(57)【要約】本発明は、移植用の均一なサイズの筋線維断片を得るための方法および組成物に関する。筋線維断片は、それぞれ、長線維へ再構成し、生来の筋肉に沿って向きを揃えることができる。組織学および免疫組織化学によって確認されたように、インプラントした筋細胞は、生来の血管網および神経回路網と統合する。本発明の筋繊維断片は、手術室で自家移植筋をドナー部位から採取加工して対象の部位へ注入できるため、特に有利である。断片化した筋線維は、それぞれ、宿主内で容易に統合することができる。
2014521488.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋再生組成物を作製する方法であって、
ドナー部位から筋組織を抽出するステップと、
前記抽出した組織から筋線維を脱凝集するステップと、
前記脱凝集した筋線維を、細胞壁破壊を呈して平均のサイズが１５０μｍ未満である線維断片に断片化するステップと、を含み、
前記組成物は、対象の筋部位にインプラントすると、前記断片から伸長筋線維を再構築し、生来の筋線維と向きを揃えて配向することができる、方法。
【請求項２】
前記断片化するステップは、組成物が、少なくともいくつかの前記断片に付随された衛星細胞を含むように、生育可能な衛星細胞を保持するステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記筋線維の断片は、平均サイズが約８０μｍ〜１２０μｍの間、または約９０μｍ〜１１０μｍの間である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記筋線維の断片は、アスペクト比が２：１〜１：１の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記筋組織を抽出するステップは、自家筋組織を抽出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組織から筋線維を脱凝集するステップは、酵素を用いて前記筋線維を脱凝集することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記酵素は、Ｉ型コラゲナーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記断片化は、機械的攪拌である、請求項１の方法。
【請求項９】
前記断片化は、流体移動を介するものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記断片化は、ピペット操作を介するものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記断片化は、超音波処理を介するものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記断片化するステップは、前記断片化した線維断片をろ過して平均サイズを１５０μｍ未満とすることをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記抽出した組織を５ｍｍ未満のサイズに細分するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記筋線維断片は、少なくともその７５％が細胞壁破裂を呈する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物を対象の筋欠損部位へ送達するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物を生理的に適合性の流体中に懸濁し、前記組成物を前記対象の筋欠損部位へ注入するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物を注入するステップは、前記筋組織をドナー部位から抽出するステップの１０時間以内に行う、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物を足場に播種し、該播種を行った足場を対象の筋欠損部位にインプラントするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記足場に支持した断片を体外培養し、さらに前記足場を対象の筋欠損部位に送達するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記足場は、コラーゲンゲル系、フィブリンゲル系、アルギン酸ゲル系、または紫外線誘導架橋性ゲル系から選択した注入可能な足場である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記足場は、ポリマー性マトリックスまたは有機マトリックスを含むインプラント可能な足場である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリマー性マトリックスは、（ａ）コラーゲンおよびエラスチンからなる群から選択される天然ポリマー、並びに（ｂ）ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）（ＰＬＣＬ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される合成ポリマー、の群から選択される少なくとも１つのポリマーを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記マトリックスは、少なくとも１つの天然ポリマーおよび少なくとも１つの合成ポリマーの組み合わせにより形成される、エレクトロスピンした線維マトリックスをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記マトリックスは、コラーゲンおよびポリカプロラクトン（ＰＣＬ）を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記播種を行った足場は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＲＵＮＸ−２タンパク質、ＬＩＭミネラリゼーションタンパク質、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、上皮成長因子、インスリン様成長因子、形質転換成長因子−α、形質転換成長因子−β、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューレグリン（ＮＲＧ）、アグリン、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物をアジュバントと同時投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記アジュバントは、幹細胞、筋前駆細胞、および成長因子の群から選択される少なくとも１つの作用物質を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記アジュバントは、筋前駆細胞を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記アジュバントは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＲＵＮＸ−２タンパク質、ＬＩＭミネラリゼーションタンパク質、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、上皮成長因子、インスリン様成長因子、形質転換成長因子−α、形質転換成長因子−β、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューレグリン（ＮＲＧ），およびアグリンの群から選択した少なくとも１つの成長因子を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
細胞壁破裂を呈して平均サイズが１５０μｍ未満である筋線維断片の個体群を含む、組成物。
【請求項３１】
前記組成物は、対象の筋部位にインプラントすると、前記断片から伸長筋線維を再構築し、生来の筋線維と向きを揃えて配向することができる、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記断片化するステップは、組成物が、少なくともいくつかの前記断片に付随された衛星細胞を含むように、生存能力のある衛星細胞を保持することをさらに含む、請求項３０の組成物。
【請求項３３】
前記筋線維断片は、平均サイズが約８０μｍ〜１２０μｍの間、または約９０μｍ〜１１０μｍの間である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３４】
前記筋線維断片は、アスペクト比が２：１〜１：１の間である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３５】
前記筋線維断片は、自家筋組織から派生したものである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３６】
前記筋線維断片は、少なくともその７５％が細胞壁破裂を呈する、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３７】
前記組成物は、生理的に適合性の流体をさらに含み、前記組成物は注入用に配合される、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３８】
前記組成物は足場をさらに含み、前記筋線維断片は前記足場に組み込まれる、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３９】
前記足場は、コラーゲンゲル系、フィブリンゲル系、アルギン酸ゲル系、または紫外線誘導架橋性ゲル系から選択される注入可能な足場である、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記足場は、ポリマー性マトリックスまたは有機マトリックスを含むインプラント可能な足場である、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ポリマー性マトリックスは、（ａ）コラーゲンおよびエラスチンからなる群から選択される天然ポリマー、並びに（ｂ）ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン（ＰＬＣＬ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される合成ポリマー、の群から選択される少なくとも１つのポリマーを含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記マトリックスは、少なくとも１つの天然ポリマーおよび少なくとも１つの合成ポリマーの組み合わせにより形成される、エレクトロスピンした線維マトリックスをさらに含む、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記マトリックスは、コラーゲンおよびポリカプロラクトン（ＰＣＬ）を含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４４】
前記足場は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＲＵＮＸ−２タンパク質、ＬＩＭミネラリゼーションタンパク質、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、上皮成長因子、インスリン様成長因子、形質転換成長因子−α、形質転換成長因子−β、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューレグリン（ＮＲＧ），アグリン、またはそれらの組み合わせ、のうち少なくとも１つをさらに含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４５】
前記組成物は、アジュバントをさらに含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４６】
