(57)【要約】提供されるものは、化合物、治療、例えば、特にグラム陰性細菌による微生物感染症の治療における前記化合物の使用である。化合物は、ポリミキシンに基づき、そして式（Ｉ）：及び医薬的に受容可能なその塩によって表され、ここで、Ｘは、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ２−又は−ＳＯ２−であり；Ｒ５は、Ｃ０−１２アルキル（Ｃ４−６ヘテロ−シクリル）、又はＣ２−１２アルキル或いはＣ０−１２アルキル（Ｃ３−８シクロアルキル）を表し、そしてアルキル又はシクロアルキルは、一つ、二つ又は三つのヒドロキシル基、又は−ＮＲ６Ｒ７基、或いは一つの−ＮＲ６Ｒ７基及び一つ又は二つのヒドロキシル基を保有し；そしてＲ１ないしＲ４及びＲ６ないしＲ８は、説明中で定義されるとおりである。【選択図】図１
2014533678.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）：
【化１】
2014533678.tif 000049
［式中：
Ｘは、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ２−又は−ＳＯ２−を表し；そして
Ｒ１は、カルボニル基及びそれが接続している炭素に対してアルファの窒素と一緒に、フェニルアラニン、ロイシン又はバリン残基を表し；
Ｒ２は、カルボニル基及びそれが接続している炭素に対してアルファの窒素と一緒に、ロイシン、イソ−ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、バリン又はノル−バリン残基を表し；
Ｒ３は、カルボニル基及びそれが接続している炭素に対してアルファの窒素と一緒に、トレオニン又はロイシン残基を表し；
Ｒ４は、カルボニル基及びそれが接続している炭素に対してアルファの窒素と一緒に、α，γ−ジアミノ酪酸又はセリン残基を表し；
Ｒ５は、Ｃ０−１２アルキル（Ｃ４−６ヘテロシクリル）、又は
Ｃ２−１２アルキル又はＣ０−１２アルキル（Ｃ３−８シクロアルキル）を表し、ここにおいて、アルキル又はシクロアルキルは：
ｉ）一つ、二つ又は三つのヒドロキシル基、又は
ｉｉ）−ＮＲ６Ｒ７基、或いは
ｉｉｉ）一つの−ＮＲ６Ｒ７基及び一つ又は二つのヒドロキシル基、
を保有し；
Ｒ６は、水素又はＣ１−４アルキルを表し；そして
Ｒ７は、水素又はＣ１−４アルキルを表し、
Ｒ８は、水素又はメチルを表す；］
の化合物、又はこれらの医薬的に受容可能な塩。
【請求項２】
カルボニル基及びそれが接続している炭素に対してアルファの窒素と一緒のＲ１が、フェニルアラニン残基を表す、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項３】
前記フェニルアラニンが、Ｄ−フェニルアラニン残基である、請求項２に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項４】
カルボニル基及びそれが接続している炭素に対してアルファの窒素と一緒のＲ２が、ロイシン残基を表す、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項５】
カルボニル基及びそれが接続している炭素に対してアルファの窒素と一緒のＲ３が、トレオニン残基を表す、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項６】
カルボニル基及びそれが接続している炭素に対してアルファの窒素と一緒のＲ４が、α，γ−ジアミノ酪酸残基を表す、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項７】
Ｒ５が、−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）５ＣＨ３、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−（ＣＨ２）５ＮＨ２、−（ＣＨ２）７ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、及び−（ＣＨ２）７ＯＨから選択される、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項８】
Ｒ６が、水素又はメチルである、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項９】
Ｒ７が、水素又はメチルである、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１０】
Ｘが、−Ｃ（Ｏ）−である、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
２−ヒドロキシオクタノイルポリミキシンＢノナペプチド；
２−アミノエタノイルポリミキシンＢノナペプチド；
３−アミノプロパノイルポリミキシンＢノナペプチド；
３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−プロパノイルポリミキシンＢノナペプチド；
４−アミノブタノイルポリミキシンＢノナペプチド；
６−アミノヘキサノイルポリミキシンＢノナペプチド；
８−ヒドロキシオクタノイルポリミキシンＢノナペプチド；
８−アミノオクタノイルポリミキシンＢノナペプチド；
３−（Ｎ−メチルアミノ）プロパノイルポリミキシンＢノナペプチド；
２−アミノシクロペンタンカルボニルポリミキシンＢノナペプチド；
３−アミノプロパノイルコリスチン（ポリミキシンＥ）ノナペプチド；
３−ピロリジン−３−カルボニルポリミキシンＢノナペプチド；
３−アミノ−３−シクロヘキサンプロパノイルポリミキシンＢノナペプチド、
５−アミノペンタノイルポリミキシンＢノナペプチド
ヒドロキシアセチルポリミキシンＢノナペプチド
３−ヒドロキシオクタノイルポリミキシンＢノナペプチド
４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−ブタノイルポリミキシンＢノナペプチド
７−アミノヘプタノイルポリミキシンＢノナペプチド
４−モルホリニルブタノイルポリミキシンＢノナペプチド
６−ヒドロキシヘキサノイルポリミキシンＢノナペプチド
３−ヒドロキシブタノイルポリミキシンＢノナペプチド
４−（Ｎ−メチルアミノ）−ブタノイルポリミキシンＢノナペプチド、
ｔｒａｎｓ−４−アミノシクロヘキサンカルボニルポリミキシンＢノナペプチド、
４−アミノブタノイルポリミキシンＥノナペプチド、
２−ヒドロキシオクタノイルポリミキシンＥノナペプチド、
ｃｉｓ−４−アミノシクロヘキサンカルボニルポリミキシンＢノナペプチド、
４−アミノ−４−メチルペンタノイルポリミキシンＢノナペプチド
４−アミノ−５−メチルヘキサノイルポリミキシンＢノナペプチド
３−（１−ピロリジン−２−イル）−プロピオニルポリミキシンＢノナペプチド
４−アミノペンタノイルポリミキシンＢノナペプチド
ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボニルポリミキシンＢノナペプチド、
３−ヒドロキシプロパノイルポリミキシンＢノナペプチド
（２−ヒドロキシ−２−シクロヘキシル）エタノイルポリミキシンＢノナペプチド
２−アミノオクタノイルポリミキシンＢノナペプチド、又は
医薬的に受容可能なこれらの塩；
からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物又は医薬的に受容可能なその塩を、医薬的に受容可能な担体と一緒に含んでなる、医薬組成物。
【請求項１３】
治療において使用するための、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物又は医薬的に受容可能なその塩、或いは請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
細菌性感染症の治療において使用するための、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
前記細菌が多剤耐性である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
前記細菌が、グラム陰性である、請求項１４又は１５のいずれか１項に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本案件は、２０１１年１１月１８日（１８／１１／２０１１）に出願された米国特許出願６１／５６１３６１の優先権及び利益を主張するものであり、その内容は、本明細書中にその全てが参考文献として援用される。
【０００２】
本開示は、新規な化合物、前記化合物を含んでなる医薬組成物、並びに治療、例えば、特にグラム陰性細菌による微生物感染症の治療のための前記化合物及び医薬組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
感受性な個体において、ある種のグラム陰性細菌は、肺炎、尿路感染症、創傷感染症、耳感染症、眼感染症、腹腔内感染症、口腔細菌異常繁殖及び敗血症のような、重度の合併症及び感染症を起こすことができる。臨床治療における重度の細菌性感染症の治療は、抗生物質耐性によって複雑化される得る。近年、アミノグリコシド、セファロスポリン、そして更にカルバペネムのような広薬広範囲抗生物質を含む多くの種類の抗菌剤に対して耐性であるグラム陰性細菌による感染症の増加が観察されている。従って、グラム陰性細菌に対して、特に多剤耐性グラム陰性細菌に対して有効である新しい抗菌剤を確認する必要性が存在する。
【０００４】
ポリミキシンは、グラム陽性細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａによって産生された群の抗生物質である。１９４０年代後期に最初に確認されたポリミキシン、特にポリミキシンＢ及びポリミキシンＥ（コリスチン）は、グラム陰性感染症の治療において使用された。然しながら、これらの抗生物質は、腎毒性のような副作用を示した。従って、治療におけるこれらの使用は、治療の最後の手段に制約される。
【０００５】
ＷＯ２００８／０１７７３４は、少なくとも二つの、しかし三つより多くない正の電荷を保有するポリミキシン誘導体を提供することによってこの毒性問題に取組むことを試みた。これらの化合物は、減少した毒性を持つ有効な抗細菌剤であると言われている。この開示において、減少した正の電荷の数が、単離されたラットの腎臓の組織に対する化合物の親和性を減少し、これが次に腎毒性の減少に導くことができると仮定している。
【０００６】
驚くべきことに、本発明人等は、四つ又はそれより多い電荷を伴うものを含むある種の別のポリミキシン型の化合物が、適した抗細菌活性を有し、一方、更により少ない毒性、特に腎毒性を明白に示すことを見出している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際特許出願公開ＷＯ２００８／０１７７３４。
【発明の概要】
【０００８】
従って、以下の式（Ｉ）：
【０００９】
【化１】
2014533678.tif 000003
【００１０】
［式中：
Ｘは、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ２−又は−ＳＯ２−を表し；そして
Ｒ１は、カルボニル基及びそれが接続している炭素に対してアルファの窒素と一緒に、フェニルアラニン、ロイシン又はバリン残基を表し；
Ｒ２は、カルボニル基及びそれが接続している炭素に対してアルファの窒素と一緒に、ロイシン、イソ−ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、バリン又はノル−バリン残基を表し；
Ｒ３は、カルボニル基及びそれが接続している炭素に対してアルファの窒素と一緒に、トレオニン又はロイシン残基を表し；
Ｒ４は、カルボニル基及びそれが接続している炭素に対してアルファの窒素と一緒に、α，γ−ジアミノ酪酸又はセリン残基を表し；
Ｒ５は、Ｃ０−１２アルキル（Ｃ４−６ヘテロシクリル）、又は
Ｃ２−１２アルキル又はＣ０−１２アルキル（Ｃ３−８シクロアルキル）を表し、ここにおいて、アルキル又はシクロアルキルは：
ｉ）一つ、二つ又は三つのヒドロキシル基、又は
ｉｉ）−ＮＲ６Ｒ７基、或いは
ｉｉｉ）一つの−ＮＲ６Ｒ７基及び一つ又は二つのヒドロキシル基；
を保有し；
Ｒ６は、水素又はＣ１−４アルキルを表し；そして
Ｒ７は、水素又はＣ１−４アルキルを表し、
Ｒ８は、水素又はメチルを表す；］
の化合物、又はこれらの医薬的に受容可能な塩が提供される。
【００１１】
