(57)【要約】  本発明は、２−カルボキサミドシクロアミノ尿素誘導体であるホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害化合物または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１つの哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む薬学的組み合わせ、そのような組み合わせを含む医薬組成物ならびに増殖性疾患、より具体的には、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）キナーゼ依存性疾患の治療へのそのような組み合わせの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）式（Ａ）の化合物
【化４】
2014513097.tif 000007
［式中、
Ａは、
【化５】
2014513097.tif 000008
からなる群から選択されるヘテロアリールを表し、
Ｒ１は、以下：（１）非置換または置換、好ましくは、置換Ｃ１〜Ｃ７−アルキル（前記置換基は、１つまたは複数、好ましくは、１から９つの以下の部分：重水素、フルオロまたは１から２つの以下の部分、Ｃ３〜Ｃ５−シクロアルキルから独立に選択される）；（２）場合により置換されたＣ３〜Ｃ５−シクロアルキル（前記置換基は、１つまたは複数、好ましくは、１から４つの以下の部分：重水素、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル（好ましくは、メチル）、フルオロ、シアノ、アミノカルボニルから独立に選択される）；（３）場合により置換されたフェニル（前記置換基は、１つまたは複数、好ましくは、１から２つの以下の部分：重水素、ハロ、シアノ、Ｃ１〜Ｃ７−アルキル、Ｃ１〜Ｃ７−アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ７−アルキル）アミノ、Ｃ１〜Ｃ７−アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１〜Ｃ７−アルキル）アミノカルボニル、Ｃ１〜Ｃ７−アルコキシから独立に選択される）；（４）場合によりモノまたはジ置換アミン（前記置換基は、以下の部分：重水素、Ｃ１〜Ｃ７−アルキル（これは、非置換であるか、または重水素、フルオロ、クロロ、ヒドロキシの群から選択される１つもしくは複数の置換基によって置換されたものである）、フェニルスルホニル（これは、非置換であるか、または１つもしくは複数、好ましくは、１つの、Ｃ１〜Ｃ７−アルキル、Ｃ１〜Ｃ７−アルコキシ、ジ（Ｃ１〜Ｃ７−アルキル）アミノ−Ｃ１〜Ｃ７−アルコキシによって置換されたものである）から独立に選択される）；（５）置換スルホニル（前記置換基は、以下の部分：Ｃ１〜Ｃ７−アルキル（これは、非置換であるか、または重水素、フルオロの群から選択される１つもしくは複数の置換基によって置換されたものである）、ピロリジノ、（これは、非置換であるか、または重水素、ヒドロキシ、オキソの群から選択される１つもしくは複数の置換基、特に、１つのオキソによって置換されたものである）から選択される）；（６）フルオロ、クロロ；の置換基の１つを表し、
Ｒ２は、水素を表し；
Ｒ３は、（１）水素、（２）フルオロ、クロロ、（３）場合により置換されたメチルを表し、前記置換基は、１つまたは複数、好ましくは、１から３つの以下の部分：重水素、フルオロ、クロロ、ジメチルアミノから独立に選択される］
であって、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−ピリミジン−４−イル］−４−メチル−チアゾール−２−イル｝−アミド）を除く化合物、またはその塩
および
ｂ）少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤
を含む薬学的組み合わせ。
【請求項２】
式（Ａ）の化合物が、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）である、請求項１に記載の薬学的組み合わせ。
【請求項３】
ｍＴＯＲ阻害剤が、ＲＡＤラパマイシン（シロリムス）ならびにエベロリムス（ＲＡＤ００１）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、ゾタロリムス（ＡＢＴ５７８）、ＳＡＲ５４３、アスコマイシン（ＦＫ５０６のエチルアナログ）、デフェロリムス（ＡＰ２３５７３／ＭＫ−８６６９）、ＡＰ２３８４１、ＫＵ−００６３７９４、ＩＮＫ−１２８、ＥＸ２０４４、ＥＸ３８５５、ＥＸ７５１８、ＡＺＤ０８０５５、ＯＳＩ−０２７、ＷＹＥ−１２５１３２、ＸＬ７６５、ＮＶ−１２８、ＷＹＥ−１２５１３２およびＥＭ１０１／ＬＹ３０３５１１などのその誘導体／類似体から選択される、請求項１または２に記載の薬学的組み合わせ。
【請求項４】
哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）キナーゼ依存性疾患の治療または予防に使用するための、請求項１または２に記載の薬学的組み合わせ。
【請求項５】
請求項１に記載の式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む、医薬組成物。
【請求項６】
哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）キナーゼ依存性疾患の治療または予防のための薬剤を製造するための、式（Ａ）の化合物
【化６】
2014513097.tif 000009
［式中、
Ａは、
【化７】
2014513097.tif 000010
からなる群から選択されるヘテロアリールを表し、
Ｒ１は、以下：（１）非置換または置換、好ましくは、置換Ｃ１〜Ｃ７−アルキル（前記置換基は、１つまたは複数、好ましくは、１から９つの以下の部分：重水素、フルオロまたは１から２つの以下の部分、Ｃ３〜Ｃ５−シクロアルキルから独立に選択される）；（２）場合により置換されたＣ３〜Ｃ５−シクロアルキル（前記置換基は、１つまたは複数、好ましくは、１から４つの以下の部分：重水素、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル（好ましくは、メチル）、フルオロ、シアノ、アミノカルボニルから独立に選択される）；（３）場合により置換されたフェニル（前記置換基は、１つまたは複数、好ましくは、１から２つの以下の部分：重水素、ハロ、シアノ、Ｃ１〜Ｃ７−アルキル、Ｃ１〜Ｃ７−アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ７−アルキル）アミノ、Ｃ１〜Ｃ７−アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１〜Ｃ７−アルキル）アミノカルボニル、Ｃ１〜Ｃ７−アルコキシから独立に選択される）；（４）場合によりモノまたはジ置換アミン（前記置換基は、以下の部分：重水素、Ｃ１〜Ｃ７−アルキル（これは、非置換であるか、または重水素、フルオロ、クロロ、ヒドロキシの群から選択される１つもしくは複数の置換基によって置換されたものである）、フェニルスルホニル（これは、非置換であるか、または１つもしくは複数、好ましくは、１つの、Ｃ１〜Ｃ７−アルキル、Ｃ１〜Ｃ７−アルコキシ、ジ（Ｃ１〜Ｃ７−アルキル）アミノ−Ｃ１〜Ｃ７−アルコキシによって置換されたものである）から独立に選択される）；（５）置換スルホニル（前記置換基は、以下の部分：Ｃ１〜Ｃ７−アルキル（これは、非置換であるか、または重水素、フルオロの群から選択される１つもしくは複数の置換基によって置換されたものである）、ピロリジノ、（これは、非置換であるか、または重水素、ヒドロキシ、オキソの群から選択される１つもしくは複数の置換基、特に、１つのオキソによって置換されたものである）から選択される）；（６）フルオロ、クロロ；の置換基の１つを表し、
Ｒ２は、水素を表し；
Ｒ３は、（１）水素、（２）フルオロ、クロロ、（３）場合により置換されたメチルを表し、前記置換基は、１つまたは複数、好ましくは、１から３つの以下の部分：重水素、フルオロ、クロロ、ジメチルアミノから独立に選択される］
であって、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−ピリミジン−４−イル］−４−メチル−チアゾール−２−イル｝−アミド）を除く化合物、または薬学的に許容されるその塩、および
少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤の使用。
【請求項７】
式（Ａ）の化合物が、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
ｍＴＯＲ阻害剤が、ＲＡＤラパマイシン（シロリムス）ならびにエベロリムス（ＲＡＤ００１）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、ゾタロリムス（ＡＢＴ５７８）、ＳＡＲ５４３、アスコマイシン（ＦＫ５０６のエチルアナログ）、デフェロリムス（ＡＰ２３５７３／ＭＫ−８６６９）、ＡＰ２３８４１、ＫＵ−００６３７９４、ＩＮＫ−１２８、ＥＸ２０４４、ＥＸ３８５５、ＥＸ７５１８、ＡＺＤ０８０５５、ＯＳＩ−０２７、ＷＹＥ−１２５１３２、ＸＬ７６５、ＮＶ−１２８、ＷＹＥ−１２５１３２およびＥＭ１０１／ＬＹ３０３５１１などのその誘導体／類似体から選択される、請求項６または７に記載の使用。
【請求項９】
治療対象の疾患が、良性または悪性腫瘍；脳、腎臓、肝臓、副腎、膀胱、乳房、腎細胞癌、神経内分泌腫瘍、前立腺、胃、胃腫瘍、卵巣、結腸、直腸、前立腺、膵臓、肺、膣もしくは甲状腺の癌、肉腫、膠芽腫、多発性骨髄腫または胃腸癌、特に、結腸癌もしくは結腸直腸腺腫または頭頸部腫瘍、上皮過剰増殖、乾癬、前立腺肥大症、新形成、上皮性新形成、リンパ腫、乳癌または白血病；臓器または組織移植拒絶反応；再狭窄；結節性硬化症；カウデン病；リンパ脈管筋腫症；網膜色素変性；自己免疫疾患；ステロイド抵抗性急性リンパ芽球性白血病；線維性疾患；肺高血圧症；免疫修飾；多発性硬化症；ＶＨＬ症候群；カーニー複合；家族性アデノナムトスポリポーシス；若年性ポリポーシス症候群；バート・ホッグ・デューク症候群；家族性肥大型心筋症；ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群；神経変性（Neurodegenarative）障害；滲出型および乾燥型黄斑変性；筋消耗（萎縮、悪液質）またはミオパチー；細菌性またはウイルス性感染症；神経線維腫症あるいはポイツ・ジェガース症候群である、請求項６または７に記載の使用。
【請求項１０】
哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）キナーゼ依存性疾患の治療または予防に使用するための、請求項１または２に記載の薬学的組み合わせ。
【請求項１１】
請求項１もしくは２に記載の式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を投与することによって、ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）キナーゼ依存性疾患を治療または予防する方法。
【請求項１２】
治療有効量の請求項１もしくは２に記載の式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩をそれを必要とする温血動物に投与するステップを含む、少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤による治療においてもたらされるＡＫＴのリン酸化および活性化に依存する増殖性疾患を治療する方法。
【請求項１３】
治療対象の疾患が、良性または悪性腫瘍；脳、腎臓、肝臓、副腎、膀胱、乳房、腎細胞癌、神経内分泌腫瘍、前立腺、胃、胃腫瘍、卵巣、結腸、直腸、前立腺、膵臓、肺、膣もしくは甲状腺の癌、肉腫、膠芽腫、多発性骨髄腫または胃腸癌、特に、結腸癌もしくは結腸直腸腺腫または頭頸部腫瘍、上皮過剰増殖、乾癬、前立腺肥大症、新形成、上皮性新形成、リンパ腫、乳癌または白血病；臓器または組織移植拒絶反応；再狭窄；結節性硬化症；カウデン病；リンパ脈管筋腫症；網膜色素変性；自己免疫疾患；ステロイド抵抗性急性リンパ芽球性白血病；線維性疾患；肺高血圧症；免疫修飾；多発性硬化症；ＶＨＬ症候群；カーニー複合；家族性アデノナムトスポリポーシス；若年性ポリポーシス症候群；バート・ホッグ・デューク症候群；家族性肥大型心筋症；ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群；神経変性（Neurodegenarative）障害；滲出型および乾燥型黄斑変性；筋消耗（萎縮、悪液質）またはミオパチー；細菌性またはウイルス性感染症；神経線維腫症あるいはポイツ・ジェガース症候群である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
治療有効量の請求項１もしくは２に記載の式（Ａ）の化合物、または薬学的に許容されるその塩をそれを必要とする温血動物に投与するステップを含む、少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤による治療に耐性を持つようになったか、またはそれに対する感受性が低下した増殖性疾患を治療する方法。
【請求項１５】
請求項１または２に記載の式（Ａ）の化合物および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤を含む組み合わせをそれを必要とする温血動物に投与するステップを含む、少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤による増殖性疾患の標的の治療の有効性を改善する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２−カルボキサミドシクロアミノ尿素誘導体であるホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害化合物または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１つの哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む薬学的組み合わせ、そのような組み合わせを含む医薬組成物ならびに増殖性疾患、より具体的には、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）キナーゼ依存性疾患の治療へのそのような組み合わせの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）の阻害が、癌細胞においてＡＫＴ活性化をもたらす上流のインスリン様増殖因子１レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）シグナル伝達を誘導する可能性があることが示されてきた。この現象がｍＴＯＲ阻害に対する細胞応答の減衰に関与すると示唆され、それが、ｍＴＯＲ阻害剤の臨床活性を弱める場合もある。例えば、進行性腫瘍を患う患者の第Ｉ相臨床試験において全患者の腫瘍のおよそ５０％においてｐＡＫＴの増加が見られた（Tabernoら、Journal of Clinical Oncology、26（2008年）、1603〜1610ページ）。
