(57)【要約】  本発明は、複合液体から１つまたは複数の表面特性が異なる細胞および／または生体粒子を同時に単離するための簡単かつ廉価な方法を記載している。そのために、追加の段階工程によって狙い通りに個々の標的粒子を「中和する」ことを可能にするように、固体担体の表面に異なる捕捉分子を備えさせる。それによって、段階的に、同じ識別構造も異なる識別構造をも有する異なる標的粒子を捕捉粒子から解離して、それらが単離／分離されることが望ましい。本発明の適用分野は、生物工学（生物学的研究および医学的研究を含む）、病気の診断および処置である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体担体による異なる細胞または生体粒子を分離し、単離するための方法において、表面上に標的特異性の異なる少なくとも２つの捕捉分子が公知法により結合されている固体担体であって、かつそのうち少なくとも１つの捕捉分子は、公知法により、捕捉分子と標的粒子との間または捕捉分子と担体との間の直接的橋かけ結合が解離されるように処理できる固体担体を、標的粒子含有液体と接触させ、続いて担体−捕捉分子−標的複合体をまず公知法により単離し、次いで該標的粒子を、各橋かけ結合の開裂によって連続的に解離することを特徴とする、方法。
【請求項２】
捕捉分子として、好ましくは、担体表面上に吸着で、または共有結合もしくは非共有結合で結合している抗体を使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
捕捉分子が、直接的にまたはスペーサー／橋かけ分子を介して、スペーサーおよび標的を化学的または酵素的または物理的に分離するための所定の特性を備えていることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
捕捉分子が、更に磁化可能におよび／または蛍光可能に作製されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
担体−捕捉分子複合体と標的粒子との間の橋かけ結合が、標的粒子からの捕捉分子の分離によって、もしくは担体からの捕捉分子の分離によって、または、捕捉分子と標的粒子との結合の解離によって解離されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
標的粒子または固体担体からの捕捉分子の分離が、酵素の作用によってまたは水素結合を弱める物質の作用によって行われることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
捕捉分子と標的粒子との結合の解離は、レセプターまたはアクセプターを模した物質であって、捕捉分子レセプターおよび標的粒子アクセプターの間よりも高い比結合強度を有する物質による置換反応によって行われることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
固体担体上の捕捉分子の所望の各特異性について、好ましくは、担体−捕捉分子複合体と標的粒子との間の直接的橋かけ結合の解離の異なる手順が行われることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
無制限に多数の異なる捕捉分子特異性が、立体障害と、標的粒子の数と、担体−捕捉分子複合体と標的粒子との間の直接的橋かけ結合を解離するために用意された方法の全体によってのみ制限されて、固体担体の表面上に結合されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１０】
固体担体−捕捉分子複合体と標的粒子との間の橋かけ結合の解離のために、例えば還元剤、例えばβ−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、スペーサー内またはスペーサー周辺に存在する切断部位に応じた酵素ならびに捕捉分子レセプターおよび標的粒子アクセプターの間に存在するものよりも高い結合能を有する物質、例えばビオチンによるデスチオビオチンの置換が使用されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