式（Ｉ）の化合物は、天然のポリミキシンは１０個のアミノ酸を含んでなるが、分子のペプチド部分は、９個のアミノ酸のみを含有することにおいて特徴づけられる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、化合物２、６、及び１４並びにコリスチンに対する０、４及び７日目におけるＮＡＧの濃度（ｎｇ／２４時間）を示す。
【図２】図２は、化合物２、６、及び１４並びにコリスチンに対する０、４及び７日目におけるアルブミンの濃度（ｎｇ／２４時間）を示す。
【図３】図３は、化合物２、６、及び１４並びにコリスチンに対する０、４及び７日目におけるシスタチンＣの濃度（ｎｇ／２４時間）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
驚くべきことに、式（Ｉ）の化合物は、有用な抗細菌活性を保持したまま、親のポリミキシン化合物より低い毒性を有するように見受けられる。
【００１４】
アシル鎖を欠損したポリミキシンナノペプチドは、減少した毒性を有するが、しかし有用な抗細菌活性を欠くことは知られている。然しながら、簡単なアシルポリミキシンＢノナペプチド誘導体の鎖長の研究（Ｋ．Ｏｋｉｍｕｒａ  ｅｔ．ａｌ，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ，２００７，８０，５４３）は、概略８個の炭素原子の最適値で、抗細菌活性に対する鎖長の重要性を示唆し、そしてアセチル誘導体が、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに対して非常に不良な活性を有することを証明した。これは、ペンタノイル及びブタノイル類似体が、活性の顕著な減少を示したアシルデカペプチド系列からの結論（Ｐ．Ｃ  ｄｅ  Ｖｉｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ，２００３，６１，２９８）と一致した。
【００１５】
本出願人等は、驚くべきことに、短いアシル鎖により置換されたアシルノナペプチド、特にアミノ置換基を保有するものを含む、本発明によるポリミキシンＢノナペプチドにおける減少した毒性を伴う良好な抗細菌活性を見出している。
【００１６】
ポリミキシン型化合物の毒性が、真核細胞の膜とのデタージェント様相互作用に起因することが疑われる。更に、ポリミキシン型化合物の腎毒性は、これらが腎細胞中に保持され、そして従って身体から排出されるより蓄積する事実に起因することができる。理論によって束縛されることを望むものではないが、本発明の化合物が、そのアルキル成分の疎水性を破壊する置換基を含んでなるＲ５基を有することが仮定される。本発明人等は、この破壊が、分子の疎水性及び親水性の特質の平衡を変化し、これは、これらが膜を形成する脂質二重層にそれら自体を整列するために十分に適していないことを意味すると信じる。次に、この膜中に整列する不能性は、より低いその中の保持時間をもたらし、そして従ってより低い毒性をもたらすことができる。
【００１７】
ポリミキシンノナペプチドは、本明細書中で使用される場合、ポリミキシンＢ又はポリミキシンＥのアミノ酸２−１０を指すことを意図している。
【００１８】
アミノ酸残基（例えばロイシン残基、等）は、本明細書中で使用される場合、水分子を失い、そしてそのカルボニル末端を経由してもう一つの成分（例えばもう一つのアミノ酸等）との結合を形成し、そして更にその窒素末端を経由してもう一つの成分（例えばもう一つのアミノ酸等）への結合を形成するアミノ酸を指すことを意図している。形成された結合は、例えばアミド結合であることができる。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、アルキルは、直鎖又は分枝鎖アルキル、例えば、制約されるものではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ブチル、ｎ−ブチル及びｔｅｒｔ−ブチルを指す。一つの態様において、アルキルは、直鎖アルキルを指す。
【００２０】
リンカー分子（即ち、置換アルキル）の文脈におけるアルキルは、その分枝及び直鎖変種を含むアルキレン断片に明確に拡大適用される。分枝は、アルキルラジカル、例えば−ＣＨ３で終結することができる。
【００２１】
ヘテロシクリルは、本明細書中で使用される場合、少なくとも一つの環の窒素原子、例えば１又は２個の環の窒素原子、例えば１個のみの環の窒素原子を含んでなり、そして所望により酸素及び硫黄から選択される更なる環の異種原子を含有していてもよい飽和の炭素環式環である。Ｃ４−６ヘテロシクリル基の例は、アゼチジン、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル及びモルホリニルを含む。一つの態様において、ヘテロシクリルは、分子の残部に窒素を経由して連結される。用語“Ｃ４−６ヘテロシクリル”において、表現Ｃ４−６は、炭素及び異種原子を含む環の原子の合計の数を表す。
【００２２】
一つの態様において、カルボニル基及びそれが接続している炭素に対してアルファの窒素と一緒のＲ１は、フェニルアラニン残基、例えばＤ−フェニルアラニン又はロイシン残基、例えばＤ−ロイシン残基を表す。
【００２３】
一つの態様において、カルボニル基及びそれが接続している炭素に対してアルファの窒素と一緒のＲ２は、ロイシン残基を表す。
【００２４】
一つの態様において、カルボニル基及びそれが接続している炭素に対してアルファの窒素と一緒のＲ３は、トレオニン残基を表す。
【００２５】
一つの態様において、カルボニル基及びそれが接続している炭素に対してアルファの窒素と一緒のＲ４は、α，γ−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）又はセリン残基、例えばＬ−Ｄａｂ又はＤ−Ｓｅｒを表す。
【００２６】
一つの態様において、Ｘは、−Ｃ（＝Ｏ）を表す。
【００２７】
一つの態様において、Ｒ５は、アゼチジン、ピロリジニル又はピペリジニルを表す。
【００２８】
一つの態様において、Ｒ５のＣ２−１２アルキル成分は、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ７アルキル、Ｃ８アルキル、Ｃ９アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１１アルキル又はＣ１２アルキルである。
【００２９】
一つの態様において、Ｒ５のＣ２−１２アルキル成分は、Ｃ３−１０アルキル、例えばＣ４−８アルキルである。
【００３０】
一つの態様において、Ｒ５は、Ｃ３−８シクロアルキル、例えば、Ｃ５シクロアルキル又はＣ６シクロアルキルである。
【００３１】
一つの態様において、Ｒ５は、一つの置換基を保有する。
【００３２】
一つの態様において、Ｒ５は、二つの置換基を保有する。
【００３３】
一つの態様において、Ｒ５は、三つの置換基を保有する。
【００３４】
一つの態様において、Ｒ５は、一つ、二つ又は三つのヒドロキシル基、例えば一つのヒドロキシル基を保有する。
【００３５】
一つの態様において、Ｒ５は、一つのアミン基、例えば一つのアミンを保有するＣ２−１２アルキル、例えば一つのアミンを保有するＣ２−４アルキル、を保有する。
【００３６】
一つの態様において、Ｒ５は、一つ、二つ又は三つのヒドロキシル基、例えば一つのヒドロキシルを保有する。
【００３７】
一つの態様において、Ｒ５は、一つのアミン基及び一つのヒドロキシル基を保有する。
【００３８】
一つの態様において、Ｒ５は、一つのアミン基及び二つのヒドロキシル基を保有する。
【００３９】
Ｒ５が一つ又はそれより多いヒドロキシルを保有する一つの態様において、アルキル鎖は、Ｃ５−１２である。
【００４０】
一つの態様において、Ｒ５は、一つより多いアミン基を保有しない。
【００４１】
Ｒ５が一つより多い置換基を保有する一つの態様において、置換基は、同一炭素原子上に位置しない。
【００４２】
一つの態様において、少なくとも一つのＲ５置換基（例えば一つの置換基）は、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ７アルキル、Ｃ８アルキル、Ｃ９アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１１アルキル又はＣ１２アルキル上に位置する。
【００４３】
一つの態様において、少なくとも一つのＲ５置換基（例えば一つの置換基）は、直鎖アルキル又は分枝鎖アルキル、例えば直鎖アルキルの末端炭素上にある。
【００４４】
置換基が直鎖アルキルの末端炭素（又は更に分枝の末端炭素）上にある場合、アルキル鎖の残部（又は更に分枝のアルキル連結部分）は、アルキレン連結を形成するものである。従って、用語アルキルは、本明細書中で使用される場合、実際に、アルキル分子の一部又は全てが、実際にアルキレン分子である状況を包含する包括的用語である。
【００４５】
末端炭素は、本明細書中で使用される場合、これが置換基を保有しない場合、−ＣＨ３であるものである炭素を指すことを意図している。
【００４６】
一つの態様において、少なくとも一つ（例えば一つのみ）の置換基は、末端炭素上になく、即ち、−ＣＨ（置換基）−である。
【００４７】
一つの態様において、Ｒ６は、水素である。
【００４８】
一つの態様において、Ｒ６は、Ｃ１−４アルキル、例えば、Ｃ１アルキル、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル又はＣ４アルキル、例えばメチルである。
【００４９】
一つの態様において、Ｒ７は、水素である。
【００５０】
一つの態様において、Ｒ７は、Ｃ１−４アルキル、例えば、Ｃ１アルキル、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル又はＣ４アルキル、例えばメチルである。
【００５１】
一つの態様において、Ｒ６及びＲ７は、メチルを表す。
【００５２】
一つの態様において、Ｒ６はＨを表し、そしてＲ７はメチルを表す。
【００５３】
一つの態様において、Ｒ５は、−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）５ＣＨ３、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−（ＣＨ２）５ＮＨ２、−（ＣＨ２）７ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、及び−（ＣＨ２）７ＯＨから選択される。
【００５４】
一つの態様において、Ｒ８は、メチルである。
【００５５】
一つの態様において、Ｒ８は、水素である。
【００５６】
一つの態様において、化合物は、以下の式（Ｉａ）：
【００５７】
【化２】
2014533678.tif 000004
【００５８】
のもの又は医薬的に受容可能なその塩である。
【００５９】
Ｒ１（随伴基と一緒に）が、フェニルアラニンを表し、Ｒ２（随伴基と一緒に）が、ロイシンを表し、Ｒ３（随伴基と一緒に）が、トレオニンを表し、Ｒ４（随伴基と一緒に）が、α，γ−ジアミノ酪酸を表し；そしてＲ８が、メチルを表す（そして随伴基と一緒にトレオニンを表す）場合、式（Ｉａ）の化合物は、ポリミキシンＢのアミノ酸２−１０を有するポリミキシンノナペプチドである。
【００６０】
Ｒ１（随伴基と一緒に）が、ロイシンを表し、Ｒ２（随伴基と一緒に）が、ロイシンを表し、Ｒ３（随伴基と一緒に）が、トレオニンを表し、Ｒ４（随伴基と一緒に）が、α，γ−ジアミノ酪酸を表し；そしてＲ８が、メチルを表す（そして随伴基と一緒にトレオニンを表す）場合、式（Ｉａ）の化合物は、ポリミキシンＥのアミノ酸２−１０を有するポリミキシンノナペプチドである。
【００６１】
一つの態様において、式（Ｉ）の化合物は、三つの正の電荷を有する。
【００６２】
一つの態様において、式（Ｉ）の化合物は、四つ又は五つ、例えば四つの正の電荷を有する。
【００６３】
一つの態様において、式（Ｉ）の化合物は、五つの正の電荷を有する。
【００６４】
一つの態様において、式（Ｉ）の化合物は、六つの正の電荷を有する。
【００６５】
一つの態様において、化合物は：
２−ヒドロキシオクタノイルポリミキシンＢノナペプチド；
２−アミノエタノイルポリミキシンＢノナペプチド；
３−アミノプロパノイルポリミキシンＢノナペプチド；
３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−プロパノイルポリミキシンＢノナペプチド；
４−アミノブタノイルポリミキシンＢノナペプチド；
６−アミノヘキサノイルポリミキシンＢノナペプチド；
８−ヒドロキシオクタノイルポリミキシンＢノナペプチド；
８−アミノオクタノイルポリミキシンＢノナペプチド；
３−（Ｎ−メチルアミノ）プロパノイルポリミキシンＢノナペプチド；
２−アミノシクロペンタンカルボニルポリミキシンＢノナペプチド；
