(57)【要約】  本発明は、（ａ）式（Ａ）の化合物Ａ（（Ｒ）−３−（４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−３−シクロペンチルプロパンニトリル）またはその医薬的に許容される塩；および（ｂ）式（Ｂ）の化合物Ｂ（Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド）またはその医薬的に許容される塩；を含む、同時の、並行した、別々の、または連続的な使用のための、特に増殖性疾患の治療に使用するための組合せに関する。本発明はまた、このような組合せを含む医薬組成物、さらにはこのような組合せを用いた、哺乳動物、特にヒトにおける増殖性疾患の治療方法にも関する。また本発明はさらに、このような組合せを含む商業的なパッケージまたは製品にも関する。
2014517039.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ａ）：
【化５】
2014517039.tif 000025
の化合物Ａ（（Ｒ）−３−（４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−３−シクロペンチルプロパンニトリル）またはその医薬的に許容される塩；および
式（Ｂ）：
【化６】
2014517039.tif 000026
の化合物Ｂ（Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド）またはその医薬的に許容される塩
を含む組成物。
【請求項２】
医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
単一製剤または単位投薬形態の、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
対象に有効量の前記請求項のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、それを必要とする対象における癌の治療方法。
【請求項５】
前記癌が、骨髄増殖性腫瘍である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記骨髄増殖性腫瘍が、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、真性多血症（ＰＶ）、本態性血小板血症（ＥＴ）、原発性または特発性骨髄線維症（ＰＭＦ）、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、若年性骨髄単球性白血病、好酸球増加症候群、全身性肥満細胞症、および異型慢性骨髄性白血病からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記対象が、ヒトである、請求項４から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記治療が、化合物Ａと化合物Ｂとを共投与することを含む、請求項４から６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
化合物Ａおよび化合物Ｂが、単一製剤または単位投薬形態である、請求項４から６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記治療が、化合物Ａと化合物Ｂとを実質的に同時に投与することを含む、請求項４から６のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記治療が、化合物Ａと化合物Ｂとを異なる時に投与することを含む、請求項４から６のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
化合物Ａの投与の後に、化合物Ｂが対象に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
化合物Ｂの投与の後に、化合物Ａが対象に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
化合物Ａおよび化合物Ｂが、別々の製剤または単位投薬形態である、請求項８から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ルキソリチニブが、１日２回で３〜７ｍｇ与えられ、パノビノスタットが、１週間おきに週３回、８〜１２ｍｇ投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
ルキソリチニブが、１日２回で８〜１２ｍｇ与えられ、パノビノスタットが、１週間おきに週３回、８〜１２ｍｇ投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
ルキソリチニブが、１日２回で１０〜２０ｍｇ与えられ、パノビノスタットが、１週間おきに週３回、８〜１２ｍｇ投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１８】
ルキソリチニブが、１日２回で１０〜２０ｍｇ与えられ、パノビノスタットが、１週間おきに週３回、１０〜２０ｍｇ投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１９】
ルキソリチニブが、１日２回で１０〜２０ｍｇ与えられ、パノビノスタットが、１週間おきに週３回、１０〜３０ｍｇ投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項２０】
ルキソリチニブが、１日２回で１０〜２０ｍｇ与えられ、パノビノスタットが、１週間おきに週３回、１０〜３０ｍｇ投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項２１】
ルキソリチニブが、１日２回で１０〜２０ｍｇ与えられ、パノビノスタットが、１週間おきに週３回、２０〜４０ｍｇ投与される、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、
（ａ）式（Ａ）：
【０００２】
【化１】
2014517039.tif 000003
【０００３】
の化合物Ａ（名称：（Ｒ）−３−（４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−３−シクロペンチルプロパンニトリル）またはその医薬的に許容される塩；および
（ｂ）式（Ｂ）：
【０００４】
【化２】
2014517039.tif 000004
【０００５】
の化合物Ｂ（名称：Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド）またはその医薬的に許容される塩；
を含む、同時の、並行した、別々の、または連続的な使用のための、特に増殖性疾患の治療に使用するための組合せに関する。本発明はまた、このような組合せを含む医薬組成物、さらにはこのような組合せを用いた、哺乳動物、特にヒトにおける増殖性疾患の治療方法にも関する。また本発明はさらに、このような組合せを含む商業的なパッケージまたは製品にも関する。
【背景技術】
【０００６】
骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）は、骨髄中の血液細胞（血小板、白血球、および赤血球）の過剰生産を引き起こす障害群である。ＭＰＮは、真性多血症（ＰＶ）、原発性または本態性血小板血症（ＥＴ）、原発性または特発性骨髄線維症、慢性骨髄性（骨髄球性）白血病（ＣＭＬ）、慢性好中球性白血病（ＣＮＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＬ）、および慢性好酸球性白血病（ＣＥＬ）／好酸球増加症候群（ＨＥＳ）を含む。これらの障害は、以下の特徴、すなわち多能性造血前駆細胞の関与、形質転換されていない造血前駆細胞よりも形質転換クローンが優性であること、限定できる刺激の非存在下での１種または複数種の造血系の過剰生産、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増殖因子とは無関係のコロニー形成、骨髄の細胞過形成、巨核球の過形成および異形成、主として第１、第８、第９、第１３、および第２０染色体が関与する異常、血栓性および出血性素因、過増殖性の骨髄外造血、ならびに急性白血病への自然転換または骨髄線維症の発生（ただしＣＭＬの比率と比較して低い比率で）の一部または全部を共有するため、一つの群に分類される。ＭＰＮの発生率は、ＣＭＬについては１年で６０歳より高齢の個体１００，０００人あたりおよそ３人から、ＪＭＬについては１年で出生後から１４歳までの子供１００，０００人あたり０．１３人まで広範囲にわたり様々である（Vardiman JWら, Blood 100 (7): 2292〜302, 2002）。
【０００７】
従って、ＭＰＮ、加えてその他の癌の新しい治療法が未だ必要である。
【発明の概要】
【０００８】
本明細書において、式（Ａ）のＪＡＫ阻害剤である化合物Ａまたはその医薬的に許容される塩；および式（Ｂ）のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤である化合物Ｂまたはその医薬的に許容される塩を含む組合せ療法が提供される。本組合せ療法は、様々な癌の治療に有用である。本組合せ療法はまた、多数のＪＡＫ関連疾患および／またはＨＤＡＣ関連疾患の治療にも有用である。式（Ａ）の化合物Ａはまた、ルキソリチニブとしても知られている。式（Ｂ）の化合物Ｂはまた、パノビノスタットとしても知られている。
【０００９】
本明細書で示される組合せ療法は、対象におけるＪＡＫ関連疾患の治療に有用である。従って、一態様において、本明細書において、対象に有効量の上記で考察された組成物を投与することを含む、それを必要とする対象における癌の治療方法が提供される。一実施形態において、癌は、骨髄増殖性腫瘍である。本発明の組合せ療法を用いて治療することができる骨髄増殖性腫瘍の非限定的な例としては、これらに限定されないが、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、真性多血症（ＰＶ）、本態性血小板血症（ＥＴ）、原発性または特発性骨髄線維症（ＰＭＦ）、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、若年性骨髄単球性白血病、好酸球増加症候群、全身性肥満細胞症、および異型慢性骨髄性白血病が挙げられる。
【００１０】
これらの治療方法の一実施形態において、対象は、ヒトである。
【００１１】
その他の実施形態において、本治療は、化合物Ａと化合物Ｂとを共投与することを含む。
【００１２】
別の実施形態において、化合物Ａおよび化合物Ｂは、単一製剤または単位投薬形態である。
【００１３】
さらに別の実施形態において、本治療は、化合物Ａと化合物Ｂとを実質的に同時に、または異なる時に投与することを含む。
【００１４】
本方法の別の実施形態において、化合物Ｂの投与の後に、化合物Ａが対象に投与される。
【００１５】
さらに別の実施形態において、化合物Ａの投与の後に、化合物Ｂが対象に投与される。
【００１６】
本方法の別の実施形態において、化合物Ａおよび／または化合物Ｂは、一方または両方が単独で投与される場合には有効ではないと予想される量であるが、組み合わせると有効な量で投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】化合物Ａおよび／または化合物Ｂでの治療期間にわたる体重を示す図である。
