(57)【要約】  （ｉ）熱安定性キナーゼと、（ii）単一ドメイン抗体又は単一ドメイン抗体断片とを含む単鎖融合タンパク質が提供される。単一ドメイン抗体又は単一ドメイン抗体断片を調製する方法であって、（ｉ）大腸菌などの宿主細胞において単一ドメイン抗体又は抗体断片を熱安定性キナーゼとの単鎖融合タンパク質として発現させるステップと、（ii）融合タンパク質を宿主細胞の細胞質から精製するステップとを含む方法も提供される。
2014531206.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）熱安定性キナーゼと、
（ii）単一ドメイン抗体又は単一ドメイン抗体断片と
を含む単鎖融合タンパク質。
【請求項２】
熱安定性キナーゼが、三量体熱安定性キナーゼ、四量体熱安定性キナーゼ、六量体熱安定性キナーゼ又は八量体熱安定性キナーゼなどのポリマー熱安定性キナーゼである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
熱安定性キナーゼが、アデニル酸キナーゼ、酢酸キナーゼ又はピルビン酸キナーゼである、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
熱安定性キナーゼが三量体アデニル酸キナーゼである、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
熱安定性キナーゼがスルホロブス属の種、例えば、Ｓ．アシドカルダリウスなど由来である、請求項１〜４のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項６】
単一ドメイン抗体がサメ新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）又はその断片である、或いは単一ドメイン抗体がラクダ科の動物の抗体又はその断片である、請求項１〜５のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチド配列を含むプラスミド。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質を産生する方法であって、
（ｉ）請求項７に記載のポリヌクレオチド配列又は請求項８に記載のプラスミドを大腸菌などの宿主細胞において発現させるステップと、
（ii）発現された融合タンパク質を前記宿主細胞の細胞質から精製するステップと
を含む方法。
【請求項１０】
単一ドメイン抗体又は単一ドメイン抗体断片を調製する方法であって、
（ｉ）大腸菌などの宿主細胞において単一ドメイン抗体又は抗体断片を熱安定性キナーゼとの単鎖融合タンパク質として発現させるステップと、
（ii）前記融合タンパク質を前記宿主細胞の細胞質から精製するステップと
を含む方法。
【請求項１１】
融合タンパク質が請求項１〜６のいずれかに記載されているものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれかに記載の２又は３以上の融合タンパク質を含み、熱安定性キナーゼがポリマー熱安定性キナーゼである、多量体融合タンパク質複合体。
【請求項１３】
２又は３以上の融合タンパク質の、熱安定性キナーゼ単量体と融合した単一ドメイン抗体又は抗体断片が、同じである又は異なる、請求項１２に記載の多量体融合タンパク質複合体。
【請求項１４】
試料上又は試料中の分析物を検出するためのレポーター分子であって、請求項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質、或いは請求項１２又は１３に記載の多量体融合タンパク質複合体を含むレポーター分子。
【請求項１５】
（ｉ）請求項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質、請求項１２又は１３に記載の多量体融合タンパク質複合体、又は請求項１４に記載のレポーター分子と、
（ii）熱安定性キナーゼの基質と
を含む検出キット。
【請求項１６】
試料上又は試料中の分析物を検出するインビトロでの方法であって、
（ｉ）前記試料を請求項１４に記載のレポーター分子と接触させるステップであって、単一ドメイン抗体又は抗体断片が前記分析物と結合して抗体−分析物複合体が形成されるステップと、
（ii）前記抗体−分析物複合体を、熱安定性キナーゼのキナーゼ活性を検出することなどによって検出するステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一ドメイン抗体又は抗体断片を含む高度に安定なアッセイ試薬の発現及び産生、並びに試料上又は試料中の分析物を検出するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
２つの重鎖と２つの軽鎖で構成される一般的な抗体とは異なり、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、single-domain antibody）は、単一の単量体抗体可変ドメインからなる単鎖抗体ポリペプチドである。
【０００３】
単一ドメイン抗体は、一般には、約１１０アミノ酸長であり、典型的な分子量は１２〜１５ｋＤａ付近である。よって、単一ドメイン抗体は、一般的な抗体（１５０〜１６０ｋＤａ）よりもはるかに小さく、さらにはＦａｂ断片（軽鎖１つと重鎖半分からなり、分子量が約５０ｋＤａである）及び単鎖可変性断片（１つが軽鎖由来であり１つが重鎖由来である２つの可変ドメインからなり、分子量が約２５ｋＤａである）よりも小さい。
【０００４】
「ＶＨＨ断片」と称される最初の単一ドメイン抗体は、ラクダ科の動物に見いだされる重鎖抗体から工学的に産生された。「ＶＮＡＲ断片」と称される単一ドメイン抗体は、軟骨魚類の重鎖抗体（「免疫グロブリン新規抗原受容体」（ＩｇＮＡＲ、immunoglobulin new antigen receptor））から得ることもできる。単一ドメイン抗体は、一般的な免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ、immunoglobulin G）（例えば、ヒト又はマウス由来のもの）由来の二量体可変ドメインを単量体に分割することによって得ることもできる。単一ドメイン抗体に関する大部分の研究が現在は重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖に由来する単一ドメイン抗体も、標的エピトープに特異的に結合することが示されている。
【０００５】
単一ドメイン抗体は、当技術分野において、ヒトコブラクダ、ラクダ、ラマ、アルパカ又はサメを、所望の抗原を用いて免疫化し、その後、重鎖抗体をコードするｍＲＮＡを単離することによって得られている。数百万のクローンを含有する単一ドメイン抗体の遺伝子ライブラリーが逆転写及びＰＣＲによって産生され、ファージディスプレイ及びリボソームディスプレイなどのスクリーニング技法を用いて抗原に結合するクローンが同定される。
【０００６】
あるいは、単一ドメイン抗体は、当技術分野において、一般的なマウス又はヒトＩｇＧから作製されている。この手法の問題は、一般的なＩｇＧの結合領域が、２つのドメイン（ＶＨ及びＶＬ）からなり、それらが親油性であることに起因して二量体又は凝集体を形成する傾向があることである。通常、親油性アミノ酸を親水性アミノ酸と交換することによって単量体化（monomerization）が実現されるが、多くの場合、抗原に対する親和性が失われる。
【０００７】
ドメイン構造が単純であることを考慮すると、単一ドメイン抗体は融合タンパク質としての組換え発現に適している。
【０００８】
大腸菌（E.coli）は、遺伝子操作が容易であるので、抗体を発現させるための魅力的な宿主である。標識した抗体断片を大腸菌のペリプラズムから発現させることは当技術分野で公知である。例として、Dooley M.F. et al., Mol. Imm., (2003)40:25-33；Arbabi M. et al., FEBS Letters(1997)414:521-526；及びNuttall S.D. et al., Eur. J. Biochem. 2003 Sep. 270(17):3543-54には、大腸菌ペリプラズムにおけるラクダ科の動物及びサメの抗体の高レベルの発現が記載されている。しかし、これらの発現系には、収量が当てにならないこと及び活性を有する抗体ポリペプチドが一貫して分泌されないことなどのいくつもの技術的な問題が伴う。
【０００９】
大腸菌の特殊化された菌株を、条件を変更し、安定化抗原の存在下で使用した、抗体の低レベル細胞質発現についても記載されている（Bossi S. et al., Protein Expression and Purification, Volume 72, Issue 1, July 2010, pages 55-58を参照されたい）。抗体の細胞質発現に伴う技術的難題は、抗体の構造を制約し、したがって親和性の高い結合性をもたらすために必須である、単一ドメイン抗体のペプチド鎖内の１又は２以上の鎖内ジスルフィド結合の形成の必要性を反映している。ジスルフィド結合の形成及び単一の好ましいコンフォメーションを生成するための複合体タンパク質内でのこれらのシャッフリングに関与するタンパク質は、大腸菌のペリプラズムの内部に位置している。対照的に、大腸菌の細胞質は、一般に、ジスルフィド結合の形成に好都合ではなく、また、ジスルフィド結合が還元されて２つの遊離のスルフヒドリル基になることが積極的に促進される還元的環境であるとみなされている。少数の大腸菌株が、例えば、非還元性の環境を生じさせることによって（例えば、細胞質のチオレドキシンをノックアウトすることによって）細胞質においてペリプラズム様条件をもたらすために工学的に産生されている。しかし、これらの菌株は、ネイティブな菌株よりも成長がよくない傾向があり、これにより、生成されるバイオマスが減少し、また、発現レベルも低くなり、したがって、タンパク質の収量が減少する。
【００１０】
これらの技術的な問題から見て、細胞質で発現された抗体断片又はそのドメインはほとんど普遍的に誤って折り畳まれており、それらの標的抗原に高親和性で結合することができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Dooley M.F. et al., Mol. Imm., (2003)40:25-33
【非特許文献２】Arbabi M. et al., FEBS Letters(1997)414:521-526
【非特許文献３】Nuttall S.D. et al., Eur. J. Biochem. 2003 Sep. 270(17):3543-54
【非特許文献４】Bossi S. et al., Protein Expression and Purification, Volume 72, Issue 1, July 2010, pages 55-58
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、当技術分野において、先行技術において直面する問題の１又は２以上が克服される、単一ドメイン抗体及び抗体断片を大腸菌の細胞質において発現させるための、信頼できる効率的な手段が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、この当技術分野における必要性を、単一ドメイン抗体又は抗体断片を大腸菌の細胞質において熱安定性キナーゼとの融合タンパク質として発現させることによって満たす。
【００１４】
したがって、本発明の第１の態様では、（ｉ）熱安定性キナーゼと、（ii）単一ドメイン抗体又は単一ドメイン抗体断片とを含む単鎖融合タンパク質が提供される。
【００１５】
本発明は、単一ドメイン抗体又は抗体断片を調製する方法であって、（ｉ）大腸菌などの宿主細胞において単一ドメイン抗体又は抗体断片を熱安定性キナーゼとの単鎖融合タンパク質として発現させるステップと、（ii）融合タンパク質を宿主細胞の細胞質から精製するステップとを含む方法も提供する。
【００１６】
熱安定性キナーゼを大腸菌の細胞質からの組換えタンパク質として発現させ、精製することは、宿主好熱生物体から単離した場合（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００５／０９３０８５号パンフレット、国際公開第２００９／１０４０１３号パンフレット及び国際公開第２０１０／０７９３５７号パンフレットを参照されたい）よりも、利用しやすく且つ再現性のある材料を提供することが当技術分野で公知である。熱安定性アデニル酸キナーゼ（ｔＡＫ、thermostable adenylate kinase）、例えば、スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）由来のもの及びサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）由来のものなどは分子内ジスルフィド結合を欠くので、これらの酵素は、大腸菌細胞質の比較的酸化的な環境内で正確に折り畳まれることが示されている。
【００１７】
熱安定性タンパク質を融合タグとして使用することが増えてきている。この点について、本来的に高温においてさえも可溶性であるタンパク質を融合することにより、パッセンジャータンパク質の折り畳みが促進されることが公知である［de Marco et al., J. Biotech., (2004)107:125-133；Fox J.D. et al., FEBS Lett. 2003 Feb 27;537(1-3):53-7；Kondo N. et al., Anal Biochem. 2009 Feb 15;385(2):278-85. Epub 2008 Nov 19；Luke J.M. et al., J Biotechnol. 2011 Feb 10;151(3):242-50. Epub 2010 Dec 17.］。この手法は、正確なジスルフィド結合の形成を得ることに関する問題、及びこれらの融合パートナーが細胞質内に局在化していることに主に起因して各抗体鎖上に別々の融合タグが必要であることに起因して、以前は組換え抗体を発現させるためには用いられていなかった。
【００１８】
本発明者らは、予想外に、細胞質から発現させると、融合タンパク質の熱安定性キナーゼ成分により、単一ドメイン抗体成分の折り畳みが積極的に促進され、安定化機能がもたらされ、同時に測定可能なキナーゼ活性が保持されることを明らかにした。
【００１９】
さらに、本発明の融合タンパク質は、大腸菌の細胞質から、活性型で、ペリプラズムで発現する同じ単一ドメイン抗体又は抗体断片について予測される収量よりも高い収量で精製することができる。
【００２０】
単一ドメイン抗体断片への高レベルの熱安定性の授与については以前には記載されていない。この場合、「高レベルの熱安定性」とは、８０℃超、好ましくは９０℃超での熱安定性を指す。
【００２１】
発現された融合タンパク質の安定性が高いことにより、大腸菌細胞溶解物を高温で処理し、それを清澄化し、単一のクロマトグラフィーカラムにアプライすることを伴う急速プロトコールによってそれらを精製することが有利に可能になる。発現された融合タンパク質の安定性が高いことにより、それらを室温で（４℃以下ではなく）保管することも有利に可能になる。
【００２２】
本発明の融合タンパク質の高い安定性は、融合タンパク質を検出アッセイにおいてレポーター分子として使用する場合にも有利である。例として、本発明の高度に安定な融合タンパク質を使用することにより、高レベルの尿素を試料の抽出用溶剤又は希釈剤に添加することが可能になり、これにより、検出感度を失うことなく、抗原の抽出を改善すること及びバックグラウンドを低下させることができる（国際公開第２０１０／０７９３５７号パンフレットにおいて詳述されている通り）。試料を尿素で処理することにより、異なる種類の抗原を検出すること、通常は溶媒露出していない保存されたエピトープに焦点を合わせることも可能になる。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「単一ドメイン抗体」という用語は、単一の単量体抗体可変ドメインからなる単鎖抗体ポリペプチドのいずれも包含する。単一ドメイン抗体の例としては、「ＶＨＨ断片」（例えば、ラクダ科の動物の重鎖抗体から工学的に産生されたもの）及び「ＶＮＡＲ断片」（例えば、サメなどの軟骨魚類のＩｇＮＡＲ重鎖抗体から得られたもの）が挙げられる。
【００２４】
一実施形態では、単一ドメイン抗体又は抗体断片は、サメ免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）のＶＮＡＲ断片である。サメ由来の単一ドメイン抗体のＶＮＡＲ配列の１つの例が本明細書では配列番号８として提供される。
【００２５】
一実施形態では、単一ドメイン抗体又は抗体断片は、ラクダ科の動物の重鎖抗体のＶＨＨ断片である。ラクダ科の動物由来の単一ドメイン抗体のＶＨＨ配列の１つの例が本明細書では配列番号１３として提供される。
【００２６】
融合タンパク質の単一ドメイン抗体成分は抗原に結合する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「単一ドメイン抗体断片」という用語は、本明細書で定義されている任意の「単鎖抗体」の断片を包含する。断片の例としては、おそらく当業者に公知の１又は２以上の従来の技法によって人工的に制約される、抗原特異性の決定に関与する相補性決定領域（ＣＤＲ、complementarity determining region）のみ、ＶＮＡＲ断片の場合ではＣＤＲ３のみをコードする切断された遺伝子が挙げられる。本発明の抗体断片は、組換えＤＮＡ技法によって産生することができる。一実施形態では、単一ドメイン抗体断片は、少なくとも５０アミノ酸長、例えば、少なくとも６０アミノ酸長、７０アミノ酸長、８０アミノ酸長、９０アミノ酸長又は１００アミノ酸長である。
【００２８】
融合タンパク質の単一ドメイン抗体断片成分は抗原に結合する。単一ドメイン抗体の断片は、全長の単一ドメイン抗体が結合する抗原と同じ抗原に結合することができる。
【００２９】
単一ドメイン抗体又は単一ドメイン抗体断片と抗原の結合（抗体−抗原複合体が形成される）は、任意の当技術分野で公知の従来のアッセイを用いて検出することができ、また、抗原を含む分析物を検出するためのアッセイの基礎を形成することができる。
【００３０】
単一ドメイン抗体（又はその断片）の使用には、従来の「全抗体」と比較して、いくつもの技術的な利点が伴う。例として、単一ドメイン抗体の分子質量が比較的小さいことにより、組織内への浸透性が良好になり、また血漿内半減期が短くなる。さらに、単一ドメイン抗体はＦｃ領域を欠くので、補体誘発性細胞傷害（complement-triggered cytotoxicity）が誘導されない。いくつかの単一ドメイン抗体及び抗体断片は、全抗体が接近できない「隠れた」抗原（例えば、酵素の活性部位）に結合する。この性質は、それらのＣＤＲ３ループが延長されており、そのような部位に侵入できることに起因することが示されている。
【００３１】
したがって、単一ドメイン抗体及びその抗体断片は新規の診断用試薬及び治療薬の開発に適している。
【００３２】
実施例及び図面において示されている一実施形態では、例示的な単一ドメイン抗体は、ラクダ科の動物の重鎖抗体（ＶＨＨ）又はサメＩｇ新規抗原受容体の可変ドメイン（ＶＮＡＲ）のいずれかに由来する。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「抗体成分」という用語は、本明細書で定義されている単一ドメイン抗体及び単一ドメイン抗体断片を指す。
【００３４】
「熱安定性」である限りはいかなるキナーゼ酵素も本発明において使用することができる。
【００３５】