３−アミノプロパノイルコリスチン（ポリミキシンＥ）ノナペプチド；
３−ピロリジン−３−カルボニルポリミキシンＢノナペプチド；
３−アミノ−３−シクロヘキサンプロパノイル］ポリミキシンＢノナペプチド、又は
医薬的に受容可能なこれらの塩；
から選択される。
【００６６】
更に又は別に、化合物は：
５−アミノペンタノイルポリミキシンＢノナペプチド
ヒドロキシアセチルポリミキシンＢノナペプチド
３−ヒドロキシオクタノイルポリミキシンＢノナペプチド
４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−ブタノイルポリミキシンＢノナペプチド
７−アミノヘプタノイルポリミキシンＢノナペプチド
４−モルホリニルブタノイルポリミキシンＢノナペプチド
６−ヒドロキシヘキサノイルポリミキシンＢノナペプチド
３−ヒドロキシブタノイルポリミキシンＢノナペプチド
４−（Ｎ−メチルアミノ）−ブタノイルポリミキシンＢノナペプチド、
ｔｒａｎｓ−４−アミノシクロヘキサンカルボニルポリミキシンＢノナペプチド、
４−アミノブタノイルポリミキシンＥノナペプチド、
２−ヒドロキシオクタノイルポリミキシンＥノナペプチド、
ｃｉｓ−４−アミノシクロヘキサンカルボニルポリミキシンＢノナペプチド、
４−アミノ−４−メチルペンタノイルポリミキシンＢノナペプチド
例えば４−（Ｒ）−アミノ−５−メチルヘキサノイルポリミキシンＢノナペプチドを含む４−アミノ−５−メチルヘキサノイルポリミキシンＢノナペプチド
例えば３−（Ｓ）−（１−ピロリジン−２−イル）−プロピオニルポリミキシンＢノナペプチドを含む３−（１−ピロリジン−２−イル）−プロピオニルポリミキシンＢノナペプチド
例えば４−（Ｓ）−アミノペンタノイルポリミキシンＢノナペプチドを含む４−アミノペンタノイルポリミキシンＢノナペプチド
ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボニルポリミキシンＢノナペプチド、
３−ヒドロキシプロパノイルポリミキシンＢノナペプチド
（２−ヒドロキシ−２−シクロヘキシル）エタノイルポリミキシンＢノナペプチド
２−アミノオクタノイルポリミキシンＢノナペプチド、又は
医薬的に受容可能なこれらの塩
から選択される。
【００６７】
式（Ｉ）の化合物の塩の例は、全ての医薬的に受容可能な塩、例えば、制約されるものではないが、無機強酸の酸付加塩、例えばＨＣｌ及びＨＢｒ塩、並びに有機強酸の付加塩、例えばメタンスルホン酸塩を含む。塩の更なる例は、硫酸塩及び酢酸塩、例えばトリフルオロ酢酸塩又はトリクロロ酢酸塩を含む。
【００６８】
一つの態様において、本開示の化合物は、硫酸塩として提供される。
【００６９】
本開示の化合物は、更にプロドラッグとして処方することができる。プロドラッグは、一つ又はそれより多いアミノ基が、ｉｎ  ｖｉｖｏで開裂して、生物学的に活性な化合物を放出することができる基で保護された本明細書中に記載される抗細菌性化合物を含むことができる。一つの態様において、プロドラッグは、“アミンプロドラッグ”である。アミンプロドラッグの例は、例えば、Ｂｅｒｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２００６，５０，１９５３中に記載されているようなスルホメチル、又は例えば、Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００２，４５（１９）４２６４中に記載されているようなＨＳＯ３−ＦＭＯＣ、及びこれらの塩を含む。アミンプロドラッグの更なる例は、Ｋｒｉｓｅ及びＯｌｉｙａｉによって、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ，２００７，５（２），１０１−１３１中に与えられている。
【００７０】
一つの態様として、本発明の化合物は、プロドラッグとして提供される。
【００７１】
本明細書中の開示は、式（Ｉ）の化合物の溶媒和物に拡大適用される。溶媒和物の例は、水和物を含む。
【００７２】
本開示の化合物は、規定された原子が、天然に存在する又は天然に存在しない同位体によって置換されているものを含む。一つの態様において、同位体は、安定な同位体である。従って、本開示の化合物は、例えば重水素を含有する化合物等を含む。
【００７３】
本発明は、ポリミキシンＢのアミノ酸２−１０を有する化合物、又は以下に記載されるようなその変種を提供し、ここにおいて、ポリミキシンＢの残基２に対応するアミノ酸のＮ末端が、Ｒ５−Ｘ−基で修飾されている。可変基Ｒ５及びＸは、上記で定義されたとおりである。本発明の化合物において、ポリミキシンＢの残基１は非存在である。
【００７４】
化合物の変種は、一つ又はそれより多い、例えば、１から５まで、例えば１、２、３又は４個のアミノ酸が、もう一つのアミノ酸で置換されている化合物である。アミノ酸は、２、３、６、７又は１０位（ポリミキシンＢで使用される残基の番号付けを指す）から選択される位置にある。置換は、もう一つのアミノ酸又は立体異性体のためであることができる。
【００７５】
２位において、変種は、Ｄ−Ｓｅｒ置換を有することができる。
【００７６】
３位において、変種は、Ｓｅｒ置換を有することができる。
【００７７】
６位において、変種は、Ｌｅｕ又はＶａｌ置換を有することができる。
【００７８】
７位において、変種は、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ又はＮｖａ（ノルバリン）置換を有することができる。
【００７９】
１０位において、変種は、Ｌｅｕ置換を有することができる。
【００８０】
ポリミキシンＥ化合物は、６位においてＬｅｕ置換を有するポリミキシンＢ化合物とみなすことができる。
【００８１】
便宜上、本発明の化合物は、２、３、６、７又は１０位におけるアミノ酸が、それぞれＲ８、Ｒ４、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３基の特質によって決定される式（Ｉ）によって表される。先に記載した変種を含む本発明の化合物は、生物学的に活性である。
【００８２】
式（Ｉ）の化合物は、当業者にとって既知の方法を使用して、慣用的なペプチド合成法によって調製することができる。適した方法は、例えばＹａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．６４，２００４，４３−５０によって記載されているような溶液相合成、又はｄｅ  Ｖｉｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ，６１，２００３，２９８−３０６、及びＶａａｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，５２，２００８．３２２９−３２３６によって記載されているような固相合成法によるものを含む。これらの方法は、適した保護戦略、及び環化工程のための方法を含む。あるいは、化合物は、容易に入手可能なポリミキシンから、例えばポリミキシンのＮ−末端アミノ酸（残基１）の除去によって調製することができる。このような方法は、ポリミキシンＢ及びＥの残基２−１０に基づく化合物の調製のために本明細書中に記載される。
【００８３】
本発明は、更に以下の式（ＩＩ）：
【００８４】
【化３】
2014533678.tif 000005
【００８５】
［式中：
Ｒ１は、カルボニル基及びそれが接続している炭素に対してアルファの窒素と一緒に、フェニルアラニン、ロイシン又はバリン残基を表し；
Ｒ２は、カルボニル基及びそれが接続している炭素に対してアルファの窒素と一緒に、ロイシン、イソ−ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、バリン又はノル−バリン残基を表し；
Ｒ３は、カルボニル基及びそれが接続している炭素に対してアルファの窒素と一緒に、トレオニン又はロイシン残基を表し；
Ｒ４は、カルボニル基及びそれが接続している炭素に対してアルファの窒素と一緒に、α，γ−ジアミノ酪酸又はセリン残基を表す；］
の化合物又は保護されたその誘導体を、以下の式（ＩＩＩ）：
Ｒ５Ｘ１−（Ｌ）ｍ    （ＩＩＩ）
［式中、
Ｒ５は、式（Ｉ）の化合物のために先に定義され；
Ｘ１は、式（ＩＩ）の化合物とカップリングした後、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ２−又は−ＳＯ２に転換されるか、或いは転換されることができる基を表し；そして
Ｌは、脱離基を表し、
ｍは、０又は１を表す；］
の化合物又は保護されたその誘導体と反応させ、所望により、式（Ｉ）の化合物を得るための脱保護によって追従されることによる、ある種の式（Ｉ）の化合物又は医薬的に受容可能なこれらの塩を調製する方法を提供する。
【００８６】
一般的に、式（ＩＩ）の化合物は、提唱された反応に関与することが好ましくない全ての三つの遊離のアミンが、適した保護基、例えばｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、又は他の適したアミン保護基、例えば“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”ｂｙ  Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９中に記載されているものによって保護された形態で使用されるものである。
【００８７】
必要な化学反応後、式（Ｉ）の化合物を得るための脱保護を、標準的な方法、例えば“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”ｂｙ  Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９中に記載されているものを使用して行うことができる。
【００８８】
Ｘが−ＮＨＣ（＝Ｏ）−である式（Ｉ）の化合物は、イソシアン酸に対応する式（ＩＩＩ）の化合物、例えば：
Ｒ５−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ  （式ＩＩＩａ）
［式中、Ｒ５は、上記で定義されている；］
を使用して合成することができる。
【００８９】
反応は、適した溶媒、例えばジクロロメタン中で、所望により塩基、例えばトリエチルアミン又はＮ−エチルジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）の存在中で行うことができる。
【００９０】
あるいは、Ｘが−ＮＨＣ（＝Ｏ）−である式（Ｉ）の化合物は、以下の式（ＩＩＩｂ）：
【００９１】
【化４】
2014533678.tif 000006
【００９２】
［式中、Ｒ５は、先に定義されている；］
の化合物を使用して、Ｇａｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００５，７０，６９６０中に記載されているように塩基の存在中で合成することができる。
【００９３】
Ｘが、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、又は−ＳＯ２−である式Ｉの化合物は、Ｒ５が本明細書中で先に定義したとおりであり、Ｘ１が−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、又は−ＳＯ２−であり、そしてＬが脱離基、例えばＣｌ又はＢｒを表す、式（ＩＩＩ）の化合物を使用して合成することができる。
【００９４】
反応は、適した溶媒、例えば極性の非プロトン性溶媒、例えばジクロロメタン中で行うことができる。
【００９５】
Ｘが、−Ｃ（＝Ｏ）である式（Ｉ）の化合物は、以下の式（ＩＩＩｃ）：
Ｒ５−ＣＯＯＨ  （ＩＩＩｃ）
［式中、Ｒ５は、上記で定義される；］
の化合物を使用して、例えばカップリング剤、例えばＨＡＴＵ、（ヘキサフルオロリン酸Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム）、ＨＢＴＵ（（ヘキサフルオロリン酸２−（１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム）、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）、又はＰＹＢＯＰ（ヘキサフルオロリン酸ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリ−ピロリドノ−ホスホニウム）の存在中で、極性溶媒中の塩基性条件下で調製することができる。
【００９６】
Ｘが、−ＣＨ２−である式（Ｉ）の化合物は、以下の式（ＩＩＩｄ）：
Ｒ５−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ  （ＩＩＩｄ）
