(57)【要約】ヌクレアーゼ、ならびにＨＰＲＴ遺伝子座を修飾し、標的遺伝子座およびクローンにおける遺伝子修飾の頻度を増加させ、かつ動物を生成するためにこれらのヌクレアーゼを用いる方法。一実施形態において、内因性ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子に結合するジンクフィンガータンパク質および切断ドメインを含む非天然融合タンパク質が提供され、この非天然融合タンパク質は、内因性ＨＰＲＴ遺伝子を修飾する。【選択図】  図１１【特許請求の範囲】
【請求項１】
内因性ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子に結合するジンクフィンガータンパク質および切断ドメインを含む非天然融合タンパク質であって、内因性ＨＰＲＴ遺伝子を修飾する、前記融合タンパク質。
【請求項２】
前記ジンクフィンガータンパク質が、認識ヘリックス領域を含む４、５、または６個のジンクフィンガードメインを含み、前記ジンクフィンガータンパク質が、表１の単一列に示される順序で前記認識ヘリックス領域を含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載の１つ以上の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１に記載の１つ以上の融合タンパク質または請求項３に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含む単離細胞。
【請求項５】
前記細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、または幹細胞からなる群から選択される、請求項３に記載の細胞。
【請求項６】
前記幹細胞が、胚幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ＣＤ３４＋造血幹細胞、および肝幹細胞からなる群から選択される、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
請求項１または請求項２に記載の融合タンパク質または請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むキット。
【請求項８】
細胞中の内因性ＨＰＲＴ遺伝子を切断する方法であって、
前記１つ以上の融合タンパク質が発現され、かつ前記ＨＰＲＴ遺伝子が切断されるような条件下で、前記細胞に、請求項３に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを導入することを含む、前記方法。
【請求項９】
前記細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、または幹細胞からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記幹細胞が、胚幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ＣＤ３４＋造血幹細胞、および肝幹細胞からなる群から選択される、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
導入遺伝子を前記細胞のゲノムに組み込むことをさらに含む、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記導入遺伝子が前記ＨＰＲＴ遺伝子座に組み込まれる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記導入遺伝子が、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、アルブミン遺伝子、ＡＡＶＳ１遺伝子、Ｒｏｓａ遺伝子、またはβ−グロビン遺伝子に組み込まれる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記導入遺伝子が内因性プロモーターの制御下にある、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記導入遺伝子が外因性プロモーターの制御下にある、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
内因性遺伝子座でヌクレアーゼによって修飾された細胞を富化する方法であって、
請求項８〜１５のいずれかに記載の方法に従って細胞中の内因性ＨＰＲＴ遺伝子を切断することと、
前記細胞に、前記内因性遺伝子座で前記細胞の前記ゲノムを切断するヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入することと、
前記細胞を６−ＴＧ選択に供し、それによって前記細胞を前記内因性遺伝子座が修飾された細胞に富化することと、を含む、前記方法。
【請求項１７】
前記内因性遺伝子座が不活性化される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記内因性遺伝子座が、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、アルブミン、β−グロビン、およびＲｏｓａ２６からなる群から選択される、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、または幹細胞からなる群から選択される、請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記幹細胞が、胚幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ＣＤ３４＋造血幹細胞、および肝幹細胞からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照 
本出願は、２０１１年１０月２７日出願の米国仮特許出願第６１／５５２，３０９号、および２０１１年１１月７日出願の米国仮特許出願第６１／５５６，６９１号の利益を主張するものであり、これらの開示内容は、すべての目的のために参照によりこれらの全体が組み込まれる。
【０００２】
本開示は、ゲノム編集の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子治療は、ヒト治療薬の新時代に非常に大きな可能性を有している。これらの方法論は、これまでに標準の医療行為では対処することができなかった状態の治療を可能にする。遺伝子治療は、遺伝子座の破壊または修正、および導入遺伝子に融合される特異的外来プロモーターまたはゲノムへの挿入部位に見られる内在性プロモーターのいずれかによって制御され得る発現可能な導入遺伝子の挿入等のゲノム編集技術の多くの変形を含み得る。
【０００４】
導入遺伝子の送達および挿入は、この任意の科学技術を実装するために解決されなければならない障壁の例である。例えば、様々な遺伝子送達方法が治療上での使用に利用可能であり得るが、すべて、安全性、持続性、および発現レベルの間で実質的なトレードオフを伴う。導入遺伝子をエピソーム（例えば、基本的なアデノウイルス、ＡＡＶ、およびプラスミドベースの系）として提供する方法は、一般に安全であり、高い初期発現レベルをもたらし得るが、これらの方法は、ロバストなエピソーム複製を欠き、有糸分裂的に活性な組織または経時的に再生する組織における発現の期間を制限し得る。対照的に、所望の導入遺伝子のランダムな組み込み（例えば、組み込みレンチウイルス）をもたらす送達方法は、より持続的な発現を提供するが、レシピエント細胞における無秩序な増殖を引き起こし得、ランダムに組み込まれた導入遺伝子カセットの近くで癌遺伝子の活性化を介した悪性腫瘍につながる可能性がある。さらに、導入遺伝子組み込みは複製による損失を回避するが、導入遺伝子に融合される外来プロモーターの最終的に起こるサイレンシングを阻止しない。継時的に、このようなサイレンシングは、ランダムな挿入事象の大部分において導入遺伝子発現の減少をもたらす。導入遺伝子の組み込みは、あらゆる標的細胞において稀にしか生じず、このことは、所望の治療効果を得るのに十分高い導入遺伝子の発現レベルを達成することを困難にし得る。
【０００５】
近年、部位特異的ヌクレアーゼでの切断を用いて選択されたゲノム遺伝子座への挿入を付勢する導入遺伝子組み込みの新たな戦略が開発されている（例えば、共同所有の特許文献１および特許文献２を参照のこと）。このアプローチは、遺伝子サイレンシングまたは隣接した癌遺伝子の活性化の危険性を最小限に抑えるための正確な導入遺伝子の位置決めを可能にするため、典型的な組み込みアプローチと比較して、導入遺伝子発現の改善、安全性の向上、および発現持続性の向上の可能性を提供する。
【０００６】
１つのアプローチは、導入遺伝子のその同族遺伝子座への組み込み、例えば、変異遺伝子を修正するための野生型導入遺伝子の内因性第ＶＩＩＩ因子遺伝子座への挿入を含む。あるいは、導入遺伝子は、特にその有益な特性のために選択された非同族遺伝子座に挿入され得る。同族遺伝子座の標的化は、内因性調節要素によってもたらされる発現制御を引き続き維持しながら内因性遺伝子の発現を導入遺伝子で置き換えることを望む場合に有用であり得る。内因性遺伝子座内または内因性遺伝子座の近くで切断する特異的ヌクレアーゼを使用することができ、導入遺伝子は、相同指向修復（ＨＤＲ）によって、または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）中の末端捕捉によってその切断部位に、またはその切断部位の近くに組み込まれ得る。この組み込みプロセスは、導入遺伝子ドナーにおける相同性領域の使用または不使用に影響される。ドナーにおけるこれらの染色体相同性領域は、導入遺伝子カセットに隣接し、切断部位における内因性遺伝子座の配列に相同である。
【０００７】
あるいは、導入遺伝子は、そのセーフハーバー遺伝子座で見つけられるプロモーターを利用するか、または挿入前に導入遺伝子に融合される外因性プロモーターによる導入遺伝子の発現調節を可能にするかのいずれかを行い得るゲノム内の特定の「セーフハーバー」位置に挿入され得る。ヒト細胞中のＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃとしても知られている）およびＣＣＲ５遺伝子、Ｒｏｓａ２６、ならびにアルブミンを含むいくつかのそのような「セーフハーバー」遺伝子座が説明されている（共同所有の特許文献３、特許文献４および米国特許公開第２０１０００２１８２６４号、ならびに米国出願第１３／６２４，１９３および同第１３／６２４，２１７号を参照のこと）。上述のように、導入遺伝子構築物がＨＤＲによるプロセスまたはＮＨＥＪによるプロセスのいずれかによって挿入されるようにセーフハーバーに特異的なヌクレアーゼを利用することができる。
【０００８】
６−チオグアニン（６−ＴＧ）は、細胞におけるｄＧＴＰ生合成を妨害し得るグアニン類似体である。チオ−ｄＧは、グアニンの代わりに複製中にＤＮＡに組み込まれ得、組み込まれると、多くの場合メチル化される。このメチル化は、適切なミスマッチＤＮＡ修復を妨害し得、細胞周期停止をもたらし、かつ／またはアポトーシスを起こし得る。６−ＴＧは、急速に分裂する細胞に対して毒性があるため、ある種の悪性腫瘍を有する患者を治療するために臨床的に使用されている。
【０００９】
癌および自己免疫疾患等のいくつかの種類の病状の治療は、多くの場合、例えば骨髄または他の組織移植片の移植の前に、患者自身の免疫系を除去する免疫除去を伴う。免疫除去は、全身放射線療法または高用量化学療法によって達成され得る。そのような治療が移植片を患者に定着させることにより免疫系を「再起動させる」と考えられているが、免疫除去治療は、多くの場合、過酷であり、患者が耐えることができず、利用する治療レジメン次第で重度の合併症につながり得る。したがって、より緩やかな免疫除去療法レジメンが必要とされている。
【００１０】
ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）は、ＨＰＲＴ１遺伝子によってコードされるプリン代謝に関与する酵素である。ＨＰＲＴ１は、Ｘ染色体上にあり、したがって、男性（雄）における単一コピー内に存在する。ＨＰＲＴ１は、５−ホスホリボシル基を５−ホスホリボシル１−ピロホスフェートからプリンに移動させるによってヒポキサンチンからイノシン一リン酸への変換およびグアニンからグアノシン一リン酸への変換を触媒するトランスフェラーゼをコードする。この酵素は、新たなプリン合成で用いるために、主にプリンを劣化したＤＮＡから救い出す機能を果たす。６−ＴＧの存在下で、ＨＰＲＴは、細胞中のＤＮＡおよびＲＮＡへの６−ＴＧの組み込みに関与する酵素であり、適切なポリヌクレオチド合成および代謝の妨害をもたらす。したがって、６−ＴＧは、機能的ＨＰＲＴ酵素で細胞を死滅させる選択作用物質として用いることができ、加えて、６−ＴＧは、それを必要とする対象において穏やかな免疫除去を引き起こすために与えられ得る。幹細胞移植片（例えば、造血幹細胞または前駆幹細胞）を受ける患者において、目的とする導入遺伝子をＨＰＲＴ遺伝子座に組み込んで、ＨＰＲＴ１遺伝子をノックアウトすることができる。そのような細胞集団は、６−ＴＧ毒性に耐性を示す。したがって、導入遺伝子（＋）／ＨＰＲＴ１（−）細胞が患者に注入されるとき、一連の穏やかな６−ＴＧ治療は、細胞の生着を強化し得、これらの生着した細胞は、より大きな割合の導入遺伝子組み込みを有する。
【００１１】
ＨＰＲＴは、導入遺伝子組み込みのセーフハーバーとして従来から標的とされている（例えば、非特許文献１を参照のこと）。これは、低レベルで構成的に発現され、ＨＰＲＴ遺伝子の破壊は、６−ＴＧを用いてインビトロおよびインビボの両方において選択され得る。しかしながら、ランダム組み込みによるＨＰＲＴ遺伝子座への組み込みは困難であり得、低頻度でしか生じない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第７，８８８，１２１号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００８／０２９９５８０号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００８／０１５９９９６号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｊａｓｉｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９６）９３，ｐ．８８０４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、ＨＰＲＴ遺伝子を直接標的化するか、または成功を収める核酸の細胞への形質導入（ＨＰＲＴまたは他の遺伝子座での）のマーカーおよびトランスフェクトされたヌクレアーゼ（複数可）の発現および機能のマーカーとしてこの遺伝子の標的破壊を用いることによって、特異的ゲノム編集の頻度を増加させる組成物および方法の必要性が未だ存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
導入遺伝子の細胞内の特定の位置への標的挿入を増加させるか、または標的遺伝子座における遺伝子修飾の頻度を増加させるための方法および組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子挿入は、ＨＰＲＴ遺伝子で生じ、導入遺伝子挿入の選択は、細胞、動物、または患者を６−ＴＧに曝露することにより生じる。他の実施形態では、ヌクレアーゼ切断によるＨＰＲＴ遺伝子の破壊（例えば、切断後のＮＨＥＪ中のヌクレオチド挿入または欠失による遺伝子ノックアウト）は、活性ヌクレアーゼ活性を有する細胞の代理としての役割を果たし、導入遺伝子挿入は、ドナー導入遺伝子を共形質導入したさらなるヌクレアーゼおよびＨＰＲＴ特異的ヌクレアーゼの存在下でゲノム内の１つ以上の他の位置で生じる。挿入は、例えば、ＡＡＶＳ１、Ｒｏｓａ、アルブミン、もしくはＣＣＲ５等のセーフハーバー位置を含む任意の遺伝子座で、または目的とする任意の遺伝子の内因性位置で生じ得る。対応する内因性遺伝子座への導入遺伝子の挿入は、遺伝子ノックアウト、遺伝子修正、または所望の属性を有する遺伝子変異形の導入もしくは目的とするポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードする遺伝子の導入のためであり得る。
【００１６】
いくつかの実施形態において、一方の組がＨＰＲＴを標的とし、他方が目的とする別の位置を標的とする２つ以上の組のヌクレアーゼは、両方の遺伝子座のノックアウトがこれらのヌクレアーゼ組による切断によって引き起こされる二本鎖切断（ＤＳＢ）のＮＨＥＪ媒介修復によって生じるように細胞に導入される（任意の順序で同時に、かつ／または連続して）。これらの実施形態において、ヌクレアーゼ媒介ＨＰＲＴ破壊は、成功を収めるヌクレアーゼ対の形質導入のマーカー、ならびにヌクレアーゼ活性を含有する細胞の指標として用いられる。これは、ゲノム編集が生じた可能性の高い細胞を特定する効率を高めるのに有用である。いくつかの実施形態において、これらの方法および組成物は、Ｔ細胞またはＢ細胞において用いられ、他の実施形態では、幹細胞、例えば、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）において用いられる。いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物は、造血幹細胞／前駆細胞とともに用いられる。
【００１７】
一態様において、ゲノム中のＨＰＲＴ遺伝子における標的部位に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）が本明細書に記載され、このＺＦＰは、１つ以上の操作されたジンクフィンガー結合ドメインを含む。一実施形態において、ＺＦＰは、目的とする標的ゲノム領域を二量体化し、その後切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の対として用いられ、このＺＦＮは、１つ以上の操作されたジンクフィンガー結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。別の態様において、ゲノム内のＨＰＲＴ遺伝子における標的部位に結合するＴＡＬＥタンパク質（転写アクチベーター様エフェクター）が本明細書に記載され、このＴＡＬＥは、１つ以上の操作されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。一実施形態において、ＴＡＬＥは、目的とする標的ゲノム領域を切断するヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であり、このＴＡＬＥＮは、１つ以上の操作されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。ＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮの切断ドメインおよび切断ハーフドメインは、例えば、様々な制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼから得られ得る。一実施形態において、切断ハーフドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）に由来する。ある実施形態において、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、表１および４に示されるＨＰＲＴ遺伝子における標的部位を認識する。
【００１８】
ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮは、ＨＰＲＴ遺伝子のコーディング領域内、またはＨＰＲＴ遺伝子内もしくはその遺伝子に隣接した非コーディング配列、例えば、リーダー配列、トレーラー配列、もしくはイントロン等で、またはコーディング領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内でＨＰＲＴ遺伝子に結合し、かつ／または切断し得る。
【００１９】
別の態様において、本明細書に記載のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥヌクレアーゼのうちの１つ以上を含む組成物が本明細書に記載される。ある実施形態において、この組成物は、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて１つ以上のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、２つ以上の組のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥヌクレアーゼを含み、それぞれの組は異なる特異性を有する。いくつかの態様において、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥヌクレアーゼの１つの組は、ＨＰＲＴ遺伝子に特異的である。他の態様では、組成物は、ＺＦＮもＴＡＬＥＮもいずれも含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ＨＰＲＴ特異的ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む一方で、他の実施形態では、組成物は、ヌクレアーゼタンパク質を含む。
【００２０】
別の態様において、本明細書に記載の１つ以上のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドが本明細書に記載される。このポリヌクレオチドは、例えば、ｍＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。いくつかの態様において、ｍＲＮＡは、化学的に修飾され得る（例えば、Ｋｏｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９（２）：１５４−１５７を参照のこと）。別の態様において、プロモーターに作動的に連結される本明細書に記載の１つ以上のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドを含むＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ発現ベクターが本明細書に記載される。一実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクターである。一態様において、ウイルスベクターは、組織特異的向性を呈する。
