(57)【要約】【課題】レトロウイルスにより引き起こされる疾患の予防および／または治療など。【解決手段】本発明は、ＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現および／または活性を調節する候補化合物を、レトロウイルスにより引き起こされる疾患の予防および／または治癒的治療のために使用され得る候補化合物として同定する、レトロウイルスにより引き起こされる疾患の予防および／または治癒的治療のために使用され得る候補化合物のインビトロ・スクリーニング方法に関する。  本発明はまた、ｉ）ＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現および／または活性の阻害剤；ならびにｉｉ）レトロウイルスの少なくとも１つの抗原を含む、ワクチン組成物および免疫原性組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レトロウイルスにより引き起こされる疾患の予防および／または治癒的治療のために使用され得る候補化合物のインビトロ・スクリーニング方法であって、
以下の工程：
・候補化合物をＳＡＭＨＤ１発現細胞またはＳＡＭＨＤ１タンパク質に接触させること；および
・候補化合物がＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現および／または活性を調節するか否かを決定することを含み、
ＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現および／または活性を調節する前記候補化合物が、レトロウイルスにより引き起こされる疾患の予防および／または治癒的治療のために使用され得る候補化合物として同定される、方法。
【請求項２】
・候補化合物がＳＡＭＨＤ１の発現を調節する能力の決定が、ＳＡＭＨＤ１  ｍＲＮＡおよび／またはＳＡＭＨＤ１タンパク質を定量することにより行われること；ならびに
・候補化合物がＳＡＭＨＤ１の活性を調節する能力の決定が、ＳＡＭＨＤ１のホスホヒドロラーゼ活性を測定することにより行われることを特徴とする、請求項１に記載のインビトロ・スクリーニング方法。
【請求項３】
レトロウイルスが、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、レンチウイルスおよびスプーマウイルスからなる群より選ばれる属に属するレトロウイルスであることを特徴とする、請求項１または２記載のインビトロ・スクリーニング方法。
【請求項４】
レトロウイルスがレンチウイルス属に属しており、かつ、１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−２）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる種を構成する群から選ばれることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項記載のインビトロ・スクリーニング方法。
【請求項５】
レトロウイルスにより引き起こされる疾患の治療および／または予防における使用のためのＳＡＭＨＤ１の発現および／または活性の調節剤。
【請求項６】
レトロウイルスが、レンチウイルス、特に、１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−２）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる種であることを特徴とする、請求項５に記載の使用のための調節剤。
【請求項７】
調節剤が、化学低分子、ＳＡＭＨＤ１  ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡに対する干渉性ＲＮＡ、ＳＡＭＨＤ１をコードする遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＳＡＭＨＤ１  ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡに対するリボザイム、抗ＳＡＭＨＤ１抗体、または抗ＳＡＭＨＤ１抗体の誘導体、およびアプタマーからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項５または６に記載の使用のための調節剤。
【請求項８】
以下：
ｉ）ＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現および／または活性の阻害剤；ならびに
ｉｉ）レトロウイルスの少なくとも１つの抗原、または前記抗原をコードするポリヌクレオチド配列
を含む、免疫原性またはワクチン組成物。
【請求項９】
抗原が、前記レトロウイルスのタンパク質またはそのフラグメント、前記レトロウイルスのタンパク質またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、前記レトロウイルスの構造タンパク質を有するウイルス様粒子、前記レトロウイルスのタンパク質またはペプチドフラグメントを含むリポペプチド抗原、不活化型または弱毒型の前記レトロウイルス、および偽型ウイルスベクターからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項８に記載の免疫原性またはワクチン組成物。
【請求項１０】
阻害剤が、抗ＳＡＭＨＤ１抗体、ＳＡＭＨＤ１  ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡに対する干渉性ＲＮＡ、ＳＡＭＨＤ１をコードする遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＳＡＭＨＤ１  ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡに対するリボザイム、およびアプタマーからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項８または９に記載の免疫原性またはワクチン組成物。
【請求項１１】
レトロウイルスが、１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）であることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性またはワクチン組成物。
【請求項１２】
レトロウイルスベクターによるＳＡＭＨＤ１発現細胞の形質導入を向上させるための、ＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現および／または活性の阻害剤のインビトロまたはエキソビボ使用。
【請求項１３】
レトロウイルスが、１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−２）、またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）であることを特徴とする、請求項１２に記載のその使用。
【請求項１４】
以下：
・ＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現および／または活性の阻害剤；
・Ｖｐｘタンパク質を天然に発現しないレトロウイルス発現ベクター；
を含む、ＳＡＭＨＤ１を天然に発現する細胞にレトロウイルスベクターを形質導入するためのキット。
【請求項１５】
樹状細胞および／または単球系譜の細胞による１型インターフェロンの発現を誘導するための、ＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現および／または活性の阻害剤のインビトロまたはエキソビボ使用。
【請求項１６】
樹状細胞および／または単球系譜の細胞による１型インターフェロンの発現を誘導するための医薬としてのその使用のための、ＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現および／または活性の阻害剤。
【請求項１７】
ＳＡＭＨＤ１タンパク質非天然発現細胞における、レトロウイルスによる感染に対する耐性を誘導するためのインビトロまたはエキソビボ方法であって、
前記方法が、ＳＡＭＨＤ１タンパク質を天然に発現しない前記細胞に、ＳＡＭＨＤ１タンパク質をコードする配列を導入することからなる工程を含み、
ＳＡＭＨＤ１タンパク質を発現する前記細胞がレトロウイルスによる感染に耐性である、方法。
【請求項１８】
レトロウイルスにより引き起こされる疾患を治療または予防するための医薬としてのその使用のための、ＳＡＭＨＤ１タンパク質をコードする配列が導入されている、ＳＡＭＨＤタンパク質を天然に発現しない細胞であって、
前記細胞が、感染の間におけるレトロウイルスの標的細胞であるか、またはレトロウイルスの標的細胞に分化する能力がある細胞である、細胞。
【請求項１９】
請求項１８に記載される、ＳＡＭＨＤ１タンパク質をコードする配列が導入されている、ＳＡＭＨＤ１タンパク質非天然発現細胞であって、
前記細胞が、被検体に由来するものであり、かつレトロウイルスにより引き起こされる疾患を治療または予防するための医薬としてのその使用が、前記被検体において行われることを特徴とする、細胞。
【請求項２０】
前記レトロウイルスがＨＩＶ−１ウイルスであることを特徴とする、請求項１７に記載されるインビトロまたはエキソビボ方法、または請求項１８または１９に記載される、ＳＡＭＨＤ１タンパク質をコードする配列が導入されている、ＳＡＭＨＤ１タンパク質非天然発現細胞。
【請求項２１】
ＳＡＭＨＤ１タンパク質を天然に発現しない前記細胞が、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球に分化する能力があるＣＤ３４＋幹細胞であることを特徴とする、請求項１７または２０に記載されるインビトロまたはエキソビボ方法、または請求項１８〜２０のいずれか一項に記載される、ＳＡＭＨＤ１タンパク質をコードする配列が導入されている、ＳＡＭＨＤ１タンパク質非天然発現細胞。
【請求項２２】
ＳＡＭＨＤ１タンパク質を天然に発現しない前記細胞におけるＳＡＭＨＤ１をコードする遺伝子の配列の導入が、遺伝子移入ベクターにより行われることを特徴とする、請求項１７、２０および２１のいずれか一項に記載されるインビトロまたはエキソビボ方法、または請求項１８〜２１のいずれか一項に記載される、ＳＡＭＨＤ１タンパク質をコードする配列が導入されている、ＳＡＭＨＤ１タンパク質非天然発現細胞。
【請求項２３】
組換えＳＡＭＨＤ１タンパク質を発現することを特徴とする、ＳＡＭＨＤ１タンパク質非天然発現細胞。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、現代の医薬が取り組んでいる主要な公衆衛生問題の一つを代表する感染性疾患である後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因因子である。
【０００２】
２００８年に世界保健機関（ＷＨＯ）により公表されたデータによると、ＨＩＶに罹患して生活している人々の数は、３３４０万人であると見積もられている。このウイルスによる新たな感染数は２７０万人であると現在見積もられており、ＡＩＤＳにより引き起こされる死亡数は約２００万人である。サハラ以南のアフリカは、世界全体の全症例の６７％、成人のうち報告された新たな症例の６８％、および子供のうち報告された新たな症例の９１％の割合を占める最も侵された地域である。
【０００３】
ＨＩＶの主要標的細胞は、免疫系の細胞、特にＣＤ４＋  Ｔリンパ球であり、また、樹状細胞、単球、およびマクロファージである。長期にわたる感染は、ＨＩＶが標的細胞の免疫機能と干渉し、その複製がこれらの細胞の破壊を引き起こす範囲において、免疫系の弱体化をもたらし、日和見疾患に対して身体を脆弱にする。したがって、抗レトロウイルス治療をしない場合、ＨＩＶに感染している実質的に全ての被検体は、免疫系の進行性破壊の最終的臨床症状であるＡＩＤＳへと進行する。
【０００４】
１９９６年に始まった、プロテアーゼ阻害剤および逆転写酵素阻害剤を用いる多重薬物併用療法の導入は、罹患率および日和見感染の発生率の大幅な減少をもたらし、それによりＡＩＤＳ段階へのＨＩＶ感染の進行を遅延させた。しかしながら、現在まで、身体からウイルスを消失させ、かつＨＩＶからの永久的な治癒を提供することを可能にする治療は何ら存在しなかった。
【０００５】
さらに、ワクチン学分野において２０年を超えて行われてきた集中的研究にもかかわらず、有効な治癒または予防ワクチン戦略は未だ、特定されていない。
【０００６】
ヒト免疫不全ウイルスは、レトロウイルス科およびレンチウイルス属に属する。霊長類レンチウイルスに関して、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶｓ）およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶｓ）の比較系統発生解析は、一方ではＨＩＶ−１、チンパンジーＳＩＶ（ＳＩＶｃｐｚ）およびゴリラＳＩＶ（ＳＩＶｇｏｒ）の間、他方ではＨＩＶ−２およびスーティーマンガベイＳＩＶ（ＳＩＶｓｍ）の間で遺伝的類似性を明らかにし、これは、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ウイルスのサル起源に関する仮説の信憑性を高めた。
