(57)【要約】  本発明は、Ａプラーク関連症状の少なくとも一つの症状又は徴候を効果的に治療するため又はアミロイドプラーク負荷を低減させるための組成物及び方法を含む。本方法は、ヒトのような生存している哺乳動物の生物系に抗ＡｐｏＥ抗体の有効量を投与することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体がＡｐｏＥに特異的に結合し、ＨＪ６．１（ＡＴＣＣ特許寄託符号ＰＴ−１１８０５）、ＨＪ６．２（ＡＴＣＣ特許寄託符号ＰＴ−１１８０６）、ＨＪ６．３（ＡＴＣＣ特許寄託符号ＰＴ−１１８０７）、及びＨＪ６．４（ＡＴＣＣ特許寄託符号ＰＴ−１１８０８）からなる群から選択されるハイブリドーマに由来する単離抗体。
【請求項２】
抗体が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、及び配列番号：１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる請求項１に記載の単離抗体。
【請求項３】
抗体が、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、及び配列番号：１５からなる群から選択される核酸配列を含んでなる核酸配列によりコードされる請求項１に記載の単離抗体。
【請求項４】
抗体が、単鎖抗体、抗体断片、キメラ抗体、又はヒト化抗体からなる群から選択される請求項１に記載の単離抗体。
【請求項５】
抗体がＡｐｏＥに特異的に結合し、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：２１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む単離抗体。
【請求項６】
抗体がＡｐｏＥに特異的に結合し、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：２７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む単離抗体。
【請求項７】
抗体がＡｐｏＥに特異的に結合し、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：３３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む単離抗体。
【請求項８】
被験体のＡβプラーク関連症状の少なくとも一つの症状又は徴候を治療する方法において、少なくとも一つの抗ＡｐｏＥ抗体の有効量をその被験体に投与することを含む方法。
【請求項９】
治療が、被験体のＡβプラーク関連症状の少なくとも一つの症状又は徴候を予防し、減弱し、逆転させ又は改善することを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ａβプラーク関連症状の症状又は徴候が、障害性認知機能、行動変化、異常な言語機能、情緒調節不全、発作、障害性神経系構造又は機能、及びアルツハイマー病又は脳アミロイド血管症の発症の危険性の増加を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
抗ＡｐｏＥ抗体が、ＡｐｏＥコード化配列内のエピトープに結合する請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
投与が効果的な全身投与経路を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
投与が、中枢神経系内への直接的なものを含む、効果的な局所投与経路を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
被験体の脳内のアミロイドプラーク負荷を低減させる方法であって、少なくとも一つの抗ＡｐｏＥ抗体の有効量をその被験体に投与することを含む方法。
【請求項１５】
抗ＡｐｏＥ抗体がＡｐｏＥコード化配列内のエピトープに結合する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
投与が効果的な全身投与経路を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
投与が、中枢神経系内への直接的なものを含む、効果的な局所投与経路を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
アミロイドプラーク負荷が海馬において減少している請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
アミロイドプラーク負荷が皮質において減少している請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府支援）
この発明は、ＮＩＨにより付与されたＡＧ０１３９５６の元、政府支援によりなされた。政府は本発明に所定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、Ａβプラーク関連症状、例えば被験体のアルツハイマー病（ＡＤ）に関連したものを遅延化又は防止するための組成物及び方法に関する。特に、本発明は、被験体の脳におけるアミロイド−β（Ａβ）の濃度の調節に関する。
【背景技術】
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知症の最も一般的な原因であり、ますます増加する公共衛生問題である。現在、アメリカ合衆国においてが５００万の人々が苦しめられていると推定され、２０５０年までには１３００万人に増加すると予想されている。アルツハイマー病により、記憶の損失、認知機能、及び最終的には自我の損失に至る。対象者及び家族には、かなりの個人的及び財政的犠牲がかかる。人口における疾患の重篤度及び有病率の増加のため、より良い治療法を開発することが急務である。
【０００４】
生化学、遺伝学及び動物モデルでの証拠では、ＡＤの病原性ペプチドとしてアミロイド−β（Ａβ）が関与している。ＡＤの神経病理学的及び神経化学的特徴には、シナプス損失及び選択的ニューロン死、所定の神経伝達物質の低下、ニューロン（神経原線維変化）内及び細胞外空間（脳血管、びまん性、神経突起プラーク）における、異常なタンパク質沈着が含まれる。これらのプラークの主要な構成成分は、Ａβ、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から切断された３８−４３のアミノ酸配列ペプチドである。
【０００５】
一生を通じて、可溶性Ａβは主として神経細胞から分泌されるが、他の種類の細胞タイプの場合もある。過剰のＡβ沈着は、家族性早期発症型ＡＤにおいて生じ、又は脳内のＡβクリアランスが低下するので、Ａβ合成の増加に起因しうる。Ａβ生成がＡＤのより一般的な遅発型において生じるという説得力ある証拠がないことは、不十分なＡβクリアランスが、Ａβ沈着とさらにはアミロイドプラーク形成を促進させうることを示唆している。
【０００６】
アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）遺伝子は、遅発型ＡＤの最も広く複製された遺伝的危険因子を保持したままであり、Ｅ４アレルのキャリアは３−１５倍多いリスクを有し、より早い年齢で疾患を発病する。脳内で、ＡｐｏＥは主として合成され、周囲のアミロイドプラークに見出されるアストロサイト及びミクログリアにより分泌される。本発明は、ＡＤマウスモデルにおけるアミロイドプラーク負荷を低減するのに効果的なＡｐｏＥ抗体を提供する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の一態様は、生存しているヒト患者に有効量の抗ＡｐｏＥ抗体を投与することを含む、少なくとも一つの臨床的に検出可能なＡβプラーク関連症状を効果的に治療する方法を包含する。他の態様では、本発明は、このような治療に有用な抗体を包含する。例えば、生存している哺乳動物においてＡβペプチドの毒性作用を治療的に減弱する抗体である。
【０００８】
本発明の他の態様は、少なくとも一つの抗ＡｐｏＥ抗体を含有する組成物を包含する。一態様では、本発明は、ハイブリドーマＨＪ６．１、ＨＪ６．２、ＨＪ６．３、ＨＪ６．４、又はその組合せから産生少なくとも一つの抗ＡｐｏＥ抗体を含んでなる組成物を包含する。一態様では、本発明は、少なくとも一つの抗ＡｐｏＥ抗体を含有する医薬組成物を包含する。一態様では、本発明は、ハイブリドーマＨＪ６．１、ＨＪ６．２、ＨＪ６．３、ＨＪ６．４、又はその組合せから産生される少なくとも一つの抗ＡｐｏＥ抗体を含有する医薬組成物を包含する。
