(57)【要約】本発明は、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドおよびそれをコードする核酸分子を提供する。ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドおよびそれをコードする核酸分子は、真菌症、特にムコール菌症を診断、治療、または予防するために有利に使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド、その免疫原性断片またはその機能性断片をコードする、単離核酸。
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｃ）から選択される核酸を含んでいる、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド、その免疫原性断片、またはその機能性断片をコードする単離核酸：
（ａ）配列番号１、３、５、１１、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２に示すアミノ酸配列をコードする核酸
（ｂ）中程度にストリンジェントな条件下で上記（ａ）の核酸とハイブリダイズし、生物学的に活性なケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドを連続してコードする核酸
（ｃ）生物学的に活性なケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドをコードする、上記（ａ）の核酸または上記（ｂ）の核酸に対する核酸縮重体。
【請求項３】
高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
上記アミノ酸配列は、上記配列番号１、３、５、１１、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２に示す上記アミノ酸配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する請求項２に記載の核酸。
【請求項５】
上記アミノ酸配列は、上記配列番号１、３、５、１１、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２に示す上記アミノ酸配列またはその修飾体から構成される請求項２に記載の核酸。
【請求項６】
ｃＤＮＡである請求項２に記載の核酸。
【請求項７】
請求項２に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項８】
請求項２に記載の核酸を含む、組み換え細胞。
【請求項９】
配列番号２、４、６、９、１０、１２〜１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１に示す連続する１５〜３００個のヌクレオチドまたはそのアンチセンス鎖を含むＣｏｔＨオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドは、ＡＴＧＡＡＡＴＴＡＴＣＴＡＴＴＡＴＡＴＣＣＧＣＴＧＣＣ（配列番号３３）、ＧＣＴＧＧＧＡＡＴＡＴＡＡＴＴＧＴＣＡＴＣＧＡ（配列番号３４）、ＧＡＴＧＡＣＡＡＴＴＡＴＡＴＴＣＣＣＡＧＣ（配列番号３５）、ＧＡＧＴＡＧＡＣＧＴＡＡＴＴＡＧＡＴＣＣＡＡ（配列番号３６）、またはＡＡＡＣＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＡＴＣ（配列番号３７）の核酸配列を含む請求項９に記載のＣｏｔＨオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項２に記載の核酸がコードするｍＲＮＡと特異的に結合できる、アンチセンス核酸。
【請求項１２】
請求項９に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、ケカビ目ＣｏｔＨ核酸配列の存在を検出するためのキット。
【請求項１３】
上記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、ＡＴＧＡＡＡＴＴＡＴＣＴＡＴＴＡＴＡＴＣＣＧＣＴＧＣＣ（配列番号３３）、ＧＣＴＧＧＧＡＡＴＡＴＡＡＴＴＧＴＣＡＴＣＧＡ（配列番号３４）、ＧＡＴＧＡＣＡＡＴＴＡＴＡＴＴＣＣＣＡＧＣ（配列番号３５）、ＧＡＧＴＡＧＡＣＧＴＡＡＴＴＡＧＡＴＣＣＡＡ（配列番号３６）、またはＡＡＡＣＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＡＴＣ（配列番号３７）から選択される核酸配列を含む請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
単離ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド、その免疫原性断片、またはその機能性断片。
【請求項１５】
配列番号１、３、５、１１、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する請求項１４に記載のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド。
【請求項１６】
上記配列番号１、３、５、１１、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２に示すアミノ酸配列を含む請求項１５に記載のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド。
【請求項１７】
上記機能性断片はＧＲＰ７８と結合する請求項１４に記載のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド。
【請求項１８】
上記機能性断片は、内皮細胞によって発現されるＧＲＰ７８と結合する請求項１７に記載のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号２、４、６、９、１０、１２〜１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１に示す核酸配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる請求項１４に記載のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号２、４、６、９、１０、１２〜１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１に示す核酸配列を含むヌクレオチド配列にコードされる請求項１４に記載のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド。
【請求項２１】
上記免疫原性断片は、ＧＡＧＫＫＨＮＮＡＫＱＳＷＮＷ（配列番号３９）またはＭＧＱＴＮＤＧＡＹＲＤＰＴＤＮＮＫ（配列番号４０）のアミノ酸配列から本質的に構成される請求項１４に記載のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド。
【請求項２２】
上記免疫原性断片は、担体タンパク質と接合している請求項２１に記載のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド。
【請求項２３】
上記ポリペプチド上記担体タンパク質はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である請求項２２に記載のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド。
【請求項２４】
上記ケカビ目ＣｏｔＨの発現に好適な条件下で請求項８に記載の細胞を培養する工程を含む、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの発現の方法。
【請求項２５】
請求項１４に記載のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドに対する特異反応性を有する、単離抗ケカビ目ＣｏｔＨ抗体。
【請求項２６】
モノクローナル抗体である請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
請求項２６に記載のモノクローナル抗体を産生する、細胞株。
【請求項２８】
ポリクローナル抗体である請求項２５に記載の抗体。
【請求項２９】
ＧＡＧＫＫＨＮＮＡＫＱＳＷＮＷ（配列番号３９）またはＭＧＱＴＮＤＧＡＹＲＤＰＴＤＮＮＫ（配列番号４０）のアミノ酸配列から本質的に構成されるポリペプチドに対して特異反応性を有する請求項２５に記載の抗体。
【請求項３０】
ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの発現を阻害するのに効果的な量の請求項１１に記載のアンチセンス核酸と、上記アンチセンス核酸を細胞に送達することができる許容可能な担体とを含む組成物。
【請求項３１】
核酸を含むサンプルを請求項９に記載の１つ以上のオリゴヌクレオチドと接触させ、上記接触を高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で達成する工程と、
上記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする核酸を特定する工程とを含む、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドをコードする核酸を特定する方法。
【請求項３２】
請求項９に記載の２つ以上のオリゴヌクレオチドにサンプルを接触させる工程と、
核酸分子を増幅する工程と、
上記増幅を検出する工程とを含む、上記サンプル内のケカビ目ＣｏｔＨ核酸分子を検出する方法。
【請求項３３】
上記増幅がポリメラーゼ連鎖反応を用いることによって行われる請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
上記２つ以上のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、ＡＴＧＡＡＡＴＴＡＴＣＴＡＴＴＡＴＡＴＣＣＧＣＴＧＣＣ（配列番号３３）、ＧＣＴＧＧＧＡＡＴＡＴＡＡＴＴＧＴＣＡＴＣＧＡ（配列番号３４）、ＧＡＴＧＡＣＡＡＴＴＡＴＡＴＴＣＣＣＡＧＣ（配列番号３５）、ＧＡＧＴＡＧＡＣＧＴＡＡＴＴＡＧＡＴＣＣＡＡ（配列番号３６）、またはＡＡＡＣＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＡＴＣ（配列番号３７）の核酸配列を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
請求項２５に記載の抗体にサンプルを接触させる工程と、
上記サンプルに対する上記抗体の特異的結合の存在を検出し、これにより上記サンプル内のケカビ目有機体の存在を検出する工程とを含む、上記サンプル内のケカビ目有機体の存在を検出する方法。
【請求項３６】
薬学的に許容可能な担体と、請求項１４に記載のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド、上記ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの免疫原生断片、または上記ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの機能性断片、請求項１１に記載のアンチセンス核酸もしくは請求項２５に記載の抗ケカビ目ＣｏｔＨ抗体からなる一群から選択される化合物とを含む、医薬組成物。
【請求項３７】
免疫原生効果を発揮する量のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドまたはその免疫原性断と、薬学的に許容可能な担体とを含む、真菌症に対する免疫性を対象に与えるワクチン組成物。
【請求項３８】
アジュバントをさらに含む請求項３７に記載のワクチン組成物。
【請求項３９】
ムコール菌症の治療または予防を必要とする対象に対してムコール菌症を治療または予防する方法であって、
請求項３６に記載の医薬組成物または請求項３７に記載のワクチン組成物を治療に効果的な量で投与する工程を含む方法。
【請求項４０】
対象内のムコール菌症感染を診断する方法であって、
（ａ）上記対象由来の試験サンプルを提供する工程と、
（ｂ）請求項１に記載の核酸または請求項１４に記載のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドと結合可能な作用物質に対して、上記作用物質を上記核酸またはポリペプチドに特異的に結合させることを可能にする好適な条件下で上記サンプルを接触させる工程と、
（ｃ）上記試験サンプル内の特異的結合の量をコントロールサンプル内の特異的結合の量と比較し、上記試験サンプル内の特異的結合の量が上記コントロールサンプル内の特異的結合の量と比較して増加または減少している場合に菌症感染と診断する工程とを含む方法。
【請求項４１】
上記作用物質は、請求項２５に記載の抗ケカビ目ＣｏｔＨ抗体または請求項９に記載のＣｏｔＨオリゴヌクレオチドからなる一群から選択される請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は米国仮出願第６１／５３５，２５７号（出願日：２０１１年９月１５日）に基づく優先権を主張する。この米国仮出願を参照することによって、その全開示内容を本願に援用する。
【０００２】
本発明はＮＩＡＩＤ認可のＮＩＨ助成金第０１１６７１号および第０１３３７７号の下に政府支援を受けてなされた。政府は本発明について一定の権利を有する。
【０００３】
〔背景技術〕
本発明は、一般的には、患者の感染症を検出、治療、および予防するための組成物および方法に関し、より具体的には、ムコール菌症の原因となる真菌に特有の特定のタンパク質または核酸を標的とする組成物および方法に関する。
【０００４】
既知の２５０，０００種類の真菌類のうち約１８０種類については、ヒトおよび動物に疾病（真菌症）を発生させることが認められている。一部の真菌類（たとえば、全身性病原菌であるHistoplasma capsulatumおよびCoccidioides immitis）は、これに暴露した全ての対象に感染を引き起こせる。Candida属、Asergillus種、および接合菌綱などの他の真菌類は、通常は易感染性宿主にのみ疾病を引き起こす日和見病原体である。接合菌綱ケカビ目の菌類は、死に至らしめる恐れのある真菌感染症であるムコール菌症をヒトに引き起こす。ケカビ目の菌類は少なくとも６つの科に分類され、これら全ての科はムコール菌症を引き起こせる（Ibrahim et al. Zygomycosis, p. 241-251, In W. E. Dismukes, P. G. Pappas, and J. D. Sobel (ed.), Clinical Mycology, Oxford University Press, New York (2003); Kwon-Chung, K. J., and J. E. Bennett,  Mucormycosis, p. 524-559, Medical Mycology, Lea & Febiger, Philadelphia (1992), and Ribes et al. Zygomycetes in Human Disease, Clin Microbiol Rev 13:236-301 (2000)）。しかし、ケカビ科（具体的にはRhizopus oryzae種（Rhizopus arrhizus））の菌類は感染を引き起こす最も一般的な原因である（前掲したRibes et al.）。また、Cunninghamellaceae科のCunninghamella spp.への感染によって発生するムコール菌症の事例も多く報告されている（Cohen-Abbo et al., Clinical Infectious Diseases 17:173-77 (1993); Kontoyianis et al., Clinical Infectious Diseases 18:925-28 (1994); Kwon-Chung et al., American Journal of Clinical Pathology 64:544-48 (1975), and Ventura et al., Cancer 58:1534-36 (1986)）。一方、ケカビ目の残りの４つの科は、疾病の原因としてはあまり一般的ではない（Bearer et al., Journal of Clinical Microbiology 32:1823-24 (1994); Kamalam and Thambiah, Sabouraudia 18:19-20 (1980); Kemna et al., Journal of Clinical Microbiology 32:843-45 (1994); Lye et al., Pathology 28:364-65 (1996), and Ribes et al.（前掲））。
【０００５】
ムコール菌症の原因物質は免疫不全宿主に対してほぼ一様に影響を与える（Spellberg et al., Clin. Microbiol. Rev. 18:556-69 (2005)）。ムコール菌症の主なリスク要因は、糖尿病性ケトアシドーシス（ＤＫＡ）として知られているコントロール不良のケトアシドーシス状態の糖尿病、代謝性アシドーシスの他の形態、コルチコステロイド治療、器官または骨髄の移植、好中球減少症、外傷性障害および火傷、悪性血液疾患、および血液透析を受けている患者のデフェロキサミンによるキレート治療を含む。
【０００６】
近年の報告によって、ムコール菌症の報告事例数が過去２０年間において顕著に増大してきたことが立証されている（Gleissner et al., Leuk. Lymphoma 45(7):1351-60 (2004)）。主要な移植センターにおけるムコール菌症の発生率に憂慮すべき上昇が見られている。たとえば、フレッドハッチンソン癌センターでは、１９８５〜１９８９年から１９９５〜１９９９年に掛けて発生件数が２倍を超えて増大したことがMarr et al.らによって記述されている（Marr et al., Clin. Infect. Dis. 34(7):909-17 (2002)）。同様に、同様の期間に移植対象におけるムコール菌症の発生率が２倍を超えて増大したことがKontoyiannis et al.によって記述されている（Kontoyiannis et al, Clin. Infect. Dis. 30(6):851-6 (2000)）。高齢化する米国人口において糖尿病および癌の流行および臓器移植の普及が高まりを見せているためことから判断すると、予見できる将来においてもムコール菌症の発生率の上昇が衰えずにいることが予想される。
【０００７】
したがって、ムコール菌症の病原体のリスクを低減し、かつ、副作用のない効果的な治療法を提供することができる組成物および方法が必要とされている。本発明はこうした必要性を満たすとともに、これに関連する利点をも提供する。
【０００８】
〔発明の概要〕
本発明によれば、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドおよびコード核酸分子が提供される。真菌症状、特にムコール菌症、を診断、治療、および予防するためケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドおよびコード核酸を有利に使用することができる。さらに、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドおよびコード核酸は、ケカビ目ＣｏｔＨの活性または発現を改変する作用物質を作製またはスクリーニングすることに有用であり、真菌症状を治療または予防するためにさらに使用することもできる。
【０００９】
本発明は、ケカビ目ＣｏｔＨ核酸を含むベクター、当該ベクターを含む宿主細胞、ケカビ目ＣｏｔＨアンチセンス核酸、および関連組成物をも提供する。本発明は、ケカビ目ＣｏｔＨ核酸とハイブリダイズするか、またはケカビ目ＣｏｔＨ核酸を増幅するために使用することができるケカビ目ＣｏｔＨオリゴヌクレオチドをさらに提供する。抗ケカビ目ＣｏｔＨ特異抗体もまた提供する。さらに、ケカビ目ＣｏｔＨ核酸またはケカビ目ＣｏｔＨ特異抗体を備えるキットをも提供する。ケカビ目生物が引き起こす真菌感染を診断するために、このようなキットおよび試薬を使用することができる。医薬組成物およびワクチン組成物をもまた提供する。
【００１０】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、細胞表面タンパク質であることが予測される４つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＦＡＲウエスタンブロットを示す。
【００１１】
図２は、R. oryzae胞子以外の胞子発芽体に対するＧＲＰ７８の結合を示す。
【００１２】
図３は、ＧＲＰ７８に対するリガンドとしての働きをすることが予測される４つの結合グリコシルホスファチジルイニソトール（ＧＰＩ）の発現を示す。
【００１３】
図４のパネルＡおよびＢは、内皮細胞と一緒に培養させたR. oryzae胞子発芽体におけるＣｏｔＨ遺伝子の発現を示す。
【００１４】
図５は、ＣｏｔＨ３における４つの推定ＧＰＩ結合タンパク質の互いに対する相同性および予測Ｎ−およびＯ−糖鎖付加部位の数を示す。
【００１５】
図６のパネルＡは、樹脂以外のヒト臍帯内皮細胞に対するR. oryzaeの付着能を示す。また、Saccharomyces Cerevisiaeは内皮細胞に付着しない。パネルＢは、S. cerevisiaeがＧＲＰ７８発現内皮細胞と結合できるR. oryzaeのＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３を示す。
【００１６】
図７は、ＣｏｔＨ３が多様なケカビ目（R. oryzae ９９〜８８０、R. oryzae ９９〜８９２、Mucor sp.、Lichtheimia corymbifera、Cunninghamella bertholetiae、およびR. microsporusを含む）において保存されている。
【００１７】
図８のパネルＡおよびＢは、ＣｏｔＨ２またはＣｏｔＨ３発現S. cerevisiaeがＣＨＯ親細胞以外のＣＧＲＰ７８過剰発現内皮細胞またはＣＨＯ細胞に付着して侵入していることを示す。
【００１８】
図９は、R. oryzae由来のＣｏｔＨ１のアミノ酸配列（配列番号１）および核酸コード配列（配列番号２）を示す。
【００１９】
図１０は、R. oryzae由来のＣｏｔＨ２のアミノ酸配列（配列番号３）および核酸コード配列（配列番号４）を示す。
【００２０】
図１１は、R. oryzae由来のＣｏｔＦＢのアミノ酸配列（配列番号５）および核酸コード配列（配列番号６）を示す。
【００２１】
図１２は、R. oryzae由来のＲＯ３Ｇ＿１６２９５のアミノ酸配列（配列番号７）および核酸コード配列（配列番号８）を示す。
【００２２】
図１３は、配列番号３３および３４に示す核酸配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法による、R. oryzaeでスパイクしたヒツジ血液中のＣｏｔＨ３の検出を示す。
【００２３】
図１４は、配列番号３３および３４に示す核酸配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法による、Mucor sp.またはLichtheimia corymbiferaでスパイクしたヒツジ血液中のＣｏｔＨ３の検出を示す。
【００２４】
図１５は、配列番号３３および３４に示す核酸配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法による、Cunninghamella bertholetiaeまたはR. microsporusでスパイクしたヒツジ血液中のＣｏｔＨ３の検出を示す。
【００２５】
図１６は、配列番号３３および３４に示す核酸配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法による、Aspergillus fumigatesまたはCandida albicansによってスパイクされたヒツジ血液中のＣｏｔＨ３の非検出を示す。
【００２６】
図１７は、Stigmatella aurantiaca由来のタンパク質（ＺＰ＿０１４６０５８４）のアミノ酸配列（配列番号６５）に対する任意のＣｏｔＨ予測タンパク質（この場合ではＣｏｔＨ３［Ｒ０３Ｇ＿１１８８２］配列番号５）の最も高い相同性を示す。
【００２７】
図１８は、R. oryzae由来のＲＯ３Ｇ＿１６２９５タンパク質（配列番号６６）とTalaromyces stipitatus ATCC１０５００（ＥＥＤ２３９８６）タンパク質（配列番号６７）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【００２８】
図１９は、R. oryzae由来のＲＯ３Ｇ＿１６２９５タンパク質（配列番号６６）とPenicillium marneffei ATCC１８２２４（ＸＰ＿００２１４４１７５）タンパク質（配列番号６８）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【００２９】
図２０は、R. oryzae由来のＲＯ３Ｇ＿１６２９５タンパク質（配列番号６６）とAspergillus niger（ＸＰ＿００１３９２２３６）タンパク質（配列番号６９）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【００３０】
図２１は、R. oryzae由来のＲＯ３Ｇ＿１６２９５タンパク質（配列番号６６）とAspergillus nidulans（ＸＰ＿６５８９３４）タンパク質（配列番号７０）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【００３１】
図２２は、R. oryzae由来のＲＯ３Ｇ＿１６２９５タンパク質（配列番号６６）とUstilago maydis（ＸＰ＿７６００２７）タンパク質（配列番号７１）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【００３２】
図２３は、R. oryzae由来のＲＯ３Ｇ＿１６２９５タンパク質（配列番号６６）とCoccidioides immitis（ＸＰ＿００１２４３２１１）タンパク質（配列番号７２）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【００３３】
図２４は、R. oryzae由来のＲＯ３Ｇ＿１６２９５タンパク質（配列番号６６）とNeurospora crassa（ＸＰ＿９５６７９２）タンパク質（配列番号７３）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【００３４】
図２５は、R. oryzae由来のＲＯ３Ｇ＿１６２９５タンパク質（配列番号６６）とCryptococcus neoformans（ＸＰ＿７７５５５８）タンパク質（配列番号７４）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【００３５】
図２６は、R. oryzae由来のＲＯ３Ｇ＿１６２９５タンパク質（配列番号６６）とStreptomyces lividans（ＥＦＤ６５１７０）タンパク質（配列番号７５）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【００３６】
図２７は、Rhizopus oryzae ９９〜８８０由来のＣｏｔＨ３（データベース内のイントロンを含む）の核酸配列（配列番号９）を示す。
【００３７】
図２８は、Rhizopus oryzae ９９〜８８０由来のＣｏｔＨ３（データベース内のエクソンのみ）の核酸配列（配列番号１０）を示す。
【００３８】
図２９は、Rhizopus oryzae ９９〜８８０由来のＣｏｔＨ３（予測アミノ酸）のアミノ酸配列（配列番号１１）を示す。
【００３９】
図３０は、Rhizopus oryzae ９９〜８８０由来のＣｏｔＨ３（配列データ）内のイントロンを含む）の核酸配列（配列番号１２）を示す。
【００４０】
図３１は、Rhizopus oryzae ９９〜８９２由来のＣｏｔＨ３（配列データ内のエクソンのみを含む）の核酸配列（配列番号１３）を示す。
【００４１】
図３２は、Rhizopus oryzae ９９〜８９２由来のＣｏｔＨ３（配列データ内のイントロンを含む）の核酸配列（配列番号１４）を示す。
【００４２】
図３３は、R. oryzae ９９〜８９２由来のＣｏｔＨ３（イントロンを除く）の予測アミノ酸配列（配列番号１５）を示す。
【００４３】
図３４は、R. oryzae ９９〜８９２由来のＣｏｔＨ３（イントロンを含む）の予測アミノ酸配列（配列番号１６）を示す。
【００４４】
図３５は、Mucor sp.９９〜９３２由来のＣｏｔＨ３配列（配列データ内のエクソンのみ）の核酸配列（配列番号１７）を示す。
【００４５】
図３６は、Mucor９９〜９３２由来のＣｏｔＨ３（ＡＡエクソンのみ）の予測アミノ酸配列（配列番号１８）を示す。
【００４６】
