(57)【要約】    【課題】本発明は、サンプル中に存在する１つ又は複数の核酸標的を検出する組成物、装置及び方法を提供する。    【解決手段】本発明の方法は、相互に非常に近接して標的核酸と可逆的に結合し、相補的な反応性連結部分を保有する２つ以上の連結プローブを使用することを含む。このようなプローブが適切な方向で標的に結合すると、自発的な化学的連結反応が生じ、直接検出されるか、又は後で検出されるアンプリコンを生成するように増幅される連結生成物を生じる。本発明は、分解が分析の結果に大きく影響しないようにサンプルＲＮＡを安定化させる方法も提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の複数の異なる標的核酸を検出する方法であって、各標的核酸が、第２の標的ドメインに隣接する第１の標的ドメインと、前記第１及び第２の標的ドメインの上流又は下流に位置する第３の標的捕捉ドメインとを含み、前記方法が、
（ａ）複数の連結基質を提供する工程を含み、各基質が
（ｉ）前記標的核酸の１つと、
（ｉｉ）第１のセットの連結プローブと、を含み、該第１のセットの連結プローブが、
（Ａ）第１の核酸連結プローブを含み、該第１の核酸連結プローブが、
（１）前記１つの標的核酸配列の第１の標的ドメインとハイブリダイズする第１のプローブドメインと、
（２）５’連結部分と、を含み、更に、
（Ｂ）第２の核酸連結プローブを含み、該第２の核酸連結プローブが、
（１）前記１つの標的核酸配列の第２の標的ドメインとハイブリダイズする第２のプローブドメインと、
（２）３’連結部分と、を含み、更に、
（ｂ）第１の複数の連結生成物を形成するために、リガーゼ酵素を使用せずに前記第１の連結プローブと前記第２の連結プローブを連結する工程と、
（ｃ）標的複合体を形成するために、捕捉部分を含む標的捕捉プローブを、前記標的核酸の前記第３の標的ドメインとハイブリダイズさせる工程と、
（ｄ）前記捕捉部分を使用して、表面上で前記標的複合体を捕捉する工程と、
（ｅ）アンプリコンを形成するために、前記連結生成物を増幅する工程と、
（ｆ）前記アンプリコンを検出する工程と、
を含み、それにより前記標的核酸を検出する、方法。
【請求項２】
前記標的核酸が、第５の標的ドメインに隣接する第４の標的ドメインを更に含み、
前記複数の連結基質がそれぞれ、前記第４の標的ドメインとハイブリダイズする第３の核酸連結プローブと、前記第５の標的ドメインとハイブリダイズする第４の核酸連結プローブを含む第２のセットの連結プローブとを更に含み、
前記方法が、前記１つの標的核酸配列が多数の連結生成物を含むように、リガーゼ酵素が存在しない状態で、前記第３の連結プローブと前記第４の連結プローブを連結することを更に含み、
前記検出工程（ｆ）が、前記多数の連結生成物から生成されたアンプリコンを検出することを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的核酸が、第７の標的ドメインに隣接する第６の標的ドメインを更に含み、
前記複数の連結基質がそれぞれ、前記第６の標的ドメインとハイブリダイズする第５の核酸連結プローブと、前記第７の標的ドメインとハイブリダイズする第６の核酸連結プローブを含む第３のセットの連結プローブとを更に含み、
前記方法が、前記１つの標的核酸配列が多数の連結生成物を含むように、リガーゼ酵素が存在しない状態で、前記第３の連結プローブと前記第４の連結プローブを連結することを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記連結プローブがそれぞれ、プライマー配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
連結プローブの各セットのうち少なくとも１つの連結プローブが、前記アンプリコンが標的特異的な長さを有するように、可変スペーサ配列を更に含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
連結プローブの各セットのうち１個の連結プローブのみが、前記可変スペーサ配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記可変スペーサ配列が、前記連結プローブの前記プローブドメインと前記プライマーとの間に含まれている、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記標的捕捉プローブの前記捕捉部分が、捕捉核酸配列、ビーズ、及び結合パートナー対の結合パートナーから選択される要素を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記５’連結部分がＤＡＢＳＹＬを含み、前記３’連結部分がホスホロチオエートを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記３’連結部分がＤＡＢＳＹＬを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルが、塩酸グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ）を含む緩衝剤中に採取されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルが血液である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的核酸がＤＮＡ又はＲＮＡを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出工程（ｆ）が、キャピラリ電気泳動、質量分析、マイクロアレイ分析、シーケンシング、リアルタイムＰＣＲ、光学検出、蛍光検出、生物発光検出、化学発光検出、電気化学検出、電気化学発光検出、及びLateral Flow Detectionからなる群から選択される技術を使用する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ハイブリダイゼーション工程（ｃ）が前記連結工程（ｂ）と同時に実行される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
サンプル中の複数の異なる標的核酸を検出する方法であって、各標的配列が隣接する第１の標的ドメインと、第２の標的ドメインとを含み、
ａ）複数の連結基質を提供する工程を含み、各基質が、
ｉ）前記異なる標的核酸のうち１つと、
ｉｉ）第１の核酸連結プローブと、を含み、該第１の核酸連結プローブが
１）前記１つの標的核酸の第１の標的ドメインに対して相補的な第１のプローブドメインと、
２）第１のプライマー配列と、
３）５’連結部分と、を含み、更に、
ｉｉｉ）第２の核酸連結プローブを含み、該第２の核酸連結プローブが、
１）前記１つの標的核酸の第２の標的ドメインに対して相補的な第２のプローブドメインと、
２）第２のプライマー配列と、
３）３’連結部分と、を含み、
前記連結プローブの１つが可変スペーサ配列を含み、更に、
ｂ）複数の異なる連結生成物を形成するために、リガーゼ酵素が存在しない状態で、前記第１の連結プローブと前記第２の連結プローブを連結する工程であって、異なる連結生成物が異なる標的特異的な長さを有する工程と、
ｃ）前記連結生成物を増幅する工程と、
ｄ）前記異なる標的長さに基づいて、前記異なる連結生成物の存在を検出する工程と、
を含む、方法。
【請求項１７】
前記標的核酸配列がＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸標的配列がＤＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルが血液由来である、請求項１６、１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルがパラフィン包埋サンプル由来である、請求項１６、１７又は１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出がキャピラリ電気泳動による、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記検出が質量分析による、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１のプライマーがそれぞれ同じであり、前記第２のプライマーがそれぞれ同じである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
標的核酸配列を検出するキットであって、前記標的配列が、隣接する第１の標的ドメインと、第２の標的ドメインとを含み、
ａ）６ＭのＧｕＨＣｌを含む２×の溶解緩衝剤と、
ｂ）以下を含む第１の連結プローブと、
ｉ）前記第１の標的ドメインに対して相補的な第１のプローブドメイン、
ｉｉ）第１のプライマー配列、及び
ｉｉｉ）５’連結部分、
ｃ）以下を含む第２の核酸連結プローブと、
ｉ）前記第２の標的ドメインに対して相補的な第２のプローブドメイン、
ｉｉ）第２のプライマー配列、及び
ｉｉｉ）３’連結部分、
を含む、キット。
【請求項２５】
前記連結プローブの１つが、可変スペーサ配列を更に含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
サンプル中の複数の異なる標的核酸を検出する方法であって、各標的配列が隣接する第１の標的ドメインと、第２の標的ドメインとを含み、
ａ）反応混合物を提供する工程を含み、該反応混合物が
ｉ）血液を含む標的サンプルと、
ｉｉ）３ＭのＧｕＨＣｌを含む１×の溶解緩衝剤と、を含み、更に、
ｂ）前記反応混合物を複数の異なるプローブセットと接触させる工程を含み、各プローブセットが、
ｉ）第１の連結プローブを含み、該第１の連結プローブが
１）前記１つの標的核酸の第１の標的ドメインに対して相補的な第１のプローブドメインと、
２）第１のプライマー配列と、
３）５’連結部分と、を含み、更に、
ｉｉｉ）第２の核酸連結プローブを含み、該第２の核酸連結プローブが
１）前記１つの標的核酸の第２の標的ドメインに対して相補的な第２のプローブドメインと、
２）第２のプライマー配列と、
３）３’連結部分と、を含み、更に、
ｃ）複数の異なる連結生成物を形成するために、リガーゼ酵素が存在しない状態で、前記第１の連結プローブと前記第２の連結プローブを連結する工程と、
ｄ）前記異なる連結生成物を増幅する工程と、
ｅ）前記連結生成物の存在を検出する工程と、
を含む、方法。
【請求項２７】
前記連結プローブの１つが、可変スペーサ配列を更に含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的核酸がＲＮＡである、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１及び第２の連結プローブの１つが、結合パートナー対の一方を更に含み、前記増幅の前に、他方の結合対を含むビーズを追加して、前記連結生成物を捕捉する、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記検出を、前記可変スペーサ配列を使用して実行する、請求項２７、２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
サンプル中の複数の標的ＲＮＡ配列を検出する方法であって、各標的核酸配列が隣接する第１及び第２の標的ドメインと、第３の標的ドメインとを含み、
（ａ）安定化したサンプルを形成するために、サンプルを緩衝剤中に採取する工程と、
（ｂ）前記複数の標的核酸を検出するために、前記安定化したサンプル中で請求項１に記載のアッセイを実行する工程と、
を含む、方法。
【請求項３２】
前記サンプルが、周囲室温で少なくとも１週間安定である、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
[0001]  本出願は、２０１１年５月１７日出願の米国仮特許出願第６１／４８６，８１７号に対する優先権を主張し、２０１０年３月２９日出願の米国特許出願第１２／７９８，１０８号の一部継続出願であり、上記各特許出願は参照によりその全文を本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
（連邦政府後援の研究に関する声明）
[0002]  本発明は中小企業イノベーションリサーチ（ＳＢＩＲ）プログラムにより与えられた認可第１Ｒ４３ＨＧ００６６５６−０１号を受けて政府の支援で実施された。政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
[0003]  特定の核酸の検出は、診断医療及び分子生物学研究にとって重要なツールである。遺伝子プローブアッセイは現在、診断医療及び分子生物学の幾つかの領域である役割を果たしている。例えば、正常遺伝子及び突然変異遺伝子の発現を探って腫瘍遺伝子などの疾患又は傷害に伴う遺伝子を識別する、組織移植に先だって適合性のために組織の型を決定する、法医学のために組織又は血液サンプルを照合する、原子力事故又はインフルエンザの全国的流行の発生のような緊急対応の状況に対応する、疾患の予後又は因果関係を判断する、及び様々な種の遺伝子の間の相同を調査する際に、細菌及びウイルスなどの感染組織を識別することなどである。
【背景技術】
【０００４】
[0004]  遺伝子プローブアッセイは、感度が高く、特異的で容易に自動化できることが理想的である。感度（すなわち、低い検出限界）の要件は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及び研究者が分析前に特定の核酸配列を指数関数的に増幅できるようにする他の増幅技術の開発によって大幅に緩和されている。例えば、ＳＮＰ座の複数回ＰＣＲ増幅、及びその後のオリゴヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを使用して、数百のＳＮＰの遺伝子型を同時に決定することができる。
【０００５】
[0005]  特異性は遺伝子プローブアッセイにとって難問である。プローブと標的との間の分子相補性の程度が相互作用の特異性を決定する。ハイブリダイゼーション反応におけるプローブ、標的及び塩の組成及び濃度の変化、更に反応温度、及びプローブの長さはすべて、プローブ／標的の相互作用の特異性を変化させることがある。幾つかの状況では、完全に相補性がある標的をミスマッチの標的から区別することが可能な場合があるが、従来のテクノロジーでは通常は困難である。何故なら、反応状態の小さな変化がハイブリダイゼーションを変化させるからである。ミスマッチ検出の技術には、ミスマッチがプローブ分裂の部位を発生させるプローブ消化アッセイ、及び一点ミスマッチが連結を阻止するＤＮＡ連結アッセイが含まれる。
【０００６】
[0006]  配列の変化を検出するために、様々な酵素法及び非酵素法が使用可能である。酵素に基づく方法の例にはInvader（商標）、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）一塩基伸長法、対立遺伝子ＰＣＲ、及び競合的プローブアッセイ（例えばハイブリダイゼーションによる競合的シーケンシング）が含まれる。酵素ＤＮＡ連結反応は当技術分野で周知であり、ＳＮＰ検出、酵素増幅反応法及びＤＮＡ修復に広範に使用されてきた。幾つかの非酵素又はテンプレート仲介化学的連結法も、配列変化の検出に使用することができる。これには、Ｎ−シアノイミダゾール、臭化シアン、及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−塩酸カルボジイミドなどのカップリング試薬を使用する化学的連結法が含まれる。
【０００７】
[0007]  遺伝子研究でＲＮＡを分析する場合に広く認識されている問題は、ＲＮＡ自体に固有の不安定性である。ＲＮＡは本来、生体内では短命である。何故なら、生体はＲＮＡ濃度を調節し、これがＲＮＡに依存する下流プロセスを調節するからである。ＲＮＡの破壊につながる天然のプロセスも多くある。
【０００８】
[0008]  近年、研究者は細胞中の遺伝子発現の分析方法の開発に多大な労力を費やしている。これは一般的に、存在する特異的ｍＲＮＡ分子の量について、細胞含有物を分析することによって遂行される。遺伝子発現の測定は、分析するＲＮＡのサンプルがin vivoの転写物の数に非常に類似しているという基本となる仮説に基づいている。したがって、細胞から抽出した後にＲＮＡの完全性（integrity）を維持することが最も重要である。研究者は、様々な遺伝子（ｍＲＮＡ）の転写物が様々な安定性を有し、そのことは分離手順中に生じるＲＮＡの分解が様々なＲＮＡ分子間に不均一に分布している可能性があることを示唆すると認識している。様々な分解程度のＲＮＡサンプルの１つの比較は、様々な遺伝子発現のマイクロアレイに基づく測定値の最大７５％が、分解のバイアスを原因とする可能性があることを示す。Auer H、Liyanarachchi S、Newsom D、Klisovic MI、Marcucci G、Kornacker K (2003)、Nature Genetics 35:292-293。
【０００９】
[0009]  効率的で特異的な核酸検出、及び細胞から抽出後のＲＮＡ安定化のための方法及び組成物が依然として求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
[0010]  したがって、本発明は、迅速な標的検出を提供し、標的核酸の検出及び測定プロセスを大幅に簡単化する非酵素化学的連結反応の方法及び組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
[0011]  一態様では、本発明はサンプル中の複数の異なる標的核酸を検出する方法を提供し、各標的核酸は、第２の標的ドメインに隣接する第１の標的ドメインと、第１及び第２の標的ドメインの上流又は下流に位置する第３の標的捕捉ドメインとを含む。上記方法は、（ａ）それぞれが標的核酸のうち１つを含む複数の連結基質を提供する工程を含み、第１のセットの連結プローブは、（ｉ）ハイブリダイズして１つの標的核酸配列及び５’連結部分の第１の標的ドメインにする第１のプローブドメインを含む第１の核酸連結プローブと、（ｉｉ）ハイブリダイズして１つの標的核酸配列及び３’連結部分の第２の標的ドメインにする第２のプローブドメインを含む第２の核酸連結プローブとを含み、更に、（ｂ）第１の複数の連結生成物を形成するために、リガーゼ酵素を使用せずに第１及び第２の連結プローブを連結させる工程と、（ｃ）標的複合体を形成するために捕捉部分を含む標的捕捉プローブを標的核酸の第３の標的ドメインにハイブリダイズする工程と、（ｄ）捕捉部分を使用して表面上の標的複合体を捕捉する工程と、（ｅ）アンプリコンを形成するために連結生成物を増幅する工程と、（ｆ）アンプリコンを検出する工程とを含み、それにより標的核酸を検出する。
【００１２】
[0012]  他の実施形態では、上記に従って、標的核酸は、第５の標的ドメインに隣接する第４の標的ドメインと、それぞれがハイブリダイズして第４の標的ドメインになる第３の核酸連結プローブ、及びハイブリダイズして第５の標的ドメインになる第４の核酸連結プローブを含む第２のセットの連結プローブを更に含む複数の連結基質とを更に含む。このような実施形態では、上記方法は１つの標的核酸配列が複数の連結生成物を含むように、リガーゼ酵素がない状態で第３の連結プローブと第４の連結プローブを連結させる複数の工程を更に含み、検出する工程（ｆ）は複数の連結生成物から生成されたアンプリコンを検出することを含む。
【００１３】
[0013]  他の実施形態では、上記のいずれかに従って、標的核酸は第７の標的ドメインに隣接する第６の標的ドメインを更に含み、複数の連結基質はそれぞれ、ハイブリダイズして第６の標的ドメインになる第５の核酸連結プローブ及びハイブリダイズして第７の標的ドメインになる第６の核酸連結プローブを含む第３のセットの連結プローブを更に含み、上記方法は、１つの標的核酸配列が複数の連結生成物を含むように、リガーゼ酵素がない状態で第３の連結プローブと第４の連結プローブを連結させることを更に含む。
【００１４】
[0014]  更に他の実施形態では、上記のいずれかに従って、連結プローブはそれぞれ、プライマー配列を更に含む。
【００１５】
[0015]  更に他の実施形態では、上記のいずれかに従って、各セットの連結プローブのうち少なくとも１つの連結プローブは、アンプリコンが標的特異的長さを有するように、可変スペーサ配列を更に含む。
【００１６】
[0016]  更に他の実施形態では、上記のいずれかに従って、各セットの連結プローブのうち１つの連結プローブのみが可変スペーサ配列を含む。
【００１７】
[0017]  更に他の実施形態では、更に上記のいずれかに従い、可変スペーサ配列は連結プローブのプローブドメインとプライマーとの間に含まれる。
【００１８】
[0018]  他の実施形態では、上記のいずれかに従って、標的捕捉プローブの捕捉部分は、捕捉核酸配列、ビード、及び結合パートナー対の結合パートナーから選択された要素を含む。
【００１９】
[0019]  他の実施形態では、上記のいずれかに従って、５’連結部分はＤＡＢＳＹＬを含み、３’連結部分はホスホロチオエートを含む。
【００２０】
[0020]  他の実施形態では、上記のいずれかに従って、３’連結部分はＤＡＢＳＹＬを含む。
【００２１】
[0021]  他の実施形態では、上記いずれかに従って、サンプルを、塩酸グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ）を含む緩衝液中に採取する。例示的実施形態では、サンプルは血液である。
【００２２】
[0022]  他の実施形態では、上記のいずれかに従って、標的核酸はＤＮＡ又はＲＮＡを含む。
【００２３】
[0023]  更に他の実施形態では、上記のいずれかに従って、検出工程（ｆ）はキャピラリ電気泳動、質量分析法、マイクロアレイ分析、塩基シーケンシング法、リアルタイムＰＣＲ、光学検出、蛍光検出、生物発光検出、化学発光検出、電気化学検出、電気化学発光検出、及びLateral Flow Detectionからなる群から選択された技術を使用する。
【００２４】
[0024]  他の実施形態では、上記のいずれかに従って、ハイブリダイゼーションの工程（ｃ）は連結工程（ｂ）と同時に実行する。
【００２５】
[0025]  他の態様では、上記のいずれかに従って、本発明はサンプル中の複数の異なる標的核酸を検出する方法を提供し、各標的配列は隣接する第１の標的ドメインと、第２の標的ドメインとを含み、上記方法は、（ａ）それぞれが様々な標的核酸の１つと、１つの標的核酸の第１の標的ドメインに相補的である第１のプローブドメイン、第１のプライマー配列、及び５’連結部分を含む第１の核酸連結プローブと、１つの標的核酸の第２の標的ドメインに相補的である第２のプローブドメイン、第２のプライマー配列、及び３’連結部分を含む第２の核酸連結プローブとを含む複数の連結基質を提供する工程を含む。連結プローブのうち１つは可変スペーサ配列を含む。上記方法は、（ｂ）複数の異なる連結生成物を形成するために、リガーゼ酵素がない状態で第１の連結プローブと第２の連結プローブを連結させる工程を更に含み、異なる連結生成物は異なる標的特異性の長さを有し、更に、（ｃ）連結生成物を増幅させる工程と、（ｄ）異なる標的の長さに基づいて異なる連結生成物の存在を検出する工程とを含む。
【００２６】
[0026]  他の実施形態では、上記のいずれかに従って、標的核酸配列はＲＮＡ又はＤＮＡである。
【００２７】
[0027]  他の実施形態では、上記のいずれかに従って、サンプルは血液から誘導する。
【００２８】
[0028]  更に他の実施形態では、上記のいずれかに従って、サンプルはパラフィン包埋サンプルから誘導される。
【００２９】
[0029]  更に他の実施形態では、上記のいずれかに従って、検出はキャピラリ電気泳動又は質量分析法によって実施する。
【００３０】
[0030]  他の実施形態では、上記のいずれかに従って、第１のプライマーはそれぞれ同じであり、第２のプライマーはそれぞれ同じである。
【００３１】
[0031]  他の実施形態では、上記のいずれかに従って、本発明は標的核酸配列を検出するキットを提供し、標的配列は隣接する第１の標的ドメイン及び第２の標的ドメインを含み、キットは（ａ）６ＭのＧｕＣＨｌを含む２Ｘの溶解緩衝液と、（ｂ）（ｉ）第１の標的ドメインに相補的である第１のプローブドメイン、（ｉｉ）第１のプライマー配列、及び（ｉｉｉ）５’連結部分を含む第１の連結プローブと、（ｃ）（ｉ）第２の標的ドメインに相補的である第２のプローブドメイン、（ｉｉ）第２のプライマー配列、及び（ｉｉｉ）３’連結部分を含む第２の核酸連結プローブとを含む。
【００３２】
[0032]  他の実施形態では、上記のいずれかに従って、連結プローブの一方又は両方は、可変スペーサ配列を更に含む。
【００３３】
[0033]  他の態様では、上記のいずれかに従って、本発明はサンプル中の複数の異なる標的核酸を検出する方法を提供し、各標的配列は、隣接する第１の標的ドメインと、第２の標的ドメインとを含み、上記方法は（ａ）（ｉ）血液を含む標的サンプル、及び（ｉｉ）３ＭのＧｕＨＣｌを含む１Ｘの溶解緩衝液を含む反応混合物を提供する工程と、（ｂ）反応混合物を複数の異なるプローブのセットと接触させる工程とを含み、各プローブセットが（ｉ）（１）１つの標的核酸の第１の標的ドメインに相補的である第１のプローブドメイン、（２）第１のプライマー配列、及び（３）５’連結部分を含む第１の連結プローブと、（ｉｉｉ）（１）１つの標的核酸の第２の標的ドメインに相補的である第２のプローブドメイン、（２）第２のプライマー配列、及び（３）３’連結部分を含む第２の核酸連結プローブとを含み、更に、（ｄ）複数の異なる連結生成物を形成するために、リガーゼ酵素がない状態で第１の連結プローブと第２の連結プローブを連結させる工程と、（ｅ）異なる連結生成物を増幅する工程と、（ｆ）連結生成物の存在を検出する工程とを含む。
【００３４】
[0034]  他の実施形態では、上記のいずれかに従って、連結プローブは可変スペーサ配列を更に含む。
【００３５】
[0035]  他の実施形態では、上記のいずれかに従って、標的核酸はＲＮＡである。
【００３６】
[0036]  他の実施形態では、上記のいずれかに従って、第１及び第２の連結プローブのうち一方が結合パートナー対のうち１つを更に含み、増幅前に、他方の結合パートナー対を含むビードを追加して連結生成物を捕捉する。
【００３７】
[0037]  他の実施形態では、上記のいずれかに従って、検出は可変スペーサ配列を使用して実行する。
【００３８】
[0038]  他の態様では、上記のいずれかに従って、本発明はサンプル中の複数の標的ＲＮＡ配列を検出する方法を提供し、各標的核酸配列は、隣接する第１の標的ドメインと、第２の標的ドメインと、第３の標的ドメインとを含む。上記方法は、安定化したサンプルを形成するためにサンプルを緩衝液中に採取する工程と、複数の標的核酸を検出するために上記のいずれかに従い安定化したサンプルでアッセイを実施する工程とを含む。
【００３９】
[0039]  他の実施形態では、上記のいずれかに従って、サンプルは周囲室温で少なくとも１週間安定している。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】[0040]ＣＬＰＡ−ＣＥアッセイの一実施形態の概略図である。
【図２】[0041]ＣＬＰＡ−ＭＤＭアッセイの一実施形態の概略図である。
【図３】[0042]２プローブ及び３プローブのＣＬＰＡ反応の一実施形態を示す概略図である。
【図４】[0043]３’−ＤＡＢＳＹＬ離脱基を有するＤＮＡの製造に使用することができるＤＮＡ合成用樹脂の概略図である。
【図５】[0044]ＣＬＰＡ−ＣＥアッセイの一実施形態のプロセスの流れの概略図である。
【図６】[0045]プローブがサイズ可変のスタッファー配列を含有するＣＬＰＡアッセイ用プローブの設計を示す概略図である。
【図７】[0046]ＣＬＰＡ−ＣＥで分析したサンプルの電気泳動分離プロフィールを示す。
【図８】[0047]ＣＬＰＡ−ＣＥアッセイにおける標的濃度とピーク高さとの直線関係を示す。
【図９】[0048]様々な標的のLuminex Signalと前立腺ＦＦＰＥ組織の切片（各標的の左手側の棒）及び非標的対照標準（ｐＮＴＣ−各標的の右手側の棒）とを比較するＦＦＰＥ組織サンプルの分析データを示す。
【図１０】[0049]結合したＣＬＰＡプローブセットを溶液相／非結合ＣＬＰＡ−ＣＥアッセイプローブセットから分離するために使用する標的捕捉法の概略図である。
【図１１】[0050]単一標的捕捉プローブとともにサンプル標的に結合している複数の一意のＣＬＰＡプローブセットの概略図である。
【図１２】[0051]サンプルの完全性の評価に特に使用することができる本発明の一実施形態の使用可能な方向の他の概略図である。図１２Ａは、図１１と同様の方向を示すが、ただし連結プローブセットの「下流」の捕捉プローブを除く。ＣＭは捕捉部分である。当業者に認識されるように、ＣＭは捕捉プローブの３’末端又は５’末端にあってもよいが、通常は３’端部に示される。また、標的ドメインにハイブリダイズされない各連結プローブの部分は、図１１に示すように、プライマー結合ドメイン、サイズタグ、捕捉配列などを含むが、これらに限定されない幾つかの異なる機能性を含むことができる。図１２Ａは、サンプルの完全性評価のために連結プローブセットが標的の長さにわたってほぼ２５〜３０％の増分で離隔されている状況を示す。当業者に認識され、また以下で説明するように、異なる連結プローブセットの間隔は必要に応じて変化することができる。図１２Ｂは代替方向を示す。図１２Ｃは、完全性評価又は冗長性の両方に使用することができる方向を示す。
