(57)【要約】  本発明は、バイオ発酵によりバイオ生成物を製造のために供給原料として油含有材料を使用するための組成物及び方法を提供する。一つの好ましい実施形態では、本発明の組成物及び方法では界面活性剤は使用されない。一つの好ましい実施形態では、油含有供給原料は、微生物、植物及び動物油加工を含む他の工業的プロセスの副生成物である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
供給原料からバイオ生成物を製造する方法であって、
ａ）脂肪、油及びそれらのフラクションを含む供給原料を用意する；
ｂ）供給原料に含有される脂肪、油及びそれらのフラクションの融点より高い温度に供給原料を加熱する；
ｃ）工程（ｂ）の供給原料を混合しながら発酵培地に加える、ここで、発酵培地は供給原料の存在下で発酵することができる少なくとも一つのバイオ触媒を含み、供給原料は、混合しながら発酵培地に添加後に、安定な分散体を形成する；
ｄ）発酵培地中で供給原料を混合しながら発酵して、少なくとも一つのバイオ生成物を製造する；そして
ｅ）発酵期間中又は発酵が完了した後、発酵培地からバイオ生成物、バイオ触媒又は供給原料を任意に分離する
ことを含む、方法。
【請求項２】
発酵培地及び供給原料が外因性の界面活性剤を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｃ）の供給原料を含む発酵培地が、発酵のためのバイオリアクターに含有される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
バイオ触媒が、中温性菌、好熱性菌又はその両方から選ばれる微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｃ）の発酵培地が、供給原料を加えるとき供給原料に含有される脂肪、油又はそれらのフラクションの融点より低い温度である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）の発酵培地が、供給原料を加えるとき供給原料に含有される脂肪、油又はそれらのフラクションの融点より高い温度である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
さらに、発酵プロセスの終わりに発酵培地の温度を上げ、そして、発酵培地から、バイオ変換を受けなかった供給原料、バイオ触媒及びバイオ生成物を分離する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）の発酵培地が、供給原料を加えるとき２５℃と７０℃の間の温度である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｃ）の発酵培地が、供給原料を加えるとき約５０℃以上の温度である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｃ）の発酵培地が、供給原料を加えるとき約３７℃以上の温度である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
供給原料に含有する脂肪、油又はそれらのフラクションが工業的プロセスの副生成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
工業的プロセスは、バイオ燃料製造、脂肪の鹸化、アルコール飲料の製造、植物油の製造、又は油脂化学工業で使用されるプロセス及び油精製工業で使用されるプロセスを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
植物油はヤシ油である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
さらに、工程（ｃ）の発酵培地に供給原料を加える前に供給原料にリパーゼを加えることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
さらに、工程（ｃ）の発酵培地への供給原料の添加と同時に供給原料にリパーゼを加えることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｃ）のバイオ触媒がリパーゼを発現する微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
さらに、工程（ｄ）の発酵プロセス完了後に、発酵した供給原料からバイオ触媒を分離する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
供給原料がヤシ酸油（ＰＡＯ）及びヤシ脂肪酸留出物（ＰＦＡＤ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ＰＡＯ又はＰＦＡＤは、供給原料の少なくとも約２０重量％を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
脂肪、油及びそれらのフラクションは、供給原料の少なくとも約２０重量％を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１の工程（ｂ）における加熱される供給原料を、
ｉ）約４５℃より高い又は約４８℃より高い、又は約５０℃より高い、又は約５２℃より高い、又は約５５℃より高い、又は約５８℃より高い、又は約６０℃より高い、又は約７０℃より高い、又は約８０℃より高い、又は約１００℃より高い、温度に加熱し；
ｉｉ）約４５℃より高い又は約４８℃より高い、又は約５０℃より高い、又は約５２℃より高い、又は約５５℃より高い、又は約５８℃より高い、又は約６０℃より高い、又は約７０℃より高い、又は約８０℃より高い、又は約１００℃より高い、温度で微粒化し、
工程（ｃ）又は（ｄ）の発酵培地の温度は、約１５℃と４５℃の間、好ましくは約２５℃と４０℃の間である、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
加熱される供給原料は約０．５０から約１．５ｇ／ｍＬのＰＦＡＤを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
加熱される供給原料の約０．５から約１００容量部を、発酵の約６から８時間のインターバルで発酵培地の約４００容量部に加え、そして任意に、発酵の約３２、４８、５２、５６及び７２時間目に、追加の加熱される供給原料の約０．５から約１００容量部を発酵培地に加える、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
発酵が微好気性条件で起きる、請求項２１から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
供給原料からバイオ生成物を製造する方法であって、
ａ）脂肪、油及びそれらのフラクションを含む供給原料を用意する、ここで、脂肪、油及びそれらのフラクションの少なくとも一部は半固体又は固体形態であり；
ｂ）工程（ａ）の供給原料を発酵培地に加えて混合する、ここで、発酵培地は供給原料の存在下で発酵することができる少なくとも一つのバイオ触媒を含み、発酵培地は供給原料に含有される脂肪、油及びそれらのフラクションの融点より高い温度であり、供給原料は発酵培地への添加後に安定な分散体を形成する；
ｃ）発酵培地中で供給原料を混合しながら発酵して、少なくとも一つのバイオ生成物を製造する；そして
ｄ）発酵期間中又は発酵が完了した後、発酵培地からバイオ生成物、バイオ触媒又は供給原料を任意に分離する
ことを含む、方法。
【請求項２６】
発酵培地及び供給原料が界面活性剤を含まない、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
供給原料がヤシ脂肪酸留出物、ヤシ酸油又はそれらの両方を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
供給原料がヤシ脂肪酸留出物、ヤシ酸油又はそれらの両方の少なくとも約２０重量％を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
工業的プロセスの副生成物である供給原料からバイオ生成物を製造する方法であって、
ａ）工業的プロセスから誘導される副生成物を含む供給原料を用意する、ここで、副生成物は少なくとも約２０％の脂肪、油及びそれらのフラクションを含み；
ｂ）供給原料を、供給原料に含有される脂肪、油及びそれらのフラクションの融点より高い温度に加熱する；
ｃ）工程（ｂ）の加熱された供給原料を発酵培地に加えて混合する、ここで、発酵培地は供給原料の存在下で発酵することができる少なくとも一つのバイオ触媒を含み、供給原料は発酵培地への添加後に安定な分散体を形成する；
ｄ）供給原料を発酵培地中で混合しながら発酵して、少なくとも一つのバイオ生成物を製造する；そして
ｅ）発酵期間中又は発酵が完了した後、発酵培地からバイオ生成物、バイオ触媒又は供給原料を任意に分離する
ことを含む、方法。
【請求項３０】
工程（ｃ）の発酵培地及び供給原料が界面活性剤を含まない、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
副生成物を含む供給原料が、ヤシ油を製造する工業的プロセスからのものである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
副生成物がヤシ酸油、ヤシ脂肪酸留出物又はそれらの両方を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
供給原料がヤシ酸油、ヤシ脂肪酸留出物又はそれらの両方の少なくとも約２０％を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
請求項の工程（ｂ）における加熱される供給原料を、