前記アジュバントは、幹細胞、筋前駆細胞、および成長因子の群から選択される少なくとも１つの作用物質を含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記アジュバントは、筋前駆細胞を含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４８】
前記アジュバントは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＲＵＮＸ−２タンパク質、ＬＩＭミネラリゼーションタンパク質、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、上皮成長因子、インスリン様成長因子、形質転換成長因子−α、形質転換成長因子−β、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューレグリン（ＮＲＧ），およびアグリンの群から選択される少なくとも１つの成長因子を含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４９】
尿失禁を処置する方法であって、
筋線維断片および生理的に適合性の流体を含む組成物を、被験者の尿道括約筋に近接した対象の部位に注入するステップを含み、
前記筋線維断片は、細胞壁破裂を呈して平均サイズが１５０μｍ未満である、方法。
【請求項５０】
前記組成物は、少なくともいくつかの前記断片に付随された衛星細胞を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記筋線維断片は、平均サイズが約８０μｍ〜１２０μｍの間、または約９０μｍ〜１１０μｍの間である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記筋線維断片は、それぞれ、アスペクト比が２：１〜１：１の間である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記筋線維断片は、前記被験者自身の筋組織から派生したものである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記筋線維断片は、少なくともその７５％が細胞壁破裂を呈する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記組成物は、足場をさらに含み、前記筋線維断片は前記足場に組み込まれる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記足場は、コラーゲンゲル系、フィブリンゲル系、アルギン酸ゲル系、または紫外線誘導架橋性ゲル系から選択される注入可能な足場である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記足場は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＲＵＮＸ−２タンパク質、ＬＩＭミネラリゼーションタンパク質、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、上皮成長因子、インスリン様成長因子、形質転換成長因子−α、形質転換成長因子−β、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューレグリン（ＮＲＧ），アグリン、またはそれらの組み合わせ、のうち少なくとも１つをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記組成物は、アジュバントをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
前記アジュバントは、幹細胞、筋前駆細胞および成長因子の群から選択される少なくとも１つの作用物質を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記アジュバントは、筋前駆細胞を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記アジュバントは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＲＵＮＸ−２タンパク質、ＬＩＭミネラリゼーションタンパク質、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、上皮成長因子、インスリン様成長因子、形質転換成長因子−α、形質転換成長因子−β、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューレグリン（ＮＲＧ），およびアグリンの群から選択される少なくとも１つの成長因子を含む、請求項５８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［米国政府の権利］
本発明は、米国防総省の外傷整形研究プログラム（ＯＴＲＰ）より認可された許可番号第Ｗ８１ＸＷＨ−０８−１−０３３３号のもとに米国政府援助によりなされた。米国政府は本発明において所定の権利を有する。
【０００２】
本発明の技術分野は筋組織の再生方法および組成物に関する。本発明はまた筋組織を含む構造物に関する。
【背景技術】
【０００３】
外傷性損傷、腫瘍切除もしくは腫瘍焼灼、または機能的損傷により喪失した骨格筋組織の再構築は、利用可能な機能的筋組織または筋組織代替物の不足により妨げられる。臨床的には自家移植が利用されているが、自家移植においてはドナー筋組織を近場に十分に準備する必要がある上、ドナー部位に筋欠陥を残すおそれがある。非特許文献１にはドナー組織を提供するさまざまな箇所の分析およびこれらの技術の利益と不利益が記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｈｅｒｔｅｒ他著、プラスチック、再構築および美容外科ジャーナル６０巻（Ｊ．Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ａｅｓｔｈｅｔｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ６０，７６０−７６８（２００７））
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在行われている、移植片（グラフト）を利用しない筋再生方法は、主に体外組織培養によって単離および拡張した筋細胞または筋線維に依拠している。これらの細胞または線維を、注入療法、または足場（ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）を用いた筋組織工学のいずれかに用いて筋機能を実現する。これらの工程においては、治療に使えるようになるまでに、細胞操作および長期間が必要とされる。さらに細胞や長線維を筋肉に直接注入する場合、この方法では細胞や線維の向きを制御することが難しく、また血管および神経の統合の遅延による生存率の低さの点で限界がある。よって、要修復領域において注入またはインプラントにより筋再生する方法であって、移植体（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）が宿主の血管網や神経回路網と容易に結合して生存能力のある筋肉を生成可能とするよりよい筋再生方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
筋再生のための種々の方法および組成物が開示されている。機能的筋組織の再生において、脱凝集筋線維断片が特に効果的であることが発見された。いくつかの好適な実施形態では、脱凝集筋線維断片は機能的衛星細胞を保持する一方、細胞壁の破裂を呈し、その平均サイズは１５０μｍ未満である。このような各方法においては、ドナー部位から筋組織を抽出し、該抽出した組織から筋線維を脱凝集し、機能的衛星細胞を保持しつつ脱凝集した筋線維を、細胞壁破裂を呈し好ましくは１５０μｍ未満の平均サイズを有する線維断片に断片化することにより、組成物の作製およびインプラントを行うものである。インプラントの際は、筋線維断片組成物により、筋線維断片から伸長筋線維を再構成または再構築することが可能であり、対象の筋部位にインプラントすると、生来の筋線維と向きを揃えて配向することが可能である。
【０００７】
本発明の一態様によれば、細胞断片の平均サイズは、３００μｍ未満、好ましくは１５０μｍ未満であり、いくつかの例では、より好ましい平均サイズは約８０μｍ〜１２０μｍの間、または約９０μｍ〜１１０μｍの間である。各断片は任意の形状でよいが、好ましくは、円形状または長楕円形状であり、例えば、その長短軸のアスペクト比を約２：１〜１：１の間とする。筋線維は長円筒状の多核細胞であるため、さらに好ましくは、各断片は少なくとも１つの核を保持するとともに、少なくとも１つの機能的衛星細胞に付随される。
【０００８】
一実施形態によれば、筋組織を抽出するステップは、自家筋組織を抽出するステップによって実施することができ、筋線維を組織から脱凝集するステップは、Ｉ型コラゲナーゼ等の酵素を用いて筋線維を脱凝集するステップをさらに含む。個々の線維を断片化するステップは、流体移動（ピペット操作）または超音波処理等の機械的撹拌により実施してもよい。いくつかの例では、この断片化は少なくとも約７５％の筋線維断片が細胞壁破裂を呈するまで行うことができる。
【０００９】
本発明の組成物を対象となる筋欠損部位に供給することにより、本発明を治療用途に用いることができる。一つのアプローチとして、組成物を生理的に適合性の流体中に懸濁し、その組成物を対象の筋欠損部位に注入してもよい。別法として、組成物を足場上に播種し、播種を行った足場を対象の筋欠損部位にインプラントしてもよい。
【００１０】
本発明の方法は、さらに、組成物を、幹細胞、筋前駆細胞、成長因子等の作用物質、またはその組み合わせ等である補助剤（アジュバント）と同時投与するステップを含んでもよい。例えば、アジュバントは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＲＵＮＸ−２タンパク質、ＬＩＭミネラリゼーションタンパク質、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、上皮成長因子、インスリン様成長因子、形質転換成長因子−α、形質転換成長因子−β、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューレグリン（ＮＲＧ），およびアグリンの群から選択した少なくとも１つの成長因子を含んでいてもよい。
【００１１】
足場を利用する場合は、足場で支持した断片を体外培養してから、足場を対象の筋欠損部位に送達することが好ましいといえる。足場は、コラーゲンゲル系、フィブリンゲル系、アルギン酸ゲル系、または紫外線誘導架橋性ゲル系から選択した注入可能な足場でもよい。別法として、足場は、有機マトリックスまたはポリマー性マトリックスを含むインプラント可能な足場でもよい。有機マトリックスは例えば、粘膜下組織のような脱細胞化組織でもよい。ポリマー性マトリックス物質の例として、例えばコラーゲンまたはエラスチン等の１つまたは複数の天然ポリマー、または、例えばポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）（ＰＬＣＬ）等の１つまたは複数の合成ポリマー、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。
【００１２】
いくつかの実施形態によれば、マトリックスは、例えばコラーゲンとポリカプロラクトン（ＰＣＬ）の組み合わせのように、少なくとも１つの天然ポリマーおよび少なくとも１つの合成ポリマーの組み合わせにより生成した、エレクトロスピンした線維マトリックスでもよい。