【０００９】
さらなる本発明の他の態様は、少なくとも一つの臨床的に検出可能なＡβプラーク関連症状の治療に有用な医薬組成物を包含する。本組成物は、生存しているヒト被験体への投与に適合化された医薬的有効量の抗ＡｐｏＥ抗体を含有する。一態様では、このような治療に有用な抗体は、生存している哺乳動物におけるＡβペプチドの毒性作用を治療的に減弱する抗体を含む。一態様では、医薬組成物は、生存している被験体に効果的に投与される。
【００１０】
本発明のさらなる他の態様は、生存しているヒト被験体への投与に適合化された医薬的有効量の抗ＡｐｏＥ抗体の機能的治療用医薬組成物を含む容器と、前記投与に使用される任意の医薬装置を具備する医薬キットを包含する。一態様では、このような治療に有用な抗体は、生存している哺乳動物におけるＡβペプチドの毒性作用を治療的に減弱する抗体を含む。
【００１１】
本発明の他の態様及び繰り返しを以下に詳述する
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、抗Ａβ抗体（ＨＪ３．４）、又は１又は２の抗ＡｐｏＥ抗体（ＨＪ６．２又はＨＪ６．３）のいずれかを用い、月齢３ヶ月で始めて７ヶ月にまるまで、１０ｍｇ／ｋｇで週に１回、腹腔内的に治療されたＰＳ／ＡＰＰマウスからの海馬のサンプル内の、アミロイドプラーク負荷の低減における抗ＡｐｏＥ抗体の強力な効果をグラフで表したものである。コントロール群はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で治療した。評価した動物の数は、Ｎ＝７（ＰＢＳ）、Ｎ＝１６（ＨＪ３．４）、Ｎ＝１６（ＨＪ６．２）、Ｎ＝１６である。
【図２】図２は、抗Ａβ抗体（ＨＪ３．４）、又は１又は２の抗ＡｐｏＥ抗体（ＨＪ６．２又はＨＪ６．３）のいずれかを用い、１０ｍｇ／ｋｇで週に１回、腹腔内的に治療されたＰＳ／ＡＰＰマウスからの大脳皮質のサンプル内の、アミロイドプラーク負荷の低減における抗ＡｐｏＥ抗体の強力な効果をグラフで表したものである。コントロール群はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で治療した。評価した動物の数は、Ｎ＝７（ＰＢＳ）、Ｎ＝１６（ＨＪ３．４）、Ｎ＝１６（ＨＪ６．２）、Ｎ＝１６である。
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用する、ヒトａｐｏＥに対する抗ＡｐｏＥ抗体ＨＪ６．１、ＨＪ６．２、ＨＪ６．３及びＨＪ６．４の結合性をグラフで表したものである。
【図４】図４は、（Ａ）血漿中のヒトａｐｏＥに対する、ＨＪ６．１、ＨＪ６．２、ＨＪ６．３及びＨＪ６．４の結合性、及び（Ｂ）ＨＪ６．１、ＨＪ６．２、ＨＪ６．３及びＨＪ６．４抗体を受容した同じマウスにおけるコレステロールレベルをグラフで表したものである。
【図５】図５は、末梢投与後の中枢神経系における、抗ａｐｏＥ抗体ＨＪ６．１、ＨＪ６．２、ＨＪ６．３及びＨＪ６．４の存在をグラフで表したものである。
【図６】図６は、１０日にわたって、ＨＪ６．２及びＨＪ６．３（抗ａｐｏＥ抗体）、及びＨＪ３．４（抗Ａβ抗体）を短時間、マウスに投与した後のミクログリア活性をグラフで表したものである。
【図７−１】図７は、（Ａ）ＨＪ６．１重鎖可変領域及び第１定常領域（配列番号：４）；（Ｂ）ＨＪ６．１軽鎖可変領域及び定常領域（配列番号：２）；（Ｃ）ＨＪ６．２重鎖可変領域及び第１定常領域（配列番号：８）；（Ｄ）ＨＪ６．２軽鎖可変領域及び定常領域（配列番号：６）のアミノ酸配列を表す。ＣＤＲを含む領域がハイライトされている。
【図７−２】図７は、（Ｅ）ＨＪ６．３重鎖可変涼気及び第１定常領域（配列番号：１２）；（Ｆ）ＨＪ６．３軽鎖可変領域及び定常領域（配列番号：１０）；（Ｇ）ＨＪ６．４重鎖可変領域及び定常領域（配列番号：１６）；（Ｈ）ＨＪ６．４軽鎖可変領域及び定常領域（配列番号：１４）のアミノ酸配列を表す。ＣＤＲを含む領域がハイライトされている。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本出願人は、Ａβプラーク関連症状を効果的に治療するための抗体及びその使用方法を発見した。本方法は、生存している被験体に製薬的有効量の抗ＡｐｏＥ抗体を効果的に投与することを含む。本発明は、抗ＡｐｏＥ抗体が、Ａβプラーク関連症状に罹患した被験体に対する治療を提供するという発見を包含する。よって、本発明は、Ａβプラーク関連症状の徴候及び症状が、少なくとも部分的にはＡｐｏＥの悪影響のためでありうるという証拠を提供する。一態様では、少なくとも一つの前臨床的又は臨床的症状又は徴候は、その被験体により提示される。一態様では、このような治療に有用な抗体は、生存している哺乳動物におけるＡβペプチドの毒性作用を治療的に減弱する抗体を含む。一態様では、このような治療に有用な抗体は、ＡｐｏＥ内のエピトープに結合するものを含む。
【００１４】
一態様では、抗ＡｐｏＥ抗体は、少なくとも一つの適切な適合性のあるアジュバント又は賦形剤と混合され、Ａβプラーク関連症状に罹患している生存被験体、例えばヒトに、上手にかつ効果的に投与（付与）される治療用の医薬組成物が得られる。典型的には、これは高純度の水性組成物である。
【００１５】
ここで使用される場合、「治療する」又は「治療」なる用語は、Ａβプラーク関連症状の少なくとも一つの症状又は徴候を、予防、減弱、又は改善することを含む。
【００１６】
ここで使用される場合、「治療的減弱」なる用語は、そこから得られる有益な正の効果を有するか又は変化を誘導することを含む。
【００１７】
Ａβプラーク関連症状の一つの定義は、アミロイド線維と称される規則的に整列した原線維凝集体からなるアミロイドプラークの形成に起因する任意の症状を指す。Ａβプラーク関連症状を有する例示的な疾患には、限定されるものではないが、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、及び脳アミロイド血管症が含まれる。
【００１８】
例示的なＡβプラーク関連症状には、障害性認知機能、行動変化(altered behavior)、情緒調節不全、発作、障害性神経系構造又は機能、アルツハイマー病の発症の危険性の増加が含まれる。障害性認知機能には、限定されるものではないが、記憶、注意、集中、言語、論理的思考、創造性、実行機能、計画性、及び器質化が含まれる。行動変化には、限定されるものではないが、身体的又は言語的攻撃性、衝動性、抑制力の低下、アパシー、惹起の低下、人格変化、アルコール、たばこ又は薬剤の中毒、及び他の嗜好に関連した行動が含まれる。情緒調節不全には、限定されるものではないが、鬱、不安症、躁、易刺激性、及び情緒失調が含まれる。発作には、限定されるものではないが、全身性強直性間代性発作、複雑部分発作、及び非てんかん性、心因性発作が含まれる。障害性神経系構造又は機能には、限定されるものではないが、水頭症、パーキンソン病、睡眠障害、精神病、バランスと協調性の障害が含まれる。これには、運動障害、例えば不全単麻痺、不全片麻痺、四肢不全麻痺、運動失調、バリズム、及び振戦が含まれる。また、これには、嗅覚、触覚、味覚、視覚及び聴覚を含む、感覚の消失又は機能不全が含まれる。さらに、これには、自律神経系障害、例えば大腸及び膀胱の機能不全、性機能不全、血圧、及び温度調節不全が含まれる。最後に、これには、視床下部及び脳下垂体の機能不全に起因するホルモン障害、例えば成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体ホルモン、濾胞刺激ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、プロラクチン、及び多くの他のホルモン及びモジュレーターの欠乏及び調節不全が含まれる。アルツハイマー病の発症の危険性の増加は、被験体の年齢、家族の病歴、遺伝状態、及び他の既知の危険因子がある場合の予期される危険性が上昇した危険を含む。
【００１９】
