(57)【要約】本発明は、癌、例えば三種陰性乳癌を患う患者の処置における同時または連続的な使用のための、（ｉ）ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチド、および（ｉｉ）有糸分裂阻害剤である化学療法薬の組合せに関する。本発明はまた、薬物効果の維持に、有糸分裂阻害剤である化学療法薬に対する癌を患う患者の感受性の増加または回復または増強に使用するための、ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチドに関する。本発明はさらに、ＡＴＩＰ３のフラグメントを含むまたはからなる生物学的に活性なポリペプチド、およびそれに結合する抗体を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＩＰ３の最大５００個連続したアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチドであって、前記フラグメントは、
ａ）配列番号１のアミノ酸４１０〜８７４からなる配列；
ｂ）配列番号６のアミノ酸４１０〜８２０からなる配列；
ｃ）配列番号１のアミノ酸３３３〜５８０からなる配列；
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の配列に対して少なくとも８０％同一である配列；
ｅ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の配列の少なくとも６個連続したアミノ酸；
ｆ）（ｄ）または（ｅ）の配列、前記配列は、配列番号１もしくは配列番号６のアミノ酸４６２〜４６５、または配列番号１のアミノ酸４１０〜６３４もしくは７０５〜８７４もしくは８１７〜８７４を含む；
ｇ）配列番号１のアミノ酸４１０〜６３４または７０５〜８７４または８１７〜８７４からなる配列；
ｈ）（ｇ）の配列に対して少なくとも８０％同一である配列；または
ｉ）（ｇ）または（ｈ）の配列の少なくとも６個連続したアミノ酸
を含む、前記ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドがさらにペネトラチンを含む、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
医薬品としての使用のための、請求項１または２記載のポリペプチド。
【請求項４】
癌の処置における使用のための、請求項１または２記載のポリペプチド。
【請求項５】
癌を患う患者の処置における同時または連続的な使用のための、
ｉ．アンギオテンシンＩＩ２型レセプター相互作用タンパク質３（ＡＴＩＰ３）またはその生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチド；および
ｉｉ．有糸分裂阻害剤である化学療法薬
の組合せ。
【請求項６】
前記癌がＡＴＩＰ３を低発現している癌である、請求項５記載の使用のための組合せ。
【請求項７】
前記化学療法薬がタキサン、好ましくはパクリタキセルまたはドセタキセルである、請求項６記載の使用のための組合せ。
【請求項８】
前記化学療法薬は、前記薬物がＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントを含む前記ポリペプチドを伴わずに投与される場合に推奨される用量よりも低い用量で使用されるものである、請求項５〜７のいずれか一項記載の使用のための組合せ。
【請求項９】
ＡＴＩＰ３を低発現している癌の処置に、または薬物効果の維持に、または有糸分裂阻害剤である化学療法薬に対する癌を患う患者の感受性の増加、回復もしくは増強に使用するための、ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチド。
【請求項１０】
ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントを含む前記ポリペプチドが、請求項１または２において定義したようなポリペプチドである、請求項５〜８のいずれか一項記載の使用のための組合せ、または請求項９記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項１１】
前記癌が、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、頭頸部癌、大腸癌、結腸直腸癌、肝臓癌、前立腺癌、膀胱癌、胃癌および非小細胞肺癌からなる群より選択される、請求項５〜８のいずれか一項記載の使用のための組合せ、または請求項４もしくは９記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項１２】
前記癌が、組織学的等級の高い癌および／または転移性癌である、請求項１１記載の使用のための組合せまたはポリペプチド。
【請求項１３】
前記癌が三種陰性乳癌である、請求項１１または１２記載の使用のための組合せまたはポリペプチド。
【請求項１４】
有糸分裂阻害剤である化学療法薬と場合により組合せて、アンギオテンシンＩＩ２型レセプター相互作用タンパク質３（ＡＴＩＰ３）またはその生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチドによって処置しようとする癌を患う患者をin vitroにおいて選択するための方法であって、前記方法は、
ａ）前記癌からの細胞を含む生物学的試料を準備する工程；
ｂ）−前記癌が、三種陰性乳癌であるかどうか；および／または
−  ＡＴＩＰ３が前記の生物学的試料において発現されているかどうか
を決定する工程；および
ｃ）前記患者が、三種陰性乳癌を患っている場合、および／またはＡＴＩＰ３が、対照試料よりも前記の生物学的試料において有意により低いレベルで発現されている場合に前記患者を選択する工程
を含む、前記方法。
【請求項１５】
アンギオテンシンＩＩ２型レセプター相互作用タンパク質３（ＡＴＩＰ３）の最大５００個連続したアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントからなるポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、前記フラグメントは、
ａ）配列番号１のアミノ酸４１０〜８７４からなる配列；
ｂ）配列番号６のアミノ酸４１０〜８２０からなる配列；
ｃ）配列番号１のアミノ酸３３３〜５８０からなる配列；
ｄ）配列番号１のアミノ酸４１０〜６３４または７０５〜８７４または８１７〜８７４からなる配列；
ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の配列に対して少なくとも８０％同一である配列；
ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の配列の少なくとも６個連続したアミノ酸；
ｇ）（ｅ）または（ｆ）の配列、前記配列は、配列番号１もしくは配列番号６のアミノ酸４６２〜４６５または配列番号１のアミノ酸４１０〜６３４もしくは７０５〜８７４もしくは８１７〜８７４を含む
を含む、前記抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌、例えば三種陰性乳癌を患う患者の処置における同時または連続的な使用のための、（ｉ）ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチドと、（ｉｉ）有糸分裂阻害剤である化学療法薬との組合せに関する。本発明はまた、薬物効果の維持に、有糸分裂阻害剤である化学療法薬に対する癌を患う患者の感受性の増加または回復または増強に使用するための、ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチドに関する。本発明はさらに、ＡＴＩＰ３のフラグメントを含むまたはからなる生物学的に活性なポリペプチド、およびそれに結合する抗体を提供する。
【０００２】
ＡＴＩＰタンパク質
アンギオテンシンＩＩ２型レセプター相互作用タンパク質（ＡＴＩＰ）は、微小管結合腫瘍サプレッサー１（ＭＴＵＳ１）遺伝子という単一の遺伝子によってコードされている。この遺伝子は、ゲノムＤＮＡのヒト染色体８ｐ２２の１５０ｋｂ以上におよび点在している、１７個のコードエキソンおよび３個の５’非コードエキソンを含む。５個のＭＴＵＳ１転写変異体は、その組織分布およびその５’エキソンの利用に基づいて３つの主要な群に分類され得る（ＡＴＩＰ１、ＡＴＩＰ３およびＡＴＩＰ４）。従って、変異体１、２および３（それぞれＡＴＩＰ３ａ、ＡＴＩＰ３ｂおよびＡＴＩＰ２）は全て同じ５’コードエキソン（エキソン１および２）を使用し、そしてエキソン３および／または４の選択的スプライシングによって異なる。変異体４（ＡＴＩＰ４）および５（ＡＴＩＰ１）はそれぞれエキソン５および８を使用する。ＡＴＩＰ２変異体はエキソン３を特異的に使用し、これはタンパク質の中途での切断短縮をもたらす終止コドンを含む（例えば、第ＷＯ０１／５７２０９号を参照、そしてレビューについてはRodrigues-FerreiraおよびNahmias, 2010, Trends Endocrinol Metab. 21:684-90）。
【０００３】
Rodrigues-Ferreira et al. (2009, PLoS One. 4(10):e7239 2009)は、ＡＴＩＰ３が主要なＭＴＵＳ１スプライス変異体であり、その発現は、組織学的等級の高いおよび三種陰性の表現型の侵襲性の乳腺腫瘍において有意に減少していることを示した。分子クローニングおよび機能的研究により、ＡＴＩＰ３は、in vitroおよびin vivoにおいて乳癌の細胞分裂を減少させる新規な紡錘体結合タンパク質であることが判明した。特に、ＡＴＩＰ３は、その発現が臨床転帰の不良な高度に増殖性の乳癌において有意に減少している新規な微小管結合タンパク質として同定された。ＡＴＩＰ３の再発現は、in vitroおよびin vivoにおいて腫瘍細胞の増殖を制限するので、Rodrigues-Ferreira et al.は、このタンパク質が、乳癌の処置のための新規で有用なバイオマーカーおよび興味深い候補を示し得ることを示唆する。
【０００４】
乳癌
乳癌は、依然として世界中における悪性腫瘍による女性の死亡の第一原因である。その有病率は西洋諸国において９人中１人の女性という高さである。
【０００５】
過去１０年間におよび、エストロゲンレセプター（ＥＲ）、プロゲステロンレセプター（ＰＲ）およびヒト上皮増殖因子レセプター２（ＨＥＲ２）を含む伝統的な予後診断および予測バイオマーカーが、新たに診断された乳癌において免疫組織化学法によって日常的に評価されてきた（DowsettおよびDunbier, 2008, Clin Cancer Res. 14:8019-8026）。ＥＲまたはＰＲについて陽性である腫瘍は、一般的にホルモン療法によって処置されるが、ＨＥＲ２陽性腫瘍を有する患者は、標的化抗ＨＥＲ２療法の候補である。三種陰性表現型（ＥＲ、ＰＲおよびＨＥＲ２について陰性）を示す腫瘍は、現在、利用可能な標的化処置は全くなく、そして依然として予後は非常に不良である（Rakha et al., 2008, J Clin Oncol. 26:2568-2581）。このような三種陰性腫瘍は、全乳腺腫瘍の１５％を示すが、この癌による死亡は２５％に等しい。