【図２】治療７日後、すなわち細胞注入の１１日後（治療は細胞注入後の４日目に開始された）の生物発光レベルの治療効果を示す図である。
【図３】治療７日後、すなわち細胞注入の１１日後（治療は細胞注入後の４日目に開始された）の生物発光レベルの治療効果を示す図である。
【図４】治療８日後の脾臓の質量を示す図である。
【図５】療法後２時間におけるＰＤマーカー解析（脾臓抽出物）の結果を示す図である。
【図６】療法後２時間におけるＰＤマーカー解析（脾臓抽出物）の結果を示す図である。
【図７】ビヒクル、Ｍ／Ｗ／Ｆのスケジュールで腹腔内への用量８ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ｂ、１日２回で用量６０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ａ、または両方の薬剤の組合せのいずれかを連続２１日投与された、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ形質導入骨髄細胞を移植したＢａｌｂ／ｃ雌マウスを示す図である。屠殺したときの体重および脾臓の質量の変化は、平均±標準誤差として示される。Ｎ＝９／群。Ｂａｌｂ／ｃ雌の正常な脾臓の質量の平均値は、１００ｍｇの範囲である，）。＊屠殺した日においてｐ＜０．０５（片側ＡＮＯＶＡ片側、続いてダネット検定またはテューキー検定。脾臓の質量の値の逆数の形態を統計的分析に用いた）。
【図８】ビヒクル、Ｍ／Ｗ／Ｆのスケジュールで腹腔内への用量８ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ｂ、１日２回で用量６０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ａ、または両方の薬剤の組合せのいずれかを連続２１日投与された、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ形質導入骨髄細胞を移植したＢａｌｂ／ｃ雌マウスを示す図である。屠殺したときの体重および脾臓の質量の変化は、平均±標準誤差として示される。Ｎ＝９／群。Ｂａｌｂ／ｃ雌の正常な脾臓の質量の平均値は、１００ｍｇの範囲である，）。＊屠殺した日においてｐ＜０．０５（片側ＡＮＯＶＡ片側、続いてダネット検定またはテューキー検定。脾臓の質量の値の逆数の形態を統計的分析に用いた）。
【図９】ビヒクル、Ｍ／Ｗ／Ｆのスケジュールで腹腔内への用量８ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ｂ、１日２回で用量６０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ａ、または両方の薬剤の組合せのいずれかを連続２１日投与された、ｍＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ形質導入骨髄細胞を移植したＢａｌｂ／ｃ雌マウスを示す図である。屠殺した日に血液を採取し、シスメックス（Ｓｙｓｍｅｘ）血液解析装置で解析した。Ｎ＝７〜９／群（いくつかのサンプルは、化合物Ａ／化合物Ｂの組合せ群で解析するには不適切であった。グラフパッドクイック（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｑｕｉｃｋ）異常値計算プログラムでの解析（全ての値を用いてデータ解析を行った）に基づいて、屠殺した日に、ビヒクル群（ＩＤ３）で１つの異常値を検出し、化合物Ａ群（ＩＤ２７）で１つの異常値を検出した。図９：Ｈｃｔ。＊屠殺した日においてｐ＜０．０５（ＷＢＣおよびＰＬＴ数についてはｌｏｇ１０変換値での、片側ＡＮＯＶＡ、続いて多重比較のためのダネット検定またはテューキー検定）。
【図１０】ビヒクル、Ｍ／Ｗ／Ｆのスケジュールで腹腔内への用量８ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ｂ、１日２回で用量６０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ａ、または両方の薬剤の組合せのいずれかを連続２１日投与された、ｍＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ形質導入骨髄細胞を移植したＢａｌｂ／ｃ雌マウスを示す図である。屠殺した日に血液を採取し、シスメックス（Ｓｙｓｍｅｘ）血液解析装置で解析した。Ｎ＝７〜９／群（いくつかのサンプルは、化合物Ａ／化合物Ｂの組合せ群で解析するには不適切であった。グラフパッドクイック（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｑｕｉｃｋ）異常値計算プログラムでの解析（全ての値を用いてデータ解析を行った）に基づいて、屠殺した日に、ビヒクル群（ＩＤ３）で１つの異常値を検出し、化合物Ａ群（ＩＤ２７）で１つの異常値を検出した。図１０：網状赤血球数。＊屠殺した日においてｐ＜０．０５（ＷＢＣおよびＰＬＴ数についてはｌｏｇ１０変換値での、片側ＡＮＯＶＡ、続いて多重比較のためのダネット検定またはテューキー検定）。
【図１１】ビヒクル、Ｍ／Ｗ／Ｆのスケジュールで腹腔内への用量８ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ｂ、１日２回で用量６０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ａ、または両方の薬剤の組合せのいずれかを連続２１日投与された、ｍＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ形質導入骨髄細胞を移植したＢａｌｂ／ｃ雌マウスを示す図である。屠殺した日に血液を採取し、シスメックス（Ｓｙｓｍｅｘ）血液解析装置で解析した。Ｎ＝７〜９／群（いくつかのサンプルは、化合物Ａ／化合物Ｂの組合せ群で解析するには不適切であった。グラフパッドクイック（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｑｕｉｃｋ）異常値計算プログラムでの解析（全ての値を用いてデータ解析を行った）に基づいて、屠殺した日に、ビヒクル群（ＩＤ３）で１つの異常値を検出し、化合物Ａ群（ＩＤ２７）で１つの異常値を検出した。図１１：血小板数。＊屠殺した日においてｐ＜０．０５（ＷＢＣおよびＰＬＴ数についてはｌｏｇ１０変換値での、片側ＡＮＯＶＡ、続いて多重比較のためのダネット検定またはテューキー検定）。
【図１２】ビヒクル、Ｍ／Ｗ／Ｆのスケジュールで腹腔内への用量８ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ｂ、１日２回で用量６０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ａ、または両方の薬剤の組合せのいずれかを連続２１日投与された、ｍＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ形質導入骨髄細胞を移植したＢａｌｂ／ｃ雌マウスを示す図である。屠殺した日に血液を採取し、シスメックス（Ｓｙｓｍｅｘ）血液解析装置で解析した。Ｎ＝７〜９／群（いくつかのサンプルは、化合物Ａ／化合物Ｂの組合せ群で解析するには不適切であった。グラフパッドクイック（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｑｕｉｃｋ）異常値計算プログラムでの解析（全ての値を用いてデータ解析を行った）に基づいて、屠殺した日に、ビヒクル群（ＩＤ３）で１つの異常値を検出し、化合物Ａ群（ＩＤ２７）で１つの異常値を検出した。図１２：白血球数。＊屠殺した日においてｐ＜０．０５（ＷＢＣおよびＰＬＴ数についてはｌｏｇ１０変換値での、片側ＡＮＯＶＡ、続いて多重比較のためのダネット検定またはテューキー検定）。
【図１３】ｍＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ細胞を移植し、Ｍ／Ｗ／Ｆのスケジュールで腹腔内に用量８ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ｂ、１日２回で用量６０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ａ、または両方の薬剤の組合せで連続２１日で治療したＢａｌｂ／ｃ雌マウスの代表的な骨髄染色画像を示す図である。
【図１４】ｍＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ細胞を移植し、Ｍ／Ｗ／Ｆのスケジュールで腹腔内に用量８ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ｂ、１日２回で用量６０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ａ、または両方の薬剤の組合せで連続２１日で治療したＢａｌｂ／ｃ雌マウスの代表的な骨髄染色画像を示す図である。
【図１５】ｍＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ細胞を移植し、Ｍ／Ｗ／Ｆのスケジュールで腹腔内に用量８ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ｂ、１日２回で用量６０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ａ、または両方の薬剤の組合せで連続２１日で治療したＢａｌｂ／ｃ雌マウスの代表的な骨髄染色画像を示す図である。
【図１６】ｍＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ細胞を移植し、Ｍ／Ｗ／Ｆのスケジュールで腹腔内に用量８ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ｂ、１日２回で用量６０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ａ、または両方の薬剤の組合せで連続２１日で治療したＢａｌｂ／ｃ雌マウスの代表的な骨髄染色画像を示す図である。
【図１７】ｍＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ細胞を移植し、Ｍ／Ｗ／Ｆのスケジュールで腹腔内に用量８ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ｂ、１日２回で用量６０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ａ、または両方の薬剤の組合せで連続２１日で治療した代表的なＢａｌｂ／ｃ雌マウスの脾臓染色画像を示す図である。
【図１８】ｍＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ細胞を移植し、Ｍ／Ｗ／Ｆのスケジュールで腹腔内に用量８ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ｂ、１日２回で用量６０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ａ、または両方の薬剤の組合せで連続２１日で治療した代表的なＢａｌｂ／ｃ雌マウスの脾臓染色画像を示す図である。