「熱安定性キナーゼ」という用語は、熱への曝露後にキナーゼ活性を保持する、すなわち、高温の影響を比較的受けないキナーゼを指す。本発明の一実施形態では、５０〜１２０℃の温度への曝露後の熱安定性キナーゼのキナーゼ活性は、曝露させる前のキナーゼのキナーゼ活性の少なくとも７０％（又は少なくとも８０％、９０％、９５％若しくは１００％）である。一実施形態では、４０℃に３０分曝露させた後、又は５０℃に３０分曝露させた後、又は６０℃に３０分曝露させた後、又は７０℃に３０分曝露させた後、又は８０℃に２０分曝露させた後、又は９０℃に１０分曝露させた後、又は１２０℃に３分曝露させた後、熱安定性キナーゼは、曝露前のキナーゼ活性の少なくとも７０％（又は曝露前のキナーゼ活性の少なくとも８０％、９０％、９５％若しくは１００％）を保持し得る。
【００３６】
熱安定性キナーゼは、常套的にタンパク質に損傷を与える若しくは破壊する又はそれらを不活性にする種々の他の生化学的プロセス及び物理的プロセス、例えば、特定の化学物質、例えばカオトロープへの曝露、フリーラジカルによる損傷、界面活性剤、極度のｐＨ、プロテアーゼへの曝露、タンパク質の架橋、不透性膜若しくは半透性膜若しくはポリマー内への封入、又は表面上への不可逆的な固定化などに対して非熱安定性キナーゼよりも抵抗性であり得る（例えば、Daniel R.M. et al., Biochem J. 1982 207:641-4；Rees DC and Robertson AD, Protein Sci. 2001 10:1187-94；Burdette DS et al., Enzyme Microb Technol. 2000 27:11-18；Scandurra R. et al., Biochimie. 1998 Nov;80(11):933-41；及びLiao HH. Enzyme Microb Technol. 1993 Apr;15(4):286-92）。一実施形態では、上記の生化学的プロセス及び物理的プロセスの１又は２以上への曝露後、熱安定性キナーゼは、それらの曝露前のキナーゼ活性の少なくとも７０％（又は８０％、９０％、９５％若しくは１００％）を保持し得る。
【００３７】
先行技術において利用可能な従来の試験のいずれかを用いて「保持されるキナーゼ活性」を測定することによって、キナーゼが「熱安定性」であるかどうかを同定することは、当業者にとって常套的な事柄である。
【００３８】
当業者は、本発明において使用するために適した広範囲の異なる熱安定性キナーゼについてよく知っている。
【００３９】
熱安定性キナーゼは種々の認識されている三次構造を有し、それらの分子構造に基づいて、大まかに２つの群、すなわち「多量体」／「ポリマー」キナーゼ又は「単量体」キナーゼに分類することができる。
【００４０】
一実施形態では、熱安定性キナーゼは多量体を形成する、すなわち、熱安定性キナーゼは、二量体キナーゼ、三量体キナーゼ、四量体キナーゼ、五量体キナーゼ、六量体キナーゼ、七量体キナーゼ又は八量体キナーゼなどの「多量体」キナーゼである。多量体（例えば、二量体、三量体、四量体、六量体、八量体）三次構造は、温度、ｐＨ、化学的変性剤、又はプロテアーゼなどの条件に対するキナーゼの安定性の改善と関連する可能性がある。
【００４１】
一実施形態では、熱安定性キナーゼは三量体を形成する、すなわち、熱安定性キナーゼは、「三量体」熱安定性キナーゼである。
【００４２】
例として、スルホロブス属（Sulfolobus）の種（例えば、Ｓ．アシドカルダリウス（S. acidocaldarius））由来の熱安定性キナーゼ酵素は、それらの活性が高温で維持されることの原理の決定因子である中心の疎水性コアを伴う三量体構造を有する。三量体熱安定性キナーゼの例が配列番号６（Ｓ．アシドカルダリウス由来のアデニル酸キナーゼ）で提供される。
【００４３】
一実施形態では、熱安定性キナーゼは二量体熱安定性キナーゼである。酢酸キナーゼ、例えば、メタノサルシナ・サーモフィラ（Methanosarcina thermophila）（本明細書において提供される配列番号１）由来の酵素及びサーモトガ・マリティマ由来の酵素（配列番号１９）などは二量体である。
【００４４】
一実施形態では、熱安定性キナーゼは四量体熱安定性キナーゼである。ピルビン酸キナーゼ、例えば、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）由来の酵素（本明細書において提供される配列番号２）などは四量体である。
【００４５】
一実施形態では、熱安定性キナーゼは六量体熱安定性キナーゼである。ウリジン一リン酸（ＵＭＰ、uridine monophosphate）キナーゼ、例えば、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来の酵素（本明細書において提供される配列番号３）、スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）由来の酵素（配列番号２１）及びサーモトガ・マリティマ由来の酵素（配列番号２０）などは六量体である。
【００４６】
一実施形態では、熱安定性キナーゼは八量体熱安定性キナーゼである。酪酸キナーゼ、例えば、サーモトガ・マリティマ由来のもの（本明細書において提供される配列番号４）などは八量体である。
【００４７】
他の熱安定性キナーゼ酵素は単量体構造を有し、その例はサーモトガ（Thermatoga）種（例えば、Ｔ．マリティマ（T. maritima）、本明細書において提供される配列番号５を参照されたい）由来のアデニル酸キナーゼである。これらのキナーゼは、活性部位に影響を及ぼす追加的な「ｌｉｄ」ドメインを伴うわずかに長いポリペプチド鎖を有する。したがって、一実施形態では、熱安定性キナーゼは単量体熱安定性キナーゼである。
【００４８】
一実施形態では、熱安定性キナーゼは、アデニル酸キナーゼ、酢酸キナーゼ、ＵＭＰキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ又は酪酸キナーゼである。一実施形態では、熱安定性キナーゼは三量体アデニル酸キナーゼである。一実施形態では、熱安定性キナーゼは単量体アデニル酸キナーゼである。一実施形態では、熱安定性キナーゼは二量体酢酸キナーゼである。一実施形態では、熱安定性キナーゼは、六量体ＵＭＰキナーゼである。
【００４９】
一実施形態では、熱安定性キナーゼは、パイロコッカス・フリオサス、Ｐ．アビシ（P.abyssi）、Ｐ．ホリコシイ（P. horikoshii）、Ｐ．ヴェッセイ（P. woesii）；スルホロブス属の種、例えば、スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）、Ｓ．アシドカルダリウス（S.acidocaldarius）、又はＳ．シバタエ（S. shibatael）など；サーモトガ属（Thermotoga）の種、例えば、サーモトガ・マリティマ（Thermatoga maritima）又はＴ．ネアポリタナ（T. neapolitana）など；メタノコッカス属（Methanococcus）の種；ロドサーマス・マリナス（Rhodothermus marinus）、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス、及びメタノサルシナ・サーモフィラからなる群から選択される生物体の微生物性キナーゼである。
【００５０】
一実施形態では、熱安定性キナーゼは、Ａ．フルギドゥス（A. fulgidus）キナーゼ、Ａ．ペルニクス（A. pernix）キナーゼ、Ａ．ピロフィルス（A. pyrophilus）キナーゼ、Ｂ．カルドテナクス（B. caldotenax）ＢＴ１キナーゼ、バチルス属（Bacillus）の種のＰＳ３キナーゼ、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）１１０５７キナーゼ、Ｂ．ステアロサーモフィルス１２００１キナーゼ、Ｂ．サーモカテニュラタス（B. thermocatenulatus）キナーゼ、Ｃ．ステルココラリウム（C. stercocorarium）キナーゼ、Ｇ．ステアロサーモフィルス（G. stearothermophilus）キナーゼ、メタノコッカス属の種のキナーゼ、Ｍ．サーモフィラ（M. thermophila）キナーゼ、Ｍ．ルバー（M. ruber）キナーゼ、Ｐ．アビシ（P. abyssi）キナーゼ、Ｐ．フリオスス（P. furiosus）キナーゼ、Ｐ．ホリコシイキナーゼ、Ｐ．ヴェッセイキナーゼ、Ｒ．マリヌスキナーゼ、Ｓ．アシドカルダリウスキナーゼ、Ｓ．シバタエ（S. shibatae）キナーゼ、Ｓ．ソルファタリクス（S. solfataricus）キナーゼ、Ｔ．エタノリクス（T. ethanolicus）キナーゼ、Ｔ．サーモスルフロゲネス（T. thermosulfurogenes）キナーゼ、Ｔ．セレレ（T. celere）キナーゼ、Ｔ．リトラリス（T. litoralis）キナーゼ、Ｔ．アクアティクス（T. aquaticus）ＹＴ１キナーゼ、Ｔ．カルドフィルス（T. caldophilus）ＧＫ２４キナーゼ、Ｔ．サーモフィルス（T. thermophilus）ＨＢ８キナーゼ、Ｔ．マリティマキナーゼ、又はＴ．ネアポリタナキナーゼであってよい。
【００５１】
一実施形態では、熱安定性キナーゼは、Ｔ．マリティマ単量体アデニル酸キナーゼである。一実施形態では、熱安定性キナーゼは、Ｔ．マリティマ二量体酢酸キナーゼである。一実施形態では、熱安定性キナーゼは、Ｓ．アシドカルダリウス三量体アデニル酸キナーゼである。一実施形態では、熱安定性キナーゼは、Ｓ．アシドカルダリウス六量体ＵＭＰキナーゼである。一実施形態では、熱安定性キナーゼは、Ｔ．マリティマ六量体ＵＭＰキナーゼである。
【００５２】
一実施形態では、「熱安定性キナーゼ」という用語は、本明細書で考察されている本発明の熱安定性キナーゼのいずれかの配列バリアントを包含し、また、その断片（配列バリアントの断片、及び断片の配列バリアントを含む）も包含する。
【００５３】
この点について、熱安定性キナーゼの遺伝子改変により、熱安定性の有意な上昇がもたらされることが示されている。種々のキナーゼ酵素の熱安定性を、三量体（古細菌の）ＡＫの定義済みの３Ｄ構造と比較することにより、安定性に影響を及ぼすアミノ酸が同定された（Vonrhein et al.(1998)J. Mol. Biol. 282:167-179及びCriswell et al.(2003)J. Mol. Biol.330:1087-1099）。
【００５４】
改変（例えば、改善）された熱安定性を示す熱安定性キナーゼの遺伝子操作されたバリアントは、アミノ酸（例えば、三量体分子の中心コアパッキング領域の一部を形成すると考えられているアミノ酸）の特定の部位特異的変異誘発によって、又は、キナーゼ分子全体をその後の何回かの変異誘発及び性質が改善された分子についての選択／スクリーニングに供するランダムな「定向進化」法によって同定することができる。
【００５５】
一実施形態では、「熱安定性キナーゼ」ポリペプチドのキナーゼ活性は必要ない。この実施形態によると、融合タンパク質の「熱安定性キナーゼ」成分の目的は、単一ドメイン抗体成分の産生を容易にする（例えば、増加させる）ことだけである。この実施形態によると、「熱安定性キナーゼ」という用語は、参照キナーゼのキナーゼ活性と比較してキナーゼ活性が改変された（例えば、低下した）配列バリアント及び切断されたポリペプチドを包含する。例として、バリアント又は切断されたポリペプチドはキナーゼ活性を実質的に有さなくてよい。
【００５６】
一実施形態では、熱安定性キナーゼは、配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列、又はその少なくとも５０個、７５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個、２７５個、３００個、３２５個、３５０個、３７５個、４００個、４２５個、４５０個、４７５個、５００個、５２５個若しくは５５０個の連続するアミノ酸を含むその断片に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又はそれからなる。
【００５７】
一実施形態では、熱安定性キナーゼは、配列番号１〜６のいずれかの少なくとも５０個、７５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個、２７５個、３００個、３２５個、３５０個、３７５個、４００個、４２５個、４５０個、４７５個、５００個、５２５個又は５５０個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又はそれからなる。
【００５８】
適切なレポーターキナーゼの他の例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第００／４６３５７号パンフレット及び国際公開第２００５／０９３０８５号パンフレットに開示されている。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「熱安定性キナーゼ成分」という用語は、本明細書で定義されている熱安定性キナーゼ（そのバリアント／断片を含む）を指す。
【００６０】
本発明の融合タンパク質は、（ｉ）熱安定性キナーゼ成分、及び（ii）単一ドメイン抗体又は単一ドメイン抗体断片成分の両方を含む。
【００６１】
融合タンパク質の熱安定性キナーゼ成分と抗体成分は、任意の順序で融合することができる。したがって、一実施形態では、熱安定性キナーゼを融合タンパク質において単一ドメイン抗体／抗体断片よりもＮ末端側で発現させる（すなわち、Ｎ−［熱安定性キナーゼ］−［抗体成分］−Ｃ）。代替の実施形態では、融合タンパク質の単一ドメイン抗体／抗体断片を融合タンパク質において熱安定性キナーゼよりもＮ末端側で発現させる（すなわち、Ｎ−［抗体成分］−［熱安定性キナーゼ］−Ｃ）。
【００６２】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、多数（すなわち、少なくとも２又は３以上、例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つなど）の単一ドメイン抗体及び／又は抗体断片を含み、それらは同じであっても異なってもよい。
【００６３】
例として、融合タンパク質は、熱安定性キナーゼと、同じであってもよく、異なってもよい２又は３以上の単一ドメイン抗体又は抗体断片とを含んでよい。例えば、各熱安定性キナーゼを、同じであっても異なってもよい多数の単一ドメイン抗体及び／又は抗体断片と融合することができる。例えば、融合タンパク質は、熱安定性キナーゼのＮ末端に融合した単一ドメイン抗体又は抗体断片と、熱安定性キナーゼのＣ末端に融合した別の単一ドメイン抗体又は抗体断片とを含んでよく、Ｎ末端の単一ドメイン抗体／抗体断片とＣ末端の単一ドメイン抗体／抗体断片は同じであってもよく、異なってもよい。
【００６４】
そのように、一実施形態では、融合タンパク質内の成分の順序は、
Ｎ−［抗体成分１］−［熱安定性キナーゼ］−［抗体成分２］−Ｃ
である（抗体成分１と２は同じであっても異なってもよい）。
【００６５】
融合タンパク質内の異なる単一ドメイン抗体／抗体断片は、それらの結合活性に関して互いと異なってよい。この点について、同じ熱安定性キナーゼと融合した異なる単一ドメイン抗体又は抗体断片は、異なる分析物に結合してもよく、同じ分析物の別のエピトープに結合してもよく、同じ分析物／エピトープに結合するが親和性が異なってもよい。一実施形態では、単一ドメイン抗体又は抗体断片が結合した異なる分析物は、異なる生物学的な感染因子又は非感染性因子（例えば、異なる細菌抗原又はウイルス抗原）であってよい（又はそれに由来してよい／その成分であってよい）。一実施形態では、単一ドメイン抗体又は抗体断片が結合した異なる分析物は、（ｉ）１又は２以上の異なる生物学的な感染因子／非感染性因子由来の分析物と（ii）検出機能（「検出器分子」）を有する分析物の組み合わせであってよい。
【００６６】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、多数（すなわち、少なくとも２又は３以上、例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つなど）の熱安定性キナーゼを含み、それらは同じであっても異なってもよい。
【００６７】
例として、融合タンパク質は、単一ドメイン抗体又は抗体断片と、同じであってもよく、異なってもよい２又は３以上の熱安定性キナーゼとを含んでよい。例えば、各単一ドメイン抗体又は抗体断片を、同じであっても異なってもよい多数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ）の熱安定性キナーゼと融合することができる。例えば、融合タンパク質は、単一ドメイン抗体又は抗体断片のＮ末端に融合した熱安定性キナーゼと、単一ドメイン抗体又は抗体断片のＣ末端に融合した別の熱安定性キナーゼを含んでよく、Ｎ末端の熱安定性キナーゼとＣ末端の熱安定性キナーゼは同じであってもよく、異なってもよい。
【００６８】
そのように、一実施形態では、融合タンパク質内の成分の順序は、
Ｎ−［熱安定性キナーゼ１］−［抗体成分］−［熱安定性キナーゼ２］−Ｃ
であり、熱安定性キナーゼ１と２は同じであっても異なってもよい。
【００６９】
異なる熱安定性キナーゼは、（例えば）それらの標的に関して、及び／又はそれらのキナーゼ活性のレベルに関して互いと異なってよい。
【００７０】
一実施形態では、単一ドメイン抗体又は抗体断片成分の分子量は、熱安定性キナーゼの分子量の５０％超（例えば、熱安定性キナーゼの分子量の６０％超、７０％超、８０％超又は９０％超など）である。一実施形態では、単一ドメイン抗体又は抗体断片成分の総分子量は熱安定性キナーゼの分子量よりも大きい。一実施形態では、単一ドメイン抗体又は抗体断片成分の総分子量は、融合タンパク質の分子量の５０％超（例えば、融合タンパク質の分子量の６０％超、７０％超、８０％超又は９０％超など）を形成する。
【００７１】
本発明の融合タンパク質は、従来の技法を用いて、例えば、熱安定性キナーゼ（上で定義されている）をコードする核酸配列と単一ドメイン抗体又は抗体断片（上で定義されている）をコードする核酸配列を融合することによって調製することができる（例えば、実施例１、実施例２、実施例６及び実施例７に記載の通り）。
【００７２】
したがって、本発明は、本明細書で定義されている本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
【００７３】
融合タンパク質の熱安定性キナーゼ成分及び抗体成分をコードする核酸配列は、任意の順序で配置／融合することができる。したがって、一実施形態では、熱安定性キナーゼをコードする核酸配列を、単一ドメイン抗体又は抗体断片をコードする核酸配列よりも５’側に位置させる／融合することができる。あるいは、単一ドメイン抗体又は抗体断片をコードする核酸配列を、熱安定性キナーゼをコードする核酸配列よりも５’側に位置させる／融合することができる。
【００７４】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、単一ドメイン抗体及び／又は抗体断片をコードする核酸配列を多数（すなわち、少なくとも２又は３以上）含み、それらは同じであっても異なってもよい（例えば、上記の通り）。
【００７５】
その代わりに、又はそれに加えて、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、熱安定性キナーゼをコードする核酸配列を多数（すなわち、少なくとも２又は３以上）含んでよく、それらは同じであっても異なってもよい（例えば、上記の通り）。
【００７６】
一実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、熱安定性キナーゼと、同じであっても異なってもよい２つの単一ドメイン抗体又は抗体断片とを含む上記の融合タンパク質をコードする。この実施形態によると、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、熱安定性キナーゼをコードする核酸配列と、２つの単一ドメイン抗体又は抗体断片をコードする核酸配列とを含む。例えば、ポリヌクレオチド配列は、以下の配列：第１の単一ドメイン抗体又は抗体断片をコードする核酸配列、熱安定性キナーゼをコードする核酸配列、及び第２の単一ドメイン抗体又は抗体断片をコードする核酸配列を５’から３’の方向で含んでよく、第１の単一ドメイン抗体／断片と第２の単一ドメイン抗体／断片は同じである又は異なる。
