(57)【要約】いくつかの側面において、本発明は、サンプルを得ること、前記サンプルを複数の時点において照光すること、前記サンプルにおける代謝活性のマーカーに由来する透過光を前記複数の時点において測定すること、および、代謝活性の存在または不存在を前記複数の時点での前記透過光における変化から検出することによる、サンプルにおける代謝活性を検出するための方法に関する。他の側面において、本発明は、サンプルにおける代謝活性を反映している検出可能なマーカーをサンプル中に有するサンプルを提供すること、前記マーカーに由来する増幅シグナルを生じさせること、前記増幅シグナルを複数の時点において測定すること、および、代謝活性を前記シグナルにおける変化から検出することによる、サンプルにおける代謝活性を検出するための方法に関する。追加的な側面において、本発明は、サンプルにおける代謝活性を検出するためのシステムに関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルにおける代謝活性を検出するための方法であって、
サンプルを得ること；
前記サンプルを複数の時点において実質的単色光により照光すること；
前記サンプルにおける代謝活性の化学的マーカーに由来するラマン散乱光を前記複数の時点において測定すること；および
代謝活性を前記複数の時点での前記ラマン散乱光における変化から検出すること
を含む方法。
【請求項２】
サンプルにおける代謝活性を検出するための方法であって、
サンプルにおける代謝活性を反映している検出可能なマーカーをサンプル中に有するサンプルを提供すること；
前記マーカーに由来する増幅シグナルを生じさせること；
前記増幅シグナルを複数の時点において測定すること；および
代謝活性を前記複数の時点での前記増幅シグナルにおける変化から検出すること
を含む方法。
【請求項３】
前記ラマン散乱光が共鳴増強される、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記マーカーが抗酸化剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記マーカーがフリーラジカルスカベンジャーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記マーカーがカロテノイドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記マーカーがリコペンである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記マーカーが元素捕捉タンパク質複合体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記マーカーが鉄捕捉タンパク質複合体である、請求項１〜３および８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記代謝活性がフリーラジカルの産生である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記代謝活性がカロテノイドの産生である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記代謝活性が鉄の捕捉である、請求項１〜３および８〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ラマン散乱光における前記変化が累積的である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
代謝活性の存在により、病原体の存在が示される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
代謝活性の存在により、細菌、真菌、寄生虫またはウイルスの存在が示される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記マーカーの量が前記代謝活性の結果として増大する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記マーカーの量が前記代謝活性の結果として低下する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルが抗病原体物質を含有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルが、前記検出された代謝活性からの病原体分類を可能にするために構成される抗病原体物質を含有する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルが、代謝活性の存在からの病原体分類を可能にするために構成される培養ブロスを含有する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記サンプルが、抗生物質、抗真菌性物質および抗ウイルス性物質からなる群から選択される抗病原体物質を含有し、かつ、前記検出された代謝活性により、前記抗病原体物質の有効性または無効性が示される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記サンプルが体液を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンプルが、血液、脳脊髄液および尿からなる群から選択される体液を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記サンプルが培養される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記サンプルが培養細胞株を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記マーカーが前記サンプルにおいて生来的に存在する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記マーカーが照光前の前記サンプルに添加される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記検出することが約６時間未満で完了する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記検出することが約３０分未満で完了する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記サンプルが校正用ラマンマーカーを前記サンプルの中またはサンプル容器の表面に含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記サンプルまたは前記サンプル容器を前記校正用ラマンマーカーの存在または強度について調べることをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記代謝活性により、毒性物質が前記サンプルに存在することが示される、請求項１〜７、１０、１３、１７〜１８および２２〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
サンプルにおける代謝活性を検出するためのシステムであって、
光源；
サンプルを前記光源により定期的に照光するための制御装置（ただし、前記サンプルは、前記サンプルにおける代謝活性に対して応答し得る化学的マーカーを含有する）；
前記マーカーに由来する光シグナルを測定するために構成される検出器；および
前記検出器からの光測定結果を受け取り、前記サンプルにおける代謝活性を示す経時的な前記マーカーにおける変化を確認するために構成されるコンピュータ
を含むシステム。
【請求項３４】
前記マーカーが抗酸化剤または鉄捕捉タンパク質複合体である、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】
前記マーカーがフリーラジカルスカベンジャーである、請求項３３〜３４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３６】
前記マーカーがカロテノイドである、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３７】
前記マーカーがリコペンである、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３８】
前記マーカーが前記サンプルに生来的に存在しない、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３９】
前記マーカーが前記サンプルに生来的に存在する、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４０】
前記マーカーに由来する前記光シグナルがストークスラマン散乱に由来する、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４１】
前記マーカーに由来する前記光シグナルが反ストークスラマン散乱に由来する、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４２】
前記マーカーの量が時間とともに前記サンプル中に蓄積して、前記サンプルにおける代謝活性を示す、請求項３３〜４１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４３】
前記サンプルにおける前記マーカーが時間とともに減少して、前記サンプルにおける代謝活性を示す、請求項３３〜４１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４４】
前記マーカーによって伝えられる前記光が共鳴増強される、請求項３３〜４３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４５】
前記代謝活性がフリーラジカルの産生である、請求項３３〜４４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４６】
前記代謝活性が鉄の捕捉である、請求項３３〜４４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４７】
前記マーカーによって伝えられる前記光が累積的である、請求項３３〜４６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４８】
代謝活性の存在により、病原体の存在が示される、請求項３３〜４７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４９】
代謝活性の存在により、細菌、真菌、寄生虫またはウイルスの存在が示される、請求項３３〜４８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５０】
前記サンプルが抗病原体物質を含有する、請求項３３〜４９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５１】
前記サンプルが、代謝活性の存在からの病原体分類を可能にするために構成される抗病原体物質を含有する、請求項３３〜５０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５２】
前記サンプルが、代謝活性の存在からの病原体分類を可能にするために構成される培養ブロスを含有する、請求項３３〜５１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５３】
前記サンプルが、抗生物質、抗真菌性物質および抗ウイルス性物質からなる群から選択される抗病原体物質を含有し、かつ、前記検出された代謝活性により、前記抗病原体物質の有効性または無効性が示される、請求項３３〜５２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５４】
前記サンプルが体液を含む、請求項３３〜５３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５５】
時間が約６時間未満である、請求項３３〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
時間が約３０分未満である、請求項３３〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記シグナルが、共鳴増強されたラマン光散乱である、請求項３３〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記代謝活性により、毒性物質が前記サンプルに存在することが示される、請求項３３〜４１、４３〜４５、４７、５０および５４〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記サンプルが校正用ラマンマーカーを前記サンプルの中またはサンプル容器の表面に含む、請求項３３〜５８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項６０】
前記検出器が、前記サンプルまたは前記サンプル容器を前記校正用ラマンマーカーの存在または強度について測定するために構成される、請求項５９に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府援助の研究開発に関する陳述
本発明の一部は合衆国政府支援によりなされている場合がある。そのようなものとして、合衆国政府は本発明においてある一定の権利を有する場合がある。
【０００２】
関連出願に対する相互参照
本出願は、米国特許仮出願第６１／５２６，１６０号（２０１１年８月２２日出願；これは本明細書により、その全体が参照によって明示的に組み込まれる）に対する優先権の利益を主張する。
【０００３】
サンプルにおける代謝活性を検出するための方法およびシステム、具体的には、代謝活性を検出することによるサンプル中の病原体および毒素の検出および／または特徴づけのための方法およびシステム。
【背景技術】
【０００４】
感染症（細菌性、ウイルス性または真菌性）の症状を呈する患者には多くの場合、抗菌性薬物が与えられる。薬物耐性細菌病原体（いくつかが現在、処置できない）の近年増大した発達によってより重要になっているが、病原体を正しく特定すること、および、その病原体に対して正しく調整される薬物療法を処方することが重要である。しかしながら、感染性疾患を引き起こす病原体の特定は長期間を要し、現在の技術を使用した場合、通常的には４８時間〜７２時間を要する。この遅れのために、多くの場合、病原体の特定または具体的な治療に対するその感受性に関して検査室からの具体的な情報によって必然的に導かれない広域スペクトルの経験的な抗菌剤治療を施すことが必要となる。情報がないそのような経験的治療では、重大な二次的合併症（例えば、薬物反応など）、抗菌剤耐性の発達、および、不必要な診断試験の実施が引き起こされる場合がある。多大な努力が、そのような感染症のより迅速な診断および特徴づけのためのツールを開発するために余儀なくされているのは、これらの検討事項のためである。
【０００５】
迅速な診断のための確立された方法の中で、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）に基づく様々な方法（これらは核酸物質を検出する）が、可能性のある迅速診断ツールとして最も開発されているものである。しかしながら、この方法は病原体特異的であり、病原体についての分子的標的を最初に特定し、開発することを必要とする。加えて、ＰＣＲに基づくこれらの方法では、病原体の抗菌剤感受性に関する情報が、そのような情報が以前に明らかにされていない限り、何ら提供されない。特定の薬物に対する病原体の感受性（または耐性）に関する情報を明らかにするための他の記録された方法がいくつかある。しかしながら、これらの方法では、事前に得られた臨床サンプルからの事前の成長が要求され、したがって、情報が、時宜を得た様式で提供されない。
【０００６】
例えば、米国特許第３，７７２，１５４号には、細菌サンプルの自動化された抗生物質感受性分析のための方法および装置であって、臨床サンプルがいくつかのアリコートに等分され、様々な抗生物質を含有する１つまたは複数の容器に供給され、かつ、これらのアリコートが数時間インキュベーションされ、その後、止められ、細菌数が様々な手段によって求められる、そのような方法および装置が記載される。この方法は、細菌細胞を計数することに頼るので、多数の細胞が、正確な感受性情報が明らかにされ得る前に存在しなければならない。この要件のために、この方法は、臨床サンプルについては、とりわけ、低レベルの病原体負荷量に遭遇するときには非実用的となる。
【０００７】
米国特許第３，９８３，００６号には、抗生物質の最小発育阻止濃度（「ＭＩＣ」）を、細菌懸濁物の細菌成長速度に対する応答での光学的性質における変化を抗生物質の非存在下および存在下で連続測定することによって求めるための方法が記載される。米国特許第４，１３２，５９９号には、細菌の単離を何ら伴うことなく、感染尿サンプルにおける細菌について抗菌剤感受性を決定するための方法が記載される。それらの方法は細菌のＡＴＰアッセイに基づいており、細菌以外のＡＴＰの除去を必要とする。