【図１９】ｍＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ細胞を移植し、Ｍ／Ｗ／Ｆのスケジュールで腹腔内に用量８ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ｂ、１日２回で用量６０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基当量）の化合物Ａ、または両方の薬剤の組合せで連続２１日で治療した代表的なＢａｌｂ／ｃ雌マウスの脾臓染色画像を示す図である。
【図２０】研究の設計および方法を説明する図である。
【図２１】コホート１での経時的な触診可能な脾臓（speen）の長さを説明する図である。
【図２２】コホート２での経時的な触診可能な脾臓の長さを説明する図である。
【図２３】コホート３での経時的な触診可能な脾臓の長さを説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（ａ）式（Ａ）：
【００１９】
【化３】
2014517039.tif 000005
【００２０】
の化合物Ａ（（Ｒ）−３−（４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−３−シクロペンチルプロパンニトリル）またはその医薬的に許容される塩；および
（ｂ）式（Ｂ）：
【００２１】
【化４】
2014517039.tif 000006
【００２２】
の化合物Ｂ（Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド）またはその医薬的に許容される塩；
の組合せを投与することにより、対象における癌の治療に驚くべき相乗作用がもたらされることが見出された。このようなアプローチ、すなわち２つのタイプの薬剤の組合せまたは共投与は、癌に罹っており現在のところ利用可能な療法に応答しないか、あるいは耐性を有する個体を治療するのに有用な可能性がある。また本明細書で示される組合せ療法は、このような療法に応答する個体のために、現在のところ利用可能な癌の療法の有効性を改善すること、および／またはその副作用を減少させることにも有用である。
【００２３】
本明細書において用いられる所定の用語を以下で説明する。本発明の化合物は、標準的な学術名を用いて記載される。特に他の指定がない限り、本明細書において用いられる全ての専門用語や科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。
【００２４】
化合物Ａおよびその医薬的に許容される塩（複数可）は、文献で、例えば米国特許第７，５９８，２５７号に記載されている。化合物Ａはまた、ルキソリチニブとしても知られている。
【００２５】
化合物Ｂおよびその医薬的に許容される塩（複数可）は、文献で、例えば米国特許第６，８３３，３８４号、７，０６７５５１号、および６，５５２，０６５号に記載されている。化合物Ｂはまた、パノビノスタットとしても知られている。
【００２６】
特に他の規定がない限り、または文章で明示されていない限り、本発明の組合せ療法において有用な化合物への言及は、化合物の遊離塩基と化合物のあらゆる医薬的に許容される塩との両方を含む。
【００２７】
用語「医薬的に許容される塩」は、本明細書で用いられる場合、本発明のピリミジン化合物の非毒性の酸またはアルカリ土類金属塩を意味する。これらの塩は、ピリミジン化合物の最終的な単離および精製中にその場で製造することもできるし、あるいは塩基または酸の官能基をそれぞれ適切な有機または無機の酸もしくは塩基と別々に反応させることによって製造することもできる。代表的な塩としては、これらに限定されないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、ジグルコン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩（phenylproionate）、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびウンデカン酸塩が挙げられる。また塩基性窒素を含む基は、ハロゲン化アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、およびブチルの塩化物、臭化物、およびヨウ化物；硫酸ジアルキル、例えば硫酸ジメチル、硫酸ジエチル、硫酸ジブチル、および硫酸ジアミル、長鎖ハロゲン化物、例えば塩化、臭化、およびヨウ化デシル、ラウリル、ミリスチル、ならびにステアリル、ハロゲン化アラルキル、例えばベンジルおよびフェネチルの臭化物などの物質で四級化されてもよい。それにより、水溶性もしくは油溶性の、または分散性の生成物が得られる。
【００２８】
医薬的に許容される酸付加塩を形成するのに用いることができる酸の例としては、塩酸、ヒドロホウ酸（hydroboric acid）、硝酸、硫酸、およびリン酸などの無機酸、ならびにギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、酒石酸、シュウ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸、クエン酸などの有機酸、ならびにアスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性アミノ酸が挙げられる。
【００２９】
塩基付加塩は、ピリミジン化合物の最終的な単離および精製中にその場で製造することもできるし、あるいはカルボン酸部分を、医薬的に許容される金属カチオンの水酸化物、炭酸塩もしくは炭酸水素塩などの適切な塩基と、またはアンモニアもしくは有機性の第一、第二または第三級アミンと別々に反応させることによって製造することもできる。医薬的に許容される塩としては、これらに限定されないが、例えばナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム塩などのアルカリおよびアルカリ土類金属をベースとするカチオンが挙げられ、加えて非毒性のアンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンカチオン、例えば、これらに限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどが挙げられる。塩基付加塩の形成に有用なその他の代表的な有機アミンとしては、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ピリジン、ピコリン、トリエタノールアミンなど、ならびに例えばアルギニン、リシン、およびオルニチンなどの塩基性アミノ酸が挙げられる。
【００３０】
本明細書において、ＪＡＫ阻害剤である化合物Ａと、ＨＤＡＣ阻害剤である化合物Ｂとを含む組合せ療法が提供される。この組合せの投与は、あらゆる適切な経路で、単一製剤または単位投薬形態での組合せを投与すること、組合せの個々の薬剤を並行して、ただし別々に投与すること、または組合せの個々の薬剤を連続的に投与することを含む。組合せの個々の薬剤の投薬は、薬剤（複数可）のうち一方を、組合せ中の他方の薬剤（複数可）よりも頻繁に投与することを必要とする場合がある。それゆえに、適切な投薬を可能にするためには、パッケージ化された医薬品は、薬剤の組合せを含む１種または複数種の投薬形態、および薬剤の組合せの１種を含むがその組合せの他方の薬剤（複数可）を含まない１種または複数種の投薬形態を含んでいてもよい。
【００３１】
用語「単一製剤」は、本明細書で用いられる場合、患者に両方の治療剤の有効量が送達されるように配合された単一の担体またはビヒクルを意味する。単一のビヒクルは、あらゆる医薬的に許容される担体または賦形剤と共に、それぞれの薬剤の有効量が送達されるように設計される。いくつかの実施形態において、ビヒクルは、錠剤、カプセル、丸剤またはパッチである。その他の実施形態において、ビヒクルは、溶液または懸濁液である。
【００３２】
用語「単位用量」は、本明細書では、治療される患者に、両方の薬剤を一緒に１つの投薬形態で同時に投与することを意味するものとして用いられる。いくつかの実施形態において、単位用量は、単一製剤である。特定の実施形態において、単位用量は１種または複数種のビヒクルを含み、それぞれのビヒクルが医薬的に許容される担体および賦形剤と共に有効量の少なくとも１種の薬剤を含むようになっている。いくつかの実施形態において、単位用量は、患者に同時に投与される１種または複数の錠剤、カプセル、丸剤またはパッチである。
【００３３】
用語「治療する」は、本明細書では、対象において疾患の症状の少なくとも１つを軽減する、弱める、または緩和することを意味するものとして用いられる。本発明の趣旨において、用語「治療する」はさらに、発病を止める、遅延させる（すなわち、疾患の臨床徴候または疾患の症状が現れる前の期間）、および／または疾患の症状を進行または悪化させる危険を低減することも意味する。
【００３４】
用語「対象」は、動物を包含することが意図されている。対象の例としては、哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、およびトランスジェニック非ヒト動物が挙げられる。特定の実施形態において、対象は、ヒトであり、例えば、多発性骨髄腫に罹ったヒト、多発性骨髄腫に罹る危険性があるヒト、または潜在的に多発性骨髄腫に罹る可能性があるヒトである。
【００３５】
用語「約」または「およそ」は通常、所定値または範囲の２０％以内、より好ましくは１０％以内、最も好ましくはさらに５％以内を意味する。あるいは、特に生物系において、用語「約」は、所定値の約１対数（すなわち１桁）以内、好ましくは２倍以内を意味する。
【００３６】
本明細書において説明される薬剤の組合せは相乗作用を示す。用語「相乗作用」は、本明細書で用いられる場合、例えば癌またはその症状の徴候的な進行を遅くすること等の効果を生じる、投与される各薬物単独の作用を単に加算したものより大きい２つの薬剤の作用を意味する。相乗作用は例えば適切な方法を用いて計算することができ、このような方法としては、例えば、シグモイド−Ｅｍａｘ（Ｓｉｇｍｏｉｄ−Ｅｍａｘ）方程式（Holford, N. H. G.およびScheiner, L. B., Clin. Pharmacokinet. 6: 429〜453 (1981))、ロエベ（Ｌｏｅｗｅ）の加算方程式（Loewe, S.およびMuischnek, H.、Arch. Exp. Pathol Pharmacol. 114: 313〜326 (1926)）、およびメジアン−エフェクト（ｍｅｄｉａｎ−ｅｆｆｅｃｔ）方程式(Chou, T. C.およびTalalay, P.、Adv. Enzyme Regul. 22: 27〜55 (1984)）が挙げられる。上述した各方程式を実験データに適用して、複合薬の作用を評価するのに役立つ対応グラフを生成することができる。上述した方程式に関連する対応グラフは、それぞれ濃度−作用曲線、アイソボログラム曲線、およびコンビネーションインデックス曲線である。
【００３７】
薬剤の組合せの「有効量」は、本組合せで治療された抑うつ障害の基準となる臨床的に観察可能な徴候および症状に比べて観察可能な改善を提供するのに十分な量である。
【００３８】
「経口用投薬形態」は、経口投与用に処方または意図された単位投薬形態を含む。
【００３９】
化合物Ａおよび化合物Ｂの組合せを用いた治療方法
本発明は、個体に化合物Ａおよび化合物Ｂの組合せを投与することによる、個体におけるＪＡＫ関連疾患、例えば癌、例えば骨髄増殖性腫瘍の治療方法を提供する。
【００４０】
一実施形態において、本明細書において、このような治療が必要な個体に、本発明の組合せまたはその医薬組成物の治療有効量または用量を投与することによる、対象（例えば患者）におけるＪＡＫ関連疾患または障害の治療方法が提供される。ＪＡＫ関連疾患は、ＪＡＫの発現または活性、例えば過剰発現および／または異常な活性レベル等に直接的または間接的に関連するあらゆる疾患、障害または状態を包含し得る。またＪＡＫ関連疾患は、ＪＡＫ活性を調節することにより予防、改善または治癒することができるあらゆる疾患、障害または状態も包含し得る。