図３７は、Mucor９９〜９３２由来のＣｏｔＨ３（イントロンを含む）の核酸配列（配列番号１９）を示す。
【００４７】
図３８は、Mucor９９〜９３２由来のＣｏｔＨ３（イントロンを含む）の予測アミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【００４８】
図３９は、Lichtheimia corymbifera由来のＣｏｔＨ３（配列データ内のエクソンのみ）の核酸配列（配列番号２１）を示す。
【００４９】
図４０は、Lichtheimia corymbifera由来のＣｏｔＨ３（配列データ内のエクソンのみ）の予測アミノ酸配列（配列番号２２）を示す。
【００５０】
図４１は、Lichtheimia corymbifera由来のＣｏｔＨ３（イントロンを含む）の核酸配列（配列番号２３）を示す。
【００５１】
図４２は、Lichtheimia corymbifera由来のＣｏｔＨ３（イントロンを含む）の予測アミノ酸配列（配列番号２４）を示す。
【００５２】
図４３は、Cunninghamella bertholetiae由来のＣｏｔＨ３配列（エクソンのみ）の核酸配列（配列番号２５）を示す。
【００５３】
図４４は、Cunninghamella bertholetiae由来のＣｏｔＨ３（配列データ内のエクソンのみ）の予測アミノ酸配列（配列番号２６）を示す。
【００５４】
図４５は、Cunninghamella bertholetiae由来のＣｏｔＨ３（イントロンを含む）の核酸配列（配列番号２７）を示す。
【００５５】
図４６は、Cunninghamella bertholetiae由来のＣｏｔＨ３（配列データ内のイントロンを含む）の予測アミノ酸配列（配列番号２８）を示す。
【００５６】
図４７は、R. microsporus由来のＣｏｔＨ３（配列データ内のエクソンのみ）の核酸配列（配列番号２９）を示す。
【００５７】
図４８は、R. microsporus由来のＣｏｔＨ３（配列データ内のエクソンのみ）の予測アミノ酸配列（配列番号３０）を示す。
【００５８】
図４９は、R. microsporus由来のＣｏｔＨ３（イントロンを含み、イントロンを１つのみ含む）の核酸配列（配列番号３１）を示す。
【００５９】
図５０は、R. microsporus由来のＣｏｔＨ３（イントロンを含む）の予測アミノ酸配列（配列番号３２）を示す。
【００６０】
図５１のパネルＡおよびＢは、ＧＲＰ７８と結合するR. oryzae表面タンパク質のＦＡＲウエスタンブロット（パネルＡ）、および、ＣｏｔＨ２予測タンパク質およびＣｏｔＨ３予測タンパク質の近接な同一性と、真菌類に広く存在している、特定機能を有さない４番目の特定ＯＲＦ（たとえば、Ｒ０３Ｇ＿１６２９５）からのＣｏｔＨタンパク質の分岐とを示す系統樹（パネルＢ）を示す。
【００６１】
図５２のパネルＡ〜Ｃは、発芽および宿主細胞との相互作用に反応して起きるＣｏｔＨ遺伝子およびＲＯ３Ｇ＿１６２９５の発現を示す。全てのＣｏｔＨ遺伝子が休眠胞子内で発現した一方で、ＣｏｔＨ３のみが、ＹＰＤ内に３７℃で増殖させたR. oryzae胞子発芽体内で発現した（パネルＡ）。R. oryzae胞子発芽体を内皮細胞に暴露すると、ＲＴ−ＰＣＲによって測定したように、ＣｏｔＨ２遺伝子およびＣｏｔＨ３遺伝子のみ発現が誘起された（パネルＢ）。内皮細胞上のR. oryzae胞子発芽体内のＣｏｔＨ遺伝子の遺伝子発現をｑＲＴ−ＰＣＲ法によって定量化すると、ＣｏｔＨ３およびＣｏｔＨ２の発現は、発現しなかったＣｏｔＨ１と比較してそれぞれ１６倍および４倍に増大していたことが示された。ＲＯ３Ｇ＿１６２９５はいずれの試験条件下でも発現しなかった。ウイルコクソンの順位和検定の測定において、＊Ｐ＜０．００１ ｖｓ. ＣｏｔＨ１発現および＊＊Ｐ＜０．００１ ｖｓ. ＣｏｔＨ１およびＣｏｔＨ２発現（パネルＣ）。３つの独立した実験においてＮ＝９。
【００６２】
図５３は、ＧＡＧＫＫＨＮＮＡＫＱＳＷＮＷ（配列番号３９）のペプチドに対して産生させた抗体はＣｏｔＨ２タンパク質およびＣｏｔＨ３タンパク質を認識したが、S. cerevisiaeが異種発現したＣｏｔＨ１タンパク質は認識しなかったことを示す。ペプチドをＫＬＨと結合し、ウサギ抗体を商業的に産生するようにこれを使用した。細胞を共焦点顕微鏡法で視覚化する前に、ＣｏｔＨタンパク質異種発現S. cerevisiaeを抗体で染色し、その後にＦＩＴＣ標識化抗ウサギヤギ抗体で対比染色した。
【００６３】
図５４のパネルＡ〜Ｃは、内皮細胞表面ＧＲＰ７８が、ＣｏｔＨ１を除くＣｏｔＨ２またはＣｏｔＨ３を異種発現しているS. cerevisiae細胞と結合し、ＣｏｔＨ１または空プラスミド発現S. cerevisiaeを除くＣｏｔＨ２またはＣｏｔＨ３発現S. cerevisiaeが、ＧＲＰ７８過剰発現内皮細胞またはＣＨＯ細胞に付着して侵入していたことを示す。ＮＨＳビオチンを用いて内皮細胞表面タンパク質を標識し、その後に、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含むＰＢＳ中のｎ−オクチル−β−ｄ−グルコピラノシドおよびプロテアーゼ阻害剤を用いてこれを抽出した。標識タンパク質（２５０μｇ）を酵母細胞（２×１０８）と一緒に培養させ、その後に、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含むＰＢＳを用いた広範囲洗浄によって非結合タンパク質を回収した。有機体と結合した状態を保つ膜タンパク質を６Ｍの尿素で溶離させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離させ、抗ＧＲＰ７８ Ａｂを用いた免疫ブロット法によって特定した（パネルＡ）。１２ｍｍガラスカバースリップ上にスプリットした内皮細胞（パネルＢ）またはＣＨＯ親細胞またはＧＲＰ７８過剰発現細胞（パネルＣ）を用いて、付着およびエンドサイトーシス（微分蛍光分析法によって測定）分析を行った。ウイルコクソンの順位和検定の測定において、＊：空プラスミドまたはＣｏｔＨ１発現S. cerevisiaeの場合と比較してＰ＜０．００１、＊＊：ＣｏｔＨ１およびＣｏｔＨ２発現の場合と比較してＰ＜０．００１。３つの独立に行われる実験においてＮ＝９。データを中央値±四分位範囲で表す。
【００６４】
図５５のパネルＡおよびＢは、抗ＣｏｔＨ３ Ａｂｓ（ＧＡＧＫＫＨＮＮＡＫＱＳＷＮＷ（配列番号３９）のペプチドに対して産生）によって、R. oryzaeが引き起こす内皮細胞のエンドサイトーシスおよび損傷が阻止されたことを示す。１２ｍｍガラスカバースリップ上にスプリットした内皮細胞を用いて付着およびエンドサイトーシス（微分蛍光分析法によって測定）分析する一方で、９６ウェルプレート５１Ｃｒ放出方法によって損傷を与えた。R. oryzae胞子発芽体の添加前に、ワクチン接種後のウサギから取得した５０μｇ／ｍｌの抗ＣｏｔＨ３またはワクチン接種前の同一ウサギから作製した血清（コントロール）と一緒に内皮細胞を１時間培養させた。ＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３の阻害（抗体がＣｏｔＨ２タンパク質に反応することため）によって、内皮細胞によるR. oryzaeのエンドサイトーシスが抑制され（実験の各集団の内皮細胞（約２００個）と相互作用している真菌細胞（＞７００個）から取得したデータ。コントロールでは平均して５９％の細胞にエンドサイトーシスが生じた）（パネルＡ）、内皮細胞の損傷を引き起こす真菌の能が低下する（パネルＢ）。ウイルコクソンの順位和検定の測定において、＊：ワクチン接種前の血清または場合と比較して＜０．０１。３つの独立したエンドサイトーシス実験内の各集団に用いたスライドはｎ＝６。２つの独立した損傷分析実験内の各集団に用いたウェルはｎ＝９。データを中央値±四分位範囲で表す。
【００６５】
図５６のパネルＡ〜Ｃは、ＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３を標的とするＲＮＡ−ｉコンストラクトよって両遺伝子の発現が阻害され、細胞表面上のＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３タンパク質の合成が低下され、R. oryzaeの増殖または発芽パターンに対しては何ら作用が生じなかったことを示す。ＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３発現を標的とするＲＮＡ−ｉコンストラクト（ｐＲＮＡｉ）または空プラスミドを用いて、R. oryzaeを形質転換させた。２系統の形質転換体について、ｑＲＴ−ＰＣＲ法によってＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３発現を測定したところ、空プラスミドを用いて形質転換させた細胞の場合と比較して＞８０％の比で低下していたことが示された（パネルＡ）。抗ＣｏｔＨ抗体を用いたフローサイトメトリー試験によって、ＲＮＡ−ｉコンストラクトを用いて形質転換させたR. oryzae細胞では、空プラスミド、野生型細胞、またはネガティブコントロール（すなわち、抗ＣｏｔＨ抗体に代えて市販のＩｇＧで染色した野生型R. oryzae）の場合と比較してＣｏｔＨタンパク質の細胞表面発現が低下していたことが示された（パネルＢ）。ＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３発現が低下した２系統の形質転換体は、野生型細胞または空プラスミドを用いて形質転換させた細胞の場合と比較して類似の増殖速度を有していた（パネルＣ）。
【００６６】
図５７のパネルＡ〜Ｃは、ＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３の発現を阻害することによって、ＧＲＰ７８過剰発現内皮細胞およびＣＨＯ細胞に侵入し損傷を与えるR. oryzaeの能が低下したことを示す。１２ｍｍガラスカバースリップ上にスプリットした内皮細胞を用いて付着およびエンドサイトーシス（微分蛍光分析法によって測定）分析する一方で、９６ウェルプレート５１Ｃｒ放出方法によって損傷を与えた。ＲＮＡ−ｉコンストラクトによって形質転換したR. oryzae胞子発芽体が引き起こす内皮細胞への侵入（パネルＡ）および損傷（パネルＢ）は、空プラスミドで形質転換した細胞の場合と比較して低下していた。ＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３を標的とするＲＮＡ−ｉによって作製した形質転換体が引き個起こすＧＲＰ７８過剰発現ＣＨＯ細胞の損傷は、ＣＨＯ親細胞の場合と比較して同等の損傷であった。これとは対照的に、空プラスミドまたは野生型R. oryzaeを用いて形質転換させたR. oryzae胞子発芽体が引き起こすＧＲＰ７８過剰発現ＣＨＯ細胞の損傷は、ＣＨＯ親細胞の場合と比較して著しく増大していた（パネルＣ）。ウイルコクソンの順位和検定法による測定において、＊：空プラスミドと比較してＰ＜ ０．００５、＊＊：野生型または空プラスミドと比較してＰ＜０．０１、‡：ＣＨＯ親細胞と比較してＰ＜０．０１。３つの独立したエンドサイトーシス実験内の各集団に用いたスライドはｎ＝６。３つの独立した損傷分析実験内の各集団に用いたウェルはｎ＝９。データを中央値±四分位範囲で表す。
【００６７】
図５８のパネルＡ〜Ｃは、糖尿病性ケトアシドーシス発症マウス体内においてＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３の発現を阻害することによってR. oryzaeの毒性が弱まったことを示す。パネルＡは、野生型R. oryzae、ＲＮＡ−ｉによるR. oryzaeの形質転換体、および空プラスミドによるR. oryzaeの形質転換体の３つの株の１つに気管内感染させたマウス（野生型R. oryzaeに対しはｎ＝１０、またはＲＮＡ−ｉまたは空プラスミドによるR. oryzaeの形質転換体に対してはｎ＝９）の生存時間を示す。空気感染による接種材料は、野生型、空プラスミド、またはＲＮＡ−ｉ細胞について、それぞれ２．４×１０３、２．８×１０３、および２．５×１０３の胞子とした。＊Ｐ＜０．００３ ｖｓ.野生型または空プラスミド感染マウス、ログランク検定。パネルＢは、野生型（１．７×１０３）細胞、空プラスミド（３．０×１０３）細胞、またはＲＮＡ−ｉ（３．１×１０３）細胞に気管内感染させた糖尿病性ケトアシドーシス発症マウス（各グループにつきｎ＝９）の肺および脳内の真菌量を示す。感染から２日目にマウスから器官を採取し、これを組織内の真菌量のためにSYBR Green アッセイ法を用いて処理した。データを中央値±四分位範囲で示した。野生型または空プラスミド感染マウスと比較して＊Ｐ＜０．００１、ウイルコクソン順位和検定。パネルＣは、野生型、空プラスミド、またはＲＮＡ−ｉコンストラクトに感染させたマウスから採取した肺および脳について、各ＣｏｔＨ遺伝子に対して特異的プライマー用いるｑＲＴ−ＰＣＲ法によって測定したＣｏｔＨ遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ発現を示す。データを平均±標準偏差で示した。＊Ｐ＜０．００１ ｖｓ.野生型または空プラスミド。
【００６８】
図５９は、野生型R. oryzaeまたは空プラスミドまたはＲＮＡ−ｉで形質転換したR. oryzaeに感染した糖尿病性ケトアシドーシス発症マウスから採取した肺の組織病理学検査を示す。過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色部分は、野生型R. oryzaeまたはＲＮＡ−ｉコンストラクトによって形質転換したR. oryzae以外の空プラスミドで形質転換したR. oryzaeに感染したマウスから採取した器官の多大な菌糸要素（矢印）を示す。
【００６９】
図６０は、ＧＡＧＫＫＨＮＮＡＫＱＳＷＮＷ（配列番号３９）のペプチド（Ａ）またはＭＧＱＴＮＤＧＡＹＲＤＰＴＤＮＮＫ（配列番号４０）のペプチド（Ｂ）に対して作製した抗ＣｏｔＨ抗体を用いた受動免疫法によって、マウスをR. oryzae感染から予防したことを示す。糖尿病性ケトアシドーシス発症マウスに対して、R. oryzae 99-880（野生型）の胞子（２．４×１０３）に気管内感染させる２時間前に、１ｍｇの抗ＣｏｔＨ ＩｇＧまたはワクチン接種前の血清（コントロール）を与えた。感染から３日目にポリクローナル抗体またはワクチン接種前の血清を第２の投与量で与えた。＊Ｐ＜０．０３ ｖｓ.ワクチン接種前の血清を与えたマウス。
【００７０】
図６１は、異なる真菌種のＣｏｔＨ３分子指標検出の特異性を示す。StepOnePlus Real-Time PCR machine（Applied Biosystems）内で増幅プロットを作製した。ｘ軸は増幅開始時からの経過時間を表し、ｙ軸は蛍光の増大（ΔＲｎ）を表す。閾値蛍光を水平方向の太線（これは、ネガティブコントロールの水サンプルについての平均に対して標準偏差×２を加算したものと等しい）として示す。Candida albicansまたはAspergillus fumigatus以外のR. oryzaeの１０５の胞子でスパイクした水サンプル（０．５ｍｌ）から信号を増幅させられる。
【００７１】
図６２は、R. oryzae ９９〜８８０の異なる接種材料でスパイクした水サンプル（０．５ｍｌ）のＣｏｔＨ３分子指標検出の特異性を示す。StepOnePlus Real-Time PCR machine（Applied Biosystems）内で増幅プロットを作製した。ｘ軸は増幅開始時からの経過時間を表し、ｙ軸は蛍光の増大（ΔＲｎ）を表す。閾値蛍光を水平方向の太線（これは、ネガティブコントロールの水サンプルについての平均に対して標準偏差×２を加算したものと等しい）として示す。
【００７２】
図６３は、血液中のRhizopus oryzae胞子の検出におけるＣｏｔＨ３分子指標検出の特異性を示す。StepOnePlus Real-Time PCR machine（Applied Biosystems）内で増幅プロットを作製した。ｘ軸は増幅開始時からの経過時間を表し、ｙ軸は蛍光の増大（ΔＲｎ）を表す。閾値蛍光を水平方向の太線（これは、ネガティブコントロールの水サンプルについての平均に対して標準偏差×２を加算したものと等しい）として示す。血液はｍ予防接種されたコントロールである。Ｒ：異なる接種材料のR. oryzae 99-880（たとえば、Ｒ１０＝３５０μｌの血液をスパイクするのに使用したR. oryzaeの１０個の胞子）。Ａ：A. fumigants。Ｃ：１０５細胞において３５０μｌの血液をスパイクするのに各々使用したC. albicans。
【００７３】
図６４は、クモノスケカビ属の検出におけるＣｏｔＨ３分子指標プローブの特異性を示す。StepOnePlus Real-Time PCR machine（Applied Biosystems）内で増幅プロットを作製した。ｘ軸は増幅開始時からの経過時間を表し、ｙ軸は蛍光の増大（ΔＲｎ）を表す。閾値蛍光を水平方向の太線（これは、ネガティブコントロールの水サンプルについての平均に対して標準偏差×２を加算したものと等しい）として示す。血液：予防接種を行っていない血液サンプル。９９〜８９２：R. oryzae 99-892。ATCC62417：R. microspores ATCC62417。R1000：R. oryzae 99-880。血液（３５０μｌ）を胞子（１０３）でスパイクするために全株を使用した。
【００７４】
〔発明の詳細な説明〕
本願開示の組成物および方法は、ケカビ目の真菌が独特に発現する細胞表面タンパク質の特定および特徴付けに少なくとも部分的に基づいており、真菌感染時の内皮細胞の結合を促進させられる。ムコール菌症は主にRhizopus oryzaeによって引き起こされる真菌症であり、血管侵入および血管内血栓によって特徴付けられる。内皮細胞およびケカビ目の相互作用は真菌症の発症に重要な要因である。近年特定されたグルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）は、R. oryzae胞子発芽体によるヒト臍静脈内皮細胞への侵入およびその後の損傷を媒介する新規の宿主レセプターであり、R. oryzaeおよび他のケカビ目種が感染時に結合し得る標的リガンドを提供する（Liu et al., J. Clin. Invest. 120:1914-24 (2010)）。
【００７５】
本発明によれば、本願開示のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドおよび他のポリペプチドまたはこれらの機能性ポリペプチド断片をコードする核酸が提供される。
【００７６】
本明細書で使用するように、用語「ケカビ目ＣｏｔＨ」はＣｏｔＨ族のタンパク質の亜族のＣｏｔＨを指す。ケカビ目ＣｏｔＨタンパク質は、内皮細胞などの宿主細胞に付着して侵入する過程に関与するケカビ目の真菌によって発現される細胞表面タンパク質を含む。ケカビ目ＣｏｔＨタンパク質はケカビ目特有のタンパク質であるので、ケカビ目ＣｏｔＨ核酸またはポリペプチドはその存在または不在によって、またはその発現の変化によって、ケカビ種感染（たとえばムコール菌症）を示すマーカーとしての機能を果たせる。したがって本発明は、真菌病の病状のスクリーニングおよび／またはその治療用の候補薬剤を開発するために使用できるケカビ目ＣｏｔＨ核酸および／またはポリペプチドを含む。
【００７７】
本明細書においてケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドまたはそのポリペプチド断片の修飾語句として使用する場合、用語「機能性」は、本願開示のＣｏｔＨ１、ＣｏｔＨ２、およびＣｏｔＨ３の機能特性と類似の機能特性を示すポリペプチドを指す。たとえば、S. cerevisae内にＣｏｔＨ３またはＣｏｔＨ２を発現した場合、S. cerevisaeの細胞は、ＧＲＰ７８過剰発現内皮細胞またはＣＨＯ細胞に付着して侵入する。したがって、ケカビ目ＣｏｔＨの１つの機能は、向付着性および／または向侵入性である。他の態様では、機能性ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドまたはその断片は、ＧＲＰ７８タンパク質またはその変異体または断片に対するｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ結合を含むことができる。
【００７８】
核酸を当業者に公知の多様なタンパク質発現系に組み込む場合では、本願記載の核酸分子は発明タンパク質の作製に有用である。さらに、核酸分子またはその断片を容易に検出可能な置換基によって標識化し、所定サンプル内にある発明ケカビ目ＣｏｔＨ遺伝子またはｍＲＮＡ転写物の存在および／または量を分析するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。本願記載の核酸分子およびその断片はまた、本願記載の発明タンパク質をコードする遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応法におけるプライマーおよび／または鋳型としても有用である。
【００７９】
用語「核酸」はポリヌクレオチドとも称され、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、プローブ、オリゴヌクレオチド、およびプライマーを含んでおり、一本鎖または二本鎖とすることができる。ＤＮＡは、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）およびゲノムＤＮＡのいずれかとすることができ、センス鎖またはアンチセンス鎖、またはその両方を表すことができる。核酸の例は、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドをコードするＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または単離ゲノムＤＮＡである。このような核酸は、配列番号２、４、６、９、１０、１２〜１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１に示すヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含むが、これらに限定されない。通常、本発明のゲノム配列は、ケカビ目ＣｏｔＨをコードするエクソンの領域外に存在するプロモーター、エンハンサー、およびイントロンなどの調節領域を含む一方で、ケカビ目ＣｏｔＨをコードすることのない近位遺伝子を含まない。
【００８０】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、またはタンパク質の修飾語句として用語「単離」および／または「精製」を本明細書および特許請求の範囲において使用しているが、当該用語の使用は、修飾対象のＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、またはタンパク質が単離または精製形態となるよう人為的に作製され、したがって天然のｉｎ ｖｉｖｏ細胞環境から分離されていることを意味する。
【００８１】
用語「実質的に同一のヌクレオチド配列」は、参照ポリヌクレオチドに対する十分な同一性を有しているため、中度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で当該参照ポリヌクレオチドとハイブリダイズするＤＮＡを指す。一実施形態では、参照ヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有するＤＮＡは、配列番号２、４、６、９、１０、１２〜１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１に示すものと実質的に同一のアミノ酸配列をコードする。他の実施形態では、参照ヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有するＤＮＡは、当該参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも６５％の同一性を有する。実質的に同一のヌクレオチド配列を有するＤＮＡは、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有しうる。
【００８２】
本明細書に使用するように、核酸の「修飾」はまた、参照配列に対する１つ以上のヌクレオチド付加、欠失、または置換を含みうる。核酸修飾は、コード対象のアミノ酸配列が遺伝子コードの縮重を原因として変化することがない置換を含みうる。このような核酸修飾は、意図的に生じさせるか、または核酸複製時に突然変異として発生する変異に対応できる。
【００８３】
記載のケカビ目ＣｏｔＨ配列の典型的な修飾は、ケカビ目種のA. corymbifera、A. elegans、A. rouxii、B. circina、B. multispora、C. brefeldii、C. angarensis、C. recurvatus、D. fulva、E. anomalus、H. elegans、H. assamensis、K. cordensis、M. amphibiorum、P. parasitica、P. agaricina、P. anomala、P. circinans、R. endophyticus、R. javensis、S. umbellata、S. megalocarpus、T. elegans、T. indicaeseudaticae、Z. californiensis、R. azygosporus、R. caespitosus、R. homothallicus、R. oryzae、R. microspores、R. microsporus var. rhizopodiformis、R. schipperae、またはこれら以外の本願開示のケカビ目種を含む他種の同族体に対応する配列を含む。ＰＣＲ法などの当該技術分野に公知の方法、またはゲノム、ｃＤＮＡ、または発現ライブラリのスクリーニングによって、ケカビ目種の対応するケカビ目ＣｏｔＨ配列を決定できる。
【００８４】
発明ケカビ目ＣｏｔＨの他の典型的な修飾は、ケカビ目ＣｏｔＨ核酸配列のスプライス変異形態に対応できる。さらに、核酸配列の修飾は、たとえば塩基、糖、またはリン酸部分に対する修飾を含むか、または修飾ホスホジエステル結合を含む１つ以上の非天然ヌクレオチドを含みうる。さらに、核酸配列の修飾は、たとえば塩基、糖、またはリン酸部分に対する修飾または修飾ホスホジエステル結合を含む１つ以上の非天然ヌクレオチドを含みうる。このような修飾は、核酸分子の安定性を向上させるのに都合が良い。
【００８５】
本発明はまた、配列番号２、４、６、９、１０、１２〜１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１に示す核酸と異なりはするが同一の表現型を有する核酸をも含む。表現型が類似の核酸はまた、機能的に同等の核酸とも称される。本明細書に使用するように、語句「機能的に同等の核酸」は、本願開示の核酸の生成物と同一の生成物を生成するように実質的に同一の方法で機能する、僅かかつ軽微の配列変異によって特徴付けられる核酸を含む。具体的には、機能的に同等の核酸は、本願開示の核酸がコードするポリペプチドと同一のポリペプチドまたは本願開示の核酸がコードするポリペプチドに対してアミノ酸の保存変異を有するポリペプチドをコードする。たとえば、保存変異は、非極性残基を他の非極性残基に置き換える置換、または荷電残基を同様の荷電残基に置き換える置換を含む。これら変異は、タンパク質の三次構造を実質的に改変することのないものとして当業者に認識されている変異を含む。
【００８６】
本発明はさらに、特定のハイブリダイゼーション条件下において遺伝子コードの縮重に起因して本発明の核酸と必ずしもハイブリダイズすることのない、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドをコードする核酸を提供する。本明細書に使用されるように、用語「縮重」は、参照核酸と比較して少なくとも１つのヌクレオチドが異なるものの、当該参照核酸にコードされるアミノ酸と同一のアミノ酸をコードするコドンを指す。本発明のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドをコードする核酸は、配列番号１、３、５、１１、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２に示すアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸から構成されうる。
【００８７】
一実施形態では、本発明は、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド、その免疫原性断片、またはその機能性断片を含む本願開示のポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。本発明はまた、（ａ）配列番号１、３、５、１１、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２に示すアミノ酸をコードする核酸、（ｂ）低度、適度、または高度にストリンジェントな条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズし、生物活性を有するケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドを隣接してコードする核酸、または（ｃ）生物活性を有するケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドをコードしかつ（ａ）または（ｂ）のいずれかの核酸に対して縮重している核酸から選択される核酸を含む、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド、その免疫原性断片、またはその機能性断片をコードする単離核酸を提供する。一態様では、本発明の核酸は、高度にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする。