【０００３】
増殖性疾患患者に対して数々の治療選択肢があるにもかかわらず、有効で安全な治療用薬剤の必要性およびそれらの併用療法への優先的な使用の必要性が未だに存在している。本明細書中に記載されるとおりであり、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル）−アミドなどの式（Ａ）の化合物は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）のアルファアイソフォームの高度選択的阻害剤である。驚くべきことに、有効量の少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤との有効量の式（Ａ）のアルファ−特異的ＰＩ３Ｋ阻害化合物の組み合わせが哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）依存性疾患、特に、癌の治療に予想外の相乗的改善をもたらすことがわかった。同時に、順次または単独で投与されると、このアルファ−特異的ＰＩ３Ｋ阻害化合物と本発明のｍＴＯＲ阻害剤とが相互に作用して細胞増殖を強力に阻害する。この有益な相互作用により、各化合物の必要とされる用量が低減でき、副作用の緩和および治療における化合物の長期的な臨床効果の向上につながる。
【発明の概要】
【０００４】
本発明によると、式（Ａ）のアルファ−アイソフォーム特異的ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害化合物または薬学的に許容されるその塩は、ｍＴＯＲ阻害剤によるＡＫＴのリン酸化および活性化を低減または阻止することがわかった。したがって、本発明は、式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む薬学的組み合わせに関する。
【０００５】
好適な実施形態において、本発明の式（Ａ）の化合物は、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」又は「化合物１」）である。
【０００６】
好適な実施形態において、本発明のｍＴＯＲ阻害剤は、ＲＡＤラパマイシン（シロリムス）ならびにエベロリムス（ＲＡＤ００１）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、ゾタロリムス（ＡＢＴ５７８）、ＳＡＲ５４３、アスコマイシン（ＦＫ５０６のエチルアナログ）、デフェロリムス（ＡＰ２３５７３／ＭＫ−８６６９）、ＡＰ２３８４１、ＫＵ−００６３７９４、ＩＮＫ−１２８、ＥＸ２０４４、ＥＸ３８５５、ＥＸ７５１８、ＡＺＤ０８０５５、ＯＳＩ−０２７、ＷＹＥ−１２５１３２、ＸＬ７６５、ＮＶ−１２８、ＷＹＥ−１２５１３２およびＥＭ１０１／ＬＹ３０３５１１になどのその誘導体／類似体から選択される。
【０００７】
一態様において、本発明は、ｍＴＯＲキナーゼ依存性疾患の治療または予防に使用するための、式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む薬学的組み合わせを提供する。
【０００８】
別の態様において、本発明は、ｍＴＯＲキナーゼ依存性疾患の治療または予防のための薬剤を製造するための、式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩の使用を提供する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を投与することによってｍＴＯＲキナーゼ依存性疾患を治療または予防する方法を提供する。
【００１０】
別の態様において、本発明は、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）キナーゼ依存性疾患の治療に対して同時、個別または逐次使用するための、式（Ａ）の化合物と、ＲＡＤラパマイシン（シロリムス）ならびにエベロリムス（ＲＡＤ００１）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、ゾタロリムス（ＡＢＴ５７８）、ＳＡＲ５４３、アスコマイシン（ＦＫ５０６のエチルアナログ）、デフェロリムス（ＡＰ２３５７３／ＭＫ−８６６９）、ＡＰ２３８４１、ＫＵ−００６３７９４、ＩＮＫ−１２８、ＥＸ２０４４、ＥＸ３８５５、ＥＸ７５１８、ＡＺＤ０８０５５、ＯＳＩ−０２７、ＷＹＥ−１２５１３２、ＸＬ７６５、ＮＶ−１２８、ＷＹＥ−１２５１３２およびＥＭ１０１／ＬＹ３０３５１１などのその誘導体／類似体からなる群から選択される少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤との組み合わせを提供し、ここで、その活性成分は、それぞれの場合、遊離型または薬学的に許容される塩の形態で存在し、場合により少なくとも１つの薬学的に許容される担体も含む。
【００１１】
別の態様において、本発明は、式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩をそれを必要とする温血動物に投与するステップを含む、ｍＴＯＲ阻害剤によるＡＫＴのリン酸化および活性化を低減または阻止するための方法を提供する。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、治療有効量の式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩をそれを必要とする温血動物に投与するステップを含む、少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩による治療中にもたらされるＡＫＴのリン酸化および活性化に依存する増殖性疾患を治療する方法を提供する。
【００１３】
さらに別の実施形態において、本発明は、治療有効量の式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩をそれを必要とする温血動物に投与するステップを含む、少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤もしくは薬学的に許容されるその塩による治療に耐性を持つようになったか、またはそれに対する感受性が低下した増殖性疾患を治療する方法に関する。耐性は、例えば、ＡＫＴのリン酸化および活性化によるものである。
【００１４】
別の態様において、本発明は、式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む組み合わせをそれを必要とする温血動物に投与するステップを含む、少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩による増殖性疾患の治療の有効性を改善するための方法を提供する。
【００１５】
一態様において、本発明は、式（Ａ）のＰＩ３Ｋ阻害化合物または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＢＴ４７４乳腺腫瘍細胞において、エベロリムス（ＲＡＤ００１）単独薬剤、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）単独薬剤および化合物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下でウエスタンブロット分析により検出したＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＭＡＰＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）、ＭＥＫ１／２（Ｓ２１７／Ｓ２２１）のリン酸化レベルおよびアクチンレベルを示す図である。
【図２】ＢＴ４７４乳腺腫瘍細胞おいて、エベロリムス（ＲＡＤ００１）単独薬剤、化合物Ｉ単独薬剤および化合物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下で逆相タンパク質アレイ方法論によって定量した、ビヒクル対照と比較したＡＫＴ（Ｓ４７３）リン酸化レベルを示すグラフである。
【図３】ＢＴ４７４乳腺腫瘍細胞おいて、エベロリムス（ＲＡＤ００１）単独薬剤、化合物Ｉ単独薬剤および化合物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下で逆相タンパク質アレイ方法論によって定量した、ビヒクル対照と比較したＡＫＴ（Ｔ３０８）リン酸化レベルを示すグラフである。
【図４】ＢＴ４７４乳腺腫瘍細胞おいて、エベロリムス（ＲＡＤ００１）単独薬剤、化合物Ｉ単独薬剤および化合物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下で逆相タンパク質アレイ方法論によって定量した、ビヒクル対照と比較した全ＡＫＴ発現レベルを示すグラフである。
【図５】ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳腺腫瘍細胞において、エベロリムス（ＲＡＤ００１）単独薬剤、化合物Ｉ単独薬剤および化合物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下でウエスタンブロット分析により検出したＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＭＡＰＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）のリン酸化レベルおよびアクチンレベルを示す図である。
【図６】ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳腺腫瘍細胞において、エベロリムス（ＲＡＤ００１）単独薬剤、化合物Ｉ単独薬剤および化合物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下で逆相タンパク質アレイ方法論によって定量した、ビヒクル対照と比較したＡＫＴ（Ｓ４７３）リン酸化レベルを示すグラフである。
【図７】ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳腺腫瘍細胞において、エベロリムス（ＲＡＤ００１）単独薬剤、化合物Ｉ単独薬剤および化合物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下で逆相タンパク質アレイ方法論によって定量した、ビヒクル対照と比較したＡＫＴ（Ｔ３０８）リン酸化レベルを示すグラフである。
【図８】ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳腺腫瘍細胞において、エベロリムス（ＲＡＤ００１）単独薬剤、化合物Ｉ単独薬剤および化合物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下で逆相タンパク質アレイ方法論によって定量した、ビヒクル対照と比較した全ＡＫＴ発現レベルを示すグラフである。
【図９】ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳腺腫瘍細胞において、エベロリムス（ＲＡＤ００１）および化合物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下でウエスタンブロットによって検出し、さらにＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して定量した、実験の第２のセットのＡＫＴ（Ｓ４７３）のリン酸化レベル（パネルＡ）および全ＡＫＴレベル（パネルＢ）を示すグラフである。
【図１０】ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳腺腫瘍細胞において、エベロリムス（ＲＡＤ００１）単独薬剤、化合物Ｉ単独薬剤および化合物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下で逆相タンパク質アレイ方法論によって定量し、ビヒクル対照と比較した実験の第２のセットのＡＫＴ（Ｓ４７３）リン酸化レベルを示すグラフである。
【図１１】ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳腺腫瘍細胞において、エベロリムス（ＲＡＤ００１）単独薬剤、化合物Ｉ単独薬剤および化合物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下で逆相タンパク質アレイ方法論によって定量し、ビヒクル対照と比較した実験の第２のセットのＡＫＴ（Ｔ３０８）リン酸化レベルを示すグラフである。
【図１２】ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳腺腫瘍細胞において、エベロリムス（ＲＡＤ００１）単独薬剤、化合物Ｉ単独薬剤および化合物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下で逆相タンパク質アレイ方法論によって定量し、ビヒクル対照と比較した実験の第２のセットの全ＡＫＴ発現レベルを示すグラフである。
【図１３】ＳＫＢＲ−３ヒト乳癌細胞モデルにおける単独薬剤ならびにエベロリムス（ＲＡＤ００１）および／または化合物Ｉの両方による処置の全用量マトリックス細胞増殖データを示す。
【図１４】ＢＴ−４７４ヒト乳癌細胞モデルにおける単独薬剤ならびにエベロリムス（ＲＡＤ００１）および／または化合物Ｉの両方による処置の全用量マトリックス細胞増殖データを示す。
【図１５】Ｔ４７−Ｄヒト乳癌細胞モデルにおける単独薬剤ならびにエベロリムス（ＲＡＤ００１）および／または化合物Ｉの両方による処置の全用量マトリックス細胞増殖データを示す。
