(57)【要約】  本発明は、過酸化水素の検出に有用な式（Ｉ）、（II）又は（III）（式中、Ｒ１及びＲ１１は、ボロン酸又はホウ酸エステルである）で示される化合物、及びそれを用いる方法を提供する。  【化１】2014525411.tif 000080  【化２】2014525411.tif 000081  【化３】2014525411.tif 000082【選択図】なし
2014525411.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式(I)で示される化合物。
2014525411.tif 000065
（Ｉ）
（式中、
Ｒ1は、ボロン酸又はホウ酸エステルであり、
各Ｒ4、Ｒ5及びＲ7は、独立して、Ｈ、ハロ、メチル、及びトリフルオロメチルから選択され、
Ｌ1は、リンカーである。）
【請求項２】
Ｒ1が、−Ｂ（ＯＲ6）2であり、
各Ｒ6が、独立して、Ｈ及びＣ1-4アルキルから選択される、
請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ1が、
2014525411.tif 000066
であり、
各Ｒ12及びＲ13が、独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、ＣＦ3、フェニルもしくは置換されたフェニルから選択されるか、又はＲ12とＲ13が共に、３〜７個の炭素を有するアルキル環をとすることができ、もしくは縮合６員芳香族環により置き換え得る、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ1が、
2014525411.tif 000067
であり、
各Ｒ14、Ｒ15及びＲ16が独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、ＣＦ3、フェニル及び置換されたフェニルから選択されるか、又は両Ｒ15が共に、３〜７個の炭素を有するアルキル環を形成することができ、Ｒ14及びＲ15又はＲ15及びＲ16が共に、３〜７個の炭素原子を有するアルキル環をなすことができ、又は６員芳香族環により置き換え得る、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｌ1が、
2014525411.tif 000068
であり、
Ａが、−Ｃ6（Ｒ10）4−、−Ｏ−Ｃ6（Ｒ10）4−又は（ＣＲ11＝ＣＲ11）n−又はＳ−Ｃ6（Ｒ10）4−又はＮＲ’−Ｃ6（Ｒ10）4又は直接結合であり、
Ｒ’が、Ｈ又はＣ1-4アルキルであり、
各Ｒ3が独立して、ハロ、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4ヒドロキシアルキル、又はＣ1-4アルキルカルボン酸であり、
各Ｒ10が独立して、Ｈ、ハロ、ＣＨ3、ＯＣＨ3、又はＮＯ2であり、
各Ｒ11が独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、
ｎが、１又は２であり、
Ｘが、−Ｏ−、
2014525411.tif 000069
から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
次式（ＩＩ）で示される化合物。
2014525411.tif 000070
（式中、
Ｒ11は、ボロン酸又はホウ酸エステルであり、
Ｒ2は、−（ＣＨ2）n−Ｔ又はＣ1-5アルキルであり、
Ｒ6は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ又はＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒからなる群より選択され、
Ｒ8は、
2014525411.tif 000071
Ｈ又は低級シクロアルキルからなる群より選択され、
ここでＲ3及びＲ4は、両者ともＨ又は両者ともＣ1-2アルキルであり、
ｎは、０〜３であり、
各Ｒは独立して、Ｃ1-7アルキルであり；
Ｔは、アリール、ヘテロアリール、置換されたアリール、置換されたヘテロアリール又はシクロアルキルであり、
Ｌ2は、リンカーであり、
破線の結合は、飽和又は不飽和となり得る任意の環の存在を示す。）
【請求項７】
Ｌ2が、
2014525411.tif 000072
であり、
Ａが、−Ｃ6（Ｒ10）4−又は（ＣＲ21＝ＣＲ21）n−又はＯ−Ｃ6（Ｒ10）4−又はＳ−Ｃ6（Ｒ10）4−又はＮＲ’−Ｃ6（Ｒ10）4−又は直接結合であり、
Ｒ’が、Ｈ又はＣ1-4アルキルであり、
各Ｒ3が独立して、ハロ、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4ヒドロキシアルキル、又はＣ1-4アルキルカルボン酸であり、
各Ｒ10が独立して、Ｈ、ハロ、ＣＨ3、ＯＣＨ3、又はＮＯ2であり、
各Ｒ21が独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、
ｎが、１又は２であり、
Ｘが、直接結合、−Ｃ（Ｏ）−、及びＣ（Ｏ）ＮＲ22（ここで、Ｒ22は、Ｈ又はＣ1-4アルキルである）から選択される、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
式（ＩＩＩ）で示される化合物。
2014525411.tif 000073
（式中、
Ｒ11が、ボロン酸又はホウ酸エステルであり、
Ｒ2が、−（ＣＨ2）n−Ｔ又はＣ1-5アルキルであり、
Ｒ6が、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ又はＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒからなる群より選択され、
Ｒ8が、
2014525411.tif 000074
Ｈ又は低級シクロアルキルからなる群より選択され、
ここでＲ3及びＲ4が、両者ともＨ又は両者ともＣ1-2アルキルであり；
ｎが、０〜３であり；
各Ｒが独立して、Ｃ1-7アルキルであり、
Ｔが、アリール、ヘテロアリール、置換されたアリール、置換されたヘテロアリール又はシクロアルキルであり、
Ｌ3が、リンカーであり、
破線の結合が、飽和又は不飽和となり得る任意の環の存在を示す。）
【請求項９】
Ｌ3が、
2014525411.tif 000075
であり、
式中、Ａが、−Ｃ6（Ｒ10）4−又は（ＣＲ21＝ＣＲ21）n−であり、
各Ｒ3が独立して、ハロ、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4ヒドロキシアルキル、又はＣ1-4アルキルカルボン酸であり、
各Ｒ10が独立して、Ｈ、ハロ、ＣＨ3、ＯＣＨ3、又はＮＯ2であり、
各Ｒ21が独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、
ｎが、１又は２である、
請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ11が、
2014525411.tif 000076
であり、
各Ｒ12及びＲ13が、独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、ＣＦ3、フェニル、もしくは置換されたフェニルから選択されるか、又はＲ12及びＲ13共に、３〜７個の炭素を有するアルキル環をなすことができ、もしくは縮合６員芳香族環により置き換え得る、請求項６〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ11が、
2014525411.tif 000077
であり、
各Ｒ14、Ｒ15、及びＲ16が独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、ＣＦ3、フェニル及び置換されたフェニルから選択されるか、又は両Ｒ15が共に、３〜７個の炭素を有するアルキル環を形成することができ、Ｒ14及びＲ15又はＲ15及びＲ16が共に、３〜７個の炭素原子を有するアルキル環をなすことができ、又は６員芳香族環により置き換え得る、請求項６〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ2が、
2014525411.tif 000078
であり、Ｘが、Ｏ又はＳである、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ2が、Ｃ2-5直鎖状アルキルである、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ8が、
2014525411.tif 000079
低級シクロアルキル又はＨであって、式中、Ｒ3及びＲ4は、両者ともＨ又はＣ1-2アルキルである、請求項６〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ8が、ベンジルである、請求項６〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
細胞中の過酸化水素を検出する方法であって、
（ａ）細胞を請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物と接触させる工程、
（ｂ）ルシフェラーゼ反応混合物を前記接触させた細胞に添加する工程、
（ｃ）バイオルミネッセンスを測定し、それにより前記細胞中の過酸化水素の存在を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
細胞中の過酸化水素を検出する方法であって、
（ａ）細胞を第１の反応ベッセル中で請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物と接触させて、インキュベーション混合物を形成させる工程、
（ｂ）前記インキュベーション混合物の少なくとも一部を第２の反応ベッセルに移す工程、
（ｃ）ルシフェラーゼ反応混合物を前記第２の反応ベッセルに添加する工程、
（ｄ）バイオルミネッセンスを測定し、それにより前記細胞中の過酸化水素の存在を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
前記ルシフェラーゼ反応混合物が、Ｄ−システインを更に含む、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、動物のものである、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項２０】
試料中の過酸化水素を検出する方法であって、
（ａ）試料を請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物と接触させて、第１の混合物を形成させる工程、
（ｂ）前記第１の混合物の少なくとも一部をルシフェラーゼ反応混合物及びＤ−システインと接触させる工程、
（ｃ）バイオルミネッセンスを測定し、それにより前記試料中の過酸化水素の存在を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
前記Ｄ−システインが、ルシフェラーゼ反応混合物のための反応混合物の一部である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記バイオルミネッセンスを定量する、請求項１６〜２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞又は試料を検査化合物又は検査条件で処理した後、請求項１〜１５に記載の化合物と接触させる、請求項１６〜２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記検査条件が、温度の変化、酸素張力、又はイオン強度もしくは浸透圧の変化を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記試料が、細胞又は細胞培地を含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記試料が、細胞又は動物の生理学的試料を含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２７】
試料中の過酸化水素の存在又は量に及ぼす検査化合物又は検査条件の影響を測定する方法であって、
ａ）試料を検査化合物又は検査条件で処理する工程、
ｂ）前記ａ）からの試料を請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物と接触させる工程、
ｃ）ルシフェラーゼ反応混合物を前記試料に添加する工程、
ｄ）バイオルミネッセンスを測定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
前記試料が、細胞又は細胞培地を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料が、細胞又は動物の生理学的試料を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記検査条件が、温度の変化、酸素張力、又はイオン強度もしくは浸透圧の変化を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、参照により本明細書に組み入れられる２０１１年８月１６日に出願した米国特許仮出願第６１／５２４，０６６号の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、過酸化水素の検出のためのアッセイを提供する。
【背景技術】
【０００３】
健康を維持するために、細胞、特に哺乳類細胞は、場合により酸化還元状態／電位と呼ばれる酸化状態と還元状態の間の均衡を保つ必要がある。過酸化物をはじめとする活性酸素種（ＲＯＳ）は、細胞活性及び代謝に関わっている。
【０００４】
細胞代謝に及ぼすＲＯＳの影響は、様々な化学種において十分に実証されてきた。これらは、アポトーシスにおける役割のみならず、宿主防御遺伝子の誘導及びイオン輸送系の動員における役割も含む。ＲＯＳは、酸化シグナル伝達としても公知の酸化還元シグナル伝達に関わっている。加えてＲＯＳは、心臓血管疾患をはじめとする様々な炎症反応に対する細胞活性に関わっている。一般に細胞に及ぼすＲＯＳの有害作用としては、（ａ）ＤＮＡの損傷、（ｂ）脂質における多価不飽和脂肪酸の酸化（脂質過酸化）；（ｃ）蛋白質におけるアミノ酸の酸化、及び（ｄ）補因子の酸化による特定酵素の不活化、が挙げられる。
【０００５】
過酸化水素は、細胞内で様々な方法で生じる。モノアミンオキシダーゼなどの酵素は、酵素活性の産物として過酸化水素を産生する。また、過酸化水素は、スーパーオキシドとの反応の際に、スーパーオキシドジスムターゼにより産生されるものなどの他の活性酸素種の相互変換によっても形成され得る。
【０００６】
ＡｍｐｌｅｘＲｅｄなどの現在の過酸化水素検出技術は、西洋ワサビペルオキシダーゼを必要とすること、酵素結合アッセイを必要とすること、ＤＴＴ、２−メルカプトエタノールなどのチオールの存在下での不安定性、及び８．５を超えるｐＨでの不安定性、をはじめとする複数の限定を有する。
【発明の概要】
【０００７】
一実施形態において、本発明は、式（Ｉ）
【化１】
2014525411.tif 000003
の化合物であって、
式中、
Ｒ1が、ボロン酸又はホウ酸エステルであり、
各Ｒ4、Ｒ5及びＲ7が独立して、Ｈ、ハロ、メチル、及びトリフルオロメチルから選択され、
Ｌ1が、リンカーである
化合物を提供する。
【０００８】
また、本発明は、式（ＩＩ）
【化２】
2014525411.tif 000004
の化合物であって、
式中、
Ｒ11が、ボロン酸又はホウ酸エステルであり、
Ｒ2が、−（ＣＨ2）n−Ｔ又はＣ1-5アルキルであり、
Ｒ6が、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ又はＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒからなる群より選択され、
Ｒ8が、
【化３】
2014525411.tif 000005
、
【化４】
2014525411.tif 000006
、
Ｈ又は低級シクロアルキルからなる群より選択され、
ここでＲ3及びＲ4が、両者ともＨ又は両者ともＣ1-2アルキルであり、
ｎが、０〜３であり、
各Ｒが、独立してＣ1-7アルキルであり、
Ｔが、アリール、ヘテロアリール、置換されたアリール、置換されたヘテロアリール又はシクロアルキルであり、
Ｌ2が、リンカーであり、
破線の結合が、飽和又は不飽和となり得る任意の環の存在を示す、
化合物も提供する。
【０００９】
加えて本発明は、式（ＩＩＩ）
【化５】
2014525411.tif 000007
の化合物であって、
式中、
Ｒ11が、ボロン酸又はホウ酸エステルであり、
Ｒ2が、−（ＣＨ2）n−Ｔ又はＣ1-5アルキルであり、
Ｒ6が、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ又はＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒからなる群より選択され、
Ｒ8が、
【化６】
2014525411.tif 000008
、
【化７】
2014525411.tif 000009
、
