(57)【要約】本発明は遺伝子検査分野、特に遺伝子コピー数多型の検査方法に関する。この方法では、検査待ち遺伝子の配列と似て非なる内源性或いは外源性類似配列を選び、対応するプライマーを設計し、検査待ち遺伝子の配列と類似配列を同時に増幅させた後、融解曲線を分析する。検査待ち遺伝子にコピー数多型が発生する時、それの融解曲線の分析結果は野生型検査待ち遺伝子の分析結果と明らかな区別ができることで、検査の目的が達成できる。本発明の方法は遺伝子コピー数多型の検査だけでなく、染色体異数体の検査にも使われる。また、本発明の方法は遺伝子コピー数多型患者や染色体異数体患者のスクリーニング、通常の出生前検査に適用される他、非侵襲的な出生前診断にも適用される。本発明の方法は高速、正確、高感度、高特異性、高スループット、低コスト、無汚染などのメリットを持っている。【選択図】図１
2014531208.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）検査待ち遺伝子の配列に基づき、全遺伝子グループ範囲内から似て非なる内源性類似配列又は人工合成の対応する外源性類似配列を選ぶ工程と、
２）検査待ち遺伝子配列を類似配列と比較し、共同の増幅プライマーを設計する工程と、
３）共同のプライマーを採用してＰＣＲを実施し、一つの反応管の中に、検査待ち遺伝子配列と類似配列を同時に増幅させる工程と、
４）融解曲線でＰＣＲ産物を分析する工程と
を含むことを特徴とする遺伝子コピー数多型の検査方法。
【請求項２】
前記増幅プライマーの上に対応する蛍光グループ標識のオリゴヌクレオチドプローブ又は非標識のオリゴヌクレオチドプローブを設計することを特徴とする請求項１に記載の遺伝子コピー数多型の検査方法。
【請求項３】
前記類似配列と検査待ち遺伝子配列は同種関係、又は非同種関係であることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子コピー数多型の検査方法。
【請求項４】
前記類似配列と検査待ち遺伝子配列は一つの染色体に、又は違った染色体に位置することを特徴とする請求項２に記載の遺伝子コピー数多型の検査方法。
【請求項５】
前記類似配列は亜硫酸塩で転化して形成した類似配列を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の遺伝子コピー数多型の検査方法。
【請求項６】
前記共同の増幅プライマーはワンペアの増幅プライマー、又は数ペアの増幅プライマーの多部位検証であることを特徴とする請求項１又は２に記載の遺伝子コピー数多型の検査方法。
【請求項７】
前記共同の増幅プライマーはモールドと完全マッチ、又は不完全マッチすることを特徴とする請求項１又は２に記載の遺伝子コピー数多型の検査方法。
【請求項８】
前記融解曲線分析は通常融解曲線分析と高解像度融解曲線分析を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の遺伝子コピー数多型の検査方法。
【請求項９】
前記融解曲線分析は飽和ＤＮＡ染料を使ってＰＣＲ産物の融解曲線分析を直接実施し、或いは飽和ＤＮＡ染料と非標識オリゴヌクレオチドプローブを結合して融解曲線分析を実施し、或いは蛍光グループ標識のオリゴヌクレオチドプローブを採用して融解曲線分析を実施する含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の遺伝子コピー数多型の検査方法。
【請求項１０】
前記飽和ＤＮＡ染料はＥｖａＧｒｅｅｎ染料、ＬＣ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）  ＰＬＵＳ染料、ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ染料或いはＳＹＴＯ  ９染料を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の遺伝子コピー数多型の検査方法。
【請求項１１】
前記蛍光グループ標識のオリゴヌクレオチドプローブは加水分解プローブ、分子ビーコン、隣接プローブ、リング状プローブ或いは二本鎖プローブを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の遺伝子コピー数多型の検査方法。
【請求項１２】
