(57)【要約】  本発明は、試料中のミクロシスチン産生毒性シアノバクテリアを検出するための方法であって、環境試料から得た核酸を、Microcystis aeruginosa、Anabaena sp.およびPlanktothrix agardhiiに存在するmcyB遺伝子の核酸配列と特異的にハイブリダイズするプライマーと接触させる工程を包含する方法を提供する。さらに本発明は、本発明の方法に用いるために設計したプライマー、プライマーペアおよびプローブも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のミクロシスチン産生毒性シアノバクテリアの検出方法であって、以下の工程を包含する方法。
ａ）該試料中の細胞を溶解し、
ｂ）溶解した細胞から得られた核酸と、Microcystis aeruginosa、Planktothrix agardhiiおよびAnabaena sp.中に存在するmcyB遺伝子の核酸配列に特異的にハイブリダイズするプライマーとをポリメラーゼ連鎖反応用混合物中で接触させ、該プライマーは配列番号１、配列番号２、または配列番号３に示したmcyB遺伝子内の標的配列の少なくとも一部を増幅するものであり、
ｃ）工程ｂ）で得られた反応用混合物をポリメラーゼ連鎖反応に付し、該mcyB遺伝子の配列が試料中に存在する場合は、該配列を特異的に増幅し、そして
ｄ）増幅された核酸配列の存在を検出し、増幅されたmcyB遺伝子配列の存在をもって、試料中にミクロシスチン産生毒性シアノバクテリアが存在することの指標とする。
【請求項２】
プライマーの少なくとも１つが、以下の塩基配列からなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
5'-GCTTTAATCCACAAGAAGCTTTATTAGC-3'（配列番号４）
5'-AGATTTTAATCCACAAGAAGCTTTATTAGC-3'（配列番号５）
5'-GGTTTAATCAACAAGAGGCTTTATTAGC-3'（配列番号６）
5'-CTGTTGCCTCCTAGTTCAAAAAATGACT-3'（配列番号７）
【請求項３】
該ポリメラーゼ連鎖反応用混合物が、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応用であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
以下の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１種のプローブを反応に用いることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
5'-ACTGAATTATTGGAGGTAGAGGTGAGTGATAC-3'（配列番号８）
5'-CCTCTACCTCCAATAATTCA-3'（配列番号９）
5'-GGGTGAGTTATTAGAAGCAGAAGTTAGTAACAG-3'（配列番号１０）
5'-TTCTGCTTCTAATAACTCACC-3'（配列番号１１）
5'-GGGGTGAATTATTAGAAATAGAAGTAAGTGACAA-3'（配列番号１２）
5'-TTACTTCTATTTCTAATAATTCACC-3'（配列番号１３）
【請求項５】
該リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応が定量的ＰＣＲ反応であり、試料中のmcyB遺伝子のコピー数を決定するための工程をさらに包含する、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
定量的ＰＣＲによって得られた該遺伝子のコピー数と、対応するミクロシスチンの濃度とを相関させることによって、試料中の毒性ミクロシスチン濃度のモニタリングを行うための工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
配列番号４〜７に示した塩基配列のいずれかを含むヌクレオチドプライマー。
【請求項８】
配列番号４〜７に示した塩基配列のいずれかからなるものである、請求項７に記載のプライマー。
【請求項９】
２８〜４０ヌクレオチドを有するプライマーである、請求項７に記載のプライマー。
【請求項１０】
配列番号８〜１３に示した塩基配列のいずれかを含むヌクレオチドプローブ。
【請求項１１】
配列番号８〜１３に示した塩基配列のいずれかからなるものである、請求項１０に記載のプローブ。
【請求項１２】
４０ヌクレオチド未満のプローブである、請求項１０に記載のプローブ。
【請求項１３】
試料中のミクロシスチン産生毒性シアノバクテリアの検出のための、配列番号４〜１３の塩基配列からなる群より選ばれるヌクレオチドプライマーまたはヌクレオチドプローブの使用。
【請求項１４】
ミクロシスチン産生毒性シアノバクテリアが、Microcystis aeruginosa、Planktothrix agardhiiおよびAnabaena sp.からなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
請求項７〜９のプライマーの少なくとも１種を包含する、試料中のミクロシスチン産生毒性シアノバクテリアを検出するためのキット。
【請求項１６】
請求項１０〜１２のいずれかのプローブをさらに包含する、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応に使用するための、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
ミクロシスチン産生毒性シアノバクテリアが、Microcystis aeruginosa、Planktothrix agardhiiおよびAnabaena sp.からなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項１５に記載のキット。
【請求項１９】
試料中のミクロシスチン産生毒性シアノバクテリアの検出のための、請求項１５〜１８のいずれかのキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミクロシスチン産生毒性シアノバクテリアの環境試料からの検出の分野に関する。特に本発明は、上記毒性シアノバクテリアの検出のための、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイ法を提供する。さらに本発明は、本発明の方法のために設計した、プライマー、プライマーペアおよびプローブ等の材料も提供する。
【背景技術】
【０００２】
