(57)【要約】本発明は、癌、特に乳癌を治療するために有用な併用療法を提供する。本発明は、様々な実施形態において、癌を治療する方法を提供し、この方法は、癌に冒された患者に、モノクローナル抗体部分と、それに結合した第１の前アポトーシス薬部分とを含む免疫抱合体の有効量を投与することと、第２の前アポトーシス薬の有効量を患者に投与することとを含む。免疫抱合体のモノクローナル抗体部分は、ＨＥＲ２などのホルモン耐性乳癌細胞の受容体を標的とするよう作用することができる。通常の分子的機能によって作用する（垂直性調節）又は異なる分子的機構によって作用する（水平性調節）２つの前アポトーシス薬が、ホルモン耐性乳癌などの乳癌に冒された患者に投与される場合、相乗効果が認められ得る。
2014513692.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を治療する方法であって、癌に冒された患者に、モノクローナル抗体部分と、前記モノクローナル抗体部分に結合した第１の前アポトーシス薬部分と、を含む免疫抱合体の有効量を投与する工程と、第２の前アポトーシス薬の有効量を前記患者に投与する工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記第１の前アポトーシス薬部分が、前記モノクローナル抗体部分に共有結合されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記癌が乳癌であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、前記乳癌が、アロマターゼ耐性乳癌であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法において、前記乳癌が、タモキシフェン耐性乳癌であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項３に記載の方法において、前記乳癌が、ＥＲ＋ホルモン不応性乳癌であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項３に記載の方法において、前記乳癌が、ＨＥＲ２陽性乳癌であることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項５に記載の方法において、前記乳癌が、ＨＥＲ２陽性乳癌であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法において、前記モノクローナル抗体部分が、ＨＥＲ２に結合することを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、前記モノクローナル抗体部分が、トラスツズマブであることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法において、前記第１の前アポトーシス薬部分が、微小管脱重合化剤であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記第１の前アポトーシス薬部分が、マイタンシノイド又はオーリスタチンであることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法において、前記モノクローナル抗体部分が、ＨＥＲ−２に結合することを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法において、前記免疫抱合体が、Ｔ−ＤＭ１であることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法において、前記第２の前アポトーシス薬が、前記第１の前アポトーシス薬部分によって及ぼされる細胞障害性の分子機構以外の分子機構によって、細胞毒性を及ぼすことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法において、前記免疫抱合体及び前記第２の前アポトーシス薬を投与することが、相乗効果を有することを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法において、前記第２の前アポトーシス薬が、外因性経路を介してアポトーシスを誘導する薬剤であることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、前記第２の前アポトーシス薬が、Ｆａｓ経路を介してアポトーシスを誘導することを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法において、前記第２の前アポトーシス薬が、ｃ−ＦＬＩＰ経路を介してアポトーシスを誘導することを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の方法において、前記第２の前アポトーシス薬が、ＣＭＨ、Ｅ２、又はδ−トコトリエノールであることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１５に記載の方法において、前記第２の前アポトーシス薬が、内因性経路を介してアポトーシスを誘導する薬剤であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法において、前記第２の前アポトーシス薬が、カスパーゼ非依存的経路を介してアポトーシスを誘導することを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載の方法において、前記第２の前アポトーシス薬が、カスパーゼ依存的経路を介してアポトーシスを誘導することを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２１に記載の方法において、前記第２の前アポトーシス薬が、Ｅ２、ＦＴＳ、δ−トコトリエノール、サリノマイシン、又はクルクミンであることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の方法において、前記第２の前アポトーシス抗癌剤が、ＦＴＳ、ＣＭＨ、Ｅ２、ＴＭＳ、δ−トコトリエノール、サリノマイシン、又はクルクミンであることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１３に記載の方法において、前記第２の前アポトーシス薬が、外因性経路を介してアポトーシスを誘導することを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法において、前記免疫抱合体及び前記第２の前アポトーシス薬を投与することが、相乗効果を有することを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２６に記載の方法において、前記第２の前アポトーシス薬が、ＣＭＨ、Ｅ２、又はδ−トコトリエノールであることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２６に記載の方法において、前記免疫抱合体が、Ｔ−ＤＭ１であることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項１３に記載の方法において、前記第２の前アポトーシス薬が、内因性経路を介してアポトーシスを誘導することを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法において、前記免疫抱合体及び前記第２の前アポトーシス薬を投与することが、相乗効果を有することを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項３０に記載の方法において、前記第２の前アポトーシス薬が、ＦＴＳであることを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項３０に記載の方法において、前記免疫抱合体が、Ｔ−ＤＭ１であることを特徴とする方法。
【請求項３４】
アロマターゼ耐性、タモキシフェン耐性、又はＥＲ＋ホルモン不応性の乳癌に冒された患者における治療を含む請求項１に記載の方法において、Ｔ−ＤＭ１の有効量と、ＦＴＳ、ＣＭＨ、Ｅ２、ＴＭＳ、δ−トコトリエノール、又はクルクミン、若しくはこれらの組み合わせの有効量と、を前記患者に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法において、前記方法が、アジュバント療法であることを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法において、前記方法が、第１選択療法であることを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法において、前記方法が、第２選択療法であることを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法において、前記免疫抱合体と前記第２の前アポトーシス薬が、組み合わせ製剤として又は交互に投与されることを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法において、追加的抗癌剤を患者に投与する工程であって、前記追加的抗癌剤が、任意選択的に前記第１の前アポトーシス抗癌剤部分の分子機構とは異なり、かつ前記第２の前アポトーシス抗癌剤の前記分子機構とは異なる分子機構を介して効果を及ぼす前記工程、或いはＸ線、γ線、放射核種の放射、又は亜原子的粒子、若しくはこれらの組み合わせを含むイオン化放射線の前記患者への投与工程、を更に含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
治療用組成物であって、（ａ）第１の前アポトーシス薬部分に結合したモノクローナル抗体部分を含む免疫抱合体と、（ｂ）第２の前アポトーシス薬と、を含むことを特徴とする治療用組成物。
【請求項４１】
請求項４０に記載の組成物において、前記共有結合免疫抱合体が、Ｔ−ＤＭ１であることを特徴とする組成物。
【請求項４２】
請求項４０に記載の組成物において、前記第２の前アポトーシス抗癌剤が、ＦＴＳ、ＣＭＨ、Ｅ２、ＴＭＳ、δ−トコトリエノール、又はクルクミンであることを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌を治療するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２０１１年のヨーロッパ共同体における乳癌に関する予測死亡率は、７５，６８８例の死亡であると推定される［１］。合衆国については、２０１０年の乳癌による死亡は、３９，８４０例であることが予測された［２］。乳癌のおよそ７０％において、エストロゲン受容体（ＥＲ）が腫瘍増殖の重要なプロモータであり、従って第１選択治療は、エストロゲン産生を遮断するタモキシフェン又はアロマターゼ阻害剤を通して、ＥＲシグナル伝達を阻害することである［３］。しかしながら、これら阻害剤の効果に対する癌細胞の初期（デノボ）又は後続（獲得）耐性は、生物学的再プログラム化を通しての癌細胞によるエストロゲンに対する感受性の増加の発現によって生じると考えられ、これら耐性は、多くの患者でエストロゲン降下剤の治療的有益性を制限する可能性がある。
【０００３】
エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳癌患者の女性の２／３が、ホルモン治療に反応し、これは卵巣の摘出によって、タモキシフェン又はアロマターゼ（エストロゲン合成）阻害剤の投与によって、並びにＧｎＲＨスーパーアゴニスト類似体と呼ばれる化合物の使用によって達成され得る。しかしながら、臨床観察によって、乳癌細胞が、エストラジオールに対する応答性の増強の発現によって、低エストラジオールの条件に適応できることが明らかになった。特に、エストラジオールの急激な欠乏の前には、２００ｐｇ／ｍｌのエストラジオールが、腫瘍増殖を刺激するために必要とされるが、一方１２〜１８ヶ月の適応化の後には、１０〜１５ｐｇ／ｍｌのレベルが腫瘍増殖を引き起こすのに十分である。かかるホルモン耐性乳癌は、この時、アロマターゼの長期投与に不応性であり、これらホルモン耐性細胞を含む癌は、制御不能となり得る。
【０００４】
培養における乳癌の増殖の研究は、野生型ＭＣＦ−７細胞がエストロゲンを含まない培地中で長期間にわたって培養される場合、細胞は、最初のうちは増殖を停止するが、次いで数か月後には、細胞は適応し、エストラジオールで最大限に刺激された野生型ＭＣＦ−７細胞と同様に急激に増殖することを示した。ＬＴＥＤ（長期無エストロゲン下）細胞と呼ばれるこれら適応性培養細胞は、アロマターゼ阻害剤に対する乳癌の反応性の消失の原因となるために、「ホルモン耐性」又は「ホルモン不応性」細胞であり、ホルモン適応性に関する研究プロセスに使用されてきた。患者においてかかる細胞で突然変異が生じる場合、これは、これらの生存予想における重要な否定的な進展である。
【０００５】
エストロゲン受容体ＨＥＲ２のアップレギュレーションは、ホルモン療法後に観察される。トラスツズマブ−マイタンシノイド抱合体、Ｔ−ＤＭ１は、マイタンシンの類似体である微小管阻害剤ＤＭＩに共有結合したＨＥＲ２に特異的なヒト化抗体のトラスツズマブを含む抗体−薬剤抱合体である。この抱合体は、ＨＥＲ２陽性乳癌細胞を標的にすることが示されている。例えば、（非特許文献１）、（非特許文献２）、（非特許文献３）を参照されたい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌｅｗｉｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＧＤ、Ｌｉ  Ｇ、Ｄｕｇｇｅｒ  ＤＬ、Ｃｒｏｃｋｅｒ  ＬＭ、Ｐａｒｓｏｎｓ  ＫＬ、Ｍａｉ  Ｅ、Ｂｌａｔｔｌｅｒ  ＷＡ、Ｌａｍｂｅｒｔ  ＪＭ、Ｃｈａｒｉ  ＲＶ、Ｌｕｔｚ  ＲＪ、Ｗｏｎｇ  ＷＬ、Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ＦＳ、Ｋｏｅｐｐｅｎ  Ｈ、Ｓｃｈｗａｌｌ  ＲＨ、Ｋｅｎｋａｒｅ−Ｍｉｔｒａ  ＳＲ、Ｓｐｅｎｃｅｒ  ＳＤ、Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  ＭＸ、“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＨＥＲ２−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−ＤＭＩ，ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ”、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００８、６８：９２８０〜９０
【非特許文献２】Ｊｕｎｔｔｉｌａ  ＴＴ、Ｌｉ  Ｇ、Ｐａｒｓｏｎｓ  Ｋ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＧＬ、Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  ＭＸ、“Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−ＤＭ１（Ｔ−ＤＭ１）ｒｅｔａｉｎｓ  ａｌｌ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｌａｐａｔｉｎｉｂ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ”、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ、２０１０、１２８（２）：３４７〜５６
【非特許文献３】Ｌｉｕ  Ｃ  ａｎｄ  Ｃｈａｒｉ  Ｒ、“Ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐｏｔｅｎｔ  ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ”、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ、１９９７、６（２）：１６９〜１７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
新しい治療戦略が、耐性と戦うため並びにより永続性のある寛解を達成するために極めて必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、様々な実施形態では、癌の治療のための併用療法を目的とし、この癌は、限定されるものではないが、アナストロゾールなどのアロマターゼ阻害剤、タモキシフェンなどのエストロゲン受容体調節剤等の患者への投与などの第１選択治療にもはや反応しないものなどのホルモン耐性（ホルモン不応性）乳癌を含む。本発明は、様々な実施形態において、癌を治療する方法を含み、この方法は、癌に悩まされる患者に、モノクローナル抗体部分と、それに結合した第１の前アポトーシス薬部分とを含む免疫抱合体の有効量を投与することと、第２の前アポトーシス薬の有効量を投与することとを含む。例えば、この癌は、アロマターゼ耐性乳癌、タモキシフェン耐性乳癌、ＥＲ＋ホルモン不応性乳癌、又はその中でＨＥＲ２発現がアップレギュレートされる癌細胞を含む乳癌、若しくはこの任意の組み合わせ等の乳癌であり得る。
【０００９】
特定の実施形態では、免疫抱合体は、リンカーを介して第１の前アポトーシス薬部分と結合したモノクローナル抗体部分を含む。様々な実施形態では、第１の前アポトーシス薬部分は、マイタンシノイド又はオーリスタチン等の微小管脱重合化剤である。例えば、第１の前アポトーシス薬部分は、マイタンシン類似体（マイタンシノイド）であり得、これはリンカー部分を介してモノクローナル抗体部分に結合される。より具体的には、この免疫結合体は、トラスツズマブ−マイタンシノイド抱合体であり得、これは、非還元性リンカー部分を介してマイタンシノイド前アポトーシス薬部分に結合したトラスツズマブ（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標））を含む（例えばＴ−ＤＭ１）。本発明者は、本明細書において、耐性細胞の増殖をただ単に阻害するよりはむしろ、耐性細胞を排除することによって、適応性再プログラム化のプロセスを消失することが、増殖阻害戦略に好ましいとして、前アポトーシス戦略を選択した。
【００１０】
様々な実施形態では、第２の前アポトーシス薬は、第１の前アポトーシス薬によって及ぼされる細胞毒性の分子機構以外の分子機構によって、細胞毒性を及ぼす。
これは、本明細書では「水平性調節」と呼ばれ、単一の前アポトーシス経路内の２つ又はそれ以上のステップが標的とされる「垂直性調節」とは対照的に、「水平性調節」では、２の独立したアポトーシス経路が、最適治療計画によって活性化又は誘導される。本発明者は、本明細書で、例えば第２の前アポトーシス薬とのＴ−ＤＭ１の併用を使用する水平性調節が、ホルモン不応性乳癌細胞中のアポトーシスの誘導において相乗効果を示したことを開示する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、第２の前アポトーシス薬は、外因性経路を介してアポトーシスを誘導する薬剤である。他の実施形態では、第２の前アポトーシス薬は、内因性経路を介してアポトーシスを誘導する薬剤である。例えば、第２の前アポトーシス抗癌剤は、ファルネシル−チオサリチル酸（ＦＴＳ）、４−（４−クロロ−２−メチルフェノキシ）−Ｎ−ヒドロキシブタンアミド（ＣＭＨ）、エストラジオール（Ｅ２）、テトラメトキシスチルベン（ＴＭＳ）、δ−トコトリエノール（δ−ｔｏｃａｔｒｉｅｎｏｌ）、サリノマイシン、又はクルクミンであり得る。
【００１２】
様々な実施形態では、本発明は、乳癌などの癌の治療のために、より具体的には、上記記載のようなホルモン耐性乳癌の治療のために、第１の前アポトーシス薬及び第２の前アポトーシス薬の併用に関する医薬用途を提供する。例えば、第１の前アポトーシス薬は、Ｔ−ＤＭＩなどの免疫抱合体であり得、第２の前アポトーシス薬は、これによって第１の前アポトーシス薬がその抗癌作用を及ぼすことができる分子機構とは異なる分子機構によって、癌においてアポトーシスを誘導する薬剤であり得る。
【００１３】
様々な実施形態では、本発明は、乳癌などの癌の治療のための、より具体的には、上記記載のようなホルモン耐性乳癌の治療のための、モノクローナル抗体部分及び第１の前アポトーシス薬部分を含む免疫抱合体、並びに第２の前アポトーシス薬を含む治療用組成物を提供する。
【００１４】
免疫抱合体のモノクローナル抗体部分は、ホルモン耐性乳癌細胞中のアップレギュレートされたＨＥＲ２受容体を標的化するなどの第１の前アポトーシス薬のための標的化機構を提供することができる。抗癌剤のための標的化成分は、抱合体、例えば共有結合された部分の使用によって達成化され、この部分の一方は、標的化機構をもたらし、もう一方は細胞毒性又はアポトーシス効果をもたらす。かかる薬剤の１つであるＴ−ＤＭ１は、マイタンシノイドモノクローナル抗体トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））のマイクロ環状前アポトーシス細胞障害剤との共有結合抱合体である。Ｔ−ＤＭ１は、標的化部分として、前アポトーシス微小管阻害性薬剤ＤＭ１に共有結合したＨＥＲ−２に特異的なヒト化抗体トラスツズマブを含む。例えば、オロウジェフ（Ｏｒｏｕｄｊｅｖ）Ｅ、ロパス（Ｌｏｐｕｓ）Ｍ、ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）Ｌ、アウデッテ（Ａｕｄｅｔｔｅ）Ｃ、プロベンザーノ（Ｐｒｏｖｅｎｚａｎｏ）Ｃ、エリクソン（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ）Ｈ、コフタン（Ｋｏｖｔｕｎ）Ｙ、チャリ（Ｃｈａｒｉ）Ｒ、ジューダン（Ｊｏｒｄａｎ）ＭＡら著、２０１０年、「モルキュラー・キャンサー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ）」、第９巻、ｐ．２７００〜２７１３、「微小管重合化を抑制することによる核分裂停止を誘導するマイタンシノイド−抗体抱合体（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｍｉｔｏｔｉｃ  ａｒｒｅｓｔ  ｂｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）」を参照されたい。驚くべきことに、本発明者は、本明細書において、Ｔ−ＤＭ１は、ファルネシル−チオサリチル酸（ＦＴＳ、サリラシブ（Ｓａｌｉｒａｓｉｂ（登録商標））、内因性ミトコンドリア死経路カスパーゼ依存性を標的化するＲａｓ阻害剤）、エストラジオール（Ｅ２、内因性ミトコンドリア死経路カスパーゼ依存性）、テトラメトキシスチルベン（ＴＭＳ、ミトコンドリア死経路カスパーゼ依存性）、４−（４−クロロ−２−メチルフェノキシ）−Ｎ−ヒドロキシブタンアミド（ＣＭＨ、外因性アポトーシス経路）、δ−トコトリエノール、サリノマイシン、又はクルクミン、若しくはこれらの組み合わせが挙げられる他の前アポトーシス抗癌剤との併用で、相乗的に作用し、非毒性アポトーシスを誘発し、インビトロで、ホルモン耐性（ＭＣＦ−７；Ｔ４７Ｄ）及びホルモン不応性（ＬＴＥＤ；ＴａｍＲ）乳癌細胞を殺傷することを発見した。本明細書で開示されかつ主張される療法の評価で使用されるかかる細胞系は、癌に冒される患者における療法のインビボ使用において、治療の成功を高く予測する可能性があることは、当該技術分野で周知である。
【００１５】
様々な実施形態では、本発明者は、本明細書において、特定の前アポトーシス薬の併用が、ホルモン耐性（ホルモン不応性）乳癌細胞において、アポトーシス、細胞死を相乗的に誘導するよう作用することができるという仮説を確認するために実施された実験の結果を開示する。例えば、本発明は、癌の治療の方法を提供し、この方法は、癌に悩まされる患者に、標的化モノクローナル抗体と、第１の前アポトーシス薬部分とを含む免疫抱合体の有効量を投与することと、患者に第２の前アポトーシス薬の有効量を投与することを含む。相乗的とは、治療的効果が、それぞれの薬剤の単独での投与によって達せられる個々の治療的効果に関して、治療的効果が相加的効果を超えることを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｄ及び１Ｅは、細胞質ゾル及びミトコンドリア分画中のタンパク質のレベルにおける変化の検討によって、ＬＴＥＤ細胞がＦＴＳで処置された場合、示された前アポトーシスタンパク質のレベルによって得られた結果の概要を示す電気泳動ゲルオートラジオグラムであり、図１Ｃ及び１Ｆはその棒グラフである。
【図１Ｂ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｄ及び１Ｅは、細胞質ゾル及びミトコンドリア分画中のタンパク質のレベルにおける変化の検討によって、ＬＴＥＤ細胞がＦＴＳで処置された場合、示された前アポトーシスタンパク質のレベルによって得られた結果の概要を示す電気泳動ゲルオートラジオグラムであり、図１Ｃ及び１Ｆはその棒グラフである。
【図１Ｃ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｄ及び１Ｅは、細胞質ゾル及びミトコンドリア分画中のタンパク質のレベルにおける変化の検討によって、ＬＴＥＤ細胞がＦＴＳで処置された場合、示された前アポトーシスタンパク質のレベルによって得られた結果の概要を示す電気泳動ゲルオートラジオグラムであり、図１Ｃ及び１Ｆはその棒グラフである。
【図１Ｄ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｄ及び１Ｅは、細胞質ゾル及びミトコンドリア分画中のタンパク質のレベルにおける変化の検討によって、ＬＴＥＤ細胞がＦＴＳで処置された場合、示された前アポトーシスタンパク質のレベルによって得られた結果の概要を示す電気泳動ゲルオートラジオグラムであり、図１Ｃ及び１Ｆはその棒グラフである。
【図１Ｅ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｄ及び１Ｅは、細胞質ゾル及びミトコンドリア分画中のタンパク質のレベルにおける変化の検討によって、ＬＴＥＤ細胞がＦＴＳで処置された場合、示された前アポトーシスタンパク質のレベルによって得られた結果の概要を示す電気泳動ゲルオートラジオグラムであり、図１Ｃ及び１Ｆはその棒グラフである。