【図１３】[0052] 図１３Ａ〜Cは、ＳＮＰ検出に使用する本発明の実施形態の幾つかの概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
[0053]  本発明の実践は、他に指示していない限り、有機化学、ポリマーテクノロジー、分子生物学（組み換え技術を含む）細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技術及び説明を使用することができ、これらは当技術分野の技術に入る。このような従来の技術にはポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、連結、ファージの表示、及びラベルを使用したハイブリダイゼーションの検出が含まれる。本明細書の以下の例を参照することにより、適切な技術の個々の実例を見ることができる。しかし、言うまでもなく、他の同等の従来手順も使用することができる。このような従来技術及び説明は、Genome Analysis; A Laboratory Manual Series（Ｉ〜ＩＶ巻）、Using Antibodies: A Laboratory Manual、Cells: A Laboratory Manual、PCR Primer: A Laboratory Manual、及びMolecular Cloning: A Laboratory Manual（すべてCold Spring Harbor Laboratory Pressより出版）、Stryer, L. (1995)のBiochemistry（第４版）（ニューヨーク州フリーマン）、Gaitの「Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach」(1984)（IRL Press、ロンドン）、Nelson及びCox(2000）のLehninger, Principles of Biochemistry第３版（ニューヨーク州ニューヨーク、W.H. Freeman Pub.）、及びBerg他(2002)のBiochemistry第５版（W.H. Freeman Pub.、ニューヨーク州ニューヨーク）に見ることができ、これらはすべての目的のために、参照によりその全文を本明細書に組み込むものとする。
【００４２】
[0054]  本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数の形態の「ある」及び「上記」は、文脈で明らかにそれ以外と規定されていない限り複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば「ポリメラーゼ」に言及した場合、それは１つの薬剤又はこのような薬剤の混合物を指し、「上記方法」に言及した場合、それは当業者に知られている同等の工程及び方法への言及を含み、以下同様である。
【００４３】
[0055]  他に規定されていない限り、本明細書で使用するすべての技術及び科学的用語は、本発明の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載するすべての出版物は、その出版物で説明され、本明細書で説明する発明と関連して使用することができる装置、組成物、製剤及び方法を説明し、開示するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４４】
[0056]  ある範囲の値が提供されている場合は、他に明記されていない限り、その範囲の上限と下限の間で下限の単位の１０分の１まで、各介在値及びその記述された範囲内にある任意の他の記述された値又は介在値は、発明に含まれることが理解される。これらの小さい方の範囲の上限及び下限は、小さい方の範囲に別個に含まれ、これも本発明に含まれるが、規定された範囲に特に除外された限界があることがある。規定された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、これらの含まれる限界の一方又は両方も本発明に含まれる。
【００４５】
[0057]  以下の説明では、本発明を更に完璧に理解するために、多数の特有の詳細について記載する。しかし、本発明はこれらの特有の詳細のうち１つ又は複数がない状態で実践できることが当業者には明白である。他の場合、本発明が曖昧になるのを回避するために、周知の特徴及び当業者に周知の手順については説明しなかった。
【００４６】
[0058]  範囲を含むすべての数値の指示、例えばｐＨ、温度、時間、濃度及び分子量は、０．１の増分で（＋）又は（−）に変化する近似値である。常に明示的に規定しているわけではないが、すべての数値的指示の前には「約」という用語があることを理解されたい。「約」という用語は、「Ｘ＋０．１」又は「Ｘ−０．１」などの「Ｘ」の小増分に加えて正確な値「Ｘ」も含む。常に明示的に規定しているわけではないが、本明細書で説明する試薬は例示にすぎず、その同等物が当技術分野で知られていることも理解されたい。
【００４７】
Ｉ．概要
[0059]  本発明はサンプル中の標的核酸を検出する方法及び組成物を含む。一般的に、標的核酸は、標的核酸の隣接するドメインにハイブリダイズされた２つの連結プローブを、外来性リガーゼ酵素を使用せずに連結させる化学的連結の工程を含む方法により検出される。
【００４８】
[0060]  本発明は、標的核酸を非常に近く相互に可逆的に結合し、相補的な反応性連結部分を保有する２つ以上の連結プローブ（本明細書では「オリゴヌクレオチドプローブ」とも呼ぶ）を使用する方法を提供する。連結反応では、プローブを適切な方向で標的に結合すると、リガーゼ酵素の使用に頼らない連結オリゴヌクレオチド生成物を生成する自発的な化学的連結反応を実行することができる。これで、連結オリゴヌクレオチド生成物（本明細書では「連結生成物」とも呼ぶ）の存在又はその量を幾つかの異なる方法で測定することにより、問題の１つ又は複数の標的の存在を判定することができる。以下で説明するように、連結プローブは様々な追加の機能を含むことができ、それは以下で更に詳細に説明するように、例えば光学及び電気化学的ラベルなどの直接的ラベルのような連結オリゴヌクレオチド生成物の識別、定量化又は検出を補助する検出可能なラベル、特定の標的に対して特異的であるようにサイズ決定された核酸配列を含む可変スペーサ配列又は「サイズタグ」を含むが、これらに限定されず、したがって特定サイズの連結生成物（又はこのような連結生成物から生成されたアンプリコン）の検出が、特定の標的核酸配列の存在及び／又は量を識別する。１つ又は複数の連結プローブに含まれる別の任意選択の機能は、後に固体支持体（例えばマイクロアレイ、マイクロビーズ、ナノ粒子など）上に捕捉するように設計された捕捉部分であり、ビオチンなどの結合パートナー、固着オリゴヌクレオチド配列（本明細書では「固着配列」又は「捕捉配列」とも呼ぶ）、連結生成物（磁気粒子、オリゴヌクレオチドコード化配列）の濃縮又は操作を促進する分子ハンドル、及びＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼのような酵素を介して連結生成物のその後の２次増幅を促進するプロモータ及びプライマー配列を含むが、これらに限定されない。
【００４９】
[0061]  本発明の連結反応は外部から追加されるリガーゼの存在も追加の酵素も必要としないが、以下で説明するように、幾つかの副反応がポリメラーゼのような酵素の使用に依存することもできることが好ましい。標的の増幅は、連結生成物の代謝回転も含むことができ、その連結生成物は別個の連結プローブよりもテンプレート又は標的核酸に対する親和性が低いか、又は同等である。したがって、ハイブリダイズしたプローブが連結すると、連結生成物が標的から解放され、標的を自由にして、新しい連結反応のテンプレートとして働く。あるいは、熱サイクルを実施して、連結生成物を標的配列から除去し、新しい連結プローブが別の連結サイクルのためにハイブリダイズできるようにすることができる。
【００５０】
[0062]  本発明は、ＤＮＡ及びＲＮＡ標的を含むが、これらに限定されないサンプル中の１つ又は複数の核酸標的を検出する組成物、装置及び方法を提供する。核酸標的の検出に非酵素方法を使用することの利点には、非天然のＤＮＡ類似構造に対する感度が低下し、ＲＮＡ標的配列を使用することができ、費用が低下して、様々な状態で頑健さが向上することが含まれる。特に、本明細書で説明する方法は、重要なサンプルの準備を必要としない。すなわち、検出のための酵素プロセスを阻害するか又は不活性化するような汚染物質及び緩衝剤の存在下で、連結反応を実行することができる。例えば、血液サンプルを大いに変性させる安定化緩衝剤中に採取し、プローブを添加することができ、酵素プロセスを変性させるような状態で反応が生じる。不純なサンプル中で標的核酸、特にＲＮＡを分析するこの能力は、医学的診断（遺伝子発現プロファイリング及びＳＮＰ検出など）、法医学用途、及び環境毒素及び／又は放射線による損傷の検査などの用途に特に有用である。更に、本発明の方法及び組成物は、固定してパラフィンに包埋するプロセスの結果、サンプルの核酸が分解してしまうパラフィン包埋サンプルなど、分解したサンプルから核酸を検出する際に有用である。
【００５１】
[0063]  また、本発明の一実施形態は、標的核酸の「完全性（integrity）」に関するアッセイを提供する。すなわち、例えばｍＲＮＡ又は固定サンプル中の核酸の技術分野で知られているように、核酸は経時的に分解する。図１１及び図１２に示し、以下で更に詳細に説明するように、本発明はサンプルの完全性を評価できるように複数の連結複合体を使用可能にする。同様に、標的配列ごとにこれらの複数の連結複合体を使用することは、例えば二重又は三重にサンプルで作業するのと同様に、冗長性によりデータ及びアッセイの完全性のためにも使用することができる。
【００５２】
[0064]  他の態様では、本発明はサンプル中の核酸を安定化させる働きをする緩衝剤を提供する。このような緩衝剤は、一般的に、非限定的な実施形態で塩酸グアニジニウムを含むカオトロピックカチオンを含む変性剤を含む。本発明の特定の実施形態では、サンプルを採取してそのまま本発明の緩衝剤に入れ、これでサンプルから核酸を精製する必要なく、その緩衝剤中で連結プローブのその後のハイブリダイゼーション及び連結を実行する。特定の実施形態では、緩衝剤中に採取したサンプルを最初に希釈し、その後に、サンプル中で標的核酸を精製する必要なく、その希釈サンプル中で２つ以上の連結プローブをハイブリダイズし、連結する本明細書で説明する方法を実行する。
【００５３】
[0065]  以上で説明したように、本発明の連結プローブをハイブリダイズして標的核酸にし、次にリガーゼ酵素を使用せずに連結する。連結した後、生成された新生成物（「連結生成物」）を任意選択で酵素又は化学反応により増幅することができる。好ましい実施形態では、化学的連結反応は、例えばユニバーサルＰＣＲプライマーなどのＰＣＲプライマー部位を自身上に有する２つのプローブを結合する。また、本発明の一実施形態では、一方又は両方の連結プローブがスタッファー配列、又はプローブセットごとに（すなわち、標的配列ごとに）異なる長さを有し、それにより連結生成物が標的特異的長さを有するように設計された可変スペーサ配列を含む。連結後、これで規定された長さのオリゴヌクレオチドをＰＣＲによって指数関数的に増幅することができる。本発明の一態様によれば、連結オリゴヌクレオチド生成物の識別、精製、定量化、又は検出を補助する検出可能なラベル（例えば蛍光ラベル、電気化学ラベル、磁気ビーズ、ナノ粒子、ビオチンなど）を保有することができる。プローブは任意選択で、その構造中にその後に固体支持体（マイクロアレイ、マイクロビーズ、ナノ粒子）上に捕捉するように設計された固着オリゴヌクレオチド配列、連結生成物（磁気粒子、オリゴヌクレオチドコード化配列）の濃縮又は操作を促進する分子ハンドル、及びＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼのような酵素を介して連結生成物のその後の２次増幅を促進するプロモータ配列も含むことができる。
【００５４】
[0066]  本発明の連結反応は迅速に進行し、問題の１つ又は複数の標的に対して特異的であり、標的ごとに連結生成物の複数のコピーを生成することができ、その結果、検出可能な信号が増幅される（本明細書では「生成物の代謝回転」と呼ぶことがある）。本発明の連結反応は外部から追加されるリガーゼの存在も追加の酵素も必要としないが、以下で説明するように、幾つかの副反応がポリメラーゼのような酵素の使用に依存することもある。連結化学は、上述した化学部分の多くから選択することができる。好ましい化学は日常の製造技術に容易に組み込める、保存中に安定している、及び適切に設計された連結プローブセットに組み込まれた場合に標的特異的連結に対して大きい優先性を実証するものである。また、その後に酵素による増幅を含む実施形態では、酵素によって効率的に処理できる連結生成物をもたらす連結化学及びプローブの設計（非天然のヌクレオチド類似体を含む）が好ましい。標的の増幅は連結生成物の代謝回転も含むことができ、これは例えば連結生成物が別個の連結プローブよりもテンプレート又は標的核酸に対する親和性が低いか、又は同等である不安定化、又は余分なプローブの存在下での標準的な熱サイクルによって実行する。したがって、ハイブリダイズしたプローブが連結されると、連結生成物が標的から解放され、標的を自由にして、新しい連結反応のテンプレートとして働く。
【００５５】
[0067]  本発明の他の態様では、また以下で更に詳細に説明するように、本発明のアッセイの特異性は、標的捕捉プローブを使用することにより任意選択で改良される。本発明の標的捕捉プローブは、標的核酸及び捕捉部分上のドメインに対して相補的であるドメインを含む。標的捕捉プローブは連結プローブとの連結反応に関与せず、代わりに連結プローブの上流又は下流の標的核酸にハイブリダイズするように設計される。標的捕捉プローブが標的核酸とハイブリダイズすると、標的核酸、標的捕捉プローブ、及び標的核酸上に形成される任意の連結生成物を含む標的複合体を生成する。これで、標的複合体を表面又は基質（ビーズなど）に結合することができ、結合していない反応物があればすべて、表面又は基質に結合した標的複合体から分離することができる。したがって、その後のすべての増幅及び／又は検出工程は、連結プローブとのハイブリダイゼーションに成功した標的核酸の元のサンプルのサブセット上で実行されるので、その後のアッセイの特異性が改良される。
【００５６】
[0068]  本発明の上記及び他の態様及び実施形態を、以下のセクションで更に詳細に説明する。
【００５７】
ＩＩ．サンプル
[0069]  一態様では、本発明はサンプル中の標的核酸（本明細書では「標的配列」とも呼ぶ）の有無を検出する組成物及び方法を提供する。当業者に認識されるように、サンプルは任意の数の物質を含むことができ、それは体液（事実上すべての器官の血液、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門及び膣分泌物、汗及び精液を含むが、これらに限定されず、哺乳類のサンプルが好ましく、ヒトのサンプルが特に好ましい）と、環境サンプル（空気、農業、水及び土壌サンプルを含む）と、植物材料と、生物兵器サンプルと、研究用サンプル（例えばサンプルは増幅反応の生成物、例えばゲノムＤＮＡの一般的増幅の生成物でもよい）と、精製ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質などの精製サンプルと、未処理サンプル（細菌、ウイルス、ゲノムＤＮＡなど）とを含むが、これらに限定されず、当業者に認識されるように、事実上どんな実験操作でもサンプルで実施することができる。標的配列としてｓｉＲＮＡ及びマイクロＲＮＡを使用する実施形態もある（Zhang他、J Cell Physiol. (2007)210(2):279-89；Osada他、Carcinogenesis. (2007)28(1):2-12；及びMattes他、Am J Respir Cell MOl Biol. (2007)36(1):8-12：それぞれを、すべての目的のために、特に標的配列に関するすべての教示を、参照によりその全内容を本明細書に組み込むものとする）。
【００５８】
[0070]  本発明の幾つかの実施形態は、保存（例えば凍結及び／又はアーカイブ保管）組織又は新鮮な組織からのサンプルを使用する。パラフィン包埋サンプルが多くの実施形態で特に有用である。何故なら、これらのサンプルはサンプルに付随する追加のデータが存在するので、診断及び予後に非常に有用な場合があるからである。本明細書で説明するような固定してパラフィン包埋した組織は、保存可能又はアーカイブ保管組織サンプルを指す。患者由来の病理学的サンプルは大部分が、組織分析及びその後のアーカイブ保管を可能にするために、日常的に固定し、パラフィン包埋する。このようなサンプルは、多くの場合、従来の核酸検出法には有用でない。何故なら、このような研究では核酸の発現を正確に測定できるように核酸サンプルの高度の完全性が必要だからである。多くの場合、パラフィン包埋サンプルの遺伝子発現研究は免疫組織化学的染色を使用してタンパク質の発現レベルを監視する定性監視に限定される。
【００５９】
[0071]  すべての目的のために、特にパラフィン包埋サンプルからの核酸の精製に関する全教示に関して、参照によりその全内容を本明細書に組み込むものとする国際特許ＷＯ２００７／１３３７０３号に記載されているように、固定されたパラフィン包埋サンプルから核酸を精製する幾つかの技術が存在する。Foss他のDiagnostic Molecular Pathology, (1994)3:148-155及びPaska, C.他のDiagnostic Molecular Pathology, (2004)13:234-240によって説明された方法、更にAmbionのRecoverall Total Nucleic acid Isolationキットのような市販のキットの全体を参照により組み込むものとする。一般的な方法は、キシレン又は他の有機溶媒での抽出により組織からパラフィンを除去する工程で開始し、その後に熱、及び組織及びタンパク質を分割して組織からゲノム材料を解放するのを助けるプロテイナーゼＫのようなプロテアーゼで処理する。解放された核酸を、次に膜上で捕捉するか、溶液から沈殿させ、洗浄して不純物を除去し、ｍＲＮＡ分離の場合はＤＮアーゼ処理工程を追加して、望ましくないＤＮＡを分解することがある。
【００６０】
[0072]  本明細書で更に詳細に説明するように、標的分析物、及び標的分析物の検出に使用される連結プローブは両方とも、本発明により核酸を含むことができる。本明細書では、「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は文法的にその同等である語は、相互に共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。標的核酸はＤＮＡ又はＲＮＡを含むことができる。本発明の核酸は、（例えば標的配列の場合は）一般的にホスホジエステル結合を含むが、場合によっては、以下で概略説明するように、例えばホスホラミド（Beaucage他、Tetrahedron (1993)49(10):1925及びその中の参考文献；Letsinger, J. Org. Chem. (1970)35:3800；Sprinzl他、Eur. J. Biochem. (1977)81:579；Letsinger他、Nucl. Acids Res. (1986)14:3487；Sawai他、Chem. Lett. (1984)805；Letsinger他、J. Am. Chem. Soc. (1988)110:4470；及びPauwels他、Chemica Scripta (1986)26:141）、ホスホロチオエート（Mag他、Nucleic Acids Res. (1991)19:1437；及び米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Briu他、J. Am. Chem. Soc. (1989)111:2321）、Ｏ−メチルホスホラミダイトリンケージ（EcksteinのOligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press参照）、及びペプチド核酸バックボーン及びリンケージ（EgholmのJ. Am. Chem. Soc. (1992)114:1895；Meier他のChem. Int. Ed. Engl. (1992)31:1008；NielsenのNature, (1993)365:566；Carlsson他のNature (1996) 380:207を参照。これらのすべてを参照によりその全文を本明細書に組み込むものとする）を含む代替バックボーン（特に連結、ラベル又は捕捉プローブとともに使用する）を有することができる核酸類似体が含まれる。他の類似核酸にはロックト核酸（Koshkin他、J. Am. Chem. Soc.(1998) 120:13252 3）、陽性バックボーン（Denpcy他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995)92:6097）、非イオン性バックボーン（米国特許第5,386,023号、第5,637,684号、第5,602,240号、第5,216,141号、及び第4,469,863号；Kiedrowshi他、Angew. Chem. Intl. Ed. English (1991)30:423；Letsinger他、J. Am. Chem. Soc. (1988)110:4470；Letsinger他、Nucleoside & Nucleotide (1994)13:1597；ASC Symposium Series 580第２章及び第３章、Y. S. Sanghui及びP. Dan Cook編集；Mesmaeker他、Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. (1994)4:395；Jeffs他、J. Biomolecular NMR (1994)34:17；Xu他、Tetrahedron Lett. (1996)37:743）、及び米国特許第５，２３５，０３３号及び第５，０３４，５０６号、及びASC Symposium Series 580（Y.S. Sanghui及びP. Dan Cook編集）第６章及び第７章で説明されているような非リボースバックボーンなどの二環構造を有するものが含まれる。１つ又は複数の炭素環糖を含有する核酸も、核酸の定義に含まれる（Jenkins他のChem. Soc. Rev. (1995)pp 169-176を参照）。幾つかの核酸がRawlsのC & E News１９９７年６月２日号３５ページに説明されている。これらの参考文献はすべて、すべての目的のために、特に核酸に関するすべての教示を参照により明示的に本明細書に組み込むものとする。ラベル又は他の部分の追加を促進する、生理学的環境におけるこのような分子の安定性及び寿命を増加又は現象させるなどのために、リボースリン酸バックボーンのこれらの変性を実行することができる。
【００６１】
[0073]  例えば、本発明の連結部分を使用すると、場合によっては使用する化学に応じて、連結生成物と同様の核酸類似体になることがある。例えば、以下のスキーム１に示すように、特定の連結部分を使用すると、ホスホチオエステル結合になる。
【００６２】
[0074]  当業者に認識されるように、これらの核酸類似体はすべて本発明に用途がある。また、天然由来の核酸と類似体との混合物を作成することができ、例えば連結部分の部位にて類似構造を使用することができる。あるいは、様々な核酸類似体の混合物、及び天然に発生した核酸と類似体との混合物を作成することができる。
【００６３】
[0075]  核酸類似体は例えばペプチド核酸（ＰＮＡ、参照によりその全文を本明細書に組み込むものとする国際特許９２／２０７０２号）、及びロックされた核酸（ＬＮＡ、Koshkin AA他、Tetrahedron (1998)54:3607-3630、Koshkin AA他、J. Am. Chem. Soc. (1998)120:13252-13253.、Wahlestedt C他、PNAS (2000)97:5633-5638、それぞれを参照によりその全文を本明細書に組み込むものとする）を含むことができる。幾つかの用途では、このタイプの類似体バックボーンは改良されたハイブリダイゼーションの動態、改良された熱安定性、及びミスマッチ配列に対する改良された感度を呈することができる。
【００６４】
[0076]  核酸は、規定されているように一本鎖又は二本鎖であるか、又は二本鎖又は一本鎖配列の両方の一部を含む場合がある。核酸はＤＮＡ、ゲノム及びｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、又は核酸がデオキシリボ−及びリボ−ヌクレオチドの任意の組み合わせを含むハイブリッド、及び任意の塩基の組み合わせ、例えば天然由来の核酸塩基（ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン）、及び非天然由来の核酸塩基（イノシン、キサタニン、ハイポキサタニン、イソシトシン、イソグアニン、５−メチルシトシン、偽性イソシトシン、２−チオウラシル及び２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９（２，６−ジアミノプリン）、ハイポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）及びＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル）などでよい。本明細書で使用する「核酸塩基」という用語は「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」と、核酸類似体の単量体との両方を含む。したがって、例えばそれぞれが塩基を含有するペプチド核酸の個々の単位を、本明細書では核酸塩基と呼ぶ。
【００６５】
[0077]  １つ又は複数の標的配列の領域内に一本鎖状態で存在しない核酸サンプル（例えば標的配列）は、通常、検出又はハイブリダイゼーション前にこのような１つ又は複数の領域内で一本鎖になる。通常、核酸サンプルは、熱又は化学的変性を使用して標的配列の領域内で一本鎖にすることができる。増幅により取得されたポリヌクレオチドの場合、一本鎖の増幅生成物を生成するのに適切な方法が好ましい。一本鎖の増幅生成物のポリヌクレオチドを生成するために適切な増幅プロセスの非限定的な例には、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼランオフ転写、ＲＣＡ、非対称ＰＣＲ（Bachmann他、Nucleic Acid Res. (1990)18:1309）、及び非同時性ＰＣＲ（国際特許ＷＯ０１／９４６３８号）が含まれるが、これらに限定されない。ＰＮＡオープナ（米国特許第６，２６５，１６６号）の使用など、二本鎖のポリヌクレオチドの領域を一本鎖にするために一般的に知られている方法は、ポリヌクレオチド上に一本鎖の標的配列を生成するためにも使用することができる。
【００６６】
[0078]標的核酸
[0079]  本明細書で更に説明するように、本発明は標的配列を検出する方法及び組成物を提供する。本明細書では、「標的配列」又は「標的核酸」又はその文法的同義語は、核酸の一本鎖上にある核酸配列を意味する。標的配列は、遺伝子、制御配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ及びＲＮＡ、又はその他の一部である場合がある。本明細書で概略説明するように、標的配列は、サンプル、又は増幅反応の生成物のような２次標的などからの標的配列でよい。これは任意の長さでよく、長い配列ほど特異性が高いことが理解される。当業者に認識されるように、相補的標的配列は多くの形態をとることができる。例えば、より大きい核酸配列、すなわち遺伝子又はｍＲＮＡの全体又は一部、プラスミド又はゲノムＤＮＡの制限フラグメントなどの中に含むことができる。これらの組み合わせのいずれか、及びすべてが特定のアッセイにて標的核酸の働きをすることができる。多くの場合は、多数のアッセイが実施され、例えば以下で更に詳細に説明するような遺伝子発現のプロファイリングのために、複数の標的配列が同時に検出される。
【００６７】
[0080]  一般的に、各標的配列は複数の異なる標的ドメインで構成される。各標的配列は、以下で説明するように、１セットの連結プローブ、又はそれ以上にハイブリダイズするために、少なくとも１対の連結ドメインを有する。例えば自発的化学的連結が可能であるほど化学的連結部分を空間的に十分に近づけるように、例えば、サンプル標的配列の第１の標的ドメインを第１の連結プローブとハイブリダイズさせ、標的配列の第２の標的ドメインを第２の連結プローブとハイブリダイズさせることができる。
【００６８】
[0081]  一般的に、標的連結ドメインの各対は相互に隣接する、すなわち２つのドメインを分離するヌクレオチドはない。これで、標的配列の一般的検出（例えば標的配列としてｍＲＮＡを使用する遺伝子発現プロファイリング）と、以下で説明するような転移反応との両方、更に一塩基多型（ＳＮＰ）の検出に用途が見出される。ＳＮＰ検出の場合、標的配列は配列情報を取得したい位置を含み、これは本明細書で一般的に「検出位置」と呼ばれる。幾つかの実施形態では、検出位置は１つのヌクレオチドであるが、幾つかの実施形態では相互に隣接するか、１つ又は複数のヌクレオチドによって分離された複数のヌクレオチドを含むことができる。本明細書で使用する「複数」とは、少なくとも２つの意味である。本明細書では、ハイブリッド中の検出位置塩基と塩基対を成す連結プローブの塩基を「問い合わせ位置」と称する。
【００６９】
