(57)【要約】  本発明は、ＤＭ１／ＤＭＰＫ、ＳＣＡ８又はＪＰＨ３遺伝子の転写物中のＣＵＧリピートの伸長により引き起こされる筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）、脊髄小脳失調症８型及び／又はハンチントン病類縁疾患２型などのヒト遺伝性疾患の治療、遅延及び／又は予防のための新規の化合物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチド配列（ＮＡＧ）ｍ［式中、ＮはＣ又は５−メチルシトシンであり、少なくとも１つのＮは５−メチルシトシンであり、及び／又は、少なくとも１つのＡは２，６−ジアミノプリン核酸塩基修飾を含み、ｍは４〜１５の整数である。］を含むか又はそれからなる化合物。
【請求項２】
イノシンヌクレオチドが存在しない、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｎはすべて５−メチルシトシンである、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
Ａはすべて２，６−ジアミノプリン核酸塩基修飾を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
配列番号１６、１７、１９、２０を含むか又はそれからなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
配列番号１６を含み、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチドの長さを有する、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
ＬＧＡＱＳＮＦを含むペプチド部分を含む化合物であって、ペプチド部分は、（ＮＡＧ）ｍ［式中、ＮはＣ又は５−メチルシトシンであり、ｍは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５である。］を含むオリゴヌクレオチド部分に連結している、化合物。
【請求項８】
（ＮＡＧ）ｍ［式中、ＮはＣ又は５−メチルシトシンである。］を含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド部分の長さが１２〜４５ヌクレオチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド部分が、ＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドと比較して少なくとも１つの修飾を含み、前記修飾は、骨格修飾、糖修飾及び塩基修飾からなる群から選ばれる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
前記修飾は、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート、モルホリノホスホロジアミデート、ロックド核酸及びペプチド核酸からなる群から選ばれる、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド部分は２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチド部分は、２，６−ジアミノプリン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−メチルウラシル、５−メチルシトシン、チミン、８−アザ−７−デアザグアノシン、及び／又はヒポキサンチンの少なくとも１つを含む、請求項７〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
１〜１０個の脱塩基モノマーが前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド部分の遊離末端に存在し、前記脱塩基モノマーは、好ましくは、１−デオキシリボース、１，２−ジデオキシリボース、及び／又は１−デオキシ−２−Ｏ−メチルリボースからなる群から選ばれる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
１−デオキシリボース、１，２−ジデオキシリボース、及び／又は１−デオキシ−２−Ｏ−メチルリボースの４個のモノマーがオリゴヌクレオチド部分の３’末端に存在し、好ましくは、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド部分は（ＮＡＧ）７［式中、ＮはＣ又は５−メチルシトシンである。］である、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
ペプチド部分は、チオエーテル部分を含むリンカーを介してオリゴヌクレオチドに連結している、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｈ−（Ｘ）ｐ−（ＮＡＧ）ｍ−（Ｙ）ｑ−Ｈ
［式中、
ＮはＣ又は５−メチルシトシンであり、少なくとも１つのＮは５−メチルシトシンであり、及び／又は、少なくとも１つのＡは２，６−ジアミノプリン核酸塩基修飾を含み、
ｍは４〜１５の整数であり、
Ｘ及びＹの各々は個別に、存在しないか、又は脱塩基モノマー若しくはヌクレオチドであり、
ｐ及びｑは各々個別に０〜１０の整数である。］
により表される化合物。
【請求項１７】
ヒト遺伝性疾患の治療、予防及び／又は遅延のための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物であって、ヒト遺伝性疾患は、ＤＭ１／ＤＭＰＫ、ＳＣＡ８又はＪＰＨ３遺伝子の転写物中のＣＵＧリピート伸長により引き起こされる筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）、脊髄小脳失調症８型及び／又はハンチントン病類縁疾患２型である、化合物。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物を含む、薬学的に許容される組成物。
【請求項１９】
細胞におけるＤＭ１／ＤＭＰＫ、ＳＣＡ８又はＪＰＨ３遺伝子の転写物中のＣＵＧリピートの数を低減させるためのインビトロの方法であって、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１８に記載の薬学的に許容される組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項２０】
ＤＭ１／ＤＭＰＫ、ＳＣＡ８又はＪＰＨ３遺伝子の転写物中のＣＵＧリピートの伸長により引き起こされる筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）、脊髄小脳失調症８型及び／又はハンチントン病類縁疾患２型の治療、予防及び／又は遅延のための医薬の製造のための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１８に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２１】
個体におけるＤＭ１／ＤＭＰＫ、ＳＣＡ８又はＪＰＨ３遺伝子の転写物中のＣＵＧリピートの伸長により引き起こされる筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）、脊髄小脳失調症８型及び／又はハンチントン病類縁疾患２型の１つ又は複数の症状及び／又は特徴を緩和し、及び／又はそれらの疾患のパラメータを改善するための方法であって、請求項１〜６４のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１８に記載の医薬組成物を前記個体に投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ＤＭ１などのヒト遺伝性疾患の治療、遅延及び／又は予防のための新規の化合物を提供する。
【発明の背景】
【０００２】
筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）は、複雑な多臓器病変を伴う優性遺伝性の神経筋疾患である（Ｈａｒｐｅｒ  Ｐ．Ｓ．ら）。ＤＭ１は、スプライス及び転写因子を隔離又は上方制御し、それによって正常な細胞の機能及び生存能力を妨害する、長いＣＵＧリピートを含むＤＭＰＫ転写物の発現を特徴とする。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を介した毒性ＤＭＰＫ転写物の抑制は、この頻繁なトリヌクレオチドリピート病のための潜在的な治療戦略と考えられる。ＣＵＧリピートはＤＭＰＫ転写物のエキソン１５中に存在する。
【０００３】
（ＣＵＧ）ｎトラクト自体は、変異転写物と正常サイズの転写物との間の唯一知られた多型であり、明白な標的を形成する。先の研究において、本発明者らは、ＤＭ１細胞及び動物モデルにおける変異転写物の分解を誘導することのできる、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート修飾（ＣＡＧ）７オリゴヌクレオチド（ＰＳ５８）（配列番号１）を同定した（Ｍｕｌｄｅｒｓ  Ｓ．Ａ．ら）。ＡＯＮがＤＭ１において臨床的に有効であるためには、ＡＯＮは多種多様な組織及びその中の細胞タイプに到達し、これらの細胞の核に首尾よく送達される必要がある。本発明において、ＰＳ５８に基づき、本明細書中で説明されるメチル化シトシン及び／又は脱塩基部位を含む新たな化合物が設計され、前記化合物は改善された活性、心筋、骨格筋及び平滑筋を含む複数の組織への標的化及び／又は送達及び／又は取り込みを有する。
【０００４】
国際公開第２００９／０９９３２６号パンフレット及び国際公開第２００７／８０８５３２号パンフレットは、ＰＳ５８などの（ＣＡＧ）ｎリピート単位を含むオリゴマーを記載する。
【発明の詳細な説明】
【０００５】
第一の態様において、ＬＧＡＱＳＮＦ／（ＮＡＧ）ｍ［式中、オリゴヌクレオチド部分（ＮＡＧ）ｍ中に含まれるＮはＣ（すなわちシトシン）又は５−メチルシトシンである。］を含むか又はそれからなる化合物が提供される。そのような化合物は、コンジュゲートと呼ばれ得る。この化合物は、（ＮＡＧ）ｍ［式中、ＮはＣ又は５−メチルシトシンである。］を含むか又はそれからなるオリゴヌクレオチド部分に連結又はカップリング又はコンジュゲートされたＬＧＡＱＳＮＦ（配列番号２）を含むか又はそれからなる、ペプチド部分を含む。この化合物はコンジュゲートとも命名され得る。ＬＧＡＱＳＮＦ／（ＮＡＧ）ｍ中のスラッシュ（／）は、本発明の化合物のペプチド部分とオリゴヌクレオチド部分の間の連結、カップリング又はコンジュゲーションを示す。本発明の化合物のペプチド部分は、ＬＧＡＱＳＮＦを含むか又はそれからなる。本発明の化合物のオリゴヌクレオチド部分は、（ＮＡＧ）ｍ［式中、ＮはＣ又は５−メチルシトシンである。］を含むか又はそれからなる。ある実施形態において、ＬＧＡＱＳＮＦ／（ＮＡＧ）ｍ［式中、オリゴヌクレオチド部分（ＮＡＧ）ｍに含まれるＮはＣ又は５−メチルシトシンである。］を含むか又はそれからなる化合物は、オリゴヌクレオチド部分（ＮＡＧ）ｍに含まれるＡの少なくとも１つが２，６−ジアミノプリン核酸塩基修飾を含むものである。ｍは、好ましくは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０である整数である。好ましい実施形態において、ｍは７である。したがって、好ましい（ＮＡＧ）ｍ［式中、ＮはＣ又は５−メチルシトシンである。］は、１２〜９０ヌクレオチド、より好ましくは１２〜４５ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜３６ヌクレオチド、最も好ましくは２１ヌクレオチドの長さを有する。上記オリゴヌクレオチド部分は、好ましくはリピート配列ＣＵＧに相補的な少なくとも１５〜４５個の連続するヌクレオチド、又はリピート配列ＣＵＧに相補的な少なくとも１８〜４２個の連続するヌクレオチド、より好ましくはリピート配列ＣＵＧに相補的な２１〜３６個のヌクレオチド、さらに好ましくは１８〜２４個のヌクレオチドを含む。
【０００６】
本発明のこの態様の化合物は、ＬＧＡＱＳＮＦ／（ＮＡＧ）ｍからなることができ、これは、ＬＧＡＱＳＮＦ配列以外の他のアミノ酸が存在せず、反復するＮＡＧモチーフ以外の他のヌクレオチドが存在しないことを意味する。あるいは、前記化合物はＬＧＡＱＳＮＦ／（ＮＡＧ）ｍを含むことができ、これは、ＬＧＡＱＳＮＦ配列以外の他のアミノ酸、又はその類似体若しくは等価物及び／又は反復するＮＡＧモチーフの片側又は両側における他のヌクレオチド又はその類似体若しくは等価物が存在し得ることを意味する。
【０００７】
本発明の関連において、アミノ酸の「類似体」又は「等価物」は、ペプチド中の天然アミノ酸に関する少なくとも１つの修飾を含むアミノ酸として理解されるべきである。そのような修飾は、骨格修飾及び／又は糖修飾及び／又は塩基修飾であってもよく、以下でさらに説明／例示される。
【０００８】
本発明の関連において、ヌクレオチドの「類似体」又は「等価物」は、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＵなどの、ＲＮＡ中の天然のヌクレオチドに関する少なくとも１つの修飾を含むヌクレオチドであると理解されるべきである。そのような修飾は、骨格修飾及び／又は糖修飾及び／又は塩基修飾であってもよく、以下でさらに説明／例示される。
【０００９】
好ましい実施形態において、本発明のこの態様のオリゴヌクレオチド部分は、Ｌ−（Ｘ）ｐ−（ＮＡＧ）ｍ−（Ｙ）ｑ−Ｌ［式中、Ｎ及びｍは上記と同義である。］により表すことができる。各Ｌは個別に、本発明の化合物のペプチド部分に接続又は結合された、水素原子又は以下でさらに定義される連結部分、カップリング部分若しくはコンジュゲーション部分であり、ここで、少なくとも１つのＬは、連結部分、カップリング部分又はコンジュゲーション部分である。好ましい実施形態において、１つのＬが水素原子であり、他のＬは連結部分、カップリング部分又はコンジュゲーション部分である。別の実施形態において、両方のＬが水素であり、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基又はヌクレオシド間連結を介してなどの内部ヌクレオチドの１つを介して、ペプチド部分に連結、カップリング又はコンジュゲートされる。Ｘ及びＹの各々は個別に、以下でさらに定義される脱塩基部位、あるいはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕなどのヌクレオチド又はその類似体若しくは等価物であり、ｐ及びｑは各々個別に、整数、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０超又は５０以下である。したがって、ｐ及びｑは各々個別に、０〜５０の整数、好ましくは０〜１０、より好ましくは０〜６の整数である。したがって、ｐが０である場合、Ｘは存在せず、ｑが０である場合、Ｙは存在しない。
【００１０】
本明細書中で、（Ｘ）ｐ−（ＮＡＧ）ｍ−（Ｙ）ｑ［式中、Ｎ及びｍは上記と同義であり、ｐ及びｑは０である。］は、そのオリゴヌクレオチド部分が（ＮＡＧ）ｍからなる、本発明のこの態様の化合物のオリゴヌクレオチド部分であるとみなされる。（ＮＡＧ）ｍを含むそのようなオリゴヌクレオチド部分は、（Ｘ）ｐ−（ＮＡＧ）ｍ−（Ｙ）ｑ［式中、Ｎ、ｍ、Ｘ、Ｙ、ｐ及びｑは上記と同義であり、ｐ及びｑのうちの少なくとも１つは０でない。］により表すことができる。
【００１１】
好ましい実施形態において、ｐは０でなく、（Ｘ）ｐは、（Ｘ’）ｐ’ＡＧ又は（Ｘ’）ｐ”Ｇ［式中、各Ｘ’は個別に、脱塩基部位、あるいはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕなどのヌクレオチド又はその類似体若しくは等価物であり、ｐ’はｐ−２であり、ｐ’’はｐ−１である。］により表される。そのような化合物は、
Ｌ−（Ｘ’）ｐ’ＡＧ−（ＮＡＧ）ｍ−（Ｙ）ｑ−Ｌ、又は
Ｌ−（Ｘ’）ｐ”Ｇ−（ＮＡＧ）ｍ−（Ｙ）ｑ−Ｌ
として表され得る。
【００１２】
同程度に好ましい実施形態において、ｑは０でなく、（Ｙ）ｑはＮＡ（Ｙ’）ｑ’又はＮ（Ｙ’）ｑ”［式中、Ｎは上記と同義であり、各Ｙ’は個別に、脱塩基部位、あるいはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕなどのヌクレオチド又はその類似体若しくは等価物であり、ｑ’はｑ−２であり、ｑ”はｑ−１である。］により表される。そのような化合物は、
Ｌ−（Ｘ）ｐ−（ＮＡＧ）ｍ−ＮＡ（Ｙ’）ｑ’−Ｌ、又は
Ｌ−（Ｘ）ｐ−（ＮＡＧ）ｍ−Ｎ（Ｙ’）ｑ”−Ｌ
として表され得る。
【００１３】
別の好ましい実施形態において、ｐ及びｑは両方とも０でなく、（Ｘ）ｐ及び（Ｙ）ｑは両方とも、それぞれ、（Ｘ’）ｐ’ＡＧ若しくは（Ｘ’）ｐ”Ｇ及びＮＡ（Ｙ’）ｑ’若しくはＮ（Ｙ’）ｑ”［式中、Ｎ、Ｘ’、Ｙ’、ｐ’、ｐ”、ｑ’及びｑ”は上記と同義である。］により表される。そのような化合物は、
Ｌ−（Ｘ’）ｐ’ＡＧ−（ＮＡＧ）ｍ−ＮＡ（Ｙ’）ｑ’−Ｌ、
Ｌ−（Ｘ’）ｐ”Ｇ−（ＮＡＧ）ｍ−ＮＡ（Ｙ’）ｑ’−Ｌ、
Ｌ−（Ｘ’）ｐ’ＡＧ−（ＮＡＧ）ｍ−Ｎ（Ｙ’）ｑ”−Ｌ、又は
Ｌ−（Ｘ’）ｐ”Ｇ−（ＮＡＧ）ｍ−Ｎ（Ｙ’）ｑ”−Ｌ
として表され得る。
【００１４】
ｐ’、ｐ”、ｑ’及びｑ”が負の整数であってはならないことは理解されるべきである。したがって、（Ｘ）ｐが（Ｘ’）ｐ’ＡＧ又は（Ｘ’）ｐ”Ｇにより表される場合、ｐはそれぞれ、少なくとも１又は少なくとも２であり、（Ｙ）ｑがＮＡ（Ｙ’）ｑ’又はＮ（Ｙ’）ｑ”により表される場合、ｑはそれぞれ、少なくとも１又は少なくとも２である。
【００１５】
したがって、本発明のこの態様の化合物のオリゴヌクレオチド部分は、以下の配列：（ＮＡＧ）ｍ、ＡＧ（ＮＡＧ）ｍ、Ｇ（ＮＡＧ）ｍ、ＡＧ（ＮＡＧ）ｍＮＡ、Ｇ（ＮＡＧ）ｍＮＡ、（ＮＡＧ）ｍＮＡ、ＡＧ（ＮＡＧ）ｍＮ、Ｇ（ＮＡＧ）ｍＮ、又は（ＮＡＧ）ｍＮのうちの１つを含むか又はそれからなることができる。ある実施形態において、オリゴヌクレオチド部分の１つ又は複数の遊離末端、すなわち、Ｌが水素である末端は、以下でさらに定義される１〜１０個の脱塩基部位を含有することができる。これらの脱塩基部位は、同じ又は異なるタイプであってもよく、互いに及びオリゴヌクレオチド部分と、３’−５’、５’−３’、３’−３’又は５’−５’結合により接続されることができる。技術的に、（核酸塩基の非存在、それゆえ環原子の番号付けのために）３’及び５’原子は脱塩基部位中に存在しないが、明確性のために、これらは対応するヌクレオチド中にあると同様に番号付けされる。
【００１６】
第二の態様において、本発明は、オリゴヌクレオチド配列（ＮＡＧ）ｍ［式中、ＮはＣ又は５−メチルシトシンであり、少なくとも１つのＮは５−メチルシトシンであり、及び／又は少なくとも１つのＡは２，６−ジアミノプリン核酸塩基修飾を含む。］を含むか又はそれからなる化合物に関する。好ましい実施形態において、Ｎはすべて５−メチルシトシンである。別の好ましい実施形態において、Ａはすべて２，６−ジアミノプリン核酸塩基を含む。別の好ましい実施形態において、Ｎはすべて５−メチルシトシンであり、Ａはすべて２，６−ジアミノプリン核酸塩基を含む。さらなる好ましい実施形態において、本発明のこの態様の化合物は、ヒポキサンチン塩基又は言い換えればイノシンヌクレオチドを含まない。
【００１７】
ｍは好ましくは整数であり、好ましくは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５である。言い換えれば、ｍは好ましくは４〜１５であり、より好ましくは５〜１２であり、さらに好ましくは６〜８である。特に好ましい実施形態において、ｍは５、６、７である。（ＮＡＧ）ｍを含むオリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９又は９０ヌクレオチドの長さを有する。言い換えれば、本発明のこの態様のオリゴヌクレオチドは、好ましくは１２〜９０ヌクレオチド、より好ましくは１５〜４９ヌクレオチド、さらに好ましくは２１ヌクレオチドの長さを有する。上記オリゴヌクレオチドは、好ましくはリピート配列ＣＵＧに相補的な少なくとも１５〜４５個の連続したヌクレオチド、又はリピート配列ＣＵＧに相補的な少なくとも１８〜４２個の連続したヌクレオチド、より好ましくはリピート配列ＣＵＧに相補的な、少なくとも１８〜３６個の連続したヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１８〜２４個の連続したヌクレオチドを含む。
【００１８】
本発明のこの態様の化合物はオリゴヌクレオチドとみなされ得る。そのようなオリゴヌクレオチドは（ＮＡＧ）ｍからなることができ、これは、反復するＮＡＧモチーフ以外の他のヌクレオチドが存在しないことを意味する。あるいは、オリゴヌクレオチドは（ＮＡＧ）ｍを含むことができ、これは、他のヌクレオチド又はその類似体若しくは等価物が、反復するＮＡＧモチーフの片側又は両側に存在することを意味する。
【００１９】
本発明の関連において、ヌクレオチドの「類似体」又は「等価物」は、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＵなどのＲＮＡ中の天然のヌクレオチドに関する少なくとも１つの修飾を含むヌクレオチドであると理解されるべきである。そのような修飾は、以下でさらに説明／例示される骨格修飾及び／又は糖修飾及び／又は塩基修飾であってもよい。
【００２０】
あるいは、本発明のこの態様のオリゴヌクレオチドは、Ｈ−（Ｘ）ｐ−（ＮＡＧ）ｍ−（Ｙ）ｑ−Ｈ［式中、Ｎ及びｍは上記と同義である。］により表され得る。Ｘ及びＹの各々は個別に、以下でさらに定義される脱塩基部位、あるいはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕなどのヌクレオチド又はその類似体若しくは等価物であり、ｐ及びｑは各々個別に、整数、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０超又は５０以下である。したがって、ｐ及びｑは各々個別に、０〜５０の整数、好ましくは０〜１０の整数、より好ましくは０〜６の整数である。したがって、ｐが０である場合、Ｘは存在せず、ｑが０である場合、Ｙは存在しない。当業者は、オリゴヌクレオチド中に存在するヌクレオチドの量及び性質にかかわらず、オリゴヌクレオチドが常に水素原子（Ｈ）で始まり、かつ終わることを理解するであろう。
【００２１】
本明細書中で、Ｈ−（Ｘ）ｐ−（ＮＡＧ）ｍ−（Ｙ）ｑ−Ｈ［式中、Ｎ及びｍは上記と同義であり、ｐ及びｑは０である。］は、本発明のこの態様の（ＮＡＧ）ｍからなる化合物とみなされる。（ＮＡＧ）ｍを含む化合物は、Ｈ−（Ｘ）ｐ−（ＮＡＧ）ｍ−（Ｙ）ｑ−Ｈ［式中、Ｎ、ｍ、Ｘ、Ｙ、ｐ及びｑは上記と同義であり、ｐ及びｑのうちの少なくとも１つは０でない。］により表され得る。
【００２２】
好ましい実施形態において、ｐは０でなく、（Ｘ）ｐは（Ｘ’）ｐ’ＡＧ又は（Ｘ’）ｐ”Ｇ［式中、各Ｘ’は個別に、脱塩基部位、あるいはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕなどのヌクレオチド又はその類似体若しくは等価物であり、ｐ’はｐ−２であり、ｐ”はｐ−１である。］により表される。そのようなオリゴヌクレオチドは、
Ｈ−（Ｘ’）ｐ’ＡＧ−（ＮＡＧ）ｍ−（Ｙ）ｑ−Ｈ、又は
Ｈ−（Ｘ’）ｐ”Ｇ−（ＮＡＧ）ｍ−（Ｙ）ｑ−Ｈ
として表され得る。
【００２３】
同程度に好ましい実施形態において、ｑは０でなく、（Ｙ）ｑはＮＡ（Ｙ’）ｑ’又はＮ（Ｙ’）ｑ”［式中、Ｎは上記と同義であり、各Ｙ’は個別に、脱塩基部位、あるいはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕなどのヌクレオチド又はその類似体若しくは等価物であり、ｑ’はｑ−２であり、ｑ”はｑ−１である。］により表される。そのようなオリゴヌクレオチドは、
