(57)【要約】  酵母の構成的なＴＤＨ３転写プロモーターの制御下にあるヒトＨ−フェリチンをコードする核酸配列を含む組換え酵母、ＴＤＨ３部位で酵母染色体に組み込まれたヒトＨ−フェリチンをコードする核酸配列を含む組換え酵母、酵母の構成的なＴＤＨ３転写プロモーターの制御下でヒトＨ−フェリチンを発現する、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）用のＨ−フェリチン発現カセット、この組換え酵母を含む組成物、及び、治療における、例えば鉄障害の処置におけるそれらの使用を記載する。
2014516535.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母の構成的なＴＤＨ３転写プロモーターの制御下にあるヒトＨ−フェリチンをコードする核酸配列を含む組換え酵母。
【請求項２】
ＴＤＨ３部位で酵母染色体に組み込まれたヒトＨ−フェリチンをコードする核酸配列を含む組換え酵母。
【請求項３】
酵母の構成的なＴＤＨ３転写プロモーターの制御下でヒトＨ−フェリチンを発現する、出芽酵母用のＨ−フェリチン発現カセット。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の組換え酵母を含む組成物。
【請求項５】
医薬組成物、医療食品又は栄養補助食品である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
１種又は複数種のさらなる活性化合物を含む、請求項４又は５に記載の組成物。
【請求項７】
経口投与用である、請求項４から６までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
治療で使用するための、請求項１若しくは２に記載の組換え酵母、又は請求項４から８までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
治療における、請求項１若しくは２に記載の組換え酵母又は請求項４から８までのいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１０】
疾患又は障害の処置方法であって、それを必要とする患者に、請求項１若しくは２に記載の組換え酵母又は請求項４から８までのいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む上記方法。
【請求項１１】
疾患又は障害の処置のための医薬の製造における、請求項１若しくは２に記載の組換え酵母又は請求項４から８までのいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１２】
治療が鉄障害の処置を含む、請求項８に記載の組換え酵母若しくは組成物、又は請求項９に記載の使用。
【請求項１３】
鉄障害が、（ｉ）脳の鉄欠乏症に関係する鉄障害、（ｉｉ）鉄欠乏性貧血、（ｉｉｉ）神経障害若しくは神経変性障害、（ｉｖ）パーキンソン病、アルツハイマー病、うつ病、不眠症、多発性硬化症、不穏下肢症候群、注意欠陥障害若しくは筋萎縮性側索硬化症、（ｖ）生後発達期間中の鉄欠乏症に付随する神経性、認知性、行動性若しくは運動性の障害、（ｖｉ）鉄過剰障害又は（ｖｉｉ）サラセミア若しくはヘモクロマトーシスから選択される、請求項１２に記載の組換え酵母、組成物又は使用。
【請求項１４】
疾患又は障害が鉄障害である、請求項１０に記載の方法又は請求項１１に記載の使用。
【請求項１５】
鉄障害が、（ｉ）脳の鉄欠乏症に関係する鉄障害、（ｉｉ）鉄欠乏性貧血、（ｉｉｉ）神経障害若しくは神経変性障害、（ｉｖ）パーキンソン病、アルツハイマー病、うつ病、不眠症、多発性硬化症、不穏下肢症候群、注意欠陥障害若しくは筋萎縮性側索硬化症、（ｖ）生後発達期間中の鉄欠乏症に付随する神経性、認知性、行動性若しくは運動性の障害、（ｖｉ）鉄過剰障害又は（ｖｉｉ）サラセミア若しくはヘモクロマトーシスから選択される、請求項１４に記載の方法又は使用。
【請求項１６】
患者の鉄障害の処置方法であって、それを必要とする患者に治療有効量のフェリチン−鉄複合体を投与することを含む上記方法。
【請求項１７】
フェリチン−鉄複合体がＨ−フェリチンを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｈ−フェリチンが哺乳動物のＨ−フェリチンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物のＨ−フェリチンがヒトＨ−フェリチン又はそのホモログである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ホモログがヒトＨ−フェリチンと少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｈ−フェリチンが組換えＨ−フェリチンである、請求項１７から２０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
組換えＨ−フェリチンが酵母、細菌又はバキュロウイルス中で産生される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
鉄障害が鉄欠乏性貧血である、請求項１６から２２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
鉄障害が脳の鉄欠乏症に関係している、請求項１６から２２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
鉄障害が神経障害又は神経変性障害である、請求項１６から２２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
鉄障害が、パーキンソン病、アルツハイマー病、うつ病、不眠症、多発性硬化症、不穏下肢症候群、注意欠陥障害及び筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
鉄障害が、生後発達期間中の鉄欠乏症に付随する神経性、認知性、行動性又は運動性の障害を含む、請求項１６から２２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
鉄障害が鉄過剰障害である、請求項１６から２２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
マルチサブユニットフェリチン複合体が１００％未満の鉄結合能力である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
マルチサブユニットフェリチン複合体が哺乳動物のＨ−フェリチン又はそのホモログを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
鉄障害がサラセミア及びヘモクロマトーシスからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
輸血液でフェリチン−鉄複合体又はアポフェリチンが患者に投与される、請求項２８から３１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
治療有効量の鉄を脳に送達するための方法であって、フェリチン−鉄複合体を患者に投与することを含み、これによって治療有効量の鉄が血液脳関門を越えて輸送され脳に送達される上記方法。
【請求項３４】
フェリチン−鉄複合体がターゲッティング部分をさらに含む、請求項１６から３３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ターゲッティング部分が、抗体、アプタマー、レセプター、リガンド及びそれらの結合断片からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ターゲッティング部分が脳特異的又は血液脳関門特異的なマーカーを認識する、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
ターゲッティング部分としてＨ−フェリチンを用いるための方法であって、Ｈ−フェリチンをリポソームに付着させることを含み、これによってリポソームが脳にターゲティングされる上記方法。
【請求項３８】
酵母染色体に組み込まれたヒトＨ−フェリチンをコードする核酸配列を含む組換え酵母。
【請求項３９】
ヒトＨ−フェリチンをコードする核酸配列がＴＤＨ３部位で酵母染色体に組み込まれている、請求項３８に記載の組換え酵母。
【請求項４０】
請求項３８に記載の組換え酵母を含む、患者の鉄障害を経口的に処置するための組成物。
【請求項４１】
請求項３９に記載の組換え酵母を含む、患者の鉄障害を経口的に処置するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、組換え酵母の新規な系統、この酵母を含む組成物、及び鉄欠乏障害を処置するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
鉄は、血流全体にわたって酸素を運搬するのに必要とされるだけでなく、酸化的呼吸に必要な酵素の重要な構成要素でもある、必須栄養素である。鉄欠乏は、世界中で最も一般的な栄養素欠乏であり、２歳未満の小児の２５％に見られる（ＤｅＭａｅｙｅｒ，Ｅ．ａｎｄ  Ａｄｉｅｌｓ−Ｔｅｇｍａｎ，Ｍ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔａｔ．Ｑ．３８：３０２−３１６，１９８５；Ｂｅａｒｄ，Ｊ．ａｎｄ  Ｓｔｏｌｔｚｆｕｓ，Ｒ．，Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３１：５６３Ｓ−７０３Ｓ，２０００）。慢性の重篤な小児期鉄欠乏症の神経学的後遺症としては、学業不振、認知能力の低下及び行動に関する問題が挙げられ（Ｂｅａｒｄ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．２３：４１−５８，２００３；Ｌｏｚｏｆｆ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｔｒ．Ｒｅｖ．６４：Ｓ３４−Ｓ４３，２００６）、それらの多くは食事的に栄養補給した後も続く（Ｆｅｌｔ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｅｈａｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１７１：２６１−２７０；Ｌｏｚｏｆｆ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｔｒ．Ｒｅｖ．６４：Ｓ３４−Ｓ４３，２００６）。脳はあらゆる器官の中で酸化的代謝率が最も高く、比較的多量の鉄を必要とする。生後初期発達中の食事性の鉄欠乏によって精神障害と重篤な運動障害の両方が引き起こされる恐れがあり、これは成人期になっても続く可能性がある。特に重要な成長期中において、髄鞘形成過程は鉄の利用能に特に依存していると考えられている（例えば、Ｈｕｌｅｔ，Ｓ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７２：８６８−８７４，１９９９を参照されたい）。
【０００３】
多数の鉄栄養補助食品が開発されているが、それらは、鉄が吸収されにくいため、又は栄養補助食品が一定レベルの鉄を生じるのは環境条件次第であるため、効果が限られている。先進国の標準処置では、３２５ｍｇの硫酸第一鉄を１日３回摂取する。この形態では鉄が吸収されにくいので、こうした非常に高い用量の鉄が必要となる。しかし、こうした高い投薬レジメンによって胃腸不快感及び高い服薬不履行率が生じるため、鉄欠乏障害を処置するための、より効果があり費用効率が高い経口の鉄栄養補助食品が依然として必要とされている。
【０００４】
従来、トランスフェリンは細胞性鉄送達の主要な機構であると考えられており、トランスフェリン媒介性輸送系が血液脳関門で同定されている（Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ  Ｗ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：１６２−１６３，１９８４；Ｆｉｓｈｍａｎ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．１８：２９９−３０４，１９８７）。しかし、低トランスフェリン血症マウスの実験から、トランスフェリン非依存性の脳への鉄送達が示唆されており（Ｍａｌｅｃｋｉ  Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１７０：１１２−１１８，１９９９）、これにはフェリチンが関与している可能性がある。
【０００５】
フェリチンは、多くの原核生物及び真核生物の主要な細胞内鉄貯蔵タンパク質であり、２４のポリペプチドサブユニットを含む巨大（ほぼ４８０ｋＤａ）なマルチサブユニット複合体である。この鉄貯蔵複合体は、血清中に高濃度で見つかり、４，５００原子もの数の鉄イオン（Ｆｅ３＋）を含水酸化第二鉄コア内に含むことができる。哺乳動物では、２つの別々のサブユニットクラス、すなわち分子量がそれぞれ約２１ｋＤａ及び１９ｋＤａである重型（Ｈ）及び軽型（Ｌ）があり、それらは約５４％の配列同一性を有する。Ｈ及びＬサブユニットは異なる機能を有すると考えられる。すなわち、Ｌサブユニットは鉄コアの安定性を高めるのに対して、Ｈサブユニットは第一鉄の急速な取り込みに必要であると考えられるフェロキシダーゼ活性を有する。Ｈに富むフェリチンは、局所的なイオン濃度の急速な変化を受ける組織内に局在している。例えばＨサブユニットの発現は、分化、発達、増殖中の細胞及び代謝ストレスを受ける細胞で、Ｌサブユニットに比べて優先的に増大する。