【図１６】ＺＲ−７５−１ヒト乳癌細胞モデルにおける単独薬剤ならびにエベロリムス（ＲＡＤ００１）および／または化合物Ｉの両方による処置の全用量マトリックス細胞増殖データを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、（ａ）本明細書中で定義されるとおりの式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩および（ｂ）少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む薬学的組み合わせに関する。
【００１８】
別に指定がない限り、以下の一般的定義を本明細書では適用する。
【００１９】
「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、本明細書中では、別に記載がない限り、制約のない、非限定的な意味で使用される。
【００２０】
「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語ならびに同様の表示は、本発明を説明する文脈において（特に、以下の特許請求の範囲の文脈において）は、本明細書中で別に指示がある場合または文脈から明らかに矛盾している場合を除いて、単数および複数の両方を対照として含むものと解釈されるべきである。化合物、塩および同種のものに対して複数形が使用される場合、１つの化合物、塩または同種のものも意味することになる。
【００２１】
「組み合わせ」は、固定の組み合わせの１単位剤形または併用投与用の要素のキットのいずれかを指し、キットの場合、式（Ａ）の化合物および組み合わせパートナー（例えば、以下に説明されるとおりの別の薬物、「組み合わせパートナー」または「治療用薬剤」としても言及される）は、独立に同時にまたは、特に、組み合わせパートナーが、協同的な、例えば、相乗効果を示す時間間隔で単独で投与されてもよい。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「薬学的組み合わせ」とは、２つ以上の活性成分を混合または組み合わせることにより得られ、固定および非固定の両方の活性成分の組み合わせを含む製品を意味する。「固定の組み合わせ」または「固定用量」という用語は、活性成分、例えば、式（Ａ）の化合物および組み合わせパートナーの両方が単一の要素または投薬の形態で患者に同時に投与されることを意味する。「非固定の組み合わせ」という用語は、活性成分、例えば、式（Ｉ）の化合物および組み合わせパートナーの両方が個別の要素として、ともに同時にまたは特定の時間制限なく順次、患者に投与されることを意味し、そのような投与により、治療有効レベルの２つの化合物がそれを必要とする温血動物の体にもたらされる。後者は、カクテル療法、例えば、３つ以上の活性成分の投与にも適用する。
【００２３】
「ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤」という用語は、本明細書中では、ＰＩ３−キナーゼを標的とする、低下させるか、または阻害する化合物を指すものと定義される。ＰＩ３−キナーゼ活性は、インスリン、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖因子、上皮増殖因子、コロニー刺激因子および肝細胞増殖因子などのいくつかのホルモンならびに増殖因子の刺激に応じて増すことが示されてきており、細胞増殖およびトランスフォーメーションに関連する過程に関わってきた。
【００２４】
「医薬組成物」という用語は、本明細書中では、温血動物を冒す特定の疾患もしくは状態を予防もしくは治療するために温血動物、例えば、哺乳動物もしくはヒトに投与される、少なくとも１つの活性成分または治療用薬剤を含む組み合わせあるいは溶液を指すものと定義される。
【００２５】
「薬学的に許容される」という用語は、本明細書中では、適切な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激症状アレルギー反応およびその他の問題となる障害がなく、適度に利益／リスクの割合が釣り合った、温血動物、例えば、哺乳動物もしくはヒトの組織との接触に適した化合物、材料、組成物および／または剤形を指すものと定義される。
【００２６】
「治療有効量」という語句は、本明細書中では、必要とする温血動物の活性、機能および反応における臨床的に重篤な欠陥を少なくとも約１５パーセント、好ましくは、少なくとも５０パーセント、より好ましくは、少なくとも９０パーセント低減するのに十分な量、最も好ましくは、それを予防するのに十分な量の意味で使用される。あるいは、治療有効量とは、それを必要とする温血動物の臨床的に重篤な状態／症状を改善させるのに十分な量である。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「治療すること」または「治療」という用語は、対象の少なくとも１つの症状を軽減、低減もしくは緩和するか、または疾患の進行の遅延をもたらす治療を含む。例えば、治療は、癌などの障害の１つもしくはいくつかの症状の減少または障害の完全な根絶であってもよい。本発明の意図において、「治療する」という用語は、発症（すなわち、疾患の臨床病態より前の期間）を阻止する、遅延させるかつ／または疾患を起こすリスクまたは悪化させるリスクを低減することも指す。「保護する」という用語は、本明細書中では、対象の疾患の発症もしくは継続もしくは悪化を予防する遅延させるもしくは治療する、または適切な場合はそれらすべての意味で使用される。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「予防する」、「予防すること」または「予防」という用語は、予防対象の状態、疾患または障害に関連するか、またはそれが原因の少なくとも１つの症状の予防を含む。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「共同で治療的に有効な」（jointly therapeutically active）または「共同治療効果」（joint therapeutic effect）という用語は、治療対象の温血動物、特に、ヒトに好まれ、依然として（好ましくは、相乗的な）相互作用（共同治療効果）を示すような時間間隔で治療用薬剤が単独（経時的に差を設ける様式、特に、順序が特定的な様式）で与えられてもよいことを意味する。それがそのケースであるか否かは、とりわけ、少なくとも特定の時間間隔の間は両化合物が治療対象のヒトの血液中に存在することを示す血中濃度を追跡することによって確認できる。
【００３０】
ＷＯ２０１０／０２９０８２は、ＰＩ３−キナーゼ（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ）に対する阻害活性を有することがわかった特異的２−カルボキサミドシクロアミノ尿素誘導体について記載している。これらの特異的ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤は、有利な薬理学的特性を有し、ベータおよび／またはデルタおよび／またはガンマサブタイプと比較した場合にＰＩ３−キナーゼアルファに対して改善された選択性を示す。本発明に適した特異的２−カルボキサミドシクロアミノ尿素誘導体、それらの調製およびそれらを含む適した製剤について、ＷＯ２０１０／０２９０８２に記載されており、それは、式（Ａ）の化合物
【００３１】
【化１】
2014513097.tif 000002
［式中、
Ａは、
【００３２】
【化２】
2014513097.tif 000003
からなる群から選択されるヘテロアリールを表し、
Ｒ１は、以下：（１）非置換または置換、好ましくは、置換Ｃ１〜Ｃ７−アルキル（前記置換基は、１つまたは複数、好ましくは、１から９つの以下の部分：重水素、フルオロまたは１から２つの以下の部分、Ｃ３〜Ｃ５−シクロアルキルから独立に選択される）；（２）場合により置換されたＣ３〜Ｃ５−シクロアルキル（前記置換基は、１つまたは複数、好ましくは、１から４つの以下の部分：重水素、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル（好ましくは、メチル）、フルオロ、シアノ、アミノカルボニルから独立に選択される）；（３）場合により置換されたフェニル（前記置換基は、１つまたは複数、好ましくは、１から２つの以下の部分：重水素、ハロ、シアノ、Ｃ１〜Ｃ７−アルキル、Ｃ１〜Ｃ７−アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ７−アルキル）アミノ、Ｃ１〜Ｃ７−アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１〜Ｃ７−アルキル）アミノカルボニル、Ｃ１〜Ｃ７−アルコキシから独立に選択される）；（４）場合によりモノまたはジ置換アミン（前記置換基は、以下の部分：重水素、Ｃ１〜Ｃ７−アルキル（これは、非置換であるか、または重水素、フルオロ、クロロ、ヒドロキシの群から選択される１つもしくは複数の置換基によって置換されたものである）、フェニルスルホニル（これは、非置換であるか、または１つもしくは複数、好ましくは、１つの、Ｃ１〜Ｃ７−アルキル、Ｃ１〜Ｃ７−アルコキシ、ジ（Ｃ１〜Ｃ７−アルキル）アミノ−Ｃ１〜Ｃ７−アルコキシによって置換されたものである）から独立に選択される）；（５）置換スルホニル（前記置換基は、以下の部分：Ｃ１〜Ｃ７−アルキル（これは、非置換であるか、または重水素、フルオロの群から選択される１つもしくは複数の置換基によって置換されたものである）、ピロリジノ、（これは、非置換であるか、または重水素、ヒドロキシ、オキソの群から選択される１つもしくは複数の置換基、特に、１つのオキソによって置換されたものである）から選択される）；（６）フルオロ、クロロ；の置換基の１つを表し、
Ｒ２は、水素を表し；
Ｒ３は、（１）水素、（２）フルオロ、クロロ、（３）場合により置換されたメチルを表し、前記置換基は、１つまたは複数、好ましくは、１から３つの以下の部分：重水素、フルオロ、クロロ、ジメチルアミノから独立に選択される］
であって、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−ピリミジン−４−イル］−４−メチル−チアゾール−２−イル｝−アミド）を除く化合物、または薬学的に許容されるその塩を含む。
【００３３】
式（Ａ）の化合物の定義に使用されるようなラジカルおよび記号は、ＷＯ２０１０／０２９０８２に開示されるとおりの意味を持ち、この公報全体を参照によって本出願に組み込んだものとする。
【００３４】
本発明の好適な化合物は、ＷＯ２０１０／０２９０８２に具体的に記載されている化合物である。本発明の非常に好適な化合物は、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物Ｉ）または薬学的に許容されるその塩である。（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）の合成については、ＷＯ２０１０／０２９０８２に実施例１５として記載されている。
【００３５】
本発明の薬学的組み合わせは、セリン／セロニンｍＴＯＲキナーゼの活性／機能を標的とする、低下させるか、または阻害する少なくとも１つの化合物を含む。そのような化合物は、「ｍＴＯＲ阻害剤」と称され、以下に限定されるものではないが、ｍＴＯＲキナーゼファミリーのメンバーの活性／機能を標的とする／阻害する化合物、タンパク質もしくは抗体、例えば、ＲＡＤラパマイシン（ラパミューンの名称でも知られているシロリムス）ならびにエベロリムス（ＲＡＤ００１、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）などのその誘導体／類似体または酵素のＡＴＰ−結合溝（ATP-binding cleft）に直接結合することによってｍＴＯＲのキナーゼ活性を阻害する化合物を含む。エベロリムス（ＲＡＤ００１）は、サーティカンまたはアフィニトールの名称でも知られている。
【００３６】
適したｍＴＯＲ阻害剤としては、例えば、以下のものが挙げられる：
Ｉ．ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）によって産生される免疫抑制性ラクタムマクロライドであるラパマイシン。
【００３７】
ＩＩ．ラパマイシン誘導体、例えば：
ａ．置換ラパマイシン、例えば、ＵＳ５，２５８，３８９、ＷＯ９４／０９０１０、ＷＯ９２／０５１７９、ＵＳ５，１１８，６７７、ＵＳ５，１１８，６７８、ＵＳ５，１００，８８３、ＵＳ５，１５１，４１３、ＵＳ５，１２０，８４２、ＷＯ９３／１１１３０、ＷＯ９４／０２１３６、ＷＯ９４／０２４８５およびＷＯ９５／１４０２３などに記載されている４０−Ｏ−置換ラパマイシン。これらすべての文献を参照によって本明細書に組み込んだものとする。
【００３８】
ｂ．例えば、ＷＯ９４／０２１３６、ＷＯ９５／１６６９１およびＷＯ９６／４１８０７に開示されるような１６−Ｏ−置換ラパマイシン。これらの文献の内容を参照によって本明細書に組み込んだものとする。
【００３９】
ｃ．例えば、参照によって本明細書に組み込んだものとするＷＯ９６／４１８０７およびＵＳ５  ２５６  ７９０に記載されるような３２−水素化ラパマイシン。
【００４０】
ｄ．好適なラパマイシン誘導体は、式（Ｂ）の化合物
【００４１】
【化３】
2014513097.tif 000004
であって、ここで、
Ｒ１は、ＣＨ３もしくはＣ３〜６アルキニルであり、
Ｒ２は、Ｈもしくは−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ、３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチル−プロパノイルまたはテトラゾリルであり、Ｘは、＝Ｏ、（Ｈ，Ｈ）もしくは（Ｈ，ＯＨ）であるが、
Ｘが＝Ｏであり、Ｒ１がＣＨ３である場合、Ｒ２は、Ｈ以外である化合物、
またはＲ２が−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨである場合は、そのプロドラッグ、例えば、生理学的に加水分解可能なそのエーテルである。
【００４２】
式（Ｂ）の化合物は、例えば、国際ＰＣＴ出願ＷＯ９４／０９０１０、ＷＯ９５／１６６９１またはＷＯ９６／４１８０７において開示されている。これらの文献を参照によって本明細書に組み込んだものとする。式（Ｂ）の化合物は、これらの参考文献に開示されるとおりに、またはそれらに記載されている手順の類似法によって調製されてもよい。
【００４３】
好適な化合物は、３２−デオキソラパマイシン、１６−ペンタ−２−イニルオキシ−３２−デオキソラパマイシン、１６−ペンタ−２−イニルオキシ−３２（Ｓ）−ジヒドロ−ラパマイシン、１６−ペンタ−２−イニルオキシ−３２（Ｓ）−ジヒドロ−４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシンであり、より好ましくは、国際ＰＣＴ出願ＷＯ９４／０９０１０に実施例８として開示されている４０−０−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシンである。