【０００７】
レンチウイルス属のウイルスは、分裂細胞内および非分裂細胞内の双方で複製するそれらの能力の点で、他の属のレトロウイルスと異なり、この特徴的な特性により、これらのウイルスは、遺伝子療法の状況で用いられ得るレンチウイルスベクターの開発のための有望な候補となっている。
【０００８】
ＨＩＶｓおよびＳＩＶｓのゲノムは、９個の遺伝子を含むポジティブな極性を有する、２つの同種の一本鎖ＲＮＡ鎖からなる。全てのレトロウイルスに共通する３つの主要なレトロウイルス遺伝子は、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子であり、これらは、構造タンパク質（マトリックスタンパク質、カプシドタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、ｇｐ１２０およびｇｐ４１エンベロープタンパク質）を、ウイルスプロテアーゼによりプロセシングされた後の成熟の際に生成するポリタンパク質、ならびに宿主細胞のゲノム中へのその組み込みにおいて、および前駆体ポリタンパク質の成熟において、ウイルスの複製に関与するウイルス酵素をコードする（それぞれ、逆転写酵素、インテグラーゼおよびプロテアーゼ）。２つの他のレトロウイルス遺伝子は、調節性タンパク質であるｔａｔおよびｒｅｖをコードする。ｔａｔタンパク質は、細胞ゲノムおよび細胞遺伝子中へのレトロウイルスＤＮＡの組込み後のウイルス遺伝子の転写調節に関与し、一方、ｒｅｖタンパク質は、転写物の核輸送に関与する。
【０００９】
ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒおよびｖｐｕと名付けられた４つの他の遺伝子は、ウイルスのライフサイクルの異なる段階、および異なる細胞経路の調節に作用する、いわゆるアクセサリータンパク質をコードする。ＨＩＶ−２および所定のＳＩＶｓ、特にＳＩＶｓｍの場合、Ｖｐｕタンパク質をコードする遺伝子ｖｐｕが存在せず、Ｖｐｘと呼ばれるアクセサリータンパク質をコードする遺伝子ｖｐｘにより複製される。
【００１０】
成熟ＨＩＶ／ＳＩＶビリオンは、直径８０ｎｍ〜１２０ｎｍとして測定される球状の形態を有し、マトリクスおよび円錐型のヌクレオカプシドを囲むウイルスエンベロープ（ｇｐ１２０糖タンパク質の三量体に共有結合している３つのｇｐ４１膜貫通糖タンパク質からなる、いわゆるスパイクが埋包されたリン脂質膜（非特許文献１）：１０７５〜１０８２，１９９５））からなる。ヌクレオカプシドは、ウイルスゲノム、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ、ならびに幾つかのウイルス性Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、ＶｐｕおよびＮｅｆ（またはＨＩＶ−２および所定のＳＩＶｓ、特にＳＩＶｓｍの場合にはＶｐｘ）タンパク質を含む。
【００１１】
ＨＩＶウイルスのサイクルは、以下の段階から構成される：
・細胞表面上のｇｐ１２０ウイルス糖タンパク質と細胞表面上のＣＤ４分子との間の特定の相互作用による標的細胞の形質膜へのウイルスの結合；
・ｇｐ１２０のコンフォメーション変化、およびＣＤ４に近接して存在する共レセプター、即ち、ケモカインレセプターＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４への結合；
・ｇｐ４１の関与によるウイルスエンベロープと細胞質膜との間の融合；
・細胞中へのウイルスの侵入、およびウイルス粒子の脱コーティング；
・ウイルス粒子中に存在する逆転写酵素を介する二本鎖ＤＮＡ中へのウイルスゲノムＲＮＡの逆転写（ウイルスの複製およびその発現を保障するため、ウイルスＤＮＡが組み込まれる細胞ＤＮＡの構造と適合性の構造）；
・新たに形成された二本鎖ウイルスＤＮＡの細胞核中への移入、次いでウイルスインテグラーゼを介する細胞ゲノム中への組込み（以降、ウイルスＤＮＡをプロウイルスＤＮＡと呼ぶ）；
・プロウイルスＤＮＡの発現、新たなウイルス粒子の形成および放出。
【００１２】
ウイルスサイクルの各段階は、抗レトロウイルス化合物の開発のための潜在的標的である。したがって、最初に開発された抗ＨＩＶ抗レトロウイルス薬は、レトロウイルスプロテアーゼ阻害剤および逆転写酵素阻害剤であった。より最近、ウイルスエンベロープと細胞膜との間の融合を阻害する分子が、開発されている。
【００１３】
ＨＩＶウイルスによる感染を遮断し得る分子に関する研究の状況において、ここ数年では、とりわけこれらのＨＩＶ／ＳＩＶを含む所定のレトロウイルスの複製サイクルと干渉する、霊長類における細胞因子の発見（制限因子と呼ばれる）が顕著である。これらの制限因子は、宿主細胞中へのそれらの侵入後に、ＨＩＶｓ／ＳＩＶｓの複製を制限し得る。
【００１４】
ＨＩＶに対する実証された活性を有する第１の制限因子（即ち、タンパク質ＴＲＩＭ５アルファ）は、２００４年に発見された（非特許文献２）。ＨＩＶ−１に対する幾つかの非ヒト霊長類、特にアカゲザルの耐性を担う遺伝子の同定を試みていたＳｔｒｅｍｌａｕおよび彼の同僚は、アカゲザル細胞のｃＤＮＡライブラリをスクリーニングしたところ、サルＴＲＩＭ５アルファタンパク質が、一旦ヒト細胞により発現されると、ＨＩＶ−１に対してこれらの細胞を保護するが、サル対応物に対しては保護しないことを発見した。サルＴＲＩＭ５アルファタンパク質は、ＨＩＶ−１が細胞中に侵入することを妨げないが、それは、ウイルスサイクルを非常に迅速に遮断する。
【００１５】
その後の研究は、サル起源のＴＲＩＭ５アルファタンパク質によるＨＩＶ−１の制限の特異性が、このタンパク質のＣ−末端部に位置しているＳＰＲＹとして知られるドメインの３３２位にあるプロリンにより行われることを示した。そのヒト対応物のＳＰＲＹドメインにおける単一の変異、Ｒ３３２Ｐは、ＨＩＶ−１を阻害する能力を後者に付与する。
【００１６】
最近、ＨＩＶに対する別の制限因子の存在が、発見されており、注目されている。したがって、樹状細胞、および単球系譜の細胞、特にマクロファージは、所定のレンチウイルス、特にＨＩＶ−１および幾つかのＳＩＶｓによるそれらの感染を制限し得る制限因子を発現することが示されている。ＨＩＶ−２により、および幾つかのＳＩＶｓ、特にＳＩＶｓｍにより発現されるＶｐｘ補助タンパク質は、制限因子の作用を中和し得ることもまた示されている。したがって、このことは、この制限因子がＨＩＶ−２に対して有効でないこと、およびＨＩＶ−２が、感染の初期からすぐに、効率的な様式で樹状細胞に感染することを説明する。
【００１７】
多くの研究が、この制限因子の作用機構をさらに特徴付け、かつその起源となる細胞因子を同定するために、行われている（総説については、非特許文献３を参照）。
【００１８】
Ｖｐｘにより中和される制限因子は同定されていないが、この制限因子は、細胞において構成的様式で発現されることが実証されている。この制限因子は、ウイルスが細胞中に侵入することを妨げないが、ゲノムＲＮＡの逆転写に由来するＤＮＡの蓄積（制限因子ＴＲＩＭ５アルファによりまた標的にされるウイルスサイクルの段階）を妨害するようである。さらに、ＴＲＩＭ５アルファと同様に、Ｖｐｘにより阻害される因子は、１型インターフェロンによって誘導性であるらしい（非特許文献４）。しかしながら、この新たな制限因子は、幾つかの点で、ＴＲＩＭ５アルファと異なる。ＴＲＩＭ５アルファの発現は遍在的であるが、Ｖｐｘにより阻害される制限因子は、樹状細胞および単球系譜の細胞でのみ発現している。また、ＴＲＩＭ５アルファとは異なり、この制限因子は、飽和性でないようである。なぜならば、大過剰のウイルス粒子は、機能的Ｖｐｘタンパク質を発現しないマカクＳＩＶの感染性を回復させないためである（非特許文献５）。
【００１９】
Ｖｐｘにより阻害される制限因子は、樹状細胞および単球系譜の細胞に特異的に発現する。最近の研究調査は、これらの細胞により媒介される生来の免疫応答におけるこの制限因子の関与に焦点を当てている。感染の間、樹状細胞は、特に１型インターフェロンの発現および分泌により、生来の免疫応答において必須の役割を果たす。これらの細胞はまた、抗原の捕捉、プロセシングおよび提示に特化しており、免疫応答における中心的な役割を果たす。なぜならば、それらは、ナイーブＴリンパ球を活性化し、かつ免疫系からの協調的かつ持続性の一次免疫応答を開始し得、それにより、感染因子に対して身体を保護することを可能にする唯一の細胞だからである。しかしながら、性的接触を介するＨＩＶ感染、特にＨＩＶ−１の場合には、生来の免疫応答は、急性期（つまり、感染後の第１週）の間では弱く、１型インターフェロン（これは抗ウイルス活性を有する）は一般的には発現しない。
【００２０】
最近の研究は、樹状細胞の感染に対する耐性が迂回される場合（ＨＩＶ−１ウイルスおよびＶｐｘを保有するウイルス様粒子による共感染）、ＨＩＶ−１による感染が、感染細胞の成熟、１型インターフェロンにより媒介される抗ウイルス応答、ならびにＴ細胞の活性化を誘導することを示した（非特許文献６）。したがって、樹状細胞における効率的な複製が特に１型インターフェロンの発現により強力な生来の免疫応答を誘導する（これは、感染日後の早期からすぐに有効な免疫応答を確立することを可能にし得る）範囲において、Ｖｐｘにより阻害される制限因子は、ＨＩＶ−１回避戦略に役立つことを示唆する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｌｕら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２（１２）：１０７５〜１０８２，１９９５
【非特許文献２】Ｓｔｒｅｍｌａｕら，Ｎａｔｕｒｅ，４２７：８４８〜８５３，２００４
【非特許文献３】Ａｙｉｎｄｅら，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ，７：３５，２０１０
【非特許文献４】Ｇｒａｍｂｅｒｇら，Ｃｕｒｒ  ＨＩＶ／ＡＩＤＳ  Ｒｅｐ．，６：３６〜４２，２００９
【非特許文献５】Ｇｏｕｊｏｎら，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ，４：２，２００７
【非特許文献６】Ｍａｎｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ，４６７（９）：２１４〜２１７，２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
これらの研究は、現在のＨＩＶ−１ワクチンの非有効性が樹状細胞およびマクロファージにおけるＨＩＶ−１による感染の制限に主に起因するであろうことを示唆する。これらの細胞により発現される制限因子の同定は、したがって、レトロウイルス、一般的にはレンチウイルス、好ましくはＶｐｘを発現しないレンチウイルス、特にＨＩＶ−１に対して有効なワクチンの開発に重要である。
【００２３】
さらに、この制限因子の同定は、レトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターを用いる遺伝子移入のための方法の開発のために重要である。事実上、この制限因子の阻害は、遺伝子療法の目的のために、またはインビトロ遺伝子移入実験のために、レンチウイルスベクターによる、この因子を発現している細胞、特に樹状細胞および単球系譜の細胞の形質導入を向上させることを可能にする。
【００２４】
しかしながら、この制限因子に焦点を当てている多くの研究にもかかわらず、その同定は、現在まで依然として未知であった。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明者らは今回、この制限因子がタンパク質ＳＡＭＨＤ１であることを同定した。
【００２６】
２０番染色体上に位置する遺伝子ＳＡＭＨＤ１（遺伝子ＩＤ  ２５９３９）は、ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩアクセッション番号  ＮＭ＿０１５４７４）に転写され、ｍＲＮＡは６２６残基からなるＳＡＭＨＤ１タンパク質（ＮＣＢＩアクセッション番号  ＮＰ＿０５６２８９；配列番号１）へと翻訳される。
【００２７】
タンパク質ＳＡＭＨＤ１は、２つの識別可能な領域を有する。第１のもの（残基４４〜１０７）は、（「無菌アルファモチーフ（Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ａｌｐｈａ  Ｍｏｔｉｆ）」について）「ＳＡＭ」と名付けられ、第２（残基１６２〜３３５）のものは、ホスホヒドロラーゼ活性（ＲＮａｓｅ）を実証する「ＨＤｃ」と名付けられている。
【００２８】