【図１Ｆ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｄ及び１Ｅは、細胞質ゾル及びミトコンドリア分画中のタンパク質のレベルにおける変化の検討によって、ＬＴＥＤ細胞がＦＴＳで処置された場合、示された前アポトーシスタンパク質のレベルによって得られた結果の概要を示す電気泳動ゲルオートラジオグラムであり、図１Ｃ及び１Ｆはその棒グラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、野生型ＭＣＦ−７細胞に及ぼすＦＴＳ及びクルクミンの併用の効果を表す経時変化棒グラフであり、図２Ｂは、ＦＴＰ単独か又はクルクミンと併用されたＭＣＦ−７細胞の生存率に及ぼす効果を表す濃度曲線に対する細胞生存率である。
【図２Ｂ】図２Ａは、野生型ＭＣＦ−７細胞に及ぼすＦＴＳ及びクルクミンの併用の効果を表す経時変化棒グラフであり、図２Ｂは、ＦＴＰ単独か又はクルクミンと併用されたＭＣＦ−７細胞の生存率に及ぼす効果を表す濃度曲線に対する細胞生存率である。
【図３Ａ】図３Ａは、ＭＣＦ−７細胞に及ぼすサリノマイシンの効果を表す、経時変化棒グラフであり、図３Ｂは、その濃度曲線に対する細胞生存率を示す。
【図３Ｂ】図３Ａは、ＭＣＦ−７細胞に及ぼすサリノマイシンの効果を表す、経時変化棒グラフであり、図３Ｂは、その濃度曲線に対する細胞生存率を示す。
【図４Ａ】非適応性細胞（示された組み合わせで５日間処理されたＭＣＦ−７細胞（ａ−ｃ；上部のグラフ）及びＴ４７Ｄ（ｄ−ｆ；下部のグラフ））の用量効果プロットのグラフ図である。
【図４Ｂ】非適応性細胞（示された組み合わせで５日間処理されたＭＣＦ−７細胞（ａ−ｃ；上部のグラフ）及びＴ４７Ｄ（ｄ−ｆ；下部のグラフ））の用量効果プロットのグラフ図である。
【図４Ｃ】非適応性細胞（示された組み合わせで５日間処理されたＭＣＦ−７細胞（ａ−ｃ；上部のグラフ）及びＴ４７Ｄ（ｄ−ｆ；下部のグラフ））の用量効果プロットのグラフ図である。
【図４Ｄ】非適応性細胞（示された組み合わせで５日間処理されたＭＣＦ−７細胞（ａ−ｃ；上部のグラフ）及びＴ４７Ｄ（ｄ−ｆ；下部のグラフ））の用量効果プロットのグラフ図である。
【図４Ｅ】非適応性細胞（示された組み合わせで５日間処理されたＭＣＦ−７細胞（ａ−ｃ；上部のグラフ）及びＴ４７Ｄ（ｄ−ｆ；下部のグラフ））の用量効果プロットのグラフ図である。
【図４Ｆ】非適応性細胞（示された組み合わせで５日間処理されたＭＣＦ−７細胞（ａ−ｃ；上部のグラフ）及びＴ４７Ｄ（ｄ−ｆ；下部のグラフ））の用量効果プロットのグラフ図である。
【図５Ａ】適応性細胞系（示された組み合わせで５日間処理されたＬＴＥＤ  Ｄ２９）の用量効果プロットのグラフ図である。
【図５Ｂ】適応性細胞系（示された組み合わせで５日間処理されたＬＴＥＤ  Ｄ２９）の用量効果プロットのグラフ図である。
【図５Ｃ】適応性細胞系（示された組み合わせで５日間処理されたＬＴＥＤ  Ｄ２９）の用量効果プロットのグラフ図である。
【図５Ｄ】適応性細胞系（示された組み合わせで５日間処理されたＬＴＥＤ  Ｄ２９）の用量効果プロットのグラフ図である。
【図５Ｅ】適応性細胞系（示された組み合わせで５日間処理されたＬＴＥＤ  Ｄ２９）の用量効果プロットのグラフ図である。
【図５Ｆ】適応性細胞系（示された組み合わせで５日間処理されたＬＴＥＤ  Ｄ２９）の用量効果プロットのグラフ図である。
【図５Ｇ】適応性細胞系（示された組み合わせで５日間処理されたＬＴＥＤ  Ｄ２９）の用量効果プロットのグラフ図である。
【図５Ｈ】適応性細胞系（示された組み合わせで５日間処理されたＬＴＥＤ  Ｄ２９）の用量効果プロットのグラフ図である。
【図５Ｉ】適応性細胞系（示された組み合わせで５日間処理されたＬＴＥＤ  Ｄ２９）の用量効果プロットのグラフ図である。
【図５Ｊ】適応性細胞系（示された組み合わせで５日間処理されたＬＴＥＤ  Ｄ２９）の用量効果プロットのグラフ図である。
【図６Ａ】示されたように処理された非適応性ＭＣＦ−７細胞（ａ−ｃ；上部の３つのグラフ）及びＴ４７Ｄ（ｄ−ｆ；下部の３つのグラフ）の併用係数のグラフ図を示す。縦座標−併用係数（ＣＩ）；横座標−分画効果。
【図６Ｂ】示されたように処理された非適応性ＭＣＦ−７細胞（ａ−ｃ；上部の３つのグラフ）及びＴ４７Ｄ（ｄ−ｆ；下部の３つのグラフ）の併用係数のグラフ図を示す。縦座標−併用係数（ＣＩ）；横座標−分画効果。
【図６Ｃ】示されたように処理された非適応性ＭＣＦ−７細胞（ａ−ｃ；上部の３つのグラフ）及びＴ４７Ｄ（ｄ−ｆ；下部の３つのグラフ）の併用係数のグラフ図を示す。縦座標−併用係数（ＣＩ）；横座標−分画効果。
【図６Ｄ】示されたように処理された非適応性ＭＣＦ−７細胞（ａ−ｃ；上部の３つのグラフ）及びＴ４７Ｄ（ｄ−ｆ；下部の３つのグラフ）の併用係数のグラフ図を示す。縦座標−併用係数（ＣＩ）；横座標−分画効果。
【図６Ｅ】示されたように処理された非適応性ＭＣＦ−７細胞（ａ−ｃ；上部の３つのグラフ）及びＴ４７Ｄ（ｄ−ｆ；下部の３つのグラフ）の併用係数のグラフ図を示す。縦座標−併用係数（ＣＩ）；横座標−分画効果。
【図６Ｆ】示されたように処理された非適応性ＭＣＦ−７細胞（ａ−ｃ；上部の３つのグラフ）及びＴ４７Ｄ（ｄ−ｆ；下部の３つのグラフ）の併用係数のグラフ図を示す。縦座標−併用係数（ＣＩ）；横座標−分画効果。
【図７ＡＡ】図７Ａ及び７Ｂは、示されるように処置した適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９（ａ−ｉ）及びＴａｍＲ細胞（ｊ−ｓ）の併用係数のグラフ図を示す。
【図７ＡＢ】図７Ａ及び７Ｂは、示されるように処置した適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９（ａ−ｉ）及びＴａｍＲ細胞（ｊ−ｓ）の併用係数のグラフ図を示す。
【図７ＡＣ】図７Ａ及び７Ｂは、示されるように処置した適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９（ａ−ｉ）及びＴａｍＲ細胞（ｊ−ｓ）の併用係数のグラフ図を示す。
【図７ＡＤ】図７Ａ及び７Ｂは、示されるように処置した適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９（ａ−ｉ）及びＴａｍＲ細胞（ｊ−ｓ）の併用係数のグラフ図を示す。
【図７ＡＥ】図７Ａ及び７Ｂは、示されるように処置した適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９（ａ−ｉ）及びＴａｍＲ細胞（ｊ−ｓ）の併用係数のグラフ図を示す。
【図７ＡＦ】図７Ａ及び７Ｂは、示されるように処置した適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９（ａ−ｉ）及びＴａｍＲ細胞（ｊ−ｓ）の併用係数のグラフ図を示す。
【図７ＡＧ】図７Ａ及び７Ｂは、示されるように処置した適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９（ａ−ｉ）及びＴａｍＲ細胞（ｊ−ｓ）の併用係数のグラフ図を示す。
【図７ＡＨ１】図７Ａ及び７Ｂは、示されるように処置した適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９（ａ−ｉ）及びＴａｍＲ細胞（ｊ−ｓ）の併用係数のグラフ図を示す。
【図７Ｈ２】図７Ａ及び７Ｂは、示されるように処置した適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９（ａ−ｉ）及びＴａｍＲ細胞（ｊ−ｓ）の併用係数のグラフ図を示す。
【図７ＡＩ】図７Ａ及び７Ｂは、示されるように処置した適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９（ａ−ｉ）及びＴａｍＲ細胞（ｊ−ｓ）の併用係数のグラフ図を示す。
【図７ＢＪ】図７Ａ及び７Ｂは、示されるように処置した適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９（ａ−ｉ）及びＴａｍＲ細胞（ｊ−ｓ）の併用係数のグラフ図を示す。
【図７ＢＫ】図７Ａ及び７Ｂは、示されるように処置した適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９（ａ−ｉ）及びＴａｍＲ細胞（ｊ−ｓ）の併用係数のグラフ図を示す。
【図７ＢＬ】図７Ａ及び７Ｂは、示されるように処置した適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９（ａ−ｉ）及びＴａｍＲ細胞（ｊ−ｓ）の併用係数のグラフ図を示す。
【図７ＢＭ】図７Ａ及び７Ｂは、示されるように処置した適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９（ａ−ｉ）及びＴａｍＲ細胞（ｊ−ｓ）の併用係数のグラフ図を示す。
【図７ＢＮ】図７Ａ及び７Ｂは、示されるように処置した適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９（ａ−ｉ）及びＴａｍＲ細胞（ｊ−ｓ）の併用係数のグラフ図を示す。
【図７ＢＯ】図７Ａ及び７Ｂは、示されるように処置した適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９（ａ−ｉ）及びＴａｍＲ細胞（ｊ−ｓ）の併用係数のグラフ図を示す。
【図７ＢＰ】図７Ａ及び７Ｂは、示されるように処置した適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９（ａ−ｉ）及びＴａｍＲ細胞（ｊ−ｓ）の併用係数のグラフ図を示す。
【図７ＢＱ】図７Ａ及び７Ｂは、示されるように処置した適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９（ａ−ｉ）及びＴａｍＲ細胞（ｊ−ｓ）の併用係数のグラフ図を示す。
【図７ＢＲ】図７Ａ及び７Ｂは、示されるように処置した適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９（ａ−ｉ）及びＴａｍＲ細胞（ｊ−ｓ）の併用係数のグラフ図を示す。
【図７ＢＳ】図７Ａ及び７Ｂは、示されるように処置した適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９（ａ−ｉ）及びＴａｍＲ細胞（ｊ−ｓ）の併用係数のグラフ図を示す。
【図８Ａ】示される組み合わせで処置された非適応性細胞ＭＣＦ−７（ａ−ｃ；上部の３つのグラフ）及びＴ４７Ｄ細胞（ｄ−ｆ；下部の３つのグラフ）のアイソボログラム分析のグラフ図である。縦座標−用量Ａ；横座標−用量Ｂ。
【図８Ｂ】示される組み合わせで処置された非適応性細胞ＭＣＦ−７（ａ−ｃ；上部の３つのグラフ）及びＴ４７Ｄ細胞（ｄ−ｆ；下部の３つのグラフ）のアイソボログラム分析のグラフ図である。縦座標−用量Ａ；横座標−用量Ｂ。
【図８Ｃ】示される組み合わせで処置された非適応性細胞ＭＣＦ−７（ａ−ｃ；上部の３つのグラフ）及びＴ４７Ｄ細胞（ｄ−ｆ；下部の３つのグラフ）のアイソボログラム分析のグラフ図である。縦座標−用量Ａ；横座標−用量Ｂ。
【図８Ｄ】示される組み合わせで処置された非適応性細胞ＭＣＦ−７（ａ−ｃ；上部の３つのグラフ）及びＴ４７Ｄ細胞（ｄ−ｆ；下部の３つのグラフ）のアイソボログラム分析のグラフ図である。縦座標−用量Ａ；横座標−用量Ｂ。
【図８Ｅ】示される組み合わせで処置された非適応性細胞ＭＣＦ−７（ａ−ｃ；上部の３つのグラフ）及びＴ４７Ｄ細胞（ｄ−ｆ；下部の３つのグラフ）のアイソボログラム分析のグラフ図である。縦座標−用量Ａ；横座標−用量Ｂ。
【図８Ｆ】示される組み合わせで処置された非適応性細胞ＭＣＦ−７（ａ−ｃ；上部の３つのグラフ）及びＴ４７Ｄ細胞（ｄ−ｆ；下部の３つのグラフ）のアイソボログラム分析のグラフ図である。縦座標−用量Ａ；横座標−用量Ｂ。
【図９Ａ】示されたように処置された適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９細胞（ａ−ｉ）アイソボログラム分析のグラフ図である。縦座標−用量Ａ；横座標−用量Ｂ。
【図９Ｂ】示されたように処置された適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９細胞（ａ−ｉ）アイソボログラム分析のグラフ図である。縦座標−用量Ａ；横座標−用量Ｂ。
【図９Ｃ】示されたように処置された適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９細胞（ａ−ｉ）アイソボログラム分析のグラフ図である。縦座標−用量Ａ；横座標−用量Ｂ。
【図９Ｄ】示されたように処置された適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９細胞（ａ−ｉ）アイソボログラム分析のグラフ図である。縦座標−用量Ａ；横座標−用量Ｂ。
【図９Ｅ】示されたように処置された適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９細胞（ａ−ｉ）アイソボログラム分析のグラフ図である。縦座標−用量Ａ；横座標−用量Ｂ。
【図９Ｆ】示されたように処置された適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９細胞（ａ−ｉ）アイソボログラム分析のグラフ図である。縦座標−用量Ａ；横座標−用量Ｂ。
【図９Ｇ】示されたように処置された適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９細胞（ａ−ｉ）アイソボログラム分析のグラフ図である。縦座標−用量Ａ；横座標−用量Ｂ。
【図９Ｈ１】示されたように処置された適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９細胞（ａ−ｉ）アイソボログラム分析のグラフ図である。縦座標−用量Ａ；横座標−用量Ｂ。
【図９Ｈ２】示されたように処置された適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９細胞（ａ−ｉ）アイソボログラム分析のグラフ図である。縦座標−用量Ａ；横座標−用量Ｂ。
【図９Ｉ】示されたように処置された適応性細胞系、ＬＴＥＤ  Ｄ２９細胞（ａ−ｉ）アイソボログラム分析のグラフ図である。縦座標−用量Ａ；横座標−用量Ｂ。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明を説明及び主張することにおいて、以下の専門用語は、以下に記載される定義に従って使用されるであろう。別に規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は等価な任意の方法又は材料が本発明の実行又は試験において使用され得るが、好ましい方法及び材料が本明細書に記載される。本明細書で使用するとき、以下の用語のそれぞれは、このセクションにおいてそれに関連した意味を有する。基、置換基、及び範囲に関する以下に列挙された特定かつ好ましい数値は、例示のためのものにすぎず、これらは、他の定義された数値若しくは基及び置換基に関して定義された範囲内の他の数値を除外するものではない。
【００１８】
本明細書で使用するとき、「ａ」及び「ａｎ」は、１つ又は複数、即ち、物品の文法的対象物の少なくとも１つを指す。例として、「１つの要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは、１つ又は複数の要素を意味する。
【００１９】
本明細書で使用するとき、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、およそ、ほぼ、概略的に、又は近辺を意味する。用語「約（ａｂｏｕｔ）」が数値範囲と併せて使用される場合、これは、境界を述べられる数値よりも高く又は低く広げることによってその範囲を修正する。一般的に、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、数値を２０％の変動によって、記述された値よりも高い及び低い数値に修正するよう本明細書で使用される。
【００２０】
本明細書で使用するとき、用語「冒された細胞」とは、疾患又は障害を煩う被験体の細胞を指し、この冒された細胞は、疾患、病状又は障害を患っていない被験体に比べて変更された表現型を有する。
【００２１】
細胞又は組織が、疾患、病状、又は障害を煩わない被験体における同一の細胞又は組織と比べて、変更された表現型を有する場合、細胞又は組織は、疾患又は障害に「冒されている」。
【００２２】
本明細書で使用するとき、「作動薬」とは、ヒトなどの哺乳類に投与される場合、関心の生物学的活性を増強するか又は拡大する物質の組成物である。かかる効果は、直接的又は間接的であってもよい。
【００２３】
用語「拮抗薬」とは、ヒトなどの哺乳類に投与される場合、哺乳類の内因性化合物のレベル又は存在に寄与する生物学的活性を阻害するか又は妨害する物質の組成物である。かかる効果は、直接的又は間接的であってもよい。
【００２４】
本明細書で使用するとき、用語「アロマターゼ阻害剤」は、アンドロステンジオンのエストロンへの転化及び／又はテストステロンのエストラジオールへの転化を遮断する組成物に関するものである。アロマターゼ阻害剤は、例えば、エキセメスタン、アナストロゾール及びレトロゾールを含む阻害剤のステロイド系及び非ステロイド系クラスの双方を含む。
【００２５】
本明細書で使用するとき、化学化合物の「類似体」とは、例として、構造では他のものに似ているが、必ずしも異性体であるというわけではない化合物である（例えば、５−フルオロウラシルは、チミンの類似体である）。
【００２６】
用語「アポトーシス」とは、様々な手段によって誘導され得る生化学的経路によって仲介されるプログラム細胞死を指す。「前アポトーシス」剤又は薬剤とは、プログラム細胞死をもたらす生化学的効果を生じる生物活性剤又は薬剤である。本明細書に記載されるように、アポトーシスは、以下に更に記載されるような内因性又は外因性経路又は機構によって引き起こされ又は誘導され得る。「外因性」アポトーシス経路は細胞死受容体に関与し、この経路は、細胞死受容体に結合するリガンドによって活性化される。「内因性」アポトーシス経路は、アポトーシスを開始するミトコンドリア経路に関与する。水平性調節における「水平性」とは、複数の特異的経路に影響を与える刺激を指し、一方垂直性調節における「垂直性」とは、同一の経路において、いくつかのステップが関与することを意味する。
【００２７】
本明細書で使用するとき、用語「乳癌」は、乳房又は乳腺組織の多様なタイプ及びサブタイプの癌種のいずれかに関係する。
本明細書で使用するとき、用語「癌」とは、その特徴的な形質−正常の制御が不能な形質が−未制御の増殖、分化の欠如、局所組織浸潤、及び転移をもたらす細胞の増殖として定義される。例としては、限定されるものではないが、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌及び肺癌が挙げられる。
【００２８】
本明細書で使用するとき、「化合物」とは、一般的に、薬剤、又は薬剤としての使用のための候補物質、並びに上記の組み合わせ及びの混合物と考えられる任意のタイプの物質又は薬剤を指す。
【００２９】
「抱合体」とは、少なくとも２つの「部分」、又はドメインを、互いに関連付けて組み合わせる分子実体である。「共有結合」抱合体とは、当該技術分野で周知であるものなどの共有化学結合の手段によって部分が結合されるところの抱合体である。例えば、モノクローナル抗体等のタンパク質は、共有結合を通してなど、薬剤などの有機化合物と共に抱合体を形成するよう起こり得る。タンパク質が抗体、例えばモノクローナル抗体である場合、生じる抱合体は、本明細書では「免疫抱合体」と呼ばれる。タンパク質（例えば、モノクローナル抗体）と有機化合物（例えば、薬剤）との間の共有結合は、「リンカー」又は「リンカー部分」を通して起こり得、このリンカー又はリンカー部分は、有機化合物とタンパク質の双方に共有結合される。例は、以下に説明される。
【００３０】
本明細書で使用するとき、用語「リンカー」又は「リンカー部分」とは、２つの他の分子部分を、共有結合的に、又は非共有結合的に（例えばイオン結合又は水素結合若しくはファンデルワールス相互作用）のいずれかで結びつける分子部分を指す。具体例は、以下に提供される。「リンケージ（ｌｉｎｋａｇｅ）」又は「リンカー」とは、２つの基の間の接続部位を指す。
【００３１】
本明細書で使用される用語としての「部分」とは、より大きな分子の領域を指し、例えば、抱合体Ｔ−ＤＭ１においては、マイタンシノイド薬がリンカーを介してモノクローナル抗体に結合されることで、最終産物においてマイタンシノイド薬部分が、リンカー部分を介してモノクローナル抗体部分に結合される。かかる部分を含む抱合体の例が、分子実体Ｔ−ＤＭ１によって提供され、これは、モノクローナル抗体トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、及びマイタンシノイド大環状細胞障害性化合物との共有結合抱合体であり、この構造は以下に示される。
【００３２】
【化１】
2014513692.tif 000003
リンカーのトラスツズマブへのカップリングは、タンパク質トラスツズマブの側鎖アミノ酸残基（リジン残基等）の窒素原子へのリンカー部分の結合を介するものであると信じられている。当該技術分野で周知であるトラスツズマブの分子構造は、詳細には提供されていない。抗体と、マイタンシノイドなどの前アポトーシス薬等の免疫抱合体は、本明細書に記載された方法並びに参照により本明細書に組み込まれた文献に記載の方法によって調製され評価され得る。
【００３３】
免疫抱合体は、１つ以上の生理活性分子に抱合された抗体を含む。上記に示されたような免疫抱合体Ｔ−ＤＭ１は、モノクローナル抗体に結合されたマイタンシノイド部分を含む。マイタンシノイドは、チューブリン重合化を阻害することによって、又は微小管脱重合化を誘導することによって作用する有糸分裂（ｍｉｔｏｔｏｔｉｃ）阻害剤である。当該技術分野で周知であるように、チューブリン重合化及び脱重合化は、有糸分裂、細胞分裂に関与する重要な事象である。細胞分裂の長期抑制は、有糸分裂抑制細胞中でアポトーシスを誘導可能な状態であると考えられる。
【００３４】
マイタンシンは、まず初めに東アフリカの低木であるマイテヌス・セーラタ（Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａ）から単離された（米国特許出願公開第３８９６１１１号明細書）。引き続いて、特定の微生物がまた、マイタンシノール及びＣ−３マイタンシノールエステルなどのマイタンシノイドを産生するが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号明細書）。合成マイタンシノール並びにそれらの誘導体及び類似体が、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号明細書、同第４，２４８，８７０号明細書、同第４，２５６，７４６号明細書、同第４，２６０，６０８号明細書、同第４，２６５，８１４号明細書、同第４，２９４，７５７号明細書、同第４，３０７，０１６号明細書、同第４，３０８，２６８号明細書、同第４，３０８，２６９号明細書、同第４，３０９，４２８号明細書、同第４，３１３，９４６号明細書、同第４，３１５，９２９号明細書、同第４，３１７，８２１号明細書、同第４，３２２，３４８号明細書、同第４，３３１，５９８号明細書、同第４，３６１，６５０号明細書、同第４，３６４，８６６号明細書、同第４，４２４，２１９号明細書、同第４，４５０，２５４号明細書、同第４，３６２，６６３号明細書及び同第４，３７１，５３３号明細書に開示されている。
【００３５】
マイタンシノイド薬部分は、抗体−薬剤抱合体中で魅力的な薬剤部分であり、なぜなら、これらが（ｉ）発酵又は発酵産物の化学的修飾又は誘導体化によって調製することが比較的利用でき、（ｉｉ）抗体への非ジスルフィド（非還元性）リンカーを通しての抱合に好適な官能基による誘導体化が容易であり、（ｉｉｉ）血漿中で安定であり、並びに（ｉｖ）多様な腫瘍細胞系に対して有効であるためである。
【００３６】
マイタンシノイド薬部分としての使用に好適なマイタンシン化合物は、当該技術分野で周知であり、既知の方法に従って天然供給源から単離され得、又は遺伝子操作技術を使用して産生され得る（ユー（Ｙｕ）ら著、２００２年、プロシィーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（ＰＮＡＳ）、第９９巻、ｐ．７９６８〜７９７３を参照されたい）。マイタンシノール及びマイタンシノール類似体はまた、既知の方法に従って合成的に調製され得る。
【００３７】
マイタンシノイド薬部分としては、Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号明細書）（アンサマイトシンＰ２の水素化アルミニウムリチウム還元によって調製）；Ｃ−２０−ヒドロキシ（又はＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号明細書及び同第４，３０７，０１６号明細書）（ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）又はアクチノマイセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）を使用する脱メチル化若しくはＬＡＨを使用する脱塩素化によって調製）；及びＣ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号明細書）（塩化アシルを使用するアシル化によって調製）、並びに他の位置で修飾を有するものなどの修飾芳香族環を有するものが挙げられる。
【００３８】
例示的マイタンシノイド薬部分はまた、Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号明細書）（Ｈ２Ｓ又はＰ２Ｓ５とのマイタンシノールの反応によって調製）；Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号明細書）；Ｃ−１４−ヒドロキシメチル又はアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号明細書）（ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）から調製）；Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号明細書）（ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）によるマイタンシノールの転化によって調製）；Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号明細書及び同第４，３１５，９２９号明細書）（トレビア・ヌーディフロラ（Ｔｒｅｗｉａ  ｎｕｄｌｆｌｏｒａ）から単離）；Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号明細書及び同第４，３２２，３４８号明細書）（ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）によるマイタンシノールの脱メチル化によって調製）；及び４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号明細書）（マイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元によって調製）等の修飾を有するものが挙げられる。