近年、世界中において、毒性シアノバクテリアブルームが科学会、関係機関および一般大衆の注目を集めている。シアノバクテリアの大量発生によって産生された毒素は、野生動物および家畜の死をもたらし（概要についてはStewart et al., 2008を参照）、ヒトの病気や死とも関連づけられている（Turner et al., 1990、Pilotto et al., 1997、Jochimsen et al., 1998）。ミクロシスチン、即ち、９０種を超える公知の構造異型を含む主要なシアノトキシン群を構成する環状ヘプタペプチド肝毒素（Welker and von Dohren, 2006）は、Anabaena、Microcystis、PlanktothrixおよびNostocの菌株によって産生されるものであり（Sivonen and Jones, 1999）、孤立した事象ではあるものの、ミクロシスチン産生性のHapalosiphon（Prinsep et al., 1992）、Phormidium（Izaguirre et al., 2007）およびFischerella（Fiore et al., 2009）についても報告がある。これら８属の内、淡水における肝毒素ブルームの原因となるものは、主としてAnabaena、MicrocystisおよびPlanktothrixである。シアノバクテリアブルームの動態および毒素産生機構をより深く理解し、これら現象に関連したリスクを予測するためには、種々のミクロシスチン異型および種々の毒素産生シアノバクテリアを簡便に検出するための方法が必要である。ミクロシスチンに対する継続的な低レベルの暴露は、肝臓癌発症リスクの上昇と関連づけられており（Yu, 1995、Ueno et al., 1996、Svircev et al., 2009）、これは上記方法の必要性をさらに強調するものである。
【０００３】
ミクロシスチン産生性およびミクロシスチン非産生性のシアノバクテリアを信頼性高く同定するのは困難である。形態学的に区別することのできない、同一種の毒性株と非毒性株の混ざったブルームは一般的である（Vezie et al., 1998）。mcyS遺伝子クラスターの発見は、ミクロシスチン産生菌のＰＣＲに基づく検出における一群の潜在的な標的を明らかにした。毒素構造における非タンパク性の希アミノ酸残基に関連した遺伝子は、特にこの目的に適している（Mbedi et al., 2005）。ミクロシスチン産生シアノバクテリアを検出するための核酸に基づく方法、および毒性ブルームに関連したリスク評価のためのその使用が、多くの研究において報告されている（概要についてはSivonen, 2008を参照）。例えば、WO 2011/003184公報は、ミクロシスチン産生シアノバクテリアを検出するために設計したプライマーを開示している。開示されたプライマーは、Microcystis aeruginosa UTCC 299株のmcyD遺伝子のｓｓ−ケトアシルシンターゼ（ＫＳ）ドメインの保存性領域、またはMicrocystis aeruginosa UTCC 300株のmcyD遺伝子の第１デヒドラターゼドメインの保存性領域に相補的である。WO 2006/128230公報には、肝臓毒性シアノバクテリアを検出するための、ＰＣＲに基づく別の方法が開示されている。増幅のための標的配列は、ミクロシスチンシンセターゼ遺伝子複合体のmcyE遺伝子、およびノジュラリンシンセターゼ遺伝子複合体のndaF遺伝子に由来する肝毒素関連アミノトランスフェラーゼドメイン配列内に存在する。
【０００４】
しかしながら、２つ以上のミクロシスチン産生属を検出可能なリアルタイム定量ＰＣＲに関する報告はわずかであり（Al-Tebrineh et al., 2011、Vaitomaa et al., 2003、Briand et al., 2008）、現在では、発表されているｑＰＣＲ方法の大部分がたった１つの属、もっとも多くはMicrocystis、に集中している（Foulds et al., 2002、Kurmayer and Kutzenberger, 2003、Rinta-Kanto et al., 2005、Furukawa et al., 2006、Fortin et al., 2010）。
【０００５】
試料調製法と標識技術の選択は、ｑＰＣＲにおいて重要である。複数工程からなるＤＮＡ抽出方法における試料ロスと、ＰＣＲ阻害物質の不完全な除去による非効率的な増幅とが組み合わさると、有意な定量誤差となり得る（Wilson, 1997）。これら問題に取り組むことは、ＰＣＲの信頼性を高めることにつながる。その結果、特異性の向上は、配列特異的標識プローブ（例えば、TaqMan）によって達成することが可能となり、ランタニドキレート標識は、より一般的に使用されている迅速な蛍光色素分子とは異なり、時間分解蛍光分光法による検出を可能とする。励起と測定の間の時間窓における自己蛍光減衰によってバックグラウンドシグナルは低下するため、ランタニドキレート標識の使用は感度の向上につながる（Soini and Lovgren, 1987）。
【０００６】
本研究の目的は、潜在的にミクロシスチン産生性であるAnabaena、MicrocystisおよびPlanktothrixを検出するための、定量的リアルタイムＰＣＲ法を開発することである。信頼性の高い定量を達成するために、ＤＮＡ抽出と単純な細胞溶解を、ｑＰＣＲの性能およびテンプレートの収率の観点から比較した。開発したｑＰＣＲアッセイを環境試料解析に応用し、遺伝子コピー数とミクロシスチン濃度との相関性を検討した。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】mcyB用ｑＰＣＲアッセイのための標準曲線。mcyBコピー数の１０を底とする値を、ａ）Anabaena、ｂ）Microcystisおよびｃ）Planktothrixのそれぞれに対応する閾値サイクル（Ｃｔ）に対してプロットした。標的とするそれぞれの属について、１０１〜１０７コピーの範囲内のmcyB標的配列を検出することができた。増幅効率は全ての標的において同様（９２．７〜９４．２％）であった。４回の反復反応におけるＣｔの変動は非常に低く、標準偏差は符号の中にほぼ隠れてしまうほどに小さなエラーバーとして示された。
【図２】２種のｑＰＣＲ試料調製方法の比較。顕微鏡下で決定した細胞量（パターン付きの棒）を、抽出したゲノムＤＮＡから検出したmcyB遺伝子コピー数（白い棒）と、濾過して崩壊させた細胞から検出したmcyB遺伝子コピー数（グレーの棒）と比較した。比較は、ミクロシスチン産生性のMicrocystis aeruginosa NIVA-CYA 140、Anabaena cf. flos-aquae NIVA-CYA 267/4およびPlanktothrix agardhii NIVA-CYA 299について行った。濾過と細胞溶解は、同量の細胞から抽出したＤＮＡと比べて、常に高いコピー数をもたらした。エラーバーは、試料間および試料内の両方におけるコピー数の変動を示す。
【図３】２００８年４月〜６月の期間にハウニネン（Hauninen）の貯水池（フィンランド国、ライシオ）で発生したPlanktothrixのmcyB遺伝子コピー数（■、実線）、Planktothrixの細胞数（▲、点線）、およびＬＣ−ＭＳで決定した総ミクロシスチン濃度（□、破線）。細胞数は、１００μｍのフィラメント単位の顕微鏡下における計数値および１単位を３０細胞とする概算値に基づいて求めた。明確な正の相関関係がmcyBコピー数と総ミクロシスチン濃度（ｄｍＭＣ−ＲＲおよびｄｍＭＣ−ＬＲ）の間に見られた。潜在的に毒性のMicrocystisやAnabaenaは検出されなかった。
【図４】Anabaena sp.、Microcystis aeruginosaおよびPlanktothrix agardhiiのmcyB遺伝子内の標的配列、ならびに実施例で用いたプライマーおよびプローブ。
【図５】ＥＬＩＳＡで測定した、環境水試料におけるmcyB遺伝子の総遺伝子コピー数とミクロシスチン濃度［ＭＣ］との相関関係。
【図６】ＨＰＬＣで測定した、環境水試料におけるmcyB遺伝子の総遺伝子コピー数とミクロシスチン濃度［ＭＣ］との相関関係。
【図７】ＬＣ−ＭＳで測定した、環境水試料におけるmcyB遺伝子の総遺伝子コピー数とミクロシスチン濃度［ＭＣ］との相関関係。