Ａβペプチドは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と称されるより大きなタンパク質のカルボキシ末端における領域から誘導されるものである。ＡＰＰをコードする遺伝子は染色体２１に位置する。毒性作用を有しているおそれのある多くの形態のＡβが存在する。Ａβペプチドは典型的には３８−４３のアミノ酸配列長であるが、それらの全体的な大きさを変えるトランスケーション及び修飾がなされている場合がある。それらは、モノマー、オリゴマー及び凝集体の形態で、細胞内又は細胞外的に、可溶性及び不溶性の区画に見出すことができ、他のタンパク質又は分子と複合体化している場合がある。Ａβの副作用又は毒性作用は、上述した形態のいずれか又は全て、並びに特に記載していない他のものに起因している場合がある。
【００２０】
一実施態様では、本発明は、本発明の脳内のアミロイドプラーク負荷を低下させるための方法を提供する。本方法は、被験体に、ＡｐｏＥに特異的に結合する治療的有効量の抗体を投与することを含む。適切な抗体には、ここに開示されたものが含まれる。例示的な実施態様では、適切なＡｂは、以下の表Ａに説明した抗体を含む。本発明の方法は、被験体の海馬におけるアミロイドプラーク負荷を低減させる。また本発明の方法は、被験体の大脳皮質におけるアミロイドプラーク負荷を低減させる。上述した実施態様のそれぞれにおいて、アミロイドプラーク負荷は、未治療又は負のコントロール体で治療された被験体と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０％低下している。いくつかの実施態様では、アミロイドプラーク負荷は、未治療又は負のコントロール体で治療された被験体と比較して、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％低下している。他の実施態様では、アミロイドプラーク負荷は、未治療又は負のコントロール体で治療された被験体と比較して、少なくとも１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０％低下している。アミロイドプラーク負荷を測定する方法は、当該技術分野で知られている。
【００２１】
ここで有用な抗ＡｐｏＥ抗体は、Ａβの副作用又は毒性作用を治療的に減弱させる全ての抗体を含む。有用な抗体には、限定されるものではないが、ＡｐｏＥコード化配列内のエピトープに特異的に結合するものが含まれる。ここで有用な抗ＡｐｏＥ抗体には、Ａβの副作用又は毒性作用を減弱させ、ＡｐｏＥの特定の領域及び他の形態のＡｐｏＥに結合する抗体が含まれる。ＡｐｏＥの特定の領域は、限定されるものではないが、Ｃ末端、Ｎ末端、及び他の中心ドメインが含まれる。他の形態のＡｐｏＥには、限定されるものではないが、切断、修飾、可溶性、不溶性、細胞内、細胞外、モノマーＡｐｏＥ、オリゴマーＡｐｏＥ、原線維、凝集化ＡｐｏＥ、又は他のタンパク質又は分子と錯化したＡｐｏＥが含まれる。
【００２２】
一態様では、ここで有用な抗体には、単離され、特徴付けされ、精製された抗体が、官能化され、Ａβプラーク関連症状を患っている生存している被験体に投与される、機能的治療用組成物に使用するために回収されるものが含まれる。
【００２３】
「モノクローナル抗体」は、任意の真核生物、原核生物、又はファージクローンを含む、単一のコピー又はクローンから誘導される抗体を意味する。「モノクローナル抗体」はハイブリドーマ技術で産生されえる抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、例えば、当該技術分野でよく知られているハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、又はこのような技術の組合せ、及び当該技術分野で直ぐに知られている他の技術を使用し、生成することができる。さらに、モノクローナル抗体は、当該技術分野で知られている方法に従い、検出可能な標識で標識化されてよく、固相に固定されてもよく、及び／又は異種化合物（例えば、酵素又は毒素）とコンジュゲートされてもよい。
【００２４】
さらに、「抗体」とは、機能的モノクローナル抗体、又は免疫学的に有効なその断片；例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、又はそのＦ(ａｂ')２断片を意味する。ここで本文の一部において、断片は特に強調されて記載されているが、それにもかかわらず、断片が特異的であるかどうかにかかわらず、「抗体」なる用語が、このような断片並びに単鎖形態を含むと理解されるであろう。タンパク質が、意図した標的に特異的に結合する能力を保持している限り、「抗体」なる用語に含まれる。例えば、「抗体」なる定義には、この特異性を有する抗体の単鎖形態、一般的にＦｖと称される領域が含まれる。好ましくは、必要ではないが、適切な特異性を有する典型的なマウス又は他の非ヒト抗体のマニピュレーションが、それらをヒト化形態に転換させるために必要である場合、この発見に有用な抗体は、組換え的に生成される。抗体は、グリコシル化されていてもされていなくてもよいが、グリコシル化された抗体が好ましい。知られているように、抗体はジスルフィド結合を介して適切に架橋している。
【００２５】
ここで有用な抗体の基本的な抗体構造単位は、テトラマーを含む。各テトラマーは２の同一のポリペプチド鎖対からなり、各対は１の「軽」（約２５ｋＤａ）及び１の「重」鎖（約５０−７０Ｄａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識の主因である約１００から１１０又はそれ以上のアミノ酸配列の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能の主因である定常領域を定める。
【００２６】
ここで有用な抗ＡｐｏＥ抗体には、単離され、特徴付けされ、精製され、官能化され、それらの調製プロセスから回収される（得られる）もの、よって治療的及び医薬的に十分な量の有用な形態で、ここでの使用に有用なものが含まれる。
【００２７】
軽鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ及びラムダに分類分けされている。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロンに分類分けされており、抗体アイソタイプは、それぞれＩｇＯ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＦ及びＩｇＥと定められている。軽鎖及び重鎖において、可変及び定常領域は、約１０以上のアミノ酸配列の「Ｄ」領域を含む重鎖と、約１２又はそれ以上のアミノ酸配列の「Ｊ」領域とが結合している。
【００２８】
各軽／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成している。よって、無傷抗体は２の結合部位を有している。鎖は、相補性決定領域と称される(ここでは、以下「ＣＤＲ」と称される)、３の高頻度可変領域に結合した、相対的に保存されているフレームワーク領域(ＦＲ)と同様の一般構造を示す。２の鎖からのＣＤＲは、特異的エピトープに結合可能なフレームワーク領域に整列している。Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖及び重鎖の双方は、それぞれドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。各ドメインに対するアミノ酸配列の割当ては、既知の協定に従いなされている（Kabat 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」 National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 及び 1991；Chothiaら, J. Mol. Bio. (1987) 196:901-917；Chothiaら, Nature (1989) 342:878-883を参照）。
【００２９】
一態様では、モノクローナル抗ＡｐｏＥ抗体は、哺乳動物の抗体生成細胞からハイブリドーマを形成させ、又はそれらを不死化させ、適切な特異性について、それらを評価するために、ハイブリドーマ又は不死化細胞を培養する、哺乳動物を免疫化させる標準的な技術により、適切な特異性を有するように作製される。本例では、このような抗体は、例えば、ＡｐｏＥタンパク質をコードする配列の領域、又はそれらの適切な小領域を含むエピトープを表すペプチドを用いて、ヒト、ウサギ、ラット又はマウスを免疫化させることにより作製することができる。組換えマニピュレーション用の物質は、ハイブリドーマ、又はそれを生成する他の細胞からの所望の抗体をコードするヌクレオチド配列を回収することにより得ることができる。これらのヌクレオチド配列はマニピュレートされ、単離され、特徴付けされ、精製され、回収され、所望するならば、ここで使用するために、ヒト化形態でそれらを提供することができる。