【０００６】
脳微小血管系を構成する隣接した内皮細胞を結び付ける高度に発達した密着結合のため、脳は、鉄を獲得するために高度な課題を課す。こうした結合は、分子が脳へ傍細胞流動するのを防ぐ。生成した血液脳関門は、血中を循環する有害の恐れがある物質から脳を保護するのに非常に有効な機構である。しかし、こうした遮断の結果、特異的な輸送機構が、正常な脳機能に必要とされる鉄などの多くの栄養物質用に設けられなければならない。さらに、血液試料のヘモグロビン及びヘマトクリットのレベルを測定する従来の方法は、鉄が血液脳関門を通過しているかどうかについて対処しておらず、脳の鉄濃度のいかなる指標も提供しない（Ｂｅａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．７９：２５４−２６１，２００５；Ｍａｌｅｃｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５６：１１３−１２２，１９９９）。
【０００７】
Ｈ−フェリチンは鉄欠乏性ラットへ鉄を供給することが示されているが、こうした研究においてＨ−フェリチンを与えた動物でのヘモグロビン及びヘマトクリットレベルの回復は、現在の標準処置であるＦｅＳＯ４を与えた動物の場合とたいして変わらなかった（Ｃｈａｎｇ，Ｙ−Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ２１：５２０−５２４，２００５）。したがって、鉄欠乏障害を処置するための改善法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様によれば、酵母の構成的なＴＤＨ３転写プロモーターの制御下にあるヒトＨ−フェリチンをコードする核酸配列を含む組換え酵母が提供される。
【０００９】
本発明の別の態様によれば、ＴＤＨ３部位で酵母染色体に組み込まれたヒトＨ−フェリチンをコードする核酸配列を含む組換え酵母が提供される。
【００１０】
本発明のさらなる態様によれば、酵母の構成的なＴＤＨ３転写プロモーターの制御下でヒトＨ−フェリチンを発現する出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のためのＨ−フェリチン発現カセットが提供される。
【００１１】
好ましくは、発現カセットは、ヒトＨ−フェリチンをコードするオープンリーディングフレームを含む。
【００１２】
好ましくは、発現カセットは転写ターミネーター、好ましくは酵母ＣＹＣ１遺伝子由来の転写ターミネーターを含む。
【００１３】
好ましくは、発現カセットは１つ又は複数のｌｏｘＰ部位、好ましくは２つのｌｏｘＰ部位を含む。
【００１４】
好ましくは、発現カセットは選抜マーカー、好ましくはＵＲＡ３を含む。
【００１５】
本発明の別の態様によれば、本発明の組換え酵母を含む組成物が提供される。
【００１６】
好ましくは、組成物は医薬組成物である。
【００１７】
好ましくは、組成物は医療食品である。
【００１８】
好ましくは、組成物は栄養補助食品である。
【００１９】
好ましくは、本発明の組成物は１種又は複数種のさらなる活性化合物を含む。好ましくは、１種又は複数種のさらなる活性化合物は、例えば本明細書に記載の組成物とともに送達するためのさらなる治療用化合物の形態にある、治療的に活性な化合物である。
【００２０】
好ましくは、組成物は経口投与用である。
【００２１】
好ましくは、組成物は、輸血液中、鼻腔用スプレー中又は液体での摂取を介して患者に投与するためのものである。
【００２２】
本発明のさらなる態様によれば、治療で用いるための本発明の組換え酵母又は組成物が提供される。
【００２３】
本発明の別の態様によれば、治療における本発明の組換え酵母又は組成物の使用が提供される。
【００２４】
本発明のさらなる態様によれば、疾患又は障害の処置方法が提供され、この方法は、それを必要とする患者に本発明の組換え酵母又は組成物を投与することを含む。
【００２５】
本発明の別の態様によれば、疾患又は障害の処置のための医薬の製造における本発明の組換え酵母又は組成物の使用が提供される。
【００２６】
好ましくは、治療は疾患又は障害の処置を含む。
【００２７】
好ましくは、疾患又は障害は鉄障害である。
【００２８】
好ましくは、Ｈ−フェリチンは哺乳動物のＨ−フェリチンである。
【００２９】
好ましくは、哺乳動物のＨ−フェリチンはヒトＨ−フェリチン又はそのホモログである。
【００３０】
好ましくは、ホモログはヒトＨ−フェリチンと少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【００３１】
本発明の別の態様は、患者の鉄障害の処置方法であって、それを必要とする患者に治療有効量のフェリチン−鉄複合体を投与することを含む方法である。
【００３２】
好ましくは、フェリチン−鉄複合体はＨ−フェリチンを含む。
【００３３】
好ましくは、Ｈ−フェリチンは組換えＨ−フェリチンである。
【００３４】
好ましくは、組換えＨ−フェリチンは酵母、細菌又はバキュロウイルス中で産生される。
【００３５】
好ましくは、鉄障害は鉄欠乏性貧血である。
【００３６】
好ましくは、鉄障害は脳の鉄欠乏症に関係している。
【００３７】
好ましくは、鉄障害は神経障害又は神経変性障害である。
【００３８】
好ましくは、鉄障害はパーキンソン病、アルツハイマー病、うつ病、不眠症、多発性硬化症、不穏下肢症候群、注意欠陥障害及び筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択される。
【００３９】
好ましくは、鉄障害は生後発達期間中の鉄欠乏症に付随する神経性、認知性、行動性又は運動性の障害を含む。
【００４０】
好ましくは、鉄障害は鉄過剰障害である。
【００４１】
好ましくは、マルチサブユニットフェリチン複合体は１００％未満の鉄結合能力である。
【００４２】
好ましくは、マルチサブユニットフェリチン複合体は哺乳動物のＨ−フェリチン又はそのホモログを含む。
【００４３】
好ましくは、鉄障害はサラセミア及びヘモクロマトーシスからなる群から選択される。
【００４４】
好ましくは、フェリチン−鉄複合体又はアポフェリチンは、輸血液中、鼻腔用スプレー中又は液体での摂取を介して患者に投与される。
【００４５】
本発明のさらなる態様によれば、治療有効量の鉄を脳に送達するための方法であって、フェリチン−鉄複合体を患者に投与することを含み、これによって治療有効量の鉄が血液脳関門を越えて輸送され脳に送達される方法が提供される。
【００４６】
好ましくは、フェリチン−鉄複合体はターゲッティング部分をさらに含む。
【００４７】
好ましくは、ターゲッティング部分は抗体、アプタマー、レセプター、リガンド及びそれらの結合断片からなる群から選択される。
【００４８】
好ましくは、ターゲッティング部分は脳特異的又は血液脳関門特異的なマーカーを認識する。
【００４９】
本発明の別の態様では、ターゲッティング部分としてＨ−フェリチンを用いるための方法であって、Ｈ−フェリチンをリポソームに付着させることを含み、これによってリポソームが脳にターゲティングされる方法が提供される。
【００５０】
本発明のさらなる態様によれば、酵母染色体に組み込まれたヒトＨ−フェリチンをコードする核酸配列を発現する組換え酵母が提供される。
【００５１】
好ましくは、ヒトＨ−フェリチンをコードする核酸配列はＴＤＨ３部位で酵母染色体に組み込まれている。
【００５２】
本発明のさらなる態様では、本発明の組換え酵母を含む、患者の鉄障害を経口的に処置するための組成物が提供される。
【００５３】
本発明の別の態様では、本発明の組換え酵母を含む、患者の鉄障害を経口的に処置するための組成物が提供される。
【００５４】
好ましくは、患者は、１種又は複数種の鉄欠乏障害を発症しやすい患者、１種又は複数種の鉄欠乏障害を有するがいかなる臨床症状も示さない対象、又は１種又は複数種の鉄欠乏障害を有し、１種又は複数種の鉄欠乏障害の症状を患っている対象から選択される。
【００５５】
好ましくは、患者はヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、げっ歯類又は霊長類などの哺乳動物である。
【００５６】
好ましくは、患者はヒトである。
【００５７】
本発明は、患者の鉄障害を処置する方法であって、それを必要とする患者に治療有効量のフェリチン−鉄複合体を投与することを含む方法を提供する。こうした方法で使用することができる、酵母染色体に組み込まれたヒトＨ−フェリチンをコードする核酸配列を含む組換え酵母及びこの組換え酵母を含む組成物が提供される。本発明は、治療有効量の鉄を脳に送達する方法であって、フェリチン−鉄複合体を患者に投与することを含み、これによって、治療有効量の鉄が血液脳関門を越えて輸送され、脳に送達されることが提供される方法にも関する。
【００５８】
本発明は、ターゲッティング部分としてＨ−フェリチンを用いる方法であって、Ｈ−フェリチンをリポソームに付着させることを含み、これによってリポソームが脳にターゲティングされることがさらに提供される方法をさらに提供する。
【００５９】
本明細書の中で、明瞭且つ簡潔な明細書を記述することを可能にする方法で実施形態を説明したが、実施形態は、本発明から逸脱することなく様々に組み合わされ得る又は分離され得ることが意図されており、また認識される。
【００６０】
ここで、本発明の実施例を添付の図面を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１Ａ】４８時間循環後の器官における、ウマ脾臓フェリチン（脾臓フェリチンはＬ−フェリチンに富む）と比較した、組換えヒトＨ−フェリチン（ｒＨ−フェリチン）からの５９Ｆｅのｉｎ  ｖｉｖｏでの取り込みを示すグラフである。５９Ｆｅ標識したｒＨ−フェリチン又は脾臓フェリチンを成体ラットの尾静脈に注射し、４８時間循環させた。１．０グラムの各器官の放射能量を測定し、注射した全体と比較した組織１グラムあたりのμＣｉ量を計算して全体％／グラム組織重量を決定した。相対量を明らかにするために、この同じスケールで２つの脳構造を示す。ｐ＜０．０５＊。３匹の動物由来の平均値は、±Ｓ．Ｅ．（標準誤差）が示される。
【図１Ｂ】ラットの脳における、ｒＨ−フェリチンからの５９Ｆｅのｉｎ  ｖｉｖｏでの取り込みを示すグラフである。図１Ａの説明文に記載したように、ラットに、５９Ｆｅで標識したｒＨ−フェリチン又は脾臓フェリチンを、尾静脈を介して注射した。全体％を、脳の一半球中のμＣｉ／注射した全μＣｉ×１００％を決定することによって計算した。ｐ＜０．００５＊＊。３匹の動物由来の平均値を、±Ｓ．Ｅ．で示す。
【図２Ａ】Ｈ−フェリチン欠損マウス（−／＋）及び野生型（＋／＋）マウスにおける、全身の器官へのｒＨ−フェリチンからの５９Ｆｅの取り込みを示すグラフである。動物には、腹腔内に注射された等量のｒＨ−フェリチンが与えられた。フェリチンを４８時間循環させた。示した器官（脳を含める；図２Ｂを参照されたい）を取り出し、０．１ｇを基にして、各器官に関して全体の放射能の％を決定した。ｐ＜０．０５＊。
【図２Ｂ】Ｈ−フェリチン欠損マウス（＋／−）の脳対野生型（＋／＋）マウスの脳における、ｒＨ−フェリチンを介して送達された５９Ｆｅの取り込みを示すグラフである。これらのデータは、図２Ａのデータを作成するのに用いたマウスの脳に由来する。脳内の放射能の％は、脳から得られた５９Ｆｅの崩壊カウント／分を注射した全μＣｉと比較することによって決定した。ｐ＜０．０５＊。３匹の動物に対する平均値を、±Ｓ．Ｅ．で示す。
【図３Ａ】Ｈ−フェリチン欠損（−／＋）及び野生型（＋／＋）マウスの全身の器官における、脾臓の（Ｌに富む）フェリチンを介して送達される５９Ｆｅ取り込みを示すグラフである。マウスを、５９Ｆｅを含む脾臓フェリチンで腹腔内に注射した。４８時間後に、このマウスを屠殺し、器官を取り出した。グラフは、各組織に存在する、組織１グラムあたりの、注射した全放射能の％を示す。３匹の動物由来の平均値を、±Ｓ．Ｅ．で示す。いずれの差も統計学的有意に達しなかった。
【図３Ｂ】Ｈ−フェリチン欠損マウスの脳（＋／−）対野生型（＋／＋）マウスの脳における、脾臓フェリチンを介して送達された５９Ｆｅの取り込みを示すグラフである。これらのデータは、図３Ａで用いたマウス由来である。報告する放射能量は動物に注射した全体の％である。結果は、３匹の動物由来の平均値±Ｓ．Ｅ．を示す。これらのデータは、統計的有意性を示さなかった。
【図４Ａ】２チャンバートランスウェル培養皿で増殖させたウシの網膜内皮細胞（ＢＲＥＣ）培養単層を超える、フルオレセイン標識したｒＨ−フェリチンの流動を示すグラフである。基底部チャンバーにおける、ＦＩＴＣ標識したｒＨ−フェリチンの４時間にわたる輸送速度を示す。輸送速度は、例１に記載するように決定した。データは、単位量の上部チャンバーの蛍光あたりの下部チャンバーの蛍光（Ｂｆ／Ｔｆ）対時間のプロットから勾配（ｃｍ／ｓ）として得られる流動速度の平均及び平均の標準誤差として表わす。ｒＨ−フェリチン輸送は、デキストラン対照及び脾臓フェリチンと比較して統計的に有意である（ｐ＜０．０１）＊＊。