ＤＣＰＩ（「樹状細胞由来ＩＦＮガンマ誘導タンパク質」に対する）とも呼ばれるタンパク質ＳＡＭＨＤ１は、樹状細胞に由来するｃＤＮＡライブラリのスクリーニング後に同定され、インターフェロンガンマ誘導性タンパク質であるネズミ（マウス）タンパク質ＭＧ１１におけるオルソログタンパク質であることが示された（Ｌｉら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，７４：２２１〜２２４，２０００）。ＳＡＭＨＤ１は、生来の抗ウイルス応答に関与し得（Ｈａｒｔｍａｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，８１：１７９６〜１８１２，２００７）、ＴＮＦアルファにより誘導される炎症誘発性応答における役割を果たす（Ｌｉｏら，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，８：２６４０〜２６５０，２００８）。最近、ＳＡＭＨＤ１をコードする遺伝子中の変異が、その症状が先天性ウイルス感染で見受けられるものと同様である遺伝的障害のＡｉｃａｒｄｉ−Ｇｏｕｔｉｅｒｅｓ症候群と関連することが実証された（Ｒｉｃｅら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１（７）：８２９〜８３２，２００９；Ｄａｌｅら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ａ．，１５２Ａ（４）：９３８〜９４２，２０１０；Ｔｈｉｅｌｅら，Ｈｕｍ．Ｍｔａｔ．，３１（１１）：１８３６〜１８５０，２０１０）。ＳＡＭＨＤ１は、生来の免疫応答の自己活性化を防ぐために、保護的役割を果たすこともまた提唱されている（Ｒｉｃｅら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１（７）：８２９〜８３２，２００９；Ｄａｌｅら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ａ．，１５２Ａ（４）：９３８−９４２，２０１０；Ｔｈｉｅｌｅら，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．，３１（１１）：１８３６−１８５０，２０１０）。しかしながら、樹状細胞および単球系譜の細胞のＨＩＶ−１による感染に対する耐性とＳＡＭＨＤ１発現との間の関連性については、言及されていない。
【００２９】
本発明者らはさらに、制限に関与する領域（単数または複数）をも調査した。本発明者らは、それにより、このタンパク質のホスホヒドロラーゼ活性がＨＩＶ−１感染の制限に必要とされることを実証した。「ＨＤｃ」ドメイン内で変異したＳＡＭＨＤ１タンパク質を発現する樹状細胞は、もはや感染に耐性ではなく、ＨＩＶ−１ウイルスはこれらの細胞中で強力に複製する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１．Ａは、連続して抗Ｆｌａｇ、次いで抗ＨＡ抗体を用いて、ＦｌａｇおよびＨＡペプチドと融合したＶｐｘを発現するＴＨＰ−１細胞の溶解液（レーン２）またはそれを発現しないＴＨＰ−１細胞の溶解液（レーン１）に対して行われ、かつ過剰のＦｌａｇおよびＨＡペプチドとの競合によるネイティブ条件下の溶出と組み合わされた免疫沈降を示す図である。このように溶出したタンパク質を、ウエスタンブロッテイングにより、かつ抗ＳＡＭＨＤ１抗体を用いて解析した。図１．Ｂは、ｅＶｐｘ発現細胞（レーン４）または非発現細胞（レーン３）から調製された総細胞抽出液（「ＷＣＥ」  全細胞抽出液）について、抗ＳＡＭＨＤ１、Ｆｌａｇまたはチューブリン抗体を用いたウエスタンブロット解析を示す図である。
【図２】図２．Ａは、ＳＡＭＨＤ１非特異的コントロールｓｈＲＮＡ（Ｓｃｒ）またはその発現を阻害するＳＡＭＨＤ１特異的ｓｈＲＮＡ（センス鎖  ５’ＣＧＣＡＧＧＡＵＧＧＣＧＡＵＧＵＵＡＵ３’；アンチセンス鎖  ５’ＡＵＡＡＣＡＵＣＧＣＣＡＵＣＣＵＧＣＧ３’）を形質導入した、ＳＡＭＨＤ１を天然に発現するＴＨＰ１細胞のルシフェラーゼ発現ＨＩＶ−１（ＨＩＶ−ＬＵＣ−Ｇ）による感染（ルシフェラーゼ活性の定量により測定された感染）を示す柱状図である。図２．Ｂは、ｉ）ＳＡＭＨＤ１非特異的コントロールｓｈＲＮＡ（Ｓｃｒ）、ｉｉ）ＳＡＭＨＤ１特異的ｓｈＲＮＡ（Ｓａｍｈｄ１）、またはｉｉｉ）ＳＡＭＨＤ１特異的ｓｈＲＮＡ（Ｓａｍｈｄ１）およびＲＮＡｉ耐性型ＳＡＭＨＤ１をコードするベクター（Ｓａｍｈｄ１−Ｒ）を形質導入した、ＳＡＭＨＤ１を天然に発現するＴＨＰ１細胞のＨＩＶ−ＬＵＣ−Ｇによる感染を示す柱状図である。「ＮＩ」のカラムは、非感染細胞を示す。
【図３】図３は、ＨＩＶ感染の阻害におけるＳＡＭＨＤ１タンパク質の「ＨＤｃ」ドメインの関与を示す柱状図である。「ＷＴ」のカラムは、ＨｅＬａ細胞（ＨＩＶ−１に許容）がＳＡＭＨＤ１を過剰発現する場合に得られた結果を示す。「ＨＤ／ＡＡ」のカラムは、ＨｅＬａ細胞がホスホヒドロラーゼ活性を示さない変異型ＳＡＭＨＤ１を過剰発現する場合に得られた結果を示す。「ＨＩＶ−ＬＵＣ−Ｇ」のカラムは、ルシフェラーゼ発現ＨＩＶ−１を有する細胞の感染の間に得られた結果を表す。「ＮＩ」のカラムは、非感染細胞を示す。
【図４】図４．Ａは、ＳＡＭＨＤ１を特異的に標的とするｓｉＲＮＡで、ＨＩＶ−１による健常ドナー（「ＨＤ」）に由来する初代樹状細胞を処理した、または処理しなかった場合における、その細胞の感染を示す柱状図である（ウイルスタンパク質ｐ２４発現細胞数の定量により行われた測定）。「Ｓｃｒ」のカラムは、ＳＡＭＨＤ１非特異的コントロールｓｉＲＮＡで細胞を処理した場合に得られた結果を表し、一方、カラム「１」および「２」は、ＳＡＭＨＤ１を特異的に標的とする２つの異なるｓｉＲＮＡ（それぞれ配列番号３および４に対応するｓｉＲＮＡ）で細胞を処理した場合に得られた結果を表す。図４．Ｂは、ＳＡＭＨＤ１を特異的に標的とするｓｉＲＮＡで、健常ドナー「ＨＤ１」および「ＨＤ２」に由来する初代樹状細胞を処理した、または処理しなかった場合における、レンチウイルスベクターｐＴｒｉｐによる、これらの細胞の感染を示す柱状図である。「Ｓｃｒ」のカラムは、ＳＡＭＨＤ１非特異的コントロールｓｉＲＮＡで細胞を処理した場合に得られた結果を表す；「ダイナミン２」のカラムは、ダイナミン２特異的ｓｉＲＮＡで細胞を処理した場合に得られた結果を表し、一方、カラム「１」および「２」は、ＳＡＭＨＤ１を特異的に標的とする２つの異なるｓｉＲＮＡで細胞を処理した場合に得られた結果を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
インビトロ・スクリーニング方法
ＨＩＶ−１の複製を阻害する制限因子としてＳＡＭＨＤ１タンパク質を本発明者らが同定したことから、本発明の目的は、レトロウイルスにより引き起こされる疾患の予防および／または治癒的治療のために使用され得る候補化合物のインビトロ・スクリーニング方法を提供することである。
【００３２】
本方法は、以下の工程：
・候補化合物をＳＡＭＨＤ１発現細胞またはＳＡＭＨＤ１タンパク質に接触させること；および
・候補化合物がＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現および／または活性を調節するか否かを決定することを含み、
ここで、ＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現および／または活性を調節する当該候補化合物が、レトロウイルスにより引き起こされる疾患の予防および／または治癒的治療のために使用され得る候補化合物として同定される。
【００３３】
レトロウイルスは、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、レンチウイルスおよびスプーマウイルスからなる群より選ばれる属に属するレトロウイルスであり得る。
【００３４】
好ましくは、この疾患を引き起こすレトロウイルスは、以下からなる群より選ばれるレンチウイルスである：
・ウシレンチウイルス（ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ））；
・ウマレンチウイルス（ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ））；
・ネコレンチウイルス（ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびピューマレンチウイルス）；
・ヤギ／ヒツジレンチウイルス（ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、マエディビスナウイルス（ＭＶＶ））；ならびに
・霊長類レンチウイルス（ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−２）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ））。
【００３５】
より好ましくは、この疾患を引き起こすレトロウイルスは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶウイルスからなる群より選ばれる霊長類レンチウイルスである。有利には、それは、ＨＩＶ−１ウイルスである。
【００３６】
用語「ＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現を調節する」は、このタンパク質の発現の向上または阻害のいずれかを意味すると理解される。ＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現は、ＳＡＭＨＤ１をコードする遺伝子からのｍＲＮＡの転写、および／またはｍＲＮＡからのＳＡＭＨＤ１タンパク質（配列番号１）へのｍＲＮＡの翻訳を調節することにより調節することができる。同様の様式において、用語「ＳＡＭＨＤ１タンパク質の活性を調節する」は、ＳＡＭＨＤ１タンパク質の活性の亢進または阻害を示す。
【００３７】
ＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現および活性は、このタンパク質の天然発現細胞、特に、樹状細胞および単球系譜の細胞（特に単球およびマクロファージ）において、または、実際にはＳＡＭＨＤ１を天然には発現しないが、遺伝子工学によりＳＡＭＨＤ１の遺伝子またはｃＤＮＡ（配列番号２）が細胞中で発現する様式で導入されている細胞において、測定することができる。
【００３８】
細胞中にポリヌクレオチド配列を導入するための技術、およびこれらの技術を行うために用いられるベクターは、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）により記載されている。引用されるべき例としては、ＳＡＭＨＤ１の遺伝子またはｃＤＮＡを含む発現ベクターによる細胞のトランスフェクション、特に、リン酸カルシウムによる発現ベクターの共沈殿を用いる技術、または脂質小胞（リポソーム）との発現ベクターの種々の複合体の使用が挙げられる。細胞は、真核生物細胞、または原核生物細胞であり得る。
【００３９】
細胞中でのタンパク質の発現を測定する方法は、当業者に周知である。ＳＡＭＨＤ１の発現は、例えば、細胞溶解液中に存在するＳＡＭＨＤ１タンパク質を、特にこのタンパク質に特異的な抗体、クロマトグラフィー技術または質量分析技術により、定量することにより測定され得る。ＳＡＭＨＤ１の発現はまた、ＳＡＭＨＤ１のｍＲＮＡを、特にこのｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプライマーを用いる定量的ＲＴ−ＰＣＲにより定量することにより測定され得る。
【００４０】
さらに、ホスホヒドロラーゼ活性はタンパク質ＳＡＭＨＤ１の活性に必須であることから、このタンパク質の活性は、既知の量で提供されているＳＡＭＨＤ１基質、すなわち、レトロウイルスＲＮＡおよび／またはレトロウイルスＤＮＡ（逆転写により得られる）の分解を測定することにより、インビトロでアッセイされ得る。ＳＡＭＨＤ１の活性に対する候補化合物の効果は、したがって、残存基質および／または分解産物を測定することにより、およびこれらの測定物の測定値を候補化合物の非存在下で得られたものと比較することにより評価される（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら，ＪＭＢ，３７８：２１５〜２２６，２００８を参照）。
【００４１】
本実施形態では、用いられるＳＡＭＨＤ１タンパク質は、好ましくは、精製された、または部分的に精製された形態である。それは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１）により記載されるもの等の従来の遺伝子工学技術により、例えば、ＳＡＭＨＤ１タンパク質をコードする遺伝子またはｃＤＮＡを発現ベクター中にクローニングし、次いで、プラスミドで形質転換された細菌、特にＥ．ｃｏｌｉにより発現させ、または実際にはＳＡＭＨＤ１をインビトロで転写、次いで翻訳することより、作製され得る。
【００４２】
本発明のインビトロ・スクリーニング方法の一つの好ましい実施形態は、以下である：
・候補化合物がＳＡＭＨＤ１の発現を調節する能力の決定が、ＳＡＭＨＤ１  ｍＲＮＡおよび／またはＳＡＭＨＤ１タンパク質を定量することにより行われる；ならびに
