(57)【要約】本発明は、ＮＩＫタンパク質のインヒビターのスクリーニングおよび同定のための細胞ベースのアッセイに関する。本発明の方法は、ＩＫＫ１のリン酸化に関するＮＩＫ活性を阻害する化合物の同定を可能にする。前記アッセイは、トランスフェクトヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞の使用を、「アクセプター」ビーズおよび「ドナー」ビーズを用いた非放射性のホモジニアス近接アッセイと組み合わせる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＩＫ活性を阻害する化合物を同定する方法であって、
（ａ）培養培地においてＮＩＫをコードするＤＮＡおよびＩＫＫ１−ＫＤをコードするＤＮＡを含有するＨＥＫ細胞（トランスフェクトＨＥＫ細胞）を提供すること；
（ｂ）該トランスフェクトＨＥＫ細胞を、試験されるべき候補分子有り無し両方で、３７℃＋／−２℃の温度で、５％ＣＯ２の存在下、２４時間インキュベートすること；
（ｃ）前記培養培地を除去すること；
（ｄ）前記細胞を溶解すること；
（ｅ）前記細胞溶解物にアクセプター複合体、続いてドナー複合体を添加すること；
（ｆ）レーザー照射により前記細胞溶解物を励起させること；ならびに
（ｇ）ビーズベースの発光近接検出システムを用いて、細胞溶解物のレーザー励起に伴って生じるシグナルを計測すること
を含む、
ここで、試験化合物の存在下で培養されたトランスフェクトＨＥＫ細胞に由来する細胞溶解物から得られたシグナルの低下または欠如は、ＩＫＫ１−ＫＤのＮＩＫ媒介リン酸化の阻害を示し、前記アクセプター複合体は、分子コーティングされたビーズおよび前記ＩＫＫ１−ＫＤタンパク質に結合する結合パートナーを含み、前記ドナー複合体は、分子コーティングされたビーズおよび前記ＩＫＫ１−ＫＤタンパク質に結合する結合パートナーを含む、
前記方法。
【請求項２】
試験化合物の非存在下で培養されたトランスフェクトＨＥＫ細胞に由来する細胞溶解物から得られたシグナルと比較した、試験化合物の存在下で培養されたトランスフェクトＨＥＫ細胞に由来する細胞溶解物から得られたシグナルの低下が、ＩＫＫ１−ＫＤのＮＩＫ媒介リン酸化の低下を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＮＩＫをコードするＤＮＡおよびＩＫＫ１−ＫＤをコードするＤＮＡが、ＨＥＫ細胞に、ＮＩＫをコードするＤＮＡを含有する第一の発現ベクターおよびＩＫＫ１−ＫＤをコードするＤＮＡを含有する第二の発現ベクターをトランスフェクトすることによって、該ＨＥＫ細胞内に挿入される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
アクセプター複合体の分子コーティングされたビーズが、プロテインＡでコーティングされたビーズであり、アクセプター複合体の結合パートナーが、ＩＫＫ１−ＫＤのＳｅｒ−１７６残基のリン酸化形態に特異的に結合する抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ドナー複合体の分子コーティングされたビーズが、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズであり、ドナー複合体の結合パートナーが、ＩＫＫ１−ＫＤに結合するビオチン化抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ビーズベースの発光近接検出システムが、AlphaScreen検出システムである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
細胞毒性アッセイにおいてＮＩＫ阻害活性を示す候補分子を試験する工程をさらに含み、これにより細胞毒性効果に関連するＮＩＫ阻害活性を有する候補分子を、細胞毒性効果に関連しないＮＩＫ阻害活性を有する候補分子から区別することを可能にする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＩＫタンパク質のインヒビターのスクリーニングおよび同定のための細胞ベースのアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
