(57)【要約】  本発明は、ヒト血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）を認識し、ＶＥＧＦＲ２受容体とその相互作用を遮断し、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖及びｉｎ  ｖｉｖｏ血管新生促進効果に干渉する組換えヒト抗体を開示する。前記抗体は、ヒトＶＥＧＦ−Ａにおいて以前に報告された任意の他のエピトープと異なるエピトープを同定し、１つの免疫グロブリン軽鎖可変領域と他の３つの重鎖領域を組み合わせることによって得られた。これらの抗体はヒト免疫グロブリン可変領域の突然変異誘発によって得られ、加齢黄斑変性、癌及びその他などの、血管増殖を伴う病的実体の免疫療法に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）配列番号１、配列番号２及び配列番号３の配列により構成される群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及びヌクレオチド配列の配列番号７によってコードされる軽鎖可変領域、又はｉｉ）アミノ酸配列の配列番号４、配列番号５及び配列番号６により構成される群から選択される重鎖可変領域、及びアミノ酸配列の配列番号８を有する軽鎖可変領域を含む組換え抗体。
【請求項２】
アミノ酸残基Ｋ１０１、Ｒ１０３、Ｅ１０５及びＹ２５が抗体−抗原相互作用の基盤であるヒト血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）における機能性エピトープを同定する組換え抗体。
【請求項３】
ｉ）ヌクレオチド配列の配列番号１によってコードされる重鎖可変領域、及びヌクレオチド配列の配列番号７によってコードされる軽鎖可変領域、又はｉｉ）アミノ酸配列の配列番号４からなる重鎖可変領域、及びアミノ酸配列の配列番号８からなる軽鎖可変領域を含む、請求項２に記載の組換え抗体。
【請求項４】
異なるアイソフォームのヒトＶＥＧＦ−Ａのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激効果、及びｉｎ  ｖｉｖｏ血管新生促進効果に干渉する、請求項１〜３に記載の組換え抗体。
【請求項５】
単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）型の抗体断片である、請求項１〜４に記載の組換え抗体。
【請求項６】
ｉ）配列番号９、配列番号１１及び配列番号１３により構成されるヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされ、又はｉｉ）配列番号１０、配列番号１２及び配列番号１４により構成される群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の組換え抗体。
【請求項７】
Ｆａｂ型の抗体断片である、請求項１〜４に記載の組換え抗体。
【請求項８】
ｉ）配列番号１５と配列番号１６、配列番号１９と配列番号２０、及び配列番号２３と配列番号２４により構成される群から選択されるヌクレオチド配列の対によりそれらの２本の鎖に関してコードされ、又はｉｉ）配列番号１７と配列番号１８、配列番号２１と配列番号２２、及び配列番号２５と配列番号２６により構成される群から選択されるアミノ酸配列の対によりそれらの２本の鎖に関して構成される、請求項７に記載の組換え抗体。
【請求項９】
ｓｃＦｖ２−Ｆｃ型であり、ｓｃＦｖ断片がスペーサーにより、そのタンパク質型で別の同一ポリペプチド鎖と共有結合して二量体分子を形成するヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインと連結している、請求項１〜４に記載の組換え抗体。
【請求項１０】
ヌクレオチド配列の配列番号２７、配列番号２９及び配列番号３１により構成される群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされ、又はｉｉ）配列番号２８、配列番号３０及び配列番号３２により構成される群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の組換え抗体。
【請求項１１】
ヒト免疫グロブリンのＦｃ定常ドメインがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４型である、請求項９に記載の組換え抗体。
【請求項１２】
重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列の配列番号１、配列番号２又は配列番号３、及び軽鎖可変領域をコードする配列番号７が、１つは重鎖可変領域、次にヒトＩｇＧ１免疫グロブリンの定常ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３として、もう１つは軽鎖可変領域、次にヒトＣκ又はＣλ定常ドメインとして、２本のポリペプチド鎖をコードする配列中に含まれる、請求項１から４までのいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１３】
ヒト免疫グロブリンの定常ドメインがＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４型である、請求項１２に記載の組換え抗体。
【請求項１４】
請求項１〜４に記載の組換え抗体の同等な変異体である組換え抗体。
【請求項１５】
放射性同位体、化学的作用物質、又は生物的作用物質とさらにコンジュゲートしている、前出請求項のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１６】
組換え細菌又は哺乳動物細胞において産生される、請求項１〜１４に記載の組換え抗体。
【請求項１７】
請求項１〜１４に記載の組換え抗体をコードするベクターであって、組換えＤＮＡ遺伝子操作によって得られ、宿主細胞中に組み込むことができるプラスミド又は配列である、上記ベクター。
【請求項１８】
請求項１〜１４に記載の組換え抗体を含む医薬組成物。
【請求項１９】
徐放可能であることで特徴付けられる、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
悪性腫瘍及びその転移、急性及び慢性炎症過程、自己免疫過程、並びに加齢黄斑変性などの目の疾患などの、血管新生の増大を伴う実体の免疫療法用の医薬品を製造するための、請求項１〜１４に記載の組換え抗体の使用。
【請求項２１】
イメージング技術による悪性腫瘍及びその転移のｉｎ  ｖｉｖｏ診断用の放射性医薬品を製造するための、請求項１〜１４に記載の組換え抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー及び製薬産業の分野、特にヒト血管内皮増殖因子−Ａ（略してＶＥＧＦ−Ａ）を特異的に認識するヒト組換え抗体の開発及び適用に関する（Ｆｅｒｒａｒａ、Ｎ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９：６６９〜６７６頁）。本発明中に含有される異なる型の組換え抗体は、遺伝子操作技術を使用し、１つの同じ免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と他の３つの重鎖可変領域（ＶＨ）を組み合わせて開発された。これらの組換え抗体は、ＶＥＧＦ−Ａにおいて以前に記載されていないエピトープを認識し、ＶＥＧＦ−ＡとそのＶＥＧＦＲ２受容体の相互作用を遮断し、結果として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏでＶＥＧＦ−Ａの刺激効果及び血管新生促進効果に干渉する。これらの特性のため、これらの新たなヒト組換え抗体は、加齢黄斑変性、癌、関節リウマチ及びその他などの、脈管構造の増大を伴う病的実体の免疫療法に利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
既存の血管から新血管の形成の過程（血管新生）は、血管内皮及びその骨髄前駆体に作用する血管新生促進及び抗血管新生因子の平衡状態によって制御される。血管内皮増殖因子は、直接的及び特異的に新血管の形成を誘導する分子のファミリーである（Ｌｅｕｎｇ、Ｄ．ｅｔ  ａｌ．１９８９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１３０６〜１３０９頁）。このファミリーは、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）としても知られる血管透過性因子（略してＶＰＦ）、胎盤増殖因子（略してＰＬＧＦ）、血小板由来増殖因子（略してＰＤＧＦ）Ａ及びＢ、並びにＶＥＧＦ−Ａと構造的及び生化学的に関係があり、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、及びＶＥＧＦ−Ｅと称される他の分子を包含する（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ、Ｂ．ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：２５７６〜２５８１頁；Ｊｏｕｋｏｖ、Ｖ．ｅｔ  ａｌ．１９９６．ＥＭＢＯ  Ｊ  １５：２９０〜２９８頁；Ｙａｍａｄａ、Ｙ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４２：４８３〜４８８頁；Ｏｇａｗａ、Ｓ．ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：３１２７３〜３１２８２頁）。
【０００３】
ＶＥＧＦ−Ａは、２３ｋＤａの２サブユニットによって形成されるホモ二量体糖タンパク質である（Ｆｅｒｒａｒａ、Ｎ．ｅｔ  ａｌ．１９８９．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｕｎ  １６１：８５１〜８５８頁）。１つの同じリボ核酸（ＲＮＡ）の差次的スプライシングに由来する、５つのアイソフォームが存在する。これらは、２つの細胞膜結合アイソフォーム（ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６）及び３つの分泌可溶性因子（ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、及びＶＥＧＦ１６５）を含む。ＶＥＧＦ１６５は、ＶＥＧＦ１８９が優位を占める心臓及び肺以外の、哺乳動物組織中に最も多量に存在する（Ｎｅｕｆｅｌｄ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｃａｎｃ  Ｍｅｔ  Ｒｅｖ  １５：１５３〜１５８頁）。胎盤では、ＶＥＧＦ１２１の発現が高い（Ｓｈｉｂｕｙａ、Ｍ．１９９５．Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７：２８１〜３１６頁）。ＶＥＧＦファミリーの分子は、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ１）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ１）及びＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｔ４）を含むチロシンキナーゼクラスＩＩＩ細胞受容体と結合することによりそれらの機能を果たし効果を発揮する（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ、Ａ．１９９３．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７８：２０７７〜２０８８頁）。
【０００４】
ＶＥＧＦ−Ａは、このファミリーの最も研究され特徴付けられているタンパク質であり、このタンパク質が病状過程と関係がある幾つかの疾患が記載されている（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ、Ｐ．ｙ  Ｊａｉｎ、ＲＫ．２０００．Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：２４９〜２５７頁；Ｋｕｗａｎｏ  Ｍ、ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  ４０：５６５〜５７２頁）。ＶＥＧＦ−Ａの過剰発現は、異なる起源の腫瘍の増殖及び局在、並びにそれらの播種と関係がある（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、Ｊ．ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５９：１５９２〜１５９８頁）。特定の腫瘍症例では、ＶＥＧＦ−Ａの３つの基本アイソフォーム（１２１、１６５及び１８９）を発現する細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでより速く増殖する細胞である（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、Ｊ．２０００．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０：７２８２〜７２９１頁）。
【０００５】
ＶＥＧＦ−Ａは、潰瘍性大腸炎及びクローン病（Ｋａｎａｚａｗａ、Ｓ．ｅｔ  ａｌ．２００１．Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ９６：８２２〜８２８頁）、乾癬（Ｄｅｔｍａｒ、Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８０：１１４１〜１１４６頁）、呼吸窮迫（Ｔｈｉｃｋｅｔｔ、ＤＲ．ｅｔ  ａｌ．２００１．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １６４：１６０１〜１６０５頁）、アテローム性動脈硬化症（Ｃｅｌｌｅｔｔｉ、ＦＬ．ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７：４２５〜４２９頁）、子宮内膜症（ＭｃＬａｒｅｎ、Ｊ．２０００．Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｕｐｄａｔｅ  ６：４５〜５５頁）、喘息（Ｈｏｓｈｉｎｏ、Ｍ．ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０７：２９５〜３０１頁）、関節リウマチ及び骨関節炎（Ｐｕｆｅ、Ｔ．ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ２８：１４８２〜１４８５頁）、甲状腺炎（Ｎａｇｕｒａ、Ｓ．ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ  ３２：１０〜１７頁）、糖尿病性網膜症及び新生児網膜症（Ｍｕｒａｔａ、Ｔ．ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ７４：８１９〜８２５頁；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、ＪＤ．２００１．Ｐａｅｄｉａｔｒ  Ｄｒｕｇｓ  ３：２６３〜２７２頁）、黄斑変性及び緑内障（Ｗｅｌｌｓ、ＪＡ．ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｂｒ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ８０：３６３〜３６６頁）、組織浮腫（Ｋａｎｅｒ、ＲＪ．ｅｔ  ａｌ．２０００．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２：６４０〜６４１頁）、肥満（Ｔｏｎｅｌｌｏ、Ｃ．ｅｔ  ａｌ．１９９９．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４４２：１６７〜１７２頁）、血管腫（Ｗｉｚｉｇｍａｎｎ、Ｓ．ｙ  Ｐｌａｔｅ、ＫＨ．１９９６．Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ  １１：１０４９〜１０６１頁）、炎症性関節症（Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ、ＭＪ．ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１９：１８２〜１８８頁）及び移植片拒絶（Ｖａｓｉｒ、Ｂ．ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７１：９２４〜９３５）などの、慢性炎症過程とも関係している。
【０００６】