【００３０】
ここで使用される場合、「ヒト化抗体」には、非ヒト相補性決定領域(「ＣＤＲ」)を有する抗体の配列を変えることにより、ヒト抗体生殖系列から誘導される、アミノ酸配列の一部又は全体からなる抗ＡｐｏＥ抗体が含まれる。最も簡単なこのような変化は、単に、マウス定常領域をヒト抗体の定常領域に置き換える、よって、製薬用途において許容可能な、十分低い免疫原性を有するヒト／マウスキメラにすることからなる。しかしながら好ましくは、抗体の可変領域、及びＣＤＲは、当該技術でよく知られている技術により、ヒト化されてもよい。可変領域のフレームワーク領域は、ヒトゲノムから誘導された配列でＣＤＲを置き換える、又は実質的に無傷の非ヒトＣＤＲを残した、対応するヒトフレームワーク領域で置換される。またＣＤＲは、ＡｐｏＥに対する結合活性及び親和性が、完全なヒト生殖系列フレームワーク領域、又は実質的にヒトであるフレームワーク領域において保持される又は高められるように、ランダムに変異していてもよい。実質的にヒトフレームワーク領域は、公知のヒトフレームワーク配列と、少なくとも９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する。完全に有用なヒト抗体は、その免疫系がヒト免疫系に対応するように変更された、遺伝的に修飾されたマウスにおいて生成される。上述したように、それは、単鎖形態を表す断片を含む、抗体の免疫学的に特異的な断片を使用するため、この発見の方法における使用に十分である。
【００３１】
さらに、ここで使用される場合、「ヒト化抗体」なる用語は、ヒトフレームワーク、非ヒト抗体からの少なくとも一つのＣＤＲを含む抗ＡｐｏＥ抗体を称し、存在する任意の定常領域は、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち少なくとも約８５-９０％、好ましくは少なくとも９５％同一である。よって、可能ならばＣＤＲを除く、ヒト化抗体の全ての部分は、一又は複数の天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する対と、実質的に同一である。
【００３２】
所望されるならば、ヒト化免疫グロブリンのデザインは以下の通りに実施されうる。アミノ酸配列が以下のカテゴリーに入る場合、使用されるヒト免疫グロブリン（アクセプター）のフレームワークアミノ酸配列は、ＣＤＲ提供非ヒト免疫グロブリン（ドナー免疫グロブリン）からのフレームワークアミノ酸配列により置き換えられ：（ａ）アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域におけるアミノ酸配列は、その位置でヒト免疫グロブリンとは異なるが、ドナー免疫グロブリンにおける対応するアミノ酸は、その位置でヒト免疫グロブリンに対して典型的であり；（ｂ）アミノ酸配列の位置は、ＣＤＲの一つに近接しており；又は（ｃ）フレームワークアミノ酸配列の任意の側鎖原子は、３次元免疫グロブリンモデルのＣＤＲアミノ酸配列の任意の原子の約５−６オングストローム（中心間）内にある（Queenら, op. cit., 及び Coら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:2869）。アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域におけるアミノ酸配列、及びドナー免疫グロブリンにおける対応するアミノ酸配列のそれぞれが、その位置でヒト免疫グロブリンとは異なる場合、このようなアミノ酸配列は、その位置でヒト免疫グロブリンに対して典型的なアミノ酸配列に置き換えられる。
【００３３】
全ての例において、本発明の抗体はＡｐｏＥに特異的に結合する。例示的実施態様では、本発明の抗体はヒトＡｐｏＥに特異的に結合する。ここで「特異的に結合」なる表現は、少なくとも１０−４−１０−６Ｍ−１の範囲、好ましくは１０−７−１０−９Ｍ−１の範囲の結合定数で、タンパク質に結合している抗体を意味する。多様な種のＡｐｏＥの配列は当該技術で公知であり、抗体がＡｐｏＥに結合するかどうかを測定する方法は、当該技術で公知である。例えば、実施例を参照。本発明の抗体は、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、又はその対立遺伝子変異体を認識する。一実施態様では、本発明の抗体はヒトＡｐｏＥ４を認識する。
【００３４】
好ましい抗体は、ハイブリドーマ命名でＨＪ６．１（ＡＴＣＣ特許寄託符号ＰＴ−１１８０５）、ＨＪ６．２（ＡＴＣＣ特許寄託符号ＰＴ−１１８０６）、ＨＪ６．３（ＡＴＣＣ特許寄託符号ＰＴ−１１８０７）、又はＨＪ６．４（ＡＴＣＣ特許寄託符号ＰＴ−１１８０８）から誘導されたマウス抗体のヒト化形態である。ここで使用される場合、「から誘導された」なる用語は、「誘導された」抗体が、ＨＪ６．１、ＨＪ６．２、ＨＪ６．３、又はＨＪ６．４により生成された抗体から少なくとも一つのＣＤＲ領域を含むことを意味する。換言すれば、「誘導された抗体」は、配列番号：１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、及び３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも一つのＣＤＲ領域を含む。
【００３５】
一実施態様では、本発明の抗体は、ハイブリドーマＨＪ６．１から誘導されてよく、配列番号：１の軽鎖可変領域と、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する核酸配列によりコードされてよく、又は配列番号：２の重鎖可変領域と、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する核酸配列によりコードされてよい。他の実施態様では、本発明の抗体は、配列番号：３の軽鎖可変領域と、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてよく、又は配列番号：４の重鎖可変領域と、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてよい。上述した実施態様のそれぞれにおいて、抗体はヒト化されていてよい。
【００３６】
さらなる他の実施態様では、本発明の抗体は、ハイブリドーマＨＪ６．２から誘導されてよく、配列番号：５の軽鎖可変領域と、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する核酸配列によりコードされてよく、又は配列番号：６の重鎖可変領域と、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する核酸配列によりコードされてよい。他の実施態様では、本発明の抗体は、配列番号：７の軽鎖可変領域と、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてよく、又は配列番号：８の重鎖可変領域と、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてよい。上述した実施態様のそれぞれにおいて、抗体はヒト化されていてよい。
【００３７】
付加的な実施態様では、本発明の抗体は、ハイブリドーマＨＪ６．３から誘導されてよく、配列番号：９の軽鎖可変領域と、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する核酸配列によりコードされてよく、又は配列番号：１０の重鎖可変領域と、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する核酸配列によりコードされてよい。他の実施態様では、本発明の抗体は、配列番号：１１の軽鎖可変領域と、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてよく、又は配列番号：１２の重鎖可変領域と、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてよい。上述した実施態様のそれぞれにおいて、抗体はヒト化されていてよい。