[0082]  各サンプル標的核酸は、追加的に連結ドメインの複数の対を有することができる。すなわち、１セット、２セット、３セット又はそれ以上の連結プローブを、図１１又は図１２に全体的に示すように、多数の位置で同じ標的配列とハイブリダイズすることができる。以下で更に詳細に概略説明するように、標的核酸ごとに多数の連結ドメインを使用すると、サンプル中の標的核酸（及び／又は元のサンプル）の完全性を評価するベースとして働くことができる。
【００７０】
[0083]  サンプル標的核酸は、連結ドメイン以外に他のドメインを含むことができる。特定の実施形態では、本発明の標的核酸は、標的捕捉ドメインがハイブリダイズできる相手である標的捕捉ドメインを含む。一般的に、図１１に示すように、アッセイの目的に応じて、標的捕捉ドメインは、標的核酸の連結ドメインのうち１つ又は複数の「上流」、「下流」、又は「中間」にあってもよい。
【００７１】
[0084]  規定されていない限り、「第１」及び「第２」という用語は、標的配列の５’−３’方向に対する配列の方向を与える意味ではない。例えば、相補的標的配列の５’−３’方向を想定すると、第１の標的ドメインは第２のドメインに対して５’又は第２のドメインに対して３’の位置にあってもよい。参照を容易にするためであり、限定するものではなく、これらのドメインを「上流」及び「下流」と呼ぶことがあり、通常の用法では標的配列は５’から３’の方向に表示される。しかし、連結ドメインは、連結プローブセットの３’及び５’連結部分が完全に隣接して（例えば介入する核酸塩基がない状態で）ハイブリダイズするか、又は連結部分に付着するリンカーが連結できる距離以内でハイブリダイズするような方向を有することに留意されたい。
【００７２】
[0085]  幾つかの実施形態では、標的連結ドメインの対を分離することができる。例えば幾つかの事例では、連結増幅することが望ましい場合、連結プローブはリンカーを使用し、標的配列の１つ又は複数の核酸塩基によってハイブリダイズする場合に分離して、連結生成物にハイブリダイゼーションの不安定性を与えることがある。他の用途では、以下で更に詳細に説明するように、本発明の緩衝剤はサンプル中の核酸、特にＲＮＡの安定化に有用である。本発明の幾つかの態様では、サンプルを本発明の緩衝剤中に採取する。他の実施形態では、以下で更に詳細に説明するように、このような緩衝剤は変性剤、還元剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝剤、ＥＤＴＡ、及びこれらの任意の組み合わせのうち１つ又は複数を含む。
【００７３】
ＩＩＩ．緩衝剤
[0086]  一態様では、本発明は核酸（本明細書では「サンプル核酸」又は「標的核酸」とも呼ぶ）を安定化させる方法及び組成物を提供する。本明細書で使用する「安定化」とは、サンプル中の核酸が、周囲室温以上である期間にわたって保存された場合でも分解に対する耐性があることを意味する。幾つかの実施形態では、本発明の緩衝剤に含有される核酸は、室温以上でも約１日間から約３カ月間安定している。安定性は、以下で更に説明するような核酸完全性のアッセイなど、当技術分野で知られている任意の手段を使用して測定することができる。他の実施形態では、本発明の緩衝剤に含有される核酸を含むサンプルは、緩衝剤中で保存されたサンプル中の核酸の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％が、緩衝剤中で保存されていなかったサンプルよりも低い分解率を示す場合、緩衝剤中で保存されていなかったサンプルと比較して安定性が上昇していると評価される。更に他の実施形態では、少なくともサンプル中の核酸の大部分が緩衝剤中で保存されていなかったサンプルと比較して分解の減少を示す場合、サンプルは本発明の緩衝剤によって安定化されたと識別される。ＲＮＡサンプルの安定性は、多くの場合、核酸サンプルの平均サイズの測定に頼るキャピラリ電気泳動測定法によって評価する。安定化したサンプルは、安定化していないサンプルよりも長い平均サイズを有する。本発明の別の態様は、標的核酸の平均サイズ、及び相関関係によって標的核酸の分解レベルを評価するために使用することができる１つ又は複数の標的捕捉プローブと組み合わせて、多数の連結プローブセットを使用することである。
【００７４】
[0087]  本発明の緩衝剤は、任意選択で、又は任意の組み合わせで、変性剤、還元剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝剤、ＥＤＴＡなどのキレート剤、及びこれらの任意の組み合わせを含むことができる。認識されるように、本発明の緩衝剤は同じクラス内に多数のタイプの成分を含むことができ、例えば本発明の緩衝剤は、１つ又は複数のタイプの界面活性剤との組み合わせで、１つ又は複数の異なる種類の変性剤を含むことができ、以下同様である。
【００７５】
[0088]  本発明の緩衝剤の利点は、サンプル中のＲＮＡなどの核酸を安定化させるために使用することができ、これでサンプルを、本明細書で説明する方法に従って緩衝溶液から直接分析することができることである。すなわち、本発明の緩衝溶液に含有されるサンプルは、ＲＮＡを単離又は精製せずに、本明細書で説明する化学的連結及び検出方法にかけることができる。本発明の緩衝剤の別の利点は、緩衝剤中のサンプルを採取すると細胞溶解が生じ、したがってサンプルから標的核酸を解放するために追加の溶解工程を必要としないことである。
【００７６】
[0089]  例示的実施形態では、ＲＮＡを含むサンプルは、塩酸グアニジニウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、Triton X-100、及びTris-HCLを７．５のｐＨで含む緩衝溶液中で化合させることができる。別の実施形態では、ＲＮＡを含むサンプルは、グアニジニウムイソチオシアネート、ＥＤＴＡ、ＤＴＴ、Triton X-100、及びTris-HClを７．５のｐＨで含む緩衝溶液中で化合させることができる。ＲＮＡはこのような緩衝溶液中で安定しており、ＲＮＡの分解を促進するような他のサンプル成分からＲＮＡを単離する必要がない。
【００７７】
[0090]  他の実施形態では、本発明の緩衝剤はＲＮＡの２次構造を解く助けをすることにより、本明細書で説明する方法及びアッセイの反応及び結合効率を向上させる効果を有する変性剤、特にカオトロピックカチオンを含むことが好ましい。一般的なカオトロピック分子は塩酸グアニジニウム、グアニジニウムイソチオシアネート、ベタイン又はグリクリンベタイン、尿素、チオ尿素、及び過塩素酸リチウムである。理論に拘束されることなく、核酸の３次構造を破壊するのに効果的であるカオトロピック剤が好ましく、溶液中の核酸標的の可溶性も維持するカオトロピック剤が特に有利である。本発明の緩衝剤、特にカオトロピックカチオンを含む緩衝剤の利点は、緩衝剤が溶液中のサンプルの核酸を維持することである。これは、血液系検査の輸送システムに使用される他の従来からの緩衝剤とは対照的であり、後者はサンプルの核酸（特にＲＮＡ）の周囲にカチオン殻を析出／形成する傾向がある。本発明の緩衝剤は溶液中の核酸を維持し、本発明のアッセイの化学的連結法は酵素を必要としないので、サンプルを緩衝剤中に採取することができ、連結プローブ（及び多くの実施形態では標的捕捉プローブ）をサンプルに追加して、連結生成物を形成することができる。連結生成物又は標的複合体を更に分析するために、そのハイブリダイゼーション条件を変化させて、次に解放するために、サンプルと緩衝剤を簡単に希釈して、変性剤を希釈し、それによってハイブリダイゼーション条件を変化させ、したがって本明細書で説明し、当技術分野で知られている方法のいずれを使用しても核酸の分析を可能にすることができる。
【００７８】
[0091]  他の実施形態では、本発明の緩衝剤は約５から約８．５のｐＨを有する。緩衝溶液は約６から８のｐＨを有することが更に好ましく、約７．３又は７．５のｐＨが更に好ましい。
【００７９】
[0092]  以下のセクションでは、例示的緩衝剤成分を更に詳細に説明する。これらの成分をそれぞれ別個に説明するが、本発明は以下の緩衝剤成分、更に当技術分野で知られている任意の他の成分の任意の組み合わせを包含する。
【００８０】
変性剤
[0093]  好ましい実施形態では、本発明の緩衝剤は１つ又は複数の変性剤を含む。本明細書で使用する変性剤とは、２次及び３次構造を喪失して核酸の二重らせんを解く働きをする任意の物質を意味する。他の実施形態では、変性剤はカオトロピックカチオン、例えば塩酸グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ）及びグアニジニウムイソチオシアネートを含むが、これらに限定されない。
【００８１】
[0094]  他の実施形態では、変性剤は塩酸グアニジニウムであり、これは約１モルから約８モルの濃度、更に好ましくは約２モルから約４モルの濃度、更に好ましくは約３モルの濃度で存在する。他の実施形態では、本発明の緩衝剤中のＧｕＨＣｌの濃度は、約０．２〜１０、０．５〜９、１〜８、１．５〜７、２〜６、２．５〜５、及び３．０〜４．０モルの範囲である。更に他の実施形態では、本発明の緩衝剤中のＧｕＨＣｌの濃度は約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５モルの範囲である。
【００８２】
[0095]  他の実施形態では、変性剤はグアニジニウムイソチオシアネートであり、それは約１モルから約８モルの濃度、更に好ましくは約２モルから約４モルの濃度、更に好ましくは約３モルの濃度で存在する。他の実施形態では、本発明の緩衝剤中のグアニジニウムイソチオシアネートの濃度は、約０．２〜１０、０．５〜９、１〜８、１．５〜７、２〜６、２．５〜５、及び３．０〜４．０モルの範囲である。更に他の実施形態では、本発明の緩衝剤中のグアニジニウムイソチオシアネートの濃度は約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５モルの範囲である。
【００８３】
[0096]  認識されるように、当技術分野で知られている他の変性剤を、本発明の緩衝剤中に、塩酸グアニジニウム及びグアニジニウムイソチオシアネートに関して以上に列記したものと同様の濃度で使用することができる。
【００８４】
[0097]  幾つかの実施形態では、グアニジニウム塩などの高濃度の塩を使用する場合のように、これらの試薬も溶解剤として働く。当業者に認識されるように、一般的に、細胞溶解剤としても働く変性剤の使用は特に有益であるが、本発明は第１の分離溶解工程を使用した後に変性剤を添加することも想定する。
【００８５】
界面活性剤
[0098]  幾つかの実施形態では、本発明の緩衝剤は１つ又は複数の界面活性剤を含む。他の実施形態では、界面活性剤はTriton X-100及びナトリウムＮ−ラウロイルサルコシンを含むが、これらに限定されない。
【００８６】
[0099]  他の実施形態では、界面活性剤は本発明の緩衝剤中に重量で約０．１％から約５％の濃度で存在する。更に他の実施形態では、界面活性剤は重量で約０．１％〜１０％、０．５％〜９．５％、１％〜９％、１．５％〜８．５％、２％〜８％、２．５％〜７．５％、３％〜７％、３．５％〜６．５％、４％〜６％、及び４．５％〜５．５％の濃度で存在する。好ましい実施形態では、界面活性剤は約０．５％から約３％の濃度を有する。他の実施形態では、界面活性剤は重量で約１．５％の濃度を有する。
【００８７】
ｐＨ緩衝剤
[0100]  幾つかの実施形態では、本発明の緩衝剤は１つ又は複数のｐＨ緩衝剤を含む。このようなｐＨ緩衝剤はTrisを含むが、これらに限定されない。他の実施形態では、ｐＨ緩衝剤は当業者に知られている多くの中の１つでよい。一般的に、本発明に使用されるｐＨ緩衝剤は、オペレーティングｐＨの１ｐＨ単位内にｐＫａを有する薬剤を含む。
【００８８】
[0101]  幾つかの実施形態では、ｐＨ緩衝剤は本発明の緩衝剤中に約１０ｍＭから約１００ｍＭの濃度で存在する。好ましい実施形態では、ｐＨ緩衝剤は約２０ｍＭから約５０ｍＭの濃度を、更に好ましくは約３０ｍＭの濃度を有する。他の実施形態では、ｐＨ緩衝剤は、約５〜１５０、１０〜１４０、１５〜１３０、２０〜１２０、２５〜１１０、３０〜１００、３５〜９０、４０〜８０、４５〜７０、及び５０〜６０ｍＭの濃度を有する。
【００８９】
還元剤
[0102]  幾つかの実施形態では、本発明の緩衝剤は１つ又は複数の還元剤を含む。このような還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びメルカプトエタノールを含むことができるが、これらに限定されない。
【００９０】
[0103]  他の実施形態では、還元剤は約１ｍＭから約１００ｍＭの濃度を有する。好ましい実施形態では、還元剤は約４ｍＭから約７ｍＭの濃度、更に好ましくは約５ｍＭの濃度を有する。更に他の実施形態では、還元剤は、約０．５〜１０、１〜９．５、１．５〜９、２〜８．５、２．５〜８、３〜７．５、３．５〜７、４〜６．５ｍＭの濃度を有する。更に他の実施形態では、還元剤は、約１〜１５０、１０〜１４０、１５〜１３０、２０〜１２０、２５〜１１０、３０〜１００、３５〜９０、４０〜８０、４５〜７０、及び５０〜６０ｍＭの濃度を有する。
【００９１】
ＥＤＴＡ
[0104]  他の実施形態では、本発明の緩衝剤は約１ｍＭから約１００ｍＭの濃度でＥＤＴＡを含有する。更に好ましくは、ＥＤＴＡは約１０ｍＭから約５０ｍＭの濃度、更に好ましくは約２０ｍＭの濃度を有する。他の実施形態では、ＥＤＴＡは、約１〜１５０、１０〜１４０、１５〜１３０、２０〜１２０、２５〜１１０、３０〜１００、３５〜９０、４０〜８０、４５〜７０、及び５０〜６０ｍＭの濃度で存在する。更に他の実施形態では、ＥＤＴＡは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ｍＭの濃度を有する。
【００９２】
追加の緩衝剤成分
[0105]  本発明の緩衝剤は、当技術分野で知られている任意の追加成分、特に核酸を伴う反応に有用であると当技術分野で知られている成分を含む。追加成分はアジュバント、希釈剤、結合剤、安定化剤、塩（ＮａＣｌ及びＭｇＣｌ2を含む）、親油性溶媒、保存剤などを含むことができるが、これらに限定されない。緩衝剤成分は医薬品賦形剤及び添加剤、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、及び炭水化物（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、及びオリゴ糖を含む糖類と、アルジトール、アルドン酸、エステル型糖などの誘導糖類と、多糖類又は糖ポリマー）も含むことができ、これらは単独で、又は化合して存在することができ、単体又は化合して重量又は体積で１〜９９．９９％を含む。例示的なタンパク質賦形剤にはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清アルブミン、組み換え型ヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどが含まれる。緩衝能でも機能することができる代表的なアミノ酸／抗体成分には、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどが含まれる。炭水化物賦形剤も本発明の範囲内にあるものとされ、その例には果糖、麦芽糖、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなどのような単糖と、乳糖、蔗糖、トレハロース、セロビオースなどのような二糖と、ラフィノース、メレチトース、マルトデキストリン、デキストラン、澱粉などのような多糖と、マンニトール、キシリトール、マルチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）及びミオイノシトールなどのアルジトールとが含まれるが、これらに限定されない。
【００９３】
本発明の緩衝剤の使用
[0106]  本発明の緩衝剤は、本明細書で説明するサンプル採取、化学的連結、又はアッセイのいずれとでもともに使用することができる。
【００９４】
[0107]  幾つかの実施形態では、標的核酸を含有するサンプルを本発明の緩衝剤中に採取する。本発明の緩衝剤の利点は、サンプルに含有される核酸を安定化する傾向があることである。したがって、採取直後に特にＲＮＡで発生しはじめることが多い分解が、本発明の緩衝剤によって少なくともある程度は防止され、本発明の方法を使用するさらなる分析のために、頑健な標的核酸のセットという利点を提供する。
【００９５】
[0108]  他の実施形態では、サンプルを本発明の緩衝剤中に採取すると、標的核酸を精製せずに、連結プローブ及び任意選択で標的捕捉プローブ（これについては以下で詳細に更に説明する）を緩衝剤中のサンプルに直接追加することができる。幾つかの実施形態では、緩衝剤中のサンプルは、プローブ（連結及び標的捕捉プローブを含む）を追加する前に最初に希釈する。本発明の連結方法は酵素に依存していないので、サンプルから核酸を精製せず、リガーゼ酵素の使用に頼らずに、連結プローブのハイブリダイゼーション及び連結を実行することができる。これは更に、サンプルの核酸で生じる分解を制限する働きをする。
【００９６】
ＩＶ．連結プローブ及び化学的連結法
[00100]  一態様では、本発明の連結プローブは配列に特異的な方法で核酸標的と相互作用することができ、プローブが、相補的化学的部分を保有する別のポリマー種と自発的な化学的連結反応できるようにする化学的部分を保有する任意のポリマー種を含む。一実施形態では、連結プローブはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、上述の修飾タイプ及び／又はその任意のハイブリッド（例えばＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッド、ＤＮＡ／ＬＮＡのハイブリッド、ＤＮＡ／ＰＮＡのハイブリッド）とすることができる。好ましい実施形態では、連結プローブはＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。
【００９７】
[0109]  本発明の連結プローブはプローブが標的ポリヌクレオチドの一部と空間的に非常に近接して結合すると、プローブ間に化学的連結反応が生じるように設計される。一般的に、プローブは化学反応性部分（本明細書では一般的に「連結部分」と呼ぶ）を含み、特定の方向で標的ポリヌクレオチドと結合し、したがって化学反応性部分が空間的に非常に近接して、その結果、リガーゼ酵素を使用せずに生じることができる自発的連結反応となる。
【００９８】
[0110]  一実施形態では、本発明は連結プローブのセット、通常は第１及び第２の連結プローブを提供するが、本明細書で説明するように、幾つかの実施形態は３つ以上を使用する。また本明細書に記載するように、幾つかの事例では、連結ではなく転移反応が実行され、「連結プローブ」が「転移プローブ」を含む。各連結プローブは、実質的に標的ドメインのうち１つと相補的であり、「連結ドメイン」又は「プローブドメイン」と呼ばれることもある核酸部分を含む。本発明のプローブは、標的配列と相補的であるように設計され、したがって標的配列と本発明のプローブとのハイブリダイゼーションが生じる。本明細書で概略説明するように、相補性は完璧である必要はなく、標的配列と本発明のプローブとの間のハイブリダイゼーションに介入する任意の数の塩基対のミスマッチがあってもよい。しかし、厳密さが最低のハイブリダイゼーション状態でさえ、ハイブリダイゼーションが発生できないほど変異の数が大きい場合、その配列は相補的配列ではない。したがって、本明細書の「実質的に相補的」とは、通常の反応状態で標的配列がハイブリダイズするほど、プローブが十分に相補的であることを意味する。「同一」配列とは、核酸塩基の短い方の配列の長さにわたって、完璧な相補性が存在する配列である。本発明では、高い、中位、及び低い厳密性の状態など、本発明では様々なハイブリダイゼーション状態を使用することができる。例えば、参照により本明細書に組み込むものとするManiatis他のMolecular Cloning: A Laboratory Manual第２版(1989)、及びAusubel他のShort Protocols in Molecular Biologyを参照されたい。ハイブリダイゼーション状態は、当技術分野で知られているように、非イオン性バックボーン、例えばＰＮＡを使用する場合にも変化することがある。
【００９９】
[0111]  本発明の一態様では、プローブの長さは、標的配列の長さ、必要な特異性、反応（例えば連結又は転移）、及びハイブリダイゼーション及び洗浄状態とともに変化するように設計される。一般的に、この態様では連結プローブは約５個から約１５０個の核酸塩基の範囲であり、約１５個から約１００個であることが好ましく、約２５個から約７５個が特に好ましい。一般的に、これらの長さは連結及び転移プローブに同等に当てはまる。
【０１００】
[0112]  本明細書で「ＣＬＰＡ−ＣＥ」と呼ばれ、以下で更に詳細に説明する本発明の別の実施形態では、プローブの長さは関連する標的ごとに変化するように設計され、それにより長さの変動に基づいて識別し、分析することができる連結生成物が生成される。
【０１０１】
[0113]  本発明の連結プローブは、ポリヌクレオチド標的に対して特異的であるように設計される。これらのプローブは、相互に対して空間的に非常に近接した状態で標的に結合し、化学的に反応性の連結部分が空間的に非常に近接するような方法で配向される。一態様では、２つ以上のプローブが標的ポリヌクレオチドの隣接部位付近に結合するように設計される。好ましい実施形態では、一方のオリゴヌクレオチドプローブの５’末端にある連結部分が、他方のプローブの３’末端にある連結部分と相互作用できるように、２つのプローブが標的に結合する。好ましい実施形態では、外部のリガーゼ酵素を使用せずに連結部分間の連結反応が生じ、本明細書では「化学的連結」とも呼ばれる。連結部分が存在するので、連結プローブのセットがリガーゼを使用して連結することがないことに留意されたい。
【０１０２】
[0114]  ＳＮＰ検出の場合、１セットの連結プローブは、場合によっては実際に３つ、４つ又は５つの異なる連結プローブを含み、その一部は対立遺伝子に特異的である。「対立遺伝子に特異的」なプローブ又はプライマーとは、標的配列とハイブリダイズし、対立遺伝子同士を区別するプローブ又はプライマーの意味である。この場合、例えばＳＮＰが（図１３に示すように）二対立遺伝子である場合、連結プローブ３個のセットを使用し、そのうち２個は検出位置に異なるヌクレオチドを含有する。すなわち、当技術分野で知られているように、連結複合体の接合部における不整合は、その結果、連結がなくなるか、連結量が減少する。したがって、プローブの方向に応じて、検出位置は、（図１３Ａ及び図１３Ｃに示すように）「上流」プローブ又は下流プローブの末端位置にあってもよい。不整合は、プローブの内部に位置決めすることもでき、不整合の区別は、（図１３Ｂに示すように）結合強度の差、又は不整合区別プローブのＴｍに基づく。二対立遺伝子ＳＮＰの場合、プローブのうち２つは同じプローブドメインを有するが、ただし標的配列上の問い合わせ位置に対応する検出位置にあるヌクレオチドは異なる。したがって、患者が同型接合体（Ｔ／Ｔ又はＣ／Ｃ）であるか異型接合体（Ｔ／Ｃ又はＣ／Ｔ）であるかに応じて、プローブ間の連結が生じる。更に、本発明では、通常、不整合の検出連結プローブ間に追加の違いがあり、それによってどのプローブが優先的に連結したかを容易に識別することができる。例えば、「Ａ」対立遺伝子プローブはヌクレオチド１５個の可変スペーサ配列（１５量体）を有することができ、「Ｇ」対立遺伝子プローブはヌクレオチド２０個の可変スペーサ配列（２０量体）を有することができ、プローブは異なる捕捉ドメイン又はラベル配列を有することができるなどである。
【０１０３】
[0115]  同様に、当業者に認識されるように、三対立遺伝子又は四対立遺伝子ＳＮＰは、セット中に４つの連結プローブ（３つのプローブは同じ標的ドメインがあり、１つは他の標的ドメインがある）又は５つの連結プローブ（４つのプローブは同じ標的ドメインがあり、１つは他の標的ドメインがある）を使用する。
【０１０４】
[0116]  プライマー及びプローブ核酸のサイズは、当業者に認識されるように、プローブの各部分とともに変化することがあり、プローブの全長は一般的にヌクレオチド５個から５００個の長さで変動する。各部分は、好ましくは使用及び増幅技術に応じて１０個と１００個の間が好ましく、１５個と５０個の間が特に好ましく、１０個から３５個が殊更好ましい。したがって、例えばプローブのユニバーサルプライミング部位はそれぞれヌクレオチド約１５〜２０個の長さであることが好ましく、１８個であることが殊更好ましい。プローブのアダプタ配列は、ヌクレオチド１５〜２５個の長さであることが好ましく、２０個が殊更好ましい。プローブの標的特異的部分は、ヌクレオチド１５〜５０個の長さであることが好ましい。また、プライマーは追加の増幅プライミング部位を含むことができる。好ましい実施形態では、追加の増幅プライミング部位はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプライミング部位である。
【０１０５】
[0117]  本発明によれば、幾つかの非酵素又はテンプレート仲介の化学的連結法を使用することができる。それには、Ｎ−シアノイミダゾール、臭化シアン、及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−塩酸カルボジイミドなどのカップリング試薬を使用する化学的連結法が含まれる。Metelev, V.G.他のNucleosides & Nucleotides(1999) 18:2711、Luebke, K.J.、及びDervan, P.B.のJ. Am. Chem. Soc. (1989)111:8733、及びShabarova, Z.A.他のNucleic Acids Research (1991)19:4247を参照されたい。それぞれ、すべての目的のために、特に化学的連結に関連する全教示を、参照によりその全文を本明細書に組み込むものとする。参照によりその全体を本明細書に組み込むものとするKool（米国特許第７，０３３，７５３号）は、化学的連結及び蛍光共鳴エネルギー移行（ＦＲＥＴ）を使用して、遺伝的多型を検出することについて説明している。このプロセスの読み取り値は、蛍光強度中の溶液相変化に基づいている。参照によりその全文を本明細書に組み込むものとするTerbrueggen（米国特許公開第１２００８／０１２４８１０号）は、化学的連結法、マイクロアレイ検出を介して核酸を検出するための組成物及び試薬の使用について説明している。５’−トシラート又は５’−ヨード基を３’−ホスホロチオエート基と反応させ、その結果、硫黄原子が架橋ホスホジエステル酸素原子の１つを置換したＤＮＡ構造になる化学的連結法もある。Gryanov, S.M.及びLetsinger, R.L.のNucleic Acids Research (1993)21:1403、Xu, Y.及びKool, E.T.のTetrahedron Letters (1997)38:5595、及びXu, Y.及びKool, E.T.のNucleic Acids Research (1999)27:875を参照されたい。それぞれ、参照によりその全文を本明細書に組み込むものとする。Letsinger他（米国特許第５，７８０，６１３号、参照によりその全文を本明細書に組み込むものとする）は、隣接してテンプレート結合したオリゴヌクレオチドの不可
逆的で非酵素的な共有結合的自己連結について以前に説明しており、ここで一方のオリゴヌクレオチドは５’置換基を有し、他方のオリゴヌクレオチドは３’チオホスホリル基を有する。化学的連結法について説明したこれらの参考文献はそれぞれ、すべての目的のために、特に化学的連結に関する全教示について、参照によりその全文を本明細書に組み込むものとする。
【０１０６】
[0118]  一態様では、本発明の連結反応は転移反応を含む。この実施形態では、プローブが標的配列とハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドプローブが相互に連結して連結生成物を形成するのではなく、一方のオリゴヌクレオチドプローブから他方への分子本体（蛍光体、失活剤などのレポータ分子を含む）の核酸指向の転移が生じる。この転移反応は連結反応と類似しているが、２つ以上のプローブを接合するのではなく、プローブの一方が転移分子に連結され、他方のプローブが化学反応の「離脱」である。重要なことは、連結反応と同様に、転移反応は転移プローブの核酸標的への近位結合によって促進され、したがって転移反応が生じるほど相互に十分に近接して（例えば隣接部位で）プローブが標的核酸とハイブリダイズしていた場合にのみ、有意な信号が検出されることである。
【０１０７】
[0119]  一態様では、本発明は化学的連結の方法に関し、第１及び第２の連結プローブの連結部分が自発的に反応して、外部リガーゼがない状態で、すなわち外部リガーゼが反応に追加されず、リガーゼを使用せずに反応が進行する状態でプローブを相互に連結するような状態で、「連結基質」を形成するために少なくとも第１及び第２の連結プローブを標的核酸に結合することを含む。転移反応の場合、これは「連結基質」又は「転移基質」と呼ぶことができる。本明細書の「連結基質」は、少なくとも１つの標的核酸配列及び２つ以上の連結プローブを含む化学的連結用基質を意味する。同様に、「連結基質」の定義には、少なくとも１つの標的核酸配列及び２つ以上の転移プローブを含む「転移基質」が含まれる。いったん化学的連結工程が生じると、反応の生成物は「連結複合体」と呼ばれることがあり、連結プローブ及びまだこれとハイブリダイズされている標的を含む。
【０１０８】
