(57)【要約】  二相系移動相／固定相液−液クロマトグラフィーシステムを用いて、ある混合物からあるオリゴヌクレオチドを分離するための方法。第一の移動相は前記オリゴヌクレオチドを含有し、前記固定相は目的のオリゴヌクレオチドに除去可能に結合する交換体物質を含有する。前記移動相は液−液クロマトグラフィー装置内に前記固定相と接触して流され、前記オリゴヌクレオチドは前記液体固定相中の交換体物質に結合する。次に、前記オリゴヌクレオチドは、前記液体固定相から第二の液体移動相へと、前記オリゴヌクレオチドを前記固定相から前記第二の移動相へ移すことができる置換体物質の手段により移される。
2014525254.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のオリゴヌクレオチドと１以上の不純物との混合物から目的のオリゴヌクレオチドを分離する方法であって、
第一の液体移動相と、目的のオリゴヌクレオチドに除去可能に結合する少なくとも１種類の交換体物質を含有する液体固定相とを含んでなる、二相系移動相−固定相液−液クロマトグラフィーシステムを準備すること；
液−液クロマトグラフィー装置のカラム内の液体固定相に対する、その液体固定相と接触した流れにおいて、第一の液体移動相に目的のオリゴヌクレオチドを運ばせ、目的のオリゴヌクレオチドを液体固定相中の交換体物質に結合させること、そして、
目的のオリゴヌクレオチドを前記液体固定相から、カラム内を前記固定相に対して、前記固定相と接触して流れる第二の液体移動相へと、目的のオリゴヌクレオチドを前記液体固定相から前記第二の移動相へ移すことができる置換体物質の手段により移すこと
を含んでなる、方法。
【請求項２】
工程：
（１）溶液中に目的のオリゴヌクレオチドと１以上の不純物とを含有する第一の液体相、および目的のオリゴヌクレオチドに除去可能に結合する交換体物質を含有する第二の液体相を準備し、ここで、第一の液体相と第二の液体相は、互いに接触した際に２つの明瞭な相を形成すること；
（２）前記第二の液体相を遠心分配クロマトグラフィー装置にその中の固定液体相として導入すること；
（３）溶液中に目的のオリゴヌクレオチドと１以上の不純物とを含有する前記第一の液体相を前記遠心分配クロマトグラフィー装置に第一の移動相として導入し、この第一の液体相を前記遠心分配クロマトグラフィー装置に、前記第二の液体固定相と接触させて流し、目的のオリゴヌクレオチドを前記第二の液体固定相中の交換体物質に除去可能に結合させること；
（４）前記第二の液体相と接触した際に明瞭な相を形成し、かつ、溶液中に目的のオリゴヌクレオチドを前記第二の液体相から遠心分配クロマトグラフィー装置へ移すことができる少なくとも１種類の置換体物質を含有する第三の液体相を第二の移動相として導入し、この第二の移動相を前記遠心分配クロマトグラフィー装置に、第二の液体相と接触させて流し、目的のオリゴヌクレオチドを固定相から移し、前記第二の移動相の溶液に入れること；
（５）第二の移動相から移された目的のオリゴヌクレオチドを単離すること
を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
目的のオリゴヌクレオチドが１０〜３０塩基を含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
目的のオリゴヌクレオチドが、配列５’−ＵＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＡ−３’を有する２０塩基のオリゴヌクレオチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
目的のオリゴヌクレオチドが、それもまたオリゴヌクレオチドである１以上の不純物から分離される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記固定相が、水と実質的に不混和性の１以上の有機液と水と混和性の１以上の有機液との混合物を含んでなる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第一および第二の移動相が、水と混和性の１以上の有機液と水との混合物を含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記固定相および移動相が、Ｃ１−６アルキルＣ１−６アルカン酸エステル、Ｃ１−８アルカノールおよび水を含有する液体系の平衡相をそれぞれ２つ含んでなる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｃ１−６アルキルＣ１−６アルカン酸エステルが酢酸エチルであり、前記Ｃ１−８アルカノールが１−ブタノールである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記固定相および移動相が、Ｃ１−８アルカノールおよび水を含有する液体系の平衡相をそれぞれ２つ含んでなる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｃ１−８アルカノールが１−ペンタノールまたは１−ブタノールである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記固定相および移動相が、Ｃ１−８アルカノール、ジ−（Ｃ１−８アルキル）ケトンおよび水を含有する液体系の平衡相をそれぞれ２つ含んでなる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｃ１−８アルカノールが１−ブタノールであり、前記ジ−（Ｃ１−８アルキル）ケトンがメチルイソブチルケトンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記固定相および移動相が、ジ−（Ｃ１−８アルキル）ケトンおよび水を含有する液体系の平衡相をそれぞれ２つ含んでなる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１５】
前記ジ−（Ｃ１−８アルキル）ケトンがメチルイソブチルケトンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記固定相および移動相が、Ｃ１−６アルキルＣ１−６アルキルエーテルまたはＣ４−１０環状エーテル、Ｃ１−８アルカノールおよび水を含有する液体系の平衡相をそれぞれ２つ含んでなる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｃ１−６アルキルＣ１−６アルキルエーテルおよびＣ４−１０環状エーテルがメチル−第三級ブチルエーテルおよび２−メチルテトラヒドロフランから選択され、前記Ｃ１−８アルカノールが１−ペンタノールおよび１−ブタノールから選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第一の移動相がｐＨ７〜１４を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記カラム中の目的のオリゴヌクレオチドの濃度が２００ｍｇ〜８０ｇ／Ｌである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記交換体物質が有機アミンの対アニオンとの塩である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記塩が第二級、第三級または第四級アンモニウム塩である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記交換体物質が、塩化トリ−（ｎ−オクチル）メチルアンモニウムと塩化トリ−（ｎ−デシル）メチルアンモニウムとの混合物、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化メチルトリオクチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム（塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウムおよびＡＤＢＡＣとしても知られる、様々なアルキル鎖長の塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウムの混合物）、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム、塩化テトラブチルアンモニウム、およびプロトン化型のアンバーライトＬＡ２（遊離塩基型の液体として供給される高分子量の油溶性第二級アミン）から選択される、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記交換体物質が、塩化トリ−（ｎ−オクチル）メチルアンモニウムと塩化トリ−（ｎ−デシル）メチルアンモニウムとの混合物、および塩化ベンザルコニウムから選