(57)【要約】改変した人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を生産するための方法を提供する。この方法は、体細胞に、それらのゲノムに組み込むための第一の核酸を導入することと、細胞をリプログラミングし、核酸がそれらのゲノムに組み込まれた改変されたｉＰＳ細胞を生産することを含む。例えば、特定の側面では、１つまたは複数のリプログラミング因子を発現する遺伝要素を導入し、この細胞を、リプログラムされた細胞を生産するのに十分な条件下で培養することにより、細胞をリプログラムする。【選択図】  図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）体細胞を得る工程；
ｂ）該細胞のゲノムに組み込むための第一の核酸分子および、該体細胞中で発現した場合に、該体細胞を多能性幹細胞へと変換するのに十分な１つまたは複数のリプログラミング因子を発現する遺伝要素を含む少なくとも１つの第二の核酸分子を前記細胞に導入する工程；
ｃ）前記細胞をリプログラミング条件下で培養する工程；および
ｄ）それらのゲノム中に組み込まれた前記第一の核酸を含むｉＰＳ細胞の集団を得る工程を含み、ここで前記第一の核酸が発現可能であり、かつ、該第二の核酸分子が該ｉＰＳ細胞中には存在しない、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞集団の生産方法。
【請求項２】
ｄ）（ｉ）それらのゲノムに組み込まれた前記第一の核酸を含む細胞および（ｉｉ）それらのゲノムに組み込まれた該第一の核酸を含まない細胞を含むｉＰＳ細胞の集団を得る工程をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】
ｄ）それらのゲノムに組み込まれた前記第一の核酸を含むｉＰＳ細胞の第一集団およびそれらのゲノムに組み込まれた該第一の核酸を含まないｉＰＳ細胞の第二集団を得る工程をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項４】
ｄ）それらのゲノムに組み込まれた、発現可能な第一の核酸を含むｉＰＳ細胞をスクリーニングまたは選択し、それによって、前記第一の核酸が発現可能である、ｉＰＳ細胞の該集団を得る工程をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項５】
該ｉＰＳ細胞の分化に際して該第一の核酸が発現可能な、請求項１の方法。
【請求項６】
該体細胞、該第一の核酸分子および該第二の核酸分子を含有する組成物を形成すること、ならびに前記組成物を培養することによってさらに定義される、請求項１の方法。
【請求項７】
該第一のまたは第二の核酸分子が、該細胞の該ゲノム中に無作為に組み込まれている、請求項１の方法。
【請求項８】
工程（ｂ）が、該第一のもしくは第二の核酸分子を含有しているウイルスベクターを該細胞に形質導入すること、または該第一のもしくは第二の核酸分子を含有しているｐｉｇｇｙＢａｃベクターをトランスフェクトすることを含む、請求項１の方法。
【請求項９】
該ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、シンプルレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターである、請求項８の方法。
【請求項１０】
該第一のまたは第二の核酸分子が、該細胞のゲノムの選択された部位に組み込まれている、請求項１の方法。
【請求項１１】
該選択された部位がＡＡＶＳ１組み込み部位である、請求項１０の方法。
【請求項１２】
該第一のまたは第二の核酸分子が、メガヌクレアーゼ、または該選択された部位でゲノムＤＮＡを切断する転写活性化因子様エフェクターエンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を使用して、選択されたゲノム部位に組み込まれる、請求項１０の方法。
【請求項１３】
該第一のまたは第二の核酸分子が相同的組換えを使用して選択されたゲノム部位に組み込まれる、請求項１０の方法。
【請求項１４】
該第一の核酸分子が、スクリーニング可能なマーカーまたは選択マーカーのコード配列を含む、請求項１の方法。
【請求項１５】
該第一の核酸分子が、細胞内の遺伝的欠損を修正する配列；病原体感染に対する耐性を付与する配列；薬剤物への耐性を付与する配列；薬剤物への感受性を付与する配列；細胞の免疫原性を変える配列；および細胞内に遺伝的タグを付与する配列からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項１の方法。
【請求項１６】
該体細胞が、ヒト線維芽細胞、角化細胞、造血細胞、間葉細胞、脂肪細胞、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞、筋肉細胞、乳房細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、皮膚細胞、消化管細胞、卵丘細胞、腺細胞、または膵島細胞である、請求項１の方法。
【請求項１７】
該第二の核酸分子が染色体外の遺伝要素である、請求項１の方法。
【請求項１８】
該第二の核酸分子がＲＮＡである、請求項１７の方法。
【請求項１９】
該第二の核酸分子がエピソームベクターである、請求項１７の方法。
【請求項２０】
該エピソームベクターが、複製起点および、リプログラミング因子を発現させるための１つもしくは複数の発現カセットを含み、ここで１つもしくは複数の前記発現カセットが、染色体外の鋳型を複製するための該複製起点に結合するトランス活性化因子をコードしているヌクレオチド配列をさらに含み、ならびに／または該体細胞がそのようなトランス活性化因子を発現している、請求項１９の方法。
【請求項２１】
該リプログラミング因子が、Ｓｏｘ、Ｏｃｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ−２８、Ｋｌｆ４、Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ、形質転換欠損性のｍｙｃ突然変異体またはホモログ、およびＳＶ４ＯＬＴからなる群より選択される１つまたは複数を含む、請求項１の方法。
【請求項２２】
前記細胞をリプログラミング条件下で培養する工程（ｃ）が、フィーダー細胞を本質的に使用せずに該細胞を培養することを含む、請求項１の方法。
【請求項２３】
前記細胞をリプログラミング条件下で培養する工程（ｃ）が、マトリックス成分の存在下で該細胞を培養することを含む、請求項１の方法。
【請求項２４】
工程（ｃ）が、該第一の核酸分子の存在に関して、前記細胞を選択することまたはスクリーニングすることをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項２５】
該選択またはスクリーニングが、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）またはフローサイトメトリーによる、請求項２４の方法。
【請求項２６】
該選択することが、該細胞培養への薬剤の添加を含む、請求項２４の方法。
【請求項２７】
該細胞が、該第一の核酸分子および染色体外の遺伝要素の該細胞への導入後、およそ１日目〜３日目に開始される該薬剤の存在下で培養される、請求項２６の方法。
【請求項２８】
該細胞が、およそ１〜１０日間、該薬剤の存在下で培養される、請求項２６の方法。
【請求項２９】
前記細胞をリプログラミング条件下で培養する工程（ｃ）が、該細胞を、少なくともおよそ１日〜１５日間、リプログラミング条件下で培養することを含む、請求項１の方法。
【請求項３０】
前記細胞をリプログラミング条件下で培養する工程（ｃ）が、該細胞をリプログラミング培地中で培養することを含む、請求項２９の方法。
【請求項３１】
該リプログラミング培地が、ＧＳＫ−３β阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤またはそれらの組み合わせを含む、請求項３０の方法。
【請求項３２】
該リプログラミング培地が、外部から添加された線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、Ｒｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤を含む、請求項３０の方法。
【請求項３３】
該リプログラミング培地が化学的に規定されている、請求項３０の方法。
【請求項３４】
該化学的に規定されている培地が、ＴｅＳＲ培地、必須８培地、ヒト胚細胞培養用培地、またはＮ２Ｂ２７培地である、請求項３３の方法。
【請求項３５】
（ｅ）該ｉＰＳ細胞を増殖条件下で培養する工程をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３６】
該ｉＰＳ細胞を増殖条件下で培養する工程（ｅ）が、外部から添加されたＧＳＫ−３β阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＴＧＦ−β受容体阻害剤を本質的に含まない培地中で該ｉＰＳ細胞を培養することを含む、請求項３５の方法。
【請求項３７】
該増殖培地が化学的に規定されている、請求項３６の方法。
【請求項３８】
該増殖培地がＴｅＳＲ培地、ｍＴｅＳＲ培地または必須８培地である、請求項３７の方法。
【請求項３９】
（ｆ）該ｉＰＳ細胞を特徴付ける工程をさらに含む、請求項３５の方法。
【請求項４０】
該ｉＰＳ細胞を特徴付ける工程（ｆ）が、１つ以上の多能性マーカーを検出すること；核型分析を実施すること；該第一の核酸分子の存在を検出すること；該第一の核酸分子の配列を決定すること；該染色体外の遺伝要素の存在を検出すること；テラトーマ形成解析；エピジェネティック解析；ＲＮＡ発現解析；タンパク質発現解析；または縦列型反復配列（ＳＴＲ）の検出を含む、請求項３９の方法。
【請求項４１】
ａ）体細胞を得る工程；
ｂ）該細胞のゲノムに組み込むための第一の核酸分子および、該体細胞中で発現した場合に、該体細胞を多能性幹細胞へと変換するのに十分な１つまたは複数のリプログラミング因子を発現している遺伝要素を含む少なくとも１つの第二の核酸分子を前記細胞に導入する工程；
ｃ）前記細胞をリプログラミング条件下で培養する工程；および
ｄ）それらのゲノムに組み込まれた前記第一の核酸を含むｉＰＳ細胞の第一の集団およびそれらのゲノムに組み込まれた該第一の核酸を含まないｉＰＳ細胞の第二の集団を得る工程を含む、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の集団および改変したｉＰＳ細胞の集団を生産するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１１年７月１１日に出願の、米国仮特許出願第６１／５０６，３１４号の優先権を主張し、その全文は参照することにより本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、基本的には、幹細胞開発の分野に関わる。より具体的には、本発明は、改変した多能性幹細胞の生成に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞の制限のない増殖能および多能性によって、前例のなかった、ヒトの体全ての細胞型を入手する機会がもたらされた。望まれる遺伝的バックグランドをもった患者の体細胞から直接誘導されたヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、これら２つのヒトＥＳ細胞の重要な特性を有するため、これらの細胞は、疾患モデル、薬剤物のスクリーニング、毒性試験および移植治療に関する有力な候補となっている。しかしながら、ヒト体細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）へと遺伝的にリプログラミングするには、依然として時間がかかり、費用も高額となり、また、この工程の効率は総体的に低い。さらに、望ましいｉＰＳＣが生成されたとしても、多くの使用用途では、網羅的な解析や細胞特性を特徴付けに加えて、これらの細胞をさらに遺伝的に修飾する必要がある。
【０００４】
そのため、遺伝的に改変した人工多能性幹細胞の調製における効率の低さ、高い費用、および他の問題に取り組む必要が依然として残っている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、遺伝的に改変した人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を生産するための効率的な方法を提供することによって、当該分野における大きな欠点を克服するものである。第一の態様では、改変したｉＰＳ細胞の集団を生産するための方法を提供し、この方法は、（ａ）体細胞を得る工程；（ｂ）前記細胞に、この細胞のゲノムに組み込むための第一の核酸分子と、１つまたは複数のリプログラミング因子を発現している遺伝的要素を含む、少なくとも１つの第二の核酸分子を導入する工程；（ｃ）前記細胞を、リプログラミング条件下で培養する工程；および（ｄ）前記第一の核酸がゲノムに組み込まれたｉＰＳ細胞の集団を回収する工程、を含む。従って、本態様で使用される場合、この１つまたは複数のリプログラミング因子は、適切な細胞培養条件下で体細胞内において発現する場合には、体細胞を多能性幹細胞へと変換するのに十分な能力を有するものである。この態様のさらなる側面では、方法は、細胞のゲノムに組み込まれた第一の核酸を含まない、ｉＰＳ細胞の少なくとも第二の集団を生産する工程を含む。特定の側面では、この態様の方法によって得られたｉＰＳ細胞および／または改変したｉＰＳ細胞は、リプログラミング因子（つまり、遺伝的要素によってコードされている因子）を発現しない。一層さらなる側面では、そのような方法によって得られたｉＰＳ細胞（および／または改変したｉＰＳ細胞）は、細胞に組み込まれた第二の核酸分子の遺伝的要素を含まない。従って、特定の側面では、１つまたは複数のリプログラミング因子を発現している遺伝的要素は、染色体外の遺伝的要素である。
【０００６】
第二の態様では、改変したｉＰＳ細胞の集団を生産するための方法を提供し、この方法は、（ａ）体細胞を得る工程；（ｂ）この細胞のゲノムに組み込むための第一の核酸分子を細胞に導入する工程；（ｃ）前記細胞に、１つまたは複数のリプログラミング因子を発現している染色体外要素を導入する工程；および（ｄ）前記第一の核酸がゲノムに組み込まれたｉＰＳ細胞の集団を生産するために、前記細胞をリプログラミング条件下で培養する工程、を含む。特定の側面では、この態様の方法によって生産されたｉＰＳ細胞および／または改変したｉＰＳ細胞は、細胞に組み込まれた染色体外の遺伝的要素を含まない。さらなる態様では、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の集団および改変したｉＰＳ細胞の集団を生産するための方法を提供し、この方法は、（ａ）体細胞を得る工程；（ｂ）前記細胞に、この細胞のゲノムに組み込むための第一の核酸分子を導入する工程；（ｃ）前記細胞に、１つまたは複数のリプログラミング因子を発現している染色体外の遺伝的要素を導入する工程；および（ｄ）ｉＰＳ細胞の集団を生産し、前記第一の核酸がゲノムに組み込まれている第一のｉＰＳ細胞とゲノムに第一の核酸が組み込まれていない第二のｉＰＳ細胞の両方を回収するために、前記細胞をリプログラミング条件下で培養する工程、を含み、この場合、第一のｉＰＳ細胞でも第二のｉＰＳ細胞でも、染色体外の遺伝的要素はそれらのゲノムに組み込まれていない。
【０００７】
さらなる側面では、この態様の方法によって生産されたｉＰＳ細胞は、ゲノムに組み込まれた第一の核酸分子を含み、ここでこの第一の核酸は発現可能である。例えば、第一の核酸は、適切な条件において、ｉＰＳ細胞内でまたはｉＰＳ細胞から分化した細胞内で発現可能な少なくとも１つの遺伝的要素（例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードしている配列）を含む場合がある。いくつかの側面では、第一の核酸分子は、誘導性のまたは組織もしくは細胞特異的なプロモーターの制御下にある遺伝的要素を含む。この場合遺伝的要素は、プロモーターが活性な条件において（例えば、誘導剤の存在下で、または特定の分化した細胞型の場合に）発現可能となる。その上さらなる側面では、この態様の方法は、ｉＰＳ細胞内にある発現可能な第一の核酸分子の存在をスクリーニングするためまたは選択するための工程を含む。
【０００８】
この態様の特定の側面では、遺伝的要素（１つまたは複数のリプログラミング因子を発現している）を含む第一の核酸分子と第二の核酸は、約１週間以内の時間間隔で、例えば２、３、４、５または６日の時間間隔で、体細胞に導入される。一層さらなる側面では、第一の核酸分子と第二の核酸分子は、同じ日に、例えば２、３、４、５、または６時間の間隔をあけて、細胞に導入される。一層さらなる側面では、第一の核酸分子と第二の核酸分子は、本質的に同時に細胞に導入される。例えば、この態様による方法は、体細胞、第一の核酸分子および第二の核酸分子（遺伝的要素を含んでいる）を含む組成物を作出する工程、および前記組成物を培養する工程を含む場合がある。
【０００９】
この態様の特定の側面は、細胞のゲノムに組み込むための第一の核酸分子に関する。このような核酸分子を、細胞ゲノムの選択した位置に、もしくは特定の領域内に組み込んでもよく、または本質的に無作為にゲノムに組み込んでもよい。いくつかの例では、ゲノム中の１つの部位に、第一の核酸を１コピーだけ組み込む。他の例では、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上のコピーのこの核酸を、ゲノム中の単一の部位に（例えば、コピーを一続きにして）または複数の部位に組み込む。体細胞のゲノムに第一の核酸分子を組み込むには、様々な機構を使用することができる。例えば、ゲノム中の本質的に無作為な位置に組み込む場合、第一の核酸を、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、アデノ随伴ウイルスベクター（機能性Ｒｅｐ遺伝子を除いたもの）に組み込むことができるか、またはトランスポゾンシステム、例えばｐｉｇｇｙＢａｃベクターの一部として組み込むことができる。他の側面では、第一の核酸をゲノム中の選択した位置に組み込む。例えば核酸を、ＡＡＶＳ１組み込み部位（例えば、機能性Ｒｅｐ遺伝子存在下でアデノ随伴ウイルスベクターを使用することによって）に組み込むことができる。同様に、特定の側面では、相同的組換えによって、ゲノム中の選択した位置に組み込むことができる。例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはゲノムＤＮＡを選択した位置で開裂させる転写活性化因子様エフェクターエンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を使用して、選択した位置への組み込みを仲介させることができる。本明細書で使用する場合、ゲノム中の選択した位置への組み込みとは、ゲノム中の２つの連続したヌクレオチド位置の間に、または連続していない２つのヌクレオチド位置の間に（例えば、その結果、間に挟まれているゲノム配列が置き換わる）、核酸分子（もしくはその一部分）を挿入することも含み得る。例えば、ゲノム中の選択した位置への核酸の組み込みは、遺伝子のエクソン、イントロン、プロモーター、コード配列または遺伝子全体の置換も含み得る。
【００１０】
この態様のさらなる側面では、第一の核酸分子は、スクリーニング可能なマーカーまたは選択マーカーのコード配列を含む。あるいは、またはそれに加えて、第一の核酸分子は、細胞内の遺伝的欠損を修正する配列；病原体感染に対する耐性を付与する配列；薬剤物への耐性を付与する配列；薬剤物への感受性を付与する配列；細胞の免疫原性を変える配列；および細胞内に遺伝的タグを付与する配列、からなる群より選択される核酸配列を含む。その上さらなる側面では、この態様の方法は、ゲノムに組み込むための第二の、第三の、第四のまたは第五の核酸分子を体細胞に導入する工程を含み、ここで核酸分子はそれぞれ別のものであり、かつ、それぞれ独立してゲノムに組み込まれる。
【００１１】
本明細書で使用する場合、１つまたは複数のリプログラミング因子を発現する遺伝的要素とは、いかなる遺伝子材料または核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。特定の側面では、遺伝的要素は細胞のゲノムに組み込まれてもよい（つまり、上述したように、無作為にまたは特定の位置に組み込まれてもよい）。しかしながら、特定の好ましい側面では、遺伝的要素は、エピソームベクターまたはＲＮＡなどの、細胞への導入に際しても染色体外に保持される要素である。例えば、エピソームベクターは、複製起点および、リプログラミング因子を発現させるための１つまたは複数の発現カセットを含んでいてもよい。そのような１つまたは複数の発現カセットは、複製起点に結合して、染色体外の鋳型を複製するための、トランス活性化因子をコードしているヌクレオチド配列をさらに含んでいてもよい。あるいは、またはこれに加えて、体細胞がそのようなトランス活性化因子を発現してもよい。
【００１２】
特定の側面では、本発明に従って使用するためのエピソームベクターは、本質的に、細菌の構成要素を含まない可能性がある。そのような細菌の構成要素とは、細菌内でプラスミドを増やすために必要とされるベクター骨格の成分、例えば、細菌の複製起点、例えば、ｐＵＣ複製起点、および細菌の選択カセット、例えば、アンピシリン選択カセットであってよい。
【００１３】
例示的な態様では、複製起点は、リンパ増殖性のヘルペスウイルス、すなわちガンマヘルペスウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、または酵母の複製起点、例えば、リンパ増殖性のヘルペスウイルス、すなわちＥＢＶのｏｒｉＰに対応するガンマヘルペスウイルスの複製起点であってよい。さらなる側面では、リンパ増殖性のヘルペスウイルスは、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、サイミリヘルペスウイルス（ＨＳ）、またはマレック病ウイルス（ＭＤＶ）であってもよい。
【００１４】
染色体外の遺伝的要素を複製するため、および一過的に維持するために、トランス活性化因子は、ＥＢＶのＥＢＮＡ−１（ＥＢＶ核抗原１）の野生型タンパク質に対応するポリペプチドであるか、またはこれに由来するものであってよく、好ましくは、ＥＢＶのＯｒｉＰに対応する複製起点が存在する。誘導体が組み込まれた鋳型からの転写を活性化する能力は野生型ＥＢＮＡ−１と比較して低い可能性があるため、染色体遺伝子を異所的に活性化し、癌への転換を引き起こす可能性も低くなる。同時に、誘導体が複製起点に結合した後の染色体外の鋳型からの転写は、対応する野生型タンパク質の少なくとも５％となり得る。
【００１５】
体細胞をリプログラミングするために、本方法の特定の側面は、適切な細胞培養条件において体細胞中で発現させた場合に、体細胞を多能性幹細胞へと変換するのに十分なリプログラミング因子を使用することを含んでいてもよい。例えば、リプログラミング因子には、Ｓｏｘ、Ｏｃｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ−２８、Ｋｌｆ４、Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃおよびＳＶ４ＯＬＴからなる群より選択される１つまたは複数が、例えば、Ｓｏｘ、Ｏｃｔ、Ｎａｎｏｇ、および必要に応じてＬｉｎ−２８のセット、Ｓｏｘ、Ｏｃｔ、Ｋｌｆ４、および必要に応じてＣ−ｍｙｃのセット、またはこれら因子の組み合わせが含まれ得る。特定の側面では、Ｃ−ｍｙｃが発現することによって起こる可能性のある毒性効果を低減するために、ＳＶ４０ラージＴ遺伝子（ＳＶ４ＯＬＴ）がｃ−Ｍｙｃと共に含まれていてもよい。特定の側面では、さらにリプログラミング効率を高めるために、形質転換活性を欠損したＭｙｃ変異体、変異株またはホモログを使用してもよい。非限定的な例としては、Ｍｙｃ原癌遺伝子ファミリーメンバー、例えばＬＭＹＣ（ＮＭ＿００１０３３０８１）、Ｎ−末端の４１アミノ酸を欠損したＭＹＣ（ｄＮ２ＭＹＣ）、または１３６番目のアミノ酸が変異したＭＹＣ（Ｗ１３６Ｅ）が挙げられる。
【００１６】
特定の側面では、この態様に従って使用するための体細胞は、生きているヒト対象から直接得られた細胞である初代ヒト細胞であり、かつ、確立されたまたは不死化した細胞株は使用しなくてもよい。いくつかの側面では、高分化したヒト細胞を使用することができる。初代ヒト細胞の非限定的な例としては、線維芽細胞、角化細胞、造血細胞、間葉細胞、脂肪細胞、内皮細胞、神経細胞、筋肉細胞、上皮細胞、乳房細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、皮膚細胞、消化管細胞、卵丘細胞、腺細胞、または膵島細胞が挙げられる。より具体的には、初代ヒト細胞は、造血前駆細胞、例えばＣＤ３４＋細胞であってよい。初代ヒト細胞は、血液試料、毛髪試料、皮膚試料、唾液試料、固形組織試料または当業者に既知のいずれの供給源に由来するものであってよい。
【００１７】
特定の側面では、リプログラミング条件下で細胞を培養する工程には、リプログラミング培地で細胞を培養することが含まれる。例えば、リプログラミング培地は、１種または複数種のシグナル伝達阻害剤を含む場合がある（例えば、培地に添加された阻害剤）。シグナル伝達阻害剤は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ−３β）阻害剤、マイトゲン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、トランスフォーミング増殖因ベータ（ＴＧＦ−β）受容体阻害剤、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、およびその組み合わせからなる群より選択される１種または複数種であってよい。特に、リプログラミング培地は、ＧＳＫ−３β阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、および必要に応じてＬＩＦ、の組み合わせを含む可能性がある。この培地は、外から添加されたＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤をさらに含む場合もある。ＲＯＣＫ阻害剤はＨＡ−１００であってよい。この培地は、外から添加されたＦＧＦをさらに含んでいてもよい。特定の側面では、組成物は、化学的に規定された培地をさらに含んでいてもよい。化学的に規定された培地の非限定的な例としては、ＴｅＳＲ培地、ヒト胚細胞培地、Ｎ２Ｂ２７培地、必須８ＴＭ培地として市販されているＥ８培地（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、参照することによって本明細書に組み込まれる）、およびその派生物が挙げられる。体細胞をリプログラミングするためのさらなる方法は、米国特許公開第２０１１０１０４１２５号に詳細に記載されており、その全体は、参照することによって本明細書に組み込まれる。
【００１８】
その上さらなる側面では、この態様による方法には、フィーダー細胞、例えば照射マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細胞の存在下で細胞を培養することが含まれる。あるいは、フィーダー細胞を本質的に含まない条件で細胞を培養してもよい。例えば、この態様による方法には、フィーダー細胞の代わりに、細胞集団の培養を支持するためのマトリックス成分存在下で細胞を培養することが含まれる場合がある。細胞接着用の、そのようなマトリックス成分は、幹細胞またはフィーダー細胞（使用した場合には）を付着させることを目的とする、いかなる材料であってよい。マトリックス成分の非限定的な例としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ビトロネクチン、ラミニン、ならびにフィブロネクチンおよびその混合物、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）と溶解した細胞膜との調製物が挙げられる。特定の例では、マトリックス組成物には、フィブロネクチン断片、例えばＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）（例えば、参照することによって本明細書に組み込まれる米国特許第５，６８６，２７８号；同第６，０３３，９０７号、同第７，０８３，９７９号および同第６，６７０，１７７号を参照のこと）が含まれる。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）は、５７４アミノ酸からなるおよそ６３ｋＤａのタンパク質で、ヒトフィブロネクチンの中心となる細胞結合ドメイン（ＩＩＩ型反復、８、９、１０）、高親和性のヘパリン結合ドメインＩＩ（ＩＩＩ型反復、１２、１３、１４）、およびＣＳ１部位、あるいはスプライシングされたＩＩＩＣＳ領域を含むものである。
【００１９】
いくつかの側面では、リプログラミング条件下で細胞を培養する工程には、細胞をリプログラミング条件下で少なくとも約１日、１週間または１ヶ月培養することが含まれる。例えば、細胞をリプログラミング培地（例えば、上述したシグナル伝達阻害剤を含む培地）中で、少なくともまたはおよそ１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日間、またはここから導き出せる任意の期間、培養することができる。第一の核酸分子および／または染色体外の要素を体細胞に導入した後、少なくとも約１日から５日を含む間は、リプログラミング条件を維持してもよい。開始時および終了時は、導入後、１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日、またはここから導き出せる任意の期間、例えば、核酸の導入後約１日〜１５日間、から選択することができる。