【００４４】
式（Ｂ）の特に好適なラパマイシン誘導体は、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、４０−［３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロパノアート］−ラパマイシン（ＣＣＩ７７９とも称される）、４０−エピ−（テトラゾリル）−ラパマイシン（ＡＢＴ５７８とも称される）、３２−デオキソラパマイシン、１６−ペンタ−２−イニルオキシ−３２（Ｓ）−ジヒドロラパマイシンまたはＴＡＦＡ−９３である。
【００４５】
ｅ．ラパマイシン誘導体としては、例えば、国際ＰＣＴ出願ＷＯ９８／０２４４１およびＷＯ０１／１４３８７において開示されているような、例えば、ＡＰ２３５７３、ＡＰ２３４６４またはＡＰ２３８４１などのいわゆるラパログも挙げられる。
【００４６】
ラパマイシンおよびその誘導体は、観察される活性、例えば、国際ＰＣＴ出願ＷＯ９４／０９０１０、ＷＯ９５／１６６９１またはＷＯ９６／４１８０７に記載されるようなマクロフィリン（macrophilin）−１２（ＦＫ−５０６結合タンパク質またはＦＫＢＰ−１２としても知られている）に対する結合などに基づき、例えば、急性移植片拒絶の治療の際の免疫抑制剤として有用であることがわかった。
【００４７】
ＩＩＩ．ＦＫ５０６のエチルアナログであるアスコマイシン。
【００４８】
ＩＶ．酵素のＡＴＰ−結合溝に直接結合することによってｍＴＯＲのキナーゼ活性を阻害する化合物であるＡＺＤ０８０５５（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）およびＯＳＩ−０２７（ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）。
【００４９】
Ｖ．ＳＡＲ５４３、デフェロリムス（ＡＰ２３５７３／ＭＫ−８６６９、Ａｒｉａｄ／  Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．）、ＡＰ２３８４１（Ａｒｉａｄ）、ＫＵ−００６３７９４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／Ｋｕｄｏｓ）、ＩＮＫ−１２８（Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ）、ＥＸ２０４４、ＥＸ３８５５、ＥＸ７５１８、ＷＹＥ−１２５１３２（Ｗｙｅｔｈ）、ＸＬ７６５（Ｅｘｅｌｉｓｉｓ）、ＮＶ−１２８（Ｎｏｖｏｇｅｎ）、ＷＹＥ−１２５１３２（Ｗｙｅｔｈ）、ＥＭ１０１／ＬＹ３０３５１１（Ｅｍｉｌｉｅｍ）。
【００５０】
本発明に好適なｍＴＯＲ阻害剤は、エベロリムス（ＲＡＤ００１）である。エベロリムス（ＲＡＤ００１）は、化学名（（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｅ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−ジヒドロキシ−１２−｛（１Ｒ）−２−［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−メトキシシクロヘキシル］−１−メチルエチル｝−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−１１，３６−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−２，３，１０，１４，２０−ペンタオン）を有する。エベロリムスおよび類似体については、米国特許第５，６６５，７７２号の、第１欄、３９行目から第３欄、１１行目に記載されている。
【００５１】
コード番号、一般名または商標名によって特定される活性剤の構造は、規格便覧（standard compendium）「The Merck Index」の現行版またはデータベース、例えば、Patents International（例えば、IMS World Publication）から得てもよい。それらの対応する内容を参照により本明細書に組み込んだものとする。
【００５２】
上で開示した化合物（すなわち、式（Ａ）の化合物およびｍＴＯＲ阻害剤）の、そこで開示されるその薬学的に許容される塩、対応するラセミ体、ジアステレオ異性体、鏡像異性体、互変異性体ならびに対応する結晶変態、存在する場合、例えば、溶媒和物、水和物および多形体がさらに含まれる。本発明の組み合わせに活性成分として使用される化合物は、それぞれ引用文献に記載されるとおりに調製および投与できる。また、３つ以上の個別の上記のような活性成分の組み合わせは本発明の範囲内であり、すなわち、本発明の範囲内の薬学的組み合わせは、３つ以上の活性成分を含んでもよい。
【００５３】
一実施形態において、本発明は、式（Ａ）の化合物、すなわち、特に、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む薬学的組み合わせを提供する。
【００５４】
一実施形態において、本発明は、発明は提供する式（Ａ）の化合物、すなわち、特に、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）または薬学的に許容されるその塩およびｍＴＯＲ阻害剤であるエベロリムス（ＲＡＤ００１）または薬学的に許容されるその塩を含む薬学的組み合わせを提供する。
【００５５】
本発明の薬学的組み合わせは、それを必要とする温血動物のｍＴＯＲキナーゼ依存性疾患の治療または予防に有用である。このように、一態様において、本発明は、ｍＴＯＲキナーゼ依存性疾患の治療または予防に使用するための、式（Ａ）の化合物、すなわち、特に、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む薬学的組み合わせを提供する。
【００５６】
「ｍＴＯＲキナーゼ依存性疾患」という用語には、それらに制限されるものではないが、以下の症状が含まれる：
・臓器または組織移植拒絶反応、例えば、心臓、肺、心肺同時、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚もしくは角膜移植などのレシピエントの、例えば、治療；骨髄移植後などの移植片対宿主病；
・再狭窄
・結節性硬化症またはカウデン病などの過誤腫症候群（Hamartoma syndromes）
・リンパ脈管筋腫症
・網膜色素変性（Retinitis pigmentosis）
・脳脊髄炎、インスリン依存性糖尿病、ループス、皮膚筋炎、関節炎およびリウマチ性疾患などの自己免疫疾患
・ステロイド抵抗性急性リンパ芽球性白血病
・強皮症、肺線維症、腎線維症、嚢胞性線維症などの線維性疾患
・肺高血圧症
・免疫修飾
・多発性硬化症
・ＶＨＬ症候群
・カーニー複合
・家族性アデノナムトスポリポーシス
・若年性ポリポーシス症候群（Juvenile polyposis syndrome）
・バート・ホッグ・デューク症候群
・家族性肥大型心筋症
・ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群
・パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病およびタウ変異によって引き起こされる認知症、脊髄小脳失調症３型、ＳＯＤ１変異によって引き起こされる運動ニューロン疾患、神経セロイドリポフスチン症／バッテン病（小児神経変性）などの神経変性障害
・滲出型および乾燥型黄斑変性
・筋消耗（萎縮、悪液質）およびダノン病などのミオパチー。
・結核菌、Ａ群連鎖球菌、ＨＳＶ１型、ＨＩＶ感染症などの細菌性およびウイルス性感染症
・神経線維腫症１型などの神経線維腫症、
・ポイツ・ジェガース症候群
【００５７】
さらに、「ｍＴＯＲキナーゼ依存性疾患」としては、癌およびその他の関連する悪性腫瘍などの増殖性疾患が挙げられる。病理学的なｍＴＯＲシグナルカスケードに関連する癌の非限定的一覧には、乳癌、腎細胞癌、胃腫瘍、神経内分泌腫瘍、リンパ腫および前立腺癌が含まれる。
【００５８】
増殖性疾患についての例は、例えば、良性または悪性腫瘍、脳、腎臓、肝臓、副腎、膀胱、乳房、胃、胃腫瘍、卵巣、結腸、直腸、前立腺、膵臓、肺、膣もしくは甲状腺の癌、肉腫、膠芽腫、多発性骨髄腫または胃腸癌、特に、結腸癌もしくは結腸直腸腺腫または頭頸部腫瘍、上皮過剰増殖（epidermal hyperproliferation）、乾癬、前立腺肥大症、新形成、上皮性新形成（neoplasia of epithelial character）、リンパ腫、乳癌あるいは白血病である。
【００５９】
別の態様において、本発明は、ｍＴＯＲキナーゼ依存性疾患の治療または予防のための薬剤を製造するための、式（Ａ）の化合物、すなわち、特に、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物Ｉ）または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩の使用を提供する。
【００６０】
別の態様において、本発明は、式（Ａ）の化合物、すなわち、特に、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物Ｉ）または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を投与することによってｍＴＯＲキナーゼ依存性疾患を治療または予防する方法を提供する。
【００６１】
別の態様において、本発明は、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）キナーゼ依存性疾患の治療に対して同時、個別または逐次使用するための、式（Ａ）の化合物、すなわち、特に、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物Ｉ）と、ＲＡＤラパマイシン（シロリムス）ならびにエベロリムス（ＲＡＤ００１）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、ゾタロリムス（ＡＢＴ５７８）、ＳＡＲ５４３、アスコマイシン（ＦＫ５０６のエチルアナログ）、デフェロリムス（ＡＰ２３５７３／ＭＫ−８６６９）、ＡＰ２３８４１、ＫＵ−００６３７９４、ＩＮＫ−１２８、ＥＸ２０４４、ＥＸ３８５５、ＥＸ７５１８、ＡＺＤ０８０５５、ＯＳＩ−０２７、ＷＹＥ−１２５１３２、ＸＬ７６５、ＮＶ−１２８、ＷＹＥ−１２５１３２およびＥＭ１０１／ＬＹ３０３５１１などのその誘導体／類似体からなる群から選択される少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤との組み合わせを提供し、ここで、その活性成分は、それぞれの場合、遊離型または薬学的に許容される塩の形態で存在し、場合により少なくとも１つの薬学的に許容される担体も含む。
【００６２】
本発明は、式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩をそれを必要とする温血動物に投与するステップを含む、ｍＴＯＲ阻害剤によるＡＫＴのリン酸化および活性化を低減または阻止するための方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、治療有効量の式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩をそれを必要とする温血動物に投与するステップを含む、少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩による治療中にもたらされるＡＫＴのリン酸化および活性化に依存する増殖性疾患を治療する方法を提供する。
【００６３】
別の実施形態において、本発明は、治療有効量の式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩をそれを必要とする温血動物に投与するステップを含む、少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤もしくは薬学的に許容されるその塩による治療に耐性を持つようになったか、またはそれに対する感受性が低下した増殖性疾患を治療する方法に関する。耐性は、例えば、ＡＫＴのリン酸化および活性化によるものである。
【００６４】
別の態様において、本発明は、式（Ａ）の化合物、すなわち、特に、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物Ｉ）または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む組み合わせをそれを必要とする温血動物に投与するステップを含む、少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩による増殖性疾患の治療の有効性を改善するための方法を提供する。
【００６５】
本発明に従って使用されるｍＴＯＲ阻害剤は、ＲＡＤラパマイシン（シロリムス）ならびにエベロリムス（ＲＡＤ００１）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、ゾタロリムス（ＡＢＴ５７８）、ＳＡＲ５４３、アスコマイシン（ＦＫ５０６のエチルアナログ）、デフェロリムス（ＡＰ２３５７３／ＭＫ−８６６９）、ＡＰ２３８４１、ＫＵ−００６３７９４、ＩＮＫ−１２８、ＥＸ２０４４、ＥＸ３８５５、ＥＸ７５１８、ＡＺＤ０８０５５、ＯＳＩ−０２７、ＷＹＥ−１２５１３２、ＸＬ７６５、ＮＶ−１２８、ＷＹＥ−１２５１３２およびＥＭ１０１／ＬＹ３０３５１１などのその誘導体／類似体から選択されてもよい。特に好適な本発明によるｍＴＯＲ阻害剤は、シロリムスおよび／またはエベロリムスである。
【００６６】
本発明による医薬組成物または組み合わせは、臨床試験において試験されてもよい。適した臨床試験は、例えば、増殖性疾患の患者における非盲検用量漸増試験であってもよい。当該試験は、特に、本発明の組み合わせの活性成分の相乗作用について試験する。増殖性疾患に対して有益な効果は、それ自体が当業者に既知のこうした試験の結果から直接確認できる。そのような試験は、この活性成分を使用した単剤療法の効果と本発明の組み合わせの効果とを比較するのに特に適している場合がある。好ましくは、最大許容用量に達するまで薬剤（ａ）の用量が漸増され、薬剤（ｂ）は、固定用量で投与される。あるいは、薬剤（ａ）が固定用量で投与され、薬剤（ｂ）の用量を漸増させてもよい。各患者は、毎日または断続的のいずれかで各用量の薬剤（ａ）を投与されてもよい。治療の有効性は、そのような試験において、例えば、１２週、１８週または２４週間後の６週毎に症状スコアを評価することによって確認できる。