播種を行った足場は、さらに、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＲＵＮＸ−２タンパク質、ＬＩＭミネラリゼーションタンパク質、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、上皮成長因子、インスリン様成長因子、形質転換成長因子−α、形質転換成長因子−β、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明では、効率的な機能的筋再生のための、均一に構成した筋線維の小断片、および、これらの筋線維断片の作成方法および使用方法について説明する。筋線維の小断片を用いることにより、注入した断片は、生来の筋線維方向に沿って、宿主筋組織への効率的に再集合するようになる。宿主の血管網および神経回路網への統合が観察されている。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明に係る、筋組織再生のために筋線維細胞から筋線維断片を形成する方法を示す概略図である。
【図２】本発明に係る筋線維断片のマイクロ写真である。
【図３】本発明に係る筋組織再生における各ステップを示すブロック図である。
【図４Ａ】ラットにおいて化学的に誘発したＴＡ筋損傷へ筋線維断片（ＭＦ）を注入することによる、ＭＦ技術の筋委縮モデルへの適用を示す概略図である。
【図４Ｂ】ＭＦをＴＡ筋損傷へ直接注入したことにより、７日間、２１日間、２８日間で筋機能が顕著に増強したことを示すグラフである（スチューデントｔ検定、Ｐ＜０．０５、ｎ＝７、２つの独立した実験）。
【図５Ａ】注入より３週間後の筋委縮研究の細胞の形態学的分析であり、注入したＭＦとＭＦ由来の筋前駆細胞（Ｐａｘ７＋細胞）（図５Ｂ）の宿主の筋肉（図５Ａ）への統合を５０μｍ縮尺で示す図である。
【図５Ｂ】注入より３週間後の筋委縮研究の細胞の形態学的分析であり、注入したＭＦとＭＦ由来の筋前駆細胞（Ｐａｘ７＋細胞）（図５Ｂ）を５０μｍ縮尺で示す図である。
【図５Ｃ】注入より３週間後の筋委縮研究の細胞の形態学的分析であり、注入したＭＦとＭＦ由来の筋前駆細胞（Ｐａｘ７＋細胞）（図５Ｂ）の宿主の血管網（図５Ｃ）への統合を５０μｍ縮尺で示す図である。
【図５Ｄ】注入より３週間後の筋委縮研究の細胞の形態学的分析であり、注入したＭＦとＭＦ由来の筋前駆細胞（Ｐａｘ７＋細胞）（図５Ｂ）の宿主の神経回路網（図５Ｄ）への統合を５０μｍ縮尺で示す図である。
【図６Ａ】インプラント可能なＭＦ含有構造物の、外傷性筋欠陥モデルへの適用を示す図である。図６Ａは、外科的に誘導したＴＡ筋欠陥ラットにおいて、ＭＦ／コラーゲン構造物をインプラントする概略図である。
【図６Ｂ】インプラント可能なＭＦ含有構造物の、外傷性筋欠陥モデルへの適用を示す図である。欠陥ＴＡ筋へＭＦ／コラーゲンをインプラントすると、機能的に[図６Ｂ]筋回復の増強が効率的に誘導された。＊ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙのＢおよびＣにおける分析、Ｐ＜０．０５、ｎ＝７、２つの独立した実験。
【図６Ｃ】インプラント可能なＭＦ含有構造物の、外傷性筋欠陥モデルへの適用を示す図である。欠陥ＴＡ筋へＭＦ／コラーゲンをインプラントすると、構造的にも（図６Ｃ、インプラント後４週間）筋回復の増強が効率的に誘導された。＊ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙのＢおよびＣにおける分析、Ｐ＜０．０５、ｎ＝７、２つの独立した実験。
【図７Ａ】尿道括約筋障害による失禁（ＵＳＩ）モデルにＭＦ技術を適用した例であり、尿道括約筋損傷にＭＦを注入した概略図である。
【図７Ｂ】尿道括約筋障害による失禁（ＵＳＩ）モデルにＭＦ技術を適用した例である。ＭＦ注入後の括約筋機能の改善により、尿流動態機能が増強したことを示すグラフである。電気刺激有り（Ｐ２）の場合と無し（Ｐ１）の場合の尿漏出点圧力。Ｐ２−Ｐｌ＝外括約筋が維持する最大膀胱圧力、＊スチューデントｔ検定、Ｐ＜０．０１、ｎ＝３。
【図８Ａ】臨床応用のための、ヒト筋線維断片処理の代替技術を示す図である（処理時間約３０分）。
【図８Ｂ】均質かつ均一なサイズのヒトＭＦの形態および重量収率（３０％〜４０％）を示す顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の理解がより容易になるよう、いくつかの用語を最初に定義しておく。
【００１６】
「約（ａｂｏｕｔ）」や「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、特定の値について、当業者によって決められた許容可能な誤差範囲内にあることを意味し、それは部分的には、その値がどのように測定されたか、または決定されたか（例えば、測定システムの限界、または特定の目的のために必要とされる精度の度合いなど）に依存する。例えば、「約」は、その分野の慣例にしたがって１以内または１より大きい標準偏差を意味することができる。また、「約」は、ある与えられた値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、さらにより好ましくは１％までの範囲を意味することができる。特定の値が、本出願や特許請求の範囲に記載されている場合、別段の記載がない限り、「約」という用語は、特定の値に対し許容可能な誤差範囲内にあることを意味するものと想定すべきである。
【００１７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形（「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」）は、文脈から明らかに単数形であるとの示唆がない限り、複数の指示対象を含む。よって例えば、「分子（ａ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」との記載は、１つ以上のそのような分子を含み、「樹脂（ａ  ｒｅｓｉｎ）」との記載は、１つ以上のそのような異なる樹脂を含む。「前記方法（ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」との記載は、本明細書に記載の方法と変更または代替可能である当業者にとって既知の等価のステップおよび方法についても言及するものである。
【００１８】
「異方性」とは、物質（例えば、筋管、足場等）の物理的性質（例えば、弾性、抗張力、破断伸び等）が作用（例えば、伸縮や張り）の方向によって異なることを意味し、これは、物質の性質が全方位において同一である「等方性」とは反対である。例えば、異方性の細胞基質では、一の軸（例えば長手方向の軸）に沿った最大抗張力が、その軸に対して垂直な軸に沿った最大抗張力よりも（例えば、０ＭＰａ、１ＭＰａまたは２ＭＰａから４ＭＰａ、５ＭＰａ、６ＭＰａ以上）大きくてもよい。一の軸（例えば長手方向の軸）に沿った破断伸びは、その軸に対して垂直な軸に沿った破断伸びよりも（例えば、１０％、２０％、３０％または４０％から５０％、６０％、７０％または８０％以上）小さくてもよい。一の軸（例えば長手方向の軸）に沿った応力曲線（ＭＰａ）のピークは、その軸に対して垂直な軸と比較して、より低ひずみ（％）で達成されていてもよい。好ましくは、物質は濡れた状態（例えば、リン酸緩衝食塩水に浸した状態）にて室温で検査される。
【００１９】
本明細書において用いる、「付着（ａｔｔａｃｈ）」または「付着する（ａｔｔａｃｈｅｓ）」という用語は、直接または間接的に基質に接着する細胞、および他の細胞に接着する細胞をいう。
【００２０】
本明細書において用いる、「生体適合性基質」という語句は、被験者へのインプラントに適した物質をいい、生体適合性基質には細胞個体群を沈着させることができる。生体適合性基質は、いったん被験者にインプラントされれば、毒性作用または有害作用を引き起こすことはない。一実施形態では、生体適合性基質は、修復または交換を必要とする所望の構造に成形可能な表面を有するポリマーである。このポリマーは、修復または交換を必要とする構造の一部として成形することも可能である。生体適合性基質は、それに細胞が付着可能で、またその上で細胞が成長することも可能な、支持的枠組みを提供する。そして、培養された細胞個体群は、その生体適合性基質上で成長し得、それにより細胞間の相互作用に必要な適切な間隙距離が得られる。
【００２１】
「生分解性足場」、「生分解性メッシュ」、または「生分解性マトリックス」は、被験者の体内において、分解および／または吸収可能な物質を有する足場である。望ましくは、足場またはマトリックは、多孔質でマトリックスの各孔の表面と内側の両方に細胞が沈着可能であり、特定の実施形態では、形作られたものである。そのような形成は、少なくとも１つの細胞個体群を生分解性足場に供給することで行われ、その細胞個体群を足場の表面および／または内部に播種する。いくつかの実施形態では、播種を行った足場を、その後レシピエントである被験者の体内にインプラントして、そこで組織化された細胞個体群が機能的組織構造の形成を促進する。
【００２２】
本明細書において用いる「共重合体（コポリマー）」という用語は、コポリマー、ターポリマー、および、各ポリマー性成分のブロック、グラフ、または無作為な組み合わせにより形成した、より高次の多重ポリマー組成を包含することを意図している。
【００２３】
本明細書において用いる、「脱細胞化した（ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ）」または「脱細胞化（ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）」という用語は、無損傷の無細胞のインフラ構造を残した状態で、細胞および組織の内容物が取り除かれた生体構造（例えば、臓器または臓器の一部）に言及する際に使われる。腎臓のような臓器は種々の特殊化した組織から構成されている。ある臓器の特殊化した組織構造、または実質組織は、その臓器と対応付けられた特有の機能を提供する。臓器の支持的線維網はストロマである。ほとんどの臓器は、非特殊化結合組織からなるストロマ性枠組みを有し、それによって特殊化した組織を支持する。脱細胞化のプロセスにより、複雑な接合組織の三次元網を残して、特殊化した組織を取り除く。その結合組織のインフラ構造は主にコラーゲンから構成される。脱細胞化した構造により、生体適合性基質が得られ、生体適合性基質には種々の細胞個体群が注入可能である。脱細胞化した生体構造は、その形状を変える能力を有して、剛性、または半剛性とすることができる。本発明において有用な脱細胞化臓器の例として、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿管、尿道が挙げられるが、本発明はそれらに限定されない。
【００２４】
本明細書において、筋線維断片ついて用いる「直径」という用語は、各断片の平均直径を意味する。好ましくは、すべての断片の少なくとも８０％が、記載した直径の範囲内とする。より好ましくは、すべての断片の少なくとも９０％が記載される直径の範囲内とする。もっとも好ましくは、すべての断片の少なくとも９５％が記載される直径の範囲内とする。
【００２５】
本明細書において用いる、「エレクトロスピニング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）」または「エレクトロスピンした（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ）」という用語は、電界の存在下で、物質を流す、噴霧する、スパッタする、滴下する、または輸送する場合に用いる、任意の方法に言及するものである。エレクトロスピンした物質は、荷電容器の方向から接地した目標物へ向けて、または接地した容器から帯電した目標物の方向へ向けて沈着させることができる。特に「エレクトロスピニング」という用語は、電気的に帯電した溶液を穴や開口部を通して接地している目標物へ向かって流すことによって、少なくとも１つの天然生体物質、少なくとも１つの合成ポリマー物質、またはそれらの組み合わせを含む帯電した溶液から、線維を形成するプロセスを意味する。
【００２６】
「伸長（ｅｌｏｎｇａｔｅｄ）」という用語は、例えば、筋線維の長さがその幅よりも大きいことを意味する。好ましくは、伸長筋線維の長さは、その幅の少なくとも５倍である。または、より好ましくは、その幅の少なくとも１０倍の長さ、その幅の少なくとも５０倍の長さ、または、その幅の少なくとも１００倍の長さを有する。
【００２７】
タンパク質または他の生体マーカーの「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓ）」または「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は、その遺伝子の前駆体を暗号化する遺伝子が転写されること、および、好ましくは翻訳されることを意味する。典型的には、本発明によれば、遺伝子の符号化領域が発現することによって結果として暗号化されたポリペプチドが生成されるため、その細胞はそのタンパク質または他の生物学的マーカーに対し「陽性」となる。
