(57)【要約】本発明は、ウイルスの再活性化に基づいて、感染対象の細胞中に存在するレンチウイルス感染症を処置するための、より具体的には潜伏レトロウイルスＨＩＶ感染症を処置するための新規な方法を提供する。本発明は、対象中で感染細胞を破壊して免疫反応を惹起することができる潜伏ＨＩＶウイルスの強力な再活性化を引き起こす複数の薬剤を用いる併用療法を用いる。これは、前記対象中でウイルスを完全に根絶することを最終目標として感染を更に広げ得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのような処理が必要な対象におけるレトロウイルスに関連する疾患又は状態を処置する方法であって、治療又は予防有効量の
ａ）ＤＮＡメチル化阻害剤及び
ｂ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤
を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、前記ＤＮＡメチル化阻害剤が投与された後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡメチル化阻害剤が、５−アザシチジン（アザシチジン）、５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ＣｄＲ、デシタビン）、１−β−Ｄアラビノフラノシル−５−アザシトシン（ファザラビン）及びジヒドロ−５−アザシチジン（ＤＨＡＣ）、５−フルオロデオキシシチジン（ＦｄＣ）、２−Ｈピリミジノンを含むオリゴデオキシヌクレオチド二本鎖、ゼブラリン、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＭＧ９８、（−）−エピガロカテキン−３−ガラート、ヒドララジン、プロカイン、及びプロカインアミドを含む、２つのクラス（非ヌクレオシド及びヌクレオシド脱メチル化剤）から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡメチル化阻害剤が５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ＣｄＲ、デシタビン）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、ＴＳＡ、ＳＡＨＡ、ＭＳ−２７５、アミノスベロイルヒドロキサム酸、Ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサマート、ＬＡＱ−８２４、ＬＢＨ−５８９、ベリノスタット（ＰＸＤ−１０１）、Ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサマートの桂皮ヒドロキサム酸アナログであるパノビノスタット（ＬＢＨ−５８９）、ＩＦ２３５７、アリールオキシアルカノン酸ヒドロキサミド、デプシペプチド、アピシジン、分子のペプチド基を含む環状ヒドロキサム酸、ＦＫ−２２８、レッドＦＫ、脂肪族鎖でヒドロキサム酸に連結された環状ペプチド模倣物、ブチラート、酪酸フェニル、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕｔ）、バルプロ酸、ピバロイルオキシメチルブチラート、５  ＮＯＸ−２７５、及びＭＧＣＤ０１０３を含む種々のファミリー（ヒドロキサマート、環状ペプチド、脂肪酸、及びベンズアミド）から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒストンデアセチラーゼがＳＡＨＡ又はＮａＢｕｔである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
５−アザ−２’−デオキシシチジン＋ＳＡＨＡ及び５−アザ−２’−デオキシシチジン＋ＮａＢｕｔの組合せが使用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
そのような処置が必要な対象におけるレトロウイルスに関連する疾患又は状態を処置する方法であって、治療又は予防有効量のヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項９】
前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤が、ケトシン、ＵＮＣ０２２４、ジアゼピニル−キナゾリンアミン、非ＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）アナログ系ＨＭＴａｓｅ阻害剤、ＢＩＸ  ０１２９４、ＢＩＸ−０１３３８（水和物）、及び２−シクロヘキシル−Ｎ−（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）−６−メトキシ−７−（３−（ピロリジン−１−イル）プロポキシ）キナゾリン−４−アミンを含む群から選択される、請
求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒストンメチルトランスフェラーゼがケトシン又はＢＩＸ  ０１２９４である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
ＨＩＶ誘導物質、例えば
ａ）ＰＭＡ、プロストラチン、ブリオスタチン、及びＴＮＦ−αを含む群から選択されるＮＦ−κ−Ｂ誘導物質；
ｂ）ＴＳＡ、ＳＡＨＡ、ＭＳ−２７５、アミノスベロイルヒドロキサム酸、Ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサマート、ＬＡＱ−８２４、ＬＢＨ−５８９、ベリノスタット（ＰＸＤ−１０１）、Ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサマートの桂皮ヒドロキサム酸アナログであるパノビノスタット（ＬＢＨ−５８９）、ＩＦ２３５７、アリールオキシアルカノン酸ヒドロキサミド、デプシペプチド、アピシジン、分子のペプチド基を含む環状ヒドロキサム酸、ＦＫ−２２８、レッドＦＫ、脂肪族鎖によってヒドロキサム酸に連結された環状ペプチド模倣物、ブチラート、酪酸フェニル、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、ピバロイルオキシメチルブチラート、５  ＮＯＸ−２７５、及びＭＧＣＤ０１０３を含む種々のファミリー（ヒドロキサマート、環状ペプチド、脂肪酸、及びベンズアミド）から選択されるヒストンデアセチラーゼ阻害剤、及び／又は
ｃ）５−アザシチジン（アザシチジン）、５−アザ−２’−デオキシシチジン（デシタビン）、１−β−Ｄアラビノフラノシル−５−アザシトシン（ファザラビン）及びジヒドロ−５−アザシチジン（ＤＨＡＣ）、５−フルオロデオキシシチジン（ＦｄＣ）、２−Ｈピリミジノンを含むオリゴデオキシヌクレオチド二本鎖、ゼブラリン、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＭＧ９８、（−）−エピガロカテキン−３−ガラート、ヒドララジン、プロカイン、及びプロカインアミドを含む、２つのクラス（非ヌクレオシド及びヌクレオシド脱メチル化剤）から選択されるＤＮＡメチル化阻害剤
の投与を更に含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ケトシン＋プロストラチン及びケトシン＋ＳＡＨＡの組合せが使用される、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＢＩＸ  ０１２９４＋ＳＡＨＡの組合せが使用される、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記レトロウイルスが、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１、及びＨＴＬＶ−２からなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ａ）ＤＮＡメチル化阻害剤、
ｂ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、及び
ｃ）１又は複数の更なる成分、例えば、限定されるものではないが、１若しくは複数の溶媒及び／又は１若しくは複数の薬学的に許容される担体
を含む、医薬組成物又は製剤。
【請求項１６】
ａ）ＤＮＡメチル化阻害剤、
ｂ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、及び
ｃ）１又は複数の更なる成分、例えば、限定されるものではないが、１若しくは複数の溶媒及び／又は１若しくは複数の薬学的に許容される担体
を含む、そのような処置が必要な対象におけるレトロウイルスに関連する疾患又は状態の処置のための医薬組成物又は製剤。
【請求項１７】
前記ＤＮＡメチル化阻害剤が、５−アザシチジン（アザシチジン）、５−アザ−２’−
デオキシシチジン（デシタビン）、１−β−Ｄアラビノフラノシル−５−アザシトシン（ファザラビン）及びジヒドロ−５−アザシチジン（ＤＨＡＣ）、５−フルオロデオキシシチジン（ＦｄＣ）、２−Ｈピリミジノンを含むオリゴデオキシヌクレオチド二本鎖、ゼブラリン、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＭＧ９８、（−）−エピガロカテキン−３−ガラート、ヒドララジン、プロカイン、及びプロカインアミドを含む２つのクラス（非ヌクレオシド及びヌクレオシド脱メチル化剤）から選択される、請求項１５又は１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記ＤＮＡメチル化阻害剤が５−アザ−２’−デオキシシチジンである、請求項１５又は１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、ＴＳＡ、ＳＡＨＡ、ＭＳ−２７５、アミノスベロイルヒドロキサム酸、Ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサマート、ＬＡＱ−８２４、ＬＢＨ−５８９、ベリノスタット（ＰＸＤ−１０１）、Ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサマートの桂皮ヒドロキサム酸アナログであるパノビノスタット（ＬＢＨ−５８９）、ＩＦ２３５７、アリールオキシアルカノン酸ヒドロキサミド、デプシペプチド、アピシジン、分子のペプチド基を含む環状ヒドロキサム酸、ＦＫ−２２８、レッドＦＫ、ヒドロキサム酸に脂肪族鎖で連結された環状ペプチド模倣物、ブチラート、酪酸フェニル、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕｔ）、バルプロ酸、ピバロイルオキシメチルブチラート、５  ＮＯＸ−２７５、及びＭＧＣＤ０１０３を含む種々のファミリー（ヒドロキサマート、環状ペプチド、脂肪酸、及びベンズアミド）から選択される、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤がＳＡＨＡ又はＮａＢｕｔである、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記ＤＮＡメチル化阻害剤が５−アザ−２’−デオキシシチジンであり、前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤がＳＡＨＡ又はＮａＢｕｔである、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ａ）ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、及び
ｂ）１又は複数の更なる成分、例えば、限定されるものではないが、１若しくは複数の溶媒及び／又は１若しくは複数の薬学的に許容される担体
を含む医薬組成物又は製剤。
【請求項２３】
ａ）ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、及び
ｂ）１又は複数の更なる成分、例えば、限定されるものではないが、１若しくは複数の溶媒及び／又は１若しくは複数の薬学的に許容される担体
を含む、そのような処置が必要な対象におけるレトロウイルスに関連する疾患又は状態の処置のための医薬組成物又は製剤。
【請求項２４】