【００８８】
ハイブリダイゼーションは、染色体ＤＮＡにおいて自然に形成される結合と類似の水素結合を介して形成される核酸の相補鎖間の結合（たとえばセンス鎖／アンチセンス鎖またはプローブ／標的核酸）を指す。当業者であれば、所定プローブを標的ＤＮＡに対してハイブリダイズさせるために用いるストリンジェントレベルを容易に変化させられる。
【００８９】
本明細書では、ポリ核酸のハイブリッド体が安定する条件を指すために語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」を使用している。当業者に公知のように、ハイブリッド体の安定性は、当該ハイブリッド体の融解温度（Ｔｍ）に反映される。通常、ハイブリッド体の安定性は、ナトリウムイオン濃度および温度の関数となる。典型的には、ハイブリダイゼーション反応は低ストリンジェントの条件下で行われ、変動はするが高度なストリンジェントの条件下で洗浄が行われる。典型的には、ハイブリダイゼーション反応は低ストリンジェントの条件下で行われ、その後によって高ストリンジェントの条件に変化させて洗浄が行われる。ハイブリダイゼーション時の基準ストリンジェントレベルは、こうした洗浄の条件に関係する。
【００９０】
本明細書に使用するように、語句「中度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、標的核酸が相補的核酸を結合できる条件を指す。ハイブリダイズした核酸は、通常、少なくとも６０％、少なくとも７５％、または少なくとも８５％の同一性を有することになるか、または少なくとも９０％の同一性を有することになる。中度にストリンジェントな条件は、４２ＥＣの５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中においてハイブリダイゼーションを行い、その後に４２ＥＣの２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中において洗浄することと同等の条件である。
【００９１】
語句「高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、６５ＥＣの０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中において安定したハイブリッド体を形成する核酸配列のみがハイブリダイズできる条件を指す。たとえば、ハイブリッド体が６５ＥＣの０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中において不安定となる場合、本明細書において意図するように高度にストリンジェントな条件下では不安定となる。たとえば、４２ＥＣの５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中においてハイブリダイゼーションを行い、その後に６５ＥＣの０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中において洗浄することによって、高度にストリンジェントな条件を提供できる。
【００９２】
語句「低度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、２２ＥＣの１０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でハイブリダイゼーションを行い、その後に３７ＥＣの１×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で洗浄するのと同等の条件を指す。Ｄｅｎｈａｒｔ溶液は、１％ Ｆｉｃｏｌｌ、１％ポリビニルピロリドン、および１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。２０×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、エチレンジアミド四酢酸（ＥＤＴＡ））は、３Ｍ塩化ナトリウム、０．２Ｍリン酸ナトリウム、および０．０２５ Ｍ（ＥＤＴＡ）を含む。中度および高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション用の他の好適なバッファおよび条件は当業者に周知であり、たとえばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989、およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)に記載されている。ポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２、４、６、９、１０、１２〜１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１に示す核酸配列の実質的に全体または大部分（たとえば、典型的には１５〜３０個のヌクレオチド）に対して、中度または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００９３】
本発明はまた、中度にストリンジェントな条件下でケカビ目ＣｏｔＨ核酸分子（たとえば、配列番号２、４、６、９、１０、１２〜１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１に示す核酸分子）とハイブリダイズするケカビ目ＣｏｔＨヌクレオチド配列の修飾をも提供する。また、ケカビ目ＣｏｔＨヌクレオチド配列に対して少なくとも６５％の同一性を有する配列修飾も提供する。本発明はまた、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するケカビ目ＣｏｔＨヌクレオチド配列の修飾も提供する。本発明はまた、修飾核酸にコードされるアミノ酸配列が配列番号１、３、５、１１、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する、ケカビ目ＣｏｔＨヌクレオチド配列の修飾も提供する。
【００９４】
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較することを目的としてアラインメントが行われうる各配列内の位置を比較することによって決定できる。比較した配列内の位置が同一の塩基またはアミノ酸によって占められている場合、核酸分子は当該位置において互いに相同する。配列間の相同性の程度は、配列間に共通する適合または相同位置の個数の関数となる。「非関連性」または「非相同性」配列は、本発明の配列の１つに対する同一性が４０％未満であるか、または２５％未満である。
【００９５】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（または、ポリペプチドまたはポリペプチド領域）が他の配列に対して一定のパーセンテージ（たとえば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％）の「配列同一性」を有しているということは、これら２つの配列をアラインメントして比較した場合、当該一定のパーセンテージの塩基（またはアミノ酸）が同一であることを意味している。当該技術分野に公知のソフトウェアプログラム（たとえば、前掲したAusubel et al.に記載のソフトウェアプログラム）を用いて、アラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性を決定することができる。アラインメントには初期設定パラメータを使用することが好ましい。アラインメントプログラムの１つは、初期設定パラメータを用いるＢＬＡＳＴである。具体的には、プログラムは、次の初期設定パラメータを用いるＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝子コード＝標準；フィルター＝無し；ストランド＝一本鎖および二本鎖；カットオフ値＝６０；期待値＝１０；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；分類＝高得点に応じる；データベース＝非冗長ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。プログラムの詳細は国立生物工学情報センターに公開されている。生物学的に同等のポリヌクレオチドは、特定のパーセント相同性を有し、かつ同一または類似の生物活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００９６】
ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドをコードする核酸を単離する１つの手段は、天然核酸プローブまたは当該技術分野に周知の方法によって人為的に設計した核酸プローブを用いてｃＤＮＡライブラリまたはゲノムライブラリを精査することである。この目的に関して、ケカビ目ＣｏｔＨ遺伝子由来の核酸プローブは特に有用である。当該技術分野に周知の方法を用いて任意の数のケカビ目種源から相補的ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡを取得するため、またはｃＤＮＡまたはゲノムライブラリのスクリーニングを行って関連ｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離するために、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドをコードするＤＮＡおよびｃＤＮＡ分子を使用できる（たとえば、前掲したSambrook et al., 1989：前掲したAusubel et al., 1999参照）。
【００９７】
本発明はさらに、配列番号２、４、６、９、１０、１２〜１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１に示す連続する１５〜３００個のヌクレオチドまたはそのアンチセンス鎖を含むケカビ目ＣｏｔＨオリゴヌクレオチドを提供する。本明細書に使用するように、用語「オリゴヌクレオチド」は、参照ヌクレオチド配列内の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドを含む核酸分子を指す。オリゴヌクレオチドが指す核酸分子は、参照ヌクレオチド配列内の連続する少なくとも１６個、１７個、１８個、１９個、２０個または少なくとも２５個のヌクレオチドを含むことができ、多くの場合では参照ヌクレオチド配列内の連続する少なくとも３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個、２７５個、３００個、３２５個、最大で３５０個のヌクレオチドを含む。参照ヌクレオチド配列は、センス鎖またはアンチセンス鎖とすることができる。したがって、本発明の一態様では、ＣｏｔＨオリゴヌクレオチドは、核酸配列ＡＴＧＡＡＡＴＴＡＴＣＴＡＴＴＡＴＡＴＣＣＧＣＴＧＣＣ（配列番号３３）、ＧＣＴＧＧＧＡＡＴＡＴＡＡＴＴＧＴＣＡＴＣＧＡ（配列番号３４）、ＧＡＴＧＡＣＡＡＴＴＡＴＡＴＴＣＣＣＡＧＣ（配列番号３５）、ＧＡＧＴＡＧＡＣＧＴＡＡＴＴＡＧＡＴＣＣＡＡ（配列番号３６）、ＡＡＡＣＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＡＴＣ（配列番号３７）、または本願開示のオリゴヌクレオチドの核酸配列を含みうる。
【００９８】
参照ケカビ目ＣｏｔＨヌクレオチド配列内の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドを含む本発明のケカビ目ＣｏｔＨオリゴヌクレオチドは、中度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてケカビ目ＣｏｔＨとハイブリダイズできる。したがって、たとえば、サンプル内のケカビ目ＣｏｔＨのＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのプローブ、およびこれらＤＮＡまたはＲＮＡのスプライス変異を検出するためのプローブとしての使用；配列決定プライマーまたはＰＣＲ用プライマーとしての使用；ケカビ目ＣｏｔＨのＲＮＡの細胞内転写を阻害するアンチセンス試薬としての使用；または、ケカビ目ＣｏｔＨ核酸分子とのハイブリダイゼーションが所望される当業者に公知の他の用途に都合良く用いることができる。
【００９９】
本発明のケカビ目ＣｏｔＨの単離核酸分子は、多様な診断および治療用途に使用できる。たとえば、本発明のケカビ目ＣｏｔＨの単離核酸分子は、上述のようにプローブとして使用でき；ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの組み換え発現用の鋳型として使用可能でき；または、ケカビ目ＣｏｔＨを結合する細胞分子を特定するためのスクリーニング分析に使用できる。
【０１００】
本発明のケカビ目ＣｏｔＨ核酸分子を作製する他の有用な方法は、ＰＣＲ法およびケカビ目ＣｏｔＨオリゴヌクレオチドを用いた当該核酸分子の増幅工程を含み、適宜、ゲル電気泳動法による増幅結果物の精製工程を含む。任意の所望ヌクレオチド境界を有するケカビ目ＣｏｔＨ核酸分子を作製するために、ＰＣＲ法またはＲＴ−ＰＣＲ法のいずれかを使用できる。また、１つ以上の付加、欠失、または置換を含む適当なオリゴヌクレオチドプライマーを選択することによって、核酸配列に対する所望の修飾を導入できる。このような核酸分子は、対象の遺伝子またはｍＲＮＡの単一コピーといった程度の少量の開始材料、または対象の細胞、組織、または種から指数関数的に増幅できる。
【０１０１】
したがって本発明は、サンプル内のケカビ目ＣｏｔＨ核酸を検出する方法を提供する。サンプル内のケカビ目ＣｏｔＨ核酸を検出する方法は、要求に応じて定性または定量量法のいずれにすることもできる。たとえば、要求に応じて、ハイブリダイゼーションに使用する分析フォーマットおよびプローブまたは用途に選択されるプライマー組に基づいてケカビ目ＣｏｔＨの存在、不在、完全性、または構造を決定できる。
【０１０２】
ケカビ目ＣｏｔＨの単離核酸分子に対する特定のハイブリダイゼーションに基づいてケカビ目ＣｏｔＨ核酸を検出する有用な分析法は当該技術分野に周知であり、たとえば、使用する分析フォーマットに応じて、核酸分子内の改変染色体の位置、改変遺伝子コピーの数、およびＲＮＡの存在量を検出するために使用できるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む。他のハイブリダイゼーション分析法は、たとえば、異なるＲＮＡのスプライス変異体の存在量および完全性を決定するのに使用できるノーザンブロット法およびリボヌクレアーゼ保護分析法と、ＤＮＡのコピー数および完全性を決定するのに使用できるサザンブロット法とを含む。放射性同位体、蛍光色素、化学発光マーカー、ビオチン、または分析方法によって検出できる当該技術分野に公知の検出可能部分などの任意の好適な検出可能部分を用いて、ケカビ目ＣｏｔＨのハイブリダイゼーション用プローブを標識化することができる。
【０１０３】
２つ以上のケカビ目ＣｏｔＨオリゴヌクレオチドを含むケカビ目ＣｏｔＨ核酸の増幅に基づいてケカビ目ＣｏｔＨ核酸を検出する有用な分析法も当該技術分野に周知であり、たとえば、定性型また定量型のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法；逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法；非変性ゲル電気泳動における電気泳動移動度の変化をもたらす一本鎖ＤＮＡの二次構造上の差異に基づいて、ＤＮＡ内の単一点突然変異を容易に特定できる一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析法；および、ＤＮＡ内の突然変異が電気泳動ゲル上の変性タンパク質生成物によって決定される、タンパク質トランケーション試験などの共役ＰＣＲ法、転写分析法、および翻訳分析法を含む。さらに、増幅したケカビ目ＣｏｔＨの核酸は、突然変異およびその突然変異多発領域を検出するようにアラインメントが行われることができる。また、これら突然変異を特定する大規模のサンプルスクリーニング用の特定分析法を開発することができる。
【０１０４】
本発明は、本発明のケカビ目ＣｏｔＨ核酸にコードされるケカビ目ＣｏｔＨの単離ポリペプチド、その免疫原性断片、または機能性断片をさらに提供する。たとえば、本発明は、配列番号１、３、５、１１、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２に示すアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。また、配列番号２、４、６、９、１０、１２〜１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１に示すヌクレオチド配列と同一または実質的に同一のヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列にコードされるケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドも提供する。
【０１０５】
本明細書に使用するように、用語「実質的に同一のアミノ酸配列」は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも６５％の配列同一性を有し、当該参照アミノ酸配列によって定義されるタンパク質に特有の機能活性および生物活性を同等に保持するアミノ酸配列を指す。一態様では、実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質は、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する。一方で、レベル未満の配列同一性を有し、スプライス変異体として現れるポリペプチドまたはコード核酸、または、アミノ酸の同類置換または縮重コドンの置換によって修飾されるポリペプチドについても本発明の範囲に含まれるものと理解される。
【０１０６】
また、用語「ケカビ目ＣｏｔＨ」には、ケカビ目ＣｏｔＨの機能性断片またはポリペプチド類似体も含まれている。用語「機能性断片」は、ケカビ目ＣｏｔＨ全長タンパク質の一部が、本明細書に定義するように対応全長タンパク質に特有の生物活性を有していることを条件として、当該ケカビ目ＣｏｔＨ全長タンパク質の一部であるペプチド断片を指す。たとえば、本発明の態様では、本発明の機能性断片は、ＧＲＰ７８タンパク質と結合することができる。または、より具体的には、本発明の機能性断片は、上皮細胞が発現するＧＲＰ７８タンパク質と結合することができる。したがって、本発明はまた、本明細書に記載の生物学的検定法などの結合および通常の方法を用いて特定できる発明ケカビ目ＣｏｔＨタンパク質の機能性断片も提供する。
【０１０７】
本明細書で使用するように、用語「ポリペプチド」は、ケカビ目ＣｏｔＨに関連して使用する場合、２つ以上のアミノ酸からなるペプチドまたはポリペプチドを指すように意図している。用語「ポリペプチド類似体」は、本明細書に明確に記載されている、１つ以上の残基が機能的に類似する残基によって同類置換され、本願開示のケカビ目ＣｏｔＨの機能を模倣する能を示す配列と実質的に同一のアミノ酸残基配列を有する任意のポリペプチドを含む。ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの「修飾」はまた、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドのアミノ酸配列の同類置換を含む。コードされるアミノ酸の同類置換は、たとえば、次のグループに属するアミノ酸を含む：（１）非極性アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅ）；（２）中性アミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、およびＧｌｎ）；（３）酸性アミノ酸（ＡｓｐおよびＧｌｕ）；（４）塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓ）；および（５）芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＨｉｓ）。他の軽微な修飾は、本願開示のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの一部または全部の機能が保持されているかぎり、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドに含まれる。
【０１０８】
本発明の機能性断片またはポリペプチド類似体のアミノ酸長は、本発明のケカビ目ＣｏｔＨタンパク質配列の約５つのアミノ酸から全長配列の範囲とすることができる。特定の実施形態では、アミノ酸長は、たとえば、アミノ酸長にして少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個、少なくとも約４０個、少なくとも約４５個、少なくとも約５０個、少なくとも約７５個、少なくとも約１００個、少なくとも約１５０個、少なくとも約２００個、少なくとも約２５０個以上のアミノ酸から最大でケカビ目ＣｏｔＨタンパク質配列の全長までを含む。機能性断片は、配列番号１、３、５、１１、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２に示す連続するアミノ酸配列を含む、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの連続するアミノ酸配列とすることができる。
【０１０９】
他の実施形態では、本発明は、本願開示のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの免疫原性断片を提供する。本発明の免疫原性断片は、当該技術分野に周知の実験的方法を用いて特定できる免疫原性エピトープを含むことができる。さらに、免疫原性エピトープを特定するために、計算モデルを使用することもできる。たとえば、Tong et al. (Brief Bioinform. 8(2):96-108 (2006)) and Ponomarenko et al. (2008) “B-cell epitope prediction,” in Structural Bioinformatics, Bourne PE and Gu J (eds) Wiley-Liss; 2 edition, pgs. 849-879参照。無傷タンパク質に対して発生する抗体に対する反応性を有するエピトープを特定後、各位置のアミノ酸置換および／またはＣ末端および／またはＮ末端伸長のアミノ酸置換によって、ポリペプチドを特異性について試験できる。ポリペプチドを有するこのようなエピトープは少なくとも６個〜１４個のアミノ酸残基を含み、たとえば、当該技術分野に周知の方法を用いたポリペプチド合成または既存のタンパク質を断片化することによって作製できる。したがって、本発明の一部の実施形態では、本願開示のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの免疫原性断片は、アミノ酸配列ＧＡＧＫＫＨＮＮＡＫＱＳＷＮＷ（配列番号３９）またはＭＧＱＴＮＤＧＡＹＲＤＰＴＤＮＮＫ（配列番号４０）を含みうる。
【０１１０】
本発明に従って免疫原として使用する分子に関しては、免疫原性ワクチンとしての特質を失うことなくタンパク質のトランケーションまたは断片化できることを当業者は理解するであろう。たとえば、分子の免疫原性としての機能性を保存しつつＣ末端側からトランケーションすることによって、Ｎ末端断片を作製するようタンパク質のトランケーションすることができる。同様に、分子の免疫原性としての機能性を保存しつつＮ末端側からトランケーションすることによって、Ｃ末端断片を作製できる。本願の教示およびガイダンスに従う他の修飾は、天然タンパク質に関して本願に記載する治療上有用な特性を実現する上記以外のポリペプチドの機能性断片、免疫原性断片、変異体、これらの類似体または誘導体を作製するように、本発明に従って作成できる。
【０１１１】
したがって、用語「免疫原性断片」は、本明細書において使用するように、Ｔ細胞および／またはＢ細胞の抗原レセプターに認識されるタンパク質の一部を指す。通常、免疫原性部分は、本願に開示のＣｏｔＨポリペプチドの少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、または少なくとも１００個のアミノ酸残基を含む。または、免疫原性部分は、本願開示のＣｏｔＨポリペプチドの最大で５個、最大で６個、最大で７個、最大で８個、最大で９個、最大で１０個、最大で１１個、最大で１２個、最大で１３個、最大で１４個、最大で１５個、最大で１６個、最大で１７個、最大で１８個、最大で１８個、最大で１９個、最大で２０個、最大で２５個、最大で３０個、最大で５０個、または最大で１００個のアミノ酸残基を含むことができる。一部の態様では、免疫原性タンパク質は、Ｎおよび／Ｃ末端の小さい断片（たとえば、５個〜３０個のアミノ酸、好ましくは１０個〜２５個のアミノ酸）を含むことができる。
【０１１２】
ポリペプチドの修飾はまた、修飾ポリペプチドがケカビ目ＣｏｔＨの生物活性を示すことを条件として、誘導体、類似体、およびこれらの機能模倣体を含むこともできる。たとえば、誘導体は、アルキル化、アシル化、カルバミル化、ヨウ素化、またはポリペプチドの誘導体化を伴う任意の修飾などのポリペプチドの化学修飾を含むことができる。このような誘導体化分子は、たとえば、遊離アミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、またはホルミル基を形成する分子を含む。遊離カルボキシル基は、塩、メチルおよびエチルエーテル、または他の種類のエーテルまたはヒドラジドを形成するように誘導体化されることができる。遊離ヒドロキシル基は、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成するように誘導体化されることができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成するように誘導体化されることができる。また、２０個の標準アミノ酸（たとえば、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン、３−メチルヒスチジン、ホモセリン、オルニチン、またはカルボキシグルタミン酸塩）の天然アミノ酸誘導体を１つ以上含むペプチドも誘導体または類似体として含まれる。ペプチドは、ペプチド結合によって結合されていないアミノ酸を含むことができる。本発明のポリペプチドはまた、ケカビ目ＣｏｔＨの活性が保持されることを条件として、本願に示すポリペプチドの配列に対して１つ以上の残基の付加および／または欠失を有する任意のポリペプチドを含む。
【０１１３】
本発明は、ケカビ目ＣｏｔＨの単離ポリペプチド、その免疫原生断片、またはその機能性断片を提供する。本発明のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドは、当該技術分野に周知の多様な方法（たとえば、組み換え発現系、沈殿クロマトグラフィー法、ゲル濾過クロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、逆相クロマトグラフィー法、および親和性クロマトグラフィー法など）によって単離できる。他の周知の方法は、Deutscher et al., Guide to Protein Purification:  Methods in Enzymology, Vol. 182, (Academic Press, (1990))に記載されている。また代替的に、本発明の単離ポリペプチドは周知の組み換え方法（たとえば、前掲したSambrook et al.、前掲したAusubel et al.を1999参照）を用いても取得できる。本発明のポリペプチドの生化学的精製の方法および条件は当業者によって選択でき、さらには免疫分析または機能分析によって観察される精製を行うことによって選択できる。
【０１１４】
本発明のポリペプチドの調整手段の例は、本願記載のように、ケカビ目ＣｏｔＨをコードする核酸を当該技術分野に周知の方法を用いて好適な宿主細胞内（細菌細胞、酵母細胞、卵母細胞などの両生類細胞、または哺乳類細胞など）に発現させ、周知の精製方法を再度用いて発現ポリペプチドを回収することである。本発明のポリペプチドは、本願記載の発現ベクターを用いて形質転換を行った細胞から直接的に単離できる。また、組み換え発現ポリペプチドは、適当な親和性標識（グルタチオン S-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはポリＨｉｓなど）を含む融合タンパク質として発現でき、かつアフィニティー精製可能でもある。また、本発明のポリペプチド、その生物学的機能を有する断片、およびその機能性同等物は、化学合成法によって作製できる。たとえば、合成ポリペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ, ＣＡ）のＭｏｄｅｌ ４３０ａまたは４３１ａ自動ペプチド合成器を製造者提供の化学反応を採用して用いることによって作製できる。
