(57)【要約】ポリペプチド及びタンパク質コンストラクトを提供し、それらはＩｇＥに対して向けられている。特定の局面において、ＩｇＥに対するナノボディを記載し、血清アルブミン結合ペプチドに連結されている。さらに記載するのは、そのようなポリペプチド及びタンパク質コンストラクトをコードする核酸；そのようなポリペプチド及びタンパク質コンストラクトを含む組成物、特に医薬組成物；ならびに、そのようなポリペプチド、タンパク質コンストラクト、及び組成物の使用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）３９Ｄ１１（配列番号１１９）と、（ヒト）ＩｇＥへの結合について競合し、及び／又は（ｉｉ）（ヒト）ＩｇＥ上で３９Ｄ１１と同じエピトープに結合し；及び／又は（ｉｉｉ）（ヒト）ＩｇＥへの３９Ｄ１１の結合を交差遮断する免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項２】
請求項１記載の免疫グロブリンの単一可変ドメインであって、以下：
ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＤＭＳ（配列番号１３４）及び／又はアミノ酸配列ＮＹＤＭＡ（配列番号１３５）あるいは（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＹＤＭＳ（配列番号１３４）及び／又はアミノ酸配列ＮＹＤＭＡ（配列番号１３５）とわずか３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるＣＤＲ１；及び／又は
ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＩＤＴＧＧＤＩＴＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３６）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＩＤＴＧＧＤＩＴＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３６）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、少なくとも９４%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＳＩＤＴＧＧＤＩＴＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３６）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるＣＤＲ２；及び／又は
ｃ）（ｉ）アミノ酸配列ＤＥＤＹＡＬＧＰＮＥＹＤＹ（配列番号１３７）及び／又はアミノ酸配列ＤＥＥＹＡＬＧＰＮＥＦＤＹ（配列番号１３８）あるいは（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＥＤＹＡＬＧＰＮＥＹＤＹ（配列番号１３７）及び／又はアミノ酸配列ＤＥＥＹＡＬＧＰＮＥＦＤＹ（配列番号１３８）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、少なくとも９２%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＥＤＹＡＬＧＰＮＥＹＤＹ（配列番号１３７）及び／又はアミノ酸配列ＤＥＥＹＡＬＧＰＮＥＦＤＹ（配列番号１３８）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるＣＤＲ３
を含む又はそれらから本質的になる、免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項３】
ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＳＹＤＭＳ（配列番号１３４）及び、好ましくは、アミノ酸配列ＮＹＤＭＡ（配列番号１３５）を含む又はそれから本質的になり、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＳＩＤＴＧＧＤＩＴＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３６）を含む又はそれから本質的になる；及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＤＥＤＹＡＬＧＰＮＥＹＤＹ（配列番号１３７）及び、好ましくは、アミノ酸配列ＤＥＥＹＡＬＧＰＮＥＦＤＹ（配列番号１３８）を含む又はそれから本質的になる、請求項１又は２のいずれか記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項４】
アミノ酸配列３９Ｄ１１（配列番号１１９）と少なくとも７０%、例えば少なくとも８０%など、例えば、少なくとも８５%、例えば少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有する、請求項１〜３のいずれか一項記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項５】
Ｅ１Ｄ、Ｖ５Ｌ、Ｅ６Ｑ、Ｆ２９Ｙ、Ｓ３１Ｎ、Ｓ３５Ａ又はＳ３５Ｇ、Ｇ４４Ｒ、Ｎ７５Ｋ、Ｍ７７Ｔ又はＭ７７Ｌ、Ｋ８３Ｒ、Ｗ９１Ｙ、Ｄ９７Ｅ、Ｙ１００ｅＦ、及び／又はＱ１０８Ｌ（Ｋａｂａｔに従ったナンバリングによる）から選択される１つ又は複数の変異（配列番号１１９と比較し）を含む、３９Ｄ１１のヒト化及び／又は配列最適化した変異体である、請求項１〜４のいずれか一項記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項６】
配列番号１２０〜１３３のいずれか、あるいは、配列番号１２０〜１３３のいずれかと少なくとも７０%、例えば少なくとも８０%など、例えば、少なくとも８５%、例えば少なくとも９０%又は９５%を上回る、などの配列同一性を有する免疫グロブリンの単一可変ドメインより選択される、請求項１〜５のいずれか一項記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項７】
配列番号１２８及び１２９より選択される、請求項１〜６のいずれか一項記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン。
【請求項８】
（ｉ）請求項１〜７のいずれか一項記載の少なくとも１つの（例えば１つ又は２つなど）免疫グロブリンの単一可変ドメイン及び（ｉｉ）少なくとも１つの他のアミノ酸配列、タンパク質、（ポリ）ペプチド、結合ドメイン、結合単位、基、残基、又は部分；（互いに、１つ又は複数の適切なリンカー又はスペーサーを介して適切に連結されている）を含む又はそれらから本質的になるタンパク質、ポリペプチド、コンストラクト、又は化合物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項記載の対応する免疫グロブリンの単一可変ドメインそれ自体と比較し、増加した半減期を有する、請求項８記載のタンパク質、ポリペプチド、コンストラクト、又は化合物。
【請求項１０】
前記の１つ又は複数の他の基、残基、部分、又は結合単位は、請求項１〜７のいずれか一項記載の対応する免疫グロブリンの単一可変ドメインそれ自体と比較し、増加した半減期を伴うタンパク質、ポリペプチド、コンストラクト、又は化合物を提供する、請求項９記載のタンパク質、ポリペプチド、コンストラクト、又は化合物。
【請求項１１】
増加した半減期を伴うタンパク質、ポリペプチド、コンストラクト、又は化合物を提供する、前記の１つ又は複数の他の基、残基、部分、又は結合単位が、血清タンパク質又はそれらのフラグメント、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、及び血清タンパク質に結合することができる小さなタンパク質又はペプチドからなる群より選ばれる、請求項１０記載のタンパク質、ポリペプチド、コンストラクト、又は化合物。
【請求項１２】
増加した半減期を伴うタンパク質、ポリペプチド、コンストラクト、又は化合物を提供する、前記の１つ又は複数の他の結合単位が、血清タンパク質に結合することができる結合単位（例えばヒト血清アルブミンなど）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧなど）からなる群より選ばれる、請求項１１記載のタンパク質、ポリペプチド、コンストラクト、又は化合物。
【請求項１３】
以下：
ａ）ＩｇＥに対する１つ又は複数の（例えば１つ又は２つなど）免疫グロブリンの単一可変ドメイン；及び
ｂ）ヒト血清アルブミンの以下のアミノ酸残基の（少なくとも）１つ又は複数を含む、（ヒト）血清アルブミン中のサブポケット（中）へ結合することができる（ヒト）血清アルブミンに対する１つ又は複数の（例えば１つ又は２つなど、限定を伴わず、そのタンデムリピートを含む）ペプチド：Ｖ４４２、Ｓ４４３、Ｔ４４６、Ｌ４８４、Ｌ４８７、Ｈ４８８、Ｋ４９０、Ｔ４９１、及び／又はＶ４９３
を含む又はそれらから本質的になるポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、又は化合物。
【請求項１４】
以下：
ａ）請求項１〜７のいずれか一項記載の１つ又は複数の（例えば１つ又は２つなど）免疫グロブリンの単一可変ドメイン；及び
ｂ）ヒト血清アルブミンの以下のアミノ酸残基の（少なくとも）１つ又は複数を含む、（ヒト）血清アルブミン中のサブポケット（中）へ結合することができる（ヒト）血清アルブミンに対する１つ又は複数の（例えば１つ又は２つ、限定を伴わず、そのタンデムリピートを含む）ペプチド：Ｖ４４２、Ｓ４４３、Ｔ４４６、Ｌ４８４、Ｌ４８７、Ｈ４８８、Ｋ４９０、Ｔ４９１、及び／又はＶ４９３
を含む又はそれらから本質的になる、請求項１３記載のポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、又は化合物。
【請求項１５】
（ヒト）血清アルブミンに対する１つ又は複数のペプチドが、配列番号１〜１８のいずれかより選択される、請求項１３又は１４のいずれかに記載のポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、又は化合物。
【請求項１６】
配列番号１４７〜１６１のいずれかより選択される、請求項１５記載のポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物、又は配列番号１４７〜１６１のいずれかと少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、例えば少なくとも９５%などの配列同一性を有するポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号１５５である、請求項１６記載のポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、又は化合物。
【請求項１８】
請求項８〜１７のいずれか一項記載のポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、又は化合物を調製における、結合ドメイン又は結合単位としての、請求項１〜７のいずれか一項記載の免疫グロブリンの単一可変ドメインの使用。
【請求項１９】
請求項１〜７のいずれか一項記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン；又は、請求項８〜１７のいずれか一項記載のポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物をコードする核酸又はヌクレオチド配列。
【請求項２０】
遺伝子コンストラクトの形態にある、請求項１９記載の核酸又はヌクレオチド配列。
【請求項２１】
請求項１〜７のいずれか一項記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン又は請求項８〜１７のいずれか一項記載のポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物をコードする遺伝子コンストラクトの調製のための、請求項１〜７のいずれか一項記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン又は請求項８〜１７のいずれか一項記載のポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物をコードする、請求項１９記載の核酸もしくはヌクレオチド配列の使用。
【請求項２２】
請求項１〜７のいずれか一項記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン、請求項８〜１７のいずれか一項記載のポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物を発現する、又は適切な状況下で発現することが可能である、ならびに／あるいは請求項１９記載の核酸もしくはヌクレオチド配列又は請求項１９記載の遺伝子コンストラクトを含む、宿主又は宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１〜７のいずれか一項記載の少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン、請求項８〜１７のいずれか一項記載のポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物、又は請求項１９及び２０のいずれかに記載の核酸もしくはヌクレオチド配列を含む組成物。
【請求項２４】
医薬的組成物である、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
医薬的組成物であり、少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体、希釈剤、もしくは賦形剤、及び／又はアジュバントをさらに含み、１つ又は複数のさらなる医薬的に活性なポリペプチド及び／又は化合物を場合により含む、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
請求項１〜７のいずれか一項記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン、請求項８〜１７のいずれか一項記載のポリペプチドを産生するための方法であって、該方法が以下：
ａ）適切な宿主細胞もしくは宿主生物又は別の適切な発現系において、請求項１９記載の核酸又はヌクレオチド配列、あるいは、請求項２０記載の遺伝子コンストラクトを発現する工程を少なくとも含み；場合により、以下：
ｂ）このようにして得られた、請求項１〜７のいずれか一項記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン又は請求項８〜１７のいずれか一項記載のポリペプチドを単離及び／又は精製する工程が続く、方法。
【請求項２７】
請求項１〜７のいずれか一項記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン又は請求項８〜１７のいずれか一項記載のポリペプチドを産生するための方法であって、該方法が以下：
ａ）前記の宿主又は宿主細胞が、請求項１〜７のいずれか一項記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン又は請求項８〜１７のいずれか一項記載のポリペプチドを発現及び／又は産生するようにする条件下で、請求項２２記載の宿主又は宿主細胞を培養及び／又は維持する工程を少なくとも含み；場合により、以下：
ｂ）このようにして得られた、請求項１〜７のいずれか一項記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン又は請求項８〜１７のいずれか一項記載のポリペプチドを単離及び／又は精製する工程が続く、方法。
【請求項２８】
請求項１３〜１７のいずれか一項記載のポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物を調製するための方法であって、該方法が、請求項１〜７のいずれか一項記載の少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン及び（ヒト）血清アルブミンに対する１つ又は複数のペプチド、及び、場合により、１つ又は複数のリンカーを連結する工程を少なくとも含む、方法。
【請求項２９】
治療における使用のための、請求項１〜７のいずれか一項記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又は請求項８〜１７のいずれか一項記載のポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物。
【請求項３０】
ＩｇＥと、ＩｇＥの増加レベル及び／又は過剰産生と、あるいはＩｇＥについての異常感受性（例えば過感受性など）と関連付けられる少なくとも１つの疾患又は障害の防止及び／又は処置のための、請求項１〜７のいずれか一項記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又は請求項８〜１７のいずれか一項記載のポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物。
【請求項３１】
ＩｇＥ、その生物学的もしくは薬理学的活性、及び／又はＩｇＥが含まれる生物学的経路もしくはシグナル伝達を調節することにより処置することができる、少なくとも１つの疾患又は障害の防止及び／又は処置のための、請求項１〜７のいずれか一項記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又は請求項８〜１７のいずれか一項記載のポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物。
【請求項３２】
喘息、アレルギー性鼻炎、花粉症、結膜炎、湿疹、蕁麻疹、食物アレルギー、及び他のアレルギー（重篤な及び／又は生命を脅かすアレルギー反応、例えば虫刺され又は刺傷、ヘビ咬傷などに対するものなどを含む）、ならびに投薬に対するアレルギー反応；ならびに、より一般的には、アナフィラキシー過敏症及び／又は（アトピー性）アレルギーに関連付けられる任意の疾患又は障害の防止及び／又は処置のための、請求項１〜７のいずれか一項記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又は請求項８〜１７のいずれか一項記載のポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物。
【請求項３３】
ＩｇＥと、ＩｇＥの増加レベル及び／又は過剰産生と、あるいはＩｇＥについての異常感受性（例えば過感受性など）と関連付けられる少なくとも１つの疾患又は障害の防止及び／又は処置のための方法であって、該方法が、それを必要とする被験者に、請求項１〜７のいずれか一項記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン、請求項８〜１７のいずれか一項記載のポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物、及び／又は同を含む医薬的組成物の医薬的に活性な量を投与することを含む、方法。
【請求項３４】
ＩｇＥ、その生物学的もしくは薬理学的活性、及び／又はＩｇＥが含まれる生物学的経路もしくはシグナル伝達を調節することにより処置することができる、少なくとも１つの疾患又は障害の防止及び／又は処置のための方法であって、該方法が、それを必要とする被験者に、請求項１〜７のいずれか一項記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又は請求項８〜１７のいずれか一項記載のポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物、及び／又は同を含む医薬的組成物の医薬的に活性な量を投与することを含む、方法。
【請求項３５】
喘息、アレルギー性鼻炎、花粉症、結膜炎、湿疹、蕁麻疹、食物アレルギー、及び他のアレルギー（重篤な及び／又は生命を脅かすアレルギー反応、例えば虫刺され又は刺傷、ヘビ咬傷などに対するものなどを含む）、ならびに投薬に対するアレルギー反応；ならびに、より一般的には、アナフィラキシー過敏症及び／又は（アトピー性）アレルギーに関連付けられる任意の疾患又は障害の防止及び／又は処置のための方法であって、該方法が、それを必要とする被験者に、請求項１〜７のいずれか一項記載の免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又は請求項８〜１７のいずれか一項記載のポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物、及び／又は同を含む医薬的組成物の医薬的に活性な量を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、ＩｇＥに対するポリペプチド及びタンパク質コンストラクト；そのようなポリペプチド及びタンパク質コンストラクトをコードする核酸；そのようなポリペプチド及びタンパク質コンストラクトを含む組成物、特に医薬的組成物；ならびに、そのようなポリペプチド、タンパク質コンストラクト、及び組成物の使用に関する。任意の用語が、本明細書において具体的に定義されない場合、これらの用語は、WO 09/068627においてそれらに与えられた意味を有する。本明細書において使用する任意の用語は、本明細書において又はWO 09/068627において具体的に定義されない場合、それらは、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有し、それについて、例えば、標準的なハンドブックが参照される。
【０００２】
背景技術
国際出願WO 04/041865は、ＩｇＥに対する少なくとも１つのＶＨＨ又はヒト化ＶＨＨ及び血清タンパク質、例えば（ヒト）血清アルブミンなどに対する少なくとも１つのナノボディを含む、ＩｇＥに対する特定のタンパク質コンストラクトを記載し、それは、血清アルブミン結合ナノボディの存在のため、ＩｇＥ単独に対する対応するＶＨＨと比較し、インビボで増加した半減期を有する。そのような二重特異的抗ＩｇＥ／抗血清アルブミンコンストラクトの例が、WO 04/041865の配列番号２２〜２４において与えられる。
【０００３】
国際出願WO 04/041867は、ＩｇＥに対するＶＨＨを記載する（例えば、WO 04/041867の配列番号１〜１１を参照のこと）。WO 04/041867は、さらに、これらのＶＨＨをヒト化してもよく、血清タンパク質（例えば血清アルブミンなど）に対する１つ又は複数のＶＨＨに適切に連結してもよく、増加した半減期ならびにＶＨＨ及びナノボディに関連付けられる好ましい特性を有するタンパク質コンストラクトを提供することに言及する。
【０００４】
国際出願WO 06/122787は、（ヒト）血清アルブミンに対する多数のナノボディを記載する。これらのナノボディは、Ａｌｂ−１と呼ばれるナノボディ（WO 06/122787における配列番号５２）及びそれらのヒト化変異体、例えばＡｌｂ−８など（WO 06/122787における配列番号６２；本明細書における配列番号１７４）を含む［ナノボディ（登録商標）及びナノボディ（複数形、登録商標）は、Ablynx N.V.の商標である］。
【０００５】
本願の最初の出願日の時点で、治療的部分（例えばナノボディなど）の半減期を延長するための（ヒト）血清アルブミンに対するナノボディの使用が、臨床試験を用いて検証されている。例えば、ＡＬＸ−０１４１、すなわちＲＡＮＫ−Ｌに対する２つのナノボディ及びヒト血清アルブミンに対する１つのナノボディを含むタンパク質コンストラクトの安全性、耐容性、免疫原性、及び薬物動態（ＰＫ）が第Ｉ相臨床試験において確認されている（２０１１年５月２７日に、ロンドンにおけるAnnual European Congress of Rheumatology（EULAR）で、Ablynx N.V．により提示されたデータ）。また、Ablynx N.V．の数多くの公開された特許出願は、治療的標的に対する１つ又は複数のナノボディ及び血清アルブミンに対する１つ又は複数のナノボディ（例えばＡｌｂ−８など）を含む増加した半減期を伴うコンストラクトの例を与える。例えば、WO 04/041862、WO 06/122786、WO 08/020079、WO 08/142164、WO 09/068627、及びWO 09/147248を参照されたし。
【０００６】
（ヒト）血清アルブミンに対するナノボディの使用は、ナノボディ及び他の治療的実体の半減期を延長する良好で、広く適用可能な方法であることが確立されているが、本発明者らは、WO 06/122787に従った代表的なナノボディを適用し、ＩｇＥに向けられたナノボディの半減期を延長すること（一般的に、WO 04/041865及びWO 04/041867において記載される様式において）、このようにして得られたコンストラクトは、それらがＩｇＥに対して十分に生物学的に活性であり、治療的適用のために適切である半減期を有するにもかかわらず、さらなる改善から利益を受けうる一部の特性を有することを見出している。
【０００７】
特に、ＩｇＥ及びＡｌｂ−８に対するナノボディ、WO 06/122787に従った代表的な血清アルブミン結合ナノボディを含むそのポリペプチドは、さらなる改善のための余地を残す、限定された保存安定性を有することが見出されている（例えば、本明細書における実験部分において提示する結果を参照のこと）。
【０００８】
発明の概要
このように、本発明は、一般的に、ＩｇＥに対する少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン（例えばナノボディなど）を含み、WO 04/041865及びWO 04/041867において一般的に記載される型の抗ＩｇＧコンストラクトを使用した場合に生じることが現在見出されているものと同じ問題に関連付けられない、インビボでの増加した半減期（本明細書においてさらに記載され、ＩｇＥ自体に対する免疫グロブリンの単一可変ドメインと比較した通り）を有する改善されたポリペプチド及び（他の）タンパク質コンストラクトを提供する目的を有する。
【０００９】
公開された国際出願WO 08/068280、WO 09/127691、ＵＳ出願US 2011/0243954、及びWO 2011/095545には、ヒト血清アルブミンに対して向けられ、治療的部分（例えば治療的標的に対するナノボディなど）に連結させて、増加した半減期を伴う前記の治療的部分を提供することができるペプチドが記載されている。これらの国際出願において記載された半減期延長技術は、また、NExpedite（商標）技術［NExpedite（商標）はAblynx N.V．の商標である］として公知である。WO 08/068280には、また、一般的に、治療的部分が、WO 04/041867において記載されている通りの、ＩｇＥに対するナノボディでありうることに言及している。
【００１０】
驚くべきことに、ＩｇＥに対するナノボディの半減期を延長するための、WO 08/068280において、WO 09/127691において、US 2011/0243954において、及び、特に、WO 2011/095545において記載される血清アルブミン結合ペプチドの使用が、WO 04/041865及びWO 04/041867において一般的に記載される型の抗ＩｇＥ／抗血清アルブミンポリペプチド及びコンストラクトが使用される場合に生じる問題に関連付けられないことが見出されている。特に、ＩｇＥに対する１つ又は複数のナノボディならびにWO 08/068280において、WO 09/127691において、US 2011/0243954において、及び、特に、WO 2011/095545において記載される通りの１つ又は複数のアルブミン結合ペプチドを含むコンストラクトが、WO 06/122787に従った代表的なアルブミン結合ナノボディを使用する同等の半減期延長抗ＩｇＥポリペプチドと比較し、改善された保存安定性（例えば、実施例１６において記載するＳＥ−ＨＰＬＣ実験により決定される通り）を有することが見出されている。再び、本明細書における実験部分において提示するデータ及び結果を参照されたし。
【００１１】
本発明を確立する際の、公知の抗ＩｇＥコンストラクトに伴うこれらの問題（それらの問題は、未だに、先行技術において認識されていない）を解決することに加えて、本発明者らは、また、ＩｇＥに対する公知のナノボディ（例えばWO 04/041865及びWO 04/041867において記載されるものなど）と比較し、特定の利点を有する、ＩｇＥに対する多数の免疫グロブリンの単一可変ドメインを生成してきた。ＩｇＥに対するこれらの改善されたナノボディは、例えば、利点を伴い、「構築ブロック」として使用し、本明細書において記載する半減期延長抗ＩｇＥタンパク質コンストラクトを提供することができる。これらの抗ＩｇＥ免疫グロブリンの単一可変ドメイン（又は「ＩＳＶ」）ならびにこれを含むポリペプチド及びタンパク質コンストラクトは、本発明のさらなる局面を形成する。
【００１２】
さらに、本明細書において開示する改善された抗ＩｇＥ構築ブロックを、WO 08/068280において、WO 09/127691において、US 2011/0243954において、及び、特に、WO 2011/095545において記載される半減期延長ペプチドと組み合わせることにより、本発明者らは、また、WO 04/041865において記載される半減期延長抗ＩｇＥコンストラクトと比較し、改善された特性を伴う広範囲の異なる半減期延長抗ＩｇＥタンパク質コンストラクトを提供してきた。これらの改善されたタンパク質コンストラクト及びポリペプチドは、本発明のさらなる局面を形成する。
【００１３】
本発明の他の局面、実施態様、利点、及び適用は、本明細書におけるさらなる記載から明らかになるであろう。
【００１４】
詳細な説明
このように、第１の局面において、本発明は、以下を含む又はそれらから本質的になる、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、又は化合物（また、本明細書において、「本発明の抗ＩｇＥポリペプチド」又は「本発明のポリペプチド」として集合的に言及される）に関する：
ａ）ＩｇＥに対する１つ又は複数の（例えば１つ又は２つ、などの）免疫グロブリンの単一可変ドメイン（ＩＳＶ）（それらは、本明細書においてさらに記載する通りでありうるが、好ましくは、本明細書において記載する好ましい局面に従う）；及び
ｂ）WO 08/068280において、WO 09/127691において、US 2011/0243954において、及び、特に、WO 2011/095545において記載される通りである（ヒト）血清アルブミンに対する１つ又は複数の（例えば１つ又は２つなど、限定を伴わず、そのタンデムリピートを含む、などの）ペプチド（それらは、好ましくは、本明細書において記載する好ましい局面に従っている）；
互いに、直接的に、又は１つもしくは複数の適切なリンカーもしくはスペーサーを介して、適切に連結される。
【００１５】
そのようなポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、又は化合物（及び／又は、その中に存在するＩｇＥに対する１つ又は複数のＩＳＶ）は、特に、それらが、（ヒト）ＩｇＥと（ヒト）Ｆｃ（エプシロン）ＲＩ（高親和性ＩｇＥ受容体）の間の相互作用を（完全に又は部分的に）調節する、特に、阻害する又は遮断することが可能であるようにしてもよいが、例えば、適切なアッセイ、例えば、下の実験部分において使用されるアッセイの１つ（例えば、実施例７において使用されるアッセイ）などにおいて測定される通りである。例えば、それは、それが、ＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩ相互作用を（例えば、実施例７において記載するＥＬＩＳＡアッセイにおいて；実施例６において記載するAlphascreenアッセイにおいて）、８．１０−１０Mよりも良い、好ましくは、６．１０−１０Mよりも良い、例えば１０−１０Mよりも良い、５．１０−１１Mよりも良い、２．１０−１１Mよりも良い、又はさらに１０−１１Mよりも良いＩＣ５０値を伴い阻害するようにしてもよい。
【００１６】
そのようなポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、又は化合物（及び／又は、その中に存在するＩｇＥに対する１つ又は複数のＩＳＶ）は、また、それらが、（ヒト）ＩｇＥと（ヒト）Ｆｃ（エプシロン）ＲＩＩ（低親和性ＩｇＥ受容体）の間のその相互作用を（完全に又は部分的に）調節する、特に、阻害する又は遮断することが可能であるようにしてもよい（又は、加えて、しうる）が、例えば、適切なアッセイ、例えば、下の実験部分において使用されるアッセイの１つ（例えば、実施例８において使用されるアッセイ）などにおいて測定される通りである。例えば、それは、それが、ＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩＩ相互作用を（例えば、実施例８において記載するＥＬＩＳＡアッセイにおいて）、５．１０−８Mよりも良い、好ましくは、２．１０−８Mよりも良い、例えば１０−８Mよりも良い、５．１０−９Mよりも良い、２．１０−９Mよりも良い、１０−９Mよりも良い、５．１０−１０Mよりも良い、又は２．１０−１０Mよりも良いＩＣ５０値を伴い阻害するようにしてもよい。
【００１７】
また、任意のそのようなポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、又は化合物（及び／又は、その中に存在するＩｇＥに対する１つ又は複数のＩＳＶ）は、それが、実施例１１において記載する脱顆粒アッセイにおいて、１００nMよりも良い、好ましくは、５０nMよりも良い、より好ましくは、２０nMよりも良い、例えば５nMよりも良い、１nMよりも良い、又はさらに０．５nMよりも良いＩＣ５０値を有するようにしてもよい。
【００１８】
ＩｇＥ結合ＩＳＶ
本発明のＩｇＥコンストラクト中に存在する、ＩｇＥに対する１つ又は複数の免疫グロブリンの単一可変ドメイン又は「ＩＳＶ」は、ＩｇＥに対する任意の適切な免疫グロブリンの単一可変ドメインでありうる。そのようなものとして、ＩｇＥに対するＩＳＶは、例えば、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体、ｄＡｂ（商標）、ナノボディ、ＶＨＨ、ＩｇＮＡＲドメイン、又はＩｇＥに対する他の適切な免疫グロブリンの単一可変ドメインでありうる。好ましくは、ＩｇＥに対する前記の１つ又は複数のＩＳＶは、ナノボディ（例えばＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、又はラクダ化ＶＨ、例えばラクダ化ヒトＶＨなど）である。
【００１９】