・候補化合物がＳＡＭＨＤ１の活性を調節する能力の決定が、ＳＡＭＨＤ１のホスホヒドロラーゼ活性を測定することにより行われる。
【００４３】
本発明のインビトロ・スクリーニング方法により試験される候補化合物が、ＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現および／または活性に対する効果を有する場合、当該候補化合物が実際に、レトロウイルスの複製に対する効果を有することを保障することが有利である。
【００４４】
これを行うため、以下の工程が適用されてもよい：
ｉ）試験されるべき当該候補化合物の存在下で、当該レトロウイルスに感染した細胞を培養すること、ここで、当該細胞は、樹状細胞、単球およびマクロファージからなる群より選ばれる；
ｉｉ）レトロウイルスの複製を測定すること；
ｉｉｉ）候補化合物の存在下で工程ｉｉ）で測定されたレトロウイルスの複製が、試験されるべき候補化合物の非存在下であることを除いて工程ｉ）と同じ条件下で同じレトロウイルスが培養された場合に得られたレトロウイルスの複製と異なるものである候補化合物を、レトロウイルスにより引き起こされる疾患の予防および／または治癒的治療のために使用され得る候補化合物として、候補化合物を選択すること。
【００４５】
本発明の状況では、用語「ＳＡＭＨＤ１タンパク質をコードする遺伝子」は、配列番号１を有するタンパク質をコードするヒト遺伝子、ならびに配列番号１を有するタンパク質をコードする遺伝子のホモログおよびオルソログならびに対立遺伝子変異体である遺伝子を意味すると理解される。好ましくは、ホモログおよびオルソログ遺伝子ならびに対立遺伝子変異体は、「ＳＡＭ」および「ＨＤｃ」領域の双方を保有し、かつ、配列番号１と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９２％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示すタンパク質をコードする。
【００４６】
同様の様式では、用語「ＳＡＭＨＤ１タンパク質」は、配列番号１およびＮＣＢＩアクセッション番号  ＮＰ＿０５６２８９に対応するＳＡＭＨＤ１タンパク質、ならびに「ＳＡＭ」および「ＨＤｃ」領域の双方を保有し、かつ、配列番号１と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９２％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示す任意のホモログタンパク質を包含する。
【００４７】
本発明の開示と関連して参照がなされる配列同一性百分率は、比較されるべき配列の全体的アライメントを基礎として、すなわち、それらの全体において採用される配列のアライメントに基づいて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアライメントアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３〜４５３，１９７０）を用いることにより、決定される。配列のこの比較は、例えば、ソフトウエアプログラム  Ｎｅｅｄｌｅを利用することにより、および１０．０に相当する「Ｇａｐ  ｏｐｅｎ」パラメータ、０．５に相当する「Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ」パラメータ、および「Ｂｌｏｓｕｍ  ６２」マトリクスを用いることにより行われ得る。Ｎｅｅｄｌｅソフトウエアプログラムは、例えば、表示「Ａｌｉｇｎ」の下、ウエブサイト  ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ  ワールドワイドで利用可能である。
【００４８】
本発明の状況では、用語「ＳＡＭＨＤ１タンパク質の活性」は、ＳＡＭＨＤ１（「ＨＤｃ」ドメイン）のホスホヒドロラーゼ活性がこの阻害効果を担うことが判明しているので、ＨＩＶ−１（またはＶＰＸタンパク質をコードしないＳＩＶ）の複製に対するＳＡＭＨＤ１の阻害効果を意味すると理解される。したがって、ＳＡＭＨＤ１タンパク質の活性に対する効果は、ウイルス複製またはＳＡＭＨＤ１のホスホヒドロラーゼ活性のいずれかに対する候補化合物の効果を測定することにより測定することができる。
【００４９】
「候補化合物」は、任意のタイプの化合物であり得る。
・候補化合物がＳＡＭＨＤ１をコードする遺伝子の発現を阻害することを目的とする場合、それは、例えば、ＳＡＭＨＤ１のｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡに対する干渉性ＲＮＡ、ＳＡＭＨＤ１をコードする遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＳＡＭＨＤ１のｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡに対するリボザイムであってもよい。
・候補化合物がタンパク質ＳＡＭＨＤ１の活性を阻害することを目的とする場合、それは、特に、化学合成分子（好ましくは、化学低分子）、または天然分子（例、植物または微生物からの抽出物）、抗体または抗ＳＡＭＨＤ１抗体のフラグメント、またはアプタマーでもよい。
【００５０】
ＳＡＭＨＤ１タンパク質の活性を阻害することを目的とする、化学的に合成された分子、特に化学低分子である場合、後者は、インシリコでのスクリーニング（すなわち、いわゆる「バーチャル」スクリーニング）後、すなわち、ＳＡＭＨＤ１の「ＨＤｃ」ドメインの三次元構造、特に、ＳＡＭＨＤ１ホスホヒドロラーゼの活性部位の構造をコンピュータによりモデリングし、そして「ＨＤｃ」ドメインのホスホヒドロラーゼ活性と干渉し得るような様式において（例えば、活性部位を遮断するために）、分子をコンピュータにより実質的に設計開発および試験した後、予め選択することができる。
【００５１】
同様の様式では、試験される抗ＳＡＭＨＤ１抗体は、ＳＡＭＨＤ１のホスホヒドロラーゼ活性を阻害するために、好ましくは、ＳＡＭＨＤ１の「ＨＤｃ」ドメインに対するものである。
【００５２】
ワクチンおよび免疫原性組成物
本発明者らは、ＳＡＭＨＤ１発現の阻害が細胞の感染および樹状細胞の活性化につながり、後者の細胞が特にかなり多量の１型インターフェロンを分泌することを示した。
【００５３】
ＨＩＶ−１に対する現在のワクチンの非有効性は、樹状細胞およびマクロファージにおけるＨＩＶ−１による感染の制限に主に起因すると考えられる。これらの細胞の特異的感染の本制限は、ワクチン接種後の十分な免疫応答の発生を防ぐ。
【００５４】
所望のレトロウイルスに対する免疫応答を誘導し得る免疫原性組成物に加えて、ＳＡＭＨＤ１の発現および／または活性を阻害し得る化合物を含むワクチン組成物は、樹状細胞および単球系譜の細胞が早期に活性化されることから、当該レトロウイルスに対してより早期かつより強力な免疫応答を誘導する。
【００５５】
したがって、本発明の別の目的は、ｉ）ワクチン組成物、またはｉｉ）免疫原性組成物に関するものであり、当該組成物は、以下を含む：
・ＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現および／または活性の阻害剤；ならびに
・免疫応答が指向されるべきレトロウイルスの少なくとも１つの抗原、またはこの抗原をコードするポリヌクレオチド配列（好ましくは、当該少なくとも１つの抗原は、レンチウイルスの抗原である）。
【００５６】
本発明にしたがうＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現およびＳＡＭＨＤ１タンパク質の活性の阻害剤は、ＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現、またはＳＡＭＨＤ１タンパク質の活性を、少なくとも１０％、好ましくは３０％、より好ましくは少なくとも５０％、および有利には、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％低減し得る。
【００５７】
好ましくは、ＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現および／または活性の阻害剤は、ＳＡＭＨＤ１遺伝子、ＳＡＭＨＤ１  ｍＲＮＡまたはＳＡＭＨＤ１タンパク質との相互作用により作用し、そして間接様式では作用しない。
【００５８】
阻害剤は、好ましくは、化学低分子、ＳＡＭＨＤ１のｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡに対する干渉性ＲＮＡ、ＳＡＭＨＤ１をコードする遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＳＡＭＨＤ１のｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡに対するリボザイム、抗ＳＡＭＨＤ１抗体（好ましくはヒト化抗体）、または抗ＳＡＭＨＤ１抗体誘導体、およびアプタマーからなる群より選ばれる。
【００５９】
阻害剤がタンパク質のレベルで作用し、かつ遺伝子またはＳＡＭＨＤ１転写物のレベルで作用しない場合、それは、この活性を不活化するために、好ましくは、ＳＡＭＨＤ１の「ＨＤｃ」ドメイン、有利には、ＳＡＭＨＤ１のホスホヒドロラーゼドメインの活性部位を標的とする。
【００６０】
阻害剤は、本発明のスクリーニング方法により同定され得る。
【００６１】
用語「低分子」とは、１０００ダルトン未満のサイズの分子（特に有機または無機化合物）をいう。化学構造のコンピュータ支援設計およびインシリコスクリーニングは、このような分子の設計に有用である。
【００６２】
ここで、用語「抗ＳＡＭＨＤ１抗体」は、ＳＡＭＨＤ１のホスホヒドロラーゼ活性を阻害し、かつホスホヒドロラーゼ活性を遮断するために、ＳＡＭＨＤ１に対する、好ましくは、ＳＡＭＨＤ１の「ＨＤｃ」ドメインに対する免疫グロブリン分子を意味すると理解される。
【００６３】
用語「ヒト化抗体」とは、ＳＡＭＨＤ１タンパク質に対するその結合特異性を維持するが、ヒトにおけるその免疫原性を低減するために、殆どの潜在的非ヒト配列が対応ヒト配列で置換されている、非ヒト動物、好ましくはマウスで産生された抗体をいう。可変ドメインに関して、置換される配列は、一般的に、ＦＲ（フレームワーク）領域、すなわち、超可変ループ（ＣＤＲｓ）間に位置する配列である。ヒト化抗体を得るための種々の方法が、周知であり、また、明らかである（定期刊行物については、例えば、ＡＬＭＡＧＲＯ  ＆  ＦＲＡＮＳＳＯＮ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１３，１６１９〜１６３３，２００８を参照）。
【００６４】
抗体のＣＤＲｓ（「相補性決定領域」）は、抗原の特異的認識に関与する可変ドメインのそれらの部分であることを想起すべきである。抗体の各重鎖および軽鎖は、重鎖の場合にはＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３と名付けられる３つのＣＤＲｓを有し、そして軽鎖の場合にはＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、ＶＬ  ＣＤＲ３を有する。
【００６５】
抗ＳＡＭＨＤ１抗体誘導体は、特に、以下であり得る：
・当該抗体の重鎖および軽鎖のうちの少なくともＣＤＲ３を含む、好ましくは、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ１をさらに含む、抗ＳＡＭＨＤ１抗体の任意のフラグメント；
・本明細書において先に定義された抗ＳＡＭＨＤ１抗体フラグメントを含む、任意の組換えタンパク質。
【００６６】
本発明にしたがって使用され得る抗ＳＡＭＨＤ１抗体のこのようなフラグメントは、特に、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２またはｓｃＦｖフラグメントを含む。Ｆｖフラグメントは、疎水性相互作用により互いに会合する、抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインＶＨおよびＶＬから構成される。ｄｓＦｖフラグメントは、ジスルフィド架橋により接続されたダイマーＶＨ：：ＶＬから構成される。ｓｃＦｖフラグメントは、可撓性リンカーにより互いに連結した、抗体の重鎖および軽鎖の可変部分から構成され（ＣＬＡＣＫＳＯＮら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４〜６２８，１９９１）、それにより単鎖タンパク質を形成する。Ｆａｂフラグメントは、免疫グロブリン分子に対するパパインの作用から生じ、各々は、ジスルフィド架橋により連結されている、軽鎖、および重鎖の前半部を含む。フラグメントＦ（ａｂ’）２は、ペプシンによる抗体の処理により得られうる：このフラグメントは、２つのＦａｂフラグメントおよびヒンジ領域の一部を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、ヒンジ領域中のジスルフィド架橋の切断によりＦ（ａｂ’）２フラグメントから得られうる。
