(57)【要約】本発明は、βへリックス構造を有する成熟多糖リアーゼの変異体であって、Ｎ末端および／またはＣ末端の切断を含み、成熟多糖リアーゼのβへリックス構造の少なくとも９０％から実質的に構成されている変異体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
βへリックス構造を有する成熟多糖リアーゼの変異体であって、Ｎ末端および／またはＣ末端の切断を含み、成熟多糖リアーゼのβへリックス構造の少なくとも９０％から構成されている、変異体。
【請求項２】
上記Ｎ末端および／またはＣ末端の切断は少なくとも１０個のアミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
低アレルゲン性であることを特徴とする請求項１または２に記載の変異体。
【請求項４】
βへリックス構造の一部である最初と最後のβシートが無傷の状態を保っていることを条件として、上記Ｎ末端の切断は、多糖リアーゼのＮ末端から、当該βへリックス構造の最初のβシートのＮ末端の前にある約１〜５０個のアミノ酸残基まで伸びている領域を含み、上記Ｃ末端の切断は、多糖リアーゼのＣ末端から、当該βへリックス構造の最後のβシートのＣ末端の後ろにある約１〜５０個のアミノ酸残基まで伸びている領域を含むことを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の変異体。
【請求項５】
上記多糖リアーゼはペクチン酸リアーゼであり、好ましくはアレルゲン性ペクチン酸リアーゼであることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の変異体。
【請求項６】
上記アレルゲンは、Ａｍｂ ａ 1、Ａｒｔ ｖ ６，Ｃｈａ ｏ １，Ｃｕｐ ａ １，Ｃｒｙ ｊ １，およびＪｕｎ ａ １からなる一群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の変異体。
【請求項７】
Ａｍｂ ａ １由来の変異体は配列番号１のアミノ酸配列から実質的に構成され、Ｃｒｙ ｊ １由来の変異体は配列番号２のアミノ酸配列から実質的に構成され、Ｃｕｐ ａ １由来の変異体は配列番号３のアミノ酸配列から実質的に構成され、Ｊｕｎ ａ １由来の変異体は配列番号４のアミノ酸配列から実質的に構成され、Ｃｈａ ｏ １由来の変異体は配列番号５のアミノ酸配列から実質的に構成され、Ａｒｔ ｖ ６由来の変異体は配列番号６のアミノ酸配列から実質的に構成されることを特徴とする請求項６に記載の変異体。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項に記載の変異体と直接またはリンカーを介して融合されている分泌シグナル配列を含む、ポリペプチド。
【請求項９】
上記分泌シグナル配列は、ＰｅｌＢ、ＰｅｌＣ、ＯｍｐＡ、ＳｔＩＩ、ＥＸ、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ＰｈｏＥ、ＭａｌＥ、ＯｍｐＣ、ＬＰＰ、ＬａｍＢ、ＯｍｐＴ、ＬＴＢ、ホスファターゼ（ｐｈｏ１）、インベルターゼ（Ｓｕｃ）分泌シグナル配列、およびα接合因子プレプロ配列からなる一群から選択されることを特徴とする請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
上記リンカーはプロテアーゼ切断部位を含むことを特徴とする請求項８または９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
上記プロテアーゼ切断部位は、トロンビン、キモトリプシン、トリプシン、ペプシン、スブチリシン、エンテロキナーゼ、因子Ｘａ、ＴＥＶプロテアーゼ、およびＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼによって切断可能であり、
ＴＥＶプロテーゼが特に好適であることを特徴とする請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜７の何れか１項に記載の多糖リアーゼの変異体または請求項８〜１１の何れか１項に記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項１３】
上記核酸分子のヌクレオチド配列はコドン最適化および／またはコドン整合化が行われていることを特徴とする請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１４】
Ａｍｂ ａ １の変異体をコードする核酸分子は配列番号７または８のヌクレオチド配列を有し、Ｃｒｙ ｊ １の変異体をコードする核酸分子は配列番号９または１０のヌクレオチド配列を有し、Ｃｕｐ ａ １の変異体をコードする核酸分子は配列番号１１または１２のヌクレオチド配列を有し、Ａｒｔ ｖ ６の変異体をコードする核酸分子は配列番号１３または１４のヌクレオチド配列を有し、Ｊｕｎ ａ １の変異体をコードする核酸分子は配列番号１５または１６のヌクレオチド配列を有し、Ｃｈａ ｏ １の変異体をコードする核酸分子は配列番号１７または１８のヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項１２または１３に記載の核酸分子。
【請求項１５】
請求項１２〜１４の何れか１項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１６】
請求項１〜７の何れか１項に記載のβへリックス構造を有する多糖リアーゼ変異体または請求項８〜１１の何れか１項に記載のポリペプチドの組み換え作製を行う方法であって、
（ａ）請求項１２〜１４の何れか１項に記載の核酸分子または請求項１５に記載のベクターを含む宿主細胞を培地中で培養する工程、
（ｂ）当該培地の上清から当該多糖リアーゼ変異体または当該ポリペプチドを単離する工程を含む、方法。
【請求項１７】
ポリペプチドの多糖リアーゼから分泌シグナル配列を切断可能なプロテアーゼに対して、上記工程（ｂ）で単離した上記多糖リアーゼ変異体または上記ポリペプチドをインキュベートすることによって、上記多糖リアーゼ変異体または上記ポリペプチドから分泌シグナル配列が分離されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、多糖リアーゼの変異体およびその作製方法に関する。
【０００２】
βへリックス構造を含む植物多糖リアーゼでは、宿主細胞内に組み換え発現が可能になることはほぼない（例えば、Takai T. Int Arch Allergy Immunol (2010);153(4):431-3 and Liu Z. et al. Int Arch Allergy Immunol (2010);153(4):347-58参照）。
【０００３】
このようなタンパク質の組み換え発現率を向上させるために、幾つかの手法を使用してもよい。例えば、リアーゼが発現され得る宿主細胞に核酸分子のコドン使用頻度を適応させてもよい。これに代わる手法では、対象タンパク質を最も効率的に露出することが可能な宿主細胞を特定することもできる。しかし、これら何れの手法によっても、βへリックス構造を有する植物多糖リアーゼ（Ａｍｂ ａ １およびＣｕｐ ａ １などのアレルゲンを含む）を組み換え作製できるようにするという課題を解決するには至らないと考えられる。
【０００４】
Liu Z. et al. (Int Arch Allergy Immunol (2010);153(4):347-58)は、Ｊｕｎ ａ １のタンパク質分解部位を隠すことが予測される、ペプチドの終端となるシグナルペプチドを含むＪｕｎ ａ １のＮ末端切断を構築した。切断されたＪｕｎ ａ １はウイルスベクターに挿入され、タバコ植物の形質転換はそれぞれのウイルス粒子を用いて行われたが、タバコの葉内での切断Ｊｕｎ ａ １の発現に関して成功は収められていない。
【０００５】
ＷＯ２０１１／０５２６９７号では、スギ花粉由来のアレルゲン性ポリガラクツロナーゼであるＣｒｙ ｊ ２がワクチン候補として作製された。このアレルゲンは切断されかつシャッフルされた。
【０００６】
ＷＯ２００７／１４０５０５号では、低アレルゲン性アレルゲンを生成するための融合フラグメントとしての活用可能性に関してＡｍｂ ａ １の多様なフラグメントが開示されている。
【０００７】
ＷＯ２００４／０９００９９号は、ペクチン酸リアーゼおよびその変異体に関する。上記国際特許出願のペクチン酸リアーゼは切断を含んでいてもよい。
【０００８】
ＵＳ２００９／３０４６６５号では、ヒアルロン酸分解酵素の作製が記載され、膜内の結合に関与するＧＰＩアンカーがＣ末端切断によって除去されている。
【０００９】
ＷＯ０２／０７２８３３号では、アレルゲンＣｕｐ ｓ １のフラグメントが開示されている。
【００１０】
本発明の目的は、βへリックス構造を含む多糖リアーゼを作製する方法および手段を提供することである。本発明のさらなる目的は、βへリックス構造を含むタンパク質（特に多糖リアーゼ）由来の低アレルゲン性分子およびその作製方法を提供することである。
【００１１】
したがって本発明は、βへリックス構造を有する成熟多糖リアーゼの変異体であって、Ｎ末端および／またはＣ末端の切断を含み、成熟多糖リアーゼのβへリックス構造の少なくとも９０％から構成される変異体に関する。
【００１２】
βへリックス構造を含む植物多糖リアーゼは、その３次元構造が特異的であるため、組み換え方法によって発現されることがほとんどない。このようなリアーゼを多様な宿主細胞内で発現させようとする幾つかの試みが行われてきたが、失敗に終わってきた。しかし今回驚くべきことに、野生の多糖リアーゼのβへリックス構造から実質的に構成される（すなわち、野生の多糖リアーゼのβへリックス構造の少なくとも９０％から構成される）多糖リアーゼの変異体が用いられる場合では、上述の多糖リアーゼは組み換え発現可能になることが判明した。
【００１３】
当該技術分野に公知の一部の多糖リアーゼはアレルギー誘発活性を示す。例えば、ペクチン酸リアーゼファミリーに属する一部のペクチン酸リアーゼは、アレルゲン性物質であることが知られている。ペクチン酸リアーゼファミリーに属する一部のペクチン酸リアーゼの変異体は、アレルギー誘発活性を示さないか、または野生のペクチン酸リアーゼに比べてアレルギー誘発活性が低下している。これらの変異体は、ペクチン酸リアーゼの低アレルゲン性変異体であると考えられる。
【００１４】
本発明のβへリックス構造を有する成熟多糖リアーゼの低アレルゲン性変異体は、Ｎ末端切断および／またはＣ末端切断（好ましくはその両方）を含み、かつ成熟多糖リアーゼのβへリックス構造から実質的に構成される。本明細書において使用されるように、用語「βへリックス構造から実質的に構成される変異体」は、野生の多糖リアーゼの部分のうちβへリックス構造と関係の無い部分を実質的に欠いている多糖リアーゼの誘導体／変異体を指す。語句「〜から構成される」は、列挙される成分が所要または必須の成分であること、および他の成分が含まれていてもよいことを示唆している。したがって語句「〜から実質的に構成される」および「〜の少なくとも９０％から構成される」は、列挙される成分が所要または必須の成分である一方で、他の成分は任意であり、含まれていてもよいが、含まれていなくてもよいことを示唆している。「βへリックス構造から実質的に構成される」または「βへリックス構造のみから実質的に構成される」本発明の変異体は、本発明の変異体が野生の多糖リアーゼのβへリックス構造の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％となるよう構成されていることを意味する。
【００１５】
本明細書において使用されるように、語句「多糖リアーゼ」は、β脱離機序を介する多糖鎖の切断を行って、新たに形成される非還元末端の二重結合を形成させる一群の酵素を指す（例えば、Linhardt RJ et al. Appl Biochem Biotechnol. 12(1986):135-76参照）。
【００１６】
本明細書において使用されるように、「成熟多糖リアーゼ」は、それぞれのｃＤＮＡによってコードされる場合の末端シグナル配列が、多糖リアーゼが天然に存在するような細胞内の成熟過程によって脱離されている多糖リアーゼである。
【００１７】
「βへリックス構造」は、２つまたは３つの面を有する螺旋状の並行βストランドの結び付きによって形成されるタンパク質構造を指す。この構造は、ストランド間水素結合およびタンパク質間相互作用によって安定化される（例えば、Yoder MD et al. FASEB J. 9(1995):335-42参照）。βへリックス構造を特定するため、配列および構造の予測ツールを用いて２段階検査することができる。最初のアプローチでは、配列相同性アライメントを（例えば、ＮＣＢＩのｂｌａｓｔｐのようなタンパク質ｂｌａｓｔを介して）作製するために、特定のタンパク質の配列を使用することができる。これにより、特定のタンパク質配列を公知のタンパク質ファミリーおよび／またはタンパク質スーパーファミリーに分類することが可能になる。さらなるアプローチまたは上記アプローチに代わるアプローチでは、特定のタンパク質配列を用いてタンパク質構造を予測することによって（例えば、secondary structure prediction server, Dundee University, http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/ Cole C. et al. Nucleic Acids Res (2008) 1;36(Web Server Issue):W197-201）、ｂｌａｓｔアライメントの確認を行い、かつ二次構造要素を予測して特定のタンパク質配列をβへリックスのコア要素を含む多糖リアーゼファミリーに分類することができる。上記手法の一方のみを使用することも可能であるが、両方を適用することも可能である。上記二次構造の予測によれば、少なくとも８つのβストランドからなる連続したクラスターの最初のβストランドはβへリックスの開始として指定されることになり、その一方で、この予測による少なくとも８つ、好ましくは１０個、より好ましくは１２個、さらに好ましくは１４個のβストランドからなる連続したクラスターの最後のβストランドに対しては仮定的βへリックス終局地点が割り当てられる。