Ｈ−（Ｘ）ｐ−（ＮＡＧ）ｍ−ＮＡ（Ｙ’）ｑ’−Ｈ、又は
Ｈ−（Ｘ）ｐ−（ＮＡＧ）ｍ−Ｎ（Ｙ’）ｑ”−Ｈ
として表され得る。
【００２４】
別の好ましい実施形態において、ｐ及びｑは両方とも０でなく、（Ｘ）ｐ及び（Ｙ）ｑは両方とも、それぞれ、（Ｘ’）ｐ’ＡＧ若しくは（Ｘ’）ｐ”Ｇ及びＮＡ（Ｙ’）ｑ’若しくはＮ（Ｙ’）ｑ”［式中、Ｎ、Ｘ’、Ｙ’、ｐ’、ｐ”、ｑ’及びｑ”は上記と同義である。］により表される。そのようなオリゴヌクレオチドは、
Ｈ−（Ｘ’）ｐ’ＡＧ−（ＮＡＧ）ｍ−ＮＡ（Ｙ’）ｑ’−Ｈ、
Ｈ−（Ｘ’）ｐ”Ｇ−（ＮＡＧ）ｍ−ＮＡ（Ｙ’）ｑ’−Ｈ、
Ｈ−（Ｘ’）ｐ’ＡＧ−（ＮＡＧ）ｍ−Ｎ（Ｙ’）ｑ”−Ｈ、又は
Ｈ−（Ｘ’）ｐ”Ｇ−（ＮＡＧ）ｍ−Ｎ（Ｙ’）ｑ”−Ｈ
として表され得る。
【００２５】
ｐ’、ｐ”、ｑ’及びｑ”が負の整数であってはならないことは理解されるべきである。したがって、（Ｘ）ｐが（Ｘ’）ｐ’ＡＧ又は（Ｘ’）ｐ”Ｇにより表される場合、ｐはそれぞれ、少なくとも１又は少なくとも２であり、（Ｙ）ｑがＮＡ（Ｙ’）ｑ’又はＮ（Ｙ’）ｑ”により表される場合、ｑはそれぞれ、少なくとも１又は少なくとも２である。
【００２６】
したがって、本発明のこの態様のオリゴヌクレオチドは、以下の配列：（ＮＡＧ）ｍ、ＡＧ（ＮＡＧ）ｍ、Ｇ（ＮＡＧ）ｍ、ＡＧ（ＮＡＧ）ｍＮＡ、Ｇ（ＮＡＧ）ｍＮＡ、（ＮＡＧ）ｍＮＡ、ＡＧ（ＮＡＧ）ｍＮ、Ｇ（ＮＡＧ）ｍＮ、又は（ＮＡＧ）ｍＮのうちの１つを含むか又はそれからなることができる。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドの１つ又は複数の遊離末端は、以下でさらに定義される１〜１０個の脱塩基部位を含んでもよい。これらの脱塩基部位は、同じ又は異なるタイプであってもよく、互いに及びオリゴヌクレオチド部分と、３’−５’、５’−３’、３’−３’又は５’−５’結合により接続されることができる。技術的に、（核酸塩基の非存在、それゆえ環原子の番号付けのために）３’及び５’原子は脱塩基部位中に存在しないが、明確性のために、これらは対応するヌクレオチド中にあると同様に番号付けされる。
【００２７】
（Ｘ）ｐ及び／又は（Ｙ）ｑが１つ又は複数の脱塩基部位を含むときは必ず、この脱塩基部位はオリゴヌクレオチドの片方又は両方の末端に存在し得る。したがって、本発明のこの態様のオリゴヌクレオチドの５’−末端及び／又は３’−末端には１つ又は複数の脱塩基部位が存在し得る。しかしながら、以下でさらに説明されるように、脱塩基部位はオリゴヌクレオチド配列内部にも存在し得る。
【００２８】
本発明による特に好ましいオリゴヌクレオチドは、Ｈ−（Ｘ）ｐ−（ＮＡＧ）ｍ−（Ｙ）ｑ−Ｈ［式中、ｍ＝５、６、７であり、Ｎはすべて５−メチルシトシンである。］により表される。
【００２９】
本発明による特に好ましいオリゴヌクレオチドは、Ｈ−（Ｘ）ｐ−（ＮＡＧ）ｍ−（Ｙ）ｑ−Ｈ［式中、ｍ＝５、６、７であり、Ｎはすべて５−メチルシトシンであり、ｐ＝ｑ＝０であり、Ｘ及びＹは存在しない。］により表される。
【００３０】
本発明による別の特に好ましいオリゴヌクレオチドは、Ｈ−（Ｘ）ｐ−（ＮＡＧ）ｍ−（Ｙ）ｑ−Ｈ［式中、ｍ＝５、６、７であり、Ｎはすべて５−メチルシトシンであり、ｐ＝０、ｑ＝４であり、Ｙはすべて脱塩基部位である。］により表される。
【００３１】
この第二の態様のより好ましいオリゴヌクレオチドは実験パートに記載のものであり、配列番号１６、１７、１９、２０を含むか又はそれからなる。
【００３２】
好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１６を含み、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチドの長さを有する。
【００３３】
別の好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１７（２１個のヌクレオチド及び４個の脱塩基部位）を含み、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチドの長さ及び４個の脱塩基部位を有する。
【００３４】
別の好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１９又は２０を含み、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチドの長さを有する。
【００３５】
脱塩基部位を含むオリゴヌクレオチド：
第三の態様において、本発明は、片方又は両方の末端に、以下にさらに定義される１つ又は複数の脱塩基部位を含むオリゴヌクレオチドに関する。好ましくは、２〜２０個、より好ましくは３〜１０個、最も好ましくは４個の脱塩基部位が、オリゴヌクレオチドの単一の末端に存在する。１つ又は複数の脱塩基部位が、オリゴヌクレオチドの両方（５’及び３’）又は一方のみの遊離末端に存在してもよい。本発明のこの態様のオリゴヌクレオチドは、好ましくは（ＮＡＧ）ｍ［式中、Ｎ及びｍは上記と同義である。］を含み、さらに、場合により、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、２’−Ｏ−メチル、ホスホロチオエート、及びこれらの組み合わせなどの、１つ又は複数の塩基修飾、糖修飾及び／又は骨格修飾などの、本明細書中で議論される任意の修飾を含んでもよい。
【００３６】
片方又は両方の末端に１つ又は複数の脱塩基部位を含む、本発明のこの態様のオリゴヌクレオチドは、本明細書中で後述される、そのような脱塩基部位を含まないオリゴヌクレオチドよりも改善されたパラメータを有する。
【００３７】
オリゴヌクレオチド部分又はオリゴヌクレオチド：
次のセクションにおいて本発明のオリゴヌクレオチドがさらに定義される。この開示は、明らかな別段の記載がない限り、ＬＧＡＱＳＮＦ／（ＮＡＧ）ｍを含むか又はそれからなるコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分（すなわち第一の態様）、（ＮＡＧ）ｍを含むか又はそれからなるオリゴヌクレオチド（すなわち第二の態様）、及び片方又は両方の末端に１つ又は複数の脱塩基部位を含む、（ＮＡＧ）ｍを含むか又はそれからなるオリゴヌクレオチド（すなわち第三の態様）に適用可能である。したがって、明細書全体にわたって、「本発明のオリゴヌクレオチド」は、「ＬＧＡＱＳＮＦ／（ＮＡＧ）ｍを含むか又はそれからなるコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分」又は「１つ又は複数の脱塩基部位を含む、（ＮＡＧ）ｍを含むか又はそれからなるオリゴヌクレオチド」によって置き換え可能である。
【００３８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、９〜９０個、若しくは９〜６０個、若しくは９〜４５個、若しくは９〜４２個、若しくは９〜３９個、若しくは９〜３６個のヌクレオチド、又は９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、若しくは９０個のヌクレオチドを有してもよい。したがって、本発明が、結果として生じる配列のどちらかがより効率的であるという偏見なしに、所与のＮＡＧ（ここで、ＮはＣ又は５−メチルシトシンである）中の任意の位置で開始及び／又は終止することによって設計可能な任意の特定のオリゴヌクレオチドも包含することは明らかである。
【００３９】
ある実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド又はＬＧＡＱＳＮＦ／（ＮＡＧ）ｍを含むか又はそれからなるコンジュゲートは、処置される個体の細胞中に存在する配列に相補的な追加のオリゴヌクレオチド部分をさらに含んでもよい。この追加のオリゴヌクレオチド部分は、例えば、ＤＭ１／ＤＭＰＫ（配列番号１０）、ＳＣＡ８（配列番号１１）、又はＪＰＨ３（配列番号１２）遺伝子の転写物中に存在するＣＵＧリピートに隣接する配列に相補的な配列であってもよい。あるいは、この追加のオリゴヌクレオチド部分は、例えば、ＤＭ１／ＤＭＰＫ、ＳＣＡ８、又はＪＰＨ３遺伝子の転写物中のリピート配列ＣＵＧに直接隣接しない配列に相補的な配列であってもよい。あるいは、この追加のオリゴヌクレオチド部分は、例えば、ＤＭ１／ＤＭＰＫ、ＳＣＡ８、又はＪＰＨ３遺伝子の転写物中に存在するリピート配列ＣＵＧに直接隣接せず、かつ機能モチーフを含む配列に相補的な配列であってもよい。あるいは、この追加のオリゴヌクレオチド部分は、例えば、ＤＭ１／ＤＭＰＫ、ＳＣＡ８、又はＪＰＨ３遺伝子の転写物中に存在するリピート配列ＣＵＧに直接隣接しないが、二次構造又は三次構造のせいで近接する配列に相補的な配列であってもよい。好ましくは、配列（ＮＡＧ）ｍ［式中、ＮはＣ又は５−メチルシトシンである。］は、本発明のオリゴヌクレオチドの長さの少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％以上である。この点で、本発明のオリゴヌクレオチドの片方又は両方の末端に存在する１つ又は複数の脱塩基部位は、配列の一部ではない。より好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、（ＮＡＧ）ｍ［式中、ＮはＣ又は５−メチルシトシンである。］からなる。さらに好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは（ＮＡＧ）ｍ［式中、Ｎは５−メチルシトシンである。］からなる。さらに好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは（ＮＡＧ）７［式中、Ｎは５−メチルシトシンである。］からなる。
【００４０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。二本鎖は、ｓｉＲＮＡのように、オリゴヌクレオチドが２つの相補鎖でできているヘテロダイマーであることを意味する。好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは一本鎖である。当業者は、それでも一本鎖オリゴヌクレオチドが内部二本鎖構造を形成し得ることを理解するであろう。しかしながら、このオリゴヌクレオチドは、なお本発明の関係において、一本鎖オリゴヌクレオチドと命名される。一本鎖オリゴヌクレオチドは、二本鎖ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドと比較して次のいくつかの利益を有する。（ｉ）その合成が二本の相補的ｓｉＲＮＡ鎖よりも容易であると予想される；（ｉｉ）より効果的な細胞への取り込み、より優れた（生理学的）安定性を最適化し、潜在的な一般的有害作用を減少させるためのより広範囲の化学修飾が可能である；（ｉｉｉ）ｓｉＲＮＡは、（オフターゲット遺伝子を含む）非特異的作用及び（処置スケジュール及び用量による有効性及び選択性の制御の可能性の低さなどの）悪化した薬理学に対する高い潜在性を有する、及び（ｉｖ）ｓｉＲＮＡｓは核内では作用しそうもなく、かつイントロンに対して向けられることはできない。
【００４１】
本発明のオリゴヌクレオチドを生成するために異なるタイプの核酸モノマーが使用され得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドと比較して、少なくとも１つの骨格修飾、及び／又は少なくとも１つの糖修飾、及び／又は少なくとも１つの塩基修飾を有し得る。
【００４２】
塩基修飾は、ヒポキサンチン、オロチン酸、アグマチジン、リシジン、２−チオピリミジン（例えば、２−チオウラシル、２−チオチミン）、２，６−ジアミノプリン、Ｇ−クランプ及びその誘導体、５−置換ピリミジン（例えば、５−ハロウラシル、５−メチルウラシル、５−メチルシトシン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、５−アミノメチルウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−アミノメチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｓｕｐｅｒ  Ｔ）、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、８−アザ−７−デアザグアニン、８−アザ−７−デアザアデニン、８−アザ−７−デアザ−２，６−ジアミノアデニン、Ｓｕｐｅｒ  Ｇ、Ｓｕｐｅｒ  Ａ、及びＮ４−エチルシトシン、又はそれらの誘導体などの天然のプリン及びピリミジン塩基（例えば、アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン及びチミン）の修飾体（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖｅｒｓｉｏｎ）；並びに、２，６−ジフルオロトルエン又は脱塩基部位（例えば、１−デオキシリボース、１，２−ジデオキシリボース、１−デオキシ−２−Ｏ−メチルリボースのような非存在塩基（ａｂｓｅｎｔ  ｂａｓｅ）；又は環酸素が窒素で置換されているピロリジン誘導体）のような変性又は普遍的塩基を含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０を超える塩基修飾を含み得る。Ｓｕｐｅｒ  Ａ、Ｓｕｐｅｒ  Ｇ及びＳｕｐｅｒ  Ｔの誘導体の例は、参照することによりその全体が本明細書中に組み込まれる米国特許第６，６８３，１７３号（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に見出される。上記オリゴヌクレオチド部分に２つ以上の異なる塩基修飾を導入することも本発明に包含される。
【００４３】
本発明のオリゴヌクレオチド（すなわち第一、第二、第三の態様）は、好ましくは、すべて本明細書中で同定されている修飾塩基及び／又は塩基性部位を含み、なぜなら、それは改善されたＲＮＡ結合動力学及び／又は熱力学的特性を有する本発明の化合物又はオリゴヌクレオチドを提供し、低減した又は許容可能なレベルの毒性及び／又は免疫原性を有する本発明の化合物又はオリゴヌクレオチドを提供し、及び／又は本発明のオリゴヌクレオチド又は化合物の薬物動態、薬物力学、活性、アレル選択性、細胞取り込み及び／又は潜在的なエンドソームからの放出を促進することが期待されるからである。
【００４４】
より好ましい実施形態において、本発明の上記オリゴヌクレオチドには、１つ又は複数の２−チオウラシル、２−チオチミン、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、チミン、２，６−ジアミノプリン塩基が存在する。上述の通り、ペプチド部分にコンジュゲートされていない本発明のオリゴヌクレオチド、すなわち、Ｈ−（Ｘ）ｐ−（ＮＡＧ）ｍ−（Ｙ）ｑ−Ｈにより表されるオリゴヌクレオチドは、５−メチルシトシン（５−メチル−Ｃ）及び２，６−ジアミノプリンから選ばれる少なくとも１つの塩基修飾を含む。好ましい実施形態において、ペプチド部分とコンジュゲートされていない本発明のこの態様のオリゴヌクレオチドはヒポキサンチン塩基修飾を含まない。
【００４５】
糖修飾は、２’−Ｏ−アルキル又は２’−Ｏ−（置換）アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−（２−シアノエチル）、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル（２’−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−（２−チオメチル）エチル、２’−Ｏ−ブチリル、２’−Ｏ−プロパルギル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−（２−アミノ）プロピル、２’−Ｏ−（２−（ジメチルアミノ）プロピル）、２’−Ｏ−（２−アミノ）エチル及び２’−Ｏ−（２−（ジメチルアミノ）エチル））；２’−デオキシ（ＤＮＡ）、２’−Ｏ−アルコキシカルボニル（例えば、２’−Ｏ−［２−（メトキシカルボニル）エチル］（ＭＯＣＥ）、２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］（ＭＣＥ）及び２’−Ｏ−［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイル）エチル］（ＤＣＭＥ）、２’−ハロ（例えば、２’−Ｆ、ＦＡＮＡ（２’−Ｆアラビノシル核酸））；カルバ糖及びアザ糖修飾；並びに３’−Ｏ−アルキル（例えば、３’−Ｏ−メチル、３’−Ｏ−ブチリル、３’−Ｏ−プロパルギル、及びそれらの誘導体）などのリボシル部分の修飾体を含む。別の可能な修飾は、「架橋」又は「二環性」核酸（ＢＮＡ）、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）、キシロ−ＬＮＡ、α−Ｌ−ＬＮＡ、β−Ｄ−ＬＮＡ、ｃＥｔ（２’−Ｏ，４’−Ｃ束縛エチル）ＬＮＡ、ｃＭＯＥｔ（２’−Ｏ，４’−Ｃ束縛メトキシエチル）ＬＮＡ、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）；アンロックド核酸（ＵＮＡ）；シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、アルトリオール核酸（ＡＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、フッ化ＨＮＡ（Ｆ−ＨＮＡ）、ピラノシル−ＲＮＡ（ｐ−ＲＮＡ）、３’−デオキシピラノシル−ＤＮＡ（ｐ−ＤＮＡ）；トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）；モルホリノ（ＰＭＯ）、カチオン性モルホリノ（ＰＭＯＰｌｕｓ）、ＰＭＯ−Ｘ；及びそれらの誘導体を含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０を超える糖修飾を含み得る。上記オリゴヌクレオチドに２つ以上の異なる糖修飾を導入することも本発明に包含される。
【００４６】
好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル、モルホリノ、架橋ヌクレオチド又はＢＮＡから選ばれる少なくとも１つの糖修飾を含むか、あるいは前記オリゴヌクレオチドは、架橋ヌクレオチド及び２’−デオキシ修飾ヌクレオチド（ＢＮＡ／ＤＮＡミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）若しくはギャップマー（ｇａｐｍｅｒ））の両方、又は２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル核酸及びＤＮＡヌクレオチド（２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル／ＤＮＡミックスマー若しくはギャップマー）の両方を含む。より好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル、モルホリノ、架橋核酸（ＢＮＡ）、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル／ＤＮＡミックスマー、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル／ＤＮＡギャップマー、ＢＮＡ／ＤＮＡギャップマー又はＢＮＡ／ＤＮＡミックスマーから選ばれる糖修飾により、その長さ全体にわたって修飾される。さらに好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル修飾を含む。より好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは完全に２’−Ｏ−メチル修飾される。
【００４７】
好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、核酸塩基を欠いた１〜１０個又は１０を超えるモノマーを含む。そのようなモノマーは、脱塩基部位又は脱塩基モノマーとも呼ばれ得る。そのようなモノマーは、本発明のオリゴヌクレオチドの遊離末端に存在するか、又は連結されるか、又は取り付けられるか、又はコンジュゲートされ得る。
【００４８】
本発明のオリゴヌクレオチドがＨ−（Ｘ）ｐ−（ＮＡＧ）ｍ−（Ｙ）ｑ−Ｈにより表される場合、脱塩基部位はオリゴヌクレオチドの（Ｘ）ｐ部分及び／又はオリゴヌクレオチドの（Ｙ）ｑ部分内に存在し得る。本発明のオリゴヌクレオチドが、ＬＧＡＱＳＮＦ／（ＮＡＧ）ｍにより表される化合物内に存在する場合、脱塩基部位は、オリゴヌクレオチド部分の遊離末端に存在し得る。これらの脱塩基部位は、オリゴヌクレオチドの末端領域、すなわち、５’−末端及び／又は３’−末端に存在し得る。コンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分も脱塩基部位を含んでもよい。これらの脱塩基部位は、コンジュゲートの上記オリゴヌクレオチド部分の遊離末端に取り付けられ得る。ペプチド部分とのコンジュゲーションのために、末端のうちの１つだけが遊離であってもよい。したがって、ペプチドが５’−末端を介してコンジュゲートされている場合には、３’−末端が遊離であり、又はペプチドが３’−末端を介してコンジュゲートされている場合には、５’−末端が遊離である。一方、ペプチド部分とのコンジュゲーションは、オリゴヌクレオチド部分内に存在するヌクレオチド又は他の部位を介して起こってもよく、５’−及び３’−の両末端を遊離に、したがって、１つ又は複数の脱塩基部位の取り付けが可能なままにしておく。
【００４９】
本発明のオリゴヌクレオチドの遊離末端に存在する脱塩基部位とは別に、脱塩基部位はオリゴヌクレオチド配列の内部にも存在し得る。この点で、脱塩基部位は塩基修飾とみなされる。
【００５０】
より好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、１〜１０個又は１０個を超える脱塩基部位、あるいは１−デオキシリボース、１，２−ジデオキシリボース、及び／又は１−デオキシ−２−Ｏ−メチルリボースのモノマーを含む。そのようなモノマーは、本発明のオリゴヌクレオチドの遊離末端に存在し得る。モノマーの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個又はさらに多くてもよい。本発明のオリゴヌクレオチドにおける多数のこれら脱塩基モノマーの取り付けは、そのようなモノマーを含まない対照オリゴヌクレオチドに関して活性増大を示す。これらのモノマーは、３’又は５’末端ヌクレオチド又はその両方に取り付けられ得る。脱塩基モノマーは、通常の５’→３’順序又は逆の（３’→５’）様式で取り付けられてもよく、互いに及び本発明のオリゴヌクレオチドの残りの部分に、リン酸、ホスホロチオエート又はホスホジアミデート結合によって連結されてもよい。好ましい実施形態では、２〜８個の脱塩基部位又はモノマーが本発明のオリゴヌクレオチドの３’又は５’末端に取り付けられる。より好ましい実施形態では、４個の脱塩基部位又はモノマーが本発明の（ＮＡＧ）ｍオリゴヌクレオチドの３’末端に取り付けられる。さらに好ましくは、４個の脱塩基部位又はモノマーが本発明の（ＮＡＧ）７オリゴヌクレオチドの３’末端に取り付けられる。最も好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端に存在する１−デオキシリボース、１，２−ジデオキシリボース、及び／又は１−デオキシ−２−Ｏ−メチルリボースの４個のモノマーを含み、好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは（ＮＡＧ）７である。
【００５１】