【０１１５】
本発明はまた、許容可能な担体と、ケカビ目ＣｏｔＨの成熟タンパク質またはその機能性ポリペプチドの断片を単離して精製した任意のものとを単独または組み合わせて含む組成物を提供する。これらのポリペプチドまたはタンパク質は、天然の原料から組み換え誘導化、化学合成化、または化学精製化できる。本明細書に使用するように、用語「許容可能な担体」は、リン酸緩衝生理食塩溶液、水、油および水エマルジョンなどのエマルジョン、および多様な種類の湿潤剤などの標準薬物担体のうち任意のものを含む。
【０１１６】
したがって本発明は、薬学上許容可能な担体、本願開示のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド、その免疫原性断片、またはその機能性断片からなる一群から選択される化合物、本願開示のアンチセンス核酸、または本願開示の抗ケカビ目ＣｏｔＨ抗体を含む医薬組成物を提供する。本発明はさらに、ムコール菌症に罹患し、その治療または予防を必要としている対象に対して、薬学上許容可能な担体と本願開示のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド、その免疫原性断片、またはその機能性断片、本願開示のアンチセンス核酸、または本願開示の抗ケカビ目ＣｏｔＨ抗体からなる一群から選択される化合物とを含む医薬組成物を治療上有効な量投与して、ムコール菌症を治療または予防する方法を提供する。本発明はさらに、ムコール菌症に罹患し、その治療または予防を必要としている対象に対して本願開示のワクチン組成物を治療上有効な量投与することによってムコール菌症を治療または予防する方法を提供する。
【０１１７】
また、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡの全長または任意の一部と特異的に結合して、当該ｍＲＮＡの翻訳を防止できる配列を有するアンチセンス核酸も提供する。アンチセンス核酸は、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドをコードするｃＤＮＡの配列の任意の一部分と特異的に結合できる配列を有することができる。本明細書に使用するように、語句「特異的に結合」は、相補的アミノ酸配列を認識し、相補的塩基対との間に水素結合を形成して当該相補的アミノ酸配列と二重螺旋セグメントを形成することを可能にする核酸配列の能力を含む。アンチセンス核酸の例は、ヌクレオチドの化学類似体を含むアンチセンス核酸である。
【０１１８】
本発明は、ケカビ目ＣｏｔＨのアンチセンス核酸を組み換え発現するか、またはケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を抑制するアンチセンス核酸組成物（以後ＳＡＮＣと称す）を利用して、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの発現レベルを調節する手段を提供する。合成オリゴヌクレオチド、または、ｍＲＮＡを認識して特異的に結合するよう設計された他のアンチセンス核酸試薬構造は、配列番号２、４、６、９、１０、１２〜１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１に示す核酸配列を含むケカビ目ＣｏｔＨのコード鎖の全長または一部を相補するように構築される。
【０１１９】
ＳＡＮＣは、注射による対象への投与のために血流中で安定するか、または実験室の細胞培養条件で安定するように設計される。ＳＡＮＣは、その物理的および化学的特性によって細胞質に侵入するために細胞膜を通過できるように設計される。これにより、たとえば、ＳＡＮＣの疎水性を有する小さな化学構造を設計するか、またはＳＡＮＣを認識して細胞内へ輸送する細胞の特異的輸送系を利用することによって、ＳＡＮＣが細胞膜を通過することを可能にする。さらに、選択する細胞集団内のみのＳＡＮＣと結合してこれを吸収する特異的な細胞取り込み機構によって認識されるようにＳＡＮＣを標的化することによって、ＳＡＮＣを特定の選択細胞集団にのみ投与されるよう設計できる。具体的な実施形態では、ＳＡＮＣはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１２０】
たとえば、ＳＡＮＣは、上述のように、特定の種類の細胞のみに見られるレセプターと結合するよう設計されてもよい。またＳＡＮＣは、配列番号２、４、６、９、１０、１２〜１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１に示す配列内に含まれる配列に対応できる標的ｍＲＮＡ配列を認識し、これと特異的に結合するよう設計される。ＳＡＮＣは、標的ｍＲＮＡ配列と結合して、たとえばリボヌクレアーゼＩによる消化によって当該標的ｍＲＮＡの分解を誘発するか、または翻訳調節因子またはリボソームの結合に対する干渉または他の化学構造（当該標的ｍＲＮＡを分解するか、または化学的に修飾するリボソーム配列または反応性化学基）の含有を介してｍＲＮＡの標的配列の翻訳を阻害することによって、当該標的ｍＲＮＡ配列を不活性化するよう設計される。ＳＡＮＣは、ｍＲＮＡの標的に対して向けられた場合、このような特性を有することができることが示されている（Cohen et al., TIPS, 10:435 (1989) and Weintraub, Sci. American, January (1990), pp.40参照）。
【０１２１】
また本願では、細胞内に侵入し、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を抑制するように当該ｍＲＮＡと特異的に結合することによって当該ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの発現を低下させるのに効果的な量の本発明のアンチセンス核酸と、細胞膜を通過することのできる許容可能な疎水性担体とを含む組成物も提供する。好適な疎水性担体は、たとえば、米国特許第５，３３４，７６１号、第４，８８９，９５３号、および第４，８９７，３５５号などに記載されている。細胞膜を通過することのできる許容可能な疎水性担体は、選択される種類の細胞に特有のレセプターと結合することによって、当該細胞内に取り込まれる構造を含んでいてもよい。
【０１２２】
アンチセンス核酸組成物は、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに有用である。合成オリゴヌクレオチドまたはそれ以外のアンチセンス化学構造は、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡと結合し、当該ｍＲＮＡの翻訳を阻害するよう設計されるとともに、ケカビ目ＣｏｔＨ関連の遺伝子が組織サンプルまたは対象内で発現することを阻害する組成物として有用である。
【０１２３】
また本発明は、ケカビ目ＣｏｔＨ核酸を含む細胞をケカビ目ＣｏｔＨの発現に好適な条件下で培養させることによって、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドを発現させる方法を提供する。したがって、ケカビ目ＣｏｔＨをコードする核酸配列を好適な細胞内で発現させることによって、本発明のケカビ目ＣｏｔＨを組み換え発現する方法が提供される。本願に記載のケカビ目ＣｏｔＨを作製するのに好適な組み換えＤＮＡ発現系は当該技術分野に周知である（たとえば、前掲したAusubel et al., 1999参照）。たとえば、上述の核酸配列をさらなる操作のためにベクター内に組み入れることができる。本明細書に使用するように、ベクターは、異種ＤＮＡの発現または複製を実現するための細胞内への導入に使用する個別要素を含む組み換えＤＮＡまたはＲＮＡプラスミドまたはウイルスを指す。
【０１２４】
また本発明は、本発明のケカビ目ＣｏｔＨの核酸を含むベクターを提供する。好適な発現ベクターは当該技術分野に周知であり、調節配列または要素（調節配列または要素と動作可能に結合している核酸の発現を調節可能なプロモーター領域またはエンハンサー領域）と作動可能に結合している核酸を発現可能なベクターを含む。適当な発現ベクターは、真核細胞および／または原核細胞内で複製可能なベクター、およびエピソーム性を保持するベクターまたは宿主細胞のゲノム内に組み込み可能なベクターを含む。
【０１２５】
用語「ベクター」、「クローニングベクター」、および「発現ベクター」は、核酸を宿主細胞内に導入できる媒体を指す。核酸を増殖させるため、核酸を含ませるため、またはコード配列をポリペプチド発現するためにベクターを使用できる。多種多様のベクターが当該技術分野に公知であり、たとえば、プラスミド、ファージ、およびウイルスが含まれる。典型的なベクターは、たとえば、前掲したSambrook et al.；前掲したAusubel et al.に記載されている。
【０１２６】
プロモーターまたはエンハンサーは、調節の性質に応じて構成型または調節型とすることとができる。調節配列または調節要素を本発明の核酸と作動可能に結合させて、本発明の核酸と調節配列との物理的および機能的関係によって本発明の核酸の転写を可能としている。
【０１２７】
原核細胞または真核細胞内での発現に好適なベクターは当業者に周知である（たとえば前掲したAusubel et al., 1999参照）。真核細胞内での発現に有用なベクターは、たとえば、ＳＶ４０早期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘発性プロモーター、およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターなどを含む調節要素を含む。本発明のベクターは、ケカビ目ＣｏｔＨ核酸分子のサブクローニングおよび増幅、およびケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドを組み換え発現するのに有用である。本発明のベクターは、たとえば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、またはレトロウイルスなどのウイルスベクターと、コスミドまたはプラスミドと、巨大な核酸分子をサブクローニングする場合には特に細菌人工染色体ベクター（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクターとを含む。このようなベクターは市販化されており、その使用は当該技術分野に周知である。当業者は、特定の宿主細胞内の発現に適当なプロモーターを知るかまたは容易に決定できる。
【０１２８】
本発明はさらに、本発明のケカビ目ＣｏｔＨ核酸を含む組み換え細胞を提供する。組み換え細胞は、ケカビ目ＣｏｔＨ核酸分子を含むベクターを宿主細胞内へ導入することによって作製できる。組み換え細胞は、トランスダクション、トランスフェクション、または、それ以外の遺伝子組み換えが行われている。カビ目ＣｏｔＨの組み換え分子を発現させるために使用できる典型的な宿主細胞は、哺乳類の一次細胞；ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、およびＰＣ１２細胞などの哺乳類の株化細胞；アフリカツメガエル胚および卵母細胞などの両生類細胞；および、他の脊椎動物細胞を含む。典型的な宿主細胞はまた、ショウジョウバエなどの昆虫細胞、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces pombe、またはPichia pastorisなどの酵母細胞、およびEscherichia coliなどの原核細胞を含む。
【０１２９】
一実施形態では、本発明は、免疫原生量のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド、その免疫原性断片、または当該ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの変異体を有するワクチン組成物を提供する。またワクチン組成物はアジュバントを含むことができる。本発明のワクチン組成物の製剤は、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドに対する特異的な液性（中和抗体）およびエフェクター細胞性免疫反応の両方を刺激して対象内に感染防御免疫を誘起するのに効果的である。本発明のワクチン組成物はまた、たとえばムコール菌症などの真菌感染症の治療または予防にも使用される。
【０１３０】
本発明のワクチンは、免疫防御量のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド抗原を含み、当該技術分野に周知の方法によって調整される。通常、ワクチンの調整は、たとえば、M. F. Powell and M. J. Newman, eds., "Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach),” Plenum Press (1995)；A. Robinson, M. Cranage, and M. Hudson, eds., “Vaccine Protocols (Methods in Molecular Medicine),” Humana Press (2003)；および、D. Ohagan, ed., “Vaccine Ajuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Methods in Molecular Medicine),” Humana Press (2000)に記載されている。
【０１３１】
ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド、および、そのペプチド断片または変異体は、たとえばGeysen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998 (1984)に記載される当該技術分野に公知の方法を用いて特定できる免疫原性エピトープを含む。簡潔には、重複している数百個の短ペプチド（たとえば、ヘキサペプチド）は、標的ポリペプチド（すなわち、ケカビ目ＣｏｔＨ）のアミノ酸配列全体をカバーして合成できる。一方でペプチドはペプチド合成に用いられる固相支持体に付着された状態のままであり、それから多様な抗血清を用いたＥＬＩＳＡ方法によって抗原性のために試験される。ケカビ目ＣｏｔＨタンパク質に対する抗血清は、公知の手法（Kohler and Milstein, Nature 256: 495-499 (1975）)によって取得できるとともに、抗原性を低減するようにヒト化されるか（たとえば、米国特許第５，６９３，７６２号参照）、または非再配列のヒト免疫グロブリン遺伝子を残して遺伝子導入マウス内で作製される（たとえば、米国特許第５，８７７，３９７号参照）ことができる。無傷タンパク質への抗体に対して反応性を示すヘキサペプチドを有するエピトープを一度特定すると、ペプチドに対して、各位のアミノ酸置換および／またはＣおよび／またはＮ末端伸長による特異性をさらに試験できる。このようなポリペプチドを有するエピトープは、一般的に少なくとも６個〜１４個のアミノ酸残基を含み、たとえば、当該技術分野に周知の方法を用いたポリペプチドの合成またはケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの断片化によって作製できる。本発明に従って免疫原として使用する分子に関しては、免疫原生ワクチンとしての特質を失うことなくケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドにトランケーションまたは断片化できることが当業者に理解されるであろう。たとえば、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドに対して、Ｎ末端断片を作製するように、分子の免疫原としての特質を保持しつつＣ末端側からトランケーションすることができる。同様に、分子の免疫原としての特質を保持しつつＮ末端側からトランケーションすることによって、Ｃ末端断片を作製できる。本願の教示およびガイダンスに応じて行われる他の修飾については、天然タンパク質に関して本願に記載の治療上有用な特性を実現するケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの他の機能性断片、免疫原生断片、その変異体、類似体、または誘導体を作製するように、本発明に準じて行える。
【０１３２】
本発明のワクチン組成物は従来の医薬担体をさらに含む。好適な担体は当業者に周知である。ワクチン組成物は、単位用量の液体の状態で調整されうる。他の任意の成分（たとえば、医薬品等級の安定剤、緩衝剤、防腐剤、および賦形剤など）は、当業者によって容易に選択できる。しかし、組成物を凍結乾燥させ、使用前に元に戻すこともできる。またはその代わりに、選択する投与様式（たとえば、鼻内への注入、経口投与など）に適当な任意の方法でワクチン組成物を調整することもできる。薬学上許容可能なワクチンの調整は、ｐＨ、等張性、および安定性などを考慮すれば当該技術分野の技術水準内にある。
【０１３３】
本発明のワクチン組成物がアジュバント物質をさらに含んでいる場合、その免疫原性をさらに向上させられる。ワクチンへのアジュバント効果を実現する多様な方法が公知となっている。一般的原理および方法の詳細は、"The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E.S. Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6および"Vaccines: New Generationn Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G et al. (eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9に記載されている。本明細書において両方の文献を参照することによって、その開示内容を本願に援用する。
【０１３４】
好ましいアジュバントは、樹枝状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるワクチン分子の摂取を促進させ、当該抗原提示細胞を活性化させる。アジュバントの例は、免疫標的アジュバント；毒素、サイトカイン、およびマイコバクテリア誘導体などの免疫修飾アジュバント；油製剤；重合体；ミセル形成アジュバント；サポニン；免疫賦活複合マトリクス（ＩＳＣＯＭ（登録商標）マトリクス）；粒子；ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシル臭化アンモニウム）；アルミニウムアジュバント；ＤＮＡアジュバント；および封入アジュバントからなる一群から選択されるが、これらに限定されない。リポソーム製剤もまたアジュバント効果を付与することが知られている。したがって、リポソームアジュバントは本発明に従い含まれる。
【０１３５】
ムコール菌症などの真菌感染症に罹患し易い対象に対するワクチン接種に加えて、本発明のワクチン組成物は、多様な真菌感染症に罹患している対象に対して免疫療法的治療を施すために使用できる。したがって、本願に開示のケカビ目ＣｏｔＨのポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または抗体の組成物の１つ以上をアジュバントと組み合わせて含み、予防または治療上の用途の目的で機能するワクチンもまた、本発明の範囲に含まれる。実施形態では、本発明のワクチンは、ケカビ目ＣｏｔＨの分子を捜し出して阻害するよう対象の体内の免疫系を誘発する。
【０１３６】
用語「ワクチン」は、本明細書に使用するように、個体を感染病から保護するために当該個体に投与できる組成物を指す。ワクチンは、感染病に対する動物の免疫反応を誘発または増大させることによって、疾病に対する保護を行う。本発明のワクチンを用いた治療が適している感染病の典型例はムコール菌症である。ワクチンによって介在される保護を、対象がたとえばケカビ目ＣｏｔＨまたはその免疫原性部分または断片に犯された場合に宿主内に誘発される液性および／または細胞性免疫とすることができる。
【０１３７】
用語「アジュバント」は、一般的には抗原の位置またはその近傍に当該抗原と共に供給されることによって当該抗原に対する免疫反応を向上させる能力を有する組成物を意味するように意図される。免疫反応を増大させる能力は、免疫介在の予防の増大によって示される。液性免疫の向上は、たとえば、抗原に対する抗体の抗体力価の増大によって決定できる。細胞性免疫の向上は、たとえば、陽性皮膚試験、細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ法、ＩＦＮ−ガンマまたはＩＬ−２に関するＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法によって測定できる。アジュバントは当該技術分野に周知である。アジュバントの典型例は、たとえば、Ｆｒｅｕｄ完全アジュバント、Ｆｒｅｕｄ不完全アジュバント、アルミニウムアジュバント、ＭＦ５９、およびＱＳ２１を含む。
【０１３８】
用語「治療する」または「治療」は、本明細書に使用するよう、真菌感染症状を示す臨床症状の改善を意味するように意図される。臨床症状の改善は、たとえば、治療を施した個体において少なくとも１つの真菌感染症状が、治療前のレベルまたは真菌感染症を呈する個体と比較して低下または減少することを含む。用語「治療する」はまた、真菌感染症状に関連する病状、慢性合併症、または日和見真 菌感染症の重症度の減少を含むように意図される。ムコール菌症を参照して、こうした病状、慢性合併症、または日和見感染症を以下に例示する。ムコール菌症、および、こうした他の病状、慢性合併症、および日和見感染症はまた、たとえば、Merck Manual, Sixteenth Edition, 1992およびSpellberg et al., Clin. Microbio. Rev. 18:556-69 (2005)に記載されている。
【０１３９】
用語「予防する」または「予防」は、本明細書において使用するように、真菌感染病状を呈する臨床症状を未然に防ぐことを意味するように意図されている。こうした臨床症状の未然の防止は、たとえば、１つ以上の真菌による感染リスクを有する個体が明らかな病状症状を持ち始めるか、またはそうした病状の診断を受ける前に、当該個体内の正常な生理指標を維持することを含む。したがって、用語「予防する」は、真菌感染病状の発生を防ぐような個体の予防的治療を含む。個体の真菌感染病状の予防はまた、真菌感染病状の進行の阻害または抑止を含むように意図されている。真菌感染病状の進行の阻害または抑止は、たとえば、異常な生理指標の発生、または上述の臨床症状および当該技術分野に周知の臨床症状などの臨床症状の発生を阻害または抑止することを含む。したがって、真菌感染病状の効果的な予防は、真菌感染病に罹患し易い個体の正常な体温、体重、心理状態の維持、ならびに病変または他の疾病徴候の欠如を含むことになる。真菌感染病に罹患し易い個体は免疫障害を持つ個体を含み、これには、たとえばＡＩＤＳ、高窒素血症、糖尿病、糖尿病性ケトアシドーシス、好中球減少症、気管支拡張症、肺気腫、ＴＢ、リンパ腫、白血病を発症している個体、火傷を負っている個体、化学療法、骨髄移植、幹細胞移植、および／または固形臓器移植を受けている個体、または、真菌感染病状に罹患し易い病歴を有する個体が含まれるが、これらに限定されるものではない。真菌感染病状の進行の阻害または抑止は、たとえば、１つ以上の病状の進行、慢性合併症、または真菌感染病状を伴う日和見感染症に対する高感受性の阻害または抑止をも含む。
【０１４０】
本明細書において「対象」、「個体」、または「患者」は互換可能に使用しており、脊椎動物を指し、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを指す。哺乳類は、マウス、ラット、ウサギ、サル、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、家畜、競技用動物、愛玩動物、ウマ、および霊長類（特にヒト）を含むが、これらに限定されない。
【０１４１】
用語「真菌症」は、本明細書において使用するように、表在性真菌症（すなわち、皮膚、毛髪、爪、および粘膜の真菌病；たとえば、白癬感染症またはイースト菌感染症）、皮下真菌症（すなわち、皮下組織、筋膜、および骨の真菌病；たとえば、足菌腫、黒色真菌感染症、またはスポロトリクム症）、および全身性真菌症（すなわち、病原菌が産生する浮遊胞子を吸入した結果発症する深在性の真菌感染症；たとえば、接合菌症、アスペルギルス症、クリプトコッカス症、カンジダ症、ヒストプラスマ症、コクシジオイデス症、パラコクシジオイデス症、フサリウム症（無色菌糸症）、ブラストミセス症、ペニシリウム症、またはスポロトリクム症）を含む真菌病、真菌感染症、または真菌コロニーの形成を指す。
【０１４２】
本明細書に使用するように、用語「接合菌症」は、ケカビ目およびハエカビ目から構成される接合菌綱の真菌によって発生する真菌症を意味するように意図されている。ハエカビ目は、発展途上国の免疫正常宿主の間で猛威を振るっているエントモフトラ症として知られる皮下感染および粘膜皮膚感染の原因となる。また接合菌症はムコール菌症とも称され、２つの用語を互換可能に用いて同類種の真菌感染症を指している。
【０１４３】
本明細書において使用するように、用語「ムコール菌症」は、ケカビ目の真菌によって引き起こされる真菌症を意味するように意図されている。ムコール菌症は、発展途上国または先進国の免疫不全宿主にほぼ一様に影響をおよぼすような生死に関わる真菌感染症である。ケカビ目に属する真菌は少なくとも６つの科に分布しており、これら全てが皮膚および皮下感染を引き起こせる。ケカビ科に属する種は、他の科と比較して、より頻繁にムコール菌症患者から単離される。ケカビ科のうち、Rhizopus oryzae（Rhizopus arrhizus）は最も一般的な感染原因である。同様の範囲の感染を引き起こすケカビ科の種の他の典型例は、たとえば、Rhizopus microspores var. rhizopodiformis、Absidia corymbifera、Apophysomyces elegans、Mucor species、Rhizomucor pusillus、およびCunninghamella spp（Cunninghamellaceae科）を含む。ムコール菌症は当該技術分野に周知であり、たとえば、鼻能ムコール菌症、肺ムコール菌症、消化管ムコール菌症、播種性ムコール菌症、骨ムコール菌症、隔膜ムコール菌症、気管ムコール菌症、腎臓ムコール菌症、腹膜ムコール菌症、上大静脈ムコール菌症、または外耳炎ムコール菌症を含む。
【０１４４】
ケカビ目に属する真菌は、現在、Choanephoraceae科、Cunninghamellaceae科、Mucoraceae科、Mycotyphaceae科、Phycomycetaceae科、Pilobolaceae科、Saksenaeaceae科、Syncephalastraceae科、およびUmbelopsidaceae科に分布している。真菌の各科は、１つ以上の属から構成されている。たとえば、ケカビ目Mucoraceae科に属する真菌は、ユミケカビ属（たとえば、A. corymbifera）、Actinomucor属（たとえば、A. elegans）、Amylomyces属（たとえば、A. rouxii）、Apophysomyces属、Backusella属（たとえば、B. circina）、Benjaminiella属（たとえば、B. multispora）、Chaetocladium属（たとえば、C. brefeldii）、Circinella属（たとえば、C. angarensis）、Cokeromyces属（たとえば、C. recurvatus）、Dicranophora属（たとえば、D. fulva）、Ellisomyces属（たとえば、E. anomalus）、Helicostylum属（たとえば、H. elegans）、Hyphomucor属（たとえば、H. assamensis）、Kirkomyces属（たとえば、K. cordensis）、ケカビ属（たとえば、M. amphibiorum）、Parasitella科（たとえば、P. parasitica）、Philophora属（たとえば、P. agaricina）、Pilaira属（たとえば、P. anomala）、Pirella属（たとえば、P. circinans）、Rhizomucor属（たとえば、R. endophyticus）、Rhizopodopsis属（たとえば、R. javensis）、クモノスケカビ属、Sporodiniella属（たとえば、S. umbellata）、Syzygites属（たとえば、S. megalocarpus）、Thamnidium属（たとえば、T. elegans）、Thermomucor属（たとえば、T. indicae-seudaticae）、およびZygorhynchus属（たとえば、Z. californiensis）にさらに分類される。たとえばクモノスケカビ属は、R. azygosporus種、R. caespitosus種、R. homothallicus種、R. oryzae種、R. microsporus種、R. microspores var. rhizopodiformis種、およびR. schipperae種から構成されている。