[0120]  本発明の幾つかの実施形態では、例えば追加の特異性があることが望ましい場合、図３に全体的に示されているように３つ以上の連結プローブを使用することができる。この実施形態では、「中央」連結プローブも隣接するか、標的配列の１つ又は複数の核酸塩基によって分離することができる。好ましい実施形態では、連結反応は、リガーゼ酵素の存在を必要とせず、追加の（例えば外部の）リガーゼが一切ない状態で結合プローブ間に自発的に生じる。
【０１０９】
[0121]  化学的連結は、適切な状態では追加の活性化試薬又は刺激を追加せずに自発的に生じることができる。あるいは、「活性化」剤又は外部刺激を使用して、化学的連結反応を促進することができる。活性化剤の例にはカルボジイミド、臭化シアン（ＢｒＣＮ）、イミダゾール、１−メチルイミダゾール／カルボジイミド／シスタミン、Ｎ−シアノイミダゾール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）及び他の還元剤、更に紫外線、熱及び／又は圧力変化のような外部刺激が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１０】
[0122]  本明細書で概略説明するように、本発明の連結部分は幾つかの要因に応じて様々な構成になることができる。本明細書で示される化学の大部分は、一般的に３’から５’の方向に進行するホスホラミダイト反応で使用される。すなわち、樹脂は、分子の５’末端でホスホラミダイトの付着を可能にする化学を含む。しかし、当技術分野で知られているように、ホスホラミダイトを使用して、５’から３’の方向に進行することができ、したがって本発明は本明細書で概略説明するものと反対方向の部分を含む。
【０１１１】
[0123]  連結プローブ（又は転移プローブ）の各セットは、第１の連結部分と第２の連結部分のセットを含む。これらの連結部分対の識別は、使用される連結の化学に依存する。また、本明細書で説明するように、リンカー（不安定化リンカーを含むが、これに限定されない）は、一方又は両方の連結プローブのプローブドメインと連結部分との間に存在することがある。一般的に、説明を容易にするために、本明細書の説明では「上流」及び「下流」連結プローブという用語を使用することがあるが、これは限定的な意味ではない。
【０１１２】
[0124]  本明細書で説明するアッセイ及び方法のいずれかで使用するために、連結プローブの様々なセットを設計することができる。連結プローブのセットは、標的核酸の１つ又は複数の標的ドメインを検出する連結プローブを含むように設計することができ、又は様々な標的核酸を指向するように様々なプローブのセットを設計することができる。例えば、２つの連結プローブを使用する実施形態で特定の標的核酸を検出するために、連結プローブのセットは、第１のプローブ（例えば「上流プローブ」）が第１の標的ドメインを指向するプローブドメインを含むように設計される。このセットは、第１の標的ドメインに隣接して、その下流にある第２の標的ドメインを指向する第２の連結プローブ（例えば「下流プローブ」）も含む。第１及び第２の標的ドメインは、幾つかの実施形態では、１個、２個又は３個のヌクレオチドのギャップによって分離される。したがって、この連結プローブのセットは、それが指向する標的核酸の存在を識別するために検出することができる連結生成物を生成する。他の実施形態では、連結プローブの様々なセットは、様々な標的核酸を検出するように設計することができる。更に他の実施形態では、連結プローブの様々なセットが同じ標的核酸を指向するように設計され、そのような実施形態では、連結プローブの様々なセットが同じ標的核酸の様々なドメインを指向し、したがって使用される様々なプローブのセットの数に応じて、同じ標的核酸が複数の連結生成物を有することができる。認識されるように、１つの連結生成物を形成するために３つ以上の連結プローブを使用する実施形態で使用するプローブのセットを設計する場合、同様の設計を使用することができる。
【０１１３】
ハロ離脱基の化学
[0125]  本発明の一実施形態では、化学は、そのすべてを参照により本明細書に明示的に組み込むものとするGryanov, S.M.及びLetsinger, R.L.(1993)のNucleic Acids Research, 21:1403、Xu, Y.及びKool, E.T.(1997)のTetrahedron Letters, 38:5595、Xu, Y.及びKool, E.T.(1999)のNucleic Acids Research, 27:875、Arar他(1995)のBioConj. Chem., 6:573、Kool, E. T.他(2001)のNature Biotechnol 19:148、Kool, E. T.他(1995)のNucleic Acids Res, 23(17):3547、Letsinger他の米国特許第５，４７６，９３０号、Shouten他の米国特許第６，９５５，９０１号、Andersen他の米国特許第７，１５３，６５８号で概略的に説明されているような５’ハロゲン離脱基テクノロジーに基づいている。この実施形態では、第１の連結プローブはその５’末端に５’離脱基を有するヌクレオシドを含み、第２の連結プローブはその３’末端に３’チオホスホリルのような３’求核基を有するヌクレオシドを含む。５’離脱基は、例えばハロゲン種（Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ）、及び参照によりその全文を本明細書に組み込むものとするAbe及びKool, J.のAm. Chem, Soc. (2004)126:13980-13986で説明されているような基など、当業者に知られている多くの一般的な離脱基を含むことができる。本発明のこの態様の更に好ましい実施形態では、第１の連結プローブは柔軟なリンカーを通して取り付けられる５’離脱基、及び３’チオホスホリル基を有する下流オリゴヌクレオチドを有する。この構成は、反応速度の大幅な上昇につながり、その結果、連結生成物の多数のコピーが標的ごとに生成される。
【０１１４】
[0126]  「上流」オリゴヌクレオチドは、テンプレートの「上流」側（すなわち、左側、又は５’側）に結合するオリゴヌクレオチドとして、ポリヌクレオチドテンプレートの５’から３’方向に関して規定され、その５’末端として５’離脱基を含む。求核剤として硫黄、セレン、又はテルルを伴うＳN２反応に関与することが可能ないかなる離脱基も、使用することができる。離脱基とは、変性ホスホリル基の求核試薬（硫黄、セレン又はテルル）によって炭素原子が求核攻撃されると、離脱基がアニオンとして離脱するように炭素に結合した元素又は基である。適切な離脱基には、ヨウ化物、臭化物又は塩化物などのハロゲン化物、トシラート、ベンゼンスルホナート又はｐ−ニトロフェニルエステル、更にＲＳＯ3が含まれるが、これらに限定されず、ここでＲはフェニル、又はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アルキル（Ｃ１からＣ６）、ニトロ、シアノ、スルホニル及びカルボニルを含む１個から５個の原子又は基で置換されたフェニルであるか、又はＲは１個から６個の炭素を有するアルキルである。離脱基はヨウ化物であることが好ましく、上流オリゴヌクレオチドの５’末端にあるヌクレオシドは、ＤＮＡの場合、５’−デオキシ−５’−ヨード−２’−デオキシヌクレオシドである。適切な５‘−デオキシ−５’−ヨード−２‘−デオキシヌクレオシドの例には５’−デオキシ−５’−ヨードチミジン（５’−Ｉ−Ｔ）、５’−デオキシ−５’−ヨード−２’−デオキシチジン（５’−Ｉ−ｄＣ）、５’−デオキシ−５’−ヨード−２’−デオキシアデノシン（５’−Ｉ−ｄＡ）、５’−デオキシ−５’−ヨード−３−デアザ−２’−デオキシアデノシン（５’−Ｉ−３−デアザ−ｄＡ）、５’−デオキシ−５’−ヨード−２’−デオキシグアノシン（５’−Ｉ−ｄＧ）及び５’−デオキシ−５’−ヨード−３−デアザ−２’−デオキシグアノシン（５’−Ｉ−３−デアザ−ｄＧ）、及びそのホスホラミダイト誘導体が含まれるが、これらに限定されない（図２参照）。ＲＮＡオリゴヌクレオチドの場合、適切な５’−デオキシ−５’−ヨードヌクレオシドの類似例には５’−デオキシ−５’−ヨードウラシル（５’−Ｉ−Ｕ）、５’−デオキシ−５’−ヨードシチジン（５’−Ｉ−Ｃ）、５’−デオキシ−５’−ヨードアデノシン（５’−Ｉ−Ａ）、５’−デオキシ−５’−ヨード−３−デアザアデノシン（５’−Ｉ−３−デアザ−Ａ）、５’−デオキシ−５’−ヨードグアノシン（５’−Ｉ−Ｇ）及び５’−デオキシ−５’−ヨード−３−デアザグアノシン（５’−Ｉ−３−デアザ−Ｇ）、及びこれらのホスホラミダイト誘導体が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、上流連結プローブは２’−デオキシリボヌクレオチドを含むが、ただし５’離脱基を含む５’末端の変性ヌクレオチドはリボヌクレオチドである。上流ヌクレオチドのこの実施形態は有利である。何故なら、末位から２番目の２’−デオキシリボヌクレオチドと末端の５’リボヌクレオチドとの間の結合は、塩基を使用して分割しやすいからである。これによって、以下で更に詳細に説明するように例えば固体支持体に結合されたオリゴヌクレオチドプローブを再使用する可能性ができる。以下で更に十分に説明するＣＬＰＡアッセ��に関して、「上流」プローブの５’脱離基はＤＡＢＳＹＬであることが最も好ましい。
【０１１５】
[0127]  上流オリゴヌクレオチドの「下流」、すなわち、３’側のポリヌクレオチドテンプレートに結合した「下流」オリゴヌクレオチドは、その３’末端として、その３’ヒドロキシルに連結したホスホロチオエート基（すなわち、「３’−ホスホロチオエート基」）、ホスホロセレノエート基（すなわち、「３’−ホスホロセレノエート基」）、又はホスホロテルロエート基（すなわち、「３’−ホスホロテルロエート基」）を有するヌクレオシドを含む。したがって、自己連結に使用する化学は、硫黄仲介、セレン仲介、又はテルル仲介による。自己連結は、下流オリゴヌクレオチドの３’末端を含む基から決定されるように、５’架橋ホスホロチオエステル（--Ｏ--Ｐ（Ｏ）（Ｏ．ｓｕｐ.-）--Ｓ--）、ホスホロセレノエステル（--Ｏ--Ｐ（Ｏ）（Ｏ．ｓｕｐ.-）--Ｓｅ--）又はホスホロテルロエステル（--Ｏ--Ｐ（Ｏ）（Ｏ．ｓｕｐ.-）--Ｔｅ--）を含有する連結生成物を生じる。この非天然由来のアキラル架橋ジエステルは２つの隣接するヌクレオチドの間に位置し、天然由来の５’架橋ホスホジエステルに取って代わる。驚くべきことに、セレン仲介の連結は硫黄仲介の連結よりも３倍から４倍高速であり、Ｓｅ−Ｐ結合の結合強度は比較的低いにもかかわらず、セレン含有連結生成物は非常に安定していた。更に、架橋ホスホロセレノエステル、更に架橋ホスホロテルロエステルは、非常に穏やかな状態で銀又は水銀イオンによって選択的に分割可能であると予想される（Mag他のNucleic Acids Res. (1991)19:1437 1441を参照）。
【０１１６】
[0128]  一実施形態では、下流オリゴヌクレオチドは２’−デオキシリボヌクレオチドを含有するが、ただし３’ホスホロチオエート、ホスホロセレノエート、又はホスホロテルロエートを含む３’末端の修飾ヌクレオチドはリボヌクレオチドである。上流ヌクレオチドのこの実施形態は有利である。何故なら、末位から２番目の２’−デオキシリボヌクレオチドと末端のリボヌクレオチドとの間の結合は、塩基を使用して分割しやすく、これによって、例えば固体支持体に結合されたオリゴヌクレオチドプローブを再使用する可能性ができるからである。ＣＬＰＡアッセイに関して、以下で更に十分に説明するように、「下流」プローブはその３’末端に３’−ホスホロチオエートを含むことが最も好ましい。
【０１１７】
[0129]  「上流」及び「下流」オリゴヌクレオチドは、任意選択で１つのオリゴヌクレオチドの２つの末端を構成することができ、その場合、連結は環状連結生成物を生じることに留意されたい。線形前駆体オリゴヌクレオチドの５’及び３’末端の結合領域は、５’及び３’結合領域をポリヌクレオチド標的に結合できるようにするのに十分な幾つかの介在ヌクレオチドによってリンクしなければならない。
【０１１８】
[0130]  本発明によって提供される組成物には５’−デオキシ−５’−ヨード−２’−デオキシヌクレオシド、例えば５’−デオキシ−５’−ヨードチミジン（５’−Ｉ−Ｔ）、５’−デオキシ−５’−ヨード−２’−デオキシシチジン（５’−Ｉ−ｄＣ）、５’−デオキシ−５’−ヨード−２’−デオキシアデノシン（５’−Ｉ−ｄＡ）、５’−デオキシ−５’−ヨード−３−デアザ−２’−デオキシアデノシン（５’−Ｉ−３−デアザ−ｄＡ）、５’−デオキシ−５’−ヨード−２’−デオキシグアノシン（５’−Ｉ−ｄＧ）、及び５’−デオキシ−５’−ヨード−３−デアザ−２’−デオキシグアノシン（５’−Ｉ−３−デアザ−ｄＧ）、及びそのホスホラミダイト誘導体、更にその５’末端に本発明の５’−デオキシ−５’−ヨード−２’−デオキシヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明によって提供される組成物には更に５’−デオキシ−５’−ヨードヌクレオシド、例えば５’−デオキシ−５’−ヨードウラシル（５’−Ｉ−Ｕ）、５’−デオキシ−５’−ヨードシチジン（５’−Ｉ−Ｃ）、５’−デオキシ−５’−ヨードアデノシン（５’−１−Ａ）、５’−デオキシ−５’−ヨード−３−デアザアデノシン（５’−Ｉ−３−デアザ−Ａ）、５’−デオキシ−５’−ヨードグアノシン（５’−Ｉ−Ｇ）及び５’−デオキシ−５’−ヨード−３−デアザグアノシン（５’−Ｉ−３−デアザ−Ｇ）、及びこれらのホスホラミダイト誘導体、更に、その５’末端に本発明の５’−デオキシ−５’−ヨードヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドが含まれる。様々なヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドを作成する方法と同様に、本発明には、３’−ホスホロセレノエート基又は３’−ホスホロテルロエート基を含むヌクレオシドも含まれ、３’−ホスホロセレノエート基又は３’−ホスホロテルロエート基を含むヌクレオシドを３’末端に含むオリゴヌクレオチド、修飾ヌクレオシドのこれらのクラスのいずれか、又は両方を含むオリゴヌクレオチドも本発明に含まれる。本発明により５’又は３’末端のいずれか又は両方が修飾されたオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識、好ましくは放射能標識、蛍光エネルギー供与体又は受容体グループ、エキシマ標識、又はこれらの任意の組み合わせを任意選択で含むが、含む必要はない。
【０１１９】
[0131]  また、幾つかの事例では、置換基は保護基（本明細書では「ＰＧ」と呼ぶことがある）であってもよい。適切な保護基は、保護される原子及び部分が曝露する状態によって決定される。多種多様な保護基礎が知られ、例えば、ＤＭＴはホスホラミダイト化学の保護基として（複数の図に示されているように）頻繁に使用されているが、これらの実施形態では、ＤＭＴを他の保護基で置換することができる。多種多様な保護基が適切であり、例えば保護基及び関連する化学に関して、参照により本明細書に組み込むものとするGreeneのProtective Groups in organic Synthesisを参照されたい。
【０１２０】
[0132]  本明細書の「アルキル基」又は文法上のその同義語は、直鎖又は枝分かれ鎖のアルキル基を意味し、直鎖アルキル基が好ましい。枝分かれの場合、それは１つ又は複数の位置で、また明記していない限り任意の位置で枝分かれしてよい。アルキル基は約１個から約３０個の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ３０）の範囲とすることができ、好ましい実施形態は約１個から約２０個の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ２０）を使用し、約Ｃ１から約Ｃ１２まで、更に約Ｃ１５までが好ましく、Ｃ１からＣ５が特に好ましいが、幾つかの実施形態では、アルキル基ははるかに大きくなることがある。アルキル基の定義にはＣ５及びＣ６環、及び窒素、酸素、硫黄又はリンを有する複素環などのシクロアルキル基も含まれる。アルキルはヘテロアルキルも含み、硫黄、酸素、窒素、及びシリコーンのヘテロ原子が好ましい。アルキルは置換アルキル基を含む。本明細書の「置換アルキル基」とは、以上で定義したような１つ又は複数の置換部分「Ｒ」を更に含むアルキル基を意味する。
【０１２１】
[0133]  本明細書の「アミノ基」又はその文法上の同義語は、ＮＨ2、--ＮＨＲ及び--ＮＲ2基を意味し、Ｒは本明細書で定義されている通りである。幾つかの実施形態では、例えばペプチド連結反応の場合、１級及び２級アミン塩が特に使用法を見出され、１級アミン塩の方が通常は高速の反応速度を示す。
【０１２２】
[0134]  本明細書の「ニトロ基」は--ＮＯ2基を意味する。
【０１２３】
[0135]  本発明の「硫黄含有部分」は、硫黄原子を含有する化合物を意味し、チア−、チオ−及びスルホ−化合物、チオール類（--ＳＨ及び--ＳＲ）、及びスルフィド（--ＲＳＲ--）を含むが、これらに限定されない。硫黄含有部分の特定のタイプはチオエステル（-（ＣＯ）-Ｓ）であり、通常は置換チオエステル（-（ＣＯ）-ＳＲ）として見られる。本明細書の「リン含有部分」は、リンを含有する化合物を意味し、ホスフィン及びリン酸塩を含むが、これらに限定されない。本明細書の「ケイ素含有部分」は、ケイ素を含有する化合物を意味する。
【０１２４】
[0136]  本明細書の「エーテル」は、--Ｏ--Ｒ基を意味する。好ましいエーテルにはアルコキシ基が含まれ、--Ｏ--（ＣＨ2）2ＣＨ3及び--Ｏ--（ＣＨ2）4ＣＨ3が好ましい。
【０１２５】
[0137]  本明細書の「エステル」は--ＣＯＯＲ基を意味する。
【０１２６】
[0138]  本明細書の「ハロゲン」は臭素、ヨウ素、塩素、又はフッ素を意味する。好ましい置換アルキルはＣＦ3などの一部又は全部がハロゲン化したアルキルである。
【０１２７】
[0139]  本明細書の「アルデヒド」は--ＲＣＯＨ基を意味する。
【０１２８】
[0140]  本明細書の「アルコール」は--ＯＨ基、及びアルキルアルコールは--ＲＯＨを意味する。
【０１２９】
[0141]  本明細書の「アミド」は--ＲＣＯＮＨ--又はＲＣＯＮＲ--基を意味する。
【０１３０】
[0142]  本明細書の「エチレングリコール」は--（Ｏ--ＣＨ2--ＣＨ2）n--基を意味するが、エチレン基の各炭素原子は一置換又は二置換、すなわち--（Ｏ--ＣＲ2--ＣＲ2）n--でもよく、Ｒは以上で説明した通りである。酸素の代わりに他のヘテロ原子があるエチレングリコール誘導体（すなわち−（Ｎ--ＣＨ2--ＣＨ2）n--又は--（Ｓ--ＣＨ2--ＣＨ2）n--、又は置換基がある）も好ましい。
【０１３１】
[0143]  また、幾つかの実施形態では、Ｒ基は官能基であってもよく、（以下で規定するような）失活剤、不安定化部分及び蛍光体を含む。この実施形態で特に使用される蛍光体にはフルオレセイン及びその誘導体、ＴＡＭＲＡ（テトラメチル−６−カルボキシローダミン）、アレクサ染料及びシアニン染料（例えばＣｙ３及びＣｙ５）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３２】
[0144]  失活剤部分又は分子は当技術分野で知られており、通常は別の分子の励起状態を失活することができる芳香族多重環化合物である。蛍光体−失活剤の対は当技術分野で周知である。適切な失活部分には、Dabsyl（ジメチルアミニ（アゾベンゼン）スルホニル）、Dabcyl（ジメチルアミノ（アゾベンゼン）カルボニル）、Eclipse Quenchers（Glen Research Catalog）及びBiosearch TechnologiesからのブラックホールQuenchers（BHQ-1、BHQ-2及びBHQ-3）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３３】
[0145]  ハロ離脱基を有するプローブの作成方法は、当技術分野で知られている。例えば、それぞれを参照によりその全文を本明細書に組み込むものとするAbe他のProc Natl Acid Sci USA (2006)103(2):263-8、Silverman他のNucleic Acids Res,(2005)33(15):4978-86、Cuppolletti他のBioconjug Chem. (2005)16(3):528-34、Sando他のJ Am Chem Soc. (2004) 4;126(4):1081-7、Sando他の、Nucleic Acids Res Suppl. (2002)2:121 -2、Sando他のJ Am Chem Soc, (2002)124(10):2096-7、Xu他のNat Biotechnol. (2001)19(2):148-52、Xu他のNucleic Acids Res, (1998) 26(13):3159-64、Moran他のProc Natl Acad Sci USA (1997)94(20):10506-11、Koolの米国特許第７，０３３，７５３号、Koolの米国特許第６，６７０，１９３号、Koolの米国特許第６，４７９，６５０号、Koolの米国特許第６，２１８，１０８号、Koolの米国特許第６，１４０，４８０号、Koolの米国特許第６，０７７，６６８号、Koolの米国特許第５，８０８，０３６号、Koolの米国特許第５，７１４，３２０号、Koolの米国特許第５，６８３，８７４号、Koolの米国特許第５，６７４，６８３号、及びKoolの米国特許第５，５１４，５４６号を参照されたい。
【０１３４】
求核連結部分
[0146]  幾つかの実施形態では、本発明の連結プローブはアミンなどの求核剤を含む連結部分を含む。チオール及びアミンの両方を含む連結部分は、特定の反応に特に使用されている。一般的に、求核連結部分は、求核連結部分が１級又は２級アミノに近いチオール基を含み、相対的位置決めが、ＳからＮアシルへのシフト中に少なくとも５又は６員環遷移状態を達成することができるような位置決めである限り、多種多様な潜在的アミノ、チオール化合物を含むことができる。
【０１３５】
[0147]  したがって、１，２又は１，３アミンチオール基を含む求核連結分子には特に用途がある。反応時間は通常、２級アミン塩より１級アミン塩が高速であるので、１級アミン塩は反応時間が重要な場合、幾つかの実施形態で使用法が見られるが、２級アミン塩は、以下で説明するように不安定化に寄与するアシル転移酵素反応で使用法が見られる。アミノ基とチオール基との間の炭素は、非水素Ｒ基で置換することができるが、通常は炭素１個当たり非水素Ｒ基は１個しか使用されない。また、隣接するＲ基を相互に結合して、置換及び非置換シクロアルキル及びアリル基、例えばヘテロシクロアルキル及びヘテロアリルなどの環状構造、及びその置換及び非置換誘導体を形成することができる。１，２アミノチオール基を使用し、隣接するＲ基を結合する場合は、通常、隣接するＲ基がアリル基ではなくシクロアルキル基（ヘテロシクロアルキル及びその置換誘導体を含む）を形成することが好ましい。
【０１３６】
[0148]  この実施形態では、不安定化のために鎖の４シグマ結合収縮を生成する場合、置換連結部分はアシル転移酵素反応に依存する。
【０１３７】
リンカー
[0149]  多くの実施形態では、リンカー（本明細書では「Ｌ」又は「−（リンカー）n−」と示すことがあり、ここでｎはゼロ又は１である）は、任意選択で連結プローブ内の様々な位置に含めることができる。適切なリンカーには、ヘテロアルキル及びヘテロアリルなどのアルキル及びアリル基、及びこれらの置換誘導体が含まれる。幾つかの場合、例えば天然ペプチド連結反応を実行する場合、リンカーはアミノ酸ベースであり、及び／又はアミド結合を含むことができる。本明細書で説明するように、リンカーによっては、連結プローブが１つ又は複数の核酸塩基によって分離され、連結生成物内に塩基性部位を形成することができ、以下で説明するように不安定化部分として働く。
【０１３８】
不安定化部分
[0150]  本発明の一態様によれば、酵素の補助がない状態で、標的分子ごとに連結生成物の多数のコピーを生成することが望ましい。この目的を達成するための１つの方法は、化学的連結反応後に標的から連結生成物を分離し、新しいプローブセットを標的に結合可能にすることを含む。連結生成物の代謝回転を向上させるために、標的分子からの生成物分離を増加させるプローブの設計、計器、及び化学的連結反応の化学が望ましい。適切な不安定化部分を以下で説明するが、これはオリゴヌクレオチドがその標的部位に結合する全体的エネルギーの減少をもたらす分子単位を含むが、これに限定されない。潜在的な例にはアルキル鎖、荷電複合体、及び環状構造が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３９】
[0151]  以前の研究で、生成物の分離を達成し、生成物の代謝回転を増大させる１つの方法が、反応混合物の「熱サイクル」であることが示されている。熱サイクリングは、所望の成果を助長するように反応の温度を変動させるプロセスである。熱サイクリングは、反応温度が短時間だけ連結生成物の溶融温度より高くなり、標的からの生成物の分離を引き起こすように、反応混合物の温度を短時間上昇させる形態をとることが最も多い。冷却すると、プローブの新しいセットが標的に結合し、別の連結反応をすることができる。この熱サイクリング手順は、ＰＣＲのような酵素反応に広範に実践されている。
【０１４０】
[0152]  熱サイクリングは生成物の代謝回転を達成する１つの方法であるが、熱サイクリングがない状態で大幅な生成物の回転代謝があるようにプローブを設計することが可能である。連結生成物の溶融温度を低下させるのに役立つプローブの設計及び連結の化学は、反応サイクルの生成物抑制を減少させることによって生成物の代謝回転を増大させる。
【０１４１】
[0153]  したがって、一態様では、プローブは、プローブが連結されると連結生成物と標的配列のハイブリダイゼーションを不安定化させる働きをする要素（例えば不安定化部分）を含むように設計される。その結果、連結基質は連結後に分離して、連結生成物の代謝回転をもたらし、例えば２つの連結プローブを含む連結生成物が標的配列から脱ハイブリダイズし、別のプローブセットとのハイブリダイゼーションのために標的配列を遊離する。
【０１４２】
[0154]  また、遊離（例えば非ハイブリダイゼーション）連結プローブの濃度上昇は、平衡を標的配列からの連結生成物（又は転移生成物）の解放に向かって促す補助となることもできる。したがって、本発明の幾つかの実施形態は標的よりも１，０００，０００倍高い濃度のプローブを使用するが、他の実施形態では、プローブは標的よりも１０，０００倍から１００倍高い。当業者に認識されるように、遊離プローブの濃度上昇は単独で、又は本明細書で概略説明する任意の実施形態とともに使用して、生成物の代謝回転（例えば増幅）を達成することができる。プローブ濃度の上昇は、生成物代謝回転の増大をもたらすことがあるが、プローブの加水分解及び非標的媒介の連結のような重要な標的以外の反応につながることもある。
【０１４３】
[0155]  一態様では、プローブ要素は連結生成物の溶融温度を低下させる構造を含む。幾つかの実施形態では、プローブ要素は非隣接標的核酸塩基とハイブリダイズするように設計され、例えば２つのハイブリダイズされた非連結プローブ間に「ギャップ」がある。一般的に、これはプローブドメインと連結部分との間に１つ又は２つのリンカーを使用して実行する。すなわち、第１のプローブドメインと第１の連結部分との間にリンカーがあり、第２のプローブドメインと第２の連結部分との間に１つある、又はその両方であってもよい。幾つかの実施形態では、ギャップは単一の核酸塩基を含むが、所望に応じてそれ以上使用することもできる。当業者に認識されるように、反応動力学とリンカーの長さとの間にトレードオフがあることがあり、リンカーの長さが、接触した結果、連結して動力学的に好ましくないほど長い場合、より短いリンカーが望ましいことがある。しかし、場合によっては、動力学が重要ではない場合、ギャップの長さ、及びその結果としてのリンカーを長くすることができ、核酸塩基１個から１０個分にまたがるギャップにすることができる。一般的に、この実施形態では、重要なことは、１つ又は複数のリンカーの長さがギャップ内の核酸塩基の数に対応することである。
【０１４４】
[0156]  本発明のこの実施形態の別の態様では、標的配列と比較すると、連結生成物の塩基性部位の形成は、二重鎖の不安定化の働きをする。例えばAbe及びKool（J. Am. Chem. Soc. (2004)126:13980-13986）は、２つの異なる８量体オリゴヌクレオチドプローブ（Ｂｕ４２及びＤＴ４０）を同じ７量体プローブ（Ｔｈｉｏ  ４）と連結した場合の代謝回転を比較した。Ｔｈｉｏ４をＤＴ４０と連結すると、ほぼ天然のＤＮＡ構造を有する連続的な１５量体オリゴヌクレオチドプローブが形成され、これはＤＮＡ標的と完璧に整合するはずである。しかし、Ｔｈｉｏ４をＢｕ４２と連結すると１５量体オリゴヌクレオチドプローブが形成されるが、プローブを標的と結合すると、これはアルカンリンカーが及ぶ中央に塩基離脱部位を有する。標的に結合した場合のこれら２つのプローブの溶融温度（Ｔｍ）を比較すると、溶融温度にほぼ１２℃の差（Ｂｕ４２の５８．５℃対ＤＴ４０の７０．７℃）が示される。この１２℃という溶融温度の差は、プローブのセット（１０μＭ濃度）が標的（１ｎＭ）と比較して大きな過剰状態（１０，０００倍過剰）で存在する場合、生成物の代謝回転がほぼ１０倍増加することになる（Ｂｕ４２が９１．６対ＤＴ４０が８．２）。同様に、Dose他（Dose 2006）は、２つの同等の配列で化学的に連結したＰＮＡプローブのＴｍが４℃低下すると（５３℃対５７℃）、いかに生成物の代謝回転が約４倍増加するかを示した。