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明は、試料中のミクロシスチン産生毒性シアノバクテリアの検出方法であって、以下の工程を包含する方法に関する。
ａ）上記試料中の細胞を溶解し、
ｂ）溶解した細胞から得られた核酸と、Microcystis aeruginosa、Planktothrix agardhiiおよびAnabaena sp.中に存在するmcyB遺伝子の核酸配列に特異的にハイブリダイズするプライマーとをポリメラーゼ連鎖反応用混合物中で接触させ、上記プライマーは配列番号１、配列番号２、および／または配列番号３に示したmcyB遺伝子内の標的配列の少なくとも一部を増幅するものであり、
ｃ）工程ｂ）で得られた反応用混合物をポリメラーゼ連鎖反応に付し、上記mcyB遺伝子の配列が試料中に存在する場合は、上記配列を特異的に増幅し、そして
ｄ）増幅された核酸配列の存在を検出し、増幅されたmcyB遺伝子配列の存在をもって、試料中にミクロシスチン産生毒性シアノバクテリアが存在することの指標とする。
【０００９】
本発明の方法に用いるために調製した、シアノバクテリア由来材料を含む試料は、好ましくは環境試料であり、具体的には、海水試料や淡水試料などの水試料、または他の適切な環境試料である。
【００１０】
本発明の方法は、主としてMicrocystis aeruginosa、Planktothrix agardhiiおよびAnabaena sp.等の毒性シアノバクテリアの検出に関するものであるが、試料中のミクロシスチン産生毒性シアノバクテリアの定量にも用いることができる。ミクロシスチン産生毒性シアノバクテリアの定量は、抽出したＤＮＡに対して本発明のプライマーを用いた定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実施し、mcyB遺伝子のコピー数を決定することによって達成される。さらに、ｑＰＣＲで得られた上記遺伝子コピー数と対応するミクロシスチンの濃度とを相関させることによって、試料中の毒性ミクロシスチン濃度をモニタリングすることもできる。
【００１１】
工程ａ）においては、工程ｂ）で行うＰＣＲのテンプレートとして用いる核酸を、溶解した細胞から公知の方法によって抽出し、精製することができる。しかし、溶解した細胞から得た懸濁液は、ＰＣＲテンプレートとして直接使用することが好ましい。よって本発明の１つの態様においては、毒性シアノバクテリアを含むと考えられる、希釈していない水試料を始めに濾過することができる。次に濾過した細胞を滅菌済みの脱イオン水に懸濁し、熱処理によって細胞溶解を実施する。得られた懸濁液およびそこに含まれる核酸は、工程ｂ）の反応用混合物としてそのまま使用することができる。
【００１２】
工程ｂ）において上記プライマーは、図４に示したMicrocystis aeruginosaゲノムの６１４７位〜６２５１位に対応する配列番号１の塩基配列、図４に示したPlanktothrix agardhiゲノムの６２０３位〜６３０５位に対応する配列番号２の塩基配列、または図４に示したAnabaena sp.ゲノムの６１７０位〜６２７２位に対応する配列番号３の塩基配列である、mcyB遺伝子の標的配列の少なくとも一部を増幅する。
【００１３】
本発明の１つの態様においては、工程ｂ）で増幅するアンプリコン、即ち、標的配列は、配列番号１、配列番号２または配列番号３によって定義される標的配列内の、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも５０個、さらに好ましくは少なくとも８０個、もっとも好ましくは１０３個または１０５個の連続したヌクレオチドを包含する。
【００１４】
本発明の方法に用いるプライマーは、以下の配列のいずれか１つを含むもの、または以下の配列のいずれか１つからなるものであることが好ましい。
5'-GCTTTAATCCACAAGAAGCTTTATTAGC-3'（配列番号４）
5'-AGATTTTAATCCACAAGAAGCTTTATTAGC-3'（配列番号５）
5'-GGTTTAATCAACAAGAGGCTTTATTAGC-3'（配列番号６）
5'-CTGTTGCCTCCTAGTTCAAAAAATGACT-3'（配列番号７）
【００１５】
本発明のもっとも好ましい態様の１つにおいては、いくつものキットが市販されているリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって本発明の方法を実施する。
【００１６】
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応に使用するために、本発明はさらにMicrocystis aeruginosa、Planktothrix agardhiiおよびAnabaena sp.に存在するmcyB遺伝子の核酸配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブも提供する。このようなプローブは、以下の配列を有するものである。
5'-ACTGAATTATTGGAGGTAGAGGTGAGTGATAC-3'（配列番号８）
5'-CCTCTACCTCCAATAATTCA-3'（配列番号９）
5'- GGGTGAGTTATTAGAAGCAGAAGTTAGTAACAG-3'（配列番号１０）
5'-TTCTGCTTCTAATAACTCACC-3'（配列番号１１）
5'-GGGGTGAATTATTAGAAATAGAAGTAAGTGACAA-3'（配列番号１２）
5'-TTACTTCTATTTCTAATAATTCACC-3'（配列番号１３）
【００１７】
さらに本発明は、配列番号４〜７に示した配列を含むか、配列番号４〜７に示した配列からなるプライマーにも関する。プライマーは、２８〜４０ヌクレオチドを有するものが好ましい。プライマーは３０ヌクレオチド未満、３５ヌクレオチド未満または４０ヌクレオチド未満を含むものがより好ましい。
【００１８】
さらに本発明は、配列番号８〜１３に示した配列を含むか、配列番号８〜１３に示した配列からなるプローブにも関する。プローブは、４０ヌクレオチド未満であることが好ましい。
【００１９】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブは短いヌクレオチド（ＲＮＡやＤＮＡ、好ましくはＤＮＡ）の配列であり、典型的には２５〜３０塩基、またはそれよりも短いものである。しかし、自動シンセサイザーは１６０〜２００塩基までのオリゴヌクレオチドの合成が可能であり、本発明のオリゴヌクレオチドも、例えば、制限酵素切断部位をオリゴヌクレオチドに追加するために、伸張することができる。典型的なプライマーの長さは２６〜３２ヌクレオチド、より好ましくは２８〜３０ヌクレオチドである。
【００２０】
さらに本発明は、ミクロシスチン産生毒性シアノバクテリアの存在を検出するためのキットも提供する。キットは、上記で定義したプライマーとプローブを包含するものである。このようなプライマーとプローブは、上記において説明されており、さらに下記実施例においても説明する。
【００２１】
本発明のキットは、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を実施するための手段、例えば、標識されたプローブ、ポリメラーゼ酵素、バッファーとヌクレオチドを包含することが好ましい。
【００２２】