【００６７】
抗原に結合するこれらのフラグメントはまた、抗原に結合するこれらのフラグメントの２個または３個の組合せから生じる「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」または「トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）」等の多価誘導体を得るために、組み合わされてもよい。
【００６８】
抗ＳＡＭＨＤ１抗体フラグメントを含む組換えタンパク質は、特に、以下を含んでいてもよい：
・少なくとも１つの抗ＳＡＭＨＤ１抗体フラグメントを、別の抗体の少なくとも１つのフラグメントと組み合わせたタンパク質；引用され得るその例としては、抗ＳＡＭＨＤ１抗体のＦａｂまたはＦｖフラグメントと、異なる特異性を有する抗体のＦｖまたはＦａｂフラグメントとのコンジュゲートである二重特異的免疫グロブリン、抗ＳＡＭＨＤ１抗体のｓｃＦｖフラグメントと、異なる特異性を有する抗体のＦｖまたはＦａｂフラグメントとの組合せから生じる「二重特異的ダイアボディ」；
・少なくとも１つの抗ＳＡＭＨＤ１抗体フラグメントを、インビボで投与された場合にその血漿半減期を延長することを可能にする分子、特に、このように得られる融合ポリペプチドの分子量が腎ろ過の閾値よりも大きくなるための十分な分子量の水溶性ポリペプチドと組み合わせたタンパク質。
【００６９】
キメラまたは組換え抗体、ｓｃＦｖフラグメントおよびそれらの誘導体などは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１）により記載されるもの等の従来の遺伝子工学技術により得られうる。
【００７０】
用語「干渉性ＲＮＡ」とは、そのｍＲＮＡの分解を引き起こすことにより、標的遺伝子の発現を、そのｍＲＮＡの分解を引き起こすことにより配列特異的様式で阻害し得る二本鎖ＲＮＡ分子をいう。
【００７１】
哺乳動物細胞において使用されるようにするため、干渉性ＲＮＡは、より長い二本鎖ＲＮＡにより誘導される非特異的インターフェロン応答を回避するために、３０ｂｐ（塩基対）未満の二本鎖部分を保有しなければならない。標的配列および対応するアンチセンス配列の双方を含むＲＮＡである、これらの干渉性ＲＮＡとしては、特に、低分子干渉性ＲＮＡ（「低分子干渉性ＲＮＡ」、すなわちｓｉＲＮＡ）（ＥＬＢＡＳＨＩＲら，Ｎａｔｕｒｅ，４１１（６８３６）：４９４−８，２００１；ＴＵＳＣＨＬ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０（５）：４４６−８，２００２），細胞機構によりその後にｓｉＲＮＡに変換される、ヘアピン形状を有する短いＲＮＡｓ（短ヘアピン「ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡｓ」、すなわちｓｈＲＮＡｓ）（ＰＡＤＤＩＳＯＮら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１６（８）：９４８−５８，２００２；ＹＵら，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，９９（９）：６０４７−５２，２００２；ＳＩＯＬＡＳら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３（２）：２２７−３１，２００５），ならびにプレｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡが挙げられる。
【００７２】
ｓｉＲＮＡは一般に、２１〜２５個のヌクレオチドを有し、それは、標的配列および対応するアンチセンス配列から構成される、一般に１９〜２１個のヌクレオチド長の二本鎖部分を含む。一方もしくは他方の鎖、またはそれらの双方は一般に、２〜３個のヌクレオチドの一本鎖の延長を３’端に含む。（必須ではないが）殆どの場合、それは、ジヌクレオチドであり、ＴＴ配列を有する。
【００７３】
ｓｈＲＮＡは、標的配列および対応するアンチセンス配列、ならびに５〜１０個のヌクレオチドのループから構成される、１９〜２９個のヌクレオチドの長さを有する二本鎖部分を含む、ヘアピン様構造を形成するように折り畳まれ得る５０〜７０個のヌクレオチドの長さを有する一本鎖から構成される。それらはまた、２〜３個のヌクレオチドの一本鎖の延長を３’端に含み得る。
【００７４】
上記で先に述べたとおり、干渉性ＲＮＡはまた、前駆体（プレｍｉＲＮＡ）またはｍｉＲＮＡの形態で使用することができる。ｍｉＲＮＡは、ループを含むヘアピン形状を有する約７０個のヌクレオチドのプレｍｉＲＮＡ前駆体から産生される。真核生物細胞において天然条件下で同定されたプレｍｉＲＮＡの配列は、ＤＩＣＥＲにより放出される際、初期に標的とされたｍＲＮＡ以外のｍＲＮＡを分解するｓｉＲＮＡ配列を、真核細胞中に導入するために修飾することができる。次いで、この修飾ｍｉＲＮＡは、干渉の効力の向上をもたらす目的ｓｉＲＮＡ用キャリアとして使用される。有利なことには、プレｍｉＲＮＡは、５’から３’へと、標的アンチセンス配列、続いて天然プレｍｉＲＮＡのループの配列、次いで標的センス配列を含む。好ましくは、ループは、特にマウス、ニワトリまたはヒトで見出されたＢＩＣ（Ｂ細胞組込みクラスター）をコードしないＲＮＡを起源とするｍｉＲ−１５５  プレｍｉＲＮＡのものである（ＫＷＡＮ−ＨＯ  ＣＨＵＮＧら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３４（７），２００６）。
【００７５】
核酸を調製するための従来の方法は、本発明にしたがって、干渉性ＲＮＡを作製するために行われ得る（総説については、例えば、ＡＭＡＲＺＧＵＩＯＵＩら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，５７９，５９７４，２００５を参照）。それは、化学合成または実際に遺伝子工学技術による作製を含んでいてもよい。後者の場合、使用は、適切なプロモータの制御下に配置された、本発明にしたがう少なくとも１つの干渉性ＲＮＡへと転写されることができるＤＮＡ配列を含む発現ベクターによりなされてもよい。
【００７６】
「アプタマー」は、分子認識の観点から抗体の代替を表す分子クラスである。アプタマーは、全ての種類の標的分子を高アフィニティかつ高特異性で現実的に認識する能力を有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチド配列である。これらのリガンドは、Ｔｕｅｒｋ  Ｃ．およびＬ．Ｇｏｌｄ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２４９（４９６８）：５０５〜１０）に記載されるような、「ＳＥＬＥＸ」法（「指数的改良によるリガンドの体系的進化」に対する）を行うことにより無作為配列のライブラリから単離され得る。無作為配列ライブラリは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成により得られうる。このライブラリでは、各メンバーは、単一の配列を有する、化学修飾されている可能性がある線状オリゴマーである。このクラスの分子について可能性がある修飾、使用および利点は、Ｊａｙａｓｅｎａ  ＳＤ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，４５（９）：１６２８〜５０により開示されている。ペプチドアプタマーは、一般的には、ツーハイブリッドシステムによりコンビナトリアルライブラリから選ばれた約２０残基からなるコンフォメーションペプチドである（Ｃｏｌａｓら，Ｎａｔｕｒｅ，１９９６，３８０：５４８−５０；Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒら．，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００１，７８（２）：１０５−１１））。
【００７７】
用語「リボザイム」とは、他の異なるＲＮＡ分子を切断し得る酵素活性を有するＲＮＡ分子であって、切断が所望の標的リボヌクレオチド配列に特異的であるものをいう。本件の場合には、標的リボヌクレオチド配列は、ＳＡＭＨＤ１タンパク質をコードする遺伝子の転写に由来するｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡの配列中に含まれる。
【００７８】
本発明のワクチンまたは免疫原性組成物は、ワクチンが指向されるべきである、レトロウイルスの少なくとも１つの抗原、またはこの抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００７９】
レトロウイルスの抗原をコードするポリヌクレオチド配列を組成物が含む場合、当該配列は、発現ベクターが真核生物中にある場合に抗原の発現を可能にする任意の発現ベクター中に含まれる。
【００８０】
選択されたワクチンまたは免疫応答が指向されるべきレトロウイルスの抗原は、好ましくは、当該レトロウイルスのタンパク質またはそのフラグメント、当該レトロウイルスのタンパク質またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、当該レトロウイルスの構造タンパク質を保有するウイルス様粒子、当該レトロウイルスのタンパク質またはペプチドフラグメントを含むリポペプチド抗原、不活化型または弱毒化型の当該レトロウイルス、およびウイルスベクターからなる群からのものである。抗原がウイルスタンパク質である場合、それは、好ましくは、エンベロープ糖タンパク質（ＨＩＶの場合におけるｇｐ１２０およびｇｐ４１）、カプシドタンパク質、マトリクスタンパク質からなる群より選ばれる構造タンパク質であり、より好ましくはエンベロープ糖タンパク質である。
【００８１】
この抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、特に、Ｋｕｍａｒ  Ｐ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１１（２）：１４４〜５３，２０１１による総説記事中に記載される発現ベクターを含む。これらの発現ベクターは、特に、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクターなどであり得る。
【００８２】
好ましくは、レトロウイルスベクターは、ＨＩＶ、ＳＩＶ、およびＦＩＶ型のレンチウイルスベクターである。これは、ワクチンの主要標的である単球および樹状細胞等の非分裂細胞を早期に活性化すべきであることから、これらのベクターがこれらの細胞に形質導入し得る特性を有するという事実を前提とするためである。レンチウイルスベクターは、好ましくはＨＩＶベクターである。この型のレンチウイルスベクターは、特に、Ｋｕｍａｒ  Ｐ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１１（２）：１４４〜５３，２０１１）による総説記事中に記載されている。好ましくは、Ｒｏｙｅｒ−Ｌｅｖｅａｕら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０５：１３３〜１４０，２００２）により以前に記載されるもの等のｐＴＲＩＰ型のレンチウイルスベクターである。
【００８３】
用語「ウイルス様粒子」は、ゲノムを有しないウイルス粒子（レトロウイルスの構造タンパク質を少なくとも含む）を意味すると理解される。ウイルス様粒子を得るための技術は、当業者に周知である。言及されるべき技術は、特に、レンチウイルスの構造タンパク質をコードするベクターの発現を、細胞中で、特に哺乳動物、昆虫、酵母、または細菌の細胞中で誘導することからなる。
【００８４】
用語「不活化型（の）レトロウイルス」とは、感染に対して正常な感受性および許容性がある標的細胞に感染する能力を有しないか、または感染に対して正常な感受性および許容性がある標的細胞中で複製サイクルを行う能力を有しない任意のウイルス粒子を意味すると理解される。
【００８５】
不活化型レトロウイルスは、当業者に周知である技術により得られうる。とりわけ、アルドリチオール−２（ａｌｄｒｉｔｈｉｏｌ−２）での処理により不活化された、または熱（例、５６℃  ３０分間を２回）により不活化されたレトロウイルスである。
【００８６】
用語「弱毒化型（の）レトロウイルス」は、ウイルス複製サイクルを終了する能力が、同じネイティブレトロウイルスのものよりも低い任意のレトロウイルスを意味すると理解される。弱毒化レトロウイルスを得るために、レトロウイルスの所定の遺伝子、特にアクセサリー遺伝子を欠失させることが可能である。例えば、ＨＩＶウイルスの場合には、ウイルスを弱毒化するように、ウイルスゲノムから、遺伝子ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒおよび／またはｖｐｕを除去することが可能である（Ｗａｔｋｉｎｓ  ＤＩ．Ｔｏｐ  ＨＩＶ  Ｍｅｄ；１８（２）：３５〜６，２０１０を参照）。
【００８７】