【０００６】
従って、乳癌、特に三種陰性表現型を有する乳腺腫瘍の処置は、深刻で公衆衛生上重要な問題を示す。より具体的には、当技術分野において、乳癌を患う患者のための療法、特に三種陰性乳腺腫瘍を患う患者のための標的化療法の開発が必要とされる。
【０００７】
発明の説明
本発明者らは、驚くべきことに、ＡＴＩＰ３の投与が、乳癌細胞を化学療法に対して感作させることを見出した。特に、ＡＴＩＰ３の発現は微小管を安定化させ、そして乳癌細胞をより低用量のタキサンに対して感作させる。
【０００８】
従って、本発明者らは、利用可能な標的化療法をもたない癌を処置するための新規な標的化療法を見出した。前記発明は、三種陰性乳腺腫瘍を処置するために特に有利である。いずれかの理論によって固めたくはないが、本発明者らは、ＡＴＩＰ３の発現が有意に減少しているこのような腫瘍におけるＡＴＩＰ３の再発現は、薬物の効果を持続させ、治療剤または予防剤、特にタキサンなどの有糸分裂阻害剤に対する腫瘍細胞の感受性を増加または回復させることを可能とする。結果として、より低用量の有糸分裂阻害剤を患者に投与することができ、これにより有糸分裂阻害剤の効力を維持しつつ副作用を低減することができる。さらに、ＡＴＩＰ３は、他の化学療法薬の非存在下でさえも強力な転移抑制剤であることが示された。
【０００９】
本発明者らはさらに、完全長タンパク質と同じ抗癌活性を示す、残基４１０〜８７４からなる、ＡＴＩＰ３のドメインを見出した。従って、このドメインは完全長タンパク質よりもはるかに短いが、完全長ＡＴＩＰ３の代わりに癌の処置に有利に使用することができる。さらに、生物学的に活性なペプチドをそれから誘導することができる。
【００１０】
ＡＴＩＰ３およびその生物学的に活性なフラグメント
本明細書においてさらに記載されているような癌の処置における使用のための、本発明によるポリペプチドは、ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントを含むまたはからなるポリペプチドである。
【００１１】
本明細書全体を通して使用する「ＡＴＩＰｓ」という用語は、アンギオテンシンＩＩ２型レセプター相互作用タンパク質を指し、これはＡＴ２レセプター相互作用タンパク質とも呼ばれる。「ＡＴＩＰ３」という用語は、ＡＴＩＰ３ａタンパク質（微小管結合腫瘍サプレッサー１アイソフォーム１の名称でも知られる）（例えば、ＮＣＢＩリファレンス配列：NP_001001924およびUniProtKB/Swiss-Protエントリー番号Q9ULD2-1, バージョン64、２０１１年１月１１日付を参照）およびＡＴＩＰ３ｂタンパク質（微小管結合腫瘍サプレッサー１アイソフォーム２の名称でも知られる）（例えば、ＮＣＢＩリファレンス配列：NP_001001925およびUniProtKB/Swiss-Protエントリー番号Q9ULD2-2, バージョン64、２０１１年１月１１日付を参照）の両方を指す。微小管結合腫瘍サプレッサー１のアイソフォーム１および２は、ＭＴＵＳ１遺伝子によってコードされている。より具体的には、これらのアイソフォームは、ヒトＭＴＵＳ１遺伝子のエキソン１および２によってコードされるアミノ酸、またはホモサピエンス以外の別の種の対応するエキソンのアミノ酸を含むが、エキソン３によってコードされるアミノ酸は含まない（Rodrigues-FerreiraおよびNahmias, 2010, Trends Endocrinol Metab. 21:684-90、および特に６８５頁の図１参照）。
【００１２】
本発明によると、ＡＴＩＰ３は好ましくはヒトＡＴＩＰ３である。
【００１３】
ＡＴＩＰ３は、例えば、配列番号１（ヒトＡＴＩＰ３ａ）または配列番号６（ヒトＡＴＩＰ３ｂ）の配列を有し得るか、またはその変異体（好ましくは対立遺伝子変異体）、またはホモサピエンス以外の別の種のその相同タンパク質に対応し得る。
【００１４】
最も好ましくは、ＡＴＩＰ３は、
−  配列番号１の配列、
−  配列番号６の配列、または
−  配列番号１または配列番号６の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列（ただし、コードされるポリペプチドは生物学的に活性である）
からなる配列を有する。このような配列は、例えば、配列番号１または配列番号６のヒトＡＴＩＰ３タンパク質の対立遺伝子変異体に対応し得る。
【００１５】
配列番号１または６のヒトＡＴＩＰ３タンパク質の対立遺伝子変異体は、当業者には公知である。例えば、配列番号１のヒトＡＴＩＰ３タンパク質または配列番号６のヒトＡＴＩＰ３タンパク質の対立遺伝子変異体は、２０１１年１月１１日付のUniProtKB/Swiss-Protエントリー番号Q9ULD2、バージョン64に開示されている。
【００１６】
本発明の質問アミノ酸配列に対して少なくとも例えば９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドによって、対象のポリペプチド配列が質問アミノ酸配列の１００アミノ酸毎に５個までのアミノ酸改変を含み得ることを除いて、対象のポリペプチドのアミノ酸配列が質問配列と同一であることを意図する。別の言葉で言えば、質問アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列における５％（１００中５個）までのアミノ酸残基を、別のアミノ酸を用いて挿入、欠失または置換し得る。
【００１７】
本出願の枠組みにおいて、同一性の比率は、グローバルアラインメントを使用して計算される（すなわち２つの配列をその全長におよび比較する）。２つ以上の配列の同一性および相同性を比較するための方法は当技術分野において周知である。Needleman-Wunschグローバルアラインメントアルゴリズム（NeedlemanおよびWunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453）を使用して、その完全長を考慮して２つの配列の最適なアラインメント（ギャップを含む）を見つける「needle」プログラムを例えば使用し得る。needleプログラムは、例えば、ワールドワイドウェブサイトのebi.ac.ukで入手可能である。本発明による同一性の比率は、好ましくは、１０．０に等しい「ギャップ・オープン」パラメーター、０．５に等しい「ギャップ・エクステンド」パラメーターおよびＢｌｏｓｕｍ６２マトリックスを有するＥＭＢＯＳＳ：：needle（グローバル）プログラムを使用して計算される。
【００１８】
リファレンス配列に対して「少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一」であるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、リファレンス配列と比較して欠失、挿入および／または置換などの突然変異を含み得る。リファレンス配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、リファレンス配列の対立遺伝子変異体に対応し得る。それは、例えば、リファレンス配列と比較して置換だけを含んでいてもよい。置換は、好ましくは、以下の表に示したような保存的置換に対応する。  
【００１９】
【表１】
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【００２０】
また好ましくは、置換は、例えば、２０１１年１月１１日付のUniProtKB/Swiss-Prot エントリー番号Q9ULD2、バージョン64に記載されたもの、および／またはncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ウェブサイトで利用可能なｄｂＳＮＰデータベースに記載されたものなどの、多型変異に対応し得る。例えば、本発明によるＡＴＩＰ３ポリペプチドは、rs61733703、rs61742544、rs61733702、rs3739407、rs61733701、rs3739408、rs61733698、rs73206291、rs61733697、rs209568、rs113749634、rs61733696、rs11203910、rs61733695、rs41528945、rs75253845、rs61733694、rs17690844、rs61740538、rs2979788、rs209569、s77588184、rs113445081、s61733691、rs75653293、rs75383511、rs61733690、rs2979792、rs74754090、rs61748836、rs112428784、rs71882531、rs72007854、rs71838742、rs72185938、s72175917、rs61733708、rs34504210、rs34069077、rs12224、rs35188785、s61733707、rs34178284、rs61999336、rs72190379、rs17853231、rs71990301、rs111237660、rs61733705、rs76290497、rs61733704およびrs12550193からなる群より選択された１つ以上の置換を含み得る。
【００２１】
本明細書においてさらに記載されたような癌の処置における使用のための、本発明によるポリペプチドは、完全長ＡＴＩＰ３を含むまたはからなるポリペプチドだけでなく、そのフラグメント（ただし前記フラグメントは生物学的に活性である）を含むまたはからなるポリペプチドも包含する。
【００２２】
本発明の枠組みにおいて、生物学的に活性なフラグメントは、例えば、ＡＴＩＰ３の少なくとも６、８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４６０、４６４、４７５、５００、５５０、６００、７００、８００、９００、１０００または１１１０の連続したアミノ酸を含み得る。
【００２３】
ＡＴＩＰ３またはそのフラグメントの「生物学的活性」によって、（ｉ）腫瘍の増殖を減少させる能力（すなわちそれは抗癌活性を示す）；および／または（ｉｉ）腫瘍の転移を減少させる能力；および／または（ｉｉｉ）微小管と結合する能力；および／または（ｉｖ）延長された有糸分裂を促進させる能力；（ｉｖ）薬物の効果を持続させる能力、および／または（ｖ）治療剤もしくは予防剤に対する癌細胞の感受性を増加もしくは回復させる能力を意味する。
【００２４】
当業者は、ＡＴＩＰ３またはそのフラグメントが生物学的に活性であるかどうかを容易に決定することができる。例えば、腫瘍の増殖を減少させる能力は、例えば、クローン形成能実験（例えば実施例２に記載したような）を通して乳癌細胞の増殖を評価することによって、および／またはin vivoにおいて腫瘍の増殖を評価することによって（例えばRodrigues-Ferreira et al., 2009, PLoS One. 4(10):e7239 2009に提供されたプロトコールを使用して）決定することができる。腫瘍の転移を減少させる能力は、例えば、ボイデンチャンバーまたは創傷治癒実験（例えば実施例４に記載のような）を通して乳癌細胞の遊走を評価することによって、および／またはin vivoにおいて腫瘍の転移を評価することによって（例えば本明細書において提供した実施例に記載のような）決定することができる。微小管と結合する能力は、免疫蛍光研究においてα−チューブリンとの同時局在を分析することによって、および／または例えばRodrigues-Ferreira et al. (2009, PLoS One. 4(10):e7239 2009)に記載の共沈降プロトコールを使用して細胞抽出物における微小管の結合を評価することによって決定することができる。延長された有糸分裂を促進する能力は、ｍＣｈｅｒｒｙ−ヒストン２Ｂを発現しそして例えばRodrigues-Ferreira et al. (2009, PLoS One. 4(10):e7239 2009)に記載されたプロトコールを使用してＧＦＰに融合した試験しようとするポリペプチドを用いてトランスフェクションされた細胞の生細胞イメージングを実施することによって決定することができる。