Ｈ又は低級シクロアルキルからなる群より選択され、
ここでＲ3及びＲ4が、両者ともＨ又は両者ともＣ1-2アルキルであり、
ｎが、０〜３であり、
各Ｒは独立して、Ｃ1-7アルキルであり、
Ｔが、アリール、ヘテロアリール、置換されたアリール、置換されたヘテロアリール又はシクロアルキルであり、
Ｌ3が、リンカーであり；
破線の結合が、飽和又は不飽和となり得る任意の環の存在を示す、
化合物を提供する。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、細胞を式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で示される化合物及びルシフェラーゼ反応混合物と接触させ、バイオルミネッセンスを測定し、それにより細胞中の過酸化水素の存在を検出する、細胞中の過酸化水素を検出する方法を提供する。
【００１１】
更に別の実施形態において、本発明は、細胞を式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で示される化合物と接触させてインキュベーション混合物を形成させる、細胞中の過酸化水素を検出する方法を提供する。インキュベーション混合物の少なくとも一部を第２の反応ベッセルに移して、ルシフェラーゼ反応混合物を第２の反応ベッセルに添加する。その後、バイオルミネッセンスを測定し、それにより細胞中の過酸化水素の存在を検出する。
【００１２】
更なる実施形態において、本発明は、試料を式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で示される化合物及びルシフェラーゼ反応混合物及びＤ−システインと接触させる、試料中の過酸化水素を検出する方法を提供する。その後、バイオルミネッセンスを測定し、それにより試料中の過酸化水素の存在を検出する。
【００１３】
更に別の実施形態において、本発明は、試料を検査化合物と接触させる、試料中の過酸化水素の存在又は量に及ぼす検査化合物の影響を測定する方法を提供する。式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で示される化合物及びルシフェラーゼ反応混合物を添加して、バイオルミネッセンスを測定する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、様々なホウ酸ルシフェリン(luciferin borate)を示す。
【図２】図２は、様々なベンゾチアゾールを示す。
【図３】図３は、ＰＢＩ４７５９を用いた過酸化水素の高感度検出を示す。
【図４】図４は、還元剤の添加が、ＰＢＩ４４７２などのホウ酸ルシフェリンにより見られ得るバックグランドを還元する可能性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、過酸化水素の検出に有用な化合物、及びそれを用いる方法を提供する。
【００１６】
定義
本明細書で用いられる以下の用語及び表現は、以下に表示された意味を有する。本発明の化合物が不斉置換された炭素原子を含み、光学活性又はラセミ体の形態で単離され得るとされる。ラセミ体の形態の分割又は光学活性のある出発原料からの合成などによる光学活性形態を調製する方法は、当業者に知られている。全てのキラル、ジアステレオマー、ラセミ体の形態及び全ての幾何異性体が、本発明の一部をなす。
【００１７】
ラジカル、置換基及び範囲について以下に列挙された具体的な値は例示に過ぎず、それらはラジカル及び置換基についての他の定義された値、又は定義された範囲内の他の値を排除するものではない。
【００１８】
本明細書で用いられる用語「置換された」は、示された原子の通常の原子価を超えていないこと、及び置換基が安定した化合物をもたらすことを前提に、基上の１個以上（例えば、１、２、３、４、又は５個、幾つかの実施形態において１、２又は３個、他の実施形態において１又は２個）の水素が、「置換された」を用いる表現において、示された基（複数可）の選択物又は当業者に公知の適切な基で置き換えられていることを示すものとする。適切な示された基としては、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリフルオロメチルチオ、ジフルオロメチル、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルフィニル、ヘテロアリールスルホニル、複素環スルフィニル、複素環スルホニル、ホスファート、スルファート、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシル（アルキル）アミン、及びシアノが挙げられる。加えて、適切な示された基としては、例えば、−Ｘ、−Ｒ、−Ｏ-、−ＯＲ、−ＳＲ、−Ｓ-、−ＮＲ2、−ＮＲ3、＝ＮＲ、−ＣＸ3、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ2、＝Ｎ2、−Ｎ3、ＮＣ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＲ  −Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ-、−Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｒ、−ＯＳ（＝Ｏ）2ＯＲ、−Ｓ（＝Ｏ）2ＮＲ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ、−ＯＰ（＝Ｏ）Ｏ2ＲＲ、−Ｐ（＝Ｏ）Ｏ2ＲＲ  −Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ−）2、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）2、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｘ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ、−Ｃ（Ｓ）ＮＲＲ、−Ｃ（ＮＲ）ＮＲＲを挙げることができ、ここで、各Ｘは独立して、ハロゲン（「ハロ」）、すなわちＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、各Ｒは独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、保護基又はプロドラッグ部分である。当業者によって容易に理解される通り、置換基がオキソ（＝Ｏ）又はチオキソ（＝Ｓ）などである場合、置換された原子上の２個の水素原子が置き換えられる。
【００１９】
本明細書で用いられる用語「アルキル」は、例えば、１〜３０個の炭素原子、多くの場合１〜１２個又は１〜約６個の炭素原子を有する分枝状、非分枝状、又は環状炭化水素を指す。例としては、限定するものではないが、メチル、エチル、１−プロピル、２−プロピル、１−ブチル、２−メチル−１−プロピル、２−ブチル、２−メチル−２−プロピル（ｔ−ブチル）、１−ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、２−メチル−２−ブチル、３−メチル−２−ブチル、３−メチル−１−ブチル、２−メチル−１−ブチル、１−ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル，２−メチル−２−ペンチル、３−メチル−２−ペンチル、４−メチル−２−ペンチル、３−メチル−３−ペンチル、２−メチル−３−ペンチル、２，３−ジメチル−２−ブチル、３，３−ジメチル−２−ブチル、ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシルなどが挙げられる。アルキルは、非置換であっても、又は置換されていてもよい。アルキルは、場合により部分的又は完全に不飽和とすることができる。それゆえ、アルキル基の列挙は、アルケニル基及びアルキニル基の両方を含む。先に記載及び例示された通り、アルキルは、一価炭化水素ラジカルとすることができ、又は二価炭化水素ラジカル（即ち、アルキレン）とすることができる。
【００２０】
用語「アルケニル」は、モノラジカル分枝状又は非分枝状の部分的に不飽和の炭化水素鎖（即ち、炭素−炭素ｓｐ2二重結合）を指す。一実施形態において、アルケニル基は、２〜１０個の炭素原子、又は２〜６個の炭素原子を有することができる。別の実施形態において、アルケニル基は、２〜４個の炭素原子を有する。例としては、限定するものではないが、エチレン又はビニル、アリル、シクロペンテニル、５−ヘキセニルなどが挙げられる。アルケニルは、非置換又は置換され得る。
【００２１】
用語「アルキニル」は、完全な不飽和の点を有する、モノラジカル分枝状又は非分枝状炭化水素鎖（即ち、炭素−炭素ｓｐ三重結合）を指す。一実施形態において、アルキニル基は、２〜１０個の炭素原子、又は２〜６個の炭素原子を有することができる。別の実施形態において、アルキニル基は、２〜４個の炭素原子を有することができる。この用語は、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、１−オクチニルなどの基により例示される。アルキニルは、非置換又は置換され得る。
【００２２】
用語「シクロアルキル」は、単環式又は多環式の縮合環を有する３〜１０個の炭素原子の環状アルキル基を指す。このようなシクロアルキル基は、例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチルなどの単環式構造、又はアダマンタニルなどの多環式構造を含む。シクロアルキルは、非置換又は置換され得る。シクロアルキル基は、一価又は二価とすることができ、上述の通り、アルキル基と、場合により置換され得る。シクロアルキル基は、場合により１つ以上の不飽和の部位を含むことができ、例えばシクロアルキル基は、シクロヘキセン、１，３−シクロヘキサジエン、１，４−シクロヘキサジエンなどの１つ以上の炭素−炭素二重結合を含むことができる。
【００２３】
用語「アルコキシ」は、基アルキル−Ｏ−（ここで、アルキルは、本明細書に定義された通りである）を指す。一実施形態において、アルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペンタオキシ（ｐｅｎｔｏｘｙ）、ｎ−ヘキサオキシ（ｈｅｘｏｘｙ）、１，２−ジメチルブトキシなどが挙げられる。アルコキシは、非置換又は置換され得る。
【００２４】
本明細書で用いられる「アリール」又は「Ａｒ」は、親芳香族環系の単一の炭素原子から１つの水素原子を除去することにより得られる芳香族炭化水素基を指す。ラジカルは、親環系の飽和又は不飽和炭素原子の位置に存在することができる。アリール基は、６〜３０個の炭素原子を有することができる。アリール基は、単環（例えば、フェニル）又は多環式縮合（縮合）環を有することができ、ここで少なくとも１つの環は、芳香族（例えば、ナフチル、ジヒドロフェナントレニル、フルオレニル、又はアントリル）である。典型的なアリール基としては、限定するものではないが、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルなどから得られるラジカルが挙げられる。アリールは、アルキル基で上述した通り、非置換又は場合により置換され得る。
【００２５】
用語「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードを指す。同様に、用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素を指す。
【００２６】
用語「ハロアルキル」は、同一であっても、又は異なっていてもよい本明細書に定義された１個以上のハロ基により置換されている、本明細書に定義されたアルキルを指す。一実施形態において、ハロアルキルは、１、２、３、４又は５個のハロ基で置換されることができる。別の実施形態において、ハロアルキルは、１、２又は３個のハロ基で置換されることができる。また、用語ハロアルキルは、ペルフルオロアルキル基をも含む。代表的なハロアルキル基としては、例えば、トリフルオロメチル、３−フルオロドデシル、１２，１２，１２−トリフルオロドデシル、２−ブロモオクチル、３−ブロモ−６−クロロヘプチル、１Ｈ，１Ｈ−ペルフルオロオクチルなどが挙げられる。ハロアルキルは、アルキル基で上述した通り、場合により置換され得る。
【００２７】
用語「ヘテロアリール」は、１、２又は３個の芳香族環を含有し、芳香族環内に少なくとも１個の窒素、酸素、又は硫黄原子を含有する、単環式、二環式、又は三環式環系として本明細書に定義され、非置換であってもよく、又は「置換された」との定義で上述した通り、例えば、１個以上、特に１〜３個の置換基で置換され得る。典型的なヘテロアリール基は、１個以上のヘテロ原子に加えて、２〜２０個の炭素原子を含む。ヘテロアリール基の例としては、限定するものではないが、２Ｈ−ピロリル、３Ｈ−インドリル、４Ｈ−キノリジニル、アクリジニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、ベンゾチアゾリル、β−カルボリニル、カルバゾリル、クロメニル、シンノリニル、ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラニル、フラザニル、フリル、イミダゾリル、イミジゾリル（ｉｍｉｄｉｚｏｌｙｌ）、インダゾリル、インドリジニル、インドリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフチリジニル、オキサゾリル、ペリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナルサジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、テトラゾリル、及びキサンテニルが挙げられる。一実施形態において、用語「ヘテロアリール」は、炭素を含有する５又は６個の環原子と、非過酸化物の酸素、硫黄及びＮ（Ｚ）（ここで、Ｚは、存在しないか、又はＨ、Ｏ、アルキル、アリールもしくは（Ｃ1−Ｃ6）アルキルアリールである）から独立して選択される１、２、３又は４個のヘテロ原子と、を含む単環式芳香族環を意味する。別の実施形態において、ヘテロアリールは、それから得られる約８〜１０個の環原子のオルト縮合二環式複素環、特にベンゾ誘導体、又はそれにプロピレンジラジカル、トリメチレンジラジカルもしくはテトラメチレンジラジカルを縮合させることにより得られるものを意味する。
【００２８】
用語「複素環」は、酸素、窒素及び硫黄の群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有し、用語「置換された」の下で本明細書に定義された１個以上の基で場合により置換された、飽和又は部分的に不飽和の環系を指す。複素環は、１個以上のヘテロ原子を含有する単環式、二環式、又は三環式の基とすることができる。複素環基は、環に付着されたオキソ（＝Ｏ）基又はチオキソ（＝Ｓ）基も含有することができる。複素環基の非限定的な例としては、１，３−ジヒドロベンゾフラン、１，３−ジオキソラン、１，４−ジオキサン、１，４−ジチアン、２Ｈ−ピラン、２−ピラゾリン、４Ｈ−ピラン、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、インドリニル、イソクロマニル、イソインドリニル、モルホリン、ピペラジニル、ピペリジン、ピペリジル、ピラゾリジン、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピロリジン、ピロリン、キヌクリジン、及びチオモルホリンが挙げられる。
【００２９】
用語「複素環」は、限定ではなく例として、Ｐａｑｕｅｔｔｅ，  Ｌｅｏ  Ａ．；  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗ．Ａ．  Ｂｅｎｊａｍｉｎ、ニューヨーク、１９６８年）、特に１、３、４、６、７及び９章、Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、「Ａ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９５０年から現在）の特に１３、１４、１６、１９及び２８巻、ならびにＪ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １９６０，  ８２，  ５５６６中に記載される複素環のモノラジカルを含むことができる。一実施形態において、「複素環」は、本明細書に定義される「炭素環」を含み、ここでは１個以上（例えば１、２、３又は４個）の炭素原子は、ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、又はＳ）で置き換えられている。
【００３０】