ＲＮＡ結合動力学及び／又は熱力学的特性は、一本鎖ＲＮＡに関して、（ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．５を用いて）その標的ＲＮＡに結合した本発明のオリゴヌクレオチドの基本的な融点及び最近傍モデルを用いて、本発明のオリゴヌクレオチドの融点（Ｔｍ；オリゴヌクレオチド特性計算機によって計算された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｃ．ｅｄｕ／〜ｃａｉｌ／ｂｉｏｔｏｏｌ／ｏｌｉｇｏ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ））によって少なくとも部分的に決定される。
【００５２】
免疫原性は、動物モデルにおいて、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋細胞の存在及び／又は前記動物の筋肉バイオプシーにおける炎症性単核細胞の浸潤を評価することによって、評価され得る。免疫原性及び／又は毒性も、本発明の化合物若しくはオリゴヌクレオチド又は前記化合物のオリゴヌクレオチド部分で処置された動物又はヒトの血液において、当業者に知られた標準的な免疫アッセイを用いて、本発明の前記化合物若しくはオリゴヌクレオチド又は前記化合物のオリゴヌクレオチド部分を認識する抗体の存在を検出することによって評価され得る。
【００５３】
毒性は、本発明の化合物若しくはオリゴヌクレオチド又は前記化合物のオリゴヌクレオチド部分で処置された動物又はヒトの血液において、サイトカインの存在及び／又は補体の活性化を検出することによって評価され得る。これに関連して、サイトカインは、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α及び／又はＩＰ−１０であってもよい。これらの各サイトカインの存在は、ＥＬＩＳＡ、好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて評価され得る。Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓからのＥＬＩＳＡキットが、ヒトＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０の存在を評価するために使用可能であり、ＩＦＮ−αのためにはＶｅｒｉｋｉｎからの、サルＩＬ−６及びＴＮＦ−αのためにはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＥＬＩＳＡキットが使用可能である。補体の活性化は、Ｂｂ及びＣ３ａの存在を評価することによってＥＬＩＳＡにより評価可能である。この目的のための好適なＥＬＩＳＡキットはＱｕｉｄｅｌ（ＣＡ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）のものである。
【００５４】
免疫原性の増大は、好ましくは、これらの細胞タイプのうちの少なくとも１つの、処置前あるいは修飾塩基を有さない本発明の化合物若しくはオリゴヌクレオチド又は前記化合物のオリゴヌクレオチド部分で処置された動物の対応する筋肉バイオプシーにおける各細胞タイプの量と比較した検出可能な増加に相当する。あるいは、免疫原性の増大は、上記本発明の化合物若しくはオリゴヌクレオチド又は前記化合物のオリゴヌクレオチド部分を認識する抗体の存在又は増加量を標準的な免疫アッセイを用いて検出することによって評価され得る。
【００５５】
免疫原性の減少は、好ましくは、これらの細胞タイプのうちの少なくとも１つの、処置前あるいは修飾塩基を有さない本発明の対応する化合物若しくはオリゴヌクレオチド又は前記化合物のオリゴヌクレオチド部分で処置された動物の対応する筋肉バイオプシーにおける対応する細胞タイプの量と比較した検出可能な減少に相当する。あるいは、免疫原性の低下は、本発明の上記化合物若しくはオリゴヌクレオチド又は前記化合物のオリゴヌクレオチド部分及び／又は中和抗体の非存在又は減少量を標準的な免疫アッセイを用いて検出することによって評価され得る。
【００５６】
毒性の増大は、好ましくは、処置前あるいは修飾塩基を有さない本発明の化合物若しくはオリゴヌクレオチド又は前記化合物のオリゴヌクレオチド部分で処置された動物の状況と比較した、上で同定されたサイトカインの検出可能な増加及び／又は補体活性化の検出可能な増大に相当する。
【００５７】
毒性の減少は、好ましくは、処置前あるいは修飾塩基を有さない本発明の対応する化合物若しくはオリゴヌクレオチド又は前記化合物のオリゴヌクレオチド部分で処置された動物の、上で同定されたサイトカインの検出可能な減少及び／又は補体活性化の検出可能な低下に相当する。
【００５８】
骨格修飾は、ＲＮＡ中に存在するホスホジエステルの修飾体を含む。この点で、用語「骨格」は、ヌクレオシド間連結と解釈されるべきである。そのような骨格修飾の例は、ホスホロチオエート（ＰＳ）、キラル純粋なホスホロチオエート、ホスホロジチオエート（ＰＳ２）、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、ホスホノアセトアミド（ＰＡＣＡ）、チオホスホノアセテート、チオホスホノアセトアミド、ホスホロチオエートプロドラッグ、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、メチルホスフェート、メチルホスホロチオエート、エチルホスフェート、エチルホスホロチオエート、ボラノホスフェート、ボラノホスホロチオエート、メチルボラノホスフェート、メチルボラノホスホロチオエート、メチルボラノホスホネート、メチルボラノホスホノチオエート、及びそれらの誘導体である。他の可能な修飾は、ホスホルアミダイト、ホスホルアミデート、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｄｉａｍｉｄａｔｅ）、ホスホロチオジアミデート、スルファメート、ジメチレンスルホキシド、スルホネート、チオアセトアミド核酸（ＴＡＮＡ）、及びそれらの誘導体を含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又は１０を超える骨格修飾を含み得る。本発明の上記オリゴヌクレオチドに２つ以上の異なる骨格修飾を導入することも本発明に包含される。
【００５９】
好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは少なくとも１つのホルホロチオエート修飾を含む。より好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは完全にホスホロチオエート修飾されている。
【００６０】
本発明のオリゴヌクレオチドの他の化学修飾は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホウ素クラスタ修飾ＰＮＡ、ピロリジンベースのオキシペプチド核酸（ＰＯＰＮＡ）、グリコール又はグリセロールベースの核酸（ＧＮＡ）、トレオースベースの核酸（ＴＮＡ）、非環式トレオニノールベースの核酸（ａＴＮＡ）、モルホリノベースのオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ、ＰＭＯ−Ｘ）、カチオン性モルホリノベースのオリゴマー（ＰＭＯＰｌｕｓ）、統合された塩基及び骨格を有するオリゴヌクレオチド（ＯＮＩＢｓ）、ピロリジン−アミドオリゴヌクレオチド（ＰＯＭｓ）、及びそれらの誘導体を含む。好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、モルホリノベースのヌクレオチド（ＰＭＯ）又はペプチドヌクレオチド（ＰＮＡ）によってその長さ全体にわたって修飾されている。
【００６１】
核酸模倣技術の登場とともに、核酸自体と、必ずしも量的でなく種類として類似した、好ましくは同じハイブリダイゼーション特性を有する分子を作り出すことが可能となった。そのような機能的等価物も本発明における使用に好適である。
【００６２】
当業者は、各糖、塩基及び／又は骨格が同じ方法で修飾されなくてよいことを理解するであろう。数種の異なる糖、塩基及び／又は骨格の修飾が本発明の単一のオリゴヌクレオチド中に組み合わされてよい。
【００６３】
当業者は、オリゴヌクレオチドの多くの合成誘導体があることも理解するであろう。したがって、「オリゴヌクレオチド」は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホジチオエート、ホスホロチオジアミデート及びＨ−ホスホネート誘導体を含む（これらに限定されない）。それはまた、天然及び合成のオリゴヌクレオチド誘導体の両方を包含する。
【００６４】
ＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖は非常に安定であるため、好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドはＲＮＡを含む。ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡに追加の特性、例えば、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ及びＲＮａｓｅＨに対する抵抗性、さらなるハイブリダイゼーション強度、（例えば体液中での）増大した安定性、増加又は減少したフレキシビリティー、低下した毒性、増加した細胞間輸送、組織特異性などを提供する修飾を含むことが好ましい。好ましい修飾は上で同定されている。
【００６５】
好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格により接続された２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーを含むか又はそれからなる。２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマー及びホスホロチオエート骨格からなるそのようなオリゴヌクレオチドは「２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートＲＮＡ」とも呼ばれ得る。本発明のオリゴヌクレオチドの一部のみが２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマー及びホスホロチオエート骨格からなる場合も、この部分は「２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートＲＮＡ」と呼ばれ得る。その場合、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格により接続された２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマー又は２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオエートＲＮＡを含む。したがって、一実施形態は、修飾、好ましくは、２’−Ｏ−メチル修飾リボース（ＲＮＡ）、より好ましくは、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートＲＮＡをさらに含有するＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドを提供する。
【００６６】
１つ又は複数の等価物の中の相互間及び／又は核酸とのハイブリッドも好適である。
【００６７】
少なくとも部分的に天然のＤＮＡヌクレオチドを含有する、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨ活性（ＥＣ．３．１．２６．４）による細胞中でのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子の分解を誘導するために有用である。
【００６８】
天然のＲＮＡリボヌクオチド又は本発明のオリゴヌクレオチドを含むＲＮＡ様の合成リボヌクレオチドは、本明細書中に包含され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）による標的ＲＮＡ分解が続く、センス−アンチセンス鎖対形成による標的ＲＮＡ認識を含むＲＮＡ緩衝又はサイレンシング（ＲＮＡｉ／ｓｉＲＮＡ）経路により、酵素依存性アンチセンスとして作用する二本鎖ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成する。
【００６９】
あるいは又はさらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物の標的配列に結合し、スプライスドナー又はスプライスアクセプター部位の翻訳又はブロッキングなどの過程の障害となることによって、前駆体ＲＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡのプロセシング又は発現を妨害（立体的ブロッキング、ＲＮａｓｅ−Ｈ非依存性過程）、限定的ではないが、特にＲＮＡスプライシング及びエキソンスキッピングを妨害することができる。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、立体障害によってタンパク質、核因子などの結合を阻害し、及び／又は標的ＲＮＡの真正の空間的折りたたみを妨害し、及び／又は本発明のオリゴヌクレオチド自身を元来標的ＲＮＡに結合するタンパク質に結合させ、及び／又は標的ＲＮＡに対する他の効果を有することができ、それにより標的ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡの脱安定化及び／又は病気の又は毒性のある転写物の量の減少に貢献し、それにより本明細書中で後に同定されるＤＭ１などの疾患におけるリボ核内フォーカスの核内蓄積の減少をもたらす。
【００７０】
本明細書中で定義される通り、本発明のオリゴヌクレオチドは、その５’又は３’末端のうちの少なくとも１つにおいて（ＲＮａｓｅＨ抵抗性の）化学置換基を有するヌクレオチドを含んで細胞間安定性を提供することができ、９個未満、より好ましくは６個未満の連続した（ＲＮａｓｅＨ感受性の）デオキシリボースヌクレオチドを残りのその配列中に含む。残りの配列は好ましくは配列の中心である。そのようなオリゴヌクレオチドはギャップマーと呼ばれる。ギャップマーは、国際公開第ＷＯ２００７／０８９６１１号パンフレットに広範に記載されている。ギャップマーは、ＲＮａｓｅＨの動員及び／又は活性化を可能とするために設計される。理論に束縛されることを望むことなく、デオキシリボースから作られるギャップマーの中心領域への結合を介してＲＮａｓｅＨは動員及び／又は活性化されると考えられる。実質的にＲＮａｓｅＨ非依存性であることが好ましい本発明のオリゴヌクレオチドは、実質的にＲＮａｓｅＨを動員及び／又は活性化しない中心領域を有するように設計される。好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドの残りの配列は、より好ましくはその中心部分がデオキシリボースを９、８、７、６、５、４、３、２、１個未満含むか又は含まない。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、前述の通り部分的〜完全に置換されることが好ましい。「部分的に置換」されるとは、好ましくは、置換されたそのヌクレオチドが本発明のオリゴヌクレオチドの少なくとも５０％を構成し、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（すなわち完全に）置換されることを意味する。
【００７１】
上述の通り、Ｈ−（Ｘ）ｐ−（ＮＡＧ）ｍ−（Ｙ）ｑ−Ｈにより表される本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ヌクレオチドとしてのイノシン又は核酸塩基としてのヒポキサンチンを含まない。
【００７２】
他方、本発明のオリゴヌクレオチドが、ペプチド部分を有するコンジュゲートの一部である場合、好ましくは、前記オリゴヌクレオチド部分は、イノシン及び／又はウォッブル塩基対を形成することのできる塩基を含むヌクレオチドを含有するか又は含む。より好ましくは、前記オリゴヌクレオチド部分はイノシンを含む。本発明において、少なくとも１つのイノシンを含むオリゴヌクレオチド部分を含む化合物が魅力的である。特に好ましい実施形態において、（ＮＡＧ）ｍ中のＡはすべて又はほとんどすべてがイノシン（Ｉ）により置換されている。すべてのＡがＩにより置換されている場合、本発明のオリゴヌクレオチドはｍ個のＩを含む。「Ｉで置換されたほとんどすべてのＡ」は、ｍ−１、２又は３個のＡがＩにより置換されていることを意味すると理解されるべきである。そのような化合物は、少なくとも２つの疾患、（ＣＵＧ）ｎ伸長リピートにより引き起こされる筋強直性ジストロフィー１型、及び（ＣＡＧ）ｎ伸長リピートにより引き起こされる例えばハンチントン病を処置するために使用可能である。さもなければ、これらの伸長リピートを特異的に標的化することは２つの化合物を必要とし、各化合物は１つの異なるオリゴヌクレオチド部分を含む。イノシンを含むオリゴヌクレオチド部分及び／又はウォッブル塩基対を形成することのできる塩基を含有するヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチドがイノシン及び／又はウォッブル塩基対を形成することのできる塩基を含有するヌクレオチドで置換されたオリゴヌクレオチドとして定義され得る。当業者は、ヌクレオチドがウォッブル塩基対を形成することのできる塩基を含有するか否かを試験する方法を知っている。例えば、イノシンはウラシル、アデニン及び／又はシトシンと塩基対を形成することができるため、それは、ウラシル、アデニン及び／又はシトシンと塩基対を形成することのできる少なくとも１つのヌクレオチドがイノシンで置換されていることを意味する。しかしながら、特異性を保護するためには、イノシン含有オリゴヌクレオチドはウラシル又はアデニン又はシトシンと塩基対を形成することのできる少なくとも１つのヌクレオチドの置換を含むことが好ましい。より好ましくは、ウラシル又はアデニン又はシトシンと塩基対を形成することのできるすべてのヌクレオチドがイノシンで置換される。リピート配列（ＣＵＧ）ｎに相補的なオリゴヌクレオチド部分は、好ましくは、（ＮＩＧ）ｎ［式中、ＮはＣ又は５−メチルシトシンである。］を含むか又はそれからなるであろう。本明細書中で定義されるオリゴヌクレオチド部分中では、少なくとも１つのヌクレオチドがイノシン及び／又はウォッブル塩基対を形成することのできる塩基を含有するヌクレオチドで置換されているため、（ＣＵＧ）ｎなどのリピート配列に相補的なオリゴヌクレオチド部分は、（ＮＩＧ）ｎ［式中、ＮはＣ又は５−メチルシトシンである。］を含むか又はそれからなることができるということも本発明に包含される。（ＮＩＧ）ｎ［式中、ＮはＣ又は５−メチルシトシンである。］を例にとり、例えばｎを３とすると、本発明は、（ＮＩＧ）３などの所与の式をベースとし、１つ又は２つ又は３つのイノシンを次の位置に含む任意の可能なオリゴヌクレオチド部分を包含する。（ＮＡＧ）（ＮＩＧ）（ＮＡＧ）、（ＮＩＧ）（ＮＡＧ）（ＮＡＧ）、（ＮＩＧ）（ＮＡＧ）（ＮＩＧ）、（ＮＩＧ）（ＮＩＧ）（ＮＡＧ）、（ＮＩＧ）（ＮＩＧ）（ＮＩＧ）［ここで、ＮはＣ又は５−メチルシトシンである］。本発明の化合物のオリゴヌクレオチド部分の（ＮＡＧ）ｍ部分が（ＮＩＧ）ｎを含むか又はそれからなることができることは理解されるべきである。この点で、ｎは、ｍと等しいか又はｍより小さい整数である。好ましい実施形態において、ｎはｍに等しく、したがって、本発明の化合物中でオリゴヌクレオチド部分の（ＮＡＧ）ｍ部分は（ＮＩＧ）ｍからなる。この実施形態において、少なくとも１つのアデニン核酸塩基が塩基修飾、特にヒポキサンチン核酸塩基を含有する。好ましくは、本発明の化合物のオリゴヌクレオチド部分の（ＮＡＧ）ｍ部分は、１、２、３、４、５、…、ｍ個のヒポキサンチン核酸塩基を含む。
【００７３】
したがって、好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、
（ａ）２−チオウラシル、２−チオチミン、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、チミン、２，６−ジアミノプリンから選ばれる少なくとも１つの塩基修飾、及び／又は
（ｂ）２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル、モルホリノ、架橋ヌクレオチド若しくはＢＮＡから選ばれる少なくとも１つの糖修飾、あるいは架橋ヌクレオチド及び２’−デオキシ修飾ヌクレオチドの両方（ＢＮＡ／ＤＮＡミックスマー又はギャップマー）、あるいは２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチルヌクレオチド及びＤＮＡヌクレオチドの両方（２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル／ＤＮＡミックスマー又はギャップマー）、及び／又は
（ｃ）ホスホロチオエート及びホスホルジアミデートから選ばれる少なくとも１つの骨格修飾
を含む。
【００７４】
別の好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、（ａ）上記塩基修飾のうちの１つ、及び／又は（ｂ）上記糖修飾のうちの１つ、及び／又は（ｃ）上記骨格修飾のうちの１つから選ばれる、１つ又は複数の同じ修飾によって、その長さ全体にわたって修飾されている。
【００７５】
好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド又は化合物のオリゴヌクレオチド部分は、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート、モルホリノホスホロジアミデート、ロックド核酸及びペプチド核酸からなる群から選ばれる少なくとも１つの修飾を含む。より好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド又は化合物のオリゴヌクレオチド部分は１つ又は複数の２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートモノマーを含む。より好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド又は化合物のオリゴヌクレオチド部分は２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートモノマーからなる。言い換えれば、本発明の化合物のオリゴヌクレオチド部分は２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであることが好ましい。好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド又は化合物のオリゴヌクレオチド部分は、２，６−ジアミノプリン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−メチルウラシル、チミン、８−アザ−７−デアザグアノシン、及び／又はヒポキサンチンから選ばれる少なくとも１つの塩基を含む。
【００７６】
ＬＧＡＱＳＮＦ／（ＮＡＧ）ｍにより表されるコンジュゲートの連結部分：