【００３９】
本明細書で使用される用語としての「オーリスタチン」とは、ドラスタチン類及びオーリスタチン類等のペプチド性抗癌剤を指し、これらは微小管動力学、ＧＴＰ加水分解、及び核及び細胞分裂を妨害し（ウォイケ（Ｗｏｙｋｅ）ら著、２００１年、「アンティマイクロビアル・エージェント・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．）」、第４５巻（１２）、ｐ．３５８０〜３５８４）、並びに抗癌活性（米国特許第５，６６３，１４９号明細書）及び抗真菌活性（ペティット（Ｐｅｔｔｉｔ）ら著、１９９８年、「アンティマイクロビアル・エージェント・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇ類似体ｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．）」、第４２巻、ｐ．２９６１〜２９６５）を有することが示された。例えば、米国特許第５，６３５，４８３号明細書及び同第５，７８０，５８８号明細書を参照されたい。
【００４０】
「対照」被験体とは、同一のタイプの依存性等の試験被験体と同一の特性を有する被験体である。対照被験体は、例えば、試験被験体が処置又は検査される時間と正確に又は殆ど同一の時間で検査され得る。対照被験体はまた、例えば、試験被験体が検査される時間から離れた時間で検査されてもよく、対照被験体の検査の結果が記録されることで、記録された結果が試験被験体の検査によって得られた結果と比較されてもよい。
【００４１】
「試験」被験体とは、処置される被験体である。
本明細書で使用するとき、化合物の「誘導体」とは、アルキル、アシル、又はアミノ基によるＨの置き換えにおけるような、１つ以上のステップで、同様な構造の別の化合物から生成され得る化学化合物を指す。
【００４２】
「疾患」とは、被験者がホメオスタシスを維持することができない、並びに疾患が軽減されない場合、次いで被験者の健康が悪化し続ける、被験者の健康の状態である。これとは対照的に、被験者における「異常」とは、被験者がホメオスタシスを維持することはできるが、被験者の健康の状態が、異常の不在下におけるよりも、より好ましくない健康の状態であるものである。
【００４３】
疾患又は異常の症状の重篤性、かかる症状が患者によって経験される頻度が、又はこれらの双方が低減される場合、疾患、状態、又は異常は軽減される。
本明細書で使用するとき、「有効量」とは、疾患又は障害の症状を軽減するなどの選択された効果をもたらすのに十分な量を意味する。２つ又はそれ以上の化合物を投与することに関しては、別の化合物（複数可）と併用されて投与される場合、各化合物の量は、その化合物が単独で投与される場合とは異なることがある。
【００４４】
本明細書で使用するとき、用語「エストロゲン」とは、エストロゲン応答性細胞において細胞増殖を誘導し及び／又は新しいタンパク質合成を開始する天然起源及び合成的に製造された化合物の部類に関するものである。天然起源エストロゲンとしては、エストロン（Ｅ１）、エストラジオール−１７Ｂ（Ｅ２）、及びエストリオール（Ｅ３）が挙げられ、これら中で、エストラジオールが最も薬理学的に活性である。合成エストロゲンは、天然には存在せず、内因性エストロゲンの活性をある程度まで複製又は擬似する化合物である。これら化合物は、ジエネストロール、ベンゼストロール、ヘキセストロール、メテストロール、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、キネストロール（エストロビス（Ｅｓｔｒｏｖｉｓ））、クロロトリアニセン（Ｔａｃｅ）、及びメタレネストリル（バレストリル（Ｖａｌｌｅｓｔｒｉｌ））によって例示される、多様なステロイド性及び非ステロイド性組成物を含む。
【００４５】
本明細書で使用するとき、用語「エストロゲン拮抗薬」とは、エストロゲンと同時に投与される場合、エストロゲンの活性に及ぼす中和作用又は阻害効果を有する化合物に関するものである。エストロゲン阻害剤の例として、タモキシフェン及びトレミフェンが挙げられる。
【００４６】
本明細書で使用するとき、「機能的分子」は、この分子がそれによって特性評価される特性又は活性を、呈する形態にある分子を指す。機能的酵素とは、例えば、この酵素がそれによって特性化される特徴的触媒活性を呈するものである。
【００４７】
本明細書で使用するとき、「ホルモン遮断療法」とは、患者からホルモンの存在の作用をブロックするか、又はホルモンの存在を除去する（合成を妨害するか又はホルモンの分解を増強させるかのいずれかで）、患者の任意の治療に関するものである。乳癌の特定の場合には、ホルモン抑制療法は、エストロゲンの生合成を遮断することによる、又はＨＥＲ２などのエストロゲン受容体に及ぼすエストロゲンの効果をブロックすることによる、エストロゲンの遮断を含み得る。
【００４８】
本明細書で使用するとき、用語「ホルモン応答性細胞／組織」とは、例えばエストロゲン又はアンドロゲンに対して天然に応答性である非癌性細胞又は組織に関するものであり、この細胞又は組織は、このホルモンの存在下で新しいタンパク質合成を増大し及び／又は開始する。ホルモン応答性組織としては、乳腺、精巣、前立腺、子宮及び子宮頚部が挙げられる。エストロゲン又はアンドロゲンに対して正常に応答する組織は、このホルモンに対してその応答性を低下させる場合がある。従って、「ホルモン応答性組織」とは、本明細書で使用するとき、広範な用語であり、ホルモンに対して正常に応答するホルモン感受性及びホルモン非感受性組織の双方を包含する。「エストロゲン応答性細胞／組織」とは、エストロゲンに応答性であるものである。
【００４９】
本明細書で使用するとき、用語「ホルモン応答性癌」とは、ホルモン応答性細胞／組織から誘導される細胞又は組織に関するものであり、並びに「適応性ホルモン応答性癌細胞」とは、対応するホルモン応答性細胞において応答を生じないホルモンのレベルに応答して増殖するホルモン応答性癌細胞である。
【００５０】
上述のようにエストロゲン産生をブロックするアロマターゼ阻害剤、又はタモキシフェンなどのエストロゲン拮抗薬、若しくは同様なエストロゲンブロッキング効果の他の薬剤等の物質への曝露時に、乳癌で見出されるようなエストロゲン応答性癌細胞は、組織中でのエストロゲンのレベルの低減に対して耐性を発現することができる。かかる場合には、アロマターゼ阻害剤の使用は、乳癌を制御することにおいて、もはや有効ではない。かかる癌に関与する細胞は、本明細書では「長期無エストロゲン下」、「ホルモン耐性」、又は「ホルモン不応性」細胞と呼ばれ、巨視的疾患は、互換的には「ホルモン耐性」又は「ホルモン不応性」乳癌と呼ばれる。しかしながら、「ホルモン耐性」又は「ホルモン不応性」細胞及び癌は、他の機構を介しても十分に出現し得ることが理解される。
【００５１】
本明細書で使用するとき、用語「適応性ホルモン応答」又は「適応性応答」とは、それによって、ホルモン応答性組織から誘導される細胞又は組織が、これら細胞中で以前には応答を生じなかったホルモンのレベルに応答することができるようになる（即ち、新しいタンパク質合成を増大し及び／又は開始する）プロセスに関するものである。
【００５２】
本明細書で使用するとき、用語「阻害する」とは、用語「阻害する」が使用される文脈に基づいて、化合物又は任意の薬剤が、記載された機能、レベル、活性、合成、放出、結合等を低減又は妨害する能力を指す。好ましくは、阻害は、少なくとも１０％まで、より好ましくは少なくとも２５％まで、更により好ましくは少なくとも５０％までの阻害であり、最も好ましくは、その機能が少なくとも７５％まで阻害される。用語「阻害する」とは、「低減する」、及び「ブロックする」と互換的に使用される。
【００５３】
本明細書で使用するとき、用語「タンパク質を阻害する」とは、タンパク質の合成、レベル、活性、又は機能を阻害する任意の方法又は技術、並びに関心のタンパク質の合成、レベル、活性、又は機能の誘導又は刺激を阻害する方法を指す。この用語はまた、関心のタンパク質の合成、レベル、活性、又は機能を調節し得る任意の代謝経路又は調節経路を指す。この用語は、他の分子との結合及び複合体形成を含む。従って、用語「タンパク質阻害剤」とは、その適用が、タンパク質機能及びタンパク質経路機能の阻害をもたらす任意の薬剤又は化合物を指す。しかしながら、この用語は、これら機能のそれぞれ及びそのどれもが、同時に阻害されねばならないことを意味していない。「阻害剤」は、これらの機能のいずれか（例えば、それによってアロマターゼ酵素（タンパク質）が前駆体をエストロゲンに転化する生合成触媒活性をアロマターゼ阻害剤がブロックする）を実行することができる。
【００５４】
本明細書で使用するとき、用語「ｍＴＯＲ活性の阻害」とは、例えば、ｐ７０  Ｓ６Ｋ及びＰＨＡＳ−Ｉを含むｍＴＯＲの基質の１つ以上をリン酸化するためのｍＴＯＲの能力における検出可能な低下に関するものである。ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲ活性に及ぼす直接的阻害効果を有するものである（即ち、ｍＴＯＲ活性の阻害は、上流経路の酵素に及ぼす阻害効果を通して仲介されない）。
【００５５】
本明細書で使用するとき、「使用説明書」とは、本明細書に記載される種々の疾患又は障害の軽減をもたらすために、キット中の本発明の化合物の有用性を伝えるよう使用され得る刊行物、レコーディング、図表、又は任意の表現の他の媒体を含む。任意選択的に、又はこの代わりに、使用説明書は、被験者における疾患又は障害の軽減の１つ以上の方法を記載する場合がある。本発明のキットの使用説明書は、例えば、本発明の同定された化合物を収容する容器に添付されてもよく、又は同定された化合物を収容する容器と併せて出荷されてもよい。或いは、使用説明書は、使用説明書及び化合物がレシピエントと協同的に使用されるとの意図で、容器とは別個に出荷されてもよい。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、「リガンド」とは、標的化合物又は分子に特異的に結合する化合物である。リガンドは、リガンドが、異種化合物の試料中の化合物の存在の決定因である結合反応において機能する場合、化合物と「特異的に結合する」又は「特異的に反応する」。
【００５７】
「受容体」とは、リガンドに特異的に結合する化合物又は分子である。
本明細書で使用するとき、用語「核酸」とは、ＲＮＡ並びに単鎖及び二重鎖ＤＮＡ及びｃＤＮＡを包含する。更に、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」及び同様な用語もまた、核酸類似体、即ち、ホスホジエステル主鎖以外を有する類似体も含む。
【００５８】
用語「ペプチド」とは、典型的には、短鎖ポリペプチドを指す。
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合を介する天然起源の構造変異体及びその合成非天然起源の類縁体に関連する、天然起源の構造変異体、及びその合成非天然起源の類似体に関連するアミノ酸残基から構成されるポリマーを指す。合成ポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチドシンセサイザーを使用して合成され得る。
【００５９】
用語「タンパク質」とは、典型的には大きなポリペプチドを指す。
「組換えポリペプチド」とは、組換えポリヌクレオチドの発現時に産生されるものである。
【００６０】
本明細書で使用するとき、用語「適用毎」とは、被験体への薬剤又は化合物の投与を指す。
本明細書で使用するとき、「薬学的に許容可能な塩」とは、リン酸塩緩衝生理食塩水溶液、水、水中油型又は油中水型エマルジョン等の乳剤、並びに種々のタイプの湿潤剤などの標準薬学的担体のいずれかを含む。この用語はまた、合衆国連邦政府の規制機関によって承認された、又はヒトを含む動物における使用に米国薬局方で列挙された薬剤のいずれかを包含する。「薬学的許容可能な塩」とは、規制機関による承認又は米国薬局方中の列挙に関して薬学的に許容可能である酸性又は塩基性のいずれかの、対イオンとの塩の形態での分子実体を指す。
【００６１】
本明細書で使用するとき、用語「生理学的に許容可能な」エステル又は塩とは、医薬組成物中の任意の他の成分と適合性があり、並びにこの組成物が投与される被験体に対して有害ではない活性成分のエステル又は塩形態を意味する。
【００６２】
用語「予防する」とは、本明細書で使用するとき、何かが起こることを止めること、又は起こる可能性又は疑いがある何かに対する事前の処置を取ることを意味する。医学に関しては、「予防」とは、一般的に、疾患又はある状態になる機会を減少させるために行われる行為を指す。
【００６３】
本明細書で使用するとき、末端アミノ基に関する「保護基」とは、その末端アミノ基が、ペプチド合成で従来から使用されている種々のアミノ末端保護基のいずれかに結合されるペプチドの末端アミノ基を指す。かかる保護基としては、例えば、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、スクシニル、及びメトキシスクシニルなどのアシル保護基；ベンジルオキシカルボニルなどの芳香族ウレタン保護基；及び脂肪族ウレタン保護基、例えば、ｔ−ブトキシカルボニル又はアダマンチルオキシカルボニルが挙げられる。好適な保護基に関しては、グロス（Ｇｒｏｓｓ）及びマイエンホーファー（Ｍｉｅｎｈｏｆｅｒ）編集、「ザ・ペプチドス（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、第３巻、ｐ．３〜８８、「アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）」、ニューヨーク、１９８１年を参照されたい。
【００６４】
本明細書で使用するとき、末端カルボキシ基に関する「保護基」とは、その末端カルボキシ基が、種々のカルボキシ末端保護基のいずれかに結合されるペプチドの末端カルボキシ基を指す。かかる保護基としては、例えば、ｔ−ブチル、ベンジル、又はエステル又はエーテル結合を通して末端カルボキシル基に結合する他の許容可能な基が挙げられる。
【００６５】
本明細書で使用するとき、用語「精製された」及び類似する用語は、天然環境における分子又は化合物に通常結合した他の成分に対しての分子又は化合物の高濃度化を指す。用語「精製された」は、プロセス中に特定の分子の完全な純度が達成されたことを示す必要は必ずしもない。本明細書で使用するとき、「高度に精製された」化合物とは、９０％を超えて純粋である化合物を指す。
【００６６】
用語「調節する」とは、関心対象の機能又は活性を刺激するか又は阻害するかのいずれかを指す。
本明細書で使用するとき、「試料」とは、被験体からの生物学的試料を指し、限定されないが、正常組織試料、疾患組織試料、生検、血液、唾液、糞便、精液、涙液、及び尿が挙げられる。試料はまた、細胞、組織、又は関心対象の液体を含有する被験体から得られた材料の任意の他の供給源であり得る。
【００６７】
本明細書で使用するとき、用語「特異的に結合する」とは、特異的分子を認識しかつそれに結合するが、試料中の他の分子を実質的に認識せず又はそれに結合しない分子を意味するか、若しくは、これは該分子がサンプル中の他の分子を実質的に認識しないか又はそれに結合しない場合の、細胞調節プロセスの部分におけるような２つ又はそれ以上の分子の間の結合を意味する。
【００６８】
本明細書で使用するとき、用語「標準」とは、比較のために使用される何かを指す。例えば、これは、試験化合物を添加する場合、結果を比較するために投与され又は添加されかつ使用される既知の標準薬剤又は化合物であり得、若しくは、これは、パラメータ又は機能に及ぼす薬剤又は化合物の効果を測定する場合、対照値を取得するよう測定される標準パラメータ又は機能であり得る。標準とはまた、サンプルに既知量で添加される薬剤又は化合物等の「内部標準」を指すこともでき、これは、関心対象のマーカが測定される前に、サンプルが処理され若しくは精製又は抽出処理を受ける場合、精製率又は回収率などのかかる事項を決定する上で有用である。内部標準は、関心対象の精製されたマーカであることが多く、これは放射活性同位体などで標識化されていて、これが内因性マーカから識別されることを可能にする。
【００６９】
診断又は治療の「被験体」は、ヒトを含む哺乳類である。
本明細書で使用するとき、用語「症状」とは、患者によって経験される、任意の病的な現象若しくは構造、機能、又は感覚における正常な状態からの逸脱並びに疾患の示唆を指す。これとは対照的に、徴候（ｓｉｇｎ）とは、疾患の客観的証拠である。例えば、鼻血は徴候である。これは患者、医者、看護師及び他の観察者に明らかなものである。
【００７０】
本明細書で使用するとき、用語「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、特定の疾患、異常、又は状態の予防、又は特定の疾患、異常又は状態に関連する症状の軽減及び／又は該症状の防止又は排除を含むことができる。「予防的」治療とは、疾患に関連する病理を発症するリスクを低減する目的で、疾患の徴候を呈してはいないか又は疾患の初期徴候のみを呈する被験体に施される治療である。「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、本明細書では「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」と互換的に使用される。例えば、癌を治療することは、癌細胞の増殖及び／又は分裂を防止又は緩慢化すること並びに癌細胞を致死させること及び／又は腫瘍のサイズを低減させることを含む。癌の成功した治療の追加的徴候は、白血球細胞計数、赤血球細胞計数、血小板計数、赤血球沈降速度、及びトランスアミナーゼ及びヒドロゲナーゼ等の種々の酵素レベルなどの試験の正常化を含む。加えて、臨床医が、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）等の検出可能な腫瘍マーカにおける減少を観察してもよい。
【００７１】
「治療的」処置とは、病理の徴候を呈する被験体に投与される処置で、これら徴候の減少又は排除を目的とするものである。
化合物の「治療的有効量」とは、この化合物が投与される被験体に有益な効果をもたらすのに十分である化合物の量である。
【００７２】
本発明の方法の様々な実施形態では、免疫抱合体は、上記で説明された免疫抱合体のいずれかであり得る。Ｔ−ＤＭ１の構造は、上記に提供されている。
本明細書に記載される前アポトーシス薬は
【００７３】
【化２】
2014513692.tif 000004
2014513692.tif 000005
を含む。
【００７４】
実施形態
本発明は、様々な実施形態では、本明細書に開示され主張されるような、細胞死（アポトーシス）を誘導する薬剤の相加的又は相乗的併用を使用する、癌細胞の耐性の発現が発生したか又は発生の可能性が高い場合の疾患状態に好適な抗癌療法の開発を目的とする。これら方法の使用によって、癌細胞による薬剤への耐性の発現は、単一の抗癌剤を使用する耐性発現の頻度に比べて減少され得、又は療法に対して適応性変異を既に起こした癌細胞において、耐性が克服され得る。様々な実施形態では、本発明の方法は、アナストラゾール等などのアロマターゼ阻害剤の使用、若しくはタモキシフェン等などのエストロゲン受容体調節剤又は拮抗剤の使用などの第一選択療法に癌がもはや応答しない場合のホルモン耐性乳癌の処置に有効であり得る。
【００７５】
例えば、療法耐性癌は、アロマターゼ耐性乳癌、タモキシフェン耐性乳癌、ＥＲ＋ホルモン不応性乳癌、又はその中でＨＥＲ２発現がアップレギュレートされる癌細胞を含む乳癌（ＨＥＲ２−陽性乳癌）、若しくはこれらの組み合わせなどの乳癌であり得る。
【００７６】
上記で説明の通りに、アロマターゼ阻害剤又はエストロゲン拮抗薬療法を受けた患者におけるエストロゲン応答性乳癌細胞などの長期無エストロゲン下の細胞は、乳房組織で通常見出されるものよりも十分に低いエストロゲンレベルへの応答性の増加した度合いを発現することができる。この作用は、ＨＥＲ２をコード化する遺伝子などのＨＥＲ受容体をコード化する遺伝子のアップレギュレーション及び過発現の結果として起こり得る。アロマターゼ阻害剤又はエストロゲン拮抗薬などの第一選択療法剤で治療された乳癌患者においては、かかる細胞は、正常なエストロゲンレベルの非存在下で増殖することが可能であり、これら第一選択療法に対する耐性を発現した乳癌をもたらし、即ち、ホルモン耐性、又はホルモン不応性乳癌となる。かかる疾患状態では、第二選択療法の使用が、患者の生存に重要となる。様々な実施形態では、本発明は、かかる機構によって耐性を発現したこれら癌などのホルモン耐性乳癌の処置のための第二選択療法を提供する。
【００７７】
前アポトーシス戦略が、単に耐性癌細胞の増殖を阻害するよりはむしろ、耐性癌細胞の排除によって標的細胞中の適応的変異の頻度を低減するための増殖阻害戦略に好ましいものとして、本明細書の本発明者によって選択された。本発明者はまた、水平的に作用する、即ち、２つの異なる経路に作用する（「水平性調節」）（このそれぞれがアポトーシス及び細胞死をもたらし得る）少なくとも２つの前アポトーシス薬の使用が、アポトーシスの誘導における相加的又は相乗的効果をもたらし、この中で、耐性を発現する頻度が減少されることが見出されたことを本明細書で開示する。ホルモン耐性乳癌細胞の処置を必要とする第二選択療法では、この前アポトーシス戦略が、細胞死を誘導することによって、更なる適応性変異の可能性を低減することができる。水平性調節の更なる使用は、適応性変異によってアポトーシスを回避する細胞の可能性を更に低減するよう働くことができ、これは、複数のアポトーシス誘導機構が起動され得、単一の細胞中で、その細胞死の前に耐性を発現する２つの機構の可能性は、耐性を発現する単一の機構の可能性よりも低いためである。
【００７８】
アポトーシスは、細胞死受容体経路（外因性経路）を通してか又はミトコンドリア仲介経路（内因性経路）によってのいずれかで発生することができる。本発明者は、本明細書で、別個の分子機構を介してアポトーシスを誘導するよう作用する、一組の前アポトーシス薬などの前アポトーシス抗癌剤の相加的及び相乗的併用を予期せず発見し、これは、ホルモン不応性乳癌のモデルのためのタモキシフェン耐性（ＴａｍＲ）及び長期無エストロゲン（ＬＴＥＤ）細胞系、及び比較のための野生型ＭＣＦ−７及びＴ４７Ｄ細胞系などの十分に特性評価された細胞系においてホルモン適応性癌細胞を致死させることで有効である。相乗効果は、２つの前アポトーシス抗癌剤が異なる機構によってアポトーシスを誘導する場合、最も発生しやすいと考えられている。
【００７９】
様々な実施形態では、本発明の処置の方法は、癌治療、特に乳癌の治療において相乗的な治療効果をもたらす。本出願は、乳癌細胞を治療する場合、薬剤の特定の併用が相乗的効果をもたらすという驚くべき結果を開示する。一実施形態では、ＦＴＳ及びＣＭＨを使用する併用治療が、相乗効果をもたらすことが見出された。一実施形態では、ＴＭＳ及びＣＭＨを使用する併用治療が、相乗効果をもたらす。従って、本発明は、ＦＴＳ、ＴＭＳ、及びＣＭＨのみならず、同様の活性を有する薬剤もまた使用する併用療法を更に包含し、２つ又はそれ以上のかかる薬剤を併用しての投与が、乳癌、例えばホルモン不応性及びホルモン耐性乳癌の処置においてなどで、相乗的治療効果をもたらすことができる。例えば、ＦＴＳ及びＥＳを使用する併用は、驚くべき高い相乗効果をもたらす。
【００８０】
いくつかの実施形態では、Ｅ２、ＦＴＳ及びＣＭＨのいずれかとのＴ−ＤＭ１の併用は、ＦＴＳ又はＣＭＨのいずれかとのＴ−ＤＭ１の併用が最強の相乗性を伴い、相乗効果をもたらす。以下の表１を参照されたい。
【００８１】
本発明者は、本明細書で、治療の方法を開示し、この方法は、水平性調節を通して細胞に影響を及ぼす２つ又はそれ以上の前アポトーシス抗癌剤の乳癌などの癌に悩む患者への投与を含み、ここで２つの薬剤は、単一のアポトーシス経路における連続的ステップに作用する（垂直性調節）よりはむしろ、別個のアポトーシス経路に作用する。外因性経路は細胞死受容体に関与し、この経路が、細胞死受容体に結合するリガンドによって活性化される。内因性経路は、アポトーシスを開始させるミトコンドリア経路に関与する。水平性とは、２つ以上の特定の経路に影響を及ぼす刺激を指し、一方垂直性とは、同一の経路内にいくつかのステップが伴うことを意味する。様々な実施形態では、少なくとも２つの薬剤が水平性調節を達成する。様々な実施形態では、水平性調節は少なくとも２つの薬剤の相乗効果をもたらす。様々な実施形態では、少なくとも２つの薬剤を使用する本発明の併用療法は、非適応性乳癌細胞に及ぼす相乗効果を生じる。
【００８２】
本発明の方法は、様々な実施形態では、癌を治療する方法を提供し、この方法は、癌に悩む患者に、モノクローナル抗体部分と、リンカー部分を介してこれに結合した第１の前アポトーシス薬部分とを含む免疫抱合体の有効量を投与することと、この患者に、第２の前アポトーシス薬の有効量を投与することとを含む。例えば、以下に非常に詳細に説明するように、免疫抱合体は、これに共有結合した第１の前アポトーシス薬部部分を含むことができる。
【００８３】
例えば、処置される癌は乳癌であり得る。より具体的には、この乳癌は、適応性変異を起こした長期無エストロゲン下細胞の増殖からの結果などの、ホルモン耐性（ホルモン不応性）乳癌であり得る。ホルモン耐性を生じさせる一部の適応性変異においては、乳癌はＨＥＲ２耐性乳癌と呼ばれる。ＨＥＲ２耐性乳癌とは、その中で細胞が、分子実体及びＨＥＲ２受容体とのそれらの相互作用を標的とする第一選択療法に耐性をもたらす適応性変異を起こした乳癌を意味する。ホルモン耐性を生じさせる一部の適応性変異においては、この乳癌は、アロマターゼ耐性乳癌と呼ばれる。アロマターゼ耐性乳癌とは、アロマターゼ療法に耐性を示すようになった乳癌を意味する。上述のように、アロマターゼは、エストロゲン生合成の重要なステップに関与する酵素である。
【００８４】