【０１４５】
[0157]  最近の研究は、化学的連結に基づくQuenched Auto-Ligation（失活自己連結、ＱＵＡＬ）プローブを使用して、ＲＮＡの発現を監視し、細菌及びヒト細胞内の単塩基の不整合を検出することを実証した（参照により本明細書に組み込むものとする国際特許ＷＯ２００４／０１０１０１１号）。
【０１４６】
[0158]  一実施形態では、不安定化部分は安定化部分の除去に基づく。すなわち、連結プローブが標的とのハイブリダイゼーションを安定化させる部分を含有する場合、連結して安定化部分を解放すると、連結生成物の安定性に低下がある。したがって、生成物抑制を低下させる１つの一般的スキームは、初期の化学的連結反応の過程で、又は連結後の２次反応の後に、副溝結合分子のような分子単位を解放するプローブを開発することである。オリゴヌクレオチド配列に応じて、Kutyavin（Kutyavin 1997及びKutyavin 2000）が説明しているジヒドロピロロインドールトリペプチド（ＤＰＩ３）のような副溝結合剤は、オリゴヌクレオチドプローブの末端に共役すると、二重核酸のＴｍを最大４０℃まで上昇させることができる。対照的に、ＤＰＩ３の非結合タイプは同じ二重核酸のＴｍを２℃程度しか上昇させない。このように、副溝結合剤を使用して、結合強度が向上したプローブセットを生成することができるが、反応の過程で副溝結合剤が解放されると、結合の増強が喪失し、連結生成物は副溝結合剤がまだ結合しているプローブに対してＴｍの低下を呈する。
【０１４７】
[0159]  適切な副溝結合分子にはジヒドロピロロインドールトリペプチド（ＤＰＩ3）、ジスタマイシンＡ、及びピロール−イミダゾールポリアミドが含まれるが、これらに限定されない（(Gottesfeld, J. M.他、J. MOl. Biol. (2001)309:615-629）。
【０１４８】
[0160]  副溝結合分子に加えて、テザー介入物及び関連する分子も、オリゴヌクレオチド二重鎖の溶融温度を大幅に上昇させることができ、この安定化はテザー結合していない状態では大幅に低下する（Dogan他、J Am. Chem Soc. (2004)126:4762-4763、及びNarayanan他、Nucleic Acids Research, (2004)32:2901-2911）。
【０１４９】
[0161]  同様に、当業者には認識されるように、三重らせん体を形成できるオリゴヌクレオチドフラグメント（ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡなど）が結合したプローブは、解放されると、標的配列への連結生成物の安定化を低下させることになる安定化部分として働くことができる（Pooga, M他、Biomolecular Engineering (2001)17:183-192）。
【０１５０】
[0162]  連結生成物の結合強度を低下させることによって生成物抑制を低下させる別の一般的方法は、連結点に塩基離脱部位を組み込むことである。この方法は、以前にAbe（J. Am. Chem. Soc. (2004)126:13980-13986）によって実証されているが、２次プローブの再構成を設計し、連結プローブと標的との間の位置合わせを変形させることにより、Ｔｍの低下を更に増幅することも可能である。例えば、Dose他（Org. Letters (2005)7:20 4365-4368）はＰＮＡ塩基間の間隔を理想的な１２シグマ結合から１３に変化させた連結後の再構成が、いかにＴｍを４℃低下させたかを示した。再構成の大型化、及び標的への生成物の結合を妨害するか、又はオリゴヌクレオチド塩基の喪失につながる２次反応は、Ｔｍを更に低下させることができる。
【０１５１】
[0163]  本発明は、再構成中に最大４シグマ結合の連鎖収縮をもたらす連結反応の方法及び組成物を提供し、これはDoseが説明している化学を使用した１塩基増殖と比較して、再構成後のＴｍに多大な影響を及ぼすはずである。この化学は、以前に説明されているアシル転移助剤に基づいている（Offer他、J Am Chem Soc. (2002)124(17):4642-6）。鎖収縮の完了後、別個の分子とともに、又は単独で別の反応をすることができる遊離チオールが生成される。例えば、このチオールは内部チオエステルと反応して、オリゴヌクレオチドを激しく捻り、したがって連結生成物が標的に結合する能力を更に低下させることができる。
【０１５２】
[0164]  したがって、この実施形態では、連結生成物との第２の反応をする官能基を解放する連結反応が、連結生成物と標的配列とのハイブリッドの安定化を低下させることができる。
【０１５３】
可変スペーサ配列
[0165]  標的ドメイン、連結部分、及び任意選択のリンカーに加えて、本発明の連結プローブのうち１つ又は複数は、可変スペーサ配列（「スタッファー配列」とも呼ぶ）を有することができる。これらの可変スペーサ配列は、本明細書で更に詳細に説明するＣＬＰＡ−ＣＥアッセイで特に有用である。すなわち、可変スペーサ配列は、生成物を長さに基づいて、例えばキャピラリ電気泳動（ＣＥ）を使用して検出する場合、標的配列を識別するためのあるタイプの「ラベル」又は「バーコード」として働くことができる。
【０１５４】
[0166]  可変スペーサ配列は、可変長を有することができる連結プローブのドメインである。これらの可変長は、幾つかの実施形態では、連結プローブの他のドメイン（例えばプローブドメイン）がハイブリダイズすることができる特定の標的配列に対して特異的であり、したがってスタッファー配列を含む連結プローブの連結に由来する連結生成物の長さは、標的に特異的な長さになる。その結果、このような連結生成物から生成されるいかなるアンプリコンも、標的に特異的な長さを有することになる。他の実施形態では、可変スペーサ配列は、同様の長さの連結生成物がすべて、その後の増幅反応の効率を助長するように設計される。
【０１５５】
[0167]  幾つかの実施形態では、連結プローブ対の連結プローブの一方のみが可変スペーサ配列を含む。他の実施形態では、両方の連結プローブが可変スペーサ配列を含む。３つ以上の連結プローブを使用する実施形態では、特定の連結生成物を形成する連結プローブのうち１つ又は複数が可変スペーサ配列を含有することができるが、この実施形態では、通常、可変スペーサ配列を含有するのは末端プローブの一方又は両方である。
【０１５６】
[0168]  更に他の実施形態では、上記のいずれかによれば、可変スペーサ配列は、標的核酸の任意の他のドメインと、更にサンプル中の標的核酸のいずれかとの両方に対して実質的に相補的ではない連結プローブの領域に含有される。
【０１５７】
[0169]  他の実施形態では、連結プローブは（以下で更に詳細に説明するように）プライマー配列を含有する。上記のいずれかによれば、可変スペーサ配列は、幾つかの実施形態ではプローブドメイン（標的配列にハイブリダイズする連結プローブの領域）とプライマー配列との間に含有され、したがってアンプリコンは可変スペーサ配列を含有する。
【０１５８】
[0170]  他の態様では、本発明の可変スペーサ配列はＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸を含む。可変スペーサ配列は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの両方の組み合わせも含む。可変スペーサ配列は、ヌクレオチド類似体、リンカー、又は本発明の連結及び／又は標的捕捉プローブ内に任意選択に存在するものとして、本明細書で説明する追加部分のいずれかを更に含むことができる。
【０１５９】
[0171]  一般的に、多数の標的配列を同時に検出すべき多重アッセイでは、可変スペーサ配列は、連結生成物又は（連結工程の後に増幅反応がある場合は）各連結生成物に由来するアンプリコンのいずれか、又は両方がサンプル中の他方の連結生成物又はアンプリコンとは異なるヌクレオチドの長さを有する結果となるように設計される。すなわち、１つの標的核酸からのアンプリコンは、異なる標的核酸からのアンプリコンと長さが異なる。同様に、図６及び図１１に示すように多数の連結プローブセットを１つの標的に使用する場合、各連結生成物及び／又はアンプリコンは異なる長さを有し、それによって異なる生成物を検出することができる。
【０１６０】
[0172]  可変スペーサ配列の異なる長さは、検出システムの感度によって決定される。Life Technologies製のGenetic Analyzerシステム又はBeckman CoulterによるPACEシステムのように洗練されたキャピラリ電気泳動（ＣＥ）システムでは、長さがヌクレオチド１個しか違わない場合でも、連結生成物及び／又はアンプリコンを分離し、したがって検出することができる。サイズ解像度がこれより低い他のＣＥシステムでは、解像度に応じて５〜１００塩基対の長さの差が必要となることがある。一般的に、ＣＥシステムの解像度が高いほど、必要となる分離チャネルの長さが長くなり、多くの場合、分離時間が長くなる。更に、変性キャピラリ電気泳動システムは、非変性システムよりも解像度が良好である傾向がある。一般的に、可変スペーサ配列は、ヌクレオチドの差が塩基１〜１００個の範囲になるように設計され、塩基５〜２０個が好ましい。これより大きいサイズの差を使用することができるが、多くの場合、追加の費用が必要となるか、又は１つの検査で組み合わせることが可能な連結プローブの数が低減される。
【０１６１】
[0173]  また、可変スペーサ配列は、他のラベルとの関連で使用して、使用可能な異なる「バーコード」の数を拡張することができる。すなわち、可変スペーサ配列の長さを、第２のラベルでコード化することによって「再使用」することができ、例えばヌクレオチド２０個の可変スペーサ配列を含有する１つのアンプリコンは、第１の色の蛍光ラベルを使用することができ、２０量体スペーサ配列を含有する別のアンプリコンは、異なる色の蛍光ラベルを使用することができる。これらの同サイズのアンプリコンは、法医学で一般的に実践されているように、異なる波長（色）の生成物でアンプリコンを識別することができる多チャネルＣＥ計器を使用して、同時に検出することができる。
【０１６２】
連結プローブの追加機能
[0174]  標的ドメイン、連結部分、及び任意選択のリンカーに加えて、本発明の連結プローブの１つ又は複数は、追加の機能を有することができ、それにはプロモータ及びプライマー配列（又はアッセイに応じてその補体）、ラベルプローブ結合配列などのラベル、及び捕捉又は固定配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６３】
[0175]  多くの実施形態では、連結プローブは、その後の増幅スキームのために必要な１つ又は複数のプライミング部位を含有するように構築される。好ましい実施形態では、プライミング部位はユニバーサルプライミング部位である。本明細書の「ユニバーサルプライミング部位」又は「ユニバーサルプライミング配列」は、増幅のためにプライマーに結合するプローブの配列を意味する。
【０１６４】
[0176]  好ましい実施形態では、１つのユニバーサルプライミング配列又は部位を使用する。この実施形態では、好ましいユニバーサルプライミング配列はＲＮＡポリメラーゼＴ７配列であり、これによってＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは以下で概略説明するようにアダプタ配列のＲＮＡコピーを作成することができる。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの使用に関する追加の開示が米国特許第６，２９１，１７０号、第５，８９１，６３６号、第５，７１６，７８５号、第５，５４５，５２２号、第５，９２２，５５３号、第６，２２５，０６０号及び第５，５１４，５４５号に見られ、これらはすべて参照により明示的に本明細書に組み込むものとする。
【０１６５】
[0177]  好ましい実施形態では、例えばＰＣＲなどの２つのプライマーを必要とする増幅法を使用する場合、各プローブは上流ユニバーサルプライミング部位（ＵＵＰ）及び下流ユニバーサルプライミング部位（ＤＵＰ）を含むことが好ましい。この場合も、「上流」及び「下流」は、特定の５’−３’方向を伝える意味ではなく、システムの方向によって決定される。プローブセットには単一のＵＵＰ配列及び単一のＤＵＰ配列のみを使用することが好ましいが、当業者に認識されるように、異なるアッセイ又は異なる多重化分析は複数のユニバーサルプライミング配列を使用することができる。幾つかの実施形態では、プローブセットは様々なユニバーサルプライミング配列を含むことができる。また、ユニバーサルプライミング配列は標的プローブ（又は連結プローブ）の５’及び３’末端に位置することが好ましい。プライミング配列が側面にある配列のみが増幅されるからである。
【０１６６】
[0178]  また、特定のアッセイ及びホストゲノムがアッセイの特異性を確保するとすれば、ユニバーサルプライミング配列は通常、可能な限り一意であるように選択される。しかし、当業者に認識されるように、プライミング配列／プライマーのセットを使用することができる。すなわち、１つの反応は、第１のプライミング配列又は配列セットを有する５００の標的プローブ、及び第２の配列又は配列セットを有する追加の５００のプローブを使用することができる。
【０１６７】
[0179]  当業者に認識されるように、２つのプライミング配列を使用する場合、２つのプライミング部位の方向は通常、異なる。すなわち、一方のプライマーは第１のプライミング部位と直接ハイブリダイズし、他方のＰＣＲプライマーは第２のプライミング部位の補体とハイブリダイズする。言い換えると、第１のプライミング部位はセンス方向にあり、第２のプライミング部位はアンチセンス方向にある。
【０１６８】
[0180]  当業者に認識されるように、一般的に、すべての反応に対してすべてのユニバーサルプライミング部位が同じである状態で、高度に多重化した反応を実行することができる。あるいは、ユニバーサルプライミング部位又は対応するプローブの「セット」を同時に、又は順番に使用することができる。ユニバーサルプライミング部位を使用して、修飾したプローブを増幅し、複数のアンプリコンを形成して、次にそれを本明細書で概略説明するように様々な方法で検出する。好ましい実施形態では、ユニバーサルプライミング部位の１つはＴ７部位である。幾つかの実施形態では、このプライミング部位はＲＮＡ合成のテンプレートとして働く。
【０１６９】
[0181]  好ましい実施形態では、多数の標的を同時に検出する場合、反応中のオリゴヌクレオチド連結プローブセットはすべて、連結及び精製後に適宜、同じ酵素及び／又は同じプライマーを使用して連結生成物をすべて同時に増幅できるように、同位置のプロモータ又はプライマー対結合部位を含むように設計される。すなわち、多数の標的核酸の検出を含む実施形態では、異なる標的核酸配列を指向する連結プローブを含有する異なる連結プローブセットは、幾つかの実施形態では、これらの連結プローブのハイブリダイゼーション及び連結に由来する連結生成物を、同じ酵素及び／又はプライマーを使用して増幅できるように、同一のプロモータ又はプライマー対結合部位（例えば「ユニバーサル」プライマー結合部位）を保有することができる。
【０１７０】
[0182]  一実施形態では、連結プローブの１つ又は複数はプロモータ配列を含む。プロモータ配列を使用する実施形態では、プロモータ配列又はその補体は、適切なポリメラーゼがそれと相互作用できるのに十分な長さとなる。ポリメラーゼが相互作用するのに十分な長さである配列に関する詳細な説明は、特にSambrook及びRussellに見ることができ、これらは、すべての目的のために、特にポリメラーゼのプロモータ配列に関する全教示について、参照により本明細書に組み込むものとする。特定の実施形態では、増幅方法は少なくとも１サイクルの増幅を含み、それは例えばポリメラーゼとプロモータとの相互作用と、ポリメラーゼを使用してテンプレート依存の方法でヌクレオチドの鎖を合成することと、鎖を分離するために、新しく形成された核酸二重鎖を変性することという連続手順であるが、これらに限定されない。
【０１７１】
[0183]  別の実施形態では、連結プローブの一方又は両方はプライマー配列を含む。以下で概略説明するように、本発明の連結生成物は、酵素増幅反応などの追加反応に使用することができる。一実施形態では、連結プローブは増幅の追加のレベルを可能にするように設計されたプライマー配列を含む。本明細書で使用する「プライマー」という用語は、精製された制限消化物内のように天然由来であるにしても、合成で生成されるにしても、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長生成物の合成を誘導する状態に、すなわち適切な緩衝（「緩衝」にはｐＨ、イオン強度、補助因子などが含まれる）及び適切な温度で様々なヌクレオチド三リン酸及びポリメラーゼが存在する状態された場合、核酸配列合成の開始点として作用することができるヌクレオチド配列を指す。プライマーのヌクレオチドの１つ又は複数は、例えばメチル基、ビオチン又はジゴキシゲニン部分、蛍光タグを追加するか、又は放射性ヌクレオチドを使用することによって修飾することができる。プライマー配列は、テンプレートの正確な配列を反映する必要がない。例えば、非相補的ヌクレオチドフラグメントをプライマーの５’末端に取り付けることができ、プライマー配列の残りの部分は標的鎖に実質的に相補的である。
【０１７２】
[0184]  幾つかのプライミング配列及びプライマーを使用することにより、第１の連結生成物は追加的連結生成物のテンプレートとして働くことができる。これらのプライマー配列は、ＰＣＲ反応のプライミング部位として働くことができ、これは連結生成物の増幅に使用することができる。ＰＣＲ反応に加えて、他の増幅方法がプライミング配列を使用することができる。それにはリガーゼ連鎖反応、Invader（商標）、ニックトランスレーション法（ＮＩＣＫ）による位置増幅、プライマー伸長／ニックトランスレーション法及び当技術分野で知られている他の方法が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用する「増幅」は、特定の核酸のコピー数の増加を指す。増幅反応においてin vitroで作成された特定の核酸のコピーを「アンプリコン」又は「増幅生成物」と呼ぶ。
【０１７３】
[0185]  増幅は第２の連結反応を通しても生じることがあり、ここではプライマー部位が、元の連結生成物を生成した第１の連結プローブセットと同一である配列を含むか、又は含まないことがある新しい連結プローブセットのハイブリダイゼーション部位として働く。したがって、標的配列はその後の増幅サイクルにて連結生成物の増幅を通して指数関数的に増幅される。
【０１７４】
[0186]  本発明のこの態様の別の実施形態では、プライマー配列は入れ子連結反応に使用される。このような入れ子連結反応では、第１の連結反応は、例えばビオチン化プライマーを使用して連結生成物を所望の鎖に捕捉し、ストレプトアビジンでコーティングしたビーズ（特に磁気ビーズ）上に捕捉できるように、本明細書で説明する方法を使用して遂行される。連結生成物の捕捉後、第２の連結反応は、捕捉ビーズ、プローブなどに取り付けられた連結生成物の末端から（すなわち、その下流に）空間的に取り出された連結生成物の区間内で連結プローブがプライマー配列とハイブリダイズすることによって生成される。２次連結反応のためのプライマー配列の少なくとも１つは、アンカー又は捕捉配列を含んだ連結プローブではない連結プローブに対して相補的である連結生成物の領域内に位置する。したがって、この第２の連結反応からの連結生成物は必然的に、第１の化学的連結からの形成に成功し、したがって増幅反応から「偽陽性」をすべて除去したこれらの配列に由来する。別の実施形態では、副反応に使用されるプライマー配列は、ＰＣＲなどの他のタイプの増幅反応のためのプライマー部位でもよい。
【０１７５】
[0187]  一実施形態では、連結プローブの１つ又は複数はアンカー配列を含む。本明細書の「アンカー配列」は、検出目的で連結生成物を支持体に取り付けられるようにする連結プローブの成分を意味する。適切な検出手段には、適切な捕捉部分が取り付けられた支持体が含まれる。一般的に、このような取り付けは、アンカー配列と、アンカー配列に対して実質的に相補的である捕捉プローブとのハイブリダイゼーションを介して実行される。
【０１７６】
[0188]  好ましい実施形態では、プローブの１つは「アンカー」配列（当技術分野及び本明細書では「ジップコード」又は「バーコード」又は「アダプタ」と呼ぶことがある）を更に含む。アダプタは、プローブの固定化を促進し、それによって「ユニバーサルアレイ」を使用することができる。すなわち、標的特異性ではなく、個々の（好ましくは）人工的アダプタ配列に対して特異的である捕捉プローブを含有するアレイ（固体相又は液体相アレイ）が生成される。
【０１７７】
[0189]  したがって、「アダプタ配列」は、一般的に標的配列由来ではなく、外来性であり、標的配列に追加又は取り付けられた核酸である。この文脈では、「標的配列」は１次サンプル標的配列を含むか、本明細書で概略説明する反応の反応物又は生成物などの誘導体標的とすることができ、したがって例えば標的配列はＰＣＲ生成物、第１の連結プローブ又はＯＬＡ反応での連結プローブなどでよいことに留意されたい。「バーコード」、「アダプタ」、「アドレス」、「タグ」、及び「ジップコード」という用語はすべて、核酸フラグメントプールを分離可能にするためにアンプリコンに追加される人工配列を説明するために使用されている。アダプタの１つの好ましい形態はハイブリダイゼーションアダプタである。この実施形態では、アダプタは、アレイの表面上の相補的捕捉プローブにハイブリダイズできるように選択される。アダプタは、プローブの、したがって標的配列の一意の識別子として働く。一般的に、アレイ上のアダプタと対応する捕捉プローブとのセットは、相互の、及び標的配列、及び標的配列（例えばゲノムＤＮＡ内の配列）の外側のこれより大きい核酸配列上の配列などの反応混合物の他の成分との交差ハイブリダイゼーションを最小化するように開発されている。他の形態のアダプタは、質量分析法を使用して分離することができる質量タグ、電気泳動移動度に基づいて分離することができる電気泳動タグなどである。幾つかのアダプタ配列が２００１年８月２７日出願の米国特許第０９／９４０，１８５号で概略説明されており、それは参照によりその全文を本明細書に組み込むものとする。好ましいアダプタは、以下の基準に適合するアダプタである。それはゲノム、好ましくはヒトゲノムには見られず、ヘアピンループなどの望ましくない構造を有していない。
【０１７８】
[0190]  一実施形態では、アダプタ配列を使用することによって、より「ユニバーサル」な表面を生成することができる。すなわち、捕捉プローブの有限なセットを含む１つの標準的アレイを作成し、任意の用途で使用することができる。最終使用者は、当業者に認識されるように通常は比較的簡単で安価である様々な可溶性標的プローブを設計することにより、アレイをカスタム化することができる。好ましい実施形態では、様々で通常は人工的な捕捉プローブのアレイが作成される。すなわち、捕捉プローブは既知の標的配列に対して相補性を有していない。これで、アンカー配列を標的プローブに組み込むことができる。
【０１７９】
[0191]  当業者に認識されるように、アンカー配列の長さは、結合の所望の「強度」及び様々な所望のアンカーの数に応じて変化する。好ましい実施形態では、アダプタ配列は長さが約６〜約５００塩基対の範囲であり、約８〜約１００塩基対が好ましく、約１０〜約２５塩基対が特に好ましい。
【０１８０】
[0192]  好ましい実施形態では、アダプタ配列は、標的プローブが結合する標的分析物を一意に識別する。すなわち、アダプタ配列は自身を標的分析物に結合する必要がないが、システムはアダプタの存在を検出することによって標的分析物の識別を可能にする。したがって、結合又はハイブリダイゼーションアッセイ及び洗浄の後に、アダプタを含むプローブが増幅される。次に、アダプタの検出は、標的核酸の存在を示すものとして働く。
【０１８１】
[0193]  一実施形態では、アダプタは、識別子領域と、上述したようなユニバーサルアレイ上の捕捉プローブに対して相補的である領域との両方を含む。この実施形態では、アンプリコンがユニバーサルアレイ上の捕捉プローブとハイブリダイズする。アダプタの検出は、アダプタ配列に対して相補的であるプローブとのハイブリダイゼーション後に遂行される。プローブは本明細書で説明するように標識することが好ましい。
【０１８２】
[0194]  一般的に、可変スペーサ配列と同様に、一意の標的分析物ごとに一意のアダプタ配列を使用する。すなわち、特定のアダプタ配列の解明又は検出によって、そのアダプタ配列を含有する標的プローブが結合する標的分析物を識別することができる。しかし、本明細書で説明するように、場合によってはアダプタ配列を「再使用」し、複数の標的分析物にアダプタ配列を共有させることが可能である。
【０１８３】
[0195]  好ましい実施形態では、アダプタは、特定の標的分子を示す様々な配列又は特性を含む。すなわち、各アダプタは標的配列を一意に識別する。上述したように、アダプタは増幅されてアンプリコンを形成する。アダプタは、標的分析物、すなわち特定の標的核酸の存在を示すものとして検出される。
【０１８４】
[0196]  本発明のこの態様の一実施形態では、上流オリゴヌクレオチドは、問題の標的に結合せず、その後に適切な固体支持体又は何らかのデバイス上に連結生成物を捕捉するために使用されるべき追加のヌクレオチドセグメントを有するように設計される。本発明のこの態様の好ましい実施形態では、下流オリゴヌクレオチドはそれに取り付けられる検出可能な標識を有し、したがって連結後に、結果となる生成物はその３’末端に固体支持体用の捕捉配列を、５’末端に検出可能な標識を含有し、連結生成物のみが捕捉配列と標識との両方を含有する。
【０１８５】
[0197]  特に多重標的検出に関する本発明の別の態様では、プローブセットの各上流プローブは、ＤＮＡアレイ上の異なる位置に対応するその３’末端に、一意の配列（本明細書では「アンカー配列」とも呼ぶ）を有するように設計することができる。プローブセットの各下流プローブは任意選択で、他方の下流プローブに同一であるが、その個々の標的に対応する一意の標的結合配列である検出可能な標識を含むことができる。ＤＮＡアレイとのハイブリダイゼーション後、アドレス配列（上流プローブ）と標識（下流プローブ）との両方を有する連結プローブのみが観察可能になる。本発明の別の態様では、検出可能な標識は上流プローブに取り付けることができ、捕捉配列は下流プローブの部分でよく、したがって連結生成物は、より３’末端に向かう検出可能な標識、及び連結生成物の５’末端に向かう捕捉配列を有することになる。正確な構成は、合成の容易さを、更にその後に連結反応生成物の検出に使用するデバイスの特徴を考慮することによって、最適に判定される。
【０１８６】
[0198]  アンカー配列は、核酸及び非核酸部分の両方を有することができる。したがって、例えばポリエチレングリコールリンカーなどのアルキル基のような柔軟なリンカーを使用して、アンカー配列の核酸部分と支持体表面との間に空間を提供することができる。これは、連結生成物が大きい場合に特に有用である。
【０１８７】
[0199]  また、場合によっては、「ユニバーサルアレイ」の捕捉プローブに対応するアンカー又は配列のセットを使用することができる。当技術分野で知られているように、アレイは、捕捉プローブとして一般的合成配列で作成することができ、これは分析中のサンプルの標的配列に対して非相補的であるが、連結プローブセットのアレイ結合配列に対して相補的であるように設計される。これらの「ユニバーサルアレイ」は、多数のタイプのサンプル及び診断試験に使用することができる。何故なら、プローブの同じアレイ結合配列を様々な標的認識配列で再使用／対形成できるからである。
【０１８８】
[0200]  一実施形態では、連結プローブの１つ又は複数は標識を含む。本明細書の「標識」又は「標識付けされた」は、化合物が、化合物を検出できるように、例えば連結プローブ又は連結又は転移生成物が既知の検出方法、例えば電子、分光、光化学、又は電気化学発光法で検出可能になるように取り付けられた少なくとも１つの元素、同位体又は化合物を有することを意味する。一般的に、標識は３つのクラスに入る。すなわち、ａ）放射性又は重同位元素とすることができる同位体標識、ｂ）磁気、電気、熱、及びｃ）着色又は蛍光染料であるが、標識には酵素、及び磁気粒子などの粒子も含まれる。染料は、発色団又はリンでよいが、蛍光染料であることが好ましく、これは信号が強力であるので、良好な信号対雑音比を提供する。本発明で使用する適切な染料にはユーロピウム及びテルビウムの錯体を含む蛍光ランタニド錯体、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、ウンベリフェロン、エオシン、エリトロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、スチルベン、Lucifer Yellow、Cascade Blue（商標）、Texas Red、アレクサ染料、塩化ダンシル、フィコエリトリン、緑蛍光タンパク質及びその波長シフト変形、ボディパイ、及びHauglandのMolecular Probes Handbook（オレゴン州ユージーン）第６版、The Synthegen catalog（テキサス州ヒューストン）、LakowiczのPrinciples of Fluorescence Spectroscopy第２版（Plenum Press New York (1999)）で説明されたような当技術分野で知られているもの、及びRichard P. Hauglandのthe Molecular Probes Handbook第６版で説明されているものが含まれるが、これらに限定されず、これは参照により明示的に本明細書に組み込むものとする。追加の標識は、参照により明示的に本明細書に組み込むものとする米国特許第０９／３１５，５８４号で説明されているようなナノ結晶又はＱドットを含む。