ｉ）約４５℃より高い又は約４８℃より高い、又は約５０℃より高い、又は約５２℃より高い、又は約５５℃より高い、又は約５８℃より高い、又は約６０℃より高い、又は約７０℃より高い、又は約８０℃より高い、又は約１００℃より高い、温度に加熱し；
ｉｉ）約４５℃より高い又は約４８℃より高い、又は約５０℃より高い、又は約５２℃より高い、又は約５５℃より高い、又は約５８℃より高い、又は約６０℃より高い、又は約７０℃より高い、又は約８０℃より高い、又は約１００℃より高い、温度で微粒化する、
請求項２９から３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
工程（ｃ）の発酵培地の温度が２５℃と４５℃の間である、請求項２９から３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
工程（ｄ）の発酵培地の温度が２５℃と４５℃の間である、請求項２９から３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
工業的プロセスの副生成物を含む供給原料からバイオ生成物を製造する方法であって、
ａ）工業的プロセスから誘導される副生成物を含む供給原料を用意する、ここで、副生成物は脂肪、油及びそれらのフラクションを含み、脂肪、油及びそれらのフラクションの少なくとも一部は半固体又は固体形態である；
ｂ）工程（ａ）の供給原料を混合しながら発酵培地に加える、ここで、発酵培地は供給原料の存在下で発酵することができる少なくとも一つのバイオ触媒を含み、供給原料に含有される脂肪、油及びそれらのフラクションの融点より高い温度であり、供給原料は発酵培地への添加後に安定な分散体を形成する；
ｃ）発酵培地中で供給原料を、混合しながら、供給原料に含有される脂肪、油及びそれらのフラクションの融点より高い温度で発酵して、少なくとも一つのバイオ生成物を製造する；そして
ｄ）発酵期間中又は発酵が完了した後、発酵培地からバイオ生成物、バイオ触媒又は供給原料を任意に分離する
ことを含む、方法。
【請求項３８】
発酵培地及び供給原料が界面活性剤を含まない、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
供給原料がヤシ脂肪酸留出物、ヤシ酸油又はそれらの両方を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
供給原料を含むバイオ発酵に使用するための組成物であって、供給原料は、脂肪、油及びそれらのフラクションの少なくとも約２０重量％を含み、発酵培地に混合したときに発酵培地中で安定に分散し、発酵培地は、少なくとも一つのバイオ生成物を製造するために、該供給原料を基質として使用できる少なくとも一つのバイオ触媒を含み、組成物は界面活性剤を含まない、組成物。
【請求項４１】
組成物はさらにリパーゼを含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
バイオ触媒が、リパーゼを過剰発現する微生物である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４３】
組成物は、供給原料に含有される脂肪、油及びそれらのフラクションの融点より高い温度である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４４】
供給原料がヤシ脂肪酸留出物、ヤシ酸油又はそれらの両方を含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４５】
供給原料の発酵培地中での前記分散前に供給原料を、
ｉ）約４５℃より高い又は約４８℃より高い、又は約５０℃より高い、又は約５２℃より高い、又は約５５℃より高い、又は約５８℃より高い、又は約６０℃より高い、又は約７０℃より高い、又は約８０℃より高い、又は約１００℃より高い、温度に加熱し；そして
ｉｉ）約４５℃より高い又は約４８℃より高い、又は約５０℃より高い、又は約５２℃より高い、又は約５５℃より高い、又は約５８℃より高い、又は約６０℃より高い、又は約７０℃より高い、又は約８０℃より高い、又は約１００℃より高い、温度で微粒化する、
請求項４０から４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４６】
発酵培地の温度が２５℃と４５℃の間である、請求項４０から４５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４７】
供給原料を含むバイオ発酵に使用するための組成物であって、供給原料はＰＦＡＤを含み、発酵培地に混合したときに発酵培地中で安定に分散し、発酵培地は、少なくとも一つのバイオ生成物を製造するために、該供給原料を基質として使用できる少なくとも一つのバイオ触媒を含み、組成物は界面活性剤を含まない、組成物。
【請求項４８】
供給原料がＰＦＡＤの少なくとも約２０％を含む、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
供給原料の発酵培地中での分散前に供給原料を、
ｉ）約４５℃より高い又は約４８℃より高い、又は約５０℃より高い、又は約５２℃より高い、又は約５５℃より高い、又は約５８℃より高い、又は約６０℃より高い、又は約７０℃より高い、又は約８０℃より高い、又は約１００℃より高い、温度に加熱し；そして
ｉｉ）約４５℃より高い又は約４８℃より高い、又は約５０℃より高い、又は約５２℃より高い、又は約５５℃より高い、又は約５８℃より高い、又は約６０℃より高い、又は約７０℃より高い、又は約８０℃より高い、又は約１００℃より高い、温度で微粒化する、
請求項４７又は４８に記載の組成物。
【請求項５０】
発酵培地の温度が２５℃と４５℃の間である、請求項４７から４９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５１】
発酵によるバイオ生成物の製造のための植物油製造の副生成物の使用であって、植物油製造の前記副生成物は一つ以上の脂肪又は油を含み、ここで、
ｉ）植物油製造の副生成物を含む供給原料を、少なくとも一つ以上の前記脂肪又は油又は植物油製造の副生成物の融点より高く加熱し；
ｉｉ）前記供給原料を微粒化し；そして
ｉｉｉ）前記供給原料を発酵培地に加える
使用。
【請求項５２】
さらに、工程（ｉｉｉ）の前記発酵培地をインキュベートする工程を含む、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
インキュベートの前記工程は、少なくとも一つ以上の前記脂肪又は油の融点より高い温度である、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
前記副生成物がＰＦＡＤ又はＰＡＯである、請求項５１から５３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５５】
ＰＦＡＤ又はＰＡＯを含む前記懸濁体又は分散体であって、懸濁体又は分散体が、ＰＦＡＤ又はＰＡＯを含む組成物を前記ＰＦＡＤ又はＰＡＯの融点より高く加熱し、ＰＦＡＤ又はＰＡＯを含む加熱した組成物を微粒化し、ＰＦＡＤ又はＰＡＯを含む前記微粒化した組成物を水性媒体に加えることにより製造される、懸濁体又は分散体。
【請求項５６】
前記懸濁体又は分散体が実質的に均質であり及び／又は安定である、請求項５５に記載の懸濁体又は分散体。
【請求項５７】
前記水性媒体が発酵培地である、請求項５５又は５６に記載の懸濁体又は分散体。
【請求項５８】
前記発酵培地がバイオ触媒を含む、請求項５７に記載の懸濁体又は分散体。
【請求項５９】
前記バイオ触媒が、中温性菌、好熱性菌又はそれらの混合物から選ばれる微生物である、請求項５８に記載の懸濁体又は分散体。
【請求項６０】
発酵による前記バイオ生成物の製造のための、請求項５５から５９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６１】
バイオ生成物がメバロネートである、請求項６０に記載の使用。
【請求項６２】
半固体又は脂肪物質を含む実質的に均質な懸濁体又は分散体の製造方法であって、前記半固体物質又は脂肪組成物を含む組成物を、前記半固体物質又は脂肪組成物の融点より高く加熱し、次いで、任意に攪拌して水性媒体に加える、製造方法。
【請求項６３】
半固体又は脂肪物質を含む加熱された前記組成物を、前記水性媒体に加える前に、微粒化する、請求項６２に記載の製造方法。
【請求項６４】
前記半固体又は脂肪物質がＰＦＡＤ又はＰＡＯである、請求項６２又は６３に記載の製造方法。
【請求項６５】
前記水性媒体が発酵培地である、請求項６２から６４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６６】
前記発酵培地がリパーゼを含む、請求項６５に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年７月２８日に出願された米国仮出願第６１／５１２，７４８号の利益を主張する。前記米国仮出願の全教示は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
再生可能で持続可能な非食品供給原料から生化学物質及び他のバイオ生成物を製造することに一般的な関心が寄せられている。主成分がトリアシルグリセリド（「タグ（ＴＡＧｓ）」）である植物油は、出発材料及び終了材料の両方が非常に減少しているために、生化学物質、特にポリヒドロキシブチレートなどのポリヒドロキシアルカノエートの製造のために、トウモロコシなどの食品にも使用される供給原料の代替の炭素源として数年前から検討されている。しかしながら、これらの基質は水溶性ではなく、潜在的な工業的発酵のための主要な実用的な問題と動的（質量移動（ｍａｓｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒ））制限をもたらすことが、問題である。
【０００３】
