(57)【要約】  本発明は、新規な転写終結シグナル配列、特に、少なくとも二つの連続した転写終結シグナルを含み、前記連続した転写終結シグナルが、少なくとも、最大で１０００ヌクレオチド離れている第一および第二の転写終結シグナルを含み、かつ該終結シグナルの少なくとも一つがＲＮＡヘアピン構造を有するまたはコードすることを特徴とする、ポリヌクレオチドを提供する。
2014516546.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも二つの連続した転写終結シグナルを含むポリヌクレオチドであって、前記連続した転写終結シグナルが、少なくとも、最大で１０００ヌクレオチド離れている第一および第二の転写終結シグナルを含み、かつ該終結シグナルの少なくとも一つがＲＮＡヘアピン構造を有するまたはコードし、前記ヘアピン構造が少なくとも６０％ＧまたはＣ核酸を有する少なくとも１２の内部塩基対のステムを含むことを特徴とする、ポリヌクレオチドを提供する。
【請求項２】
任意にＲＮＡヘアピン構造を含むまたはコードする、第三の転写終結シグナルを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、前記第三の転写終結シグナルが第一または第二の転写終結シグナルから最大で１０００ヌクレオチド離れている、ポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドであって、
前記ヘアピン構造が、配列Ｙ−Ｘ−Ｚ、
ここで、Ｙは少なくとも１２塩基長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも６０％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９塩基長のヌクレオチド配列であり、かつ
ＺがＹに対して少なくとも７０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無いループである、
によって定義されることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
Ｘが３、４、５、６、７、８または９ヌクレオチド長を有することを特徴とする、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３または４に記載のポリヌクレオチドであって、Ｘが、Ｕ（Ｔ）、Ａ、Ｃ、Ｇから選択される任意のヌクレオチドであるＮを有する、配列Ｕ／Ｔ−ＮＮＧを含むかまたはからなり；好ましくは配列Ｕ／Ｔ−ＮＮＧはＵ／Ｔ−ＮＣＧ、特にＵ／Ｔ−Ｕ／Ｔ−ＣＧであることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、前記第一、第二および／または第三の転写終結シグナルが請求項３から５のいずれか一項に定義される前記ヘアピン構造を含む、好ましくは少なくとも一つの転写終結シグナルが請求項５で定義されるヘアピン構造を含み、かつ少なくともさらなる転写終結シグナルが、独立して選択されるＹ、ＸおよびＺを有する請求項３のヘアピン構造を含むことを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、少なくとも一つのターミネーターシグナルがクラスＩＩターミネーターである、ポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列Ｙ−Ｕ／Ｔ−ＮＮＧ−Ｚを有するヘアピン構造を含む少なくとも一つの転写終結シグナルを含むポリヌクレオチドであって、
Ｙが少なくとも１２ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも６０％のＧ／Ｃ含量を有し、
ＺがＹに対して少なくとも７０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、配列Ｕ／Ｔ−ＮＮＧは、ＹまたはＺとの塩基対形成が無く、Ｔ（Ｕ）、Ａ、Ｃ、Ｇから選択される任意のヌクレオチドであるＮを有するループであり；好ましくは配列Ｕ／Ｔ−ＮＮＧはＵ／Ｔ−Ｕ／Ｔ−ＣＧである、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、少なくとも一つの転写終結シグナルが、少なくとも７５％ＡまたはＴ（Ｕ）を含む、少なくとも４ヌクレオチド長のＡ／Ｔ（Ｕ）−リッチ領域を含み、ここで好ましくは前記Ａ／Ｔ（Ｕ）−リッチ領域はヘアピンの下流であり、特に好ましくは、前記ヘアピンから２０ヌクレオチド以下離れている、ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項３から９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、Ｙが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である、ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項３から１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、ＹおよびＺがｍヌクレオチド長であり、Ｙはヌクレオチドｙ１からｙｍからなり、かつＺはヌクレオチドｚ１からｚｍからなり、ヘアピンは、配列ｙｍｙｍ−１ｙｍ−２．．．ｙ８ｙ７ｙ６ｙ５ｙ４ｙ３ｙ２ｙ１−Ｘ−ｚ１ｚ２ｚ３ｚ４ｚ５ｚ６ｚ７ｚ８．．．ｚｍ−１ｚｍからなり、ここで、ｚ１はｙ１に対して相補的であり、ｚｍはｙｍに対して相補的であることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項３から１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、ＹおよびＺが少なくとも８０％相補的、好ましくは少なくとも９０％相補的、特に好ましくは１００％相補的、より好ましくは少なくとも７０％Ｇ−ＣまたはＡ−Ｔ（Ｕ）相補性であることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項３から１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、ヘアピンにおいて、ＹとＺのヌクレオチドの間で、最大で３、２または１のＧ−Ｕ相補性が別のＧ−Ｕ相補性に隣接し、好ましくは、ヘアピンは隣接したＧ−Ｕ相補性を有さないことを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に定義される終結シグナルをコードするＤＮＡ；または請求項１から１２のいずれか一項に定義される終結シグナルを含むＲＮＡである、請求項１から１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
最大で１００００ヌクレオチド長の大きさを有する、請求項１から１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが、前記転写終結シグナルに挟まれた一以上の制限部位および／もしくは転写終結シグナルの上流のクローニングサイト、または転写終結シグナルの上流のコード配列を含み、好ましくはさらにプロモーターに作動可能に連結されることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、
配列Ｙ−Ｘ−Ｚで定義されるヘアピン構造を含む第一のターミネーターシグナルであって、Ｙが少なくとも１２ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、かつ、
ＺがＹに対して少なくとも８０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無いループである、第一のターミネーターシグナル；
クラスＩＩ終結シグナルを含む、好ましくはコンセンサス配列ＴＣＴＧＴＴを含む、特に好ましくは少なくとも４０％のＴ含量を有する少なくとも２０ヌクレオチド長の配列を含む、第二のターミネーターシグナル；
を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、
配列Ｙ−Ｘ−Ｚで定義されるヘアピン構造を含む第一のターミネーターシグナルであって、Ｙが少なくとも１４ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、かつ、
ＺがＹに対して少なくとも９０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無いループである、第一のターミネーターシグナル；
配列Ｙ−Ｘ−Ｚで定義されるヘアピン構造を含む第二のターミネーターシグナルであって、Ｙが少なくとも８ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも６０％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、かつ、
ＺがＹに対して少なくとも７０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無いループである、第二のターミネーターシグナル；第一および第二のターミネーターは、第一および第二の終結シグナルによって協調終結を提供するよう、最大で１０００ヌクレオチド離れており、ここで、第一および第二のターミネーターのＹ、Ｘ、およびＺは独立して選択でき、特に請求項４、５、１０から１３で定義される、
を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１から１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、
配列Ｙ−Ｘ−Ｚで定義されるヘアピン構造を含む第一のターミネーターシグナルであって、Ｙが少なくとも１２ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、かつ、
ＺがＹに対して少なくとも８０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無いループである、第一のターミネーターシグナル；
クラスＩＩ終結シグナルを含む、好ましくはコンセンサス配列ＴＣＴＧＴＴを含む、特に好ましくは少なくとも４０％のＴ含量を有する少なくとも２０ヌクレオチド長の配列を含む、第二のターミネーターシグナル、
を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１から１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、
配列Ｙ−Ｘ−Ｚで定義されるヘアピン構造を含む第一のターミネーターシグナルであって、Ｙが少なくとも１２ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、かつ、
ＺがＹに対して少なくとも８０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無いループである、第一のターミネーターシグナル；
配列Ｙ−Ｘ−Ｚで定義されるヘアピン構造を含む第二のターミネーターシグナルであって、Ｙが少なくとも８ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも６０％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、かつ、
ＺがＹに対して少なくとも７０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無いループである、第二のターミネーターシグナル；
配列Ｙ−Ｘ−Ｚで定義されるヘアピン構造を含む第三のターミネーターシグナルであって、Ｙが少なくとも８ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも６０％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、かつ、
ＺがＹに対して少なくとも７０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無いループである、第三のターミネーターシグナル；第一、第二および第三のターミネーターは、第一、第二および第三の終結シグナルによって協調終結を提供するよう、最大で１０００ヌクレオチド離れており、ここで、第一、第二または第三のターミネーターのＹ、Ｘ、およびＺは独立して選択でき、特に請求項４、５、１０から１３で定義される、
を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項１から１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、
配列Ｙ−Ｘ−Ｚで定義されるヘアピン構造を含む第一のターミネーターシグナルであって、Ｙが少なくとも１２ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、かつ、
ＺがＹに対して少なくとも８０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無いループである、第一のターミネーターシグナル；
クラスＩＩ終結シグナルを含む、好ましくはコンセンサス配列ＴＣＴＧＴＴを含む、特に好ましくは少なくとも４０％のＴ含量を有する少なくとも２０ヌクレオチド長の配列を含む、第二のターミネーターシグナル；
配列Ｙ−Ｘ−Ｚで定義されるヘアピン構造を含む第三のターミネーターシグナルであって、Ｙが少なくとも８ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも６０％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、かつ、
ＺがＹに対して少なくとも７０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無いループである、第三のターミネーターシグナル；第一、第二および第三のターミネーターは、第一、第二および第三の終結シグナルによって協調終結を提供するよう、最大で１０００ヌクレオチド離れており、ここで、第一または第三のターミネーターのＹ、Ｘ、およびＺならびにクラスＩＩ終結シグナルのコンセンサスおよびＴ−リッチ配列は独立して選択でき、特に請求項４、５、１０から１３で定義される、
を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項１から１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、
配列Ｙ−Ｘ−Ｚで定義されるヘアピン構造を含む第一のターミネーターシグナルであって、Ｙが少なくとも１２ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、かつ、
ＺがＹに対して少なくとも８０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無いループである、第一のターミネーターシグナル；
配列Ｙ−Ｘ−Ｚで定義されるヘアピン構造を含む第二のターミネーターシグナルであって、Ｙが少なくとも８ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも６０％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、かつ、
ＺがＹに対して少なくとも７０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無いループであり、かつ、好ましくはコンセンサス配列ＴＣＴＧＴＴを含む、特に好ましくは少なくとも４０％のＴ含量を有する少なくとも２０ヌクレオチド長の配列を含む、ヘアピン構造に隣接するクラスＩＩ終結シグナルである、第二のターミネーターシグナル；
配列Ｙ−Ｘ−Ｚで定義されるヘアピン構造を含む第三のターミネーターシグナルであって、Ｙが少なくとも８ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも６０％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、かつ、
ＺがＹに対して少なくとも７０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無いループである、第三のターミネーターシグナル；第一、第二および第三のターミネーターは、第一、第二および第三の終結シグナルによって協調終結を提供するよう、最大で１０００ヌクレオチド離れており、ここで、第一、第二または第三のターミネーターのＹ、Ｘ、およびＺならびにクラスＩＩ終結シグナルのコンセンサスおよびＴ−リッチ配列は、独立して選択でき、特に請求項４、５、１０から１３で定義される、