【００４１】
ＪＡＫ関連疾患の例としては、例えば臓器移植による拒絶反応（例えば同種移植片拒絶反応および移植片対宿主疾患）などの免疫系に関する疾患が挙げられる。
【００４２】
ＪＡＫ関連疾患のさらなる例としては、例えば多発性硬化症、リウマチ様関節炎、若年性関節炎、Ｉ型糖尿病、狼瘡、乾癬、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、重症筋無力症、免疫グロブリン腎症、自己免疫性甲状腺障害などの自己免疫疾患が挙げられる。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は、自己免疫水疱性の皮膚障害、例えば尋常性天疱瘡（ＰＶ）または水疱性類天疱瘡（ＢＰ）である。
【００４３】
ＪＡＫ関連疾患のさらなる例としては、例えば喘息、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、および鼻炎などのアレルギー性の状態が挙げられる。ＪＡＫ関連疾患のさらなる例としては、例えばエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ１、水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）などのウイルス性疾患が挙げられる。
【００４４】
ＪＡＫ関連疾患または状態のさらなる例としては、例えば乾癬（例えば尋常性乾癬）、アトピー性皮膚炎、皮膚発疹、皮膚の過敏症、皮膚の感作（例えば接触皮膚炎またはアレルギー性接触皮膚炎）などの皮膚障害が挙げられる。例えば、何らかの医薬を含む特定の物質が局所的に適用されると、皮膚の感作を引き起こす可能性がある。いくつかの実施形態において、皮膚障害は、少なくとも１種の本発明のＪＡＫ阻害剤を局所投与することによって治療される。
【００４５】
さらなる実施形態において、ＪＡＫ関連疾患は、固形腫瘍（例えば、前立腺癌、腎臓癌、肝臓癌、膵臓癌、胃癌、乳癌、肺癌、頭頸部癌、甲状腺癌、グリア芽腫、カポジ肉腫、カストルマン病、黒色腫など）、血液の癌（例えばリンパ腫、白血病、例えば急性リンパ性白血病または多発性骨髄腫）、ならびに皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）および皮膚Ｂ細胞性リンパ腫などの皮膚癌を特徴とする癌である。皮膚Ｔ細胞リンパ腫の例としては、セザリー症候群および菌状息肉腫が挙げられる。
【００４６】
ＪＡＫ関連疾患としてはさらに、例えば偽キナーゼドメインに少なくとも１つの突然変異を有する突然変異体（例えばＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ）などの突然変異ＪＡＫ２の発現を特徴とする疾患も挙げられる。
【００４７】
ＪＡＫ関連疾患としてはさらに、例えば真性多血症（ＰＶ）、本態性血小板血症（ＥＴ）、骨髄線維症を伴う骨髄化生（ＭＭＭ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、好酸球増加症候群（ＨＥＳ）、全身性肥満細胞症（ＳＭＣＤ）などの骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）も挙げられる。
【００４８】
さらなるＪＡＫ関連疾患としては、炎症および炎症性疾患が挙げられる。炎症性疾患の例としては、目の炎症性疾患（例えば虹彩炎、ブドウ膜炎、強膜炎、結膜炎、または関連疾患）、気道の炎症性疾患（例えば鼻および鼻腔を含む上気道の場合、鼻炎または副鼻腔炎など、または下気道の場合、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患など）、炎症性筋疾患、例えば心筋炎、およびその他の炎症性疾患が挙げられる。
【００４９】
本明細書において説明される組合せ療法はさらに、虚血再潅流傷害または炎症性の虚血性の事象に関する疾患もしくは状態、例えば卒中または心停止を治療するのに使用することができる。本明細書において説明される組合せ療法はさらに、例えば癌の結果生じる、あるいは癌に伴う、食欲低下、悪液質または疲労を治療するのに使用することができる。本明細書において説明される組合せ療法はさらに、再狭窄、硬化性皮膚炎（sclerodermitis）または線維症を治療するのに使用することができる。本明細書において説明される組合せ療法はさらに、低酸素症またはアストログリオーシス（astrogliosis）に伴う状態、例えば糖尿病性網膜症、癌または神経変性を治療するのに使用することができる。
【００５０】
本明細書において、疾患に罹った個体に有効量の化合物Ａおよび化合物Ｂを投与することによる、例えば骨髄増殖性障害などの疾患を治療する方法が提供される。薬剤の組合せの量は、疾患を治療するのに有効な量である。薬剤の組合せの相乗作用、すなわち特定の投薬量でそれぞれ単独で投与された１種または複数種の薬剤が有効ではなかったとしても、各薬剤を同じ投薬量で組み合わせて投与すると、治療が有効であることに留意することが重要である。それゆえに組合せ中の１種または複数種の薬剤の用量は、各薬剤のＦＤＡに認可された用量よりも少なくてもよい。
【００５１】
投薬量
疾患を治療するための薬剤の組合せの最適な用量は、公知の方法を用いてそれぞれ個々に経験的に決定することができ、これらに限定されないが、疾患の進行度；個体の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、および食物；投与時間および経路；ならびに個体が受けているその他の薬物療法などの様々な要因によって決まると予想される。最適な投薬量は、慣例的な試験および当技術分野で公知の手法を用いて確立することが可能である。
【００５２】
単一の投薬形態を生産するための担体材料と組み合わせることが可能な薬剤の組合せの量は、治療される個体および具体的な投与様式に応じて様々であると予想される。いくつかの実施形態において、本明細書で説明されているような薬剤の組合せを含む単位投薬形態は、組合せの各薬剤を、それらの薬剤が単独で投与される場合に典型的に投与される量で含むと予想される。
【００５３】
投薬の頻度は、用いられる化合物および治療または予防しようとする具体的な状態に応じて様々であってもよい。一般的には、有効な治療を提供するのに必要十分な最小限の投薬量の使用が好ましい。一般的に、患者は、治療または予防される状態に適した分析を用いて、治療有効性に関してモニターされてもよく、このような分析は当業者によく知られている。
【００５４】
投薬形態は、製剤化学における当業者であれば容易に理解することができる様々な従来の混合、粉砕、および製造技術によって製造することができる。
【００５５】
薬剤の組合せまたは薬剤の組合せの個々の薬剤を含む経口用投薬形態は、カプセル、例えばゼラチンカプセルの内部に封入されたマイクロタブレットの形態であってもよい。この場合、医薬製剤で用いられるようなゼラチンカプセルを用いることができ、このようなゼラチンカプセルとしては、例えばＰｆｉｚｅｒより入手可能なＣＡＰＳＵＧＥＬとして知られているハードゼラチンカプセルが挙げられる。
【００５６】
本明細書において有用な経口用投薬形態の多くは、薬剤の組合せまたは薬剤の組合せの個々の薬剤を粒子の形態で含む。このような粒子は、錠剤に圧縮されて、味をマスキングした投薬形態、プレスコートされた投薬形態、または腸溶性の投薬形態などのコーティングされた投薬形態のコア部分に存在していてもよいし、あるいはカプセル、浸透圧ポンプの投薬形態またはその他の投薬形態中に含まれていてもよい。
【００５７】
本発明の薬物化合物は、１００：１〜１：１００、より好ましくは１：１〜１：１００、さらにより好ましくは１：１０〜１：１００の範囲の比率で本明細書において開示された組合せ、投薬形態、医薬組成物、および医薬製剤中に存在する。
【００５８】
一実施形態において、ヒトに投与する場合、ルキソリチニブは、１日２回で５ｍｇ与えられ、パノビノスタットは、１週間おきに週３回、１０ｍｇ投与される。
【００５９】
一実施形態において、ヒトに投与する場合、ルキソリチニブは、１日２回で１０ｍｇ与えられ、パノビノスタットは、１週間おきに週３回、１０ｍｇ投与される。
【００６０】
一実施形態において、ヒトに投与する場合、ルキソリチニブは、１日２回で１５ｍｇ与えられ、パノビノスタットは、１週間おきに週３回、１０ｍｇ投与される。
【００６１】
一実施形態において、ヒトに投与する場合、ルキソリチニブは、１日２回で１５ｍｇ与えられ、パノビノスタットは、１週間おきに週３回、１５ｍｇ投与される。
【００６２】
一実施形態において、ヒトに投与する場合、ルキソリチニブは、１日２回で１５ｍｇ与えられ、パノビノスタットは、１週間おきに週３回、２０ｍｇ投与される。
【００６３】
一実施形態において、ヒトに投与する場合、ルキソリチニブは、１日２回で１５ｍｇ与えられ、パノビノスタットは、１週間おきに週３回、２５ｍｇ投与される。
【００６４】
一実施形態において、ヒトに投与する場合、ルキソリチニブは、１日２回で１５ｍｇ与えられ、パノビノスタットは、１週間おきに週３回、３０ｍｇ投与される。
【００６５】
一実施形態において、ヒトに投与する場合、ルキソリチニブは、１日２回で３〜７ｍｇ与えられ、パノビノスタットは、１週間おきに週３回、８〜１２ｍｇ投与される。
【００６６】
一実施形態において、ヒトに投与する場合、ルキソリチニブは、１日２回で８〜１２ｍｇ与えられ、パノビノスタットは、１週間おきに週３回、８〜１２ｍｇ投与される。
【００６７】
一実施形態において、ヒトに投与する場合、ルキソリチニブは、１日２回で１０〜２０ｍｇ与えられ、パノビノスタットは、１週間おきに週３回、８〜１２ｍｇ投与される。
【００６８】
一実施形態において、ヒトに投与する場合、ルキソリチニブは、１日２回で１０〜２０ｍｇ与えられ、パノビノスタットは、１週間おきに週３回、１０〜２０ｍｇ投与される。
【００６９】
一実施形態において、ヒトに投与する場合、ルキソリチニブは、１日２回で１０〜２０ｍｇ与えられ、パノビノスタットは、１週間おきに週３回、１０〜３０ｍｇ投与される。
【００７０】
一実施形態において、ヒトに投与する場合、ルキソリチニブは、１日２回で１０〜２０ｍｇ与えられ、パノビノスタットは、１週間おきに週３回、１０〜３０ｍｇ投与される。
【００７１】
一実施形態において、ヒトに投与する場合、ルキソリチニブは、１日２回で１０〜２０ｍｇ与えられ、パノビノスタットは、１週間おきに週３回、２０〜４０ｍｇ投与される。
【００７２】
毒性を示さずに有効性を生じる薬物化合物の最適な比率、個々の、ならびに組み合わされた投薬量および濃度は、標的部位への活性成分の利用率の動態学に基づき、当業者に公知の方法を用いて決定される。
【００７３】
医薬組成物
本明細書で示される医薬組成物または組合せは、臨床研究で試験することができる。適切な臨床研究は、例えば増殖性疾患を有する患者における非盲検用量漸増試験であり得る。このような研究は、具体的には、本発明の組合せの活性成分の相乗作用を証明する。増殖性疾患への有益な作用は、これらの研究（それ自体当業者に公知である）の結果から直接的に決定することもできる。このような研究は特に、本発明の活性成分および組合せを用いた単剤療法の作用を比較するのに適している可能性がある。
【００７４】