用語「レトロウイルスのタンパク質またはペプチドフラグメントを含むリポペプチド抗原」は、脂質基の付加により一方の端で修飾されている、レトロウイルスのタンパク質またはそのフラグメントを意味すると理解される。好ましくは、脂質基は、Ｎ−ε−パルミトイル−リシルアミド基である。リポペプチド抗原は、例えば、刊行物Ｃｏｂｂら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６５：２７〜３７，２０１１）に記載されるものである。
【００８８】
用語「偽型ウイルスベクター」は、ワクチンが指向されるべきレトロウイルスにエンベロープ糖タンパク質が由来し、一方で、当該ウイルスの残部、特に内部構成成分が別のウイルスに由来するウイルス粒子を意味すると理解される。
【００８９】
好ましい実施形態では、本発明のワクチン組成物および免疫原性組成物は、弱毒化型レトロウイルスまたはレトロウイルスベクター、ならびにＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現および／または活性の少なくとも１つの阻害剤を含む。
【００９０】
ワクチン組成物または免疫原性組成物が指向されるべきレトロウイルスは、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、レンチウイルスおよびスプーマウイルスからなる群より選ばれる属に属するレトロウイルスであり得る。
【００９１】
好ましくは、それは、以下からなる群より選ばれるレンチウイルスである：
・ウシレンチウイルス（ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ））；
・ウマレンチウイルス（ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ））；
・ネコレンチウイルス（ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびピューマレンチウイルス）；
・ヤギ／ヒツジレンチウイルス（ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、マエディビスナウイルス（ＭＶＶ））；ならびに
・霊長類レンチウイルス（１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−２）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ））。
【００９２】
レンチウイルスは、より好ましくはＨＩＶ、有利にはＨＩＶ−１である。
【００９３】
抗原は、ワクチン組成物または免疫原性組成物が指向されるべきレトロウイルスと同じ起源のものとなるように選択される。
【００９４】
好ましくは、抗原は、レンチウイルス抗原、有利にはＨＩＶ−１のものである。
【００９５】
ワクチン組成物および免疫原性組成物は、投与に適切であり得る任意の形態であり得る。代表的には、本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、注射可能な形態（液体溶液の形態、または懸濁液の形態のいずれか）、注射前に液体中に懸濁または溶解されるために適切である固体形態に調製される。
【００９６】
医薬として許容され得る賦形剤、すなわち、被検体に対して有害な生理学的効果を何ら有さず、かつワクチン中に存在するマイコバクテリアの生存に適合性であるものが、使用され得る。引用されるべきこれらの賦形剤には、水、生理食塩溶液（生理食塩水）、グリセロールが含まれる。
【００９７】
ワクチンまたは免疫原性組成物はまた、ｐＨ緩衝剤等の微量の補助的物質、またはワクチチン中に存在するマイコバクテリアに対する免疫応答を刺激、活性化、拡張、亢進、増強および／または調節することによりワクチンの効力を改善する機能を果たすアジュバントを含んでいてもよい。ヒト医薬に用いられるアジュバント、特に、生弱毒化ワクチンの場合に一般に用いられるものは、当業者に周知である。特に、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム、スクアレン、トコフェロール、ヒドロキシアパタイト、完全および不完全フロイントアジュバント、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、リンホカイン（特にＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１およびＩＬ−１２）、Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ株由来の細胞壁について言及されるべきである。
【００９８】
ＳＡＭＨＤ１の発現および／または活性の調節剤
本発明はまた、レトロウイルスによる疾患の治療および／または予防におけるその使用のための、ＳＡＭＨＤ１の発現および／または活性の調節剤に関する。
【００９９】
用語「ＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現の調節剤」は、このタンパク質の発現の向上または阻害のいずれかをし得る任意の化合物を意味すると理解される。用語「ＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現」は、ＳＡＭＨＤ１をコードする遺伝子からのｍＲＮＡの転写、またはｍＲＮＡからのＳＡＭＨＤ１タンパク質（配列番号１）へのｍＲＮＡの翻訳を意味すると理解される。同様に、用語「ＳＡＭＨＤ１タンパク質の活性の調節剤」は、ＳＡＭＨＤ１タンパク質の活性の増幅または阻害を意味すると理解される。
【０１００】
ＳＡＭＨＤ１の発現および／または活性の調節剤は、本発明のスクリーニング方法により単離され得る。
【０１０１】
ＳＡＭＨＤ１の発現および／または活性のタンパク質の調節剤がＳＡＭＨＤ１の発現および／または活性の阻害剤である場合、それは、好ましくは、ワクチン組成物において本明細書で上記のとおり定義したような阻害剤、すなわち、化学低分子、ＳＡＭＨＤ１  ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡに対する干渉性ＲＮＡ、ＳＡＭＨＤ１をコードする遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＳＡＭＨＤ１  ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡに対するリボザイム、抗ＳＡＭＨＤ１抗体（好ましくはヒト化抗体）、または抗ＳＡＭＨＤ１抗体誘導体、およびアプタマーからなる群より選ばれる阻害剤である。
【０１０２】
阻害剤がタンパク質のレベルで作用し、かつこの遺伝子またはＳＡＭＨＤ１転写物のレベルで作用しない場合、それは、好ましくは、ＳＡＭＨＤ１の「ＨＤｃ」ドメインを標的とし、有利には、その活性を不活化するために、ＳＡＭＨＤ１のホスホヒドロラーゼドメインの活性部位を標的とする。
【０１０３】
ＳＡＭＨＤ１の発現および／または活性の調節剤は、治療有効量において用いられる。レトロウイルスに既に感染した被検体では、用語「治療有効量」は、疾患が増悪レベルへと進行することを防ぐのに十分、または疾患の退行を引き起こすのに十分である化合物の量を意味すると理解される。非感染被検体では、「治療有効量」は、当該レトロウイルスと接触した被検体を保護し、かつこのレトロウイルスにより引き起こされる疾患の発生を防ぐのに十分である量である。投与されるべき調節剤の厳密な量は、処置されるべき被検体の年齢および体重、疾患のタイプ、疾患のステージ、被検体の状態、投与様式、投与頻度、ならびに阻害剤を含む組成物中に存在する他の成分に応じて変動する。
【０１０４】
疾患は、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、レンチウイルスおよびスプーマウイルスからなる群より選ばれるレトロウイルスにより引き起こされる。
【０１０５】
好ましくは、疾患は、以下からなる群より選ばれるレンチウイルスであるレトロウイルスにより引き起こされる：
・ウシレンチウイルス（ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ））；
・ウマレンチウイルス（ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ））；
・ネコレンチウイルス（ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびピューマレンチウイルス）；
・ヤギ／ヒツジレンチウイルス（ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、マエディビスナウイルス（ＭＶＶ））；ならびに
・霊長類レンチウイルス（１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−２）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ））。
【０１０６】
より好ましくは、疾患を引き起こすレンチウイルスは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶウイルスから選ばれる霊長類レンチウイルスである。有利には、それは、ＨＩＶ−１ウイルスである。
【０１０７】
レトロウイルス形質導入および形質導入キット
本発明者らは、ＳＡＭＨＤ１タンパク質が、このタンパク質の発現細胞において、特に樹状細胞および単球系譜の細胞において、ＨＩＶ−１の複製サイクルの阻害を担うことを示した。したがって、ＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現および／または活性の阻害は、レトロウイルスベクターによるこれらの細胞の形質導入の効率を向上させることを可能にする。
【０１０８】
したがって、本発明の目的はまた、レトロウイルス発現ベクター、好ましくはレンチウイルス発現ベクター、より好ましくはＨＩＶ−１発現ベクターによるＳＡＭＨＤ１発現細胞の形質導入を向上させるための、ＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現および／または活性の阻害剤のインビトロまたはエキソビボ使用に関する。
【０１０９】
本発明の別の目的は、ＳＡＭＨＤ１発現細胞、好ましくは単球系譜からの細胞または樹状細胞に、レトロウイルス発現ベクター、好ましくはレンチウイルス発現ベクターを形質導入するためのキットに関し、以下を含む：
・ＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現および／または活性の阻害剤；
・レトロウイルス発現ベクター、好ましくはＶｐｘタンパク質を天然に発現しないレトロウイルス発現ベクター、より好ましくはさらにＶｐｘタンパク質を天然に発現しないレンチウイルス発現ベクター、より好ましくはＨＩＶ−１発現ベクター。
【０１１０】
キット中に存在する阻害剤は、本特許出願中に先に記載したような任意の阻害剤であり得る。
【０１１１】
本発明のインビトロまたはエキソビボ使用およびキットの好ましい実施形態では、用いられるレトロウイルス発現ベクターは、ＳＡＭＨＤ１発現細胞で発現されるべきである目的タンパク質をコードする。
【０１１２】
本発明の状況では、用語「形質導入」または「形質導入する」は、レトロウイルスに感染した際、宿主細胞中にレトロウイルスのゲノムＲＮＡが移入されること、続いて宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得るように、かつ、必要に応じて、ベクターが目的タンパク質をコードする場合にはこのようなタンパク質を発現し得るように、ゲノムＲＮＡが二本鎖ＤＮＡへと逆転写されることを意味すると理解される。
【０１１３】
レトロウイルス発現ベクターは、任意のレトロウイルスベクターであり、特に、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、レンチウイルスおよびスプーマウイルスからなる群より選ばれるレトロウイルスベクターである。レトロウイルス発現ベクターは、好ましくは、以下からなる群より選ばれるレンチウイルス発現ベクターである：
・ウシレンチウイルス（ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ））；
・ウマレンチウイルス（ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ））；
・ネコレンチウイルス（ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびピューマレンチウイルス）；
・ヤギ／ヒツジレンチウイルス（ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、マエディビスナウイルス（ＭＶＶ））；ならびに
・霊長類レンチウイルス（１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−２）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ））。