を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項１から２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドおよびコード配列を含む発現カセットであって、配列がコード配列の終結のために作動可能に配置される、発現カセット。
【請求項２４】
請求項１から２２のいずれか一項に定義されるポリヌクレオチドまたは請求項１８の発現カセットを含むベクターであって、好ましくはプラスミドである、ベクター。
【請求項２５】
好ましくはベクターにおいて、請求項１から２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの転写終結シグナルに作動可能に連結された遺伝子を有するポリヌクレオチド分子を含む、細胞。
【請求項２６】
請求項２５に記載の細胞であって、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む、細胞。
【請求項２７】
請求項２５または２６に記載の細胞を提供すること、および前記細胞を前記遺伝子の発現を可能にする条件下で培養することを含む、遺伝子産物を産生する方法。
【請求項２８】
ｍＲＮＡを産生するインビトロの方法であって、請求項１から２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドおよび前記転写終結シグナルの上流のコード配列を提供すること、および前記ポリヌクレオチドをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼと接触させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は発現系およびポリヌクレオチド構築体の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
発現系により産生される組換えタンパク質の十分な収量のためには、ポリヌクレオチド構築体および発現系を設計する際に、数種の側面を検討しなければならない。重要な側面は、宿主細胞培養の種類、ならびに全産生工程の間の細胞生存能力および高発現効率を保証する、適切なトランスフェクションシステムの選択である。（生存に不要な二次タンパク質の）高発現率は細胞の健康および生存に有害であるため、これらの懸案事項は拮抗的であることが多い。発現率および細胞代謝の改変の特的の調節を可能にする、制御可能な発現系が望まれている。発現系の一つの重要な側面は、終結の効率を含む、転写効率である。低い終結効率はリードスルー転写（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）、および、それら自身により細胞にとってストレスの多い、非常に長いｍＲＮＡの産生を導くが、−特に、プラスミドベクターの分野において−望まれていないタンパク質の発現を導き、導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）構築体の複製制御を妨げ得る。望まれていない複製は同様に、多数のコピー数の導入遺伝子を産生し、それによって、不十分な発現系の問題を増加させる、細胞系への代謝負担（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｂｕｒｄｅｎ）を上昇させる。
【０００３】
転写は細胞性遺伝子発現の中心にあり、それゆえ、単一の遺伝子または遺伝子群の発現率を操作する、最も強力な選択肢を示し得る。一旦、三成分複合体（ｔｅｒｎａｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）が築かれると、それは非終結転写の一時停止あるいは遅延の間、ＲＮＡポリメラーゼが解離しないで、毎秒最大１００塩基の組み込みを可能にするのに十分に安定していなければならない。それゆえ、鋳型ＤＮＡおよび産生ＲＮＡ転写産物と伸長作業中の（ｅｌｏｎｇａｔｉｎｇ）ＲＮＡポリメラーゼの強固な連結が、数百または数千ヌクレオチドの長さを有するｍＲＮＡを産生する能力に不可欠である。
【０００４】
転写開始および非常に安定した三成分複合体（ｔｅｒｎａｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）の構築の後、酵素は鋳型に沿って移動し、一つずつヌクレオチドを組み込み、所望のＲＮＡ鎖を生産する。ＲＮＡの合成および単一の遺伝子あるいは転写オペロンのｍＲＮＡの解放（ｒｅｌｅａｓｅ）は、鋳型上の特異的な部位で停止しなければならない。この過程は転写終結と呼ばれ、転写開始の間の事象に似ているが、順番が逆であり、ＲＮＡポリメラーゼの解離および転写されたＲＮＡの解放をもたらす。終結は鋳型ＤＮＡの明確に定義されたシグナル、いわゆる転写ターミネーターに応答して起こる。すべての生物学的過程のように、終結はのるかそるかの決定とは限らず、従って、１００％の範囲では起こらない。実際、ターミネーターは、終結効率（ＴＥ）において大きく異なっており、その終結の効率が広く変化する。実際、終結シグナルは、所与のＲＮＡポリメラーゼに高度に特異的である。また、非終結事象がポリメラーゼのリードスルーとして記載される。
【０００５】
ターミネーターは数種のグループに分類することができる。終結シグナルの第一のグループでは、コア酵素が、他の因子の非存在下、ある部位で、インビトロで終結させることができる。これらの終結部位は、内因性ターミネーター（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）、あるいはクラスＩターミネーターとも呼ばれる。内因性ターミネーターは通常、一つの一般的な構造的特徴、いわゆるヘアピンまたはステム−ループ構造、を共有する。一方、ヘアピンは二個一組の対称構造（ｄｙａｄ  ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）のｄＧ−ｄＣリッチな配列によってコードされる、ステム構造を含む。他方、ターミネーターはまた、３’末端でステム構造に直接続く、ｄＡ−ｄＴ領域を示す。３’末端のウリジンリッチ領域は、ＲＮＡポリメラーゼがヘアピン構造で一時停止する際、転写産物解放を促進すると考えられている。
【０００６】
長い間、ステム構造内のＧ−Ｃ対によって介在されるヘアピンの安定性は、ＴＥに影響する、ヘアピン構造の最も本質的な部分であると信じられていた。ステム構造内への推定塩基の挿入は、より高い全体ΔＧ値を理論上もたらすはずであり、それゆえ、全体のＴＥが増大するはずである。驚いたことに、Ｇ−Ｃ対を挿入することによる熱力学的安定性の増大はより高いＴＥをもたらさず、ヘアピン構造の安定性だけが終結の本質的な決定因子ではないことを示している。安定性に加え、ヘアピンの三次元構造が終結に重要な役割を果たすことが想定される。最も特徴付けられた内因性ターミネーターに関して、ステム構造の最初の閉鎖塩基対（ｃｌｏｓｉｎｇ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ）から最初の終結位置への距離が保存されている。その不変性を、三次構造の重要性に関する推定証拠と見ることができるのではないだろうか。結論として、伸長ポリメラーゼとの相互作用のために、ヘアピンは別個の三次元構造をとらなければならないようである。
【０００７】
Ｗｉｌｓｏｎおよびｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ（ＰＮＡＳ  ９２，１９９５；８７９３−８７９７）は、ｔＲ２ヘアピンターミネーターのバリアントおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼによる終結効率について記載する。最大終結効率のための最適なヘアピン構造は、８または９の大部分Ｇ／Ｃ塩基対のステム、および６−８ｒＵ残基が続く４−８残基のループを有していた。さらなるステムの延長は、終結効率を減少させた。
【０００８】
Ｏｒｏｓｚら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０１、１９９１：６５３−６５９）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼによるｒｒｎＢの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ターミネーターの構造的な必要条件を調査した。天然のターミネーター領域は、それぞれ小さなステムを形成することができると考えられる二つの断続的な小リピートを有する、二つのヘアピンターミネーターからなる。興味深いことに、第一のターミネーターを除く全ての構造の欠失は、終結効率の減少を生じなかった。この第一のターミネーターは４３％のＧ／Ｃ含量を有していた。
【０００９】
Ｊｅｎｇら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７（２７）、１９９２：１９３０６−１９３１２）は、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによるｔｈｒアテニュエーターのインビトロ終結について記載する。ｔｈｒアテニュエーターの終結は、ｔｈｒアテニュエーターの上流かつ遠位のリモート配列、様々なＡ／Ｔ付加を有する７Ｇ／Ｃ塩基対のＧ／Ｃリッチステムループヘアピン、ヘアピンに先行するデオキシチミジン伸長（ｓｔｒｅｔｃｈ）、およびループ構造（ｔｈｒアテニュエーターの逆配列（ｉｎｖｅｒｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が好適である）に潜在的に影響される。後の調査では、ステムループの上流のアデニン残基伸長は、終結に必要でないと示されている（Ｙａｎｇら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０（４９）、１９９５：２３３３０−２３３３６）。
【００１０】
ターミネーターは、プラスミドｐＡＰＥＣ−Ｏ１−ＣｏｌＢＭ（ＮＣＢＩデータベース登録番号ＮＣ＿００９８３７．１）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＰＥＣ  Ｏ１株（ＮＣＢＩデータベース登録番号ＮＣ＿００８５６３．１）において等、微生物配列に含有される。
【００１１】
Ｃａｒａｆａら（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１６（４）（１９９９）：８３５−８５８）は、Ｒｈｏ非依存性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）転写ターミネーターについて記載する。
【００１２】
Ｍｉｔｒａら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３９（２０１１）：Ｄ１２９−Ｄ１３５）は、ＷｅｂＧｅＳＴｅｒデータベース、転写ターミネーターデータベースの説明を提供する。
【００１３】
Ｕｎｎｉｒａｍａｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０（３）（２００２）：６７５−６８４）は、特定のターミネーター構造および分類の総説を提供する。
【００１４】
ＱｕｉａｇｅｎのＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｐＱＥベクター（「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓシステム」、Ｔｈｅ  ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ  ０６／２００３、５ｔｈ  ｅｄ．、ｐａｇｅ  １５）は、二つのターミネーターを含有する。
【００１５】
Ｕｎｎｉｒａｍａｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７６（４５）（２００１）：４１８５０−４１８５５）は、真正細菌における内因性転写ターミネーターに関する。
【００１６】
Ｆｒｉｅｄｍａｎら（Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２１（１）（１９８７）：４５３−４８８）は、タイプＩおよびタイプＩＩターミネーターの総説を提供する。
【００１７】
Ｌｅｓｎｉｋら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２９（１７）（２００１）：３５８３−３５９４）は、内因性ｒｈｏ依存性ターミネーターの検索に使用するためのプログラムＲＮＡＭｏｔｉｆについて記載する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的は、効率の良い転写終結、とりわけＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのような高進行性（ｈｉｇｈｌｙ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ）ＲＮＡポリメラーゼによって、所望の生産物の発現のため効率が増大した、改善された発現系を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
この目的は、請求項の発明特定事項および本明細書に記載される定義によって、解決される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】発現プラスミドｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ、ＨＥ、ドイツ）のプラスミドマップ。
【図２】改変ｐＥＴ３０ａプラスミドを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株の流加（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）バイオリアクター培養。供給（ｆｅｅｄ）モードで一世代（７時間）後、工程の終わりに計算された量のＣＤＭに従って、２０μｍｏｌ／ｇ  ＣＤＭのＩＰＴＧ濃度を達成する量のインデューサーを添加することにより、細胞を完全に誘導した。１６ｈ後、細胞は生育せず、推定組換えタンパク質産生が検出できなかったので、供給開始後最初の１６ｈのみが図示されている。プラスミドＩ：内因性Ｔ７ターミネーター；プラスミドＪ：１０４ｂｐ欠失の内因性Ｔ７ターミネーター。黒線は、制限無しでの対数増殖を仮定する時の理論上の細胞生育に類似する。プラスミドＪは、リードスルーに起因する増大したプラスミドコピー数を示したが、減少したタンパク質（ＳＯＤ）産生を示した。
【図３】４つの終結シグナル（制限部位が示される）。上から下へ：バクテリオファージＴ３に存在する内因性ターミネーター、オリジナルのＴ７ターミネーター、変化したテトラループを有する改変Ｔ７ターミネーター、およびＶＳＶに由来するクラスＩＩターミネーター。
【図４】人工ターミネーター「Ｔ７ＵＵＣＧ」および高度に類似するオリジナルのＴ７ターミネーターヘアピンループ。（ａ）野生型Ｔ７ターミネーターは６ヌクレオチドのループ配列および二つの不対Ｇ−Ｕ残基を含む不対領域を含有する。（ｂ）人工合成新規Ｔ７ＵＵＣＧ終結シグナルはオリジナルのＴ７ターミネーターと比べていくつかの改変を示す。ヘキサヌクレオチドループは強力な核形成部位（ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）ＵＵＣＧに交換されている。ステム構造内の不対領域は、Ｇ−Ｕに代わるＧ−Ｃ塩基対の存在により、削除されている。
【図５】示されたｐＥＴ３０ａ誘導体を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株の流加バイオリアクター培養。供給モードで一世代（７時間）後、工程の終わりに計算された量のＣＤＭに従って、２０μｍｏｌ／ｇ  ＣＤＭのＩＰＴＧ濃度を達成する量でインデューサーを添加することにより、細胞を完全に誘導した。供給開始後最初の１６ｈのみが図示されている。
【図６】示されたｐＥＴ３０ａ誘導体を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株の流加バイオリアクター培養。供給モードで一世代（７時間）後、実際に存在するＣＤＭに従って、連続的なインデューサーの供給により（０，９μｍｏｌ／ｇ  ＣＤＭ）、細胞を誘導した。細胞生育および組換えタンパク質産生を、発酵工程全体にわたって観察した。培養は流加段階から２８ｈ後に停止した。
【図７】限定誘導（ｌｉｍｉｔｅｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）の流加培養（Ａ：ｐｔＺＥＮＩＴ、Ｂ：ｐＥＴ３０ａ）。計算上および実際の細胞乾燥重量（ＣＤＷ）の経過、プラスミドコピー数（ＰＣＮ）の経過および総生産物収量の経過。
【図８】限定誘導での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）の流加培養（Ａ：ｐｔＺＥＮＩＴ、Ｂ：ｐＥＴ３０ａ）。水溶性の、凝集した、および全体の、特定の組換えタンパク質（ヒトスーパーオキシドジスムターゼ）の経過。