【００１８】
言及されている「変異体」、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、「単離変異体」、「単離タンパク質」、「単離ポリペプチド」、および「単離ペプチド」である。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態によれば、Ｎ末端切断および／またはＣ末端切断は少なくとも１０個のアミノ酸残基を含む。
【００２０】
上述のように、本発明の変異体は、野生の多糖リアーゼのβへリックス構造から実質的に構成される。このような変異体は、野生の多糖リアーゼの少なくとも１０個、好ましくは１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個、より好ましくは２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、または３０個、さらに好ましくは３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、または５０個のアミノ酸残基からなるＮ末端切断および／またはＣ末端切断を含む。当然ながら、切断されるアミノ酸残基の数は多糖リアーゼのＮ末端およびＣ末端の間で異なっていてもよい。また、βへリックス構造が開始または終了する多糖リアーゼのアミノ酸位置に応じてそれぞれ決定されてもよい。
【００２１】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、βへリックス構造の一部である最初と最後のβシートが無傷の状態を保っていることを条件として、Ｎ末端切断は、多糖リアーゼのＮ末端からβへリックス構造の最初のβシートのＮ末端の前にある約１〜５０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜２０個、特に１〜１０個のアミノ酸残基まで伸びている領域を含み、Ｃ末端切断は、多糖リアーゼのＣ末端からβへリックス構造の最後のβシートのＣ末端の後ろにある約１〜５０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜２０個、特に１〜１０個のアミノ酸残基まで伸びている領域を含む。
【００２２】
本発明の変異体は、多糖リアーゼのＮ末端からβへリックス構造の一部である最初のβシートの一部である最初のアミノ酸残基までの領域を含むＮ末端切断を含んでいてもよい。Ｃ末端切断は、多糖リアーゼのＣ末端からβへリックス構造の一部である最後のβシートの最後のアミノ酸残基までの範囲を含んでいてもよい。したがって、Ｎ末端切断および／またはＣ末端切断は、１〜５０、１〜４９、１〜４８、１〜４７、１〜４６、１〜４５、１〜４４、１〜４３、１〜４２、１〜４１、１〜４０、１〜３９、１〜３８、１〜３７、１〜３６、１〜３５、１〜３４、１〜３３、１〜３２、１〜３１、１〜３０、１〜２９、１〜２８、１〜２７、１〜２６、１〜２５、１〜２４、１〜２３、１〜２２、１〜２１、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２を含む。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態によれば、多糖リアーゼは、ペクチン酸リアーゼ（ＥＣ ４．２．２．２）、ヒアルロン酸リアーゼ（ＥＣ ４．２．２．１）、ポリ（β−Ｄ−マンヌロン酸）リアーゼ（ＥＣ ４．２．２．３）、コンドロイチンＡＣリアーゼ（ＥＣ ４．２．２．５）、オリゴガラクツロニドリアーゼ（ＥＣ ４．２．２．６）、ヘパリンリアーゼ（ＥＣ ４．２．２．７）、ヘパリン硫酸リアーゼ（ＥＣ ４．２．２．８）、ペクチン酸二糖リアーゼ（ＥＣ ４．２．２．９）、ペクチンリアーゼ（ＥＣ ４．２．２．１０）、ポリ（α−Ｌ−グルロン酸）リアーゼ（ＥＣ ４．２．２．１１）、キサンタンリアーゼ（ＥＣ ４．２．２．１２）、エキソ−（１−−＞４）−α−Ｄ−グルカンリアーゼ（ＥＣ  ４．２．２．１３）、グルクロナンリアーゼ（ＥＣ４．２．２．１４）、アンヒドロシアリダーゼ（ＥＣ ４．２．２．１５）、レバンフルクトトランスフェラーゼ（ＥＣ ４．２．２．１６）、イヌリンフルクトトランスフェラーゼ（ＥＣ ４．２．２．１７、ＥＣ ４．２．２．１８）、コンドロイチンβリアーゼ（ＥＣ ４．２．２．１９）、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエンドリアーゼ（ＥＣ ４．２．２．２０）、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼ（ＥＣ ４．２．２．２１）、およびペクチン酸三糖リアーゼ（ＥＣ ４．２．２．２２）からなる一群から選択されるタンパク質ファミリーに属する多糖リアーゼである。
【００２４】
上述のように、一部のアレルゲンは多糖リアーゼ（具体的にはペクチン酸リアーゼである）である。したがって、多糖リアーゼ由来の変異体である本発明の変異体は、好ましくはＣｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｏｂｔｕｓａ（ヒノキ）、Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ（スギ）、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ａｒｉｚｏｎｉｃａ（イトスギ）、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ（マウンテンシーダー）、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ｖｕｌｇａｒｉｓ（ヨモギ）、およびＡｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ（ブタクサ）に由来のアレルゲン性ペクチン酸リアーゼであることが好ましい。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、アレルゲンは、Ａｍｂ ａ １、Ａｒｔ ｖ ６、Ｃｈａ ｏ １、Ｃｕｐ ａ １、Ｃｒｙ ｊ １、およびＪｕｎ ａ １からなる一群から選択される。
【００２６】
驚くべきことに、本願に定義されるようにβへリックス構造の少なくとも９０％から構成されるアレルゲンの変異体は、野生アレルゲンに比べて低減したＩｇＥ反応性を示すことが判明した。したがって、アレルゲン由来の本発明の変異体は、低アレルギー性分子として考慮される。
【００２７】
本明細書において使用されるように、用語「低アレルギー性」は、個体への投与時に低下アレルギー反応を示すか、または如何なるアレルギーも示さないようなアレルギー特性を有する、アレルゲン由来のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の能を指す。アレルゲンの「低アレルギー性」変異体では、アレルゲンのＩｇＥ結合エピトープが除去または破壊されていることによって、個体にアレルギー反応を引き起こさせる能が低下または消失している。本発明の好ましい実施形態によれば、βへリックス構造を有する成熟多糖リアーゼの低アレルギー性変異体は、野生の多糖リアーゼのＩｇＥ反応性よりも少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、具体的には少なくとも５０％低下しているＩｇＥ反応性を示す。
【００２８】
多糖の低アレルゲン性ついては、適当な患者血清を用いたＩｇＥウエスタンブロット法によって定期的に試験することができる。それぞれの低アレルゲン性アレルゲンのＩｇＥ結合能力の低下は、野生のアレルゲン性分子のＩｇＥ結合能力に比べて評価される。また、ＵＳ２００９／０１０４２０８号（例えば実施例２参照）には、ＩｇＥ反応性の決定方法が記載されている。
【００２９】
アレルゲン性ペクチン酸リアーゼの変異体は、アレルギーの特異的免疫療法に用いられる薬剤の活性薬剤成分として使用されることができる。このような薬剤は、含まれるペクチン酸リアーゼの変異体に応じて、異なるアレルギーを治療するために調整されることができる。例えば、Ａｍｂ ａ １の少なくとも１つの変異体を含む薬剤をブタクサアレルギーの治療用薬剤とすることができ、Ｃｒｙ ｊ １の少なくとも１つの変異体を含む薬剤をＪａｐａｎｅｓｅ ｃｅｄａｒ（スギ）アレルギーの治療に使用することができ、Ａｍｂ ａ １およびＣｒｙ ｊ １の変異体を含む薬剤をブタクサアレルギーおよびスギアレルギーの両アレルギーの治療に使用することができる。したがって、本発明の成熟多糖リアーゼの変異体はＡｍｂ ａ １またはＣｒｙ ｊ １であることが特に好ましい。
【００３０】
ペクチン酸リアーゼの低アレルゲン性変異体は特異的免疫療法にとって特に有用である。したがって、本発明の特に好ましい実施形態は、少なくとも１つの低アレルゲン性ペクチン酸リアーゼ変異体を含むアレルギー治療用のワクチン製剤に関する。上記ワクチン製剤は、少なくとも１つのアジュバント、薬学上許容可能な賦形剤、および／または防腐剤をさらに含むことが好ましい。
【００３１】
本発明の低アレルゲン性分子の免疫原性を向上させるため、本発明の製薬に例えばアジュバントを使用してもよい。本発明のアジュバントは、抗体と一緒または並行して投与された場合に免疫原性を向上させ、および／または免疫反応の質へ作用する助剤である。したがって本発明のアジュバントは、例えば、液性または細胞性の免疫反応の程度に著しく作用することができる。通常のアジュバントは、例えば、アルミニウム化合物、脂質含有化合物、または不活性化ミコバクテリウムである。
【００３２】
通常、ヒトへの投与に適したものであれば、アジュバントは異なる形態とすることができる。このようなアジュバントのさらなる例は、鉱物または植物起源の油乳剤、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムまたはリン酸カルシウムなどの無機化合物、Ｐ４０（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍの細胞壁由来）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ、ＬＰＳの誘導体）、およびムラミルペプチド誘導体およびその複合体（ミコバクテリウム成分由来）などの細菌産物および誘導体、ミョウバン、フロイント不完全アジュバント、リポシン、サポニン（例えばＱＳ２１）、スクアレンなどである（例えばGupta R. K. et al. (Vaccine 11:293-306 (1993)およびJohnson A. G. (Clin. Microbiol. Rev. 7:277-289)参照）。本発明の薬剤は、最も好ましくはアジュバントとしてミョウバンを含む。
【００３３】
Ａｍｂ ａ １由来の本発明の変異体は配列番号１のアミノ酸配列から実質的に構成され、Ｃｒｙ ｊ １由来の変異体は配列番号２のアミノ酸配列から実質的に構成され、Ｃｕｐ ａ １由来の変異体は配列番号３のアミノ酸配列から実質的に構成され、Ｊｕｎ ａ １由来の変異体は配列番号４のアミノ酸配列から実質的に構成され、Ｃｈａ ｏ １由来の変異体は配列番号５のアミノ酸配列から実質的に構成され、Ａｒｔ ｖ ６由来の変異体は配列番号６のアミノ酸配列から実質的に構成される。
【００３４】
本発明のペクチン酸リアーゼ変異体、タンパク質、およびポリペプチドは、宿主細胞内の組み換え発現によって産生（作製）可能である。本発明は特定の発現標的（すなわち、タンパク質の発現位置）に限定されるものではない。したがって、本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は宿主細胞内で発現（細胞内発現、細胞質やペリプラスム内での発現）されてもよいが、宿主細胞外で発現（細胞壁または外膜に付着した状態で発現）されてもよい。または、培地中（細胞外）に分泌されてもよい。ペクチン酸リアーゼ変異体が細胞内で発現される場合、これらタンパク質は封入体として可溶性または不溶性の何れであってもよい。
【００３５】
本発明の他の態様は、上述のように定義される本発明の変異体と直接またはリンカーを介して融合された分泌シグナル配列を含むポリペプチド（すなわち、ペクチン酸リアーゼ、ヒアルロン酸リアーゼ、ポリ（β−Ｄ−マンヌロン酸)リアーゼ）、コンドロイチンＡＣリアーゼ、オリゴガラクツロニドリアーゼ、ヘパリンリアーゼ、ヘパリン硫酸リアーゼ、ペクチン酸二糖リアーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリ（α−Ｌ−グルロン酸）リアーゼ、キサンタンリアーゼ、エキソ−（１−−＞４）−α−Ｄ−グルカンリアーゼ、グルクロナンリアーゼ、アンヒドロシアリダーゼ、レバンフルクトトランスフェラーゼ、イヌリンフルクトトランスフェラーゼ、コンドロイチンＢリアーゼ、コンドロイチン硫酸塩ＡＢＣエンドリアーゼ、コンドロイチン硫酸塩ＡＢＣエキソリアーゼ、およびペクチン酸三糖リアーゼであり、好ましくは、Ａｍｂ ａ １、Ａｒｔ ｖ ６、Ｃｈａ ｏ １、Ｃｕｐ ａ １、Ｃｒｙ ｊ １、およびＪｕｎ ａ １からなる一群から選択される）に関する。
【００３６】
驚くべきことに、本発明に定義される多糖リアーゼおよびその変異体はより高い安定性を示し、かつより高い収率で組み換え発現可能であることが判明した。宿主細胞内の分泌シグナル配列の除去を避けるためには、異種分泌シグナル配列を使用すること、および／または、分泌シグナル配列と天然のプロテアーゼ切断部位を含まない本発明の変異体または成熟多糖リアーゼとの間にリンカーを導入することが特に好都合である。分泌シグナル配列を含まずにタンパク質生成物を得るためには、人工プロテアーゼ切断部位を含むリンカーを提供することが好都合である。