【００２０】
この態様の一層さらなる側面では、リプログラミング条件下で細胞を培養する工程には、第一の核酸分子に関して、細胞を選択するまたはスクリーニングすることがさらに含まれる。例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）またはフローサイトメトリーによって、細胞を選択またはスクリーニングすることができる。あるいはまたはこれに加えて、第一の核酸が薬剤剤耐性マーカーを含んでいてもよく、細胞培養用培地に適切な薬剤剤（例えば、ピューロマイシン）を添加することで、細胞を選択することができる。従って特定の側面では、リプログラミング条件下で細胞を培養する工程には、第一の核酸分子を含む細胞を選択するための薬剤剤を含むリプログラミング培地中で、細胞を培養することが含まれる。例えば、第一の核酸分子および／または染色体外の遺伝的要素を細胞に導入した後、最初の約１〜１０日間（例えば、約１〜２日間、１〜３日間または１〜５日間）の間、細胞を選択薬剤剤の存在下で培養することができる。同様に、特定の側面では、細胞を薬剤剤の存在下で少なくとも約１〜１０日間、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０日間またはそれ以上の期間、培養する。従って特定の態様では、細胞がリプログラミング培地中にある間ずっと、選択薬剤剤の存在下で細胞を培養してもよい（例えば、少なくともｉＰＳ細胞が生産されるまで）。しかしながら別の態様では、薬剤剤による選択は、細胞がリプログラミング培地中にある期間のうちの一定の期間のみに実施される。
【００２１】
一層さらなる側面では、この態様の方法は、ｉＰＳ細胞を選択すること、例えば、１つまたは複数の胚細胞の特徴、例えばＥＳ細胞様の形態に基づいて、ｉＰＳ細胞を選択することをさらに含む場合がある。従って、その上さらなる態様において方法には、少なくとも第一の多能性マーカーの発現に基づいて多能性の細胞を選択すること、および第一の核酸分子の存在に関して細胞を選択することが含まれる。そのような選択工程は、連続して、または本質的に同時に実施することができる。例えば、少なくとも第一の多能性マーカー（例えば、Ｔｒａ１６０）を発現している細胞の集団を、クローナルな細胞のコロニーを採取すること、またはＦＡＣＳによって、単離することができる。次いで、その多能性の集団を、第一の核酸分子を含む細胞（改変したｉＰＳ細胞）と第一の核酸分子を含まない細胞（ｉＰＳ細胞）とに、さらに分離することができる。
【００２２】
この態様のさらなる側面において、この態様の方法は、（ｅ）増殖条件下で、ｉＰＳ細胞および／または改変したｉＰＳ細胞を培養する工程を含む。例えば、リプログラムした後（および／またはスクリーニングもしくは選択した後）、細胞を、例えば増殖培地で培養することによって、増殖条件におくことができる。増殖培地は、例えば、外から添加されたＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＴＧＦ−β受容体阻害剤を本質的に含まないものであってよい。特定の側面では、増殖培地は、１種または複数種のシグナル伝達阻害剤および／またはＬＩＦを含んでいてもよい。増殖培地の例としては、通常のＥＳ細胞用培地、必須８培地またはＴｅＳＲ培地が挙げられるがこれらには限定されない。
【００２３】
その上さらなる側面において、この態様の方法は、（ｆ）ｉＰＳ細胞および／または改変したｉＰＳ細胞を特徴付ける工程、を含む。例えば、ｉＰＳ細胞を特徴付ける工程は、１つまたは複数の多能性マーカーを検出すること；核型の解析を実施すること；第一の核酸分子の存在を検出すること；第一の核酸分子の配列を決定すること；染色体外の遺伝的要素の存在を検出すること；テラトーマ形成の解析；エピジェネティック解析；ＲＮＡ発現の解析；タンパク質の発現解析；または縦列型反復配列（ＳＴＲ）の検出、を含む可能性がある。
【００２４】
特定の側面では、本方法に関する出発細胞は、少なくともまたはおよそ、１０４、１０５、１０６１０７、１０８、１０９１０１０、１０１１、１０１２、１０１３個の細胞、またはここから導き出せる任意の範囲の数の細胞を含み得る。出発細胞の集団の播種密度は、少なくともまたはおよそ、１０、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８細胞／ｍｌ、またはここから導き出せる任意の範囲であってよい。
【００２５】
本発明の方法および／または組成物に関して議論した態様を、本明細書に記載の他の方法または組成物のいずれかに関して使用してもよい。従って、１つの方法または組成物に関する態様は、同様に、本発明の他の方法や組成物にも適用することができる。
【００２６】
本明細書で使用する場合、核酸に関する用語、「コードする」または「コードしている」は、当業者が本発明を容易に理解できるように使用される。しかしながら、これらの用語は、それぞれ、「含む」または「含んでいる」と同じ意味で使用される場合もある。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「１つ」または「１個」は、１つ以上を意味する場合がある。特許請求の範囲で、語「含む（含有する）」と関連して使用する場合、語「１つ」または「１個」は、１つまたは１を上回ることを意味し得る。
【００２８】
本開示では、「または」は選択肢のどちらか一方および「および／または」を指すという定義を支持するが、特許請求の範囲で使用する場合の用語「または」は、どちらか一方であることが明示されていない限り、または選択肢が相互に相容れない場合以外は、「および／または」を意味するとして使用される。本明細書で使用する場合「別の」は、少なくとも第二の、またはそれ以上を意味し得る。
【００２９】
この出願全体を通じて、用語「約（およそ）」は、ある値が、装置やその値を決定するのに使用される方法につきものの誤差の変動、または被検対象間に存在する違いを含むことを示すために使用される。
【００３０】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下に記す詳細な説明から明らかになる。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は本発明の好ましい態様を示してはいるが、当然のことながらこれらは例を示すためだけに記載されているものであり、当業者はこの詳細な説明から、本発明の精神および範囲内で、様々な変更や修正を理解するだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
以下の図面は本明細書の一部をなし、かつ、本発明の特定の側面を示すためにさらに含まれるものである。本発明は、これらの図面のうちの１つまたはいくつかを、本明細書に提示する特定の態様の詳細な説明と合わせて参照するばあいに、より深く理解されるだろう。
【００３２】
【図１】この態様による例示的な方法の模式図。この例のゲノム改変構築物には、ｚｓＧｒｅｅｎ用の発現カセットが含まれており、また、多能性は、赤色蛍光色素を用いて可視化した抗Ｔｒａ１６０抗体によって評価される。この方法では、４種類の細胞型が得られる可能性がある：１．リプログラムされ、かつ、改変されたｉＰＳ細胞。Ｔｒａ１６０＋（赤）およびｚｓＧｒｅｅｎ＋（緑）；２．リプログラムされたｉＰＳ細胞。Ｔｒａ１６０＋およびｚｓＧｒｅｅｎ−；３．改変された細胞。Ｔｒａ１６０−およびｚｓＧｒｅｅｎ＋、および４．改変もリプログラムもされなかった細胞。Ｔｒａｌ６０−およびｚｓＧｒｅｅｎ−。
【図２】ベクター１０２４の模式図。このベクターは、ジンクフィンガーヌクレアーゼＲＮＡと共に、恒常的に発現しているピューロマイシン耐性遺伝子をＡＡＶＳ１切断部位−染色体１９：６０、３１８、９３１〜６０、３１８、９６１に挿入するのに使用することができる。このベクターはまた、蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を心筋トロポニンＴ（ＴＮＮＴ２）プロモーターの制御下に挿入する。
【図３】細胞リプログラミングベクター＃３４、ｐＥＰ４ＥＯ２ＳＥＮ２Ｋの模式図。
【図４】細胞リプログラミングベクター＃３６、ｐＥＰ４ＥＯ２ＳＥＴ２Ｋの模式図。
【図５】細胞リプログラミングベクター＃１２３、ｐＣＥＰ４−ＬＭ２Ｌ（Ｌ−ｍｙｃ  ｉｒｅｓ  Ｌｉｎ２８とも呼ぶ）の模式図。
【図６】細胞改変ベクター＃１０３６、ｐＺＤ  ＥＦｘ−ＺｓＧｒｅｅｎ  ＰＧＫｐｕｒｏの模式図。このベクターをジンクフィンガーヌクレアーゼＲＮＡと共に使用して、ｐＥＦｘプロモーターを使用した恒常的に活性のｚｓＧｒｅｅｎ蛍光タンパク質遺伝子と、ＰＧＫプロモーターを使用した恒常的に活性のピューロマイシン耐性遺伝子の両方を挿入することができる。
【図７】ピューロマイシン耐性遺伝子およびＺｓＧｒｅｅｎ蛍光タンパク質遺伝子を恒常的に発現させるための、ｐｉｇｇｙＢａｃベクター＃１０３８の模式図。このベクターを、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼをコードしているプラスミドまたはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼをコードしているＲＮＡと共に使用して、プラスミド＃１０３８由来の配列をゲノムに挿入することができる。
【図８】ゲノム改変のためにｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステムを使用した、この態様による例示的な方法の模式図。
【図９】ゲノム改変のためにジンクフィンガーヌクレアーゼシステムを使用した、この態様による例示的な方法の模式図。
【図１０】ゲノムの改変とリプログラムを連続して実施した方法の効率と、本発明の態様による、ゲノム改変とリプログラムを組み合わせた方法の効率を比較する模式図。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
序論
治療用ツールおよび研究用ツール両者のｉＰＳ細胞を獲得するための様々なプロトコールでは、細胞を、それらのゲノム中に組み込まれる外生の核酸分子で改変する必要がある。しかしながら、ｉＰＳ細胞のリプログラムは、それ自体が複雑で、時間と費用のかかる過程である。さらに、そのような細胞のゲノムの改変は、その生産過程を煩雑で長期間にわたるものにし、また、得られる細胞いずれもの価格を上昇させる。そのためこの分野では、改変したｉＰＳ細胞を生産するための、改良された方法が必要とされている。
【００３４】
本発明は、部分的には、遺伝的に改変したｉＰＳ細胞を生産するための、細胞のリプログラムと改変を実質的に同時行うことができる方法という、驚くべき発見に基づいている。具体的には、リプログラムが成功した後でさえも、リプログラミングの過程でサイレンシングを受けず、かつ、ｉＰＳ細胞中で（またはそれに由来する分化した細胞中で）発現可能な、細胞ゲノムを改変した構築物を用いてｉＰＳ細胞を生産することができる、ということを発見した。さらに、体細胞をリプログラミングする間は、細胞培養の条件を厳しく制御する必要があるにもかかわらず、リプログラミング過程の間に、選択した核酸分子のゲノムへの組み込みに関して、細胞をスクリーニング、または選択さえもすることができる。そのような同時並行の選択（またはスクリーニング）およびリプログラミングの後、個別の組み込み事象を提示しているｉＰＳ細胞のクローンを単離し、増殖させることができる。図１および図１０に例を図示するこの組み合わせた過程によって、時間と費用が大きく削減される。具体的には、この態様による方法によって、時間を少なくとも１／３短縮することができ（３４％の短縮）、またこの方法では、リプログラミングの後にゲノムの改変を行う方法と比較して、使用される培養プレートの量が半分未満となる（６０％少ない）。同様に、遺伝的に改変したｉＰＳ細胞の単離に加えて、組み込み事象が起こっていない細胞も同時に単離することができるため、ｉＰＳ細胞と改変したｉＰＳ細胞の両方が、同じ方法で生産される。改変していないｉＰＳＣは、改変したｉＰＳＣの解析に関して対照として役立つ場合があるため、改変したｉＰＳＣと改変していないｉＰＳＣの両方を並行して生成する能力は特に有用である。
【００３５】
改変したｉＰＳ細胞集団を生産するための組成物および方法に関するさらなる利点は以下にも記載する。
ＩＩ．定義
【００３６】
本明細書で使用する場合、「初代細胞」とは、生体またはその子孫から、細胞株としての確立または不死化を経ずに、直接得られた細胞を指す。「ヒト初代細胞」とは、生きているヒト対象から得られた初代細胞を指す。
【００３７】
「胚性幹（ＥＳ）細胞」は、初期胚から誘導した多能性幹細胞である。ＥＳ細胞は最初、１９８１年に確立され、１９８９年からは、ノックアウトマウスの生産に使用されてきた。ヒトＥＳ細胞は１９９８年に確立され、現在では、再生医療に利用可能となってきている。
【００３８】
「人工多能性幹細胞」、一般的にはｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略されている、は、多能性でない細胞、通常は成体の体細胞、または高分化した細胞、例えば線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、上皮細胞などから、リプログラムすることによって人工的に調製された型の多能性幹細胞を指す。
【００３９】
「多能性」とは、１つ以上の組織もしくは器官を構成している全ての細胞、または、好ましくは、三胚葉：内胚葉（胃内部の裏打ち、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、もしくは外胚葉（上皮組織および神経系）のうちのいずれかに分化する能力を有する幹細胞を指す。本明細書で使用する場合、「多能性幹細胞」は、三胚葉のいずれかに由来する細胞に分化することが可能な細胞、例えば、全能性細胞の直接の子孫、胚性幹細胞、または人工多能性幹細胞を指す。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「体細胞」は、生殖細胞、例えば、卵、精子など以外の、そのＤＮＡを次世代に直接伝達しないいずれもの細胞を指す。通常、体細胞の多能性は限定されているか、または体細胞は全く多能性をもたない。本明細書で使用される体細胞は、天然に存在するものであってもまたは遺伝的に変更されたものであってもよい。
【００４１】
「リプログラミング」とは、培養中またはインビボのいずれかで、リプログラミングしないで同じ条件で有し得るよりも、少なくとも１つの新しい細胞型の後代を形成する測定可能な程度の高い能力を細胞に付与する過程である。より具体的には、リプログラミングとは、体細胞に多能性能を付与する過程である。これは、十分に増殖させた後には、新しい細胞型の表現型の特徴を有する後代がリプログラミング前には本質的には形成されないとしても、測定可能な程度の割合の後代がそのような表現型の特徴を有すること、あるいは、新しい細胞型の特徴を有する後代の割合がリプログラミング前を測定可能な程度に上回る、ことを意味する。特定の条件では、新しい細胞型の特徴を有する後代の割合は、昇順で、少なくとも約０．０５％、０．１％、０．５％、１％、５％、２５％またはそれ以上であってもよい。
【００４２】
本明細書で使用する場合、細胞に関連する用語、「改変した」は、細胞のゲノムに組み込まれた、細胞にとって外生の少なくとも１つの遺伝的要素を含む細胞を指す。いくつかの側面では、外生の遺伝的要素は、細胞ゲノムの無作為の位置に組み込まれる可能性がある。他の側面において遺伝的要素は、ゲノムの特定の位置に組み込まれる。例えば、遺伝的要素は特定の位置に組み込まれて、例えば内生の配列に関連する変化（例えば、単一のヌクレオチド位置における変化）を生じるために、内生の核酸配列と置き換わる場合がある。
【００４３】
タンパク質、遺伝子、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝的要素、または細胞もしくは器官中のベクター要素に関連して使用される場合、用語「外生の」は、人工的な手段でまたは天然にある手段によって、細胞または生物中に導入されたタンパク質、遺伝子、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝的要素またはベクター要素を指し、細胞に関連して使用される場合には、単離した後に、人工的な手段でまたは天然にある手段によって、他の細胞または生物に導入された細胞を指す。外生の核酸は、別の生物もしくは細胞に由来するものであってよく、または、その生物もしくは細胞中に天然に生じる核酸の１つ以上の追加的なコピーであってもよい。外生の細胞は別種の生物に由来するものであってよく、または同種の生物に由来するものであってもよい。外生の核酸の非限定的な例としては、天然の状態の細胞とは異なる染色体上の位置にある核酸、そうでなければ、天然の状態とは別の核酸配列と隣接した核酸がある。あるいは、外生の核酸は染色体外に、例えばエピソームベクター中にあってもよい。
【００４４】
用語「薬剤」は、疾患に関連する表現型を変えるまたは変える候補である、低分子、核酸およびタンパク質またはその組み合わせを含むがこれらには限定されない分子を指す。
【００４５】
「複製の起点」（「ｏｒｉ」）または「複製起点」は、例えば、リンパ増殖性のヘルペスウイルス中にあって、細胞内のプラスミド中に含まれる場合にプラスミド中の関連する配列を維持することができるＤＮＡ配列、および／またはＤＮＡ合成が開始される部位またはその近傍の部位のＤＮＡ配列である。ＥＢＶのｏｒｉには、ＦＲ配列（３０ｂｐ反復の２０個の不完全なコピー）と、好ましくはＤＳ配列が含まれるが、ＥＢＶ中の他の部位はＥＢＮＡ−１する。例えば、Ｒｅｐ＊配列を複製の起点としてＤＳと置き換えることができる（ＫｉｒｃｈｍａｉｅｒおよびＳｕｇｄｅｎ、１９９８）。従って、ＥＢＶの複製起点には、ＦＲ、ＤＳもしくはＲｅｐ＊配列または、それらに由来する修飾または合成の組み合わせを介した任意の機能性の等価な配列が含まれる。例えば、本発明では、Ｌｉｎｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００８）に具体的に記載されているように、遺伝的に改変した、例えば挿入または個々の要素の変異によって改変したＥＢＶの複製起点を使用してもよい。
【００４６】
「リンパ増殖性の」ヘルペスウイルスとは、リンパ芽球（例えば、ヒトＢリンパ芽球）または他の細胞型中で複製され、かつ、その天然の生活環の少なくとも一部分で、染色体外に複製されるヘルペスウイルスである。宿主に感染すると、これらのウイルスは、ウイルスゲノムをプラスミドとして維持することで、宿主に潜在的に影響を及ぼす。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は「リンパ増殖性の」ヘルペスウイルスではない。リンパ増殖性のヘルペスウイルスの例としては、ＥＢＶ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、サイミリヘルペスウイルス（ＨＳ）およびマレック病ウイルス（ＭＤＶ）が挙げられるがこれらには限定されない。
【００４７】
「ベクター」または「構築物」（遺伝子送達または遺伝子移入「媒体」と呼ばれることもある）は、インビトロまたはインビボのいずれかで、宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む高分子または分子の複合体を指す。
【００４８】
一般的な型のベクターである「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとば別の染色体外のＤＮＡ分子であり、これは、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる。特定の例では、プラスミドは環状であり、かつ、二本鎖である。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「鋳型」とは、複製起点を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。「組み込まれた鋳型」は、細胞のゲノム中に安定に維持されている鋳型、例えば細胞の染色体に組み込まれた鋳型である。「染色体外の鋳型」は、細胞内で安定に維持されているが、染色体には組み込まれていない鋳型である。
【００５０】
「発現構築物」または「発現カセット」は、転写を誘導することが可能な核酸分子を意味する。発現構築物には、少なくとも、プロモーターまたはプロモーターと機能的に等価な構造が含まれる。その他の要素、例えばおエンハンサー、および／または転写終結シグナルも含まれ得る。核酸分子はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
【００５１】
本明細書で使用される、用語「に対応する」は、あるポリヌクレオチド配列が、参照しているポリヌクレオチド配列の全体もしくは一部と相同である（つまり、同一であるが、厳密には進化的な関連はない）こと、またはあるポリペプチド配列が、参照しているポリペプチド配列と同一であることを意味する。それと対比して、本明細書で使用される、用語「相補的な」は、その相補的な配列が、参照しているポリヌクレオチド配列の全体または一部と相同であることを意味する。例えば、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、かつ、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
ＩＩＩ．ｉＰＳ細胞
【００５２】
人工多能性幹細胞、一般的にはｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略されている、は、多能性でない細胞、通常は成体の体細胞から人工的に誘導された種の多能性幹細胞である。人工多能性幹細胞は、天然の多能性幹細胞、例えば胚性幹細胞と同一とまでは言わないまでも、多くの点で、例えば、特定の幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンのメチル化パターン、倍加時間、胚様体の形成、テラトーマの形成、生存可能なキメラの形成、ならびに潜在力や分化能に関しては同様であると考えられているが、天然の多能性幹細胞と人工多能性幹細胞との関係の全体像については、まだ評価されている途中である。
【００５３】
胚を起源とするのではなく、ヒト組織からの人工多能性細胞の生成は、胚や胚性組織を研究に使用することに関する倫理的な問題を低減するために望まれている。人工多能性細胞の治療への応用がさかんに言われている。治療への応用には、いくつかの例を挙げると、アルツハイマー病、糖尿病および脊髄損傷の治療が挙げられる。他の応用例としては、疾患モデルおよび医薬品のスクリーニングが挙げられる。
【００５４】
ｉＰＳ細胞は最初、２００６年にマウス細胞から（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）、そして２００７年にヒトの細胞から（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ、  ２００７）生産された。研究にとって重要であり、かつ、治療に使用できる可能性のある多能性幹細胞を、従来のように胚を使用することなく、研究者らが得られるようになったことから、これらは幹細胞に関する研究における重要な前進であったと言われている。最初にうまくいくことが示された、マウスまたはヒト組織からの人工多能性細胞（ｉＰＳ細胞）の生成には、特定のセットの転写因子を発現しているレトロウイルスベクターが使用されていた。Ｊａｍｅｓ  Ｔｈｏｍｓｏｎ研究室および山中伸弥研究室の研究から、レトロウイルスベクターを使って、特定の転写因子をマウスまたはヒト線維芽細胞に導入することで、十分に、これらの細胞を未分化の多能性幹細胞へとリプログラムされることが示された。Ｔｈｏｍｓｏｎは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の因子を使用した。山中の使用した因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃであった。いずれの遺伝子セットによるリプログラミングも、転写因子が宿主細胞のゲノムに組み込まれて発現することによって起こる。Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２はリプログラミングに必須の転写因子だと考えられる。リプログラミングの効率は低く、その頻度は、出発細胞集団の０．０１〜０．０２％の範囲である。
【００５５】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）はそもそも、初期段階の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞である。ＥＳ細胞は、その多能性とＥＳ細胞自体を無限に自己再生する能力という２つの特徴によって識別される。ＥＳ細胞は多能性である。すなわちＥＳ細胞は、初期の三胚葉、つまり内胚葉、中胚葉、外胚葉から誘導される全ての細胞に分化することができる。加えて胚性幹細胞は、限定的な条件では自己を無制限に増殖することができる。そのため胚性幹細胞は、研究または臨床用途用に、継続して数に制限なく自己を生産できるため、研究と再生医療双方にとって有用なツールとして使用することができる。
【００５６】
しかしながら、マウス細胞とヒトＥＳ細胞の間には注目すべき違いがある。Ｊａｍｅｓ  Ｔｈｏｍｓｏｎによって発見された時点でヒトＥＳ細胞は、その可能性およびそれらの培養条件がマウスＥＳ細胞とは異なることが見出された。ヒトＥＳ細胞はＬＩＦ（マウスＥＳ細胞の培養には必須の要素）には全く反応せず、これは、ヒトＥＳ細胞内の白血病抑制因子経路が不活性であることよって生じる。現存するヒトｉＰＳ細胞は、これらの点に関してヒトＥＳ細胞と類似しているため、彼らは、ヒトＥＳ細胞様ｉＰＳ細胞と命名することができた。
ＩＶ．核酸のゲノムへの組み込み
【００５７】
特定の態様では、本発明は、遺伝子操作を介した、核酸分子のゲノムへの組み込みを含む。例えば、そのような核酸を、細胞の遺伝的欠損を修正するために、病原体感染に対する耐性を付与するために、薬剤耐性を付与するために、薬剤への感受性を付与するために、細胞の免疫原性を変更するために、または細胞に遺伝的タグ（例えば、発現している蛍光マーカー）を付与するために、使用してもよい。そのような核酸分子を部位特異的にまたは無作為にゲノムに組み込むための方法は当該分野において公知であり、かつ、遺伝子を操作するために用いることができる。
Ａ．ウイルスベクター
【００５８】
特定の側面では、ウイルスベクターを使用して、細胞ゲノムへの核酸分子の組み込みを促進してもよい。例えばレトロウイルスを使用して、宿主細胞ゲノムに、核酸分子を無作為に組み込むことができる。レトロウイルスベクターを構築するために、ウイルスゲノムの特定のウイルス配列の部位に核酸を挿入して、複製欠損ウイルスを生産する。ウイルス粒子を生産するには、ｇａｇ、ｐｏｉ、およびｅｎｖ遺伝子を含むがＬＴＲを含まないパッケージング細胞株と、パッケージング成分を構築する（Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）。ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドの場合には、レトロウイルスＬＴＲとパッケージング配列を一緒に、特殊な細胞株に導入する（例えば、リン酸カルシウム沈殿などによって）。この場合、パッケージング配列によって組換えプラスミドのＲＮＡ転写産物のウイルス粒子へのパッケージングが可能となり、これが次いで、培地に分泌される（Ｎｉｃｏｌａｓ  ａｎｄ  Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６；Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８３）。その後、組換えたレトロウイルスを含む培地を回収し、必要に応じて濃縮し、遺伝子移入に使用する。レトロウイルスベクターは、多様な細胞型に感染することができる。しかしながら、組み込みと安定な発現には、宿主細胞の分裂が必要とされる（Ｐａｓｋｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５）。
【００５９】
レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、一般的にはレトロウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖに加えて、制御的なまたは構造的な機能を有する他の遺伝子を含む。レンチウイルスベクターは当該分野において良く知られている（例えば、Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｂｌｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；米国特許第６，０１３，５１６号および同第５，９９４，１３６号を参照のこと）。
【００６０】