転写因子の核因子−カッパーＢ（ＮＦ−κＢ）ファミリーは、免疫応答、炎症、細胞死および生存率を含む種々の生物学的なプロセスに関与する、構造的に関係するタンパク質の集合からなる（Thu Y.M. and Richmond A. Cytokine & Growth Factor Rev 2010, 21:213-226）。
【０００３】
哺乳類のＮＦ−κＢファミリーは、ｐ６５（ＲｅｌＡとしても知られる）、ｐ５０（ＮＦ−κＢ１としても知られる）、ｐ５２（ＮＦ−κＢ２としても知られる）、ＲｅｌＢおよびｃ−Ｒｅｌを含む５つのメンバーを含み、これらは、κＢエンハンサーへの結合を通じて種々の下流遺伝子標的の転写および発現を調節することができる、いくつかのダイマー複合体を形成する。ＮＦ−κＢの典型的な形態は、ｐ５０／ｐ６５ヘテロダイマーからなる。かかる複合体は、κＢタンパク質のインヒビター（ＩκＢ）のメンバー、特にＩκＢαに結合している限り、細胞質において不活性の形態で通常隔絶される(Sun S.C., Cell Res 2011, 21:71-85)。
【０００４】
現在、ＮＦ−κＢの活性化を制御する２つの主な経路、すなわち、古典的経路および非古典的経路が知られている。良く知られた限界ＮＦ−κＢ経路は、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＣＤ４０Ｌなどの炎症誘発性サイトカインを含む広範な細胞外刺激により始動される。この経路は、典型的には、ＩκＢのメンバーをリン酸化するκＢキナーゼトリマー複合体キナーゼのインヒビター（ＩＫＫα、−βおよび−γ）により媒介され、これは次々にユビキチン化およびプロテアソームによるＩκＢの完全分解へと導き、放出されたＲｅｌＡ／ｐ５０ヘテロダイマーを核内へ移行させて遺伝子転写を開始させる（Hayden M.S. et al., Cell 2008, 132:344-362; Vallabhapurapu S. et al., Annu Rev Immunol 2009, 27:693-733）。
【０００５】
良く知られた古典的経路に加え、非古典的経路もまた存在する。この代替的なＮＦ−κＢ活性化経路は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）またはリンフォトキシンβ受容体（ＬＴβＲ）のためのリガンドなどの腫瘍壊死因子リガンド（ＴＮＦＬ）ファミリーメンバーのサブセットによって誘導される。実験的証拠は、この経路が、二次リンパ器官発達、Ｂ細胞生存率および成熟ならびに適応免疫に関与する特定のケモカインの誘導などの多くの生物学的プロセスを調節するのに重要であることを示唆する（Dejardin E., Biochem Pharmacol 2006, 72:1161-1179）。
【０００６】
この経路は、ＩＫＫαおよびＮＦカッパーＢ誘導キナーゼ（ＮＩＫ）タンパク質によりｐ１００前駆体タンパク質を成熟ｐ５２へのプロセシングを誘導することによる、ＲｅｌＢ／ｐ５２複合体の活性化を含む。両キナーゼは、ＩκＢ様Ｃ末端部分を含有する結果ＮＦ−κＢインヒビターとして機能するｐ１００をリン酸化し、これはｐ１００タンパク質の部分的なタンパク質分解へと導き、ｐ５２の活性形態を得る。よって、ｐ１００のプロセシングは、ｐ５２を生じさせることおよびＲｅｌＢ／ｐ５２ヘテロダイマーの核移行を誘導させることの両方を担う（Coope H.J. et al., EMBO J 2002, 15:5375-5385）。
【０００７】
ドミナントネガティブ変異体の過剰発現を用いて、ＮＩＫが、ＴＮＦαおよびＩＬ−１受容体の下流の近接シグナル伝達を媒介するキナーゼとして初めて同定され、このプロセスのために、ＮＩＫのキナーゼ活性が要求される（Malinin N.L. et al., Nature 1997, 385:540-544）。ＮＩＫはまた、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＬＴβＲおよびＢＡＦＦＲなどの他の受容体を通じた刺激を媒介する。過剰発現された場合、ＮＩＫは、ＮＦ−κＢの活性化を導くことから、細胞をＴＮＦα誘導アポトーシスを経ることから保護することとなる。