【００３８】
さらなる他の実施態様では、本発明の抗体は、ハイブリドーマＨＪ６．４から誘導されてよく、配列番号：１３の軽鎖可変領域と、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する核酸配列、又は配列番号：１４の重鎖可変領域と、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する核酸配列を有していてよい。他の実施態様では、本発明の抗体は、ハイブリドーマＨＪ６．４から誘導されてよく、配列番号：１５の軽鎖可変領域と、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号：１６の重鎖可変領域と、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有していてよい。上述した実施態様のそれぞれにおいて、抗体はヒト化されていてよい。
【００３９】
抗ＡｐｏＥに結合する本発明の抗体の例示的実施態様では、抗体は、配列番号：１の軽鎖核酸配列、及び配列番号：２の重鎖核酸配列を含む［すなわち、ＨＪ６．１とここで称されるモノクローナル抗体］。抗ＡｐｏＥに結合する本発明の抗体の他の例示的実施態様では、抗体は、配列番号：３の軽鎖アミノ酸配列、及び配列番号：４の重鎖アミノ酸配列を含む［すなわち、ＨＪ６．１とここで称されるモノクローナル抗体］。抗ＡｐｏＥに結合する本発明の抗体のさらなる他の例示的実施態様では、抗体は、配列番号：５の軽鎖核酸配列、及び配列番号：６の重鎖核酸配列を含む［すなわち、ＨＪ６．２とここで称されるモノクローナル抗体］。抗ＡｐｏＥに結合する本発明の抗体のさらなる他の例示的実施態様では、抗体は、配列番号：７の軽鎖アミノ酸配列、及び配列番号：８の重鎖アミノ酸配列を含む［すなわち、ＨＪ６．２とここで称されるモノクローナル抗体］。
【００４０】
ある実施態様では、本発明の抗体は、配列番号：９の軽鎖核酸配列、及び配列番号：１０の重鎖核酸配列によりコードされる［すなわち、ＨＪ６．３とここで称されるモノクローナル抗体］。他の実施態様では、本発明の抗体は、配列番号：１１の軽鎖アミノ酸配列、及び配列番号：１２の重鎖アミノ酸配列によりコードされる［すなわち、ＨＪ６．３とここで称されるモノクローナル抗体］。他の実施態様では、本発明の抗体は、配列番号：１３の軽鎖核酸配列、及び配列番号：１４の重鎖核酸配列によりコードされる［すなわち、ＨＪ６．４とここで称されるモノクローナル抗体］。さらなる他の実施態様では、本発明の抗体は、配列番号：１５の軽鎖アミノ酸配列、及び配列番号：１６の重鎖アミノ酸配列によりコードされる［すなわち、ＨＪ６．４とここで称されるモノクローナル抗体］。
【００４１】
一実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖ＣＤＲ１、例えば表Ａの抗体１、４９、９７、及び１４５を含んでよい。他の実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖ＣＤＲ２、例えば表Ａの抗体４、５２、１００、及び１４８を含んでよい。さらなる他の実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖ＣＤＲ３、例えば表Ａの抗体６、５４、１０２、及び１５０を含んでよい。別の実施態様では、本発明の抗体は、２又は３の軽鎖ＣＤＲ、例えば表Ａの抗体２、３、５、５０、５１、５３、９８、９９、１０１、１４６、１４７、及び１４９の組合せを含んでよい。
【００４２】
同様に、一実施態様では、本発明の抗体は、重鎖ＣＤＲ１、例えば表Ａの抗体７、５５、１０３、及び１５１を含んでよい。他の実施態様では、本発明の抗体は、重鎖ＣＤＲ２、例えば表Ａの抗体１０、５８、１０６、及び１５４を含んでよい。さらなる他の実施態様では、本発明の抗体は、重鎖ＣＤＲ３、例えば表Ａの抗体１２、６０、１０８、及び１５６を含んでよい。別の実施態様では、本発明の抗体は、２又は３の重鎖ＣＤＲ、例えば表Ａの抗体８、９、１１、５６、５７、５９、１０４、１０５、１０７、１５２、１５３、及び１５５の組合せを含んでよい。
【００４３】
また、本発明の抗体は、一又は複数の軽鎖ＣＤＲ、及び一又は複数の重鎖ＣＤＲ、例えば、表Ａの抗体１３−４８、６１−９６、１０９−１４４、及び１５７−１９２を含んでよい。
【００４４】
2014502276.tif 000002
2014502276.tif 000003
2014502276.tif 000004
2014502276.tif 000005
2014502276.tif 000006
2014502276.tif 000007
【００４５】
種々の実施態様では、本発明の抗体はヒト化されている。例えば、一実施態様では、本発明のヒト化抗体は、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：１７のアミノ酸配列のＣＤＲ１、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：１８のアミノ酸配列のＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＬＳＰのＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を有していてもよく、又は０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：１９のアミノ酸配列のＣＤＲ１、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：２０のアミノ酸配列のＣＤＲ２、及び０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：２１のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有していてもよい。好ましい実施態様では、本発明のヒト化抗体は、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：１７のアミノ酸配列のＣＤＲ１、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：１８のアミノ酸配列のＣＤＲ２、アミノ酸配列ＬＳＰのＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：１９のアミノ酸配列のＣＤＲ１、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：２０のアミノ酸配列のＣＤＲ２、及び０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：２１のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有していてもよい。例示的な実施態様では、本発明のヒト化抗体は、配列番号：１７のアミノ酸配列のＣＤＲ１、配列番号：１８のアミノ酸配列のＣＤＲ２、アミノ酸配列ＬＳＰのＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、配列番号：１９のアミノ酸配列のＣＤＲ１、配列番号：２０のアミノ酸配列のＣＤＲ２、及び配列番号：２１のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有していてもよい。また本発明は、当業者により容易に決定可能で、ベクター又は他の大きなＤＮＡ分子、例えば染色体に導入されて、本発明の抗体を発現する配列番号：１７、１８、１９、２０、及び２１の対応する核酸配列も含む。
【００４６】
