(57)【要約】  本発明は、植物の耐乾燥性を改善するための、植物遺伝子JAZ5aの使用を提供する。本発明は、さらに、植物の耐乾燥性を改善するための方法であって、前記植物におけるJAZ5Aの発現または活性を増強することを含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)配列番号4のアミノ酸配列を有するタンパク質;または
(b)(a)のタンパク質から、配列番号4のアミノ酸配列の1つまたは複数の残基の置換、欠失または付加によって得られ、配列番号4で示されるアミノ酸配列と同一の機能を有するタンパク質;または
(c)(a)のタンパク質から得られ、配列番号4のアミノ酸配列に対して少なくとも60%の同一性を有し、配列番号4で示されるアミノ酸配列と同等の機能を有するタンパク質
である、植物起源の単離された耐乾燥性タンパク質。
【請求項２】
(i)請求項1に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド;または
(ii)(i)のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド
からなる群から選択される、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号1または配列番号2に記載のヌクレオチド配列を有する、請求項2に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項2または3に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
請求項4に記載のベクターを含む、または請求項2もしくは3に記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項６】
ポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれている、請求項5に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項７】
(a)請求項5または6に記載の宿主細胞を培養するステップと、
(b)請求項1に記載のタンパク質を発現させるステップと、
(b)請求項1に記載のタンパク質を単離するステップと
を含む、請求項1に記載のタンパク質を調製するための方法。
【請求項８】
耐乾燥性が改善された植物をもたらすための、請求項1に記載のタンパク質または前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項９】
耐乾燥性が改善された植物をもたらすための方法であって、前記植物における請求項1に記載のタンパク質の発現または活性をもたらすまたは増強することを含む方法。
【請求項１０】
前記植物を、請求項1に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換することを含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドを植物のゲノムに組み込む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
(1)請求項1に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含有するアグロバクテリウム株を用意するステップと、
(2)植物の細胞、器官または組織を用意するステップと、
(3)タンパク質をコードするポリヌクレオチドが植物の細胞、器官または組織に導入されるように、ステップ(2)の植物の細胞、器官または組織を、ステップ(1)のアグロバクテリウム株と接触させるステップと、
(4)任意選択により、植物細胞を選抜するステップと、
(5)植物の細胞、器官または組織を植物に生長させるステップと
を含む、請求項10または11に記載の方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドを植物の細胞、器官または組織に導入した後、ポリヌクレオチドが植物の細胞、器官または組織のゲノム内に組み込まれる、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
請求項2または3に記載のポリヌクレオチド、または請求項4に記載のベクターを含む、遺伝子改変植物。
【請求項１５】
植物が、双子葉植物、単子葉植物および裸子植物からなる群から選択され、より詳細には、コムギ、オオムギ、ライムギ、イネ、トウモロコシ、モロコシ、ビート、リンゴ、セイヨウナシ、セイヨウスモモ、モモ、アンズ、サクランボ、イチゴ、タイワンウラジロイチゴ、クロイチゴ、マメ、レンズマメ、エンドウマメ、ダイズ、セイヨウアブラナ、マスタード、ケシ、オリーブ、ヒマワリ、ヤシ、ヒマシ油を産生する植物、カカオ、ピーナッツ、ヒョウタン、キュウリ、スイカ、綿、アマ、アサ、ジュート、柑橘類、レモン、グレープフルーツ、ホウレンソウ、レタス、アスパラガス、キャベツ、ハクサイ、チンゲンサイ、ニンジン、タマネギ、ジャガイモ、トマト、ピーマン、アボカド、カッシア、ショウノウ、タバコ、ナッツ、コーヒー、ナス、サトウキビ、茶、コショウ、ブドウ、イラクサ、バナナ、天然ゴムノキおよび観賞植物からなる群から選択される、請求項14に記載の遺伝子改変植物。
【請求項１６】
植物が、アブラナ科、イネ科およびバラ科の植物からなる群から選択される、請求項14に記載の遺伝子改変植物。
【請求項１７】
請求項14から16までのいずれか一項に記載の遺伝子改変植物由来の種子。
【請求項１８】
配列番号1または配列番号2の配列の少なくとも30ヌクレオチドを含む、植物における耐乾燥性を同定するための分子マーカー。
【請求項１９】
植物細胞のDNAの配列決定を行い、配列番号1または配列番号2の配列の少なくとも30ヌクレオチドを同定するステップを含む、請求項18に記載の分子マーカーを同定する方法。
【請求項２０】
配列番号1または配列番号2の少なくとも30ヌクレオチドを増幅するステップと、そうして得られたアンプリコンを検出するステップとを含む、請求項18に記載の分子マーカーを同定する方法。
【請求項２１】
配列番号1または配列番号2の少なくとも30ヌクレオチドを、プライマー対を使用して増幅する、請求項20に記載の分子マーカーを同定する方法。
【請求項２２】
プライマー対が、配列番号5および配列番号6のヌクレオチド配列で示される、請求項21に記載の分子マーカーを同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーおよび植物学の分野に属する。本発明は、植物の耐乾燥性を改善するための新規の方法に関する。本発明は、耐乾燥性を改善するための、前記植物におけるタンパク質の使用を伴う。本発明は、タンパク質の発現または活性を増強し、それにより、植物に、タンパク質の発現が増強されるように改変されていない植物と比較して改善された耐乾燥性をもたらすことに関する。
【背景技術】
【０００２】
アブラナ科植物(cabbage)としては、主に、ハクサイ(Brassica campestris L. ssp. Pekinensis)およびチンゲンサイ(Brassica campestris L. ssp. chinensis)が挙げられる。チンゲンサイは、中国北部ではグリーンキャベツ(green cabbage)およびbaby Brassica campestris L ssp. chinensisとも名づけられている。チンゲンサイは、高い順応性、生長、生産性および栄養を示す。チンゲンサイは、中国の長江流域地方の地域において、種々の植物の中でも最も多く消費される植物であり、広範に育てられている。チンゲンサイには種々の種類および品種がある。アブラナ科植物は、生長期間が短く、順応性が幅広く、生産性が高い。アブラナ科植物は植え付けも容易であり、それにより、持続的に通年供給することが可能になる。
【０００３】
チンゲンサイの産物は新鮮で柔らかく、栄養豊富で消費者に好まれている。チンゲンサイは、一年の国内の総植物生産量の30〜40%を構成し、閑期の植物の補充および一年を通した植物供給の均衡に有意に寄与している。ハクサイおよびチンゲンサイは、どちらも涼しい気候を好み、多年生に植えることができる。最も適切な生長温度は15〜20℃である。近年、市場の需要に応じるために、アブラナ科植物は主に集約栽培の技法によって植えられている。四季の間でむらのない生産および供給を確実にするために、チンゲンサイは、一般に、異なる季節には異なる様式で植える必要がある。過去には、チンゲンサイは、主に春および冬に植えられていた。現在は、チンゲンサイは、種々の栽培様式によって灼熱の夏および秋に植えられ始めている。これにより、確実にチンゲンサイが、その生長の間、特に晩春、夏および初秋に乾燥によるストレスにさらされることになる。
【０００４】
高温の季節に栽培されるチンゲンサイは、20日の栽培後に市場に大量に出すことができる。しかし、通常、高温により、節間の伸長、生長の鈍化、苦味、および繊維の望ましくない増加などが導かれる。これにより、生産性が低くなり、品質が劣る。結果として、価格が上昇し、供給が需要を下回る。消費者の需要に応じることができない。ハクサイは乾燥に対する耐容性が乏しい。ハクサイは、ロゼット段階および頭部形成段階において乾燥感受性が高い。平均温度が高すぎると、中心の葉が抱茎して詰まった鱗茎をなすことができない、または全く結球することができない。強制的に結球させたとしても、頭部形成がゆるくなる。夏の自然の圃場条件では、生産は、耐乾燥性植物の正常な葉状の頭部を形成する能力に依拠する。また、圃場における自然の高温の下での頭部形成能力は、ハクサイにおける耐乾燥性の指標となる。
【０００５】