【００２１】
別の態様において、１つ以上のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ発現ベクターを含む宿主細胞が本明細書に記載される。宿主細胞は、１つ以上のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ発現ベクターで安定的に形質転換されるか、一過性にトランスフェクトされるか、またはこれらの組み合わせであり得る。一実施形態において、宿主細胞は、胚幹細胞である。他の実施形態では、１つ以上のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ発現ベクターは、宿主細胞において１つ以上のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮを発現する。別の実施形態において、宿主細胞は、外因性ポリヌクレオチドドナー配列をさらに含み得る。本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、宿主細胞は、胚細胞、例えば、１つ以上のマウス、ラット、ウサギ、または他の哺乳動物胚細胞（例えば、非ヒト霊長類）を含み得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、組織を含む。
【００２２】
別の態様において、細胞内のＨＰＲＴ遺伝子を切断するための方法が本明細書に記載され、この方法は、（ａ）ＺＦＮ（複数可）またはＴＡＬＥＮ（複数可）が発現され、かつ１つ以上のＨＰＲＴ遺伝子が切断されるような条件下で、細胞に、１つ以上の遺伝子内の標的部位に結合する１つ以上のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入することを含む。両方の組の共形質導入が行われ、その後、レシピエント細胞が６−ＴＧで選択される。他の実施形態では、ヌクレアーゼ誘導ＤＳＢ後のＮＨＥＪによるＨＰＲＴのノックアウトを経た６−ＴＧに耐性を示す細胞を、異なる（非ＨＰＲＴ）部位でのヌクレアーゼ媒介切断によって、例えば、第２のヌクレアーゼ組による切断、続いてＮＨＥＪによって修飾することもできる。このプロトコルによってノックアウトされ得る遺伝子の例には、ＨＩＶコレセプターＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４が挙げられる。
【００２３】
他の実施形態では、標的遺伝子内のゲノム配列は、例えば、本明細書に記載のＺＦＮもしくはＴＡＬＥＮ（またはそれらのＺＦＮもしくはＴＡＬＥＮをコードするベクター）を用いて切断され、ＺＦＮもしくはＴＡＬＥＮでの標的切断後に「ドナー」配列が遺伝子に挿入される。ドナー配列は、別個のベクター（例えば、Ａｄ、ＡＡＶ、もしくはＬＶベクター）に存在するＺＦＮもしくはＴＡＬＥＮベクターに存在し得るか、またはあるいは、別個および／もしくは異なる核酸送達機構を用いて細胞に導入され得る。ＨＰＲＴ遺伝子座へのドナーヌクレオチド配列の挿入は、ＨＰＲＴ遺伝子制御要素の制御下で導入遺伝子の発現をもたらし得る。いくつかの態様において、目的とする導入遺伝子の挿入は、無傷の外因性タンパク質配列の発現をもたらし、任意のＨＰＲＴコードアミノ酸を欠く。他の態様では、発現された外因性タンパク質は、融合タンパク質であり、導入遺伝子およびＨＰＲＴ遺伝子によってコードされるアミノ酸を含む。いくつかの例において、ＨＰＲＴ配列が外因性タンパク質のアミノ（Ｎ）末端部分に存在する一方で、他の例において、ＨＰＲＴ配列は、外因性タンパク質のカルボキシ（Ｃ）末端部分に存在する。他の例では、ＨＰＲＴ配列は、外因性タンパク質のＮ末端部分およびＣ末端部分の両方に存在する。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＨＰＲＴプロモーターの制御下においてインビボで導入遺伝子を発現するために使用され得る方法および組成物を記載する。いくつかの態様において、導入遺伝子は、目的とする治療用タンパク質をコードし得る。導入遺伝子は、本発明の方法がタンパク質置換のために使用され得るようにタンパク質をコードし得る。いくつかの態様において、導入遺伝子は、導入遺伝子によってコードされるタンパク質を産生して血液に輸送するためにＢ細胞に挿入される。他の非限定的な例には、異常グロビン遺伝子を有する患者における野生型または抗鎌状グロビン配列の導入によるＣＤ３４＋幹／前駆細胞における異常血色素症の治療が挙げられる。いくつかの態様において、導入遺伝子は、治療用タンパク質、治療用ホルモン、血漿タンパク質、抗体等をコードする。別の非限定的な例には、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の挿入またはエクスビボでのＴ細胞への１つ以上のＴ細胞受容体遺伝子（複数可）の挿入（それを必要とする患者に再注入するため）が挙げられる（Ｊｅｎａ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｂｌｏｏｄ  １１６：１０３５−１０４４を参照のこと）。さらなる態様において、本発明の方法および組成物は、細胞中の遺伝子をノックアウトするために用いられる。非限定的な例には、エクスビボでのＴ細胞中のＣＣＲ５等のウイルス受容体のノックアウト（それを必要とする患者に再注入するため）が挙げられる。Ｂｃｌ１１Ａ遺伝子もしくはＥＫＬＦ遺伝子のノックアウトまたはＢｃｌ１１Ａ遺伝子中のＥＫＬＦ結合部位のノックアウトによる異常血色素症の治療（これらはすべて胎児（γ）グロビン合成の再活性化をもたらす）は、他の非限定的な例である。他の実施形態は、ＨＬＡ遺伝子のノックアウトまたは遺伝子の遺伝子修正またはスプライスアクセプター部位の挿入を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ切断部位は、ＮＨＥＪでのＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ誘導ＤＳＢの修復が６−ＴＧに対する感受性を示し続ける細胞を産生するように、ＨＰＲＴ遺伝子のイントロン内に存在する。いくつかの実施形態において、ＨＰＲＴに組み込まれたＤＮＡは、ＨＰＲＴの正常なスプライシングを妨害するスプライスアクセプター配列を含み、ＨＰＲＴスプライシングの妨害は、遺伝子を不活性化して６−ＴＧ耐性細胞を作成する。いくつかの実施形態において、組み込まれたＤＮＡは、捕捉されたスプライス形態を用いてＨＰＲＴとの融合タンパク質を産生する導入遺伝子を含有する。他の実施形態では、組み込まれたＤＮＡは、ＨＰＲＴスプライシングが妨害され、かつ導入遺伝子が発現されるように、プロモーターおよび導入遺伝子を含む。
【００２６】
他の実施形態では、ヌクレアーゼ切断によるＨＰＲＴ遺伝子の破壊（例えば、ＮＨＥＪ中のヌクレオチド挿入または欠失による遺伝子ノックアウト）は、肯定的な形質導入および活性ヌクレアーゼ活性のマーカーとしての役割を果たし、導入遺伝子挿入は、ゲノム内の別の位置（例えば、セーフハーバー）で生じ得る。このようなヌクレアーゼ修飾細胞を富化する方法および組成物を用いて、ＨＰＲＴ以外の遺伝子座での修飾、例えば、ＨＰＲＴ遺伝子座での導入遺伝子の不活性化および／または組み込みを富化することができる。導入遺伝子は、インビボまたはインビトロで目的とする別の内因性または外因性プロモーターの制御下にあり得る。いくつかの態様において、導入遺伝子は、目的とするタンパク質、例えば、治療用タンパク質または置換タンパク質（例えば、ホルモン、血漿タンパク質、抗体等）をコードし得る。タンパク質治療物または置換物をコードする導入遺伝子の非限定的な例には、野生型グロビンタンパク質をコードする配列（例えば、異常グロビン遺伝子を有する患者における異常血色素症の治療のためのＣＤ３４＋幹細胞において）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／またはＴ細胞受容体遺伝子（複数可）（例えば、それを必要とする患者への再注入のためのＴ細胞におけるエクスビボ挿入）、凝固因子（例えば、凝固障害を有する対象の治療のため、例えば、造血細胞もしくはＣＤ３４＋造血幹細胞、肝細胞、または肝幹細胞のエクスビボまたはインビボでの標的挿入のため）、および／または１つ以上の抗ＨＩＶタンパク質、ならびに修正または疾患の予防（例えば、リソソーム蓄積症の治療）のための異常遺伝子の野生型コピーの挿入が挙げられる。
【００２７】
さらなる態様において、本発明の方法および組成物は、細胞中の遺伝子のノックアウトを監視するために用いられる。非限定的な例には、エクスビボでのＴ細胞中のＣＣＲ５等のウイルス受容体のヌクレアーゼ媒介ノックアウトの監視（それを必要とする患者に再注入するため）が挙げられる。他の実施形態は、遺伝子の遺伝子修正またはスプライスアクセプター部位の挿入を含む。これらの実施形態において、本明細書に記載のＨＰＲＴノックアウト後のインビボまたはインビトロでの細胞の６−ＴＧへの曝露は、ＨＰＲＴ以外の遺伝子座でのヌクレアーゼ媒介標的修飾の形質導入（例えば、不活性化または挿入）がヌクレアーゼ活性のため成功した細胞を選択する。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、トランスジェニック動物系の開発においてインビボで用いられ得る。いくつかの態様において、トランスジェニック動物は、導入遺伝子がヒト遺伝子をコードするモデル開発において用いられ得る。いくつかの例において、トランスジェニック動物は、対応する内因性遺伝子座でノックアウトされ得、ヒトタンパク質が単離について研究され得るインビボ系の開発を可能にする。そのようなトランスジェニックモデルは、目的とするヒトタンパク質と相互作用し得るか、またはそれを修飾し得る小分子、大きい生体分子、または他の実体を特定するスクリーニング目的のために用いられ得る。他の態様において、トランスジェニック動物は、産生目的、例えば、目的とする抗体または他の生体分子の産生のために用いられ得る。ある実施形態において、動物は、小型の哺乳動物、例えば、ラビット、齧歯類、例えば、ラット、マウス、もしくはテンジクネズミである。他の実施形態では、動物は、非ヒト霊長類である。なおさらなる実施形態において、動物は、ウシ、ヤギ、またはブタ等の家畜動物である。いくつかの態様において、導入遺伝子は、本明細書に記載の方法のいずれかによって胚幹細胞または動物胚中のＨＰＲＴ遺伝子座に組み込まれ、その後、この胚は、生きた動物が生まれるように移植される。その後、この動物を性的に成熟するまで育て、子孫を生ませ、子孫のうちの少なくともいくつかは、組み込まれた導入遺伝子を含む。
【００２９】
なおさらなる態様において、染色体のＨＰＲＴ遺伝子座への核酸配列の部位特異的組み込みの方法が本明細書に提供される。ある実施形態において、この方法は、（ａ）胚に、（ｉ）組み込まれる核酸配列に隣接する上流配列および下流配列を含む少なくとも１つのＤＮＡベクター、ならびに（ｉｉ）ＨＰＲＴ遺伝子座における組み込み部位を認識するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子を注入することと、（ｂ）胚を培養してジンクフィンガーおよび／またはＴＡＬＥヌクレアーゼの発現を可能にすることとを含み、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮによって組み込み部位に導入される二本鎖切断は、核酸配列を染色体に組み込むように、ＤＮＡベクターとの相同的組換えによって修復される。
【００３０】
好適な胚は、哺乳類を含むいくつかの異なる脊椎動物種、鳥類、爬虫類、両生類、および魚種から得られ得る。一般的に言えば、好適な胚は、収集、注入、および培養されてジンクフィンガーまたはＴＡＬＥヌクレアーゼの発現を可能にし得る胚である。いくつかの実施形態において、好適な胚には、小型の哺乳動物（例えば、齧歯動物、ウサギ等）、ペット動物、家畜、および霊長類由来の胚が含まれ得る。齧歯動物の非限定的な例として、マウス、ラット、ハムスター、アレチネズミ、およびテンジクネズミが挙げられ得る。ペット動物の非限定的な例として、ネコ、イヌ、ウサギ、ハリネズミ、およびフェレットが挙げられ得る。家畜の非限定的な例として、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラマ、アルパカ、およびウシが挙げられ得る。霊長類の非限定的な例として、オマキザル、チンパンジー、キツネザル、マカク、マーモセット、タマリン、クモザル、リスザル、および尾長ザルが挙げられ得る。他の実施形態では、好適な胚には、魚、爬虫類、両生類、または鳥類由来の胚が含まれ得る。あるいは、好適な胚は、昆虫胚、例えば、ショウジョウバエ胚または蚊胚であり得る。
【００３１】
本明細書に記載の方法または組成物のいずれかにおいて、操作されたＨＰＲＴ遺伝子座または他のゲノム編集を有する細胞は、幹細胞または前駆細胞であり得る。本発明の方法および組成物とともに使用され得る特定の幹細胞型には、胚幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）が含まれる。ｉＰＳＣは、患者試料および正常対照に由来し得、患者由来のｉＰＳＣは、目的とする遺伝子で正常もしくは野生型遺伝子配列に変異し得るか、または正常細胞は、目的とする遺伝子で既知の疾患対立遺伝子に改変され得る。同様に、造血幹細胞は、患者またはドナーから単離され得る。その後、これらの細胞は、目的とする導入遺伝子または遺伝子修飾を発現するように操作され、増殖され、その後、患者に再導入される。
【００３２】
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（複数可）またはＴＡＬＥＮ（複数可）をコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組み合わせを含み得る。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、プラスミドを含む。他の実施形態では、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。
【００３３】
少なくとも１つのＤＮＡベクターを含む胚も提供され、このＤＮＡベクターは、組み込まれる核酸配列に隣接する上流配列および下流配列ならびに染色体組み込み部位を認識するジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む。本明細書に記載の胚のいずれかに由来する生物も提供される。
【００３４】
別の態様において、本発明の方法および組成物は、異常血色素症、リソソーム蓄積症、筋骨格疾患、凝固障害、癌、ＨＩＶ等の治療に用いる薬物ライブラリおよび／または他の治療用組成物（すなわち、抗体、構造ＲＮＡ等）のスクリーニングにおける細胞、細胞株、および動物（例えば、トランスジェニック動物）の使用を提供する。そのようなスクリーニングは、操作された細胞株または初代細胞を用いて細胞レベルで開始することができ、全動物（例えば、ヒト）の治療のレベルまで進み得る。
【００３５】
本発明のＺＦＰまたはＴＡＬＥＮを含むキットも提供される。このキットは、ＺＦＰもしくはＴＡＬＥＮをコードする核酸（例えば、好適な発現ベクターに含まれるＲＮＡ分子またはＺＦＰもしくはＴＡＬＥＮをコードする遺伝子）、ドナー分子、好適な宿主細胞株、本発明の方法を実行するための説明書等を含み得る。
【００３６】
これらおよび他の態様は、本開示を全体として考慮することにより、当業者に容易に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】パネルＡおよびＢ、ＮＨＥＪ事象を受けた一組のジンクフィンガーヌクレアーゼ対による目的とする位置での切断を測定するＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイ（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）の結果を示すゲルを示す。ＮＨＥＪは、ヌクレオチド塩基の挿入または欠失（「挿入欠失」）を引き起こし、これは、その後、ＤＮＡ鎖が野生型ＤＮＡ鎖とアニーリングされるときにミスマッチをもたらす。その後、Ｃｅｌ−Ｉ酵素は、このミスマッチ部位でＤＮＡを切断し、２つの小さい断片を作成する。図は、Ｋ５６２細胞（図１Ａ）またはマウスＮｅｕｒｏ２Ａ細胞（図１Ｂ）へのＨＰＲＴジンクフィンガーヌクレアーゼ対のトランスフェクション後の結果を示す。パーセントミスマッチ、または「％ＮＨＥＪ」は修飾された対立遺伝子の割合に相当し、各対のヌクレアーゼ活性の程度であり、各レーンの下に示される。ＧＦＰは、ＧＦＰコードプラスミドでトランスフェクトした対照細胞である。
【図２】ＨＰＲＴ特異的ＺＦＮでトランスフェクトし、その後、６−ＴＧで処理した細胞における挿入欠失のパーセントを測定するゲルを示す。Ｋ５６２細胞もＣＣＲ５またはグルココルチコイド受容体遺伝子座（ＧＲ）のいずれかに特異的なＺＦＮ対でトランスフェクトした。Ｃｅｌ−Ｉ実験（上述）を、６−ＴＧで増殖させた１０〜１４日後にＨＰＲＴ遺伝子座における細胞上で行った。ＨＰＲＴ耐性細胞は、ＨＰＲＴ遺伝子座を標的としたＺＦＮで処理した試料でのみ観察された。レーンの上部に１〜１３で番号付けし、以下を示す：レーン１〜３は、６−ＴＧの不在下（レーン２）または６−ＴＧの存在下（レーン３）でのＺＦＮ投与（レーン１）の３日後の８０ｎｇのＨＰＲＴ特異的ＺＦＮおよび４００ｎｇのＣＣＲ５特異的ＺＦＮ（例えば、米国特許第７，９５１，９２５号を参照のこと）を用いたＣｅｌ−Ｉ結果を示す。レーン４〜６は、６−ＴＧの不在下（レーン５）または６−ＴＧの存在下（レーン６）でのＺＦＮ投与（レーン４）の３日後の２０ｎｇのＨＰＲＴ特異的ＺＦＮおよび８０ｎｇのＣＣＲ５特異的ＺＦＮ（例えば、米国特許第７，９５１，９２５号）を用いたＣｅｌ−Ｉ結果を示す。レーン７〜９は、６−ＴＧの不在下（レーン８）または６−ＴＧの存在下（レーン９）でのＺＦＮ投与（レーン７）の３日後の８０ｎｇのＨＰＲＴ特異的ＺＦＮおよび４００ｎｇのＧＲ特異的ＺＦＮ（例えば、米国特許公開第２００８０１８８０００号）を用いたＣｅｌ−Ｉ結果を示す。レーン１０〜１３は、６−ＴＧの不在下（レーン１１）または６−ＴＧの存在下（レーン１２）またはＧＦＰの存在下（レーン１３）でのＺＦＮ投与（レーン１０）の３日後の２０ｎｇのＨＰＲＴ特異的ＺＦＮおよび８０ｎｇのＧＲ特異的ＺＦＮ（例えば、米国特許公開第２００８０１８８０００号）を用いたＣｅｌ−Ｉ結果を示す。
【図３】ＨＰＲＴ特異的ＺＦＮ、ならびにＣＣＲ５遺伝子座を標的とするＺＦＮの別の対でトランスフェクトしたＫ５６２細胞における挿入欠失のパーセントを測定するゲルを示す。その後、これらの細胞を６−ＴＧ上で選択した。選択後、ＤＮＡを細胞から単離し、Ｃｅｌ−ＩアッセイをＣＣＲ５遺伝子座で行った。見ることができるように、６−ＴＧ上でのトランスフェクト細胞の選択は、ＣＣＲ５で切断された細胞を富化する。レーンは以下の通りである：試料番号レーン（１、２等）は、トランスフェクションの３日後に回収したＤＮＡ上で行ったＣｅｌ−Ｉアッセイの結果を示す。ボックスで囲まれたゲルの上の数字または（−）は、トランスフェクション反応において使用したＤＮＡのｎｇを示す。「＊＊」が操作した偏性ヘテロ二量体性ＥＬＤ／ＫＫＲ  ＦｏｋＩドメインを有するヌクレアーゼ対の使用を示す一方で、「＊」は、ヌクレアーゼ対がＤＤ／ＲＲ  ＦｏｋＩ偏性ヘテロ二量体ドメインを含むことを示す。米国特許公開第２０１１０２０１０５５号を参照されたい。試料区分において、（−）または（＋）は、それぞれ、６−ＴＧの不在下または６−ＴＧの存在下で増殖した細胞から単離したＤＮＡを示す。観察された修飾パーセントは、各レーンの下に示される。
【図４】ＨＰＲＴ遺伝子座に導入した制限部位での切断パーセントを測定するゲルを示す。Ｋ５６２細胞を、ＨＰＲＴ特異的ＺＦＮを含むベクターでトランスフェクトした。新規の制限部位、および挿入部位に隣接するＨＰＲＴ遺伝子座と相同のより短い（３５９ヌクレオチド長）またはより長い（７２５ヌクレオチド長）領域（「アーム」）のいずれかを含むドナー分子も含んだ。すべてのドナーをプラスミドに基づくアプローチを用いて導入したがある一連の実験において、ドナープラスミドは、エンハンサー要素（「短いアーム＋ｅｎ」）をさらに担持した。すべての条件は、制限部位を担持するドナーのＨＰＲＴ遺伝子座への導入に成功し、６−ＴＧ選択を用いたときに最大３倍および対立遺伝子の４０％を超えるレベルまで富化した。
【図５】パネルＡおよびＢ、Ｋ５６２細胞におけるＨＰＲＴ遺伝子座へのＧＦＰ導入遺伝子の組み込みを示す。図５Ａは、導入遺伝子が、ＰＣＲに基づく半定量的アッセイにおいて測定したときに６−ＴＧ選択によって２〜３倍富化したドナーの相同組換えによって組み込まれたことを示す。図５Ｂは、アッセイにおける増幅のために用いた３個のＰＣＲプライマーの位置を示す図解を示し、組み込みがより大きいＰＣＲ産物のｐｇｋｒ１＋１５５１２ｆプライマー対からの産生を引き起こす（５Ａにおいて矢印で示される）一方で、ＨＰＲＴ  ｒ１−１６０７８＋１５５１２ｆプライマー対が修飾されていない遺伝子座からより短いバンドを生成することを示す。一般的な順方向プライマー１５５１２ｆの使用ならびに野生型特異的バンドおよび組み込み特異的バンドの両方の生成は、ＰＣＲ反応が標的組み込みの効率の半定量的評価として用いられることを可能にした。
【図６】ＨｈａＩ制限部位を含むドナーのβ−グロビン遺伝子座への標的組み込み後の制限酵素消化の結果を示すゲルである。この実験において、ドナーを、ＨＰＲＴに特異的なＺＦＮ、ＺＦＮに特異的なβ−グロビン、およびβ−グロビン特異的ドナーの共トランスフェクション後にＫ５６２細胞におけるβ−グロビン遺伝子座に挿入した。トランスフェクションから回復した後、細胞を分け、１つの群を６−ＴＧ選択した。ＤＮＡを細胞から単離し、β−グロビン遺伝子座をＰＣＲ増幅し、その後、ＨｈａＩ制限消化に供した。βグロビン遺伝子座での遺伝子挿入（矢印で示される）の成功に関連したＨｈａ  Ｉ特異的断片の頻度の劇的な増加が６−ＴＧ選択後に観察された。