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記固定相中の交換体物質の濃度が５〜５００ｍＭである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第二の液体移動相が前記第一の移動相と同じ液体組成を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記固定相が主としてＣ１−８アルカノールとＣ１−６アルキルＣ１−６アルカン酸エステルとの混合物を含んでなり、前記第二の移動相が水とＣ１−８アルカノールとの混合物を含んでなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記固定相が主としてＣ１−６環状エーテルとＣ１−８アルカノールとの混合物を含んでなり、前記第二の移動相が主として水とＣ１−８アルカノールとの混合物を含んでなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記第二の移動相のｐＨがｐＨ７〜１４の範囲である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記置換体物質が、一価であっても多価であってもよいアニオン部分を組み込んでいる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記置換体物質が、ヨウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウム、サッカリンナトリウム塩、サンセットイエローおよびアマランスから選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第二の移動相中の置換体物質の濃度が５〜３０ｍＭである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
目的のオリゴヌクレオチドが次に前記第二の移動相から単離される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なプロセスであって、特に、支持体不含の液−液クロマトグラフィーを用いてオリゴヌクレオチドを化学的不純物から分離するためのプロセスに関する。
【０００２】
オリゴヌクレオチドは、最大およそ２００塩基のオリゴヌクレオチドも今や合成可能ではあるが、一般に５０以下の塩基を有する、比較的に短い配列の核酸ポリマー（ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい）を含んでなる。オリゴヌクレオチドは治療に有用である。Ｐｒｏｓｅｎｓａ社によりＰＲＯ０５１の名称で、また、本出願者の名称ＧＳＫ２４０２９６８で示される合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列５’−ｕｃａ  ａｇｇ  ａａｇ  ａｕｇ  ｇｃａ  ｕｕｕ  ｃａ−３’を有する。このオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、すなわち、選択された配列と相補的な一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡである。このオリゴヌクレオチドはエキソン５１のエキソンスキッピングを誘導すると考えられており、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の外来小児に関する第ＩＩＩ相臨床試験で検討中である。
【０００３】
このようなオリゴヌクレオチドに伴う問題は、不純物からのそれらの精製である。例えば、上述のＧＳＫ２４０２９６８は２０ｍｅｒであり、その合成の過程で、例えば１７、１８、１９および２１塩基を含有するショートマーやロングマーを含め、他のオリゴヌクレオチドを含む不純物が夾雑する場合がある。他の不純物もまた存在するかもしれない。
【０００４】
工業生産規模に有効かつ適用可能な、このようなオリゴヌクレオチドの分離プロセスを提供することが望まれる。“Therapeutic oligonucleotides: The state of the art in purification technologies” Sanghvi et. al. Current Opinion in Drug Discovery (2004) Vol. 7 No. 8には、オリゴヌクレオチド精製に用いられるプロセスが概説されている。この文献には他のプロセスが開示されている。様々なプロセスがＤＮＡおよびＲＮＡ配列の精製に使用されてきた。ＷＯ−Ａ−０１／５５１６０には、夾雑物とイミン結合を形成し、その後、このイミン結合不純物をクロマトグラフィーまたは他の技術で除去することによるオリゴヌクレオチドの精製が開示されている。“Size Fractionation of DNA Fragments Ranging from 20 to 30000 Base Pairs by Liquid/Liquid chromatography” Muller et al. Eur. J. Biochem (1982) 128-238には、ヌクレオチド配列の分離のための、ＰＥＧ／デキストラン相を沈着させた微晶質セルロースの固相カラムが開示されている。“Separation and identification of oligonucleotides by hydrophilic interaction chromatography.” Easter et. al. The Analyst (2010); 135(10)には、固相シリカ支持相を採用したＨＰＬＣの変形を用いるオリゴヌクレオチドの分離が開示されている。“Fractionation of  oligonucleotides of yeast soluble ribonucleic acids by countercurrent distribution” Doctor et al. Biochemistry (1965) 4(1) 49-54には、乾燥ＤＥＡＥ−セルロースを充填した乾燥固相カラムの使用が開示されている。“Oligonucleotide composition of a yeast lysine transfer ribonucleic acid” Madison et al; Biochemistry, 1974, 13(3)には、ヌクレオチド配列の分離のための固相クロマトグラフィーの使用が開示されている。ウィキペディア文献http://en.wikipedia.org/wiki/Hydrophilic_interaction_chromatographyには、固相シリカ支持体を用いた生体分子の分離のための親水性相互作用クロマトグラフィーの使用が開示されている。
【０００５】
液−液クロマトグラフィーは、公知の分離法である。液−液クロマトグラフィーでは、細長いカラム（従来のクロマトグラフィーの管状カラム内に配備される固相に類似）内に維持される固定液体相と、前記固定相と接触してカラムに流す移動液体相とを含んでなる二相系液体系を使用する。このような流動の過程で、物質は従来の固相クロマトグラフィーと同様の様式で移動相と固定相の間で分配される。液−液クロマトグラフィー技術では、移動相は、分離される物質を、従来の液固クロマトグラフィーと類似した画分に溶出する。液液体クロマトグラフィーでは、このプロセスは通常、支持体なしでなされ、すなわち、液体相を支持するための固相支持体マトリックスは必要なく、液体相は、プロセス中、回転しているカラム内の遠心力によって互いに接触した関係で維持される。“Countercurrent Chromatography - The Support- Free Liquid Stationary Phase” Billardello, B.; Berthod, A; Wilson & Wilson’s Comprehensive Analytical Chemistry 38; Berthod, A., Ed.; Elsevier Science B.V.: Amsterdam (2002) pp 177-200には、液−液クロマトグラフィーの有用な概要が示されている。
【０００６】
種々の液−液クロマトグラフィー技術が知られている。
【０００７】
１つの技術は、液液向流クロマトグラフィー（本明細書では「ＣＣＣ」と呼ぶ）である。ＣＣＣ装置では、一般に一定内径の、円形、例えば、ヘリカルまたはスパイラル管状カラムはその円の中心およびその中心から偏心した回転軸の両方の周りを回転する（すなわち、いわゆる惑星回転）。この組み合わさった動きがカラム内に振動遠心力場を作り出し、カラムに沿って混合ゾーンと非混合ゾーンができる。典型的なＣＣＣ装置はＷＯ−Ａ−０３／０８６６３９（Ｂｒｕｎｅｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）に開示されている。
【０００８】