ＭＩＴの研究者による最近の出版物（Ｂｕｄｄｅ ｅｔ ａｌ．（Ｊａｎｕａｒｙ  ２９，２０１１）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ００２５３−０１１−３１０２−０）には、発酵のための植物油を使用することに伴ういくつかの困難について記載されている。ＭＩＴの研究者は、水性増殖培地への不溶性植物油の添加により、低密度オイルが容器の上部に濃縮された不均一な混合物が生成されて容器の壁上に集まり、供給原料が細胞に利用できなくさせることに、注目した。
【０００４】
これらの実際的な問題に加えて、水相中の溶解速度は油滴の大きさに比例するので、植物油及び炭化水素などの不溶性基質の使用に関連する重要な質量移動の制限が存在する。材料が合体するように油滴が大きくなり、全表面積が減少する。これらの問題は、ヤシ油（ＰＯ）や、ヤシ酸油（ＰＡＯ）及びヤシ脂肪酸留出物（ＰＦＡＤ）などのヤシ油製造生成物を含むほとんどのタグ（ＴＡＧｓ）の場合と同様に、動作温度において半固体（一般的にそれらの半固体状態で「脂肪」という。）である油に特に深刻である。従来技術は、水中油型エマルジョン及び油滴サイズを安定化させる界面活性剤の使用により、この問題に対処しているが、これらの界面活性剤は高価であり、これは工業的規模での実用的な解決策ではない。
【０００５】
その他は、発酵の供給原料としてタグ由来の脂肪酸の使用を提案し、生化学物質の製造を証明している（例えば、ＰＣＴ公報：ＷＯ２００９／０７８９７３Ａ２；Ｄｅｌｌｏｍｏｎａｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，（Ａｕｇ  ２０１０）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７６（１５）：５０６７−５０７８；Ｒａｈｍａｎ  ａｌ．，（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．１８：１２７７−１２８１）が、すべての公開された結果は、水中油型エマルジョンを維持するために、界面活性剤の使用を必要とする。先行技術は、典型的には大規模な工業プロセスの実施に非常に費用がかかるであろう０．５ｇ／Ｌの脂肪酸及び０．２ｇ／Ｌの界面活性剤の混合物を使用している。
【０００６】
他の工業的プロセスの副生成物を含む豊富な油含有材料を、コスト的に有効な方法でバイオ生成物及び生化学物質の製造のためのバイオ発酵プロセスにおいて再生可能で持続可能な非食品の供給原料として使用することが望ましいであろう。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、バイオ発酵によるバイオ生成物の製造のために供給原料として油含有材料を使用するための組成物及び方法を提供する。好ましい一つの実施形態では、界面活性剤は、本発明の組成物及び方法では使用されない。好ましい一つの実施形態では、油含有供給原料は、微生物、植物及び動物油処理を含む他の工業プロセスの副生成物である。他の一つの実施形態では、油含有供給原料中の油は、それらの発酵培地への添加前及び発酵培地中での使用前に、油の融点を超える温度で微粒化される。
【０００８】
他の一つの実施形態では、本発明は、物質、好ましくは半固体物質又は脂肪物質をその融点より高く加熱し、次いで微粒化し媒体と混合することにより、分散体又は懸濁体を形成する方法に関する。一つの実施形態では、半固体物質又は脂肪含有物質、例えばＰＦＡＤを、その融点より高く加熱し、微粒化する。一つの実施形態では、本発明は、半固体又は脂肪物質を含む組成物を、その半固体又は脂肪物質の一つ以上の融点より高く加熱し、加熱した組成物を微粒化し、次いで微粒化した組成物を媒体に加えて分散体又は懸濁体を形成することに関する。微粒化された半固体又は脂肪物質、あるいは半固体又は脂肪物質を含む組成物は、分散体又は懸濁体を形成するために培地に添加され、培地は好ましくは発酵培地である。好ましい実施形態では、ＰＦＡＤは、その融点より高く、例えば約４５℃より高く、好ましくは４８℃より高く、好ましくは５０℃より高く、好ましくは５２℃より高く、好ましくは５５℃より高く、好ましく５８℃より高く、好ましく６０℃より高く、好ましく７０℃より高く、好ましくは８０℃より高く、加熱され、微粒化され、次いで水性媒体に添加されて、バイオ発酵の供給原料となる。ＰＦＡＤを含有する組成物は、約４５℃と約１５０℃の間の温度に、好ましくは約５０℃と約１２５℃の間の温度に加熱し、次いで微粒化し、発酵培地などの水性媒体に加えることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１はＰＦＡＤでのＥ．ｃｏｌｉ  ＦＡＯ１細胞の増殖を示す。
【図２】図２は、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓＮＲＲＬ  ＮＲＳ−５８によるＰＦＡＤからの酢酸、１，３−ＰＤＯ及び他の生成物の製造を示すクロマトグラムである。
【図３】図３は、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓＮＲＲＬ  Ｂ−１１６７によるコハク酸エステル及び他の生成物の製造を示すクロマトグラムである。
【図４】図４は、Ａ−Ｄは冷水での微粒化ＰＦＡＤの分散と直径を示す写真である。
【図５】図５は、４８時間にわたるＰＦＡＤでの細胞増殖及びメバロネート製造を示す折れ線グラフである。
【図６】図６は、４８時間にわたる細胞培養期間のＰＦＡＤの異化を示す折れ線グラフである。
【図７】図７は、２週間にわたるＰＦＡＤの異化及び細胞増殖を示す折れ線グラフである。
【図８】図８は、７２時間にわたるＰＦＡＤでの細胞増殖を示す折れ線グラフである。
【図９】図９は、７２時間にわたるＰＦＡＤからのメバロネート製造を示す折れ線グラフである。
【図１０】図１０は、７２時間にわたる細胞培養からの残留ＰＦＡＤ脂肪酸レベルを示す折れ線グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
一つの実施形態では、本発明は、好ましくは、界面活性剤を使用せずに、脂肪、油及びそれらのフラクションを含む油含有供給原料からバイオ生成物を製造する方法を提供する。その方法は、脂肪、油及びそれらのフラクションを含有する供給原料を用意し；供給原料に含有される脂肪、油及びそれらのフラクションの融点より高い温度まで供給原料を加熱し；供給原料の存在下で発酵することができる少なくとも一つのバイオ触媒を含む発酵培地を混合しながら、加熱した供給原料を発酵培地に加えて、発酵培地への添加により安定な分散体を形成し；発酵培地を混合しながら、発酵培地中で供給原料を発酵させ；そして、発酵培地から粗バイオ生成物を任意に集めることを、含む。好ましい一つの実施形態では、加熱された供給原料を含む発酵培地はまた、好ましくは、発酵プロセスを通じて供給原料中に含有される油の融点より高い温度に維持される。好ましい実施形態では、発酵培地及び供給原料は、界面活性剤を含まない。他の一つの実施形態では、油含有供給原料中の油は、それらの添加前及び発酵培地中での使用前に、油の融点より高い温度で微粒化される。好ましい実施形態では、油含有供給原料を約４５℃より高く加熱し、好ましくは４８℃より高く、好ましくは５０℃より高く、好ましくは５２℃より高く、好ましくは５５℃より高く、好ましく５８℃より高く、好ましくは６０℃より高く、好ましくは７０℃より高く、好ましくは８０℃より高く、好ましくは約１００℃より高く、加熱し、微粒化し、約１５℃と約４５℃の間などの脂肪の融点より低い温度の発酵培地に任意に撹拌しながら加え、約１５℃と約４５℃の間などの通常の発酵温度で発酵させる。
【００１１】
他の一つの実施形態では、本発明は、物質、好ましくは半固体物質又は脂肪を、その融点より高く加熱することにより、分散体又は懸濁体を形成し、次いで微粒化し及び媒体と混合する方法に関する。一つの実施形態では、半固体物質又は脂肪含有物質、例えばＰＦＡＤ又はＰＡＯを、その融点より高く加熱し、微粒化する。一つの実施形態では、バイオ発酵のための供給原料であるＰＦＡＤ又はＰＡＯなどの半固体又は脂肪物質を含有する組成物を、ＰＦＡＤ又はＰＡＯの融点より高く加熱して微粒化する。一つの実施形態では、組成物中の実質的に全ての固体物質を、それらの微粒化を可能にするレベルに溶融する。微粒化された半固体又は脂肪物質を、分散体又は懸濁体を形成するために、媒体、好ましくは水性媒体に添加する。好ましい実施形態では、水性媒体がバイオ発酵に適している。好ましい実施形態では、ＰＦＡＤを、その融点より高く、例えば約４５℃より高く、好ましくは４８℃より高く、好ましくは５０℃より高く、好ましくは５２℃より高く、好ましくは５５℃より高く、好ましく５８℃より高く、好ましくは６０℃より高く、好ましくは７０℃より高く、好ましくは８０℃より高く、好ましくは１００℃より高く、加熱し、微粒化し、次いで発酵培地などの水性媒体に加える。水性媒体を、懸濁体又は分散体の均一性を向上させるために、微粒化半固体又は脂肪物質の添加後に撹拌することができる。より好ましい実施形態では、微粒化物質、例えばＰＦＡＣは、約１５℃と約４５℃の間などの脂肪の融点より低い温度の発酵培地に激しく撹拌しながら加え、約１５℃と約４５℃の間などの通常の発酵温度で発酵させる。
【００１２】
一つの実施形態では、本発明は、好ましくは界面活性剤を使用せずに、脂肪、油及びそれらのフラクションを含む油含有供給原料からのバイオ生成物を製造する方法を提供する。この方法は、脂肪、油及びそれらのフラクションの少なくとも一部は少なくとも半固体の形態にある脂肪、油及びそれらのフラクションを含有する供給原料を用意し；供給原料を発酵培地に加えて発酵培地を混合し、ここで、発酵培地は、供給原料の存在下で発酵することができる少なくとも一つのバイオ触媒を含み、供給原料に含有される脂肪、油及びそれらのフラクションの融点より高い温度であり、供給原料は、発酵培地へ添加後に安定な分散体を形成し；発酵培地中で供給原料を発酵して少なくとも一つのバイオ生成物を製造し；そして、発酵培地から粗バイオ生成物を任意に集めることを、含む。
【００１３】