【０１８９】
[0201]  好ましい実施形態では、標識は結合パートナー対の一部である２次標識である。例えば、標識はハプテン又は抗原であってもよく、その結合パートナーに結合する。好ましい実施形態では、結合パートナーは固体支持体に取り付けることができ、それによって伸長及び非伸長プライマーを分離することができる。例えば、適切なパートナー対には抗原（タンパク質（ペプチドを含む）など）及び抗体（そのフラグメント（ＦＡｂなど）を含む）と、ビオチン／ストレプトアビジンなどのタンパク質及び小分子と、酵素及び基質又は阻害剤と、他のタンパク質−タンパク質相互作用対と、受容体−配位子と、炭水化物及びその結合パートナーとが含まれるが、これらに限定されない。核酸−核酸結合タンパク質対も有用である。一般的に、対の小さい方がプライマーに組み込まれるためにＮＴＰに取り付けられる。好ましい結合パートナー対にはビオチン（又はイミノ−ビオチン）及びストレプトアビジン、ジゲオキシニン（digeoxinin）及びＡｂｓ、及びProlinx（商標）試薬が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９０】
[0202]  好ましい実施形態では、結合パートナー対はビオチン又はイミノ−ビオチン及びストレプトアビジンを含む。イミノ−ビオチンが特に好ましい。何故なら、イミノ−ビオチンはｐＨ４．０緩衝剤中でストレプトアビジンから分離する一方、ビオチンは不快な変性剤（例えば９５℃で６ＭグアニジニウムＨＣｌ、ｐＨ１．５又は９０％のホルムアルデヒド）を必要とするからである。
【０１９１】
[0203]  好ましい実施形態では、結合パートナー対は１次検出標識（例えば連結プローブに取り付けられる）及び１次検出標識に特異的に結合する抗体を含む。本明細書の「特異的に結合する」とは、パートナーが、対とシステムの他の成分又は汚染物質とを区別するのに十分な特異性がある状態で結合することを意味する。結合は、非特異的結合を除去する洗浄工程を含むアッセイの状態で、結合したままであるのに十分でなければならない。幾つかの実施形態では、対の解離定数は約１０-4から１０-6Ｍ-1未満になり、約１０-5から１０-9Ｍ-1未満が好ましく、１０-9Ｍ-1が特に好ましい。
【０１９２】
[0204]  好ましい実施形態では、２次標識は化学的に修飾可能な部分である。この実施形態では、反応性官能基を含む標識を核酸に組み込む。これで、官能基はその後、１次標識で標識付けすることができる。適切な官能基にはアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、オキソ基及びチオール基が含まれるが、これらに限定されず、アミノ基及びチオール基が特に好ましい。例えば、アミノ基を含有する１次標識は、例えば当技術分野で知られているようなリンカーを使用して、アミノ基を含む２次標識に取り付けることができ、例えば同質又は異質二官能リンカーがよく知られている（参照により本明細書に組み込むものとする１９９４年のPierce Chemical Companyカタログ、交差リンカーに関する技術的セクション、１５５〜２００ページを参照）。
【０１９３】
[0205]  この実施形態では、標識は、標識プローブ結合配列又はその補体でもよい。本明細書の「標識プローブ」は、結合配列に実質的に相補的であり、一般的に直接的に標識付けされる核酸を意味する。
【０１９４】
[0206]  本発明の組成物は通常、既知の合成技術を使用して作成される。一般的に、標準的なホスホラミダイトの化学に基づく方法が本発明の一態様では特に有用であるが、当業者に認識されるように、多種多様な核酸合成反応が知られている。蛍光体及び失活剤の追加の間隔も周知である。
【０１９５】
ＶＩ．標的捕捉プローブ
[0207]  特定の態様では、更に本明細書で説明する連結プローブの説明のいずれかにより、本発明は標的捕捉プローブの使用を更に含む。これらの標的捕捉プローブは通常、連結プローブの化学的連結反応に関与しないが、アッセイの特異性を向上させるために有用である。本明細書で更に説明するように、標的捕捉プローブは、本明細書で説明するように連結プローブから形成された連結生成物の上流又は下流で、標的核酸とハイブリダイズする。標的捕捉プローブを標的核酸とハイブリダイズすると、標的核酸、１つ又は複数の連結生成物、及び標的捕捉プローブを含む標的複合体が形成される。標的捕捉プローブは、固体支持体又はビーズ上で標的複合体を捕捉するために使用することができる捕捉部分を含有する。支持体又はビーズ上に捕捉後、非結合種が除去される。次に、標的複合体（本明細書では「捕捉複合体」とも呼ぶ）及び／又は連結生成物を分析するか、増幅させる（ＰＣＲなど）。
【０１９６】
[0208]  一般的に、本発明の標的捕捉プローブは標的核酸とハイブリダイズするドメインと、ハイブリダイゼーション又は他の相互作用を通して標的捕捉に結合される複合体／分子を選択的に捕捉するために使用することができる追加の捕捉部分とを含有する。幾つかの実施形態では、捕捉部分は捕捉核酸配列、ビーズ、又は結合パートナー対の結合パートナー（次にその結合パートナーであるストレプトアビジンで捕捉することができるビオチンなど）とすることができる。
【０１９７】
[0209]  標的捕捉プローブは、核酸の標的ドメインとハイブリダイズされる連結プローブの上流又は下流でハイブリダイズするように設計される。特定の実施形態では、標的捕捉プローブは連結プローブに対して所定の距離内でハイブリダイズする。
【０１９８】
[0210]  本明細書で説明するように、本発明の方法は連結プローブが、リガーゼ酵素を追加せずに自発的に化学的連結を実行するような状況で、２つ以上の連結プローブを標的核酸の標的ドメインとハイブリダイズすることを含む。連結プローブとともに標的捕捉プローブを使用する本発明の実施形態では、１つ又は複数の連結プローブのハイブリダイゼーションの前、その後、又はそれと同時に標的捕捉プローブを標的核酸とハイブリダイズできることが認識される。同様に、標的捕捉プローブのハイブリダイゼーションも、連結プローブの自発的連結の前、その後、又はそれと同時に実行することができる。
【０１９９】
[0211]  特定の実施形態では、多数の標的捕捉プローブを標的核酸に適用する。認識されるように、これらの多数の捕捉プローブは、標的の長さに沿った任意の点とハイブリダイズするように設計することができる。標的核酸上に単一の連結生成物を形成する実施形態では、多数の連結プローブを使用して、いずれかの側部に連結生成物を位置させることができる。この実施形態では、核酸の品質管理又は評価に特に有用である。何故なら、多数の標的捕捉プローブを使用する場合は、分解した標的核酸でも捕捉される可能性が上がるからである。
【０２００】
[0212]  標的核酸上に多数の連結生成物を形成する実施形態では、多数の標的捕捉プローブも標的核酸とハイブリダイズすることができる。以上で説明したように、これらの多数の標的捕捉プローブは、標的核酸の長さに沿った様々な点でハイブリダイズするように設計することができる。幾つかの実施形態では、標的捕捉プローブは標的核酸の３’又は５’、又は３’及び５’末端で、又はその付近でハイブリダイズするように設計される。他の実施形態では、標的捕捉プローブは、標的核酸上に形成された様々な連結生成物の上流、下流、及び／又はその間に挿入された領域とハイブリダイズするように設計される。
【０２０１】
ＶＩＩ．アッセイ及び検出方法
[0213]  例示的態様では、本発明はサンプル中の複数の異なる標的核酸を検出する方法を提供する。このような標的核酸は、少なくとも第１及び第２の標的ドメインを含み、第１の標的ドメインと第２の標的ドメインとは相互に隣接する。標的核酸は標的捕捉ドメインである第３のドメインも含むことができ、標的捕捉ドメインは第１及び第２の標的ドメインの上流又は下流（すなわち、５’又は３’）に位置する。
【０２０２】
[0214]  好ましい実施形態では、本発明のアッセイは、以上で説明した標的ドメイン及び標的捕捉ドメインを含む標的核酸を含む連結基質を提供する工程を含む。これらの連結基質はそれぞれ、第１及び第２の核酸連結プローブを含む第１のセットの連結プローブを更に含む。第１の核酸連結プローブは標的核酸配列の第１の標的ドメインとハイブリダイズし、第２の核酸連結プローブは標的核酸配列の第２の標的ドメインとハイブリダイズする。このような実施形態では、第１の標的ドメインが第２の標的ドメインの上流にある。第１の核酸連結プローブは５’連結部分を更に含み、第２の核酸連結プローブは３’連結部分を更に含む。第１の標的ドメインと第２の標的ドメインとは相互に隣接しているので、標的ドメインとハイブリダイズする２つの連結プローブの連結部分は相互に隣接し、リガーゼ酵素を使用せずに連結して、連結生成物を形成することができる。
【０２０３】
[0215]  本発明の実施形態は、標的複合体を形成するために、標的捕捉プローブを標的核酸の第３の標的捕捉ドメインとハイブリダイズすることを更に含む。したがって、標的複合体は標的核酸、第１の標的ドメインとハイブリダイズする第１の連結プローブ、第２の連結ドメインとハイブリダイズする第２の連結プローブ、及び第３の標的捕捉ドメインとハイブリダイズする標的捕捉プローブを含む。標的捕捉プローブは捕捉部分を含み、それによって表面又は基質（ビーズなど）上で標的複合体を捕捉することができる。標的複合体の捕捉を使用して、結合していない標的核酸及び連結プローブから標的複合体を分離することができる。すなわち、標的捕捉プローブの使用は、連結生成物の形成に成功したこれらの標的核酸を単離する方法を提供する。
【０２０４】
[0216]  本発明のアッセイは、アンプリコンを形成するために様々な連結基質から形成された連結生成物を増幅することと、次に標的核酸を検出するためにアンプリコンを検出することとを更に含むことができる。
【０２０５】
[0217]  認識されるように、本発明のアッセイは多数の標的ドメインを指向する多数のセットの連結プローブを使用することができる。例えば、核酸は第５の標的ドメインに隣接する第４の標的ドメインを更に含むことができ、連結基質は第４の標的ドメインとハイブリダイズする第３の連結プローブ、及び第５の標的ドメインとハイブリダイズする第４の連結プローブを含む第２のセットの連結プローブを更に含む。以上で説明した第１及び第２の連結プローブと同様に、第３の連結プローブと第４の連結プローブはリガーゼ酵素を使用せずに結合し、したがって標的核酸は多数の連結生成物を含む。標的捕捉プローブは、この場合も標的核酸とハイブリダイズして、多数の連結生成物、標的核酸及び標的捕捉プローブを含む標的複合体を形成することができる。以上で説明したように、これらの標的複合体を表面上に捕捉することができ、多数の連結生成物は、幾つかの実施形態では増幅してアンプリコンを形成することができ、次にこれを検出することができる。
【０２０６】
[0218]  同様に、標的核酸は第７の標的ドメインに隣接する第６の標的ドメインを更に含むことができ、第５及び第６の連結プローブを含有する第３のセットの連結プローブを、それぞれ第６及び第７の標的ドメインとハイブリダイズすることができる。本明細書で説明する連結プローブのいずれとも同様に、第５の連結プローブと第６の連結プローブはリガーゼ酵素を使用せずに連結され、したがって、多数の連結生成物（すなわち、第１の連結プローブと第２の連結プローブとの連結から形成された連結生成物、及び／又は第３及び第４の連結プローブから形成された連結生成物）を含む標的核酸が生成される。認識されるように、標的核酸は任意の数の標的ドメインを含有することができ、したがって、本発明により任意の数の連結プローブセットを使用して、その標的核酸上に連結生成物を形成することができる。
【０２０７】
[0219]  多数の連結生成物を含む以上の標的核酸のいずれも、１つ又は複数の標的捕捉プローブと更にハイブリダイズして、標的複合体を形成することができる。これらの標的複合体を、次に基質上に捕捉することができる。次に、標的複合体の連結生成物を、複合産物を形成するために当技術分野で知られ、本明細書で説明する方法を使用して増幅し、次にこれらのアンプリコンを検出して、標的核酸の存在を識別及び／又は定量化する。
【０２０８】
[0220]  特定の実施形態では、本明細書で説明する方法のいずれかにより形成された連結生成物は増幅されず、代わりに本明細書で説明する方法のいずれかを使用して直接検出される。
【０２０９】
[0221]  連結又は転移反応生成物を検出する前に、追加の増幅反応があってもよい。例えば標的のコピーごとに生成される連結生成物の数を増加させることにより、２次増幅反応を使用して、標的配列を検出するための信号を増加させることができる。一実施形態では、連結生成物で任意の数の標準的な増幅反応を実行することができるが、それにはストランド置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、連結増幅及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えばＰＣＲの幾つかの変形、例えば「定量的競合ＰＣＲ」すなわち「ＱＣ−ＰＣＲ」、「任意プライミングＰＣＲ」すなわち「ＡＰ−ＰＣＲ」、「免疫ＰＣＲ」、「Ａｌｕ−ＰＣＲ」、「ＰＣＲ一本鎖の高次構造多型分析」すなわち「ＰＣＲ−ＳＳＣＰ」、「逆転写ＰＣＲ」すなわち「ＲＴ−ＰＣＲ」、「ビオチン捕捉ＰＣＲ」、「Ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅ  ＰＣＲ」、「パンハンドルＰＣＲ」、及び「ＰＣＲ選択ｃＤＮＡ差分」などが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、増幅技術はＰＣＲではない。特定の実施形態によれば、ギャップ充填連結などの連結技術を使用することができ、これにはギャップ充填ＯＬＡ及びＬＣＲ、架橋オリゴヌクレオチド連結、ＦＥＮ−ＬＣＲ、及び補正連結が含まれるが、これらに限定されない。これらの技術に関する説明は、米国特許第５，１８５，２４３号、欧州特許出願公開ＥＰ３２０３０８号及びＥＰ４３９１８２、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ９０／０１０６９号、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ０２／０２８２３号、及び米国特許出願第０９／８９８，３２３号に見られる。
【０２１０】
[0222]  標準的な酵素増幅反応に加えて、最初に生成される連結生成物がそれ自体、２次化学的連結反応の標的となり得るプローブスキームを設計することが可能である。
【０２１１】
[0223]  更に、開始サンプル核酸で「事前増幅反応」を実行して、化学反応連結のために更に多くの標的配列を生成することができる。例えば、全ゲノムの増幅を実行することができる。
【０２１２】
[0224]  当業者に認識されるように、本発明の方法及び組成物を使用するアッセイは所望の用途に応じて多種多様な構成にすることができ、（ＦＩＳＨと同様の）in situアッセイ、溶液系アッセイ（例えば蛍光体及び／又は失活剤の転移／除去）、及び異種アッセイ（例えば、高密度アレイを使用するように、操作、除去及び／又は検出に固体支持体を使用する）を含むことができる。また、アッセイは本明細書で概略説明するように、標的配列の事前増幅及び連結が生じた後の２次増幅反応などの追加の反応を含むことができる。
【０２１３】
[0225]  本発明のこの態様に関するアッセイは、本明細書で説明するように、信号の増加、例えば蛍光又は化学発光の生成を利用することができる。しかし、当業者に認識されるように、このような信号の減少を利用するアッセイも可能である。
【０２１４】
[0226]  一実施形態では、アッセイ反応は、ＦＩＳＨ反応と同様に「in situ」（様々なアッセイのフォーマットで、サンプルに応じて「in vitro」及び「ex vivo」とも言う）で実行される。外来性酵素を追加する必要がないので、特に疾患状態又は他の病理学に関連するような標的配列の存在を判定するために、組織学的サンプルなどの細胞（生細胞、電気穿孔細胞、固定細胞など）に試薬を追加することができる。
【０２１５】
[0227]  また、標的配列をサンプルから抽出する「in vitro」アッセイを実行することができる。サンプルを処理し（例えばパラフィン包埋サンプル用にサンプルを調製することができる）、試薬を追加して、反応の進行を可能にすることができ、その後に当技術分野で実行されているような検出をする。
【０２１６】
[0228]  幾つかの実施形態では、固体支持体を使用して連結生成物（本明細書では「連結生成物」とも呼ぶ）を検出する。例えば、連結生成物はアンカープローブ／捕捉プローブのハイブリダイゼーション又は他の結合技術を使用して、例えば結合パートナー対（例えばビオチン及びストレプトアビジン）の使用などで、ビーズに取り付けられる。一実施形態では、転移反応の結果、ビオチン部分が第１の連結プローブから標識を含む第２の連結プローブへと転移する。ストレプトアビジンを含むビーズをサンプルに接触させ、例えばＦＡＣＳテクノロジーを使用して、標識が存在するかビーズを検査する。
【０２１７】
[0229]  他の実施形態では、異種アッセイを使用して連結生成物を検出する。すなわち、反応は溶液中で実行され、生成物をアレイ又はビーズのような固体支持体に追加する。一般的に、一方の連結プローブはアンカー配列又は結合対パートナー（例えばビオチン、ハプテンなど）を含み、他方は標識（例えば蛍光体、標識プローブ結合配列など）を含む。連結生成物を固体支持体に追加し、支持体を任意選択で洗浄する。この実施形態では、連結生成物のみを捕捉して、標識を付ける。
【０２１８】
[0230]  本発明の別の態様では、オリゴヌクレオチドプローブの１つを磁気ビーズ又は何らかの他の標識（ビオチン）に取り付け、これによって連結生成物を容易に操作することができる。磁気ビーズ又は標識は、本明細書で概略説明するような任意の数の構成を使用して、上流又は下流のプローブに取り付けることができる。
【０２１９】
[0231]  本明細書で説明するように、追加の官能基部分（例えばアンカー配列、プライマー、標識など）を追加する副反応も実行することができる。同様に、本明細書で説明するように副増幅反応も実行することができる。
【０２２０】
[0232]  検出システムが当技術分野で知られており、光学アッセイ（蛍光及び化学発光アッセイを含む）、酵素アッセイ、放射標識付け、表面プラズモン共鳴、磁気抵抗、カンチレバーの偏向、シーケンシング、表面プラズモン共鳴などが含まれる。幾つかの実施形態では、連結生成物は、例えば参照により本明細書に組み込むものとする第２００６／０００６８３７８号で説明されているように、追加のアッセイテクノロジーで使用することができ、連結生成物は、コロイドなどの光散乱粒子間のリンカーとして働くことができ、その結果、連結生成物が存在すると変色する。
【０２２１】
[0233]  幾つかの実施形態では、検出システムをサンプル採取管に含めることができ、例えば採血装置は、管又は装置に組み込まれたアッセイを有して、病原体又は疾患の検出を可能にすることができる。
【０２２２】
[0234]  すべてを参照によりその全文を本明細書に明示的に組み込むものとするＰＣＴ特許出願ＷＯ９５／１５９７１号、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９７６９号、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０９７３９号、ＰＣＴＵＳ９９／０１７０５号、ＷＯ９６／４０７１２号及びＷＯ９８／２０１６２号は、核酸ハイブリダイゼーションの新規の検出方法を可能にし、電極などの電子伝達部分を含有する核酸を含む新規の組成物について説明している。
【０２２３】
[0235]  知名度が上がった１つのテクノロジーは、特に無数の核酸標的を同時に測定する用途に、ＤＮＡアレイを使用することを含む（Marshall他、Nat Biotechnol. (1998)16(1):27-31）。ＤＮＡアレイは、遺伝子発現の監視に最も多く使用され、１個から１００，０００個の核酸標的（ｍＲＮＡ）の相対的濃度を同時に測定する。ＤＮＡアレイは小型の装置で、独特で製造時に分かっているパターンにて核酸アンカープローブを表面に取り付ける（Marshall他、Nat Biotechnol. (1998)16(1):27-31）、又はビーズアレイの場合のように後に正確に解読することができる（Steemers他のNat Biotechnol. (2000)18(1):91-4、及びYang他のGenome Res. (2001)11(11):1888-98.）。一連の上流処理工程の後、問題のサンプルをＤＮＡアレイに接触させ、サンプル中の核酸標的が表面上のアンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、サンプル中の標的核酸の同一性及び多くの場合濃度が判定される。
【０２２４】
[0236]  現在使用されている核酸検出方法の多くが、その広い適用性を妨げる特徴及び／又は限界を有している。例えばＤＮＡマイクロアレイの場合、サンプルをマイクロアレイに接触する前に、通常はサンプル上で実行しなければならない一連の処理工程がある。これらの工程はアレイの製造業者及び／又はアレイを読み取るために使用するテクノロジー（蛍光、電気化学、化学発光、磁気抵抗、カンチレバーの偏向、表面プラズモン共鳴）に応じて変化するが、これらの処理工程は通常、幾つかの一般的カテゴリに入る。すなわち、核酸の単離と精製、酵素増幅、検出可能な標識の組み込み、及び増幅後クリーンアップである。他の一般的な工程には、サンプル濃縮、核酸標的の平均サイズを小型化するような増幅した標的の断片化、及びＰＣＲで増幅した標的を単鎖種に変換するエキソヌクレアーゼ消化作用がある。
【０２２５】
[0237]  ＤＮＡアレイをサンプルに接触する前にある多くの上流処理工程の要件は、これらの方法により拡散標的を検出する時間及び費用を大幅に増加させることがある。獲得されるデータの品質に重大な影響を及ぼすこともある。例えば、標的の分解に非常に敏感で、入力される核酸材料が良好に保存されていない場合は良好に実行されない増幅手順がある（Foss他、Diagn Mol Pathol.(1994)3(3):148-55）。上流処理工程の数及び／又は複雑さを解消又は軽減できるテクノロジーがあれば、費用を大幅に削減し、ＤＮＡアレイ試験から得られる結果の品質を改良することができる。上流処理工程を削減する１つの方法は、信号の強度を増大させて特異性を改良するために、連結反応を使用することを含む。
【０２２６】
[0238]  以上で概略説明したように、アッセイは様々な方法で実行することができる。固体支持体上の検出を利用するアッセイでは、本発明で使用法を発見したアレイなどの様々な固体支持体がある。
【０２２７】
[0239]  幾つかの実施形態では、ビーズなどの固体支持体が本発明で使用法が発見された。例えば、結合パートナー対（一方が連結された生成物上にあり、一方がビーズ上にある）を以上で概略したように使用して、非連結反応物を除去することができる。この実施形態では、磁気ビーズが特に好ましい。
【０２２８】
[0240]  本発明の幾つかの実施形態では、検出するために捕捉プローブを固体支持体に取り付ける。例えば、後で任意の適切な技術、例えばＦＡＣＳを使用して分析するために、捕捉プローブをビーズに取り付けることができる。同様に、以下で説明するようなビーズアレイを使用することができる。
【０２２９】
[0241]  一実施形態では、本発明はアレイを提供し、各アレイの位置は最低でも共有結合した核酸プローブを含み、これは一般的に「捕捉プローブ」と呼ばれる。本明細書の「アレイ」は、アレイフォーマットの複数の核酸プローブを意味し、アレイのサイズはアレイの組成及び最終用途によって決定される。約２個の異なる捕捉配位子から数千個まで含有するアレイを作成することができる。通常、電極ベースのアッセイの場合、アレイは、電極のサイズ、更にアレイの最終用途に応じて、２個〜１００，０００個以上も含む。好ましい範囲は約２個〜約１０，０００個であり、約５個〜約１０００個が好ましく、約１０個〜約１００個が特に好ましい。幾つかの実施形態では、本発明の組成物はアレイフォーマットでなくてもよい。すなわち、幾つかの実施形態では単一の捕捉プローブを含む組成物も作成することができる。また、幾つかのアレイでは、異なる組成物又は同一組成物の多数の基質を使用することができる。したがって、例えば大きいアレイが複数のこれより小さい基質を含むことができる。核酸アレイは当技術分野で知られており、幾つかの方法で分類することができ、規則正しいアレイ（例えば孤立した部位で化学を解明する能力）、及びランダムアレイ（例えばビーズアレイ）の両方が含まれる。規則正しいアレイには、写真平板技術（例えばAffymetrix GeneChip（登録商標））、スポッティング技術（Synteniその他）、印刷技術（Hewlett Packard及びRosetta）、電極アレイ、３次元「ゲルパッド」アレイ及び液体アレイが含まれるが、これらに限定されない。
【０２３０】
[0242]  好ましい実施形態では、アレイは基質上に存在する。本明細書の「基質」又は「固体支持体」又は他の文法上の同義語は、核酸の付着又は会合に適した孤立した個々の部位を含有するように修飾された任意の物質を意味する。基質は当業者に認識されるように多種多様な物質を含むことができ、それにはガラス、プラスチック、ポリマー、金属、メタロイド、セラミック、及び有機体が含まれるが、これらに限定されない。固体支持体がビーズである場合、多種多様な基質が可能であり、それには磁気物質、ガラス、ケイ素、デキストラン、及びプラスチックが含まれるが、これらに限定されない。
【０２３１】
[0243]  認識されるように、また以上でも説明したように、幾つかの検出方法を使用して、本発明により形成された連結生成物（又は連結生成物のアンプリコン）の存在を検出し、定量化することができる。このような検出方法は、連結生成物（又はそのアンプリコン）のいずれかとともに、本明細書で説明するアッセイのいずれかで使用することができる。このような検出方法にはキャピラリ電気泳動、質量分析法、マイクロアレイ分析、シーケンシング、リアルタイムＰＣＲ、光学検出、蛍光検出、生物発光検出、化学発光検出、電気化学検出、電気化学発光検出、及びLateral Flow Detectionが含まれるが、これらに限定されない。
【０２３２】
[0244]  上述したアッセイに加えて、本発明で使用する特定のアッセイには、化学的連結依存のプローブ増幅（ＣＬＰＡ）アッセイが含まれ、それについて以下で更に詳細に説明する。
【０２３３】
化学的連結依存のプローブ増幅（ＣＬＰＡ）
[0245]  幾つかの態様では、本発明は化学的連結依存のプローブ増幅（ＣＬＰＡ）テクノロジーに関する。ＣＬＰＡは、連結生成物を形成する標的特異的連結プローブの化学的連結に基づく。この連結生成物はその後、酵素増幅反応のテンプレートとして働いてアンプリコンを生成し、これはその後、任意の適切な手段を使用して分析されるが、その手段には以上で説明したような検出方法、すなわちリアルタイムＰＣＲ、光学検出、蛍光検出、生物発光検出、化学発光検出、電気化学検出、電気化学発光検出及びLateral Flow Detectionが含まれるが、これらに限定されない。ＣＬＰＡは、複合遺伝子シグネチャーパターンの分析を含むが、これらに限定されない様々な目的に使用することができる。酵素連結反応を使用するＤＡＳＬ（Bibikova, M.他、American Journal of Pathology,(2004),165:5,1799-1807）及びＭＬＰＡ（Schouten、米国特許第６，９５５，９０１号）などの他の技術とは異なり、ＣＬＰＡは化学的連結反応を使用する。
【０２３４】
[0246]  一実施形態では、ＣＰＬＡアッセイは、標的配列上で適切に位置決めされると自動連結することができる反応性部分を組み込む２つ以上の連結プローブを使用することを含む。好ましい実施形態では、第１のプローブ上の３’−ホスホロチオエート部分が第２のプローブ上の５’−ＤＡＢＳＹＬ離脱基と反応する（以下のスキーム１を参照されたい）。
【化１】
2014513557.tif 000002
スキーム１：３’ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（Ｓプローブ）と５’ＤＡＢＳＹＬ修飾オリゴヌクレオチド（Ｌプローブ）との化学的連結反応。
【０２３５】
[0247]  ５’ＤＡＢＳＹＬ基は他の部分、例えばヨウ素より約４倍速く反応し、合成中のプローブの精製も簡単化する。
【０２３６】
[0248]  ＣＬＰＡは他の配列に基づくハイブリダイゼーション技術に対して幾つかの顕著な利点を有する。第一に、ＣＬＰＡは、前もってＤＮＡのコピーを作成する必要なく、ＲＮＡ分析に直接適用することができる。第二に、ＣＬＰＡはサンプルの汚染物質に対して比較的感度が低く、血液、尿、唾液及び糞便のような身体サンプルなどの不純なサンプルに直接適用することができる。第三に、ＣＬＰＡは他の既知の方法よりも工程が少なく、それにより結果の獲得に必要な時間が短縮する。更に、ＣＬＰＡプローブは乾燥状態で保存することができ、適切に設計されたシステムは、相補的な標的配列が存在する状態で自発的に反応して、２つ以上のオリゴヌクレオチドを結合する。化学的連結反応は優れた配列選択性を示し、単一のヌクレオチド多型を区別するのに使用することができる。
【０２３７】