【０００８】
ＮＩＫが、ＩＫＫαおよびＩＫＫβと相互作用し、これらを活性化することが、実証されている。しかしながら、ＮＩＫは、ＩＫＫβよりも多くＩＫＫαをリン酸化する。よって、ＮＩＫは、種々のサイトカイン受容体の近接シグナル伝達の原因となる、上流ＩＫＫ複合体キナーゼとして働く。
【０００９】
ＩＫＫα（ＩＫＫ１としてもまた知られる）は、ＮＩＫにとって優先的な基質である。ＮＩＫは、Ｓｅｒ−１７６でＩＫＫαを直接的にリン酸化し、そして、この残基のアラニンへの変異がＩＫＫαのＮＩＫ活性化を防ぐことから、ＩＬ−１およびＴＮＦα刺激からのシグナルを妨害することとなる（Ling L. et al., Proc Natl Acad Sci 1998, 95:3792-3797）。
【００１０】
ＩＫＫαとの優先的な相互作用から、ＮＩＫが、ＩＫＫβよりもＩＫＫαにとって重要なキナーゼであること、および、ＮＩＫが、非古典的経路のみに必須であることが推定できる。しかしながら、インデューサーおよびおよび細胞のタイプに依っては、ＮＩＫは、古典的および非古典的ＮＦ−κＢ経路の両方において役割を果たす。マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）と、ＮＩＫノックアウトまたは天然起源のＮＩＫ欠損変異体であるリンパ形成不全（aly/aly）とともに用いる研究からのデータは、この考えを支持する（Shinkura R. et al., Nature Genetics 1999, 22:74-77）。
【００１１】
ＮＩＫがｐ１００のｐ５２へのプロセシングに必要とされることから、非古典的経路におけるその役割の確認となる（Xiao G. et al., Mol Cell 2001, 7:401-409）。ＮＩＫまたはＩＫＫαのキナーゼ活性は、両方のキナーゼへのｐ１００の動員には必要ではないが、リガンド誘導タンパク質分解を起こすためには必要とされる（Xiao G. et al., J Biol Chem 2004, 279:30099-30105）。驚くべきことに、ＮＩＫは、ｐ１００のｐ５２への恒常的プロセシングには必要とされない。ＮＩＫがｐ１００のｐ５２へのプロセシングを制御する機構は、その安定性によるものである。ＣＤ４０ＬまたはＢＡＦＦなどのリガンドでの刺激に際し、基本的に、翻訳されたＮＩＫは、ｐ１００のｐ５２へのプロセシングを誘導するために安定化される（Qing G. et al., J Biol Chem 2005, 280(49):40578-82）。
【００１２】
要約すると、ＮＩＫは、古典的経路において機能するキナーゼだが、特定のリガンドに応答するＮＦ−κＢの活性化にしか必要とされない。この選択的な必要条件の生理学的意義は、理解しづらいままである。恐らく、ＮＩＫは、ＮＦ−κＢの古典的および非古典的経路の十字路にたたずみ、これら２つの経路の間のポジティブおよびネガティブな調節バランスを維持するものであろう。例えば、ＮＩＫは、古典的経路を活性化し、したがって恐らくＮＦ−κＢファミリーの４番目のＩκＢであるｐ１００の産生を誘導する（ネガティブフィードバック機構）。ＮＩＫは、ＲｅｌＡ／ｐ５０などのＮＦ−κＢヘテロダイマーを、遺伝子転写を活性化させるために遊離させる（ポジティブフィードバック機構）ため、ＮＩＫは、同時に、このＩκＢをプロセシングするための原因となるキナーゼである。したがって、ＮＩＫが、ＮＦ−κＢ活性化においてダイナミックな役割を果たし、ＮＦ−κＢの古典的および非古典的調節の間の複雑なバランスを協調させることが、ことのほか明らかとなってきた。
【００１３】
多くの疾患、特に炎症／自己免疫疾患に関する生物学的プロセスの調節においてＮＩＫが有し得る重要な役割がために、ＮＩＫのための一連の生化学的および細胞ベースのアッセイが報告されている。
【００１４】