【図９】完全誘導（ｆｕｌｌ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）の流加培養（Ａ：ｐｔＺＥＮＩＴ、Ｂ：ｐＥＴ３０ａ）。水溶性の、凝集した、および全体の、特定の組換えタンパク質（ヒトスーパーオキシドジスムターゼ）の経過。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
第一の態様において、本発明は、少なくとも二つの連続した転写終結シグナルを含むポリヌクレオチドであって、前記連続した転写終結シグナルが、少なくとも、最大で１０００ヌクレオチド離れている第一および第二の転写終結シグナルを含み、かつ該終結シグナルの少なくとも一つがＲＮＡヘアピン構造を有するまたはコードする、ポリヌクレオチドを提供する。本発明によると、連続した終結シグナルはもう一方に影響を与えることができ、かつ、とりわけ少なくとも一つのターミネーターがヘアピン構造を含む場合、劇的に増大した終結効率をもたらすことができることが見出された。前記ヘアピンは、少なくとも６０％ＧまたはＣ（「Ｇ／Ｃ」）核酸を有する、少なくとも１２の内部塩基対のステムを含む構造を有する。好ましい実施形態では、ヘアピンは、第二の態様で定義される特別な構造を有する。本発明は、終結効率を増大できるようにするように、協調作用（ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ａｃｔｉｏｎ）において、先行するコード配列の転写の後の終結が可能となるように、作動可能に連結された、２、３、４以上の終結シグナルの組み合わせを含む、ポリヌクレオチドを提供する。
【００２２】
第二の態様において、本発明はさらに、配列Ｙ−Ｕ／Ｔ−ＮＮＧ−Ｚを有するヘアピン構造を含む少なくとも一つの転写終結シグナルを含むポリヌクレオチドであって、
Ｙが少なくとも８ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％のＧ／Ｃ含量を有し、
ＺがＹに対して少なくとも７０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、配列Ｕ／Ｔ−ＮＮＧは、ＹまたはＺとの塩基対形成が無く、Ｔ（Ｕ）、Ａ、Ｃ、Ｇから選択される任意のヌクレオチドであるＮを有するループであり；好ましくは配列Ｕ／Ｔ−ＮＮＧはＵ／Ｔ−Ｕ／Ｔ−ＣＧである、ポリヌクレオチドを提供する。この第二の態様は、本発明の第一の態様と組み合わせ可能である：この種のターミネーターはまた、ポリヌクレオチド上の第二のヘアピンとして用いることができ、また第一の態様の限定（少なくとも１２ヌクレオチド長であるＹおよびＺ）に適合することを前提として、最初のヘアピンをさらに定義してもよい。とりわけ、特定の遺伝子または発現構築体のターミネーターとしてのみ用いられる場合、より長いステム構造が好ましい、例えば、少なくとも１３、１４、１５、１６以上の塩基対（ＹおよびＺ）。本発明によると、終結効率は、Ｇ／Ｃ含量、ステム相補性をさらに増大させ、かつ以下に詳細に説明されるループを最適化することにより、増大できる。これらの選択肢は全て、本発明により見出されるような、増大した終結効率をもたらすヘアピン安定性を増大する。一般的に、ヘアピンのギブスエネルギー（ｄＧ）の形成は、これらの構造的最適化により低下する。しかしながら、単純なｄＧ最適化は、Ｗｉｌｓｏｎおよびｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ（上記）によって見出されたように、増大した終結効率をもたらすとは限らない：９塩基対を超えてステム長を増加させることは−それはｄＧを減少させる（かつヘアピン安定性を増大させる）が−終結効率の増大をもたらさなかった。
【００２３】
本明細書で用いる場合、ヌクレオチド配列における「／」または括弧内に示されるヌクレオチドは、ＤＮＡ配列におけるＴの代わりのＲＮＡ配列における代替的なＵなどの、代替的なヌクレオチドを指す。それゆえ、Ｕ／ＴまたはＵ（Ｔ）は、ＵまたはＴのいずれかとすることができる一つのヌクレオチド位置を示す。同様に、Ａ／ＴはヌクレオチドＡまたはＴを指す；Ｇ／ＣはヌクレオチドＧまたはＣを指す。ＵとＴの間の機能的同一性に起因して、本明細書におけるＵまたはＴへのあらゆる言及は、ＴまたはＵの他方としての開示としても見られるべきである。例えば、配列ＵＵＣＧ（ＲＮＡ上）は、配列ＴＴＣＧ（対応するＤＮＡ上）の開示としても理解されるべきである。簡単にするためだけに、これらの選択肢の一つだけが本明細書において記載され得る。
【００２４】
相補的ヌクレオチドまたは塩基は、ＡおよびＴ（またはＵ）；ＧおよびＣ；ＧおよびＵなど、塩基対合できるものである。
【００２５】
ヘアピンまたはステムループは、ステム内に（内部）塩基対を形成し、ステム部分の間の中間のループ配列では塩基対合しない、それ自身の上で折りたたむ、ＲＮＡ一本鎖部分のＲＮＡ構造である。ループは、好ましくは短く、例えば３、４、５、６、７または８ヌクレオチド長である。本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１２塩基対、好ましくは１４から２６塩基対の範囲の、より長いステム長を有する少なくとも一つを有する、本明細書で定義される少なくとも１、２、３または４である、１、２、３、４以上のヘアピンを有し得る。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（通常、ターミネーターをコードする）またはＲＮＡ（通常、ヘアピン構造に折りたたむことができ、かつ本発明のターミネーターを含み得る）とすることができる。ポリヌクレオチドは一本鎖（特にＲＮＡについて）または二本鎖（特にＤＮＡについて）とすることができる。
【００２７】
本明細書で用いる場合、「同一性」は、配列が、配列一致を最大にするように、すなわち、ギャップおよび挿入を考慮して、アラインメントされる場合の、二以上の配列における対応する位置での同一のヌクレオチドのパーセンテージを意味する。同一性を決定する方法は、検証される配列間の最大の一致を与えるように設計される。さらに、同一性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータープログラムに分類されている。二つの配列間の同一性を決定するコンピュータープログラム法には、限定するものではないが、ＧＣＧプログラムパッケージ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡが挙げられる。ＢＬＡＳＴプログラムはＮＣＢＩおよび他の供給元から公的に入手可能である（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．、ｅｔ  ａｌ．、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．２０８９４；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））。よく知られているＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために用いられ得る。ＢＬＡＳＴＮは、例えば１１．０のオープンギャップペナルティおよび１．０のエクステンディッドギャップペナルティを備える初期設定パラメータを用いて、ｂｌｏｓｕｍ−６２マトリックスを利用して、実行することができる。
【００２８】
本明細書で用いる場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、類似するまたは他の特徴のさらなる要素を認める、開放定義（ｏｐｅｎ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）として理解されるべきである。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、限定された範囲の特徴に関する閉鎖定義（ｃｌｏｓｅｄ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）として理解されるべきである。
【００２９】
本明細書で用いられる「終結」は、他に断らない限り、転写終結を指す。「終結シグナル」または単に「ターミネーター」は、他に断らない限り、「転写終結シグナル」を指す。ターミネーターはポリメラーゼの転写を妨げるまたは停止させる配列である。本発明のターミネーターは、とりわけ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ用に最適化されているが、ある程度、他のＲＮＡポリメラーゼに対する終結ももたらすことができる。
【００３０】
「ＯＲＦ」または「オープンリーディングフレーム」は、ポリペプチドに翻訳できるヌクレオチド配列である。そのような配列の伸張のコード配列（「ＣＤＳ」）は、終止コドンによって中断されない。終止コドンは、遺伝子発現の間に切除されるイントロ（ｉｎｔｒｏ）に存在してもよい。完全なタンパク質のためのコード配列を表すＯＲＦは、「開始」コドン、通常ＡＴＧ、で始まり、「終止」コドンの一つで終結する。本願の目的のため、ＯＲＦは、開始および／または終止コドン有りまたは無しの、コード配列の任意の部分であってもよい。「ＯＲＦ」および「ＣＤＳ」は、遺伝子産物をコードする配列に関して、互換可能に用いられ得る。
【００３１】
本明細書で用いる場合、ＯＲＦに関連して、例えば、発現カセットにおいて、用語「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」または「作動可能に配置される（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｅｄ）」は、本発明のターミネーター活性を有する配列が、核酸分子の別のヌクレオチド成分と機能的な関係にあることを意味する。例えば、ターミネーターは、それがコード配列の転写に影響する場合、コード配列に作動可能に連結される。かかる作動可能な連結は、例えば、遺伝子のコード配列と同一のＤＮＡ分子上の本発明のターミネーターを提供することによることができる。二以上のターミネーターは、それらが先行するコード配列の協調終結（ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）を提供するよう、互いに位置する場合、作動可能に連結できる。特に好ましくは、ターミネーター配列はコード配列の下流、すなわちコード配列の３’位置上にある。ターミネーターは、例えば、コード配列の少なくとも１、少なくとも１０、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００ヌクレオチド下流、または直接隣接させることができる。これと組み合わせて、またはこれとは別に、ターミネーター配列は、コード配列の下流の１００００未満、８０００未満、６０００未満、５０００未満、４５００未満、４０００未満、３５００未満、３０００未満、２５００未満、２０００未満、１５００未満、１０００未満、７５０未満、５００未満、２５０未満、１００未満のヌクレオチドとすることができる。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、任意にＲＮＡヘアピン構造を含むまたはコードする、第三の転写終結シグナル（上で定義され、しかしながら、任意の他のヘアピンターミネーター、あるいは他から独立して選択されるものなど）を含んでもよく、前記第三の転写終結シグナルは、第一または第二の転写終結シグナルから最大で１０００ヌクレオチド離れている。第一、第二および任意に第三のターミネーターは、遺伝子またはコード配列の転写を停止させるため、（同一の）遺伝子またはコード配列の終わりに配置され得る。ポリヌクレオチドはさらなるターミネーターを含んでもよい。
【００３３】
第一および第二のターミネーターの間、第一および第三の間、ならびに／または第二および第三の間のヌクレオチド距離は、それぞれ個別に、以下の範囲、最大で１０００ヌクレオチド、最大で９００ヌクレオチド、最大で８００ヌクレオチド、最大で７００ヌクレオチド、最大で６００ヌクレオチド、最大で５００ヌクレオチド、最大で４００ヌクレオチド、最大で３００ヌクレオチド、最大で２５０ヌクレオチド、最大で２００ヌクレオチド、最大で１８０ヌクレオチド、最大で１６０ヌクレオチド、最大で１５０ヌクレオチド、最大で１４０ヌクレオチド、最大で１３０ヌクレオチド、最大で１２０ヌクレオチド、最大で１１０ヌクレオチド、最大で１００ヌクレオチド、最大で９０ヌクレオチド、最大で８０ヌクレオチド、最大で７０ヌクレオチド、最大で６０ヌクレオチド、最大で５０ヌクレオチド、のいずれかから選択され得る。さらにまた、第一および第二のターミネーターの間、第一および第三の間、ならびに／または第二および第三の間のヌクレオチド距離は、それぞれ個別に、以下の範囲、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチド、少なくとも７０ヌクレオチド、少なくとも８０ヌクレオチド、のいずれかから選択され得る。ポリヌクレオチド上のターミネーターの配置は、他のターミネーターの終結に影響を及ぼす、作動可能な位置決めを認め得る。
【００３４】
ヘアピンは、分子内塩基対合を含むステムループ構造であり、かつ一本鎖ＤＮＡまたは、より一般に、ＲＮＡにおいて生じ得るパターンである。その構造はヘアピンループとしてもまた知られている。それは、不対ループで終了する二重ヘリックスを形成するために、反対方向に読んだ場合ヌクレオチド配列において大部分相補的である、同一鎖の二つの領域が塩基対合する場合に生じる。ステムループ構造の形成は、結果として生じるヘリックスおよびループ領域の安定性に依存する。もちろん、第一の要件は、対合した二重ヘリックスを形成するように、それ自身の上で折りたたまれ得る配列の存在である。このヘリックスの安定性は、その長さ、それが含むミスマッチまたは膨らみ（ｂｕｌｇｅ）の数（少ない数は認容できる、特に長いヘリックスにおいて）、および対合領域の塩基組成によって決定される。グアニンとシトシンの間の対合は３つの水素結合を有し、２つしか有していないアデニン−ウラシル対合に比べ、より安定である。ＲＮＡでは、２つの水素結合を特色とするグアニン−ウラシル対合もまた、一般的であり好ましい。好ましい配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）で塩基の芳香環のパイ軌道を整列させる、塩基の積み重ね（ｂａｓｅ  ｓｔａｃｋｉｎｇ）の相互作用もまた、ヘリックス形成を促進する。
【００３５】
特に好ましい実施形態では、ヘアピン構造は、配列Ｙ−Ｘ−Ｚ、ここで、Ｙは少なくとも８塩基長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも４０％、少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも６０％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９塩基長のヌクレオチド配列であり、かつ
ＺがＹに対して少なくとも７０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無い（またＸ内でも内部的にそうではない）ループである、によって定義される。好ましくは、Ｘは３、４、５、６、７または８ヌクレオチド長を有する。この一般的な構造は、ステムのＧ／Ｃ含量を増大させること、ループを最適化すること、およびＹとＺの間の相補性を増大させることにより改良される、さらなるＴＥである。Ｘについてテトラループ（長さが４）構造が特に好ましい。Ｘは、Ｕ（Ｔ）、Ａ、Ｃ、Ｇから選択される任意のヌクレオチドであるＮを有する、配列Ｕ／Ｔ−ＮＮＧまたはその逆を含むかまたはからなり；好ましくは配列Ｕ／Ｔ−ＮＮＧはＵ／Ｔ−ＮＣＧ、特にＵ／Ｔ−Ｕ／Ｔ−ＣＧである、を含んでもよく、またはそれからなる。ＹおよびＺ上に隣接するＧ／Ｃを有するテトラループは、非常に高い終結効率を示した、本発明の最も好ましい実施形態にある、非常に安定したループ構造を形成する。
【００３６】
そのような式Ｘ−Ｙ−Ｚのヘアピン構造は、第一、第二および／または第三の転写終結シグナルにあってもよい。さらに、転写シグナルは、他のヘアピンターミネーターまたは代替的な非ヘアピン（例えば、クラスＩＩ）ターミネーターを、あるいは、もちろん個別に選択されるＹ、ＸおよびＺを有する式Ｘ−Ｙ−Ｚのヘアピンのターミネーターもまた、含み得る。好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは二つのヘアピンターミネーター、特に好ましくは本発明のＸ−Ｙ−Ｚ構造である一つまたは二つ、を含む。
【００３７】
本発明はまた、前記配列Ｙ−Ｕ／Ｔ−ＮＮＧ−Ｚを有するヘアピン構造を含む少なくとも一つの転写終結シグナルを含むポリヌクレオチドであって、
Ｙが少なくとも１０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも６０％のＧ／Ｃ含量を有し、