ハクサイおよびチンゲンサイはどちらも、中国で最初に植えられた。外国では、アブラナ科植物の育種に関する研究はわずかしか存在しない。日本起源、朝鮮起源および台湾起源の品種は耐乾燥性が乏しく、中国において植えるためには不適当である。国内で優勢なのは、主に秋に植えられる耐病性品種である。アブラナ科の野菜(vegetables of cabbages)は、耐乾燥性の遺伝子ライブラリーが狭い。耐乾燥性アブラナ科植物品種の育種は、アブラナ科植物材料の中でスクリーニングすることに限られており、そのため、耐乾燥性が乏しく、ストレス耐性が低いいくつかの品種のみが得られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Sambrookら、Molecular Cloning. A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N. Y.、1989年
【非特許文献２】Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York、1987年および定期的更新
【非特許文献３】the series Methods in Enzymology、Academic Press、San Diego
【非特許文献４】COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY、Lesk, A. M.編、Oxford University Press、New York、1988年
【非特許文献５】BIOCOMPUTING:INFORMATICS AND GENOME PROJECTS、Smith, D. W.編、Academic Press、New York、1993年
【非特許文献６】COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA、PART I、Griffin, A. M.、およびGriffin, H. G.編、Humana 5 Press、New Jersey、1994年
【非特許文献７】SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY、von Heinje, G.、Academic Press、1987年
【非特許文献８】SEQUENCE ANALYSIS PRIMER;Gribskov, M.およびDevereux、J.編、M Stockton Press、New York、1991年
【非特許文献９】Carillo, H.、およびLipton, D.、SIAM J. Applied Math(1988年)48巻:1073頁
【非特許文献１０】GUIDE TO HUGE COMPUTERS、Martin J. Bishop編、Academic Press、San Diego、1994年
【非特許文献１１】Devereux, J.ら、Nucleic Acids Research(1984年)12巻(1号):387頁
【非特許文献１２】Atschul, S. F.ら、J. Molec. Biol.(1990年)215巻:403頁
【非特許文献１３】Albert L. Lehninger、Principles of Biochemistry、793〜800頁(Worth Pub. 1982年)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これらの問題を解決するために、国内の育種専門家は、耐乾燥性遺伝子を導入するためにアブラナ科の野菜の耐乾燥性品種を広範にスクリーニングして栽培し、アブラナ科の野菜の耐乾燥能を特定の程度に改善し実際の生産に効果をもたらす活用源を広げるために、従来の育種方法を利用してきた。しかし、現行の方法は、一地方に特有の気候の下での耐乾燥性および高温ストレスの下での形態学的変化を評価することに限られている。これらの方法は、適切な選択ストレスを伴う圃場条件をもたらすことができない温帯地方には適さない。1つの耐乾燥性植物が選択されたとしても、収集された種子において耐乾燥性を次の春まで維持するために、一連の複雑な方法および手段が必要になる。スクリーニングには長い期間が必要であり、地理的に限定され、それによって普遍的に適応できる耐乾燥性品種をもたらすことはできない。したがって、耐乾燥性のアブラナ科の野菜の育種において、実生段階の間の乾害の出現および発生について集中的に試験すること、ならびに、操作性、安定性、効率および順応性の改善をもたらす、実生段階における耐乾燥性をスクリーニングするための方法および技法を開発することが、緊急の課題である。アブラナ科植物における耐乾燥性と密接に関連する形質は、定量的性質のものであり、それにより遺伝子型決定に困難が生じる。特に分子育種に関しては、困難には、補助的選択において有用なDNAマーカーの数が限られていることだけでなく、定量的形質遺伝子座(QTL)の数と有意性が一致しないことも含まれる。したがって、アブラナ科植物のゲノム配列決定は未だ終了しておらず、機能的ゲノム研究に対する研究への関心が増加しているため、耐乾燥性アブラナ科植物の育種において有用な、植物の種々の形質およびDNAプロファイルに関する迅速な感度が高く効率的な定性的分析、ならびに植物の表現型および遺伝子発現の変化に関する定量的分析が必要とされている。
【０００８】
当技術分野では、植物耐乾燥性遺伝子を同定することが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、植物における耐乾燥性をもたらすことである。耐乾燥性がもたらされた植物、または耐乾燥性が改善された植物を用いると、例えば、植物を1つまたは複数の期間の乾燥にさらした場合に、(改善された)耐乾燥性がもたらされていない植物と比較して高収量の作物および/または植物産物を得ることが可能である。植物におけるJAZ5a遺伝子の発現を増強すると、前記植物に(改善された)耐乾燥性をもたらすことができることが見いだされた。したがって、本発明は、(改善された)耐乾燥性をもたらすためのJAZ5a遺伝子の使用を提供する。本発明の他の態様は、本明細書に開示されている内容に基づいて当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】15DOD以降のしおれの症状を示すグラフである。植物に、それらが示したしおれの症状に基づいて毎日0〜4のスコアを付与した(y軸)。しおれの症状を、0、症状なし;1、非常に軽度の膨圧の損失;2、膨圧の損失;3、重度の膨圧の損失;4、枯れたと推定される、として表した。赤色のアスタリスクは、突然変異植物と野生型植物の間のしおれスコアの統計学的差異を示す(ステューデントのt検定;a<0.05)。説明文中の黒色のアスタリスクはその系統のヘテロ接合性を示す。各グラフは個々のトレーを示す。
【図２】19DODまたは20DODにおける補水の1週間後の代表的な補水の効果を、野生型植物と35:BcpJAZ5a植物とを比較して示す写真である。35:BcpJAZ5a植物が野生型植物よりよく機能することが明白である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
以下の説明および実施例では、いくつもの用語が使用されている。そのような用語に与えられる範囲を含めた本明細書および特許請求の範囲の明瞭かつ一貫した理解をもたらすために、以下の定義が提供される。ここで特に定義されていなければ、使用されている技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００１２】
本発明の方法において用いられる従来の技法を実行する方法は、当業者には明らかであろう。分子生物学、生化学、コンピュータ化学、細胞培養、組換えDNA、バイオインフォマティクス、ゲノム、配列決定および関連する分野の従来の技法の実施は、当業者に周知であり、例えば、以下の参考文献において考察されている:Sambrookら、Molecular Cloning. A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N. Y.、1989年;Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York、1987年および定期的更新;ならびにthe series Methods in Enzymology、Academic Press、San Diego。
【００１３】
本文書およびその特許請求の範囲では、「含む(to comprise)」という動詞およびその活用は、その単語の次に続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目が排除されるものではないことを意味する、その非限定的な意味で使用されている。本明細書で使用される場合、「含む(comprising)」、「有する(having)」または「含有する(containing)」という用語は、「含む(comprising)」、「から実質的になる(consisting substantively of)」、「から本質的になる(consisting essentially of)」、および「からなる(consisting of)」を包含する。「から実質的になる(consisting substantively of)」、「から本質的になる(consisting essentially of)」および「からなる(consisting of)」とは、一般用語「含む(comprising)」、「有する(having)」および「含有する(containing)」の特定の概念である。
【００１４】
本明細書で使用される場合、単数形「a(1つの)」、「an(1つの)」および「the(その)」は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、複数の指示対象を包含する。例えば、「a(1つの)」DNA分子を単離するための方法とは、上記で使用される場合、複数の分子(例えば、数十の、数百の、数千の、数万の、数十万の、数百万の、またはそれ以上の分子)を単離することを包含する。
【００１５】