【０１４５】
用語「免疫原生量」は、本明細書において使用するように、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドを発現している感染体に対する宿主の免疫反応を誘起できる、本発明のポリペプチドまたはその断片または変異体の特定のエピトープの効果的な量を指す。免疫原生量は、通常、ワクチンの投与量当たり２０μｇ〜１０ｍｇの抗原の範囲内であり、治療を施す対象、抗体を合成する当該対象の免疫系の能力、および所望される防止の程度によって決まる。要求される免疫原生の正確な量は、たとえば抗体滴定法などの多様な方法によって測定できる。用語「効果的な量」は、所望の結果を得るのに十分な化合物または組成物の量を指す。したがって、ワクチンを説明するのに使用したように、効果的な量は、防御免疫反応を提供または引き出すのに十分な化合物または組成物（たとえば抗体）の量を指す。免疫学的組成物についての効果的な量は、免疫反応が防御的であるか否かに関わらず、免疫反応を引き出すのに十分な量である。
【０１４６】
「治療に効果的な量」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、抗体断片または組成物、疾病およびその重症度、および、治療対象の患者の年齢や体重などに応じて変化し、これら全ては主事臨床医学者の技術の範囲内である。本願に記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、抗体断片または組成物の１つ以上の治療上効果的な量は、治療が行われていない場合と比較して、患者の内皮細胞に対する菌類病原体の穿通侵入および損傷を改変させることが意図されている。したがって、真菌性の発病が減少する。治療上効果的な量は、生物学的効果を有する量（「生物学的に有効な量」）と区別できる。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、抗体断片、または組成物は、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの機能を低下させるなどの１つ以上の生物学的効果をｉｎ ｖｉｔｒｏで有するか、またはｉｎ ｖｉｖｏにおいてですら有していてもよい。しかし、生物学的効果は、主事臨床医学者の技術範囲の方法によって決定される本願に記載の臨床学的に測定可能な治療効果をもたらさないこともあり得る。
【０１４７】
一実施形態では、本発明のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドをコードする核酸は、当該技術分野に周知の好適なベクターを用いてｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで哺乳類細胞内に供給されうる。ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド、その免疫原性断片、またはその機能性断片を哺乳類細胞へ供給する好適なベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルスなどのウイルスベクター、ならびにプラスミドベクターなどの非ウイルスベクターを含む。このようなベクターは、治療量または免疫原生量のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドを提供するのに有用である（たとえば、米国特許第５，３９９，３４６号（発行日：１９９５年３月２１日）参照）。ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドまたは核酸の治療的な供給は、筋細胞、骨髄細胞、またはＢ細胞を標的に行われる場合に特に有用である。これにより、免疫反応の発展のためにコード化されたケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドを示している。このような提示は、ＤＮＡワクチン接種として当該技術分野において一般に知られている。
【０１４８】
ウイルス由来の系は、比較的高いレベルの異種核酸を多様な細胞内に導入できるという利点をもたらす。ケカビ目ＣｏｔＨタンパク質をコードする本発明の核酸を哺乳類細胞内に導入する好適なウイルスベクターは当該技術分野に周知である。ウイルスベクターは、たとえば、単純疱疹ウイルスベクター（Geller et al., Science, 241:1667-1669 (1988)）、ワクシニアウイルスベクター（Piccini et al., Meth. Enzymology, 153:545-563 (1987)）、サイトメガロウイルスベクター（Mocarski et al., in Viral Vectors, Y. Gluzman and S.H. Hughes, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988, pp. 78-84）、モロニーマウス白血病ウイルスベクター（Danos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:6460-6464 (1988);  Blaese et al., Science, 270:475-479 (1995); Onodera et al., J. Virol., 72:1769-1774 (1998)）、アデノウイルスベクター（Berkner, Biotechniques, 6:616-626 (1988); Cotten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6094-6098 (1992); Graham et al., Meth. Mol. Biol., 7:109-127 (1991); Li et al., Human Gene Therapy, 4:403-409 (1993); Zabner et al., Nature Genetics, 6:75-83 (1994)）、アデノ随伴ウイルスベクター（Goldman et al., Human Gene Therapy, 10:2261-2268 (1997); Greelish et al., Nature Med., 5:439-443 (1999); Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:3906-3910 (1999); Snyder et al., Nature Med., 5:64-70 (1999); Herzog et al., Nature Med., 5:56-63 (1999)）、レトロウイルスベクター（Donahue et al., Nature Med., 4:181-186 (1998); Shackleford et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:9655 9659 (1988);米国特許第４，４０５，７１２号、４，６５０，７６４号、および５，２５２，４７９号、および国際公開第ＷＯ９２／０７５７３号、ＷＯ９０／０６９９７号、ＷＯ８９／０５３４５号、ＷＯ９２／０５２６６号、およびＷＯ９２／１４８２９号）、およびレンチウイルスベクター（Kafri et al., Nature Genetics, 17:314-317 (1997)）を含む。
【０１４９】
核酸からなるケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドを治療目的のために投与するのに有用なベクターは、調節可能に連結された核酸の組織特異発現または組織誘導発現をもたらす調節因子を含むことができる。当業者は、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドまたは核酸が所望の組織または細胞内で発現することを可能にする適当な組織特異プロモーターまたはエンハンサーを容易に決定することができる。また多様な誘導プロモーターまたはエンハンサーのいずれも、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドまたは核酸の調節発現のためのベクター内に含まれうる。このような誘導系は、たとえば、テトラサイクリン誘導系（Gossen & Bizard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992); Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995); Clontech, Palo Alto, CA）、重金属によって誘導されるメタロチオネインプロモーター、エクジソンまたはなどの関連ステロイドに対して反応を示す昆虫ステロイドホルモン（No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996); Yao et al., Nature, 366:476-479 (1993) Invitrogen, Carlsbad, CA)）、グルココルチコイドおよびエストロゲンなどのステロイドに誘発されるマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）（Lee et al., Nature, 294:228-232 (1981)）、および温度変化によって誘導できる熱ショックプロモーターを含む。
【０１５０】
治療投与を行うのに特に有用な誘導系では、個体に投与される所定濃度の薬剤に反応してある濃度の治療薬を送達し、薬剤の不在下では治療薬が僅かに発現されるか、または全く発現されないよう調節できる誘導プロモーターを利用する。このような誘導系の１つでは、修飾アデノウイルスベクター内のミフェプリストンなどの抗黄体ホルモンによって誘導可能なＧａｌ４融合を利用する（Burien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:355-360 (1999)）。こうした融合系の他の誘導系では、アデノ随伴ウイルスベクター内のＦＫＢＰ１２およびＦＲＡＰのラパマイシン結合領域を含む転写活性化因子の再構成を誘発するために薬剤ラパマイシンを利用する（Ye et al., Science, 283:88-91 (1999)）。誘導系の任意の組み合わせは、本願に開示のベクターを含む任意の好適なベクター内で組み合わせ可能であることが理解される。治療薬の発現量は個体に投与される薬剤の量によって調整可能であるか、または、必要に応じて、治療薬の発現は薬剤の投与を停止することによって終了できるので、上述のような調整可能な誘導系は有利である。
【０１５１】
本発明はさらに、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド、その免疫原生断片、またはその機能性断片に対する特異反応性を有する抗ケカビ目ＣｏｔＨ単離抗体を提供する。たとえば、本発明の抗ケカビ目ＣｏｔＨ抗体は、アミノ酸配列ＧＡＧＫＫＨＮＮＡＫＱＳＷＮＷ（配列番号３９）またはＭＧＱＴＮＤＧＡＹＲＤＰＴＤＮＮＫ（配列番号４０）を有するポリペプチドに対する特異反応性を有できる。抗ケカビ目ＣｏｔＨ抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体にできる。本発明は、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド、その免疫原生断片、またはその機能性断片に対する特異反応性を有するモノクローナル抗体を産生する細胞株をさらに提供する。
【０１５２】
したがって本発明は、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドを特異的に結合する抗体を提供する。本明細書に使用するように、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびにこれら抗体の抗原結合断片を含むよう最も広い意味で使用される。本発明の抗ケカビ目ＣｏｔＨ抗体に関しては、用語「抗原」は、天然または合成のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドまたはその断片を意味する。抗ケカビ目ＣｏｔＨ抗またはこのような抗体の抗原結合断片は、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドまたはその少なくとも約１×１０５Ｍ１のペプチド部分に対する特異的な結合活性を有することによって特徴付けられる。したがって、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドに対する特異的な結合活性を保持する抗ケカビ目ＣｏｔＨ抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、およびＦｖ断片は、抗体の定義の内に含まれる。ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの特異的な結合活性は、たとえば、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドに対する抗ケカビ目ＣｏｔＨ抗体の結合活性をケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド以外のコントロールペプチドと比較することによって、当業者が容易に決定できる。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を調製する方法は当業者に周知である（たとえば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)参照）。
【０１５３】
さらに、本発明の抗体は、たとえば一本鎖抗体、キメラ抗体、二官能性抗体、ヒト化抗体、およびこれらの抗原結合断片を含む天然および非天然の抗体にできる。このような非天然の抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築可能であるか、組み換え作製可能であるか、または、たとえば、Huse et al. (Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989))に記載の多様な重鎖および軽鎖からなる組み合わせライブラリをスクリーニングすることによって取得可能である。たとえばキメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体、一本鎖抗体、および二官能性抗体を作製するこれら方法および他の方法は当業者に周知である（Winter and Harris, Immunol. Today 14:243-246 (1993); Ward et al., Nature 341:544-546 (1989) ；前掲したHarlow and Lane, 1988); Hilyard et al., Protein Engineering:  A practical approach (IRL Press 1992); Borrabeck, Antibody Engineering, 2d ed. (Oxford University Press 1995)）。
【０１５４】
抗ケカビ目ＣｏｔＨ抗体は、配列番号１、３、５、１１、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２に示すアミノ酸配列を有するケカビ目ＣｏｔＨ単離ポリペプチド、天然原料から調製可能であるか、または組み換え作製可能である当該ケカビ目ＣｏｔＨ単離ポリペプチドの免疫原生断片、または当該ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドのペプチド部分などのケカビ目ＣｏｔＨ免疫原を用いて上昇させることが可能である。このようなケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドのペプチド部分は、抗原ペプチドを用いてケカビ目ＣｏｔＨ特異抗体を作製できる場合、機能性抗原断片である。非免疫原性または弱免疫原生のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドまたはその一部分は、ハプテンをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの担体分子と連結させることによって、免疫原生のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチとすることができる。したがって、本発明の一部態様では、本願に開示のＣｏｔＨポリペプチドの免疫原生断片は、担体分子（ＫＬＨまたはＢＳＡなどが挙げられるが、これらに限定されない）と接合できる。ハプテンを担体分子と連結させるための他の多様な担体分子および方法は当該技術分野に周知である（たとえば前掲したHarlow and Lane, 1988参照）。ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの免疫原生断片はまた、ペプチド部分をたとえばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはポリＨｉｓなどとの融合タンパク質として発現することによって作製できる。ペプチド融合を発現する方法は当業者に周知である（前掲したAusubel et al.）。
【０１５５】
本発明は、サンプルをケカビ目ＣｏｔＨ特異抗体と接触させ、当該サンプルに対する抗体の特異的結合の存在を検出し、これにより当該サンプル内のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの存在を検出することによって、当該サンプル内のケカビ目有機体の存在を検出する方法をさらに提供する。ケカビ目ＣｏｔＨ特異抗体は、サンプル内に存在するケカビ目ＣｏｔＨの濃度を検出する診断方法および診断系に使用することができる。本明細書に使用するように、用語「サンプル」は、ケカビ目ＣｏｔＨ核酸またはポリペプチドを含んでいるか、または潜在的に含んでいる任意の生体液、生体細胞、生体組織、または生体器官、またはこれらの部分を意味するように意図される。上記用語は、個体内のサンプル、ならびに個体から取得または導出されるサンプルを含む。たとえば、サンプルは、生体組織検査法によって試料から取得される組織切片、または組織培養に留置または適合される細胞とすることができる。サンプルは、さらに細胞亜分画または抽出物、または未処理または実質的に純粋な核酸またはタンパク質の調合液とすることができる。
【０１５６】
ケカビ目ＣｏｔＨ特異抗体はまた、本発明のケカビ目ＣｏｔＨの免疫親和性または親和性クロマトグラフィー精製を行うために使用することができる。さらに、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドに対して特異的に結合する抗体がケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドと結合することを可能にする条件下で、当該抗体に細胞を接触させる工程と、当該ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドに結合されている当該抗体の存在を検出する工程と、細胞内にある本発明のポリペプチドの存在これによりを検出する工程とを含む、細胞内にある本発明のケカビ目ＣｏｔＨタンパク質の存在を検出する方法も本願において意図されるものである。このようなポリペプチドの検出に関して、抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法またはｉｎ ｖｉｖｏ撮像方法に使用することができる。
【０１５７】
サンプル内の標的ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏ検出するのに有用な免疫学的方法は、抗体を利用する免疫学的検定法を含む。このような免疫学的アッセイ法は、たとえば、当該技術分野の周知の免疫組織化学法、免疫蛍光測定法、ＥＬＩＳＡアッセイ法、放射免疫アッセイ法、ＦＡＣＳ分析法、免疫沈降法、イムノブロット解析法、Ｐａｎｄｅｘ顕微蛍光測定アッセイ法、凝集アッセイ法、フローサイトメトリー法、および血清診断アッセイ法を含む（前掲したHarlow and Lane, 1988；Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1999)）。
【０１５８】
抗体は、当該技術分野に周知の多様な手段によって検出可能に作製することができる。たとえば、検出可能なマーカーは、抗体に直接付着させるか、またはたとえばケカビ目ＣｏｔＨ特異抗体を認識する二次標識を用いて間接的に付着させることができる。有用なマーカーは、たとえば、放射性ヌクレオチド、酵素、ビオチンなどの結合タンパク質、発蛍光団、色原体、および化学発光標識を含む。
【０１５９】
本願に使用するように、用語「標識」およびその文法上の多様な形態が示す意味は、検出可能信号の形成に直接的または間接的に関与する単一原子および単一分子を指す。標識または示される意味のいずれもが、本発明の核酸プローブ、発現タンパク質、ポリペプチド断片、または抗体分子と連結できる。上記の単一原子または単一分子は、単独またはさらなる試薬と併せて使用されることができる。このような標識は、それ自体が、臨床診断化学において周知である。
【０１６０】
標識手段としては、有用な免疫蛍光トレーサ（tracer）となる蛍光色素（色素）を形成するように、変性を伴うことなく抗体または抗原と化学的に結合する蛍光標識剤を使用することができる。免疫蛍光分析技術については、DeLuca, "Immunofluorescence Analysis", in Antibody As a Tool, Marchalonis et al., eds., John Wiley & Sons, Ltd., pp. 189 231 (1982)に説明が記載されている。なお、上記文献を参照することによって、その開示内容を本願に援用する。
【０１６１】
一実施形態では、指示基は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびブドウ糖酸化酵素などの酵素である。他の実施形態では、標識剤として放射性元素が用いられている。基質に対する標識の結合（すなわち、核酸プローブ、抗体、ポリペプチド、およびタンパク質の標識化）は当該技術分野に周知である。たとえば、本発明の抗体は、培地に供給される放射性標識抗体を代謝によって取り込むことによって標識化されることができる。たとえば、Galfre et al., Meth. Enzymol., 73:3 46 (1981)を参照。活性化した官能基によるタンパク質接合またはンパク質連結を行う従来の手段は、特に適用できる。たとえば、Aurameas et al., Scand. J. Immunol., Vol. 8, Suppl. 7:7 23 (1978), Rodwell et al., Biotech., 3:889 894 (1984)および米国特許第４，４９３，７９５号を参照。
【０１６２】
本発明の核酸、アンチセンスを含むオリゴヌクレオチド、本発明の核酸を含むベクター、形質転換宿主細胞、ポリペプチド、およびこれらの組み合わせ、ならびに本発明の抗体は、複数の化合物をスクリーニングしていずれかの化合物が本発明のポリペプチドの潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストとして機能するか否かを決定するよう使用できる。これらスクリーニングのアッセイ法は、本発明のポリペプチドの機能および活性に関する情報を提供する。こうして提供される情報によって、１種類以上のポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質と特異的に相互作用可能な化合物を特定または設計できる。
【０１６３】
したがって、本発明は、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドと結合する化合物を特定する方法を提供する。本発明のタンパク質は、結合タンパク競合測定法に使用することができる。このようなアッセイ法は、仮に存在するとすればいずれの化合物がケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドと結合できるかを決定できるように、多数の化合物の高速スクリーニングを適応させることができる。その後、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドと結合することが判明した化合物が本発明のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの調節因子、アゴニスト、またはアンタゴニストとして機能するか否かをさらに決定するためによって詳細なアッセイ法を当該化合物について行うことができる。本発明のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドと結合するおよび／または本発明のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドを調節する化合物は、本発明のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドに媒介される多様な病変を治療するために使用できる。
【０１６４】
タンパク質結合領域と相互作用する細胞タンパク質を特定する多様な結合アッセイ法は当該技術分野に周知である。こうした結合アッセイ法としては、たとえば、酵母２−ハイブリッドスクリーニングアッセイ法（たとえば、米国特許第５，２８３，１７３号、５，４６８，６１４号、および５，６６７，９７３号；前掲したAusubel et al., 1999；Luban et al., Curr. Opin. Biotechnol. 6:59-64 (1995)を参照）、および細胞抽出物を用いた親和性カラムクロマトグラフィー法が含まれる。多様なケカビ目ＣｏｔＨポリペプチド配列または欠失を含むポリペプチド断片の合成または発現によって、ケカビ目ＣｏｔＨの結合界面を容易に特定することができる。
【０１６５】
本発明の他の実施形態では、本発明のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの活性を調節する化合物を特定するバイオアッセイ法を提供する。このバイオアッセイ法では、たとえばケカビ目ＣｏｔＨのシグナル経路に対応するレポーター遺伝子コンストラクトの存在下で本発明のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドを「未知」または試験用の基質と接触させ、この接触後に本発明のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの活性をモニタリングし、当該レポーター遺伝子コンストラクトを発現させる物質を本発明のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドに対する機能的リガンドとして特定する。このようなレポーター遺伝子のアッセイ法およびアッセイ系は当業者に周知である（前掲したAusubel et al., 1999）。さらに、レポーター遺伝子コンストラクトは、ケカビ目ＣｏｔＨのプロモーター領域を用いて作製でき、かつケカビ目ＣｏｔＨ遺伝子のプロモーター活性を増大または低減させる化合物についてスクリーニングできる。このような化合物は、ケカビ目ＣｏｔＨの発現を改変させるために使用することもできる。
【０１６６】
本発明の他の実施形態によれば、本発明のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドを組み換え発現する形質転換宿主細胞を被検基質と接触させることができ、その後、ケカビ目ＣｏｔＨ媒介反応（たとえば、試験用の化合物の存在下または不在下におけるレポーター遺伝子の発現を介した反応）を化合物の存在と比較するか、または被検細胞またはコントロール細胞の反応を化合物の存在と比較することによって、当該接触による調節効果を評価することができる。
【０１６７】
本明細書に使用するように、本発明のポリペプチドの活性を調節する化合物または信号は、こうした化合物または信号の存在下における本発明のポリペプチドの活性がこれら化合物または信号の不在下における活性と異なるようケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの活性を改変させる化合物または信号を指す。特に、このような化合物または信号としては、アゴニストおよびアンタゴニストが含まれる。アゴニストとしては、ケカビ目ＣｏｔＨタンパク質の発現または生物活性を活性化させる化合物または信号が含まれる。またはこれに代わり、アンタゴニストとしては、ケカビ目ＣｏｔＨの発現または生物活性と相互作用する化合物または信号が含まれる。典型的には、アンタゴニストの効果は、アゴニスト誘導性のタンパク質活性化の遮断として観察される。アンタゴニストとしては、競合的アンタゴニストおよび非競合的アンタゴニストが含まれる。