ＺがＹに対して少なくとも７０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、配列Ｕ／Ｔ−ＮＮＧは、ＹまたはＺとの塩基対形成が無く、Ｔ（Ｕ）、Ａ、Ｃ、Ｇから選択される任意のヌクレオチドであるＮを有するループであり；好ましくは配列Ｕ／Ｔ−ＮＮＧはＵ／Ｔ−Ｕ／Ｔ−ＣＧである、ポリヌクレオチドを提供する。Ｕ／Ｔ−ＮＮＧ（もちろん、任意にその逆も含まれる）であるＸを有する上記のＹ−Ｘ−Ｚ構造を有する、かかるポリヌクレオチドは、特に、他のターミネーターからは独立して配置される、例えばＯＲＦまたはＯＲＦが挿入され得るクローニングサイトに作動可能に連結される、たった１つのターミネーターを含んでもよい。Ｘ−Ｙ−Ｚヘアピンに言及する場合、上記および以下は本発明の全ての態様に適用される。
【００３８】
ヘアピンのステムにおける高Ｇ／Ｃ含量は（ＹまたはＺまたは両者共に）、エネルギー的に好ましく、同様に終結効率を増大させる、高度に安定したヘアピンをもたらす。好ましい実施形態では、Ｇ／Ｃ含量は、ＹまたはＺまたは両者のいずれかのヌクレオチドの、少なくとも５０％、少なくとも５２％、少なくとも５４％、少なくとも５６％、少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％である。
【００３９】
好ましい実施形態では、少なくとも一つの転写終結シグナル（第一、第二および／または第三）は、少なくとも７５％、ＡまたはＴ（Ｕ）を含む、少なくとも４、好ましくは少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０ヌクレオチド長のＡ／Ｔ（Ｕ）−リッチ領域を含み、ここで、好ましくは前記Ａ／Ｔ（Ｕ）−リッチ領域はヘアピンの下流にあり、特に好ましくは前記ヘアピンから２０ヌクレオチド以下離れている。Ａ／Ｔ（Ｕ）−リッチ領域は、好ましくは最大で１、最大で２、最大で３のＧ／Ｃヌクレオチドを有するＡ／Ｔ（Ｕ）から選択される、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０ヌクレオチドを含んでもよい。特に好ましくは、Ａ／Ｔ（Ｕ）−リッチ領域は、最大で２０ヌクレオチド、好ましくは最大で１５ヌクレオチド、最大で１２ヌクレオチド、最大で１０ヌクレオチド、最大で８ヌクレオチド、最大で７ヌクレオチド、最大で６ヌクレオチド、最大で５ヌクレオチド、最大で４ヌクレオチド、最大で３ヌクレオチド、最大で２ヌクレオチド、最大で１ヌクレオチド、ヘアピンから離れている（通常、下流）、または直接隣接している。Ａ／Ｔ（Ｕ）−リッチ領域はＴ（Ｕ）−リッチであってもよく、好ましくは、少なくとも３Ｔ（Ｕ）、少なくとも４Ｔ（Ｕ）、少なくとも５Ｔ（Ｕ）、少なくとも６Ｔ（Ｕ）、少なくとも７Ｔ（Ｕ）、または少なくとも８Ｔ（Ｕ）を含む。Ａ／Ｔ（Ｕ）−リッチ領域は、最大２０、最大１５、最大１２、最大１０、最大８ヌクレオチド長とすることができる。ヘアピンの下流のＡ／Ｔ（Ｕ）−リッチ領域は、通常、終結効率を増大させる。それはステム（Ｚ）とオーバーラップしていてもよい。この場合、好ましくは、Ｚの最後の１、２、３、４または５ヌクレオチドが、ＡまたはＴ（Ｕ）、好ましくはＴ（Ｕ）であってもよい。
【００４０】
式Ｙ−Ｘ−Ｚの本発明のヘアピにおいて、好ましくは、Ｙは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である。Ｙの長さは、（同一のヌクレオチド長から選択できる、相補性により）Ｚの長さを決定する。実質的に相補的なＹおよびＺ、ヘアピンのステム、の長さは、塩基対でステム長を決定する。以下に記載されるように、ステムは必ずしも１００％相補的ではないが、ＹおよびＺについて、限定された非相補的な対向する（ｏｐｐｏｓｉｎｇ）塩基を有する。
【００４１】
特に、ＹおよびＺはｍヌクレオチド長とすることができ、ここで、Ｙはヌクレオチドｙ１からｙｍからなり、Ｚはヌクレオチドｚ１からｚｍからなり、ヘアピンは、配列ｙｍｙｍ−１ｙｍ−２．．．ｙ８ｙ７ｙ６ｙ５ｙ４ｙ３ｙ２ｙ１−Ｘ−ｚ１ｚ２ｚ３ｚ４ｚ５ｚ６ｚ７ｚ８．．．ｚｍ−１ｚｍからなる。好ましくは、ｚ１はｙ１に対して相補的であり、ｚｍはｙｍに対して相補的であり、ヘアピンのステムの両終端が相補的であることを意味する。さらにまた、１からｍまでの整数であるａを有する、ｙａのいずれか一つをｚａと相補的とすることができ、とりわけ、ｙａとｚａの間の相補性は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０およびそれらの任意の組み合わせであるａに関してとすることができる。特に好ましくは、ステムの最初および／または最後の１、２、３、４または５ヌクレオチドが相補的である。
【００４２】
ＹおよびＺは、効率良く安定したヘアピン形成のために高い相補性を有するべきであり、例えば、ＹおよびＺは少なくとも８０％相補的、好ましくは少なくとも８２％相補的、少なくとも８４％相補的、少なくとも８５％相補的、少なくとも８６％相補的、少なくとも８８％相補的、少なくとも９０％相補的、少なくとも９２％相補的、少なくとも９４％相補的、少なくとも９５％相補的、少なくとも９６％相補的、少なくとも９７％相補的、少なくとも９８％相補的、少なくとも９９％相補的、または１００％相補的でさえある。相補性は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％、Ｇ−ＣまたはＡ−Ｔ（Ｕ）相補性であることが、最も好ましい。
【００４３】
ＸおよびＺで形成されるステム構造において、非相補性は限定されるべきではない。いくつかの限定された非相補性が可能であるが、「バブル」またはさらなるループの形成を阻むために、互いに隣接して配置されるべきではない。好ましい実施形態では、ヘアピンにおいて、ＹとＺのヌクレオチドの間で、最大で３、２または１のＧ−Ｕ相補性が別のＧ−Ｕ相補性に隣接し、好ましくは、ヘアピンは隣接したＧ−Ｕ相補性を有さない。
【００４４】
本発明の特に好ましいターミネーターは、配列番号４によってコードされる。本発明は、配列番号４によってコードされるターミネーターと、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％配列同一性を有する、さらなる相同的なターミネーターにまで及ぶ。好ましくは、上に定義される非同一性が残っており、かつ、例えば、上述のような非相同的ステム構造またはＡ／Ｔリッチ領域を形成しない、または限定されたそれらを形成する。配列番号４には、ステム（ｎｔｓ  １から１６、２１から３６）、ループ（ｎｔｓ  １７から２０）およびステムに続くＡ／Ｕリッチ領域（ｎｔｓ  ３７から４０）を有する、人工最適化ターミネーターが記載されている。それは、ステム構造において７８％のＧ／Ｃ含量を有する（２５／３２  ｎｔｓ）。
【００４５】
好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも一つのターミネーターがクラスＩＩターミネーターである。
【００４６】
通常のヘアピン様ターミネーターとは対照的に、終結事象、クラスＩＩターミネーターの作用は、非コード鎖の存在を必要とし、それゆえ、二本鎖駆動（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｄｒｉｖｅｎ）過程である（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７、１９９８：１９３０６−１９３１２）。これらの新規な配列での終結シグナル、いわゆるクラスＩＩ終結シグナル、が、クラスＩ終結経路から独立したメカニズムを介して介在されるというさらなる証拠は、変異Ｔ７ポリメラーゼによるインビトロ転写解析に由来する。２０ｋＤａのＮ末端部分と８０ｋＤａのＣ末端断片の間の変異は、クラスＩＩ終結シグナルでは終結することができないが、転写ヘアピンがクラスＩ終結シグナルを含有する場合には、まだ伸長を停止することができる、「ニックが入った」形態のポリメラーゼをもたらす（Ｌｙａｋｈｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６９、１９９７：２８−４０）。それゆえ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における転写終結を達成できる二つの異なるメカニズムが存在し、両経路は互いに独立して作動する。
【００４７】
推定生物の配列解析から、さらなるクラスＩＩ終結シグナルの存在が明らかとなった。これらの稀な配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｒｒｎＢ  Ｔ１終結部位内に、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のｃＤＮＡコピーにおいて、アデノウイルスＤＮＡにおいて、およびバクテリオファージラムダＤＮＡ内に存在する（Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｕｄｉｅｒ、１９９５）（Ｓｏｕｓａ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２）。これらの新たに発見された配列の全ては、７ｂｐ長のコンセンサス配列（非鋳型鎖によればＡＴＣＴＧＴＴ）、および、内因性終結シグナルでのＵ−ラン（ｒｕｎ）に比べて、３’末端に不均一に長いウリジンのラン（ｒｕｎ）を共有する。
【００４８】
【表１】
2014516546.tif 000003
（Ｌｙａｋｈｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２８０（１９９８）：２０１−２１３より）
【００４９】
ウリジン（非鋳型鎖ではＴ）の隣接するラン（ｒｕｎ）を欠くコンセンサス配列は、複製Ｔ７  ＤＮＡのコンカテマージャンクション（ＣＪ）の末端に存在する（Ｌｙａｋｈｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７）。ウリジン区域（ｔｒａｃｔ）の欠如のため、この７ｂｐ長配列の重要性が、内因性Ｔ７ポリメラーゼを「ニックが入った」形態へ変異させることにより、これまでに解析された。ニックが入ったＴ７ポリメラーゼを発現するファージは、潜在的クラスＩＩ終結部位を認識できない。
【００５０】
本発明によれば、本発明のクラスＩＩターミネーターは７つの例全てに共通するコンセンサス配列ＴＣＴＧＴＴを含み、好ましくはＴが前記ＴＣＴＧＴＴ配列の３’の２ヌクレオチド内にある。好ましくは、クラスＩＩターミネーターは、少なくとも４０％のＴ含量を有する、少なくとも２０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも２２、少なくとも２４または少なくとも２６ヌクレオチド長の配列を含む（コンセンサス配列を含む）。８ヌクレオチド長内の少なくとも４０％ＴのＴリッチ領域は、コンセンサス配列に３’または５’で隣接している。
【００５１】
クラスＩＩ終結シグナルはヘアピン終結シグナルに隣接できる。かかるクラスＩＩターミネーターは、中間のヌクレオチドがほとんど無い、または中間のヌクレオチドが全く無い、好ましくは最大で１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１の中間のヌクレオチドを有する、または中間のヌクレオチドが全く無い、ヘアピンの直前または直後とすることができる。ヘアピンに続くＡ／Ｔ（Ｕ）−リッチ、とりわけＴ（Ｕ）リッチ領域は、ヘアピンと隣接するクラスＩＩターミネーターの間にあってもよい。
【００５２】
ＰＴＨ遺伝子に存在するクラスＩＩ終結部位を含有する鋳型を用いるインビトロ転写アッセイから、約５５％の転写効率であり、それゆえ、そのターミネーターはＴ７ターミネーターを形成するヘアピンよりも効率が悪いことが明らかになった（天然のＴ７ターミネーターは約８０％のＴＥを示す）。しかしながら、本発明によれば、組み合わせでは、クラスＩおよびクラスＩＩターミネーターは、驚くほど増大した全体効率を有することがわかった。
【００５３】
作動可能に連結される、少なくとも二つのターミネーターシグナルを含む、可能な本発明のポリヌクレオチドは、以下である：
【００５４】
１）配列Ｙ−Ｘ−Ｚで定義されるヘアピン構造を含む第一のターミネーターシグナルであって、Ｙが少なくとも１４ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、かつ、
ＺがＹに対して少なくとも９０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無い（またＸ内でも内部的にそうではない）ループである、第一のターミネーターシグナル；
配列Ｙ−Ｘ−Ｚで定義されるヘアピン構造を含む第二のターミネーターシグナルであって、Ｙが少なくとも８ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも６０％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、かつ、
ＺがＹに対して少なくとも７０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無い（またＸ内でも内部的にそうではない）ループである、第一のターミネーターシグナル；第一および第二のターミネーターは、第一および第二の終結シグナルによって協調終結（ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）を提供するよう、最大で１０００ヌクレオチド離れている。第一および第二のターミネーターのＹ、Ｘ、およびＺは上述のように独立して選択できる。ターミネーターシグナルは、任意の順番または上記のような順番とすることができる。
【００５５】
２）配列Ｙ−Ｘ−Ｚで定義されるヘアピン構造を含む第一のターミネーターシグナルであって、Ｙが少なくとも１２ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、かつ、
ＺがＹに対して少なくとも８０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無い（またＸ内でも内部的にそうではない）ループである、第一のターミネーターシグナル；
クラスＩＩ終結シグナルを含む、好ましくはコンセンサス配列ＴＣＴＧＴＴを含む、より好ましくは少なくとも４０％のＴ含量を有する少なくとも２０ヌクレオチド長の配列を含む、第二のターミネーターシグナル；第一および任意のさらなるターミネーターのＹ、Ｘ、およびＺならびにクラスＩＩ終結シグナルのパラメータは、上述のように独立して選択できる。ターミネーターシグナルは、任意の順番または上記のような順番とすることができる。クラスＩＩ終結シグナルは、上記またはさらなるヘアピン終結シグナルの一つに隣接することができる。
【００５６】
３）配列Ｙ−Ｘ−Ｚで定義されるヘアピン構造を含む第一のターミネーターシグナルであって、Ｙが少なくとも１２ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、かつ、
ＺがＹに対して少なくとも８０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無い（またＸ内でも内部的にそうではない）ループである、第一のターミネーターシグナル；
配列Ｙ−Ｘ−Ｚで定義されるヘアピン構造を含む第二のターミネーターシグナルであって、Ｙが少なくとも８ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも６０％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、かつ、
ＺがＹに対して少なくとも７０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無い（またＸ内でも内部的にそうではない）ループである、第二のターミネーターシグナル；
配列Ｙ−Ｘ−Ｚで定義されるヘアピン構造を含む第三のターミネーターシグナルであって、Ｙが少なくとも８ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも６０％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、かつ、
ＺがＹに対して少なくとも７０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無い（またＸ内でも内部的にそうではない）ループである、第三のターミネーターシグナル；第一、第二および第三のターミネーターは、第一、第二および第三の終結シグナルによって協調終結（ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）を提供するよう、最大で１０００ヌクレオチド離れている。第一、第二または第三のターミネーターのＹ、Ｘ、およびＺは上述のように独立して選択できる。終結シグナルは、任意の順番または上記のような順番とすることができる。