【０００８】
米国特許第４，１４６，４３３号には、静菌活性を寒天希釈法によって得ることができる方法が記載される。抗生物質の希釈物を含有する寒天平板が調製され、試験細菌が寒天平板に接種され、ＭＩＣ値が得られる。続いて、抗生物質不活性化酵素の溶液が、抗生物質を不活性化するために平板に噴霧される。さらなるインキュベーションの後、視認される成長が平板において生じなかった最小濃度が求められ、最小殺菌濃度（「ＭＢＣ」）として定義される。この方法は、ＭＩＣ値およびＭＢＣ値が今日では得られる標準法である。しかしながら、この方法は一般に、２４時間を超える時間が、関連した情報を提供するためにかかる。
【０００９】
米国特許第４，２０９，５８６号には、試験された成長阻害薬剤の存在下および非存在下での微生物の培養物の酸化還元電位における変化が、酸化還元電位が通常の場合には正であり、かつ、電位変化の速度がほぼ直線的である成長期間の期間中にモニターされる方法が記載される。効果的な成長阻害薬剤は、より負側の値への酸化還元電位の変化における測定可能な低下を１時間未満のうちに生じさせる。試験された薬剤の成長阻害作用を示す著しいシグナルが、第１の時間における酸化還元電位を示す増幅シグナルを記憶し、記憶されたシグナルを、その後１時間未満で得られる別の増幅シグナルと一緒にコンパレーターに与えることによってコンパレーターから得られる場合がある。
【００１０】
米国特許第４，２３６，２１１号には、所定の抗生物質の少数の濃度（例えば、１つまたは２つの濃度）の存在下における様々な微生物の成長と、そのようなサンプルの活性を少なくとも阻害するために必要であるそのような抗生物質の最小濃度との間における表形式または式形式のどちらかでのある一定の機能的関係を明らかにする方法が記載される。この関係が、抗生物質と、一般的な種類の微生物とのそれぞれの所望される組合せについて確立され、成長の程度が、所定の成長時間または成長レベルにおいて、好ましくは、飽和が「成長」または「成長なし」の両極端において生じる前に測定される。これらの一定の関係を導くことにおいて使用される最小濃度が、標準的な受け入れられている定量的技術によって求められる。その後、どのような病原性微生物であれ、同じ所定の一般的な種類の微生物から選ばれる所与の病原性微生物の活性を少なくとも阻害するために必要である所定の抗生物質の最小濃度が、（１）そのようなサンプリングされた病原性生物の成長を抗生物質の同じ少数の所定の濃度（例えば、１つまたは２つの所定の濃度）の存在下において同じ所定の時間の後で測定すること、および、（２）得られた測定結果を以前に確立された一定の機能的関係と一緒に使用して、要求される最小濃度を微生物および抗生物質のその特定の組合せについて特定することによって迅速かつ正確に求められる場合がある。この方法を半自動的に行うための装置、および、この方法を自動的に行うための装置もまた開示される。
【００１１】
米国特許第４，２５２，８９７号には、細菌試験のための方法および装置であって、多ピン接種ヘッドにより、区画化されたサンプルトレーにおける細菌サンプルが拾い上げられ、インキュベーションのための区画化された培養プレートに移される、そのような方法および装置が記載される。培養プレートは、試験培地と、おそらくは抗生物質（いくつかの細菌がこれに対して感受性である）とを含有する。指標物質もまた含められ、これは、細菌成長に起因するｐＨ変化のときに変色する。結果が色の幾何学的パターンであり、これがコンピュータ記憶装置に入力される。さらなる培養プレートにもまた、同じように接種され、ただし、この場合、それぞれが、異なる試験培地を指標物と一緒に含有する。すべてのプレートがインキュベーションされ、データが記憶装置に入力された後、コンピュータ設備により、未知細菌の感受性のパターンが、可能性が最も高い特定を未知細菌サンプルのそれぞれについて決定するために既知細菌の既知の感受性パターンと比較される。
【００１２】
米国特許第４，１３２，５９９号には、細菌の感受性を求めるための方法であって、培養培地における細菌懸濁物のアリコート、抗菌性薬物およびトリチウム化チミジンが、微細なフィルターによって隔てられる２つの区画を有するポリエチレンチューブの中に入れられる、そのような方法が掲載される。沈殿化剤（例えば、トリクロロ酢酸など）が、細菌を沈殿させるためにポリエチレンチューブに入れられる。この後、真空システムが、液体をフィルターに通して抜き取るために使用され、ろ取された細菌が計数される。米国特許第３，７７２，１５４号の場合と同様に、この方法は、細菌細胞を計数することに頼っており、このことは、多数の細胞が存在することを必要とする。
【００１３】
米国特許第４，４４８，５３４号には、マルチアリコートトレーにおける細菌数が光学密度法によって求められる、抗生物質感受性試験のための装置が記載される。この方法もまた、多数の細菌細胞の存在を必要とする。米国特許第４，６０４３５１号には、類似するデバイスが記載されており、しかし、このデバイスでは、標識されたヌクレオチドの取り込みが、様々な化学剤の存在下における細菌成長を求めるために使用される。この方法は、標識されたヌクレオチドを取り込むであろう細菌細胞に限定される。
【００１４】
米国特許第６，７５０，０３８号には、細菌菌体内の具体的な酵素経路を阻害することが知られている抗菌剤に対する細菌の感受性が測定されるデバイスが記載される。この場合、耐性が、耐性機構に対応する特定の酵素の抑制または発現によって特徴づけられる。この方法は、特異的な耐性機構を有する細菌に対してだけ限定される。米国特許第６，８６１，２３０号には、細菌細胞のための成長の外部条件のためのインビトロ試験におけるアデニル酸キナーゼについてのアッセイが記載される。
【００１５】
米国特許第７，０８１，３５３号には、様々な細菌および抗菌剤濃度を有するサンプルにおける酸素消費速度に基づく、薬物感受性試験のためのデバイスが記載される。薬物感受性を、溶存酸素濃度を酸素電極により検出することによって測定することは、広く知られており、しかし、典型的には、長い時間（数日）を要する。Ｍａｃｈｉｄａ他は、この期間を数時間に短縮することができる様々な改善を記載する。しかし、たとえそうであっても、酸素測定は、臨床サンプルに存在する宿主細胞の代謝に起因する酸素消費によって損なわれる。したがって、これらの方法のどれもが、感受性情報を、時宜を得た様式で臨床サンプルから直接に明らかにするために適用することができない。
【００１６】
病原体特定および病原体感受性の情報を臨床サンプルにおいて直接に明らかにすることの困難さを、ラマン散乱法により例示することができる。臨床サンプルから出発するとき、従来のラマン法では、大きいサンプル調製時間（約２４時間）が病原体特定のために要求され、かつ、さらなる数時間が感受性試験のために要求される。ラマン法は、目的とするサンプル（この場合、疑わしい病原体を有する臨床サンプルを含有するサンプルバイアル）を照光することを伴う。入射光の一部が、入射光の波長とは異なる波長で非干渉的に散乱させられ、波長に対する散乱光強度のスペクトルが病原体のシグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）となる。
【００１７】
しかしながら、問題が、臨床的に関連し得る病原体の低濃度において生じる。例えば、単に１コロニー形成単位／ミリリットル（ＣＦＵ／ｍＬ）の血液がヒトでは「菌血症／真菌血症」の状態と一致するであろうと思われる。より典型的な数が１０ＣＦＵ／ｍＬ〜１００ＣＦＵ／ｍＬであり、希な場合には数が１００，０００ＣＦＵ／ｍＬ〜１，０００，００ＣＦＵ／ｍＬもの高さになり得る。１，０００，００ＣＦＵ／ｍＬでさえ、臨床サンプルは他の成分が優勢である。例えば、全血において、赤血球および白血球はともに、数で細菌細胞を上回るであろうと思われる。赤血球および白血球がたとえ、（例えば、遠心分離によって）血液から除かれたとしても、病原体よりも、内因性の血清タンパク質（そのラマンスペクトルは病原体のラマンスペクトルと類似している）が優勢であろうと思われる。
【００１８】
具体的には、およそ１０，０００，０００ＣＦＵ／ｍＬにおいて、血清サンプルは、内因性の血清成分の含有量に匹敵した病原体含有量を有するであろうと思われる。１００ＣＦＵ／ｍＬにおいて、血清サンプルは、内因性の血清成分の１００，０００分の１である病原体含有量を有する。
【００１９】
したがって、臨床サンプルのラマンスペクトルは、臨床サンプルの内因性成分が優勢である。このことが、以前の方法では、有用なラマンスペクトルが臨床サンプルから取得され得る前に、病原体が単離され、かつ、培養されなければならないことが要求される根本的理由である。ラマン法の実行に伴うこの困難さはまた、他の方法にも当てはまる。
【００２０】
これらの制限にもかかわらず、ラマンに基づくいくつかの方法が、病原体特定および病原体感受性の測定のために提案されてきている。これらの方法のすべてにおいて、様々な機構が、病原体の低い臨床濃度を克服するために使用される。
【００２１】
例えば、米国特許第５，８６６，４３０号には、化学的分析物および微生物分析物を検出および特定するための方法が記載される。この方法は４つの基本的工程を含み、第１の工程が、微生物細胞を濃縮することを試みる生物濃縮器である。米国特許第５，５７３，９２７号には、最初に培養された細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の第１の組の標的細胞のラマンスペクトルが、抗生物質の存在下で培養された同じ細胞のラマンスペクトルと比較され、比較が、抗生物質に対する細菌の耐性に関する情報を明らかにするために使用される方法が記載される。この場合、サンプルは、単離および培養されているＥ．ｃｏｌｉ細胞からなり、したがって、この方法は臨床サンプルに適用され得るのではなく、差スペクトル法が、さらなる感受性を明らかにするために使用される。米国特許第６，０４０，９０６号には、共鳴ラマン法が、生体物質の様々な有機成分および無機成分を特定するために使用される方法が記載される。以前において、米国特許第４，８４７，１９８号は、細菌の純粋培養物の共鳴ラマンスペクトルが分類学的識別のためのものを示すことを示している。共鳴ラマンスペクトルをレーザー励起振動数の関数として集めることによって、これらの発明者らは、問題としている生物種のラマンスペクトルの励起挙動を使用する分類学的特定の方法を特許請求している。米国特許第６，３７９，９２０号では、非感染患者から得られる臨床サンプルのラマンスペクトルが、未知臨床サンプルのラマンスペクトルから差し引かれる参照として使用される方法が記載される。この方法に関して、発明者らは、特定の細菌が、より速やかに、かつ、培養を行うことなく特定され得ることを主張する。しかしながら、この方法では、病原体を有するサンプルのラマンスペクトルが、病原体を有しないサンプルのラマンスペクトルと異なるように、著しい細菌細胞数が要求される。
【００２２】
米国特許第７，２５６，８７５号および米国特許第７，２６２，８４０号には、ラマン画像化による病原性微生物の検出および特定のための方法が記載される。これらの方法は、通常の場合には透明なサンプルにおける病原体（例えば、米国特許第７，４２８，０４５号に記載されるように、地方自治体の上水道におけるクリプトスポリジムなど）を検出するために使用することができるが、これらの方法は、類似するラマンシグネチャーを有する多数の細胞が存在することが予想される臨床サンプルには適用することができない。
【００２３】
この技術分野の現状におけるこれらの制限を考えると、臨床サンプルに存在する未知の病原体の特定および抗菌性薬剤に対する感受性の特徴づけを、単離工程を何ら必要とすることなく迅速に行うことができる方法およびシステムを開発することが望ましい。本発明者らは今回、サンプルにおける代謝活性を検出するための方法およびシステム、具体的には、代謝活性を検出することによるサンプル中の病原体および関連物質の検出および／または特徴づけのための方法およびシステムを発見している。
【発明の概要】
【００２４】
いくつかの実施形態において、本発明は、サンプルにおける代謝活性を検出するための方法であって、サンプルを得ること；前記サンプルを複数の時点において実質的単色光により照光すること；前記サンプルにおける代謝活性の化学的マーカーに由来するラマン散乱光を前記複数の時点において測定すること；および、代謝活性を前記複数の時点での前記ラマン散乱光における変化から検出することを含む方法に関する。他の実施形態において、本発明は、サンプルにおける代謝活性を検出するための方法であって、サンプルにおける代謝活性を反映している検出可能なマーカーをサンプル中に有するサンプルを提供すること；前記マーカーに由来する増幅シグナルを生じさせること；前記増幅シグナルを複数の時点において測定すること；および、代謝活性を前記複数の時点での前記増幅シグナルにおける変化から検出することを含む方法に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、サンプルにおける代謝活性を検出するためのシステムであって、光源；サンプルを前記光源により定期的に照光するための制御装置（ただし、前記サンプルは、前記サンプルにおける代謝活性に対して応答し得る化学的マーカーを含有する）；前記マーカーに由来する光シグナルを測定するために構成される検出器；および、前記検出器からの光測定結果を受け取り、前記サンプルにおける代謝活性を示す経時的な前記マーカーにおける変化を確認するために構成されるコンピュータを含むシステムに関する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ラマン散乱光は共鳴増強される。いくつかの実施形態において、ラマン散乱光における変化は累積的である。他の実施形態において、マーカーは、抗酸化剤、フリーラジカルスカベンジャー、カロテノイドおよび／またはリコペンである。いくつかの実施形態において、マーカーは元素捕捉タンパク質複合体および／または鉄捕捉タンパク質複合体である。いくつかの実施形態において、マーカーは代謝活性の結果として増大する。他の実施形態において、マーカーは代謝活性の結果として低下する。
【００２６】
いくつかの実施形態において、代謝活性は、フリーラジカルの産生、カロテノイドの産生、および／または、鉄の捕捉である。いくつかの実施形態において、代謝活性の存在により、病原体、例えば、細菌、真菌、寄生虫またはウイルスなどの存在が示される。他の実施形態において、代謝活性により、病原体によって放出される毒素または他の疾患改変物質がサンプルに存在することが示される。
【００２７】
いくつかの実施形態において、サンプルは抗病原体物質を含有する。抗病原体物質は場合により、検出された代謝活性からの病原体の特定および／または分類を可能にするために構成される。いくつかの実施形態において、サンプルは、代謝活性の存在からの病原体の特定および／または分類を可能にするために構成される培養ブロスを含有する。抗病原体物質は場合により、抗生物質、抗真菌性物質および抗ウイルス性物質からなる群から選択される。測定された代謝活性により、抗病原体物質の有効性または無効性が示される。
【００２８】
いくつかの実施形態において、サンプルは、体液、例えば、血液、脳脊髄液および／または尿などを含む。サンプルは場合により培養され、また、培養された細胞株を含むことができる。いくつかの実施形態において、マーカーはサンプルにおいて生来的に存在する。他の実施形態において、マーカーが照光前のサンプルに添加される。いくつかの実施形態において、サンプルは校正用ラマンマーカーをサンプルの中またはサンプル容器の表面に含む。サンプルまたはサンプル容器は場合により、校正用ラマンマーカーの存在または強度について調べられる。
【００２９】
いくつかの実施形態において、検出することが約６時間未満で完了する。他の実施形態において、検出することが約３０分未満で完了する。
いくつかの実施形態において、マーカーに由来する光シグナルがストークスラマン散乱に由来する。他の実施形態において、マーカーに由来する光シグナルが反ストークスラマン散乱に由来する。
【００３０】
いくつかの実施形態において、マーカーの量が時間とともにサンプル中に蓄積して、サンプルにおける代謝活性を示す。他の実施形態において、サンプルにおけるマーカーは時間とともに減少して、サンプルにおける代謝活性を示す。いくつかの実施形態において、マーカーによって伝えられる光は共鳴増強される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】サンプルにおける代謝活性を検出する１つの方法を記載するフローダイアグラムである。
【図２】サンプルにおける代謝活性を検出する第２の方法を記載するフローダイアグラムである。
【図３】サンプルにおける代謝活性を検出するための１つの実施形態を記載するシステムである。
【図４】サンプルにおける代謝活性を検出するための方法の１つの実施形態で、鉄の捕捉を代謝活性の指標として使用する実施形態を記載する概略である。
【図５】サンプルにおける代謝活性を検出する方法の１つの実施形態について得られる代表的なスペクトルである。
【図６】サンプルにおける代謝活性を検出するための１つの方法を例示する正規化ピーク強度対時間のプロットである。
【図７】病原体のタンパク質による鉄の捕捉を例示するスキームである。
【図８】サンプルにおける代謝活性を検出するための方法の第２の実施形態で、リコペンにおける変化を代謝活性の指標として使用する実施形態を記載する概略である。