前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤が、ケトシン、ＵＮＣ０２２４、ジアゼピニル−キナゾリンアミン、非ＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）アナログ系ＨＭＴａｓｅ阻害剤、ＢＩＸ−０１２９４、ＢＩＸ−０１３３８（水和物）、及び２−シクロヘキシル−Ｎ−（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）−６−メトキシ−７−（３−（ピロリジン−１−イル）プロポキシ）キナゾリン−４−アミンを含む群から選択される、請求項２２又は２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ＨＩＶ誘導物質、例えば
ａ）ＰＭＡ、プロストラチン、ブリオスタチン、及びＴＮＦ−αを含む群から選択され
るＮＦ−κ−Ｂ誘導物質、
ｂ）ＴＳＡ、ＳＡＨＡ、ＭＳ−２７５、アミノスベロイルヒドロキサム酸、Ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサマート、ＬＡＱ−８２４、ＬＢＨ−５８９、ベリノスタット（ＰＸＤ−１０１）、Ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサマートの桂皮ヒドロキサム酸アナログであるパノビノスタット（ＬＢＨ−５８９）、ＩＦ２３５７、アリールオキシアルカノン酸ヒドロキサミド、デプシペプチド、アピシジン、分子のペプチド基を含む環状ヒドロキサム酸、ＦＫ−２２８、レッドＦＫ、脂肪族鎖によってヒドロキサム酸に連結された環状ペプチド模倣物、ブチラート、酪酸フェニル、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、ピバロイルオキシメチルブチラート、５  ＮＯＸ−２７５、及びＭＧＣＤ０１０３を含む種々のファミリー（ヒドロキサマート、環状ペプチド、脂肪酸、及びベンズアミド）から選択されるヒストンデアセチラーゼ阻害剤、及び／又は
ｃ）５−アザシチジン（アザシチジン）、５−アザ−２’−デオキシシチジン（デシタビン）、１−β−Ｄアラビノフラノシル−５−アザシトシン（ファザラビン）及びジヒドロ−５−アザシチジン（ＤＨＡＣ）、５−フルオロデオキシシチジン（ＦｄＣ）、２−Ｈピリミジノンを含むオリゴデオキシヌクレオチド二本鎖、ゼブラリン、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＭＧ９８、（−）−エピガロカテキン−３−ガラート、ヒドララジン、プロカイン、及びプロカインアミドを含む２つのクラス（非ヌクレオシド及びヌクレオシド脱メチル化剤）から選択されるＤＮＡメチル化阻害剤
を更に含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
ケトシン＋プロストラチン又はケトシン＋ＳＡＨＡの組合せを含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
ＢＩＸ−０１２９４＋ＳＡＨＡの組合せを含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
種々の成分を混合して組成物又は製剤にすることを含む、上に記載の組成物又は製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬分野、より具体的にはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）等の感染症を処置する分野に関する。本発明は、（潜伏性）ＨＩＶ感染症を処置する新規な方法及びそれに有用な組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
有効な抗レトロウイルス薬併用療法（ｃＡＲＴ）にも関わらず、転写的にサイレントであるが複製能のある安定に組み込まれたＨＩＶ−１プロウイルスを有するＨＩＶ−１リザーバーの残存は、ｃＡＲＴ処置ＨＩＶ感染個体からＨＩＶ−１を根絶する希望に対する深刻な課題である。実際、ＨＩＶ−１リザーバーは、ｃＡＲＴに非感受性であり、宿主免疫反応から逃れることができる。したがって、これらの潜伏性リザーバーは、ウイルス再活性化の永続的な源であり、ｃＡＲＴ中断後に観察される血漿ウイルス量のリバウンドに関与し得る。したがって、ｃＡＲＴ処置は生涯続ける必要があり、複数の長期副作用及び未感染個体より短い平均余命を招く。感染の完全解消（ヒトの体からＨＩＶを排除すること）又はより可能性が高い実質的完治（ｃＡＲＴを用いずにＨＩＶ感染及び疾患の進行を長期間制御すること）を目指した複数の治療アプローチが提唱されてきた。このような流れで、有効なｃＡＲＴと組み合せた潜伏感染細胞におけるＨＩＶ−１遺伝子発現の再活性化は、持続的リザーバーのプールを低減することを目的としたアジュバント治療となり得る。
【０００３】
ＨＩＶ−１転写阻害は、組込み後の潜伏の確立及び維持に重要である。クロマチン構成及びＨＩＶ−１プロモーターのエピジェネティックな制御がこの転写サイレンシングの重要な要素である。一方で、転写開始部位のすぐ下流に位置する抑制ヌクレオソームｎｕｃ−１は、潜伏状態においてヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）によって低アセチル化状態で維持されている。本発明者らの研究室は、潜伏ＨＩＶ−１感染細胞系をＨＤＡＣ阻害剤（ＨＤＡＣＩ）で処理するとウイルス転写及びｎｕｃ−１のリモデリングが誘導されることを以前に報告している。更に、ヒストンＨ３リジン９（Ｈ３Ｋ９）メチル化がクロマチンを介したＨＩＶ−１発現の抑制において主要な役割を果たしていることが、本発明者らの研究室により小膠細胞中で、他の研究者によりＴ細胞又は患者細胞中で示されている。Ｈ３Ｋ９トリメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）に主に関与するヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）であるＳｕｖ３９Ｈ１及びＨ３Ｋ９ジメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ２）に関与するＧ９ａは、ＨＩＶ−１転写サイレンシングにおいて役割を果たすことが示されている。他方、本発明者らの研究室及び他の研究者らにより、ＤＮＡメチル化が、ＨＩＶ−１組込み後潜伏に関わるもう１つのエピジェネティックな修飾であることが報告されている。ＤＮＡメチル化は、おそらくは抑制的なヒストン修飾と共に、プロウイルスのサイレント状態を「ロック」して、活性状態への回復を困難にすることの一因となっている。これらの観察結果は、ＨＤＡＣ又はＨＭＴ又はＤＮＡメチル化の阻害剤が、有効なｃＡＲＴと一緒に、潜伏リザーバーのプールを宿主免疫系が耐えられるレベルまで低減／排除することを目的とした良好な抗潜伏薬物候補となることを示唆している。
【０００４】
このような中、複数の臨床研究で、ＨＩＶ＋患者の血液から単離した生体外細胞培養物においてＨＤＡＣＩ単独（バルプロ酸（ＶＰＡ）又はボリノスタット（スベロイルアニリドヒドロキサム酸、ＳＡＨＡ）、２つのＦＤＡ承認薬物））の再活性化能が調べられた。彼らの公開された結果又は非公開の予備的結果は有望であるが、彼らは、潜伏ＨＩＶ−１リザーバーのサイズ減少に対する、単独で使用されたこれらの薬物の効率を疑問視している。本発明者らの研究室は以前に、２つの薬物の併用（ＨＤＡＣＩ及びＮＦ−κＢ誘導物質プロストラチン）により、使用された潜伏感染細胞系においてＨＩＶ−１産生の相乗的
な再活性化、すなわち各薬物により個々に生じる再活性化の合計より大きな再活性化が引き起こされることを示している。更に、同じ薬物の組合せは、ｃＡＲＴ処置患者由来のＣＤ８+枯渇ＰＢＭＣ培養物中、薬物を単独で用いた時に観察されるよりも大きな割合の細
胞中でＨＩＶ−１発現を再活性化する。したがって、彼らは、潜伏ＨＩＶ−１リザーバーのプールを低減させる治療展望として、有効なｃＡＲＴと一緒に異なる２種類の治療上有望なＨＩＶ−１誘導物質を共投与するというコンセプトの検証を示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、彼らの培養物の４０％において、彼らはプロストラチン及びＨＤＡＣＩで個々に又は組み合せて処理した後に如何なるウイルス成長も検出することができなかった。これは、効率的なウイルスの転写再活性化及び発現を妨げる、休止細胞中の一部の組み込まれたプロウイルスのより強力なエピジェネティックな抑制によるものと考えられ、新規な組合せの再活性化戦略を発見することの重要性を示している。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで、本発明では、単独又は他のクラスのＨＩＶ−１誘導物質と組み合せて、２つの別のクラスの化合物、すなわちＤＮＡメチル化阻害剤及びヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（ＨＭＴＩ）のＨＩＶ−１再活性化能を利用する。
【０００７】
本発明は、単独又は他のクラスのＨＩＶ−１誘導物質と組み合せて、２つのクラスの化合物、すなわちＤＮＡメチル化阻害剤（５−アザ−２’デオキシシチジン［５−アザ−ＣｄＲ又はデシタビン］）及びヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（ケトシン及びＢＩＸ−０１２９４）のＨＩＶ−１再活性化能を利用する。
【０００８】
本発明は、単独又は他のＨＩＶ−１誘導物質と組み合せたＤＮＡメチル化阻害剤又はＨＭＴ阻害剤がＨＩＶ−１産生をその潜伏状態から再活性化し、薬物併用時にこの効果が更に強まることを報告する。したがって、これは、持続的な抗レトロウイルス薬療法と共に、ｃＡＲＴ処置ＨＩＶ＋感染患者における潜伏リザーバーのプールを低減する治療戦略となる。
【０００９】
一方で、本発明者らは、骨髄異形成症候群についてヒトの治療に承認されているＤＮＡメチル化阻害剤５−アザ−ＣｄＲ及びヒトの治療において（例えば、ＶＰＡ、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕｔ）、又はＳＡＨＡ）又は臨床試験において（例えばＭＳ−２７５）に用いられる種々の構造的ＨＤＡＣＩファミリーを含む複数のＨＤＡＣＩを含む組合せの再活性化の効果を試験した（図５）。これにより、そのような組合せが、組込み後潜伏モデルＴ細胞系においてＨＩＶ−１産生の相乗的活性化（ウイルスｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方）を誘導すること及び５−アザ−ＣｄＲ＋ＮａＢｕｔ及び５−アザ−ＣｄＲ＋ＳＡＨＡの組合せを用いた時に最も強い相乗作用が観察されることが示された（図５）。これらの相乗作用は、少なくとも一部は、非反応性細胞が発現細胞集団へと相乗的にリクルートされることによるものであり（図５ｂ）、ＨＩＶ−１  ５’ＬＴＲ中のＣｐＧジヌクレオチドの部分的脱メチル化を伴っていた。更に、ウイルス量が検出不能なＨＩＶ+  ｃＡＲＴ処置患者から単離したＣＤ８+枯渇ＰＢＭＣ培養物における本発明者らの予備データは、５−アザ−ＣｄＲがＳＡＨＡの再活性化能を増大させ得ることを強調していた。
【００１０】
好ましい実施形態では、５−アザ−ＣｄＲ等のＤＮＡメチル化阻害剤を、ＶＰＡ、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕｔ）、又はＳＡＨＡ等のヒトの治療に用いられる種々の構造的ＨＤＡＣＩファミリーを含むＨＤＡＣＩと組み合せる。ＳＡＨＡと比べて毒性が低く、活性が高いため、酪酸ナトリウムとの組合せが特に好ましい。
【００１１】
他方で、本発明者らは、ＨＭＴ阻害剤（それぞれＳｕｖ３９Ｈ１又はＧ９ａの２つの特異的阻害剤であるケトシン及びＢＩＸ−０１２９４）の治療可能性を、潜伏期からのＨＩＶ−１の再活性化に与える影響について評価した。最初に、潜伏感染細胞系において、本発明者らは、ＨＭＴＩケトシンが単独でＨＩＶ−１遺伝子発現及び産生を増大させ（図１）、非腫瘍ＮＦ−κＢ誘導物質プロストラチンと相乗的に機能すること（図２）を示した。第２に、本発明者らは、ウイルス量が検出不能な６７名のＨＩＶ+ｃＡＲＴ処置患者か
ら単離したＣＤ８+枯渇ＰＢＭＣ又は休止ＣＤ４+Ｔ細胞の生体外培養物中で単独の又は他のＨＩＶ−１誘導物質（ＩＬ−２及び同種異系刺激の非存在下）と組み合せたＨＭＴＩで処理した後のＨＩＶ−１復活を測定した。これにより、ケトシンが、ＨＩＶ−１+ｃＡＲ