様々な実施形態では、免疫抱合体の標的化部位は、ＨＥＲ２受容体に結合する。アロマターゼ又はエストロゲン拮抗薬療法に耐性となった癌細胞では、ＨＥＲ２受容体の過発現が原因であり得る。過発現が起こった場合、耐性細胞中では、受容体が選択的に細胞毎により大量になり、ＨＥＲ２に特異的なモノクローナル抗体標的化部位の存在下では、抗体−薬剤抱合体のより多くの分子が細胞毎に結合することができる。腫瘍細胞上に局在化した免疫抱合体によって、第１の前アポトーシス抗癌剤部分のより高い局所濃度が達成され得る。リュー（Ｌｉｕ）Ｃ及びチャリ（Ｃｈａｒｉ）Ｒ著、「非常に強力なマイタンシノイドを有する癌を標的とするための抗体送達システムの開発（Ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐｏｔｅｎｔ  ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）」、エキスパート・オピニオン・オン・インベスティゲーショナル・ドラッグス、１９９７年、第６巻（２）、ｐ．１６９〜１７２を参照されたい。
【００８５】
従って、様々な実施形態では、本発明の方法は、癌の処置で使用され得、この癌は乳癌である。より具体的には、この乳癌はアロマターゼ耐性乳癌であり得、又はこの乳癌はＥＲ＋ホルモン不応性乳癌であり得、又はこの乳癌はＨＥＲ２陽性乳癌であり得、若しくはこの乳癌は、その中でＨＥＲ２発現がアップレギュレートされている癌細胞を含む。様々な実施形態では、上述のような免疫抱合体は、ホルモン耐性乳癌細胞などの乳癌細胞中で発現されるような受容体ＨＥＲ２に結合する。例えば、免疫抱合体のモノクローナル抗体は、ＨＥＲ２受容体に特異的であるとして既知のトラスツズマブであり得る。
【００８６】
様々な実施形態では、第１の前アポトーシス抗癌剤部分は、マイタンシノイド又はオーリスタチンなどの微小管脱重合化剤であり得る。例えば、共有結合抱合体は、リンカーを介してマイタンシノイド前アポトーシス抗癌剤部分に共有結合したトラスツズマブから本質的になり得る。
【００８７】
モノクローナル抗体標的化部位と抱合され得るマイタンシノイド薬部分の例示的実施形態は、ＤＭ１、ＤＭ３、及びＤＭ４を含み、これらは以下の構造を有する。
【００８８】
【化３】
2014513692.tif 000006
式中、波線は、抗体−薬剤抱合体のリンカー（Ｌ）への薬剤のイオウ原子の共有結合的結合を示す。ＳＭＣＣによってＤＭＩに結合するハーセプチン（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）（登録商標）（トラスツズマブ）が報告されている（国際公開第２００５／０３７９９２号パンフレット、米国特許出願公開第２００５／０２７６８１２  Ａ１号明細書）。
【００８９】
様々な実施形態では、共有結合免疫抱合体は、Ｔ−ＤＭ１（上記に示した構造）であり、即ち、上記に示すようなＤＭ１は、トラスツズマブに共有結合する。他の実施形態では、共有結合免疫抱合体は、トラスツズマブに結合するＤＭ３又はＤＭ４などの別のマイタンシノイドであり得る。例えば、本発明の方法の実行で使用されるマイタンシノイド抗体−薬剤抱合体は、以下の構造及び略号を有することができる（式中Ａｂは抗体であり、ｐは１〜約８である）。
【００９０】
【化４】
2014513692.tif 000007
ＢＭＰＥＯリンカーを介して、ＤＭ１が抗体のチオール基に結合する例示的抗体−薬剤抱合体は、以下の構造及び略号を有し
【００９１】
【化５】
2014513692.tif 000008
式中、Ａｂは抗体であり、ｎは０、１、又は２であり、ｐは１、２、３、又は４である。
【００９２】
マイタンシノイドを含有する免疫抱合体、この製造法、並びにこれらの治療的用途が、例えば、これらの開示が参照により明白に本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２０８，０２０号明細書、同第５，４１６，０６４号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２７６８１２  Ａ１号明細書、及び欧州特許第０４２５２３５  Ｂ１号明細書に開示されている。リュー（Ｌｉｕ）ら著、「プロシィーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ  米国（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ）」、第９３巻、ｐ．８６１８〜８６２３、１９９６年、は、ＤＭ１と名づけられたマイタンシノイドを含有する免疫抱合体が、ヒト結腸直腸癌に対して向けられるモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合したことを記載している。この抱合体は、培養された結腸癌細胞に対して高い細胞毒性であることが認められ、インビボ腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性を示した。チャリ（Ｃｈａｒｉ）ら著、「キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、第５２巻、ｐ．１２７〜１３１、１９９２年、は、その中でマイタンシノイドが、ジスルフィドリンカーを介して、ヒト結腸癌細胞系上の抗原に結合するネズミ抗体Ａ７に抱合され、又はＨＥＲ２／ｎｅｕオンコジンに結合する別のネズミモノクローナル抗体ＴＡ．１に抱合されたことを記載している。ＴＡ．１−マイタンシノイド抱合体の細胞毒性は、細胞当たり３×１０５個のＨＥＲ２表面抗原を発現するヒト乳癌細胞系ＳＫ−ＢＲ−３でインビトロにおいて試験された。この薬剤抱合体は、遊離マイタンシノイド薬と同様な細胞毒性の程度を達成し、これは、抗体分子当たりのマイタンシノイド分子の数の増加に伴って増大されることができた。Ａ７−マイタンシノイド抱合体は、マウスにおいては低い全身的細胞毒性を示した。
【００９３】
抗体−マイタンシノイド抱合体は、抗体又はマイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性も著しく減少させることなく、抗体をマイタンシノイド分子に化学的に結合することによって調製される。例えば、米国特許第５，２０８，０２０号明細書（この開示は参照により本明細書に明白に組み込まれる）を参照されたい。トキシン／抗体の１つの分子であっても、裸抗体の使用にわたって細胞毒性を強化することが予想されるが、抗体当たり平均で３〜４個のマイタンシノイド分子が抱合されたものは、抗体の機能又は溶解度に悪影響を及ぼすことなく、標的細胞の細胞毒性を増強することでの有効性を示した。マイタンシノイドは当該技術分野で周知であり、既知の技術によって合成され得るか、又は天然供給源から単離され得る。好適なマイタンシノイドは、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号明細書及び他の特許文献並びに上記で参照された非特許文献刊行物で開示されている。好ましいマイタンシノイドは、マイタンシノール並びに様々なマイタンシノールエステルなどのマイタンシノール分子の芳香族環又は他の位置で修飾されたマイタンシノール類似体である。
【００９４】
抗体−マイタンシノイド抱合体を生成するための当該技術分野で既知の多くの結合基があり、これらは、例えば、これらの開示が、参照により明白に本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２０８，０２０号明細書又は欧州特許第０４２５２３５  Ｂ１号明細書；チャリ（Ｃｈａｒｉ）ら著、「キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、第５２巻、ｐ．１２７〜１３１、１９９２年；及び米国特許出願公開第２００５／０１６９９３  Ａ１号明細書に開示されたものが挙げられる。リンカー成分ＳＭＣＣを含む抗体−マイタンシノイド抱合体は、米国特許出願公開第２００５／０２７６８１２  Ａ１号明細書、「抗体−薬剤抱合体及び方法（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」で開示されたように調製され得る。上記で特定された特許文献で開示されたように、このリンカーは、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチド不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基を含む。追加的リンカーは、本明細書で記載され例示される。
【００９５】
様々な実施形態では、共有結合抱合体は、体内に侵入後に、酵素作用、酸加水分解、塩基加水分解等で結合が破壊され、次いで２つの別個の化合物が形成されるように選択されるリンカー部分を含む。他の実施形態では、リンカー部分は、トラスツズマブ等のモノクローナル抗体などの標的化部分になお係留すると同時に前アポトーシス抗癌剤部分が細胞毒性効果を及ぼすことができる、生物学的条件下での安定性に関して選択される。
【００９６】
当該技術分野内の以前の構造−活性相関（ＳＡＲ）研究からのデータが、どの化合物を使用するか、並びに化合物の有効性及び選択性を高く維持するように、テザーに結合するための分子上の最適な位置又は位置（複数）を決定するための指針として使用され得る。このテザー又はリンカー部分は、生活性分子を一緒に結合するための有用性が立証されたものの中から選択される。本明細書に開示されるものは、異なる組み合わせで一緒に結合されて、ヘテロ二価性治療用分子を形成することができる代表的化合物である。
【００９７】
抗体及びマイタンシノイドの抱合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデート  ＨＣｌなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベラートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス−（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの多様な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して生成され得る。特定の実施形態では、ジスルフィド結合をもたらすための、カップリング剤は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（カールソン（Ｃａｒｌｓｓｏｎ）ら著、「バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．）」、第１７３巻、ｐ．７２３〜７３７、１９７８年）、又はＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）である。
【００９８】
リンカーは、結合のタイプに応じて、様々な位置でマイタンシノイド分子に結合されてもよい。例えば、エステル結合は、従来のカップリング技術を使用するヒドロキシル基との反応によって形成され得る。この反応は、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位で起こる可能性がある。一実施形態では、この結合は、マイタンシノール又はマイタンシノール類似体のＣ−３位で形成される。
【００９９】
本発明の治療の方法及び用途の様々な実施形態において使用され得るような免疫抱合体は、上述のようなマイタンシノイドなどの微小管脱重合化剤に抱合された標的化モノクローナル抗体を含むことができ、又は第１の前アポトーシス抗癌剤部分として、ドラスタチン又はドラスタチンペプチド性類似体若しくは誘導体（例えばオーリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号明細書、同第５，７８０，５８８号明細書を参照））を含み得る。ドラスタチン及びオーリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、並びに核及び細胞分裂を妨害することが示され（ウォイケ（Ｗｏｙｋｅ）ら著、「アンティマイクロビアル・エージェンツ・アンッド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．）」、第４５巻（１２）、ｐ．３５８０〜３５８４）、並びに抗癌活性（米国特許第５，６６３，１４９号明細書）及び抗真菌活性（ペティット（Ｐｅｔｔｉｔ）ら著、「アンティマイクロビアル・エージェンツ・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．）」、第４２巻、ｐ．２９６１〜２９６５）を有することが示された。ドラスタチン又はオーリスタチン薬剤部分は、ペプチド性薬剤部分Ｎ（アミノ）末端又はＣ（カルボキシル）末端を通して抗体に結合されてもよい（国際公開第０２／０８８１７３号パンフレット）。
【０１００】
例示的オーリスタチン実施形態は、Ｎ末端結合モノメチルオーリスタチン薬部分ＤＥ及びＤＦを含み、これは、その開示が、その全体で参照により本明細書に明白に組み込まれる、センター（Ｓｅｎｔｅｒ）ら著、「プロシィーディングス・オブ・ザ・アメリカン・アソシエーション・フォア・キャンサー・リサーチ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、第４５巻、アブストラクト番号６２３、２００４年３月２８日提出に開示されている。例は以下に示す。
【０１０１】
オーリスタチン−類似性前アポトーシス抗癌剤部分は、以下の式ＤＥ及びＤＦから選択され得る。
【０１０２】
【化６】
2014513692.tif 000009
式中、ＤＥ及びＤＦの波線は、抗体又は抗体−リンカー成分への共有結合的結合部位を示し：
Ｒ２は、Ｈ及びＣ１−Ｃ８アルキルから選択され；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環、アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８炭素環）、Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環及びＣ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環）から選択され；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環、アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８炭素環）、Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環及びＣ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環）から選択され；
Ｒ５は、Ｈ及びメチルから選択され；
又は、Ｒ４及びＲ５は、共同で炭素環式環を形成し、式−（ＣＲａＲｂ）ｎ−を有し（式中、Ｒａ及びＲｂは独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル及びＣ３−Ｃ８炭素環から選択され、ｎは２、３、４、５及び６から選択される）；
Ｒ６は、Ｈ及びＣ１−Ｃ８アルキルから選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環、アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８炭素環）、Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環及びＣ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環）から選択され；
各Ｒ８は、独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環及びＯ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）から選択され；
Ｒ９は、Ｈ及びＣ１−Ｃ８アルキルから選択され；
Ｒ１０は、アリール又はＣ３−Ｃ８ヘテロ環から選択され；
Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、又はＮＲ１２であり、式中Ｒ１２はＣ１−Ｃ８アルキルであり；
Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、アリール、Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環、−（Ｒ１３Ｏ）ｍ−Ｒ１４、又は−（Ｒ１３Ｏ）ｍ−ＣＨ（Ｒ１５）２から選択され；
ｍは１〜１０００の範囲の整数であり；
Ｒ１３は、Ｃ２−Ｃ８アルキルであり；
Ｒ１４は、Ｈ又はＣ１−Ｃ８アルキルであり；
Ｒ１５の各存在は、独立してＨ、ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｒ１６）２、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３Ｈ、又は−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３−Ｃ１−Ｃ８アルキルであり；
Ｒ１６の各存在は、独立してＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、又は−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨであり；
Ｒ１８は、−Ｃ（Ｒ８）２−Ｃ（Ｒ８）２−アリール、−Ｃ（Ｒ８）２−Ｃ（Ｒ８）２−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環）、及び−Ｃ（Ｒ８）２−Ｃ（Ｒ８）２−（Ｃ３−Ｃ８炭素環）から選択され、並びに
ｎは、０〜６の範囲の整数である。
【０１０３】
一実施形態では、Ｒ３、Ｒ４及びＲ７は、独立してイソプロピル又はｓｅｃ−ブチルであり、Ｒ５は、−Ｈ又はメチルである。例示的実施形態では、Ｒ３及びＲ４は、それぞれイソプロピルであり、Ｒ５は−Ｈであり、並びにＲ７はｓｅｃ−ブチルである。
【０１０４】
更に別の実施形態では、Ｒ２及びＲ６は、それぞれメチルであり、Ｒ９は−Ｈである。
なお別の実施形態では、Ｒ８の各存在は−ＯＣＨ３である。
例示的実施形態では、Ｒ３及びＲ４は、それぞれイソプロピルであり、Ｒ２及びＲ６は、それぞれメチルであり、Ｒ５は−Ｈであり、Ｒ７はｓｅｃ−ブチルであり、Ｒ８のそれぞれの存在は−ＯＣＨ３であり、並びにＲ９は−Ｈである。
【０１０５】
一実施形態では、Ｚは−Ｏ−又は−ＮＨ−である。
一実施形態では、Ｒ１０はアリールである。
例示的実施形態では、Ｒ１０は−フェニルである。
【０１０６】
例示的実施形態では、Ｚが−Ｏ−である場合、Ｒ１１は−Ｈ、メチル又はｔ−ブチルである。
一実施形態では、Ｚが−ＮＨである場合、Ｒ１１は−ＣＨ（Ｒ１５）２であり、式中Ｒ１５は、−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｒ１６）２であり、Ｒ１６は、−Ｃ１−Ｃ８アルキル又は−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨである。
【０１０７】
別の実施形態では、Ｚが−ＮＨである場合、Ｒ１１は−ＣＨ（Ｒ１５）２であり、式中Ｒ１５は、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３Ｈである。
式ＤＥの例示的オーリスタチン実施形態はＭＭＡＥであり、式中、波線は、抗体−薬剤抱合体のリンカー（Ｌ）への共有結合的結合を示す。
【０１０８】
【化７】
2014513692.tif 000010
式ＤＦの例示的オーリスタチン実施形態はＭＭＡＦであり、式中、波線は、抗体−薬剤抱合体のリンカー（Ｌ）への共有結合的結合を示す（米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号明細書及びドロニナ（Ｄｏｒｏｎｉｎａ）ら著、２００６年、「バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）」、第１７巻、ｐ．１１４〜１２４を参照されたい）。
【０１０９】
【化８】
2014513692.tif 000011
他の薬剤部分としては、以下のＭＭＡＦ誘導体が挙げられ、式中、波線は、抗体−薬剤抱合体のリンカー（Ｌ）への共有結合的結合を示す。
【０１１０】
【化９】
2014513692.tif 000012
2014513692.tif 000013
一態様では、親水性基としては、限定されるものではないが、上記に示されたようなトリエチレングリコールエステル（ＴＥＧ）が挙げられ、これはＲ１１で薬剤部分に結合され得る。いずれかの特定の理論によって束縛されるものではないが、親水性基は、薬剤部分の内在化及び非塊状化において補助する。
【０１１１】
オーリスタチン／ドラスタチン又はこれらの誘導体を含む式ＩのＡＤＣｓの例示的実施形態は、参照により本明細書に明白に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５−０２３８６４９  Ａ１号明細書及びドロニナ（Ｄｏｒｏｎｉｎａ）ら著、２００６年、「バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）」、第１７巻、ｐ．１１４〜１２４で記載されている。ＭＭＡＥ又はＭＭＡＦ及び様々なリンカー成分を含む式ＩのＡＤＣｓの例示的実施形態は、以下の構造及び略号を有する（式中、「Ａｂ」は抗体、例えばトラスツズマブであり、ｐは１〜約８であり、「Ｖａｌ−Ｃｉｔ」はバリン−シトルリンジペプチドであり、「Ｓ」はイオウ原子である）。
【０１１２】
【化１０】
2014513692.tif 000014
ＭＭＡＦ及び様々なリンカー成分を含む式ＩのＡＤＣｓの例示的実施形態は、Ａｂ−ＭＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ及びＡｂ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦを更に含む。興味深いことに、タンパク質分解的に切断可能ではないリンカーによって抗体上に結合されたＭＭＡＦを含む免疫抱合体は、タンパク質分解的に切断可能なリンカーによって抗体に結合されたＭＭＡＦを含む免疫抱合体に匹敵する活性を有することが示された。ドロニナ（Ｄｏｒｏｎｉｎａ）ら著、２００６年、「バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）」、第１７巻、ｐ．１１４〜１２４を参照されたい。かかる場合には、薬剤放出は、細胞中の抗体分解（Ｉｄ（イディオタイプ））によって影響を受けると考えられる。
【０１１３】
典型的には、ペプチド系薬剤は、２つ又はそれ以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片の間のペプチド結合を形成することによって調製され得る。かかるペプチド結合は、例えば、液相合成法（ペプチド化学分野で周知である、Ｅ．シュローダー（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ）及びＫ．リュブケ（Ｌｕｅｂｋｅ）著、「ザ・ペプタイズ（Ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、第１巻、ｐ．７６〜１３６、１９６５年、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照）に従って調製され得る。オーリスタチン／ドラスタチン薬剤部分は、米国特許出願公開第２００５−０２３８６４９  Ａ１号明細書；米国特許第５，６３５，４８３号明細書；同第５，７８０，５８８号明細書、ペティット（Ｐｅｔｔｉｔ）ら著、１９８９年、「ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサヤティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）」、第１１１巻、ｐ．５４６３〜５４６５；ペティット（Ｐｅｔｔｉｔ）ら著、１９９８年、「アンティ−キャンサー・ドラッグ・デザイン（Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ）」、第１３巻、ｐ．２４３〜２７７；ペティット（Ｐｅｔｔｉｔ）、Ｇ．Ｒ．ら著、「シンセシス（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、１９９６年、ｐ．７１９〜７２５；ペティット（Ｐｅｔｔｉｔ）ら著、１９９６年、「ジャーナル・オブ・ザ・ケミカル・ソサヤティ・パーキン・トランスアクションズ  １（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１）」、第５巻、ｐ．８５９〜８６３；及びドロニナ（Ｄｏｒｏｎｉｎａ）著、２００３年、「ネーチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」、第２１巻（７）、ｐ．７７８〜７８４の方法に従って、調製されてもよい。
【０１１４】
特に、ＭＭＡＦ及びその誘導体などの式ＤＦのオーリスタチン／ドラスタチン薬剤部分は、米国特許出願公開第２００５−０２３８６４９  Ａ１号明細書及びドロニナ（Ｄｏｒｏｎｉｎａ）ら著、２００６年、「バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）」、第１７巻、ｐ．１１４〜１２４で記載される方法を使用して調製され得る。ＭＭＡＥ及びその誘導体などの式ＤＥのオーリスタチン／ドラスタチン薬剤部分は、ドロニナ（Ｄｏｒｏｎｉｎａ）ら著、２００３年、「ネーチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」、第２１巻（７）、ｐ．７７８〜７８４で記載される方法を使用して調製され得る。薬剤−リンカー部分ＭＣ−ＭＭＡＦ、ＭＣ−ＭＭＡＥ、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ、及びＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥは、例えば、ドロニナ（Ｄｏｒｏｎｉｎａ）ら著、２００３年、「ネーチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．）」、第２１巻（７）、ｐ．７７８〜７８４、及び米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９  Ａ１号明細書で記載されるような慣用的方法によって都合よく合成され得、次いで関心対象の抗体に抱合される。
【０１１５】