多くのこれらの疾患に魅力的な治療手順は、それらの影響を中和することができる分子を使用して、血管形成を変則的に刺激する血管新生促進因子の活性の阻害に基づく。特に癌に関する血管新生阻害に基づく新たな治療戦略の多くは、ＶＥＧＦ−Ａ及び／又はその受容体の遮断に基づく。承認済み又は臨床試験中の製品の中で、本発明者らは（１）ＶＥＧＦ−Ａ又はＫＤＲ受容体を遮断するモノクローナル抗体、（２）ネオバスタット及びプリノマスタットなどのメタロプロテイナーゼ阻害剤、（３）サリドマイド、スラミン、トロポニナＩ、及びＩＦＮ−αなどのＶＥＧＦ阻害剤、（４）ＳＵ５４１６、ＦＴＫ７８７及びＳＵ６６６８などのＶＥＧＦ受容体遮断薬、（５）エンドスタチン及びＣＡ４−Ｐなどの腫瘍内皮アポトーシス誘導剤、及び（６）ＶＥＧＦ又はその受容体の発現を低下させるリボザイム（アンギオザイム）を見出すことができる。
【０００７】
前述の全てから、ＶＥＧＦ−Ａの血管新生促進効果を中和する抗体及び抗体断片が、治療用製品としての適用及び容認の点で最先端にある。医療の実践では、ヒトＶＥＧＦ−Ａを認識しその血管新生促進効果を中和する、アバスチンとして商業的に知られるヒト化モノクローナル抗体ベバシズマブ（Ｆｅｒｒａｒａ、Ｎ．ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｕｎ  ３３３：３２８〜３３５頁；Ｋｉｍ、ＫＪ．ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ７：５３〜６４頁）は、様々な癌の治療用に幾つかの国で承認されている（Ａｌｌｉｓｏｎ、Ｍ．２０１０．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２８（９）：８７９〜８８０頁）。
【０００８】
近年、幾つかの国が、湿潤型加齢黄斑変性の治療用に、ルセンティスとして商業的に知られるラニビズマブ（Ｇａｕｄｒｅａｕｌｔ、Ｊ．ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉ４６：７２６〜７３３頁）の使用を承認している。ラニビズマブは、遺伝子工学を使用してベバシズマブの操作により開発された、Ｆａｂ型の組換え抗体断片である。ラニビズマブの硝子体内注射は局所生成されるＶＥＧＦ−Ａを中和し、この疾患の根底である網膜の深層における新たな血管新生に影響を与える。
【０００９】
衛生当局により既に登録されているベバシズマブ及びラニビズマブの例以外に、ヒトＶＥＧＦを認識し中和する他の抗体及び抗体断片の、幾つかの報告が存在する（Ｍｕｌｌｅｒ、Ｙ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：７１９２〜７１９７頁；Ａｓａｎｏ、Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ１７：１８５〜１９０頁；Ｖｉｔａｌｉｔｉ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：  ４３１１〜４３１４頁；Ｂｒｅｋｋｅｎ、ＲＡ．ｙ  Ｔｈｏｒｐｅ、ＰＥ．２００１．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７４：１７３〜１８１頁；Ｊａｙｓｏｎ、Ｇ．ｅｔ  ａｌ．２００２．ＪＮＣＩ  ９４：１４８４〜１４９３頁；Ｂｒｅｋｋｅｎ、ＲＡ．ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：５１１７〜５１２４頁；Ｆｕｈ、Ｇ．ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：６６２５〜６６３１頁；ＵＳ５７３０９７７；ＷＯ２００８／０５２４８９Ａ１）。
【００１０】
２Ｈ１は、ヒトＶＥＧＦを特異的に認識する、単鎖Ｆｖ型（略してｓｃＦｖ）のヒト抗体断片である（ＷＯ２００８／０５２４８９Ａ１）。２Ｈ１は、ヒト起源ｓｃＦｖ線維状ファージディスプレイライブラリーから得られた。２Ｈ１ｓｃＦｖはヒトＶＥＧＦ−Ａに特異的であるが、この分子に対して低い親和性を示す。これは、それが由来したライブラリーが、異なる供給源（末梢血、脾臓、扁桃、骨髄）及び異なる健常個体由来のヒトリンパ球様細胞から得たナイーブ可変領域で、構築されたことを考慮して説明することができる（Ｒｏｊａｓ  Ｇ、ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｕｎ３３６：１２０７〜１２１３頁）。現況技術で知られているように、ナイーブ可変領域ライブラリー由来のファージディスプレイｓｃＦｖは、それらの特異的抗原に対して中程度及び低度の親和性の抗体を産生することができる。この場合のように（Ｍａｒｋｓ  Ｊ．Ｄ、ｅｔ  ａｌ、１９９１．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７頁）、これは自己抗原の場合にさらに周知のことであり得る。抗体に対する中程度又は低度の親和性は一般に、それらが由来した免疫グロブリン生殖系列配列に関する、可変領域中の少量の突然変異の存在に対応する。低親和性の組換え抗体は、同じ抗原に対してより高い親和性を有する類似分子と比較したとき、免疫化学的適用及びｉｎ  ｖｉｖｏ治療手順において不十分な性能を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
現在、ヒトＶＥＧＦの影響を中和し、過剰な血管新生を発症する実体の治療において使用することができる新たな抗体の開発は、関心の対象であり続けている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ヒトＶＥＧＦ−Ａを特異的に認識する新たなヒト組換え抗体を提供するので、本発明は前述の問題を解決する。
【００１３】
本発明中に記載する様々な組換え抗体は、２Ｈ１ｓｃＦｖ抗体断片由来の類似分子と比較すると、優れた免疫化学的、生物学的、及び治療性能を示す。このような抗体を開発するため、ｓｃＦｖ抗体断片２Ｈ１のＶＬ及びＶＨ可変領域の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）において突然変異を実施した。線維状ファージディスプレイ技術を使用したヒトＶＥＧＦ−Ａのより良い認識のために選択した新たな突然変異可変領域を、遺伝子工学的技術を使用し組み合わせて、望ましく向上した新規の免疫化学的及び生物学的特性を有する新たな抗体結合部位を得た。この作業のため、ｓｃＦｖ抗体断片２Ｈ１をコードする遺伝子の配列の分析を最初に行い、これによって、ＶＬ及びＶＨＣＤＲ３はＶ、Ｄ及び／又はＪヒト原型生殖系列遺伝子領域に関してほとんど変化がなかったことを示した。この発見は、抗原に対する２Ｈ１の低い親和性を説明した。
【００１４】
２Ｈ１ｓｃＦｖ抗体断片のＶＬ（８アミノ酸残基）及びＶＨ（７アミノ酸残基）領域のＣＤＲ３ドメインをコードする遺伝子配列のみを対象とする、特定突然変異誘発戦略を次いで設計した。Ｐａｒｓｉｍｏｎｉｕｓ突然変異誘発技術（略してＰＭ）（Ｂａｌｉｎｔ、Ｒ．ｙ  Ｌａｒｒｉｃｋ  Ｊ．Ｗ．１９９３．Ｇｅｎｅ、１３７：１０９〜１１８頁）を使用して突然変異を誘導した。ＰＭでは、突然変異用の配列の分析を行い、抗体結合部位の特徴を変える可能性がある最小限の変更を、公のデータベースで利用可能な公知の免疫グロブリン配列に関する既存の情報を考慮してコンピュータにより行う。縮重合成オリゴヌクレオチド及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用すると、ＰＭは非常に短い時間で、望ましい遺伝子領域に関する数百万の新たな突然変異をもたらす。
【００１５】
ＰＭは２Ｈ１ｓｃＦｖ抗体断片のＶＬ及びＶＨ領域のＣＤＲ３ドメインに独立に適用し、適切なファージミドベクターにおける新たな可変領域のクローニングを使用して、前述のアミノ酸配列中の結合部位が突然変異している、２つの大きなｓｃＦｖ抗体断片ライブラリーを生成した（約５×１０８個体）（例１）。＃１と称するライブラリーでは、ＣＤＲ３中で突然変異した数百万の新たなＶＨ領域と関係がある、原型２Ｈ１ｓｃＦｖ抗体断片ＶＬ領域が保存されていた。＃２と称するライブラリーでは、ＣＤＲ３中で突然変異した数百万の新たなＶＬ領域と関係がある、原型２Ｈ１ｓｃＦｖ抗体断片ＶＨ領域が保存されていた。
【００１６】
２つのライブラリーを表す新たなｓｃＦｖ抗体断片を提示するファージを、増大させた濃度の可溶性２Ｈ１ｓｃＦｖを同時に使用して、ヒトＶＥＧＦ−Ａに対して選択し、ＶＥＧＦ−Ａに対してより高い親和性を有する新たなｓｃＦｖ抗体断片の単離を助けた（例２）。
【００１７】
２つのライブラリーそれぞれから選択したｓｃＦｖ断片の新たなクローンで始めて、それらのＶＥＧＦ−Ａの相対的認識の実験測定を、ファージでまた提示された２Ｈ１ｓｃＦｖに関してＥＬＩＳＡにより行った（例２）。これらの実験は、どの突然変異ＶＬ及びＶＨ可変領域が、新たな断片に優れた抗原認識特性及び親和性をもたらしたかを示した。
【００１８】
同定した新たな可変領域を配列決定して、新たなＣＤＲ３のヌクレオチド組成を決定した。ライブラリー＃１から選択した最良ｓｃＦｖ抗体断片由来のＶＨ領域の新たなＣＤＲ３ドメインの場合、これら全てのドメインが、それらの間でも、２Ｈ１ｓｃＦｖ抗体断片の原型ＶＨに対しても、異なるアミノ酸配列を有していた（例２、表２）。最良抗原認識性を有するｓｃＦｖ抗体断片を３Ｆ３、３Ｅ３及び４Ｄ８と称し、新たなＶＨ領域を含有する。３Ｆ３ｓｃＦｖは、本発明者らによりＨ６と称されるＶＨを含有する（塩基配列に関して配列番号１及びアミノ酸推定配列に関して配列番号４）。３Ｅ３ｓｃＦｖは、本発明者らによりＨ５と称されるＶＨを含有する（塩基配列に関して配列番号２及びアミノ酸推定配列に関して配列番号５）。４Ｄ８ｓｃＦｖは、本発明者らによりＨ７と称されるＶＨを含有する（塩基配列に関して配列番号３及び推定アミノ酸配列に関して配列番号６）。
【００１９】
ライブラリー＃２から選択した最良ｓｃＦｖ抗体断片由来のＶＬ領域の新たなＣＤＲ３ドメインの場合（例２、表３）、本発明者らは、新たなｓｃＦｖ抗体断片の突然変異は、原型ドメインに関して幾つかの位置に集中していたことを確認した。ヒトＶＥＧＦの最良認識性を有する４つのｓｃＦｖ断片の３つにおいて、８つのＣＤＲ３残基の７つが保存されており、位置５の１残基はある場合から他の場合に変化したアミノ酸であった。この分析の結果は、結合部位と抗原の間の接触が増大する可能性は、この特定位置５に追加的置換を作製することにより、さらに調べることができることを示した。この最良結合群の典型的なＶＬＣＤＲ３を基礎とし、ファージにおいて提示された新たなｓｃＦｖ抗体断片を次いで構築し、この場合第５アミノ酸をコードするＣＤＲ３ヌクレオチドを置換してアミノ酸Ｐ、Ｅ又はＤを生成した。このように生成した新たなＶＬ領域クローンはそれぞれＬ１、Ｌ２、及びＬ３と称した。
【００２０】
これらの置換から、アミノ酸Ｄを含んでいた置換は、他の２つの新たな突然変異体、全ての先例ＶＬ突然変異体、及び当然ながら、原型２Ｈ１ｓｃＦｖに対して、最良抗原認識性を有するファージディスプレイｓｃＦｖ抗体断片を結果として与えた置換であった（例３、表４）。
【００２１】
抗原認識特性を増大し続けるために、本発明者らは次いで、ライブラリー＃１由来の最良として同定したＶＨ領域Ｈ６、Ｈ５及びＨ７と、新たなＬ３ＶＬ領域（塩基に関して配列番号７及び推定アミノ酸配列に関して配列番号８）を組み合わせた。ファージにおいてＬ３Ｈ６、Ｌ３Ｈ５及びＬ３Ｈ７と称されるこれら３つの新たなｓｃＦｖ抗体断片が提示された後、２Ｈ１ｓｃＦｖ抗体断片、並びにライブラリー＃１及び＃２から選択した他のファージディスプレイｓｃＦｖに関して、ＶＥＧＦ−Ａに対する親和性の比較を実施した（例４、表Ｖ）。この試験は、ファージにおいて提示された３つの新たなｓｃＦｖ抗体断片Ｌ３Ｈ６、Ｌ３Ｈ５及びＬ３Ｈ７は、全ての他のｓｃＦｖより優れていることを示した。これら３つの中で、Ｌ３Ｈ６は阻害アッセイにおいてより良いＩＣ５０を示す抗体断片であり、アッセイ中により多量の可溶性２Ｈ１ｓｃＦｖ断片を加えて、ヒトＶＥＧＦとＬ３Ｈ６の平均的結合を阻害することが必要であることを示す。
【００２２】
本発明の異なる実施形態では、可変領域Ｈ６（配列番号１）、Ｈ５（配列番号２）、Ｈ７（配列番号３）及びＬ３（配列番号７）をコードする遺伝子を使用して、異なる型の組換え抗体：（ａ）ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖＬ３Ｈ７と称される可溶性ｓｃＦｖ断片、（ｂ）ＦａｂＬ３Ｈ６、ＦａｂＬ３Ｈ５及びＦａｂＬ３Ｈ７と称される可溶性Ｆａｂ断片、並びに（ｃ）二価抗体型分子ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ７を産生した。組換え抗体断片ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖＬ３Ｈ７を産生するため、ＶＨ領域Ｈ６（配列番号１）、Ｈ５（配列番号２）、及びＨ７（配列番号３）をコードする遺伝子を、ｐＡＣＲ．１ベクターを使用して、ＶＨ−リンカー−ＶＬの順に、リンカーセグメントにより空間を開けてＶＬ領域Ｌ３（配列番号７）と組み合わせた（例５）。ｐＡＣＲ．１ベクターは、細菌周辺質に対する組換えタンパク質の発現用に設計され、分子のＣ末端に、分析目的のタグとして有用なｃ−ｍｙｃペプチドドメイン、次に金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（略してＩＭＡＣ）を使用した精製を容易にするための６ヒスチジンドメインを付加する（Ｐｏｒａｔｈ  Ｊ．１９９２．Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３〜２８１頁）。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（略してＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において約２９ｋＤａの見かけの分子量を有する、抗体断片ｓｃＦｖＬ３Ｈ６（塩基配列に関して配列番号９及びアミノ酸配列に関して配列番号１０）、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５（塩基配列に関して配列番号１１及びアミノ酸配列に関して配列番号１２）、及びｓｃＦｖＬ３Ｈ７（塩基配列に関して配列番号１３及びアミノ酸配列に関して配列番号１４）は形質転換細菌の培養培地から回収することができ、ＩＭＡＣを使用して容易に精製される。
【００２３】
Ｆａｂ組換え抗体断片ＦａｂＬ３Ｈ６、ＦａｂＬ３Ｈ５及びＦａｂＬ３Ｈ７を産生するため、可変領域Ｈ６（配列番号１）、Ｈ５（配列番号２）、Ｈ７（配列番号３）及びＬ３（配列番号７）中に含有される配列をコードする遺伝子を、ｐＦａｂＨｕｍ−１ベクターでクローニングした（例９）。ｐＦａｂＨｕｍ−１プラスミドは、細菌周辺質に対するヒト免疫グロブリンＣＨ１及びＣλ定常領域を有するＦａｂ断片の発現用に構築された、バイシストロン性ベクターである。このベクターは、６ヒスチジン及びｃ−ｍｙｃドメインをクローニング分子のＣ末端に加える。このプラスミドでは、Ｈ６、Ｈ５又はＨ７領域を遺伝的に定常ＣＨ１領域に結合させ、一方Ｌ３は定常Ｃλ領域に結合させ、結果としてＦａｂ抗体断片（アミノ酸配列の配列番号１７及び配列番号１８をコードするヌクレオチド配列の配列番号１５及び配列番号１６を有する）ＦａｂＬ３Ｈ６、（アミノ酸配列の配列番号２１及び配列番号２２をコードするヌクレオチド配列の配列番号１９及び配列番号２０を有する）ＦａｂＬ３Ｈ５、及び（アミノ酸配列の配列番号２５及び配列番号２６をコードするヌクレオチド配列の配列番号２３及び配列番号２４を有する）ＦａｂＬ３Ｈ７をもたらした。
【００２４】
抗体断片ＦａｂＬ３Ｈ６、ＦａｂＬ３Ｈ５及びＦａｂＬ３Ｈ７を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）において発現させ、ＩＭＡＣを使用して形質転換細菌の培養培地からＩＭＡＣによって精製し、非変性条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約５０ｋＤａの見かけの分子量を有する。
【００２５】
二価組換え抗体ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ７は、それぞれの場合１０アミノ酸リンカーをコードする３’配列、次にヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列と結合した、抗体断片ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、Ｌ３Ｈ５及びＬ３Ｈ７の配列を包含する。前述の抗体は、ｐＶＳＪＧ−ＨｕｃＦｃベクターで、前述のｓｃＦｖ断片をコードする遺伝子のＰＣＲ産物のクローニングによって得た（例１０）。ｐＶＳＪＧ−ＨｕｃＦｃベクターは、哺乳動物細胞中での、ヒトＩｇＧ１型免疫グロブリンＦｃと結合した２つの同一ｓｃＦｖを包含する抗体型の分子の発現用に設計されている。分子ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６（ヌクレオチド配列に関して配列番号２７及びアミノ酸配列に関して配列番号２８）、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ５（ヌクレオチド配列に関して配列番号２９及びアミノ酸配列に関して配列番号３０）、及びｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ７（ヌクレオチド配列に関して配列番号３１及びアミノ酸配列に関して配列番号３２）が、対応するプラスミドでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の上清中で生成した。プロテインＡ又はプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製したｓｃＦｖ２−Ｆｃ分子は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて１００ｋＤａと１２０ｋＤａの間の見かけの分子量を示す。