【００３７】
分泌シグナル配列またはペプチドは、本発明のポリペプチドの分泌を誘導するのに有用である。特定の実施形態では、ポリペプチドは、自身のシグナルペプチド（すなわち、「天然」シグナルペプチド）を含んでいてもよい。他の実施形態では、ポリペプチドは異種分泌シグナル配列／ペプチド（すなわち、野生のポリペプチドと異なるタンパク質に由来のシグナルペプチド）と結合されていてもよい。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態によれば、分泌シグナル配列は、細菌起源、真菌起源、または真核（具体的には哺乳類）起源の分泌シグナル配列である。
【００３９】
本発明の特に好ましい実施形態では、分泌シグナル配列は細菌シグナルペプチドである。細菌分泌シグナル配列は軽微な面においてのみ互いに異なる。例えば、グラム陽性細菌のシグナル配列のＮ末端は、他の細菌のシグナルペプチドのＮ末端よりも僅かに長く、塩基性もより高くなっている。細菌シグナルペプチドの代わりに真核生物の分泌シグナル配列／ペプチドを用いてもよい。例えば、Ｅ. ｃｏｌｉのペリプラズムタンパク質および外膜タンパク質のシグナルペプチドと、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の液胞タンパク質および分泌タンパク質のシグナルペプチドと、多細胞真核生物の構成的分泌タンパク質および貯蔵顆粒タンパク質とは、成熟タンパク質の標的化に影響することなく互いに交換可能であることが示されてきた。実際、特定の非天然環境（例えば、細菌性細胞内での真核細胞遺伝子の発現）では、一部のタンパク質の分泌シグナル配列／ペプチドは効率的な分泌を媒介することが示されてきた。例えば、これらの遺伝子が発現されるとＥ. ｃｏｌｉからインスリンおよびオボアルブミンが分泌され、酵母は多細胞真核生物由来の多様な分泌タンパク質を効率的に分泌することが可能になる。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態によれば、分泌シグナル配列は、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＳｔＩＩ、ＥＸ、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ＰｈｏＥ、ＭａｌＥ、ＯｍｐＣ、ＬＰＰ、ＬａｍＢ、ＯｍｐＴ、ＬＴＢ、ホスファターゼ（ｐｈｏ１）、およびインベルターゼ（Ｓｕｃ）分泌シグナル配列、およびα−接合因子プレプロ配列からなる一群から選択される。
【００４１】
分泌シグナル配列／ペプチドは細菌外タンパク質由来のものであってもよい。本発明のポリペプチドに取り込まれ得るシグナルペプチドまたはシグナル配列の例は、当該技術分野に周知のもののうち特に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＰｇｓＡのシグナル配列、Ｅ．ｃｏｌｉ ＯｍｐＡのシグナル配列、Ｅ．ｃｏｌｉ Ａｇ４３のシグナル配列、Ｂ. ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼのシグナル配列、Ｅ．ｃｏｌｉリポタンパク質（ｌｐｐ）のシグナル配列、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓペニシリナーゼＩＩＩのシグナル配列、Ｓ. ａｕｒｅｕｓペニシリナーゼのシグナル配列、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ＩｇＡプロテアーゼのシグナル配列、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｅｒｉｎｅタンパク質のシグナル配列、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエンドグルカナーゼのシグナル配列、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＴＡエンテロトキシンのシグナル配列、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａまたはＥ. ｃｏｌｉクロアシン（コリシン）のシグナル配列、ＰｒｏｔｅｕｓまたはＳｅｒｒａｔｉａ Ｓｈｌａ／ＨｐｍＡヘモリシンのシグナル配列、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａプララナーゼのシグナル配列、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ、またはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓエキソ酵素のシグナル配列、Ａｅｒｏｍｏｎａｓアエロリシンのシグナル配列、Ｖｉｂｒｉｏ ＣＴＸトキシンのシグナル配列、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａＩＶ型ピリンのシグナル配列、Ｅ. ｃｏｌｉＰ型ピリンのシグナル配列、Ｅ. ｃｏｌｉＩ型ピリンのシグナル配列、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ＯＭタンパク質（ＹＯＰＳ）のシグナル配列、Ｅ. ｃｏｌｉまたはＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒフラジェリンのシグナル配列、ＳｈｉｇｅｌｌａまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ侵入タンパク質のシグナル配列、Ｅ. ｃｏｌｉ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、またはＭｏｒｇａｎｅｌｌａ ＨｌｙＡ溶血素のシグナル配列、Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ＣｙａＡシクロリシンのシグナル配列、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、またはＰｒｏｔｅｕｓプロテアーゼのシグナル配列、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＮｏｄＯのシグナル配列、Ｅ. ｃｏｌｉ ＣｏｌＶコリシンのシグナル配列を含む。
【００４２】
上記または他のシグナルペプチド配列については、当該技術分野の通常の技術によって特定することが可能である。例えば、ＰｒｅｄｉＳｉ（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）は、細菌アミノ酸配列および真核細胞アミノ酸配列の両アミノ酸配列中のシグナルペプチド配列およびその切断位置を予測するための１つの典型的なツールを表している（例えば、Hiller et al, Nucleic Acids Research. 32:W375-W379, 2004参照）。このソフトウェアツールは、膨大なデータセットをリアルタイムで高精度に分析するのに特に有用であり、タンパク質中に存在するアミノ酸偏位を考慮に入れた頻度補正によって向上した位置加重マトリックス手法に基づくものである。また、実験的検証を行った６７個のリポタンパク質からなる一連のリポタンパク質の組に基づいて作成した、グラム陽性細菌リポタンパク質のシグナルペプチド予測用の隠れマルコフモデル法も利用可能である（例えば、Bagos et al, J. Proteome Res. 7:5082-5093, 2008参照）。
【００４３】
本発明のポリペプチドは分泌シグナル配列に適用されるものであり、一般的な技術を用いて調製されてもよい。例えば、所望の融合体のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列は、別々に構築されて適当な発現ベクターにライゲートされてもよい。あるポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、他のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に対して、配列間の読み取りフレームが一致するように、ペプチドリンカーを使用してまたは使用せずにライゲートされることが可能である。これにより、上記の両ポリペプチド成分の生物活性を保持している単一の融合タンパク質となるよう翻訳されることが可能になる。
【００４４】
本発明の特に好ましい実施形態では、ペプチドリンカー配列は、本発明の変異体を分泌シグナル配列から区切るように用いられてもよい。このようなペプチドリンカー配列は、当該技術分野に公知の標準的な技術を用いて融合タンパク質に組み込まれてもよい。本発明の変異体および分泌シグナル配列の間に取り込まれるペプチドリンカー配列は、有利にはプロテアーゼ切断部位を含んでいる。１つ以上のプロテアーゼ切断部位が存在することによって、本発明の変異体から分泌シグナル配列を分離することは発現宿主単独で可能になるか、または、培養媒体内において組み換え産生の過程で分泌された本発明のポリペプチドを培養媒体から単離した後にそれぞれのプロテアーゼを添加することによって可能になる。
【００４５】
本発明の特に好ましい実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、トロンビン、キモトリプシン、トリプシン、ペプシン、スブチリシン、エンテロキナーゼ、因子Ｘａ、ＴＥＶプロテアーゼ、およびＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼによって切断可能であり、ＴＥＶプロテアーゼが特に好ましい。
【００４６】
プロテアーゼ切断部位のコード配列は、分泌シグナル配列またはリーダー配列、またはアフィニティー標識と、本発明の変異体、タンパク質、またはポリペプチドとの間に含まれることができる。これにより、上述のように、特定のプロテアーゼと一緒にインキュベートした後に、プロテアーゼ切断部位をコードする配列を分離することが可能になる。本発明のポリペプチドへの取り込みに好適なプロテアーゼ切断部位は、エンテロキナーゼ（切断部位Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）（配列番号３７）、因子Ｘａ（切断部位Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号３８）またはｌｌｅ−Ａｓｐ−ＧＩｙ−Ａｒｇ（配列番号３９））、トロンビン（切断部位Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ；Ａｒｇ−Ｇｌｙ）（配列番号４０）、ＴＥＶプロテアーゼ（切断部位Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ）（配列番号４１）、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（切断部位Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）（配列番号４２）、およびインテイン（例えばｐＨへの調整によって活性化可能な自己スプライシングインテイン配列（Chong et al., Gene, 792 (1997):27-281））などを含む。
【００４７】
本発明の代替的な実施形態では、切断部位は、３−ブロモ−３−メチル−２−（２−ニトロフェニルメルカプト）−３Ｈ−インドールによって切断されるトリプトファン残基、２−ニトロソ−５−チオシアン安息香酸よって切断されるシステイン残基、酸およびヒドロキシルアミンによってそれぞれ切断可能なジペプチド−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−または−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−、および臭化シアン（ＣＮＢｒ）によって特異的に切断されるメチオニン残基を含む化学切断部位であってもよい。
【００４８】
リンカー配列は、通常、１〜５０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜２０個、最も好ましくは１〜１０個分のアミノ酸の長さを有していてもよい。リンカー配列は、一般的に、本発明の変異体が分泌シグナル配列に融合された結果としてプロテアーゼ切断部位が形成される場合では必要とされない。
【００４９】
本発明の変異体、タンパク質、およびポリペプチドはまた、精製または検出用に用いられるタグと直接またはリンカー（プロテアーゼ切断部位であってもよい）を介して融合可能である。特定の実施形態では、本発明の変異体、タンパク質、またはポリペプチドは、本発明のポリペプチドの高親和性精製を高速に行うための基準を提供する、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼからなるタンパク質タグを含む。実際、このようなＧＳＴ−融合タンパク質は、その後、グルタチオンに対する高親和性によって細胞から精製されることが可能である。アガロースビーズはグルタチオンとカップリング可能であり、このようなグルタチオン−アガロースビーズはＧＳＴ−タンパク質を結合する。したがって、本発明の特定の実施形態では、本発明の変異体、タンパク質、またはポリペプチドは固相支持体と結合される。好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＧＳＴ部分を含む場合にはグルタチオン修飾支持体とカップリングされる。特定の場合では、グルタチオン修飾支持体はグルタチオンアガロースビーズである。
【００５０】