Ｔ処置患者から単離したＣＤ８+枯渇ＰＢＭＣ培養物の５０％（表２ａ）及び休止ＣＤ４+Ｔ細胞培養物の８６％（表２ｂ）でＨＩＶ−１復活を誘導し、一方、ＢＩＸ−０１２９４が、同様な患者から単離した休止ＣＤ４+Ｔ細胞培養物の８０％でＨＩＶ−１発現を再活
性化すること（表４）が初めて示された。更に、これらは、１つのＨＭＴＩとＨＤＡＣＩであるＳＡＨＡ又は非腫瘍促進ＮＦ−ＫＢ誘導物質であるプロストラチンのいずれかとを含む併用処置が、これらの化合物単独での処置よりも高い再活性化能を有することを示した（図３及び４並びに表３）。結論として、本発明者らは、単独又は他のＨＩＶ−１誘導物質と組み合せて用いたＨＭＴＩが、ｃＡＲＴ処置患者由来の休止記憶ＣＤ４+Ｔ細胞中
でＨＩＶ−１復活を生じさせることを初めて示した。これらの結果は２０１２年７月にＡＩＤＳで公開された（BOUCHAT et al., AIDS, 26(12), 1473-1482.PMID:22555163）。ケ
トシン及びＢＩＸ−０１２９４はヒトに安全に投与することはできないが、これらの結果は、ＨＩＶ−１潜伏リザーバーのプールを低減することを目的とした戦略にＨＭＴＩを用いるというコンセプトの証明となる。ＨＭＴＩは抗癌療法における有望な化合物でもあるので、他のより安全なＨＭＴＩがすぐに合成され、ＨＩＶ−１+ｃＡＲＴ処置個体におけ
るそれらの再活性化能が評価されるであろう。
【００１２】
これらの結果は、単独又は他のＨＩＶ−１誘導物質と組み合せたＤＮＡメチル化又はＨＭＴの阻害剤の投与が、持続的ｃＡＲＴと共に、感染患者中でＨＩＶ−１を潜伏期から再活性化する有望な治療戦略であることを示唆している。
【００１３】
したがって、本発明は以下を提供する。
１．そのような処置が必要な対象においてレトロウイルスに関連する疾患又は状態を処置する方法であって、治療又は予防有効量の
ａ）ＤＮＡメチル化阻害剤及び
ｂ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤
を前記対象に投与することを含む、方法。
【００１４】
２．ＤＮＡメチル化阻害剤が投与された後にヒストンデアセチラーゼ阻害剤が投与される、第１項に記載の方法。
【００１５】
３．前記ＤＮＡメチル化阻害剤が、５−アザシチジン（アザシチジン）、５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ＣｄＲ、デシタビン）、１−β−Ｄアラビノフラノシル−５−アザシトシン（ファザラビン）、ジヒドロ−５−アザシチジン（ＤＨＡＣ）、５−フルオロデオキシシチジン（ＦｄＣ）、２−Ｈピリミジノンを含むオリゴデオキシヌクレオチド二本鎖、ゼブラリン、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＭＧ９８、（−）−エピガロカテキン−３−ガラート、ヒドララジン、プロカイン、及びプロカインアミドを含む２つのクラスのＤＮＡメチル化阻害剤（非ヌクレオシド及びヌクレオシド脱メチル化剤）から選択される、第１項又は第２項に記載の方法。
【００１６】
４．前記ＤＮＡメチル化阻害剤が５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ＣｄＲ
、デシタビン）である、第１〜３項のいずれか一項に記載の方法。
【００１７】
５．前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、ＴＳＡ、ＳＡＨＡ、ＭＳ−２７５、アミノスベロイルヒドロキサム酸、Ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサマート、ＬＡＱ−８２４、ＬＢＨ−５８９、ベリノスタット（ＰＸＤ−１０１）、Ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサマートの桂皮ヒドロキサム酸アナログであるパノビノスタット（ＬＢＨ−５８９）、ＩＦ２３５７、アリールオキシアルカノン酸ヒドロキサミド、デプシペプチド、アピシジン、分子のペプチド基を含む環状ヒドロキサム酸、ＦＫ−２２８、レッドＦＫ、脂肪族鎖でヒドロキサム酸に連結された環状ペプチド模倣物、ブチラート、酪酸フェニル、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、ピバロイルオキシメチルブチラート、５  ＮＯＸ−２７５、及びＭＧＣＤ０１０３を含む種々のファミリーのＨＤＡＣＩ（ヒドロキサマート、環状ペプチド、脂肪酸、及びベンズアミド）から選択される、第１〜４項のいずれか一項に記載の方法。
【００１８】
６．前記ヒストンデアセチラーゼが、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ、ボリノスタット）又は酪酸ナトリウム（ＮａＢｕｔ）である、第１〜５項のいずれか一項に記載の方法。
【００１９】
７．５−アザ−２’−デオキシシチジン＋ＳＡＨＡ及び５−アザ−２’−デオキシシチジン＋ＮａＢｕｔの組合せが用いられる、第１〜６項のいずれか一項に記載の方法。
【００２０】
８．そのような処置が必要な対象におけるレトロウイルスに関連する疾患又は状態を処置する方法であって、治療又は予防有効量のヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を前記対象に投与することを含む、方法。
【００２１】
９．前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤が、ケトシン、ＵＮＣ０２２４、ジアゼピニル−キナゾリンアミン、非ＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）アナログ系ＨＭＴａｓｅ阻害剤、ＢＩＸ−０１２９４、ＢＩＸ−０１３３８（水和物）、及び２−シクロヘキシル−Ｎ−（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）−６−メトキシ−７−（３−（ピロリジン−１−イル）プロポキシ）キナゾリン−４−アミンを含む群から選択される、第８項に記載の方法。
【００２２】
１０．前記ヒストンメチルトランスフェラーゼがケトシン又はＢＩＸ−０１２９４である、第８項又は第９項に記載の方法。
【００２３】
１１．ＨＩＶ誘導物質、例えば
ａ）ＰＭＡ、プロストラチン、ブリオスタチン、及びＴＮＦ−αを含む群から選択されるＮＦ−κ−Ｂ誘導物質、
ｂ）ＴＳＡ、ＳＡＨＡ、ＭＳ−２７５、アミノスベロイルヒドロキサム酸、Ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサマート、ＬＡＱ−８２４、ＬＢＨ−５８９、ベリノスタット（ＰＸＤ−１０１）、Ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサマートの桂皮ヒドロキサム酸アナログであるパノビノスタット（ＬＢＨ−５８９）、ＩＦ２３５７、アリールオキシアルカノン酸ヒドロキサミド、デプシペプチド、アピシジン、分子のペプチド基を含む環状ヒドロキサム酸、ＦＫ−２２８、レッドＦＫ、脂肪族鎖でヒドロキサム酸に連結された環状ペプチド模倣物、ブチラート、酪酸フェニル、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、ピバロイルオキシメチルブチラート、５  ＮＯＸ−２７５、及びＭＧＣＤ０１０３を含む種々のファミリー（ヒドロキサマート、環状ペプチド、脂肪酸、及びベンズアミド）から選択されるヒストンデアセチラーゼ阻害剤、及び／又は
ｃ）５−アザシチジン（アザシチジン）、５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ＣｄＲ、デシタビン）、１−β−Ｄアラビノフラノシル−５−アザシトシン（ファザ
ラビン）及びジヒドロ−５−アザシチジン（ＤＨＡＣ）、５−フルオロデオキシシチジン（ＦｄＣ）、２−Ｈピリミジノンを含むオリゴデオキシヌクレオチド二本鎖、ゼブラリン、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＭＧ９８、（−）−エピガロカテキン−３−ガラート、ヒドララジン、プロカイン、及びプロカインアミドを含む２つクラス（非ヌクレオシド及びヌクレオシド脱メチル化剤）から選択されるＤＮＡメチル化阻害剤
の投与を更に含む、第８〜１０項のいずれか一項に記載の方法。
【００２４】
１２．ケトシン＋プロストラチン及びケトシン＋ＳＡＨＡの組合せが用いられる、第８〜１１項のいずれか一項に記載の方法。
【００２５】
１３．ＢＩＸ−０１２９４＋ＳＡＨＡの組合せが用いられる、第８〜１１項のいずれか一項に記載の方法。
【００２６】
１４．前記レトロウイルスが、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１、及びＨＴＬＶ−２からなる群から選択される、第１〜１３項のいずれか一項に記載の方法。
【００２７】
１５．
ａ）ＤＮＡメチル化阻害剤、
ｂ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、及び
ｃ）そのような医薬組成物処置が必要な対象におけるレトロウイルスに関連する疾患又は状態の処置に有用であり得る１又は複数の更なる成分、例えば、限定されるものではないが、１若しくは複数の溶媒及び／又は１若しくは複数の薬学的に許容される担体
を含む、医薬組成物又は製剤。
【００２８】
１６．前記ＤＮＡメチル化阻害剤が、５−アザシチジン（アザシチジン）、５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ＣｄＲ、デシタビン）、１−β−Ｄアラビノフラノシル−５−アザシトシン（ファザラビン）及びジヒドロ−５−アザシチジン（ＤＨＡＣ）、５−フルオロデオキシシチジン（ＦｄＣ）、２−Ｈピリミジノンを含むオリゴデオキシヌクレオチド二本鎖、ゼブラリン、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＭＧ９８、（−）−エピガロカテキン−３−ガラート、ヒドララジン、プロカイン、及びプロカインアミドを含む２つのクラス（非ヌクレオシド及びヌクレオシド脱メチル化剤）から選択される、第１５項に記載の医薬組成物。
【００２９】
１７．前記ＤＮＡメチル化阻害剤が５−アザ−２’−デオキシシチジンである、第１５項に記載の医薬組成物。
【００３０】
１８．前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、ＴＳＡ、ＳＡＨＡ、ＭＳ−２７５、アミノスベロイルヒドロキサム酸、Ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサマート、ＬＡＱ−８２４、ＬＢＨ−５８９、ベリノスタット（ＰＸＤ−１０１）、Ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサマートの桂皮ヒドロキサム酸アナログであるパノビノスタット（ＬＢＨ−５８９）、ＩＦ２３５７、アリールオキシアルカノン酸ヒドロキサミド、デプシペプチド、アピシジン、分子のペプチド基を含む環状ヒドロキサム酸、ＦＫ−２２８、レッドＦＫ、ヒドロキサム酸に脂肪族鎖で連結された環状ペプチド模倣物、ブチラート、酪酸フェニル、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、ピバロイルオキシメチルブチラート、５  ＮＯＸ−２７５、及びＭＧＣＤ０１０３を含む種々のファミリー（ヒドロキサマート、環状ペプチド、脂肪酸、及びベンズアミド）から選択される、第１５〜１７項のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【００３１】
１９．前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤がＳＡＨＡ又はＮａＢｕｔである、第１５〜１
８項のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【００３２】
２０．前記ＤＮＡメチル化阻害剤が５−アザ−２’−デオキシシチジンであり、前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤がＳＡＨＡ又はＮａＢｕｔである、第１５〜１９項のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【００３３】
２１．
ａ）ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、及び