組換えレンチウイルスベクターは、分裂していない細胞に感染することができ、かつ、インビボおよびエクスビボ両方での遺伝子移入ならびに核酸配列の発現に使用することができる。例えば、好適な宿主細胞にパッケージング機能、すなわちｇａｇ、ｐｏｉおよびｅｎｖ、ならびにｒｅｖおよびｔａｔを含んでいる２つ以上のベクターが導入されている、分裂していない細胞に感染することができる組換えレンチウイルスが、参照することによって本明細書に組み込まれる米国特許第５，９９４，１３６号に記載されている。
【００６１】
同様に、宿主細胞ゲノムへの核酸分子の組み込みを仲介させるために、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用することもできる。例えば、パッケージングに必要な領域以外の遺伝子を欠損させた（ｇｕｔｌｅｓｓ）ＡＡＶベクターを使用して、ウイルスの逆方向末端反復（ＩＴＲ）が組み込む核酸分子に隣接するようにしてもよい。そのようなベクターを細胞に導入する場合には、本質的に無作為なゲノムへの組み込みが起こり得る。一方、機能性ＡＡＶＲｅｐ遺伝子（ウイルス中で発現しているかまたはトランスで発現している）の存在下で細胞への形質導入を行う場合には、その配列はＡＡＶＳ１の組み込み部位へと、部位特異的に組み込まれる可能性がある。
Ｂ．トランスポゾンを利用した組み込みシステム
【００６２】
別の特定の態様では、核酸の組み込みには、トランスポゾン−トランスポサーゼシステムを使用してもよい。そのようなシステムを使って、核酸分子を細胞ゲノムに効率的に、かつ、無作為に挿入することができる。例えば、使用されるトランスポゾン−トランスポサーゼシステムは、良く知られているＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙ、ＦｒｏｇＰｒｉｎｃｅトランスポゾン−トランスポサーゼシステム（後者については、例えば欧州特許第１５０７８６５号明細書を参照のこと）、またはＴＴＡＡ特異的トランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃシステムとなり得る。
【００６３】
トランスポゾンとは、転位と呼ばれる過程で、単一の細胞のゲノム内で、別の位置へと動き回ることができるＤＮＡの配列である。この過程で、トランスポゾンは突然変異やゲノム中のＤＮＡ量の変化を起こす場合がある。トランスポゾンはジャンピング遺伝子と呼ばれていたこともあり、可動遺伝要素の代表的なものである。
【００６４】
可動遺伝要素には様々なものがあり、転位の機構によってそれらを分類することができる。Ｉ型の可動遺伝要素、すなわちレトロトランスポゾンは、最初にＲＮＡへと転写され、次いで逆転写酵素によってＤＮＡへと逆転写され、その後ゲノム中の別の位置に挿入されることによって、それら自体を複製する。ＩＩ型の可動遺伝要素は、それら自体をゲノム中で「カットアンドペースト」するトランスポサーゼを使って、ある位置から直接別の位置に移動する。この態様による核酸分子のゲノムへの組み込みの仲介には、そのようなシステムのいずれを用いてもよい。
Ｃ．相同的組換え
【００６５】
本発明の特定の側面では、核酸分子を細胞に、ゲノム改変に特異的な様式で、例えば相同的組換えを介して、導入することができる。上述したように、遺伝子を細胞内で発現させるためのいくつかの方法には、ウイルスベクターまたは導入ゲノム中に無作為に組み込むための遺伝子の使用が含まれる。しかしながらこれらの方法はには、組み込まれた核酸からの発現を仲介するのに適していない位置にも組み込みが起こること、または天然の遺伝子が破壊されるという欠点がある。無作為な組み込みに関連する問題は、標的ゲノムの特定の遺伝子座、例えば、ＡＡＶＳ１またはＲｏｓａ２６遺伝子座を相同的に組換えることによって、部分的に克服することができた。
【００６６】
普遍的組換えとしても知られている相同的組換え（ＨＲ）は、全ての形の生命において使用されている普遍的な組換えであり、ＨＲでは、ヌクレオチド配列がＤＮＡの２本の類似した鎖または同一の鎖の間で交換される。この技術は、１９８０年代の半ばから、哺乳類の細胞におけるゲノム改変の標準的な方法となっている。この過程には、物理的な切断やその後に起こるＤＮＡの再結合などの複数の工程が含まれる。この過程は、ＤＮＡの中で、致死となる可能性のある二本鎖の損傷を修復するために、最もよく使用される。加えて、相同的組換えによって、真核生物が精子や卵子のような生殖細胞を形成する過程である減数分裂の間に、ＤＮＡ配列の新しい組み合わせが生成される。これらＤＮＡの新しい組み合わせは子孫における遺伝的な変動を表し、これによって、経時的な環境条件の変化に、その集団が進化的に適応することが可能となる。相同的組換えは、細菌やウイルスの異なる系統や種間で遺伝材料を交換するための水平遺伝子伝達にも使用されている。相同的組換えはまた、標的生物に遺伝的な変化を導入するための分子生物学における技術としても用いられている。
【００６７】
相同的組換えを、標的ゲノムの修飾に使用することもできる。哺乳類細胞における標準的なＨＲの効率は、僅か、処理した細胞の１０−６〜１０−９である（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９９０）。メガヌクレアーゼ、またはホーミングエンドヌクレアーゼ、例えばＩ−ＳｃｅＩを使用することで、ＨＲの効率は高められてきた。ＨＲの効率を高めるために、ターゲティング特性を変えた天然のメガヌクレアーゼおよび改変したメガヌクレアーゼの両方が使用されてきた（Ｐｉｎｇｏｕｄ  ａｎｄ  Ｓｉｌｖａ、２００７；Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【００６８】
ＨＲの効率を向上させる過程で、プログラム可能なＤＮＡ特異性ドメインを用いて、キメラエンドヌクレアーゼが設計されてきた（Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、そのようなキメラ分子の一例であり、ＺＦＮでは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ、例えばＦｏｋｌの触媒ドメインに融合されている（Ｄｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３０６０６に概説されている）。
【００６９】
そのような特定の分子の他のクラスには、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ、例えばＦｏｋＩの触媒ドメインに融合させたものが含まれる（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１：ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０００１５４）。実質的に、目的の部位のいずれでもゲノムを部位特異的に修飾するために、ＴＡＬＥＮを設計することができる（Ｃｅｒｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。部位特異的ＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ開裂酵素、例えばＦｏｋＩとの融合タンパク質として発現される。ＤＮＡ結合ドメインは、反復しているアミノ酸の骨格であり、連接しているそれぞれの反復は、ＤＮＡ内の単一のヌクレオチドに結合する２つのアミノ酸である。例えば、Ａｓｎ−Ａｓｎはグアノシンに結合し、Ａｓｎ−Ｉｌｅはアデノシンに結合し、Ａｓｎ−Ｇｌｙはチミジンに結合し、Ｈｉｓ−Ａｓｐはシトシンに結合する。これら２つのアミノ酸は、反復可変２残基（Ｒｅｐｅａｔ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）またはＲＶＤとして知られている。ＲＶＤには様々な種類があり、それらをＴＡＬエフェクター／Ｆｏｋｌタンパク質構築物中に組み込んで、特定のＴＡＬＥＮを作成することができる。その後、組換えＴＡＬＥＮをコードしているＲＮＡを精製し、部位特異的にゲノムを修飾するために、細胞に導入することができる。ＴＡＬＥＮによる二本鎖ＤＮＡの切断が生じた後には、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によってまたは相同組換え修復（ＨＤＲ）によって、ＤＮＡを修飾することができる。これにより、ＤＮＡ修復の間に存在する追加の配列に応じたＤＮＡ突然変異生成、欠損、または付加が可能となる。
Ｖ．リプログラミングのための遺伝要素
【００７０】
ヒト体細胞からの多能性幹細胞の誘導は、リプログラミング遺伝子を異所的に発現させるためのレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを使用して行われてきた。組換えレトロウイルス、例えばモロニーマウス白血病ウイルスは、安定な様式で、宿主ゲノム中に組み込む能力を有する。これらには、宿主ゲノムへの組み込みを可能にする、逆転写酵素が含まれている。レンチウイルスは、レトロウイルスの下位区分である。これらは、分裂していない細胞および分裂している細胞のゲノムに組み込むその能力によって、ベクターとして広く適合されている。ＲＮＡの形態のウイルスゲノムは、ウイルスが細胞に進入すると、ＤＮＡを生産するために逆転写され、次いで、ウイルスの組み込み酵素によって、ゲノムの無作為な位置に挿入される。そのため、現在うまくいっているリプログラミング技術は、組み込みに基づくウイルスによる方法に依存している。
【００７１】
しかしながら、特定の態様において本発明の方法は、リプログラミングに染色体外の遺伝要素を活用する。例えば、染色体外で複製しているベクター、またはエピソームで複製することが可能なベクター（参照することによって本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１００００３７５７号を参照のこと）を用いることができる。さらなる側面では、リプログラミング因子をコードしているＲＮＡ分子またはリプログラミング因子タンパク質を使用することができる。それぞれの場合、リプログラミング因子の発現と、最適なリプログラミング効率および動力学を達成するための細胞間シグナル伝達阻害剤の存在下における細胞の培養とを併用することができる。
【００７２】
多数のＤＮＡウイルス、例えば、アデノウイルス、サル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）、または出芽酵母ＡＲＳ（Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を含有するプラスミドが、哺乳類細胞内で染色体外に複製される。これらのエピソームプラスミドは、組み込みベクターに関連のあるこれらの欠点を、本質的に含まないものである（Ｂｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）などのリンパ増殖性のヘルペスウイルスを利用したシステムもまた、染色体外で複製され、リプログラミング遺伝子の体細胞への送達を補助し得る。
【００７３】
例えば、本発明で使用されるエピソームベクターを利用した方法では、以下に詳述するように臨床現場でのシステムの扱いやすさを損なうことなく、ＥＢＶ要素を利用したシステムの複製および維持の成功に必要な、強力な要素が抽出される。有用なＥＢＶ要素は、ＯｒｉＰおよびＥＢＮＡ−１であるか、またはそれらの変異体もしくは機能性の均等物である。このシステムの別の利点は、これらの外生の要素は、細胞に導入した後、時間経過とともに消失し、これらの要素を本質的に含まない、自家持続性のｉＰＳ細胞を生じることである。
Ａ．エプスタイン・バーウイルス
【００７４】
ヒトヘルペスウイルス４（ＨＨＶ−４）とも呼ばれるエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、ヘルペスファミリー（単純ヘルペスウイルスやサイトメガロウイルスを含む）のウイルスであり、かつ、ヒトに最も一般的なウイルスの１種である。ＥＢＶはそのゲノムを染色体外で維持し、効率的な複製と維持のために、宿主細胞の機構と協調して機能する（ＬｉｎｄｎｅｒおよびＳｕｇｄｅｎ、  ２００７）。ＥＢＶの複製と維持は、細胞分裂の間でのその複製と保持に必須の、たった２つの特徴に依存している（Ｙａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８５；Ｙａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８４）。一般的にｏｒｉＰと呼ばれている１つめの要素はシスに存在し、複製の起点となる。もう１つの因子であるＥＢＮＡ−１は、プラスミドＤＮＡの複製と維持を促進するために、ｏｒｉＰ中の配列に結合することによってトランスで機能する。非限定的な例として、本発明の特定の側面では、これら２つの特徴を引き出し、リプログラミングに必要な遺伝子の複製と持続した発現を標準的なプラスミドよりも促進するために、これら遺伝子を体細胞に運ぶためのベクターに関連して、それらを使用する。
Ｂ．複製起点
【００７５】
特定の側面では、ＥＢＶの複製起点であるＯｒｉＰを使用してもよい。ＯｒｉＰは、ＤＮＡの複製が開始する位置またはその近傍であり、２つのシス活性化配列から構成されている。これら２つのシス活性化配列は、およそ１キロベースペアの間隔で位置しており、ＦＲ（ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｒｅｐｅａｔｓ）およびＤＳ（ｄｙａｄ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ）として知られている。
【００７６】
ＦＲは、３０ｂｐ反復の、不完全な２１のコピーから構成されており、２０の高親和性ＥＢＮＡ−１−結合部位を含む。ＦＲにＥＢＮＡ−１が結合すると、この両者が、シスの１０ｋｂ離れた位置までのプロモーターの転写エンハンサーとして機能し（Ｒｅｉｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，１９８６；Ｙａｔｅｓ，１９８８；  Ｓｕｇｄｅｎ  ａｎｄ  Ｗａｒｒｅｎ，１９８９；Ｗｙｓｏｋｅｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｙａｔｅｓ，１９８９；Ｇａｈｎ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，１９９５；Ｋｅｎｎｅｄｙ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，２００３；Ａｌｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，２００６）、ＦＲ含有プラスミドの核での保持と忠実な維持に寄与する（Ｌａｎｇｌｅ−Ｒｏｕａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ，１９９８；Ｋｉｒｃｈｍａｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，１９９５；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００６；Ｎａｎｂｏ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，２００７）。ｏｒｉＰプラスミドの効率的な分割もまた、ＦＲに起因するようである。ウイルスは、ＦＲ中で２０のＥＢＮＡ−１−結合部位を維持するように進化してきたが、効率的なプラスミドの維持には、これらの部位のうちのたった７つだけが必要であり、および３コピーのＤＳのポリマーによって、合計で１２のＥＢＮＡ−１−結合部位を有するように再構成することができる（Ｗｙｓｏｋｅｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｙａｔｅｓ，１９８９）。
【００７７】
ＤＳ（ｄｙａｄ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ）要素は、ＥＢＮＡ−１存在下でのＤＮＡ合成の開始に十分なものであり（Ａｉｙａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｙａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、開始は、ＤＳまたはその近傍で起こる（Ｇａｈｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ、１９８９；Ｎｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。ＦＲにＥＢＮＡ−１が結合すると、ＦＲが複製フォークの障壁として機能することが２次元ゲル電気泳動によって示されたことから（Ｇａｈｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ、１９８９；Ｅｒｍａｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、ウイルスＤＮＡ合成の終了はＦＲで起こると考えられている。ＤＳからのＤＮＡ合成の開始は、一細胞周期に一度だけ（ｏｎｃｅ−ｐｅｒ−ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ）であることが認められており（Ａｄａｍｓ、１９８７；Ｙａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｇｕａｎ、１９９１）、かつ、細胞複製システムの成分によって制御されている（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｒｉｔｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｄｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｓｃｈｅｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｊｕｌｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＤＳは、４つのＥＢＮＡ−１−結合部位を含むが、ＦＲに見られるものよりも親和性が低い（Ｒｅｉｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）。ＤＳのトポロジーは、各組の間の中心間の距離が２１ｂｐとなり、組になっていない、内側にある２つの結合部位の間の中心間の距離が３３ｂｐとなるように、４つの結合部位が、２組の部位として配置されるというものである（Ｂａｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４；Ｒａｗｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）。
【００７８】
ＤＳに含まれている要素の機能的な役割は、Ｒｅｐ＊と名付けられた、ＥＢＶゲノムの別の領域に関する研究によって確認されてきた。Ｒｅｐ＊は、効率は悪いがＤＳの代わりになる可能性のある要素として同定された（ＫｉｒｃｈｍａｉｅｒおよびＳｕｇｄｅｎ、１９９８）。Ｒｅｐ＊を８つ重合させると、複製の支持においてＤＳと同程度の効率を有する要素となる（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。Ｒｅｐ＊の生化学的な解析から、中心間の距離が２１ｂｐの、一対のＥＢＮＡ−１結合部位がその複製機能に重要であることが同定された（ｉｂｉｄ）。ポリマー中の全ての隣接した配列をλファージ由来の配列と置き換えた後も複製機能が維持されたことから、Ｒｅｐ＊の最小レプリケーターがＥＢＮＡ−１結合部位の組であることが分かった。ＤＳとＲｅｐ＊の比較から、これらのレプリケーターは、適切な距離をおいて配置された一対の部位、ＥＢＮＡ−１による屈曲および結合を介して細胞の複製機構を補充することによってＤＮＡ合成の開始を支持するという、共通の機構が明らかになった。
【００７９】
哺乳類細胞内で複製し、ＥＢＶとは関連がなく、かつ、いくつかの点でＥＢＶのＲａｊｉ株に含まれている開始領域に類似しているように考えられる、染色体外の、認可されたプラスミドが他にもある。Ｈａｎｓ  Ｌｉｐｐｓと彼の共同研究者らは、「核の足場／マトリックス結合領域」（Ｓ／ＭＡＲ）と強力な転写単位を含むプラスミドを開発し、調査した（Ｐｉｅｃｈａｃｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｊｅｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。彼らのＳ／ＭＡＲはヒトインターフェロンベータ遺伝子に由来するものでＡ／Ｔに富み、かつ、核マトリックスとの関係と、低イオン強度でのまたはスーパーコイルＤＮＡに埋め込まれた場合のその優先的な巻き戻しによって、操作的に定義される（Ｂｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ、１９９２）。これらのプラスミドは半保存的に複製し、ＯＲＣタンパク質に結合し、そしてそのＤＮＡ全体を通して無作為に、ＤＮＡ合成の開始を効率よく支持する（Ｓｃｈａａｒｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。それらは薬剤選択なしでも、増殖しているハムスター細胞およびヒト細胞中で効率よく維持され、ブタの胚に導入した場合には、胎仔のほとんどの組織におけるＧＦＰの発現を支持することができる（Ｍａｎｚｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
Ｃ．トランス活性化因子
【００８０】
トランス活性化因子の具体例としては、エプスタイン・バー核抗原１（ＥＢＮＡ−１）を挙げることができる。ＥＢＮＡ−１は、ｏｒｉＰまたはＲｅｐ＊のＦＲおよびＤＳに結合して、複製と、細胞の染色体とは独立しているがこれらと協調して、各細胞分裂の間にＥＢＶベースのベクターの娘細胞への忠実な分割を促進するＤＮＡ結合タンパク質である。
【００８１】
ＥＢＮＡ−１の６４１個のアミノ酸（ＡＡ）は、変異を用いた解析および欠損を用いた解析によって、その多様な機能に関連するドメイン毎に分類された。ＡＡ４０−８９およびＡＡ３２９−３７８の２領域は、ＥＢＮＡ−１が結合すると、シスまたはトランスにある２つのＤＮＡ要素に結合することができる。そのためこれらは結合領域１および２（ＬＲ１、ＬＲ２）と命名された（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ、１９９２；Ｆｒａｐｐｉｅｒ  ａｎｄ  Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ、１９９１；Ｓｕｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｍａｃｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。ＥＢＮＡ−１のこれらドメインをＧＦＰに融合すると、ＧＦＰは有糸分裂染色体に接近する（Ｍａｒｅｃｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｋａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。複製に関しては、ＬＲ１とＬＲ２の機能は重複しており、どちらか一方を欠損させても、ＤＮＡ複製を支持することが可能なＥＢＮＡ−１の派生物が生じる（Ｍａｃｋｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ、１９９９；Ｓｅａｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＬＲ１とＬＲ２はアルギニン残基とグリシン残基に富んでおり、Ａ／Ｔに富むＤＮＡに結合するＡＴ−フックモチーフに類似している（ＡｒａｖｉｎｄおよびＬａｎｄｓｍａｎ、１９９８）、（Ｓｅａｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＥＢＮＡ−１のＬＲ１とＬＲ２のインビトロ解析から、それらがＡ／Ｔに富むＤＮＡに結合可能なことが示された（Ｓｅａｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。そのようなＡＴ−フックを１つ含むＬＲ１を、ＥＢＮＡ−１のＤＮＡ結合ドメインおよび二量体化ドメインに融合させると、野生型ＥＢＮＡ−１（ｉｂｉｄ）の効率より低くはあるが、ｏｒｉＰプラスミドのＤＮＡ複製に十分となることが分かった。
【００８２】
しかしながら、ＬＲ１とＬＲ２の機能は異なる。ＬＲ１のＣ末端側の半分は、Ｎ末端側半分にあるＡｒｇ−Ｇｌｙの反復以外のアミノ酸で構成されており、ユニーク領域１（ＵＲ１）と命名されている。ＵＲ１は、ＥＢＮＡ−１が、導入され、組み込まれたＦＲを含むレポーターＤＮＡから、効率的に転写を活性化させるのに必須である（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｋｅｎｎｅｄｙ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ、２００３；Ａｌｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。また、ＵＲ１は、ＥＢＶを感染させたＢ細胞の効率的な形質転換に必須である。ウイルス全体に関して、このドメインを欠損しているＥＢＮＡ−１の派生物で野生型タンパク質を置き換えると、これら派生ウイルスの形質転換能は、野生型ウイルスの０．１％となる（Ａｌｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。
【００８３】
ＬＲ２は、ＥＢＮＡ−１がｏｒｉＰの複製を支持するのには必要ではない（Ｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｍａｃｋｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ、１９９９；Ｓｅａｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。加えて、ＥＢＮＡ−１のＮ末端側の半分はＡＴ−フックモチーフを含む細胞タンパク質、例えばＨＭＧＡｌａで置き換えることができ、それでもなお、複製機能は維持される（Ｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ、２００１；Ｓｅａｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ａｌｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。これらの発見は、ＬＲ１とＬＲ２のＡＴ−フック活性が、ヒト細胞でのｏｒｉＰの維持に必要である可能性があることを示している。
【００８４】
第三のＥＢＮＡ−１の残基（ＡＡ９１−３２８）は、プロテアソーム分解と提示によって宿主の免疫応答を回避するＥＢＮＡ−１の能力に関与している、グリシンーグリシンーアラニン（ＧＧＡ）の反復から構成されている（Ｌｅｖｉｔｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｌｅｖｉｔｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。これらの反復が、インビトロおよびインビボでＥＢＮＡ−１の翻訳を阻害することも分かっている（Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。しかしながら、  細胞培養中ではこのドメインの大部分を欠損させてもＥＢＮＡ−１の機能に明かな効果がないことから、このドメインの機能を明かにすることは難しくなっている。
【００８５】
核局在シグナル（ＮＬＳ）は、細胞の核輸送機構にも関係のある、ＡＡ３７９−３８６によってコードされている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７；Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。ＬＲ１およびＬＲ２のＡｒｇ−Ｇｌｙに富む領域中の配列も、それらが高度に塩基性であることから、ＮＬＳとして機能し得る。
【００８６】
最後に、Ｃ−末端（ＡＡ４５８−６０７）は、ＥＢＮＡ−１の重複しているＤＮＡ結合ドメインおよび二量体化ドメインをコードしている。ＤＮＡに結合しているこれらドメインの構造がＸ線を用いた結晶学によって明らかになっており、パピローマウイルスのＥ２タンパク質のＤＮＡ結合ドメインと類似していることが分かった（Ｈｅｇｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｂｏｃｈｋａｒｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【００８７】
本発明の特異的態様では、リプログラミングベクターは、ｏｒｉＰと、プラスミドの複製および細胞分裂している間でのその正確な維持を支持する、ＥＢＮＡ−１の相補型をコードしている短い配列との両方を含む。野生型ＥＢＮＡ−１のアミノ末端の３分の１に含まれる非常に反復性の高い配列と、様々な細胞において毒性が示されている２５アミノ酸領域の除去は、ｏｒｉＰと関連があるＥＢＮＡ−１のトランス活性化機能には必須ではない（Ｙａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５；Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。そのため、一態様では、このエピソームベクターを利用したシステムにおいて、デルタＵＲ１としても知られる短くなった型のＥＢＮＡ−１を、ｏｒｉＰに並べて使用してもよい。