【００２６】
本発明の目的である組換え抗体は、２Ｈ１ｓｃＦｖ抗体断片の原型可変領域由来のものを含めて、ヒトＶＥＧＦ−Ａを認識又は中和する他の抗体及び抗体断片に対して新規である。これは、
（ａ）本発明の目的である組換え抗体が、それらの可変領域ＣＤＲ３中に新規なＤＮＡ配列を有するからである。このため本発明の目的である組換え抗体は、ハイブリドーマ由来の抗体（Ｋｉｍ、ＫＪ．ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ７：５３〜６４頁；Ｍｕｌｌｅｒ、Ｙ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：７１９２〜７１９７頁；Ａｓａｎｏ、Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １７：１８５〜１９０頁；Ｓｃｈａｅｐｐｉ、ＪＭ．ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １２５：３３６〜３４２頁；Ｂｒｅｋｋｅｎ、ＲＡ．ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：５１１７〜５１２４頁；Ｂｒｅｋｋｅｎ、ＲＡ．ａｎｄ  Ｔｈｏｒｐｅ、ＰＥ．２００１．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７４：１７３〜１８１頁）、又は別のウイルスによるヒト細胞の形質転換によって得られた抗体（ＵＳ５７３０９７７）、遺伝子操作による既存の抗体の改変（Ｊａｙｓｏｎ、Ｇ．ｅｔ  ａｌ．２００２．ＪＮＣＩ  ９４：１４８４〜１４９３頁；Ｆｅｒｒａｒａ、Ｎ．ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｕｎ  ３３３：３２８〜３３５頁）、及びヒト抗体断片ライブラリー由来の抗体（Ｖｉｔａｌｉｔｉ、Ａ．ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：４３１１〜４３１４頁；Ｆｕｈ、Ｇ．ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：６６２５〜６６３１頁）などの、他の著者によって報告されたＶＥＧＦ−Ａに対する他の抗体とは異なるものとなる。
【００２７】
２Ｈ１ｓｃＦｖ抗体断片（ＷＯ２００８／０５２４８９Ａ１）のＶＬ及びＶＨ領域に関して、本発明中に記載する抗体はまた異なる。ＶＨ領域Ｈ６（配列番号４）、Ｈ５（配列番号５）及びＨ７（配列番号６）は、２Ｈ１に対して全７個のＣＤＲ３アミノ酸が異なる。ＶＬ領域Ｌ３（配列番号８）は、２Ｈ１に対して８個のＣＤＲ３アミノ酸の３個が異なる。
【００２８】
（ｂ）本発明の目的である組換え抗体が、他のライブラリー（Ｆｕｈ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：６６２５〜６６３１頁）から得たヒトＦａｂ抗体断片のものと異なる、及びベバシズマブのそれとも異なる、ヒトＶＥＧＦ−Ａに対する免疫化学的特異性を有するからである。本発明中に記載する抗体と異なり、ベバシズマブはマウスＶＥＧＦを認識することができない。さらに、ベバシズマブは低減したＶＥＧＦ−Ａを同定し、一方で本発明中に記載する抗体はそれができない。本発明の例６、７及び９では、どのようにして新たな組換え抗体が、２Ｈ１ｓｃＦｖ抗体断片、及び２Ｈ１由来の組換え抗体（ＷＯ２００８／０５２４８９Ａ１）に対して、ヒトＶＥＧＦ−Ａの異なる優れた認識性をさらに有するかを記載する。
【００２９】
（ｃ）抗体断片ｓｃＦｖＬ３Ｈ６及びそれに由来する組換え抗体（ＦａｂＬ３Ｈ６及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ−Ｌ３Ｈ６）は、ヒトＶＥＧＦ−Ａにおいて、ヒトＶＥＧＦ−Ａの影響を中和する他の抗体により同定される他の全てと異なる、機能性エピトープを認識するからである（Ｍｕｌｌｅｒ、Ｙ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９４：７１９２〜７１９７頁；Ｍｕｌｌｅｒ、ＡＹ．ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６：１１５３〜１１６７頁；Ｓｃｈａｅｐｐｉ、ＪＭ．ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １２５：３３６〜３４２頁；Ｂｒｅｋｋｅｎ、ＲＡ．ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：５１１７〜５１２４頁；Ｆｕｈ、Ｇ．ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：６６２５〜６６３１頁；ＷＯ２００５０１２３５９；ＷＯ２００８／０５２４８９Ａ１）。本発明中に記載する新たな組換え抗体ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ＦａｂＬ３Ｈ６及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ−Ｌ３Ｈ６によりヒトＶＥＧＦ−Ａにおいて定義される新たな機能性エピトープは、重要なアミノ酸として、残基Ｋ１０１、Ｒ１０３、Ｅ１０５及びＹ２５を有する（例１１）。これらのアミノ酸が置換される場合、本発明中に記載する抗体の認識は激しく影響を受ける。
【００３０】
本発明中に記載する新たな組換え抗体は、可溶性ヒトＶＥＧＦ−Ａ、固体表面に吸着したヒトＶＥＧＦ−Ａ、又はこの因子を生成するヒト細胞と結合した若しくはその近辺のヒトＶＥＧＦ−Ａと結合することができ、特に後者では、ヌード（無胸腺）マウスで増殖するヒト腫瘍中に存在する細胞である。
【００３１】
本発明中に記載する新たな組換え抗体は、ヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォーム１２１及び１６５、同定済みマウスＶＥＧＦを特異的に認識し、ＶＥＧＦＲ１受容体ではなく、ＶＥＧＦＲ２受容体とＶＥＧＦ−Ａの相互作用を遮断する。後者２つの特性によって、本発明中に記載する新たな組換え抗体と、ベバシズマブ及びラニビズマブを区別する。
【００３２】
本発明中に記載する新たな組換え抗体は、例８中に示すように、２Ｈ１ｓｃＦｖ抗体断片由来の組換え抗体より、ヒトＶＥＧＦ−Ａに対して高い親和性を有する。結果として、これらの新たな抗体は、（ａ）ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ２の結合の遮断（例７）、（ｂ）ヒトＶＥＧＦ−Ａの刺激下での、培養中内皮細胞の増殖の阻害（例１２）、（ｃ）ＶＥＧＦを含有するマトリゲルペレットによって誘導されるマウスにおける皮下血管新生の阻害（例１３）、及びヌードマウスに移植したヒト腫瘍の増殖の阻害（例１４）を測定する試験において、ｓｃＦｖ２Ｈ１及び２Ｈ１由来の抗体に対して優れた性能を有する。
【００３３】
本発明中で利用する専門用語の定義
抗原結合部位
この用語は、抗原（又はその一部分）と特異的に相互作用する抗体の一部分を記載する。抗体結合部位は主に、２つの抗体可変領域、軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）可変領域によって形成される。抗体結合部位は、可変領域の非共有結合性相互作用によって形成される。抗体結合部位は、特異的抗原結合性に干渉しないペプチドと２つの可変領域の連結によって、人為的に安定化させることが可能である。これはｓｃＦｖ型の断片の場合である。本来、抗体結合部位は可変領域の非共有結合性相互作用によって構築され、ＣＨ１及びＣＬ（κ又はλ）定常ドメインの非共有結合性相互作用、及びＣＬ中に存在するシステインと抗体重鎖のヒンジ領域中に位置する別のシステインの間で確立したジスルフィド結合によって補強される。完全天然抗体は、２つ以上の同一抗原結合部位を有する。
【００３４】
組換え抗体
この用語は、１つ又は複数の抗原結合部位により抗原を特異的に認識する、組換えＤＮＡ技術又は人為的遺伝子合成によって合成型で完全又は部分的に生成される免疫グロブリン又はその一部分を記載する（Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ、Ｊ．ｙ  Ｌａｒｒｉｃｋ．Ｊ．Ｗ．２０００．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２９：１２８〜１３６頁）。組換え抗体の例は、その中で遺伝子操作を使用して、一種から得た可変領域遺伝子（又はその一部分）と別種の免疫グロブリン定常領域を結合させた、いわゆるキメラ及びヒト化抗体である。組換え抗体の中で、本発明者らは、遺伝子操作によって生成する、１つ又は複数の抗原結合部位を包含する抗体断片も見出すことができる。組換え抗体断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１免疫グロブリンドメインを含むＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨからなるＦｖ断片、（ｉｖ）所与の抗体のＶＨ及びＶＬドメインを異なる順序（ＶＨ−ＶＬ又はＶＬ−ＶＨ）で、２つの可変領域の結合を可能にするペプチドリンカーと組み合わせて、抗原結合部位を形成するｓｃＦｖ断片（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．１９８８．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６頁；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８８．ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３頁）、（ｖ）ｓｃＦｖと同様の形式で、ただし１つの同一分子のＶＨ及びＶＬドメインを結合部位に構築できない短鎖ペプチドリンカーを用いて構築される多価又は多重特異性断片である「ダイアボディ」、後者は２つ以上のｓｃＦｖの結合によって作製され、それによって多価性を与えなければならない（ＷＯ９４／１３８０４；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．１９９３．ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８頁）、（ｖｉ）ｄＡｂ（Ｗａｒｄ  ＳＥ  ｅｔ  ａｌ．１９８９．Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６頁）、単離ＣＤＲ、Ｆ（ａｂ’）２断片、ナノボディ、及び二重特異性ｓｃＦｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ  ｙ  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．１９９３．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：４４６〜４４９頁；ｄｅ  Ｈａａｒｄ、Ｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．３１：５〜３１頁）などの他の断片である。ｓｃＦｖ及びＦａｂなどの幾つかの型の断片は、抗体ライブラリーから得ることができ、この場合、一種の可変領域の大きな合成又は天然遺伝子レパートリーを、ランダムに組み合わせて可変領域の特定の結合を生成し、次いでそれらは線維状ファージの表面に抗体断片として提示される。
【００３５】
さらに考えられる組換え抗体は、抗体断片を抗体定常領域に構築する遺伝子操作によって生じる、「抗体型」分子である。例えば、免疫グロブリンＦｃのヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３及び時折ＣＨ４ドメインにより形成される領域にｓｃＦｖを接合させることによって、（本明細書ではｓｃＦｖ２−Ｆｃと称する）二価「抗体型」分子を構築することができる。その構築に関与する部分、及びグリコシル化の存在に応じて、前記分子は免疫グロブリンＦｃと関係がある全てのエフェクター機能を示すことができる。適切な宿主中での発現後、ｓｃＦｖ２−Ｆｃ分子は、２つの同一ｓｃＦｖによって表される２つの結合部位を有する。
【００３６】
最後に、組換え抗体は、１つの供給源（即ちｓｃＦｖ又はＦａｂ）から得た軽鎖及び重鎖の可変領域を、ヒト免疫グロブリンの定常領域、例えば重鎖可変領域に関してＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３及び時折ＣＨ４、及び軽鎖可変領域に関してＣκ又はＣλに構築する分子でもある。
【００３７】
抗体の同等な変異体
抗体の同等な変異体は、抗原を特異的に認識し、それ、及びその生物学的特性に対して影響を与える能力を保持する、抗体可変領域の正確な配列の結合及び操作に由来するポリペプチド分子である。これらのポリペプチド分子は、その中でＶＬドメインがリンカー及びＶＨｓｃＦｖドメインの前に位置する、又は現況技術で知られている他のリンカーセグメントが利用される、又はＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆａｃｂ、二量体、三量体又は四量体ｓｃＦｖ断片として生成されるような、他の組換え抗体断片の型をとることができる（Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ．１９９１．Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３〜２９９頁；ＷＯ９４／１３８０４；ｄｅ  Ｈａａｒｄ、Ｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．３１：５〜３１頁）。また、免疫グロブリン由来配列の付加によって多価分子が生成するとき（Ｂｅｓｔａｇｎｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：１０６８６〜１０６９２頁）。その可変領域の正確な配列が二重抗体、又は完全サイズの抗体の型に含有され、ヒト免疫グロブリン又は多種由来の定常ドメインと結合するとき、抗体の同等な変異体がまた生成される。全てのこれらの遺伝子工学的操作は、当技術分野の当業者には知られている。
【００３８】
抗体の同等な変異体、その中で可変領域のＣＤＲ配列を外来免疫グロブリンフレームワーク中に人為的に置く、いわゆるＣＤＲ移植によって生成する分子又は変異体も考えられ、この操作が原型抗原を認識し生物学的及び生化学的影響を誘発する能力に影響を与えることはない。
【００３９】
抗体又はその変異体の特異性
抗体又はその断片が、その特異的結合対（抗原）と異なる他の分子と有意に結合しない状況を指す。この用語は、抗原結合部位が幾つかの関連又は無関連抗原中に現れる特定エピトープに特異的である場合にも適用可能であり、この場合抗体結合部位は、前述のエピトープを有する幾つかの抗原を同定することができる。
【００４０】
エピトープ。機能性エピトープ
抗原が大きい場合、抗体はエピトープと称される抗原の特定部分に専ら結合することができる。抗原がタンパク質である場合、抗体結合部位によって認識されるエピトープは直鎖状アミノ酸配列により形成されてよく、又は高次構造的、即ち抗体結合部位と相互作用する抗原中のアミノ酸がタンパク質の三次構造において構造上近似していてよいが、その一次構造は必ずしも配列状ではない。タンパク質の場合、所与のエピトープは本来不連続であり、非共有結合により抗体のアミノ酸と相互作用する一群の特異的アミノ酸によって画定する。機能性エピトープは、抗原中の特異的アミノ酸の置換により実験によって決定されるエピトープであり、抗体認識の消失に対する影響（又はその変異体のそれ）は免疫化学的方法によって評価する。
【００４１】
本発明中に記載する新たな抗体は、レーザー光凝固により目の損傷を引き起こす非ヒト霊長類実験モデルにおいて、脈絡膜血管新生を予防するのに有用である（例１６）。
【００４２】
ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ２受容体の間の相互作用を遮断するので、本発明中に記載する新たな抗体は、活性化内皮細胞及びそれらの骨髄前駆体が増殖する能力、並びに異なる疾患において病理学的に形成される新たな血管の生理的安定性の維持に影響を与える。この遮断は、ヒトＶＥＧＦに関して記載する他の生物学的機能、例えば免疫応答の負の制御剤としてのその役割にも影響を与え得る（Ｃｈｏｕａｉｂ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １８：４９３〜４９７頁）。
【００４３】
異常又は過剰な血管新生と共に進行する疾患の新規な治療手順の開発に関して、本発明中に記載する新たな組換え抗体が有用である後者の疾患、その中で本発明者らは以下のものを見出すことができる：
（ａ）癌、原発性固形腫瘍及びその転移を意味する。これらの治療が見込まれる疾患には、類表皮腫瘍、扁平頭頸部腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺癌、乳房腫瘍、肺小細胞及び非小細胞癌、膵臓腫瘍、甲状腺癌、卵巣癌、肝臓腫瘍、カポジ肉腫、中枢神経系新生物（神経芽細胞腫、血管芽細胞腫、髄膜腫、及び脳転移）、メラノーマ、腎臓及び胃腸癌、横紋筋肉腫、神経膠芽細胞腫及び平滑筋肉腫があるが、これらだけには限られない。
【００４４】
本発明中に記載する組換え抗体ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ７は、ヌードマウスに移植したヒト腫瘍の増殖に対する影響を示した（例１４）。本発明中に記載する組換え抗体は、ヒトＶＥＧＦ−Ａの新規なエピトープ認識を有するので、これらは、ヒトＶＥＧＦ−ＡとそのＶＥＧＦＲ２受容体の結合に干渉するその方法が、他の抗体及び抗血管新生分子と異なり、これが異なるｉｎ  ｖｉｖｏ治療効果をもたらす可能性がある。同じ抗原に対して産生されるが、異なるエピトープを認識するか又は異なる親和性を有する抗体を用いて、癌を有するヒトにおける付帯的影響の低減を含めて、異なるｉｎ  ｖｉｖｏ治療効果をもたらすことができることは、十分文書化されている（Ａｌｌａｎ  Ｄ．Ｇ．Ｐ．２００５．Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １０：７６０〜７６１頁；Ｂｏｌａｎｄ、Ｗ．Ｋ  ｙ  Ｂｅｂｂ、Ｇ．２００９．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．９（９）：１〜８頁）。
【００４５】
（ｂ）湿潤型加齢黄斑変性、血管新生緑内障、並びに糖尿病性網膜症及び新生児網膜症などの目の疾患。本発明中に記載するｓｃＦｖＬ３Ｈ６及びｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６分子は、非ヒト霊長類実験モデルにおけるレーザー熱傷によって誘導される、脈絡膜血管新生に対する予防及び治療効果を示し（例１６）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）（Ｇａｕｄｒｅａｕｌｔ、Ｊ．ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉ  ４６：７２６〜７３３頁；Ｃｏｓｔａ、ＲＡ  ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉ  ４７：４５６９〜４５７８頁）、及び同様の病的基礎を共有する他の目の疾患の治療に関する、この抗体の有用性を示した。
（ｃ）喘息、呼吸窮迫、子宮内膜症、並びにアテローム性動脈硬化症及び組織浮腫のような慢性及び急性炎症過程。
（ｄ）肝炎及びカポジ肉腫のような感染性疾患。
（ｅ）糖尿病、乾癬、関節リウマチ及び甲状腺炎のような自己免疫疾患。
（ｆ）臓器移植片拒絶、血管腫、及び血管線維腫などの、他の幾つかの疾患及び状態。
【００４６】
本発明中に記載する組換え抗体は、ヒトＶＥＧＦ−Ａとのその結合と異なる機能特性を原型分子に与え得る、酵素又はその断片、生物反応修飾物質（ＢＲＭ）、毒素若しくは薬剤、又は放射性同位体に、結合又はコンジュゲートさせることが可能である。本発明中に記載するｓｃＦｖＬ３Ｈ６分子を放射標識して、ヒト腫瘍を有する無胸腺ヌードマウスに注射した（例１５）。分子は腫瘍内に留まり、注射後３日でさえ解剖学的領域内に存在し続けることが実証された。このように、他の治療作用物質に結合した本発明中に記載する組換え抗体は、医薬品又は医薬組成物としてのそれらの投与を包含する治療法の基礎となり得る。治療用放射性核種、毒素、薬剤又はＢＲＭと化学的又は遺伝的に結合した抗体を、腫瘍及びそのすぐ近辺であってよい異常なヒトＶＥＧＦ−Ａ濃度を有する解剖学的領域と結合した要素の治療効果を標的化することができ、治療効果を発揮することができる。投与するための量、頻度及び治療間隔は、疾患の性質及び重症度に依存し、これらの決定は、当技術分野で既に知られていることに基礎を置く専門家及び医者の責任である。
【００４７】
本発明の別の態様は、血管新生を阻害することができそれと関連する病状の治療に使用することができる医薬組成物を生成するための、記載する組換え抗体の使用である。このような治療は、有効量の記載する分子を人間に投与することを包含する。
【００４８】
本発明中に記載する組換え抗体を用いて生成する組成物は、個別又は他の治療剤と組み合わせて投与することができ、これは同時又は逐次的であり、これらはいずれも治療する疾患に依存する。医薬組成物は、活性成分以外に、薬学的に許容される賦形剤、バッファー、安定化剤又は担体、及び当業者によく知られている他の物質を包含する。これらの物質は毒性ではなく、活性成分の有効性に干渉せず、それらの性質は投与経路に依存し、これは経口、粘膜、又は非経口、例えば静脈内注射によるものである。特定の実施形態では、本発明中の組成物は、本発明の組換え抗体、及び組成物中の他の活性成分を徐放するための組成物である。
【００４９】
本発明中に記載する組換え抗体、又はその同等な変異体は、コード核酸の発現によって産生される。結果として、記載する組換え抗体のいずれかをコードする核酸配列、並びに前記核酸の発現に関する手順も本発明の一部である。好ましい実施形態では、核酸は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３（それぞれｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖＬ３Ｈ７）、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４（ＦａｂＬ３Ｈ６、ＦａｂＬ３Ｈ５及びＦａｂＬ３Ｈ７、それぞれ個別鎖）、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１（それぞれｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ７）で例示される塩基配列を、独占的にではなく優先的にコードする。
【００５０】
本発明中に記載する分子、又はその同等な変異体の組換え発現用に、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列を含めた必要な制御配列、マーカー遺伝子及び他の考えられる関連物質を含有する、適切なベクターを構築又は選択することができる。ベクターはプラスミドであってよい。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】大腸菌周辺質及び培養上清における可溶性ｓｃＦｖ断片の生成に使用したｐＡＣＲ．１プラスミドの概略図である。このベクターは、ＬａｃＺプロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、及びｐｅｌＢシグナルペプチド（ＳＰ）を有する。
【図２】図２ＡはプラスミドｐＡＣＲ．１ｓｃＦｖＬ３Ｈ６で形質転換した大腸菌ＢＬ−２１細胞の上清、β−メルカプトエタノールを含むローディングバッファー中で調製したサンプルから開始した、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、及びＩＭＡＣを使用したｓｃＦｖＬ３Ｈ６抗体断片の精製の結果の図である。レーン１：分子量マーカー。レーン２：約２９ｋＤａで断片に相当するバンドを示す、２５０ｍＭイミダゾールを用いた溶出。図２Ｂは抗ｃ−ｍｙｃ抗体９Ｅ１０を使用して発色させた、電気泳動のレプリカのウエスタンブロットの図である。
【図３】図３Ａは固相に吸着したヒトＶＧＦ−Ａへの可溶型受容体ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ−Ｆｃ）及びＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ−１−Ｆｃ）のアクセスを遮断する、異なる濃度の抗体断片ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖＬ３Ｈ７の能力を評価するための、競合ＥＬＩＳＡの図である。結合した可溶性受容体の検出は、ＨＲＰＯとコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して行った。ＫＤＲ−Ｆｃの遮断の図である。ｓｃＦｖ２Ｈ１断片は参照として使用し、抗ＨＢｓＡｇ無関連ｓｃＦｖは陰性対照として使用した。図３Ｂは固相に吸着したヒトＶＧＦ−Ａへの可溶型受容体ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ−Ｆｃ）及びＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ−１−Ｆｃ）のアクセスを遮断する、異なる濃度の抗体断片ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖＬ３Ｈ７の能力を評価するための、競合ＥＬＩＳＡの図である。結合した可溶性受容体の検出は、ＨＲＰＯとコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して行った。ＦＬＴ−１−Ｆｃの遮断の図である。抗ＨＢｓＡｇ無関連ｓｃＦｖは陰性対照として使用し、Ｆａｂ断片ルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ）は阻害対照として使用した。
【図４】大腸菌周辺質及び培養上清における可溶性Ｆａｂ断片の生成に使用したプラスミドｐＦａｂＨｕｍ−１の概略図である。このベクターは、定常ヒト免疫グロブリンドメインＣＨ１及びＣλのいずれかと一緒に、各発現カセット中にＬａｃＺプロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、並びにｐｅｌＢ及びｐ３Ｍ１３シグナルペプチド（ＳＰ）を有する。
【図５】図５ＡはプラスミドｐＦａｂＨｕｍ−１ＦａｂｓｃＦｖＬ３Ｈ６で形質転換した大腸菌ＢＬ−２１細胞の上清、β−メルカプトエタノールを含むローディングバッファー中で調製したサンプルから開始した、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、及びＩＭＡＣを使用したＦａｂＬ３Ｈ６抗体断片の精製の結果の図である。レーン１：分子量マーカー。レーン２：Ｆａｂの２本の鎖は約２８〜３０ＫＤａで目に見える。レーン３：抗ｃ−ｍｙｃ抗体９Ｅ１０を使用して発色させた、電気泳動のレプリカのウエスタンブロット。ｃ−ｍｙｃドメインを含有するＦａｂの重鎖のみを認識する。図５Ｂはβ−メルカプトエタノールを含まないローディングバッファー中で調製した（非還元）サンプルの図である。レーン１：Ｆａｂバンドは約５０ｋＤａで明らかである。レーン２：抗ｃ−ｍｙｃ抗体９Ｅ１０を使用して発色させた、電気泳動のレプリカのウエスタンブロット。
【図６】図６ＡはＡｆｌＩＩとＸｂａ制限部位の間のｓｃＦｖ断片遺伝子のクローニングによる「抗体様」二価分子の生成に使用した、プラスミドｐＶＳＪＧ−ＨｕｃＦｃの概略図である。図６ＢはｓｃＦｖ遺伝子をベクターでクローニングした後に、このプラスミドを用いたトランスフェクション後に哺乳動物細胞により生成された分子型の概略図である。
【図７】ＰｙＭｏｌプログラムを使用した、ヒトＶＥＧＦ−Ａの溶媒露出（表面）残基の概略図である。２本のホモ二量体鎖は白及びライトグレーで表す。白色の鎖では、本発明中に記載する組換え抗体によって認識されるエピトープと関連がある重要なアミノ酸Ｋ１０１、Ｒ１０３、Ｅ１０５及びＹ２５はダークグレーで強調している。これらが優れた溶媒露出性を示す分子の領域中の「クラスター」又は高次構造群を画定することを、見ることができる。
【図８】図８Ａはヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨｕＶＥＣ）の増殖に対するヒトＶＥＧＦ−Ａの刺激効果を遮断する、抗体断片ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５、及びｓｃＦｖＬ３Ｈ７の能力を示す図である。抗体断片ｓｃＦｖ２Ｈ１及び二価組換え抗体ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１  ８．２は参照として使用した。グラフは、４０μｇ／ｍＬで抗体断片のサンプルを細胞に加えたときの、ＶＥＧＦ及び無抗体（１００％）の添加に関する増殖相対値を示す。陰性対照は、無関連抗ＨＢｓＡｇｓｃＦｖ及び抗ＥＧＦ受容体ヒト化抗体ニモツズマブであった。阻害の対照として、可溶性ＫＤＲ−Ｆｃを使用した。それぞれのバーは、グループによって作製した３レプリカの平均値とその対応する標準偏差を表す。図８Ｂはヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨｕＶＥＣ）の増殖に対するヒトＶＥＧＦ−Ａの刺激効果を遮断する、二価組換え抗体ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ７の能力を示す図である。抗体断片ｓｃＦｖ２Ｈ１及び二価組換え抗体ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１  ８．２は参照として使用した。グラフは、１０μｇ／ｍＬで二価分子のサンプルを細胞に加えたときの、ＶＥＧＦ及び無抗体（１００％）の添加に関する増殖相対値を示す。陰性対照は、無関連抗ＨＢｓＡｇｓｃＦｖ及び抗ＥＧＦ受容体ヒト化抗体ニモツズマブであった。阻害の対照として、可溶性ＫＤＲ−Ｆｃを使用した。それぞれのバーは、グループによって作製した３レプリカの平均値とその対応する標準偏差を表す。
【図９】Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける、マトリゲル皮下ペレット中に含有されるヒトＶＥＧＦ−Ａの血管新生刺激効果に干渉する、二価組換え抗体ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ７の能力を示す図である。無関連抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体は陰性対照として使用した。阻害の対照として、可溶性ＫＤＲ−Ｆｃを利用した。二価分子ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１  ８．２は参照として使用した。実験の最後に、マトリゲルペレットの含有物をヘモグロビンに関して処理し新たな血管の相対量を評価した。グラフは、ＶＥＧＦ及び無抗体の添加に関する相対ヘモグロビン濃度値（１００％）を表す。それぞれのバーは、それぞれのグループ中に含まれた動物に関する平均値とその対応する標準偏差を表す。
【図１０】ヌードマウスへのヒト腫瘍細胞系Ａ６７３の接種から誘導した皮下腫瘍の増殖に対する、体重１ｋｇ当たり２、５ｍｇ用量での、二価分子ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ５、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ７及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１  ８．２の腹腔内注射の影響の図である。曲線中のドットは、グループ当たり５匹の動物に関して推測した平均腫瘍値である。陰性対照として、無関連ＣＢ−Ｈｅｐ．１モノクローナル抗体を同じ用量で使用した。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００５２】
（例１）
突然変異可変領域を含有するｓｃＦｖ抗体断片ファージディスプレイライブラリーの構築
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による突然変異可変領域の調製
それぞれ２Ｈ１ｓｃＦｖ抗体断片（ＷＯ２００８／０５２４８９Ａ１）のＶＨ及びＶＬドメインのＣＤＲ３に相当する、配列ＬＶＶＲＤＴＥ及びＬＬＳＹＳＧＡＲを、突然変異誘発の標的として使用した。一組の合成オリゴヌクレオチド（表１）を、Ｐａｒｓｉｍｏｎｉｕｓ突然変異誘発（ＰＭ、Ｂａｌｉｎｔ、Ｒ．ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ、Ｊ．Ｗ．１９９３．Ｇｅｎｅ、１３７：１０９〜１１８頁）の原理に従い設計した。
【表１】
2014504498.tif 000002
【００５３】