科学文献に報告されたリンカーの例としては、メチレン（ＣＨ２）ｎリンカー（ハッセー（Ｈｕｓｓｅｙ）ら著、ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサヤティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、２００３年、第１２５巻、ｐ．３６９２〜３６９３；タミズ（Ｔａｍｉｚ）ら著、「ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．）」、２００１年、第４４巻、ｐ．１６１５〜１６２２）、ナルトレキサミンを他のオピオイド、式−ＮＨ−（ＣＯＣＨ２ＮＨ）ｎＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ――（ＮＨＣＨ２ＣＯ）ｎＮＨ―のグリシンオリゴマー（オピオイド拮抗薬及び作動薬を一緒に結合するために使用される）を結合するよう使用されるオリゴエチレンオキシＯ（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）ｎ単位（（ａ）ポルトゲス（Ｐｏｒｔｏｇｈｅｓｅ）ら著、「ライフ・サイエンス（Ｌｉｆｅ．Ｓｃｉ．）」、１９８２年、第３１巻、ｐ．１２８３〜１２８６、（ｂ）ポルトゲス（Ｐｏｒｔｏｇｈｅｓｅ）ら著、「ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．）」、１９８６年、第２９巻、ｐ．１８５５〜１８６１）、オピオイドペプチドを一緒に結合するよう使用される親水性ジアミン（ステピンスキー（Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ）ら著、「インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプタイド  ＆  プロテイン  リサーチ（Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｊ．ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＆  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．）」、１９９１年、第３８巻、ｐ．５８８〜９２）、強固な二重鎖ＤＮＡスペーサ（パール（Ｐａａｒ）ら著、「ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）」、２００２年、第１６９巻、ｐ．８５６〜８６４）並びに生体分解性リンカーポリ（Ｌ−乳酸）（クロック（Ｋｌｏｋ）ら著、「マクロモリキュールズ（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」、２００２年、第３５巻、ｐ．７４６〜７５９）が挙げられる。テザーの化合物への結合は、好ましい結合配向を達成する化合物をもたらすことができる。リンカーそれ自体は、生体分解性であってもそうでなくともよい。リンカーはプロドラッグの形態を取ってもよく、結合した薬剤の最適な放出運動学に同調可能であってもよい。リンカーは、その長さ全体を通して立体構造的に柔軟であってもよく、それともテザーのセグメントが立体構造的に制限されるよう設計されてもよいかのいずれかである（ポルトゲス（Ｐｏｒｔｏｇｈｅｓｅ）ら著、「ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．）」、１９８６年、第２９巻、ｐ．１６５０〜１６５３）。
【０１１６】
例示的リンカー
リンカーは、１つ以上のリンカー成分を含んでもよい。例示的リンカー成分としては、６−マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、バリン−シトルリン（「ｖａｌ−ｃｉｔ」又は「ｖｃ」）、アラニン−フェニルアラニン（「ａｌａ−ｐｈｅ」）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（「ＳＰＰ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、及びＮ−スクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエート（「ＳＩＡＢ」）が挙げられる。様々なリンカー成分は、当該技術分野で既知であり、その一部が以下に記載される。
【０１１７】
リンカーは、細胞中で薬剤の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン）、プロテアーゼ感受性（例えば、ペプチダーゼ感受性）リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（チャリ（Ｃｈａｒｉ）ら著、「キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、第５２巻、ｐ．１２７〜１３１、１９９２年；米国特許第５，２０８，０２０号明細書）が使用されてもよい。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、リンカー成分は、抗体を別のリンカー成分又は薬剤部分に結合させる「ストレッチャ単位」を含んでもよい。例示的ストレッチャ単位が、以下に示される（式中、波線は、抗体への共有結合的結合の部位を示す）。
【０１１９】
【化１１】
2014513692.tif 000015
いくつかの実施形態では、リンカー成分は、アミノ酸単位を含んでもよい。かかる実施形態の１つでは、アミノ酸単位は、プロテアーゼによるリンカーの切断を可能にし、これによって、リソソーム酵素などの細胞内プロテアーゼへの曝露時の免疫抱合体からの薬剤の放出を容易にする。例えば、ドロニナ（Ｄｏｒｏｎｉｎａ）著、２００３年、「ネーチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」、第２１巻、ｐ．７７８〜７８４を参照されたい。例示的アミノ酸単位としては、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、及びペンタペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。例示的ジペプチドとしては、バリン−シトルリン（ｖｃ又はｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｆ又はａｌａ−ｐｈｅ）、フェニルアラニン−リジン（ｆｋ又はｐｈｅ−ｌｙｓ）、又はＮ−メチル−バリン−シトルリン（Ｍｅ−ｖａｌ−ｃｉｔ）が挙げられる。例示的トリペプチドとしては、グリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ）及びグリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）が挙げられる。アミノ酸単位は、天然起源であるアミノ酸残基、並びにシトルリンなどのマイナーなアミノ酸で非天然起源のアミノ酸類似体であるアミノ酸残基を含んでもよい。アミノ酸単位は、特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ、又はプラズミンプロテアーゼによる酵素的切断に関するそれらの選択性において設計かつ最適化され得る。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、リンカー成分は、直接的に又はストレッチャ単位及び／又はアミノ酸単位を経由して抗体を薬剤に結合させる「スペーサ」単位を含んでもよい。スペーサ単位は、「自壊性」又は「非自壊性」であってもよい。「非自壊性」スペーサ単位は、スペーサ単位の一部又は全てが、ＡＤＣの酵素的（例えばタンパク質分解的）切断時に、薬剤部分に結合されたままであるものである。非自壊性スペーサ単位の例としては、グリシンスペーサ単位及びグリシン−グリシンスペーサ単位が挙げられるが、これらに限定されない。配列特異的酵素的切断に感受性が強いペプチドスペーサの他の組み合わせもまた考えられる。例えば、腫瘍細胞関連プロテアーゼによるグリシン−グリシンスペーサ単位を封じ込めるＡＤＣの酵素的切断は、ＡＤＣの残部からのグリシン−グリシン−薬剤部分の放出をもたらすと考えられる。１つのかかる実施形態では、グリシン−グリシン−薬剤部分は、次いで腫瘍細胞中の別個の加水分解ステップを受け、従ってグリシン−グリシンスペーサ単位を薬剤部分から切断させる。
【０１２１】
「自壊性」スペーサ単位は、スペーサ加水分解ステップなしに、薬剤部分の放出を可能にする。特定の実施形態では、リンカーのスペーサ単位は、ｐ−アミノベンジル単位を含む。１つのかかる実施形態では、ｐ−アミノベンジルアルコールが、アミド結合を介してアミノ酸単位に結合され、カルバメート、メチルカルバメート、又はカルボネートが、ベンジルアルコールと細胞障害剤との間に生成される。例えば、ハマン（Ｈａｍａｎｎ）ら著、２００５年、「エキスパート・オピニオン・オン・セラピュウティック・パテンツ（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ）」、２００５年、第１５巻、ｐ．１０８７〜１１０３を参照されたい。一実施形態では、スペーサ単位は、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）である。特定の実施形態では、ｐ−アミノベンジル単位のフェニレン部分は、Ｑｍ（式中、Ｑは−Ｃ１−Ｃ８−アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８−アルキル）、−ハロゲン、−ニトロ又は−シアノであり、ｍは０〜４の範囲の整数である）で置換される。自壊性スペーサ単位の例としては、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体（ハイ（Ｈａｙ）ら著、１９９９年、「バイオオーガニック＆メディシナル・ケミストリー・レタース（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．）」、第９巻、ｐ．２２３７）及びオルト−又はパラ−アミノベンジルアセタールなどの、ｐ−アミノベンジルアルコールと電子的に類似する芳香族化合物（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２５６０３０  Ａ１号明細書を参照）を更に含むが、これらに限定されない。スペーサは、置換及び非置換の４−アミノ酪酸アミド（ロドリゲス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ）ら著、「ケミストリー・バイオロジー（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９５年、第２巻、ｐ．２２３）、適当な置換ビシクロ［２．２．１］及びビシクロ［２．２．２］環系（ストーム（Ｓｔｏｒｍ）ら著、「ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサヤティ（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）」、１９７２年、第９４巻、ｐ．５８１５）、及び２−アミノフェニルプロピオン酸アミド（アムスベリー（Ａｍｓｂｅｒｒｙ）ら著、「ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）」、１９９０年、第５５巻、ｐ．５８６７）などのアミド結合加水分解時に、環化を実行するよう使用され得る。グリシンのａ−位で置換されているアミン含有薬剤の除去（キングズバリ（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ）ら著、「ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．）」、１９８４年、第２７巻、ｐ．１４４７）もまた、ＡＤＣｓで有用な自壊性スペーサの例である。
【０１２２】
一実施形態では、スペーサ単位は、以下に示されるような分岐状のビス（ヒドロキシメチル）スチレン（ＢＨＭＳ）単位であり、これは複数の薬剤を組み込みかつ放出するために使用され得る。
【０１２３】
【化１２】
2014513692.tif 000016
式中Ｑは、−Ｃ１−Ｃ８−アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８−アルキル）、−ハロゲン、−ニトロ又は−シアノであり、ｍは０〜４の範囲の整数であり、ｎは０又は１であり、ｐは、１〜約２０の範囲にわたる。
【０１２４】
リンカーは、上記リンカー成分のいずれか１つ以上を含んでもよい。特定の実施形態では、リンカーは、以下のＡＤＣ式ＩＩ中のカッコ内で示されるものである。
Ａｂ（［Ａａ−Ｗｗ−Ｙｙ］−Ｄ）ｐ      ＩＩ
式中、Ａはストレッチャ単位であり、ａは０〜１の整数であり、Ｗは、アミノ酸単位であり、ｗは１〜１２の整数であり、Ｙはスペーサ単位であり、ｙは０，１または２であり、かつＡｂ、Ｄおよびｐは上記式Ｉについて定義された通りである。かかるリンカーの例示的実施形態は、参照により本明細書に明白に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５−０２３８６４９  Ａ１号明細書で記載されている。
【０１２５】
例示的リンカー成分及びこれらの組み合わせは、式ＩＩのＡＤＣｓとともに以下に示される。
【０１２６】
【化１３】
2014513692.tif 000017
ストレッチャ、スペーサ、及びアミノ酸単位を含有するリンカー成分は、米国特許出願公開第２００５−０２３８６４９  Ａ１号明細書で記載されるものなど、当該技術分野で既知の方法によって合成され得る。
【０１２７】
本発明の治療の方法は、様々な実施形態において、上述のような水平性調節をもたらす治療的方法を提供し、ここでは、第２の前アポトーシス薬が、第１のアポトーシス抗癌剤部分によって及ぼされた細胞障害性の分子機構とは異なる分子機構によって、アポトーシスを含める細胞障害性を及ぼす。水平性調節は、第１の前アポトーシス抗癌剤部分と第２の前アポトーシス抗癌剤が、それぞれが別個にアポトーシスに導く異なる生化学的カスケード又はプロセスに作用する場合に達成される。例えば、以下の表２に示すように、マイタンシノイド又はオーリスタチンなどの第１の前アポトーシス抗癌剤部分は、微小管脱重合化などの内因性アポトーシス機構を介して動作することができ、第２の前アポトーシス抗癌剤は、当該技術分野で周知のように、Ｆａｓ経路又はｃ−ＦＬＩＰ経路などの外因性経路を介してアポトーシスを誘導する薬剤であり得る。或いは、第１の前アポトーシス抗癌剤部分が、外因性経路を介してその効果を及ぼす場合、第２の前アポトーシス抗癌剤は、カスパーゼ非依存的経路などの内因性経路を介して、又はカスパーゼ依存的経路を介してアポトーシスを誘導する薬剤であり得る。
【０１２８】
結果的に、様々な実施形態では、第２の前アポトーシス薬は、外因性経路を介してアポトーシスを誘導する薬剤であり；例えば、第２の前アポトーシス薬は、Ｆａｓ経路を介してアポトーシスを誘導するか、又は第２の前アポトーシス薬は、ｃ−ＦＬＩＰ経路を介してアポトーシスを誘導する。より具体的には、第２の前アポトーシス薬は、ＣＭＨ、Ｅ２、又はδ−トコトリエノールであり得る。
【０１２９】
他の実施形態では、第２の前アポトーシス薬は、内因性経路を介してアポトーシスを誘導する薬剤であり；例えば、第２の前アポトーシス薬は、カスパーゼ非依存的経路を介してアポトーシスを誘導し得るか、或いは、第２の前アポトーシス薬は、カスパーゼ依存的経路を介してアポトーシスを誘導し得る。より具体的には、第２の前アポトーシス薬は、Ｅ２、ＦＴＳ、δ−トコトリエノール、サリノマイシン、又はクルクミンであり得る。
【０１３０】
従って、様々な実施形態では、第２の前アポトーシス抗癌剤は、ＦＴＳ、ＣＭＨ、Ｅ２、ＴＭＳ、δ−トコトリエノール、サリノマイシン、又はクルクミンである。様々な実施形態では、免疫抱合体はＴ−ＤＭ１であり、第２の前アポトーシス薬はＦＴＳ、ＣＭＨ、Ｅ２、ＴＭＳ、δ−トコトリエノール、又はクルクミンである。免疫抱合体がＴ−ＤＭ１である場合、第２の前アポトーシス薬は、Ｅ２、ＦＴＳ、δ−トコトリエノール、又はＴＭＳであり得、若しくは、より具体的には、免疫抱合体がＴ−ＤＭ１であり、第２の前アポトーシス薬はＦＴＳである。
【０１３１】
本発明は、免疫抱合体及び第２のアポトーシス薬を投与することが、相乗的効果を有する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この相乗性は、水平性調節の使用によって達成される。
【０１３２】
しかしながら、２つの前アポトーシス抗癌剤が垂直性調節で作用する場合でも、相乗的又は相加的効果は達成され得る。更には、水平性調節が達成されるために、２つの抗癌剤が経路内の同一のプロセスで両者共に動作しない限り、２つの抗癌剤が外因性又は内因性経路を介して両者共に動作することがなお可能であり得、ここでは薬剤耐性をもたらすための適応性変異は、耐性をもたらすための２つの同時変異を介してなお発生する必要があると考えられる。
【０１３３】
様々な実施形態では、本発明は、癌の治療の方法を提供し、この方法は、トラスツズマブ−ＤＭ１（Ｔ−ＤＭ１）の癌患者への投与を含み、このＴ−ＤＭ１は、リンカー部分を介して第１の前アポトーシス抗癌剤部分であるマイタンシノイドａｎｓａマクロライドに結合された標的化モノクローナル抗体であるトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））の上述の共有結合抱合体の実施形態である。この抱合体Ｔ−ＤＭ１は、本明細書で本発明者によって、併用療法レジメンにおいて、第２の前アポトーシス抗癌剤としてファルネシル−チオサリシレート（ＦＴＳ）を使用することが、驚くべきことに高い相乗効果をもたらすことが見出されることが開示されている。更に別の態様では、Ｅ２及びＴ−ＤＭ１の併用療法も、驚くべきことに、高い相乗効果をもたらす。更に別の態様では、ＣＭＨ及びＴ−ＤＭ１の併用療法も、驚くべきことに、高い相乗効果をもたらす。
【０１３４】
Ｔ−ＤＭ１の上記例では、マイタンシンの類似体に近いものである第１の前アポトーシス抗癌剤部分は、リンカー部分を介して、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｍｕｚａｂ）（ハーセプシン）に結合する。このリンカーは、ジスルフィド結合を組み込まず、従って、本明細書の用語の意味に従って、非還元性リンカー部分であると考えられ、即ち、容易に還元可能なジスルフィド結合は存在しない。結果的に、様々な実施形態では、本発明は、非還元性リンカーを介して第１の前アポトーシス抗癌剤部分と共有結合されたモノクローナル抗体部分から本質的になる共有結合抱合体を提供し、ここで非還元性とは、ジスルフィド結合又はその中で生物学的条件下での還元が発生する可能性が高いと考えられる他の基が存在しないことを指す。
【０１３５】
以下の表１では、相加的及び相乗的効果を示す様々な併用の結果を示す。
【０１３６】
【表１】
2014513692.tif 000018
ＦＴＳ及びＣＭＨとのＴ−ＤＭ１の併用において、強い相乗性が観察される。相乗性の程度を決定するよう使用された方法、及び様々な試験の結果が以下に記載され、図のグラフ形式で表示される。
【０１３７】
他の実施形態では、第１の前アポトーシス薬部分は、還元性リンカーを介して第１の前アポトーシス薬部分に共有結合され得る。「還元性」結合とは、かかるリンカーが、生物学的条件下で発生することが可能な還元性プロセス、即ち、ジスルフィド結合の還元によって切断される可能性が高いことが考えられ又は予想されることを意味する。かかる抱合体では、ホルモン耐性乳癌の場合、標的化部位、例えば、モノクローナル抗体は、第１の前アポトーシス薬部分を、所望の標的、例えば、ＨＥＲ２又は関連する受容体に搬送し、これによって、標的化部分からの薬剤の切断が起こり、薬剤がより容易に組織を通して拡散でき、細胞膜等を通過することができるように、薬剤を遊離する。
【０１３８】
様々な実施形態では、本発明の癌の治療の方法は、この癌が乳癌である場合、使用され得る。乳癌とは、乳房組織を冒し得る多数のタイプの癌のいずれかを意味する。他の実施形態では、他のタイプの癌も同時に処置され、即ち、このことは過発現受容体などのそのタイプの癌のエピトープ特性に特異的な標的化部位の使用によってなされ、ここでは、選択されるモノクローナル抗体又は他の標的化部分は、第１の前アポトーシス薬に共有結合され、生じた抱合体が第２の前アポトーシス薬と併せて投与される。これら実施形態ではなお、水平性調節アプローチが、標的化癌細胞による耐性の発現の低い可能性をもたらすと考えられる。
【０１３９】
癌細胞における前アポトーシス機構
本発明の治療的方法で使用され得る特異的前アポトーシス薬が、以下に非常に詳細に記載される。
【０１４０】
ＦＴＳ
本発明者は、本明細書において、アポトーシスの内因性経路の重要な成分であるＭＯＭＰ（ミトコンドリア外膜孔）形成に影響を及ぼすタンパク質の部類をまず初めに検討した。Ｂａｘ、Ｂｉｍ、及びＢａｋなどの前アポトーシス膜は、ミトコンドリアからのシトクロームｃの放出を促進するが、一方、Ｂｃｌ−２及びＭｃｌ−１などの抗アポトーシス膜は、放出を抑制する。従って、前アポトーシス及び坑アポトーシスＢｃｌ−２タンパク質のバランスが、細胞の運命に影響を及ぼす。ＬＴＥＤ細胞を、サイトゾル分画の試験を使用して、７５μＭのＦＴＳで、０、４、８、１６、２４及び４８時間処置した（図１Ａ）。アポトーシスシグナル伝達が、２４時間までにＭｃｌ−１での減少及びＢｉｍでの増加をもたらしたが、Ｂｃｌ−２は変化しなかった。ホスホＪＮＫは４８時間にわたって増加し、ｐ２１は、４時間から始まり４８時間の時点まで続く安定した減少を示した（図４Ａ）。サバイビンは、８時間から始まり１６時間まで減少し、２４時間及び４８時間では検出不能なレベルに到達したが、ＸＩＡＰは、変化しなかった（図１Ａ）。
【０１４１】
ＢａｘがＦＴＳ処置ＬＴＥＤ細胞において活性化されたかどうかを確認するために、Ｂｃｌ−２を免疫沈降させて、次いでＢｉｍ及びＢａｘについて探査した（図１Ｂを参照）。探査された細胞抽出物を、立体構造的な変化を受けたＢａｘタンパク質のみを認識する抗体の使用で探査した。図１Ｂに示すように、ＢａｘはＦＴＳ処置細胞中で立体構造的変化を実行し、これがＭＯＭＰを促進すると考えられる。Ｂｉｍの前アポトーシス効果は、主としてＢｃｌ−２の生存促進性機能を除去するＢｃｌ−２へのその結合を通してのものである［１６、１７］。図１Ｂに示すように、ＢｉｍとＢｃｌ−２との間の相互作用は増加するが、一方ＢａｘとＢｃｌ−２との間の相互作用は減少することを我々は見出した。ミトコンドリア膜孔を経てのタンパク質の脱出の証拠として、サイトゾル中のシトクロームｃ及びＳｍａｃレベルは、２４時間と４８時間で増加し、その時点でＭｃｌ−１は減少し、Ｂｉｍは増加した（図１Ａ）。別の重要な細胞死成分であるアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）は、サイトゾル中で４８時間のみに出現した。ＭＯＭＰに及ぼすこれらの効果を示した後に、アポトーシスに関与する他の重要な因子を検討した。
【０１４２】
ＦＴＳは、非乳房組織においてカスパーゼ活性を通して細胞死を実行することが報告されている［１８−２０］。ＦＴＳが、カスパーゼの活性化によって乳癌細胞の死を促進しているかどうかを解決するために、ＬＴＥＤ細胞をビヒクル、ＦＴＳ、又は増大する濃度のパン−カスパーゼ阻害剤ｖ−ＶＡＤ−ｆｍｋの存在下のＦＴＳのいずれかで処置した（図１Ｃの上部パネルを参照）。ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋがＦＴＳ−誘導アポトーシスをブロックすることが認められた。以前の報告は、他の癌において、カスパーゼ−８における増加によって証明されたように、ＦＴＳは細胞死受容体を通してアポトーシスを誘導することを示唆した［１８−２０］。乳癌細胞では、この細胞死受容体経路は、関連して出現せず、これは実質的なカスパーゼ−８の変化が起こらなかったためである（図１Ｃの下部パネルを参照）。カスパーゼ−８活性は、増加するようには見えないが、しかしながら、これはＺ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫによっては阻害されない。（図２Ａ）経時変化棒グラフ（２Ａ）及び野生型ＭＣＦ−７細胞に及ぼす組み合わされたＦＴＳ及びクルクミンの効果を表す濃度曲線に対する細胞生存率（２Ｂ）、並びに（図２Ｂ）ＭＣＦ−７細胞生存率に及ぼすＦＴＳ単独又はクルクミンとの併用の効果を示す図２を参照されたい。
【０１４３】
エストラジオール
如何なる前アポトーシス因子が、ＬＴＥＤ細胞中のエストラジオール誘導アポトーシスに重要であるかを検討した。細胞を、エストラジオールで、０、２、４、８、２４及び４８時間処置し、サイトゾル分画を調製した。ＢｉｍＥＬ及びＢｉｍＬは、初期の時点で増加した（図１Ｄ、４、８時間を対照と比較されたい）が、Ｂａｘは増加しなかった。ミトコンドリア分画（図１Ｄ、右側パネル）は、Ｂｉｍイソ型における増加を確認した。４８時間の時点までに、シトクロームｃ及びＳｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏがサイトゾルに放出され、このことは、エストラジオールアポトーシスの成分が、ミトコンドリア経路を介して仲介されることを裏付けている。Ｂｉｍがエストラジオール仲介アポトーシスに重要なものとして出現したために、我々は、Ｅ２の滴定を行い、Ｂｉｍについて探査し、これが経時的に増加することを見出した（図１Ｅを参照）。Ｂｉｍノックダウンもまた、アポトーシスをブロックした（図１Ｆ）。アポトーシスの上流調節物質を検討し、ＪＮＫのリン酸化型が増加することを見出した（図１Ｅを参照）。前アポトーシスタンパク質であるＢｏｋもまた、濃度依存的様式で増加した（図１Ｅを参照）。抗アポトーシス因子Ｍｃｌ−１は、エストロゲンの添加によって減少するが、ＸＩＡＰ又はサバイビンは減少しないことが認められた。
【０１４４】
以前に公開されたデータは、エストラジオール誘導アポトーシスにおける外因性細胞死受容体経路を間接的に示唆している。これら先行データは、エストラジオールがＬＴＥＤ細胞においてＦＡＳ−リガンドのレベルを増加させること、ＦＡＳが存在すること、及びこの経路がアポトーシスを刺激するＦＡＳに対するモノクローナル抗体によって活性化されることを立証した。ここで、Ｆａｓ−リガンドに対するｓｉＲＮＡがエストラジオール誘導アポトーシスを部分的に無効にすることを立証することによって、ＦＡＳ／ＦＡＳ−リガンド関与の直接証拠が提供される（図１Ｆ）。結果的に、エストラジオールは、外因性及び内因性経路活性化の双方によって、アポトーシスを開始する。
【０１４５】
過去及び現在の結果並びに文献の再検討に基づいて、ミトコンドリア仲介アポトーシスに及ぼす薬剤のそれぞれの作用及び外因性細胞死受容体仲介アポトーシスの作用が、以下の表２に概説されている。
【０１４６】
サリノマイシン