Ling L. et al.（Proc Natl Acad Sci 1998, 95:3792-3797）は、ＦＬＡＧ−ＮＩＫ−ｗｔおよびＦＬＡＧ−ＩＫＫ−α（kinase-dead）をコードする発現プラスミドで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ細胞の使用を開示する。３６時間トランスフェクションの後、免疫精製されたタンパク質は、γ−［３２Ｐ］−ＡＴＰでインキュベートされ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、そしてオートジオグラフィーによって解析された。これらの研究は、ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−α（kinase-dead）のＦＬＡＧ−ＮＩＫ−ｗｔ特異的リン酸化が起こったことを示した。さらなる実験が、ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−α（ｋｄ）−Ｓ１７６Ａ、ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−α（ｋｄ）−Ｔ１７９ＡおよびＦＬＡＧ−ＩＫＫ−α（ｋｄ）−Ｓ１８０Ａを基質として用いて行われ、これらは主要なＮＩＫ媒介リン酸化部位がＩＫＫ−α（ｋｄ）のＳｅｒ−１７６であることを示した。このアッセイがＦＬＡＧ−ＩＫＫ−α（ｋｄ）の全てのリン酸化現象を検出する潜在能力を有することから、タンパク質発現およびさらなるシグナル伝達現象が起こったとした場合に、３６時間のトランスフェクションの間にＦＬＡＧ−ＩＫＫ−α（ｋｄ）のＳｅｒ−１７６の特定のリン酸化がどの程度起こっていたか不明であり、はたまた、このアプローチがハイスループットのインヒビター発見の影響を受けやすいかどうかも不明である。
【００１５】
US 6,841,556は、種々のin vitroアッセイ系において、ＮＩＫを阻害する一連のピラゾロイソキノリン誘導体の能力を開示する。しかしながら、そのin vitroＮＩＫアッセイの詳細は提供されていない。
【００１６】
WO/2009/158011は、化学発光（ＣＬ）およびホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）の形式に基づいた、一連のin vitroＮＩＫ自己リン酸化アッセイを開示する。両形式は、全長のタンパク質と比べて実質的に増加した自己リン酸化活性を伴う、触媒ドメインのみを含有するＮＩＫのトランケート形態を利用した。ＮＩＫタンパク質は、バキュロウイルス発現系において発現され、精製され、ビオチン化された。ＣＬアッセイのために、５０ｎＭのビオチン化ＮＩＫは、化合物および５０μＭのＡＴＰとともに、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４０ｍＭのＭｇＣｌ２および１．５ｍＭのＤＴＴを含有するバッファーにおいて、室温で１時間インキュベートされた。次に、反応混合物は、ストレプトアビジンがコーティングされたプレートに固定化され、ＮＩＫの自己リン酸化活性が、抗ホスホセリン／スレオニン抗体およびホースラディッシュペルオキシダーゼがコンジュゲートされた二次抗体とともに検出された。
【００１７】
ＨＴＲＦアッセイのために、１０ｎＭのＮＩＫは、化合物とともに、２０、１００、２００、または５００μＭのＡＴＰの存在下で、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２％のTween 20および１ｍＭのＤＴＴを含有するバッファーにおいて、室温で２時間インキュベートされた。反応は、５ｍＭのＥＤＴＡ、１２．５ｎｇ／ｍｌのＥｕ標識抗ホスホセリン／スレオニン抗体および１ｎＭのストレプトアビジン−Alexa647を添加することにより停止された。２時間インキュベートした後、蛍光が６１５ｎｍおよび６６５ｎｍにおいて測定され、その一方で特定の酵素活性が、６６５ｎｍと６１５ｎｍとのシグナル比によって計算された。これらのアッセイがトランケートＮＩＫタンパク質を利用するため、インヒビターのスクリーニングは、この現象を防ぐ分子を検出するにとどまる。