本発明の抗ＩｇＥポリペプチド中に存在するＩｇＥに対する１つ又は複数のＩＳＶ（及び、特に、ナノボディ）は、特に、配列番号１７２のヒトＩｇＥ  Ｆｃ配列と配列番号１７３中に与えられるカニクイザルからのＩｇＥ  Ｆｃ配列の間で交差反応性のあるＩＳＶ又はナノボディでありうる。特に、そのようなＩＳＶは、ヒトＩｇＥについてのＩＳＶの親和性の少なくとも１%、例えば、５%（例えば少なくとも１０%など）、例えば、少なくとも２５%（例えば少なくとも５０%又はそれ以上など）である、カニクイザルＩｇＥについての親和性（適切な技術、例えばBIAcoreなど、により決定される通り、例えば、実施例１２において記載されるプロトコールを使用し）を有しうる。例えば、本発明の抗ＩｇＥポリペプチド中に存在するＩｇＥに対する１つ又は複数のＩＳＶ（及び、特に、ナノボディ）は、５０nMよりも良い、好ましくは、２５nMよりも良い（ＫＤ１値−実施例１２を参照のこと）及び／又は５nMよりも良い、好ましくは、２nMよりも良い（例えば１nMよりも良い、など）（ＫＤ２値−実施例１２を参照のこと）であるヒトＩｇＥについての親和性；ならびに、５０nMよりも良い（例えば３０nMよりも良い、など）（ＫＤ１値）及び／又は５nMよりも良い、好ましくは、２nMよりも良い（例えば１nMよりも良い、など）（ＫＤ２値）であるヒトＩｇＥについての親和性を有しうる。
【００２０】
本発明の抗ＩｇＥポリペプチドにおいて使用することができる、ＩｇＥに対するナノボディのいくつかの非限定的な例は、WO 04/041865又はWO 04/041867において記載される抗ＩｇＥナノボディ、例えばＶＨＨ＃２Ｃ３、ＶＨＨ＃４Ｇ１２、ＶＨＨ＃２Ｃ１、ＶＨＨ＃２Ｈ３、ＶＨＨ＃２Ｄ１２、ＶＨＨ＃２Ｇ４、ＶＨＨ＃４Ｃ５、ＶＨＨ＃４Ａ２、ＶＨＨ＃２Ｄ４、ＶＨＨ＃２Ｂ６、又はＶＨＨ＃２Ｈ１１（表１４及びWO 04/041867からの配列番号１〜１１）など、あるいは、それらのヒト化及び／又は配列最適化した変異体である。本発明の抗ＩｇＥポリペプチドにおいて使用することができるＩｇＥに対する他のナノボディは、本明細書において記載する抗ＩｇＥナノボディ、例えば３９Ｂ０２（配列番号１１４）、３９Ｄ８（配列番号１１５）、４２Ｄ７（配列番号１１６）、４２Ｇ５（配列番号１１７）、３６Ｇ５（配列番号１１８）、あるいはそれらのヒト化及び／又は配列最適化したバージョン、及び、特に、３９Ｄ１１（配列番号１１９）、「３９Ｄ１１型配列」（本明細書において定義する通り）、及び、特に、「３９Ｄ１１様配列」（本明細書において定義する通り）、あるいは３９Ｄ１１のヒト化及び／又は配列最適化したバージョン、例えば、配列番号１２０〜１３３の変異体、その内、ＩＧＥ０２６（配列番号１２８、また、本明細書においてＩＧＥ００４５又はＩｇＥ６６Ｇ０２として言及される）は、特に、好ましい例である。そのような構築ブロックの別の特に好ましい例は（特に、それがＮ末端に存在する場合）、１位でのＥからＤ変異を伴うＩＧＥ０２６である。この構築ブロックは、また、本明細書において、ＩｇＥ６６Ｇ０２（Ｅ１Ｄ）又はＩｇＥ６６Ｇ０２Ｅ１Ｄ（配列番号１２９）として言及する。
【００２１】
３９Ｄ１１のアミノ酸配列は、（下線を引いた、太字のＣＤＲを伴う。これらのＣＤＲは、また、配列番号１３４、１３６、及び１３７においてそれぞれ与える）：
【化１】
2014525736.tif 000002
【００２２】
３９Ｄ１１の１つの好ましいヒト化及び配列最適化した変異体（それは、また、３９Ｄ１１と比較し、親和性成熟されている）は、ＩＧＥ０２６（また、ＩｇＥ００４５と呼ばれる）である。ＩＧＥ０２６のアミノ酸配列は、（下線を引いた、太字のＣＤＲを伴う。これらのＣＤＲは、また、配列番号１３５、１３６、及び１３８においてそれぞれ与える；ＣＤＲ２は、３９Ｄ１１及びＩＧＥ０２６について同じであると理解されている）：
【化２】
2014525736.tif 000003
【００２３】
本明細書において定義する通り、「３９Ｄ１１型配列」、「３９Ｄ１１型ＩＳＶ」、又は「３９Ｄ１１型構築ブロック」は、その最も広い意味において、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、及び、特に、ナノボディであり、（ｉ）それが、（ヒト）ＩｇＥへの結合について３９Ｄ１１と競合する（例えば、適切な結合アッセイにおいて、例えばBIAcoreなど、例えば、実施例９において本質的に記載するBIAcoreアッセイのセットアップ又はAlphascreenアッセイ、しかし、オマリズマブの代わりに、３９Ｄ１１を使用する）；及び／又は（ｉｉ）それは、３９Ｄ１１と、（ヒト）ＩｇＥ上の同じエピトープに結合する；及び／又は、それは、ＩｇＥへの３９Ｄ１１の結合を交差遮断する（WO 09/068627において定義する通り）ようにする。３９Ｄ１１型配列は、また、好ましくは、本明細書においてさらに記載する通り、ヒトＩｇＥとカニクイザルＩｇＥの間で交差反応性がある。「３９Ｄ１１型配列」、「３９Ｄ１１型ＩＳＶ」、又は「３９Ｄ１１型構築ブロック」は、好ましくは、さらに、それが、（ｉ）ＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩ相互作用を（例えば、実施例７において記載するＥＬＩＳＡアッセイにおいて；実施例６において記載するAlphascreenアッセイにおいて）、８．１０−１０Mよりも良い、好ましくは、６．１０−１０Mよりも良い、例えば１０−１０Mよりも良い、５．１０−１１Mよりも良い、２．１０−１１Mよりも良い、又はさらに１０−１１Mよりも良いＩＣ５０値を伴い阻害する；及び／又は（ｉｉ）ＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩＩ相互作用を（例えば、実施例８において記載するＥＬＩＳＡアッセイにおいて）、５．１０−８Mよりも良い、好ましくは、２．１０−８Mよりも良い、例えば１０−８Mよりも良い、５．１０−９Mよりも良い、２．１０−９Mよりも良い、１０−９Mよりも良い、５．１０−１０Mよりも良い、又は２．１０−１０Mよりも良いＩＣ５０値を伴い阻害する；及び／又は（ｉｉｉ）実施例１１において記載する脱顆粒アッセイにおいて、１００nMよりも良い、好ましくは、５０nMよりも良い、より好ましくは、２０nMよりも良い、例えば５nMよりも良い、１nMよりも良い、又はさらに０．５nMよりも良いＩＣ５０値を有するようにする。
【００２４】
「３９Ｄ１１型配列」は、そのようなものとして、また、本発明の部分を形成する。
【００２５】
本明細書において定義する通り、「３９Ｄ１１様配列」、「３９Ｄ１１様配列」、「３９Ｄ１１様ＩＳＶ」、又は「３９Ｄ１１様構築ブロック」は、以下を含むＩＳＶ（本明細書において記載する通り）として定義される：
ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＤＭＳ（配列番号１３４）及び／又はアミノ酸配列ＮＹＤＭＡ（配列番号１３５）あるいは（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＹＤＭＳ（配列番号１３４）及び／又はアミノ酸配列ＮＹＤＭＡ（配列番号１３５）とわずか３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるＣＤＲ１；及び／又は
ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＩＤＴＧＧＤＩＴＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３６）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＩＤＴＧＧＤＩＴＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３６）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＳＩＤＴＧＧＤＩＴＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３６）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるＣＤＲ２；及び／又は
ｃ）（ｉ）アミノ酸配列ＤＥＤＹＡＬＧＰＮＥＹＤＹ（配列番号１３７）及び／又はアミノ酸配列ＤＥＥＹＡＬＧＰＮＥＦＤＹ（配列番号１３８）あるいは（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＥＤＹＡＬＧＰＮＥＹＤＹ（配列番号１３７）及び／又はアミノ酸配列ＤＥＥＹＡＬＧＰＮＥＦＤＹ（配列番号１３８）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＥＤＹＡＬＧＰＮＥＹＤＹ（配列番号１３７）及び／又はアミノ酸配列ＤＥＥＹＡＬＧＰＮＥＦＤＹ（配列番号１３８）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるＣＤＲ３；
それにおいて、そのようなＩＳＶ中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、それにおいて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、３９Ｄ１１様ＩＳＶが、（ｉ）ＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩ相互作用を（例えば、実施例７において記載するＥＬＩＳＡアッセイにおいて；実施例６において記載するＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎアッセイにおいて）、８．１０−１０Mよりも良い、好ましくは、６．１０−１０Mよりも良い、例えば１０−１０Mよりも良い、５．１０−１１Mよりも良い、２．１０−１１Mよりも良い、又はさらに１０−１１Mよりも良いＩＣ５０値を伴い阻害する；及び／又は（ｉｉ）ＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩＩ相互作用を（例えば、実施例８において記載するＥＬＩＳＡアッセイにおいて）、５．１０−８Mよりも良い、好ましくは、２．１０−８Mよりも良い、例えば１０−８Mよりも良い、５．１０−９Mよりも良い、２．１０−９Mよりも良い、１０−９Mよりも良い、５．１０−１０Mよりも良い、又は２．１０−１０Mよりも良いＩＣ５０値を伴い阻害する；及び／又は（ｉｉｉ）実施例１１において記載する脱顆粒アッセイにおいて、１００nMよりも良い、好ましくは、５０nMよりも良い、より好ましくは、２０nMよりも良い、例えば５nMよりも良い、１nMよりも良い、又はさらに０．５nMよりも良いＩＣ５０値を有するようにする。
【００２６】
好ましくは、そのような３９Ｄ１１様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれａ）及びｂ）の下に定義される通りであり；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれａ）及びｃ）の下に定義される通りであり；又は、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｂ）及びｃ）の下に定義される通りである。より好ましくは、そのような３９Ｄ１１様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、全て、それぞれａ）、ｂ）、及びｃ）の下に定義される通りである。再び、そのような３９Ｄ１１様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、３９Ｄ１１様ＩＳＶが：（ｉ）ＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩ相互作用を（例えば、実施例７において記載するＥＬＩＳＡアッセイにおいて；実施例６において記載するＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎアッセイにおいて）、８．１０−１０Mよりも良い、好ましくは、６．１０−１０Mよりも良い、例えば１０−１０Mよりも良い、５．１０−１１Mよりも良い、２．１０−１１Mよりも良い、又はさらに１０−１１Mよりも良いＩＣ５０値を伴い阻害する；及び／又は（ｉｉ）ＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩＩ相互作用を（例えば、実施例８において記載するＥＬＩＳＡアッセイにおいて）、５．１０−８Mよりも良い、好ましくは、２．１０−８Mよりも良い、例えば１０−８Mよりも良い、５．１０−９Mよりも良い、２．１０−９Mよりも良い、１０−９Mよりも良い、５．１０−１０Mよりも良い、又は２．１０−１０Mよりも良いＩＣ５０値を伴い阻害する；及び／又は（ｉｉｉ）実施例１１において記載する脱顆粒アッセイにおいて、１００nMよりも良い、好ましくは、５０nMよりも良い、より好ましくは、２０nMよりも良い、例えば５nMよりも良い、１nMよりも良い、又はさらに０．５nMよりも良いＩＣ５０値を有するようにする。
【００２７】
例えば、そのような３９Ｄ１１様配列において：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＳＹＤＭＳ（配列番号１３４）及び、好ましくは、アミノ酸配列ＮＹＤＭＡ（配列番号１３５）（それぞれｂ）及びｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２及びＣＤＲ３を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＳＩＤＴＧＧＤＩＴＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３６）（それぞれａ）及びｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ３を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＤＥＤＹＡＬＧＰＮＥＹＤＹ（配列番号１３７）及び、好ましくは、アミノ酸配列ＤＥＥＹＡＬＧＰＮＥＦＤＹ（配列番号１３８）（それぞれａ）及びｂ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ２を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる。特に、３９Ｄ１１様配列がこの局面に従う場合：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＳＹＤＭＳ（配列番号１３４）及び、好ましくは、アミノ酸配列ＮＹＤＭＡ（配列番号１３５）を含みうる又はそれから本質的になりうる、及び、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＳＩＤＴＧＧＤＩＴＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３６）（上のｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ３を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＳＹＤＭＳ（配列番号１３４）及び、好ましくは、アミノ酸配列ＮＹＤＭＡ（配列番号１３５）を含みうる又はそれから本質的になりうる、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＤＥＤＹＡＬＧＰＮＥＹＤＹ（配列番号１３７）及び、好ましくは、アミノ酸配列ＤＥＥＹＡＬＧＰＮＥＦＤＹ（配列番号１３８）（上の（ｂ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＳＩＤＴＧＧＤＩＴＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３６）を含みうる又はそれから本質的になりうる、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＤＥＤＹＡＬＧＰＮＥＹＤＹ（配列番号１３７）及び、好ましくは、アミノ酸配列ＤＥＥＹＡＬＧＰＮＥＦＤＹ（配列番号１３８）（上のａ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる。再び、そのような３９Ｄ１１様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、３９Ｄ１１様ＩＳＶが、（ｉ）ＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩ相互作用を（例えば、実施例７において記載するＥＬＩＳＡアッセイにおいて；実施例６において記載するAlphascreenアッセイにおいて）、８．１０−１０Mよりも良い、好ましくは、６．１０−１０Mよりも良い、例えば１０−１０Mよりも良い、５．１０−１１Mよりも良い、２．１０−１１Mよりも良い、又はさらに１０−１１Mよりも良いＩＣ５０値を伴い阻害する；及び／又は（ｉｉ）ＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩＩ相互作用を（例えば、実施例８において記載するＥＬＩＳＡアッセイにおいて）、５．１０−８Mよりも良い、好ましくは、２．１０−８Mよりも良い、例えば１０−８Mよりも良い、５．１０−９Mよりも良い、２．１０−９Mよりも良い、１０−９Mよりも良い、５．１０−１０Mよりも良い、又は２．１０−１０Mよりも良いＩＣ５０値を伴い��害する；及び／又は（ｉｉｉ）実施例１１において記載する脱顆粒アッセイにおいて、１００nMよりも良い、好ましくは、５０nMよりも良い、より好ましくは、２０nMよりも良い、例えば５nMよりも良い、１nMよりも良い、又はさらに０．５nMよりも良いＩＣ５０値を有するようにする。
【００２８】
特に好ましい３９Ｄ１１様配列において：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＳＹＤＭＳ（配列番号１３４）及び、好ましくは、アミノ酸配列ＮＹＤＭＡ（配列番号１３５）を含む又はそれから本質的になり、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＳＩＤＴＧＧＤＩＴＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３６）を含む又はそれから本質的になる；及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＤＥＤＹＡＬＧＰＮＥＹＤＹ（配列番号１３７）及び、好ましくは、アミノ酸配列ＤＥＥＹＡＬＧＰＮＥＦＤＹ（配列番号１３８）を含む又はそれから本質的になる。
【００２９】
具体的に好ましい局面において、「３９Ｄ１１様配列」、「３９Ｄ１１様ＩＳＶ」、又は「３９Ｄ１１様構築ブロック」は、以下を含むＩＳＶである：
ｄ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＤＭＳ（配列番号１３４）及び、好ましくは、アミノ酸配列ＮＹＤＭＡ（配列番号１３５）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＹＤＭＳ（配列番号１３４）及び／又はアミノ酸配列ＮＹＤＭＡ（配列番号１３５）とわずか３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ１；及び／又は
ｅ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＩＤＴＧＧＤＩＴＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３６）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＩＤＴＧＧＤＩＴＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３６）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＳＩＤＴＧＧＤＩＴＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３６）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ２；及び／又は
ｆ）（ｉ）アミノ酸配列ＤＥＤＹＡＬＧＰＮＥＹＤＹ（配列番号１３７）及び、好ましくは、アミノ酸配列ＤＥＥＹＡＬＧＰＮＥＦＤＹ（配列番号１３８）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＥＤＹＡＬＧＰＮＥＹＤＹ（配列番号１３７）及び／又はアミノ酸配列ＤＥＥＹＡＬＧＰＮＥＦＤＹ（配列番号１３８）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＥＤＹＡＬＧＰＮＥＹＤＹ（配列番号１３７）及び／又はアミノ酸配列ＤＥＥＹＡＬＧＰＮＥＦＤＹ（配列番号１３８）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ３；
それにおいて、そのようなＩＳＶ中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、それにおいて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、３９Ｄ１１様ＩＳＶが、（ｉ）ＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩ相互作用を（例えば、実施例７において記載するＥＬＩＳＡアッセイにおいて；実施例６において記載するＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎアッセイにおいて）、８．１０−１０Mよりも良い、好ましくは、６．１０−１０Mよりも良い、例えば１０−１０Mよりも良い、５．１０−１１Mよりも良い、２．１０−１１Mよりも良い、又はさらに１０−１１Mよりも良いＩＣ５０値を伴い阻害する；及び／又は（ｉｉ）ＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩＩ相互作用を（例えば、実施例８において記載するＥＬＩＳＡアッセイにおいて）、５．１０−８Mよりも良い、好ましくは、２．１０−８Mよりも良い、例えば１０−８Mよりも良い、５．１０−９Mよりも良い、２．１０−９Mよりも良い、１０−９Mよりも良い、５．１０−１０Mよりも良い、又は２．１０−１０Mよりも良いＩＣ５０値を伴い阻害する；及び／又は（ｉｉｉ）実施例１１において記載する脱顆粒アッセイにおいて、１００nMよりも良い、好ましくは、５０nMよりも良い、より好ましくは、２０nMよりも良い、例えば５nMよりも良い、１nMよりも良い、又はさらに０．５nMよりも良いＩＣ５０値を有するようにする。
【００３０】
好ましくは、この具体的に好ましい局面に従った３９Ｄ１１様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれｄ）及びｅ）の下に定義される通りであり；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれ、ｄ）及びｆ）の下で定義される通りであり；又は、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、ｅ）及びｆ）の下で定義される通りである。より好ましくは、そのような３９Ｄ１１様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、全て、それぞれｄ）、ｅ）、及びｆ）の下に定義される通りである。再び、そのような３９Ｄ１１様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、３９Ｄ１１様ＩＳＶが、（ｉ）ＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩ相互作用を（例えば、実施例７において記載するＥＬＩＳＡアッセイにおいて；実施例６において記載するAlphascreenアッセイにおいて）、８．１０−１０Mよりも良い、好ましくは、６．１０−１０Mよりも良い、例えば１０−１０Mよりも良い、５．１０−１１Mよりも良い、２．１０−１１Mよりも良い、又はさらに１０−１１Mよりも良いＩＣ５０値を伴い阻害する；及び／又は（ｉｉ）ＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩＩ相互作用を（例えば、実施例８において記載するＥＬＩＳＡアッセイにおいて）、５．１０−８Mよりも良い、好ましくは、２．１０−８Mよりも良い、例えば１０−８Mよりも良い、５．１０−９Mよりも良い、２．１０−９Mよりも良い、１０−９Mよりも良い、５．１０−１０Mよりも良い、又は２．１０−１０Mよりも良いＩＣ５０値を伴い阻害する；及び／又は（ｉｉｉ）実施例１１において記載する脱顆粒アッセイにおいて、１００nMよりも良い、好ましくは、５０nMよりも良い、より好ましくは、２０nMよりも良い、例えば５nMよりも良い、１nMよりも良い、又はさらに０．５nMよりも良いＩＣ５０値を有するようにする。
【００３１】
例えば、この具体的に好ましい局面に従った３９Ｄ１１様配列において：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＳＹＤＭＳ（配列番号１３４）及び、好ましくは、アミノ酸配列ＮＹＤＭＡ（配列番号１３５）（それぞれｅ）及びｆ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２及びＣＤＲ３を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＳＩＤＴＧＧＤＩＴＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３６）（それぞれｄ）及びｆ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ３を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＤＥＤＹＡＬＧＰＮＥＹＤＹ（配列番号１３７）及び、好ましくは、アミノ酸配列ＤＥＥＹＡＬＧＰＮＥＦＤＹ（配列番号１３８）（それぞれｄ）及びｅ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ２を伴う）である。特に、３９Ｄ１１様配列がこの局面に従う場合：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＳＹＤＭＳ（配列番号１３４）及び、好ましくは、アミノ酸配列ＮＹＤＭＡ（配列番号１３５）であり、及び、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＳＩＤＴＧＧＤＩＴＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３６）（上のｆ）の下に定義される通りであるＣＤＲ３を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＳＹＤＭＳ（配列番号１３４）及び、好ましくは、アミノ酸配列ＮＹＤＭＡ（配列番号１３５）であり、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＤＥＤＹＡＬＧＰＮＥＹＤＹ（配列番号１３７）及び、好ましくは、アミノ酸配列ＤＥＥＹＡＬＧＰＮＥＦＤＹ（配列番号１３８）（上のｅ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＳＩＤＴＧＧＤＩＴＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３６）であり、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＤＥＤＹＡＬＧＰＮＥＹＤＹ（配列番号１３７）及び、好ましくは、アミノ酸配列ＤＥＥＹＡＬＧＰＮＥＦＤＹ（配列番号１３８）（上のｄ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１を伴う）である。再び、そのような３９Ｄ１１様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、３９Ｄ１１様ＩＳＶが、（ｉ）ＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩ相互作用を（例えば、実施例７において記載するＥＬＩＳＡアッセイにおいて；実施例６において記載するAlphascreenアッセイにおいて）、８．１０−１０Mよりも良い、好ましくは、６．１０−１０Mよりも良い、例えば１０−１０Mよりも良い、５．１０−１１Mよりも良い、２．１０−１１Mよりも良い、又はさらに１０−１１Mよりも良いＩＣ５０値を伴い阻害する；及び／又は（ｉｉ）ＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩＩ相互作用を（例えば、実施例８において記載するＥＬＩＳＡアッセイにおいて）、５．１０−８Mよりも良い、好ましくは、２．１０−８Mよりも良い、例えば１０−８Mよりも良い、５．１０−９Mよりも良い、２．１０−９Mよりも良い、１０−９Mよりも良い、５．１０−１０Mよりも良い、又は２．１０−１０Mよりも良いＩＣ５０値を伴い阻害する；及び／又は（ｉｉｉ）実施例１１において記載する脱顆粒アッセイにおいて、１００nMよりも良い、好ましくは、５０nMよりも良い、より好ましくは、２０nMよりも良い、例えば５nMよりも良い、１nMよりも良い、又はさらに０．５nMよりも良いＩＣ５０値を有するようにする。
【００３２】
特に好ましい３９Ｄ１１様配列において：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＳＹＤＭＳ（配列番号１３４）及び、好ましくは、アミノ酸配列ＮＹＤＭＡ（配列番号１３５）であり、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＳＩＤＴＧＧＤＩＴＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３６）であり；及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＤＥＤＹＡＬＧＰＮＥＹＤＹ（配列番号１３７）及び、好ましくは、アミノ酸配列ＤＥＥＹＡＬＧＰＮＥＦＤＹ（配列番号１３８）である。
【００３３】
本明細書において記載する全ての３９Ｄ１１様配列において、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列は、それぞれ、好ましくは、まとめると、これらのフレームワーク配列が、３９Ｄ１１のフレームワーク配列（それぞれ配列番号１３９、１４１、１４３、及び１４５）及び／又はＩＧＥ０２６のフレームワーク配列（それぞれ配列番号１４０、１４２、１４４、及び１４６）と、少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、例えば少なくとも９５%などの配列同一性を有するようにする。例えば及び限定を伴わず、３９Ｄ１１様配列中のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列の各々が、それぞれ３９Ｄ１１のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列と、ならびに／あるいは、それぞれＩＧＥ０２６のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４配列と、０と７の間、例えば０と５の間など、例えば１、２、３、又は４などの（適切な）アミノ酸の違いを有しうる。他の適切なフレームワーク配列は、本質的に、WO 09/068627のページ２７３〜２９１上に記載されている通りでありうる（ＩＬ−２３に対するナノボディについてはWO 09/068627において記載されている）。参照が、例えば、WO 09/068627の表Ａ−１０〜Ａ−２５、ならびにWO 09/068627の表Ａ−６〜Ａ−９において記載されている種々のヒト化置換に作られる。
【００３４】
再び、所与の配列中に存在するＣＤＲ及びフレームワークの組み合わせは、好ましくは、結果として生じる３９Ｄ１１様ＩＳＶが、（ｉ）ＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩ相互作用を（例えば、実施例７において記載するＥＬＩＳＡアッセイにおいて；実施例６において記載するAlphascreenアッセイにおいて）、８．１０−１０Mよりも良い、好ましくは、６．１０−１０Mよりも良い、例えば１０−１０Mよりも良い、５．１０−１１Mよりも良い、２．１０−１１Mよりも良い、又はさらに１０−１１Mよりも良いＩＣ５０値を伴い阻害する；及び／又は（ｉｉ）ＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩＩ相互作用を（例えば、実施例８において記載するＥＬＩＳＡアッセイにおいて）、５．１０−８Mよりも良い、好ましくは、２．１０−８Mよりも良い、例えば１０−８Mよりも良い、５．１０−９Mよりも良い、２．１０−９Mよりも良い、１０−９Mよりも良い、５．１０−１０Mよりも良い、又は２．１０−１０Mよりも良いＩＣ５０値を伴い阻害する；及び／又は（ｉｉｉ）実施例１１において記載する脱顆粒アッセイにおいて、１００nMよりも良い、好ましくは、５０nMよりも良い、より好ましくは、２０nMよりも良い、例えば５nMよりも良い、１nMよりも良い、又はさらに０．５nMよりも良いＩＣ５０値を有するようにする。
【００３５】
１つの特定の局面において、３９Ｄ１１様配列は、アミノ酸配列３９Ｄ１１（配列番号１１９）と少なくとも７０%、例えば少なくとも８０%など、例えば、少なくとも８５%、例えば少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するＩＳＶである。例えば、この局面に従った３９Ｄ１１様配列において、ＣＤＲは、上に記載する具体的に好ましい局面に従いうるが、特に（しかし、限定を伴わず）、ＳＹＤＭＳ（配列番号１３４）及び、好ましくは、ＮＹＤＭＡ（配列番号１３５）（ＣＤＲ１）；ＳＩＤＴＧＧＤＩＴＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３６）（ＣＤＲ２）；及びＤＥＤＹＡＬＧＰＮＥＹＤＹ（配列番号１３７）及び、好ましくは、ＤＥＥＹＡＬＧＰＮＥＦＤＹ（配列番号１３８）（ＣＤＲ３）でありうる。再び、好ましくは、そのような３９Ｄ１１様ＩＳＶ中に存在するＣＤＲ及びフレームワークの組み合わせは、好ましくは、結果として生じる３９Ｄ１１様ＩＳＶが、（ｉ）ＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩ相互作用を（例えば、実施例７において記載するＥＬＩＳＡアッセイにおいて；実施例６において記載するAlphascreenアッセイにおいて）、８．１０−１０Mよりも良い、好ましくは、６．１０−１０Mよりも良い、例えば１０−１０Mよりも良い、５．１０−１１Mよりも良い、２．１０−１１Mよりも良い、又はさらに１０−１１Mよりも良いＩＣ５０値を伴い阻害する；及び／又は（ｉｉ）ＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩＩ相互作用を（例えば、実施例８において記載するＥＬＩＳＡアッセイにおいて）、５．１０−８Mよりも良い、好ましくは、２．１０−８Mよりも良い、例えば１０−８Mよりも良い、５．１０−９Mよりも良い、２．１０−９Mよりも良い、１０−９Mよりも良い、５．１０−１０Mよりも良い、又は２．１０−１０Mよりも良いＩＣ５０値を伴い阻害する；及び／又は（ｉｉｉ）実施例１１において記載する脱顆粒アッセイにおいて、１００nMよりも良い、好ましくは、５０nMよりも良い、より好ましくは、２０nMよりも良い、例えば５nMよりも良い、１nMよりも良い、又はさらに０．５nMよりも良いＩＣ５０値を有するようにする。