【００５７】
４）配列Ｙ−Ｘ−Ｚで定義されるヘアピン構造を含む第一のターミネーターシグナルであって、Ｙが少なくとも１２ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、かつ、
ＺがＹに対して少なくとも８０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無い（またＸ内でも内部的にそうではない）ループである、第一のターミネーターシグナル；
クラスＩＩ終結シグナルを含む、好ましくはコンセンサス配列ＴＣＴＧＴＴを含む、より好ましくは少なくとも４０％のＴ含量を有する少なくとも２０ヌクレオチド長の配列を含む、第二のターミネーターシグナル；
配列Ｙ−Ｘ−Ｚで定義されるヘアピン構造を含む第三のターミネーターシグナルであって、Ｙが少なくとも８ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも６０％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、かつ、
ＺがＹに対して少なくとも７０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無い（またＸ内でも内部的にそうではない）ループである、第三のターミネーターシグナル；第一、第二および第三のターミネーターは、第一、第二および第三の終結シグナルによって協調終結（ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）を提供するよう、最大で１０００ヌクレオチド離れている。第一または第三のターミネーターのＹ、Ｘ、およびＺならびにクラスＩＩ終結シグナルのコンセンサスおよびＴ−リッチ配列は、上述のように独立して選択できる。終結シグナルは、任意の順番または上記のような順番とすることができる。クラスＩＩ終結シグナルは、上記またはさらなるヘアピン終結シグナルの一つに隣接することができる。
【００５８】
５）配列Ｙ−Ｘ−Ｚで定義されるヘアピン構造を含む第一のターミネーターシグナルであって、Ｙが少なくとも１２ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、かつ、
ＺがＹに対して少なくとも８０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無い（またＸ内でも内部的にそうではない）ループである、第一のターミネーターシグナル；
配列Ｙ−Ｘ−Ｚで定義されるヘアピン構造を含む第二のターミネーターシグナルであって、Ｙが少なくとも８ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも６０％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、かつ、
ＺがＹに対して少なくとも７０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無い（またＸ内でも内部的にそうではない）ループであり、かつ、好ましくはコンセンサス配列ＴＣＴＧＴＴを含む、より好ましくは少なくとも４０％のＴ含量を有する少なくとも２０ヌクレオチド長の配列を含む、ヘアピン構造に隣接するクラスＩＩ終結シグナルである、第二のターミネーターシグナル；
配列Ｙ−Ｘ−Ｚで定義されるヘアピン構造を含む第三のターミネーターシグナルであって、Ｙが少なくとも８ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であって、かつ少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも６０％のＧ／Ｃ含量を有し、
Ｘが３から９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、かつ、
ＺがＹに対して少なくとも７０％相補性を有するヌクレオチド配列であり、
Ｚの該相補的ヌクレオチドはＹのヌクレオチドと塩基対形成し、かつ、ＸはＹまたはＺとの塩基対形成が無い（またＸ内でも内部的にそうではない）ループである、第三のターミネーターシグナル；第一、第二および第三のターミネーターは、第一、第二および第三の終結シグナルによって協調終結（ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）を提供するよう、最大で１０００ヌクレオチド離れている。第一、第二または第三のターミネーターのＹ、Ｘ、およびＺならびにクラスＩＩ終結シグナルのコンセンサスおよびＴ−リッチ配列は、上述のように独立して選択できる。終結シグナルは、任意の順番または上記のような順番とすることができる。クラスＩＩ終結シグナルは、上記またはさらなるヘアピン終結シグナルの一つに隣接することができる。
【００５９】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、容易な取り扱いに適した形態で、例えば限定された長さで提供される。それゆえ、ポリヌクレオチドは、ゲノム配列または大きなゲノム断片を除いてもよい。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、最大で３０，０００  ｎｔｓ（ヌクレオチド）、最大で２５，０００  ｎｔｓ、最大で２０，０００  ｎｔｓ、最大で１５，０００  ｎｔｓ、最大で１２，５００  ｎｔｓ、最大で１０，０００  ｎｔｓ、最大で９，０００  ｎｔｓ、最大で８，０００  ｎｔｓ、最大で７，０００  ｎｔｓ、最大で６，０００  ｎｔｓを含む。
【００６０】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、前記転写終結シグナルに挟まれた一以上の制限部位および／もしくは転写終結シグナルの上流のクローニングサイト、または転写終結シグナルの上流のコード配列（ＣＤＳ）を含み、好ましくはさらにプロモーターに作動可能に連結される。かかるポリヌクレオチドは、作動可能に連結されたＣＤＳの転写の間、機能的に高い転写率を可能にする。選択されたＣＤＳは、ポリヌクレオチド分子上の制限部位を提供することにより挿入できる。本発明のターミネーターは、（コード配列が挿入され得る）マルチクローニングサイトの転写産物の終結のために、作動可能に位置され得る。用語「マルチクローニングサイト」は、制限酵素のための少なくとも２部位を含む部位を指すが、好ましくは、それは様々な制限酵素のための多数の部位を含む。
【００６１】
プロモーターは転写を開始するために用いることができる。好ましくは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが用いられる。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、その５’末端および／または３’末端で、エンドヌクレアーゼ制限部位に挟まれている。末端制限部位は、ベクターまたは発現カセットなどの他の核酸分子内への組み込みのため、本発明のポリペプチドの取り扱いを容易にする。
【００６２】
本発明のターミネーター配列は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと共に、特に良く機能する。好ましい実施形態では、新たなターミネーターを有する本発明のポリヌクレオチドは、Ｔ７ターミネーターを含む任意のポリヌクレオチドまたはベクターから、本発明のターミネーター配列でＴ７ターミネーターを置き換えることにより、得ることができる。
【００６３】
Ｔ７ターミネーターはバクテリオファージＴ７のゲノム内にその起源を有し、プラスミドベクターｐＥＴ３０などの人工ベクターにおいて、広く用いられてきた。市販のｐＥＴ３０ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍｅｒｃｋ  ｋｇａＡ、ＨＥ、Ｇｅｒｍａｎｙ；図１；配列番号１、逆相補配列：配列番号２）において、Ｔ７ターミネーターＤＮＡ配列（配列番号３）は、逆相補配列（配列番号２）の位置５３４５から５４１７に見られる。Ｔ７ターミネーターは、さらに、例を挙げると、ベクターｐＩＧＤＭＣＴ７ＲＳ（ＮＣＢＩデータベースＤＱ４８５７２１．１）、ｐＬＭ９９（ＮＣＢＩデータベースＡＦ３０８７３９．１）、ｐＬＭ１００（ＮＣＢＩデータベースＡＦ３０８７４０．１）、ｐＬＭ１０１（ＮＣＢＩデータベースＡＦ３０８７４１．１）、ｐＸＺ２４０（ＮＣＢＩデータベースＡＦ３１６５５５．１）、ｐＪＨ３９１（ＮＣＢＩデータベースＡＦ３１６５５４．１）、ｐＪＨ３７０（ＮＣＢＩデータベースＡＦ３１６５５３）、ｐＴ７ＲＳ（ＮＣＢＩデータベースＡＹ９２３８６６．１）、ｐＬＭ３（ＮＣＢＩデータベースＡＦ１７９８９２．１）、ｐＬＳ１３（ＮＣＢＩデータベースＡＦ１６９１９０．１）、ｐＬＳ３（ＮＣＢＩデータベースＡＦ１６９１８９．１）、ｐＺＨ３（ＮＣＢＩデータベースＡＦ１６８６１２）、ｐＢＩＴ（ＮＣＢＩデータベースＪＦ２７５０６３．１）、ｐＮｉｔ：：ＥＴ（ＮＣＢＩデータベースＧＵ４５９０７３．１）、ｐＹＵＢＤｕｅｔ（ＮＣＢＩデータベースＨＱ２４７８１５．１）、ｐＹＵＢ２８ｂ（ＮＣＢＩデータベースＨＱ２４７８１４．１）、ｐＳＢ４３１６（ＮＣＢＩデータベースＨＱ３４３２３９．１）において、用いられる。Ｔ７ターミネーターを有するさらなるベクターは、ＮＣＢＩデータベース、ＥＭＢＬ−ＥＢＩデータベース、ＤＤＢＪデータバンクなどの、入手可能なヌクレオチド配列データベースにおけるＢＬＡＳＴ検索によって、容易に決定できる。ＢＬＡＳＴプログラムは、ＮＣＢＩおよびその他の供給元から公的に入手可能である（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．、ｅｔ  ａｌ．、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．２０８９４；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）。機能的に同等なターミネーターは、配列番号３と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するさらなる配列において見出され得る。任意のかかる配列およびベクターは、本発明の転写終結シグナルによって転写終結を改変するために用いることができる。
【００６４】
本発明のさらなる実施形態では、上で定義される核酸の配列、および遺伝子産物の配列（すなわちコード配列、ＯＲＦ）を含む発現カセットであって、本発明のターミネーター配列が遺伝子産物の転写終結のために作動可能に配置される、発現カセットが提供される。発現カセットはまた、単離および／または精製され得る。かかる発現カセットは、例えば、宿主細胞のトランスフェクションのために好適なベクターにおいて提供される。また、発現カセットは、宿主細胞の改変されたゲノムにおいて提供され得る。ゲノムは、例えば、組換え技術、特にノックイン法または人工染色体を提供することにより、改変できる。
【００６５】
好ましくは、本発明の発現カセットは、容易な取り扱いに適した形態で、例えば限定された長さで提供される。それゆえ、発現カセットは、ゲノム配列または大きなゲノム断片を除いてもよい。好ましい実施形態では、発現カセットは、最大で３０，０００  ｎｔｓ（ヌクレオチド）、最大で２５，０００  ｎｔｓ、最大で２０，０００  ｎｔｓ、最大で１５，０００  ｎｔｓ、最大で１２，５００  ｎｔｓ、最大で１０，０００  ｎｔｓ、最大で９，０００  ｎｔｓ、最大で８，０００  ｎｔｓ、最大で７，０００  ｎｔｓ、最大で６，０００  ｎｔｓを含む。好ましい実施形態では、発現カセットは、その５’末端および／または３’末端で、エンドヌクレアーゼ制限部位に挟まれている。
【００６６】
さらなる好ましい実施形態では、発現カセットは、翻訳されず、転写と翻訳の間で切除される、イントロン配列を含む。かかるイントロン配列は、例えば、プロモーター配列とコード配列の開始コドンの間、またはコード配列内に位置され得る。かかるイントロン配列が、転写プロセシングとの機構的関係に起因して、遺伝子発現を増大できることが見出されている。
【００６７】
本発明のさらなる態様において、上で定義される核酸分子の配列を含むベクターが提供される。ベクターはまた、上述した発現カセットを含んでもよい。それは単離および／または精製され得る。好ましくは、ベクターは発現ベクターまたはファージなどの生物学的に機能的なベクターである。
【００６８】
遺伝子転写終結活性を有する本発明の配列は、好ましくはエンドヌクレアーゼ部位に挟まれて位置される。ターミネーター活性を有する本発明の配列に作動可能に連結されたこのベクターへの、コード配列のクローニングを容易にする。プラスミドは、以下の一以上を含んでもよい：原核生物複製起点、マーカーもしくは抗生物質耐性遺伝子配列、加えて、本発明のターミネーターと作動可能に配置される、マルチクローニングサイトまたはコード配列。
【００６９】
さらなる実施形態では、本発明は、上で定義されるポリヌクレオチドまたは発現カセットまたはベクターを含む細胞に関する。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチド、発現カセットまたはベクターは、前記細胞のゲノム内に安定的にインテグレートされる。あるいは、これらのポリヌクレオチド、発現カセットまたはベクターを一過性に組み込むことも可能である。
【００７０】
細胞は本発明のポリヌクレオチドから遺伝子産物を発現するのに適しているだろう。遺伝子産物の発現に適した宿主細胞は、例えば、原核生物、真核生物、酵母、とりわけ、微生物細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、植物細胞または昆虫細胞である。好ましい実施形態では、細胞は、極めて精密であり、かつ、ヘアピンターミネーター（クラスＩターミネーター）−野生型かつニックの入った形態のＴ７ポリメラーゼ−を、かつ任意にクラスIIターミネーター−野生型であるがニックの入った形態でないＴ７ポリメラーゼ−も認識できるＴ７プロモーター配列を伴う、ＤＮＡ配列を正確に転写する、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼと比べ、Ｔ７ポリメラーゼは最大５転写する。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの発現は、内因性（例えば宿主細胞、特に宿主細胞のゲノムによってコードされるＴ７ポリメラーゼ）、あるいは人工的なトランスフェクションによって（例えばベクター上にあるが、ゲノムにインテグレートされてもよいＴ７ポリメラーゼ）、のいずれかとすることができる。好ましくは、細胞は原核生物、とりわけ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。好ましくは、細胞は微生物細胞培養物であり、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の非病原性株、例えば株ＭＧ１６５５、ＢＬ２１、ＨＭＳ１７４または前記株のＤＥ３溶原菌のような、非病原性培養物である。
【００７１】
さらなる態様において、本発明のポリヌクレオチド、発現カセットまたはベクターは、遺伝子産物の発現（または産生）のために用いることができる。一つの例は、本発明の発現カセットにおいて単離された細胞または細胞株をトランスフェクトすること、および遺伝子産物を発現することを含み、任意に発現された遺伝子産物を単離することをさらに含む、遺伝子産物、好ましくはタンパク質を発現する方法である。遺伝子産物を産生する本発明の方法は、上述した細胞を提供すること、および前記遺伝子の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養することを含んでもよい。
【００７２】
あるいは、遺伝子産物は、人工／細胞外翻訳系で、エクスビボで発現できる。
【００７３】
本発明は、本発明のターミネーターシグナルを有するポリヌクレオチド、および前記転写終結シグナルの上流のコード配列を提供すること、ならびに前記ポリヌクレオチドをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼと接触させることを含む、ｍＲＮＡを産生するインビトロの方法を提供する。インビトロ転写は、プロモーターを含有する、ポリヌクレオチド鋳型、通常ＤＮＡ、リボヌクレオチド三リン酸、マグネシウムイオンを含むバッファー系、および適当なファージＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを必要とする。産生されたｍＲＮＡは、次いで、解析的使用のため、および／または遺伝子産物を発現するために用いることができる。最も頻繁に用いられる無細胞翻訳系は、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来の抽出物からなる。全て、外因性ＲＮＡの翻訳に必要とされる全ての高分子成分（７０Ｓまたは８０Ｓリボソーム、ｔＲＮＡｓ、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ、開始、伸長および終結因子等）を含有する粗抽出物として、調製される。効率のよい翻訳を確実にするために、各抽出物は、アミノ酸、エネルギー源（ＡＴＰ、ＧＴＰ）、エネルギー再生系（真核細胞系のためにクレアチンリン酸およびクレアチンホスホキナーゼ、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物のためにピルビン酸およびピルビン酸キナーゼ）、および当技術分野で知られている他の補因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）が、添加されるだろう。