【００１８】
Mortier, J. et al.（Bioorg & Med Chem Lett 2010, 20:4515-4520）は、ProQinase 33PanQinase技術を用いたin vitroＮＩＫアッセイの使用を開示する。ＮＩＫは、Ｓｆ９昆虫細胞においてヒト組換えＧＳＴ融合タンパク質として発現され、ＧＳＨアガロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。ＮＩＫの純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ／銀染色によってチェックされ、その同一性は質量分析によって検証された。ＮＩＫ活性は、アミノ酸Ｓ７７３−Ｋ９２８からなるヒト網膜芽タンパク質ＲＢ１の断片からトロンビン切断部位で分離されるＮ末端ＧＳＴ標識、それに続く１１個のＡｒｇ残基（ＥＲ）およびペプチド配列ＫＫＫＶＲＳＧＬＹＲＳＰＳＭＰＥＮＬＮＲＰＲ（ＣＨＫｔｉｄｅ）からなる、E. Coliで発現される人工融合タンパク質である人工基質ＲＢＥＲ−ＣＨＫｔｉｄｅへの３３Ｐの取り込みによって測定された。このアッセイが人工基質を利用するため、インヒビターのスクリーニングにおけるその使用が生理学的に関連性のあるであろう分子の検出を可能にするのか不明である。
【００１９】
Hassan, N.J. et al.（Biochem J 2009, 419:65-73）は、バキュロウイルス感染Ｓｆ９昆虫細胞の、その下流基質ＦＬＡＧ−ＩＫＫα−（ｋｄ）のＳｅｒ−１７６／Ｓｅｒ−１８０のＦＬＡＧ−ＮＩＫ−ｗｔ媒介リン酸化を監視するための使用を開示する。このアッセイは、ＩＫＫαのＳｅｒ−１７６／Ｓｅｒ−１８０に対する特定の抗体を利用した、３８４ウェルマイクロタイタープレートにおける時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）の形式であった。このアッセイは、キナーゼに焦点を当てた小分子ライブラリに対するスクリーニング目的として用いられた。いくつかの明らかなＮＩＫインヒビターがスクリーニングキャンペーンによって同定され、それらから選択されたものはさらに解析され、そのうちの１つは、無細胞毒性であることが示され、蛍光偏光アッセイにおいてＮＩＫと直接的に相互作用し、かつリンフォトキシンに誘導されるｐ５２の核への移行を阻害した。これは、昆虫細胞系が真正のＮＩＫインヒビターを同定することができることの強い支持を提供したものの、細胞のバックグラウンドはヒトではなかった。
【００２０】
ＮＩＫインヒビターを同定するための、頑強で生理学的に関連性のあるアッセイへの需要が存在する。かかるアッセイは、現在入手できる解析機器装置を用いて容易かつ迅速に実施できることが望まれる。今のところ、アプローチは、ＩＫＫαを基質として用いたin vitro活性を伴う全長のＮＩＫ酵素を産生することができていない。自己リン酸化を経る昆虫細胞ではＮＩＫのトランケート型を発生することができるが、これらの変異体はＩＫＫαをリン酸化しない。したがって、このアッセイにおけるインヒビターがin vivoにおいて関連性を有するかは、不確かである。
【００２１】
この頑強性を欠いたＮＩＫ特異的アッセイは、この潜在的に重要な疾患標的に対する既知インヒビターの欠乏の主要な原因であり、今のところ、そのような化合物は少数しか報告されていない（Mortier J. et al., Bioorg & Med Chem Lett 2010, 20:4515-4520; WO/2009/158011）。例えば、最初にクレームされるＮＩＫインヒビターは、現在、ＮＦ−κＢシグナル伝達カスケードの他の場所で標的に影響を及ぼすことが知られており、これは、これらの化合物が細胞ベースのリポーターアッセイを用いて発見されたことを示唆する。
【発明の概要】
【００２２】
本発明の目的は、ＮＩＫインヒビター、すなわち、ＮＩＫ活性を阻害する候補分子のスクリーニングおよび同定に有用な細胞ベースのアッセイを提供することである。
【００２３】