本発明の医薬の組合せの投与は、例えば症状を緩和すること、症状の進行を遅らせること、または症状を抑制することに関して、有益な作用、例えば相乗的な治療効果をもたらすだけでなく、本発明の組合せで用いられる医薬活性成分のいずれか１種のみを用いた単剤療法と比較して、例えばより少ない副作用、改善された生活の質、または罹患率の低減といったさらなる驚くべき有益な作用ももたらす可能性がある。
【００７５】
さらなる利益は、用いられる本発明の組合せの活性成分の用量をより少なくすることができる点であり、例えば、多くの場合、より少ない投薬量でよいだけでなく、適用される頻度もより少なくすることができ、それにより副作用の発生または重症度を低減することができる。これは、治療しようとする患者の要望および必要条件に一致している。
【００７６】
本発明の目的の一つは、癌、例えば骨髄増殖性障害を標的または予防することにおいて連携的な治療上有効であり得る量を含む医薬組成物を提供することである。この組成物において、化合物Ａと化合物Ｂとは、１つの組み合わされた単位投薬形態で、または２つの別々の単位投薬形態で、一緒に、順々に、または別々に投与してもよい。また単位投薬形態は、固定された組合せであってもよい。
【００７７】
両方の化合物を別々に投与するための、または固定された組合せで、すなわち本発明に係る両方の化合物を含む単一のガレヌス組成物で投与するための医薬組成物は、自体公知の方式で調製することも可能であり、このような医薬組成物は、ヒトなどの哺乳動物（温血動物）への経腸投与、例えば経口投与または経直腸投与、および非経口投与に適しており、少なくとも１種の薬理学的に活性な組合せパートナーの治療有効量を、例えば上記で示したように単独で、あるいは特に経腸または非経口での適用に適した１つまたは複数の医薬的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて含む医薬組成物である。
【００７８】
製剤
本明細書で示される複合薬は、医薬製剤分野の当業者には明らかな様々な方法によって配合することができる。多種多様の方法で、上述した様々な放出特性を達成することができる。適切な製剤としては、例えば、錠剤、カプセル、プレスコート製剤、およびその他の容易に投与される製剤が挙げられる。
【００７９】
適切な医薬製剤は、例えば約０．１％〜約９９．９％、好ましくは約１％〜約６０％の活性成分（複数可）を含んでいてもよい。経腸または非経口投与用の組合せ療法のための医薬製剤は、例えば、糖衣錠、錠剤、カプセルもしくは坐剤、またはアンプルなどの単位投薬形態である。特に他の指定がなければ、これらは、自体公知の方式で、例えば従来の混合、顆粒化、糖のコーティング、溶解または凍結乾燥処理によって調製される。当然のことながら、複数の投薬単位を投与することによって必要な有効量に達すればよいため、各投薬形態の個々の用量に含まれる組合せパートナーの単位含量それ自体が有効量を構成していなくてもよい。
【００８０】
具体的には、治療有効量の本発明の組合せの、組合せパートナーはそれぞれ、同時または連続的に、あらゆる順番で投与してもよく、その構成要素は、別々に投与してもよいし、あるいは固定された組合せとして投与してもよい。例えば、本発明に係る疾患の治療方法は、（ｉ）第一の薬剤を（ａ）遊離の形態または医薬的に許容される塩の形態で投与すること、および（ｉｉ）薬剤を（ｂ）遊離の形態または医薬的に許容される塩の形態で、同時または連続的に、あらゆる順番で、連携的な治療有効量で、好ましくは相乗的な有効量で、例えば本明細書において説明される量に相当する１日投薬量または断続的な投薬量で投与することを含んでもよい。本発明の組合せの個々の組合せパートナーは、療法中の異なる時に別々に投与してもよいし、あるいは数回に分けた形態で、または単一の組合せの形態で並行して投与してもよい。さらに、投与という用語はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで組合せパートナーそのものに変換される、組合せパートナーのプロドラッグの使用も包含する。従って、本発明は、このようなあらゆる同時または交互の治療の処方計画を包含すると理解されるものとし、用語「投与」は、それに従って解釈されるものとする。
【００８１】
本発明の組合せで用いられる組合せパートナーそれぞれの有効な投薬量は、用いられる具体的な化合物または医薬組成物、投与様式、治療される状態、治療される状態の重症度に応じて様々であってもよい。従って、本発明の組合せの投薬計画は、投与経路、ならびに患者の腎機能および肝機能などの様々な要因に従って選択される。通常の技術を有する臨床医または医師であれば、状態を緩和する、状態の進行を阻止または停止するのに必要な単一の活性成分の有効量を容易に決定して、処方することができる。
【実施例】
【００８２】
本開示を以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。
【００８３】
実施例Ａ
１×１０６個のＢａ／Ｆ３  ＥｐｏＲ  ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ−ｌｕｃクローン８細胞を静脈（尾静脈）に注入したＳｃｉｄ−ベージュマウスで化合物Ａおよび化合物Ｂの組合せの有効性を試験するための研究が行われる。
【００８４】
プロトコール：
動物：８０匹のＳｃｉｄ−ベージュ雌マウス、１８〜２２ｇ（無作為化時に２４匹を排除し、マウス７匹ずつで８群にした）
細胞：Ｂａ／Ｆ３  ＥｐｏＲ  ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ−ｌｕｃクローン８細胞。
【００８５】
細胞注入後４日、７日、９日、および１１日目に全身のＸｅｎｏｇｅｎイメージングを行った。
【００８６】
動物の治療群への無作為化は、細胞注入後４日目の生物発光（ＢｉｏＬ）に基づいて行われた。
【００８７】
マウスモデルおよびプロトコールは、Baffertら、Mol. Cancer Ther; 9(7)、1945、2010年7月によって説明されている。
【００８８】
動物および細胞株：
細胞株：Ｂａ／Ｆ３ＥｐｏＲ  ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ−ｌｕｃクローン８
遺伝子：ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ
細胞数／注入部位：２００μｌ中に１×１０６個の細胞／尾静脈内に注入
種：マウス
株：ＣＢ１７／Ｃ．Ｂ−Ｉｇｈ−１ｂ／ＧｂｍｓＴａｃ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ−ｌｙｓｔｂｇＮ７、タコニック飼育場（正式名称Ｔａｃｏｎｉｃ）
性別：雌
年齢：２２〜２４ｇ
数：８０匹のマウス。
【００８９】
細胞の調製および注入：
試薬：ＲＰＭＩ１６４０（Ａｍｉｎｅｄ）
１０％ＦＣＳ（Ａｍｉｎｅｄ）
２ｍＭのＬ−グルタミン（Ａｍｉｎｅｄ）
ピューロマイシン、１μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ、ロット０３６Ｋ４０７３）
ハイグロマイシン（Hygromicin）Ｂ、１００μｇ／ｍｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロットＢ１３８７１０１０）
【００９０】
Ｂａ／Ｆ３  ＥｐｏＲ  ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ−ｌｕｃ細胞を、１０％ＦＣＳ、１％グルタミン、ピューロマイシン（１μｇ／ｍＬ）、およびハイグロマイシン（１００μｇ／ｍＬ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０中で増殖させる。実験の２週間より前に、細胞を３日毎に剥ぐ（１：５０）。注入の前の日に、抗生物質をまったく用いないで細胞を増殖させる（ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞増殖を遅延させるあらゆる可能性を回避するため）。
【００９１】
注入の日に、細胞を回収し、ＨＢＳＳ緩衝液に再懸濁する（２００μｌ中に１０６個の細胞）。２７Ｇのツベルクリン用注射器を用いて細胞を尾静脈に注入する。
【００９２】
群の定義：
群１（７匹のマウス）：ビヒクル群（経口で０．５％ＨＰＭＣ＋腹腔内に５％Ｄ５Ｗ）
群２（７匹のマウス）：５ｍｇ／ｋｇの化合物Ｂを腹腔内に週３回（Ｍ／Ｗ／Ｆ）＋経口で０．５％ＨＰＭＣ
群３（７匹のマウス）：１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｂを腹腔内に週３回（Ｍ／Ｗ／Ｆ）＋経口で０．５％ＨＰＭＣ
群４（７匹のマウス）：１５ｍｇ／ｋｇの化合物Ｂを腹腔内に週３回（Ｍ／Ｗ／Ｆ）＋経口で０．５％ＨＰＭＣ
群５（７匹のマウス）：７９．２ｍｇ／ｋｇの化合物Ａを経口で１日２回＋腹腔内に５％Ｄ５Ｗ
群６（７匹のマウス）：７９．２ｍｇ／ｋｇの化合物Ａを経口で１日２回＋５ｍｇ／ｋｇの化合物Ｂを腹腔内に週３回（Ｍ／Ｗ／Ｆ）
群７（７匹のマウス）：７９．２ｍｇ／ｋｇの化合物Ａを経口で１日２回＋１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｂを腹腔内に週３回（Ｍ／Ｗ／Ｆ）
群８（７匹のマウス）：７９．２ｍｇ／ｋｇの化合物Ａを経口で１日２回＋１５ｍｇ／ｋｇの化合物Ｂを腹腔内に週３回（Ｍ／Ｗ／Ｆ）
治療は同時に施される。
【００９３】
化合物：
化合物Ａは、一リン酸塩であり、７９．２ｍｇ／ｋｇ（６０ｍｇ／ｋｇの遊離塩基当量）であり、０．５％ＨＰＭＣファーマコート（Ｐｈａｒｍａｃｏａｔ）６０３中で１０ｍＬ／ｋｇである。
【００９４】
化合物Ａを含む製剤：６６ｍｌの０．５％ＨＰＭＣファーマコート６０３中の、５２２．７ｍｇの化合物Ａ（一リン酸塩の形態）。
【００９５】
化合物Ｂは、乳酸塩の形態であり、１５ｍｇ／ｋｇ（１１．９０ｍｇ／ｋｇの遊離塩基当量）、１０ｍｇ／ｋｇ（７．９４ｍｇ／ｋｇの遊離塩基当量）、および５ｍｇ／ｋｇ（３．９７ｍｇ／ｋｇの遊離塩基当量）であり、５％Ｄ５Ｗ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ、ロット３９５１４７）中で１０ｍＬ／ｋｇである。
【００９６】
化合物Ｂを含む製剤：それぞれ１０ｍｌの５％Ｄ５Ｗ中の１５ｍｇの化合物Ｂ（乳酸塩の形態）、１０ｍｌの５％Ｄ５Ｗ中の１０ｍｇの化合物Ｂ、および１０ｍｌの５％Ｄ５Ｗ中の５ｍｇの化合物Ｂ。
【００９７】
モニタリングおよびデータ/サンプルの収集：
動物を毎日、トランスポンダーで確認してモニターする。
【００９８】
細胞注入後４日目、７日目、および１０日目に、イソフルラン麻酔下で（３〜５体積％イソフルラン、０．８Ｌ／分の空気流）、Ｘｅｎｏｇｅｎカメラ（非浸潤性のＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステム、キャリパー）を用いて生物発光を記録する。動物に、Ｄ−ルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、参照番号ＸＲ−１００１）を１５０ｍｇ／ｋｇ（１０ｍｌ／ｋｇ、Ｎａｃｌ）で腹腔内注入する。続いて、ルシフェリン注入後１５分間イメージングするために、イメージングチャンバー内に麻酔したマウスを置く。
【００９９】
Ｘｅｎｏｇｅｎのパラメーター：Ｄ／１０秒／ｍｅｄ／１５分。
【０１００】
４日目に動物を無作為化し、ビヒクルで治療される動物の健康状態を基準として少なくとも６日間、治療を開始する。
【０１０１】
スコアシートに体重（ＢＷ）および健康状態を記録する。２日連続してＢＷが１５％を超えたら動物を屠殺する。１群あたり動物の５０％より多くが死亡したら、全てのマウスを屠殺する。