【００６７】
本発明の薬学的組み合わせの投与は、有益な効果、例えば、症状を緩和する、症状の進行を遅延するか、または症状を抑制することなどに関する相乗的な治療効果をもたらすだけでなく、さらに驚くべき有益な効果、例えば、本発明の組み合わせに使用される薬学的活性成分の一方のみを適用する単剤療法と比較して副作用の軽減、クオリティオブライフの改善または罹患率の低下をもたらす場合もある。
【００６８】
さらなる利益は、本発明の組み合わせの活性成分はより低用量で使用されてもよく、例えば、投薬量が少量しか必要でないことが多いだけでなく、少ない頻度で適用されてもよく、これにより、副作用の発生率または重症度を低減することができる場合もある。これは、治療対象の患者の要望および要求に合致する。
【００６９】
本発明の一目的は、温血動物の哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）依存性疾患を標的とするか、または予防することに対して共同で治療効果のある量の（ａ）式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩および（ｂ）少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩ならびに場合により少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供することである。本組成物において、組み合わせパートナー（ａ）および（ｂ）は、一緒に、一方の後にもう一方を、または単独で、１つの組み合わされた単位剤形でまたは２つの個別の単位剤形で投与されてもよい。この単位剤形は、固定の組み合わせであってもよい。
【００７０】
一態様において、本発明は、（ａ）式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩および（ｂ）少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩ならびに場合により少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、本医薬組成物は、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）依存性疾患に対して共同で治療効果のある量の式（Ａ）の化合物および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤を含む。
【００７１】
別の態様において、本発明は、同時、個別または逐次使用のための、（ａ）式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩および（ｂ）少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩ならびに場合により少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む薬学的組み合わせを提供する。組み合わせパートナー（ａ）および（ｂ）は、一緒にまたは単独でそれを必要とする温血動物に投与されてもよい。
【００７２】
本発明によれば、組み合わせパートナー（ａ）および組み合わせパートナー（ｂ）の個別投与のためまたは固定の組み合わせ、すなわち、少なくとも２つの組み合わせパートナー（ａ）および（ｂ）を含む単一の生薬組成物で投与するための、治療有効量の少なくとも１つの薬理学的に活性な、例えば、上記のような組み合わせパートナーのみを含むか、または、特に、経腸もしくは非経口適用に適した１つもしくは複数の薬学的に許容される担体もしくは希釈剤をともに含む医薬組成物は、それ自体が既知の手法で調製されてもよく、ヒトを含む哺乳動物（温血動物）に経口または経直腸などの経腸および非経口投与に適したものである。
【００７３】
「担体」という用語は、化合物とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。そのような医薬担体は、水ならびに石油、動物、植物または合成由来のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油および同種のものを含む油などの殺菌した液体であってもよい。好ましくは、水または水溶液、生理食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液が、特に、注射可能な溶液用の担体として利用される。適した医薬担体については、E． W． Martinの「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
【００７４】
経腸または非経口投与のための併用療法用の医薬調製物は、例えば、糖衣錠、錠剤、カプセル剤もしくは座剤などの単位剤形またはアンプルの状態のものである。別に示されていない場合、これらは、それ自体が既知の手法で、例えば、従来の混合、造粒、糖衣、溶解または凍結乾燥プロセスによって調製される。当然のことながら、必要な有効量は、複数の投薬単位の投与によって達成されてもよいため、各剤形の個々の用量に含まれる組み合わせパートナーの単位量は、それ自体で有効量となる必要はない。
【００７５】
適した医薬組成物は、例えば、約０．１％から約９９．９％、好ましくは、約１％から約６０％の（１つまたは複数の）活性成分を含んでもよい。本発明に従って投与される式（Ａ）の化合物およびｍＴＯＲ阻害剤の実際の量は、治療される疾患の重症度、年齢および対象の相対的な健康、使用される化合物の効能、投与経路および形態などの数々の要素ならびにその他の要素によって決まる。本薬物は、１日に２回以上投与でき、好ましくは、１日に１回または２回である。こうした要素のすべては、主治医の技術範囲内にある。
【００７６】
式（Ａ）の化合物は、１日にレシピエントの体重１キログラムあたり約０．０５から約５０ｍｇの範囲にわたる治療有効量、好ましくは、約０．１〜２５ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは、約０．５から１０ｍｇ／ｋｇ／日で投与されてもよい。したがって、７０ｋｇのヒトに対する投与の場合、投薬量範囲は、最も好ましくは、１日に約３５〜７００ｍｇになる。
【００７７】
ｍＴＯＲ阻害剤、エベロリムス（ＲＡＤ００１）は、毎日、０．５から１０００ｍｇの投薬量範囲、好ましくは、０．５ｍｇから１５ｍｇの範囲、最も好ましくは、０．５ｍｇから１０ｍｇの範囲でヒトに投与されてもよい。
【００７８】
特に、治療有効量の本発明の組み合わせの組み合わせパートナーのそれぞれは、同時にまたは順次に任意の順序で投与されてもよく、構成成分は、単独でまたは固定の組み合わせとして投与されてもよい。例えば、本発明に従い増殖性疾患を予防または治療する方法は、同時または任意の順序で順次、共同で治療有効量、好ましくは、相乗的有効量で、例えば、毎日または断続的に本明細書に記載される量に相当する投薬量での（ｉ）遊離型または薬学的に許容される塩の状態の第１の薬剤（ａ）の投与および（ｉｉ）遊離型または薬学的に許容される塩の状態の薬剤（ｂ）の投与を含んでもよい。本発明の組み合わせの個々の組み合わせパートナーは、療法の過程中単独でさまざまな時点で、または分離した組み合わせ形態もしくは単一の組み合わせ形態で同時に投与されてもよい。さらに、投与することという用語は、インビボにおいて組み合わせパートナーそれ自体に変わる組み合わせパートナーのプロドラッグの使用も包含する。本発明は、このように同時または交代治療のそのような投与計画のすべてを包含するものと解釈されるべきであり、「投与すること」という用語は、それに応じて解釈されるべきである。
【００７９】
本発明の組み合わせに利用される組み合わせパートナーのそれぞれの有効な投薬量は、利用される特定の化合物または医薬組成物、投与様式、治療される状態、治療される状態の重症度に応じて変化する場合もある。このように、本発明の組み合わせの投薬計画は、投与経路ならびに患者の腎機能および肝機能などのさまざまな要素に従って選択される。通常の技術を有する臨床医または内科医であれば、状態の進行を緩和、逆行または阻止するために必要とされる各活性成分単独の有効量を容易に決定および処方することができる。最適な精度で毒性がなく効力をもたらす範囲内の活性成分濃度を得るには、標的部位に対する活性成分の利用能についての動態学に基づく投与計画が必要である。
【００８０】
本発明は、以下の実施形態をさらに含む。
【００８１】
・遊離型またはその塩の形態の（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）である式（Ａ）の化合物および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤をそれぞれ、ＳＫＢＲ−３乳癌細胞モデルまたはＢＴ−４７４乳癌細胞モデルにおける相乗的組み合わせ範囲であるおよそ３３０ｎＭ〜３μＭおよびおよそ１ｎＭ〜２７ｎＭに相当する組み合わせ範囲で含む、ヒトに投与するための相乗的組み合わせ。
【００８２】
・遊離型またはその塩の形態の（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）である式（Ａ）の化合物および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤をそれぞれ、Ｔ４７−Ｄ乳癌細胞モデルにおける相乗的組み合わせ範囲であるおよそ１２ｎＭ〜１００ｎＭおよびおよそ１ｎＭ〜２７ｎＭに相当する組み合わせ範囲で含む、ヒトに投与するための相乗的組み合わせ。
【００８３】
・遊離型またはその塩の形態の（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）である式（Ａ）の化合物および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤をそれぞれ、ＺＲ−７５−１乳癌細胞モデルにおける相乗的組み合わせ範囲であるおよそ３μＭおよびおよそ１ｎＭ〜２７ｎＭに相当する組み合わせ範囲で含む、ヒトに投与するための相乗的組み合わせ。
【００８４】
以下の実施例は、説明のためのものにすぎず、限定の意図はない。
【実施例１】
【００８５】
ウエスタンブロット分析によって検出されたＢＴ４７４およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺腫瘍細胞におけるエベロリムス（ＲＡＤ００１）の化合物Ｉとの組み合わせの効果。
材料および方法
化合物の調製：化合物、エベロリムス（ＲＡＤ００１）は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧによって合成されたものである。ＤＭＳＯ中の２０ｍＭの原液を調製し、−２０℃で保存する。ＤＭＳＯ中の１０ｍＭの（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）の原液を調製し、−２０℃で保存する。
【００８６】
細胞および細胞培養条件：ヒト乳癌ＢＴ４７４細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２６）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２０）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、ロックビル、ＭＤ、米国）から入手する。
【００８７】
ＢＴ４７４細胞を、１０％ｖ／ｖウシ胎仔血清および２ｍＭのＬ−グルタミンを加えたＨｙｂｒｉ−Ｃａｒｅ培地（ＡＴＣＣ）中に維持する。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１０％ｖ／ｖウシ胎仔血清および２ｍＭのＬ−グルタミンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地（Ａｍｉｍｅｄ、アルシュヴィル、スイス）中で増殖させる。すべての培地に１００μｇ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを加え、細胞を３７℃、５％ＣＯ２中に維持する。
【００８８】
細胞処理および細胞抽出：ＢＴ４７４およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をそれぞれ、細胞３．３×１０４個／ｃｍ２および細胞１．６×１０４個／ｃｍ２の密度で播き、ＤＭＳＯビヒクル、２０ｎＭのＲＡＤ００１および／または各種濃度の化合物Ｉによる２４時間の処理に先だって、３７℃および５％ＣＯ２で４８時間インキュベートする。
【００８９】
細胞溶解物を以下のとおり調製する。培養プレートを、１ｍＭのＰＭＳＦを含む氷冷ＰＢＳで一度洗浄し、氷冷抽出バッファで一度洗浄する［５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのβ−グリセロリン酸、２５ｍＭのＮａＦ、５ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５ｍＭのＰＰｉ、２ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１０ｍＭのモリブデン酸ナトリウム、ロイペプチン（１０μｇ／ｍＬ）、アプロチニン（１０μｇ／ｍＬ）、１ｍＭのＤＴＴおよび１ｍＭのＰＭＳＦ］。プロテアーゼ阻害剤は、ＳＩＧＭＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、セントルイス、Ｍｏから購入する。この細胞を、１％ＮＰ−４０（ＳＩＧＭＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む同じバッファ中で抽出する。この抽出物を、均質化し、遠心分離によって澄ませ、分取し、−８０℃で冷凍する。ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、ＩＬ、米国）によりタンパク質濃度を測定する。
【００９０】
イムノブロッティング：２０マイクログラムの細胞抽出物を、ウェットブロッティング（１時間、２５０ｍＡ）によって１２％変性ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で電気泳動的に分離し、ポリフッ化ビニリデンフィルター（ＰＶＤＦ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ベッドフォード、ＭＡ、米国）に転写し、以下の一次抗体により４℃で一晩調べる。