前記融解曲線分析のデータ処理方式はノーマライゼーション処理、温度変化と差分値プロットを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の遺伝子コピー数多型の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子コピー数多型の検査分野に関し、特に類似配列を融解曲線分析と結合して遺伝子コピー数多型を検査する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コピー数多型（Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ，  ＣＮＶｓ）は最初、７０年前ショウジョウバエＢａｒ遺伝子を研究する過程中に発見したものである。その後、動植物遺伝子グループに普遍的に存在している現象と認められた。それは、遺伝子グループＤＮＡの中に大きい断片の欠失又は重複が存在する現象を指している。一部のコピー数多型は多態性範囲に属し、動植物の表現型に影響しないが、一部のコピー数多型は遺伝子配列を乱したり、遺伝子含有量を変わったりするので、遺伝子の表現に影響し、表現型差異や表現型適応を引き起こし、さらに、病気をも招く。保守的な予測では、少なくとも１０％の人間の遺伝子グループの配列にコピー数多型現象が存在している。機能遺伝子エリア、例えば、ＳＭＮ遺伝子、ＨＥＲ２遺伝子等にコピー数多型が発生する時、遺伝子産物数の異常が発生し、非正常表現型が現れ、関係病気の脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、乳癌などが発生する可能性がある。染色体異数性（Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ）も典型的なコピー数多型の現象であり、体細胞に染色体の欠失や増加で、違った危害程度の病状、例えば、ターナー症候群（４５，Ｘ）、クラインフェルター症候群（４７，ＸＸＹ）、ダウン症候群（４７，＋２１）等を引き起こす可能性がある。これらの遺伝病の罹患率が極高いだけでなく、生まれてから完全に癒さないため、これらの遺伝性疾患に対し、スクリーニングや出生前診断は極めて重要である。
【０００３】
現在、コピー数多型検査に運用する技術は主に以下である：
１．比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）：該技術の発展は今日に至って、既にマイクロアレイ技術（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）と結合して、マイクロアレイの比較ゲノムハイブリダイゼーション技術（Ａｒｒａｙ−ＣＧＨ）になった。該技術はすべての染色体又は染色体サブバンドレベルに対し、違った遺伝子グループ間のＤＮＡ配列のコピー数を検査するので、コピー数多型が発見できる。しかし、該技術の解像度はＭｂレベルで、より小さいコピー数断片の検査が難しい。同時に、該技術の操作が煩雑で、スループットが低く、時間が長い且つコストが高く、大量のモールドＤＮＡが必要なので、大範囲の普及にとって不利である。
【０００４】
２．多重連接プローブ増幅技術（ＭＬＰＡ）：ＭＬＰＡ技術は２００２年から発展してきたコピー数の検査方法である。現在、例えば、ＳＭＡ、ダウン症候群等の病気に対応するキット検査が既に存在した。該技術は相対正確な定量機能を持っているが、プローブ製造が複雑で、操作工程が煩雑で、時間が掛かる面もある。また、キャピラリー電気泳動法を分析手段として使うので、スループットが低く、コストが高い。さらに、操作が開放式であるため、ＰＣＲ産物の汚染が発生しやすい。
【０００５】
３．高解像度融解曲線分析（ＨＲＭ）：ＨＲＭは２００３年に発明され、近年注目された一つの技術である。それは精確な変温速率制御及びＤＮＡ飽和染料の指示を通して、ＰＣＲ産物配列の融解温度を研究してＰＣＲ産物を鑑定する技術である。該技術には高速、安価、高スループット等のメリットがあることで、一塩基多型（ＳＮＰｓ）、遺伝子突然変異（Ｍｕｔａｔｉｏｎ）やエピジェネティク（Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ）等の研究において広く運用されている。現在、ＨＲＭを遺伝子コピー数多型研究に運用する報道が既に出てくるが、すべては検査待ち配列内部のＳＮＰ部位を検査することを通し、実現する。原理は、検査待ち遺伝子のあるＳＮＰ部位はヘテロ接合体であり、コピー数多型が発生する時、該ＳＮＰ部位のヘテロ接合比率が変わることにより、ＨＲＭ分析で差別が出てくる。該原理には幾つかの不足がある：まず、該方法が実現できる条件は、ＳＮＰ部位は必ずヘテロ接合体で、もしそうでなければ、ＨＲＭは二つの対立遺伝子配列の区別がつかない。それで、単個のＳＮＰ部位は一部の検査グループにしか使わない、全部の検査待ち群体を包括したいときには多数のＳＮＰ部位を採用して連合検査する必要がある。そうすると、実験のコストや設計の難しさが増加するばかりでなく、検査のスループットも下がった。且つ、単独のヌクレオチドの差異は融解曲線への影響が小さく、あるいは差異があっても、融解曲線の偏移に影響しない。これらのことは検査感度が低い主要原因である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的として、ある遺伝子コピー数多型の検査方法を提供する。該方法は類似配列を融解曲線分析と組み合わせて遺伝子コピー数多型を検査する方法である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記の目的を達成するため、本発明は以下の技術手段を採用し、