【０１０２】
屠殺すること、サンプルの収集：
化合物Ａの最後の投与から２時間後；
化合物Ｂの最後の投与から２時間後；
−  脾臓の質量は、屠殺したときに記録する。
−  サンプルを収集して液体窒素中で急速冷凍し、解析まで−８０℃で維持する：
−  ＰＫ解析用に、脾臓、ＢＭ、血液、および肝臓
−  ＰＤマーカー解析（ｐ−ＳＴＡＴ５（化合物Ａ）およびタンパク質のアセチル化（化合物Ｂ））用に脾臓、
−  ＰＤマーカー解析（ｐ−ＳＴＡＴ５（化合物Ａ）用に胸骨。
【０１０３】
実施例Ａの結果：
用量は、遊離塩基当量として示した。
【０１０４】
表１．１〜１．８は、様々な群に関する無作為化時の生物発光を示す。
【０１０５】
【表１】
2014517039.tif 000007
【０１０６】
【表２】
2014517039.tif 000008
【０１０７】
【表３】
2014517039.tif 000009
【０１０８】
【表４】
2014517039.tif 000010
【０１０９】
【表５】
2014517039.tif 000011
【０１１０】
【表６】
2014517039.tif 000012
【０１１１】
【表７】
2014517039.tif 000013
【０１１２】
【表８】
2014517039.tif 000014
【０１１３】
図１は、化合物Ａおよび／または化合物での治療期間にわたる体重を示す。化合物Ａと化合物Ｂとを組み合わせた場合の忍容性に大きい変化はない。
【０１１４】
図２および３は、治療７日後、すなわち細胞注入の１１日後（治療は細胞注入後の４日目に開始された）の生物発光レベルの治療作用を示す。
【０１１５】
図４は、治療８日後の脾臓の質量を示す。
【０１１６】
図５および６は、治療後２時間におけるＰＤマーカー解析（脾臓抽出物）の結果を示す。
【０１１７】
表２は、バイオルックス（ｂｉｏｌｕｘ）の増加率に対する治療作用を示す。
【０１１８】
【表９】
2014517039.tif 000015
【０１１９】
【表１０】
2014517039.tif 000016
【０１２０】
上記の結果は、Ｂａ／Ｆ３  ＥｐｏＲ  ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ−ｌｕｃ細胞により誘発された白血病の機構的マウスモデルにおいて、化合物Ａおよび化合物Ｂの組合せは許容できることを示す（化合物Ｂによる単剤療法群と、化合物Ｂ＋化合物Ａの組合せの群とで、体重の減少が同等である）。
【０１２１】
白血病細胞の拡散を評価したところ（Ｘｅｎｏｇｅｎバイオルックスによる読出し）、それぞれ用量６０ｍｇ／ｋｇおよび１２ｍｇ／ｋｇの化合物Ａおよび化合物Ｂの組合せは、これらの薬物が単剤療法として与えられた場合と比較して有意な差を示す。
【０１２２】
実施例Ｂ
ＪＡＫ１／２阻害剤である化合物Ａと組み合わせた場合のデアセチラーゼ阻害剤である化合物Ｂの活性および忍容性を、真性多血症様疾患のＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ骨髄移植モデルで評価した。このＭＰＮ疾患モデルにおける組合せの活性を、用量８ｍｇ／ｋｇの化合物Ｂと用量６０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａとで試験した。以下で詳細に示されるように、化合物ＢとＪＡＫ１／２阻害剤である化合物Ａとの組合せは、それぞれの薬剤が単独の場合と比較して、脾腫および骨髄ならびに脾臓の組織において有意な改善を示した。
【０１２３】
骨髄移植および解析
骨髄感染および移植
マウスの骨髄移植実験を、実質的に、Wernigら（Wernig, G.、Mercher, T.、OkabeR.ら (2006) Expression of JAK2V617F causes a polycythemia vera-like disease with associated myelofibrosis in a murine bone marrow transplant model. Blood 107: 4274〜4281）で説明されているようにして行った。簡単に言えば、Ｂａｌｂ／ｃドナーマウス（６〜８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、雄または雌）を、ＢＭ移植の５日前に５−フルオロウラシル（１５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ６６２７）で処理した。ドナーマウスからの骨髄細胞を、大腿骨と脛骨とを洗い流すことにより回収した。赤血球を溶解させた後（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒｅｎｏｂｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ、カタログ番号０７８００）、有核細胞を、移植培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ＋２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｂｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ、カタログ番号４０３−ＭＬ）、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４０６−ＭＬ）、および５０ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣ  Ｆ、Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、カタログ番号Ｄ−６３１２０）中で２４時間培養した。翌日、６ウェルプレート中で、１０μｇのｐ−ＭＳＣＶ−ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入した元のベクターｐ−ＭＳＣＶベクターの改変型）、および１０μｇのｐＣＬ−ＥＣＯベクター（Ｉｍｇｅｎｅｘ、カタログ番号１００４５Ｐ）でトランスフェクションした２９３Ｔ由来のビリオンを含む上清１ｍＬの存在下で、細胞を２×１０６個の細胞／ｍｌ／ウェルで平板培養した。２回のスピンインフェクション（２５００ｒｐｍ、９０分、３２℃、Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  １Ｓ−Ｒ、Ｈｅｒａｅｕｓ）の後に、未選択の感染したＢＭ細胞をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中に再懸濁し、続いて細胞（感染率に応じて１〜３×１０６）を、ＢＩＯＢＥＡＭ８０００ガンマ照射器（ＢＥＢＩＧ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、４時間の間隔をあけて２種の線量４．５または３．５Ｇｙを当てることにより致死量の放射線（合計で９Ｇｙまたは７Ｇｙ）を照射されたＢａｌｂ／ｃ雌レシピエントマウスの尾静脈に注入した。
【０１２４】
動物を毎日モニターし、目立った苦痛の徴候がみられた場合（連続して２日以上、改善がなく、嗜眠および起毛と共に過剰な体重減少がみられた場合）、屠殺した。
【０１２５】
サンプル収集および解析
ＣＢＣおよび臓器の収集
血液を、イソフルラン麻酔（終末法）下で、尾静脈から、あるいは屠殺したときに大静脈から２０Ｇの針を用いて採取し、自動化コンプリートおよびディファレンシャル血液細胞計数器（シスメックス血液解析装置、ＸＴ２０００ｉＶ、Ｓｙｓｍｅｘ  Ｄｉｇｉｔａｎａ  ＡＧ、Ｎｏｒｄｅｒｓｔｅｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙで１：５希釈を用いたキャピラリーモード）を用いて解析した。脾臓の重さを量り、脾腫を評価した。薬物動態学的研究、薬力学的研究のために血液、脾臓、胸骨、および肝臓を収集した。
【０１２６】
フローサイトメトリーによる血液サンプル中でのＧＦＰ陽性細胞の検出
１０マイクロリットルの全血を用いて、循環血中のＧＦＰ陽性細胞を検出した。簡単に言えば、血液を９６ウェルの丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３７９５）に分配し、赤血球（ＲＢＣ）を２００μｌの赤血球溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｒ−７７５７）で溶解させた。暗所で、プレートアジテーターで７分インキュベートした後、細胞を遠心分離し（５分、３００ｇ）、プレートを転置することにより上清を捨てた。ＦＡＣＳ緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）、３％ＦＢＳ、および０．０２％アジ化ナトリウム）での３回の洗浄工程の後、有核細胞を２００μｌの冷ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＧＦＰ検出用に処理した。
【０１２７】
組織学的研究（ｐ−ＳＴＡＴ５、アセチル−ヒストンＨ３、レチクリン）
胸骨および脾臓を収集し、ホルマリン中で固定し、形を整え、パラフィンに埋め込み、マイクロトームを用いて（名目上）４μｍに薄く切断した。
【０１２８】
レチクリン線維用の銀含浸キットを用いて、胸骨で骨髄線維症を評価した（Ｂｉｏ−Ｏｐｔｉｃａ、カタログ０４−０４０８０）。
【０１２９】
脾臓および骨髄において、化合物ＡのＰＤマーカーであるｐ−ＳＴＡＴ５と、化合物ＢのＰＤマーカーであるアセチル化ヒストンＨ３とを評価した。簡単に言えば、脾臓全体を取り出し、重さを量り、切開トレイに置いた。メスを用いて脾臓を横方向に切断して半分にし、中央部分から２つの等しい断片を取り出した。脾臓断片の厚さは３〜４ｍｍを超えないようにした。脾臓断片を標識されたヒストカセット（histocassette）に移し、中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）１０％（ｖ／ｖ）中で室温で（ｐＨ６．８〜７．２）浸漬固定した（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｍｅｄｉｔｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。固定剤の体積は、組織体積と比較して少なくとも１０倍過量であった。胸骨全体を取り出し、室温で１０％ＮＢＦ中で４８時間固定し、ＰＢＳで洗浄し、ｐＨ７．５のＥＤＴＡクエン酸緩衝液（Ｂｉｏｃｙｃ  ＧｍｂＨ、Ｌｕｃｋｅｎｗａｌｄｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で、３×２４時間、３７℃でカルシウム除去した。最後のＰＢＳでの洗浄後、組織を細かく切断し、対象となる表面をユニバーサルヒストカセットの下方にセットし、続いてパラフィン処理用のＴＰＣ１５Ｄｕｏ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ）中で処理した。スライド式または回転式のマイクロトーム（Ｍｉｋｒｏｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上で、各組織パラフィンブロックから厚さ３μｍの断片を数枚切り出し、４５℃の水槽中で拡げ、顕微鏡スライド（Ｐｏｌｙｓｉｎｅ、ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）上に載せ、オーブン中で、３７℃で一晩風乾させた。乾燥した組織切片スライドをオーブンから取り出し、完全に自動化されたＨ＆Ｅ（ヘマトキシリン＆エオシン）染色のための、または免疫組織化学（ＩＨＣ）染色用に加工された、一列に並んだ染色装置ＣＯＴ２０（Ｍｅｄｉｔｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のスライドラックに置いた。ＩＨＣの場合、組織切片サンプルを、ウサギ抗リン酸ＳＴＡＴ５抗体（クローンＣ１１Ｃ５）およびウサギ抗アセチルヒストンＨ３抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）で染色し、カバースリップをかけて風乾させた。