［式中、Ｒ５は、本明細書中で先に記載したとおりである；］
のアルデヒドを使用して、例えば還元剤、例えばトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、又はポリマー支持シアノ水素化ホウ素の存在中で、溶媒、例えばメタノール、ジクロロメタン、ＤＭＦ中で、Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗｉｌｅｙ，２００１中に記載されているような条件を使用して調製することができる。
【００９７】
一つの側面において、本発明は、例えばその治療的に有効な量の式（Ｉ）の化合物、及び医薬的に受容可能な賦形剤、希釈剤及び／又は担体（これらの組合せを含む）を含んでなる医薬組成物を提供する。
【００９８】
投与（供給）の経路は、制約されるものではないが：経口（例えば、乾燥粉末／自由流動粒子製剤、錠剤、カプセルとして、又は摂取可能な溶液又は懸濁液として）頬側、舌下の一つ又はそれより多くを含む。
【００９９】
本開示の組成物は、非経口、頬側、直腸、局所、インプラント、眼、鼻腔、直腸又は尿生殖器使用のために特に処方された形態のものを含む。本発明の一つの側面において、薬剤は、経口的に供給され、従って、薬剤は、経口供給のために適した形態である。
【０１００】
幾つかの場合、本開示の化合物を、局所、非経口（例えば注射用形態によって）又は粘膜（例えば鼻腔噴霧又は吸入のためのエアゾールとして）を含む経皮経路、鼻腔、消化管、脊髄内、腹腔内、筋肉内、静脈内、子宮内、眼内、皮内、頭蓋内、気管内、膣内、脳室内、脳内、皮下、眼（硝子体内又は前房内を含む）によって供給することが可能である。
【０１０１】
異なった供給系又は異なった投与の経路によって、異なった組成物／製剤の要求が存在することができる。例として、本開示の医薬組成物は、ミニポンプを使用して又は粘膜経路によって、例えば鼻腔噴霧又は吸入のためのエアゾール、又は摂取可能な溶液として、或いは組成物が、例えば静脈内、筋肉内又は皮下経路による供給のための注射用形態で処方される非経口的に供給するために処方することができる。あるいは、製剤は、両方の経路によって供給されるように設計することができる。適宜に、医薬組成物は、吸入によって、座薬又はペッサリーの形態で、ローション、溶液、クリーム、軟膏又は散布粉の形態で局所的に、皮膚貼布の使用によって、賦形剤、例えばデンプン又はラクトースを含有する錠剤、或いは単独で又は賦形剤との混合物のいずれかのカプセル又はオビュール（ｏｖｕｌｅｓ）の形態で、或いは芳香剤又は着色剤を含有するエリキシル、溶液又は懸濁液の形態で経口的に投与することができるか、或いはこれらは、非経口的に、例えば静脈内、筋肉内又は皮下に注射することができる。
【０１０２】
非経口投与のために、組成物は、他の物質、例えば溶液を血液と等張にするために十分な塩又は糖類、特に単糖類を含有することができる滅菌水溶液の形態で最良に使用することができる。非経口投与の例は：静脈内、動脈内、腹腔内、くも膜下腔内、脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内又は皮下的に薬剤を投与することの一つ又はそれより多く、及び／又は注入技術を使用することを含む。
【０１０３】
一つの態様において、本発明の化合物の製剤は、リポソーム製剤として提供される。リポソームは、小さいマイクロメーターの範囲から数十マイクロメートルのサイズで変化することができ、単層リポソームは、疾病の治療のための病理学的分野におけるその表面接続及び蓄積を可能にするその表面に接続した各種の標的リガンドを伴う、典型的には小さいサイズの範囲である。リポソームは、二層の脂質から製造される人工的に調製された小胞である。
【０１０４】
一つの態様において、製剤は、注入又はゆっくりした注射による供給のために適合される。
【０１０５】
一つの態様において、製剤は、ボーラス注射による供給のために適合される。
【０１０６】
頬側又は舌下投与にために、組成物は、錠剤又はロゼンジの形態で投与することができ、これは、慣用的な様式で処方することができる。
【０１０７】
本開示の化合物は、錠剤、カプセル、オビュール、エリキシル、溶液又は懸濁液の形態で投与（例えば経口又は局所的に）することができ、これは、即時、遅延、改変、継続、パルス又は制御放出の適用のために芳香又は着色剤を含有することができる。
【０１０８】
本開示の化合物は、更に経口又は頬側投与のために適した形態で、例えば溶液、ゲル、シロップ、口腔洗浄剤又は懸濁液、或いは使用の前の水又は他の適したベヒクルによる構成のための乾燥粉末の形態で、所望により芳香及び着色剤を伴って、ヒト又は動物の使用のために提供することができる。
【０１０９】
固体組成物、例えば錠剤、カプセル、ロゼンジ、パステル、ピル、粉末、ペースト、顆粒、ブレット（ｂｕｌｌｅｔｓ）又はプレミックス製剤を更に使用することができる。経口使用のための固体又は液体組成物は、当技術において公知の方法によって調製することができる。このような組成物は、更に一つ又はそれより多い固体又は液体の形態であることができる医薬的に受容可能な担体及び賦形剤を含有することができる。
【０１１０】
錠剤は、賦形剤、例えば微結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム、並びにグリシン、マンニトール、アルファデンプン、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、崩壊剤、例えばデンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム及びある種の複合ケイ酸塩、並びに顆粒化結合剤、例えばポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン及びアラビアゴムを含有することができる。
【０１１１】
更に、潤滑剤、例えばステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル及びタルクを含むことができる。
【０１１２】
類似の種類の固体組成物は、更にゼラチン又はＨＰＭＣ（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）カプセル中で投与することができる。これに関して適した賦形剤は、微結晶セルロース、ラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム並びに、マンニトール、アルファデンプン、コーンスターチ、ジャガイモデンプン或いは高分子量ポリエチレングリコールを含む。
【０１１３】
水性懸濁液及び／又はエリキシルのために、薬剤は、各種の甘味又は芳香剤、着色物質又は染料と、乳化及び／又は懸濁剤を伴って、そして希釈剤、例えば水、エタノール、プロピレングリコール及びグリセリン、並びにこれらの組合せを伴って混合することができる。
【０１１４】
カプセルは、それぞれが一つ又はそれより多い本開示の塩及び所望により担体を含んでなる粉末（医薬単独又は選択された充填剤（類）とのブレンドとしての）で、又は別の方法として、液体で充填することができる。カプセルが粉末で充填される場合、本開示の塩及び／又は担体は、適当な粒子サイズを持つ物質を得るために粉砕又は微粒子化することができる。
【０１１５】
あるいは、錠剤又はカプセルは、適宜に、もう一つのカプセル（好ましくはＨＰＭＣカプセル、例えばＣａｐｓｕｇｅｌ（登録商標））に充填して、カプセル中の錠剤又はカプセル中のカプセルのいずれかの構造を得ることができ、これは、患者に投与された場合、消化管内で制御された溶解をもたらし、これによって腸溶性被覆と類似の効果が得られる。
【０１１６】
従って、一つの側面において、本開示は、例えば製剤が腸溶性被覆を有するような、本開示の塩の固体の剤形を提供する。
【０１１７】
もう一つの側面において、本開示は、例えばカプセル中の錠剤又はカプセル中のカプセルとして、外部層としての保護カプセルを含んでなる固体の剤形を提供する。腸溶性被覆は、被覆されない製剤より改良された安定性を提供することができる。
【０１１８】
本開示の化合物は、更に液体水薬、例えば活性成分の溶液、懸濁液又は分散物の形態の動物用医薬中で、医薬的に受容可能な担体又は賦形剤と一緒に経口的に投与することができる。
【０１１９】
本発明の化合物は、更に例えば、例えばヒト又は動物の医薬中で使用するための慣用的な座薬基剤を含有する座薬として、或いは例えば慣用的なペッサリー基剤を含有するペッサリーとして処方することができる。
【０１２０】
一つの態様において、製剤は、吸入を含む局所投与のための製剤として提供される。
【０１２１】
適した吸入用製剤は、吸入用散剤、噴射用ガスを含有する計量されるエアゾール又は噴射用ガスを含まない吸入用溶液を含む。活性物質を含有する本開示による吸入用散剤は、上述の活性物質のみか、又は上述の活性物質の生理学的に受容可能な賦形剤との混合物からなることができる。
【０１２２】
これらの吸入用散剤は、単糖類（例えばグルコース又はアラビノース）、二糖類（例えばラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ−及び多糖類（例えばデキストラン）、ポリアルコール（例えばソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）又はこれらのお互いの混合物を含むことができる。好ましくは、単糖又は二糖類が使用される、ラクトース又はグルコースの、特に排他的ではないが、これらの水和物の形態における使用。
【０１２３】
肺における体積のための粒子は、１０ミクロンより小さい、例えば１−９ミクロン、適当には０．１から５μｍまで、特に好ましくは１から５μｍまでの粒子サイズを必要とする。
【０１２４】
吸入用エアゾールを調製するために使用することができる噴射用ガスは、従来に技術から知られている。適した噴射用ガスは、炭化水素、例えばｎ−プロパン、ｎ−ブタン又はイソブタン及びハロ炭化水素、例えばメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン又はシクロブタンの塩化及び／又はフッ化誘導体の中から選択される。上述の噴射用ガスは、これら自体又はこれらの混合物で使用することができる。
【０１２５】
特に適した噴射用ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ及びＴＧ２２７の中から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上述のハロゲン化炭化水素の中で、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）並びにこれらの混合物が本発明の製剤中で使用するために適している。
【０１２６】
噴射用ガスを含有する吸入用エアゾールは、更に他の成分、例えば共溶媒、安定剤、表面活性剤（界面活性剤）、抗酸化剤、潤滑剤及びｐＨを調節するための手段を含有することができる。全てのこれらの成分は、当技術において既知である。
【０１２７】
本発明による噴射用ガスを含有する吸入用エアゾールは、５重量％までの活性物質を含有することができる。本開示によるエアゾールは、例えば０．００２ないし５重量％、０．０１ないし３重量％、０．０１５ないし２重量％、０．１ないし２重量％、０．５ないし２重量％又は０．５ないし１重量％の活性（物質）（ａｃｔｉｖｅ）を含有することができる。
【０１２８】
本開示の塩は、更に他の治療剤との組合せで使用することができる。従って、本開示は、更なる側面において、本開示の塩を、更なる治療剤と一緒に含んでなる組合せを提供する。組合せは、例えば式（Ｉ）の化合物の塩及び抗生物質、例えばバンコマイシン、ホスホマイシン、リファマイシン、ベータラクタム（例えばセファロスポリン又はカルバペネム）、アミノグルコシド、マクロライド、テトラサイクリン、リポペプチド、オキサゾリジノン、及び／又は抗炎症剤、例えばステロイドの組合せであることができる。組合せは、同時処方剤として又は別個の製剤として一緒に簡単に包装して、同時又は連続供給のために提供することができる。
【０１２９】
一つの態様において、更なる治療剤と組合せた本開示の塩が提供される。
【０１３０】
組合せの化合物／塩の全てが、同一経路によって投与される必要がないことは理解されることである。従って、治療が一つより多い活性成分を含んでなる場合、これらの成分は異なった経路によって投与することができる。
【０１３１】
このような組合せの個々の成分は、連続的に又は同時に、別個の又は組み合わせられた医薬製剤のいずれかを、いずれもの好都合な経路によって投与することができる。
【０１３２】