他の実施態様では、本発明のヒト化抗体は、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：２２のアミノ酸配列のＣＤＲ１、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：２３のアミノ酸配列のＣＤＲ２、及び０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：２４のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を有していてもよく、又は０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：２５のアミノ酸配列のＣＤＲ１、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：２６のアミノ酸配列のＣＤＲ２、及び０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：２７のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有していてもよい。好ましい実施態様では、本発明のヒト化抗体は、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：２２のアミノ酸配列のＣＤＲ１、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：２３のアミノ酸配列のＣＤＲ２、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：２４のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、及び０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：２５のアミノ酸配列のＣＤＲ１、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：２６のアミノ酸配列のＣＤＲ２、及び０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：２７のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有していてもよい。例示的な実施態様では、本発明のヒト化抗体は、配列番号：２２のアミノ酸配列のＣＤＲ１、配列番号：２３のアミノ酸配列のＣＤＲ２、配列番号：２４のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、配列番号：２５のアミノ酸配列のＣＤＲ１、配列番号：２６のアミノ酸配列のＣＤＲ２、及び配列番号：２７のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有していてもよい。また本発明は、当業者により容易に決定可能で、ベクター又は他の大きなＤＮＡ分子、例えば染色体に導入されて、本発明の抗体を発現する、配列番号：２２、２３、２４、２５、２６、及び２７の対応する核酸配列も含む。
【００４７】
さらなる他の実施態様では、本発明のヒト化抗体は、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：２８のアミノ酸配列のＣＤＲ１、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：２９のアミノ酸配列のＣＤＲ２、及び０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：３０のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を有していてもよく、又は０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：３１のアミノ酸配列のＣＤＲ１、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：３２のアミノ酸配列のＣＤＲ２、及び０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：３３のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有していてもよい。好ましい実施態様では、本発明のヒト化抗体は、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：２８のアミノ酸配列のＣＤＲ１、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：２９のアミノ酸配列のＣＤＲ２、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：３０のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、及び０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：３１のアミノ酸配列のＣＤＲ１、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：３２のアミノ酸配列のＣＤＲ２、及び０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：３３のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有していてもよい。例示的な実施態様では、本発明のヒト化抗体は、配列番号：２８のアミノ酸配列のＣＤＲ１、配列番号：２９のアミノ酸配列のＣＤＲ２、配列番号：３０のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、配列番号：３１のアミノ酸配列のＣＤＲ１、配列番号：３２のアミノ酸配列のＣＤＲ２、及び配列番号：３３のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有していてもよい。また本発明は、当業者により容易に決定可能で、ベクター又は他の大きなＤＮＡ分子、例えば染色体に導入されて、本発明の抗体を発現する、配列番号：２８、２９、３０、３１、３２、及び３３の対応する核酸配列も含む。
【００４８】
さらなる他の実施態様では、本発明のヒト化抗体は、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：３４のアミノ酸配列のＣＤＲ１、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：３５のアミノ酸配列のＣＤＲ２、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：３０のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を有していてもよく、又は０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：３７のアミノ酸配列のＣＤＲ１、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：３８のアミノ酸配列のＣＤＲ２、及び０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：３９のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有していてもよい。好ましい実施態様では、本発明のヒト化抗体は、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：３４のアミノ酸配列のＣＤＲ１、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：３５のアミノ酸配列のＣＤＲ２、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：３６のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：３７のアミノ酸配列のＣＤＲ１、０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：３８のアミノ酸配列のＣＤＲ２、及び０から２のアミノ酸置換を伴う配列番号：３９のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有していてもよい。例示的な実施態様では、本発明のヒト化抗体は、配列番号：３４のアミノ酸配列のＣＤＲ１、配列番号：３５のアミノ酸配列のＣＤＲ２、配列番号：３６のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、配列番号：３７のアミノ酸配列のＣＤＲ１、配列番号：３８のアミノ酸配列のＣＤＲ２、及び配列番号：３９のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有していてもよい。また本発明は、当業者により容易に決定可能で、ベクター又は他の大きなＤＮＡ分子、例えば染色体に導入されて、本発明の抗体を発現する、配列番号：３４、３５、３６、３７、３８、及び３９の対応する核酸配列も含む。