[0249]  酵素連結法とは異なり、ＣＬＰＡはＤＮＡ及びＲＮＡ標的に対してほぼ同一の反応性を示し、これによって以下で更に十分に説明するように、ＣＬＰＡは他の既知のシステムよりも効率的になり、ＣＬＰＡを使用できる用途の範囲を拡張させることが重要である。
【０２３８】
[0250]  ＣＬＰＡアッセイは、標的核酸の検出に必要な工程数を減少させ、このことで結果を大幅に短い期間で達成する可能性が提供されるので有利である。例えば、標準的な逆転写酵素（ＲＴ）−多重リガーゼ依存のプローブ連結（ＭＬＰＡ）の全体的なプロセスの流れは以下の工程を含む。
１．全ＲＮＡを単離する。
２．ｃＤＮＡのコピーを作成するために逆転写酵素を使用する。
３．ＭＬＰＡプローブセットをｃＤＮＡ標的と一晩ハイブリダイズする。
４．標的結合したプローブに結合するためにＤＮＡリガーゼを追加する。
５．連結プローブを増幅する、例えばＴａｑポリメラーゼ及び蛍光標識したＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲ増幅する。
６．例えばＣＥにより、サンプルを分析する。
【０２３９】
[0251]  標準的ＲＴ−ＭＬＰＡとは異なり、ＣＬＰＡによって、連結前にｃＤＮＡコピーを作成するために、ＲＮＡを単離する工程、及び逆転写反応を実行する工程を必要とせずに、細胞及び血液の溶解産物、及びＲＮＡ標的上で分析を直接実行することができる。これは、結果を達成するための時間を短縮し、より迅速な分析を達成する手段を提供する。
【０２４０】
[0252]  他の実施形態では、本発明のＣＬＰＡ法はホルマリン固定したパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織で実施する。更に他の実施形態では、ＦＦＰＥ組織は最初に化学的変性剤に曝露させて、組織を溶解させ、次に本明細書で説明するＣＬＰＡ法のいずれかにかける。更に他の実施形態では、タンパク質分解酵素Ｋ及び／又は音波処理を使用して、ＣＬＰＡ法を適用する前にＦＦＰＥ組織を更に処理する。
【０２４１】
[0253]  本発明の他の実施形態では、プローブ濃度を高くしてハイブリダイゼーション反応をさせることにより、より高速な反応時間を更に促進する。したがって、例えば入力プローブセットを比較的高い濃度、例えばＭＬＰＡ反応で通常使用されている濃度より約１００倍高い濃度でＣＬＰＡ反応に組み込むことができる。プローブ濃度を上昇させると、ハイブリダイゼーション工程に必要な時間が、通常は一晩から約１５分ないし約１時間へと大幅に短縮される。
【０２４２】
[0254]  ＣＬＰＡプローブは通常、プローブごとに２５０ナノモル（ｎＭ）から０．０１ｐＭ（ピコモル）の濃度で反応に組み込まれる。通常、濃度は約１ｎＭから約１ｐＭの間である。プローブ濃度を選択する場合に考慮する要素には、特定のアッセイ及び分析される標的が含まれる。Ｓプローブ又はホスホロチオエート又は求核プローブ及びＬプローブ又は離脱基又はＤＡＢＳＹＬ含有プローブは、標的の濃度と同等、又はそれを超える濃度で組み込まれる。Ｓ及びＬプローブの合計濃度は、１０マイクロモル（ｕＭ）もの高さに到達することがある。非限定的な例として、各Ｓ及びＬプローブで１ｎＭ×２５０ＣＬＰＡプローブ対ではプローブごとに１０ｎＭで５００ｎｍに等しくなり（１ｎｍ／プローブ×プローブ２個／対×標的２５０個）、これは合計濃度が５ｕＭという意味になる。
【０２４３】
[0255]  標的濃度は通常、合計ＲＮＡが約１０マイクログラム〜約１０ナノグラムの範囲になるが、１個の遺伝子のコピーという少ない値にもなり得る。
【０２４４】
[0256]  より高いプローブ濃度を使用する場合、通常は増幅する前に精製工程を組み込むことが、特に高多重分析（例えば標的約５個より多い）では好ましい。本発明のこの態様の一実施形態では、膜捕捉、磁気ビーズ捕捉及び／又は粒子捕捉などの固体支持体に基づく捕捉方法を使用することができる。好ましい実施形態では、連結後、及び酵素増幅の前にビオチン／ストレプトアビジン磁気ビーズ精製プロトコルを使用する。幾つかの場合では、その後の増幅反応を干渉せずに、磁気粒子を増幅マスタ混合物に直接追加することができる。他の場合では、捕捉したオリゴヌクレオチドをビーズから解放することが好ましく、解放されたオリゴヌクレオチド溶液はその後、捕捉粒子又は表面が存在しない状態で増幅される。
【０２４５】
[0257]  好ましい実施形態では、ＣＬＰＡはリガーゼを追加せずにプローブが自己連結できるように、１セットのプローブを核酸標的とハイブリダイズすることを含む。連結生成物が生成された後、通常は増幅を使用して生成物の検出及び分析を促進する。このために、プローブは、例えばユニバーサルＰＣＲプライマーのようなＰＣＲプライマーを組み込むように設計される。好ましい実施形態では、反応の連結部分が終了した後までユニバーサルプライマーが追加されず、プライマーは、（本明細書で更に詳細に説明する標的捕捉プローブの使用と同様に）表面捕捉精製の後に、ポリメラーゼとともに、多くの場合、ＰＣＲマスタ混合物の一部として追加される。
【０２４６】
[0258]  ＣＬＰＡプローブは、ＣＬＰＡプローブが核酸標的に結合されると、空間的に近い方向になり、リガーゼ酵素を追加しなくても連結反応を実行できるように位置決めされた反応性部分を保有する。好ましい実施形態では、化学的連結部分は、増幅酵素によって効率的に増幅することができる連結反応生成物を生じるように選択され、増幅酵素は好ましい実施形態ではＤＮＡポリメラーゼであるが、ＲＮＡポリメラーゼのように他の酵素を含んでもよい。理論に拘束されることなく、ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼによって増幅できると知られている基質に更に密接に類似する反応生成物を生成する化学的連結の化学的部分及びプローブセットの設計は、ＣＬＰＡアッセイに使用することができる効率的なプローブセットを生じる可能性が高くなる。特に好ましい反応化学は、３’−ホスホロチオエートと５’ＤＡＢＳＹＬ離脱基との間の反応を伴うスキーム１に示すような天然ＤＮＡに非常に類似した反応生成物を生じる化学的部分である。別の好ましい実施形態では、プローブセットは３’−ジホスホロチオエート（Miller, G.P.他、Bioorganic and Medicinal Chemistry, (2008)16:56-64、参照によりその全文を、特にプローブ及び３’−ジホスホロチオエート化学に関する全教示を本明細書に組み込むものとする）及び５’−ＤＡＢＳＹＬ離脱基を含む。
【０２４７】
[0259]  本発明のＣＬＰＡプローブは連結部分の長さを調節するスタッファー配列（本明細書では可変スペーサ配列とも呼ぶ）も組み込むことができる。スタッファー配列の長さは、連結プローブが指向する標的配列に対して特異的でよく、したがって連結生成物の分析を促進する都合のよい手段を提供する。スタッファー配列はいずれかのプローブ又は両方のプローブに配置することができる。３’−ホスホロチオエートプローブを使用する実施形態では、スタッファー配列は好ましい実施形態ではこのプローブ（本明細書では「Ｓプローブ」とも呼ぶ）上に組み込まれる。以上でも説明したように、スタッファー配列は、標的核酸に対して相補的ではない連結プローブの領域に配置することができる、又はスタッファー配列は、標的核酸のドメインに対して相補的である領域と少なくとも部分的に重複する領域に配置することができる。他の実施形態では、スタッファー配列はプライマー配列とプローブドメインとの間に配置される。
【０２４８】
[0260]  本発明の他の実施形態では、長さの変動に基づいて特異的な標的配列を検出し、識別するためのベースを提供する１つ又は複数の可変長連結生成物を生成するために、ＣＬＰＡ−ＣＥ、スタッファー配列は長さが変動する。好ましい実施形態では、可変長連結生成物はキャピラリ電気泳動（ＣＥ）によって分析される。一般的に、スタッファー配列は、様々な連結生成物の長さが少なくとも１塩基対（ｂｐ）〜約１０塩基対、好ましくは１塩基対〜４塩基対までの範囲で変動するように含まれる。ましい実施形態では、様々な連結生成物の長さは、約８０ｂｐ〜約４００ｂｐ、好ましくは約１００ｂｐ〜約３００ｂｐの範囲、更に好ましくは約１００ｂｐ〜約２００ｂｐの範囲で変動する。他の実施形態では、スタッファー配列は連結生成物の長さが約５〜１０００、１０〜９５０、１５〜９００、２０〜８５０、２５〜８００、３０〜７５０、３５〜７００、４０〜６５０、５０〜６００、５５〜５５０、６０〜５００、６５〜４５０、７０〜４００、７５〜３５０、８０〜３００、８５〜２５０、９０〜２００、９５〜１５０塩基対であるような長さである。
【０２４９】
[0261]  幾つかの実施形態では、ＣＬＰＡプローブは、連結生成物の分析及び検出を促進する他の任意選択の要素を更に含有することができる。このような要素には、連結プローブ対のセクションで以上で説明した要素のいずれかが含まれる。例えば、本明細書でＣＬＰＡ−ＭＤＭと呼ばれ（及び以下で更に詳細に説明する）実施形態では、連結プローブの少なくとも１つがアレイ結合配列を組み込んで、マイクロアレイプラットホーム上で適切な捕捉配列に結合することが好ましい。ＣＬＰＡ−ＭＤＭの場合、様々なＣＬＰＡ反応生成物はサイズの違いでは分離されず、アレイ結合配列の違いによって分離される。この実施形態では、アレイ結合配列の配列は、各ＣＬＰＡプローブがＤＮＡマイクロアレイ上の一意の部位に結合するように変化する。ＣＬＰＡ−ＭＤＭのアレイ結合配列の長さは通常、１５〜１５０塩基、更に特異的には２０〜８０塩基、最も特異的には２５〜５０塩基まで変動する。
【０２５０】
[0262]  他の実施形態では、ＣＬＰＡプローブは精製及び／又は分析を促進する他の要素も含むことが好ましく、それには蛍光標識及びハプテン部分、例えば連結生成物を精製又は検出するビオチンなどの標識が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ビオチンを組み込んだプローブ及び／又は連結生成物を、ビーズを含む任意の適切なアビジン／ストレプトアビジンプラットホーム上で精製することができる。ビオチン／アビジン捕捉システムが好ましいが、ハイブリダイゼーション／オリゴヌクレオチド捕捉のように他のハプテンシステム（例えばジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識付け）を使用することができる。その後の段階でビーズから捕捉生成物を解放することが望ましい場合は、ハイブリダイゼーション／オリゴヌクレオチド捕捉が好ましい方法である。磁気ビーズに加えて、抗ハプテン標識を付けた支持体（フィルタ紙、多孔性フィルタ、表面捕捉）を使用することができる。
【０２５１】
[0263]  ＣＬＰＡプローブの標識付けは、いずれかのプローブで、末端又は内部で実行することができる。ビオチンは、ホスホロチオエート（Ｓプローブ）の５’末端に組み込むことが好ましい。
【０２５２】
[0264]  好ましい実施形態では、ＣＬＰＡプローブセットは相補的な反応基を有する２個のオリゴヌクレオチドプローブで構成される（図１及び図２）。別の実施形態では、ＣＬＰＡプローブセットは標的上で相互に隣接して結合する３個以上のプローブで構成することができる。プローブ３個のＣＬＰＡ反応の好ましい実施形態では、外部プローブは酵素増幅プライマー結合部位を含有するように設計され、内部プローブは他のプローブ間の標的の領域に広がるように設計される。更に好ましい実施形態では、外部プローブは、内部（中央）プローブがない状態では相互に反応できないように、非相補的反応基を有する（図３）。幾つかの場合では、両方の外部プローブが同様の反応性部分を有することができるが、ただし１つの基が一方のプローブの５’末端及び他方のプローブの３’末端にあり、Ｌプローブ化学も、プローブ上の位置決め以外は相互に類似していてもよい。当業者に知られているように、プローブ２個のＣＬＰＡシステムのプローブと比較して、プローブ３個のＣＬＰＡ反応のプローブを製造するには、異なる化学試薬及びプロセスが必要になることがある。
【０２５３】
[0265]  プローブ３個のＣＬＰＡシステムの好ましい実施形態では、一方の外部プローブが３’ホスホロチオエート（３’Ｓプローブ）を含有し、他方の外部プローブが５’−ホスホロチオエート（５’プローブ）を含有し、中心プローブが３’−及び５’−ＤＡＢＳＹＬ離脱基を両方含有する。５’−ＤＡＢＳＹＬ離脱基プローブの製造については、以前に報告されている（Sando他、J. Am. Chem. Soc., (2002),124(10)2096-2097）。出願人らは最近、３’−ＤＡＢＳＹＬ離脱基を日常的に組み込むことができる新しいＤＮＡ合成試薬を開発した（図４参照）。
【０２５４】
[0266]  他の実施形態では、更に本明細書で説明するＣＬＰＡ法のいずれかによれば、本発明の緩衝剤が存在する状態でアッセイを実行することができる。このような緩衝剤については以上で詳細に説明されており、緩衝剤成分の任意の組み合わせが、本発明のＣＬＰＡ法で有用な場合がある。好ましい実施形態では、以下で説明する標的捕捉ＣＬＰＡ、ＣＬＰＡ−ＣＥ、及びＣＬＰＡ−ＭＤＭ法などの本発明のＣＬＰＡ法は、塩酸グアニジニウムなどのカオトロピックカチオンを含む変性剤を含む緩衝剤など、本発明の緩衝剤中で実行される。
【０２５５】
標的捕捉ＣＬＰＡ
[0267]  他の実施形態では、２個以上の連結プローブを使用するＣＬＰＡアッセイを、同じ核酸標的上のＣＬＰＡプローブセットの上流又は下流に結合する標的捕捉プローブと組み合わせることができる。この標的捕捉プローブは、ハイブリダイゼーション又は他の相互作用を通して標的捕捉に結合される複合体／分子の選択的捕捉に使用することができる捕捉部分（ハプテン、ビーズ、オリゴヌクレオチド捕捉配列などを含むことができるが、これらに限定されない）を含有する（図１０）。
【０２５６】
[0268]  標的捕捉プローブは、本明細書で説明するＣＬＰＡの任意の実施形態で使用することができる。
【０２５７】
[0269]  以上でも更に詳細に説明したように、複数の標的捕捉プローブを標的核酸に適用することができる。これらの多数の標的捕捉プローブは、標的核酸の３’及び５’末端の両方に、又はその付近に結合するか、多数の連結生成物の間にある標的捕捉プローブに介在することによって、１つ又は複数の連結生成物の側部に付くように設計することができる。以下で更に詳細に説明するように、標的核酸、特にＲＮＡの品質／完全性を評価する方法に、多数の標的捕捉プローブを使用することができる。
【０２５８】
ＣＬＰＡ−ＣＥ
[0270]  一態様では、本発明は、連結生成物を生成するために可変スペーサ配列を含有する連結プローブを使用する方法を提供し、これらの連結生成物は、次にキャピラリ電気泳動を使用して検出される。
【０２５９】
[0271]  特定の実施形態では、連結生成物を最初に、（ＰＣＲなどの）当技術分野で知られている任意の方法を使用して増幅し、次にキャピラリ電気泳動を使用して検出されるのはアンプリコンである。他の実施形態では、連結生成物及び／又はアンプリコンは、篩い分けマトリクス上のサイズ分別キャピラリ電気泳動（ＣＥ）、又はスラブゲル電気泳動によって検出される。
【０２６０】
[0272]  ＣＬＰＡ−ＣＥの概略図が図１に提供されている。この図に示された実施形態では、化学、機械又は浸透圧細胞溶解を含むが、これらに限定されない任意の適切な方法で、血液サンプルを細胞溶解現象にかける。化学的溶解を使用することが好ましい。
【０２６１】
[0273]  化学的溶解の後、標的核酸を指向するプローブを適用する。図６は、ＣＬＰＡ−ＣＥ分析用のプローブセットの設計の全体的概略図を提供する。この実施例では、Ｓプローブは、その後に連結生成物を増幅するためにユニバーサルＰＣＲプライマーを含むように設計される。Ｓプローブは、特定の標的配列と相関する長さで設計されたスタッファー配列も含む。Ｓプローブは、スタッファー配列と相関する標的配列を含む標的核酸の標的ドメインに対して相補的である標的結合配列（本明細書では「プローブドメイン」とも呼ぶ）も含む。認識されるように、プローブのセットは、すべてが同じ標的ドメインを指向する複数のＳプローブを含有することができる、又はセットは異なる標的ドメインを指向するＳプローブの混合物を含有することができる。同様に、Ｌプローブは、Ｓプローブが結合する標的ドメインに隣接する標的ドメインに対して相補的である標的結合配列を含む。この実施形態では。Ｌプローブはユニバーサルプライマーも含む。他の実施形態では、プローブの一方又は両方が蛍光体（ＦＡＭ、Ｃｙ３、Ｃｙ５など）で標識を付けられるが、蛍光標識を付けなくても検出することができる。標識付けは、幾つかの実施形態では蛍光標識を付けたＰＣＲプライマーを使用して遂行される。
【０２６２】
[0274]  図６に図示されたＣＬＰＡ−ＣＥプローブの実施形態では、Ｓプローブは５’末端にビオチン部分も含み、非連結プローブの精製及び除去を促進する。
【０２６３】
[0275]  図１に示すように、Ｓ及びＬプローブを標的核酸とハイブリダイズした後、プローブは自発的化学的連結を実行して、連結生成物を生成する。図１による幾つかの実施形態では、ビーズ精製工程を使用して非連結プローブを除去するが、ＣＬＰＡ−ＣＥ法のすべての実施形態では、非連結プローブを除去する工程は不必要である。連結し、非連結プローブを任意選択で除去した後、連結生成物を増幅する。連結プローブがユニバーサルプライマー配列を含有する実施形態では、ユニバーサルＰＣＲプライマー対を使用して、アンプリコンを生成する。他のタイプのプライマー配列を使用する実施形態では、相補的なプライマー対を使用して、アンプリコンを生成することができる。
【０２６４】
[0276]  連結プローブの一方（又は幾つかの実施形態では両方）に可変スペーサ配列が存在するので、アンプリコンは、特定の標的核酸に対応する一意の長さを有する。次に、これらのアンプリコンをキャピラリ電気泳動分析を使用して分析すると、各ピークの相対的強度は相対的発現に対応する（図１及び図７）。代替実施形態では、他の適切なサイズ分離技術を使用して、サンプル中の標的核酸の発現を判定することができる。
【０２６５】
[0277]  他の実施形態では、及び上記のいずれかによれば、ＣＬＰＡ−ＣＥ法は、標的捕捉プローブを標的核酸とハイブリダイズする工程を含む。その結果であり、標的捕捉プローブ、標的核酸及び連結生成物を含む標的複合体は、次に、連結生成物の増幅前に標的捕捉プローブの捕捉部分を通して表面又は基質上に捕捉される。他の実施形態では、結合していない標的核酸及び連結プローブが除去荒れ、標的複合体及び連結生成物のみが残る。次に、本明細書で説明する方法のいずれかにより、連結生成物を増幅し、分析することができる。幾つかの実施形態では、変性剤又はハイブリダイゼーション状態を変化させる他の薬剤の加熱及び追加など、当技術分野で知られている方法を使用して、増幅前に標的複合体から連結生成物が除去される。
【０２６６】
ＣＬＰＡ−ＭＤＭ
[0278]  本発明のこの態様の別の実施形態では、ＣＬＰＡ連結生成物をマイクロアレイ分析（ＣＬＰＡ−ＭＤＭ）によって分析／検出する。ＣＬＰＡ−ＭＤＭの概略図が図２に提供されている。ＣＬＰＡ−ＭＤＭは、少なくとも以下の点でＣＬＰＡ−ＣＥとは異なる。第一に、プローブセットの設計が異なる。例えば、ＣＬＰＡ−ＭＤＭプローブセットの全体図が図２に示されている。ＣＬＰＡ−ＣＥプローブと同様に、ＣＬＰＡ−ＭＤＭプローブセットは連結生成物を増幅するためのユニバーサルプライマーを含むことができる。これは、標的特異的配列、更に酵素依存の連結のための連結部分も含む。また、ＣＬＰＡ−ＭＤＭプローブセットはスタッファー配列も含むことができるが、スタッファー配列の目的は、酵素増幅の効率を標準化しようとして、ＣＬＰＡ−ＭＤＭのサイズを同じ長さに調節することである。アンプリコンのサイズの正規化は必要条件ではないが、増幅効率に利点を提供することができる。ＣＬＰＡ−ＣＥプローブセットとＣＬＰＡ−ＭＤＭプローブセットとの設計における第２の違いは、後者が、適切なマイクロアレイプラットホームで使用する一意のアレイ結合配列を含むことである。
【０２６７】
[0279]  本発明のＣＬＰＡ−ＭＤＭの態様に関して、検出用の「ユニバーサル」マイクロアレイプラットホームで使用するために、マイクロアレイ結合部位（ＡＢＳ配列）をプローブの設計に組み込む。ＣＬＰＡ−ＣＥシステムと同様に、プローブは例えば蛍光標識を付けたＰＣＲプライマーを使用して、蛍光体で標識を付けることが好ましい。あるいは、例えばサンドイッチアッセイ標識付け技術を最終的な読み出しのために使用することができる。サンドイッチアッセイは、スタッファー配列の代わりに、又はそれに加えて普通の（一般的）標識結合部位（ＬＢＳ）でプローブを設計することと、アレイのハイブリダイゼーション工程中にこの部位と結合する２次プローブを使用することとを含む。この方法は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のような化学発光システムで、又は電気化学的検出システムでアレイに標識を付けることが望ましい場合に特に有用である。一般的に、読み出しには平面マイクロアレイ（例えばガラスのスライド又は回路基板に点在させたマイクロアレイ）を使用する。しかし、Luminex and Illuminaから入手できるようなビーズマイクロアレイも使用することができる（例えばLuminex xMAP/xtag）。
【０２６８】
核酸品質評価
[0280]  特定の態様では、標的捕捉プローブに対して核酸標的上の結合位置が異なる多数のＣＬＰＡプローブセットを、核酸の品質を評価する方法に使用する（図１１）。図１１に図示した実施形態では、標的捕捉プローブを標的核酸の一方の末端とハイブリダイズし、標的核酸の異なる標的ドメインを指向する異なるプローブセットから生成された多数の連結生成物を使用して、標的捕捉プローブ及び多数の連結生成物を含む標的複合体を生成する。
【０２６９】
[0281]  このような態様では、異なる連結生成物からの信号の違いで、核酸標的の品質が評価される。例えば、標的捕捉プローブに最も近く配置された（例えば標的捕捉プローブから１〜１００ｂＰ離れた）一意のＣＬＰＡプローブセットからの捕捉効率／信号を、標的捕捉プローブが更に遠い（例えば３００〜１０００ｂｐ離れた）ＣＬＰＡプローブセットと比較し、その違いを測定することにより、核酸標的のフラグメント化又は分解レベルを推論することが可能である。他の例示的実施形態では、様々なＣＬＰＡプローブセットについて生成された信号の相対比は、特定の核酸標的について分解レベルの尺度を提供する。他の実施形態では、連結プローブセットは、標的捕捉プローブとハイブリダイズするドメインから既知の距離にて標的ドメインを指向するように設計される。このような実施形態では、標的捕捉プローブ、連結生成物及び標的核酸を含む標的複合体は、標的捕捉プローブ上の捕捉部分を通して表面又は基質上に捕捉され、結合していない標的核酸及び連結プローブは捕捉された標的複合体から分離される。これで、多数の異なるプローブセットに関連する信号の相対比は、サンプル中の標的核酸に存在する分裂の量の指標を提供し、連結生成物と標的捕捉プローブとの間で分かっている距離は、標的核酸の分裂を定量化するある種の「分子定規」を提供する。例えば、図１１に関して、例示的実施形態でサンプル中の標的核酸の大部分が、ＣＬＰＡセット２及びＣＬＰＡセット３がハイブリダイズされるドメイン間に配置されたドメイン中で分解した場合、これでＣＬＰＡセット１及び２からの信号はＣＬＰＡセット３からの信号よりも相対的に大きくなる。この信号間の相対比は、サンプル中の標的核酸の長さ及び完全性の指標を提供する。
【０２７０】
[0282]  当業者に認識されるように、様々なプローブセットの間隔は元の標的のサイズ及び所望の情報によって決定される。間隔は、相対的に等間隔とするか（例えば全長のほぼ３０％で離隔された３つのプローブセットを使用する）、又は所望に応じてクラスタ状にすることができる。
【０２７１】
[0283]  他の実施形態では、核酸標的の品質を評価するために多数の標的捕捉プローブを使用する。本明細書で更に説明するように、様々な標的捕捉プローブは、標的核酸の末端で、又はその付近でハイブリダイズするように設計することができ、様々な連結生成物の間でハイブリダイズするように追加的又は代替的に設計することができる。幾つかの実施形態では、２つの標的捕捉プローブを、１つ又は複数の連結生成物の上流及び下流の両方のドメインとハイブリダイズするように設計する。２つの異なる捕捉プローブを使用すると、高度に分解したサンプルでも、連結生成物を含むすべての標的複合体が、連結生成物の増幅前に表面又は基質上に効率的に捕捉され、結合していない標的核酸から確実に分離されるようにするのに役立てることができる。
【０２７２】
[0284]  分解に関する情報は、サンプルに含有される核酸の、及び更に特異的にＲＮＡの品質を評価する際に有用である。この技術は、サンプルが分解する危険性が高い場合、固定したパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプル及び他のサンプル中のＲＮＡの品質を非公式に評価する際に特に有用である。
【０２７３】
[0285]  以上で説明したように、捕捉効率の差は、信号の相対比を測定することによって間接的に判定することができる。この方法はマイクロアレイ、ＣＥ、シーケンシング、リアルタイムＰＣＲ、及び他の核酸分析法と組み合わせて、上述した方法のいずれかに従って標的核酸を更に評価することができる。
【０２７４】
ＶＩＩＩ．ハードウェア
[0286]  本発明の一態様では、Liu(2006)で説明されているものと同様の流体装置を使用して、本明細書で説明する方法を自動化する。カートリッジ、装置、ポンプ、ウェル、反応室、及び検出室を含むが、これらに限定されない構成要素に関しては、例えば参照により本明細書に組み込むものとする米国特許第６，９４２，７７１号を参照されたい。流体装置は、磁気粒子を捕捉するゾーン、分離フィルタ及び樹脂、例えば細胞分離用の膜も含むことができる（すなわち、PallからのLeukotrap（商標））。装置は、リアルタイムＰＣＲ増幅中に生成される蛍光信号をカートリッジ内で撮像するための検出室（すなわち、SYBR green、Taqman、Molecular Beacons）、更に反応生成物（アンプリコン及び連結生成物）を装置上で分離及び検出するためのキャピラリ電気泳動チャネルを含むことができる。好ましい実施形態では、キャピラリ電気泳動チャネルをプラスチック基質中で成形し、篩い分けポリマーマトリクス（Applied BiosystemsのPOP-7（商標））を充填することができる。適切に設計されたプローブセットでは、篩い分けしないマトリクスを含有するチャネルも使用することができる。
【０２７５】
[0287]  好ましい実施形態では、本発明の装置は、各ステーション又はステーションセットにて流体を装填し、取り出すための構成要素など、液体取扱い構成要素を含む。液体取扱いシステムは、任意の数の構成要素を含むロボットシステムを含むことができる。また、本明細書で概略説明する工程のいずれか、又はすべてを自動化することができ、したがって例えばシステムを完全に、又は部分的に自動化することができる。
【０２７６】
[0288]  当業者には認識されるように、使用可能な多種多様な構成要素があり、これには１つ又は複数のロボットアーム、マイクロプレートを位置決めするプレートハンドラ、カートリッジ及び／又はキャップを有するホルダ、非相互汚染プレートのウェルの蓋を外し、戻す自動蓋又はキャップハンドラ、使い捨てチップでサンプルを分配するチップアセンブリ、サンプルを分配する洗浄可能なチップアセンブリ、９６ウェルの装填ブロック、冷却した試薬ラック、マイクロタイタプレートのピペット位置（任意選択で冷却）、プレート及びチップの積み重ねタワー、及びコンピュータシステムが含まれるが、これらに限定されない。
【０２７７】
[0289]  完全なロボット又はミクロ流体システムは、スクリーニング用途の全工程を実行する高スループットのピペット操作など、自動化した液体、粒子、細胞及び有機体の取扱いを含む。これには、吸引、定量分配、混合、希釈、洗浄、正確な容積移送などの液体、粒子、細胞、及び有機物の操作と、ピペットチップの回収及び廃棄と、１回のサンプル吸引から多数を分配するための同一容積の反復的ピペット操作とが含まれる。これらの操作は、相互汚染がない液体、粒子、細胞、及び有機物の移送である。この計器は、フィルタ、膜及び／又は娘プレートへのマイクロプレートサンプルの自動複製、高密度移送、プレートの完全系列希釈、及び大容量運転を実行する。
【０２７８】
[0290]  好ましい実施形態では、アッセイの構成要素に対して特異性を有する化学的に誘導した粒子、プレート、カートリッジ、管、磁気粒子、又は他の固体相マトリクスを使用する。マイクロプレート、管又は任意の固体相マトリクスの結合表面は、無極性表面、高極性表面、共有結合を促進する修飾デキストランコーティング、抗体コーティング、融合タンパク質又はペプチドを結合する親和性媒質、組み換え型タンパク質Ａ又はＧなどの表面固定タンパク質、ヌクレオチド樹脂又はコーティング、及び本発明で有用な他の親和性マトリクスが含まれる。
【０２７９】
[0291]  好ましい実施形態では、多ウェルのプレート、多重管、ホルダ、カートリッジ、微小管、深いウェルのプレート、微量遠心管、極低温バイアル、正方形ウェルのプレート、フィルタ、チップ、光ファイバ、ビーズ、及び他の固体相マトリクスのプラットホーム、又は様々な容積のプラットホームは、追加の容量のために拡張性があるモジュール式プラットホーム上に収容される。このモジュール式プラットホームは、可変速軌道振盪装置、原料サンプル用の多位置作業デスク、サンプル及び試薬希釈、アッセイプレート、サンプル及び試薬のリザーバ、ピペットチップ、及び能動的洗浄ステーションを含む。
【０２８０】