ＬＧＡＱＳＮＦ／（ＮＡＧ）ｍにより表される本発明の第一の態様の化合物を調製するために、本発明のこの態様のペプチド又はペプチド模倣体部分へのオリゴヌクレオチド部分のカップリングは、化合物をアミノ酸又はペプチドにカップリングさせるための知られた方法を介して生じる。一般的な方法は、部分を、ペプチド又はペプチド模倣体中の遊離アミノ基又は遊離ヒドロキシル基又は遊離カルボン酸基又は遊離チオール基に連結することである。一般的なコンジュゲーション方法は、チオール／マレイミドカップリング、アミド若しくはエステル若しくはチオエーテル結合形成、又は異種ジスルフィド形成を含む。当業者は、必要とされるカップリングを引き起こすために使用可能な標準的化学をよく知っている。オリゴヌクレオチド部分は、ペプチド部分に直接カップリングされても又はスペーサー若しくはリンカー分子を介してカップリングされてもよい。そのようなスペーサー又はリンカーは二価であって１つのペプチド若しくはペプチド模倣体部分と１つのオリゴヌクレオチド部分を連結しても、又は多価であってもよい。多価スペーサー又はリンカーは、２つ以上のペプチド又はペプチド模倣体部分と１つのオリゴヌクレオチド部分を連結するために使用され得る。二価及び多価のリンカー又はスペーサーは当業者に知られている。オリゴヌクレオチド部分は、本発明のこの態様のペプチド又はペプチド模倣体部分と共有結合する必要はない。それは、静電的相互作用を介して会合させるか、又はコンジュゲートされてもよい。そのような非共有結合も本発明の対象であり、「連結」に包含されると理解されるべきである。一実施形態において、本発明は、本発明のこの態様のペプチド又はペプチド模倣体部分及び前記ペプチド部分をオリゴヌクレオチド部分に連結するための連結部分を含む化合物にも関する。連結部分は、ペプチドでなくてもよく、又はペプチドであってもよい。連結部分は、例えば、生物活性を有するポリ−又はオリゴヌクレオチドと複合体形成する（ポリ）カチオン性基であってもよい。そのような（ポリ）カチオン性基は、スペルミン又はポリエチレンイミン、ポリ−オルニチン、ポリ−リジン、ポリ−アルギニンなどの線状の又は分岐した異形であってもよい。連結部分は、中性、例えば、ポリエチレングリコールを含むか又はそれからなる連結部分であってもよい。
【００７７】
本発明の第一の態様の化合物のペプチド又はペプチド模倣体部分は、Ｃ−末端を介して、Ｎ−末端を介して、又はアミノ酸側鎖を介して、オリゴヌクレオチド部分に連結、カップリング、又はコンジュゲートすることができ、オリゴヌクレオチド部分の特別なヌクレオチドの塩基、骨格又は糖部分を介して５’−末端ヌクレオチド、３’−末端ヌクレオチド又は非末端ヌクレオチドに連結され得る。
【００７８】
オリゴヌクレオチド部分をペプチド部分にカップリング又は連結する任意の可能な知られた方法が、本発明のこの態様において、本発明のこの態様の化合物を得るために使用されてよい。ペプチド部分は、チオエーテル、アミド、アミン、オキシム、ジスルフィド、チアゾリジン、尿素、チオウレア、エステル、チオエステル、カーバメート、チオカーバメート、カーボネート、チオカーボネート、ヒドラゾン、スルフェート、スルファミデート、ホスフェート、ホスホロチオエート、若しくはグリオキシル酸オキシム部分を含むリンカー、又は、ディールス・アルダー環化付加、シュタウディンガー・ライゲーション、自然のライゲーション若しくはヒュイスゲン１，３−双極子環化付加を介して得られる連結、又は銅触媒によるその変形を含む（それらに限定されない）連結を介してオリゴヌクレオチド部分にカップリング又は連結され得る。好ましい実施形態において、連結はチオエーテル部分を含む。一実施形態において、本発明は、ＬＧＡＱＳＮＦを含むペプチド部分及び（ＮＡＧ）ｍ［式中、Ｎは５−メチルシトシンである。］を含むオリゴヌクレオチド部分を含む化合物を提供し、前記化合物は式Ａにより表される。
【００７９】
【化１】
2014513946.tif 000002
【００８０】
式中、
Ｒ１は、
【化２】
2014513946.tif 000003
であり；
Ｒ２はアセチル又はＨであり；
Ｒ３は、置換又は非置換（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１０）シクロアルキル、アリール、又は（Ｃ１〜Ｃ１０）アラルキルであり；
Ｒ４は、（Ｃ１〜Ｃ１５）アルキル、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ポリエチレングリコール又は誘導体であり；
ＸはＳ、Ｃ＝Ｏ又はＮＨであり；
ＹはＳ又はＮＨであり；
ＺはＳ又はＯであり；
ｒ及びｓは０又は１であるが、ただし、ｒ＋ｓ＝０又は１であり、
ここでＲ１は、上記ペプチド部分のＮ−末端、Ｃ−末端又はアミノ酸側鎖においてアミド又はエステル結合を介してアミン又はアルコールと接続され；
さらにここで、Ｒ４は、上記オリゴヌクレオチド部分の５’又は３’に接続されている。
好ましくは、ｒ＝１の場合、Ｘ＝Ｓ又はＮＨである。
【００８１】
好ましい実施形態において、本発明のこの態様は、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかにより表される化合物を提供する。
【化３】
2014513946.tif 000004
【００８２】
2014513946.tif 000005
【００８３】
式Ｉによる化合物において、Ｘはペプチド部分のＮ−末端アミノ基である。式ＩＩによる化合物において、Ｘはペプチド部分のＣ−末端カルボキシル基である。式ＩＩＩ〜ＶＩＩＩによる化合物のいずれかにおいて、Ｒ１は、アミド結合を介してペプチド部分のＮ−末端に接続される。化合物Ｖ、ＶＩ及びＶＩＩにおいて、「シクロヘキシル」は「シクロヘキサン−１，４−ジイル」又は「１，４−シクロヘキサンジイル」である。
【００８４】
式Ｉ中に表されるコンジュゲーションは当業者に周知であるが、好ましくは、実施例に記載の方法で合成される。同様に、他のコンジュゲーション方法が当業者に周知であるか、又は本分野で知られるであろう。ペプチド部分は、Ｎ−末端、Ｃ−末端又はアミノ酸側鎖からオリゴヌクレオチド部分に連結されることができ、５’−末端ヌクレオチドから連結されることができる。当業者は、ペプチド部分が、３’−末端ヌクレオチド又は非末端モノマーにも、その特別なモノマーの塩基、骨格又は糖部分により連結され得ることを理解するであろう。本発明のこの態様の同程度に好ましい化合物は、オリゴヌクレオチドがその３’−末端を介して連結部分に取り付けられることを除いて、化合物Ｉ〜ＶＩＩＩと同一である。
【００８５】
脱塩基部位又はモノマーが、本発明の化合物のオリゴヌクレオチド部分の末端に存在するか又は取り付けられている場合、ペプチド部分は同じ末端に取り付けられない。したがって、ペプチド部分がオリゴヌクレオチド部分の５’末端にカップリングされる場合、脱塩基部位又はモノマーは、（組み込まれるならば）オリゴヌクレオチド部分の３’末端に取り付けられる。
【００８６】
ＬＧＡＱＳＮＦ／（ＮＡＧ）ｍにより表されるコンジュゲートのペプチド部分：
上述の通り、本発明のこの態様の化合物のペプチド部分はＬＧＡＱＳＮＦを含むか又はそれからなる。本発明のこの態様の関連において、ペプチド部分は少なくとも７個のアミノ酸を含む。本発明のこの態様の化合物は、本明細書中で同定されているペプチド部分を２つ以上含んでもよく、本発明のこの態様の化合物は、すべてが本明細書中で同定されている、オリゴヌクレオチド部分に連結した１、２、３、４、５、６、７、８個のペプチド部分を含んでもよい。ペプチドは、天然のＬ−アミノ酸により完全に構築されることができ、又はＬ−アミノ酸に関して１つ又は複数の骨格及び／又は側鎖への修飾を含むことができる。これらの修飾は、天然アミノ酸への類似性を示すアミノ酸模倣体の取り込みによって導入可能である。アミノ酸の１つ又は複数の模倣体を含む上記ペプチド群は、ペプチド模倣体と呼ばれる。本発明のこの態様の関連において、アミノ酸の模倣体は、β２−及びβ３−アミノ酸、β２，２、β２，３、及びβ３，３−二置換アミノ酸、α，α−二置換アミノ酸、アミノ酸のスタチン誘導体、Ｄ−アミノ酸、α−ヒドロキシ酸、α−アミノニトリル、Ｎ−アルキルアミノ酸などを含む（これらに限定されない）。さらに、本発明のこの態様のペプチド部分中のアミノ酸は、１つ又は複数の炭化水素部位及び／又は誘導体でグリコシル化されてもよく、又はリン酸化されてもよい。
【００８７】
さらに、ペプチドのＣ−末端は、カルボン酸若しくはカルボキサミド、又は上記アミノ酸模倣体のうちの１つの取り込みの結果としての他のものでもあり得る。さらに、上記のペプチド部分は、スルホンアミド、レトロアミド、アミノオキシ含有結合、エステル、アルキルケトン、α，α−ジフルオロケトン、α−フルオロケトン、ペプトイド結合（Ｎ−アルキル化グリシルアミド結合）を含む（それらに限定されない）基による、１つ又は複数の天然のペプチド結合の置換を含んでもよい。さらに、上記のペプチド部分は（対応する天然アミノ酸の側鎖に関する）アミノ酸側鎖中に、例えば、４−フルオロフェニルアラニン、４−ヒドロキシリジン、３−アミノプロリン、２−ニトロチロシン、Ｎ−アルキルヒスチジン又は天然のキラリティーを妨害するβ−側鎖炭素原子におけるキラリティーを有するβ−分岐アミノ酸若しくはβ−分岐アミノ酸模倣体（例えば、アロ−トレオニン、アロ−イソロイシン及び誘導体）などの置換を含んでもよい。他の一実施形態において、上記ペプチドは、アミノ酸のよく似た構造的類似体又はアミノ酸模倣体、例えば、リジンの代わりにオルニチン、フェニルアラニンの代わりにホモフェニルアラニン又はフェニルグリシン、グリシンの代わりにβ−アラニン、グルタミン酸の代わりにピログルタミン酸、ロイシン、あるいはメチオニン及び／又はシステインの硫黄酸化形の代わりにノルロイシンなどを含んでもよい。この特許は、上記ペプチド部分の線状及び環化形態、並びに上記ペプチド部分のレトロ、インベルソ及び／又はレトロインベルソ類似体に及ぶ。当業者にはもっと多くのよく似た異形が知られ得るが、これらが本明細書中で言及されないことは本発明の範囲を限定するものではない。一実施形態において、本発明のこの態様のペプチド部分又はペプチド模倣体部分は、最大３０アミノ酸の長さ、又は少なくとも２５個のアミノ酸、又は２０個のアミノ酸、又は１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８若しくは７アミノ酸の長さである。好ましいペプチド部分は、ＸＸＸＬＧＡＱＳＮＦＸＸＸ［式中、Ｘは任意のアミノ酸であってもよい。］などの、ＬＧＡＱＳＮＦを含むか又はそれからなり、少なくとも０、１、２、３個、又は３個を超えるアミノ酸をＮ−末端及び／又はＣ−末端に有する。
【００８８】
適用：
本発明の化合物又はオリゴヌクレオチドは、ＤＭ１／ＤＭＰＫ、ＳＣＡ８、又はＪＰＨ３遺伝子の転写物中のリピート伸長によりそれぞれ引き起こされる筋強直性ジストロフィー１型、脊髄小脳失調症８型、及び／又はハンチントン病類縁疾患２型としてのヒト遺伝性疾患の治療、遅延及び／又は予防、及び／又は処置、及び／又は治癒、及び／又は緩和のために特に有用である。好ましくは、これらの遺伝子はヒトに由来する。ヒトＤＭＰＫ、ＳＣＡ８、ＪＰＨ３遺伝子の好ましいゲノムＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号１０、１１、１２により表される。ヒトＤＭＰＫ、ＳＣＡ８、ＪＰＨ３遺伝子の対応する好ましいコーディングｃＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号１３、１４、１５により表される。
【００８９】
好ましい実施形態において、本明細書において設計された化合物又はオリゴヌクレオチドが、患者の細胞中、患者の組織中及び／又は患者におけるＤＭ１／ＤＭＰＫ、ＳＣＡ８又はＪＰＨ３遺伝子の病的なアレルの転写物中のＣＵＧリピートの数を低減又は減少させることができる場合、本発明の関連において、この化合物又はオリゴヌクレオチドは、ＤＭ１／ＤＭＰＫ、ＳＣＡ８又はＪＰＨ３遺伝子の転写物中のＣＵＧリピート伸長により引き起こされる筋強直性ジストロフィー１型、脊髄小脳失調症８型及び／又はハンチントン病類縁疾患２型としてのヒト遺伝性疾患を遅延させ、及び／又は治癒させ、及び／又は治療し、及び／又は予防し、及び／又は寛解させることができる。
【００９０】
患者の大多数とは言いながら、「純粋な」ＣＵＧリピートが前記患者のゲノム中の転写された遺伝子配列中に存在する。しかしながら、いくらかの患者において、例えば、前記リピートに前記リピートのヌクレオチドに当てはまらない少なくとも１、２又は３個のヌクレオチドが点在している場合、前記リピートが「純粋」であるとは認定されないか、又は「異形」として認定される（Ｂｒａｉｄａ  Ｃ．ら）ということも本発明に包含される。
【００９１】
本発明のオリゴヌクレオチドは標的ＣＵＧリピートに１００％逆相補的でなくてもよい。通常、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＣＵＧリピートに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％逆相補的であってもよい。
【００９２】
ＤＭ１の場合、ＣＵＧリピートは、ＤＭＰＫ転写物のエキソン１５中に存在する。ヒトを含む対象のゲノム中のＤＭＰＫ遺伝子の転写された遺伝子配列中で、ＣＵＧリピートは、トリヌクレオチド反復ユニットＣＵＧを含む、少なくとも３０、３５、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、７０、１００、２００、５００個又は５００個を超える反復ユニットＣＵＧの連続した繰り返しとして本明細書中で定義され得る。
【００９３】
脊髄小脳失調症８型の場合、リピート伸長は、ＳＣＡ８遺伝子の３’ＵＴＲ中に位置する。ＳＣＡ８遺伝子座は、二方向に転写され、（ＣＵＧ）ｎ又は（ＣＡＧ）ｎ伸長のいずれかを有するＲＮＡを生成する。（ＣＡＧ）ｎ伸長転写物は、ほとんど純粋のポリグルタミン（ｐｏｌｙＱ）タンパク質を生成する。本明細書において、ＣＵＧ又はＣＡＧリピートはそれぞれ、ヒトを含む対象のゲノム中のＳＣＡ８遺伝子の転写された遺伝子配列における、ＣＵＧトリヌクレオチド反復ユニットを含む、少なくとも６５、７０、７５、８０、１００、２００、５００個又は５００個を超える反復ユニットＣＵＧの連続した繰り返し、又はＣＡＧトリヌクレオチド反復ユニットを含む、少なくとも６５、７０、７５、８０、１００、２００、５００個又は５００個を超える反復ユニットＣＡＧの連続した繰り返しとして定義され得る。
【００９４】
ハンチントン病類縁疾患２型は、ＪＰＨ３遺伝子の転写物中の（ＣＵＧ）ｎ伸長により引き起こされる。ＪＰＨ３転写物のオルタナティブスプライシングに依存して、ＣＵＧリピートはイントロン中、３’ＵＴＲ又はポリロイシン若しくはポリアラニントラクトをコードするコード領域中にある。ヒトを含む対象のゲノム中のＪＰＨ３遺伝子の転写された遺伝子配列中で、ＣＵＧリピートは、トリヌクレオチド反復ユニットＣＵＧを含む反復ユニットＣＵＧの、少なくとも３５、４０、４１、４５、５０、５５、６０個又は６０個を超える連続した繰り返しとして本明細書中で定義され得る。
【００９５】
本発明全体にわたって、ＣＵＧリピートという語は（ＣＵＧ）ｎで置き換え可能であり、ここで、前記リピートが健康な個体のＤＭＰＫ転写物のエキソン１５中に存在する場合、ｎは１０、２０、３０又は３０以下の整数であり、前記リピートが健康な個体のＳＣＡ８遺伝子中に存在する場合、２０、３０、４０、５０、６０、６５又は６５以下であり、又は前記リピートが健康な個体のＪＰＨ３遺伝子中に存在する場合、１０、２０、３０、３５又は３５以下である。ＤＭ１、脊髄小脳失調症８型又はハンチントン病の患者の場合、ｎは上記以外の値を有し得る。
【００９６】
好ましくは、それは、本発明の化合物又はオリゴヌクレオチドが、上記患者に細胞中、上記患者の組織中及び／又は患者における、伸長する又は不安定な数のＣＵＧリピートを含む、疾患に関連するか又は疾患の原因であるか又は変異体である転写物の検出可能な量を低減させることを意味する。先の文章の代りに又はそれと併せて、上記化合物は、上記変異転写物の翻訳を低減させ得る。ＣＵＧリピートの数又は上記変異転写物の量の低減又は減少は、治療前のＣＵＧリピートの数又は上記変異転写物の量と比較して、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％であってもよい。前記低減は、好ましくは実験パートにおいて実施されるノーザンブロッティング又はＱ−ＲＴ−ＰＣＲにより評価され得る。本発明の化合物又はオリゴヌクレオチドは、実験において使用される、５００個のＣＵＧリピートを含む細胞系において最初に試験され得る。
【００９７】
本発明の関連において、先の好ましい実施形態の代わりに又はそれと併せて、本明細書中で設計される本発明の化合物又はオリゴヌクレオチドが、個体における筋強直性ジストロフィー１型、脊髄小脳失調症８型及び／又はハンチントン病類縁疾患２型の１つ又は複数の症状及び／又は特徴を緩和し、及び／又は筋強直性ジストロフィー１型、脊髄小脳失調症８型及び／又はハンチントン病類縁疾患２型と結びついた又は関連するパラメータを改善することができる場合、この化合物又はオリゴヌクレオチドは、ＤＭ１／ＤＭＰＫ、ＳＣＡ８又はＪＰＨ３遺伝子転写物中のＣＵＧリピート伸長により引き起こされる筋強直性ジストロフィー１型、脊髄小脳失調症８型及び／又はハンチントン病類縁疾患２型としてのヒト遺伝性疾患を遅延させ、及び／又は治癒させ、及び／又は治療し、及び／又は予防し、及び／又は寛解させることができる。本明細書中で定義される本発明の化合物又はオリゴヌクレオチドの用量を使用する治療の少なくとも１週間、１ヶ月、６か月、１年後又は１年後より後に、上記パラメータが改善されたか又は上記症状若しくは特徴が低減したと言える場合には、本明細書中で定義される化合物又はオリゴヌクレオチドは、１つのパラメータを改善するか又は症状若しくは特徴を低減させることができる。
【００９８】
これに関連した改善は、上記パラメータが健常者の前記パラメータの値の方向に及び／又は治療開始時の同個体における前記パラメータの値に相当する前記パラメータ値の方向に有意に変化したことを意味し得る。
【００９９】
これに関連した低減又は緩和は、上記症状又は特徴が、健常者に特徴的な上記症状又は特徴の非存在の方向に及び／又は治療の開始時の同個体の状態に相当する症状又は特徴の変化の方向に有意に変化したことを意味し得る。
【０１００】
これに関連して、筋強直性ジストロフィー１型の好ましい症状は、筋強直、筋力又はつまずき及び転倒である。これらの各症状は、文献記載の公知の方法を用いて医師によって評価され得る。
【０１０１】
筋強直は、ＥＭＧ（筋電図）を用いて評価されることができる。ＥＭＧは、当業者に知られた、筋強直性ジストロフィーにおける握力、筋強直、及び／又は疲労の定量試験である（Ｔｏｎｅｓ  Ｃ．ら）。本明細書中で同定されている本発明の化合物の用量を使用する治療の好ましくは少なくとも１週間、１ヶ月、６か月、１年後又は１年後より後に、ＥＭＧによって評価された筋強直の、健常者のＥＭＧパターンの方向への検出可能な低減がある場合、本発明者らは、好ましくは上記筋強直が低減したか又は緩和されたと結論する。
【０１０２】
筋強直性ジストロフィー１型の他の好ましい症状は、筋力（Ｈｅｂｅｒｔら）、又はつまずき若しくは転倒の低減（Ｗｉｌｅｓら）である。ここでも、本明細書中で同定されている本発明の化合物又はオリゴヌクレオチドの用量を使用する治療の好ましくは少なくとも１週間、１ヶ月、６か月、１年後又は１年後より後に、健常者の筋力又はつまずき及び転倒の方向への、検出可能な筋力の改善又は検出可能なつまずき及び転倒の低減がある場合、本発明者らは、好ましくは上記筋力が改善されたか又は上記つまずき及び転倒が低減したか若しくは緩和されたと結論する。
【０１０３】
これに関連して、脊髄小脳失調症８型の好ましい症状は、歩行障害並びに上部運動ニューロン機能不全、嚥下障害、末梢性感覚障害を含む運動制御の一般的欠如を含む、運動失調、固有受容及び共同作用の欠如を含む。これらの各症状は、文献記載の公知の方法を用いて医師によって評価され得る。運動失調は、静的重心動揺検査又は動的重心動揺検査などの、文献記載の公知の方法を用いて医師によって評価され得る。静的重心動揺検査は、本質的に、バランス及び振動の様々な側面を測定する。ＳＣＡ８に関連する症状の存在を診断するための技術の使用についての文献はわずかであるが、本発明者らは、ＳＣＡ６としての他の密接に関連した兆候における同じ症状を診断するために使用され得る技術が、ＳＣＡ８を診断するために使用され得ると推測した（Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｊａｎｕａｒｉｏら）。例えば、ＩＣＡＲＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ａｔａｘｉａ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃｏｒｅ）は、（Ｎａｋａｍｕｒａら又はＴｒｏｕｉｌｌａｓ  Ｐ．らにおいて評価された）ＳＣＡ８を診断するために使用され得る。別の例として、ＯＡＳＩ（全安定度指数（Ｏｖｅｒａｌｌ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ））は、（Ｊａｎｕａｒｉｏらにおいて評価された）ＳＣＡ８を診断するために使用され得る。
【０１０４】
より微細な運動機能スキルに関しては、ここでもこの兆候について特異的又は有効なものではないが、ジェブソン・タイムド検査（Ｊｅｂｓｏｎ  ｔｉｍｅｄ  ｔｅｓｔ）、パーデュー・ペグボード検査（Ｐｅｒｄｕｅ  Ｐｅｇｂｏａｒｄ  ｔｅｓｔ）又は９ペグホール検査（９  ｐｅｇ  ｈｏｌｅ  ｔｅｓｔ）などの一般的な上肢機能検査が考慮され得る。本明細書中で同定されている本発明の化合物又はオリゴヌクレオチドの用量を使用する治療の好ましくは少なくとも１週間、１ヶ月、６か月、１年後又は１年後より後に、脊髄小脳失調症８型のこれらの症状のうちの少なくとも１つの検出可能な低減、あるいは上述のように評価されたＩＣＡＲＳ及び／又はＯＡＳＩの検出可能な変化が、健常者の前記症状の値あるいは前記ＩＣＡＲＳ又はＯＡＳＩの値の方向にある場合、本発明者らは、好ましくは前記症状又は前記ＩＣＡＲＳ若しくはＯＡＳＩが、本発明の化合物を用いて低減したか又は緩和されたか又は変更されたと結論する。
【０１０５】
これに関連して、ハンチントン病類縁疾患２型の好ましい症状は、舞踏病及び／又はジストニア舞踏病及び／又はジストニアを含む。これらの各症状は、文献記載の公知の方法を用いて医師によって評価され得る。それらは、遺伝子検査（Ｗａｌｋｅｒら）により、及びＵｎｉｆｉｅｄ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ（Ｍｏｖｅｍｅｎｔ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｖｏｌ．ＩＩ，Ｎｏ．２，１９９６，ｐｐ．１３６〜１４２及びＭａｈａｎｔら）などの尺度を使用することによる臨床評価によって診断され得る。本明細書中で同定されている本発明の化合物又はオリゴヌクレオチドの用量を使用する治療の好ましくは少なくとも１週間、１ヶ月、６か月、１年後又は１年後より後に、上述のように評価されたハンチントン病類縁疾患２型のこれらの症状のうちの少なくとも１つの検出可能な低減が、健常者の前記症状の値の方向にある場合、本発明者らは、好ましくは前記症状が、本発明の化合物又はオリゴヌクレオチドを用いて低減したか又は緩和されたと結論する。
【０１０６】
筋強直性ジストロフィー１型に関するパラメータは、（ＣｌＣ−１、ＳＥＲＣＡ、ＩＲ、Ｔｎｎｔ、Ｔａｕなどの）一定の転写物のスプライシングパターンであってもよい。筋強直性ジストロフィーは、多種多様の転写物に関する胚のスプライシングパターンを特徴とする（筋強直性ジストロフィーのマウスモデルにおける異常なオルタナティブスプライシング及び細胞外マトリックス遺伝子発現；Ｈｏｎｇｑｕｉｎｇ  Ｄ．ら）。これらの遺伝子のスプライシングパターンは、ＰＣＲを用いて、又はゲノムスクリーンを用いて可視化可能である。本明細書中で同定されている本発明の化合物又はオリゴヌクレオチドの用量を使用する治療の少なくとも１ヶ月、６か月後又は６か月後より後に、対応する遺伝子の野生型のスプライシングパターンの方向に、上で同定された遺伝子のうちの少なくとも１つの胚のスプライシングパターンが変更されたことが見出された場合、本発明の化合物又はオリゴヌクレオチドは、個体における筋強直性ジストロフィー１型に結びついた又は関連するパラメータを改善することができると言える。