【図４Ｂ】蛍光及びＨ−フェリチン抗体への特異的結合による、下部チャンバー中のＦＩＴＣ標識したｒＨ−フェリチンの検出を示す図である。下部チャンバー中のＨ−フェリチンの存在は、Ｈ−フェリチンがＢＲＥＣ細胞層を越えて経細胞輸送されることを示す。レーン：１）対照（未標識のフェリチン）培養由来の、１０μｌの濃縮した基底部チャンバー培地；２）ＦＩＴＣ標識したｒＨ−フェリチン培養からの基底部チャンバー培地由来の、１０μｌの濃縮したタンパク質；３）分子量マーカー；４）対照培養由来の、３０μｌの濃縮した基底部チャンバー培地；５）ＦＩＴＣ標識したｒＨ−フェリチン培養からの基底部チャンバー培地由来の、３０μｌの濃縮したタンパク質；６）未標識のｒＨ−フェリチン；７）ＦＩＴＣ標識したｒＨ−フェリチン。
【図５Ａ】ＢＲＥＣ細胞ホモジネートへの１２５Ｉ−ｒＨ−フェリチン及び１２５Ｉ−脾臓フェリチンの結合に対する飽和曲線を示すグラフである。このグラフは、ＢＲＥＣ細胞へのＨ−フェリチン結合は飽和性であるが、脾臓フェリチンがＢＲＥＣ細胞に結合する証拠はないことを図示している。飽和結合は４℃で２時間行った。Ｋｄは２．７±０．９ｎＭであると決定され、Ｂｍａｘは４６５．７±６３．１ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質である。
【図５Ｂ】ラットの脳から単離した微小血管における、１２５Ｉ−ｒＨ−フェリチン及び１２５Ｉ−脾臓フェリチンに対する飽和曲線を示すグラフである。これらの曲線は、Ｈ−フェリチンに関しては飽和結合を示しているが、脾臓フェリチンに関しては結合を示していない。Ｋｄは７．９±１．６ｎＭであり、Ｂｍａｘは５７２．６±６４．０ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質である。
【図６Ａ】ＢＲＥＣホモジネートにおける１２５Ｉ−ｒＨ−フェリチン結合部位に関する競合は、未標識のｒＨ−フェリチンにより、脾臓フェリチンにはよらないことを示すグラフである。このグラフは、ＢＲＥＣホモジネートへの１２５Ｉ−ｒＨ−フェリチンの結合は未標識のｒＨ−フェリチンの濃度を増大させることによって競合的に阻害されるが、脾臓フェリチンによって競合されないことを示す。
【図６Ｂ】ラットの微小血管における競合結合アッセイの結果を示すグラフである。このグラフは、未標識のｒＨ−フェリチンによって、１２５Ｉ−ｒＨ−フェリチンの結合は濃度依存的様式で解離し得るが、未標識の脾臓フェリチンにはよらないことを図示する。
【図７】組換え酵母でのｒＨ−フェリチンの発現を示すウェスタンブロット（４〜２０％のグラジエント）を示す図である。レーン１は標準（組換えヒトＨ−フェリチン）である。レーン２及び４は、ヒトＬ−フェリチンで形質転換された２つの異なる酵母コロニーである。レーン３及び５は、ヒトＨ−フェリチンで形質転換された２つの異なる酵母コロニーである。この試験で用いた抗体は、抗ＨＦ  ＨＳ−５９（１：４０，０００、１６時間）であり、これは、Ｐａｏｌｏ  Ａｒｏｓｉｏ（Ｂｒｅｓｃｉａ  Ｉｔａｌｙ）から寛大に供給された、Ｈ−フェリチンに対するマウスモノクローナルである。
【図８】鉄について染色したウェスタンブロットを示す図である。最初にゲル電気泳動によってタンパク質を分離し、フェリチンの鉄含有量を示すのに用いられる標準的な鉄用の組織学的染色剤であるＰｅｒｌ試薬でゲルを染色した。レーン１及び２は、Ｌ−フェリチンで形質転換された酵母コロニーに由来する。Ｌ−フェリチンは鉄を負荷することができないので、これらのレーンでは鉄に関する反応生成物は見られない。レーン３及び４は、鉄を補充した培地（レーン３）及び正常な鉄培地条件下（レーン４）で増殖させた、Ｈ−フェリチンを発現する酵母由来のタンパク質抽出物である。Ｈ−フェリチン標準を対照として用いた（レーン５）。レーン６は、フェリチンの大きさを示すために分子量マーカーを含む。
【図９】鉄欠乏症の標準的なラットモデルを用いて得た結果を示すグラフである。鉄欠乏性（ＩＤ）食の動物は、ヘモグロビン（Ｈｂ）のレベルが最も低かった。鉄がない酵母（酵母Ｆｅなし）を与えられた動物は、ＩＤ動物と類似したＨｂレベルであった。Ｈｂレベルの改善は他の３つの群で見られ、最も急速な改善の増大は、鉄が補充され及びＨ−フェリチンで強化された酵母（酵母Ｆｅ＋Ｆｔ）を与えられた動物で起こった。
【図１０】図９で試験した動物群由来のヘマトクリットレベルを表すグラフである。これらのデータは、鉄用ビヒクルとしての酵母は、Ｈ−フェリチンが存在する場合又は存在しない場合においてヘマトクリットを是正するのに同程度に有効であり、両方とも、標準的な現在の処置選択であるＦｅＳＯ４よりも著しく優れていることを示す。ＩＤ食を続けた動物及び鉄を補充しなかった酵母を与えた動物は、試験した１１日にわたってヘマトクリットの増加を示さなかった。
【図１１】図９及び１０で試験した動物群における、鉄の生物学的利用能の測定試験の結果を示すグラフである。これらのデータは、フェリチンを強化した鉄補充酵母（酵母Ｆｅ＋Ｆｔ）が、トランスフェリン（Ｔｆ）飽和を最も大きく増大させ、続いてフェリチンがない鉄補充酵母（酵母Ｆｔなし）であったことを示している。酵母Ｆｅ＋Ｆｔ対酵母Ｆｔなしを除く全群に関してｐ＜０．０５。
【図１２】発達的に重要な２つの脳領野、すなわち腹側中脳及び尾状核の鉄の状況を示すグラフである。Ｈｂ及びＨｃｔ分析（図９及び１０）で記載した動物を１４日齢で屠殺し、腹側中脳（ＶＭＢ）及び尾状核の鉄濃度を測定した。Ｈ−フェリチンで強化され鉄を補充された酵母（酵母−Ｆｅ＋Ｆｔ）を与えられた動物は、両方の脳領域で、いずれの他の群よりも多くの鉄を有していた。
【図１３】脳の中隔側座核（ＮＡ）及び前頭前野皮質（ＰＦＣ）領域の鉄レベルを表すグラフである。この図では、フェリチンを強化した鉄補充酵母（酵母−Ｆｅ＋Ｆｔ）から送達される鉄の領域特異性が明らかである。（図１２に示すＶＭＢ及び尾状核と類似する）ＮＡでは、他の鉄送達方式と比較して鉄含有量が増大する。しかしＰＦＣでは、フェリチンを強化した鉄富化酵母から送達される鉄は、他の群で見出されたものと類似している。
【図１４Ａ】ヒトＨ−フェリチンのアミノ酸配列（配列番号：１）を示す図である。
【図１４Ｂ】ヒトＨ−フェリチンのｃＤＮＡ配列（配列番号：２）を示す図である。開始（ＡＴＧ）及び終止（ＴＡＡ）コドンは太字であり、（配列の５’末端の）ＢａｍＨＩ及び（配列の３末端の）ＸｈｏＩ制限部位には下線が引かれている。
【図１５】免疫染色されたＨ−フェリチンレセプターを絨毛上（ａ及びｃ）に局在させる成体ラットの十二指腸の横断面を示す図である。核をＤＡＰＩで染色する（ｂ及びｃ）。重ねた画像を（ｃ）に示す。
【図１６】酵母ＴＤＨ３転写プロモーターの制御下でＨ−フェリチンを発現する遺伝子カセットの構造を示す図である。Ｈ−フェリチンＯＲＦ、ヒトＨ−フェリチンをコードするオープンリーディングフレーム；ＣＹＣ１ｔｅｒ、酵母ＣＹＣ１遺伝子由来の転写ターミネーター；塗りつぶされた長方形、ｌｏｘＰ部位；ＵＲＡ３、選抜マーカー。
【図１７】形質転換酵母における組換えＨ−フェリチンの発現に対する染色体組み込み部位の影響を示すウェスタンブロットを示す図である。レーン１、ＲＬＫ３１９０のＨ−フェリチン；レーン２及び４、Ｈ−フェリチン遺伝子の他の染色組み込み部位を有する酵母系統のＨ−フェリチン；レーン３、多コピーの染色体外プラスミドを含むＲＬＫ３１７７のＨ−フェリチン；レーン５、試料なし；レーン６、Ｈｉｓでタグ付けした精製ｒＨ−フェリチン；レーン７、分子量マーカー。
【図１８Ａ】フェリチンを強化した鉄補充酵母によって送達される鉄の優れた生物学的利用能を示すデータを提供するグラフである。図９〜１１によって代表される実験由来の１４日目のデータをグラフ化して、摂取された鉄１ｍｇあたりの変化を示す。Ａ．ヘモグロビンの回復、ｐ＜０．０５＊＊。
【図１８Ｂ】フェリチンを強化した鉄補充酵母によって送達される鉄の優れた生物学的利用能を示すデータを提供するグラフである。図９〜１１によって代表される実験由来の１４日目のデータをグラフ化して、摂取された鉄１ｍｇあたりの変化を示す。Ｂ．ヘマトクリットの回復、ｐ＜０．０５＊＊。
【図１８Ｃ】フェリチンを強化した鉄補充酵母によって送達される鉄の優れた生物学的利用能を示すデータを提供するグラフである。図９〜１１によって代表される実験由来の１４日目のデータをグラフ化して、摂取された鉄１ｍｇあたりの変化を示す。Ｃ．トランスフェリン飽和、ｐ＜０．０５＊＊。
【図１８Ｄ】フェリチンを強化した鉄補充酵母によって送達される鉄の優れた生物学的利用能を示すデータを提供するグラフである。図９〜１１によって代表される実験由来の１４日目のデータをグラフ化して、摂取された鉄１ｍｇあたりの変化を示す。Ｄ．異なる食事に対するトランスフェリン飽和％の比較、ｐ＜０．０５＊＊。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本出願は、組換え酵母の新規な系統、この酵母を含む組成物、並びに鉄欠乏障害を処置するための方法及び組成物に関する。
【００６３】
本明細書中には、明瞭且つ簡潔な明細書を記述することを可能にする方法で実施形態について説明したが、実施形態は本発明から逸脱することなく様々に組み合わされ得る又は分離され得ることが、意図され且つ認識される。
【００６４】
鉄の生物学的利用能を増大させ、現在の標準処置であるＦｅＳＯ４よりも速く効率的に正常な鉄レベルを回復させる、鉄欠乏症及び他の鉄障害を処置するための優れた方法を記載する。
【００６５】
本開示の一実施形態では、鉄欠乏症を緩和する新規な食事的アプローチが提示される。このアプローチは、消化管及び脳のＨ−フェリチンに対するレセプターについての本発明者らの発見、及びＬに富むフェリチンと比べてＨ−フェリチンが鉄取り込みの好ましい様式であるという本発明者らの実証に由来した。Ｈ−フェリチンの遺伝子配列及びタンパク質構造は動物界全体にわたって高度に保存されている。したがって、鉄送達タンパク質としてのＨ−フェリチンの適用はヒトに限定されない。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「鉄障害」は、鉄欠乏、鉄取り込み及び／又は鉄代謝に関係した障害又は疾患を含む。鉄欠乏障害の例としては、これらに限定されないが、食事摂取又は鉄吸収が不十分であることに起因する鉄欠乏性貧血などの鉄欠乏性貧血が挙げられる。鉄欠乏性貧血は、例えば栄養失調、（産褥期を含めた）妊娠、大量の子宮出血、（慢性腎疾患を含めた）慢性疾患、癌、腎透析、胃バイパス手術の合併症、不穏下肢症候群（ＲＬＳ、エクボム病）、多発性硬化症、糖尿病（例えばＩ型及びＩＩ型糖尿病）、インスリン抵抗性及び注意欠陥障害に関係する可能性がある。鉄取り込み及び鉄代謝に関係する障害としては、これらに限定されないが、鉄過剰症、ハンチントン病、脳内鉄蓄積を伴う神経変性（ＮＢＩＡ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ミエリン形成不全症及び多発性硬化症が挙げられる。
【００６７】
本開示の一実施形態では、鉄欠乏障害は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ＲＬＳ、女性の貧血に付随する最適以下の認識能力、うつ病及び不眠症を含めた様々な神経性及び神経変性疾患などにおいて生じる、脳内の鉄欠乏レベルに関係している。別の実施形態では、鉄欠乏障害は、乏しい認識能力及び運動障害並びに注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）につながる発達性鉄欠乏症が原因であるミエリン形成不全症及び遅い脳発達を含めた、生後発達期間中の脳の鉄欠乏症に付随する神経性障害（単数又は複数）を含む。
【００６８】
脳内の鉄の欠如及びドーパミン合成の低下は、例えばＲＬＳ及び小児の発達性鉄欠乏症などの鉄欠乏障害の重要な要因である。ドーパミンは、適切な中枢神経系機能に必須の、脳内で合成される神経伝達物質である。ドーパミン合成では、鉄は、ドーパミン代謝の律速段階である酵素チロシンヒドロキシラーゼの補助因子である（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）。ドーパミン作動系における鉄は、ＲＬＳの病態生理、及びＡＤＨＤを含めた小児の行動障害の重要な構成要素であると考えられる。ＲＬＳ患者及び対照のいずれの血清中においてもフェリチン及びトランスフェリンが正常な血清レベルであるにもかかわらず、ＲＬＳ患者は、脳脊髄液（ＣＳＦ）フェリチンが６５％少なく、ＣＳＦトランスフェリン（鉄輸送血中のタンパク質）が３倍多い。鉄濃度は、脳全体、ドーパミン合成部位で変動する。ＲＬＳ患者は、脳の黒質及び被殻部分の鉄は少ない。一般に、血清フェリチンレベルの低下程度はＲＬＳ症状の重症度の指標となる。ＡＤＨＤの小児で血清フェリチンレベルが低下したという報告もある。
【００６９】