投与が連続的である場合、本開示の塩又は第２の治療剤のいずれかを最初に投与することができる。投与が同時である場合、組合せは、同一の又は異なった医薬組成物いずれかの中で投与することができる。
【０１３３】
上記で言及された組合せは、好都合には医薬製剤の形態の使用のために提供することができ、そして従って、上記で定義したような組合せを医薬的に受容可能な担体又は賦形剤と一緒に含んでなる医薬剤剤は、本開示の更なる側面を構成する。
【０１３４】
同一製剤中に組合された場合、二つの成分／塩が安定で、そして互いに、そして製剤の他の成分と適合性でなければならないことは認識されるものである。別個に処方された場合、これらは、いずれもの好都合な処方で、当技術においてこのような化合物に対して既知であるような様式で提供することができる。
【０１３５】
組成物は、０．０１−９９％の活性物質を含有することができる。例えば、局所投与のために、組成物は、一般的に０．０１−１０％、更に例えば０．０１−１％の活性物質を含有するものである。
【０１３６】
本開示の塩が、同一疾病状態に対して活性な第２の治療剤との組合せで使用される場合、それぞれの化合物／塩の投与量は、化合物／塩が単独で使用される場合に使用されるものと同一であるか又は異なっていることができる。適当な投与量は、当業者によって容易に認識されるものである。治療において使用するために必要な本開示の塩の量が、治療される症状の特質、並びに患者の年齢及び症状で変化するものであり、そして最終的に担当医師又は獣医師の判断によるものであることも更に認識されるものである。
【０１３７】
典型的には、医師が個々の患者に対して最も適したものである実際の投与量を決定するものである。いずれもの特定の個体に対する具体的な投与量レベル及び投与の頻度は、変化することができ、そして使用される具体的な塩の活性、その塩の代謝安定性及び作用の長さ、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食餌、投与のモード及び時間、排出の速度、薬物の組合せ、特定の症状の重篤度、及び個体が受けている治療を含む各種の因子に依存するものである。
【０１３８】
ヒトに対する経口及び非経口投与のために、薬剤の日量のレベルは、一回又は分割投与であることができる。全身性投与のために、成人のヒトの治療のために使用されるような日量は、２−１００ｍｇ／Ｋｇ体重の範囲、例えば５−６０ｍｇ／Ｋｇ体重であるものであり、これは、例えば、投与の経路及び患者の症状によるが、一日に１ないし４回投与で投与することができる。組成物が投与量単位を構成する場合、それぞれの単位は、好ましくは１００ｍｇないし１ｇの活性成分を含有するものである。治療の期間は、任意の日数ではなく反応の速度によって指示されるものである。
【０１３９】
一つの態様において、治療計画は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１日間又はそれより多く継続される。
【０１４０】
先に記載したように、本開示の塩は、ヒト及び／又は動物の治療又は予防において使用することができる。
【０１４１】
本発明によって更に医薬組成物を調製する方法が提供され、この方法は、本開示の塩又は医薬的に受容可能なその誘導体を、医薬的に受容可能な賦形剤、希釈剤及び／又は担体と一緒に混合することを含んでなる。
【０１４２】
もう一つの側面において、本発明は、治療において、そして特に感染症、例えば細菌性感染症、例えばグラム陰性細菌性感染症の治療において使用するための、式（Ｉ）の化合物又は医薬的に受容可能なその塩、或いは同一物を含んでなる組成物を提供する。
【０１４３】
一つの態様において、本開示の化合物及び組成物は、肺炎、尿路感染症、創傷感染症、耳感染症、眼感染症、腹腔内感染症、細菌異常繁殖及び／又は敗血症の治療において有用である。
【０１４４】
一つの態様において、化合物は、多剤耐性である細菌による感染症の治療において有用である。
【０１４５】
グラム陰性細菌の例は、制約されるものではないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ種、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ及び他の腸内細菌科、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ、酢酸菌、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ及びアルファ−プロテオバクテリア例えばＷｏｌｂａｃｈｉａ、並びに多くの他のものを含む。グラム陰性細菌の他の注目すべき群は、シアノバクテリア、スピロヘータ、緑色硫黄細菌及び緑色非硫黄細菌を含む。
【０１４６】
医学的に関連するグラム陰性球菌は、三つの生物体を含み、これらは、性行為感染症（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、及び呼吸器症状（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）を起こす。
【０１４７】
医学的に関連するグラム陰性桿菌は、多数の種を含む。これらの幾つかは、主に呼吸器の問題（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、主に泌尿器の問題（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、及び主に消化器の問題（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）を起こす。
【０１４８】
院内感染症に関係するグラム陰性細菌は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉを含み、これは、菌血症、二次髄膜炎、及び病院施設の集中治療室の人工呼吸器関連肺炎を起こす。
【０１４９】
一つの態様において、本発明の化合物及び組成物は、次のグラム陰性細菌：Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ：Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ：Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ、Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ：Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌａ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｔｕａｒｔｉｉ、Ｐｒｏｔｅｕｓ：、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓの一つ又はそれより多くの感染症の治療において有用である。
【０１５０】
一つの態様において、式（Ｉ）の化合物又は医薬的に受容可能なその塩、或いは同一物を含んでなる組成物は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染症を含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ感染症、例えば皮膚及び軟組織感染症、消化器感染症、尿路感染症、肺炎及び敗血症の治療のために有用である。
【０１５１】
一つの態様において、式（Ｉ）の化合物又は医薬的に受容可能なその塩、或いは同一物を含んでなる組成物は、肺炎、尿路感染症及び敗血症に対するＡ．ｂａｕｍａｎｉｉ感染症を含むＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ感染症の治療のために有用である。
【０１５２】
一つの態様において、式（Ｉ）の化合物又は医薬的に受容可能なその塩、或いは同一物を含んでなる組成物は、肺炎、尿路感染症、髄膜炎及び敗血症に対するＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染症を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ感染症の治療のために有用である。
【０１５３】
一つの態様において、式（Ｉ）の化合物又は医薬的に受容可能なその塩、或いは同一物を含んでなる組成物は、菌血症、胆嚢炎、胆管炎、尿路感染症、新生児髄膜炎及びニューモニエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対するＥ． ｃｏｌｉ感染症を含むＥ． ｃｏｌｉ感染症の治療のために有用である。
【０１５４】
一つの態様において、式（Ｉ）の化合物又は医薬的に受容可能なその塩、或いは同一物を含んでなる組成物は、長期の治療のために有用であることができる。
【０１５５】
一つの側面において、式（Ｉ）の化合物又は同一物を含んでなる組成物が、上記で定義した指示の一つ又はそれより多くのための医薬の製造のために提供される。
【０１５６】
一つの側面において、治療的に有効な量の式（Ｉ）の化合物又は医薬的に受容可能なその塩、或いは同一物を含んでなる組成物を、例えば、本明細書中で記載したような感染症の治療のために、それを必要とする患者（ヒト又は動物）に投与する工程を含んでなる治療の方法が提供される。
【０１５７】
技術的に適当である場合、態様を組合せることができ、そして従って開示は、本明細書中で提供される態様の全ての並べ替え／組合せに拡大適用される。
【０１５８】
式（Ｉ）の化合物に与えられる優先度は、技術的に適当である場合、本明細書中で開示される本発明の他の化合物に対して同等に適用することができる。
【０１５９】
略語        意味
ＰＭＢＮ    ポリミキシンＢノナペプチド
Ｔｈｒ      トレオニン
Ｓｅｒ      セリン
ＤＳｅｒ    Ｄ−セリン
Ｌｅｕ      ロイシン
Ｉｌｅ      イソロイシン
Ｐｈｅ      フェニルアラニン
ＤＰｈｅ    Ｄ−フェニルアラニン
Ｖａｌ      バリン
Ｄａｂ      α，γ−ジアミノ酪酸
ＤＩＰＥＡ  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン。
【実施例】
【０１６０】
中間体１．ポリミキシンＢノナペプチド
ポリミキシンＢ（２０ｇ）、固定化パパイン（１８５ＥＬＵ／ｇ）、リン酸カリウム緩衝液（２５ｍＭ；ｐＨ７、１．２５Ｌ）、塩化カリウム（３０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）及びシステイン（１ｍＭ）の混合物を、３７℃で穏やかに撹拌しながら１８時間インキュベートした。反応の進行を、ＬＣ−ＭＳによって、表１に概略示した条件を使用してモニターした。固定化パパインを濾過によって除去し、そして濾液を真空中で濃縮して、固体の残渣を残し、これを、１０％メタノール水溶液中に再懸濁し、そして室温で一晩放置した。上清をデカントし、そして真空中で濃縮した。ポリミキシンＢノナペプチドを、残渣から、Ｃ１８シリカのＳＰＥによって、０−１０％メタノール水溶液で溶出して精製した。適当な画分の蒸発により、生成物を白色の固体として得た。ｍ／ｚ  ４８２、［Ｍ＋２Ｈ］２＋。
【０１６１】
【表１】
2014533678.tif 000007
【０１６２】
中間体２．テトラ−（Ｂｏｃ）ポリミキシンＢノナペプチド
【０１６３】
【化５】
2014533678.tif 000008
【０１６４】
ポリミキシンＢノナペプチドのＤａｂ残基上の遊離のγ−アミノ基の選択的ＢＯＣ保護を、Ｈ．Ｏ’Ｄｏｗｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２００７，４８，２００３−２００５の方法を使用して行った。ポリミキシンＢノナペプチド（中間体１、７．５ｇ、７．７８ｍｍｏｌ）を、水（６５ｍＬ）中に超音波処理を伴って懸濁した。ジオキサン（６５ｍＬ）及びトリエチルアミン（６５ｍＬ）を加え、そして混合物を氷中で１０分間冷却してから、１−（Ｂｏｃ−オキシイミノ）−２−フェニルアセトニトリル（Ｂｏｃ−ＯＮ）（７．６７ｇ；３１．１５ｍｍｏｌ）を加えた。反応の進行をＬＣ−ＭＳによって追跡し、そして３０分後完結に達し、この時点で混合物を２０％のメタノール性アンモニア（５０ｍＬ）の添加によってクエンチした。液相をデカントし、そして残留固体をシリカゲルのクロマトグラフィー（ジクロロメタン中の０−２０％メタノールの溶出剤）によって精製して、テトラ−（Ｂｏｃ）ポリミキシンＢノナペプチドを、白色の固体（２．５ｇ、２４％）として得た。ＴＬＣ、Ｒｆ０．２（ジクロロメタン中の１０％メタノール）。ｍ／ｚ  １３６２．８［ＭＨ］＋。
【０１６５】