ｂ）あり得る１又は複数の更なる成分、例えば、限定されるものではないが、１若しくは複数の溶媒及び／又は１若しくは複数の薬学的に許容される担体
を含む、そのような処置が必要な対象におけるレトロウイルスに関連する疾患又は状態の処置のための医薬組成物又は製剤
【００３４】
２２．前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤が、ケトシン、ＵＮＣ０２２４、ジアゼピニル−キナゾリンアミン、非ＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）アナログ系ＨＭＴａｓｅ阻害剤、ＢＩＸ−０１２９４、ＢＩＸ−０１３３８（水和物）、及び２−シクロヘキシル−Ｎ−（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）−６−メトキシ−７−（３−（ピロリジン−１−イル）プロポキシ）キナゾリン−４−アミンを含む群から選択される、第２１項に記載の医薬組成物。
【００３５】
２３．ＨＩＶ誘導物質、例えば
ａ）ＰＭＡ、プロストラチン、ブリオスタチン、及びＴＮＦ−αを含む群から選択されるＮＦ−κ−Ｂ誘導物質、
ｂ）ＴＳＡ、ＳＡＨＡ、ＭＳ−２７５、アミノスベロイルヒドロキサム酸、Ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサマート、ＬＡＱ−８２４、ＬＢＨ−５８９、ベリノスタット（ＰＸＤ−１０１）、Ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサマートの桂皮ヒドロキサム酸アナログであるパノビノスタット（ＬＢＨ−５８９）、ＩＦ２３５７、アリールオキシアルカノン酸ヒドロキサミド、デプシペプチド、アピシジン、分子のペプチド基を含む環状ヒドロキサム酸、ＦＫ−２２８、レッドＦＫ、脂肪族鎖によってヒドロキサム酸に連結された環状ペプチド模倣物、ブチラート、酪酸フェニル、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、ピバロイルオキシメチルブチラート、５  ＮＯＸ−２７５、及びＭＧＣＤ０１０３を含む種々のファミリー（ヒドロキサマート、環状ペプチド、脂肪酸、及びベンズアミド）から選択されるヒストンデアセチラーゼ阻害剤、及び／又は
ｃ）５−アザシチジン（アザシチジン）、５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ＣｄＲ、デシタビン）、１−β−Ｄアラビノフラノシル−５−アザシトシン（ファザラビン）及びジヒドロ−５−アザシチジン（ＤＨＡＣ）、５−フルオロデオキシシチジン（ＦｄＣ）、２−Ｈピリミジノンを含むオリゴデオキシヌクレオチド二本鎖、ゼブラリン、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＭＧ９８、（−）−エピガロカテキン−３−ガラート、ヒドララジン、プロカイン、及びプロカインアミドを含む２つのクラス（非ヌクレオシド及びヌクレオシド脱メチル化剤）から選択されるＤＮＡメチル化阻害剤
を更に含む、第２１項又は第２２項に記載の医薬組成物。
【００３６】
２４．ケトシン＋プロストラチン又はケトシン＋ＳＡＨＡの組合せを含む、第２３項に記載の医薬組成物。
【００３７】
２５．ＢＩＸ−０１２９４＋ＳＡＨＡの組合せを含む、第２３項に記載の医薬組成物。
【００３８】
２６．種々の成分を混合して組成物又は製剤にすることを含む、上記項のいずれかに記載の組成物又は製剤の製造方法。
【００３９】
２７．レトロウイルス、好ましくはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１、及びＨＴＬＶ−２からなる群から選択されるレトロウイルス、好ましくは潜伏感染のレトロウイルスに関連する疾患又は状態の処置のための、第１５〜２５項のいずれか一項に記載の組成物。
【００４０】
２８．潜伏レトロウイルス感染症の根絶及び／又はレトロウイルスリザーバーの破壊のための、第１５〜２５項のいずれか一項に記載の組成物。
【００４１】
２９．ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、ＤＮＡメチル化阻害剤が投与された後に投与される、レトロウイルス、好ましくはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１、及びＨＴＬＶ−２からなる群から選択されるレトロウイルス、より好ましくは潜伏感染症のレトロウイルスに関連する疾患又は状態の処置のための、第１５〜２５項のいずれか一項に記載の組成物。
【００４２】
以下に本発明を図を用いて説明するが、これらは例示のみを目的とすると理解するべきであり、発明は開示されている実施形態に何ら限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１Ａ】単独又はＨＩＶ−１誘導物質と組み合せたＨＭＴＩの結果。ケトシンはＨＩＶ−１復活を用量依存的に誘導する。ケトシンは、感染Ｔリンパ球細胞においてＨＩＶ−１  ５’ＬＴＲの転写活性を上昇させる。ジャーカット又はＳｕｐＴ１細胞系をＰＬＴＲHIV-I−ＩＵＣエピソームレポーターコンストラクトで一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、偽処理又は記載されているようにケトシン処理を細胞に行った。誘導２４時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。ルシフェラーゼ活性をタンパク質濃度に関して標準化した。偽処理細胞で得られた結果を任意で１の値に設定した。
【図１Ｂ】単独又はＨＩＶ−１誘導物質と組み合せたＨＭＴＩの結果。ケトシンはＨＩＶ−１復活を用量依存的に誘導する。ケトシンは、感染Ｔリンパ球細胞においてＨＩＶ−１  ５’ＬＴＲの転写活性を上昇させる。ジャーカット又はＳｕｐＴ１細胞系をＰＬＴＲHIV-I−ＩＵＣエピソームレポーターコンストラクトで一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、偽処理又は記載されているようにケトシン処理を細胞に行った。誘導２４時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。ルシフェラーゼ活性をタンパク質濃度に関して標準化した。偽処理細胞で得られた結果を任意で１の値に設定した。
【図１Ｃ】単独又はＨＩＶ−１誘導物質と組み合せたＨＭＴＩの結果。ケトシンは、潜伏感染Ｊ−Ｌａｔ  １５．４細胞系でＨＩＶ−１産生を増加させる。Ｊ−Ｌａｔ  １５．４細胞系に、偽処理又は記載されているようにケトシン処理を行った。細胞上清中でのｐ２４産生を測定した。偽処理細胞で得られた結果を任意でそれぞれ１又は１００％の値に設定した。
【図１Ｄ】単独又はＨＩＶ−１誘導物質と組み合せたＨＭＴＩの結果。ケトシンは、潜伏感染Ｊ−Ｌａｔ  １５．４細胞系でＨＩＶ−１産生を増加させる。Ｊ−Ｌａｔ  １５．４細胞系に、偽処理又は記載されているようにケトシン処理を行った。細胞上清中での細胞生存率を測定した。偽処理細胞で得られた結果を任意でそれぞれ１又は１００％の値に設定した。
【図２】単独又はＨＩＶ−１誘導物質と組み合せたＨＭＴＩの結果。ケトシン＋プロストラチンの併用処理は、潜伏感染Ｊ−Ｌａｔ  １５．４細胞系においてＨＩＶ−１転写を相乗的に増加させる。Ｊ−Ｌａｔ  １５．４細胞系に、偽処理又はケトシン、プロストラチン、若しくは両方の薬物の組合せを用いた処理を行った。これらの細胞から全ＲＮＡを抽出し、ランダムプライマーを用いて逆転写した。その後、ｃＤＮＡを、開始転写産物を定量化するためのＴＡＲ中でハイブリダイズするプライマー対又は伸長転写産物を定量化するためのＴａｔ中でハイブリダイズするプライマー対を用いたＰＣＲ反応に用いた。βアクチンを用いて結果を標準化し、偽処理条件と比べた誘導倍率を示すヒストグラムとして表す。
【図３ａ】単独又はＨＩＶ−１誘導物質と組み合せたＨＭＴＩの結果。ケトシンを含む併用処理は、ＨＩＶ−１感染ｃＡＲＴ処置患者由来の休止記憶ＣＤ４+Ｔ細胞の一部の生体外培養物においてより高いウイルス産生を誘導する。休止記憶ＣＤ４+Ｔ細胞の培養物を偽処理又は記載通りに処理した。処理の６日後、培養上清中のウイルスＲＮＡ濃度を測定した（１ｍｌ当たりのコピー数）。ケトシン＋プロストラチンの組合せは、ＨＩＶ−１感染ｃＡＲＴ処置患者由来の休止記憶ＣＤ４+Ｔ細胞においてＨＩＶ−１復活を誘導する。再活性化された患者培養物を、併用処理後にＨＩＶ−１復活が個々の処理後より高いウイルス産生を示した関連するカテゴリーに分類した。
【図３ｂ】単独又はＨＩＶ−１誘導物質と組み合せたＨＭＴＩの結果。ケトシンを含む併用処理は、ＨＩＶ−１感染ｃＡＲＴ処置患者由来の休止記憶ＣＤ４+Ｔ細胞の一部の生体外培養物においてより高いウイルス産生を誘導する。休止記憶ＣＤ４+Ｔ細胞の培養物を偽処理又は記載通りに処理した。処理の６日後、培養上清中のウイルスＲＮＡ濃度を測定した（１ｍｌ当たりのコピー数）。ケトシン＋ＳＡＨＡの組合せは、ウイルス量が検出不能なＨＩＶ−１感染ｃＡＲＴ処置患者由来の休止記憶ＣＤ４+Ｔ細胞においてＨＩＶ−１復活を誘導する。再活性化された患者培養物を２つの関連するカテゴリー、すなわち、（ｂ１）併用処理後のＨＩＶ−１の復活が個々の処理後より高かった培養物及び（ｂ２）併用処理後にウイルスＲＮＡ産生の相乗的再活性化が観察された培養物、に細分した。
【図４】単独又はＨＩＶ−１誘導物質と組み合せたＨＭＴＩの結果。ＳＡＨＡと組み合せたＢＩＸ−０１２９４は、ウイルス量が検出不能なＨＩＶ−１感染ｃＡＲＴ処置患者に由来する休止記憶ＣＤ４+Ｔ細胞においてＨＩＶ−１復活を誘導する。休止記憶ＣＤ４+Ｔ細胞の培養物を偽処理、ＢＩＸ−０１２９４単独、ＳＡＨＡ単独、又はＳＡＨＡ＋ＢＩＸ−０１２９４の組合せで処理した。処理の６日後、培養上清中のウイルスＲＮＡ濃度を１ｍｌ当たりのコピー数として決定した（｜は閾値未満を示す）。本発明者らが併用処理後に１ミリリットル当たりのウイルスＲＮＡコピー数の相乗的増加を観察した患者細胞培養物の関連カテゴリーが示されている。
【図５Ａ】ＨＤＡＣＩと組み合せたＤＮＡメチル化阻害剤の結果。Ｊ−Ｌａｔ  ８．４細胞系における５−アザ−ＣｄＲ及びＨＤＡＣＩによるＨＩＶ−１発現の相乗的活性化。ｎｅｆの代わりに緑色蛍光タンパク質ＧＦＰをコードする遺伝子を含む全長潜伏ＨＩＶ−１プロウイルスを有するＪ−Ｌａｔ  ８．４細胞系を偽処理又は５−アザ−ＣｄＲで４８時間処理した。その後、ＨＤＡＣＩを２４時間加えた。複製サンプルの平均値及び平均値の標準誤差を示す。３つのうちの代表的な１つの実験を示す。５−アザ−ＣｄＲ処理後７２時間目に、細胞上清中のｐ２４産生を測定した。偽処理細胞で得られた結果を任意に１の値に設定した。
【図５Ｂ】ＨＤＡＣＩと組み合せたＤＮＡメチル化阻害剤の結果。Ｊ−Ｌａｔ  ８．４細胞系における５−アザ−ＣｄＲ及びＨＤＡＣＩによるＨＩＶ−１発現の相乗的活性化。ｎｅｆの代わりに緑色蛍光タンパク質ＧＦＰをコードする遺伝子を含む全長潜伏ＨＩＶ−１プロウイルスを有するＪ−Ｌａｔ  ８．４細胞系を偽処理又は５−アザ−ＣｄＲで４８時間処理した。その後、ＨＤＡＣＩを２４時間加えた。複製サンプルの平均値及び平均値の標準誤差を示す。３つのうちの代表的な１つの実験を示す。Ｂ．５−アザ−ＣｄＲ処理後７２時間目にＦＡＣＳにより分析し、ＧＰＦ+細胞の割合をヒストグラムで表した。
【図５Ｃ】ＨＤＡＣＩと組み合せたＤＮＡメチル化阻害剤の結果。Ｊ−Ｌａｔ  ８．４細胞系における５−アザ−ＣｄＲ及びＨＤＡＣＩによるＨＩＶ−１発現の相乗的活性化。ｎｅｆの代わりに緑色蛍光タンパク質ＧＦＰをコードする遺伝子を含む全長潜伏ＨＩＶ−１プロウイルスを有するＪ−Ｌａｔ  ８．４細胞系を偽処理又は５−アザ−ＣｄＲで４８時間処理した。その後、ＨＤＡＣＩを２４時間加えた。複製サンプルの平均値及び平均値の標準誤差を示す。３つのうちの代表的な１つの実験を示す。これらの細胞から全ＲＮＡを抽出し、ランダムプライマーを用いて逆転写した。その後、ｃＤＮＡを、開始転写産物を定量化するためのＴＡＲ中でハイブリダイズするプライマー対及び伸長転写産物を定量化するためのＴａｔ遺伝子中でハイブリダイズするプライマー対を用いたＰＣＲ反応に用いた。βアクチン遺伝子プライマーを用いて結果を標準化し、偽処理条件と比べた誘導倍率を表すヒストグラムとして示す。
【００４４】