本発明の他の態様は、本発明の多糖リアーゼまたはポリペプチドの変異体をコードする核酸分子に関する。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態によれば、核酸分子はリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００５２】
リーダー配列をコードするヌクレオチド配列は、本発明の変異体をコードするヌクレオチド配列の５’末端に設けられた、当該ヌクレオチド配列とインフレームの配列であって、転写および翻訳された場合、宿主細胞からの翻訳ポリペプチドの分泌を誘起することを可能にする。リーダー配列は、本発明のポリペプチドが発現されている宿主細胞がそれぞれの分泌シグナル配列を認識可能である限り、任意の起源のポリペプチドであってよい。
【００５３】
リーダー配列は、ＰｅｌＢおよびＰｅｌＣからなる一群から選択されることが好ましい。
【００５４】
本発明の核酸部分は、当然ながら、コードされる変異体の精製、濃縮、または安定化を促進し得る、ポリペプチドおよびペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。
【００５５】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、核酸分子のヌクレオチド配列では、コドン最適化および／またはコドン整合化が行われている。
【００５６】
コドンの最適化によって宿主細胞内のタンパク質発現を高レベルにすることは頻繁に用いられる方法である。こうした方法は、通常、「好適とされない」または「あまり好適とされない」コドンを特定すること、および特定した「好適とされない」または「あまり好適とされない」コドンの１つ以上をこれと同一のアミノ酸をコードする「好適とされる」コドンで置き換えることを含む。また、核酸中の少なくとも１つの好適とされないまたはあまり好適とされないコドンは、これと同一のアミノ酸をコードする好適なコドンによって置き換えられている。好適とされるコドンは、宿主細胞の遺伝子のコード配列中で過剰に示されているコドンであり、好適とされないまたはあまり好適とされないコドンは、宿主細胞の遺伝子のコード配列中で過小に示されているコドンである。
【００５７】
本発明の変異体を細胞内で安定化させるために、Ｎ末端アミノ酸残基（好ましくは最初の２つの残基、または少なくとも２番目の残基）は、安定化アミノ酸残基（例えばグリシン）によってそれぞれ交換されることが好ましい（例えば、Varshavsky A. Nature Structural & Molecular Biology 15(2008):1238-40; Dougan DA et al. Molecular Microbiology 76(2010): 545-558; Tobias JW, et al. Science 254(1991):1374-7参照）。
【００５８】
本発明の核酸発現宿主細胞、発現カセット、および発現ベクターは、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、昆虫細胞、および哺乳類細胞を含む。したがって、これら全ての細胞におけるコドン使用頻度、コドン改変核酸、およびコドン改変核酸からなるポリペプチドを適合化する方法が本発明によって提供される。典型的な宿主細胞は、グラム陰性菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓなど）、グラム陽性菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を含む。また、典型的な宿主細胞は、真核生物（例えば、Ｓａｃｃｈａｍｍｙｃｅｓ Ｓｐなどの多様な酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒを含む）、哺乳類細胞および哺乳類細胞株、および昆虫細胞株を含む。特に好ましい実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが宿主細胞である。他の特に好ましい実施形態では、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓが宿主細胞である。
【００５９】
本発明はまた、これらの生物および生物種内での発現について最適化が行われた核酸およびポリペプチドも含む。コドンの整合化が行われる方法を用いることが特に好ましい。コドンの整合化する方法は当該技術分野において周知である（Angov E, et al. PloSOne 3(2008):e2189）。このような方法では、宿主細胞、並びに転写および翻訳対象のポリペプチドをコードする核酸部分が由来する細胞の使用頻度が考慮される。これにより、宿主細胞と発現対象のポリペプチドをコードする核酸部分を産生する細胞との間でコドン使用頻度のバランスがとれたヌクレオチド配列を取得することが可能になる。
【００６０】
特定の生物のコドン使用頻度は、コドン使用頻度データベースhttp://www.kazusa.or.jp/codon/（Nakamura Y. et al. Nucleic Acids Res (2000);28(1):292）より入手可能である。ペクチン酸リアーゼ遺伝子に関しては、それぞれの発生源となる生物ごとにコドン使用頻度が決定されている。対象遺伝子のコドン使用頻度を発生源となる生物から宿主生物へと導入するように、宿主生物のコドン使用頻度が用いられている。その結果、例えば、特定位置のそれぞれのアミノ酸をコードするE．coliコドンであって、それぞれのアミノ酸をコードする発生源の生物の本来のコドンに最も相似するコドン使用頻度を示すE．coliコドンが選択される。その後、これに応じてＤＮＡコードは変更され、その結果得られる新たなコドン組成を有する遺伝子が合成的に生成された。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態によれば、Ａｍｂ ａ １の変異体をコードする核酸分子は、配列番号７または８のヌクレオチド配列を有し、Ｃｒｙ ｊ １をコードする核酸分子は配列番号９または１０のヌクレオチド配列を有し、Ｃｕｐ ａ １をコードする核酸分子は配列番号１１または１２のヌクレオチド配列を有し、Ａｒｔ ｖ ６をコードする核酸分子は配列番号１３または１４のヌクレオチド配列を有し、Ｊｕｎ ａ １をコードする核酸分子は配列番号１５または１６のヌクレオチド配列を有し、そしてＣｈａ ｏ １をコードする核酸分子は配列番号１７または１８のヌクレオチド配列を有する。
【００６２】
本発明の他の態様は、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６の核酸配列を有するか、または含んでいる核酸分子に関する。これらの核酸分子は、本願に記載の分泌シグナル配列をコードする核酸配列と融合されていてもよい。また、これらの核酸分子によってコードされるポリペプチドも本発明に含まれる。
【００６３】
本発明の他の態様は、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。
【００６４】
本発明の変異体をコードする本発明の核酸酸分は、ＲＮＡの合成および発現を引き起こすか、または調節する転写および翻訳制御配列（例えば、プロモータ遺伝子またはエンハンサー）と作用可能に結合されていてもよい。発現制御配列は発現ベクター内にあってもよい。典型的な細菌プロモータ配列は、ｌａｄ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ＰＬ、ｔａｃ、およびｔｒｐを含む。典型的な酵母プロモータは、ＡＯＸ１、ＧＡＰ／ＧＡＰＤＨ、ＡＤＨ２、ＰＧＫ、ＦＬＤ１、ＭＯＸを含む。典型的な真核生物プロモータは、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネインＩを含む。
【００６５】
細菌内のポリペプチドを発現（または過剰発現）させるのに好適なプロモータは、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃまたはｔｒｐプロモータ、ｌａｄプロモータ、ｌａｃＺプロモータ、Ｔ３プロモータ、Ｔ７プロモータ、ｇｐｔプロモータ、ラムダＰＲプロモータ、ラムダＰＬプロモータ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）などの糖分解酵素をコードするオペロン由来のプロモータ、および酸ホスファターゼプロモータを含む。真核生物プロモータは、ＣＭＶ前初期プロモータ、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモータ、熱ショックプロモータ、初期および後期ＳＶ４０プロモータ、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉプロモータを含む。原核または真核細胞の遺伝子またはこれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモータを使用してもよい。本発明はまた、本発明の核酸（例えば本発明の変異体をコードする配列）を含む、本発明のポリペプチドの発現（および過剰発現）用の発現系（発現カセット、ベクター、およびクローニング媒体など）に関する。本発明の発現ベクターおよびクローニング媒体は、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルスＤＮＡ（例えばワクシニア、アデノウイルス、ｆｏｕｌ ｐｏｘウイルス、仮性狂犬病、およびＳＶ４０変異体）、Ｐｌ系人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、および特定の対象宿主に対して特異的な他のベクター（バチルス、アスペルギルス、および酵母）を含むことができる。典型的な細菌ベクターは、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド、ｐＮＨベクター、（ラムダ−ＺＡＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ：ｐＸＴｌ、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＡｃＳＧ２、ｐＡｃＧＰ６７、ｐＡｃＵＷ２１、ｐＡｃＵＷ５１、ｐＡｃＭＰ２およびｐＡｃＭＰ３、およびｐＡｃＧＨＬＴ（ＧＳＴ−融合ベクター）およびｐＡｃＨＬＴ（６ｘＨｉｓ−融合ベクター）［ＢＤ］を含む。しかし、宿主内での複製および存続が可能であれば、他の任意のプラスミドまたは他のベクターが使用されてもよい。低コピー数または高コピー数のベクターが本発明と一緒に用いられてもよい。
【００６６】
使用され得る発現ベクターの代表例として、ウイルス粒子、バキュロウイルスファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、ｆｏｕｌ ｐｏｘウイルス、仮性狂犬病、およびＳＶ４０誘導体）、Ｐｌ系人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、および特定の対象宿主に対して特異的な他の任意のベクター（バチルス、アスペルギルス、および酵母）などが言及され得る。したがって、例えば、ＤＮＡは、ポリペプチドを発現するための多様な発現ベクターの何れか１つに含まれていてもよい。このようなベクターは、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を含む。多数の好適なベクターが当業者に公知である。
【００６７】
発現ベクター内の核酸配列は、ＤＮＡ合成を引き起こす適当な発現制御配列（プロモータ）と作用可能に結合されている。特に名前を挙げた細菌プロモータは、ｌａｄ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ＰＬ、およびｔｒｐを含む。真核生物プロモータは、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉを含む。適当なベクターおよびプロモータの選択は当業者のレベルの範囲内である。発現ベクターはまた、翻訳開始用のリボソーム結合部位および転写ターミネータを含んでいる。上記ベクターはまた、発現を増幅するための適当な配列を含んでいてもよい。プロモータ領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは他のベクターを選択可能なマーカーと一緒に用いることによって任意の所望遺伝子から選択可能である。さらに、発現ベクターは、形質転換宿主細胞を選択するための表現型形質（真核細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、Ｅ.ｃｏｌｉについてはテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシン耐性、Ｐ. ｐａｓｔｏｒｉについてはゼオシンまたは栄養要求性マーカー、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、およびＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）についてはゲンタマイシン、アムホテリシンＢ、ペニシリンストレプトマイシン）を提供する１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含むことが可能である。
【００６８】