【００７７】
一実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、単一ドメイン抗体又は抗体断片と２つの熱安定性キナーゼとを含む上記の融合タンパク質をコードする。この実施形態によると、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、単一ドメイン抗体又は抗体断片をコードする核酸配列と、２つの熱安定性キナーゼをコードする核酸配列とを含む。例えば、ポリヌクレオチド配列は、以下の配列：第１の熱安定性キナーゼをコードする核酸配列、単一ドメイン抗体又は抗体断片をコードする核酸配列、及び第２の熱安定性キナーゼをコードする核酸配列を５’から３’の方向で含んでよく、第１の熱安定性キナーゼと第２の熱安定性キナーゼは同じである又は異なる。
【００７８】
ポリヌクレオチド配列は、融合タンパク質の熱安定性キナーゼ成分のコード配列と単一ドメイン抗体成分のコード配列の間に位置する１又は２以上のリンカー領域を含んでもよい。
【００７９】
そのように、ポリヌクレオチド配列は、以下の成分を以下の順序のいずれかで含んでよい：
５’−［熱安定性キナーゼコード配列］−［リンカー］−［抗体コード配列］−３’
５’−［抗体コード配列］−［リンカー］−［熱安定性キナーゼコード配列］−３’
５’−［抗体コード配列］−［リンカー］−［熱安定性キナーゼコード配列］−［リンカー］−［抗体コード配列］−３’
５’−［熱安定性キナーゼコード配列］−［リンカー］−［抗体コード配列］−［リンカー］−［熱安定性キナーゼコード配列］−３’
【００８０】
当技術分野で公知の適切な従来のリンカー配列の例としては、非構造化リンカー（例えば、(GGGGS)n、ｎ＝３〜５）又はヘリックスリンカー（例えば、LAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAAA）が挙げられる。
【００８１】
ポリヌクレオチド配列は、切断部位をコードする１又は２以上の配列を含んでもよく、これは、融合タンパク質の熱安定性キナーゼ成分のコード配列と単一ドメイン抗体成分のコード配列の間に位置してよい。コードされる切断部位は、プロテアーゼによって認識され得る。これにより、必要であれば、切断部位において切断することによって熱安定性キナーゼと単一ドメイン抗体又は抗体断片を分離することが可能になる。例えば、熱安定性キナーゼ成分と単一ドメイン抗体成分は、第Ｘａ因子（ＩＥＧＲ↓）、エンテロキナーゼ（ＤＤＤＤＫ↓）、又はＴＥＶプロテアーゼ（ＥＮＬＹＦＱ↓Ｇ）によって認識される切断部位によって分離することができる。切断部位の他の例は、文献に記載されている。
【００８２】
場合によって、融合タンパク質の成分は、熱安定性キナーゼと抗体又は抗体断片の間にインテイン切断部位を含めることによって分離することができる。これには、追加的にインテインドメインが融合物のＣ末端に存在すること、又は熱安定性キナーゼドメインに順次位置づけられていることが必要な場合がある。したがって、この実施形態によると、融合タンパク質は、以下の立体配置のうちの１つをとってよい：
Ｎ−熱安定性キナーゼ−インテインドメイン−インテイン切断部位−抗体成分−Ｃ
又は
Ｎ−熱安定性キナーゼ−インテイン切断部位−抗体成分−インテインドメイン−Ｃ
【００８３】
本発明は、本明細書で定義されている本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミドも提供する。
【００８４】
プラスミドは、１又は２以上の追加的なポリヌクレオチド配列を含んでよく、これは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列とインフレームで作動可能に連結していてよい。例として、プラスミドは、ポリペプチドタグ又は標識をコードするポリヌクレオチド配列を含んでよく、プラスミドから発現させることにより、タグが付いた／標識された融合タンパク質を産生することができる。場合によって、追加的なポリヌクレオチド配列をいずれも、上記の通り、リンカー配列によって及び／又は切断部位をコードする配列によって、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列から分離することができる。切断部位が存在することにより、融合タンパク質を、追加的なポリヌクレオチド配列によりコードされる任意の追加的なポリペプチド（例えば、タグ又は標識）から分離することが可能になる。
【００８５】
遺伝子発現は、当業者によく知られている記載のプロモーター系、例えば、ＩＰＴＧ誘導性のｌａｃＺに基づくプロモーター又はｔｅｔプロモーターなどのいずれかから駆動することができる。発現は、例えば、以前に記載されている通り、リンゴ酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ＭＤＨ、malate dehydrogenase promoter）によって駆動することができる（Ungurs et al., J. Hospital Infection, Vol. 74, 2010, pages 144-151 “Quantitative measurement of the efficacy of protein removal by cleaning formulations；comparative evaluation of prion-directed cleaning chemistries”）。
【００８６】
従来の市販の発現系、一般には、ｐＭＴＬ１０１５ベクター（Ungurs et al. 2010、上記）などのGateway適合ベクターを使用することができる。図３に例示されているGateway適合ベクターは、カセットに基づく構築方法を有し、代替の単一ドメイン抗体融合物を急速に生成するために使用することができる。他のカセットに基づくベクターも、本明細書に記載の単一ドメイン抗体融合タンパク質を構築するために用いることができる。
【００８７】
ポリヌクレオチド配列は、当技術分野における従来の技法を用いて、宿主細胞の細胞質において発現させることができる。
【００８８】
適切な宿主細胞としては、原核細胞及び真核細胞が挙げられ、大腸菌などの原核生物宿主細胞が好ましい。一実施形態では、発現の間の遺伝子構築物の再編成を最小限にするために、組換え欠陥宿主細胞を用いることができる（例えば、２又は３以上の異なる融合タンパク質を同じ宿主細胞において発現させる場合）。例として、本発明の融合タンパク質を発現させるために使用することができる適切な組換え欠陥宿主細胞は大腸菌ＲＶ３０８である。
【００８９】
したがって、一態様では、本発明は、本明細書で定義されている本発明の融合タンパク質を産生する方法であって、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、又は前記ポリヌクレオチド配列を含むプラスミドを大腸菌などの宿主細胞において発現させるステップと、発現された融合タンパク質を宿主細胞の細胞質から精製するステップとを含む方法を提供する。
【００９０】
本発明の一実施形態では、多数の異なる融合タンパク質（同じであっても異なってもよい）を単一の宿主細胞において発現させる。これらの融合タンパク質は、単一のプラスミドから同じプロモーター又は異なるプロモーターを使用して発現させることができる。あるいは、融合タンパク質を、２つの異なる適合性プラスミドから発現させることができる。１又は２以上のプラスミドから発現させる融合タンパク質の比率は、高コピー数プラスミド若しくは低コピー数プラスミド、及び／又は高発現性プロモーター、中発現性プロモーター、若しくは低発現性プロモーターを使用することによって変動させることができる（例えば、実施例１３、パート（ii）において例示されている通り）。以下に考察するように、発現された融合タンパク質を多量体化して多量体タンパク質複合体を形成することができ、これを宿主細胞から回収することができる。
【００９１】
本発明は、単一ドメイン抗体又は単一ドメイン抗体断片を調製する方法であって、
（ｉ）大腸菌などの宿主細胞において単一ドメイン抗体又は抗体断片を熱安定性キナーゼとの単鎖融合タンパク質として発現させるステップと、
（ii）融合タンパク質を宿主細胞の細胞質から精製するステップと
を含む方法も提供する。
【００９２】
本発明の（本明細書で定義されている）融合タンパク質の複数の実施形態は全て、対応するポリヌクレオチド（及びプラスミド、宿主細胞など）、並びに本発明の発現方法に同等に当てはまる。
【００９３】
発現された融合タンパク質は、当技術分野で公知の任意の従来の技法によって宿主細胞（例えば、大腸菌）の細胞質から抽出することができる。典型的な抽出プロトコールは、宿主細胞を溶解させるステップと、溶解物の可溶性部分を遠心分離によって分離するステップとを含んでよい。
【００９４】
発現させ、抽出した融合タンパク質は、当技術分野で公知の任意の従来の技法によって宿主細胞溶解物から精製することができる。
【００９５】
一実施形態では、発現された融合タンパク質の熱安定性（heat stability）を考慮して、精製ステップは溶解物を高温処理すること（例えば、およそ８０℃で約２０分又は３０分）を伴ってよい。加熱処理した後、沈殿したタンパク質を除去することによって溶解物を清澄化することができる。精製ステップは、溶解物をクロマトグラフィーカラム（例えば、Blue Sepharoseカラム）に適用するステップと、ＡＭＰ及びＡＴＰを使用して融合タンパク質を溶出させるステップとを含んでよい。
【００９６】
融合タンパク質は、場合によって、単一ドメイン抗体成分（複数可）に対するリガンド（複数可）をローディングしたアフィニティーカラムを使用してさらに精製することができる。このステップは、異なるリガンドに結合する２又は３以上の異なる抗体成分を含む融合タンパク質（又は多量体融合タンパク質複合体）が異なる抗体成分のそれぞれを実際に含有することを確実にするために特に有用であり得る。
【００９７】
正確に折り畳まれた単一ドメイン抗体又は抗体断片の機能回復は、従来のＥＬＩＳＡアッセイにおいて、熱安定性キナーゼ活性（例えば、ｔＡＫ活性）をアッセイの読み出しとして使用して評価することができる。
【００９８】
上記の通り、熱安定性キナーゼは多量体複合体を形成することが公知である。
【００９９】
よって、一実施形態では、本発明の融合タンパク質を宿主細胞から多量体（多量体融合タンパク質複合体）として回収する。
【０１００】
多量体融合タンパク質複合体の形成は、多数（すなわち、２又は３以上、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つなど）の本発明の融合タンパク質の熱安定性キナーゼ成分間の多量体化に起因する。例として、三量体融合タンパク質複合体の形成は、３つの本発明の融合タンパク質の熱安定性キナーゼ成分（単量体）間の三量体化に起因する。
【０１０１】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、宿主細胞から回収された後（例えば、精製及びリフォールディングの間）に多量体を形成する。溶解段階中に使用される緩衝液の塩濃度が高いことが、正確に折り畳まれたタンパク質の回収に役立ち得る。したがって、一実施形態では、溶解は、９００ｍＭ、１０００ｍＭ、１２００ｍＭ又は１５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭ、７００ｍＭ、９００ｍＭのＮＨ４ＳＯ４、又は等価物を含有する緩衝溶液中で行う。有機溶媒を添加することによっても、回収されたタンパク質の正確な折り畳みを優先的に促進することができる。
【０１０２】
したがって、本発明は、多数（すなわち、２又は３以上、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つなど）の本発明の融合タンパク質を含む多量体融合タンパク質複合体を提供する。
【０１０３】
「多量体（multimer）」／「多量体（multimeric）」という用語及び「ポリマー（polymer）」／「ポリマー（polymeric）」という用語は、本明細書では互換的に使用され、例えば、二量体、三量体、五量体、四量体、六量体、七量体及び八量体を包含する。
【０１０４】
一実施形態では、本発明の多量体融合タンパク質複合体は、本発明の融合タンパク質を２つ含む二量体融合タンパク質複合体；又は本発明の融合タンパク質を３つ含む三量体融合タンパク質複合体；又は本発明の融合タンパク質を４つ含む四量体融合タンパク質複合体；又は本発明の融合タンパク質を４つ含む六量体融合タンパク質複合体；又は本発明の融合タンパク質を４つ含む八量体融合タンパク質複合体である。
【０１０５】
したがって、本発明の多量体融合タンパク質複合体は、熱安定性キナーゼ多量体（多数の本発明の融合タンパク質の熱安定性キナーゼ成分の多量体化によって形成された）を含み、熱安定性キナーゼ多量体の個々の単量体が１つの（又は少なくとも１つの）単一ドメイン抗体又は抗体断片と融合している。本発明の一実施形態では、熱安定性キナーゼ多量体の個々の単量体が、同じであってもよく、異なってもよい（上記の通り）２又は３以上の単一ドメイン抗体又は抗体断片と融合していてよい。
【０１０６】
例として、多量体融合タンパク質複合体は、熱安定性キナーゼ二量体を含んでよく、二量体の２つの熱安定性キナーゼ単量体のそれぞれが単一ドメイン抗体又は抗体断片と融合している。融合タンパク質は、熱安定性キナーゼ三量体を含んでよく、３つの熱安定性キナーゼ単量体のそれぞれが単一ドメイン抗体又は抗体断片と融合している。融合タンパク質は、熱安定性キナーゼ四量体を含んでよく、４つの熱安定性キナーゼ単量体のそれぞれが単一ドメイン抗体又は抗体断片と融合している。融合タンパク質は、熱安定性キナーゼ六量体を含んでよく、６つの熱安定性キナーゼ単量体のそれぞれが単一ドメイン抗体又は抗体断片と融合している。融合タンパク質は、熱安定性キナーゼ八量体を含んでよく、８つの熱安定性キナーゼ単量体のそれぞれが単一ドメイン抗体又は抗体断片と融合している。
【０１０７】
あるいは、多量体融合タンパク質複合体は、熱安定性キナーゼ二量体を含んでよく、二量体の２つの熱安定性キナーゼ単量体のそれぞれが、同じであってもよく、異なってもよい２又は３以上の単一ドメイン抗体又は抗体断片と融合している。融合タンパク質は、熱安定性キナーゼ三量体を含んでよく、３つの熱安定性キナーゼ単量体のそれぞれが、同じであってもよく、異なってもよい２又は３以上の単一ドメイン抗体又は抗体断片と融合している。融合タンパク質は、熱安定性キナーゼ四量体を含んでよく、４つの熱安定性キナーゼ単量体のそれぞれが、同じであってもよく、異なってもよい２又は３以上の単一ドメイン抗体又は抗体断片と融合している。融合タンパク質は、熱安定性キナーゼ六量体を含んでよく、６つの熱安定性キナーゼ単量体のそれぞれが、同じであってもよく、異なってもよい２又は３以上の単一ドメイン抗体又は抗体断片と融合している。融合タンパク質は、熱安定性キナーゼ八量体を含んでよく、８つの熱安定性キナーゼ単量体のそれぞれが、同じであってもよく、異なってもよい２又は３以上の単一ドメイン抗体又は抗体断片と融合している。
【０１０８】
本発明の多量体融合タンパク質複合体を構成する本発明の融合タンパク質は同じであっても異なってもよい（すなわち、多量体複合体はホモ多量体であってもヘテロ多量体であってもよい）。例えば、本発明の多量体融合タンパク質複合体は、ホモ二量体、ホモ三量体、ホモ四量体、ホモ六量体又はホモ八量体であってよい。あるいは、本発明の多量体融合タンパク質複合体は、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体、ヘテロ六量体又はヘテロ八量体であってよい。
【０１０９】
一実施形態では、多量体融合タンパク質複合体内の単一ドメイン抗体又は抗体断片は全て同じである。したがって、同じ単一ドメイン抗体又は抗体断片が個々の熱安定性キナーゼ単量体のそれぞれと融合している。
【０１１０】
代替の実施形態では、多量体複合体内の熱安定性キナーゼの個々の単量体と融合している単一ドメイン抗体又は抗体断片は全て同じとは限らない。この実施形態によると、多量体融合タンパク質複合体は、２又は３以上の異なる単一ドメイン抗体／抗体断片（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つの異なる単一ドメイン抗体／抗体断片）の混合物を含み、それぞれが個々の熱安定性キナーゼ単量体と融合している。例として、異なる抗体／抗体断片は、同じ融合タンパク質内、又は異なる融合タンパク質内に位置してよい。
【０１１１】
異なる単一ドメイン抗体／抗体断片は、それらの結合活性に関して互いと異なってよい。この点について、異なる熱安定性キナーゼ単量体と融合している異なる単一ドメイン抗体又は抗体断片は、異なる分析物に結合してもよく、同じ分析物の別のエピトープに結合してもよく、同じ分析物／エピトープに結合するが親和性が異なってもよい。一実施形態では、単一ドメイン抗体又は抗体断片が結合した異なる分析物は、異なる生物学的な感染因子又は非感染性因子（例えば、異なる細菌抗原又はウイルス抗原）であってよい（又はそれに由来してよい／その成分であってよい）。一実施形態では、単一ドメイン抗体又は抗体断片が結合した異なる分析物は、（ｉ）１又は２以上の異なる生物学的な感染因子／非感染性因子由来の分析物と（ii）検出器分子機能を有する分析物の組み合わせであってよい。
【０１１２】
一実施形態では、多量体融合タンパク質複合体内の融合タンパク質は全て同じである（すなわち、ホモ多量体融合タンパク質複合体が形成される）。
【０１１３】
代替の実施形態では、多量体融合タンパク質複合体内の融合タンパク質は全て同じとは限らない（すなわち、ヘテロ多量体融合タンパク質複合体が形成される）。この実施形態によると、多量体融合タンパク質複合体は、２又は３以上の異なる融合タンパク質（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つの異なる融合タンパク質）の混合物を含む。異なる融合タンパク質は、１つのプラスミドから同じプロモーターを使用して、又は１つのプラスミドから異なるプロモーターを使用してのいずれによっても発現させることができる。あるいは、異なる融合タンパク質は、２つの異なる（適合性）プラスミドから発現させることができる。
【０１１４】
本発明のヘテロ多量体融合タンパク質複合体内に存在する異なる融合タンパク質の比率は、発現される融合タンパク質の相対的な存在量に左右され、高コピー数プラスミド若しくは低コピー数プラスミド、及び／又は高発現性プロモーター、中発現性プロモーター、若しくは低発現性プロモーターを使用することによって変動させることができる（例えば、実施例１３、パート（ii）において考察されている通り）。
【０１１５】
本発明の（本明細書で定義されている）融合タンパク質の実施形態は全て、その多量体複合体、及び本発明の抽出及び精製方法に同等に当てはまる。
【０１１６】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、熱安定性キナーゼのキナーゼ活性を検出することによって検出することができる。
【０１１７】
一般に、熱安定性キナーゼは、ＡＤＰを含む基質を使用して検出される。熱安定性キナーゼのキナーゼ活性によりＡＤＰをＡＴＰに変換し、それ自体を使用して光を生成させる（例えば、生物発光試薬を用いた反応によって）。
【０１１８】
「生物発光試薬」という用語は、ＡＴＰと反応して光を生成することができる任意の物質又は物質の混合物、例えば、ルシフェリンとルシフェラーゼの混合物などを指す。標準のルシフェリン−ルシフェラーゼアッセイ方法により、わずか１０−１５モルのＡＴＰを検出することができる。酵素による増幅と生物発光による検出方法を結びつけることにより、わずか１０−２０モルのキナーゼを検出することが可能である。ＡＴＰと生物発光試薬の反応により放出される光は、標準の照度計（例えば、Berthold Orion９６ウェルマイクロプレート照度計、又は手持ち式照度計）を使用することなどの当技術分野で公知の従来の技法を使用して測定することができる。