さらなる実施形態では、本発明は、好ましくは界面活性剤を使用せずに、脂肪、油及びそれらのフラクションを含む油含有供給原料からのバイオ生成物を製造する方法を提供する。この方法は、脂肪、油及びそれらのフラクションの少なくとも一部は少なくとも半固体の形態にある脂肪、油及びそれらのフラクションを含有する供給原料を用意し；供給原料を発酵培地に加えて発酵培地を混合し、ここで、発酵培地は、供給原料の存在下で発酵することができる少なくとも一つのバイオ触媒を含み、供給原料に含有される脂肪、油及びそれらのフラクションの融点より低い温度であり、供給原料は、発酵培地へ添加後に安定な分散体を形成し；そして、発酵培地中で供給原料を発酵して少なくとも一つのバイオ生成物を製造することを、含む。好ましい実施形態では、油含有供給原料を、約４５℃より高く、好ましくは４８℃より高く、好ましくは５０℃より高く、好ましくは５２℃より高く、好ましくは５５℃より高く、好ましく５８℃より高く、好ましくは６０℃より高く、好ましくは７０℃より高く、好ましくは８０℃より高く、好ましくは１００℃より高く、加熱し、微粒化し、次いで、約１５℃と約４５℃の間などの脂肪の融点より低い温度の発酵培地などの水性媒体に任意に撹拌しながら加え、そして、約１５℃と約４５℃の間などの通常の発酵温度で発酵させる。
【００１４】
加熱された油脂又は半固体物質あるいは脂肪又は半固体物質を含有する組成物を微粒化するために、種々の微粒化装置及び噴霧装置を使用することができる。微粒化装置は微粒化し加熱することができ、あるいは微粒化される液状形態の加熱物質を用意することができる。微粒化のためのＰＦＡＤの好ましい濃度は、少なくとも約０．５ｇ／ｍＬであり、好ましくは少なくとも約０．７ｇ／ｍＬであり、好ましくは少なくとも約０．９ｇ／ｍＬである。微粒化の好ましい方法は、噴霧凝固である。
【００１５】
噴霧凝固には、流体の融点より低い温度に維持された環境（蒸気又は液体のいずれか）への流体の微粒化が含まれる。微粒化により、冷却すると固化する溶融液滴の形成が導かれ、最終的には微粒子が製造される。噴霧凝固の医薬応用では、微粒化は、空気式ノズル （二つの流体又は空気ノズルとも呼ばれる）、ロータリーもしくは遠心噴霧器、超音波噴霧器などの一連のデバイスを介して得ることができる。一般的に用いられる噴霧器は、内部もしくは外部混合のいずれかで使用できる空気式ノズルである。ノズルの選択は、噴霧凝固によって調製した微粒子の特性及び性能に影響を及ぼし得る（Ｐａｓｓｅｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｓｐｒａｙ  Ｃｏｎｇｅａｌｉｎｇ：Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｔｏｍｉｚｅｒ  ｏｎ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｌｅａｓｅ．ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，ＶＯＬ．９９，ＮＯ．２，ＦＥＢＵＡＲＹ  ２０１０，９１６−９３１）。
【００１６】
発酵培地内の好ましいＰＦＡＤ濃度は、少なくとも約２ｇ／Ｌであり、そして、好ましくは３ｇ／Ｌ、好ましくは４ｇ／Ｌ、好ましくは４．１ｇ／Ｌと１０ｇ／Ｌの間などの４ｇ／Ｌよりも大きい濃度である。
【００１７】
本明細書で使用される用語「油含有供給原料」、「油含有材料」又は「油含有副生成物」は、材料中の脂肪及び油の物理的状態に関係なく、脂肪、油又はそれらのフラクションの任意の組合せを含有する任意の材料を指し、例えば、材料は半固体又はほとんど固体であり、従って、「脂肪」であることができ、しかし、用語「油」は、半固形又は「脂肪」状態のいずれの材料も依然としてカバーする。脂肪、油及びそれらのフラクションは、それらに限定されないが、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、セレブロシド、ステロール、テルペン、脂肪アルコール、脂肪酸、植物ワックス、パラフィンワックスを含む。一つの実施形態では、油含有供給原料は、油、脂肪又はそれらのフラクションの少なくとも約２０重量％、好ましくは油、脂肪又はそれらのフラクションの少なくとも約３０重量％、好ましくは油、脂肪又はそれらの少なくとも約５０重量％、好ましくは油、脂肪又はそれらの少なくとも約７０重量％を含む。
【００１８】
一つの実施形態では、本発明は、バイオ発酵に使用するための供給原料を含む組成物であって、供給原料は、脂肪、油又はそれらのフラクションを含み、発酵培地中に安定に分散され、発酵培地は、供給原料の存在下で嫌気性発酵が可能な少なくとも一つのバイオ触媒を含み、組成物は界面活性剤を含まない、前記組成物を提供する。
【００１９】
この実施形態の一つの好ましい面では、バイオ発酵のための組成物はさらにリパーゼを含む。リパーゼは、組成物に別個の試薬として添加してもよく、あるいは、バイオ触媒が生物である場合、そのような生物は、分子生物学の分野で知られているようにリパーゼを過剰発現するように好適に遺伝子操作されていてもよい。リパーゼは、供給原料、発酵培地又はそれらの両方におけるトリグリセリド油、脂肪又はそれらのフラクションの構造及び組成を改変し、それらを基質としてのバイオ触媒に対してより利用可能にする能力のために、本明細書では使用されてもよい。リパーゼは、加水分解、エステル化及びエステル交換などの異なるタイプのトリグリセリド変換を触媒する。好適なリパーゼには、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｉｔｃａ  ｌｉｐａｓｅ及びＣａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａなどの当該技術分野でよく知られているような酸性、中性及び塩基性リパーゼが含まれる。より好ましいリパーゼは、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｉｔｃａリパーゼ（リパーゼＡ）、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｉｔｃａリパーゼ（リパーゼＢ）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａリパーゼ及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉリパーゼなどの精製されたリパーゼである。リパーゼは、約１から４００ＬＵ／ｇＤＳ（乾燥固形物）、好ましくは１から１０ＬＵ／ｇＤＳ、より好ましくは１から５ＬＵ／ｇＤＳの量で加えることができる。
【００２０】
本明細書で用いられる「供給原料」は、一般に、バイオ触媒による所望の生成物への材料のバイオ変換のための基質として機能する材料を指す。本発明によれば、供給原料には、脂肪、油及びそれらのフラクションを含む油含有物質が含まれる。供給原料は、好ましくはバイオ触媒による所望の生成物への供給原料のバイオ変換に適した条件下でのバイオファーメンター中で好ましくバイオ触媒と組み合わされる。好ましい供給原料には、他の工業プロセスからの副生成物が含まれ、他の工業プロセスには、それらに限定されないが、バイオ燃料製造、脂肪の鹸化、アルコール飲料の製造、植物油の製造及び油脂化学工業で使用される他のプロセスなどが含まれる。工業プロセスは、パラフィンワックスなどの副生成物を生成する油精製工業に関連するものである。
【００２１】
「供給原料のバイオ変換のための適切な条件」は、特定の供給原料を特定の生成物に変換するバイオ触媒のために必要な生化学的経路をサポートする微生物培養物の維持及び増殖のための材料及び方法を指す。このような材料及び方法は、微生物学及びバイオ発酵の技術分野で良く知られている。与えられた供給原料のバイオ変換をサポートするために微生物の特定の要件に応じた発酵条件のための適当な媒体、ｐＨ、温度及び要件を考慮しなければならない。「媒体」は、一般に、バイオ触媒の微生物を培養するための栄養素を含有する液体を指す。
【００２２】
本明細書では「発酵ブロス」、「ビール」又は「発酵液」とも称される「発酵培地」は、供給原料の生成物への変換及び発酵が起こる液体であり、それは、一般に、バイオファーメンターで起こり、供給原料、バイオ触媒及び関連媒体を含む。発酵液は、所望の生成物の選択的除去のために、あるいは使用済バイオ触媒（例えば、微生物の細胞塊）、生存可能なバイオ触媒、及び本明細書に記載されるように再利用のためのバイオ変換を受けていない供給原料の選択的分離のために、バイオファーメンターから除去することができる。適当な供給原料に加えて、発酵培地は、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝剤及び当業者に公知の他の成分を含有する。これらのサプリメントは、バイオ触媒の増殖に適し、バイオ発酵生成物を生成するのに必要な生化学的経路を促進しなければならない。
【００２３】
「バイオ触媒」は、選択した供給原料を所望の生成物に変換することができるいずれの微生物又はその関連部分であってもよい。バイオ触媒は、微生物全体、一つ以上の単離された酵素又はそれらの任意の組み合わせであることができる。本出願の目的のために、「微生物」には、一つ以上の真核生物又は原核生物が含まれ、そして、昆虫、動物又は植物又はそれらの組織からの細菌、酵母又は細胞が含まれる。バイオ触媒は、微生物全体又は単離された酵素触媒の形態であってもよい。微生物は、所望の生成物への最適なバイオ変換を提供するように遺伝子操作されていてもよい。好ましい一つの実施形態では、本発明のバイオ触媒の生物は、本明細書で説明するように、リパーゼを過剰発現するように遺伝子操作される。
【００２４】