固体担体によって分離された、同じおよび異なる捕捉分子−標的特異性を併有する標的粒子は、担体−捕捉分子複合体と標的粒子との間の橋かけ結合を段階的に解離させ、続いて、公知の磁気法、重量法または篩法により分離することによって、同じ標的レセプター／アクセプター特異性を有するそれぞれ同種の標的集団に分離し、単離されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
固体担体が任意の幾何学形状、好ましくはマイクロ粒子を有し得ることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一つに記載の方法の、細胞を体液から分離するための、生物工学、医学的研究、病気の診断および治療において用いられる、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
序論
本発明は、複合液体から１つまたは複数の表面特性が異なる細胞および／または生体粒子を同時に単離するための方法を記載している。本発明によって、好適な担体および公知の固定化法を使用して、異なる特定の細胞および／または生体粒子を認識し、段階的に分離することができる。
【０００２】
本発明は、液体、好ましくは血液から細胞および／または粒子を穏やかに分離／単離するための簡単な方法を記載している。このために、タンパク質結合法、タンパク質切断法、分子間および分子内水素結合の加水分解、タンパク質置換法および抗原−抗体解離法といった公知の段階が、捕捉粒子の篩分け法と組み合わされる。
【０００３】
細胞とは、生理学的または病理学的な調節状態にあるか否かと無関係に任意の体細胞型、微生物、例えば細菌、酵母／菌類および原生動物ならびにウイルスを表す。生体粒子とは、液状媒体（例えば血液、栄養培地、細胞培養培地、バッファー中での細胞調製物など）における溶解性の喪失に付随して現れる任意の状態の有機分子を表す。簡潔にするために、目的細胞および生体粒子の用語を、以下、「標的粒子」という用語でまとめる。
【０００４】
本発明の適用分野は、生物工学（生物学的研究および医学的研究を含む）、病気の診断および処置である。
【背景技術】
【０００５】
先行技術
粒子、特に体細胞および病原体の、血液などの複合液体からの同定、分離および単離は、病気の研究、診断および処置のために不可欠な工程段階である。
【０００６】
異なる密度を有する粒子（例えば白血球および赤血球）の分離のためには、遠心分離法またはフィルタが適していると認められている。病気の病原および免疫原の研究の進展とともに、同じ密度であるが異なる機能を有する細胞を同定、分離および単離するための要求が高まってきている。例えばリンパ球の異なる機能は、細胞外膜上にある特徴的な構造の発現によって与えられる（例えばここでは、いわゆる分化抗原群−ＣＤ類）。これらの構造に対して抗体を生成でき、それらの抗体は、より特異的な分離法のための決定的なツールである。この課題のためには数１０年にわたり、蛍光活性化分離法と磁気分離法とが適していると認められてきた。近頃、ｐｌｕｒｉＳｅｌｅｃｔ社（ドイツ）によって、捕捉粒子に支援された二重篩分け法も提案されている（独国特許出願第ＤＥ１０２００７０４１０４９．４（特許文献１））。これらの方法は、簡単に、膜上の特徴が他と異なる細胞を複合液体から単離することを可能にする。
【０００７】
しかし、異なる機能を有する多くの細胞は、しばしば分化特性以外は同じ（重複した）特性を有する。例えばＮＫ細胞（ＣＤ８＋；ＣＤ５６＋、ＣＤ１６２Ｒ）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋、ＣＤ３＋）、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ３＋；ＣＤ４＋）、制御性Ｔ細胞（ＣＤ３＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ４＋）。
【０００８】
ＣＤ類の一つだけの望ましい組合せを有する細胞の単離は、依然として、生物学的研究において大きな挑戦である。目下、多重標識による蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によってのみこの課題を解決できるにすぎない。ＦＡＣＳは、疑いなく、細胞の診断的な分離のための至適基準であるが、高い設備投資と人件費を伴うものである。この技術の更なる欠点は、単離された細胞にとっての高いストレスであり、更に、この技術は複雑な滅菌作業を必要とする。更にまた、より多数の生細胞のソーティングには方法上の限界が定められている。
【０００９】