【００７４】
本発明のさらなる態様は、ターミネーター活性を有する本発明の配列の一つに相補的な配列を含むポリヌクレオチド分子に関する。かかる相補的な分子は、通常、いわゆる「アンチ−ターミネーター」として、本発明の配列に結合する。アンチ−ターミネーターは、例えば、Ｓｏｏｎｃｈｅｏｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３８（１８）、２０１０：６０４５−６０５３）に記載される。相補的な分子は、好ましくは、本発明のターミネーターのステム−ループ配列に結合し、かつステム配列の少なくとも一部に競合的に結合することにより、適切なステム形成を阻むまたは妨げる。好ましくは、アンチ−ターミネーターは、ステム配列の３、４、５、６、７以上の核酸に相補的である。かかる相補配列を用いて、例えば、例えば遺伝子の発現を制御するために、ターミネーター活性を有する本発明の配列に安定的に結合することができる。かかる相補配列の安定した結合で、終結は増強または抑制され、特に抑制される。相補配列を有する核酸分子は、任意のヌクレオチドタイプ、好ましくはターミネーター活性を有する本発明の配列を有するＤＮＡ分子に強く結合するヌクレオチドタイプであってもよい。高い結合活性を有するかかる核酸タイプは、例えば、ＲＮＡ、ＬＮＡ（ロックト核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ））、またはＰＮＡ（ペプチド核酸）である。
【００７５】
本発明は、さらに、上述した相補配列を有する核酸分子を、発現カセットと細胞に投与することを含む、上で定義される発現カセットによる、遺伝子産物の終結および／または発現を制御する方法に関する。
【００７６】
本発明は、以下の図および実施例によってさらに説明されるが、本発明のこれらの例示的な実施形態に限定されるものではない。
【００７７】
実施例：
１．材料および方法
１．１：菌株
クローニング法のため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株（Ｆ−  ｅｎｄＡ１  ｇｌｎＶ４４  ｔｈｉ−１  ｒｅｃＡ１  ｒｅｌＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｄｅｏＲ  ｎｕｐＧ  Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５  Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９、ｈｓｄＲ１７（ｒＫ−  ｍＫ＋）、λ−）が宿主として用いられ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（Ｆ−  ｒｅｃＡ１  ｈｓｄＲ（ｒＫ１２−  ｍＫ１２＋）（ＤＥ３）（Ｒｉｆ  Ｒ））（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ、ＨＥ、ドイツ）が産生株として用いられた。従って、Ｔ７ポリメラーゼの発現は、ＩＰＴＧの添加により誘導できる。
【００７８】
１．２：プラスミド
標準的な発現ベクターとして、ｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ、ＨＥ、ドイツ；図１；配列番号１および２を参照のこと）が利用された。該プラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子およびリプレッサー分子ＬａｃＩをコードする推定遺伝子を保有する。外来ＤＮＡのクローニングのため、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）内の多数の制限部位が利用できる。挿入された遺伝子は、誘導性Ｔ７／ｌａｃハイブリッドプロモーターの制御下にあり、Ｔ７ポリメラーゼに介在される転写は、３’末端の単一のＴ７終結シグナルによって止められる。複製は、ＣｏｌＥ１様複製起点を介して介在される。
【００７９】
１．３：発現遺伝子
組換えヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ｒｈＳＯＤ）がモデルタンパク質として選択された。今まで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現された場合、ｈＳＯＤの非毒性効果を観察することができた、それゆえ、外来遺伝子の発現によって引き起こされる、宿主の細胞負担（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｕｒｄｅｎ）は、もっぱら産生率（ｑＰ）のレベルによって引き起こされる。
【００８０】
その活性中心におけるＣｕ／Ｚｎと複合体形成したｈＳＯＤは、酸素にさらされるほとんど全ての細胞の細胞質において、抗酸化防御に参加する。とりわけ、赤血球と肝細胞は、２つの酸素ラジカルの減少を触媒し、過酸化水素の形成をもたらす、高レベルの活性ｈＳＯＤ酵素を有する。該タンパク質は３２ｋＤａの分子量を有し、その活性形態において、該酵素は、その活性中心において一つのＺｎと一つのＣｕ原子と複合体形成した、２つの非共有結合した同一のサブユニット（それぞれ１５３ＡＡ）からなる。
【００８１】
ｈＳＯＤをコードする遺伝子が、制限酵素ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩの認識配列をそれらの５’末端に含有するプライマー（プライマーＧＴＣＧＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＧＧＣＧＡＴＣＣＣ（配列番号５）およびＧＴＣＧＴＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣ（配列番号６））を用いて増幅された。結果として生じる断片が、ｈＳＯＤをオリジナルのｐＥＴ３０ａベクターへクローニングするために用いられた。
【００８２】
１．４：クローニング方法
クローニング法は（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ、２００１）に従って行った。制限酵素および他の修飾酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、米国）から購入し、製造業者の推奨に従って適用した。全てのプライマーおよび合成オリゴヌクレオチドは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）から入手した。
【００８３】
プライマー設計、インシリコクローニング、配列解析および二次構造予測は、ＣＬＣ  ｍａｉｎ  ｗｏｒｋｂｅｎｃｈを用いて行った。適切な配列領域にわたるＰＣＲを用いて、断片の正しい挿入を確認し、アガロースゲル電気泳動を介して、増幅産物を長さに関して検証した。正しいクローニング産物を有するクローンを液体培地で増幅し、標準的なプラスミド調製キット（ＰｒｏｍｅｇａからのＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  精製システム、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ａ１３３０）を用いて各プラスミドを単離した。精製したプラスミドを配列解析のためＡＧＯＷＡ（ＡＧＯＷＡ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｂ、ドイツ）に送付した。サンプルの大部分が顕著な二次構造を示す配列領域を含有しているという事実によって、配列解析は、シングルエコノミーリードモードで変性試薬の存在下、行われた。
【００８４】
１．５：内因性ターミネーター欠失
プラスミドコピー数制御の調節解除（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）での、不十分な転写終結の役割を調査するために、内因性Ｔ７ターミネーターを欠くｐＥＴ３０ａ誘導体を産生した。開始材料として、モデルタンパク質としてクローニングされた（ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ）ｈＳＯＤを有するオリジナルのｐＥＴ３０プラスミドを用いた。そのプラスミドはプラスミド＿Ｉと命名され、全ての続く解析のための参照プラスミドとして機能する。
【００８５】
オリジナルのｐＥＴ３０ａ上の内因性Ｔ７終結シグナルを欠失するために、インバースＰＣＲが設計された。プライマーが、それらの３’末端に従って、反対方向にＤＮＡ鋳型に結合するように構築された（プライマーＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号７）およびＧＧＡＧＧＡＡＣＴＡＴＡＴＣＣＧＧＡＴＴＧＧＣＧ（配列番号８）。それゆえ、二つのプライマー結合部位の間に存在するＤＮＡ配列は欠失される。再び、ＫＯＤ  Ｈｉｆｉ  ポリメラーゼ（Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ、ＨＥ、ドイツ）を、ＰＣＲ反応のために選択した。結果として生じるプラスミドはＰｌａｓｍｉｄ＿Ｊと命名され、鋳型として用いられたプラスミド＿Ｉよりも１０４ｂｐ短い。終結シグナルの正しい欠失を、適切な領域を配列解析することにより確認した。
【００８６】
１．６：インビトロ転写
変化した終結シグナルを有する数種のｐＥＴ３０ａ誘導体の構築の後、Ｔ７ポリメラーゼ介在転写を終結させるそれらの個々の能力を、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｉｏｚｙｍ  Ｓｃｉ−ｅｎｔｉｆｉｃ  ＧｍｂＨ、ＮＩ、ドイツ）からのＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ（商標）  Ｔ７  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキットを用いて検証した。
【００８７】
鋳型として、ＱＩＡｆｉｌ−ｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉキットで精製された純粋プラスミド溶液が用いられた。使用前に、鋳型はＳｍａＩでの制限により線状化された。その制限部位は全ての鋳型に存在し、消化後、平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡが産生される。ＳｍａＩ部位は、最長の可能性のある転写産物を示す、ｐＥＴ３０ａのＭＣＳの約１０００ｂｐ下流に位置する。終結産物およびリードスルー産物は、約１０００ｂｐの大きさの点で異なり、電気泳動による分離の後、区別できた。約２μｇの異なる鋳型ＤＮＡを、ＳｍａＩで３時間、２５℃で消化した。続いて、制限酵素は６５℃で２０分間のインキュベーションにより不活化され、反応混合液はＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐシステムで精製された。約２００ｎｇの線状化精製プラスミドＤＮＡを含有する容量を、続くインビトロ転写のために用いた。
【００８８】
転写法（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ）全体は、３７℃で２ｈ−３ｈの間インキュベートした。続いて、任意のＤｎａｓｅ  Ｉ消化を実行し、鋳型ＤＮＡを取り除いた。その目的のため、１μｌのＲｎａｓ−フリーＤｎａｓｅ  Ｉ溶液（１ＭＢＵ／μｌ）をインビトロ転写反応混合液に添加して、さらなる１５分間、３７℃で消化を行った。Ｄｎａｓｅ  Ｉの１分子生物学的単位（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｎｉｔ（ＭＢＵ））は、１μｇのｐＵＣ１９ＤＮＡを３７℃で１０分間にオリゴヌクレオチドに分解するのに十分な酵素の量として定義される。
【００８９】
１．７：転写解析および終結効率（ＴＥ）の計算
精製したＲＮＡサンプルを、それらの大きさに従って解析し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、米国）から提供されたバイオアナライザー２１００システムを用いて定量した。原理的には、該システムは伝統的な電気泳動に基づくが、支持材としての機能を果たすガラスにマイクロチャンネルをエッチングすることにより、チップ形態へ移されている。チップ形態は、分離時間ならびにサンプルおよび試薬消費を劇的に減少させる。詳細には、２５ｎｇ−２５０ｎｇのＲＮＡを含むほんの１μｌが、単回の測定に十分である。該システムは、デジタル形式で自動化された大きさ情報および定量情報を提供する。
【００９０】
分離のため、マイクロチャンネルはふるいポリマーおよび蛍光色素で満たされる。サンプルをロードした後、電圧がかけられ、それゆえ、核酸のような荷電した生体分子は正に帯電したポールへ移動する。一定の質量電荷比（ｍａｓｓ−ｔｏ−ｃｈａｒｇｅ  ｒａｔｉｏ）およびふるいポリマーマトリックスの存在のため、分子は大きさによって分離される。小さいフラグメントは、大きいものよりもより速く移動する。色素分子はＤＮＡまたはＲＮＡ鎖にインターカレートし、それらの複合体はレーザー誘起蛍光測定により検出される。データはゲル様画像（バンド）またはエレクトロフェログラム（ピーク）に移される。既知の大きさの成分を含むラダーを活用して、移動時間対フラグメントサイズの標準曲線をプロットする。サンプル中の各フラグメントに関して測定された移動時間から、大きさが算出される。ラダーはまた、異なる濃度の成分を含み、それゆえ、ラダー領域の計算、および続くサンプルピーク領域との比較により、定量を行うことができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ）。
【００９１】
インビトロ転写されたＲＮＡの分離および定量のため、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）キットが用いられた。サンプル調製および解析は、製造業者の推奨に従って行った。全ての測定について、２００ｎｇのＲＮＡを含む約１μｌが、チップにロードされた。各インビトロ転写アッセイを、一つのチップに少なくとも３サンプルロードすることにより、検証した。さらに一つの転写アッセイに由来するＲＮＡサンプルの大部分を、二つの異なるチップにロードすることにより、検証した。両方の場合で、計算された終結効率（ＴＥ）の標準偏差は非常に小さな範囲で異なり、±０．４は決して超えなかった。稀に、異なるインビトロ転写アッセイからもＴＥが計算され、それによって、計算されたＴＥが約±１％のより高い標準偏差値を示した。
【００９２】
大きさに従ったＲＮＡ転写産物の分離後、各ＲＮＡフラクションの量が、領域ピークの計算、および続くラダー領域との比較により評価された。終結効率は、終結した転写産物と、終結した転写産物とリードスルー転写産物の合計の間でのモル比として計算され、少なくとも三回の測定の平均値が採られた。
【００９３】
１．８：細胞培養条件
全ての発酵は流加（ｆｅｄ  ｂａｔｃｈ）モードで実行した。調節された生育速度、インデューサーの量、および培地供給速度が、誘導方法に供された（工程設計および組換えタンパク質の誘導を参照のこと）。接種材料として、１ｍｌ（ＯＤ６００）の融解したマスター細胞バンク（ＭＣＢ）バイアルを、無菌状態で注入した。発酵工程は、以下の工程パラメータとの下で実行され、示された装置で観察された。
【００９４】
標準的な制御ユニット（Ｓｉｅｍｅｎｓ  ＰＳ７、Ｉｎｔｅｌｌｕｔｉｏｎ  ｉＦＩＸ）を備える、ＭＢＲ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ＡＧ（Ｗｅｔｚｉｋｏｎ、スイス）からの２０Ｌバイオリアクター（１４Ｌ実容量、４Ｌバッチ容量）を用いた。温度は３７℃±０．５℃に維持され、Ｐｔ１００温度プローブで測定された。ｐＨは２５％アンモニア溶液（ＡＣＲＯＳ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ）の添加によりｐＨ７．０±０．０５で維持された。キャリブレーションのため、市販バッファー溶液が適用された。泡立ちは、１リットル培地当たり０．５ｍｌ  アンチフォーム（ＰＰＧ  ２０００  Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の添加により抑制された。