もう１つの公知の技術が遠心分配クロマトグラフィー（本明細書では「ＣＰＣ」と呼ぶ）である。ＵＳ−Ａ−６，５３７，４５２およびＷＯ−Ａ−２０１０／０５９７１５は、生体分子の分離のためのＣＰＣの使用の可能性を示唆している。“High Performance Centrifugal Partition Chromatography” 2005 (online: http://web.archive.org/web/20050208201013/http://everseko.co.jp/p02.html)および “Applications of Liquid-Liquid Chromatography Instrumentation for Laboratory Preparative & Process Chemistry” Brown et al. Chromatography Today (Nov-Dec 2009) 16-19は、ＣＰＣに関する一般的な文献である。“Anion-Exchange Displacement Centrifugal Partition Chromatography” Maciuk et al., Anal. Chem. (2004) 76, 6179-6186は、置換クロマトグラフィープロセスを開示し、ヒドロキシ桂皮酸異性体が、固定相中に交換体物質（または保持物）を提供してヒドロキシ桂皮酸を前記固定相上に除去可能に保持し、その後、それを置換体物質を用いて前記固定相から移されることにより分離される。
【０００９】
例えば、Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔ  Ｒｏｂａｔｅｌ  Ｇｒｏｕｐの一部であるＫｒｏｍａｔｏｎなど、多くのタイプのＣＰＣ装置が市販されている。一般に、ＣＰＣ装置は、回転軸の周りに回転するための１以上の円の円周に配置された多数の（最大１００であることもある）小チャンバー（「分配セル」と呼ばれることがある）を含んでなるカラムを含んでなり、これらの分配セルは流路により内部連絡しており、従って、液体を順次それらに流すことができる。１つの公知の配置では、例えばステンレス鋼などの金属製のディスクの周囲に複数の分配セルを食刻または機械加工し、複数のディスクはそれらの中心回転軸に沿って積み重ねられ、前記回転軸の周りを回転することができるローターを形成する。ディスクの積み重ねが比較的少なく、分配セルの容積が比較的大きいいくつかの形態のＣＰＣ装置は、遠心分配抽出（「ＣＰＥ」）装置と呼ばれることがある。典型的なＣＰＣ装置は、例えば、ＵＳ−Ａ−６，５３７，４５２（Ｋｒｏｍａｔｏｎ）、ＷＯ−Ａ−２００４／０７９３６３（Ｐａｒｔｕｓ）およびその他の科学文献および商業文献に開示されている。
【００１０】
ＣＰＣプロセスでは、分配セルのリングが回転軸の周りを回転する間に、液体相が一連の分配セルおよびチャネルに導入される。この回転が遠心力を生じ、この相、すなわち固定相を適切な位置に保持する。次に、第二の液体相、すなわち、移動相をこれらの分配セルに流すことができ、それにより、この移動相に溶解した物質が、カラムクロマトグラフィーにおける移動溶離液と固定固相の間での物質分配の様式と同様に、移動相と固定相の間で分配され得る。
【００１１】
液−液クロマトグラフィー装置は、いわゆる「下降」または「上昇」いずれかの様式で作動させることができる。カラムが回転すると、移動相と固定相が異なる密度を有する場合、この回転により生じた遠心力が、密度の高い相は密度の低い相よりもカラムの回転軸から放射状により外側にいかせる。このような装置で移動相の密度が高く、放射状により外側の相となれば、これは「下降モード」の作動と呼ばれる。逆、すなわち、移動相の密度が低く、放射状により内側の相になれば、これは「上昇モード」と呼ばれる。
【００１２】
ＣＰＣは、種々のタイプの物質の分離に使用されている。例えば、グルコシノレート（グルコースとアミノ酸から誘導される有機化合物）の分離がToribio A, Nuzillard J-M, Renault J-H; Journal of Chromatography A. 1170 (2007) 44-51に記載されている。例えば、ＣＰＣを用いたペプチドの精製はＷＯ−Ａ−２０１１／１５７８０３に開示されている。
【００１３】
本発明の目的は、分離に有効であり、かつ、工業生産規模での使用に好適でもある、オリゴヌクレオチドを不純物から分離するための液−液クロマトグラフィーを用いたプロセスを提供することである。
【００１４】
本発明によれば、目的のオリゴヌクレオチドと１以上の不純物との混合物から目的のオリゴヌクレオチドを分離するための方法は、
第一の液体移動相と、目的のオリゴヌクレオチドに除去可能に結合する少なくとも１種類の交換体物質を含有する液体固定相とを含んでなる、二相系移動相−固定相液−液クロマトグラフィーシステムを準備すること；
液−液クロマトグラフィー装置のカラム内の液体固定相に対する、その液体固定相と接触した流れにおいて、第一の液体移動相に目的のオリゴヌクレオチドを運ばせ、目的のオリゴヌクレオチドを液体固定相中の交換体物質に結合させること；そして、
目的のオリゴヌクレオチドを前記液体固定相から、カラム内を前記固定相に対して、前記固定相と接触して流れる第二の液体移動相へと、目的のオリゴヌクレオチドを前記液体固定相から前記第二の移動相へ移すことができる置換体物質の手段により移すこと
を含んでなる。
【００１５】
その後、目的のオリゴヌクレオチドを第二の移動相から単離することができる。
【００１６】
この方法の一実施形態では、その流れにおいて第一の液体移動相に目的のオリゴヌクレオチドを運ばせることは、目的のオリゴヌクレオチドを含有する、例えば、そこに目的のオリゴヌクレオチドが溶解している第一の液体移動相を提供することによって達成することができる。
【００１７】
ＣＰＣに好適なこの方法の一実施形態では、方法は、工程：
（１）溶液中に目的のオリゴヌクレオチドと１以上の不純物を含有する第一の液体相、および目的のオリゴヌクレオチドに除去可能に結合する交換体物質を含有する第二の液体相を準備し、ここで、第一の液体相と第二の液体相は、互いに接触した際に２つの明瞭な相を形成すること；
（２）前記第二の液体相を遠心分配クロマトグラフィー装置にその中の固定液体相として導入すること；
（３）溶液中に目的のオリゴヌクレオチドと１以上の不純物を含有する前記第一の液体相を前記遠心分配クロマトグラフィー装置に第一の移動相として導入し、この第一の液体相を前記遠心分配クロマトグラフィー装置に、前記第二の液体相と接触させて流し、目的のオリゴヌクレオチドを前記第二の液体相中の交換体物質に除去可能に結合させること；
（４）前記第二の液体相と接触した際に明瞭な相を形成し、かつ、溶液中に目的のオリゴヌクレオチドを前記第二の液体相から遠心分配クロマトグラフィー装置へ移すことができる少なくとも１種類の置換体物質を含有する液体相を第二の移動相として導入し、この第二の移動相を前記遠心分配クロマトグラフィー装置に、固定液体相と接触させて流し、目的のオリゴヌクレオチドを固定相から移し、前記第二の移動相の溶液に入れること；
（５）第二の移動相から移された目的のオリゴヌクレオチドを単離すること
を含んでなる。
【００１８】
オリゴヌクレオチドは一般に５０以下の塩基を含み、前述のように、最大２００塩基のオリゴヌクレオチドも容易に合成することができる。本発明の方法はこのようなオリゴヌクレオチドの総て、ならびに天然および合成両方のオリゴヌクレオチド、例えば、塩基修飾または修飾された塩基を有するオリゴヌクレオチドに好適であると思われる。本明細書において用語「オリゴヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方、ＬＮＡ（ロック核酸、すなわち、ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分が２’酸素と４’炭素をつなぐ付加的な架橋で修飾されている）配列、２’修飾（ｓｉＲＮＡ）、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートを有するオリゴヌクレオチドが含まれ、保護された配列および非保護配列が含まれる。
【００１９】
本発明は、例えばオリゴヌクレオチドの合成または抽出から生じる不純物からの目的のオリゴヌクレオチドの分離を助ける。分離は例えば、不純物が固定相中の交換体物質に結合しないことから得られ、従って、この不純物は、なお移動相に溶解してＣＰＣ装置を通り抜けて流れる。あるいは、このような不純物は固定相中の交換体物質に、目的のオリゴヌクレオチドとは異なる程度で結合してもよく、かつ／または固定相から、目的のオリゴヌクレオチドとは異なる程度で移されてよく、その結果、従来のクロマトグラフィーと同様に、第二の移動相がＣＰＣを流れる際に、第二の移動相の流れの中で、目的のオリゴヌクレオチドと不純物が画分として分離する。このような分離プロセスの両方が起こってもよい。
【００２０】