【００３６】
１つの特別な局面において、任意の３９Ｄ１１様配列は、本明細書においてさらに記載する通り、ヒト化及び／又は配列最適化されうる。これらは、例えば及び限定を伴わず、３９Ｄ１１の配列と比較し、以下の変異の１つ又は複数、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０など、及び、本質的に、全てまで（の任意の適切な組み合わせ）を含む：Ｅ１Ｄ、Ｖ５Ｌ、Ｅ６Ｑ、Ｆ２９Ｙ、Ｓ３１Ｎ、Ｓ３５Ａ又はＳ３６Ｇ、Ｇ４４Ｒ、Ｎ７３Ｋ、Ｍ７７Ｔ又はＭ７７Ｌ、Ｋ８３Ｒ、Ｗ９１Ａ、Ｄ９７Ｅ、Ｙ１００ｅＦ、及び／又はＱ１０８Ｌ（Ｋａｂａｔに従ったナンバリングを伴い、例えば、WO 08/020079の表Ａ−５〜Ａ−８を参照のこと；及び、標準的な１文字アミノ酸コードに従って、アミノ酸残基を命名する各々の文字を伴い、それらについて、参照が、WO 08/020079の表Ａ−２に作られる）。別の局面において、これらは、例えば及び限定を伴わず、３９Ｄ１１の配列と比較し、以下の変異の１つ又は複数、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０など、及び、本質的に、全てまで（の任意の適切な組み合わせ）を含む：Ｅ１Ｄ、Ｖ５Ｌ、Ｅ６Ｑ、Ｆ２９Ｙ、Ｓ３１Ｎ、Ｓ３５Ａ又はＳ３５Ｇ、Ｇ４４Ｒ、Ｎ７５Ｋ、Ｍ７７Ｔ又はＭ７７Ｌ、Ｋ８３Ｒ、Ｗ９１Ｙ、Ｄ９７Ｅ、Ｙ１００ｅＦ、及び／又はＱ１０８Ｌ（Ｋａｂａｔに従ったナンバリングを伴い、例えば、WO 08/020079の表Ａ−５〜Ａ−８を参照のこと；及び、標準的な１文字アミノ酸コードに従って、アミノ酸残基を命名する各々の文字を伴い、それらについて、参照が、WO 08/020079の表Ａ−２に作られる）。当業者に明らかであろう通り、これらの変異の一部は、ＣＤＲ中にあり、ＩｇＥのＩＳＶの親和性、３９Ｄ１１様配列の効力、活性、及び／又は他の生物学的特性を（３９Ｄ１１と比較し）改善しうる。他の適切なヒト化及び／又は配列最適化した置換は、例えば、本明細書におけるさらなる開示から及び／又は３９Ｄ１１の配列をヒトＶＨ配列と比較することから、当業者に明らかであろう（それらについて、参照が、再び、WO 08/020079の表Ａ−５〜Ａ−８に作られる）。
【００３７】
好ましい局面において、３９Ｄ１１様配列は、配列番号１２０〜１３３のいずれか、あるいは、配列番号１２０〜１３３のいずれかと少なくとも７０%、例えば少なくとも８０%など、例えば、少なくとも８５%、例えば少なくとも９０%又は９５%を上回る、などの配列同一性を有するＩＳＶより選択される。好ましい３９Ｄ１１様配列は、配列番号１２８及び１２９である。
【００３８】
３９Ｄ１１様配列は、また、好ましくは、本明細書においてさらに記載する通り、ヒトＩｇＥとカニクイザルＩｇＥの間で交差反応性がある。
【００３９】
既に言及した通り、一般的に、任意の「３９Ｄ１１様配列」、「３９Ｄ１１様配列」、「３９Ｄ１１様ＩＳＶ」、又は「３９Ｄ１１様構築ブロック」は、好ましくは、それが、（ｉ）ＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩ相互作用を（例えば、実施例７において記載するＥＬＩＳＡアッセイにおいて；実施例６において記載するAlphascreenアッセイにおいて）、８．１０−１０Mよりも良い、好ましくは、６．１０−１０Mよりも良い、例えば１０−１０Mよりも良い、５．１０−１１Mよりも良い、２．１０−１１Mよりも良い、又はさらに１０−１１Mよりも良いＩＣ５０値を伴い阻害する；及び／又は（ｉｉ）ＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩＩ相互作用を（例えば、実施例８において記載するＥＬＩＳＡアッセイにおいて）、５．１０−８Mよりも良い、好ましくは、２．１０−８Mよりも良い、例えば１０−８Mよりも良い、５．１０−９Mよりも良い、２．１０−９Mよりも良い、１０−９Mよりも良い、５．１０−１０Mよりも良い、又は２．１０−１０Mよりも良いＩＣ５０値を伴い阻害するようにする。
【００４０】
また、任意の「３９Ｄ１１様配列」、「３９Ｄ１１様配列」、「３９Ｄ１１様ＩＳＶ」、又は「３９Ｄ１１様構築ブロック」は、好ましくは、それが、実施例１１において記載する脱顆粒アッセイにおいて、１００nMよりも良い、好ましくは、５０nMよりも良い、より好ましくは、２０nMよりも良い、例えば５nMよりも良い、１nMよりも良い、又はさらに０．５nMよりも良いＩＣ５０値を有するようにする。
【００４１】
「３９Ｄ１１様配列」は、そのようなものとして、また、本発明の部分を形成する。
【００４２】
ＩｇＥに対するＩＳＶ、ならびに、特に、「３９Ｄ１１型配列」及び「３９Ｄ１１様配列」は、１つ又は複数の他の基、残基、部分、又は結合単位をさらに含みうる、又は含まないであろう。存在する場合、そのようなさらなる基、残基、部分、又は結合単位は、さらなる機能性を、免疫グロブリンの単一可変ドメインに（及び／又は、それが存在するポリペプチドに）提供しうる、又は提供しないであろう、免疫グロブリンの単一可変ドメインの特性を改変しうる、又は改変しないであろう。
【００４３】
例えば、そのようなさらなる基、残基、部分、又は結合単位は、１つ又は複数の追加のアミノ酸配列でありうるが、ポリペプチドは、（融合）タンパク質又は（融合）ポリペプチドであるようにする。
【００４４】
上に記載する通り、追加の結合単位を連結し、多特異的ポリペプチドを形成することができる。
【００４５】
上に記載するポリペプチドにおいて、１つ、２つ、又はそれ以上の免疫グロブリンの単一可変ドメイン及び１つ又は複数の基、残基、部分、又は結合単位を、互いに、及び／又は、１つ又は複数の適切なリンカーもしくはスペーサーを介して直接的に連結してもよい。例えば、１つ又は複数の基、残基、部分、又は結合単位が、アミノ酸配列である場合、リンカーは、また、アミノ酸配列でありうるが、結果として生じるポリペプチドが、融合（タンパク質）又は融合（ポリペプチド）であるようにする。
【００４６】
１つ又は複数のさらなる基、残基、部分、又は結合単位は、任意の適切な及び／又は所望のアミノ酸配列でありうる。さらなるアミノ酸配列は、融合ポリペプチドの（生物学的な）特性を変化させうる、もしくは変化させないであろう、変えうる、もしくは変えないであろう、又は、そうでなければ、影響しうる、もしくは影響しないであろう、及び、さらなる機能性を融合ポリペプチドに加えうる、もしくは加えないであろう。好ましくは、さらなるアミノ酸配列は、それが、１つ又は複数の所望の特性又は機能性を融合ポリペプチドに与えるようにする。
【００４７】
そのようなアミノ酸配列の例は、当業者に明かであろうが、一般的には、従来の抗体及びそれらのフラグメント（しかし、限定しないが、ＳｃＦｖ及び単一ドメイン抗体を含む）に基づくペプチド融合体において使用される全てのアミノ酸配列を含みうる。参照が、例えば、Holliger and Hudson（Nature Biotechnology 23: 1126-1136, 2005）によるレビューに作られる。
【００４８】
例えば、そのようなアミノ酸配列は、半減期、溶解性、もしくは吸収を増加させ、免疫原性もしくは毒性を低下させ、望ましくない副作用を除去又は減弱させ、（融合）ポリペプチドに、他の有利な特性を与える、及び／又はその非所望の特性を低下させる（ＩＳＶ自体と比較し）アミノ酸配列でありうる。そのようなアミノ酸配列の一部の非限定的な例は、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（例えば、WO 00/27435を参照のこと）又はハプテン分子（例えば、循環抗体により認識されるハプテン、例えば、WO 98/22141を参照のこと）などである。
【００４９】
本発明の１つの特定の局面において、ポリペプチドを調製し、それは、ＩｇＥに対する対応するＩＳＶと比較し、増加した半減期を有する。そのような半減期延長部分を含む、本発明のポリペプチドの例は、例えば、限定を伴わず、免疫グロブリンの単一可変ドメインが、１つ又は複数の血清タンパク質又はそのフラグメント（例えば（ヒト）血清アルブミン又はその適切なフラグメントなど）あるいは血清タンパク質に結合することができる１つ又は複数の結合単位（例えば、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために適切であるアミノ酸、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために適切であるアミノ酸、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用のために適切であるアミノ酸、又はナノボディなど）（それらは、血清タンパク質、例えば血清アルブミンなど（例えばヒト血清アルブミンなど）、血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧなど）、トランスフェリン、又は、WO 04/003019において列挙されている他の血清タンパク質に結合することができる）に適切に連結されているポリペプチド；免疫グロブリンの単一可変ドメインが、Ｆｃ部分（例えばヒトＦｃなど）又はその適切な部分もしくはフラグメントに連結されているポリペプチド；あるいは、１つ又は複数の免疫グロブリンの単一可変ドメインが、血清タンパク質に結合することができる１つ又は複数の小さなタンパク質又はペプチド（例えば、限定を伴わず、WO 91/01743、WO 01/45746、又はWO 02/076489において記載されるタンパク質及びペプチドなど）に適切に連結されているポリペプチドを含む。参照が、また、WO 03/002609及びWO 04/003019において記載されるｄＡｂに、ならびに、Harmsen et al.（Vaccine 23: 4926-42, 2005）に；EP 0368684に、ならびにWO 08/028977、WO 08/043821、WO 08/043822（Ablynx N.V．による）及びWO 08/068280、WO 09/127691、US 2011/0243954、及びWO 2011/095545に作られる。
【００５０】
本発明の特定の、しかし、非限定的な局面に従い、本発明のポリペプチドは、ＩｇＥ対する１、２、又はそれ以上の免疫グロブリンの単一可変ドメインの他、ヒト血清アルブミンに対する少なくとも１つのペプチド（さらに定義する通り）を含みうる。
【００５１】
一般的に、増加した半減期を伴う本発明のポリペプチドは、好ましくは、本発明の対応する免疫グロブリンの単一可変ドメイン又はポリペプチドそれ自体の半減期よりも、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍など、例えば、少なくとも１０倍又は２０倍を上回る、より大きい半減期を有する。
【００５２】
一般的には、増加した半減期を伴う本発明のポリペプチドは、好ましくは、対応する免疫グロブリンの単一可変ドメイン又はポリペプチドそれ自体の半減期と比較し、１時間を上回る、好ましくは２時間を上回る、より好ましくは６時間を上回る、例えば１２時間を上回る、又はさらに２４、４８、もしくは７２時間を上回り増加した半減期を有する。
【００５３】
別の好ましいが、しかし、非限定的な局面において、本発明のそのようなポリペプチドは、ヒトにおいて、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間又はそれ以上の血清中半減期を示す。例えば、本発明のポリペプチドは、少なくとも５日（例えば約５〜１０日など）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９〜１４日など）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば約１０〜１５日など）、又は少なくとも約１１日（例えば約１１〜１６日など）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば約１２〜１８日又はそれ以上など）、又は１４日を上回る（例えば約１４〜１９日など）の半減期を有しうる。
【００５４】
さらなるアミノ酸残基は、（融合）ポリペプチドの他の（生物学的）特性を変化させうる、もしくは変化させないであろう、変えうる、もしくは変えないであろう、又は、そうでなければ、影響しうる、もしくは影響しないであろう、及び、さらなる機能性を（融合）ポリペプチドに加えうる、もしくは加えないであろう。例えば、そのようなアミノ酸残基は：
ａ）Ｎ末端Ｍｅｔ残基を、例えば、異種宿主細胞又は宿主生物における発現の結果として含むことができ；
ｂ）合成時に宿主細胞からの（融合）ポリペプチドの分泌に向けるシグナル配列又はリーダー配列を形成しうる（例えば、（融合）ポリペプチドのプレ、プロ、又はプレプロ形態を、（融合）ポリペプチドを発現するために使用される宿主細胞に依存して提供する）。適切な分泌リーダーペプチドは、当業者に明らかであろうし、本明細書においてさらに記載する通りでありうる。通常、そのようなリーダー配列は、（融合）ポリペプチドのＮ末端に連結されるであろうが、本発明は、その最も広い意味において、それに限定されず；
ｃ）（融合）ポリペプチドの精製を許す又は促進する「タグ」、例えば、アミノ酸配列又は残基を、例えば、前記配列又は残基に対する親和性技術を使用し、形成してもよい。その後、前記配列又は残基を除去し（例、化学的又は酵素的開裂により）、ポリペプチドを提供しうる（この目的のために、タグは、場合により、切断可能なリンカー配列を介して、アミノ酸配列もしくはポリペプチド配列に連結してもよく、又は切断可能なモチーフを含んでもよい）。そのような残基の一部の好ましいが、しかし、非限定的な例は、複数のヒスチジン残基、グルタチオン残基、及びｍｙｃタグ、例えばＡＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡ（配列番号１９３）など；
ｄ）おそらく、官能化されている及び／又は官能基の付着のための部位として役立ちうる１つ又は複数のアミノ酸残基である。適切なアミノ酸残基及び官能基は当業者に明らかであろうが、しかし、限定しないが、本発明のポリペプチドの誘導体について本明細書において言及するアミノ酸残基及び官能基を含む。
【００５５】
したがって、１つ又は複数のＩＳＶは、（融合）ポリペプチドの調製のための「結合単位」、「結合ドメイン」、又は「結合ブロック」（これらの用語は互換的に使用される）として使用してもよく、それらは、場合により、１つ又は複数のさらなる結合単位（即ち、ＩｇＥ上の同じもしくは別のエピトープに対する及び／又はＩｇＥ以外の１つ又は複数の他の抗原、タンパク質、又は標的に対する）を含みうる。
【００５６】
本明細書において記載する通りのＣＤＲ配列を含むＩＳＶは、（融合）ポリペプチドの調製のための（構築）ブロックを又は結合単位としての使用のために特に適している。
【００５７】
したがって、本発明は、また、多価ポリペプチドを調製する際での、本明細書において記載する通りのＩＳＶの使用に関する。多価ポリペプチドの調製のための方法は、場合により、１つ又は複数のリンカーを介した、少なくとも１つのさらなる結合単位へのＩＳＶの連結を含みうる。本明細書において定義する通りのＩＳＶは、次に、結合ドメイン又は結合単位として、２つ（例、二価ポリペプチド中で）、３つ（例、三価ポリペプチド中で）又はそれ以上（例、多価ポリペプチド中で）の結合単位を含む多価ポリペプチドを提供及び／又は調製する際に使用する。この点において、本明細書において定義する通りのＩＳＶは、結合ドメイン又は結合単位として、多価、例えば２つ、３つ又はそれ以上の結合単位を含む二価又は三価ポリペプチドなどを提供及び／又は調製する際に使用されうる。
【００５８】
血清アルブミン結合ペプチド
本発明の抗ＩｇＥポリペプチド中に存在しうる血清アルブミン結合ペプチドは、一般的に、WO 08/068280において、WO 09/127691において記載されている通り、特に、WO 2011/095545において記載されている通りでありうる。このように、これらのペプチドの一般的な記載について、参照が、これらの出願に作られる。
【００５９】
これらの出願において言及される通り、これらのペプチドは、５〜５０の間、好ましくは７〜４０の間、より好ましくは１０〜３５の間、例えば約１５、２０、２５、又は３０アミノ酸残基などの全長を有しうる、及び、それらが、ヒト血清アルブミンの以下のアミノ酸残基の（少なくとも）１つ又は複数を含む（ヒト）血清アルブミン中のサブポケット（中）に結合することができるようにする：Ｖ４４２、Ｓ４４３、Ｔ４４６、Ｌ４８４、Ｌ４８７、Ｈ４８８、Ｋ４９０、Ｔ４９１、及び／又はＶ４９３（WO 09/127691の実施例８において記載される通りのナンバリング）。これらの出願では、また、これらのペプチドを、それらの半減期を増加させるために、治療的部分、化合物、タンパク質、又は他の治療的実体に連結又は融合することができることが言及される。
【００６０】
WO 08/068280には多数のそのようなペプチドが記載され、アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１９）を含み、それは、WO 08/068280において「１７Ｄ１２」と呼ばれ、及び、それは、WO 08/068280において配列番号３として列挙される。
【００６１】
WO 09/127691には、１７Ｄ２の多数の改善された変異体が記載され、それらは、一般的に、配列番号１９のアミノ酸配列と、少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６５%、より好ましくは少なくとも７０%、さらにより好ましくは少なくとも７５%、例えば少なくとも８０%など、例えば少なくとも９０%など、しかし、１００%ではない配列同一性（本明細書において定義する通り）を有し、及び、それらは、ヒト血清アルブミンに、配列番号１９のアミノ酸配列よりも良好に結合することができる。
【００６２】
特に、WO 09/127691に従った好ましいペプチドの一部は、以下を含む：
（ｉ）Ａｒｇ（Ｒ）残基、特に、ヒト血清アルブミンのアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）１３３及びＡｓｎ（Ｎ）１３５と水素結合を形成することが可能であり、及び／又はヒト血清アルブミンのＰｒｏ（Ｐ）１３４及びＬｅｕ（Ｌ）１３６残基の主鎖酸素原子と静電相互作用を形成することが可能であるＡｒｇ（Ｒ）残基；及び／又は
（ｉｉ）Ｔｒｐ（Ｗ）残基、特に、ヒト血清アルブミンのＡｒｇ（Ｒ）１３８残基と静電相互作用を形成することが可能であるＴｒｐ（Ｗ）残基；及び／又は
（ｉｉｉ）配列モチーフＧＧＧ；
及び、好ましくは、（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の少なくとも任意の２つ、より好ましくは、全て３つ。
【００６３】
特に、WO 09/127691において記載される例示的なペプチドの一部は、例えば、以下の特徴の１つ又は複数を含みうる：
（ｉ）配列モチーフＲＸＷＤ、それにおいて、Ｘは、任意のアミノ酸配列でありうるが、しかし、好ましくは、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、又はＤである；及び／又は
（ｉｉ）配列モチーフＧＧＧ、好ましくは配列モチーフＦＧＧＧ（配列番号２４）、より好ましくは配列モチーフＤＶＦＧＧＧ（配列番号３３）、特に、配列モチーフＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号３７）；ならびに、最も好ましくは、これらの配列モチーフ（ｉ）及び（ｉｉ）の両方。
【００６４】
WO 2011/095545には、WO 09/127691において記載されるペプチドの一部のさらに改善された変異体が記載され、それは、WO 09/127691において記載されるペプチドと比較し、上に言及するＡｒｇ（Ｒ）残基（それは、WO 08/068280、WO 09/127691、及びWO 2011/095545において使用されるナンバリングに従い、位置３である）の上流（WO 2011/095545において定義される通り）に、特に、上に言及するＲＸＷＤモチーフの上流に、２〜１０アミノ酸残基の間のアミノ酸残基のストレッチを含み、それは、少なくとも１つの疎水性及び／又は芳香族アミノ酸残基（及び、残部について、１つ又は複数のさらなる適切なアミノ酸残基、例えばWO 2011/095545において例示される通り）を含み、それにおいて、前記の少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基は、特に、Ｌ、Ｉ、Ｖ、及び／又はＭより選ばれうる、及び／又は、それにおいて、前記の少なくとも１つの芳香族アミノ酸残基は、特に、Ｗ、Ｙ、及び／又はＦより選ばれうる。好ましくは、位置３の上流のアミノ酸の前記ストレッチは、好ましくは、前記の疎水性及び／又は芳香族アミノ酸残基の少なくとも１つが、ヒト血清アルブミンの以下のアミノ酸残基の（少なくとも）１つ又は複数を含む、（ヒト）血清アルブミン中のサブポケット（中）へ結合することができるようにする：Ｖ４４２、Ｓ４４３、Ｔ４４６、Ｌ４８４、Ｌ４８７、Ｈ４８８、Ｋ４９０、Ｔ４９１、及び／又はＶ４９３。特に、WO 2011/095545において記載されるアルブミン結合ペプチドは、位置３の上流に、２〜１０アミノ酸残基の間のアミノ酸残基のストレッチを含みうるが、それは、少なくとも１つのＷ残基及び／又は少なくとも１つのＹ残基を含み、前記Ｗ又はＹ残基の少なくとも１つが、ヒト血清アルブミンの以下のアミノ酸残基の（少なくとも）１つ又は複数を含む、（ヒト）血清アルブミン中のサブポケット（中）へ結合することができるようにする：Ｖ４４２、Ｓ４４３、Ｔ４４６、Ｌ４８４、Ｌ４８７、Ｈ４８８、Ｋ４９０、Ｔ４９１、及び／又はＶ４９３。より特に、アミノ酸残基の前記ストレッチは、（ｉ）少なくとも２つのＷ残基；（ｉｉ）少なくとも２つのＹ残基；及び／又は（ｉｉｉ）少なくとも１つのＷ残基及び少なくとも１つのＹ残基、前記Ｗ又はＹ残基の少なくとも１つが、ヒト血清アルブミンの以下のアミノ酸残基の（少なくとも）１つ又は複数を含む、（ヒト）血清アルブミン中のサブポケット（中）へ結合することができるようにする：Ｖ４４２、Ｓ４４３、Ｔ４４６、Ｌ４８４、Ｌ４８７、Ｈ４８８、Ｋ４９０、Ｔ４９１、及び／又はＶ４９３。位置３の上流に存在しうるアミノ酸残基のそのようなストレッチの一部の非限定的な例を、配列番号７２〜９２（WO 2011/095545の配列番号７８〜９８）において与える。
【００６５】
WO 2011/095545には、本明細書において記載するペプチドにおいて、以下が可能であり、さらには有利でありうることが、さらに記載されている：（ｉ）位置８のアスパラギン酸（Ｄ）残基をスレオニン（Ｔ）残基により置換する（例えば、しかし、限定を伴わず、位置１４にスレオニン残基を含まない、本発明のアミノ酸配列において）；及び／又は、（ｉｉ）位置１４のスレオニン（Ｔ）残基を、別のアミノ酸残基、例えば（例えば及び限定を伴わず）Ａ、Ｎ、又はＤなどを用いて置換する。
【００６６】
例えば、WO 2011/095545に従ったアルブミン結合ペプチド中に存在しうる一部の配列モチーフは：
−  WO 2011/095545において記載される通りである（また、本明細書における先行するパラグラフを参照すること）位置３の上流のアミノ酸残基のストレッチである。これは、例えば、WO 2011/095545の配列番号７８〜９８（本明細書における配列番号７２〜９２）の配列の１つ、又はWO 2011/095545において定義される通りの、これらの配列の少なくとも１つと、２つ又は１つだけの「アミノ酸の違い」を有する配列；以下の配列モチーフの１つとの組み合わせにおいて：
−  アミノ酸配列ＲＸＷＤＸＤＶＦＧＧＧ（WO 2011/095545の配列番号２３；本明細書における配列番号９３）、それにおいて、Ｘにより示される第１の（Ｎ末端から）アミノ酸残基は、Ｙ、Ｓ、又はＤより選ばれ；及び、Ｘにより示される第２のアミノ酸残基は、Ｙ又はＦより選ばれ；
−  アミノ酸配列ＲＸＷＤＸＤＶＦＧＧＧＴ（WO 2011/095545の配列番号２４；本明細書における配列番号９４）、それにおいて、Ｘにより示される第１の（Ｎ末端から）アミノ酸残基は、Ｙ、Ｓ、又はＤより選ばれ；及び、Ｘにより示される第２のアミノ酸残基は、Ｙ又はＦより選ばれ；
−  アミノ酸配列ＲＸＷＤＸＤＶＦＧＧＧＴＰ（WO 2011/095545の配列番号２５；本明細書における配列番号９５）、それにおいて、Ｘにより示される第１の（Ｎ末端から）アミノ酸残基は、Ｙ、Ｓ、又はＤより選ばれ；及び、Ｘにより示される第２のアミノ酸残基は、Ｙ又はＦより選ばれ；
−  アミノ酸配列ＲＸＷＤＸＤＶＦＧＧＧＴＰＧ（WO 2011/095545の配列番号２６；本明細書における配列番号９６）、それにおいて、Ｘにより示される第１の（Ｎ末端から）アミノ酸残基は、Ｙ、Ｓ、又はＤより選ばれ；及び、Ｘにより示される第２のアミノ酸残基は、Ｙ又はＦより選ばれ；
−  アミノ酸配列ＲＸＷＤＸＤＶＦＧＧＧＴＰＧＧ（WO 2011/095545の配列番号２７；本明細書における配列番号９７）、それにおいて、Ｘにより示される第１の（Ｎ末端から）アミノ酸残基は、Ｙ、Ｓ、又はＤより選ばれ；及び、Ｘにより示される第２のアミノ酸残基は、Ｙ又はＦより選ばれ；
−  ＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧ（WO 2011/095545の配列番号２８；本明細書における配列番号９８）；ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧ（WO 2011/095545の配列番号２９；本明細書における配列番号９９）；ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧ（WO 2011/095545の配列番号３０；本明細書における配列番号１００）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧ（WO 2011/095545の配列番号３１；本明細書における配列番号１０１）より選ばれた；及び、特に、ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧ（WO 2011/095545の配列番号２８；本明細書における配列番号９８）；ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧ（WO 2011/095545の配列番号２９；本明細書における配列番号９９）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧ（WO 2011/095545の配列番号３０；本明細書における配列番号１００）より選ばれたアミノ酸配列；
−  ＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴ（WO 2011/095545の配列番号３２；本明細書における配列番号１０２）；ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴ（WO 2011/095545の配列番号３３；本明細書における配列番号１０３）；ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴ（WO 2011/095545の配列番号３４；本明細書における配列番号１０４）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴ（WO 2011/095545の配列番号３５；本明細書における配列番号１０５）より選ばれた；及び、特に、ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴ（WO 2011/095545の配列番号３３；本明細書における配列番号１０３）；ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴ（WO 2011/095545の配列番号３４；本明細書における配列番号１０４）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴ（WO 2011/095545の配列番号３５；本明細書における配列番号１０５）より選ばれたアミノ酸配列；
−  ＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰ（WO 2011/095545の配列番号３６；本明細書における配列番号１０６）；ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰ（WO 2011/095545の配列番号３７；本明細書における配列番号１０７）；ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰ（WO 2011/095545の配列番号３８；本明細書における配列番号１０８）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰ（WO 2011/095545の配列番号３９；本明細書における配列番号１０９）より選ばれた；及び、特に、ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰ（WO 2011/095545の配列番号３７；本明細書における配列番号１０７）；ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰ（WO 2011/095545の配列番号３８；本明細書における配列番号１０８）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰ（WO 2011/095545の配列番号３９；本明細書における配列番号１０９）より選ばれたアミノ酸配列；
−  ＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（WO 2011/095545の配列番号４０；本明細書における配列番号１１０）；ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（WO 2011/095545の配列番号４１；本明細書における配列番号１１１）；ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（WO 2011/095545の配列番号４２；本明細書における配列番号１１２）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（WO 2011/095545の配列番号４３；本明細書における配列番号１１３）より選ばれた；及び、特に、ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（WO 2011/095545の配列番号４１；本明細書における配列番号１１１）；ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（WO 2011/095545の配列番号４２；本明細書における配列番号１１２）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（WO 2011/095545の配列番号４３；本明細書における配列番号１１３）より選ばれたアミノ酸配列でありうる。
【００６７】
このように、WO 2011/095545に従ったアルブミン結合ペプチド中に存在しうる一部の他の（非限定的な）配列モチーフ：
−  WO 2011/095545の配列番号２４〜２７（本明細書における配列番号９４〜９７）又はWO 2011/095545の３２〜４３（本明細書における配列番号１０２〜１１３）の配列モチーフのいずれかに従ったアミノ酸配列、それにおいて、位置１４のスレオニン（Ｔ）残基は、別のアミノ酸残基（好ましくは、しかし、限定を伴わず、Ａ、Ｎ、又はＤ）により置換されている；
−  WO 2011/095545の配列番号２３〜４３（本明細書における配列番号９３〜１１３）の配列モチーフのいずれかに従ったアミノ酸配列、それにおいて、位置８のアスパラギン酸（Ｄ）は、スレオニン（Ｔ）により置換されている；
−  WO 2011/095545の配列番号２４〜２７（本明細書における配列番号９４〜９７）又はWO 2011/095545の３２〜４３（本明細書における配列番号１０２〜１１３）の配列モチーフのいずれかに従ったアミノ酸配列、それにおいて、（ｉ）位置１４のスレオニン（Ｔ）残基は、別のアミノ酸残基（好ましくは、しかし、限定を伴わず、Ａ、Ｎ、又はＤ）により置換されている、及び（ｉｉ）位置８のアスパラギン酸（Ｄ）は、スレオニン（Ｔ）により置換されている。
【００６８】
また、WO 2011/095545において記載されている通り、全てのこれらの配列モチーフは、１つ又は複数の適切な置換、例えば（例えば及び限定を伴わず）WO 2011/095545の表Ｉにおいて列挙する置換の１つ又は複数などを含みうる。
【００６９】
WO 2011/095545及びWO 09/127691は、また、本明細書において記載するペプチドの２つ又はそれ以上（例えば２つなど）を、２つ（又はそれ以上）のそのような血清アルブミン結合ペプチドの「タンデムリピート」を提供するために、互いに連結してもよい（直接的に、又は適切なリンカー、例えば、ＧＳリンカー、例えば本明細書における配列番号１６４の９ＧＳリンカーなどを介して）。これらの出願は、また、これらのペプチドが、その半減期を増加するために、治療的部分、化合物、タンパク質、又は他の治療的実体と連結又は融合することができることを言及する。
【００７０】
言及する通り、本発明の抗ＩｇＥポリペプチド中に存在する血清アルブミン結合ペプチド又はペプチドは、一般的に、WO 08/068280において、WO 09/127691において記載される通り、特に、WO 2011/095545において記載される通りでありうる。
【００７１】
このように、一局面において、本発明の抗ＩｇＥポリペプチド中に存在する血清アルブミン結合ペプチド又はペプチドは、５〜５０の間、好ましくは７〜４０の間、より好ましくは１０〜３５の間、例えば約１５、２０、２５、又は３０アミノ酸残基など（単一リピートとして）の全長を伴うペプチドでありうるが、それは、ヒト血清アルブミンの以下のアミノ酸残基の（少なくとも）１つ又は複数を含む、（ヒト）血清アルブミン中のサブポケット（中）へ結合することができるようにする：Ｖ４４２、Ｓ４４３、Ｔ４４６、Ｌ４８４、Ｌ４８７、Ｈ４８８、Ｋ４９０、Ｔ４９１、及び／又はＶ４９３（WO 09/127691の実施例８において記載される通りのナンバリング）。
【００７２】
特に、本発明の抗ＩｇＥポリペプチド中に（単一リピート又はタンデムリピートとして）存在する血清アルブミン結合ペプチドは、配列番号１９のアミノ酸配列と、少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６５%、より好ましくは少なくとも７０%、さらにより好ましくは少なくとも７５%、例えば少なくとも８０%など、例えば少なくとも９０%など、しかし、１００%ではない配列同一性（本明細書において定義する通り）を有し、及び、それらは、ヒト血清アルブミンに、配列番号１９のアミノ酸配列よりも良好に結合することができるそのようなペプチドでありうる。
【００７３】
より特に、本発明の抗ＩｇＥポリペプチド中に（単一リピート又はタンデムリピートとして）存在する血清アルブミン結合ペプチドは、以下を含むそのようなペプチドでありうる：
（ｉ）Ａｒｇ（Ｒ）残基、特に、ヒト血清アルブミンのアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）１３３及びＡｓｎ（Ｎ）１３５と水素結合を形成することが可能であり、及び／又はヒト血清アルブミンのＰｒｏ（Ｐ）１３４及びＬｅｕ（Ｌ）１３６残基の主鎖酸素原子と静電相互作用を形成することが可能であるＡｒｇ（Ｒ）残基；及び／又は