【図７】動員ヒトＣＤ３４＋幹細胞におけるＨＰＲＴ遺伝子座の修飾を示すゲルである。ＨＰＲＴ特異的ＺＦＮ発現プラスミドをＣＤ３４＋細胞にトランスフェクトし、ヌクレオフェクションからの回復後、これらを分け、６−ＴＧ選択した。ＨＰＲＴ遺伝子座の修飾を上述のＣｅｌ−Ｉアッセイを用いて分析し、挿入欠失のパーセントが各レーンの下に示される。６−ＴＧ選択は、この細胞プールにおけるＨＰＲＴ修飾ゲノムの割合を増加させた。
【図８】パネルＡおよびＢ、ＨＰＲＴ特異的ＴＡＬＥＮを用いたＫ５６２細胞におけるＨＰＲＴ遺伝子座の修飾を示す。図８Ａは、ヌクレアーゼ処理細胞由来のＨＰＲＴ遺伝子座をＰＣＲ増幅し、その後、Ｃｅｌ−Ｉアッセイに供したＣｅｌ−Ｉアッセイの結果を示す。これらの組の上の三角形は、トランスフェクションで用いたＴＡＬＥＮ発現プラスミドの増加量を示す。図８Ｂは、Ｃｅｌ−Ｉアッセイで決定したゲノム修飾の量（％挿入欠失）を示す。
【図９】ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮヌクレアーゼによって切断された標的領域に対応するイヌおよびヒトＨＰＲＴ遺伝子座におけるＤＮＡ配列のアライメントである。イヌ（ｃａｎｉｎｅ）（「イヌ（ｄｏｇ）」）ＤＮＡ配列は各配列対の上に示され（この図において示される、配列番号６１、６３、６５、および６７）、ヒトＤＮＡ配列は各配列対の下に示される（この図において示される、配列番号６２、６４、６６および、６８）。灰色で強調表示された配列内の文字列は、これら２つのＤＮＡ配列間で相同ではないヌクレオチドを示す。一列に並べたＤＮＡ配列下の黒色の囲みはＴＡＬＥＮ結合部位を示し、灰色の縁取り囲みはＺＦＮ結合部位を示す。矢印は、ヌクレアーゼがどのＤＮＡ鎖に結合するかを示し、左から右への矢印は、５’から３’またはワトソン鎖上の結合部位を示し、右から左への矢印は、３’から５’またはクリック鎖上の結合部位を示す。
【図１０】様々なヒトＨＰＲＴ特異的ヌクレアーゼ対でトランスフェクトしたイヌ細胞株Ｄ１７から単離したＤＮＡ上でのＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイの結果を示すゲルを示す（各レーンは以下の表６で特定される）。検出された修飾のパーセント（「％ＮＨＥＪ」）は、各レーンの下に示される。
【図１１】様々なヒトＨＰＲＴ特異的ヌクレアーゼ対でトランスフェクトしたアカゲザル細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２から単離したＤＮＡ上でのＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイの結果を示すゲルを示す。検出された修飾のパーセント（「％ＮＨＥＪ」）は、各レーンの下に示される。
【図１２】は、６個のヒトＨＰＲＴ特異的ヌクレアーゼ対と個別にトランスフェクトしたヒトＣＤ３４＋細胞から単離したＤＮＡ上でのＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイの結果を示す一連のゲルを示し、これらはそれぞれイントロンで切断される。「部位」とは、各ＺＦＮ対が切断する標的部位を指す。加えて、さらなるＺＦＮ対（「Ａ’」）をＫ５６２細胞において試験した。検出された修飾のパーセント（「％ＮＨＥＪ」）は、各レーンの下に示される。
【図１３】パネルＡ〜Ｆ、図１２における切断された６個の遺伝子座それぞれへのオリゴドナーのＣＤ３４＋細胞における標的組み込みを示すゲルを示す。検出された標的修飾のパーセントは、各レーンの下に示される。
【図１４】パネルＡ〜Ｃ、ヒトＫ５６２細胞におけるＨＰＲＴ遺伝子座へのＳＡ−２Ａ−ＧＦＰ−ｐＡ導入遺伝子の組み込みを示す。図１４Ａは、組み込まれた導入遺伝子の概略図を示し、スプライシング時に配列がどこで欠失されるかを図解する。図１４Ｂは、６−ＴＧ選択を用いて（右側の棒線）、６−ＴＧ選択を用いずに（左側の棒線）試験した条件のそれぞれにおけるＧＦＰ導入遺伝子を含む細胞のパーセントを示す。図１４Ｃは、これらの条件のそれぞれにおける細胞の生存を示すグラフである（左側の棒線は、６−ＴＧ選択を用いなかったものを示し、右側の棒線は、６−ＴＧ選択を用いたものを示す）。
【図１５】パネルＡおよびＢ、６−ＴＧ選択を用いなかったヒトＫ５６２細胞におけるＨＰＲＴへのＳＡ−２Ａ−ＧＦＰ−ｐＡカセットの標的組み込みのＰＣＲ検出を示す。図１５Ａは、組み込まれた導入遺伝子の概略図であり、増幅に用いたＰＣＲプライマーの位置を含む。図１５Ｂは、ＰＣＲ産物を示すゲルを示し、選択の不在下における標的挿入（ＧＦＰ  ＴＩ）によるＧＦＰ導入遺伝子の標的組み込みを示す。
【図１６】ヒトＣＤ３４＋細胞におけるＨＰＲＴイントロン遺伝子座へのＳＡ−２Ａ−ＧＦＰ−ｐＡ導入遺伝子の組み込みを示すグラフである。一番左の棒線は、ＧＦＰ陽性細胞の割合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
細胞内の特定の位置への導入遺伝子の挿入を増加させるか、または標的遺伝子座の遺伝子編集または修飾の頻度を増加させるための方法および組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、ゲノム編集は、ＨＰＲＴ遺伝子座（例えば、ＨＰＴＲ１）での外因性導入遺伝子の挿入を含み、導入遺伝子挿入の選択は、細胞または動物の６−ＴＧへの曝露によって生じる。他の実施形態では、ヌクレアーゼ切断（例えば、ＮＨＥＪ中のヌクレオチド挿入または欠失による遺伝子ノックアウト後の切断）によるＨＰＲＴ遺伝子の破壊は、１つ以上の他の（非ＨＰＲＴ）遺伝子座での活性ヌクレアーゼ活性、例えば、導入遺伝子挿入のマーカーとしての役割を果たす。他の実施形態では、ＨＰＲＴを標的とするヌクレアーゼ対および目的とする別個の遺伝子座を標的とする別個のヌクレアーゼ対の導入は、ＮＨＥＪ媒介二本鎖切断修復による両方の位置での遺伝子ノックアウトをもたらす。
【００３９】
したがって、本発明の方法および組成物は、ＨＰＲＴノックアウト（遺伝子ノックアウトまたはＨＰＲＴへの導入遺伝子の標的挿入のいずれか）、その後、いずれの場合にも６−ＴＧ選択を用いて、所望の設定においてゲノム編集の効率を増加させるために使用され得る。例えば、本明細書に記載の組成物および方法を用いて、治療的に有益なタンパク質（例えば、グロビンまたは他の凝固等の血液障害に関与するタンパク質等のタンパク質、抗ＨＩＶタンパク質、ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体遺伝子、および単性タンパク質を含む様々な他のタンパク質）をコードし、かつ／または発現する導入遺伝子を挿入することができる。あるいは、これらの方法を用いて、治療的利益または他の利益のために別の遺伝子をノックアウトすることができる（例えば、抑制遺伝子由来の遺伝子産物がその産物が必要とされる遺伝子を抑制する場合に、抑制因子のノックアウトは有益である）。
【００４０】
本明細書に記載の組成物および方法のいずれかは、任意の宿主細胞における遺伝子ノックアウトおよび／または導入遺伝子挿入ために使用され得る。ある実施形態において、細胞は、患者由来の細胞、例えば、患者由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、または他の種類の幹細胞もしくは前駆細胞（非限定的な組として、胚細胞、造血細胞、神経細胞、もしくは間葉細胞）である。これらの改変された幹細胞は、例えば、その後骨髄移植に用いられ得る造血細胞または前駆幹細胞である。あるいは、遺伝子ノックアウトおよび／または導入遺伝子組み込みは、エクスビボでＴ細胞等の患者由来の細胞において達成され得、その後、修飾細胞は患者に再導入され得る。修飾に望ましい遺伝子座の非限定的な例には、ＣＤ４、ＣＣＲ５、またはＣＸＣＲ４等のウイルス受容体が挙げられる。
【００４１】
概要
方法の実践、ならびに本明細書に開示の組成物の調製および使用は、別途示されない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、および当分野の技術の範囲内の関連分野における従来の技法を用いる。これらの技法は、文献内で十分に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９  ａｎｄ  Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｕｐｄａｔｅｓ、ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９８、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９９、およびＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。
【００４２】
定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、同義に使用され、線状または環状構造であり、かつ一本鎖または二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であると解釈されるべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基部分、糖部分、および／またはリン酸部分において修飾されるヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）を包含することができる。概して、特定のヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対合特異性を有し、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合する。
【００４３】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために同義に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００４４】
「結合」とは、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的かつ非共有結合的な相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用のすべての構成要素が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格におけるリン酸残基と接触する）必要はない。そのような相互作用は、概して、１０−６Ｍ−１以下の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」は、結合の強度を指し、結合親和性の増加は、Ｋｄの低下と相関性がある。
【００４５】
「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合し得る。タンパク質結合タンパク質の場合、それは、それ自身に結合することができ（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成するために）、かつ／または、異なるタンパク質（単数または複数）の１つ以上の分子に結合し得る。結合タンパク質は、２つ異常の種類の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、およびタンパク質結合活性を有する。
【００４６】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、亜鉛イオンの配位によってその構造が安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的な様式でＤＮＡに結合するタンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。
【００４７】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥのその同族の標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には、３３〜３５アミノ酸長であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列に少なくともある程度の配列相同性を示す。米国特許公開第２０１１０３０１０７３号も参照されたい。
【００４８】
ジンクフィンガー結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガータンパク質の認識へリックス領域を操作する（１つ以上のアミノ酸を改変する）ことによって、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」され得る。同様に、ＴＡＬＥも、例えば、ＤＮＡ結合に関与するアミノ酸（「反復可変二残基」または「ＲＶＤ」領域）を操作することによって、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」され得る。したがって、操作されたジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥタンパク質は、非天然タンパク質である。ジンクフィンガータンパク質およびＴＡＬＥを操作するための方法の非限定的な例には、設計および選択がある。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が主に合理的基準によってもたらされる非天然タンパク質である。設計のための合理的基準は、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰまたはＴＡＬＥ設計および結合データの情報を格納するデータベース内の情報を処理するためのコンピュータ化アルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、および同第６，５３４，２６１号を参照されたく、国際公開第ＷＯ９８／５３０５８号、同第ＷＯ９８／５３０５９号、同第ＷＯ９８／５３０６０号、同第ＷＯ０２／０１６５３６号、および同第ＷＯ０３／０１６４９６号、ならびに米国出願第１３／０６８，７３５号も参照されたい。
【００４９】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その生成が主にファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択等の実験プロセスからもたらされる天然には見られないタンパク質である。例えば、米国第５，７８９，５３８号、米国第５，９２５，５２３号、米国第６，００７，９８８号、米国第６，０１３，４５３号、米国第６，２００，７５９号、国際公開第ＷＯ９５／１９４３１号、同第ＷＯ９６／０６１６６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ９８／５４３１１号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／６０９７０号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、同第ＷＯ０２／０９９０８４号、および米国特許出願第１３／０６８，７３５号を参照されたい。
【００５０】
「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間における遺伝子情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、相同性指向性の修復機構を介して細胞における二本鎖切断の修復中に生じるような交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝子情報の伝達をもたらすため、「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として広く知られている。任意の特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、そのような伝達は、切断された標的とドナーとの間に生じるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／または標的の一部になる遺伝子情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存鎖アニーリング」、および／または関連プロセスを含み得る。そのような特殊なＨＲは、多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべてが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、標的分子の配列の改変をもたらす。
【００５１】
本開示の方法において、本明細書に記載の１つ以上の標的化されたヌクレアーゼは、所定の部位で標的配列（例えば、細胞クロマチン）に二本鎖切断を作成し、この切断領域内のヌクレオチド配列と相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドが細胞に導入され得る。二本鎖切断の存在は、ドナー配列の組み込みを促進することが示されている。ドナー配列は、物理的に組み込まれ得るか、またはあるいは、ドナーポリヌクレオチドは、相同組換えによる切断の修復用の鋳型として使用され、その結果、ドナーにおいて見られるようなヌクレオチド配列のすべてまたは一部を細胞クロマチンに導入する。したがって、細胞クロマチン内の第１の配列を改変することができ、ある実施形態において、ドナーポリヌクレオチドに存在する配列に変換することができる。したがって、「置換する」または「置換」という用語の使用が、あるヌクレオチド配列の別のヌクレオチド配列による置換（すなわち、情報の意味において、配列の置換）を表し、かつあるポリヌクレオチドの別のポリヌクレオチドによる物理的または化学的置換は必ずしも必要としないことが理解され得る。
【００５２】
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、ジンクフィンガーおよび／またはさらなるＴＡＬＥＮタンパク質のさらなる対が、細胞内のさらなる標的部位のさらなる二本鎖切断のために使用され得る。
【００５３】
細胞クロマチンにおける目的とする領域内の配列の標的組換えおよび／または置換および／または改変のための方法のある実施形態において、染色体配列は、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列との相同組換えによって改変される。切断領域に対する配列相同性が存在する場合、そのような相同組換えは、細胞クロマチンにおける二本鎖切断の存在によって促進される。
【００５４】
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、第１のヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は、目的とする領域のゲノム配列と相同であるが同一ではない配列を含み得、それによって相同組換えを促進して目的とする領域内の非同一配列を挿入する。したがって、ある実施形態において、目的とする領域内の配列と相同であるドナー配列の一部は、置換されるゲノム配列に約８０〜９９％（またはそれらの間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態では、例えば、１００を超える連続した塩基対のドナー配列とゲノム配列との間で１つのヌクレオチドのみが異なる場合、ドナー配列とゲノム配列との間の相同性は９９％よりも高い。ある場合において、新しい配列が目的とする領域に導入されるように、ドナー配列の非相同部分は、目的とする領域に存在しない配列を含み得る。これらの例において、非相同配列は、概して、５０〜１，０００個の塩基対（もしくはそれらの間の任意の整数値）または目的とする領域内の配列と相同もしくは同一である１，０００を超える任意の数の塩基対の配列に隣接している。他の実施形態において、ドナー配列は、第１の配列と非相同であり、非相同組換え機構によってゲノムに挿入される。
【００５５】
本明細書に記載の方法のいずれかは、配列の欠失および／または目的とする遺伝子（複数可）の発現を妨害するドナー配列の標的組み込みによる細胞における１つ以上の標的配列の部分的または完全な不活性化のために使用され得る。部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞株も提供される。
【００５６】
さらに、本明細書に記載の標的組み込みの方法を用いて、１つ以上の外因性配列（「ドナー」または「導入遺伝子」とも称される）を組み込むこともできる。外因性核酸配列は、例えば、１つ以上の遺伝子またはｃＤＮＡ分子、または任意の種類のコードもしくは非コード配列、ならびに１つ以上の制御要素（例えば、プロモーター）を含み得る。加えて、外因性核酸配列は、１つ以上のＲＮＡ分子（例えば、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等）を産生し得る。
【００５７】
「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合の骨格の切断を指す。切断は、リン酸ジエステル結合の酵素加水分解または化学的加水分解を含むが、これらに限定されない様々な方法によって開始され得る。一本鎖切断も二本鎖切断もいずれも可能であり、二本鎖切断は、２つのはっきりと異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成をもたらし得る。ある実施形態において、融合ポリペプチドは、標的化二本鎖ＤＮＡ切断に用いられる。
【００５８】
「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なる）とともに、切断活性（好ましくは、二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。「第１および第２の切断ハーフドメイン」、「＋および−切断ハーフドメイン」、ならびに「右および左切断ハーフドメイン」という用語は、二量体化する切断ハーフドメインの対を指すために同義に使用される。
【００５９】