本発明のプロセスは、療法において使用される典型的な長さ、例えば５〜５０塩基、例えば１０〜３０塩基、例えば１５〜２５塩基のオリゴヌクレオチドに好適であると思われる。現在利用可能なデータによれば、本発明のプロセスはいずれの塩基配列のオリゴヌクレオチドにも適用可能であることが示唆される。目的のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列５’−ｕｃａ  ａｇｇ  ａａｇ  ａｕｇ  ｇｃａ  ｕｕｕ  ｃａ−３’を有する、ＧＳＫ２４０２９６８と呼ばれる２０塩基のＲＮＡオリゴヌクレオチドであり得る。１０塩基のＤＮＡオリゴヌクレオチドの一例は、５’  ＧＧＣ  ＣＡＡ  ＡＣＣ  Ｔ  ３’である。２０塩基のＤＮＡオリゴヌクレオチドの別の例は５’  ＧＧＣ  ＣＡＡ  ＴＣＧ  ＧＣＴ  ＴＡＣ  ＣＴ  ３’である。３０塩基のＤＮＡオリゴヌクレオチドの一例は、５’  ＧＧＣ  ＣＡＡ  ＴＣＧ  ＧＣＴ  ＴＣＡ  ＣＴＣ  ＧＧＣ  ＣＡＡ  ＡＣＣ  ３’である。ＬＮＡオリゴヌクレオチドの一例は、５’  ＴＴＴ  ＡＣＧ  ＡＣＧ  ＡＣＧ  ＴＴＴ  ３’である。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの一例は、５’−ｇｃａ  ｃｇａ  ｕｕｃ  ｕｃａ  ａｇａ  ｕｇｃ  ｃｇ−３’である。
【００２１】
本発明のプロセスにおいて使用されるオリゴヌクレオチドはまた、ペプチド核酸またはその誘導体を含んでなってもよい。
【００２２】
本明細書で特定される用語「塩基修飾」または「修飾された塩基」は、既存の塩基（すなわち、ピリミジンまたはプリン塩基）の修飾または塩基のｄｅ  ｎｏｖｏ合成を意味する。このｄｅ  ｎｏｖｏ合成塩基は、既存の塩基との比較により「修飾された」と言える。
【００２３】
本発明の範囲内に含まれるオリゴヌクレオチドの他の化学構造および修飾を以下に定義する。これらの付加的化学構造および修飾は、オリゴヌクレオチドに関してすでに定義されている化学構造、例えば、５−メチルシトシン、５−メチルウラシルおよび／または２，６−ジアミノプリン、ならびに２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートＲＮＡを含んでなるオリゴヌクレオチドの存在と組み合わせて存在してもよい。
【００２４】
上記の修飾に加え、本発明のプロセスにおいて使用されるオリゴヌクレオチドは、下記のような種々のタイプの核酸モノマーまたはヌクレオチドなどのさらなる修飾を含んでなってよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡに基づくオリゴヌクレオチドに比べて、少なくとも１つの主鎖、および／または糖修飾および／または少なくとも１つの塩基修飾を有してもよい。
【００２５】
塩基修飾という用語はまた、天然プリンおよびピリミジン塩基（例えば、アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン、およびチミン）の修飾型、例えば、ヒポキサンチン、オロト酸、アグマチジン、リシジン、２−チオピリミジン（例えば、２−チオウラシル、２−チオチミン）、Ｇ−クランプおよびその誘導体、５−置換ピリミジン（例えば、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、５−ハロウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、５−アミノメチルウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−アミノメチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、スーパーＴ）、２，６−ジアミノプリン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、７−アザ−２，６−ジアミノプリン、８−アザ−７−デアザグアニン、８−アザ−７−デアザアデニン、８−アザ−７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、スーパーＧ、スーパーＡ、およびＮ４−エチルシトシン、またはそれらの誘導体；Ｎ２−シクロペンチルグアニン（ｃＰｅｎｔ−Ｇ）、Ｎ２−シクロペンチル−２−アミノプリン（ｃＰｅｎｔ−ＡＰ）、およびＮ２−プロピル−２−アミノプリン（Ｐｒ−ＡＰ）、またはそれらの誘導体；ならびに２，６−ジフルオロトルエンなどの縮重もしくはユニバーサル塩基、または脱塩基部位（例えば、１−デオキシリボース、１，２−ジデオキシリボース、１−デオキシ−２−Ｏ−メチルリボース；または環酸素が窒素で置換されたピロリジン誘導体（アザリボース））などの不在塩基も含む。スーパーＡ、スーパーＧおよびスーパーＴの誘導体の例は、引用することにより全内容が本明細書の一部とされるＵＳ−Ａ−６，６８３，１７３に見出すことができる。ｃＰｅｎｔ−Ｇ、ｃＰｅｎｔ−ＡＰおよびＰｒ−ＡＰは、ｓｉＲＮＡに組み込まれた場合、免疫刺激作用を軽減することが示された(Peacock H. et al. J. Am. Chem. Soc. (2011), 133, 9200)。
【００２６】
本発明において使用されるオリゴヌクレオチドは、脱塩基部位または脱塩基モノマーを含んでなり得る。脱塩基部位またはモノマーは、その核酸塩基を含んでなる対応するモノマーと比較して１つの核酸塩基を欠くモノマーまたは構成ブロックである。従って、脱塩基モノマーは、１つの核酸塩基を欠く、オリゴヌクレオチドの構成ブロック部分である。このような脱塩基モノマーは、オリゴヌクレオチドの遊離末端に存在するか、または遊離末端に連結もしくは結合もしくはコンジュゲートされていてよい。脱塩基モノマーは当業者により知られ、企図され得るいずれのタイプのものであってもよく、その非限定例を下記に示す：
【化１】
2014525254.tif 000003
式中、Ｒ１およびＲ２は独立にＨ、オリゴヌクレオチドまたは他の脱塩基部位であり、ただし、Ｒ１およびＲ２は両方ともＨであることはなく、かつ、Ｒ１およびＲ２は両方ともオリゴヌクレオチドであることはない。脱塩基モノマーは先に明示したオリゴヌクレオチドの一方または両方の末端と結合させることができる。１または２つの脱塩基部位または脱塩基モノマーと結合しているオリゴヌクレオチドは、１０未満のヌクレオチドを含んでなってよいことに留意されたい。
【００２７】
本発明のプロセスにおいて使用されるオリゴヌクレオチドとしては、糖修飾、すなわち、修飾型のリボシル部分、例えば、２’−Ｏ修飾ＲＮＡ、例えば、２’−Ｏ−アルキルまたは２’−Ｏ−（置換）アルキル、例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−（２−シアノエチル）、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル（２’−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−（２−チオメチル）エチル、２’−Ｏ−ブチリル、２’−Ｏ−プロパルギル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−（３−アミノ）プロピル、２’−Ｏ−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）、２’−Ｏ−（２−アミノ）エチル、２’−Ｏ−（２−（ジメチルアミノ）エチル；２’−デオキシ（ＤＮＡ）；２’−Ｏ−（ハロアルコキシ）メチル(Arai K. et al. Bioorg. Med. Chem. 2011, 21, 6285)、例えば、２’−Ｏ−（２−クロロエトキシ）メチル（ＭＣＥＭ）、２’−Ｏ−（２，２−ジクロロエトキシ）メチル（ＤＣＥＭ）；２’−Ｏ−アルコキシカルボニル、例えば、２’−Ｏ−［２−（メトキシカルボニル）エチル］（ＭＯＣＥ）、２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］（ＭＣＥ）、２’−Ｏ−［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイル）エチル］（ＤＣＭＥ）；２’−ハロ、例えば、２’−Ｆ、ＦＡＮＡ（２’−Ｆアラビノシル核酸）；カルバ糖およびアザ糖修飾；３’−Ｏ−アルキル、例えば、３’−Ｏ−メチル、３’−Ｏ−ブチリル、３’−Ｏ−プロパルギル；およびそれらの誘導体を含み得る。
【００２８】