【図９】シグナル対ノイズ比を様々な検出方法について例示する表である。
【図１０】鉄‐トランスフェリンの励起プロフィルを例示するプロットである。
【図１１】細菌分類を実証するラマンスペクトルである。
【図１２】細菌分類実験期間中の一定のピーク強度を例示するデータプロットである。
【図１３】細菌分類実験期間中のピーク強度における変化を例示するデータプロットである。
【図１４】ＭＲＳＡを含有する血液サンプルについてのラマンスペクトルの重ね合わせである。
【図１５】ピーク強度における変化を様々な病原体濃度について例示するプロットである。
【図１６】バイオマーカーの傾きを病原体濃度の関数として例示するプロットである。
【図１７】ＭＩＣを抗生物質について検出するための１つの実施形態の使用を例示するプロットである。このプロットは、ＭＩＣを推定するために行われた測定を例示する。
【図１８】ＭＩＣを抗生物質について検出するための１つの実施形態の使用を例示するプロットである。このプロットは、ＭＩＣを推定することができる１つの具体的な方法を例示する。
【図１９】多数の病原体を含有するサンプルを区別するためのマーカーの使用を示すプロットである。
【図２０】ＭＩＣを、多数の病原体を有するサンプルについて検出するための１つの実施形態の使用を例示するプロットである。
【図２１】Ｍ．ｂｏｖｉｓによるリコペンの産生を実証するプロットである。
【図２２】Ｍ．ｂｏｖｉｓによるリコペンの産生を実証する第２のプロットである。
【図２３】Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍによるリコペンの産生を実証するプロットである。
【図２４】サンプルにおける毒素の検出を例示するプロットである。
【図２５】サンプルにおける毒素の存在から生じる経時的な検出可能な変化を例示する第２のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本明細書中で使用される場合、様々な略号が下記のように定義される：
ＡＴＰ          アデノシン三リン酸
ＣＢＣ          全血球計算値
ＣＦＵ          コロニー形成単位
ｃｍ−１          逆センチメートルまたは波数
ＥＤＴＡ        エチレンジアミン四酢酸
Ｆｅ‐Ｔｒ      鉄‐トランスフェリン
ＭＢＣ          最小殺菌濃度
ＭＩＣ          最小発育阻止濃度
ＭＤＲ          多剤耐性
ｎｍ            ナノメートル
ＰＣＲ          ポリメラーゼ連鎖反応
アポ‐Ｔｒ        結合型鉄を有しないトランスフェリン
ＲＯＳ          活性酸素種
ＲＮＳ          活性窒素種
ＵＶ            紫外
【００３３】
序論
この技術分野における必要性が、侵入病原体に対する応答でのサンプルにおける代謝活性における変化をモニターするデバイスによって対処される。先行技術における様々な困難が、臨床サンプルにおける病原体濃度または生物汚染度を測定することを試みるという一般的取り組みによって生じたと考えられ得る。病原体濃度は臨床サンプルにおける内因性成分と比較して小さいので、測定は困難である。対照的に、いくつかの開示された実施形態では、時間とともに蓄積する変化を含めて、また、取るに足らないほどにより小さいベースラインレベルからの変化を含めて、侵入病原体に対する応答での化合物における変化が測定される。したがって、これらの実施形態では、臨床サンプルに存在する低レベルの病原体の特徴づけが可能となる。
【００３４】
本発明の他の実施形態では、臨床サンプルにおいて容易に検出することができる化合物の生成が測定される。すべての場合（マーカーの産生、消費または改変）において、測定の感度を、マーカーに起因するシグナルを本来的に増幅する測定技術の適切な使用によって高めることができる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、鉄捕捉プロセスの使用が利用される。どの侵入細菌も鉄を成長のために必要とし、脊椎動物宿主は鉄を特別な鉄含有タンパク質（例えば、血中に存在する鉄‐トランスフェリン複合体など）において捕捉している。したがって、病原体は鉄を宿主タンパク質から取り出さなければならない。種々の病原体により、様々な機構が、鉄を宿主タンパク質から捕捉するために用いられる。生存可能な病原体が血液に存在するならば（血液は偶然にも、遊離鉄の不足を除けば、すべての点で病原体のための最も好ましい成長培地であるので）、トランスフェリンの鉄含有量が急速に枯渇する。対照的に、生存可能な病原体が血液サンプルに存在しないならば、トランスフェリンの鉄含有量は維持される。
【００３６】
鉄‐トランスフェリン（Ｆｅ‐Ｔｒ）複合体における鉄の存在は、強いラマンバンドをもたらす。これらのラマンバンドは、市販のラマン分光計によりトランスフェリンにおける鉄含有量のマーカーとしてモニターすることができる。例えば、Ｆｅ‐Ｔｒバンドは、強いラマンピークを１５１０ｃｍ−１、１２８０ｃｍ−１、１１６０ｃｍ−１および１６０５ｃｍ−１において有する。鉄‐トランスフェリン（Ｆｅ‐Ｔｒ）複合体における鉄の存在はまた、４７０ｎｍ前後に中心を有する光学的吸収ピークをもたらす。この光学的吸収ピークは、市販の色彩センサーによりトランスフェリンにおける鉄含有量についてのマーカーとしてモニターすることができる。
【００３７】
したがって、１つの実施形態が、１５１０ｃｍ−１のラマンピークを臨床サンプルにおいて時間の関数としてモニターする市販のラマン分光計である。臨床サンプルは、遊離鉄の最小限の利用可能性を除けば、また、唯一の利用可能な鉄源が鉄‐タンパク質複合体であることにより、すべての点で、臨床サンプルを適切な成長培地に変換するための何らかの処理を必要とする。血液サンプルに関しては、このことが、病原体および鉄‐トランスフェリン複合体の両方を含有する血清または血漿を分離する、非凝固血を用いた遠心分離工程または重力の使用により達成される。尿サンプルに関しては、このことが、少量の尿サンプルをストック血清のより大きいアッセイに加えることによって達成され得る。生存可能な病原体が存在するならば、Ｆｅ‐Ｔｒの鉄含有量が急速に枯渇することになる。他の実施形態において、抗菌剤感受性が、添加された抗菌性薬剤とともに測定を繰り返すことによって特徴づけられる。
【００３８】
別の実施形態において、リコペン類に起因する共鳴ラマンピークがモニターされる。５３２ｎｍの波長のレーザーを使用するとき、リコペン類は、共鳴により増強されたラマンピークを、１５１０ｃｍ−１〜１５２０ｃｍ−１（すなわち、１５１６ｃｍ−１）、１１５０ｃｍ−１〜１１６０ｃｍ−１（すなわち、１１５６ｃｍ−１）、および、１００５ｃｍ−１において有する。さらに、リコペン類はフリーラジカルの効率的なスカベンジャーであり、様々なフリーラジカルが、正常な代謝の期間中に細菌細胞および真菌細胞によって、また、ヒト細胞によって常に生じる。そのようなフリーラジカル産生は、細胞呼吸の期間中における化学浸透およびＡＴＰ生成の結果である。したがって、生存可能な活発に複製している細菌細胞および真菌細胞の血清サンプルにおける存在は、（最終分化したヒト細胞に由来するラジカルと比較して、はるかにより多く増幅される）フリーラジカル産生をもたらすことになり、これがその結果として、血清中のリコペンによって除去されることになる。これらのラジカルがリコペンによって捕捉されることにより、その共鳴ラマン光学的性質を含めて、リコペン分子の光学的性質が変化することになる。光学的性質におけるこれらの変化（例えば、リコペンピークについて強度における低下など）を、病原体の生存性を検出するためにモニターすることができる。
【００３９】
別の実施形態において、選択培地が臨床サンプルに添加されるので、病原体の生存性が（上記で列挙された方法のいずれかにより）モニターされる。病原体の成長に好都合である選択培地の添加は、増大した生存性シグネチャーを生じさせることになり、このことを、病原体を分類するために使用することができる。特定の病原体の成長を排除する選択培地の添加は、低下した生存性シグネチャーを生じさせることになり、このこともまた、病原体を特定するために使用することができる。
【００４０】
さらに別の実施形態において、（マーカーを介した、例えば、上記で記載されるリコペンマーカーなどを介した）フリーラジカル産生が、異物の疑わしい存在のもとでヒト細胞についてモニターされる。ある種の異物（例えば、病原体など）が存在するならば、ヒト細胞はフリーラジカルを生成させることになり、これがラマン装置によって検出される。
【００４１】
定義
本発明の議論のために、ラマン散乱は、一定の波長でサンプルに入射する光が、初めにより低い準位（基底状態）から、より高い振動準位への構造体の励起による入射光子の吸収、および、異なる基底状態準位へのその後の再緩和に起因する非干渉性プロセスによって他の波長で散乱されるいずれかの方法である。
【００４２】
本発明の議論のために、ラマンバンドは、分子内の特定の化学結合からのラマン散乱に対応するスペクトルプロフィル（強度対振動数）である。それぞれの化学結合が別個の振動数におけるラマンバンドとして現れること、および、一部の場合には、これらのラマンバンドが重なり合い、これにより、これらのラマンバンドを識別困難にするかもしれないことが理解される。さらに、化学結合のラマン断面積が、対応するラマンピークの強度を規定する定数であることが理解される。そのうえ、この断面積が、波長により、および／または、共鳴により変化し得ることが理解される。そのような共鳴変化が共鳴ラマン増強時に生じる。
【００４３】
本発明の議論のために、サンプルのラマンスペクトルはラマンバンドすべての総和であること、および、ラマンスペクトルにおける個々のラマンバンドでの相対的高さが、それらのラマン断面積を乗じた対応する化学結合の相対的存在量に比例することが理解される。
【００４４】
本発明の議論のために、吸収は、入射光が目的のサンプルによって吸収され、入射光子が、外側電子の励起（これはＵＶ放射線または可視放射線の吸収に対応する）またはより高い振動／回転エネルギー状態への分子の励起を含めて、いくつかの機構によって構造体と相互作用し得るいずれかの方法である。
【００４５】
共鳴ラマン散乱は、最初の基底状態から、実際の振動状態に対応する実際の励起状態への分子の励起を伴う特別なタイプのラマン散乱プロセスであると理解されるプロセスである。したがって、本発明の議論のために、共鳴ラマン増強（または共鳴ラマン）は、特定のバンドのラマン断面積が強い光学吸収によって増大するいずれかの方法である。
【００４６】
本発明の議論のために、シデロホアは、鉄を宿主の鉄‐タンパク質複合体から奪い、その鉄を病原体に輸送する、病原体によって放出されるタンパク質である。
【００４７】
本発明の議論のために、鉄捕捉は、侵入病原体が鉄を宿主の鉄‐タンパク質複合体から獲得するプロセスである。鉄の獲得はその結果として、宿主がタンパク質‐鉄複合体を生じさせることによって遊離鉄の量を低下させるプロセスを示す。
【００４８】
本発明の議論のために、シデロホア媒介の鉄捕捉は、鉄を宿主の鉄‐タンパク質複合体から捕捉するために病原体によって使用され得るいくつかの可能な機構の１つであると理解される。さらに、そのような機構にもかかわらず、最終結果が、鉄を宿主における鉄‐タンパク質複合体から奪うことであると理解される。
【００４９】
本発明の議論のために、鉄を宿主において捕捉することができる種々の宿主タンパク質複合体には、トランスフェリン、ラクトフェリン、ヘムおよびフェリチンが含まれることが理解される。
【００５０】
本発明の議論のために、鉄‐タンパク質複合体が、鉄を含む形態、または、鉄を含まない形態で存在し得ることが理解される。これら２つの形態が鉄含有（ｆｅｒｒｉｃ）状態およびアポ状態として記載される。トランスフェリンを例として使用すると、これら２つの形態はＦｅ‐Ｔｒおよびアポ‐Ｔｒと書くことができる。
【００５１】
本発明の議論のために、カロテノイド類は、フリーラジカルを除去する化合物であること、および、リコペンは非常に効率的なフリーラジカルスカベンジャーであることが理解される。
【００５２】
本発明の議論のために、エキソミコバクチン（ｅｘｏｍｙｃｏｂａｃｔｉｎ）は、鉄を獲得するために、細胞内ミコバクチンのシデロホアと一緒に病原性マイコバクテリアによって使用される細胞外シデロホア（これはカルボキシミコバクチンとして示されることがある）である。
【００５３】
本発明の議論のために、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、病原体が標準的濃度（これは通常的には１００，０００ＣＦＵ／ｍＬとして定義される）を有する場合における病原体の成長を阻害するであろう抗菌剤の最小濃度として定義される。
【００５４】
本発明の議論のために、どのような測定システムであれ、測定システムにおけるノイズは、測定されている量の平方根に比例していることが理解される。
【００５５】
検出法ダイアグラム
図１および図２は、サンプルにおける代謝活性を検出する方法を例示するフローダイアグラムの例を示す。図１を参照することにより、方法が、サンプルを得ることによってブロック１において始まる。サンプルを得るための様々な方法がこの技術分野では知られている。いくつかの実施形態において、サンプルは、分析がすぐに行える形態で提供される。他の実施形態において、サンプルは分析前のさらなる調製を必要とする。サンプルがブロック１において提供された後、方法は、サンプルが複数の時点で照光されるブロック２に続く。その後、方法は、サンプルにおけるマーカーに由来するラマン散乱光が複数の時点で測定されるブロック３に続く。その後、方法は、代謝活性が、複数の時点での伝えられた光における変化から検出されるブロック４に続く。
【００５６】
図２を参照することにより、方法が、検出可能なマーカーを有するサンプルを得ることによってブロック５において始まる。そのようなマーカーは代謝活性を直接的または間接的に反映している。サンプルを得るための様々な方法がこの技術分野では知られている。いくつかの実施形態において、サンプルは、分析がすぐに行える形態で提供される。他の実施形態において、サンプルは分析前のさらなる調製を必要とする。サンプルがブロック５において提供された後、方法は、増幅シグナルがマーカーからもたらされるブロック６に続く。増幅の限定されない一例が共鳴ラマン増強である。その後、方法は、増幅シグナルが測定されるブロック７に続く。そのような測定を、複数の時点を含めて、１つまたは複数の時点で行うことができる。その後、方法は、代謝活性が、複数の時点を含めて、１つまたは複数の時点での増幅シグナルにおける変化から検出されるブロック８に続く。
【００５７】
検出システムダイアグラム
図３は、サンプルにおける代謝活性を検出するためのシステムの一例を示す。図３を参照することにより、システムは、制御装置３０１、光源３０２、サンプル３０３、検出器３０４およびコンピュータ３０５を有する。図３はこれらのシステム構成要素を別個のブロックとして表しているが、いくつかの実施形態において、１つまたは複数のシステム構成要素が多重的構成要素として機能し得ることが理解される。例えば、コンピュータおよび制御装置は同じ構成要素であることが可能である。
【００５８】
図３を参照することにより、制御装置は、光源に、サンプルを照光するように命令する。いくつかの実施形態において、制御装置は周期的な照光を可能にする。他の実施形態において、制御装置は連続照光を可能にする。サンプル３０３は、サンプルにおける代謝活性に応答し得るマーカーを含有する。サンプル３０３におけるマーカーはシグナル（例えば、光など）を検出器３０４に伝える。検出器３０４は、マーカーに由来するシグナルを測定するために構成される。コンピュータ３０５は、検出器からの測定結果を受け取り、経時的なマーカーにおける変化を確認するために構成される。そのような変化はサンプルにおける代謝活性を示している。
【００５９】
鉄捕捉法の説明
図４に示されるように、１つの実施形態は、臨床サンプル１１の採取、それに続く、サンプル調製１２を含む。サンプル調製１２により、サンプルがアッセイ１４に転換される。アッセイ１４が代謝活性についてモニターされ、この代謝活性がこの実施形態においては、経時的な鉄捕捉（１５）として示される。代謝活性が、ラマン分光計１３を使用して測定される。
【００６０】
前記で議論されたように、サンプル調製１２により、サンプルが試験アッセイに転換される。試験アッセイは、遊離鉄の限定された利用性を除いて、病原体成長の必要なすべての要素を含有する。すべての鉄が特別な鉄‐タンパク質複合体の中に捕捉されており、したがって、病原体は鉄をこの複合体から捕捉しなければならない。
【００６１】
図４において、サンプル調製工程１２は、臨床サンプルを、鉄のすべてが宿主タンパク質（例えば、トランスフェリンなど）の中に捕捉されていることにより遊離鉄が利用できないことを除いて、病原体代謝に資するサンプルに転換することを含む。最初の臨床サンプルが血液であるならば、サンプル調製工程は場合により、血清を分離して取り出すために、重力沈降法、および／または、血液サンプルを遠心分離することを伴う。血清は、血液に存在するいずれかの病原体、同様にまた、遊離鉄を除いて、病原体の代謝を支えるために必要な完全な成長培地を含むであろう。臨床サンプルが尿であるならば、サンプル調製工程は場合により、少量の尿サンプルを好適に調製されたストック血清に添加することを伴う。