一態様では、本発明の発現カセットは、本発明の配列と、これら配列に適合する宿主の構造遺伝子（すなわち、タンパク質コード配列）の発現に作用することが可能なヌクレオチド配列とを含む。発現カセットは、ポリペプチドコード配列および適宜他の配列（例えば、転写終結シグナル）と作用可能に結合されているプロモータを少なくとも含む。発現に作用するのに必要または有用なさらなる因子（例えば、エンハンサー）を使用してもよい。一態様では、本明細書に使用の「作用可能に結合される」は、プロモータによってＤＮＡ配列の転写が媒介されるように、プロモータをＤＮＡ配列の上流側に結合させることを指す。したがって、発現カセットはまた、プラスミド、発現ベクター、組み換えウイルス、および任意の形態の組み換え裸ＤＮＡベクターなどを含むことになる。一態様では、「ベクター」は、細胞を感染させるか、細胞の形質転換を引き起こすか、または細胞に一過性のまたは永続的な形質導入を行うことが可能な核酸を含む。ベクターは、裸核酸、または、タンパク質または脂質と錯体を形成する核酸であることができる。
【００６９】
ＤＮＡ配列は、多様な手法によってベクターに挿入されてもよい。一般的には、挿入物およびベクターが適当な制限エンドヌクレアーゼによって分解された後、ＤＮＡ配列は制限ベクター内の所望位置にライゲートされる。その代わりに、挿入物およびベクターの両方の平滑末端をライゲートしてもよい。多様なクローニング技術が当該技術分野に公知である。
【００７０】
本発明はまた、本発明の核酸配列（例えば、本発明の多糖リアーゼの変異体をコードする配列）、または、本発明の発現カセット、ベクター、クローニング媒体、発現ベクター、またはクローニングベクターを含む形質転換細胞に関する。宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、または植物細胞などの原核細胞および真核細胞を含む、当業者によく知られた任意の宿主細胞であってもよい。典型的な細菌細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の任意の種（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓを含む）を含む。典型的な真菌細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の任意の種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒを含む）を含む。典型的な酵母細胞は、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｍｍｙｃｅｓ属、またはＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属の任意の種（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅを含む）を含む。典型的な昆虫細胞は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ属またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ属の任意の種（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓ／Ｐを含む）を含む。典型的な昆虫細胞は、バキュロウイルスと一緒に用いられる従来の細胞株であって、ＵＳＤＡ Ｉｎｓｅｃｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで創出されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２とＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９およびＳｆ２１とを含む。上記細胞株はまた、ＩｎｓｅｃｔＳｅｌｅｃｔ（商標）システムでの使用に好適である。これら２系統の細胞株は、ＩＰＬＢＳＦ−２１細胞株に起源を有し、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の蛹の卵巣組織に由来するものである（O'Reilly et al., 1992; Vaughn et al., 1977）。さらに、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標）細胞株（ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、ｔｈｅ  Ｂｏｙｃｅ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｉｔｈａｃａ, ＮＹ）によって開発された、イラクザギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）の卵巣細胞に起源を有する細胞株である（Davis et al., 1992; Granados et al., 1994; Wickham et al., 1992; Wickham and Nemerow, 1993）。さらに、ＨＰｇ、ＩＺＤＭＢ０５０３、ＩＰＬＢ−ＴＮ−Ｒ２、ＩＰＬＢＳＦ−１２５４、ＩＰＬＢ−ＬｄＥＩｔａ、ＣＭ−１、ＩＰＬＢ−ＨｖＴ１、ＩＰＬＢ−ＳＦ２１ＡＥ、ＩＰＬＢ−ＳＦ２１ＡＥ−１５、ＩＰＬＢ−ＳＦ−１２５４、およびＢＣＩＲＬ−ＰＸ２−ＨＮＶ３昆虫細胞株を用いてもよい。
【００７１】
典型的な動物細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、またはＢｏｗｅｓ ｍｅｌａｎｏｍａ、または任意のマウスまたはヒト細胞株を含む。適当な宿主の選択は当業者の能力の範囲内である。
【００７２】
ベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃、またはＴｉ媒介遺伝子導入を含む多様な技術のうち任意のものを用いて宿主細胞内に導入されてもよい。具体的な方法は、リン酸カルシウムトランスフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション法、リポフェクション法、または電気穿孔法を含む。
【００７３】
適当な場合であれば、プロモータの活性化、形質転換細胞の選択、または本発明の遺伝子の増幅を行えるよう適宜修飾を行った従来の培養液中において、遺伝子工学的に作製した宿主細胞を培養することができる。好適な宿主株を形質転換させて適当な細胞密度まで増殖させた後、選択したプロモータを適当な手段（例えば、温度変化または化学作用による誘発）によって誘導させてもよい。また、細胞が所望のポリペプチドまたはそのフラグメントを産生することができるように、期間を追加して細胞培養を行ってもよい。
【００７４】
硫安分画法またはエタノール沈殿法、酸抽出法、陰イオン交換クロマトグラフィー法または陽イオン交換クロマトグラフィー法、ホスホセルロースクロマトグラフィー法、疎水性相互作用クロマトグラフィー法、親和性クロマトグラフィー法、水酸燐灰石クロマトグラフィー法、およびレクチンクロマトグラフィー法を含む方法によって、発現または分泌させた変異体を組み換え細胞培養から回収して精製することができる。組み換え配列にコードされる遺伝子産物を作成する従来の方法に宿主細胞内の構築物を使用することができる。組み換え作製処置で用いる宿主に応じて、ベクターを含む宿主細胞によって産生されるポリペプチドは糖化ペプチドまたは非糖化ペプチドであってもよい。本発明のポリペプチドはまた、初期メチオニンアミノ酸残基を含んでいてもよいが、含んでいなくてもよい。
【００７５】
本発明のポリペプチドが産出されるように、無細胞翻訳系を使用することも可能である。無細胞翻訳系は、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸と作用可能に結合されるプロモータを含む核酸構築物から転写されたｍＲＮＡを使用することが可能である。一部の態様では、核酸構築物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応を起こす前に線状化されてもよい。転写ｍＲＮＡは、その後、所望のポリペプチドまたはそのフラグメントを生成するように適当な無細胞翻訳抽出物（ウサギ網状赤血球抽出液など）を用いて培養される。
【００７６】
対象のポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、プロモータの活性化、形質転換細胞の選択、または遺伝子の増幅を行うために適宜変更が加えられた従来の培養液中で培養されることが可能である。
【００７７】
プロモータの活性化、形質転換細胞の選択、または遺伝子の増幅を行えるように適宜修飾を行った従来の培養液中において、対象のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することが可能である。温度およびｐＨなどの培養条件は、発現用に選択される宿主細胞に事前に用いられる培養条件であり、当業者に自明であろう。その後、特定の酵素活性を有することを特定したクローンの配列を決定して、活性が亢進している酵素をコードするポリヌクレオチド配列を特定する。
【００７８】
本発明のさらに他の態様は、本発明のβへリックス構造を有する多糖リアーゼ変異体を組み換え作製する方法であって、（ａ）本発明の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞を培地で培養する工程、（ｂ）本発明のβへリックス構造を有する多糖リアーゼ変異体を細胞培養物から単離する工程を備える方法に関する。
【００７９】
ペクチン酸リアーゼ変異体を細胞培養物から単離することは、細胞バイオマスまたは細胞ペレット（細胞質またはペリプラスムの細胞内発現の場合）から単離すること、または細胞培養物の上清または細胞培地の上清（細胞外分泌の場合）から単離することによって実現可能である。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態によれば、ペクチン酸リアーゼ変異体は培地中に分泌される。他の好ましい実施形態では、ポリペプチドのリアーゼ変異体から分泌シグナル配列を切断可能なプロテアーゼに対して上記工程（ｂ）のリアーゼ変異体またはポリペプチドをインキュベートすることによって、上記工程（ｂ）のリアーゼ変異体またはポリペプチドから分泌シグナル配列が分離される。それぞれの方法は当業者に周知である。
【００８１】
本発明の他の態様は、本発明の変異体を特定する方法であって、（ｉ）多糖リアーゼの２次元および３次元構造を特定する工程、（ｉｉ）βへリックス構造を特定する工程、（ｉｉｉ）当該βへリックス構造の一部である最初と最後のβシートを決定する工程、（ｉｖ）当該βへリックス構造の一部である最初と最後のβシートが無傷の状態を保っていることを条件として、多糖リアーゼのＮ末端から本発明の変異体のβへリックス構造の一部である最初のβシートのＮ末端の前にある約１〜５０個のアミノ酸残基まで伸びている領域と、当該多糖リアーゼのＣ末端から当該βへリックス構造の一部である最後のβシートのＣ末端の後にある約１〜５０個のアミノ酸残基まで伸びている領域とを切断する工程によって、多糖リアーゼのＮ末端切断および／またはＣ末端切断を特定する方法に関する。
【００８２】
上述の単一の方法は当該技術分野に周知である。
【００８３】
本発明はまた、以下の実施形態に関する。
【００８４】
１．βへリックス構造を有する成熟多糖リアーゼの変異体（好ましくは低アレルゲン性変異体）であって、Ｎ末端および／またはＣ末端の切断を含み、成熟多糖リアーゼのβへリックス構造から実質的に構成されるか、または成熟多糖リアーゼのβへリックス構造の少なくとも９０％から構成されている、変異体。
【００８５】
２．上記Ｎ末端および／またはＣ末端の切断は少なくとも１０個のアミノ酸残基を含む実施形態１に記載の変異体。
【００８６】
３．上記βへリックス構造の最初と最後のβシートが無傷の状態を保っていることを条件として、上記Ｎ末端の切断は、上記多糖リアーゼのＮ末端から上記βへリックス構造の一部である最初のβシートのＮ末端の前にある約１〜５０個のアミノ酸残基まで伸びている領域を含み、上記Ｃ末端の切断は、上記多糖リアーゼのＣ末端から上記βへリックス構造の一部である最後のβシートのＣ末端の後にある約１〜５０個のアミノ酸残基まで伸びている領域を含む実施形態１または２に記載の変異体。
【００８７】
４．多糖リアーゼは、ペクチン酸リアーゼ、ヒアルロン酸リアーゼ、ポリ（β−Ｄ−マンヌロン酸）リアーゼ、コンドロイチンＡＣリアーゼ、オリゴガラクツロニドリアーゼ、ヘパリンリアーゼ、ヘパリン硫酸リアーゼ、ペクチン酸二糖リアーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリ（α−Ｌ−グルロン酸）リアーゼ、キサンタンリアーゼ、エキソ−（１−−＞４）−α−Ｄ−グルカンリアーゼ、グルクロナンリアーゼ、アンヒドロシアリダーゼ、レバンフルクトトランスフェラーゼ、イヌリンフルクトトランスフェラーゼ、コンドロイチンβリアーゼ、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエンドリアーゼ、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼ、およびペクチン酸三糖リアーゼからなる一群から選択されるタンパク質ファミリーに属するものである実施形態１〜３の何れか１つに記載の変異体。
【００８８】
５．上記多糖リアーゼはペクチン酸リアーゼであり、好ましくはアレルゲン性ペクチン酸リアーゼである実施形態４に記載の変異体。
【００８９】
６．上記アレルゲンは、Ａｍｂ ａ １、Ａｒｔ ｖ ６、Ｃｈａ ｏ １、Ｃｕｐ ａ １、Ｃｒｙ ｊ １、およびＪｕｎ ａ １からなる一群から選択される実施形態５に記載の変異体。
【００９０】
７．上記変異体は低アレルゲン性である実施形態５または６に記載の変異体。
【００９１】
８．Ａｍｂ ａ １由来の変異体は配列番号１のアミノ酸配列から実質的に構成され、Ｃｒｙ ｊ １由来の変異体は配列番号２のアミノ酸から実質的に構成され、Ｃｕｐ ａ １由来の変異体は配列番号３のアミノ酸配列から実質的に構成され、Ｊｕｎ ａ １由来の変異体は配列番号４のアミノ酸配列から実質的に構成され、Ｃｈａ ｏ １由来の変異体は配列番号５のアミノ酸配列から実質的に構成され、Ａｒｔ ｖ ６由来の変異体は配列番号６のアミノ酸配列から実質的に構成される実施形態７に記載の変異体。