【０１６８】
ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの発現を調節する化合物を特定するアッセイ法は、ケカビ目ＣｏｔＨの活性を調節する化合物に細胞を接触させた結果として生じたケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの存在量の変化を検出する工程を備える。ポリペプチドの発現の変化を検出するアッセイ法は、上述のように、たとえば、ケカビ目ＣｏｔＨ特異ケカビ目ＣｏｔＨ抗体を用いた免疫学的アッセイ法（免疫ブロット法、免疫蛍光法、免疫組織化学法、免疫沈降法など）を含む。
【０１６９】
当業者に理解されるように、ケカビ目ＣｏｔＨの活性を調節する化合物を特定するアッセイ方法では、一般的に、コントロールとの比較が必要になる。「コントロール」の１つの種類は、化合物に暴露された被検細胞または被検培養物と実質的に同一の処理を施した、「コントロール」細胞または培養物は化合物に暴露されていない点が相違している細胞または培養物である。「コントロール」細胞または培養物の他の種類は、「コントロール」細胞または培養物がケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドを発現しない点を除いて被検細胞と同一の細胞または培養物とすることができる。したがって、化合物に対するトランスフェクト細胞の反応を、同一の反応条件下における同一の化合物に対する「コントロール」細胞または培養物の反応またはその欠如と比較する。
【０１７０】
本発明は、ケカビ目ＣｏｔＨ活性を調節する有効な調節量の薬剤にケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドを接触させることによって、ケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドに媒介される活性を調節する方法をさらに提供する。ケカビ目ＣｏｔＨ活性は、たとえば、ＧＲＰ７８と結合することができる。本発明は、細胞に対する付着のレベルを調節する方法をさらに提供する。
【０１７１】
一部の実施形態では、本発明は、サンプル内のケカビ目ＣｏｔＨ核酸分子を検出する方法を提供する。本発明のこのような方法は、サンプルを本願開示の２つ以上のオリゴヌクレオチドと接触させる工程、核酸分子を増幅させる工程、および当該増幅を検出する工程を含むことができる。核酸を増幅する方法は当業者に周知であり、容易に選択されて本発明の方法に対して適用できることが理解される。たとえば、一部の態様では、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行われる。本発明の一部の態様では、本発明の方法に用いられる２つ以上のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、核酸配列ＡＴＧＡＡＡＴＴＡＴＣＴＡＴＴＡＴＡＴＣＣＧＣＴＧＣＣ（配列番号３３）、ＧＣＴＧＧＧＡＡＴＡＴＡＡＴＴＧＴＣＡＴＣＧＡ（配列番号３４）、ＧＡＴＧＡＣＡＡＴＴＡＴＡＴＴＣＣＣＡＧＣ（配列番号３５）、ＧＡＧＴＡＧＡＣＧＴＡＡＴＴＡＧＡＴＣＣＡＡ（配列番号３６）、またはＡＡＡＣＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＡＴＣ（配列番号３７）を有するオリゴヌクレオチド、または本願開示のいずれかのオリゴヌクレオチドを含む。
【０１７２】
本発明は、患者由来のサンプル内のケカビ目有機体の存在を検出することによって対象のムコール菌症感染を診断する方法をさらに提供する。この方法は、（ａ）対象由来の被検サンプルを提供する工程、（ｂ）本発明の核酸またはポリペプチドと結合できる薬剤がこれら核酸またはポリペプチドと結合することを可能にする好適な条件下において、被検サンプルを当該薬剤と接触させる工程、および（ｃ）被検サンプル内の特異的結合量をコントロールサンプル内の特異的結合量と比較する工程を含むことができ、被検サンプル内の特異的結合量がコントロールサンプル内の特異的結合量と比較して増大または減少することがムコール菌症感染の診断であることを特徴とする。本発明の一部の態様では、薬剤は、本願記載の抗ケカビ目ＣｏｔＨ抗体またはＣｏｔＨオリゴヌクレオチドからなる一群から選択される。
【０１７３】
本発明の他の実施形態によれば、少なくとも１つの本発明の核酸または抗体を好適な包装材内に含む診断系（好ましくは診断キットの形態）を提供する。核酸を備える診断キットは、本願に記載のケカビ目ＣｏｔＨコード核酸由来の診断キットである。一実施形態では、たとえば、診断用の核酸は、配列番号２、４、６、９、１０、１２〜１４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１のいずれかに由来し、かつ本発明のオリゴヌクレオチドとすることができる。本発明の一部の実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、ＡＴＧＡＡＡＴＴＡＴＣＴＡＴＴＡＴＡＴＣＣＧＣＴＧＣＣ（配列番号３３）、ＧＣＴＧＧＧＡＡＴＡＴＡＡＴＴＧＴＣＡＴＣＧＡ（配列番号３４）、ＧＡＴＧＡＣＡＡＴＴＡＴＡＴＴＣＣＣＡＧＣ（配列番号３５）、ＧＡＧＴＡＧＡＣＧＴＡＡＴＴＡＧＡＴＣＣＡＡ（配列番号３６）、ＡＡＡＣＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＡＴＣ（配列番号３７）、または本願に開示の任意のオリゴヌクレオチドからから選択される核酸配列を含む。本発明の診断系は、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ内のケカビ目ＣｏｔＨをコードする核酸の存在または不在のアッセイを行うのに有用である。
【０１７４】
好適な診断系は、少なくとも１つのアッセイを行うのに十分な量で分離して包装された化学試薬として、少なくとも１つの核酸または抗体を含む。本発明の核酸を含む診断キットに関しては、当該診断キットは通常、２つ以上の核酸を含む。診断キットをＰＣＲに使用する場合、診断キットは、ＰＣＲのプライマーとしての役割を果たす少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを備える。当業者であれば、本発明の核酸プローブおよび／またはプライマーまたは本発明の抗体を本願に開示の発明方法を実施するのに適当な緩衝剤および溶液と組み併せてキット形態内に容易に組み込むことができる。ケカビ目ＣｏｔＨ抗体を備えるキットは、サンプル内のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの発現量を決定するためのアッセイ（たとえば、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫学的アッセイ）を行うのを可能にする適当な条件を提供する反応カクテルを備えることができる。また、公知量のケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドと、必要に応じて、ケカビ目ＣｏｔＨ抗体に特異的な第２の抗体とを含むコントロールサンプルを備えることができる。
【０１７５】
本発明の診断キットの内容物（たとえば、ケカビ目ＣｏｔＨ核酸または抗体）は包装材内に含まれており、これにより不純物のない無菌環境を提供することが好ましい。さらに、包装材は、特定のケカビ目ＣｏｔＨ配列またはケカビ目ＣｏｔＨポリペプチドの存在または不在を検出するか、またはムコール菌症関連の病状の存在または疾病素因を診断するために診断キットの両材料を使用する方法を示す説明を備える。使用用の説明は、典型的には、試薬濃度または少なくとも１つのアッセイ方法パラメータ（混合対象の試薬およびサンプルの相対量など）を記載する有形発現、試薬／サンプルの混合の保守期間、温度、および緩衝条件などを含む。
【０１７６】
本発明の多様な実施形態の活性に対して実質的に影響をおよぼさない改変もまた、本願に提供する発明の定義内に提供されることが理解される。したがって、以下の実施例は、本発明を説明するように意図されるものであり、本発明を限定するものではない。
【０１７７】
〔実施例Ｉ〕
内皮細胞内への菌侵入時に宿主ＧＲＰ７８に対する結合を促進する細胞表面ＣｏｔＨ３タンパク質
R. oryzaeの胞子発芽体の原形質体の培養上清から細胞壁物質を回収した。抗Ｇｒｐ７８  Ａｂを用いたＦＡＲウエスタンブロットアッセイ法によって、ｒＧｒｐ７８と結合しているR. oryzaeのリガンドを単離し、これをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳ分析法によって特定した（図１）。簡潔には、Eksigent（Dublin, CA）NanoLiquid chromatography-1D plus系およびEksigent自動サンプル採集器を設けたThermo LTQ-Orbitrap XL質量分析計（San Jose, CA）上で特定するために、対象のタンパク質スポットを切除し、これをUCLA W. M. Keck Proteomic Centerへと送った。スポット内のタンパク質は、Shevchenko et al.（Shevchenko et al.(1996). Proc Natl Acad Sci U S A 93: 14440-14445.; Shevchenko et al., Anal. Chem., 68(5):850-8 (1996)）に記載のように、ゲル内トリプシン消化された。溶出ペプチドをCVC Microtech（Fontana, CA）の３５ｍｍ長の１００ μＭ ＩＤ Ｃ１８ ｐｒｅ−Ｔｒａｐカラム上に充填し、流速５μｌ／ｍｉｎの１００％バッファＡ（０．１％ギ酸を含む２％アセトニトリル）を用いて１０分間洗浄した。３００ｎｌ／ｍｉｎの流速を利用して、１５ｃｍのNew Objective ProteoPep IntegraFritカラム（Woburn, MA）上にペプチドを分離した。次の溶離勾配を用いた：０〜３０％バッファＢ（０．１％ギ酸を含む９８％アセトニトリル）を０〜１５分、３０〜８０％バッファＢを１５〜２０分、および８０％バッファＢを２０〜２２分。その後、カラムに対してバッファＡを用いた再平衡化を１３分間行った。２００Ｖのエレクトロスプレーイオン化電圧、４５Ｖのキャピラリー電圧、１３０Ｖのチューブレンズ、および２００℃のキャピラリー温度を用いて、溶離検体を正極モードでLTQ-Orbitrap MS内に溶射した。情報依存取得を行った。情報依存取得では、６０Ｋ解像ＦＴＭＳスキャンを用いて６つの最も強力なイオンを３００〜１６００ｍ／ｚの範囲で選択し、これらに対して３５の正規化衝突エネルギーの広帯域衝突誘起分離およびＬＴＱ検出を用いたＭＳ−ＭＳを行った。ピークは、６０秒間のさらなるＭＳ−ＭＳから除外した。
【０１７８】
その結果得られたＭＳ／ＭＳスペクトルは、Matrix Science MASCOT Daemon検索エンジン（Boston, MA）を用いて、Rhizopus oryzae ９９〜８８０のデータベース（http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/rhizopus_oryzae/MultiHome.html）に対して検索を行った。次の検索パラメータを使用した：ペプチド耐性：±１０ｐｐｍ、ＭＳ／ＭＳ耐性±０．３ＤＡ、最大ミス劈開：２、固定修飾：カルボキシメチル（Ｃ）および可変修飾：脱アミド化（ＮＤ）および酸化（Ｍ）。特に特定されるタンパク質としては、１番にランク付けされる特異的ペプチドを最小で２つ有し、イオンのスコアがｐ＜０．０５であるタンパク質が含まれた。
【０１７９】
内皮細胞と一緒に培養させたR. oryzae内の推定リガンドの発現をＲＴ−ＰＣＲ法によって検出した（図４）。リガンドとＧＲＰ７８との相互作用は、リガンドをSaccharomyces cerevisiae（図６）内で異種発現させ、ＧＲＰ７８を過剰発現している内皮細胞およびＣＨＯ細胞内への侵入への付着を空のプラスミド（コントロール）（図８）を用いて形質転換させたS. cerevisiaeと比較することによって確認した。
【０１８０】
ＯＲＦのうち３つは、幾つかの細菌由来の胞子殻形成に関与しているＣｏｔＨ族のタンパク質に対する相同性を有していた：
・RO3G_05018、ＣｏｔＨ１
・RO3G_08029、ＣｏｔＨ２
・RO3G_11882、ＣｏｔＨ３
４番目のＯＲＦ（RO3G_16295）は、他の病原性真菌に広く存在していたが、ＯＲＦのいずれもが、識別した機能を有するタンパク質をコードしていないように思われた。特定したＣｏｔＨポリペプチドと他の細菌性ＣｏｔＨタンパク質との配列間の比較は、極めて僅かな配列同一性を示した（図１７および表１）。
【０１８１】
表１：クモノスケカビ属ＣｏｔＨと細菌性ＣｏｔＨとの間の配列相同性（異なるサイズ）
【０１８２】
【表１】
2014528715.tif 000002
【０１８３】
ＲＯ３Ｇ＿１６２９５は共通のタンパク質のように思われ、そのホモログ（通常、アミノ酸において〜２５％の同一性）は、多くの異なる細菌ならびに少数の細菌に見られた（図１８〜２６）。これら全てのタンパク質は特性決定を行わなかった。幾つかを挙げると：
- Talaromyces stipitatus ATCC 10500 (EED23986)；
- Penicillium marneffei ATCC 18224 (XP_002144175)；
- Aspergillus niger (XP_001392236)；
- Aspergillus nidulans (XP_658934)；
- Ustilago maydis (ＸＰ＿７６００２７)；
- Coccidioides immitis (XP_001243211)；
- Neurospora crassa (XP_956792)；
- Cryptococcus neoformans (XP_775558)；および
- Streptomyces lividans (EFD65170)。
【０１８４】
ＣｏｔＨ３およびより低度のＣｏｔＨ２をヒト臍静脈内皮細胞と相互作用しているR. oryzaeの胞子発芽体内に発現させた（図４）。内皮細胞と相互作用している胞子発芽体内に代えてR. oryzaeの胞子によって、ＣｏｔＨ１を発現させた（図３）。ＦＡＲウエスタンブロット分析法によって４番目のＯＲＦ（ＲＯ３Ｇ＿１６２９５）を特定したが、この遺伝子は、内皮細胞と相互作用しているR. oryzaeの胞子発芽体に発現されていなかった。ＣｏｔＨ３およびより低度にはＣｏｔＨ２を発現しているS. cerevisiaeは、内皮細胞ＧＲＰ７８と特定的に結合した（図６）。非接着性S. cerevisiae内でＣｏｔＨ３を異種発現させることによって、ＧＲＰ７８発現内皮細胞およびＣＨＯ細胞への付着およびその後行われる細胞内侵入が促進した（図５８）。多様なケカビ目種由来のＣｏｔＨ３ポリペプチド間の配列アラインメントによって、多様なケカビ目種間において９０％を超える配列同一性が示された（図７および表２）。
【０１８５】
これらの結果によって、R. oryzaeによる内皮細胞内への侵入はＣｏｔＨ３またはＧＲＰ７８と結合しているＣｏｔＨ２によって促進されることが示された。
【０１８６】
表２：ヌクレオチド（ＣｏｔＨ３および他の属のエクソンのみ）のアラインメント
【０１８７】
【表２】
2014528715.tif 000003
【０１８８】
〔実施例ＩＩ〕
ＣｏｔＨ３およびＣｏｔＨ２は、内皮細胞ＧＲＰ７８と結合する特異なケカビ目インバシンである
R. oryzaeおよび培養条件   
本願に開示の実験では、幾つかのケカビ目の臨床単離株を用いた。たとえば、R. oryzae ９９〜８８０およびMucor sp.９９〜９３２を脳サンプルから単離し、R. oryzae ９９〜８９２およびRhizopus sp９９〜１１５０を感染患者の肺サンプルから単離した（サンプルはthe Fungus Testing Laboratory, University of Texas Health Science Center at San Antonioから取得した）。Cunninghamella bertholletiae 182もまた臨床単離株であり、Dr. Tomas Walsh (NIH)からの贈り物である。また、Lichtheimia corymbiferaも、ケカビのＤＥＦＥＡＴ臨床研究から取得された臨床単離株である（Spellberg et al. (2102), J Antimicorbiol Chemother 67(3):715-22）。
【０１８９】
ケカビ目をポテトデキストロース寒天培地（PDA、BD Diagnostic）プレート上で３７℃で３〜５日間培養させる一方、A. fumigatusおよびC. albicansをサブローデキストロース寒天培地（ＳＤＡ）プレート上で３７℃でそれぞれ２週間および４８時間培養させた。０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ８０を含む、エンドトキシン非含有のＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）内に胞子嚢胞子を回収し、これをＰＢＳで洗浄し、血球計算板を用いてカウントして、最終接種材料の調製を行った。C. albicansに関しては、有機体を３０℃で一晩の間ＹＰＤ培地［１％酵母エキス（Difco Laboratories）、２％バクトペプトン（Difco）、および２％グルコース（Sigma）］内で培養させた後、出芽胞子をＰＢＳ中に回収した。研究中、胞子発芽体を形成するために、アッセイに基づいて、振動させながら胞子を液状ＹＰＤ培地内で３７℃で１〜３時間培養させた。胞子発芽体の洗浄をＰＢＳ（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋添加）を用いて２回行った内皮細胞レセプターの単離実験を除く全てのアッセイに関しては、グルタミン無添加のＲＰＭＩ １６４０（Irvine Scientific）を用いて胞子発芽体を２回洗浄した。
【０１９０】
S. cerevisiae内でのＣｏｔＨ遺伝子の異種発現
Phusion高性能ＰＣＲキット（New England Biolabs）および表３に記載のプライマーを使用してＰＤＡプレート上で培養させたR. oryzae胞子から抽出したｃＤＮＡから、ＣｏｔＨ1、ＣｏｔＨ2、およびＣｏｔＨ3の全ＯＲＦをＰＣＲ増幅させた。Ｇａｌ1プロモーターの下でこれら遺伝子のクローン化および発現するために、ｐＥＳＣ−ＬＥＵ酵母二重発現ベクター（Stratagene）を使用した。ベクターをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩによって消化させた。In-Fusion 2.0 Dry-DownＰＣＲクローニングキット（Clontech Laboratories）を製造者の指示に従って使用することによって、ＰＣＲ増幅後の各ＣｏｔＨ遺伝子の挿入物をクローン化させてｐＥＳＣ−ＬＥＵとした。ポリエチレングリコールＬｉＯＡｃ方法によって、作製後の酵母発現ベクターを独立して形質転換させて酵母株ＬＬ−２０とし、ロイシン無添加の固相合成デキストロース最少培地上でこれら形質転換体のスクリーニングを行った。空のプラスミドを用いて形質転換を行ったS. cerevisiaeがコントロールとなる。
【０１９１】
表３：本研究に使用されるプライマー
【０１９２】
【表３】
2014528715.tif 000004
【０１９３】
抗ＣｏｔＨ抗体産生および細胞表面局在化
抗原性であることが予測される２つのペプチドに対して、ウサギポリクローナル抗体を発生させた。ペプチドＧＡＧＫＫＨＮＮＡＫＱＳＷＮＷ（配列番号３９）およびペプチドＭＧＱＴＮＤＧＡＹＲＤＰＴＤＮＮＫ（配列番号４０）をＫＬＨと連結し、商業的にウサギにワクチン接種するために使用した（ProMab Biotechnologies Inc., Richmond, CA）。ワクチン接種したウサギから得られる精製ＩｇＧを用いて、内皮細胞と相互作用しているS. cerevisiaeおよびR. oryzae上のＣｏｔＨタンパク質の細胞表面局在を検出した（Liu et al., J. Clin. Invest., 120:1914-1924 (2010)）。
【０１９４】
S. cerevisiaeの細胞表面に対してＣｏｔＨタンパク質を局在化するために、個々のＣｏｔＨ遺伝子を発現している出芽胞子をまず抗ＣｏｔＨ ＩｇＧと１：５０の比で一緒に培養し、その後にフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ヤギ抗ウサギＩｇＧと１：１００の比で一緒に培養した。染色した細胞をＬｅｉｃａ共焦点顕微鏡を用いて撮像し、全酵母細胞を微分干渉コントラスト法（ＤＩＣ）によって可視化した。
【０１９５】
R. oryzae上のＣｏｔＨタンパク質の発現を検出するために、胞子をＹＰＤ内にて３７℃で３時間発芽させた。胞子発芽体を抗ＣｏｔＨ ＩｇＧ（比率、１：５０）で染色し、その後にＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（比率、１：１００）で染色した。４８８ｎｍで発光するアルゴンレーザーを設けたFACSCaliber（Becton Dickinson）器具をフローサイトメトリー分析に使用した。蛍光発光を５１５／４０帯域通過フィルターで読み取った。蛍光データを対数増幅器によって回収した。１０４個のイベントの蛍光強度の平均値をCELLQUESTソフトウェアを用いて計算した。
【０１９６】
内皮細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞
Jaffe et al.の方法（Jaffe et al., J. Clin. Invest. 52:2745-2756 (1973)）によって、臍静脈の内皮細胞から内皮細胞を回収した。コラゲナーゼを用いることによって内皮細胞を回収し、１０％ウシ胎仔血清、１０％規定ウシ胎仔血清、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシン（全てGemini Bio-Products, CA）で増強したＭ−１９９（Gibco BRL）内で回収後の細胞を増殖させた。第２の通過細胞を９６ウェル組織培養プレート（Costar, Van Nuys, CA）内においてフィブロネクチン（BD Biosciences）上でコンフルエント状態になるまで増殖させた。全培養を５％ＣＯ２および３７℃の環境で行った。カブトガニ血球抽出物の発色分析法（BioWhittaker, Inc., Walkersville, MD）を用いて試薬のエンドトキシンについて試験を行った。エンドトキシンの濃度は０．０１ＩＵ／ｍｌ未満であった。内皮細胞の回収については、Institutional Review Board at Los Angeles Biomedical Research Institute at Harbor-UCLA Medical Centerによる承認を受けた。また、Dr. Randall Kaufmanから、ＧＲＰ７８を過剰発現するよう遺伝子組み換えを行ったＤＨＦＲ欠乏親ＣＨＯ細胞由来のＣＨＯ細胞株Ｃ．１（Morris et al., J. Biol. Chem., 272:4327-4334 (1997); Reddy et al., J. Biol. Chem., 278:20915-20924 (2003)）を譲り受けた。
【０１９７】
内皮細胞膜タンパク質の抽出
Isberg and Leongの方法（Isberg and Leong, Cell 60:861-871 (1990)）に従って内皮細胞膜タンパク質を抽出した。簡潔に説明すれば、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含む温ＤＰＢＳ（ＰＢＳ−ＣＭ）を用いて直径１００ｍｍの組織培養皿内の融合性内皮細胞を２回洗浄し、その後、ＰＢＳ−ＣＭ中のＥｚ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＳ Ｂｉｏｔｉｎ）（０．５ｍｇ／ｍｌ、Ｐｉｅｒｃｅ）と一緒に５％ＣＯ２の条件の下３７℃で１２分間培養した。その後、冷ＰＢＳ−ＣＭを用いて融合性内皮細胞を大規模に洗浄し、これを組織培養皿からこすり取った。内皮細胞を５００×ｇの遠心分離に４℃で５分間掛けて回収し、その後、冷蔵庫に入れて５．８％ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｗ／ｖ）およびプロテアーゼ阻害剤（１ｍＭフェニルメチルスルホニルフッ化物、１μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、１μｇ／ｍｌロイペプチン、および１μｇ／ｍｌアプロチニン）（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳ−ＣＭ（Ｃａｌ  ＢｉｏＣｈｅｍ）中で２０分間培養して溶解させた。５０００×ｇの遠心分離に４℃で５分間掛けて細胞残屑を除去した。上清を回収し、これを１００，０００×ｇの遠心分離によって４℃で１時間分離した。その結果得られた上清内の内皮細胞タンパク質濃度をブラッドフォード法（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いて測定した。
【０１９８】
ＣｏｔＨ２／ＣｏｔＨ３のＲＮＡ干渉
上述のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術（Ibrahim et al., Mol. Microbiol., 77:587-604 (2010)）を用いて、R. oryzae内のＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３発現を阻害した。ＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３に共通する４５０ｂｐ断片をＰＣＲ増幅し、Rhizopus発現ベクターｐＰｄｃＡ−Ｅｘの制御下で逆方向反復としてクローニング化させた（Mertens et al., Archives of microbiology 186:41-50 (2006)）。さらに、Rhizopus pdcA遺伝子（Skory, Curr. Microbiol., 47: 59-64 (2003)）のイントロンを反復間に含めて、対象とするｄｓＲＮＡ構造の安定化を図るリンカーとして機能させた（Nakayashiki et al., Fungal Genet. Biol., 42:275-283 (2005); Wesley et al., Plant J., 27:581-590 (2001)）。遺伝子銃式送達システム（Skory, Mol. Genet. Genomics 268: 397-406 (2002)）（BioRad）を用いて、生成プラスミドを形質転換させてR. oryzae pyrF突然変異体とし、この形質転換体をウラシル無添加の最少培地上で選択した。
【０１９９】
ＣｏｔＨ発現S. cerevisiaeによるＧＲＰ７８の結合
ＣｏｔＨ１、ＣｏｔＨ２、ＣｏｔＨ３、または空のプラスミドを発現しているS. cerevisiae細胞（８×１０８）を冷蔵庫内に入れ、１．５％ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドおよびプロテアーゼ阻害剤を添加したＰＢＳ−ＣＭ中において２５０μｇのビオチン標識内皮細胞表面タンパク質と一緒に１時間培養させた。このバッファを用いて３回洗浄することによって、非結合内皮細胞タンパク質を洗い流した。真菌細胞との結合状態を維持している内皮細胞タンパク質を６Ｍ尿素（Fluka）を用いて２回溶離させ、その上清を組み合わせ、適当な体積となるようMicrocon遠心濾過器（１０，０００ＭＷＣＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮させた。その後、内皮細胞タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ＰＶＤＦ−ｐｌｕｓ膜（GE Water& Process Technologies）へと移した。膜をそれからWestern Blocking Reagent（Roche）によって処理し、そして、ウサギ抗ＧＲＰ７８抗体（Abcam）を用い、その後にＨＲＰ共役ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Pierce）の第２抗体を用いることによってプローブした。SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate（Pierce）と一緒の培養後、ＣＣＤカメラを用いて信号を検出した。
【０２００】
真菌と内皮細胞またはＣＨＯ細胞との相互作用
