフェロール、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、Ｎ−アセチルシステイン）ならびに局所麻酔剤が挙げられる。
【０１６４】
１つの例において、いずれかの例による本明細書中に記載された組成物は、低い骨芽細胞のレベルまたは活性に関連する障害の治療または予防のためのさらなる因子を含む。
【０１６５】
別法として、または加えて、いずれかの例による本明細書中に記載された細胞、分泌された因子および／または組成物は、低い骨芽細胞のレベルまたは活性に関連する障害の公知の治療と組み合わされる。
【０１６６】
１つの例において、いずれかの例による本明細書中に記載された医薬組成物は、低い骨芽細胞のレベルまたは活性に関連する障害に対して用いられる化合物を含む。別法として、いずれかの実施態様による本明細書中に記載された治療／予防の方法は、加えて、低い骨芽細胞のレベルまたは活性に関連する障害を治療するのに用いられる化合物を投与することを含む。例示的な化合物は本明細書中に記載されており、準じて、本開示のこれらの例に適応されると把握されるべきである。
【０１６７】
もう１つの例において、いずれかの例による本明細書中に記載された組成物は、加えて、先祖細胞の血管細胞への分化を誘導し、または高める因子を含む。例示的な因子としては、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ；例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ）、およびＦＧＦが挙げられる。
【０１６８】
もう１つの例において、いずれかの例による本明細書中に記載された組成物は、加えて、組織特異的委任細胞（ＴＳＣＣ）を含む。これに関して、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＡＵ２００５／００１４４５は、ＴＳＣＣおよびＳＴＲＯ−１＋細胞の投与がＴＳＣＣの増強された増殖に導くことができるのを示している。1つの例において、ＴＳＣＣは血管細胞である。そのような組成物の対象への投与は血管系の増加した生産に導くことができ、例えば、患部組織に送達される栄養の増加に導く。
【０１６９】
医療機器
本開示は、いずれかの例による本明細書中で記載された方法で用いるための、または該方法で用いる場合の医療機器も提供する。例えば、本開示は、いずれかの例による本明細書中に記載された幹細胞および／またはその子孫細胞および／またはそれからの可溶性因子および／または組成物を含むシリンジまたはカテーテルまたは他の適当な送達デバイスを提供する。所望により、シリンジまたはカテーテルは、いずれかの例による本明細書中に記載された方法で用いるための説明書で包装してよい。
【０１７０】
もう１つの例において、本開示は、いずれかの例による本明細書中に記載された幹細胞および／またはその子孫細胞および／またはそれからの可溶性因子および／または組成物を含むインプラントを提供する。所望により、インプラントは、いずれかの例による本明細書中に記載された方法で用いるための説明書で包装してよい。適当なインプラントは、例えば、前記にて本明細書中に記載された足場ならびに幹細胞および／またはその子孫細胞および／またはそれからの可溶性因子で形成されてよい。
【０１７１】
投与の態様
１つの例において、幹細胞―由来の上清または可溶性因子、幹細胞またはその子孫は対象の血流に送達される。例えば、幹細胞―由来の上清または可溶性因子、幹細胞またはその子孫は非経口送達される。非経口投与の例示的な経路としては、限定されるものではないが、腹腔内、心室内、脳室内、髄腔内または静脈内が挙げられる。1つの例において、幹細胞―由来の上清または可溶性因子、幹細胞またはその子孫は動脈内、大動脈、心臓の心房または心室に、または血管に、例えば、静脈内送達される。
【０１７２】
心臓の心房または心室への細胞送達の場合には、細胞を左心房または心室に投与して、肺への細胞の迅速な送達から生じ得る合併症を回避することができる。
【０１７３】
１つの例において、幹細胞―由来の上清または可溶性因子、幹細胞またはその子孫は静脈内に送達される。
【０１７４】
１つの例において、幹細胞―由来の上清または可溶性因子、幹細胞またはその子孫は、例えば、シリンジを用い、またはカテーテルまたは中心線を通って送達の部位に注射される。
【０１７５】
治療製剤用の投与計画の選択は、構成要素の血清または組織回転速度、兆候のレベル、および構成要素の免疫原性を含む数個の因子に依存する。１つの例において、投与計画は、副作用の許容されるレベルに合致する患者に送達される治療化合物の量を最大化する。従って、送達される製剤の量は、部分的には、特定の構成要素、および治療すべき疾患の重症度に依存する。
【０１７６】