同じ遺伝子であっても、微生物の種間でいくらか異なることは当業界ではよく知られており、故に、Microcystis aeruginosa、Planktothrix agardhiiおよびAnabaena sp.に存在するmcyB遺伝子の配列は、それぞれの種の全株間で１００％同一であることはない。しかし、本願明細書、特に下記実際例の記載から、当業者はこれら遺伝子配列の類似性および相同性に基づいて、いかなる関連株のmcyB遺伝子配列であっても認識可能であることは明らかである。
【００２３】
本願明細書において「特異的にハイブリダイズする」とは、オリゴヌクレオチドと標的配列との相補的なハイブリダイゼーションを意味する。「特異的」という用語は、ハイブリダイゼーションシグナルを検出するためのアニーリングを妨害することのない僅かなミスマッチを許容する、相補的なハイブリダイゼーションにおいて見られる特異性を意味する。
【００２４】
本発明の背景を明らかにし、特にその実施におけるさらなる詳細を提供するために、本願明細書において使用した出版物やその他の資料は、参照をもって本願に組み込まれたものとする。本発明の範囲を限定することを意図しない以下の実施例によって、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００２５】
材料と方法
１．１．シアノバクテリア株と環境試料
本研究に用いるシアノバクテリア株を表１に列挙した。菌株は、パスツール研究所カルチャーコレクション（Pasteur Culture Collection、ＰＣＣ）（フランス国、パリ）とノルウェー水質研究所（Norwegian Institute for Water Research、ＮＩＶＡ）（ノルウェー国、オスロ）のシアノバクテリアカルチャーコレクションから購入し、提供者の推奨する方法で維持した。ＮＩＶＡの株はすべてＺ８培地（Staub, 1961、ＮＩＶＡによる変法、1972, 1976）で培養した。ＰＣＣより得た株は、ＢＧ１１培地（Sigma製）、硝酸塩抜きのＢＧ１１０培地、またはＰＣＣの処方に基づく、ＮａＮＯ３およびＮａＨＣＯ３添加ＢＧ１１０培地のいずれかで培養した。さらに他の出所の３株も維持した。Microcystis aeruginosa NIES-107（日本国、つくば市、国立環境研究所）はＺ８培地で培養した。Anabaena sp. 90（ヘルシンキ大学（University of Helsinki）のProf. Kaarina Sivonen）のほか、Anabaena lapponica 966株（フィンランド環境研究所（Finnish Environment Institute）のDr. Jarkko Rapala）も、窒素添加なしの変法Ｚ８培地で培養した。培養菌株は全て２０ＷのPowerGlo水槽用電球（日本国、Hagen製）を光源として、２３℃で維持した。２．５週間培養後のNIVA-CYA 267/4、NIVA-CYA 140およびNIVA-CYA 299について、シアノバクテリア細胞数を顕微鏡下で計数した。試料は脱イオン水で１：１００〜１：２００に希釈し、ルゴールヨウ素溶液中で保存した。１０ｍｌ等量の試料を１６時間の沈降反応に付した後に、ニコンＴＥ−２００倒立顕微鏡（日本国、ニコン社製）と１０×および４０×の対物レンズを用いて細胞数を計数した。細胞数を求めた培養液から細胞を回収し、mcyBの定量用とした。環境試料は、フィンランド国、ライシオのハウニネン貯水池から２００８年４月〜６月に採取したもの（１１試料）と、オーランド諸島の淡水湖から２００８年７月に採取したもの（１３試料）である。抽出ＤＮＡおよび他のＰＣＲテンプレートを含む全試料を、次の解析まで−２０℃で凍結保存した。培養試料と環境試料は、そのまま凍結するか、または凍結乾燥した。
【００２６】
１．２．ミクロシスチンの抽出
凍結乾燥シアノバクテリア材料の８〜１０ｍｇの試料、または濾過したシアノバクテリア材料を含む凍結乾燥ＧＦ／Ｃグラスファイバー製フィルター（φ２５ｍｍ）（英国、メードストン、Whatman製）を、１．２ｍｌの７５％メタノール（ＨＰＬＣグレード）（英国、ウォーカーバーン、Rathburn製）で抽出した。抽出物を保温槽付きウルトラソニケーター（ドイツ国、ベルリン、Bandelin製のSonorex RK 156）で１５分間処理し、さらにプローブソニケーター（Bandelin製のSonopuls HD 2070、３ｍｍのマイクロチップ付き、パルス：３０％、出力：３０％）で１分間処理した。１０，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、上澄みを等量に分け、アルゴンランプ下、４０℃で乾燥するまで蒸発させた。ＨＰＬＣ−ＤＡＤおよびＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳによるミクロシスチン解析に用いるための抽出物は７５％メタノールに再懸濁し、ＥＬＩＳＡに用いるための抽出物は水に再懸濁した。
【００２７】
１．３．ダイオードアレイＵＶ検出を用いるＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ−ＤＡＤ）
サンプルの解析は、脱ガス装置、クォータナリポンプ、４０℃の恒温装置付きカラムコンパートメント、および２００〜３００ｎｍで運転するダイオードアレイ検出器（２３８ｎｍで定量）からなる、１１００シリーズＨＰＬＣシステム（ドイツ国、ヴァルトブロン、Agilent製）で行った。固定相は、Purospher STARカラム（ドイツ国、ダルムシュタット、Merck製）、粒子は３μｍ、５５ｍｍ×４ｍｍ、またはAscentis ＲＰ−アミドカラム（米国、ペンシルバニア州、ベルフォンテ、Supelco製）、粒子は３μｍ、１００ｍｍ×４．６ｍｍ（内径）を用いた。移動相は、アセトニトリル（英国、ウォーカーバーン、Rathburn製のＨＰＬＣ Ｓグレード）（溶媒Ｂ）と、Milli-Q ウルトラピュアウォーター（フランス国、モルスアイム、Millipore製）（溶媒Ａ）からなり、いずれもが０．０５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（スイス国、ブックス、Fluka製）を含有し、以下の直線濃度勾配プログラムで使用した：０分は２５％Ｂ、７分は７０％Ｂ、１０分は７０％Ｂ、１０．１分は２５％Ｂ、停止時間は１５分、流速は１ｍｌ／分、注入量は１０μｌ。さらに試料を、Merck製のPurospher STAR RP-18eカラム、５５ｍｍ×４ｍｍ（内径）、粒子は３μｍで解析した（Spoof and Meriluoto, 2005）。実験室で精製したそれぞれのミクロシスチンと、以下の参照用試料をミクロシスチンの同定に用いた： (Spoof et al., 2003)に記載の、ａ）Microcystis aeruginosa PCC 7820の抽出物およびｂ）Microcystis aeruginosa NIES-107の抽出物。
【００２８】
１．４．ＬＣ−ＭＳおよびＬＣ−ＭＳ−ＭＳ