上述の微分蛍光アッセイ法（Ibrahim et al., Infect. Immun., 63:4368-4374 (1995)）を変更したものを用いて、内皮細胞またはＣＨＯ細胞に取り込まれる有機体の数を決定した。簡潔に説明すれば、２４ウェル細胞培養プレート内の１２ｍｍガラスカバースリップをフィブロネクチンで少なくとも４時間コーティングし、内皮細胞またはＣＨＯ細胞をコンフルエントとなるまで播種した。これを予め温めておいたＨＢＳＳによって２回洗浄した。その後、１時間発芽させておいたＲＰＭＩ １６４０培地内において、ＣｏｔＨまた：はR. oryzaeを発現しているS. cerevisiaeの細胞１０５個を上記細胞に感染させた。３時間の培養後、細胞を３％パラホルムアルデヒド中に固定させ、真菌細胞壁のキチンと特異的に結合する１％Ｕｖｉｔｅｘ（Jay Isharani, Ciba-Geigy, Greensboro, N.C.から提供）を用いて１時間染色を行った。ＰＢＳを用いて３回洗浄を行った後、少量のＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止試薬（Molecular Probes）を滴下したスライドガラス上にカバースリップを載置し、マニキュア液で封止した。細胞結合有機体（すなわち、単層に付着している胞子発芽体）の総量を位相コントラスト技法によって決定した。同一の領域を落射蛍光顕微鏡によって検査し、非吸収胞子発芽体（これらは明るく蛍光発光している）の数を決定した。可視有機体の総数から蛍光有機体の数を引いて、取り込まれた有機体の数を算出した。各スライド上の２０〜４０個の異なる領域内において少なくとも４００個の有機体が数えられた。各アームにつき２つのスライドを各試験に使用し、各試験を異なる日に３通り行った。
【０２０１】
クロム（５１Ｃｒ）遊離試験（Ibrahim et al., J. Infect. Dis., 198:1083-1090 (2008)）によって、R. oryzaeが引き起こす内皮細胞またはＣＨＯ細胞の細胞傷害を定量化した。簡潔に説明すれば、着脱可能な壁を含む９６ウェル組織培養プレート内で増殖させた内皮細胞またはＣＨＯ細胞を各壁につき１μＣｉのＮａ２５１ＣｒＯ４（ICN, Irvine, CA）と一緒にＭ−１９９培地またはＡｌｐｈａ最小Ｅａｇｌｅ培地（ＣＨＯ細胞用）内で１６時間培養させた。試験当日、取り込まれずにいる５１Ｃｒを吸引し、９６ウェルを温Ｈａｎｋｓ平衡塩類溶液（Irvine Scientific, Irvine, CA）で２回洗浄した。細胞に対して、グルタミンを添加した１５０μｌのＲＰＭＩ １６４０培地（Irvine Scientific）内で懸濁させた真菌胞子発芽体（１時間発芽させた１．５×１０５）を感染させた。R. oryzae不在下で内皮細胞またはＣＨＯ細胞をグルタミン添加ＲＰＭＩ １６４０培地内で培養させることによって、５１Ｃｒの自然放出を決定した。５％ＣＯ２培養器内で３７℃で３時間の培養後、各ウェルから培地の５０％を吸引してガラス管へと移し、細胞を手作業で分離させ、他のガラス管組内に載置した。吸引物および分離壁中の５１Ｃｒの量をガンマカウンティング法によって決定した。各ウェル内の内皮細胞に取り込まれた５１Ｃｒの総量は、吸引した培地の毎分の放射性カウント数と対応する分離壁の毎分の放射性カウント数との合計に等しかった。各ウェル内に取り込まれたトレーサ量の変化についてデータ補正を行った後、内皮細胞の特異的な５１Ｃｒ放出を次の式によって算出した：［（実験的放出×２）−（自然放出×２）］／［総取り込み−（自然放出×２）］。各実験条件を少なくとも３通り試験し、実験を少なくとも１回繰り返した。
【０２０２】
R. oryzaeが引き起こす付着、エンドサイトーシス、または傷害の抗体遮断に関しては、R. oryzae胞子発芽体の添加前に内皮細胞を５０μｇの抗ＣｏｔＨ抗体（精製ＩｇＧ）と、または抗原性であることが予測されるＣｏｔＨ３ペプチドのワクチン接種前の同一のウサギから取得した血清と一緒に１時間培養する点を除いて、上述の方法でアッセイを行った。
【０２０３】
ｉｎ ｖｉｖｏ病原性研究
ｉｎ ｖｉｖｏ研究に関しては、ＩＣＲ雄マウス（＞２０ｇ）（Taconic Farms）は、真菌感染させる１０日前に１９０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンを０．２ｍｌのクエン酸塩緩衝剤中に単一ｉ.ｐ.注入したＤＫＡにした（Ibrahim et al., Antimicrob. Agents Chemother., 47:3343-3344 (2003)）。ストレプトゾトシン処理から７日経過後、全てのマウスにおいて糖尿およびケトン尿が確認された。糖尿病性ケトアシドーシスマウスは、ケタミン（６６ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（４．８ｍｇ／ｋｇ）と２．５×１０５の標的接種材料とを用いた鎮静後、気管内経路で真菌胞子に感染していた。接種材料を確認するために、植菌直後の３系統のマウスから摘出した肺をＰＢＳ内で均質化し、０．１％トリトンを含むＰＤＡプレート上で定量的に培養し、３７℃で２４時間の培養期間後にコロニーの数をカウントした。有効性の主要評価項目は瀕死状態に至るまでの時間とした。一部の実験では、副次的評価項目として、感染から２日経過後に肺および脳（主要標的器官）内の真菌負担を上述のｑＰＣＲアッセイ法（Ibrahim et al., Antimicrob. Agents Chemother., 49:721-727 (2005)）で決定した。値を組織のｌｏｇ１０胞子相当／ｇとして示す。１０％亜鉛ホルマリン内に固定後、採取器官の切片に対して組織病理学検査を行った。固定後の採取器官をパラフィン内に埋め込み、R. oryzae hyphaeを検出するように５ｍｍの切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）またはパス染色（Ibrahim et al., J. Clin. Invest., 117:2649-2657 (2007)）で染色した。
【０２０４】
ＣｏｔＨ遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ発現に関しては、野生型R. oryzaeまたは空のプラスミドまたはＲＮＡ−ｉコンストラクトによって変異させた変異体に気管内経路感染してから４８時間経過後のマウスから摘出した肺および脳を液体窒素およびＴｒｉ Ｒｅａｇｅｎｔ溶液（Ａｍｂｉｏｎ）を用いたＲＮＡ抽出処理で急速冷凍させた。表３に列挙するプライマーを使用し、ＲＥＴＲＯｓｃｒｉｐｔ（Ａｍｂｉｏｎ）による逆転写を行った。定量ＲＴ−ＰＣＲに関しては、ＳＹＢＲグリーンアッセイを行った。構成的に発現したＡＣＴ１を全反応のコントロールとして使用した。ABI PRISM 7000 Sequence Detection System User Bulletin 2（Applied Biosystems）を用いて算出および統計分析を行った。
【０２０５】
受動免疫法
ＣｏｔＨタンパク質に対する抗体によってマウスがムコール菌症から保護されるか否かを検出するために、糖尿病ケトアシドーシス性マウスを上述の方法で気管内経路感染させる２時間前に、ＧＡＧＫＫＨＮＮＡＫＱＳＷＮＷ（配列番号１９）またはＭＧＱＴＮＤＧＡＹＲＤＰＴＤＮＮＫ（配列番号４０）に対して産生したウサギ精製抗ＣｏｔＨ ＩｇＧ１ｍｇを腹腔内投与して、当該マウスに免疫性を与えた。コントロールマウスを同様に感染させたが、ＣｏｔＨ３ペプチドによるワクチン接種前に同一のウサギ由来の同様の投与量を与えた。感染から３日経過後、抗体またはコントロール血清の反復投与（ワクチン接種前）を導入した。有効性の主要評価項目は瀕死状態に至るまでの時間とした。
【０２０６】
統計分析
ノンパラメトリックWilcoxon順位和検定によって、ＣｏｔＨ発現上の差異および真菌−内皮細胞間の相互作用上の差異を比較した。生存時間の差異を決定するよう、ノンパラメトリックログランク検定を使用した。＜０．０５のＰ値との比較は有意であると考慮した。
【０２０７】
結果
内皮細胞ＧＲＰ７８と結合する推定R. oryzaeリガンドの単離
内皮細胞ＧＲＰ７８と結合するR. oryzaeリガンドを特定するために、R. oryzae胞子発芽体のプロトプラストの上清由来の細胞壁材料を回収した（Michielse et al., Mol. Genet. Genomics, 271:499-510 (2004)）。浸透安定剤（たとえば、ソルビトール）の存在下でプロトプラストを培養することによって細胞壁の再生が可能になり、再生時に細胞壁の構成要素が上清中に放出される（Pitarch et al., Mol. Cell. Proteomics, 5:79-96 (2006); Pitarch et al., Electrophoresis, 20:1001-1010 (1999)）。２時間の培養期間（Michielse et al., Mol. Genet. Genomics, 271:499-510 (2004)）経過後、プロトプラストをペレットし、上清をプロテアーゼ阻害剤の存在下で殺菌した。上清を濃縮し、タンパク質濃度を測定した。プロトプラストの不在以外は同様の方法によって負のコントロールサンプルの処理を行った。組み換えヒトＧｒｐ７８および抗Ｇｒｐ７８Ａｂを用いたＦＡＲウエスタンブロット分析法（Wu et al., Nat. Protoc., 2:3278-3284 (2007)）によって、Ｇｒｐ７８と結合したR. oryzaeのプロトプラストの回収上清には４つの帯域が存在していることが判明した（図５１Ａ）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳ分析によるタンパク質特定のためにバンドを摘出した。細胞表面タンパク質であると予測された４つのＯＲＦのみが、ｃ末端のＧＰＩアンカー配列と、Ｎ末端の信号配列と、複数の予測Ｎ−およびＯ−糖鎖付加部位とによって識別された。ＯＲＦの３つ（すなわち、ＲＯ３Ｇ＿０５０１８、ＲＯ３Ｇ＿０８０２９、およびＲＯ３Ｇ＿１１８８２）は、幾つかの種類の細菌由来の胞子殻形成に関与しているタンパク質のＣｏｔＨ族に対して、アミノ酸レベルにおいて１７％という限られた同一性を有している（Giorno et al., J. Bacteriol., 189:691-705 (2007); Naclerio et al., J. Bacteriol., 178:6407 (1996)）。これらをＣｏｔＨ１（ＲＯ３Ｇ＿０５０１８）、ＣｏｔＨ２（ＲＯ３Ｇ＿０８０２９）、およびＣｏｔＨ３（ＲＯ３Ｇ＿１１８８２）と命名した。４つ目のＯＲＦ  ＲＯ３Ｇ＿１６２９５は、特定され機能を持たずに多くの真菌および一部の細菌に広く存在している。ＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３は、アミノ酸レベルの同一性が７７％であり、互いに近縁関係にある一方、ＣｏｔＨ１はより遠縁関係にある（図５１ｂ）。４つ目のＯＲＦの他の３つのＣｏｔＨタンパク質に対するアミノ酸レベルの全体的な同一性は１０％である。R. oryzae（delemar）９９８８０ゲノムデータベースの検索後、２つのより関連性の高いＯＲＦ（アミノ酸レベルで６６％の同一性）を見出した。２つのＯＲＦはＧＰＩ結合タンパク質をコードすると予測された。２つのＯＲＦ（ＲＯ３Ｇ＿０９２７６およびＲＯ３Ｇ＿０１１３９）は、ＣｏｔＨ１、ＣｏｔＨ２、およびＣｏｔＨ３タンパク質に対する同一性が低かった（アミノ酸レベルで２０％〜２４％）。ＯＲＦをそれぞれＣｏｔＨ４およびＣｏｔＨ５と命名した。
【０２０８】
ヒトムコール菌症を引き起こすことが知られている他のケカビ目に上記遺伝子族が存在している可能性についても検査した。ＣｏｔＨ３ ＯＲＦ全体（１．９ｋｂ）に亘るプライマーを使用し、臨床分離株（R. oryzae ９９〜８９２、Mucor sp. ９９〜９３２、Lichtheimia corymbifera、Cunninghamella bertholletiae、およびRhizomucorを含む）からバンドを増幅させた。ＰＣＲ増幅させた帯域の配列分析によって、R. oryzae ９９〜８８０ ＣｏｔＨ３に対するヌクレオチドおよびアミノ酸レベルの同一性が９０％を超えることが明らかになった。これらの研究は集合的に、ムコール菌症の病因に対するＣｏｔＨ遺伝子族の独自性を示すものである。
【０２０９】
ＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３はR. oryzaeおよび内皮細胞の相互作用時に発現する
本願開示の結果に基づき、いずれかの単離タンパク質がＧＲＰ７８に対する真菌リガンドを示す場合、当該単離タンパク質はR. oryzaeおよび内皮細胞の相互作用時に発現する筈である仮定した。R. oryzaeは胞子発芽体内にあるうちに内皮細胞ＧＲＰ７８を結合するため、胞子または胞子発芽体内における４系統のＯＲＦの発現を研究した。ＣｏｔＨ遺伝子は全て胞子状態で発現したが、ＣｏｔＨ３のみはR. oryzaeの胞子発芽体内で発現した。重要なことに、R. oryzaeの胞子発芽体を内皮細胞と一緒に培養させた場合、ＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３の両方が発現し（図５２Ｂ）、ＣｏｔＨ３はＣｏｔＨ１およびＣｏｔＨ２と比較してそれぞれ１６倍および４倍に増大していた（図５２Ｃ）。最終的に、４系統目のＯＲＦ＿Ｒ０３Ｇは、R. oryzaeの胞子または胞子発芽体（図５２Ａ）または内皮細胞と相互作用しているR. oryzaeの胞子発芽体（図５２Ｂ）では発現しなかった。これらの結果によって、ＣｏｔＨ３および、より低度ではあるがＣｏｔＨ２は、ヒト細胞内への侵入時にＧＲＰ７８と相互作用する推定候補であることが示された。
【０２１０】
ＧＲＰ７８と結合し、かつＧＲＰ７８過剰発現内皮細胞およびＣＨＯ細胞に付着して侵入している、ＣｏｔＨ２またはＣｏｔＨ３発現S. cerevisiae細胞
ＧＲＰ７８レセプターとの相互作用においてＣｏｔＨ１、ＣｏｔＨ２、およびＣｏｔＨ３が担う役割を研究するために、ＣｏｔＨ２またはＣｏｔＦＢを非付着性かつ非侵入性のS. cerevisiae内で異種発現させた。内皮細胞ＧＲＰ７８を特異的に結合することを可能にする能力について形質転換酵母細胞を試験した。抗原性を有し、かつ表面発現していることが予測される２系統のＣｏｔＦＢペプチド（ＧＡＧＫＫＨＮＮＡＫＱＳＷＮＷ（配列番号３９およびＭＧＱＴＮＤＧＡＹＲＤＰＴＤＮＮＫ（配列番号４０））に対して生成した抗体は、ＣｏｔＦＢ発現S. cerevisiaeを認識し、より低度ではあるがＣｏｔＨ２発現S. cerevisiaeについても認識したが、ＣｏｔＨｌ発現S. cerevisiaeは認識しなかった（図５３）。ＣｏｔＦＢ発現S. cerevisiaeは、主に内皮細胞膜タンパク質の抽出物由来のＧＲＰ７８を結合した。ＣｏｔＨ２発現酵母細胞はまた、同一の抽出物由来のＧＲＰ７８をも結合したが、ＣｏｔＨｌ発現S. cerevisiaeは結合しなかった（図５４）。これらの結果は、ＣｏｔＨ３および（より低度において）ＣｏｔＨ２はR. oryzaeによる内種皮への侵入時に内皮細胞ＧＲＰ７８と相互作用していたことを示した。この仮定を裏付けるために、ｉｎ ｖｉｔｒｏの内皮細胞に付着して侵入する形質転換酵母細胞の能力を検査した。
【０２１１】
空プラスミドと比較して、ＣｏｔＨｌ発現S. cerevisiaeにおける内皮細胞への付着またはエンドサイトーシス（侵入）は向上していなかった。対照的にＣｏｔＨ２またはＣｏｔＨ３発現酵母細胞は、ＣｏｔＨｌ発現S. cerevisiaeまたは空プラスミドによる形質転換S. cerevisiaeと比較して、内皮細胞への付着および侵入が複数倍に増大していた（図５４Ｂ）。重要なことに、ＣｏｔＨ２発現酵母細胞と比較して、ＣｏｔＨ３発現細胞は、内皮細胞に付着して侵入することを可能にする能力が著しく高くなっていた。こうした内皮細胞に対する付着および侵入の向上はＧＲＰ７８との相互作用に起因するものか否かを検査するために、親ＣＨＯ細胞に対して付着して侵入することを可能にするＣｏｔＨ１、ＣｏｔＨ２、ＣｏｔＨ３、または空プラスミド発現S. cerevisiaeの能力をＧＲＰ７８過剰発現ＣＨＯ細胞と比較した（Morris et al, J. Biol. Chem., 272:4327-4334 (1997); Reddy et al, J. Biol. Chem., 278:20915-20924 (2003)）。
【０２１２】
ＣｏｔＨ２またはＣｏｔＨ３発現酵母細胞のみが、ＧＲＰ７８過剰発現ＣＨＯ細胞に対する付着および侵入が著しく増大していた（図５４Ｃ）。ＣｏｔＨ１、ＣｏｔＨ２、またはＣｏｔＨ３発現酵母細胞については、親ＣＨＯ細胞に結合して侵入することを可能にする能力が示されなかった。これらのデータは全体として、ＣｏｔＨ３および（より低度であるが）ＣｏｔＨ２は内皮細胞ＧＲＰ７８との相互作用時のR. oryzaeのアドヘシン／インバシンを表していることを示していた。
【０２１３】
ＣｏｔＨ３タンパク質はR. oryzaeのインバシンである
R. oryzaeが内皮細胞の細胞障害を引き起こすために真菌のエンドサイトーシスが必須条件であることが既に示されてきている（Ibrahim et al., Infect. Immun. 73:778-783 (2005); Liu et al, J. Clin. Invest, 120: 1914-1924 (2010)）ため、R. oryzae誘起エンドサイトーシスおよびその後の細胞障害から内皮細胞を保護するためのＣｏｔＨ３機能または発現の阻止を検査する。ウサギ抗ＣｏｔＨ３ポリクローナル抗体（同一動物から回収される免疫前血清ではない）を添加することによってR. oryzae胞子発芽体のエンドサイトーシス（付着ではない）を無効化した（図５５Ａ）。抗ＣｏｔＨ３抗体を用いて、R. oryzae胞子発芽体が引き起こす内皮細胞の損傷を低減（＞４０％）させた（図５５Ｂ）。
【０２１４】
抗体阻止の研究を補足するために、付着、エンドサイトーシス、および内皮細胞損傷への影響を決定するようにＣｏｔＨ３およびＣｏｔＨ２発現を抑制した。上述のＲＮＡ−ｉ方法（Ibrahim et al., Mol. Microbiol, 77:587-604 (2010)）を用いて、１つのコンストラクト内の両遺伝子を抑制するように〜４００ｂｐ断片を使用した。空プラスミドで形質転換したR. oryzae pyrf突然変異体と比較して、PyrFを選択マーカーとして含むＲＮＡ−ｉコンストラクトによって形質転換したR. oryzae pyrf突然変異体（すなわち、Ｔｒａｎｓ ２およびＴｒａｎｓ ３）の２つのコロニー内に存在するＣｏｔＨ２およびＣｏｔＦＢ（Skory and Ibrahim, Curr. Genet. 52:23-33 (2007)）の発現をほぼ全体的に無効化した（図５６Ａ）。
【０２１５】
次に、本願記載の抗ＣｏｔＨ３ポリクローナル抗体を用いたフローサイトメトリー法によって、構築した突然変異体上のＣｏｔＨ２およびＣｏｔＦＢの細胞表面発現を分析した。ＲＮＡ−ｉコンストラクトによって形質転換させたR. oryzaeは、野性型R. oryzaeまたは空プラスミドによって形質転換させたR. oryzaeと比較して、より少量の細胞表面ＣｏｔＨ２およびＣｏｔＦＢタンパク質を発現した（図５６Ｂ）。これらＲＮＡ−ｉ形質転換体は、野性型の細胞または空プラスミドによる形質転換細胞と比較した場合において増殖速度、細胞サイズ、または発芽に差異がなかった（図５６Ｃ）。しかし、R. oryzaeのＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３の細胞表面発現を減少させた結果、R. oryzae胞子発芽体の内皮細胞エンドサイトーシスおよびその後の内皮細胞損傷が著しく低減した（図５７Ａおよび５７Ｂ）。これらの結果は、R. oryzaeが内皮細胞へ最大限侵入するためにＣｏｔＨ３およびＣｏｔＨ２が必要であることを示していた。
【０２１６】
ＣｏｔＨ３およびＣｏｔＨ２がＧＲＰ７８との結合を介してインバシンとして機能することをさらに証明するために、ＧＲＰ７８過剰発現ＣＨＯ細胞または（ＧＲＰ７８過剰発現型以外の）親ＣＨＯ細胞に対して細胞損傷を引き起こすことを可能にする、ＣｏｔＨ３およびＣｏｔＨ２のＲＮＡ−ｉコンストラクトを有するR. oryzaeの胞子発芽体の能力を、空プラスミドで形質転換したR. oryzaeまたは野生型R. oryzae細胞（Morris et al, J. Biol. Chem., 272:4327-4334 (1997); Reddy et al, J. Biol. Chem., 278:20915-20924 (2003)）と比較した。上述のように（Liu et al, J. Clin. Invest., 120: 1914-1924 (2010)）、野生型R. oryzaeは、ＣＨＯ親細胞と比較して、ＧＲＰ７８過剰発現ＣＨＯに対して相当大きな細胞損傷を引き起こした。空プラスミドで形質転換したR. oryzae胞子発芽体が引き起こした細胞損傷の同様のパターンによって、これらの結果をさらに確認した。対照的に、ＧＲＰ７８過剰発現ＣＨＯ細胞およびＣＨＯ親細胞は、ＣｏｔＨ３およびＣｏｔＨ２の細胞表面発現が低減したR. oryzae胞子発芽体が引き起こす損傷の影響を同等に受け易かった（図５７Ｃ）。結果は全体として、ＣｏｔＨ３およびＣｏｔＨ２は、ＧＲＰ７８との結合を介して内皮細胞への侵入（エンドサイトーシス）を媒介する細胞表面タンパク質であることを示す。
【０２１７】
ＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３は、ｉｎ ｖｉｖｏのR. oryzaeの全病原性に必要である
ＣｏｔＨ３およびＣｏｔＨ２が内皮細胞のインバシンとして機能するので、これらの二系統の遺伝子が病原性の主要な決定因子であると仮定した。この仮説を検証するために、器官内感染した糖尿病性ケトアシドーシスマウスモデルを用いて、ＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３の細胞表面発現を低減したR. oryzaeの病原性を野生型R. oryzaeまたは空プラスミドで形質転換したR. oryzaeと比較した。初期感染がモデルの肺に植菌することによって開始するにも関わらず、当該感染は脳などの他の標的器官に血行性転移する。空プラスミドを有する細胞は、野性型R. oryzae細胞と同程度に悪性である（野性型および空プラスミドによる感染マウスの生存時間の中央値はそれぞれ３日および４日であり、Ｐ＝０．３３）。対照的に、ＲＮＡｉ形質転換体に感染したマウスは病原性が弱毒化しており、これは生存時間の中央値が１０日であったこと、および１／３のマウスが致命的感染を生き延びたこと（Ｐ＝０．３３）によって示された（図５８Ａ）。さらに、ＲＮＡ−ｉ形質転換体に感染したマウスでは、野性型細胞に感染したマウスまたは空プラスミドによる形質転換体に感染したマウスから摘出した同一器官と比較した場合、肺および脳（一次標的器官および二次標的器官）内の真菌量が著しく減少していた（図５８Ｂ）。
【０２１８】
ＲＮＡ−ｉコンストラクトによって形質転換させたR. oryzaeに感染したマウスに観察される弱毒性はＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３が実際に阻害されていることに起因することをさらに証明するために、マウスの標的器官から採取した菌糸体内においてこれら遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ発現を評価した。野生型R. oryzae、または空プラスミドまたはＲＮＡ−ｉコンストラクトによって形質転換させたR. oryzaeに感染しているマウスでは、ＣｏｔＨ１は発現していなかった。これと対照的にＣｏｔＨ２では、野生型R. oryzaeまたは空プラスミドで形質転換させたR. oryzaeに感染しているマウスの肺および脳内の発現量において、ＣｏｔＨ１と比較してそれぞれ４倍および２倍の増大を示した（図５８Ｃ）。さらに、ＣｏｔＨ３はＣｏｔＨ２と比較して、野性型R. oryzaeまたは空プラスミドで形質転換させたR. oryzaeに感染しているマウスの肺内での発現が著しく増大していた。なお、このようなＣｏｔＨ３の発現の増大はマウスの脳内では確認されなかった。最後に、ＲＮＡ−ｉコンストラクトによって形質転換させたR. oryzaeに感染しているマウスから採取した真菌細胞では、いずれのＣｏｔＨ遺伝子も発現していなかった（図５８Ｃ）。これらの結果は、ＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３はｉｎ ｖｉｖｏで発現しており、ＲＮＡ−ｉコンストラクトによって形質転換させたR. oryzaeに感染しているマウス内の病原性の低減はいずれのＣｏｔＨ遺伝子も発現が欠如していることに起因していることを示す。
【０２１９】
感染の重症度を比較するために、３つの異なる株に感染したマウスの器官について組織病理学検査を行った。ＲＮＡ−ｉコンストラクトによって形質転換したR. oryzaeに感染したマウスから採取した肺では、野生型R. oryzaeまたは空プラスミドによって形質転換したR. oryzaeに感染したマウスから採取した肺と比較して、正常な組織像が示された。なお、野生型R. oryzaeまたは空プラスミドによって形質転換したR. oryzaeに感染したマウスから採取した肺では、食細胞浸潤および実質的な浮腫によって特徴付けられる真菌腫瘍が多く存在していた（図５９）。
【０２２０】
抗ＣｏｔＨ３ｐ抗体はR. oryzae感染から糖尿病性ケトアシドーシス罹患マウスを保護する
上述のデータから、ＣｏｔＨ２タンパク質およびＣｏｔＨ３タンパク質が哺乳類細胞に対するインバシンとしてｉｎ ｖｉｔｒｏで機能することが示され、かつ、ＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３は、気管内接種が起こすマウスモデルの血行性播種感染のR. oryzaeの完全毒性に対して必要であったので、ＧＡＧＫＫＨＮＮＡＫＱＳＷＮＷ（配列番号３９）またはＭＧＱＴＮＤＧＡＹＲＤＰＴＤＮＮＫ（配列番号４０）のペプチドに対して発生する抗ＣｏｔＨ３抗体および抗ＣｏｔＨ２抗体の使用を、疾病に対する保護作用（これら２つのペプチドに対して発生する抗体は、ＣｏｔＨ２タンパク質発現S. cerevisiaeまたはＣｏｔＨ３タンパク質発現S. cerevisiaeを認識した）について調査した。糖尿病性ケトアシドーシス罹患マウスをR. oryzae胞子に気管内感染させる２時間前および感染から３日経過後に、当該マウスに対して１ｍｇのポリクローナル抗体を投与した。抗ＣｏｔＨ２ウサギＩｇＧおよび抗ＣｏｔＨ２ウサギＩｇＧを投与されたマウスの生存時間は、同じウサギから作製したワクチン接種前の血清を投与されたウサギと比較して著しく向上した。感染から２１日目の生存率に関しては、ＧＡＧＫＫＨＮＮＡＫＱＳＷＮＷ（配列番号３９）のペプチドに対して産生された抗体の投与を受けたマウスでは４４％であったが、ワクチン接種前のコントロールＩｇＧの投与を受けたマウスでは０％であった（図６０Ａ）。さらに、感染から１４日目の生存率に関しては、ＭＧＱＴＮＤＧＡＹＲＤＰＴＤＮＮＫ（配列番号４０）のペプチドに対して産生された抗体の投与を受けたマウスでは７５％であったが、ワクチン接種前のコントロールＩｇＧの投与を受けたマウスでは０％であった（図６０Ｂ）。これらの結果は、ムコール菌症を治療するために、ＣｏｔＨタンパク質を標的とする抗体を使用できることを示す。
【０２２１】
〔実施例ＩＩＩ〕
ムコール菌症検出の診断方法
核酸配列系増幅（ＮＡＳＢＡ）法の検出能力を決定するように一連の実験を行った。Rhizopus oryzaeの総ＮＡを鋳型として用いて１２７ｂｐのＣｏｔＨ３を増幅するようにＮＡＳＢＡプライマー組を設計した。
ＣｏｔＨ３順方向プライマー：５’−ＧＡＴＧＡＣＡＡＴＴＡＴＡＴＴＣＣＣＡＧＣ−３’（配列番号３５）
ＣｏｔＨ３逆方向プライマー：５’−ＧＡＧＴＡＧＡＣＧＴＡＡＴＴＡＧＡＴＣＣＡＡ−３’（配列番号３６）
分子指標プローブ：５’−ＣＧＣＧＡＴＣＡＡＡＣＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＡＴＣＧＡＴＣＧＣＧ−３’（配列番号３８）
RNeasy（登録商標） Plant Mini Kit （Qiagen）を製造者の指示に従って使用し、Aspergillus fumigatus、Candida albicans、およびRhizopus oryzae由来のＲＮＡの単離を行った。ＮＡＳＢＡ反応に対して、４つのR. oryzae胞子（それぞれ１０、１００、１０００、１００００胞子）から単離した総ＲＮＡを添加した。
【０２２２】
Rhizopus spp.に対する分子指標の特異性を試験するために、C. albicansおよびA. fumigatusから単離したＲＮＡをコントロールとして使用した。各反応に３００ｎｇの総ＲＮＡを添加した。NucliSENS EasyQ Basic kit v2（bioMerieux bv, Boxtel, NL）を製造者の指示に従って使用してＮＡＳＢＡ反応を行った。簡潔に説明すれば、ＮＡＳＢＡ反応体積はMicroAmp（登録商標） 96-Well Reaction Plate（Applied Biosystems）内において２０μｌ（反応毎）であり、５．４μｌの滅菌水、０．４μｌの各プライマー、０．２μｌのプローブ、４μｌの５×ＮＡＳＢＡバッファを含んでいた。予め混ぜておいた混合体に５μｌの精製ＲＮＡ（３００ｎｇ）または水（鋳型コントロールを調製しない場合）を添加した。その後に反応混合物を６５℃で５分間培養し、５分間掛けて４１℃まで冷まし、その後、NucliSENS EasyQ Basic kit v2由来の５μｌの酵素混合を添加した。この混合は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＡＭＶ−ＲＴ（トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素）、ＲＮａｓｅ Ｈ、およびＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含んで構成されている。反応物を４１℃で９０分間培養した。StepOnePlus Real-Time PCR machine（Applied Biosystems）を用いて蛍光シグナルを測定した。