検査待ち遺伝子の配列に基き、全遺伝子グループ範囲内から似て非なる内源性類似配列（内標法）又は人工合成の対応する外源性類似配列（外標法）を選び、
検査待ち遺伝子配列を類似配列と比較し、共同の増幅プライマーを設計し、必要により、対応の蛍光グループマークのオリゴヌクレオチドプローブ又は非マークのオリゴヌクレオチドプローブを設計することもでき、
共同のプライマーを採用してＰＣＲを実施し、一つの反応管の中に、検査待ち遺伝子配列と類似配列を同時に増幅させ、
融解曲線でＰＣＲ産物を分析する。
【０００８】
前記類似配列と検査待ち遺伝子配列は同種関係、又は非同種関係である。
【０００９】
前記類似配列と検査待ち遺伝子配列は一つの染色体に、又は違った染色体に位置する。
【００１０】
前記類似配列はエピジェネティクスの研究方法、例えば、重亜硫酸塩転化（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）で形成した類似配列を含む。
【００１１】
前記共同の増幅プライマーはワンペアの増幅プライマー、又は数ペア増幅プライマーの多部位検証である。
【００１２】
前記共同の増幅プライマーはモールドと完全マッチ、又は不完全マッチする。
【００１３】
前記融解曲線分析は通常融解曲線分析（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）と高解像度融解曲線分析（ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を含む。
【００１４】
前記融解曲線分析は飽和ＤＮＡ染料を使ってＰＣＲ産物の融解曲線分析を直接実施し、或いは飽和ＤＮＡ染料と非標識オリゴヌクレオチドプローブを結合して融解曲線分析を実施し、或いは蛍光グループ標識のオリゴヌクレオチドプローブを採用して実施する融解曲線分析を含む。
【００１５】
前記飽和ＤＮＡ染料はＥｖａＧｒｅｅｎ染料、ＬＣ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）  ＰＬＵＳ染料、ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ染料或いはＳＹＴＯ  ９染料を含むが、これらに限らない。
【００１６】
前記蛍光グループ標識のオリゴヌクレオチドプローブは加水分解プローブ、分子ビーコン、隣接プローブ、リング状プローブ或いは二本鎖プローブ等に限らない。
【００１７】
前記融解曲線分析のデータ処理方式はノーマライゼーション処理、温度変化と差分値プロット等に限らない。
【００１８】
前記方法は遺伝子コピー数多型の検査に適用され、ＳＭＮ遺伝子、ＨＥＲ２遺伝子等の検査を含むが、これらに限らない；染色体の異数体検査にも適用され、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、ダウン症候群等の検査を含むが、これらに限らない。
【００１９】
前記方法には極高の検査感度が持っているので、通用のスクリーニングや出生前診断サンプルに運用できる以外、キャメラ検査及び母体末梢血中胎児の遊離ＤＮＡ（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｆｅｔａｌ  ＤＮＡ）又はＲＮＡサンプルの検査にも適用される。それで、本発明は非侵襲的な出生前診断（
ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｒｅｎａｔａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）にも使える。
【００２０】
本発明に言及した類似配列は、２本配列の中に少なくとも２０％の塩基が同じであることを指し、もっといいのは少なくとも７０％の塩基が同じ、一番よいのは少なくとも９０％の塩基が同じことである；又は、２本増幅される類似配列の中に、塩基の違う位置（単個塩基の位置）は１−３０個であり、もっといいのは塩基違いの位置は２−２０個であり、一番よいのは塩基違いの位置は２−１０個であること、他の塩基が同じである。理論上から見ると、少なくとも１個の違う塩基があるならば、検査はできる。
【００２１】