【００８８】
特定の側面では、本発明で使用することができるＥＢＮＡ−１の派生物は、修飾されたアミノ酸配列を有する、対応する野生型ポリペプチドに関連のあるポリペプチドである。修飾には、ＥＢＮＡ−１のＬＲ１（残基約４０〜約８９）のユニーク領域（約６５〜約８９番目の残基）に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、挿入または置換が含まれ、また、得られる派生物が望ましい特性、例えば、二量体化し、ｏｒｉＰに対応するｏｒｉに結合する、核に局在する、毒性でない、および染色体外からの転写を活性化するが、組み込まれた鋳型からの転写は実質的に活性化しない、などの特性を有する限り、ＥＢＮＡ−１の他の残基に対応する領域中の１つまたは複数のアミノ酸残基、例えば、約１番目の残基〜約４０番目の残基、約９０番目〜約３２８番目の残基（「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ」反復領域）、約３２９番目〜約３７７番目の残基（ＬＲ２）、約３７９番目〜約３８６番目の残基（ＮＬＳ）、約４５１番目〜約６０８番目の残基（ＤＮＡ結合および二量体化）、または約６０９番目〜約６４１番目の残基の欠失、挿入および／または置換が含まれ得る。
Ｄ．残基とは無関係の特徴
【００８９】
さらに重要なことに、ｏｒｉＰを利用したエピソームベクターの複製と維持は不完全で、かつ、細胞に導入されてから最初の２週間の間には、細胞から、急速に（細胞分裂１回当たり２５％）失われる。しかしながら、プラスミドを保持している細胞の消失率はもっと低い（細胞分裂１回当たり３％）（Ｌｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ、２００１；Ｎａｎｂｏ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ、２００７）。プラスミドを内部に保有している細胞の選択を行わなければ、プラスミドは、それらが以前存在したことの足跡を、生じる娘細胞の中に残すことなく、時間経過とともにそれら全てが消失するまで、各細胞分裂の経過中に失われる。本発明の特定の側面は、ｏｒｉＰを利用したシステムのこの足跡を残さない特性を、遺伝子を送達してｉＰＳ細胞を生成するために現在使用されている、ウイルスを介した方法の代わりとして活用する。他の染色体外のベクターも、複製と宿主細胞の成長の間に消失する可能性があり、本発明において使用することもできるだろう。
Ｅ．リプログラミング因子
【００９０】
ｉＰＳ細胞の生成は、導入に使用された遺伝子に対して重要である。本発明で開示するベクターシステムでは、以下に挙げる因子またはその組み合わせが使用され得る。特定の側面では、ＳｏｘおよびＯｃｔ（好ましくはＯｃｔ３／４）をコードしている核酸がリプログラミングベクターに含まれる。例えば、リプログラミングベクターは、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇおよび必要に応じてＬｉｎ−２８をコードしている発現カセット、またはＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４および必要に応じてＣ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃまたはＧｌｉｓ−１をコードしている発現カセットを含み得る。これらのリプログラミング因子をコードしている核酸は、同じ発現カセットに含まれていても、別々の発現カセットに含まれていてもよく、同じリプログラミングベクターに含まれていても、または別々のリプログラミングベクターに含まれていてもよい。
【００９１】
Ｏｃｔ−３／４と、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの特定のメンバー（Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、およびＳｏｘ１５）が、導入過程に重要な転写制御因子であり、これらがないと導入が不可能であることが分かっている。しかしながら、Ｋｌｆファミリーの特定のメンバー（Ｋｌｆｌ、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、およびＫ１ｆ５）、Ｍｙｃファミリー（Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ、およびＮ−ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、ならびにＬ１Ｎ２８を含むさらなる遺伝子が、導入効率を高めることが分かっている。
【００９２】
Ｏｃｔ−３／４（ＰｏｕＳｆｌ）は、オクタマー（「Ｏｃｔ」）転写因子のファミリーのうちの１つであり、多能性の維持に重要な役割を果たしている。割球や胚性幹細胞などのＯｃｔ−３／４＋細胞でＯｃｔ−３／４が欠損すると栄養膜への自発的な分化が生じるため、Ｏｃｔ−３／４の存在が、多能性および胚性幹細胞の分化能を与えている。Ｏｃｔ−３／４の近縁であるＯｃｔｌおよびＯｃｔ６を含む、「Ｏｃｔ」ファミリーの多くの他の遺伝子は、導入を促進しない。
【００９３】
Ｓｏｘファミリー遺伝子は、Ｏｃｔ−３／４と同様に、多能性の維持に関係しているが、主に多能性幹細胞で発現しているＯｃｔ−３／４とは対照的に、多分化能をもつ幹細胞や単分化能をもつ幹細胞とも関係がある。Ｓｏｘ２は、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）、Ｗｅｒｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）、およびＹｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）によって導入に使用された最初の遺伝子であるが、導入の過程では、Ｓｏｘファミリーの他の遺伝子も同様に機能することが分かった。Ｓｏｘ１とＳｏｘ２は同程度の効率でｉＰＳ細胞を生じる。Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、およびＳｏｘ１８遺伝子もｉＰＳ細胞を生成するが、その効率は低い。
【００９４】
Ｎａｎｏｇは、未分化の胚性幹細胞の自己再生に関与する、重要な転写因子である。ヒトでは、このタンパク質は、ＮＡＮＯＧ遺伝子によってコードされている。Ｎａｎｏｇは胚性幹細胞（ＥＳＣ）で発現する遺伝子であり、多能性の維持に重要な因子であると考えられている。ＮＡＮＯＧは、Ｏｃｔ４（ＰＯＵ５Ｆ１）およびＳｏｘ２などの他の因子と協調して、ＥＳＣの独自性の確立に機能していると考えられる。
【００９５】
ＬＩＮ２８は、分化と増殖に関連のある胚性幹細胞と胚性癌細胞で発現する、ｍＲＮＡ結合タンパク質である。Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）によって、この因子がｉＰＳの生成に関与するが、必須ではないことが示された。
【００９６】
Ｋｌｆファミリー遺伝子のＫｌｆ４は、最初、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）によって同定され、その後、Ｗｅｒｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）によって、マウスｉＰＳ細胞の生成に関する因子であることが確認され、ヒトｉＰＳ細胞の生成にも関与する因子であることがＴａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）によって示された。しかしながら、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）は、ヒトｉＰＳ細胞の生成には、Ｋ１ｆ４は必須ではないことを報告した。Ｋｌｆ２およびＫｌｆ４がｉＰＳ細胞を生じることができる因子であること、および関連遺伝子であるＫｌｆ１およびＫ１ｆ５も同様に機能するが、その効率は低いことが分かった。
【００９７】
Ｍｙｃファミリーの遺伝子は、癌に関係のある癌原遺伝子である。Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）およびＷｅｒｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）によって、Ｃ−ｍｙｃがマウスｉＰＳ細胞の生成に関係のある因子であることが示され、また、Ｙａｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．によって、Ｃ−ｍｙｃがヒトｉＰＳ細胞の生成にも関係のある因子であることが示された。しかしながら、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）およびＴａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）は、ｃ−ｍｙｃはヒトｉＰＳ細胞の生成には必須ではないと報告した。ｃ−ｍｙｃで誘導したｉＰＳ細胞を移植したマウスの２５％で致死的な奇形腫が発生したことから、「ｍｙｃ」ファミリーの遺伝子をｉＰＳ細胞の誘導に使用することは、最終的に、そのｉＰＳ細胞を臨床治療に使用する場合には問題がある。Ｃ−ｍｙｃの替りに、Ｎ−ｍｙｃおよびＬ−ｍｙｃも同程度の効率で多能性を誘導することが分かっている。特定の側面では、Ｍｙｃ変異体、変異株、ホモログ、または誘導体、例えば細胞の形質転換効率の低い突然変異体を使用してもよい。例としては、ＬＭＹＣ（ＮＭ＿９０１０３３０８１）、Ｎ−末端の４１アミノ酸が欠失したＭＹＣ（ｄＮ２ＭＹＣ）、または１３６番目のアミノ酸が変異したＭＹＣ（例えば、Ｗ１３６Ｅ）が挙げられる。
ＶＩ．細胞間シグナル伝達阻害剤
【００９８】
本発明の特定の側面では、少なくともリプログラミング過程の一部では、細胞を、シグナル伝達カスケードに関連のあるシグナルトランスデューサーを阻害する、１つまたは複数のシグナル伝達阻害剤の存在下に、例えば、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、ＭＥＫ阻害剤とＧＳＫ３阻害剤の両方、ＧＳＫ３阻害剤とＴＧＦ−β受容体阻害剤の両方、ＭＥＫ阻害剤とＴＧＦ−β受容体阻害剤の両方、これら３つの阻害剤の組み合わせ、またはこの同じ経路に含まれる他のシグナルトランスデューサーの阻害剤の存在下に維持してもよい。特定の側面では、ＲＯＣＫ阻害剤、例えばＨＡ−１００およびＨ−１１５２、またはミオシンＩＩ阻害剤、例えばブレビスタチンを、リプログラムされた細胞のクローナルな増殖を促進し、ｉＰＳ細胞を得るために、使用してもよい。高濃度のＦＧＦを、特定のリプログラミング培地と組み合わせて、例えば馴化ヒトＥＳ細胞用培地または化学的に規定されている培地、例えば血清を含まない限定Ｎ２Ｂ２７培地、ＴｅＳＲ培地、もしくは必須８培地と組み合わせて使用して、リプログラミング効率を高めてもよい。
【００９９】
特定の態様では、染色体外の遺伝要素によって、１つまたは複数の（例えば、本明細書に記載したように２つ、３つまたはそれ以上の）リプログラミング因子を細胞に導入することに加えて、細胞を、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、および必要に応じてＬＩＦを含むリプログラミング培地で処理する。このような培地は、リプログラミング効率やリプログラミングの動力学を高め、初代リプログラミング培養におけるｉＰＳ細胞の同定を促し、その結果、ｉＰＳ細胞の同一性を保つという利点を有する。
【０１００】
当然のことながら、これらの側面および態様では、ＭＥＫ阻害剤が望ましい場合には、同じシグナル伝達経路（例えばＥＲＫ１またはＥＲＫ２カスケード）のシグナル伝達成分を阻害する他のシグナル伝達阻害剤を置き換えてもよい。このことには、ＭＡＰＫ経路の上流での刺激の阻害、具体的にはＦＧＦ受容体を介した阻害（Ｙｉｎｇ、  ２００８）が含まれ得る。同様に、ＧＳＫ３関連シグナル伝達経路、例えばインスリンの合成およびＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の他の阻害剤が望ましい場合にはＧＳＫ３阻害剤を置き換えてもよく；Ｓｔａｔ３またはｇｐ１３０シグナル伝達の他の活性化因子が望ましい場合にはＬＩＦを置き換えてもよい。
【０１０１】
そのようなシグナル伝達阻害剤、例えば、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤は、少なくともまたは約０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、５００〜約１０００μＭ、またはここから導き出される任意の範囲である有効な濃度で使用することができる。
【０１０２】
阻害剤は、標準的な手段または標準的な供給源から、当業者によって提供されても、あるいは得られてもよい（国際公開第２００７１１３５０５号パンフレットもまた参照のこと）。
Ａ．グリコーゲン合成酵素キナーゼ３阻害剤
【０１０３】
グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ−３）は、特定のセリンおよびトレオニンアミノ酸、具体的には細胞基質へのリン酸分子の付加を仲介するセリン／トレオニンタンパク質キナーゼである。ＧＳＫ−３によるこれらタンパク質のリン酸化は、通常、標的タンパク質（「基質」とも呼ばれる）を阻害する。ＧＳＫ−３は、上述したようなリン酸化と、その結果起こるグリコーゲン合成の不活性化に関して知られている。ＧＳＫ−３は、損傷を受けたＤＮＡに対する細胞反応の制御やＷｎｔシグナル伝達にも関与している。また、ＧＳＫ−３は、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｈｈ）経路中のＣｉをリン酸化し、その結果、Ｃｉをタンパク質分解へと誘導して不活性化形態にする。グリコーゲン合成に加えて、ＧＳＫ−３は他にも多くの基質をもつ。しかしながら、ＧＳＫ−３は、通常、基質を前もってリン酸化する「プライミングキナーゼ」を必要とする点で、他のキナーゼとは異なる。
【０１０４】
ＧＳＫ−３によるリン酸化の結果は、通常、基質の阻害である。例えば、ＧＳＫ−３が基質のもう一方の基質であるＮＦＡＴファミリーの転写因子をリン酸化すると、これらの転写因子は核移行することができず、その結果、阻害される。Ｗｎｔシグナル伝達経路における重要な役割に加えて、ＧＳＫ−３は、発達途中の組織パターンの確立にも必要である。また、ＧＳＫ−３は骨格筋肥大などの状況で誘導されるタンパク質の合成にも重要である。ＮＦＡＴキナーゼとしての役割から、ＧＳＫ−３は分化および細胞増殖両方の重要な制御因子でもある。
【０１０５】
ＧＳＫ３阻害とは、１つまたは複数のＧＳＫ３酵素を阻害することを指す可能性がある。ＧＳＫ３酵素のファミリーは良く知られており、かつ、多数の変異体についての記載がある（を参照のこと例えばＳｃｈａｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。特定の態様では、ＧＳＫ３−βが阻害される。ＧＳＫ３−α阻害剤もまた適しており、本発明特定の側面で使用される阻害剤は、ＧＳＫ３−αとＧＳＫ３−βの両方を阻害する。
【０１０６】
ＧＳＫ３の阻害剤としては、ＧＳＫ３に結合する抗体、ＧＳＫ３の優性阻害変異体、ならびにＧＳＫ３を標的とするｓｉＲＮＡおよびアンチセンス核酸が挙げられ得る。ＧＳＫ３阻害剤の例は、Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）およびＲｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）に記載されている。
【０１０７】
ＧＳＫ３阻害剤の具体例としては、ケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、１−アザケンパウロン、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＲ−Ａ０１４４１８（例えば、Ｇｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４を参照のこと）、ＣＴ９９０２１（例えば、Ｗａｇｍａｎ、２００４を参照のこと）、ＣＴ２００２６（Ｗａｇｍａｎ、上記を参照のこと）、ＳＢ４１５２８６、ＳＢ２１６７６３（例えば、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５を参照のこと）、ＡＲ−Ａ０１４４１８（例えば、Ｎｏｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５を参照のこと）、リチウム（例えば、Ｇｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３を参照のこと）、ＳＢ４１５２８６（例えば、Ｆｒａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１を参照のこと）およびＴＤＺＤ−８（例えば、Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５を参照のこと）が挙げられるがこれらには限定されない。Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手可能なさらなるＧＳＫ３阻害剤の例としては（参照により本明細書に組み込まれる、例えば、Ｄａｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第２００８／０９４５９７号パンフレットを参照のこと）、ＢＩＯ（２’Ｚ、３’Ｅ）−６−ブロモジルビン−３’−オキシム（ＧＳＫ３阻害剤ＩＸ）；ＢＩＯ−アセトキシム（２’Ｚ、３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム（ＧＳＫ３阻害剤Ｘ）；（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−（２−フェニルキナゾリン−４−イル）アミン（ＧＳＫ３−阻害剤ＸＩＩＩ）；ピリドカルバゾール−シクロペナジエニルルテニウム錯体（ＧＳＫ３阻害剤ＸＶ）；ＴＤＺＤ−８  ４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン（ＧＳＫ３ベータ阻害剤Ｉ）；２−チオ（３−ヨードベンジル）−５−（１−ピリジル）−［１，３，４］−オキサジアゾール（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＩＩ）；ＯＴＤＺＴ  ２，４−ジベンジル−５−オキソチアジアゾリジン−３−チオン（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＩＩＩ）；アルファ−４−ジブロモアセトフェノン（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＶＩＩ）；ＡＲ−ＡＯ１４４１８Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）尿素（ＧＳＫ−３ベータ阻害剤ＶＩＩＩ）；３−（１−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−ピラジン−２−イル−ピロール−２，５−ジオン（ＧＳＫ−３ベータ阻害剤ＸＩ）；ＴＷＳ１  １９ピロールピリミジン化合物（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＸＩＩ）；Ｌ８０３Ｈ−ＫＥＡＰＰ  ＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ２またはそのミリストイル化型（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＸＩＩＩ）；２−クロロ−１−（４，５−ジブロモ−チオフェン−２−イル）−エタノン（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＶＩ）；ＡＲ−ＡＯ１４４−１８；ＳＢ２１６７６３；およびＳＢ４１５２８６が挙げられるがこれらには限定されない。
【０１０８】
ＧＳＫ３阻害剤は、例えば、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を活性化することができる。β−カテニンの下流遺伝子の多くは一緒になって、多能性遺伝子のネットワークを制御する。例えば、ＧＳＫ阻害剤はｃＭｙｃの発現を活性化し、そのタンパク質の安定性と転写活性を高める。従って、いくつかの態様では、細胞内の内生Ｍｙｃポリペプチドの発現を刺激し、それによって多能性を誘導するのに必要とされるＭｙｃの発現を排除するために、ＧＳＫ３阻害剤を使用することができる。
【０１０９】
加えて、ＧＳＫ３−βの活性部位の構造が解析され、特異的な阻害剤および非特異的な阻害剤と相互作用する重要な残基が同定されている（Ｂｅｒｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。この構造解析から、さらなるＧＳＫ阻害剤を容易に同定することが可能になっている。
【０１１０】
本明細書で使用される阻害剤は、好ましくは、標的となるキナーゼに特異的なものである。特定の態様の阻害剤は、ＧＳＫ３−βおよびＧＳＫ３−αに特異的なものであり、実質的にはｅｒｋ２を阻害せず、かつ、実質的にｃｄｃ２を阻害しない。好ましくは、阻害剤は、ＩＣ５０値の比として測定した場合に、マウスｅｒｋ２および／またはヒトｃｄｃ２よりもヒトＧＳＫ３に対して、少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも２００倍、さらに好ましくは少なくとも４００倍高い選択性を有する。ここで、ＧＳＫ３の基準となるＩＣ５０値は、ヒトＧＳＫ３−βおよびＧＳＫ３−αの平均値を指す。ＧＳＫ３に特異的なＣＨＩＲ９９０２１を使用した場合に、良い結果が得られた。使用に適したＣＨＩＲ９９０２１の濃度は、０．０１〜１００、好ましくは０．１〜２０、より好ましくは０．３〜１０マイクロモルの範囲である。
Ｂ．ＭＥＫ阻害剤
【０１１１】
本発明の特定の側面では、マイトゲン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼまたはＭＥＫ）またはその関連するシグナル伝達経路、例えばＭＡＰＫカスケードの阻害剤を含むＭＥＫ阻害剤を使用してもよい。マイトゲン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ（ｓｉｃ）は、マイトゲン活性化タンパク質キナーゼをリン酸化するキナーゼである。これはＭＡＰ２Ｋとしても知られている。細胞外刺激は、ＭＡＰキナーゼ、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ、ＭＫＫ、ＭＥＫＫ、またはＭＡＰ２Ｋ）、およびＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＫＫＫまたはＭＡＰ３Ｋ）から構成されるシグナル伝達カスケード（「ＭＡＰＫカスケード」）を介して、ＭＡＰキナーゼの活性化を誘導する。
【０１１２】
本明細書では、ＭＥＫ阻害剤とは、一般的なＭＥＫ阻害剤を指す。従って、ＭＥＫ阻害剤は、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２およびＭＥＫ５を含むＭＥＫファミリータンパク質のメンバーのいかなる阻害剤をも指す。ＭＥＫ１、ＭＥＫ２およびＭＥＫ5阻害剤についても説明する。当該分野において既知の好適なＭＥＫ阻害剤の例としては、ＭＥＫ１阻害剤であるＰＤ１８４３５２およびＰＤ９８０５９、ＭＥＫ１とＭＥＫ２の阻害剤であるＵ０１２６およびＳＬ３２７、ならびにＤａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）で議論されている阻害剤が挙げられる。
【０１１３】
具体的には、ＰＤ１８４３５２およびＰＤ０３２５９０１が、他の既知のＭＥＫ阻害剤と比較して、高い特異性および効力をもつことが分かっている（Ｂａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。他のＭＥＫ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤のクラスに関しては、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）に記載されている。
【０１１４】
ＭＥＫの阻害剤としては、ＭＥＫに対する抗体、ＭＥＫの優性阻害変異体、ならびにＭＥＫの発現を抑制するｓｉＲＮＡおよびアンチセンス核酸が含まれ得る。ＭＥＫ阻害剤の具体例としては、ＰＤ０３２５９０１（例えば、Ｒｉｎｅｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４を参照のこと）、ＰＤ９８０５９（例えば、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能）、Ｕ０１２６（例えば、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能）、ＳＬ３２７（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）、ＡＲＲＹ−１６２（例えば、アレイＢｉｏｐｈａｒｍａから入手可能）、ＰＤ１８４１６１（例えば、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６を参照のこと）、ＰＤ１８４３５２（ＣＩ−１０４０）（例えば、Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６を参照のこと）、スニチニブ（例えば、参照することによって本明細書に組み込まれるＶｏｓｓ、  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ２００８００４２８７を参照のこと）、ソラフェニブ（Ｖｏｓｓ上記を参照のこと）、バンデタニブ（Ｖｏｓｓ上記を参照のこと）、バゾバニブ（例えば、Ｖｏｓｓ上記を参照のこと）、アキシチニブ（Ｖｏｓｓ上記を参照のこと）およびＰＴＫ７８７（Ｖｏｓｓ上記を参照のこと）が挙げられるがこれらには限定されない。
【０１１５】
現在の、複数のＭＥＫ阻害剤に関する臨床評価が行われている。ＣＩ−１０４０は、癌の第Ｉ相試験および第ＩＩ相試験で評価された（例えば、Ｒｉｎｅｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４を参照のこと）。臨床試験での評価が行われている他のＭＥＫ阻害剤には、ＰＤ１８４３５２（を参照のこと例えば、Ｅｎｇｌｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、ＢＡＹ４３−９００６（を参照のこと例えば、Ｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、ＰＤ−３２５９０１（ＰＤ０３２５９０１とも）、ＧＳＫ１１２０２１２、ＡＲＲＹ−４３８１６２、ＲＤＥＡＩ１９、ＡＺＤ６２４４（ＡＲＲＹ−１４２８８６またはＡＲＲＹ−８８６とも）、R０５１２６７６６、ＸＬ５１８およびＡＺＤ８３３０（ＡＲＲＹ−７０４とも）がある。
【０１１６】
ＭＥＫは、ＲＮＡ介在性の干渉（ＲＮＡｉ）を使用することでも阻害することができる。通常、ＭＥＫ遺伝子の全体または一部分に相補的な二本鎖ＲＮＡを多能性細胞に導入し、ＭＥＫをコードしているｍＲＮＡ分子の特異的な分解を促進する。この転写後機構によって、標的ＭＥＫ遺伝子の発現が抑制されるかまたは完全に消失する。ＲＮＡｉを用いてＭＥＫを阻害するための好適な技術およびプロトコールは知られている。
【０１１７】
ＧＳＫ３阻害剤やＭＥＫ阻害剤を含むキナーゼ阻害剤を同定するためのいくつかのアッセイが知られている。例えば、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）には、ペプチド基質と放射性標識したＡＴＰ存在下でキナーゼをインキュベートするキナーゼアッセイが記載されている。キナーゼによって基質がリン酸化される結果、基質に標識が取り込まれる。各反応の分割量をホスホセルロース紙上に固定化し、リン酸中で洗浄して遊離ＡＴＰを除去する。その後、インキュベートした後の基質の活性を測定し、キナーゼ活性の目安を提供する。そのようなアッセイを使用することで、候補キナーゼ阻害剤の存在下および非存在下での総体的なキナーゼ活性を容易に決定することができる。Ｄｏｗｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）にも、キナーゼ阻害剤を同定するためのキナーゼ活性に関するアッセイが記載されている。
Ｃ．ＴＧＦ−β受容体阻害剤
【０１１８】