【００２８】
「線維芽細胞」とは、細胞外マトリックスとコラーゲンを合成する細胞であり、体中の結合組織中に存在する細胞である。
【００２９】
「インプラント片（ｉｍｐｌａｎｔ）」は、（例えば、獣医学または（ヒト）医療の用途において）被験者の天然組織を（少なくとも部分的に）修復、増補、交換するよう構成した生成物をいう。「インプラント可能（ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ）」という用語は、そのデバイスが挿入、埋め込み、移植（グラフト）可能、また長期にわたって患者の内部または身体上に取り付けまたは設置可能である、ということを意味する。インプラント片は、足場または生体足場（それは足場または生体足場上に播種した細胞をさらに含んでも含まなくてもよい）を含むがそれに限られるものではない。
【００３０】
本明細書において用いる「単離した（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」という用語は、細胞がそれらの天然の環境以外の条件下に置かれることを意味する。組織または細胞を被験者から最初に単離すること（例えば、第一次外植）を「採取」という。
【００３１】
本明細書において用いる「筋欠損」という用語は、身体の損傷、やけど、外科手術による組織切除、筋萎縮、筋ジストロフィー、梗塞、虚血性イベント、神経筋疾患等、筋機能を損なうおそれのある疾患、病気、欠陥、傷害等を広く包含することを意図する。なお筋機能を損なうおそれのある疾患等は上記に限定されない。
【００３２】
筋細胞は、任意の適切な種の筋線維またはミオサイトを含むが、これらに限定されない。また、いくつかの実施形態では、組織をインプラントする被験者と同じ種のものを用いる。いくつかの実施形態では、哺乳類の細胞（マウス、ラット、イネ、ネコ、サル、ヒト細胞を含む）が特に好ましい。筋細胞は、骨格筋細胞、平滑筋細胞、および心筋細胞を含む。
【００３３】
筋線維断片は、同一遺伝子型（すなわち、遺伝的に同一または近縁として、組織移植による拒絶を最小限にする）、同種異系型（すなわち同種で、遺伝子的には非同一の器官から）、または異種型（すなわち異種の器官から）であってもよい。同一遺伝子型の筋線維断片は自家筋線維断片（すなわち処置される患者から）および同質遺伝子型（すなわち遺伝子的に同一だが異なる被験者、例えば一卵性双生児から）の筋線維断片を含む。筋線維断片は、例えばドナー（生体ドナーでも死体ドナーでも）から得てもよいし、または確立された細胞株（ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎ）または株化細胞（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）の細胞から派生させてもよい。例えば、筋線維断片は、本分野で知られている標準的な生検技術を用いてドナー（例えば、生体足場移植片の潜在的レシピエント）から採取してもよい。好適な一実施形態では、筋線維断片は自家移植である。
【００３４】
筋線維（ｍｕｓｃｌｅ  ｆｉｂｅｒまたはｍｙｏｆｉｂｅｒ）は、多核単一筋細胞である。物理的には、それらは高度に伸長され、そのサイズは、直径１００ミクロン未満で全長数ミリメートルのものから直径数百ミクロンで全長数センチメートルのものまで、幅広い。細胞には、収縮性タンパク質、エネルギー貯蔵所およびシグナル伝達機構が密集している。
【００３５】
筋線維細胞は発達中の筋芽細胞（筋細胞を生じさせる胚性の前駆細胞の一種）同士の融合により形成される。筋線維は、長円筒状の多核細胞であり、サルコメアとして繰り返されるアクチンおよびミオシン筋原線維からなる。サルコメアは、筋線維の基本的機能単位であると同時に、骨格筋に縞模様の外観を与えており、筋収縮に必要な基本的な機構を形成している。
【００３６】
筋線維はもっとも小さい完全な収縮系である。よって、それは代謝、刺激、収縮のための下位システムを必要とする。効率よく力を生成するために、収縮は線維全体の長さに沿って同時に刺激されなければならない。収縮信号は、Ｔ管系によって線維に沿って素早く広がり、それは筋小胞体（ＳＲ）からカルシウムイオンを素早く放出することを合図する。収縮信号がやむと速やかに、ＡＴＰ駆動カルシウムポンプが、このＳＲ中のほぼすべての細胞内カルシウムを隔離し始める。
【００３７】
各筋線維の内部には筋原線維の回路網が存在する。これらの原線維は、実際に力を生成するタンパク質を含んでいる。骨格筋がその特徴的な縞模様パターンを示すのはこれらの原線維によるものである。タンパク質の大規模な回路網は、各筋原線維をその隣接する原線維および細胞膜に結び付けている。
【００３８】
「筋芽細胞」は筋幹細胞の一種で、通常は脊椎生物におけるその一生涯を通じて筋線維と密接に関連付けられている。もし筋線維が損傷を受けた場合、その筋芽細胞は分裂し再増殖させることができる。典型的には、筋肉が損傷を負った後、筋線維は壊死し、マクロファージによって除去される（Ｈｕｒｍｅ他著、（１９９１）「骨格筋損傷の治癒：微細構造および免疫組織化学的研究」、スポーツおよびエクササイズにおける医薬および科学、第２３巻、８０１頁〜８１０頁（Ｈｅａｌｉｎｇ  ｏｆ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｉｎｊｕｒｙ：  ａｎ  ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ，  Ｍｅｄ．Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｅｘｅｒｃ．２３，８０１−８１０）。これは筋芽細胞の増殖および融合を誘導し、多核伸長筋管を形成する。そしてこれらは、自ら集合し、より高度に組織化された構造、すなわち筋線維を形成する（Ｃａｍｐｉｏｎ著、（１９８４）「筋衛星細胞：レビュー」、細胞学の国際的レビュー、第８７巻、２２５頁〜２５１頁（Ｔｈｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｃｅｌｌ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ，  Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．８７．２２５−２５１））。
【００３９】
「ミオサイト」は筋細胞、筋線維、または骨格筋細胞である。ミオサイトは筋芽細胞同士の融合により形成される。
【００４０】
上記のとおり、「筋原線維」は、多数の筋細線維（ｍｙｏｆｉｌａｍｅｎｔｓ）からなる、筋線維の細い糸である。筋原線維は、細胞の一端から他端まで伸び、各端が細胞表面の膜に付着している。
【００４１】
「筋管」は、長尺の多核細胞であり、通常は筋芽細胞同士の融合により形成される。筋管は成熟した筋線維に成熟することができ、その細胞質において、核および筋原線維は周囲に位置する（例えば、哺乳類の場合）。血清濃度が低い状態では、筋芽細胞は、細胞周期を抜け出して、融合し収縮可能な多核筋管を形成する。
【００４２】
本明細書において、「ナノ粒子」、「ナノ構造」および「量子ドット」という用語は、同義で用いられ、いずれも１ナノメートルまたは数ナノメートルから数マイクロメートル程度、より好ましくは約１ナノメートルから約１０００ナノメートルの寸法を有する物質を表す。
【００４３】
「天然生体構造」という用語は、本明細書では、被験者の内部に存在する生体配置に言及する際に使われる。例えば、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿管、尿道を含む臓器のことを指すが、これらに限定されない。「天然生体構造」という用語は、生体構造の各部を含むことも意図する。例えば、各臓器の各部であり、それは例えば、腎臓の腎動脈である。天然の生体物質は、哺乳動物、植物、または他の有機生命体に自然に存在する任意の物質を含む自然に発生する有機物質であればよい。合成ポリマー物質は、人工的な合成、処理、または製造方法を使って作製した任意の物質であればよい。好ましくは合成物質は生体適合物質である。これらの天然物質または合成物質はまた、電界下において帯電可能な物質である。
【００４４】
「配向された（ｏｒｉｅｎｔｅｄ）」細胞および／または細胞基質は、典型的には１つ（またはそれ以上）の配向軸（例えば縦軸）を有し、それは関心領域内であれば、どの所望の方向でもよい。組織において十分に増加して、本明細書に記載した方法の特定の態様における、意図した効果や利益を得られるのであれば、本明細書で使われる「配向（ｏｒｉｅｎｔｉｎｇ）」とは、部分的または全体的配向を含み得ると理解されよう。例えば、７０％、８０％、９０％、または９５％以上より多い線維および／または細胞が、基準軸から任意の方向に５０度、４０度、３０度、２０度、または１０度以下の角度になるよう、線維および／または細胞を縦軸に沿って配向してもよい。
【００４５】
「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」という用語は、本明細書では、外傷や腫瘍切除、機能的損傷等によって失われた筋組織の修復または再構築を必要としている宿主動物に言及する際に使われる。好ましい患者は、哺乳類である。患者の例として、ヒト、ウマ、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジが挙げられるが、これに限られるものではない。いくつかの実施形態では「患者」は一般的にヒトの患者である。
【００４６】
「初代培養」とは、脱凝集した細胞または第一次移植片を培養容器に播種した後に確立される第１の培養物のことである。「拡張する（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）」または「拡張（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）」は、本明細書では、生存細胞の数の増加を言及する際に使われる。拡張は例えば、１つ以上の細胞周期を通じて細胞を「成長させる」ことで達成されてもよい。細胞の拡張においては、少なくとも細胞の一部が分裂することで、さらなる細胞が生成される。本明細書で「成長させる（ｇｒｏｗｉｎｇ）」とは、細胞を生きた状態で維持するように行う細胞培養を含み、細胞の拡張および／または分化を含んでも含まなくてもよい。
【００４７】
本明細書で使われる「衛星細胞」は、成熟筋でみとめられる細胞質がほとんどない、単核の小さな前駆細胞である。それらは個々の筋線維の基底膜と筋線維鞘（細胞膜）の間に位置している。衛星細胞は、分化および融合して現存の筋線維を増補し、新たな筋線維を形成することができる。損傷を受けていない筋肉においては、衛星細胞の大多数は休眠状態である。すなわち分化もしないし細胞分裂もしない。力学的歪みを受けると、衛星細胞は活性化する。活性化された衛星細胞は、最初は骨格筋芽細胞として増殖し、筋原性分化をする前に、筋管に分化できる。本発明の一実施形態では、ドナーの筋線維は衛星細胞を含む。いくつかの実施形態では、筋線維一断片あたり平均で２〜３個の衛星細胞を含む。他の実施形態では、筋線維断片はより多くの衛星細胞を含む。
【００４８】
「足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）」は、細胞または線維が付着可能な天然または合成のマトリックス分子の配列を指す。線維は、エラスチン、弾性ストランドまたはペプチド、フィブリン、コラーゲン、プロテオグリカン、ヒアルロナンまたはオリゴマーヒアルロン酸、合成線維または原線維、または生物活性ヒドロゲル、微粒子、ビーズ、リポソーム、または小胞等の細胞外マトリックス分子または細胞外マトリックス成分を含んでいてもよい。足場は、さらに、エラスチン、エラスチン様またはエラスチン模倣ペプチド、フィブリン、プロテオグリカン、または、市販のマトリゲル（商標）マトリックス（ＢＤバイオサイエンス社製（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）米国カリフォルニア州サンノゼ）等のマトリックスまたはマトリックス代替物、任意の種類のコラーゲン、合成線維または原線維、または生物活性ヒドロゲル等のような細胞外マトリックス成分を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、米国特許出願公開第２０１０／０３３１９８０号明細書に記載の足場を用いるが、その開示の内容は参照により本明細書に完全に援用される。いくつかの実施形態では、足場は、顕著な一軸性の力学的特性を呈するエレクトロスピンした足場であり、それは極めて高度に配向した、その基礎をなす細胞外マトリックスを反映している。いくつかの実施形態では、足場はエレクトロスピンしたナノ線維のメッシュを含んでいる。いくつかの実施形態では、そのメッシュは一軸性の線維角を有している。