前記配列は、単個遺伝子の完全配列又は単個遺伝子の一部配列でもいいし、多数遺伝子からなる配列でも良い。そのため、塩基数も対応して変化する。つまり、ＰＣＲで増幅されることさえできれば良い。
【００２２】
該方法の主要原理を図１に示す。遺伝子グループの中には沢山の類似配列（ｓｉｍｉｌａｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）があり、これらの配列は同種遺伝子（ｐａｒａｌｏｇｕｅ）、例え、ＺＦＸ遺伝子とＺＦＹ遺伝子、Ｄｓｃａｍ遺伝子とＤｓｃａｍ３遺伝子等によるものでもよいし、非同種遺伝子によるものでもよい。遺伝子グループに目的遺伝子の類似配列が存在しない時、一段の対応する外源性類似配列を導入する又は人工合成することが出来る。遺伝子グループ中の内源性類似配列を採用する方法は内標法と呼び、人工合成又は外源性相類似配列を導入する方法は外標法と呼ぶ。検査待ち遺伝子配列と類似配列のヌクレオチド組成の大部分が同じであり、中には少しの違いが入り込み、まるで多数の天然ＳＮＰヘテロ接合部位のようである。融解曲線分析の温度変化ヘテロ接合過程中、検査待ち配列と類似配列がお互いに作用して特定の融解曲線になる。検査待ち遺伝子にコピー数多型が発生する時、検査待ち配列と類似配列の比例も伴って変化し、形成した融解曲線は野生型検査待ち遺伝子と明らかな区別が出てくる。検査待ち遺伝子配列と類似配列の区別は単個ＳＮＰの区別より遥かに大きいので、理論上、類似配列を採用した融解曲線の分析は単個ＳＮＰ分析よりもっと高い感度や特異性を持つ。且つ、ＳＮＰ部位にホモ接合とヘテロ接合の区別が存在することと違い、類似配列の差異は固定であるので、すべての検査待ちグループに応用できる。
【００２３】
染色体の異数体により、染色体全体上の関係遺伝子にコピー数多型が発生する。そのため、本発明は前記染色体上の遺伝子を検査することを通し、染色体の異数体を検査する目的を達成することができる。
【００２４】
同時に、ＣＮＶは人間の遺伝子グループに存在するだけでなく、他の動植物の遺伝子グループの中にも存在している。例えば、最近トウモロコシのＣＮＶ関係の報道（Ａｌｌｅｌｉｃ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍａｉｚｅ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ａｒｒａｙ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．  Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ．  ２０１０  Ｊａｎ；１２０（２）：３５５−６７）がある。そのため、本発明は動植物の遺伝子グループのＣＮＶ検査にも運用できる。
【００２５】
現有キット検査及び関係技術と比べ、本発明には以下のメリットがある：
１）デザインが簡単、結果が正確であること；
２）ＳＮＰ部位にはヘテロ接合の制限がないので、すべての検査待ちグループに応用できること；
３）検査待ち配列と類似配列の区別は単個ＳＮＰの区別より高く、融解曲線への影響がもっと大きいので、検査感度や特異性が高いこと；
４）高感度や高特異性を持つので、微量標本の検査に適用する。例えば、乾燥血液スポットの標本、羊水細胞、絨毛細胞のサンプル、母体末梢血中の胎児遊離核酸のサンプル、植物花粉のサンプルなど。
５）閉鎖式操作であるため、ＰＣＲ産物の汚染が避けられること；
６）操作便利、高速（１ｈ）、安価、高スループットであること；
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】類似配列を融解曲線分析と結合して遺伝子コピー数多型を検査する原理図である。（Ａ）は２１号染色体上の目標配列検査を例として、１２号染色体から対応の内源性類似配列を選ぶ（内標法）。もし内源性類似配列がないならば、一段の目標配列と類似する外源性配列を人工合成し、又は導入してもよい（外標法）。（Ｂ）は内標法を例として、目標配列と類似配列の内部には３個のヌクレオチドの差異があり、双方向矢印でマークする。大文字はプライマーの結合位置である。（Ｃ）は同じペアのプライマーを採用してＰＣＲで増幅され、及び融解曲線分析された後、データ処理を通し、２１三体を正常対照エリアと区分することができる。
【図２】染料法を使って、２１、１８、１３三体を検査する図である。融解曲線中の点線は三体標本であり、実線は正常対照である。統計学分析中、ブロックの上下境界は２５％と７５％の信頼区間を指し、ブロック中の点は平均値であり、ブロック内の横線は中値であり、エラーバーは５％と９５％の信頼区間を指す。
【図３】染料法を使って性染色体の異数体を検査する図である。融解曲線中の点線は異数体標本であり、実線は正常対照である。統計学分析中、ブロックの上下境界は２５％と７５％の信頼区間を指し、ブロック中の点は平均値であり、ブロック内の横線は中値であり、エラーバーは５％と９５％の信頼区間を指す。