（ａ）ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｓ４７３）（クローン１４−０５；１：２０００）をＤＡＫＯ（グロストルプ、デンマーク）から入手し、ＰＢＳ、０．５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ、０．５％ｗ／ｖ牛乳中で薄める。
（ｂ）ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＡＰＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）（クローンＥＣＡ２９７；１：５０）をＤＡＫＯ（グロストルプ、デンマーク）から入手し、ＰＢＳ、０．５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ、０．５％ｗ／ｖ牛乳中で薄める。
（ｃ）ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＥＫ１／２（Ｓ２１７／Ｓ２２１）（カタログ＃９１５４；１：１０００）をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手し、ＰＢＳ、０．１％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ、０．５％ｗ／ｖ牛乳中で薄める。
（ｄ）ａｎｔｉ−Ａｃｔｉｎ（カタログ＃ＭＡＢ１５０１；１：２０，０００）をＣｈｅｍｉｃｏｎ（ビルリカ、ＭＡ、米国）から入手し、ＰＢＳ、０．１％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ中で薄める。
【００９１】
（上で挙げたような）適切な一次抗体とともにインキュベーションした後、一次抗体の付いたタンパク質を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスまたは抗ウサギ免疫グロブリン、その後、高度化学発光（ＥＣＬ  Ｐｌｕｓキット；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、バッキンガムシャー、英国）を使用して明らかにし、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ミュンヘン、ドイツ）を使用して定量する。
【００９２】
以下に記載されるように逆相タンパク質アレイ方法論によってそれぞれの細胞抽出物をさらに定量する。
【００９３】
それぞれの細胞抽出物をＺｅｐｔｏＭＡＲＫ（登録商標）ＰＷＧタンパク質マイクロアレイチップ（Ｚｅｐｔｏｓｅｎｓ、ヴィッタースヴィル、スイス）に圧電性マイクロディスペンスベースの、非接触Ｎａｎｏ−Ｐｌｏｔｔｅｒ２．１（ＧｅＳｉＭ、グローセルクマンスドルフ、ドイツ）によりスポットする。ＺｅｐｔｏＭＡＲＫ（登録商標）タンパク質マイクロアレイにスポット後、チップを、３７℃で１時間インキュベートする。均等なブロッキング結果を得るために、ＣｅＬｙＡブロッキングバッファＢＢ１（Ｚｅｐｔｏｓｅｎｓ、カタログＮｏ．９０４０）を超音波ネブライザーにより施す。３０分間のブロッキング後、このチップを、徹底的に脱イオン化水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ品質、１８ＭΩ×ｃｍ）ですすぎ、窒素気流中で乾燥する。
【００９４】
サンプルをスポットし、ブロッキングする手順の後、ＺｅｐｔｏＭＡＲＫ（登録商標）チップを６つのフローセルが個々にチップの６つのアレイに向けられるＺｅｐｔｏＣＡＲＲＩＥＲ（Ｚｅｐｔｏｓｅｎｓ、カタログＮｏ．１１００）に移し、２００μｌのＣＡＢ１  ＣｅＬｙＡアッセイバッファ（Ｚｅｐｔｏｓｅｎｓ、カタログＮｏ．９０３２）で２回洗浄する。そのアッセイバッファをその後吸引し、それぞれの区画を１００μｌの一次標的抗体（ｐＡｋｔ  Ｓｅｒ４７３：ＣＳＴ＃４０６０；ｐＡｋｔ  Ｔｈｒ３０８：ＣＳＴ＃２９６５、Ａｋｔ１  ｐａｎ：Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ  ＃１０８５−１）とともにＲＴで一晩インキュベートする。インキュベーション後、一次抗体を除去し、アレイをＣＡＢ１バッファで２回洗浄し、１００μｌのＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７−標識抗ウサギＩｇＧ  Ｆｉｂフラグメント（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ；＃Ｚ２５３０５）とともにＲＴの暗所でさらに１時間インキュベートする。インキュベーション後、アレイを２００μｌのＣＡＢ１バッファで２回洗浄した。標的結合Ｆｉｂフラグメントの蛍光を、レーザー（励起波長が６３５ｎｍ）およびＣＣＤカメラを使用したＺｅｐｔｏＲｅａｄｅｒ（Ｚｅｐｔｏｓｅｎｓ、ヴィッタースヴィル、スイス）により読み取る。蛍光シグナルを、シグナルの強度に応じて１、３、５および１０秒の照射時間で評価した。
【００９５】
それぞれのアレイについての蛍光画像を、ＺｅｐｔｏＶＩＥＷ  Ｐｒｏ  ２．０ソフトウェア（Ｚｅｐｔｏｓｅｎｓ、ヴィッタースヴィル、スイス）により分析し、それぞれのシグナルについてのＲＦＩを算出する。この実験に使用される抗体および抗体希釈：
【００９６】
【表１】
2014513097.tif 000005
【００９７】
結果：
ＢＴ４７４乳腺腫瘍細胞において、エベロリムス（ＲＡＤ００１）および化合物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下でウエスタンブロット分析によって確認したＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＭＡＰＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）、ＭＥＫ１／２（Ｓ２１７／Ｓ２２１）のリン酸化レベルおよび全アクチンレベルを図１に示す。
【００９８】
ＢＴ４７４乳腺腫瘍細胞において、エベロリムス（ＲＡＤ００１）および化合物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下で逆相タンパク質アレイによって定量したＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＡＫＴ（Ｔ３０８）のリン酸化レベルおよび全ＡＫＴレベルをそれぞれ図２から４に示す。
【００９９】
ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳腺腫瘍細胞において、エベロリムス（ＲＡＤ００１）および化合物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下でウエスタンブロット分析によって確認したＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＭＡＰＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）のリン酸化レベルおよび全アクチンレベルを図５に示す。
【０１００】
ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳腺腫瘍細胞において、エベロリムス（ＲＡＤ００１）および化合物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下で逆相タンパク質アレイによって定量したＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＡＫＴ（Ｔ３０８）のリン酸化レベルおよび全ＡＫＴレベルをそれぞれ図６から８に示す。
【０１０１】
図９に示されるような、ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳腺腫瘍細胞において、エベロリムス（ＲＡＤ００１）および化合物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下でウエスタンブロット分析によって確認し、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して定量した、実験の第２のセットのＡＫＴ（Ｓ４７３）のリン酸化レベルおよび全ＡＫＴレベル。
【０１０２】
ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳腺腫瘍細胞において、エベロリムス（ＲＡＤ００１）および化合物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下で逆相タンパク質アレイによって定量した、実験の第２のセットのＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＡＫＴ（Ｔ３０８）のリン酸化レベルおよび全ＡＫＴレベルをそれぞれ図１０から１２に示す。
【実施例２】
【０１０３】
ＳＫＢＲ−３ヒト乳癌細胞モデルにおけるエベロリムス（ＲＡＤ００１）の化合物Ｉとの組み合わせの効果
材料および方法
ヒト乳癌細胞株ＳＫＢＲ−３を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入する。ＳＫＢＲ−３ヒト乳癌細胞株は、ＨＥＲ２増幅されている。ＳＫＢＲ−３ヒト乳癌細胞株を、ＲＰＭＩ１６４０（ＡＴＣＣ  ＃３０−２００１）または１０％のウシ胎仔血清、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミンおよび１％のピルビン酸ナトリウムを加えたその他の推奨されている培地中、３７℃において５％ＣＯ２のインキュベーターで培養する。
【０１０４】
細胞増殖アッセイ：細胞生存率は、製造業者の手順に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｇ７５７３）を使用して細胞のＡＴＰ含有量を測定することによって求められる。簡単にいえば、１５００〜５００００の細胞を、３８４または９６ウェルプレートのいずれかの２５μｌ（３８４ウェル）または１００μｌ（９６ウェル）の増殖培地に蒔き、細胞を一晩付着させた後、各種濃度の薬物または薬物の組み合わせとともに７２時間インキュベーションし、薬物処理の終わりに、同量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ摂政をそれぞれのウェルに添加して、細胞を溶解させ、発光シグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーにより記録する。
【０１０５】
組み合わせの効果を算出するための方法：エベロリムス（ＲＡＤ００１）および（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）の組み合わせの効果を評価するためおよび起こりうるすべての濃度における相乗作用の可能性を確認するために、組み合わせ試験を「用量マトリックス」を用いて行う。組み合わせについて、連続的に希釈したエベロリムス（ＲＡＤ００１）および化合物Ｉの起こりうるすべての単独薬剤用量を組み替えて試験するあらゆる組み合わせアッセイでは、各化合物を同時に適用する。単独薬剤用量の反応曲線、ＩＣ５０、ＩＣ９０および相乗作用のすべてをＣｈａｌｉｃｅソフトウェア（ＣｏｍｂｉｎａｔｏＲｘ、ケンブリッジ  ＭＡ）を使用して分析する。単独薬物用量相加性参照モデルに対して、組み合わせの反応を、その各単独薬剤の反応と比較することによって相乗効果を算出する。用量相加性の偏差は、アイソボログラムにより視覚的にまたは併用係数（Combination Index）により数量的に評価することができる。相乗作用が生じている場所を捕らえられるよう、相加性と比較した過剰阻害も全用量マトリックスチャートとしてグラフ化できる。組み合わせ効果の全般的な強度を定量化するために、単独薬剤希釈要素ｆＸ、ｆＹについて正規化したデータおよび最高単独薬剤面（highest-single-agent surface）間の量スコアＶＨＳＡ＝ΣＸ，ＹｌｎｆＸｌｎｆＹ（Ｉｄａｔａ−ＩＨＳＡ）も算出する。
【０１０６】
結果：
単独薬剤およびエベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理の細胞増殖に対する効果を、上記のｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  ｇｌｏｗ（ＣＴＧ）アッセイを使用して評価する。細胞は、トリプリケートで１ウェルあたり３０００の細胞を３８４ウェルプレートに蒔き、測定前に７２時間化合物により処理する（図１３）。この「用量マトリックス」試験では、エベロリムス（ＲＡＤ００１）は、高用量が２７ｎＭであり、低用量が１ｎＭである４用量に３倍段階希釈され、化合物Ｉは、高用量が３μＭであり、低用量が約４ｎＭである７用量に３倍段階希釈される。
【０１０７】
この試験の結果を図１３に示す。化合物Ｉ単独では、Ａｍａｘ、阻害の最大割合＝０．４０（ＤＭＳＯ対照と比較して４０％の増殖阻害）の細胞増殖の濃度依存性阻害がもたらされ、単独薬剤の場合のエベロリムス（ＲＡＤ００１）に置き換えても細胞増殖に対して同様のレベルの弱い増殖阻害効果がもたらされ、ＩＣ５０は達成されず、Ａｍａｘ＝０．３２である。エベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理は、いずれの単独薬剤と比較しても阻害の最大レベルを著しく増大させ、Ａｍａｘ＝０．６３である（エベロリムス（ＲＡＤ００１）のＡｍａｘ＝０．３２、化合物ＩのＡｍａｘ＝０．４０）。用量マトリックス全体にわたって、エベロリムス（ＲＡＤ００１）についてはすべての用量（１ｎＭ〜２７ｎＭ）で、化合物Ｉについては高用量範囲の部分（３３０ｎＭ〜３μＭ）で向上した相乗作用が観察される。化合物Ｉが比較的低濃度においては（４ｎＭ〜３７ｎＭ）、本組み合わせは、この実験の単独薬剤の場合の化合物Ｉおよびエベロリムス（ＲＡＤ００１）の処理と比較して付加的な利益を呈していないようである。
【実施例３】
【０１０８】
ＢＴ−４７４乳腺腫瘍細胞におけるエベロリムス（ＲＡＤ００１）の化合物Ｉとの組み合わせの効果
材料および方法
ヒト乳癌細胞株ＢＴ−４７４をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入する。ＢＴ−４７４ヒト乳癌細胞株には、ＰＩＫ３ＣＡ変異およびＨＥＲ２増幅の両方が含まれる。ＢＴ−４７４乳癌細胞株を、ＲＰＭＩ１６４０（ＡＴＣＣ  ＃３０−２００１）または１０％のウシ胎仔血清、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミンおよび１％のピルビン酸ナトリウムを加えたその他の推奨されている培地中３７℃において５％ＣＯ２インキュベーターで培養する。