【０１１９】
例として、熱安定性キナーゼを３０℃〜７０℃の温度でＡＤＰと反応させることができ、ＡＴＰの形成を検出し、ルシフェリン／ルシフェラーゼ及び適切な照度計を２０〜３０℃で１０分〜１時間使用し、生物発光による検出によって測定することができる。
【０１２０】
照度計によって生成されたデータは、「相対発光量」（ＲＬＵ、Relative Light Unit）で表される。ＲＬＵは絶対的ではなく相対的な測定値である。この問題に取り組むために、製造者によりＲＬＵ「因子」についてのデータが生成されており、これにより、所与の照度計によって生成されたデータを較正された基準に対して正規化することができる。したがって、異なる計器間で比較を行うことができる。本明細書で示されている図は、インジェクターシステムを備えたBerthold Orion９６ウェルマイクロプレート照度計を使用して、ルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬（３００〜６５０ｎｍの波長で放出された光を測定する技術的特異化光電子増倍物質）を添加したすぐ後に２秒間光測定する「フラッシュ」方法を用いて取得した測定値に関する。Berthold Orion９６ウェルマイクロプレート照度計についてのＲＬＵ因子は１である。したがって、本明細書で示されているＲＬＵ値は、標準化／正規化されたＲＬＵ値であるとみなすことができる。
【０１２１】
絶対値という観点では、ＲＬＵ値は、方法に記載の試薬を用いて前記値を得るために必要なＡＴＰの濃度と関連づけることができる。おおよその変換として、また、ＲＬＵ値とＡＴＰ濃度の直線関係を考慮して、以下の値を使用することができる：
【０１２２】
【表１】
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【０１２３】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質の熱安定性キナーゼ成分の活性は、ルシフェリン／ルシフェラーゼの存在下で照度計によって測定した場合、キナーゼ１ｍｇ当たり少なくとも５００，０００ＲＬＵ、又はキナーゼ１ｍｇ当たり少なくとも１，０００，０００ＲＬＵ、又はキナーゼ１ｍｇ当たり少なくとも３，０００，０００、又はキナーゼ１ｍｇ当たり少なくとも５，０００，０００ＲＬＵ、又はキナーゼ１ｍｇ当たり少なくとも８，０００，０００ＲＬＵ、又はキナーゼ１ｍｇ当たり少なくとも１０，０００，０００相対発光量（ＲＬＵ）である。
【０１２４】
当業者には、ＡＴＰを熱安定性キナーゼ反応の生成物として検出するための他の方法が理解されよう。これらは、ＨＰＬＣによる吸収測定、又は適切な反応性化合物を使用した化学発光測定、蛍光測定若しくは比色定量測定を用いた検出を含んでよい。
【０１２５】
本発明の一実施形態では、１又は２以上の追加的な熱安定性キナーゼに結合し、それを抗体−分析物複合体に動員する１又は２以上の追加的な単一ドメイン抗体又は抗体断片を提供すること（すなわち、融合タンパク質内に存在する抗体及び熱安定性キナーゼ成分（複数可）に加えて）によって、ＡＴＰ検出反応の感度をさらに増大させることができる。本発明のこの実施形態の例は実施例１２及び実施例１３に示されている。追加的な単一ドメイン抗体／抗体断片は、所望の分析物（すなわち、検出される分析物）を標的とする融合タンパク質内に存在してよい。あるいは、追加的な単一ドメイン抗体／抗体断片は、所望の分析物（複数可）を標的とする融合タンパク質由来の異なる融合タンパク質内に存在してよい。追加的な熱安定性キナーゼに結合し、それを動員する単一ドメイン抗体／抗体断片を含む融合タンパク質は、単一の融合タンパク質の形態で、又はホモ多量体融合タンパク質複合体若しくはヘテロ多量体融合タンパク質複合体の一部として存在してよい。
【０１２６】
所望の分析物（複数可）を標的とする融合タンパク質及び追加的な熱安定性キナーゼ（複数可）に結合し、それを動員する融合タンパク質は、同じヘテロ多量体融合タンパク質複合体内に存在していてもよい。
【０１２７】
抗体−分析物複合体に動員される追加的な熱安定性キナーゼ（追加的な単一ドメイン抗体／抗体断片によって）は、例えば、本明細書に記載の熱安定性キナーゼのいずれかであってよい。
【０１２８】
本発明の一実施形態では、例えば、実施例１４、パート（ii）において考察されている通り、（本明細書で定義されている）１又は２以上の代替の又は追加的な「検出器分子」を使用して、（ＡＴＰ検出ステップに加えて、又はその代わりに）本発明の融合タンパク質複合体によって形成される抗体−分析物複合体を検出することができる。
【０１２９】
例として、検出ステップでは、検出器分子（複数可）に結合し、それを抗体−分析物複合体に動員する１又は２以上の追加的な単一ドメイン抗体又は抗体断片を使用することができる。検出器分子を標的とする追加的な単一ドメイン抗体／抗体断片は、所望の分析物（すなわち、検出される分析物）を標的とする融合タンパク質内に存在してよい。あるいは、追加的な単一ドメイン抗体／抗体断片は、所望の分析物（複数可）を標的とする融合タンパク質由来の異なる融合タンパク質内に存在してよい。追加的な検出器分子に結合し、それを動員する融合タンパク質は、単一の融合タンパク質の形態で、又はホモ多量体融合タンパク質複合体若しくはヘテロ多量体融合タンパク質複合体の一部として存在してよい。
【０１３０】
所望の分析物（複数可）を標的とする融合タンパク質及び追加的な検出器分子（複数可）に結合し、それを動員する融合タンパク質は、同じヘテロ多量体融合タンパク質複合体内に存在していてもよい。
【０１３１】
適切な検出器分子の例は本明細書に記載されている（例えば、フルオロフォア）。本明細書に記載の検出器分子は、当技術分野で公知の任意の従来の手段を用いて検出することができる。
【０１３２】
国際公開第００／４６３５７号パンフレットには、「レポーター」熱安定性キナーゼとコンジュゲートした抗体を使用した分析物の検出について記載されている。
【０１３３】
本発明の融合タンパク質は、単鎖抗体又は抗体断片が結合する分析物を同定及び／又は数量化するための検出アッセイにおいてレポーター分子として使用することができる。
【０１３４】
したがって、一態様では、本発明は、試料上又は試料中の分析物を検出するためのレポーター分子であって、本明細書で定義されている本発明の融合タンパク質を含むレポーター分子を提供する。
【０１３５】
本発明のレポーター分子は、異なる本発明の融合タンパク質を多数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ）含んでよい。この点について、融合タンパク質は、異なる熱安定性キナーゼ及び／又は異なる単一ドメイン抗体／抗体断片を含んでよい。例として、異なる単一ドメイン抗体／抗体断片は異なる分析物に結合してもよく、同じ分析物上の同じエピトープ又は異なるエピトープに結合してもよい。
【０１３６】
一実施形態では、本発明の受容体分子は、上で定義されている本発明の多量体融合タンパク質複合体を含む。
【０１３７】
本発明は、試料上又は試料中の分析物を検出するためのインビトロでの方法であって、
（ｉ）試料を本明細書で定義されている本発明の融合タンパク質又はレポーター分子と接触させるステップであって、単一ドメイン抗体又は抗体断片が分析物と結合して抗体−分析物複合体が形成されるステップと、
（ii）抗体−分析物複合体を検出するステップと
を含む方法も提供する。
【０１３８】
抗体−分析物複合体が検出されることにより、試料上又は試料中に分析物が存在することが示される。抗体−分析物複合体が検出されなければ、それにより、試料上又は試料中に分析物が存在しないことが示される。
【０１３９】
本発明のこの態様によると、融合タンパク質が単一ドメイン抗体又は抗体断片を介して分析物に結合して、抗体−分析物複合体が形成される。抗体−分析物複合体が検出されれば、それにより、本発明の融合タンパク質が分析物に結合したこと、すなわち、試料中に分析物が存在することが示される。抗体−分析物複合体が検出されなければ、それにより、融合タンパク質が分析物に結合しなかったこと、すなわち、試料中に分析物が存在しないことが示される。
【０１４０】
異なる分析物に結合する多数（例えば、少なくとも２つ）の異なる抗体成分を含む、本明細書に記載の融合タンパク質又は多量体融合タンパク質複合体を含むレポーター分子の１つの利点は、単一の試薬を使用して多数の異なる分析物を同時に検出することができることである。
【０１４１】
したがって、本発明は、試料上又は試料中の多数（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ）の異なる分析物を検出するためのインビトロでの方法であって、
（ｉ）試料を多数（例えば、少なくとも２つ）の抗体成分を含む融合タンパク質又はレポーター分子と接触させるステップであって、前記抗体成分が前記多数の異なる分析物に結合して、抗体−分析物複合体が形成されるステップと、
（ii）抗体−分析物複合体を検出するステップと
を含む方法を提供する。
【０１４２】
抗体−分析物複合体が検出されることにより、試料上、又は試料中に分析物が存在することが示される。
【０１４３】
ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス又はノロウイルスなど）は、急速に変異し、抗原多様性のシフトを受ける能力を有する。ウイルス感染の検出は、一般には、単一のウイルス抗原を標的とする単一のモノクローナル抗体を使用して実施される（当技術分野では）。抗原の変異によりモノクローナル抗体の結合が妨げられ、偽陰性シグナルが導かれる。ポリクローナル抗体を使用してこの問題に対処することができるが、ポリクローナル抗体は産生に時間がかかり、また、品質が変動する。
【０１４４】
一実施形態において、本発明は、多数の異なる抗原（例えば、多数の異なるウイルス抗原）を認識する多数の異なる抗体成分を含む単一の試薬を提供することによってこの問題を克服する。異なる標的抗原の全てが変異を受けて抗体／抗体断片による検出を逃れる可能性は低く、したがって、本発明の融合タンパク質／融合タンパク質複合体により、（例えば）ウイルス感染の存在を決定する際の偽陰性の結果のリスクが有利に低下する。本発明のこの態様の例は、実施例１３のパート（ｉ）に記載されている。
【０１４５】
本明細書に記載の融合タンパク質／融合タンパク質複合体及びレポーター分子は、多数の異なるウイルスの遺伝子型を単一の試薬を使用して検出するためにも有用である（融合タンパク質／融合タンパク質複合体の異なる単一ドメイン抗体成分が異なるウイルスの遺伝子型に結合する）。例として、本明細書に記載の本発明の融合タンパク質／融合タンパク質複合体又はレポーター分子は、ノロウイルスの遺伝子型ＧＩ及びＧIIの存在を同時に検出するために有用である（例えば、実施例１３パート（ｉ）において考察されている通り）。
【０１４６】
したがって、本発明は、試料上又は試料中の多数（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ）の異なるウイルスの遺伝子型（例えば、ノロウイルスの遺伝子型ＧＩ及びＧII）を検出するためのインビトロにおける方法であって、
（ｉ）試料を多数（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ）の抗体成分を含む本発明の融合タンパク質又はレポーター分子と接触させるステップであって、前記抗体成分が前記多数の異なる遺伝子型由来のウイルス抗原に結合して、抗体−抗原複合体が形成されるステップと、
（ii）抗体−抗原複合体を検出するステップと
を含む方法を提供する。
【０１４７】
抗体−抗原複合体が検出されることにより、試料上、又は試料中にウイルスの遺伝子型が存在することが示される。
【０１４８】
単一の試薬を使用して多数の分析物を同時に検出することができることは、細菌感染の存在を検出する場合、例えば、多数の異なる細菌感染の存在を検出するため、又は個別に若しくは組み合わさるかのいずれかで疾患を媒介する可能性がある多数の異なる毒素を伴う単一の細菌感染の存在を検出するために利点になる。例えば、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）は、毒素Ｂを単独で、又は毒素Ａと組み合わせて発現することによって疾患を媒介する可能性がある。したがって、一実施形態では、本明細書で定義されている本発明の融合タンパク質／融合タンパク質複合体又はレポーター分子は、臨床分離株をスクリーニングして、毒素Ａのみ若しくは毒素Ｂのみ、又は毒素Ａと毒素Ｂ両方の組み合わせを発現しているクロストリジウム・ディフィシレの存在を検出するために有用である（例えば、実施例１３パート（ｉ）において考察されている通り）。
【０１４９】
したがって、本発明は、試料上又は試料中の多数（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ）の異なる細菌タンパク質（例えば、Ｃ．ディフィシレ（C. difficile）のタンパク質、例えば、毒素Ａ及び／又は毒素Ｂなど）を検出するためのインビトロでの方法であって、
（ｉ）試料を多数（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ）の抗体成分を含む融合タンパク質又はレポーター分子と接触させるステップであって、前記抗体成分が前記多数の異なる細菌タンパク質に結合して抗体−タンパク質複合体が形成されるステップと、
（ii）抗体−タンパク質複合体を検出するステップと
を含む方法を提供する。
【０１５０】
抗体−タンパク質複合体が検出されることにより、試料上、又は試料中に細菌タンパク質が存在することが示される。
【０１５１】
「試料」という用語は、任意の品目、計器、表面、流体又は材料を包含する。例としては、これだけに限定されないが、臨床試料（例えば、血液（例えば、清澄化された全血）、血清、痰、口腔試料、例えば唾液など、膿、膣試料、便試料、吐物など）；環境試料（例えば、水、土壌、空気試料など）；外科用及び医療用の設備及び計器、例えば、内視鏡、マイクロタイタープレート、尿試験紙、側方流動デバイス、病衣、寝具など；バルク液体；淘汰動物材料；医薬品；作業台、壁及び床が挙げられる。
【０１５２】
融合タンパク質に「試料を接触させるステップ」への言及は、分析物を含むことが疑われる試料の部分又は抽出物を接触させることを包含する。
【０１５３】
本発明の方法を実行する前に試料上又は試料中に分析物が存在することが必ずしも分かっているとは限らない。試料がいかなる分析物も全く含有しない可能性がある。しかし、一般に、試料上又は試料中に分析物が存在することが分かっている。一実施形態では、アッセイの目的は、試料上又は試料中に分析物が存在するかどうかを同定することである。一実施形態では、アッセイの目的は、試料上、又は試料中に存在することが分かっている分析物を数量化することである。
【０１５４】
一実施形態では、本発明の方法は、試料上、又は試料中に存在するいかなる内在性キナーゼも（実質的に）除去するために試料を処理するステップを含む。この処理ステップは、熱安定性キナーゼのキナーゼ活性を検出することによって抗体−分析物複合体を検出するステップの前に行う限りは、試料を本発明の融合タンパク質又はレポーター分子と接触させるステップの前、その後、又はそれと同時に行うことができる。一実施形態では、試料を本発明の融合タンパク質又はレポーター分子と接触させる前に内在性キナーゼの除去を実施する。この処理ステップにより、アッセイから得られるシグナルが、試験されている試料中に存在するいかなる内在性キナーゼによっても汚染されていない又は別のように悪影響を受けていないことが確実になる（すなわち、「偽陽性」読み取りのリスクが低下する）。
【０１５５】
試料から「キナーゼを除去すること」への言及は、例えば、いかなる内在性キナーゼもインサイツで変性させる又は別のやり方で不活性化することなどによってキナーゼ活性を除去することを包含する。例として、内在性の中温性キナーゼの除去は、試料を、いかなる内在性の中温性キナーゼ（存在する場合）も変性する又はＡＴＰの形成を触媒することができなくなるが、本発明の融合タンパク質内に存在する熱安定性キナーゼは変性せず、そのキナーゼ活性が保持される温度に加熱することによって都合よく実現することができる。適切な処理は、試料を、少なくとも１０分にわたって６０〜９０℃に（例えば、少なくとも３０分にわたって７０℃、又は少なくとも１０分にわたって８０℃など）加熱することであり得る。あるいは、本発明の熱安定性キナーゼの活性を保持しながら内在性キナーゼの活性を破壊するために、他の処理、例えば、超音波、又は極度のｐＨ若しくは塩濃度の使用などが適する場合がある。
【０１５６】
一実施形態では、本発明の方法は、試料を本発明の融合タンパク質又はレポーター分子と接触させるステップの後、抗体−分析物複合体を検出するステップの前に、分析物に結合していないいかなる融合タンパク質も除去することを含む。このステップにより、アッセイから得られるシグナルが、試料に添加された、所望の分析物に結合しないキナーゼによって汚染されていない又は別のように悪影響を受けていないことが確実になる（すなわち、「偽陽性」読み取りのリスクが低下する）。
【０１５７】
一実施形態では、抗体−分析物複合体は、融合タンパク質の熱安定性キナーゼ成分のキナーゼ活性を検出することによって検出することができる。
【０１５８】
熱安定性キナーゼのキナーゼ活性は、当技術分野で公知の任意の従来の手段によって測定することができる。一実施形態では、融合タンパク質の熱安定性キナーゼ成分により、ＡＴＰの生成、したがって、光の生成の形態で高度に特異的な出力がもたらされ、これにより、抗体／抗体断片と分析物の間の結合事象を高感度で特異的に検出することが可能になる。検出限界は抗体の解離定数（Ｋｄ）以下であり、これにより、高感度のアッセイがもたらされる。
【０１５９】
一実施形態では、抗体−分析物複合体内の結合した熱安定性キナーゼのキナーゼ活性を、基質（例えば、ＡＤＰ）を添加し、ＡＴＰの形成を検出することによって検出する。ＡＴＰは、直接検出し、測定することができるが、通常は間接的に、例えば、ＡＴＰとルシフェリン／ルシフェラーゼなどの生物発光試薬が反応して光が生成されることによって検出される。アッセイからの光の出力（すなわち、ＡＴＰと生物発光試薬の反応により放出される光）は、照度計を使用することなどの当技術分野で公知の従来の技法を使用して測定することができる。
【０１６０】
ＡＴＰが検出されることにより、アッセイ物に分析物に結合した本発明の融合タンパク質が含有されたこと、すなわち、試料中に分析物が存在したことが示される。ＡＴＰが検出されなければ、それにより、融合タンパク質が分析物に結合しなかったこと、すなわち、試料中に分析物が存在しなかったことが示される。
【０１６１】
一実施形態では、方法は、ＡＤＰを添加し、キナーゼ活性を検出する前に、試料上、又は試料中に存在するいかなる内在性ＡＴＰも除去するステップを含む。このステップにより、アッセイにおけるバックグラウンドノイズがさらに減少する。内在性ＡＴＰの除去は、当技術分野で公知の任意の従来の方法によって、例えば、温度の上昇を用いることによってそれ自体を破壊することができる熱不安定性ＡＴＰアーゼなどのＡＴＰアーゼを添加することによって（ＡＴＰアーゼが熱安定性キナーゼから得られるシグナルに不利に影響を及ぼすことを回避するために）実現することができる。
【０１６２】
一実施形態では、方法は、以下のステップを含む：
１．所望の分析物を含有する又は含有することが疑われる試料を、所望の分析物に結合する単一ドメイン抗体又は抗体断片を含む本発明の融合タンパク質又はレポーター分子と接触させるステップ；
２．融合タンパク質を、単一ドメイン抗体又は抗体断片を介して試料中の分析物（存在する場合）に結合させて抗体−分析物複合体を形成するステップ；
３．アッセイ物を、試料の結合していない成分及び結合していない融合タンパク質が除去されるが、いかなる抗体−分析物複合体も保持されるよう処理する（例えば、洗浄することによって）ステップ；