２ステップのＰＣＲ手順を実施した。第一のＰＣＲステップでは、突然変異ｓｃＦｖＶＬ領域用にプライマーＶＬ−Ｂ及びＶＬ、並びにプライマーＶＨ−Ｂ及びＶＨを使用して突然変異ｓｃＦｖＶＨ領域を生成し増幅した（表１参照）。製造者の説明書に従い、「野生型」２Ｈ１ｓｃＦｖ抗体断片遺伝子（２Ｈ１−Ｆと称される；ＷＯ２００８／０５２４８９Ａ１）を有するファージミドベクターｐＨＧ−１ｍ（Ｒｏｊａｓ、Ｇ．ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２９３：７１〜８３頁）を、いずれの場合も鋳型ＤＮＡとして、及びＫＯＤ耐熱性酵素（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用した。この第一のＰＣＲでは、２０増幅サイクルを実施した。後に反応混合物を、ＱＩＡＱｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してアガロースゲルから独立に精製し、水に溶出させた。ＤＮＡ濃度は、ＤＮＡ標準（ＮＥＢ）を使用して電気泳動により推定した。次いで、第二のＰＣＲステップを、ＶＨ領域増幅用にプライマーＶＨ−Ｂ及びＶＨ−Ｆ、並びにＶＬ領域増幅用にプライマーＶＬ−Ｂ及びＶＬ−Ｆを使用して実施した（表１参照）。いずれの場合も、各第一ＰＣＲ反応からの１０ｎｇの精製ＤＮＡを使用した。同じ耐熱性酵素（Ｎｏｖａｇｅｎ）を製造者の説明書に従い使用し、１５増幅サイクルを実施した。後に反応混合物を、ＱＩＡＱｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してアガロースゲルから独立に精製し、水に溶出させた。ＤＮＡ濃度は、ＤＮＡ標準（ＮＥＢ）を使用して電気泳動により推定した。
【００５４】
（ｂ）ファージミドベクターにおけるＰＣＲ突然変異可変領域のクローニング。
２Ｈ１−Ｆベクターと突然変異ＶＨ領域から精製したＤＮＡ産物のサンプルをＳｆｉＩ及びＡｐａＬＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ及びＮＥＢ）で消化し、ＱＩＡＱｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用しアガロースゲルから精製し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を使用してそれぞれ１：１．５で連結させた。連結産物はＱＩＡＱｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、水に溶出させた。
【００５５】
同様に、２Ｈ１−Ｆベクターと突然変異ＶＬ領域から精製したＤＮＡ産物をＳａｌＩ及びＮｏｔＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ及びＮＥＢ）で消化し、前に記載したように精製し連結させた。
【００５６】
ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’エレクトロコンピテントセル（１×１０９／μｇ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、それぞれに関して５０の異なる反応において各連結で独立に形質転換し、さらに大皿中に２ｘＹＴ／アンピシリンで独立に播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。ライブラリーサイズを計算するための参照プレートは、両ライブラリーが約５×１０８のメンバーを含有していたことを示す。突然変異ＣＤＲ３ＶＨ領域を含有し２Ｈ１ｓｃＦｖ由来の野生型ＶＬを維持するライブラリーはライブラリー＃１と称し、一方で、突然変異ＣＤＲ３ＶＬ領域及び２Ｈ１ｓｃＦｖ由来の野生型ＶＨを有するライブラリーはライブラリー＃２と称した。
【００５７】
（ｃ）突然変異可変領域を含有するライブラリーからのＤＮＡ精製
細菌コロニーをプレートからかき取り、それらの起源に従いプールし、細胞はペレット状にした。高純度ＤＮＡは、製造者の説明書に従い、ＭａｘｉＰｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細胞ペレットから得た。
【００５８】
（例２）
突然変異重鎖及び軽鎖可変領域を有し、ヒトＶＥＧＦに対する親和性がより高い、ファージ上で提示されるｓｃＦｖ抗体断片の選択。
突然変異可変領域ライブラリーのＤＮＡを使用して、ＴＧ１大腸菌細胞を独立にエレクトロポレーション処理し、次いでそれらにヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を感染させてファージを生成した。ファージは精製し、選択実験に使用するまで−２０℃でアリコートに保存した。
【００５９】
選択用に、各ライブラリーの２×１０１２個のファージを、５０μｇ／ｍｌの可溶性ｓｃＦｖ２Ｈ１（ＷＯ２００８／０５２４８９Ａ１）を含むＰＢＳ−４％スキムミルクに希釈し、後者はｓｃＦｖ２Ｈ１より高いヒトＶＥＧＦ−Ａに対する高親和性でファージにおけるｓｃＦｖの単離を助けた。これらの混合物はヒトＧＳＴ−ＶＥＧＦ  ｈｕｍａｎｏ（Ｍｏｒｅｒａ、Ｙ  ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：４５〜５３頁）と共に５時間独立にインキュベートし、Ｍａｘｉｓｏｒｐイムノチューブ（Ｎｕｎｃ）中に固定した。イムノチューブは１６時間の間４℃において１０μｇ／ｍＬのタンパク質、ＰＢＳ中で事前にコーティングし、次いでＰＢＳ−４％スキムミルクでブロッキングした。非結合ファージは、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎを使用した２０回の洗浄、次にさらに２回のＰＢＳ洗浄によって除去した。次いで、結合ファージは１０分間１００ｍｍｏｌ／Ｌトリエチルアミン溶液を用いて溶出させ、０．５ｍｏｌ／Ｌトリス（ｐＨ７．５）を用いてすぐに中和した。溶出ファージは大腸菌ＴＧ１細胞において増殖させ、別の選択サイクル用の出発物質として使用した。この手順は同様の条件下で２回繰り返した。第一及び第二選択サイクルから溶出したファージを使用して、播種したＴＧ１細胞に感染させた。ランダムに選択した代表細菌コロニーを単離し、感染させて、９６ウエルプレートスケールでファージを生成した（Ｍａｒｋｓ、Ｊ．ｅｔ  ａｌ．１９９１、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５８７頁）。ＧＳＴ−ＶＥＧＦと結合する、それらのタンパク質ＩＩＩにおいてｓｃＦｖを提示するこれらのファージクローンの能力を、ＥＬＩＳＡによって評価した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウエルプレート（Ｎｕｎｃ）を１０μｇ／ｍＬのヒトＧＳＴ−ＶＥＧＦでコーティングし、次いで２２℃において１時間の間ＰＢＳ−４％スキムミルクでブロッキングし、次にＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で数回洗浄した。結合ファージは、２２℃において１時間、ペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて検出した。数回洗浄した後、反応物を基質溶液で発色させた。吸光度はマイクロプレートリーダーにおいて４９２ｎｍで測定した。
【００６０】
ＥＬＩＳＡにおいて高い吸光度値をもたらした、各ライブラリーから単離した広範囲のクローンサンプル（１９以上）を独立に処理して、ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列を得た（Ｍａｃｒｏｇｅｎ、Ｋｏｒｅａ）。
【００６１】
表２は、ライブラリー＃１から単離したクローン由来の重鎖（ＶＨ）可変領域ＣＤＲ３の、ヌクレオチド配列から推定したアミノ酸配列を示す。得られた全ての配列（１９）が異なっていた。同じ表中、それぞれのファージに関して、ＩＣ５０値は、ＥＬＩＳＡ中のファージとＶＥＧＦでコーティングした固相の結合を阻害するのに必要な、可溶性ｓｃＦｖ２Ｈ１断片の濃度を記載する。このため、Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウエルプレート（Ｎｕｎｃ）を１０μｇ／ｍＬのＧＳＴ−ＶＥＧＦでコーティングし、次にＰＢＳ−４％スキムミルクでブロッキングした。評価用の各クローンからの同量のファージを可溶性ｓｃＦｖ２Ｈ１の連続希釈液と混合し、２２℃において１時間プレート内でインキュベートした。ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で数回洗浄した後、ＶＥＧＦ結合ファージは、２２℃において１時間、ペルオキシダーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とコンジュゲートした抗Ｍ１３抗体を使用して検出した。数回洗浄した後、反応物を基質溶液で発色させた。吸光度はマイクロプレートリーダーにおいて４９２ｎｍで読み取った。可溶性ｓｃＦｖ２Ｈ１の濃度に対して得た吸光度値をプロットし、ファージディスプレイｓｃＦｖと固定ＶＥＧＦの結合の５０％を遮断するのに必要な濃度（ＩＣ５０）をμｇ／ｍｌで計算した。この値は、抗原に対する異なるクローンの親和性の相対指標である。高いＩＣ５０値は高い親和性に対応する。表２は、比較目的で、原型ファージディスプレイｓｃＦｖ２Ｈ１に関するＩＣ５０値をさらに示す。重鎖中に突然変異ＣＤＲ３配列を有するファージディスプレイｓｃＦｖの新たなクローンの中で、３Ｆ３、３Ｅ３及び４Ｄ８と称するクローンがヒトＶＥＧＦに対する最高の相対親和性を有していた。これらの値は、原型ファージディスプレイｓｃＦｖ２Ｈ１に関して得た値より６倍〜１０倍高い。これらのクローンのＶＨ配列は、Ｈ６（塩基配列に関して配列番号１及び推定アミノ酸配列に関して配列番号４）、Ｈ５（塩基配列に関して配列番号２及び推定アミノ酸配列に関して配列番号５）、及びＨ７（塩基配列に関して配列番号３及び推定アミノ酸配列に関して配列番号６）と称した。
【表２】
2014504498.tif 000003
【００６２】
表３は、ライブラリー＃２から単離したクローン由来の軽鎖可変領域（ＶＬ）の、ＣＤＲ３ヌクレオチド配列から推定したアミノ酸配列を示す。２１クローンの配列分析によって、１３個が異なり、５、３及び３クローンにグループ分けされる３反復パターンがそれぞれ見られたことが明らかになった。表３はＩＣ５０値をさらに示し、ヒトＶＥＧＦでコーティングした固体表面とファージの結合を前に記載したＥＬＩＳＡ試験において阻害するのに必要な、原型可溶性ｓｃＦｖ２Ｈ１の濃度を記載する。この表は、比較目的で、原型ファージディスプレイｓｃＦｖ２Ｈ１に関するＩＣ５０値を示す。最高ＩＣ５０値は１Ｂ１、１Ｈ２、２Ｆ６及び１Ｈ３と称するクローンに対応する。これらの値は、原型ファージディスプレイｓｃＦｖ２Ｈ１に関して得た値より２３倍〜３０倍高い。
【表３】
2014504498.tif 000004
【００６３】
（例３）
軽鎖可変領域ＣＤＲ３の新たな突然変異。
例２の２つの表中に報告した配列及びＩＣ５０値を考慮して、ＶＬＣＤＲ３において抗原に対する相対親和性をさらに増大するための、考えられる新たな突然変異の分析を行った。４つの最良ＩＣ５０クローンの３つにおけるその保存、及びこの配列の第５位における突然変異の集中のため、配列ＲＬＳＹ（ｘ）ＬＡＲが保護されると決定した。この位置における突然変異に関して考えられた新たなアミノ酸は、これら特定残基の特性、及びこれらが他のクローンにおいてこの位置に現れたかどうかを考慮して、Ｐ、Ｄ又はＥであった。
【００６４】
例１ａ中に記載したＰＣＲと類似した２ステップのＰＣＲを使用し、鋳型としてクローン２Ｆ６由来のＤＮＡ及びプライマーとして合成オリゴヌクレオチドを使用して、これらの新たな突然変異体を作製した。
【００６５】
新たな断片のクローニングのため、ファージミドベクター２Ｈ１−Ｆ及び新たなＰＣＲバンドの逐次消化を、例１ｂ中に記載した手順と同様の手順で行った。３つの新たな組換えベクターを独立に形質転換し、それぞれの形質転換を表す５つのコロニーを選択した。ＤＮＡをそれぞれのサンプルから精製し、望ましい突然変異の存在を確認した。高純度ＤＮＡを得て、大腸菌ＴＧ１細胞を独立にエレクトロポレーション処理するために使用し、次いでそれらにＭ１３ヘルパーファージを感染させた。生じたファージは精製し、この同じ実施例で前に記載したように、ＩＣ５０値を決定するために試験した。
【００６６】
この同じ実施例で前に使用したのと同様のＥＬＩＳＡ試験において決定した、ヒトＶＥＧＦでコーティングした固相とファージの結合の５０％を阻害するのに必要な原型可溶性ｓｃＦｖ２Ｈ１の濃度を記載するＩＣ５０値を、それぞれの新たなファージクローンに関して表４中に示す。原型ファージディスプレイｓｃＦｖ２Ｈ１に関する値も比較目的で含める。他の以前に記載したクローンも示す。最高ＩＣ５０値は新たなクローンＬ３に対応し、それは原型ファージディスプレイｓｃＦｖ２Ｈ１の値より７３倍高い。
【表４】
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【００６７】
（例４）
ヒトＶＥＧＦに対する親和性が高い突然変異ＶＨとＶＬ可変領域を組み合わせたｓｃＦｖ抗体断片の構築。
制限消化及びクローニング手順を前に記載したように実施し、クローンＬ３からのＶＬコード遺伝子（同様にＬ３と称する、ヌクレオチド配列に関して配列番号７及び推定アミノ酸配列に関して配列番号８）と、例２中で既に述べた重鎖：Ｈ６（ヌクレオチド配列に関して配列番号１及び推定アミノ酸配列に関して配列番号４）、Ｈ５（ヌクレオチド配列に関して配列番号２及び推定アミノ酸配列に関して配列番号５）、及びＨ７（ヌクレオチド配列に関して配列番号３及び推定アミノ酸配列に関して配列番号６）をコードする遺伝子を組み合わせた、３個の新たな抗体断片を得た。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’エレクトロコンピテントセルを、これら３つの新たな組換えプラスミドで独立に形質転換し、各々からの５つの独立コロニーを採取し、増殖させてＤＮＡを得た。正確な配列を確認した後、これらのプラスミドを使用してＴＧ１大腸菌細胞を独立にエレクトロポレーション処理し、次いでそれらにヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を感染させてファージを生成した。例２中に記載したように、ファージを精製し、これらを使用してＥＬＩＳＡにおいてＩＣ５０を評価した。
【００６８】
表５は、前に記載したように、ＥＬＩＳＡにおけるファージとＶＥＧＦでコーティングした固相の結合を阻害するのに必要な可溶性ｓｃＦｖ２Ｈ１抗体断片の濃度を記載する、それぞれの新たなファージクローンに関するＩＣ５０値を示す。高いＩＣ５０値、及びしたがってより良い抗原認識性は新たなクローンＬ３Ｈ６に対応する。
【表５】
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【００６９】
（例５）
抗体断片ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖＬ３Ｈ７の細菌における発現及び精製。
（ａ）ｐＡＣＲ．１ベクターでの抗体断片ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖＬ３Ｈ７のクローニング
ベクターｐＡＣＲ．１は、大腸菌周辺質に対する抗体断片の発現用に設計したプラスミドである（図１）。ベクターｐＡＣＲ．１は、主なエレメントとして、ＬａｃＺプロモーター、シグナルペプチド、断片コード遺伝子の挿入用のＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ制限部位、ｃ−ｍｙｃペプチドをコードするドメイン、及び６ヒスチジンをコードする配列を有し、後者はＩＭＡＣ精製用である。ディスプレイｓｃＦｖ抗体断片Ｌ３Ｈ６、Ｌ３Ｈ５及びＬ３Ｈ７をコードするファージミドに対応するＤＮＡは、３つの個別ＰＣＲ反応用の鋳型として使用した。これらの手順はＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）酵素を使用し、製造者の説明書に従い実施した。表６中の合成オリゴヌクレオチドはプライマーとして使用した。
【表６】
2014504498.tif 000007
【００７０】
予想サイズ（７００ｂｐ）のバンドを３回の増幅から得て、これらはＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して１％アガロースゲルから精製した。異なるＤＮＡをＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）制限酵素を用いて消化し、連結用に再度精製した。ｐＡＣＲ．１ベクターを同様に消化及び再精製し、消化したバンドは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してベクターに独立に連結させた。連結反応産物を使用して、エレクトロポレーションにより大腸菌コンピテントセル（ＸＬ−１Ｂｌｕｅ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換した。形質転換細胞は固体選択培地に播種し、３７℃で増殖させた。使用した方法は広く知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ｙ  Ｍａｎｉａｔｉｓ．１９８９  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）。