ＬＣ−ＭＳ実験は、エレクトロスプレーインターフェイスを装備したMicromass Quattro Micro三重四重極型子質量分析計（英国、マンチェスター、Waters製）に連結した、Agilent 1100シリーズＨＰＬＣシステムで実施した。毒素は、Merck製Purospher STAR RP-18のエンドキャップ済カラム（３０ｍｍ×４ｍｍ、粒子は３μｍ）で定量した。移動相は、０．１％のギ酸水溶液（溶媒Ａ）とアセトニトリル（溶媒Ｂ）との濃度勾配からなり、以下の直線濃度勾配プログラムに基づくものであった：１０分間で２５％のＢから７０％のＢ、次の２分間で９０％のＢとし、そのまま１分間保持した。注入間隔は１６分、注入量は１０μｌ、流速は０．５ｍｌ／分、そしてカラムオーブン温度は４０℃とした。キャピラリー電圧は３．８ｋＶ、コーン電圧は４０Ｖ（ｄｍＭＣ−ＲＲとＭＣ−ＲＲの場合）または７５Ｖ（残りのミクロシスチンとノジュラリンの場合）に設定した。脱溶媒和用ガス（窒素）の温度と流速は、それぞれ３００℃と６５０Ｌ／時とした。イオン源温度は１５０℃に設定した。イオンは、陽性エレクトロスプレーイオン化モードで検出した。選択イオン記録（ＳＩＲ）モードにおいてモニタリングしたシグナルは、ｍ／ｚ ［ｄｍＭＣ−ＲＲ＋２Ｈ］２＋  ５１２．８、［ＭＣ−ＲＲ＋２Ｈ］２＋  ５１９．８、［ＭＣ−ＬＦ＋Ｈ］＋  ９８６．５および［ＭＣ−ＬＦ＋Ｎａ］＋  １００８．５、［ｄｍＭＣ−ＬＲ＋Ｈ］＋  ９８６．５、［ＭＣ−ＬＲ＋Ｈ］＋  ９９５．５、［ＭＣ−ＬＹ＋Ｈ］＋  １００２．５、［ＭＣ−ＬＷ＋Ｈ］＋  １０２５．５および［ＭＣ−ＬＷ＋Ｎａ］＋  １０４７．５、［ＭＣ−ＹＲ＋Ｈ］＋  １０４５．５、［ｄｍＮｏｄ＋Ｈ］＋  ８１１．５および［Ｎｏｄ＋Ｈ］＋  ８２５．５だった。データの取得は、Masslynx v. 4.0ソフトウエア（Micromass製）で行った。ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ実験は、エレクトロスプレーイオン（ＥＳＩ）源を有するDaltonics HCT Ultraイオントラップ質量分析計（ドイツ国、ブレーメン、Bruker製）に連結したAgilent 1200 Rapid Resolution (RR) LCで実施した。1200 RR LCシステムは、バイナリポンプ、真空脱ガス装置、ＳＬ自動サンプラー、および恒温カラムコンパートメントを含んでいる。イオントラップは、陽性エレクトロスプレーイオンモードで運転した。イオン源のパラメーターは以下のように設定した。乾燥温度：３５０℃、ネブライザー圧力：４０ｐｓｉ、乾燥ガス流量：１０．０Ｌ／分、キャピラリー電圧：４．０ｋＶ。ＭＳスキャン範囲としては、Smart Parameter Setting（ＳＰＳ）ファンクションを有する５００〜１２００ｍ／ｚを使用した。ＩＣＣのターゲットは３００，０００に設定し、最大積算時間を１００ｍｓとした。大量のＭＳ−ＭＳ断片化は、SmartFrag設定で補助した。毒素の分離は、AscentisのＣ１８、５０ｍｍ×３ｍｍ（内径）カラムと３μｍの粒子（Supelco製）によって、４０℃で達成した。注入量は５μｌだった。移動相は水−アセトニトリル−ギ酸（９９：１：０．１、溶媒Ａ）およびアセトニトリル−ギ酸（１００：０．１、溶媒Ｂ）からなり、以下の直線濃度勾配プログラムに基づくものであった：０分は２５％Ｂ、５分は７０％Ｂ、６分は７０％Ｂ、６．１分は２５％Ｂ、停止時間は１０分、流速は０．５ｍｌ／分。一次モニタリングシグナルはQuattro microの装置と同じであったが、HCT Ultra装置で取得した質量スペクトルは、断片化パターンに基づくさらなる毒素の同定を可能にした。データの取得はBruker Compass 1.3ソフトウエアで実施した。
【００２９】
１．５．ＥＬＩＳＡ
試料はQuantiplateミクロシスチンキット（米国、メイン州、ポートランド、Envirologix製）によって、製造者の提供するプロトコルに従って解析した。抽出物はＨＰＬＣの結果に基づいて水で希釈し、ミクロシスチン濃度をアッセイの測定範囲内に調整した。試料によっては、２種の異なる希釈を用意した。
【００３０】
１．６．ＰＣＲ用試料の調製
２つの方法を使用し、ＰＣＲ解析用試料を調製した。ゲノムＤＮＡは、培養株の凍結乾燥細胞または凍結乾燥したオーランド諸島環境試料から、NucleoSpin Plant II ＤＮＡ抽出キット（ドイツ国、デューレン、Macherey-Nagel製）を製造者の使用説明書に基づいて使用し抽出した。ＤＮＡの濃度と品質は、分光測定（米国、デラウエア州、ウィルミントン、NanoDrop Technologies製のND-1000）で決定した。濾過と細胞溶解は次のように実施した。１０ｍｌの回収した培養細胞を９０ｍｌの滅菌脱イオン水に懸濁し、グラスファイバー製フィルター（φ４７ｍｍ、GF/C、Whatman製）で真空濾過した。ハウニネン貯水池試料の場合は、５０ｍｌの未希釈試料を濾過した。各フィルターから一部を切り出し、１００μｌの滅菌脱イオン水に懸濁した。細胞溶解は８０℃で５分間行った。その後、懸濁液は、ＰＣＲテンプレートとして直接使用した。切り出したフィルターの大きさを定量のために記録した。顕微鏡下で計数した培養試料は、以下の僅かな変更以外は、上述した２つの方法で処理した：細胞は５ｍｌ等量と１０ｍｌ等量の両方で回収し、濾過とＤＮＡ抽出のいずれかに付した。試料の調製は、回収したばかりの細胞を使って実施した。ＤＮＡ抽出のための細胞は、遠心分離（４℃、３２２０×ｇ、２０分）（ドイツ国、ハンブルグ、Eppendorf製の5810R）によって回収した。
【００３１】
１．７．プライマーおよびプローブ
GenBankのヌクレオチドデータベースからmcyBの配列（Nishizawa et al., 1999、Tillett et al., 2000、Christiansen et al., 2003、Rouhiainen et al., 2004、Kaneko et al., 2007）を入手し、配列のアライメントに基づき、プライマーとプローブを設計した。オリゴヌクレオチドは、Thermo Scientific（ドイツ国、ウルム）およびbiomers.net（ドイツ国、ウルム）により委託合成した（表２）。プローブは、５’−Ｃ６−アミノリンカーおよび３’−リン酸基を用いて合成した。全ての検出プローブの５’末端アミノリンカーに、公知文献（Nurmi et al., 2002）記載の有機Ｔｂ３＋キレート（２，２’，２’’，２’’’−｛｛６，６’−｛４’’−［２−（４−イソチオシアナトフェニル）エチル］ピラトゾル−１’’，３’’−ジイル｝ビス（ピリジン）−２，２’−ジイル｝ビス（メチレンニトリロ）｝テトラキス（アセタト）｝テルビウム（ＩＩＩ））を標識した。全てのクエンチャープローブが、その３’末端にオリゴヌクレオチドの製造者によって結合されたＢＨＱ１（ブラックホールクエンチャー（登録商標）１）分子を有していた。プライマーの特異性は、表１に示したシアノバクテリア株で試験した。個々のＰＣＲ反応は、５ｎｍｏｌのｄＮＴＰ（フィンランド国、エスポー、Finnzymes製）、２．６７ｐｍｏｌの各フォワードプライマーと８ｐｍｏｌのリバースプライマー、０．５単位のDyNAzyme II HotStart ＤＮＡポリメラーゼ（Finnzymes製）、１× DyNAzyme II HotStart バッファーおよび１μｌのテンプレート、即ち、１ｎｇのゲノムＤＮＡまたは１μｌの溶解した細胞を含む懸濁液、を含んでいた。反応容積（２０μｌ）となるように、滅菌Milli-Q水で満たした。熱サイクリングは、PTC-200サーモサイクラー（米国、マサチューセッツ州、ウォータータウン、MJ Research製）で実施し、９５℃で１０分から開始し、続いて９５℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で１分を３５サイクル、そして７２℃で１０分の後に停止した。ＰＣＲ産物はエチジウムブロミド（０．５ｎｇ／Ｌ）で染色した２％アガロースゲルによって解析した。
【００３２】
１．８．ｑＰＣＲ