【００４９】
一態様では、免疫学的に反応性のある断片を含む、好ましくは製薬グレードの製薬的有効量の抗体が、Ａβプラーク関連症状を治療するために、生存している被験体等の被験体に投与される。投与は、好ましくは標準的な効果的技術を使用して実施され、中枢神経系への局所的又は末梢的（すなわち、中枢神経系への投与によらない）なものを含む。末梢的投与には、限定されるものではないが、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、経鼻、口腔、舌下、又は坐薬的投与が含まれる。中枢神経系（ＣＮＳ）への直接的なものを含む局所投与には、限定されるものではないが、腰部、脳室内、又は実質内カテーテルを介して、又は外科的に移植された徐放製剤の使用が含まれる。
【００５０】
有効投与のための製薬用組成物は、選択された投与方式に適したように意図的に設計されており、製薬的に許容可能な賦形剤、例えば適合性のある分散剤、バッファー、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、等張剤、安定剤等が、適切に使用される。その全体が参照としてここに導入される、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Pa., 16Ed ISBN: 0-912734-04-3, 最新版により、一般的に実施が知られているような、製剤化技術の概要が提供される。それは、この発見に有用な抗体の可溶性を変えるために特に有用であり、例えば、それらをリポソームにカプセル化させ、極性基をブロックすることにより、さらに親油性にされる。
【００５１】
静脈内又は腹腔内又は皮下注射による効果的な末梢系送達は、生存している被験体への好ましい投与方法である。このような注射に適したビヒクルは容易である。しかしながら、さらに、投与は鼻用エアゾール又は坐薬の手段で、粘膜を介してもたらされてもよい。このような投与方式に適した製剤はよく知られており、典型的には、経膜移動を容易にする界面活性剤を含む。このような界面活性剤は多くの場合ステロイド類から誘導され、カチオン性脂質、例えばＮ-[１-(２,３-ジオレオイル)プロピル]-Ｎ,Ｎ,Ｎ-トリメチルアンモニウムクロリド(ＤＯＴＭＡ)、又は種々の化合物、例えばコレステロールヘミスクシナート、ホスファチジルグリセロール等である。
【００５２】
投与される製剤におけるヒト化抗体の濃度は有効な量であり、少なくて約０．１重量％、多くて約１５又は約２０重量％の範囲であり、所望するならば、選択された特定の投与方式に従い、流体の容量、粘度等に基づき、主として選択される。生存している被験体への注射用の典型的な組成物は、リン酸緩衝食塩水の滅菌緩衝水を１ｍＬ、及び本発見のヒト化抗体の任意の一つ又は組合せを約１−１０００ｍｇ含有するように作製することができる。製剤は、処方後、又は微生物学的に許容可能なように、滅菌濾過されることができる。静脈内注入用の典型的な組成物は、１−２５０ｍＬの流体、例えば滅菌リンガー液の容量で、ｍｌ当たり１−１００ｍｇ又はそれ以上の抗ＡｐｏＥ抗体濃度とすることができる。本発見の治療剤は、保管用に凍結又は凍結乾燥させ、使用前に適切な滅菌担体において再構成させることができる。凍結乾燥及び再構成は、種々の程度の抗体活性損失に至る可能性がある（例えば、従来の免疫グロブリンを用いると、ＩｇＭは、ＩｇＧ抗体よりも大きな活性損失を有する傾向にある）。投与される用量は有効な用量であり、補償するように調節されなくてはならない。一般的に、製薬グレード品質の製剤のｐＨは、投与された被験体の痛みを和らげ、抗体の安定性（化学的及び物理的）が釣り合うように選択されるであろう。一般的に、ｐＨ４〜８が許容される。用量は、成功裏に投与を受容する個人の、サイズ、体重、及び他の生理学的特徴に基づき、ヒトによって変わるであろう。
【００５３】
ここで使用される場合、「有効量」なる用語は、物質が投与される被験体に対して、測定可能な有益な効果に至らしめる、すなわち有意な有効性のある化合物等の物質の量を意味する。この発見に従い投与される化合物の有効量又は用量は、投与される化合物、投与経路、治療される症状の状態、同様の被験体、及び他の考慮事項のなかでも、投与状況の考慮事項を含む、本ケースを囲む状況により決定されるであろう。一態様では、典型的な用量は、ここで記載の抗ＡｐｏＥ抗体を約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ含む。用量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができる。投与頻度は、症状を効果的に治療するのに必要ならば、毎日、又は週毎もしくは月毎に１、２、３回又はそれ以上である。
【００５４】
疾患それ自体に対する治療の投与のタイミング及び治療時間は、本ケースを囲む状況により決定されるであろう。緊急医療従事者により投与される場合、治療は、例えば損傷の部位にて、直ちに始められる。治療は、病因又は診療所で、もしくは病院を退院した後、又は外来クリニックで診察された後に始めることもできる。治療時間は、１回基本で投与された単一用量から、治療的治療の生涯コースの範囲とすることができる。
【００５５】
先の方法は、適切に適応させることにより、ヒト化抗体等のタンパク質の投与に対して、最も簡便で最も適切で効果的であると思われるが、投与のための他の効果的な技術、他の脳室内投与、経皮投与及び経口投与も、提供された適切な製剤をここで利用するために使用することができる。
【００５６】
さらに、生物分解性フィルム又はマトリックス、又は浸透圧ミニポンプ、又はデキストランビーズ、アルギナート、又はコラーゲンをベースにした送達システムを使用して、徐放性製剤を使用することが望ましい。
【００５７】
典型的な用量レベルは、標準的な臨床技術を使用して決定及び最適化され、投与方式に依存するであろう。
【００５８】
次の実施例は、本発明の好ましい実施態様を証明するために含められる。当業者には、以下の実施例に開示される技術が、本発明の実施においてよく機能すると本発明者により見出された技術を表していることが理解されなければならない。しかしながら、当業者であれば、本開示に鑑み、開示された特定の実施態様において多くの変更をなすことができ、本発明の精神及び範囲を逸脱しないで同様の結果が得られ、よって付随する実施例及び図に説明された又は示された全ての事項は、例証のためであり、限定する意味ではないと理解すべきである。
【実施例】
【００５９】
以下の実施例は、本発明の種々の反復を例証するものである。
【００６０】
ＡｐｏＥタンパク質に特異的な抗体を、以下の実施例１及び２に記載されるように、ハイブリドーマ技術を使用して産生した。特に、４のハイブリドーマを産生し、ＡｐｏＥ抗体をハイブリドーマから得た。ハイブリドーマＨＪ６．１、ＨＪ６．２、ＨＪ６．３及びＨＪ６．４には、それぞれＡＴＣＣ特許寄託符号ＰＴ−１１８０５、ＰＴ−１１８０６、ＰＴ−１１８０７、及びＰＴ−１１８０８が割り当てられた。
【００６１】
実施例１：ハイブリドーマの調製
最初に、生理食塩水に１００μｌの抗原ペプチド（ＡｐｏＥ、１ｍｇ／ｍｌ）が入ったものを、同量のフロイント完全アジュバントと混合し、乳化させ、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ、６週齢）の背中に接種した。２週間後、フロイント不完全アジュバントと抗原ペプチド（ＡｐｏＥ、１ｍｇ／ｍｌ）の生理食塩水５０μｌの混合物を、超音波処理で乳化させたものにてマウスを再免疫化し、その後、追加免疫を週毎に実施した。免疫化の４０日後、脾臓を取り出し、ＰＲＭ１６４０培地（ペニシリンとストレプトマイシンを補填）にリンパ球を収集し、０．１７Ｍの塩化アンモニウムで処理し、赤血球を除去した。単離されたリンパ球を、ポリエチレングリコール法（ＰＥＧ４０００）により、マウス骨髄腫瘍から誘導された骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１株と融合させ、ハイブリドーマ細胞を得た。このようにして得られたハイブリドーマ細胞を、フィーダー細胞を有するＨＡＴ培地に懸濁させ、ついで、９６ウェルプレートに分配させ、１５日間培養した。