中間体３．コリスチン（ポリミキシンＥ）ノナペプチド
コリスチン（ポリミキシンＥ、５ｇ）を、固定化パパイン（１８５ＥＬＵ／ｇ）、リン酸カリウム緩衝液（２５ｍＭ；ｐＨ７、１．２５Ｌ）、塩化カリウム（３０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）及びシステイン（１ｍＭ）と共に３７℃で３２時間、穏やかに撹拌しながら処理して、コリスチン（ポリミキシンＥ）ノナペプチドを生成した。反応の進行を、ＬＣ−ＭＳによって中間体１、表１に概略示した条件を使用してモニターした。固定化パパインを濾過によって除去し、そして濾液を真空中で濃縮して、固体の残渣を残し、これを１０％のメタノール水溶液中に再懸濁し、そして室温で一晩放置した。上清をデカントし、そして真空中で濃縮した。コリスチン（ポリミキシンＥ）ノナペプチドを、残渣から、Ｃ１８シリカ（１０ｇ）のＳＰＥによって、０−２５％メタノール水溶液で溶出して精製した。適当な画分の蒸発により、生成物を、白色の固体として得た。ｍ／ｚ  ４６５．３２［Ｍ＋２Ｈ］２＋。
【０１６６】
中間体４．テトラ−（Ｂｏｃ）コリスチン（ポリミキシンＥ）ノナペプチド
【０１６７】
【化６】
2014533678.tif 000009
【０１６８】
コリスチン（ポリミキシンＥ）ノナペプチド（２．５ｇ、２．６９ｍｍｏｌ）を、水（３５ｍＬ）中に超音波処理を伴って懸濁した。ジオキサン（３５ｍＬ）及びトリエチルアミン（３５ｍｌ）を加え、そして混合物を氷中で１０分間冷却してから、１−（Ｂｏｃ−オキシイミノ）−２−フェニルアセトニトリル（Ｂｏｃ−ＯＮ）（２．６５ｇ；１０．７６ｍｍｏｌ）を加えた。反応の進行をＬＣ−ＭＳによって追跡し、そして１０分後完結に達し、この時点で混合物を２０％のメタノール性アンモニア（２５ｍＬ）の添加によってクエンチした。液相をデカントし、そして残留固体を水中に再溶解し、そしてジクロロメタン及びイソ−ブタノールで連続して抽出した。ＬＣ−ＭＳ分析に基づき、デカントした液体、並びにジクロロメタン及びイソ−ブタノールの両方の抽出物を一緒にプールし、続いて真空中で濃縮して、黄色のゴム状物を得て、これをフラッシュクロマトグラフィー（Ｓｉ６０Ａ−３５−７０）に付加した。カラムを、ジクロロメタン中の０−２０％メタノール（２％アンモニアを含有）で溶出した。ジクロロメタン中の７−１０％メタノール（２％のアンモニアを含有）で溶出したカラム画分から、テトラ−（Ｂｏｃ）コリスチン（ポリミキシンＥ）ノナペプチドを、白色の固体（１．１８ｇ、３３％）として得た。ｍ／ｚ  １３２９．７［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１６９】
実施例１．［２（Ｒ，Ｓ）−２−ヒドロキシオクタノイル］ポリミキシンＢノナペプチド、トリフルオロ酢酸塩。
【０１７０】
【化７】
2014533678.tif 000010
【０１７１】
ａ）［２−（Ｒ，Ｓ）−２−ヒドロキシオクタノイル］［テトラ−（Ｂｏｃ）］−ポリミキシンＢノナペプチド
【０１７２】
【化８】
2014533678.tif 000011
【０１７３】
２−ヒドロキシオクタン酸（１．１６ｇ、７．３４ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（２ｍＬ）中に溶解した。次いでＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．１９ｍＬ、７．３４ｍｍｏｌ）及びヘキサフルオロリン酸２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム（ＨＡＴＵ）（２．７９ｇ、７．３４ｍｍｏｌ）を反応混合物に加えた。室温で３０分間撹拌した後、中間体２の化合物（２．０ｇ、１．４７ｍｍｏｌ）を加えた。１６時間後、反応の完結をＬＣ−ＭＳによって確認し、そして反応混合物を乾燥状態まで蒸発し、そしてシルカゲルのカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中の０−１０％メタノールの溶出剤）を使用して精製した。適当な画分を濃縮して、［２（Ｒ，Ｓ）−２−ヒドロキシオクタノイル］［テトラ−（Ｂｏｃ）］−ポリミキシンＢノナペプチドを無色の油状物（１．２８ｇ、５８％）として残した。ＴＣＬ、Ｒｆ０．６（ジクロロメタン中の１０％メタノール）。ｍ／ｚ  １５２７．５、［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【０１７４】
ｂ）表題化合物：［２−（Ｒ，Ｓ）−２−ヒドロキシオクタノイル］ポリミキシンＢノナペプチド、トリフルオロ酢酸塩
２−ヒドロキシオクタノイル［テトラ−（Ｂｏｃ）］−ポリミキシンＢノナペプチド  １．２８ｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（２ｍＬ）中に溶解した。トリフルオロ酢酸（３．９ｍＬ、５１．０２ｍｍｏｌ）を加え、そして混合物を室温で１６時間撹拌し、その時間後、ＬＣ−ＭＳにより反応の完結を確認した。反応混合物を真空中で濃縮して、［２（Ｒ，Ｓ）−２−ヒドロキシオクタノイル］ポリミキシンＢノナペプチド、トリフルオロ酢酸塩を、無色の油状物（１．３ｇ、９３％）として残した。ＴＣＬ、Ｒｆ基線（ジクロロメタン中の１０％メタノール）。ｍ／ｚ  １１０４．８、［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１７５】
実施例２．［２（Ｒ，Ｓ）−２−ヒドロキシオクタノイル］ポリミキシンＢノナペプチド、硫酸塩
【０１７６】
【化９】
2014533678.tif 000012
【０１７７】
実施例１の化合物（１．３ｇ）に、水（１ｍＬ）を加え、そして混合物を５分間超音波処理した。得られた懸濁液に、混合物がｐＨ９に達するまで、１ＭのＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）を加えた。次いで混合物を１０ｇのＣ１８ＳＰＥカラムを通過させ、０、４０、５０、６０、７０、８０及び１００％のメタノール水溶液で連続して溶出した。それぞれの画分のＬＣ−ＭＳ分析は、所望の生成物が６０、７０及び８０％のメタノール水溶液の画分中に溶出されたことを示した。これらの画分をプールし、そして蒸発して、白色の固体（０．５ｇ）を残し、これにｐＨ７が達成されるまで、０．１ＭのＨ２ＳＯ４（３０ｍＬ）を加えた。ｔｅｒｔ−ブタノール（１０ｍＬ）を加え、そして混合物を１６時間室温で撹拌し、そしてその後、冷凍乾燥して、［２（Ｒ，Ｓ）−２−ヒドロキシオクタノイル］ポリミキシンＢノナペプチド、硫酸塩を、白色の固体（０．５２ｇ）として得た。表２に概略記載した条件によるＨＰＬＣによる分析は、５．９３分の保持時間を与えた。ｍ／ｚ  １１０４．９［ＭＨ］＋。
【０１７８】
【表２】
2014533678.tif 000013
【０１７９】
実施例３．２−アミノエタノイルポリミキシンＢノナペプチド、硫酸塩
【０１８０】
【化１０】
2014533678.tif 000014
【０１８１】
２−アミノエタノイルポリミキシンＢノナペプチド、硫酸塩を、テトラ−（Ｂｏｃ）ポリミキシンＢノナペプチド及び２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−エタン酸から、実施例１及び２のために記載した反応の順序に従って調製した。保持時間（ＨＰＬＣ）４．９９分；ｍ／ｚ  １０２０．８［ＭＨ］＋。
【０１８２】
実施例４．３−アミノプロパノイルポリミキシンＢノナペプチド、硫酸塩
【０１８３】
【化１１】
2014533678.tif 000015
【０１８４】
３−アミノプロパノイルポリミキシンＢノナペプチド硫酸塩を、テトラ−（Ｂｏｃ）ポリミキシンＢノナペプチド及び３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−プロパン酸から、実施例１及び２のために記載した反応の順序に従って調製した。保持時間（ＨＰＬＣ）４．９７分；ｍ／ｚ  １０３４．４２［ＭＨ］＋。
【０１８５】
実施例５．３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−プロパノイルポリミキシンＢノナペプチド硫酸塩
【０１８６】
【化１２】
2014533678.tif 000016
【０１８７】
３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−プロパノイルポリミキシンＢノナペプチド硫酸塩を、テトラ−（Ｂｏｃ）ポリミキシンＢノナペプチド及び３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロパン酸から、実施例１及び２のために記載した反応の順序に従って調製した。保持時間（ＨＰＬＣ）５．０１分；ｍ／ｚ  ５３０．９２［Ｍ＋２Ｈ］２＋。
【０１８８】
実施例６．４−アミノブタノイルポリミキシンＢノナペプチド、硫酸塩
【０１８９】
【化１３】
2014533678.tif 000017
【０１９０】
４−アミノブタノイルポリミキシンＢノナペプチド、硫酸塩を、テトラ−（Ｂｏｃ）ポリミキシンＢノナペプチド及び４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブタン酸から、実施例１及び２のために記載した反応の順序に従って調製した。保持時間（ＨＰＬＣ）４．９７分；ｍ／ｚ  ５２４．９１［Ｍ＋２Ｈ］２＋。
【０１９１】
実施例７．６−アミノヘキサノイルポリミキシンＢノナペプチド、硫酸塩
【０１９２】
【化１４】
2014533678.tif 000018
【０１９３】
６−アミノヘキサノイルポリミキシンＢノナペプチド、硫酸塩を、テトラ−（Ｂｏｃ）ポリミキシンＢノナペプチド及び６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸から、実施例１及び２のために記載した反応の順序に従って調製した。保持時間（ＨＰＬＣ）４．９７分；ｍ／ｚ  １０７７．１５、［ＭＨ］＋。
【０１９４】
実施例８．８−ヒドロキシオクタノイルポリミキシンＢノナペプチド硫酸塩
【０１９５】
【化１５】
2014533678.tif 000019
【０１９６】
８−ヒドロキシオクタノイルポリミキシンＢノナペプチド、硫酸塩を、テトラ−（Ｂｏｃ）ポリミキシンＢノナペプチド及び８−ヒドロキシオクタン酸から、実施例１及び２のために記載した反応の順序に従って調製した。保持時間（ＨＰＬＣ）５．２９分；ｍ／ｚ  １１０４．８７、［Ｍ］＋。
【０１９７】
実施例９．８−アミノオクタノイルポリミキシンＢノナペプチド硫酸塩
【０１９８】
【化１６】
2014533678.tif 000020
【０１９９】
８−アミノオクタノイルポリミキシンＢノナペプチド、硫酸塩を、テトラ−（Ｂｏｃ）ポリミキシンＢノナペプチド及び８−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）オクタン酸から、実施例１及び２のために記載した反応の順序に従って調製した。保持時間（ＨＰＬＣ）５．０２分；ｍ／ｚ  １１０５．２、［ＭＨ］＋。
【０２００】
実施例１０．３−（Ｎ−メチルアミノ）プロパノイルポリミキシンＢノナペプチド、硫酸塩
【０２０１】
【化１７】
2014533678.tif 000021
【０２０２】
３−（Ｎ−メチルアミノ）プロパノイルポリミキシンＢノナペプチド、硫酸塩を、テトラ−（Ｂｏｃ）ポリミキシンＢノナペプチド及びＮ−［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］−Ｎ−メチルβ−アラニンから、実施例１及び２のために記載した反応の順序に従って調製した。保持時間（ＨＰＬＣ）５．０分；ｍ／ｚ  ５２５．０５、［Ｍ＋２Ｈ］２＋。
【０２０３】
実施例１１．（１Ｒ，Ｓ／２Ｒ，Ｓ）−２−アミノシクロペンタンカルボニルポリミキシンＢノナペプチド、硫酸塩
【０２０４】
【化１８】
2014533678.tif 000022
【０２０５】
（１Ｒ，Ｓ／２Ｒ，Ｓ）−２−アミノシクロペンタンカルボニルポリミキシンＢノナペプチド、硫酸塩を、テトラ−（Ｂｏｃ）ポリミキシンＢノナペプチド及びｃｉｓ−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）シクロペンタンカルボン酸から、実施例１及び２のために記載した反応の順序に従って調製した。保持時間（ＨＰＬＣ）５．０７分；ｍ／ｚ  １０７４．８７、［ＭＨ］＋。
【０２０６】
実施例１２．３−アミノプロパノイルコリスチン（ポリミキシンＥ）ノナペプチド、硫酸塩
【０２０７】
【化１９】
2014533678.tif 000023
【０２０８】