【００６２】
病原体濃度は、病原体が鉄を捕捉する速度から導き出すことができる。より高い病原体濃度では、時間に対するＦｅ‐Ｔｒピーク高さのトレース線の傾きがより大きくなる。したがって、いくつかの実施形態において、鉄捕捉の速度が、様々な病原体濃度の１組の既知標準サンプルにより事前に特徴づけられ、また、いくつかの実施形態において、臨床サンプルからの鉄捕捉の速度がこれらの速度に対して照合される。
【００６３】
本明細書中においてさらに記載されるように、抗菌剤感受性をメトリック（ｍｅｔｒｉｃ）最小発育阻止濃度（「ＭＩＣ」）により特徴づけることができる。増大する抗菌剤濃度の一連のアッセイ物が、同じ臨床サンプルから調製される。いくつかの実施形態において、増大する濃度の抗病原体物質がサンプルに添加される。これらのサンプルを代謝活性についてモニターすることにより、抗病原体物質の有効性または無効性に関する情報がもたらされる。加えて、これらのサンプルをモニターすることにより、効果的な抗病原体物質のＭＩＣに関する情報がもたらされる。そのような実施形態の限定されない一例として、鉄捕捉マーカーのトレース線が時間とともに変化しなくなるアッセイが、臨床サンプルにおける病原体濃度での最小発育阻止濃度である。
【００６４】
上記で記載されるように、鉄捕捉プロセスがラマン分光法によりモニターされるならば、試験は、一連のラマンスペクトルを経時的に集めることを伴う。鉄以外のマーカーについてのこの収集の仮想的描写が図５に示される。個々のラマンスペクトルが１つまたは複数のピーク（例えば、２２、２２および２３など）を含んでおり、これらのピークが鉄捕捉の場合には、Ｆｅ‐Ｔｒ（２１および２２）、あるいは、アポ‐Ｔｒおよび／または血清リポタンパク質（２３）のどちらかに起因すると考えられる。Ｆｅ‐Ｔｒピークの１つ（例えば、２２）に由来するピーク高さが、図５に示されるように、経時的にモニターされる。生存可能な病原体が存在し、かつ、鉄を捕捉してＦｅ‐Ｔｒをもたらしているならば、鉄‐トランスフェリンのピークが、図６におけるトレース線（３３および３４）によって示されるように、時間とともに減少する。他方で、生存可能な病原体が存在していないならば、または、生存可能な病原体が、効果的な抗菌性薬剤と一緒にアッセイにおいて存在するならば、ピーク高さは経時的にほぼ不変である。図６に示される４つのトレース線は、非感染患者からの血清（トレース線３１）、多量のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）を有する血清（トレース線３３）、ＭＲＳＡと、有効用量のバンコマイシンとを有する血清（トレース線３２）、および、ＭＲＳＡと、非有効用量のアンピシリンとを有する血清（トレース線３４）を表している。
【００６５】
いくつかの実施形態において、シグナルの質が時間の関数として高まる。例えば、病原体が鉄を代謝し、消費するにつれ、鉄のレベルが着実に枯渇する。鉄枯渇化の速度は、低い病原体濃度については小さいかもしれないが、この枯渇化は時間とともに著しいレベルにまで増大し得る。したがって、およそ２０分〜３０分の適度な時間間隔の範囲内で、非常に低い病原体濃度を特徴づけることができる。
【００６６】
シデロホアによる病原体特定
いくつかのさらなる実施形態が上記の基本的構成体に由来し得る。マーカーは図７における概略によってまとめることができる。ベースラインマーカーが鉄‐タンパク質複合体であり（図７では鉄‐トランスフェリン複合体が記載されており、しかし、他のタンパク質もまた使用することができる）、図７においてスキーム１によって記述される。生存可能な病原体が存在し、かつ、鉄を鉄‐タンパク質複合体から捕捉しているならば、鉄‐タンパク質複合体に対応するレベルが低下する。この低下が様々な分析法によりモニターされる。いくつかの実施形態において、分析法は分光学的であり、例えば、ラマン分光法などである。他の実施形態において、分析方法が光学的である。
【００６７】
一部の場合において、生存可能な病原体は鉄を鉄タンパク質複合体から捕捉することができないであろう。この具体的な一例が病原性マイコバクテリアの例である。そのような場合において、マーカーを、臨床サンプルにおけるそのような病原性マイコバクテリアの存在（または非存在）を診断するデバイスにおいて利用することができる。改変されたマーカーがスキーム２によって記述される。病原性マイコバクテリアは、鉄を宿主タンパク質複合体から獲得するために、協力して働かなければならない２つのシデロホアタンパク質を必要とする。これら２つのシデロホアには、細胞内のミコバクチンシデロホアと、細胞外のエキソミコバクチンシデロホアとが含まれる。これらのうち、病原性マイコバクテリアはミコバクチンシデロホアを必要に応じて産生することができ、しかし、エキソミコバクチンシデロホアは、病原性マイコバクテリアが鉄枯渇の非常に長期間の条件にさらされたときにだけ産生される。
【００６８】
したがって、病原性マイコバクテリアが体液（例えば、血清など）に存在するならば、病原性マイコバクテリアは通常、鉄を鉄‐タンパク質複合体から捕捉することができず、したがって、成長することができない。血清は、病原性マイコバクテリアに対して静菌的であると言われる。しかしながら、エキソミコバクチンがアッセイサンプルに添加されるならば、鉄捕捉のすべての条件が満たされ、病原性マイコバクテリアは鉄捕捉を開始する。したがって、いくつかの実施形態では、病原体の代謝活性を促進させる物質（例えば、記載されたエキソミコバクチンシデロホアなど）をサンプルに添加すること、および、得られた代謝活性（すなわち、鉄捕捉速度）を、必要に応じて行われるコントロールアッセイ（エキソミコバクチンが添加されていないアッセイ）における代謝活性（すなわち、鉄捕捉速度）と比較することが伴う。試験アッセイ（エキソミコバクチンが添加されているアッセイ）における鉄捕捉速度がコントロールアッセイ（エキソミコバクチンが添加されていないアッセイ）の場合よりも大きいならば、そのことは、病原性マイコバクテリアの存在についての陽性の指標である。いくつかの実施形態において、コントロールアッセイとの比較は随意的である。他の実施形態において、病原体の代謝活性を促進させるサンプルへの物質の添加を、サンプルにおける病原体の特定および／または種分類のために使用することができる。
【００６９】
フリーラジカル産生およびプロトン産生を介した病原体検出
いくつかの実施形態において、病原体の存在が、マーカーのレドックス活性に伴う共鳴ラマンスペクトルにおける変化を介して、病原体関連の代謝活性によって確認される。試験アッセイにおける病原体の存在により、フリーラジカルおよびプロトンの生成がもたらされる。フリーラジカル／プロトンの産生は、微生物において実証されているミッチェル仮説（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｐ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１９６１、８１：２４；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｐ．、Ｎａｔｕｒｅ、１９６１（Ｊｕｌ）、１９１：１４４〜１４８を参照のこと）によれば、細胞代謝の保証された結果である（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｐ．、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．、１９６７（Ｓｅｐ）、２６（５）：１３７０〜１３７９）。この「仮説」は今や、微生物細胞におけるエネルギー産生のための、証明され、かつ、受け入れられている機構である。したがって、フリーラジカルおよび／またはプロトンの産生に応答し得るマーカーが、病原体の代謝活性および存在を検出するために有用である。そのようなマーカーには、抗酸化剤、フリーラジカルスカベンジャー、ＲＯＳ感受性色素およびＲＮＳ感受性色素、ならびに、プロトン感受性化学物質（例えば、酸塩基指示薬など）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、リコペン（これはヒト血清／血漿の成分である）を含むカロテノイド類は、非常に効率的なフリーラジカルスカベンジャーである。リコペンは、ヒト血漿に存在する最も効率的なフリーラジカルスカベンジャーであると言われている（Ｗａｓｓｅｒｍａｎｎ  Ａ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、１９５９（Ａｐｒ）、２（２）：２２６〜２２８；食物およびヒト血漿におけるリコペンの含有量および異性体比、１０．１０１６／Ｓ０３０８−８１４６（９６）００１７７−Ｘ：Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；Ｅｒｍａｋｏｖ  ＩＶ他、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔ．２００５、１０（６）：０６４０２８〜０６４０２８を参照のこと）。細菌／真菌の代謝によって生成したフリーラジカルおよびプロトンにさらされたとき、リコペンはプロトン化されてカルボカチオンを形成し、最終的には反応して、ベータ−カロテンおよびレチナールを当該生物においてもたらす。
【００７０】
リコペンは、約５３２ｎｍに中心を有する再現性のある吸収極大を含む光学吸収スペクトルを有する。（他の化学反応と一緒に）プロトン化されたとき、リコペンの光学吸収スペクトルは赤方偏移し、約５３２ｎｍにおける吸収ピークが消失する。リコペンの対応するラマンスペクトルは、約５３２ｎｍの波長の入射レーザーによるラマンスペクトルを集めているとき、共鳴により増強される。対照的に、リコペンがプロトン化され、約５３２ｎｍにおける吸収極大が赤方偏移するとき、共鳴ラマン増強もまた低下する。これらの性質は、ヒト血清またはヒト血漿の光学的性質に関する下記の観測結果をもたらす：（１）５３２ｎｍの波長のレーザーによるラマンスペクトルを集めているとき、ヒト血清（または血漿）のラマンスペクトルは、リコペンが名目的にヒト血清の優勢な成分でないとしても、リコペンのラマンスペクトルが優勢となる（優勢なピークが１５１６ｃｍ−１および１１５６ｃｍ−１にある）。（２）生存可能な病原体が存在するならば、また、そのような病原体が代謝活性を受けているならば、ラマンスペクトルにおけるリコペンのピークの強度が時間とともに低下する。
【００７１】
そのような実施形態が図８に記載される。図８を参照することにより、臨床サンプル１６が得られ、場合により、アッセイ１９に供されるサンプルを得るためのサンプル調製１７に供される。アッセイ１９は、ラマン分光計１８を用いたアッセイにおいてサンプルを照光すること、および、ブロック２０において例示されるように、リコペンの量における変化を経時的に検出することを含む。そのような変化は、アッセイからのシグナルによって測定されるようなものであり、代謝活性を示している。代謝活性は結果として、病原体の存在を示している。１つの実施形態において、病原体の存在が、病原体が代謝期間中に産生するフリーラジカルを介して検出される。すべての生存生物の代謝はある濃度のフリーラジカルを細胞壁においてもたらすが、細菌病原体および真菌病原体はただ１つの細胞壁を有する。したがって、真菌病原体および細菌病原体における代謝は、それらの細胞壁において濃縮されるフリーラジカルを産生し、それらの細胞壁において、これらのフリーラジカルが、血清に存在するフリーラジカルスカベンジャーによって除去され得る。フリーラジカルスカベンジャーのいくつかが、共鳴により増強されたラマンスペクトルを有する。例えば、また、上記で記載されたように、リコペンは、ベータ−カロテンに類似し、かつ、強い吸収極大スペクトルを５３２ｎｍに有する赤色カロテノイドである。したがって、５３２ｎｍのレーザーを使用するとき、リコペンは、血清のそれ以外の内因性成分よりも優勢である、共鳴により増強されたラマンスペクトルを有する。さらに、リコペンは非常に効率的なフリーラジカルスカベンジャーであり、病原体の代謝によって産生されるフリーラジカルと反応する。リコペンの構造における生じた変化を、約５３２ｎｍの波長のレーザーを使用するラマン分光法によって容易にモニターすることができる。当業者は、この基本的論述が、類似する他の論述に拡張され得ることを認識するでろう。例えば、この基本的原理は、４８０ｎｍ〜５１０ｎｍのわずかに低波長側のレーザー波長を用いるラマン散乱設定を使用するとき、（いくつかの病原体によってそれらの代謝の期間中に産生される）ベータ−カロテン類の検出に適用することができる。当業者はまた、複数のレーザーの組合せが、病原体の生化学的プロフィルを明らかにするために使用され得ることを認識するであろう。例えば、ベータ−カロテン産生を特徴づけるための４８８ｎｍのレーザー波長を有するラマン装置を使用することができ、また、リコペン‐フリーラジカル除去を特徴づけるための５３２ｎｍのレーザー波長のラマン装置と組み合わせることができる。得られた生化学的プロフィルは代謝サイクル期間中のベータ‐カロテン産生を特徴づけており、病原体を特定するために使用することができる。
【００７２】
いくつかの実施形態において、マーカー消費の速度がサンプルにおける病原体の量に比例している。例えば、いくつかの実施形態において、リコペンピーク強度の割合が、サンプルに存在する病原体の量に比例して、また、そのような病原体が代謝している速度により時間とともに低下する。結果的には、いくつかの実施形態において、マーカー消費の速度が、サンプルにおける病原体の濃度を求めるために使用される。
【００７３】
図５および図６を参照することにより、リコペン消費が代謝活性の指標としてラマン分光法によりモニターされるならば、試験は、一連のラマンスペクトルを経時的に集めることを伴う。この収集の代表的な描写が図５に示される。個々のラマンスペクトルが、リコペン消費の場合にはサンプルにおけるリコペンまたは他の成分のどちらかに起因すると考えられる１つまたは複数のピーク（例えば、２２、２２および２３など）を含む。生存可能な病原体が存在するならば、リコペン濃度が減少することになり、リコペンのピークが、図６におけるトレース線（３３および３４）によって示されるように、時間とともに低下することになる。他方で、生存可能な病原体が存在していないならば、または、生存可能な病原体が、効果的な抗菌性薬剤と一緒にアッセイにおいて存在するならば、ピーク高さは、図６に示されるように、経時的にほぼ不変である。以前に記載されたように、図６に示される４つのトレース線は、非感染患者からの血清（トレース線３１）、多量のメチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を有する血清（トレース線３３）、ＭＲＳＡと、有効用量のバンコマイシンとを有する血清（トレース線３２）、および、ＭＲＳＡと、非有効用量のアンピシリンとを有する血清（トレース線３４）を表している。
【００７４】
加えて、ある種の病原体がカロテノイド類を代謝活性の兆候として産生する。そのような場合には、病原体の存在を明らかにするマーカーとしてのカロテノイド（すなわち、リコペン）を使用するトレース線は、サンプルにおけるマーカーの濃度が病原体の代謝活性とともに増大し続けるので、時間とともに正の傾きを有することになる。しかしながら、病原体の非存在を明らかにするトレース線は、ピーク強度がぼぼ不変のままであるので、依然として比較的一定のままであろう。したがって、代謝活性および病原体の存在を示しているのが、サンプルにおける代謝活性を表すマーカーについての経時的なピーク強度における変化である。そのような変化は、下記でさらに詳しく議論されるように、マーカー消費またはマーカー産生のどちらでもあり得る。
【００７５】
マーカー産生を介した代謝活性の検出
いくつかの実施形態において、サンプルにおける代謝活性がマーカーの産生によって検出される。サンプルにおけるマーカーの産生の例には、元素‐病原体タンパク質複合体（すなわち、Ｆｅ‐Ｔｒ）、低下した抗酸化剤、低下したフリーラジカルスカベンジャー、低下したカロテノイド、または、それどころか、低下したリコペンが含まれる。したがって、サンプルにおける代謝活性がマーカーの量における低下（例えば、マーカーの消費など）から検出可能であり、または、代謝活性がマーカーの量における増大から検出可能である。これらの概念の限定されない一例として、リコペンがマーカーであると考えられるかもしれず、サンプルにおけるその消費が代謝活性を示しているであろうと思われる。逆に、抗酸化剤として機能するリコペンの生成物がマーカーであると考えられるかもしれず、その産生が代謝活性を示しているであろうと思われる。
【００７６】