「操作された切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の操作された切断ハーフドメイン）を有する偏性ヘテロ二量体を形成するように修飾された切断ハーフドメインである。参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００５００６４４７４号、同第２００７０２１８５２８号、同第２００８０１３１９６２号、および同第２０１１０２０１０５５号も参照されたい。
【００６０】
「配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、線状、環状、または分岐状であってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。「導入遺伝子」および「ドナー配列」という用語は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指すドナー配列は、任意の長さであってもよく、例えば、２〜１０，０００ヌクレオチド長（またはそれらの間もしくはそれらを超える任意の整数値）、好ましくは、約１００〜１，０００ヌクレオチド長（またはそれらの間の任意の整数）、より好ましくは、約２００〜５００ヌクレオチド長であってもよい。
【００６１】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大半は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４をそれぞれ２つ含む八量体と会合した約１５０個の塩基対のＤＮＡを含み、（生物に応じて可変長の）リンカーＤＮＡは、ヌクレオソームコアの間に延在する。ヒストンＨ１の分子は、概して、リンカーＤＮＡと会合している。本開示の目的のために、「クロマチン」という用語は、すべての種類の細胞核タンパク質（原核および真核の両方）を包含するよう意図される。細胞クロマチンは、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方を含む。
【００６２】
「染色体」は、細胞のゲノムのすべてまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、その核型を特徴とし、これは、この細胞のゲノムを含むすべての染色体の集合である。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を含み得る。
【００６３】
「エピソーム」は、複製核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例として、プラスミドおよびあるウイルスゲノムが挙げられる。
【００６４】
「標的部位」または「標的配列」は、結合分子が結合する核酸の一部を定義する核酸配列であるが、但し、結合に十分な条件が存在することを条件とする。
【００６５】
「外因性」分子は、通常は細胞に存在しないが、１つ以上の遺伝学的方法、生化学的方法、または他の方法によって細胞内に導入され得る分子である。「通常は細胞に存在する」かは、細胞の特定の発達段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は、成人筋肉細胞に対して外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に対して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全型内因性分子の機能バージョン、または正常機能型内因性分子の機能不全バージョンを含み得る。
【００６６】
外因性分子は、とりわけ、小分子（組み合わせ化学プロセスによって生成される小分子等）、または高分子（タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上述の分子の任意の修飾誘導体）、または上述の分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体であり得る。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖であってもよく、線状、分岐状、または環状であってもよく、任意の長さであってもよい。核酸には、二重鎖を形成することができる核酸、ならびに三重鎖形成核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構成因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、およびヘリカーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
外因性分子は、内因性分子と同一の種類の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であってもよい。例えば、外因性核酸は、感染ウイルスゲノム、細胞に導入されるプラスミドもしくはエピソーム、または通常は細胞に存在しない染色体を含み得る。外因性分子を細胞に導入するための方法は、当業者に既知であり、脂質媒介導入（すなわち、中性脂質および陽イオン性脂質を含むリポソーム）、電気穿孔、直接注入、細胞融合、粒子衝突、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介導入、およびウイルスベクター媒介導入を含むが、これらに限定されない。外因性分子は、内因性分子と同一の種類の分子でもあり得るが、細胞が由来するものとは異なる種に由来し得る。例えば、ヒト核酸配列は、本来はマウスまたはハムスターに由来する細胞株に導入され得る。
【００６８】
対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下で特定の発達段階にある特定の細胞に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、クロロプラスト、もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。さらなる内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含み得る。
【００６９】
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が好ましくは共有結合的に連結した分子である。サブユニット分子は、同一の化学型の分子であり得るか、または異なる化学型の分子であり得る。第１の型の融合分子の例として、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと１つ以上の切断ドメインまたは他の活性化ドメインとの間の融合物）および融合核酸（例えば、上述の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。第２の型の融合分子の例として、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合物、および副溝結合剤と核酸との間の融合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
細胞における融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達から、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達によって生じ得、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断、およびポリペプチド連結も、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを細胞に送達するための方法は、本開示の他の個所に示される。
【００７１】
本開示の目的のために、「遺伝子」は、遺伝子産物（以下を参照のこと）をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域（そのような調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているか否かに関わらず）を含む。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列（リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位等）、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位、および遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもこれらに限定されない。
【００７２】
「遺伝子発現」とは、遺伝子内に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、もしくは任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集等のプロセスによって修飾されたＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチン化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含む。
【００７３】
遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節は、遺伝子活性化および遺伝子抑制を含み得るが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、切断、改変、不活性化、ランダム変異）を用いて発現を調節することができる。遺伝子の不活性化とは、本明細書に記載のＺＦＰまたはＴＡＬＥＮを含まない細胞と比較して遺伝子発現における任意の低下を指す。したがって、遺伝子の不活性化は、部分的または完全であり得る。
【００７４】
「目的とする領域」は、細胞クロマチンの任意の領域であり、例えば、遺伝子、または遺伝子内もしくは遺伝子に隣接する非コード配列等であり、そこで外因性分子に結合することが望ましい。結合は、標的ＤＮＡ切断および／または標的組換えの目的のためであり得る。目的とする領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官のゲノム（例えば、ミトコンドリア、クロロプラスト）、または感染ウイルスゲノムに存在し得る。目的とする領域は、遺伝子のコード領域内、転写された非コード領域（例えば、リーダー配列、トレーラー配列、もしくはイントロン等）内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内に存在し得る。目的とする領域は、単一のヌクレオチド対と同程度に小さいか、または最大２，０００ヌクレオチド対長であるか、またはヌクレオチド対の任意の整数値であり得る。
【００７５】
「真核」細胞には、真菌細胞（酵母等）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
「分泌組織」とは、個々の細胞からの産物を典型的には上皮に由来するいくつかの種類の管腔に分泌する動物における組織である。消化管に限局される分泌組織の例として、腸管、膵臓、および胆嚢を裏打ちする細胞が挙げられる。他の分泌組織には、肝臓、目および粘膜に関連する組織、例えば、唾液腺、乳腺、前立腺、下垂体、および他の内分泌系のメンバーが含まれる。さらに、分泌組織は、分泌することができる組織型の個々の細胞と考えられ得る。
【００７７】
「作動可能な連結」および「作動可能に連結した」（または「作動的に連結した」）という用語は、２つ以上の構成要素（配列要素等）の並列に関して同義に使用され、これらの構成要素は、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素のうちの少なくとも１つが他の構成要素のうちの少なくとも１つに与えられる機能を媒介し得る可能性を許容するように配置される。一例として、プロモーター等の転写調節配列は、その転写調節配列が１つ以上の転写調節因子の存在または不在に応答してコード配列の転写レベルを制御する場合にコード配列に作動可能に連結される。転写調節配列は、概して、コード配列とシスに作動可能に連結されるが、それに直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、たとえそれらが隣接していなくても、コード配列に作動可能に連結される転写調節配列である。
【００７８】
融合ポリペプチドに関して、「作動可能に連結した」という用語は、構成要素の各々が、そのように連結されていない場合に実行したであろう機能と同一の機能を他の構成要素との連結において実行するという事実を指し得る。例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが機能ドメイン（例えば、切断ドメイン、活性化ドメイン、抑制ドメイン等）に融合される融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができる場合、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインが作動可能に連結している一方で、活性化ドメインは、遺伝子発現を上方制御することができる。ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合される融合ポリペプチドである場合、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができる場合、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインが作動可能に連結している一方で、切断ドメインは、標的部位の近傍でＤＮＡを切断することができる。
【００７９】
タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能的断片」は、その配列が、完全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一ではないが、完全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一の機能を保持するタンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能的断片は、対応する天然の分子よりも多いか、少ないか、もしくは同一の数の残基を有することができ、かつ／または１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有することができる。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当技術分野において周知である。同様に、タンパク質の機能を決定するための方法も周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によって評価することができる。上述のＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または相補性（遺伝子的相補性もしくは生化学的相補性の両方）によって決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６、米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８／４４３５０号を参照されたい。
【００８０】
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子導入ベクター」は、目的とする遺伝子の発現を指向することができ、かつ遺伝子配列を標的細胞に導入し得る任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニング、および発現ベヒクル、ならびに組み込みベクターを包含する。
【００８１】
「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」とは、日常的なアッセイにおいて必ずしも測定されないが、好ましくは容易に測定されるタンパク質産物を産生する任意の配列を指す。好適なレポーター遺伝子には、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、有色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、および強化された細胞増殖および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素）が含まれるが、これらに限定されない。エピトープ標識は、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡ、または任意の検出可能なアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む。「発現標識」は、目的とする遺伝子の発現を監視するために所望の遺伝子配列に作動的に連結され得るレポーターをコードする配列を含む。
【００８２】
ヌクレアーゼ
組成物、具体的には、導入遺伝子の挿入のための遺伝子の標的化に有用なヌクレアーゼ、例えば、ＨＰＲＴに特異的なヌクレアーゼが本明細書に記載される。ある実施形態において、ヌクレアーゼは、天然に存在する。他の実施形態では、ヌクレアーゼは天然には存在せず、すなわち、ＤＮＡ結合ドメインおよび／または切断ドメインにおいて操作される。例えば、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位（例えば、同族の結合部位とは異なる部位に結合するように操作されたメガヌクレアーゼ）に結合するように改変され得る。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、異種のＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼ、異種の切断ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含む。

【００８３】
Ａ．ＤＮＡ結合ドメイン
特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）である。天然に存在するメガヌクレアーゼは、１５〜４０個の塩基対切断部位を認識し、一般に、４つのファミリー、すなわち、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓｔボックスファミリー、およびＨＮＨファミリーに分類される。例示のホーミングエンドヌクレアーゼには、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩが含まれる。これらの認識配列は既知である。米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８、Ｄｕｊｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８、Ｐｅｒｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，１１２５〜１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８、Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３〜１８０、Ａｒｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３、およびｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。
【００８４】
ある実施形態において、ヌクレアーゼは、操作された（天然には存在しない）ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）を含む。Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩ等のホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼ認識配列が既知である。米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８、Ｄｕｊｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８、Ｐｅｒｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，１１２５−１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８、Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０、Ａｒｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３、およびｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位に結合するように操作され得る。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５、Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２、Ａｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：６５６−６５９、Ｐａｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４９−６６、米国特許公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、全体としてのヌクレアーゼという文脈において改変され得るか（すなわち、ヌクレアーゼが同族の切断ドメインを含むように）、または異種の切断ドメインに融合され得る。
【００８５】