【００９２】
９．実施形態１〜８の何れか１つに記載の変異体と直接またはリンカーを介して融合される分泌シグナル配列を含む、ポリペプチド。
【００９３】
１０．上記分泌シグナル配列は、細菌、真菌、昆虫、または哺乳類に起源を有する実施形態９に記載のポリペプチド。
【００９４】
１１．上記分泌シグナル配列は、ＰｅｌＢ、ＰｅｌＣ、ＯｍｐＡ、ＳｔＩＩ、ＥＸ、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ＰｈｏＥ、ＭａｌＥ、ＯｍｐＣ、ＬＰＰ、ＬａｍＢ、ＯｍｐＴ、ＬＴＢ、エクジステロイドＵＤＰグルコシルトランスフェラーゼ（ｅｇｔ）およびエンベロープ糖タンパク質ｇｐ６７、ホスファターゼ（ｐｈｏ１）およびインベルターゼ（Ｓｕｃ）分泌シグナル配列、およびα−接合因子プレプロ配列からなる一群から選択される実施形態９または１０に記載のポリペプチド。
【００９５】
１２．上記リンカーはプロテアーゼ切断部位を含む実施形態９〜１１の何れか１つに記載のポリペプチド。
【００９６】
１３．上記プロテアーゼ切断部位は、トロンビン、キモトリプシン、トリプシン、ペプシン、スブチリシン、エンテロキナーゼ、因子Ｘａ、ＴＥＶプロテアーゼ、およびＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼによって切断可能であり、ＴＥＶプロテアーゼが特に好ましい実施形態１２に記載のポリペプチド。
【００９７】
１４．実施形態１〜８の何れか１つに記載の多糖リアーゼの変異体または実施形態１〜１３の何れか１つのポリペプチドをコードする、核酸分子。
【００９８】
１５．リーダー配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含む実施形態１４に記載の核酸分子
１６．上記リーダー配列は、ＰｅｌＢ、ＰｅｌＣ、およびα接合因子プレプロ配列からなる一群から選択される実施形態１５に記載の核酸分子。
【００９９】
１７．上記核酸分子のヌクレオチド配列はコドン最適化および／またはコドン整合化が行われている実施形態１４〜１６の何れか１つに記載の核酸分子。
【０１００】
１８．Ａｍｂ ａ １の変異体をコードする核酸分子は配列番号７または８のヌクレオチド配列を有し、Ｃｒｙ ｊ １の変異体をコードする核酸分子は配列番号９または１０のヌクレオチド配列を有し、Ｃｕｐ ａ １の変異体をコードする核酸分子は配列番号１１または１２のヌクレオチド配列を有し、Ａｒｔ ｖ ６の変異体をコードする核酸分子は配列番号１３または１４のヌクレオチド配列を有し、Ｊｕｎ ａ １の変異体をコードする核酸分子は配列番号１５または１６のヌクレオチド配列を有し、Ｃｈａ ｏ １をコードする核酸分子は配列番号１７または１８のヌクレオチド配列を有する実施形態１４〜１７の何れか１つに記載の核酸分子。
【０１０１】
１９．実施形態１４〜１８の何れか１つに記載の核酸分子を含む、ベクター。
【０１０２】
２０．実施形態１〜８の何れか１つに記載のβへリックス構造を有する多糖リアーゼ変異体または実施形態９〜１３の何れか１つに記載のポリペプチドを組み換え作製する方法であって、（ａ）実施形態１４〜１８の何れか１つに記載の核酸分子または実施形態１９に記載のベクターを含む宿主細胞を培地で培養する工程、（ｂ）当該多糖リアーゼ変異体または当該ポリペプチドを細胞培養物から単離する工程を含む、方法。
【０１０３】
２１．上記多糖リアーゼ変異体またはポリペプチドは細胞バイオマスから単離される実施形態２０に記載の方法。
【０１０４】
２２．上記多糖リアーゼ変異体または上記ポリペプチドは細胞培養の上清または細胞培養の培地から単離される実施形態２０の方法。
【０１０５】
２３．上記多糖リアーゼ変異体または上記ポリペプチドは細胞から分泌され、分泌シグナル配列は、ポリペプチドのリアーゼ変異体から分泌シグナル配列を切断可能なプロテアーゼに対して上記工程（ｂ）の多糖リアーゼ変異体またはポリペプチドをインキュベートすることによって、多糖リアーゼ変異体またはポリペプチドから分泌シグナル配列が分離される実施形態２０に記載の方法。
【０１０６】
２４．宿主細胞はＥ.ｃｏｌｉである実施形態２０〜２３の何れか１つに記載の方法。
【０１０７】
２５．宿主細胞はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである実施形態２０〜２３の何れか１つに記載の方法。
【０１０８】
２６．実施形態５〜７に記載の変異体の少なくとも１つを含むアレルギー治療用のワクチン製剤であって、少なくとも１つのアジュバント、薬学上許容される賦形剤、および／または防腐剤をさらに含む、ワクチン製剤。
【０１０９】
以下の図および実施例を用いて本発明をさらに説明するが、本発明はこれらの何れにも限定されるものではない。
【０１１０】
図１はアミノ末端が修飾されているＣｒｙ ｊ １を示す。（１）はさらなるＧｌｙ−Ａｌａを有するＣｒｙ ｊ １を示す。（２）は、Ａｓｐ−Ａｓｎが欠失し、これらに代えてＧｌｙを有するＣｒｙ ｊ １を示す。（３）はＡｓｐ−ＡｓｎがＧｌｙ−Ｔｈｒに交換されているＣｒｙ ｊ １を示す。（４）はＡｓｐ−ＡｓｎがＧｌｙ−Ｍｅｔに交換されているＣｒｙ ｊ １を示す。
【０１１１】
図２は、Ｅ．ｃｏｌｉ内での発現後の可溶性の細菌タンパク質の一部分を示す。マウスモノクローナル抗Ｃｒｙ ｊ １抗体を用いたクーマシィー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット。
【０１１２】
図３は、アミノ末端にさらなるＧｌｙ−Ａｌａを有するＣｒｙ ｊ １のコドン最適化およびコドン整合化後のＮ末端のコドン使用頻度の差異を示す。
【０１１３】
図４は、自己誘導培地を使用してＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）内に３７℃で２４時間発現させたＣｒｙ ｊ １構築物のマウス抗Ｃｒｙ ｊ １モノクロ―ナル検出抗体を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥ法およびウエスタンブロット法を示す。
【０１１４】
図５は、ｐＥＴ２６−ｂベクターｐｅｌＢのリーダー配列とＥｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ ｐｅｌＣのリーダー配列との差異を示す。
【０１１５】
図６は、Ａｍｂ ａ １．３ Ｒ２の配列を示す。イタリックのフォントで示した配列領域は欠損しているため、切断Ａｍｂ ａ １．３ Ｒ２が形成されている。
【０１１６】
図７は、Ａｍｂ ａ １．３ Ｒ２切断モデルを黒色で示す。天然Ｊｕｎ ａ １（ＰＤＢ １ｐｘｚ）の結晶構造を鋳型構造として使用した。
【０１１７】
図８は、ＬＢｓｕｐｐ培地中のＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｓｔａｒ内で１６℃で２０時間発現させたＡｍｂ ａ １．３ Ｒ２切断構築物の全細胞タンパク質抽出物を示す。
【０１１８】
図９は、Ｅ．ｃｏｌｉ内に発現させたＡｍｂ ａ １およびその誘導体のドットブロット分析を示す。空の発現プラスミドおよび精製天然Ａｍｂ ａ １でトランスフェクトを行ったＥ．ｃｏｌｉを参照として使用した。
【０１１９】
図１０は、Ｅ．ｃｏｌｉ内に発現させたＡｍｂ ａ １およびその誘導体のＥＬＩＳＡ分析を示す。空の発現プラスミドおよび精製天然Ａｍｂ ａ １でトランスフェクトを行ったＥ．ｃｏｌｉを参照として使用した。
【０１２０】
図１１は、Ｅ．ｃｏｌｉ内とＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（図１１（ａ））およびＣｕｐ ａ １（図１１（ｂ））内とで発現させたＡｍｂ ａ １およびその誘導体のメディエーター放出分析を示す。空の発現プラスミドおよび精製天然Ａｍｂ ａ １でトランスフェクトを行ったＥ．ｃｏｌｉを参照として使用した。
【０１２１】
図１２は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２およびＥ．ｃｏｌｉ Ｂのコドン使用頻度の比較を示す。
【０１２２】
図１３は、それぞれの配列識別子（配列番号）に対応付けた配列を示す。
【０１２３】
図１４は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの幾つかのクローンから分泌されるＡｍｂ ａ １．３切断（配列番号１）の細胞上清から得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１４（Ａ））およびウエスタンブロット（図１４（Ｂ））を示す。データは振盪フラスコ内での培養より得られる。矢印は、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ法（図１４（Ａ））およびウエスタンブロット法（図１４（Ｂ））による所望のＡｍｂ ａ １．３．切断分子（分子量の予測値：２７．７ ｋＤａ）ｎメタノール不含株（レーン２〜５）、またはメタノール誘導株（レーン６〜１１）を示す。
【０１２４】
図１５は、生体リアクター（発酵槽）内で培養させたＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのＡｍｂ ａ １．３切断（配列番号１）の細胞上清から得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。矢印は、所望のＡｍｂ ａ １．３.切断分子（予測分子量：２７．７ ｋＤａ）を示す。
【０１２５】
図１６：分子量の大きい組み換え型の野生Ａｍｂ ａ １を含むＩＭＡＣ溶出液の一部から得られるＳＤＳ−ＰＡＧＥは、カラム１〜４および１１〜１８のゲルスロットの頂部で凝集している。
【０１２６】
〔実施例〕
（実施例１：本発明のペクチン酸リアーゼ変異体の発現および特性決定）
（材料および方法）
（患者および血清）
病歴、ｉｎ ｖｉｖｏの皮膚プリックテストに対する陽性反応、またはｉｎ ｖｉｔｒｏのＩｇＥ検出（ＣＡＰ ｓｙｓｔｅｍ, Ｐｈａｄｉａ ＡＢ）に対する陽性反応に基づいて、Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ、またはＣｕｐｒｅｓｓｕｓ ａｒｉｚｏｎｉｃａの花粉アレルギー患者を選抜した。
【０１２７】
（Ａｍｂ ａ １およびＣｒｙ ｊ １のコドン最適化）
特定の生物のコドン使用頻度はコドン使用頻度データベース（http://www.kazusa.or.jp/codon/）より入手可能である。Ａｍｂ ａ １およびＣｒｙ ｊ １に対して、公開されている方法（Gustafsson C. et al., Trends Biotechnol. 2004 Jul;22(7):346-53）に従ってコドン最適化を行った。一般的に使用される市販のＥ．ｃｏｌｉ株は、その大半がＥ．ｃｏｌｉ Ｂの誘導体（例えば、ＢＬ２１およびその誘導体、ＴｕｎｅｒＴＭ、Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ、Ｒｏｓｅｔｔａ−Ｇａｍｉ Ｂ：それぞれＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより入手可能）またはＥ.ｃｏｌｉ Ｋ−１２の誘導体（例えば、Ｏｒｉｇａｍｉ ２、Ｒｏｓｅｔｔａ ２、Ｒｏｓｅｔｔａ−Ｇａｍｉ ２：それぞれＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより入手可能）である。タンパク質を発現させるために、ＢＬ２１ Ｓｔａｒ株（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ誘導体、およびＯｒｉｇａｍｉ ２（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２誘導体を選択した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢおよびＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２は近縁種であり（Lukjancenko O. et al., Microb Ecol. 2010 Nov; 60(4):708-20）、これら両株のコドン使用頻度は互いに類似している。グラフィカルコドン使用頻度分析器（http://gcua.schoedl.de/compare_v2.html）を用いて上記両株のコドン使用頻度表のグラフ比較を行った（図１２）。コドン最適化にはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２のコドン使用頻度を使用し、これに応じて対象遺伝子（例えば、Ａｍｂ ａ １およびＣｒｙ ｊ １）のコドン最適化を行った。
【０１２８】
（Ａｍｂ ａ １およびＣｒｙ ｊ １のコドン整合化）