【図４】正常遺伝子グループＤＮＡ背景の２１三体ＤＮＡの検査図である。（Ａ）は違った比例の２１三体ＤＮＡの融解曲線図である。毎本の融解曲線は１０個のサンプルの平均値を求めて得るものである。（Ｂ）は統計学分析である。ブロックの上下境界は２５％と７５％の信頼区間を指し、ブロック中の点は平均値であり、ブロック内の横線は中値であり、エラーバーは最大値と最小値を指す。
【図５】蛍光標識プローブ法でクラインフェルター症候群を検査する図である。（Ａ）は１０例のクラインフェルター症候群（４７、ＸＸＹ）サンプルと正常対照（４６、ＸＹ）サンプルの融解曲線のピーク図である。（Ｂ）は統計学分析である。ブロックの上下境界は２５％と７５％の信頼区間を指し、ブロック中の点は平均値であり、ブロック内の横線は中値であり、エラーバーは５％と９５％の信頼区間を指す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下は図と好ましい実施形態をまとめて、本発明の内容をいっそう詳しく説明する。
【実施例】
【００２８】
以下、４つの実施例と図により本発明についてさらに詳細に説明し、本発明の具体的な実施例を列挙するが、これらの実施例はただの説明であり、本発明のすべての可能性を表示しない、本発明はこれらの実施例に言及した材料、反応条件又はパラメーターに限定されるものではない。当業者が本発明の原理に基づいて他の材料や反応条件を利用して本発明に説明した遺伝子コピー数多型検査を実施する可能性があり，それらは本発明に説明した基本概念から排除するものではない。
【００２９】
実施例１  染料法で人間常染色体のコピー数多型を検査する
２１、１８、１３三体は人間によくある三種常染色体の異数体である。２１三体はダウン症候群とも呼び、生きている胎児中の発生率は約１／７００である。ダウン症候群には一系列の遺伝病があり、学習障害、知的障害や身体障害など高度畸形の原因となる。生まれた後、癒すことが出来ないので、ダウン症候群の出生前診断は極めて重要である。１８三体と１３三体は発病率は約１／５０００と１／２５０００であり、病気になる胎児にはひどい畸形や生理欠陥があるので、出生前の検査も同じく非常に重要である。
【００３０】
材料
１、  器械
リアルタイム蛍光ＰＣＲ機、移液管、遠心機
２、  プライマー設計
本発明は２１号染色体上の目標配列に対して７号染色体から一段類似配列を選択した；１８号染色体上の目標配列に対して９号染色体から一段類似配列を選択した；１３号染色体上の目標配列に対して１７号染色体から一段類似配列を選択した。合わせて３ペアのプライマーを設計して３本染色体の異常状況を其々測定した（表１）、プライマーの配列は以下である：
Ｔ２１−Ｆ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１
Ｔ２１−Ｒ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２
Ｔ１８−Ｆ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３
Ｔ１８−Ｒ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４
Ｔ１３−Ｆ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５
Ｔ１３−Ｒ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６
３、試薬
２  ｘ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｍａｓｔｅｒ  （Ｒｏｃｈｅ）；Ｍｇ２＋。
【００３１】
ニ、方法
１、サンプルの選択
２１三体ＤＮＡサンプル４８例、１８三体ＤＮＡサンプル１０例、１３三体ＤＮＡサンプル３例、正常対照ＤＮＡサンプル４８例。前記サンプルはすべて染色体核型分析で検証された。
【００３２】
２、ＰＣＲ増幅とＨＲＭ
ＰＣＲ反応体系は１  ｘ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｍａｓｔｅｒ、２．５  ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｍｇ２＋、２００  ｎｍｏｌ／Ｌ  上下流プライマー、１００  ｎｇ  遺伝子グループＤＮＡを包括する。
【００３３】
ＰＣＲとＨＲＭ反応は器械Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０ＩＩを使って実施し、以下の条件で増幅測定する：