サリノマイシンは、アルカリイオンに対する厳密な選択性及びカリウムに対する強い選好性を有するイオノフォアとして、細胞質及びミトコンドリア膜を含む異なる生物学的膜で作用するために、ミトコンドリア及び細胞のカリウム排出を促進し、並びにミトコンドリアの酸化的リン酸化を阻害する。最近の研究は、サリノマイシンが、異なる起源のヒト癌細胞において、アポトーシスを誘導し、アポトーシス耐性を克服することが示された。まず初めに、グプタ（Ｇｕｐｔａ）らによって使用されたものよりも低い用量でのサリノマイシンが、急性Ｔ−細胞白血病を有する患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ−細胞白血病細胞において大規模なアポトーシスを誘導することが立証された。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｔｏｐｉｃｓ．ｃｏｍ／Ｎｅｗ＿ｍｉｓｓｉｏｎ＿ｆｏｒ＿ｓａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ＿ｉｎ＿ｃａｎｃｅｒ．ｈｔｍｌを参照されたい。サリノマイシンは、内因性のカスパーゼ依存的経路によって作用し、アポトーシスを誘導すると考えられる。サリノマイシンは、癌細胞において、細胞周期阻止によっては達成されない、並びに腫瘍抑制タンパク質ｐ５３、カスパーゼ活性化、ＣＤ９５／ＤＣ９５リガンド系及び２６Ｓプロテアーゼに依存的である、アポトーシスの別個の特殊な経路を活性化する。このことは、サリノマイシンがヒト癌細胞における薬剤及びアポトーシス耐性の複数の機構を克服することができる１つの理由であり得る。多くの癌細胞は、ｐ５３の損失並びに増強したタンパク質分解活性を有するＢｃｌ−２、Ｐ−糖タンパク質又は２６Ｓプロテアソームの過発現によって仲介されるアポトーシス耐性の複数の機構を宿し又は獲得する。しかしながら、サリノマイシンは、薬剤及びアポトーシス耐性のこれらの機構を克服できるように思われる。経時変化棒グラフ（３Ａ）及びＭＣＦ−７細胞に及ぼすサリノマイシンの効果を表す濃度曲線に対する生存率（３Ｂ）を示す図３を参照されたい。
【０１４７】
【表２】
2014513692.tif 000019
様々な実施形態では、本発明は上述のような治療の方法を提供し、ここでは第２の前アポトーシス抗癌剤は、ＦＴＳ、ＣＭＨ、Ｅ２、ＴＭＳ、δ−トコトリエノール、クルクミン、又はサリノマイシンである。これら化合物の構造、上記に記載されるものの選択の理論的根拠が以下に提供される。サリノマイシン及びクルクミンなどのこれら薬剤のいくつかは、幹細胞に作用することができる。
【０１４８】
クルクミン
香辛料ウコン（クルクマ・ロンガ・リン（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａ  Ｌｉｎｎ）からの活性成分であるクルクミンは、強力な抗酸化剤及び抗炎症剤である。これは、別個の化学的予防活性を有することが最近立証された。しかしながら、癌細胞におけるアポトーシスの誘導が十分に可能な解釈であり得るとみなされたが、クルクミンのかかる抗癌特性の基礎をなす分子機構は未だ理解されないままである。最近の研究では、核ＤＮＡの細胞周期相の分布のフローサイトメトリー分析及びオリゴヌクレオゾーム分画化からの証拠として、クルクミンは、腫瘍細胞中のアポトーシスの誘導によってエールリッヒ腹水癌（ＥＡＣ）の細胞数を減少させることが見出された。ＥＡＣ細胞のアポトーシスへと導く分子シグナルへの更なる探索によって、我々は、クルクミンがプロト腫瘍性タンパク質Ｂａｘのアップレギュレーション、ミトコンドリアからのサイトクロームｃの放出、及びカスパーゼ−３の活性化によって、腫瘍細胞死を起こしていることを観察した。Ｂｃｌ−２の状態は、ＥＡＣ中では変化しないままであり、このことは、クルクミンが、Ｂｃｌ−２のチェックポイントを迂回しアポトーシスに及ぼすその保護的効果を無効にしていることを意味する。従って、クルクミンは、内因性のカスパーゼ依存的経路を介してアポトーシスを誘導することができると考えられる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／１１６７６４９３を参照されたい。
【０１４９】
併用パートナーの選択に関する理論的解釈
細胞死の複数の形態を実行する薬剤が選択されたことで、水平性調節が本発明の併用療法的方法で達成され得た。ＦＴＳ（サリラシブ）は、ミトコンドリア細胞死経路を通して、癌細胞においてカスパーゼ依存的細胞死を実行する［１１、１２］。ＦＴＳは、ＭＣＦ−７細胞及び腫瘍異種移植片においてアポトーシスを促進する［１３］。ＣＭＨは、細胞性ＦＬＩＣＥ（ＦＡＤＤ様ＩＬ−１β変換酵素）−阻害タンパク質（ｃ−ＦＬＩＰ）の小分子阻害剤であり、ＣＭＨは、ｃ−ＦＬＩＰを阻害することによって、カスパーゼ−８及びカスパーゼ−１０を活性化する［１４、１５］。ＣＭＨの細胞を細胞死リガンドに感作する能力の機構の一部は、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ６、及びＨＤＡＣ８を阻害するその能力を経るものである［１５］。ＴＭＳは、微小管阻害を介してのミトコンドリア細胞死経路を通して、カスパーゼ依存性細胞死を主として実行する薬剤である［１６、１７］。ＴＭＳは、ＴａｍＲ耐性乳癌腫瘍異種移植片の増殖を低減することに有効である［１７］。エストラジオールは、ミトコンドリア細胞死経路を通して［１８、１９］、更にＦａｓ細胞死受容体経路を通しても［１９］、長期エストロゲン下細胞のアポトーシスを誘導することが示された。先行研究は、エストラジオールが、インビトロで［１８−２２］、異種移植片モデルにおいて［２３、２４］並びに患者において［２５］、長期エストロゲン下細胞のアポトーシスを誘導することを立証した。マイタンシノイド−抗体抱合体が、微小管脱重合化を通して有糸分裂前中期／中期において乳癌細胞を停止させることによって、細胞増殖を阻害することが示されている［２６］。
【０１５０】
細胞が細胞周期中に長期にわたって停止される場合、このことがアポトーシスを誘導することができる［２７、２８］。トラスツズマブ−ＤＭ１（マイタンシン誘導体）の薬剤抗体抱合体であるＴ−ＤＭ１は、ＨＥＲ２発現異種移植片に有効であり［２９］、並びにＨＥＲ２進行乳癌を有する患者で有効であること［３０］が示された。アロマ―ターゼ阻害剤レトロゾールの投与によって、異種移植片モデルにおいてインビボでエストロゲンを奪取された乳癌細胞系は、ＨＥＲ２シグナル伝達のアップレギュレーションへと至った［３１、３２］。更に、ＨＥＲ２は、乳がん患者において、アロマターゼ阻害剤での処置中にアップレギュレートされることを示した［３３］。従って、長期のエストロゲン奪取を受けた乳癌細胞は、ＨＥＲ２のレベルを増加し、このことがこれら細胞をＴ−ＤＭ１に感受性にした。
【０１５１】
相乗性分析
併用療法における相乗効果の分析は、３つの細胞系、ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、及びＬＴＥＤに焦点を合わせた。ＭＣＦ−７及びＴ４７Ｄ細胞系は、非適応性乳癌のモデルを表現する。ＬＴＥＤ（長期エストロゲン下）細胞系は、長期エストロゲン下後の内分泌耐性を表現する。以下の薬剤を、非適応性細胞系で使用した：ファルネシルチオサリチル酸（ＦＴＳ、サリラシブ）、４−（４−クロロ−２−メチルフェノキシ）−Ｎ−ヒドロキシブタンアミド（ＣＭＨ）、及び２，４，３’，５’−テトラメトキシスチルベン（ＴＭＳ）。適応性細胞については、エストラジオール（Ｅ２）及びトラスツズマブ−ＤＭ１（Ｔ−ＤＭ１）も含まれた。
【０１５２】
腫瘍増殖の重要な成分としての幹細胞の細胞集団の出現によって、クルクミンの効果をインビトロ系において検討した。クルクミンは、非乳癌試験で、コロニー形成及び幹細胞球形成の用量及び時間依存的阻害を誘導する。このような理由で、我々は、乳癌長期エストロゲン下（ＬＴＥＤ）細胞において、この薬剤の効果の初期試験を開始した。我々は用量応答様式でのクルクミンの効果を検討した。この薬剤は、２５０ｎＭで観察された初期効果で、細胞数の減少において極めて強力であった。後期試験は、１２５ｎＭで効果を示した。次いで、我々は、ＦＴＳと併用してクルクミンを検討した。ＦＴＳの用量は、ビヒクル、２５、５０、７５、及び１００μＭを含んだ。ＦＴＳ単独は、対照の１４％まで細胞数を減少させた。１２５ｎＭでのクルクミン単独は、同様な程度まで細胞数を減少させた。クルクミンの高程度の有効性のために、ＦＴＳがこれら実験で相加的効果又は相乗的効果のいずれかを起こしたかを判定することは不可能であった。
【０１５３】
サリノマイシンは、幹細胞を殺傷することで有効であることが示された別の薬剤である。この薬剤は、クルクミンよりも効力が劣り、ＭＣＦ−７細胞上、２μＭで５０％の阻害効果を呈した。図３を参照されたい。以前にインビボでアポトーシスを受けることが示されていたＭＣＦ−７−５Ｃ細胞を使用して、Ｅ２、Ｔ−ＤＭ−１単独及びこれら細胞の組み合わせの効果を検討するために、試験を実施した。Ｅ２及びＴ−ＤＭ−１の双方がアポトーシスを誘導した。中間用量では、Ｅ２に加えてＴ−ＤＭ−１の併用が、いずれかの薬剤単独よりもより有効であると思われた。
【０１５４】
我々は、これら薬剤のいくつかを、非適応性細胞系（図４、６、８を参照）及び適応性細胞系（図５、７、９を参照）の双方で検討した。乳癌細胞を、増加濃度の個々の薬剤で処置し、続いてそれらの併用で試験した。薬剤によって殺傷された細胞の数（影響を受けた分画、ｆａ）及び影響を受けなかった細胞の数（影響されなかった分画、ｆｕ）を決定した（図４を参照）。次いで用量効果曲線を、ｙ＝ｌｏｇ（ｆａ／ｆｕ）対ｘ＝ｌｏｇ（Ｄ）である場合の半有効プロットによってそれらの対応する一次形式に変換する［８、３４］。半有効プロットから、併用係数（ＣＩ）が決定され得る。この方法が平均及び標準偏差値を算定し、並びに信頼区間を表示するために、我々はＣＩグラフをプロットするためにモンテカルロ選択（Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ  ｏｐｔｉｏｎ）を使用した（図６、７を参照）。
【０１５５】
併用係数が１に等しい（ＣＩ＝１）場合、これは２つの薬剤が相加的様式で共に作用することを意味する。併用係数が１未満（ＣＩ＜１）の場合、この時、薬剤は個々の合計よりも更に効果的であり、これらは相乗性を表す。併用係数が１未満（Ｃ＜１）の場合、この時、２つの薬剤は共に、個々に投与された場合よりも効力が劣り、従って拮抗性を表す。次いで有効用量１（Ｄ１）がｘ軸上にプロットされ、有効用量２（Ｄ２）がｙ軸上にプロットされた。有効用量（ＥＤ）のプロットは、Ｆａが０．５、０．７５、０．９及び０．９５に等しいと行うことができる。これがアイソボログラムを作成する。我々は、これら２つの方法、併用係数（図６、７）及びアイソボログラム（図８、９）を使用して、薬剤の異なる併用が使用される場合、相乗性があるかどうかを判定した。結果の概要は、上記の表１に示されている。
【０１５６】
非適応性細胞系結果
非適応性細胞を検討したときに（図４、６、８）、我々は、ＴＭＳ及びＦＴＳの併用係数がＭＣＦ−７細胞系では相加的であり（図６ａ、図８ａ）、Ｔ４７Ｄ細胞では拮抗性である（図６ｄ、図８ｄ）ことを見出した。ＦＴＳ及びＣＭＨの併用は、ＭＣＦ−７細胞系ではこの併用に関する相乗性を表したが（図６ｂ、８ｂ）、Ｔ４７Ｄ細胞系では穏やかな相乗性にすぎなかった（図６ｅ、８ｅ）。ＴＭＳ及びＣＭＨの併用は、ＭＣＦ−７（図６ｃ、８ｃ）及びＴ４７Ｄ（図６ｆ、８ｆ）の双方において相乗性を示した。
【０１５７】
適応性細胞系結果
ＴＭＳとの併用を変化させた。ＴＭＳがＣＭＨと併用された場合、ＬＴＥＤ細胞系で相乗性があり、タモキシフェン耐性細胞系では穏やかな相乗性があった。ＴＭＳがＦＴＳ、Ｅ２、又はＴ−ＤＭ１のいずれかと併用された場合、これらの併用は、ＬＴＥＤ及びＴａｍＲ細胞の双方に関して本質的に相加的であった（図７ａ、ｃ−ｄ、ｊ、ｌ−ｍ）。ＦＴＳのＣＭＨとの併用は、ＬＴＥＤ及びＴａｍＲ細胞の双方で穏やかな相乗性を示した（図７ｅ、ｎ）。しかしながら、ＦＴＳ及びＴ−ＤＭ１の併用並びにＦＴＳ及びＥ２の併用は、タモキシフェン耐性細胞系（図７ｏ、ｐ）に比べて、ＬＴＥＤ細胞においてより強い相乗性を示した（図７ｆ、ｇ）。Ｅ２のＣＭＨとの併用は、両細胞系で相加的であった（図７ｅ、ｑ）。最も有効な組み合わせは、ＬＴＥＤ細胞系においては、ＣＭＨ及びＴ−ＤＭ１の併用であった（図７ｉ）。我々は、タモキシフェン耐性細胞系では、これらの併用による穏やかな相乗性を観察した（図７ｓ）。これは、タモキシフェン耐性細胞が、低エストロゲン環境中で培養されたことが少なく、従って低いレベルのＨＥＲ２を発現するという事実に起因する可能性がある。
【０１５８】
更に図９を参照すると、これは、適応性細胞系のアイソボログラム分析のグラフ図を示す。
結果概要
上記表１は、結果概要を示し、相乗性をもたらした併用が強調されている。我々が観察した最強の相乗性は、ＬＴＥＤ細胞系に供給されたＴ−ＤＭ１とＣＭＨとの併用から起こった。これは、この併用が内因性ミトコンドリア細胞死経路並びに外因性細胞死受容体経路の双方を標的とする、即ち水平性調節が達成されたためである可能性が高い。Ｔ−ＤＭ１は、ＬＴＥＤ細胞の表面上の過発現されたＨＥＲ２を標的化することが可能であり、ＤＭ１剤は、内因性ミトコンドリア経路を通して細胞死を行う。ＣＭＨは、ｃ−ＦＬＩＰを調節し、外因性細胞死受容体経路を活性化する［１４、１５］。ＨＥＲ２に対するＴ−ＤＭ１の効力及び標的化の双方は、観察される相乗性に重要であるように思われる。試験されたＴＭＳとの全ての併用は、本質的に相加的であった（図６〜９を参照）。ＦＴＳとの併用は、非適応性ＬＴＥＤ細胞系と比べて適応細胞系でより弱かった（図６ｂ、ｄ、ｅを図７ｅ、ｆ、ｇと、更に図８ｂ、ｄ、ｅを図９ｅ、ｆ、ｇと比較）。
【０１５９】
投与及び組成物
本発明は、併用薬剤療法と併せて使用され得る補助的療法を更に提供する。様々な実施形態では、その中でアポトーシス誘導の異なる分子機構が発生する併用などの前アポトーシス抗癌剤の併用が、Ｘ線、γ線、放射核種放射、及び亜原子的粒子曝露などの放射線療法、近接照射療法、並びに前アポトーシスそれ自体であるか若しくは細胞増殖阻害剤又は細胞複製阻害剤である追加的抗癌剤の使用を含む、当該技術分野で周知のような他の治療的アプローチと組み合わせて使用され得る。これら組み合わせを評価するため並びに結果を解析するための方法は、当該技術分野で既知である。
【０１６０】
複数の経路を標的とする有効な投薬治療の組み合わせは、癌を標的化するための薬物療法の開発に新しい領域を開く。本明細書に開示されたように、本発明の併用療法は、カスパーゼ依存的細胞死を誘導すること、細胞性ＦＬＩＣＥを阻害すること、カスパーゼを活性化すること（カスパーゼの間接的活性化を含む）、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ６、及びＨＤＡＣ８を阻害すること、カスパーゼ依存的細胞死を誘導すること、ミトコンドリア細胞死及びＦａｓ細胞死受容体経路を調節すること、並びに微小管構造を破壊することが挙げられるがこれらに限定されない、異なる／複数の経路を標的化することに基づいている。
【０１６１】
本発明は、様々な実施形態において、第２のアポトーシス抗癌剤と「併せた」第１の前アポトーシス抗癌剤の投与のための方法を提供する。互いに併せて投与される２つ又はそれ以上の薬剤が、同時に又は等しい用量で投与されねばならないことが必ずしも必要でないことを当業者であれば理解されるであろう。一態様では、薬剤併用療法の一部として投与される化合物は、別個に投与される。別の態様では、第１の化合物は、第２の化合物が投与される前に投与される。更に別の態様では、第１の化合物と第２の化合物は、ほぼ同時に投与される。他の態様では、第１の化合物は、第２の化合物の投与後に引き続いて投与される。それぞれの薬剤は、医療従事者の知識及び技能に基づいて選択され得る投与の頻度、及び投与期間にわたって、投与量で複数回投与され得る。
【０１６２】
本発明は、本発明の化合物を含む医薬組成物を更に提供する。この医薬組成物は、本発明の１つ以上の化合物、並びに生物学的に活性な類似体、相同体、誘導体、修飾体、及びその薬学的に許容可能な塩、並びに薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。一実施形態では、この化合物は、医薬組成物として投与される。
【０１６３】
投与のルートは、投与される化合物のタイプに応じて異なり得る。一様態では、化合物は、経口、局所、経直腸、筋肉内、粘膜内、鼻腔内、吸入、眼、静脈内などのルートを介して投与される。
【０１６４】
本発明は、制御放出製剤としての本発明の化合物の投与の方法を更に提供する。
一実施形態では、２つ又はそれ以上の化合物の併用で被験体を処置する結果は、化合物のいずれかを単独で使用する効果と比較して相加的である。一態様では、２つ又はそれ以上の化合物を使用する場合に見られる効果は、この化合物のいずれかを単独で使用する場合よりも大きい。
【０１６５】
本組成物は、任意選択的に、患者に適切な投与のための形態をもたらすように、好適な量の薬学的に許容可能なビヒクルを含むことができる。
本組成物はまた、行動療法又は相互作用と組み合わせて、被験体に投与され得る。
【０１６６】
本発明の範囲内に包含されるものは、様々な個々のアノマー、ジアステレオマー及び鏡像異性体並びにこれらの混合物である。加えて、本発明の化合物は、例えば、ナトリウム及びカリウムなどのアルカリ金属塩；アンモニウム塩；モノアルキルアンモニウム塩；ジアルキルアンモニウム塩；トリアルキルアンモニウム塩；テトラアルキルアンモニウム塩、及びトロメタミン塩のいずれかの薬学的に許容可能な塩も含む。この化合物の水和物及び他の溶媒和物も本発明の範囲内に含まれる。
【０１６７】
初期投与量が有効でない場合、この時、併用療法の１つ以上の化合物の投与量が増加され得る。初期投与量が上記率よりも更に急激な体重減少をもたらす場合、少なくとも２つの化合物の１つ以上の投与量が低減され得る。
【０１６８】
薬学的に許容可能な塩基添加塩は、無機及び有機塩基から調製され得る。無機塩基由来の塩は、例に過ぎないが、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム及びマグネシウム塩が挙げられる。有機塩基に由来の塩としては、アルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、置換アルキルアミン、ジ（置換アルキル）アミン、トリ（置換アルキル）アミン、アルケニルアミン、ジアルケニルアミン、トリアルケニルアミン、置換アルケニルアミン、ジ（置換アルケニル）アミン、トリ（置換アルケニル）アミン、シクロアルキルアミン、ジ（シクロアルキル）アミン、トリ（シクロアルキル）アミン、置換シクロアルキルアミン、二置換シクロアルキルアミン、三置換シクロアルキルアミン、シクロアルケニルアミン、ジ（シクロアルケニル）アミン、トリ（シクロアルケニル）アミン、置換シクロアルケニルアミン、二置換シクロアルケニルアミン、三置換シクロアルケニルアミン、アリールアミン、ジアリールアミン、トリアリールアミン、ヘテロアリールアミン、ジヘテロアリールアミン、トリヘテロアリールアミン、ヘテロ環式アミン、ジヘテロ環式アミン、トリヘテロ環式アミン、アミン上の置換基の少なくとも２つが異なり、これらがアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環式等からなる群から選択される混合されたジアミン及びトリアミンなどの第一級アミン、第二級アミン及び第三級アミンの塩が挙げられるが、これらに限定されない。更に含まれるものは、２つ又は３つの置換基がアミノ窒素と共に、ヘテロ環式基又はヘテロアリール基を形成するアミンである。好適なアミンの例としては、例示に過ぎないが、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリ（イソ−プロピル）アミン、トリ（ｎ−プロピル）アミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、トロメタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、Ｎ−アルキルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、モルホリン、Ｎ−エチルピペリジン等が挙げられる。例えば、カルボキサミド、低級アルキルカルボキサミド、ジアルキルカルボキサミド等を含むカルボン酸アミドなどの他のカルボン酸誘導体も本発明の実施で有用であることも理解されるべきである。
【０１６９】
薬学的に許容可能な酸付加塩は、無機及び有機酸から調製され得る。無機酸由来の塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の塩が挙げられる。有機酸由来の塩としては、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等の塩が挙げられる。
【０１７０】
一実施形態では、本発明の組成物は、本発明の１つの化合物を含んでよい。別の実施形態では、本発明の組成物は、本発明の複数の化合物を含んでもよい。一実施形態では、他の疾患を治療するために有用な追加的な薬剤又は化合物もこの組成物の一部であり得る。一実施形態では、１つのみの本発明の化合物を含む組成物が、少なくとも１つの本発明の他の化合物を含む別の組成物と同時に投与されてもよい。一実施形態では、異なる組成物が、互いに異なる時間に投与されてもよい。本発明の組成物が、１つのみの本発明の化合物を含む場合、少なくとも１つの追加的化合物を含む追加的組成物が使用されるべきである。
【０１７１】
本発明を実施するために有用な医薬組成物は、例えば、１ｎｇ／ｋｇ／日と１００ｍｇ／ｋｇ／日との間の用量を送達するよう投与され得る。
本発明の方法において有用である医薬組成物は、例えば、経口固形製剤で全身的に投与されても、又は点眼薬、坐剤、エアロゾル剤、局所製剤又は同様のその他の製剤として投与されてもよい。適切な化合物に加えて、かかる医薬組成物は、薬剤投与を増強しかつ容易にするとして知られる薬学的に許容可能な担体及び他の成分を含有してもよい。ナノ粒子、リポソーム、再接合赤血球、及び免疫ベースのシステムなどの他の可能な製剤もまた、本発明の方法に従って、適切な化合物、又は類似体、修飾体、若しくはこれらの誘導体を投与するよう使用されてもよい。
【０１７２】
本明細書に記載された方法のいずれかを使用して同定された化合物は、製剤化され、本明細書に開示された疾患の治療に対して、被験体に投与され得る。当業者であれば、これら方法が、他の疾患、障害、及び病状に同様に有用であることを認識されるであろう。
【０１７３】
「プロドラッグ」とは、インビボで親薬物へと転化される薬剤を指す。プロドラッグは、ある状況において、これらが親薬物よりも投与することが容易である場合があるために、しばしば有用である。例えば、これらは経口投与によって生物学的に利用可能となり得る一方で、親薬物はそうではない。プロドラッグはまた、医薬組成物中で親薬物を超える改善された溶解性を有し得るか、又は風味の増加を示し若しくは製剤化が容易であり得る。プロドラッグの限定的ではない例としては、エステル（「プロドラッグ」）として投与される本発明の化合物があり、これは水溶解性が移動性に悪影響を及ぼす細胞膜を横断する場合には伝達を容易にし、水溶解性が有利である細胞の内部に一旦入ると、次いでこれが活性実体であるカルボン酸に代謝的に加水分解される。プロドラッグの更なる例は、ペプチドが代謝されて活性部分をもたらす酸基に結合された短鎖ペプチド（ポリアミノ酸）であり得る。
【０１７４】
本発明は、本明細書で開示される疾患の治療に、活性成分として有用な化合物を含む医薬組成物の調製及び使用を包含する。かかる医薬組成物は、被験体に投与するために好適な形態での活性成分単独からなってもよく、又は医薬組成物は、活性成分及び１つ以上の薬学的に許容可能な担体、１つ以上の追加的成分、若しくはこれらのいくつかの組み合わせを含んでもよい。活性成分は、当該技術分野で周知のように、生理学的に許容可能なカチオン又はアニオンと組み合されてなど、生理学的に許容可能なエステル又は塩の形態で、医薬組成物中に存在してもよい。
【０１７５】
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬剤学の分野で既知の又は今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般的に、かかる調製法は、活性成分を担体又は１つ以上の他の補助成分と結合するようにすることと、次いで、必要であるか所望する場合、製品を所望の単一又は複数の用量単位に形作る又は包装することを含む。
【０１７６】
本明細書に提供される医薬組成物の記載は、ヒトへの倫理的な投与に好適である医薬組成物を主として目的としているが、かかる組成物は、一般的に全ての種類の動物への投与に好適であることが当業者であれば理解されるであろう。多様な動物への投与に好適な医薬組成物にするために、ヒトへの投与に好適な医薬組成物を修正することは十分に理解され、当該技術分野の知識を有する獣医薬理学者であれば、たとえあったとしても、単に普通の実験のみでかかる修正を設計しかつ実施することができる。本発明の医薬組成物の投与が企図される被験体としては、ヒト及び他の霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、及びイヌなどの商業上妥当な哺乳類、並びにニワトリ、アヒル、ガチョウ、及びシチメンチョウなどの商業上妥当な鳥類を含む鳥類が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７７】
本発明の方法によって包含される投与の１つのタイプは、非経口投与であり、これは、組成物の注射による医薬組成物の投与、外科的切開を通しての組成物の供給によるもの、組織貫通非外科的創傷を通しての組成物の供給によるもの等が挙げられるが、これらに限定されない。特に、非経口投与は、限定されないが、皮下、腹腔内、筋肉内、及び胸骨内注射、並びに腎臓透析注入技術が挙げられる。
【０１７８】
本発明の方法において有用である医薬組成物は、経口、経直腸、経膣、非経口、局所、肺投与、鼻腔内、吸入、口腔内、眼用、クモ膜下投与又は別の投与経路に好適な製剤で調製され、包装され、又は販売される。他の企図される製剤としては、投影型ナノ粒子、リポソーム調製物、活性成分を含有する再接合赤血球、免疫学系製剤が挙げられる。
【０１７９】
本発明の医薬組成物は、単回単位用量、又は複数の単回単位用量として、バルクで調製され、包装され、又は販売される。本明細書で使用するとき、「単位用量」とは、予め決められた量の活性成分を含む医薬組成物の別個の量である。活性成分の量は、一般的に、被験体に投与される活性成分の投与量、又は、例えばかかる投与量の１／２又は１／３などのかかる投与量の好都合な分画に等しい。
【０１８０】
活性成分、医薬組成物中の薬学的に許容可能な担体、及び任意の追加的成分の相対的量は、処置される被験体の個性、寸法、状態に依存して、更に組成物が投与されるべきルートに依存して変化するであろう。例として、この組成物は、０．０１％〜１００％（ｗ／ｗ）の間の活性成分を含んでもよい。