（ｉｉ）Ｔｒｐ（Ｗ）残基、特に、ヒト血清アルブミンのＡｒｇ（Ｒ）１３８残基と静電相互作用を形成することが可能であるＴｒｐ（Ｗ）残基；及び／又は
（ｉｉｉ）配列モチーフＧＧＧ；
及び、好ましくは、さらに：
（ｉｖ）前記Ａｒｇ（Ｒ）残基の上流：２〜１０アミノ酸残基の間のアミノ酸残基のストレッチを含み、それは、少なくとも１つの疎水性及び／又は芳香族アミノ酸残基（及び、残部について、１つ又は複数のさらなる適切なアミノ酸残基）を含み、それにおいて、前記の少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基は、特に、Ｌ、Ｉ、Ｖ、及び／又はＭより選ばれうる、及び／又は、それにおいて、前記の少なくとも１つの芳香族アミノ酸残基は、特に、Ｗ、Ｙ、及び／又はＦより選ばれうる。特に、位置３の上流のアミノ酸の前記ストレッチは、好ましくは、前記の疎水性及び／又は芳香族アミノ酸残基の少なくとも１つが、ヒト血清アルブミンの以下のアミノ酸残基の（少なくとも）１つ又は複数を含む、（ヒト）血清アルブミン中のサブポケット（中）へ結合することができるようにする：Ｖ４４２、Ｓ４４３、Ｔ４４６、Ｌ４８４、Ｌ４８７、Ｈ４８８、Ｋ４９０、Ｔ４９１、及び／又はＶ４９３；及び、特に、位置３の上流に、２〜１０アミノ酸残基の間のアミノ酸残基のストレッチを含みうるが、それが、少なくとも１つのＷ残基及び／又は少なくとも１つのＹ残基を含み、前記Ｗ又はＹ残基の少なくとも１つが、ヒト血清アルブミンの以下のアミノ酸残基の（少なくとも）１つ又は複数を含む、（ヒト）血清アルブミン中のサブポケット（中）へ結合することができるようにする：Ｖ４４２、Ｓ４４３、Ｔ４４６、Ｌ４８４、Ｌ４８７、Ｈ４８８、Ｋ４９０、Ｔ４９１、及び／又はＶ４９３；より特に、（ｉ）少なくとも２つのＷ残基；（ｉｉ）少なくとも２つのＹ残基；及び／又は（ｉｉｉ）少なくとも１つのＷ残基及び少なくとも１つのＹ残基、前記Ｗ又はＹ残基の少なくとも１つが、ヒト血清アルブミンの以下のアミノ酸残基の（少なくとも）１つ又は複数を含む、（ヒト）血清アルブミン中のサブポケット（中）へ結合することができるようにする：Ｖ４４２、Ｓ４４３、Ｔ４４６、Ｌ４８４、Ｌ４８７、Ｈ４８８、Ｋ４９０、Ｔ４９１、及び／又はＶ４９３。例えば、本発明の抗ＩｇＥポリペプチド中に（単一リピート又はタンデムリピートとして）存在する血清アルブミン結合ペプチドにおいて、位置３の上流のアミノ酸のストレッチは、WO 2011/095545の配列番号７８〜９８（本明細書における配列番号７２〜９２）より選ばれうる。
【００７４】
さらにより特に、本発明の抗ＩｇＥポリペプチド中に（単一リピート又はタンデムリピートとして）存在する血清アルブミン結合ペプチドは、以下のペプチドでありうる：
ａ）５〜５０の間、好ましくは７〜４０の間、より好ましくは１０〜３５の間、例えば約１５、２０、２５、又は３０アミノ酸残基など（単一リピートとして）の全長を伴う；及び
ｂ）それが、ヒト血清アルブミンの以下のアミノ酸残基の（少なくとも）１つ又は複数を含む、（ヒト）血清アルブミン中のサブポケット（中）へ結合することができるようにする：Ｖ４４２、Ｓ４４３、Ｔ４４６、Ｌ４８４、Ｌ４８７、Ｈ４８８、Ｋ４９０、Ｔ４９１、及び／又はＶ４９３；及び
ｃ）それは、配列番号１９のアミノ酸配列と、少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６５%、より好ましくは少なくとも７０%、さらにより好ましくは少なくとも７５%、例えば少なくとも８０%など、例えば少なくとも９０%など、しかし、１００%ではない配列同一性（本明細書において定義する通り）を有し；及び
ｄ）それは、ヒト血清アルブミンに、配列番号１９のアミノ酸配列よりも良好に結合することができ；ならびに
ｅ）それは、以下の配列モチーフ：ＤＹＤＶ（配列番号２０）、ＹＤＶＦ（配列番号２１）、ＤＶＦＧ（配列番号２２）、ＶＦＧＧ（配列番号２３）、ＦＧＧＧ（配列番号２４）、及び／又はＧＧＧＴ（配列番号２５）の１つ又は複数、ならびに、特に、配列モチーフＤＹＤＶＦ（配列番号２６）、ＹＤＶＦＧ（配列番号２７）、ＤＶＦＧＧ（配列番号２８）、ＶＦＧＧＧ（配列番号２９）、ＦＧＧＧＴ（配列番号３０）、ＤＹＴＶＦ（配列番号４４）、ＹＴＶＦＧ（配列番号４５）又はＴＶＦＧＧ（配列番号４６）の１つ；及び、より特に、配列モチーフＤＹＤＶＦＧ（配列番号３１）、ＹＤＶＦＧＧ（配列番号３２）、ＤＶＦＧＧＧ（配列番号３３）、ＶＦＧＧＧＴ（配列番号３４）、ＤＹＴＶＦＧ（配列番号４７）、ＹＴＶＦＧＧ（配列番号４８）又はＴＶＦＧＧＧ（配列番号４９）の１つ、及び、さらにより特に、配列モチーフＤＹＤＶＦＧＧ（配列番号３５）、ＹＤＶＦＧＧＧ（配列番号３６）、ＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号３７）；ＤＹＴＶＦＧＧ（配列番号５０）、ＹＴＶＦＧＧＧ（配列番号５１）、ＴＶＦＧＧＧＴ、（配列番号５２）、ＤＶＦＧＧＧＡ（配列番号５３）、ＤＶＦＧＧＧＮ（配列番号５４）、ＤＶＦＧＧＧＤ（配列番号５５）、ＴＶＦＧＧＧＡ（配列番号５６）、ＴＶＦＧＧＧＮ（配列番号５７）又はＴＶＦＧＧＧＤ（配列番号５８）の１つ、例えば配列モチーフＤＹＤＶＦＧＧＧ（配列番号３８）、ＹＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号３９）；ＤＹＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号４０）；ＤＹＴＶＦＧＧＧ（配列番号５９）、ＹＴＶＦＧＧＧＴ（配列番号６０）、ＹＤＶＦＧＧＧＡ（配列番号６１）、ＹＤＶＦＧＧＧＮ（配列番号６２）、ＹＤＶＦＧＧＧＤ（配列番号６３）；ＹＴＶＦＧＧＧＡ（配列番号６４）、ＹＴＶＦＧＧＧＮ（配列番号６５）又はＹＴＶＦＧＧＧＤ（配列番号６６）の１つなどを含み；
ｆ）それは、ｅ）下に言及する配列モチーフの上流に、例えば、位置３〜６に、配列モチーフＲＸＷＤを含み、それにおいて、Ｘは、任意のアミノ酸配列でありうるが、しかし、好ましくは、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、又はＤである；及び／又は
ｇ）前記配列モチーフＲＸＷＤの上流を含み：２〜１０アミノ酸残基の間のアミノ酸残基のストレッチを含み、それは、少なくとも１つの疎水性及び／又は芳香族アミノ酸残基（及び、残部について、１つ又は複数のさらなる適切なアミノ酸残基）を含み、それにおいて、前記の少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基は、特に、Ｌ、Ｉ、Ｖ、及び／又はＭより選ばれうる、及び／又は、それにおいて、前記の少なくとも１つの芳香族アミノ酸残基は、特に、Ｗ、Ｙ、及び／又はＦより選ばれうる。特に、位置３の上流のアミノ酸の前記ストレッチは、好ましくは、前記の疎水性及び／又は芳香族アミノ酸残基の少なくとも１つが、ヒト血清アルブミンの以下のアミノ酸残基の（少なくとも）１つ又は複数を含む、（ヒト）血清アルブミン中のサブポケット（中）へ結合することができるようにする：Ｖ４４２、Ｓ４４３、Ｔ４４６、Ｌ４８４、Ｌ４８７、Ｈ４８８、Ｋ４９０、Ｔ４９１、及び／又はＶ４９３；及び、特に、位置３の上流に、２〜１０アミノ酸残基の間のアミノ酸残基のストレッチを含みうるが、それが、少なくとも１つのＷ残基及び／又は少なくとも１つのＹ残基を含み、前記Ｗ又はＹ残基の少なくとも１つが、ヒト血清アルブミンの以下のアミノ酸残基の（少なくとも）１つ又は複数を含む、（ヒト）血清アルブミン中のサブポケット（中）へ結合することができるようにする：Ｖ４４２、Ｓ４４３、Ｔ４４６、Ｌ４８４、Ｌ４８７、Ｈ４８８、Ｋ４９０、Ｔ４９１、及び／又はＶ４９３；より特に、（ｉ）少なくとも２つのＷ残基；（ｉｉ）少なくとも２つのＹ残基；及び／又は（ｉｉｉ）少なくとも１つのＷ残基及び少なくとも１つのＹ残基を含みうるが、前記Ｗ又はＹ残基の少なくとも１つが、ヒト血清アルブミンの以下のアミノ酸残基の（少なくとも）１つ又は複数を含む、（ヒト）血清アルブミン中のサブポケット（中）へ結合することができるようにする：Ｖ４４２、Ｓ４４３、Ｔ４４６、Ｌ４８４、Ｌ４８７、Ｈ４８８、Ｋ４９０、Ｔ４９１、及び／又はＶ４９３。例えば、本発明の抗ＩｇＥポリペプチド中に（単一リピート又はタンデムリピートとして）存在する血清アルブミン結合ペプチドにおいて、位置３の上流のアミノ酸のストレッチは、WO 2011/095545の配列番号７８〜９８（本明細書における配列番号７２〜９２）より選ばれうる。
【００７５】
さらにより特に、本発明の抗ＩｇＥポリペプチド中に（単一リピート又はタンデムリピートとして）存在する血清アルブミン結合ペプチドは、以下のペプチドでありうる：
ｉ）５〜５０の間、好ましくは７〜４０の間、より好ましくは１０〜３５の間、例えば約１５、２０、２５、又は３０アミノ酸残基など（単一リピートとして）の全長を伴う；及び
ｉｉ）それが、ヒト血清アルブミンの以下のアミノ酸残基の（少なくとも）１つ又は複数を含む、（ヒト）血清アルブミン中のサブポケット（中）へ結合することができるようにする：Ｖ４４２、Ｓ４４３、Ｔ４４６、Ｌ４８４、Ｌ４８７、Ｈ４８８、Ｋ４９０、Ｔ４９１、及び／又はＶ４９３；及び
ｉｉｉ）それは、配列番号１９のアミノ酸配列と、少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６５%、より好ましくは少なくとも７０%、さらにより好ましくは少なくとも７５%、例えば少なくとも８０%など、例えば少なくとも９０%など、しかし、１００%ではない配列同一性（本明細書において定義する通り）を有し；及び
ｉｖ）それは、ヒト血清アルブミンに、配列番号１９のアミノ酸配列よりも良好に結合することができ；
ｖ）WO 2011/095545において記載される通りである、及び、特に、上のｇ）下に記載する通りである位置３の上流のアミノ酸残基のストレッチを含む。これは、例えば、本明細書における配列番号７２〜９２の配列の１つ、又はWO 2011/095545において定義される通りの、これらの配列の少なくとも１つと、２つ又は１つだけの「アミノ酸の違い」を有する配列；以下の配列モチーフの１つとの組み合わせにおいて：
ｖｉ）アミノ酸配列ＲＸＷＤＸＤＶＦＧＧＧ（配列番号９３）、それにおいて、Ｘにより示される第１の（Ｎ末端から）アミノ酸残基は、Ｙ、Ｓ、又はＤより選ばれ；及び、Ｘにより示される第２のアミノ酸残基は、Ｙ又はＦより選ばれ；
ｖｉｉ）アミノ酸配列ＲＸＷＤＸＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号９４）、それにおいて、Ｘにより示される第１の（Ｎ末端から）アミノ酸残基は、Ｙ、Ｓ、又はＤより選ばれ；及び、Ｘにより示される第２のアミノ酸残基は、Ｙ又はＦより選ばれ；
ｖｉｉｉ）アミノ酸配列ＲＸＷＤＸＤＶＦＧＧＧＴＰ（配列番号９５）、それにおいて、Ｘにより示される第１の（Ｎ末端から）アミノ酸残基は、Ｙ、Ｓ、又はＤより選ばれ；及び、Ｘにより示される第２のアミノ酸残基は、Ｙ又はＦより選ばれ；
ｉｘ）アミノ酸配列ＲＸＷＤＸＤＶＦＧＧＧＴＰＧ（配列番号９６）、それにおいて、Ｘにより示される第１の（Ｎ末端から）アミノ酸残基は、Ｙ、Ｓ、又はＤより選ばれ；及び、Ｘにより示される第２のアミノ酸残基は、Ｙ又はＦより選ばれ；
ｘ）アミノ酸配列ＲＸＷＤＸＤＶＦＧＧＧＴＰＧＧ（配列番号９７）、それにおいて、Ｘにより示される第１の（Ｎ末端から）アミノ酸残基は、Ｙ、Ｓ、又はＤより選ばれ；及び、Ｘにより示される第２のアミノ酸残基は、Ｙ又はＦより選ばれ；
ｘｉ）ＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧ（配列番号９８）；ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧ（配列番号９９）；ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧ（配列番号１００）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧ（配列番号１０１）より選ばれた；及び、特に、ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧ（配列番号９８）；ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧ（配列番号９９）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧ（配列番号１００）より選ばれたアミノ酸配列；
ｘｉｉ）ＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１０２）；ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１０３）；ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１０４）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１０５）より選ばれた；及び、特に、ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１０３）；ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１０４）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１０５）より選ばれたアミノ酸配列；
ｘｉｉｉ）ＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰ（配列番号１０６）；ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰ（配列番号１０７）；ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰ（配列番号１０８）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰ（配列番号１０９）より選ばれた；及び、特に、ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰ（配列番号１０７）；ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰ（配列番号１０８）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰ（配列番号１０９）より選ばれたアミノ酸配列；
ｘｉｖ）ＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（配列番号１１０）；ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（配列番号１１１）；ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（配列番号１１２）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（配列番号１１３）より選ばれた；及び、特に、ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（配列番号１１１）；ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（配列番号１１２）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（本明細書における配列番号１１３）より選ばれたアミノ酸配列でありうる。
【００７６】
このように、WO 2011/095545に従ったアルブミン結合ペプチド中に存在しうる一部の他の（非限定的な）配列モチーフ：
ｉ）配列番号９４〜９７又は１０２〜１１３の配列モチーフのいずれかに従ったアミノ酸配列、それにおいて、位置１４のスレオニン（Ｔ）残基は、別のアミノ酸残基（好ましくは、しかし、限定を伴わず、Ａ、Ｎ、又はＤ）により置換されている；
ｉｉ）配列番号９３〜１１３の配列モチーフのいずれかに従ったアミノ酸配列、それにおいて、位置８のアスパラギン酸（Ｄ）は、スレオニン（Ｔ）により置換されている；
ｉｉｉ）配列番号９４〜９７又は配列番号１０２〜１１３の配列モチーフのいずれかに従ったアミノ酸配列、それにおいて、（ｉ）位置１４のスレオニン（Ｔ）残基は、別のアミノ酸残基（好ましくは、しかし、限定を伴わず、Ａ、Ｎ、又はＤ）により置換されている、及び（ｉｉ）位置８のアスパラギン酸（Ｄ）は、スレオニン（Ｔ）により置換されている。
【００７７】
本発明の抗ＩｇＥポリペプチド中に（単一リピート又はタンデムリピートとして）存在しうるそのような血清アルブミン結合ペプチドの一部の好ましいが、しかし、非限定的な例は、WO 09/127691の配列番号２〜１１５又は１４７〜１５７の配列である。
【００７８】
本発明の抗ＩｇＥポリペプチド中に（単一リピート又はタンデムリピートとして）存在しうるそのような血清アルブミン結合ペプチドの一部の非限定的な例は、WO 2011/095545の配列番号５４〜７４又は１０３〜１０８の配列である。
【００７９】
本発明の抗ＩｇＥポリペプチド中に（単一リピート又はタンデムリピートとして）存在しうるそのような血清アルブミン結合ペプチドの一部の特に好ましいが、しかし、非限定的な例は、配列番号１〜８の配列である。配列番号９〜１８は、本発明の抗ＩｇＥポリペプチド中に存在することができるそのようなペプチドの一部の好ましいが、しかし、非限定的な例である。
【００８０】
本発明のポリペプチド
本発明の抗ＩｇＥポリペプチドにおいて、ＩｇＥに対する１つ又は複数の（例えば１つ又は２つなど）ＩＳＶ（及び、特に、ＩｇＥに対する特定のナノボディ、例えば３９Ｄ１１型配列、及び、特に、３９Ｄ１１様配列など）及び１つ又は複数の（例えば１つ又は２つなど）血清アルブミン結合ペプチドを、互いに、直接的に、又は１つもしくは複数の適切なスペーサーもしくはリンカーを介して適切に連結してもよい。例えば、リンカーは、「ＧＳリンカー」（即ち、Ｇ及びＳ残基から本質的になるリンカー）、例えば配列番号１６２〜１７１のリンカーの１つなどでありうるが、その内、９ＧＳ、２０ＧＳ、３０ＧＳ、及び３５ＧＳリンカーが特に適しうる。一部の場合において、２０ＧＳリンカーの使用が、９ＧＳリンカーを上回り好ましいであろう。なぜなら、一部の例において、２０ＧＳリンカーを介して連結されているアルブミン結合ペプチドは、９ＧＳリンカーを介して連結されているアルブミン結合ペプチドよりも（タンパク質分解性）分解について改善された（即ち、より少ない）感受性を示すからである。
【００８１】
例えば及び限定を伴わず、本発明の抗ＩｇＥポリペプチドは、以下を含みうる：
−  ＩｇＥに対する単一のＩＳＶ（及び、特に、ＩｇＥに対するナノボディ、例えば３９Ｄ１１型配列、及び、特に、３９Ｄ１１様配列など）及び単一アルブミン結合ペプチド（本明細書において記載する通り）；それらは、互いに直接的に、又は適切なリンカーを介して連結されうる；
−  ＩｇＥに対する単一のＩＳＶ（及び、特に、ＩｇＥに対するナノボディ、例えば３９Ｄ１１型配列、及び、特に、３９Ｄ１１様配列など）及び２つの単一アルブミン結合ペプチドのタンデムリピート（本明細書において記載する通り）（それらは、同じでありうる又は異なりうるが、それらは、互いに直接的に、又は適切なリンカー、例えば配列番号１６４の９ＧＳリンカーなどを介して連結されうる）；それらは、互いに直接的に、又は適切なリンカーを介して連結されうる；
−  ＩｇＥに対する単一のＩＳＶ（及び、特に、ＩｇＥに対するナノボディ、例えば３９Ｄ１１型配列、及び、特に、３９Ｄ１１様配列など）及び２つの単一アルブミン結合ペプチド（本明細書において記載する通り）（それらは、本明細書において記載する通りでありうるが、それらは、同じでありうる又は異なりうる）；それらは、互いに直接的に、又は１つもしくは複数の適切なリンカーを介して連結されうる；
−  ＩｇＥに対する２つのＩＳＶ（及び、特に、ＩｇＥに対するナノボディ、例えば３９Ｄ１１型配列、及び、特に、３９Ｄ１１様配列など）、それらは、同じでありうる又は異なりうる、及び単一アルブミン結合ペプチド（本明細書において記載する通り）；それらは、互いに直接的に、又は１つもしくは複数の適切なリンカーを介して連結されうる；
−  ＩｇＥに対する２つのＩＳＶ（及び、特に、ＩｇＥに対するナノボディ、例えば３９Ｄ１１型配列、及び、特に、３９Ｄ１１様配列など）、それらは、同じでありうる又は異なりうる、及び２つの単一アルブミン結合ペプチドのタンデムリピート（本明細書において記載する通り）（それらは、同じでありうる又は異なりうるが、それらは、互いに直接的に、又は適切なリンカーを介して連結されうる）；それらは、互いに直接的に、又は１つもしくは複数の適切なリンカーを介して連結されうる；
−  ＩｇＥに対する２つのＩＳＶ（及び、特に、ＩｇＥに対するナノボディ、例えば３９Ｄ１１型配列、及び、特に、３９Ｄ１１様配列など）、それらは、同じでありうる又は異なりうる、及び２つの単一アルブミン結合ペプチド（本明細書において記載する通り）（それらは、本明細書において記載する通りでありうるが、それらは、同じでありうる又は異なりうる）；それらは、互いに直接的に、又は１つもしくは複数の適切なリンカーを介して連結されうる。
【００８２】
本発明のそのような抗ＩｇＥポリペプチドの一部の非限定的な例は、以下の通りに模式的に表すことができ、それにおいて、「［ペプチド］」は、本明細書において記載する通りの血清アルブミン結合ペプチドを表し、「［ペプチド−ペプチド］」は、本明細書において記載する通りの２つの血清アルブミン結合ペプチドのタンデムリピートを表し（それらは、同じ又は異なりうるが、それらは、直接的に、又は適切なリンカーを介して連結されうる）、「［抗ＩｇＥ］」は、ＩｇＥに対するＩＳＶを表し（特に、ＩｇＥに対するナノボディ、例えば３９Ｄ１１型配列及び、特に、３９Ｄ１１様配列など）、及び、「−」は、適切なリンカーを表し（それは任意である）、左手側にＮ末端及び右手側にＣ末端を伴う。下に模式的に示したポリペプチドは、ＩｇＥに対する２つの血清アルブミン結合ペプチド又は２つのＩＳＶを含む場合、これらは同じでありうる又は異なりうることに注意すべきである。
【化３】
2014525736.tif 000004
【００８３】
上から明らかであろう通り、抗アルブミンペプチドはＮ末端にありうる、Ｃ末端にありうる、又はリンカーの部分でありうる；又は、１を上回るアルブミン結合ペプチドが存在する場合、それらの任意の適切な組み合わせ。１つの好ましいが、しかし、非限定的な局面において、アルブミン結合ペプチドはＣ末端にある（例えば、実施例１５において与える結果を比較すること）。
【００８４】
好ましくは、本発明の抗ＩｇＥポリペプチドは、ＩｇＥに対する１つ又は２つの、より好ましくは、１つだけのＩＳＶを、及び、１つだけの血清アルブミン結合ペプチド（又は２つの血清アルブミン結合ペプチドのタンデムリピート）を含む。
【００８５】
言及する通り、これらのポリペプチド及びコンストラクト中に存在するＩｇＥに対するＩＳＶは、好ましくは、ＩｇＥに対するナノボディ、例えば３９Ｄ１１型配列及び特に３９Ｄ１１様配列などであり、そのＩＧＥ０２６／ＩＧＥ００４５（配列番号１２８）は特に好ましい例である。血清アルブミンに対するペプチドは、好ましくは、配列番号１〜８の「単一リピート」ペプチド又は配列番号９〜１８の「タンデムリピート」ペプチドのいずれかより選ばれる。存在するリンカー（仮にある場合）は、好ましくは、配列番号１６２〜１７１より選ばれ、９ＧＳ、２０ＧＳ、３０ＧＳ、及び３５ＧＳが特に好ましい。
【００８６】
１つの特定の、しかし、非限定的な局面において、本発明のポリペプチドは、それを、実施例１６において記載する保存安定性アッセイにおいてテストする場合、２５℃での１ヶ月保存後（実施例１６において与えるさらなる条件下で）ポリペプチドについてのＳＥ−ＨＰＬＣ上でのプレピークが、１０%未満、好ましくは、５%未満であるようにし；及び／又は、４０℃での１ヶ月保存後（実施例１６において与えられるさらなる条件下で）ポリペプチドについてのＳＥ−ＨＰＬＣ上でのプレピークが、２０%未満、好ましくは、１０%未満であるようにする。参照が、例えば、表１９中の比較結果に作られる。
【００８７】
本発明の抗ＩｇＥポリペプチドの一部の好ましいが、しかし、非限定的な例を、配列番号１４７〜１６１において与える（また、表Ａ−９を参照のこと）。本発明は、また、配列番号１４７〜１６１のいずれかより選択されたポリペプチド、又は、配列番号１４７〜１６１のいずれかと、少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、例えば少なくとも９５%などの配列同一性を有するポリペプチドに関する。
【００８８】
これらの内、ＩＧＥ１０９（ＩＧＥ６６Ｇ０２Ｅ１Ｄ−２０ＧＳ−ＮＥＸＰ００１−９ＧＳ−  ＮＥＸＰ００２）（配列番号１５５）が特に好ましい。このように、本発明の１つの特定の局面は、配列番号１５５と、少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、例えば少なくとも９５%などの配列同一性を有するポリペプチドに関する。そのようなポリペプチドは、好ましくは、本明細書においてさらに記載する通りであり、好ましくは、本明細書において言及する好ましい局面に従う。
【００８９】
本明細書において既に言及した通り、３９Ｄ１１及び本明細書において記載する通りのその変異体（例えば３９Ｄ１１型配列及び特に３９Ｄ１１様配列など）は、また、一般的に、当技術分野において記載されている抗ＩｇＥナノボディと比較し、多数の利点を有しうる（例えば、WO 04/041867において記載されるものなど）。これらは、一般的に、本明細書において提示する開示及びデータに基づき、当業者に明らかになるであろうが、例えば及び限定を伴わず、以下でありうる：
−  ３９Ｄ１１、３９Ｄ１１型配列、及び３９Ｄ１１様配列は、ヒトＩｇＥとカニクイザルＩｇＥの間で交差反応性である（本明細書においてさらに記載する通り）；
−  ３９Ｄ１１、３９Ｄ１１型配列、及び３９Ｄ１１様配列は、改善された効力を有しうる（例えば、実験部分において提示するデータを参照のこと）；
−  ３９Ｄ１１、３９Ｄ１１型配列、及び３９Ｄ１１様配列は、ヒト及びカニクイザルＩｇＥの相互作用を、高親和性ＩｇＥ受容体（Ｆｃ（エプシロン）ＲＩ）及び低親和性受容体（Ｆｃ（エプシロン）ＲＩＩ）の両方を用いて遮断しうる（それぞれ実施例６、７、及び８を参照のこと）；及び、一般的に、ヒト受容体とカニクイザル受容体についての親和性の間での望ましい「バランス」を有する；及び／又は
−  ３９Ｄ１１、３９Ｄ１１型配列、及び３９Ｄ１１様配列は、ヒト高親和性ＩｇＥ受容体及び低親和性ＩｇＥ受容体についての親和性の間での望ましい「バランス」を有する（例えば、再び、実験部分において提示するデータを参照のこと）；
あるいは、先述のもののいずれか又は全ての任意の組み合わせ。
【００９０】
これは、本明細書において記載する３９Ｄ１１、３９Ｄ１１型配列、及び、特に、３９Ｄ１１様配列が、本明細書において記載する本発明の抗ＩｇＥポリペプチドにおいて（即ち、WO 08/068280、WO 09/127691、及びWO 2011/095545に従った少なくとも１つのそのような構築ブロック及び少なくとも１つのアルブミン結合ペプチドを含むコンストラクトにおいて）だけでなく、しかし、また、それ自体による、あるいは他のポリペプチド、タンパク質、又は他の化合物もしくはコンストラクトのための成分又は構築ブロックとしての利点を伴い、使用されうることを意味する。例えば及び限定を伴わず、本明細書において記載する３９Ｄ１１、３９Ｄ１１型配列、及び、特に、３９Ｄ１１様配列は、WO 04/041867及び/又はWO 04/041865において記載される型のポリペプチドにおいて（即ち、本明細書において記載する抗ＩｇＥナノボディの１つの代わりに）使用されうる。そのようなポリペプチドは、また、例えば、ペグ化又は血清アルブミン結合ナノボディ（WO 04/041867、WO 04/041865、又はWO 06/122787において記載されるものを含むが、次に、そのようなポリペプチドが、本明細書に記載する通り、保存下で限定された安定性を有しうることに注意すべきである）の使用を通じて延長された半減期でありうる。
【００９１】
このように、一部の他の局面において、本発明は、さらに、以下に関する：
−  少なくとも１つ（例えば１つ又は２つ）の３９Ｄ１１、３９Ｄ１１型配列（本明細書において定義する通り）、及び、特に、３９Ｄ１１様配列（本明細書において定義する通り）を含む又はそれから本質的になるタンパク質又はポリペプチド；及び、より特に、３９Ｄ１１のヒト化及び／又は配列最適化した変異体、例えば配列番号１２０〜１３３（その内、配列番号１２８及び１２９が特に好ましい例である）の変異体の１つなどである、少なくとも１つ（例えば１つ又は２つ）の３９Ｄ１１様配列（本明細書において定義する通り）を含む又はそれから本質的になるタンパク質又はポリペプチド。そのようなタンパク質又はポリペプチドは、例えば、また、ＩｇＥに対する２つ又は３つのそのようなＩＳＶ（それらは、同じ又は異なりうる）を含みうるが、それらは、互いに、直接的に、又は１つもしくは複数の適切なリンカーを介して連結されうる。それは、また、半減期が延長された（例えば、ペグ化を通じて）、又は、そうでなければ、修飾された（例えば、WO 09/068627において一般的に記載される修飾の一部を通じて）；
−  少なくとも１つ（例えば１つ又は２つ）の（ｉ）３９Ｄ１１、３９Ｄ１１型配列（本明細書において定義する通り）、及び、特に、３９Ｄ１１様配列（本明細書において定義する通り）を含む又はそれから本質的になる（融合）タンパク質、ポリペプチド、コンストラクト、又は化合物；及び、より特に、３９Ｄ１１のヒト化及び／又は配列最適化した変異体、例えば配列番号１２０〜１３３（その内、配列番号１２８及び１２９が特に好ましい例である）の変異体の１つなどである、少なくとも１つ（例えば１つ又は２つなど）の３９Ｄ１１様配列（本明細書において定義する通り）を含む又はそれから本質的になるタンパク質又はポリペプチド；ならびに（ｉｉ）少なくとも１つの他のアミノ酸配列、タンパク質、（ポリ）ペプチド、結合ドメイン、結合単位、基、残基、又は部分；（互いに、１つ又は複数の適切なリンカー又はスペーサーを介して適切に連結されている）でありうる。例えば、そのようなさらなるアミノ酸配列は、ＩｇＥに対して（例えば、ＩｇＥ上の同じ又は異なる部分もしくはエピトープに対して）又は別の標的（例えば、増加した半減期を提供するような、血清アルブミンもしくは別の血清タンパク質、又は、二特異的コンストラクトを提供するような、別の治療的標的に対する）に対する別のＩＳＶ（例えば別のナノボディなど）でありうる。そのようなポリペプチドなどは、例えば、一般的に、WO 04/041867及び/又はWO 04/041865において記載される通りでありうるが（又は、WO 09/068627において記載される通り、しかし、WO 09/068627において使用されるＩＬ−２３のサブユニットに対するＩＳＶの代わりに、ＩｇＥに対するＩＳＶを含む）、例えば、二価（又は多価）、バイパラトープ（マルチパラトープ）及び／又は二特異的（又は多特異的）コンストラクト（これらの用語は、一般的に、WO 09/068627において定義される通り）でありうる。再び、そのようなタンパク質又はポリペプチドにおいて、３９Ｄ１１様配列は、一般的に、本明細書においてさらに記載する通りでありうるが、好ましくは、本明細書において記載する好ましい局面に従う。３９Ｄ１１様配列を含む二特異的抗ＩｇＥ／抗アルブミン二特異的ナノボディコンストラクトの一部の非限定的な例を、配列番号１７５〜１８２において与える（表Ａ−１０）。
【００９２】
別の局面において、本発明は、本明細書において記載するＩｇＥに対するアミノ酸配列又はポリペプチドの１つをコードする核酸に関する。そのような核酸は、例えば、遺伝子コンストラクトの形態でありうるが、例えば、一般的に、WO 04/041867、WO 04/041865、又はWO 09/068627において記載される通りである。
【００９３】
本発明は、さらに、本明細書において記載するポリペプチド、核酸、宿主細胞、及び組成物を調製するための方法に関する。
【００９４】
本発明のポリペプチド及び核酸は、それ自体が公知の様式において調製することができ、本明細書におけるさらなる記載から、当業者に明らかであろう通りである。例えば、本発明のポリペプチドは、抗体の調製のため及び特に抗体フラグメント（しかし、限定しないが、（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖフラグメントを含む）の調製のために、それ自体が公知の任意の様式において調製することができる。ポリペプチド及び核酸を調製するための一部の好ましいが、しかし、非限定的な方法は、本明細書において記載する方法及び技術を含む。
【００９５】
本発明のポリペプチドは、一般的に、ＩｇＥに対する免疫グロブリンの単一可変ドメインを、１つ又は複数のさらなる結合単位（例えば血清アルブミンに対する１つ又は複数のペプチドなど）に、場合により、１つ又は複数の適切なリンカーを介して、適切に連結させる少なくとも工程を含む方法により調製することができる。免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びペプチド（及びリンカー）は、当技術分野において公知の及び本明細書においてさらに記載する通りの任意の方法により共役させることができる。好ましい技術は、ポリペプチドを発現する遺伝子コンストラクトを調製するための、免疫グロブリンの単一可変ドメイン及びペプチド（及びリンカー）をコードする核酸配列の連結を含む。アミノ酸又は核酸を連結するための技術は、当業者に明らかであろうが、参照が、再び、上に言及する、標準的なハンドブック、例えばSambrook et al.及びAusubel et al.など、ならびに下の実施例に作られる。
【００９６】
本発明のポリペプチドは、このように、一般的に、少なくとも、本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供し、前記核酸を適切な様式において発現させ、及び本発明の発現ポリペプチドを回収する工程を含む。そのような方法は、それ自体が公知の様式において実施することができ、それは、当業者に明らかであろうが、例えば、本明細書においてさらに記載する方法及び技術に基づく。
【００９７】
したがって、本発明のポリペプチドを産生するための方法は、以下の工程を含みうる：
−  適切な宿主細胞もしくは宿主生物（また、本明細書において「本発明の宿主」として言及される）における、又は本発明の前記ポリペプチドをコードする核酸（また、本明細書において「本発明の核酸」として言及される）の別の適切な発現系における発現、場合により、以下が続く：
−  このようにして得られた本発明のポリペプチドを単離及び／又は精製すること。特に、そのような方法は、以下の工程を含みうる：
−  本発明の前記宿主が、本発明の少なくとも１つのポリペプチドを発現及び／又は産生するようにする条件下で、本発明の宿主を培養及び／又は維持すること；
場合により、以下が続く：
−  このようにして得られた本発明のポリペプチドを単離及び／又は精製すること。
【００９８】