【０１０９】
細胞増殖アッセイ：細胞生存率は、製造業者の手順に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｇ７５７３）を使用して細胞のＡＴＰ含有量を測定することによって求められる。簡単にいえば、１５００〜５００００の細胞を、３８４または９６ウェルプレートのいずれかの２５μｌ（３８４ウェル）または１００μｌ（９６ウェル）の増殖培地に蒔き、細胞を一晩付着させた後、各種濃度の薬物または薬物の組み合わせとともに７２時間インキュベーションし、薬物処理の終わりに、同量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ摂政をそれぞれのウェルに添加して、細胞を溶解させ、発光シグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーにより記録する。
【０１１０】
組み合わせの効果を算出するための方法：エベロリムス（ＲＡＤ００１）および（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）の組み合わせの効果を評価するためおよび起こりうるすべての濃度における相乗作用の可能性を確認するために、組み合わせ試験を「用量マトリックス」を用いて行う。組み合わせについて、連続的に希釈したエベロリムス（ＲＡＤ００１）および化合物Ｉの起こりうるすべての単独薬剤用量を組み替えて試験するあらゆる組み合わせアッセイでは、各化合物を同時に適用する。単独薬剤用量の反応曲線、ＩＣ５０、ＩＣ９０および相乗作用のすべてをＣｈａｌｉｃｅソフトウェア（ＣｏｍｂｉｎａｔｏＲｘ、ケンブリッジ  ＭＡ）を使用して分析する。単独薬物用量相加性参照モデルに対して、組み合わせの反応を、その各単独薬剤の反応と比較することによって相乗効果を算出する。用量相加性の偏差は、アイソボログラムにより視覚的にまたは併用係数により数量的に評価することができる。相乗作用が生じている場所を捕らえられるよう、相加性と比較した過剰阻害も全用量マトリックスチャートとしてグラフ化できる。組み合わせ効果の全般的な強度を定量化するために、単独薬剤希釈要素ｆＸ、ｆＹについて正規化したデータおよび最高単独薬剤面間の量スコアＶＨＳＡ＝ΣＸ，ＹｌｎｆＸｌｎｆＹ（Ｉｄａｔａ−ＩＨＳＡ）も算出する。
【０１１１】
結果：
単独薬剤およびエベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理の細胞増殖に対する効果を、上記のｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  ｇｌｏｗ（ＣＴＧ）アッセイを使用して評価する。単独薬剤およびエベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理の細胞増殖に対する効果を、上記のｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  ｇｌｏｗ（ＣＴＧ）アッセイを使用して評価する。実験セットアップは、ＳＫＢＲ−３モデルについて上で記載した実験手順と同一である（図１４）。さらに、同じ「用量マトリックス」（エベロリムス（ＲＡＤ００１）：４用量、３倍、１ｎＭから２７ｎＭ、化合物Ｉ：７用量、３倍、４ｎＭから３μＭ）が適用される。
【０１１２】
この試験の結果を図１４に示す。化合物Ｉ単独では、ＩＣ５０がおよそ３μＭであり、Ａｍａｘがおよそ０．５３（ＤＭＳＯ対照と比較して５３％の増殖阻害）の細胞増殖の濃度依存性阻害がもたらされ、単独薬剤の場合のエベロリムス（ＲＡＤ００１）に置き換えても細胞増殖に対して弱い増殖阻害効果がもたらされ、ＩＣ５０は達成されず、Ａｍａｘ＝０．３６である。エベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理は、いずれの単独薬剤と比較しても阻害の最大レベルを著しく増大させ、Ａｍａｘ＝０．６６である（エベロリムス（ＲＡＤ００１）のＡｍａｘ＝０．３６、化合物ＩのＡｍａｘ＝０．５３）。用量マトリックス全体にわたって、エベロリムス（ＲＡＤ００１）についてはすべての用量（１ｎＭ〜２７ｎＭ）で、高用量の化合物Ｉ（３３０ｎＭ〜３μＭ）で向上した相乗作用が観察される。化合物Ｉがより低濃度においては（４ｎＭ〜３７ｎＭ）、本組み合わせは、この実験の単独薬剤としての化合物Ｉおよびエベロリムス（ＲＡＤ００１）の処理と比較して付加的な利益を呈していないようである。
【実施例４】
【０１１３】
Ｔ４７−Ｄヒト乳癌細胞モデルにおけるエベロリムス（ＲＡＤ００１）の化合物Ｉとの組み合わせの効果
材料および方法
ヒト乳癌細胞株Ｔ４７−Ｄを、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入する。Ｔ４７−Ｄヒト乳癌細胞株は、ＰＩＫ３ＣＡ変異を含む。Ｔ４７−Ｄヒト乳癌細胞株を、ＲＰＭＩ１６４０（ＡＴＣＣ  ＃３０−２００１）または１０％のウシ胎仔血清、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミンおよび１％のピルビン酸ナトリウムを加えたその他の推奨されている培地中３７℃において５％ＣＯ２インキュベーターで培養する。
【０１１４】
細胞増殖アッセイ：細胞生存率は、製造業者の手順に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｇ７５７３）を使用して細胞のＡＴＰ含有量を測定することによって求められる。簡単にいえば、１５００〜５００００の細胞を、３８４または９６ウェルプレートのいずれかの２５μｌ（３８４ウェル）または１００μｌ（９６ウェル）の増殖培地に蒔き、細胞を一晩付着させた後、各種濃度の薬物または薬物の組み合わせとともに７２時間インキュベーションし、薬物処理の終わりに、同量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ摂政をそれぞれのウェルに添加して、細胞を溶解させ、発光シグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーにより記録する。
【０１１５】
組み合わせの効果を算出するための方法：エベロリムス（ＲＡＤ００１）および（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）の組み合わせの効果を評価するためおよび起こりうるすべての濃度における相乗作用の可能性を確認するために、組み合わせ試験を「用量マトリックス」を用いて行う。組み合わせについて、連続的に希釈したエベロリムス（ＲＡＤ００１）および化合物Ｉの起こりうるすべての単独薬剤用量を組み替えて試験するあらゆる組み合わせアッセイでは、各化合物を同時に適用する。単独薬剤用量の反応曲線、ＩＣ５０、ＩＣ９０および相乗作用のすべてをＣｈａｌｉｃｅソフトウェア（ＣｏｍｂｉｎａｔｏＲｘ、ケンブリッジ  ＭＡ）を使用して分析する。単独薬物用量相加性参照モデルに対して、組み合わせの反応を、その各単独薬剤の反応と比較することによって相乗効果を算出する。用量相加性の偏差は、アイソボログラムにより視覚的にまたは併用係数により数量的に評価することができる。相乗作用が生じている場所を捕らえられるよう、相加性と比較した過剰阻害も全用量マトリックスチャートとしてグラフ化できる。組み合わせ効果の全般的な強度を定量化するために、単独薬剤希釈要素ｆＸ、ｆＹについて正規化したデータおよび最高単独薬剤面間の量スコアＶＨＳＡ＝ΣＸ，ＹｌｎｆＸｌｎｆＹ（Ｉｄａｔａ−ＩＨＳＡ）も算出する。
【０１１６】
結果：
単独薬剤およびエベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理の細胞増殖に対する効果を、上記のｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  ｇｌｏｗ（ＣＴＧ）アッセイを使用して評価する。単独薬剤およびエベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理の細胞増殖に対する効果を、上記のｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  ｇｌｏｗ（ＣＴＧ）アッセイを使用して評価する。実験セットアップは、ＳＫＢＲ−３モデルについて上で記載した実験手順と同一である（図１５）。さらに、同じ「用量マトリックス」（エベロリムス（ＲＡＤ００１）：４用量、３倍、１ｎＭから２７ｎＭ、化合物Ｉ：７用量、３倍、４ｎＭから３μＭ）が適用される。
【０１１７】
この試験の結果を図１５に示す。化合物Ｉ単独では、ＩＣ５０がおよそ３３０ｎＭおよびＡｍａｘがおよそ０．６７（ＤＭＳＯ対照と比較して６７％の増殖阻害）の有意な細胞増殖の濃度依存性阻害がもたらされ、単独薬剤の場合のエベロリムス（ＲＡＤ００１）に置き換えても細胞増殖に対して弱い増殖阻害効果がもたらされ、ＩＣ５０は達成されず、Ａｍａｘ＝０．３７である。エベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理により、阻害の最大レベルは増大せず、Ａｍａｘ＝０．６８であり、化合物Ｉの単独薬剤処理と同等（Ａｍａｘ＝０．６７）である。用量マトリックス全体にわたって、エベロリムス（ＲＡＤ００１）についてはすべての用量（１ｎＭ〜２７ｎＭ）で、相対的用量の化合物Ｉ（１２ｎＭ〜１００ｎＭ）でわずかに向上した弱い相乗作用が観察される。化合物Ｉが高低両限界濃度においては（４ｎＭ、３３０ｎＭ〜３μＭ）、本組み合わせは、この実験の単独薬剤処理の場合の化合物Ｉおよびエベロリムス（ＲＡＤ００１）と比較して付加的な利益を呈していないようである。
【実施例５】
【０１１８】
ＺＲ−７５−１ヒト乳癌細胞モデルにおけるエベロリムス（ＲＡＤ００１）の化合物Ｉとの組み合わせの効果
材料および方法
ヒト乳癌細胞株ＺＲ−７５−１を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入する。ＺＲ−７５−１ヒト乳癌細胞株は、ＰＴＥＮ変異を含む。ＺＲ−７５−１ヒト乳癌細胞株を、ＲＰＭＩ１６４０（ＡＴＣＣ  ＃３０−２００１）または１０％のウシ胎仔血清、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミンおよび１％のピルビン酸ナトリウムを加えたその他の推奨されている培地中３７℃において５％ＣＯ２インキュベーターで培養する。
【０１１９】
細胞増殖アッセイ：細胞生存率は、製造業者の手順に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｇ７５７３）を使用して細胞のＡＴＰ含有量を測定することによって求められる。簡単にいえば、１５００〜５００００の細胞を、３８４または９６ウェルプレートのいずれかの２５μｌ（３８４ウェル）または１００μｌ（９６ウェル）の増殖培地に蒔き、細胞を一晩付着させた後、各種濃度の薬物または薬物の組み合わせとともに７２時間インキュベーションし、薬物処理の終わりに、同量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ摂政をそれぞれのウェルに添加して、細胞を溶解させ、発光シグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーにより記録する。
【０１２０】
組み合わせの効果を算出するための方法：エベロリムス（ＲＡＤ００１）および（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）の組み合わせの効果を評価するためおよび起こりうるすべての濃度における相乗作用の可能性を確認するために、組み合わせ試験を「用量マトリックス」を用いて行う。組み合わせについて、連続的に希釈したエベロリムス（ＲＡＤ００１）および化合物Ｉの起こりうるすべての単独薬剤用量を組み替えて試験するあらゆる組み合わせアッセイでは、各化合物を同時に適用する。単独薬剤用量の反応曲線、ＩＣ５０、ＩＣ９０および相乗作用のすべてをＣｈａｌｉｃｅソフトウェア（ＣｏｍｂｉｎａｔｏＲｘ、ケンブリッジ  ＭＡ）を使用して分析する。単独薬物用量相加性参照モデルに対して、組み合わせの反応を、その各単独薬剤の反応と比較することによって相乗効果を算出する。用量相加性の偏差は、アイソボログラムにより視覚的にまたは併用係数により数量的に評価することができる。相乗作用が生じている場所を捕らえられるよう、相加性と比較した過剰阻害も全用量マトリックスチャートとしてグラフ化できる。組み合わせ効果の全般的な強度を定量化するために、単独薬剤希釈要素ｆＸ、ｆＹについて正規化したデータおよび最高単独薬剤面間の量スコアＶＨＳＡ＝ΣＸ，ＹｌｎｆＸｌｎｆＹ（Ｉｄａｔａ−ＩＨＳＡ）も算出する。
【０１２１】
結果：
単独薬剤およびエベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理の細胞増殖に対する効果を、上記のｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  ｇｌｏｗ（ＣＴＧ）アッセイを使用して評価する。単独薬剤およびエベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理の細胞増殖に対する効果を、上記のｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  ｇｌｏｗ（ＣＴＧ）アッセイを使用して評価する。実験セットアップは、ＳＫＢＲ−３モデルについて上で記載した実験手順と同一である（図１６）。さらに、同じ「用量マトリックス」（エベロリムス（ＲＡＤ００１）：４用量、３倍、１ｎＭから２７ｎＭ、化合物Ｉ：７用量、３倍、４ｎＭから３μＭ）が適用される。
【０１２２】
この試験の結果を図１６に示す。化合物Ｉ単独では、細胞増殖に対して有意な阻害はもたらされず、Ａｍａｘがおよそ０．１６（ＤＭＳＯ対照と比較して１６％の増殖阻害）であり、単独薬剤の場合のエベロリムス（ＲＡＤ００１）に置き換えると細胞増殖に対するより良好な増殖阻害効果がもたらされ、ＩＣ５０がおよそ１５ｎＭおよびＡｍａｘ＝０．５５である。エベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理は、いずれの単独薬剤と比較しても阻害の最大レベルを著しく増大させ、Ａｍａｘ＝０．６７である（エベロリムス（ＲＡＤ００１）のＡｍａｘ＝０．５５、化合物ＩのＡｍａｘ＝０．１６）。しかしながら、用量マトリックス全体にわたって、化合物１の最高用量で有意な弱い相乗作用の増加が観察される（３μＭ）。化合物Ｉがより低用量の範囲では（４ｎＭ〜１μＭ）、本組み合わせは、この実験の単独薬剤としての化合物Ｉおよびエベロリムス（ＲＡＤ００１）の処理と比較して付加的な利益を呈していないようである。