【００７１】
プラスミドＤＮＡを異なる形質転換のコロニーから精製し（ＱＩＡＧＥＮ  ＤＮＡプラスミドＭｉｎｉＰｒｅｐキット）、制限酵素消化により挿入された遺伝子に関して調べ、形質転換当たり数個のコロニーのプラスミドは、ｐＡＣＲ．１ベクタークローニング領域の外側とハイブリダイズするプライマーを使用して自動ＤＮＡ配列決定に施した。コンセンサス配列は、ｓｃＦｖＬ３Ｈ６に関して配列番号９、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５に関して配列番号１１及びｓｃＦｖＬ３Ｈ７に関して配列番号１３であった。これらの配列は、ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ｃｍｙｃ−ヒスチジンをコードする断片として記載する。これらの構築物を表すプラスミドは、ｐＡＣＲ．１−ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｐＡＣＲ．１−ｓｃＦｖＬ３Ｈ５及びｐＡＣＲ．１−ｓｃＦｖＬ３Ｈ７と称した。
【００７２】
（ｂ）大腸菌におけるｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖＬ３Ｈ７の発現並びに精製
ＢＬ２１大腸菌コンピテントセルをプラスミドｐＡＣＲ．１−ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｐＡＣＲ．１−ｓｃＦｖＬ３Ｈ５及びｐＡＣＲ．１−ｓｃＦｖＬ３Ｈ７で形質転換した。
【００７３】
形質転換体は選択固体培地に播種し、３７℃で１６時間増殖させた。それぞれの構築物を表すコロニーは液体培地で増殖させ、６００ｎｍで、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培地に加え、１に等しいＯＤを１２時間で誘導した。細胞は遠心分離し、培養上清はカップリングバッファー（ＮａＨ２ＰＯ４  ５０ｍＭ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７〜８）で透析し、アガロース−ＮＴＡ（ＱＩＡＧＥＮ）に直接独立に施した。イミダゾール１０ｍＭによる洗浄で汚染物質を除去した後、結合したタンパク質を２５０ｍＭのイミダゾールで溶出させた。
【００７４】
得られた分画は１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによって評価し、後者では、これらのタンパク質が有するｃ−ｍｙｃ由来ペプチドを認識する、ペルオキシダーゼとコンジュゲートした９Ｅ１０モノクローナル抗体を使用した。図２は、抗体断片ｓｃＦｖＬ３Ｈ６の場合の、これらの手順の結果を例示する。図２Ａ、レーン２は、２９ｋＤａ付近に移動する抗体断片を含有する高純度の溶出物を示す。図２Ｂは、精製タンパク質が、９Ｅ１０モノクローナル抗体によって免疫化学的に認識されることを示す。
【００７５】
（例６）
ｓｃＦｖ２Ｈ１と比較した、ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖＬ３Ｈ７抗体断片による異なるＶＥＧＦ変異体の免疫化学的認識の、ＥＬＩＳＡによる特徴付け。
Ｎｕｎｃ９６ウエルＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレートを、４℃で１６時間ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの濃度で、ヒトＶＥＧＦ−Ａのアイソフォーム１２１及び１６５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、マウスＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及びＰ６４Ｋ−ＶＥＧＦＫＤＲ−（Ｍｏｒｅｒａ、Ｙ、ｅｔ  ａｌ．２００８．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  １１（４）：３８１〜３９３頁）でコーティングした。Ｐ６４Ｋ−ＶＥＧＦＫＤＲ−は、ＶＥＧＦＲ２受容体（ＫＤＲ）とのその相互作用を低減するために残基８２、８４及び８６を突然変異させた、ヒトＶＥＧＦを表す大腸菌において生成した組換えタンパク質である。ＰＢＳ−スキムミルク４％でプレートをブロッキングした後、ＰＢＳ−スキムミルク４％に希釈したｓｃＦｖＬ３Ｈ６、Ｌ３Ｈ５、Ｌ３Ｈ７及び２Ｈ１抗体断片を１０μｇ／ｍＬの濃度で加え、２２℃で１時間インキュベートした。数回洗浄した後、ペルオキシダーゼとコンジュゲートした９Ｅ１０モノクローナル抗体を加えて１時間おいた。洗浄後、固相と結合した断片を、基質溶液を加えることにより検出した。吸光度はマイクロプレートリーダーにおいて４９２ｎｍで読み取った。無関連抗ＨＢｓＡｇｓｃＦｖは陰性対照として使用した（Ａｙａｌａ、Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：８３２〜８４２頁）。
【００７６】
表７は、抗体断片ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖＬ３Ｈ７はｓｃＦｖ２Ｈ１に対して異なる認識パターンを有し、（陰性対照によって生じた参照として解釈する３ウエルの平均）より高い吸光度値を（４９２ｎｍで）もたらすことを示す。これはヒト抗原に対するより高い親和性を示す。
【表７】
2014504498.tif 000008
【００７７】
（例７）
抗体断片ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５、ｓｃＦｖＬ３Ｈ７及びｓｃＦｖ２Ｈ１によるＶＥＧＦ受容体相互作用の遮断。
ＥＬＩＳＡ競合システムを使用して、本発明者らは、ヒトＶＥＧＦ受容体とＶＥＧＦ組換え受容体ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）とＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ−１）の間の相互作用を遮断する、精製抗体断片ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５、ｓｃＦｖＬ３Ｈ７及びｓｃＦｖ２Ｈ１の能力を評価した。これらのアッセイは、増大させた濃度の断片を加えることによる、固体表面に吸着した可溶性受容体ＫＤＲ−Ｆｃ及びＦＬＴ−１−ＦｃとヒトＶＥＧＦ−Ａの結合の阻害に基づいた。
【００７８】
Ｎｕｎｃ９６ウエルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを、４℃で１６時間ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの濃度で、ヒトＶＥＧＦ−Ａのアイソフォーム１２１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）でコーティングした。プレートはブロッキングし、洗浄し、増大させた濃度（７０μｇ／ｍＬまで）の精製抗体断片ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５、ｓｃＦｖＬ３Ｈ７及びｓｃＦｖ２Ｈ１、又はＰＢＳ−ｌｅｃｈｅ  ａｌ  ４％、並びに０．５μｇ／ｍＬの可溶性受容体ＫＤＲ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ）若しくはＦＬＴ−１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ）と共にウエルをインキュベートした。無関連抗ＨＢｓＡｇｓｃＦｖは陰性対照として使用し（Ａｙａｌａ、Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：８３２〜８４２頁）、Ｆａｂ断片ルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ）は阻害対照として使用した。固相中でヒトＶＥＧＦ−Ａと結合したＫＤＲ−Ｆｃ又はＦＬＴ−１−Ｆｃ可溶性受容体は、ペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて検出した。ＫＤＲ−Ｆｃ（ＶＥＧＦＲ２）の場合、図３Ａ中に示すように、抗体断片ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖＬ３Ｈ７は、明らかな用量依存形式で、固相に結合したヒトＶＥＧＦ−Ａと受容体の結合を遮断する。抗体断片ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖＬ３Ｈ７に関する阻害値は、参照ｓｃＦｖ２Ｈ１抗体断片に関して同じ実験中で観察した値よりはるかに高い。
【００７９】
ＦＬＴ−１−Ｆｃ（ＶＥＧＦＲ１）の場合、図３Ｂ中に示すように、抗体断片ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５、ｓｃＦｖＬ３Ｈ７及びｓｃＦｖ２Ｈ１はヒトＶＥＧＦ−Ａと受容体の結合を遮断せず、一方ラニビズマブは遮断する。
【００８０】
（例８）
ヒトＶＥＧＦに対する抗体断片ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５、ｓｃＦｖＬ３Ｈ７及びｓｃＦｖ２Ｈ１の親和性測定。
ヒトＶＥＧＦに対する抗体断片ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５、ｓｃＦｖＬ３Ｈ７及びｓｃＦｖ２Ｈ１の結合親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ−Ｘ（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して測定した。ＣＭ５センサーチップは、製造者の説明書に従い、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を使用して、ヒトＶＥＧＦの共有結合を介して活性化した。ヒトＶＥＧＦのアイソフォーム１６５（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）は１０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）中に５μｇ／ｍｌまで希釈し、５μｌ／分の流量で注入して約２９０応答単位の結合タンパク質を得た。
【００８１】
動態測定用に、精製断片ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５、ｓｃＦｖＬ３Ｈ７及びｓｃＦｖ２Ｈ１の調製物の連続希釈液を、２５℃において２５μｌ／分の流量で、ＨＢＳバッファー（１０ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳ、１５０ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、３ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、０，００５％のＰ２０界面活性剤、ｐＨ７．４）中に注入した。
【００８２】
動態パラメーター及び平衡解離定数（ＫＤ）を、ＢＩＡ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．２ソフトウェアを使用して計算した。結合データは、包括的にＬａｎｇｍｕｉｒの１：１結合モデルに調整した。得られたＫＤは表８中に示す。
【表８】
2014504498.tif 000009
【００８３】
これらの結果は、抗体断片ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖＬ３Ｈ７は、抗体断片ｓｃＦｖ２Ｈ１より５倍〜２０倍高い親和性でヒトＶＥＧＦ−Ａを認識することを実証する。
【００８４】
（例９）
抗体断片ＦａｂＬ３Ｈ６、ＦａｂＬ３Ｈ５及びＦａｂＬ３Ｈ７の生成及び特徴付け。
（ａ）ｐＦａｂＨｕｍ−１ベクターでのクローニング及び配列決定
図４は、形質転換大腸菌の周辺質及び培養培地における可溶性Ｆａｂ抗体断片の生成に使用した、プラスミドｐＦａｂＨｕｍ−１の概略図である。このベクターは、ＬａｃＺプロモーター、ＲＢＳ、ＳＰ配列、軽鎖可変領域に関するクローニング部位（ＳａｌＩ及びＡｖｒＩＩ）、及びヒト免疫グロブリンＣλドメインをコードする配列、次に別のＲＢＳ、ＳＰ、及び重鎖可変領域に関するクローニング部位（ＡｐａＬＩ及びＢｓｔＥＩＩ）、次にヒトＩｇＧ１Ｆｃヒンジ領域の第一システインを含めるために延長させたヒト免疫グロブリンＣＨ１ドメインをコードする配列を有する。ベクター中に供給される重鎖可変領域−ＣＨ１は、いずれもＣ末端において、ＩＭＡＣ精製用に６ヒスチジンドメイン、及び分析目的でｃ−ｍｙｃペプチドに関して発現させる。
【００８５】
抗体断片ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖＬ３Ｈ７をコードするファージミドＤＮＡを、ＡｐａＬＩ及びＢｓｔＥＩＩ酵素で最初に消化して対応するＶＨ領域を得た。１．５％アガロースにおけるゲルサイズを確認した後、３つのＶＨをｐＦａｂＨｕｍ−１において別々にクローニングし、同じ酵素で事前に消化した。制限酵素解析によりクローニングを確認した後、（ｐＦａｂ−ＲＶＨ６、ｐＦａｂ−ＲＶＨ５及びｐＦａｂ−ＲＶＨ７と称する）中間体プラスミドを複製し、精製し、ＳａｌＩ及びＡｖｒＩＩ酵素を用いた新たな消化を施した。１．５％アガロースにおけるゲルサイズを確認した後、抗体断片ｓｃＦｖＬ３Ｈ６をコードするファージミドをＳａｌＩ及びＡｖｒＩＩ酵素で消化し特有ＶＬ領域Ｌ３を得て、次いでこれを消化プラスミドｐＦａｂ−ＲＶＨ６、ｐＦａｂ−ＲＶＨ５及びｐＦａｂ−ＲＶＨ７においてクローニングした。制限酵素解析によりクローニングを確認した後、（ｐＦａｂＬ３Ｈ６、ｐＦａｂＬ３Ｈ５及びｐＦａｂＬ３Ｈ７と称する）３つの生成したプラスミドを複製し、精製し、自動ＤＮＡ配列決定に施した。抗体断片ＦａｂＬ３Ｈ６、ＦａｂＬ３Ｈ５及びＦａｂＬ３Ｈ７を構成する（重鎖中に６ヒスチジン及びｃ−ｍｙｃドメインがない）２つの成熟タンパク質鎖をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号１５と配列番号１６、配列番号１９と配列番号２０、及び配列番号２３と配列番号２４に相当する。これらのＦａｂ抗体断片の推定アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１７と配列番号１８、配列番号２１と配列番号２２、及び配列番号２５と配列番号２６において記載する。
【００８６】
（ｂ）大腸菌におけるＦａｂＬ３Ｈ６、ＦａｂＬ３Ｈ５及びＦａｂＬ３Ｈ７の発現並びに精製
ＢＬ２１大腸菌コンピテントセルをｐＦａｂＬ３Ｈ６、ｐＦａｂＬ３Ｈ５及びｐＦａｂＬ３Ｈ７で形質転換した。形質転換体は選択固体培地に播種し、３７℃で１６時間増殖させた。それぞれの構築物を表すコロニーは液体培地で増殖させ、６００ｎｍで、ＩＰＴＧを培地に加えることにより、１に等しいＯＤをＦａｂ発現に関して誘導した。細胞は遠心分離し、培養上清はカップリングバッファーで透析し、アガロース−ＮＴＡ（ＱＩＡＧＥＮ）に直接独立に施した。洗浄で汚染物質を除去した後、結合したタンパク質を２５０ｍＭのイミダゾールで溶出させた。
【００８７】
２つの条件を電気泳動試験に利用した。第一例では、β−メルカプトエタノールを含む電気泳動バッファー中でサンプルをインキュベートして還元をもたらした。第二例では、β−メルカプトエタノールは使用しなかった。図５Ａは、（還元サンプル及び発色用抗ｃ−ｍｙｃ９Ｅ１０抗体に関する）精製及びウエスタンブロットの結果を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、約２８〜３０ＫＤａでＦａｂの両鎖を見ることができる（レーン２）。ウエスタンブロットでは、それがｃ−ｍｙｃを含有するため、Ｆａｂの重鎖のみを検出する（レーン３）。図５Ｂ中では、還元していないサンプルを見ることができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、９Ｅ１０コンジュゲートモノクローナル抗体を使用してウエスタンブロットにおいて認識される（レーン２）、約５０ｋＤａを有するＦａｂに相当するバンドを示す（レーン１）。
【００８８】
（ｃ）抗体断片ＦａｂＬ３Ｈ６、ＦａｂＬ３Ｈ５及びＦａｂＬ３Ｈ７に関する、ＥＬＩＳＡにおけるヒトＶＥＧＦの認識の特徴付け