【００４９】
筋線維断片に関連して本明細書で使われる「サイズ（ｓｉｚｅ）」という用語は、その平均直径に沿った断片の長さを意味する。
【００５０】
「破裂（ｒｕｐｔｕｒｅ）」および「破壊（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）」という用語およびそれらの派生語は、本明細書では、細胞質の少なくとも一部分を細胞外環境に露出する、細胞膜の破損または欠損という特性を示す際に使われる。
【００５１】
本明細書で使われる「実質的には」という用語は、５０％超、またはより好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、またはより好ましくは少なくとも９０％、またはさらにより好ましくは少なくとも９５％を意味する。「実質的な細胞壁破裂」という語句は、サンプル中の細胞において５０％を超えた細胞壁が、破裂または破壊されることを意味する。より好ましくは、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の細胞壁が破裂している状態を意味する。
【００５２】
本明細書で使われる「対象の筋部位」という語句は、筋組織の修復または再構築を必要としている位置である。対象の筋部位は、平滑筋、心筋、骨格筋、またはそれらの組み合わせでもよい。対象の筋部位は、外傷、腫瘍切除、または機能的損傷等を受けた部位でもよい。あるいは対象の筋部位は、老化した筋肉またはジストロフィー筋でもよい。
【００５３】
「三次元足場」という語句は、本明細書では、細胞播種および生育に適した合成マトリックスまたは大部分が無細胞の有機マトリックスに言及する際に使われる。ある好適な実施形態において、「三次元足場」は、例えば臓器や組織等の天然生体構造、が脱細胞化した際に形成される残存インフラ構造に言及する際に使われる。この複合的な三次元の足場は、極めて支持的な枠組みを提供することができ、それにより細胞がその足場に付着しそこで成長することができる。培養した細胞個体群を、続いてその三次元足場で成長させることで、細胞対細胞の相互作用に必要な的確な間隙距離が得られる。これにより生来の体内臓器または組織に類似した再構築臓器が提供される。
【００５４】
このような三次元足場には、例えば筋細胞等の培養した細胞の個体群を潅流させてもよい。いくつかの実施形態では、足場には、内皮細胞のような他の種類の細胞を播種してもよい。内皮細胞は成長発達し、例えば筋細胞等の少なくとも１つの追加の培養細胞個体群の成長および発育の土台となりうる内皮組織層を提供する。
【００５５】
「処置（ｔｒｅａｔ）」は、被験者に利益を与えるあらゆる種類の処置に言及する際に使われるが、この場合の被験者とは、例えば病気（例えば筋骨格疾患）の発症に苦しめられている、またはそのリスクにさらされている患者のことである。処置は、患者の状態を改善する目的で行われた行為、および行うことを控えた行為（例えば、１つ以上の症状の軽減）、病気の発病または進行の遅延等を含む。いくつかの実施形態では、処置は異方向性足場（筋細胞の有無にかかわらず）をそれを必要としている被験者にインプラントすることによって骨格筋組織を（例えば、そのような組織が、例えば怪我または病気で損傷を受けたり失われたりした場合に）再構築することを含む。足場は、例えば損傷を負った部位またはその近傍、および／または被験者に利益を与えうる被験者の体の別の部位にインプラントされてもよいことは、当業者であれば理解可能であろう。
【００５６】
筋細胞断片のインプラントは、他の特定の理論に限定されることなく、すぐに新たな筋組織の生成につながる一連の事象を誘導すると考えられる。これらの事象は、断片の自主的な修復、および／または、新たな筋細胞への成長または休眠状態の衛星細胞の活性化を含んでもよく、これらは断片の修復、および／または新たな筋細胞の成長を誘導する。さらには、それら断片自身が、他の断片を再構成および修復、および／または新たな筋細胞の成長を促進するために捕捉され利用されうるアクチンおよびミオシン筋原線維の即時の発生源を提供することがわかる。
【００５７】
図１は、筋組織再生のため長筋線維から筋線維断片を形成する方法を示す概略図である。上図は、損傷を受けていない伸長筋線維細胞１０を示す概略図であり、その筋線維細胞は、細胞壁１２、多数の核１４および付随する衛星細胞１６を有している。下図は、本発明による処置により得られる断片のセット２０を示す図である。各断片は、細胞壁２２が破壊されていることに特徴がある。好ましくは、ほぼ全ての断片が少なくとも１つの生来の核および少なくとも１つの関連衛星細胞１６を保持する。
【００５８】
図２は、本発明により形成された筋線維断片のマイクロ写真である。ほとんどの断片が１００μｍ程のサイズである。この倍率では必ずしも可視可能ではないが、これらの断片は破壊された細胞壁を呈している。このように細胞壁が破壊されているにもかかわらず、各衛星細胞は各断片に付随されたままである。
【００５９】
図３は、本発明に係る筋組織再生における各ステップを示すブロック図である。最初のステップにおいて、ドナー筋組織を、例えば切除または抽出により採取する。次のステップにおいて、該組織を脱凝集して個々の線維とするが、この脱凝集は、例えば結合組織の細分化および／または酵素による消化により線維同士を相互に解放することにより行う。また次のステップにおいて、各線維を、それぞれ、例えば機械的攪拌および／またはろ過により断片化する。任意で、線維断片を足場に播種することができる。（この技術のさらなる詳細については、例えば、開示の内容を参照により本明細書に援用した、Ｌｅｅ他による米国特許出願公開第２０１０／０３３１９８０号明細書を参照されたい。）最後のステップにおいて、断片化または播種を行ったマトリックスを、筋組織再生を所望する対象の部位に注入またはインプラントすることができる。以下に、方法および組成物についてさらに詳細に記載する。
【００６０】
I．線維作製
驚くべきことに、約１５０μｍ未満の均一なサイズを有する筋線維断片を筋欠陥の部位に移植することにより、断片から、生存筋組織の生成用の構築ブロックを得ることができるとともに、そのような組織の宿主血管網および神経回路網への統合が促進されることがわかった。よって、本明細書に記載の方法により、被験者自身の組織から派生した自家移植細胞個体群を効率的かつ迅速に作製して利用できる。
【００６１】
筋線維の小断片を用いると、注入した断片（または足場上の断片）は、生来の筋線維方向に沿って宿主筋組織へ効率的に再集合するようになる。そして、各線維断片は宿主の血管網および神経回路網に統合できる。
【００６２】
均一な筋線維断片を作製するために、まず筋組織をドナー部位から抽出する。この筋組織は衛星細胞だけでなく生存筋細胞も含んでいるべきである。そして筋線維断片は、酵素消化法、機械的断片化、およびろ過により取得する。そうして取得した筋線維断片は、例えば、対象の部位へそのまま直接注入するか、粒子／粉末状に成形してから対象の部位に注入するか、または培養した足場に塗布してから対象の部位にインプラントすることができる。
【００６３】
筋組織は、任意の従来技術を用いてドナー部位から抽出してもよい。ドナー筋組織は、同一遺伝子型（自家型または同質遺伝子型）、同種異型型、または異種型でもよい。一実施形態では、ドナー筋組織を自家筋組織とするが、この場合、自家組織は免疫系から拒絶されることはないので、特に有利である。筋組織は、例えば大腿四頭筋のような肢筋、または他の適切な筋肉（例えば、動物の後肢筋等）から抽出可能であり、抽出には当該技術分野において従来から既知の標準的な生検技術を用いることができる。
【００６４】
筋組織を細分化することにより、脱凝集を行うための各小片が得られる。好ましくは、筋線維を小サイズに細分化する。いくつかの実施形態では、筋組織は、無菌鉗子および／またはさみを用いて、５ｍｍ未満、４ｍｍ未満、３ｍｍ未満、２ｍｍ未満、１ｍｍ未満、または０．５ｍｍ未満のサイズに細分化できる。（サイズ分布は不均一でもよい。）
【００６５】
細分化後、筋線維を脱凝集剤により脱凝集することが好ましい。好ましくは、脱凝集剤は、衛星細胞をミオサイトから解離せずに、筋線維を消化する必要がある。一実施形態では、脱凝集剤は酵素であり、筋線維を消化する。酵素の好ましい一例として、I型コラゲナーゼが挙げられる。使用可能なその他の脱凝集剤の例としては、その他のコラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラーゼＨＩ、およびペプシン、またはそれらの混合物を含むが、それらに限定されない。
【００６６】
脱凝集筋線維を、続いて断片化する。一実施形態では、消化した筋線維を機械的に断片化する。筋線維を機械的に断片化する一方法として、反復ピペット操作による混合等を利用することが好ましい。ピペット先端へ筋繊維を繰り返し吸い上げ放出することにより、筋線維が混合され断片化される。一実施形態では、消化筋線維断片を５回以上、１０回以上、１５回以上、２０回以上、２５回以上、３０回以上、またはそれ以上の回数で、ピペット先端へ吸い上げて放出する。筋線維を機械的に断片化する別の方法は、強力な攪拌によるものである。なお、筋線維を機械的に断片化するさらに別の方法は、衛星細胞の実質的溶解を防ぐ周波数および出力で、超音波処理をすることである。
【００６７】
続いて、断片化した筋線維を含む溶液をろ過して直径１５０μｍ未満とする。本発明者らは、ろ過器サイズを１５０μｍ未満とすることが好ましいこと見出した。一実施形態では、各線維断片の直径は、１４０μｍ未満、１３０μｍ未満、１２０μｍ未満、１１０μｍ未満、１００μｍ未満である。その他の実施形態では、各線維断片の直径は、４０μｍと１５０μｍとの間、５０μｍと１４０μｍとの間、６０μｍと１３０μｍとの間、７０μｍと１２０μｍとの間、８０μｍと１１０μｍとの間、または９０μｍと１００μｍとの間である。その他の実施形態では、各線維断片の直径は、６０μｍと１５０μｍとの間、６０μｍと１４０μｍとの間、７０μｍと１３０μｍとの間、８０μｍと１２０μｍとの間、８０μｍと１１０μｍとの間、または８０μｍと１００μｍとの間である。一実施形態では、直径が８０μｍと１００μｍとの間である筋線維が、筋組織をインプラントおよび生成する際の均一な線維断片として特に有用であることがわかった。一実施形態では、ろ過器は１００μｍろ過器である。任意で、より小さいサイズの断片は、小ろ過器（すなわち、８０μｍ、７０μｍ、６０μｍ、５０μｍ、４０μｍ、または３０μｍろ過器）を通してスクリーニングし、ろ液を廃棄することで筋線維から除去してもよい。ろ過器（ｆｉｌｔｅｒ）およびこし器（ｓｔｒａｉｎｅｒ）という用語は、本明細書では同義で用いられる。
【００６８】
本明細書に記載の方法により得られた均一な筋線維断片は、それぞれ、少なくとも２つの成分を含む。各筋線維断片は、機能的衛星細胞および筋線維細胞断片を含む。一実施形態では、衛星細胞の５０％以上が機能している。別の実施形態では、衛星細胞の７５％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上が機能している。均一な筋線維断片中の各筋線維の細胞壁は、実質的に破裂している。それら細胞壁は、全筋線維の５０％超、７５％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上が破裂している。均一な筋線維断片中の衛星細胞の機能性は、当該技術分野で従来より既知の任意の方法を用いて測定することができる。例えば、衛星細胞は、ヴァイブラント（Ｖｙｂｒａｎｔ）、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、またはパックス７（Ｐａｘ７）免疫染色等といった染料で蛍光標識してもよい。