【０２２３】
上述のＮＡＳＢＡ増幅分析法を用いたところ、ＣｏｔＨ３の分子指標プライマー／プローブが示す真菌の検出（すなわち、R. oryzaeに対する特異性）は異なるものであった。R. oryzaeを添加したサンプルから得られたアプリケーション生成物は直ちに増幅を示し、A. fumigantsまたはC. albicansを添加したサンプルから得られた増幅生成物は検出されなかった（図６１）。
【０２２４】
ＣｏｔＨ３の分子指標プライマー／プローブはR. oryzaeの高感度検出を示した。真菌胞子を、撹拌しながらＹＰＤ培養液中において３７℃で３時間発芽させた。１０〜１０５個の胞子発芽体を含む１０μｌのサンプルを２５０μｌのヒツジ血液中に加えた。RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）を用いて添加後の血液サンプルから総ＲＮＡを単離し、これを３０μｌの溶出バッファ中に溶出させた。５マイクロリットルの総ＲＮＡを各ＮＡＳＢＡ反応物に添加した。僅か１０の胞子発芽体と一緒に培養したサンプルを含む全サンプル内においてアプリフィケーション結果物を検出した（図６２）。
【０２２５】
ＣｏｔＨ３の分子指標プライマーは、R. oryzaeの高感度検出だけでなく、ロバスト（robust）な特異性も示した。新鮮なR. oryzae、A. fumigatus、およびC. albicans胞子を回収し、その数をカウントし、１０μｌのＹＰＤ培養液中にそれぞれアリコートした。３５０μｌのヒツジ血液を各管内に添加し、３７℃の攪拌機で２４時間培養させた。RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）を用いて総ＲＮＡを単離し、これを３０μｌの溶出バッファ中に溶出させた。５マイクロリットルのＲＮＡを各ＮＡＳＢＡ反応物に添加した。A. fumigatusまたはC. albicansの１０６の胞子と一緒に培養したサンプル内では増幅結果物を検出されなかったが、R. oryzaeの１０〜１０４の胞子と一緒に培養した各サンプルは検出できた（図６３）。
【０２２６】
ＣｏｔＨ３の分子指標プライマー／プローブは、複数のクモノスケカビ属種の検出を示した。新鮮なR. oryzae（９９〜８８０および９９〜８９２単離体）およびR. microsporus胞子（各々１０００胞子）を１０μｌのＹＰＤ培養液中にアリコートした。３５０μｌのヒツジ血液を各管内に添加し、３７℃の攪拌機で２４時間培養させた。RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）を使用して総ＲＮＡを単離し、これを３０μｌの溶出バッファ中に溶出させた。５マイクロリットルのＲＮＡを各ＮＡＳＢＡ反応物に添加した。R. oryzae９９〜８９２の胞子を含むサンプルが検出できたのみならず、R. oryzae９９〜８８０（Ｒ１０００）およびR. microspores（ＡＴＣＣ６２４１７）を含むサンプルが増幅を示した（図６４）。これらの結果は、R. oryzaeのＣｏｔＨ遺伝子から設計したプライマーは、Mucorales間に見られるＣｏｔＨ遺伝子の保存特性を確認することによってR. oryzaeの他の株およびクモノスケカビ属の他の種を検出できたことを示す。
【０２２７】
本願全体を通して多様な刊行物を参考文献として載せた。本発明が属する技術分野の最先端技術をより完全に記載することを目的として、これら刊行物を参照することによってその開示内容全体を本願に援用する。また、上述の例に準拠して本発明を説明したとはいえ、本発明の精神から逸脱することなく多様な変更を加えることもできることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２２８】
【図１】細胞表面タンパク質であることが予測される４つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＦＡＲウエスタンブロットを示す。
【図２】R. oryzae胞子以外の胞子発芽体に対するＧＲＰ７８の結合を示す。
【図３】ＧＲＰ７８に対するリガンドとしての働きをすることが予測される４つの結合グリコシルホスファチジルイニソトール（ＧＰＩ）の発現を示す。
【図４】パネルＡおよびＢは、内皮細胞と一緒に培養させたR. oryzae胞子発芽体におけるＣｏｔＨ遺伝子の発現を示す。
【図５】ＣｏｔＨ３における４つの推定ＧＰＩ結合タンパク質の互いに対する相同性および予測Ｎ−およびＯ−糖鎖付加部位の数を示す。
【図６】のパネルＡは、樹脂以外のヒト臍帯内皮細胞に対するR. oryzaeの付着能を示す。また、Saccharomyces Cerevisiaeは内皮細胞に付着しない。パネルＢは、S. cerevisiaeがＧＲＰ７８発現内皮細胞と結合できるR. oryzaeのＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３を示す。
【図７】ＣｏｔＨ３が多様なケカビ目（R. oryzae ９９〜８８０、R. oryzae ９９〜８９２、Mucor sp.、Lichtheimia corymbifera、Cunninghamella bertholetiae、およびR. microsporusを含む）において保存されている。
【図８】パネルＡおよびＢは、ＣｏｔＨ２またはＣｏｔＨ３発現S. cerevisiaeがＣＨＯ親細胞以外のＣＧＲＰ７８過剰発現内皮細胞またはＣＨＯ細胞に付着して侵入していることを示す。
【図９】R. oryzae由来のＣｏｔＨ１のアミノ酸配列（配列番号１）および核酸コード配列（配列番号２）を示す。
【図１０】R. oryzae由来のＣｏｔＨ２のアミノ酸配列（配列番号３）および核酸コード配列（配列番号４）を示す。
【図１１】R. oryzae由来のＣｏｔＦＢのアミノ酸配列（配列番号５）および核酸コード配列（配列番号６）を示す。
【図１２】R. oryzae由来のＲＯ３Ｇ＿１６２９５のアミノ酸配列（配列番号７）および核酸コード配列（配列番号８）を示す。
【図１３】配列番号３３および３４に示す核酸配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法による、R. oryzaeでスパイクしたヒツジ血液中のＣｏｔＨ３の検出を示す。
【図１４】配列番号３３および３４に示す核酸配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法による、Mucor sp.またはLichtheimia corymbiferaでスパイクしたヒツジ血液中のＣｏｔＨ３の検出を示す。
【図１５】配列番号３３および３４に示す核酸配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法による、Cunninghamella bertholetiaeまたはR. microsporusでスパイクしたヒツジ血液中のＣｏｔＨ３の検出を示す。
【図１６】配列番号３３および３４に示す核酸配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法による、Aspergillus fumigatesまたはCandida albicansを添加したヒツジ血液中のＣｏｔＨ３の非検出を示す。
【図１７】Stigmatella aurantiaca由来のタンパク質（ＺＰ＿０１４６０５８４）のアミノ酸配列（配列番号６５）に対する任意のＣｏｔＨ予測タンパク質（この場合ではＣｏｔＨ３［Ｒ０３Ｇ＿１１８８２］配列番号５）の最も高い相同性を示す。
【図１８】R. oryzae由来のＲＯ３Ｇ＿１６２９５タンパク質（配列番号６６）とTalaromyces stipitatus ATCC１０５００（ＥＥＤ２３９８６）タンパク質（配列番号６７）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図１９】R. oryzae由来のＲＯ３Ｇ＿１６２９５タンパク質（配列番号６６）とPenicillium marneffei ATCC１８２２４（ＸＰ＿００２１４４１７５）タンパク質（配列番号６８）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図２０】R. oryzae由来のＲＯ３Ｇ＿１６２９５タンパク質（配列番号６６）とAspergillus niger（ＸＰ＿００１３９２２３６）タンパク質（配列番号６９）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図２１】R. oryzae由来のＲＯ３Ｇ＿１６２９５タンパク質（配列番号６６）とAspergillus nidulans（ＸＰ＿６５８９３４）タンパク質（配列番号７０）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図２２】R. oryzae由来のＲＯ３Ｇ＿１６２９５タンパク質（配列番号６６）とUstilago maydis（ＸＰ＿７６００２７）タンパク質（配列番号７１）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図２３】R. oryzae由来のＲＯ３Ｇ＿１６２９５タンパク質（配列番号６６）とCoccidioides immitis（ＸＰ＿００１２４３２１１）タンパク質（配列番号７２）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図２４】R. oryzae由来のＲＯ３Ｇ＿１６２９５タンパク質（配列番号６６）とNeurospora crassa（ＸＰ＿９５６７９２）タンパク質（配列番号７３）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図２５】R. oryzae由来のＲＯ３Ｇ＿１６２９５タンパク質（配列番号６６）とCryptococcus neoformans（ＸＰ＿７７５５５８）タンパク質（配列番号７４）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図２６】R. oryzae由来のＲＯ３Ｇ＿１６２９５タンパク質（配列番号６６）とStreptomyces lividans（ＥＦＤ６５１７０）タンパク質（配列番号７５）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図２７】Rhizopus oryzae ９９〜８８０由来のＣｏｔＨ３（データベース内のイントロンを含む）の核酸配列（配列番号９）を示す。
【図２８】Rhizopus oryzae ９９〜８８０由来のＣｏｔＨ３（データベース内のエクソンのみ）の核酸配列（配列番号１０）を示す。
【図２９】Rhizopus oryzae ９９〜８８０由来のＣｏｔＨ３（予測アミノ酸）のアミノ酸配列（配列番号１１）を示す。
【図３０】Rhizopus oryzae ９９〜８８０由来のＣｏｔＨ３（配列データ内のイントロンを含む）の核酸配列（配列番号１２）を示す。
【図３１】Rhizopus oryzae ９９〜８９２由来のＣｏｔＨ３（配列データ内のエクソンのみを含む）の核酸配列（配列番号１３）を示す。
【図３２】Rhizopus oryzae ９９〜８９２由来のＣｏｔＨ３（配列データ内のイントロンを含む）の核酸配列（配列番号１４）を示す。
【図３３】R. oryzae ９９〜８９２由来のＣｏｔＨ３（イントロンを除く）の予測アミノ酸配列（配列番号１５）を示す。
【図３４】R. oryzae ９９〜８９２由来のＣｏｔＨ３（イントロンを含む）の予測アミノ酸配列（配列番号１６）を示す。
【図３５】Mucor sp.９９〜９３２由来のＣｏｔＨ３配列（配列データ内のエクソンのみ）の核酸配列（配列番号１７）を示す。
【図３６】Mucor９９〜９３２由来のＣｏｔＨ３（ＡＡエクソンのみ）の予測アミノ酸配列（配列番号１８）を示す。
【図３７】Mucor９９〜９３２由来のＣｏｔＨ３（イントロンを含む）の核酸配列（配列番号１９）を示す。
【図３８】Mucor９９〜９３２由来のＣｏｔＨ３（イントロンを含む）の予測アミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図３９】Lichtheimia corymbifera由来のＣｏｔＨ３（配列データ内のエクソンのみ）の核酸配列（配列番号２１）を示す。
【図４０】Lichtheimia corymbifera由来のＣｏｔＨ３（配列データ内のエクソンのみ）の予測アミノ酸配列（配列番号２２）を示す。
【図４１】Lichtheimia corymbifera由来のＣｏｔＨ３（イントロンを含む）の核酸配列（配列番号２３）を示す。
【図４２】Lichtheimia corymbifera由来のＣｏｔＨ３（イントロンを含む）の予測アミノ酸配列（配列番号２４）を示す。
【図４３】Cunninghamella bertholetiae由来のＣｏｔＨ３配列（エクソンのみ）の核酸配列（配列番号２５）を示す。
【図４４】Cunninghamella bertholetiae由来のＣｏｔＨ３（配列データ内のエクソンのみ）の予測アミノ酸配列（配列番号２６）を示す。
【図４５】Cunninghamella bertholetiae由来のＣｏｔＨ３（イントロンを含む）の核酸配列（配列番号２７）を示す。
【図４６】Cunninghamella bertholetiae由来のＣｏｔＨ３（配列データ内のイントロンを含む）の予測アミノ酸配列（配列番号２８）を示す。
【図４７】R. microsporus由来のＣｏｔＨ３（配列データ内のエクソンのみ）の核酸配列（配列番号２９）を示す。
【図４８】R. microsporus由来のＣｏｔＨ３（配列データ内のエクソンのみ）の予測アミノ酸配列（配列番号３０）を示す。
【図４９】R. microsporus由来のＣｏｔＨ３（イントロンを含み、イントロンを１つのみ含む）の核酸配列（配列番号３１）を示す。
【図５０】R. microsporus由来のＣｏｔＨ３（イントロンを含む）の予測アミノ酸配列（配列番号３２）を示す。
【図５１】パネルＡおよびＢは、ＧＲＰ７８と結合するR. oryzae表面タンパク質のＦＡＲウエスタンブロット（パネルＡ）、および、ＣｏｔＨ２予測タンパク質およびＣｏｔＨ３予測タンパク質の近接な同一性と、真菌類に広く存在している、特定機能を有さない４番目の特定ＯＲＦ（たとえば、Ｒ０３Ｇ＿１６２９５）からのＣｏｔＨタンパク質の分岐とを示す系統樹（パネルＢ）を示す。
【図５２】パネルＡ〜Ｃは、発芽および宿主細胞との相互作用に反応して起きるＣｏｔＨ遺伝子およびＲＯ３Ｇ＿１６２９５の発現を示す。全てのＣｏｔＨ遺伝子が休眠胞子内で発現した一方で、ＣｏｔＨ３のみが、ＹＰＤ内に３７℃で増殖させたR. oryzae胞子発芽体内で発現した（パネルＡ）。R. oryzae胞子発芽体を内皮細胞に暴露すると、ＲＴ−ＰＣＲによって測定したように、ＣｏｔＨ２遺伝子およびＣｏｔＨ３遺伝子のみ発現が誘起された（パネルＢ）。内皮細胞上のR. oryzae胞子発芽体内のＣｏｔＨ遺伝子の遺伝子発現をｑＲＴ−ＰＣＲ法によって定量化すると、ＣｏｔＨ３およびＣｏｔＨ２の発現は、発現しなかったＣｏｔＨ１と比較してそれぞれ１６倍および４倍に増大していたことが示された。ＲＯ３Ｇ＿１６２９５はいずれの試験条件下でも発現しなかった。ウイルコクソンの順位和検定の測定において、＊Ｐ＜０．００１ ｖｓ. ＣｏｔＨ１発現および＊＊Ｐ＜０．００１ ｖｓ. ＣｏｔＨ１およびＣｏｔＨ２発現（パネルＣ）。３つの独立した実験においてＮ＝９。
【図５３】ＧＡＧＫＫＨＮＮＡＫＱＳＷＮＷ（配列番号３９）のペプチドに対して産生させた抗体はＣｏｔＨ２タンパク質およびＣｏｔＨ３タンパク質を認識したが、S. cerevisiaeが異種発現したＣｏｔＨ１タンパク質は認識しなかったことを示す。ペプチドをＫＬＨと結合し、ウサギ抗体を商業的に産生するようにこれを使用した。細胞を共焦点顕微鏡法で視覚化する前に、ＣｏｔＨタンパク質異種発現S. cerevisiaeを抗体で染色し、その後にＦＩＴＣ標識化抗ウサギヤギ抗体で対比染色した。
【図５４】パネルＡ〜Ｃは、内皮細胞表面ＧＲＰ７８が、ＣｏｔＨ１を除くＣｏｔＨ２またはＣｏｔＨ３を異種発現しているS. cerevisiae細胞と結合し、ＣｏｔＨ１または空プラスミド発現S. cerevisiaeを除くＣｏｔＨ２またはＣｏｔＨ３発現S. cerevisiaeが、ＧＲＰ７８過剰発現内皮細胞またはＣＨＯ細胞に付着して侵入していたことをを示す。ＮＨＳビオチンを用いて内皮細胞表面タンパク質を標識し、その後に、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含むＰＢＳ中のｎ−オクチル−β−ｄ−グルコピラノシドおよびプロテアーゼ阻害剤を用いてこれを抽出した。標識タンパク質（２５０μｇ）を酵母細胞（２×１０８）と一緒に培養させ、その後に、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含むＰＢＳを用いた広範囲洗浄によって非結合タンパク質を回収した。有機体と結合した状態を保つ膜タンパク質を６Ｍの尿素で溶離させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離させ、抗ＧＲＰ７８ Ａｂを用いた免疫ブロット法によって特定した（パネルＡ）。１２ｍｍガラスカバースリップ上にスプリットした内皮細胞（パネルＢ）またはＣＨＯ親細胞またはＧＲＰ７８過剰発現細胞（パネルＣ）を用いて、付着およびエンドサイトーシス（微分蛍光分析法によって測定）分析を行った。ウイルコクソンの順位和検定の測定において、＊：空プラスミドまたはＣｏｔＨ１発現S. cerevisiaeの場合と比較してＰ＜０．００１、＊＊：ＣｏｔＨ１およびＣｏｔＨ２発現の場合と比較してＰ＜０．００１。３つの独立して行われる実験においてＮ＝９。データを中央値±四分位範囲で表す。
【図５５】パネルＡおよびＢは、抗ＣｏｔＨ３ Ａｂｓ（ＧＡＧＫＫＨＮＮＡＫＱＳＷＮＷ（配列番号３９）のペプチドに対して産生）によって、R. oryzaeが引き起こす内皮細胞のエンドサイトーシスおよび損傷が阻止されたことを示す。１２ｍｍガラスカバースリップ上にスプリットした内皮細胞を用いて付着およびエンドサイトーシス（微分蛍光分析法によって測定）分析する一方で、９６ウェルプレート５１Ｃｒ放出方法によって損傷を与えた。R. oryzae胞子発芽体の添加前に、ワクチン接種後のウサギから取得した５０μｇ／ｍｌの抗ＣｏｔＨ３またはワクチン接種前の同一ウサギから作製した血清（コントロール）と一緒に内皮細胞を１時間培養させた。ＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３の阻害（抗体がＣｏｔＨ２タンパク質に反応することため）によって、内皮細胞によるR. oryzaeのエンドサイトーシスが抑制され（実験の各集団の内皮細胞（約２００個）と相互作用している真菌細胞（＞７００個）から取得したデータ。コントロールでは平均して５９％の細胞にエンドサイトーシスが生じた）（パネルＡ）、内皮細胞の損傷を引き起こす真菌の能が低下する（パネルＢ）。ウイルコクソンの順位和検定の測定において、＊：ワクチン接種前の血清または場合と比較して＜０．０１。３つの独立したエンドサイトーシス実験内の各集団に用いたスライドはｎ＝６。２つの独立した損傷分析実験内の各集団に用いたウェルはｎ＝９。データを中央値±四分位範囲で表す。
【図５６】パネルＡ〜Ｃは、ＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３を標的とするＲＮＡ−ｉコンストラクトによって両遺伝子の発現が阻害され、細胞表面上のＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３タンパク質の合成が低下され、R. oryzaeの増殖または発芽パターンに対しては何ら作用が生じなかったことを示す。ＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３発現を標的とするＲＮＡ−ｉコンストラクト（ｐＲＮＡｉ）または空プラスミドを用いて、R. oryzaeを形質転換させた。２系統の形質転換体について、ｑＲＴ−ＰＣＲ法によってＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３発現を測定したところ、空プラスミドを用いて形質転換させた細胞の場合と比較して＞８０％の比で低下していたことが示された（パネルＡ）。抗ＣｏｔＨ抗体を用いたフローサイトメトリー試験によって、ＲＮＡ−ｉコンストラクトを用いて形質転換させたR. oryzae細胞では、空プラスミド、野生型細胞、またはネガティブコントロール（すなわち、抗ＣｏｔＨ抗体に代えて市販のＩｇＧで染色した野生型R. oryzae）の場合と比較してＣｏｔＨタンパク質の細胞表面発現が低下していたことが示された（パネルＢ）。ＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３発現が低下した２系統の形質転換体は、野生型細胞または空プラスミドを用いて形質転換させた細胞の場合と比較して類似の増殖速度を有していた（パネルＣ）。
【図５７】パネルＡ〜Ｃは、ＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３の発現を阻害することによって、ＧＲＰ７８過剰発現内皮細胞およびＣＨＯ細胞に侵入し損傷を与えるR. oryzaeの能が低下したことを示す。１２ｍｍガラスカバースリップ上にスプリットした内皮細胞を用いて付着およびエンドサイトーシス（微分蛍光分析法によって測定）分析する一方で、９６ウェルプレート５１Ｃｒ放出方法によって損傷を与えた。ＲＮＡ−ｉコンストラクトによって形質転換したR. oryzae胞子発芽体が引き起こす内皮細胞への侵入（パネルＡ）および損傷（パネルＢ）は、空プラスミドで形質転換した細胞の場合と比較して低下していた。ＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３を標的とするＲＮＡ−ｉによって作製した形質転換体が引き個起こすＧＲＰ７８過剰発現ＣＨＯ細胞の損傷は、ＣＨＯ親細胞の場合と比較して同等の損傷であった。これとは対照的に、空プラスミドまたは野生型R. oryzaeを用いて形質転換させたR. oryzae胞子発芽体が引き起こすＧＲＰ７８過剰発現ＣＨＯ細胞の損傷は、ＣＨＯ親細胞の場合と比較して著しく増大していた（パネルＣ）。ウイルコクソンの順位和検定法による測定において、＊：空プラスミドと比較してＰ＜ ０．００５、＊＊：野生型または空プラスミドと比較してＰ＜０．０１、‡：ＣＨＯ親細胞と比較してＰ＜０．０１。３つの独立したエンドサイトーシス実験内の各集団に用いたスライドはｎ＝６。３つの独立した損傷分析実験内の各集団に用いたウェルはｎ＝９。データを中央値±四分位範囲で表す。
【図５８】パネルＡ〜Ｃは、糖尿病性ケトアシドーシス発症マウス体内においてＣｏｔＨ２およびＣｏｔＨ３の発現を阻害することによってR. oryzaeの毒性が弱まったことを示す。パネルＡは、野生型R. oryzae、ＲＮＡ−ｉによるR. oryzaeの形質転換体、および空プラスミドによるR. oryzaeの形質転換体の３つの株の１つに気管内感染させたマウス（野生型R. oryzaeに対しはｎ＝１０、またはＲＮＡ−ｉまたは空プラスミドによるR. oryzaeの形質転換体に対してはｎ＝９）の生存時間を示す。空気感染による接種材料は、野生型、空プラスミド、またはＲＮＡ−ｉ細胞について、それぞれ２．４×１０３、２．８×１０３、および２．５×１０３の胞子とした。＊Ｐ＜０．００３ ｖｓ.野生型または空プラスミド感染マウス、ログランク検定。パネルＢは、野生型（１．７×１０３）細胞、空プラスミド（３．０×１０３）細胞、またはＲＮＡ−ｉ（３．１×１０３）細胞に気管内感染させた糖尿病性ケトアシドーシス発症マウス（各グループにつきｎ＝９）の肺および脳内の真菌量を示す。感染から２日目にマウスから器官を採取し、これを組織内の真菌量のためにSYBR Green アッセイ法を用いて処理した。データを中央値±四分位範囲で示した。野生型または空プラスミド感染マウスと比較して＊Ｐ＜０．００１、ウイルコクソン順位和検定。パネルＣは、野生型、空プラスミド、またはＲＮＡ−ｉコンストラクトに感染させたマウスから採取した肺および脳について、各ＣｏｔＨ遺伝子に対して特異的プライマー用いるｑＲＴ−ＰＣＲ法によって測定したＣｏｔＨ遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ発現を示す。データを平均±標準偏差で示した。＊Ｐ＜０．００１ ｖｓ.野生型または空プラスミド。
【図５９】野生型R. oryzaeまたは空プラスミドまたはＲＮＡ−ｉで形質転換したR. oryzaeに感染した糖尿病性ケトアシドーシス発症マウスから採取した肺の組織病理学検査を示す。過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色部分は、野生型R. oryzaeまたはＲＮＡ−ｉコンストラクトによって形質転換したR. oryzae以外の空プラスミドで形質転換したR. oryzaeに感染したマウスから採取した器官の多大な菌糸要素（矢印）を示す。
【図６０】ＧＡＧＫＫＨＮＮＡＫＱＳＷＮＷ（配列番号３９）のペプチド（Ａ）またはＭＧＱＴＮＤＧＡＹＲＤＰＴＤＮＮＫ（配列番号４０）のペプチド（Ｂ）に対して作製した抗ＣｏｔＨ抗体を用いた受動免疫法によって、マウスをR. oryzae感染から予防したことを示す。糖尿病性ケトアシドーシス発症マウスに対して、R. oryzae 99-880（野生型）の胞子（２．４×１０３）に気管内感染させる２時間前に、１ｍｇの抗ＣｏｔＨ ＩｇＧまたはワクチン接種前の血清（コントロール）を与えた。感染から３日目にポリクローナル抗体またはワクチン接種前の血清を第２の投与量で与えた。＊Ｐ＜０．０３ ｖｓ.ワクチン接種前の血清を与えたマウス。
【図６１】異なる真菌種のＣｏｔＨ３分子指標検出の特異性を示す。StepOnePlus Real-Time PCR machine（Applied Biosystems）内で増幅プロットを作製した。ｘ軸は増幅開始時からの経過時間を表し、ｙ軸は蛍光の増大（ΔＲｎ）を表す。閾値蛍光を水平方向の太線（これは、ネガティブコントロールの水サンプルについての平均に対して標準偏差×２を加算したものと等しい）として示す。Candida albicansまたはAspergillus fumigatus以外のR. oryzaeの１０５の胞子でスパイクした水サンプル（０．５ｍｌ）から信号を増幅させられる。
【図６２】R. oryzae ９９〜８８０の異なる接種材料でスパイクした水サンプル（０．５ｍｌ）のＣｏｔＨ３分子指標検出の特異性を示す。StepOnePlus Real-Time PCR machine（Applied Biosystems）内で増幅プロットを作製した。ｘ軸は増幅開始時からの経過時間を表し、ｙ軸は蛍光の増大（ΔＲｎ）を表す。閾値蛍光を水平方向の太線（これは、ネガティブコントロールの水サンプルについての平均に対して標準偏差×２を加算したものと等しい）として示す。
【図６３】血液中のRhizopus oryzae胞子の検出におけるＣｏｔＨ３分子指標検出の特異性を示す。StepOnePlus Real-Time PCR machine（Applied Biosystems）内で増幅プロットを作製した。ｘ軸は増幅開始時からの経過時間を表し、ｙ軸は蛍光の増大（ΔＲｎ）を表す。閾値蛍光を水平方向の太線（これは、ネガティブコントロールの水サンプルについての平均に対して標準偏差×２を加算したものと等しい）として示す。血液はｍ予防接種されたコントロールである。Ｒ：異なる接種材料のR. oryzae 99-880（たとえば、Ｒ１０＝３５０μｌの血液をスパイクするのに使用したR. oryzaeの１０個の胞子）。Ａ：A. fumigants。Ｃ：１０５細胞において３５０μｌの血液をスパイクするのに各々使用したC. albicans。
【図６４】クモノスケカビ属の検出におけるＣｏｔＨ３分子指標プローブの特異性を示す。StepOnePlus Real-Time PCR machine（Applied Biosystems）内で増幅プロットを作製した。ｘ軸は増幅開始時からの経過時間を表し、ｙ軸は蛍光の増大（ΔＲｎ）を表す。閾値蛍光を水平方向の太線（これは、ネガティブコントロールの水サンプルについての平均に対して標準偏差×２を加算したものと等しい）として示す。血液：予防接種を行っていない血液サンプル。９９〜８９２：R. oryzae 99-892。ATCC62417：R. microspores ATCC62417。R1000：R. oryzae 99-880。血液（３５０μｌ）を胞子（１０３）でスパイクするために全株を使用した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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