多数の細胞の単離のためのＦＡＣＳの使用には問題が引き起こされる。細胞を含有する媒体は大きく希釈せねばならず、より多量の細胞のために分離時間は比較的長く、そして、無菌条件を維持するという問題が引き起こされる。該方法の実施には、全体的に多大な費用がかかり、治療的（ＧＭＰに準拠した）使用のためには適していない。
【００１０】
同じ表面構造と異なる表面構造とを有する細胞の分離／単離のための別の発明は、ＤＥ１０２００９０３７３３１．４（特許文献２）に記載されている。その発明は、この解決課題を、磁気分離法と捕捉粒子に支援された篩分け法の新規組合せによって解決している。しかし、この発明においても異なる担体が同時に使用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＤＥ１０２００７０４１０４９．４
【特許文献２】ＤＥ１０２００９０３７３３１．４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
課題／目的
本発明の目的は、複合型の細胞混合物の分離のための簡単な方法であって、僅かなステップで廉価に、１つまたは複数の表面特性が異なる細胞および／または生体粒子を分離できる方法を開発することである。また、血液または血清などの複合液体で使用するためにも適していることが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、請求項１〜１３のいずれかに従って実現される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の説明
本発明の課題は、追加の工程段階によって狙い通りに個々の標的粒子を「中和する」ことを可能にするように、固体担体の表面に異なる捕捉分子を備えさせる方法を開発することによって解決される。それによって、段階的に、同じ識別構造も異なる識別構造をも有する異なる標的粒子を捕捉粒子から解離して、それらが単離／分離されることが望ましい。
【００１５】
捕捉分子の中和に関する中和とは、捕捉粒子と標的との間の橋かけの分解（Ｄｅｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を生じる任意の処理を意味し、例えばそれは捕捉粒子からの標的の解離／切り離しによるもの、または抗体−抗原結合部位の分解によるものである。その結果、先のこの結合部位では、捕捉粒子と標的粒子との間に物理的接触は今もはや存在しない。こうした異なる戦略を、目的設定に応じて組み合わせることができる。
【００１６】
本発明は、特に、固体担体による異なる細胞または生体粒子の分離および単離のための方法において、前記固体担体であってその表面上に異なる標的特異性の少なくとも２つの捕捉分子が公知法によって結合されており、かつそのうち少なくとも１つの捕捉分子は公知法によって、捕捉分子と標的粒子との間もしくは捕捉分子と担体との間の直接的橋かけ結合が解離されるように処理できる固体担体を、前記標的粒子を含有する液体と接触させ、引き続き担体−捕捉分子−標的複合体をまず公知法により単離し、次いで該標的粒子を、その都度の橋かけ結合の開裂によって連続的に解離することを特徴とする方法に関する。
【００１７】
その際、捕捉分子として、担体表面上に吸着で、または共有結合もしくは非共有結合で結合している抗体を使用する場合が特に好適である。
【００１８】
捕捉分子が直接的にまたはスペーサー／橋かけ分子を介して、スペーサーおよび標的を化学的にまたは酵素的にまたは物理的に分離するために予め決められた特性を備えており、かつ該捕捉分子が、好ましくは付加的に磁化可能におよび／または蛍光可能に作製されている場合が特に有利である。
【００１９】
担体−捕捉分子複合体と標的粒子との橋かけ結合を、標的粒子からの捕捉分子の分離によって、もしくは担体からの捕捉分子の分離によって、または、捕捉分子と標的粒子との結合の解離によって解離させる方法を用いることが有利である。
【００２０】
標的粒子からのまたは固体担体からの捕捉分子の分離が、酵素の作用によってまたは水素結合を弱める物質の作用によって行われる方法が特に好適である。
【００２１】
特に、捕捉分子と標的粒子との結合の解離は、レセプターまたはアクセプターを模した物質であって、捕捉分子レセプターおよび標的粒子アクセプターの間よりも高い比結合強度を有する物質による置換反応によって行うことが適していると認められた。
【００２２】