本発明の方法は、ＩＫＫ１のリン酸化に関するＮＩＫ活性を阻害する化合物の同定を可能にする。アッセイは、トランスフェクトヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞の使用を、「アクセプター」ビーズおよび「ドナー」ビーズを用いる非放射性のホモジニアス近接アッセイと組み合わせる。ＨＥＫ細胞に、全長のヒトＮＩＫタンパク質をコードするＤＮＡおよびＩＫＫ１の変異型をコードするＤＮＡを含有する、少なくとも１つの発現ベクターをトランスフェクトする。変異ＩＫＫ１タンパク質基質は、ＫＤ（Kinase Dead）変異とも称されるＫ４４Ａ変異を含有する。Ｋ４４Ａ変異は、全長のＮＩＫの天然基質のタンパク質であるＩＫＫ１を、Ｓｅｒ−１７６残基において自己リン酸化ができないものにさせる（Nakano H. et al., Proc Natl Acad Sci 1998, 95:3537-3542）。トランスフェクトＨＥＫ細胞を、ＮＩＫおよび変異ＩＫＫ１タンパク質の産生を可能にする条件下で培養する。ＮＩＫは、Ｓｅｒ−１７６残基においてＩＫＫ１を特異的にリン酸化するため、ＩＫＫ１−ＫＤ変異タンパク質の基質としての使用は、ＮＩＫを媒介する基質のリン酸化をもたらすことにしかならない。したがって、ＩＫＫ１−ＫＤリン酸化の阻害は、ＮＩＫにおける阻害効果を有する化合物の同定を可能にする。
【００２４】
本発明のアッセイにおいて、ＮＩＫおよびＩＫＫ１−ＫＤを含有するトランスフェクトＨＥＫ細胞を、ウェルプレートにおいて培養する。細胞培養を、好ましくは３７℃に近い温度で５％ＣＯ２の存在下で好適な時間実施する。温度を、試験されるべき化合物（候補分子）のトランスフェクトＨＥＫ細胞への透過を促進し、かつ、生存ＨＥＫ細胞を維持するように選択する。そして、候補分子の、ＩＫＫ１−ＫＤのＮＩＫ媒介リン酸化を阻害する能力を、ビーズベースの発光近接システム(bead based luminescent proximity system)の使用により検出する。
【００２５】
ビーズベースの発光近接システムにおいて、試薬コーティングされた（マイクロ）ビーズのドナーとアクセプターとのペアは、これらのビーズに固定化された結合パートナーの生体分子的相互作用によって近接する。
【００２６】
アクセプタービーズのドナービーズへの近接は、これらに結合する分子の生物学的相互作用に依存する。最も一般的なアッセイは、一方の結合パートナーをドナービーズへ、および他方のパートナーをアクセプタービーズへ捕えることによって構築される。同一の基質と相互作用することでパートナーらが近接する場合、レーザー励起に際し電磁エネルギーがドナービーズからアクセプタービーズへ移動し、シグナルが生じる。そして、シグナルを、Envision 2103 Multilabel Readerなどの任意の好適な手段を通じて検出する。かかる技術の利点は、極めて高い感度、極めて低いシグナルバックグラウンド、高いシグナル／バックグラウンド比、小型化および対費用効果である。
【００２７】
本発明のアッセイによって、候補分子のスクリーニングを達成する単純で敏感でかつ迅速な手法が、基質としてのＩＫＫ１に対するＮＩＫインヒビターを同定することが可能になる。本発明において、用語「アッセイ」および「方法」は、互換的に用いられる。
【００２８】
略称
−  ＨＥＫ：ヒト胎児由来腎臓
−  Ｓｆ９細胞：Spodoptera frugiperda細胞
−  ｆｌ：全長
−  ＫＤ／ｋｄ：kinase dead
−  Ｋ４４Ａ：Ｌｙｓ−４４−Ａｌａ変異体（kinase dead）
−  ＮＩＫ：ＮＦ−κＢ誘導キナーゼ
−  ＮＩＫ−ｆｌ：全長ＮＦ−κＢ誘導キナーゼ
−  ＩＫＫ−α：ＮＦ−κＢキナーゼサブユニットアルファのインヒビター
−  ＩＫＫ−β：ＮＦ−κＢキナーゼサブユニットベータのインヒビター
−  ＩＫＫ１−ＫＤ：kinase dead全長ＩＫＫ−α
−  ＦＬＡＧ−ＩＫＫα（ｋｄ）：kinase deadＦＬＡＧ標識ＩＫＫ−α
−  ＦＬＡＧ−ＩＫＫα（ｋｄ）−Ｓ１７６Ａ：kinase deadＦＬＡＧ標識ＩＫＫα  Ｓｅｒ−１７６−Ａｌａ変異体
−  ＦＬＡＧ−ＩＫＫα（ｋｄ）−Ｔ１７９Ａ：kinase deadＦＬＡＧ標識ＩＫＫα  Ｔｈｒ−１７９−Ａｌａ変異体