【０１０７】
筋強直性ジストロフィー１型の別のパラメータは（血中グルコース及びＨｂＡ１ｃレベルにより測定される）インスリン抵抗性であってもよく、その正常範囲はそれぞれ、３．６〜５．８ｍｍｏｌ／Ｌ及び３〜８ｍｍｏｌ／Ｌである。これらの値の正常範囲の方向への又は正常範囲内への低減は明確な利益を示すであろう。本明細書中で同定されている本発明の化合物又はオリゴヌクレオチドの用量を使用する治療の少なくとも１ヶ月、６か月後又は６か月後より後に、これらの値の少なくとも１つが野生型の値の方向に変更されたことが見出された場合、本発明の化合物又はオリゴヌクレオチドが、個体における筋強直性ジストロフィー１型に結びついた又は関連するパラメータを改善することができると言える。
【０１０８】
筋強直性ジストロフィー１型の別のパラメータは、核内のＲＮＡ−ＭＢＮＬ（マッスルブラインドプロテイン（ｍｕｓｃｌｅ  ｂｌｉｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ））焦点又は核内封入体の数であり、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて可視化され得る。ＤＭ１患者は、彼らの核内に５〜２０個のＲＮＡ−ＭＢＮＬ焦点を有する（Ｔａｎｅｊａ  ＫＬら）。核内封入体又は焦点は、ＤＭ１患者の細胞の核内に存在し、健常者の細胞の核内には存在しない凝集体又は異常構造と定義され得る。核内の焦点又は核内封入体の数が（ＦＩＳＨで分析して）変化したことが見出され、好ましくは、治療開始時の核焦点又は核内封入体の数と比較して減少していることが見出された場合、本発明の化合物又はオリゴヌクレオチドが、個体における筋強直性ジストロフィーに結びついた又は関連するパラメータを改善することができると言える。治療開始時の焦点又は核内封入体の数と比較した焦点又は核内封入体の数の減少は、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％であり得る。好ましくは、マッスルブラインドプロテインＭＢＮＬは、（免疫蛍光顕微鏡法により分析され得るように）これらの焦点又は核内封入体から脱離し、より好ましくは、細胞中で自由に利用可能である。ＲＮＡ−ＭＢＮＬ数の減少は、治療開始時のＲＮＡ−ＭＢＮＬ数と比較して、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％であり得る。細胞中で自由に利用可能なＭＢＮＬは、免疫蛍光顕微鏡法を用いて検出可能であり：ＭＢＮＬのより拡散した染色が見られ、核（ＣＵＧ）ｎ焦点又は核内封入体と共局在するものは少なくなっているか又はない。
【０１０９】
脊髄小脳失調症８型に関するパラメータは、（好ましくはウエスタンブロッティングにより評価される）ポリグルタミンタンパク質の量の減少若しくは低下及び／又は（好ましくは免疫蛍光顕微鏡法により評価される）核ポリグルタミン封入体の数の減少若しくは低下を含む。ポリグルタミンタンパク質封入体を形成する（ＣＡＧ）ｎ転写物の他に、（ＣＵＧ）ｎ転写物がＦＩＳＨを用いて可視化可能な核内封入体又は焦点を形成する。ポリグルタミンタンパク質及び核内封入体の存在は、ニューロンにおいて評価されることが好ましい。核内封入体又は焦点は、脊髄小脳失調症８型患者の細胞の核内に存在し、健常者の細胞の核内には存在しない凝集体又は異常構造と定義され得る。核内の焦点又は核内封入体の数が（ＦＩＳＨで分析して）変化したことが見出され、好ましくは、治療開始時の核焦点又は核内封入体の数と比較して減少していることが見出された場合、本発明の化合物又はオリゴヌクレオチドが、個体における脊髄小脳失調症８型に結びついた又は関連するパラメータを改善することができると言える。治療開始時の焦点又は核内封入体の数と比較した焦点又は核内封入体の数の減少は、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％であり得る。ポリグルタミンタンパク質の量の減少は、治療開始時の前記タンパク質の量と比較して、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％であり得る。別のパラメータは、（ＣＵＧ）ｎ転写物又は上記変異転写物の量の減少であり得る。これは、治療開始時に検出された前記転写物の量と比較して、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％であり得る。
【０１１０】
ハンチントン病類縁疾患２型に関するパラメータは、病原性ポリロイシン又はポリアラニントラクトの減少又は低下を含む（ウエスタンブロッティング及び免疫蛍光顕微鏡法）。ポリロイシン又はポリアラニントラクトの量又は量の減少は、治療開始時に評価された前記トラクトの量と比較して、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％であり得る。別のパラメータは、（ＣＵＧ）ｎ転写物又は上記変異転写物の量の減少であり得る。これは、治療開始時に検出された前記転写物の量と比較して、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％であり得る。ハンチントン病類縁疾患２型のための別のパラメータは、筋強直性ジストロフィーと同様、核内のＲＮＡ−ＭＢＮＬ（マッスルブラインドプロテイン）焦点の数を含む。
【０１１１】
本発明の化合物又はオリゴヌクレオチドは、筋強直性ジストロフィー１型、脊髄小脳失調症８型及び／又はハンチントン病類縁疾患２型に罹患したか又は発症するリスクのある個体の細胞、組織及び／又は器官へのインビボでの直接投与に好適であり、インビボ、エクスビボ又はインビトロで直接投与され得る。個体、対象又は患者は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。これに関連した組織又は器官は血液であり得る。
【０１１２】
好ましい実施形態において、化合物又はオリゴヌクレオチドの濃度は０．０１ｎＭ〜１μＭの範囲内で使用される。より好ましくは、使用される濃度は０．０５〜４００ｎＭ、又は０．１〜４００ｎＭ、又は０．０２〜４００ｎＭ、又は０．０５〜４００ｎＭ、さらに好ましくは１〜２００ｎＭである。好ましい濃度は、０．０１ｎＭ〜１μＭである。より好ましくは、使用される濃度は０．３〜４００ｎＭ、さらに好ましくは、１〜２００ｎＭである。
【０１１３】
本発明の化合物又はオリゴヌクレオチドの用量範囲は、厳格なプロトコールが必要とされる臨床試験（インビボ使用）における漸増投与試験（ｒｉｓｉｎｇ  ｄｏｓｅ  ｓｔｕｄｙ）に基づいて設計されることが好ましい。本明細書中で定義される化合物又はオリゴヌクレオチドは、０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ、又は０．０１〜２５０ｍｇ／ｋｇ、又は０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ、又は０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ、又は０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、又は０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｋｇにわたる用量で用いられることができる。
【０１１４】
上述の化合物又はオリゴヌクレオチドの濃度又は用量範囲は、インビトロ又はエクスビボ使用のための好ましい濃度又は用量である。当業者は、使用される化合物又はオリゴヌクレオチドの同一性、治療される標的細胞、標的遺伝子及びその発現レベル、使用される媒体並びにトランスフェクション及びインキュベーション条件によって、使用される化合物又はオリゴヌクレオチドの濃度又は用量がさらに変化し、さらに最適化される必要があり得ることを理解するであろう。
【０１１５】
より好ましくは、筋強直性ジストロフィー１型、脊髄小脳失調症８型及び／又はハンチントン病類縁疾患２型の予防、治療又は遅延のために、本発明において使用される化合物又はオリゴヌクレオチドは、合成により生産され、細胞、組織、器官及び／又は患者若しくは個体若しくは対象に、薬学的に許容される組成物に製剤化された形態で直接投与される。本発明の化合物又はオリゴヌクレオチドの投与は、局所的、局部的、全身的及び／又は腸管外であってもよい。上記医薬組成物の対象への送達は、１つ又は複数の腸管外注射、例えば、静脈内及び／又は皮下及び／又は筋肉内及び／又は髄腔内及び／又は鼻腔内及び／又は脳室内及び／又は腹腔内、眼内、尿路内、腸内、ガラス体内、脳内、髄腔内、硬膜外及び／又は経口投与、好ましくはヒトの体の１つ又は複数の部位における注射により実施されることが好ましい。（脳脊髄液中への）髄腔内又は脳室内投与は、拡散ポンプを対象の体内に導入することによって実施されることが好ましい。数種の拡散ポンプが当業者に知られている。本明細書中で定義される化合物又はオリゴヌクレオチドを標的化するために使用されるべき医薬組成物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎらにおいて見出され得る希釈剤、充填剤、防腐剤、可溶化剤などの様々な賦形剤を含み得る。本発明において記載される化合物は、少なくとも１つのイオン化基を有してもよい。イオン化基は、塩基又は酸であってもよく、荷電しているか又は中性であってもよい。イオン化基は、反対の電荷を担持する適切な対イオンを有するイオン対として存在することができる。カチオン性対イオンの例は、ナトリウム、カリウム、セシウム、トリス、リチウム、カルシウム、マグネシウム、トリアルキルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、及びテトラアルキルアンモニウムである。アニオン性対イオンの例は、塩素、臭素、ヨウ素、ラクテート、メシレート、アセテート、トリフルオロアセテート、ジクロロアセテート及びシトレートである。対イオンの例は文献（例えば、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれるＫｕｍａｒら）に記載されている。本発明の化合物又はオリゴヌクレオチドは塩形態で調製され得る。好ましくは、それはナトリウム塩として調製される。本発明の化合物又はオリゴヌクレオチドは、場合により、医薬として許容される希釈剤及び担体を含む薬学的に許容される溶液又は組成物であってもよく、医薬として許容される添加剤が添加されて、製剤を所望のｐＨ及び／又は浸透圧とされてもよく、例えば、滅菌水又はリン酸バッファー中の溶液又は希釈物であって、酸又は塩基によって所望のｐＨに、有機又は無機塩によって所望の浸透圧とされてもよい組成物にさらに製剤化され得る。例えば、ＨＣｌを用いて溶液を所望のｐＨとしてもよく、また、ＮａＣｌを用いて溶液を所望の浸透圧としてもよい。
【０１１６】
医薬組成物は、上記化合物又はオリゴヌクレオチドの安定性、溶解性、吸収、バイオアベイラビリティー、活性、薬物動力学、薬物動態及び細胞取り込みを亢進することにおける賦形剤、特に、複合体、ナノ粒子、マイクロ粒子、ナノチューブ、ナノゲル、ハイドロゲル、ポロキサマー又はプルロニック、ポリマーソーム、コロイド、マイクロバブル、ベシクル、ミセル、リポプレックス及び／又はリポソームを形成することのできる賦形剤を含み得る。ナノ粒子の例は、ポリマーナノ粒子、金ナノ粒子、磁性ナノ粒子、シリカナノ粒子、脂質ナノ粒子、糖粒子、タンパク質ナノ粒子、及びペプチドナノ粒子を含む。
【０１１７】
ある実施形態において、本発明の化合物又はオリゴヌクレオチドは、ＤＭ１／ＤＭＰＫ、ＳＣＡ８、又はＪＰＨ３遺伝子の転写物中のリピート伸長によりそれぞれ引き起こされる筋強直性ジストロフィー１型、脊髄小脳失調症８型、及び／又はハンチントン病類縁疾患２型としてのヒトの遺伝性疾患の治療、遅延及び／又は予防、及び／又は処置、及び／又は治癒、及び／又は寛解のために使用されることが既に知られた別の化合物と一緒に使用されてもよい。そのような他の化合物はステロイドであってもよい。この併用は逐次的使用（各構成要素が異なる組成物中で投与される）であってもよい。あるいは、各化合物は単一の組成物中で一緒に使用されてもよい。
【０１１８】
本発明の方法において、本発明者らは、上記化合物又はオリゴヌクレオチドの安定性、溶解性、吸収、バイオアベイラビリティー、活性、薬物動力学、薬物動態並びに細胞へ及び細胞中への送達を亢進することをさらに助けるであろう賦形剤、特に、ベシクル又はリポソーム中に複合化又は捕捉された化合物、物質及び／又はオリゴヌクレオチドを細胞膜を通して送達する、複合体、ベシクル、ナノ粒子、マイクロ粒子、ナノチューブ、ナノゲル、ハイドロゲル、ポロキサマー又はプルロニック、ポリマーソーム、コロイド、マイクロバブル、ベシクル、ミセル、リポプレックス及び／又はリポソームを形成可能な賦形剤を使用することができる。ナノ粒子の例は、金ナノ粒子、磁性ナノ粒子、シリカナノ粒子、脂質ナノ粒子、糖粒子、タンパク質ナノ粒子、及びペプチドナノ粒子を含む。送達システムの別の群はポリマーナノ粒子である。これらの物質の多くは本分野で知られている。
【０１１９】
好適な物質は、ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ＥｘＧｅｎ５００、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）、ポリ（２−ヒドロキシプロピレンイミン）（ｐＨＰ）、デキストラン誘導体（例えば、ＤＮＡトランスフェクション試薬として周知のジエチルアミノエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストランなどのポリカチオンは、ブチルシアノアクリレート（ＰＢＣＡ）及びヘキシルシアノアクリレート（ＰＨＣＡ）と組み合わされて、細胞膜を横切って細胞中に上記化合物を送達することのできるカチオン性ナノ粒子を製剤化する）、ブチルシアノアクリレート（ＰＢＣＡ）、ヘキシルシアノアクリレート（ＰＨＣＡ）、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリアミン（例えば、スペルミン、スペルミジン、プトレシン、カダベリン）、キトサン、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（エステルアミン）、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、シクロデキストリン、ヒアルロン酸、コロミン酸及びその誘導体）、デンドリマー（例えば、ポリ（アミドアミン）、脂質｛例えば、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、塩化ジオレオイルジメチルアンモニウム（ＤＯＤＡＣ）、ホスファチジルコリン誘導体［例えば、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）］、リソ−ホスファチジルコリン誘導体［例えば、１−ステアロイル−２−リソ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｓ−ＬｙｓｏＰＣ）］、スフィンゴミエリン、２−｛３−［ビス−（３−アミノ−プロピル）−アミノ］−プロピルアミノ｝−Ｎ−ジテトラセジル−カルバモイルメチルアセトアミド（ＲＰＲ２０９１２０）、ホスホグリセロール誘導体［例えば、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール、ナトリウム塩（ＤＰＰＧ−Ｎａ）］、ホスファチジン酸誘導体［１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジン酸、ナトリウム塩（ＤＳＰＡ）］、ホスファチジルエタノールアミン誘導体［例えば、ジオレオイル−Ｌ−Ｒ−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）］、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）、１，３−ジ−オレオイルオキシ−２−（６−カルボキシ−スペルミル）−プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）、（１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、（Ｎ１−コレステリルオキシカルボニル−３，７−ジアザノナン−１，９−ジアミン（ＣＤＡＮ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、（ｂ−Ｌ−アルギニル−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレリル−アミドトリヒドロクロライド（ＡｔｕＦＥＣＴ０１）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン誘導体［例えば、１，２−ジステアロイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン］（ＤＳＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤｏＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、ホスファチジルセリン誘導体［１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン、ナトリウム塩（ＤＯＰＳ）］、コレステロール｝、合成両親媒性物質（ＳＡＩＮＴ−１８）、リポフェクチン、タンパク質（例えば、アルブミン、ゼラチン、アテロコラーゲン）、ペプチド（例えば、ＰｅｐＦｅｃｔｓ、ＮｉｃｋＦｅｃｔｓ，ポリアルギニン、ポリリジン、ＣＡＤＹ、ＭＰＧ）、それらの組み合わせ及び／又は上記化合物又はオリゴヌクレオチドを細胞に送達することのできる粒子に自己集合することのできるウイルスカプシドタンパク質を含む。リポフェクチンは、リポソームトランスフェクション剤の例を代表する。それは、２つの脂質構成要素、カチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）（ｃｐ．メチル硫酸塩であるＤＯＴＡＰ）及び中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる。中性構成要素は細胞内放出を仲介する。
【０１２０】
これらのナノ粒子材料に加えて、カチオン性ペプチドプロタミンは、上記化合物又はオリゴヌクレオチドをコロイドとして製剤化するための別のアプローチを提案する。このコロイド状ナノ粒子システムは、本明細書中で定義される化合物をひとまとめにして、その細胞内放出を仲介するための単純な自己集合過程によって調製されることができる、いわゆるプロティクル（ｐｒｏｔｉｃｌｅ）を形成することができる。当業者は、ヒトにおける筋強直性ジストロフィー１型、脊髄小脳失調症８型及び／又はハンチントン病類縁疾患２型を治療し、予防及び／又は遅延させるために、本発明における使用のために化合物又はオリゴヌクレオチドを送達し、そのような化合物又はオリゴヌクレオチドをひとまとめにし、送達するように、上記のいずれか又は他の市販の又は市販されていない別の賦形剤及び送達システムを選択し、構成することができる。
【０１２１】
さらに、別のリガンドが、細胞、細胞質及び／又はその核中へのその取り込みを容易化するために特別に設計された化合物又はオリゴヌクレオチドに、共有結合で又は非共有結合で連結され得る。そのようなリガンドは、上記化合物又はオリゴヌクレオチドのエンドソーム又はリソソームなどのベシクルからの（ｉ）細胞取り込みを容易化する、細胞、組織若しくは器官特異的な要素を認識する（ペプチド（様）構造を含むが、それに限定されない）化合物及び／又は（ｉｉ）細胞中への取り込み及び／又は細胞内放出を容易化することのできる化学化合物を含み得る。そのような標的化リガンドは、上記化合物又はオリゴヌクレオチドの、血液脳関門を通る脳内への取り込みを容易化する分子も包含するであろう。本発明の関連の中で、本発明の化合物のペプチド部分は既にリガンドと見なし得る。
【０１２２】
したがって、好ましい実施形態において、本明細書中で定義される化合物又はオリゴヌクレオチドは、医薬の一部であるか、又は医薬であるとみなされ、少なくとも１つの賦形剤及び／又は送達のための標的化リガンド及び／又は上記化合物又はオリゴヌクレオチドの細胞への及び／又はその細胞内送達を亢進する送達デバイスとともに提供される。したがって、本発明は、上記化合物又はオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも１つの賦形剤及び／又は送達のための標的化リガンド及び／又は上記化合物の細胞への及び／又はその細胞内送達を亢進する送達デバイスをさらに含む、薬学的に許容される組成物も包含する。
【０１２３】
しかしながら、本発明のコンジュゲート中のＬＧＡＱＳＮＦを含むペプチド部分の存在により、そのような賦形剤及び／又は送達のための標的化リガンド及び／又は上記化合物の細胞への及び／又はその細胞内送達を亢進する送達デバイスの使用が必要でないことが好ましい。
【０１２４】
本発明はまた、１つ又は複数の症状及び／又は特徴を緩和するため、及び／又は個体における筋強直性ジストロフィー１型、脊髄小脳失調症８型及び／又はハンチントン病類縁疾患２型のパラメータを改善するための方法であって、本明細書中に定義される化合物又はオリゴヌクレオチド又は医薬組成物を前記個体に投与するステップを含む、方法にも関する。
【０１２５】
本明細書において、“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”（「含む」、「含有する」）及びその活用形は、非限定的な意味で使用されて、該用語に続く項目が含まれるが、組み合わせ及び／又は特別に言及されない項目が排除されないことを意味する。本発明の関連において、“ｃｏｎｔａｉｎ”は、好ましくは“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”を意味する。
【０１２６】
さらに、“ｃｏｎｓｉｓｔ”（「なる」）は、本明細書中で定義される化合物又は組成物が、特に規定されたもの以外の追加の構成要素を含んでもよく、追加の構成要素が本発明の独自の特徴を変更しないことを意味する“ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ”（「から本質的になる」）で置き換えられてもよい。
【０１２７】
数値に伴って使用される場合（約１０）、「約」又は「およそ」は、好ましくは、前記値が所与の値１０よりも１％大きいか又は小さくてもよいことを意味する。
【０１２８】
さらに、不定冠詞“ａ”又は“ａｎ”による要素への言及は、該要素がただ１つのみ存在することが文脈上明らかでない限り、２つ以上の要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞“ａ”又は“ａｎ”は通常“ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ”（「少なくとも１つ」）を意味する。
【０１２９】