したがって、本発明は、また、本明細書において記載する通りのＩＳＶ又はポリペプチドをコードする核酸又はヌクレオチド配列に関する（また、「本発明の核酸」として言及される）。本発明の核酸は、一本又は二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡの形態でありうるが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡの形態である。例えば、本発明のヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又は合成ＤＮＡ（例えば、意図する宿主細胞又は宿主生物における発現のために特に適応されているコドン使用を伴うＤＮＡなど）でありうる。
【００９９】
本発明の一実施態様に従い、本発明の核酸は、本明細書において定義する通り、本質的に単離形態である。本発明の核酸は、また、ベクター（例えば、プラスミド、コスミド、又はＹＡＣなど）の形態でありうる、その中に存在しうる、及び／又はその部分でありうるが、それは、再び、本質的に単離形態でありうる。
【０１００】
本発明の核酸は、本明細書において記載する通りのＩＳＶ又はポリペプチドに関する情報に基づき、それ自体が公知の様式において調製する又は得ることができ、ならびに／あるいは適切な自然の供給源から単離することができる。また、当業者に明らかであろう通り、本発明の核酸を調製するために、また、いくつかのヌクレオチド配列、例えば、免疫グロブリンの単一可変ドメイン又は一価ポリペプチドをコードする少なくとも２つの核酸及び、例えば、１つ又は複数のリンカーをコードする核酸を、適切な様式において一緒に連結することができる。
【０１０１】
本発明の核酸を生成するための技術は、当業者に明らかであろうが、例えば、しかし、限定しないが、自動ＤＮＡ合成；部位特異的変異誘発；２つ又はそれ以上の自然発生する及び／又は合成配列（あるいはそれらの２つ又はそれ以上の部分）を組み合わせること、切断発現産物の発現に導く変異の導入；１つ又は複数の制限部位の導入（例、適切な制限酵素を使用して簡単に消化及び／又は連結されうるカセット及び／又は領域を作製すること）、及び／又は、１つ又は複数の「ミスマッチ」プライマーを使用したＰＣＲ反応を用いた変異の導入を含む。これら及び他の技術は、当業者に明らかであろうが、参照が、再び、上に言及する、標準的なハンドブック、例えばSambrook et al.及びAusubel et al.など、ならびに下の実施例に作られる。
【０１０２】
本発明の核酸は、また、遺伝子コンストラクトの形態でありうる、その中に存在しうる、及び／又はその部分でありうるが、当業者に明らかであろう通りである。そのような遺伝子コンストラクトは、一般的に、場合により、それ自体が公知の遺伝子コンストラクトの１つ又は複数のエレメント、例えば、１つ又は複数の適切な調節エレメント（例えば適切なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）及び本明細書において言及される遺伝子コンストラクトのさらなるエレメントなどに連結された少なくとも１つの本発明の核酸を含む。本発明の少なくとも１つの核酸を含むそのような遺伝子コンストラクトは、また、本明細書において、「本発明の遺伝子コンストラクト」として言及されうる。
【０１０３】
本発明の遺伝子コンストラクトは、ＤＮＡ又はＲＮＡでありうるが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。本発明の遺伝子コンストラクトは、また、意図する宿主細胞又は宿主生物の形質転換のための適切な形態で、意図する宿主細胞のゲノムＤＮＡ中への組込みのための適切な形態で、あるいは意図する宿主生物における非依存的な複製、維持、及び／又は遺伝のための適切な形態でありうる。例えば、本発明の遺伝子コンストラクトは、ベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクター、又はトランスポゾンなどの形態でありうる。特に、ベクターは、発現ベクター、即ち、発現をインビトロ及び／又はインビボで（例、適切な宿主細胞、宿主生物、及び／又は発現系において）提供することができるベクターでありうる。
【０１０４】
好ましいが、しかし、非限定的な実施態様において、本発明の遺伝子コンストラクトは、以下を含む：
ａ）本発明の少なくとも１つの核酸；動作可能に、以下に接続される
ｂ）１つ又は複数の調節エレメント、例えばプロモーター及び、場合により、適切なターミネーターなど；及び、場合により、また、
ｃ）それ自体が公知の遺伝子コンストラクトの１つ又は複数のさらなるエレメント；それにおいて、用語「調節エレメント」、「プロモーター」、「ターミネーター」、及び「動作可能に接続された」は、当技術分野において、それらの通常の意味を有する（本明細書においてさらに記載する通り）；及び、それにおいて、遺伝子コンストラクト中に存在する前記の「さらなるエレメント」は、例えば、３’又は５’ＵＴＲ配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／レポーター遺伝子、及び／又は、形質転換又は組込み（の効率）を促進又は増加しうるエレメントでありうる。そのような遺伝子コンストラクトのためのこれらの及び他の適切なエレメントは、当業者に明らかであろうが、例えば、使用するコンストラクトの型；意図する宿主細胞又は宿主生物；目的の本発明のヌクレオチド配列を発現させる様式（例、構成的、一過性、又は誘導的発現を介する）；及び／又は使用すべき形質転換技術に依存しうる。例えば、抗体及び抗体フラグメント（しかし、限定しないが、（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖフラグメントを含む）の発現及び産生のためのそれ自体が公知の調節配列、プロモーター、及びターミネーターを、本質的に類似の様式において使用してもよい。
【０１０５】
好ましくは、本発明の遺伝子コンストラクトにおいて、本発明の前記の少なくとも１つの核酸及び前記の調節エレメント、及び、場合により、前記の１つ又は複数のさらなるエレメントを、互いに「動作可能に連結」し、それにより、一般的に、それらが互いに機能的な関係にあることを意味する。例えば、プロモーターは、前記プロモーターが、コード配列の転写及び／又は発現を開始する、あるいは、そうでなければ、制御／調節することができる場合、コード配列に「動作可能に連結されている」と考えられる（それにおいて、前記コード配列は、前記プロモーター「の制御下」にあるとして理解すべきである）。一般的に、２つのヌクレオチド配列を動作可能に連結する場合、それらは同じ方向にありうる、及び、通常は、また、同じリーディングフレームにありうる。それらは、通常は、また、本質的に連続的であるが、これも要求されないであろう。
【０１０６】
本発明の核酸及び／又は本発明の遺伝子コンストラクトを使用し、宿主細胞又は宿主生物を、即ち、本明細書において記載する通りのＩＳＶ又はポリペプチドの発現及び／又は産生のために形質転換してもよい。適切な宿主又は宿主細胞が当業者に明らかでありうるが、例えば、任意の適切な真菌、原核もしくは真核細胞又は細胞株、あるいは任意の適切な真菌、原核、又は真核生物でありうるが、例えば：
−  細菌株、しかし、限定しないが、グラム陰性株、例えば大腸菌の；プロテウスの、例えば、プロテウス・ミラビリスの；シュードモナスの、例えば、シュードモナス・フルオレッセンスの株など；及び、グラム陽性株、例えばバチルス、例えば、バチルス・サブチリス又はバチルス・ブレビスの；ストレプトミセスの、例えば、ストレプトミセス・リビダンスの；スタフィロコッカスの、例えば、スタフィロコッカス・カルノサスの；及び、ラクトコッカスの、例えば、ラクトコッカス・ラクティスの株などを含み；
−  真菌細胞、しかし、限定しないが、トリコデルマの種からの、例えば、トリコデルマ・リーゼイからの；ニューロスポラの、例えば、ニューロスポラ・クラッサからの；ソルダリアの、例えば、ソルダリア・マクロスポラからの；アスペルギルスの、例えば、アスペルギルス・ニガーからの又はアスペルギルス・ソーヤからの；又は他の糸状菌からの細胞を含み；
−  酵母細胞、しかし、限定しないが、サッカロマイセスの、例えば、サッカロマイセス・セレビシエの；シゾサッカロミセスの、例えば、シゾサッカロミセス・ポンベの；ピキアの、例えば、ピキア・パストリス又はピキア・メタノリカの；ハンゼヌラの、例えば、ハンゼヌラ・ポリモルファの；クルイベロマイセスの、例えば、クルイベロマイセス・ラクティスの；アークスラの、例えば、アークスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）の；ヤロウィアの、例えば、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の種からの細胞を含み；
−  両生類細胞又は細胞株、例えばアフリカツメガエル卵母細胞など；
−  昆虫由来の細胞又は細胞株、例えば鱗翅目由来の細胞／細胞株（しかし、限定しないが、スポドプテラＳｆ９及びＳｆ２１細胞を含む）など、又はショウジョウバエ由来の細胞／細胞株、例えばシュナイダー及びＫｃ細胞など；
−  植物又は植物細胞、例えば、タバコ植物中；及び／又は
−  哺乳動物細胞又は細胞株、例えば、ヒト由来の細胞又は細胞株、哺乳動物からの細胞又は細胞株（しかし、限定しないが、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＢＨＫ−２１細胞）  を含む）及びヒト細胞又は細胞株、例えばＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、及びＰＥＲ．Ｃ６細胞など；ならびに、抗体及び抗体フラグメント（しかし、限定しないが、（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖフラグメントを含む）の発現及び産生のための、それ自体が公知の全ての他の宿主又は宿主細胞、それらは、当業者に明らかであろう。参照が、また、本明細書において上に引用する一般的な背景技術に、ならびに、例えば、WO 94/29457；WO 96/34103；WO 99/42077；Frenken et al.(Res Immunol. 149: 589-99, 1998)；Riechmann and Muyldermans (1999)、上記;van der Linden(J. Biotechnol. 80: 261-70, 2000)；Joosten et al.(Microb. Cell Fact. 2: 1, 2003)；Joosten et al.(Appl. Microbiol. Biotechnol. 66: 384-92, 2005)；及び本明細書において引用するさらなる参考文献に作られる。
【０１０７】
別の局面において、本発明は、本明細書において記載する、ＩｇＥに対するＩＳＶ、アミノ酸配列、又はポリペプチドの１つを発現する（又は、適切な状況下で発現することが可能である）；及び／又は同をコードする核酸を含む、宿主又は宿主細胞に関する。そのような宿主又は宿主細胞の一部の好ましいが、しかし、非限定的な例が、一般的に、WO 04/041867、WO 04/041865、又はWO 09/068627において記載されうる。例えば、本明細書において記載する通りの少なくとも１つの抗ＩｇＥ構築ブロックならびにWO 08/068280、WO 09/127691、及びWO 2011/095545に従った少なくとも１つのアルブミン結合ペプチドを含むポリペプチドは、利点を伴い、酵母株（例えばピキア・パストリスの株など）において発現、産生、又は製造されうる。参照が、また、WO 2011/095545に作られ、それは、また、ピキア及び他の宿主／宿主細胞における、WO 2011/095545のアルブミン結合ペプチドを含むポリペプチドの発現／産生を記載する。
【０１０８】
本明細書において記載する通りのＩＳＶ及びポリペプチドは、いわゆる「イントラボディ」として表現してもよく、例えば、WO 94/02610、WO 95/22618、及びUS 7,004,940；WO 03/014960において；Cattaneo and Biocca("Intracellular Antibodies: Development and Applications" Landes and Springer-Verlag, 1997)において；及びKontermann (Methods 34: 163-170, 2004)において記載される通りである。
【０１０９】
本発明の宿主又は宿主細胞を形質転換するための適切な技術が、当業者に明らかであろうが、意図される宿主細胞／宿主生物及び使用される遺伝子コンストラクトに依存しうる。参照が、再び、上に言及するハンドブック及び特許出願に作られる。
【０１１０】
形質転換後、本発明のヌクレオチド配列／遺伝子コンストラクトを用いて成功裏に形質転換されているそれらの宿主細胞又は宿主生物を検出及び選択するための工程を実施してもよい。これは、例えば、本発明の遺伝子コンストラクト中に存在する選択可能なマーカーに基づく選択工程又は本明細書において記載する通りのＩＳＶもしくはポリペプチドの検出を含む工程（例、特異的抗体を使用する）でありうる。
【０１１１】
形質転換された宿主細胞（それは、安定な細胞株の形態でありうる）又は宿主生物（それは、安定な変異体系統又は株の形態でありうる）は、本発明のさらなる局面を形成する。
【０１１２】
好ましくは、これらの宿主細胞又は宿主生物は、それらが、本明細書において記載する通りのＩＳＶ又はポリペプチド（宿主生物の場合において：その少なくとも１つの細胞、部分、組織、又は器官において）を発現する、又は発現することが（少なくとも）可能である（例、適切な条件下で）ようにする。本発明は、また、本発明の宿主細胞又は宿主生物のさらなる世代、後代、及び／又は子孫を含み、それらは、例えば、細胞分裂により又は有性もしくは無性生殖により得られうる。
【０１１３】
本明細書において記載する通りのＩＳＶ及びポリペプチドの発現を産生する／得るために、形質転換された宿主細胞又は形質転換された宿主生物を、一般的に、（所望の）ＩＳＶ又はポリペプチドを発現／産生するような条件下で保ち、維持し、及び／又は培養してもよい。適切な条件は当業者に明らかであろうが、通常、使用する宿主細胞／宿主生物に、ならびに本発明の（関連）ヌクレオチド配列の発現を制御する調節エレメントに依存しうる。再び、参照が、本発明の遺伝子コンストラクトに関するパラグラフにおいて上に言及するハンドブック及び特許出願に作られる。
【０１１４】
一般的に、適切な条件は、適切な培地の使用、食物の適切な供給源及び／又は適切な栄養物の存在、適切な温度の使用、ならびに、場合により、適切な誘導因子又は化合物の存在（例、本発明のヌクレオチド配列が、誘導可能なプロモーターの制御下にある場合）を含みうるが；それらの全てが当業者により選択されうる。再び、そのような条件下で、ＩＳＶ又はポリペプチドを、構成的な様式において、一過性の様式において、又は適切に誘導された場合だけで、発現されうる。
【０１１５】
また、ＩＳＶ又はポリペプチドを、（最初に）未成熟形態（上に言及する通り）において生成してもよく、それを、次に、使用する宿主細胞／宿主生物に依存して、翻訳後修飾に供してもよいことが当業者に明らかであろう。また、ＩＳＶ又はポリペプチドを、再び、使用される宿主細胞／宿主生物に依存して、グリコシル化してもよい。
【０１１６】
本発明において記載する通りのＩＳＶ又はポリペプチドを、次に、宿主細胞／宿主生物から及び／又は前記宿主細胞又は宿主生物を培養した培地から、それ自体が公知のタンパク質単離及び／又は精製技術、例えば（調製的）クロマトグラフィー及び／又は電気泳動技術、沈殿差技術、親和性技術（例、本発明のポリペプチドと融合した特定の切断可能なアミノ酸配列を使用して）、及び／又は調製的な免疫学的技術（即ち、単離すべきＩＳＶ又はポリペプチドに対する抗体を使用して）を使用して単離してもよい。
【０１１７】
本発明は、さらに、本明細書において記載する通りの（即ち、ＩｇＥに対する／本明細書において記載する通りのＩｇＥに対する少なくとも１つのＩＳＶを含む）少なくとも１つのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、又は他の化合物、及び、場合により、それ自体が公知の、即ち、組成物の意図する使用に依存し、そのような組成物の１つ又は複数のさらなる成分を含む又は含む産物又は組成物に関する。そのような産物又は組成物は、例えば、医薬的組成物（本明細書において記載する通り）、獣医学的組成物、又は診断的使用のための産物もしくは組成物（また、本明細書において記載する通り）でありうる。そのような産物又は（医薬的）組成物の一部の好ましいが、しかし、非限定的な例は、一般的に、WO 04/041867、WO 04/041865、WO 09/068627、又はWO 2011/095545において記載されうる。
【０１１８】
本発明は、また、ＩｇＥ及び／又はＩｇＥと関連付けられる１つ又は複数の生物学的作用、機構、もしくは応答を、インビトロ（例、インビトロ又は細胞アッセイにおいて）又はインビボ（例、単一細胞において又は多細胞生物において、及び、特に、哺乳動物において、より特に、ヒトにおいて、例えばＩｇＥと、ＩｇＥの増加レベル及び／又は過剰産生と、あるいはＩｇＥについての異常感受性（例えば過感受性など）と関連付けられる疾患又は障害のリスクがある又はそれに苦しむヒトなどにおいて）のいずれかで、あるいは、より一般的に、ＩｇＥと関連付けられる及び／又はそれにより媒介される任意の疾患又は障害を調節する（ための方法又は組成物）（WO 09/068627において一般的に定義される通り）における、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは他の化合物の、又は同を含む組成物の使用に関する。
【０１１９】
本発明は、また、ＩｇＥ及び／又はＩｇＥと関連付けられる１つ又は複数の生物学的作用、機構、もしくは応答を、インビトロ（例、インビトロ又は細胞アッセイにおいて）又はインビボ（例、単一細胞において又は多細胞生物において、及び、特に、哺乳動物において、より特に、ヒトにおいて、例えばＩｇＥと、ＩｇＥの増加レベル及び／又は過剰産生と、あるいはＩｇＥについての異常感受性（例えば過感受性など）と関連付けられる疾患又は障害のリスクがある又はそれに苦しむヒトなどにおいて）のいずれかで、調節するための方法に関し、その方法は、ＩｇＥを、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは他の化合物と、又は同を含む組成物と、ＩｇＥ（あるいは、ＩｇＥと関連付けられる、意図する又は所望の作用、機構、もしくは応答）を調節するために適切な様式において及び量において接触させる少なくとも工程を含む。
【０１２０】
本発明は、また、ＩｇＥ、あるいはＩｇＥと関連付けられる１つ又は複数の生物学的作用、機構、もしくは応答を、インビトロ（例、インビトロ又は細胞アッセイにおいて）又はインビボ（例、単一細胞において又は多細胞生物において、及び、特に、哺乳動物において、より特に、ヒトにおいて、例えばＩｇＥと、ＩｇＥの増加レベル及び／又は過剰産生と、あるいはＩｇＥについての異常感受性（例えば過感受性など）と関連付けられる疾患又は障害のリスクがある又はそれに苦しむヒトなどにおいて）のいずれかで調節するための組成物（例えば、限定を伴わず、本明細書においてさらに記載する通りの医薬的組成物又は調製物など）の調製における、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは他の化合物の使用に関する。
【０１２１】
本発明は、また、治療における使用のための本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、又は他の化合物に関する。
【０１２２】
特に、本発明は、また、それを必要とする被験者に、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは他の化合物（又は同を含む適切な組成物）の（医薬的に効果的な量）を投与することにより防止又は処置することができる疾患又は障害の処置のための、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは他の化合物の使用に関する。
【０１２３】
より特に、本発明は、ＩｇＥと、ＩｇＥの増加レベル及び／又は過剰産生と、あるいはＩｇＥについての異常感受性（例えば過感受性など）と関連付けられる疾患又は障害、あるいは、より一般的に、ＩｇＥと関連付けられる及び／又はそれにより媒介される任意の疾患又は障害の治療における使用のための、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは他の化合物に関する。そのような「ＩｇＥ媒介性」疾患及び障害は、当業者に明らかであろうが、例えば、限定を伴わず、状態、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、花粉症、結膜炎、湿疹、蕁麻疹（ｕｔｒｉｃａｒｉａ）、食物アレルギー、及び他のアレルギー（重篤な及び／又は生命を脅かすアレルギー反応、例えば虫刺され又は刺傷、ヘビ咬傷などに対するものなどを含む）、ならびに投薬へのアレルギー反応；ならびに、より一般的には、アナフィラキシー過敏症及び／又は（アトピー性）アレルギーに関連付けられる任意の疾患又は障害を含みうる。
【０１２４】
例えば、オマリズマブ（Xolair（登録商標））と呼ばれる、ＩｇＥに対するモノクローナルは、現在、ＩｇＥ媒介性障害のために、Genentechにより販売されている。ＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、又は他の化合物、ならびに同を含む組成物を、オマリズマブが、本発明の優先日に先立ち承認されている及び／又は本願の優先日後に承認されるであろう同じ疾患及び障害の防止又は処置において使用することができることが想定される。本明細書において提示するさらなる記載及び日付から、ＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、又は他の化合物、ならびに同を含む組成物が、オマリズマブを上回る実質的な利点を有しうること（例えば、実験部分を参照のこと、それにおいて、オマリズマブ（商業的な供給源より得られた）及び商業的なオマリズマブのパパイン消化を通じて得られたＦａｂを参照化合物として使用した）も当業者に明らかであろう。一般的に、医薬的使用のために、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、又は他の化合物は、本明細書において記載する通りの少なくとも１つのＩＳＶ又はポリペプチド及び少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体、希釈剤、もしくは賦形剤及び／又はアジュバント、ならびに、場合により、１つ又は複数のさらなる医薬的に活性なポリペプチド及び／又は化合物を含む、医薬的調製物又は組成物として製剤化されうる。非限定的な例を用いて、そのような製剤は、経口投与のため、非経口投与のために（例えば静脈内、筋肉内、もしくは皮下注射又は静脈内注入などによる）、局所投与のために、吸入による、皮膚パッチによる、インプラントによる、座剤などによる投与のための適切な形態でありうる。そのような適切な投与形態（それは、投与の様式に依存して、固形、半固形、又は液体でありうる）ならびに方法及びその調製物中での使用のための担体が、当業者に明らかであろうが、本明細書においてさらに記載される。
【０１２５】
一般的に、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、又は他の化合物は、それ自体が公知の任意の適切な様式において製剤化及び投与することができ、それについて、参照は、例えば、上に引用する一般的な背景に（及び、特にWO 04/041862、WO 04/041863、WO 04/041865、WO 04/041867、及びWO 08/020079に）ならびに標準的なハンドブック、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990), Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005);又はthe Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007に作られる（例えば、ページ２５２〜２５５を参照のこと）。
【０１２６】
例えば、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、又は他の化合物は、従来の抗体及び抗体フラグメント（ＳｃＦｖ及びダイアボディを含む）ならびに他の医薬的に活性なタンパク質のためのそれ自体が公知の任意の様式において製剤化及び投与されうる。同を調製するためのそのような製剤及び方法は、当業者に明らかであろうが、例えば、非経口投与（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、腔内、動脈内、又はくも膜下腔内投与）のために又は局所（即ち、経皮又は皮内）投与のための適切な調製物を含む。
【０１２７】
非経口投与のための調製物は、例えば、注入又は注射のために適切である滅菌溶液、懸濁剤、分散剤、又は乳剤でありうる。そのような調製物のための適切な担体又は希釈剤は、例えば、限定を伴わず、WO 08/020079のページ１４３上に言及されるものを含む。通常、水性溶液又は懸濁液が好ましいであろう。
【０１２８】
このように、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、又は他の化合物は、全身的に、例えば、経口的に、医薬的に許容可能な媒質（例えば不活性希釈剤又は同化可能な食用担体など）との組み合わせにおいて投与してもよい。それらは、硬質又は軟質シェルゼラチンカプセル中に封入してもよく、錠剤中に圧縮してもよく、又は患者の食事の食物と直接的に組み入れてもよい。経口的な治療的投与のために、本発明のＩＳＶ、アミノ酸配列、ナノボディ、及びポリペプチドは、１つ又は複数の賦形剤と組み合わせ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁剤、シロップ、ウエハなどの形態において使用してもよい。そのような組成物及び調製物は、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ナノボディ、又はポリペプチドの少なくとも０．１%を含むべきである。組成物及び調製物中のそれらのパーセンテージは、もちろん、変動しうるが、便利には、所与の単位投与形態の重量の約２〜約６０%の間でありうる。そのような治療的に有用な組成物中での本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ナノボディ、又はポリペプチドの量は、効果的な投与量レベルが得られるようにする。
【０１２９】
錠剤、トローチ、ピル、カプセルなどは、また、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤及び甘味剤又は香味剤、例えば、WO 08/020079のページ１４３〜１４４上に言及されるものを含みうる。単位投与形態がカプセルである場合、それは、上の型の材料に加えて、液体担体（例えば植物油又はポリエチレングリコールなど）を含みうる。種々の他の材料が、コーティングとして存在しうる、又は、そうでなければ、固形の単位投与形態の物理的形態を修飾しうる。例えば、錠剤、ピル、又はカプセルは、ゼラチン、ワックス、セラック、又は糖などを用いてコーティングしてもよい。シロップ又はエリキシルは、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ナノボディ、及びポリペプチド、甘味剤としてのスクロース又はフルクトース、保存剤としてのメチル及びプロピルパラベン、色素、及び香料（例えばチェリー又はオレンジフレーバーなど）を含みうる。無論、任意の単位投与形態を調製する際に使用される任意の材料は、医薬的に許容可能であり、用いられる量において実質的に非毒性であるべきである。また、記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、又は他の化合物は、持続放出調製物及びデバイス中へ組み入れてもよい。
【０１３０】
経口投与のための調製物及び製剤は、また、本発明のコンストラクトが、胃環境に耐性であり、腸中へ通過することを許しうる腸溶コーティングを伴い提供されうる。より一般的には、経口投与のための調製物及び製剤を、胃腸管の任意の所望の部分中への送達のために適切に製剤化してもよい。また、適切な坐剤を、胃腸管中への送達のために使用してもよい。
【０１３１】
本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、又は他の化合物は、また、WO 08/020079のページ１４４及び１４５上にさらに記載される通り、注入又は注射により静脈内又は腹腔内投与されうる。
【０１３２】
局所投与のために、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ナノボディ、及びポリペプチドを、純粋な形態（即ち、それらが液体である場合）において適用してもよい。しかし、一般的に、それらを、皮膚に、組成物又は製剤として、皮膚科学的に許容可能な担体（それは、固体又は液体でありうる）との組み合わせにおいて投与することが望ましいであろう（WO 08/020079のページ１４５上にさらに記載される通り）。
【０１３３】
一般的に、液体組成物（例えばローションなど）中での本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ナノボディ、及びポリペプチドの濃度は、約０．１〜２５wt-%から、好ましくは約０．５〜１０wt-%からでありうる。半固形又は固形組成物（例えばゲル又は粉末など）中での濃度は、約０．１〜５wt-%、好ましくは約０．５〜２．５wt-%でありうる。
【０１３４】
処置における使用のために要求される本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、又は他の化合物の量は、選択された特定のＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、又はコンストラクトだけでなく、しかし、また、投与の経路、処置されている状態の性質、ならびに患者の年齢及び状態に伴い変動しうるが、最終的には、担当医又は臨床医の判断によるであろう。
【０１３５】
所望の用量は、便利に、単一用量中で又は適切な間隔で投与される分割用量として（例えば、２、３、４又はそれ以上のサブ用量／日として）提示されうる。サブ用量自体を、さらに、例えば、多数の別々の緩やかな間隔の投与（例えば吸入器からの複数回の吸入又は眼中への複数の液滴の適用による、など）に分割してもよい。
【０１３６】
投与レジメンは、長期間の毎日の処置を含みうる。「長期間」により、少なくとも２週間及び好ましくは、いくつかの週、月、又は年の持続期間を意味する。この投与量の範囲における必要な改変が、当業者により、本明細書において与えられた教示の通常の実験だけを使用して決定されうる。Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed.4), Mack Publishing Co., Easton, PAを参照のこと。投与量は、また、任意の合併症の事象において個々の医師により調整されることができる。
【０１３７】
別の局面において、本発明は、ＩｇＥと、ＩｇＥの増加レベル及び／又は過剰産生と、あるいはＩｇＥについての異常感受性（例えば過感受性など）と関連付けられる少なくとも１つの疾患又は障害の防止及び／又は処置のための方法に関し、前記方法は、それを必要とする被験者に、本明細書において記載する通りのアミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物の及び／又は同を含む医薬的組成物の医薬的に活性な量を投与することを含む。
【０１３８】
本発明の文脈において、用語「防止及び／又は処置」は、疾患を防止及び／又は処置することを含むだけでなく、しかし、また、一般的に、疾患の発症を防止すること、疾患の進行を遅らせる又は逆転させること、疾患に関連付けられる１つ又は複数の症状の発生を防止する又は遅らせること、疾患に関連付けられる１つ又は複数の症状を低下及び／又は軽減すること、疾患の及び／又はそれに関連付けられる任意の症状の重症度及び／又は持続時間を低下させること、ならびに／あるいは、疾患の及び／又はそれに関連付けられる任意の症状の重症度におけるさらなる増加を防止すること、疾患により起こされる任意の生理学的な傷害を防止、低下、又は逆転させること、ならびに、一般的に、処置されている患者に有益である任意の薬理学的な作用を含む。
【０１３９】
処置すべき被験者は、任意の温血動物でありうるが、しかし、特に哺乳動物、より特にヒトである。当業者に明らかであろう通り、処置される被験者は、特に、本明細書において言及する疾患及び障害に苦しむ、又はそのリスクがある人であろう。
【０１４０】
本発明は、ＩｇＥと、ＩｇＥの増加レベル及び／又は過剰産生と、あるいはＩｇＥについての異常感受性（例えば過感受性など）と、その生物学的もしくは薬理学的活性と、及び／又はＩｇＥが含まれる生物学的経路もしくはシグナル伝達と関連付けられる少なくとも１つの疾患又は障害の防止及び／又は処置のための方法に関し、前記方法が、それを必要とする被験者に、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物、及び／又は同を含む医薬的組成物の医薬的に活性な量を投与することを含む。特に、本発明は、ＩｇＥ、その生物学的もしくは薬理学的活性、及び／又はＩｇＥが含まれる生物学的経路もしくはシグナル伝達を調節することにより処置することができる、少なくとも１つの疾患又は障害の防止及び／又は処置のための方法に関し、前記方法が、それを必要とする被験者に、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物、及び／又は同を含む医薬的組成物の医薬的に活性な量を投与することを含む。特に、前記の医薬的に効果的な量は、ＩｇＥ、その生物学的もしくは薬理学的活性、及び／又はＩｇＥが含まれる生物学的経路もしくはシグナル伝達を調節するために十分である量；及び／又は、ＩｇＥ、その生物学的もしくは薬理学的活性、及び／又はＩｇＥが含まれる生物学的経路もしくはシグナル伝達を調節するために十分である、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物のレベルを提供する量でありうる。
【０１４１】
本発明は、さらに、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物を投与することにより処置することができる少なくとも１つの疾患又は障害の防止及び／又は処置のための方法に関し、前記方法が、それを必要とする被験者に、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物、及び／又は同を含む医薬的組成物の医薬的に活性な量を投与することを含む。
【０１４２】
より特に、本発明は、本明細書において列挙する疾患及び障害からなる群より選ばれる少なくとも１つの疾患又は障害の防止及び／又は処置のための方法に関し、前記方法は、それを必要とする被験者に、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物、及び／又は同を含む医薬的組成物の医薬的に活性な量を投与することを含む。
【０１４３】