１つの例において、幹細胞―由来の上清または可溶性因子、幹細胞またはその子孫は単一のボーラス用量として送達される。別法として、幹細胞―由来の上清または可溶性因子、幹細胞またはその子孫は連続的点滴によって、または例えば、１日、１週間の間隔、または１週間当たり１〜７回の用量によって投与される。例示的な用量プロトコルは、有意な望ましくない副作用を回避する最大用量または投与頻度を含むものである。合計週用量は、用いるべき化合物／細胞の型および活性に依存する。適切な用量の決定は、例えば、治療を行うための当該分野で公知の、または考えられる、または治療を行うために予測されるパラメータまたは因子を用い、臨床医によってなされる。一般に、用量は最適用量よりも幾分少ない量で開始し、所望のまたは最適な効果がいずれかのマイナスの副作用に対して達成されるまで、その後、少量ずつ増加させる。
【０１７７】
本発明者らは、幹細胞および／またはその子孫および／またはそれに由来する可溶性因子によって提供される治療的利点が、対象において少なくとも４週間観察されることを示した。従って、いくつかの例において、細胞は毎週、２週間毎に、３週間毎に一回、または４週間毎に一回投与される。
【０１７８】
低い骨芽細胞のレベルまたは活性に関連する障害の進行の治療または遅延に向けられた開示の例によると、幹細胞および／またはその子孫細胞および／またはそれに由来する可溶性因子は、例えば、当該分野で公知の、および／または本明細書中に記載された標準的な方法を用い、障害の診断に続いて投与される。
【０１７９】
低い骨芽細胞のレベルまたは活性に関連する障害の開始の予防または遅延に向けられた例では、幹細胞および／またはその子孫細胞および／またはそれに由来する可溶性因子は、障害の臨床的診断に先立って投与することができる。
【０１８０】
本開示は以下の非限定的実施例を含む。
【実施例】
【０１８１】
実施例１：ＳＴＲＯ―３＋細胞の選択によるＭＰＣの免疫選択
骨髄（ＢＭ）は健康な通常の成人ボランティア（２０〜３５歳）から収穫する。簡単に述べれば、４０ｍｌのＢＭを後部腸骨稜からリチウム―ヘパリン抗凝固剤―含有試験管に吸引する。
【０１８２】
ＢＭＭＮＣは、従前に記載されているように（Ｚａｎｎｅｔｔｉｎｏ，A．C．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２：２６１３―２６２８）、ＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐＴＭ（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ，オスロ，ノルウェー国）を用いて密度勾配分離によって調製される。４℃における３０分間の４００×ｇでの遠心に続いて、淡黄色層を移動ピペットで取り出し、５％胎児子ウシ血清（ＦＣＳ，ＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，オーストラリア国）を含有する、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から構成される「ＨＨＦ」中で３回洗浄した。
【０１８３】
従前に記載されているように（Ｇｒｏｎｔｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１６：１８２７−１８３５；Ｇｒｏｎｔｈｏｓ，Ｓ．ａｎｄ  Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．Ｊ．（１９９５）Ｂｌｏｏｄ  ８５：９２９―９４０）、引き続いて、磁性活性化細胞ソーティングによってＳＴＲＯ−３＋（またはＴＮＡＰ＋）細胞を単離した。簡単に述べれば、ほぼ１〜３×１０８のＢＭＭＮＣを、氷上で、ＨＨＦ中の、１０％（ｖ／ｖ）の正常なウサギ血清よりなるブロッキング緩衝液中で２０分間インキュベートする。細胞を、氷上で、ブロッキング緩衝液中の２００μｌのＳＴＲＯ−３  ｍＡｂの１０μｇ／ｍｌ溶液と共に１時間インキュベートする。引き続いて、４００×ｇでの遠心によって、細胞をＨＨＦ中で２回洗浄する。ＨＨＦ緩衝液中のヤギ抗−マウスγ―ビオチン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）の１／５０希釈物を加え、細胞を氷上で１時間インキュベートする。細胞を、前記したＭＡＣＳ緩衝液（１％  ＢＳＡ、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを補足したＣａ２＋−およびＭｎ２＋−フリーＰＢＳ）中で２回洗浄し、最終容量０．９ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁させる。
【０１８４】