【００９５】
ｐＯ２測定はクラークプローブで実施した。キャリブレーションは、培養条件（３７°および８００ｒｐｍ）で、バイオリアクターの殺菌の後、行った。０％飽和のための点を設定するために、Ｎ２ガスまたはＯ２シミュレーター（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ）が用いられた。１００％飽和を与えるために、圧縮された空気が流された（１２ｌ／分）。発酵の間、ｐＯ２は、撹拌速度の調節により、３０％以上に一定に保持された。１２００ｒｐｍの最大撹拌速度に達した時、流入空気（ｉｎｌｅｔ  ａｉｒ）は段階的に増加された。
【００９６】
所望の値で生育率を維持するために、指数関数的プロフィールの後、バイオリアクターへ基質が添加された。供給制御は、基質タンクの重量喪失の積載フィードバック制御で、指数関数的生育アルゴリズムに従ってポンプ速度を増加することにより達成された。全ての化学物質は、特に断りのない限りＭｅｒｃｋから購入した。これらの培養のために用いられた最少培地は、１リットル当たり３ｇ  ＫＨ２ＰＯ４および６ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４＊３Ｈ２Ｏを含有した。これらの濃度は、必要とされるバッファー能力を提供し、その上Ｐ−またはＫ−源としての機能を果たす。他の成分は、生産されるグラム細胞乾燥質量（ＣＤＭ）に関して加えられた：Ｎａ３−クエン酸塩＊２Ｈ２Ｏ（ＡＣＲＯＳ  ｏｒｇａｎｉｃｓ）  ０．２５ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ０．１０ｇ、ＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ  ０．０２ｇ、微量元素溶液５０μｌおよびグルコース＊Ｈ２Ｏ  ３ｇ。組換えｈＳＯＤとの培養のため微量元素溶液に加え、１ｇ  ＣＤＭ当たり４ｍｇ  ＣｕＣｌ２＊２Ｈ２Ｏおよび３．２ｍｇ  ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏが添加された。微量元素溶液：５Ｎ  ＨＣｌ（ｇ＊ｌ−１）に調製される：ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ４０．０、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ  １０．０、ＡｌＣｌ３＊６Ｈ２Ｏ  １０．０、ＣｏＣｌ２（Ｆｌｕｋａ）４．０、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ２．０、Ｎａ２ＭｏＯ２＊２Ｈ２Ｏ  ２．０、ＣｕＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ  １．０、Ｈ３ＢＯ３  ０．５０。
【００９７】
供給段階のための最少培地は、合計で３８６ｇのＣＤＭ（３０  ｇ／Ｌ）を達成するように設計された。グルコースを除く、流加培地に必要とされる全ての成分は、約５０００ｇに等しい容量で混合された。グルコースは、３５００ｇに等しい容量で別に溶解された。両方の溶液は、独立してオートクレーブされ、冷却後に混ぜ合わされた。ｐＨ制御のための２５％アンモニア溶液を混合することにより、窒素レベルは固定された。全てを混ぜ合わせた後、実量が決定され、自動供給制御アルゴリズムのためのインプットとしての機能を果たした。集団の最初の生育を加速するために、複合体成分（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）酵母抽出物（０．１５ｇ／ｇ  ＣＤＭ）が、バッチ培地への最少培地へ添加され、さらに、２．５ｇ／Ｌ  塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌおよび２．１ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）が、バッチ段階におけるＮ制限（Ｎ−ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）を避けるために添加された。最小バッチ培地は、２２．５ｇ  ＣＤＭ（５．６２ｇ／ｌ）に達すると計算され、かつ、成分は３８００ｇに等しい容量に溶解された。グルコースは、再び３００ｇに等しい容量で別に溶解された。オートクレーブ後、両方の溶液を無菌的に混合した。
【００９８】
組換えタンパク質産生の誘導の前に、流加条件に適応できるようにするために、細胞は非誘導状態で生育された。一回の倍加時間（約７ｈ）の後、細胞はＩＰＴＧ（イロプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）で誘導された。誘導のため、二つの異なる方法が実施された。第一の実験計画では、細胞は高濃縮ＩＰＴＧの単一添加により、完全に誘導された。必要量のインデューサーを計算して、２０μｍｏｌ／ＣＤＭ（細胞乾燥質量）のＩＰＴＧ濃度で、工程の終わりに３８６ｇの予測ＣＤＭを供給した。その古典的パルス誘導は、ＩＰＴＧ溶液を、無菌的に、無菌フィルタを備える注射器でバイオリアクターへ直接添加することにより達成される。
【００９９】
第二の誘導方法は、Ｓｔｒｉｅｄｎｅｒら（Ｓｔｒｉｅｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  １９：  １４２７−１４３２）に従って実施された。生産されたバイオマスへの、一定比で限定された量のインデューサーの添加は、組換えタンパク質を産生する細胞の能力の最適利用（ｏｐｔｉｍａｌ  ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ）を可能にする。ＩＰＴＧ濃度は、０．９μｍｏｌ／ｇ  ＣＤＭの生理学的に許容できるレベルで維持される(限定誘導条件)。 古典的方法でのように、細胞はまた、一世代後に、注射器を用いることによるＩＰＴＧの外部添加により、誘導される。後で、ＩＰＴＧは指数関数的レジーム（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｉｍｅ）に従って供給される。その目的のため、供給培地の流入のために実施されたその配置と同様に、外部インデューサー供給が実施された。インデューサー溶液を含有するタンクが平衡に置かれ、細菌の指数関数的生育に従って、ＩＰＴＧが添加された。インデューサーの流入は、ポンプ速度を調節することにより制御され、自動化された流入アルゴリズムにより重量喪失に起因して制御された。バイオマスの増加は、インデューサーの指数関数的供給により上昇し、全体の工程にわたってバイオマスに対するインデューサーの一定比をもたらす。ＩＰＴＧ濃度の減少は、転写速度を減少させ、それゆえ、外来遺伝子の転写は、より許容できるレベルに減少し、より高い生産物収量となる。
【０１００】
１．９：工程モニタリング
発酵培養液の濁度を決するために、サンプルが、波長λ＝６００ｎｍで、分光測光計（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ５００  ｐｒｏ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  １０００Ｅ）で測定された。比例領域（ｌｉｎｅａｒ  ｒａｎｇｅ）（ＯＤ６００＝０．１−０．６）内の測定を確保するために、サンプルはＲＯ−Ｈ２Ｏで希釈され、水もまた参照として用いられた。
【０１０１】
細胞乾燥重量（ＣＤＷ）を決定するため、１０ｍｌの細胞材料がバイオリアクターから無菌的に採取され、１０分間、５０００ｒｐｍで遠心分離された（Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｌａｂｏｒｆｕｇｅ  ２００）。上清を捨て、細胞を５ｍｌ  ＲＯ−Ｈ２Ｏに再懸濁し、再び遠心分離した。過剰な水を除去した後、細胞を再びＲＯ−Ｈ２Ｏに再懸濁し、予め重さを測定したビーカーへ直ちに移した。全てのビーカーを２４時間、１０５℃で乾燥させ、再度重さを測定した。バイオリアクターにおける総ＣＤＭの決定のため、サンプルが採取された時点での総培養液容量を計算しなければならない。バイオリアクターにおける総容量は、バッチ容量、供給培地の消費量、および２５％アンモニア溶液の流入を要約することにより提供される。その値は、採取されたサンプルの容量を引くことにより減少され、異なる時点でバイオリアクターに存在する容量と等しい。総容量と決定されたＣＤＭ／ｍｌをかけることで、サンプル採取時点でのバイオリアクターにおける総ＣＤＭが示される。
【０１０２】
プラスミド安定性を決定するために、細胞が、カナマイシン存在下および非存在下で寒天プレート状に播種された。そのため、１ｍｌの適切な細胞希釈系列がペトリ皿上にピペットで移され、５５℃に予め温められた栄養寒天と混合された。その発明者に従って、その方法はコッホプレーティングと名付けられる。
【０１０３】
細菌細胞内のプラスミド分子の数を決定するため、染色体ＤＮＡに対するプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の割合が計算された。標準的なプラスミド抽出キット（ＰｒｏｍｅｇａからのＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  精製システム、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ａ１３３０）を用いることにより、ｐＤＮＡは単離された。総ＤＮＡの測定は、リゾチームおよびＳＤＳによる細胞の破壊の後、Ｈｏｃｈｓｔ色素Ｈ３３２５８で蛍光定量的に行った。精製の間のｐＤＮＡの喪失を決定するため、精製の前に、内部標準（ｐＵＣ１９）の添加によりサンプルは処理された。精製後、プラスミドＤＮＡの量およびその完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）が、キャピラリー電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）を介して解析された。
【０１０４】
誘導された細胞は、組換えタンパク質を産生することにより高度にストレスを与えられ、それゆえ、コロニーを形成するために増殖することができない。抗生物質耐性の数を検査するため、非産生細胞、サンプルが、カナマイシンおよびＩＰＴＧを含有する寒天プレート上に注がれた。１ｍｌのサンプルが、生理活性生理食塩水（０．９％）に、１０−９の最終希釈へ、希釈された。それぞれの１０−７から１０−９希釈段階から、カナマイシン無しで、およびカナマイシンの存在下（１００ｍｇ／ｌ）で、予め温められた栄養培地寒天と共に１ｍｌが３回プレーティングされた。１０−３から１０−５希釈から、カナマイシン（１００ｍｇ／ｌ）およびＩＰＴＧ（２００ｍｇ／ｌ）を含有する栄養培地寒天プレート上に１ｍｌが注がれた。プレートを２４時間、３７℃でインキュベートし、コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）を計測した。
【０１０５】
細胞質における可溶性ｈＳＯＤの量を定量するため、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）が実施された。その目的のため、ｈＳＯＤは、適切なマイクロタイタープレートの表面に同様に固定される、一次ＳＯＤ抗体に結合することにより固定化される。過剰な試薬を洗浄した後、二次モノクローナル抗体が添加される。その二次抗体は、ｈＳＯＤに結合した一次抗体を含有する複合体を認識し、かつ、黄色がかった生産物の形成をもたらす、色素生成物質ｐ−ニトロフェニルリン酸を利用することができる、アルカリフォスファターゼに結合している。有色基質の量は、光度計を用いて４０５ｎｍで測定でき、それゆえ、放射光線の強度は結合したｈＳＯＤの量と相関し、かつ産生された組換えタンパク質の定量を可能にする。
【実施例１】
【０１０６】
実施例１：ターミネーター設計およびインビトロ試験
４つの異なるターミネーター（図３を参照のこと）が、Ｔ７ターミネーターをコードする、産生プラスミドｐＥＴ３０ａ（Ｐｌａｓｍｉｄ＿Ｉ）の上流にクローニングされた（ＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）。挿入されたターミネーター配列：
ＶＳＶ：  ＴＣＧＡＣＣＴＡＧＣＡＴＡＴＣＣＡＴＧＡＴＡＴＣＴＧＴＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＧＡ（配列番号１６）
Ｔ３：  ＴＣＧＡＣＣＴＡＧＣＡＴＡＡＡＣＣＣＣＴＴＧＧＧＴＴＣＣＣＴＣＴＴＴＡＧＧＡＧＴＣＴＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴ−ＧＣＴＧＡＡＡＧＡ（配列番号１７）
Ｔ７：  ＴＣＧＡＣＣＴＡＧＣＡＴＡＡＣＣＣＣＴＴＧＧＧＧＣＣＴＣＴＡＡＡＣＧＧＧＴＣＴＴＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＧＣＴＧＡＡＡＧＡ（配列番号１８）  
Ｔ７ＵＵＣＧ：  ＴＣＧＡＣＣＴＡＧＣＡＴＡＡＣＣＣＣＧＣＧＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＧＧＧＧＴＣＴＣＧＣＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴ−ＧＣＴＧＡＡＡＧＡ（配列番号１９）
【０１０７】
それらのターミネーターの３つは典型的な内因性ターミネーターである。Ｔ７ターミネーターは良く知られたヘアピン終結シグナルであり、オリジナルのｐＥＴ３０ａでも用いられている。Ｔ３はバクテリオファージＴ３に由来し、その構造はＴ７のものと類似している。第三のターミネーターはオリジナルのＴ７とほとんど同一であるが、数個の変異を保有している（配列番号４）。最初にヘキサループが以上に安定したテトラループＵＵＣＧに交換されている（そのため「Ｔ７ＵＵＣＧ」なる名前が本明細書で用いられる）、かつステム構造内の二つの弱いＧ−Ｕ塩基対が、より安定したＧ−Ｃ塩基対に交換されている（図４を参照のこと）。
【０１０８】
オリジナルのＴ７ターミネーターはステム構造内により弱く結合したＧ−Ｕ塩基対を含有するが、それらのいくつかは、Ｔ７ポリメラーゼとの重要な相互作用部位として記載されていた（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。驚いたことに、Ａ−ＴおよびＧ−Ｃ相補性を増大させることで、終結効率が増大した。最後の終結シグナルは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に由来する、既知のクラスＩＩ終結シグナルである。全体で、４つの新規なプラスミド、すなわちプラスミド＿Ｖ、プラスミド＿  Ｋ、プラスミド＿Ｌおよびプラスミド＿Ｍが生成され（表１を参照のこと）、全て、Ｔ７終結シグナルをコードする内因性プラスミドに加え、第二の終結シグナウルを含有する。単独で存在する場合の４つのターミネーターのＴＥを得るため、オリジナルのｐＥＴ３０ａの内因性Ｔ７ターミネーターが削除され（プラスミド＿Ｊ）、４つのインサートがまた結果として生じるプラスミドのＭＣＳ内にクローニングされた（ＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）。それゆえ、４つの推定プラスミド（プラスミド＿Ｓ、プラスミド＿Ｒ、プラスミド＿Ｑ、およびプラスミド＿Ｏ）が生成され（表１を参照のこと）、これらのプラスミドはクローニングされたｈＳＯＤ遺伝子の３’末端で単一の終結シグナルを含有するだけである。
【０１０９】
その線状化形態におけるこれらのプラスミドの全てが、インビトロ転写アッセイにおける鋳型として用いられた。終結効率を計算するために、精製されたＲＮＡフラクションをバイオアナライザー２１００システムで解析した。用いられたシステムから得られた結果を検証するため、Ｔ７ターミネーターを含有するそのオリジナルの終結領域を備えるプラスミド＿Ｉが、インビトロ転写に用いられ、またバイオアナライザーシステムを用いて続く電気泳動解析が実行された。ＲＮＡ純度が計算されたＴＥに影響を及ぼす最も重要な要因であると判明した。その目的のため、Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓから得られた十分に純粋でないプラスミド調製を、ＱＩＡＧＥＮからのＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉキットを利用することに由来する、より純粋なプラスミドフラクションで置き換えた。第二の作用として、ＲＮＡ沈殿の間に９５％のエタノールを用いるさらなる精製ステップが実行された。それらの二つの段階から、バイオアナライザーシステムでＲＮＡ転写産物を解析した場合、極めてはっきりとしたピークが得られた。それらの電気泳動図に基づいて計算されたＴＥは、プラスミド＿Ｉに存在するＴ７ターミネーターで、７９．４５％±０．３５のＴＥを示した。それゆえ、その値は、文献中に言及されたＴ７ターミネーターに関する８０％のＴＥとよく適合する。