複素環の例としては、限定ではなく例として、ジヒドロピリジル（ｄｉｈｙｄｒｏｙｐｙｒｉｄｙｌ）、テトラヒドロピリジル（ピペリジル）、チアゾリル、テトラヒドロチオフェニル、硫黄酸化テトラヒドロチオフェニル、ピリミジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、ピペリジニル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、２−ピロリドニル、ピロリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オクタヒドロイソキノリニル、アゾシニル、トリアジニル、６Ｈ−１，２，５−チアジアジニル、２Ｈ，６Ｈ−１，５，２−ジチアジニル、チエニル、チアントレニル、ピラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサチニル（ｐｈｅｎｏｘａｔｈｉｎｙｌ）、２Ｈ−ピロリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、１Ｈ−インダゾリ（１Ｈ−ｉｎｄａｚｏｌｙ）、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、カルバゾリル、β−カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ピリミジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フラザニル、フェノキサジニル、イソクロマニル、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、インドリニル、イソインドリニル、キヌクリジニル、モルホリニル、オキサゾリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、オキシンドリル、ベンゾオキサゾリニル、イサチノイル、及びビステトラヒドロフラニルが挙げられる。
【００３１】
限定ではなく例として、炭素結合複素環は、ピリジンの２、３、４、５もしくは６位、ピリダジンの３、４、５もしくは６位、ピリミジンの２、４、５もしくは６位、ピラジンの２、３、５もしくは６位、フラン、テトラヒドロフラン、チオフラン、チオフェン、ピロールもしくはテトラヒドロピロールの２、３、４もしくは５位、オキサゾール、イミダゾールもしくはチアゾールの２、４もしくは５位、イソオキサゾール、ピラゾールもしくはイソチアゾールの３、４もしくは５位、アジリジンの２もしくは３位、アゼチジンの２、３もしくは４位、キノリンの２、３、４、５、６、７もしくは８位、又はイソキノリンの１、３、４、５、６、７もしくは８位で結合されている。炭素結合複素環としては、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、５−ピリジル、６−ピリジル、３−ピリダジニル、４−ピリダジニル、５−ピリダジニル、６−ピリダジニル、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル、６−ピリミジニル、２−ピラジニル、３−ピラジニル、５−ピラジニル、６−ピラジニル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリルなどが挙げられる。
【００３２】
限定ではなく例として、窒素結合複素環は、アジリジン、アゼチジン、ピロール、ピロリジン、２−ピロリン、３−ピロリン、イミダゾール、イミダゾリジン、２−イミダゾリン、３−イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、２−ピラゾリン、３−ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドール、インドリン、１Ｈ−インダゾールの１位、イソインドール又はイソインドリンの２位、モルホリンの４位、及びカルバゾール又はβ−カルボリンの９位で結合され得る。一実施形態において、窒素結合複素環としては、１−アジリジル、１−アゼテジル、１−ピロリル、１−イミダゾリル、１−ピラゾリル、及び１−ピペリジニルが挙げられる。
【００３３】
用語「炭素環」は、単環として３〜８個の炭素原子、二環として７〜１２個の炭素原子、及び多環として最大約３０個の炭素原子を有する飽和、不飽和又は芳香族環を指す。単環式炭素環は、典型的には３〜６個の環原子、更により典型的には５又は６個の環原子を有する。二環式炭素環は、例えばビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］もしくは［６，６］系として配列された７〜１２個の環原子、又はビシクロ［５，６］もしくは［６，６］系として配列された９もしくは１０個の環原子を有する。炭素環の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１−シクロペント−１−エニル、１−シクロペント−２−エニル、１−シクロペント−３−エニル、シクロヘキシル、１−シクロヘキサ−１−エニル、１−シクロヘキサ−２−エニル、１−シクロヘキサ−３−エニル、フェニル、スピリル及びナフチルが挙げられる。炭素環は、アルキル基について上述した通り場合により置換され得る。
【００３４】
用語「アルカノイル」又は「アルキルカルボニル」は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒを指し、ここで、Ｒは先に定義されたアルキル基である。
【００３５】
用語「アシルオキシ」又は「アルキルカルボキシ」は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｒを指し、ここで、Ｒは、上述のアルキル基である。アシルオキシ基の例としては、限定するものではないが、アセトキシ、プロパノイルオキシ、ブタノイルオキシ、及びペンタノイルオキシが挙げられる。上述のいずれかのアルキル基を用いて、アシルオキシ基を形成させることができる。
【００３６】
用語「アルコキシカルボニル」は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ（又は「ＣＯＯＲ」）を指し、ここで、Ｒは、上述のアルキル基である。
【００３７】
用語「アミノ」は、−ＮＨ2を指す。アミノ基は、用語「置換された」について本明細書に定義された通り、場合により置換され得る。
【００３８】
用語「アルキルアミノ」は−ＮＲ2を指し、ここで、少なくとも１個のＲは、アルキルであり、第２のＲは、アルキル又は水素である。
【００３９】
用語「アシルアミノ」は、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒを指し、ここで、各Ｒは独立して、水素、アルキル又はアリールである。
【００４０】
用語「ヒドロキシアルキル」は、−ＯＨにより置換されたアルキル基を指す。
【００４１】
用語「アルキルカルボン酸」は、−ＣＯＯＨにより置換されたアルキル基を指す。
【００４２】
用語「中断される」は、示された原子それぞれの通常の原子価を超えず、中断により安定した化合物が得られることを前提として、用語「中断される」を使用する表現において参照される特定の炭素鎖の２つの隣接した炭素原子（及びそれらが付着されている水素原子（例えば、メチル（ＣＨ3）、メチレン（ＣＨ2）又はメチン（ＣＨ）））の間に別の基が挿入されることを示す。炭素鎖を中断し得る適切な基としては、例えば、１個以上の非過酸化物オキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）、イミノ（−Ｎ（Ｈ）−）、メチレンジオキシ（−ＯＣＨ2Ｏ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、カルボニルジオキシ（−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−）、カルボキシラト（−ＯＣ（＝Ｏ）−）、イミン（Ｃ＝ＮＨ）、スルフィニル（ＳＯ）及びスルホニル（ＳＯ2）が挙げられる。アルキル基は、前述の適切な基の１個以上（例えば、１、２、３、４、５又は約６）によって中断することができる。中断の部位は、アルキル基の炭素原子と、アルキル基が付着されている炭素原子との間とすることができる。
【００４３】
用語「リンカー」は、１〜４個のＯ原子、Ｎ原子、Ｓ原子、又は場合により置換されたアリール、ヘテロアリールもしくは複素環基によって場合により中断された（Ｃ1−Ｃ12）アルキルジラジカルを指す。
【００４４】
他に明記されていない限り用語「ルシフェラーゼ」は、天然由来、組換え体、又は突然変異体のルシフェラーゼを指す。天然由来の場合のルシフェラーゼは、生物体の当業者により容易に得ることができる。ルシフェラーゼが、天然由来のもの、又は組換え体もしくは突然変異体ルシフェラーゼ、即ち、天然由来ルシフェラーゼのルシフェラーゼ−ルシフェリン反応における活性を保持するものである場合、それは、ルシフェラーゼをコードする核酸を発現するように形質転換された細菌、酵母、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞などの培養物から容易に得ることができる。更に、組換え体又は突然変異体ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼをコードする核酸を用いて、インビトロの無細胞系から得ることができる。ルシフェラーゼは、ウィスコンシン州マディソン所在のＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手できる。
【００４５】
本明細書で用いられる「バイオルミネッセンス」又は「ルミネッセンス」は、酵素と光を発生する基質との間の反応の結果生じる光である。このような酵素（バイオルミネッセンス酵素）の例としては、ホタルルシフェラーゼ、例えばフォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）又はフォチヌス・ペンスリバニカ（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｅｎｎｓｌｙｖａｎｉｃａ）、コメツキムシルシフェラーゼ、ウミホタルルシフェラーゼなどが挙げられる。
【００４６】
「ルシフェラーゼ反応混合物」は、ルシフェラーゼ酵素と、ルシフェラーゼ酵素に光シグナルを発生させる物質とを含有する。発光シグナルを発生させるのに必要となる物質、ならびに必要となる物質の特定の濃度及び／又は量は、使用するルシフェラーゼ酵素及び実施するルシフェラーゼ系アッセイの種類に応じて変動する。一般にホタルルシフェラーゼの場合、これらの物質としては、ＡＴＰ、硫酸マグネシウムなどのマグネシウム（Ｍｇ2+）塩、例えば熱安定性ホタルルシフェラーゼといったホタルルシフェラーゼ酵素及びルシフェリンがホタルルシフェラーゼの基質として用いられる場合に光を発生させることが可能なルシフェリンを挙げることができる。多くの場合、適切なｐＨで反応を保持するための緩衝液、ルシフェラーゼ活性の保持を助けるＰＲＩＯＮＥＸ又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの添加剤、還元剤、洗浄剤、エステラーゼ、塩、アミノ酸、例えばＤ−システインなどをはじめとする他の物質が、溶液に添加される。例示的なルシフェラーゼ反応混合物は、熱安定性ホタルルシフェラーゼ、ＭｇＳＯ4、ＡＴＰ、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ、ＮＰ−９、及びトリシンを含有する。他の代替的ルシフェラーゼ反応混合物は、例えばＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼといったオプロフォラス（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ）ルシフェラーゼ、例えばＴｒｉｓ−Ｃｌ又はＴｒｉｓ塩基といった緩衝液、場合により例えばＴＣＥＰといったバックグランド還元剤（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）、を含む。
【００４７】
化合物
一態様において、本発明は、式（Ｉ）
【化８】
2014525411.tif 000010
の化合物であって、
式中、
Ｒ1が、ボロン酸又はホウ酸エステルであり、
各Ｒ4、Ｒ5及びＲ7が独立して、Ｈ、ハロ、メチル、及びトリフルオロメチルから選択され、
Ｌ1が、リンカーである、
化合物を提供する。
【００４８】
特定の実施形態において、Ｒ1は、ホウ酸エステルである。例えばＲ1は、−Ｂ（ＯＲ6）2（ここで、各Ｒ6は独立して、Ｈ及びＣ1-4アルキルから選択される）とすることができる。
【００４９】
Ｒ1は、
【化９】
2014525411.tif 000011
であって、式中、
各Ｒ12及びＲ13が独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、ＣＦ3、フェニル、又は置換されたフェニルから選択されてもよい。あるいはＲ12及びＲ13が共に、３〜７個の炭素を有するアルキル環をなすことができ、又は縮合６員芳香族環により置き換えられ得る。
【００５０】
加えてＲ1は、
【化１０】
2014525411.tif 000012
であって、式中、各Ｒ14、Ｒ15、及びＲ16が独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、ＣＦ3、フェニル及び置換されたフェニルから選択されてもよい。あるいは両方のＲ15が共に、３〜７個の炭素を有するアルキル環を形成することができ、Ｒ14及びＲ15又はＲ15及びＲ16が共に、３〜７個の炭素原子を有するアルキル環をなすことができ、又は６員芳香族環により置き換えられ得る。
【００５１】
特定の実施形態において、Ｌ1は、
【化１１】
2014525411.tif 000013
であり、Ａが、−Ｃ6（Ｒ10）4−又は（ＣＲ11＝ＣＲ11）n−又は直接結合又はＯ−（Ｃ6（Ｒ10）4−又はＳ−Ｃ6（Ｒ10）4−又はＮＲ’−Ｃ6（Ｒ10）4であり、Ｒ’が、Ｈ又はＣ1-4アルキルであり、各Ｒ3が独立して、ハロ、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4ヒドロキシアルキル、又はＣ1-4アルキルカルボン酸であり、各Ｒ10が独立して、Ｈ、ハロ、ＣＨ3、ＯＣＨ3、又はＮＯ2であり、各Ｒ11が独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、ｎが、１又は２であり、Ｘが、−Ｏ−、
【化１２】
2014525411.tif 000014
、
【化１３】
2014525411.tif 000015
、
及び
【化１４】
2014525411.tif 000016
から選択される。
【００５２】
幾つかの実施形態において、−Ｌ1−Ｒ1は、
【化１５】
2014525411.tif 000017
である。更なる実施形態において、−Ｌ1−Ｒ1は、
【化１６】
2014525411.tif 000018
であり、Ａが、−Ｏ−（Ｃ6Ｈ4）−であり、Ｘは、−Ｏ−である。他の実施形態において、−Ｌ1−Ｒ1は、
【化１７】
2014525411.tif 000019
であり、Ａは、直接結合であり、Ｘは、−Ｏ−である。
【００５３】
特定の実施形態において、−Ｌ1−Ｒ1は、
【化１８】
2014525411.tif 000020
であり、Ａは、−Ｏ−（Ｃ6Ｈ4）−であり、Ｘは、−ＮＨＣＯ2−である。特定の実施形態において、−Ｌ1−Ｒ1は、
【化１９】
2014525411.tif 000021
であり、Ａは、−Ｏ−（Ｃ6Ｈ4）−であり、Ｘは、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ2−である。
【００５４】
【化２０】
2014525411.tif 000022
が挙げられる。
【００５５】
別の実施形態において、本発明は、式（ＩＩ）
【化２１】
2014525411.tif 000023
又は式（ＩＩＩ）
【化２２】
2014525411.tif 000024
の化合物であって、
式中、
Ｒ11が、ボロン酸又はホウ酸エステルであり、
Ｒ2が、−（ＣＨ2）n−Ｔ又はＣ1-5アルキルであり、
Ｒ6が、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ又はＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒからなる群より選択され、
Ｒ8が、
【化２３】
2014525411.tif 000025
、
【化２４】
2014525411.tif 000026
、Ｈ又は低級シクロアルキルからなる群より選択され、
ここでＲ3及びＲ4が、両者ともＨ又は両者ともＣ1-2アルキルであり、
ｎが、０〜３であり、
各Ｒは独立して、Ｃ1-7アルキルであり、
Ｔが、アリール、ヘテロアリール、置換されたアリール、置換されたヘテロアリール又はシクロアルキルであり、
Ｌ2又はＬ3が、リンカーであり、
破線の結合が、飽和又は不飽和となり得る任意の環の存在を示す、
化合物を提供する。
【００５６】
特定の実施形態において、Ｒ11はホウ酸エステルである。例えばＲ11は、−Ｂ（ＯＲ7）2であって、式中、ここで、各Ｒ7は独立して、Ｈ及びＣ1-4アルキルから選択されてもよい。
【００５７】
Ｒ11は、
【化２５】
2014525411.tif 000027
であって、各Ｒ12及びＲ13は独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、ＣＦ3、フェニル、又は置換されたフェニルから選択されてもよい。あるいはＲ12及びＲ13は共に、３〜７個の炭素を有するアルキル環をなすことができ、又は縮合６員芳香族環により置き換えられ得る。