第一段階：９５℃  １０  ｍｉｎ；
第二段階：９５℃  １５  ｓｅｃ、６０℃  １５  ｓｅｃ、７２℃  １５  ｓｅｃ、４０回循環；
第三段階：９５℃  １０  ｓｅｃ、４０℃  １０  ｓｅｃ、６０℃から９５℃まで  毎秒２０回の蛍光を採集する、５０℃  １０  ｓｅｃ。
【００３４】
３、結果分析
順次でノーマライゼーション処理、温度変化と差分値プロットを実施する。最後は野生型サンプルを基準として分析する。
【００３５】
図２から見ると、２１、１８、１３三体患者のＤＮＡサンプルは正常対照のＤＮＡサンプルと明らかな区分ができる。２１三体と１８三体検査の臨床感度と特異性は皆１００％である。１３三体検査の臨床感度は１００％、臨床特異性は９７．９％である。
【００３６】
表１  染色体にある２１、１８、１３三体検査用類似配列の位置
【００３７】
【表１】
2014531208.tif 000003
【００３８】
実施例２  染料法で人間の性染色体コピー数多型を検査する
２１三体以外、出生後生存できる染色体異数体の多くは性染色体異数体であり、例えば、４５，Ｘと４７，ＸＸＹ等である。性染色体の異数体発生率が高い、例えば、女性中４５，Ｘの比例は約１／２０００、男性中４７，ＸＸＹの比例は約１／５００である。性染色体異数体は患者の表現型発育、特に生殖系統に対して一定の影響がある。性染色体異数体が完全に癒さないけれども、性染色体異数体が早期に発見され、その後の発育期間にホルモン治療をかければ、病状を有効的に軽減することが出来る。そのため、性染色体の早期、高速診断が極めて重要である。
【００３９】
一、材料
１、器械
リアルタイム蛍光ＰＣＲ機、移液管、遠心機
２、プライマー設計
本発明はＸ染色体上の二つの目標配列に対して３号染色体とＹ染色体から別々に一段の類似配列を選択した。これで、Ｘ染色体と常染色体の数比例が分析できる以外、Ｘ染色体とＹ染色体の数比例を分析することもできる。合わせって２ペアのプライマーを設計して検査した（表２）。プライマー配列は以下である：
Ｘ３−Ｆ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７
Ｘ３−Ｒ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８
ＸＹ−Ｆ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９
ＸＹ−Ｒ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０
３、試薬
２  ｘ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｍａｓｔｅｒ  （Ｒｏｃｈｅ）；Ｍｇ２＋。
【００４０】
ニ、方法
１、サンプルの選択
ターナー症候群（４５，Ｘ）ＤＮＡサンプル８例、クラインフェルター症候群（４７，ＸＸＹ）ＤＮＡサンプル１４例、正常男性ＤＮＡサンプル２４例、正常女性ＤＮＡサンプル２４例。前記サンプルはすべて染色体核型分析で検証された。
【００４１】
２、ＰＣＲ増幅とＨＲＭ
ＰＣＲ反応体系は１  ｘ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｍａｓｔｅｒ，２．５  ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｍｇ２＋，２００  ｎｍｏｌ／Ｌ  上下流プライマー，１００  ｎｇ遺伝子グループＤＮＡを包括する。
【００４２】
ＰＣＲとＨＲＭ反応は器械Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０ＩＩを使って実施し、以下の条件で増幅測定する：
第一段階：９５℃  １０  ｍｉｎ；
第二段階：９５℃  １５  ｓｅｃ，６０℃  １５  ｓｅｃ，７２℃  １５  ｓｅｃ，４０回循環；
第三段階：９５℃  １０  ｓｅｃ，４０℃  １０  ｓｅｃ，６０℃から９５℃まで  毎秒は２０回の蛍光を採集する，５０℃  １０  ｓｅｃ。
【００４３】
３、結果分析
順次でノーマライゼーション処理、温度変化と差分値プロットを実施する。野生型サンプルを基準として分析を行い、最後は表３に基づいて結果を判断する。
【００４４】
図３から見ると、ターナー症候群患者とクラインフェルター症候群のＤＮＡサンプルは正常対照のＤＮＡサンプルと明らかな区分ができる。二つの検査の臨床感度と特異性は皆１００％である。
【００４５】
表２  染色体にある性染色体異数体検査用類似配列の位置
【００４６】
【表２】
2014531208.tif 000004
【００４７】
表３  性染色体異数体の結果判断表
【００４８】
【表３】
2014531208.tif 000005
【００４９】