【０１１４】
レンチウイルス発現ベクターは、最も好ましくは、１型免疫ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−２）、またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）である。有利には、それは、ＨＩＶ−１である。
【０１１５】
好ましくは、ＳＡＭＨＤ１発現細胞は、樹状細胞、ならびに単球細胞系譜の細胞、特に単球およびマクロファージからなる群より選ばれる。
【０１１６】
本発明はまた、ＳＡＭＨＤ１発現細胞に目的タンパク質を発現させるための方法に関する。この方法は、以下の工程を含む：
ｉ）ＳＡＭＨＤ１発現細胞を、ＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現および／または活性の阻害剤と配置すること；
ｉｉ）工程ｉ）からのＳＡＭＨＤ１発現細胞を、目的タンパク質をコードするレトロウイルス発現ベクター、好ましくはレンチウイルス発現ベクターに感染させること；
ｉｉｉ）必要に応じて、ＳＡＭＨＤ１発現細胞が目的タンパク質を実際に発現することを保障するために、例えば、目的タンパク質に特異的な抗体を利用するウエスタンブロットまたは免疫蛍光試験によりチェックすること。
【０１１７】
一実施形態では、工程ｉ）およびｉｉ）は、同時に行われる。
【０１１８】
本発明の方法の特定の実施形態では、ＳＡＭＨＤ１発現細胞は、被検体から、例えば、被検体の末梢血から得られた。それらは、例えば、白血球アフェレーシス（Ｃｏｂｂら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６５：２７−３７，２０１１を参照）により単離することができ、または特にそれらの粒子サイズおよび／またはこれらの細胞に特異的な表面マーカーに基づいて、フローサイトメトリにより選別することができる。樹状細胞の場合、特異的マーカーとしては、特に、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ８３が挙げられる。単球およびマクロファージの場合、ＣＤ１４マーカーが特に言及されるべきである。
【０１１９】
有利な実施形態では、本方法は、工程ｉｉ）（または工程ｉｉｉ））で得られた被検体に由来するＳＡＭＨＤ１発現細胞を当該被検体に再移植する最終工程を含む。この方法は、ＳＡＭＨＤ１を発現する被検体の細胞により、好ましくは樹状細胞および／または単球系譜の細胞により、被検体において目的タンパク質の発現を誘導することを目的とする遺伝子療法の状況において特に興味深い。
【０１２０】
本発明の別の目的は、その予防、当該疾患の治癒、その症状の低下、および／またはこの疾患に罹患している患者の健康を改善することを目的タンパク質の発現が可能にする疾患を治療および／または予防するための医薬としてのその使用のために、本発明にしたがって目的タンパク質を発現させるための方法により得ることができる目的タンパク質をコードするＳＡＭＨＤ１発現細胞の使用に関する。
【０１２１】
目的タンパク質は、とりわけ、微生物が関与する疾患を治療または予防することを可能にする微生物の抗原、例えば、細菌抗原、ウイルスまたは酵母由来抗原であり得る。タンパク質はまた、癌細胞（この細胞はその後、抗腫瘍療法の範囲内で使用される）により特異的に発現される抗原であり得る。
【０１２２】
１型インターフェロンの発現の誘導
本発明者らは今回、樹状細胞における干渉性ＲＮＡによるＳＡＭＨＤ１発現の阻害が、如何なる感染の非存在下でも、１型インターフェロンの発現および分泌を活性化したことを示した。
【０１２３】
用語「１型インターフェロン」は、アルファインターフェロンおよびベータインターフェロンを意味すると理解される。
【０１２４】
したがって、本発明の目的は、ＳＡＭＨＤ１タンパク質の天然発現細胞において１型インターフェロンの発現を誘導する、ＳＡＭＨＤ１タンパク質（配列番号１）の発現および／または活性の阻害剤のインビトロまたはエキソビボ使用に関する。
【０１２５】
さらに、１型インターフェロンは、生来の抗ウイルス免疫応答に関与することから、本発明はまた、ＳＡＭＨＤ１タンパク質の天然発現細胞において１型インターフェロンの発現を誘導するための、好ましくは、ウイルス感染、特にレトロウイルス感染、例えばＨＩＶウイルスによる感染の間に生来の免疫応答を誘導するための医薬としての使用のための、ｉ）ＳＡＭＨＤ１タンパク質の発現の阻害剤、およびｉｉ）ＳＡＭＨＤ１タンパク質の活性の阻害剤から選ばれる化合物に関する。
【０１２６】
ＳＡＭＨＤ１タンパク質天然発現細胞は、好ましくは、樹状細胞、および／または単球細胞系譜の細胞である。
【０１２７】
レトロウイルスによる感染に対する耐性の誘導
本発明の別の目的は、ＳＡＭＨＤ１タンパク質非天然発現細胞において、レトロウイルス、好ましくはレンチウイルス属のレトロウイルスによる感染に対する耐性を誘導するためのインビボ、インビトロまたはエキソビボ方法に関する。当該方法は、以下の工程：
・当該ＳＡＭＨＤ１タンパク質非天然発現細胞に、ＳＡＭＨＤ１タンパク質をコードする配列を導入すること；
・必要に応じて、ＳＡＭＨＤ１の発現を検証することを含み、
ＳＡＭＨＤ１タンパク質発現細胞は、レトロウイルスによる感染に対して耐性である。
【０１２８】
ＳＡＭＨＤ１タンパク質をコードする配列は、ＳＡＭＨＤ１に対応する遺伝子またはｃＤＮＡであり得る。
【０１２９】
本発明の状況において、用語「レトロウイルスによる感染に対する耐性」は、同様のＳＡＭＨＤ１非発現細胞（すなわち、ＳＡＭＨＤ１をコードする遺伝子が導入されていない細胞）で観察される複製速度と比較して、細胞中のレトロウイルスの複製が低減することを意味すると理解される。好ましくは、レトロウイルスの複製の減少は、少なくとも１０％、好ましくは３０％、より好ましくは少なくとも５０％、および有利には少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％である。
【０１３０】
レトロウイルスの複製は、当業者に周知である技術により測定することができる。例えば、レトロウイルスの複製の測定は、当該レトロウイルスの配列に特異的にハイブリダイズするプライマーを用いる定量的ＰＣＲにより、逆転写酵素活性の定量により、および／またはウイルス抗原の定量により、行うことができる。
【０１３１】
本発明はまた、被検体におけるレトロウイルス感染を治療または予防するための方法に関する。この方法は、以下の工程を含む：
ｉ）処置されるべき被検体の細胞に、ＳＡＭＨＤ１タンパク質をコードする配列を導入すること、ここで、当該細胞は、ＳＡＭＨＤ１タンパク質を天然に発現しておらず、かつ、感染の間にレトロウイルスの標的細胞であるか、またはレトロウイルスの標的細胞に分化する能力がある細胞である；
ｉｉ）必要に応じて、ＳＡＭＨＤ１をコードする遺伝子の配列が導入されている細胞においてＳＡＭＨＤ１の発現を制御すること、ここで、ＳＡＭＨＤ１タンパク質発現細胞は、レトロウイルスによる感染に対して耐性である；ならびに
ｉｉｉ）工程ｉ）（またはｉｉ）で得られたＳＡＭＨＤ１発現細胞を被検体に再移植すること。
【０１３２】
用語「感染の間の（に）レトロウイルスの標的細胞」は、ウイルスに自然感染する任意の細胞を意味すると理解される。例えば、ＨＩＶウイルスによる感染の場合、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球が特に言及される。
【０１３３】
用語「再移植」とは、被検体への細胞の投与をいう。ＣＤ３４＋幹細胞の場合、それは、これらの細胞を受容するように準備された患者の骨髄中に再注入されるＣＤ３４＋細胞による再構成をいう（Ｓｅｒｒａｎｏら，Ｃｕｒｒ  ＨＩＶ／ＡＩＤＳ  Ｒｅｐ．，７（３）：１７５〜８４，２０１０による総説記事を参照）。
【０１３４】
本発明の別の目的は、被検体におけるレトロウイルスにより引き起こされる疾患を治療または予防するための医薬としてのその使用のための、ＳＡＭＨＤ１タンパク質をコードする配列が導入されているＳＡＭＨＤ１タンパク質非天然発現細胞であって、当該細胞が感染の間のレトロウイルスの標的細胞であるか、またはレトロウイルスの標的細胞に分化する能力があるものに関する。
【０１３５】
特に有利な実施形態では、細胞は、自己細胞、すなわち、レトロウイルスにより引き起こされる疾患を治療または予防するための医薬として細胞が使用される被検体に由来するものである。したがって、本発明はまた、被検体におけるレトロウイルスにより引き起こされる疾患を治療または予防するための医薬としてのその使用のための、ＳＡＭＨＤ１タンパク質をコードする配列が導入されているＳＡＭＨＤ１タンパク質非天然発現被検体細胞であって、当該細胞が感染の間のレトロウイルスの標的細胞であるか、またはレトロウイルスの標的細胞に分化する能力があるものに関する。
【０１３６】
被検体は、好ましくは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、特に非ヒト霊長類、ネコ、ヤギである。
【０１３７】
一般的な観点では、被検体は、レトロウイルスおよびこのレトロウイルスの宿主特異性に基づいて選択される。例えば、ＨＩＶウイルスについて被検体はヒトであり、ＦＩＶについて被検体はネコである、などである。
【０１３８】
上述したような、レトロウイルスによる感染に対する耐性を誘導するためのインビボ、インビトロまたはエキソビボ方法、および被検体においてレトロウイルスにより引き起こされる感染を治療または予防するための方法、ならびにＳＡＭＨＤ１タンパク質をコードする配列が導入されているＳＡＭＨＤ１タンパク質非天然発現細胞の使用の状況内では、レトロウイルスは、特に、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、レンチウイルスおよびスプーマウイルスからなる群より選ばれる属に属するレトロウイルスである。レトロウイルスは、好ましくは、以下からなる群より選ばれるレンチウイルスである：
・ウシレンチウイルス（ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ））；
・ウマレンチウイルス（ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ））；
・ネコレンチウイルス（ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびピューマレンチウイルス）；
・ヤギ／ヒツジレンチウイルス（ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、マエディビスナウイルス（ＭＶＶ））；ならびに
・霊長類レンチウイルス（１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−２）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ））。
【０１３９】
レンチウイルスは、より好ましくは、１型免疫ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−２）、またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）である。有利には、それは、Ｖｐｘタンパク質を天然に発現しないＨＩＶ−１またはＳＩＶウイルスである。
【０１４０】
好ましくは、ＳＡＭＨＤ１タンパク質非天然発現細胞は、ｉ）その後に分裂してリンパ系細胞、特にＣＤ４＋  Ｔリンパ球細胞、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球細胞、Ｂリンパ球細胞、形質細胞様樹状細胞を生成するリンパ系幹細胞；およびｉｉ）その後に分裂して骨髄細胞系譜の細胞、特に単球を生成する骨髄幹細胞に分化する能力がある造血幹細胞である。造血幹細胞は、特に、免疫学的マーカーＣＤ３４およびＴｈｙ１（ＣＤ３４＋およびＴｈｙ１＋細胞）の発現、ならびにマーカーＣＤ３３発現の非存在（ＣＤ３３−細胞）により特徴付けられる。これらの細胞は、当業者に周知の技術により、特に骨髄から、また、表面マーカー、特にＣＤ３４に基づいてフローサイトメトリにより細胞を選別することにより末梢血から、単離され得る。
【０１４１】
好ましい実施形態では、当該ＳＡＭＨＤ１タンパク質非発現細胞におけるＳＡＭＨＤ１タンパク質をコードする配列の導入は、遺伝子療法で一般的に使用される遺伝子移入ベクターにより行われる。これらのなかでも特に注目すべき価値があるものは、アデノウイルスおよびレトロウイルスベクター等のウイルスベクター、ならびにプラスミド発現ベクター等の非ウイルスベクターである（Ｅｌｓａｂａｈｙら，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ，２０１１年２月３日，ＰＭＩＤ：２１２９１３８１）。
【０１４２】
ＳＡＭＨＤ１タンパク質をコードする遺伝子が宿主細胞のゲノムに組み込まれることが所望される場合、レトロウイルスベクター、好ましくはレンチウイルス発現ベクターが、使用されるべきである。
【０１４３】