いくつかの実施形態において、病原体により、マーカーが産生される。例えば、いくつかの病原体がカロテノイド（具体的にはリコペン）を産生し、その産生を、サンプルにおける代謝活性、サンプルにおける病原体の存在を示すために、また、それどころか、サンプルにおける病原体の分類を容易にするために検出することができる。実際、カロテノイド産生およびリコペン産生が、Ｍ．ｐｈｌｅｉ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉおよびＭ．ａｕｒｕｍ（これらに限定されない）を含むいくつかのマイコバクテリア属菌種において記録されている。加えて、本明細書中に記載されるある種の実施形態が、リコペン産生をＭ．ｂｏｖｉｓ（図１９および図２０を参照のこと）およびＭ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ（図２１を参照のこと）において検出するために使用されている。そのうえ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍおよび他のマイコバクテリウム属菌種におけるカロテン生成が知られており、光依存的であることが見出されている。最後に、Ｍ．ｔｂは、カロテノイドオキシゲナーゼを媒介することが知られている；種々のマイコバクテリア属菌種をそれらのカロテノイド産生に基づいて表現型分類することができる。したがって、いくつかの実施形態において、病原体が、具体的にはマイコバクテリアが、サンプルにおけるカロテノイドの産生から検出される。他の実施形態において、病原体が、具体的にはマイコバクテリアが、サンプルにおけるリコペンの産生から検出される。
【００７７】
抗菌剤感受性および／または抗菌剤感受性を介した病原体特定
いくつかの実施形態において、抗病原体物質に対する病原体の感受性が求められる。例えば、特定の抗菌剤および／または抗菌剤カクテルに対する特定の細菌の感受性が求められる。類似する感受性がまた、抗真菌剤および抗ウイルス剤に関連して特定の真菌およびウイルスについて容易に求められる。加えて、いくつかの実施形態において、サンプルにおける病原体は不明であり、感受性が、当該病原体の正体に関する知識とは無関係に求められる。したがって、特定の処置のもっともらしい有効性または無効性がいくつかの実施形態において容易に求められる。そのうえ、いくつかの実施形態では、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）測定規準の迅速な決定が規定される。
【００７８】
ＭＩＣは、標的生物のインビトロ成長を効果的に阻害する薬物の最小濃度である。標準的なＭＩＣ試験に関して、試験は検討中の生物の純粋成長を必要とし、通常的には、サンプルが採取された少なくとも４８時間後〜７２時間後に臨床医に利用可能になる。しかしながら、いくつかの実施形態において、また、マーカー（例えば、リコペンなど）が代謝活性を反映し、かつ、代謝速度が、効果的な抗病原体薬物が病原体に作用するときには低下することが予想されるので、ＭＩＣ測定規準を標準的な試験時間よりも速く特徴づけることができる。いくつかの実施形態において、ＭＩＣ測定規準が試験の約３０分以内にもたらされる。
【００７９】
いくつかの実施形態により、未知（病原体）および／または１つもしくは複数の既知病原体が感染したサンプルにおける特定の抗病原体物質の有効性／無効性が求められる。他の実施形態において、２つ以上の抗病原体物質の組合せの有効性／無効性が、未知（病原体）および／または１つもしくは複数の既知病原体を有するサンプルについて求められる。
【００８０】
サンプルにおける毒素の検出
哺乳動物細胞株に対する毒素の１つの影響が代謝ストレスの誘導である。フリーラジカルが代謝ストレスの結果として産生され、したがって、哺乳動物細胞は、毒素にさらされたときにフリーラジカルを産生するにちがいない。カロテノイド類（とりわけ、リコペン）がフリーラジカルの効率的なスカベンジャーである。したがって、哺乳動物細胞が毒素にさらされることにより、リコペン濃度における測定可能な変化が生じるにちがいない。そのような変化が、本明細書中に記載される様々な方法を使用して検出可能である。
【００８１】
いくつかの実施形態において、マーカーが、サンプル（例えば、血液、尿または他の臨床サンプルなど）における化学的毒素または生物学的毒素の存在を検出するために使用される。他の臨床サンプルには、物質が毒性および／または毒性濃度であるかを明らかにするために物質を試験することのために特に調製される様々なサンプルが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、マーカーは、抗酸化剤、フリーラジカルスカベンジャー、カロテノイドおよび／またはリコペンである。
【００８２】
血液サンプルを一例として使用すると、化学的毒素または生物学的毒素は小分子または細胞であり、通常の処理方法（例えば、遠心分離または重力沈降法など）のもとでは血清に濃縮されるであろう。哺乳動物細胞が、サンプルを得るために血清またはその一部と一緒にされる。栄養ブロスが場合により、サンプルに含まれる。化学的毒素または生物学的毒素がサンプルから存在するならば、毒素により、哺乳動物細胞によるフリーラジカル産生が誘導されることになる。フリーラジカルに対して応答して、マーカーは、測定可能な変化を受け、サンプルにおける毒素の検出を提供するであろう。
【００８３】
他の実施形態において、マーカーはリコペンであり、ヒト細胞（例えば、ＨＬ６０細胞など）が利用される。ヒト細胞に対して毒性である物質がサンプルに存在するならば、ヒト細胞はフリーラジカルを産生するであろう。フリーラジカルがリコペンマーカーによって除去されることにより、リコペンマーカーにおける測定可能な変化、または、変化を表すシグナルが生じることになる。いくつかの実施形態において、測定されている変化が、ラマン装置を用いて検出される。
【００８４】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数の物質が、ヒト細胞に対して毒性であるかを明らかにするために試験される。実際、そのような物質は、必要に応じて使用される栄養ブロスとともにヒト細胞と一緒にすることができ、ヒト細胞に対する物質の影響をモニターすることができる。したがって、物質の毒性（または、サンプルにおける毒素の存在）が、フリーラジカル産生、および、フリーラジカルに対して感受性のマーカーにおける変化によって検出される。いくつかの実施形態において、サンプルが、１つまたは複数の細菌毒素、真菌毒素および／または化学物質（すなわち、有機化合物、無機化合物および有機金属化合物、ならびに、そのような化合物の合成において使用される溶媒および試薬）の存在について試験される。他の実施形態において、１つまたは複数の物質、例えば、化学物質（すなわち、化合物の合成において使用される溶媒および試薬を含めて、様々な有機化合物および無機化合物）などが、物質が毒性であるかを明らかにするためにサンプルに含められる。いくつかの実施形態において、物質の様々な濃度が、もっともらしい毒性閾値を求めるために試験される。例えば、殺虫剤、医薬品、医薬品成分、活性な医薬品成分、キャリア、フィラー、合成中間体、および、医薬品において特定される不純物が、毒性またはその欠如が特に重要である物質に相当する。
【００８５】
いくつかの実施形態において、測定されている変化および／またはシグナルは時間とともに蓄積し、非常に低い毒素レベルの検出を可能にする。いくつかの実施形態において、検出限界が、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭおよび／または１００μＭ、ならびに／あるいは、前記数字のいずれか２つによって制限される範囲、ならびに／あるいは、およそ前記数字のいずれかである。他の実施形態において、検出の限界が約４μＭである。他の実施形態において、検出限界が、１μＭ未満、５μＭ未満、１０μＭ未満、２０μＭ未満、３０μＭ未満、４０μＭ未満、５０μＭ未満、６０μＭ未満、７０μＭ未満、８０μＭ未満、９０μＭ未満および／または１００μＭ未満であり、ならびに／あるいは、前記数字のいずれか２つによって制限される範囲よりも小さく、ならびに／あるいは、およそ前記数字のいずれかよりも小さい。
【００８６】
増強された感度および分解能を有する測定
測定システムの観点から、ノイズが、測定されている量の平方根に比例している。前記の抗菌剤感受性試験は、臨床サンプルに存在する病原体の量に正比例している変数を測定しており、この取り組みでは、大きい測定誤差が生じる。例えば、米国特許第４，４４８，５３４号は、マルチアリコートトレーにおける細菌数が光学密度法によって求められる、抗生物質感受性試験のための装置を記載する。ベースライン測定では多数の病原性細胞が含まれ、かつ、測定における誤差が病原性細胞の数の平方根に比例しているので、抗菌性薬物の影響は、薬物が多数の細胞の生存性を低下させているときにだけ認めることができる。この取り組みでは、試験のための大きい時間要求が生じる。
【００８７】
図９に例示されるように、第１の近似に対して、どのような測定システムであれ、測定システムにおけるノイズが、測定されているノイズの平方根に比例している。スキーム５１およびスキーム５２では、シグナル対ノイズ比が、シグナルＳを、バックグラウンドレベルＢを伴って、または伴うことなく測定する測定システムについて例示される。抗生物質感受性を測定するための以前の方法はスキーム５３によってまとめることができ、この場合、Ｎは、細菌細胞数に比例している変数を表し、ΔＮはその変数における変化である。これらの状況のもとでは、測定された量はＮ±ΔＮであり、測定におけるノイズは、Ｎ±ΔＮの平方根になる。したがって、測定されたシグナルは、ΔＮがＮと同程度になるときにだけノイズ閾値を超える。この要件は一般に、２０分の倍加時間により、十分に強いシグナルが生じることになるように、細菌細胞を臨床サンプルから単離することに変わる。代替において、デバイスが臨床サンプルとともに直接に作動しているならば、当該方法は、細菌細胞数が臨床サンプルの内因的成分のカウント数を超えるように、数回の倍加時間を待たなければならない。
【００８８】
対照的に、本明細書中に開示される実施形態では、存在（生存可能な病原体が存在するとき）または非存在（生存可能な病原体が存在しないとき、または、それらの活性が効果的な抗病原体物質（例えば、抗菌剤など）によって抑制されているとき）のどちらかである宿主‐病原体相互作用が測定される。いくつかの実施形態におけるベースライン測定は相互作用の非存在であるので、測定感度が、試験のために要求される時間が少ないときでさえ、はるかにより大きい。より一般的に言えば、ある特定の実施形態により、病原体の存在に伴う十分でない資源（すなわち、鉄またはリコペン）が測定される。このことの利点が図９においてスキーム５４によって記載され得る。シグナルがΔＳＲであり、これは、十分でない資源のレベルにおける変化である。このシグナルが、比較的小さいバックグラウンドで測定される（２＊ΔＳＲが、図９において引用される例であり、それは、ΔＳＲを大きく超えない他の数字のどれもが可能である）。したがって、いくつかの実施形態において、ノイズがΔＳＲの平方根に比例している。
【００８９】
様々な程度にではあるが、抗菌剤感受性試験のためのすべての以前の取り組みは、米国特許第４，４４８，５３４号について記載されたこの固有的に不備のある取り組みに悩まされる。例えば、米国特許第６，３７９，９２０号は、非感染患者から得られる臨床サンプルのラマンスペクトルが、未知臨床サンプルのラマンスペクトルから差し引かれる参照として使用される方法を記載する。この方法に関して、発明者らは、特定の細菌が、より速やかに、かつ、培養を行うことなく特定され得ることを主張する。しかしながら、ベースライン測定は未知臨床サンプルのラマンスペクトルであり、臨床サンプルの内因的成分のすべてを含有する。さらに、そのような内因的成分のラマンバンドは細菌病原体のラマンバンドと重なっている；したがって、細菌細胞数は、有意な示差的測定を行うことができる前に非常に多数でなければならない。
【００９０】
米国特許第３，９８３，００６号には、抗生物質の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を、細菌懸濁物の細菌成長速度に対する応答での光学的性質における変化を抗生物質の非存在下および存在下で連続測定することによって求めるための方法が記載される。米国特許第４，４４８，５３４号の場合と同様に、この方法は、多数の病原性細胞の測定に伴う大きい測定誤差に悩まされており、結果として、デバイスは、効果的な測定を行うことができる前に抗菌剤が多数の細菌細胞を殺すための大きい時間スケールを必要とする。
【００９１】
ラマン増幅に起因する増強
いくつかの実施形態では、様々な共鳴プロセスが、測定されたシグナルを増幅するために利用される。この特徴が、図１０において概略されるスキームにより例示される。具体的には、重要な光学的差異が、Ｆｅ‐Ｔｒと、Ｔｒとの間に存在する。例えば、Ｆｅ‐Ｔｒは、４８５ｎｍの波長に中心を有する幅広い光学吸収ピークを有する。この光学吸収ピークのために、様々なＦｅ‐Ｔｒラマンバンドが、ラマンレーザー波長がこの光学吸収バンドの中にあるときには強い共鳴ラマン増強を示す。図１０は、光学吸収６１と、１６０８ｃｍ−１、１５０６ｃｍ−１、１２８１ｃｍ−１および１１７４ｃｍ−１における４つのＦｅ‐Ｔｒピーク（それぞれ、６２、６３、６４および６５）のラマン断面積と、波長との間における関係を例示する。図１０は、レーザー波長が、Ｆｅ‐Ｔｒピークの１つまたは複数が共鳴により増幅される値に位置するならば、得られたラマンスペクトルは、Ｆｅ‐Ｔｒのスペクトルが優勢となるであろうことを明らかにする。そのうえ、共鳴ラマン増強は上記のＦｅ‐Ｔｒ系に限定されるのではなく、増幅が他のマーカーについても同様に存在する。例えば、共鳴ラマン増強が、様々なマーカーについて、例えば、抗酸化剤、フリーラジカルスカベンジャーおよび／またはカロテノイド類（すなわち、ベータ‐カロテンおよびリコペン）などについて利用可能である。実際、リコペンのラマンシグネチャーが５３２ｎｍの光の使用によって共鳴により増強される。この共鳴増強は約１０倍〜約１０００倍の程度であり得る。いくつかの実施形態において、共鳴増強が、１０倍程度、５０倍程度、１００倍程度、２００倍程度、３００倍程度、４００倍程度、５００倍程度、６００倍程度、７００倍程度、８００倍程度、９００倍程度および／または１０００倍程度、ならびに／あるいは、前記数字のいずれか２つによって制限される範囲、ならびに／あるいは、およそ前記数字のいずれかである。したがって、共鳴ラマン増強は、臨床サンプルを、細菌の単離または成長を何ら必要とすることなく試験することを可能にする。いくつかの実施形態において、共鳴ラマンが、測定されているシグナルを増幅するために使用される。他の実施形態において、増幅が、サンプルにおける病原体を単離することを必要とすることなく使用される。いくつかの実施形態において、増幅が、病原体計数時間を増大させることを必要とすることなく使用される。他の実施形態において、増幅が、サンプルにおける病原体を濃縮することを必要とすることなく使用される。
【００９２】
いくつかの実施形態において、マーカーは、測定されているシグナルにおける変化が累積的であるように時間とともに「積分される」。しかしながら、いくつかのマーカーは「示差的」である。「積分的」マーカーの一例がリコペンであり、これに対して、蛍光のバイオマーカーは「示差的」マーカーの一例である。この違いを理解するために、少数の細菌細胞がリコペンラマンおよび蛍光バイオマーカーによって同時に調べられることを考える。細胞の数が測定期間中に著しく変化しないことを仮定すれば、蛍光バイオマーカーの出力は、条件が変化しないならば、おそらくは一定であるそのような群の細胞の代謝速度に比例している。しかしながら、対照的に、リコペンマーカーの出力は、代謝速度の時間積分である総代謝活性に比例している；したがって、リコペンマーカーの出力は時間とともに絶え間なく変化する。したがって、十分に長い時間が経過した後では、リコペンマーカーは、最初の値とは著しく異なる値であって、測定されているノイズを超えて比較的容易に読み取ることができる値を有することになる。
【００９３】
選択培地を使用する病原体分類
いくつかの実施形態において、抗病原体物質がサンプルに存在する。抗病原体物質の一例が選択培地または培養ブロスである。いくつかの実施形態において、選択培地が、サンプルにおける病原体を特定するために使用される。図１１、図１２および図１３ではさらに、選択培地を使用して特定することが例示される。図１１は、ラマンスペクトルを、１０７ｃｆｕ／ｍＬのＳ．ａｕｒｅｕｓが接種されている血清サンプルについて種々の時点において例示する。添加されたブロスが何ら存在しない場合、ピーク高さが時間の関数として変化しない。したがって、その点において、ブロスが添加されていない感染サンプルの挙動は、非感染サンプルの挙動とほぼ同一である。図１２は、８０％ブロスに希釈された非感染の熱性患者に由来する血清サンプルの時間プロフィルを示す。２つのトレース線は、１５１６ｃｍ−１および１１５６ｃｍ−１（これらはともに、リコペンに起因すると考えられる）におけるピーク高さを示す。この場合、これら２つのピーク高さは時間とともにほぼ不変のままである。添加されたブロスの非存在下において、感染サンプル（感染患者に由来するサンプルを含む）は、この挙動、すなわち、ピーク高さが時間とともに変化しないことを明らかにする。
【００９４】
成長に好都合である培地を添加すると、ピーク高さが低下し始める。このことの一例が図１３に示される。図１３は、１５１６ｃｍ−１および１１５６ｃｍ−１（これらはともに、リコペンに起因すると考えられる）におけるピーク高さを、感染患者に由来するが、トリプチカーゼソイブロス（ＴＳＢ）の添加を伴う血清サンプルについて時間の関数として示す。ＴＳＢは、ＭＲＳＡの成長を可能にする選択培地である。したがって、図１３は、図１３に示されるような、１５１６ｃｍ−１および１１５６ｃｍ−１でのラマンピークにおける低下を例示する。この低下が、代謝活性の存在、したがって、病原体の存在を示している。