表１．ケトシンは、ウイルス量が検出不能なＨＩＶ−１感染ｃＡＲＴ処置患者から単離したＣＤ８+枯渇ＰＢＭＣ中でＨＩＶ−１復活を用量依存的に誘導する。ＣＤ８+枯渇ＰＢＭＣの培養物に、偽処理、ケトシン処理（３０、６０、又は９０ｎｍｏｌ／ｌ）、又は陽性対照処理を行った。処理の６日後、培養上清中のウイルスＲＮＡ濃度を決定した（１ｍｌ当たりのコピー数；「｜」は閾値未満であることを示す）。
【００４５】
【表１】
2014528432.tif 000002
【００４６】
表２：ケトシンは、ウイルス量が検出不能なＨＩＶ−１感染ｃＡＲＴ処置患者由来のＣＤ８+枯渇ＰＢＭＣ及びＨＬＡ  ＤＲ-  ＣＤ４+Ｔ細胞においてＨＩＶ−１の復活を誘導す
る。
（a）ＣＤ８+枯渇ＰＢＭＣの培養物を偽処理又はケトシン処理（９０ｎｍｏｌ／ｌ）した。処理の６日後、培養上清中のウイルスＲＮＡ濃度を決定した。全ＨＩＶ−１  ＤＮＡを細胞１０6個当たりのＨＩＶ−１のＤＮＡコピー数として又は細胞１０6個当たりのＨＩＶ−１のＤＮＡコピー数の対数として表す（「／」は非試験条件を表す）。（b）ＨＬＡ
ＤＲ-  ＣＤ４+Ｔ細胞の限界希釈培養物を偽処理又はケトシン処理（４５又は９０ｎｍｏｌ／ｌ）した。培養上清中のウイルスＲＮＡ濃度を決定した。最後の陽性希釈培養物は、複製能を有し且つケトシン反応性であるウイルスを有する細胞が少なくとも１つ存在することを示している。
【００４７】
【表２Ａ】
2014528432.tif 000003
【００４８】
【表２Ｂ】
2014528432.tif 000004
【００４９】
【表３】
2014528432.tif 000005
【００５０】
表３への付記：患者細胞の培養物を偽処理又は記載の化合物で処理した。処理の６日後、培養上清中のウイルスＲＮＡ濃度を決定した（１ｍｌ当たりのコピー数；「｜」は閾値未満であることを意味し、「／」）は非試験条件を表す）。全ＨＩＶ−１  ＤＮＡを細胞１０6個当たりのＨＩＶ−１  ＤＮＡコピー数として又は細胞１０6個当たりのＨＩＶ−１
ＤＮＡコピー数の対数として表す。灰色で示されている培養物は、薬物単独よりも薬物
併用でより高いウイルス産生を示しており、黒色で示されている培養物は、個々の薬物では再活性化されず、併用処理でのみ再活性化された。
【００５１】
表４．単独のＢＩＸ−０１２９４は、ウイルス量が検出不能なＨＩＶ−１感染ｃＡＲＴ処置患者由来の休止記憶ＣＤ４+Ｔ細胞においてＨＩＶ−１復活を誘導する。休止記憶ＣＤ
４+Ｔ細胞の培養物を偽処理又はＢＩＸ−０１２９４処理した。処理の６日後、培養上清
中のウイルスＲＮＡ濃度を１ｍｌ当たりのコピー数として決定した（｜は閾値未満を示す）。
【００５２】
【表４】
2014528432.tif 000006
【発明を実施するための形態】
【００５３】
本発明において、文脈中で明らかに複数と記載していない限り、単数形は単数及び複数の両方を包含する。
【００５４】
本発明において、「含む」という用語は、「包含する」、又は「含有する」と同義であり、包括的且つ開放型（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）であり、列挙されていない更なるメンバー、エレメント、又は方法のステップを除外するものではない。
【００５５】
終点による数値範囲の記載は、各範囲に包含される全ての数値及び端数、並びに記載されている終端を包含する。
【００５６】
本発明において、「約」という用語は、パラメーター、量、期間等の測定可能な値を参照する場合、指定された値の又は値からの変動値、具体的には指定された値の又は値からの±１０％以下、好ましくは±５％以下、より好ましくは±１％以下、更により好ましくは±０．１％以下の変動値を包含することが意図される。但し、本開示の発明の実施にそのような変動値が適切である場合に限る。修飾語「約」で言及される値自体も具体的に且つ好ましく開示されていると理解されるべきである。
【００５７】
本明細書中で引用される全ての文献の全体を参照により本明細書に援用する。
【００５８】
特に断りのない限り、科学技術用語を含む本発明の開示に用いられる全ての用語は、本発明が属する分野の熟練者に一般的に理解される意味を有する。更なる指針として、本発明の教示を理解し易くするために用語の定義を含めることがある。
【００５９】
本発明に関連する一般的方法については、とりわけ、周知の教科書、例えば"Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed." (Sambrook et al., 1989), Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987), the series Methods in Enzymology (Academic Press), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in 10 Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Ed." (F. M. Ausubel et al., eds., 1987 & 1995); Recombinant DNA Methodology II (R. Wu ed., Academic Press 1995)を参照されたい。細胞培養及び培
地の使用における一般的技術はとりわけLarge Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al. 1997. Curr Opin Biotechnol 8: 148); Serum-free Media (K. Kitano. 1991. Biotechnology 17: 73);又はLarge Scale Mammalian Cell Culture (Curr Opin Biotechnol 2: 375, 1991)に概説されている。
【００６０】
「レトロウイルス」という用語は、本明細書中においてその通常の意味で用いられており、一般的に、遺伝材料が一本鎖ＲＮＡであり、逆転写酵素を用いて宿主中でウイルスＲＮＡをＤＮＡに転写するクラスのウイルスを包含する。本明細書中で意図されるように、レトロウイルスは特にレトロウイルス科、より具体的にはレンチウイルス亜科に属し得る。本明細書中で意図されるように、レトロウイルスは病原性であってもよく（すなわち、感染宿主において明白な疾患表現型を引き起こす）、非病原性であってもよい（すなわち、感染宿主の状態が明白な疾患表現型を現さない）。本明細書中で特に意図されるのは、動物に感染するレトロウイルス、より好ましくは温血動物、更に好ましくは脊椎動物、更により好ましくは哺乳類、特に好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトのレトロウイルスである。本明細書で特に好ましいのはヒトレトロウイルス、例えば、限定されるものではないが、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１、及びＨＴＬＶ−２である。
【００６１】
「レトロウイルスに関連する疾患又は状態」への言及は通常、宿主がレトロウイルスに感染したことによる宿主のあらゆる状態を包含する。限定されるものではないが、そのような状態の典型例は、感染宿主中におけるウイルスの生物学的材料の存在、例えば感染宿主の１若しくは複数の細胞のゲノム中におけるプロウイルスの存在及び／又は感染宿主中におけるウイルス核酸、ウイルスタンパク質、若しくはウイルス粒子の存在であり得る。限定されるものではないが、そのような状態は、プロウイルスが休止状態又は潜伏状態の段階、感染宿主中でウイルスが産生されるが明白な疾患症状はない臨床前状態、及び明白な疾患症状を含む臨床状態、例えば、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２によって引き起こされる後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）又はＨＴＬＶ−１によって引き起こされる成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、若しくは熱帯性痙性不全対麻痺症（ＴＳＰ）等を含み得る。
【００６２】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）はレトロウイルス科の一部であるレンチウイルスである。これは、一本鎖で正の向きの２倍体エンベロープＲＮＡウイルスである。標的細胞に侵入した後、ウイルスのウイルスＲＮＡゲノムは二本鎖ＤＮＡへと逆転写される。これは、ウイルス粒子中のウイルスゲノムと共に輸送されるウイルスがコードする逆転写酵素によりなされる。その後、転写されたウイルスＤＮＡは細胞核中に移入され、インテグラーゼによって（これもウイルスにコードされる）細胞ＤＮＡに組み込まれる。ＨＩＶ及び他のレンチウイルスの潜伏は、それらが宿主細胞ゲノム中に組み込まれて潜伏形態で（すなわち複製せずに）そこに留まる能力による。このため、ウイルスは免疫系による検出を回避し、そこに何年も留まることができ、感染対象中でＨＩＶのいわゆる「リザーバー」となる。ウイルスが再活性化されると、ウイルスＤＮＡが転写され、新たなＲＮＡゲノム及
びウイルスタンパク質を産生し、これらがパッケージングされて新たなウイルス粒子として細胞から放出され、これは新たな細胞に感染することができる。ＨＩＶは主に免疫系の細胞に感染するので、感染対象の免疫応答を弱める。このため、これらは「免疫不全ウイルス」と命名されている。ＨＩＶ陽性対象は、ウイルスが複製能を獲得した時にＡＩＤＳ、すなわち後天性免疫不全症候群を発症し得る。基本的に、ＨＩＶはＣＤ４+Ｔ細胞、マ
クロファージ、及び小膠細胞に付着しこれを破壊する。Ｔ細胞及びマクロファージの破壊により、対象は通常であれば簡単に回避できるあらゆる種類の感染症に罹り易くなる。ＣＤ４+Ｔ細胞数が２００細胞／μＬのレベルより下がると、細胞性免疫が失われ、種々の
日和見性微生物による感染症が現れ、その後、一般的な日和見感染症及び腫瘍（そのほとんどは通常強力なＣＤ４+Ｔ細胞介在免疫により制御される）が患者に影響し始める。Ｈ
ＩＶ感染又はＡＩＤＳの対象が処置されなかった場合、対象は最終的に、免疫系の機能障害のため、そうでなければ治癒が容易であった感染症により死亡し得る。
【００６３】
ＨＩＶの潜伏性のため、例えば持続的な抗ウイルス処置により制御された場合、顕著な徴候なしに、ＨＩＶ−ＤＮＡのリザーバーが感染対象の全生涯にわたって存在し続け得る。しかし、処置を止めると結局ウイルスが再活性化する。したがって、感染対象はＨＩＶ感染から完全に免れることはできない。
【００６４】
ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の２種類のＨＩＶが特徴解析されている。ＨＩＶ−１は、最初に発見されたウイルスであり、最も病原性のある種類であり、より感染性であり、全世界のＨＩＶ感染の大部分の原因である。ＨＩＶ−２は、ＨＩＶ−１より感染性が弱く、ＨＩＶ−２に晒された人のうち、暴露当たり、感染する人はＨＩＶ−１より少ない。ＨＩＶ−２は主に西アフリカに限定されている。
【００６５】
本発明において、「薬剤」又は「剤」という用語は、任意の化学的（例えば、無機又は有機）、生化学的、又は生物学的な物質、分子、又は巨大分子（例えば生物学的巨大分子）、その組合せ若しくは混合物、組成の決定されていないサンプル、又は細菌、植物、真菌、若しくは動物の細胞若しくは組織等の生物学的材料からの抽出物を幅広く指す。限定されるものではないが、好ましい「薬剤」としては、核酸、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ポリペプチド又はタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、抗体並びにその断片及び誘導体、アプタマー、化学物質、好ましくは有機分子、より好ましくは有機小分子、脂質、炭水化物、多糖等、並びにこれらの任意の組合せが含まれる。
【００６６】