リアルタイム定量的ＰＣＲ技術の原理については、他の文献（Nurmi et al., 2002）に詳細に記載されている。簡単に説明すると、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エクソヌクレアーゼ活性によって検出プローブから遊離されたキレート分子から得られる長寿命蛍光の測定によって、増幅産物の蓄積をモニタリングする。バックグラウンドの蛍光は、クエンチャープローブの助けによって最小に維持する。検出プローブの特異性は、ｑＰＣＲと全ての培養株から得た精製ゲノムＤＮＡを用いて確認した。各ｑＰＣＲ反応混合物は、４ｎｍｏｌのｄＮＴＰ、２ｐｍｏｌの各フォワードプライマーと６ｐｍｏｌのリバースプライマー、０．２単位のDyNAzyme II HotStart ＤＮＡポリメラーゼ、１×DyNAzyme II HotStart バッファー、０．２５ｐｍｏｌの検出プローブ（ｍｃｙＢ−ｍＰ、ｍｃｙＢ−ｐＰまたはｍｃｙＢ−ａＰ）、２．５ｐｍｏｌの対応するクエンチャープローブ（ｍｃｙＢ−ｍＱまたはｍｃｙＢ−ｐＱ、ｍｃｙＢ−ａＱは３．０ｐｍｏｌを使用）および１ｎｇのテンプレートＤＮＡを含んでいた。反応混合物は滅菌Milli-Q水で２０μlまで満たした。全ての反応をThermoFast 96 Robotic ＰＣＲプレート（英国、サリー、Abgene製）とApplied Biosystems（米国、カリフォルニア州、フォスターシティー）製のオプティカルキャップを用いて実施した。ｑＰＣＲの反応は、９５℃で５分で開始し、続いて９５℃で３０秒、６２℃で１分を８サイクル実施した。８回目のサイクルの後には、蛍光測定のために温度を３５℃に下げて１５秒保持した。２回のサイクルごとに４０サイクルまで測定を繰り返し、各測定には、Victor2 1420 マルチラベルカウンター（フィンランド国、トゥルク、PerkinElmer Life Sciences Wallac製）をＴｂ蛍光の時間分解測定のための製造者の標準的プロトコルに従って使用した。
【００３３】
１．９．標準曲線の作製
二本鎖ＤＮＡ標準は、上述したように、ＰＣＲによってAnabaena sp. 90、PCC 7806（Microcystis）およびNIVA-CYA 299（Planktothrix）から作製した。mcyB増幅産物の精製は、Qiaquick ＰＣＲ精製キット（ドイツ国、ヒルデン、Qiagen製）で行い、続く定量は、QuantIt PicoGreen キット（米国、オレゴン州、ユージーン、Invitrogen製）で行った。いずれも製造者の使用説明書に従った。精製増幅産物のモル濃度を計算し、それぞれの属特異的標準について、１０倍の希釈系列（ｎ＝７）を調製した。標準は、使用するまで−２０℃で保存した。ｑＰＣＲは上述したように実施した。閾値サイクル（Ｃｔ）をlog mcyBコピー数に対してプロットし、増幅効率（Ｅ）を回帰直線の傾きから計算した（Ｅ＝１０−１／傾き−１、１．００は効率１００％に相当する）。
【００３４】
１．１０．ｑＰＣＲによる環境試料および培養試料の解析
テンプレートの１０倍希釈系列（ｎ＝４）を、顕微鏡下で計数した培養試料から調製した。この実験の目的は、ｑＰＣＲによる定量と細胞密度とを比較し、増幅効率と起こりうるＰＣＲ阻害を評価することだった。全てのｑＰＣＲを上述したように実施したが、但し、テンプレートの量を４ｎｇのＤＮＡまたは４μｌの熱処理済み試料に増量した。培養試料は４回、未希釈環境試料は３回の反復反応によって解析した。mcyBに対して陰性の結果を示した環境試料については、１ｎｇのAnabaena sp. 90ゲノムＤＮＡを各反応系に添加し、エチジウムブロミドで染色したアガロースゲルで上述したようにＰＣＲ産物を可視化することによって、ＰＣＲ阻害について試験した。
【００３５】
結果
２．１．プライマーとプローブの特異性
mcyBのプライマーと検出プローブの特異性を、３０株のシアノバクテリアの抽出ＤＮＡおよび熱処理細胞で試験した。各株に対するプローブの特異性、産生ミクロシスチンおよび他の産生毒素を表１に列挙した。偽陰性は見られなかった。ノジュラリン産生性Nodularia harveyana PCC 7804以外の非ミクロシスチン産生株からは、増幅産物は得られなかった。しかし、Nodulariaの増幅産物は、ｑＰＣＲのいずれの検出プローブによっても検出されなかった。従って、全ての属特異的検出プローブが、１００％の特異度と感度をもって機能した。可能な３種のプライマーの組み合わせのいずれもが、属に関係なく、全てのミクロシスチン産生株から標的mcyB配列を増幅するために使用可能であったが、しかし、増幅効率は株間で異なっていた（データは示さない）。３種のフォワードプライマーを組み合わせた場合、効率的な増幅が達成された。
【００３６】
２．２．標準曲線と増幅効率
感度と増幅効率を、精製ＰＣＲ産物から調製した標準を使用して決定した。分析感度は、反応当たり１０コピーのmcyBであり、全３種の標的属におけるログ比例領域は、mcyBコピー数で１０〜１０７（図１）だった。標準曲線から導き出した増幅効率と相関係数は、Anabaena、MicrocystisおよびPlanktothrixのそれぞれについて、９３．８％（ｒ２＝０．９９７）、９１．７％（ｒ２＝０．９９９）および９５．３％（ｒ２＝０．９９８）だった。
【００３７】
２．３．試料調製方法の比較
２種の試料調製方法を比較するために、ＰＣＲテンプレートを細胞密度が既知の培養試料から調製した。濾過および熱処理によって調製したテンプレートから得られた増幅効率は、対応する精製ＤＮＡテンプレートの増幅効率よりも高いか同等であった（それぞれ８９〜１００％、平均ｒ２＝０．９９９３±０．０００８および８３〜９７％、平均ｒ２＝０．９９７６±０．００１８）。抽出ＤＮＡの品質は一定ではなく、Ａ２６０／Ａ２８０比は１．７〜２．０に及んだ。熱処理試料は希釈しすぎで分光学的には分析不可能であった。濾過と熱処理によって得られた試料からは、対応する抽出ＤＮＡと比べて４〜３３０倍のmcyBコピー数が得られた（図２）。もっとも大きな差がPlanktothrix agardhiiのNIVA-CYA 299株で見られ、濾過試料から検出されたコピー数は細胞数と比べてたった１．５倍だったものの、対応するＤＮＡ抽出試料から得たコピー数の３３０倍だった。Anabaenaの場合は、ＤＮＡと細胞溶解物から得たコピー数は、細胞数と同じ桁だった。Microcystisの場合も、細胞数と抽出ＤＮＡから得たコピー数の関係は同様であったが、細胞の濾過と熱分解によって得られたコピー数は、細胞数の約３０倍だった。
【００３８】
２．４．環境試料のｑＰＣＲ解析
合計２４種の環境試料を解析した。オーランド諸島湖水試料の大部分（９／１３）がMicrocystisに由来するmcyB遺伝子のコピーのみ、またはMicrocystis由来のものと共にAnabaenaまたはPlanktothrixに由来するmcyB遺伝子のコピーを含んでいた（表３）。ミクロシスチンは、ｑＰＣＲによってmcyBに対して陽性の結果が得られた全ての試料に存在した。しかし、総コピー数と毒素濃度との間に線形相関を確立することはできなかった。４種の試料は標的とした属のmcyBコピーを含んでおらず、偽陰性結果をもたらしうるＰＣＲ阻害の証拠も示さなかった。ＥＬＩＳＡの結果は、mcyB陰性の全てのオーランド諸島試料について陽性であり、一方、同じ試料に対するＨＰＬＣ−ＤＡＤ結果は全て陰性であり、ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ解析の結果においては、試料１ｇ（乾燥重量）当たりのミクロシスチン濃度が０〜０．６７μｇの範囲となった。