他の糖修飾としては、「架橋」または「二環式」核酸（ＢＮＡ）、例えば、ロック核酸（ＬＮＡ）、キシロ−ＬＮＡ、α−Ｌ−ＬＮＡ、β−Ｄ−ＬＮＡ、ｃＥｔ（２’−Ｏ，４’−Ｃ拘束エチル）ＬＮＡ、ｃＭＯＥｔ（２’−Ｏ，４’−Ｃ拘束メトキシエチル）ＬＮＡ、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、トリシクロＤＮＡ；非ロック核酸（ＵＮＡ）；シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、アルトリオール核酸(altriol nucleic acid)（ＡＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、フッ素化ＨＮＡ（Ｆ−ＨＮＡ）、ピラノシル−ＲＮＡ（ｐ−ＲＮＡ）、３’−デオキシピラノシル−ＤＮＡ（ｐ−ＤＮＡ）；モルホリノ（例えば、ＰＭＯ、ＰＰＭＯ、ＰＭＯＰｌｕｓ、ＰＭＯ−Ｘ）；およびそれらの誘導体が含まれる。
【００２９】
本発明のプロセスにおいて使用されるオリゴヌクレオチドとしては、主鎖修飾、例えば、ＲＮＡ中に存在する修飾型のホスホジエステル、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、キラル的に純粋なホスホロチオエート、ホスホロジチオエート（ＰＳ２）、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、ホスホノアセトアミド（ＰＡＣＡ）、チオホスホノアセテート、チオホスホノアセトアミド、ホスホロチオエートプロドラッグ、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、メチルホスフェート、メチルホスホロチオエート、エチルホスフェート、エチルホスホロチオエート、ボラノホスフェート、ボラノホスホロチオエート、メチルボラノホスフェート、メチルボラノホスホロチオエート、メチルボラノホスホネート、メチルボラノホスホノチオエートおよびそれらの誘導体を含み得る。別の修飾としては、ホスホラミダイト、ホスホルアミダート、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミダート、ホスホルジアミダート、ホスホロチオジアミダート、スルファメート、ジメチレンスルホキシド、スルホネート、トリアゾール、オキサリル、カルバメート、メチレンイミノ（ＭＭＩ）、およびチオアセトアミド核酸（ＴＡＮＡ）；およびそれらの誘導体が含まれる。
【００３０】
本発明のプロセスにおいて使用されるオリゴヌクレオチドは、ペプチドに基づく核酸（ＰＮＡ）、ホウ素クラスター修飾ＰＮＡ、ピロリジンに基づくオキシペプチド核酸（ＰＯＰＮＡ）、グリコールまたはグリセロールに基づく核酸（ＧＮＡ）、トレオースに基づく核酸（ＴＮＡ）、非環状トレオニノールに基づく核酸（ａＴＮＡ）、モルホリノに基づくオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ、ＰＰＭＯ、ＰＭＯ−Ｘ）、陽イオンモルホリノに基づくオリゴマー（ＰＭＯｐｌｕｓ）、塩基および主鎖組み込みオリゴヌクレオチド(oligonucleotides with integrated bases and backbones)（ＯＮＩＢ）、ピロリジン−アミドオリゴヌクレオチド（ＰＯＭ）；およびそれらの誘導体などの他の修飾も含み得る。当業者ならば、オリゴヌクレオチドには多くの合成誘導体が存在することも認識するであろう。主鎖修飾としては、ＲＮＡに存在する修飾型のホスホジエステル、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、キラル的に純粋なホスホロチオエート、ホスホロジチオエート（ＰＳ２）、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、ホスホノアセトアミド（ＰＡＣＡ）、チオホスホノアセテート、チオホスホノアセトアミド、ホスホロチオエートプロドラッグ、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、メチルホスフェート、メチルホスホロチオエート、エチルホスフェート、エチルホスホロチオエート、ボラノホスフェート、ボラノホスホロチオエート、メチルボラノホスフェート、メチルボラノホスホロチオエート、メチルボラノホスホネート、メチルボラノホスホロチオエート、およびそれらの誘導体が含まれる。別の修飾としては、ホスホラミダイト、ホスホルアミダート、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミダート、ホスホルジアミダート、ホスホロチオジアミダート、スルファメート、ジメチレンスルホキシド、スルホネート、およびチオアセトアミド核酸（ＴＡＮＡ）；およびそれらの誘導体が含まれる。
【００３１】
各糖、塩基、および／または主鎖は同じ方法で修飾される必要はない。本発明のプロセスにおいて使用されるオリゴヌクレオチドでは、いくつかの異なる修飾の糖、塩基および／または主鎖を単一のオリゴヌクレオチドに組み合わせてもよい。本発明のプロセスにおいて使用されるオリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチド内に、２以上の異なる塩基修飾および／または２以上の異なる糖修飾および／または１以上の異なる主鎖修飾を含んでよい。
【００３２】
本発明のプロセスは、オリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドでない不純物から分離するために好適であると思われる。
【００３３】
このプロセスはまた、それもまたオリゴヌクレオチドである１以上の不純物から目的のオリゴヌクレオチドを分離するためにも好適であると思われる。例えば、本発明のプロセスは、目的のオリゴヌクレオチドと１つまたは２つの塩基だけが異なるオリゴヌクレオチド不純物を分離することができると思われる。例えば、本発明のプロセスは、２０塩基を有する目的のオリゴヌクレオチドを、１７、１８、１９または２１塩基を有するショートマーおよびロングマーオリゴヌクレオチドである不純物から分離するために好適であると思われる。このようなオリゴヌクレオチド不純物は、固定相中の交換体物質と、目的のオリゴヌクレオチドとは異なる程度で結合すると考えられ、かつ／または固定相から、目的のオリゴヌクレオチドとは異なる程度で移され、その結果、第二の移動相をＣＰＣに流した際に、第二の移動相の流れの中で、目的のオリゴヌクレオチドと不純物としてのオリゴヌクレオチドが画分として分離する。
【００３４】
本発明のプロセスににおいて、目的のオリゴヌクレオチドは遊離型のオリゴヌクレオチドとして存在してもよく、または保護基で保護された形態など、目的のオリゴヌクレオチドの誘導体の形態であってもよい。オリゴヌクレオチドに関して多くの保護基が知られている。好適な保護基はジメトキシトリチルであり、他の既知の保護基もまた好適であると考えられる。
【００３５】
第一の移動相および固定相は、互いに接触した際に２つの明瞭な相を形成するいずれの液体を含んでなってもよく、かつ、目的のオリゴヌクレオチドを溶解させる移動相と、交換体物質および交換体物質と結合した際の目的のオリゴヌクレオチドを溶解させる固定相とを含んでなる。このような液体の他の望ましい特性としては、それらが２つの明瞭な相を容易に形成する密度の違いがあり、かつ、乳化の傾向が小さい二相を形成することが含まれる。
【００３６】
例えば、これらの二相は、混合した際に、交換体物質がそれらの（移動または固定）相の一方にのみ存在するまたは一方にのみ実質的に可溶であり、かつ、置換体物質が他方の（固定または移動）相にのみ存在するまたは他方にのみ実質的に可溶であるという二相系を生じる、溶媒の組合せまたは水と１以上の溶媒の組合せを含んでなり得る。
【００３７】
例えば、固定相は、Ｃ１−６アルキルＣ１−６アルカン酸エステル、ジ−Ｃ１−６アルキルエーテル、Ｃ４−１０環状エーテル、液体ハロゲン化Ｃ１−６アルカン、または液体Ｃ５−１０アルカンなどの、水と不混和性または部分的混和性の１以上の有機液と、Ｃ１−８アルカノールまたはジ−（Ｃ１−８アルキル）ケトンなどの、水と少なくとも部分的に混和性の１以上の有機液との混合物を含んでなり得る。
【００３８】
「部分的混和性」には、そのアルカノール−水組成物範囲の少なくとも一部で二相系が形成され得ることを含むことが含まれる。このような二相のそれぞれはアルカノールと水の両方を含有するが、一方の相ではアルカノールが主要であり、他方の相では水が主要である。例えばＣ１−３アルカノールなどの低級なものは一般に、水−アルカノール組成物全体にわたって水と完全な混和性があるが、例えばＣ４−８アルカノールなどの高級なものは一般に、水と不混和性または部分的な混和性しかない。例えば、第一および第二の移動相は、Ｃ１−８アルカノールまたはジ−（Ｃ１−８アルキル）ケトンなどの、水と混和性のある１以上の有機液と水との混合物を含んでなり得る。このような有機液の例としては、酢酸エチル、メチル−ｔｅｒｔブチルエーテル、アルキル置換テトラヒドロフラン（例えば、２−メチルテトラヒドロフラン）、クロロホルム、ヘキサン、１−ブタノール、エタノール、メタノールおよび高極性非プロトン性溶媒（例えば、ジメチルスルホキシドおよびジメチルホルムアミド）が含まれる。
【００３９】