「調節する」という用語は、通常、調節されているものの特に増加（例えば、活性化）又は減少（例えば、阻害）の両方を包含する、定性的又は定量的変化、変更、又は変動を意味する。この用語は、あらゆる程度のそのような調節を包含する。例えば、調節が決定可能又は測定可能な変数に影響を与える場合、調節は、前記調節のない参照状況と比べて少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約７５％、更により好ましくは少なくとも約１００％、例えば、少なくとも約１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、又は少なくとも約５００％の前記変数の値の増加を包含し得；あるいは調節は、前記調節のない参照状況と比べて少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、例えば、少なくとも約９５％、例えば少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％、更には１００％の前記変数の値の低下又は減少を包含し得る。好ましくは、意図する標的、すなわち本明細書中に記載のＤＮＡメチル化阻害剤及びヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤の活性及び／又はレベルの調節は特異的且つ選択的であり得、すなわち、意図される標的の活性及び／又はレベルは、ランダムな無関係の標的の活性及び／又はレベルを実質的に変化させることなく調節され得る。
【００６７】
複合体又はタンパク質等の標的の「活性」への言及は通常、標的の生物学的活性の１又は複数の側面、例えば、限定されるものではないが、例えば細胞、組織、器官、又は生物体内における、その生化学的活性、酵素活性、シグナル伝達活性、及び／又は構造的活性の１又は複数の側面を包含し得る。好ましくは、前記活性はメチル化活性である。
【００６８】
一実施形態では、複合体又はタンパク質等の標的の活性は、前記標的のドミナントネガティブなバリアント、例えば複合体の１若しくは複数の構成要素のドミナントネガティブなバリアント又はタンパク質のドミナントネガティブなバリアントを細胞、組織、器官、又は生物体に導入する又はその中で発現させることにより調節、特に低減され得る。
【００６９】
複合体又はタンパク質等の標的の「レベル」への言及は、好ましくは、例えば細胞、組織、器官、又は生物体内での、標的の量及び／又は利用能（例えば、その生物学的活性を行うための利用能）を包含し得る。例えば、標的のレベルは、標的の発現を調節することにより及び／又は発現された標的を調節することにより調節され得る。標的の発現の調節は、例えば、標的をコードするヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）、前駆体ｍＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡのレベルで達成又は観察され得る。例えば、限定されるものではないが、標的の発現の低減は、当該技術分野で公知の方法、例えば、細胞、組織、器官、又は生物体にアンチセンス薬剤、例えばアンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡオリゴヌクレオチド、アンチセンス薬剤をコードするコンストラクト、ＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ、又はリボザイム若しくはそれをコードするベクター等をトランスフェクト（例えば、レクトロポレーション、リポフェクション等により）又は形質導入（例えば、ウイルスベクターを用いる）することにより達成され得る。例えば、限定されるものではないが、標的の発現の増加は、当該技術分野で公知の方法、例えば、細胞、組織、器官、又は生物体に、前記細胞、組織、器官、又は生物体中で好適な発現レベルをもたらす制御配列の制御下に前記標的をコードする組換え核酸をトランスフェクト（例えば、レクトロポレーション、リポフェクション等により）又は形質導入（例えば、ウイルスベクターを用いる）することにより達成され得る。例えば、限定されるものではないが、標的のレベルは、標的の形成（例えば、フォールディング、又は複合体形成に導く相互作用）及び／又は標的の安定性（例えば、複合体と会合しようとする又は複合体から分離しようとする複合体構成要素の傾向）、分解、若しくは細胞局在等の変化を介して調節され得る。
【００７０】
「ＤＮＡメチル化阻害剤」という用語は、ＤＮＡのメチル化を低減、防止、又は除去するあらゆる公知又は未知の化合物又は薬剤を包含する。複数の種類のＤＮＡメチル化阻害剤が知られている：（１）何らかの形でメチルトランスフェラーゼの酵素活性を低下させる化合物又は薬剤を包含する「ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤」又は「ＤＮＭＴｉ」、（２）メチル化ＤＮＡからメチル基を除去する「ＤＮＡ脱メチル化剤」、及び（３）ＤＮＡへのメチル基の導入を妨げる「ＤＮＡメチル化阻害剤」。ＤＮＡメチル化の阻害剤は癌の処置に広く試験されており、ほとんどがヌクレオシドのデオキシシチジンのアナログである。デオキシシチジンの複数の分子的バリエーションが開発されており、例えば"DNA methyltransferase inhibitors - state of the art", by J. Goffin & E. Eisenhauer (Annals of Oncology 13: 1699-1716, 2002)に概括されているように、それぞれピリミジン環の５位が修飾されている。この特有な性質がＤＮＭＴの阻害に関与する。ピリミジン環中にこの変化を有さないａｒａ−Ｃ及びゲムシタビン等のアナログはメチル化を阻害しない。オリゴデオキシヌクレオチドの例としては、５−アザデオキシシチジン（ＡｚａｄＣ）、例えば、５−アザシチジン（アザシチジン）、５−アザ−２’−デオキシシチジン（デシタビン）、１−β−Ｄアラビノフラノシル−５−アザシトシン（ファザラビン）、及びジヒドロ−５−アザシチジン（ＤＨＡＣ）を含むもの；５−フルオロデオキシシチジン（ＦｄＣ）を含むもの；又はゼブラリン等の２−Ｈピリミジノンを含むオリゴデオ
キシヌクレオチド二本鎖を有するものが挙げられる。ＤＮＭＴ阻害の別の機構は、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の利用である。これらは、特異的ｍＲＮＡ配列にハイブリダイズするように設計された比較的短い合成核酸である。ハイブリダイゼーションは、ｍＲＮＡの翻訳をブロックしてｍＲＮＡの分解を引き起こすことができる。そのようなアンチセンスＯＤＮはＤＮＭＴ  ｍＲＮＡに対して向けられており、ＤＮＭＴのｍＲＮＡ及びタンパク質を減少させた。例えば、ＭＧ９８はＤＮＭＴ１  ｍＲＮＡ３’非翻訳領域に対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドである。この薬剤は、ＤＮＭＴ３に影響することなくＤＮＭＴ１発現を阻害する能力を示した。効果はデシタビンとの組合せで相乗的になり得る。あるいは、非ヌクレオシド脱メチル化剤、例えば、限定されるものではないが、（−）−エピガロカテキン−３−ガラート、ヒドララジン、プロカイン、及びプロカインアミドを用いることができる。
【００７１】
「ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤」又は「ＨＭＴｉ」という用語は、何らかの形でヒストンメチルトランスフェラーゼの活性を低下させるあらゆる公知又は未知の化合物又は薬剤を包含する。例として、ケイマン・ケミカル社（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のケトシン、ＵＮＣ０２２４；トクリス・バイオサイエンス社（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のＢＩＸ−０１２９４；非ＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）アナログ系ＨＭＴａｓｅ（ヒストンメチルトランスフェラーゼ）阻害剤であるＥＭＤミリポア社のジアゼピニル−キナゾリンアミン；エンゾ・ライフサイエンス社（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ）社のＢＩＸ  ０１２９４；シグマ  アルドリッチ社のＢＩＸ−０１３３８（水和物）；シグマ  アルドリッチ社のＵＮＣ０６３８（水和物）（２−シクロヘキシル−Ｎ−（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）−６−メトキシ−７−（３−（ピロリジン−１−イル）プロポキシ）キナゾリン−４−アミン）、又は任意の他の化合物が挙げられる。
【００７２】
「ヒストンデアセチラーゼ阻害剤」又は「ＨＤＡＣｉ」という用語は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の活性を低下させるあらゆる公知又は未知の化合物又は薬剤を包含する。例としては、例えば、Dokmanovic et al., 2007 (Mol Cancer Res October 2007 5; 981)に概括されている化合物が挙げらえる。ＨＤＡＣｉは、ヒドロキサマート、環状ペプチド、脂肪酸、及びベンズアミドを含む複数の構造的ファミリーに分けることができる。好ましい例として以下が挙げられる：ＴＳＡ、ボリノスタット（ＳＡＨＡ）、アミノスベロイルヒドロキサム酸、Ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサマート及び誘導体、例えばＬＡＱ−８２４、ＬＢＨ−５８９及びスルホンアミド誘導体のベリノスタット（ＰＸＤ−１０１）、Ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサマートの桂皮ヒドロキサム酸アナログであるパノビノスタット（ＬＢＨ−５８９、ノバルティスＡＧ社製）、ＩＦ２３５７（イタルファルマコ社（Ｉｔａｌｐｈａｒｍａｃｏ  ＳｐＡ）製、芳香族環に連結されたヒドロキサム酸部分を含むＨＤＡＣｉ）、アリールオキシアルカノン酸ヒドロキサミド；環状ペプチド、例えば天然産物デプシペプチド（ロミデプシン、ＦＫ−２２８、グロセスター・ファーマスーティカル社（Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）製）、アピシジン、及び分子のペプチド基を含む環状ヒドロキサム酸、ＦＫ−２２８は活性薬剤レッドＦＫのプロドラッグである；脂肪族鎖でヒドロキサム酸に連結された環状ペプチド模倣物；脂肪酸、例えばブチラート、酪酸フェニル、酪酸ナトリウム、及びバルプロ酸；ＡＮ−９（ピバロイルオキシメチルブチラート、タイタン・ファーマスーティカル社（Ｔｉｔａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、Ｉｎｃ．）製）は酪酸のプロドラッグである；５  ＮＯＸ−２７５（ＭＳ−２７５；シンダックス・ファーマスーティカル社（Ｓｙｎｄａｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）製）は合成ベンズアミド誘導体である；ＭＧＣＤ０１０３（メチルジーン社（Ｍｅｔｈｙｌｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．）、ファーミオン社（Ｐｈａｒｍｉｏｎ  Ｃｏｒｐ．））は置換２−アミノフェニルベンズアミドのジヒドロ臭化物塩である。好ましい例はスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ又はボリノスタット）である。
【００７３】
「ＮＦ−κ−Ｂ誘導物質」という用語は、ＮＦ−κ−Ｂ活性を誘導又は活性化できるあらゆる公知又は未知の化合物又は薬剤を包含する。好ましい例としてはプロストラチン（１２−デオキシホルボール１３−アセタート）、ホルボールミリスタートアセタート（ＰＭＡ）、又は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）が挙げられる。
【００７４】
以下に例を用いて本発明を更に説明するが、例は発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００７５】
本開示の種々の活性物質又は薬剤、例えばヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデサセチラーゼ阻害剤、及び／又はＤＮＡメチル化阻害剤、又はＮＦ−κ−Ｂ誘導物質、とりわけ、本明細書中で教示される複合体、タンパク質、核酸、ベクター、細胞、及び薬剤又はその薬学的に許容される誘導体は、１又は複数の薬学的に許容される担体／補形剤と共に医薬組成物又は製剤へと製剤化され得る。
【００７６】
本発明において「薬学的に許容される」という用語は、この分野での一般的な意味と一致し、医薬組成物のその他の成分と適合性であり、そのレシピエントに有害ではないことを意味する。
【００７７】