[0292]  好ましい実施形態では、制御されたブロック又はプラットホームなどの熱交換器の温度を安定化させるために、熱サイクル装置及び熱調節器を使用して、０℃から１００℃でインキュベーションサンプルの正確な温度制御を提供し、これはステーションの熱制御装置に追加して、又はその代わりである。
【０２８１】
[0293]  好ましい実施形態では、１個又は多数の磁気プローブ、親和性プローブ、又はピペットを有する交換可能なピペットヘッド（単又は多チャネル）が、液体、粒子、細胞、及び有機体をロボットで操作する。多ウェル又は多重管磁気分離器又はプラットホームが、単一又は多数のサンプルホーマットで液体、粒子、細胞、及び有機体を操作する。
【０２８２】
[0294]  幾つかの実施形態では、計器類は検出器を含み、これは標識及びアッセイに応じて多種多様な異なる検出器とすることができる。好ましい実施形態では、有用な検出器には多数の蛍光チャネルがある顕微鏡と、蛍光、電気化学及び／又は電気インピーダンス分析器、単一及び二重波長終点及び動力学能力での紫外線及び可視光分光光度検出、蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）、ルミネセンス、消光、２光子励起、及び強度再分配を提供するプレート読み取り装置と、データ及び像を捕捉して数量化可能なフォーマットに変換するＣＣＤカメラと、キャピラリ電気泳動システム、質量分析計及びコンピュータワークステーションとが含まれる。
【０２８３】
[0295]  これらの計器は多ウェルプレート又は管内で細胞培養物を増殖させ、変換するために、及び有害業務のために、無菌層流又は換気フードに嵌め込むことができるか、又は封入された自給式システムである。生細胞は、制御された増殖状態で増殖することができ、時系列の生細胞アッセイのために温度、湿度及び気体が制御される。細胞の自動変換及び自動コロニー採収装置が、所望の細胞の迅速なスクリーニングを促進することができる。
【０２８４】
[0296]  磁気及び他のビーズ、粒子、細胞、及び有機体を個々に捕捉するために、フローサイトメトリ又はキャピラリ電気泳動フォーマットを使用することができる。
【０２８５】
[0297]  柔軟なハードウェア及びソフトウェアは、計器を多数の用途に適用可能にすることができる。ソフトウェアプログラムモジュールによって、方法を生成し、変更して、実行することができる。システム診断モジュールによって計器の位置合わせ、正確な接続、及びモータの操作が可能になる。カスタム化されたツール、実験器具、及び液体、粒子、細胞及び有機体移送パターンによって、様々な用途を実行することができる。データベースにより、方法及びパラメータを記憶させることができる。ロボット及びコンピュータのインタフェースにより、計器間の通信が可能になる。
【０２８６】
[0298]  好ましい実施形態では、ロボット装置は、バスを通して記憶装置及び入出力装置のセット（例えばキーボード、マウス、モニタ、プリンタなど）と通信する中央処理装置を含む。この場合も、以下で概略説明するように、これは本発明の多重化装置のＣＰＵに追加する、又はそれに代わって実行することができる。中央処理装置と記憶装置と入出力装置とバスとの間の一般的な相互作用は、当技術分野で知られている。したがって、実行すべき実験に応じて、様々な異なる手順をＣＰＵの記憶装置に記憶する。
【０２８７】
[0299]  これらのロボットの流体取扱いシステムは緩衝剤、試薬、サンプル、洗浄剤、標識プローブのようなアッセイ成分など、任意の数の異なる試薬を使用することができる。
【０２８８】
ＩＸ．全体的プロセス
[0300]  本発明の態様の１つの顕著な利点はサンプルを、特にＲＮＡ検出のために安定化緩衝剤中に採取することであり、これによってａ）検査する前に、サンプルを分解することなく長期間置くことができ（特に、ＲＮＡは従来の状態では極めて急速に分解するので、ＲＮＡのアッセイに有用である）、更にｂ）高い変性塩の濃度など、酵素アッセイの実行を妨げる成分を混合物から除去するために、さらなる精製工程を実行する必要なく、採取緩衝剤中でアッセイを実行する能力ができる。血液などのサンプルを採取し、細胞の溶解と長期間（例えば数日から数週間、又はそれ以上）にわたるＲＮＡの安定化を同時に実行する緩衝剤へと直接入れる能力によって、遠方で採取し、アッセイ処理の前に時間遅れを設けることができる。また、これらの方法はこのように、熱曝露及び／又は低温の鎖の取扱いを回避するなど、いかなる特殊な取扱い状態も回避する。例えば、サンプルを採取し、通常の郵便を使用して郵送し、追加の工程なしに検査することができる。
【０２８９】
[0301]  更に、採取したサンプル中で直接アッセイする能力は、従来の酵素系アッセイでサンプルを精製するサンプル調製工程を使用することに対して、重要な利点である。
【０２９０】
[0302]  他の実施形態では、サンプルを、１つの地理的位置で安定化緩衝剤中に採取し、次に、本明細書で説明する本発明の態様及び実施形態のいずれかによりサンプルでアッセイを実行する前に、異なる地理的位置に輸送することができる。すなわち、以上で説明したように、本発明は、１つの地理的位置で採取し、次に異なる地理的位置で本明細書で説明したような化学的連結法及びアッセイにかけることができる安定化したサンプルをもたらす方法及び組成物を提供する。
【０２９１】
Ｘ．キット
[0303]  本発明の別の態様では、核酸標的の所定のセットを日常的に検出するために、検出プロセスの一部として本明細書で説明するプローブ、技術、方法、及び化学的連結反応を使用するキットが生成される。キットはプローブ、標的配列、指示書、緩衝剤、及び／又は他のアッセイ構成要素を含むことができる。
【０２９２】
[0304]  他の態様では、本発明は、サンプル中のＲＮＡを安定化させ、検出又は定量化するために、変性剤を含む緩衝溶液、第１の連結プローブ、及び第２の連結プローブを含むキットを提供する。好ましい実施形態では、変性剤は、塩酸グアニジニウム及びグアニジニウムイソチオシアネートからなる群から選択される。他の好ましい実施形態では、緩衝溶液はＥＤＴＡ、還元剤、界面活性剤およびｐＨ緩衝剤を更に含む。特に好ましい実施形態では、還元剤はＤＴＴ及びメルカプトエタノールからなる群から選択される。別の特に好ましい実施形態では、界面活性剤はTriton X-100及びナトリウムＮ−ラウロイルサルコシンからなる群から選択される。
【０２９３】
[0305]  更に他の態様では、本発明は標的核酸配列を検出するキットを提供し、その標的配列は隣接する第１及び第２の標的ドメインを含む。このようなキットは、６ＭのＧｕＨＣｌを含む２ｘの溶解緩衝剤、及び少なくとも１セットの連結プローブを含むことができ、その少なくとも１セットの連結プローブは、標的核酸配列の第１の標的ドメインに対して相補的な第１のプローブドメインを含む第１の連結プローブと、標的核酸配列の第２の標的ドメインに対して相補的な第２のプローブドメインを含む第２の連結プローブとを含む。以上で更に説明したように、本発明のキットに含まれる連結プローブは、スタッファー配列、プライマー配列、及びアンカー配列、及びこれらの任意の組み合わせなど、他の機能を含むことができる。
【０２９４】
実施例
実施例１：標的５個の定量的多重検出
[0306]  １つの反応で組み合わせた５個のＤＮＡ標的模倣物（ＭＯＡＰ１（配列ＩＤ番号：５）、ＰＣＮＡ（配列ＩＤ番号：９）、ＤＤＢ２（配列ＩＤ番号：１２）、ＢＢＣ３（配列ＩＤ番号：１６）及びＢＡＸ（配列ＩＤ番号：１９）遺伝子の部分に対応する）を、その個々のＣＬＰＡプローブが存在する状態で使用し、多重ＣＬＰＡ反応を実行した。標的模倣物を、表２に示すように様々な濃度で貯蔵した。標的模倣物、すなわちＳプローブ及びＬプローブをＰＣＲ緩衝剤（１×ＰＣＲ緩衝剤は１．５ｍＭのＭｇＣＬ2、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３である）を５０℃で約１時間インキュベートした。各反応混合物の１μＬアリコートを、ユニバーサルプライマー（配列ＩＤ  番号１及び２、３００ｎＭ）の存在下でDynamo SYBR緑色ＰＣＲ混合物を使用したＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用した。サンプルでＰＣＲサイクルを２７回実施した（(95℃で１５分の後、９５℃（１０秒）、６０℃（２４秒）、７２℃（１０秒）の２７サイクル）。ＰＣＲ増幅の後、サンプルを変性し、ABI 3130 DNAシーケンサ（キャピラリ電気泳動計器）に注入した。サンプル３個のＡＢＩのＣＥトレース、更にＰＣＮＡのピーク対標的模倣物濃度のプロットを図７に示し、入力濃度に関する関数としてＰＣＮＡの信号の線形応答のプロットを図８に示す。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【０２９５】
実施例２：ＭＯＡＰ１及びＤＤＢ２のＤＮＡ及びＲＮＡ標的模倣物を使用したＣＬＰＡ反応
[0307]  反応物は、ＭＯＡＰ１及びＤＤＢ２遺伝子のＤＮＡ又はＲＮＡ標的模倣物、及び配列を標的にするように設計されたＣＬＰＡプローブを使用し、表３で提示するような複製物で調製した。プローブ番号は、表１では配列ＩＤ番号とする。試薬を、表４に示す濃度及び体積で追加した。反応性Ｓプローブ、Ｌプローブ及び標的模倣物を０．２ｍＬのＰＣＲ管に入れて５０℃まで６０分間加熱し、その後に４０増幅サイクルのリアルタイムＰＣＲ反応で、テンプレートとして２．５μＬのＣＬＰＡ反応物を使用した。リアルタイムＰＣＲのデータを複製サンプルについて平均し、表３に提示する（Ｃｔ値の列）。ＲＮＡ標的模倣物とＤＮＡ標的模倣物の間にＣｔ値の最小差が観察され、このことはＲＮＡ基質とＤＮＡ基質のプローブ連結効率が同様であることを示す。
【表６】
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【表７】
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【０２９６】
実施例３：溶解緩衝剤及び溶解した血液中のＤＤＢ２  ＲＮＡ転写物の直接分析
[0308]  OrigeneのAmbion及びｃＤＮＡベクタプラスミドからのin vitro転写キット（ＳＣ１２２５４７）を使用して、ＤＤＢ２メッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を調製した。ｍＲＮＡの濃度は、invitrogenのPicoGreen RNAアッセイキットを使用して判定した。水又は全血に注入したＤＤＢ２のｍＲＮＡ転写物の様々な濃度で、ＤＤＢ２プローブセット（表５）を検査した。反応物の混合成分を表５に列挙した。サンプル１〜４は、水中に１０ｎｇ、１ｎｇ、０．１ｎｇ及び０．０１ｎｇのＤＤＢ２転写物で構成し、サンプル５〜８は、全血中に注入した同じ濃度範囲で構成した。同様の反応プロトコルに従ったが、ただしタンパク質の凝固を減少させるように血液サンプルにはプロテイナーゼＫを添加した。手順は以下の通りである。すなわち、試薬を表５及び表６の濃度及び体積で添加した。
【０２９７】
[0309]  ＲＮＡ転写物は、その後の加熱工程の前に緩衝剤と組み合わせると安定し、ＲＮＡに有意な分解が観察されずに、この緩衝溶液中で数日間保存することができた。Ｓプローブ、ｍＲＮＡ転写物、塩酸グアニジニウム溶解緩衝剤、及び水（サンプル１〜４）又は全血（サンプル５〜８）を、８０℃まで５分間加熱し、次に５５℃の熱ブロックへと移動させた。Ｌプローブ、洗浄緩衝剤、ストレプトアビジンビーズ及びプロテイナーゼＫを添加し、反応物を５５℃まで６０分間インキュベートした。サンプルを熱ブロックから取り出し、dynal MPC 96S磁気捕捉プレートを使用して磁気ビーズを捕捉した。上澄みを取り出し、ビーズを洗浄緩衝剤で３回洗浄した。DyNamo SYBR緑色ＰＣＲマスタ混合物（２５ｕＬ、１×）及びユニバーサルプライマー（配列ＩＤ番号１及び２、３００ｎＭ）をビーズに添加し、Stratagen MX4000リアルタイムＰＣＲ計器を使用し、サンプルの熱サイクルを３０サイクル（５０℃で１５分間、３０サイクルを９５℃（１０秒間）、６０℃（２４秒間）、７２℃（１０秒間））実施した。Ｃｔ値を記録し、アンプリコンの長さを検証するように、増幅したサンプルをAgilent Bioanalyzer 2100に注入した。すべてのアンプリコンは適正なサイズ（約９６ｂｐ）を示し、性能は血液サンプルと水サンプルで同等であったが、このことは溶解した血液中でＲＮＡを直接分析する能力を実証した。表を以下の表７に要約する。追加の実験では、最初の加熱工程の前にＲＮＡ転写物を緩衝溶液中に保存した（数分から数時間、更には数日までもの）時間の長さは、表７に要約する結果を有意に変化させなかったことが示された。
【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【０２９８】
実施例４：３−プローブのＣＬＰＡ−ＣＥアッセイ
[0310]  ＤＮＡ標的模倣物プローブ配列ＩＤ番号２４及び３−プローブのＣＬＰＡプローブセット（配列ＩＤ番号２０、２１及び２２）を使用して、表８に提示する複製物として反応物を調製した。プローブ番号は表１の配列ＩＤ番号を指す。試薬を表９の濃度及び体積で添加した。Ｓプローブ、Ｌプローブ及び標的模倣物を、０．２ｍＬのＰＣＲ管中で即座に５０℃まで６０分間加熱し、その後に２５増幅サイクルのDynamo SYBR緑色ＰＣＲ反応で、テンプレートとして２．５μＬのＣＬＰＡ反応物を使用した。リアルタイムＰＣＲのデータを複製サンプルについて平均し、表８に提示する（Ｃｔ値の列）。次に、Agilent Bioanalyzer 2100により各サンプルの１μＬのサンプルを分析し、反応生成物のサイズを判定した。
【表１１】
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【表１２】
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【０２９９】
実施例５：ｍＲＮＡの多重リアルタイムＣＬＰＡ検出
[0311]  ０．２ｍＬのＰＣＲ管に、様々な色の二重標識プローブに対して一意の結合部位を保有するように下降した４セットのＣＬＰＡ試薬を添加した。反応物は、表１０及び表１１に示すように調製した。ＣＬＰＡプローブセット及び二重標識を付けたプローブは、表１の配列ＩＤ番号２５から３６に対応する。Ｓ及びランオフ転写ｍＲＮＡ（ＧＡＰＤＨ、ＰＣＮＡ及びＤＤＢ２）を、２×の溶解緩衝剤（ＧｕＨＣＬの溶解緩衝剤（１×）は３ＭのＧＵＨＣＬ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＤＴＴ、１．５％のＴｒｉｔｏｎ、３０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．２である）を添加した。ｍＲＮＡ転写物は、その後の加熱工程の前に緩衝剤と組み合わせると安定し、ＲＮＡの有意な分解が観察されずに、この緩衝溶液中に数日間保存することができた。次に、溶液を８０℃まで５分間加熱した。サンプルを氷の上で冷却し、ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズ（DYNAL M-270）及びＬプローブを添加した。サンプルを５０℃で１時間加熱した。磁気ビーズをDYNAL MPCプレート上に捕捉し、洗浄緩衝剤で２回洗浄した。ビーズを再捕捉し、ダイナモＰＣＲ１×マスタ混合物に４種類の異なる二重標識プローブ及びユニバーサルＰＣＲプライマー（合計体積２５ｕＬ）を添加した。Stratagene MX4000リアルタイムＰＣＲ計器を使用し、ＦＡＭ、Ｃａｌ蛍光オレンジ５６０、Ｃａｌ蛍光赤色６１０、及びQuasar 670チャネル内に蛍光を監視するための適切なフィルタを設け、サンプルの熱サイクルを３０サイクル（９５℃で１５分間、３０サイクルを９５℃（１０秒間）、６０℃（２４秒間）、７２℃（１０秒間））実施した。各チャネルで観察したＣｔ値を記録し、表１０に示す。
【表１３】
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【表１４】
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【０３００】
実施例６：ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ＣＬＰＡアッセイ
[0312]プロトコル
１．それぞれ４００ｐＭのＳプローブ（配列ＩＤ４７、４９、５１、５３及び５５）及び２５ｕＬのＴＥ緩衝剤を含有する２５ｕＬのＣＬＰＡ溶解緩衝剤（６ＭのＧｕＨＣｌ、４０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、３％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５）を、２００ｕＬのＰＣＲ管に添加した。
２．ミクロトーム刃（Leica、RM 2155）を使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織ブロックを５ミクロンの厚さに切断し、病理学用スライドガラスに固定した。約２ｍｍ×５ｍｍ×５ミクロンのサイズのＦＦＰＥサンプルをスライドガラスから掻き落とし、ＰＣＲ管に添加した。
３．ＦＦＰＥサンプル及び溶解緩衝剤を入れたＰＣＲ管を、水槽超音波処理機（Branson Ultrasonics）に入れ、５０Ｈｚで５分間、５５℃で音波処理する。
４．管を音波処理水槽から取り出し、混合しながら４０ｕＬのプロテイナーゼＫ溶液（２．５ｍｇ／ｍＬ）及び１０ｕＬのＬプローブ溶液（プローブごとに１ｎＭ、配列ＩＤ４６、４８、５０、５２及び５４）を添加した。
５．管を５５℃で３時間インキュベートした。
６．サンプルを熱ブロックから取り出し、ベンチトップスイングロータ遠心機を使用して、サンプルを１分間、３０００ｒｐｍで遠心分離した。
７．上澄みのみを新しいＰＣＲ管に移した。
８．２．０ｕＬのインビトロゲン／Dynal M-270ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズを添加し、混合して、サンプルを５分間インキュベートした。
９．Dynal MPC 96-S磁気プレートを使用してビーズを捕捉し、上澄みを除去した。
１０．ビーズを２００ｕＬの洗浄緩衝剤（１００ｍＭのトリス緩衝剤、ｐＨ７．０）で２回洗浄した。
１１．最終洗浄液を廃棄し、ビーズを１０ｕＬのDynamo F450 Taqポリメラーゼマスタ混合物（Finnzymes）及び１０ｕＬのＰＣＲプライマーセット（配列ＩＤ５６及び５７でそれぞれ６００ｎＭ）中で再懸濁させた。
１２．次に、サンプルをプロトコルに従って熱サイクルにかけた。すなわち、９５℃で１０分間ランプ、２８サイクルのＰＣＲ、９４℃で１０秒間、６０℃で２０秒間、７２℃で２０秒間である。
１３．熱サイクルの終了時に、１ｕＬのエキソヌクレアーゼを各ＰＣＲ反応管に添加し、サンプルを３７℃で２０分間、その後に９２℃で２分間インキュベートした。
１４．２．５ｕＬのＰＣＲ反応物を各ウェルから取り出し、２２．５ｕＬのLuminex Bead Mixに添加した。Luminex Bead Mixは以下のように調製した。各反応でセットごとに２５００個の微小球を混合する（ビーズ６６、６３、６８、１２及び７２）。MagPlex-TAG微小球混合物を渦及び音波処理により、１．１×のTm Hybridization Buffer中で１ｕＬ当たり１１１個の各微小球セットに約２０秒間希釈／濃縮する。
１５．次に、Thermomixerを使用して攪拌しながら、サンプルを９５℃で１．５分間、次に３７℃で１時間インキュベートする。
１６．１×のTm Buffer（０．２ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＴｒｉｓ、０．０８％のTriton X-100、ｐＨ８．０）中でSAPEを１０ｕｇ／ｍＬまで希釈することにより、Reporter Mixを調製する。
１７．１００ｕＬのReporter Mixを各ウェルに添加する。穏やかに混合する。
１８．３７℃で１５分間インキュベートする。
１９．次に、製造業者のプロトコルに従ってLuminex計器でMag Tagアッセイを実施した。
結果を図９に示す。
【０３０１】
実施例７：標的捕捉ＣＬＰＡ血液アッセイ
[0313]  ０．２ｍＬのＰＣＲ管中で、２５ｕＬの全血を２５ｕＬの２×のＧｕＨＣｌ溶解緩衝剤と混合した。サンプルで短時間、渦を形成した。この管に、２．０ｎＭの標的捕捉プローブ（ＴＣ）及び２．０ｎＭのＳプローブを含有する２５ｕＬの溶液を添加した。溶液を混合して、８０℃まで５分間加熱し、次に５５℃まで冷却した。５５℃である間に、１．０ｎＭのＬプローブ及び１ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを含有する５０ｕＬの溶液を添加した。Ｓプローブ、Ｌプローブ及びＴＣプローブの配列を表１の配列ＩＤ３７〜４５に列挙する。溶液を混合し、５５℃まで３０分間加熱した。３０分後に、２ｕＬのＭ−２７０ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズを添加した。穏やかにピペットで取ってサンプルを混合し、その後に５５℃で更に５分間長くインキュベートした。サンプルを熱ブロックから取り出し、即座に９６ウェルの磁気濃縮器プレート（Dynal）に載せた。１５秒後、上澄みを完全に除去した。ビーズを１８０ｕＬの洗浄緩衝剤（１００ｍＭのトリス緩衝剤、ｐＨ７．４、０．０１％のTriton）で３回洗浄した。緩衝剤を除去し、それぞれ３００ｎＭのプライマー１及び２を含有するＰＣＲ混合物を添加した。サンプルを２８サイクルの熱サイクル（９５℃で２分間、２８サイクル、９４℃（１０秒間）、６０℃（２０秒間）、及び７２℃（２０秒間））にかけた。熱サイクルの後、２．０ｕＬのＰＣＲ生成物を１ｕＬのABI Genescan 600 V2サイズ標準及び１７ｕＬのホルムアミドと混合した。サンプルを９５℃まで５分間加熱し、次に分析のためにABI 3500キャピラリ電気泳動計器に載せた。ＣＥトレースの１１０〜２００塩基対の範囲には、ピークが３個しか観察されなかった。
【表１５】
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【０３０２】
[0314]  本明細書は、本明細書で説明したテクノロジーの例示的態様における方法、システム及び／又は構造、及びその使用法について完全に説明するものである。以上で、このテクノロジーの様々な態様を特定の程度まで詳細に、又は１つ又は複数の個々の態様に関して説明してきたが、そのテクノロジーの精神又は範囲から逸脱することなく、当業者には開示された態様に無数の変更ができる。本明細書で説明したテクノロジーの精神及び範囲から逸脱することなく、多くの態様を作成することができるので、適切な範囲は添付の特許請求の範囲内にある。したがって、他の態様も想定される。更に、他で明示的に特許請求の範囲にあるか、特許請求の範囲の言葉によって特定の順序が本質的に必要とされていない限り、いずれの操作も任意の順序で実行できることを理解されたい。以上の説明に含まれ、添付図面で図示された事項はすべて、特定の態様の例示にすぎないと解釈されるべきであり、示された実施形態を限定しないものとする。異なることが文脈から明らかになるか、明示的に言及されていない限り、本明細書で提供したいかなる濃度値も、混合物の特定の成分の添加時又は添加後に生じるいかなる変換も考慮せずに、混合の値又はパーセンテージに関して与えられたものである。本明細書で既に明示的に組み込まれていない範囲については、本開示で言及したすべての公開された参考文献及び特許文献は、すべての目的のために、参照によりその全文を本明細書に組み込むものとする。特許請求の範囲で規定された通りの本発明のテクノロジーの基本的要素から逸脱することなく、詳細又は構造を変更することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年3月19日(2014.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９４】
実施例
実施例１：標的５個の定量的多重検出
[0306]  １つの反応で組み合わせた５個のＤＮＡ標的模倣物（ＭＯＡＰ１（配列ＩＤ番号：５）、ＰＣＮＡ（配列ＩＤ番号：９）、ＤＤＢ２（配列ＩＤ番号：１２）、ＢＢＣ３（配列ＩＤ番号：１６）及びＢＡＸ（配列ＩＤ番号：１９）遺伝子の部分に対応する）を、その個々のＣＬＰＡプローブが存在する状態で使用し、多重ＣＬＰＡ反応を実行した。標的模倣物を、表２に示すように様々な濃度で貯蔵した。標的模倣物、すなわちＳプローブ及びＬプローブをＰＣＲ緩衝剤（１×ＰＣＲ緩衝剤は１．５ｍＭのＭｇＣＬ2、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３である）を５０℃で約１時間インキュベートした。各反応混合物の１μＬアリコートを、ユニバーサルプライマー（配列ＩＤ番号１及び２、３００ｎＭ）の存在下でDynamo SYBR緑色ＰＣＲ混合物を使用したＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用した。サンプルでＰＣＲサイクルを２７回実施した（(95℃で１５分の後、９５℃（１０秒）、６０℃（２４秒）、７２℃（１０秒）の２７サイクル）。ＰＣＲ増幅の後、サンプルを変性し、ABI 3130 DNAシーケンサ（キャピラリ電気泳動計器）に注入した。サンプル３個のＡＢＩのＣＥトレース、更にＰＣＮＡのピーク対標的模倣物濃度のプロットを図７に示し、入力濃度に関する関数としてＰＣＮＡの信号の線形応答のプロットを図８に示す。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３００】
実施例６：ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ＣＬＰＡアッセイ
[0312]プロトコル
１．それぞれ４００ｐＭのＳプローブ（配列ＩＤ４７、４９、５１、５３及び５５）及び２５ｕＬのＴＥ緩衝剤を含有する２５ｕＬのＣＬＰＡ溶解緩衝剤（６ＭのＧｕＨＣｌ、４０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、３％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５）を、２００ｕＬのＰＣＲ管に添加した。
２．ミクロトーム刃（Leica、RM 2155）を使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋（Ｆ
ＦＰＥ）組織ブロックを５ミクロンの厚さに切断し、病理学用スライドガラスに固定した。約２ｍｍ×５ｍｍ×５ミクロンのサイズのＦＦＰＥサンプルをスライドガラスから掻き落とし、ＰＣＲ管に添加した。
３．ＦＦＰＥサンプル及び溶解緩衝剤を入れたＰＣＲ管を、水槽超音波処理機（Branson 
Ultrasonics）に入れ、５０Ｈｚで５分間、５５℃で音波処理する。
４．管を音波処理水槽から取り出し、混合しながら４０ｕＬのプロテイナーゼＫ溶液（２．５ｍｇ／ｍＬ）及び１０ｕＬのＬプローブ溶液（プローブごとに１ｎＭ、配列ＩＤ４６、４８、５０、５２及び５４）を添加した。
５．管を５５℃で３時間インキュベートした。
６．サンプルを熱ブロックから取り出し、ベンチトップスイングロータ遠心機を使用して、サンプルを１分間、３０００ｒｐｍで遠心分離した。
７．上澄みのみを新しいＰＣＲ管に移した。
８．２．０ｕＬのインビトロゲン／Dynal M-270ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズを添加し、混合して、サンプルを５分間インキュベートした。
９．Dynal MPC 96-S磁気プレートを使用してビーズを捕捉し、上澄みを除去した。
１０．ビーズを２００ｕＬの洗浄緩衝剤（１００ｍＭのトリス緩衝剤、ｐＨ７．０）で２回洗浄した。
１１．最終洗浄液を廃棄し、ビーズを１０ｕＬのDynamo F450 Taqポリメラーゼマスタ混合物（Finnzymes）及び１０ｕＬのＰＣＲプライマーセット（配列ＩＤ５６及び２３でそれぞれ６００ｎＭ）中で再懸濁させた。
１２．次に、サンプルをプロトコルに従って熱サイクルにかけた。すなわち、９５℃で１０分間ランプ、２８サイクルのＰＣＲ、９４℃で１０秒間、６０℃で２０秒間、７２℃で２０秒間である。
１３．熱サイクルの終了時に、１ｕＬのエキソヌクレアーゼを各ＰＣＲ反応管に添加し、サンプルを３７℃で２０分間、その後に９２℃で２分間インキュベートした。
１４．２．５ｕＬのＰＣＲ反応物を各ウェルから取り出し、２２．５ｕＬのLuminex Bead Mixに添加した。Luminex Bead Mixは以下のように調製した。各反応でセットごとに２５００個の微小球を混合する（ビーズ６６、６３、６８、１２及び７２）。MagPlex-TAG微小球混合物を渦及び音波処理により、１．１×のTm Hybridization Buffer中で１ｕＬ当たり１１１個の各微小球セットに約２０秒間希釈／濃縮する。
１５．次に、Thermomixerを使用して攪拌しながら、サンプルを９５℃で１．５分間、次に３７℃で１時間インキュベートする。
１６．１×のTm Buffer（０．２ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＴｒｉｓ、０．０８％のTriton X-100、ｐＨ８．０）中でSAPEを１０ｕｇ／ｍＬまで希釈することにより、Reporter Mixを調製する。
１７．１００ｕＬのReporter Mixを各ウェルに添加する。穏やかに混合する。
１８．３７℃で１５分間インキュベートする。
１９．次に、製造業者のプロトコルに従ってLuminex計器でMag Tagアッセイを実施した。
結果を図９に示す。
【国際調査報告】
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