用語「フェリチン−鉄複合体」は、多数のフェリチンサブユニット及び鉄原子を含むタンパク質複合体を指す。適切なフェリチン−鉄複合体は、哺乳動物のＨ−フェリチンサブユニット及びＬ−フェリチンサブユニットを含む。様々な哺乳動物種由来のＨ−フェリチンサブユニットのアミノ酸配列が同定されている（例えば、Ｏｒｉｎｏ  Ｋｏｉｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．４２：７−１１（２００５）；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：０６Ａ００６４８６を参照されたい）。一実施形態では、Ｈ−フェリチンはヒトＨ−フェリチン（配列番号：１；図１４Ａを参照されたい）である。Ｈ−フェリチンは、天然起源のヒトＨ−フェリチン又はヒトＨ−フェリチンの合成ホモログ若しくは変異体でもよい。特定の実施形態では、Ｈ−フェリチンホモログは、ヒトＨ−フェリチンに対して約８０％から約１００％の配列同一性を有し、例えばヒトＨ−フェリチンと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性である。Ｈ−フェリチンホモログは鉄と結合してマルチサブユニットのフェリチン−鉄複合体を形成する能力を保持するが、変異させて鉄とフェリチンの間の様々な結合及び解離強度をもたらすことができる。フェリチン−鉄複合体はＨ−フェリチンサブユニットを含むが、いくらかのＬ−フェリチンサブユニットも含むことができる。特定の実施形態では、複合体のフェリチンサブユニット構成要素は、Ｌ−フェリチンと比較して少なくとも２０％のＨ−フェリチンを含み、例えばＬ−フェリチンと比較して約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％のＨ−フェリチンである。一実施形態では、フェリチン−鉄複合体のフェリチンサブユニットの全て（すなわち１００％のフェリチンサブユニット）がＨ−フェリチンである。Ｈ−フェリチンは組換えＨ−フェリチンでもよい。例えば一実施形態では、Ｈ−フェリチンは、適切な酵母プロモーターの制御下にあるＨ−フェリチンをコードするポリヌクレオチド配列を含む酵母系統で産生されるヒトＨ−フェリチンでもそのホモログでもよい。酵母で産生されたＨ−フェリチンは、標準的なタンパク質精製方法を用いて治療的使用のために精製することができる。
【００７０】
フェリチン−鉄複合体中の鉄は鉄分子でもよいし、鉄含有複合体の形でもよい。「鉄含有複合体」又は「鉄複合体」は（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）酸化状態の鉄を含む化合物であり、有機化合物と複合体を形成している。鉄複合体には、鉄ポリマー複合体、鉄炭水化物複合体及び鉄アミノグリコサン複合体が含まれる。これらの複合体は市販品として入手可能であり、及び／又は当技術分野で既知の方法によって合成することができる。
【００７１】
鉄炭水化物複合体の例としては、鉄サッカリド複合体、鉄オリゴ糖複合体及び鉄多糖複合体、例えばカルボキシマルトース鉄、ショ糖鉄、ポリイソマルトース鉄（デキストラン鉄）、ポリマルトース鉄（デキストリン鉄）、グルコネート鉄、ソルビトール鉄及び水素化デキストラン鉄などが挙げられ、これらは他の化合物、例えばソルビトール、クエン酸及びグルコン酸などとさらに複合体を形成してもよく（例えば、デキストリン鉄−ソルビトール−クエン酸複合体及びショ糖鉄−グルコン酸複合体）、又これらの混合物も挙げられる。
【００７２】
鉄アミノグリコサン複合体の例としては、コンドロイチン硫酸鉄、デルマチン硫酸鉄、ケラタン硫酸鉄が挙げられ、これらは他の化合物とさらに複合体を形成してもよく、又これらの混合物も挙げられる。鉄ポリマー複合体の例としては、ヒアルロン酸鉄、鉄タンパク質複合体及びこれらの混合物が挙げられる。
【００７３】
本明細書で使用する場合、「処置」又は「処置する」は、患者又は対象が処置されている状態の完全排除及びその状態の任意の臨床的に又は定量的に測定可能な低減を指す。「処置」は、障害の発症を防止する又は障害の病態若しくは症状を変化させる意図を持って実施される介入である。したがって「処置」は、治療処置と予防策又は防止策の両方を指す。「処置」は、緩和治療と定めることもできる。処置を必要としている人には、既に１種又は複数種の鉄欠乏障害を罹患している人及び障害を防止すべき人が含まれる。
【００７４】
それを必要とする患者を処置する際に、治療有効量の本フェリチン−鉄組成物を本発明に従って患者に投与する。本明細書で使用する場合、用語「治療有効量」は、処置のために指示される量であるが、重大な有害作用を引き起こす恐れのある量を超えない組成物の量である。治療処置の有効性を評価する方法は当業者に既知である。
【００７５】
「それを必要とする患者」又は「患者」は、本発明の処置方法の利益を享受する可能性のある任意の患者又は対象を指す。特定の実施形態では、それを必要とする患者は、１種若しくは複数の鉄欠乏障害を発症しやすい患者、１種若しくは複数の鉄欠乏障害を有するがいかなる臨床症状も示さない対象、又は１種又若しくは複数の鉄欠乏障害を有しており１種若しくは複数の鉄欠乏障害の症状を患っている対象である。それを必要とする患者は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、げっ歯類又は霊長類などの哺乳動物でもよい。一実施形態では、患者はヒトである。特定の実施形態では、本発明の方法は、実験動物、獣医若しくは畜産用途及び／又は疾患に関する動物モデルの開発において用途を見出す。
【００７６】
投与量は、処置期間、投与頻度、受容者並びに障害の性質及び重症度に応じて変えられる。用量は、過度な実験をすることなく当業者によって決定することができる。本発明の組成物は、十分な投薬単位のフェリチン−鉄複合体を患者に確実に放出して鉄欠乏障害の所望の処置を提供するのに十分である投薬濃度で投与する。実際の投薬量は、患者の年齢、体重、状態の重症度及び／又は病歴などの身体的及び生理的要因によって決定することになる。活性成分は、フェリチン−鉄複合体が約５０μＭから約１０００μＭのｉｎ  ｖｉｖｏ血漿濃度になるように投与することができる。例えば本発明の方法は、組成物を用いて、約０．１から約１，０００又は約１から約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日のフェリチン−鉄複合体、例えば約３０ｍｇ／ｋｇ体重／日のフェリチン−鉄複合体などを提供することができる。しかし、提供した範囲から逸脱する投薬量レベルも所与の障害の処置に適切であり得ることを理解されたい。
【００７７】
本発明のフェリチン−鉄複合体は、投与に適した任意の形態でよい。こうした投与可能な形態としては、錠剤、緩衝化錠剤、丸剤、カプセル剤、腸溶カプセル剤、糖衣錠、カシェ剤、散剤、顆粒剤、エアロゾル剤、リポソーム剤、坐剤、クリーム剤、ローション剤、軟膏剤、皮膚パッチ剤、非経口剤、ロゼンジ剤、懸濁剤、液剤及び乳剤（水中油型又は油中水型）などの経口液剤、点眼用液剤及び注射用液剤又はこれらの徐放形態並びにエアロゾル剤が挙げられる。所望の用量は、連続注入又は徐放製剤によって１日を通して一定間隔で数回増分して提供してもよいし、ボーラス、舐剤又はペースト剤として与えてもよい。
【００７８】
一実施形態では、フェリチン−鉄複合体を含む医薬若しくは栄養補助食品の組成物又は製剤は、１種又は複数種の薬学的に許容される担体と混合することによって調製する。場合によっては、フェリチン−鉄複合体は、鉄−フェリチン結合（すなわちフェリチン−鉄複合体の形成）を可能にするために、フェリチン−鉄複合体及び鉄分子及びフェリチン分子が溶解した緩衝液を含む組成物として送達してもよい。しかし必要に応じて、鉄の送達、貯蔵を最大にする又は特定の送達方法を最適化するために、他の生成物を加えてもよい。さらに本発明は、鉄欠乏障害の処置に適した他の薬剤と組み合わせた、本明細書に記載のフェリチン−鉄複合体を含む組み合わせ組成物の使用を含む。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」とは、医薬及び獣医学分野での使用に関して許容され、製剤の他の成分と適合性があり、且つ有毒でなく、妥当な利益／危険比に応じて他の点でも許容不可能でないことを意味する。「薬学的に許容される担体」又は「希釈剤」とては、フェリチン−鉄複合体を含む組成物の医薬投与と適合性のある、ありとあらゆる溶剤、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤並びに吸収遅延剤などが挙げられる。こうした担体又は希釈剤の例としては、これらに限定されないが、水、生理食塩水、フィンガー溶液及びデキストロース溶液が挙げられる。医薬組成物の容量は、医療専門家によって決定される個々の患者に対する目的の投与方式及び安全な容量に基づく。
【００８０】
担体の選択も目的の投与方式に依存する。本発明の組成物は、これらに限定されないが、全身投与（例えば静脈内注射、内部非経口（ｉｎｔｒａｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）注射、吸入、経皮送達、経口送達、経鼻送達、直腸送達）及び／又は局所的投与（例えば標的組織への直接注射、カニューレを介した組織への送達、持続放出物質の埋め込みによる標的組織への送達）、ポンプなど、経口、非経口、骨内、脳脊髄液中などによる組織への送達などを含めた、いくつかの好都合な手段のうちのいずれかによって投与することができる。さらなる投与方式としては、バッカル、舌下、腟、皮下、筋肉内又は皮内が投与が挙げられる。
【００８１】
一実施形態では、経口的に投与する組成物を、経口摂取用にフェリチン−鉄複合体と適切に組み合わせた物質を用いて調製する。こうした物質としては、限定はされないが、ラクトース（含水、高流動性）、グルコース及びショ糖などの糖；トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン；微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースを含めた、セルロース及びその誘導体；粉末化トラガント；コロイド状二酸化ケイ素；クロスカルメロースナトリウム；麦芽；ゼラチン；タルク；ステアリン酸；ステアリン酸マグネシウム；硫酸カルシウム；ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油及びトウモロコシ油などの植物油；プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；寒天；アルギン酸；水酸化アルミニウム又は水酸化マグネシウムなどの制酸薬；クエン酸ナトリウム、アセテート又はバイカーボネートなどの緩衝液；水；等張生理食塩水並びにリン酸緩衝液が挙げられる。湿潤剤、ラウリル硫酸ナトリウムなどの潤滑剤、安定化剤、錠剤化剤、抗酸化剤、防腐剤、着色剤及び着香剤も存在してよい。
【００８２】
非経口投与に適した組成物又は製剤としては、これらに限定されないが、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬又は製剤を血液と等張にする溶質を含み得る水性及び非水性の等張滅菌注射液剤、並びに懸濁化剤及び増ちょう剤を含み得る水性の及び非水性の滅菌懸濁剤が挙げられる。組成物は、単位用量又は多用量の密閉容器、例えばアンプル及びバイアルで提供することができ、滅菌した液体担体、例えば注射用の水を使用前に加えることだけしか必要としないフリーズドライされた（凍結乾燥された）状態で保存することができる。即席の注射液剤及び懸濁剤は、滅菌散剤、顆粒剤又は錠剤などから調製することができる。
【００８３】
静脈内投与に適した組成物又は製剤は、生理食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ；Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの担体を含む。組成物は滅菌しなければならず、且つ注射器を用いて投与するために流動性がある必要がある。こうした組成物は、製造中及び貯蔵中に安定である必要があり、且つ細菌及び真菌などの微生物汚染から保護されなければならない。担体は、例えば、水、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール及び液状ポリエチレングリコールなど）及び他の適合性のある適切な混合物を含む分散媒でもよい。様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸及びチメロサールが微生物汚染を抑えることができる。糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールなど、及び塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含むことができる。吸収を遅らせることができる組成物としては、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの薬剤が挙げられる。滅菌注射液剤調製用の滅菌固形物の調製方法としては、真空乾燥及びフリーズドライを行って、フェリチン−鉄複合体及び他の任意の所望成分を含む固形物を得ることが挙げられる。
【００８４】
全身投与は、例えば経粘膜的又は経皮的であってもよい。経粘膜的又は経皮的投与に関しては、標的障壁（単数又は複数）に浸透することができる浸透剤が選択される。経粘膜的浸透剤としては、界面活性剤、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体が挙げられる。鼻腔用スプレー又は坐剤を経粘膜的投与に使用してもよい。経皮的投与に関しては、軟膏剤、膏薬、ゲル剤又はクリーム剤中に活性化合物が配合される。
【００８５】