当然のことながら、このような二相が互いに接触する平衡系でも、それらの液体成分の微小な割合の相互混合が存在する可能性があり、従って、固定相の液体は移動相の液体から溶け込んだ微小な割合の水を含有する可能性があり、移動相の液体は固定相の液から溶け込んだ微小な割合の、水と実質的に不混和性の液体を含む可能性があると考えられる。
【００４０】
好適には、各相は、２種類以上のこのような液体を混合し、その系を静置して２つの平衡相を得ることによって形成することができ、上は密度の低い相で、下は密度が高い相であり、それぞれ固定相または移動相として使用することができる。従って、固定相および移動相は、このような液体を含有する液体系のそれぞれ２つの平衡相を含んでなり得る。このような相のそれぞれは、その系を含んでなる液体の総てを含有し得るが、このような相のそれぞれは主成分としての１以上の液体と、副成分としての１以上の液体とを主として含有すると考えられる。
【００４１】
このような相の例としては、下記に挙げられる二相系（ａ）〜（ｅ）が含まれる。このような相を得るためにこのような液体が混合され得る相対的割合は液体によって異なるが、実験的に容易に決定することができる。典型的な割合を以下に提案する。
【００４２】
（ａ）Ｃ１−６アルキルＣ１−６アルカン酸エステル−Ｃ１−８アルカノール−水。低密度相は、主成分エステル＋アルカノールを含んでなる。高密度相は、主成分水＋アルカノールを含んでなる。例えば、酢酸エチル−１−ブタノール−水（３：２：５）。
【００４３】
（ｂ）Ｃ４−８アルカノール−水。低密度相は、主成分アルカノールを含んでなる。高密度相は、主成分水を含んでなる。例えば、１−ペンタノールまたは１−ブタノール−水。
【００４４】
（ｃ）Ｃ１−８アルカノール−ジ−（Ｃ１−８アルキル）ケトン−水。低密度相は、主成分アルカノール＋ケトンを含んでなる。高密度相は、主成分水＋アルカノールを含んでなる。例えば、１−ブタノール−メチルイソブチルケトン−水（１：３：４）。
【００４５】
（ｄ）ジ−（Ｃ１−８アルキル）ケトン−水。低密度相は、主成分ケトンを含んでなる。高密度相は、主成分水を含んでなる。例えば、メチルイソブチルケトン−水。
【００４６】
（ｅ）ジ−Ｃ１−６アルキルエーテルまたはＣ４−１０環状エーテル−Ｃ１−８アルカノール−水。低密度相は、主成分エーテルおよびアルカノールを含んでなる。高密度相は、主成分水を含んでなる。例えば、メチル−第三級ブチルエーテル−１−ペンタノール−水（３：１：４）または２−メチルテトラヒドロフラン−１−ブタノール−水（３：１：４）。
【００４７】
その独特な主成分に加えて、ある対のこのような相のそれぞれは、その対の他相の主成分である副成分を含むと理解される。本発明のプロセスにおいて、固定相は、このような相の対のうち密度の低い方であり得る。
【００４８】
好ましい第一の移動相は、水と１−ブタノールとの混合物を主成分として含んでなり、酢酸エチルと１−ブタノールとの混合物を主成分として含んでなる固定相を用いる。別の好ましい第一の移動相は、水と１−ブタノールとの混合物を主成分として含んでなり、２−メチルテトラヒドロフランと１−ブタノールとの混合物を主成分として含んでなる固定相を用いる。このような混合物は、互いに接触した際に２つの明瞭な相を形成する。
【００４９】
好適には、第一の移動相は、目的のオリゴヌクレオチドの溶解および安定化を助けるために、例えば、塩基、例えば、無機塩基、例えば、アルカリ金属水酸化物、例えば、水酸化ナトリウム、またはアンモニアを含めることによって好適なｐＨに調整することができる。好適なｐＨはとりわけオリゴヌクレオチドによって異なり、それが保護されるかどうかによって異なる。適用によっては＜７の酸性ｐＨが実施可能であるが、第一の移動相の好適なｐＨ範囲はｐＨ７〜１４であると思われる。上述の２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドのジメトキシトリチル保護型または非保護型の好適なｐＨ範囲は、およそｐＨ７〜１２である。このオリゴヌクレオチドのジメトキシトリチル保護型の好適なｐＨ範囲は、例えばｐＨ１０〜１２、好適にはｐＨ１１前後である。現在利用可能なデータによれば、このようなｐＨ範囲は他のオリゴヌクレオチドにも好適であり得ることが示唆される。このようなｐＨを達成するための第一の移動相におけるこのような塩基の好適な濃度は実験的に決定することができる。本明細書に記載の実験では、好適な濃度は１０＋／−５ｍＭ、例えば１０ｍＭの水酸化ナトリウムであることが判明した。
【００５０】
上記に言及される２０ｍｅｒなどの目的のオリゴヌクレオチドの好適な濃度は実験的に決定することができる。カラム中の濃度として２００ｍｇ〜１００ｇ／Ｌ、例えば２００ｍｇ〜８０ｇ／Ｌ、例えば２０〜６０ｇ／Ｌが好適であると思われる。
【００５１】
交換体物質（あるいは当技術分野においては「保持物」と呼ばれる場合もある）は、固定相において目的のオリゴヌクレオチドと除去可能に結合する。好適には、交換体物質はアニオン交換体物質である。
【００５２】
目的のオリゴヌクレオチドと結合する好適な交換体物質は、有機アミンと対アニオン、好適には第二級、第三級または第四級アンモニウム塩との塩である。このようなアンモニウム塩の例は一般式：
Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｎ＋Ｘ−
式中、前記配列の第二、第三および第四、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれ２つ、３つまたは４つは独立にＣ１−２０アルキルもしくは置換アルキル（例えば、フルオロまたはトリフルオロメチル置換アルキル）、またはベンジルであり、残りは水素であり、Ｘ−はハリドアニオン、好適には塩素である。好適な交換体物質は、塩化トリ−（ｎ−オクチル）メチルアンモニウムおよび塩化トリ−（ｎ−デシル）メチルアンモニウムの混合物であり、この場合、ｎ−オクチル化合物が優位であるのが好適である。このような混合物はＡｌｉｑｕａｔ  ３３６（商標）の名称で市販されている。好適であると考えられるその他の交換体物質としては、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化メチルトリオクチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム（塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウムおよびＡＤＢＡＣとしても知られる、様々なアルキル鎖長の塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウムの混合物）、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム、塩化テトラブチルアンモニウム、およびプロトン化型のアンバーライトＬＡ２（遊離塩基型の液体として供給される高分子量の油溶性第二級アミン）が含まれる。
【００５３】
固定相中の交換体物質の濃度は、とりわけ、使用する物質、目的のオリゴヌクレオチド自体、および移動相の流速に依存する。計算は、目的のオリゴヌクレオチドと交換体物質のモル比に基づいて行うことができる。１０〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドでは、交換体物質のモル比の好適な範囲は、イオン部位当たり０．５〜１５当量、好ましくはおよそ５当量であり、交換体物質：目的のオリゴヌクレオチドのモル比は１：５〜５００、好ましくは１：１０〜３００、より好ましくは１：２０〜１５０となる。交換体物質濃度５〜５００、例えば５〜１００、一般に８〜５０ｍＭが、少なくともＡｌｉｑｕａｔ  ３３６（商標）について、また、おそらく他の交換体物質でも好適であると思われる。
【００５４】
本発明の方法を実施するためには、液液固定相および移動相系を使用する任意の市販の液−液クロマトグラフィー装置を使用することができると考えられる。
【００５５】
好適なＣＰＣ装置の例は、ＫｒｏｍａｔｏｎからのＦＣＰＣ２００（商標）ＣＰＣ装置である。好適なＣＰＣ装置はまたＡｒｍｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔからも入手可能である。このような装置の通常の仕様動作条件は、本発明のプロセスの実施に好適であると思われる。固定相は、装置の通常操作手順の後にカラムに導入するのが好適である。
【００５６】
典型的な操作では、固定相の液体、例えば、第二の液体相をポンプにて高流速でカラムに送り込み、その後、その装置に好適な運転速度でカラムの回転を開始することにより、カラムに固定相を充填することができる。
【００５７】
第一の移動相に、その流れにおいて様々な方法で目的のオリゴヌクレオチド（不純物を伴う）を運ばせることができる。
【００５８】
１つの方法では、例えば、溶解した目的のオリゴヌクレオチドを含有する第一の移動相を次にカラムに導入し、固定相に対して、固定と接触してカラムに流すことができる。