本発明によれば、発酵培地は、供給原料中に含有される脂肪、油及びそれらのフラクションの融点より高い温度に維持することが好ましい。このような温度は、発酵プロセスを通じて発酵培地中で安定な分散体での油含有供給原料を維持するのを助ける。分散体の安定性を維持することはまた、本明細書に記載されるように、発酵の終了時にバイオ生成物、未使用バイオ触媒及び未使用供給原料を分離するのに役立つ。一つの実施形態では、発酵は、供給原料を含有する油の融点より低い温度での温度で、次いで、発酵分離工程を助けるために、発酵終了時に供給原料の融点より高く発酵培地の温度を上昇させることによって、起こる。
【００２５】
本発明によれば、他の実施形態により、発酵培地への添加前での１００℃より高い温度での供給原料の微粒化であって、加熱された供給原料の添加前での発酵培地の温度が約１５℃と約４５℃の間である、微粒化が提供される。他の一つの実施形態では、発酵は、約１５℃と約４５℃の間、約３７℃のような、供給原料中に含有される脂肪、油及びそれらのフラクションの融点の温度よりも低い温度で起こる。供給原料の微粒化により、発酵培地中で発酵プロセス全体を通して油含有供給原料の安定で均一な分散体が提供される。
【００２６】
一つの実施形態では、本発明は、約０．５から約１００容量部の加熱された供給原料を、発酵の約６時間から８時間のインターバルで、約４００容量部の発酵培地に添加し、任意に追加の０．５から約１００部の加熱された供給原料を、発酵の約３２、４８、５２、５６及び７２時間後に発酵培地に添加する方法に関する。好ましい実施形態では、供給原料はＰＦＡＤ又はＰＡＯを含有する。
【００２７】
発酵のための最適温度は、供給原料が発酵培地へ添加される前に微粒化されるか否かに拘らず、使用するバイオ触媒のみならず、油脂原料中に含有される特定の脂肪及び油に応じて、変動するが、しかし、約２５℃から約７０℃の範囲が一般に好ましい。約３０℃より高い、好ましくは約４０℃より高い、好ましくは約５０℃より高いなどのより高い発酵温度は、供給原料の微粒化がない場合には好ましい。好ましい一つの実施形態では、発酵を通じて発酵培地の温度は、供給原料が微粒化されていないときには、約３７℃以上に維持される。好ましい一つの実施形態では、発酵を通じて発酵培地の温度は、供給原料が微粒化されていないときには、約５０℃と約７０℃の間に維持される。より好ましい実施形態では、加熱され微粒化された供給原料の添加前そして発酵プロセスを通して、発酵培地の温度は、約１５℃と約４５℃の間、好ましくは約３０℃より高い、好ましくは約３７℃より高いなどの通常の発酵温度に維持される。
【００２８】
発酵のための好ましいバイオ触媒の微生物は、耐熱性である。本発明において使用するためのバイオ触媒として適切な好ましい微生物には、中温性及び好熱性であるものが含まれる。好ましい生物は、３７℃以上を超える温度に耐えることができ、油含有供給原料の存在下で所望の生成物を生成することができる（例えば、供給原料はバイオ触媒に対して毒性でなく、バイオ触媒のための適切な炭素源である）。例えば、エタノールへのグリセロールの転化における使用に適した生物には、これらに限定されないが、例えば、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ７００９２６）、Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）、ＭＣ４１００（ＡＴＣＣ３５６９５）及びＥ．ｃｏｌｉ  Ｂ（ＡＴＣＣ１１３０３）などの米国特許出願公開第２００９／０１８６３９２号に記載された野生型及びバイオ工学微生物、腸内細菌のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ亜種、ｃｌｏａｃａｅ  ＮＣＤＣ２７９−５６（ＡＴＣＣ１３０４７）及び酵母Ｓａｃｃｈａｒａｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが含まれる。他の適切な生物には、ｔｈｅ  Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ／ＬＭＧ、Ｇｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）から入手できる野生型Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ（Ｐ．ｍａｃｅｒａｎｓ）、Ｎｏｒｔｈｒｕｐ株Ｎ２３４Ａ（＝ＬＭＧ１３２８５＝Ｎ２３４Ａ）；野生型Ｐ．ｍａｃｅｒａｎｓ株Ｂ−３９４（ＮＲＲＬ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｐｅｏｒｉａ、ＩＬ）及びＡＴＣＣ７０６８（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ及びＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ．ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓなどの株が含まれる。適切なＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ及びＧ．ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ株は、オハイオ州立大学のｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒから入手できる。
【００２９】
用語「生成物」、「バイオ生成物」又は「生化学物質」は、供給原料の発酵の結果としてバイオ触媒によって生成されるいずれのバイオ触媒的に製造された生成物を指す。本発明に従って製造されたバイオ生成物には、これらに限定されないが、有機酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、クエン酸など）、アルコール類（メタノール、エタノール、プロパノール、プロパンジオールなど）、ヒドロキシ酸及びジヒドロキシ酸、ビタミン、酵素、抗生物質、ポリヒドロキシアルカノエート、又はポリヒドロキシブチレートが含まれる。バイオ生成物には、これらに限定されないが、エタノール、アセテート、スクシネート、メバロネート、イソプレン、及びブチレートが含まれる。
【００３０】
本発明は、様々なバイオ発酵方法に応用可能であり、特に大規模な工業的プロセスに適している。本発明は、バッチ、フェドバッチ、又は連続プロセスを使用して実施することができ、多種多様の発酵槽容器で実施することができる。
【００３１】
また、本発明は、油含有供給原料が安定的に分散される発酵培地から種々の成分を回収するための分離方法を提供する。懸濁体の非継続的な性質のために、二相発酵中の炭化水素、タグ又は脂肪酸（ＦＡｓ）の濃度を監視することは困難である。従って、反応器内の全ての基質が消費されるときを判断することは困難である。これは、発酵終了時に残留する供給原料をもたらすことができ、これは廃棄され（高価である）、又は発酵ビールから分離されねばならない（技術的に困難である）。
【００３２】
発酵プロセスを通していずれの時点での、あるいは発酵プロセスの完了後の非極性物質の分離及び再利用は、それが液体形態である場合には、かなり容易であり、発酵期間の間約５０℃より高い発酵中でバイオ触媒として好熱生物を使用することによる、あるいは発酵培地を発酵後の供給原料の融点より高く加熱することによるなどの本発明に従い、分離工程前に完了される。炭化水素、トリアシルグリセリド又は脂肪酸は、二つの相に分離することができ、次いで液体の表面をすくい取る凝集フィルターシステムで分離することができる。あるいは、炭化水素、トリアシルグリセリド又は脂肪酸が液体形態である場合には、二相を液体サイクロンを用いて分離することができる。このアプローチの一つの利点は、バイオ触媒は非極性相に付着し、バイオ触媒である細胞の分離及び潜在的な再利用を容易にすることである。
【００３３】
好ましい一つの実施形態では、本発明は、界面活性剤を使用せずにバイオベースの化学物質やその他のバイオ発酵生成物を製造するために、微生物、植物及び動物油加工を含む他の工業プロセスの副生成物である油含有供給原料を含む油含有材料を供給原料として使用するための組成物及び方法を提供する。好ましい一つの実施形態では、供給原料は、ヤシ油、ココナッツ油、大豆油及びパーム核油などの植物油を製造する工業プロセスの副生成物を含む。これらのプロセスは、これらに限定されないが水蒸気蒸留や種々の有機溶媒を用いた抽出を含むいくつかの経路を介して、副生成物として、種々の脂肪酸留出物を生成する傾向がある。
【００３４】
実施例では、特に困難な基質である、ヤシ脂肪酸留出物（ＰＦＡＤ）として知られるパーム油プロセッシングの副生成物を供給原料として、植物油製造の副生成物の使用を証明した。
【００３５】
ヤシ油（ＰＯ）は、高温多湿の熱帯の国、主としてマレーシア、インドネシアで、よく育つヤシの木の果実から得られる。ヤシ油は、事実、３３−３９℃の融点、５０−５５のヨウ素価及び約２６％の固形脂肪含量を有する、温帯の国の脂肪である。その脂肪酸組成は、パルミチン酸（４４％）、オレイン酸（３９％）及びリノール酸（１１％）に基づいている。主な利点は、同一の融点を有する水素添加油とは異なり、それは現在心臓病の危険因子であると認めらているトランス脂肪酸を含まないことである。未精製のＰＯは、通常５％ＦＦＡに基づいて取引されるが、輸出されるＰＯのほとんどは、最大０．１％の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を有するＲＢＤ（精製、漂白及び脱臭）グレードである。遠国への輸送の間に品質のいくらかの劣化は避けられないが、それでも、このグレードは、多くの国では、それ以上の処理をせずに消費のために受け入れられている。しかし、ヨーロッパやアメリカでは、常に穏やかな精製処理がされている。
【００３６】
ＰＯの主な用途は、加熱調理やマーガリン、ショートニング及びバナスパチギーの製造である。それを用いた石鹸の色は獣脂と同様に非常に良好ではないものの、石鹸業界は大きなユーザーでもある。一方、その植物起源により他の利点が与えられている。
【００３７】