【００３９】
１１種のハウニネン貯水池試料の内の５種は、mcyBに対して陽性だった。顕微鏡観察結果と同様に、集団の大部分がPlanktothrixであり、潜在的に毒性のMicrocystisやAnabaenaは検出されなかった。スパイクした試料から得た増幅産物の目視による検査では、ＰＣＲ阻害は見られなかった。PlanktothrixのmcyBコピー数と総ミクロシスチン濃度との間には、明確な正の相関関係が認められた（図３）。４月３日からフィラメントの量が徐々に増加し、５月２９日にはピークに達し、その後、急激に減少することが観察された。総ミクロシスチン濃度とPlanktothrix特異的mcyBのコピー数が同時にピークに達する現象は、Planktothrixについて観察された最大細胞密度とは一致しなかった。毒素含有試料には、２種の主要なミクロシスチン異型であるｄｍＭＣ−ＲＲとｄｍＭＣ−ＬＲが存在した。
【００４０】
考察
３．１．mcyB用ｑＰＣＲおよびその遺伝的背景
数種の毒性属の検出に適した標的を同定することは非常に重要である。ここに記載したｑＰＣＲアッセイにおいては、標的配列はmcyBの第２チオール化モチーフ内の、ペプチジルキャリアタンパク質ドメインコード配列内に位置し、このドメインは、成長するポリペプチド鎖をＭｃｙＢからＭｃｙＣへ移動し、ポリペプチド鎖をさらに伸張させるために働くものである（Nishizawa et al., 1999、Tillett et al., 2000）。我々の知る限り、このドメインがｑＰＣＲ検出のための標的として使用されるのは本研究が初めてである。多くの研究において標的として使用されているmcyBの第１アデニル化ドメイン（例えば、Mbedi et al., 2005、Kurmayer and Kutzenberger, 2003、Nonnemann and Zimba, 2002、Mikalsen et al., 2003）とは異なり、第２チオール化モチーフはミクロシスチン構造の変異による影響を受けにくい。従って、毒素プロファイルに関係なく、複数の潜在的に毒性の属を同時に検出することが可能である。検出された潜在的な肝毒素産生菌が広範囲にわたることは、ノジュラリン産生性のNodularia harveyana PCC 7804由来の、mcyBに相同なndAの増幅によって示された。ndaA遺伝子内には、mcyBの第二縮合、アデニル化およびチオール化モチーフに対応するモチーフが存在し（Moffitt and Neilan, 2004）、Nodulariaのアンプリコンは、Anabaena、MicrocystisおよびPlanktothrixの対応するアンプリコンとそれぞれ８０％、７５％および７６％の配列同一性を有している。しかし、検出プローブはその目的とする標的にのみハイブリダイズすることから、mcyB用ｑＰＣＲの特異度が、ndaAの増幅のために犠牲となることはなかった。
【００４１】
現存するmcyB用定量的ｑＰＣＲアッセイの大部分が、１つの属を標的とする数種のプローブ（TaqMan検出化学を使用した場合）およびプライマーペア（Kurmayer and Kutzenberger, 2003、Nonnemann and Zimba, 2002、Kaebernick et al., 2002）に基づくものである。同じ遺伝子内の異なる部位を検出するように設計された新規なプライマーと属特異的なプローブによって、定量的mcyB検出は、AnabaenaおよびPlanktothrixも含むように拡張され、新たな標的をレパトア解析に追加することによって、２種以上のミクロシスチン産生属を検出するように設計されたアッセイが得られる。一般的なプライマーが全毒性種の存在量に関する情報を提供する（Al-Tebrineh et al., 2011）のに対し、属特異的な検出には、個体群動態のモニタリングという付加的な利点もある。使用した感受性の高い標識技術（Nurmi et al., 2002）は、優れた感度と幅広い定量範囲をアッセイに提供する。検出限界が反応当たり１０コピーのmcyBであり、検出範囲が７桁にも及ぶことから、本アッセイは既報の方法と同等である（Al-Tebrineh et al., 2011、Vaitomaa et al., 2003、Foulds et al., 2002、Kurmayer and Kutzenberger, 2003、Rinta-Kanto et al., 2005、Furukawa et al., 2006）。
【００４２】
３．２．試料の調製
ｑＰＣＲ標準と試料との間の増幅効率の違いは、定量結果に実質的な影響を与えうるものである（Wilson, 1997）。同様の誤差原因が、異なる方法で調製した試料間にも存在し、いかなる比較も慎重に行う必要がある。本研究においては、観察される増幅効率の違いによって生じる試料種間の論理的なコピー数の差は、３〜５倍の範囲内に維持された。これは、（MicrocystisおよびPlanktothrixにおいて）検出されたコピー数の違いが１〜２桁であったことの説明にはならず、シアノバクテリア細胞の単純な溶解と、ゲノムＤＮＡの抽出および精製が、細胞当たりの利用可能なテンプレート量に実際に有意差をもたらすことを示している。このような結果は種々の原因、例えば、ＤＮＡ抽出の際の試料材料の損失や非効率的な細胞溶解、によって生じうると考えられる。遺伝子のコピー数と計数した細胞数との不一致は、ある程度は顕微鏡下での定量誤差によるものであるとも考えられるが、しかし、熟練者が計測することによってこの可能性はかなり低くなる。
【００４３】
我々の観察によると、細胞当たりの遺伝子コピー数が１であると仮定した場合、熱処理試料におけるMicrocystis由来mcyBの数は、細胞濃度の過大評価となると考えられる。しかし、同じ仮説に基づくと、精製ゲノムＤＮＡからのmcyBの定量値は、特にPlanktothrixの場合、細胞濃度の過小評価となると考えられる。細胞数の過大評価をもたらす定量的ＰＣＲ結果は、既にAnabaenaおよびMicrocystisについても報告されており（Vaitomaa et al., 2003）、複数の研究によってシアノバクテリア細胞が複数のゲノムを保有することが支持されている（Labarre et al., 1989、Becker et al., 2002）。これが正しければ、過大評価の説明はつくが、しかし同時に、過小評価をより深刻なものとする。従って、我々は環境試料の分析の際には、可能な限り濾過と熱処理を使用すること、そして遺伝子コピー数を毒素濃度と直接比較することによって、遺伝子コピー数から細胞数への誤った換算を回避することを選択した。
【００４４】
本研究で実施した比較と同様の結果が、定量解析について既に報告されており、この報告では、代替可能な数種の試料調製方法によって、精製ＤＮＡに匹敵するテンプレート収率が得られた（Hisbergues et al., 2003、Ouahid et al., 2005）。種々の試料調製方法に対する定量性能評価によって、ＤＮＡのフェノール−クロロホルム抽出がより高いコピー数をもたらすこと、そしてそれ故に、細胞濃度についても、市販のＤＮＡ抽出用試薬キットよりも高い推定値をもたらすことが判明した（Schober and Kurmayer, 2006）。Rasmussen et al., 2008は、界面活性剤溶液中における超音波と電磁波による処理が、市販の試薬キットによるＤＮＡ抽出と同等の性能を示すことを見いだした。我々の知見は、細胞溶解と精製なしのＤＮＡの放出が、mcy遺伝子標的の検出と定量に先立つ試料調製法として有効な方法であることを示す既報の結果と一致する。