【実施例６】
【０１２３】
ＤＵ１４５ヒト前立腺癌ヌードマウス異種移植モデルにおけるエベロリムス（ＲＡＤ００１）の化合物Ｉとの組み合わせの効果
方法および材料：
試験の１日目に体重（ＢＷ）が２１．０〜３１．３ｇの範囲の８週齢の雄ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ、Ｈａｒｌａｎ）を使用する。動物に適宜、水（逆浸透、１ｐｐｍ  Ｃｌ）ならびに１８．０％粗タンパク質、５．０％粗脂肪および５．０％粗繊維からなるＮＩＨ  ３１  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｎｄ  Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ｌａｂ  Ｄｉｅｔ（登録商標）を与える。１２時間の光サイクル、２１〜２２℃、湿度４０〜６０％の静的マイクロアイソレーター内の光照射したＥｎｒｉｃｈ−ｏ’ｃｏｂｓ（商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｂｅｄｄｉｎｇにマウスを収容する。
【０１２４】
ＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手する。ＤＵ１４５細胞株を、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭのグルタミン、１００単位／ｍＬのペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン硫酸塩、２μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび０．０７５％炭酸水素ナトリウムを加えたＲＰＭＩ−１６４０培地に指数関数的増殖培養になるように維持する。その腫瘍細胞を、３７℃、５％ＣＯ２および９５％空気雰囲気の加湿されたインキュベーター内の組織培養フラスコで培養する。
【０１２５】
ＤＵ１４５前立腺癌細胞を、指数関数的な増殖の間に回収し、細胞５×１０７個／ｍＬの濃度で５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む冷えたＰＢＳに再懸濁させる。各ヌードマウスの右脇腹の皮下に０．２ｍＬの懸濁液（１×１０７細胞）を接種する。その平均体積が所望の１００〜１５０ｍｍ３の範囲に近づくよう、増殖を観察するために腫瘍を二次元にキャリパスで測る。腫瘍体積＝（幅２×長さ）／２により腫瘍の大きさをｍｍ３で算出する。腫瘍の重量は、１ｍｇが腫瘍体積の１ｍｍ３に相当するという想定により推定できる。腫瘍移植の７日後、試験の１日目に、個々の腫瘍の大きさが１４４〜１９６ｍｍ３のマウスを、群の平均腫瘍体積が１８１〜１８４ｍｍ３のマウス１０匹の１１群に仕分ける。
【０１２６】
（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）を室温で溶解するまでＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ；最終体積の１０％）中で撹拌する。ポリエチレングリコール３００（ＰＥＧ３００）を添加し（最終体積の３０％）、続いて、Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳＳ１５（最終体積の２０％）を添加し、その混合物を均質になるまで撹拌する。脱イオン化水（最終体積の４０％）の添加によって最終体積にする。化合物Ｉビヒクル、ＮＭＰ：ＰＥＧ３００：Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５：脱イオン化水（１０：３０：２０：６０）、を「ビヒクル１」と呼ぶ。ビヒクル１を含む高用量溶液の希釈によって、より低用量の溶液を調製する。新しい投薬溶液を、週に１回調製し、光から保護して４℃で保存する。
【０１２７】
エベロリムス（ＲＡＤ００１）を、活性成分を２％（ｗ／ｗ）含む、すなわち、２０ｍｇＲＡＤ００１／ｇのマイクロエマルションとして製剤化し、このマイクロエマルションの密度は、０．９９５ｇ／ｃｍ３とする。ＲＡＤ００１マイクロエマルションを得て、まず−２０℃で保存する。ストックのアリコートを解凍し、計量して１日の１回分に分け、４℃で保存する。各処置日に、ＲＡＤ００１のアリコートを室温にし、デキストロース水溶液（Ｄ５Ｗ）で希釈して、最高用量の１ｍｇ／ｍＬ溶液を得る。このストックをＤ５Ｗで希釈して、より低用量の溶液を調製する。Ｄ５Ｗで希釈したプラセボのマイクロエマルションを「ビヒクル２」と呼ぶ。
【０１２８】
処置計画：
化合物Ｉ、ＲＡＤ００１およびそれらのビヒクルをそれぞれ、経口胃管栄養法（ｐ．ｏ．）によって１日に１回、連続して２１日間（ｑｄ×２１）投与する。１〜２０日目の併用療法については、化合物Ｉの後３０分以内にＲＡＤ００１を投薬する。群１０には、２１日目および７日目に、ケージごとにＲＡＤ００１のすぐ後に化合物Ｉを続けた。パクリタキセルを、急速尾部ベール注射（ｉ．ｖ．）により１日おきに１日に１回５用量（ｑｏｄ×５）投与する。金曜のＢＷが繰り越される週末を除き、投薬の日に測定する場合は、各動物についての体重に対して、投薬量、１０ｍＬ／ｋｇ（）．２ｍＬ／２０ｇマウス）を計る。
【０１２９】
１１群のヌードマウス（群あたりｎ＝１０）を以下のように処置する：群１のマウスには、ビヒクル１およびビヒクル２を与え、すべての分析についての対照とする。群２〜４には、それぞれ１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉによる単剤療法を受けさせる。群５〜７には、それぞれ２．５、５および１０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ００１による単剤療法を受けさせる。群８には、１０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ００１と組み合わせて１２．５ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉを与える。群９には、５ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ００１と組み合わせて２５ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉを与える。群１０には、２．５ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ００１と組み合わせて５０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉを与える。毒性の理由から、この処置は、７用量の各薬剤（ｑｄ×７）の後止める。群１１には、２５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルを与える。
【０１３０】
腫瘍増殖阻害：
２１日目に処置の有効性を確認する。統計的分析およびグラフによる分析のために、２１日目まで生き延びた各動物について、ΔＴＶ、１日目（投薬開始）および最終日間の腫瘍体積の差を測定する。各処置群について、以下の関係によって最終日の反応を算出する。
Ｔ／Ｃ（％）＝１００×ΔＴ／ΔＣ、ΔＴ＞０
ここで、ΔＴ＝（最終日の処置群の平均腫瘍体積）−（１日目の処置群の平均腫瘍体積）であり、ΔＣ＝（最終日の対照群の平均腫瘍体積）−（１日目の対照群の平均腫瘍体積）である。Ｔ／Ｃ値が４０％以下を達成した処置は、場合によって治療的に有効であると分類してもよい。
【０１３１】
退縮反応（regression response）についての基準：
処置の有効性は、退縮反応の数から確認してもよい。処置により、動物の腫瘍の部分的退縮（ＰＲ）または完全な退縮（ＣＲ）が起こることもある。ＰＲは、試験の過程の連続した３測定値について、腫瘍体積が１日目の体積の５０％以下であり、これらの３測定値のうちの１つまたは複数が１３．５ｍｍ３以上であることを指す。ＣＲは、試験の過程の連続した３測定値について、腫瘍体積が１３．５ｍｍ３未満であることを指す。
【０１３２】
毒性：
試験の終了まで、動物を１〜５日目および各処置日（週末を除く）に計量する。最大耐用量の許容される毒性は、試験中の群の平均ＢＷ減少が１５％未満であり、１０匹の動物のうち処置関連（ＴＲ）死が最大で１匹までと定義する。１測定値について、ＢＷ減少が２０％を上回る動物がいれば、それが、その群の最初の死亡でない限り、安楽死させ、ＴＲ死亡と分類する。処置非関連（ＮＴＲ）死を、ＮＴＲａ（事故または過失による）、ＮＴＲｕ（原因不明）またはＮＴＲｍ（死体解剖により確認された浸潤および／または転移による腫瘍内転移）と分類する。最大限の情報を得ながらも動物を保護するために、群の最初の死亡は、ＮＴＲｕと分類するが、以降の群の結果により処置が有毒であると示された場合は、その死亡をＴＲと再分類する。
【０１３３】
サンプリング：
７日目に、ＣＯ２麻酔下において致死的心臓穿刺によって、群１０の動物＃１〜４を投薬の２時間後に安楽死させる。８日目に、投薬の２４時間後に動物＃５から同様にサンプルを取る。各動物から全量の血液を採取し、抗凝固剤としてのＫ−ＥＤＴＡにより血漿を個々に処理する。その血漿サンプルを−８０℃で冷凍する。腫瘍を切除し、液体Ｎ２中で瞬間冷凍（snap frozen）する。２１日目の最終投薬の２時間および２４時間後に、各時点につき群１、４、６および９の動物４匹ずつから、前に記載したように血液および腫瘍のサンプルを取る。
【０１３４】
未処理データにおいて、群４の動物＃２、６および７をＴＲ死亡として試験から除き、群９の動物＃４および１０をそれぞれＴＲおよびＮＴＲとして除く。これらの動物は、実際には２１日目まで生き延び、サンプルを取られている。
【０１３５】
統計的分析およびグラフによる分析：
統計的分析およびグラフによる分析をＷｉｎｄｏｗｓ用Ｐｒｉｓｍ３．０３（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ）により行う。マウスの処置群対対照群間の平均ΔＴＶ値の差の有意性を、バートレット検定およびダネットの事後多重比較検定（post-hoc Dunnett's multiple comparison test）による分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって確認する。バートレット検定により、分散（Ｐ＜０．０００１）に有意差が示された場合、その結果を、体積変化の中央値の有意差（Ｐ＜０．０００１）を示すノンパラメトリック・クラスカル・ウォリス検定（nonparametric Kruskal-Wallis test）により分析する。各群間の差をダンの事後多重比較検定（post-hoc with Dunn's multiple comparison test）により分析する。マン・ホイットニーのＵ検定を２群間の体積変化の中央値を比較するために利用する。Ｐ＝０．０５で両側統計分析を行う。Ｐｒｉｓｍは、検定結果を、Ｐ＞０．０５では有意でない（ｎｓ）、０．０１＜Ｐ≦０．０５では有意（「＊」で表す）、０．００１＜Ｐ≦０．０１では非常に有意（「＊＊」で表す）、Ｐ≦０．００１では極めて有意（「＊＊＊」で表す）とまとめる。検定の統計的有意性は、各群間の差の大きさの推定値を提供するものではないため、あらゆるレベルの有意性も有意かまたは有意でないかのいずれかで記載する。
【０１３６】
群別の個々の動物についてのΔＴＶ値を示すために散布図を作る。群平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）または腫瘍体積の中央値を時間の一次関数としてグラフ化する。試験期間にわたる群平均ＢＷ変化を、１日目からの変化率、±ＳＥＭとしてグラフ化する。ＴＲ死亡が１０％を上回った場合は、腫瘍増殖曲線を切り捨てる。
【０１３７】
結果：
本試験から以下のデータを得ている：
【０１３８】
【表２】
2014513097.tif 000006
【０１３９】
この試験において、ビヒクル処置群１のマウスのΔＴＶ値は、広範囲にわたり、個々の動物間で最大９．９倍の差になっている。それでもなお、治療活性の可能性を示す４０％限界点未満のＴ／Ｃ値をもたらす処置のすべてに有意な活性が観察されている。
【０１４０】
１２．５：１０および２５：５ｍｇ／ｋｇの用量比の化合物Ｉ／ＲＡＤ００１の組み合わせ（群８および９）により、それぞれ２９％および１５％のＴ／Ｃならびに統計学的に有意な活性（Ｐ＜０．０５およびＰ＜０．００１）がもたらされている。１２．５：１０ｍｇ／ｋｇの比の併用療法（群８）は、それぞれ群２および群７の化合物ＩおよびＲＡＤ００１の単剤療法よりも改善されているが、群８のΔＴＶ値は、群２および群７の値の範囲内にあり、単剤療法を上回る統計学的に有意な改善は観察されていない。
【０１４１】
２５：５ｍｇ／ｋｇの比の併用療法（群９）は、１５％のＴ／Ｃという結果になり、したがって、群３の化合物Ｉの単剤療法（１６％のＴ／Ｃ）よりもやや改善している。５０：２．５ｍｇ／ｋｇの用量比の化合物Ｉ／ＲＡＤ００１の組み合わせは、５日目に群の平均ＢＷ減少が１９．４％であり、処置を止めた７日目までの死亡率が５０％という結果になっている。
【図１】
2014513097.tif 000011
【図２】
2014513097.tif 000012
【図３】
2014513097.tif 000013
【図４】
2014513097.tif 000014
【図５】
2014513097.tif 000015
【図６】
2014513097.tif 000016
【図７】
2014513097.tif 000017
【図８】
2014513097.tif 000018
【図９】
2014513097.tif 000019
【図１０】
2014513097.tif 000020
【図１１】
2014513097.tif 000021
【図１２】
2014513097.tif 000022
【図１３】
2014513097.tif 000023
【図１４】
2014513097.tif 000024
【図１５】
2014513097.tif 000025
【図１６】
2014513097.tif 000026
【国際調査報告】
2014513097.tif 000027
2014513097.tif 000028
2014513097.tif 000029