【００５８】
加えてＲ11は、
【化２６】
2014525411.tif 000028
であって、各Ｒ14、Ｒ15、及びＲ16は独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、ＣＦ3、フェニル及び置換されたフェニルから選択されてもよい。あるいは両方のＲ15が共に、３〜７個の炭素を有するアルキル環を形成することができ、Ｒ14及びＲ15又はＲ15及びＲ16が共に、３〜７個の炭素原子を有するアルキル環をなすことができ、又は６員芳香族環により置き換えられ得る。
【００５９】
特定の実施形態において、Ｌ2は、
【化２７】
2014525411.tif 000029
であり、Ａが、−Ｃ6（Ｒ10）4−又は（ＣＲ21＝ＣＲ21）n−又はＯ−Ｃ6（Ｒ10）4−又はＳ−Ｃ6（Ｒ10）4−又はＮＲ’−Ｃ6（Ｒ10）4−又は直接結合であり、Ｒ’は、Ｈ又はＣ1-4アルキルであり、各Ｒ3は独立して、ハロ、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4ヒドロキシアルキル、又はＣ1-4アルキルカルボン酸であり、各Ｒ10は独立して、Ｈ、ハロ、ＣＨ3、ＯＣＨ3、又はＮＯ2であり、各Ｒ21は独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、ｎは、１又は２であり、Ｘは、直接結合、−Ｃ（Ｏ）−、及びＣ（Ｏ）ＮＲ22（ここで、Ｒ22は、Ｈ又はＣ1-4アルキルである）から選択される。
【００６０】
幾つかの実施形態において、−Ｌ2−Ｒ11は、
【化２８】
2014525411.tif 000030
である。
【００６１】
特定の実施形態において、Ｌ3は、
【化２９】
2014525411.tif 000031
であって、Ａは、−Ｃ6（Ｒ10）4−又は（ＣＲ21＝ＣＲ21）n−であり、各Ｒ3は独立して、ハロ、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4ヒドロキシアルキル、又はＣ1-4アルキルカルボン酸であり、各Ｒ10は独立して、Ｈ、ハロ、ＣＨ3、ＯＣＨ3、又はＮＯ2であり、各Ｒ21は独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、ｎは、１又は２である。
【００６２】
特定の実施形態において、−Ｌ3−Ｒ11は、
【化３０】
2014525411.tif 000032
である。
【００６３】
幾つかの実施形態において、Ｒ2は、
【化３１】
2014525411.tif 000033
又はＣ2-5アルキルであり、各Ｘは独立して、−Ｓ−、−Ｏ−又はＮＨ−であり、Ｚは、−ＣＨ−又はＮ−であり：Ｙは、−Ｈ又はＯＨであり、Ｗは、−ＮＨ2、ハロ、−ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ2Ｒであり、Ｒは、Ｃ1-7アルキルである。
【００６４】
幾つかの実施形態において、Ｒ2は、
【化３２】
2014525411.tif 000034
であり、Ｘは、Ｏ又はＳである。他の実施形態において、Ｒ2は、Ｃ2-5直鎖状アルキルである。特定の実施形態において、Ｒ8は、
【化３３】
2014525411.tif 000035
、低級シクロアルキル又はＨであって、Ｒ3及びＲ4は、両者ともＨ又はＣ1-2アルキルである。別の実施形態において、Ｒ8は、ベンジルである。
【００６５】
式（ＩＩ）で示される適切な化合物は、
【化３４】
2014525411.tif 000036
を含む。
【００６６】
化合物の合成
本明細書に記載された化合物は、様々な方法を用いて合成してもよい。例示的な合成を、以下のスキーム１及び２に概括する。
【化３５】
2014525411.tif 000037
スキーム１
【００６７】
芳香族ベンジル−６−Ｏ−２−シアノベンゾチアゾールのホウ酸ピナコールの合成を、２段階で完遂することができる。典型的には、ホウ酸ピナコールエステル４−芳香族メチルアルコールを、Ｐｈ3Ｐ及びＣＢｒ4を用いてホウ酸ピナコール４−芳香族臭化メチルに変換し、その後、Ｋ2ＣＯ3の存在下で２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾールと反応させて、所望の化合物を得る。アリル−６−Ｏ−２−シアノベンゾチアゾールのホウ酸ピナコールの合成を、６−ヒドロキシ−２−シアノベンゾチアゾールをホウ酸ピナコールアリルヨージドで直接アルキル化することにより完了させることができる（スキーム１）。
【化３６】
2014525411.tif 000038
スキーム２
【００６８】
典型的にはホウ酸ピナコール芳香族メチルアルコールを、ピリジンの存在下、トリホスゲンを用いてそのカルボノクロリダートに変換し、その後、６−アミノ−２−シアノベンゾチアゾールと反応させて目的の分子を得る。
【００６９】
ホウ酸セレンテラジン誘導体を、一般に、セレンテラジンをホウ酸ピナコール４−芳香族メチルブロミドでアルキル化してＯ−アルキル化されたホウ酸セレンテラジン及びＣ−アルキル化されたホウ酸セレンテラジンを得ることにより、合成してもよい（スキーム３）。
【化３７】
2014525411.tif 000039
スキーム３
【００７０】
当業者に認識され得る通り、本明細書の式で示される化合物を合成する代替的な方法は、当業者に明白であろう。加えて様々な合成ステップを代替的な配列又は順序で実施して、所望の化合物を得てもよい。本明細書に記載された化合物を合成する際に有用となる合成化学転位及び保護基の方法論（保護及び脱保護）は、当業者に知られており、例えば、Ｒ．  Ｌａｒｏｃｋ， Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ， ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  （１９８９）；  Ｔ．Ｗ．  Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．  Ｗｕｔｓ, Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｄ．  Ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９９１）；  Ｌ．  Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｆｉｅｓｅｒ， Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ‘ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９４）；及びＬ．  Ｐａｑｕｅｔｔｅ，  ｅｄ．，  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９５）、及びそれらの後の版に記載されるものを含む。
【００７１】
使用方法
一態様において、本発明は、過酸化水素を検出する方法を提供する。一実施形態において、試料を本明細書に記載された式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で示される化合物と接触させて、第１の混合物を形成させる。第１の混合物の少なくとも一部を、ルシフェラーゼ反応混合物及びＤ−システインと接触させる。バイオルミネッセンスを検出し、それにより過酸化水素の存在を検出する。
【００７２】
本発明の別の実施形態において、細胞を本明細書に記載された式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で示される化合物と接触させ、ルシフェラーゼ反応混合物を接触させた細胞に添加し、バイオルミネッセンスを検出する。特定の実施形態において、Ｄ−ルシフェリンも、接触させた細胞に添加する。
【００７３】
別の態様において、本発明は、試料、細胞又は動物中の過酸化水素の存在又は量に及ぼす検査化合物又は検査条件の影響を測定する方法を提供する。一実施形態において、試料、細胞又は動物を検査化合物又は検査条件と接触させた後、本明細書に記載された式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で示される化合物及びルシフェラーゼ反応混合物と接触させる。試料又は細胞中の過酸化水素の存在又は量に及ぼす検査化合物又は検査条件の影響を、バイオルミネッセンスを検出することにより決定する。適宜、検査条件が、温度の変化、酸素張力、又はイオン強度もしくは浸透圧の変化であってもよい。
【００７４】
試薬は、連続して、又は同時に添加してもよい。試薬を同時に添加する場合、単一溶液又は複数の溶液中に存在してもよい。
【００７５】
望ましい場合、シグナルを定量してもよい。シグナルを、標準曲線と比較してもよい。このシグナル強度は、試料中の過酸化水素の量の存在の関数である。シグナルを、対照と比較してもよい。
【００７６】
本発明は、培地中の細胞、又は動物、例えば生存する動物体内の細胞の細胞増殖の際の過酸化水素の存在又は量を測定してもよい。研究の目的のために、動物の細胞中での測定の場合、本明細書に記載された式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で示される化合物を注射などで動物に投与し、又は動物により摂取される水などの水溶液もしくは食物に添加する。この化合物の、ルシフェラーゼの基質となる産物への変換を、動物の細胞中で発現されるルシフェラーゼにより媒介されるバイオルミネッセンスにより、
具体的には、注射などで動物に投与されるルシフェラーゼによるトランスジェニック動物（例えば、マウス、ラット、及びマーモセットザル）の全身画像により、又は例えば血液、血漿、尿など、もしくは組織試料といった生理学的液体を採取して、それらをルシフェラーゼ反応混合物と混和することにより、検出することができる。
【００７７】
細胞は、真核細胞、例えば酵母、トリ、植物、昆虫、又は限定するものではないがヒト、サル、ネズミ、イヌ、ウシ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ヤギもしくはブタの細胞をはじめとする哺乳類細胞、あるいは原核細胞、あるいは２種以上の異なる生物体の細胞、あるいは細胞溶解物又はその上清であってもよい。この細胞は、組み換え技術により遺伝子改変されていてもよい。特定の態様において、細胞は、例えばトランスジェニック動物といった動物、又は例えば血液、血漿、尿、粘膜分泌物といった生理学的液体などであってもよい。培地を採取することができるため、細胞の破壊は必要ない。
【００７８】
加えて、本明細書に記載された生物発光アッセイのいずれでも、限定するものではないがルシフェラーゼの不活化を阻害もしくは予防するもの、さもなければバイオルミネッセンスシグナルを延長もしくは増強するものをはじめとする他の試薬を反応混合物に添加してもよい。
【００７９】
発生したバイオルミネッセンスを、対照と比較してもよい。適切な対照は、本化合物と過酸化水素の間の反応、又はルシフェラーゼ反応のいずれかの必須成分又は条件の１つ以上を欠く。このような成分又は条件としては、限定するものではないが、補因子、酵素、温度及び阻害剤が挙げられる。
【００８０】
適切な基質としては、限定するものではないが、本明細書に記載された式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示される化合物が挙げられる。
【００８１】
特定の基質が、本発明の様々な実施形態における使用に特に有利となり得る。例えば特定の基質は、インビトロで使用するのにより適する場合があってもよく、他の基質がインビボで使用するのにより適する場合があってもよい。当業者により認識される通り、全てのホウ酸塩が、本発明の方法の使用に適するわけではない。例えば化合物における小さな変動が、過酸化水素への反応性又は特定のアッセイ条件での作業能力に影響を及ぼす可能性がある。
【００８２】
本発明を、以下の非限定的な実施例において更に記載する。
【００８３】
実施例
実施例１．６−（（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンジル）オキシ）ベンゾ−［ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル（ＰＢＩ４４７２）
【化３８】
2014525411.tif 000040
２−（４−（ブロモメチル）フェニル）−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（１２０３−３２）の合成。４−ヒドロキシメチルフェニルボロン酸ピナコールエステル（１．０８ｇ、４．６１ｍｍｏｌ）を、トリフェニルホスフィン（２．４２ｇ、９．２３ｍｍｏｌ）と共にＴＨＦ（２０ｍｌ）に溶解した。この反応混合物を氷水浴で冷却して、四臭化炭素（３．０６ｇ、９．２３ｍｍｏｌ）少しずつ添加した。室温で４時間撹拌した後、反応混合物を水に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。この有機層をひとまとめにして、硫酸ナトリウムで乾燥させた。ろ過の後、溶媒を蒸発させて、残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、生成物を白色固体として得た（１．７２ｇ、９２％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ2Ｃｌ2，  δ）：  ７．６２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．３２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．５８  （ｄ，  ２Ｈ），  １．３４  （ｓ，  ９Ｈ）；  ＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ２９７．０。
【００８４】
６−（（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンジル）オキシ）ベンゾ−［ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル（ＰＢＩ４４７２）の合成。アセトニトリル中の６−ヒドロキシベンゾチアゾール（０．５ｇ、２．８４ｍｍｏｌ）と、炭酸カリウム（０．７８ｇ、５．６８ｍｍｏｌ）と、ヨウ化カリウム（０．９４ｇ、５．６８ｍｍｏｌ）との混合物を、１時間加熱還流した。２−（４−（ブロモメチル）フェニル）−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（０．９３ｇ、３．１２ｍｍｏｌ）を添加して、この反応混合物を一晩還流した。冷却した後、懸濁液を酢酸エチル／水で抽出して、残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、生成物を白色固体として得た（０．８ｇ、７２％）。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ2Ｃｌ2，  δ）：  ８．１１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４７  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．３４  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ９．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．２２  （ｓ，  ２Ｈ），  １．３５  （ｓ，  ９Ｈ）；  ＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ３９３．２。
【００８５】
実施例２．（４−（（（２−シアノベンゾ［ｄ］チアゾール−６−イル）オキシ）メチル）フェニル）ボロン酸（ＰＢＩ４４５２）
【化３９】
2014525411.tif 000041
６−（（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンジル）オキシ）ベンゾ［ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル（ＰＢＩ４４７２）（０．２６ｇ、０．６６ｍｍｏｌ）を含むアセトン（４０ｍｌ）溶液に、水（４０ｍｌ）中の過ヨウ素酸ナトリウム（０．４３ｇ、１．９９ｍｍｏｌ）及び酢酸アンモニウム（０．１１ｇ、１．３３ｍｍｏｌ）の懸濁液を、室温で添加した。濃厚な懸濁液を、室温で１８時間撹拌した。全ての溶媒を蒸発させて、残渣をＤＭＦに溶解した。懸濁液を遠心分離し、アセトニトリル／１０％酢酸アンモニウムを用いた分取ＨＰＬＣにより透明な溶液を精製して、生成物を白色結晶として得た（０．１５ｇ、７２％）。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ，  δ）：  ８．１５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．０４  （ｓ，  ２Ｈ），  ７．９７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．０Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．０Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４１  （ｍ，  ３Ｈ），  ５．２３  （ｓ，  ２Ｈ）；  ＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ３１１．１。