【００２５】
ＡＴＩＰ３の生物学的活性はまた、ＡＴＩＰ３が、その天然の結合対、例えばＥＢ１、ＡＴ２レセプターおよびチューブリンなどに結合する能力を評価することによっても決定され得る。その天然の結合対に対するＡＴＩＰ３の結合は、例えば、共免疫沈降アッセイ、プルダウンアッセイまたは酵母ツーハイブリッドシステム（Ｙ２Ｈ）を使用して評価され得る。
【００２６】
ＡＴＩＰ３の活性はさらに、特に免疫学的方法、例えばポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を使用した検出、またはＰＣＲもしくは逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む方法、ＤＮＡアレイ（マクロアレイまたはマイクロアレイ）およびIn Situハイブリダイゼーションの使用を含む方法を含む、当業者に周知の方法を使用して、ＡＴＩＰ３ペプチド配列および／またはＡＴＩＰ３遺伝子がダウンレギュレーションされているかどうかを決定することによって評価され得る。
【００２７】
本明細書において使用する「生物学的に活性な」フラグメントは、配列番号１の完全長ＡＴＩＰ３ポリペプチドの生物学的活性の少なくとも１つ、好ましくは全てを示すフラグメントを指し、ただし、生物学的に活性なフラグメントは、腫瘍の増殖を減少させる能力を保持する。生物学的に活性なフラグメントは、例えば、クローン形成能実験（実施例２および図７参照）を通して評価した場合に乳癌細胞の増殖を減少させることができる、および／またはボイデンチャンバーもしくは創傷治癒実験（実施例４並びに図４および５参照）を通して評価した場合に細胞の遊走を減少させることができることにより特徴付けられ得る。
【００２８】
本発明者らは、完全長ＡＴＩＰ３の抗癌活性を保持した約４６５アミノ酸のＡＴＩＰ３の機能的ドメインを同定した。本発明者らはさらに、ＥＢ１タンパク質との相互作用のための２つの共通部位を発見した（実施例２および図６参照）。
【００２９】
それ故、本発明は、ＡＴＩＰ３の最大５００個連続したアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントを含むまたはからなるポリペプチドを提供し、前記フラグメントは、
ａ）配列番号１のアミノ酸４１０〜８７４からなる配列；
ｂ）配列番号６のアミノ酸４１０〜８２０からなる配列；
ｃ）配列番号１のアミノ酸３３３〜５８０からなる配列；
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の配列に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一である配列；
ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の配列の少なくとも６、８、１０、１２、１５、１８、２０、３０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０または４６０個連続したアミノ酸；
ｆ）（ｄ）または（ｅ）の配列、前記配列は、配列番号１もしくは配列番号６のアミノ酸４６２〜４６５、または配列番号１のアミノ酸４１０〜６３４もしくは７０５〜８７４もしくは８１７〜８７４からなるＫＮＩＰ ＥＢ１結合配列を含む、
ｇ）配列番号１のアミノ酸４１０〜６３４または７０５〜８７４または８１７〜８７４からなる配列、
ｈ）（ｇ）の配列に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一である配列；
ｉ）（ｇ）または（ｈ）の配列の少なくとも６、８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、５０、７５、９０、１００、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５または１６０個連続したアミノ酸；
ｊ）配列番号１のアミノ酸１２４０〜１２７０からなる配列；
ｋ）（ｊ）の配列に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一である配列；
ｌ）（ｊ）または（ｋ）の配列の少なくとも６、８、１０、１２、１５、１８、２０または２５個連続したアミノ酸；または
ｍ）（ｋ）または（ｌ）の配列、前記配列は、配列番号１のアミノ酸１２４９〜１２５２からなるＳＡＩＰ ＥＢ１結合配列を含む
を含むまたはからなる。
【００３０】
本発明によると、ＡＴＩＰ３の最大５００個連続したアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントを含むまたはからなるポリペプチドは、ＡＴＩＰ３の５００個を超える連続したアミノ酸を含まない。実際に、本発明による「ＡＴＩＰ３の最大５００個連続したアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントを含むまたはからなるポリペプチド」は、ＡＴＩＰ３の最大５００個連続したアミノ酸のポリペプチドを指す。結果として、前記の「ＡＴＩＰ３の最大５００個連続したアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントを含むまたはからなるポリペプチド」は、ＡＴＩＰ３タンパク質ではない。
【００３１】
それにも関わらず、ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチドは、癌を患う患者の処置における同時または連続的な使用のための化学療法薬との組み合わせにおいて本発明によって想定される。
【００３２】
１つの態様において、ＡＴＩＰ３の最大５００個連続したアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントを含むまたはからなる前記ポリペプチドは、それが、ＫＮＩＰ ＥＢ１結合配列（配列番号１のアミノ酸４６２〜４６５）を含むことを特徴とする。
【００３３】
別の態様において、ＡＴＩＰ３の最大５００個連続したアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントを含むまたはからなる前記ポリペプチドは、それがＳＡＩＰ ＥＢ１結合配列（配列番号１のアミノ酸１２４９〜１２５２）を含むことを特徴とする。
【００３４】
ＡＴＩＰ３の最大５００個連続したアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントを含むまたはからなる上のポリペプチドは、有利には医薬品として使用することができる。従って、本発明は、このようなポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。特に、このようなポリペプチドは、単独で、または有糸分裂阻害剤（本明細書において以後にさらに記載したような）などの化学療法薬と組み合わせてのいずれかで、癌（前記癌は本明細書において以後に詳細に定義されている）を処置するために使用することができる。
【００３５】
本発明の枠組みにおいて、ＡＴＩＰ３の最大５００個連続したアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントを含むまたはからなる上のポリペプチドは、ＡＴＩＰ３またはＡＴＩＰ３の生物学的に活性なフラグメントを含むまたはからなる好ましいポリペプチドである。
【００３６】
特定の態様において、ＡＴＩＰ３の最大５００個連続したアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントを含むまたはからなる上のポリペプチドはペプチドである。
【００３７】
さらなる特定の態様において、前記ポリペプチドは、ＡＴＩＰ３の最大５００個連続したアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントを含むまたはからなり、ただし、前記ポリペプチドは、配列番号１の配列のアミノ酸８５６〜８７６、５４〜６８５または６８６〜８１５からならない。本発明によるポリペプチドとは対照的に、配列番号１の配列のアミノ酸８５６〜８７６、５４〜６８５または６８６〜８１５からなるポリペプチドは、微小管またはＥＢ１タンパク質に結合しない。
【００３８】
本明細書において使用する「ポリペプチド」という用語は、好ましくはペプチド結合によって連結された、少なくとも６個のアミノ酸の鎖を指す。この用語は、例えばタンパク質およびペプチドを包含する。
【００３９】
「ペプチド」という用語は、最大５０のアミノ酸長、好ましくは最大３０のアミノ酸長であるポリペプチドを指す。前記ペプチドは場合により、例えば、その生物活性および／またはそのバイオアベイラビリティーを増強するために化学的に修飾されていてもよい。例えば、前記ペプチドは、以下の化学的修飾の１つ以上を含み得る：
−  アミノ酸を、修飾および／または異常アミノ酸を用いて置換、例えばアミノ酸を、Ｎｌｅ、ＮｖａまたはＯｒｎのような異常アミノ酸を用いて置換；および／または
−  アミノ酸を、異なるキラリティーを有するアミノ酸を用いて置換；および／または
−  ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端への修飾、例えばＮ末端アシル化（好ましくはアセチル化）もしくは脱アミノ化、またはアミドもしくはアルコール基へのＣ末端カルボキシル基の修飾；および／または
−  ２つのアミノ酸間のアミド結合における修飾：２つのアミノ酸を連結しているアミド結合の窒素原子またはα炭素におけるアシル化（好ましくはアセチル化）またはアルキル化（好ましくはメチル化）；および／または
−  ２つのアミノ酸を連結しているアミド結合のα炭素における修飾、例えば２つのアミノ酸を連結しているアミド結合のα炭素におけるアシル化（好ましくはアセチル化）またはアルキル化（好ましくはメチル化）；および／または
−  １つ以上のα炭素が窒素原子により置換されている、アザペプチドを得ることを可能とする修飾；および／または
−  １つ以上のアミノ酸のアミノ基が、α炭素ではなくβ炭素に結合している、βペプチドを得ることを可能とする修飾。
【００４０】
ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメント（特に本明細書において上で定義したようなＡＴＩＰ３の最大５００個連続したアミノ酸の生物学的に活性なフラグメント）に加えて、本発明によるポリペプチドは、さらなるアミノ酸配列、例えばシグナルペプチドおよび／またはプロペプチド（宿主細胞におけるポリペプチドの発現を可能とするための）、精製に有用なタグ（例えばＨｉｓタグ、これは典型的には６個のヒスチジン残基からなる）、および／または真核細胞内にポリペプチドを形質導入するのに有用な配列（例えばペネトラチン）を含み得る。