実施例３  正常遺伝子グループＤＮＡ背景の２１三体ＤＮＡの測定
キャメラは二種或いは二種以上遺伝子型細胞を含む個体を指している。異常細胞の比例
差異により、キャメラは一系列の違う程度の病状を表現する。一般的に言うと、異常細胞の比例の大きい方の病状がもっとひどい。
【００５０】
現在、非侵襲的な出生前診断は主に母体血中の胎児遊離ＤＮＡ或いはＲＮＡを検査して胎児の遺伝子情報を得る診断である。侵入式サンプリングのリスクが避けられるので、未来出生前診断の発展方向だと思われる。研究で示すように、妊娠初期胎児遊離ＤＮＡ数量は約母体血漿中の総遊離ＤＮＡ数量の約１０％を占める。低い含有量で、測定技術に対する要求は非常に厳格である。
【００５１】
本発明がキャメラ検査や非侵襲的な出生前診断での応用能力を説明するため、本実施例は一系列の違う濃度比例の２１三体ＤＮＡと正常遺伝子グループＤＮＡの混合サンプルを採用し、キャメラ及び胎児遊離ＤＮＡが母体血漿中の状況を模擬し、その中の２１三体のＤＮＡを検査した。
【００５２】
一、材料
１、器械
リアルタイム蛍光ＰＣＲ機、移液管、遠心機
２、プライマー設計
本発明は内標法を採用し、２１号染色体と７号染色体から類似配列を選択して検査対象とする。１ペアのプライマーを設計して増幅させた（表１）。プライマー配列は以下である：
Ｔ２１−Ｆ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１
Ｔ２１−Ｒ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２
３、試薬
２  ｘ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｍａｓｔｅｒ  （Ｒｏｃｈｅ）；Ｍｇ２＋。
【００５３】
ニ、方法
１、サンプルの選択
正常対照ＤＮＡサンプル１０例、２１三体ＤＮＡサンプル１０例。前記サンプルはすべて染色体核型分析で検証された。
【００５４】
混合された正常ＤＮＡサンプルを背景とし、一系列の２１三体ＤＮＡ濃度の混合溶液を配合した。うち、２１三体ＤＮＡの比例は其々５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、０でした。
【００５５】
２、ＰＣＲ増幅とＨＲＭ
ＰＣＲ反応体系は１  ｘ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｍａｓｔｅｒ，２．５  ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｍｇ２＋，２００  ｎｍｏｌ／Ｌ  上下流プライマー，１０  ｎｇ遺伝子グループＤＮＡを包括する。
【００５６】
ＰＣＲとＨＲＭ反応は器械Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０ＩＩを使って実施し、以下の条件で増幅測定する：
第一段階：９５℃  １０  ｍｉｎ；
第二段階：９５℃  １５  ｓｅｃ，６０℃  １５  ｓｅｃ，７２℃  １５  ｓｅｃ，４０回循環；
第三段階：９５℃  １０  ｓｅｃ，４０℃  １０  ｓｅｃ，６０℃から９５℃まで  毎秒は２０回の蛍光を採集する，５０℃  １０  ｓｅｃ。
【００５７】
３、結果分析
順次でノーマライゼーション処理、温度変化と差分値プロットを実施する。最後は正常対照ＤＮＡサンプルを基準として分析を行う。
【００５８】
図４から見ると、２１三体ＤＮＡの含有量が２０％より高い時、本発明は２１三体ＤＮＡの存在を明確に検査することができる。即ち、実際の応用中、異常細胞の嵌合比例が２０％を超えるキャメラが検出できる。同様、胎児の遊離ＤＮＡ含有量を１０％から２０％に富化させたら、本発明で明確に検出できる。関連の富化技術も多く報道された。前記の例は本発明がキャメラ検査や非侵襲的な出生前診断における応用能力を表した。
【００５９】
実施例４  蛍光標識プローブ法でクラインフェルター症候群を検査する
クラインフェルター症候群（４７，ＸＸＹ）は男性精巣機能不全症の主要遺伝原因であり、男性での発生比例は１／５００程度である。クラインフェルター症候群で男性が両性性徴を持ち、且つ、大人になった後、患者の睾丸中に活性精子が存在していないので、生育ができない。もし、早期からクラインフェルター症候群患者にホルモン治療を掛けると、症状を軽くすることができる。且つ、青春期に活性精子がもらえれば、子孫繁殖もできるようになる。そのため、クラインフェルター症候群の早期スクリーニングや高速診断が極めて重要である。
【００６０】
一、材料
１、器械
リアルタイム蛍光ＰＣＲ機、移液管、遠心機
２、プライマーとプローブの設計