【０１８１】
活性成分に加えて、本発明の医薬組成物は、１つ以上の追加的薬学的に活性な薬剤を更に含んでもよい。特に企図される追加的薬剤としては、抗催吐剤並びにシアニド及びシアネート排出薬などの排出薬が挙げられる。
【０１８２】
本発明の医薬組成物の制御放出性又は徐放性の製剤は、従来の技術を使用して製造され得る。
経口投与に好適な本発明の医薬組成物の製剤は、限定されるものではないが、それぞれが予め決められた量の活性成分を含有する錠剤、硬質又は軟質カプセル、カシュ剤、トローチ、又はロゼンジ剤が挙げられるが、別個の固形用量の形態で調製され、包装され、又は販売され得る。経口投与に好適な他の製剤としては、粉末又は顆粒製剤、水性又は油性の懸濁液、水性又は油性の液剤、若しくは乳剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８３】
本明細書で使用するとき、「油性」液体とは、炭素含有液体分子を含むもので、水よりも小さな極性を呈するものである。
活性成分を含む錠剤は、例えば、任意選択的に１つ以上の追加的成分と共に、活性成分を圧縮し又は成形することによって製造され得る。圧縮錠剤は、好適な装置内で、任意選択的に、結合剤、滑沢剤、賦形剤、表面活性剤、及び分散剤の１つ以上と混合されて、粉末又は顆粒調製物などの自由流動形態で、活性成分を圧縮することによって調製され得る。成形錠剤は、好適な装置内で、活性成分の混合物、薬学的に許容可能な担体、及び混合物を湿らすのに少なくとも十分な液体を成形することによって製造され得る。錠剤の製造で使用される薬学的に許容可能な賦形剤としては、不活性希釈剤、造粒及び崩壊剤、結合剤、及び滑沢剤が挙げられるが、これらに限定されない。既知の分散剤としては、馬鈴薯デンプン及びデンプングリコール酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。既知の界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウムが挙げられるが、これに限定されない。既知の希釈剤としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、微結晶セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、及びリン酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。既知の造粒及び崩壊剤としては、トウモロコシデンプン及びアルギン酸が挙げられるが、これらに限定されない。既知の結合剤としては、ゼラチン、アラビアゴム、前糊化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、及びヒドロキシメチルセルロースが挙げられるが、これらに限定されない。既知の滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリカ、及びタルクが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８４】
錠剤は、非コーティングであってもよく、又は被験体の異腸管内の遅延崩壊を達成するために、既知の方法を使用してコーティングされてもよく、これによって、活性成分の徐放性及び吸収をもたらす。例として、一ステアリン酸グリセリル又は二ステアリン酸グリセリルなどの材料が、錠剤をコーティングするために使用され得る。更に例として、錠剤は、米国特許第４，２５６，１０８号明細書、同第４，１６０，４５２号明細書及び同第４，２６５，８７４号明細書で記載される方法を使用してコーティングされ、浸透圧的に制御された放出錠剤を形成してもよい。錠剤は、薬学的にエレガントで口当たりがよい調製物をもたらすために、甘味剤、風味剤、着色剤、防腐剤、又はこれらのいくつかの組み合わせを更に含んでもよい。
【０１８５】
活性成分を含む硬質カプセルは、ゼラチンなどの生理学的に分解可能な組成物を使用して製造され得る。かかる硬質カプセルは、活性成分を含み、更に、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、又はカオリンなどの不活性固体希釈剤を含む追加的な成分を含むことができる。
【０１８６】
活性成分を含む軟質カプセルは、ゼラチンなどの生理学的に分解可能な組成物を使用して製造され得る。かかる軟質カプセルは、水若しくはピーナッツ油、液体パラフィン、又はオリーブ油などの油性媒体と混合され得る活性成分を含むことができる。
【０１８７】
ラクチュロースもまた、遊離食用充填剤として使用され得、これは、本発明の化合物がカプセル形態で調製される場合有用である。
経口投与に好適である本発明の医薬組成物の液体製剤は、液体形態又は使用前に水又は別の好適なビヒクルとの再構成を意図される乾燥製品の形態のいずれかで、調製され、包装され、及び販売され得る。
【０１８８】
液体懸濁液は、従来の方法を使用して調製され、水性又は油性ビヒクル中の活性成分の懸濁液を達成することができる。水性ビヒクルとしては、例えば、水又は等張生理食塩水が挙げられる。油性ビヒクルとしては、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、ラッカセイ油、オリーブ、ゴマ、又はココナッツ油などの植物油、分画化植物油、及び液体パラフィンなどの鉱油が挙げられる。液体懸濁液は、懸濁剤、分散又は湿潤剤、乳化剤、緩和剤、防腐剤、緩衝剤、塩、風味剤、着色剤、及び甘味剤が挙げられるがこれらに限定されない１つ以上の追加的成分を更に含んでもよい。油性懸濁液は、増粘剤を更に含んでもよい。既知の懸濁剤としては、ソルビトールシロップ、水素添加食用脂肪、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アラビアゴム、並びにカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。既知の分散又は湿潤剤としては、レシチンなどの天然型ホスファチド、酸化アルキレンと脂肪酸との、長鎖脂肪族アルコールとの、脂肪酸とヘキシトールに由来の部分的エステル誘導体との、又は脂肪酸とヘキシトール無水物に由来の部分的エステルとの縮合生成物（例えば、それぞれ、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ソルビトールモノオレイン酸ポリオキシエチレン、及びソルビタンモノオレイン酸ポリオキシエチレン）が挙げられるが、これらに限定されない。既知の乳化剤としては、レシチン及びアラビアゴムが挙げられるが、これらに限定されない。既知の防腐剤としては、メチル、エチル、またはパラヒドロキシ安息香酸プロピル、アスコルビン酸、ソルビン酸が挙げられるが、これらに限定されない。既知の甘味料としては、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、スクロース、及びサッカリンが挙げられるが、これらに限定されない。油性懸濁液のための既知の増粘剤としては、例えば蜜蝋、硬質パラフィン、及びセチルアルコールが挙げられる。
【０１８９】
一態様では、シロップ又はエリキシル剤の形態での、又はドロップの形態での調製物は、甘味剤と共に活性成分を含むことができ、この甘味剤は、カロリーフリーであることが好ましく、この調製物は、殺菌剤としてのメチルパラベン又はプロピルパラベン、風味剤及び好適な着色剤を更に含んでもよい。
【０１９０】
水性又は油性溶媒中の活性成分の液体溶液は、液体懸濁液と実質的に同様な方法で調製され得、主たる相違点は、活性成分が溶媒中に懸濁されるよりはむしろ溶解されることである。本発明の医薬組成物の液体溶液は、液体懸濁液に関して記載された成分のそれぞれを含むことができる。懸濁剤が、溶媒中の活性成分の溶解を必ずしも助けるというわけではないことが理解されるべきである。水性溶媒としては、例えば、水及び等張生理食塩水が挙げられる。油性溶媒としては、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、ラッカセイ油、オリーブ、ゴマ、又はココナッツ油などの植物油、分画化植物油、及び液体パラフィンなどの鉱油が挙げられる。
【０１９１】
本発明の医薬調製物の粉末化又は顆粒化製剤は、既知の方法を使用して調製され得る。かかる製剤は、例えば、錠剤を成形するため、カプセルを充填するため、又はそれに水性又は油性ビヒクルをそれに添加することによって水性又は油性懸濁液若しくは溶液を調製するために使用されて、被験体に直接的に投与されてもよい。これら製剤のそれぞれは、分散又は湿潤剤、懸濁剤、及び防腐剤の１つ以上を更に含む。充填剤及び甘味剤、風味剤、又は着色剤などの追加的な賦形剤もまた、これら製剤中に含まれてもよい。
【０１９２】
本発明の医薬組成物は、水中油型エマルジョン又は油中水型エマルジョンの形態で、調製され、包装され、又は販売され得る。油性相は、オリーブ油又はラッカセイ油などの植物油、液体パラフィンなどの鉱油、又はこれらの組み合わせであってもよい。かかる組成物は、アラビアゴム又はトラガカントゴムなどの天然型ゴム、ダイズ又はレシチンホスファチドなどの天然型ホスファチド、モノオレイン酸ソルビタンなどの脂肪酸及びヘキシトール無水物の組み合わせに由来のエステル又は部分的エステル、並びにかかる部分的エステルとソルビタンモノオレイン酸ポリオキシエチレンなどの酸化エチレンとの縮合生成物を含む１つ以上の乳化剤を更に含んでもよい。これら乳剤はまた、例えば、甘味剤又は風味剤を含む追加的な成分を含有してもよい。
【０１９３】
本発明の医薬組成物は、経直腸投与に好適な製剤で、調製され、包装され、又は販売されてもよい。かかる組成物は、例えば坐剤、滞留浣腸剤、及び直腸又は結腸潅注のための溶液の形態であり得る。
【０１９４】
坐剤は、活性成分を、通常の室温（即ち、約２０℃）で固体であり、被験体の直腸の温度（即ち、健康なヒトでは約３７℃）で液体である非刺激性の薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせることで製造され得る。好適な薬学的に許容可能な賦形剤としては、ココアバター、ポリエチレングリコール、及び種々のグリセリドが挙げられるが、これらに限定されない。坐剤は、酸化防止剤及び防腐剤が挙げられるが、これらに限定されない種々の追加的成分を更に含んでもよい。
【０１９５】
直腸又は結腸灌注用の滞留浣腸調製物又は溶液は、活性成分を薬学的に許容可能な担体と組み合わせることによって製造され得る。当該技術分野で周知のように、浣腸調製物は、被験体の直腸構造に適合された送達装置を使用して投与され得、又はこの中に包装され得る。浣腸調製物は、酸化防止剤及び防腐剤が挙げられるが、これらに限定されない種々の追加的成分を更に含んでもよい。
【０１９６】
本発明の医薬組成物は、膣内投与に好適な製剤で、調製され、包装され又は販売され得る。かかる組成物は、例えば、坐剤、タンポン、潅注調製物、若しくは膣潅注用のゲル又はクリーム又は溶液などの含浸処理された又はコーティングされた膣挿入可能な材料の形態であり得る。
【０１９７】
材料を化学的組成物で含浸処理又はコーティングするための方法は、当該技術分野で既知であり、化学的組成物を表面に付着又は結合させる方法、材料（即ち、生理学的分解可能な材料）の合成中に化学的組成物を材料の構造に組み込む方法、及び水性又は油性溶液若しくは懸濁液を吸収性材料に吸収させ、続いて乾燥させるか乾燥させない方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９８】
膣潅注のための潅注調製物又は溶液は、活性成分を薬学的に許容可能な液体担体と組み合わせることで製造され得る。当該技術分野で周知であるように、潅注調製物は、膣の構造に適合された送達装置を使用して投与され得、並びにその中に包装され得る。潅注調製物は、酸化防止剤、抗菌剤、抗真菌剤、及び防腐剤が挙げられるがこれらに限定されない種々の追加的成分を更に含んでもよい。
【０１９９】
本明細書で使用するとき、医薬組成物の「非経口投与」とは、被験体の組織の物理的裂け目（ｂｒｅａｃｈｉｎｇ）によって特徴付けられる投与のいずれかのルート及び組織内のその裂け目を通しての医薬組成物の投与を含む。従って、非経口投与としては、組成物の注射による、外科的切開を通して組成物の供給による、組織貫通性非外科的損傷を通しての組成物の供給による等の組成物の投与が挙げられるが、これらに限定されない。特に非経口投与としては、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内注射、及び腎臓透析注入技術が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２００】
非経口投与に好適な医薬組成物の製剤は、無菌水又は無菌等張生理食塩水などの薬学的に許容可能な担体と組み合された活性成分を含む。かかる製剤は、ボーラス投与又は連続的投与に好適な形態で、調製され、包装され、又は販売され得る。注射可能な製剤は、アンプル又は防腐剤を含有する複数回用量容器などのなどの単位用量形態で調製され、包装され、又は販売され得る。非経口投与のための製剤としては、懸濁液、液剤、油性又は水性ビヒクル中の乳剤、ペースト、及び埋め込み可能な徐放性又は生体分解可能な製剤が挙げられるが、これらに限定されない。かかる製剤は、懸濁剤、安定化剤、又は分散剤が挙げられるがこれらに限定されない１つ以上の追加的成分を更に含んでもよい。非経口投与のための製剤の一実施形態では、再構成組成物の非経口投与の前には、活性成分が、好適なビヒクル（例えば、無菌のパイロジェンフリーの水）とともに再構成のための乾燥（即ち、粉末又は顆粒状の）形態で提供される。
【０２０１】
医薬組成物は、無菌の注射可能な水性又は油性懸濁液又は溶液の形態で、調製され、包装され、又は販売される。この懸濁液又は溶液は、既知の技術に従って製剤化され得、活性成分に加えて、本明細書に記載の分散剤、湿潤剤、又は懸濁剤などの追加的成分を含んでもよい。かかる無菌注射可能製剤は、例えば水又は１，３−ブタンジオールなどの非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒を使用して調製され得る。他の許容可能な希釈剤及び溶媒としては、リンガー溶液、等張塩化ナトリウム溶液、及び合成モノ−又はジ−グリセリドなどの固定油が挙げられるが、これらに限定されない。有用である他の非経口的に投与可能な製剤としては、微結晶性形態で、リポソーム調製物で、又は生体分解性ポリマー系の成分として活性成分を含むものが挙げられる。徐放性又は埋め込みのための組成物は、エマルジョン、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、又は難溶性塩などの薬学的に許容可能なポリマー材料又は疎水性材料を含んでもよい。
【０２０２】
局所投与に好適な製剤としては、リニメント、ローションなどの液体又は半液体調製物、クリーム、軟膏又はペーストなどの水中油型又は油中水型の乳剤、並びに溶液又は懸濁液が挙げられるが、これらに限定されない。局所投与製剤は、例えば、約１％〜約１０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含んでもよいが、活性成分のこの濃度は、溶媒中の活性成分の溶解限界と同じほど高い場合がある。局所投与のための製剤は、本明細書に記載の追加的成分の１つ以上を更に含んでもよい。
【０２０３】
本発明の医薬組成物は、口腔を介しての肺投与に好適な製剤で、調製され、包装され、又は販売され得る。かかる製剤は、乾燥成分を含み、約０．５〜約７ナノメートルの範囲、好ましくは約１〜約６ナノメートルの範囲の直径を有する乾燥粒子を含むことができる。かかる組成物は、そこに推進剤の流れが向けられ粉末を分散させる乾燥粉末リザーバを含む装置を使用して、又は密封された容器内で低沸点推進剤中に溶解され又は懸濁された活性成分を含む装置などの自動推進式の溶媒／粉末分配容器を使用しての投与のために、好都合な乾燥粉末の形態である。好ましくは、かかる粉末は、粒子を含み、その中で粒子の少なくとも９８重量％が、０．５ナノメートルを超える直径を有し、粒子の数で少なくとも９５％が７ナノメートル未満の直径を有する。より好ましくは、少なくとも９５重量％の粒子が、１ナノメートルを超える直径を有し、粒子の数で少なくとも９０％の粒子が６ナノメートル未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、好ましくは、糖などの固体微粉末希釈剤を含み、単位用量形態で好都合に提供される。
【０２０４】
低沸点推進剤は、一般的には、大気圧で６５°Ｆ（１８．３℃）以下の沸点を有する液体推進剤を含む。一般的には、推進剤は、約５０％〜約９９．９％（ｗ／ｗ）の組成を構成してもよく、活性成分は、約０．１％〜約２０％（ｗ／ｗ）の組成を構成することができる。推進剤は、液体非イオン性又は固体アニオン性界面活性剤若しくは固体希釈剤（好ましくは、活性成分を含む粒子と同一のオーダの粒径を有する）などの追加的成分を更に含んでもよい。
【０２０５】
肺送達用に製剤化される本発明の医薬組成物はまた、溶液又は懸濁液の液滴の形態で活性成分を提供してもよい。かかる製剤は、活性成分を含む、任意選択的に無菌の水性若しくは希アルコール溶液又は懸濁液として調製され、包装され、又は販売され得、任意の霧状化又は噴霧化装置を使用して好都合に投与され得る。かかる製剤は、サッカリンナトリウムなどの風味剤、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤、又はメチルヒドロキシベンゾエートなどの防腐剤が挙げられるが、これらに限定されない１つ以上の追加的成分を更に含んでもよい。投与のこのルートによって提供される液滴は、約０．１〜約２００ナノメートルの範囲の平均径を有する。
【０２０６】
肺送達に有用な本明細書に記載される製剤はまた、本発明の医薬組成物の鼻腔内送達にも有用である。
鼻腔内投与に好適な別の製剤は、活性成分を有し、約０．２〜約５００マイクロメートルの平均粒子を有する粗粉末である。かかる製剤は、吹入されるような方法、即ち、鼻孔の近くに保たれた容器から鼻の経路を通って急速に吸入することにより投与される。
【０２０７】
鼻腔投与に好適な製剤は、例えば、わずか約０．１％（ｗ／ｗ）から約１００％（ｗ／ｗ）までもの活性成分を含んでもよく、本明細書に記載の追加的成分の１つ以上を更に含んでもよい。
【０２０８】
本発明の医薬組成物は、口腔内投与に好適な製剤で調製され、包装され、又は販売され得る。かかる製剤は、例えば、従来の方法を使用して製造された錠剤又はロゼンジの形態であり得、例えば、約０．１％〜約２０％（ｗ／ｗ）の活性成分、経口的に溶解可能な又は分解可能な組成物を含む残部、任意選択的に、本明細書に記載の１つ以上の追加的成分を含むことができる。或いは、口腔内投与に好適な製剤は、活性成分を含む粉末若しくはエアロゾル化又は霧状化溶液又は懸濁液を含んでもよい。かかる粉末化、エアロゾル化、又は霧状化製剤は、分散される場合、好ましくは約０．１〜約２００ナノメートルの範囲の平均粒径または液滴径を有し、本明細書に記載の追加的成分の１つ以上を更に含んでもよい。
【０２０９】
本発明の医薬組成物は、眼用投与に好適な製剤で調製され、包装され、又は販売され得る。かかる製剤は、例えば、点眼剤の形態であってもよく、この点眼剤は、例えば、水性又は油性液体担体中の活性成分の０．１％〜１．０％（ｗ／ｗ）の溶液又は懸濁液であり得る。かかる点眼剤は、緩衝剤、塩、または本明細書に記載の１つ以上の他の追加的成分を更に含んでもよい。有用である他の眼用投与可能な製剤としては、微結晶性形態又はリポソーム調製物で活性成分を含むものが挙げられる。
【０２１０】
本発明の医薬組成物は、粘膜内投与に好適な製剤で調製され、包装され、又は販売され得る。本発明は、粘膜を横断する化合物の経路又は吸収を可能にする化合物の粘膜内投与を提供する。かかるタイプの投与は、経口（歯肉、舌下、頬粘膜等）、直腸、膣、肺、鼻腔等の吸収に有用である。
【０２１１】
いくつかの態様では、舌下投与は、場合によっては経口投与されるとき、活性成分が肝臓を通して実質的な初回代謝及び酵素的分解にさらされ、迅速な代謝をもたらし、並びに分子を不活性代謝物に転化する肝臓酵素の活性に関する治療的活性の損失、又はこの生体転化のために減少される活性を生じることに対し、活性成分に関する利点を有する。
【０２１２】
場合によっては、投与の舌下ルートは、頬粘膜の相当な透過性又は血管新生のために、迅速な作用の開始をもたらすことができる。更に、舌下投与はまた、経口投与後に胃粘膜又は消化管粘膜のレベルで通常は吸収されない活性成分、或いは、例えば錠剤の摂取後に酸性媒体中に部分的に又は完全に分解される活性成分の投与を可能にする。
【０２１３】
先行技術から既知である舌下錠剤調製技術は、活性成分と、希釈剤、結合剤、崩壊剤及びアジュバントなどの圧縮のための賦形剤とを含む粉末の混合物の直接圧縮によって通常調製される。調製の代替法では、活性成分及び圧縮賦形剤が、事前に乾式造粒化又は湿式造粒化される。一態様では、活性成分が錠剤の質量全体に分配される。国際公開第００／１６７５０号パンフレットは、迅速に崩壊し、その中で活性成分がミクロ粒子の形態で存在する（このミクロ粒子が、活性マイクロ粒子に対する支持を構成している実質的にサイズが大きい水溶性粒子の表面に接着する）規則混合物と粘膜付着性の薬剤を含む化合物とを含む舌下錠用途のための錠剤を記載する。国際公開第００／５７８５８号パンフレットは、吸収を促進するよう意図された発泡性系、及びｐＨ−調節剤にも組み合わされた活性成分を含む舌下用途のための錠剤を記載する。
【０２１４】
本発明の化合物は、粘膜全体の吸収を可能にする又は増強する投与に適切な製剤又は医薬組成物で調製され得る。粘膜吸収増強剤としては、胆汁酸塩、脂肪酸、界面活性剤、又はアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、浸透増強剤はコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸、グリコール酸ナトリウム、ジメチルスルホキシド又はエタノールであり得る。他の実施形態では、本発明の化合物は、化合物の送達を容易にするために、粘膜浸透強化剤と共に製剤化され得る。この製剤はまた、溶解性、薬剤安定性、及び鼻腔粘膜、口腔粘膜、膣粘膜、呼吸器、及び腸粘膜などの粘膜を通しての吸収を最適化したｐＨで調製され得る。
【０２１５】
本発明の範囲内の医薬品の粘膜送達を更に増強するために、活性成分を含む製剤はまた、基剤又は賦形剤として親水性低分子量化合物を含有してもよい。かかる親水性低分子量化合物は、それを通して、生理学的に活性なペプチド又はタンパク質などの水溶性活性薬剤が、基剤から活性薬剤が吸収される身体表面に拡散する通過媒体を提供する。親水性低分子量化合物は、任意選択的に、粘膜又は投与雰囲気から水分を吸収し、水溶性活性ペプチドを溶解する。親水性低分子量化合物の分子量は、一般的に１００００以下であり、好ましくは３０００以下である。例示的親水性低分子量化合物としては、スクロース、マンニトール、乳糖、Ｌ−アラビノース、エリトロース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、ラクチュロース、セロビオース、ゲンチビオース、グリセリン、及びポリエチレングリコール等のオリゴ糖類、二糖類及び単糖類などのポリオール化合物が挙げられる。本発明の範囲内の担体として有用な親水性低分子量化合物の他の例としては、Ｎ−メチルピロリドン、及びアルコール（例えば、オリゴビニルアルコール、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール等）が挙げられる。これら親水性低分子量化合物は、単独で、又は互いに組み合わされて、若しくは他の活性又は不活性の鼻腔内製剤の成分と共に使用され得る。
【０２１６】
本発明の制御放出医薬調製物が親水性基剤を更に含む場合、多くの選択肢が含有物に使用可能である。ポリエチレングリコール及びポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、Ｄ−ソルビトール及びキシリトールなどの糖アルコール、スクロース、マルトース、ラクチュロース、Ｄ−フルクトース、デキストラン、及びグルコースなどの糖類、ポリオキシエチレン−水素付加ヒマシ油、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレングリコール、及びポリオキシエチレン・ソルビタン高脂肪酸エステルなどの界面活性剤、塩化ナトリウム及び塩化マグネシウムなどの塩、クエン酸及び酒石酸などの有機酸、グリシン、β−アラニン、及びリジン塩酸などのアミノ酸、並びにメグルミンなどのアミノ糖類は、親水性基剤の例として提供される。ポリエチレングリコール、スクロース、及びポリビニルピロリドンが好ましく、ポリエチレングリコールは更に好ましい。２つ又はそれ以上の親水性基剤の１つ又は組み合わせが、本発明で使用され得る。
【０２１７】
本発明は、吸入器を通しての肺、鼻孔、又は経口投与を企図する。一実施形態では、吸入器からの送達は、投与量計量式であり得る。
吸入器は、本発明の少なくとも１つの化合物の患者の自己投与のための装置であり、本発明の少なくとも１つの化合物と薬学的に許容可能な分散剤とのエアロゾル噴霧製剤を含有する噴霧式吸入器（例えば、鼻腔、経口、又は肺噴霧式吸入器）を含む。一態様では、この装置は本発明によって包含される疾患又は障害を治療するのに有効な本発明の少なくとも１つの化合物の用量を封じ込めるスプレーを形成することによって、ある量のエアロゾル製剤を分散するよう計量される。分散剤は、限定されないが、ポリオキシエチレン・脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン・脂肪酸アルコール、及びポリオキシエチレン・ソルビタン・脂肪酸エステルなどの界面活性剤であり得る。リン脂質系界面活性剤もまた使用されてもよい。
【０２１８】
他の実施形態では、エアロゾル製剤は、その中で本発明の化合物が微細粉末として存在する乾燥粉末エアロゾル製剤として提供される。乾燥粉末製剤は、乳糖、ソルビトール、スクロース、及びマンニトールなど（これらに限定されない）の増量剤を更に含むことができる。
【０２１９】
別の特定の実施形態では、エアロゾル製剤は、液体エアロゾル製剤であり、これは、無菌水、生理食塩水、緩衝生理食塩水及びデキストロース溶液など（これらに限定されない）の薬学的に許容可能な希釈剤を更に含む。
【０２２０】
他の実施形態では、エアロゾル製剤は、本発明の少なくとも１つの追加的化合物を更に含み、この追加的化合物は、装置によって分散される計量された量のエアロゾル製剤が、本発明の少なくとも第１又は第２の化合物と組み合されて使用される場合、本明細書で開示される疾患又は障害の症状を軽減するのに有効である計量された量で追加的化合物の用量を含有するような濃度にて含まれる。