フェリチン−鉄複合体を含む組成物は、埋込体及びマイクロカプセル化送達系を含めた、放出制御製剤などの体からの急速な排除に対して複合体を保護する担体を用いて調製することができる。エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などの生分解性又は生体適合性のポリマーを使用することができる。こうした材料は、これらに限定されないが、ＡＬＺＡ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）及びＮＯＶＡ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ  Ｅｌｓｉｎｏｒｅ、ＣＡ）を含めた供給源から市販品として入手することができるし、当業者によって調製することもできる。
【００８６】
眼適用組成物は、緩衝食塩水若しくは生理食塩水、リポソーム又は塩基性アミノ酸などの適切な液状担体中で調製する。クリーム剤、ローション剤及び軟膏剤は、トリグリセリド基材、リポソーム又は塩基性アミノ酸などの適切な基材を用いて、局所適用目的で調製することができる。こうしたクリーム剤、ローション剤及び軟膏剤は、表面活性薬剤を含んでもよい。
【００８７】
本発明の一実施形態では、フェリチン−鉄複合体は、染色体に組み込まれたＨ−フェリチン発現カセットからＨ−フェリチンを発現する組換え酵母系統の形で投与する。鉄の栄養補給に適した組換え酵母系統は、ヒトを含めた哺乳動物にとって高い生物学的利用能を有する形態で鉄を貯蔵することができる。酵母系統は、ヒトの摂取に関して一般に安全と認められる（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｇａｒｄｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ）（ＧＲＡＳ）要求を満たすものを含む。こうしたものとして、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属の酵母並びに治療用化合物の生成プロセスで使用することができる他の酵母を挙げることができる。本実施形態では、鉄補給の適切なビヒクルとして働くのに十分な高レベルの鉄貯蔵タンパク質を酵母が産生するように、鉄貯蔵遺伝子（例えばＨ−フェリチンのコード配列）を鉄貯蔵発現カセット中の適切な酵母プロモーターの制御下に配置する。ｒＨ−フェリチンを構成的に発現し、ＦｅＳＯ４又は脾臓フェリチンを用いる標準的な栄養素補充よりも著しく高いレベルの生物が利用可能な鉄を提供する、特定の組換え酵母系統の構築を例２に記載する。
【００８８】
適切な酵母プロモーターは当技術分野で既知であり、高レベルの構成的発現を誘導するプロモーター及びその発現を環境条件によって調節することができるプロモーターが含まれる。さらに、酵母の遺伝子構成をさらに操作して、有利な可能性がある種々のアウトカムを得ることができる。例えば、タンパク質分解を操作して、これらに限定はされないが、細胞表面、液胞又はミトコンドリアのものを含めた、鉄貯蔵タンパク質の安定性又は鉄輸送機構を強化することができ、タンパク質分解を操作して、特定の細胞内コンパートメント中の鉄濃度を変化させるなどの望ましいアウトカムを得ることができる。さらに酵母を他の方法で改変して、鉄貯蔵タンパク質又は細胞内コンパートメント内の鉄レベルを操作することができる。酵母の鉄含有量は、酵母が増殖している培地へ既知の量の鉄化合物を加えることによって調節することができる。組換え酵母を使用する場合、ヒト又は他の動物に対する鉄補給は、これらに限定されないが、栄養補助食品として組換え酵母を摂取すること又は組換え酵母から精製若しくは単離したフェリチン−鉄複合体を摂取することを含めたいくつかの手段のうちのいずれかによって成し遂げることができる。酵母は、特に鉄補給の目的で増殖させてもよいし、別のプロセス（例えば発酵）の副産物でもよい。
【００８９】
代わりに又はさらに、フェリチン−鉄複合体は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バキュロウイルス並びにトランスジェニック植物及びトランスジェニック動物を含めた、当技術分野で既知の他の発現系で産生したｒＨ−フェリチンを含むことができる。一実施形態では、フェリチン−鉄複合体は、フェリチンサブユニットと鉄分子とを適切な緩衝液中でインキュベートして、次に、得られたフェリチン−鉄複合体からいずれの未結合鉄分子も分離することで、形成することができる。
【００９０】
特定の実施形態では、フェリチン−鉄複合体は、抗体、アプタマー、レセプター、リガンド又はそれらの結合断片などのターゲッティング部分をさらに含む。ターゲッティング部分は１種又は複数種の細胞、組織及び／又は器官特異的なマーカーを認識することができるので、体の所望の標的又は位置への送達を媒介又は改善することができる。一実施形態では、フェリチン−鉄複合体は、ターゲッティングペプチドと融合した、Ｈ−フェリチンなどのフェリチンサブユニットを含む融合タンパク質を含有することができる。別の実施形態では、フェリチン−鉄複合体は、リポソーム、リポソーム構築物又は赤血球ゴーストなどの他の膜結合性小胞にカプセル化されて送達してもよいし投与してもよい。リポソーム、リポソーム構築体又は他の小胞は、リポソーム又は小胞に組み込まれた、特定の細胞表面タンパク質又はレセプターに対して特異的な抗体又はリガンドなどのターゲッティング部分を含むことができる（上記を参照されたい）。ターゲッティング部分は、フェリチン−鉄複合体又はフェリチン−鉄複合体を含む小胞を、脳及び／又は血液脳関門にターゲッティングすることができる。適切なターゲッティング部分の例としては、トランスフェリン、インターロイキン−１３（星状膠細胞腫への送達用）及びリポ多糖（ＬＰＳ）が挙げられる。
【００９１】
本発明の別の実施形態では、Ｈ−フェリチンそれ自体を使用して他の部分をターゲティングすることができる。例えばＨ−フェリチンを生理活性剤に結合させて、その薬剤を脳へ送達することができる。一実施形態では、Ｈ−フェリチンペプチドを別の生理活性ペプチドに融合する。代わりに又はさらに、Ｈ−フェリチンをリポソーム又は他の小胞にコンジュゲートして、その小胞及び小胞の内容物を脳に送達することができる。さらに別の実施形態では、Ｈ−フェリチンをコントラスト増強化合物などの薬剤に結合させて、脳（例えば白質路及びその中の異常）の可視化を増強することができる。生理活性剤と同様に、コントラスト増強化合物を、Ｈ−フェリチンタンパク質に又はその中に結合させることもできるし、レセプターリガンドとして働くリポソームコンジュゲート化Ｈ−フェリチンを介して脳内のＨ−フェリチンレセプターにターゲティングされるリポソーム又は他の小胞内にカプセル化することもできる。
【００９２】
本発明の別の実施形態では、例えば本発明の組換え酵母又は組成物の形のＨ−フェリチンは、過剰な鉄又は鉄過剰症に関係する障害を処置するのに使用することができる。臨床的にはヘモクロマトーシスとして知られる鉄過剰症は、例えば癌、心不全、肝臓機能障害及び糖尿病の危険性の増大を伴う。脳内の鉄過剰は、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ハレルフォルデン−スパッツ病及びハンチントン病並びに黄斑変性などの幅広い神経変性疾患で生じる可能性がある。Ｈ−フェリチンの著しい鉄結合能力のために、Ｈ−フェリチン及び／又はＨ−フェリチンを含むマルチサブユニット複合体は、鉄キレーターとして使用することができる。「マルチサブユニットフェリチン複合体」は、多数のフェリチンサブユニット及び場合によっては鉄を含むタンパク質複合体を意味する。上記で定義したように、Ｈ−フェリチンは哺乳動物のフェリチン又そのホモログ若しくは変異体である。マルチサブユニットフェリチン複合体は、得られた複合体が１００％未満の総鉄結合能力であるように、比較的鉄が存在しない環境で調製することができる。特定の実施形態では、この複合体は、約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％又は１％の鉄結合能力など、５０％以下の鉄結合能力である。一実施形態では、複合体は約０％の鉄結合能力（すなわち１００％又は１００％に近い鉄結合能力が残存するアポフェリチン（鉄を含まないフェリチン））であり得る。Ｈ−フェリチンを改変して、それが任意の内在性レセプターに認識され得る可能性を減らすこともできるし、体による排出を増大させることもできる。こうした改変は十分に当業者の専門技術内であり、このような改変はタンパク質の鉄結合能力に必ずしも影響を与えない。鉄キレーターとしての使用に適したマルチサブユニットフェリチン複合体はＨ−フェリチンサブユニットを含むが、いくらかのＬ−フェリチンサブユニットを含むこともできる。特定の実施形態では、マルチサブユニットフェリチン複合体は、Ｌ−フェリチンと比較して約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％のＨ−フェリチンなど、Ｌ−フェリチンと比較して少なくとも２０％のＨ−フェリチンを含む。
【００９３】
鉄キレーターとして使用するためのマルチサブユニットフェリチン複合体の送達は、鉄欠乏障害処置のためのフェリチン−鉄複合体送達に関して先に述べたことと同じ範囲の送達機構（例えば、フェリチンを産生する酵母の摂取、精製したフェリチンタンパク質、ターゲッティング部分及び／又はリポソーム若しくは他の小胞の投与）を含むことができる。マルチサブユニットフェリチン複合体は、消化管、消化管の内壁の細胞内、又は血流内に送達することができる。本アプローチを利用すると、さもなければ無秩序な様式で脳又は他の器官に不適切に到達する可能性のある鉄が排除されると考えられる。さらに血液及び全身の器官由来の鉄をキレートすることによって、脳からの鉄の放出を含めた、体中の鉄の再分配を促進すると考えられる。場合によっては、１００％未満の総鉄結合能力であるアポフェリチン又はフェリチン複合体は、脳脊髄液、脳又は血流に直接的に送達することができる。
【００９４】
フェリチンは、鉄だけでなくその多くが体に有毒である様々な金属にも結合する能力を有する。したがって本発明の別の実施形態は、消化器系、血液、脳及び体全体から潜在的な有毒金属を低減及び排除するための、アポフェリチン（又は１００％未満の総鉄結合能力である他のマルチサブユニットフェリチン複合体）の使用に関する。
【００９５】
輸血の際は、少なくとも１５％の細胞が輸血プロセス中に崩壊して、損傷を与える可能性のある遊離鉄が放出される。輸血は、赤血球（ＲＢＣ）を必要とし、それ故貧血である患者に実施される。本発明は、アポフェリチン（又は１００％未満の総鉄結合能力である他のマルチサブユニットフェリチン複合体）を輸血液と混合するための方法に関する。これは、細胞の崩壊が原因で放出された鉄に対するキレーターを提供するだけでなく、貧血の処置に対してより生理的な又は生物が利用可能な形態で、その鉄を体に利用可能にする働きもする。
【００９６】
頻繁に輸血を必要とするある患者集団は、サラセミア患者である。この集団は、過剰な鉄蓄積が原因で最終的に肝損傷を罹患する。Ｈ−フェリチン及び／又はＨ−フェリチンを含むマルチサブユニットフェリチン複合体は、より効率的に体中に鉄を分配するのを手助けすることができるので、肝臓中の過剰な蓄積を制限することができる。頻繁に輸血を受けている別の集団は新生児であり、特に未熟児である。Ｈ−フェリチン、Ｈ−フェリチンを含むマルチサブユニットフェリチン複合体及び／又はフェリチン−鉄複合体を輸血液とともに与えると、脳への鉄分配はもちろん全体的に鉄分配を改善すると考えられる。
【００９７】
Ｈ−フェリチンサブユニットを含めたフェリチンサブユニットを、患者の体内で発現することができる。本実施形態では、フェリチン−鉄複合体をｉｎ  ｖｉｖｏで形成する。宿主動物又は患者中に再注入するための安定的な形質転換体又は一過的にトランスフェクトした細胞のいずれかを作出するために細胞をｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクトする目的で、いくつかのプラスミドキャリヤー及びトランスフェクション試薬システムが利用可能である。適切な発現プラスミドは、トランスフェクション試薬と同様に市販品として入手可能であり、後者の多くはあらゆる型のカチオン性リポソームである。遺伝子治療などのｉｎ  ｖｉｖｏ並びにｅｘ  ｖｉｖｏでの遺伝子導入に関しては、適切なベクターは当技術分野で既知であり、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター及びエレクトロポレーションシステムが含まれる。
【００９８】
本発明の他の態様及び利点は、以下の例示的な実施例を考慮することにより理解されよう。これらの実施例は、決して本発明の範囲を制限するものとして解釈すべきでない。当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に変更を施すことができ、さらに本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様又は類似の結果を得ることができることを認識すべきである。
【００９９】
本出願中に引用する全ての参考文献、刊行物及び特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１００】
（例１）
フェリチンの取り込み及び輸送
方法
フェリチンの調製
本実施例の全ての実験は、組換えヒトＨ−フェリチン又はウマ脾臓フェリチンを使用した。組換えヒトＨ−フェリチンは、組換えヒトＨ−フェリチンプラスミドでＢｒ２１コンピテントセルを化学的に形質転換して調製した。この細胞を増殖させた後、ニッケルタンパク質フィルターカラムを用いてタンパク質を精製して、２．８ｍｇ／ｍｌの終濃度とした。ウマ脾臓フェリチンは市販品として入手し（Ｓｉｇｍａ）、約９０：１０のＬ−フェリチンサブユニットとＨ−フェリチンサブユニットを含むのでこれを選択した。