４．場合によって、熱不安定性ＡＴＰアーゼを固相に添加して、いかなる内在性ＡＴＰも除去するステップ；
５．アッセイ物を、熱不安定性ＡＴＰアーゼ（添加した場合）が破壊され、存在する可能性があるいかなる内在性キナーゼも変性するが、融合タンパク質内の熱安定性キナーゼは変性しないように処理する（例えば、加熱することによって）ステップ；
６．熱安定性キナーゼの基質としてＡＤＰをアッセイ物に添加し、アッセイ物をＡＴＰの存在及び／又は量について試験する（例えば、生物発光化合物を添加し、光の出力を検出／測定することによって）ステップ。
【０１６３】
一実施形態では、抗体−分析物複合体によって生成されるＡＴＰ検出シグナルを、１又は２以上の追加的な熱安定性キナーゼ（複数可）に結合し、それを抗体−分析物複合体に動員する１又は２以上の追加的な単一ドメイン抗体又は抗体断片を使用してさらに増幅する。
【０１６４】
一実施形態では、追加的な単一ドメイン抗体／抗体断片は、所望の分析物（すなわち、検出される分析物）を標的とする融合タンパク質内に存在してよい。あるいは、追加的な単一ドメイン抗体／抗体断片は、所望の分析物（複数可）を標的とする融合タンパク質由来の異なる融合タンパク質内に存在してよい。追加的な熱安定性キナーゼに結合し、それを動員する単一ドメイン抗体／抗体断片を含む融合タンパク質は、単一の融合タンパク質の形態で、又はホモ多量体融合タンパク質複合体及びヘテロ多量体融合タンパク質複合体の一部として存在してよい。
【０１６５】
所望の分析物（複数可）を標的とする融合タンパク質及び追加的な熱安定性キナーゼ（複数可）に結合し、それを動員する融合タンパク質は、同じヘテロ多量体融合タンパク質複合体内に存在していてもよい。
【０１６６】
本発明の代替の実施形態では、１又は２以上の代替の又は追加的な「検出器分子」を使用して、本発明の融合タンパク質複合体によって形成される抗体−分析物複合体を検出することができる（ＡＴＰ検出ステップに加えて、又はその代わりに）例えば、実施例１４パート（ii）において考察されている通り。
【０１６７】
例として、検出ステップでは、検出器分子（複数可）に結合し、それを抗体−分析物複合体に動員する１又は２以上の追加的な単一ドメイン抗体又は抗体断片を使用することができる。検出器分子を標的とする追加的な単一ドメイン抗体／抗体断片は、所望の分析物（すなわち、検出される分析物）を標的とする融合タンパク質内に存在してよい。あるいは、追加的な単一ドメイン抗体／抗体断片は、所望の分析物（複数可）を標的とする融合タンパク質由来の異なる融合タンパク質内に存在してよい。追加的な検出器分子に結合し、それを動員する単一ドメイン抗体／抗体断片を含む融合タンパク質は、単一の融合タンパク質の形態で、又はホモ多量体融合タンパク質複合体若しくはヘテロ多量体融合タンパク質複合体の一部として存在してよい。
【０１６８】
所望の分析物（複数可）を標的とする融合タンパク質及び追加的な検出器分子（複数可）に結合し、それを動員する融合タンパク質は、同じヘテロ多量体融合タンパク質複合体内に存在していてもよい。
【０１６９】
適切な検出器分子の例は本明細書に記載されている（例えば、フルオロフォア）。本明細書に記載の検出器分子は、当技術分野で公知の任意の従来の手段を用いて検出することができる。
【０１７０】
一実施形態では、融合タンパク質の熱安定性キナーゼ成分のキナーゼ活性（及び／又は抗体−分析物複合体に動員される任意の追加的な熱安定性キナーゼのキナーゼ活性）を検出することに加えて、検出器分子の検出を実施する。あるいは、融合タンパク質の熱安定性キナーゼ成分のキナーゼ活性（及び／又は抗体−分析物複合体に動員される任意の追加的な熱安定性キナーゼのキナーゼ活性）を検出することの代わりに、検出器分子の検出を実施することができる。
【０１７１】
本発明の一実施形態では、抗体−分析物複合体に動員される追加的なレポーター分子又はトレーサー分子を使用して、所望の分析物（複数可）の存在を全身系において、又は単離された組織試料において組織学的検査によって、検出することができる。
【０１７２】
「分析物」という用語は、生物学的供給源に由来する感染性因子及び非感染性因子の両方を包含する。分析物の例としては、細菌、ウイルス、真菌、プリオン、毒素、アレルゲン、胞子、並びに前述のもののいずれかの断片及び誘導体／成分が挙げられる。一実施形態では、分析物は、「汚染物質」又は「汚染性生物学的因子」と称することができる。
【０１７３】
本発明は、単一ドメイン抗体を生じさせることができる任意の分析物を検出するために適用可能である。言い換えれば、本発明の融合タンパク質が単一ドメイン抗体又は抗体断片を介して結合することができる限りは、いかなる分析物も本発明を用いて検出することができる。
【０１７４】
一実施形態では、分析物は、１又は２以上のタンパク質、核酸、炭水化物及び／又は脂質を含む、又はそれからなる。一実施形態では、分析物は、ウイルス、又は細菌若しくは酵母などの細胞を含む、又はそれからなる。
【０１７５】
一実施形態では、分析物は、病原性細菌又は病原性ウイルスなどの病原体に由来する。
【０１７６】
一実施形態では、分析物は、タンパク質、例えば、動物（例えば、ヒトなどの哺乳動物）タンパク質、細菌タンパク質、ウイルスタンパク質、植物タンパク質又は真菌タンパク質からなる群から選択されるタンパク質などを含む、又はそれからなる。一実施形態では、分析物は、血液タンパク質又は神経組織に由来するタンパク質を含む、又はそれからなる。
【０１７７】
一実施形態では、分析物は、ヒト、動物又は植物の病原体である可能性があり、臨床試料、環境試料、又は加工試料において見いだすことができる細菌種由来の細菌タンパク質を含む、又はそれからなる。細菌タンパク質は、例えば、細菌の線毛タンパク質（例えば、大腸菌由来のＣｇｓＡ及びサルモネラ属（Salmonella）由来のＡｇｆＡ）、細菌の毒素タンパク質（例えば、バチルス属（Bacillus）の種、例えば、炭疽菌（Bacillus anthracis）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）など由来の毒素、クロストリジウム属（Clostridium）の種、例えば、ボツリヌス菌（Clostridium botulium）由来の毒素（例えば、ボツリヌス菌（C. botulinum）神経毒（ＢｏＮＴ））及びクロストリジウム・ディフィシレ（例えば、Ｃ．ディフィシレの毒素Ａ及び毒素Ｂ）など、ブドウ球菌属（Staphylococcus）の種、例えば、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来の毒素（例えば、黄色ブドウ球菌（S. aureus）エンテロトキシンＢ）など）、細菌の酵素、例えば、細菌メタロプロテアーゼ（例えば、大腸菌及びクレブシエラ属（Klebsiella）によって産生されるニューデリー・メタロプロテアーゼ）など；細菌の細胞表面タンパク質（例えば、ペプチドグリカン、リポタンパク質）；及び細菌の胞子タンパク質（例えば、グラム陽性細菌由来のもの）からなる群から選択することができる。
【０１７８】
１つの別の実施形態では、分析物は、ヒト、動物、細菌又は植物の病原体である可能性があり、臨床試料、環境試料、又は加工試料において見いだすことができるウイルス由来のウイルスタンパク質を含む、又はそれからなる。ウイルスタンパク質は、核タンパク質、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、又はウイルスのコアタンパク質であってよい。ウイルスタンパク質の例は、バクテリオファージウイルス由来のもの（例えば、ＭＳ２タンパク質及びＰＰ７タンパク質）、ノーウォークウイルス由来のもの（例えば、カプシドタンパク質）、ロタウイルス由来のもの（例えば、ＶＰ２タンパク質、ＶＰ６タンパク質及びＶＰ７タンパク質）、コロナウイルス由来のもの（例えば、ＳＡＲＳ  Ｓタンパク質、ＳＡＲＳ  Ｅタンパク質及びＳＡＲＳ  Ｍタンパク質）、ブルータングウイルス由来のもの（例えば、ＶＰ２タンパク質）、ヒトパピローマウイルス由来のもの（例えば、ウイルスの主要構造タンパク質、Ｌ１）、Ｂ型肝炎由来のもの（例えば、小エンベロープタンパク質ＨＢｓＡｇ）、Ｃ型肝炎ウイルス由来のもの（例えば、コアタンパク質、Ｅ１タンパク質及びＥ２タンパク質）、インフルエンザウイルス由来のもの（例えば、ノイラミニダーゼ及び赤血球凝集素及びマトリックスタンパク質）、ポリオウイルス由来のもの（例えば、カプシドＶＰ０タンパク質、カプシドＶＰ１タンパク質及びカプシドＶＰ３タンパク質）、ＨＩＶ由来のもの（例えば、Ｐｒ５５ｇａｇタンパク質、エンベロープタンパク質）、デングＢウイルス由来のもの（例えば、エンベロープ（ｅ）及びプレ膜／膜（ｐｒＭ／Ｍ）、エボラウイルス由来のもの及びノロウイルス由来のものである。
【０１７９】
別の実施形態では、分析物は、細胞壁タンパク質（例えば、スエヒロタケ（Schizophyllum commune）由来のＳＣ３、アスペルギルス・フムガタス（Aspergillus fumigates）由来のＲｏｄＡ／Ｂ、及び酵母由来の同等のタンパク質）、真菌の胞子タンパク質、菌糸タンパク質、マイコトキシン、及び真菌のプリオン（例えば、Ｓｕｐ３５、Ｈｅｔ  Ｓ、ＵＲＥ２、Ｒｎｑ１、Ｎｅｗ１）からなる群から選択される真菌タンパク質を含む、又はそれからなる。
【０１８０】
一実施形態では、分析物は、血液凝固タンパク質（例えば、フィブリノーゲン、フィブリンペプチド、フィブリン、トランスグルタミナーゼの基質、トロンビン）、血清タンパク質（例えばアルブミン及びグロブリン）、血小板タンパク質、血液細胞の糖タンパク質、第VIII因子、並びにヘモグロビンからなる群から選択される血液タンパク質を含む、又はそれからなる。
【０１８１】
さらに別の実施形態では、分析物は、プリオン（例えば、ＰｒＰＳｃ及びＰｒＰｃ、Ｓｕｐ３５、Ｈｅｔ  Ｓ、Ｕｒｅ２、Ｒｎｑ１、Ｎｅｗ１）、プリオン模倣タンパク質、アミロイド線維、（例えば、アミロイドベータ）、並びに誤って折り畳まれたタンパク質（例えば、アルファ−シヌクレイン）からなる群から選択される自己凝集性（self-aggregating）タンパク質を含む、又はそれからなる。
【０１８２】
一実施形態では、分析物は、乱用される物質である小分子を含む、又はそれからなる。そのような分子の例としてはニコチン及びコカインが挙げられる。
【０１８３】
別の実施形態では、分析物は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子などの核酸分子を含む、又はそれからなる。例として、核酸分析物は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ、single-stranded DNA）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ、single-stranded RNA）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、double-stranded DNA）又は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、double-stranded RNA）を含んでもよく、それからなってもよい。一実施形態では、核酸分子は、上で定義されているタンパク質分析物のいずれかをコードする核酸配列を含む、又はそれからなる。
【０１８４】
別の実施形態では、分析物は、炭水化物、例えば、菌体外多糖、リポ多糖（ＥＰＳ／ＬＰＳ、時には内毒素として公知である）（例えば、レジオネラ種、大腸菌、ブドウ球菌属の種、連鎖球菌属（Streptococcus）の種、シュードモナス属（Pseudomonas）の種、アシネトバクター属（Acinetobactor）の種、カンピロバクター属（Campylobactor）の種、及びバチルス属（Bacillus）の種に由来する）、ペプチドグリカン、植物、真菌及び酵母の細胞壁成分（例えば、キチン、リグニン、グルカン）、ムチン調製物、糖脂質（例えば、脳由来の糖脂質）、糖タンパク質（例えば、細胞表面糖タンパク質、Ｅａｐ１ｐ）、胞子抽出物（例えば、バチルス属の種、クロストリジウム属の種及び他の胞子菌に由来するもの）、酵母莢膜由来の多糖、並びに無脊椎動物の分泌物（例えば、軟体動物のゲルに由来するもの）からなる群から選択される炭水化物などを含む、又はそれからなる。
【０１８５】
別の実施形態では、分析物は、脂質、例えば、糖脂質（例えば、脳由来の糖脂質）、ガングリオシド（例えば、ＧＴ１ｂ、ＧＴ１ａなどの神経細胞ガングリオシド及びＧＭ１などのより一般的な細胞起源のガングリオシド）、並びに植物の油及び脂質からなる群から選択される脂質などを含む、又はそれからなる。
【０１８６】
別の実施形態では、分析物は、血液、血清、アルブミン、粘液、卵、神経組織、食物、淘汰動物材料の１又は２以上の成分、又は土壌、水又は空気試料中に存在する１又は２以上の成分から得ることができる、又は、それを含んでよい／それからなってよい。本発明のさらに別の実施形態では、生物学的マトリックスは、フィブリノーゲン、トロンビン、第VIII因子、ＣａＣｌ２、及び場合によってアルブミン及び／又はヘモグロビンからなる群から選択される１又は２以上の成分を含む。
【０１８７】
別の実施形態では、「分析物」という用語は、上記の通り検出反応物の一部としてもたらされる検出器機能を有する分子も包含する。本発明では、検出器機能を有する分析物（「検出器分子」）は、所望の生物学的分析物（複数可）（例えば、上記の）を検出するための検出反応の感度を増大させるためにもたらすことができる。
【０１８８】
一実施形態では、検出器分子は、熱安定性キナーゼ（例えば、アデニル酸キナーゼ、酢酸キナーゼ、ＵＭＰキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ又は酪酸キナーゼ又は本明細書に記載の任意の熱安定性キナーゼなど）を含んでもよく、それからなってもよい。
【０１８９】
別の実施形態では、検出器分子は、フルオロフォア、ハプテン（例えば、ビオチン又はジゴキシゲニン）、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、アクリジンエステル、放射性同位元素（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ）又は当技術分野で公知の任意の他の従来のレポーター分子を含んでもよく、それからなってもよい。別の実施形態では、検出器分子は、トレーサー、例えば、同位体トレーサー（例えば、２Ｈ、１３Ｃ、及び１５Ｎ）、又は当技術分野で公知の任意の他の従来のトレーサー分子などを含んでもよく、それからなってもよい。
【０１９０】
融合タンパク質は、当業者によく知られている種々のアッセイ形式で使用することができる。したがって、一実施形態では、本発明は、本発明の融合タンパク質又はレポーター分子を提供し、融合タンパク質は固体支持体に付着している。適切なアッセイ形式の例としては、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）又はそのバリアント、磁気ビーズに基づく固体支持体アッセイ、ウエスタンブロット、自動分析器、核酸増幅系、側方流動若しくは尿試験紙アッセイ又は他の急速アッセイ形式が挙げられる。
【０１９１】
本発明の別の態様では、（ｉ）１又は２以上の、本明細書で定義されている本発明の融合タンパク質、融合タンパク質複合体又はレポーター分子と、（ii）熱安定性キナーゼの基質とを含む検出キットが提供される。
【０１９２】
一実施形態では、キットは、多数の本発明の（本明細書で定義されている）融合タンパク質を含む多量体融合タンパク質複合体を含む。
【０１９３】
一実施形態では、熱安定性キナーゼの基質はＡＤＰである。
【０１９４】
一実施形態では、熱安定性キナーゼの量又は活性を測定するために、キットは、ＡＴＰを検出するための手段、例えば、生物発光試薬（例えば、ルシフェリン／ルシフェラーゼ）及び場合によって照度計なども含んでよい。
【０１９５】
公知の分析物を用いた以前の試験から、データを、キナーゼ活性の量と分析物の量又は活性の相関が明らかになるように調製することができる。したがって、キットは、観察されたキナーゼ活性と指定の分析物の一覧の量又は活性との相関が明らかになるルックアップテーブルをさらに含む。
【０１９６】
一実施形態では、キットは、融合タンパク質の熱安定性キナーゼ活性を検出することに加えて（又はその代わりに）、抗体−分析物複合体を検出するために用いることができる１又は２以上の検出器分子（本明細書で定義されている）をさらに含んでよい。一実施形態では、追加的なレポーター分子は、１又は２以上の追加的な熱安定性キナーゼ、フルオロフォア、ビオチン、ジゴキシゲニン、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、及び当技術分野で公知の他の従来のレポーター分子又はトレーサー分子を含んでもよく、それからなってもよい。キットは、検出器分子（複数可）を検出するための従来の手段も含んでよい。
【０１９７】
本出願において引用されている参考文献は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９８】
ここで、本発明を以下の実施例の特定の実施形態において、及び付属図を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】Ｓａｃ  ｔＡＫドメイン及びグルタチオンの存在下での、正確に折り畳まれた単一ドメイン抗体（ＶＮＡＲ）の機能回復を例示するグラフである。融合タンパク質を、マイクロタイタープレート上に固定化したニワトリ卵白リゾチームに結合するそれらの能力について、ＥＬＩＳＡ形式で、アッセイの読み取りとしてｔＡＫ活性を用いて評価した。それぞれの場合において、バックグラウンド結合を、関連性のない抗原対照としてＢＳＡを使用して測定した。Ｔｍａ  ｔＡＫ融合物の場合では、グルタチオン抽出、加熱処理又はその２つの組み合わせのいずれを用いても、ＢＳＡに対するバックグラウンド結合を超える結合の有意な増加は観察されなかった。対照的に、Ｓａｃ  ｔＡＫ融合物に関しては、グルタチオンの存在下で加熱又は抽出することにより、増殖性の結合がＢＳＡ対照を超えて増加し、その２つの因子の組み合わせでは、結合がおよそ１０倍に増加した。
【図２】サメＩｇ新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）の図表示である。
【図３】ＳａｃＡＫ−Ｆ３−ＶＮＡＲ融合物又はＳａｃＡＫ−Ｆ３−ＶＨ融合物の構築を例示する図である。ＳａｃＡＫをGateway適合性ｐＭＴＬ１０１５ベクター（Ungurs et al. 2010）の組換え部位の上流にクローニングした。エントリーベクターからＶＮＡＲ又はＶＨを組み換えて、第１世代の構築物を生成した。必要な場合には、示されている通り、工学的に産生された制限酵素部位を使用して追加的なリンカー領域（例えば、(GGGGS)3）をクローニングして、遺伝子間領域（intergene region）を置き換えた。
【図４】ＳａｃＡＫ−Ｆ３−ＶＮＡＲ融合物の精製のＳＤＳ  ｐａｇｅ分析を例示する写真である。精製の各段階から等量のタンパク質を４〜１２％ビストリスゲルにローディングし、標準の条件下、ＭＥＳ緩衝液中で電気泳動した。精製されたＳａｃＡＫ−Ｆ３−ＶＮＡＲが矢印で示されており、レーンは以下の通りローディングした：１：See Blueプラス２ラダー、２：ＳａｃＡＫ対照（２．５μｇ）、３：不溶性ホモジネート、４：可溶性ホモジネート、５：不溶性の熱沈降物（thermoprecipitate）、６：可溶性熱沈降物／カラムローディング液、７：Blue Sepharoseカラム洗浄液、８：Blue Sepharoseカラム溶出液。
【図５】およそ２０ｎＭにおけるＶＮＡＲの推定ＫＤ付近におけるＳａｃＡＫ−Ｆ３−ＶＮＡＲによるＨＥＬの検出を例示するグラフである（Dooley et al.）。PBS中、最終濃度が５〜５００ｎＭであるＨＥＬの希釈物を生成し、１００μｌを白色Maxisorpプレート上にコーティングし、５％ＢＳＡを用いてブロッキングした。プレートを、１０μｇ／ｍｌのＳａｃＡＫ−Ｆ３−ＶＮＡＲを用いて探索し、シグナル（バックグラウンドについて補正した）をプロットした。感度のレベルをブランク（抗原なし）対照値の３ＳＤ超と定義した。結果は２又は３以上の実験の典型的なものである（ｎ＝６）。