精製抗体断片ＦａｂＬ３Ｈ６、ＦａｂＬ３Ｈ５及びＦａｂＬ３Ｈ７を、参照Ｆａｂ２Ｈ１−３２（ＷＯ２００８／０５２４８９Ａ１）を使用して、ＥＬＩＳＡにおけるヒトＶＥＧＦ−Ａの認識に関して評価した。Ｎｕｎｃ９６ウエルＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレートを、４℃で１６時間ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの濃度で、ヒトＶＥＧＦ−Ａのアイソフォーム１２１及び１６５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、マウスＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及びＰ６４Ｋ−ＶＥＧＦＫＤＲ−（Ｍｏｒｅｒａ、Ｙ、ｅｔ  ａｌ．２００８．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  １１（４）：３８１〜３９３頁）でコーティングした。ＰＢＳ−スキムミルク４％でプレートをブロッキングした後、ＰＢＳ−スキムミルク４％に希釈したＦａｂ抗体断片を１０μｇ／ｍＬの濃度で加え、２２℃で１時間インキュベートした。数回洗浄した後、ペルオキシダーゼとコンジュゲートした９Ｅ１０モノクローナル抗体を加えて１時間おいた。洗浄後、固相と結合した断片を、基質溶液を加えることにより検出した。吸光度はマイクロプレートリーダーにおいて４９２ｎｍで読み取った。抗ヒトＥＧＦ受容体抗体ニモツズマブの酵素による消化から誘導した無関連ＦａｂもｈＲ３と称した（Ｂｏｌａｎｄ、Ｗ．Ｋ  ｙ  Ｂｅｂｂ、Ｇ．２００９．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．９（９）：１〜８頁）。
【００８９】
表９は、抗体断片ＦａｂＬ３Ｈ６、ＦａｂＬ３Ｈ５及びＦａｂＬ３Ｈ７はＦａｂ２Ｈ１−３２のそれと異なる認識パターンを有し、陰性対照によって生じた吸光度値を参照とする（４９２ｎｍ；３ウエルの平均）より高い吸光度値を示し、これらはいずれもヒト抗原に対して良い親和性を示すことを実証する。
【表９】
2014504498.tif 000010
【００９０】
（例１０）
二量体分子ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ７の作製及び認識の特徴付け。
（ａ）抗体様分子ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ７を産生するトランスフェクトーマの作製
抗体様分子ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ７を得るために、鋳型としてプラスミドｐＡＣＲ．１−ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｐＡＣＲ．１−ｓｃＦｖＬ３Ｈ５及びｐＡＣＲ．１−ｓｃＦｖＬ３Ｈ７、並びに表１０中に示す合成オリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲを実施して、これらの抗体断片をコードするＤＮＡ配列を改変し、後のクローニングに適合させた。この手順は、製造者の説明書に従いＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて実施した。
【表１０】
2014504498.tif 000011
【００９１】
ＰＣＲ増幅したＤＮＡ配列はｐＶＳＪＧ−ＨｕｃＦｃベクターにクローニングした。このベクター（図６Ａ）は、ネズミモノクローナル抗体由来の重鎖シグナルペプチド、次にヒトＩｇＧ１免疫グロブリン由来のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインをコードし（スペーサーとして働く）１０アミノ酸のコンセンサス配列により隔てられたｓｃＦｖコード配列をこの順に含有するポリペプチド鎖の、哺乳動物細胞中での発現用に設計した。シグナルペプチドが原因で、このポリペプチド鎖は、ヒンジ領域内の共有ジスルフィド結合の形成及びＣＨ２とＣＨ３ドメインの相補的結合を介して二量体が起こる、小胞体を対象とする。ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインはヒト免疫グロブリンＦｃ領域を形成し、それはそのＮ末端により２つの同一ｓｃＦｖと結合し二価抗体様分子を生成する（図６Ｂ）。
【００９２】
ＰＣＲ増幅した断片はＡｆｌＩＩ及びＸｂａＩ制限酵素で消化し、ｐＶＳＪＧ−ＨｕｃＦｃベクターに独立にクローニングした。自動ＤＮＡ配列決定によってクローン産物の同一性を確認した。生成した３つの成熟タンパク質ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ７をコードするヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１で記載し、一方で推定アミノ酸配列はそれぞれ配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２で記載する。
【００９３】
プラスミドｐＶＳＪＧ−ＨｕｃＦｃＬ３Ｈ６、ｐＶＳＪＧ−ＨｕｃＦｃＬ３Ｈ５及びｐＶＳＪＧ−ＨｕｃＦｃＬ３Ｈ７は、Ｐｕｒｅ  Ｙｉｅｌｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してエンドトキシンを含まない条件下で精製した。ＣＨＯ細胞（ＥＡＣＣカタログ番号８５０５０３０２）は、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してこれらのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトーマは、耐性マーカーとしてＧ４１８を含有する培地中で選択した。Ｇ４１８と共に増殖させたトランスフェクトーマコロニーから得た細胞培養上清は、ＥＬＩＳＡによって評価した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウエルプレート（Ｎｕｎｃ）はヒトＶＥＧＦ１２１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）でコーティングした。ＰＢＳ−２％スキムミルクに希釈した上清をプレートに加え、ｓｃＦｖ２−Ｆｃ抗ＶＥＧＦ分子はペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗ヒトＦｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）で検出した。ＥＬＩＳＡにより検出されたｓｃＦｖ２−Ｆｃ抗ＶＥＧＦ分子の高い分泌レベルを有するトランスフェクトーマ細胞コロニーは、Ｇ４１８を含有する培地中での限界希釈によって繰り返しクローニングし、ＥＬＩＳＡによりその分泌能力を常に試験した。少なくとも２連続クローニング後、３つの安定クローン産生抗体様分子を得て、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ７と称した。
【００９４】
（ｂ）ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ７分子の精製、及びＥＬＩＳＡによるヒトＶＥＧＦとの結合活性の評価
ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ７分子を産生したトランスフェクトーマクローンを、１６２ｃｍ２フラスコ中、０．５％ウシ胎児血清を含有する培地中で培養した。高い細胞密度を得た後、上清を回収し、０．１Ｍのリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０中に１：１希釈し、次いでｓｃＦｖ２−Ｆｃ分子を、プロテインＡセファロースファストフロー４（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用したアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。異なるｓｃＦｖ２−Ｆｃ分子を０．２Ｍのグリシンバッファー、ｐＨ４．０で独立に溶出させ、１Ｍのトリス、ｐＨ１０．０ですぐに中和した。ＰＢＳで透析した後、２８０ｎｍでの吸光度測定によりタンパク質濃度を計算した。純度は１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより推定した。精製分子のサンプルは、非精製上清と比較して、（ａ）中に記載したのと同様にＥＬＩＳＡにより試験し、ヒトＶＥＧＦ−Ａに対する適切な認識活性を示した。
【００９５】
（例１１）
ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖＬ３Ｈ７抗体断片によって認識されるヒトＶＥＧＦにおける機能性エピトープの同定。
ヒトＶＥＧＦ１２１を入手し提示するため、突然変異体を最初に選択し、分子の三次元構造分析（ＰＤＢ：１ＦＬＴ）、他の抗体による認識が報告された領域の位置、及びヒトＶＥＧＦとネズミＶＥＧＦの間の差に基づいて残基を突然変異させた。突然変異させた残基は表１１中に示す。
【表１１】
2014504498.tif 000012
【００９６】
突然変異は、Ｎ−及びＣ−末端コード配列とヒトＶＥＧＦ１２１をハイブリダイズさせる合成オリゴヌクレオチド（表１２）を使用したＰＣＲにより、及び望ましい突然変異を導入した特異的領域において生成した。
【表１２】
2014504498.tif 000013
【００９７】
２ステップのＰＣＲを実施して、鋳型としてヒトＶＥＧＦ１２１、及びＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ酵素（Ｎｏｖａｇｅｎ）を含有するプラスミドｐＶＥＧＦ（Ｏｊａｌｖｏ、Ａ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６、２０８〜２２２頁）を使用し突然変異体を導入した。第一のステップでは、末端と相補的なオリゴヌクレオチド（ＶＥＧＦ−ＦＯＲ又はＶＥＧＦ−ＢＡＣＫ）を使用し、耐熱性ポリメラーゼ酵素の製造者の説明書に従い、１５サイクルの反応中で、突然変異体当たりで対応する（Ｍ−ＢＡＣＫ又はＭ−ＦＯＲ）との反応により対形成させた。第二のＰＣＲでは、ステップ１からの２つの前反応の混合物を、各突然変異体に関する鋳型として使用した。突然変異体（Ｍ−ＢＡＣＫ又はＭ−ＦＯＲ）を導入するために利用したオリゴヌクレオチドは１：１００に希釈し、末端と相補的なオリゴヌクレオチド（ＶＥＧＦ−ＦＯＲ又はＶＥＧＦ−ＢＡＣＫ）と一緒に使用した。ＤＮＡ増幅断片はＱＩＡｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して独立に精製し、次いで４時間ＡｐａＬＩとＮｏｔ−ＩＨＦ（ＮＥＢ）で二重消化した。ＱＩＡｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で反応混合物を精製し水に溶出させた後、消化したＤＮＡ断片は、同じ酵素で事前に消化したｐＨＧ−１ｍベクター（Ｒｏｊａｓ、Ｇ．ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２９３：７１〜８３頁）でクローニングし、１時間ホスファターゼ（ＮＥＢ）で処理し、同じカラムを使用してアガロースゲルから精製した。ｐＨＧ−１ｍベクター中のクローン遺伝子は、タンパク質ＩＩＩ融合体として線維状ファージの表面上に提示される。１：５のベクター：バンド比及びＴ４リガーゼ（ＮＥＢ）を、１６℃で１２時間連結反応において使用した。
【００９８】
ＴＯＰ１０Ｆ１’細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を突然変異体による各連結で独立に形質転換し、アンピシリンを含有する選択ＬＢ培地に播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。５個のコロニーを各突然変異体から選択し、５ｍｌ培養物中で増殖させ、プラスミドＭｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してプラスミドを精製した。ＤＮＡは配列決定し、望ましい突然変異体の存在を確認した。ファージ発現試験に十分な物質を得た。
【００９９】
ＴＧ１大腸菌コンピテントセルを、各突然変異体をコードするファージミドで独立に形質転換した。野生型（ＷＴ）ＶＥＧＦ及び無関連（ＮＲ）タンパク質をコードするファージミドも、この実験における対照として含めた。形質転換細胞はＭ１３Ｋ０７に感染させてファージを生成した。ファージは精製し、これらをＥＬＩＳＡ中で使用して異なる抗ＶＥＧＦ抗体：ベバシズマブ、ウサギポリクローナル抗体（ｐＡｂ）及びｓｃＦｖＬ３Ｈ６抗体断片による互いの認識を評価した。９６ウエルプレートを、４℃において１６時間の間ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬで、これらの抗体でコーティングした。ＰＢＳ−４％スキムミルクでブロッキングした後、ファージ上で提示された突然変異体又は野生型ＶＥＧＦをプレートに加え、１時間の間インキュベートした。プレートはＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で洗浄し、結合ファージは、１時間、ペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて検出した。プレートは再度洗浄し、反応混合物は基質溶液で発色させた。２０分後、反応は１ＭのＨ２ＳＯ４で停止させ、吸光度はマイクロプレートリーダーにおいて４９２ｎｍで測定した。
【０１００】
表１３は、ファージにおいて提示された異なる突然変異体、ＷＴ−ＶＥＧＦ又はＮＲタンパク質に対するそれぞれの抗ＶＥＧＦ抗体に関する、３ウエルからの平均吸光度値で表した免疫反応性を示す。
【表１３】
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【０１０１】
表１３中、突然変異体Ｍ２（Ｒ５６Ｅ）及びＭ１０（Ｒ５６Ａ）はグレーのセルで強調し、これらは試験した３つの抗体による認識の障害を引き起こす。このアミノ酸が、ヒトＶＥＧＦ並びにＰＬＧＦ及びＰＤＧＦなどの他のファミリーのメンバーの構造完全性において、重要な役割を果たすことは知られている（Ｋｅｙｔ、Ｂ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：５６３８〜５６４６頁）。これらの突然変異体は、分子の全体構造の障害に関する実験において、内部対照として使用した。同じ表１３中で、突然変異体：Ｍ１１（Ｋ１０１Ｒ）、Ｍ２２（Ｅ１０３Ａ）、Ｍ２３（Ｒ１０５Ａ）及びＭ２４（Ｙ２５Ａ）に相当するデータを、太字及びイタリックで強調する。これらの突然変異体はｓｃＦｖＬ３Ｈ６抗体断片による認識に顕著に影響を与え、一方、同じ実験で使用した、ウサギで得た抗ＶＥＧＦポリクローナル抗体又はヒト化治療用抗体ベバシズマブによる認識は影響を受けなかった。これらの結果は、本発明中に記載するｓｃＦｖＬ３Ｈ６抗体断片及びそれに由来する他の組換え抗体（ＦａｂＬ３Ｈ６及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ−Ｌ３Ｈ６）によって画定するヒトＶＥＧＦにおける新たな機能性エピトープは、重要なアミノ酸として残基Ｋ１０１、Ｒ１０３、Ｅ１０５及びＹ２５を正確に有することを示す。
【０１０２】
図７は、ＰｙＭｏｌソフトウェアを使用して得た、ヒトＶＥＧＦ−Ａホモ二量体における表面残基の概略図を示す。この図中では、２つのホモ二量体の１つにおけるアミノ酸Ｋ１０１、Ｒ１０３、Ｅ１０５及びＹ２５をダークグレーで強調し、これらは本発明中に記載する新たな組換え抗体による抗原認識に重要である。
【０１０３】
ＰｙＭｏｌソフトウェアを使用して得たヒトＶＥＧＦ−Ａホモ二量体のグラフ図は、アミノ酸Ｋ１０１、Ｒ１０３、Ｅ１０５及びＹ２５が、優れた溶媒露出性を有する分子領域中の高次構造クラスターを画定することを示す。
【０１０４】
（例１２）
ヒトＶＥＧＦで刺激したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨｕＶＥＣ）のモデルにおける、ヒトＶＥＧＦを認識する異なる組換え抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗増殖効果の評価。
分子ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５、ｓｃＦｖＬ３Ｈ７、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ７のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗増殖効果を、ヒトＶＥＧＦで刺激したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨｕＶＥＣ）のモデルにおいて決定した。抗体ｓｃＦｖ２Ｈ１及びｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−８．２（ＷＯ２００８／０５２４８９Ａ１）は参照として使用し、ｓｃＦｖ抗ＨＢｓＡｇ（Ａｙａｌａ、Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１８：８３２〜８４２頁）及びニモツズマブ（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｈａｖａｎａ）は陰性対照として使用した。阻害対照として、可溶性ＫＤＲ−Ｆｃ  ａ  １μｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ）を利用した。