【００８６】
実施例３．６−（（３−クロロ−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンジル）オキシ）−ベンゾ［ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル（ＰＢＩ４５９５）
【化４０】
2014525411.tif 000042
ＰＢＩ４５９５
この化合物を、ＰＢＩ４４７２（実施例１）と同様の手順に従って生成した。
【００８７】
実施例４．（２−クロロ−４−（（（２−シアノベンゾ［ｄ］チアゾール−６−イル）オキシ）メチル）フェニル）ボロン酸（ＰＢＩ４４７０）
【化４１】
2014525411.tif 000043
ＰＢＩ４４７０
この化合物を、ＰＢＩ４４５２（実施例２）と同様の手順に従って生成した。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＦ，  δ）：  ８．４３  （ｓ，  ２Ｈ），  ８．２２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．０７  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５６  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．４７  （ｍ，  ２Ｈ），  ５．３３  （ｓ，  ２Ｈ）；  ＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ３４５．１
【００８８】
実施例５．６−（（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ナフタレン−１−イル）メトキシ）ベンゾ［ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル（ＰＢＩ４４８０）
【化４２】
2014525411.tif 000044
４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−１−ナフトエ酸（１２０３−３３）の合成。アセトニトリル中の４−ブロモ−１−ナフトエ酸（４．１２ｇ、１６．４３ｍｍｏｌ）と、ビス（ピナコラト）ジボラン（４．３８ｇ、１７．２５ｍｍｏｌ）と、フッ化セシウム（７．４９ｇ、４９．２８ｍｍｏｌ）と、トリフェニルホスフィン（０．８６ｇ、３．２９ｍｍｏｌ）との混合物に、酢酸パラジウム（０．３７ｇ、１．６４ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を、一晩還流した。冷却後にＣｅｌｉｔｅでろ過し、酢酸エチル／水で抽出した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで脱水した。ろ過の後、溶媒を除去して、残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、生成物を白色固体として得た（２．５ｇ、５１％）。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ，  δ）：  ８．７６  （ｍ，  １Ｈ），  ８．６９  （ｍ，  １Ｈ），  ８．０２  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．６１  （ｍ，  １Ｈ），  １．２８  （ｓ，  １２Ｈ）。
【００８９】
（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ナフタレン−１−イル）メタノール（１２０３−４４）の合成。４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−１−ナフトエ酸（２．５ｇ、８．３９ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦに溶解した。この溶液を氷水浴で冷却した。ボラン溶液（ＴＨＦ中に１．００Ｍ、２５ｍｌ、２５ｍｍｏｌ）を滴下した。滴下の後、この反応物を室温で４時間撹拌した。メタノール（２０ｍｌ）を氷水浴中で添加して、気体が発生しなくなるまで反応物をクエンチした。溶媒を蒸発させて、残渣を酢酸エチル／水で抽出し、生成物を白色固体として得た（１．７９ｇ、７５％）。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ2Ｃｌ2，  δ）：  ８．８０  （ｍ，  １Ｈ），  ８．１０  （ｍ，  １Ｈ），  ８．０４  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５７  （ｍ，  ３Ｈ），  ５．１８  （ｓ，  ２Ｈ），  １．４３  （ｓ，  １２Ｈ）。
【００９０】
２−（４−（ブロモメチル）ナフタレン−１−イル）−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（１２０３−４７）の合成。この化合物を、１２０３−３２（実施例１）と同様の手順に従って生成した。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ2Ｃｌ2，  δ）：  ８．８２  （ｍ，  １Ｈ），  ８．１９  （ｍ，  １Ｈ），  ８．００  （ｍ，  １Ｈ），  ７．６０  （ｍ，  ３Ｈ），  ５．０２  （ｓ，  ２Ｈ），  １．４３  （ｓ，  １２Ｈ）。
【００９１】
６−（（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ナフタレン−１−イル）メトキシ）ベンゾ［ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル（ＰＢＩ４４８０）の合成。この化合物を、ＰＢＩ４４７２（実施例１）と同様の手順に従って生成した。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ2Ｃｌ2，  δ）：  ８．８５  （ｍ，  １Ｈ），  ８．１１  （ｄ，  １Ｈ），  ８．０６  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．０９  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．３８  （ｍ，  １Ｈ），  ５．３５  （ｓ，  ２Ｈ），  １．４２  （ｓ，  １２Ｈ）；  ＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ４４３．２。
【００９２】
実施例６．６−（（３−フルオロ−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンジル）オキシ）ベンゾ［ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル（ＰＢＩ４４８１）
【化４３】
2014525411.tif 000045
２−（４−（ブロモメチル）−２−フルオロフェニル）−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（１２０３−４０）の合成。この化合物を、１２０３−４４（実施例５）と同様の手順に従って生成した。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ2Ｃｌ2，  δ）：  ７．７０  （ｍ，  １Ｈ），  ７．１５  （ｍ，  １Ｈ），  ７．０６  （ｍ，  １Ｈ），  ４．７１  （ｓ，  ２Ｈ），  １．３５  （ｓ，  １２Ｈ）；  ＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ２５３．２。
【００９３】
２−（４−（ブロモメチル）−２−フルオロフェニル）−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（１２０３−４５）の合成。この化合物を、１２０３−３２（実施例１）と同様の手順に従って生成した。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ2Ｃｌ2，  δ）：  ７．７１  （ｍ，  １Ｈ），  ７．６８  （ｍ，  １Ｈ），  ７．０９  （ｍ，  １Ｈ），  ４．４９  （ｓ，  ２Ｈ），  １．３５  （ｓ，  １２Ｈ）；  ＦＮＭＲ：  １０２．９７；  ＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ３１５．１。
【００９４】
６−（（３−フルオロ−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンジル）オキシ）ベンゾ［ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル（ＰＢＩ４４８１）の合成。この化合物を、ＰＢＩ４４７２（実施例１）と同様の手順に従って生成した。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ2Ｃｌ2，  δ）：  ８．１２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．０  Ｈｚ，  １Ｈ），    ７．７７  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．０Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３５  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ３．０Ｈｚ，  ９．０Ｈｚ），  ７．２６  （ｍ，  １Ｈ），  ７．１７  （ｍ，  １Ｈ），  ５．２１  （ｓ，  ２Ｈ），  １．３６  （ｓ，  １２Ｈ）；  ＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ４１１．２。
【００９５】
実施例７．６−（１−（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）エトキシ）ベンゾ［ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル（ＰＢＩ４５１３）
【化４４】
2014525411.tif 000046
１−（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）エタノール（１２０３−５９）の合成。４−アセチルフェニルボロン酸（３．０ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）を、無水エタノール（３０ｍｌ）に溶解して、氷水浴で冷却した。ＮａＢＨ4（１．１５ｇ、３０．５ｍｍｏｌ）を固体として一度に添加した。室温で一晩撹拌した後、この溶液を氷水浴で冷却し、１Ｎ  ＨＣｌ（２０ｍｌ）で処理した。その後、この混合物を酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過して真空濃縮した。得られた粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、生成物を白色固体として得た（２．９８ｇ、９９％）。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ2Ｃｌ2，  δ）：  ７．７５  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３９  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．９０  （ｑ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ），  １．４７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ），  １．３２  （ｓ，  １２Ｈ）。
【００９６】
２−（４−（１−ブロモエチル）フェニル）−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（１２０３−６４）の合成。この化合物を、１２０３−３２（実施例１）と同様の手順に従って生成した。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ2Ｃｌ2，  δ）：  ７．７６  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．４５  （ｍ，  ２Ｈ），  ５．２５  （ｑ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ），  ２．０５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０Ｈｚ），  １．３２  （ｓ，  １２Ｈ）；  ＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ３１１．２。
【００９７】
６−（１−（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）エトキシ）ベンゾ［ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル（ＰＢＩ４５１３）の合成。この化合物を、ＰＢＩ４４７２（実施例１）と同様の手順に従って生成した。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ2Ｃｌ2，  δ）：  ８．０３  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７６  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．４４  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．２８  （ｍ，  ２Ｈ），  ５．４３  （ｑ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  １．６９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  ３Ｈ），  １．３２  （ｓ，  １２Ｈ）；  ＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ４０７．２。
【００９８】
実施例８．６−（（３−メトキシ−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンジル）オキシ）ベンゾ［ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル（ＰＢＩ４５１２）
【化４５】
2014525411.tif 000047
３−メトキシ−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）安息香酸（１２０３−７０）の合成。この化合物を、１２０３−３３（実施例５）と同様の手順に従って生成した。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ，  δ）：  ７．７４  （ｍ，  １Ｈ），  ７．６６  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５７  （ｍ，  １Ｈ），  ３．９０  （ｓ，  ３Ｈ），  １．３５  （ｓ，  １２Ｈ）；  ＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ２７７．６。
【００９９】
（３−メトキシ−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）メタノール（１２０３−７９）の合成。この化合物を、１２０３−４４（実施例５）と同様の手順に従って生成し、精製を行わずに次のステップで用いた。
【０１００】
２−（４−（ブロモメチル）−２−メトキシフェニル）−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（１２０３−８２）の合成  この化合物は、１２０３−３２（実施例１）と同様の手順に従って生成し、精製を行わずに次のステップで用いた。
【０１０１】