【図６】８０℃超で加熱処理した後のＳａｃＡＫ−Ｆ３−ＶＮＡＲ結合及び酵素活性の保持を例示するグラフである。ＳａｃＡＫ−Ｆ３−ＶＮＡＲの１０μｇ／ｍｌの一定分量を種々の温度でインキュベートし、室温まで冷却し、次いで、１０μｇ／ｍｌのＨＥＬをコーティングしたプレートを探索するために使用した。融合物の活性は８０℃まで影響を受けず、８０〜１００℃でシグナルが有意に降下し、融解温度（融合物が最大半量の活性を保持する温度）はおよそ８８．９℃であると推定された。等モル濃度及び同じ塩濃度の下で、ＳａｃＡＫ単独で同様の／異なる融解曲線が示された。  Ｓａｃ−Ｆ３−ＶＨ融合タンパク質を用いると同様の結果が観察され（結果は示されていない）、Ｓａｃドメインの活性は８０℃までの温度に影響されず、９０℃で処理した３０分後には活性のおよそ１０％が保持された。
【図７】ＳａｃＡＫ−Ｆ３−ＶＮＡＲ融合物が尿素で処理した後に活性を保持することを例示するグラフである。１００μｇ／ｍｌの融合タンパク質を最終濃度が０ｍＭ、１ｍＭ、４ｍＭ又は８ｍＭの尿素を用いて３７℃で３０分処理した。試料をすぐに１：１０に希釈し、ＨＥＬの希釈物でコーティングしたMaxisorpプレートを探索するために使用した。抗原なしの対照値の３ＳＤ超によって定義されるアッセイの検出の限界は、試験した条件下では変化しないままであった。結合したＨＥＬを同じ濃度の尿素で処理することにより、融合物の結合は低下したが、消滅はしなかった（結果は示されていない）。結果は２又は３以上の実験の典型的なものである（ｎ＝４）。
【図８】ＳａｃＡＫ−Ｆ３−ＶＨ融合物の精製のＳＤＳ  ｐａｇｅ分析を例示する写真である。精製の各段階から等量のタンパク質を４〜１２％ビストリスゲルにローディングし、標準の条件下、ＭＥＳ緩衝液中で電気泳動した。精製されたＳａｃＡＫ−Ｆ３−ＶＨが矢印で示されており、レーンは以下の通りローディングした：１：See Blueプラス２ラダー、２：不溶性ホモジネート、３：可溶性ホモジネート、４：不溶性の熱沈降物、５：可溶性熱沈降物／カラムローディング液、６：Blue Sepharoseカラムフロースルー、７：Blue Sepharoseカラム洗浄液、８：Blue Sepharoseカラム溶出液。Ｓａｃ−Ｆ３−ＶＨ融合物は、一貫して、おおよその分子量が２８ｋＤａの２重のバンドとして流れ、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて観察されたＳａｃ融合タンパク質の移動と一致した。
【発明を実施するための形態】
【０２００】
配列番号の一覧
配列番号１：メタノサルシナ・サーモフィラ由来の酢酸キナーゼ
1 mkvlvinags sslkyqlidm tnesalavgl cerigidnsi itqkkfdgkk lekltdlpth
61 kdaleevvka ltddefgvik dmgeinavgh rvvhggekft tsalydegve kaikdcfela
121 plhnppnmmg isacaeimpg tpmvivfdta fhqtmppyay myalpydlye khgvrkygfh
181 gtshkyvaer aalmlgkpae etkiitchlg ngssitaveg gksvetsmgf tpleglamgt
241 rcgsidpaiv pflmekeglt treidtlmnk ksgvlgvsgl sndfrdldea askgnrkael
301 aleifaykvk kfigeysavl ngadavvfta gigensasir kriltgldgi gikiddeknk
361 irgqeidist pdakvrvfvi ptneelaiar etkeivetev klrssipv
【０２０１】
配列番号２：ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のピルビン酸キナーゼ
1 mkrktkivct igpasesvdk lvqlmeagmn varlnfshgd heehgrrian ireaakrtgr
61 tvailldtkg peirthnmen gaielkegsk lvismsevlg tpekisvtyp sliddvsvga
121 killddglis levnavdkqa geivttvlng gvlknkkgvn vpgvkvnlpg itekdradil
181 fgirqgidfi aasfvrrasd vleirellea hdalhiqiia kieneegvan ideileaadg
241 lmvargdlgv eipaeevpli qkllikkcnm lgkpvitatq mldsmqrnpr ptraeasdva
301 naifdgtdav mlsgetaagq ypveavktmh qialrteqal ehrdilsqrt kesqttitda
361 igqsvahtal nldvaaivtp tvsgktpqmv akyrpkapii avtsneavsr rlalvwgvyt
421 keaphvnttd emldvavdaa vrsglvkhgd lvvitagvpv getgstnlmk vhvisdllak
481 gqgigrksaf gkavvaktae earqkmvdgg ilvtvstdad mmpaiekaaa iiteegglts
541 haavvglslg ipvivgvena ttlfkdgqei tvdggfgavy rghasvl
【０２０２】
配列番号３：ＵＭＰキナーゼ、例えばパイロコッカス・フリオサス由来
1 gsshhhhhhs sglvprgshm rivfdiggsv lvpenpdidf ikeiayqltk vsedhevavv
61 vgggklarky ievaekfnss etfkdfigiq itranamlli aalrekaypv vvedfweawk
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181 mkpeelleiv gkgiekagss svidplaaki iarsgiktiv igkedakdlf rvikgdhngt
241 tiep
【０２０３】
配列番号４：サーモトガ・マリティマ由来の酪酸キナーゼ
1 mfriltinpg ststklsife dermvkmqnf shspdelgrf qkildqlefr ekiarqfvee
61 tgyslssfsa fvsrgglldp ipggvylvdg lmiktlksgk ngehasnlga iiahrfsset
121 gvpayvvdpv vvdemedvar vsghpnyqrk sifhalnqkt vakevarmmn kryeemnlvv
181 ahmgggisia ahrkgrvidv nnaldgdgpf tpersgtlpl tqlvdlcfsg kftyeemkkr
241 ivgngglvay lgtsdarevv rrikqgdewa krvyramayq iakwigkmaa vlkgevdfiv
301 ltgglaheke flvpwitkrv sfiapvlvfp gsneekalal salrvlrgee kpknyseesr
361 rwrerydsyl dgilr
【０２０４】
配列番号５：サーモトガ・マリティマ由来のアデニル酸キナーゼ（単量体）
1 mmaylvflgp pgagkgtyak rlqeitgiph istgdifrdi vkkendelgk kikeimerge
61 lvpdelvnev vkrrlsekdc ergfildgyp rtvaqaefld gflktqnkel taavlfevpe
121 evvvqrltar ricpkcgriy nlislppked elcddckvkl vqreddkeet vrhrykvyle
181 ktqpvidyyd kkgilkrvdg tigidnviae vlkiigwsdk
【０２０５】
配列番号６：スルホロブス・アシドカルダリウス由来のアデニル酸キナーゼ（三量体）
1 mkigivtgip gvgkstvlak vkeildnqgi nnkiinygdf mlatalklgy akdrdemrkl
61 svekqkklqi daakgiaeea raggegylfi dthavirtps gylpglpsyv iteinpsvif
121 lleadpkiil srqkrdttrn rndysdesvi letinfarya atasavlags tvkvivnveg
181 dpsiaaneii rsmk
【０２０６】
配列番号７：非構造化リンカー及びＶＮＡＲ配列を伴うスルホロブス・アシドカルダリウス由来のアデニル酸キナーゼの遺伝子配列
ATGAAGATCGGCATTGTGACCGGCATTCCGGGCGTTGGCAAAAGCACCGTTCTGGCAAAGGTGAAGGAGATCCTGGACAACCAGGGCATTAATAACAAAATTATTAATTATGGTGATTTTATGCTGGCGACCGCGCTGAAGCTGGGCTACGCAAAAGATCGTGACGAAATGCGCAAACTGAGCGTGGAAAAACAGAAGAAGCTGCAGATTGATGCGGCGAAGGGCATTGCGGAAGAGGCACGCGCGGGCGGCGAAGGCTACCTGTTTATCGATACCCATGCGGTGATCCGCACCCCGAGCGGTTATCTGCCGGGCCTGCCGTCTTACGTGATTACGGAAATCAACCCGAGCGTTATTTTTCTGCTGGAGGCAGATCCGAAGATTATTCTGAGCCGCCAGAAGCGCGATACCACCCGCAACCGCAACGATTATAGCGACGAAAGCGTTATCCTGGAGACCATCAACTTTGCGCGCTATGCGGCAACCGCGAGCGCGGTTCTGGCAGGCTCTACCGTTAAAGTGATCGTGAACGTGGAGGGTGATCCAAGCATCGCGGCGAACGAAATCATTCGCAGCATGAAACAGTCGACCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGATCCGCACGTGTTGATCAGACACCGCGTAGCGTTACCAAAGAAACCGGTGAAAGCCTGACCATTAATTGTGTTCTGCGTGATGCAAGCTATGCACTGGGTAGCACCTGTTGGTATCGTAAAAAAAGCGGCAGCACCAATGAAGAAAGCATTAGCAAAGGTGGTCGTTATGTTGAAACCGTGAATAGCGGTAGCAAAAGCTTTAGCCTGCGTATTAATGATCTGACCGTTGAAGATGGTGGGACCTACCGTTGTGGTCTGGGTGTTGCCGGTGGTTATTGTGATTATGCACTGTGCAGCAGCCGTTATGCAGAATGTGGTGATGGTACTGCAGTTACCGTGAAT
【０２０７】
配列番号８：サメ由来のニワトリ卵白リゾチーム特異的単一ドメイン抗体のＶＮＡＲ配列。
GSARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLRDASYALGSTCWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCGLGVAGGYCDYALCSSRYAECGDGTAVTVN
【０２０８】
配列番号９：非構造化リンカー及びＶＮＡＲ配列を伴うスルホロブス・アシドカルダリウス由来のアデニル酸キナーゼの融合タンパク質配列
MLATALKLGYAKDRDEMRKLSVEKQKKLQIDAAKGIAEEARAGGEGYLFIDTHAVIRTPSGYLPGLPSYVITEINPSVIFLLEADPKIILSRQKRDTTRNRNDYSDESVILETINFARYAATASAVLAGSTVKVIVNVEGDPSIAANEIIRSMKQSTGGGGSGGGGSGGGGSGSARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLRDASYALGSTCWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCGLGVAGGYCDYALCSSRYAECGDGTAVTVN
【０２０９】
配列番号１０：ヘリックスリンカー及びＶＮＡＲ配列を伴うスルホロブス・アシドカルダリウス由来のアデニル酸キナーゼの融合タンパク質配列
MLATALKLGYAKDRDEMRKLSVEKQKKLQIDAAKGIAEEARAGGEGYLFIDTHAVIRTPSGYLPGLPSYVITEINPSVIFLLEADPKIILSRQKRDTTRNRNDYSDESVILETINFARYAATASAVLAGSTVKVIVNVEGDPSIAANEIIRSMKQSTLAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAAAGSARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLRDASYALGSTCWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCGLGVAGGYCDYALCSSRYAECGDGTAVTVN
【０２１０】
配列番号１１：ヘリックスリンカー及びスルホロブス・アシドカルダリウス由来のアデニル酸キナーゼを伴うＶＮＡＲ配列の融合タンパク質配列
MGSARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLRDASYALGSTCWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCGLGVAGGYCDYALCSSRYAECGDGTAVTVNSTLAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAAAGSMLATALKLGYAKDRDEMRKLSVEKQKKLQIDAAKGIAEEARAGGEGYLFIDTHAVIRTPSGYLPGLPSYVITEINPSVIFLLEADPKIILSRQKRDTTRNRNDYSDESVILETINFARYAATASAVLAGSTVKVIVNVEGDPSIAANEIIRSMK
【０２１１】
配列番号１２：非構造化リンカー及びスルホロブス・アシドカルダリウス由来のアデニル酸キナーゼを伴うＶＮＡＲ配列の融合タンパク質配列
MGSARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLRDASYALGSTCWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCGLGVAGGYCDYALCSSRYAECGDGTAVTVNSTGGGGSGGGGSGGGGSGSMLATALKLGYAKDRDEMRKLSVEKQKKLQIDAAKGIAEEARAGGEGYLFIDTHAVIRTPSGYLPGLPSYVITEINPSVIFLLEADPKIILSRQKRDTTRNRNDYSDESVILETINFARYAATASAVLAGSTVKVIVNVEGDPSIAANEIIRSMK
【０２１２】
配列番号１３：ラクダ科の動物由来のニワトリ卵白リゾチーム特異的単一ドメイン抗体のＶＨＨ配列
EVQLQASGGGSVQAGQSLRLSCATSGATSSSNCMGWFRQAPGKEREGVAVIDTGRGNTAYADSVQGRLTISLDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAADTSTWYRGYCGTNPNYFSYWGQGTQVTVSS
【０２１３】
配列番号１４：非構造化リンカー及びＶＨＨ配列を伴うスルホロブス・アシドカルダリウス由来のアデニル酸キナーゼの融合タンパク質配列
MLATALKLGYAKDRDEMRKLSVEKQKKLQIDAAKGIAEEARAGGEGYLFIDTHAVIRTPSGYLPGLPSYVITEINPSVIFLLEADPKIILSRQKRDTTRNRNDYSDESVILETINFARYAATASAVLAGSTVKVIVNVEGDPSIAANEIIRSMKQSTGGGGSGGGGSGGGGSGSEVQLQASGGGSVQAGQSLRLSCATSGATSSSNCMGWFRQAPGKEREGVAVIDTGRGNTAYADSVQGRLTISLDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAADTSTWYRGYCGTNPNYFSYWGQGTQVTVSS
【０２１４】
配列番号１５：ヘリックスリンカー及びＶＨＨ配列を伴うスルホロブス・アシドカルダリウス由来のアデニル酸キナーゼの融合タンパク質配列
MLATALKLGYAKDRDEMRKLSVEKQKKLQIDAAKGIAEEARAGGEGYLFIDTHAVIRTPSGYLPGLPSYVITEINPSVIFLLEADPKIILSRQKRDTTRNRNDYSDESVILETINFARYAATASAVLAGSTVKVIVNVEGDPSIAANEIIRSMKQSTLAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAAAGSEVQLQASGGGSVQAGQSLRLSCATSGATSSSNCMGWFRQAPGKEREGVAVIDTGRGNTAYADSVQGRLTISLDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAADTSTWYRGYCGTNPNYFSYWGQGTQVTVSS
【０２１５】
配列番号１６：ヘリックスリンカー及びスルホロブス・アシドカルダリウス由来のアデニル酸キナーゼを伴うＶＨＨ配列の融合タンパク質配列
MEVQLQASGGGSVQAGQSLRLSCATSGATSSSNCMGWFRQAPGKEREGVAVIDTGRGNTAYADSVQGRLTISLDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAADTSTWYRGYCGTNPNYFSYWGQGTQVTVSSSTLAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAAAGSMLATALKLGYAKDRDEMRKLSVEKQKKLQIDAAKGIAEEARAGGEGYLFIDTHAVIRTPSGYLPGLPSYVITEINPSVIFLLEADPKIILSRQKRDTTRNRNDYSDESVILETINFARYAATASAVLAGSTVKVIVNVEGDPSIAANEIIRSMK
【０２１６】
配列番号１７：非構造化リンカー及びスルホロブス・アシドカルダリウス由来のアデニル酸キナーゼを伴うＶＨＨ配列の融合タンパク質配列
EVQLQASGGGSVQAGQSLRLSCATSGATSSSNCMGWFRQAPGKEREGVAVIDTGRGNTAYADSVQGRLTISLDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAADTSTWYRGYCGTNPNYFSYWGQGTQVTVSSSTGGGGSGGGGSGGGGSGSMLATALKLGYAKDRDEMRKLSVEKQKKLQIDAAKGIAEEARAGGEGYLFIDTHAVIRTPSGYLPGLPSYVITEINPSVIFLLEADPKIILSRQKRDTTRNRNDYSDESVILETINFARYAATASAVLAGSTVKVIVNVEGDPSIAANEIIRSMK
【０２１７】
配列番号１８：ヘリックスリンカー
LAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAAA
【０２１８】
配列番号１９：サーモトガ・マリティマ由来の酢酸キナーゼ