「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」または「核酸配列」という用語は、一本鎖または二本鎖の形態のDNA分子またはRNA分子、特に、本発明によるタンパク質をコードするDNAを指す。「単離された核酸配列」とは、もはやそれが単離された天然の環境にない核酸配列、例えば、細菌宿主細胞または植物の核もしくは色素体ゲノム内の核酸配列を指す。例えば、生細胞内で天然の状態にあるポリヌクレオチドおよびポリペプチドは単離または精製されていない。しかし、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、前記天然の状態でそれと共存している他の物質から分離されると、それは「単離された」かつ/または「精製された」と称される。
【００１６】
位置合わせおよびアラインメント:「位置合わせ」および「アラインメント」という用語は、2つ以上のヌクレオチド配列を、短いまたは長い同一または同様のヌクレオチドのひと続きの存在に基づいて比較することを意味する。下でさらに説明される通り、ヌクレオチド配列のアラインメントのためのいくつかの方法が当技術分野で公知である。
【００１７】
「遺伝子の発現」とは、適切な調節領域、特にプロモーターに作動可能に連結したDNA領域が、生物活性のある、例えば、生物活性のあるタンパク質またはペプチドまたは活性ペプチド断片に翻訳することができるRNAに転写されるプロセスを指す。ある特定の実施形態では、活性なタンパク質とは、恒常的に活性であるタンパク質を指す。コード配列は、センス方向であり、所望の生物活性のあるタンパク質またはペプチド、または活性ペプチド断片をコードすることが好ましい。
【００１８】
タンパク質(または変異体、例えば、オルソログもしくは突然変異体、および断片など)と関連して「機能的な」とは、遺伝子および/またはコードされるタンパク質の、植物の定量的特徴および/または定性的特徴に対する効果を有する能力を指す。遺伝子の発現レベルを改変すること(例えば、発現を増強することまたは発現を低下させることによって)により、植物の定量的特徴および/または定性的特徴が影響を受ける。例えば、タンパク質が耐乾燥性における機能を有する場合、遺伝子発現を増強することにより、耐乾燥性をもたらすことができる。乾燥などの非生物的ストレスに関する機能性を試験することは当業者には難しくない。
【００１９】
「遺伝子」という用語は、細胞内の、適切な調節領域(例えば、プロモーター)に作動可能に連結した、RNA分子(例えば、mRNA)に転写される領域(転写領域)を含むDNA配列を意味する。したがって、遺伝子は、プロモーター、例えば、翻訳開始に関与する配列を含む5'リーダー配列、(タンパク質)コード領域(cDNAまたはゲノムDNA)、および、例えば、転写終結配列部位を含む3'非翻訳配列などの作動可能に連結した配列をいくつか含んでよい。「キメラ遺伝子」(または組換え遺伝子)とは、ある種において通常は天然には見いだされない任意の遺伝子、特に、天然では互いに関連しない核酸配列の1つまたは複数の部位が存在する遺伝子を指す。例えば、プロモーターは、天然では転写領域の一部または全部と、または別の調節領域と関連しない。「キメラ遺伝子」という用語は、プロモーターまたは転写調節配列が、1つまたは複数のコード配列またはアンチセンス(センス鎖の逆相補物およびアンチセンス鎖)または逆方向反復配列(センスおよびアンチセンス、それにより、転写の際にRNA転写物が二本鎖RNAを形成する)に作動可能に連結している発現構築物を包含するものと理解される。
【００２０】
「同一性」とは、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、最上位のマッチが得られるように配列を位置合わせする。「同一性」それ自体は当技術分野で認められている意味を有し、公開された技法を用いて算出することができる。例えば:(COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY、Lesk, A. M.編、Oxford University Press、New York、1988年;BIOCOMPUTING:INFORMATICS AND GENOME PROJECTS、Smith, D. W.編、Academic Press、New York、1993年;COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA、PART I、Griffin, A. M.、およびGriffin, H. G.編、Humana 5 Press、New Jersey、1994年;SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY、von Heinje, G.、Academic Press、1987年;およびSEQUENCE ANALYSIS PRIMER;Gribskov, M.およびDevereux、J.編、M Stockton Press、New York、1991年)を参照されたい。2つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の間の同一性を測定するためのいくつもの方法が存在し、「同一性」という用語は当業者に周知である(Carillo, H.、およびLipton, D.、SIAM J. Applied Math(1988年)48巻:1073頁)。2つの配列間の同一性または類似性を決定するために一般に用いられる方法としては、これだけに限定されないが、GUIDE TO HUGE COMPUTERS、Martin J. Bishop編、Academic Press、San Diego、1994年、およびCarillo, H.、およびLipton, D.、SIAM J. Applied Math(1988年)48巻:1073頁に開示されている方法が挙げられる。同一性および類似性を決定するための方法は、コンピュータプログラムに体系化されている。2つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラムによる方法としては、これだけに限定されないが、GCSプログラムパッケージ(Devereux, J.ら、Nucleic Acids Research(1984年)12巻(1号):387頁)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul, S. F.ら、J. Molec. Biol.(1990年)215巻:403頁)が挙げられる。
【００２１】
実例として、特定の配列のポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも、例えば、95%の「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列に参照ポリペプチド配列の100ヌクレオチドあたり最大5つの点突然変異を含んでよい以外は参照配列と同一であることを意図する。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列内のヌクレオチドの最大5%が、欠失しかつ/または別のヌクレオチドと置換されてよい、および/または、参照配列内の全ヌクレオチドの最大5%の数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてよい。これらの参照配列の突然変異は、参照ヌクレオチド配列の5'末端位または3'末端位、またはそれらの末端位の間のどこにでも生じてよく、参照配列のヌクレオチドの中に個別に、または参照配列内に1つまたは複数の連続した群で散在してよい。
【００２２】
同様に、配列番号1の参照アミノ酸配列に対して少なくとも、例えば、95%の「同一性」を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、そのポリペプチドのアミノ酸配列が、ポリペプチド配列に配列番号1の参照アミノ酸の100アミノ酸あたり最大5つのアミノ酸の変更を含んでよい以外は参照配列と同一であることを意図する。言い換えれば、参照アミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列内のアミノ酸残基の最大5%が欠失してよいまたは別のアミノ酸と置換されてよい、または、参照配列内の全アミノ酸残基の最大5%の数のアミノ酸が参照配列に挿入されてよい。これらの参照配列の変更は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位またはカルボキシ末端位、またはこれらの末端位の間のどこにでも生じてよく、参照配列の残基の中に個別に、または参照配列内で1つまたは複数の連続した群で散在してよい。
【００２３】
本発明による核酸とは、ピリミジン塩基およびプリン塩基の任意のポリマーまたはオリゴマー、好ましくはそれぞれシトシン、チミン、およびウラシル、ならびにアデニンおよびグアニンを含んでよい(あらゆる目的についてその全体が参照により本明細書組み込まれるAlbert L. Lehninger、Principles of Biochemistry、793〜800頁(Worth Pub. 1982年)を参照されたい)。本発明は、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはペプチド核酸の構成成分、および任意のその化学的変異体、例えば、これらの塩基のメチル化形態、ヒドロキシメチル化形態またはグリコシル化形態などを意図している。ポリマーまたはオリゴマーは、組成物内で不均一であっても均一であってもよく、天然に存在する供給源から単離することも、人工的または合成的に作製することもできる。さらに、核酸は、DNAまたはRNA、またはこれらの混合物であってよく、ホモ二重鎖(homoduplex)、ヘテロ二本鎖(heteroduplex)、およびハイブリッドの状態を含めた一本鎖または二本鎖の形態で恒久的にまたは過渡的に存在してよい。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結している」という用語は、ポリヌクレオチドエレメントが機能的な関係で連結していることを指す。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合、「作動可能に連結している」。例えば、プロモーター、またはそうではなく転写調節配列は、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結している。作動可能に連結しているとは、連結しているDNA配列が、一般には連続しており、必要な場合には「キメラタンパク質」が作製されるように2つのタンパク質コード領域が連続して読み枠内につながっていることを意味する。「キメラタンパク質」または「ハイブリッドタンパク質」とは、天然ではそのように見いだされないが、つながって、つながったドメインの機能性を示す機能的タンパク質を形成する種々のタンパク質「ドメイン」(またはモチーフ)で構成されるタンパク質である。キメラタンパク質は、天然に存在する2つ以上のタンパク質の融合タンパク質であってもよい。「ドメイン」という用語は、本明細書で使用される場合、ドメインの少なくとも機能的な特性を有する新規のハイブリッドタンパク質をもたらすために別のタンパク質に移入することができる特異的な構造または機能を有するタンパク質の任意の一部分またはドメインを意味する。