６−（（３−メトキシ−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンジル）オキシ）ベンゾ［ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル（ＰＢＩ４５１２）の合成。この化合物を、１２０３−３６（実施例１）と同様の手順に従って生成した。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ2Ｃｌ2，  δ）：  ８．１１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．６９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．４７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３５  （ｍ，  １Ｈ），  ７．０４  （ｍ，  １Ｈ），  ６．９８  （ｍ，  １Ｈ），  ５．２０  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．８４  ｎ（ｓ，  ３Ｈ），  １．３４  （ｓ，  １２Ｈ）。
【０１０２】
実施例９．４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンジル（２−シアノベンゾ［ｄ］チアゾル−６−イル）カルバマート（ＰＢＩ４５７９）
【化４６】
2014525411.tif 000048
トリホスゲン（０．２６ｇ、０．７７ｍｍｏｌ）及び４−ヒドロキシメチルフェニルボロン酸ピナコールエステル（０．５ｇ、２．１４ｍｍｏｌ）を、氷水浴中でＴＨＦ（２０ｍｌ）に溶解した。ピリジン（０．３５ｍｌ、４．２８ｍｍｏｌ）を滴下して、薄層クロマトグラフィーで出発原料の消失が示されるまで、反応混合物を０℃で撹拌した。温度を室温にした後、この反応混合物をジクロロメタン／水で抽出した。有機層を回収して、硫酸ナトリウムで脱水した。ろ過の後、溶媒を除去して、残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、生成物を白色固体として得た（０．１ｇ、１１％）。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ2Ｃｌ2，  δ）：  ８．４３  （ｍ，  １Ｈ），  ８．１０  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７８  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．４１  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．２６  （ｍ，  １Ｈ），  ５．２５  （ｓ，  ２Ｈ），  １．３２  （ｓ，  １２Ｈ）；  ＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ４３６．１。  
【０１０３】
実施例１０．
６−（（４−（５，５−ジメチル−１，３，２−ジオキサボリナン−２−イル）ベンジル）オキシ）ベンゾ［ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル（ＰＢＩ４５７８）
【化４７】
2014525411.tif 000049
トルエン（５０ｍｌ）中のＰＢＩ４４５２（実施例２）（２０ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）とネオペンチルグリコール（３４ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）との混合物を、ディーン・スターク装置で加熱還流した。この反応物を１６時間後に冷却した。トルエンを蒸発させて、残渣をフラッシュクトマトグラフィーにより精製し、生成物を白色固体として得た（１０ｍｇ、４１％）。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ2Ｃｌ2，  δ）：８．１１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．０Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４６  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．３４  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ６．０Ｈｚ，  ３．０Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．２０  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７８  （ｓ，  ｓ，  ４Ｈ），  １．０３  （ｓ，  ６Ｈ）。
【０１０４】
実施例１１．（Ｅ）−６−（（３−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）アリル）オキシ）−ベンゾ［ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル（ＰＢＩ４４５８）
【化４８】
2014525411.tif 000050
反応バイアルにテトラブチルアンモニウム２−シアノベンゾ［ｄ］チアゾール−６−オラート（２０９ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）、（Ｅ）−２−（３−ヨードプロパ−１−エン−１−イル）−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（３８６ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ）及び１５ｍＬの無水ジクロロメタンを充填した。バイアルを密閉し、この溶液を油浴中、８０℃で一晩（〜１６時間）加熱した。粗反応混合物を１ｇのＣｅｌｉｔｅ  に添加して、溶媒を真空蒸発させた。溶離液として勾配を増加させる酢酸エチルを含むジクロロメタンを用いたシリカゲルクロマトグラフィーにより、生成物を精製した。これにより、１６６ｍｇの（Ｅ）−６−（（３−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）アリル）オキシ）−ベンゾ［ｄ］チアゾール−２−カルボニトリルを無色油状物として得、周囲温度で静置させることにより白色固体に結晶化させた。
【０１０５】
実施例１２．８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニル−３−（（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンジル）オキシ）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジンの合成
【化４９】
2014525411.tif 000051
８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニル−３−（（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンジル）オキシ）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン（４７５９）の合成。８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（５０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）の溶液に、２−（４−（ブロモメチル）フェニル）−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（４７ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２７ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）及びヨウ化カリウム（３３ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で１時間撹拌し、ＨＰＬＣで反応の完了が示されるまで４０℃に加熱した。冷却後、この反応混合物を酢酸エチル／水で抽出した。有機層を回収し、硫酸マグネシウムで脱水した。蒸発後に、残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、生成物を黄色固体として得た（３０ｍｇ、４９％）。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ2Ｃｌ2，  δ）：  ７．７９−７．２３（ｍ，  １８Ｈ），  ７．３２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ５．１１  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．５３  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１５  （ｓ，  ２Ｈ），  １．５３（ｓ，  １２Ｈ）；  ＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ５９７．４１。
【０１０６】
データ裏付けのない実施例１３．８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニル−２−（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンジル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（２Ｈ）−オンの合成
【化５０】
2014525411.tif 000052
８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニル−２−（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ベンジル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（２Ｈ）−オンの合成。８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オンの溶液に、２−（４−（ブロモメチル）フェニル）−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン、炭酸カリウム及びヨウ化カリウム（３３ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を室温で撹拌して、ＨＰＬＣが反応の完了を示すまで４０℃に加熱する。
【０１０７】
実施例１４．過酸化物での処理によるバイオルミネッセンスの発生
この実施例では、ホウ酸ルシフェリンを過酸化水素と共にインキュベートして、ルシフェリンの生成を、ルシフェラーゼにより触媒された光反応を用いて測定した。ホウ酸ルシフェリンを過酸化水素で処理した結果である光出力（バイオルミネッセンス）の増加は、過酸化水素との反応の結果であるルシフェリンの生成を示す。
【０１０８】
（ＫＨ2ＰＯ4（Ｆｉｓｈｅｒ）６．８ｇ又はＫ2ＨＰＯ4（Ｓｉｇｍａ）１１．４ｇのいずれかをＮａｎｏｐｕｒｅ水に１Ｍになるように溶解した）１Ｍリン酸塩溶液を、Ｎａｎｏｐｕｒｅ水で１：５に希釈して、２００ｍＭリン酸塩溶液を生成した。ｐＨ６．８７、７．４１、７．７３、８．０４、及び９．１８の２００ｍＭリン酸緩衝液を調製した。ＤＭＳＯ（Ｆｌｕｋａ  ４１６４１）中のＰＢＩ３０４８、４０１３、４４２４及び４４２５（図１）の４ｍｇ／ｍｌ溶液を、固体粉末から作製した。
【０１０９】
２枚の９６ウェル白色平底ルミノメータープレート（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｚ３２９１）（「Ａ」及び「Ｂ」と標識）に、２００ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．８７）５０μｌをＡ１〜Ｈ２ウェルに添加し、２００ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．４１）５０μｌをＡ３〜Ｈ４ウェルに添加し、２００ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．７３）５０μｌをＡ５〜Ｈ６ウェルに添加し、２００ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０４）５０μｌをＡ７〜Ｈ８ウェルに添加し、２００ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ９．１８）５０μｌをＡ９〜Ｈ１０ウェルに添加した。
【０１１０】
４ｍｇ／ｍｌのＰＢＩ４０１３を含むＤＭＳＯ５０μｌを、Ｎａｎｏｐｕｒｅ水で１．２５ｍｌに希釈して、２５μｌをプレートＡのＡ１〜Ｄ１０ウェルに添加した。４ｍｇ／ｍｌのＰＢＩ４４２４を、５０μｌ、Ｎａｎｏｐｕｒｅ水で１．２５ｍｌに希釈して、２５μｌをプレートＡのＥ１〜Ｈ１０に添加した。４ｍｇ／ｍｌのＰＢＩ３０４８を、５０μｌ、Ｎａｎｏｐｕｒｅ水で１．２５ｍｌに希釈して、２５μｌをプレートＢのＡ１〜Ｄ１０に添加した。４ｍｇ／ｍｌのＰＢＩ４４２５を５０μｌ、Ｎａｎｏｐｕｒｅ水で１．２５ｍｌに希釈して、２５μｌをプレートＢのＥ１〜Ｈ１０に添加した。Ｎａｎｏｐｕｒｅ水  ２５μｌを、両方のプレートのＡ及びＥ行に添加した。Ｎａｎｏｐｕｒｅ水  １７μｌを、両方のプレートのＢ及びＦ行に添加して、Ｎａｎｏｐｕｒｅ水  ８μｌを、両方のプレートのＣ及びＧ行に添加した。
【０１１１】
過酸化水素溶液（３０％過酸化水素、Ｓｉｇｍａ  Ｈ１００９−５ｍｌ）を、Ｎａｎｏｐｕｒｅ水で６０μＭ過酸化水素に希釈し、６０μＭ過酸化水素  ２５μｌを両方のプレートのＤ及びＨ行に添加し、６０μＭ過酸化水素  １７μｌを両方のプレートのＣ及びＧ行に添加し、６０μＭ過酸化水素  ８μｌを両方のプレートのＢ及びＦ行に添加した。その後、Ａ及びＢのプレートの両方を、７０分間ゆっくりと混合した。
【０１１２】
Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｅｓｔｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｖ１４４Ｂ）のボトルを解凍して、Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｖ８５９Ｂ）を再構成して、再構成されたＬｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（「ＬＤＲ」）を作製するために使用した。１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）１５ｍｌを、２５ｍｌのＬＤＲと混合して、８０μｌを２枚の新しいルミノメータープレート（「Ｒ１」及び「Ｒ２」）のＡ１〜Ｈ１０ウェルに添加した。
【０１１３】
インキュベーションに続いて、プレートＡのＡ１〜Ｈ１０ウェルの内容物２０μｌを、プレートＲ１と同一のウェルに移して、プレートＢのＡ１〜Ｈ１０の２０μｌをプレートＲ２と同一のウェルに移した。その後、プレートＲ１及びＲ２を、室温で１５分間インキュベートして、バイオルミネッセンスをＧｌｏＭａｘ（登録商標）ルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ）で測定した。
【０１１４】
二重測定のウェルから得たバイオルミネッセンスを平均して、過酸化物を含有する試料からの平均相対発光量（ＲＬＵ）を、同一のｐＨでインキュベートした過酸化物を含有しない試料からの発光量と比較した（表１）。
【表１】
2014525411.tif 000053
【０１１５】
表１に見られる通り、２種の化合物ＰＢＩ４０１３及びＰＢＩ３０４８から発せられた光は、全てのｐＨ値の過酸化水素の添加により強く増加した。しかし、より大きな光シグナル増加が、ｐＨ６．８７からｐＨ９．１８へのｐＨ上昇に伴って認められた。他の２種の化合物ＰＢＩ４４２５及びＰＢＩ４４２４について測定された光シグナル増加は、過酸化水素添加の場合はＰＢＩ３０４８又はＰＢＩ４０１３について認められたものよりもかなり小さかった。
【０１１６】
これらの結果から、ホウ酸ルシフェリンを用いて、低レベルの過酸化水素を検出及び測定することができるが、特定の化合物における小さな構造変化が、光シグナルの相対強度の増加に対して非常に劇的な影響を有し得ることが示される。加えてこれらの結果から、より強度の光シグナルが、ホウ酸ルシフェリンとｐＨ８．０を超えるｐＨ値の過酸化水素との反応から得られることが示される。
【０１１７】
実施例１５．過酸化水素とのインキュベーション後の本発明の化合物からの光発生の比較
この実験では、異なるｐＨ溶液中の過酸化水素を検出する特性について、様々な化合物を検査した。複数の化合物が、ＰＢＩ３０４８よりもかなり良好なシグナル強度及びシグナル対バックグランド比を与えることが示される（実施例２３）。
【０１１８】