ヤシ酸油（ＰＡＯ）は、ヤシ油の化学精製からの副生成物である。それは、２−３％の水分と他の不純物とともに、主にＦＦＡ（５０％以上）と中性油から構成される。それは、ヤシ脂肪酸蒸留物（ＰＦＡＤ）に非常に似ているが、そのＦＦＡは一般的に低い。ＰＡＯの主な用途は、動物飼料、石鹸作り及び蒸留脂肪酸製造である。マレーシアとインドネシアではヤシ油は、ＰＡＯよりＰＦＡＤが得られる物理的プロセスにより精製されているため、この生成物は、現在、ヨーロッパ以外では大規模に生産されていない。
【００３８】
ヤシ脂肪酸蒸留物（ＰＦＡＤ）は、現在、主要生産国で最も広く使用されているヤシ油の物理的精製からの副生成物である。その生産規模は、重要な国際貿易をサポートするのに十分に大きい。ＰＦＡＤはヤシ酸油（ＰＡＯ）に非常に類似した組成を有しているが、それは一般的により高いＦＦＡ（７０％以上）を有し、残りは中性油、１％までの水分及び不純物である。その主な用途は、いくつかの特産品を含む動物飼料、石鹸作り、蒸留脂肪酸製造である。ＰＦＡＤは、ＰＡＯよりもはるかに大きい量で製造される。
【００３９】
我々は、通常の発酵温度（約１５℃から約４５℃）でＰＦＡＤを使用する難しさを実証した。Ｂｕｄｄｅ  ｅｔ  ａｌ．ｓｕｐｒａ．で言及されているように、植物油含有物質を含む供給原料は、容器の側面及び撹拌機に付着し、流体中に分散されない。我々は、実施例に記載されるように、ＰＦＡＤでの実験を繰り返し、ＰＦＡＤは容易に媒体中に分散できないことを確認した。しかし、我々は、材料を５０℃よりも高い温度で使用すれば、ＰＦＡＤが溶融し、容易にかつ安定的に界面活性剤を必要とすることなく、媒体中に分散されることを示した。また、我々は、ＰＦＡＤの融点より低い温度のブロスへの導入前に材料が溶融していれば、攪拌が継続している限り合体しない非常に小さな液滴として材料が分散することを示した。我々はさらに、通常の発酵温度（約１５℃から約４５℃でＰＦＡＤの融点より低い温度）の発酵ブロスに導入する前に、ＰＦＡＤを１００℃より高い温度に加熱し、続いてその温度で微粒化すれば、攪拌が継続している限り合体しない非常に小さな液滴としてＰＦＡＤ材料が迅速に分散することを示した。我々はまた、ＰＦＡＤは工業的発酵プロセスにおいて使用される標準的なバイオ触媒の生物に対して驚くほど毒性ではないことを実証した。以下は、本発明の非限定的な例である。
【実施例】
【００４０】
実施例１
この実施例は、通常の発酵温度でＰＦＡＤを使用することの難しさを示している。
ＰＦＡＤ２ｇを、室温で１００ｍＬの水のビーカーに加える。ＰＦＡＤは、攪拌の存在下でも、未分散で凝集したままである。
ＰＦＡＤ２ｇを、室温で１００ｍＬの水のビーカーに加える。ＰＦＡＤは未分散で凝集したままである。溶液をＰＦＡＤの融点より高く（約４９℃より高く）加熱し、ＰＦＡＤは水の上に膜を形成する。激しく攪拌すると、ＰＦＡＤは水によく分散する。この混合物をＰＦＡＤの凝固点まで冷却すると（約４９℃）、ＰＦＡＤは、溶液を撹拌する限りよく分散したままである。攪拌を中止したときには、ＰＦＡＤはもはや安定に分散せず、ビーカーの側面には凝集する。
ＰＦＡＤ２ｇを、激しく攪拌した室温で１００ｍＬの水のビーカーに添加する前に、溶融する。ＰＦＡＤは水中に安定に分散される。
【００４１】
実施例２
この実施例は、ＰＦＡＤでの細菌の増殖を示している。
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＦＡ０１（ＭＧ１６５５株：ＡＴＣＣ７００９２６）を５０ｍＬのバッフル付きエルレンマイヤーフラスコ中の滅菌最小培地１０ｍＬで培養した。最小培地のための成分は、沈殿を防止するために、撹拌せずに次の順序で添加した。すなわち、８．４ｍＬのＬ−アラニン、６．４ｍＬのＬ−アルギニン、５ｍＬのＬ−アスパラギン、１３ｍＬのＬ−アスパラギン酸、５ｍＬのＬ−システイン、４０ｍＬのＬ−グルタミン酸、５ｍＬのグルタミン、５ｍＬのグリシン、４．２ｍＬのＬ−ヒスチジン、１０ｍＬのＬ−イソロイシン、１６．４ｍＬのＬ−ロイシン、１４ｍＬのＬ−リジン、５．２ｍＬのＬ−メチオニン、８．６ｍＬ、ｍｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、１０ｍＬのＬ−プロリン、１４ｍＬのＬ−セリン、８．４ｍＬのＬ−スレオニン、３ｍＬのＬ−トリプトファンＨＣｌ、５．６ｍＬのＬ−チロシン、１２．６ｍＬのＬ−バリン、１０ｍＬのビオチン（１０ｍｇ／１００ｍＬ）、１０ｍＬのチアミンＨＣｌ（１０ｍｇ／１００ｍＬ）、１０ｍＬのニコチン酸（１０ｍｇ／１００ｍＬ）、０．１ｍＬの無水塩化カルシウム（５％）、０．１ｍＬのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（０．０５％）、０．１ｍＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（５％）、０．１ｍＬのＭｎＣｌ２（１０ｍＭ）、１００ｍＬの無機塩溶液（リットル当たり１０ｇのＮＨ４Ｃｌ、１０ｇの塩化ナトリウム、４ｇの硫酸）、５０ｍＬのリン酸カリウム緩衝液（５００ｍＬ当たり１２５ｇのＫ２ＨＰＯ４及び３０ｇのＫＨ２ＰＯ４）である。Ｅ．ｃｏｌｉ規定培地の全てのストックアミノ酸溶液は１％（ｗｔ／ｖｏｌ）であった。最終溶液をｐＨ７．３に調整し、滅菌濾過した。
【００４２】
培養物中の中性ｐＨを維持するために、滅菌した５ｇ／ＬのＣａＣＯ３をフラスコに補充した。２０ｇ／Ｌのグルコースを一つのフラスコに添加し、陽性対照として用いた。第二のフラスコは最少培地を含有し、陰性対照として用いた。第三のフラスコは、０．５％（ｗ／ｖ）ＰＦＡＤを含有し、これは以下のように調製した。すなわち、２．５％（ｗ／ｖ）のＰＦＡＤ及び１％（ｗ／ｖ）のＢｒｉｊ−５８を別々に２０分間１２１℃でオートクレーブした。ＰＦＡＤ／Ｂｒｉｊ−５８ブレンドを、次いで、培地に添加する前に激しく混合しながら室温まで冷却した。
【００４３】
Ｅ．ｃｏｌｉの単離されたコロニーを、グリセロールストックからのＬＢ寒天プレート上に細胞をこすりつけることによって得た。一つの単離されたコロニーは、ループによって収集し、各フラスコに播種するために使用した。培養物を１３５ｒｐｍで振とうしながら３７℃でインキュベートした。サンプルは、０時間、２４時間及び４８時間目で、解析のために回収した。細胞は、Ｃ−チップ血球計（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｂｉｏ，Ｅａｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ，ＧＢ）を用いて顕微鏡下でカウントした。
【００４４】
図１は、Ｅ．ｃｏｌｉが、グルコースでの場合と同様に、ＰＦＡＤでも増殖していることを示している。これは、伝統的に工業的に適切な菌がＰＦＡＤで増殖できることを初めて実証している。我々は、細菌に毒性であるかあるいは増殖をサポートしていない多くの同様の材料を評価したので、これは予想外で驚くべきことであった。
【００４５】
同様の実験を好熱性細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ及びＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを使用して繰り返し、類似の強化された増殖が見られた。これらの実験では、培養物は、ＰＦＡＤの融点よりかなり高い５５℃で増殖させた。
【００４６】
実施例３
この実施例は、代表的な好熱性生物がＰＦＡＤで増殖し、ＰＦＡＤは商業的に関連する生成物を製造するために使用できることを示している。
【００４７】
増殖実験において、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ株を５０ｍＬのバッフル付きエルレンマイヤーフラスコ中の１０ｍＬのＮＢＹＥで増殖させた。培養物の中性ｐＨを維持するために、滅菌した５ｇ／ＬのＣａＣＯ３をフラスコに補充した。加熱された液体ＰＦＡＤの０．０５ｇを、５ｇ／Ｌの終濃度となるようにＮＢＹＥの１０ｍＬに加えた。ＮＢＹＥ（コントロール）とＮＢＹＥ＋５ｇ／ＬのＰＦＡＤの二つの培養物のそれぞれにＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ株を播種した。 
【００４８】
Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓの単離コロニーを、グリセロールストックからのＮＢＹＥ寒天プレート上に細胞をこすりつけることによって得た。 一つの単離コロニーをループによって収集し、各フラスコに播種するために使用した。ＰＦＡＤを加える前に細胞を１時間増殖させた。
【００４９】
培養物を２４時間１５０ｒｐｍで振盪しながら水浴中で５５℃で増殖させた。
生成物製造実験では、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ培養物をＮＢＹＥ（５ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ栄養ブロス、２０ｇ／Ｌの酵母エキス、１．５ｇ／ＬのＮａＣｌ）中で増殖させた。
【００５０】
２．５ｍＭのＨ２ＳＯ４移動相（無勾配、０．６ｍＬ／分）、紫外線（ＵＶ、ＳＰＤ−１０Ａ  ｖｐ、２８０ｎｍ）及び屈折率検出器（ＲＩＤ−１０Ａ）とともに、６５℃でＲｅｚｅｘ  ＲＯＡ−有機酸Ｈ＋（８％）カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣA）を用いたＨＰＬＣ（ＬＣ−１０ＡＤ  ｖｐ、島津製作所、京都、日本）に１０μＬのサンプルを注入することにより、培養物の液体発酵生成物について分析した。全てのサンプルをＨＰＬＣ分析の前に０．２２μｍのポリフッ化ビニリデンシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過した。
【００５１】