【００４１】
特定の態様において、本発明によるポリペプチドはペネトラチンを含む。ペネトラチンは、１６アミノ酸長のペプチドであり、その配列は配列番号５として示され、これはアンテナペディアホメオドメインから誘導される。このペプチドは正に荷電し、そして形質導入を通して細胞膜を横切ることができる。従って、それは、真核細胞内への分子カーゴの形質導入のために使用することができる。それはin vitroおよびin vivoの両方において効率的である（Prochiantz, 2008, Adv Drug Deliv Rev. 60:448-51）。好ましくは、ペネトラチンは、ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントのＣ末端に融合している。
【００４２】
本発明によるポリペプチドはさらに、ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントのＮ末端に融合したＨｉｓタグ、および場合によりＨｉｓタグのＮ末端に融合したシグナルペプチドを含み得る。
【００４３】
本発明によるポリペプチドは、当技術分野において公知の任意の方法を使用して産生され得る。それらは例えば、宿主細胞において（例えば細菌、酵母または真核宿主細胞において）組換えポリペプチドとして産生されても、または化学的に合成されてもよい（例えばポリペプチドがペプチドである場合）。
【００４４】
本発明はまた、ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントをコードおよび／または発現する核酸、特にＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントをコードおよび／または発現する発現ベクターを提供する。このような核酸は、ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントを、アデノウイルスベクターを使用して患者に投与しようとする場合に、および／または遺伝子療法の枠組みにおいて有用性を見出す。
【００４５】
癌の処置における使用のための、化学療法薬とＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントとの組合せ
本発明者らは、ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントを含むまたはからなるポリペプチドは、治療剤または予防剤に対する癌細胞の感受性を維持、増加または回復させ、そして特に、タキソールまたはドセタキセルの効力の減少を防ぎ、そして乳癌細胞をタキソールおよびドセタキセル有糸分裂阻害剤に対して感作させることを見出した。それ故、本発明は、癌を患う患者の処置において、特にＡＴＩＰ３を低発現する癌を患う患者の処置における、同時または連続的な使用のための、
ｉ．ＡＴＩＰ３もしくはその生物学的に活性なフラグメント（上の段落において定義したような）を含むまたはからなるポリペプチド、またはそれをコードする核酸；および
ｉｉ．有糸分裂阻害剤である化学療法薬
の組合せを提供する。
【００４６】
本発明はまた、ＡＴＩＰ３を低発現する癌の処置に、薬物の効果の持続に、または有糸分裂阻害剤である化学療法薬に対する癌を患う患者の感受性の増加、回復または増強において使用するための、ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメント（上の段落において定義したような）を含むまたはからなるポリペプチドを提供する。
【００４７】
「薬物の効果を維持」は、疾病（例えば癌）がより低い効力で応答するか、または疾病が以前には応答性であった治療剤に対して応答しなくなった場合の環境を指す。癌のためのこのような治療剤は、癌化学療法において使用されるアントラサイクリン、ビンカアルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、タキサンまたは他の小分子などの化学療法薬であり得る。
【００４８】
「化学療法薬」によって、癌の処置のための市販の認可を受けている薬物、または癌の処置のための臨床または前臨床試験を受けている薬物を意味する。
【００４９】
「有糸分裂阻害剤」（「紡錘体毒」または「有糸分裂毒（mitosis poison）」とも呼ばれる）によって、有糸分裂を減速および／または阻害することのできる薬剤を意味する。このような有糸分裂阻害剤は、例えば、チューブリンを安定化させることができ、従って、有糸分裂過程（殆どのタキサンの場合のような）を「凍結」、または紡錘体（殆どのビンカアルカロイドの場合のような）を破壊させることができる。
【００５０】
本発明による組合せの好ましい態様において、化学療法薬はタキサンである。タキサンは、イチイ（Taxus）属（イチイ、yew）の植物から最初に誘導されたジテルペンである。現在、それらは通常合成される。タキサンは、例えばパクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテア）、ハラヴェン（エリブリン）およびカバジタキセルなどの種々の化学療法薬を産生するために使用されている。これらのタキサン、特にパクリタキセル（タキソール）は、本発明の枠組みにおいて使用することのできる好ましい化学療法薬である。
【００５１】
あるいは、化学療法薬は、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンまたはビノレルビンなどのビンカアルカロイドであり得る。
【００５２】
ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントを含むまたはからなるポリペプチドおよび化学療法薬は、患者に同時にまたは連続的にのいずれかで投与され得る。投与が連続的である場合、ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントを含むまたはからなるポリペプチドは、患者を感作させるために化学療法薬の前に好ましくは投与される。
【００５３】
有糸分裂阻害剤およびＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチドの他に、患者の処置レジメンはさらに、手術、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法および／または他の化学療法薬の投与を含み得る。
【００５４】
ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチドは、乳癌細胞を有糸分裂阻害剤に対して感作させるので、有糸分裂阻害剤を、有利には、単独で投与される処置レジメンにおけるよりもより低い用量で使用することができる。
【００５５】
それ故、本発明による組合せの好ましい態様において、化学療法薬は、低い用量で使用され、すなわち、前記薬物を、ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントを含む前記ポリペプチドを伴わずに投与する場合に推奨される用量よりも低い用量で使用される。
【００５６】
当業者は、所与の化学療法薬のための低用量を直ちに決定することができる。このような低用量は、特に、処置しようとする癌および治療プロトコールに依存する。
【００５７】
本発明の枠組みにおいて、「低用量」によって、化学療法薬がＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントの非存在下で投与される場合に患者に投与される推奨投与量よりも低い用量を意味する。前記の低用量は、好ましくは、推奨用量よりも少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％または５０％少ない。
【００５８】
化学療法薬がＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントの非存在下で投与される場合に患者に投与される推奨用量は、当業者には公知である。このような推奨用量は、例えば、医薬品販売承認を交付する当局によって提供される情報（例えばＥＭＥＡによって発行されたＥＰＡＲ）に見出すことができる。
【００５９】
説明的な例として、本明細書の以下に低用量のドセタキセルによって意味されるものが記載されている。
【００６０】
例えば、局所的に進行したまたは転移性の乳癌を有する患者の処置のために、ドセタキセルの推奨用量は、単独療法において１００mg／m２である。それ故、局所的に進行したまたは転移性乳癌を有する患者の単独療法における処置の枠組みにおける、ドセタキセルの低用量は、１００mg／m２より少ない用量、好ましくは９０mg／m２、７５mg／m２または５０mg／m２より少ない用量である。
【００６１】
これに対して、ドセタキセルを手術可能なリンパ節転移陽性およびリンパ節転移陰性乳癌のアジュバント処置として使用する場合、ドセタキセルの推奨用量は、３週間毎に６サイクルかけて、ドキソルビシン５０mg／m２およびシクロホスファミド５００mg／m２の１時間後に投与される７５mg／m２である（ＴＡＣレジメン）。より一般的には、ドセタキセルは通常、別の薬物（例えばエンドキサンまたはカペシタビン）と併用した場合または患者が積極的な化学療法に耐えられないリスクがある場合には、７５mg／m２で投与される。それ故、別の薬物と併用した場合または患者が積極的な化学療法に耐えられないと考えられる場合の、ドセタキセルの低用量は、７５mg／m２、好ましくは５０mg／m２、４０mg／m２または３０mg／m２より少ない用量である。
【００６２】
別の説明的な例として、本明細書の以下に低用量のパクリタキセル（タキソール）によって意味されるものが記載されている。
【００６３】
パクリタキセルは、通常、１週間に１回８０または９０mg／m２で投与される（例えば、１日目、８日目、１５日目、その後、２８日目およびそれから毎週、場合により他の薬物と組み合わせて）。それ故、パクリタキセルの低用量は、８０mg／m２、好ましくは７０mg／m２、６０mg／m２、５０mg／m２または４０mg／m２よりも少ない用量である。
【００６４】
本発明による組合せの好ましい態様において、ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントを含むまたはからなるポリペプチドはＡＴＩＰ３である。
【００６５】
本発明による組合せの別の好ましい態様において、ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントを含むまたはからなるポリペプチドは、ＡＴＩＰ３の最大５００個連続したアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントを含むまたはからなるポリペプチドであり、前記フラグメントは、
ａ）配列番号１のアミノ酸４１０〜８７４からなる配列；
ｂ）配列番号６のアミノ酸４１０〜８２０からなる配列；
ｃ）配列番号１のアミノ酸３３３〜５８０からなる配列；