別の局面において、本発明は、免疫療法のため、特に受動免疫療法のための方法に関し、その方法は、本明細書において言及する疾患及び障害に苦しむ又はそのリスクがある被験者に、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物、及び／又は同を含む医薬的組成物の医薬的に活性な量を投与することを含む。
【０１４４】
上の方法において、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物及び／又は同を含む医薬的組成物を、使用される特定の医薬的製剤又は組成物に依存して、任意の適切な様式において投与することができる。このように、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物及び／又は同を含む医薬的組成物を、例えば、使用される特定の医薬的製剤又は組成物に依存して、経口、腹腔内（例、静脈内、皮下、筋肉内、又は胃腸管内を回避する他の任意の投与経路を介して）、鼻腔内、経皮、局所、坐剤を用いて、吸入により投与することができる。臨床医は、そのような投与において使用される適切な投与経路及び適切な医薬的製剤又は組成物を、防止又は処置すべき疾患又は障害及び臨床医に周知である他の因子に依存して、選択することができるであろう。
【０１４５】
本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物及び／又は同を含む医薬的組成物を、防止又は処置すべき疾患又は障害を防止及び／又は処置するために適切な処置レジメンに従って投与する。臨床医は、一般的に、適切な処置レジメンを、因子、例えば、防止又は処置すべき疾患又は障害、処置すべき疾患の重症度及び／又はその症状の重症度、使用すべき特定のＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物、使用すべき特定の投与経路及び医薬的製剤又は組成物、患者の年齢、性別、体重、食事、全身状態、ならびに臨床医に周知の同様の因子などに依存して、決定することができるであろう。
【０１４６】
一般的に、処置レジメンは、本明細書において記載する通りの１つ又は複数のＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは他の化合物、あるいは同を含む１つ又は複数の組成物の、１つ又は複数の医薬的に効果的な量又は用量における投与を含みうる。投与する特定の量又は用量は、臨床医により、再び、上に引用する因子に基づき、決定することができる。
【０１４７】
一般的に、本明細書において言及する疾患及び障害の防止及び／又は処置のために、処置すべき特定の疾患又は障害、使用される特定のＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物の効力、特定の投与経路、及び使用される特定の医薬的製剤又は組成物に依存し、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは他の化合物は、一般的に、１グラム〜０．０１マイクログラム／kg体重／日、好ましくは０．１グラム〜０．１マイクログラム／kg体重／日、例えば約１、１０、１００、又は１０００マイクログラム／kg体重／日の量で、連続的（例、注入による）、単一の１日用量として又は１日の間の複数の分割用量として投与されうる。臨床医は、一般的には、適切な一日用量を、本明細書において言及する因子に依存し、決定することができるであろう。また、特定の場合において、臨床医は、これらの量から逸脱することを、例えば、上に引用する因子及び彼の専門家判断に基づき、選んでもよいことが明らかであろう。一般的に、投与される量に関する一部のガイダンスを、しかし、親和性／結合力、有効性、生物分布、半減期、及び当業者に周知の同様の因子における違いを考慮に入れて、本質的に同じ経路を介して投与される、同じ標的に対する同等の従来の抗体又は抗体フラグメントについて通常投与される量から得ることができる。
【０１４８】
通常、上の方法において、本明細書において記載する通りの単一のＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、又は化合物を使用する。しかし、本明細書において記載する通りの２つ又はそれ以上のＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、又は他の化合物を使用することは、本発明の範囲内である。
【０１４９】
本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、又は他の化合物を、また、１つ又は複数のさらなる医薬的に活性な化合物又は成分との組み合わせにおいて、即ち、組み合わせ処置レジメンとして使用してもよく、それは、相乗効果に導きうる又は導かないであろう。再び、臨床医は、そのようなさらなる化合物又は成分、ならびに適切な組み合わせの処置レジメンを、上に引用する因子及び彼の専門家判断に基づき、選択することができるであろう。
【０１５０】
特に、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、又は他の化合物を、本明細書において引用する疾患及び障害の防止及び／又は処置のために使用する又は使用することができる他の医薬的に活性な化合物又は成分との組み合わせにおいて使用してもよく、その結果として、相乗効果が得られうる又は得られないであろう。そのような化合物及び成分、ならびにそれらを投与するための経路、方法、及び医薬的製剤又は組成物の例が、臨床医には明らかでありうる。
【０１５１】
２つ又はそれ以上の物質又は成分を、組み合わせ処置レジメンの部分として使用する場合、それらは、同じ投与経路を介して、又は、異なる投与経路を介して、本質的に同じ時間に又は異なる時間に（例、本質的に同時に、連続的に、又は代わりのレジメンに従って）投与することができる。物質又は成分を、同じ投与経路を介して、同時に投与すべき場合、それらは、異なる医薬的製剤もしくは組成物又は組み合わせた医薬的製剤もしくは組成物の部分として投与してもよく、当業者に明らかであろう通りである。
【０１５２】
また、２つ又はそれ以上の活性物質又は成分を、組み合わせ処置レジメンの部分として使用する場合、物質又は成分の各々を、化合物又は成分をそれ自体で使用する場合に使用される同じ量で、同じレジメンに従って投与してもよく、そのような組み合わせ使用は、相乗効果に導きうる又は導かないであろう。しかし、２つ又はそれ以上の活性物質又は成分の組み合わせ使用が、相乗効果に導く場合、投与すべき物質又は成分の１つ、それ以上、又は全ての量を低下させ、依然として所望の治療的作用を達成することも可能でありうる。これは、例えば、物質又は成分の１つ又は複数の使用に関連付けられる任意の不要な副作用を回避、限定、又は低下させる（それらを、それらの通常の量で使用した場合で、依然として所望の医薬的又は治療的効果が得られる）ために有用であろう。
【０１５３】
本発明に従って使用される処置レジメンの有効性は、含まれる疾患又は障害についてそれ自体が公知である任意の様式で決定及び／又は追跡してもよく、臨床医に明らかであろう通りである。臨床医は、また、適当な場合、及び、ケースバイケースに基づき、特定の処置レジメンを変化又は修飾することができ、所望の治療的効果を達成し、不要な副作用を回避、限定、又は低下させ、及び／又は、一方で所望の治療的効果を達成し、他方で不要な副作用を回避、限定、又は低下させる適当なバランスを達成するようにする。
【０１５４】
一般的に、処置レジメンには、所望の治療的効果が達成されるまで及び／又は所望の治療的効果が維持される限り、従いうる。再び、これは、臨床医により決定されることができる。
【０１５５】
別の局面において、本発明は、ＩｇＥと、ＩｇＥの増加レベル及び／又は過剰産生と、あるいはＩｇＥについての異常感受性（例えば過感受性など）と、その生物学的もしくは薬理学的活性と、及び／又はＩｇＥが含まれる生物学的経路もしくはシグナル伝達と関連付けられる少なくとも１つの疾患又は障害の防止及び／又は処置のための；及び／又は、本明細書において言及する処置の方法の１つ又は複数における使用のための、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物の使用に関する。
【０１５６】
処置すべき被験者は、任意の温血動物でありうるが、しかし、特に哺乳動物、より特にヒトである。当業者に明らかであろう通り、処置される被験者は、特に、本明細書において言及する疾患及び障害に苦しむ、又はそのリスクがある人でありうる。
【０１５７】
本発明は、また、本発明のＩＳＶ、アミノ酸配列、ナノボディ、もしくはポリペプチドを患者に投与することにより防止及び／又は処置することができる少なくとも１つの疾患又は障害の防止及び／又は処置のための医薬的組成物の調製における、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質、コンストラクト、もしくは化合物の使用に関する。
【０１５８】
より特に、本発明は、ＩｇＥと、ＩｇＥの増加レベル及び／又は過剰産生と、あるいはＩｇＥについての異常感受性（例えば過感受性など）と関連付けられる疾患又は障害の防止及び／又は処置のための、及び、特に、本明細書において列挙するそのような疾患及び障害の１つ又は複数の防止及び処置のための医薬的組成物の調製における、本明細書において記載する通りのＩＳＶ、アミノ酸配列、ナノボディ、もしくはポリペプチドの使用に関する。
【０１５９】
再び、そのような医薬的組成物において、本明細書において記載する通りの１つ又は複数のＩＳＶのアミノ酸配列、ナノボディ、もしくはポリペプチドは、また、１つ又は複数の他の活性成分（例えば本明細書において言及するものなど）と適切に組み合わせてもよい。
【０１６０】
定義
他に示さない又は定義しない限り、使用する全ての用語は、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有し、それらは、当業者に明らかであろう。例えば、標準的なハンドブック、例えばSambrook et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual ( 2nd Ed.)Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、F. Ausubel et al.(Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987)、Lewin(Genes II, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1985)、Old et al.(Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering (2nd edition) University of California Press, Berkeley, CA, 1981);Roitt et al.(Immunology (6th.Ed.)Mosby/Elsevier, Edinburgh, 2001)、Roitt et al.(Roitt's Essential Immunology (10th Ed.)Blackwell Publishing, UK, 2001)、及びJaneway et al.(Immunobiology (6th Ed.)Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York, 2005)、ならびに本明細書において引用する一般的な背景技術が参照される。
【０１６１】
他に示さない限り、具体的に詳細に記載されていない全ての方法、工程、技術、及びマニピュレーションを実施することができ、それ自体が公知の様式において実施されており、当業者に明かであろう通りである。例えば、再び、標準的なハンドブック及び本明細書において言及する一般的な背景技術に、ならびに、本明細書において引用するさらなる参考文献に；ならびに、例えば、以下のレビュー、Presta(Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (5-6): 640-56, 2006)、 Levin and Weiss (Mol. Biosyst. 2(1): 49-57, 2006)、Irving et al.(J. Immunol. Methods 248(1-2): 31-45, 2001)、Schmitz et al.(Placenta 21 Suppl.A: S106-12, 2000)、Gonzales et al.(Tumour Biol. 26(1): 31-43, 2005)が参照され、それらは、タンパク質工学のための技術、例えば親和性成熟ならびにタンパク質（例えば免疫グロブリンなど）の特異性及び他の所望の特性を改善するための他の技術などを記載する。
【０１６２】
用語「配列」は、本明細書において使用する通り（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」、「ポリペプチド配列」、又は「タンパク質配列」などの用語において）、一般的に、文脈がより限定された解釈を要求しない限り、関連するアミノ酸配列ならびにこれをコードする核酸又はヌクレオチド配列の両方を含むと理解すべきである。
【０１６３】
核酸又はアミノ酸は、例えば、それが得られた反応媒質又は培養媒質と比較し、それが、それが、通常、前記の供給源又は媒質中で関連付けられる少なくとも１つの他の成分、例えば別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分もしくは巨大分子、又は少なくとも１つの汚染物、不純物、もしくは微量成分から分離されている場合、「（本質的に）単離された（形態）（における）」であると考えられる。特に、核酸又はアミノ酸は、それが、少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、より特に少なくとも１００倍、及び１０００倍まで又はそれ以上で精製されている場合、「（本質的に）単離された」を考える。「（本質的に）単離された形態において」である核酸又はアミノ酸は、好ましくは、本質的に均質であり、適切な技術、例えば適切なクロマトグラフィー技術など、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動などを使用して決定される通りである。
【０１６４】
ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を、別のヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列をそれぞれ「含む」、又は別のヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列「から本質的になる」と言う場合、これは、後者のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が、最初に言及したヌクレオチド又はアミノ酸配列にそれぞれ組み入れられていることを意味するが、しかし、通常は、これは、一般的に、最初に言及したヌクレオチド又はアミノ酸配列が、その配列内に、最初に言及した配列が、実際に、どのように生成された又は得られたかとは無関係に、同じヌクレオチド配列又はアミノ酸配列をそれぞれ後者の配列として有する、ヌクレオチド又はアミノ酸残基のストレッチをそれぞれ含むことを意味する。非限定的な例を用いて、ポリペプチドが免疫グロブリンの単一可変ドメインを含むと言う場合、これは、前記の免疫グロブリンの単一可変ドメイン配列が、ポリペプチドの配列中に組み入れられていることを意味しうるが、しかし、より通常は、これは、一般的に、ポリペプチドが、その配列内に、どのように生成された又は得られたかとは無関係に、免疫グロブリンの単一可変ドメインの配列を含むことを意味する。また、核酸又はヌクレオチド配列が、別のヌクレオチド配列を含むと言う場合、最初に言及した核酸又はヌクレオチド配列は、好ましくは、それが発現産物（例、ポリペプチド）中に発現される場合、後者のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列は、前記の発現産物の部分を形成するようにする（言い換えると、後者のヌクレオチド配列は、最初に言及した、より大きな核酸又はヌクレオチド配列と同じリーディングフレーム中にある）。
【０１６５】
ＩＳＶ「から本質的になる」ポリペプチドにより、免疫グロブリンの単一可変ドメインのいずれかが、ポリペプチドと厳密に同じある、又は、限定された株のアミノ酸残基、例えば１〜２０アミノ酸残基、例えば、１〜１０アミノ酸残基及び、好ましくは、１〜６アミノ酸残基、例えば１、２、３、４、５、又は６アミノ酸残基（免疫グロブリンの単一可変ドメインのアミノ末端に、カルボキシル末端に、又はアミノ末端及びカルボキシル末端の両方に加えられた）を有するポリペプチドに対応することを意味する。
【０１６６】
２つ又はそれ以上のアミノ酸配列を比較する目的のために、第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列の間の「配列同一性」（また、本明細書において「アミノ酸同一性」として言及される」のパーセンテージを、［第２アミノ酸配列中の対応する位置でのアミノ酸残基と同一である第１アミノ酸配列中のアミノ酸残基の数］を、［第１アミノ酸配列中のアミノ酸残基の総数］により割り、［１００%］を乗じることにより算出してもよく、それにおいて、第２アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の各々の欠失、挿入、置換、又は付加（第１アミノ酸配列と比較し）は、単一アミノ酸残基（位置）での違いとして、即ち、本明細書において定義する通りの「アミノ酸の違い」として考えられる。あるいは、２つのアミノ酸配列の間での配列同一性の程度は、配列アラインメント用の公知のコンピューターアルゴリズム（例えばNCBI Blast v2.0など）を使用し、標準的な設定を使用して算出してもよい。配列同一性の程度を決定するための一部の他の技術、コンピューターアルゴリズム、及び設定は、例えば、WO 04/037999、EP 0967284、EP 1085089、WO 00/55318、WO 00/78972、WO 98/49185、及びGB 2357768において記載されている。通常は、本明細書において上に概説する算出方法に従って、２つのアミノ酸配列の間の「配列同一性」のパーセンテージを決定する目的のために、最大数のアミノ酸残基を伴うアミノ酸配列を、「第１」アミノ酸配列として取りうるが、他のアミノ酸配列は、「第２」アミノ酸配列として取りうる。
【０１６７】
また、２つのアミノ酸配列の間の配列同一性の程度を決定する際、当業者は、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れうるが、それは、一般的に、アミノ酸残基が、同様の化学的構造の別のアミノ酸残基を用いて置換されており、ポリペプチドの機能、活性、又は他の生物学的特性に対するほとんどない又は本質的にない影響を有する、アミノ酸置換として記載することができる。そのような保存的アミノ酸置換は、当技術分野において、例えば、WO 04/037999、GB 335768、WO 98/49185、WO 00/46383、及びWO 01/09300から周知であり；ならびに、そのような置換の（好ましい）型及び／又は組み合わせは、WO 04/037999ならびにWO 98/49185からの及び本明細書において引用するさらなる参考文献からの関連のある教示に基づいて選択されうる。
【０１６８】
そのような保存的置換は、好ましくは、それにおいて、以下の群（ａ）−（ｅ）内の１つのアミノ酸が、同じ群内の別のアミノ酸により置換されている置換である：（ａ）小さな脂肪族、非極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、及びＧｌｙ；（ｂ）極性、負に荷電した残基及びそれらの（非荷電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、及びＧｌｎ；（ｃ）極性、正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、及びＬｙｓ；（ｄ）大きな脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、及びＣｙｓ；ならびに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐ。特に好ましい保存的置換は、以下の通りである：ＡｌａをＧｌｙに又はＳｅｒに；ＡｒｇをＬｙｓに；ＡｓｎをＧｌｎに又はＨｉｓに；ＡｓｐをＧｌｕに；ＣｙｓをＳｅｒに；ＧｌｎをＡｓｎに；ＧｌｕをＡｓｐに；ＧｌｙをＡｌａに又はＰｒｏに；ＨｉｓをＡｓｎに又はＧｌｎに；ＩｌｅをＬｅｕに又はＶａｌに；ＬｅｕをＩｌｅに又はＶａｌに；ＬｙｓをＡｒｇに、Ｇｌｎに、又はＧｌｕに；ＭｅｔをＬｅｕに、Ｔｙｒに、又はＩｌｅに；ＰｈｅをＭｅｔに、Ｌｅｕに、又はＴｙｒに；ＳｅｒをＴｈｒに；ＴｈｒをＳｅｒに；ＴｒｐをＴｙｒに；ＴｙｒをＴｒｐに；ならびに／あるいはＰｈｅをＶａｌに、Ｉｌｅに、又はＬｅｕに。
【０１６９】
２つのアミノ酸配列を比較する場合、用語「アミノ酸の違い」は、第２配列と比較した、第１配列の位置での単一アミノ酸残基の挿入、欠失、又は置換を指す；２つのアミノ酸配列が、１、２、又はそれ以上のそのようなアミノ酸の違いを含むことができることが理解されている。より特に、本明細書において記載する通りのアミノ酸配列及び／又はポリペプチドにおいて、用語「アミノ酸配列の違い」は、考慮下にあるＣＤＲ配列と比較し、特定のＣＤＲ配列の位置での単一アミノ酸残基の挿入、欠失、又は置換を指す。
【０１７０】
「アミノ酸の違い」は、１、２、３、４、５、６、又は最大７つの置換、欠失、もしくは挿入、又はそれらの任意の組み合わせでありうるが、それは、ポリペプチドの特性を改善する、あるいは、本明細書において記載する通りのポリペプチドの所望の特性から又は所望の特性のバランスもしくは組み合わせから少なくとも過剰を減じない。この点において、本発明の結果として生じるポリペプチドは、１つ又は複数のＣＤＲ配列を含むが、１、２、３、４、５、６、又は最大７つの置換、欠失、もしくは挿入を伴わないポリペプチドと比較し、同じ、ほとんど同じ、又はより高い親和性を伴い、ＩｇＥに少なくとも結合すべきであり、前記親和性は、表面プラズモン共鳴により測定される通りである。
【０１７１】
この点において、考慮下のアミノ酸配列は、それ自体が公知の親和性成熟の１つ又は複数の技術を使用した親和性成熟を用いて、従って、特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列でありうる。
【０１７２】
例えば、及び、ポリペプチドを発現するために使用される宿主生物に依存し、そのような欠失及び／又は置換は、翻訳後修飾のための１つ又は複数の部位（例えば１つ又は複数のグリコシル化部位など）を除去するように設計されうるが、当業者の能力内であろう通りである。
【０１７３】
特定のエピトープ、抗原、又はタンパク質（又は、その少なくとも１つの部分、フラグメント、又はエピトープについて）「に結合する」又は「に特異的に結合する」ことができる、「について親和性を有する」及び／又は「について特異性を有する」ポリペプチド（例えば本発明の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は、一般的に、抗原結合分子もしくはそのフラグメントなど）は、前記エピトープ、抗原、又はタンパク質「に対する」又は「に対して向けられた」と言われ、あるいは、そのようなエピトープ、抗原、又はタンパク質に関して、「結合」分子である、あるいは「抗」エピトープ、「抗」抗原、又は「抗」タンパク質（例、「抗」ＩｇＥ）であると言う。
【０１７４】
用語「（交差）遮断する」、「（交差）遮断した」、「（交差）遮断している」、「競合的結合」、「（交差）競合する」、「（交差）競合している」、及び「（交差）競合」を本明細書において互換的に使用し、所与の標的への他の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は結合薬剤の結合と干渉する、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤の能力を意味する。免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤が、標的への別のものの結合と干渉することができる範囲は、従って、それが、本発明に従って交差遮断すると言うことができるか否かを問わず、競合結合アッセイを使用して決定することができる。１つの特に適切な定量的な交差遮断アッセイでは、表面プラズモン共鳴技術を使用して相互作用の範囲を測定することができるBIAcore機器を使用する。別の適切な定量的な交差遮断アッセイでは、標的へのそれらの結合という点で、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤の間での競合を測定するためのＥＬＩＳＡベースのアプローチを使用する。
【０１７５】
以下では、一般的に、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤が、本発明に従って交差遮断する又は交差遮断することが可能であるかを決定するための適切なBIAcoreアッセイを記載する。アッセイを、本明細書において記載する免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤のいずれかと使用することができることが認められるであろう。BIAcore機器（例えば、BIAcore 3000）は、製造者の推奨に沿って操作する。このように、１つの交差遮断アッセイにおいて、標的タンパク質（例、ＩｇＥ）は、CM5 BIAcoreチップに、標準的なアミンカップリング化学を使用して共役し、標的を用いてコートされている表面を生成する。典型的には、標的の２００〜８００共鳴単位をチップに共役させうる（結合の簡単に測定可能なレベルを与えるが、しかし、使用されているテスト試薬の濃度により容易に飽和可能である量）。互いに交差遮断するそれらの能力について評価すべき２つのテスト結合薬剤（Ａ＊及びＢ＊と名付ける）を、適切な緩衝液中での結合部位の１対１モル比で混合し、テスト混合物を作製する。結合部位ベースで濃度を算出する場合、結合薬剤の分子量は、その結合薬剤上の標的結合部位の数により割った結合薬剤の全分子量である仮定される。テストミックス中の各々の結合薬剤の濃度は、BIAcoreチップ上に捕捉された標的分子上のその結合薬剤についての結合部位を容易に飽和させるために十分に高いはずである。混合物中の結合薬剤は同じモル濃度（結合ベースで）であり、その濃度は、典型的には、１．００と１．５マイクロモル（結合部位ベースで）の間でありうる。Ａ＊単独及びＢ＊単独を含む別々の溶液も調製する。これらの溶液中のＡ＊及びＢ＊は、同じ緩衝液中で、テストミックス中と同じ濃度であるべきである。テスト混合物を、標的コートBIAcoreチップの上に通し、結合の全量を記録する。チップを、次に、チップが結合した標的を損傷することなく、結合した結合薬剤を除去するような方法において処理する。典型的には、これは、チップを、３０mM  ＨＣｌを用いて、６０秒間にわたり処理することにより行う。Ａ＊単独の溶液を、次に、標的コート表面の上に通し、結合の量を記録する。チップを再び処理し、チップが結合した標的を損傷することなく、結合した結合薬剤の全てを除去する。Ｂ＊単独の溶液を、次に、標的コート表面の上に通し、結合の量を記録する。Ａ＊及びＢ＊の混合物の最大理論的結合を次に算出し、標的表面単独の上を通した場合での各々の結合薬剤の結合の合計である。混合物での実際の記録された結合が、この理論的最大値未満である場合、次に、２つの結合薬剤は、それぞれ交差遮断すると言う。このように、一般的に、本発明に従った、交差遮断する免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤は、上のBIAcore交差遮断アッセイにおいて標的に結合するであろうものであり、アッセイの間に、及び第２免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤の存在において、記録された結合が、組み合わせにおける２つの免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ド���イン、ポリペプチド、又は結合薬剤の、最大理論的結合の８０%〜０．１%（例、８０%〜４%）の間、特に、最大理論的結合の７５%〜０．１%（例、７５%〜４%）の間、より特に、最大理論的結合の７０%〜０．１%（例、７０%〜４%）の間であるようにする（ちょうど上に定義する通り）。上に記載するBIAcoreアッセイは、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤が、本発明に従い、互いに交差遮断するか否かを決定するために使用される一次アッセイである。稀な場合では、特定の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤は、アミン化学を介して、CM5 BIAcoreチップに共役させた標的に結合しないであろう（これは、通常、標的上の関連する結合部位が、チップへの共役によりマスク又は破壊される場合に生じる）。そのような場合において、交差遮断は、標的のタグ付きバージョン、例えば、Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きバージョンを使用して決定することができる。この特定のフォーマットにおいて、抗Ｈｉｓ抗体は、BIAcoreチップに共役されうるが、次に、Ｈｉｓタグ付き標的は、チップの表面の上を通し、抗Ｈｉｓ抗体により捕捉されうる。交差遮断分析は、本質的に上に記載する通りに行いうる（各々のチップ再生サイクル後、新たなＨｉｓタグ付き標的を、抗Ｈｉｓ抗体コート表面上に戻し充填しうることを除く）。Ｎ末端Ｈｉｓタグ付き標的を使用して与えられた例に加えて、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付き標的を代わりに使用することができうる。さらに、当技術分野において公知である種々の他のタグ及びタグ結合タンパク質の組み合わせを、そのような交差遮断分析のために使用することができうる（例、抗ＨＡ抗体を伴うＨＡタグ；抗ＦＬＡＧ抗体を伴うＦＡＬＧタグ；ストレプトアビジンを伴うビオチンタグ）。
【０１７６】
以下は、一般的に、標的（例、ＩｇＥ）に対する免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤が、本明細書において定義する通り、交差遮断する又は交差遮断することが可能であるか否かを決定するためのＥＬＩＳＡアッセイを記載する。アッセイを、本明細書において記載する免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤のいずれかと使用することができることが認められるであろう。アッセイの一般的な原理は、ＥＬＩＳＡプレートのウェル上にコートされた標的に対する免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は結合薬剤を有することである。第２の、潜在的に交差遮断する、抗標的免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチドの過剰量を、溶液中に加える（即ち、ＥＬＩＳＡプレートに結合していない）。限定された量の標的を、次に、ウェルに加える。コートされた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチド及び溶液中の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチドは、限定された数の標的分子の結合について競合する。プレートを洗浄し、コートされた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチドにより結合されていない過剰な標的を除去し、また、第２の溶液相の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチドならびに第２の溶液相の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチドと標的の間に形成された任意の複合体を除去する。結合した標的の量を、次に、標的を検出するために適当である試薬を使用して測定する。コートされた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチドを交差遮断することができる溶液中の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチドは、コートされた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチドが結合することができる標的分子の数における、コートされた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチドが、第２の溶液相の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチドの非存在において結合することができる標的分子の数と比べ、減少を起こすことができる。第１の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチド（例、Ａｂ−Ｘ）を選び、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチドにする場合での例において、それは、ＥＬＩＳＡプレートのウェル上にコートされ、その後、プレートを、適切な遮断溶液を用いて遮断し、その後に加えられた試薬の非特異的結合を最小限にする。第２の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチド（例、Ａｂ−Ｙ）の過剰量を、次に、ＥＬＩＳＡプレートに加え、１ウェル当たりのＡｂ−Ｙ標的結合部位のモルが、ＥＬＩＳＡプレートのコーティングの間に１ウェル当たりに使用されたＡｂ−Ｘ標的結合部位のモルよりも少なくとも１０倍高いようにする。標的を、次に、加え、１ウェル当たりの標的のモルが、各々のウェルをコートするために使用されたＡｂ−Ｘ標的結合部位のモルよりも少なくとも２５倍低いようにする。適切なインキュベーション期間に続き、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、標的を検出するための試薬を加え、コートされた抗標的免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチド（この場合においてＡｂ−Ｘ）により特異的に結合された標的の量を測定する。アッセイについてのバックグラウンドシグナルは、コートされた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチド（この場合においてＡｂ−Ｘ）、第２溶液相の免疫グロブリンの単一可変ドメイン又はポリペプチド（この場合においてＡｂ−Ｙ）、標的緩衝液だけ（即ち、標的を伴わない）、及び標的検出試薬を伴うウェルにおいて得られたシグナルとして定義する。アッセイについての陽性コントロールシグナルは、コートされた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチド（この場合においてＡｂ−Ｘ）、第２溶液相の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン又はポリペプチド緩衝液だけ（即ち、第２溶液相の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチドを伴わない）、標的及び標的検出試薬を伴うウェルにおいて得られたシグナルとして定義する。ＥＬＩＳＡアッセイは、陽性コントロールシグナルがバックグラウンドシグナルの少なくとも６倍であるようにする様式において実行してもよい。コーティングする免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチドとして使用するための及び第２の（コンペティター）免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチドとして使用するための免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチドの選択から結果として生じる任意のアーチファクト（例、標的についてのＡｂ−ＸとＡｂ−Ｙの間の有意に異なる親和性）を回避するために、交差遮断アッセイを２つのフォーマットにおいて実行しうる：１）フォーマット１は、Ａｂ−Ｘが、ＥＬＩＳＡプレート上にコートされている免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチドであり、Ａｂ−Ｙが、溶液中にあるコンペティターの免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチドである場合であり、及び、２）フォーマット２は、Ａｂ−Ｙが、ＥＬＩＳＡプレート上にコートされている免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチドであり、Ａｂ−Ｘが、溶液中にあるコンペティターの免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチドである場合である。Ａｂ−Ｘ及びＡｂ−Ｙは、フォーマット１において又はフォーマット２において、溶液相の抗標的免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチドが、溶液相の抗標的免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチドの非存在（即ち、陽性コントロールウェル）において得られた標的検出シグナルと比較し、標的検出シグナル（即ち、コートされている免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチドにより結合された標的の量）の６０%〜１００%の間、特に７０%〜１００%の間、より特に８０%〜１００%の間の低下を起こすことができる場合、交差遮断するとして定義される。