【００４５】
３．３．環境試料
ハウニネン貯水池内のシアノバクテリア集団について、２００８年の春〜初夏の期間にmcyBコピー数および総ミクロシスチン濃度を定量することによって追跡調査を行った。理論的には、ミクロシスチンシンセターゼ遺伝子の存在は潜在的な毒素産生能を示すに過ぎないが、PlanktothrixのmcyBコピー数と毒素濃度との間の正の相関は明確だった。他の２種の標的毒素産生菌のいずれもが検出されなかったことから、Planktothrixは、貯水池における唯一のミクロシスチン産生属であると推定された。この結論は、試料中に存在するミクロシスチン異型であるＭＣ−ｄｍＬＲとＭＣ−ｄｍＲＲがPlanktothrixに典型的なものであることによって支持されていた（Fastner et al., 1999）。フィラメントの計数値は、mcyBコピー数や毒素濃度と明確な関連を示しておらず、これは、ハウニネン貯水池におけるPlanktothrix集団が毒性株と非毒性株との混成体であり、その割合は、調査期間中に大きく変動したことを示していた。Planktothrixの不活性mcy遺伝子型について報告されており、この異型は比較的に一般的であると見受けられる（Kurmayer et al., 2004、Ostermaier and Kurmayer, 2009）。ハウニネン貯水池におけるこのような遺伝子型の存在は、観察された毒素濃度および遺伝子のコピー数から推論することはできないため、無視できると考えられた。
【００４６】
ハウニネン貯水池とは異なり、オーランド諸島の複数の淡水湖の各々から個別に採取した単一試料は、ミクロシスチン濃度とmcyBコピー数との間に明確な相関は示さなかったものの、偽陰性の定性的mcyB結果（即ち、遺伝子のコピーは検出されたが、試料中にミクロシスチンは存在しないという結果）は観察されなかった。環境因子は様々な変種をmcy遺伝子発現パターンおよび毒素産生に導入することが可能であり（Kaebernick et al., 2000、Sevilla et al., 2008）、よって、湖の環境の違いがこの結果にもっとも寄与したものと考えられる。影響を与えた可能性のある他の因子は、試料の調製方法である。種々の方法で作成したテンプレートがｑＰＣＲの性能に与える影響を考慮すると、ＤＮＡ抽出における収率の低下が、定量結果に方法依存性の誤差を導入したと考えられる。
【００４７】
４種のオーランド試料については、ＨＰＬＣ−ＤＡＤおよびＬＣ−ＭＳ−ＭＳで分析した際に、全体としてミクロシスチンが非常に低濃度または毒素なしという結果が得られ、ｑＰＣＲでもシグナルが得られなかった。ＥＬＩＳＡアッセイは、しかしながら、種々の濃度のミクロシスチンが試料中に存在することを示した。ミクロシスチンの免疫アッセイは試料マトリクスの影響を受けることがあり（Metcalf et al., 2000）、使用した他の２種の方法は高い毒素濃度を示さなかったことから、ＥＬＩＳＡの結果が過剰評価または擬陽性であるという可能性を排除することはできない。ミクロシスチンは比較的安定であり、数週間にわたり水中で持続可能であることから（Lahti et al., 1997）、産生生物が既に存在していなくとも、試料中に痕跡量のミクロシスチンが存在することは考えられる。
【００４８】
結論
毒性シアノバクテリアの大量発生の健康リスクに関する認識が大きくなるにつれ、モニタリング方法に関する要求も増加した。シアノバクテリアリスクの評価方法に関するガイドラインと法規が、現在の科学的知識に合わせて改訂されている。３種の主要なブルーム形成性属の潜在的ミクロシスチン産生性メンバーの全てを検出して定量するためのｑＰＣＲ法は、効率的な試料調製法と組み合わせることで、迅速な早期警戒モニタリングのための方法を提供する。この方法は、潜在的ミクロシスチン産生シアノバクテリアを高感度および広い定量範囲で検出可能であり、環境中の細胞密度に見られる有意な偏差にも応答することができる。オーランド諸島試料に関する遺伝子定量結果は、クロマトグラフィーのデータと定性的によく一致するものの、少量の個別の試料回収ポイントでは、一般的な遺伝子コピー数のガイドラインを提供するには不十分であることを示した。このようなガイドラインはより多数の試料の分析によってのみ確立可能である。ハウニネン貯水池のPlanktothrix集団は、毒素濃度の推定における顕微鏡観察に基づく定量の不確実性を明示し、ｑＰＣＲ検出の利点を強調するものである。総合すると、全ての結果がミクロシスチン産生シアノバクテリアの環境モニタリングにおける分子的方法の使用を推奨している。
【００４９】
【表１−１】
2014532438.tif 000002
【００５０】
【表１−２】
2014532438.tif 000003
【００５１】
【表２】
2014532438.tif 000004
【００５２】
【表３−１】
2014532438.tif 000005
【００５３】
【表３−２】
2014532438.tif 000006
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００５４】
【非特許文献１】Al-Tebrineh, J., Gehringer, M.M., Akcaalan, R., Neilan, B.A., 2011. A new quantitative PCR assay for the detection of hepatotoxigenic cyanobacteria. Toxicon 57, 546-554.
【非特許文献２】Becker, S., Fahrbach, M., Boger, P., Ernst, A., 2002. Quantitative tracing, by Taq nuclease assays, of a synechococcus ecotype in a highly diversified natural population. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4486-4494.
【非特許文献３】Briand, E., Gugger, M., Francois, J.C., Bernard, C., Humbert, J.F., Quiblier, C., 2008. Temporal variations in the dynamics of potentially microcystin-producing strains in a bloom-forming Planktothrix agardhii (cyanobacteria) population. Appl. Environ. Microbiol. 74, 3839-3848.
【非特許文献４】Christiansen, G., Fastner, J., Erhard, M., Borner, T., Dittmann, E., 2003. Microcystin biosynthesis in Planktothrix: genes, evolution, and manipulation. J. Bacteriol. 185, 564-572.
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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