【０１３０】
組織学的評価のために、ＢＭの細胞形成を、細胞過形成（３＋）、正常な細胞形成（２＋）、および細胞形成の減少（１＋）のように評価した。脾臓の構造を、破壊（１＋）または維持（０）のように評価した。骨髄、赤血球、および脂肪細胞の存在を、細胞形成に基づき０、１＋、２＋、３＋のように評価した。ｐ−ＳＴＡＴ５評価のために、デジタルスライド画像データを、Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｒａｘスライドスキャナー（スキャンソフトウェアバージョン１．１２、Ｚｅｉｓｓ  ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて最終倍率２００×でスライドガラスから作製した。Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  ｅＣｏｇｎｉｔｉｏｎソフトウェア（ｅＣｏｇｎｉｔｉｏｎバージョンＸＤ１．５、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、全スライドのｐ−ＳＴＡＴ５陽性および陰性細胞核に関する自動定量的評価を行った。結果を、全ての核のうち陽性のｐ−ＳＴＡＴ５核のパーセントとして示した。アセチル化ヒストンＨ３の染色を、陽性細胞の染色強度および数に基づき１＋、２＋、３＋のようにスコア付けした。
【０１３１】
アセチル化リシンのウェスタンブロット解析
凍結させた脾臓サンプルを、０．１％ＳＤＳ、２ｍＭバナジン酸ナトリウム、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、および１種の抗プロテアーゼカクテルタブレット（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１１８３６１４５００１）が補充された溶解緩衝液（ＲＩＰＡ緩衝液：ｐＨ７．２の５０ｍＭトリスＨＣｌ、１２０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５の６ｍＭのＥＧＴＡ、１％ＮＰ−４０、２０ｍＭのＮａＦ中で、ポリトロンホモジナイザー（ＩＫＡ  ＬａｂｏｒＴｅｃｈｎｉｋ、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａ  Ｔ２５、最大速度で１分）を用いて、ホモジナイズ中に氷上でサンプルを維持しながら、ホモジナイズした。次にホモジネートを１０，０００ｒｐｍ（１５分、４℃）で遠心分離し、ガラス繊維フィルターを通過させてろ過し、−８０℃で凍結させた。ＢＣＡタンパク質分析キット（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号７１２８５−３）を用いてホモジネートの全タンパク質含量を測定した。
【０１３２】
各サンプルからの全タンパク質１００μｇを４〜１２％Ｎｕｐａｇｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＷＧ１４０２ＢＸ１０）により変性させ、半乾性のブロッティング（ＢＩＯＲＡＤ、セミドライトランスファーシステム、カタログ番号１７０−３９４０）によりＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）、カタログ番号ＩＰＶＨ２０２００、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）に移した。メンブレンを、ブロッキング溶液（５％ＢＳＡ、０．１％トゥイーン２０、ＰＢＳ中）で室温で１時間ブロックし、続いて０．１％トゥイーン２０を含むＰＢＳを１０分毎に交換しながら３０分洗浄した。続いてメンブレンを、０．１％トゥイーン２０および５％乳汁を含むＰＢＳ中で１：１０００に希釈した一次抗アセチル化リシン抗体（ウサギポリクローナル抗アセチル化リシン抗体、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号９４４１）で４℃で一晩インキュベートした。翌日、メンブレンを、０．５％トゥイーン２０を含むＰＢＳを１０分毎に交換しながら３０分洗浄し、続いて０．１％トゥイーン２０および１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１：２０００に希釈した抗ウサギＨＲＰ結合二次抗体と室温で１時間インキュベートした。メンブレンを上述したように再度洗浄し、ＥＣＬ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＲＰＮ２１３２）で展開して脾臓抽出物中のアセチル化リシンを検出した。
【０１３３】
β−チューブリンまたはＧＡＰＤＨを用いた全タンパク質の検出
全β−チューブリンレベルを検出するために、メンブレンを、０．１％トゥイーン２０および２％ＳＤＳを含むＰＢＳ中で６０℃で３０分ストリッピングし、０．１％トゥイーン２０を含むＰＢＳで４〜５回洗浄し、０．１％トゥイーン２０および３％ＢＳＡを含むＰＢＳで１：５０００に希釈した一次抗β−チューブリン抗体（マウスモノクローナル抗β−チューブリン抗体、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ−４０２６）中で４℃で一晩インキュベートした。翌日、メンブレンを、０．５％トゥイーン２０を含むＰＢＳを１０分毎に交換しながら３０分洗浄し、続いて０．１％トゥイーン２０および１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１：５０００に希釈した抗マウスＨＲＰ結合二次抗体と室温で１時間インキュベートした。メンブレンを上述したように再度洗浄し、ＥＣＬで展開してβ−チューブリンタンパク質を検出した。
【０１３４】
ＧＡＰＤＨレベルを以下のようにして検出した：サンプルを再度ローディングし（４０μｇの全タンパク質、さらにメンブレンを、０．１％トゥイーン２０および３％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１：５０００に希釈した一次抗ＧＡＰＤＨ抗体（ウサギ抗ＧＡＰＤＨ抗体、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号２１１８）中で４℃で一晩インキュベートした。翌日、メンブレンを、０．５％トゥイーン２０を含むＰＢＳを１０分毎に交換しながら３０分洗浄し、続いて０．１％トゥイーン２０および１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１：１０００に希釈した抗ウサギＨＲＰ結合二次抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＮＡ９３１）と室温で１時間インキュベートした。メンブレンを上述したように再度洗浄し、ＥＣＬで展開して脾臓抽出物中のＧＡＰＤＨタンパク質を検出した。
【０１３５】
化合物Ａおよび化合物Ｂを定量するための生物学的分析（ＬＣ／ＭＳ−ＭＳ）
化合物Ａおよび化合物Ｂの血漿中および組織中の濃度をＵＰＬＣ／ＭＳ−ＭＳ分析によって同時に決定した。Ｆａｓｔ  Ｐｒｅｐ（登録商標）−２４システム（Ｍ．Ｐ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、等しい体積のＨＰＬＣ水（クロマトグラフィー用の水、Ｍｅｒｃｋ）中で組織をホモジナイズした。血液または組織ホモジネートの分析アリコート（２５μｌ）に２５μｌの内部標準混合物（１μｇ／ｍｌ）を添加した後、２００μｌのアセトニトリルの添加によりタンパク質を沈殿させた。上清を新しいバイアルに移した。乾燥するまで蒸発させた後、サンプルを、６０μｌのアセトニトリル／水（１／１、ｖ／ｖ）中に再溶解させた。この溶液のアリコート（５μｌ）を、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ（商標）、粒度１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ）上で、水中の０．１％ギ酸（溶媒Ａ）とアセトニトリル中の０．１％ギ酸（溶媒Ｂ）との混合物からなる移動相を用いて分離させた。勾配のプログラミングを、流速６００μｌ／分で用いた。９５％溶媒Ａで平衡化した後、５μｌのサンプルを注入した。０．２５分の待ち時間の後、サンプルを０．６５分にわたり直線的な濃度勾配の５〜１００％溶媒Ｂで溶出させ、続いて０．３５分保持した。次のサンプルのために、０．２５分にわたり再度平衡化することによりカラムを開始時の状態に調製した。カラムの溶出液を、Ｍａｓｓｌｙｎｘ（商標）４．１ソフトウェアで制御されたトリプル四重極型質量分析計ＴＱＤ（商標）（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）のイオン源に直接導入した。分析物のＭＳ／ＭＳ検出のために、エレクトロスプレー陽イオン化（ＥＳＩ＋）の多重反応モニタリングを用いた。化合物Ａに関しては、生成物前駆体の３０７．０からｍ／ｚ１８６．０へのイオン転位を用いた。同時に、化合物Ｂに関しては、生成物前駆体の３５０．１からｍ／ｚ１４２．９へのイオン転位を記録した。両方の化合物の定量限界（ＬＯＱ）は、血漿および組織それぞれについて９ｎｇ／ｍｌおよび９ｎｇ／ｇに設定された（ＣＶ、全体のバイアスは３０％未満）。ＱｕａｎＬｙｎｘ（商標）４．１（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）およびＥｘｃｅｌ（商標）２００７（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を用いて回帰分析およびさらなる計算を行った。未知のサンプルの濃度を、ビヒクルで治療された動物から得られたブランク血液または組織に較正サンプルを入れることにより構築された検量線から、分析物／ＩＳのピーク領域の比率に基づいて逆に計算した。
【０１３６】
維持の条件
Ｂａｌｂ／ｃＢｙＪＩｃｏマウス（Ｃ．Ｒｉｖｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）をオートクレーブしたケージ中で保持した（１ケージあたり最大で５匹の動物）。明／暗サイクルは、以下のように、すなわち１２時間暗くし、１２時間明るくした（午前６：３０から午後６：３０まで明るくした）。移植後の最初の２週間にわたり、放射線照射後の動物の回復を助け、感染を回避するために、動物に、ガンマ線照射したウェットフードと、オートクレーブした抗生物質を含む水（ＢＡＣＴＲＩＭ、４ｍｇのスルファメトキサゾリン（Ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘａｚｏｌｉｍｅ）、０．８ｍｇのトリメトプリムの最終濃度）、Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ、Ｒｅｉｎａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、飲用水２５０ｍｌ中に５ｍｌ）とを適宜与えた。