ＴＧＦ−β受容体阻害剤には、いずれものＴＧＦのシグナル伝達を全体的に阻害する阻害剤、またはＴＧＦ−β受容体（例えば、ＡＬＫ５）阻害剤に特異的な阻害剤が含まれてもよく、これらには、ＴＧＦβ受容体（例えば、ＡＬＫ５）に対する抗体、ＴＧＦβ受容体の優性阻害変異体、およびＴＧＦβ受容体の発現を抑制するｓｉＲＮＡおよびアンチセンス核酸が含まれる可能性がある。ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤の例としては、ＳＢ４３１５４２（例えば、Ｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２を参照のこと）、Ａ−８３−０１（３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミドとしても知られている）（例えば、Ｔｏｊｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５を参照のこと、また、例えば、ＴｏｉｃｒｉｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能である）；２−（３−（６−メチルピリジン−２−ｙ１）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１、５−ナフチリジン、Ｗｎｔ３ａ／ＢＩＯ（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｄａｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗ０２００８／０９４５９７、を参照のこと）、ＢＭＰ４（Ｄａｌｔｏｎ、上記を参照のこと）、ＧＷ７８８３８８（−（４−［３−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］ピリジン−２−イル｝−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）ベンズアミド）（例えば、Ｇｅｌｌｉｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６を参照のこと）、ＳＭ１６（例えば、Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７を参照のこと）、ＩＮ−１１３０（３−（（５−（６−メチルピリジン−２−イル）−４−（キノキサリン−６−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）ベンズアミド）（例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００８を参照のこと）、ＧＷ６６０４（２−フェニル−４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン）（例えば、ｄｅＧｏｕｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６を参照のこと）、ＳＢ−５０５１２４（２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩）（例えば、ＤａＣｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４を参照のこと）およびピリミジン誘導体（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳｔｉｅｆｌ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第２００８／００６５８３号パンフレットに記載されている誘導体を参照のこと）が挙げられるがこれらには限定されない。
【０１１９】
さらに、「ＡＬＫ５阻害剤」は非特異的キナーゼ阻害剤を包含することを意図しないが、「ＡＬＫ５阻害剤」がＡＬＫ５に加えてＡＬＫ４および／またはＡＬＫ７を阻害する阻害剤、例えば、ＳＢ−４３１５４２を包含すると理解すべきである（例えば、Ｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２を参照のこと）。本発明の範囲を制限することを意図しないが、ＡＬＫ５阻害剤は、間葉から上皮への転換／移行（ＭＥＴ）過程に影響を及ぼすと考えられている。ＴＧＦβ／アクチビン経路は、上皮から間葉への移行（ＥＭＴ）を誘導するものである。本願発明者らは、ＴＧＦβ／アクチビン経路を阻害することで、ＭＥＴ（つまり、リプログラミング）過程を促進することができるということを想定している。
【０１２０】
ＴＧＦβ／アクチビン経路を阻害することも、同様な効果を有すると考えられている。従って、ＴＧＦβ／アクチビン経路の任意の阻害剤（例えば、上流または下流の阻害剤）を、本明細書に記載したように、ＴＧＦ−β／ＡＬＫ５阻害剤と併せて、あるいはＴＧＦ−β／ＡＬＫ５阻害剤の変わりに使用することができる。ＴＧＦβ／アクチビン経路阻害剤の例としては、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＳＭＡＤ２／３リン酸化の阻害剤、ＳＭＡＤ２／３とＳＭＡＤ４の相互作用の阻害剤、ならびにＳＭＡＤ６およびＳＭＡＤ７の活性化因子／アゴニストが挙げられるがこれらには限定されない。さらに、本明細書に記載した分類は、単にまとめるための目的のものであり、当業者であれば、化合物が、経路中の複数の点で効果を発揮し、そのため、定義した分類の２つ以上の機能を有する場合もあることを理解するだろう。
【０１２１】
ＴＧＦβ受容体阻害剤には、ＴＧＦβ受容体に対する抗体、ＴＧＦβ受容体の優性阻害変異体、およびＴＧＦβ受容体を標的とするｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸が含まれ得る。阻害剤の具体例としては、ＳＵ５４１６；２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩（ＳＢ−５０５１２４）；ラルデリムマブ（ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍｂ）（ＣＡＴ−１５２）；メテリムマブ（ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ）（ＣＡＴ−１９２）；ＧＣ−１００８；ＩＤ１１；ＡＰ−１２００９；ＡＰ−１１０１４；ＬＹ５５０４１０；ＬＹ５８０２７６；ＬＹ３６４９４７；ＬＹ２１０９７６１；ＳＢ−５０５１２４；ＳＢ−４３１５４２；ＳＤ−２０８；ＳＭ１６；ＮＰＣ−３０３４５；Ｋｉ２６８９４；ＳＢ−２０３５８０；ＳＤ−０９３；グリベック；３、５、７、２’、４’−ペンタヒドロキシフラボン（ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙｆｉａｖｏｎｅ）（Ｍｏｒｉｎ）；アクチビン−Ｍ１０８Ａ；Ｐ１４４；可溶性ＴＢＲ２−Ｆｃ；および、ＴＧＦβを標的とするアンチセンスを導入した腫瘍細胞（例えば、Ｗｒｚｅｓｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｋａｍｉｎｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；およびＣｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７を参照のこと）が挙げられるがこれらには限定されない。
Ｄ．ＲＯＣＫ阻害剤およびミオシンＩＩ  ＡＴＰアーゼ阻害剤
【０１２２】
多能性幹細胞、特にヒトＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞は、細胞が脱離および分離するとアポトーシスを起こしやすく、このことは、クローンの単離または増殖、および分化の誘導に重要である。最近になって、ある少数の分子、例えばＲｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤が、クローン効率および分離した多能性幹細胞の生存を高めることが分かった。Ｒｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤は、ＲＯＣＫに関連するシグナル伝達経路の阻害剤、例えば、Ｒｈｏ特異的阻害剤、ＲＯＣＫ特異的阻害剤またはミオシンＩＩ−特異的阻害剤である。本発明の特定の側面では、多能性幹細胞の培養および継代および／または幹細胞の分化にＲＯＣＫ阻害剤を使用してもよい。そのため、ＲＯＣＫ阻害剤は、多能性幹細胞を育てる、分離する、凝集を形成する、または分化する培地、例えば接着培養または懸濁培養用の培地のいずれにも含まれていてもよい。特にことわりがない限り、本明細書においては、ミオシンＩＩ阻害剤、例えばブレビスタチンを、実験用に使用するＲＯＣＫ阻害剤の変わりに使用することができる。
【０１２３】
ＲＯＣＫシグナル伝達経路には、ＲｈｏファミリーＧＴＰアーゼ；ＲＯＣＫ、Ｒｈｏの下流の主要なエフェクターキナーゼ；ミオシンＩＩ、ＲＯＣＫの下流の優勢なエフェクター（Ｈａｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）；および中間、上流、または下流のシグナル処理因子のいずれもが含まれ得る。ＲＯＣＫは、ミオシンホスファターゼ標的サブユニット１（ＭＹＰＴ１）をリン酸化および不活性化させ得る。ミオシンホスファターゼ標的サブユニット１は、ミオシン制御軽鎖（ＭＲＬＣ）の脱リン酸化を介してミオシンの機能を負に制御するＲＯＣＫの下流にある主要な標的の１つである。
【０１２４】
ＲＯＣＫは、Ｒｈｏ（ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢおよびＲｈｏＣの３種類のイソ型が存在する）の標的タンパク質となるセリン／トレオニンキナーゼである。これらのキナーゼは最初、ＲｈｏＡ遊走性の張力線維および接着斑の形成の仲介因子として特徴付けられた。ＲＯＣＫの２種類のイソ型、つまりＲＯＣＫ１（ｐ１６０ＲＯＣＫ、ＲＯＫＩ３とも呼ばれている）およびＲＯＣＫ２（ＲＯＫα）は、Ｎ末端キナーゼドメインと、それに続く、Ｒｈｏ結合ドメインとプレクストリン相同性ドメイン（ＰＨ）を含むコイルドコイルドメインから構成されている。このＲＯＣＫは両方とも、細胞骨格系の制御因子であり、張力線維の形成、平滑筋の収縮、細胞接着、膜ラフリングおよび細胞運動に及ぼすＲｈｏＡの効果を仲介する。ＲＯＣＫは、下流の分子、例えばミオシンＩＩ、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）、ＭＬＣホスファターゼ（ＭＬＣＰ）およびホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）を標的とすることで、その生物活性を発揮し得る。
【０１２５】
ＲＯＣＫ阻害剤の非限定的な例としては、ＨＡ−１００、Ｙ−２７６３２、Ｈ−１１５２、ファスジル（ＨＡ１０７７とも呼ばれている）、Ｙ−３０１４１（米国特許第５、４７８、８３８号に記載されている）、Ｗｆ−５３６、ＨＡ−１０７７、ヒドロキシル−ＨＡ−１０７７、ＧＳＫ２６９９６２Ａ、ＳＢ−７７２０７７−Ｂ、およびその誘導体、ならびにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、競合ペプチド、アンタゴニストペプチド、阻害的抗体、抗体−ＳｃＦＶ断片、優性阻害変異体およびその発現ベクターが挙げられる。さらに、他の低分子化合物もＲＯＣＫ阻害剤であることが知られており、そのような化合物またはその誘導体も態様において使用することができる（例えば、参照により組み込まれる米国特許公開第２００５０２０９２６１号、同第２００５０１９２３０４号、同第２００４００１４７５５号、同第２００４０００２５０８号、同第２００４０００２５０７号、同第２００３０１２５３４４号および同第２００３００８７９１９号、および国際特許公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号および同第２００４／０３９７９６号を参照のこと）。本発明の特定の側面では、１つまたは２つまつ以上のＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせも使用することができる。
【０１２６】
Ｒｈｏ特異的阻害剤、例えばボツリヌス菌Ｃ３細胞外酵素、および／またはミオシンＩＩ特異的阻害剤もまた、本発明の特定の側面では、ＲＯＣＫ阻害剤として使用してもよい。
ＶＩＩ．リプログラムした細胞の培養
【０１２７】
出発細胞および最終的な、リプログラムされた細胞が培地に必要とするものや条件は通常、異なる。同様に、改変構築物の組み込みに関して、細胞を同時に選択する場合には、リプログラミング過程の特定の期間に、培地に選択薬剤を添加してもよい。このことを、細胞のリプログラミングを行いながらも可能にするためには、リプログラミング因子の導入後、培養の少なくとも初期の時期に、培地の存在下で、かつ、出発細胞の成長に適していることが知られている条件で、これは通常行われる。しかしながら、この早い時期には、耐性マーカーを含む細胞だけがこの初期成長段階で増殖するように、選択薬剤を含めてもよい。
【０１２８】
この後、続く期間では、リプログラミング培地（選択薬剤を含まないまたは含む）存在下で、多能性細胞に適していることが分かっている条件で、すなわち血清を含むフィーダー上でまたは化学的に規定された培地を使ってまたはフィーダーを含まない条件で、培養を行う。好適なフィーダーとしては（使用する場合には）、初代のまたは不死化した線維芽細胞株、典型的には、不活性化されており、リプログラムする細胞の成長を超えて成長することのない細胞株が挙げられる。十分な期間のリプログラミングの後、リプログラムされた細胞を、ｉＰＳ細胞の選択を行う前または行った後に、増殖培地中でさらに培養してｉＰＳ細胞を増殖させてもよい。そのような増殖培地は、上述した１つまたは複数のシグナル伝達阻害剤を含んでいても、あるいは、これら阻害剤を本質的に含まない培地を含んでいてもよい。
【０１２９】
培養の初期の段階とは、好ましくは６日までの期間、より好ましくは４日まで、以下に記載する特定の態様では、３日以内、より具体的には、１日未満、またはおよそ１日である。１つまたは複数のシグナル伝達阻害剤を含むリプログラミング培地中での続く期間とは、好適には、少なくともまたは約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３日の期間またはそこから導き出される任意の範囲の期間であり、１２０までの期間、好ましくは１０日まで、またはｉＰＳ細胞および／または改変したｉＰＳ細胞が検出されるまでの期間である。リグロブラムされたヒト細胞を生成するために使用される、以下に記載する特定の態様では、培養の初期の段階を約１日とし、ＭＥＫ阻害剤、ａＴＧＦ−β受容体阻害剤、およびａＧＳＫ３阻害剤を含むリプログラミング培地の存在下で、リプログラミング条件で培養することで、続く段階を約９〜２８日間とした。リプログラミング条件は、フィーダー細胞を本質的に含まないものであってもよい。さらなる側面では、リプログラミング培地は化学的に規定されていてもよい。リプログラミングを向上させるために、リプログラミング培地は、高濃度のＦＧＦをさらに含んでいてもよく、本質的にＴＧＦβを含まないものであってもよい。
【０１３０】
ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、およびＧＳＫ３阻害剤の併用は、リプログラミング効率およびリプログラミング時間の短縮を含むリプログラミング過程を促進し得る。ＬＩＦはｇｐ１３０シグナル伝達の活性化因子の一例であり、別の例としてはＩＬ−６と可溶性ＩＬ−６受容体との組み合わせがあるが、リプログラムされる過程にそれが含まれることで、細胞の成長および生存を促進する。リプログラミングの間に、細胞をＬＩＦ存在下で培養してもよく、ＬＩＦの使用は、本発明の特定の側面では、リプログラムされる細胞を助け、細胞の生存率とクローン形成能を向上させ得る。
Ａ．一般的な幹細胞培養の条件
【０１３１】
本発明による培養条件は、使用する培地や幹細胞に応じて、適切に定義される。本発明の特定の側面による培地は、その基本培地として動物細胞の培養に使用される培地、例えばＴｅＳＲ、必須８培地、ＢＭＥ、ＢＧＪｂ、ＣＭＲＬ  １０６６、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ、ＩＭＤＭ、１９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ、ＲＰＭＩ１６４０、およびフィッシャー培地のうちのいずれか、ならびにその任意の組み合わせを使用して調製することができるが、培地は、動物細胞の培養に使用することが可能な限り、これらに特に限定されるものではない。
【０１３２】
本発明による培地は、血清を含むものであっても、または血清を含まないものであってもよい。血清を含まない培地とは、未処理のまたは未精製の血清を含まない培地を指し、従って、この培地は、精製した血液由来の成分または動物組織に由来する成分（成長因子など）を含む場合がある。異種の動物由来成分の混入を避けるという側面から、血清は、幹細胞を誘導したのと同じ動物に由来するものである場合がある。
【０１３３】
本発明による培地は、任意の血清代替物を含んでいても、または含んでいなくてもよい。血清代替物としては、アルブミンを適切に含む物質（例えば、脂質に富むアルブミン、組換えアルブミンなどのアルブミン代用品、植物デンプン、デキストランおよびタンパク質加水分解物）、トランスフェリン（または他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオグリセロール（ｔｈｉｏｌｇｉｙｃｅｒｏｌ）、またはそれらの均等物を挙げることができる。血清代替物は、例えば、国際公開第９８／３０６７９号パンフレットに開示されている方法によって調製することができる。あるいは、より簡便に、市販されている任意の物質を使用することができる。市販されている物質には、ノックアウト血清代用品（ＫＳＲ）、化学的に規定された脂質濃縮物（Ｇｉｂｃｏ）、およびＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）がある。
【０１３４】
本発明の培地は、脂肪酸または脂質、アミノ酸（例えば非必須アミノ酸）、ビタミン、成長因子、サイトカイン、酸化防止剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、および無機塩を含んでいる場合もある。２−メルカプトエタノールの濃度は、例えば、約０．０５〜１．０ｍＭ、特に約０．１〜０．５ｍＭであってよいが、濃度は、幹細胞の培養に適している限り、それらに特に限定されるものではない。
【０１３５】
幹細胞の培養に使用される培養容器としては、その中で幹細胞を培養することができる限り、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、シャーレ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバー、培養バッグ、およびローラーボトルを挙げることができるが、特にこれらに限定されるものではない。幹細胞は、培養のニーズに応じて、少なくともまたは約０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌ、４５０ｍｌ、５００ｍｌ、５５０ｍｌ、６００ｍｌ、８００ｍｌ、１０００ｍｌ、１５００ｍｌの用量、またはここから導き出される任意の範囲の容量中で、培養してもよい。特定の態様では、培養容器はバイオリアクターであってよく、バイオリアクターとは、生物学的に活性な環境を支持するいずれもの装置またはシステムを指し得る。バイオリアクターは、少なくともまたは約２、４、５、６、８、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００リットル、１、２、４、６、８、１０、１５立方メートル、またはここから導き出される任意の範囲の容量を保持し得る。
【０１３６】
培養容器は細胞接着性であってもまたは非接着性であってもよく、目的に応じて選択される。細胞接着性の培養容器を細胞接着のための任意の基質、例えば細胞外マトリックス（ＥＣＭ）でコーティングして、細胞に対する容器表面の接着性を高めることができる。細胞接着のための基質は、幹細胞またはフィーダー細胞（使用する場合）を結合することを目的としたいかなる物質であってもよい。細胞接着のための基質としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、およびＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎおよびその混合物例えばＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ならびに溶解した細胞膜調製物（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）が挙げられる。
【０１３７】
他の培養条件も適切に定義することができる。例えば、培養温度は、約３０ｔｏ４０℃、例えば、少なくともまたは約３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９℃であってよいが、特にこれらには限定されない。ＣＯ２濃度は約１〜１０％、例えば、約２〜５％、またはここから導き出される任意の範囲であってよい。酸素圧は、少なくともまたは約１、５、８、１０、２０％、またはここから導き出される任意の範囲であってよい。
【０１３８】
本発明の方法は、特定の側面では、例えば、幹細胞の接着培養に使用することができる。この場合、細胞は、フィーダー細胞の存在下で培養することができる。本発明の方法において、フィーダー細胞が使用される例では、ストローマ細胞、例えば胎性線維芽細胞をフィーダー細胞として使用することができる（例えば、Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９４）；Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９３）；Ｍａｒｔｉｎ（１９８１）；Ｅｖａｎｓ  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎ（１９８１）；Ｊａｉｎｃｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ，（１９６９）；Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）；Ｋｏｄａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）；および、国際公開第０１／０８８１００号パンフレットおよび同第２００５／０８０５５４号パンフレットを参照のこと）。
【０１３９】
本発明の方法は、特定の側面では、幹細胞の懸濁培養、例えば担体上での懸濁培養（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）またはゲル／生体高分子封入（米国特許出願第２００７／０１１６６８０号）にも使用することができる。幹細胞の懸濁培養という用語は、培養容器または培地中のフィーダー細胞（使用する場合）に幹細胞が接着しない条件で幹細胞を培養することを意味する。幹細胞の懸濁培養には、幹細胞の分離培養と幹細胞の集合体の懸濁培養が含まれる。幹細胞の分離培養という用語は、懸濁した幹細胞を培養することを意味し、幹細胞の分離培養には、単一の幹細胞の培養または複数の幹細胞から構成されている（例えば、約２〜４００個の細胞から構成されている）小さい細胞集合体の培養が含まれる。前述した分離培養を継続すると、培養され、分離した細胞は幹細胞のより大きな集合体を形成し、その後、集合体の懸濁培養を実施することができる。集合体の懸濁培養は、胚様体培養法（Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５を参照のこと）、およびＳＦＥＢ方法（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；国際公開第２００５／１２３９０２号パンフレット）を含む。
Ｂ．多能性幹細胞の培養
【０１４０】
培養条件によって、多能性幹細胞は分化した細胞または未分化の細胞のコロニーを生成することができる。「分化する」という用語は、発達経路の後期に至る、細胞の進行を意味する。「分化した」という用語は、別の細胞と比較して、発達経路の後期に至る細胞の進行を記述している、相対的な用語である。例えば、多能性細胞は、体のいずれの細胞をも生じることができるが、より分化した細胞、例えば造血細胞は、より少ない細胞型しか生じない。
【０１４１】
多能性幹細胞の培養は、集団に含まれている幹細胞およびその誘導体の大部分が、それらと、分化した胚細胞または成体起源が明確に区別される未分化細胞の形態的な特徴を示している場合に、「未分化な」として記述される。未分化なＥＳ細胞または未分化なｉＰＳ細胞は当業者によって確認され、大抵は、細胞コロニーの顕微鏡像において、核／細胞質の比が高いことと核小体が目立つことの２種類の測定値として現れる。未分化細胞のコロニーの近傍に、分化した細胞がある場合があることも理解される。
【０１４２】
ＥＳ細胞は、血清およびフィーダー細胞層、通常はマウス胎性線維芽細胞存在下で細胞を培養することで、未分化の状態に維持することができる。幹細胞を未分化状態に維持するための他の方法も知られている。例えば、マウスＥＳ細胞は、ＬＩＦの存在下およびフィーダー細胞層の非存在下で培養することで、未分化状態に維持することができる。しかしながら、マウスＥＳ細胞とは異なり、既存のヒトＥＳ細胞はＬＩＦには応答しない。ヒトＥＳ細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下で、線維芽細胞のフィーダー細胞層上でＥＳ細胞を培養することによって（Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、または線維芽細胞馴化培地と塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下、タンパク質マトリックス、例えばＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはラミニン上で、かつ、フィーダー細胞層を使用せずに培養することで（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；米国特許第６，８３３，２６９号）、未分化状態に維持することができる。
【０１４３】
ＥＳ細胞の調製および培養するための方法は、細胞生物学、組織培養、および奇形腫や胚性幹細胞を含む発生学の標準的な教科書および総説、例えば参照することによって全てが本明細書に組み込まれる、Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８７）；Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（１９９３）；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９８）の中に見ることができる。組織培養に使用される標準的な方法は、概して、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８７）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（１９８７）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７  ＆  １９９５）に記載されている。
【０１４４】
リプログラミング因子を体細胞に導入した、またはリプログラミング因子を体細胞に接触させた後、これらの細胞を、多能性および未分化状態を維持するのに効果的な培地中で培養してもよい。本発明で生成された人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の培養では、ここで参照することにより組み込まれる、米国特許公開第２００７０２３８１７０号、同第２００３０２１１６０３号、および同第２００８０１７１３８５号に記載されている、様々な培地や、霊長類の多能性幹細胞、より具体的には、胚性幹細胞を培養するために開発された技術を使用することができる。当然のことながら、当業者によって理解されるように、多能性幹細胞を培養および維持するためのさらなる方法を本発明と併せて使用してもよい。
【０１４５】
特定の態様では、規定されていない培地を使用してもよい。例えば、多能性細胞を、線維芽細胞のフィーダー細胞上で培養しても、または幹細胞を未分化状態に維持するために線維芽細胞のフィーダー細胞に曝露した培地上で培養してもよい。
【０１４６】
あるいは、規定された、フィーダーを使用しない培養システム、例えばＴｅＳＲ培地（Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ａ；Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ｂ）または必須８培地を使用して多能性細胞を培養し、本質的に未分化の状態に維持してもよい。フィーダーを使用しない培養システムおよび培地を使用して、多能性細胞を培養および維持してもよい。これらの方法によって、マウス線維芽細胞の「フィーダー細胞層」を必要とせずに、誘導したヒトｉＰＳ細胞ならびにヒト胚性幹細胞を本質的に未分化の状態に保持することができる。本明細書に記載したように、要望通りに費用を削減するために、これらの方法に様々な変更を行っても良い。
【０１４７】