【００６９】
均一な筋線維断片中の筋衛星細胞の量は、有効量、すなわち筋線維断片が、衛星細胞がその筋形成の役割を果たすのに十分な細胞の量を含むということである。線維断片中の衛星細胞の実際の量は、ドナー物質の種類、修復される筋損傷の種類、投与方法、および線維断片に提供される追加成分等の要因によって可変である。
【００７０】
一実施形態では、筋線維断片は無細胞筋線維断片でもよい。別の実施形態では、筋線維断片は、無細胞筋線維由来粒子／粉末でもよい。免疫原性成分を含まない無細胞断片の利用は、機能的筋再生のための同種異系移植への有望な方法になりうる。細胞や残留ＤＮＡ等の免疫原性成分を除去することにより、無細胞断片はドナー細胞含有筋線維と比較すると免疫反応をより低減させることができる。加えて、無細胞断片は、ｉ）内因性衛星細胞の付着、生存、および増殖のための適切な構造的構築物および細胞外マトリックスを提供する、筋肉に特有の鋳型としての役割、およびｉｉ）栄養素を分泌することにより筋細胞を刺激するものとしての役割等、重要な役割を果たす。
【００７１】
ＩＩ．３次元再構築物
いくつかの実施形態では、均一な線維断片を、足場、または工学技術で構築された筋組織である３次元（３Ｄ）再構築物を用いて筋損傷箇所にインプラントする。筋損傷が大規模な欠陥部位を含む場合、３Ｄ再構築物の利用は特に有用である。３Ｄ筋組織は、筋線維断片を、注入可能な足場（コラーゲンゲル系、フィブリンゲル系、アルギン酸ゲル系、または紫外線誘導架橋ゲル系）または天然ポリマーおよび合成ポリマー由来のインプラント可能な足場のような足場システムと組み合わせることにより作製し得る。
【００７２】
一実施形態では、エレクトロスピニング法を用いて足場を形成して、マトリックスを作製する。エレクトロスピニングで作製したマトリックスとして特に有用なものは、例えば以下の文献に記載されている。それらは、米国特許第７，５３１，５０３号明細書「組み込まれた治療薬を備えた細胞足場マトリックス（Ｃｅｌｌ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ  Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ）」、米国特許出願公開第２０１０／０１２９４５０号明細書「エレクトロスピンした細胞マトリックス（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｔｒｉｃｅｓ）」、および米国特許出願公開第２０１０／０３３１９８０号明細書「骨格筋再生のための整列足場システム（Ａｌｉｇｎｅｄ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」であり、その各開示内容は参照により本明細書に完全に援用される。
【００７３】
均一な線維断を表面にインプラント可能なマトリックスは、生体適合性を有し、好ましくは生分解性を有する。生分解性物質を形成する物質の代表例としては、コラーゲン、ポリ（乳酸）等のポリ（アルファ  エステル）、ポリ（グリコール酸）、ポリオルトエステルおよびポリ無水物およびそれらのコポリマー等の、天然もしくは合成のポリマーが挙げられ、これらは制御速度で加水分解され、再吸収される。これらの物質においては、分解性、扱い易さ、サイズ、および形状を最大限制御することができる。好適な生分解性ポリマー物質の例として、吸収性の合成縫合物質として開発されたポリグリコール酸およびポリグラクチンがある。
【００７４】
本発明の１つの態様では、マトリックスはエレクトロスピンしたマトリックスであり、少なくとも１つの天然生体物質成分および少なくとも１つの合成ポリマー物質を含む。一実施形態では、天然生体物質成分は、（生体組織源から派生または合成し得る）コラーゲンを含み、合成ポリマー成分は、高分子量、例えば、分子量１，０００以上、好ましくは、２，０００と２０，０００との間の分子量を有する。天然成分により、マトリックスにおいて高度な生体適合性を実現し、および／または免疫抗原性の低減する一方、分子量ポリマー成分はさらなる機械的強度をマトリックスに与え得、および／またはエレクトロスピニングを行う際の溶液の粘度およびスピン特性を増加させることにより製造の容易性を高める。エレクトロスピンしたマトリックスに用いられる物質は、帯電溶液中で帯電可能または輸送可能である。
【００７５】
エレクトロスピンしたマトリックスは、さらに、弾性を与えるために選択した第２の天然成分を含むことができる。例えば、天然生体物質成分は、（上記と同様に、生体組織源から派生または合成した）エラスチンを含むことができる。エレクトロスピニングに続き、マトリックスは、従来から既知の様々な架橋方法を用いて、架橋結合して、安定性および強度を向上することもできる。
【００７６】
エレクトロスピンしたマトリックスに含まれうる自然発生物質の例としては、アミノ酸類、ペプチド類、変性コラーゲンに由来するゼラチン等の変性ペプチド類、ポリペプチド類、タンパク質類、炭水化物類、脂質類、核酸類、糖タンパク質類、リポタンパク質類、糖脂質類、グリコサミノグリカン類、およびプロテオグリカン類が挙げられるが、これらに限定されない。好適な実施形態では、物質成分は、細胞外マトリックス物質であり、細胞外マトリックス物質の例として、コラーゲン、フィブリン、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、コンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、ヘパリン、およびケラタン硫酸、およびプロテオグリカンが挙げられるが、これらに限定されない。これらの物質は、ヒトまたは他の動物または細胞より単離してもよい。好ましい天然成分はコラーゲンである。コラーゲンの例は、これらに限定されるものではないが、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶ、コラーゲンＶＩ、コラーゲンＶＩＩ、コラーゲンＶＩＩＩ、コラーゲンＩＸ、およびコラーゲンＸが挙げられる。別の好ましい天然成分は、エラスチンである。エラスチン線維は、数種の組織に弾性を与える役割を果たす。エラスチンは、例えば、皮膚、血管、および肺組織に存在して、強度、弾性および柔軟性を与える。
【００７７】
エレクトロスピンしたマトリックスに含まれうる合成ポリマーの例は、１つ以上のポリ（乳酸）ポリマー類、ポリ（グリコール酸）ポリマー類、ポリ（ラクチド−コ−グリコライド類）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ウレタン類）、ポリ（シロキサン類）またはシリコーン類、ポリ（エチレン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（ビニル酢酸）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレン−コ−ビニル酢酸）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸類（ＰＧＡ）、ナイロン類、ポリアミド類、ポリ無水物類、ポリ（エチレン−コ−ビニルアルコール）（ＥＶＯＨ）、ポリカプロラクトン類、ポリ（ビニル酢酸）、ポリビニルヒドロキシド、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、およびポリオルトエステル類が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。一実施形態では、合成ポリマー成分は、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）等のポリ（乳酸）ポリマーまたはポリ（グリコール酸）ポリマーまたはそれらのコ−ポリマーであり、約１，０００から約２０，０００の分子量を有する。
【００７８】
一実施形態では、足場は、さまざまな溶媒およびポロゲンから１つ以上を利用して、合成ポリマーを用いて形成する。一実施形態では、分子自己集合を用いて足場を形成する。好適な一実施形態において、ヒドロゲル足場を形成する。
【００７９】
本発明の方法および組成物を用いて、均一な線維断片を局所的に送達することができる。付加的な治療剤および／または生物剤をマトリックスに追加してもよいし、それらの試剤を被験者における対象の目的部位で制御放出することも考えられる。機能的添加剤として、画像増感剤または造影剤（例えば、ガドリニウム、またはバリウム）、または治療薬またはその他の生物学的薬剤を含むことができる。一実施形態では、治療薬または生物学的薬剤はナノ粒子と結合させうる。ここで、ナノ粒子は、例えば量子ドット構造であり、例えば、ある波長の放射線またはナノ粒子に容易に吸収可能な範囲の波長の放射線を照射する等のエネルギー印加、により活性化する。
【００８０】
３次元再構築物は、（ポリマー基質を均一な筋線維断片とともにインプラントする前または後で）インプラントに先立って添加剤または薬剤を用いて処理して、例えばインプラント後の新たな組織形成を促進することができる。よって、例えば、成長因子類、サイトカイン類、細胞外マトリックス成分、および他の生物活性物質を基質に加えて、移植（ｇｒａｆｔ）治癒および新たな組織の形成を促進することができる。このような添加剤は、一般に、再構築または増補しようとする組織または臓器に照らして選択され、適切な新たな組織が、移植された臓器または組織に確実に形成されるようにする（骨組織治癒を促進するために利用される添加剤の例として、例えば、Ｋｉｒｋｅｒ−Ｈｅａｄ著、ＣＡ  獣医外科、第２４（５）巻：４０８−１９、（１９９５）（Ｃ．Ａ．  Ｖｅ．Ｓｕｒｇ．２４（５）：４０８−１９（１９９５））を参照されたい）。例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ、例えば、開示の内容を参照により本明細書に援用した米国特許第５６５４２７３号明細書を参照）を用いて、新たな血管組織の形成を促進することができる。成長因子および他の添加剤（例えば上皮成長因子（ＥＧＦ）、ヘパリン結合上皮様成長因子（ＨＢＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、サイトカイン類、遺伝子類、タンパク質類、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューレグリン（ＮＲＧ）、およびアグリン等）は、基質上に播種した細胞により生成され得る成長因子がある場合は、その量よりも多く加えることができる。そのような添加剤の添加量は、好ましくは、（例えば宿主細胞の移植片への浸潤を生じさせるか、または浸潤を促進することにより）修復または増補しようとする組織または臓器に適切な種類の新たな組織の形成を促進するのに十分な量とする。その他の有用な添加剤の例として、抗生物質等の抗菌剤が挙げられる。
【００８１】
マトリックスは保管され、均一な筋線維断片をインプラント直前に播種することにより利用することができる。多くのエレクトロスピンしたマトリックスは、いったんスピンされると乾燥し、そして乾燥もしくは凍結状態で保管することができる。保管条件は、用いたエレクトロスピンした成分、および治療薬がマトリックス上または内部に包含されているかどうかにより決まる。治療薬を包含した実施形態では、マトリックスの保管は、０℃未満の温度で真空下、または凍結乾燥状態で行いうる。マトリックス内部およびマトリックス上の物質によっては、その他の保管条件、例えば、室温、暗中、真空もしくは減圧下、不活性な雰囲気下、冷蔵温度、水性もしくは他の液体溶液中、または粉末状態等を利用することができる。
【００８２】
マトリックスは、照射および加熱等従来より当業者にとって既知の手段を介して滅菌することができる。マトリックスは、チメロサール等の静菌剤と組み合わせて、バクテリアの成長を阻害することもできる。いくつかの実施形態では、保管および輸送を安定して行うための化学品、溶液、または方法で組成物を処理することができる。
【００８３】
ＩＩＩ．移植
本発明においては、均一な筋線維断片を患者に注入する。線維断片は、それぞれ、移植後に宿主内で容易に統合可能な細胞の生存能力を維持する。よって、各線維断片を長線維に再構築し、生来の筋方向に沿って向きを揃えることができる。各線維断片は宿主筋線維に再集合し血管系及び神経系と統合し、機能的な再構築筋または修復筋が得られる。