本発明はＸ染色体とＹ染色体上の一段の類似配列を採用し、Ｘ染色体とＹ染色体の数比例を分析した（表２）。本発明は二本の類似配列中の同じ部分を選択してプライマーの結合部位とし、二本の類似配列中の差異部分を選択してプローブの結合部位とした。ワンペアの増幅プライマーと一本の検査プローブを設計した。検査プローブＸＹ−Ｐは加水分解プローブであり、その
５’末端はＦＡＭ蛍光グループで標記され、３’末端はＢＨＱ１グループで標記される。検査プローブはＸ染色体上の配列と完全に補い合い、Ｙ染色体上の配列と不完全に補い合うので、違った融解曲線になった。プライマーとプローブの配列は以下である：
ＸＹ−Ｆ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９
ＸＹ−Ｒ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０
ＸＹ−Ｐ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１
３、試薬
１×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ：  １０  ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３），５０  ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ；Ｍｇ２＋；ホットスタート酵素；ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ。
【００６１】
ニ、方法
１、サンプルの選択
クラインフェルター症候群（４７，ＸＸＹ）ＤＮＡサンプル１０例、正常男性ＤＮＡサンプル１０例。前記サンプルはすべて染色体核型分析検証された。
【００６２】
２、ＰＣＲ増幅とＨＲＭ
ＰＣＲ反応体系は１  ｘ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ，２．５  ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｍｇ２＋，８０  ｎｍｏｌ／Ｌ  ＸＹ−Ｆプライマー，８００  ｎｍｏｌ／Ｌ  ＸＹ−Ｒプライマー，４００  ｎｍｏｌ／Ｌ  ＸＹ−Ｐプローブ，１００  ｎｇ  遺伝子グループＤＮＡを包括する。
【００６３】
ＰＣＲと融解曲線反応は器械Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０ＩＩを使って実施し、以下の条件で増幅測定する：
第一段階：９５℃  １０  ｍｉｎ；
第二段階：９５℃  １５  ｓｅｃ，６３℃  ２０  ｓｅｃ，７２℃  ２０  ｓｅｃ，４０回循環；
第三段階：９５℃  １０  ｓｅｃ，３０℃  １０  ｓｅｃ，３０℃から７０℃まで  毎秒は５回の蛍光を採集する，５０℃  １０  ｓｅｃ。
【００６４】
３、結果分析
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０ＩＩ結果分析ソフトウエア中の融解曲線分析機能を選択して融解曲線のピーク図を得る。典型的な融解曲線のピーク図は図５Ａに示すように、Ｘ染色体とＹ染色体上の増幅産物は其々一つのピークと対応し、二つのピークの間には谷がある。公式：相対ピーク値＝（Ｙピーク値−谷値）／（Ｘピーク値−谷値）により、Ｘ染色体とＹ染色体の相対数量情報が入手できるので、クラインフェルター症候群の検査ができる。
【００６５】
図５Ｂの統計学分析から見ると、クラインフェルター症候群患者ＤＮＡサンプルと正常対照ＤＮＡサンプルの相対ピーク値のはっきり区分でき、差異が明らかである（Ｐ＝０）。そのため、この技術はクラインフェルター症候群を正確に診断することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
測定待ち遺伝子にコピー数多型が発生する時、その融解曲線分析結果は野生型測定待ち遺伝子の分析結果とはっきり区分でき、検査の目的を達成する。
【図１】
2014531208.tif 000006
【図２】
2014531208.tif 000007
【図３】
2014531208.tif 000008
【図４】
2014531208.tif 000009
【図５】
2014531208.tif 000010
【配列表】
2014531208000001.app
【国際調査報告】
2014531208.tif 000011
2014531208.tif 000012
2014531208.tif 000013
2014531208.tif 000014
2014531208.tif 000015
2014531208.tif 000016
2014531208.tif 000017
2014531208.tif 000018
2014531208.tif 000019