【００６２】
実施例２：モノクローナル抗体のスクリーニング
培養培地上清を、実施例１で得られたハイブリドーマ細胞が培養されたウェルから回収し、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法により、抗原ペプチドと反応するモノクローナル抗体を選択した。
【００６３】
最初に、１０μｇ／ｍｌの抗原ペプチド１００μｌを、９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、４℃で一晩保持した後、固相に固定化し、３７℃で一晩、１０％の仔ウシ
血清２００μｌでブロックした。ついで、ハイブリドーマ細胞の培養培地上清１００μｌを各ウェルに添加し、３７℃で２時間反応させ、ついで、１００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−コンジュゲート抗マウス抗体を添加し、３７℃で１時間反応させた。基質として、テトラメチルベンジジンマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（ＴＭＢ）を使用し、発色させた。
【００６４】
４Ｎの硫酸１００μＬを添加することにより反応を終結させた後、４５０〜５４０ｎｍの吸光度を測定し、約３の吸光度を示すモノクローナル抗体を選択肢、限界希釈法でクローン化した。
【００６５】
７日目、及び３日前に、腹腔内的に０．５ｍｌのプリスティンが注射されたマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）を、選択されたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を用いて、腹腔内的に接種し、腹水を約１０日後に収集した。収集した腹水を室温で３０分、４℃で一晩保持し、１５０００ｘｒｐｍで１０分間、遠心分離にかけ、ついで、上清を回収した。
【００６６】
選択されたモノクローナル抗体の力価をＥＬＩＳＡ法で測定した。ＡｐｏＥをマイクロウェルプレートに固定化し、モノクローナル抗体を添加し、反応後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−コンジュゲート抗マウス抗体とＴＭＢを使用して発色させた。結果には、選択されたモノクローナル抗体が濃度依存方式で反応したことが示された。
【００６７】
実施例３：抗ＡｐｏＥ抗体がプラーク負荷の低減を生じる
アルツハイマー病被験体において観察されたのと同様の年齢関連性アミロイドプラーク形成を示すＰＳ／ＡＰＰマウスを、アルツハイマー病のマウスモデルとして使用した。ＰＳ／ＡＰＰマウスを、抗Ａβ抗体（ＨＪ３．４）、又は１又は２の抗ＡｐｏＥ抗体（ＨＪ６．２又はＨＪ６．３）のいずれかを使用し、１０ｍｇ／ｋｇにて、１週間に１回、腹腔内的に治療した。他のグループを、コントロール体として、ＰＢＳで治療した。治療は３−７月齢であった。海馬（図１）及び皮質（図２）の双方において示されるように、Ａβプラーク負荷の低減に関連して、抗ＡｐｏＥ抗体の強い効果が存在した。
【００６８】
実施例４：ヒトＡｐｏＥへの抗ＡｐｏＥ抗体の結合性
ＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイを使用し、ヒトＡｐｏＥに対する、抗ａｐｏＥ  ＨＪ６．１、ＨＪ６．２、ＨＪ６．３、及びＨＪ６．４抗体の結合性を測定した。ヒトａｐｏＥに結合するモノクローナル抗体ＷＵＥ４を、まず、ＥＬＩＳＡプレートにおいてコーティングした。ついで、異なる濃度のヒトａｐｏＥを適用した。ビオチン化抗ａｐｏＥ抗体ＨＪ６．１、ＨＪ６．２、ＨＪ６．３、及びＨＪ６．４を最後に適用し、光学密度（ＯＤ）をプレートリーダーにて読み取った（図３）。
【００６９】
これらの結果は、抗ａｐｏＥ抗体が、低減する効力で、ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて、ヒトａｐｏＥに結合することを示している。しかしながら、抗ａｐｏＥ抗体ＨＪ６．４は、このアッセイでヒトａｐｏＥに結合しなかった。
【００７０】
実施例５：抗ａｐｏＥ抗体は血漿中のヒトａｐｏＥに結合するが血漿コレステロールに影響を与えない
これらの実験では、ヒトＡｐｏＥ４ノックインマウスを使用し、血漿ａｐｏＥ／抗体複合体を測定した。ＡｐｏＥ４ノックインマウスに、５００マイクログラムのビオチン化ＨＪ６ｍＡｂｓを腹腔内的に受容させた。２４時間後、血漿を希釈（１：１０００）し、ヒトａｐｏＥに結合する、５μｇ／ｍｌのＷＵＥ４でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに充填した。ＡｐｏＥ／抗体複合体を、１：５０００に希釈したＨＲＰ４０で検出した。光学密度（ＯＤ）をプレートリーダーにて読み取った（図４Ａ）。これらの結果は、ＨＪ６．１、ＨＪ６．２、及びＨＪ６．３抗体は、血漿においてヒトａｐｏＥに結合するが、ＨＪ６．４は、血漿においてヒトａｐｏＥに結合しないことを示している。この実験をａｐｏＥ−／−マウスで実施したときには、何のシグナルも得られなかった。
【００７１】
また、血漿コレステロールを、５００マイクログラムのＨＪシリーズのモノクローナル抗体ＨＪ６．１、ＨＪ６．２、ＨＪ６．３、及びＨＪ６．４の腹腔内注射を投与した同じａｐｏＥ４＋／＋マウスにおいて測定した。血漿コレステロールは、リン酸緩衝食塩水を投与した動物に対して、変化はなかった（図４Ｂ）。
【００７２】
実施例６：末梢投与後の中枢神経系（ＣＮＳ）に見出されたヒトａｐｏＥに対するＨＪ６シリーズ抗体
ＨＪ６シリーズｍＡｂｓ又はＰＢＳを受容したＡｐｏＥ４＋／＋又はＡｐｏＥ４−／−マウスの脳脊髄液（ＣＳＦ）（図４を参照）を希釈し（１：２３）、ＣＳＦにａｐｏＥ／ビオチン化抗体複合体が入ったものを、ＷＵＥ４に捕捉させ、ついで、ＨＲＰ４０で検出した。結果は、ＣＳＦに、抗ａｐｏＥ抗体ＨＪ６．１Ｂ、ＨＪ６．２Ｂ、又はＨＪ６．３Ｂ（図５）とａｐｏＥ４との複合体が存在することを示しており、ａｐｏＥ  ｍＡｂｓのフラクションがＣＳＦ区画に挿入可能で、ａｐｏＥに結合することが示唆される。ＯＤ６５０はＨＪ６．１Ｂ＞ＨＪ６．２Ｂ＝ＨＪ６．３Ｂ＞＞＞ＨＪ６．４Ｂの順であり、これらの抗体が、ＥＬＩＳＡプレート（図３）及び血漿（図４）において、ａｐｏＥに結合する能力を示すパターンと一致した。
【００７３】
実施例７：ＨＪ６シリーズの抗体が投与されたマウスにおけるミクログリア活性
ＰＢＳに希釈した１０ｍｇ／ｋｇのＨＪ６．２、ＨＪ６．３及びＨＪ３．４、又は同量のＰＢＳを、０日目、３日目、６日目、及び９日目の時点で、腹腔内的にＰＳＡＰＰマウスに注射した。１０日目、脳を取り出し、固定し、活性化ミクログリアを標識した、抗体ＣＤ４５で染色した。ＨＪ６．３及びＨＪ３．４が注射されたマウスにおいて、活性化ミクログリアでコーティングされた皮質の量が増加した。この実験において、ＰＳＡＰＰマウスはマウスａｐｏＥを発現した。これらの結果には、ＨＪ６．３（抗ａｐｏＥ抗体）及びＨＪ３．４（抗Ａβ抗体）の、既に１０日にわたってアミロイドプラークを有している、６月齢のＰＡＳＰＰマウスへの短期間投与により、ミクログリアの活性化に至るが、抗ａｐｏＥ抗体（ＨＪ６．２）は、この効果を有するとは思われないことが示されている（図６）。
【図１】
2014502276.tif 000008
【図２】
2014502276.tif 000009
【図３】
2014502276.tif 000010
【図４】
2014502276.tif 000011
【図５】
2014502276.tif 000012
【図６】
2014502276.tif 000013
【図７−１】
2014502276.tif 000014
【図７−２】
2014502276.tif 000015
【配列表】
2014502276000001.app
【国際調査報告】
2014502276.tif 000016
2014502276.tif 000017
2014502276.tif 000018
2014502276.tif 000019