【００２５】
「植物」とは、植物全体または植物から得られる植物の一部、例えば、細胞、組織または器官(例えば、花粉、種子、配偶子、根、葉、花、花芽、葯、果実など)など、ならびに、これらの任意の誘導体、ならびにそのような植物から自殖または交雑によって得られる後代を指す。「植物細胞」とは、単離された状態または組織、器官または生物体内にあるプロトプラスト、配偶子、懸濁培養物、小胞子、花粉粒などを包含する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、1つまたは複数の遺伝子の転写を制御するように機能し、その遺伝子の転写開始部位の転写の方向に対して上流に位置し、かつ、DNA依存性RNAポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、ならびに、これだけに限定されないが、転写因子結合部位、抑制因子タンパク質結合部位、活性化因子タンパク質結合部位、および直接的に、または間接的に作用してプロモーターからの転写の量を調節することが当業者に公知の任意の他のヌクレオチドの配列を含めた任意の他のDNA配列の存在によって構造的に同定される核酸断片を指す。任意選択により、「プロモーター」という用語は、本明細書では、5'UTR領域(5'非翻訳領域)を包含する(例えば、プロモーターは、本明細書では、遺伝子の翻訳開始コドンの上流(5')の1つまたは複数の部位が転写および/または翻訳の調節において役割を果たす可能性があるので、この領域を含む)。「恒常的」プロモーターとは、ほとんどの組織において、ほとんどの生理的条件および発生条件において活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターとは、生理的に(例えば、特定の化合物を外から適用することによって)または発生的に調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特定の種類の組織または細胞においてのみ活性である。「植物または植物細胞において活性なプロモーター」とは、プロモーターの、植物または植物細胞において転写を駆動する一般的な能力を指す。これはプロモーターの時空間活性に関するいかなる意味もなさない。
【００２７】
「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は互換的に使用され、アミノ酸の鎖からなる分子を指し、特異的な作用様式、サイズ、三次元構造または起源への言及は伴わない。したがって、タンパク質の「断片」または「部分」もなお「タンパク質」と称される。「単離されたタンパク質」とは、もはやその天然の環境、例えば、in vitroまたは組換え細菌宿主細胞または植物宿主細胞にないタンパク質を指すために使用される。
【００２８】
「遺伝子改変植物」とは、本明細書では、例えば、外因性遺伝子または内在性遺伝子の追加的な1つまたは複数のコピーを導入することによって形質転換された植物または植物細胞を指し、前記外因性遺伝子または追加的な内在性遺伝子は、ゲノムに組み込むことができる。(単離された)ポリヌクレオチド配列で形質転換されたトランスジェニック植物細胞ならびにそれから再生した植物細胞および植物は全て、前記(単離された)ポリヌクレオチド配列を含むと理解される。トランスジェニック植物細胞とは、単離された植物細胞もしくは組織培養物中の植物細胞、または植物内もしくは分化した器官または組織内に含有される植物細胞を指す場合があり、どちらの可能性も本発明に明確に含まれる。したがって、説明または特許請求の範囲における植物細胞への言及は、単離された細胞または培養物中のプロトプラストのみを指すものではなく、どこに位置してもよいまたは存在し得るどんな種類の植物組織または器官であってもよい任意の植物細胞を指す。トランスジェニック植物細胞および植物を得るための方法は当技術分野で周知であり、その方法としては、これだけに限らないが、植物外植片のアグロバクテリウム媒介形質転換、植物外植片の粒子衝撃、ウィスカー(whiskers)技術を用いた植物外植片の形質転換、ウイルスベクターを使用した形質転換、植物プロトプラストの電気穿孔、ポリエチレングリコールを使用したプロトプラストによるDNAの直接取り込み、植物外植片および/またはプロトプラストのマイクロインジェクションが挙げられる。アグロバクテリウム媒介形質転換は、本発明の核酸分子を植物外植片に導入するための好ましい方法である。アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)は、外因性核酸分子を植物ゲノムに導入するために適するように工学的に操作したTiプラスミドと称される天然のベクターを有する。遺伝子形質転換のために、植物由来の外植片をアグロバクテリウム細胞の懸濁液と一緒にインキュベートし、その後、外植片を、形質転換された細胞の生長および再生のみを促進する選択的作用剤を含有する培地で栽培する。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「単離された植物耐乾燥性タンパク質(ポリペプチド)」、「植物の耐乾燥能を改善する単離されたポリペプチド」、「単離されたBccJAZ5aタンパク質」または「単離されたBccJAZ5aポリペプチド」とは、他のタンパク質、脂質、糖類および天然で前記タンパク質と関連する他の物質を実質的に含まないBccJAZ5aタンパク質を指す。当業者は、BccJAZ5aタンパク質を精製するために、標準のタンパク質の精製技法を利用することができる。実質的に純粋なポリペプチドは、非還元ポリアクリルアミドゲル上で単一の主要バンドを形成する。
【００３０】
本発明者らは、植物における耐乾燥性の改善または耐乾燥性をもたらすために使用することができるアブラナ属(Brassica)の種由来の新規の植物耐乾燥性遺伝子を初めて単離した。単離された遺伝子は「BccJAZ5a」と称され、これに基づいて、耐乾燥能が改善されたトランスジェニック植物を作製することができる。
【００３１】
本発明は、前記植物における遺伝子の発現を改変することによって植物の耐乾燥性を改善することに関する。改善は、そのような改変が導入されていない、または存在しない植物に対するものである。そのような植物は、同じ種および/または品種であることが好ましい。言い換えれば、本発明による改変された植物は、改変されていない植物と比較して、水の利用可能性が低い条件下、水分欠乏条件下または乾燥下で、よりよく生長し、生存することができる。
【００３２】
乾燥ストレス、すなわち、上記の通りある期間の適切な水の利用可能性の制限は、植物のしおれた状態、すなわち、植物またはその一部の膨圧が、植物が水を十分に利用可能である状態と比較して低下した状態にも現れる可能性がある。この点について、JAZ5aタンパク質の発現が増強され(例えば、増強された、抑制解除された、または挿入された遺伝子を用いて)、かつ/またはその活性が増強された改変植物は、同じ期間にわたって同じ状態で乾燥ストレスに曝露された場合に、対応する改変されていない植物よりも、しおれが少ない可能性がある。
【００３３】
水の利用可能性が限られていることまたは乾燥は、水が、そのような状態における形質転換されていない植物または天然に存在する植物のバイオマスの蓄積または作物収量の制限因子になるまたはその可能性がある状況であると理解されるべきである。本発明による方法に従って得られ、前記条件下で生長させた植物に対しては、水は、制限因子にならない、またはより低い程度で制限因子になる可能性がある。
【００３４】
本発明者らは、JAZ5aの発現を増強する(例えば、遺伝子の増強、抑制解除または挿入によって)ことによって、高発現の結果としてまたはJAZ5aタンパク質の活性/機能性の増加の結果としてのいずれかでまたはその両方で、機能的なJAZ5aタンパク質の存在(または存在の増加)がもたらされ、前記機能的なJAZ5aタンパク質の存在(または存在の増加)により、前記植物の水の必要性の減少および/または乾燥に対する耐性の改善が導かれると考えている。
【００３５】
一実施形態では、植物に耐乾燥性をもたらすためのタンパク質であって、
(a)配列番号4のアミノ酸配列を有するタンパク質;または
(b)(a)のタンパク質から、配列番号4のアミノ酸配列の1つまたは複数の残基の置換、欠失または付加によって得られ、配列番号4で示されるアミノ酸配列と機能的に等しいタンパク質;または
(c)配列番号4のアミノ酸配列に対して少なくとも60%の同一性を有し、配列番号4で示されるアミノ酸配列と同じ機能を有するタンパク質
である、タンパク質の使用が提供される。
【００３６】
一実施形態では、前記植物耐乾燥性タンパク質は、配列番号4で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有する。
【００３７】