【０１０１】
細胞培養及び単層内皮細胞の調製
本発明者等は、血液脳関門（ＢＢＢ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとしてウシの網膜内皮細胞（ＢＲＥＣ）を使用して、フェリチンは内皮細胞層を越えて輸送され得るという仮説を試験し、及びＢＢＢを超えるフェリチン輸送機構に取り組み始めた。この十分研究されたモデルは、血液神経関門の必要な特性及び属性を全て持っていることが示されている（Ａｎｔｏｎｅｔｔｉ  Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８０：６６７−６７７，２００２）。ウシの眼を地域の屠殺場から得て、ウシの網膜内皮細胞（ＢＲＥＣ）単離し、以前に公表された手順（Ｇａｒｄｉｎｅｒ  Ｔ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．７２：４３９−４４４，１９９５）に従って処理した。ＢＲＥＣを、１０％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＩＥＮＤＯ  ＧＲＯ（商標）（ＶＥＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｅｎｓｓｅｌａｅｒ、Ｎ．Ｙ．、ＵＳＡ）、０．０９ｍｇ／ｍｌヘパリン、抗生物質／抗真菌剤溶液（Ｇｉｂｃｏ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．、ＵＳＡ）及びタイロシン抗生物質（Ｓｉｇｍａ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）中で増殖させた。細胞が少なくとも８０％のコンフルエンスに達するまで、細胞をフラスコ中で最初に培養する。続いてこのＢＲＥＣを穏やかにトリプシン処理して、ＣＯＳＴＡＲ（登録商標）ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（商標）０．４μｍ多孔性フィルター（Ｃｏｍｉｎｇ、Ａｃｔｏｎ  Ｍａｓｓ．）上でコンフルエンスまで増殖させた。フィブロネクチンを１μｇ／ｃｍ２の濃度で加えて、フィルターへの接着を促進した。次いでこの細胞を洗浄して、１００ｎｍヒドロコルチゾンを補充した無血清無ＥＧＦのＭＣＤＢ−１３１培地に７２時間移した。これらの細胞培養にヒドロコルチゾンを加えることによって、密着結合形成を促進した。
【０１０２】
ＢＢＢモデルにおけるフェリチン輸送
あらかじめ精製済みのトランスフェリンを購入し、再懸濁して２．５ｍｇ／ｍｌの終濃度にした。約２５０μｇの組換えヒトＨ−フェリチン、ウマ脾臓フェリチン（Ｓｉｇｍａ）及びトランスフェリンを、１００ｍＭカーボネート／バイカーボネート緩衝液、ｐＨ９．０中でフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で標識した。過剰な又は加水分解したＦＩＴＣを、５ｍｌのＧ−２５脱塩カラムを通して除去した。ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ（登録商標）濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、１０，０００ＭＷＣＯ）中で、ＦＩＴＣでコンジュゲートされたＨ−フェリチン、脾臓フェリチン及びトランスフェリンを濃縮し、緩衝液をＰＢＳに交換した。トランスフェリンは、ＢＲＥＣモデルにおける陽性輸送対照として含めた（Ｂｕｒｄｏ  Ｊ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １２１：８８３−８９０，２００３）。
【０１０３】
コンフルエントなＢＲＥＣ単層を超える流動速度を、方程式：（Ｂｆ／Ｔｊ）＊（Ｖｂ／Ａ）＝（流動）＊ｔを用いて、若干の改変を加えてＢｕｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３で以前に記載されているように決定した。簡単に述べると、ＢＲＥＣをトランスウェル装置中でコンフルエンスまで増殖させてから、１４０μｇのＦＩＴＣで標識されたｒＨ−フェリチン、脾臓フェリチン又はトランスフェリンのいずれかを上部チャンバー（頂端部）に加えた。トレーサーの輸送は、トレーサーを頂端部チャンバーに加えた後の様々な時間（１５、３０、４５、６０、１２０、１８０及び２４０分）で回収した下部チャンバー（基底部）由来の１００μｌのアリコートから試料採取することによって決定する。次いで、基底部チャンバー由来のアリコートを、分光蛍光光度計（ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）ＧＥＭＩＮＩ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）中で蛍光について分析する。流動速度は、単位量の上部チャンバーの蛍光あたりの下部チャンバーの蛍光（Ｂｆ／Ｔｆ）対時間（ｔ）のプロットから勾配（ｃｍ／ｓ）として得る。ここで、単層を越えて輸送されたトレーサーの量を指し示すＢｆは、基底部チャンバーの容量（Ｖｂ）、さらに輸送に利用可能な表面積（Ａ）に対して標準化する。上部チャンバーのＴｆ濃度は、実験が実施される４時間にわたって有意に変化しないので、流動の計算に関して一定であると考えられる。上部チャンバー中の蛍光量は、輸送アッセイ（４時間）の終わりに１００μｌのアリコートから得る。
【０１０４】
傍細胞流動の対照として、ＲＩＴＣデキストラン（７０ｋＤａ）を対照として頂端部チャンバーに同時に加えた。デキストランは、感知できるほどのレベルで内皮細胞によって取り込まれない（Ｒａｕｂ  Ｔ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４９：１４１−１５１，１９９１）。したがって、基底部チャンバーのデキストランのいかなる蓄積も傍細胞輸送によるものと考えられる。いずれの条件もデキストランの流動速度に影響を及ぼさず、その速度は各条件で最小であった。
【０１０５】
化学発光システムも使用して、基底部チャンバー中のＦＩＴＣで標識されたｒＨ−フェリチンを免疫学的に検出した。基底部培地を回収し、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ濃縮器を用いて１．５ｍｌから１００μｌに濃縮した。この濃縮した培地をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、４６２ｎｍで蛍光下でゲルを画像化した。続いて、タンパク質をメンブレンにトランスファーし、ｒＨ−フェリチンに対する抗体を用いて免疫ブロット分析を実施した。これらの実験によって、図４Ｂで示すように、ＦＩＴＣがｒＨ−フェリチンに結合していることが実証された。
【０１０６】
輸送機構の決定
ピノサイトーシスがフェリチン輸送に有意に貢献するかどうかを決定するために、５０μｇ／ｍｌのフィリピンをトランスウェル装置の頂端部チャンバーに３０分間加えてからフェリチン及びデキストランを加えた。フィリピンの添加は、ピノサイトーシスを介する非特異的な輸送作用を阻害することが示されている（Ｓｔｒｅｍｍｅｌ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｐｉｄｓ  ３６：９８１−９８９，２００１）。Ｈ−フェリチンの取り込みがクラスリン依存的なエンドサイトーシスを介して起こるかどうかを決定するために、カリウム欠損培地（１００ｍＭ  ＮａＣｌ／５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）中で試験した。カリウム欠損培地中で１０分間細胞をインキュベートしてから、フェリチンを加えた。細胞内カリウムの枯渇は、クラスリン被覆ピットを介して起こる、レセプター媒介性エンドサイトーシスプロセスを阻害する。これらの後者の実験は、デキストラン輸送の増大によって示されるようなカリウム枯渇によって完全な状態の細胞間結合が変化する前に、１時間のみ行うことができる。各処理条件（又は標準）を最低でも６回行った。実験全体を通して培養を視覚的に評価して、実験上の処理及び操作が細胞生存率に影響を及ぼさないことを確認した。ベースライン実験と同様に、完全な状態の密着結合の指標としてＲＩＴＣデキストランを含めた。異なる条件下のＦＩＴＣ  ｒＨ−フェリチンの平均間の差は、一元配置分散分析を用いて分析した。有意な差がある平均を用いた測定用に、ボンフェローニの事後比較を行ってペアワイズ差を分析した。有意性レベルは、ｐ＜０．０５に設定した。
【０１０７】
結合実験
１２５Ｉ−組換えヒトＨ−フェリチン又はウマ脾臓フェリチンを用いて、ＢＲＥＣ細胞ホモジネートでの結合実験を、第４継代のＢＲＥＣ細胞で２連で実施した。両者の比活性は約３４０，０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌであった。全体、特異的、非特異的結合を確定するために、様々な濃度の１２５Ｉ−Ｈ−フェリチンを、１０００倍モル過剰な未標識のｒＨ−フェリチンとともに又はそのまま、ＢＲＥＣ細胞ホモジネートの全タンパク質１００μｇに加えた。結合緩衝液は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１％ＢＳＡからなっていた。インキュベーションは２２℃で２時間行った。３ｍｌの氷冷５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを加えて結合を終了させた。細胞回収機を用いて、５％の脱脂粉乳及び０．１ｍｇ／ｍｌのウマ脾臓フェリチンで前もってコーティングしたＷｈａｔｍａｎのガラスファイバーＣフィルターを通して急速濾過洗浄することによって、結合放射能を単離した。
【０１０８】
平衡競合結合アッセイを実施し、濃度を増大させた未標識のＨ−フェリチンを、前に記載したのと同じ結合緩衝液中で１２０分間０．４ｎＭの１２５Ｉ−ｒＨ−フェリチンとともに、ＢＲＥＣホモジネートのタンパク質２５μｇと２２℃でインキュベートした。結合の終了、膜の単離及び特異的結合の計算は、先に記載したように実施した。
【０１０９】
ラットの脳微小血管系
６匹の雄の成体ラットを使用して、それぞれの微小血管を調製した。ラットは、致死量のペントバルビタールナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔をかけて、次いで断頭した。脳を取り出して、氷上のペトリ皿に置いた。小脳及び髄膜を取り出して、プロテアーゼインヒビターを含む、５倍量の微小血管緩衝液（１×ＭＶＢ、１×塩、１×ＨＥＰＥＳ、０．５％ＢＳＡ及び５ｍＭグルコース）を加えた。ガラス−テフロン（登録商標）ホモジナイザー（０．２５ｍｍクリアランス）を用いて２０ストロークで穏やかに脳をホモジナイズして、ホモジネートを１０００×ｇで１０分間４℃で遠心分離した。上清を捨てて、ペレットを５倍量の１７％デキストラン（１：１の比の１×塩及びデキストランを含んでいる１×ＨＥＰＥＳ）に再懸濁し、続いてボルテックスし、次いで３０００×ｇで４℃で遠心分離した。微小血管をチューブ壁から回収し、２０ｍｌの１×ＭＶＢ緩衝液に再懸濁した。この微小血管を、１２０μｍメッシュを通して濾過した。次いで、この微小血管調製物を、４０μｍメッシュ上に支持されたガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ）への接着によってさらに精製した。このビーズを、プロテアーゼインヒビターが添加された緩衝液で洗浄した。このビーズを５ｍｌのＭＶＢ中ですすぎ、次いで、１０００×ｇで１５分間４℃で遠心分離することによって微小血管を沈殿させた。この微小血管を１ｍｌのＨＥＳ＋（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５０ｍＭショ糖、ｐＨ７．４及びプロテアーゼインヒビターカクテル）（Ｓｉｇｍａ）中に再懸濁し、全タンパク質濃度を測定した。この試料は、使用するまで−８０℃で保存した。
【０１１０】
微小血管におけるフェリチンの結合
結合懸濁液は、２５０μｌの最終容量で、１μＭの未標識のｒＨ−フェリチンを添加した又は添加していない、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１％ＢＳＡ及び２０μｇの膜タンパク質調製物からなっていた。３ｍｌの氷冷５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを加えて結合を終了させた。結合した放射能を、０．１ｍｇ／ｍｌの脾臓フェリチンを含む５％脱脂粉乳（Ｂｌｏｔｔｏ）溶液中で前もってコーティングしたＷｈａｔｍａｎガラスファイバーＣフィルターを通して急速濾過することによって単離した。この組み合わせは、放射標識されたタンパク質のフィルターへの非特異的結合を加えた総カウントの１〜３％まで低減するように経験的に決定した。このフィルターを、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む３ｍｌの氷冷５０ｍＭ  Ｔｒｉｓで５回洗浄した。フィルターを、ＭＩＣＲＯＭＥＤＩＣ４／２００と自動ガンマ測定器中で測定した。特異的結合を、過剰な未標識のｒＨ−フェリチンが存在しない場合の結合（総結合）から過剰な未標識のｒＨ−フェリチンの存在下での（非特異的結合）結合を引くことによって計算した。