好ましくは、その際、前記固体担体上の捕捉分子の各々の所望の特異性について、担体−捕捉分子複合体と標的粒子との直接的橋かけ結合の解離の異なる手順が行われる。
【００２３】
有利な一実施形態においては、固体担体の表面上での無制限に多数の異なる捕捉分子特異性は、立体障害と、標的粒子の数と、担体−捕捉分子複合体と標的粒子との直接的橋かけ結合を解離するために用意された方法の全体によってのみ制限されて結合される。
【００２４】
更なる有利な一実施形態においては、固体担体−捕捉分子複合体と標的粒子との橋かけ結合の解離のためには、例えば還元剤、例えばβ−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、スペーサー内またはスペーサー周辺に存在する切断部位に応じた酵素ならびに捕捉分子レセプターおよび標的粒子アクセプターの間に存在するものよりも高い結合能を有する物質、例えばビオチンによるデスチオビオチンの置換が使用される。
【００２５】
本発明の更なる一実施形態においては、固体担体によって分離された、同じおよび異なる捕捉分子−標的特異性を併有する標的粒子は、担体−捕捉分子複合体と標的粒子との橋かけ結合を段階的に解離させ、続いて、公知の磁気法、重量法または篩法により分離することによって、同じ標的レセプター／アクセプター特異性を有するそれぞれ同種の標的集団に分離し、単離される。
【００２６】
本発明のもう一つの態様は、本発明による固体担体であって、任意の幾何学形状、好ましくはマイクロ粒子を有し得る本発明の固体担体の使用に関する。ポリスチレン（ＰＳ）、ポリメタクリレート（ＰＭＡ）、ポリラクチド（Ｐｏｌｙａｋｔｉｄｅ）（ＰＬＡ）または他の合成樹脂製の担体材料が特に好ましい。同様に、セファロース、アルギネートまたは類似の有機材料製の担体材料が特に好適である。
【００２７】
細胞を体液から分離するための本発明による方法は、生物工学、医学的研究、病気の診断および治療における使用に特に好適である。
【００２８】
同じ表面構造と異なる表面構造とを有する細胞の連続的な分離は先行技術であるが、本発明による方法は、異なる標的特異性の少なくとも２つの捕捉分子を有する１つだけの固体担体を使用して、細胞および／または生体粒子の純粋な同時分離をはじめて可能にしている。該方法は、大きな細胞数、低コストおよびわずかだけの作業用材料で、短時間かつ細胞にとって低ストレスで実施できる。該方法は、簡単な物理的分離法を用いて重複した表面特性を有する亜集団の同時単離／分離を可能にする。該方法は、被験者の全血の反応器での直接的な使用を可能にし、従って治療／診断のために体外で使用できる。
【００２９】
以下の実施例は、幾つかの適用についての方法上の具体化を説明している。当業者は、適用をその都度の目的設定に応じて任意に組み合わせ、改変できる。
【実施例】
【００３０】
例１
中和できない捕捉分子を有する捕捉粒子からの捕捉体−標的複合体の解離による捕捉体中和の組合せ
捕捉粒子（例えば３０μｍ直径を有するポリスチレン粒子）上に抗ＣＤ８抗体をカルボキシル基（ＮＨＳ／ＥＤＳ）を介して共有結合させ、かつ抗ＣＤ３抗体をデスチオビオチンリンカーを介して結合させる。前記捕捉粒子を全血中に入れて１５分にわたって転がしながらインキュベートする。この時間の間に、ＣＤ３陽性細胞とＣＤ８陽性細胞が前記粒子に結合する。これらの粒子を適切な篩（例えばｐｌｕｒｉＳｔｒａｉｎｅｒ）によって全血から単離し、洗浄する。その後に、デスチオビオチンリンカーに結合された抗ＣＤ３抗体を１２ｍＭのビオチン溶液の添加により前記捕捉粒子から置換する。前記粒子上には、ＣＤ３／ＣＤ８陽性細胞を含む全てのＣＤ８陽性細胞が残留する。解離された細胞は、ＣＤ３＋かつＣＤ８−である。
【００３１】
例２
中和できない捕捉分子を有する捕捉体／抗体−標的／抗原複合体の分解による捕捉体中和の組合せ
捕捉粒子（例えば３０μｍ直径を有するポリスチレン粒子）上に抗ＣＤ１４抗体をカルボキシル基（ＮＨＳ／ＥＤＳ）を介して共有結合させ、かつ抗ＣＤ４抗体をリンカーを介して結合させる。前記捕捉粒子を全血中に入れて１５分にわたって転がしながらインキュベートする。この時間の間に、ＣＤ１４陽性細胞とＣＤ４陽性細胞が前記粒子に結合する。これらの粒子を適切な篩（例えばｐｌｕｒｉＳｔｒａｉｎｅｒ）によって全血から単離し、洗浄する。その後に、前記の抗ＣＤ４抗体に、より高い親和性のペプチドを添加することで、このペプチドは、前記抗体を細胞上のレセプターから置換する。前記粒子上には、ＣＤ４／ＣＤ１４陽性細胞を含む全てのＣＤ１４陽性細胞が残留する。解離された細胞は、ＣＤ４＋かつＣＤ１４−である（図１）。