１００μｌのストレプトアビジンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，ドイツ国）を細胞懸濁液に加え、氷上で１５分間インキュベートする。細胞懸濁液を２回洗浄し、０．５ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、引き続いて、ミニＭＡＣＳカラム（ＭＳ  Ｃｏｌｕｍｎｓ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に負荷し、０．５ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液で３回洗浄して、（受託番号ＰＴＡ−７２８２下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｕｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に２００５年１２月１９日に寄託された−国際公開番号ＷＯ  ２００６／１０８２２９参照）ＳＴＲＯ−３  ｍＡｂに結合しなかった細胞を回収する。さらなる１ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液の添加の後に、カラムを磁石から取り出し、ＴＮＡＰ＋細胞を正圧によって単離する。各画分からの細胞のアリコットをストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色することができ、純度をフローサイトメトリーによって評価することができる。
【０１８５】
実施例２：ＳＴＲＯ−３  ｍＡｂによって選択された細胞はＳＴＲＯ−１ブライト細胞である
実験を設計して、細胞ＳＴＲＯ−１ブライト細胞を単離するための単一の試薬としてＳＴＲＯ−３  ｍＡｂの使用の潜在能力を確認した。
【０１８６】
ＳＴＲＯ−３（ＩｇＧ１）はＳＴＲＯ−１（ＩｇＭ）のそれと異なるアイソタイプであると仮定し、クローン原性ＣＦＵ−Ｆを同定するＳＴＲＯ−３の能力を、ＭＡＣＳ手法を用いて単離されたＳＴＲＯ−１−細胞とのその共発現に基づいて二色ＦＡＣＳ分析によって評価した（図１）。ドット・プロット・ヒストグラムはリストモードのデータとして収集された５×１０４の事象を表す。垂直および水平線を、同一条件下で処理されたアイソタイプがマッチした対照抗体、１Ｂ５（ＩｇＧ）および１Ａ６．１２（ＩｇＭ）で得られた＜１．０％平均蛍光の反応性レベルに対して設定した。結果は、ＳＴＲＯ−１ブライト細胞の小さな集団がＴＮＡＰを共発現し（上方右側象限）、他方、残りのＳＴＲＯ−１＋細胞はＳＴＲＯ−３  ｍＡｂと反応しなかったことを示す。全ての４つの象限からのＦＡＣＳによって単離された細胞を、引き続いて、ＣＦＵ−Ｆの発生率について検定した（表１）。
【０１８７】
表１：細胞表面マーカーＳＴＲＯ−１およびＴＮＡＰの共発現に基づいた二色ＦＡＣＳ分析によるヒト骨髄細胞豊富化（図１参照）。ＦＡＣＳソーティングした細胞を、２０％ＦＣＳを補足したアルファＭＥＭ中で標準的なクローン原性条件下で培養した。データは、平板培養した１０５細胞当たりの１４日コロニー−形成細胞（ＣＦＵ−Ｆ）の平均数±ＳＥを表す（ｎ＝３  異なる骨髄吸引物）。これらのデータは、ヒトＭＰＣが、ＳＴＲＯ−１抗原を明るく共発現させるＢＭのＴＮＡＰ陽性画分に専ら制限されることを示唆する。
【０１８８】
【表１】
2014525466.tif 000002
【０１８９】
実施例３：カニクイザルＳＴＲＯ−３＋ＭＰＣの特徴づけ
サル骨髄先祖細胞（カニクイザルからのもの；ｃｙｎｏ−ＭＰＣ）を、雌Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓから収集した〜１５ｍｌの骨髄吸引物から単離した。骨髄吸引物懸濁液を、Ｆｉｃｏｌｌグラジエントを用いて分離し、および洗浄して、無核細胞（赤血球細胞）を除去した。次いで、ＣＡ１２抗体（抗−ＳＴＲＯ−３）およびＤｙｎａｌｂｅａｄｓを攻撃することによって、有核細胞をカウントした。抗体およびビーズを付着させた細胞を、ＭＰＣ−１磁石の磁場によって陽性選択した。陽性の選択された細胞をカウントし、成長培地中において継代（ｐ．）０にてＴ−フラスコに撒いた。予備的選択、陽性および陰性細胞をコロニー形成検定（ＣＦＵ−Ｆ）で用いた。
【０１９０】
ｃｙｎｏ−ＭＰＣ細胞に成長培地を与えた。全ての培養（ｐ．０〜ｐ．５）を、それらが所望の密集に到達するまで２〜４日毎に与えた。次いで、細胞を継代し、またはＨＢＳＳ洗浄、次いで、コラゲナーゼ、続いてトリプシン／ヴェルセンを用いて収穫した。ｐ．１細胞をカウントし、Ｔ−フラスコに撒いた。ｐ．１  ｃｙｎｏ−ＭＰＣが所望の密集に到達すれば、細胞を収穫し、制御された速度のフリーザーを用いて低温保存した。
【０１９１】