他の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するか、または操作された（天然には存在しない）ＴＡＬＥエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１１０３０７３号を参照されたい。キサントモナス属の植物病原性細菌は、重要な作物に多くの病害を引き起こすことで知られている。キサントモナスの病原性は、２５個を超える異なるエフェクタータンパク質を植物細胞に注入する保存ＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されるタンパク質の中には、植物の転写活性化因子を模倣し、かつ植物のトランスクリプトームを操る転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）がある（Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４８−６５１を参照のこと）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む。最もよく特徴付けられたＴＡＬＥのうちの１つに、キサントモナス・カンペストリス病原型ベシカトリア由来のＡｖｒＢｓ３がある（Ｂｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２１８：１２７−１３６および国際公開第ＷＯ２０１００７９４３０号を参照のこと）。ＴＡＬＥは、タンデム反復の集中ドメインを含み、それぞれの反復は、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性の鍵となる約３４個のアミノ酸を含有する。加えて、これらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含む（概説については、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １６３（３）：２５６−２７２を参照のこと）。加えて、植物病原性細菌である青枯病菌において、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と指定される２つの遺伝子は、青枯病菌の次亜種１系統ＧＭＩ１０００および次亜種４系統ＲＳ１０００において、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが見出されている（Ｈｅｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ａｐｐｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒ  Ｍｉｃｒｏ  ７３（１３）：４３７９−４３８４を参照のこと）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列において互いに９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおいて１，５７５ｂｐの欠失分だけ異なる。しかしながら、両方の遺伝子産物は、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。
【００８６】
したがって、いくつかの実施形態において、ＨＰＲＴ遺伝子における標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインは、植物病原菌キサントモナス（Ｂｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０９−１５１２およびＭｏｓｃｏｕ  ａｎｄ  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０１を参照のこと）ならびにラルストニア（Ｈｅｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７３（１３）：４３７９−４３８４、米国特許公開第２０１１０３０１０７３号および同第２０１１０１４５９４０号を参照のこと）に由来するものと同様のＴＡＬＥエフェクターの操作されたドメインである。
【００８７】
ある実施形態において、ＨＰＲＴ遺伝子における標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択した標的部位に結合するように操作されるという点で非天然である。例えば、例えば、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１、Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０、Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０、Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７、Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０３０，２１５号、同第６，７９４，１３６号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，０７０，９３４号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２５３，２７３号、および米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００５／０２６７０６１号を参照されたく、これらすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００８８】
操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して新規の結合特異性を有し得る。操作方法には、合理的設計および種々の種類の選択が含まれるが、これらに限定されない。合理的設計には、例えば、三重項（または四重項）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用が含まれ、各三重項または四重項ヌクレオチド配列は、特定の三重項または四重項配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と会合している。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、共同所有の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。
【００８９】
ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む例示の選択方法は、米国特許５，７８９，５３８号、同第９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８、ならびに国際公開第ＷＯ９８／３７１８６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、同第および英国特許第２，３３８，２３７号に開示されている。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共同所有の国際公開第０２／０７７２２７号に記載されている。
【００９０】
加えて、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ＤＮＡドメイン（例えば、マルチフィンガージンクフィンガータンパク質）は、例えば、５アミノ酸長以上のリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を用いてともに連結され得る。例示の６アミノ酸長以上のリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載のジンクフィンガータンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共同所有の国際公開第ＷＯ０２／０７７２２７号に記載されている。
【００９１】
標的部位の選択、ＤＮＡ結合ドメイン、および融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）を設計および構築するための方法は、当業者に知られており、米国特許第６，１４０，０８１５号、同第７８９，５３８号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、国際公開第ＷＯ９５／１９４３１号、同第ＷＯ９６／０６１６６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ９８／５４３１１号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／６０９７０号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、同第ＷＯ０２／０９９０８４号、同第ＷＯ９８／５３０５８号、同第ＷＯ９８／５３０５９号、同第ＷＯ９８／５３０６０号、同第ＷＯ０２／０１６５３６号、および同第ＷＯ０３／０１６４９６に詳述されている。
【００９２】
加えて、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、例えば、５アミノ酸長以上のリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を用いてともに連結され得る。例示の６アミノ酸長以上のリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。
【００９３】
Ｂ．切断ドメイン
任意の好適な切断ドメインをＤＮＡ結合ドメインに作動可能に連結して、ヌクレアーゼを形成することができる。例えば、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインをヌクレアーゼドメインに融合させてＺＦＮを作成しており、これは、その操作された（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメインを介してその目的とする核酸標的を認識し、かつヌクレアーゼ活性を介してＺＦＰ結合部位付近でのＤＮＡの切断を引き起こすことができる機能的実体である。例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３（３）：１１５６−１１６０を参照されたい。ＴＡＬＥタンパク質は、ヌクレアーゼドメインに融合されて、部位特異的ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）も作成し得る。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、様々な生物におけるゲノム修飾のために使用されている。例えば、米国特許公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００６００６３２３１号、同第２０11０301073号、および国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号を参照されたい。
【００９４】
上述のように、切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼの切断ドメイン、またはＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼの切断ドメインに対して異種であり得る。異種切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得られ得る。切断ドメインが由来し得る例示のエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。例えば、２００２−２００３  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ、およびＢｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼがあり、Ｌｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照のこと）。これらの酵素（またはその機能的断片）のうちの１つ以上を切断ドメインおよび切断ハーフドメインの源として用いることができる。
【００９５】
同様に、上述のように、切断活性のために二量体化を必要とする切断ハーフドメインは、任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。概して、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が切断に必要とされる。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質が用いられ得る。２つの切断ハーフドメインは同一のエンドヌクレアーゼ（もしくはその機能的断片）に由来し得るか、または各切断ハーフドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（もしくはその機能的断片）に由来し得る。加えて、２つの融合タンパク質のそれらの各標的部位への結合が、互いに空間的定位でこれらの切断ハーフドメインを配置して、例えば二量体化によって切断ハーフドメインが機能的切断ドメインを形成することを可能にするように、２つの融合タンパク質の標的部位は、好ましくは、互いに対して配置される。したがって、ある実施形態において、標的部位の近端は、５〜８個のヌクレオチドまたは１５〜１８個のヌクレオチド分だけ離れている。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対は、２つの標的部位の間に介在してもよい（例えば、２〜５０個以上のヌクレオチド対）。概して、切断部位は、標的部位の間に位置する。
【００９６】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに配列特異的に結合し（認識部位で）、かつ結合部位でまたはその付近でＤＮＡを切断することができる。ある制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上でその認識部位から９ヌクレオチド離れた位置で、他方の鎖上でその認識部位から１３ヌクレオチド離れた位置でＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、および同第５，４８７，９９４、ならびにＬｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２７５−４２７９、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２７６４−２７６８、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８８３−８８７、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照されたい。したがって、一実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）および１つ以上のジンクフィンガー結合ドメイン（操作され得るか否かに関わらず）を含む。
【００９７】
その切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示のＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１０，５７０−１０，５７５。したがって、本開示の目的のために、開示される融合タンパク質において使用されるＦｏｋＩ酵素の一部は、切断ハーフドメインと見なされる。したがって、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を用いた細胞配列の標的二本鎖切断および／または標的置換のために、それぞれＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質を用いて、触媒的に活性な切断ドメインを再構築することができる。あるいは、ＤＮＡ結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む単一のポリペプチド分子を用いることもできる。
【００９８】
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持するか、または多量体化（例えば、二量体化）して機能的切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であり得る。
【００９９】
例示のＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号に記載されている。さらなる制限酵素も分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを含み、これらは、本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照されたい。
【０１００】
ある実施形態において、切断ドメインは、例えば、すべての開示が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、および同第２００８０１３１９６２号に記載されるように、ホモ二量体化を最小限に抑えるか、または阻止する１つ以上の操作された切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン変異体とも称される）を含む。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８位のアミノ酸残基は、すべてＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に影響を与える標的である。参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００５００６４４７４号、同第２００７０２１８５２８号、同第２００８０１３１９６２号、および同第２０１１０２０１０５５号も参照されたい。
【０１０１】
偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示の操作された切断ハーフドメインには、第１の切断ハーフドメインがＦｏｋＩの４９０位および５３８位のアミノ酸残基に変異を含み、かつ第２の切断ハーフドメインが４８６位および４９９位のアミノ酸残基に変異を含む対が含まれる。
【０１０２】
したがって、一実施形態において、４９０位における変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し、５３８位における変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し、４８６位における変異は、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）に置換し、４９９位における変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換する。具体的には、本明細書に記載の操作された切断ハーフドメインを１つの切断ハーフドメインにおいて４９０位での変異（Ｅ→Ｋ）および５３８位での変異（Ｉ→Ｋ）によって調製して「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と指定される操作された切断ハーフドメインを生成し、別の切断ハーフドメインにおいて４８６位での変異（Ｑ→Ｅ）および４９９での変異（Ｉ→Ｌ）によって調製して「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と指定される操作された切断ハーフドメインを生成した。本明細書に記載の操作された切断ハーフドメインは、異常な切断が最小限に抑えられるか、または無効にされる偏性ヘテロ二量体変異体である。例えば、米国特許公開第２００８／０１３１９６２号を参照されたく、この開示は、参照によりその全体がすべての目的のために組み込まれる。
【０１０３】
ある実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、４８６、４９９、および４９６位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付けられた）での変異、例えば、野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基を４８６位でＧｌｕ（Ｅ）残基に、野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基を４９９位でＬｅｕ（Ｌ）残基に、かつ野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基を４９６位でＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基（それぞれ、「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも称される）に置換する変異を含む。他の実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、４９０、５３８、および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付けられた）での変異、例えば、野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基を４９０位でＬｙｓ（Ｋ）残基に、野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基を５３８位でＬｙｓ（Ｋ）残基に、かつ野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基を５３７位でＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基（それぞれ、「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも称される）に置換する変異を含む。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、４９０および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対する番号付け）での変異、例えば、野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基を４９０位でＬｙｓ（Ｋ）残基に、かつ野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基を５３７位でＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基（それぞれ、「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも称される）に置換する変異を含む（米国出願第１２／９３１，６６０号を参照のこと）。なおさらなる実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、ヌクレアーゼ対が１つのＨ５３７Ｒ−Ｒ４８７Ｄ−Ｎ４９６Ｄ（「ＲＤＤ」）ＦｏｋＩハーフドメインおよび１つのＮ４９６Ｄ−Ｄ４８３Ｒ−Ｈ５３７Ｒ（「ＤＲＲ」）ＦｏｋＩハーフドメインで作成されるように変異を含む。例えば、米国特許公開第２０１１０２０１０５５号を参照されたい。