実施例１及び２のために記載した反応の順序に従って、３−アミノプロパノイルコリスチン（ポリミキシンＥ）ノナペプチド、硫酸塩を、テトラ−（Ｂｏｃ）コリスチン（ポリミキシンＥ）ノナペプチド（中間体４）及びＢｏｃ−β−アラニンから調製した。保持時間（ＨＰＬＣ）４．９８分；ｍ／ｚ  ５０１、［Ｍ＋２Ｈ］２＋。
【０２０９】
実施例１３．［３−（Ｒ，Ｓ）−ピロリジン−３−カルボニル］ポリミキシンＢノナペプチド、硫酸塩
【０２１０】
【化２０】
2014533678.tif 000024
【０２１１】
［３−（Ｒ，Ｓ）−ピロリジン−３−カルボニル］ポリミキシンＢノナペプチド、硫酸塩を、テトラ−（Ｂｏｃ）ポリミキシンＢノナペプチド及び３−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−ピロリジンカルボン酸から、実施例１及び２のために記載した反応の順序に従って調製した。保持時間（ＨＰＬＣ）４．９１分；ｍ／ｚ  １０６０．５８、［ＭＨ］＋。
【０２１２】
実施例１４．［３（Ｒ，Ｓ）−３−アミノ−３−シクロヘキサンプロパノイル］ポリミキシンＢノナペプチド、硫酸塩
【０２１３】
【化２１】
2014533678.tif 000025
【０２１４】
［３（Ｒ，Ｓ）−３−アミノ−３−シクロヘキサンプロパノイル］ポリミキシンＢノナペプチド、硫酸塩を、テトラ−（Ｂｏｃ）ポリミキシンＢノナペプチド及び３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−３−シクロヘキサンプロパン酸から、実施例１及び２のために記載した反応の順序に従って調製した。保持時間（ＨＰＬＣ）５．２４分；ｍ／ｚ  １１１６．７８、［ＭＨ］＋。
【０２１５】
更なる実施例１５−３５
実施例１５−３５の更なる化合物を、上記実施例１及び２のために記載した調製の方法を使用して調製した。従って、ポリミキシンＢノナペプチドのＮ末端に置換基を有する化合物は、テトラ−（Ｂｏｃ）ポリミキシンＢノナペプチド（中間体２）及び適当なカルボン酸から、カップリング剤（例えばＨＡＴＵ）及び塩基（例えばＤＩＰＥＡ）（実施例１ａに記載したように）の存在中で調製され、酸（例えばＴＦＡ）（実施例１ａに記載したように）による処理、及び適当な仕上げ（実施例２に記載したように）により追従された。同様に、ポリミキシンＥノナペプチドのＮ末端に置換基を有する化合物は、テトラ−（Ｂｏｃ）コリスチン（ポリミキシンＥ）ノナペプチド（中間体４）及び適当なカルボン酸から、カップリング剤（例えばＨＡＴＵ）及び塩基（例えばＤＩＰＥＡ）（実施例１ｂに記載したように）の存在中で調製され、酸（例えばＴＦＡ）（実施例１ｂに記載したように）による処理、及び硫酸塩への転換（実施例２に記載したように）により追従された。
【０２１６】
実施例１５−３５の更なる化合物は、以下の表３に示される。
【０２１７】
表中に与えられた記録された保持時間及び質量は、表２中で先に記載されたＬＣ−ＭＳ条件を使用して得られた。
【０２１８】
化合物は、示された化合物の硫酸塩の形態として単離された。
【０２１９】
【表３−１】
2014533678.tif 000026
【０２２０】
【表３−２】
2014533678.tif 000027
【０２２１】
【表３−３】
2014533678.tif 000028
【０２２２】
【表３−４】
2014533678.tif 000029
【０２２３】
【表３−５】
2014533678.tif 000030
【０２２４】
【表３−６】
2014533678.tif 000031
【０２２５】
【表３−７】
2014533678.tif 000032
【０２２６】
【表３−８】
2014533678.tif 000033
【０２２７】
【表３−９】
2014533678.tif 000034
【０２２８】
【表３−１０】
2014533678.tif 000035
【０２２９】
【表３−１１】
2014533678.tif 000036
【０２３０】
抗細菌活性
化合物の力価及び薬効範囲を評価するために、四つのグラム陰性病原体、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉのそれぞれ四つの株に対して感受性試験を行った。
【０２３１】
試験の前日、３ないし４個のコロニーを、新鮮なミューラ−ヒントン寒天（ＭＨＡ）プレートから採取し、そして１０ｍＬのカチオン調整ＭＨＢ（ＣａＭＨＢ）中に移した。培養物を、３７℃で２５０ｒｐｍで１８−２０時間インキュベートしてから、新鮮なＣａＭＨＢで１００倍に希釈した。継代培養物を、ＯＤ６００が、１０５−１０６ＣＦＵ／ｍｌに対応する０．２−０．３に達するまで更に増殖した。活発に増殖する培養物を、新鮮な培地で１００倍に希釈し、そして接種のために使用した。
【０２３２】
ＭＩＣ試験を、１７０μＬ（１５０μＬの抗細菌剤を含有するブロス、２０μＬの接種物）の合計体積で、滅菌の９６ウェルのマイクロタイタープレート中で、ＣａＭＨＢ中の２倍の抗細菌性の一連の希釈によって行った。アッセイを二重で行った。プレートを、１８−２０時間３７℃で振盪せずに好気的にインキュベートし、ＭＩＣは、目に見える増殖を防止する最低の薬物濃度として定義する。
【０２３３】
表４は、ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）と比較した実施例２ないし１４のＭＩＣ（マイクログラム／ｍＬ）を示す。
【０２３４】
【表４】
2014533678.tif 000037
【０２３５】
抗細菌活性の更なる研究
表４Ａは、更なる実施例１５ないし３５並びに実施例２、６及び１４の化合物に対して得られたＭＩＣ値を示す。データは、異なったバッチのカチオン調整ミューラ−ヒントンブロスを使用したことを除き、表４と同様な条件下で得られた。これらの化合物のＭＩＣ値を、ポリミキシンＢ、コリスチン硫酸塩、ＣＢ−１８２，８０４及びＮＡＢ７３９（ＴＦＡ塩として）に対して得られた値と比較した。ＣＢ−１８２，８０４は、Ｎ−末端にアリール尿素置換基を持つポリミキシンデカペプチド誘導体であり、これは、ポリミキシンＢ（ＷＯ２０１０／０７５４１６中の化合物５、３７ページ参照）より低い毒性を有すると主張されている。ＮＡＢ７３９は、Ｖａａｒａ等によって先に記載されている。
【０２３６】
【表４Ａ−１】
2014533678.tif 000038
【０２３７】
【表４Ａ−２】
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【０２３８】
【表４Ａ−３】
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【０２３９】
実施例２及び６の化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏの抗細菌活性を、５００種のグラム陰性細菌分離菌のパネルに対して、コリスチンと同時に評価した。パネルは、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＰ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのそれぞれの１００種の臨床的分離菌からなっていた。パネルは、現時点の欧州及び米国の疫学を代表し、そして現時点で臨床的に使用される抗細菌剤に対する定義された耐性の表現型を持つ多くの関連する株を含んでいた。これらの耐性株は、２０種のＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ、２２種のＥ．ｃｏｌｉ、２５種のＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及び２０種のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株を含んでいた。
【０２４０】
研究の結果を表４Ｂに要約する。全ての化合物は、１６μｇ／ｍＬの最大濃度まで評価されたコリスチンを除き、６４μｇ／ｍＬの最大濃度まで試験された。
【０２４１】
【表４Ｂ】
2014533678.tif 000041
【０２４２】
マウスにおけるＥ．ｃｏｌｉの大腿部感染症に対するｉｎ  ｖｉｖｏの効力
本発明の８種の化合物（実施例２、４、５、６、７、８、１０、及び１１）のｉｎ  ｖｉｖｏの効力を、Ｅ．ｃｏｌｉのマウスの大腿部感染症モデルで評価した。結果を表５に要約する。
【０２４３】
５匹の、体重２２±２ｇのメスの特異的病原体を持たないＣＤ−１マウスの群を使用した。マウスを、−４（１５０ｍｇ／ｋｇ）及び−１（１００ｍｇ／ｋｇ）日目のシクロフォスファミドの腹腔内投与によって好中球減少性にした。０日目に、マウスに、１０５ＣＦＵ／マウスのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ分離菌ＡＴＣＣ２５９２２を右大腿部に筋肉内的に接種した。１時間目に、５匹のマウスからＣＦＵ計数を決定し、そして残りのマウス（群当たり５匹）を、感染症後の＋１及び６時間目の薬物の皮下注射で処置した。それぞれの研究において、試験化合物当たり、それぞれ一日二回投与の１．５及び５ｍｇ／ｋｇの二つの投与群が存在した。実施例２、４、５、６、７、８、１０、１１、及びポリミキシンＢを、通常の生理食塩水中で２ｍｇ／ｍＬで調製し、そして溶液を、必要に応じて０．１ＭのＨ２ＳＯ４又は４．２％のＮａＨＣＯ３の添加によってｐＨ６−７に調節した。感染の２４時間後、マウスを人道的に安楽死させた。それぞれのマウスの右大腿部の筋肉を回収し、ホモジナイズし、連続的に希釈し、そしてＣＦＵ決定のために、ブレインハートインフュージョン寒天＋０．５％木炭（重量／容量）プレート上に置いた。感染後２４時間の対照の計数と比較した右大腿部の全ＣＦＵの減少を、それぞれの投与量群に対して決定した。１０ｍｇ／ｋｇ／日における化合物２及び６は、ポリミキシンＢのそれに匹敵する、細菌計数において３ｌｏｇ１０を超える減少を伴う効力を示した。
【０２４４】
【表５】
2014533678.tif 000042
【０２４５】
マウスにおけるＥ．ｃｏｌｉの大腿部感染症に対するｉｎ  ｖｉｖｏ効力に対する更なる研究
実施例１４の化合物のｉｎ  ｖｉｖｏの効力を、上記の実施例に記載した方法を使用するＥ．ｃｏｌｉのマウスの大腿部感染症モデルで評価した。結果をポリミキシンＢと比較して表５Ａに要約する。
【０２４６】
【表５Ａ】
2014533678.tif 000043
【０２４７】
１０ｍｇ／ｋｇ／日における化合物１４は、ポリミキシンＢのそれに匹敵する、細菌計数において３ｌｏｇ１０を超える減少を伴う効力を示した。
【０２４８】
マウスにおけるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの大腿部感染症に対するｉｎ  ｖｉｖｏの効力に対する更なる研究
先に記載したものと同じ方法を使用して、本発明の三つの化合物（実施例２、６、及び１４）のｉｎ  ｖｉｖｏの効力を、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＡＴＣＣ１００３１のマウス大腿部感染症モデルで、比較物質としてコリスチン（ポリミキシンＥ）を使用して評価した。結果を表５Ｂに要約する。１０ｍｇ／ｋｇ／日における化合物２、６及び１４は、コリスチンのそれに匹敵する、細菌計数において概略２ｌｏｇ１０の減少を伴う効力を示した。
【０２４９】
【表５Ｂ】
2014533678.tif 000044
【０２５０】
薬物動態及び尿排出の研究
本発明の三つの化合物（実施例２、４及び６）及びポリミキシンＢの薬物動態及び尿排出を、ラットで評価した。
【０２５１】
薬物溶液を、通常の生理食塩水中で４ｍｇ／ｍＬで調製し、そしてｐＨを、適当な体積の０．１ＭのＨ２ＳＯ４又は４．２％のＮａＨＣＯ３を加えることによって、６−７に調節した。溶液をフィルターで滅菌し、そして使用前に−８０℃で保存した。実験の当日、薬物溶液を、滅菌の通常の生理食塩水で１ｍｇ／ｍＬに希釈した。
【０２５２】
３匹のオスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの群を、研究の前に最低４日間順化させた。ラットを、イソフルランを使用して麻酔し、そしてカニューレを頸静脈に挿入した。手術の一日後、ラットに、１ｍｇ／ｋｇの溶液の静脈内ボーラス注射で、カニューレを通して投与し、通常の生理食塩水による洗浄によって追従した。血液を、化合物の投与の前に、そしてその後０．０８、０．２５、０．５、１、３、６、８及び２４時間目に、カニューレを通して手作業で収集した。血液収集の直後に、遠心によって血漿を回収した。２４時間の尿試料を、化合物の投与の前、並びに０−４時間、４−６時間、及び６−２４時間の間隔でその後収集した。血漿及び尿の試料を−２０℃で冷凍した。
【０２５３】