【０１１１】
飽和分析
各結合実験は２連で実施した。２５０μｌの最終容量で、１μｍの未標識のｒＨ−フェリチンを添加した又は添加していない、２０μｇの膜タンパク質調製物を含む、先に記載したのと同じ結合緩衝液からなる結合懸濁液に、増大させた濃度の１２５Ｉ−ｒＨ−フェリチンを加えた。２２℃で１２０分インキュベートした後、結合を終了させ、先に記載したように、全体、非特異的及び特異的結合を計算した。
【０１１２】
競合アッセイ
増大させた濃度の未標識の競合物（ｒＨ−フェリチン及び脾臓フェリチン）を、０．４ｎＭの１２５Ｉ−ｒＨ−フェリチンの存在下で先に記載したのと同じ結合緩衝液中で１００μｇの膜タンパク質とともに６０分間２２℃でインキュベートした。結合、結合の終了、膜の単離、及び特異的結合の計算は、先に記載したように実施した。競合実験は２連で行った。
【０１１３】
Ｉｎ  ｖｉｖｏでの取り込み試験
ｒＨ−又は脾臓フェリチン（１．２ｍｇ）を、４０μｌの１ｍＭニトリロ三酢酸（ｐＨ６．０）、０．５μｌ硫酸第一鉄アンモニウム、２μｌの０．５Ｍ重炭酸ナトリウム及び４０μＣｉの５９ＦｅＣｌ中で４時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、フェリチンを１×ＰＢＳ中の１０，０００ＭＷカートリッジ内で２４時間透析して、いかなる未結合５９Ｆｅも除去した。比活性は、ｒＨ−フェリチンについては０．０４μＣｉ／ｇであり、脾臓フェリチンについては０．０８μＣｉ／ｇであった。放射標識されたタンパク質（３．４μｇ／グラム重）を、雌のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（体重約３５０ｇ）の尾静脈に注射した（ｎ＝３）。４８時間後に、ラットを断頭し、器官を直ぐに取り出した。各器官を切り離し、０．１ＭのＰＢＳ中で十分にすすいだ。脳に関しては、小脳から大脳を取り出して二等分し、髄膜は脳から切除除去した。各器官由来の組織１グラム（湿重量）を用いて、鉄取り込みを測定した。
【０１１４】
器官中のおそらく障害が起きた鉄管理が、フェリチン鉄送達に影響を与え得るかどうかを決定するために、Ｈ−フェリチン欠損マウスを実験モデルとして評価した。マウスは腹腔内に注射したことを除いて、ラットに関して先に記載したのと類似のアプローチを用いて、対照及びＨ−フェリチン欠損マウスでフェリチンの取り込みを調べた。ｒＨ−フェリチンについての比活性は０．０６μＣｉ／ｇであり、脾臓フェリチンについては０．３１μＣｉ／ｇであった。フェリチンを注射し、マウスを屠殺して器官を取り出すまで４８時間血流中を循環させた。
【０１１５】
ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）ベースの、シングルチャンネルアナライザーウェルカウンターシステム（Ｃａｎｂｅｒｒａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）で、各器官の放射能量を１分間測定した。ガンマカウント／分（ｃｐｍ）をバックグラウンドカウントから引き、カウンターの効率で割り、次いで崩壊カウント／分で割って、μＣｉを計算した。全体％を計算するために、器官のμＣｉを注射した総μＣｉで割って、次いで１００％を掛けた。
【０１１６】
結果
フェリチンに結合した鉄のｉｎ  ｖｉｖｏでの取り込みを、放射標識された５９Ｆｅを含むｒＨ−フェリチン又は脾臓フェリチンを成体のラットの尾静脈に注射することによって試験した。ｒＨ−フェリチンからの鉄の取り込みは、脳、心臓、腎臓、筋肉及び肺において、脾臓フェリチンからの鉄の取り込みよりも有意に大きかった（図１Ａ）。５９Ｆｅの量は、それがｒＨ−フェリチンと結合して存在する場合、脾臓フェリチンと比較して脳内で２倍多かった（ｐ＜０．００５）（図１Ｂ）。肝臓のみが、脾臓フェリチンからの鉄の取り込みがｒＨ−フェリチンと比較して有意に高かった（ｐ＜０．０５）。
【０１１７】
ｒＨ−フェリチン及び脾臓フェリチンの様々な器官への鉄送達に対する、様々な器官内の鉄貯蔵能力の潜在的な変化の影響を解明するために、本出願人らは、これらのタンパク質からの５９Ｆｅの取り込みをＨ−フェリチンを欠損するマウス系統で調べた（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｋ．Ｊ．，Ｆｒｉｅｄ  Ｍ．Ｇ．，Ｚｈｅｎｇ  Ｙ．，Ｂｏｙｅｒ  Ｐ．，Ｃｏｎｎｏｒ  Ｊ．Ｒ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１５：２１６５−２１７７，２００２）。ｒＨ−フェリチンによる鉄送達は、同腹子対照と比較して、Ｈ−フェリチンを損なったマウスの脾臓、肺及び筋肉で低下した（ｐ＜０．０５）（図２Ａ）。類似の発見が脳で観察された（図２Ｂ）。脾臓フェリチンの取り込みは、鉄貯蔵が損なわれたマウスのいずれの器官でも変化しなかった（図３Ａ及び３Ｂ）。
【０１１８】
血清フェリチンは、非制限的に全身の器官にアクセスできたかもしれないが、脳に鉄を送達するためには内皮細胞関門（ＢＢＢ）を通過しなければならない。フェリチンの経細胞輸送が起こるかどうか調べるために、本出願者らはＢＢＢの細胞培養モデルを利用した。脾臓フェリチンではなくＨ−フェリチンがＢＲＥＣ細胞単層を越えて相当量輸送された（図４Ａ）。ＢＲＥＣ単層を越えて輸送された、ＦＩＴＣで標識されたＨ−フェリチンの速度は、ＲＩＴＣで標識されたデキストランよりも５倍大きかった（ｐ＜０．００１）。脾臓フェリチンの輸送速度は、デキストラン対照で見られるレベルと類似していた。Ｈ−フェリチンが経細胞輸送される機構を決定するために、本出願者らは、カリウムを含まない培地中で輸送アッセイを実施して、クラスリン被覆小胞を阻止した。クラスリン被覆形成を欠くことは、Ｈ−フェリチン輸送速度の８０％（ｐ＜０．００１）低下と関係があった。それとは対照的に、ピノサイトーシスを阻止するためのＢＲＥＣのフィリピン前処理は、速度を有意に低下しなかった。デキストラン対照は各実験条件に含まれており、速度は、未処理条件に対するグラフに示される速度から変化しなかった（データ非表示）。トランスフェリン輸送は陽性対照として含め、以前に報告されたように（Ｂｕｒｄｏ  Ｊ．Ｒ．，Ａｎｔｏｎｅｔｔｉ  Ｄ．Ａ．，Ｗｏｌｐｅｒｔ  Ｅ．Ｂ．，Ｃｏｎｎｏｒ  Ｊ．Ｒ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １２１：８８３−８９０，２００３）検出した。蛍光標識したトランスフェリン及びフェリチンの比活性が異なっていたので、これら２種のタンパク質に関して、輸送の相対的速度について結論することはできない。
【０１１９】
フェリチンを介する脳への鉄送達機構をより十分に評価するために、結合試験を実施して、ＢＲＥＣモデルのフェリチン輸送がレセプター媒介性であるかどうかを決定した。さらに、フェリチン結合の評価をｉｎ  ｖｉｖｏ系まで拡大するために、微小血管をラットの脳から単離した（ＲＢＭＶ）。ＢＲＥＣ及びＲＢＭＶへのフェリチン結合は、飽和実験及び競合実験を使用して実施した。ＧＲＡＰＨＰＡＤ  ＰＲＩＳＭ（商標）４．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．）において非線形回帰を用いてＫｄ及びＢｍａｘ値を得た。
【０１２０】
様々な濃度（１、２、３、５、７及び１０ｎＭ）の１２５Ｉ標識フェリチン（ｒＨ−フェリチン又は脾臓フェリチン）を１００μｇの組織（ＢＲＥＣ又はＲＢＭＶ）とともにインキュベートした。（１０００ｎＭの未標識のフェリチンの存在下における）全体及び非特異的結合を、Ｗｈａｔｍａｎフィルター上でアッセイすることによって得た。こうした結合アッセイからＫｄ及びＢｍａｘを得るために、一部位結合に対する非線形グローバル回帰を実施した。本方法では、全体及び非特異的結合の両方を標識フェリチンの濃度に対してプロットした。得られたプロットを、方程式：非特異的＝ＮＳ＊Ｘ、及び全体＝特異的＋非特異的（式中、特異的＝Ｂｍａｘ＊Ｘ／（Ｋｄ＋Ｘ））に適合させた。グローバルアプローチでは、特異的結合は全体及び非特異的結合のデータに由来しない。その代わりに、Ｋｄ及びＢｍａｘの値は、２つのデータセット（全体及び非特異的）間の非特異的結合定数（ＮＳ）を共有することによって得る。この回帰分析からのデータを図５Ａ及び５Ｂに示す。ｒＨ−フェリチンのみが、ＢＲＥＣ又はＲＢＭＶのいずれかに対して有意な飽和結合を有する。ＲＢＭＶに関するＫｄ及びＢｍａｘは、それぞれ、７．９±１．６ｎＭ及び５７２．６±６４．０ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質である。ＢＲＥＣに関しては、Ｋｄが２．７±０．９ｎＭであり、Ｂｍａｘが４６５．７±６３．１ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質である。曲線適合のＲ２値は、ＢＲＥＣ及びＲＢＭＶの両方について＞０．８である。
【０１２１】
様々な濃度の未標識のフェリチン（０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００及び１０００ｎＭ）を、０．４ｎＭの放射標識されたフェリチンと一緒に、１００μｇのＢＲＥＣ又はＲＢＭＶ組織でインキュベートした。全体結合を、Ｗｈａｔｍａｎフィルター上でアッセイすることによって得た。次いで、この全体結合（ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質）をｌｏｇ［濃度（ｎＭ）］に対してプロットした。次いで、これらのプロットを一部位競合方程式：全体＝底部＋（上部−底部）／（１＋１０（Ｘ−ＬｏｇＥＣ５０））に適合させた。これらのデータを図６Ａ及び６Ｂに示し、これらのデータは、脾臓フェリチンではなくｒＨ−フェリチンが結合部位に関して効率的に競合できることを示す。ＢＲＥＣに関する競合曲線からＫｄ及びＢｍａｘを決定することによって、２．０ｎＭのＫｄ及び２３５．１ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質のＢｍａｘを得た。ＲＢＭＶの対応する値は、Ｋｄ＝３．４ｎＭ及びＢｍａｘ＝３０４．６ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質である。適合のＲ２値は、ＢＲＥＣ及びＲＢＭＶの両方に関して＞０．９５である。データを計算するのに用いた２つの方法は、有意差がなかった。
【０１２２】
Ｈ−フェリチンに対する特異的レセプターであるＴｉｍ−２が同定され、それは、脳、肝臓、腎臓及び免疫細胞で発見された（Ｔｏｄｏｒｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  １０７：１４９５−１５０５，２００８；Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０２：９５５−９６５，２００５；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０２：４３７−４４４，２００５）このレセプターが消化管にも存在するかどうかを解明するために、Ｈ−フェリチンレセプターに対して特異的な抗体を用いて、ラットの消化管中のＨ−フェリチンレセプターの位置を特定した。成体の雌ラットの十二指腸を凍結し、１０μｍの厚さの切片を免疫細胞化学用に調製した。切片を、一次抗体（ウサギ抗Ｔｉｍ−２）とともに一晩４℃でインキュベートした。切片を洗浄し、ＦＩＴＣで標識されたＩｇＧ二次抗体とともに、室温で１時間インキュベートした。細胞の核をＤＡＰＩで染色した。切片を蛍光顕微鏡で調べた。図１５は、細胞の核（ａ）、Ｈ−フェリチンレセプター（ｂ）及びラット十二指腸中の２重染色（ｃ）を示す写真画像である。Ｈ−フェリチンレセプターは、腸絨毛上に存在し、これはレセプター媒介性吸収に関与し、このことにより、Ｈ−フェリチンが消化管からそのまま吸収され得ることが示される。
【０１２３】
考察
これらの研究結果は、フェリチンが消化管及び脳を含めた多数の器官に鉄を送達できることを明らかにする。さらに、肝臓を除く大抵の器官については、Ｌ−フェリチンの代わりにＨ−フェリチンを介して鉄が送達される場合に、フェリチンによって送達される鉄の量は増大する。Ｈ−フェリチン欠損マウスにおいて示したように、細胞に取り込まれるＨ−フェリチン鉄の量は、鉄貯蔵能力が損なわれる場合に変化し得るが、このモデルでは、Ｌ−フェリチンによる鉄送達は有意に影響されない。こららの結果は、Ｈ−フェリチンに関するフィードバックシステムを示唆する。したがって本出願者らは、脳への鉄送達の新規な輸送系、及びトランスフェリン（最大限２個のＦｅ原子）と比較した場合のフェリチン１分子中に収容され得る鉄の量（４５００Ｆｅ原子まで）を考えると非常に重要であり得る輸送系を同定した。非トランスフェリン依存的な脳への鉄送達システムの同定は、血清トランスフェリン非存在下での脳への鉄送達を示す本発明者らの以前の報告（Ｍａｌｅｃｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．５６：１１３−１２２，１９９９）と矛盾がない。
【０１２４】