【０１３７】
試験化合物および製剤
化合物Ｂを乳酸塩として静脈内または腹膜内注入によって投与した。化合物Ｂの乳酸塩を、等張のＤ５Ｗ（５％デキストロース；Ｂ．Ｂｒａｕｎ、ロット３９５１４７）中にそれぞれ１．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、および０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で配合した。この溶液は室温で最長１０日間安定であった。治療を１０ｍｌ／ｋｇの量で週３回施した。最終的な用量（遊離塩基当量）は、それぞれ１１．９０、７．９４、および３．９７ｍｇ／ｋｇであった。図面では、これらの用量は全体の値として報告した。
【０１３８】
化合物Ａの一リン酸塩を、０．５％ＨＰＭＣ（ファーマコート６０３、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｌａｑｕｅｌｉｎｅ、ＵＳＡ）中に７．９ｍｇ／ｍｌの濃度で配合した。溶液は、室温で４日間安定であった。治療を、１０ｍｌ／ｋｇの量で１日２回施した。最終的な用量（遊離塩基当量）は、６０ｍｇ／ｋｇであった。
【０１３９】
２種の化合物を同時に与えた。
【０１４０】
統計
図および表に示した結果は、平均±標準誤差で表示される。パーセンテージで示される体重の変化、および脾臓の質量に関する絶対値または変換値（ｌｏｇ１０、または指定されているその他の値）、網状赤血球、ＷＢＣ数、Ｈｃｔ、および組織学的データを、対応のないｔ検定または順位和検定によって解析し、単一の治療群とビヒクル群とを比較するか、あるいは片側ＡＮＯＶＡ、続いてダネット検定によって解析し、治療群とビヒクル群とを比較した。テューキー検定を用いて多重比較を行った。屠殺した日に全ての比較を行った。有意水準は、ｐ＜０．０５に設定された。ウィンドウズ（登録商標）用のグラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を用いて計算を行った。
【０１４１】
実施例Ｂの結果：
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける化合物Ａおよび化合物Ｂを組み合わせた場合の有効性および忍容性
化合物Ｂの有効性は、化合物Ａと組み合わせることにより改善され得るという仮説を試験するために、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ形質導入骨髄細胞を移植したＢａｌｂ／ｃマウスを、ＪＡＫ１／２阻害剤である化合物Ａと組み合わせて化合物Ａで治療した。ＪＡＫ阻害剤である化合物Ａと組み合わせた様々な用量の化合物Ｂの影響を評価するために、化合物Ａについては中程度の有効性を生じる用量を選択した。
【０１４２】
ＢＭＴ後２７日目にマウスをＨｃｔ値に基づいて無作為化し（この実験において平均で６７％、Ｎ＝９／群）、単一の薬剤または組合せとして化合物Ｂ（８ｍｇ／ｋｇ、ＭＷＦで週３回、腹腔内）および化合物Ａ（６０ｍｇ／ｋｇ、１日２回、経口）で治療した。化合物Ｂ単独の場合、多少の体重減少（平均して−５％）が示された。化合物Ｂを化合物Ａと組み合わせた場合、この体重の減少はそれよりも有意に高かった（平均して−１０％、図７および表４）。化合物Ｂを単独で与えたところ、脾臓の質量が減少し、正常値にはならなかった。化合物Ａは、脾臓の質量を減少させる傾向を示したが、大きく変動した（６７〜１１５３ｍｇの範囲）。組み合わせることにより、脾臓の質量／体積に関して有効性が改善され、治療から３週間後に正常状態に戻るか、あるいは（９匹の動物のうち６匹において）組織学的に正常な範囲を下回ることさえあった（図８および表４）。組合せは、網状赤血球数に対して強く作用する傾向を示したが（いくつかの動物では０．１×１０１２／Ｌ未満の極めて低い値が観察された）、この作用は、単一の薬剤で治療された群と有意差はなかった。化合物Ｂを単独で与えた場合、および化合物Ａと組み合わせた場合（この実験で、ビヒクル群中の１匹の動物と化合物Ａ群中の１匹の動物とを除いて、白血球増加がみられなかったにもかかわらず）、ＷＢＣ数は減少した。ＰＬＴ数は、化合物Ｂ単独の治療および化合物Ａとの組合せの影響を受けた（図１１）。この化合物Ｂおよび組合せ群に関する研究で、アレルバーデンによる代理読出し（循環血中のＧＦＰ陽性細胞）における減少の傾向が観察された（表４）。
【０１４３】
治療の全ての薬物治療群に関して、骨髄細胞過形成の減少が観察された（組合せ＞化合物Ａ＝化合物Ｂ）。治療により脾臓の構造が改善され、組合せ群で最も強い作用が観察された（組合せ＞化合物Ａ＞化合物Ｂ）。胸骨断片のレチクリン染色によって評価したところ、大きな変動があったが、化合物Ａおよび組合せ群は線維症スコアを低くする傾向を示した。
【０１４４】
単一の薬剤としての化合物Ａで、および化合物Ｂと組み合わせた化合物Ａで治療したところ、ＩＨＣによるＰＤマーカー評価によりｐ−ＳＴＡＴ５マーカーの明らかな減少が示された。アセチル化ヒストンＨ３については、化合物Ｂ単独で、または組み合わせて治療したところ、デアセチラーゼ阻害に関する代理読出しから明らかな増加がみられた。
【０１４５】
図１３〜１９は、様々な染色方法での骨髄および／または脾臓の画像を示す。
【０１４６】
組織が化合物に曝露された際の、組合せの処方計画による目立った影響はなかった（表５）。
【０１４７】
この実施例により、化合物ＡおよびＢの組合せは、脾臓の質量／体積に関する有効性を改善したことが実証される。
【０１４８】
【表１１】
2014517039.tif 000017
【０１４９】
【表１２】
2014517039.tif 000018
【０１５０】
実施例Ｃ
臨床試験
原発性骨髄線維症（ＰＭＦ）、真性多血症後の骨髄線維症（ＰＰ−ＭＦ）または本態性血小板血症後の骨髄線維症（ＰＥＴ−ＭＦ）を有する患者におけるパノビノスタットおよびルキソリチニブの組合せの経口投与の安全性および薬物動態学を評価するために、第１ｂ相の非盲検多施設単一群の用量設定試験は現在行われている。
【０１５１】
図２０は、研究の設計および方法を説明する。
【０１５２】
この試験の目的は、以下のうち１つまたは複数を確立することである：
（１）ＭＦを有する患者において、ルキソリチニブとパノビノスタットとの組合せのＭＴＤおよび／またはＲＰＩＩＤを確立すること；
（２）ＭＦを有する患者にルキソリチニブとパノビノスタットとを経口で共投与することの安全性を評価すること；
（３）ＭＦを有する患者に、単一の薬剤として、およびパノビノスタットと組み合わせて与えた場合の、ルキソリチニブの様々な用量における薬物動態学を特徴付けること；および／または
（４）ＭＦを有する患者における、ルキソリチニブと組み合わせた場合のパノビノスタットの様々な用量における薬物動態学を特徴付けること。
【０１５３】
組み入れ基準：
Ａ．患者は、彼等のＪＡＫ２  Ｖ６１７Ｆ突然変異の状態に関わりなく、ＰＭＦ、ＰＰＶ−ＭＦ、またはＰＥＴ−ＭＦであるという診断が確定している
Ｂ．ＰＭＦに関する世界保健機関（ＷＨＯ）基準のガイドに従って、この研究には、国際的予後予測スコアリングシステム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ＩＰＳＳ）基準により中間−１、−２または高い危険と指定され、肋骨縁の下に５ｃｍ以上の触診可能な脾腫を有する患者が含まれる
Ｃ．患者は、以下の危険因子の少なくとも１つを有していたはずである
ａ．全身症状があること（サイクル１、１日目［Ｃ１Ｄ１］の前の年における基準値の１０％を超える体重減少、１カ月以上続く原因不明の発熱または過剰な寝汗）
ｂ．スクリーニングのための来院時に実証される著しい貧血（ヘモグロビン＜１０ｇ／ｄＬ０
ｃ．白血球増加（２５×１０９／Ｌを超える白血球数を示す病歴）
ｄ．１％以上の循環血中の芽細胞
Ｄ．用量漸増は、過剰な用量の対照を用いたベイズのロジスティック回帰モデルで導かれ、第一サイクルにおける用量規定毒性（ＤＬＴ）、加えてその他の安全性の所見によって決まると予想される
Ｅ．各投与コホートは、３人以上の評価可能な患者からなっていた
Ｆ．ＲＰ２Ｄおよび／またはＭＴＤを決定するためには、９人以上の患者のあらゆる所定用量レベルにおけるデータが必要であると予想される
Ｇ．１日目にルキソリチニブ単独を単回投与し、２および６日目にパノビノスタットと組み合わせて投与した後に連続的に収集された血液サンプルは、液体クロマトグラフィータンデムマススペクトロメトリーにより血漿濃度について評価される
Ｈ．ノンコンパートメント解析を用いて薬物動態パラメーターを得た
【０１５４】
結果：
７つのコホートが研究に提案されている。この研究は未だ進行中であり、現状ではコホート１〜３からのデータのみが入手可能である。
【０１５５】
表６は、コホート１〜３の患者数および疾患のサブタイプを示す。
【０１５６】
図２１は、コホート１での経時的な触診可能な脾臓の長さを説明する。
【０１５７】
表７は、コホート１での最良の触診可能な脾臓の長さにおける応答および症状における応答を示す。
【０１５８】
図２２は、コホート２での経時的な触診可能な脾臓の長さを説明する。
【０１５９】
表８は、コホート２での最良の触診可能な脾臓の長さにおける応答および症状における応答を示す。
【０１６０】
図２３は、コホート３での経時的な触診可能な脾臓の長さを説明する。
【０１６１】
表９は、コホート３での最良の触診可能な脾臓の長さにおける応答および症状における応答を示す。
【０１６２】
表１０は、治療を研究するために、関係が疑われるコホート１〜３でグレード３／４の有害事象があったことを報告する。コホート１またはコホート３ではＤＬＴまたはＳＡＥは観察されなかった。コホート２において、１件のＤＬＴ（グレード４の血小板減少症）が報告された。さらに１件のＳＡＥ（グレード３の吐き気およびグレード３の下痢）もあった。これまで臨床的に有意なＥＫＧ異常は観察されなかった。
【０１６３】
【表１３】
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【０１６４】
【表１４】
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【０１６５】
【表１５】
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【０１６６】
【表１６】
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【０１６７】
【表１７】
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【０１６８】
これまでの臨床研究から、ルキソリチニブとパノビノスタットとの組合せは、有望な活性を有しつつ十分な忍容性を有すると予想されることが示される。これまでに調査されたルキソリチニブおよびパノビノスタットの用量で、グレード３／４の貧血および血小板減少症が低い割合で観察されている。初期のデータから、ルキソリチニブとパノビノスタットとの間に起こり得る薬物相互作用はないことが示唆されている。追加のコホートにより、この有望な組合せにとって最適な、ＭＦ患者の治療における投薬戦略が確立されると予想される。
【０１６９】
略語のリスト：
【０１７０】
【表１８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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