【０１７７】
標的に対する免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はポリペプチドが、交差遮断する、交差遮断する、競合的に結合する、又は交差競合的である（本明細書において定義する通り）ことが可能であるか否かを決定するための方法が、例、Xiao-Chi Jia et al.(Journal of Immunological Methods 288: 91-98, 2004)、Miller et al.(Journal of Immunological Methods 365: 118-125, 2011)及び／又は本明細書において記載する方法（例、実施例６、７、８、９、１０を参照のこと）において記載されている。
【０１７８】
本発明のポリペプチドの半減期は、一般的に、WO 08/020079のページ５７上のパラグラフｏ）において記載される通りに定義することができ、本明細書において言及する通り、ポリペプチドの血清濃度が、５０%だけ、インビボで、例えば、自然の機構による、ポリペプチドの分解及び／又はポリペプチドのクリアランスもしくは隔離に起因して低下するために要する時間を指す。本発明のポリペプチドのインビボでの半減期を、それ自体が公知の任意の様式において、例えば薬物動態解析により決定することができる。適切な技術が当業者に明らかであろうが、例えば、一般的には、WO 08/020079のページ５７上のパラグラフｏ）において記載される通りでありうる。また、WO 08/020079のページ５７上のパラグラフｏ）において言及される通り、半減期は、パラメーター、例えばｔ１／２アルファ、ｔ１／２ベータ、及び曲線下面積（ＡＵＣ）などを使用して表すことができる。参照が、例えば、標準的なハンドブック、例えばKenneth et al.(Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, John Wiley & Sons Inc, 1986)及びM Gibaldi and D Perron("Pharmacokinetics", Marcel Dekker, 2nd Rev. Edition, 1982)などに作られる。用語「半減期における増加」又は「増加した半減期」は、また、WO 08/020079のページ５７上のパラグラフｏ）において定義される通りであり、特に、ｔ１／２ベータにおける増加（ｔ１／２アルファ及び／又はＡＵＣあるいは両方における増加を伴う又は伴わない）を指す。
【０１７９】
他に示さない限り、用語「免疫グロブリン」は、本明細書において重鎖抗体に又は従来の４鎖抗体に言及するために使用されるかにかかわらず、一般的な用語として使用され、完全サイズの抗体、その個々の鎖、ならびにその全ての部分、ドメイン、又はフラグメント（しかし、限定しないが、抗原結合ドメイン又はフラグメント、例えばそれぞれＶＨＨドメイン又はＶＨ／ＶＬドメインなど）の両方を含む。
【０１８０】
用語「ドメイン」（ポリペプチド又はタンパク質の）は、本明細書において使用する通り、その三次元構造を、タンパク質の残りに非依存的に保持する能力を有する、折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般的に、ドメインは、タンパク質の別々の機能的特性に関与し、多くの場合において、他のタンパク質に、タンパク質の及び／又はドメインの残部の機能の喪失を伴わず、加える、除去する、又は移してもよい。
【０１８１】
用語「免疫グロブリンドメイン」は、本明細書において使用する通り、抗体鎖（例えば、従来の４鎖抗体の又は重鎖抗体の鎖など）の球状領域、又はそのような球状領域から本質的になるポリペプチドを指す。免疫グロブリンドメインは、それらが、抗体分子に特徴的な免疫グロブリン折り畳みを保持する点において特徴付けられ、それは、２つのベータ−シート中に配置された約７つの逆平行ベータ−ストランドの２層サンドイッチからなり、場合により、保存されたジスルフィド結合により安定化される。
【０１８２】
用語「免疫グロブリン可変ドメイン」は、本明細書において使用する通り、４つの「フレームワーク領域」から本質的になる免疫グロブリンドメインを意味し、それらは、当技術分野において、及び、本明細書において下に、「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」として；「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」として；「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」として；及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」としてそれぞれ言及され；それらのフレームワーク領域は、３つの「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」により中断され、それらは、当技術分野において、及び、本明細書において下に、「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」として；「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」として；及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」としてそれぞれ言及される。このように、免疫グロブリン可変ドメインの一般的な構造又は配列は、以下の通りに示すことができる：ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４。特異性を、抗原についての抗体に、抗原結合部位を持つことにより与えるのは、免疫グロブリン可変ドメインである。
【０１８３】
用語「免疫グロブリンの単一可変ドメイン」は、「単一可変ドメイン」及び「ＩＳＶ」と互換可能に使用され、抗原結合部位が、単一の免疫グロブリンドメイン上に存在し、及びそれにより形成される分子を定義する。これは、免疫グロブリンの単一可変ドメインを、２つの免疫グロブリンドメイン、特に、２つの可変ドメインが相互作用し抗原結合部位を形成する「従来の」免疫グロブリン又はそれらのフラグメントから区別する。典型的には、従来の免疫グロブリンにおいて、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、相互作用し、抗原結合部位を形成する。この場合において、ＶＨ及びＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗原結合部位に寄与しうる。即ち、合計６つのＣＤＲが、抗原結合部位形成に含まれうる。
【０１８４】
上の定義の観点において、従来の４鎖抗体（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ分子；当技術分野において公知である）又はＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、例えばジスルフィド結合したＦｖもしくはｓｃＦｖフラグメント、又はそのような従来の４鎖抗体に由来するダイアボディ（全てが当技術分野において公知である）の抗原結合ドメインは、正常には、免疫グロブリンの単一可変ドメインとして見なされないであろう。なぜなら、これらの場合において、抗原のそれぞれのエピトープへの結合は、正常には、１つの（単一の）免疫グロブリンドメインにより生じないであろうが、しかし、（会合する）免疫グロブリンドメイン、例えば軽及び重鎖可変ドメインなどの対により、即ち、免疫グロブリンドメインのＶＨ−ＶＬ対（それは、それぞれの抗原のエピトープに合同で結合する）により生じうるからである。
【０１８５】
対照的に、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、追加の免疫グロブリン可変ドメインと対合することを伴わず、抗原のエピトープに特異的に結合することが可能である。免疫グロブリンの単一可変ドメインの結合部位は、単一のＶＨ、ＶＨＨ、又はＶＬドメインにより形成される。故に、免疫グロブリンの単一可変ドメインの抗原結合部位は、３を上回らないＣＤＲにより形成される。
【０１８６】
そのようなものとして、単一の可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン配列（例、ＶＬ配列）もしくはその適切なフラグメント；又は、重鎖可変ドメイン配列（例、ＶＨ配列又はＶＨＨ配列）もしくはその適切なフラグメントでありうる；それが、単一の抗原結合単位（即ち、単一の可変ドメインから本質的になる機能的な抗原結合単位で、単一の抗原結合ドメインが、別の可変ドメインと相互作用し、機能的な抗原結合単位を形成する必要がないようにする）を形成することが可能である限り。
【０１８７】
本発明の一実施態様において、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、重鎖可変ドメイン配列（例、ＶＨ配列）である；より具体的には、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、従来の４鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列でありうる。
【０１８８】
例えば、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、（単一）ドメイン抗体（又は、（単一）ドメイン抗体としての使用のために適切であるアミノ酸）、「ｄＡｂ」又はｄＡｂ（又は、ｄＡｂとしての使用のために適切であるアミノ酸）又はナノボディ（本明細書において定義する通りで、しかし、限定しないが、ＶＨＨを含む）；他の単一可変ドメイン、又はそれらの任意の１つの任意の適切なフラグメントでありうる。
【０１８９】
特に、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、ナノボディ（登録商標）（本明細書において定義する通り）又はその適切なフラグメントでありうる。［注意：ナノボディ（登録商標）、ナノボディ（登録商標）、及びナノクローン（登録商標）は、Ablynx N.V.．の登録商標である］ナノボディの一般的な記載について、参照が、下のさらなる記載に、ならびに本明細書において引用する、例えば、WO 08/020079（ページ１６）において記載される先行技術に作られる。
【０１９０】
「ＶＨＨドメイン」は、また、ＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体フラグメント、及びＶＨＨ抗体として公知であり、本来は、「重鎖抗体」の（即ち、「軽鎖の欠けた抗体」の；Hamers-Casterman et al. Nature 363: 446-448, 1993)抗原結合免疫グロブリン（可変）ドメインとして記載されている。用語「ＶＨＨドメイン」が、これらの可変ドメインを、従来の４鎖抗体中に存在する重鎖可変ドメイン（それらは、本明細書において「ＶＨドメイン」又は「ＶＨドメイン」として言及される）から及び従来の４鎖抗体中に存在する軽鎖可変ドメイン（それらは、本明細書において「ＶＬドメイン」又は「ＶＬドメイン」として言及される）から区別するために選ばれている。ＶＨＨ及びナノボディのさらなる記載については、参照が、Muyldermansによるレビュー文献（Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001におけるレビュー）に、ならびに以下の特許出願に作られ、それらは、一般的な背景技術として言及される：Vrije Universiteit BrusselのWO 94/04678、WO 95/04079、及びWO 96/34103；UnileverのWO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231、及びWO 02/48193；Vlaams Instituut voor Biotechnologie(VIB)のWO 97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016、及びWO 03/055527；Algonomics N.V.及びAblynx N.V.のWO 03/050531；National Research Council of CanadaによるWO 01/90190；Institute of AntibodiesによるWO 03/025020（＝EP 1 433 793）；ならびに、Ablynx N.V．によるWO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO 05/044858、WO 06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、WO 06/122787、及びWO 06/122825ならびにAblynx N.V．によるさらなる公開特許出願。参照が、また、これらの出願において言及されるさらなる先行技術に、特に、国際出願WO 06/040153のページ４１〜４３上に言及される参考文献のリストに作られ、そのリスト及び参考文献は、本明細書において、参照により組み入れられる。これらの参考文献において記載される通り、ナノボディ（特に、ＶＨＨ配列及び部分的にヒト化されたナノボディ）は、特に、フレームワーク配列の１つ又は複数における１つ又は複数の「ホールマーク残基」の存在により特徴付けることができる。ナノボディ（ナノボディのヒト化及び／又はラクダ化を含む）ならびに他の修飾、部分又はフラグメント、誘導体又は「ナノボディ融合体」、多価コンストラクト（リンカー配列の一部の非限定的な例を含む）及びナノボディ及びそれらの調製物の半減期を増加させるための異なる修飾のさらなる記載が、例えば、WO 08/101985及びWO 08/142164において見出すことができる。ナノボディのさらなる一般的な記載について、参照が、本明細書において引用する、例えば、例、WO 08/020079（ページ１６）において記載される先行技術に作られる。
【０１９１】
「ドメイン抗体」は、また、「Ｄａｂ」、「ドメイン抗体」、及び「ｄＡｂ」（用語「ドメイン抗体」及び「ｄＡｂ」は、商標として、企業のGlaxoSmithKlineグループにより使用されている）として公知であり、例えば、EP 0368684、Ward et al.(Nature 341: 544-546, 1989)、Holt et al.(Tends in Biotechnology 21: 484-490, 2003)及びWO 03/002609ならびに、例えば、WO 04/068820、WO 06/030220、WO 06/003388及びDomantis Ltd.の他の公開特許出願において記載されている。ドメイン抗体は、本質的に、非ラクダ哺乳動物、特に、ヒト４鎖抗体のＶＨ又はＶＬドメインに対応する。単一の抗原結合ドメインとして（即ち、ＶＬ又はＶＨドメインとそれぞれ対合することなく）エピトープに結合するために、そのような抗原結合特性についての特定の選択（例えば、ヒト単一ＶＨ又はＶＬドメイン配列のライブラリーを使用することによる）が要求される。ドメイン抗体は、ＶＨＨのように、完全ヒト配列に由来する場合、約１３〜約１６kDaの分子量を有し、例、ヒトにおける治療的使用のためのヒト化を要求しない。
【０１９２】
それらが哺乳動物由来ではないため、本発明の文脈においてあまり好ましくないが、単一の変異ドメインが、サメの特定の種に由来しうることにも注目すべきである（例えば、いわゆる、「ＩｇＮＡＲドメイン」、例えば、WO 05/18629を参照のこと）。
【０１９３】
このように、本発明の意味において、用語「免疫グロブリンの単一可変ドメイン」又は「単一の可変ドメイン」は、非ヒト供給源、好ましくはラクダ、好ましくはラクダ重鎖抗体に由来するポリペプチドを含む。それらは、以前に記載された通りに、ヒト化してもよい。さらに、この用語は、非ラクダ供給源、例、マウス又はヒトに由来するポリペプチドを含み、それは「ラクダ化」されており、例、Davies and Riechmann(FEBS 339: 285-290, 1994; Biotechnol. 13: 475-479, 1995; Prot. Eng.9: 531-537, 1996)及びRiechmann and Muyldermans(J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999)において記載されている通りである。
【０１９４】
ＶＨＨドメインのアミノ酸残基に、Kabat et al.("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)により与えられたＶＨドメインについての一般的なナンバリングに従い番号を付け、ラクダからのＶＨＨドメインに適用された通りであり、例、Riechmann and Muyldermans (J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999)の図２において示されている通りである。ＶＨドメインのアミノ酸残基をナンバリングするための代替方法は、その方法が、また、類似の様式において、ＶＨＨドメインに適用することができ、当技術分野において公知である。しかし、本明細書の記載、特許請求の範囲、及び図において、上に記載された通りにＶＨＨドメインに適用された、Ｋａｂａｔに従ったナンバリングに従うであろう（他に示さない限り）。
【０１９５】
ＶＨドメインについて及びＶＨＨドメインについて当技術分野において周知である通り、ＣＤＲの各々におけるアミノ酸残基の総数は変動しうるが、Ｋａｂａｔナンバリングにより示されたアミノ酸残基の総数に対応しないであろう（すなわち、Ｋａｂａｔナンバリングに従った１つ又は複数の位置が、実際の配列において占められないであろう、又は実際の配列が、Ｋａｂａｔナンバリングにより許される数よりも多いアミノ酸残基を含みうる）ことに注意すべきである。これは、一般的に、Ｋａｂａｔに従ったナンバリングが、実際の配列中のアミノ酸残基の実際のナンバリングに対応しうる又はしないであろうことを意味する。ＶＨドメイン及びＶＨＨドメイン中のアミノ酸残基の総数は、通常、１１０〜１２０の範囲中、しばしば、１１２と１１５の間にありうる。しかし、より小さい、及び、より長い配列も、本明細書において記載する目的のために適切でありうることに注意すべきである。
【０１９６】
ＣＤＲ領域の決定は、また、異なる方法に従って行ってもよい。Ｋａｂａｔに従ったＣＤＲ決定において、ＶＨＨのＦＲ１は位置１〜３０にアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ１は位置３１〜３５にアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ２が位置３６〜４９にアミノ酸を含み、ＶＨＨのＣＤＲ２が位置５０〜６５にアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ３が位置６６〜９４にアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ３が位置９５〜１０２にアミノ酸残基を含み、及びＶＨＨのＦＲ４が位置１０３〜１１３にアミノ酸残基を含む。
【０１９７】
免疫グロブリンの単一可変ドメイン、例えばドメイン抗体及びナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などは、ヒト化に供することができる。特に、ヒト化免疫グロブリンの単一可変ドメイン、例えばナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などは、以前のパラグラフにおいて、そのために一般的に定義される免疫グロブリンの単一可変ドメインでありうるが、しかし、それにおいて、少なくとも１つのアミノ酸残基が（及び、特に、フレームワーク残基の少なくとも１つにおいて）存在し、それは、ヒト化置換である及び／又はそれに対応する。潜在的に有用なヒト化置換は、自然発生するＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を、１つ又は複数の密接に関連するヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することにより確認することができ、その後、このようにして決定した潜在的に有用なヒト化置換の１つ又は複数（又はその組み合わせ）を、前記ＶＨＨ配列中に（それ自体が公知の任意の様式において）導入することができ、結果として生じるＶＨＨ配列を、標的についての親和性について、安定性について、発現の簡単さ及びレベルについて、及び／又は他の所望の特性についてテストすることができる。この方法において、限定された程度の試行錯誤によって、他の適切なヒト化置換（又はその適切な組み合わせ）は、当業者により、本明細書における開示に基づき、決定することができる。また、先述のものに基づき、免疫グロブリンの単一可変ドメイン（のフレームワーク領域）、例えばナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などは、部分的にヒト化又は完全にヒト化してもよい。
【０１９８】
免疫グロブリンの単一可変ドメイン、例えばドメイン抗体及びナノボディなど（ＶＨＨドメイン及びヒト化ＶＨＨドメインを含む）は、また、１つ又は複数の変化を、１つ又は複数のＣＤＲのアミノ酸配列中に導入することによる親和性成熟に供することができ、それらの変化は、それぞれの親分子と比較し、そのそれぞれの抗原についての結果として生じる免疫グロブリンの単一可変ドメインの改善された親和性をもたらす。本発明の親和性成熟した免疫グロブリンの単一可変ドメイン分子は、当技術分野において公知の方法により、例えば、Marks et al.(Biotechnology 10: 779-783, 1992)、Barbas et al.(Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813, 1994)、Shier et al.(Gene 169: 147-155, 1995)、Yelton et al.(Immunol. 155: 1994-2004, 1995)、Jackson et al.(J. Immunol. 154: 3310-9, 1995)、Hawkins et al.(J. MoI. Biol. 226: 889 896, 1992)、Johnson and Hawkins(Affinity maturation of antibodies using phage display, Oxford University Press, 1996)により記載される通りに、調製されうる。
【０１９９】
ポリペプチドを設計／選択及び／又は調製するプロセスは、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、例えばドメイン抗体又はナノボディなどから開始し、また、前記の免疫グロブリンの単一可変ドメインを「フォーマット化する」として言及される；及び、ポリペプチドの作られた部分である免疫グロブリンの単一可変ドメインが、「フォーマット化」される又は前記ポリペプチド「のフォーマット中」にあると言う。免疫グロブリンの単一可変ドメインをフォーマット化することができる方法の例及びそのようなフォーマットの例は、本明細書における開示に基づき、当業者に明らかであろう；及び、そのようなフォーマット化された免疫グロブリンの単一可変ドメインは、本発明のさらなる局面を形成する。
【０２００】
例えば、及び限定を伴わず、１つ又は複数の免疫グロブリンの単一可変ドメインを、ポリペプチドの調製のための「結合単位」「結合ドメイン」、又は「結合ブロック」（これらの用語は互換可能に使用される）として使用してもよく、それらは、場合により、結合単位（即ち、ＩｇＥ上の同じもしくは別のエピトープに対する及び／又はＩｇＥ以外の１つ又は複数の他の抗原、タンパク質、もしくは標的に対する）として役立ちうる１つ又は複数の免疫グロブリンの単一可変ドメインもしくはペプチドを含みうる。
【０２０１】
一価ポリペプチドは、１つだけの結合単位（例えば、例、免疫グロブリンの単一可変ドメインなど）を含む又はそれから本質的になる。１つ又は複数の結合単位（例えば、例、免疫グロブリンの単一可変ドメインなど）を含むポリペプチドは、また、本明細書において、「多価」ポリペプチドとして言及されうるが、そのようなポリペプチド中に存在する結合単位／免疫グロブリンの単一可変ドメインは、また、本明細書において、「多価」フォーマット中にあるとして言及されうる。例えば、「二価」ポリペプチドは、２つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン（場合により、リンカー配列を介して連結されている）を含みうるのに対し、「三価」ポリペプチドは、３つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン（場合により、２つのリンカー配列を介して連結されている）を含みうる；など。
【０２０２】
多価ポリペプチドにおいて、２つ又はそれ以上の免疫グロブリンの単一可変ドメインは、同じもしくは異なりうるが、同じ抗原もしくは抗原決定基に対して（例えば、同じ部分もしくはエピトープに対して、又は異なる部分もしくはエピトープに対して）向けられうる、あるいは、代わりに、異なる抗原もしくは抗原決定基；又はそれらの任意の適切な組み合わせに対して向けられうる。少なくとも１つの結合単位が第１抗原（例、ＩｇＥ）に対して向けられており、少なくとも１つの結合単位が第２抗原（例、ＩｇＥとは異なる）に対して向けられている少なくとも２つの結合単位（例えば、例、免疫グロブリンの単一可変ドメインなど）を含むポリペプチドは、また、「多特異的」ポリペプチドとして言及されうるが、そのようなポリペプチド中に存在する結合単位（例えば、例、免疫グロブリンの単一可変ドメインなど）は、また、本明細書において、「多特異的フォーマット」中にあるとして言及されうる。このように、例えば、本発明の「二特異的」ポリペプチドは、第１抗原（例、ＩｇＥ）に対する少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン及び第２抗原（例、ＩｇＥとは異なる）に対する少なくとも１つのさらなる免疫グロブリンの単一可変ドメインを含むポリペプチドであるのに対し、本発明の「三特異的」ポリペプチドは、第１抗原（例、ＩｇＥ）に対する少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン、第２抗原（例、ＩｇＥとは異なる）に対する少なくとも１つのさらなる免疫グロブリンの単一可変ドメイン、及び第３抗原（例、ＩｇＥ及び第２抗原の両方とは異なる）に対する少なくとも１つのさらなる免疫グロブリンの単一可変ドメインを含むポリペプチドである。
【０２０３】
本発明の他の局面、実施態様、利点、及び適用は、また、本明細書におけるさらなる記載から明らかになるであろう。本発明は、現在、非限定的な実験部分及び図を用いてさらに例示されうるが、それにおいて：
【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１−１】３９Ｄ１１と比較した、３９Ｄ１１の種々のヒト化及び配列最適化した変異体の配列アラインメント。
【図１−２】３９Ｄ１１と比較した、３９Ｄ１１の種々のヒト化及び配列最適化した変異体の配列アラインメント。
【図２−１】ヒト化変異体ＩｇＥ００９と比較した、３９Ｄ１１の種々のヒト化及び配列最適化した変異体の配列アラインメント。
【図２−２】ヒト化変異体ＩｇＥ００９と比較した、３９Ｄ１１の種々のヒト化及び配列最適化した変異体の配列アラインメント。
【図３】ＰＫ／ＰＤ試験の試験デザイン。
【図４】遊離ＩｇＥ血漿レベル。媒質、ＩｇＥ１０９又はXolairのいずれかの単一注射後の経時的な遊離ＩｇＥのレベル。グラフ上のデータは、動物の各々の群についての中央値を表す。
【０２０５】
実験部分
実施例１：免疫化
４頭のラマ（Ｎｏ．００２、Ｎｏ．００４、Ｎｏ．１９３、Ｎｏ．１９７）を、４〜６回、５０〜１００マイクログラム用量のヒトＩｇＥ（Scripps Laboratories, San Diego, CA, Cat# I0224）（ラマ００２及び００４）又は５０〜１００マイクログラムのヒトＩｇＥカッパ鎖（Diatec, Oslo, Norway）を用いて免疫化した。免疫化の間の間隔は、１〜５週間の間で変動した。タンパク質を、動物００２及び００４についてＳｔｉｍｍｕｎｅアジュバント（Cedi Diagnostics, Lelystad, The Netherlands）又は動物１９３及び１９７について不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）（Difco, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）中で製剤化した。
【０２０６】
ラマ００２、００４、１９３、及び１９７の血液サンプルからの血清を、免疫化に先立ち、免疫化プロトコールの間に、及び免疫化の完了後に得た。ヒトＩｇＥを、Nunc Maxisorbプレート上に、２マイクログラム/mlでコーティングし、ＰＢＳ中の１%カゼインを用いてブロックし、免疫前及び後ラマ血清の連続希釈物を用いてインキュベートした。プレート固定化ラマＩｇＧを、ＨＲＰ共役ヤギ抗ラマＩｇＧ（Bethyl Labs, Montgomery, TX）及びＴＭＢ色素を使用し、標準的な方法に従って検出した。吸光度の比較は、免疫化が、ＩｇＥに対する体液性免疫応答を、全ての４匹の動物において誘導することを明らかに示した。
【０２０７】
末梢血単核細胞を、Ficoll-Hypaqueを使用し、製造者の指示に従って、血液サンプルから調製した。これらの細胞から及びリンパ節から抽出した全ＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲのための出発材料として使用し、ナノボディをコードする遺伝子フラグメントを増幅した。これらのフラグメントを、ｐＵＣ１１９に由来するファジミドベクター（ＬａｃＺプロモーター、コリファージｐＩＩＩタンパク質コード配列、アンピシリン又はカルベニシリンについての耐性遺伝子を含む）中にクローン化した。マルチクローニング部位は、いくつかの制限部位を持つ。ナノボディ（登録商標）コード配列を伴うフレームにおいて、ベクターは、Ｃ末端ｃ−ｍｙｃタグ及び（Ｈｉｓ）６タグについてコードする。シグナルペプチドは、発現されたナノボディ（登録商標）をペリプラズムに転位置させるｇｅｎ３リーダー配列である。ファージを、標準的なプロトコール（Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press; 1st edition (October 28, 1996)）に従って調製し、ろ過滅菌後、４℃で、さらなる使用まで保存した。合計で、４つのファージライブラリーを構築し（００２、００４、１９３、及び１９７）、ライブラリーサイズは３．５×１０６〜２８×１０６の間であり、インサートのパーセンテージは９６〜１００%の範囲であった。
【０２０８】
実施例２：ＩｇＥ結合ナノボディの選択
カニクイザルＩｇＥ−Ｆｃフラグメントを調製し、ヒト及びカニクイザルＩｇＥに交差反応性であるＩｇＥ特異的ナノボディを同定するためのツールとして使用した。ＲＮＡを、２匹の雄及び２匹の雌のカニクイザルからの末梢血単核細胞から抽出した。カニクイザルＩｇＥ配列（配列番号１７３）を、異なるプライマー（配列番号１８９〜１９２）を使用したＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。得られたフラグメントを、クローニングベクター中にクローン化し、配列決定した。カニクイザルＩｇＥ  ｃ（エプシロン）２−ｃ（エプシロン）３−ｃ（エプシロン）４フラグメントを、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー／プロモーター領域、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、アンピシリン又はカルベニシリンについての耐性遺伝子、マルチクローニング部位、及びマウスＩｇカッパ軽鎖リーダー配列を含むｐＣＩｎｅｏに由来する発現ベクター中にクローン化した。カニクイザルＩｇＥ−Ｆｃコード配列を伴うフレームにおいて、ベクターは、Ｃ末端（Ｈｉｓ）１０タグをコードした。シス作用性ウイルスＤＮＡエレメント、ｏｒｉＰ遺伝子座は、ＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞中でのエピソーム複製を許し、エプスタイン・バーウイルス核抗原１を発現した。培養上清を収集し、カニクイザルＩｇＥ  Ｆｃを、陽イオン交換（Source 30S）を使用して精製し、親和性精製（His TrapTMFF）及び脱塩（Desalting 26/10 Hiprep、全てのカラムがGE Healthcareから）が続いた。