【０１０４】
本明細書に記載の操作された切断ハーフドメインは任意の好適な方法を用いて、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号および同第２００８０１３１９６２号に記載の野生型切断ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的変異誘発によって調製され得る。
【０１０５】
あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素」技術を用いて、核酸標的部位においてインビボで組み立てられ得る（例えば、米国特許公開２００９００６８１６４号を参照のこと）。そのようなスプリット酵素の構成要素は、別個の発現構築物のいずれかで発現され得るか、または個々の構成要素が例えば自己切断２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって分離される１つのオープンリーディングフレームにおいて連結され得る。構成要素は、個々のジンクフィンガー結合ドメインであり得るか、またはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。
【０１０６】
ヌクレアーゼは、例えば、国際公開第ＷＯ２００９／０４２１６３号および同第２００９００６８１６４号に記載の酵母菌ベースの染色体系において、使用前に活性化についてスクリーニングすることができる。ヌクレアーゼ発現構築物は、当技術分野で既知の方法を用いて容易に設計することができる。例えば、米国特許公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００６００６３２３１号、および国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号を参照されたい。ヌクレアーゼの発現は、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化（脱抑制）され、かつグルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にあり得る。
【０１０７】
標的部位
上で詳述されるように、ＤＮＡドメインは、遺伝子座、例えば、ＨＰＲＴ遺伝子における任意の選択した配列に結合するように操作され得る。操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するＤＮＡ結合ドメインと比較して新規の結合特異性を有し得る。操作方法には、合理的設計および種々の種類の選択が含まれるが、これらに限定されない。合理的設計は、例えば、三重項（または四重項）ヌクレオチド配列および個々の（例えば、ジンクフィンガー）アミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、各三重項または四重項ヌクレオチド配列は、特定の三重項または四重項配列に結合するＤＮＡ結合ドメインの１つ以上のアミノ酸配列と会合している。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、共同所有の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。ＴＡＬエフェクタードメインの合理的設計も実行され得る。例えば、米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。
【０１０８】
ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む例示の選択方法は、米国特許５，７８９，５３８号、同第９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８、ならびに国際公開第ＷＯ９８／３７１８６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、同第および英国特許第２，３３８，２３７号に開示される。
【０１０９】
標的部位の選択、ヌクレアーゼ、および融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）を設計および構築するための方法は、当業者に知られており、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号同第２００６０１８８９８７号，および同第20110301073に詳述されている。
【０１１０】
加えて、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、マルチフィンガージンクフィンガータンパク質）は、例えば、５アミノ酸以上のリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を用いてともに連結され得る。例えば、例示の６アミノ酸長以上のリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のＤＮＡ結合ドメイン間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。米国仮特許公開第２０１１０２８７５１２号も参照されたい。
【０１１１】
ドナー
上述のように、例えば、変異体遺伝子の修正または野生型遺伝子の発現の増大ための外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」または「導入遺伝子」とも称される）の挿入。ドナー配列は、典型的には、それが配置されるゲノム配列と同一ではないことは容易に明らかになる。ドナー配列は、目的とする位置で効率的なＨＤＲを可能にするために、２つの相同性領域に隣接した非相同配列を含み得る。さらに、ドナー配列は、細胞染色体内の目的とする領域と相同ではない配列を含むベクター分子を含み得る。ドナー分子は、細胞染色体に対していくつかの不連続な相同性の領域を含み得る。例えば、通常は目的とする領域に存在しない配列の標的挿入の場合、この配列は、ドナー核酸分子に存在し得、目的とする領域内の配列に対して相同性の領域に隣接し得る。
【０１１２】
ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、線状または環状形態で細胞に導入され得る。例えば、米国特許公開第２０１０００４７８０５号および同第２０１１０２０７２２１号を参照されたい。加えて、ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドであり得る。線状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に既知の方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護され得る。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基は、線状分子の３’末端に付加され、かつ／または自己相補的オリゴヌクレオチドは、一方の末端もしくは両方の末端に連結される。例えば、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：４９５９−４９６３、Ｎｅｈｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：８８６−８８９を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するためのさらなる方法は、末端アミノ基（複数可）の付加、および修飾ヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミド酸、およびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基の使用を含むが、これらに限定されない。米国特許公開第２０１１０２０７２２１号も参照されたい。
【０１１３】
ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーター、および抗生物質耐性をコードする遺伝子等のさらなる配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として、リポソームもしくはポロキサマー等の作用物質と複合された核酸として、またはデンドリマー等の巨大分子ウイルス（Ｗｉｊａｇｋａｎａｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２８（７）ｐ．１５００−１９を参照のこと）として導入され得るか、あるいはウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルパー依存アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、およびインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達され得る。
【０１１４】
ドナーは、その発現が組み込み部位で内因性プロモーターによって、例えば、ＨＰＲＴ遺伝子の発現を駆動するプロモーターによって駆動されるように挿入され得る。しかしながら、ドナーは、プロモーターおよび／あるいはエンハンサー、例えば、構成的プロモーターまたは誘導的もしくは組織特異的プロモーターを含んでもよい。
【０１１５】
さらに、発現に必要とされないが、外因性配列は、転写または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドおよび／またはポリアデニル化シグナルをコードする配列であってもよい。
【０１１６】
送達
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載のタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の好適な手段によってインビボまたはエクスビボで送達され得る。
【０１１７】
本明細書に記載のヌクレアーゼを送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および第７，１６３，８２４号に記載されており、これらのすべての開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１８】
本明細書に記載のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物も、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥＮタンパク質（複数可）のうちの１つ以上をコードする配列を含むベクターを用いて送達され得る。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルパー依存アデノウイルス、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ関連ウイルスベクター等を含むが、これらに限定されない任意のベクターを用いてもよい。米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号も参照されたく、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。さらに、これらのベクターのいずれも治療に必要とされる配列のうちの１つ以上を含み得ることは明らかである。したがって、１つ以上のヌクレアーゼおよびドナー構築物が細胞に導入される場合、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、同一のベクター上または異なるベクター上に担持され得る。複数のベクターが使用される場合、各ベクターは、１つまたは複数のヌクレアーゼおよび／もしくはドナー構築物をコードする配列を含み得る。
【０１１９】
従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入方法を用いて、ヌクレアーゼおよびドナー構築物をコードする核酸を細胞（例えば、哺乳類細胞）および標的組織に導入することができる。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、およびリポソームまたはポロキサマー等の送達ビヒクルと複合された核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含む。遺伝子治療手順の概説について、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３（１９９２）、Ｎａｂｅｌ  ＆  Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：２１１−２１７（１９９３）、Ｍｉｔａｎｉ  ＆  Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６２−１６６（１９９３）、Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６７−１７５（１９９３）、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０（１９９２）、Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）、Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８：３５−３６（１９９５）、Ｋｒｅｍｅｒ  ＆  Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５１（１）：３１−４４（１９９５）、Ｈａｄｄａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｄｏｅｒｆｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂoｈｍ（ｅｄｓ．）（１９９５）、およびＹｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１３−２６（１９９４）を参照されたい。
【０１２０】
核酸の非ウイルス送達の方法は、電気穿孔、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、デンドリマー、脂質核酸複合体のポリカチオン、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、および作用物質によって強化されたＤＮＡの取り込み、またはデンドリマー等の巨大分子の使用を含む（Ｗｉｊａｇｋａｎａｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２８（７）ｐ．１５００−１９を参照のこと）。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ  ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を用いたソノポレーションも、核酸の送達のために使用され得る。
【０１２１】
さらなる例示の核酸送達系は、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃによって提供されるものを含む（例えば、米国第６００８３３６号を参照のこと）。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性脂質および中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第ＷＯ９１／１７４２４号、同第ＷＯ９１／１６０２４号に記載のものを含む。
【０１２２】
免疫脂質複合体を含む脂質核酸複合体の調製は当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４０４−４１０（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）、Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）、Ｒｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７１０−７２２（１９９５）、Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）、米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号を参照のこと）。
【０１２３】
さらなる送達方法は、送達される核酸のＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）へのパッケージングの使用を含む。これらのＥＤＶは、二重特異性抗体を用いて標的組織に特異的に送達され、この抗体の一方のアームは、標的組織に対する特異性を有し、他方のアームは、ＥＤＶに対する特異性を有する。この抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面に運び、その後、ＥＤＶは、エンドサイトーシスによって細胞内に運び込まれる。一旦細胞内に運び込まれると、その内容物は放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７（７）：６４３を参照のこと）。
【０１２４】
操作されたＺＦＰをコードする核酸を送達するためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化し、ウイルス負荷量を核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与され得るか（インビボ）、またはインビトロで細胞を治療するために使用され得、修飾細胞が患者に投与される（エクスビボ）。ＺＦＰを送達するための従来のウイルスベースの系は、遺伝子導入用のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス、および単純ヘルペスウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。宿主ゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ関連ウイルスによる遺伝子送達方法を用いて可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、高い導入効率が多くの異なる細胞型および標的組織において観察されている。
【０１２５】
レトロウイルスの向性を、外来性エンベロープタンパク質を組み込むことによって変化させることができ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡張する。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入するか、または感染させることができ、かつ典型的には高いウイルス力価を生成するレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来配列のパッケージング能力を有する、シス作用性の長い末端反復からなる。最小のシス作用ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、これはその後、治療用遺伝子を標的細胞に組み込んで恒久的な導入遺伝子の発現を提供するために用いられる。一般に用いられているレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびこれらの組み合わせに基づくベクターを含む（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ６６：２７３１−２７３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照のこと）。
【０１２６】