【００５９】
別の方法では、例えば、目的のオリゴヌクレオチドを、移動相と混和性のある、例えば、第一の移動相の液体の１つの液体成分であるか、または移動相の１以上の液体成分を含有する液体に溶解させ、この形態で第一の移動相の流れに導入することができる。第一の移動相の液体が水を含有する場合には、目的のオリゴヌクレオチドは例えば、水溶液としてこのように導入することができる。好適には、水を含有する第一の移動相の場合、一般に夾雑不純物と合わさったその未精製状態の目的のオリゴヌクレオチドを、水溶液の形態で、例えば、アンモニア水として、水を含有する第一の移動相と混合すればよい。いくつかのオリゴヌクレオチド合成では、水、溶解アンモニアならびにアセトニトリルおよびエタノールなどの溶媒の混合物としての溶液中でオリゴヌクレオチドを生産するが、適用によっては、目的のオリゴヌクレオチドをこのような溶液の形態でカラムに導入してもよい。目的のオリゴヌクレオチドを導入するこのような方法では、移動相と混和性のある液体はその流動中に移動相と混合するようになってもよいし、または実質的に明瞭に異なる相として残り、移動相によってカラムの周囲に押しやられてもよい。
【００６０】
任意選択の工程では、溶解した目的のオリゴヌクレオチドを含有する第一の移動相をカラムに導入する前に、目的のオリゴヌクレオチドを含まない第一の移動相を固定相充填済みカラムに流してもよい。このように移動相を最初に流すことでいくらかの固定相を溶出させることができ、これを流体力学的平衡が達成され、カラムの出口端から出てくる移動相が固定相を全くまたは最少量しか含まなくなるまで続ける。このような状態は、カラムの出口端からの流れをサンプリングすることによって測定することができる。
【００６１】
所望により、溶解した目的のオリゴヌクレオチドを含有する第一の移動相を、固定相の液体との混合物としてカラムに導入してもよい。移動相をこのような固定相の液体との混合物として導入することで、移動相を固定相で飽和させておくことを保証する助けとなり、移動相がカラムを流れる際に移動相によりカラムから固定相が除かれるのを防ぐことができる。これが起こる場合に必要となる固定相の量は実験的に決定することができ、数パーセントが必要となる場合がある。
【００６２】
固定相および移動相の好適な流速は、ＡｒｍｅｎまたはＫｒｏｍａｔｏｎ、例えば、Ｋｒｏｍａｔｏｎ  ＦＣＰＣ２００（商標）などの液−液クロマトグラフィー装置の通常の操作手順によって決定することができる。第一の移動相の導入は、ある量の固定相を除去する短時間の間、効果を持ち得るが、これは検出可能である。固定相の容積とカラムの容積は既知であることから、カラム内に留まる固定相の割合の尺度である固定相保持係数Ｓｆを算出することができる。
【００６３】
交換体物質を含有する固定相を含有するカラムを通る目的のオリゴヌクレオチドを含有する移動相の流れは、第一の移動相中に溶解した目的のオリゴヌクレオチドを固定相中の交換体物質結合させる。固定相における目的のオリゴヌクレオチドの保持能は、とりわけ、平衡化に見込まれる時間および固定相中の交換体物質の濃度に依存する。総てのまたは好適な割合の目的のオリゴヌクレオチドが固定相に保持される平衡を達成するためのカラムへの好適な流速、例えば、溶解した目的のオリゴヌクレオチドを含有する第一の移動相の好適な流速は、その装置の動作条件に基づいて実験的に決定することができる。好適な流速は、少なくともＫｒｏｍａｔｏｎ  ＦＣＰＣ２００（商標）で、およびおそらくは一般的に、２〜６ｍｌ／分であると思われるが、このような装置はもっと速く作動させてもよいと考えられる。他の装置、特により大規模な装置では、違った流速が適当である可能性がある。好適な条件は、例えば、ＣＰＣ装置から出てくる第一の移動相の流れにおいて、目的のオリゴヌクレオチドおよび／または他の物質の濃度をモニタリングすることによって実験的に決定することができる。好適なモニタリング技術は当業者に自明であり、例えば分光法またはＨＰＬＣなどの使用がある。
【００６４】
第二の液体移動相は、例えば上記のような第一の移動相と同じ組成の液体、例えば、１以上の溶媒または１以上の溶媒と水との混合物を含み得る。例えば、上記のように、主として、１−ブタノールなどのＣ１−８アルカノールと酢酸エチルなどのＣ１−６アルキルＣ１−６アルカン酸エステルとの混合物を含んでなる固定相と組み合わせて、第二の移動相は水と１−ブタノールなどのＣ１−８アルカノールとの混合物を含んでなってよく、上記と同様であれば、これはある種のＣ１−６アルキルＣ１−６アルカン酸エステルも微小な割合で含有してよい。あるいは、例えば、上記のように、主としてメチルテトラヒドロフランなどのＣ１−６環状エーテルとＣ１−８アルカノールとの混合物を含んでなる固定相と組み合わせて、第二の移動相は、主として水とＣ１−８アルカノールとの混合物を含んでなり得る。
【００６５】
好適には、第二の移動相は、目的のオリゴヌクレオチドの溶解および安定化を助けるために好適なｐＨに調整することもできる。好適なｐＨは、とりわけオリゴヌクレオチドによって異なり、それが保護されているかどうかによっても異なる場合がある。上述の２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドの好適なｐＨ範囲は、ジメトキシトリチル保護形態または非保護形態いずれの場合でも、およそｐＨ７〜１２である。ジメトキシトリチル保護形態のこのオリゴヌクレオチドの好適なｐＨ範囲は、例えばｐＨ１０〜１２、好適にはｐＨ１１前後である。このようなｐＨ範囲、例えばｐＨ７〜１４は他のオリゴヌクレオチドにも好適であり得、適用によっては＜７の酸性ｐＨが実施可能と考えられる。ｐＨの調整は例えば水酸化ナトリウムなどの塩基の添加によるものであってよい。このようなｐＨを達成するための第二の移動相におけるこのような塩基の好適な濃度は、１０＋／−５ｍＭ、例えば１０ｍＭ水酸化ナトリウムである。
【００６６】
好適な置換体物質は、目的のオリゴヌクレオチドよりも交換体物質とのより大きな結合定数、例えば、静電結合を形成する能力、を有する物質である。好適な置換体物質には、一価であっても多価であってもよいがアニオン部分が組み込まれている。好適な置換体物質としては、塩、特に、無機酸の塩、例えば、ハロゲン化物、硫酸塩、またはシュウ酸塩、金属、特にアルカリ金属との塩が含まれる。好適な置換体物質はヨウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウムである。他の好適な置換体物質としては、その脱プロトン化された形態のサッカリン、例えば、サッカリンのアルカリ金属塩、例えば、サッカリンナトリウム塩、サンセットイエロー（６−ヒドロキシ−５−［（４−スルホフェニル）アゾ］−２−ナフタレンスルホン酸ジナトリウム）およびアマランス（（４Ｅ）−３−オキソ−４−［（４−スルホナト−１−ナフチル）ヒドラゾノ］ナフタレン−２，７−ジスルホン酸トリナトリウム）が含まれる。後の２つのものには二塩基性および三塩基性アニオン部分が組み込まれていると考えられる。
【００６７】
計算は、交換体物質：置換体物質のモル比に基づいて行うことができ、好ましくは１：１〜５：１の範囲である。これに基づけば、置換体物質の最大濃度はおよそ５００ｍＭであると思われる。第二の移動相中の置換体物質の好適な濃度は、２〜５００ｍＭ、例えば５〜３０ｍＭであると思われる。
【００６８】
ＣＰＣ装置から出てくる第二の移動相の流れにおいて目的のオリゴヌクレオチドが好都合には不連続の画分として現れるような速度での、固定相からの目的のオリゴヌクレオチドの移動を達成するための、置換体物質を含有する第二の移動相の好適な流速は、実験的に決定することができる。本明細書に記載の実験において、好適な流速は、少なくともＫｒｏｍａｔｏｎ  ＦＣＰＣ２００（商標）では、２〜６ｍｌ／分であることが判明し、これで目的のオリゴヌクレオチドの完全な移動を達成することができると思われるが、このような装置はもっと速く、例えば、２００ｍｌのカラムにて最大２０ｍｌ／分で作動させることができると考えられる。このような移動を達成するための好適な条件は、例えば、ＣＰＣ装置から出てくる第二の移動相の流れにおいて目的のオリゴヌクレオチドの濃度をモニタリングすることによって実験的に決定することができる。好適なモニタリング技術は当業者に自明であり、例えば分光法またはＨＰＬＣなどの使用がある。
【００６９】
次に、所望により、必要であれば、保護基、交換体および／または置換体物質の痕跡などの除去を含む従来のプロセスによって、第二の移動相から目的のオリゴヌクレオチドを単離することができる。典型的な単離技術としては、脱保護（オリゴヌクレオチドが保護される場合）、脱塩（限外濾過）および凍結乾燥が含まれる。単離された目的のオリゴヌクレオチドに対し、次に、例えばイオン交換クロマトグラフィーなど、必要と考えられる任意のさらなる精製工程を行ってもよい。
【００７０】