特定の生物のコドン使用頻度はコドン使用頻度データベース（http://www.kazusa.or.jp/codon/）より入手可能である。コドン最適化に加えて、コドン整合化もタンパク質の発現および溶解性を向上させる有効なツールであることが示されてきた（Angov E. et al., PLoS One. 2008 May 14;3(5):e2189.; Marin M. Biotechnol J. 2008 Aug;3(8):1047-57.）。端的に言えば、希少コドンは、新たに合成されるポリペプチド鎖が適正な立体構造を持つことを可能にするｍＲＮＡの翻訳を鈍化させるので、タンパク質の折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）、構造、および生物活性に直接的に影響を及ぼす。したがって、それぞれの発生源生物のペクチン酸リアーゼ遺伝子のコドン使用頻度を決定した。発生源生物の対象遺伝子に関してのコドン使用頻度を宿主生物内へ導入するように宿主生物のコドン使用頻度を使用した。したがって、特定位置のアミノ酸をそれぞれコードし、かつこれらアミノ酸に対する発生源生物の本来のコドンと最も近いコドン使用頻度を示すＥ．ｃｏｌｉコドンを選抜した。その後、これに応じてＤＮＡコードの変更を行い、その結果得られる新たなコドン組成を有する遺伝子を合成的に生成した。タンパク質を発現させるために、ＢＬ２１ Ｓｔａｒ株（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ誘導体、およびＯｒｉｇａｍｉ ２（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２誘導体を選択した。コドン最適化にはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２のコドン使用頻度を使用し、これに応じて対象遺伝子（例えば、Ａｍｂ ａ １およびＣｒｙ ｊ １）のコドン最適化を行った例えば図１２ａ〜ｅ参照）。ペクチン酸リアーゼおよびその誘導体のクローニングおよび発現。
【０１２９】
（Ｅ．ｃｏｌｉのペクチン酸リアーゼ変異体の発現および精製）
オリジナルのクローニングベクターに用いるためにペクチン酸リアーゼをＰＣＲ増幅に掛け、その後にそれぞれの制限部位を用いてｐＥＴベクター（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）内にクローン化した。細胞を回転数２００ｒｐｍの振盪器に掛けた状態のままＬＢ培地中において３７℃で増殖させてＯＤ６００を０．８とし、これに０．５Ｍのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加してタンパク質発現を誘発した。異なる発現構築物並びにＥ．ｃｏｌｉ宿主株を用いて、多様な増殖条件（例えば、３７℃で６時間、１６℃で２０時間）下で発現を行った。その後、低速遠心分離に掛けて細胞を回収し、これを２５ｍＭのＴｒｉｓＣｌ（ｐＨ９．５）、０．５Ｍの尿素中に再懸濁し、液体窒素を用いて凍結／融解サイクルを３７℃で３回繰り返して行った。その後、低速の振盪器に掛けた状態のまま懸濁液の平衡化を室温で１時間行い、回転数１４，０００ｒｐｍの状態でＵｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘを用いて１分間調和化を行い、２０，０００ｇの遠心力で４℃で２０分間遠心分離を行った。さらに分析するため、可溶性タンパク質部分および不可溶性タンパク質部分を回収した。
【０１３０】
（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを用いた多糖リアーゼ変異体（Ａｍｂ ａ １．３切断型）の発現および分泌）
合成的に最適化（コドン最適化）が行われた、多糖リアーゼ（ペクチン酸リアーゼ）変異体のＡｍｂ ａ １．３切断型をコードするＤＮＡ配列を、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ｐＰＩＣＺα、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＡＯＸ１プロモータ、分泌リーダー信号α接合因子）に好適な標準的な発現ベクター内にクローン化した。直鎖状発現ベクターをコンピテントＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞内に取り込んで形質転換を引き起こし、当該直鎖状発現ベクターのゲノムの組込を行った後、多数のクローンに対してスクリーニング（マイクロウェルプレート）を行い、最終的にクローン生成物の形成および分泌の実績（Ａｍｂ ａ １．３切断型の発現量）に関しての選抜を行った。
【０１３１】
形質転換細胞の４つの単一コロニーを振盪フラスコ内で培養し、メタノールの存在下および不在下でＡｍｂ ａ １．３切断型の発現の試験を行った。図１４に示すように、分泌された組み換えＡｍｂ ａ １．３切断型はメタノール誘発培養物の培養上清中に存在し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（Ａ）およびウエスタンブロット法（Ｂ）によって検出した（矢印参照）（Ａｍｂ ａ １．３切断型の予測分子量：２７．７ ｋＤａ）。
【０１３２】
（ＥＬＩＳＡ実験）
ＥＬＩＳＡ実験するため、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ、ニューヨーク、米国）をタンパク抗原（５０μｌのＰＢＳ中において２００ ｎｇ／ウェル）によって４℃で一晩コーティングした。トリス−緩衝食塩水（ＴＢＳ）、ｐＨ７．４、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でプレートをブロックし、１：１０に希釈した患者血清を用いて４℃で一晩インキュベートした。３７℃で１時間および４℃で１時間のインキュベート後、アルカリホスファターゼ共役モノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて結合ＩｇＥを検出した。１０ｍＭの４−リン酸ニトロフェニル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を基質として使用し、光学濃度を波長４０５／４９２ｎｍで測定した。全ての測定を複製として行った。この結果を光学濃度の平均値として示す。
【０１３３】
（好塩基球の活性化）
Ｅ．ｃｏｌｉおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ内にそれぞれ発現させたＡｍｂ ａ １およびその誘導体（図１１ａ）並びにＣｕｐ ａ １およびその誘導体（図１１ｂ）に関しては、記載のラット好塩基性脱顆粒アッセイ（ＲＢＬ）法を用いてアレルゲン素質の測定を行った（Vogel L. et al., Allergy. 2005 Aug;60(8):1021-8.）。ブタクサ花粉に対してアレルギー反応を示す個々のヒトから採取した血清を含む血清プールを１：１５の希釈液に添加し、抗原溶液の滴定を行い、上清中への抗原依存性β−ヘキソスアミン酵素の放出を蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−グルコサミニドの酵素的切断によって測定し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００処理細胞の酵素の総含有量に対する百分率（％）として示した。
【０１３４】
（結果）
（第２のアミノ酸位置）
細胞質タンパク質の半減期は、アミノ末端残基によってかなりの程度まで決定される。高度に不安定な残基（例えば、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、およびロイシン）は、急速なユビキチン化にとって有利に作用する。したがって、発現タンパク質の破壊）にとっても有利に作用する、反対に、安定化残基はそのような作用を示さない。
【０１３５】
多くの植物ペクチン酸リアーゼは、こうした不安定化アミノ酸残基を成熟Ｎ末端において発現する傾向を示す。発現タンパク質の破壊を避けるとともに、発現量を向上させるため、Ｎ末端アミノ酸配列の改変を行った４つの構築物を設計した（図１参照）。
【０１３６】
ＬＢ補足培地内においてＩＰＴＧ（ＯＤ６００ｎｍ＝０，７）を用いて３７℃で７時間誘導を行った後に増殖させたＥ．ｃｏｌｉ内でのタンパク質発現を目的として、上記４つの構築物を用いた。液体窒素を用いて細胞の破砕を行い、この結果得られる可溶性タンパク部分の分析をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法およびウエスタンブロット法によって行った（図２参照）。
【０１３７】
Ｎ末端にさらなるＧｌｙ−Ａｌａを有するＣｒｙ ｊ １構築物は、他の構築物に比べてＥ．ｃｏｌｉ内の総タンパク質発現がより高くなっている。さらに、第２のアミノ酸位置にアラニンを有するＣｒｙ ｊ １構築物を使用した場合、ウエスタンブロット法によって組み換えＣｒｙ ｊ １の発現が明確に検出可能となった。
【０１３８】
こうした観察はＥ．ｃｏｌｉのタンパク質発現の研究と一致するものであり、高発現タンパク質では第２のアミノ酸位置におけるアラニンの頻度が高くなっていることを示している。
【０１３９】
（コドン整合化）
タンパク質産生を目的としてコドン最適化する方法は、分子生物学分野で広く用いられている技術である。しかし、異種タンパク質の発現中では、発現宿主および天然宿主の同義語コドンの使用頻度の差異に起因して発現量の低下または不可溶性凝集物の形成が発生する場合がある。その反対に、コドン整合化では、天然遺伝子で用いられるコドン使用頻度と可能な限り近似して一致するＥ．ｃｏｌｉ由来の同義語コドンが使用される。幾つかの研究では、コドン整合化の手法によってタンパク質の収率および可溶性が著しく向上されたことを示すことができた（Angov E, et al. PloSOne 3(2008):e2189）。
【０１４０】
したがって、Ｃｒｙ ｊ １遺伝子のコドン最適化型およびコドン整合化型を設計して、タンパク質の発現量について比較を行った。
【０１４１】
タンパク質発現に使用したＯｒｉｇａｍｉおよびＢＬ２１（ＤＥ３）株はＫ−１２株の誘導体であったため、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２のコドン使用頻度のデータを使用した。
【０１４２】
タンパク質発現に関して、元のＣｒｙ ｊ １、コドン最適化を行ったＣｒｙ ｊ １、およびコドン整合化を行ったＣｒｙ ｊ １の比較を行った（図４参照）。
【０１４３】
元のＣｒｙ ｊ １、コドン最適化を行ったＣｒｙ ｊ １、およびコドン整合化を行ったＣｒｙ ｊ １の発現は、ＬＢ培地並びに自己誘導培地を用いて行った。自己誘導培地およびＣｒｙ ｊ １のコドン整合化を行った構築物を使用した場合に発現向上結果を観察することができた（図４参照）。しかし、発現されたタンパク質の極めて少量のみが全長Ｃｒｙ ｊ １であると考えられ、大半のタンパク質は分解されていた（免疫ブロット法の２７ｋＤａ付近）。これは、ブタクサの主要アレルゲンＡｍｂ ａ １について知られているような、可能な「α鎖」であると考えられた（Wopfner N, et al. Molecular Immunology 46(2009):2090-2097）。
【０１４４】
（リーダー配列）
第２のアミノ酸位置の最適化およびコドン整合化は、組み換えＣｒｙ ｊ １構築物の可溶性発現をもたらすことが示された。タンパク質の発現量を向上させるため、組み換え産生タンパク質の潜在的なペリプラスム局所化のリーダー配列を含む発現ベクター。使用したベクターは、従来使用されていたｐＥＴ ２８ｂベクターをｐｅｌＢリーダー配列（ペクチン酸リアーゼＢ由来のｐｅｌＢ）と組み合わせたｐＥＴ２６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）である。
【０１４５】
しかし、全ての公知ペクチン酸リアーゼの系統樹に関するさらなる研究によって、Ｃｒｙ ｊ １、Ａｍｂ ａ １、およびＣｕｐ ａ １のようなアレルゲン植物ペクチン酸リアーゼは、ペクチン酸リアーゼＢ（これに含まれるペクチン酸リアーゼは、ペクチン酸／ペクチンリアーゼ用のＣＡＺＹ−炭水化物活性酵素データベース（ｎ＝１７８）に収められているものである；図５参照）よりもペクチン酸リアーゼＣによって関連していることが明らかにされた。したがって、上記ｐｅｌＣリーダー配列に代えて、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のｐｅｌＣリーダー配列を使用した。さらに、上記手法が他のペクチン酸リアーゼにも適用可能であるか否かについて研究するため、Ａｍｂ ａ １を鋳型として使用した。
【０１４６】
（切断）
一つの目的は、免疫療法用の低アレルゲン性のペクチン酸リアーゼアレルゲンを作製することであった。しかし、これまでに記載の手法では、全長ペクチンリアーゼ（すなわち、Ａｍｂ ａ １、Ｃｒｙ ｊ １、およびＣｕｐ ａ １）の可溶性発現が可能となってしまう。
【０１４７】
ペクチン酸リアーゼの一群は、何れの生物に由来するかに関わらず、１つの重要な構造的類似性、すなわちβへリックス構造を有することを特徴としている。大きな右巻きへリックスを形成する３つの並行βストランドから構成される折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）モチーフは、極めて安定的な構造モチーフ（Yoder MD, et al. The FASEB Journal 9(1995):335-342）であることが示された。多様な公知ペクチン酸リアーゼは、βへリックスの中核から突出しているループのサイズおよび立体構造が異なっている。したがって、Ａｍｂ ａ １、Ｃｒｙ ｊ １、およびＣｕｐ ａ １の切断型を設計した。これらは、野生タンパク質のＮ末端部分およびＣ末端部分を欠いているため、全βへリックスに公知のＴ細胞エピトープが残ることになる。
【０１４８】
図６および７は、Ａｍｂ ａ １．３α鎖およびＡｍｂ ａ １．３切断型の配列および構造上の差異を示す。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｓｔａｒを使用し、ＬＢｓｕｐｐ培地内において１６℃で２０時間インキュベートして、異なる構築物のタンパク質発現を行った。
【０１４９】
図８に示すように、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ ｐｅｌＣリーダー配列を有するＡｍｂ ａ １．３切断型構築物は、最も高いタンパク質発現量を示す。したがって、以下の全ての構築物（全長または切断型のＣｒｙ ｊ １、Ｃｕｐ ａ １）は、ｐｅｌＣリーダーを用いてクローン化された。したがって、上記ｐｅｌＣリーダーを用いて以下の全構築物（全長または切断型のＣｒｙ ｊ １、Ｃｕｐ ａ １）のクローン化を行った。