ヒト多能性幹細胞の培養および維持には、多種多様なマトリックス成分を使用してもよい。例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、およびビトロネクチンを組み合わせて、参照によりその全体は本明細書に組み込まれるＬｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６ａ；２００６ｂ）に記載されているように、多能性細胞の成長のための固体支持層を提供する手段として、培養表面をコーティングするために使用してもよい。特に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を使用して、ヒト多能性幹細胞の培養および維持のための基質を提供することができる。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）はマウス腫瘍細胞から分泌されるゼラチン状のタンパク質混合物で、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ニュージャージー、米国）から上市されている。この混合物は、多くの組織中に見られる複雑な細胞外環境に類似しており、細胞生物学者が細胞培養用の基質として使用しているものである。
Ｃ．細胞の継代
【０１４８】
本発明の特定の側面はさらに、幹細胞を分離させる工程を含む場合がある。幹細胞の分離は、既知のいずれの方法によっても実施することができる。これらの方法には、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）、酵素（例えばトリプシン、コラゲナーゼ）などによる処理、および機械的な分離のような操作（例えばピペット操作）が含まれる。分離の前および／または後に、幹細胞をＲＯＣＫ阻害剤で処理することもできる。例えば、幹細胞を分離の後にのみ、処理することができる。
【０１４９】
多能性幹細胞培養のいくつかのさらなる態様では、培養容器がいっぱいになったら、分離させるのに適した任意の方法によって、コロニーを凝集した細胞とまだ単一な細胞とに分けてもよく、それらの細胞は、その後、継代用の新しい培養容器に入れられる。細胞の継代は、長期間、培養条件下で、細胞を生存していて、かつ、成長している状態に維持することを可能にする技術である。細胞は一般的に、約７０％〜１００％のコンフルエントに達した時に継代される。
【０１５０】
細胞増殖、セルソーティング、および分化のための限定した播種の促進すること、ならびに培養方法およびクローナルな増殖の自動化を可能にすることなどのいくつかの利点を有する多能性幹細胞の単一細胞の分離と、それに続く単一細胞の継代を、本方法において使用してもよい。例えば、単一細胞からクローナルに誘導可能な後代の細胞は、遺伝子構造が均一でおよび／または細胞周期が同調している可能性があり、これによって、標的とする分化が高まる可能性がある。単一細胞を継代するための方法の例は、参照することによって本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００８０１７１３８５号に記載されている方法であってもよい。
【０１５１】
特定の態様では、多能性幹細胞を、個別の単一な細胞に、または個別で単一な細胞の組み合わせに、および２、３、４、５、６、７、８、９、１０個もしくはそれ以上の細胞を含む細胞の小集団に分離してもよい。分離は、機械的な力によって達成しても、または細胞分離剤、例えばクエン酸ナトリウムもしくは酵素、例えば、トリプシン、トリプシン−ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔなどによって達成してもよい。
【０１５２】
多能性幹細胞の由来や増殖のニーズに基づいて、分離した細胞を、少なくとももしくはおよそ１：２、１：４、１：５、１：６、１：８、１：１０、１：２０、１：４０、１：５０、１：１００、１：１５０、１：２００、またはここから導き出される任意の範囲の分割比で、それぞれ別々にまたは小集団として、新しい培養容器に移すことができる。懸濁細胞株の分割比は、培養細胞の懸濁液の容量によって決めることができる。継代の間隔は、少なくとももしくはおよそ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日毎、またはここから導き出される任意の範囲毎であってよい。例えば、異なる酵素的な継代プロトコールについて達成可能な分割比は、３〜７日毎に１：２、４〜７日毎に１：３、およびおよそ７日毎に１：５〜１：１０、７日毎に１：５０〜１：１００であってよい。分割比が高い場合には、継代間隔を少なくとも１２〜１４日または、過度の自発的な分化もしくは細胞死による細胞の消失を伴わない任意の期間に長くすることができる。
【０１５３】
特定の側面では、単一細胞の継代を、クローン形成効率および細胞の生存率を高めるのに有効な低分子、例えば上述したＲＯＣＫ阻害剤存在下で行ってもよい。そのようなＲＯＣＫ阻害剤、例えば、Ｙ−２７６３２、ＨＡ−１０７７、Ｈ−１１５２、ＨＡ−１００、またはブレビスタチンは、有効な濃度、例えば、少なくとももしくは約０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０〜約１００μＭ、またはここから導き出される任意の範囲で用いることができる。
ＶＩＩＩ．ｉＰＳおよび改変したｉＰＳ細胞の選択
【０１５４】
本発明の特定の側面では、組み込むための１つまたは複数の染色体外の遺伝要素および１つまたは複数の核酸分子を体細胞に導入した後、細胞を増殖させるために培養してもよく（必要に応じて、陽性選択またはスクリーニング可能なマーカーなどのベクター要素の存在に関して選択してもよく）およびこれらの遺伝要素は、これらの細胞中でリプログラミング因子を発現し、細胞分裂に伴って複製および分配される。発現したこれらのリプログラミング因子は体細胞のゲノムをリプログラムし、持続した多能性状態を確立し、ベクターの存在に関する陽性選択の除去の間にまたはその後、外生の遺伝要素は徐々に失われる。これらの人工多能性幹細胞は多能性胚性幹細胞と実質的に同一であると予測されるため、胚性幹細胞の特徴に基づいて、これらの体細胞に由来する後代から選択することができるだろう。本質的に染色体外の遺伝要素を含まないｉＰＳ細胞の選択を促進または補助するために、リプログラミングベクターＤＮＡがないことを試験することによるまたは選択マーカーを使用することによる、さらなる陰性選択の工程も使用してもよいだろう。
Ａ．胚性幹細胞の特徴に関する選択
【０１５５】
これまでの研究から上手く生成されたｉＰＳＣは、以下の点において、天然に単離された多能性幹細胞（例えばマウスおよびヒト胚性幹細胞、それぞれ、ｍＥＳＣおよびｈＥＳＣ）と非常に類似していた。よって、ｉＰＳＣの独自性、確実性、および多能性を天然に単離された多能性幹細胞に対して確認するものである。従って、本発明で開示する方法によって生成される人工多能性幹細胞も、以下の胚性幹細胞の特徴のうちの１つまたは複数に基づいて、選択することができると考えられる。
ｉ．細胞の生物学的特性
【０１５６】
形態：ｉＰＳＣとＥＳＣは形態学的に類似している。それぞれの細胞は、丸い形、大きな核小体および不十分な細胞質を有し得る。ｉＰＳＣのコロニーはＥＳＣのコロニーとも類似していると考えられる。ヒトｉＰＳＣはｈＥＳＣと同様に、輪郭がはっきりとしていて、扁平で、密にパッキングされたコロニーを形成し、マウスｉＰＳＣはｍＥＳＣと同様に、ｈＥＳＣよりも扁平ではなく、より凝集したコロニーを形成する。特定の態様では、本方法では、直径が少なくともまたは約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５ｍｍ、またはここから導き出される任意の範囲の大きなヒトｉＰＳ細胞が生成することができ、これらは非ｉＰＳ細胞とは容易に区別され得る。
【０１５７】
成長特性：幹細胞は、その定義の一環として自己再生しなくてはならないため、倍加時間および有糸分裂の活性はＥＳＣの要である。ｉＰＳＣは、有糸分裂が活性化されており、積極的に自己再生・増殖し、かつ、ＥＳＣと同様の速度で分裂していると考えられる。
【０１５８】
幹細胞マーカー：ｉＰＳＣは、ＥＳＣ上で発現している、細胞表面抗原マーカーを発現し得る。ヒトｉＰＳＣは、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ、およびＮａｎｏｇを含むがこれらには限定されない、ｈＥＳＣに特異的なマーカーを発現した。マウスｉＰＳＣはｍＥＳＣと同様に、ＳＳＥＡ−１を発現したが、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４は発現しなかった。
【０１５９】
幹細胞遺伝子：ｉＰＳＣは、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＧＤＦ３、ＲＥＸ１、ＦＧＦ４、ＥＳＧ１、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、およびｈＴＥＲＴなどの未分化なＥＳＣで発現している遺伝子を発現し得る。
【０１６０】
テロメラーゼ活性：テロメラーゼは、およそ５０回の細胞分裂に限定されるヘイフリック限界によって制限されていない、細胞分裂の維持に必要なものである。ヒトＥＳＣが発現しているテロメラーゼ活性は高く、自己再生および増殖を維持しており、ｉＰＳＣもまた高いテロメラーゼ活性を示し、テロメラーゼタンパク質複合体に必須の成分であるｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）を発現している。
【０１６１】
多能性：ｉＰＳＣはＥＳＣと同様な方法で、完全に分化した組織に分化することができる。
【０１６２】
神経の分化：ｉＰＳＣは、βＩＩＩ−チューブリン、チロシン水酸化酵素、ＡＡＤＣ、ＤＡＴ、ＣｈＡＴ、ＬＭＸ１Ｂ、およびＭＡＰ２を発現しているニューロンに分化すると考えられている。カテコラミン関連酵素が存在するということは、ｉＰＳＣがｈＥＳＣと同様に、ドパミン作動性ニューロンに分化し得ることを示している可能性がある。幹細胞関連遺伝子は、分化の後、ダウンレギュレートされる。
【０１６３】
心臓の分化：ｉＰＳＣは、自発的に拍動し始める心筋細胞へと分化すると考えられている。心筋細胞は、ＴｎＴｃ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＬ２Ａ、ＭＹＨＣβ、ＴＮＮＴ２およびＮＫＸ２．５を発現している。幹細胞関連遺伝子は分化の後に、ダウンレギュレートされる。
【０１６４】
テラトーマ形成：免疫不全マウスにｉＰＳＣを注入すると、一定の期間、例えば９週間の後に、自発的に奇形腫が形成され得る。奇形腫とは、三胚葉、すなわち、内胚葉、中胚葉および外胚葉に由来する組織を含む、複数の細胞系統の腫瘍である。このことは、通常、１種類の細胞型である他の腫瘍とは異なる。テラトーマ形成は多能性に関する試験の指標である。
【０１６５】
胚様体：培養中のヒトＥＳＣは、「胚様体」と呼ばれる、球状の胚様構造を自発的に形成する。胚様体は、その中心部には、有糸分裂が活性化されている分化しているｈＥＳＣを含み、周辺部には三胚葉全てに由来する、完全に分化した細胞を含んでいる。ｉＰＳＣも胚様体を形成する場合があり、かつ、周辺には分化した細胞を有している場合がある。
【０１６６】
胚盤胞の注入：ヒトＥＳＣは、天然では、胚盤胞の内部細胞塊（胚結節）および胚結節の中に存在し、胚盤胞の殻（栄養芽層）が胚外組織に分化する間に、胚へと分化する。中空の栄養芽層は生きた胚を形成することはできないため、胚結節中の胚性幹細胞が分化して胚を形成することが必要である。胚盤胞を生成するように栄養芽層へとマイクロピペットで注入し、メスのレシピエントに移植すると、ｉＰＳＣは、生きたキメラのマウス幼獣、体全体に１０〜９０％のキメラ化でｉＰＳＣ誘導体が組み込まれたマウスを生じ得る。
ｉｉ．後成的なリプログラミング
【０１６７】
プロモーターの脱メチル化：メチル化は、メチル基のＤＮＡ塩基への転移、一般的には、ＣｐＧ部位（シトシン／グアニン配列の近傍）中のシトシン分子へのメチル基の転移である。広く見られる遺伝子のメチル化は、発現するタンパク質の活性を抑制すること、または発現を干渉する酵素を補充することによって、発現を干渉する。従って、遺伝子のメチル化は、転写を防止することによって、効果的に遺伝子を抑制する。Ｏｃｔ−３／４、Ｒｅｘｌ、およびＮａｎｏｇなどの多能性関連遺伝子のプロモーターはｉＰＳＣでは脱メチル化されている場合があり、それによって、それらのプロモーター活性ならびにｉＰＳＣでの多能性関連遺伝子の積極的な促進および発現が現れる。
【０１６８】
ヒストンの脱メチル化：ヒストンは、様々なクロマチンに関連する修飾を介してその活性を発揮することができるＤＮＡ配列に構造的に局在している、密集しているタンパク質である。Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇと関連があるＨ３ヒストンは、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇの発現を活性化するために脱メチル化される場合がある。
Ｂ．残基に無関係な特性の選択
【０１６９】
本発明に含まれるリプログラミングベクター、例えばｏｒｉＰを利用したベクターは、染色体外で複製され、かつ、世代を追う毎に宿主細胞から消失すると考えられている。しかしながら、後代の細胞に関する、染色体外のベクター要素とは本質的に無関係のさらなる選択工程によって、この過程を促進してもよい。例えば、後代細胞の試料を抽出して、当該分野において知られているように、染色体外のベクター要素の有無を試験することができる（Ｌｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ、２００１）。
【０１７０】
リプログラミングベクターは、選択マーカーを、より具体的には、選択マーカーを本質的に含まない後代細胞を選択するためのチミジンキナーゼをコードしている遺伝子などの陰性選択マーカーをさらに含んでいてもよい。ヒト単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶｔｋ）は、ある条件では、哺乳類細胞中で致死マーカーとして機能する。ＨＳＶｔｋによってコードされている酵素は、特定のヌクレオシド類似体（例えば、ガンシクロビル、抗ヘルペス薬）をリン酸化することができ、その結果、それらを有毒なＤＮＡ複製阻害剤へと変換する。別のまたは補完的なアプローチとしては、ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）、遺伝子アレイ、またはハイブリダイゼーション（例えば、サザンブロット）などの標準的な方法を用いて、後代細胞中に染色体外の遺伝要素がないことを試験することが挙げられる。
ＩＸ．核酸分子の構築と送達
【０１７１】
特定の態様では、リプログラミング因子および／またはゲノムへ組み込むための核酸分子を含む遺伝要素を、機能的な遺伝要素、例えばコード配列を発現させるためのエレメントを含むように、構築する。これらベクター成分および送達方法の詳細を以下に開示する。
Ａ．調節エレメント
【０１７２】
ベクターに含まれる真核生物の発現カセットは、好ましくは、（５’−から−３’の方向に）タンパク質のコード配列に操作可能に連結された真核生物の転写プロモーター、介在配列を含むスプライシングシグナル、および転写終結配列／ポリアデニル化配、を含む。
ｉ．プロモーター／エンハンサー
【０１７３】
「プロモーター」は、核酸配列の領域である制御配列であり、ここで転写の開始および速度が制御される。プロモーターには、特定の核酸配列の転写を開始するために、ＲＮＡポリメラーゼや他の転写因子などの調節タンパク質や分子が結合する遺伝要素が含まれ得る。「操作可能に位置している」、「操作可能に接続されている」、「制御下にある」、および「転写制御されている」という句は、核酸配列の転写の開始および／または発現を制御するために、プロモーターがその配列に対して機能的に正しい位置および／または方向にあることを意味している。
【０１７４】
本発明のＥＢＮＡ−１をコードしているベクターに使用するのに好適なプロモーターとしては、ＥＢＮＡ−１タンパク質をコードしている発現カセット発現を誘導し、ＥＢＶ  ｏｒｉＰ含有ベクターを安定に維持するためにＥＢＮＡ−１タンパク質のレベルを効果的に一定に保つプロモーターが挙げられる。プロモーターを、リプログラミング因子をコードしている発現カセットを効率的に発現させるために使用してもよい。
【０１７５】
プロモーターは一般的に、ＲＮＡ合成の開始部位を正しい場所に配置する機能をもつ配列を含む。このような配列の最もよく知られている例としてはＴＡＴＡボックスがあるが、いくつかのプロモーター、例えば、哺乳類の末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターや、開始位置を固定するのを補助するために、開始部位そのものに重なっている分散した要素であるＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターはＴＡＴＡボックスを含まない。その他のプロモーターエレメントは転写開始の頻度を調節する。いくつかの往路モーターが機能エレメントを開始部位の下流に含むことも示されてはいるが、一般的に、これらは開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置している。コード配列をプロモーターの「制御下」にあるようにするには、転写読み枠の転写開始部位の５’末端を、選択したプロモーターの「下流」（つまりその３’に）配置する。「上流の」プロモーターはＤＮＡの転写を刺激し、コードされているＲＮＡの発現を促進する。
【０１７６】
プロモーター間の距離は、要素が逆向きになっても、または互いに対して位置が移動してもプロモーターの機能が保存されるように、大抵の場合は柔軟である。ｔｋプロモーターでは、プロモーター要素間の距離は、活性の低下が始まるまでは、５０ｂｐと大きい場合がある。プロモーターによって、個々の要素は互いに強調してまたは独立して機能し、転写を活性化すると考えられている。プロモーターを「エンハンサー」と組み合わせて使用しても、または組み合わせないで使用してもよく、エンハンサーは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作動性の調節配列を指す。
【０１７７】
プロモーターは、コードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する５’非コード領域を単離することによって得られる可能性があることから、核酸配列に天然に関連があるものであってよい。そのようなプロモーターは、「内生の」と呼ぶことができる。同様に、エンハンサーも、その配列の下流または上流に位置する、核酸配列と天然に関連があるものであってよい。あるいは、その天然の環境では核酸配列に通常は関連のないプロモーターを指す、組換えプロモーターまたは異種プロモーターの制御下にコード核酸セグメントを配置することで、特定の利点が得られる。組換えエンハンサーまたは異種エンハンサーもまた、その天然の環境中では、核酸配列に通常は関連のないエンハンサーを指す。そのようなプロモーターもしくはエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーターもしくはエンハンサー、および他の任意のウイルスまたは原核細胞もしくは真核細胞から単離されたプロモーターもしくはエンハンサー、ならびに「天然に存在する」ものではないプロモーターもしくはエンハンサー、つまり、異なる転写制御領域の異なるエレメント、および／または発現を変化させる突然変異を含むプロモーターもしくはエンハンサーが含まれ得る。例えば、組換えＤＮＡ構築物に最も一般的に使用されるプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースおよびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が挙げられる。人工的にプロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を製造することに加えて、配列は、組換えクローニング技術および／または、本発明で開示する組成物に関連したＰＣＲ（商標）などの増幅技術によって製造してもよい（各々が参照することによって本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６８３，２０２号および同第５，９２８，９０６号を参照のこと）。さらに、核以外の小器官、例えばミトコンドリアや葉緑体などに含まれている、配列の転写および／または発現を誘導する制御配列を使用することができることも想定される。
【０１７８】
当然のことながら、発現のために選択した小器官、細胞型、組織、器官、または生物中で、ＤＮＡセグメントの発現を効果的に誘導するプロモーターおよび／またはエンハンサーを使用することが重要となる。分子生物学の当業者は通常、タンパク質を発現させるために使用するプロモーター、エンハンサー、および細胞型の組み合わせを理解している（例えば参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９を参照のこと）。使用されるプロモーターは、構成的であっても、組織特異的であっても、誘導可能であっても、ならびに／または、適切な条件で導入したＤＮＡセグメントを高レベルで発現させるのに有用なものであってもよく、これは、組換えタンパク質および／もしくはペプチドの大規模な生産に好都合である。プロモーターは異種のものであっても内生のものであってもよい。
【０１７９】
加えて、発現を誘導するためには、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（例えば、ｅｐｄ．ｉｓｂ−ｓｉｂ．ｃｈ／にあるワールドワイドウェブのＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ  ＥＰＤＢに則って）を使用することもできる。Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６細胞質発現システムの使用は、実現可能な別の態様である。真核細胞は、適切な細菌性ポリメラーゼが提供されていれば、送達複合体の一部分としてまたはさらなる遺伝的発現構築物として、特定の細菌性プロモーターの細胞質での転写を補助することができる。
【０１８０】
プロモーターの非限定的な例としては、初期または後期ウイルスプロモーター、例えばＳＶ４０初期もしくは後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーター；真核細胞のプロモーター、例えば、ベータアクチンプロモーター（Ｎｇ、１９８９、Ｑｕｉｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）、ＧＡＤＰＨプロモーター（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８、Ｅｒｃｏｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、メタロチオネインプロモーター（Ｋａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）；および連鎖状反応要素プロモーター、例えばサイクリックＡＭＰ反応要素プロモーター（ｃｒｅ）、血清反応要素プロモーター（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモーター（ＴＰＡ）およびミニマルＴＡＴＡボックスの近傍にある反応要素プロモーター（ｔｒｅ）が挙げられる。ヒト成長ホルモンプロモーターの配列（例えば、ジェンバンク、受託番号Ｘ０５２４４、ヌクレオチド２８３〜３４１に記載されている、ヒト成長ホルモンミニマルプロモーター）またはマウス乳癌プロモーター（ＡＴＣＣから、カタログ番号ＡＴＣＣ４５００７で入手可能）などを使用することもできる。特定の例としては、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを挙げることができる。
ｉｉ．開始シグナルならびに配列内リボソーム結合部位およびプロテアーゼ開裂部位／自己切断型ペプチド
【０１８１】
コード配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要とされる場合がある。これらのシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接配列が含まれる。ＡＴＧ開始コドンを含む外生の翻訳制御シグナルを提供する必要がある場合もある。当業者であれば、これを容易に判断することができ、必要なシグナルを提供することができる。挿入断片全体の翻訳を確実にするために、開始コドンは、所望のコード配列の読み枠と「インフレーム」でなくてはならないことがよく知られている。外生の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然のものであっても合成されたものであってもよい。発現効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって高められ得る。
【０１８２】
本発明の特定の態様では、多重遺伝子、またはポリシストロニックなメッセージを作成するために、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）のエレメントを使用する。ＩＲＥＳエレメントは、５’がメチル化されたＣａｐ依存性の翻訳のリボソームスキャニングモデル（ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｓｃｃａｎｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ）を回避し、翻訳を内部部位で開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）。ピコルナウイルスファミリーの２種類のメンバー（ポリオおよび脳心筋炎ウイルス）に由来するＩＲＥＳエレメント（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）、および哺乳類のメッセージに由来するＩＲＥＳ（Ｍａｃｅｊａｋ  ａｎｄ  Ｓａｒｎｏｗ、１９９１）について記述されているＩＲＥＳエレメントを異種のオープンリーディングフレームに連結することができる。。ＩＲＥＳによって分断されている複数のオープンリーディングフレームをそれぞれ一緒に転写し、それによってポリシストロニックなメッセージを生成することができる。ＩＲＥＳエレメントのおかげで、各オープンリーディングフレームは、効果的な翻訳のために、リボソームに接近することができる。多重遺伝子は、単一のメッセージを転写するための単一のプロモーター／エンハンサーを使用して、効率的に発現させることができる（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９２５，５６５号および同第５，９３５，８１９号を参照のこと）。
【０１８３】
本発明の特定の態様では、マーカーまたは他のタンパク質をコードしている遺伝子を、プロテアーゼ開裂部位（つまり、プロテアーゼの認識部位を含む配列）または少なくとも１つの（２つ以上であってもよい）自己切断型ペプチドをコードしている配列によって、互いに連結させてもよい。
【０１８４】
好適なプロテアーゼ開裂部位および自己切断型ペプチドは、当業者に知られている（例えば、Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｓｃｙｍｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４を参照のこと）。プロテアーゼ開裂部位の好ましい例は、ポティウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコｅｔｃｈウイルスプロテアーゼ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）Ｎｌａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ−２−コード化プロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロ球状ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹ／ＩＦ（アメリカボウフウ黄色斑点ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、トロンビン、Ｘａ因子およびエンテロキナーゼの開裂部位である。
【０１８５】
好ましい自己切断型ペプチド（「シス作動性加水分解エレメント」、ＣＨＹＳＥＬとも呼ばれる。ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ（２００２）を参照のこと）は、ポティウイルスおよびカルジオウイルス２Ａペプチド由来のものである。特に好ましい自己切断型ペプチドは、ＦＭＤＶ（口蹄疫ウイルス）由来２Ａペプチド、アフトウイルス（ｅｑｕｉｎｅ  ｒｈｉｎｉｔｉｓ  Ａウイルス）、トセアアシグナ（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルスおよびブタテッショウウイルスから選択される。
ｉｉｉ．マルチプルクローニングサイト
【０１８６】