MRVLVINSGSSSIKYQLIEMEGEKVLCKGIAERIGIEGSRLVHRVGDEKHVIERELPDHEEALKLILNTLVDEKLGVIKDLKEIDAVGHRVVHGGERFKESVLVDEEVLKAIEEVSPLAPLHNPANLMGIKAAMKLLPGVPNVAVFDTAFHQTIPQKAYLYAIPYEYYEKYKIRRYGFHGTSHRYVSKRAAEILGKKLEELKIITCHIGNGASVAAVKYGKCVDTSMGFTPLEGLVMGTRSGDLDPAIPFFIMEKEGISPQEMYDILNKKSGVYGLSKGFSSDMRDIEEAALKGDEWCKLVLEIYDYRIAKYIGAYAAAMNGVDAIVFTAGVGENSPITREDVCSYLEFLGVKLDKQKNEETIRGKEGIISTPDSRVKVLVVPTNEELMIARDTKEIVEKIGR
【０２１９】
配列番号２０：サーモトガ・マリティマ由来のＵＭＰキナーゼ
MRVLVKLSGEALSGEGGRGFDPERVNYIVNEIKSAIEEGFKIGIVVGAGNLFRGVELKNLTMTRADQIGLLGTVMNSVYLKDIFERSGLKARIYSQIVNLPDVERVNYDSIESALRENSILIFAGGTSNPFFTTDTAAVLRAQEMRAKLVVKATKVDGVYDKDPKKFPDAKKIPHLTFSEAMKMGLKVMDAEAFALCKKLGITVKVINFFEPGTLLKALKGEDVGSTVVPD
【０２２０】
配列番号２１：スルホロブス・アシドカルダリウス由来のＵＭＰキナーゼ
MKLTLKVSGKFFDEENSENLSLLRDVIIDLVNNGHRVAVVTGGGGTARRYISMGRKLNLNESHLDILGILVSRLNAQLLLFSLDNIAYPKVPESIEDFNERWASGKVVITGGFQPGQSTAGVAALVSEIINADYLVLATNVNGVYTKDPQKFVDAKLLPKLTVSELKTILEGSQSVNAGKYELLDPLAIKIVERSKIKVLVINFKDLNKLPNILKGNEILGSVVVPE
［実施例］
【実施例１】
【０２２１】
ＩｇＮＡＲ遺伝子構築物のクローニング
スルホロブス・アシドカルダリウスアデニル酸キナーゼ（ＳａｃＡＫ、Sulfolobus acidocaldarius adenylate kinase：GenBank：YP255258）コード配列を、高発現性大腸菌コドンバイアスを使用して合成し、NdeI（R0111S）及びSalI-HF（R3138S）を使用してｐＭＴＬ１０１５ベクター（GenBank：CS249842）にライゲーションした。その後、Gateway（商標）カセット（11828029、Invitrogen社、Paisley、UK）をXhoI（R0146S）部位にライゲーションした。ライゲーションの前にT4 DNAポリメラーゼ（M0203S）を使用してXhoI部位を予め平滑末端化した。生じた細胞質発現デスティネーションベクターをｐＴＤＣｎＳａｃＡＫ−ＤＥＳＴと名付けた。デスティネーションベクターをｃｃｄＢ生存化学的コンピテント細胞（11828029、Invitrogen社、Paisley、UK）にクローニングした。
【０２２２】
ＨＥＬ特異的ＶＮＡＲ（[E] GenBank：AAN75851）を、高発現性大腸菌コドンバイアス及び５’末端にあるBamHI部位を用いて合成し、次いで、市販のpENTR/D-TOPO（Invitrogen社）に挿入した。化学的コンピテントＴＯＰ１０細胞（C404006、Invitrogen社、Paisley、UK）を使用してエントリーベクターのクローニングを行った。
【０２２３】
デスティネーションベクター及びエントリーベクターの組換えを、LR clonase IIミックス（11791020、Invitrogen社、Paisley、UK）を製造者の説明書の通り使用して行った。
【０２２４】
ゲートウェイ組換え部位からなるゲートウェイリンカー領域をアミノ酸反復[GGGGS]3を有するフレキシブルリンカー（Ｆ３）と置き換えた。リンカー領域を切断されたBamHI制限部位及びSalI制限部位に対応する重複末端を有するオリゴヌクレオチド（Sigma-Genosys社、UK）として創出した。オリゴヌクレオチドを、従来のベクターの制限消化及びライゲーションによる挿入の前に９０℃でインキュベートすることによってアニーリングさせた。
【０２２５】
次いで、完成した発現ベクターを大腸菌株ＲＶ３０８に導入してそれを形質転換し、凍結保護ビーズストック（PL170、Microbank、Prolab Diagnostics社、Canada）中で保管した。
【０２２６】
構築物の合成及び組換えを、代替のリンカー領域の融合タンパク質への挿入と同様に配列決定（Beckman Coulter Genomics社、Takeley、UK）によって確認した。
【０２２７】
あるいは、単一ドメイン抗体及び／又は単一ドメイン抗体断片融合物は、融合構築物の組み立てに用いたカセットに基づく構築方法により、急速に生成することができる（図１）。ＳａｃＡＫの遺伝子操作されたバリアント又は異なる熱安定性キナーゼ（例えば、Ｔ．マリティマ（T. maritima）酢酸キナーゼ又はＵＭＰキナーゼ）を、NdeI−SalI断片として融合構築物に挿入して、例えば、酢酸キナーゼ−Ｆ３リンカー−単一ドメイン抗体融合物を生成することができる。同様に、個々の単一ドメイン抗体断片又はそのような断片のライブラリーを融合構築物にBamHI-XhoI断片としてクローニングすることができる。このカセット手法により、多数のクローニングステップの必要性又は組換えに基づくクローニング系（Gateway）で直面するいかなる困難も回避される。
【実施例２】
【０２２８】
大腸菌におけるＩｇＮＡＲ融合タンパク質の発現
改変ＴＢ培地（Modifid Terrific Broth）（T0918）中で大腸菌ＲＶ３０８株を使用して発現を実現させた。最初のシード（ＬＢ（Luria-Bertani）ブロス＋テトラサイクリン（T7660）１０μｇ／ｍｌ）をＬＢ寒天＋テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）プレートからの１つのコロニーで接種し、２００ｒｐｍ、３７℃で一晩成長させた。
【０２２９】
一晩成長させた後、最初のシードを改変ＴＢ培地フラスコ培養物（＋１０μｇ／ｍｌのTet）に１リットル当たり５ｍｌで接種し、２００ｒｐｍ、３７℃でＯＤ６００をモニターした。ＯＤ６００が４を超えたら、H6000Aローターを備えたRC3BP（Sorvall、UK）遠心分離機を使用して、４℃、３０００ｒｐｍで３０分遠心分離することによって細胞を収集した。
【０２３０】
次いで、生じた細胞ペーストをPBSに再懸濁させ、必要になるまで−８０℃で一定分量として保管した。
【実施例３】
【０２３１】
融合タンパク質の精製
２ｍＭのグルタチオン（G4251）を添加した高塩濃度の緩衝液（２０ｍＭのTrizma塩基（T6066）、０．９ＭのＮａＣｌ（S9888）、１０ｍＭのＭｇＣｌ（H8266）、ｐＨ８．０）中で細胞ペーストを均質化して細胞を破壊した。次いで、ホモジネートの可溶性画分を８０℃で２０分インキュベートして、非熱安定性タンパク質を全て沈殿させた。遠心分離した後、可溶性画分を、均質化するために細胞ペーストを再懸濁させるために使用したものと同じ高塩濃度の緩衝液中で平衡化させた５ｍｌのBlue Sepharose FF Hitrapカラム（GE Healthcare社、17-0413-01）にローディングした。２０ｍＭのTrizma塩基、０．９ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣＬ、ｐＨ８．０への１時間の勾配を用いてグルタチオンを除去した。次いで、２０ｍＭのTrizma塩基、０．９ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ、１０ｍＭのＡＴＰ（A3377）及びＡＭＰ（A1752）、ｐＨ８．０を使用して融合タンパク質を溶出させた。カラムを１分当たり１ｍｌで流し、画分を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析し、最終的な融合タンパク質産物を含有する画分をプールした。
【０２３２】
NuPage4〜12%BisTris15ウェルゲル（NP0323BOX、Invitrogen社、Paisley、UK）上で、NuPage MES SDS泳動バッファー（２０×）（NP0002、Invitrogen社、Paisley、UK）を用い、See Blueプラス２ラダー（LC5925、Invitrogen社、Paisley、UK）、オンゲル対照として２．５μｇの組換えＳａｃＡＫを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを行った。全ての試料を５μＭのDTT（D0632）の存在下で流した。ゲルを、Simply Blue Safe Stain（LC6065、Invitrogen社、Paisley、UK）を使用して発色させ、GelDocを使用して画像化した。
【実施例４】
【０２３３】
融合タンパク質活性の特徴付け
White F96 MicroWell（商標）Maxisorpプレート（436110、Nunc社、Denmark）を全てのアッセイに使用した。
【０２３４】
全てのアッセイを、BMG Labtech FLUOstar Omegaプレートリーダーにおいて同じ利得設定（２５５３）で読み取った。
【０２３５】
プレート間の変動性を排除するために、各プレートを、１リットル当たり５μＭｏｌから０．６２５μＭｏｌまで減らした一連のＡＴＰ希釈を用いて同様に設定し、これを用いて、ＲＬＵを、プレート間の変動性を受けないＡＴＰ単位に変換した。
【０２３６】
４．１：ＡＫ活性の決定
ウェルごとに、等モルのＳａｃＡＫ−Ｆ３−ＶＮＡＲ融合タンパク質（５０μｌ）又はＳａｃＡＫ（５０μｌ）を５０μｌのルシフェラーゼ試薬（Biothema ATP kit SL144-04、Biothema AB社、Sweden）＋１５μＭのＡＤＰ（Sigma A1752、５ｍｌのDEAE Sepharose FF HiTrapカラム（GE Healthcare社、17-5055-01）を使用してＡＴＰを枯渇させた）と一緒に加えた。プレートを１分間インキュベートし、１５秒の組み込み後にエンドポイントの読み取りとしてBMG Labtech FLUOstar Omegaにおいて２５５３利得で発光を読み取った。
【０２３７】
４．１：ＶＮＡＲの抗原結合活性の検出
機能的ＥＬＩＳＡを、プレートを追加的なＢＳＡ（A6003）対照細片（５０μｇ／ｍｌ）を伴う、PBS中に作製した、ウェル当たり１μｇから減少していくＨＥＬ（L6876）の段階希釈物でコーティングし、３７℃で１時間振とうすることによって試験した。プレートを１％のTween20（P1379）を含有するPBSで３回洗浄し、次いで、PBS中５％のＢＳＡに、３７℃で１時間振とうしてブロッキングした。プレートを１％のTween20を含有するPBSで３回洗浄した。融合タンパク質を１０μｇ／ｍｌでプレートのＨＥＬでコーティングした側面とＢＳＡでコーティングした側面の両方に３７℃で１時間振とうして結合させ、次いで、Tweenを含有するPBSで洗浄した。１５μＭのＡＤＰ（Sigma A1752、５ｍｌのDEAE Sepharose FF HiTrapカラム（GE Healthcare社、17-5055-01）を使用してＡＴＰを枯渇させた）を添加したルシフェラーゼ試薬（Biothema ATPキットSL144-04、Biothema AB社、Sweden）をプレートに加えた。プレートを１分間インキュベートし、１５秒の組み込み後、エンドポイントの読み取りとしてBMG Labtech FLUOstar Omegaにおいて２５５３利得で発光を相対発光量（ＲＬＵ）として読み取った。
【実施例５】
【０２３８】
安定性の実証
５．１熱安定性試験
プレートを１０μｇ／ｍｌのＨＥＬ（L6876）並びにＢＳＡ（A6003）対照をウェル当たり１００μｌで用い、３７℃で１時間振とうしてコーティングした。プレートをPBS＋Tween20（P1379）で３回洗浄し、次いで、PBS中５％のＢＳＡに、３７℃で１時間振とうしてブロッキングした。プレートをPBS＋Tween20で３回洗浄した。
【０２３９】
精製され、特徴付けられた融合物（１０μｇ／ｍｌ）を別々のチューブ内で、１００℃までの種々の温度で３０分間インキュベートした。
【０２４０】
次いで、一定分量（ウェル当たり１００μｌ）の熱的に処理した融合物をプレートに適用し、３７℃で１時間振とうしてインキュベートした。プレートをPBS＋Tween20で３回洗浄した。
【０２４１】
プレートを発色させ、上記の機能的ＥＬＩＳＡの通り読み取った。
【０２４２】
５．２  変性剤安定性試験
変性剤試験を上記の機能的ＥＬＩＳＡの通り実施した。ＳａｃＡＫ−Ｆ３−ＶＮＡＲの安定性を試験するために、一定分量（２００μｇ／ｍｌ）を、８Ｍの尿素までの種々の尿素濃度を用いて室温で１時間処理し、次いで、１０μｇ／ｍｌまで希釈した（最大尿素濃度を０．４Ｍにした）。次に、これらの一定分量を用いてプレートをプロ−ビングして、結合したＨＥＬの変性を防いだ。
【実施例６】
【０２４３】
ＶＨＨ遺伝子構築物のクローニング
スルホロブス・アシドカルダリウスアデニル酸キナーゼ（SacAK：GenBank：YP255258）構築物の生成については実施例１に記載の通りであった。
【０２４４】
本明細書に記載の他の熱安定性キナーゼ（配列番号１〜７）に対して同様の手法を使用した。
【０２４５】
簡単に述べると、熱安定性キナーゼ遺伝子を、大腸菌コドンバイアスを用いて再合成した、又は、コドン利用（codon usage）が許容可能な場合は、対象の遺伝子をゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。遺伝子構築物について配列を検証し、実施例１において詳述されている通りデスティネーションベクターにサブクローニングした。最終的な発現構築物についても配列を検証した。
【０２４６】
ＨＥＬ特異的ＶＨＨ断片（GenBank：1RJC_Acession 29 Oct 2010）を、高発現性大腸菌コドンバイアス及び５’末端にあるBamHI部位を用いて合成し、次いで、市販のpENTR/D-TOPO（Invitrogen社）に挿入した。化学的コンピテントＴＯＰ１０細胞（C404006、Invitrogen社、Paisley、UK）を使用してエントリーベクターのクローニングを行った。
【０２４７】
デスティネーションベクター及びエントリーベクターの組換えを、LR clonase II ミックス（11791020、Invitrogen社、Paisley、UK）を製造者の説明書の通り使用して行った。
【０２４８】
ゲートウェイ組換え部位からなるゲートウェイリンカー領域を、アミノ酸反復[GGGGS]3を有するフレキシブルリンカー（Ｆ３）と置き換えた。リンカー領域を切断されたBamHI制限部位及びSalI制限部位に対応する重複末端を有するオリゴヌクレオチド（Sigma-Genosys社、UK）として創出した。オリゴヌクレオチドを、従来のベクターの制限消化及びライゲーションによる挿入の前に９０℃でインキュベートすることによってアニーリングさせた。
【０２４９】
次いで、完成した発現ベクターを大腸菌株ＢＬ２１、ＢＬＲ、ＲＶ３０８又はＯｒｉｇａｍｉに導入してそれを形質転換し、凍結保護ビーズストック（PL170、Microbank、Prolab Diagnostics社、Canada）中で保管した。
【０２５０】
構築物の合成及び組換えを、代替のリンカー領域の融合タンパク質への挿入と同様に配列決定（Beckman Coulter Genomics社、Takeley、UK）によって確認した。
【実施例７】
【０２５１】
大腸菌におけるＶＨＨ融合タンパク質の発現
改変ＴＢ培地（T0918）又は代替の培地（ＬＢブロス又は最少培地）中で大腸菌ＲＶ３０８株を使用して発現を実現させた。最初のシード（ＬＢブロス＋テトラサイクリン（T7660）１０μｇ／ｍｌ）をＬＢ寒天＋テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）プレートからの１つのコロニーで接種し、２００ｒｐｍ、３７℃で一晩成長させた。他の大腸菌株からの発現の、生じた発現レベル及びその後の下流の精製に対する影響は限られていた。
【０２５２】
一晩成長させた後、最初のシードを改変ＴＢ培地フラスコ培養物（＋１０μｇ／ｍｌのTet）に１リットル当たり５ｍｌで接種し、２００ｒｐｍ、３７℃でＯＤ６００をモニターした。４を超えるＯＤ６００が実現されたら、H6000Aローターを備えたRC3BP（Sorvall社、UK）遠心分離機を使用して、４℃、３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することによって細胞を収集した。
【０２５３】
次いで、生じた細胞ペーストをPBSに再懸濁させ、必要になるまで−８０℃で一定分量として保管した。
【実施例８】
【０２５４】
Ｓａｃ−Ｆ３−ＶＨ融合タンパク質の精製
ラクダ科の動物の融合タンパク質を基本的に上記の通り（実施例３）精製した。具体的には、
２ｍＭのグルタチオン（G4251）を添加した高塩濃度の緩衝液（２０ｍＭのTrizma-Base、０．９ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ、ｐＨ８．０）中で細胞ペーストを超音波処理によって溶解させて細胞を破壊した。次いで、ホモジネートの可溶性画分を８０℃で３０分間インキュベートして非熱安定性タンパク質を全て沈殿させた。不溶性のタンパク質を遠心分離によって除去し、可溶性画分を５ｍｌのBlue Sepharose FF Hitrapカラムにローディングした。グルタチオンを欠く同じ緩衝液中への１時間の勾配を用いてグルタチオンを除去した。次いで、２０ｍＭのTrizma-Base、０．９ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ、１０ｍＭのＡＴＰ（A3377）及びＡＭＰ（A1752）、ｐＨ８．０を使用して融合タンパク質を溶出させた。カラムを１分当たり１ｍｌで流し、画分を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析し、最終的な融合タンパク質産物を含有する画分をプールした。
【０２５５】
NuPage4〜12%BisTris12ウェルゲルにおいて、NuPage MES SDS Running Bufferを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを行った。Simply Blue Safe Stainを用いてゲルを展開した。
【実施例９】
【０２５６】
ウイルス病原体；例えば、エボラに対する検出試薬
検出試薬を基本的に実施例１〜３（サメ抗体）又は実施例６〜８（ラクダ科の動物の抗体）に記載の通り生成する。単一ドメイン抗体をBamHI-XhoI断片として上記のｐＭＴＬ発現ベクターなどの発現ベクターに、Ｓａｃアデニル酸キナーゼ遺伝子の下流にクローニングする。
【０２５７】
エボラ特異的サメＩｇＮＡＲドメインなどの適切な単一ドメイン抗体断片（「Isolation and characterisation of Ebolavirus-specific recombinant antibody fragments from murine and shark immune libraries. 2011 Goodchild SA、Dooley H、Schoepp RJ、Flajnik M、Lonsdale SG. Mol Immunol. 48:2027-37）を用いて、特異的な試薬を生成することができる。
【０２５８】
ｓａｃ−Ｆ３−ＩｇＮＡＲ試薬の発現及び精製は上記の通り実現することができる。熱安定性及び標的抗原に対する特異性は、基本的に実施例４及び実施例５に概説されている通りに決定される。
【０２５９】