【０１５０】
（患者ＩｇＥ結合）
（ドットブロット法（図９参照））
患者血清ＣＥ２００９、患者７３、７４、３、６０、９９、３８
・タンパク質：発現したてのＡｍｂ切断型Ｐｅｌ Ｃ、可溶性溶解物、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ法によって確認した切断型の含有量、２．９ ｍｇ／ｍｌの総タンパク量、総タンパク量の１０％と予測される切断型
・発現したてのＡｍｂ全長Ｐｅｌ Ｃ、可溶性溶解物、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ法によって確認した全長型の含有量、２．８ ｍｇ／ｍｌの総タンパク量、総タンパク量の１０％であると予測される全長型
・発現したてのＡｍｂα鎖、６Ｍの尿素、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ法によって確認したα鎖の含有量、５．７ ｍｇ／ｍｌの総タンパク量、総タンパク量の１０％と予測されるα鎖
・発現したてのＡｍｂ Ｒ２、６Ｍの尿素、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ法によって確認したＲ２の含有量、３．２ ｍｇ／ｍｌの総タンパク量、総タンパク量の１０％であると予測されるＲ２
・ＩＰＴＧで誘導を行ったＢＬ２１、プラスミド無し、可溶性部分
・ブラッドフォード分析法によって決定した、３．６ ｍｇ／ｍｌの総タンパク量、天然Ａｍｂ ａ １−ｃｏｎｃ．０．２ ｍｇ／ｍｌ
スポットごとに５０μｌをスポット、血清を１：１０に希釈、４°でのｏＮインキュベート、抗ヒトＩｇＥ ＡＰ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）１：５．０００を用いての検出、４ｈ ＲＴ、基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰ
ウサギ抗天然Ａｍｂ ａ １希釈１：１０．０００、４°でのｏＮインキュベート、ヤギ抗ウサギＡＰ（ＪＡＣＫＳＯＮ）１：１０．０００を用いての検出、４ｈ ＲＴ、基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰ
（ＥＬＩＳＡ（図１０参照））
患者血清を使用：ＣＥ血清５、３８、６０、６２、７４、３７、４８、９９
コーティング条件：細菌溶解物由来の２５μｇ／ｍｌの総タンパク量、２μｇ／ｍｌの精製天然Ａｍｂ ａ １（ｎＡｍｂ ａ １）
（ＲＢＬ−メディエーター放出アッセイ（図１１ａ〜ｂ参照））
タンパク質：
・天然Ａｍｂ ａ １またはＣｕｐ ａ １−０．２ ｍｇ／ｍｌ
・Ａｍｂ切断型またはＣｕｐ ａ １切断型：可溶性融解物、２．５ｍｇ／ｍｌの総タンパク量、総タンパク量の１０％と予測される切断型
・ＩＰＴＧで誘導を行ったＢＬ２１、プラスミド無し、可溶性部分、３．５ｍｇ／ｍｌの総タンパク量
抽出物内に存在するＡｍｂ切断型およびＣｕｐ ａ １切断型はそれぞれ約１０％のみであったため、天然Ａｍｂ ａ １および天然Ｃｕｐ ａ １のタンパク質濃度は切断変異体よりも１０倍低くなった。
【０１５１】
精製を行った天然Ａｍｂ ａ １および天然Ｃｕｐ ａ １のみがメディエーター放出を示すことが可能であった。切断型は、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの何れに発現されているかに関わらずメディエーター放出を示さず、アレルゲン性の著しい減少を反映することになった。対照として、ＢＬ２１、プラスミド無し、可溶性部分を使用した。
【０１５２】
（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを用いた多糖リアーゼ変異体（Ａｍｂ ａ １．３切断型）の発現および分泌）
発現量が特異的に最も高いＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのクローン（図１４中のレーン８のクローン）を生体リアクター（発酵槽）内での発酵のために選択した。振盪フラスコ（半合成培地）内での前培養後、微量元素を補充した４００ｍｌの合成培地を含む発酵槽内に培養物を移した。初期バッチ培養相中では、細胞集団（バイオマス）を拡大するために、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを炭素源としてのグリセロール上で増殖させた。その後、細胞のバイオマスをさらに増大させるために、上記培養物に対して、濃縮グリセロール溶液を用いた栄養素添加（供給）を行った。グリセロールの供給から４時間経過後、濃縮メタノールの添加によってＡｍｂ ａ １．３切断型の発現を誘起（ＡＯＸ１プロモータの誘起）した。当該分野に公知の標準的な培養条件（温度＝開始当初は２８℃／メタノールによる誘起時は２４℃；ｐＨ＝５．８；溶存酸素飽和度：３０％）を適用した。培養終了時（生体リアクターでの培養時間が約１００時間経過後）上清を含むＡｍｂ  ａ  １．３切断型を遠心分離によって細胞から分離した（最終濡れ細胞量：〜５０％ｗ／ｖ）。発酵上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥを図１５に示す。図中の矢印で示されるように、Ａｍｂ ａ １．３切断型は高力価で分泌されていた。
【０１５３】
（実施例２：野生Ａｍｂ ａ １の組み換え発現の結果、分子量の大きな凝集体の形成によって材料の損失が生じる）
Ｔ７プロモータ系発現ベクターを含むＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を用いて組み換え野生Ａｍｂ ａ １を発現された。細胞は、マグネシウム塩およびグルコースを含むＬＢ培地内の生体リアクター内で培養させた。組み換えタンパク質の発現の誘起をＩＰＴＧの添加によって行った。培養から８時間経過後、遠心分離によって細胞を回収し、その後に凍結融解サイクルによって溶解させた。可溶性の細胞溶解物（遠心分離による上清）中にはＡｍｂ ａ １が何ら検出されなかった。不可溶性部分（遠心分離によるペレット／封入体）からの組み換えＡｍｂ ａ １の抽出は、強変性条件（８Ｍの尿素＋２−メルカプトエタノール）を適用することによってのみ可能であった。Ａｍｂ ａ １の変性抽出物に対して固定化金属キレート親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を行った。図１６のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの上部に示されるように、ＩＭＡＣ溶出液の部分は、重合化された高分子凝集体をＳＤＳ−ＰＡＧＥの積み重ねゲルのスロットに多量に含んでいた。強力に凝集した野生Ａｍｂ ａ １の同様の結果が、疎水性相互作用、イオン交換、またはサイズ排除のような他のクロマトグラフィー原理を用いて得られた。高濃度の尿素の存在は、精製工程の全期間において必要であった。
【０１５４】
不可溶性の凝集体を形成する高い傾向は、収率の著しい減少および処理の出力パラメータの再現性の欠如を引き起こし、これにより上記方法は大規模な薬剤生産に不適当となった。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】アミノ末端が修飾されているＣｒｙ ｊ １を示す。（１）はさらなるＧｌｙ−Ａｌａを有するＣｒｙ ｊ １を示す。（２）は、Ａｓｐ−Ａｓｎが欠失し、これらに代えてＧｌｙを有するＣｒｙ ｊ １を示す。（３）はＡｓｐ−ＡｓｎがＧｌｙ−Ｔｈｒに交換されているＣｒｙ ｊ １を示す。（４）はＡｓｐ−ＡｓｎがＧｌｙ−Ｍｅｔに交換されているＣｒｙ ｊ １を示す。
【図２】Ｅ．ｃｏｌｉ内での発現後の可溶性の細菌タンパク質の一部分を示す。マウスモノクローナル抗Ｃｒｙ ｊ １抗体を用いたクーマシィー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット。
【図３】アミノ末端にさらなるＧｌｙ−Ａｌａを有するＣｒｙ ｊ １のコドン最適化およびコドン整合化後のＮ末端のコドン使用頻度の差異を示す。
【図４】自己誘導培地を使用してＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）内に３７℃で２４時間発現させたＣｒｙ ｊ １構築物のマウス抗Ｃｒｙ ｊ １モノクロ―ナル検出抗体を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥ法およびウエスタンブロット法を示す。
【図５】ｐＥＴ２６−ｂベクターｐｅｌＢのリーダー配列とＥｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ ｐｅｌＣのリーダー配列との差異を示す。
【図６】Ａｍｂ ａ １．３ Ｒ２の配列を示す。イタリックのフォントで示した配列領域は欠損しているため、切断Ａｍｂ ａ １．３ Ｒ２が形成されている。
【図７】Ａｍｂ ａ １．３ Ｒ２切断モデルを黒色で示す。天然Ｊｕｎ ａ １（ＰＤＢ １ｐｘｚ）の結晶構造を鋳型構造として使用した。
【図８】ＬＢｓｕｐｐ培地中のＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｓｔａｒ内で１６℃で２０時間発現させたＡｍｂ ａ １．３ Ｒ２切断構築物の全細胞タンパク質抽出物を示す。
【図９】Ｅ．ｃｏｌｉ内に発現させたＡｍｂ ａ １およびその誘導体のドットブロット分析を示す。空の発現プラスミドおよび精製天然Ａｍｂ ａ １でトランスフェクトを行ったＥ．ｃｏｌｉを参照として使用した。
【図１０】Ｅ．ｃｏｌｉ内に発現させたＡｍｂ ａ １およびその誘導体のＥＬＩＳＡ分析を示す。空の発現プラスミドおよび精製天然Ａｍｂ ａ １でトランスフェクトを行ったＥ．ｃｏｌｉを参照として使用した。
【図１１ａ】Ｅ．ｃｏｌｉ内とＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ内とで発現させたＡｍｂ ａ １およびその誘導体のメディエーター放出分析を示す。空の発現プラスミドおよび精製天然Ａｍｂ ａ １でトランスフェクトを行ったＥ．ｃｏｌｉを参照として使用した。
【図１１ｂ】Ｅ．ｃｏｌｉ内とＣｕｐ ａ １内とで発現させたＡｍｂ ａ １およびその誘導体のメディエーター放出分析を示す。空の発現プラスミドおよび精製天然Ａｍｂ ａ １でトランスフェクトを行ったＥ．ｃｏｌｉを参照として使用した。
【図１２】Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２およびＥ．ｃｏｌｉ Ｂのコドン使用頻度の比較を示す。
【図１３−１】それぞれの配列識別子（配列番号）に対応付けた配列を示す。
【図１３−２】それぞれの配列識別子（配列番号）に対応付けた配列を示す。
【図１３−３】それぞれの配列識別子（配列番号）に対応付けた配列を示す。
【図１３−４】それぞれの配列識別子（配列番号）に対応付けた配列を示す。
【図１３−５】それぞれの配列識別子（配列番号）に対応付けた配列を示す。
【図１３−６】それぞれの配列識別子（配列番号）に対応付けた配列を示す。
【図１３−７】それぞれの配列識別子（配列番号）に対応付けた配列を示す。
【図１３−８】それぞれの配列識別子（配列番号）に対応付けた配列を示す。
【図１３−９】それぞれの配列識別子（配列番号）に対応付けた配列を示す。
【図１４】Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの幾つかのクローンから分泌されるＡｍｂ ａ １．３切断（配列番号１）の細胞上清から得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１４（Ａ））およびウエスタンブロット（図１４（Ｂ））を示す。データは振盪フラスコ内での培養より得られる。矢印は、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ法（図１４（Ａ））およびウエスタンブロット法（図１４（Ｂ））による所望のＡｍｂ ａ １．３．切断分子（分子量の予測値：２７．７ ｋＤａ）ｎメタノール不含株（レーン２〜５）、またはメタノール誘導株（レーン６〜１１）を示す。
【図１５】生体リアクター（発酵槽）内で培養させたＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのＡｍｂ ａ １．３切断（配列番号１）の細胞上清から得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。矢印は、所望のＡｍｂ ａ １．３.切断分子（予測分子量：２７．７ ｋＤａ）を示す。
【図１６】分子量の大きい組み換え型の野生Ａｍｂ ａ １を含むＩＭＡＣ溶出液の一部から得られるＳＤＳ−ＰＡＧＥは、カラム１〜４および１１〜１８のゲルスロットの頂部で凝集している。
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１３−７】
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【図１３−８】
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【図１３−９】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２】
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【図４】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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