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の配列に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一である配列；
ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の配列の少なくとも６、８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４６０、４６４、４７５個連続したアミノ酸；
ｆ）（ｄ）または（ｅ）の配列、前記配列は、配列番号１または配列番号６のアミノ酸４６２〜４６５；または配列番号１のアミノ酸４１０〜６３４または７０５〜８７４または８１７〜８７４を含む、
ｇ）配列番号１のアミノ酸４１０〜６３４または７０５〜８７４または８１７〜８７４からなる配列、
ｈ）（ｇ）の配列に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一である配列；
ｉ）（ｇ）または（ｈ）の配列の少なくとも６、８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、５０、７５、９０、１００、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５または１６０個連続したアミノ酸；
ｊ）配列番号１のアミノ酸１２４０〜１２７０からなる配列；
ｋ）（ｊ）の配列に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一である配列；
ｌ）（ｊ）または（ｋ）の配列の少なくとも６、８、１０、１２、１５、１８、２０または２５個連続したアミノ酸；または
ｍ）（ｋ）または（ｌ）の配列、前記配列は配列番号１のアミノ酸１２４９〜１２５２を含む、
を含むまたはからなる。
【００６６】
本発明はさらに、必要とする個体を処置する方法を提供し、前記方法は、有効量の、
−  ＡＴＩＰ３もしくはその生物学的に活性なフラグメントを含むもしくはからなるポリペプチド、またはそれをコードする核酸；および
−  有糸分裂阻害剤である化学療法薬
を必要とする個体に投与する工程を含む。
【００６７】
ポリペプチドおよび薬物は「有効量」で、すなわち、癌を処置するのに十分な量で投与される。この量は、使用される治療剤の効力、使用される任意の担体の性質、疾病の重度および患者の年齢により変動することが理解される。任意の所与の組成物の適切な量の決定は、適切な治療レベルを評価するために設計された一連の標準的な試験を通して、当業者の技能範囲内である。
【００６８】
「それを必要とする個体」によって、癌を患う個体、または癌を患った後に寛解した個体を意味する。
【００６９】
本発明の枠組みにおいて、個体は、好ましくはヒト個体である。しかしながら、本発明によるポリペプチドおよび薬物の獣医学的使用も想定される。従って、個体はまた、非ヒト個体、好ましくは非ヒト哺乳動物にも対応し得る。
【００７０】
「処置」という用語は、治療法および予防法の両方、すなわち、容態を治癒、改善および／または癌を患う個体の寿命を延ばすことを目的とした方法を包含することを意味する。また、転移の出現または拡大を予防することを目的とした方法、並びに再発を予防することを目的とした方法も指す。
【００７１】
本発明により処置しようとする癌
本発明による方法、組合せ、使用およびポリペプチドは、癌の処置において用途を見出す。
【００７２】
本明細書全体を通して使用する「癌」という用語は、任意の種類の悪性（すなわち非良性）腫瘍を指す。悪性腫瘍は、原発性腫瘍または続発性腫瘍（すなわち転移）に対応し得る。腫瘍は、例えば、癌腫、腺癌、肉腫、メラノーマ、中皮腫または芽細胞腫などの固形悪性腫瘍に対応し得る。
【００７３】
癌は、好ましくは、上皮癌、例えば上皮組織細胞の悪性増殖を伴う癌腫または腺癌である固形悪性腫瘍に対応する。
【００７４】
癌は最も好ましくは乳癌（breast cancer）（特に乳癌（breast carcinoma））、膵臓癌、卵巣癌、頭頸部癌、大腸癌、結腸直腸癌、肝臓癌（liver cancer）（特に肝細胞癌（hepatocarcinoma））、胃癌、前立腺癌、膀胱癌または非小細胞肺癌に対応する。実際に、これらの癌は、ＭＴＵＳ１遺伝子が時に低発現および／または突然変異していることが知られる癌、および／またはタキソールの投与によって一般的に処置される癌のいずれかである。
【００７５】
特に、ＡＴＩＰ３は、転移性進行の時間経過を遅延させ、そして癌転移の形成を減少させる。それ故、本発明により処置しようとする癌は、好ましくは、組織学的等級の高い癌（すなわち高い増殖能を有すると考えられる癌）および／または転移性癌に対応する。
【００７６】
癌の「組織学的等級」は、癌の周知の分類法であり、これにより癌は１〜４の等級（Ｇ１〜４）に分類される。より具体的には、癌細胞は、正常細胞に類似したように見える場合には「低い等級」であり、そして低分化であるように見えれば「高い等級」である。等級はさらに、細胞の増殖指数を考慮に入れる。例えば、Ｇ３またはＧ４の癌は、組織学的等級の高い癌として分類されるだろう。
【００７７】
「転移性癌」によって、原発性腫瘍が位置する組織または臓器とは異なる少なくとも１つの組織または臓器にまで広がっている癌を意味する。
【００７８】
特に、ＡＴＩＰ３およびその生物学的に活性なフラグメントは、乳癌の場合には腫瘍の増殖および転移の拡大を減少させることを可能とすることが実証された。
【００７９】
それ故、本発明による好ましい態様において、本発明により処置しようとする癌は、乳癌（breast cancer）、最も好ましくは乳癌（breast carcinoma）である。
【００８０】
ＡＴＩＰ３の非常に効果のある抗発癌作用および特に抗転移作用の観点から、本発明は、三種陰性乳癌の処置に適切であると考えられる。この仮説は、本明細書に含まれる実験データによって確認されている（例えば実施例３および図１１参照）。これは、ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントを含むまたはからなるポリペプチドを有糸分裂阻害剤と組合せて使用する場合にはいよいよ真実である。なぜなら、そうしたポリペプチドは、乳癌細胞を有糸分裂阻害剤に対して感作させることができ、従って、現在までに非常に悪い予後を有する患者の処置を可能とするからである。
【００８１】
それ故、本発明による最も好ましい態様において、癌は三種陰性乳癌および／またはＡＴＩＰ３低発現癌である。
【００８２】
「三種陰性乳癌」によって、エストロゲンレセプター（ＥＲ）、プロゲステロンレセプター（ＰＲ）および上皮増殖因子レセプター２（ＨＥＲ２）を発現しない乳腺腫瘍を意味する。乳癌が三種陰性乳癌であるかどうかの決定は、好ましくは、免疫組織化学法を通して行なわれる（例えば、DowsettおよびDunbier, 2008, Clin Cancer Res. 14:8019-8026,およびRakha et al., 2008, J Clin Oncol. 26:2568-2581を参照）。
【００８３】
治療剤または予防剤に対して「癌細胞を感作させること」は、前記の治療剤もしくは予防剤またはその両方に対する癌細胞の感受性を維持（長時間におよび）、増加または回復させることを意味する。
【００８４】
「ＡＴＩＰ３低発現癌」は、対照試料よりも有意に低いレベルでＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントを発現する、癌細胞またはそのような癌細胞を含む生物学的試料を意味する。
【００８５】
標的化療法のための患者を選択
ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチドは、三種陰性乳癌の処置に適していると考えられているので、本発明は、このような三種陰性乳癌を患う患者の処置のための標的化療法を提供する。
【００８６】
特に、本発明は、場合により有糸分裂阻害剤である化学療法薬（本明細書において上に定義したような）と組み合わせて、ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメント（本明細書において上に定義したような）を含むポリペプチドによって、またはそれをコードする核酸によって処置しようとする患者をin vitroにおいて選択するための方法を提供し、前記患者は乳癌を患い、そして前記方法は、
ａ）前記の乳癌からの細胞を含む生物学的試料を準備または入手する工程；
ｂ）前記乳癌が三種陰性乳癌であるかどうかを、例えば免疫化学法を通して決定する工程；および
ｃ）前記患者が三種陰性乳癌を患っているならば前記患者を選択する工程
を含む。
【００８７】
このような方法は、容易に日常的に行なうことができる。なぜなら、乳癌が三種陰性乳癌であるかどうかの決定は、当技術分野において周知でありそして広く使用されている方法を使用して行なうことができるからである（例えば、DowsettおよびDunbier, 2008, Clin Cancer Res. 14:8019-8026, およびRakha et al., 2008, J Clin Oncol. 26:2568-2581参照）
【００８８】
ＡＴＩＰ３低発現癌を患う患者の診断法および／または予後診断法も提供され、前記方法は、
ａ）前記患者からの癌細胞を含む生物学的試料を準備する工程；
−  ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントが前記癌細胞上で発現されているかどうかを決定する工程；および
ｂ）前記ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントが、対照試料よりも前記の生物学的試料において有意により低いレベルで発現されているならば前記患者を選択する工程
を含む。
【００８９】
好ましくは、前記方法はin vitroまたはex vivo法である。
【００９０】
１つの態様において、前記方法は、発現されたＡＴＩＰ３が生物学的に活性であるかどうかを決定する工程を含む。
【００９１】
タンパク質の発現は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用した検出などの免疫学的方法を使用することによって評価され得る。適切な免疫学的方法としては、免疫組織化学法、腫瘍組織マイクロアレイハイブリダイゼーションおよびウェスタンブロットが挙げられる。
【００９２】
ＡＴＩＰ３ ｍＲＮＡの発現レベルの変化は、当業者には周知の他の方法によって評価され得、これには、特に、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）などの逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む定量的な方法、並びにＤＮＡアレイ（マクロアレイまたはマイクロアレイ）およびIn Situハイブリダイゼーションまたは新型シーケンサー（ＮＧＳ）の使用を含む方法が挙げられる。
【００９３】
ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントはまた、化学療法薬に対する感受性を増加もしくは回復させるため、または薬物の効果を持続させるために、ＡＴＩＰ３が低発現である癌の処置にも適している（例えば実施例３および図８〜１１参照）。