脳内では、レセプターへの結合に加えて、フェリチンはＢＢＢを越えて経細胞輸送されなければならない。本出願者らは、フェリチンはＢＢＢの細胞培養モデルを越えて輸送できることを示した。この細胞培養モデルでのフェリチン輸送は、クラスリン依存的であり、レセプター媒介性であり、Ｈ−フェリチンを強く好む。Ｈ−フェリチン結合に対する選好性は、輸送のデータと矛盾がない。フェリチンの結合はラットの脳由来の微小血管においても示され、細胞培養モデルと類似して、この結合もＨ−サブユニットを強く好んだ。結合及び輸送のデータは、鉄が脾臓（Ｌに富む）フェリチンと比べてＨ−フェリチンに結合する場合は、脳への送達が増大することを明らかにした鉄取り込みのデータと矛盾がない。
【０１２５】
ＢＢＢ及び他の器官でのレセプターに結合するフェリチンの供給源は、おそらく血清である。血清中にフェリチンが存在することは十分確証されているが、血清フェリチンは主としてＬ−フェリチンであると従来に考えられている。このＬに富む血清フェリチンの供給源は、主に崩壊したマクロファージ由来である（ＭｃＧｏｗａｎ  Ｓ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１１１：６１１−６１７，１９８８）。しかし本出願者らは、レセプターへのフェリチンの結合、脳へのフェリチン輸送及び鉄送達は全て、Ｈに富むフェリチンを強く好むことを驚くべきことに示した。
【０１２６】
（例２）
Ｈ−フェリチンの食事性送達
本出願者らは、酵母ゲノム中にＨ−フェリチン遺伝子が組み込まれている組換え酵母を用いて、栄養補助食品としてｒＨ−フェリチンを送達する機構を発明した。最初に、酵母を形質転換してヒトＨ−フェリチン遺伝子を発現させた。これは、Ｈ−フェリチンタンパク質に翻訳され得る。図７に示す免疫ブロットは、ｒＨ−フェリチンタンパク質が酵母によって産生されること、及びＨ−フェリチン抗体がＬ−フェリチンと交差反応しないことを示す。形質転換酵母中のｒＨ−フェリチンの鉄含有量に対する培養培地中の鉄濃度の影響に関して試験した。標準的な量の鉄を含むＹＥＰＤ培地及び鉄を補充した培地（ＹＥＰＤ＋６ｍＭ  ＦｅＳＯ４）中で酵母を増殖させた。結果を図８に示す。図８のレーン３の試料に関する組換え酵母は、鉄が豊富な培地で増殖させ、一方レーン４の試料に関する酵母は、標準的な鉄条件下で増殖させた。鉄が豊富な培地で増殖させた酵母由来のフェリチンは、標準的な培地で増殖させた酵母の２〜３倍の鉄を含むと考えられる。
【０１２７】
方法
組換え酵母の構築
酵母の構成的なＴＤＨ３転写プロモーターの制御下でヒトＨ−フェリチンを発現する、図１６に示す出芽酵母用のＨ−フェリチン発現カセットは、ｐＡＧ４２６ＧＰＤ−ｃｃｄＢ（ＡｄｄＧｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）に由来するプラスミドＲＬＫ／ｐＬ５６５９からＰＣＲによって、Ｈ−フェリチンのコード配列及びＵＲＡ３遺伝子を挿入して作出した。このＰＣＲ産物を酵母系統ＢＹ４７４１に形質転換し、例えばＨｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７５：１９２９−１９３３，１９７８に記載されているような標準的な方法を用いて、酵母染色体に組み込ませた。この発現カセットを含む酵母形質転換体を選抜マーカーを介して回収し、形質転換酵母の可溶化液を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中でガラスビーズを用いて調製した。ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって測定した２５μｇの全タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、ニトロセルロースフィルターにトランスファーした。このブロットを、１：２０００に希釈したＨ−フェリチンのポリクローナル抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ  ＰＡ  １１９２）でプローブした。二次抗体は１：５０００に希釈した抗ウサギＩｇＧ（ＧＥ  Ａｍｅｒｓｈａｍ）とし、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−ＥＣＬ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いてシグナルを検出した。図１７に示した結果は、組換えＨ−フェリチンの発現量は染色体組み込み部位に依存することを示す。染色体に組み込まれたＨ−フェリチン発現カセットを含む組換え系統ＲＬＫ３１９０は、他の染色体組み込み部位と比較して劇的に高いレベルのヒトＨ−フェリチンを予想外に発現した。このレベルは、多コピーのＨ−フェリチン発現カセットを有する染色体外プラスミドを含むＲＬＫ３１７７系統によって産生されるＨ−フェリチン量に匹敵するかそれを超える。ＲＬＫ３１９０では、発現カセットは、発現カセット上のＴＤＨ３プロモーターと染色体遺伝子との間の相同性に基づく相同組換えによって、ＴＤＨ３の染色体位置で組み込まれた。このカセット及び他のものは、当技術分野の標準的な技術を用いて、この部位での挿入に関して容易に操作することができる。
【０１２８】
ＲＬＫ３１９０系統の発現カセットは、酵母染色体のＴＤＨ３遺伝子座に組み込まれた場合、ヒトＨ−フェリチンを高レベルで構成的に産生する。酵母形質転換体を鉄が豊富な培地（例えば６ｍＭ  ＦｅＳＯ４）で増殖させる場合、この酵母は、処置効果目的には十分高い濃度である、少なくとも５０，０００ｐｐｍの乾燥細胞重量の細胞鉄含有量を獲得する。
【０１２９】
摂取試験
鉄欠乏症の標準的な前臨床動物モデルを用いて、我々は、鉄欠乏症を処置するためには、フェリチンを発現し、鉄を補充された酵母は、硫酸第一鉄を投与するという標準的なアプローチより優れていることを示した。
【０１３０】
十分に確立されたラットモデルを用いて、摂取試験をラットで行った。この試験は、フェリチンが富化された酵母の効果を、鉄補給の標準、すなわち硫酸第一鉄と直接的に比較するように設計した。２０日齢のラットを、ケージあたり１匹飼育し、鉄欠乏食（ＩＤ；３ｐｐｍ鉄）を与えた。全てのラットは、１２：１２時間の明／暗周期（午前６：００から午後６：００まで点灯）で維持された、温度（２３±２℃）及び湿度（４０％）が制御された部屋で、食糧及び脱イオン蒸留水が適宜与えられた。ＩＤ食は、炭水化物の唯一の供給源としてトウモロコシデンプンを有する、米国国立栄養研究所（ＡＩＮ）−９３Ｇ食のレシピに従って調製した。この食事の鉄レベルは、硝酸で消化後に原子吸光光度法を用いて確認した。
【０１３１】
ＩＤ食を開始後３〜４日毎に合計５０μｌの血液を各ラットから回収して、ヘマトクリット及びヘモグロビンのレベルをモニターした。鉄欠乏食を摂取させてから２３日（出生後日数４３）後では、ヘモグロビンレベル及び平均ヘマトクリットレベルの平均は、それぞれ５．４７±０．２４及び２１．６７±０．３％であった。次いで、ラットを無作為に３群（ｎ＝４／群）に分けた。
【０１３２】
各食事は、基本食としてのＩＤ食（３ｐｐｍ鉄）で調製した。鉄補充酵母（フェリチンは発現しない）又は硫酸鉄を５０ｐｐｍまでＩＤ食に加えて、対照食を作製した。ラットは指定された食事が適宜与えられ、ヘモグロビン及びヘマトクリットのレベルを出生後日数６１（合計１７日）まで３〜４日毎に再び測定した。食糧摂取量は全摂取期間にわたって測定し、群の間で違いはなかった。ラットをＰ６１で安楽死させ、血液学的測定値及び脳測定値を測定した。
【０１３３】
結果を図９に示す。ＩＤ食を続けている動物は、ヘモグロビン（Ｈｂ）レベルが最も低かった。鉄なしの酵母が与えられた動物は、ＩＤ動物と類似したＨｂレベルであった。Ｈｂレベルの改善が他の３群で見られ、鉄が補充され及びフェリチンで強化された酵母を与えられた動物で最も急速な改善の増大が起こった。フェリチンなしの鉄補充酵母を与えた動物でさえ、ＦｅＳＯ４群よりも優れたＨｂレベルの改善を示した。
【０１３４】
ヘマトクリットレベルも同じ群の動物でモニターした。これらのデータを図１０に示す。これらのデータは、鉄用ビヒクルとしての酵母は、Ｈ−フェリチンが存在する場合又は存在しない場合においてヘマトクリットを是正するのに同程度に有効であり、両方とも、現在の標準的な処置選択であるＦｅＳＯ４よりも著しく優れていることを示す。ＩＤ食を続けた動物及び鉄を補充しなかった酵母を与えた動物は、試験した１７日間にわたってヘマトクリットの増加を示さなかった。
【０１３５】
鉄を動員するための身体能力を示す重要な分析、間接的には鉄の生物学的利用能の尺度は、トランスフェリン飽和レベルである。トランスフェリンは主要な鉄動員タンパク質であり、高濃度で血清中に見出される。トランスフェリン飽和は、正常な高値の３０％から貧血状態の１０％未満まで上下する。フェリチンを強化した鉄補充酵母の効果を評価するのに本出願者らが使用した動物モデルにおけるトランスフェリン飽和分析を図１１に示す。これらのデータは、フェリチンを強化した鉄補充酵母がトランスフェリン（Ｔｆ）飽和を最も大きく増大させ、続いてフェリチンがない鉄補充酵母であったことを示す。この試験は、食事中のＦｅＳＯ４と比較した場合の、鉄送達ビヒクルとしてのフェリチン発現酵母の優位性を再度示す。ＩＤ食で維持された動物又は対照酵母（鉄又はフェリチン富化なし）を与えた動物は、Ｔｆ飽和が最も低かった。こうした研究は、フェリチンを強化した鉄補充酵母は、ヘモグロビンレベル、ヘマトクリット及び鉄の生物学的利用能の改善において食事性ＦｅＳＯ４よりも３倍まで有効であることを示し、鉄欠乏障害を処置するための優れた方法を提供する。さらに鉄欠乏動物は、フェリチンを強化した鉄補充酵母で処置してから速ければ１４日後に正常なヘモグロビン（４０〜５０％）及びヘマトクリット（１３．５〜１５．５）レベルに近づいた。
【０１３６】
摂取された鉄の量を基準にしてヘモグロビン、ヘマトクリット及びトランスフェリン飽和への影響を測定する場合は、鉄欠乏症処置におけるフェリチンを強化した鉄補充酵母の驚くべき優位性はより一層顕著である。図１８で示すように、摂取された鉄に基づくと、フェリチンを強化した鉄補充酵母は、ヘモグロビン、ヘマトクリット及びトランスフェリン飽和の改善において、現在の標準処置であるＦｅＳＯ４よりも２〜３倍有効であった。これらの結果は、鉄を送達するためには、Ｈ−フェリチンを用いることによって鉄の生物学的利用能が増大する場合は、正常なヘモグロビン及びヘマトクリットのレベルを回復させるのにより少ない鉄摂取しか必要とされないことを示す。
【０１３７】
脳の鉄への影響
鉄欠乏症は脳の発達に対して重大な影響があるので、特定の脳領域の鉄の状況を、異なる食事が与えられている動物でモニターした。発達的に重要な２つの脳領野、すなわち腹側中脳及び尾状核の鉄の状況を図１２に示す。これらの領野は、動物（例えばヒト）が成熟するにつれて比較的鉄が豊富になる運命にある。これらの脳領域は、運動活性の調節に関与し、故に、特に発達中に欠乏が起こる場合の鉄欠乏症での運動技能障害に関与する。Ｈｂ及びＨｃｔ分析で記載したのと同じ動物を１４日齢で屠殺し、腹側中脳（ＶＢＭ）及び尾状核の鉄濃度を測定した。Ｈ−フェリチンで強化され鉄を補充された酵母を与えられた動物は、両方の脳領域で、いずれの他の群よりも多くを有していた。この刺激的な発見は、フェリチンを強化した栄養補助食品は鉄欠乏症に付随する神経性障害を制限するための機構であり得ることを示す。この知見は、全体的な健康を高めることによってだけでなく、神経機能を最適化することによっても、世界規模の鉄欠乏症との戦いに対して多大な影響を有する可能性がある。
【０１３８】
脳の鉄状況の領域変化をさらに評価するために、他の２つの脳領野、すなわち中隔側座核（ＮＡ）及び前頭前野皮質（ＰＦＣ）を調べた。これらの結果を図１３に示す。この図では、フェリチンを強化した鉄補充酵母から送達される鉄の領域特異性が明らかである。ＮＡでは、図１２に示すＶＭＢ及び尾状核と類似して、他の鉄送達方式と比較して鉄含有量が増大する。しかしＰＦＣでは、フェリチンを強化した鉄補充酵母から送達される鉄は、他の群で見出されたものと類似している。これらのデータは、フェリチンを強化した鉄補充酵母からの鉄送達を差次的に調節する機構が存在することを示唆し、本発明者らの、脳微小血管系におけるＨ−フェリチンに対するレセプターの発見と矛盾がない。
【０１３９】
増大した脳への鉄取り込み、及びおそらくより重要なことに、取り込みの領域特異性は、予想外であるが本発明に関連する非常に重要な発見である。これらのデータは、フェリチンを強化した鉄補充酵母の使用は、生後発達期間中の鉄欠乏症に付随する神経性、認知性及び行動性の障害の改善をもたらすはずであることを示唆する。血液学的パラメーターに関するデータは疑いの余地なく強力であり、フェリチンを強化した鉄補充酵母は食事的栄養補給の優れた方式であることを示す。
【０１４０】
本明細書で説明された現時点で好適な実施形態への様々な変更及び改変は、当業者には明白であることを理解すべきである。そうした変更及び改変は、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく且つその付随する利点を減ずることなく行うことができる。したがって、そうした変更及び改変は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図７】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１６】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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