【００８４】
本明細書に記載したように筋線維断片を形成することにより、神経筋接合部が維持されるため、宿主内部に筋線維を形成する際、神経が筋線維断片と接続できることがわかった。筋肉の収縮には神経接続が必要とされ。よって、神経筋接合部の維持は本発明の一実施形態の重要な態様である。
【００８５】
一実施形態においては、均一な筋線維断片を患者の対象の筋部位に直接注入する。線維断片はサイズが小さく均一であるため、各線維断片は、生来の筋肉の方向に配列した長い線維に再構築可能となる。
【００８６】
一実施形態においては、均一な筋線維断片を、３次元再構築物を形成するマトリックスにインプラントまたは播種をして、患者にインプラントする。
【００８７】
本発明は、筋線維を患者内部のドナー部位から採取し、均一な筋線維断片を作製し、その均一な筋線維断片を患者内部の対象の部位に注入するという工程を、たった１日のうちに行うものである。よって、採取および注入を単時間枠で行うことが可能なため、患者は複数回にわたって病院またはそれと同様の場所へ行く必要がない。一実施形態において、筋線維を患者のドナー部位から採取し、患者がまだ手術室にいる間に均一な筋線断片を作製して、その均一な筋線維断片をその手術室で対象の部位に注入する。いくつかの実施形態では、採取から注入までの時間枠は８時間未満である。その他の実施形態では、その時間枠は６時間未満である。その他の実施形態では、その時間枠は４時間未満である。その他の実施形態では、その時間枠は３時間未満である。その他の実施形態では、その時間枠は２時間未満である。その他の実施形態では、その時間枠は１時間未満である。
【００８８】
本発明の他の実施形態および用途は、本明細書に開示する本発明の詳細および実施を考慮することにより当業者には明らかとなるだろう。理由のいかんにかかわらず本明細書に引用したすべての米国特許および参考文献は、参照により具体的に援用される。明細書および実施例は例としてのみ考えるべきであり、本発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲により示される。
【実施例】
【００８９】
実施例１：筋線維断片の作製
均一に構成した筋線維断片を、Ｃ５７ＢＬ６マウス（オス、１０週齢〜１２週齢）の前脛骨筋（ＴＡ）および腓腹筋（ＧＮ）から単離した。単離したＴＡ筋またはＧＮ筋は２つの使い捨て外科用メスを用いて細分化した。筋組織は極小サイズにまで細分化した。細分化後、各断片を０．２％のＩ型コラゲナーゼを用いて無血清ＤＭＥＭにおいて、３７℃で１時間振動させて消化させた。酵素消化の後、筋線維をピペット操作で個々の断片に分離した。続いて、それら筋線維溶液を、速やかに細胞濾し器（１００ μｍサイズ、ＢＤｆａｌｃｏｎ社製）を通してろ過して、均一なサイズの筋線維断片を得た。
【００９０】
小筋線維断片を、動物へのインプラント後の線維追跡のため、ヴァイブラント（Ｖｙｂｒａｎｔ）蛍光色素（ＤｉＤ，インビトロジェン社製）で標識した。共焦点顕微鏡検査において、表面に細胞を含む単離した線維断片はヴァイブラント蛍光色素で標識されており、各線維断片のサイズはおよそ直径１００ μｍであることが確認された。
【００９１】
実施例２：筋線維断片の移植
加工した筋断片を注入療法として展開できるかどうかを判断するために、単離した筋線維断片をＣ５７ＢＬ６マウス（１０週齢〜１２週齢）の臀部領域に注入した。ＰＢＳ（線維断片数５００／注入）中の１０μＬの線維断片溶液を２回、臀部領域上の切開部位（０．５ｃｍ〜１ｃｍ）に向けてハミルトン注射器（２６Ｇ、１０μＬ）を用いて注入した。移植後、切開部位を縫合により閉じた。移植後、１週間目、２週間目、３週間目、４週間目に、それぞれ、切開部位の筋組織を採取し、さらにＯＣＴコンパウンドで凍結した。
【００９２】
注入した各筋線維断片が宿主筋線維に再集合し、宿主動物の血管系および神経系と統合するかを調査するため、採種組織を用いて組織学および免疫組織学的実験を行った。凍結組織を薄片にし、１０％ホルマリン溶液で固定してＨ＆Ｅ染色を行った。採種組織の免疫組織化学的実験のため、薄片を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、メタノール処理で透過処理し、その後、マウス抗ミオシン重鎖（ＭＨＣ、ＭＦ２０、ハイブリドーマバンク）、ラット抗マウスＣＤ３１（ＢＤファーミンゲン）、マウス抗Ｐａｘ７（ハイブリドーマバンク）抗体、またはa−ブンガロトキシン（ＢＴＸ）染色との抗ニューロフィラメント（ＮＦ）抗体等の一次抗体で培養し、続いてアレクサ４８８ヤギ抗マウスおよびＦＩＴＣウサギ抗ラット抗体等の二次抗体での培養を行った。核染色には、免疫染色された薄片をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含む封入剤を用いて標本化した。
【００９３】
組織学および免疫組織学的実験は、移植筋線維断片が宿主筋組織の方向の線維として再集合したことを明確に実証し、また移植線維の表面の筋幹細胞（衛星細胞）が生存し続けかつ急増したことも示した。これはヴァイブラント染色およびＭＨＣまたはパックス７免疫染色による二重染色で証明した。さらに、移植線維の宿主動物の血管網への統合もヴァイブラント染色およびＣＤ３１免疫染色の二重染色により確認した。インプラントした線維の宿主動物による神経支配も、ＮＦ免疫染色およびヴァイブラント染色を含むa−ＢＴＸ染色による三重染色により確認した。
【００９４】
実施例３：筋線維断片、長線維および無細胞組織成分における移植効率の比較
脱細胞断片と衛星細胞含有断片の体内効果を比較する実験を行った。マウス体内実験の有望な結果に促されて、長線維の生着と比較して小線維断片が効率的に生着することを判断するために、さまざまな注入量及び数の線維断片を用いてラットでの拡大動物実験を行った。さらに、細胞成分を有しない無細胞断片を移植し、それらが同種異系移植において「一般的に入手可能な（ｏｆｆ−ｔｈｅ  ｓｈｅｌｆ）」成分として利用できるかどうかの可能性を調査した。ラット（ルイスラット、１０週齢〜１２週齢）から、筋線維断片を上記記載のマウスの場合と同じ手順を用いて単離した。さまざまな量（１００μＬ、２００μＬ、及び３００μＬ）の線維断片（７×１０４線維／ｍＬ）を、筋欠損のない腓腹筋（ＧＮ）に２６Ｇ針の注射器を用いて注入した。長線維移植では、ろ過処理を行わずに単離した３００μＬの線維（３×１０３線維／ｍＬ）（Ｈａｌｌ  ＪＫ他著、サイエンス・トランスラショナル・メディシン、２０１１（Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  ｍｅｄ  ２０１１））を注入した。長線維の注入回数は、１つの長線維が１ｍｍ〜３ｍｍ長を示すことが観測されたことに基づいて計算した。無細胞断片は化学的処理および酵素処置を一切利用せず、ＰＢＳにおける単純培養により作製した。簡潔には、単離線維断片を３７℃で一晩培養し、４℃で保管した。細胞成分およびＤＮＡ成分が除去されたことは、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の細胞核染色で線維断片を染色して確認した。無細胞断片移植は、上記と同様の注入手順を用いて３００μＬの断片溶液を利用して行った。移植後、１週間目、２週間目、３週間目、および４週間目のＧＮ筋を採種し、重さを量り、組織学および免疫組織学的分析のための処理をさらに行った。移植線維断片領域は、共焦点像中のＮＩＲ陽性領域を測定することにより半定量化した。
【００９５】
ＧＮ組織の筋質量の比較において、線維断片および無細胞断片の注入は、シャム、ＰＢＳ、および長線維を注入した場合と比較して、ＧＮの質量／体重量は５％増加したが、統計的な差異は見られなかった。局部注入した線維断片が共焦点像におけるＮＩＲ陽性点により確認された。線維断片および無細胞断片を３００μＬ注入した個体群においては、共焦点像によると、線維断片が宿主筋組織に沿って有望な生着を認めた一方、長線維ではそのような生着を認めなかった。これは、筋線維を断片化することで、体内において筋線維が効率的に供給されるのを促進することを強く主張するものである。マウス実験の結果と同様に、ラットからの移植線維断片は宿主動物の血管網および神経回路網と統合した。興味深いことに、無細胞断片の注入は、移植部位への宿主細胞の動員（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）を促進し、また宿主動物との効率的な統合において線維断片と類似のパターンを示した。これはまたもう一つの機能的筋再生のための異種同系移植達成への有望な手段である。
【００９６】
実施例４：筋委縮処置のための筋線維断片直接注入
本実験の目的は、筋線維断片（ＭＦｓ（ｍｕｓｃｌｅ  ｆｉｂｅｒ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ））の直接注入により、筋委縮の筋機能回復が強化できるかどうかを判断することであった。注入したＭＦｓは、宿主の血管網および神経回路網だけでなく、宿主筋組織と効率的に統合し、さらに、筋損傷の機能的な筋回復を向上させるものであるとの仮説を立てた。図４Ａに、実験計画の概要を示す。
【００９７】
ラットにおいて筋委縮モデルを作成するため、３００μＬの３％ＢａＣｌ２を１本のＴＡ筋に注入した。ＢａＣｌ２注入の３日後、３００μＬのＰＢＳ溶液に懸濁させた０．１５〜０．２×１０６ＭＦｓを、２６Ｇ針注射器を用いて、損傷ＴＡ筋に直接注入した。対照個体群として、同量のＰＢＳ溶液を損傷ＴＡ筋に投与した。動物実験の間、機能的および形態学的分析によって、機能的筋再生を評価した。機能的筋回復を判定するために、ＭＦ注入後所定の時間に筋力検査を行った。１００Ｈｚの電気刺激における等尺性強縮筋力を測定し、筋損傷以前に対する相対強縮力（％）を、ＭＦ注入後の各時点においてトルクを正常化することにより計算した。図４Ｂに示されるように、ＭＦ注入ＴＡ筋は対照個体群（ＰＢＳ注入）より高い相対強縮力を示し、統計学的な有意差はＭＦ注入後、７日、２１日、２８日のものに見られた。
【００９８】
ＭＦ注入ＴＡ筋組織の免疫染色図［５Ｂ］を用いた形態学的分析からも、筋機能の向上を裏付けており、血管網［図５Ｃ、ＣＤ３１］および神経回路網［図５Ｄ、ニューロフィラメント（ＮＦ）およびα−ブンガロトキシン（α−ＢＴＸ）］だけでなく宿主筋組織［図５Ａ、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）］  においても、注入ＭＦが効率的に統合したことを実証している。
【００９９】
実施例５：外傷性筋欠損処置のためのＭＦｓを含む容積構造物（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）のインプラント
本補助実験の目的は、ＭＦｓ含有３次元構造物をインプラントすることについて、大規模筋欠損の処置において実行可能かを調査することである。ＭＦｓを含むインプラント可能な構造物は、構造的な統合性を維持し、外科的に誘導された筋欠損の機能的筋肉の回復を向上させるであろうことが仮定された。図６Ａに、実験計画の概要を示す。
【０１００】
外傷性筋欠損のある動物モデルを作成するため、ラットの３０％〜４０％のＴＡ筋組織を外科的に切除した。ＭＦ／コラーゲン構造物（０．２ｍｌ）［０．１ｍｌの０．８％コラーゲンゲルに懸濁させたＭＦｓ（０．１ｇ≒０．１ｍｌ）］の全容量を筋欠損部位にインプラントし、そのインプラントは縫合筋膜および皮膚で閉じた。何もインプラントしない（欠損のみ）場合およびコラーゲンのみをインプラントする場合を対照個体群とした。インプラント後７日、１４日、２１日、および２８日に、ＴＡの強縮力を測定し、ＭＦ／コラーゲン構造物をインプラントしたことによる向上筋機能への効果を、相対的強縮力（％）により判定した。
【０１０１】
インプラント後の各時点において、ＭＦ／コラーゲンインプラント個体群は、欠損のみの個体群およびコラーゲンのみの個体群より、高い相対強縮力を示した。特に、統計学的な有意差は２１日と２８日で認められた（ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの分析、Ｐ＜０．０５）（図６Ｂ）。また図６Ｃに示すように、構造物のインプラントによって、インプラントから２８日経過後で、欠損のみの場合と比較して筋質量が顕著に向上している。われわれの結果によると、ＭＦ／コラーゲン構造物を外科的に誘導された筋欠損にインプラントすることは実行可能で、成功でありことがわかり、またそのインプラントにより筋質量および機能的筋回復が誘導されることがわかった。