ベクターは、複数の制限酵素部位、そのいずれもが、ベクターを消化するために標準的な組換え技術と併せて使用することができる制限酵素部位を含む核酸領域であるマルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む場合がある（例えば、参照することによって本明細書に組み込まれるＣａｒｂｏｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９、Ｌｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、およびＣｏｃｅａ、１９９７を参照のこと）。「制限酵素消化」は、核酸分子の特定の部位のみで機能する酵素による、核酸分子の触媒開裂を指す。これら制限酵素の多くが市販されている。そのような酵素の使用については、当業者によって広く理解されている。ベクターに外生の配列をライゲーションすることができるように、ＭＣＳの中に含まれる配列を切断する制限酵素を使用して、ベクターはしばしば、直線化または断片化される。「ライゲーション」とは、互いに連続していてもまたは連続していなくてもよい２つの核酸断片の間にホスホジエステル結合を形成する過程をさす。制限酵素反応およびライゲーション反応を含む技術は、組換え技術の当業者にはよく知られている。
ｉｖ．スプライシング部位
【０１８７】
転写された真核生物のＲＮＡ分子の大部分は、最初の転写産物からイントロンを除去するためのＲＮＡスプライシングを受ける。真核生物のゲノム配列を含むベクターは、タンパク質を発現するために、転写産物を正確に処理することを保障するため、スプライス供与部位および／またはスプライス受容部位を必要とする場合がある（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＣｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７を参照のこと）。
ｖ．終結シグナル
【０１８８】
本発明のベクターまたは構築物は通常、少なくとも１つの終結シグナルを含む。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡの転写物の、特異的な終結に関わるＤＮＡ配列からなる。従って、特定の態様では、ＲＮＡ転写物の生産を終わらせる終結シグナルが想定される。望ましいメッセージレベルを達成するために、インビボではターミネーターが必要とされる場合もある。
【０１８９】
真核生物の系では、ターミネーター領域には、新しい転写産物の部位特異的な開裂を許容し、ポリアデニル化部位に曝す、特定のＤＮＡ配列をも含み得る。このシグナルによって、特殊な内生ポリメラーゼが、約２００個の長さのＡ残基（ポリＡ）を転写産物の３’末端に付加する。このポリＡ尾部を有する修飾されたＲＮＡ分子はより安定で、かつ、より効率的に翻訳されると考えられている。従って、真核生物を伴う他の態様では、ターミネーターがＲＮＡを開裂させるためのシグナルを含むことが好ましく、ターミネーターシグナルがメッセージのポリアデニル化を促進することがより好ましい。ターミネーターおよび／またはポリアデニル化部位エレメントは、メッセージレベルの亢進およびカセットから他の配列へのリードスルーを最小限に抑えるのに役立つ可能性がある。
【０１９０】
本発明での使用が想定されるターミネーターとしては、本明細書に記載の、または当業者に知られている、既知の転写ターミネーターのいずれもが、例えば、遺伝子の終結配列、例えばウシ成長ホルモンターミネーターまたはウイルス終結配列、例えばＳＶ４０ターミネーターが含まれるがこれらには限定されない。特定の態様では、終結シグナルは、例えば配列のトランケーションによって、転写可能な配列または翻訳可能な配列を欠いたものであってもよい。
ｖｉ．ポリアデニル化シグナル
【０１９１】
発現、特に真核生物の発現では、ベクターは通常、転写産物を正確にポリアデニル化するためのポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明を上手く実施するのには重要でないと考えられており、かつ、そのような配列のいずれを用いてもよい。好ましい態様には、簡便で、様々な標的細胞中で機能することが知られているＳＶ４０ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが含まれる。ポリアデニル化によって、転写産物の安定性が向上するか、または細胞質への輸送が促進される可能性がある。
ｖｉｉ．複製の起点
【０１９２】
ベクターを宿主細胞中で増殖させるために、ベクターは、複製の起点となる部位（多くの場合、「ｏｒｉ」と呼ばれる）、例えば、そこから複製が始まる特定の核酸配列である、上述したＥＢＶのｏｒｉＰに対応する核酸配列、を１つまたは複数含み得る。あるいは、上述した、染色体外で複製する他のウイルスの複製起点、または自律複製（ＡＲＳ）を使用することもできる。
ｖｉｉｉ．選択およびスクリーニング可能なマーカー
【０１９３】
本発明の特定の態様では、発現カセットにマーカーを含めることで、本発明の核酸構築物を含有する細胞を、インビトロでまたはインビボで、同定または選択してもよい。そのようなマーカーによって、同定可能な変化が細胞に起こり、その結果、発現カセットを含む細胞を容易に同定することが可能になるだろう。通常、選択マーカーとは、選択を可能にする特定を付与するマーカーである。陽性選択マーカーは、マーカーが存在することが選択を可能にするマーカーであり、陰性選択マーカーは、存在することが選択を阻害するマーカーである。陽性選択マーカーの一例としては、薬剤耐性マーカーがある。
【０１９４】
一般に、薬剤選択マーカーを含めることによって、形質転換体のクローニングおよび同定が補助され、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン（ｂｌａｓｔｏｃｉｄｉｎ）、ジェネティシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子が有用な選択マーカーである。方法の条件に基づいて、形質転換体の区別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、スクリーニング可能なマーカー、例えばＧＦＰなどの、その原理が比色分析である、他の種類のマーカーも想定される。あるいは、陰性選択マーカーとしてのスクリーニング可能な酵素、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を使用してもよい。当業者であれば、免疫性マーカーを、おそらくＦＡＣＳ解析と併せて、どのように使用するかも分かるだろう。使用されるマーカーは、遺伝子産物をコードしている核酸と同時に発現することができる限り、重要ではないと考えられている。選択マーカーおよびスクリーニング可能なマーカーのさらなる例も、当業者にはよく知られている。
【０１９５】
本発明の特定の態様では、細胞の特定の特性を示すために、例えば、レポーターマーカー遺伝子の発現を制御する条件応答性制御要素を活性化することによって、決まった細胞系列に沿った分化を示すために、スクリーニング可能なレポーター遺伝子が使用される。
【０１９６】
そのようなレポーターの例としては、細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ４、ＨＡエピトープ）をコードしている遺伝子、蛍光タンパク質、抗原決定基および酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼまたはニトロレダクターゼ）が挙げられる。ベクターを含有している細胞は、例えば、蛍光標識した、細胞表面タンパク質に対する標的化抗体またはベクターによってコードされている酵素によって、蛍光産物へと変換され得る基質を使ったＦＡＣＳによって単離することができる。特定の側面では、細胞透過性の色素を使用して、レポーターを発現している細胞を同定することができる。例えば、ＮＦＡＴニトロレダクターゼ遺伝子の発現は、細胞透過性の蛍光前基質、例えばＣｙｔｏＣｙ５Ｓを使って、検出することができる（例えば、それぞれ参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６３３，１５８号、同第５，７８０，５８５号、同第５，９７７，０６５号および欧州特許第１２５２５２０号明細書を参照のこと）。
【０１９７】
特定の態様では、レポーター遺伝子は蛍光タンパク質である。可視光スペクトルのほぼ全域にわたる蛍光発光のスペクトルプロファイルを特徴とする、多種多様な蛍光タンパク質の遺伝的変異体が開発されている（非限定的な例に関する表１を参照のこと）。元々のオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）の緑色蛍光タンパク質に突然変異を加えたことによって、青色から黄色の範囲で発光する新しい蛍光プローブが得られており、これらは、生物学の研究において最も広く使用されているインビボのレポーター分子である。波長がより長く、橙色から赤色のスペクトル領域で発光する蛍光タンパク質がイソギンチャク（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｔｒｉａｔａ）および花中類に属す造礁サンゴから作られた。さらに、シアン、緑、黄、橙、および深紅の蛍光発光を有する同様のタンパク質を生産するために、他の種についても調査が行われた。蛍光タンパク質の輝度および安定性を向上させ、それらの総体的な有効性を向上させるための開発研究は現在も行われている。
【表１】
2014520551.tif 000002
2014520551.tif 000003
2014520551.tif 000004
Ｂ．核酸の送達
【０１９８】
核酸（リプログラミングベクターまたはゲノムに組み込むための他の分子）を本発明に従って体細胞に導入するには、本明細書に記載したようにまたは当業者であれは分かるように、細胞を形質転換するために核酸を送達する、任意の適した方法を使用してもよい。そのような方法としては、例えば、エクスビボトランスフェクション（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、Ｎａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）；インジェクション（米国特許第５，９９４，６２４号、同第５，９８１，２７４号、同第５，９４５，１００号、同第５，７８０，４４８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，７０２，９３２号、同第５，６５６，６１０号、同第５，５８９，４６６号および同第５，５８０，８５９号。それぞれ参照することによって本明細書に組み込まれる）、例えばマイクロインジェクションなど（Ｈａｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５；米国特許第５，７８９，２１５号。参照することによって本明細書に組み込まれる）；エレクトロポレーション（米国特許第５，３８４，２５３号。参照することによって本明細書に組み込まれる；Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｐｏｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）；リン酸カルシウム沈殿（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  ＶａｎＤｅｒＥｂ、１９７３；Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ、１９８７；Ｒｉｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）；ＤＥＡＥ−デキストランとその後のポリエチレングリコールの使用（Ｇｏｐａｌ、１９８５）；直接的な音波負荷（ｄｉｒｅｃｔ  ｓｏｎｉｃ  ｌｏａｄｉｎｇ）（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）；リポソーム介在性トランスフェクション（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、１９８２；Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０；Ｋａｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）および受容体介在性トランスフェクション（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ、１９８７；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ、１９８８）；微粒子銃（国際公開第９４／０９６９９号パンフレットおよび同第９５／０６１２８号パンフレット；米国特許第５，６１０，０４２号；同第５，３２２，７８３号、同第５，５６３，０５５号、同第５，５５０，３１８号、同第５，５３８，８７７号、および同第５，５３８，８８０号。それぞれ参照することによって本明細書に組み込まれる）；炭化ケイ素線維との撹拌（Ｋａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；米国特許第５，３０２，５２３号および同第５、４６４、７６５号。それぞれ参照することによって本明細書に組み込まれる）；乾燥／阻害介在性ＤＮＡ取り込み（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）、およびそのような方法の任意の組み合わせによるＤＮＡの直接的な送達が挙げられるがこれらには限定されない。このような技術を適用することを介して、小器官、細胞、組織または生物を、安定的にまたは一過的に形質転換することができる。
ｉ．リポソーム介在性トランスフェクション
【０１９９】
本発明の特定の態様では、核酸を脂質複合体、例えばリポソームの中に捕捉してもよい。リポソームは、リン脂質の二重膜と内側の水性媒体によって特徴付けられる小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒体によって隔てられている、複数の脂質層を有している。これらは、水溶性の溶液にリン脂質が過剰に懸濁している場合、自発的に形成される。脂質成分は自己再編成し、その後、閉じた構造が形成されて、脂質二重層の間に、水と溶けた溶質が捕捉される（Ｇｈｏｓｈ  ａｎｄ  Ｂａｃｈｈａｗａｔ、１９９１）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）またはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）と複合体を形成した核酸もまた想定される。使用されるリポソームの量は、使用されるリポソームや細胞の性質によって変わってもよく、例えば、細胞１〜１０００万個当たり、約５〜約２０μｇのベクターＤＮＡを使用してもよい。
【０２００】
リポソーム介在性の核酸送達と外生ＤＮＡのインビトロでの発現は、非常にうまくいっている（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、１９８２；Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。培養したニワトリ胚、ＨｅＬａおよび肝癌細胞でのリポソーム介在性送達および外生ＤＮＡ発現の実現可能性もまた示された（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０）。
【０２０１】
本発明の特定の態様では、リポソームとセンダイウイルス（ＨＶＪ）とで複合体を形成させてもよい。これによって細胞膜との融合が促進され、リポソームに封入されたＤＮＡの細胞への進入が促進されることが分かっている（Ｋａｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。他の態様では、リポソームと核の非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）とで複合体を形成させても、またはこれらを併せて使用してもよい（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。さらなる態様では、リポソームとＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方とで複合体を形成させても、あるいはこれらを全て併せて使用してもよい。他の態様では、送達媒体には、リガンドおよびリポソームが含まれ得る。
ｉｉ．エレクトロポレーション
【０２０２】
本発明の特定の態様では、核酸は、エレクトロポレーションによって、小器官、細胞、組織または生物へと導入される。エレクトロポレーションの型の１つとしてヌクレオフェクションがあり、この方法では、ヌクレオフェクター（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）と呼ばれる装置と細胞に特異的な試薬との併用によって（例えばＡｍａｘａシステム；ＬｏｎｚａＣｏｌｏｇｎｅＡＧ）、核酸を細胞に形質導入する。エレクトロポレーションは、細胞懸濁液とＤＮＡを高電位放電に曝露することを含む。機械的な損傷によって、受容細胞をより形質転換しやすくすることができる。使用するベクターの量もまた、使用される細胞の性質によって変わっても良く、例えば、細胞１〜１０００万個あたり、約５〜約２０μｇのベクターＤＮＡが想定され得る。
【０２０３】
エレクトロポレーションを使用した真核細胞の形質導入はかなりうまくいく。この様式で、ヒトカッパ免疫グロブリン遺伝子がマウスＢリンパ球前駆細胞に導入され（Ｐｏｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子がラット肝細胞に導入された（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）。
ｉｉｉ．リン酸カルシウム
【０２０４】
本発明の他の態様では、核酸を、リン酸カルシウム沈殿を使って、細胞に導入する。ヒトＫＢ細胞は、この技術によって、アデノウイルス５ＤＮＡを導入された（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  ＶａｎＤｅｒＥｂ、１９７３）。この様式ではまた、マウスＬ（Ａ９）、マウスＣ１２７、ＣＨＯ、ＣＶ−１、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３およびＨｅＬａに、ネオマイシンマーカー遺伝子が導入されており（ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７）、また、ラット肝細胞には様々なマーカー遺伝子が導入された（Ｒｉｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。
ｉｖ．ＤＥＡＥ−デキストラン
【０２０５】
別の態様では、核酸を、ＤＥＡＥ−デキストランとそれに続くポリエチレングリコールによって、細胞に送達する。この様式によって、レポータープラスミドがマウス骨髄腫細胞および赤血球病細胞に導入された（Ｇｏｐａｌ、１９８５）。
ｖ．超音波処理  負荷（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  Ｌｏａｄｉｎｇ）
【０２０６】
本発明の代替的な態様には、直接的な超音波負荷（ｄｉｒｅｃｔ  ｓｏｎｉｃ  ｌｏａｄｉｎｇ）による核酸の導入が含まれる。超音波処理負荷によって、チミジンキナーゼ遺伝子がＬＴＫ線維芽細胞に導入された（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。
ｖｉ．受容体介在性トランスフェクション
【０２０７】
その上さらに、核酸を、受容体介在性送達媒体を介して、標的細胞に送達してもよい。これらは、標的細胞で生じる受容体介在性エンドサイトーシスによる巨大分子の選択的な取り込みを利用するものである。様々な受容体の細胞型に特異的な分布を考慮すると、この送達方法は本発明に、別の特性を付加する。
【０２０８】
特定の受容体介在性遺伝子ターゲティング媒体は、細胞受容体特異的リガンドと核酸結合剤を含む。その他のものは、送達される核酸に操作可能に接続されている細胞受容体特異的リガンドを含む。複数のリガンドが受容体介在性移入に使用されてきており（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ、１９８７；Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｐｅｒａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｍｙｅｒｓ、ＥＰＯ０２７３０８５）、これらによって、技術の実施可能性が確立されている。別の哺乳類の細胞型に関する特定の送達についても記述されている（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ、１９９３；参照することによって本明細書に組み込まれる）。本発明の特定の側面では、リガンドは、対応する標的細胞集団上で特異的に発現している受容体に応じて選択される。
【０２０９】
他の態様では、細胞特異的核酸ターゲティング媒体の核酸送達媒体の成分は、リポソームと併せて特異的な結合リガンドを含んでいてもよい。送達される核酸は、リポソームの中に収容され、かつ、特異的な結合リガンドは、リポソーム膜の中に機能的に組み込まれる。従ってリポソームは、標的細胞の受容体に特異的に結合し、内容物を細胞へと送達する。このような系が機能的であることは、例えば、ＥＧＦ受容体のアップレギュレーションを示す細胞への核酸の受容体介在性送達に上皮成長因子（ＥＧＦ）が使用される系を用いて示された。
【０２１０】
その上さらなる態様ではターゲティング送達媒体の核酸送達媒体の成分は、リポソーム自体であってもよく、リポソームは、好ましくは１種もしくは複数種の脂質、または細胞特異的に直接結合する糖タンパク質を含む。例えば、ラクトシルセラミド、ガラクトース末端をもつアシアロガングリオシド（ａｓｉａｌｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）がリポソーム中に組み入れられ、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増加が観察された（Ｎｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。本発明の組織特異的な形質転換構築物が、同様の様式で、標的細胞に特異的に送達できることが想定される。
ｖｉｉ．微粒子銃
【０２１１】
微粒子銃の技術を、核酸を少なくとも１つの、小器官、細胞、組織または生物へ導入するために使用することができる（米国特許第５，５５０，３１８号；同第５，５３８，８８０号；同第５，６１０，０４２号；および国際公開公報第９４／０９６９９号パンフレット。それぞれ参照することによって本明細書に組み込まれる）。この方法は、微粒子が細胞膜を貫通し、そして細胞を殺すことなくその中に進入することを可能にする高速に、ＤＮＡでコーティングした微粒子を加速する能力に基づいている（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。多くの微粒子技術が当該分野において知られており、その多くを本発明に適用することができる。
【０２１２】
この微粒子銃では、１つ以上の粒子を少なくとも１種の核酸でコーティングし、推進力によって細胞内に送達してもよい。小さい粒子を加速させるための複数の装置が開発されている。そのような装置の１つは、電流を発生させるための高圧放電に基づいており、電流が次いで機動力を生じる（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。使用される微粒子は、生物学的に不活性な基質、例えばタングステン粒子もしくは金粒子またはビーズからなっていた。粒子の例としては、タングステン、白金、および好ましくは金から構成されている粒子が挙げられる。いくつかの例では、微粒子銃を使ったＤＮＡの受容細胞への送達には、ＤＮＡを金属粒子表面に沈降させる必要は必ずしもないことが想定される。しかしながら、粒子は、ＤＮＡでコーティングされるのではなく、ＤＮＡを含み得ることが想定される。ＤＮＡでコーティングした粒子は、微粒子銃を介したＤＮＡ送達のレベルを高める可能性があるが、必ずしもそれら自体の送達を高めはしない。
【０２１３】
微粒子を照射するには、懸濁液中の細胞を、フィルターまたは固体培地上に集める。あるいは、未熟胚または他の標的細胞を固体培地上に配置してもよい。微粒子の照射を受ける細胞は、微粒子停止プレート（ｓｔｏｐｐｉｎｇ  ｐｌａｔｅ）の下に、適切な距離をおいて置かれる。
【実施例】
【０２１４】
Ｘ．実施例
以下に示す実施例は、本発明の好ましい態様を示すために包含されるものである。当業者にとっては当然のことであるが、実施例中で開示されている技術は、本願発明者らによって、本発明を実施する上でよく機能することが分かった技術を表すものであり、そのため、本発明を実施するための好ましい形態を構成していると見なすことができる。しかしながら、本開示を踏まえると、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示されている特定の態様に多くの変更を施すことができ、それでもなお、同様のまたは類似した結果をえることができることを、当業者は理解すべきである。
【０２１５】
実施例１ーゲノムの改変および、ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いたヒト包皮線維芽細胞のエピソームリプログラミング
最初の細胞の調製
生きた状態の、正常ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＨＮＤＦ）をＡｌｌＣｅｌｌｓ、ＬＬＣから購入した（エメリービル、カリフォルニア、ＩＤ番号ＮＦ０９０１１９、カタログ番号ＨＮ００６００２）。線維芽細胞を、サプリメントを補った、ＡｌｌＣｅｌｌｓ、ＬＬＣの新生児ヒト皮膚線維芽細胞培地（ＮＨＮＤＦ基本培地＋サプリメント）（エメリービル、カリフォルニア、カタログ番号ＨＮ００６００６およびＨＮ００６００７）中で培養した。Ｔ７５フラスコからの細胞を、標準的なトリプシン／ＥＤＴＡ方法で１：１０に分割し、細胞のうちのいくつかを１２ウェルプレートにプレーティングして、ピューロマイシンを用いた殺菌曲線の生成に使用した。６つのウェルに１：５に希釈した細胞を播種し、さらに６つのウェルに１：１０に希釈した細胞を播種した。バイアル１本あたりおよそ１Ｍの細胞が入ったバイアルを６本凍結した。凍結は２回目の継代の時点で行った。
【０２１６】
細胞の改変
分割の６日後、コンフルエントに達した線維芽細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡ分離によって回収した。血球計算板を使って細胞を計数し、４００万個の細胞をペレットにし、リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、ＬｏｎｚａからのＡｍａｘａＮＨＤＦヌクレオフェクション溶液（ウォーカーズビル、メリーランド、カタログ番号ＶＰＤ−１００１）２００μｌに再懸濁し、その後、１００μｌチューブ２本に分けた。１５μｇのプラスミド１０２４（図２。ＡＡＶＳ１遺伝子遺伝子座のホモロジーアームの間にクローニングされている、トロポニン２プロモーターと、それによって誘導されている緑色蛍光タンパク質および常に発現しているＰＧＫ−ピューロマイシンカセットをコードしている。ベクター１０２４）を１００μｌの線維芽細胞溶液に加えた。ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼをコードしているメッセンジャーＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ、カタログ番号ＣＴＩ１−ＫＴ）５μｌを加え、この混合物をエレクトロポレーション用キュベットに移し、Ｌｏｎｚａ（ウォーカーズビル、メリーランド）のＡｍａｘａＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＩＩ装置を使用し、プログラムＵ−２０でヌクレオフェクションを行った。細胞を素早く、１４ｍｌの新生児ヒト皮膚線維芽細胞培地に再懸濁し、このうちの１２ｍｌを、１枚の６ウェルプレートにプレーティングし、残りの２ｍｌを培地１０ｍｌを加えて希釈し、２枚目の６ウェルプレートにプレーティングした。ヌクレオフェクションの効率をモニタリングするために、残りの１００μｌの線維芽細胞に、緑色蛍光タンパク質遺伝子を恒常的に発現しているプラスミドを５．５μｇ加え、ジンクフィンガーヌクレアーゼ非存在下で２回目のヌクレオフェクションを行った。ジンクフィンガーヌクレアーゼを導入した後、細胞を３日間維持し、その後、薬剤による選択を開始した（０日目）。
【０２１７】
ピューロマイシン陰性ＮＨＤＦでの細胞死の割合をモニタリングするために、ＧＦＰを導入したＮＨＤＦのうちの１つのウェルに、０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを曝露させた。トランスフェクトしたＡＡＶＳ１ＨＤＮＦの高密度プレートの５つのウェルのうちの４つに、０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを曝露した。１、３、および４日目に培地を交換した。５日目に、培地を非選択培地に交換した。ピューロマイシンで選択した細胞を粉砕し、死んだ接着性の細胞を除去した。トランスフェクトされたＧＦＰ細胞は全て除かれたが、トランスフェクトされたＡＡＶＳ１細胞はおよそ１５％が除去された。６日目、ＮＨＤＦを導入したＡＡＶＳ１細胞は、選択から回復し、増殖し始めた。選択しなかったＮＨＤＦを導入したＡＡＶＳ１を６ウェルプレート上で増殖させた。８日目、選択しなかったＮＨＤＦを導入したＡＡＶＳ１細胞のうちの５つのウェルを回収し、ゲノムＤＮＡを精製した。１つのウェルは、新しい６ウェルプレートへの継代に使用した。１０日目、組み入れられたおよび野生型のＡＡＶＳ１遺伝子座を検出するためのプライマーを用い、選択しなかったＮＨＤＦを導入したＡＡＶＳ１細胞についてＰＣＲを行った。陽性対照としては、ＧＦＰを恒常的に発現している細胞を、陰性対照としては、ｉＰＳＣから誘導した心筋細胞を使用した。以下の指標および試薬をＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ：９８℃３０秒、［９８℃１０秒、６８℃２０秒、７２℃６０秒］×３５サイクル、７２℃２分。反応成分は下記表２に示す。ＰＣＲプライマーは以下のものを使用した。