本発明は以下の実施例によってさらに説明される。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものと解されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】試薬及び条件：ａ．マレイミドプロピオン酸、ＨＣＴＵ、ＤＩＰＥＡ；ｂ．ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ  ９５／２．５／２．５、周囲温度、４時間；ｃ．チオール修飾剤  Ｃ６  Ｓ−Ｓホスホルアミダイト、ＥＴＴ；ｄ．ＰＡＤＳ、３−ピコリン；ｅ．濃縮水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）、０．１Ｍ  ＤＴＴ、５５℃、１６時間；ｆ．リン酸ナトリウムバッファー５０ｍＭ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、周囲温度、１６時間。ペプチド（配列番号２）が、そのＮ末端（アミノ酸Ｌ）を介してオリゴヌクレオチドに取り付けられる。このため、この図においてペプチドは、Ｃ末端からＮ末端までＦＮＳＱＡＧＬと表される。得られるＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８は本発明の第一の態様のコンジュゲートである。本明細書において、「ＰＳ５８」は、（ＮＡＧ）７［式中、ＮはＣである。］である、上記コンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分（配列番号１）を示し、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートＲＮＡである。このコンジュゲートはＬＧＡＱＳＮＦ／（ＣＡＧ）７と表されることもできる。図及び図の説明全体にわたって、「ＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８」は、図１による過程によって調製されたコンジュゲートを示すために使用され、「ＰＳ５８」は、（ＮＡＧ）７［式中、ＮはＣである。］からなるオリゴヌクレオチドを示すために使用され、その長さにわたって２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートで修飾されており、場合により、ペプチド又はペプチド模倣体部分にコンジュゲートされる。
【図２】ＬＧＡＱＳＮＦ／（ＣＡＧ）７は、ＤＭ５００細胞中で伸長ｈＤＭＰＫ転写物のサイレンシングを仲介する。ノーザンブロット分析は、ペプチドにコンジュゲートしたＰＳ５８（ＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８又はＬＧＡＱＳＮＦ／（ＣＡＧ）７）がなお機能的（ＰＥＩを含むレーン、実験の数（ｎ）＝３、Ｐ＜０．０１）であり、細胞核に進入し、トランスフェクション試薬を使用せずに（ｗ／ｏ）、伸長ｈＤＭＰＫ転写物のサイレンシングを引き起こすことができる（ｎ＝３、Ｐ＜０．００１）ことを示した。Ｇａｐｄｈがローディング対照として使用された。
【図３】注射スキーム  ＬＧＡＱＳＮＦ／ＰＳ５８（ＣＡＧ）７による筋肉内注射。８匹のＤＭ５００マウスが、左のＧＰＳ複合体（ＧＰＳ  ｃｏｍｐｌｅｘ）中にＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８（ＬＧＡＱＳＮＦ／（ＣＡＧ）７）を注射される。これらのマウスのうちの４匹は、右のＧＰＳ複合体中にＰＳ５８（（ＣＡＧ）７）を注射され、４匹のマウスは、ＬＧＡＱＳＮＦ−２３（「２３」は非血縁対照ＡＯＮ（配列番号３）を表す）を注射される。最後の注射の１日後（ＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８についてはｎ＝４、ＰＳ５８及びＬＧＡＱＳＮＦ−２３についてはｎ＝２）又は３日後（ＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８についてはｎ＝４、ＰＳ５８及びＬＧＡＱＳＮＦ−２３についてはｎ＝２）に、マウスは屠殺され、筋肉が単離された。
【図４】ＬＧＡＱＳＮＦ／（ＣＡＧ）７は、筋肉内注射後のＤＭＡ５００マウスにおけるインビボでの概念実証を示す。ＤＭ５００マウスにおいて、ＧＰＳ複合体中のＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８（ＬＧＡＱＳＮＦ／（ＣＡＧ）７）の注射、及びそれに続くＲＮＡ含量の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析は、（Ａ）ＰＳ５８（（ＣＡＧ）７（配列番号１））又は（Ｂ）ＬＧＡＱＳＮＦ−２３（「２３」は非血縁対照ＡＯＮ（配列番号３）を表す）処置と比較して、ＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８処置後の腓腹筋、足底筋及びヒラメ筋中のｈＤＭＰＫ（ＣＵＧ）５００ｍＲＮＡのサイレンシングを確認した。（Ｃ）ＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８処置を両対照と比較して、すべての組織における有意な低減が見られた。（Ａ〜Ｃ）データは、単離の日にかかわらず組織ごとにグループ化される。対応のある両側ｔ検定、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図５】（ＣＵＧ）ｎリピートを標的とする修飾ＡＯＮのサイレンシング能力。定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析は、モック処置細胞（ｎ＝８１）と比較して、ＰＳ３８７（ＮＡＧ）７［式中、Ｎ＝５−メチルシトシン］（配列番号１６）（ｎ＝３、Ｐ＜０．０５）及びＰＳ６１３（ＮＡＧ）７ＸＸＸＸ［式中、Ｎ＝Ｃ、Ｘ＝１，２−ジデオキシリボース脱塩基部位］（配列番号１７）（ｎ＝３、Ｐ＜０．０１）は、トランスフェクション後に、インビトロのＤＭ５００細胞モデルにおいて変異（ＣＵＧ）ｎ転写物を有意に低減させることを示した。ＰＳ５８（（ＣＡＧ）７（配列番号１））は陽性対照として含まれた（ｎ＝２６、Ｐ＜０．００１）。Ｇａｐｄｈ及びβ−アクチンがローディング対照として使用された。
【図６】ＬＧＡＱＳＮＦ／（ＮＡＧ）７の合成：ペプチド（配列番号２）が、二官能性クロスリンカーを介して、ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＮＡＧ）７［式中、Ｎ＝Ｃ（配列番号１）（１１）又は５−メチルシトシン（配列番号１６）（１２）］で完全に修飾された２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートに連結されたコンジュゲート。試薬及び条件：ａ．ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ  ９５／２．５／２．５、周囲温度、４時間；ｂ．ＭＭＴ−アミノ修飾剤  Ｃ６ホスホルアミダイト、エチルチオテトラゾール；ｃ．ＰＡＤＳ、３−ピコリン；ｄ．濃縮水酸化アンモニウム、５５℃、１６時間；ｅ．ＡｃＯＨ：Ｈ２Ｏ（８０：２０  ｖ：ｖ）；ｆ．ＤＭＳＯ−リン酸バッファー、周囲温度、１６時間；ｇ．リン酸ナトリウムバッファー（５０ｍＭ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、周囲温度、１６時間。
【図７】すべて２００ｎＭの固定されたトランスフェクション濃度の、インビトロの分化型ＤＭ５００細胞中のｈＤＭＰＫ（ＣＵＧ）５００転写物中の、（ＮＡＧ）７［式中、ＰＳ５８（配列番号１）においてはＮ＝Ｃ；ＰＳ３８７（配列番号１６）においてはＮ＝５−メチルシトシン］及び（ＮＺＧ）５［式中、ＰＳ１４７（配列番号１８）においてはＮ＝Ｃ、Ｚ＝Ａ；ＰＳ３８９（配列番号１９）においてはＮ＝５−メチルシトシン、Ｚ＝Ａ；ＰＳ３８８（配列番号２０）においてはＮ＝Ｃ、Ｚ＝２，６−ジアミノプリン］を含む、伸長（ＣＵＧ）ｎリピートを標的とするように設計されたＡＯＮの活性の比較分析。それらの活性、すなわちｈＤＭＰＫ転写物のサイレンシングは、エキソン１５中のプライマーを使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲによって定量化した。ＡＯＮ処置後のｈＤＭＰＫ転写物レベルは、モックサンプル中の対応する相対的レベルと比較された。モック（ｎ＝８１）、ＰＳ５８（ｎ＝２６）以外のすべてのＡＯＮに関してｎ＝３であった。「ｎ」は実施された実験数を表す。類似の長さを有するＡＯＮについて統計分析が実施された。５−メチルシトシンの存在は、（ＣＡＧ）５ＡＯＮ及び（ＣＡＧ）７ＡＯＮの両方の活性に対して有意に明確な利益を有した。２，６−ジアミノプリンの存在は、より短い（ＣＡＧ）５ＡＯＮがより長い（ＣＡＧ）７ＡＯＮと類似する活性を有することを可能とした。群間の相違は、Ｐ＜０．０５の場合に有意とみなされた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図８】ＬＧＡＱＳＮＦ／（ＣＡＧ）７（（ＣＡＧ）７はＰＳ５８により表される（配列番号１））で、連続して４日間、１日当たり１００ｍｇ／ｋｇの用量で皮下に処置されたＤＭ５００マウスの、最後の注射の１日後における分析。ＬＧＡＱＳＮＦ／対照ＡＯＮ（対照ＡＯＮは、配列番号２１により表されるスクランブルＰＳ５８配列）でマウスが処置された対照群が含まれた。ｈＤＭＰＫ（ＣＵＧ）５００ＲＮＡのレベルは、エキソン１５中の（ＣＵＧ）ｎリピートのプライマー５’によるＱ−ＲＴ−ＰＣＲ分析によって定量化された。ＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８（図１による過程により調製されたＬＧＡＱＳＮＦ／（ＣＡＧ）７）での処置は、腓腹筋（Ａ）、心臓（Ｂ）の両方において、ＬＧＡＱＳＮＦ／対照ＡＯＮで処置されたマウスと比較して伸長ｈＤＭＰＫレベルの低減をもたらした。群間の相違は、Ｐ＜０．０５の場合に有意とみなされた。＊Ｐ＜０．０５。
【図９】図１による過程により調製されたＬＧＡＱＳＮＦ／（ＣＡＧ）７（（ＣＡＧ）７はＰＳ５８により表される（配列番号１））で、連続して５日間、１日当たり２５０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下に処置されたＨＳＡＬＲマウスの、最後の注射の４週間後における分析。（Ａ）ＥＭＧ（筋電図）測定が、マウスの同一性について知らない試験者によって毎週実施された。処置マウスの腓腹筋において、生理食塩水を注射されたマウスと比較して有意な筋強直の低下が観察された。（Ｂ）ノーザンブロット分析が、処置マウスの腓腹筋における、生理食塩水を注射されたマウスと比較した毒性（ＣＵＧ）２５０ｍＲＮＡレベルの低下を明らかにした。（Ｃ）ＲＴ−ＰＣＲ分析が、生理食塩水を注射されたマウスと比較して、処置マウスの腓腹筋中の塩素チャンネル（Ｃｌｃｎ１）、筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（Ｓｅｒｃａ１）及びタイチン（Ｔｔｎ）転写物の胚スプライスモードの低減（すなわち、より成体のスプライシングパターンへのシフト）を実証した。
【図１０ａ】図１による過程により調製されたＬＧＡＱＳＮＦ／（ＣＡＧ）７（（ＣＡＧ）７はＰＳ５８により表される（配列番号１））で、４週間の期間中、２５０ｍｇ／ｋｇの１１回の注射で皮下に処置されたＨＳＡＬＲマウスの、最後の注射の４日後における分析。ノーザンブロット分析が、腓腹筋（１０ａ，左のグラフ）、前脛骨筋（１０ａ，右のグラフ）の両方において、長期の処置が、生理食塩水を注射されたマウスと比較して毒性（ＣＵＧ）２５０レベルの有意な低減をもたらしたことを明らかにした。ＲＴ−ＰＣＲ分析が、対照と比較した、処置マウスの腓腹筋（１０ｂ，左のグラフ）、前脛骨筋（１０ｂ，右のグラフ）の両方における塩素チャンネル（Ｃｌｃｎ１）、筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（Ｓｅｒｃａ１）及びタイチン（Ｔｔｎ）転写物の胚スプライスモードの低減（すなわち、より成体のスプライシングパターンへのシフト）を実証した。群間の相違は、Ｐ＜０．０５の場合に有意とみなされた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１０ｂ】図１による過程により調製されたＬＧＡＱＳＮＦ／（ＣＡＧ）７（（ＣＡＧ）７はＰＳ５８により表される（配列番号１））で、４週間の期間中、２５０ｍｇ／ｋｇの１１回の注射で皮下に処置されたＨＳＡＬＲマウスの、最後の注射の４日後における分析。ノーザンブロット分析が、腓腹筋（１０ａ，左のグラフ）、前脛骨筋（１０ａ，右のグラフ）の両方において、長期の処置が、生理食塩水を注射されたマウスと比較して毒性（ＣＵＧ）２５０レベルの有意な低減をもたらしたことを明らかにした。ＲＴ−ＰＣＲ分析が、対照と比較した、処置マウスの腓腹筋（１０ｂ，左のグラフ）、前脛骨筋（１０ｂ，右のグラフ）の両方における塩素チャンネル（Ｃｌｃｎ１）、筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（Ｓｅｒｃａ１）及びタイチン（Ｔｔｎ）転写物の胚スプライスモードの低減（すなわち、より成体のスプライシングパターンへのシフト）を実証した。群間の相違は、Ｐ＜０．０５の場合に有意とみなされた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【実施例】
【０１３１】
実施例１（ＰＰ０８−ＰＳ５８コンジュゲートの合成）：
ＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８（ＬＧＡＱＳＮＦ／（ＣＡＧ）７［式中、（ＣＡＧ）７は配列番号１により表される。］）を、Ｅｄｅ  Ｎ．Ｊ．らのうちの１つを改変した手順に従って合成した。ＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８コンジュゲートの調製を図１に示す。
【０１３２】
ペプチド１（配列番号２）は、標準的なＦｍｏｃ固相合成により合成した。マレイミドプロピオン酸のオンラインカップリング、並びにそれに続くＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ  ９５：２．５：２．５による樹脂の脱保護と切断、及びその後の逆相ＨＰＬＣによる精製によって、ペプチド２を３８％の収率で得た。
【０１３３】
チオール修飾剤Ｃ６  Ｓ−Ｓホスホルアミダイトを、固相支持体上でホスホロチオエート結合を介してオリゴヌクレオチド３に結合させた。４０％水性アンモニア及び０．１Ｍ  ＤＴＴによる粗製樹脂の処理は、固相支持体の同時の切断、核酸塩基の脱保護及びジスルフィド結合の還元をもたらした。逆相ＨＰＬＣによる精製後、チオール含有オリゴヌクレオチド４を５２％の収率で単離した。コンジュゲートの直前に、ｐＨ＝７において、５０ｍＭリン酸バッファーとともに、化合物４をＰＤ−１０カラムに加えた。遊離のチオールオリゴヌクレオチド４を含む溶出画分を、チオール−マレイミドカップリングを介して、室温にて１６時間、ペプチド２（５当量）に直接コンジュゲートした。粗製物を逆相ＨＰＬＣにより精製して、ＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８を４０％の収率で単離した。
【０１３４】
実験パート：
化学物質：
ペプチド合成のために、Ｆｍｏｃアミノ酸をＯｒｐｅｇｅｎから、２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアンモニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）をＰＴＩから、Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ  ＲｅｓｉｎをＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから、及び３−マレイミドプロピオン酸をＢａｃｈｅｍから購入した。オリゴヌクレオチド合成のために、２’−Ｏ−Ｍｅ  ＲＮＡホスホルアミダイトをＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから入手し、Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６  Ｓ−ＳホスホルアミダイトをＣｈｅｍＧｅｎｅｓから入手した。Ｃｕｓｔｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｕｐｐｏｒｔ及びＰＤ−１０カラムは、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した。１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌからそれぞれ購入した。
【０１３５】
ペプチド合成：
ペプチド１の合成を、Ｔｒｉｂｕｔｅ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）ペプチド合成装置において、標準的なＦｍｏｃ化学により実施した。Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ樹脂（０．６２５ｍｍｏｌ／ｇ，１６０ｍｇ，１００μｍｏｌ）を合成のために使用した。Ｆｍｏｃ脱保護を、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中の２０％ピペリジンを用いて行い、カップリングごとに、５当量のＦｍｏｃアミノ酸、５当量のＨＣＴＵ及び１０当量のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を樹脂に添加し、カップリングを１時間続行した。ペプチド配列１が完成後、前述と同じ条件下で、３−マレイミドプロピオン酸（５当量）を直結してカップリングした。脱保護及び樹脂からの切断を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）  ９５：２．５：２．５を室温で４時間用いて達成した。混合物を冷ジエチルエーテル中で沈殿させて遠心分離した。ＳｅｍｉＰｒｅｐ  Ｇｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣシステム［Ａｌｌｔｉｍａ  Ｃ１８  ５μＭ  １５０ｍｍ×２２ｍｍ；バッファーＡ：９５％Ｈ２Ｏ、５％ＡＣＮ，０．１％ＴＦＡ；バッファーＢ：２０％Ｈ２Ｏ，８０％ＡＣＮ，０．１％ＴＦＡ］における逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣによって沈殿を精製した。純粋なマレイミド含有ペプチドを含む画分をプールし、凍結乾燥してペプチド２（３３．６ｍｇ、３８％）を得た。
【０１３６】
オリゴヌクレオチド合成：
２’−Ｏ−Ｍｅホスホロチオエートオリゴヌクレオチド３を、ＡＫＴＡプライムＯＰ−１００合成装置において供給者の推奨によるプロトコールを用いて構築した。標準的な２−シアノエチルホスホルアミダイト及びＣｕｓｔｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｕｐｐｏｒｔ（Ｇ，４０μｍｏｌ／ｇ）を使用した。エチルチオテトラゾール（ＥＴＴ）（ＡＣＮ中，０．２５Ｍ）をカップリング試薬として、ＰＡＤＳ（ＡＣＮ：３−ピコリン  １：１（ｖ：ｖ）中，０．２Ｍ）を硫酸化ステップのために使用した。オリゴヌクレオチド３を５６μｍｏｌスケールで合成した。オリゴヌクレオチド配列が完成後、チオール修飾剤Ｃ６  Ｓ−Ｓホスホルアミダイト（４当量）を５’末端に直結して組み込んだ。粗製樹脂を、５５℃において１６時間、０．１ＭＤＴＴを含む４０％水性アンモニアで処理した。固相支持体を濾過し、乾燥するまで濾液を蒸発させた。粗製物を、ＳｅｍｉＰｒｅｐ  Ｇｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣシステム［Ａｌｌｔｉｍａ  Ｃ１８  ５μＭ，１５０ｍｍ×２２ｍｍ；バッファーＡ：９５％Ｈ２Ｏ，５％ＡＣＮ，０．１Ｍ（酢酸テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ））；バッファーＢ：２０％Ｈ２Ｏ，８０％ＡＣＮ，０．１Ｍ  ＴＥＡＡ］における逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣによって精製した。純粋なチオール修飾オリゴヌクレオチドを含む画分をプールし、凍結乾燥した。化合物４を５２％の収率で単離した（２９．２μｍｏｌ）。
【０１３７】
ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８の合成：
化合物４（７ｍｍｏｌ）を、５０ｍＭリン酸バッファー，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ＝７であらかじめ平衡化したＰＤ−１０カラムに加えた。チオールオリゴヌクレオチドを含む溶出画分をマレイミドペプチド（５当量、３１ｍｇ）に直接カップリングし、室温で１６時間、反応を持続した。ＳｅｍｉＰｒｅｐ  Ｇｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣシステム［Ａｌｌｔｉｍａ  Ｃ１８  ５μＭ，１５０ｍｍ×２２ｍｍ；バッファーＡ：９５％Ｈ２Ｏ，５％ＡＣＮ，０．１Ｍ  ＴＥＡＡ；バッファーＢ：２０％Ｈ２Ｏ，８０％ＡＣＮ，０．１Ｍ  ＴＥＡＡ］における逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣによって粗製物を精製した。純粋なコンジュゲートを含む画分をプールし、ＮａＣｌを添加し、乾燥するまで溶媒を蒸発させた。水で平衡化したＰＤ−１０における溶出によって脱塩を行った。脱塩後、プールした画分を凍結乾燥して、ＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８（２５．１ｍｇ，２．８μｍｏｌ，４０％収率）を得た。
【０１３８】
実施例２：
材料及び方法：
動物：
ヘミ接合性ＤＭ５００マウス（ＤＭ３００−３２８系統（Ｓｅｚｎｅｃ  Ｈ．ら）から派生）は、世代間のトリプレットリピートの不安定性のために、およそ５００個のＣＴＧトリプレットまで伸長したリピートセグメントを有するトランスジェニックヒトＤＭ１遺伝子座を発現する。不死のＤＭ５００筋芽細胞の単離のために、ＤＭ５００マウスをＨ−２Ｋｂ−ｔｓＡ５８トランスジェニックマウス（Ｊａｔ  Ｐ．Ｓ．ら）と交配させた。すべての動物実験は、Ｒａｄｂｏｕｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｎｉｊｍｅｇｅｎの動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認された。
【０１３９】
細胞培養：
不死化ＤＭ５００筋芽細胞をＤＭ３００−３２８マウスから得（Ｓｅｚｎｅｃ  Ｈ．ら）、培養して、文献（Ｍｕｌｄｅｒｓ  Ｓ．Ａ．ら）に記載の方法で筋管に分化させた。
【０１４０】
オリゴヌクレオチド：
ＡＯＮ  ＰＳ５８（（ＣＡＧ）７（配列番号１））は文献（Ｍｕｌｄｅｒｓ  Ｓ．Ａ．ら）に記載されている。コンジュゲートＬＧＡＱＳＮＦを、ＡＯＮ  ＰＳ５８の又は対照ＡＯＮ  ２３（５’−ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＵＣＧＧＣＵＵＡＣＣＵ−３’（配列番号３））の５’末端にカップリングした（ドゥシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）ＡＯＮ）。これらのＡＯＮはＰｒｏｓｅｎｓａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｂ．Ｖ．（Ｌｅｉｄｅｎ，オランダ）から提供された。ＰＳ３８７（（ＮＡＧ）７［式中、Ｎ＝５−メチルシトシン］（配列番号１６））及びＰＳ６１３（（ＮＡＧ）７ＸＸＸＸ［式中、Ｎ＝Ｃであり、Ｘは、オリゴの３’末端に取り付けられた１，２−ジデオキシリボース脱塩基部位である。］（配列番号１７））はＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（オランダ）により合成された。
【０１４１】
トラスフェクション：