一実施形態では、植物耐乾燥性タンパク質は、配列番号4のアミノ酸配列に対して1〜20残基、好ましくは1〜10残基、より好ましくは1〜5残基、最も好ましくは1〜3残基の置換、欠失または付加を有する。
【００３８】
一実施形態では、植物は、アブラナ科(Cruciferae)の植物である。一実施形態では、アブラナ科(Cruciferae)植物は、アブラナ属の種の植物およびシロイヌナズナ属(Abrabidopsis)の種の植物からなる群から選択される。一実施形態では、アブラナ属の種の植物はハクサイである。
【００３９】
一実施形態では、シロイヌナズナ属の種の植物はシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh)である。一実施形態では、植物耐乾燥性タンパク質は、アブラナ属の種の植物に由来し、チンゲンサイに由来することが好ましい。
【００４０】
一実施形態では、植物に耐乾燥性をもたらすための、
(i)前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド;または
(ii)(i)のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチドの使用が提供される。
一実施形態では、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号1または配列番号2に記載されている。ある実施形態では、そのようなポリヌクレオチドを含むキメラ遺伝子が提供される。一実施形態では、前記ポリヌクレオチドを含有するベクターが提供される。前記ベクターは、使用する宿主細胞または宿主植物に基づいて選択することができる。当業者は、指定の宿主細胞に適したベクターを選択することができる。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドを含めた遺伝子は、添付の配列表に見いだされるものなどの利用可能なヌクレオチド配列情報に基づいて、当技術分野で公知の方法によってクローニングすることができることは当業者には明らかである。これらとしては、例えば、そのような遺伝子のフランキング配列を表す、一方がセンス方向に生成されており、センス鎖の合成を開始し、他方が逆相補的に創出されており、アンチセンス鎖を生成するDNAプライマーの設計が挙げられる。そのような実験を行うために、ポリメラーゼ連鎖反応において使用されるものなどの耐熱性DNAポリメラーゼが一般に使用される。あるいは、遺伝子を表すDNA配列を化学的に合成し、その後、例えば、大腸菌(E.coli)などの適合性の細菌によって増加させることができるDNAベクター分子に導入することができる。
【００４２】
一実施形態では、前記ベクターを含む、またはゲノム内に組み込まれた前記ポリヌクレオチドを含む遺伝子操作された宿主細胞が提供される。一実施形態では、上述のポリヌクレオチドのいずれかを含む植物が提供される。
【００４３】
一実施形態では、
(a)前記宿主細胞を発現に適した条件下で培養するステップと
(b)培養物から前記タンパク質を単離するステップと
を含む、上述のタンパク質を調製するための方法が提供される。
【００４４】
一実施形態では、(改善された)耐乾燥性を有する植物をもたらすための、上述のタンパク質または前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用が提供される。一実施形態では、使用は、抽苔段階において(改善された)耐乾燥性を有する植物をもたらすためのものである。
【００４５】
一実施形態では、耐乾燥性が改善された植物をもたらすための方法であって、前記植物における上述のタンパク質の発現または活性を増強することを含む方法が提供される。一実施形態では、前記方法は、植物のゲノムに上述のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入し形質転換することを含む。一実施形態では、前記方法は、
(1)本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含有するアグロバクテリウムを用意するステップと、
(2)植物の細胞、器官または組織を用意するステップと、
(3)本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが植物細胞に導入されるように、ステップ(2)の植物の細胞、器官または組織を、ステップ(1)のアグロバクテリウムと接触させるステップと、
(4)任意選択により、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された植物の細胞、器官または組織を選抜するステップと、
(5)ステップ(3)の植物の細胞、器官または組織を植物に再生させるステップと、
を含む。一実施形態では、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを植物細胞の染色体内に組み込む。
【００４６】
一実施形態では、本発明の植物耐乾燥性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子改変植物が提供される。
【００４７】
本発明の一実施形態では、少なくとも30、35、40、45、50、またはそれ以上の(連続した)配列番号1または配列番号2の配列のヌクレオチドを含む、植物における耐乾燥性を同定するための分子マーカーが提供される。一実施形態では、そのような分子マーカーを同定するための方法であって、植物細胞のDNAの配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一実施形態では、そのような分子マーカーを同定するための方法であって、前記配列番号1または配列番号2の配列を増幅し、アンプリコンを検出するステップを含む方法が提供される。一実施形態では、前記配列番号1または配列番号2の配列を増幅することができるプライマー対が提供され、別の実施形態では、提供されるプライマー対は、ヌクレオチド配列、配列番号5および配列番号6で表される。
【００４８】
本発明において使用することができる植物には、植物を、例えば、遺伝子、キメラ遺伝子またはベクターを使用して形質転換することができる限りは特定の限定はない。植物としては、種々の作物、観花植物または林業用植物などが挙げられる。具体的には、植物として、これだけに限定されないが、双子葉植物、単子葉植物または裸子植物が挙げられる。より具体的には、植物としては、これだけに限定されないが、コムギ、オオムギ、ライムギ、イネ、トウモロコシ、モロコシ、ビート、リンゴ、セイヨウナシ、セイヨウスモモ、モモ、アンズ、サクランボ、イチゴ、タイワンウラジロイチゴ、クロイチゴ、マメ、レンズマメ、エンドウマメ、ダイズ、セイヨウアブラナ、マスタード、ケシ、オリーブ(olea europea)、ヒマワリ、ヤシ、ヒマシ油を産生する植物、カカオ、ピーナッツ、ヒョウタン、キュウリ、スイカ、綿、アマ、アサ、ジュート、柑橘類、レモン、グレープフルーツ、ホウレンソウ、レタス、アスパラガス、キャベツ、ハクサイ、チンゲンサイ、ニンジン、タマネギ、ジャガイモ、トマト、ピーマン、アボカド、カッシア、ショウノウ、タバコ、ナッツ、コーヒー、ナス、サトウキビ、茶、コショウ、ブドウ、イラクサ、バナナ、天然ゴムノキおよび観賞植物などが挙げられる。
【００４９】
「植物」という用語は、これだけに限定されないが、アブラナ科(Cruciferae)、イネ科(Gramineae)およびバラ科(Rosaceae)の植物を含む。例えば、「植物」とは、これだけに限定されないが、アブラナ科(Cruciferae)のアブラナ属の種のハクサイおよびチンゲンサイ;アブラナ科(Cruciferae)のシロイヌナズナ属の種の植物;イネ科のイネ;およびタバコ、メロンおよび果実、植物、セイヨウアブラナなどを含み、「植物」は、アブラナ科(Cruciferae)のアブラナ属の種またはシロイヌナズナ属の種の植物であることがより好ましい。
【００５０】
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであってよい。組換えポリペプチドであることが好ましい。本発明のポリペプチドは、天然の供給源から精製された、化学的に合成された、または原核生物宿主または真核生物宿主(例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞など)によって組換え産生された産物であってよい。組換え産生において使用される宿主に応じて、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい。本発明のポリペプチドは、第1のネイティブなメチオニン残基をさらに含んでもよく、含まなくてもよい。
【００５１】
本発明は、BccJAZ5aタンパク質の断片、誘導体および類似体をさらに含む。本明細書で使用される場合、「断片」、「誘導体」および「類似体」という用語は、本発明のBccJAZ5aタンパク質と実質的に同じ生物学的機能および/または活性を有するポリペプチドを指す。本発明のポリペプチド断片、誘導体または類似体は、(i)1つもしくはいくつかの保存された(好ましい)もしくは保存されていないアミノ酸残基が、遺伝子によりコードされたもしくはされていない1つもしくは複数のアミノ酸残基で置換されているポリペプチド、または(ii)置換基を担持する1つもしくは複数のアミノ酸残基を有するポリペプチド、または(iii)成熟ポリペプチドと別の化合物(例えば、ポリペプチドの半減期を延長するための化合物など、例えば、ポリエチレングリコールなど)の融合ポリペプチド、または(iv)ポリペプチド配列と融合した追加的なアミノ酸配列(例えば、リーダー配列もしくは分泌配列、もしくは精製を容易にする配列、もしくはタンパク質新生配列、もしくは融合タンパク質など)によって形成されたポリペプチドであってよい。本明細書において提供される定義に従って、当業者はこれらの断片、誘導体および類似体を理解することができる。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「BccJAZ5aタンパク質」という用語は、配列番号4の配列に基づく、植物に耐乾燥性の改善または耐乾燥性をもたらすポリペプチドを指す。この用語は、(改善された)植物の耐乾燥能をもたらす配列番号4の変異体も包含する。突然変異としては、これだけに限定されないが、1つまたは複数(一般に1〜50、好ましくは1〜30、より好ましくは1〜20、最も好ましくは1〜10、さらにより好ましくは1〜8または1〜5)のアミノ酸の欠失、挿入および/または置換、ならびにC末端および/またはN末端における1つまたは複数(一般に20以内、好ましくは10以内、より好ましくは5以内)のアミノ酸の付加または欠失が挙げられる。例えば、近いまたは同様の性質を有するアミノ酸残基での置換が、タンパク質の機能に一般に影響を及ぼさないことが理解される。さらに、例えば、C末端および/またはN末端由来の1つまたは複数のアミノ酸の付加または欠失は、タンパク質の機能に一般に影響を及ぼさない。この用語は、BccJAZ5aタンパク質の活性な断片および活性な誘導体も包含する。