【００９４】
それ故、本発明はまた、好ましくは有糸分裂阻害剤である化学療法薬と組み合わせて、ＡＴＩＰ３もしくはその生物学的に活性なフラグメント（本明細書において上に定義したような）を含むポリペプチドによって、またはこのようなポリペプチドをコードする核酸によって処置しようとする患者をin vitroにおいて選択するための方法を提供し、前記方法は、
ａ）前記癌からの細胞を含む生物学的試料を準備する工程；
ｂ）ＡＴＩＰ３が前記の生物学的試料中において発現されているかどうかを決定する工程；および
ｃ）ＡＴＩＰ３が、対照試料よりも前記の生物学的試料において有意により低いレベルで発現されているならば前記患者を選択する工程
を含む。
【００９５】
対照試料は、例えば、健康な個体からの組織試料（好ましくは癌細胞と同じ組織からの）、患者の健康な組織の試料（例えば癌組織を囲む健康な組織）、または健康な個体におけるＡＴＩＰ３の発現レベルを示すＡＴＩＰ３の量を含む試料に対応し得る。
【００９６】
ＡＴＩＰ３が発現されているかどうかの決定は、当技術分野において周知の方法を使用して、例えば免疫化学法、ウェスタンブロットまたはＲＴ−ｑＰＣＲを通して行なうことができる。ＡＴＩＰ３の発現は、タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルで評価され得る。
【００９７】
本明細書において使用する発現レベルは、差異を慣用的な方法（例えば免疫化学法、ウェスタンブロットまたはＲＴ−ｑＰＣＲを通して）を使用して検出できる場合には「有意に」より低い。好ましくは、患者は、ＡＴＩＰ３の発現が、対照試料と比較して前記の生物学的試料において少なくとも２倍の減少を示すならば選択される。
【００９８】
本発明による薬学的組成物
本発明はまた、
ｉ．ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメント（本明細書において上に定義したような）、またはそれをコードする核酸、
ｉｉ．薬学的に許容される担体；および
ｉｉｉ．場合により有糸分裂阻害剤である化学療法薬（本明細書において上に定義したような）
を含む薬学的組成物を提供する。
【００９９】
ヒトへの投与に適した様式で製剤化された薬学的組成物は当業者には公知である。本発明の薬学的組成物はさらに、安定化剤、緩衝剤なども含み得る。
【０１００】
本発明の組成物は、例えば、経口投与用の錠剤、カプセル剤またはエリキシル剤として、直腸投与用の坐剤として、注射投与用の無菌溶液または懸濁液として製剤化および使用され得る。
【０１０１】
製剤の選択は、最終的には、例えば静脈内、腹腔内、皮下もしくは経口投与法、または腫瘍への注射を介した局所的投与などの意図する投与法に依存する。
【０１０２】
本発明による薬学的組成物は、溶液または懸濁液、例えば注射溶液または懸濁液であり得る。それは、例えば単位投与形でパッケージングされ得る。
【０１０３】
ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントは、ポリペプチドまたはペプチドとして（例えばリポソームまたはナノ粒子で製剤化）、またはその核酸として（例えばアデノウイルスベクターの形態下、例えばリポソームで製剤化）投与され得る。
【０１０４】
本発明による抗体
本発明はさらに、ＡＴＩＰ３の最大５００個連続したアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントを含むまたはからなるポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供し、前記フラグメントは、
ａ）配列番号１のアミノ酸４１０〜８７４からなる配列；
ｂ）配列番号６のアミノ酸４１０〜８２０からなる配列；
ｃ）配列番号１のアミノ酸３３３〜５８０からなる配列；
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の配列に対して少なくとも８０、９５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一である配列；
ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の配列の少なくとも６、８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４６０、４６４、４７５個連続したアミノ酸；
ｆ）（ｄ）または（ｅ）の配列、前記配列は、配列番号１もしくは配列番号６のアミノ酸４６２〜４６５、または配列番号１のアミノ酸４１０〜６３４または７０５〜８７４または８１７〜８７４を含む、
ｇ）配列番号１のアミノ酸４１０〜６３４または７０５〜８７４または８１７〜８７４からなる配列、
ｈ）（ｇ）の配列に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一である配列；
ｉ）（ｇ）または（ｈ）の配列の少なくとも６、８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、５０、７５、９０、１００、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５または１６０個連続したアミノ酸；
ｊ）配列番号１のアミノ酸１２４０〜１２７０からなる配列；
ｋ）（ｊ）の配列に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一である配列；
ｌ）（ｊ）または（ｋ）の配列の少なくとも６、８、１０、１２、１５、１８、２０または２５個連続したアミノ酸；または
ｍ）（ｋ）または（ｌ）の配列、前記配列は配列番号１のアミノ酸１２４９〜１２５２を含む
を含むまたはからなる。
【０１０５】
これらの抗体は、（ａ）から（ｍ）のいずれか１つを含むまたはからなるフラグメント内に位置するエピトープ、または前記フラグメント内に位置する少なくとも１つのアミノ酸を認識することができる。
【０１０６】
好ましくは、前記エピトープは、（ａ）から（ｊ）のいずれか１つを含むまたはからなるフラグメント内に位置する。
【０１０７】
最も好ましくは、前記エピトープは、（ａ）から（ｆ）のいずれか１つを含むまたはからなるフラグメント内に位置する。このような抗体は、それらはＡＴＩＰ３には特異的に結合するが、他のＡＴＩＰアイソフォームには結合しないことを特徴とする。
【０１０８】
これらの抗体は有利には、例えば本明細書において上に記載した方法を使用して、ＡＴＩＰ３またはその生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチドによって処置しようとする患者を選択する場合に使用され得る。
【０１０９】
これらの抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。抗体がモノクローナルである場合、それらは例えばキメラ、ヒト化または完全なヒト抗体に対応し得る。
【０１１０】
このような抗体を得るための方法は当技術分野において周知である。例えば、本発明によるポリクローナル抗体は、（ａ）から（ｊ）のいずれか１つを含むまたはからなる前記フラグメントを用いた非ヒト哺乳動物の免疫化を通して得ることができる。ポリクローナル抗体から出発して、その後、標準的な方法を使用してモノクローナル抗体を得ることができる。
【０１１１】
学術論文またはアブストラクト、公開された特許出願、交付済み特許または任意の他の参考文献を含む、本明細書において引用した全ての参考文献は、引用された参考文献において提示されている全てのデータ、表、図および文章を含め、全体が本明細書において参照により組み入れられる。
【０１１２】
明確に異なる意味を有するが、「含む（comprising）」、「有する」、「含む（containing）」および「からなる」という用語は、本発明の上の記載の全体を通して互いに交換し得る。
【０１１３】
本明細書の枠組みにおいて、全てのポリペプチド、核酸および抗体は、場合により単離および／または精製され得る。
【０１１４】
本発明はさらに、以下の実施例および図面の点から評価される。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１は、ＡＴＩＰ３が、転移性進行の時間経過を遅延することを示す。
【図２】図２は、ＡＴＩＰ３が、転移性病巣の数を減少させることを示す（１７日目）。
【図３】図３は、ＡＴＩＰ３が、乳癌転移の形成を減少させることを示す。
【図４】図４は、ＡＴＩＰ３が、細胞の遊走を阻害することを示す（ボイデンチャンバーにおいて）。
【図５】図５は、ＡＴＩＰ３が、細胞の遊走を阻害することを示す（創傷治癒実験を通して評価）。ＧＦＰまたはＧＦＰ−ＡＴＩＰ３を安定に発現している転移性三種陰性乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に由来するＤ３Ｈ２ＬＮ細胞（Caliper社製）を、創傷治癒アッセイにおいて遊走させ、そしてタイムラプスビデオ顕微鏡によって分析した（１１時間かけて５分間毎に１画像）。Ｙ軸は、創傷の閉鎖の比率を示す。
【図６】図６は、ＡＴＩＰ３ａの図を示し、ここに本発明者らによって同定された領域および共通配列の位置が示されている。
【図７】図７は、ＡＴＩＰ３ａ、ＡＴＩＰ３ｂおよび配列番号１の残基４１０〜８７４からなるＡＴＩＰ３のフラグメント（ＡＴＩＰ３ＢＤとして表記）が、細胞の増殖を阻害し、そして癌細胞の増殖を減少させる（クローン形成能実験において）ことを示す。
【図８】図８は、ＡＴＩＰ３が、タキソールを用いての化学療法に対して乳癌細胞を感作させることを示す。「ＭＴＴ」はテトラゾリウム塩を意味する。
【図９】図９は、ＡＴＩＰ３のサイレンシングが、タキソールを用いての化学療法に対する乳癌細胞の感受性を減少させることを示す。「ＭＴＴ」はテトラゾリウム塩を意味する。
【図１０】図１０は、２つの異なる有糸分裂阻害剤（すなわちドセタキセル（上のパネル）およびタキソール（下のパネル））を用いての化学療法に対する乳癌細胞の感受性に対するＡＴＩＰ３の効果を示す。実験は、ＭＣＦ７ホルモン依存性乳癌細胞株を用いて行なわれた。細胞を金電極（Xcelligence technology, Roche, Germany）上に１５０００個の細胞／セルで播種し、そして５０nMのドセタキセルまたはタキソールの添加前に１８時間かけて付着させた。細胞のインピーダンスを５分毎に９６時間かけてモニタリングした。結果を、薬物添加時における細胞指数に対して較正した。
【図１１】図１１は、タキソールを用いての化学療法に対する乳癌細胞の感受性に対するＡＴＩＰ３の効果を示す。実験は、Ｄ３Ｈ２ＬＮ乳癌細胞株を使用した以外は、図１０の説明文に記載の通りに実施された。この細胞株は、三種陰性乳癌を起源とする。
【図１２】図１２は、ＡＴＩＰ３ａ、Ｄ２ＮおよびＤ２Ｃが細胞の増殖を阻害し、そして癌細胞の増殖を減少させることを示す（クローン形成能実験において）。
【図１３】図１３は、乳癌細胞の増殖に対する最小ドメインＤ２Ｎ、Ｄ２ＣおよびＤ２ＣＣの効果を示す。
【０１１６】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ＡＴＩＰ３（アイソフォームＡＴＩＰ３ａ）の完全長アミノ酸配列を示す。