本発明において、「担体」又は「補形剤」は、あらゆる溶媒、希釈剤、バッファー（例えば、中性緩衝食塩水又はリン酸緩衝食塩水等）、可溶化剤、コロイド、分散媒体、賦形剤、充填剤、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ又はグルタチオン等）、アミノ酸（例えば、グリシン等）、タンパク質、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、香味剤、芳香剤、増粘剤、デポー効果を得るための薬剤、コーティング、抗真菌剤、保存剤、抗酸化剤、張性調節剤、吸収遅延剤等を包含する。薬学的活性物質へのそのような媒体及び薬剤の使用は当該技術分野で周知である。従来の媒体又は薬剤が活性物質と不適合性でない限り、治療組成物におけるその使用が考えられ得る。
【００７８】
医薬組成物の製剤化のための担体の例としては、限定されるものではないが、例えば水中油滴型又は油中水滴型エマルション、静脈内（ＩＶ）用途に適した有機共溶媒を含む又は含まない水性組成物、リポソーム又は界面活性剤含有小胞、マイクロスフェア、マイクロビーズ及びミクロソーム、散剤、錠剤、カプセル剤、坐剤、水性懸濁剤、エアゾール剤、及び当業者に明らかなその他の担体が含まれる。
【００７９】
本発明の医薬組成物は、本質的に任意の投与経路用に、例えば、限定されるものではないが、経口投与（例えば、経口摂取又は吸入等）、鼻腔内投与（例えば、鼻腔内吸入又は鼻腔内粘膜投与等）、非経口投与（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は胸骨内への注射又は注入等）、経皮又は経粘膜（例えば、経口、舌下、鼻腔内等）投与、局所投与、直腸、膣内、又は気管内投与等用に製剤化され得る。このようにすることで、所与の本発明の適用の具体的ニーズに応じて本発明の方法及び組成物で達成可能な治療効果を例えば全身、局所、組織特異的等にすることができる。
【００８０】
例えば、経口投与のために、医薬組成物は、丸剤、錠剤、ラッカー錠剤、コーティングされた（例えば、糖衣）錠剤、顆粒剤、硬及び軟ゼラチンカプセル剤、水性、アルコール性又は油性の液剤、シロップ剤、乳剤、又は懸濁剤の形態で製剤化され得る。例えば、限定されるものではないが、経口製剤の製造は、細かく分割した１又は複数の固形担体を必要に応じて含んでもよい粉末の形態の好適な量の活性化合物を一緒に均一且つ完全にブレンドし、このブレンドを丸剤、錠剤、又はカプセル剤に製剤化することにより好適に実現することができる。固形担体の例としては、限定されるものではないが、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖（例えば、グルコース、マンノース、ラクト
ース、又はスクロース等）、糖アルコール（例えば、マンニトール等）、デキストリン、でんぷん、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックス、及びイオン交換樹脂が含まれる。医薬組成物を含む圧縮した錠剤は、活性成分を前述したような固形担体と均一且つ完全に混合して必要な圧縮特性を有する混合物を得、その後、混合物を好適な機械中で所望の形状及びサイズに圧縮することにより製造することができる。成型された錠剤は、粉末化した化合物の混合物を不活性液体希釈剤で湿らせて好適な機械中で成型することにより作製され得る。軟ゼラチンカプセル剤及び坐剤用の好適な担体としては、例えば脂肪、ワックス、半固形及び液状のポリオール、天然油又は硬化油等が挙げられる。
【００８１】
例えば、経口又は経鼻用のエアゾール剤又は吸入投与のために、医薬組成物は、担体と一緒に、例えば溶液中で食塩、ポリエチレングリコール若しくはグリコール、ＤＰＰＣ、メチルセルロースと一緒に又は混合物中で粉末化された分散剤と一緒に、更にベンジルアルコール等の好適な保存剤、バイオアベイラビリティを増大させるための吸収促進剤、フルオロカーボン、及び／又は他の当該技術分野で公知の可溶化剤若しくは分散剤を用いて、製剤化され得る。エアゾール剤又はスプレー剤の形態で投与するための好適な医薬製剤としては、例えば、薬学的に許容される溶媒中、例えばエタノール、水、又はそのような溶媒の混合物中に本発明の化合物又はその生理学的に容認できる塩を含む液剤、懸濁剤、又は乳剤が挙げられる。所望であれば、製剤は、他の製薬補助剤、例えば界面活性剤、乳化剤、及び安定化剤、並びに噴霧剤を更に含んでもよい。例えば、送達は使い捨て送達デバイス、ミストネブライザー、呼吸作動式粉末吸入器、定量噴霧式吸入器（ＭＤＩ）、又はその他の当該技術分野で利用可能な多くのネブライザー送達デバイスのいずれかを用いてなされ得る。更に、ミストテント又は器官内チューブによる直接投与も用いることができる。
【００８２】
粘膜表面を介した投与のための担体の例は、具体的経路、例えば経口、舌下、鼻腔内等によって異なる。経口投与される場合、例としては医薬品グレードのマンニトール、でんぷん、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリド、セルロース、炭酸マグネシウム等が含まれ、マンニトールが好ましい。鼻腔内投与される場合、例としては、ポリエチレングリコール、リン脂質、グリコール及び糖脂質、スクロース、及び／又はメチルセルロース、粉末懸濁液が含まれ、増量剤（例えばラクトース）及び保存剤（塩化ベンザルコニウム、ＥＤＴＡ）を含んでもよく、含まなくてもよい。特に説明的な実施形態の例では、本発明の化合物の鼻腔内投与のためにリン脂質１，２ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）が等張性水性担体として約０．０１〜０．２％で用いられる。
【００８３】
例えば、非経口投与用には、医薬組成物は好ましくは、好適な溶媒、希釈剤、可溶化剤、又は乳化剤等と共に液剤、懸濁剤、又は乳剤として製剤化され得る。好適な溶媒は、限定されるものではないが、水、生理食塩水、又はアルコール、例えば、エタノール、プロパノール、グリセロール、更に糖溶液、例えばグルコース、転化糖、スクロース、又はマンニトールの溶液、あるいは上記種々の溶媒の混合物である。注射可能な液剤又は懸濁剤は、好適な非毒性で非経口的に許容される希釈剤若しくは溶媒、例えばマンニトール、１，３−ブタンジオール、水、リンゲル液、若しくは等張食塩水、又は好適な分散剤若しくは湿潤剤及び懸濁化剤、例えば無菌で刺激の強くない不揮発性油、例えば合成モノ若しくはジグリセリド、及び脂肪酸、例えばオレイン酸を用いて公知の技術に従って製剤化され得る。本発明の化合物及びその薬学的に許容される塩はまた、凍結乾燥してもよく、得られた凍結乾燥物は、例えば注射又は注入用の製剤の製造に用いられ得る。例えば、静脈内使用のための担体の一例としては、１０％ＵＳＰエタノール、４０％ＵＳＰプロピレングリコール又はポリエチレングリコール６００、残部がＵＳＰ注射用蒸留水（ＷＦＩ）の混合物が含まれる。静脈内使用のためのその他の担体の例としては、１０％ＵＳＰエタノー
ル及びＵＳＰ  ＷＦＩ；０．０１〜０．１％トリエタノールアミンを含むＵＳＰ  ＷＦＩ；又は０．０１〜０．２％ジパルミトイルジホスファチジルコリンを含むＵＳＰ  ＷＦＩ；及び１〜１０％スクアレン又は非経口用の水中植物油滴型エマルションが含まれる。皮下又は筋肉内使用のための担体の例としては、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液、５％デキストロースを含むＷＦＩ、及び０．０１〜０．１％トリエタノールアミンを含む５％デキストロース、又は０．９％塩化ナトリウムを含むＵＳＰ  ＷＦＩ、又は１０％ＵＳＰエタノールと４０％プロピレングリコールの１：２若しくは１：４混合物（残部は５％デキストロース又は０．９％塩化ナトリウム等の許容可能な等張液）；又は０．０１〜０．２％ジパルミトイルジホスファチジルコリンを含むＵＳＰ  ＷＦＩ、及び１〜１０％スクアレン又は非経口水中植物油滴型エマルションが含まれる。
【００８４】
水性製剤が好ましい場合、それは１又は複数の界面活性剤を含み得る。例えば、組成物は、少なくとも１つの好適な界面活性剤、例えばリン脂質界面活性剤を含むミセル分散液の形態であり得る。リン脂質の例としては、ジアシルホスファチジルグリセロール、例えばジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＭＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、及びジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジアシルホスファチジルコリン、例えばジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＰＭＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、及びジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）；ジアシルホスファチジン酸、例えばジミリストイルホスファチジン酸（ＤＰＭＡ）、ジパーニトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、及びジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）；及びジアシルホスファチジルエタノールアミン、例えばジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＭＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）が含まれる。典型的には、水性製剤中の界面活性剤：活性物質のモル比は約１０：１〜約１５  １：１０、より典型的には約５：１〜約１：５であるが、関心のある具体的目的に最も合うように水性製剤中に任意の有効量の界面活性剤を用いることができる。
【００８５】
坐剤の形態で直腸投与される場合、これらの製剤は、本発明の化合物を、常温では固体であるが直腸腔内で液化及び／又は溶解して薬物を放出する好適な非刺激性補形剤、例えばカカオ脂、合成のグリセリドエステル又はポリエチレングリコールと混合することにより製造され得る。
【００８６】
マイクロカプセル、植込剤、又はロッド（ｒｏｄ）に好適な担体としては例えばグリコール酸及び乳酸のコポリマーが挙げられる。
【００８７】
当業者には上記の説明が網羅的なものではなく説明的なものであることが理解されよう。
【００８８】
実際、多くの更なる製剤技術及び薬学的に許容される補形剤及び担体溶液が当業者に周知であり、本明細書に記載の特定の組成物を種々の治療計画で用いるための好適な用量及び治療計画の作製も同様である。
【００８９】
本発明の活性物質は単独で用いてもよく、当該技術分野で公知の任意の抗レトロウイルス療法（ｃＡＲＴ）と併用してもよい（「併用療法」）。本明細書中で考えられる併用療法は、少なくとも１つの本発明の活性物質及び少なくとも１つの他の薬学的又は生物学的活性成分の投与を含んでなり得る。前記本発明の活性物質及び前記薬学的又は生物学的活性成分は、同じ医薬製剤で投与されてもよく、異なる医薬製剤で、同時に又は任意の順番で逐次投与されてもよい。本発明の活性物質が一緒に用いられ得る併用療法における抗レトロウイルス薬の例としては、限定されるものではないが、ヌクレオシド及びヌクレオチ
ド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、インテグラーゼ阻害剤、侵入阻害剤、成熟阻害剤、及び広域阻害剤が含まれる。投与される１又は複数の他の活性化合物と組み合せて使用されてもよい、使用される本発明の活性物質の投与量又は量は、個々のケース応じて決まり、通例通り、最適な効果が実現されるように個々の状況に適合させる。したがって、処置される障害の性質及び重症度、並びに性別、年齢、体重、全体の健康、食事、投与の形態及び時間、並びに処置されるヒト又は動物の個々の反応性、投与経路、有効性、代謝安定性、並びに使用される化合物の作用時間、治療が急性であるか、慢性であるか、予防的であるか、あるいは本発明の薬剤に加えて他の活性化合物が投与されるかどうかに依存する。
【００９０】