【００９５】
いくつかの実施形態において、培養ブロスはある種の病原体の成長を抑制する。他の実施形態において、培養ブロスはある種の病原体の成長を促進させる。いくつかの実施形態において、抗病原体培地および病原体有利培地の組合せが利用される。したがって、サンプルへの物質の添加は病原体の特定および／または分類を容易にすることができる。
【００９６】
１つの特定の種の微生物の代謝を促進させ、一方で、すべての他の微生物を抑制する栄養培地は１つもないが、選択培地の組合せの使用は、生物を分類することを助けることができる。例えば、マッコンキー培地は、胆汁酸塩と、グラム陽性生物を阻害し、結果として、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの成長代謝活性を支援することにはならず、かつ、グラム陰性細菌（例えば、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉおよびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなど）の代謝を促進させるであろうと考えられる色素のクリスタルバイオレットとを含有する（マッコンキー寒天平板プロトコル［インターネット］、［日付は不明である］、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｂｅｌｉｂｒａｒｙ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ／ｒｅｓｏｕｒｃｅ／ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−ｔｅｓｔ／２８５５−ｍａｃｃｏｎｋｅｙ−ａｇａｒ−ｐｌａｔｅｓ−ｐｒｏｔｏｃｏｌｓから入手可能）。対照的に、コロンビアＣＮＡ培地（これは抗菌剤のコリスチンおよびナリジクス酸を含む）は、含まれる抗生物質がグラム陰性細菌を阻害するので、グラム陽性生物について選択する（Ｂｉｏｌ  ２３０  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ、Ｌａｂ  ３［インターネット］、［日付は不明である］；ｈｔｔｐ：／／ｆａｃｕｌｔｙ．ｃｃｂｃｍｄ．ｅｄｕ／ｃｏｕｒｓｅｓ／ｂｉｏｌ４１／ｌａｂｍａｎｕａ／ｌａｂ３／ｌａｂ３．ｈｔｍｌから入手可能）。さらに、マンニトール塩の使用（７．５％の塩を伴う）は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの代謝を促進させ、グラム陰性菌の成長を阻害し、かつ、重要なことに、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（創傷培養物に混入することに最も一般的に関わる片利共生菌）の成長を阻害するであろうと思われる（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｍｅｄｉａ．Ｔｅｓｔｓ．Ｐｉｃｔｕｒｅｓ．ｐｄｆ［インターネット］、［日付は不明である］；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｅｌｔａ．ｅｄｕ／ｆｉｌｅｓ／Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ／Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｍｅｄｉａ．Ｔｅｓｔｓ．Ｐｉｃｔｕｒｅｓ．ｐｄｆから入手可能）。
【００９７】
別の一例がバンコマイシン耐性の腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）である。これらの生物を、胆汁が他のグラム陽性生物（ＭＲＳＡを含む）の成長を阻害するので、腸球菌の成長および代謝のみを支援し、かつ、上述の多剤耐性（「ＭＤＲ」）細菌の残りはどれも支援せず、また、グラム陰性菌の成長を阻害するアジ化ナトリウムを含有する胆汁エスクリン培地の使用によって選択することができる（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂ□：ＭＯＬＢ  ２２１０［インターネット］、［日付は不明である］；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｗｙｏ．ｅｄｕ／ｍｏｌｂ２２１０＿ｌａｂ／ｉｎｆｏ／ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ＿ｔｅｓｔｓ．ｈｔｍ＃ｂｉｌｅから入手可能）。グラム陰性ＭＤＲ生物の鑑別を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの代謝および成長を特異的に支援し、それ以外の２つのグラム陰性桿菌は支援しないＰＣ培地の使用によって行うことができる（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＭＥ、Ｆａｒｍｅｒ  ＳＷ、Ｓｐｅｅｒｔ  ＤＰ、フェナントロリンおよび９−クロロ−９−［４−（ジエチルアミノ）フェニル］−９，１０−ジヒドロ−１０−フェニルアクリジン塩酸塩（Ｃ−３９０）を用いる、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のための新しい選択培地、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９８８（Ｓｅｐ）、２６（９）：１９１０〜１９１２）。対照的に、リーズ（Ｌｅｅｄｓ）アシネトバクター培地（「ＬＡＭ」）は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａまたはＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの成長ではなく、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉの成長および代謝を支援するであろう（Ｊａｗａｄ  Ａ他、リーズ・アシネトバクター培地の説明、臨床的に重要なアシネトバクター属の種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）を単離するための新しい選択・鑑別培地ならびにヘレラ寒天およびホルトン寒天との比較、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９４（Ｏｃｔ）、３２（１０）：２３５３〜２３５８）。
【００９８】
したがって、かつ、要約すると、いくつかの実施形態において、選択培地を用いた多工程取り組みが、病原体を細分類するために使用される。これらの工程では、上記段落において記載される種々の選択培地の１つまたは複数（あるいは組合せ）が含まれる。
【００９９】
ＩＲ吸収分光法による方法を用いた実施
いくつかの実施形態において、代謝活性を検出するための方法が、赤外（「ＩＲ」）吸収分光法による方法を用いて行われる。ＩＲ吸収が、ラマンバンドと同一である振動バンドから生じる。したがって、分子のＩＲシグネチャーは、そのラマンシグネチャーと類似する傾向がある。しかしながら、ＩＲ吸収法は、代謝活性の検出を最大化するために、ラマン法のような吸収増強（すなわち、前記で記載されるような、アポ‐Ｔｒと、Ｆｅ‐Ｔｒとの間における違い）を利用することができない。結果的に、ＩＲ吸収法は、類似するベースラインスペクトルを分析期間中にもたらす。例えば、Ｆｅ‐Ｔｒのベースライン赤外スペクトルは、アポ‐Ｔｒのベースライン赤外スペクトルと類似する傾向がある。しかしながら、代謝活性（例えば、アポ‐ＴｒおよびＦｅ‐Ｔｒのシグネチャーなど）を、共鳴吸収増強の波長に中心を有するレーザー光をこのような２つのサンプルに同時に照射することによって検出および／または識別することができる。すなわち、そうすることにより、対応する赤外吸収ピークが、ラマンバンドが変化するのとほとんど同じ様式で変化する。
【０１００】
さらなる実施形態
他の実施形態により、ヒトまたは病原性細胞の呼吸状態を特徴づけるための方法が規定され、この場合、この方法は、呼吸時に産生されるフリーラジカルの産生をモニターすることを含む。いくつかの実施形態において、フリーラジカル産生が、フリーラジカルスカベンジャーに対するその影響を介してモニターされる。フリーラジカルスカベンジャーに対する影響が共鳴ラマン分光による方法を介してモニターされる。いくつかの実施形態において、測定されているシグナルは、時間とともに蓄積する量のシグナルであり、それにより、より大きい測定値をより低いノイズとともに与える。
【０１０１】
他の実施形態により、ヒトまたは病原性細胞の呼吸状態を特徴づけるための方法が規定され、この場合、この方法は、呼吸時に産生されるカロテノイドの産生をモニターすることを含む。いくつかの実施形態において、カロテノイドの産生が共鳴ラマン分光法を介してモニターされる。いくつかの実施形態において、測定されているシグナルは、時間とともに蓄積する量のシグナルであり、それにより、より大きい測定値をより低いノイズとともに与える。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、上記方法は、波長１のレーザー（これにより、病原体の代謝についての１つのマーカーがもたらされる）と、波長２の別のレーザー（これにより、病原体の代謝についての別のマーカーがもたらされる）とを用いて実行され、これら２つのマーカーが、病原体の生化学的プロフィルを明らかにするために組み合わされる。他の実施形態において、上記方法は、病原体を特定することに適用される。いくつかの実施形態において、上記方法は、臨床サンプルに存在する病原体の検出、特徴づけおよび定量化に対して適用される。他の実施形態において、上記方法は、臨床サンプルに存在する化学的毒素または生物学的毒素の検出、特徴づけおよび定量化に対して適用される。
【０１０３】
他の実施形態により、臨床サンプルに存在する病原性細胞を特徴づけるための方法が規定され、この場合、この方法は、病原体が、臨床サンプルにおける十分でない資源を消費し、かつ／または生成し、かつ／または改変する速度をモニターすることを含む。いくつかの実施形態において、十分でない資源の測定が、そのような十分でない資源に起因するシグナルを本来的に増幅する方法によって行われる。他の実施形態において、十分でない資源の消費または産生が、アッセイに添加される様々な選択培地の関数としてマッピングされ、結果が、病原体を特定するために使用される。いくつかの実施形態において、十分でない資源の消費または産生が、添加された抗菌性薬剤の関数としてマッピングされ、結果が、臨床サンプルに存在する病原体についての抗菌性薬物感受性情報を明らかにするために使用される。
【０１０４】
他の実施形態において、十分でない資源がリコペンであり、病原体が、リコペンを、リコペンにより除去されるフリーラジカルを生成することによって消費する。いくつかの実施形態において、リコペンの消費が、共鳴ラマン分光法によって、または、非共鳴ラマン分光法によってモニターされる。いくつかの実施形態において、十分でない資源がベータ‐カロテンであり、病原体がベータ‐カロテンを産生する。他の実施形態において、ベータ‐カロテンの産生が、共鳴ラマン分光法によって、または、非共鳴ラマン分光法によってモニターされる。
【０１０５】
他の実施形態において、十分でない資源が、特別の鉄含有タンパク質の中に宿主の脊椎動物よって捕捉されている鉄である。いくつかの実施形態において、鉄含有タンパク質はトランスフェリンである。他の実施形態において、鉄含有タンパク質はラクトフェリンである。いくつかの実施形態において、鉄含有タンパク質はフェリチンである。いくつかの実施形態において、鉄捕捉プロセスがラマン分光法によってモニターされる。他の実施形態において、鉄捕捉プロセスが赤外吸収分光法によってモニターされる。いくつかの実施形態において、鉄捕捉プロセスが、ＵＶ／可視吸収分光法を含めて、色滴定法によってモニターされる。他の実施形態において、宿主タンパク質からの鉄捕捉が、通常の場合にはアッセイに存在しないシデロホアの添加によって可能にされる。いくつかの実施形態において、特定の病原体に対して特異的であるシデロホアの添加により、その病原体の認識および特定が可能となる。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、ラマン分光法による方法は共鳴プロセスによって増幅され、それにより、高まった検出限界およびより速い検出時間を提供する。
【０１０７】
いくつかの実施形態により、臨床サンプルにおける未知（または既知）病原体の、抗菌性薬剤に対する感受性（または耐性）を特徴づけるための方法が規定される。いくつかの実施形態において、病原体は細菌性である。他の実施形態において、病原体は真菌性である。いくつかの実施形態において、病原体はウイルス性である。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、臨床サンプルは血液である。他の実施形態において、臨床サンプルは尿である。いくつかの実施形態において、臨床サンプルは脳脊髄液である。他の実施形態において、臨床サンプルは喀痰である。
【０１０９】
サンプル：
いくつかの実施形態において、サンプルが患者から臨床状況において得られる。いくつかの実施形態において、サンプルには、体液が含まれる。体液には、下記の流体が含まれるが、それらに限定されない：羊水、房水、ガラス体液、胆汁、血液、血清、乳汁、脳脊髄液、乳び、リンパ液、射精液、胃酸、胃液、粘液（鼻ドレナージ液および痰を含む）、腹腔液、膿、胸水、唾液、皮脂、精液、汗、涙、眼内液、分泌物、吐物、糞便および尿。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、各種サンプルが動物から採取される。これらのサンプルには、体液および／または動物からのスワブが含まれる。いくつかの実施形態において、サンプルが、生体対象物および非生体対象物から、対象物の表面を拭き取ることによって採取される。他の実施形態において、対象物の一部分がサンプルとして採取される。
【０１１１】
したがって、いくつかの実施形態において、サンプルを得ることには、当該サンプルを患者、動物または対象物から集めることが含まれる。しかしながら、他の実施形態において、サンプルを得ることには、既に集められた、場合により処理されたサンプルを受け取ることが含まれる。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、サンプルは、収集後、分析に先立って操作される。そのような操作には、下記の添加が含まれるが、それらに限定されない：栄養物、抗病原体物質（すなわち、培養培地（選択的および非選択の両方）、抗生物質、抗真菌剤および抗ウイルス剤）、病原体有利物質、マーカー、哺乳動物細胞、毒性測定用の物質、および／または、マーカーが機能するために必要な補充物。さらなる操作には、日常的なサンプル取り扱い手順、サンプル構成成分の取り出し（すなわち、ろ過、遠心分離、および、ろ過または遠心分離を伴うか、または伴わない沈降）、サンプル固定処理、および、サンプル雰囲気における変化（すなわち、ガスレベル（例えば、酸素および二酸化炭素など）を操作すること、ならびに、不活性雰囲気、好気的雰囲気および／または嫌気的雰囲気のもとに置くこと）が含まれる。操作が、サンプル分析が始まる前に、または、サンプル分析が始まる期間中に、または、サンプル分析が始まった後で行われる場合がある。いくつかの実施形態において、サンプルは培養される。例えば、サンプルには場合により、培養ブロスおよび／または培養培地が含まれる。他の実施形態において、サンプルには、培養細胞が含まれる。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、サンプルには、血液および／または血液成分が含まれる。様々な日常的サンプル取り扱い手順が、血液の収集およびその成分への操作のために知られている。いくつかの実施形態において、血液成分（例えば、細胞など）が取り出される。他の実施形態において、血液成分（例えば、赤血球など）が取り出される。いくつかの実施形態において、赤血球および白血球の両方が取り出される。他の実施形態において、血漿が、サンプルにおける使用のために得られる。血液成分を取り出すための様々な方法がこの技術分野では知られている。例には、重力沈降法および／または赤血球沈降速度手順が含まれるが、これらに限定されない。重力沈降法が場合により、抗凝固剤の存在下で行われる。いくつかの実施形態において、血液成分が、全血球計算が行われた後、サンプルに含めるために採取される。他の実施形態において、血液成分が、全血球計算試験から、サンプルに含めるために採取される。いくつかの実施形態において、血液成分が、赤血球沈降速度手順の後、サンプルに含めるために採取される。他の実施形態において、血液成分が、赤血球沈降速度手順の期間中に、サンプルに含めるために採取される。
【０１１４】