【０２１８】
ターゲティングしたＡＡＶＳ１遺伝子座の検出：
「ＭＪＭ３２」ＡＡＶＳ１−Ｆ１−ＡＣＣ  ＡＣＴ  ＴＴＧ  ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＡＣＴ  ＧＧＣ  ＴＴＣ  ＴＧ（配列番号１）
「ＭＪＭ１５」ＳＶ４０ｐＡ−Ｆｏｒ−ＴＧＧＡＣＡＡＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＧＡＡＴＧＣＡＧ（配列番号２）
【０２１９】
組み込まれていないＡＡＶＳ１遺伝子座の検出。
「ＭＪＭ３２」ＡＡＶＳ１−Ｆ１−ＡＣＣ  ＡＣＴ  ＴＴＧ  ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＡＣＴ  ＧＧＣ  ＴＴＣ  ＴＧ（配列番号３）
「ＭＪＭ４４」ＡＡＶＳ１−Ｒ１−ＡＣＣ  ＣＡＡ  ＡＡＧ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＴＡＧ  ＡＣ（配列番号４）
【０２２０】
【表２】
2014520551.tif 000005
【０２２１】
ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動によって、線維芽細胞のＡＡＶＳ１部位に、組換えプラスミドが正しく導入されたことが分かった。
【０２２２】
ヌクレオフェクションを行った後に使用するための培地も準備した。Ｎ２Ｂ２７培地の成分を表３に示す。いずれの例においても、培地成分を混合し、０．２２μｍフィルターを通した。
【０２２３】
【表３】
2014520551.tif 000006
2014520551.tif 000007
【０２２４】
細胞のヌクレオフェクション、改変した細胞のリプログラミング、および、同時に行う野生型細胞の改変とリプログラミング
上述した、ジンクフィンガーヌクレアーゼで修飾したＮＨＤＦ（正常ヒト胎児線維芽細胞）をリプログラミングＤＮＡベクターでヌクレオフェクションした。
【０２２５】
簡単に説明すると、３種類のリプログラミングベクター（＃３４−図３、＃３６−図４および＃１２３−図５）を２本の１．５ｍｌチューブ内で混合した。４枚の６ウェルプレートからＭａｔｒｉｇｅｌを吸引し、２ｍＬの回復培地（ＮＨＮＤＦ基本培地にＡｌｌＣｅｌｌｓからのサプリメントを加えたもの。ｚｂＦＧＦが４ｎｇ／ｍＬ、ＨＡ−１００が１０μＭ）と交換した。線維芽細胞をトリプシンで分離し、計数し、１×１０６個の細胞を、Ａｍａｘａ  ＮＨＤＦ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎキット（Ｌｏｎｚａ：ＶＰＤ−００１）のヌクレオフェクション緩衝液（１００μｌ）に再懸濁した。再懸濁した、ＡＡＶＳ１挿入断片を含有するＨＮＤＦ細胞をリプログラミングベクターに加え、その後、キュベットに移した。細胞を、ＡｍａｘａプログラムＵ−２０によるエレクトロポレーションに用いた。キュベットに温めた回復培地を加え、キュベットの中身を、６ｍＬの回復培地の入った１５ｍＬの円錐管に移した。細胞を、２枚の６ウェルプレートにまいた。
【０２２６】
リプログラミングプラスミドの入った２本目の１．５ｍＬに、８．１μｇのプラスミド１０３６を加えた（図６を参照のこと。１０３６は、ZｓＧｒｅｅｎ蛍光タンパク質の発現を誘導する、恒常的に発現しているＥＦｌαプロモーターと、恒常的に発現しているＰＧＫ−ピューロマイシンカセットを含み、これらは両方とも、ＡＡＶＳ１遺伝子座のホモロジーアームの間にクローニングした）。野生型ＨＮＤＦ細胞（ＺＦＮによって、これまでにターゲティングされていない）をトリプシン分離によって回収し、１００μｌのヌクレオフェクション溶液に再懸濁し、その後、リプログラミングプラスミドおよびプラスミド１０３６に加えた。ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的としているジンクフィンガーヌクレアーゼをコードしているメッセンジャーＲＮＡ（５μｌ）（シグマ、セントルイス、ミズーリ、カタログ番号ＣＴＩ１−ＫＴ）を加え、この細胞をＡｍａｘａプログラムＵ−２０でのヌクレオフェクションに用い、その後プレーティングした。プレーティングに続いて、順次および同時リプログラミング／改変実験からの細胞を以下のように維持した。
【０２２７】
２日目−細胞をリプログラミング培地（Ｎ２Ｂ２７、表５を参照のこと）に移した。いくつかは蛍光を示した。
【０２２８】
４日目−細胞にリプログラミング培地を与えた
【０２２９】
６日目−細胞にリプログラミング培地を与えた
【０２３０】
８日目−細胞にリプログラミング培地を与えた
【０２３１】
１０日目−細胞にリプログラミング培地を与えた。画像を取得した。
【０２３２】
１２日目−細胞にリプログラミング培地を与えた
【０２３３】
１３日目−細胞にＴｅＳＲを与えた
【０２３４】
１５日目−細胞にＴｅＳＲを与えた
【０２３５】
１７日目−細胞にＴｅＳＲを与えた
【０２３６】
２０日目−細胞にＴｅＳＲを与えた
【０２３７】
２１日目−生きたままの状態で染色を行い、コロニーを採取した
【０２３８】
２７日目−Ｐ２クローンの採取
【０２３９】
線維芽細胞における、ジンクフィンガーヌクレアーゼ介在性組換えとそれに続く細胞のリプログラミングを使用した実験からの結果を以下に要約し、また、細胞全ての表現型を図１および図９で説明する。
連続した、改変とそれに続くリプログラミング用の出発細胞：増殖させた４００万個の初代ヒト線維芽細胞
−薬剤耐性をもち、選択された、上手く改変された細胞のパーセンテージ：およそ１５％
−薬剤耐性をもつ、リプログラミング用の出発細胞：２００万個−Ｔｒａ−１６０に対する免疫染色が陽性（赤色）のリプログラミングされたコロニー（多能性）の数：＞１００
−染色されなかったコロニーの数（部分的にリプログラミングされたと考えられる）：およそ２０
【０２４０】
線維芽細胞における同時の、ジンクフィンガーヌクレアーゼ介在性組換えとリプログラミング因子を含むベクターによるゲノム改変を使用した実験からの結果を以下に要約する。
−同時の改変およびリプログラミング用の出発細胞：増殖させた２００万個の初代ヒト線維芽細胞
−抗Ｔｒａｌ６０陽性（赤色）かつ緑色ｚｓＧＦＰを発現している初期細胞コロニーの数：１４（注意：１回継代した後、６コロニーが赤色かつ緑色で、３コロニーが赤色のみ、および５コロニーが選択過程で生存しなかった）
−抗Ｔｒａ１６０陽性の初期細胞コロニー（赤色のみ）の数：およそ４０
−緑色のみの細胞の数：計数できないほど多かった（これらは改変した線維芽細胞であると考えられる）。
−染色されなかったコロニーの数：およそ２０（これらは部分的にリプログラミングされたコロニーであると考えられる）
−無色の線維芽細胞の数：計数できないほど多かった（これらは修飾されなかった出発線維芽細胞であった）。
【０２４１】
本明細書で例示したエピソームリプログラミングおよびゲノム改変の方法を図１、図８、および図１０で提供する。
【０２４２】
実施例２−エピソームリプログラミングおよびＰｉｇｇｙＢａｃを使ったＰＢＭＣのゲノム改変
実験用の試薬を最初に準備した。それら試薬の一覧を表４中に提供する。
【０２４３】
【表４】
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2014520551.tif 000010
【０２４４】
最初の細胞培養
成体ＰＢＭＣを６日間培養し、その後、改変／リプログラミングを行った。
【０２４５】
ＥＢ（赤芽球）増殖培地を表５に示すように調製した。それぞれのサイトカインを、製造業者による推奨に従って溶解する。滅菌ＰＢＳ＋２ｍｇ／ｍｌＢＳＡでストック溶液を調製する。溶解したサイトカインの分割量は、４℃で２週間までは保存可能である。初代細胞培養の初期には、抗生物質を使用するのが望ましい。ゲンタマイシン（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を使用した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【０２４６】
【表５】
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【０２４７】
１０×１０７ＰＢＭＣのバイアルを１本液体窒素から取り出し、３７℃の水浴中で融解した。細胞を、３０ｍｌのＳｔｅｍＳｐａｎ（登録商標）ＳＦＥＭが入った５０ｍｌの円錐管に一滴ずつ移した。円錐管を１２００ＲＰＭで５分間遠心した。細胞を１０ｍＬのＳｔｅｍＳｐａｎ（登録商標）ＳＦＥＭに再懸濁し、次いで、血球計算板を使って計数した。９．４×１０７個の細胞を回収した。細胞を、再度１２００ＲＰＭで遠心し、９４ｍｌのＥＢ増殖培地＋１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンに、最終的な細胞密度が１×１０６細胞／ｍｌになるように再懸濁した。６ウェルプレートのそれぞれのウェルに（合計４４ウェル）、２ｍｌの細胞を加えた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で週末の間インキュベートし、その後、それぞれのウェルに２ｍｌのＥＢ増殖培地を加えた。
ヌクレオフェクション
【０２４８】
ヌクレオフェクション（０日目）、懸濁している細胞を回収し、血球計算板を使用して計数した。１．８×１０７個の細胞が回収された。少数の細胞試料について、フローサイトメトリーを行った。
【０２４９】
この実験にはＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎでコーティングしたプレートを使用した。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎのストック（１ｍｇ／ｍＬ）を標準的な１×ＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈し、穏やかに転倒混和した。希釈したＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（１ｍＬ）を、組織で処理していない６ウェルプレートのそれぞれのウェルに加えた。確実に一定に分散するように、プレートを軽く叩いた。プレートを２時間、室温でインキュベートした。あるいは、プレートをパラフィルムで覆って、平らな場所に４℃で一晩置き、翌日使用することもできる。処理したウェルは１×ＰＢＳで洗浄し、２ｍＬの２％ＢＳＡ溶液を加え、プレートを３０分間室温でインキュベートした。ウェルを１×ＰＢＳで洗浄し、すぐに使用した。
【０２５０】
それぞれの実験条件に合わせて、ＤＮＡマスターミックスを以下のように作成した。
【０２５１】
ウェル１．１〜１．６：トランスポサーゼによって挿入されるｚｓＧｒｅｅｎを発現させるための、ＰｉｇｇｙｂａｃトランスポサーゼＤＮＡベクター＋リプログラミングＤＮＡベクター（＃３４、＃３６＆＃１２３；それぞれ、図３、４および５）＋ベクターＤＮＡ＃１０３８（図７に示す）。ウェル１．１〜１．６用のマスターミックス（６ウェルプレートの全てのウェル）。１５．５μｌのマスターミックス＋１００個の細胞を、表６に示すように、１ウェル当たりの１回のヌクレオフェクションに使用する。基本的な計画を図８に示す。
【０２５２】
【表６】
2014520551.tif 000012
【０２５３】
対照ウェル３．１〜３．２：リプログラミングＤＮＡベクター（＃３４、＃３６＆＃１２３；それぞれ、図３、４および５）＋ＰＢ転移ＤＮＡベクター＃１０３８（ｓｈｏｗｎｉｎ図７）、ＰＢトランスポサーゼなし。１１．５μｌのマスターミックス＋１００万個細胞を、下記表７に示すように、１ウェル当たりの１回のヌクレオフェクションに使用する。
【０２５４】
【表７】
2014520551.tif 000013
【０２５５】
適当量のマスターミックスをそれぞれのキュベットのそばに置いた。細胞を、１×１０７個細胞／１００μｌの密度でヌクレオフェクション溶液と混合した。１００μｌの細胞をエレクトロポレーション用キュベットに加え、何回か指先ではじいて、マスターミックスを混ぜ合わせた。細胞をエレクトロポレーション処理した（ウェル１．５にはＡｒｃ．ｃ．１のエラーが起きた）。エレクトロポレーションを行った直後に、５００μｌのリプログラミング培地を、電気穿孔処理した後の各キュベットに加えた。キュベットの中身を２ｍｌのリプログラミング培地が入った６ウェルプレートの１つのウェルに移した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０２５６】
２日目−培地をリプログラミング培地に交換する。各ウェルの細胞を短時間遠心し、２ｍｌのリプログラミング培地に細胞を再懸濁した
【０２５７】
４日目−２ｍｌのリプログラミング培地を加えた
【０２５８】
６日目−培地１ｍｌを除去し、２ｍｌの新しいリプログラミング培地と交換した。
【０２５９】
８日目−培地２ｍｌを除去し、２ｍｌの新しいリプログラミング培地と交換した。
【０２６０】
１１日目−培地１．５ｍｌを除去し、２ｍｌのＴｅＳＲ２と交換した。各ウェル中の蛍光緑色のコロニーの数を大ざっぱに数えた。
【０２６１】
１３日目−培地の７５％を除去した。２ｍｌのＴｅＳＲ２を与えた。
【０２６２】
１５日目−ＴｅＳＲ２を与えた
【０２６３】
１８日目−ＴｅＳＲ２を与えた
【０２６４】
１９日目−生きている細胞の染色、コロニー採取（ＡＳ）
【０２６５】
２０日目−生きている細胞の染色とコロニー採取（ＳＤ）
【０２６６】
ｐｉｇｇｙＢａｃベクターによる組み込みを使用した実験からの結果を以下に要約する。
−同時の改変およびリプログラミング用の出発細胞：増殖させた６００万個のヒトＰＢＭＣ（計６ウェル）
−抗Ｔｒａｌ６０陽性（赤色）かつ緑色ｚｓＧＦＰを発現している初期細胞コロニーの数：１００個代
−抗Ｔｒａ１６０陽性の初期細胞コロニー（赤色のみ）の数：およそ５０
−緑色のみの細胞の数：２
−ｐｉｇｇｙＢａｃに関する対照ウェル（トランスポサーゼを加えなかった）：２００万個のヒトＰＢＭＣ（計２ウェル）
−抗Ｔｒａｌ６０陽性（赤色）かつ緑色ｚｓＧＦＰを発現している初期細胞コロニーの数：０
−抗Ｔｒａ１６０陽性の初期細胞コロニー（赤色のみ）の数：１００個代
−緑色のみの細胞の数：０
【０２６７】
実施例３−エピソームリプログラミングおよびジンクフィンガーヌクレアーゼを使ったＰＢＭＣゲノムの改変
以下の実験条件以外は、実施例２で説明したのと同じ過程を使用した。
【０２６８】
ウェル２．１〜２．６：ジンクフィンガーヌクレアーゼによって導入されるZｓＧｒｅｅｎ遺伝子を発現させるための、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードしているＲＮＡ＋リプログラミングベクター＋ベクター１０３６。ＤＮＡはＡＡＶＳ１ジンクフィンガー切断部位に挿入される。１２．０μｌのマスターミックス＋５μｌのＺＦＮ  ＲＮＡ＋１００万個の細胞を、下記表８に示すように、１ウェル当たりの１回のヌクレオフェクションに使用した。基本的な計画を図９に示す。
【０２６９】
【表８】
2014520551.tif 000014
【０２７０】
対照ウェル４．２〜４．３：これらのは汚染され、結果が出なかった。ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードしているＲＮＡなし＋リプログラミングＤＮＡベクター＋ベクター＃１０３６。１２．０μｌのマスターミックス＋１００万個の細胞を、下記表９に示すように、１ウェル当たりの１回のヌクレオフェクションに使用した。
【０２７１】
【表９】
2014520551.tif 000015
【０２７２】
適当量のマスターミックスをそれぞれのキュベットのそばに置いた（ジンクフィンガーｍＲＮＡを使用直前にマスターミックスに加えた）。以降の方法は実施例２で記載したものと同じとした。
【０２７３】
ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用した実験からの結果を以下に要約する。
【０２７４】
−同時の改変およびリプログラミング用の出発細胞：増殖させた６００万個のヒトＰＢＭＣ（６ウェル）
【０２７５】
−抗Ｔｒａｌ６０陽性（赤色）かつ緑色ｚｓＧＦＰを発現している初期細胞コロニーの数：１５
【０２７６】
−抗Ｔｒａ１６０陽性の初期細胞コロニー（赤色のみ）の数：およそ２００
【０２７７】
−緑色のみの細胞の数：１
【０２７８】
−ジンクフィンガー実験に関する対照ウェル（ジンクフィンガーヌクレアーゼを加えなかった）：ウェルは両方とも汚染され、データが得られなかった。
【０２７９】
−抗Ｔｒａｌ６０陽性（赤色）かつ緑色ｚｓＧＦＰを発現している初期細胞コロニーの数：０
【０２８０】
−抗Ｔｒａ１６０陽性の初期細胞コロニー（赤色のみ）の数：１００個代
【０２８１】
−緑色のみの細胞の数：０
【０２８２】
実施例４−連続的な方法と比べて、ゲノム改変と細胞リプログラミングを同時に行った場合の効率は明かである
図１０に示すように、本発明の同時に行う細胞リプログラミングとゲノム改変過程は（図１０の過程３）、ゲノム改変の後に細胞リプログラミングを行った場合（図１０の過程２）と比較して、必要とされた時間が有意に短縮され、また、細胞リプログラミングの後にゲノム改変を行った場合（図１０の過程１）と比較すると、さらに時間が短縮された。かかった時間が短縮されたことに加えて、細胞のリプログラミングと改変を同時に行うと、使用される材料（培養プレートなど）も有意に少なくて済んだ。つまり、過程３は現在行われている最もよい実施方法と比較して、時間および材料の点で有意に効率的である。過程２を用いると、過程１よりもかかる時間が１９％短縮され、プレートは６０％少なくて済む。過程３を用いると、過程１よりもかかる時間が３４％短縮され、プレートは６１％少なくて済む。過程３を用いると、過程２よりもかかる時間が１９％短縮され、使用するプレートの枚数はほぼ同じである。
【０２８３】
以下の記載は、細胞リプログラミングおよびゲノム改変工程を行っている間に使用されるマイクロプレートおよびフラスコに関する、詳細な事例解析である。
【０２８４】
単一提供源の試料に関するコロニー採取およびリプログラミング後の増殖：計４４枚のプレートを使用して、３つのコロニーを得た。
【０２８５】
単一提供源の試料に関するコロニー採取およびゲノム改変後のｉＰＳＣの増殖：計６９枚のプレートを使用して、３つのコロニーを得た。
【０２８６】
単一提供源に関する、初代細胞のゲノム改変とそれに続く薬剤選択と増殖：１枚のプレートと２Ｔ−フラスコを使用したが、コロニーは採取されなかった。
【０２８７】
単一提供源の試料に関する初代細胞の同時のゲノム改変とリプログラミング：４４プレートを使用して、３つのコロニーを得た。
【０２８８】
まとめると、過程１では、１つの提供源につき、１１３枚のプレート（６９＋４４）が使用され、３つのコロニーが選択・解析された（さらに３つのコロニーを凍結した）。過程２および３では、それぞれ４４枚または４５枚のプレートが使用され、１つの提供源につき、およそ６８枚のプレートが保存された。提供源試料の準備に高処理系を使用する場合、過程２または３のどちらかを行うことで、過程１と比べて、材料を有意に削減することができ、過程３ではさらに、時間も大きく短縮される（過程２と比較して１９％の短縮）。つまり、細胞のリプログラミングとゲノムの改変を同時に行う過程３を使用すると、ゲノム改変したｉＰＳＣの生産の産業化に関する、現在行われている最もよい形態が有意に向上される。
【０２８９】
実施例５：ＭＹＨ６遺伝子をターゲティングするＴＡＬＥヌクレアーゼの設計
天然のＭＹＨ６プロモーターの制御下で融合タンパク質を生産するために、ヒトＭＹＨ６遺伝子の最後のイントロンを相同的組換えの標的とする。標的とするヒト配列染色体１４（マイナス鎖）、イントロン３８〜３９、位置２３、８５１、２７３〜２３、８５１、６３６、は、３６４ｂｐの長さである。Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｗｅｂｓｉｔｅで提供されているソフトウェアプログラム（ｂｏｇｌａｂｘ．ｐｌｐ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ＴＡＬＥＮＴ／）を使用して、ＴＡＬエフェクター結合部位（プラス鎖）の可能性があり、１６〜３０ｂｐのＤＮＡを認識する部位を２７カ所同定した。この配列のうちの１６種類を下記表１０に例示する。最適なＤＮＡ結合ドメインを選択するため、ヒトゲノムおよび転写された配列対する各配列の一意性を、ＢＬＡＳＴ相同性解析を使用して調査する。最適な配列とは、可能な限り長く、それでもなお、独自性を有し、かつ、最適な結合親和性のための適切な長さ（１６〜２５ｂｐ）をもつものである。例えば、２９４番目にあるＴＡＬＥＮ、ＨＤはＣに結合し、ＮＧはＴに結合し、ＮＮはＧに結合する。
【０２９０】
一般的に、複数のＴＡＬＥＮを構築し、二本鎖に切断を導入する場合には、効率および特異性を試験する。それぞれのＴＡＬＥＮについて、ＤＮＡ切断部位におよぶ、隣接した相同的なアームの対を同定する。これらのアームは通常、５００〜１５００ｂｐの長さであるが、様々な範囲の長さのものを使用することができる。
【０２９１】
設計したＴＡＬＥＮを使った、体細胞の同時に行うゲノム改変とリプログラミングは、実施例１〜３で概要を示したように達成することができる。しかしながら、この例における組み込み用ベクターは、ＭＹＨ６遺伝子のＴＡＬＥＮ部位に隣接するＭＹＨ６配列を含む。
【０２９２】
【表１０】
2014520551.tif 000016
【０２９３】
本明細書で開示し、請求する全ての方法は、本開示を踏まえて、過度の実験なしに、作成および実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい態様の観点から説明してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法および工程または方法の工程の順序に、変更を適用してもよいことは、当業者には明かである。より具体的には、化学および生理学の両面で関連のある特定の薬剤を、本明細書に記載の薬剤と置き換えてもよく、同時に、同じまたは同様の結果が達成されるであろうことも明かである。そのような、当業者に明かな類似する置換および変更は、添付の請求項によって定義される本発明の精神、範囲および概念の内にあると見なされる。
【０２９４】
参考文献
以下の参考文献は、例示となる方法の詳細または本明細書に示すものへの捕捉となる他の詳細を提供する範囲で、参照することによって本明細書に組み込まれる。
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Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｎ．  ２００４／０００２５０８  
Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｎ．  ２００４／００１４７５５  
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Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｎ．  ２００５／０２０９２６１  
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Ｌｅｖｉｔｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９４（２３）：  １２６１６−１２６２１  ，  １９９７．
Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，  ４：１６，  ２００９．  
Ｌｉ  ｅｔａｌ，  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，  ４：１６−１９，  ２００９．  
Ｌｉ  ｅｔａｌ，  Ｃｅｌｌ，  １３５：１２９９，  ２００８．  
Ｌｉ  ｅｔａｌ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３９（ｌ）：３５９−３７２，  ２０１１．  
Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ６：８０５−８０８，  ２００９．  
Ｌｉｎｄｎｅｒ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，  Ｐｌａｓｍｉｄ，  ５８：１−１２，  ２００７．  
Ｌｉｎｄｎｅｒ  ｅｔａｌ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ８２（１２）：５６９３−７０２，  ２００８．  
Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ３４６：  １３１  −１３９，  ２００６．  
Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３，  ５８７−５９０，  ２００８．  
ｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｌｏｏｄ，  １  １３：５４７６−５４７９，  ２００９．  
Ｌｏｗｒｙ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １０５：２８８３，  ２００８．  
Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２４（２）：  １８５−１８７，  ２００６ｂ．  
Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ３（８）：６３７−４６，  ２００６ａ．  
Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ３：６３７−６４６，  ２００６ｃ．  
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Ｏｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４４８：３１３−３１７，  ２００７．  
Ｏｋｉｔａ  ｅｌ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３２２：９４９，  ２００８．  
Ｏｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ  ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３２２：９４９−９５３，  ２００８．  
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ＰＣＴ  Ａｐｐｌｎ．  ＷＯ  ９４／０９６９９  
ＰＣＴ  Ａｐｐｌｎ．  ＷＯ  ９５／０６１２８  
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ＰＣＴ  Ｐｕｂｌｎ．  ＷＯ  ０１／０８８１００  
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Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３２４：７９７，  ２００９．  
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Ｚｈｏｕ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｄ，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，  ２００９  （Ａｈｅａｄ  ｏｆ  Ｅｐｕｂ  Ｐｒｉｎｔ）．  
Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，  ４：３８１−３８４，  ２００９．  
Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ２４（７）：  １４０６−１４１７，  ２００５．
【図１】
2014520551.tif 000017
【図２】
2014520551.tif 000018
【図３】
2014520551.tif 000019
【図４】
2014520551.tif 000020
【図５】
2014520551.tif 000021
【図６】
2014520551.tif 000022
【図７】
2014520551.tif 000023
【図８】
2014520551.tif 000024
【図９】
2014520551.tif 000025
【図１０】
2014520551.tif 000026
【配列表】
2014520551000001.app
【国際調査報告】
2014520551.tif 000027
2014520551.tif 000028
2014520551.tif 000029
2014520551.tif 000030