以下、本発明を以下の図面を参照しながら、単に例として説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、実験８のカラムから出てくる第二の移動相のＵＶクロマトグラムを示す。
【図２】図２は、実験８の画分分析後のクロマトグラムの再構成を示す。
【図３】図３は、実験２１の画分分析後のクロマトグラムの再構成を示す。
【図４】図４は、実験４のカラムから出てくる第二の移動相のＵＶクロマトグラムを示す。
【図５】図５は、実験１８の画分分析後のクロマトグラムの再構成を示す。  いくつかの実験を下表に示すとおりに行った。実験８および２１として表に挙げた２つの実験を以下に詳細に説明する。
【００７２】
実験８
液体相を以下の手順に従って調製した。酢酸エチル、１−ブタノールおよび水を３：２：５の容量比で混合した。この二相系を、２つの明瞭な相が得られるまで静置した後、これらの相を分離した。
【００７３】
上相の層（微小な割合の水を含む、酢酸エチル／ブタノール）に、４０ｍＭの濃度となるようにＡｌｉｑｕａｔ  ３３６（商標）（交換体物質）を加え、この容器に「固定相」、すなわち、第二の液体相のラベルを付けた。
【００７４】
下相（微小な割合の酢酸エチルを含む、水／ブタノール）を二等分した。一方の部分に１０ｍＭの濃度となるように水酸化ナトリウムを加え、この容器に「第一の移動相」、すなわち、第一の液体相のラベルを付けた。
【００７５】
下相のもう一方の部分に１０ｍＭの濃度となるように水酸化ナトリウムと、１３．３ｍＭ濃度となるまでヨウ化カリウム（置換体物質）を加え、この容器に「第二の移動相」、すなわち、第三の液体相のラベルを付けた。
【００７６】
使用した遠心分配クロマトグラフィー（ＣＰＣ）装置は、市販の２００ｍｌ  Ａｒｍｅｎ  ＣＰＣ装置であった。一般に、このような装置は、およそ２０枚の円形分配ディスクからなるローターを含んでなる。一般に、このような装置は２００〜２０００ｒｐｍに調節することができ、１０００ｒｐｍではおよそ１２０ｇ、２０００ｒｐｍでは４８０ｇの遠心力が生じる。Ｋｒｏｍａｔｏｎ  ＦＣＰＣ２００装置は下降モードに設定した。カラムは１２００ｒｐｍで回転させた。この装置の仕様動作条件に従い、カラムに「固定相」容器（第二の液体相＋Ａｌｉｑｕａｔ  ３３６（商標））の溶液を流速１０ｍＬ／分で充填した。一般に、市販のＤｉｏｎｅｘ  Ｐ５８０ＨＰＧ  ４ウェイバイナリ高圧グラジェントポンプ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用い、一般に２１ｍｌサンプルループを備えた、一般に低圧インジェクションバルブ（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ、ＣＩＬ、Ｃｌｕｘｅａｕ、Ｓａｉｎｔ−Ｆｏｙ−Ｌａ−Ｇｒａｎｄｅ、ＦＲなど）から、固定相および移動相を装置に導入することができる。
【００７７】
１７ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、１９ｍｅｒおよび／または２１ｍｅｒの不純物（４００ｍｇ）を含む可能性のある不純物が夾雑していることが分かっている、２０ｍｅｒＲＮＡオリゴヌクレオチド５’−ｕｃａ  ａｇｇ  ａａｇ  ａｕｇ  ｇｃａ  ｕｕｕ  ｃａ−３’である保護された目的のオリゴヌクレオチドのサンプルを、第一の移動相（１０ｍＬ）に溶解させた。溶解させたところで、１０ｍＬの固定相液体（交換体物質不含）を移動相のこのオリゴヌクレオチド溶液に加えて、二相混合物を形成した。
【００７８】
第一の移動相に溶解した目的のオリゴヌクレオチドの溶液と固定相液体との混合物をカラムに注射し、この混合物を流速５ｍＬ／分で２０分間カラムに送り込んだ。この時、平衡が達成されており、すなわち、もはや固定相は流動している移動相によってカラム外に除かれることはなく、カラムから出てくる溶出液をＨＰＬＣを用いて分析することにより検出したところ、目的のオリゴヌクレオチドはカラムから出てこなかった。
【００７９】
次に、第二の移動相（第三の液体相）を同様の流速で１００分間ポンプで送り込んだ。出てくる第二の移動相の画分を１分ごとに回収し、オフラインで分析した。
【００８０】
図１を参照すると、これは、開始時を０として、第一および第二の移動相のカラムへの導入を追跡したものである。最初のおよそ１７分間で、少量の固定相はカラムから移された。およそ２０分の時点で平衡に到達し、流動している第一の移動相によって移される固定相は極めて少なかった。置換体物質を含有する第二の移動液体相を２０分後に導入した。その後のピークは固定相から第二の移動相により移される物質の溶出を表す。このピークからの画分を分析したところ、導入されたオリゴヌクレオチド中に存在する不純物はこのピークの始めと終わりに密に重なっていることが示された。図２は、実験８の画分分析後のクロマトグラムの再構成を示す。
【００８１】
実験２１
溶媒系はぞれぞれ容量比（３：１：４）のＭｅ−ＴＨＦ／ｎ−ＢｕＯＨ／水から構成された。これらの３つの液体を混合し、静置して二相とし、これらを分離した。
【００８２】
上の有機相に濃度４０ｍＭとなるようにＡｌｉｑｕａｔ  ３３６（交換体物質）を加え、この有機相を固定相としての使用に指定した。
【００８３】
下の水相を２つに分けた。一方の部分に１０ｍＭの濃度となるように水酸化ナトリウムを加え、この部分を第一の移動相として指定した。下相のもう一方の部分に１０ｍＭの濃度となるように水酸化ナトリウムを加え、４．４ｍＭの濃度となるようにアマランス（置換体物質）を加えた。この部分を第二の移動相に指定した。
【００８４】
オリゴヌクレオチドの未精製サンプル（３５ｍＬのアンモニア水溶液中におよそ８８％の目的のオリゴヌクレオチドを含有する４００ｍｇ）を、固定相（交換体物質不含）として指定した溶媒系の上相部分５ｍＬと組み合わせた。
【００８５】
カラムを１２００ｒｐｍで回転させ、下降モードで固定相を充填した。次に、移動相１を５ｍＬ／分で送り込みながら、上記で調製したサンプルをカラムにロードした。第一の移動相を１０分間送り込み、次いで第二の移動相も５ｍＬ／分の速度で１２０分間送り込んだ。画分を１分ごとに回収した。
【００８６】
図３は実験２１の溶出液のＨＰＬＣピークを示し、そのＤＭＴ保護基を持たない目的のヌクレオチドとしての「Ｎ  ＤＭＴ−ｏｆｆ」、これもまたＤＭＴ保護基を持たない目的のヌクレオチド＋／−一塩基としての「Ｎ＋１」および「Ｎ−１」、ならびに１０種類の不純物にそれぞれ相当する痕跡としてのｉｍｐ  １〜１０を示す。不純物ｉｍｐ  １〜１０およびＮ−１の溶出は実質的に一緒に起こり、精製された目的のオリゴヌクレオチドが第二の移動相により溶出される前にだいたい完了し、第二の移動相の導入後およそ８１〜９５分の間に＞９５％純度の目的のオリゴヌクレオチドが溶出することが分かった。Ｎ＋１不純物は、主として目的のピークの終わりに溶出した。
【００８７】
さらなる実験
実験１〜３１の詳細を以下の表形式に示す。実験１は交換体または保持物質を用いない対照であった。実験１２では、二成分系２−ブタノール−水は、乳化傾向のほとんどない２つの明瞭な相を容易に形成するような密度の違いを有する二相を形成しなかったので、固定相が保持されていなかったと考えられる。
【００８８】
このカラムでは、「オリゴタイプ」Ｐ＝Ｏはオリゴヌクレオチドのホスホジエステル型を意味し、Ｐ＝Ｓはオリゴヌクレオチドのホスホロチオエート型を意味する。Ａｌ３３６はＡｌｉｑｕａｔ  ３３６を表し、ＢＡＣｌは塩化ベンザルコニウムを表す。これらの実験からのデータを提示するに当たって、目標純度を設定し、その純度で回収された目的物質の量を算出した。イソタチックトレイン(Isotachic train)は、目的のオリゴヌクレオチドが第二の移動相により設定純度で溶出される分数を意味する。「ＭＩＢＫ」は、メチルイソブチルケトンの省略形である。「ＭｔＢＥ」は、メチル第三級ブチルエーテルの省略形である。「ＭｅＴＨＦ」は、２−メチルテトラヒドロフランの省略形である。
【００８９】
図４は、実験３のカラムから出てくる第二の移動相のＵＶクロマトグラムを示し、図５は、実験１８の画分分析後のクロマトグラムの再構成を示す。これらのそれぞれにおいて、目的のオリゴヌクレオチドを表すエンベロープは、第二の移動相の実質的流動期間に、著しく精製された目的のオリゴヌクレオチドが溶出され、従来の技術を用いて第二の移動相から単離され得ることを示す。
【００９０】
【表１】
2014525254.tif 000004
【表２】
2014525254.tif 000005
【表３】
2014525254.tif 000006
【図１】
2014525254.tif 000007
【図２】
2014525254.tif 000008
【図３】
2014525254.tif 000009
【図４】
2014525254.tif 000010
【図５】
2014525254.tif 000011
【国際調査報告】
2014525254.tif 000012
2014525254.tif 000013