【００３２】
例３
中和できない捕捉分子での分解および解離による捕捉体中和の組合せ
捕捉粒子（例えば３０μｍ直径を有するポリスチレン粒子）上に抗ＣＤ１４抗体をカルボキシル基（ＮＨＳ／ＥＤＳ）を介して共有結合させ、かつ抗ＣＤ４抗体をＤＮＡリンカーを介して結合させる。前記捕捉粒子を全血中に入れて１５分にわたって転がしながらインキュベートする。この時間の間に、ＣＤ１４陽性細胞とＣＤ４陽性細胞が前記粒子に結合する。これらの粒子を適切な篩（例えばｐｌｕｒｉＳｔｒａｉｎｅｒ）によって全血から単離し、洗浄する。その後に、ＤＮＡリンカーに結合された抗ＣＤ４抗体をＤＮＡｓｅ溶液の添加により前記捕捉粒子から切り離す。前記粒子上には、ＣＤ４／ＣＤ１４陽性細胞を含む全てのＣＤ１４陽性細胞が残留する。解離された細胞は、ＣＤ４＋かつＣＤ１４−である（図２）。
【００３３】
例４
捕捉体−標的複合体の捕捉粒子からの分解および解離による捕捉体中和の組合せ
捕捉粒子（例えば３０μｍ直径を有するポリスチレン粒子）上に抗ＣＤ３抗体をデスチオビオチンリンカーを介して結合させ、かつ抗ＣＤ４抗体をＤＮＡリンカーを介して結合させる。前記捕捉粒子を全血中に入れて１５分にわたって転がしながらインキュベートする。この時間の間に、ＣＤ３陽性細胞とＣＤ４陽性細胞が前記粒子に結合する。これらの粒子を適切な篩（例えばｐｌｕｒｉＳｔｒａｉｎｅｒ）によって全血から単離し、洗浄する。その後にまず、デスチオビオチンリンカーに結合された抗ＣＤ３抗体を１２ｍＭのビオチン溶液の添加により前記捕捉粒子から置換する。前記粒子上には、ＣＤ４／ＣＤ３陽性細胞を含む全てのＣＤ４陽性細胞が残留する。解離された細胞は、ＣＤ３＋かつＣＤ４−である。その後に、ＤＮＡリンカーに結合された抗ＣＤ４抗体をＤＮＡｓｅ溶液の添加により前記捕捉粒子から切り離す。解離された細胞は、ＣＤ３＋かつＣＤ４＋である。
【００３４】
例５
捕捉粒子からのおよび中和できない捕捉分子を有する捕捉粒子からの捕捉体−標的複合体の分解および解離による捕捉体中和の組合せ
捕捉粒子（例えば３０μｍ直径を有するポリスチレン粒子）上に抗ＣＤ１４抗体をカルボキシル基（ＮＨＳ／ＥＤＳ）を介して共有結合させ、かつ抗ＣＤ３抗体をデスチオビオチンリンカーを介して結合させ、かつ抗ＣＤ４抗体をＤＮＡリンカーを介して結合させる。前記捕捉粒子を全血中に入れて１５分にわたって転がしながらインキュベートする。この時間の間に、ＣＤ３陽性細胞とＣＤ４陽性細胞およびＣＤ１４陽性細胞が前記粒子に結合する。これらの粒子を適切な篩（例えばｐｌｕｒｉＳｔｒａｉｎｅｒ）によって全血から単離し、洗浄する。その後にまず、デスチオビオチンリンカーに結合された抗ＣＤ３抗体を１２ｍＭのビオチン溶液の添加により前記捕捉粒子から置換する。前記粒子上には、ＣＤ４／ＣＤ３陽性細胞およびＣＤ４／ＣＤ１４陽性細胞を含む全てのＣＤ４陽性細胞およびＣＤ１４陽性細胞が残留する。解離された細胞は、ＣＤ３＋かつＣＤ４−かつＣＤ１４−である。その後に、ＤＮＡリンカーに結合された抗ＣＤ４抗体をＤＮＡｓｅ溶液の添加により前記捕捉粒子から切り離す。解離された細胞は、ＣＤ３＋かつＣＤ４＋かつＣＤ１４−である。前記粒子上には、ＣＤ４／ＣＤ１４陽性細胞を含む全てのＣＤ１４陽性細胞が残留する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１ａ】共有結合したＣＤ１４と組み合わせない、置換による解離での全血からのＣＤ４陽性細胞の単離。
【図１ｂ】共有結合したＣＤ１４と組み合わせた、置換による解離での全血からのＣＤ４陽性細胞の単離。
【図２ａ】共有結合したＣＤ１４と組み合わせない、ＤＮＡリンカーのＤＮＡｓｅ消化による解離での全血からのＣＤ４陽性細胞の単離。
【図２ｂ】共有結合したＣＤ１４と組み合わせた、ＤＮＡリンカーのＤＮＡｓｅ消化による解離での全血からのＣＤ４陽性細胞の単離。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【国際調査報告】
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2014533103.tif 000008
2014533103.tif 000009
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