【００５３】
ポリペプチドの変異体としては、その相同配列、保存された突然変異体、対立遺伝子突然変異体、自然突然変異体、誘導された突然変異体、高ストリンジェント条件下または低ストリンジェント条件下でBccJAZ5aタンパク質のDNAとハイブリダイズすることができるDNAによりコードされるタンパク質、およびBccJAZ5aタンパク質に対する抗血清を利用することによって得られるポリペプチドまたはタンパク質が挙げられる。本発明は、BccJAZ5aタンパク質またはその断片を含有する融合タンパク質などのより関連するポリペプチドも提供する。全長またはほぼ全長のポリペプチドに加えて、本発明は、BccJAZ5aタンパク質の可溶性断片も包含する。一般に、断片は、BccJAZ5aタンパク質の少なくとも約20個、一般に少なくとも約30個、好ましくは少なくとも約50個、より好ましくは少なくとも約80個、最も好ましくは少なくとも約100個の連続的なアミノ酸を含有する。
【００５４】
本発明は、BccJAZ5aタンパク質またはポリペプチドの類似体も提供する。これらの類似体は、ネイティブなBccJAZ5aタンパク質とは、一次配列または同じ一次配列に沿った修飾パターン、またはその両方が異なってよい。これらのポリペプチドとしては、天然のまたは誘導された遺伝子突然変異体が挙げられる。誘導された突然変異体は、種々の技法によって、例えば、放射線照射によってまたはランダム突然変異誘発が生じるように突然変異原に曝露させることによって得ることができる。これらは、部位特異的突然変異誘発またはいくつかの他の公知の生物学的技術によって得ることもできる。類似体は、天然のL-アミノ酸とは異なる残基(例えばD-アミノ酸など)を有するもの、および人為的または合成のアミノ酸、例えば、β-アミノ酸およびγ-アミノ酸などを有するものも包含する。本発明のポリペプチドは上記の代表例に限定されないことが理解されるべきである。
【００５５】
一次構造を変化させない修飾パターンとしては、in vivoまたはin vitroにおける化学的誘導、例えば、アセチル化またはカルボキシル化などが挙げられる。修飾はグリコシル化であってもよい。修飾は、配列内のアミノ酸残基のリン酸化であってもよい(例えば、リン酸化チロシン、リン酸化セリン、およびリン酸化トレオニンなど)。抗タンパク質分解性が改善されるようにまたは溶解性が最適化されるように修飾されたポリペプチドも包含される。
本発明では、「BccJAZ5aタンパク質の保存された突然変異体」とは、配列番号4のアミノ酸配列の最大20個、好ましくは最大10個、より好ましくは最大5個、最も好ましくは最大3個のアミノ酸が同様の性質または近い性質を有するアミノ酸で置き換えられたポリペプチドを指す。これらの突然変異体ポリペプチドは、以下のTable1(表1)に示されているアミノ酸の置き換えに従って作製されることが好ましい。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
本発明は、本発明のBccJAZ5aタンパク質またはその変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに提供する。
【００５８】
本発明のポリヌクレオチドはDNA分子であってもRNA分子であってもよい。DNA分子とは、cDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAを包含する。DNA分子は、一本鎖の形態であっても二本鎖の形態であってもよい。DNA分子はコード鎖であっても非コード鎖であってもよい。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、配列番号1または配列番号2のコード配列と同一であってもよく、それらの変性変異体であってもよい。その点で使用される場合、「変性変異体」とは、配列番号1または配列番号2に記載のコード配列とは異なるヌクレオチド配列を伴う配列番号4の配列を有するタンパク質をコードする核酸分子を指す。
配列番号4のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのみをコードするコード配列;成熟ポリペプチドのコード配列および追加的なコード配列;成熟ポリペプチドのコード配列および非コード配列、任意選択により、さらに追加的なコード配列を含んでよい。
【００５９】
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、任意選択により、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに加えて、追加的なコードポリヌクレオチドおよび/または非コードポリヌクレオチドを含んでよい。
【００６０】
本発明は、さらに、本発明のポリペプチド、ならびにそれらの断片、類似体および誘導体の同じアミノ酸配列をコードする、上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、天然に存在する対立遺伝子突然変異体であっても、天然に存在しない突然変異体であってもよい。ヌクレオチド変異体としては、置換変異体、欠失変異体および挿入変異体が挙げられる。先行技術において公知の通り、対立遺伝子変異体は、突然変異が1つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失または挿入であり得るが、対立遺伝子変異体によりコードされるポリペプチドの機能は実質的に変更されていない、ポリヌクレオチドの代替形態である。
【００６１】
本発明は、上記の配列のいずれかとハイブリダイズし、2つの配列間に少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%の配列同一性を有するポリヌクレオチドにも関する。本発明は、特に、ストリンジェントな条件下で本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明では、「ストリンジェントな条件」とは、(1)比較的低いイオン強度および比較的高い温度、例えば、0.2×SSC、0.1%SDS、60℃などにおけるハイブリダイゼーションおよび溶出;または(2)ハイブリダイゼーション中の変性剤の存在、例えば、50%(v/v)ホルムアミド、0.1%仔ウシ血清/0.1%Ficoll、42℃など;または(3)少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%の同一性を有する2つの配列間のハイブリダイゼーションのみが可能な条件を指す。さらに、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、配列番号4で示される成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を示す。
【００６２】
本発明は、上記の配列のいずれかとハイブリダイズすることができる核酸断片にも関する。本明細書で使用される場合、「核酸断片」は、少なくとも15ヌクレオチド、好ましくは少なくとも30ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも50ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも100ヌクレオチドを含有する。核酸の断片は、BccJAZ5aタンパク質をコードするポリヌクレオチドを決定および/または単離するために核酸の増幅技法(例えばPCRなど)において使用することができる。
【００６３】
本発明のBccJAZ5aタンパク質またはその断片の全長のヌクレオチド配列は、一般には、PCR増幅方法、組換え法または人工的な合成によって調製することができる。PCR増幅に関しては、対象の配列は、本発明に開示されている関連するヌクレオチド配列、例えば、オープンリーディングフレームに応じてプライマーを設計し、市販のcDNAライブラリーまたは当技術分野で公知の従来の方法のいずれかに従って調製したcDNAライブラリーを鋳型として用いることによって増幅することができる。大きな配列については、2回以上のPCR増幅が必要な場合があり、各増幅で得られた断片は、例えば、ライゲーションによって、正しい方向に融合することができる。
【００６４】
配列を得たら、組換え技法を用いてそれを大量に作製することができる。配列をベクターにクローニングすることができる。ベクターを細胞に導入し形質転換し、次いで増殖した宿主細胞から従来の手段を用いて配列を単離することができる。
【００６５】
さらに、特に断片が比較的短い場合、関連する配列を人工的な合成によって合成することができる。一般に、まずいくつかの小さな断片を合成し、次いで、例えば、ライゲーションまたは融合PCRによって融合して大きな断片にする。本発明のタンパク質(またはその断片、または変異体、または誘導体)をコードするDNA配列は、化学合成によって調製することができる。得られたDNA配列は、種々の公知のDNA分子(例えばベクターなど)に組み入れることができ、次いで、細胞に組み入れることができる。さらに、本発明のタンパク質配列(すなわち、タンパク質配列をコードする配列)に突然変異を化学合成によって導入することができる。