サンプル調製のための代表的な手順として、患者に由来する血液が、抗凝固剤により被覆されるバキュテーナー（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）の中に抜き取られる。好適な抗凝固剤には、エチレンジアミン四酢酸（「ＥＤＴＡ」）またはクエン酸が含まれ、しかし、ＥＤＴＡが好ましい。バキュテーナーは、約４０分間静置することを可能にし（だが、より長い時間は任意である）、そのような時間の期間中、赤血球が重力のためにボトルに沈降する。上部に留まる透明（または淡黄色）液体が血漿である。細菌細胞および真菌細胞が血漿層に留まる。実験により、赤血球が、重力に基づくこの方法によって分離されるとき、血液中の細菌／真菌細胞がそれらの生存性を実質的に保持することが示されている。この処理工程の利点が、この処理工程は現行の試験プロトコルと一致しており、新しいサンプル処理工程を何ら課さないということである。臨床医は、血液を抗凝固剤被覆バキュテーナーの中に直接抜き取ることを伴う全血球計算（「ＣＢＣ」）試験に非常に慣れ親しんでいる。さらなる実施形態には、血漿層からの微生物喪失が最小限に抑えられるような、しかし、サンプル処理時間もまた速める（すなわち、約４０分から約１０分以下にまで速める）低い十分な速度における小型遠心分離器での回転を使用するサンプル処理工程が含まれる。
【０１１５】
照光／光源
サンプルを照光するための光源および源は特に限定されない。いくつかの実施形態において、光源は、ＵＶ領域における波長を有する光をもたらす。他の実施形態において、光源は、ＩＲ領域における波長を有する光をもたらす。いくつかの実施形態において、光源は、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍ、５５０ｎｍ、６００ｎｍ、６５０ｎｍ、７００ｎｍ、７５０ｎｍ、８００ｎｍ、８５０ｎｍ、９００ｎｍ、９５０ｎｍおよび１０００ｎｍの波長、あるいは、前記数字のいずれか２つによって制限される範囲の波長、ならびに／あるいは、およそ前記数字のいずれかである波長を有する光をもたらす。いくつかの実施形態において、光源は、約６００ｎｍ未満、約５７５ｎｍ未満、約５５０ｎｍ未満、約５４０ｎｍ未満、約５３０ｎｍ未満、約５２０未満の波長、あるいは、前記数字のいずれか２つによって制限される範囲よりも小さい波長、ならびに／あるいは、およそ前記数字のいずれかよりも小さい波長を有する光をもたらす。いくつかの実施形態において、光源はレーザーである。他の実施形態において、光源は、モノクロメーターと組み合わされるランプである。いくつかの実施形態において、光源は実質的に単色光である。いくつかの実施形態において、光源はラマン分光計の一部である。
【０１１６】
マーカー
様々な実施形態における使用のための好適なマーカーには、検出可能な変化を代謝活性の関数としてもたらす化合物が含まれる。いくつかの実施形態において、好適なマーカーが化学化合物である。化学化合物の例には、抗酸化剤、フリーラジカルスカベンジャー、カロテノイド類（一群のキサントフィル類およびカロテン類を含む）、有機顔料および色素が含まれるが、これらに限定されない。化学化合物マーカーの具体的な例には、リコペンおよびベータ‐カロテンが含まれる。さらなるマーカーには、約１１５０ｃｍ−１〜約１１６５ｃｍ−１の間の光を伝えるマーカー、同様にまた、約１５００ｃｍ−１〜約１５５０ｃｍ−１の間の光を伝えるマーカーが含まれる。いくつかの実施形態において、ＲＯＳ活性化色素がマーカーとして使用される。
【０１１７】
他の実施形態において、また、上記においてより詳しく記載されるが、好適なマーカーがタンパク質（タンパク質複合体を含む）である。元素‐タンパク質複合体がマーカーの一例である。１つの具体的な元素‐タンパク質複合体が鉄‐タンパク質複合体であり、より具体的にはＦｅ‐Ｔｒ複合体である。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、マーカーにより、増幅シグナルがもたらされる。共鳴ラマンが増幅シグナルの一例である。共鳴ラマンはマーカーの吸収スペクトルの関数であることが理解される（すなわち、Ｅｒｍａｋｏｖ他、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ、２００５、１０（６）：０６４０２８を参照のこと。これはその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、光源およびその波長は、マーカーによる共鳴増強をもたらすように選択される。例えば、ベータ‐カロテンは共鳴ラマン増強を約５２５ｎｍ未満の波長において有する。同様に、リコペンは共鳴ラマン増強を約５３２ｎｍにおいて有する。加えて、Ｆｅ‐Ｔｒ複合体は共鳴ラマン増強を約５５０ｎｍ〜約４００ｎｍの間において有する。
【０１１９】
様々な他の測定技術を生来の増幅法と組み合わせるいくつかの他の実施形態を、ここに概略される原理を使用して組み立てることができる。一例として、誘電的共鳴分光法または誘電的緩和分光法を、代謝産物または代謝副産物の１つの産生、除去または修飾に伴う電子分極、原子分極、双極子緩和またはイオン緩和の１つを刺激するために使用することができる。誘電的共鳴プロセスは、（例えば、交流電磁波の振動数が、プローブ探査されている特定のモードと共鳴するならば）モニターされている分析物に伴うシグナルを増幅することができるので、生じた分析物シグネチャーが１倍を超えて増幅され得る。
【０１２０】
可能性のある別の方向の実施形態では、共鳴プロセスを測定するプローブが、診断効率を改善する様式で、別のプロセス（２番目のプロセスは共鳴または非共鳴であり得るかもしれない）を測定する別のプローブと組み合わされて含まれるであろうと考えられる。一例として、１つの実施形態では、共鳴ラマン法（これは、概略されてきたものと類似している）が、誘電モードの１つと共鳴する振動数の交流電磁場と組み合わされ得るかもしれない。この組合せが、シグナル対ノイズ比を、共鳴ラマン法だけと比較してさらに１０倍増大させる２次元相関方法論とともに実施され得るかもしれない。可能性のある別の実施形態では、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）による方法が、微生物細胞の代謝の期間中におけるフリーラジカル産生を検出するために利用される。開示された方法によれば、ＳＥＲＳ増幅を生じさせる表面（例えば、ガラス表面に被覆された金ナノ粒子など）が、すべての微生物細胞を優先的に引き寄せる表面化学（この一例が脂質層であろうと思われる）およびフリーラジカルスカベンジャー（例えば、リコペン・リポタンパク質複合体など）と組み合わされるであろうと考えられる。ＳＥＲＳ増幅は、脂質表面に吸着しているリコペンおよびすべての他の成分に関連するシグネチャーを、当該表面に吸着していないすべての血清成分と比較して増強するであろうと考えられる。したがって、表面に吸着しているフリーラジカルスカベンジャーに対するどのような変化も、または、何らかの脂質親和的な代謝副産物のどのような産生／修飾も検出され得るかもしれない。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、マーカーはサンプルにおいて生来的に産生される。他の実施形態において、マーカーはサンプルに添加される。いくつかの実施形態において、マーカーは生来的に存在しており、しかし、さらなるマーカーが、その濃度を増大させるためにサンプルに添加される。どのようなマーカーであれ、マーカーの添加は場合により、１回または複数回のデータ収集の前、またはその期間中、またはその後においてである。いくつかの実施形態において、マーカーは、サンプルを照光源／光源により照光する前に添加される。
【０１２２】
加えて、いくつかの実施形態において、マーカーが、システムまたはシグナルを（校正用マーカーの存在または校正用マーカー由来のシグナルの強度のどちらかにより）校正するための方法を与えるためにサンプル容器の表面に添加される。他の実施形態において、校正用マーカーがサンプル容器材料に組み込まれるか、またはドープされる。いくつかの実施形態において、サンプル容器が、金属酸化物である校正用マーカーにより被覆される。いくつかの実施形態において、金属酸化物である校正用マーカーは酸化バナジウムである。いくつかの実施形態において、金属酸化物である校正用マーカーは酸化アルミニウムである。金属酸化物は、知られている方法により適用することができ、または、知られている方法により取り込むことができる。１つのそのような適用方法がスパッターコート技術である。スパッターコーティングが、サンプル容器がガラスから作製されるときには金属酸化物を適用するためにとりわけ適合化される。しかしながら、サンプル容器は他の材料から作製することができ、例えば、モニターされている分析物に由来するラマンスペクトルを妨害しないプラスチックなどから作製することができる。いくつかの実施形態において、サンプル容器はそれ自体が校正用マーカーである。金属酸化物によってもたらされるシグナル（例えば、ラマンシグナルなど）の強度は、サンプル容器における被覆の厚さの関数である。容器における被覆の厚さはスパッタリングプロセスによって制御することができる。いくつかの実施形態において、厚さは、０．５ｎｍ、１ｎｍ、１．５ｎｍ、２ｎｍ、２．５ｎｍ、３ｎｍ、３．５ｎｍ、４ｎｍ、４．５ｎｍ、５ｎｍ、５．５ｎｍ、６ｎｍ、６．５ｎｍ、７ｎｍ、７．５ｎｍ、８ｎｍ、８．５ｎｍ、９ｎｍ、９．５ｎｍ、１０ｎｍ、１１ｎｍ、１３ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、５０ｎｍおよび１００ｎｍ、あるいは、前記数字のいずれか２つによって制限される範囲、ならびに／あるいは、およそ前記数字のいずれかである。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、校正用マーカーがサンプルに添加される。校正用マーカーは金属酸化物またはナノ粒子が可能である。いくつかの実施形態において、校正用マーカーは金属酸化物ナノ粒子である。金属酸化物の例には、二酸化チタンが含まれる。金属酸化物ナノ粒子の例には、アナターゼ型チタニアが含まれる。二酸化チタンのアナターゼ型チタニア形態はラマンシグナルを６４０ｃｍ−１において示す。校正用マーカーの所望される強度はサンプルにおける校正用マーカーの濃度の関数である。金属酸化物、ナノ粒子および金属酸化物ナノ粒子はまた、サンプル容器材料にドープするか、または取り込むために好適である。
【０１２４】
代謝活性
上記で記載されるように、サンプルにおける代謝活性が、マーカーに由来するシグナルにおける変化によって検出される。いくつかの実施形態において、代謝活性が、マーカーによって伝えられる光における変化によって検出される。そのような変化には、伝えられた光の１つまたは複数の波長の強度における変化が含まれるが、これに限定されない。そのような変化の存在により、サンプルにおける代謝活性が示される。そのような変化の非存在により、サンプルにおける代謝活性の欠如が示される。代謝活性により、サンプルにおける物質（例えば、病原体など）の存在が示される。いくつかの実施形態において、検出された代謝活性は病原体に起因すると考えられる。他の実施形態において、代謝活性は、サンプルにおける病原体以外の構成成分（例えば、細胞など）に起因すると考えられる。いくつかの実施形態において、伝えられた光の強度が、代謝活性が存在するときに増大する。他の実施形態において、伝えられた光の強度が、代謝活性が存在するときに低下する。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、代謝活性は、病原体の代謝のために必要とされる栄養分を捕捉することである。いくつかの実施形態において、栄養分は元素（例えば、鉄など）であり、捕捉することが酵素（例えば、トランスフェリンなど）によって行われる。
【０１２６】
他の実施形態において、代謝活性はフリーラジカルの産生である。いくつかの実施形態において、フリーラジカルは活性酸素種（「ＲＯＳ」）である。他の実施形態において、フリーラジカルは活性窒素種（「ＲＮＳ」）である。いくつかの実施形態において、マーカーはフリーラジカルを除去し、枯渇する。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、代謝活性は抗酸化剤の産生である。結果として、いくつかの実施形態において、代謝活性はマーカーの産生をもたらし、マーカーの濃度が時間とともに増大する。そのうえ、いくつかの抗酸化剤がフリーラジカルスカベンジャーである。したがって、いくつかの実施形態はフリーラジカルスカベンジャーの産生を検出可能な代謝活性として有する。他の実施形態において、代謝活性は１つまたは複数のカロテノイドの産生である。
【０１２８】
代謝活性を検出し、それに基づいて決定を行うための代表的な手順として、いくつかの実施形態では、微生物活性に伴うマーカーの時間微分である「傾き」が測定される。傾きのこの推定値は場合により、それについての信頼区間を含み、いくつかの実施形態において、診断決定が、傾き＋／−信頼区間が「非感染」帯または「感染」帯の範囲内であるときになされる。いくつかの実施形態において、感染帯／非感染帯の位置が、既知レベルの細菌が人為的に接種されている既知サンプルを用いた校正により設定される。いくつかの実施形態において、感染帯／非感染帯の位置が、患者サンプルを用いる臨床研究によって確認される。
【０１２９】
さらなる実施形態では、他のアルゴリズムが、傾きおよび信頼区間に対応する測定基準を推定するために使用される。これらのアルゴリズムには、固有値分解および主成分分析が含まれるが、これらに限定されない。このアルゴリズムに関しては、最初の少数の主成分（例えば、最初の３つ）をシグナルの度合いとして選ぶことができ、すべてのより大きい成分を信頼区間またはノイズの代用度合いとして使用することができる。
【０１３０】
病原体
いくつかの実施形態において、代謝活性の検出は、サンプルにおける異物の存在を示している。これらの異物には、様々な病原体が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、病原体は細菌である。具体的な細菌の限定されない例には、下記の種が含まれる：Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ。いくつかの実施形態において、病原体は真菌またはカビである。具体的な真菌の限定されない例には、下記のものが含まれる：Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ。いくつかの実施形態において、病原体は寄生虫である。そのうえ、いくつかの実施形態において、病原体はウイルスである。いくつかの実施形態において、２つ以上のタイプの病原体が存在する。
【０１３１】
時点
１つの実施形態において、サンプルが照光される時点は特に限定されない。いくつかの実施形態において、そのような時点は、ゼロ〜４週間の間、ゼロ〜３週間の間、ゼロ〜２週間の間、および／または、ゼロ〜１週間の間、ならびに／あるいは、およそ前記数字のいずれかである。他の実施形態において、そのような時点は、ゼロ〜７日の間、ゼロ〜６日の間、ゼロ〜５日の間、ゼロ〜４日の間、ゼロ〜３日の間、ゼロ〜２日の間、および／または、ゼロ〜１日の間、ならびに／あるいは、およそ前記数字のいずれかである。いくつかの実施形態において、そのような時点は、ゼロ〜２４時間の間、ゼロ〜２３時間の間、ゼロ〜２２時間の間、ゼロ〜２１時間の間、ゼロ〜２０時間の間、ゼロ〜１９時間の間、ゼロ〜１８時間の間、ゼロ〜１７時間の間、ゼロ〜１６時間の間、ゼロ〜１５時間の間、ゼロ〜１４時間の間、ゼロ〜１３時間の間、ゼロ〜１２時間の間、ゼロ〜１１時間の間、ゼロ〜１０時間の間、ゼロ〜９時間の間、ゼロ〜８時間の間、ゼロ〜７時間の間、ゼロ〜６時間の間、ゼロ〜５時間の間、ゼロ〜４時間の間、ゼロ〜３時間の間、ゼロ〜２時間の間、および／または、ゼロ〜１時間の間、ならびに／あるいは、およそ前記数字のいずれかである。他の実施形態において、そのような時点は、ゼロ〜１２０分の間、ゼロ〜１１０分の間、ゼロ〜１００分の間、ゼロ〜９０分の間、ゼロ〜８０分の間、ゼロ〜７０分の間、６０分、ゼロ〜５０分の間、ゼロ〜４０分の間、ゼロ〜３０分の間、ゼロ〜２０分の間、ゼロ〜１０分の間、ゼロ〜５分の間、ゼロ〜４分の間、ゼロ〜３分の間、ゼロ〜２分の間、および／または、ゼロ〜１分の間、ならびに／あるいは、およそ前記数字のいずれかである。
【０１３２】
１つの実施形態において、代謝活性を検出するための方法は、４週間未満、３週間未満、２週間未満、１週間未満で、あるいは、前記数字のいずれか２つによって制限される範囲で、ならびに／あるいは、およそ前記数字のいずれかで完了する。いくつかの実施形態において、代謝活性を検出するための方法は、７日未満、６日未満、５日未満、４日未満、３日未満、２日未満、１日未満で、あるいは、前記数字のいずれか２つによって制限される範囲で、ならびに／あるいは、およそ前記数字のいずれかで完了する。他の実施形態において、代謝活性を検出するための方法は、２４時間未満、２３時間未満、２２時間未満、２１時間未満、２０時間未満、１９時間未満、１８時間未満、１７時間未満、１６時間未満、１５時間未満、１４時間未満、１３時間未満、１２時間未満、１１時間未満、１０時間未満、９時間未満、８時間未満、７時間未満、６時間未満、５時間未満、４時間未満、３時間未満、２時間未満、１時間未満で、あるいは、前記数字のいずれか２つによって制限される範囲で、ならびに／あるいは、およそ前記数字のいずれかで完了する。いくつかの実施形態において、代謝活性を検出するための方法は、１２０分未満、１１０分未満、１００分未満、９０分未満、８０分未満、７０分未満、６０分未満、５０分未満、４０分未満、３０分未満、２０分未満、１０分未満、５分未満、４分未満、３分満、２分未満、１分未満で、あるいは、前記数字のいずれか２つによって制限される範囲で、ならびに／あるいは、およそ前記数字のいずれかで完了する。