【０１０５】
簡単に言うと、３，０００のＨｕＶＥＣ細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨ）を、１％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地において、１％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）を事前にコーティングした９６ウエル培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）のウエル毎に播種し、７２時間の間５％ＣＯ２において３７℃で増殖させた。わずか１０ｎｇ／ｍＬのヒトＶＥＧＦ−Ａ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；１００％として任意に定義した増殖対照）、又は１０ｎｇ／ｍＬのヒトＶＥＧＦ−Ａ及び４０μｇ／ｍＬのｓｃＦｖ断片、若しくは１０μｇ／ｍＬの二価分子で細胞を刺激した。実験の最後に、０．５％クリスタルバイオレット、２０％メタノール中で細胞を染色した。プレートは水で洗浄し空気中で乾燥させた。染色液はエタノール、０．１Ｍクエン酸ナトリウムの１：１溶液で溶出させ、吸光度はマイクロプレートリーダーにおいて５６２ｎｍで読み取った。基底細胞増殖の吸光度の値を１００％と考えた。試験した分子の各々の影響から誘導した吸光度データは、最大増殖対照に対する百分率として推測した。１００％に対するこれらの増殖値は、ヒトＶＥＧＦで刺激したＨｕＶＥＣ細胞の増殖を阻害する所与の分子の能力を示す。（分子ｓｃＦｖＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖＬ３Ｈ７に関する）図８Ａ、及び８Ｂ（ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ７）中に示すように、本発明の目的である組換え抗体は、利用した用量でＨｕＶＥＣ細胞の増殖を阻害する。それぞれの型の組換え抗体（ｓｃＦｖ又は二価分子）によって生じた阻害は、同量で抗体断片ｓｃＦｖ２Ｈ１又は二価分子ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１  ８．２によって生じた阻害より優れている。一般に二価分子は、細胞受容体へのＶＥＧＦのアクセスを遮断する際により有効であり、結果として、より低い用量でＨｕＶＥＣ細胞の増殖を阻害する。
【０１０６】
（例１３）
マウス皮下マトリゲルペレットモデルにおける、ヒトＶＥＧＦを認識する異なる組換え抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ抗血管新生効果の評価。
二価分子ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ７のｉｎ  ｖｉｖｏ抗血管新生効果を、Ｐａｓｓａｎｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．によって記載された実験モデルにおいて試験した（Ｐａｓｓａｎｉｔｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．６７：５１９〜２８頁）。比較用に、二価抗体型分子ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１  ８．２（ＷＯ２００８／０５２４８９Ａ１）を使用した。このモデルでは、血管新生が、血管新生促進因子の存在下での、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ＣＥＮＰＡＬＡＢ、Ｈａｂａｎａ）への細胞外マトリックスタンパク質の抽出物（マトリゲル、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の皮下接種によって誘導される。動物は１０匹のグループに分け、２００ｎｇのヒトＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、無関連抗体（ＣＢ−Ｈｅｐ．１、抗ＨＢｓＡｇ、Ｈｅｂｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｈａｖａｎａ）、又は阻害対照として１０μｇのＫＤＲ−Ｆｃ（Ｓｉｇｍａ）を含めた１００μｇの試験分子を含有する５００μＬのマトリゲルを腹部領域に皮下注射した。６日後に動物を屠殺し、マトリゲルペレットを抽出し、各々のヘモグロビン含有量を、製造者の説明書に従い、Ｄｒａｂｋｉｎの試薬キット（Ｓｉｇｍａ）を使用したＤｒａｂｋｉｎの方法により決定した。分子ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ７２は、マトリゲルペレットにおいてヒトＶＥＧＦによって誘導される血管新生を有意に阻害し（ｐ＜０．００１）、これはヘモグロビン含有量の低下と相関がある。図９中で見ることができるように、得られた阻害値は、組換え抗体ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１  ８．２によって生じた阻害値より３倍高い。
【０１０７】
（例１４）
Ａ６７３ヒト腫瘍横紋筋肉腫細胞を異種移植したヌードマウスにおける、組換え抗体ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ７のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果の評価。
腫瘍及び幾つかの腫瘍間質細胞により誘導される血管新生は、腫瘍増殖及び播種に必要不可欠である。この血管新生促進効果の主なメディエーターは、これらの細胞要素によって生成されるＶＥＧＦである。このため、抗血管新生物質のアッセイに使用するモデルは、動物における腫瘍増殖の阻害のモデルである。本特許中に記載する新たな抗体はヒトＶＥＧＦを好ましいことに同定するので、ヒト腫瘍細胞を同系無胸腺マウス（ヌードマウス；ｎｕ／ｎｕ）に接種する腫瘍増殖モデルをマウスにおいて実施する。この実験中、本発明者らは、８〜１０週齢の、ＢＡＬＢ／ｃ系統（ＣＥＮＰＡＬＡＢ、Ｈａｖａｎａ）の５群の５ｎｕ／ｎｕ無胸腺マウスを使用した。治療群に、組換え抗体ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ７、参照として組換え分子ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１−８．２（ＷＯ２００８／０５２４８９Ａ１）、及び陰性対照として抗ＨＢｓＡｇＣＢ−Ｈｅｐ．１ネズミモノクローナル抗体（Ｈｅｂｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｈａｂａｎａ）を、いずれも２．５ｍｇ／ｋｇ、ＰＢＳ  ｐＨ７．２中の用量で分配した。マウスには、右背面領域に１．５×１０７個のヒトＡ６７３腫瘍細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５９８）を皮下注射した。この多量の細胞接種原を、使用治療用量と共に利用して、異なる試験抗体の抗腫瘍効果の差をすぐに実証した。腫瘍が２００ｍｍ３の体積に達したとき、マウスを５匹の５群にランダムに分けて、各実験群に関して示すように治療を開始した。投与は３週間の間２日毎に、２００μＬの体積で腹腔内に行った。腫瘍増殖のフォローアップは、デジタルカリパーを使用し最長（長さ）、及び最狭（幅）腫瘍径を測定して行った。腫瘍体積は、腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５２×長さ（ｍｍ）×幅２（ｍｍ）として計算した。観察期間中の腫瘍体積は、一元配置ＡＮＯＶＡ  ｓｔａｄｉｇｒａｐｈ及びボンフェローニ事後検定を使用して比較した。一定治療期間後、動物を屠殺し、腫瘍は外科手術によって除去し、ヘマトキシリン及びエオシンを使用して組織学的に分析した。
【０１０８】
図１０中に示すように、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ７を接種した全ての動物が、陰性対照に対して、腫瘍増殖のほぼ完全な制御を示した。この図は、本発明の目的である新たな組換え抗体は、組換え抗体ｓｃＦｖ２−Ｆｃ２Ｈ１  ８．２に対して性能が優れていたことも示す。組織学的分析は、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６、ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ５及びｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ７で治療した動物の腫瘍には、血管密度の有意な減少、血管径の減少、腫瘍細胞アポトーシスの増大、及び有糸分裂数の減少があったことを示した。
【０１０９】
（例１５）
横紋筋肉腫系Ａ６７３のヒト腫瘍細胞を接種したヌードマウスにおいて、腫瘍領域中に選択的に存在する１３１Ｉ−放射標識ｓｃＦｖＬ３Ｈ６断片の能力。
Ａ６７３細胞の腫瘍増殖に対応する領域に存在するｓｃＦｖＬ３Ｈ６断片の能力を決定するため、この断片、及び陰性対照（ネズミ抗Ｂ型肝炎表面抗原ｓｃＦｖ；ｓｃＦｖ−Ｈｅｐ．１；Ａｙａｌａ、Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：８３２〜８４２頁）を、それぞれ１．５１ＭＢｑ／５μｇ及び１．５５ＭＢｑ／５μｇの最終比活性でＩｏｄｏｇｅｎ手順（Ｆｒａｋｅｒ  ＰＪ、Ｓｐｅｃｋ  ＪＣ  Ｊｒ．１９７８．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ８０：８４９〜８５７頁）を使用して、１３１Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）で標識した。
【０１１０】
放射標識産物を薄層クロマトグラフィーで分析して、タンパク質への取り込みを検出し、それぞれ９３％と９５％の放射活性の値を報告した。それらの対応する抗原（ヒトＶＥＧＦ及びＨＢｓＡｇ）を検出する放射標識産物の能力を、ポリスチレン製イムノチューブをアイソフォーム１２１のヒト組換えＶＥＧＦ（５μｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、又は組換えＨＢｓＡｇ（５μｇ／ｍＬ；Ｈｅｂｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｈａｖａｎａ）でコーティングしたシステムで試験し、次いでそれらをブロッキングし、対応する比活性の放射標識断片のサンプルと接触させて置き、理論上固相に捕捉され得る量に調節した。インキュベーション及び洗浄後、本発明者らは、固相は８７．３％及び８４．５％の放射活性でそれぞれｓｃＦｖＬ３Ｈ６及びｓｃＦｖ−Ｈｅｐ．１と結合することができたことを決定し、放射標識手順は重要なことに断片の生物学的活性を変えなかったことを示した。
【０１１１】
生体内分布を試験するため、本発明者らは３０匹のｎｕ／ｎｕマウスを使用した。動物には、右背面領域にＡ６７３培養系の５×１０６個のヒト腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍が約３００ｍｍ３の体積に達したとき、動物は５匹の動物の６グループにランダムに分け、治療を開始した。放射標識品（１５匹にｓｃＦｖＬ３Ｈ６及び１５匹にｓｃＦｖＨｅｐ．１）をマウスの尾静脈に注射し、それぞれの物品に関して２４、４８、及び７２時間後に５匹のグループにおいて屠殺した。腫瘍、脾臓、肝臓、腎臓、腸、筋肉、骨髄及び血液を、外科手術又はサンプリングによって除去した。放射活性の蓄積は、組織１グラム当たりの注射量の百分率として表した。較正は標準注射量サンプルを使用して行った。放射活性はシンチレーションガンマカウンターを使用して測定した。
【０１１２】
表１４は、これらの組織で行った測定から計算した腫瘍：血液放射活性比を示す。この実験は、２４時間と７２時間の間に、非特異的ｓｃＦｖＨｅｐ．１断片と異なり、ｓｃＦｖＬ３Ｈ６断片が腫瘍組織内に優先的に局在することを示す。放射標識ｓｃＦｖＬ３Ｈ６の特異的沈着は、注射の４８時間後に、腫瘍と異なる他の組織内で見られなかった。
【表１４】
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【０１１３】
５匹のマウスから回収した組織から誘導した平均値から、それぞれの比を計算した。これらの結果は、ｓｃＦｖＬ３Ｈ６は局所高濃度のヒトＶＥＧＦが存在する解剖領域に特異的に局在することができ、したがって、放射性同位体又は最終的に薬剤若しくは毒素などの異なる治療用品を、この領域に特異的に運ぶのに有用であることを示唆する。
【０１１４】
（例１６）
ｓｃＦｖＬ３Ｈ６断片及び二価分子ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６を使用した、非ヒト霊長類における実験的脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）の予防。
実験的脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）のモデルとして、本発明者らは、Ｋｒｚｙｓｔｏｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｋｒｚｙｓｔｏｌｉｋ  Ｍ．Ｇ、ｅｔ  ａｌ．２００６．Ａｃｔａ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １２０：３３８〜３４６頁）によって報告されたモデルを利用した。６匹のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、ＣＥＮＰＡＬＡＢ、Ｈａｖａｎａ）を、動物試験実施適正基準に従い維持し操作した。動物には、ケタミン塩酸塩、マレイン酸アセプロマジン、及び硫酸アトロピンの筋肉内注射を用いる全手順のため麻酔をかけた。プロパラカイン塩酸塩を用いた局所麻酔も使用した。除核及び安楽死前の麻酔は静脈内ナトリウムペントバルビタールで行った。アルゴンレーザー照射を使用して黄斑においてＣＮＶ膜を誘導し、５０μｍと１００μｍの間の適用地点で、水疱及びわずかな出血をもたらす手順を確実にした。写真撮影及び蛍光血管造影法を使用して、病巣の拡大及び特徴を検出し測定した。動物の目は、異なる日時、断片及びプラシーボ及びレーザー照射手順の適用前後、並びに実験の最後で調べ、除核及び動物屠殺で終わらせた。
【０１１５】
動物は、試験した分子：ｓｃＦｖＬ３Ｈ６抗体断片又は免疫グロブリン型ｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６の二価分子に応じて、３匹の２グループに分けた。それぞれの動物の右目には、硝子体内注射により、グループに応じて３００μｇのｓｃＦｖＬ３Ｈ６又はｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６を含む５０μＬＰＢＳを与え、一方左目には媒体のみを注射した。目にはレーザー治療前に２回注射した（第０日と第１４日）。第２１日に、ＣＮＶの誘導のため全ての目にレーザー治療を施した。それぞれの目に２日間、特定製品又は媒体を用いた注射を繰り返した。レーザー誘導後３週（第４２日）で、動物に硝子体内注射し、今回はグループに応じていずれもｓｃＦｖＬ３Ｈ６断片又はｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６分子を用い、第５６日に同様の最終注射で終わらせた。
【０１１６】
治療の第Ｉ段階（第４２日より前）に、試験は、それぞれの対照の目と比較して、ｓｃＦｖＬ３Ｈ６又はｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６を投与した目におけるグレード４の病巣の発症の減少を示し、これらはいずれも分子がＣＮＶの予防において役立つことを示唆する。治療の第２段階に、全ての目にｓｃＦｖＬ３Ｈ６又はｓｃＦｖ２−ＦｃＬ３Ｈ６を与えたとき、本発明者らはグレード４の病巣の減少を検出し、これは断片及び二価分子が樹立した病巣にも有効であることを示唆する。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図３】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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