【００６６】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、斯かるベクターまたは本発明のBccJAZ5aタンパク質のコード配列を含むように遺伝子操作された宿主細胞、および本発明のポリペプチドを組換えによって作製するための方法にも関する。
【００６７】
本発明のポリヌクレオチドを用いて、従来の組換えDNA技法を用いて、組換えBccJAZ5aタンパク質を発現させるまたは作製することができる。そのような使用には以下のステップを含めることができる:
(1)本発明のBccJAZ5aタンパク質をコードするポリヌクレオチド(またはその変異体)、または前記ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするステップ;
(2)宿主細胞を培地中で培養するステップ;
(3)培地または培養細胞からタンパク質を単離し、精製するステップ。
【００６８】
本発明では、BccJAZ5aタンパク質のポリヌクレオチド配列を組換え発現ベクターに挿入することができる。「組換え発現ベクター」という用語は、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物細胞ウイルスおよび当技術分野で公知の任意の他のベクターを指す。要約すると、宿主において複製することができ、安定に保持することができる限りは、任意のプラスミドおよびベクターを使用することができる。発現ベクターは、複製開始点、プロモーター、マーカーおよび翻訳制御エレメントを含有してよい。
【００６９】
当技術分野で公知のさまざまな方法を用いて、BccJAZ5aタンパク質をコードするDNA配列および転写/翻訳調節シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、in vitro組換え技法、DNA合成、in vivo組換え技法などが挙げられる。発現ベクターにおいてmRNA合成を導くために、DNA配列をプロモーターの下で作動可能に連結することができる。発現ベクターは、翻訳を開始するためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターをさらに含んでよい。
【００７０】
さらに、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞を選択するための表現形質をもたらすために、1つまたは複数の選択的に標識された遺伝子を含有してよい。標識された遺伝子は、例えば、真核細胞の培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性および緑色蛍光タンパク質(GFP)、ならびに大腸菌についてはカナマイシン耐性またはアンピシリン耐性をコードしてよい。
【００７１】
上記のDNA配列および適切なプロモーターまたは調節配列を含むベクターを用いて、タンパク質を発現させるための宿主細胞を形質転換することができる。
【００７２】
宿主細胞は、原核細胞、例えば、細菌の細胞など;または下等真核細胞、例えば、酵母細胞など;または高等真核細胞、例えば、植物細胞などであってよい。例としては、大腸菌、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、アグロバクテリウム、酵母などの真菌細胞、および植物細胞などが挙げられる。
【００７３】
本発明のポリヌクレオチドを高等真核細胞において発現させる場合、エンハンサー配列をベクターに挿入すると転写を増強することができる。エンハンサーは、DNAのシス作用性因子であってよく、約10〜300bpを含有してよく、プロモーターに作用して遺伝子の転写を増強する。
【００７４】
当業者は、ベクター、プロモーター、エンハンサーおよび宿主細胞をどのように選択するか分かっている。
【００７５】
組換えDNAを用いた宿主細胞の形質転換は、当業者に公知の従来の技法を用いて行うことができる。宿主が大腸菌などの原核細胞である場合、当技術分野で公知の方法に従って、DNAを取り込むことができるコンピテント細胞を指数増殖期の後に回収し、次いで、CACI2法で処理することができる。別の方法は、MgCI2を使用することである。所望であれば、電気穿孔を用いて形質転換を行うことができる。宿主細胞が真核生物起源である場合、以下のDNAトランスフェクト方法の1つまたは複数を用いることができる:リン酸カルシウム沈殿、従来の機械的方法、例えば、微量注入、電気穿孔、リポソームパッキング(liposome packing)など。植物の形質転換も、アグロバクテリウムまたは遺伝子銃による形質転換など、例えば、リーフディスク形質転換、イネ未成熟胚形質転換などを用いることによって実現することができる。形質が変更された植物が得られるように、形質転換された植物細胞、組織または器官を従来の方法によって植物に再生することができる。
【００７６】
形質転換体を従来のやり方で培養して、本発明の遺伝子によりコードされるポリペプチドを発現させることができる。使用する宿主細胞に応じて、培養に使用する培地は、種々の(従来の)培地から選択することができる。培養は、宿主細胞を成長させるために適した条件下で行うことができる。宿主細胞が適切な密度まで成長したら、選択されたプロモーターを適切な方法(例えば、温度変化または化学的誘導)によって誘導し、その後、細胞をある期間にわたってさらに培養することができる。
【００７７】
上記の方法では、組換えポリペプチドを、細胞においてまたは細胞膜において発現させることもでき、細胞の外に分泌させることもできる。所望であれば、組換えタンパク質を種々の単離方法により、タンパク質の物理的性質、化学的性質または他の性質を利用することによって単離し、精製することができる。これらの方法は当技術分野で周知である。例としては、これだけに限定されないが、従来の復元処理、タンパク質沈殿剤を用いた処理(例えば塩析など)、遠心分離、浸透(細菌を破壊するため)、超処理(ultra-treatment)、超遠心分離、分子ふるいクロマトグラフィー(ゲル濾過)、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)および他のものなどの液体クロマトグラフィー、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。
【００７８】
組換えBccJAZ5aは、多くの用途において使用することができる。例えば、組換えBccJAZ5aを用いて、抗体、ポリペプチドまたはBccJAZ5aタンパク質の機能に対して作動的または拮抗的な他のリガンドをスクリーニングすることができる。発現された組換えBccJAZ5aタンパク質を有するポリペプチドライブラリーをスクリーニングすることは、BccJAZ5aタンパク質の機能を阻害または刺激することができる有益なポリペプチド分子の発見に役立つ。
【００７９】
本発明のポリヌクレオチド全体またはその部分は、プローブとして使用することができ、マイクロアレイまたはDNAチップ(「遺伝子チップ」とも称される)に固定して遺伝子の示差的な発現の分析を実施することができる。in vitroで増幅させるためのRNA逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を実施するためのBccJAZ5aタンパク質に特異的なプライマーを用いて、BccJAZ5aタンパク質の転写産物を検出することもできる。
【００８０】
本発明は、植物を改変する(植物に耐乾燥性の改善または耐乾燥性をもたらす)ための方法であって、植物におけるBccJAZ5a遺伝子の発現またはコードされるタンパク質の活性を増強するまたはもたらすことを含む方法にも関する。
【００８１】
BccJAZ5a遺伝子の発現を増強するまたはもたらすための方法は当技術分野で周知である。例えば、植物を、BccJAZ5aコード遺伝子を保有する発現構築物で形質転換して、BccJAZ5a遺伝子を発現させることができる。プロモーターを用いて、BccJAZ5a遺伝子の発現を増強することができる。エンハンサー(例えば、イネwaxy遺伝子の第1イントロンまたはアクチン遺伝子の第1イントロンなど)を用いて、BccJAZ5a遺伝子の発現を増強することができる。本発明において使用することができるプロモーターとしては、これだけに限定されないが、イネおよびトウモロコシにおける35SプロモーターおよびUbiプロモーターが挙げられる。
【００８２】
本発明の一実施形態では、BccJAZ5aタンパク質の発現が増強された植物を得るための方法は、
(1)BccJAZ5aタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを含むアグロバクテリウム株を用意するステップと、
(2)BccJAZ5aタンパク質をコードするポリヌクレオチドが植物細胞に移入されかつゲノムに組み込まれることができ、それにより植物細胞を形質転換するように、植物細胞、組織または器官をステップ(1)のアグロバクテリウムと接触させるステップと、
(3)任意選択により、BccJAZ5aタンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換された植物細胞または組織を選抜するステップと、
(4)ステップ(3)の植物細胞または組織を植物に再生するステップと
を含む。
【００８３】
試薬、温度および圧力の制御を含めた任意の適切な従来の手段を、このプロセスにおいて用いることができる。
【００８４】
本発明は、BccJAZ5aタンパク質に対するアゴニストまたは本発明のBccJAZ5aタンパク質をコードするポリヌクレオチドも包含する。BccJAZ5aタンパク質のアゴニストはBccJAZ5aタンパク質の活性または発現を調節することができるので、前記アゴニストにより、形質の改善が実現されるようにBccJAZ5aタンパク質に影響を及ぼすことを通じて植物に耐乾燥性またはその改善をもたらすことができる。