限定されるものではないが、疾患の種類及び重症度に応じて、典型的な一日投与量は体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜１００ｍｇ以上であり得、前述の要因に依存する。数日以上にわたる反復投与では、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が起こるまで処置が持続される。本発明の活性物質の好ましい投与量は２０体重ｋｇ当たり約０．０５〜約１０ｍｇであり得る。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はその任意の組合せ）の１又は複数回用量が患者に投与され得る。このような用量は、例えば週１回又は２週間若しくは３週間に１回、断続的に投与されてもよい。
【００９１】
特に断りのない限り、「対象」又は「患者」は交換可能に用いられており、動物、好ましくは温血動物、より好ましくは脊椎動物、更に好ましくは哺乳動物、更により好ましくは霊長類を指し、具体的には、ヒト患者及び非ヒト哺乳動物及び霊長類を含む。好ましい患者はヒト対象である。
【００９２】
本発明において、「処置が必要な対象」という語句は、所与の状態、特にレトロウイルス感染の処置が有益な対象を含む。そのような対象としては、限定されるものではないが、前記状態を診断された対象、前記状態を罹患若しくは発症し易い対象、及び／又は前記状態が防止されるべき対象が含まれ得る。
【００９３】
「処置する」又は「処置」という用語は、既に発症した疾患又は状態の治療的処置、例えば既に発症したレトロウイルス感染症の治療と、望ましくない病気の発生を防止する又は発生の可能性を下げることを目的とした、例えばレトロウイルス感染症の罹患及び進行の可能性を防止することを目的とした、予防的又は防止的措置との両方を包含する。有益な又は望ましい臨床的結果としては、限定されるものではないが、１若しくは複数の症状又は１若しくは複数の生物学的マーカーの軽減、疾患の範囲の減少、疾患の安定化された（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の軽減又は緩和等が含まれ得る。「処置」は更に、処置を受けなかった場合に予想される生存時間と比べて延長された生存時間を意味し得る。好ましい実施形態では、本発明に鑑みた「処置」とは、患者をＨＩＶ感染から自由にすることを目的とした潜伏ＨＩＶ感染「リザーバー」の根絶を意味する。
【００９４】
「予防有効量」という用語は、研究者、獣医、医師、又は他の臨床医が求めるように、対象において障害の開始を阻害するか遅延させる活性化合物又は医薬剤の量を指す。
【００９５】
本発明において「治療有効量」という用語は、研究者、獣医、医師、又は他の臨床医が求める対象における生物学的又は医学的反応を惹起する活性化合物又は医薬剤の量を指し、そのような反応としては、とりわけ、処置される疾患又は状態の症状の軽減が含まれ得る。本発明の化合物の治療有効量及び予防有効量を決定する方法は当該技術分野で公知である。
【実施例】
【００９６】
方法
標準的な方法でｐ２４のＥＬＩＳＡアッセイ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、及びＦＡＣＳを行った。再活性化試験は、ウイルス量が検出不能なＨＩＶ−１+  ｃＡＲＴ処置個体の血液から
単離したＣＤ８+枯渇ＰＢＭＣ又はＨＬＡ  ＤＲ−の培養物で行った（ロシュ社のＡｍｐ
ｌｉｃｏｒキット及びアボット社のＨＩＶ−１  Ｒｅａｌｔｉｍｅを用いてＨＩＶ−１の増殖を評価した）。
【００９７】
実施例１：ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤ケトシンのＨＩＶ−１遺伝子発現への影響
【００９８】
この実験で、本発明者らは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤であるケトシンが、トランスフェクトされたＴリンパ球細胞系においてＨＩＶ−１  ５’ＬＴＲの転写活性を増大させることを示す。ジャーカット及びＳｕｐＴ１細胞系をｐＬＴＲHIV-1−ｌｕ
ｃエピソームベクターレポーターコンストラクトで一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、トランスフェクトした細胞に偽処理又はケトシン処理を行った。細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。ルシフェラーゼ活性はタンパク質濃度に関して標準化した。偽処理細胞で得られた結果を任意に１の値に設定した。結果を図１（Ａ及びＢ）に示す。この図は、偽処理細胞と比べてケトシン処理細胞においてルシフェラーゼ活性が明確に増大していることを示している。
【００９９】
更に、本発明者らは、潜伏感染Ｊ−Ｌａｔ  １５．４リンパ球Ｔ細胞系におけるケトシンの影響を調べ、ケトシンがＨＩＶ−１産生を増加させることを示す。Ｊ−Ｌａｔ  １５．４細胞系に偽処理又はケトシン処理を行った。細胞上清中におけるＨＩＶ−１  ｐ２４タンパク質産生を測定した。偽処理細胞で得られた結果を任意に１の値に設定した。結果は図１（Ｃ）に示されており、潜伏感染リンパ球Ｔ細胞をケトシンで処理した時のｐ２４形成の増加を明確に示している。
【０１００】
図２は、ケトシンで処理した時の潜伏感染Ｊ−Ｌａｔ  １５．４細胞系におけるＨＩＶ−１転写の増加を示している。Ｊ−Ｌａｔ  １５．４細胞系を偽処理又はケトシン処理した。ケトシン処理はＨＩＶ−１−ＲＮＡ転写を明確に活性化している。全ＨＩＶ−１−ＲＮＡを以下のようにして定量化した。これらの細胞から全ＲＮＡを抽出し、ランダムプライマーを用いて逆転写した。その後、ｃＤＮＡを、開始された転写産物を定量化するためのＴＡＲ中でハイブリダイズするプライマー対（ＦＷ、５’−ＧＴＴＡＧＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴ−３’及びＲＶ、５’−ＧＴＧＧＧＴＴＣＣＣＴＡＧＴＴＡＧＣＣＡ−３’）又は伸長転写産物を定量化するためのＴａｔ中でハイブリダイズするプライマー対（ＦＷ、５’−ＡＣＴＣＧＡＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＧ−３’及びＲＶ、５’−ＧＡＧＡＡＴＣＴＧＡＣＴＧＴＴＣＴＧＡＴＧＡ−３’）を用いたＰＣＲ反応で用いた。結果をβアクチン遺伝子プライマー（ＦＷ、５’−ＧＴＣＧＡＣＡＡＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣ−３’及びＲＶ、５’−ＧＧＴＧＴＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＴＴＴＣＴ−３’）を用いて標準化し、偽処理条件と比べた誘導倍率を示すヒストグラムとして表す。
【０１０１】
実施例２：ケトシンは、ウイルス量が検出不能なｃＡＲＴ処置ＨＩＶ−１陽性個体に由来するＣＤ８+枯渇ＰＢＭＣ中及びＨＬＡ  ＤＲ-  ＣＤ４+Ｔ細胞中でＨＩＶ−１の復活を
誘導する。
６．１０6個のＣＤ８+枯渇ＰＢＭＣを含む培養物を偽処理又はケトシン処理した。処理の６日後、培養上清中のウイルスＲＮＡの濃度をＡｍｐｌｉｃｏｒ法（ロシュ・ダイアグノスティックス社）により決定した。結果を表１及び２Ａに示す。再活性化された全患者について再活性化のパーセンテージを算出した。試験したＰＢＭＣ培養物１８個のうち９個がケトシン処理に反応してＨＩＶ−１発現を再活性化し、一方、それらのいずれも偽処
理ではＨＩＶ−１発現を再活性化しなかった。その後、ＨＬＡ  ＤＲ-  ＣＤ４+Ｔ細胞の限界希釈培養を行い、こららの培養物を偽処理又はケトシン処理した。最後の陽性希釈培養物は、複製能のあるＨＩＶ−１ウイルスを有する少なくとも１つの細胞の存在を示している。培養上清中のウイルスＲＮＡ濃度をＡｍｐｌｉｃｏｒ法（ロシュ・ダイアグノスティックス社）により決定した。値は、１ｍｌ当たりのＨＩＶ−１  ＲＮＡコピー数で表されている。結果は、ケトシンが患者の培養物７個のうち６個でＨＩＶ−１復活（再活性化）を誘導することが示している（表２Ｂ）。
【０１０２】
更に、ＢＩＸ−０１２９４は、ウイルス量が検出不能なＡＲＴ処置されたＨＩＶ−１陽性個体に由来するＨＬＡ  ＤＲ-  ＣＤ２５-  ＣＤ６９-  ＣＤ４+Ｔ細胞においてＨＩＶ−１の復活を誘導する。２．５×１０5個のＨＬＡ  ＤＲ-  ＣＤ２５-  ＣＤ６９-  ＣＤ４+Ｔ細胞の培養物を偽処理又はＢＩＸ−０１２９４処理した。処理の６日後に、培養上
清中のウイルスＲＮＡ濃度を決定した（表４）。
【０１０３】
実施例３：ケトシン＋プロストラチン併用処理は、潜伏感染細胞中及び患者細胞中でＨＩＶ−１の転写及び産生を相乗的に増加させる。
図２は、ケトシン＋プロストラチンの併用処理が潜伏感染Ｊ−Ｌａｔ  １５．４細胞系におけるＨＩＶ−１転写を相乗的に増加させることを示している。Ｊ−Ｌａｔ  １５．４細胞系を偽処理又はケトシン、プロストラチン、若しくは両方の薬物の組合せを用いて処理した。これらの細胞から全ＲＮＡを抽出し、ランダムプライマーを用いて逆転写した。その後、ｃＤＮＡを、開始された転写産物を定量化するためのＴＡＲ中でハイブリダイズするプライマー対又は伸長転写産物を定量化するためのＴａｔ中でハイブリダイズするプライマー対を用いたＰＣＲ反応に用いた。βアクチンを用いて結果を標準化し、偽処理条件と比べた誘導倍率を示すヒストグラムとして表す。更に、ケトシン及びプロストラチンを含む併用処理は、ＨＩＶ−１感染ｃＡＲＴ処置患者由来の休止記憶ＣＤ４+Ｔ細胞のい
くつかの生体外培養物においてより高いウイルス産生を誘導する。休止記憶ＣＤ４+Ｔ細
胞の培養物を偽処理又は記載されているように処理した。処理の６日後、培養上清中のウイルスＲＮＡ濃度を測定した（１ｍｌ当たりのコピー数）。再活性化された患者培養物を、個々に処理した後よりも併用処理後にＨＩＶ−１復活が高いウイルス産生を示す関連するカテゴリーに分類した（図３ａ）。
【０１０４】
実施例４：ＤＮＡメチル化阻害剤５−アザ−ＣｄＲ及びＨＤＡＣ阻害剤の併用処理のＨＩＶ−１遺伝子発現への影響
図５は、５−アザ−ＣｄＲ＋ＨＤＡＣＩの共処理が相乗的に、潜伏感染Ｊ−Ｌａｔ  ８．４細胞系において薬物単独よりも高い割合の細胞中でＨＩＶ−１産生を増加させ、ＨＩＶ−１発現を誘導することを示している。Ｊ−Ｌａｔ細胞系は、ｎｅｆの代わりにＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を含む全長潜伏ＨＩＶ−１プロウイルスを有する。Ｊ−Ｌａｔ  ８．４細胞系を、偽処理又は単独の若しくはＨＤＡＣＩと組み合せた５−アザ−ＣｄＲで処理した。Ａ．細胞上清中のｐ２４産生を測定した。偽処理細胞で得られた結果を任意に１の値に設定した。Ｂ．細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーで分析してＧＦＰ発現細胞の割合を定量化した。結果（ＧＦＰ+細胞の％）をヒストグラム
で表す。Ｃ．５−アザ−ＣｄＲ＋ＳＡＨＡ又は５−アザ−ＣｄＲ＋ＮａＢｕｔの併用処理は、ＨＩＶ−１  ５’ＬＴＲからの転写を相乗的に誘導する。Ｊ−Ｌａｔ  ８．４細胞系を、偽処理、単独又はＳＡＨＡ若しくはＮａｂｕｔと組み合せた５−アザ−ＣｄＲで処理した。これらの細胞から全ＲＮＡを抽出し、ランダムプライマーを用いて逆転写した。その後、ｃＤＮＡを、開始転写産物を定量化するためのＴＡＲ中でハイブリダイズするプライマー対又は伸長転写産物を定量化するためのＴａｔ中でハイブリダイズするプライマー対を用いたＰＣＲ反応に用いた。βアクチン遺伝子プライマーを用いて結果を標準化し、偽処理条件と比べた誘導倍率を示すヒストグラムとして表す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2014528432.tif 000008
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
2014528432.tif 000010
【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
2014528432.tif 000013
【図４】
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【図５Ａ】
2014528432.tif 000015
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【国際調査報告】
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2014528432.tif 000019
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