一過性の発現が好ましい用途において、アデノウイルスベースの系を用いることができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において極めて高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いて、高力価かつ高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純なシステムにおいて大量に生成することができる。アデノ関連ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターも、細胞を標的核酸で形質導入するために、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ生成において、かつインビボおよびエクスビボ遺伝子治療手順のために用いられる（例えば、Ｗｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０：３８−４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号、国際公開第ＷＯ９３／２４６４１号、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照のこと）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ＆  Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ  ８１：６４６６−６４７０（１９８４）、およびＳａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）を含むいくつかの出版物に記載されている。
【０１２７】
少なくとも６つのウイルスベクターのアプローチが、臨床試験における遺伝子導入に現在利用可能であり、それらは、形質導入剤を生成するためにヘルパー細胞株に挿入される遺伝子による欠損ベクターの相補性に関与するアプローチを利用する。
【０１２８】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験に使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８５：３０４８−３０５（１９９５）、Ｋｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）、Ｍａｌｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９４：２２  １２１３３−１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験で使用された最初の治療用ベクターである（Ｂｌａｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４７５−４８０（１９９５））。５０％以上の形質導入効率が、ＭＦＧ−Ｓパッケージングベクターにおいて観察されている（Ｅｌｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）、Ｄｒａｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７）。
【０１２９】
組換えアデノ関連ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損性および非病原性パルボウイルスアデノ関連２型ウイルスに基づく有望な代替の遺伝子送達系である。すべてのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノムへの組み込みに起因した効率的な遺伝子導入および安定した導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特徴である（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３５１：９１１７  １７０２−３（１９９８）、Ｋｅａｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７４８−５５（１９９６））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０を含む任意の他のＡＡＶ血清型も本発明に従って使用することができる。
【０１３０】
複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で生成することができ、いくつかの異なる細胞型を容易に感染させる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄＥ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置換するように操作され、その後、複製欠損ベクターは、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において増幅される。Ａｄベクターは、例えば、肝臓、腎臓、および筋肉に見られるもの等の非分裂の分化細胞を含む複数の種類の組織をインビボで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、高い輸送能力を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注入での抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド治療を含む（Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。臨床試験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例として、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ２４：１  ５−１０（１９９６）、Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７  １０８３−１０８９（１９９８）、Ｗｅｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２０５−１８（１９９５）、Ａｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３（１９９７）、Ｔｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３（１９９８）、Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９（１９９８）が挙げられる。
【０１３１】
宿主細胞を感染させることができるウイルス粒子を形成するために、パッケージング細胞が使用される。そのような細胞は、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞を含む。遺伝子治療に用いられるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする生産細胞株によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主への組み込みに必要な最小限のウイルス配列（必要に応じて）を含有し、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置換される。失われたウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療に用いられるＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノムへのパッケージングおよび組み込みに必要なＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含む細胞株内にパッケージングされる。細胞株は、ヘルパーとしてアデノウイルスにも感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。このヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如のため、相当な量でパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性の高い熱処理によって減少させることができる。
【０１３２】
多くの遺伝子治療の用途において、特定の組織型に対して高度の特異性を有する遺伝子治療ベクターが送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外表面上のウイルスのコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることにより、所与の細胞型に対して特異性を有するように修飾され得る。リガンドは、目的とする細胞型上に存在することで知られている受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：９７４７−９７５１（１９９５）は、モロニーマウス白血病ウイルスを、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現するように修飾することができ、その組換えウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現するあるヒト乳癌細胞を感染させることを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、かつウイルスが細胞表面受容体のリガンドを含む融合タンパク質を発現する他のウイルス標的細胞対にまで拡張することができる。例えば、繊維状ファージは、実質的に任意の選択された細胞受容体に対する特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように操作され得る。上記の説明は、主としてウイルスベクターに適用されるが、同一の原理が非ウイルスベクターにも適用され得る。そのようなベクターは、特定の標的細胞による取り込みを好む特定の取り込み配列を含むように操作され得る。
【０１３３】
遺伝子治療ベクターは、以下に記載されるように、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内注入）または局所適用による個々の患者への投与によってインビボで送達することができる。あるいは、ベクターは、細胞、例えば、個々の患者から移植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）または万能ドナーの造血幹細胞／前駆細胞等にエクスビボで送達することもでき、その後、通常はベクターを組み込んだ細胞の選択後に、細胞が患者に再移植される。
【０１３４】
ヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）は、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与され得る。あるいは、送達ビヒクル（例えば、リポソームまたはポロキサマー）と複合された／で製剤化された裸のＤＮＡが投与され得る。投与は、注射、注入、局所適用、および電気穿孔を含むが、これらに限定されない、通常、血液または組織細胞との最終的な接触に分子を導入するために用いられる経路のうちのいずれかによる。そのような核酸を投与する好適な方法は、利用可能であって、かつ当業者に周知であり、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路が用いられてもよいが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりも即時的かつより効果的な反応を提供することができる。
【０１３５】
本明細書に記載のポリヌクレオチドの導入に好適なベクターは、非組み込み型レンチウイルスベクターまたはインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）を含む。例えば、Ｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１１３８２−１１３８８、Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０、Ｆｏｌｌｅｎｚｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５：２１７−２２２、米国特許公開第２００９／０５４９８５号を参照されたい。
【０１３６】
薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物によって、かつ組成物を投与するために使用される特定の方法によっても部分的に決定される。したがって、以下に記載されるように、様々な薬学的組成物の好適な製剤が利用可能である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，１９８９を参照のこと）。
【０１３７】
ヌクレアーゼコード配列およびドナー構築物が同一または異なる系を用いて送達され得ることは明らかである。例えば、ドナーポリヌクレオチドは、プラスミドによって運ばれてもよく、１つ以上のヌクレアーゼは、ＡＡＶベクターによって運ばれてもよい。さらに、同一または異なる経路（筋肉内注射、尾静脈注射、他の静脈内注射、腹腔内投与および／または筋肉内注射）によって異なるベクターが投与されてもよい。ベクターは、同時にまたは任意の連続的順序で送達されてもよい。
【０１３８】
エクスビボ投与用の製剤およびインビボ投与用の製剤は両方ともに、液体中の懸濁液または乳化液を含む。有効成分は、多くの場合、薬学的に許容され、かつ有効成分と相溶性のある賦形剤と混合される。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等、およびそれらの組み合わせを含む。加えて、組成物は、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、または医薬組成物の有効性を増強する他の試薬等の少量の補助物質を含有してもよい。
【０１３９】
適用
本発明の方法および組成物は、細胞におけるゲノム編集を行うことが所望されるといったいかなる場合でも使用され得る。編集は、所望の遺伝子または遺伝子座のノックアウトの形態であり得るか、または治療用導入遺伝子またはｓｈＲＮＡ等の構造核酸をコードする核酸の標的組み込みを含み得る。本発明の方法および組成物を用いて、ＨＰＲＴ遺伝子座への標的組み込みを選択し、かつ／または例えば特異遺伝子もしくはセーフハーバー等の別の遺伝子座におけるヌクレアーゼ媒介修飾（例えば、挿入、欠失、不活性化）を選択することができるか、またはＨＰＲＴのノックアウトは、操作されたヌクレアーゼをコードする発現ベクター（複数可）の導入（形質導入）のマーカーおよび成功を収めるヌクレアーゼ活性のマーカーとして用いられ得る。所望の導入遺伝子は、ＨＰＲＴ遺伝子座に直接導入され得、実践者は、６−ＴＧへのレシピエント細胞の曝露による組み込みを選択し得る。あるいは、ＨＰＲＴを標的とするヌクレアーゼは、ＨＰＲＴの切断およびノックアウトの成功が１つ以上のさらなる標的（非ＨＰＲＴ）遺伝子座での切断に成功した細胞のスクリーニングとして用いられ得るように、別の組の１つ以上の操作されたヌクレアーゼを有する細胞に導入され得る。同様に、標的組み込み用のドナーも１つ以上のヌクレアーゼによって導入され得、ＨＰＲＴのノックアウトは、切断のために富化された細胞プールが特定されるように、ヌクレアーゼ活性に成功した細胞のスクリーンとして使用することができ、代替の（非ＨＰＲＴ）位置（複数可）での切断の可能性を増加させる。特定の遺伝子または遺伝子座のノックアウトは、多くの異なる科学技術に有益である。目的とする１つ以上の遺伝子は、表現型または他の効果の研究のために、細胞または動物モデルにおいてノックアウトされ得る。特定の位置での特定のドナーＤＮＡの導入等の他のゲノム編集アプローチも細胞および動物モデルにおいて用いられ得る。
【０１４０】
特定の遺伝子、例えば、２〜３例を挙げると、ウイルス受容体および共受容体（例えば、ＣＣＲ５）、または調節遺伝子およびそれらの産物（Ｂｃｌ１１Ａ、ＥＫＬＦ）、異常遺伝子（グロビン、血液因子、リソソーム蓄積症に関与する遺伝子）、特異的核酸標的（ＥＫＬＦ結合部位）、自己マーカー（ＨＬＡ遺伝子およびそれらの調節因子）、内因性Ｔ細胞受容体等の受容体のノックアウトを含む修飾細胞は、治療的に使用され得る。ノックアウトは、細胞のエクスビボでの治療を必要とする患者から除去された細胞（例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞）で行われ、その後、注入により戻し再導入され得るか、またはそれらは保持され、万能ドナー株に拡張され得る。幹細胞または前駆細胞、例えば、修飾造血（ＣＤ３４＋）幹細胞は、エクスビボで除去および治療され、それを必要とする患者にも与えられる。患者特異的の修飾ｉＰＳＣも作製され、患者の治療に使用され得る。さらに、ノックアウトは、任意の好適な送達方法を用いた操作されたヌクレアーゼ、例えば、ＡＡＶＳまたはアデノウイルスベクターの導入によってインビボで行われ得る。
【０１４１】
ドナー組み込みは、非常に多くの用途も有する。ノックアウトについて上で言及された使用と同様に、標的組み込みを用いて、目的とする遺伝子（複数可）を所望の位置（複数可）に追加することができる（内因性遺伝子での遺伝子修正およびセーフハーバーへのＤＮＡカセットの追加を含む）。ドナー分子は、治療用タンパク質または構造核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ）等の遺伝子産物をコードし得る。ドナーの使用は、天然タンパク質、操作された抗体、キメラ抗体受容体（ＣＡＲ）、または操作されたＴ細胞受容体等の治療用産物の追加を含み得る。これらの方法および組成物は、癌等の治療に用いられ得る。修正されたグロビン遺伝子を鎌状赤血球貧血等の疾患に罹患する患者に用いることができ、修正された共通γ鎖遺伝子は、重度のＸ連鎖性複合免疫不全を有する患者を治療するために導入され得る。凝固因子をコードする野生型遺伝子を血友病患者に治療的に用いることができる。例えば、野生型もしくは強化された第ＶＩＩＩ因子遺伝子は、血友病Ａを有する患者に導入され得るか、または野生型もしくは強化された第ＩＸ因子遺伝子は、血友病Ｂを有する患者に導入され得る。
【０１４２】
さらに、リソソーム蓄積症に関与する遺伝子を用いることができる。この疾患およびこの疾患に関与する遺伝子の最も一般的な例には、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ欠損症−遺伝子名：ＧＢＡ）、ファブリ病（αガラクトシダーゼ欠損症−ＧＬＡ）、ハンター病（イズロン酸−２−スルファターゼ欠損症−ＩＤＳ）、ハーラー病（α−Ｌイズロニダーゼ欠損症−ＩＤＵＡ）、およびニーマン・ピック病（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１欠損症−ＳＭＰＤ１）がある。あるいは、野生型ＦｏｘＢ３遺伝子は、ＩＰＥＸ（免疫調節異常多腺性内分泌障害腸疾患、Ｘ連鎖性、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ  ａｎｄ  Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｓ（２００７）Ｃｌｉｎ  Ｄｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７：８９０１７を参照のこと）に罹患する患者から単離された患者幹細胞に導入され得る。これらすべての非限定的な例において、ドナーＤＮＡは、ドナー設計に応じてＨＤＲまたはＮＨＥＪ末端捕捉によって細胞ゲノムに導入され得る。これらの処理は、上述のようにエクスビボまたはインビボで行われ得る。
【０１４３】
以下の実施例は、ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬＥＮを含む本開示の例示の実施形態に関する。これは例示目的のためにすぎず、操作されたＤＮＡ結合ドメインおよび異種切断ドメインを有する他のヌクレアーゼ（例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼ）を用いてもよいことが理解される。

【実施例】
【０１４４】
実施例１：ジンクフィンガータンパク質ヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の設計、構成、および一般的な特徴付け
ＨＰＲＴを標的としたジンクフィンガータンパク質を、本質的にＵｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３５（７０４２）：６４６−６５１、Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６（７）：８０８−８１６に記載され、米国特許第６，５３４，２６１号に記載されるように設計し、プラスミド、ＡＡＶ、またはアデノウイルスベクターに組み込んだ。表１は、例示のＨＰＲＴ  ＺＦＰのＤＮＡ結合ドメイン内の認識ヘリックスを示し、表２は、これらのＺＦＰの標的部位を示す（ＤＮＡ標的部位は大文字で示され、非接触ヌクレオチドは小文字で示される）。ＺＦＰ認識ヘリックスに接触する標的部位におけるヌクレオチドは大文字で示され、非接触ヌクレオチドは小文字で示される。
【表１−１】
2014532410.tif 000002
【表１−２】
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【表１−３】
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【表２】
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【０１４５】
実施例２：マウスおよびヒト特異的ＨＰＲＴ  ＺＦＮの活性
マウスまたはヒトＨＰＲＴ遺伝子を標的とするＺＦＮ対、ならびにヒトＨＰＲＴ遺伝子およびマウスＨＰＲＴ遺伝子の両方における保存配列を認識するように設計されたＺＦＮ対を用いて、これらのＺＦＮがＤＳＢを特異的標的部位で誘導する能力を試験した。具体的には、標的部位のＰＣＲ増幅後に、ＤＳＢ頻度の下限推定値を提供するミスマッチ検出酵素Ｃｅｌ−Ｉ（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９，３５３３−３５４１）を用いた挿入および欠失（挿入欠失）の定量化が続く、Ｃｅｌ−Ｉミスマッチアッセイ（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ，（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：８０８−８１６およびＧｕｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ，（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．６４９：２４７−５６）を用いた。Ｐｅｒｅｚ（同書）に記載されるようにＺＦＮ発現ベクターを標準の条件（３７℃）でヒトＫ５６２細胞またはマウスＮｅｕｒｏ２Ａ細胞に導入した後、ＤＮｅａｓｙ（商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡを細胞から単離した。パーセント挿入欠失は、切断後のＮＨＥＪによって変化した対立遺伝子の割合を示す。