【００８５】
BccJAZ5aタンパク質のアゴニストとは、BccJAZ5aの活性を増強すること、BccJAZ5aの安定性を維持すること、BccJAZ5aの発現を促進すること、BccJAZ5aの効果の持続時間を延長すること、またはBccJAZ5aの転写および翻訳を促進することができる任意の物質を指し得る。本発明では、これらの物質を、植物の耐乾燥性を増強するための作用剤として用いることができる。
【００８６】
本発明の一実施形態では、BccJAZ5a遺伝子が提供され、そのゲノム配列は配列番号1に列挙されており、そのcDNA配列は配列番号2に示されている。前記遺伝子は、270アミノ酸(配列番号4)を含有するタンパク質をコードする。前記BccJAZ5a遺伝子により、植物の乾燥耐容性を改変するための新規の経路がもたらされる。
【００８７】
本発明を下記の実施例と組み合わせてさらに例示する。これらの実施例は本発明を例示するためのものであると理解されるべきであり、いかなる形でも本発明の範囲を限定するものと理解されるべきではない。以下の実施例に特定の条件が示されていない実験的方法は、従来の条件、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press、2002年)に記載の条件など用いて、または製造者によって推奨されている条件に従って実施することができる。特に他の指示がなければ、百分率および部分は、重量に基づいて算出される。特に他の指示がなければ、本明細書において使用される科学用語は全て、当業者によく知られているものと同じ意味を有する。さらに、開示されている内容と等しい任意の方法および材料を本発明において用いることができる。本明細書には、好ましい実施方法および材料が単に例示する目的で開示されている。
【００８８】
本発明において引用されている参考文献は全て、そのひとつひとつが個別に引用されたのと同じく参照により本明細書に組み込まれる。さらに、上記の本発明の教示を考慮して、説明および特許請求の範囲によって定義される範囲内に入る種々の改変および/または変化が当業者に明らかになることが理解される。
【００８９】
配列表
配列番号1:BccJAZ5aタンパク質をコードするゲノムDNA配列
配列番号2:BccJAZ5aタンパク質をコードするcDNA配列
配列番号3:BccJAZ5bタンパク質をコードするゲノムDNA配列
配列番号4:BccJAZ5aタンパク質のアミノ酸配列
配列番号5:フォワードプライマー5'AAGAAGCCAAGTCTGTGA3'
配列番号6:リバースプライマー5'TCGGAGGATAATGATGAC3'
【００９０】
(実施例)
恒常的35Sプロモーター(35S::BccJAZ5a)の後にチンゲンサイ(Brassica rapa ssp. chinensis)由来のBccJAZ5aをコードするヌクレオチド配列を有するシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)(At)の2回の個々の形質転換事象由来の分離T3後代(6つの個々の植物から回収された)(以後、突然変異種子または突然変異植物と称される)をthe National Laboratory of Plant Molecular Genetics、Shanghai Institute of Plant Physiology and Ecology、Shanghai Institutes for Biological Sciences、Chinese Academy of Sciences、300 Fenglin Road、Shanghai 200032、Chinaから入手した。対照として、At Col-0(Columbia、N60000;以後対照種子または植物と称される)をthe Nottingham Arabidopsis Stock Centre(NASC;School of Biosciences、University of Nottingham、Sutton Bonington Campus、Loughborough、LE12 5RD United Kingdom)から入手した。
【００９１】
本発明の遺伝子「BccJAZ5」に対してそれぞれBccJAZ5a(コピーa)およびBccJAZ5b(コピーb)である2つのゲノム配列が提供される。BccJAZ5aのゲノム配列は配列番号1に示されており、そのCDS配列は配列番号2に示されている。BccJAZ5aは、270アミノ酸(配列番号4)を有するタンパク質「BccJAZ5a」をコードする。BccJAZ5bのゲノム配列は配列番号3に示されている。
【００９２】
チンゲンサイ(Brassica rapa ssp. chinensis)由来のBccJAZaの発現を半定量的RT-PCRを用いて確認した。使用したプライマーは、
BccJAZ5a:
フォワード:5'AAGAAGCCAAGTCTGTGA 3'(配列番号5);
リバース:5'TCGGAGGATAATGATGAC 3'(配列番号6)
であった。
【００９３】
生長培地:
砂を1部、バーミキュライトを1部および堆肥を2部含む土壌混合物(砂:バーミキュライト:堆肥=1:1:2)を使用した。この混合物は水の浸透を増加させ、したがって各ポットの均一な水の取り込みおよびよりよい排水が容易になる。播種する前に、層別化のために、種子を暗く湿気のある条件下、4℃で3日間保持した。
【００９４】
突然変異種子および対照種子をどちらも60mlのかご(ARABASKETS、Lehle seeds)にポットあたり1植物体の密度で播種した。各遺伝子型について、反復試験体は20であった。かごを、直径約4cmの穴8×5=40個を有する長方形のトレー内で保持した。植物を、生長チャンバー内で、相対湿度60〜70%で16時間の昼(24℃)および8時間の夜(20℃)で栽培した。播種した後最初の3日は、植物を透明な蓋または透明なプラスチック袋で覆うことによって100%湿度で保持した。全ての植物に、発芽後日数(DAG: days after germination)10日目にトレー内のポットの底部から栄養溶液(EC=1.5)を供給し、15DAGに、ポットを乾燥トレーに移すことによって植物を乾燥にさらした(19日間、20日間、または21日間)。その後、植物に補水し、1週間後の回復について観察した。
【００９５】
2回の個々の形質転換事象から個別に回収した突然変異体T3後代の反復試験体、および対照植物の反復試験体を含めた。完全な試験のために必要な総時間はおよそ36〜39日であった。
【００９６】
乾燥アッセイ検査
10DAGに、植物に栄養(EC-1.5)を与え、15DAGに、各ポットを乾燥トレーに移動させた。この日以降、植物に少しも水を与えなかった。水を控えている間、位置の影響を減らし、均一な蒸発を可能にするために、ポットをトレー内で毎日シャッフルした。毎日、植物、特に対照(または野生型)(Col-0)にしおれの徴候が観察された(図1参照)。乾燥日数(DOD: day of drought)19日目に、Col-0は完全にしおれ、補水しても回復しなかった。この日をその永久しおれ点(PWP)と決定した。この日以降、突然変異体の反復試験体に補水し、回復の徴候について観察し、写真を撮った(図2参照)。突然変異植物は、乾燥の下で対照よりも少なくとも1日長い生存を示した。
【００９７】
【表２】
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【００９８】
JAZ5aタンパク質内のドメイン、その変異体および機能に対する試験
本出願の発明者らは、BccJAZ5aタンパク質(配列番号4)内のドメインを同定した。101〜130位はtifyドメインを構成し、184〜209のセグメントはCCT_2モチーフである。これらのドメインは、タンパク質の耐乾燥機能の重要な活性部位である可能性がある。
【００９９】
上記の分析に基づいて、発明者らは、以下に明記されている通り、BccJAZ5aタンパク質のいくつかの変異体を構築する:
BccJAZ5aタンパク質(配列番号4)の配列において、BccJAZ5a-M1変異体が得られるようにアミノ酸9をAからVに変化させる。
BccJAZ5aタンパク質(配列番号4)の配列において、BccJAZ5a-M2変異体が得られるようにアミノ酸253をLからIに変化させる。
BccJAZ5aタンパク質(配列番号4)の配列において、BccJAZ5a-M3変異体が得られるようにアミノ酸147をVからAに変化させ、およびアミノ酸230をLからIに変化させる。
BccJAZ5aタンパク質(配列番号4)の配列において、BccJAZ5a-M4変異体が得られるようにアミノ酸266〜270を欠失させる。
BccJAZ5aタンパク質(配列番号4)の配列において、BccJAZ5a-M5変異体が得られるようにアミノ酸159〜161を欠失させる。
BccJAZ5aタンパク質(配列番号4)の配列において、BccJAZ5a-M6変異体が得られるように4つのアミノ酸ATAAをC末端に付加する。
【０１００】
配列番号2に示されているBccJAZ5a遺伝子のCDS配列をまずpCAMBIA1300ベクターのKpn I部位にクローニングして、前記CDSを含有する組換えベクターを得る。次いで、部位特異的突然変異誘発を行って、対応する置換、欠失および付加を導入して、それぞれ上記の前記変異体を含有する組換えベクターを得る。
【０１０１】
したがって構築された組換えベクターをアグロバクテリウムの株に導入し形質転換し、次いで、そのアグロバクテリウム株を使用してシロイヌナズナ属を形質転換し、したがってトランスジェニックシロイヌナズナ属植物を得る。例えば上記の乾燥処理を用いて、これらのトランスジェニックシロイヌナズナ属植物の表現型を検証する。トランスジェニック植物は野生型植物と比較して耐乾燥性の改善を示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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