上記試薬は、ＥＬＩＳＡなどの標準の検出アッセイにおいて使用することができる。簡単に述べると、捕捉抗体を固体支持体にコーティングし、５％スキムミルクなどのブロッキング剤（３％ＢＳＡ、５％ゼラチン、又は０．１％のTween20をスキムミルクと併せて又はその代わりに使用することができる）を添加することによって残っている結合部位をブロッキングする。適切な臨床試料、この場合は清澄化された全血又は血清を、捕捉抗体をコーティングした固体支持体に適用し、標的抗原（ウイルス）を結合させる。固体支持体を洗浄すること及び／又は適用された臨床試料から選択的に除去することによって結合していない材料を除去する。
【０２６０】
上記試薬は、磁気ビーズに基づく固体支持体アッセイにおいても使用することができる。アッセイは基本的に、捕捉抗体を磁気ビーズにコーティングすること以外は上記の通り実施する。次いで、磁石に誘引することによって臨床試料マトリックスから取り出すことができるビーズ上で抗原の捕捉及び検出反応を行う。ビーズを生理食塩水溶液、例えば、０．１％のTween20を含有するリン酸緩衝生理食塩水と混合することによって急速な洗浄も実現することができる。
【実施例１０】
【０２６１】
細菌性病原体に対する検出試薬
検出試薬を基本的に実施例６〜８に記載の通り生成する。単一ドメイン抗体断片、例えば、ラクダ科の動物の抗体のライブラリースクリーニングに由来するものなどが適している（例えば、「Rugged single domain antibody detection elements for Bacillus anthracis spores and vegetative cells. Walper SA、Anderson GP、Brozozog Lee PA、Glaven RH、Liu JL、Bernstein RD、Zabetakis D、Johnson L、Czarnecki JM、Goldman ER. PLoS One. 2012;7(3):e32801.Epub 2012 Mar 6」又は「Evaluation of a nanobody phage display library constructed from a Brucella-immunised camel. Abbady AQ, Al-Mariri A, Zarkawi M, Al-Assad A, Muyldermans S. Vet Immunol Immunopathol. 2011 Jul 15;142(1-2):49-56.Epub 2011 Apr 14」）。抗体をサーモトガ・マリティマ酢酸キナーゼのＣ末端に融合させて、融合タンパク質Ｔｍａ酢酸キナーゼ−Ｆ３リンカー−ＶＨを生成する。融合タンパク質を大腸菌株ＲＶ３０８又はＢＬ２１において発現させ、細胞溶解物を８０℃で３０分加熱処理することによって酵素を精製する。場合によって、融合タンパク質を色素−リガンドカラム（例えば、Blue Sepharose）に結合させることによってさらに精製することができる。
【０２６２】
次いで、試薬を、基本的に実施例９に記載の通り、ＥＬＩＳＡ形式、又は磁気ビーズ上での固相結合アッセイにおいて使用することができる。酢酸キナーゼ活性は、高度に精製されたＡＤＰ（最大１０ｍＭ）及びアセチルリン酸（最大１００ｍＭ）を使用して、ＡＴＰが生成される反応で検出することができる。ＡＴＰは、ルシフェリン／ルシフェラーゼを使用した生物発光による検出を含めた種々の手段によって検出することができる。
【０２６３】
同様の手法をとって、細菌性病原体の産物、特に、病原性に密接に関連づけることができるタンパク質毒素を検出することができる。生成し、そのような構築物に使用することができる抗体の例としては、「Isolation of a highly thermal stable lama single domain antibody specific for Staphylococcus aureus enterotoxin B. Graef RR、Anderson GP、Doyle KA、Zabetakis D、Sutton FN、Liu JL、Serrano-Gonzalez J, Goldman ER, Cooper LA. BMC Biotechnol. 2011 Sep 21;11:86」及び「Camelid single domain antibodies(VHHs) as neuronal cell intrabody binding agents and inhibitors of Clostridium botulinum neurotoxin(BoNT) proteases. Tremblay JM, Kuo CL, Abeijon C, Sepulveda J, Oyler G, Hu X, Jin MM, Shoemaker CB. Toxicon. 2010 Nov;56(6):990-8. Epub 2010 Jul 14」及び「Isolation and Characterization of Clostridium difficile Toxin-Specific Single-Domain Antibodies. Hussack G, Arbabi-Ghahroudi M, Mackenzie CR, Tanha J. Methods Mol Biol. 2012;911:211-39」が挙げられる。
【実施例１１】
【０２６４】
メタロプロテアーゼの検出及び治療剤
単一ドメイン抗体、例えば、サメ及びラクダ科の動物由来のものなどの有意な利点は、深い疎水性のくぼみを特徴とする酵素の活性部位に結合することができることである。抗体は、この目的のために、ファージディスプレイベクター又は等価物において、疎水性に結合した抗体及び／又は基質の競合によって溶出された抗体が好都合であるように結合及び溶出条件を変更することによって単一ドメイン抗体ライブラリーから選択することができる。この目的のために適したそのような抗体の例は、「Molecular imprint of enzyme active site by camel nanobodies: rapid and efficient approach to produce abzymes with alliinase activity. Li JW, Xia L, Su Y, Liu H, Xia X, Lu Q, Yang C, Reheman K. J Biol Chem. 2012 Apr 20;287(17):13713-21.Epub 2012 Feb 28」に記載されている。
【０２６５】
そのような単一ドメイン抗体は、本明細書において同定される熱安定性キナーゼ、例えば、サーモトガ・マリティマ由来のウリジル酸（ＵＭＰ）キナーゼなどのうちの１又は２以上との融合物として発現させることができる。融合物は、抗体ドメインがキナーゼのＮ末端側にあり、融合タンパク質、ＩｇＮＡＲ−ヘリックスリンカー−Ｔｍａ  ＵＭＰキナーゼが生成されるように構築する。上記試薬は、高温精製ステップ（８０℃で３０分間）、その後のBlue Sepharose上での親和性捕捉ステップを伴って、基本的に実施例１〜３に記載の通りクローニングし、発現させ、精製する。場合によって、他の色素−リガンドカラムを使用して融合タンパク質を精製することもできる。
【０２６６】
上記試薬は、検出又は診断アッセイにおいて、例えば、ベータ−ラクタマーゼ抗生物質に対する高レベルの抗生物質耐性を伴うニューデリー・メタロプロテアーゼに対して使用することができる。アッセイは、臨床試料又は細菌性病原体の培養物から標的を濃縮するために別々の捕捉抗体を使用して上記の固相結合アッセイと同様に形式化することができる。ＵＭＰキナーゼ活性は、ほぼ中性のｐＨの補助基質ＡＤＰ（最大１００ｍＭ）及びＵＤＰ（最大１００ｍＭ）を伴う、ＡＴＰが生成される反応において測定することができる。生成されたＡＴＰは、ルシフェリン−ルシフェラーゼを用いた生物発光による検出を含めたいくつもの手段によって検出することができる。
【実施例１２】
【０２６７】
多量体熱安定性キナーゼ上の単一ドメイン抗体の多価提示
単一ドメイン抗体の多量体提示を、同じ大腸菌細胞において２又は３以上の融合構築物を同時発現させることによって実現することができる。優先的に、組換え欠陥大腸菌株を使用して、発現の間に遺伝子構築物が再編成される機会を最小限にする。２つの融合タンパク質構築物を同じプラスミドから同じプロモーター又は異なるプロモーターを使用して発現させることができる。あるいは、２つの異なる適合性プラスミドを、それぞれから発現される１つの遺伝子構築物に使用することができる。異なる融合タンパク質の比率は、高コピー数プラスミド若しくは低コピー数プラスミド及び／又は高発現性プロモーター、中発現性プロモーター、若しくは低発現性プロモーターを使用することによって変動させることができる。発現された多量体熱安定性キナーゼはいずれも種々の異なる多量体抗体種を有する。
【０２６８】
２つの構築物は、異なる単一ドメイン抗体がサーモトガ・マリティマ由来の熱安定性ＵＭＰキナーゼに付き、単一ドメイン抗体の六量体提示が可能になるように生成する。２つの構築物は、単一のｐＭＴＬベクターから、基本的に実施例１に記載の通り、各遺伝子構築物をそれ自身のプロモーターによって駆動させて、発現させる。構築物は、融合物がＴｍａ  ＵＭＰキナーゼ−Ｆ３リンカー−ＩｇＮＡＲ１及びＴｍａ  ＵＭＰキナーゼ−ヘリックスリンカー−ＩｇＮＡＲ２になるように生成する。構築物は、大腸菌ＲＶ３０８（リコンビナーゼ−陰性）において同様のレベルで発現させ、また、基本的に上の実施例１〜３に記載の通り発現させ、精製することができる。六量体キナーゼを提示している抗体の集団は、ＩｇＮＡＲ１融合物とＩｇＮＡＲ２融合物が異なる比率で発現されている構築物を含む。場合によって、ＩｇＮＡＲドメインのそれぞれに対するリガンドをローディングしたアフィニティーカラムを使用して構築物をさらに精製して、全ての六量体が各抗体ドメインの少なくとも１つを含有することを確実にすることができる。
【０２６９】
特定の例は、Ｃ．ディフィシレの毒素Ａと毒素Ｂの両方の異なるエピトープを認識する単一ドメイン抗体の六量体提示であり、したがって、構築物はＴｍａ  ＵＭＰキナーゼ−Ｆ３リンカー−ＩｇＮＡＲ；毒素Ａ及びＴｍａ  ＵＭＰキナーゼ−Ｆ３リンカー−ＩｇＮＡＲ；毒素Ｂである。同等のラクダ科の動物ドメイン、例えば、Hussackの論文に記載のものなど（実施例１０）も、この種類の試薬を開発するために有益である。
【０２７０】
本明細書に記載の他の多量体熱安定性キナーゼのいずれを使用しても同様の構築物を生成することができ、したがって、単一ドメイン抗体の二価提示、三価提示、四価提示、五価提示、六価提示、又は八価提示を実現することができる。
【実施例１３】
【０２７１】
検出及び診断におけるモザイク（多価）抗体提示試薬の適用。
ｉ）モザイク試薬を使用した単純な捕捉アッセイ
多量体の「モザイク」抗体−熱安定性キナーゼ検出試薬は、種々のアッセイ形式、例えば、上の実施例に記載のものなどのいずれにおいても、例えば、細菌、毒素、ウイルス病原体、特定の酵素又は他の分析物を検出するために使用することができる。これらは、１又は２以上の抗体ドメインの多数のコピーを有することによって結合活性効果が引き起こされることにより、高感度及び／又は急速な検出システムのための非常に有用な抗体検出試薬になる。抗体試薬を同時発現させ、酵素（熱安定性キナーゼ）を検出することができることによっても、これらを新しい試薬を急速に生成するために使用することが単純且つ容易になる。
【０２７２】
好ましい適用は、単一のモノクローナル抗体の使用が可能にならない恐れがある有意な抗原性の多様性が存在する場合に、異なる単一ドメイン抗体により、単一の試薬を使用して標的種を検出することが可能になる場合の適用である。例えば、ノロウイルス及びインフルエンザなどのウイルス病原体は、抗原多様性を急速にシフトさせ、モノクローナル抗体の結合から逃れることができる。異なる抗原を認識する２又は３以上の抗体を有することにより、このリスクは最小限になる。同様に、２つの異なる毒素が、個別に又は組み合わさって疾患を媒介する可能性がある疾患を、本明細書に記載の試薬を使用して有益に検出することができる。毒素Ｂが毒素Ａを伴って又は伴わずに疾患を媒介する可能性があり、どちらの毒素も危険因子として認識されるクロストリジウム・ディフィシレの場合がそうである。多価検出試薬の利点の他の多くの例は当業者に公知であり、これは、多くの場合、ポリクローナル抗体試薬を使用することの利点のうちの１つとして挙げられる。しかし、これらは作製に時間がかかり、品質が変動する傾向があり、本明細書に記載の高度に定義された、酵素でタグ付けした多価の試薬の利点を有さない。
【０２７３】
そのようなアッセイの使用の具体的な例：
多価Ｔｍａ  ＵＭＰキナーゼを、それぞれＣ．ディフィシレの毒素Ａ及び毒素Ｂ上のエピトープを認識する２つの異なるＩｇＮＡＲドメインを用いて実施例１２に記載の通り生成した。疑いのある臨床患者からの便抽出物を、標準の方法を用いて処理し、Ｃ．ディフィシレの毒素Ａ及び毒素Ｂの両方を認識する捕捉試薬（ポリクローナル抗体）でコーティングしたＥＬＩＳＡアッセイに適用した。プレートをインキュベートし、洗浄することによって結合していない材料を除去した。ＵＭＰキナーゼ検出試薬を加え、プレートを３７℃で３０分間インキュベートして、ＩｇＮＡＲドメインを捕捉された毒素分子に結合させた。プレートを再度洗浄して結合していない検出試薬を除去し、ＡＤＰ、ＵＤＰルシフェリン及びルシフェラーゼを酢酸マグネシウム緩衝液に同時に添加することによってＵＭＰキナーゼ活性を測定した。このアッセイは、毒素Ｂを発現している臨床分離株並びに毒素Ａ及び毒素Ｂを発現している臨床分離株を急速検出するために使用することができる。このアッセイにより、毒素Ａのみの臨床分離株を検出することもできる。
【０２７４】
別の例は、ノロウイルスのゲノグループＧＩ及びＧIIを認識するモザイク検出試薬の使用である。それぞれＧＩ及びＧIIに特異的な別々の単一ドメイン抗体を発現させることによって多価の試薬を生成し、スルホロブス・アシドカルダリウス由来の三量体熱安定性アデニル酸キナーゼと融合させる。試薬の発現及び精製並びにその後のアッセイにおける使用は上記の通りである。
【０２７５】
ii）追加的な検出試薬の動員
検出反応の感度を増大させるために、生成する融合タンパク質のうちの１つを追加的な熱安定性キナーゼに対して特異的なものにする。例えば、炭疽菌の胞子を検出するためのアッセイでは、２つの構築物；例えば、Ｔｍａ  ＵＭＰキナーゼ−Ｆ３−リンカー−炭疽菌の胞子に特異的なＶＨドメイン、及びＴｍａ  ＵＭＰキナーゼ−Ｆ３−リンカー−Ｔｍａ酢酸キナーゼに対する単一ドメイン抗体を使用して多価検出試薬を生成する。遺伝子を同じプラスミドから発現させるが、融合タンパク質が炭疽菌の胞子に特異的な融合物１に対して酢酸キナーゼ特異的な融合物２の比率で発現されるように異なる調節されたプロモーターを使用する。これにより、六量体ＵＭＰキナーゼ融合物の、炭疽菌の胞子に特異的な単一ドメイン抗体２及び酢酸キナーゼ単一ドメイン抗体４に偏った分布が生じる。基質であるＡＤＰ、ＵＤＰ、アセチルリン酸、その後にルシフェリン及びルシフェラーゼを使用するアッセイにおいて使用する場合、これにより、ＵＭＰキナーゼ試薬単独と比較してシグナル強度が８倍に至る（ＡＴＰの産生を触媒することができる追加的な酢酸キナーゼ二量体が４つ動員されたことに基づいて）。
【０２７６】
同様の手法を用いて、異なる種類の診断シグナルを生成することができる。例えば、（ｉ）三量体Ｓａｃ−アデニル酸キナーゼと（ii）クラミジアの抗原に対する抗体が融合した融合タンパク質をフルオロフォアに特異的な抗体と同時発現させることにより、上記の通り標準のＡＴＰ生成アッセイにおける急速検出、並びに細胞内の病原体の運命を決定する（すなわち、感染が確立したかどうかを示す）ための組織切片の染色が可能になる。同様の手法を、全身系において、又は組織学的染色によって画像化することができるトレーサー分子に対する単一ドメイン抗体と共に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年2月25日(2013.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）多量体熱安定性キナーゼと、
（ii）単一ドメイン抗体又は単一ドメイン抗体断片と
を含む単鎖融合タンパク質。
【請求項２】
多量体熱安定性キナーゼが、三量体熱安定性キナーゼ、四量体熱安定性キナーゼ、六量体熱安定性キナーゼ又は八量体熱安定性キナーゼである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
多量体熱安定性キナーゼが、アデニル酸キナーゼ、酢酸キナーゼ、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、又は酪酸キナーゼである、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
多量体熱安定性キナーゼが三量体アデニル酸キナーゼである、請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項５】
多量体熱安定性キナーゼがスルホロブス属の種、例えば、Ｓ．アシドカルダリウスなど由来である、請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項６】
多量体熱安定性キナーゼがＳ．アシドカルダリウス由来の三量体アデニル酸キナーゼである、請求項１〜５のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項７】
単一ドメイン抗体がサメ新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）又はその断片である、或いは単一ドメイン抗体がラクダ科の動物の抗体又はその断片である、請求項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項９】
請求項８に記載のポリヌクレオチド配列を含むプラスミド。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれかに記載の融合タンパク質を産生する方法であって、
（ｉ）請求項８に記載のポリヌクレオチド配列又は請求項９に記載のプラスミドを大腸菌などの宿主細胞において発現させるステップと、
（ii）発現された融合タンパク質を前記宿主細胞の細胞質から精製するステップと
を含む方法。
【請求項１１】
単一ドメイン抗体又は単一ドメイン抗体断片を調製する方法であって、
（ｉ）大腸菌などの宿主細胞において単一ドメイン抗体又は抗体断片を多量体熱安定性キナーゼとの単鎖融合タンパク質として発現させるステップと、
（ii）前記融合タンパク質を前記宿主細胞の細胞質から精製するステップと
を含む方法。
【請求項１２】
融合タンパク質が請求項１〜７のいずれかに記載されているものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれかに記載の２又は３以上の融合タンパク質を含み、熱安定性キナーゼが多量体熱安定性キナーゼである、多量体融合タンパク質複合体。
【請求項１４】
２又は３以上の融合タンパク質の、熱安定性キナーゼ単量体と融合した単一ドメイン抗体又は抗体断片が、同じである又は異なる、請求項１３に記載の多量体融合タンパク質複合体。
【請求項１５】
試料上又は試料中の分析物を検出するためのレポーター分子であって、請求項１〜７のいずれかに記載の融合タンパク質、或いは請求項１３又は１４に記載の多量体融合タンパク質複合体を含むレポーター分子。
【請求項１６】
（ｉ）請求項１〜７のいずれかに記載の融合タンパク質、請求項１３又は１４に記載の多量体融合タンパク質複合体、又は請求項１５に記載のレポーター分子と、
（ii）多量体熱安定性キナーゼの基質と
を含む検出キット。
【請求項１７】
試料上又は試料中の分析物を検出するインビトロでの方法であって、
（ｉ）前記試料を請求項１５に記載のレポーター分子と接触させるステップであって、単一ドメイン抗体又は抗体断片が前記分析物と結合して抗体−分析物複合体が形成されるステップと、
（ii）前記抗体−分析物複合体を、熱安定性キナーゼのキナーゼ活性を検出することなどによって検出するステップと
を含む方法。
【国際調査報告】
2014531206.tif 000012
2014531206.tif 000013