【０２２１】
従って、本発明は、アルコール依存症疾患又は障害などの薬物依存性疾患又は障害の外来患者治療のための自己投与法を提供する。かかる投与は、自己投与のために非医療関係者によって、病院内、診療所内、若しくは病院外又は診療所外で使用され得る。
【０２２２】
本発明の化合物は、鼻腔投与に適切な製剤又は医薬組成物で調製されるであろう。他の実施形態では、本発明の化合物は、薬剤の送達を容易にするための粘膜侵入増強剤と共に製剤化され得る。この製剤は、溶解性、薬剤安定性、鼻腔粘膜を通しての吸収性、及び他の留意点に関して最適化されたｐＨで調製され得る。
【０２２３】
吸入器又は吹入器での使用のためのカプセル、ブリスター、及びカートリッジは、本明細書で提供される医薬組成物の粉末混合物を含有するよう製剤化されてもよく、この粉末混合物は、乳糖又はデンプンなどの好適な粉末基剤、及び１−ロイシン、マンニトール、又はステアリン酸マグネシウムなどの性能改質剤を含む。乳糖は、無水物又は一水和物の形態であってもよい。他の好適な賦形剤としては、デキストラン、グルコース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、フラクトース、スクロース、及びトレハロースが挙げられる。吸入／鼻腔内投与のための本明細書に提供される医薬組成物は、メントール及びレボメントールなどの好適な風味剤、サッカリン又はサッカリンナトリウムなどの甘味剤を更に含んでもよい。
【０２２４】
吸入による投与については、本発明の方法による使用のための化合物は、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の好適なガスなどの好適な推進剤の使用を伴い、加圧パック又は噴霧器からのエアロゾルスプレー製品として好都合に供給される。加圧エアロゾルの場合、計量された量を送り込むためのバルブを備えることによって投与量単位を決めることができる。吸入器又は吹入器での使用のため、例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジは、薬剤と、乳糖又はデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含有するよう製剤化され得る。
【０２２５】
本明細書で使用するとき、「追加的成分」とは、限定されるものではないが、以下の１つ以上を含む：賦形剤；界面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；造粒及び崩壊剤；結合剤；滑沢剤；甘味剤；風味剤；着色剤；防腐剤；ゼラチンなどの生理学的に分解可能な組成物；水性ビヒクル及び溶媒；油性ビヒクル及び溶剤；懸濁剤、分散又は湿潤剤；乳化剤；粘滑剤；緩衝剤；塩：増粘剤；充填剤；乳化剤；酸化防止剤；抗菌剤；抗真菌剤；安定化剤；及び薬学的に許容可能なポリマー又は疎水性材料。本発明の医薬組成物中に含まれ得る他の「追加的成分」は、当該技術分野で既知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ゲナロ（Ｇｅｎａｒｏ）編集、１９８５年、「レミントンの薬学科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、Ｍａｃｋ出版社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）、イーストン、ペンシルバニアで記載されている。
【０２２６】
典型的には、動物、好ましくはヒトに投与され得る本発明の化合物の投与量は、動物の体重のキログラム当たり約１．０μｇ〜約１００ｇの量の範囲である。投与される正確な投与量は、限定されないが、処置される動物のタイプ及び疾患状態、動物の年齢並びに投与のルートを含む多くの要素に応じて変化するであろう。好ましくは、この化合物の投与量は、動物の体重のキログラム当たり約１ｍｇ〜約１０ｇで変化するであろう。より好ましくは、投与量は、動物の体重のキログラム当たり約１０ｍｇ〜約１ｇで変化するであろう。
【０２２７】
この化合物は、被験体に毎日数回程度投与されてもよく、又はこれは、一日１回、週一回、二週間毎に１回、一ヶ月に１回などのより低い頻度で、若しくは数ヶ月に１回又は更に一年に１回又はそれより少ないなど更に少ない頻度で投与されてもよい。投与の頻度は、当業者には明らかであろうし、限定されるものではないが、処置される疾患のタイプ及び深刻度、並びに動物のタイプ及び年齢などの多くの要素に依存するであろう。
【０２２８】
本発明はまた、本発明の化合物と、化合物の投与を説明する使用説明書とを備えるキットを含む。別の実施形態では、このキットは、哺乳類に化合物を投与する前に、本発明の化合物を溶解又は懸濁させるために好適な（好ましくは無菌の）溶媒を備える。
【０２２９】
本明細書で使用するとき、「使用説明書」とは、本明細書に記載された種々の疾患又は障害の軽減をもたらすために、キット内の本発明の化合物の有用性を伝えるよう使用され得る刊行物、レコーディング、図表、又は任意の表現の他の媒体を含む。任意選択的に、又はこの代わりに、使用説明書は、疾患又は障害の軽減の１つ以上の方法を記載する場合がある。本発明のキットの使用説明書は、例えば、本発明の同定された化合物を収容する容器に添付されてもよく、又は同定された化合物を収容する容器と併せて出荷されてもよい。或いは、使用説明書は、使用説明書及び化合物がレシピエントと協同的に使用されるとの意図で、容器とは別個に出荷されてもよい。
【０２３０】
更に説明しなくても、当業者であれば、前述の記載及び下記例示的実施例を用いて、本発明の化合物を製造しかつ利用し、主張された方法を実行することができると信じる。従って、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘するものであり、本開示の後段部分を何ら限定するものとして解釈されるものではない。
【実施例】
【０２３１】
材料及び方法
薬剤及び薬品
Ｒａｓ阻害剤として既知のＳ−トランス、トランス−ファルネシルチオサリチル酸（ＦＴＳ、サリラシブ）は、コンコルディア（Ｃｏｎｃｏｒｄｉａ）製薬（フロリダ州フォート・ローダーデール（Ｆｔ．Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅ））から入手した。４−（４−クロロ−２−メチルフェノキシ）−Ｎ−ヒドロキシブタナミド（ＣＭＨ）（５８０９３５４）及びその不活性類似体４−（４−クロロ−２−メチルフェノキシ）−Ｎ−（３−エトキシプロピル）ブタナミド（ＣＭＢ）（６０９４９１１）は、ケンブリッジ社（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（カリフォルニア州サンディエゴ市）から購入した。ＴＭＳは、以前記載されたように合成した（キム（Ｋｉｍ）Ｓ、コー（Ｋｏ）Ｈ、パーク（Ｐａｒｋ）ＪＥ、ジュング（Ｊｕｎｇ）Ｓ、リー（Ｌｅｅ）ＳＫ、チャン（Ｃｈｕｎ）ＹＪ著、「強力かつ選択的なヒトシトクロームＰ４５０  １Ｂ１阻害剤としての新規なトランス−スチルベン類似体の設計、合成及び発見（Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｔｒａｎｓ−ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  １Ｂ１  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」、「ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ）」、２００２年、第４５巻、ｐ．１６０〜１６４）。１７β−エストラジオールは、ステラロイド社（Ｓｔｅｒａｌｏｉｄｓ，Ｉｎｃ．）（ロードアイランド州ニューポート市）から入手した。Ｔ−ＤＭ１は、ジェネンテック社（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、カリフォルニア州サンフランシスコ市から寄贈された。タモキシフェン及びδ−トコトリエノールは、シグマ−アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）（ミズーリ州セントルイス市）から購入した。
【０２３２】
細胞培養条件
親株ＭＣＦ−７を５％のＦＢＳを含むＩＭＥＭ中で増殖させた。Ｔ４７Ｄ細胞は、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６０中で増殖させた。タモキシフェン耐性閉経後細胞は、５％のＤＣＣを含むフェノールフリーのＩＭＥＭ中で増殖させて、タモキシフェン（１０−７Ｍ）で１年を超える期間にわたり処置した［５］。長期無エストロゲン細胞は、５％のＤＣＣを含むフェノールフリーのＩＭＥＭ中で増殖させた［６］。アロマターゼを過発現するＬＴＥＤａｒｏ細胞を、チェン（Ｃｈｅｎ）博士［７］から賜り、１０％のＤＣＣ、１００ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び２００ｍｇ／ＬのＧ４１８を補充したフェノール−レッドフリーのＭＥＭ中で増殖させた。
【０２３３】
増殖阻害及び薬剤相互作用アッセイ
細胞を、各ウェル当たり６０，０００細胞の密度で６ウェルプレートに播種した。２日後に、細胞を、図の説明中に記載されたように三通りで処置した。処置の終わりに、細胞を生理食塩水で２回濯いだ。１ｍＬのＨＥＰＥＳ−ＭｇＣｌ２溶液（０．０１モル／ＬのＨＥＰＥＳと１．５ミリモル／ＬのＭｇＣｌ２）及び０．１ｍＬのＺＡＰ溶液［３％の氷酢酸（ｖ／ｖ）中０．１３モル／Ｌのエチルヘキサデシルジメチルアンモニウムブロマイドの連続的追加］によって核を調製し、コールターカウンター（ベックマンコールター社（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州フラートン市）を使用して計測した。用量反応曲線を三通りの試料から取得し、半数有効量（Ｄｍ）を、Ｃｏｍｐｕｓｙｎソフトウェアを使用して算定した［８、９］。併用係数及び平均及び標準偏差による値を、バイオソフト（Ｂｉｏｓｏｆｔ）（ケンブリッジ市、英国）のＣａｌｃｕＳｙｎコンピュータソフトウェアを使ったモンテカルロ・シミュレーションを使用して算定した［１０］。
【０２３４】
免疫沈降法
１００ｍｍの培養皿内で増殖された細胞を、冷ＰＢＳで洗浄し、１ｍｌの細胞溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、２５ｍＭのＮａＦ、２ｍＭのＮａＶＯ４、５％のグリセロール、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０μｇ／ｍｌのロイペクチン、アプロチニン、及びペプスタチン）で抽出した。試料を氷上で３０分間インキュベートし、超音波処理し、４℃において１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。０．５ｍｇの総タンパク質を含有する上澄み液を、４０μｌのタンパク質Ｇビーズ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））の添加の前に、標的タンパク質に対する抗体と共に、４℃で一晩インキュベートし、４℃で２時間インキュベーションを続けた。免疫複合体を有するタンパク質Ｇビーズを、１４，０００ｒｐｍで２０秒間遠心分離した。上澄み液を注意深く除去した。ビーズを１ｍｌの緩衝液ＩＩ（２０ｍＭのＭＯＰＳ、２ｍＭのＥＧＴＡ、５ｍＭのＥＤＴＡ、２５ｍＭのＮａＦ、４０ｍＭのβ−グリセロリン酸、１０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、２ｍＭのＮａＶＯ４、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭのＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌのロイペクチン、アプロチニン、及びペプスタチン）で２回洗浄し、次いで５０μｌの２×レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の緩衝液中で煮沸した。試料を１０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で電気泳動にかけて、その後イムノブロッティングした。
【０２３５】
併用係数及びアイソボログラム分析
薬剤間の相互作用の性質を、チョウ−タラレイ（Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｔａｌａｌａｙ）の併用係数方法［８、９］によって評価した。この方法は、半有効原理：
ｆａ／ｆｕ（Ｄ／Ｄｍ）ｍ  （１）
に基づいており、ここで、Ｄは用量であり、Ｄｍは５０％の増殖阻害を生じる用量であり、ｆａは用量Ｄによって影響を受けた細胞フラクションであり、及びｆｕは影響を受けないフラクションであり、並びにｍは半有効量曲線のシグモイド曲線性を定義する計数である。この関係及び質量作用の法則が複数の阻害剤の相互作用に関する一般式に導く：
（ｆａ）Ａ，Ｂ／（ｆｕ）Ａ，Ｂ＝（ｆａ）Ａ／（ｆｕ）Ｂ＋（ｆａ）Ｂ／（ｆｕ）Ｂ＋α（ｆａ）Ａ（ｆａ）Ｂ／（ｆｕ）Ａ（ｆｕ）Ｂ  （２）
ここで、（ｆａ）Ａ、（ｆｕ）Ｂ及び（ｆａ）Ａ，Ｂは、薬剤ＡおよびＢ単独で、並びにＡおよびＢの組み合わせで、影響を受けたフラクションである。式１及び２から、併用係数（ＣＩ）は；
ＣＩ＝（Ｄ）Ａ／（ＤＸ）Ａ＋（Ｄ）Ｂ／（ＤＸ）Ｂ＋α（Ｄ）Ａ（Ｄ）Ｂ／（ＤＸ）Ａ（ＤＸ）Ｂ  （３）
のように誘導され得る。
ここで、Ｄは、ｘ％の増殖阻害を生じる用量であり、相互排他的薬剤についてはα＝０であり、相互非排他的薬剤についてはα＝１である。ＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアによって計算され画定された相乗性はＣＩ＜１であり、相加性はＣＩ＝１であり、並びに拮抗性はＣＬ＞１である［１０］。
【０２３６】
統計的分析
併用係数の平均及び標準偏差値を、ＣａｌｃｕＳｙｎプログラム内のモンテカルロ・アルゴリズムを使用して算定した［１０］。
【０２３７】
本発明の実施形態
１．癌を治療する方法であって、癌に冒された患者に、モノクローナル抗体部分とそれに結合した第１の前アポトーシス薬部分とを含む免疫抱合体の有効量を投与することと、第２の前アポトーシス薬の有効量を同患者に投与することと、を含むことを特徴とする方法。
【０２３８】
２．実施形態１に記載の方法において、第１の前アポトーシス薬部分が、モノクローナル抗体部分に共有結合することを特徴とする方法。
３．実施形態１又は２に記載の方法において、癌が乳癌であることを特徴とする方法。
【０２３９】
４．実施形態３に記載の方法において、乳癌が、アロマターゼ耐性乳癌であることを特徴とする方法。
５．実施形態３に記載の方法において、乳癌が、タモキシフェン耐性乳癌であることを特徴とする方法。
【０２４０】
６．実施形態３に記載の方法において、乳癌が、ＥＲ＋ホルモン不応性乳癌であることを特徴とする方法。
７．実施形態３に記載の方法において、乳癌が、ＨＥＲ２陽性乳癌であることを特徴とする方法。
【０２４１】
８．実施形態５に記載の方法において、乳癌が、ＨＥＲ２陽性乳癌であることを特徴とする方法。
９．実施形態３に記載の方法において、乳癌が、その中でＨＥＲ２発現がアップレギュレートされる癌細胞を含むことを特徴とする方法。
【０２４２】
１０．実施形態１〜９に記載のいずれか１つの方法において、免疫抱合体が、ＨＥＲ２に結合することを特徴とする方法。
１１．実施形態９に記載の方法において、モノクローナル抗体部分が、トラスツズマブであることを特徴とする方法。
【０２４３】
１２．実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の方法において、第１の前アポトーシス薬部分が、微小管脱重合化剤であることを特徴とする方法。
１３．実施形態１２に記載の方法において、第１の前アポトーシス薬部分が、マイタンシノイド又はオーリスタチンであることを特徴とする方法。
【０２４４】
１４．実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の方法において、免疫抱合体が、リンカーを介してマイタンシノイド前アポトーシス薬部分に共有結合したトラスツズマブであることを特徴とする方法。
【０２４５】
１５．実施例１４に記載の方法において、免疫抱合体が、Ｔ−ＤＭ１であることを特徴とする方法。
１６．実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の方法において、第２の前アポトーシス薬が、第１の前アポトーシス薬部分によって及ぼされる細胞障害性の分子機構以外の分子機構によって、細胞毒性を及ぼすことを特徴とする方法。
【０２４６】
１７．実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の方法において、免疫抱合体及び第２の前アポトーシス薬を投与することが、相乗効果を有することを特徴とする方法。
１８．実施例１６に記載の方法において、第２の前アポトーシス薬が、外因性経路を介してアポトーシスを誘導する薬剤であることを特徴とする方法。
【０２４７】
１９．実施形態１８に記載の方法において、第２の前アポトーシス薬が、Ｆａｓ経路を介してアポトーシスを誘導することを特徴とする方法。
２０．実施形態１８に記載の方法において、第２の前アポトーシス薬が、ｃ−ＦＬＩＰ経路を介してアポトーシスを誘導することを特徴とする方法。
【０２４８】
２１．実施形態１８に記載の方法において、第２の前アポトーシス薬が、ＣＭＨ、Ｅ２、又はδ−トコトリエノールであることを特徴とする方法。
２２．実施形態１６に記載の方法において、第２の前アポトーシス薬が、内因性経路を介してアポトーシスを誘導する薬剤であることを特徴とする方法。
【０２４９】
２３．実施形態２２に記載の方法において、第２の前アポトーシス薬が、カスパーゼ非依存的経路を介してアポトーシスを誘導することを特徴とする方法。
２４．実施形態２２に記載の方法において、第２の前アポトーシス薬が、カスパーゼ依存的経路を介してアポトーシスを誘導することを特徴とする方法。
【０２５０】
２５．実施形態２２に記載の方法において、第２の前アポトーシス薬が、Ｅ２、ＦＴＳ、又はδ−トコトリエノールであることを特徴とする方法。
２６．実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の方法において、第２の前アポトーシス抗癌剤が、ＦＴＳ、ＣＭＨ、Ｅ２、ＴＭＳ、δ−トコトリエノール、又はクルクミンであることを特徴とする方法。
【０２５１】
２７．実施形態１〜２６のいずれか１つに記載の方法において、免疫抱合体がＴ−ＤＭ１であり、第２の前アポトーシス抗癌剤が、ＦＴＳ、ＣＭＨ、Ｅ２、ＴＭＳ、δ−トコトリエノール、又はクルクミンであることを特徴とする方法。
【０２５２】
２８．実施形態２７に記載の方法において、第２の前アポトーシス薬が、Ｅ２、ＦＴＳ、δ−トコトリエノール、又はＴＭＳであることを特徴とする方法。
２９．実施形態２７に記載の方法において、第２の前アポトーシス薬が、ＦＴＳであることを特徴とする方法。
【０２５３】
３０．実施形態２７に記載の方法において、免疫抱合体及び第２の前アポトーシス薬を投与することが、相乗効果を有することを特徴とする方法。
３１．実施形態１〜３０のいずれか１つに記載の方法において、免疫抱合体の投与後に、リンカー部分が、ＨＥＲ−２耐性乳癌細胞内においてインビボで切断されることを特徴とする方法。
【０２５４】
３２．アロマターゼ耐性乳癌に冒された患者におけるアロマターゼ耐性乳癌の治療を含む実施形態１に記載の方法において、ＦＴＳ、ＣＭＨ、Ｅ２、ＴＭＳ、δ−トコトリエノール、又はクルクミン、若しくはこれらの任意の組み合わせの有効量と併せてＴ−ＤＭ１の有効量を患者に投与することを含むことを特徴とする方法。
【０２５５】
３３．実施形態１〜３２のいずれか１つに記載の方法において、この方法が、アジュバント療法であることを特徴とする方法。
３４．実施形態１〜３２のいずれか１つに記載の方法において、この方法が、第１選択療法であることを特徴とする方法。
【０２５６】
３５．実施形態１〜３２のいずれか１つに記載の方法において、この方法が、第２選択療法であることを特徴とする方法。
３６．実施形態１〜３５のいずれか１つに記載の方法において、免疫抱合体と第２の前アポトーシス薬が、組み合わせ製剤として又は交互に投与されることを特徴とする方法。
【０２５７】
３７．実施形態１〜３６のいずれか１つに記載の方法において、患者に追加的抗癌剤を投与する工程であって、前記追加的抗癌剤が、任意選択的に第１の前アポトーシス抗癌剤部分の分子機構とは異なり、かつ第２の前アポトーシス抗癌剤の分子機構とは異なる分子機構を介して効果を及ぼす前記工程、或いはＸ線、γ線、放射核種の放射、又は亜原子的粒子、若しくはこれらの任意の組み合わせを含むイオン化放射線の患者への投与工程、を更に含むことを特徴とする方法。
【０２５８】
３８．治療用組成物であって、（ａ）第１の前アポトーシス薬部分に結合したモノクローナル抗体部分を含む免疫抱合体と、（ｂ）第２の前アポトーシス薬を含むことを特徴とする組成物。
【０２５９】
３９．実施形態３８に記載の組成物において、共有結合免疫抱合体が、Ｔ−ＤＭ１であることを特徴とする組成物。
４０．実施形態３８に記載の組成物において、第２の前アポトーシス抗癌剤が、ＦＴＳ、ＣＭＨ、Ｅ２、ＴＭＳ、δ−トコトリエノール、又はクルクミンであることを特徴とする組成物。
【０２６０】
本明細書で引用されたそれぞれの及び全ての特許、特許出願、公開物の開示は、その全体が、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
表題は参照にために並びに特定のセクションを確認する際に補助するために、本明細書に含まれる。これら表題は、その中で記載される概念の範囲を限定するよう意図されるものではなく、これら概念は、明細書の全体を通して他のセクションにおける適応性を有し得る。
【０２６１】
本発明が特定の実施形態を参照して開示されてきたが、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の他の実施形態及び変種が当業者によって考案され得ることは明白である。
【０２６２】
【表３】
2014513692.tif 000020
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【図１Ａ】
2014513692.tif 000024
【図１Ｂ】
2014513692.tif 000025
【図１Ｃ】
2014513692.tif 000026
【図１Ｄ】
2014513692.tif 000027
【図１Ｅ】
2014513692.tif 000028
【図１Ｆ】
2014513692.tif 000029
【図２Ａ】
2014513692.tif 000030
【図２Ｂ】
2014513692.tif 000031
【図３Ａ】
2014513692.tif 000032
【図３Ｂ】
2014513692.tif 000033
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2014513692.tif 000035
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2014513692.tif 000041
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2014513692.tif 000043
【図５Ｅ】
2014513692.tif 000044
【図５Ｆ】
2014513692.tif 000045
【図５Ｇ】
2014513692.tif 000046
【図５Ｈ】
2014513692.tif 000047
【図５Ｉ】
2014513692.tif 000048
【図５Ｊ】
2014513692.tif 000049
【図６Ａ】
2014513692.tif 000050
【図６Ｂ】
2014513692.tif 000051
【図６Ｃ】
2014513692.tif 000052
【図６Ｄ】
2014513692.tif 000053
【図６Ｅ】
2014513692.tif 000054
【図６Ｆ】
2014513692.tif 000055
【図７ＡＡ】
2014513692.tif 000056
【図７ＡＢ】
2014513692.tif 000057
【図７ＡＣ】
2014513692.tif 000058
【図７ＡＤ】
2014513692.tif 000059
【図７ＡＥ】
2014513692.tif 000060
【図７ＡＦ】
2014513692.tif 000061
【図７ＡＧ】
2014513692.tif 000062
【図７ＡＨ１】
2014513692.tif 000063
【図７Ｈ２】
2014513692.tif 000064
【図７ＡＩ】
2014513692.tif 000065
【図７ＢＪ】
2014513692.tif 000066
【図７ＢＫ】
2014513692.tif 000067
【図７ＢＬ】
2014513692.tif 000068
【図７ＢＭ】
2014513692.tif 000069
【図７ＢＮ】
2014513692.tif 000070
【図７ＢＯ】
2014513692.tif 000071
【図７ＢＰ】
2014513692.tif 000072
【図７ＢＱ】
2014513692.tif 000073
【図７ＢＲ】
2014513692.tif 000074
【図７ＢＳ】
2014513692.tif 000075
【図８Ａ】
2014513692.tif 000076
【図８Ｂ】
2014513692.tif 000077
【図８Ｃ】
2014513692.tif 000078
【図８Ｄ】
2014513692.tif 000079
【図８Ｅ】
2014513692.tif 000080
【図８Ｆ】
2014513692.tif 000081
【図９Ａ】
2014513692.tif 000082
【図９Ｂ】
2014513692.tif 000083
【図９Ｃ】
2014513692.tif 000084
【図９Ｄ】
2014513692.tif 000085
【図９Ｅ】
2014513692.tif 000086
【図９Ｆ】
2014513692.tif 000087
【図９Ｇ】
2014513692.tif 000088
【図９Ｈ１】
2014513692.tif 000089
【図９Ｈ２】
2014513692.tif 000090
【図９Ｉ】
2014513692.tif 000091
【国際調査報告】
2014513692.tif 000092
2014513692.tif 000093