化合物ＰＢＩ４４８０、４４８１、４４５２、４４７０、４４７２、３０４８（図１及び２）をＤＭＳＯ（Ｆｌｕｋａ  ４１６４１）に溶解することにより、それらの４ｍｇ／ｍｌ溶液を作製した。化合物溶液の３０μｌを、Ｎａｎｏｐｕｒｅ水で１．５ｍｌに希釈し、アリコット５０μｌを白色９６ウェルルミノメータープレート中に以下の通り添加した：ＰＢＩ４４８１、Ａ１〜１２行；ＰＢＩ４４８０、Ｂ１〜１２行；ＰＢＩ４４５２、Ｃ１〜１２行；ＰＢＩ３０４８、Ｄ１〜１２行；ＰＢＩ４４７２、Ｅ１〜１２行；及びＰＢＩ４４７０、Ｆ１〜１２行。
【０１１９】
２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）２５μｌをＡ１〜Ｆ４ウェルに添加し、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．８）２５μｌをＡ５〜Ｆ８ウェルに添加し、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ１０．４）２５μｌをＡ９〜Ｆ１０ウェルに添加した。
【０１２０】
３０％過酸化水素（Ｓｉｇｍａ  Ｈ１００９−５ｍｌ）をＮａｎｏｐｕｒｅ水に４０μＭになるように希釈し、２５μｌを３、４、７、８、１１及び１２列目に添加した。水２５μｌをプレートの１、２、５、６、９、及び１０列目に添加して、プレートを室温で６０分間インキュベートした。
【０１２１】
１００ｍＭ  Ｄ−システイン１００μｌ、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．８）１ｍｌ及びＮａｎｏｐｕｒｅ水８．９ｍｌを混合することにより、変換溶液を作製した。混合した後、溶液８０μｌを新しいルミノメータープレートのＡ１〜Ｆ１２ウェルに添加した。
【０１２２】
インキュベーション後に、最初のプレートのＡ１〜Ｆ１２ウェルの試料２０μｌを、新しいルミノメータープレートと同一のウェルに移した。新しいプレートを室温で５分間インキュベートして、ＬＤＲ（実施例２３）１００μｌをＡ１〜Ｆ１２ウェルに添加して、バイオルミネッセンスをＧｌｏＭａｘ（登録商標）ルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）で検出した。
【０１２３】
二重測定のウェルのＲＬＵを平均した。過酸化水素を含むウェルの平均値を、同一のｐＨの過酸化水素を含まないウェルと比較した（表２）。ＢＺＴは、化合物のベンゾチアゾール誘導体を示すために用いる。
【表２】
2014525411.tif 000054
【０１２４】
シグナル対バックグランド（Ｓ／Ｂ）比を用いて、シグナル強度が非常に異なるアッセイ試薬を比較する。Ｓ／Ｂ比の高いアッセイは、多くの場合、Ｓ／Ｂ比の小さいアッセイ（他の全ての因子が相対的に等しいもの）よりも良好なアッセイであるとみなされる。この実施例でのシグナル（過酸化水素含有）対バックグランド（過酸化水素不含）の値を、表３に示す。
【表３】
2014525411.tif 000055
【０１２５】
ＰＢＩ４４５２及び４４７０が、ホウ酸塩であったとしても、それらは両者とも、ＰＢＩ３０４８よりもｐＨ１０．４で過酸化物により大きなシグナルを発生し、そのｐＨでより大きなＳ／Ｂ比を有する。この化合物の特性により、それらは、酵素反応においてインビトロで生成された過酸化水素を測定する際により有用となる可能性がある。その一方で、ホウ酸エステル（ＰＢＩ  ４４７２、４４８１及び４４８０）は、いずれのホウ酸塩類よりも低いｐＨでより高いＳ／Ｂ比を与えており、それらがｐＨ１０．４のｐＨで増殖し得ない生存哺乳類培養細胞を用いる実験において、より良好に働き得ることが示唆される。加えてそれらは、幾つかの条件下でＢＺＴホウ酸塩と比較して若干低い総シグナルを発生するが、ホウ酸エステルは、優れたシグナル対バックグランド比を生じ、シグナル強度が微小でなければ使用することができる。
【０１２６】
実施例１６．ホウ酸ルシフェリンを用いた活性酸素発生の検出
この実施例では、過酸化水素と反応することが示された様々な化合物を、活性酸素種（ＲＯＳ）を発生し得る２種の化合物、つまりメナジオン及び４−アミノビフェニルで処理された細胞とインキュベートした。メナジオンは、細胞内で活性酸素を直接発生させ、ＲＯＳ作用の非常に強い誘発物質である（Ｓｕｎ，  ＪＳ  ｅｔ．  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ（１９９７）  ｖｏｌ  ５３  ｐｐ９６７−７６）。４−アミノビフェニルは、ＲＯＳの形成を誘発することができるようになる前に、キニン様構造に代謝変換する必要があると考えられる（Ｍａｋｅｎａ，  Ｐ  ａｎｄ  Ｃｈｕｎｇ，  ＫＴ．    Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｏｌ．  Ｍｕｔａｇｅｎ．（２００７），  ｖｏｌ  ４８，  ｐｐ４０４−４１３）。ホウ酸塩化合物の１つであるＰＢＩ４４５８は、細胞内で活性酸素を発生させる条件下で、かなり強いシグナルを与えることが示された。この実施例では、１）本発明の化合物を用いた様々な処理の適用により、細胞内での活性酸素種の形成を検出する方法、ならびに２）１）の方法を用いて、接着（例えば、ＨｅｐＧ２）細胞株及び懸濁（例えば、Ｊｕｒｋａｔ）細胞株の両方における活性化学種を検出し得ること、を実証する。
【０１２７】
４−アミノビフェニル（Ｓｉｇｍａ  Ａ２８９８−１ｇ）２．５ｍｇをＤＭＳＯ（Ｆｌｕｋａ）３７５μｌに溶解して、４０ｍＭ溶液を作製することにより、４−アミノビフェニルの４０ｍＭ溶液を作製した。ＤＭＳＯ中の４ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＩ４４５８  ５０μｌを、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１ｍｌに希釈して、１００μｌをマイクロタイタープレートのＡ１及びＡ２ウェルに添加した。４０ｍＭ  ４−アミノビフェニルの試料１０μｌを、ＨＢＳＳ中の残りのＰＢＩ４４５８  １９０μｌと混合して、６０μｌをＢ１及びＢ２ウェルに、そして３０μｌをＣ１及びＣ２ウェルに添加した。ＤＭＳＯ中の４０ｍＭメナジオンの試料１０μｌを、ＨＢＳＳ中の残りのＰＢＩ４４５８  １９０μｌと混合して、６０μｌをＤ１及びＤ２ウェルに、そして３０μｌをＥ１及びＥ２ウェルに添加した。その後、ＨＢＳＳ中の残りのＰＢＩ４４５８の添加により、Ｂ１〜Ｅ２ウェル中の容量を１００μｌに調整した。
【０１２８】
ＤＭＳＯ中の４ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＩ４４８０  ５０μｌを、ＨＢＳＳ緩衝液で１ｍｌに希釈して、１００μｌをマイクロタイタープレートのＡ３及びＡ４ウェルに入れた。４０ｍＭ  ４−アミノビフェニルの試料１０μｌを、ＨＢＳＳ中の残りのＰＢＩ４４８０  １９０μｌと混合して、６０μｌをＢ３及びＢ４ウェルに、そして３０μｌをＣ３及びＣ４ウェルに添加した。ＤＭＳＯ中の４０ｍＭメナジオンの試料１０μｌを、ＨＢＳＳ中の残りのＰＢＩ４４８０  １９０μｌと混合して、６０μｌをＤ３及びＤ４ウェルに、そして３０μｌをＥ３及びＥ４ウェルに添加した。その後、ＨＢＳＳ中の残留ＰＢＩ４４８０の添加により、Ｂ３〜Ｅ４ウェル中の容量を１００μｌに調整した。
【０１２９】
ＤＭＳＯ中の４ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＩ３０４８  ５０μｌを、ＨＢＳＳ  １ｍｌに希釈して、１００μｌをマイクロタイタープレートのＡ５及びＡ６ウェルに添加した。４０ｍＭ  ４−アミノビフェニルの試料１０μｌを、残りのＰＢＩ３０４８  を含むＨＢＳＳ１９０μｌと混合して、６０μｌをＢ５及びＢ６ウェルに、そして３０μｌをＣ５及びＣ６ウェルに添加した。ＤＭＳＯ中の４０ｍＭメナジオンの試料１０μｌを、残りのＰＢＩ３０４８を含むＨＢＳＳ  １９０μｌと混合して、６０μｌをＤ５及びＤ６ウェルに、そして３０μｌをＥ５及びＥ６ウェルに添加した。その後、残留するＰＢＩ３０４８を含むＨＢＳＳの添加により、Ｂ５〜Ｅ６ウェル中の容量を１００μｌに調整した。
【０１３０】
２枚の細胞培養プレートに、ＨＢＳＳ中に懸濁させた細胞を播種した。一方のプレートは、Ａ１〜Ｈ６ウェルにＪｕｒｋａｔ細胞２０，０００個／ウェルを含むものであった。もう一方のプレートは、Ａ１〜Ｈ６ウェルにＨｅｐＧ２細胞２０，０００個／ウェルを含むものであった。両方のプレートを、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ中で一晩インキュベートした。ＨｅｐＧ２細胞の培地を取り出して廃棄し、ＨＢＳＳ  ５０μｌと交換した。様々なＰＢＩ化合物を含むプレートのＡ１〜Ｈ６ウェルの試料５０μｌを、２枚の細胞培養プレート内の対応するウェルに移して、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータで６０分間インキュベートした。
【０１３１】
ＬＤＲ（実施例２３）５０μｌ、及び１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中１ｍＭ  Ｄ−システイン２５μｌを、新しいルミノメータープレートの全てのウェルに添加した。インキュベーション後に、Ｊｕｒｋａｔ細胞を含むＡ１〜Ｈ６ウェルの試料２５μｌを、新しいルミノメータープレートのＡ１〜Ｈ６ウェルに添加し、ＨｅｐＧ２細胞を含むＡ１〜Ｈ６ウェルの試料２５μｌを、新しいルミノメータープレートのＡ７〜Ｈ１２ウェルに添加した。このプレートを室温で１５分間インキュベートして、バイオルミネッセンスをＧｌｏＭａｘ（登録商標）ルミノメーターで検出した。
【０１３２】
二重測定の試料から得たバイオルミネッセンスを平均して、Ａ行の細胞の値と比較した（表４）。
【表４】
2014525411.tif 000056
【０１３３】
異なるレベルの４−アミノビフェニル及びメナジオンとＰＢＩ４４５８との値は、予測された通り、いずれのエフェクターも与えられなかった細胞の値を超えるものである。同じくメナジオンでの応答の規模は、４−アミノビフェニルよりもかなり大きかった。ＰＢＩ４４８０及びＰＢＩ３０４８の値は、メナジオン又は４−アミノビフェニルへの応答ほど明瞭に示すものではない。これらの化合物は、実施例２３に見られる通り、直接の過酸化水素添加へのあまり強くない応答を示したことから、低い応答は意外なことではない。
【０１３４】
これらの結果から、ＰＢＩ４４５８が、哺乳類細胞において活性酸素を発生させる薬剤の高感度検出を可能にすることが示される。加えて結果から、ベンゾチアゾール又はルシフェリンに付着したホウ酸塩類似体の全てが、細胞と共に用いられた場合にシグナルを発生するとは限らないことも、明瞭に実証される。実際に化合物の幾つかは、緩衝液中の細胞によりシグナルを発生するが、それは哺乳類培養細胞における活性酸素発生に及ぼす化合物の影響を、信頼性を持って検出するには低すぎる可能性がある。
【０１３５】
実施例１７．ルシフェリン生成に及ぼす緩衝液の影響
この実施例では、本発明のホウ酸塩化合物を様々な緩衝液中でインキュベートして、適切な緩衝液を用いることで改善されたシグナル強度が得られる可能性を実証する。加えてこの実施例では、２種の緩衝液、つまりＤＭＥＭ及びＨＢＳＳ緩衝液中でのシグナル発生が、哺乳類細胞で良好に働くことを実証する。両方の緩衝液が同じｐＨ値を有するように配合された場合でも、幾つかの化合物はＨＢＳＳよりもＤＭＥＭでかなり強いシグナルを発生しており、こうして本発明の特定の化合物が、ＤＭＥＭなどの培地中で哺乳類細胞と共に使用するのに非常に有利となり得ることが実証される。
【０１３６】
Ａ．反応ｐＨ及び緩衝液組成によるシグナル強度差の実証
ＤＭＳＯ中の４ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＩ４４５８の試料３０μｌをＮａｎｏｐｕｒｅ水で１．５ｍｌに希釈して、５０μｌをマイクロタイタープレートのＡ１〜１２及びＥ１〜１２ウェルに添加した。ＤＭＳＯ中の４ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＩ４４７２の試料３０μｌをＮａｎｏｐｕｒｅで１．５ｍｌに希釈して、５０μｌをプレートのＢ１〜１２及びＦ１〜１２ウェルに添加した。ＤＭＳＯ中の４ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＩ４４８０の試料３０μｌをＮａｎｏｐｕｒｅ水で１．５ｍｌに希釈して、５０μｌをプレートのＣ１〜１２及びＧ１〜１２ウェルに添加した。ＤＭＳＯ中の４ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＩ４４８１の試料３０μｌをＮａｎｏｐｕｒｅ水で１．５ｍｌに希釈して、５０μｌをプレートのＤ１〜１２及びＨ１〜１２ウェルに添加した。
【０１３７】
そのプレートに、２００ｍＭ  ＫＨＰＯ4（ｐＨ７．４）の試料５０μｌをＡ１〜Ｄ４ウェルに添加し、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）５０μｌをＡ５〜Ｄ８ウェルに添加し、 ２５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）５０μｌをＡ９〜Ｄ１２ウェルに添加し、２００ｍＭ  ＫＨＰＯ4緩衝液（ｐＨ９．２）５０μｌをＥ１〜Ｈ４ウェルに添加し、２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ１０．４）５０μｌをＥ５〜Ｈ８ウェルに添加し、１００ｍＭ  ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１０．４）５０μｌをＥ９〜Ｈ１２ウェルに添加した。
【０１３８】
過酸化水素の試料（３０％、Ｓｉｇｍａ、Ｈ１００９−５ｍｌ）を、Ｎａｎｏｐｕｒｅ水で１０μＭに希釈して、１００μｌをプレートの３、４、７、８、１１、１２列目のＡ〜Ｈウェルに添加した。Ｎａｎｏｐｕｒｅ水１００μｌを、プレートの１、２、５、６、９及び１０列目に添加した。プレートを室温で１５分間インキュベートした。
【０１３９】
１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）５ｍｌ、Ｎａｎｏｐｕｒｅ水４．９ｍｌ及び１００ｍＭ  Ｄ−システイン（Ｎａｎｏｐｕｒｅ水中）１００μｌを混合することにより変換溶液を作製して、２５μｌをルミノメータープレートの全てのウェルに添加した。
【０１４０】
インキュベーション後に、プレート内の全てのウェルの試料２５μｌを、ルミノメータープレートの対応するウェルに移して混合し、室温で２〜３分間インキュベートして、ＬＤＲ（実施例２３）５０μｌを添加した。ルミノメータープレートを室温で１５分間インキュベートして、バイオルミネッセンスをＧｌｏＭａｘ（登録商標）ルミノメーターで検出した。
【０１４１】
更なる試料を、６０及び１０５分目に採取して、全てのウェルに変換溶液２５μｌを含む新しいルミノメータープレートに添加した。その後、プレートを室温で１５分間インキュベートし、バイオルミネッセンスを上述の通り検出した。
【０１４２】
二重測定ウェルから得たＲＬＵを平均して、過酸化水素を含む試料の値を、対応する過酸化水素を含まない試料の平均値と比較して（表５、７及び９）、シグナル対バックグランド比を決定した（表６、８及び１０）。
【表５】
2014525411.tif 000057
【表６】
2014525411.tif 000058
【表７】
2014525411.tif 000059
【表８】
2014525411.tif 000060
【表９】
2014525411.tif 000061
【表１０】
2014525411.tif 000062
【０１４３】
上述の通り、バイオルミネッセンスシグナル強度は、ｐＨ値が高いほど大きいが、緩衝液により特定のｐＨでのシグナル強度に変動がある。例えば緩衝液のｐＨが、緩衝液ＫＰＯ4（ｐＨ７．４）、Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）及びＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を用いて実施された反応でほぼ同一であったとしても、１０５分目のＰＢＩ４４７２で見られた正味のシグナルは異なっており、異なるシグナル対バックグランド値となる（ＫＰＯ4、Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）及びＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）における１０５分目のＰＢＩ４４７２ではそれぞれ５．３、１３．６及び８．２）。
【０１４４】
Ｂ．哺乳類細胞培地と生理学的緩衝液の間のシグナル差
ＰＢＩ４４５８の４ｍｇ／ｍｌ  ＤＭＳＯ溶液の試料１００μｌを、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １４０２５−０９２）で５００μｌに希釈して、５０μｌを新しいマイクロタイタープレート（「ＤＩＳＰ」）のＡ１〜Ａ９ウェルに添加した。ＰＢＩ４４７２の４ｍｇ／ｍｌ  ＤＭＳＯ溶液１００μｌを、ＨＢＳＳ緩衝液で５００μｌに希釈して、５０μｌをＥ１〜Ｅ９ウェルに添加した。ＨＢＳＳ  ９０μｌを、「ＲＴ」及び「３７Ｃ」と標識された２枚の新しいマイクロタイタープレートのＡ１〜Ｂ９ウェルに添加した。ＤＭＥＭ  ９０μｌを、両方のプレートのＣ１〜Ｄ９ウェルに添加した。
【０１４５】