配列番号２および３は、実施例２において使用されるプライマーの配列を示す。
配列番号４は、実施例において使用されるｓｉＲＮＡの配列を示す。
配列番号５は、ペネトラチンの配列を示す。
配列番号６は、ＡＴＩＰ３（アイソフォームＡＴＩＰ３ｂ）の完全長アミノ酸配列を示す。
配列番号７および１２は、実施例６において使用されるプライマーの配列を示す。
【０１１７】
実施例
実施例１：完全長ＡＴＩＰ３は抗転移作用を有する
完全長ＡＴＩＰ３は、in vitroおよびin vivoにおいて有糸分裂阻害作用を有する新規な微小管結合タンパク質であることが以前に示されている（Rodrigues-Ferreira et al., PLoS One. 2009; 4(10):e7239 2009）。
【０１１８】
この効果は、in vivoにおいて転移性乳癌のマウスモデルにおいて確認された。さらに、抗転移作用も認められた。
【０１１９】
簡潔に言えば、ルシフェラーゼ±ＧＦＰ−ＡＴＩＰ３を発現している転移性三種陰性乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に由来するＤ３Ｈ２ＬＮ細胞（Caliper社製）を、心内注射を通してヌードマウスに注射した。その後、マウスを、ルシフェリンの腹腔内注射後に生物発光イメージング（ＩＶＩＳ）を通して分析した。
【０１２０】
ＡＴＩＰ３が、
−  転移性進行の時間経過を遅延させる（図１）；
−  乳癌転移病巣の数を減少させる（図２）；
−  乳癌転移病巣のサイズを減少させる（データは示さず）；
−  転移性過増殖を有するマウスの数を減少させる（データは示さず）；および
−  乳癌転移の形成を減少させる（図３）
ことが判明した。
【０１２１】
実施例２：ＡＴＩＰ３の機能的ドメインの形成
２．１．ＡＴＩＰ３の異なるドメインの同定
本発明者らは、ＡＴＩＰ３一次配列（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＮＰ＿００１００１９２４）内に以下の３つのドメインを認め、前記ドメインは、異なる等電点によって特徴付けられる：
−  酸性Ｎ末端領域（配列番号１の残基１〜４０９）；
−  塩基性中央領域（配列番号１の残基４１０〜８７４）；および
−  中性Ｃ末端ドメイン（配列番号１の残基８７５〜１２７０）。
【０１２２】
本発明者らはさらに、微小管の成長末端の重要な成分である、末端結合タンパク質（ＥＢ１）との相互作用のための２つの共通部位を同定した（例えば、Honnappa et al., 2009, Cell 138(2):366-76参照）。ＥＢ１との結合のためのこれらの２つの共通部位は、
−  ＡＴＩＰ３ａおよびＡＴＩＰ３ｂに存在する、ＫＮＩＰ配列（配列番号１の残基４６２〜４６５）（それは、本明細書の上に記載された塩基性中央領域内に位置する）；および
−  殆どのＡＴＩＰアイソフォームに存在するＳＡＩＰ配列（配列番号１の残基１２４９〜１２５２）
である。
【０１２３】
さらに、２つの主要な領域（普通ではない二次構造であると予測される）、すなわち
−  配列番号１のアミノ酸３３３〜５８０（２４７残基）（この領域はＫＮＩＰ配列を包含する）；および
−  配列番号１のアミノ酸１２４０〜１２７０（３０残基）（この領域はＳＡＩＰ配列を包含する）
からなる領域が、ＡＴＩＰ３と、微小管およびＥＢ１タンパク質との相互作用において役割を果たしていると考えられる。
【０１２４】
図６は、ＡＴＩＰ３ａ上のこれらの領域および共通配列の位置を示す。
【０１２５】
２．２．ＡＴＩＰ３の中央塩基性ドメイン（ＡＴＩＰ３ＢＤ）のクローニング
ＡＴＩＰ３の塩基性中央ドメイン（配列番号１の残基４１０〜８７４をコードする、コード配列のヌクレオチド１２２８〜２６２３）を、以下のプライマーを用いてRodrigues-Ferreira et al. (PLoS One. 2009; 4(10):e7239 2009)に記載されたｐＥＧＦＰ−Ｃ１におけるＡＴＩＰ３完全長ｃＤＮＡを鋳型として使用して３５回のＰＣＲ（アニーリング温度５５℃）によって増幅した：
−  フォワード：CCG CTC GAG GA CTG ACT TGG GAT GCA AAT GAT（配列番号２）；および
−  リバース：CGG GGT ACC TCA  TGC ATT AAG AGC TGT AAA TAA（配列番号３）。
【０１２６】
増幅された１．４ＫｂのＰＣＲ産物を切断し、精製し、そしてｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター（Clontech）のＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ制限酵素部位の間に導入し、これにより得られたＡＴＩＰ３塩基性ドメイン（ＡＴＩＰ３ＢＤ）はＧＦＰとインフレームにある。ＧＦＰ−ＡＴＩＰ３ＢＤ融合タンパク質（これは８０ＫＤａの見かけの分子量を有する）の発現は、抗ＧＦＰモノクローナル抗体を使用してウェスタンブロットによって確認された。
【０１２７】
２．３．ＡＴＩＰ３ＢＤは微小管と相互作用する
ｐＥＧＦＰ−ＡＴＩＰ３ＢＤプラスミドを、ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞に一過性にトランスフェクションした。微小管細胞骨格におけるＧＦＰ−ＡＴＩＰ３ＢＤ融合タンパク質の局在は免疫蛍光法によって確認され、そして安定化された微小管と相互作用するその能力は、共沈降アッセイによって確認された。
【０１２８】
免疫蛍光研究
カバーガラス上に播種された指数関数的に増殖しているヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞を、ｐＥＧＦＰ−ＡＴＩＰ３ＢＤプラスミドを用いて一過性にトランスフェクションし（２４時間）、そして５分間かけて氷冷メタノール中で固定し、その後、Rodrigues-Ferreira et al. (PLoS One. 2009; 4(10):e7239 2009)に記載のように、一次抗体：抗ＧＦＰモノクローナル抗体（Roche、１：２００に希釈）およびヒト抗α―チューブリン抗体クローンＦ２Ｃ（１：１０に希釈）と共に室温で１時間かけてインキュベーションした。十分に洗浄した後、細胞を３０分間かけて室温で、１：５００に希釈した適切な二次Ｃｙ−２コンジュゲート抗ヒトおよび／またはＣｙ−３コンジュゲート抗マウス抗体（Jackson Laboratories, Interchim, France）と共にインキュベーションした。カバーガラスをＧｌｙｃｅｒｇｅｌマウンティングメディウム（DakoCytomation）を使用してスライドガラス上に載せ、そして適切なフィルターを使用してLeica TCS SP2 AOBS共焦点顕微鏡を用いて調べた。画像分析は、ＮＩＨイメージＪソフトウェアを用いて実施された。
【０１２９】
微小管共沈降アッセイ
微小管共沈降アッセイのために、ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞を、ｐＥＧＦＰ−ＡＴＩＰ３ＢＤプラスミドを用いて一過性にトランスフェクションし(２４時間）、そして２０分間かけて４℃でＰＥＭバッファー（１００mM ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．９、１mM ＭｇＳＯ４、１mM ＥＧＴＡ）中でインキュベーションし、掻爬し、そして超音波にかけて、その後、１５０００rpmで１０分間４℃で遠心分離にかけた。清澄化した試料をタキソール（２０μM）と共にＧＴＰ（１mM）およびＤＴＴ（１mM）の存在下で４５分間かけて３７℃でインキュベーションし、そして４０％グリセロール、２０μMタキソールおよび１mM ＧＴＰを含むクッションバッファーを通して７００００ｇで３０分間かけて３０℃で遠心沈降させた。上清（Ｓ）およびペレット（Ｐ）画分を別々に回収し、そして続いて抗ＧＦＰ（Roche）および抗αチューブリン（Sigma）抗体を用いてイムノブロットした。
【０１３０】
これらの実験から、ＡＴＩＰ３ＢＤドメインは、微小管の細胞骨格に局在し（免疫蛍光研究、データは示さず）、そして安定化した微小管と共沈降する（生化学的研究、データは示さず）と結論づけられた。
【０１３１】
従って、ＡＴＩＰ３ＢＤドメインは、インタクトな細胞において微小管とタンパク質の結合を促進するに十分であることが示された。
【０１３２】
２．４．ＡＴＩＰ３ＢＤは、全ＡＴＩＰ３タンパク質を模倣する
乳癌細胞の増殖に対するＧＦＰ−ＡＴＩＰ３ＢＤの機能的効果は、クローン形成能実験によって分析された。
【０１３３】
クローン形成能
クローン形成能実験のために、ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞を、２４時間かけて、０．２μgのｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクターまたは２μgのｐＥＧＦＰ−ＡＴＩＰ３ＢＤ ｃＤＮＡを用いてトランスフェクションした。類似のトランスフェクション効率（５０％）は、ＦＡＣＳ分析によって評価され、そして細胞生存度はトリパンブルーを使用して確認された。その後、細胞を種々の希釈度で１２ウェルプレートに播種し、そしてトランスフェクション体を、１週間に２回３週間かけて新たな培地にジェネテシン（Ｇ４１８、１mg/ml、Gibco）を添加することによって選択した。耐性コロニーを０．５％クリスタルバイオレット（Sigma）を用いて染色し、そして計測した。
【０１３４】
ＡＴＩＰ３ＢＤは、全ＡＴＩＰ３ａおよびＡＴＩＰ３ｂタンパク質の阻害作用を模倣することが示された（図７参照）。
【０１３５】
実施例３：ＡＴＩＰ３は、タキソールによる処置に対する乳癌細胞の感受性を増加させる
タキソール（パクリタキセル）は、紡錘体を標的化する微小管安定化剤であり、そして急速な分裂を起こしている腫瘍細胞を死滅させるために、乳癌細胞の慣用的な化学療法に主に使用されている。ＡＴＩＰ３が、微小管の安定性に対するタキソールの効果を増加させ得るかどうか、従って、ＡＴＩＰ３の再発現が低用量のタキソールに対して癌細胞を感作させ得るかどうかを評価するために、研究が行なわれた。
【０１３６】
実験を、ＧＦＰ−ＡＴＩＰ３を安定に発現しているＭＣＦ−７乳癌細胞株の３つの独立したクローン（すなわち、Rodrigues-Ferreira et al., PlosOne 2009に記載のＨＣ１、ＨＣ６、ＨＣ７）で行なった。細胞を４通りに９６ウェルプレートに５０００個の細胞／ウェルの密度で播種した。翌々日、細胞を漸増濃度のタキソール（パクリタキセル）を用いて４８時間かけて処理した。その後、細胞の増殖を、１mg/mlのテトラゾリウム塩ＭＴＴ（Sigma）と共に３７℃で４時間かけてインキュベーションすることによって分析した。切断産物（ホルマザン）をＤＭＳＯを用いて可溶化し、そして５６０nmにおける吸光度を、製造業者によって推奨されているように測定した。
【０１３７】
結果を図８に示す。ＧＦＰ−ＡＴＩＰ３の存在下では、低用量のタキソール（パクリタキセル）（２倍低い）は、ＧＦＰ単独と同じ程度まで細胞の増殖／生存度を減少させるのに十分であった。従って、乳癌細胞ＭＣＦ−７へのＧＦＰ−ＡＴＩＰ３の再発現は、癌細胞をタキソールの作用に対して感作させる。
【０１３８】