本発明の別の目的は、ＳＡＭＨＤ１タンパク質をコードするＳＡＭＨＤ１配列が導入されており、それにより組換えＳＡＭＨＤ１タンパク質を発現する、ＳＡＭＨＤ１タンパク質天然発現または非天然（もしくは低）発現細胞に関する。好ましくは、細胞は、ＳＡＭＨＤ１タンパク質非天然発現細胞、またはこのタンパク質を低発現しかしない細胞である。特に言及されるべきは、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球細胞、および幹細胞である。
【０１４４】
当該ＳＡＭＨＤ１タンパク質天然または非天然（または低）発現細胞におけるＳＡＭＨＤ１タンパク質をコードする配列の導入は、当業者に周知の発現ベクター、例えば、この配列を含むレトロウイルスベクターを用いて行われる。
【０１４５】
好ましくは、ＳＡＭＨＤ１タンパク質非天然（または低）発現細胞は、ｉ）その後に分裂して、特にＣＤ４＋  Ｔリンパ球細胞、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球細胞、Ｂリンパ球細胞、形質細胞様樹状細胞を含むリンパ系細胞を生成するリンパ系幹細胞；およびｉｉ）その後に分裂して骨髄細胞系譜の細胞、特に単球を生成する骨髄幹細胞に分化する能力がある造血幹細胞である。
【０１４６】
樹状細胞におけるＳＡＭＨＤ１発現の阻害が１型インターフェロン発現を誘導する一方で、また、これらの細胞をＨＩＶ−１による感染に対してより感受性にすることを示す非限定的実施例を参照する以下のさらなる記載の補助により、本発明はより良く理解される。
【実施例】
【０１４７】
実施例１：材料および方法
ＨＡおよびＦｌａｇペプチドによるタグを付されたＶｐｘを安定的に発現するＴＨＰ−１安定細胞株（本明細書中以降、ｅＶｐｘと省略）を、目的のタンパク質および選択マーカー（ＩＬ２−ＩＬ２Ｒαレセプターのα鎖）の発現を可能にする２シストロン性転写単位を含むレトロウイルスベクターＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）を用いることにより作製した。
【０１４８】
レトロウイルスベクターを形質導入した細胞を、ＩＬ２Ｒαを認識する抗体とカップリングさせた磁気ビーズで選択した。
【０１４９】
ＳＡＭＨＤ１分解に対するＶｐｘの効果を観察することを可能にする細胞抽出液を、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＫＣＬ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノールおよび０．５ｍＭのＰＭＳＦを含む溶解緩衝液で調製した。
【０１５０】
ｅＶｐｘ免疫沈降を、ＦｌａｇまたはＨＡタグを特異的に認識する抗体の使用により行った。免疫沈降物を、過剰のＨＡまたはＦｌａｇペプチドを用いたネイティブ条件下で溶出させた。
【０１５１】
感染を、ｉ）水疱性口内炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質で偽型にした、Ｎｅｆをコードする遺伝子の代わりにルシフェラーゼをコードする遺伝子を含むＨＩＶウイルス（ＨＩＶ−ＬＵＣ−Ｇ）、またはｉｉ）水疱性口内炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質で偽型にした野生型ＨＩＶウイルス（ＨＩＶ−Ｇ）のいずれかにより行った。
【０１５２】
感染を行うために用いたウイルス用量を、ウイルス産生細胞中に含まれるｐ２４タンパク質（Ｇａｇ成分）のアッセイにより測定し、感染前に標準化した。
【０１５３】
ＨＩＶ−ＬＵＣ−Ｇでの実験については、１ｎｇ（ＨｅＬａ細胞について）または
１００ｎｇ（ＴＨＰ−１細胞について）の用量を用いた。ＨＩＶ−Ｇでの実験については、１００ｎｇの用量を用いた。
【０１５４】
ＲＮＡ干渉実験は、配列番号３（５’ＧＡＵＵＣＡＵＵＧＵＧＧＣＣＡＵＡＵＡ３’）、および４（５’ＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＵＧＣＡＧＡＵＡＡ３’）に対するｓｉＲＮＡｓ（初代樹状細胞において）、またはＳＡＭＨＤ１を特異的に標的とするｓｈＲＮＡ（センス鎖  ５’ＣＧＣＡＧＧＡＵＧＧＣＧＡＵＧＵＵＡＵ３’（配列番号５）；アンチセンス鎖  ５’ＡＵＡＡＣＡＵＣＧＣＣＡＵＣＣＵＧＣＧ３’（配列番号６）（ＴＨＰ−１細胞において）を用いて行った。安定ＴＨＰ−１細胞株を、ｓｈＲＮＡをコードするベクター中に含まれるピューロマイシン選択マーカーにより樹立した。
【０１５５】
健常ドナー（ＨＤ）に由来する初代樹状細胞に対して行われた実験については、ＳＡＭＨＤ１発現の消失を、一過的様式で行った。
【０１５６】
ＳＡＭＨＤ１変異体を、部位特異的変異誘発のための標準プロトコルにしたがって作製した。これらの変異体、および野生型ＳＡＭＨＤ１をコードする配列を、レトロウイルスベクター中に導入した。
【０１５７】
野生型ＳＡＭＨＤ１およびそれに由来する変異体の発現を、これらのレトロウイルスベクターを用いる形質導入により行った。
【０１５８】
初代樹状細胞を、ＣＤ１４選別により、健常ドナーの末梢血単核細胞から精製し、続いてその実験使用前にサイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４）で６日間刺激した。
【０１５９】
実施例２：結果
文献は、レンチウイルスによる、特にＨＩＶ−１による感染を制限し得る、樹状細胞およびマクロファージ中で発現している未同定の細胞因子の存在を示している。この因子の作用は、ＨＩＶ−２により、およびＳＩＶの所定の株により発現されるウイルス性タンパク質Ｖｐｘにより中和される。Ｖｐｘタンパク質は、プロテアソーム分解について、それを標的とすることによりこの制限因子の分解を誘導する。
【０１６０】
この細胞因子を見出すために、ＨＡおよびＦｌａｇエピトープに融合したＶｐｘ（ｅＶｐｘ）を発現する非許容ＴＨＰ１細胞を作製した。
このように作製されたＴＨＰ１細胞を溶解し、その後、Ｆｌａｇエピトープに対する抗体を用いて、続いてＨＡエピトープに特異的な抗体の使用による２次免疫精製により、二重免疫精製技術を細胞溶解液に適用した。
【０１６１】
免疫沈降の生成物を、ポリアクリルアミドゲル、続いてクマシーブルー染色によるタンパク質染色で解析した。ｅＶｐｘと相互作用するタンパク質を、質量分析により同定した。
【０１６２】
その結果、ＳＡＭＨＤ１タンパク質を、主要なＶｐｘ相互作用物として同定した。
【０１６３】
Ｖｐｘタンパク質の免疫沈降、続いて特異的抗体を用いることによるＳＡＭＨＤ１タンパク質の検出により、相互作用を検証した。この目的のため、非許容ＴＨＰ１細胞に、ＦｌａｇおよびＨＡタグ化Ｖｐｘを発現するベクター（ｅＶｐｘ）（図１、レーン２を参照）または空ベクター（図１、レーン１を参照）を形質導入した。
【０１６４】
細胞抽出液を調製し、ＦｌａｇおよびＨＡタグ特異的抗体を用いた二重免疫沈降反応に供した。免疫沈降物を、アクリルアミドゲルで解析し、ＳＡＭＨＤ１の存在を、ＳＡＭＨＤ１特異的抗体を用いたウエスタンブロット解析により試験した（図１．Ａを参照）。ｅＶｐｘ発現細胞から調製した総細胞抽出液（「ＷＣＥ」）（図１、レーン４を参照）、または非発現細胞から調製した総細胞抽出液（「ＷＣＥ」）（図１、レーン３）を、示されるように、アクリルアミドゲル、続いて抗ＳＡＭＨＤ１、Ｆｌａｇまたはチューブリン抗体を用いるウエスタンブロット解析で解析した（図１．Ｂを参照）。
【０１６５】
免疫沈降の結果を、図１に提示する。
【０１６６】
図１は、Ｖｐｘが内因性ＳＡＭＨＤ１タンパク質と相互作用することを示す（図１．Ａを参照）。Ｖｐｘ発現細胞または非発現細胞の抽出液中のＳＡＭＨＤ１の定量もまた、ＶｐｘがＳＡＭＨＤ１の分解を誘導することを実証する（図１．Ｂ）。
【０１６７】
次いで、特定のｓｈＲＮＡを用いるＳＡＭＨＤ１発現の阻害がＨＩＶ−１ウイルスによる感染に対してＴＨＰ１細胞を許容にするかどうかを測定する目的のため、実験を行った。
【０１６８】
これを行うため、ＴＨＰ１細胞に、コントロールｓｈＲＮＡ（Ｓｃｒ）（ネガティブコントロール）、またはＳＡＭＨＤ１特異的ｓｈＲＮＡを形質導入して、その発現を阻害するようにした。形質導入されたＴＨＰ１に、ルシフェラーゼを発現するＨＩＶ−１を感染させ（ＨＩＶ−ＬＵＣ−Ｇのカラム）、または感染させなかった（「ＮＩ」のカラム）。感染を、細胞抽出液におけるルシフェラーゼ活性の測定により定量した。
【０１６９】
結果を図２に提示する。
【０１７０】
ＨＩＶ−１非許容細胞（分化したヒト単球細胞株ＴＨＰ１の細胞）におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によるＳＡＭＨＤ１発現の阻害は、ＨＩＶ−１に対して当該細胞を許容にした（図２．Ａ）。ＳＡＭＨＤ１レベルがＲＮＡｉにより低減している細胞中でのＲＮＡｉ耐性型ＳＡＭＨＤ１（ＳＡＭＨＤ１−Ｒタンパク質）の過剰発現は、これらの細胞がそれらのＨＩＶ非許容表現型を回復することを可能にする（図２．Ｂ）。
【０１７１】
このタンパク質を構成的に発現しない細胞、即ち、ＨｅＬａ細胞の感染に対するＳＡＭＨＤ１の過剰発現の効果を次いで評価した。
この目的のため、ＨｅＬａ細胞に、空ベクター、またはＳＡＭＨＤ１タンパク質を発現するベクター、もしくはホスホヒドロラーゼ活性（ＲＮａｓｅ）を示すその「ＨＤｃ」ドメイン内で変異させたＳＡＭＨＤ１を発現するベクター（Ｓａｍｈｄ１−ＨＤ／ＡＡ）を形質導入した。トランスフェクトした細胞に、ルシフェラーゼ発現ＨＩＶ−１を感染させた。これらの細胞の感染を、ルシフェラーゼ活性をアッセイすることにより測定した。
【０１７２】
結果を図３に提示する。
【０１７３】
この図は、ＨＩＶ−１許容細胞（ＨｅＬａ細胞）中でのＳＡＭＨＤ１の過剰発現により、当該細胞が非許容となることを示す（図３、「ＷＴ」のカラム）。興味深い様式において、ホスホヒドロラーゼ活性を示さない変異型ＳＡＭＨＤ１の過剰発現は、ウイルス複製に如何なる効果も奏しなかった（図３、「ＨＤ／ＡＡ」のカラム）。この結果は、ＨＩＶ−１の制限におけるＳＡＭＨＤ１の酵素活性（ホスホヒドロラーゼ活性）の重要性を示す。
【０１７４】
健常ドナーの血液から単離された単核細胞に由来する初代樹状細胞におけるＳＡＭＨＤ１の関与もまた、試験した。
【０１７５】
この目的のため、健常ドナー（ＨＤ）の血液からの末梢細胞を精製し、エキソビボで樹状細胞に分化させた。これらの細胞を、ＳＡＭＨＤ１を特異的に標的とする２つの異なるｓｉＲＮＡ（配列番号３および４にそれぞれ対応するｓｉＲＮＡ）（図４、それぞれカラム１および２を参照）で処理し、または処理せず（ライン  Ｓｃｒ）、次いで、ｐ２４陽性細胞の百分率を、フローサイトメトリにより測定した。
【０１７６】
これらの結果を、図４．Ａに提示する。
【０１７７】
この図は、ＳＡＭＨＤ１を特異的に標的とするｓｉＲＮＡのいずれかによる処理が、野生型ウイルスによる感染後の細胞内でＧａｇ（ｐ２４）の産生における向上を生じることを示しており、これは、ＨＩＶ−１による初代細胞のウイルス形質導入および感染性における向上に反映される。
【０１７８】
同様の実験を、Ｒｏｙｅｒ−Ｌｅｖｅａｕら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０５：１３３〜１４０，２００２）により以前に記載されたレンチウイルスベクターｐＴＲＩＰを用いることにより、２人の健常ドナー（「ＨＤ１」および「ＨＤ４」）の血液から単離された単球細胞に由来する初代樹状細胞の使用に関して行った。
【０１７９】
これらの結果を、図４．Ｂに提示する。
【０１８０】
この図は、ベクターｐＴＲＩＰによる感染が２人の健常ドナーの初代樹状細胞において大きく向上すること、およびこれがＳＡＭＨＤ１を特異的に標的とする用いたｓｉＲＮＡの種類と無関係にそうなることを明らかに示す。この結果は、ＳＡＭＨＤ１発現が阻害される場合に、レンチウイルスベクターｐＴＲＩＰの形質導入が樹状細胞において向上することを示す。
【０１８１】
結論として、ＳＡＭＨＤ１タンパク質は、樹状細胞およびマクロファージにより発現されるレンチウイルスによる感染を制限し、かつその活性がＶｐｘにより中和される制限因子として同定された。樹状細胞およびマクロファージは、免疫応答の発達に重要な役割を果たす。それらは、抗原提示細胞である。それらは、協調的かつ持続性応答を保障し、それにより感染因子に対する身体の保護を可能にするために必要である。幾つかの研究は、現在のワクチンの非有効性が樹状細胞およびマクロファージのＨＩＶ−１感染の制限に主に起因することを示唆する。これらの細胞により発現される制限因子としてのＳＡＭＨＤ１の同定は、したがって、一般的にレンチウイルス、特にＨＩＶ−１ウイルスに対する有効なワクチンの開発のために重要である。さらに、この発見は、遺伝子療法の目的のため、またはインビトロ実験のため、レンチウイルスベクターによるＳＡＭＨＤ１タンパク質発現細胞の形質導入を改善することを可能にする。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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