継代１低温保存ｃｙｎｏ−ＭＰＣを解凍し、Ｔ−フラスコに撒いた（ｐ．２）。ｐ．２細胞をｐ．３の細胞工場に継代した。ｐ．３細胞を収穫し、ｐ．４に細胞工場へと継代した。過剰のｐ．３細胞を低温保存した。ｐ．４細胞をｐ．５の６×細胞工場に継代した。ｐ．５  ｃｙｎｏ−ＭＰＣが所望の密集に到達すれば、細胞を収穫し、制御された速度のフリーザーを用いて低温保存した。細胞を５０％アルファＭＥＭ、４２．５％Ｐｒｏｆｒｅｅｚｅ、および７．５％ＤＭＳＯ中で低温保存した。試料をＣＦＵ−Ｆ検定、ＦＡＣＳ、不妊、マイコプラズマ、およびエンドトキシンについてテストした。
【０１９２】
培養されたｃｙｎｏ−ＭＰＣの免疫表現型の代表的なフローサイトメトリー分析の結果を図２に示す。示されるように、これらの細胞はＳＴＲＯ−１＋、ＳＴＲＯ−４＋およびＣＤ１４６＋である。
【０１９３】
ｐ５のｃｙｎｏ  ＭＰＣを解凍し、実施例４に記載された糖尿病および非−糖尿病カニクイザルの静脈内注射で用いた。
【０１９４】
実施例４：肥満サルにおける血中オステオカルシンレベルに対するＭＰＣの全身投与の効果
５匹のカニクイザルを、以下の基準：（ｉ）年齢＞１４年、（ｉｉ）高絶食血中グルコース（＞１０５ｍｇ／ｄＬ）、絶食血中インスリンレベル（＜６０ｍＵ／Ｌ）、（ｉｉｉ）高ＢＭＩ（＞４６雄  ＞２４雌）、（ｉｖ）雄については８ｋｇを超える体重および雌については＞３．５ｋｇ体重、（ｖ）高絶食トリグリセリド；および（ｖｉ）ＩＶＧＴＴに基づいた鈍い相１インスリン応答に基づいて治療のために選択した。
【０１９５】
サルを群１、２または３に割り当てた。動物に、以下の用量にて（用量は記録された最新の体重に調整した）、頭部静脈または適切な末梢静脈への（実施例２に記載されたように単離された）同種異系ＭＰＣの単一の遅い静脈内（ＩＶ）点滴を受けさせた。
【０１９６】
【表２】
2014525466.tif 000003
【０１９７】
各サルは以下に示されるように週０においてＭＰＣの第一の点滴および週１２において第二の点滴を受けた。
【０１９８】
【表３】
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オステオカルシンのサンプリングは週：−４、−２、０、２、４、８、１２、２０、２４に行った。
アルカリホスファターゼのサンプリングは週：−２、２、４、６、８、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４に行った。
【０１９９】
結果
血中オステオカルシン（ｎｇ／ｍｌ）についての絶食プロファイルを、個々の動物に対する同種異系ＭＰＣのＩＶ注射に続いて６カ月間モニターした。結果を図３に示し、そこでは、矢印はＭＰＣの単一の用量の投与の時間を示す。
【０２００】
全ての５匹の動物はＭＰＣ処理前のオステオカルシンの低い血漿中レベルを示し、平均ベースラインの値は１．４（＋／−１．５、ＳＥＭ）ｎｇ／ｍｌであった。
【０２０１】
データは、オステオカルシン応答が各注射後に２週間以内に起こり、効果は１２週間の持続を有することを示す。また、データは、ＭＰＣの反復注射が初期注射と少なくとも同程度効果的であることを示す。オステオカルシンのピーク値は１０〜３０ｍｇ／ｍｌの範囲であった。最大オステオカルシン誘導はテストされた最低の細胞用量で見られた。
【０２０２】
図４は、オステオカルシン応答が、肥満モーリシャスカニクイザルにおいて最初のＭＰＣ注射後２週間以内に観察されることを示す。２〜８週間におけるピーク応答に続いて、値は１２週間までにベースラインに戻る。興味深いことには、第二のＭＰＣ注射は、同一レベルのオステオカルシン応答を維持する第一の注射と同様の動態を示す。
【０２０３】
図５は、週０におけるベースラインに対する、６ヵ月の期間にわたってのオステオカルシン応答のパーセンテージ変化を示す。最も強い応答は、低用量のＭＰＣ注射（３０００００ＭＰＣ／ｋｇ）で認められた。
【０２０４】
図６は、処理前のベースラインレベルと比較した、ＭＰＣ処理後のオステオカルシンレベルの平均パーセンテージ変化を示す。ベースラインからのオステオカルシンの平均パーセンテージ増加は２週間においてピークとなり、値は１１３４％（＋／−２０２）であった。第二の注射後の応答の振幅は、第一のＭＰＣ注射のそれと同様であるように見える。
【０２０５】
図７は、（曲線下面積分析によって測定された）６ヵ月のＭＰＣ処理にわたっての血漿中アルカリホスファターゼの漸進的増加を示す。
【０２０６】
図８は、（１８〜２４週間および０〜６週間の間の曲線下面積分析において％増加によって測定された）６ヵ月のＭＰＣ処理にわたる血漿の総アルカリホスファターゼの漸進的増加を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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