同様の実験条件を使用して、他の重要な生化学物質も好熱性生物により５５℃で増殖させた。これは図２及び図３に示されている。Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＮＲＲＬ  ＮＲＳ  Ｂ−５８は、アセテート、１，３−プロパンジオールを含むいくつかの個別の生成物を製造した。図２は、Ｂ．ｃａｏｇｕｌａｎｓ  ＮＲＲＬ  ＮＲＳ  Ｂ−５８によるＰＦＡＤからのアセテート、１，３−ＰＤＯ及び他の生成物の製造を示している。
【００５２】
図３は、Ｂ．ｃａｏｇｕｌａｎｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ−１１６７によるＰＦＡＤからのスクシネート及び他の生成物の製造を示している。
【００５３】
同様の増殖実験を、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＮＲＲＬ  Ｂ−１１０２及びＮＲＲＬ  Ｂ−４４１９を用いて行った。これらの好熱性生物も分散したＰＦＡＤでよく増殖した。これは、伝統的な工業的に適切な好熱性細菌がＰＦＡＤで増殖でき、工業的に関連するバイオ生成物を製造できることを初めて実証している。
【００５４】
実施例４
この実施例は、微粒化ＰＦＡＤは通常の発酵温度でどのように使用できるか示し、我々のＰＦＡＤ溶融ストラテジーを使用できる一つの方法を示している。
【００５５】
ＰＦＡＤを最初に１００℃よりも高く加熱する。加熱されたＰＦＡＤの１．６ｍＬ又は１．６ｇを、熱い２６ゲージの針（１００℃より高く予熱した）を介して、通常の発酵温度（約４５℃までの室温）で激しく攪拌しながら、媒体の４００ｍＬに、４ｇ／ＬのＰＦＡＤ濃度のために注入する。
【００５６】
図４Ａは、固体の非微粒化ＰＦＡＤを示す。冷水に２６ゲージの針を介して熱いＰＦＡＤを注入することにより、直径約１ｍｍのＰＦＡＤの小さな球で溶液中にＰＦＡＤを均一に分散することができる（図４Ｂ−Ｄ）。強い攪拌により、ＰＦＡＤ球が凝集するのを防ぐことを助けることができる。ＰＦＡＤの１ｍｍの小さな球への微粒化により、表面積が上昇し、従ってＰＦＡＤの１．６ｇの溶解度が得られる。
【００５７】
実施例５
この実施例は、細菌の増殖及びＰＦＡＤからのイソプレンの前駆体であるメバロネートの製造を実証している。
【００５８】
ｐＧＢ１００８（ｒｅｐｐ１５Ａ，ＣｍＲ，ｔｅｔＲ，ＰＬｔｅｔＯ−１，ｍｖａＥＳＥｆ，ｏｐｔＥｃ，Ｔ１）で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＦＡ０１（ＭＧ１６５５株：ＡＴＣＣ７００９２６）を、１／２Ｌのバイオリアクター中の滅菌最少培地の４００ｍＬ中で培養した。最小培地の成分は次のとおりであった。すなわち、６６０ｍｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、１．２ｇ／Ｌの二塩基性リン酸ナトリウム、３ｇ／Ｌの塩化アンモニウム、０．２５ｇ／Ｌの硫酸カリウム、４ｇ／Ｌの塩化マグネシウム６水和物、３０ｍｇ／Ｌの硫酸鉄７水和物、７００ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム２水和物、０．１７３ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム、０．００４ｍｇ／Ｌのモリブデン酸アンモニウム４水和物、０．０２５ｍｇ／Ｌのホウ酸、０．００７ｍｇ／Ｌの塩化コバルト６水和物、０．００３ｍｇ／Ｌの銅（ＩＩ）５水和物、０．０１６ｍｇ／Ｌのマンガン４水和物、０．００３ｍｇ／Ｌの硫酸亜鉛７水和物である。
【００５９】
最小培地に、２６ゲージの針を介して微粒化した４ｇ／ＬのＰＦＡＤを補充した。我々は、３７℃で、５Ｍ  ＮａＯＨで維持されたｐＨ６．３でＦＡ０１を培養した。この実験は、ｋＬａ＝６０ｈｒ−１の酸素移動速度係数の微好気条件であった。ｐＧＢ１００８プラスミドで形質転換されたＦＡ０１細胞の選択を維持するために２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを加えた。プラスミドｐＧＢ１００８は１００μｇ／Ｌのアンヒドロテトラサイクリンで誘導した。
【００６０】
ＦＡ０１の単離コロニーを、グリセロールストックからのＬＢ寒天プレート上に細胞をこすりつけることによって得た。一つの単離コロニーは、ループによって回収し、２５０ｍＬのバッフル振盪フラスコ中の４０ｍＬのＬＢに播種するために使用し、実験のための前培養物に供した。２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを、ｐＧＢ１００８プラスミドで形質転換されたＦＡ０１細胞の選択を維持するために振盪フラスコに添加した。前培養物は、１７５ｒｐｍで振とうしながら３７℃で一晩増殖した。増殖前培養物を、０．１の開始ＯＤ６００のために十分な細胞を有する１／２Ｌのバイオリアクターに加える前に、滅菌最小培地塩中で洗浄した。
【００６１】
一般的代謝物のために、２．５ｍＭのＨ２ＳＯ４移動相（無勾配、０．６ｍＬ／分）、紫外線（ＵＶ、ＳＰＤ−１０Ａ  ｖｐ、２８０ｎｍ）及び屈折率検出器（ＲＩＤ−１０Ａ）とともに、６５℃でＲｅｚｅｘ  ＲＯＡ−有機酸Ｈ＋（８％）カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を用いたＨＰＬＣ（ＬＣ−１０ＡＤ  ｖｐ、島津製作所、京都、日本）に１０μＬのサンプルを注入することにより、培養物の液体発酵生成物について分析した。全てのサンプルをＨＰＬＣ分析の前に０．２２μｍのポリフッ化ビニリデンシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過した。
【００６２】
脂肪酸はＥＳＡコロナ帯電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を装備したＨＰＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００）を用いて分析した。ＬａｌｍａｎとＢａｇｌｅｙから採用された抽出手順を分析前に実施した。簡潔には、１ｍＬのサンプルを、発酵培養物から取り出し、３０％（ｖ／ｖ）のＨ２ＳＯ４溶液を用いて酸性化した。脂肪酸は、溶媒系（ｎ−ヘキサン：ＭＴＢＥ＝１：１  ｖ／ｖ）の５００μＬで抽出し、ボルテックスし、１６，０００ｘｇで１分間、微量遠心分離機で遠心分離した。抽出層の１０μＬのサンプルをＨＰＬＣ−ＣＡＤシステムに注入し、以下の機器パラメータを用いて脂肪酸分析を実施した。すなわち、カラム：ＡｓｃｅｎｔｉｓＣ８  １５ｃｍｘ４．６ｍｍ、２．７μｍ；カラムガード：ＡｓｃｅｎｔｉｓＣ８  ０．５ｃｍｘ４．６ｍｍｘ２．７μｍ；移動相Ａ：３７５：１２５：２  ＬＣ−ＭＳグレードメタノール：脱イオン水：酢酸；移動相Ｂ：５００：３７５：１２５：４  ＬＣ−ＭＳグレードのアセトニトリル：メタノール：ＴＨＦ：酢酸；流速：０．８ｍＬ／分；実行プログラム：０−１７．５分、７５％Ａ：２５％Ｂ、１８．１−２０．１分、  ６０％Ａ：４０％Ｂ、２０．１−２３．０分、７５％Ａ：２５％Ｂ；及びカラムオーブン：４０℃である。脂肪酸濃度は、分析脂肪酸較正から作成した検量線から計算し、同じＨＰＬＣ−ＣＡＤ法で分析した。
【００６３】
細胞増殖を連続希釈及びプレートカウントにより測定した。
図５は、ＦＡ０１がＰＦＡＤでよく増殖することを示している。ＦＡ０１は４８時間でほぼ１０代に倍増した。図５はまた、ＦＡ０１が同じ期間に６００ｍｇ／Ｌのメバロネートを製造したことを示している。
【００６４】
この実施例はまた、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸及びパルミチン酸の四つのＰＦＡＤの主要成分の全てをＦＡ０１が使用したことを示している（図６）。我々は、特定の条件下で特定の脂肪酸のためのいくつかの優先性があることを観察した（図６）。細胞塊が低いながら、まず、不飽和脂肪酸は最初の２４時間に優先された。しかし、十分な細胞量が達成された後、それらが４８時間までに枯渇されるまで、ＦＡ０１は素早く四つの全ての脂肪酸を同時に消費していた。また、高濃度の脂肪酸は、低濃度の脂肪酸より優先した。ある種の脂肪酸が特定の低い値に達したら、その種は、脂肪酸の高い濃度の種のために無視された。この値がベースラインを生成し、脂肪酸がこの値を超えていた場合は、その脂肪酸のみが消費された。脂肪酸のこのベースラインは、他の全てのより高い濃度の脂肪酸が消費されるまで、無視され、その時点で、その値未満の脂肪酸の全ての種を細胞は異化した。これらの優先性にもかかわらず、全ての種の脂肪酸は、実験の終了までに消費された。
【００６５】
我々は、各給餌後の脂肪酸の可溶化における質量移動現象を観察した。この実施例では、実験の過程の間で、０時間、２３時間の時点で、二回給餌した。両方の給餌で、４時間の期間にわたって媒体中の溶解性ＰＦＡＤの増加を観察した（図６）。この現象は、不溶性脂肪酸から可溶性脂肪酸への質量移動速度を反映する。
【００６６】
実施例６
この実施例は、ＦＡ０１が、絶食期間の２週間の増殖後にＰＦＡＤを異化し続けることを実証している。
【００６７】
ｐＧＢ１００８（ｒｅｐｐ１５Ａ，ＣｍＲ，ｔｅｔＲ，ＰＬｔｅｔＯ−１，ｍｖａＥＳＥｆ，ｏｐｔＥｃ，  Ｔ１）で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＦＡ０１（ＭＧ１６５５株：ＡＴＣＣ７００９２６）を、１／２Ｌのバイオリアクター中の滅菌最少培地の４００ｍＬ中で培養した。最小培地の成分は次のとおりであった。すなわち、６６０ｍｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、１．２ｇ／Ｌの二塩基性リン酸ナトリウム、３ｇ／Ｌの塩化アンモニウム、０．２５ｇ／Ｌの硫酸カリウム、４ｇ／Ｌの塩化マグネシウム６水和物、３０ｍｇ／Ｌの硫酸鉄７水和物、７００ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム２水和物、０．１７３ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム、０．００４ｍｇ／Ｌのモリブデン酸アンモニウム４水和物、０．０２５ｍｇ／Ｌのホウ酸、０．００７ｍｇ／Ｌの塩化コバルト６水和物、０．００３ｍｇ／Ｌの銅（ＩＩ）５水和物、０．０１６ｍｇ／Ｌのマンガン４水和物、０．００３ｍｇ／Ｌの硫酸亜鉛７水和物である。