【０１１０】
最初の８つの生成されたプラスミドの解析から、いくつかの非常に興味深く新規な特徴が明らかとなった。個々の計算された終結効率は、表１に要約される。
【０１１１】
プラスミド＿Ｖで達成されるような、第二の同一のＴ７終結シグナルの導入は、ＴＥの顕著な増大は引き起こさない。Ｊｅｎｇら（上記）で記載されるように、導入された終結シグナルは、オリジナルのターミネーターでの終結事象の二分（ｂｉｓｅｃｔｉｏｎ）を引き起こすだけである。同一の結果が、高度に類似したT3ターミネーターがクローニングされた場合に観察できた（プラスミド＿Ｋ）。驚いたことに、プラスミド＿Ｌで実施される、Ｔ７ＵＵＣＧと記される人工終結シグナルと内因性Ｔ７終結シグナルの同時存在は、９３．２％の値まで、全体の終結効率を劇的に増大する。それゆえ、ステムにおける相補性を増強するための調節された改変は、より高いＴＥのきっかけとなる。２つの異なるタイプのＲｈｏ非依存性終結シグナルの組み合わせを保有する、プラスミド＿Ｍにおいて、ほとんど同一の効果が観察できた。
【０１１２】
【表２】
2014516546.tif 000004
【０１１３】
上述のように、４つの終結インサートが、個々のＴＥを決定するために、プラスミド＿ＪのＭＣＳ内にクローニングされた。最初の見解では、テンプレートとしてこれらのプラスミドを利用するインビトロ転写から得られた結果（表１）は、多少驚くべきものであった。例えば、短縮されたプラスミド（プラスミド＿Ｓ）のＭＣＳ内にクローニングされたＴ７ターミネーターは、４８．０８％のＴＥを示すだけである、一方、野生型プラスミド（プラスミド＿Ｉ）における同一のシグナルは、およそ８０％の計算されたＴＥを示す。それゆえ、同一のターミネーターが、実際の周辺の配列に依存して、転写を終結する著しく異なる能力を有する。その知見は、ほんのわずかの周辺ヌクレオチドの変化が、異なる終結シグナルのＴＥに劇的に影響を及ぼしうる、という観察と完全に適合する。異なるターミネーターが異なるクローニングベクターに存在する場合、包含する配列へのその依存は、計算されたＴＥの点での違いを説明できる。恐らく、それらのより小さなヘアピンは終結に役立ち、かつプラスミド＿Ｊ誘導体中の減少した観察されたＴＥの理由である。表１に見られるように、プラスミド＿ＪのＭＣＳにクローニングされた全てのターミネーターが、８０％未満のＴＥを示し、それゆえ、オリジナルのＴ７ターミネーターほど効率的ではない。終結効率に影響するかもしれない、１０４ｂｐ欠失におけるさらなる要素の存在が、一つの説明かもしれない。
【実施例２】
【０１１４】
実施例２：一時停止シグナルの導入
終結効率をさらに増大させるため、プラスミド＿Ｖ、プラスミド＿Ｋおよびプラスミド＿Ｌの二つの内因性ターミネーターの間に一時停止シグナルＴ７−ＣＪをクローニングした。挿入配列：
ＨｉｎｄＩＩＩ＿Ｔ７−ＣＪ：  ＡＧＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣＣＴＡＴＣＴＧＴＴＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣ（配列番号１９）
ＮｏｔＩ＿Ｔ７−ＣＪ：  ＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＡＡＣＡＧＡＴＡＧＧＧＡＣＡＣＡＡ（配列番号２１）
【０１１５】
その一時停止シグナルは、全ての既知のクラスＩＩ終結シグナルのコンセンサス配列を共有するが、３’末端でのウリジンの隣接するラン（ａｄｊａｃｅｎｔ  ｒｕｎ）を欠く。ＲＮＡポリメラーゼを一時停止させる配列が、終結が起こることができる猶予時間を大きくするので、より効率のよい終結に役立つかもしれないと仮定される。一方、下流に位置する一時停止シグナルの存在は、新たに合成されるヘアピン構造の核形成（ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ）が起こることができる時間を大きくするので、ヘアピン構造のより効率のよい形成をもたらすことができるかもしれない。それゆえ、ヘアピン形成が、競合的ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成に比べ、好まれる。一方、終結配列の前の一時停止シグナルは、伸長ＲＮＡポリメラーゼの減速（ｄｅｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）をもたらし、それゆえ、終結を増大できるかもしれない。表１に示されるように、一時停止シグナルは確かに、第一ターミネーターでＴＥを増強するが、一時停止シグナルを有さないターミネーターの組み合わせと比較して、１例（プラスミド＿Ｗ）では全体の終結効率がわずかに増大され、残りの２例（プラスミド＿Ｚおよびプラスミド＿Ｔ）では減少さえする−しかし、天然のｐＥＴ３０  Ｔ７ターミネーターとの比較では、なお増大した。
【実施例３】
【０１１６】
実施例３：リボソーム終結シグナルのクローニング
Ｔ７ＵＵＣＧおよびＴ７の組み合わせを含有するプラスミドで最も高いＴＥが測定されたので、このプラスミドがさらなるクローニング方法に採用された。ｒｒｎＢ遺伝子の３’末端に位置される、拡大された終結領域のターミネーター１（Ｔ１）は、クラスＩおよびクラスＩＩ終結シグナルの両方を含む。それゆえ、ｒｒｎＢＴ１の挿入は、クラスＩＩターミネーターを有するプラスミドを提供する。加えて、リボソームターミネーターが３’末端に存在する二次構造を増強するだろう。リボソームターミネーターは、最初に導入されたＴ７ＵＵＣＧシグナルのすぐ続きに、プラスミド＿ＬのＭＣＳ内にクローニングされた。クローニングのために用いられた制限部位は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩであった。配列：
ＮｏｔＩ＿ｒｒｎＢＴ１：  ＧＧＣＣＧＣＡＧＣＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＧＣＣＣＡＧ−ＴＣＴＴＴＣＧＡＣＴＧＡＧＣＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＧＡ（配列番号２２）
ＨｉｎｄＩＩＩ＿ｒｒｎＢＴ１：  ＡＧＣＴＴＣＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＧＣＴＣＡＧＴＣＧＡＡＡ−ＧＡＣＴＧＧＧＣＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＣＧＣＴＧＣ（配列番号２３）
【０１１７】
改変されたプラスミドの生成後、インビトロ転写アッセイが実行され、転写産物がバイオアナライザーシステムを用いて再び分離された。表１に見られるように、さらなる終結シグナルは再び、全体のＴＥのさらなる増大をもたらす（第一ターミネーター（Ｔ７ＵＵＣＧ）で６０％  ＴＥ、第二ターミネーター（ｒｒｎＢＴ１）で３２％  ＴＥおよび第三ターミネーター（天然のＴ７）で７％  ＴＥ）。計算された全体のＴＥは、今や、約９８．５％の値を示し、この拡大された終結領域が終結反応の二分（ｂｉｓｅｃｔｉｏｎ）に起因する全体の減少無しで、非常に効率の良い転写終結を有することを明らかにする。リードスルー転写産物は劇的に減少し、転写を停止するその著しい可能性により、この終結シグナルはＺＥＮＩＴと命名され、そのシグナルを保有するｐＥＴ３０ａ誘導体はｐｔＺＥＮＩＴと命名された。
【実施例４】
【０１１８】
実施例４：組換えタンパク質合成の完全誘導の間の宿主細胞反応でのＴ７ターミネーター欠失の効果を特徴付けるための、プラスミド−Ｊおよびプラスミド＿Ｉを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）の流加培養。
例１．５に記載するように、モデルタンパク質としてｈＳＯＤを有するｐＥＴプラスミドを、内因性ターミネーター（プラスミド＿Ｉ）およびターミネーターの１０４ｂｐ欠失（プラスミド＿Ｊ）と、生成した。プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）細胞内に形質転換し、発酵過程の間のそれらの挙動を調査した。供給相における一世代の後、細胞を高用量のインデューサーＩＰＴＧ（工程の最後に、計算された量のＣＤＭに従って、２０μｍｏｌ／ｇ  ＣＤＭ)によって完全に誘導した。
【０１１９】
図２に表されるように、転写Ｔ７ターミネーターの欠如は、宿主の生育挙動において、生産物収量において、およびプラスミドコピー数制御において、重大な影響を示した。野生型のプラスミドを利用すると、最大ＰＣＮは１個のセル当たり約３５０のコピーを含み、供給時間１４で達し、かつ後にＰＣＮはその値で安定する。対照的に、転写ターミネーターの欠如は、細胞内のプラスミドの数を劇的に増加させ、かつ、供給時間１５で、ＰＣＮはおよそ６００の値に達する。ＰＣＮ曲線の形によれば、ＰＣＮは供給時間１５で最大に達しておらず、もっと正確に言えば、ＰＣＮは一層の増加を示すだろう、ということが仮定できる。データから、転写終結の欠如が、プラスミド複製の制御に強く干渉する、ということが明らかに示される。
【０１２０】
プラスミド＿Ｊを保有する細胞は、１個のセル当たりのプラスミドのすさまじい上昇を示すが、より高い量のプラスミドを維持する推定負担は、生育速度の低下を生じなかった。もっと正確に言えば、プラスミド＿Ｊを含有する株は、工程の終わりにより高い総細胞乾燥質量（ＣＤＭ）に達し、理論的なバイオマス成長からの偏差（ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）が、プラスミド＿Ｉを有する株（９ｈ）と比較して、約一時間後に（１０ｈ）生じる。それゆえ、細胞増殖相は野生型プラスミドを保有する株と比較して、１ｈの間拡大する。生産物収量を得る際、発現ベクターが転写ターミネーターを含まない時、特定量の組換えタンパク質（ｈＳＯＤ／ｇ  ＣＤＭ）ならびにｈＳＯＤの総量（−１７％）の両方が減少する。従って、終結シグナルの欠如は、総ＣＤＭの増加において顕著である、宿主の代謝負担の低下を引き起こし、それゆえ、生育段階の拡大を引き起こし、減少した生産物形成率を引き起こす。ＰＣＮで観察された増加を維持するために、プラスミド複製に由来する代謝負担は、細胞増殖に対する影響をほとんど示さず、それほど重要でないように見える。
【実施例５】
【０１２１】
実施例５：組換えタンパク質合成の完全に、または限定誘導の間の宿主細胞反応でのｔＺＥＮＩＴターミネーターの効果を特徴付けるための、プラスミドｐｔＺＥＮＩＴを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）の流加培養。
実施例３に記載されるように、ｐＥＴ３０ａ誘導体ｐｔＺＥＮＩＴが、非常に効率のよい転写終結領域であると特徴付けられる。不十分な転写終結事象が、プラスミド複製を調節解除（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅ）する能力を持っているという仮定の下では、そのような増強された終結は、プラスミドコピー数制御に顕著な効果を有するはずである。それゆえ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）がプラスミドｐｔＺＥＮＩＴで形質転換され、その産生株をバイオリアクター培養工程において特徴づけた。組換えタンパク質産生は、供給培地で一世代後に、ＩＰＴＧ（２０μｍｏｌ／ｇ  ＣＤＭ）を注入することにより誘導され、それゆえ細胞は完全に誘導された。
【０１２２】
図５に与えられた結果を検討する際、明らかに、ｐｔＺＥＮＩＴを有する場合、ＰＣＮは、劇的に参照株（プラスミド＿Ｉを備えた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＭＳ１７４（ＤＥ３））における約３５０の最大値から、約１５０の値に減少する。両方の場合で、それらの最大プラスミドコピー数に供給時間約１４で達し、次いで、全工程にわたって維持される。総ＣＤＭなどのパラメータを維持することを検討する際、特定の生産物含量および総ｈＳＯＤ量は、野生型のプラスミドを保有する参照株において測定されたものからの偏差を検知することができなかった。ＰＣＮデータを除外する場合、プラスミド＿ＩまたはｐｔＺＥＮＩＴを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株の挙動は、非常に似ている。しかしながら、転写終結およびプラスミド複製の間の推定上の相関性を立証する詳細な証拠が得られた。完全に誘導された発酵条件下では、組換えタンパク質産生に由来する代謝負担は、高すぎるように見える、従って、より低いプラスミドコピー数を維持するための減少したエネルギー消費および減少した遺伝子量の副作用は、全く重大ではないように見え、バイオマスの増大した生育を引き起こさない。
【０１２３】
発現ベクターとしてｐｔＺＥＮＩＴを保有する場合の、宿主の生存能力における結果をさらに特徴付けるため、推定バイオリアクター培養が実行された。今回、細胞は完全には誘導されず、代わりにＩＰＴＧ濃度は０．９μｍｏｌ／ＣＤＭの限界インデューサー濃度の下、維持された。図６に見られるように、より中等度の工程設計が、工程全体にわたる細胞生育の永続化を示し、宿主細胞の生存能力を大幅に増大させた。プラスミド＿Ｉを保有し、同一条件下で培養された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株との比較において、総ＣＤＭは約＋２６％上昇する。その増強された細菌細胞の生育は、発現ベクターとしてｐｔＺＥＮＩＴを用いる場合、酸性状態下で、より低いストレスレベルを示す。標準的な培養条件下で既に観察されたように、再び、ＰＣＮの減少および安定化が確認された。生産物収量を検討する際、特定のｈＳＯＤ含量および総ｈＳＯＤの両方の著しい増加が観察できた。特定の組換えタンパク質産生は、同一時間間隔でのｐｔＺＥＮＩＴ保有する細胞の場合に、約１７０ｍｇ／ｇ  ＣＤＭのほぼ一定の値から、約２４０ｍｇ／ｇ  ＣＤＭの値まで、供給時間１７ｈ−２８ｈの間に、上昇する。産生されたバイオマスの増加ならびに特定のｈＳＯＤ形成の増加の両方は、総ｈＳＯＤ収量を約＋６４％の値まで上昇させる。それは、ｈＳＯＤの総収量が、２５ｇから約４１ｇの総回収まで増加することを意味する。従って、オリジナルのｐＥＴ３０ａプラスミドにおける転写Ｔ７ターミネーターシグナルの改良が、プラスミドコピー数を安定化する（図５および図６を参照のこと）とわかり、また組換えタンパク質収量に積極的に影響を及ぼす能力を有することが示された。
【実施例６】
【０１２４】
実施例６：生産物品質
組換えタンパク質（ＳＯＤ）の生産物品質が、完全誘導条件（１ｇ  ＣＤＭ当たり２０μｍｏｌ  ＩＰＴＧ）および限定誘導条件（１ｇ  ＣＤＭ当たり０．９μｍｏｌ  ＩＰＴＧ）の間、調査された。ストレス産生の間、細胞は凝集体および封入体をもたらす不正確にフォールディングされたタンパク質を産生しがちである。この調査のため、産生されたＳＯＤを可溶性ＳＯＤとＳＯＤ凝集体の間で区別した。ｐＴＺＥＮＩＴと天然のｐＥＴ３０ａプラスミドの間の違いが実証された。既に述べたように、プラスミド計測はｐＴＺＥＮＩＴについてより低かったが、総タンパク質産生は増大した（図７）。限定および完全誘導に関して、産生されたＳＯＤの種類は、図８および９にそれぞれ示される。明らかに、凝集したＳＯＤに対して、総産生ならびに可溶性が、ｐＴＺＥＮＩＴに関してより高く、効率の良い終結を介するストレスが減少した発現条件に起因して、産生品質が増大したことを実証する。
【図１】
2014516546.tif 000005
【図２】
2014516546.tif 000006
【図３】
2014516546.tif 000007
【図４ａ】
2014516546.tif 000008
【図４ｂ】
2014516546.tif 000009
【図５】
2014516546.tif 000010
【図６】
2014516546.tif 000011
【図７】
2014516546.tif 000012
【図８】
2014516546.tif 000013
【図９】
2014516546.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成26年1月31日(2014.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2014516546000001.app
【国際調査報告】
2014516546.tif 000015
2014516546.tif 000016
2014516546.tif 000017
2014516546.tif 000018
2014516546.tif 000019
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