【０２０９】
ヒト高親和性ＩｇＥ受容体Ｆｃ（エプシロン）ＲＩα（遺伝子バンクＰ１２３１９）のＦｃ融合体をツールとして産生した。ヒトＦｃεＲＩαを合成し、発現ベクター中に、ヒトＩｇＧ  Ｆｃフラグメントとの融合体としてクローン化した。安定トランスフェクトＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ）を生成し、培養上清を収集した。ヒトＦｃ（エプシロン）ＲＩ（アルファ）Ｆｃフラグメントを、次に、プロテインＡ（Mabselect sure; GE Healthcare）を使用して精製した。
【０２１０】
ファージディスプレイを使用し、ＩｇＥ特異的ナノボディを濃縮した。ファージを、標準的な方法に従って、ラマＮｏ．００２、００４、１９３、及び１９７から得られたライブラリーより調製した。ファージライブラリーを、プレート固定化カニクイザルＩｇＥ  Ｆｃ上での２ラウンド（Ｒ１／Ｒ２）の選択のために使用した。カニクイザルＩｇＥ  ｃ（エプシロン）２−ｃ（エプシロン）３−ｃ（エプシロン）４−Ｆｃを、０．２〜２マイクログラム/mlで変動する濃度で、Nunc Maxisorp ELISAプレート上に固定化した。プレート固定化ファージを、トリプシン溶出物又はＦｃ（エプシロン）ＲＩα溶出物を使用して回収した。Ｒ１／Ｒ２選択物のアウトプットを、濃縮係数（コントロールと比べた、溶出物中に存在する＃ファージ）について分析した。これらのパラメーターに基づき、最善の選択物を、さらなる分析のために選んだ。個々のコロニーを選別し、９６ディープウェルプレート（１ml容積）中で成長させ、ナノボディ発現のためにＩＰＴＧを加えることにより誘導した。ペリプラズム抽出物を、標準的な方法に従って調製した。ナノボディを、Ｃ末端にｃ−ｍｙｃならびに６つのＨｉｓタグの両方を含む融合タンパク質として発現させた。
【０２１１】
実施例３：AlphaScreenアッセイにおけるＩｇＥ遮断ナノボディについてのスクリーニング
ヒト／カニクイザル交差反応性ＩｇＥ遮断ナノボディについてスクリーニングするために、ペリプラズム抽出物を、ヒトＩｇＥ（Diatec, Oslo, Norway）又はカニクイザルＩｇＥ  ｃ（エプシロン）２−ｃ（エプシロン）３−ｃ（エプシロン）４とヒトＦｃ（エプシロン）ＲＩ（アルファ）−Ｆｃとの相互作用を遮断するそれらの能力について分析した。この目的で、２つのalphascreenアッセイ（Amplified Luminiscent Proximity Homogeneous Assay; Perkin Elmer, Waltman, MA）をセットアップした。簡単には、０．０５nMビオチン化ｈＩｇＥ又は０．１nMビオチン化カニクイザルＩｇＥ  ｃ（エプシロン）２−ｃ（エプシロン）３−ｃ（エプシロン）４を、ストレプトアビジンドナービーズにより捕捉し、０．０５nM  Ｆｃ（エプシロン）ＲＩを、抗ｈＦｃアクセプタービーズにより捕捉した。
【０２１２】
個々のナノボディクローンの希釈したペリプラズム抽出物を分析した。オマリズマブＦａｂフラグメントは、ヒトＩｇＥ／Ｆｃ（エプシロン）ＲＩ（アルファ）Ｆｃ相互作用を阻害することが公知であり、陽性コントロールとして使用した。アッセイは、Envision alphascreenオプション装着マルチモードリーダー（Perkin Elmer, Waltman, MA）において読み取った。個々のクローンを、ペリプラズム抽出物の存在によってアクセプタービーズの蛍光シグナルが減少した場合、推定ＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩ（アルファ）Ｆｃ相互作用又はカニクイザルＩｇＥ  ｃ（エプシロン）２−ｃ（エプシロン）３−ｃ（エプシロン）４／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩ（アルファ）Ｆｃ相互作用の阻害としてスコア化した。全ての４つのライブラリーが、ヒトＩｇＥ上でテストされた場合、非遮断及び遮断クローンの両方を含んだが、しかし、ライブラリー１９７だけが、カニクイザル交差反応性中和ナノボディを回収した。カニクイザル交差反応性阻害ナノボディを選択し、配列決定した。配列分析によって、１つのファミリー（ファミリー１２と名付けた）が明らかになったが、それは、２つのサブファミリー１２．１（クローン３９Ｄ１１、３９Ｄ８、４２Ｄ７、及び４２Ｇ５を含む；それぞれ配列番号１１９、１１５、１１６、及び１１７）及び１２．２（クローン３６Ｇ５；配列番号１１８）ならびに固有クローン（３９Ｂ０２；配列番号１１４）に細分された。対応するＤＮＡ配列を、配列番号１８３〜１８８において与える。この低い多様性(low diversity)は、ＩｇＥとＦｃ（エプシロン）ＲＩ（アルファ）との相互作用を遮断するカニクイザル交差反応性ナノボディを生成及び同定することが非常に困難であることを示す。
【０２１３】
実施例４：ＩｇＥ結合ナノボディのオフレート（解離速度）決定
個々の阻害的ナノボディクローンペリプラズム抽出物のオフレート（解離）定数（ｋｏｆｆ）を、BIAcore T100機器上での表面プラズモン共鳴により決定した。ヒトＩｇＥ（Diatec, Oslo, Norway）を、ＣＭ５センサーチップに、３１００ＲＵの密度でアミンカップリングした。残りの反応基を、エタノールアミンを使用して不活化した。ナノボディ結合及びオフレートを、ペリプラズム抽出物の単一希釈で評価した。オマリズマブＦａｂフラグメントを、１００nMの単一濃度でテストした。各々のサンプルを、２分間、流速４５μl/分で注射し、チップ結合抗原への結合を許した。次に、ペリプラズム抽出物を伴わない結合緩衝液を、チップの上に、同じ流速で送り、結合ナノボディの自然解離を許した。モニターされた解離相後に結合して残った分析物を、再生溶液（４．５M  ＭｇＣｌ２）を注射することにより除去した。サブファミリー当たりの最善の代表のデータ及び固有クローン３９Ｂ２（全てが精製及びより詳細な分析のために選択された）を表１に示す。
【０２１４】
【表１】
2014525736.tif 000005
【０２１５】
実施例５：ＩｇＥ結合ナノボディ発現及び精製
選択したナノボディを、大腸菌のペリプラズム間隙において、ｃ−ｍｙｃ、Ｈｉｓ６タグ付きタンパク質として、２５０mLの培養容積中で発現させた。発現を、１mM  ＩＰＴＧの添加により高密度培養において誘導し、３７℃で４時間にわたり継続することを許した。細胞培養物をスピンした後、ペリプラズム抽出物を、ペレットを凍結融解し、ｄＰＢＳ中に再懸濁することにより調製した。これらの抽出物を、HisTrap粗カラム（GE Healthcare）を使用した親和性クロマトグラフィーのための出発材料として使用した。ナノボディを、カラムから、２５０mMイミダゾールを用いて溶出し、その後、ｄＰＢＳに向けて脱塩した。
【０２１６】
実施例６：AlphascreenにおけるＨｕＩｇＥ又はカニクイザルＩｇＥ  Ｆｃ（ｃｅ２−ｃｅ３−ｃｅ４）／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩ（アルファ）Ｆｃ相互作用の阻害
精製ナノボディの連続希釈物を、次に、ＨｕＩｇＥ又はカニクイザルＩｇＥ  Ｆｃ（ｃｅ２−ｃｅ３−ｃｅ４）とＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩ（アルファ）Ｆｃとの相互作用を遮断するためのそれらの能力について、上に記載する通りの同じalphascreenを使用し、分析した。データを表２及び３において示し、３９Ｂ２を除く全てのナノボディが、陽性コントロールＦａｂ（商業的に得られたオマリズマブのパパイン消化により得られた）と比較し、同様の又はより良い効力を有することを示す。
【０２１７】
【表２】
2014525736.tif 000006
【０２１８】
【表３】
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【０２１９】
実施例７：ＥＬＩＳＡにおけるＨｕＩｇＥ又はカニクイザルＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩ相互作用の阻害
ナノボディを、ＨｕＩｇＥ（Diatec, Oslo, Norway）又はカニクイザルＩｇＥ（血漿）とＦｃ（エプシロン）ＲＩとの相互作用を遮断するそれらの能力について分析した。この目的で、ＥＬＩＳＡプレートを、Ｆｃ（エプシロン）ＲＩ（０．１マイクログラム/ml）を用いてコーティングし、次に、ブロックした。連続的なナノボディ希釈物を、５０ｐＭ  ＨｕＩｇＥ又は１／５０カニクイザル血漿希釈物を用いてプレインキュベートし、Ｆｃ（エプシロン）ＲＩコートされたＥＬＩＳＡプレートへのプレインキュベートした混合物の添加が続いた。固定化したＦｃ（エプシロン）ＲＩへのＨｕＩｇＥ又はカニクイザルＩｇＥの結合を、ヤギ抗ヒトＩｇＥ−ＨＲＰ（KPL, Gaithersburg, MD）を使用することにより検出した。推定ＩｇＥ／Ｆｃ（エプシロン）ＲＩ相互作用阻害剤の存在は、減少したＯＤシグナルをもたらしうる。結果を表４及び５に示す。
【０２２０】
【表４】
2014525736.tif 000008
【０２２１】
【表５】
2014525736.tif 000009
【０２２２】
実施例８：ＥＬＩＳＡにおけるＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩＩ相互作用の阻害
ナノボディを、ＨｕＩｇＥ（Diatec, Oslo, Norway）と組換えＦｃ（エプシロン）ＲＩＩ（R&D Systems, Minneapolis, MN）との相互作用を遮断するそれらの能力について分析した。この目的で、ＥＬＩＳＡプレートを、Ｆｃ（エプシロン）ＲＩＩを用いてコーティングし、次に、ブロックした。連続的なナノボディ希釈物を、２０nM  ＨｕＩｇＥを用いてプレインキュベートし、Ｆｃ（エプシロン）ＲＩＩコートされたＥＬＩＳＡプレートへのプレインキュベートした混合物の添加が続いた。固定化Ｆｃ（エプシロン）ＲＩＩへのＨｕＩｇＥの結合を、ヤギ抗ヒトＩｇＥ−ＨＲＰ（KPL, Gaithersburg, MD）を使用することにより検出した。推定ＨｕＩｇＥ／Ｆｃ（エプシロン）ＲＩＩ相互作用阻害剤の存在は、減少したＯＤシグナルをもたらしうる。データを表６に示し、全ての３つのテストされたナノボディがＦｃ（エプシロン）ＲＩＩへのＩｇＥ結合を遮断することを示す。ナノボディ３９Ｄ１１及び３６Ｇ５が、参照Ｆａｂと比較し、同様の効力及び有効性（１００%遮断）を有したのに対し、ナノボディ３９Ｂ２は１０倍効力が低く、５００nMナノボディ濃度で、およそ８０%遮断に達しただけであった。
【０２２３】
【表６】
2014525736.tif 000010
【０２２４】
実施例９：AlphascreenにおけるＨｕＩｇＥ／オマリズマブ相互作用の阻害
ナノボディを、ＨｕＩｇＥ（Diatec, Oslo, Norway）とオマリズマブとの相互作用を遮断するそれらの能力について分析した。この目的で、alphascreenアッセイ（Perkin Elmer, Waltman, MA）をセットアップした。簡単には、個々のナノボディの連続希釈系列を、０．１nMビオチン化ｈｕＩｇＥ、０．１nMオマリズマブ、ストレプトアビジンコートしたドナービーズ及び抗ヒトＦｃナノボディ共役アクセプタービーズを用いてインキュベートした。参照Ｆａｂフラグメントは、ＨｕＩｇＥ／オマリズマブ相互作用を阻害することが公知であり、陽性コントロールとして使用した。アッセイは、Envision alphascreenオプション装着マルチモードリーダー（Perkin Elmer, Waltman, MA）において読み取った。個々のクローンは、それらの存在がアクセプタービーズの蛍光シグナルを減少させた場合、推定ＨｕＩｇＥ／オマリズマブ相互作用としてスコア化した。結果を表７に示し、３９Ｂ２を除く、全てのテストされたナノボディが、ＩｇＥ結合についてオマリズマブと競合することを示す。ナノボディ阻害曲線のボトムプラトーレベルは、参照Ｆａｂ又はＩｇＥのもの（%阻害最大値がそれぞれ９６．９及び９９．６）との比較において、有意に高く（%阻害最大値が７９．９%）、オマリズマブ及びナノボディエピトープが部分的にだけオーバーラップしていることを示唆する。
【０２２５】
【表７】
2014525736.tif 000011
【０２２６】
実施例１０：ＦＡＣＳにおけるＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩ及びＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩＩ相互作用の阻害
ナノボディ３９Ｄ１１及び３６Ｇ５を、ＦＡＣＳ競合アッセイにおいて、ＲＢＬ  Ｆｃ（エプシロン）ＲＩ（アルファ）安定トランスフェクタント上でのＦｃ（エプシロン）ＲＩ及びＲａｊｉ細胞上でのＦｃ（エプシロン）ＲＩＩへのＩｇＥ結合を阻害するそれらの能力についてテストした。この目的で、ナノボディの連続希釈物を細胞に加え、ヒトＩｇＥの添加が続いた（ＲＢＬ  Ｆｃ（エプシロン）ＲＩアッセイについて７．５nM；Ｒａｊｉ細胞アッセイについて１０nM）。推定相互作用阻害剤の存在は、減少したＭＣＦシグナルをもたらしうる。表８中のデータは、両方のナノボディが、Ｆｃ（エプシロン）ＲＩ及びＦｃ（エプシロン）ＲＩＩへのＩｇＥ結合を遮断する（陽性コントロール参照Ｆａｂと同程度）ことを示す。全ての３つのテストされた分子は、１μM濃度で、９０%を上回る阻害に達した。
【０２２７】
【表８】
2014525736.tif 000012
【０２２８】
実施例１１：脱顆粒アッセイにおける阻害
アッセイのセットアップは、xCELLigence RTCA機器（Roche）と共に供給されるプロトコールに基づいていた。このシステムは、組織培養Ｅ−プレートの底上に集積したインターデジタル微小電極にわたる電気インピーダンスを測定する。リアルタイムインピーダンス測定は、標識の取り込みを伴わず、細胞の形態学的状態（脱顆粒を含む）に関する定量的な情報を提供する。Ｆｃ（エプシロン）ＲＩアルファを用いてトランスフェクトしたＲＢＬ細胞を、一晩、Ｅプレート中でインキュベートし、抗ＤＮＰキメラＩｇＥ（５０ng/ml；Serotec）を用いて１時間にわたり感作した。次に、脱顆粒を、ＮＩＰ−ＢＳＡ（５０ng/ml；Biosearch Technologies）を加えることにより誘発した。好塩基球の活性化／脱顆粒を、リアルタイムにおいて、インピーダンスを測定する（８時間の間、毎分で測定する）xCELLigence System上で検出することができる。１ウェル当たりの最大細胞指数シグナルを使用し、ＥＣ５０及びＩＣ５０値を算出した。相関は、上清中でのヒスタミン放出を用いて示した（LDNヒスタミンResearch ELISA）。
【０２２９】
ナノボディ３９Ｄ０８、３９Ｄ１１、３６Ｇ５、及び３９Ｂ２を、脱顆粒アッセイにおいて、ＩｇＥ媒介性脱顆粒を阻害するそれらの能力についてテストした。この目的で、ナノボディ又はコントロール抗体の連続希釈物を、ヒトＩｇＥとプレインキュベートし、次に、細胞に加えた。結果を表９に示す。ナノボディ３９Ｂ２は、５００nMのナノボディ濃度で、脱顆粒の２５%遮断に達しただけであるのに対し、他の３つのナノボディ及び参照Ｆａｂは、この濃度で、９５%を上回り遮断した。ナノボディの効力は、参照Ｆａｂコントロールとの比較において、３〜４０倍弱かった。
【０２３０】
【表９】
2014525736.tif 000013
【０２３１】
実施例１２：親和性決定
個々のナノボディの親和性定数を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、BIAcore 3000機器上で決定した。簡単には、ヒトＩｇＥ（Diatec, Oslo, Norway）又はカニクイザルＩｇＥ  Ｆｃ（Ｃｅ２−ｃｅ３−ｃｅ４）を、ＣＭ５センサーチップにアミンカップリングした。残りの反応基を、エタノールアミンを使用して不活化した。ナノボディを異なる濃度で注射した。各々のサンプルを４５μl/分の流速で注射し、チップ結合抗原への結合を許し、同じ流速でのナノボディを伴わない結合緩衝液が続き、自然解離を許した。モニターされた解離相後に結合して残った分析物を、再生溶液（４．５M  ＭｇＣｌ２）を注射することにより除去した。異なる濃度での結合曲線を使用し、動態パラメーターｋｏｎ値（ｋａ）、ｋｏｆｆ値（ｋｄ）、及びＫＤを算出した。動態パラメーターは、異種リガンド適合を使用して決定した。なぜなら、二相相互作用が観察されたからである。得られた結果を表１０に提示する。
【０２３２】
【表１０】
2014525736.tif 000014
【０２３３】
実施例１３：３９Ｄ１１の配列最適化及び親和性成熟
Ａ．配列最適化：配列分析
ＩｇＥ特異的ナノボディ３９Ｄ１１は、スクリーニングの間に同定された最も強力なカニクイザル交差反応ナノボディであった。それは、配列最適化及び親和性成熟のために選択され、さらに追跡された。
【０２３４】
３９Ｄ１１配列のＶＨ３−２３／ＪＨ５ヒト生殖系列とのアラインメントに基づき、４つの変異体を生成することを決めた：ＩＧＥ００９、ＩＧＥ０１０、ＩＧＥ０１１、及びＩＧＥ０１２（それぞれ配列番号１２０〜１２３）。全ての変異体が、３つの変異、Ｖ５Ｌ、Ｋ８３Ｒ、及びＱ１０８Ｌを含む。変異体ＩＧＥ０１１及びＩＧＥ０１２において、固有変異Ｗ９１Ｙが含まれる。全て４つの変異体において、位置７７でのメチオニンが、スレオニン（ＩＧＥ００９及びＩＧＥ０１１）又はロイシン（ＩＧＥ０１０及びＩＧＥ０１２）により置換される。配列最適化した変異体の３９Ｄ１１との配列アラインメントを、図１に示す。
【０２３５】
Ｂ．効力アッセイにおける４つの３９Ｄ１１ヒト化変異体の特徴付け
４つの変異体を、最初に、脱顆粒アッセイにおいてテストし、ＩｇＥ媒介性脱顆粒を阻害する能力に対する導入された突然変異の効果を評価した。表１１は、得られた算出ＩＣ５０値を示す。これらの結果は、導入された変異Ｗ９１Ｙが、効力について有害であり、より高いオフレートをもたらすことを示した（変異体ＩＧＥ０１１及びＩＧＥ０１２除く）。変異体ＩＧＥ００９を親和性成熟のために選択した。なぜなら、それは、ヒト生殖系列配列と最も高いパーセンテージのフレームワーク同一性を有するからである。
【０２３６】
【表１１】
2014525736.tif 000015
【０２３７】
Ｃ．エラープローン（エラーを起こしやすい）ＰＣＲ方法論によるＩＧＥ００９の親和性成熟
エラープローンライブラリーを、エラーを起こしやすい条件下でＩＧＥ００９を増幅させ、フラグメントをファージディスプレイベクター中にクローン化することにより生成した。得られたライブラリーを、ビオチン化ヒトＩｇＥの徐々に減少させた濃度（１０〜０．００１nM）を使用した、溶液中での複数回のパニングに供した。ファージ選択からのアウトプットを、オフレートについて、ＰｒｏｔｅＯｎ上で分析した。３９Ｄ１１と比べ、６倍まで改善したオフレートを、最善のクローンについて測定した。配列分析によって、オフレートに対するプラス効果を伴う変異（フレームワーク及びＣＤＲの両方において）が同定された。これらは、Ｅ６Ｑ；Ｆ２９Ｙ；Ｇ３０Ｄ；Ｓ３１Ｎ又はＳ３１Ｐ；Ｓ３５Ｇ又はＳ３５Ａ；Ｇ４４Ｒ；Ｎ７５Ｋ；Ｄ９７Ｅ及びＹ１００ｅＦであった。
【０２３８】
これらの変異を、コンビナトリアルライブラリーに含めた。得られたライブラリーを、再び、溶液中で、１nMビオチン化ヒトＩｇＥを使用したパニングに供した。ファージ選択からのアウトプットを、オフレートについて、ProteOn上で分析し、配列を分析した。配列分析及びオフレート分析を組み合わせ、結果として、有益な変異の異なる組み合わせを含む７つの変異体（ＩＧＥ０２５−ＩＧＥ０３０、配列番号１２７〜１３３）を設計し、コンストラクトのインビボでの半減期を改善させるためのＨＳＡ特異的ナノボディＡＬＢ８を伴う融合体（配列番号１７７〜１８２）としてピキアにおいて発現させた。コントロールとして、同様のＮｂ−９ＧＳ−ＡＬＢ８フォーマットを作り、親ＩｇＥ特異的ナノボディ３９Ｄ１１又はそのヒト化変異体ＩＧＥ００９（コンストラクトＩＧＥ０２０及びＩＧＥ０１９は、それぞれ配列番号１７５及び１７６）を含んだ。３９Ｄ１１及びＩＧＥ００９を伴う親和性成熟変異体のアラインメントを、それぞれ図１及び２に示す。
【０２３９】
Ｄ．１０の親和性成熟二特異的変異体のBIAcore上でのオフレート決定
オフレートをBIAcore上で分析した。結合プロファイル及びオフレートを表１２に示す。BIAcore上でのオフレート分析は、ＩＧＥ００９と比較し、親和性成熟変異体について、減少したオフレートを示す（ヒトＩｇＥ上での２５倍まで及びカニクイザルＩｇＥ−Ｆｃ上での１５倍まで）。結合パターンは依然として二相性であるが、しかし、速いオフレートのパーセンテージは、親和性成熟後（確かに、ヒトＩｇＥ上で）に有意に低下する。
【０２４０】
【表１２】
2014525736.tif 000016
【０２４１】
Ｅ．親和性成熟二特異的変異体の脱顆粒アッセイにおけるインビトロ効力分析
親和性成熟変異体を、脱顆粒アッセイにおいて、精製ヒト血清アルブミン（Sigma，Ａ８７６３）の存在又は非存在においてテストした。算出されたＩＣ５０及びＣＩ９５を表１３に示す。得られた結果は、多数の変異体が、脱顆粒アッセイにおいてオマリズマブより優れていることを明らかに示す。ＨＳＡの結合は、ナノボディコンストラクトの効力に影響しない。
【０２４２】
【表１３】
2014525736.tif 000017
【０２４３】
Ｆ．KinExAアプローチを使用したＩＧＥ０２６及びＩＧＥ０２７の親和性決定
ナノボディＩＧＥ０２６、ＩＧＥ０２７、及び３９Ｄ１１の親和性を、溶液中でのヒトＩｇＥで、KinExA技術を使用して決定した。ナノボディＩＧＥ０２６及びＩＧＥ０２７での得られた親和性は、３９Ｄ１１のものと比較し、３０〜５０倍改善した（表１４）。
【０２４４】
【表１４】
2014525736.tif 000018
【０２４５】
Ｇ．血清アルブミンへの結合親和性
血清アルブミンへのフォーマット化ナノボディの結合を、SPR（BIAcore 3000）により、低密度アルブミン固定化（５００RU）を伴う条件において分析した。ナノボディの力価系列（２．５〜２００nM）を、流速４５μl/分で注射した。親和性定数を決定し、表１５に列挙した。ＨＳＡ特異的ナノボディＡＬＢ８を、比較のために含めた。一般的に、より低い親和性が観察された。
【０２４６】
【表１５】
2014525736.tif 000019
【０２４７】
実施例１４：ＮＥｘｐｅｄｉｔｅペプチド融合を用いたＩＧＥナノボディの発現及び精製
上の実施例１〜１３は、それ自体で、あるいは多価、多特異的及び／又はバイパラトープコンストラクトを提供するために、構築ブロックとして使用した場合、抗ＩｇＥナノボディ（３９Ｄ１１、３９Ｄ１１型配列、及び３９Ｄ１１様配列を含む）の好ましい特性を例示する。
【０２４８】
実施例１４〜１７において、本発明の抗ＩｇＥナノボディを、本発明に従った好ましい半減期延長ペプチドと組み合わせる。
【０２４９】
本発明のこの好ましい局面に従い、ＩｇＥナノボディのインビボ半減期の改善のためにＡＬＢ８を使用する代わりに、ＩＧＥ０２６／ＡＬＢ８のＩｇＥ結合ナノボディ構築ブロック、即ち、ＩｇＥ６６Ｇ０２（配列番号１２８又は１２９）を、そのＮ又はＣ末端で、１つ又は複数のＨＳＡ結合NExpediteペプチドに、短い又は長いＧｌｙＳｅｒリンカーを介して遺伝的に融合し、１５の変異体（ＩＧＥ１００−１０５、ＩＧＥ１０７−１１３、ＥＸＰ４７６、ＥＸＰ４８３、配列番号１４７〜１６１）をもたらした。コンストラクトを、ピキア・パストリスにおけるナノボディ（登録商標）の厳密に制御された、メタノール誘導性発現のためのＡＯＸ１プロモーター、Zeocin（商標）のための耐性遺伝子、マルチクローニング部位、及びアルファ因子分泌シグナルを含む、ｐＰＩＣＺａ（Invitrogen）に由来する社内ピキア・パストリス発現ベクター中にクローン化した。コンストラクトの発現及び精製を、US 2011/0243954の実施例２０において本質的に記載される通りに実施した。
【０２５０】
実施例１５：ＩＧＥ−ＮＥｘｐｅｄｉｔｅナノボディの特徴付け
ナノボディＩｇＥ６６Ｇ０２のＩｇＥ遮断特性に対するＮ又はＣ末端ＮＥｘｐｅｄｉｔｅペプチドの影響を、ならびに、ＮＥｘｐｅｄｉｔｅペプチドのＨＳＡ結合特性に対するナノボディの影響を研究した。
【０２５１】
Ａ．ＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎにおけるＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩ（アルファ）Ｆｃ相互作用の阻害
ＮＥｘｐｅｄｉｔｅペプチド融合体を伴う精製ナノボディの連続希釈物を、ＨｕＩｇＥとＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩ（アルファ）Ｆｃの相互作用を遮断するそれらの能力について、上に記載するのと同じAlphascreenアッセイ（実施例６）を使用し、ＨＳＡの存在又は非存在において分析した。データを表１６に示す。全てのナノボディＮＥｘｐｅｄｉｔｅコンストラクトが、対応する一価の抗ＩｇＥナノボディ構築ブロック、即ち、ＩｇＥ６６Ｇ０２（表１６においてＩｇＥ０４５として言及する）と比較し、同様の効力を有する。ＨＳＡの存在において、しかし、ナノボディのＮ末端にＮＥｘｐｅｄｉｔｅ部分を含む全てのコンストラクトについて、ＩＣ５０における４〜１２倍増加がある。効力に対するＨＳＡのマイナスの効果が、（ｉ）ＮＥｘｐｅｄｉｔｅペプチドとナノボディの間のリンカー長及び（ｉｉ）ＮＥｘｐｅｄｉｔｅペプチドの数に依存して変動する。対照的に、ＮＥｘｐｅｄｉｔｅ部分がナノボディのＣ末端にあるナノボディ−ＮＥｘｐｅｄｉｔｅ融合体について観察されたＨＳＡの影響はなかった。それにもかかわらず、全てのコンストラクトが、陽性コントロールＦａｂと比較し、より良い効力を有する。
【０２５２】
【表１６】
2014525736.tif 000020
【０２５３】
Ｂ．脱顆粒アッセイにおける阻害
全てのＩＧＥ−ＮＥｘｐｅｄｉｔｅナノボディを、脱顆粒アッセイにおいて、上に記載する通りに、ＨＳＡの存在又は非存在においてテストした（実施例１１を参照のこと）。データを表１７に示す。得られた結果は、ＨｕＩｇＥ／ＨｕＦｃ（エプシロン）ＲＩ（アルファ）Ｆｃ  Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎにおいて得られたデータと一致している。ＩＧＥ１０３を除き、全ての化合物が、ＩｇＥ０４５のものと比較し、同様の効力を有する。ＨＳＡの結合は、ＮＥｘｐｅｄｉｔｅペプチドがそのＣ末端にある場合、ナノボディの効力に影響しない。ＩＧＥ１０２−１０３−１０４及び１０５の効力に対するＨＳＡ複合体形成のマイナス効果が、また、この脱顆粒アッセイにおいて観察されるが、効果はそれほど顕著ではない。
【０２５４】
【表１７】
2014525736.tif 000021
【０２５５】
Ｃ．AlphascreenにおけるＨＳＡ／ＮＥｘｐｅｄｉｔｅ相互作用の阻害
全てのＩＧＥ−ＮＥｘｐｅｄｉｔｅナノボディについて、ＮＥｘｐｅｄｉｔｅペプチドのＨＳＡ結合特性に対するナノボディの影響を、Alphascreenにおいて研究した。簡単には、アクセプタービーズ（Perkin Elmer, Waltham, MA, USA）を、ＥＸＰ４１３、即ち、製造者の指示に従って、９  ＧＳリンカー（即ち、Ｎｂ２１１２−９ＧＳ−ＥＸＰ８９Ｄ３）を介してＥＸＰ８９Ｄ３に連結されたWO 09/068625の配列番号２１１２（本明細書において「Ｎｂ２１１２」として言及する）を含むコンストラクトと共役させた。精製されたＩＧＥ−ＮＥｘｐｅｄｉｔｅナノボディを、３．４pM  ｂｉｏ−ＨＳＡと、ｈＩｇＥの存在又は非存在において、ＥＸＰ４１３共役アクセプタービーズ及びストレプトアビジンドナービーズ（Perkin Elmer）の添加に先立ち、インキュベートした。蛍光を、プレートを、EnVision Multilabel Plate Reader（Perkin Elmer）上で、６８０nmの励起波長及び５２０nMの発光波長を使用して読み取ることにより測定した。蛍光シグナルにおける減少は、Ｎｂ２１１２−９ＧＳ−ＥＸＰ８９Ｄ０３へのｂｉｏ−ＨＳＡの結合が、ＩＧＥ−ＮＥｘｐｅｄｉｔｅナノボディにより遮断されることを示す。陽性コントロールとして、ＥＸＰ４１３、ＥＸＰ４８６（Ｎｂ２１１２−９ＧＳ−ＥＸＰ８９Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ８９Ｄ３）、及びＥＸＰ５５３（Ｎｂ２１１２−２０ＧＳ−ＮＥＸＰ００１−９ＧＳ−ＮＥＸＰ００２）をアッセイにおいて含んだ。データを表１８に示す。単一のＮＥｘｐｅｄｉｔｅペプチドがＩＧＥナノボディ（ＩＧＥ１０２、ＩＧＥ１０３）のＮ末端にある場合、ＩＣ５０が著しく増加され、ナノボディが、ＨＳＡへのＮＥｘｐｅｄｉｔｅペプチドの結合を妨害することを示唆する。ＩＧＥ１０４及びＩＧＥ１０５（それらは、ＩＧＥナノボディのＮ末端に融合された２つのＮＥｘｐｅｄｉｔｅペプチドを有する）についてのＩＣ５０が、ＥＸＰ４８６のＩＣ５０と同様であるが、しかし、これらのデータは決定的ではないことに注意すること。なぜなら、このAlphascreenアッセイにおいてＥＸＰ４１３とＥＸＰ４８６の間に観察された明かな効力差はないからである。対照的に、ＮＥｘｐｅｄｉｔｅ部分がＩＧＥナノボディのＣ末端にある場合、ＩＣ５０は、それらのそれぞれのＮｂ２１１２−ＮＥｘｐｅｄｉｔｅコントロールのＩＣ５０と同程度である：ＥＸＰ４７６及びＩＧＥ１００をＥＸＰ４１３と比較する、ＥＸＰ４８３、ＩＧＥ１０１、及びＩＧＥ１０７をＥＸＰ４８６と比較する、ＩＧＥ１０９をＥＸＰ５５３と比較する。さらに、ナノボディへのｈＩｇＥの結合は、ＮＥｘｐｅｄｉｔｅペプチドのＨＳＡ結合に影響しない。
【０２５６】
【表１８】
2014525736.tif 000022
【０２５７】
実施例１６：保存安定性：ＩｇＥ−ＮＥｘｐｅｄｉｔｅコンストラクト及びアルブミン結合ナノボディを含むコンストラクトの比較
代表的なＩｇＥ−ＮＥｘｐｅｄｉｔｅコンストラクトの保存安定性を、アルブミン結合ＮＥｘｐｅｄｉｔｅペプチドを、アルブミン結合ナノボディ（Ａｌｂ−８）を用いて置換した対応するコンストラクトと比較した。使用したコンストラクトは、ＩＧＥ０２６／ＡＬＢ−８（配列番号１７８）及びＩＧＥ１０９（配列番号１５５）であった。
【０２５８】
コンストラクトを、Ｄ−ＰＢＳ緩衝液中の５０mg/mlで製剤化し、示した温度で、プラスチックＰＣＲチューブ中で、暗所において保存した。
【０２５９】
その後、プレピークのパーセンテージ（形成された二量体の量に対応する）を、ＳＥ−ＨＰＬＣを使用して決定した。ＩｇＥ０２６／ＡＬＢ−８について、ＳＥ−ＨＰＬＣを、aBioSep SEC-2000カラム（Phenomenex）及びＤ−ＰＢＳ（泳動緩衝液として）を使用し、０．２ml／分の流速で実施した。１０μgの材料を注射し、データを、Chromeleonソフトウェアを使用して分析した。ＩＧＥ１０９について、ＳＥ−ＨＰＬＣを、ＳＥＣ−５カラム（Agilent）及び１０mM  Ｎａリン酸（ｐＨ７．５）、１２５mMアルギニンＨＣｌ、１０%エタノール（泳動緩衝液として）を使用し、０．５ml/分の流速で実施した。１０μgの材料を注射し、データを、Chromeleonソフトウェアを使用して分析した。結果を表１９に示す。
【０２６０】
【表１９】
2014525736.tif 000023
【０２６１】
保存安定性を、また、３つの他のＩｇＥ−ＮＥｘｐｅｄｉｔｅコンストラクト、すなわち、ＥＸＰ４８３（配列番号１６１）、ＩＧＥ１００（配列番号１４７）、及びＩＧＥ１０１（配列番号１４８）について決定した。同じＳＥ−ＨＰＬＣプロトコールを、上のＩＧＥ１０９に関して使用した。結果を表２０に示す。
【０２６２】
【表２０】
2014525736.tif 000024
【０２６３】
実施例１７：カニクイザルにおけるＩｇＥ１０９のインビボＰＫ／ＰＤ分析
ＰＫ、ＰＤ、及び免疫原性マーカーを、カニクイザルにおけるＩｇＥ又はXolairの単一投与後の異なる時間点で測定し、中程度から高いＩｇＥ血漿レベルについてスクリーニングした。インビボでのＫＤの決定をもたらすモデル化分析を、Xolairについての公開モデルを使用して実施する（Hayashi et al, British Journal of Clinical Pharmacology, 2006）。
【０２６４】
Ａ．試験デザイン
この試験において、３匹のカニクイザルの６群が、媒質、ＩｇＥ１０９、又はXolairのいずれかの単一投与を受けた（表２１）。媒質の単一投与、異なる量のＩｇＥ１０９（０．５及び１mg/kg）又はXolair（０．５及び１mg/kg）を、表２１において示す通りに、皮下（ｓ．ｃ．）又は静脈内（ｉ．ｖ．）のいずれかで投与した。
【０２６５】
試験の開始に先立ち、血漿ＩｇＥのレベルを、試験の全ての動物において決定した。媒質、ＩｇＥ１０９、又はXolairの単一投与後、動物を毎日モニターし、血液サンプルを、大腿静脈から、異なる所定の時間点で採取した（図３を参照のこと）。
【０２６６】
【表２１】
2014525736.tif 000025
【０２６７】
Ｂ．遊離ＩｇＥレベルに対する抗ＩｇＥナノボディの効果。
遊離ＩｇＥレベルにおける減少が、ＩｇＥ１０９投与時に、全ての濃度について、薬物投与後１時間という早期に、媒質群での一定の遊離ＩｇＥレベルとの比較で、観察された。遊離ＩｇＥレベルにおける減少が、また、２つのXolair群において観察された。
【０２６８】
薬物動態（ＰＫ、遊離及び全ＩｇＥ１０９、ならびに全Xolair）及び薬力学（ＰＤ、遊離及び全ＩｇＥ）マーカーに基づくモデル化分析は、ＩｇＥ１０９及びXolairの両方のインビボＫＤの決定を許すであろう。
【０２６９】
本願を通じて引用する参考文献（文献・参考文献、発行された特許、公開特許出願、及び同時係属中の特許出願を含む）の全ての全内容が、本明細書により、参照により、特に、本明細書において参照する教示について、明確に組み入れられる。
【０２７０】
配列
【表２２】
2014525736.tif 000026
【０２７１】
【表２３】
2014525736.tif 000027
【０２７２】
【表２４】
2014525736.tif 000028
【０２７３】
【表２５】
2014525736.tif 000029
【０２７４】
【表２６】
2014525736.tif 000030
【０２７５】
【表２７】
2014525736.tif 000031
【０２７６】
【表２８】
2014525736.tif 000032
2014525736.tif 000033
2014525736.tif 000034
【０２７７】
【表２９】
2014525736.tif 000035
【０２７８】
【表３０】
2014525736.tif 000036
2014525736.tif 000037
【０２７９】
【表３１】
2014525736.tif 000038
【０２８０】
【表３２】
2014525736.tif 000039
【図１−１】
2014525736.tif 000040
【図１−２】
2014525736.tif 000041
【図２−１】
2014525736.tif 000042
【図２−２】
2014525736.tif 000043
【図３】
2014525736.tif 000044
【図４】
2014525736.tif 000045
【配列表】
2014525736000001.app
【国際調査報告】
2014525736.tif 000046
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2014525736.tif 000048
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