【００６８】
最小培地に、２６ゲージの針を介して微粒化した熱いＰＦＡＤ（密度０．９０３６ｇ／ｍＬ）を補充した。我々は、３７℃で、５Ｍ  ＮａＯＨで維持されたｐＨ６．３でＦＡ０１を培養した。この実験は、ＫＬＡ＝６０ｈｒ−１の酸素移動速度係数の微好気条件であった。ｐＧＢ１００８プラスミドで形質転換されたＦＡ０１細胞の選択を維持するために２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを加えた。プラスミドｐＧＢ１００８は１００μｇ／Ｌのアンヒドロテトラサイクリンで誘導した。
【００６９】
ＦＡ０１の単離コロニーを、グリセロールストックからのＬＢ寒天プレート上に細胞をこすりつけることによって得た。一つの単離コロニーは、ループによって回収し、２５０ｍＬのバッフル振盪フラスコ中の４０ｍＬのＬＢに播種するために使用し、実験のための前培養物に供した。２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを、ｐＧＢ１００８プラスミドで形質転換されたＦＡ０１細胞の選択を維持するために振盪フラスコに添加した。前培養物は、１７５ｒｐｍで振とうしながら３７℃で一晩増殖した。増殖前培養物を、０．１の開始ＯＤ６００のために十分な細胞を有する１／２Ｌのバイオリアクターに加える前に、滅菌最小培地塩中で洗浄した。
【００７０】
一般的代謝物のために、２．５ｍＭのＨ２ＳＯ４移動相（無勾配、０．６ｍＬ／分）、紫外線（ＵＶ、ＳＰＤ−１０Ａ  ｖｐ、２８０ｎｍ）及び屈折率検出器（ＲＩＤ−１０Ａ）とともに、６５℃でＲｅｚｅｘ  ＲＯＡ−有機酸Ｈ＋（８％）カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を用いたＨＰＬＣ（ＬＣ−１０ＡＤ  ｖｐ、島津製作所、京都、日本）に１０μＬのサンプルを注入することにより、培養物の液体発酵生成物について分析した。全てのサンプルをＨＰＬＣ分析の前に０．２２μｍのポリフッ化ビニリデンシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過した。
【００７１】
脂肪酸はＥＳＡコロナ帯電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を装備したＨＰＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００）を用いて分析した。ＬａｌｍａｎとＢａｇｌｅｙから採用された抽出手順を分析前に実施した［Ｌａｌｍａｎ，Ｊｅｒａｌｄ  Ａ．ａｎｄ  Ｂａｇｌｅｙ，  Ｄａｖｉｄ  Ｍ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｖｏｌ．８１，ｎｏ．２（２００４）１０５−１１０］。簡潔には、１ｍＬのサンプルを、発酵培養物から取り出し、３０％（ｖ／ｖ）のＨ２ＳＯ４溶液を用いて酸性化した。脂肪酸は、溶媒系（ｎ−ヘキサン：ＭＴＢＥ＝１：１ｖ／ｖ）の５００μＬで抽出し、ボルテックスし、１６，０００ｘｇで１分間、微量遠心分離機で遠心分離した。抽出層の１０μＬのサンプルをＨＰＬＣ−ＣＡＤシステムに注入し、以下の機器パラメータを用いて脂肪酸分析を実施した。すなわち、カラム：ＡｓｃｅｎｔｉｓＣ８  １５ｃｍｘ４．６ｍｍ、２．７μｍ；カラムガード：ＡｓｃｅｎｔｉｓＣ８  ０．５ｃｍｘ４．６ｍｍｘ２．７μｍ；移動相Ａ：３７５：１２５：２  ＬＣ−ＭＳグレードメタノール：脱イオン水：酢酸；移動相Ｂ：５００：３７５：１２５：４  ＬＣ−ＭＳグレードのアセトニトリル：メタノール：ＴＨＦ：酢酸；流速：０．８ｍＬ／分；実行プログラム：０−１７．５分、７５％Ａ：２５％Ｂ、１８．１−２０．１分、６０％Ａ：４０％Ｂ、２０．１−２３．０分、７５％Ａ：２５％Ｂ；及びカラムオーブン：４０℃である。脂肪酸濃度は、分析脂肪酸較正から作成した検量線から計算し、同じＨＰＬＣ−ＣＡＤ法で分析した。
【００７２】
細胞増殖を、連続希釈及びプレートカウントにより測定した。
【００７３】
この実施例では、細胞にまず３日間様々な濃度で２４時間毎にＰＦＡＤを与えた。次いで、細胞を４日間絶食させた。この後、給餌を再開し、細胞を次の３日間、再び２４時間毎に与えた。
【００７４】
図７は、細胞が、増殖の８−１０日後そして絶食の４日後にＰＦＡＤを依然として異化し続けたことを示している。細胞は７日間でほぼ１４倍に倍増した。細胞は、次の３日間で死に始めたが、その後、実験の終わりまでに回復し始めた。
【００７５】
実施例７
この実施例では、我々は、１．３４ｘ１０１０細胞／ｍＬ／時間の増殖速度を達成し、０．０３ｇ／Ｌ／ｈの速度で７２時間で２．１３ｇ／Ｌのメバロネートを製造したことを示している。
【００７６】
ｐＧＢ１００８（ｒｅｐｐ１５Ａ，ＣｍＲ，ｔｅｔＲ，ＰＬｔｅｔＯ−１，ｍｖａＥＳＥｆ，ｏｐｔＥｃ，  Ｔ１）で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＦＡ０１（ＭＧ１６５５株：ＡＴＣＣ７００９２６）を、１／２Ｌのバイオリアクター中の滅菌最少培地の４００ｍＬ中で培養した。最小培地の成分は次のとおりであった。すなわち、６６０ｍｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、１．２ｇ／Ｌの二塩基性リン酸ナトリウム、３ｇ／Ｌの塩化アンモニウム、０．２５ｇ／Ｌの硫酸カリウム、４ｇ／Ｌの塩化マグネシウム６水和物、３０ｍｇ／Ｌの硫酸鉄７水和物、７００ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム２水和物、０．１７３ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム、０．００４ｍｇ／Ｌのモリブデン酸アンモニウム４水和物、０．０２５ｍｇ／Ｌのホウ酸、０．００７ｍｇ／Ｌの塩化コバルト６水和物、０．００３ｍｇ／Ｌの銅（ＩＩ）５水和物、０．０１６ｍｇ／Ｌのマンガン４水和物、０．００３ｍｇ／Ｌの硫酸亜鉛７水和物である。最小培地に、２６ゲージの針を介して微粒化した熱いＰＦＡＤ（密度０．９０３６ｇ／ｍＬ）を補充した。我々は、０、８、２４及び２８時間目にＰＦＡＤを１ｍＬ加えた。我々は、３２、４８、５２、５６及び７２時間目にＰＦＡＤ２ｍＬを加えた。我々は、３７℃で、５Ｍ  ＮａＯＨで維持されたｐＨ６．３でＦＡ０１を培養した。この実験は、かなりの微好気条件下であった。空気をバイオリアクターのヘッドスペースを通してのみポンプで送った。ｐＧＢ１００８プラスミドで形質転換されたＦＡ０１細胞の選択を維持するために２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを加えた。
【００７７】
ＦＡ０１の単離コロニーを、グリセロールストックからのＬＢ寒天プレート上に細胞をこすりつけることによって得た。一つの単離コロニーは、ループによって回収し、２５０ｍＬのバッフル振盪フラスコ中の４０ｍＬのＬＢに播種するために使用し、実験のための前培養物に供した。２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを、ｐＧＢ１００８プラスミドで形質転換されたＦＡ０１細胞の選択を維持するために振盪フラスコに添加した。前培養物は、１７５ｒｐｍで振とうしながら３７℃で一晩増殖した。増殖前培養物を、０．１の開始ＯＤ６００のために十分な細胞を有する１／２Ｌのバイオリアクターに加える前に、滅菌最小培地塩中で洗浄した。
【００７８】
我々がメバロネート、細胞増殖及び残留脂肪酸をどのように測定かについては、前の実施例を参照せよ。
【００７９】
この実施例では、我々は、ＰＦＡＤを与えたときのＦＡ０１の上昇した増殖速度を示す。最初の２４時間で、細胞は１．３４ｘ１０１０細胞／ｍＬ／時間の速度で増殖した（図８）。これは、最初の２４時間での８．７３倍加、又は１時間当たりの０．３６倍加、又は２．７５時間当たりの１倍加に相当する。最初の４８時間で、細胞は５．０４ｘ１０１０細胞／ｍＬ／時間の速度で増殖した（図８）。これは、最初の４８時間での１１．７７倍加、又は１時間当たりの０．２５倍加、又は４．１時間当たりの１倍加に相当する。
【００８０】
この実施例では、我々はまた、０．０３ｇ／Ｌ／時間の速度で７２時間に２．１３ｇ／Ｌのメバロネートを製造し（図９）、そして我々は、７２時間でおおよそ合計で１２５ｇ／ＬのＰＦＡＤを消費した（図１０）。
【００８１】
本明細書で引用する特許及び科学文献は当業者に利用可能である知識を確立する。本明細書で引用する全ての米国特許及び公開もしくは未公開米国特許出願は、参照により組み込まれる。本明細書で引用する全ての公開外国特許及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用する全ての他の公開参考文献、文書、原稿及び科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８２】
本発明は特にその好ましい実施形態を参照して示し記載されたが、形態及び細部に様々な変更が、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、成される得ることが当業者には理解されるであろう。本明細書に記載された実施形態は相互に排他的ではなく、種々の実施形態からの特徴は本発明に従って全体的に又は部分的に組み合わせることができることもまた理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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