すべてのＡＯＮをトランスフェクション試薬の存在下で試験し、ＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８はトランスフェクション試薬の非存在下でも試験した。製造者の指示に従って、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（ＥｘＧｅｎ  ５００，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ，ＭＤ）でＡＯＮをトランスフェクトした。典型的には、ＡＯＮ  １μｇ当たり５μＬのＰＥＩ溶液を分化用培地中で、筋形成の５日目に２００ｎＭの最終オリゴヌクレオチド濃度において筋管に添加した。４時間後に、新鮮な培地を最大体積２ｍＬまで補充した。２４時間後に培地を交換した。トランスフェクションの４８時間後にＲＮＡを単離した。トランスフェクション試薬を使用しなかったこと以外は、上記プロトコールに従ってＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８を試験した。
【０１４２】
ＲＮＡの単離：
製造者のプロトコールに従ってＡｕｒｕｍ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、培養細胞からのＲＮＡを単離した。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて筋肉組織のＲＮＡを単離した。すなわち、組織サンプルをＴＲＩｚｏｌ中（１００ｍｇ  組織／ｍＬ  ＴＲＩｚｏｌ）で、パワーホモジナイザー（ウルトラＴＵＲＲＡＸ  Ｔ−８，ＩＫＡ  ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ）を用いてホモジナイズした。ＴＲＩｚｏｌ  １ｍＬ当たり０．２ｍＬのクロロホルム（Ｍｅｒｃｋ）を添加し、混合し、室温で３分間インキュベーションし、１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上部の水性相を集め、ＴＲＩｚｏｌ  １ｍＬ当たり０．５ｍＬのイソプロパノール（Ｍｅｒｃｋ）を添加し、その後、室温での１０分間のインキュベーション及び遠心分離（１３，０００ｒｐｍ，１０分間）が続いた。ＲＮＡ沈殿を７５％（ｖ／ｖ）エタノール（Ｍｅｒｃｋ）で洗浄し、空気乾燥し、ＭｉｌｌｉＱ中に溶解した。
【０１４３】
ノーザンブロッティング：
文献（Ｍｕｌｄｅｒｓ  Ｓ．Ａ．ら）に記載の方法でノーザンブロッティングを行った。ランダム−プライム３２Ｐ標識ｈＤＭＰＫ（２．６ｋｂ）及びラットＧａｐｄｈ（１．１ｋｂ）プローブを使用した。ホスホ−イメージャー分析（ＧＳ−５０５又はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によってシグナルを定量化し、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）又はＩｍａｇｅＪソフトウエアにより分析した。Ｇａｐｄｈレベルを正規化のために使用し、対照サンプルに関するＲＮＡレベルを１００に設定した。
【０１４４】
インビボの処置及び筋肉の単離：
７ヶ月齢のＤＭ５００マウスを、イソフルランを用いて麻酔した。１日目と２日目に、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）中、４ｎｍｏｌのＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８、ＬＧＡＱＳＮＦ−２３又はＰＳ５８（配列番号１）を、ＧＰＳ（腓腹筋−足底筋−ヒラメ筋）複合体、ＧＰＳ筋肉の同じ中心位置に注射した。いずれの場合も注入量は４０μＬであった。最後の注射の１又は３日後にマウスを屠殺し、個々の筋肉を単離し、液体窒素中で瞬間凍結し、−８０℃で貯蔵した。
【０１４５】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析：
総体積２０μＬでＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔファーストストランド合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、およそ１μｇのＲＮＡをランダムヘキサマーによるｃＤＮＡ合成に供した。続いて、３μＬの１／５００ｃＤＮＡ希釈調製物を、１×ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）の存在下、標準的手順による定量的ＰＣＲ分析において使用した。定量的ＰＣＲプライマーは、ＮＣＢＩデータベース配列情報に基づいて設計した。生成物の同一性は、ＤＮＡ配列決定により確認した。β−アクチン及びＧａｐｄｈに関するシグナルを正規化のために使用した。増幅は、Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ６０００において、「９５℃で１５分間の変性、並びに１５秒，９５℃及び５０秒，６０℃を４０サイクル」という２ステップＰＣＲプロトコールを用いて実施した。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎの蛍光を伸長ステップ（６０℃）の最後に測定した。増幅後、増幅されたＤＮＡを６４℃〜９４℃の融解によって解離させた。このステップの間にＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎの蛍光を測定して、単一アンプリコンの増幅を確認した。各プライマーセットの効率を決定するためにｃＤＮＡ標準の一連の希釈物を使用した。Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ６０００  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて臨界サイクル閾（Ｃｔ）値を決定し、目的の遺伝子（ＧＯＩ）の発現をβ−アクチン及びＧａｐｄｈに対して正規化し、ΔΔＣｔ法による式を用いて対応する対照に対する比率として表した。以下のプライマーを使用した。
【０１４６】
ｈＤＭＰＫ  エキソン１５  （５’）−Ｆ：  ５’−ＡＧＡＡＣＴＧＴＣＴＴＣＧＡＣＴＣＣＧＧＧ−３’（配列番号４）
ｈＤＭＰＫ  エキソン１５  （５’）−Ｒ：  ５’−ＴＣＧＧＡＧＣＧＧＴＴＧＴＧＡＡＣＴＧ−３’（配列番号５）
β−アクチン−Ｆ：  ５’−ＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴ−３’（配列番号６）
β−アクチン−Ｒ：  ５’−ＧＣＣＡＣＣＧＡＴＣＣＡＣＡＣＡＧＡＧＴ−３’（配列番号７）
Ｇａｐｄｈ−Ｆ：  ５’−ＧＴＣＧＧＴＧＴＧＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧ−３’（配列番号８）
Ｇａｐｄｈ−Ｒ：  ５’−ＧＡＡＣＡＴＧＴＡＧＡＣＣＡＴＧＴＡＧＴＴＧ−３’（配列番号９）
【０１４７】
結果：
インビトロのＤＭ１モデルにおけるＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８によるｈＤＭＰＫ（ＣＵＧ）５００ＲＮＡのサイレンシング。ノーザンブロッティングは、トランスフェクション試薬（ＰＥＩ）の存在下におけるＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８によるＤＭ５００細胞の処理後の、約９０％のｈＤＭＰＫ転写物のサイレンシングを明らかにし、ペプチドにコンジュゲートされたＰＳ５８の機能性を確認した。トランスフェクション試薬の非存在下においてＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８をＤＭ５００細胞に添加した場合には、同じレベルの変異ｈＤＭＰＫ  ｍＲＮＡの低減が見出された（図２）。これは、ＬＧＡＱＳＮＦがＰＳ５８の細胞及び核取り込みの原因であったことを示している。
【０１４８】
ＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８の筋肉内注射が、インビボで伸長ｈＤＭＰＫ転写物のサイレンシングを引き起こす。ペプチドにコンジュゲートされたＰＳ５８のインビボでの機能性を明らかにするために、ＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８をＤＭ５００マウスのＧＰＳ複合体中に筋肉内注射（Ｉ．Ｍ．）した。対照として、コンジュゲートされていないＰＳ５８及びＤＭＤ対照ＡＯＮ２３にカップリングされたＬＧＡＱＳＮＦ（配列番号３）（ＬＧＡＱＳＮＦ−２３）を含めた。マウスを毎日１回のＩ．Ｍ．注射で２日間処置し、組織を最後の注射の１日又は３日後に単離した（図３）。定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析は、組織単離の日の間に統計的有意差はなかったため、両単離日のデータをひとまとめにした。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ分析は、腓腹筋中（５５％）及び足底筋（６０％）の両方において、コンジュゲートされていないＰＳ５８と比較して、ＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８による処置後のｈＤＭＰＫ  ｍＲＮＡレベルの有意な低減を示し、ヒラメ筋においては２８％の低減が見出された（図４Ａ）。ＧＰＳ複合体の個々の組織すべてにおいて、ＬＧＡＱＳＮＦ−２３と比較して、ＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８による処置後のｈＤＭＰＫ（ＣＵＧ）５００レベルの約５０％のサイレンシングが見出された（図４Ｂ）。対照間でｈＤＭＰＫ転写物レベルが有意に相違しなかったため、ＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８処置後の変異ＤＭＰＫ  ｍＲＮＡレベルをＰＳ５８及びＬＧＡＱＳＮＦ−２３の両方に関連させた（図４Ｃ）。試験したＧＰＳ複合体のすべての個々の組織において、ＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８は、対照による処置後には見られないｈＤＭＰＫ（ＣＵＧ）５００レベルのサイレンシングの原因であった。
【０１４９】
脱塩基部位に連結したオリゴヌクレオチド部分（ＣＡＧ）７を有する化合物が、伸長ｈＤＭＰＫ（ＣＵＧ）５００転写物のインビトロにおけるサイレンシングの効率の、前記脱塩基部位を有さない対応化合物の効率と比較した有意な増加を引き起こす。
【０１５０】
ＤＭ５００細胞を、２００ｎＭ  ＰＳ３８７、ＰＳ６１３及びＰＳ５８でトランスフェクトした。定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析は、両修飾ＡＯＮ（ＰＳ３８７及びＰＳ６１３）が、対照により処理した細胞（モック）と比較して、変異（ＣＵＧ）５００ｈＤＭＰＫ転写物の有意なサイレンシングを引き起こしたことを明らかにした。ＰＳ５８は陽性対照として含まれた（図５）。
【０１５１】
実施例３：
ペプチド−２’−Ｏ−ＭｅホスホロチオエートＲＮＡオリゴヌクレオチドコンジュゲートＬＧＡＱＳＮＦ−（ＮＧＡ）７［式中、Ｎ＝Ｃ又は５−メチルシトシン］の二官能性クロスリンカーによる合成：
２’−Ｏ−Ｍｅホスホロチオエート（ＰＳ）ＲＮＡオリゴヌクレオチドコンジュゲートＬＧＡＱＳＮＦ−（ＮＡＧ）７［式中、Ｎ＝Ｃ（配列番号１）又は５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）（配列番号１６）］を、図６に示すコンジュゲーション方法に従って調製した。このコンジュゲーション方法は、チオール官能化ペプチドにカップリング可能なマレイミド修飾オリゴヌクレオチド（９、１０）を提供する、５’アミノ修飾オリゴヌクレオチド（６、７）のヘテロ二官能性クロスリンカー８へのカップリングに依存する。
【０１５２】
標準的なＦｍｏｃペプチド合成手順に従って、ペプチドを固相支持体上に構築した。ペプチドのオリゴヌクレオチドへのカップリングを可能とするためのチオール官能基を有するペプチドを提供するために、ペプチドのＮ−末端にシステイン残基を付加した。その後の酸による切断及び脱保護によってペプチド５を得た。ペプチド５のＮ−末端は、最後のアミノ酸導入後のアセチル化によるキャッピングを通じて遊離アミン（５ａ）又はアセトアミド基（５ｂ）として調製され得る。
【０１５３】
モノメトキシトリチル（ＭＭＴ）−保護Ｃ６−アミノ修飾剤ホスホルアミダイト（Ｌｉｎｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、構築された（ＮＡＧ）７２’−Ｏ−Ｍｅ  ＰＳ  ＲＮＡオリゴヌクレオチド配列（Ｎ＝Ｃ又は５−メチルシトシン）の５’に直結してカップリングした。２ステップの塩基処理（ジエチルアミン（ＤＥＡ）、次いでアンモニア）及びその後の酸処理によって固相支持体からの切断及び同時の核酸塩基の脱保護を行ってＭＭＴ保護を除去し、アミノ修飾オリゴヌクレオチド６及び７を得た。
【０１５４】
６及び７と、スクシニミド及びマレイミド官能基を担持するヘテロ二官能性クロスリンカーであるβ−マレイミドプロピオン酸スクシニミドエステル（ＢＭＰＳ，８）と、の反応によって、マレイミドを備えたオリゴヌクレオチド９及び１０をそれぞれ得た。ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲーションを、チオール標識ペプチド５とマレイミド由来オリゴヌクレオチド９及び１０とのチオール−マレイミドカップリングにより行った。
【０１５５】
ペプチド合成：
ペプチド配列ＣＬＧＡＱＳＮＦを、Ｔｒｉｂｕｔｅペプチド合成装置（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、実施例１と同様に、Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ樹脂（０．６２５ｍｍｏｌ／ｇ，１６０ｍｇ，１００μｍｏｌ，ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）を使用する標準的なＦｍｏｃ化学によって構築した。ペプチド合成が完了後、最後のキャッピングステップ（無水酢酸（Ａｃ２Ｏ），ピリジン）を実施するか（５ｂ）又は省略する（５ａ）。脱保護及び樹脂からの切断を、ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＴＩＳ  ９５：２．５：２．５（ｖ：ｖ：ｖ）を用いて周囲温度において４時間で達成した。混合物を濾過し、冷ジエチルエーテル中で沈殿させ、遠心分離し、上清を捨てた。沈殿した粗ペプチド又はＲＰ−ＨＰＬＣ精製ペプチドを両方ともコンジュゲーションのために使用した。
【０１５６】
オリゴヌクレオチド合成：
２’−Ｏ−ＭｅホスホロチオエートＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＮＡＧ）７（ここで、Ｎ＝Ｃ（配列番号１）又は５−メチルシトシン（配列番号１６）を、実施例１と同様にＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ  ＯＰ−１００合成装置（ＧＥ）において構築した。オリゴヌクレオチド配列が完成後、ＭＭＴ−Ｃ６−アミノ−修飾剤ホスホルアミダイトを５’末端に直結して組み込んだ。次いで、切断及び塩基不安定保護基の脱保護のために、５５℃において１６時間、粗製樹脂を最初にＤＥＡで、次いで２９％水性アンモニアで洗浄した。反応混合物を濾過し、蒸発によって溶媒を除去した。オリゴヌクレオチドを８０ｍＬの酢酸（（ＡｃＯＨ）：Ｈ２Ｏ  ８０：２０（ｖ：ｖ））で処理し、周囲温度において１時間振とうしてＭＭＴ基を除去し、その後、溶媒を蒸発によって除去した。粗製混合物を１００ｍＬのＨ２Ｏに溶解し、酢酸エチルで洗浄した（３×３０ｍＬ）。水層を濃縮し、残基をＧｉｌｓｏｎ  ＧＸ］−２７１システム［Ｃ１８  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ａｘｉａ  ＮＸ  Ｃ−１８  ５μｍカラム（１５０×２１．２ｍｍ）；バッファーＡ：９５％  Ｈ２Ｏ，５％  ＡＣＮ，０．１Ｍ  ＴＥＡＡ；溶媒Ｂ：バッファーＢ：２０％  Ｈ２Ｏ，８０％  ＡＣＮ，０．１Ｍ  ＴＥＡＡ；勾配：２０分で１０〜６０％バッファーＢ］又はＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  調製システムにおけるＩＥＸ条件［ポリスチレンＳｔｒｏｎｇ  Ａｎｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ，Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｑ，３０μｍ（１００×５０ｍｍ）；溶出液Ａ：０．０２Ｍ  ＮａＯＨ，０．０１Ｍ  ＮａＣｌ；溶出液Ｂ：０．０２Ｍ  ＮａＯＨ，３Ｍ  ＮａＣｌ；勾配：４０分で勾配０〜１００％Ｂ］のいずれかにおけるＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。７０μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中、１００ｍＭ  ＢＭＰＳ（８，  ７当量）を、２８０μＬの（２０％ＡＣＮを含む）リン酸バッファー中、１μｍｏｌのアミノ修飾オリゴヌクレオチド（６、７）に添加した。反応混合物を周囲温度において１６時間振とうした。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５による濾過後、５’−マレイミド標識オリゴヌクレオチド９及び１０を得た。
【０１５７】
ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲーション：
ペプチドＣＬＧＡＱＳＮＦ（５ａ又は５ｂ，１０当量）を、３．５ｍＬリン酸バッファー中、５’−マレイミド修飾オリゴヌクレオチド（９又は１０，  １μｍｏｌ）に添加し、反応混合物を周囲温度において１６時間、振とうした。遠心分離後、上清をＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）［Ａｌｌｔｉｍａ  Ｃ１８カラム（５μｍ，１０×２５０ｍｍ）；バッファーＡ：９５％  Ｈ２Ｏ，５％  ＡＣＮ，０．１Ｍ  酢酸テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）；バッファーＢ：２０％  Ｈ２Ｏ，８０％  ＡＣＮ，０．１Ｍ  ＴＥＡＡ］における逆相ＨＰＬＣによって精製した。純粋なコンジュゲートを含む画分をプールし、ＮａＣｌを添加し、溶媒を蒸発させた。脱塩を、水で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムにおいて行った。脱塩後、プールした画分を凍結乾燥して、最終的なコンジュゲートを得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ，ネガティブモード）分析により正確な質量が明らかとなった。
１０ａ（Ｎ＝Ｃ、Ｒ＝Ｈ、図６）：計算値：８５９５．３；実測値：８５９５．４
１０ｂ（Ｎ＝５−メチルシトシン，Ｒ＝Ａｃ）：計算値：８７３５．６；実測値：８７３５．４
【０１５８】
実施例４：
イントロダクション：
選ばれたＡＯＮ化学の特別な特徴は、物資の合成及び／又は精製手順の長さを低減させるか又は改善することによって、少なくとも部分的に結合親和性及び安定性を亢進し、活性を亢進し、安全性を改善し、及び／又は製品のコストを低減させることができる。この実施例は、インビトロの分化型ＤＭ５００細胞中のｈＤＭＰＫ（ＣＵＧ）５００転写物中の伸長（ＣＵＧ）ｎリピートを標的化するために設計されたＡＯＮの活性の比較分析を記載し、５−メチルシトシン（ＰＳ３８７（配列番号１６）及びＰＳ３８９（配列番号１９））又は２，６−ジアミノプリン（ＰＳ３８８（配列番号２０））を含むＡＯＮ対この塩基修飾を含まない対応するＡＯＮ（ＰＳ１４７（配列番号１８）及びＰＳ５８（配列番号１））を含む。
【０１５９】
材料及び方法：
細胞培養：
不死化ＤＭ５００筋芽細胞を、ＤＭ３００−３２８マウスから得（Ｓｅｚｎｅｃ  Ｈ．ら）、培養して、文献（Ｍｕｌｄｅｒｓ  Ｓ．Ａ．ら）に記載の方法で筋管に分化させた。すなわち、ＤＭ５００筋芽細胞を、ゼラチン被覆したディッシュにおいて、高血清ＤＭＥＭ中、３３℃で増殖させた。低血清ＤＭＥＭ中、３７℃においてＭａｔｒｉｇｅｌ上にＤＭ５００筋芽細胞を置き、コンフルエントまで増殖させることによって、筋管への分化を誘導した。
【０１６０】
オリゴヌクレオチド：
ＡＯＮ  ＰＳ５８（（ＣＡＧ）７）は文献（Ｍｕｌｄｅｒｓ  Ｓ．Ａ．ら）に記載されている。使用したＡＯＮは完全に２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート修飾されていた。ＰＳ１４７（ＮＺＧ）５［Ｎ＝Ｃ、Ｚ＝Ａ］（配列番号１８）、ＰＳ３８９（ＮＺＧ）５及びＰＳ３８７（ＮＺＧ）７［Ｎ＝５−メチルシトシン、Ｚ＝Ａ］（配列番号１９及び１６）、及びＰＳ３８８（ＮＺＧ）５［Ｎ＝Ｃ、Ｚ＝２，６−ジアミノプリン］（配列番号２０）。
【０１６１】
トランスフェクション：
ＰＥＩ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中，ＡＯＮ  １μｇ当たり２μＬ）と複合化したＡＯＮによって細胞をトランスフェクトした。筋形成の５日目に、ＡＯＮ−ＰＥＩ複合体を、最終オリゴヌクレオチド濃度２００ｎＭで分化用培地中、筋管に添加した。４時間後、２ｍＬの最大体積まで新鮮な培地を補充した。２４時間後、培地を交換した。トランスフェクションの４８時間後にＲＮＡを単離した。
【０１６２】
ＲＮＡの単離：
培養細胞由来のＲＮＡを、製造者のプロトコールに従ってＡｕｒｕｍ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｆｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて単離した。
【０１６３】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析：
総体積２０μＬでＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔファーストストランド合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、およそ１μｇのＲＮＡをランダムヘキサマーによるｃＤＮＡ合成に供した。続いて、３μＬの１／５００ｃＤＮＡ希釈調製物を、１×ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）の存在下、標準的手順による定量的ＰＣＲ分析において使用した。定量的ＰＣＲプライマーは、ＮＣＢＩデータベース配列情報に基づいて設計した。生成物の同一性は、ＤＮＡ配列決定により確認した。実施例２と同様に、β−アクチン及びＧａｐｄｈに関するシグナルを正規化のために使用した。
【０１６４】
結果：
定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析は、モック処置細胞と比較して、試験したすべてのＡＯＮがＡＯＮ処置後にｈＤＭＰＫ転写物の有意なサイレンシングを誘導したことを実証した（図７）。５−メチルシトシンの存在は、（ＣＡＧ）５（ＰＳ１４７）及び（ＣＡＧ）７（ＰＳ５８）ＡＯＮの両方の活性に対する有意に明確な利益を有した。２，６−ジアミノプリンの存在は、より短い（ＣＡＧ）５ＡＯＮ（ＰＳ１４７）が、より長い（ＣＡＧ）７ＡＯＮ（ＰＳ５８）と類似した活性を有することを可能とした。
【０１６５】
実施例５：
イントロダクション：
筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）は複雑な多臓器疾患である。ＡＯＮがＤＭ１において臨床的に有効であるためには、ＡＯＮは多種多様な組織及びその中の細胞タイプに到達する必要がある。改善された活性、心筋、骨格筋及び平滑筋を含む複数の組織を標的化し及び／又はそこへ送達し及び／又はそこにより取り込まれるための新たな化合物が、ペプチドＬＧＡＱＳＮＦのＰＳ５８へのコンジュゲーションに基づいて設計された。この実施例は、ＤＭ５００マウスの全身処置に続く、毒性ＤＭＰＫ転写物のサイレンシングに対するそのインビボでの有効性を実証する。
【０１６６】
材料及び方法：
動物：
ヘミ接合性ＤＭ５００マウス（ＤＭ３００−３２８系統（Ｓｅｚｎｅｃ  Ｈ．ら）から派生）は、世代間のトリプレットリピートの不安定性のために、およそ５００個のＣＴＧトリプレットまで伸長したリピートセグメントを有するトランスジェニックヒトＤＭ１遺伝子座を発現する。すべての動物実験は、Ｒａｄｂｏｕｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｎｉｊｍｅｇｅｎの動物実験委員会により承認された。
【０１６７】
オリゴヌクレオチド：
ペプチドＬＧＡＱＳＮＦを、実施例１と同様に、ＡＯＮ  ＰＳ５８（ＣＡＧ）７（配列番号１）又は対照ＡＯＮ（スクランブルＰＳ５８）（５’−ＣＡＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＧ−３’（配列番号２１））の５’末端にカップリングした。
【０１６８】
インビボでの処置：
１００ｍｇ／ｋｇのＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８又はＬＧＡＱＳＮＦ−対照ＡＯＮをＤＭ５００マウスの頸部に皮下注射した。注射は４日間連続して行い、最後の注射の１日後に組織を単離した。
【０１６９】
ＲＮＡの単離：
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて組織のＲＮＡを単離した。すなわち、組織サンプルをＴＲＩｚｏｌ中（１００ｍｇ  組織／ｍＬ  ＴＲＩｚｏｌ）で、パワーホモジナイザー（ウルトラＴＵＲＲＡＸ  Ｔ−８，ＩＫＡ  ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ）を用いてホモジナイズした。ＴＲＩｚｏｌ  １ｍＬ当たり０．２ｍＬのクロロホルム（Ｍｅｒｃｋ）を添加し、混合し、室温で３分間インキュベーションし、１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上部の水性相を集め、ＴＲＩｚｏｌ  １ｍＬ当たり０．５ｍＬのイソプロパノール（Ｍｅｒｃｋ）を添加し、その後、室温での１０分間のインキュベーション及び遠心分離（１３，０００ｒｐｍ，１０分間）が続いた。ＲＮＡ沈殿を７５％（ｖ／ｖ）エタノール（Ｍｅｒｃｋ）で洗浄し、空気乾燥し、ＭｉｌｌｉＱ中に溶解した。
【０１７０】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析：
総体積２０μＬでＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔファーストストランド合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、およそ１μｇのＲＮＡをランダムヘキサマーによるｃＤＮＡ合成に供した。続いて、３μＬの１／５００ｃＤＮＡ希釈調製物を、１×ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）の存在下、標準的手順による定量的ＰＣＲ分析において使用した。定量的ＰＣＲプライマーはＮＣＢＩデータベース配列情報に基づいて設計した。生成物の同一性はＤＮＡ配列決定により確認した。実施例２と同様に、β−アクチン及びＧａｐｄｈに関するシグナルを正規化のために使用した。
【０１７１】
結果：
定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＬＧＡＱＳＮＦ−対照ＡＯＮにより処置されたマウスと比較して、ＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８による全身処置がＤＭ５００マウスにおいて伸長ｈＤＭＰＫ（ＣＵＧ）５００転写物の有意な低減をもたらしたことを実証した。腓腹筋及び心筋の両方において、全体として約４０％のｈＤＭＰＫレベルの低減が見出された（図８）。これは、ペプチドＬＧＡＱＳＮＦが、ＤＭ１で冒された２つの標的器官におけるＰＳ５８の送達及び／又は活性を促進したことを示している。
【０１７２】
実施例６：
イントロダクション：
筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）は複雑な多臓器疾患である。ＡＯＮがＤＭ１において臨床的に有効であるためには、ＡＯＮは多種多様な組織及びその中の細胞タイプに到達する必要がある。改善された活性、心筋、骨格筋及び平滑筋を含む複数の組織を標的化し及び／又はそこへ送達し及び／又はそこにより取り込まれるための新たな化合物が、ペプチドＬＧＡＱＳＮＦのＰＳ５８へのコンジュゲーションに基づいて設計された。この実施例は、そのＨＳＡＬＲマウスにおけるインビボでの有効性を実証する。ヒト骨格アクチン導入遺伝子中の毒性（ＣＵＧ）２５０リピートを発現するこれらのマウスは、ＤＭ１患者に類似した分子欠損を示すだけでなく、筋強直表現型も呈する。
【０１７３】
材料及び方法：
動物：
ホモ接合性ＨＳＡＬＲマウス（ＨＳＡＬＲ２０ｂ系統）は、トランスジェニックヒト骨格α−アクチン遺伝子の３’ＵＴＲ内で２５０個のＣＴＧリピートを発現する（Ｍａｎｋｏｄｉ  Ａ．ら）。ＨＳＡＬＲマウスは、リボ核封入体、筋強直、筋障害性の特徴及びＤＭ１に類似した病理学的な筋肉変化を発症する。すべての動物実験は、Ｒａｄｂｏｕｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｎｉｊｍｅｇｅｎの動物実験委員会により承認された。
【０１７４】
オリゴヌクレオチド：
実施例１と同様に、ペプチドＬＧＡＱＳＮＦをＡＯＮ  ＰＳ５８（ＣＡＧ）７（配列番号１）の５’末端にカップリングした。
【０１７５】
インビボでの処置：
２５０ｍｇ／ｋｇの用量のＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８をＨＳＡＬＲマウスの頸部に連続して５日間皮下注射し、生理食塩水のみを受容した対照マウスと比較した。ＥＭＧ測定を毎週実施し、最初の注射の４週間後に組織を単離した。
【０１７６】
ＥＭＧ：
ＥＭＧを全身麻酔下で実施した。各筋肉試験のために最小限の５〜１０回の針穿刺を行った。ミオトニー放電を４ポイントスケールで等級づけした。０：筋強直なし；１：針穿刺の５０％未満における時折のミオトニー放電；２：針穿刺の５０％超におけるミオトニー放電；３：ほぼ毎回の穿刺におけるミオトニー放電。
【０１７７】
ＲＮＡの単離：
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて組織のＲＮＡを単離した。すなわち、組織サンプルをＴＲＩｚｏｌ中（１００ｍｇ  組織／ｍＬ  ＴＲＩｚｏｌ）で、パワーホモジナイザー（ウルトラＴＵＲＲＡＸ  Ｔ−８，ＩＫＡ  ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ）を用いてホモジナイズした。ＴＲＩｚｏｌ  １ｍＬ当たり０．２ｍＬのクロロホルム（Ｍｅｒｃｋ）を添加し、混合し、室温で３分間インキュベーションし、１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上部の水性相を集め、ＴＲＩｚｏｌ  １ｍＬ当たり０．５ｍＬのイソプロパノール（Ｍｅｒｃｋ）を添加し、その後、室温での１０分間のインキュベーション及び遠心分離（１３，０００ｒｐｍ，１０分間）が続いた。ＲＮＡ沈殿を７５％（ｖ／ｖ）エタノール（Ｍｅｒｃｋ）で洗浄し、空気乾燥し、ＭｉｌｌｉＱ中に溶解した。
【０１７８】
ノーザンブロッティング：
１レーン当たり１μｇのＲＮＡを負荷した１．２％アガロース−ホルムアルデヒド変性ゲルにおいてＲＮＡを電気泳動した。ＲＮＡをＨｙｂｏｎｄ−ＸＬナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）に移行させ、３２Ｐ−末端標識（ＣＡＧ）９又はマウス骨格アクチン特異的（ＭＳＡ）オリゴとハイブリダイズした。ブロットをＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ，Ｘ−ＯＭＡＴ  ＡＲ）に曝露した。シグナルの定量化をホスホ−イメージャー分析（ＧＳ−５０５又はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により行い、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）又はＩｍａｇｅＪソフトウエアにより分析した。正規化のためにＭＳＡレベルを使用した。
【０１７９】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析：
総体積２０μＬでＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔファーストストランド合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、およそ１μｇのＲＮＡをランダムヘキサマーによるｃＤＮＡ合成に供した。続いて、１μＬのｃＤＮＡ調製物を、標準的手順による半定量的ＰＣＲ分析において使用した。ＲＴ−対照実験においてリバーストランスクリプターゼを省略した。生成物の同一性はＤＮＡ配列決定により確認した。ＰＣＲ生成物を１．５〜２．５％アガロースゲルにおいて分析し、エチジウムブロミドで染色した。シグナルの定量化をＬａｂｗｏｒｋｓ  ４．０ソフトウエア（ＵＶＰ  ＢｉｏＩｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を用いて行った。オルタナティブスプライシングの分析のために、胚（Ｅ）：成体（Ａ）スプライス比を、各サンプルにおける胚形態シグナルを成体形態シグナルで除したものとして定義した。スプライス比の補正は、ＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８処置のオルタナティブスプライシングに対する効果を示す（すなわち、Ｓｅｒｃａ１、Ｔｔｎ及びＣｌｃｎ１）。以下のプライマーを使用した。
【０１８０】
Ｓｅｒｃａ１−Ｆ：  ５’−ＧＣＴＣＡＴＧＧＴＣＣＴＣＡＡＧＡＴＣＴＣＡＣ−３’（配列番号２２）
Ｓｅｒｃａ１−Ｒ：  ５’−ＧＧＧＴＣＡＧＴＧＣＣＴＣＡＧＣＴＴＴＧ−３’（配列番号２３）
Ｔｔｎ−Ｆ：  ５’−ＧＴＧＴＧＡＧＴＣＧＣＴＣＣＡＧＡＡＡＣＧ−３’（配列番号２４）
Ｔｔｎ−Ｒ：  ５’−ＣＣＡＣＣＡＣＡＧＧＡＣＣＡＴＧＴＴＡＴＴＴＣ−３’（配列番号２５）
Ｃｌｃｎ１−Ｆ：  ５’−ＧＧＡＡＴＡＣＣＴＣＡＣＡＣＴＣＡＡＧＧＣＣ−３’（配列番号２６）
Ｃｌｃｎ１−Ｒ：  ５’−ＣＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＡＡＧＧＣＡＣＴＧＡＡＴＧＴ−３’（配列番号２７）
【０１８１】
結果：
最初の注射の４週間後、腓腹筋におけるＥＭＧ測定は、生理食塩水処置マウスと比較して、有意ではあるが、軽度のＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８処置マウスにおける筋強直の低減を明らかにした（図９Ａ）。この筋強直の低減は、腓腹筋における、毒性（ＣＵＧ）２５０転写物レベルの約５０％の低減（図９Ｂ）並びにＣｌｃｎ１、Ｓｅｒｃａ１及びＴｔｎ転写物に関する胚様（Ｅ）から正常な成体（Ａ）へのスプライシングパターンのシフト（図９Ｃ）と平行した。これらの結果は、ペプチドＬＧＡＱＳＮＦが実際に、インビボの筋肉において分子レベル及び表現型レベルの両方でＰＳ５８の送達及び／又は活性を促進したことを示す。
【０１８２】
実施例７：
イントロダクション：
この実施例も、ＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８のＨＳＡＬＲマウスにおけるインビボでの有効性を実証する。ここでは、マウスは、延長された時間、処置された。毒性（ＣＵＧ）２５０転写物のサイレンシング及び下流遺伝子のスプライシングパターンシフトをモニターし、生理食塩水処置マウスにおける毒性（ＣＵＧ）２５０転写物のサイレンシング及び下流遺伝子のスプライシングパターンシフトと比較した。
【０１８３】
材料及び方法：
動物：
ホモ接合性ＨＳＡＬＲマウス（ＨＳＡＬＲ２０ｂ系統）は、トランスジェニックヒト骨格α−アクチン遺伝子の３’ＵＴＲ内で２５０個のＣＴＧリピートを発現する（Ｍａｎｋｏｄｉ  Ａ．ら）。ＨＳＡＬＲマウスは、リボ核封入体、筋強直、筋障害性の特徴及びＤＭ１に類似した病理学的な筋肉変化を発症する。すべての動物実験は、Ｒａｄｂｏｕｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｎｉｊｍｅｇｅｎの動物実験委員会により承認された。
【０１８４】
オリゴヌクレオチド：
実施例１と同様に、ペプチドＬＧＡＱＳＮＦをＡＯＮ  ＰＳ５８（ＣＡＧ）７（配列番号１）の５’末端にカップリングした。
【０１８５】
インビボでの処置：
２５０ｍｇ／ｋｇのＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８の皮下注射を４週間頸部に受容した１１匹のＨＳＡＬＲマウスを、生理食塩水のみを受容したマウスと比較した。最初の注射の３２日後にすべてのマウスを屠殺し、組織を単離した。
【０１８６】
ＲＮＡの単離：
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて組織のＲＮＡを単離した。すなわち、組織サンプルをＴＲＩｚｏｌ中（１００ｍｇ  組織／ｍＬ  ＴＲＩｚｏｌ）で、パワーホモジナイザー（ウルトラＴＵＲＲＡＸ  Ｔ−８，ＩＫＡ  ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ）を用いてホモジナイズした。ＴＲＩｚｏｌ  １ｍＬ当たり０．２ｍＬのクロロホルム（Ｍｅｒｃｋ）を添加し、混合し、室温で３分間インキュベーションし、１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上部の水性相を集め、ＴＲＩｚｏｌ  １ｍＬ当たり０．５ｍＬのイソプロパノール（Ｍｅｒｃｋ）を添加し、その後、室温での１０分間のインキュベーション及び遠心分離（１３，０００ｒｐｍ，１０分間）が続いた。ＲＮＡ沈殿を７５％（ｖ／ｖ）エタノール（Ｍｅｒｃｋ）で洗浄し、空気乾燥し、ＭｉｌｌｉＱ中に溶解した。
【０１８７】
ノーザンブロッティング：
１レーン当たり１μｇのＲＮＡを負荷した１．２％アガロース−ホルムアルデヒド変性ゲルにおいてＲＮＡを電気泳動した。ＲＮＡをＨｙｂｏｎｄ−ＸＬナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）に移行させ、３２Ｐ−末端標識（ＣＡＧ）９又はマウス骨格アクチン特異的（ＭＳＡ）オリゴとハイブリダイズした。ブロットをＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ，Ｘ−ＯＭＡＴ  ＡＲ）に曝露した。シグナルの定量化をホスホ−イメージャー分析（ＧＳ−５０５又はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により行い、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）又はＩｍａｇｅＪソフトウエアにより分析した。正規化のためにＭＳＡレベルを使用した。
【０１８８】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析：
総体積２０μＬでＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔファーストストランド合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、およそ１μｇのＲＮＡをランダムヘキサマーによるｃＤＮＡ合成に供した。続いて、１μＬのｃＤＮＡ調製物を、標準的手順による半定量的ＰＣＲ分析において使用した。ＲＴ−対照実験においてリバーストランスクリプターゼを省略した。生成物の同一性はＤＮＡ配列決定により確認した。ＰＣＲ生成物を１．５〜２．５％アガロースゲルにおいて分析し、エチジウムブロミドで染色した。シグナルの定量化をＬａｂｗｏｒｋｓ  ４．０ソフトウエア（ＵＶＰ  ＢｉｏＩｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を用いて行った。オルタナティブスプライシングの分析のために、胚（Ｅ）：成体（Ａ）スプライス比を、各サンプルにおける胚形態シグナルを成体形態シグナルで除したものとして定義した。スプライス比の補正は、ＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８処置のオルタナティブスプライシングに対する効果を示す（すなわち、Ｓｅｒｃａ１、Ｔｔｎ及びＣｌｃｎ１）。以下のプライマーを使用した。
【０１８９】
Ｓｅｒｃａ１−Ｆ：  ５’−ＧＣＴＣＡＴＧＧＴＣＣＴＣＡＡＧＡＴＣＴＣＡＣ−３’（配列番号２２）
Ｓｅｒｃａ１−Ｒ：  ５’−ＧＧＧＴＣＡＧＴＧＣＣＴＣＡＧＣＴＴＴＧ−３’（配列番号２３）
Ｔｔｎ−Ｆ：  ５’−ＧＴＧＴＧＡＧＴＣＧＣＴＣＣＡＧＡＡＡＣＧ−３’（配列番号２４）
Ｔｔｎ−Ｒ：  ５’−ＣＣＡＣＣＡＣＡＧＧＡＣＣＡＴＧＴＴＡＴＴＴＣ−３’（配列番号２５）
Ｃｌｃｎ１−Ｆ：  ５’−ＧＧＡＡＴＡＣＣＴＣＡＣＡＣＴＣＡＡＧＧＣＣ−３’（配列番号２６）
Ｃｌｃｎ１−Ｒ：  ５’−ＣＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＡＡＧＧＣＡＣＴＧＡＡＴＧＴ−３’（配列番号２７）
【０１９０】
結果：
最初の注射の３２日後、ＨＳＡＬＲマウスを屠殺し、組織を単離した。ノーザンブロッティングは、生理食塩水処置マウスの腓腹筋及び前脛骨筋中の毒性（ＣＵＧ）２５０レベルと比較して、ＬＧＡＱＳＮＦ−ＰＳ５８処置マウスの腓腹筋（図１０ａ，左のグラフ）及び前脛骨筋（図１０ａ，右のグラフ）の両方における有意な毒性（ＣＵＧ）２５０レベルの低減を示した。両筋肉群において、約５０％の平均（ＣＵＧ）２５０レベルの低減が見出された。この（ＣＵＧ）２５０レベルの低減は、腓腹筋（図１０ｂ，左のグラフ）及び前脛骨筋（図１０ｂ，右のグラフ）の両方における、Ｃｌｃｎ  １、Ｓｅｒｃａ  １及びＴｔｎ転写物に関する胚様（Ｅ）から正常な成体（Ａ）へのスプライシングパターンのシフトと平行した。これらの結果も、インビボの筋肉においてペプチドＬＧＡＱＳＮＦがＰＳ５８の送達及び／又は活性を促進することを示す。
【０１９１】
2014513946.tif 000006
【０１９２】
参考文献：
Ｂｒａｉｄａ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ，  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（２０１０），ｖｏｌ  ９：  １３９９−１４１２
Ｅｄｅ，Ｎ．Ｊ．；Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｇ．Ｗ．；Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ，  Ｊ．Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１９９４，  ５，  ３７３−３７８
Ｈａｒｐｅｒ  ＰＳ（１９８９）  Ｍｙｏｔｏｎｉｃ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｗ．Ｂ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）
Ｈｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  ＢＭＣ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ２０１０，  １１：  ７２
Ｈｏｎｇｑｕｉｎｇ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１０；  １７：  １４１−１４２
Ｊａｎｕａｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ，  ２０１０；  ３２（２１）：  １７７５−１７７９
Ｊａｔ  ＰＳ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：  ５０９６−５１００
Ｋｕｍａｒ  Ｌ，  Ｐｈａｒｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００８，  ３，  １２８
Ｍａｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２００３；  ６１（８）：  １０８５−９２
Ｍａｎｋｏｄｉ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２００７；  １２９（１）：  ７９−９４
Ｍｕｌｄｅｒｓ  ＳＡ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０６：  １３９１５−１３９２０
Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２７８（２００９）  １０７−１１１
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  ＭＤ：  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００
Ｓｅｚｎｅｃ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ９：  １１８５−１１９４
Ｔａｎｅｊａ  ＫＬ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９５；  １２８：  ９９５−１００２
Ｔｏｎｅｓ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １９８３；  ６０：  １５７−１６８
Ｔｒｏｕｉｌｌａｓ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，１９９７：  １４５：  ２０５−２１１
Ｗａｌｋｅｒ，２００７  ＬＡＮＣＥＴ  ３６９；ｐ．２１８−２２８
Ｗｉｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２００６；  ７７：  ３９３−３９６
【図１】
2014513946.tif 000007
【図２】
2014513946.tif 000008
【図３】
2014513946.tif 000009
【図４】
2014513946.tif 000010
【図５】
2014513946.tif 000011
【図６】
2014513946.tif 000012
【図７】
2014513946.tif 000013
【図８】
2014513946.tif 000014
【図９】
2014513946.tif 000015
【図１０ａ】
2014513946.tif 000016
【図１０ｂ】
2014513946.tif 000017
【配列表】
2014513946000001.app
【国際調査報告】
2014513946.tif 000018
2014513946.tif 000019
2014513946.tif 000020