別のセットの実験において、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞（内因性ＡＴＩＰ３タンパク質を発現）を、特異的ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクションさせ、そしてタキソールに対する癌細胞の感受性に対するＡＴＩＰ３のダウンレギュレーションの結果を、前記したようにＭＴＴ（Sigma）を使用して評価した。小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を、リポフェクタミン試薬２０００を使用して５０nMで７２時間かけてトランスフェクションした。対照ｓｉＲＮＡ二本鎖（non targeting pool、１番）および特異的ＭＴＵＳ１ ｓｉＲＮＡ１番（on-target plus smart pool, NM020749）およびｓｉＲＮＡ２番（on-target plus siRNA duplex、センス鎖：UGG CAG AGG UUU AAG GUU A；配列番号４）はDharmacon (Chicago, IL, USA)から購入した。サイレンシング効率はウェスタンブロットおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定した。
【０１３９】
結果を図９に示す。ＡＴＩＰ３のサイレンシングは、タキソールを用いての化学療法に対する乳癌細胞の感受性を減少させ、これによりタキソール有糸分裂阻害剤に対する感受性に対するＡＴＩＰ３の効果を確認することが分かる。
【０１４０】
さらに別のセットの実験において、タキソールに加えて第２の有糸分裂阻害剤を研究することによって、および別の細胞株を使用することによって、ＡＴＩＰ３が、化学療法に対して乳癌細胞を感作させることが確認された。より具体的には、乳癌細胞（ＭＣＦ７または三種陰性転移性Ｄ３Ｈ２ＬＮ）を、金電極（Xcelligence technology, Roche）上に１５０００個の細胞／ウェルで播種し、そして１８時間かけて付着させ、その後、５０nMのタキソテール（ドセタキセル）またはタキソール（パクリタキセル）を添加した。細胞のインピーダンスを、５分間毎に９６時間かけてモニタリングした。結果を、薬物添加時における細胞指数に対して較正した。
【０１４１】
結果を図１０および１１に示す。乳癌細胞へのＧＦＰ−ＡＴＩＰ３の再発現は、癌細胞を、タキソールの効果に対してだけでなく、ドセタキセルの効果に対しても感作させることが判明した。さらに、この効果は、ＭＣＦ７ホルモン依存性細胞（図１０）において見られるだけでなく、三種陰性転移性細胞（図１１）においても見られることが判明した。
【０１４２】
実施例４：ＡＴＩＰ３の生物学的活性の特徴付け
ＡＴＩＰ３が細胞の遊走を阻害および／または減少させる能力は、ボイデンチャンバー実験を通して、および創傷治癒実験を通して評価された。
【０１４３】
実験を、ＧＦＰ−ＡＴＩＰ３を安定に発現している転移性乳癌細胞Ｄ３Ｈ２ＬＮ（三種陰性乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Caliper社製に由来）の２つの独立したクローン（すなわちＣｌ３、Ｃｌ６）に実施し、そして野生型およびＧＦＰ発現細胞クローンと比較した。
【０１４４】
化学誘因物質に応答した癌細胞の遊走（ボイデンチャンバー）を測定するために、細胞を２４時間かけて飢餓させ、そして４通りに１０００００または２０００００個の細胞／ウェルの密度で、トランスウェルフィルター（直径６．５mm、孔径８μm）を含むボイデンチャンバー上に播種した。１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を下の区画に加え、そして細胞を１８時間かけて遊走させ、その後、フィルターをエタノールを用いて固定した。フィルターの下に遊走した細胞を、０．５％クリスタルバイオレット（Sigma）を用いて染色した。ＤＭＳＯ中でクリスタルバイオレットを可溶化した後、５６０nmにおける吸光度を測定した（図４参照）。
【０１４５】
創傷治癒実験において癌細胞の遊走を測定するために、細胞を、ＩＢＩＤＩチャンバー上に１００，０００個の細胞の密度で２４時間かけて蒔き、単層を形成させた。その後、ＩＢＩＤＩチャンバーのプラスチックインサートを除去し、２つの境界間に空の空間を残し、そして細胞を１０％ＦＣＳの存在下で４時間、７時間または１１時間かけて遊走させ、その後、写真を撮影した（位相差、拡大率１０倍）。創傷の閉鎖を、細胞間で空であり続けた領域を測定することによって、ImageJを使用して計算した（図５参照）。
【０１４６】
ＡＴＩＰ３は、図４および５に示されているように、細胞の遊走を阻害することが判明した。
【０１４７】
実施例５：さらなる実験
ＡＴＩＰ３またはＡＴＩＰ３ＢＤとペネトラチンとの融合タンパク質を構築する。ペネトラチンは、細胞内にタンパク質を形質導入するために使用することのできる、膜を貫通することのできる、１６アミノ酸長のペプチド（RQIKIWFQNRRMKWKK、配列番号５）である（Prochiantz, 2008, Adv Drug Deliv Rev. 60:448-51）。原核生物発現ベクター中で融合タンパク質に（６×Ｈｉｓ）エピトープを用いてタグをつけ、E.coliにおける産生およびニッケルカラムにおける精製を可能とした。得られたタンパク質は、ＡＴＩＰ３−ｐｅｎまたはＡＴＩＰ３ＢＤ−ｐｅｎと呼ばれる。
【０１４８】
乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＣＦ−７、これはＡＴＩＰ３を発現しない）への形質導入後の、漸増用量のＡＴＩＰ３−ｐｅｎまたはＡＴＩＰ３ＢＤ−ｐｅｎの機能的効果を、漸増用量のタキサンの存在下または非存在下で評価する。
【０１４９】
非腫瘍性ストロマ細胞のモデルとしてのヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）へのＡＴＩＰ３−ｐｅｎまたはＡＴＩＰ３ＢＤ−ｐｅｎの形質導入の結果を研究する。
【０１５０】
ＡＴＩＰ３−ｐｅｎの効果をin vivoにおいて調べる。漸増量のＡＴＩＰ３−ｐｅｎ融合タンパク質をマウスの血流中に、原発性腫瘍（皮下注射）または遠隔転移（心内注射）の発達の異なる時点で投与する。
【０１５１】
実施例６：全ＡＴＩＰ３タンパク質を模倣することのできるＡＴＩＰ３の最小機能ドメインの同定
ＡＴＩＰ３ＢＤは、いくつかのドメインに細分され（配列番号１のアミノ酸４１０〜６３４位、７０５〜８７４位および８１７〜８７４位をそれぞれ包含する、Ｄ２Ｎ、Ｄ２ＣおよびＤ２ＣＣ）、そしてこれらの各ドメインが微小管と結合しそして乳癌細胞の増殖を減少させる能力を、乳癌細胞へのその発現後に分析した。
【０１５２】
６．１  ＡＴＩＰ３の最小機能ドメインのクローニング
ドメインＤ２Ｎ、Ｄ２ＣおよびＤ２ＣＣをコードするｃＤＮＡフラグメントを、鋳型として完全長ＡＴＩＰ３ｃＤＮＡフラグメント（配列番号１）および以下のオリゴヌクレオチド：
【化１】
2014513062.tif 000004
を使用して、３５回のＰＣＲ（アニーリング温度５５℃）によって増幅した。
【０１５３】
増幅されたＰＣＲ産物（Ｄ２Ｎ、Ｄ２ＣおよびＤ２ＣＣについてそれぞれ６７６ｂｐ、５１１ｂｐおよび１７５ｂｐ）をｐＥＧＦＰ−Ｃ１発現ベクター（Clontech）のＸｈｏＩ／ＫｐｎＩの制限酵素部位にサブクローニングし、よって翻訳された産物はＧＦＰとインフレームにある。
【０１５４】
ヒト細胞（乳癌ＭＣＦ７および非腫瘍性ＲＰＥ１）における対応するＧＦＰ−Ｄ２Ｎ、ＧＦＰ−Ｄ２ＣおよびＧＦＰ−Ｄ２ＣＣ融合タンパク質の発現は、抗ＧＦＰモノクローナル抗体（ROCHE）を使用した全細胞溶解液のウェスタンブロットによって確認された。予期された分子量のポリペプチド（Ｄ２Ｎについては５０ＫＤａ、Ｄ２Ｃについては４２ＫＤａ、およびＤ２ＣＣについては３１ＫＤａ）が判明した。
【０１５５】
６．２  最小ドメインＤ２Ｎ、Ｄ２ＣおよびＤ２ＣＣの機能的分析
細胞内局在化
免疫蛍光研究を実施例２の通りに実施した。簡潔に言うと、ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ１）細胞を、ＧＦＰ−Ｄ２Ｎ、ＧＦＰ−Ｄ２ＣまたはＧＦＰ−Ｄ２ＣＣ構築物を用いて２４時間かけてトランスフェクションし、その後、氷冷メタノール中で固定し、そして記載のように（２１頁、１〜９行）抗ＧＦＰ抗体と共にインキュベーションした。免疫蛍光アッセイ（データは示さず）は明瞭に、ＧＦＰ−Ｄ２ＮおよびＧＦＰ−Ｄ２Ｃは両方共に微小管細胞骨格と結合し、一方ＧＦＰ−Ｄ２ＣＣはサイトゾルに拡散して留まることを示す。
【０１５６】
クローン形成能
最小ドメインＤ２ＮおよびＤ２Ｃの発現後にヒトＭＣＦ７乳癌細胞がコロニーを形成する能力を、前記のように（実施例２参照）クローン形成能実験によって分析した。
【０１５７】
図１２は、ＧＦＰ−Ｄ２ＮおよびＧＦＰ−Ｄ２Ｃの発現が、ＧＦＰと比較してＧ４１８耐性コロニーの数を強力に減少させることを示す。Ｄ２ＮおよびＤ２Ｃの阻害作用は、それぞれ、ＧＦＰ−ＡＴＩＰ３の７１％および７８％に達する。
【０１５８】
Xcelligence
中程度のレベルのＧＦＰ−Ｄ２Ｎ（クローンＤ２Ｎ６およびＤ２Ｎ８）、ＧＦＰ−Ｄ２Ｃ（クローンＤ２Ｃ６および陽性細胞のプール）およびＧＦＰ−Ｄ２ＣＣ（クローンＣｌ３）を発現しているＭＣＦ７乳癌細胞の安定なクローンを、４週間かけて、Ｇ４１８（１mg/ml）含有培地において選択した。各場合における予期される分子量の単一のポリペプチドの検出可能な発現を、抗ＧＦＰ抗体を使用してウェスタンブロットによって確認した。
【０１５９】
細胞の増殖を、Xcelligence技術（Roche）を使用して測定した。簡潔に言うと、細胞のクローンを、金電極を含む９６ウェル上に１５０００個の細胞／ウェルで播種し、そして細胞のインピーダンスをリアルタイムで４０時間かけてモニタリングした。
【０１６０】
図１３は、ＧＦＰ−Ｄ２Ｎ（クローンＤ２Ｎ６、Ｄ２Ｎ８）またはＧＦＰ−Ｄ２Ｃ（Ｄ２Ｃ６およびプール）のいずれかを発現している各々の独立したクローンについて、増殖率は、ＧＦＰ−ＡＴＩＰ３を発現しているクローンＨＣ１と類似し、そしてＧＦＰでトランスフェクションされた細胞と比較して強く減少していたことを示す。
【０１６１】
興味深いことに、クローンＤ２ＣＣ３（ＧＦＰ−Ｄ２ＣＣドメインを安定に発現している）の増殖はクローンＨＣ１と比較して有意に減少し（２倍）、このことは、乳癌細胞における発現時のこの５８アミノ酸ポリペプチドの高い抗増殖効果を示す。
【０１６２】
ＡＴＩＰ３の２つの最小機能ドメイン、すなわちＤ２Ｎ（２２４ａａ）およびＤ２Ｃ（１７０ａａ）は、微小管と結合することができ、そして完全長ＡＴＩＰ３と同程度に細胞の増殖を減少させることができる。これらは抗癌療法のための非常に良い候補である。
【０１６３】
Ｄ２ＣＣドメイン（５８ａａ）は興味深く、そして高い抗増殖特性（ＡＴＩＰ３と比較して２倍増加）を示すが、微小管とは結合しない。従って、このドメインは、見込みある可能性ある治療標的として現れる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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