【０１４６】
Ｋ５６２細胞試料（図１Ａ）またはＮｅｕｒｏ２Ａ細胞試料（図１Ｂ）から単離したＤＮＡにおけるＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイの結果は、ＺＦＮがそれらの各標的部位で切断することを示す。レーンの正体は示される通りであり、ヌクレオチドが挿入または欠失（「挿入欠失」）されたＰＣＲ産物の割合は、各レーンの下に示される（「％ＮＨＥＪ」）。
【０１４７】
実施例３：ＺＦＮ処理および６−ＴＧ選択後の修飾された細胞の割合
トランスフェクト細胞の６−ＴＧ選択後の標的修飾の頻度を試験するために、細胞を、ＨＰＲＴ特異的ＺＦＮ（ＳＢＳ番号２９２５１およびＳＢＳ番号２９２５０、上の表１を参照のこと）ならびにＣＣＲ５特異的ＺＦＮ（ＳＢＳ番号８１９６ｚおよびＳＢＳ番号８２６６、共同所有特許米国特許第７，９５１，９２５号を参照のこと）の組み合わせでトランスフェクトした。
【０１４８】
ＺＦＮをコードする発現プラスミドをＫ５６２細胞に導入し、トランスフェクションの３日後、細胞を２つのプールに分けた。一方のプールを６μＭの濃度の６−ＴＧで選択し、８〜１１日間の選択後、挿入欠失の存在についてＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイで分析した。結果が図２に示される。６−ＴＧ選択前の細胞の結果と６−ＴＧ選択された細胞の結果の比較は、修飾細胞の劇的な富化を示した。例えば、６−ＴＧ選択前に０〜４．６％の検出可能な修飾率を最初に示した細胞プールは、選択後に７１〜１００％の修飾が測定された。６−ＴＧ選択細胞由来のＰＣＲ産物をクローニングおよび配列決定し、配列分析は、配列決定されたすべてのクローンの修飾を示した（８８個中８８個のクローンが修飾された）。
【０１４９】
実施例４：第２の標的部位での切断の富化のための６−ＴＧ選択の使用
６−ＴＧ選択を用いて、ＨＰＲＴ特異的ヌクレアーゼを導入した別のＺＦＮ対による第２の遺伝子座での修飾を富化することもできるという概念を次に試験した。我々は、第２のＺＦＮ対がＨＰＲＴ  ＺＦＮ対を超えて提供され、かつＨＰＲＴ  ＺＦＮ対の活性が第２のＺＦＮ対の活性よりも弱い場合に、そのような「共選択」が最も効率的であると推測し、それは、その対におけるＨＰＲＴ  ＺＦＮ  ＤＮＡ結合ドメインをより活性の低い偏性ヘテロ二量体性ＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン変異体ＤＤおよびＲＲに結合し、さらに第２の（非ＨＰＲＴ標的）ＺＦＮ対におけるＤＮＡ結合ドメインをＥＬＤ  ＫＫＲ変異体対に結合することによって達成された（共同所有の米国特許公開第２０１１／０２０１０５５号および同第２０１１０１５８９５７号を参照のこと）。この取り決めは、ＤＤ／ＲＲ変異体がより活性の高いヘテロ二量体性ＥＬＤ／ＫＫＲ  ＦｏｋＩ変異体に対してオルソロガスであるというさらなる利点を有し、これは、４つのＺＦＮが細胞に同時に導入されたとしても、活性二量体ＺＦＮ対が２つの所望の組み合わせからのみ形成され得ることを意味する。
【０１５０】
図３は、２９２５１／２９２５０のＨＰＲＴ  ＺＦＮ対およびＣＣＲ５を標的とするＺＦＮ対のＫ５６２細胞への導入時、６−ＴＧ選択がＣＣＲ５修飾細胞の劇的な富化をもたらすことを示し、第２の標的遺伝子座での修飾の富化のための「共選択アプローチ」の有用性を実証する。この実験において、用いたＣＣＲ５特異的ＺＦＮは、上の実施例４に記載の８１９６ｚおよび８２６６であり、ＣＣＲ５遺伝子座での修飾をＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイでアッセイした。図３において、ボックスで囲まれたゲルの上に、トランスフェクション時に用いたＤＮＡのｎｇが示される。２つ（「＊＊」）または１つ（「＊」）のアスタリスクは、それぞれ、ＦｏｋＩ偏性ヘテロ二量体性対ＥＬＤ／ＫＫＲまたはＤＤ／ＲＲが使用されることを示す（共同所有の米国特許公開第２００８０１３１９６２号および同第２０１１０２０１０５５号、ならびに米国特許第７，９１４，７９６号を参照のこと）。実験番号を有するレーンは、トランスフェクションからの回復後に細胞から単離したＤＮＡから観察されたＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイの結果を示し、（−）は、６−ＴＧの不在下で増殖した細胞から単離したＤＮＡのＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイ結果を示す一方で、（＋）は、６−ＴＧ選択下で増殖した細胞から単離したＤＮＡのＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイ結果を示す。レーンの下の数字は、Ｃｅｌ−Ｉミスマッチアッセイで測定されたＮＨＥＪの割合を示す。
【０１５１】
実施例５：標的ドナー挿入の富化のための６−ＴＧ選択の使用
ＨＰＲＴ遺伝子座で導入されたドナーとの相同組換えを経た細胞を富化するために、２９２５１／２９２５０のＨＰＲＴ  ＺＦＮ対およびＨＰＲＴ遺伝子座との相同性を有するドナー分子でトランスフェクトしたＫ５６２細胞における６−ＴＧ選択の使用も試験した。具体的には、ＨＰＲＴ遺伝子座に標的化されたＢａｍＨＩ制限部位を含むドナーを、上述のようにＨＰＲＴ  ＺＦＮを用いて導入した。この実験において、制限部位を有するドナー分子を担持する３つの異なる種類のプラスミドをヌクレアーゼと共導入した：標的ＨＰＲＴ挿入部位との相同性を有する短い領域（アーム）（３５９ヌクレオチド長）を有するドナーＤＮＡ断片８μｇ、ドナープラスミドがエンハンサー要素を含んだこと以外同一のドナー８μｇ、および挿入部位との相同性を有する長いアーム（７２５ヌクレオチド長）を有するドナーＤＮＡ断片８μｇ。トランスフェクタントをあらゆる選択の不在下でトランスフェクション後に回復させ、その後、分割し、６−ＴＧの存在下（＋）または不在下（−）のいずれかで増殖させた。選択が完了した日（８〜１１日目）にＤＮＡを単離し、挿入部位を包囲する領域をＰＣＲで増幅させた。その後、ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ制限酵素消化に供した。
【０１５２】
図４に示されるように、ドナー組み込みは、６−ＴＧ選択を用いたときに最大３倍および対立遺伝子の４０％を超えるレベルまで富化した。レーンの下の数字は、酵素によって切断されたＰＣＲ産物のパーセント（「％切断」）を示す。ＤＮＡの最大４３％がＨＰＲＴ遺伝子座でドナーＤＮＡを含み、トランスフェクタントが６−ＴＧ選択されたときに制限酵素で切断することによって測定された。
【０１５３】
次に、ＨＰＲＴ遺伝子座へのＧＦＰ導入遺伝子の組み込みを同様の実験スキームを用いてＫ５６２細胞において達成した。この実験において、２つのドナー濃縮物を使用し、ドナーは、ＨＰＲＴ挿入部位に隣接する相同性を有する短い（３５９ヌクレオチド長）または長い（７２５ヌクレオチド長）の領域のいずれかを有した。
【０１５４】
導入遺伝子の組み込みの割合を以下のように半定量ＰＣＲアッセイを用いて決定した。導入遺伝子の標的組み込みに特異的な産物（プライマー１５５１２ｆ＋ｐｇｋｒ１）または挿入を欠く野生型ＨＰＲＴ遺伝子座に特異的な産物（プライマー１５５１２ｆ＋ｒ１−１６０７８）のいずれかを増幅した３つのプライマー（図５Ｂ）を使用し、これら２つのＰＣＲ産物の比率を決定した。使用したプライマーの配列は以下のものである：
１５５１２ｆ：５’ＡＧＣＣＡＣＴＧＧＣＣＣＡＧＴＴＴＣＴＡＣＡＧＴＣＴＣ  ３’（配列番号５８）
ｐｇｋｒ１：５’ＧＡＣＧＴＧＣＧＧＣＴＴＣＣＧＴＴＴＧＴＣ  ３’（配列番号５９）
ｒ１−１６０７８：５’ＧＣＣＴＣＣＣＡＴＣＴＣＣＴＴＣＡＴＣＡＣＡＴ  ３’（配列番号６０）
【０１５５】
図５に示され、かつ上述の制限部位の挿入と同様に、ＧＦＰ導入遺伝子ドナーの組み込みも、半定量ＰＣＲベースのアッセイにおいて測定されたように、６−ＴＧ選択によって２〜３倍富化された。導入遺伝子組み込みを示すＰＣＲ産物は、図５Ａにおいて矢印で示される。最大２６％のＨＰＲＴ遺伝子座への導入遺伝子の挿入が検出され、６−ＴＧ選択時に標的組み込みを２〜３倍富化した。
【０１５６】
実施例５：ヒトβグロビンの遺伝子修正のための６−ＴＧ選択の使用
次に、我々は、β−グロビン標的ＺＦＮ、ＨＰＲＴ  ＺＦＮでの共トランスフェクションおよび６−ＴＧ選択後に、標的組み込みドナーを用いてヒトβ−グロビン遺伝子座の修飾を試験した。この実験において、細胞をＨＰＲＴ  ＺＦＮおよび以下の表３に示されるβグロビン特異的ＺＦＮでトランスフェクトした。
【表３】
2014532410.tif 000006
【０１５７】
ドナーは、ＨｈａＩ制限部位を導入した鎌状変異に隣接するβ−グロビン遺伝子と約１．１ｋｂの相同性を有した。２つの濃度（低濃度（１反応当たりそれぞれ２０ｎｇのＺＦＮ）および高濃度（それぞれ８０ｎｇのＺＦＮ））の２９２５１／２９２５０のＨＰＲＴ特異的ＺＦＮを用いた。トランスフェクションからの回復後、細胞を分割し、半分を６−ＴＧ選択に供した。選択完了時、ＤＮＡを単離し、βグロビン周辺の標的領域をＰＣＲ増幅した。この実験のために、以下のプライマーを使用した：
βグロビンＦ：ＣＣＡＧＡＡＧＧＴＴＴＴＡＡＴＣＣＡＡＡＴＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＴＡＴＧ（配列番号５６）
βグロビンＲ：ＡＡＣＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＣＴＴＣＣＡＣＡＣＴＧＡＴＧＣ（配列番号５７）
【０１５８】
ＰＣＲ産物は、ＨｈａＩ制限部位を含み、標的βグロビン遺伝子座の増幅後、ＨｈａＩ制限酵素でのＰＣＲ産物の切断は、ドナー組み込みが生じた場合に２つの断片を産生する。
図６に示されるように、６−ＴＧ選択細胞におけるβグロビン遺伝子座での遺伝子修正頻度の劇的な増加が観察され、ＨｈａＩでの切断が生じたことを示し、６−ＴＧ選択が６７％の遺伝子修正を含む細胞プールをもたらすことができることを実証した。
【０１５９】
実施例６：ヒトＣＤ３４細胞におけるＨＰＲＴの修飾
ＨＰＲＴ  ＺＦＮ発現プラスミドを末梢血動員造血幹細胞（男性ドナー由来のＣＤ３４＋細胞、すなわち、これらの細胞は１細胞当たり１コピーのＨＰＲＴ遺伝子のみを有した）にトランスフェクトした。手短に、２００，０００個の細胞を、Ｐｅｒｅｚ（同書）に記載されるようにＡｍａｘａヌクレオフェクションを用いてトランスフェクトした。この実験において、２つの組のＨＰＲＴ特異的ＺＦＮを用い、２つの濃度の２９２５１／２９２５０対または３０１７９／２９２５０対のいずれかであり、１回のヌクレオフェクション当たりそれぞれ２００（＋）ｎｇまたは４００（＋＋）ｎｇのいずれかのＺＦＮ発現プラスミドであった。トランスフェクションからの回復後、細胞をプールに分け、６−ＴＧの存在下または不在下で増殖させた。選択が完了した後、ＨＰＲＴ遺伝子座での修飾を実施例３に記載されるようにＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイで分析した。
【０１６０】
図７に示されるように、６−ＴＧ選択の存在下で、増幅ＤＮＡの最大８４％がＨＰＲＴ遺伝子座での修飾を示した。様々な試料におけるＨＰＲＴ遺伝子座の修飾の頻度が各レーンの下に列記される。「Ｃ」は、ＧＦＰをコードするプラスミドでの対照ヌクレオフェクションを示す。
【０１６１】
実施例７：ＴＡＬＥＮを用いたＨＰＲＴの修飾
ＨＰＲＴ特異的ＴＡＬＥＮもＫ５６２細胞において試験した。これらの実験のために、１０個の異なるＴＡＬＥＮを、ＦｏｋＩドメインを＋６３Ｃ末端ＴＡＬＥ変異形（米国特許出願第１３／０６８，７３５号を参照のこと）に結合して構築した。各位置に用いた標的ヌクレオチドおよびＲＶＤが以下の表４に示される。表中、Ｒ０および半反復の標的ヌクレオチドが各標的配列の脇に示されており、各反復単位における各ＲＶＤの正体（各組の２列目）が各標的ヌクレオチドの正体（各組の１列目）の下に示される（配列番号６９〜７８）。構築されたＴＡＬＥＮは１１〜１６個の完全反復に及び、したがって、表４において、１６個未満の反復を有するＴＡＬＥＮは、必然的に１５、１４、１３、または１２位で（該当せず）を有する。
【表４−１】
2014532410.tif 000007
【表４−２】
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【０１６２】
ＴＡＬＥＮ対をＫ５６２細胞に導入し、導入の３日後または１１日後、ＤＮＡを細胞から単離し、ＨＰＲＴ遺伝子座を包囲する領域をＰＣＲ増幅し、その後、上述のＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイに供した。
【０１６３】
図８および表５に示されるように、ＴＡＬＥＮは、ＨＰＲＴ遺伝子座を修飾した。図８Ａは、１１日目の試料におけるＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイのゲルを示し、図８Ｂは、１１日目のＨＰＲＴ遺伝子座での修飾の割合を示す。図８Ａのレーン上の三角形は、各グループにおけるＴＡＬＥＮ発現ベクターの増加する濃度を示す（以下の表５を参照のこと）。レーンの正体が以下の表５に示されており、「ＤＮＡ濃度」は、各条件で用いた発現プラスミドの量を示し、３日目と１１日目の両方の修飾または「％ＮＨＥＪ」の結果が示される。
【表５】
2014532410.tif 000009
【０１６４】
したがって、ＨＰＲＴ特異的ＴＡＬＥＮは、ＨＰＲＴ遺伝子座を効率的に切断することができる。
【０１６５】
実施例８：イヌＨＰＲＴの切断
次に、ＨＰＲＴ１特異的ヌクレアーゼ対をイヌ細胞においてインビトロで試験した。これらの実験において、リードヒトＨＰＲＴ１  ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮヌクレアーゼ対を使用し、ヌクレアーゼ標的部位を包囲するヒト配列およびイヌ（ｃａｎｉｎｅ）（イヌ（ｄｏｇ））配列のアライメントが図９に示される。ヒト配列およびイヌ配列のアライメントを調べることで、標的部位での類似性が明らかになる。したがって、様々な量の対応するヌクレアーゼ発現ベクターのヌクレオフェクションによって、ヌクレアーゼ対をイヌ細胞株Ｄ１７にトランスフェクトした。試験した対およびヌクレオフェクションで用いたＤＮＡの量が以下の表６に示されており、レーンは図１０と一致する。
【表６】
2014532410.tif 000010
【０１６６】
イヌＨＰＲＴ遺伝子座に特異的なＰＣＲプライマー対を用いた遺伝子修飾レベルの分析後のＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイは、いくつかのヌクレアーゼ対がイヌＨＰＲＴ遺伝子座を非常に効率的に修飾したことを示した（図１０および表６を参照のこと）。様々なヌクレアーゼ対の遺伝子修飾の効率は、ヒトＨＰＲＴ遺伝子とイヌＨＰＲＴ遺伝子との間の各結合部位の保存の程度とかなり相関している。
【０１６７】
実施例９：アカゲザルＨＰＲＴの切断
リードヒト特異的ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ  ＨＰＲＴ対の結合部位は、ヒトとアカゲザルとの間に保存される。したがって、我々は、アカゲザル細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２に対してこれらのヌクレアーゼを試験し、予想した通り、ヌクレアーゼが効率的な切断を示したことを見出した。
【０１６８】
使用したヌクレアーゼ対およびＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイで決定した観察されたＨＰＲＴの修飾の割合が以下の表７に示され、ゲル分析が図１１に示される。
【表７】
2014532410.tif 000011
【０１６９】
これらのデータは、ＨＰＲＴ遺伝子座を修飾するヒト特異的ヌクレアーゼがアカゲザルＨＰＲＴ遺伝子を修飾することもできることを示す。
【０１７０】
実施例１０：ヒトＨＰＲＴイントロンの切断
以下の表８に示されるＺＦＮ対を、製造業者のプロトコルに従ってＢＴＸ（登録商標）トランスフェクションを用いてｍＲＮＡとしてＣＤ３４＋細胞（対Ａ〜Ｆ）またはＫ５６２細胞（対Ａ’）のいずれかにトランスフェクトした。各トランスフェクションについて、２５０，０００個の細胞を用いた。ＤＮＡをトランスフェクションの３日後に標準の手順で回収した。
【０１７１】
図１２は、７個のヌクレアーゼ対の活性をＣｅｌ−Ｉアッセイでアッセイした修飾の割合とともに示す。したがって、ＺＦＮ対は、ＨＰＲＴイントロンＤＮＡを切断した。ＣＥＬ−Ｉ分析のためのＰＣＲに用いたオリゴヌクレオチドが以下に示される。
【表８】
2014532410.tif 000012
【０１７２】
実施例１１：ＣＤ３４＋細胞におけるヒトＨＰＲＴ遺伝子座への標的組み込み
図１３において、オリゴヌクレオチドドナーを示されるＺＦＮ  ｍＲＮＡ対で共トランスフェクトした。表８に示されるオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ産物を生成した。ＨＰＲＴイントロンへの外因性ＤＮＡ配列の組み込みを以下に示される制限酵素消化によってアッセイした。したがって、我々は、ＣＤ３４＋細胞におけるヒトＨＰＲＴ遺伝子座の修飾を実証した。オリゴヌクレオチドドナーのＤＮＡ配列および標的組み込みの検出に用いた制限酵素が以下の表９に示される。アスタリスクは、ホスホロチオエート結合を示す。
【表９−１】
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【表９−２】
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【０１７３】
実施例１２：Ｋ５６２細胞中のヒトＨＰＲＴ遺伝子座への導入遺伝子の標的組み込み
５’のＣ切断部位に隣接するＨＰＲＴ  ＤＮＡ（４７６ｂｐ）および３’の切断部位に隣接するＨＰＲＴ  ＤＮＡ（３５４ｂｐ）を含有するプラスミドＤＮＡドナーを構築した。これらの染色体相同性領域の間に強いスプライスアクセプター配列を配置した（ＤｅＫｅｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：１１３３−１１４２）。同様に、Ａ切断部位の５’末端に４２９ｂｐのＨＰＲＴ相同性および３’末端に６１６ｂｐのＨＰＲＴ相同性を有するドナーを構築した。次に、ＨＰＲＴを有するフレームに、ウイルス２Ａ自己切断ペプチドをコードするＤＮＡ配列を配置し、その後、緑色蛍光タンパク質の遺伝子を配置した。ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化シグナルを導入遺伝子コード配列後に挿入した。このプラスミドを部位Ｃまたは部位ＡのＺＦＮ対をコードするｍＲＮＡを有するＫ５６２細胞に共トランスフェクトした。トランスフェクションの４日後に培養物を半分に分け、上述のように６−ＴＧ選択をその細胞の半分に適用した。培養物の生存率およびＧＦＰ陽性細胞の割合を６−ＴＧ選択の１週間後に製造業者のプロトコルに従ってＧｕａｖａに基づく細胞蛍光測定によってアッセイした。結果は、ＨＰＲＴへの導入遺伝子の組み込みの成功およびＨＰＲＴ陰性の導入遺伝子含有細胞の６−ＴＧ選択の成功を示す。
【０１７４】
次に、部位Ｃへの標的組み込みをＰＣＲによってアッセイした（図１５）。ドナー送達の２つの系：上述のプラスミドの送達（Ｐ）、またはＡＡＶ２  ＩＴＲをさらに含有するプラスミド（Ａ）を用いた送達を試験した。オリゴヌクレオチド５’−ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＣＴＧ  ＧＡＴ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＧＡＴ  Ｔ−３’（配列番号１４９）および５’−ＣＣＣ  ＡＴＴ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＴＡＴ  ＡＴＴ  ＣＡＡ  ＡＧＴ  Ｃ−３’（配列番号１５０）を用いてＨＰＲＴ遺伝子座をＰＣＲで増幅した。野生型ＨＰＲＴ遺伝子は９６８ｂｐのＰＣＲ産物をもたらし、導入遺伝子を挿入したＨＰＲＴ対立遺伝子は２０７６ｂｐのＰＣＲ産物をもたらす。
【０１７５】
実施例１３：ＣＤ３４＋細胞中のヒトＨＰＲＴ遺伝子座への導入遺伝子の標的組み込み
次に、部位Ｃの導入遺伝子ドナーをＣＤ３４＋細胞中のＨＰＲＴに組み込んだ。細胞を、製造業者のプロトコルに従ってコードｍＲＮＡのＡｍａｘａヌクレオフェクションによって部位ＣのＺＦＮでトランスフェクトし、ドナーを上述のようにＡＡＶ２プラスミドを介して送達した。
【０１７６】
図１６に示されるように、ＧＦＰ陽性細胞の数を製造業者のプロトコルに従ってＧｕａｖａによって３日後にアッセイし、ＣＤ３４＋細胞への標的組み込みの成功を示した。
【０１７７】
本明細書において言及されるすべての特許、特許出願、および出版物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７８】
理解の明瞭化ために図解および例を用いてある程度詳しく開示を提供しているが、本開示の精神または範囲から逸脱することなく様々な変更および修正を行うことができることは当業者には明らかである。したがって、前述の説明および実施例は、限定的であると解釈されるべきではない。
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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