【０１３３】
１つの実施形態において、サンプルが照光される時点の数は特に限定されない。いくつかの実施形態において、サンプルが照射される時点の数は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１５回、２０回、２５回、３０回、４０回、５０回、６０回、７０回、８０回、９０回、１００回、あるいは、前記数字のいずれか２つによって制限される範囲、ならびに／あるいは、およそ前記数字のいずれかである。他の実施形態において、サンプルが照光される時点の数は、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１５回、少なくとも２０回、少なくとも２５回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも６０回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも９０回、および／または、少なくとも１００回、ならびに／あるいは、およそ前記数字のいずれかである。いくつかの実施形態において、サンプルが照光される時点の数は、２回未満、３回未満、４回未満、５回未満、６回未満、７回未満、８回未満、９回未満、１０回未満、１５回未満、２０回未満、２５回未満、３０回未満、４０回未満、５０回未満、６０回未満、７０回未満、８０回未満、９０回未満、および／または、１００回未満、ならびに／あるいは、およそ前記数字のいずれかである。
【０１３４】
複数の時点が記載の実施形態において利用されるかもしれないことが理解される。そのような場合において、複数の時点には、異なった時点での連続測定および競合的測定が含まれる。
【実施例】
【０１３５】
リコペンマーカーを介した病原体検出
血清サンプルに１０７ｃｆｕ／ｍＬのメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（「ＭＲＳＡ」）を接種した。５３２ｎｍの波長を使用して、ラマン散乱プロフィルを時間の関数として測定した。１５１６ｃｍ−１におけるピークがリコペンに起因すると考えられ、このピークが、０．１分、１０分、１５分および２０分に対応する４つのトレース線によって示されるように、代謝活性な細菌によるリコペンの消費を反映して時間とともに低下したことが認められた（図１４を参照のこと）。図１４には示されていないが、１１５６ｃｍ−１における他のリコペンピークもまた、類似する挙動を示す。
【０１３６】
図１５は、４部の添加ブロスおよび様々な量（病原体非存在、１０１ｃｆｕ／ｍＬ、１０３ｃｆｕ／ｍＬ、１０５ｃｆｕ／ｍＬおよび１０７ｃｆｕ／ｍＬ）の添加Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌を伴う健康な志願者の血清における１５１６ｃｍ−１のリコペンピークの正規化強度対時間プロフィルを例示する。すべての場合において、細菌が添加されているサンプルについては、ピーク高さが時間の間数として低下する。対照的に、コントロールサンプル（細菌が添加されていない場合）の高さは、時間とはほぼ無関係のままである。さらに、添加された細菌の量が増大するにつれ、リコペンピークの強度が、より速い速度で低下する。図１６は、図１５に示されるプロフィルのすべての傾き（すなわち、時間微分の傾き）を添加された病原体の濃度の関数として例示する。同様に示されるのが、コントロールサンプルの傾きを示すバンドである。すべての場合において、バンドの幅および不確かさが推定傾きの９５％信頼区間（９５ＣＩ）に対応する。
【０１３７】
抗菌剤感受性および／または抗菌剤感受性を介した病原体特定
図１７および図１８は、マーカーが、最小発育阻止濃度ＭＩＣを推定するために使用され得る方法を例示する。図１７は、（リコペンに起因すると考えられている）１５１６ｃｍ−１におけるラマンピーク高さをいくつかのサンプルについて時間の関数として例示する。サンプルには、凡例に示されるように、Ｓ．ａｕｒｅｕｓが１０５ｃｆｕ／ｍＬの濃度に人為的に接種されている血清サンプル、および、様々な濃度のバンコマイシン（１μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬおよび２０μｇ／ｍＬ）もまた含有するさらなるサンプルが含まれる。図に示されるように、ピーク強度がすべての場合において低下しており、しかし、ピーク強度が、バンコマイシンが何ら添加されていないサンプルについては最も速く低下しており、傾きが、より多くのバンコマイシンがアッセイに添加されるにつれ次第に低下している。
【０１３８】
図１８では、図１７におけるトレース線のすべての傾きが添加バンコマイシンの濃度の関数としてプロットされる。水平の破線は、バンコマイシンが何ら添加されていないサンプルの傾きに対応し、３つのデータ点が、１μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬおよび２０μｇ／ｍＬのバンコマイシン濃度に対応する。黒実線は３つのデータ点の対数適合線であり、ＭＩＣが、黒実線が破線と交差する点に対応する。この特定の例において、推定ＭＩＣが０．５４μｇ／ｍＬであり、これは、従来のキルビー・バウアー試験から推定されるＭＩＣ（０．７μｇ／ｍＬ）に非常に近い。
【０１３９】
図１９および図２０は、薬物効力が、２つ以上の生物が同時接種されるサンプルに対して特徴づけられるプロセスを示す。図１９は、（リコペンに起因すると考えられる）１５１６ｃｍ−１におけるピーク高さを時間の関数として示す。この例では、サンプルに、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方が同時接種された。４つのトレース線は、リコペンのピーク高さを、バンコマイシン（２０μｇ／ｍＬ）が添加されているサンプル、セフタジジム（２０μｇ／ｍＬ）が添加されているサンプル、バンコマイシンおよびセフタジジム（ともに２０μｇ／ｍＬで）の両方を有するサンプルについて時間の関数として示す。グラム陰性細菌は一般にバンコマイシンに対して耐性であり、グラム陽性細菌は一般にセフタジジムに対して耐性であるので、本発明者らは、両方の薬物が、孤立して使用されるときには部分的な効力を有すると予想する。対照的に、これら２つの薬物が併用で使用されるとき、その場合には、本発明者らは、最大の効力の有すると予想する。このことは観測結果と一致している。すなわち、リコペンのピーク高さの時間傾きが、バンコマイシンおよびセフタジジムが添加されているサンプルについては最も小さい。図２０には、これらのトレース線の傾きが薬物濃度の関数として示されており、薬物有効性が図１８の場合と同様な様式で示されるようにされている。
【０１４０】
マーカー産生を介した代謝活性の検出
病原体の存在がまた、共鳴により増幅される様々なマーカーの産生として現れ得る。具体的な一例が、ある種の微生物による様々なカロテノイドの産生である。カロテノイドを明所において合成するいくつかの微生物の能力は、細胞をＵＶ光暴露および／または活性酸素種の他の源の有害な影響から保護することを目的とする自然の最も精巧な創造物の１つである。光誘導によるカロテン生成がいくつかの細菌（例えば、マイコバクテリア種など）において記録されている（Ｋｏｌｍａｎｏｖａ  Ａ、Ｈｏｃｈｍａｎｎｏｖａ  Ｊ、Ｍａｌｅｋ  Ｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉの非抗酸株のＵＶ誘導変異体によって合成されるカロテノイド、Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）、１９７０、１５（６）：４２６〜４３０；Ｈｏｕｓｓａｉｎｉ−Ｉｒａｑｕｉ  Ｍ、Ｌａｚｒａｑ  ＭＨ、Ｃｌａｖｅｌ−Ｓｅｒｅｓ  Ｓ、Ｒａｓｔｏｇｉ  Ｎ、Ｄａｖｉｄ  ＨＬ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒｕｍのカロテン生成遺伝子のクローニングおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓにおける発現、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１９９２（Ｊａｎ）、６９（３）：２３９〜２４４）。カロテノイドの蓄積が、酸化的バーストからの生存のために必要であることによって余儀なくされると考えられる。
【０１４１】
図２１は、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）を１０ｃｆｕ／ｍＬの濃度に含有するサンプルにおけるリコペンの産生を示す。この増大が、リコペンに起因すると考えられる１５１６ｃｍ−１のラマンピークの強度において明らかである。添加Ｍ．ｂｏｖｉｓを何ら含有しないコントロールサンプルはリコペンを産生しない。リコペンはまた、病原体の代謝によって消費され得るので、異なる条件により、図２２に示されるようなリコペンの強度における初期の増大、それに続く、その後の低下がもたらされ得る。図２３は、Ｍ．ｆｏｒｔｉｕｔｕｍを含有するサンプルにおける類似するリコペン産生を示す。
【０１４２】
毒素の検出
図２４は、１つの毒素検出実験の結果を示す。ヒト血清（健康な志願者から集められた血液から遠心分離されたもの）を含むコントロールサンプルを、トリプチカーゼソイブロスおよびＨＬ６０ヒト細胞と一緒にした。予想されたように、コントロールサンプルは、ラマン分光法によって測定された場合、リコペンのピーク高さにおける変化を何ら明らかにしなかった。この結果は、このヒト細胞株が正常な代謝を受けているときのこのヒト細胞株による無視できるフリーラジカル産生と一致している。対照的に、４μＭの毒素（リゾキシン）がアッセイに添加されるとき、その場合には、リコペンのピークは最初に著しく増大し、その後、このヒト細胞株の、ストレスを受けた代謝と安定した一定した低下が続く。図２５には、１５１６ｃｍ−１のピークについての正規化された強度がリゾキシン含有サンプルについて時間の関数としてプロットされる。このプロットは、正規化されたシグナルの強度における経時的な低下を明瞭に示す。
【０１４３】
参考文献
別途規定される場合を除き、本明細書中に引用されるすべての参考文献がそれらの全体において参照によって組み込まれる。
【０１４４】
結論
発明が、その具体的な実施形態を参照して記載されているが、発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変化がなされるかもしれないこと、および、様々な均等物が代用されるかもしれないことが、当業者によって理解されなければならない。これには、本明細書中に示される利点および特徴のすべてを提供しない実施形態が含まれる。加えて、多くの改変が、特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセス工程（１つまたは複数）を、記載された実施形態の目的、精神および範囲に対して適合化するために行われるかもしれない。すべてのそのような改変が、本明細書に添付されている請求項の範囲の範囲内であることが意図される。したがって、発明の範囲は、添付された請求項を参照することによってのみ明確にされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年1月20日(2014.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルにおける代謝活性を検出するための方法であって、
サンプルを得ること；
前記サンプルを複数の時点において実質的単色光により照光すること；
前記サンプルにおける代謝活性の化学的マーカーに由来するラマン散乱光を前記複数の時点において測定すること；および
代謝活性を前記複数の時点での前記ラマン散乱光における変化から検出すること
を含む方法。
【請求項２】
前記ラマン散乱光が共鳴増強される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マーカーが抗酸化剤である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記マーカーがフリーラジカルスカベンジャーである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記マーカーがカロテノイドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記マーカーがリコペンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記代謝活性がフリーラジカルの産生である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記代謝活性がカロテノイドの産生である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ラマン散乱光における前記変化が累積的である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
代謝活性の存在により、病原体の存在が示される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
代謝活性の存在により、細菌、真菌、寄生虫またはウイルスの存在が示される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記マーカーの量が前記代謝活性の結果として増大する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記マーカーの量が前記代謝活性の結果として低下する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルが抗病原体物質を含有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルが、前記検出された代謝活性からの病原体分類を可能にするために構成される抗病原体物質を含有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルが、代謝活性の存在からの病原体分類を可能にするために構成される培養ブロスを含有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルが、抗生物質、抗真菌性物質および抗ウイルス性物質からなる群から選択される抗病原体物質を含有し、かつ、前記検出された代謝活性により、前記抗病原体物質の有効性または無効性が示される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルが体液を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルが、血液、脳脊髄液および尿からなる群から選択される体液を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルが培養される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記サンプルが培養細胞株を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記マーカーが前記サンプルにおいて生来的に存在する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記マーカーが照光前の前記サンプルに添加される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記検出することが約６時間未満で完了する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記検出することが約３０分未満で完了する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記サンプルが校正用ラマンマーカーを前記サンプルの中またはサンプル容器の表面に含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記サンプルまたは前記サンプル容器を前記校正用ラマンマーカーの存在または強度について調べることをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記代謝活性により、毒性物質が前記サンプルに存在することが示される、請求項１〜７、９、１３〜１４、および１８〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
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2014520575.tif 000029
2014520575.tif 000030
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