３０％過酸化水素の試料（Ｓｉｇｍａ  Ｈ１００９−５ｍｌ）を、Ｎａｎｏｐｕｒｅ水で１ｍＭに希釈し、１ｍＭ過酸化水素７．５μｌをＨＢＳＳで１．５ｍｌに希釈して、９０μｌをプレートＲＴ及び３７℃のＡ４〜Ｂ６ウェルに添加した。１ｍＭ過酸化水素１５μｌをＨＢＳＳで１ｍＭに希釈して、９０μｌを両方のプレートのＡ７〜Ｂ９ウェルに添加した。ＨＢＳＳ  ９０μｌを両方のプレートのＡ１〜Ｂ３ウェルに、そしてＤＭＥＭ  ９０μｌを両方のプレートのＣ１〜Ｄ３ウェルに添加した。１ｍＭ過酸化水素７．５μｌをＤＭＥＭで１．５ｍｌに希釈して、９０μｌを両方のプレートのＣ４〜Ｄ６ウェルに添加した。１ｍＭ過酸化水素１５μｌをＤＭＥＭで１．５ｍｌに希釈して、９０μｌを両方のプレートのＣ７〜Ｄ９ウェルに添加した。
【０１４６】
プレート「ＤＩＳＰ」のＡ行の試料１０μｌを、プレートＲＴ及び３７℃のＡ及びＣ行に移して、プレート「ＤＩＳＰ」のＢ行の１０μｌを、プレートＲＴ及び３７℃のＢ及びＤ行に移した。プレート３７℃を３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートし、プレートＲＴを、室温でインキュベートした。プレートは両方とも、３０分間インキュベートした。
【０１４７】
１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）７．５ｍｌ、Ｎａｎｏｐｕｒｅ水７．４ｍｌ及び１００ｍＭ  Ｄ−システイン１００μｌを混合することにより、変換溶液を作製した。混合した後、７５μｌを新しいルミノメータープレートの全てのウェルに添加した。
【０１４８】
インキュベーション後に、プレート３７℃のＡ１〜Ｄ９ウェルの２５μｌを、新しいルミノメータープレートのＥ１〜Ｈ９ウェルに移し、プレートＲＴのＡ１〜Ｄ９ウェルの２５μｌを、新しいルミノメータープレートのＡ１〜Ｄ９ウェルに移して、プレートを室温で２〜３分間インキュベートした。ＬＤＲ（実施例２３）の試料１００μｌをＡ１〜Ｈ９ウェルに添加して、室温で１５分間インキュベートし、バイオルミネッセンスをＧｌｏＭａｘ（登録商標）ルミノメーターで検出した。測定の後、二重測定のウェルを平均して、過酸化物の添加を有する平均値を、過酸化物を含まない値と比較した（表１１）。
【表１１】
2014525411.tif 000063
【０１４９】
表１１に見られる通り、３７℃での「０μＭ過酸化物」の値は、ＲＴよりも低く、ＤＭＥＭ中の反応物からのシグナルは、ＨＢＳＳよりも大きかったことから、ＤＭＥＭ中の幾つかの成分（ＨＢＳＳ中では存在しないか、又は異なる濃度のいずれかである）がシグナル強度に影響を及ぼすことが示唆される。室温で実施された反応と３７℃で実施された反応の間に見られたシグナル差の正確な原因は分からないが、バックグランドの還元が、３７℃のＤＭＥＭ中でこれらの２種の化合物をインキュベートした場合に見られたことから、それらがＤＭＥＭ中で増殖させた哺乳類細胞の過酸化水素センサーとして良好に働くことが示唆される。ＢにおいてＰＢＩ３０４８又は４４８０と比較した培地中ＰＢＩ４４５８からの強いシグナルは、このバックグランド還元の結果である可能性がある。
【０１５０】
９５４７  ＵＳ００の更なる実施例
実施例１８．ホウ酸セレンテラジンを用いた活性酸素発生の検出
【化５１】
2014525411.tif 000064
ＰＢＩ４７５９
ＰＢＩ４７５９（１０ｍＭ；最終濃度１２．５μＭ）、様々な濃度の過酸化水素及び４０ｎｇ／ｍｌ  ＮａｎｏＬｕｃ（商標）ルシフェラーゼ酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、ｐＨ８．５又はｐＨ９．０のいずれかの２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌを含む９６ウェルアッセイプレートのウェルに添加した。ルミネッセンスをＧｌｏＭａｘ（登録商標）ルミノメーターで検出した。
【０１５１】
結果から、ＰＢＩ４７５９が過酸化水素の高感度検出を可能にすることが示される（図３）。このシグナルは、反応物中に存在する過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）のレベルに比例し、また、ＮａｎｏＬｕｃ（商標）ルシフェラーゼ酵素（ＮＬ）の存在にも依存する。図３の最初の枠内の数値組が、「ＮＬ及びＨ２Ｏ２含有」及び「ＮＬ不含、Ｈ２Ｏ２含有」という列に表記されているが、実際にはこれらの反応物にはいずれのＨ2Ｏ2も含有せず、他の添加についての対照として働くことに留意されたい。
【０１５２】
実施例１９．ＰＢＩ４４７２のバックグランド還元
ＰＢＩ４４７２（５０μＭ）を、アッセイ緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ１０．４）と共に室温で１５分間インキュベートした。その後、試料をバックグランド還元剤（ＢＲＲ；ＴＣＥＰ）で処理するか、又は未処理のままにした。室温での１５分間のインキュベーションの後、１ｍＭ  Ｄ−システインを含むルシフェリン検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をこの試料に添加して、室温で２０分間インキュベートした。ルミネッセンスを、Ｔｅｃａｎ  Ｆ５００プレートリーダーで検出した。
【０１５３】
結果から、還元剤の添加により、ＰＢＩ４４７２などのホウ酸ルシフェリンを含む際に見られ得るバックグランドを還元させる可能性が実証される（図４）。
【０１５４】
全ての発行物、特許及び特許出願が、参照により本明細書に組み入れられる。前述の明細書において本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記載されたが、多くの詳細は例示の目的で示されており、本発明が更なる実施形態に受け入れられること、及び本明細書に記載された特定の詳細が本発明の基本原理から逸脱せずに著しく変動可能であることは、当業者に明白であろう。
【図１】
2014525411.tif 000083
【図２】
2014525411.tif 000084
【図３】
2014525411.tif 000085
【図４】
2014525411.tif 000086
【手続補正書】
【提出日】平成26年5月16日(2014.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式(I)で示される化合物。
2014525411.tif 000087
（Ｉ）
（式中、
Ｒ1は、ボロン酸又はホウ酸エステルであり、
各Ｒ4、Ｒ5及びＲ7は、独立して、Ｈ、ハロ、メチル、及びトリフルオロメチルから選択され、
Ｌ1は、リンカーである。）
【請求項２】
Ｒ1が、下式、
−Ｂ（ＯＲ6）2、
2014525411.tif 000088
（式中、各Ｒ6が、独立して、Ｈ及びＣ1-4アルキルから選択され、
各Ｒ12及びＲ13が、独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、ＣＦ3、フェニルもしくは置換されたフェニルから選択されるか、又はＲ12とＲ13が共に、３〜７個の炭素を有するアルキル環をとすることができ、もしくは縮合６員芳香族環により置き換え得る、そして
各Ｒ14、Ｒ15及びＲ16が独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、ＣＦ3、フェニル及び置換されたフェニルから選択されるか、又は両Ｒ15が共に、３〜７個の炭素を有するアルキル環を形成することができ、Ｒ14及びＲ15又はＲ15及びＲ16が共に、３〜７個の炭素原子を有するアルキル環をなすことができ、又は６員芳香族環により置き換え得る。）
で示される請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｌ1が、
2014525411.tif 000089
であり、
Ａが、−Ｃ6（Ｒ10）4−、−Ｏ−Ｃ6（Ｒ10）4−又は（ＣＲ11＝ＣＲ11）n−又はＳ−Ｃ6（Ｒ10）4−又はＮＲ’−Ｃ6（Ｒ10）4又は直接結合であり、
Ｒ’が、Ｈ又はＣ1-4アルキルであり、
各Ｒ3が、独立して、ハロ、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4ヒドロキシアルキル、又はＣ1-4アルキルカルボン酸であり、
各Ｒ10が、独立して、Ｈ、ハロ、ＣＨ3、ＯＣＨ3、又はＮＯ2であり、
各Ｒ11が、独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、
ｎが、１又は２であり、
Ｘが、−Ｏ−、
2014525411.tif 000090
から選択される、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
次式（ＩＩ）で示される化合物。
2014525411.tif 000091
（式中、
Ｒ11は、ボロン酸又はホウ酸エステルであり、
Ｒ2は、−（ＣＨ2）n−Ｔ又はＣ1-5アルキルであり、
Ｒ6は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ又はＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒからなる群より選択され、
Ｒ8は、
2014525411.tif 000092
Ｈ又は低級シクロアルキルからなる群より選択され、
ここでＲ3及びＲ4は、両者ともＨ又は両者ともＣ1-2アルキルであり、
ｎは、０〜３であり、
各Ｒは独立して、Ｃ1-7アルキルであり；
Ｔは、アリール、ヘテロアリール、置換されたアリール、置換されたヘテロアリール又はシクロアルキルであり、
Ｌ2は、リンカーであり、
破線の結合は、飽和又は不飽和となり得る任意の環の存在を示す。）
【請求項５】
Ｌ2が、
2014525411.tif 000093
であり、
Ａが、−Ｃ6（Ｒ10）4−又は（ＣＲ21＝ＣＲ21）n−又はＯ−Ｃ6（Ｒ10）4−又はＳ−Ｃ6（Ｒ10）4−又はＮＲ’−Ｃ6（Ｒ10）4−又は直接結合であり、
Ｒ’が、Ｈ又はＣ1-4アルキルであり、
各Ｒ3が、独立して、ハロ、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4ヒドロキシアルキル、又はＣ1-4アルキルカルボン酸であり、
各Ｒ10が、独立して、Ｈ、ハロ、ＣＨ3、ＯＣＨ3、又はＮＯ2であり、
各Ｒ21が、独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、
ｎが、１又は２であり、
Ｘが、直接結合、−Ｃ（Ｏ）−、及びＣ（Ｏ）ＮＲ22（ここで、Ｒ22は、Ｈ又はＣ1-4アルキルである）から選択される、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
式（ＩＩＩ）で示される化合物。
2014525411.tif 000094
（式中、
Ｒ11が、ボロン酸又はホウ酸エステルであり、
Ｒ2が、−（ＣＨ2）n−Ｔ又はＣ1-5アルキルであり、
Ｒ6が、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ又はＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒからなる群より選択され、
Ｒ8が、
2014525411.tif 000095
Ｈ又は低級シクロアルキルからなる群より選択され、
ここでＲ3及びＲ4が、両者ともＨ又は両者ともＣ1-2アルキルであり；
ｎが、０〜３であり；
各Ｒが独立して、Ｃ1-7アルキルであり、
Ｔが、アリール、ヘテロアリール、置換されたアリール、置換されたヘテロアリール又はシクロアルキルであり、
Ｌ3が、リンカーであり、
破線の結合が、飽和又は不飽和となり得る任意の環の存在を示す。）
【請求項７】
Ｌ3が、
2014525411.tif 000096
であり、
式中、Ａが、−Ｃ6（Ｒ10）4−又は（ＣＲ21＝ＣＲ21）n−であり、
各Ｒ3が独立して、ハロ、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4ヒドロキシアルキル、又はＣ1-4アルキルカルボン酸であり、
各Ｒ10が、独立して、Ｈ、ハロ、ＣＨ3、ＯＣＨ3、又はＮＯ2であり、
各Ｒ21が、独立して、Ｈ又はＣＨ3であり、
ｎが、１又は２である、
請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ11が、次式、
2014525411.tif 000097
（式中、各Ｒ12及びＲ13が、独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、ＣＦ3、フェニル、もしくは置換されたフェニルから選択されるか、又はＲ12及びＲ13が共に、３〜７個の炭素を有するアルキル環をなすことができ、もしくは縮合６員芳香族環により置き換え得、そして
各Ｒ14、Ｒ15、及びＲ16が、独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、ＣＦ3、フェニル及び置換されたフェニルから選択されるか、又は両Ｒ15が共に、３〜７個の炭素を有するアルキル環を形成することができ、Ｒ14及びＲ15又はＲ15及びＲ16が共に、３〜７個の炭素原子を有するアルキル環をなすことができ、又は６員芳香族環により置き換え得る。）
で示される請求項４〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ2が、
2014525411.tif 000098
又はＣ2-5直鎖状アルキル
であり、式中、Ｘが、Ｏ又はＳである、請求項４〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ8が、
2014525411.tif 000099
低級シクロアルキル又はＨであり、式中、Ｒ3及びＲ4は、両者ともＨ又はＣ1-2アルキルであるか、又はＲ8が、ベンジルである請求項４〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
細胞中の過酸化水素を検出する方法であって、
（ａ）細胞を請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物と接触させる工程、
（ｂ）ルシフェラーゼ反応混合物を前記接触させた細胞に添加する工程であって、前記ルシフェラーゼ反応混合物が、任意に、Ｄ−システインを含む工程、
（ｃ）バイオルミネッセンスを測定し、それにより前記細胞中の過酸化水素の存在を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
細胞中の過酸化水素を検出する方法であって、
（ａ）細胞を第１の反応ベッセル中で請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物と接触させて、インキュベーション混合物を形成させる工程、
（ｂ）前記インキュベーション混合物の少なくとも一部を第２の反応ベッセルに移す工程、
（ｃ）ルシフェラーゼ反応混合物を前記第２の反応ベッセルに添加する工程であって、前記ルシフェラーゼ反応混合物が、任意に、Ｄ−システインを含む工程、
（ｄ）バイオルミネッセンスを測定し、それにより前記細胞中の過酸化水素の存在を検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
試料中の過酸化水素を検出する方法であって、
（ａ）試料を請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物と接触させて、第１の混合物を形成させる工程、
（ｂ）前記第１の混合物の少なくとも一部をルシフェラーゼ反応混合物及びＤ−システインと接触させる工程、
（ｃ）バイオルミネッセンスを測定し、それにより前記試料中の過酸化水素の存在を検出する工程、及び
（ｄ）任意に、前記バイオルミネッセンスを定量する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記細胞又は試料を検査化合物又は検査条件で処理した後、請求項１〜１０に記載の化合物と接触させる、請求項１１〜１３に記載の方法。
【請求項１５】
試料中の過酸化水素の存在又は量に及ぼす検査化合物又は検査条件の影響を測定する方法であって、
ａ）試料を検査化合物又は検査条件で処理する工程、
ｂ）前記ａ）からの試料を請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物と接触させる工程、
ｃ）ルシフェラーゼ反応混合物を前記試料に添加する工程、
ｄ）バイオルミネッセンスを測定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記試料が、細胞又は細胞培地を含むか、又は、動物の細胞又は生理学的試料を含む請求項１３〜１５のいずれかに１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記検査条件が、温度の変化、酸素張力、又はイオン強度もしくは浸透圧の変化を含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物を含むキット。
【国際調査報告】
2014525411.tif 000100
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