薬物の血漿及び尿濃度決定を、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって行った。分析の前に、血漿及び尿試料を次のように調製した。血漿試料を分析の当日に解凍し、そして０．１％（容量／容量）のギ酸及び１００ｎｇ／ｍＬの内部標準を含有する３体積のアセトニトリルと混合した。遠心後、上清を９６ウェルプレートに移し、そしてＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析に対する準備として水で１：１に希釈した。尿試料を、ＯａｓｉｓＨＬＢカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ，ＵＫ）の固相抽出（ＳＰＥ）によって、１００％メタノールで溶出して精製した。アリコートを、９６ウェルプレートに移し、そして水で１：１に希釈してから、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析に対する準備として内部標準溶液を加えた。
【０２５４】
カラム：    Ｋｉｎｅｔｅｘ  ２．６μｍ、ＸＢ−Ｃ１８  ５０×２．１ｍｍ
移動相Ａ：  水＋０．１５％ＴＦＡ又は０．１％ギ酸
移動相Ｂ：  アセトニトリル＋０．１５％ＴＦＡ又は０．１％ギ酸
流量：      ０．５ｍＬ／分
勾配：
時間      ０分      ９５％Ａ      ５％Ｂ
時間１．２０分        ５％Ａ    ９５％Ｂ
時間１．５０分        ５％Ａ    ９５％Ｂ
時間１．５１分      ９５％Ａ      ５％Ｂ
時間３．００分      ９５％Ａ      ５％Ｂ
サイクル時間          ４．５分
注入体積：            ２０μＬ。
【０２５５】
薬物動態のパラメーターは、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ  ｖ５．３を使用するノンコンパートメント解析によって決定した。尿の回収を、注射後の最初の２４時間に対して尿中で回収されたインタクトな薬物のパーセントとして記録した。
【０２５６】
【表６】
2014533678.tif 000045
【０２５７】
興味あることに、全ての化合物は、ポリミキシンＢより高い尿回収を示す。従来の研究は、ポリミキシンＥ（コリスチン）が、大規模な腎尿細管再吸収を受けることを報告した（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２００３，４７（５）；Ｙｏｕｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１１，５５（９））。理論によって束縛されることを望むものではないが、化合物の高い尿排出は、減少した腎尿細管再吸収を反映することができ、これは、次にその腎毒性の潜在性を減少することができる。
【０２５８】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏの腎細胞毒性アッセイ
化合物の腎細胞毒性を、正常なヒトの腎臓から誘導される固定化された近位尿細管細胞系のＨＫ−２細胞系を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで評価した。化合物の毒性を説明するための終点は、細胞の代謝活性と相関するレサズリンの減少であった。
【０２５９】
細胞を、１５０ｃｍ２のフラスコ中の２５ｍＬの補充された（５ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ及び５０μｇ／ｍＬのＢＰＥで）ＫＳＦ中で培養した。細胞を７０％密集で、最大２５継代で維持した。
【０２６０】
１日目：培地を除去し、そして細胞を１０ｍｌのＤＰＢＳで洗浄した。次いで、６ｍｌの０．２５％トリプシンの溶液をＥＤＴＡと共にフラスコに加え、そして細胞をインキュベーターに戻した。１ないし３分のインキュベーション後、１４ｍｌの培地をフラスコに加えて、トリプシンを不活化した。細胞の懸濁液を遠心試験管に移し、そして細胞を１０００ｒｐｍで６分間ペレット化した。次いで細胞のペレットを、ＥＧＦ及びＢＰＥで補充された新鮮な培地中に再懸濁した。細胞の数を数え、そして細胞を、ＥＧＦ及びＢＰＥで補充された新鮮な培地中で、４６８７５細胞／ｍＬに希釈した。７５００個の細胞を、１６０μｌの体積でそれぞれのウェルに分配し、そして３７℃で２４時間インキュベートした。
【０２６１】
２日目：試験化合物を培地に直接調製した。９点の濃度を、新鮮な培地中の２倍希釈で１０００μｇ／ｍＬから１．９５μｇ／ｍＬまで調製した。マイクロタイタープレートをインキュベーターから取出し、そして培地を、１００μＬの化合物溶液の希釈物で置換えた。全ての濃度の組を三重で行い、そして正及び負の対照を、それぞれのプレートに加えた。次いでプレートを、２４時間３７℃で５％ＣＯ２の湿った雰囲気中でインキュベートした。
【０２６２】
３日目：レサズリン（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ，Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有する試薬を、ＰＢＳ中に希釈（１：４）し、そしてそれぞれのウェルに、２０％（容積／容積）で加えた。次いでプレートを３７℃で２時間インキュベートしてから、蛍光が減少した生成物を検出した。
【０２６３】
培地のみのバックグラウンド値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して、データを分析する前に差引いた。化合物の濃度値を、対数値としてプロットして、用量−反応曲線を当てはめ、そしてＩＣ５０値を決定することを可能にした（表７）。
【０２６４】
【表７】
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【０２６５】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏの腎細胞毒性アッセイに対する更なる研究
更なる実施例化合物の腎細胞毒性を、上記の実施例中に記載したようなＨＫ−２細胞を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで評価した。これらの化合物に対するＩＣ５０値を以下の表７Ａに示す。比較のために、コリスチン、並びにＣＢ１８２，８０４（ＷＯ２０１０／０７５４１６の化合物５）及びＮＡＢ７３９の腎細胞毒性も更に評価した。
【０２６６】
【表７Ａ】
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【０２６７】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏの腎細胞毒性アッセイに対する更なる研究
ポリミキシンの腎毒性のモデル（Ｙｏｕｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，２０１１，５５（９）：４０４４−４０４９から適合）をラット中に確立した。実施例２、６、及び１４の化合物をモデル中で試験し、そしてコリスチン（その硫酸塩の形態で）と比較した。１週間の順化後、オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、頸静脈カニューレで外科的に準備し、そして必要に応じて、前もって指定された収容ケージ又は代謝ケージのいずれかに別個に収容した。コリスチン及び実施例の化合物を、生理食塩水中で調製した。化合物を、７時間間隔で一日２回、頸静脈カニューレを経由して導入した。それぞれの投与量を、３日間で最大投与量まで徐々に増加し、次いでこれを研究の終了まで投与した。２４時間の尿収集（氷上）を、投与前、並びに４及び７日目に行った。投与計画を以下の表８に記載する。
【０２６８】
【表８】
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【０２６９】
Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）の尿中の活性を、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ＳｃｉｅｎｃｅからのＮＡＧアッセイキットを使用して分光光度的に決定した。腎臓損傷のバイオマーカーを、Ｍｕｌｔｉ−Ｓｐｏｔ（登録商標）Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（メソスケールディスカバリー）からのＫｉｄｎｅｙ  Ｉｎｊｕｒｙ  Ｐａｎｅｌ  ＩＩを使用して決定した。
【０２７０】
８ｍｇ／ｋｇの計画を使用して投与された実施例２、６、及び１４は、同じ投与計画のコリスチンと比較して、腎バイオマーカーＮＡＧ、アルブミン及びシステインＣの有意に減少したレベルを示した（図１ないし３を参照）。反応は、２ｍｇ／ｋｇの最大濃度におけるコリスチンによって誘発されるものと同様であった。
【０２７１】
図１は、化合物２、６、及び１４並びにコリスチンに対する０、４及び７日目におけるＮＡＧの濃度（ｎｇ／２４時間）を示す。左手のグラフは、左から右に、コリスチン（２ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）、コリスチン（８ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）、化合物２（８ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）及び６（８ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）を示す。右手のグラフは、コリスチン（２ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）、コリスチン（８ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）及び化合物１４（８ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）を示す。
【０２７２】
図２は、化合物２、６、及び１４並びにコリスチンに対する０、４及び７日目におけるアルブミンの濃度（ｎｇ／２４時間）を示す。左手のグラフは、左から右に、コリスチン（２ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）、コリスチン（８ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）、化合物２（８ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）及び６（８ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）を示す。右手のグラフは、コリスチン（２ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）、コリスチン（８ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）及び化合物１４（８ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）を示す。
【０２７３】
図３は、化合物２、６、及び１４並びにコリスチンに対する０、４及び７日目におけるシスタチンＣの濃度（ｎｇ／２４時間）を示す。左手のグラフは、左から右に、コリスチン（２ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）、コリスチン（８ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）、化合物２（８ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）及び６（８ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）を示す。右手のグラフは、コリスチン（２ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）、コリスチン（８ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）及び化合物１４（８ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2014533678.tif 000054
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