【０１０２】
実施例６：尿道括約筋失禁へのＭＦ技術の応用
尿失禁（ＵＩ）は、膀胱制御になんらかの喪失を持つ人々の３人に１人が、日常生活のある時点で影響されているという、深刻な健康問題である。ＵＩ処置の市場規模は２００億ドル以上であり、２０２０年までには３００億ドルにまで届くと見込まれている。現在の処置としては、生体物質由来のメッシュおよびスリングインプラントが挙げられるが、メッシュただれ、尿道閉塞、隣接臓器の損傷、大量出血、内部臓器への損傷、瘢痕化、などの合併症がしばしば起こる。筋前駆細胞を用いた細胞治療はＵＩ処置にとって有望な技術ではあるが、治療に利用可能になるまでに、細胞操作および長時間が必要とされている点で限界がある。
【０１０３】
本実験の目的は、ＵＩ処置において筋線維断片を利用できることを実証することにある。注入ＭＦｓが、宿主の血管網および神経回路網とだけでなく、損傷括約筋内部の宿主筋組織とも統合し、さらに、括約筋骨格筋機能を強化することで尿流動態機能が向上するであろうことを仮定した。全体の実験計画を図７Ａに記載する。尿道括約筋失禁動物モデルを作製するために、ラットの尿道括約筋の一方を電気凝固で損傷させた。括約筋損傷後１カ月後、ＰＢＳ溶液に懸濁させた０．０５ｇ（≒０．０５ｍｌ）のＭＦｓを損傷括約筋部位へ注入した。ＭＦ注入後１週間および４週間で、電気刺激なしの場合（Ｐ１）と電気刺激ありの場合（Ｐ２）の尿漏出圧力を測定することにより、尿道括約筋収縮力を判定した。結果を図７Ｂの一覧に示す。Ｐ２とＰ１の差は、外括約筋が支える最大膀胱圧力である。括約筋損傷後では、括約筋を電気刺激をしても、膀胱の漏出点圧力はどの時点においても上昇しなかった。しかしながら、ＭＦ注入個体群においてはＭＦ注入から１か月後で、漏出点圧力差異は通常の値（シャム群）の６７％であり、これは統計学的差異がある（スチューデントｔ検定、Ｐ＜０．０１、ｎ＝３）。
【０１０４】
実施例７：ＭＦｓ採種のさらなる方法
本実験の目標は、ヒト筋線維断片化工程を洗練化させ、収率、作業時間、および試薬利用を向上させることである。図８Ａは、代替処理技術を示す図であり、筋組織をドナー部位から採種し、細分化し、その後ＧＭＰグレードコラゲナーゼ溶液（ロシュ社製リベラーゼＭＮＰ−Ｓ）を用いて酵素的に均質化した。その後生成物をろ過し、ノルモソル（Ｎｏｒｍｏｓｏｌ）（ＧＭＰグレードの食塩水）で洗浄した。均質化及びろ過のステップは、均質なサイズのＭＦ断片（例えば、直径５０〜１５０マイクロメートル）が得られるまで繰り返した。図８Ｂは、その結果得られたＭＦｓを示すマイクロ写真であり、処理時間は約３０分で、筋重量収率は３０％〜４０％であった。
【０１０５】
本明細書に引用されるすべての記事、論文、特許、特許出願および他の出版物の開示の内容は、参照により本明細書に完全に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年4月15日(2014.4.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋再生組成物を作製する方法であって、
ドナー部位から筋組織を抽出するステップと、
前記抽出した組織から筋線維を脱凝集するステップと、
少なくともいくつかの前記断片に付随された、生育可能な衛星細胞を保持しながら、前記脱凝集した筋線維を、細胞壁破壊を呈して平均のサイズが１００μｍ未満である線維断片に断片化するステップと、を含み、
前記組成物は、対象の筋部位にインプラントすると、前記断片から伸長筋線維を再構築し、生来の筋線維と向きを揃えて配向することができる、方法。
【請求項２】
前記筋線維の断片は、アスペクト比が２：１〜１：１の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記筋組織を抽出するステップは、自家筋組織を抽出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組織から筋線維を脱凝集するステップは、Ｉ型コラゲナーゼのような酵素を用いて前記筋線維を脱凝集することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記断片化するステップは、前記断片化した線維断片をろ過して平均サイズを１００μｍ未満とすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記筋線維断片は、少なくともその７５％が細胞壁破裂を呈する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物を足場に播種するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記足場に支持した断片を体外培養するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記足場は、コラーゲンゲル系、フィブリンゲル系、アルギン酸ゲル系、または紫外線誘導架橋性ゲル系から選択される注入可能な足場である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記足場は、ポリマー性マトリックスまたは有機マトリックスを含むインプラント可能な足場であって、
前記ポリマー性マトリックスまたは有機マトリックスは、例えば、（ａ）コラーゲンおよびエラスチンからなる群から選択される天然ポリマー、並びに（ｂ）ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）（ＰＬＣＬ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される合成ポリマー、の群から選択される少なくとも１つのポリマーであり、
前記マトリックスは、コラーゲンおよびポリカプロラクトン（ＰＣＬ）の組み合わせのように、少なくとも１つの天然ポリマーおよび少なくとも１つの合成ポリマーの組み合わせにより形成される、エレクトロスピンした線維マトリックスをさらに任意に含む、
請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記播種を行った足場は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＲＵＮＸ−２タンパク質、ＬＩＭミネラリゼーションタンパク質、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、上皮成長因子、インスリン様成長因子、形質転換成長因子−α、形質転換成長因子−β、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューレグリン（ＮＲＧ）、アグリン、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物をアジュバントと同時投与することをさらに含み、
前記アジュバントは、例えば、幹細胞、筋前駆細胞、および成長因子の群から選択される少なくとも１つの作用物質、または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＲＵＮＸ−２タンパク質、ＬＩＭミネラリゼーションタンパク質、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、上皮成長因子、インスリン様成長因子、形質転換成長因子−α、形質転換成長因子−β、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューレグリン（ＮＲＧ）、およびアグリンの群から選択される少なくとも１つの成長因子である、
請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記断片から伸長筋線維を再構築できる筋線維断片の個体群を含む組成物であって、
前記断片は、細胞壁破裂を呈して平均サイズが１００μｍ未満であり、さらに、
前記組成物が、少なくともいくつかの前記断片に付随された、生存能力のある衛星細胞をさらに含む、組成物。
【請求項１４】
前記組成物は、対象の筋部位にインプラントすると、生来の筋線維と向きを揃えて配向することができる、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記筋線維断片は、アスペクト比が２：１〜１：１の間である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記筋線維断片は、自家筋組織から派生したものである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記筋線維断片は、少なくともその７５％が細胞壁破裂を呈する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物は、生理的に適合性の流体をさらに含み、前記組成物は注入用または足場用に配合され、且つ、前記筋線維断片は、該足場に組込まれている、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１９】
前記足場は、コラーゲンゲル系、フィブリンゲル系、アルギン酸ゲル系、または紫外線誘導架橋性ゲル系から選択される注入可能な足場である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記足場は、ポリマー性マトリックスまたは有機マトリックスを含むインプラント可能な足場であって、
前記ポリマー性マトリックスまたは有機マトリックスは、例えば、（ａ）コラーゲンおよびエラスチンからなる群から選択される天然ポリマー、並びに（ｂ）ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）（ＰＬＣＬ）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される合成ポリマー、の群から選択される少なくとも１つのポリマーであり、
前記マトリックスは、コラーゲンとポリカプロラクトン（ＰＣＬ）との組み合わせのように、少なくとも１つの天然ポリマーおよび少なくとも１つの合成ポリマーの組み合わせにより形成されるエレクトロスピンした線維マトリックスをさらに任意に含む、
請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記足場は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＲＵＮＸ−２タンパク質、ＬＩＭミネラリゼーションタンパク質、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、上皮成長因子、インスリン様成長因子、形質転換成長因子−α、形質転換成長因子−β、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューレグリン（ＮＲＧ），アグリン、またはそれらの組み合わせ、のうち少なくとも１つをさらに含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
前記組成物は、アジュバントをさらに含み、
前記アジュバントは、例えば、幹細胞、筋前駆細胞、および成長因子の群から選択される少なくとも１つの作用物質、または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＲＵＮＸ−２タンパク質、ＬＩＭミネラリゼーションタンパク質、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、上皮成長因子、インスリン様成長因子、形質転換成長因子−α、形質転換成長因子−β、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューレグリン（ＮＲＧ）、およびアグリンの群から選択される少なくとも１つの成長因子である、
請求項１３に記載の組成物。
【国際調査報告】
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