−  ＦＬＡＧ−ＩＫＫα（ｋｄ）−Ｓ１８０Ａ：kinase deadＦＬＡＧ標識ＩＫＫα  Ｓｅｒ−１８０−Ａｌａ変異体
−  ｈＮＩＫ１−ｆｌ−ｗｔ−ｐＦｌａｇＮ：野生型ＦＬＡＧ標識全長ヒトＮＩＫプラスミド
−  ｈＮＩＫ１−ｆｌ−ｗｔ−ＦｌａｇＮ：野生型全長ＦＬＡＧ標識ヒトＮＦ−κＢ誘導キナーゼ
−  ＩＫＫ１−ＫＤ−ｐＦｌａｇＮ：kinase deadＦＬＡＧ標識ＩＫＫ−１プラスミド
−  ＩＫＫ１−ＫＤ−ＦｌａｇＮ：kinase deadＦＬＡＧ標識ＩＫＫ−α
−  AlphaScreen：増幅発光近接ホモジニアスアッセイ
−  AlphaScreen SureFire ＩＫＫα（リン酸−Ｓｅｒ−１７６／１８０）アッセイキット：細胞におけるＳｅｒ−１７６／１８０リン酸化ＩＫＫαタンパク質を定量するためのAlphaScreenキット
−  図１９（Ａ）において描写された分子に関する化合物Ａ
−  図１９（Ｂ）において描写された分子に関する化合物Ｂ
−  図１９（Ｃ）において描写された分子に関する化合物Ｃ
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】（Ａ）一重トランスフェクト、二重トランスフェクトおよび非トランスフェクトＨＥＫ細胞（ｈＮＩＫ１−ｆｌ−ｗｔ−ｐＦｌａｇＮおよびＩＫＫ１−ＫＤ−ｐＦｌａｇＮプラスミド）の２４時間後のAlphaScreen SureFire ＩＫＫα（リン酸−Ｓｅｒ１７６／１８０）読取値；（Ｂ）（Ａ）と同じだが、４８時間トランスフェクション。AlphaScreenシグナルは、ＨＥＫ細胞にｈＮＩＫ１−ｆｌ−ｗｔ−ｐＦｌａｇＮおよびＩＫＫ１−ＫＤ−ｐＦｌａｇＮプラスミドを二重トランスフェクトしたときにのみ観察された。
【図２】ｈＮＩＫ１−ｆｌ−ｗｔ−ｐＦｌａｇＮおよびＩＫＫ１−ＫＤ−ｐＦｌａｇＮプラスミドを二重トランスフェクトしたＨＥＫ細胞の免疫細胞化学。
【００３０】
【図３】（Ａ）リン酸化ＩＫＫ１−ＫＤ−ＦｌａｇＮのAlphaScreenシグナル、対、ｈＮＩＫ１−ｆｌ−ｗｔ−ｐＦｌａｇＮおよびＩＫＫ１−ＫＤ−ｐＦｌａｇＮプラスミドを２４時間JetPEI二重トランスフェクトしたＨＥＫ細胞の総ＤＮＡ（Ｂ）ｈＮＩＫ１−ｆｌ−ｗｔ−ｐＦｌａｇＮおよびＩＫＫ１−ＫＤ−ｐＦｌａｇＮプラスミドを２４時間JetPEI二重トランスフェクトしたＨＥＫ細胞の０．０６２５〜１０μｇ／ｍｌ総ＤＮＡでの化合物Ａの用量反応。
【図４−１】二重jetPEI ｈＮＩＫ１−ｆｌ−ｗｔ−ｐＦｌａｇＮおよびＩＫＫ１−ＫＤ−ｐＦｌａｇＮトランスフェクトＨＥＫ細胞を用いた化合物の用量反応曲線（Ａ）実験１：リン酸化ＩＫＫ１−ＫＤ−ＦｌａｇＮの２４時間でのAlphaScreenシグナル；（Ｂ）実験１：リン酸化ＩＫＫ１−ＫＤ−ＦｌａｇＮの４８時間でのAlphaScreenシグナル；
【図４−２】（Ｃ）実験２：リン酸化ＩＫＫ１−ＫＤ−ＦｌａｇＮの２４時間でのAlphaScreenシグナル；（Ｄ）CellTiter-Gloアッセイを用いた細胞生存率研究。
【００３１】
【図５】トランスフェクトＨＥＫ細胞のＤＭＳＯ耐性。
【図６】AlphaScreen検出試薬の添加後３時間および１６時間での、ＡlphaScreenシグナル安定性査定。
【図７】（Ａ）３８４ウェルマイクロタイタープレートにおけるＨＥＫ細胞ベースのアッセイにおける中、低および高対照の典型的な性能；（Ｂ）３８４ウェルマイクロタイタープレートの３５２個のＤＭＳＯウェルのための統計。
【００３２】
【図８Ａ】（Ａ）ｎ＝１およびｎ＝２のＨＥＫ細胞ベースのアッセイ研究からの１４個のマイクロタイタープレートについてのＺ’。９個のプレートについてＺ’＞０．５であり、１０個のマイクロタイタープレートについてＺ’＞０．４である；
【図８Ｂ】（Ｂ）マイクロタイタープレート４についてのローデータ；
【図８Ｃ】（Ｃ）マイクロタイタープレート５についてのローデータ。カラム１および２ならびにカラム２３および２４は対照カラム；カラム３〜２２は、試験化合物のために用いたカラムである。
【図９】図９．ＨＥＫ細胞ベースのアッセイについての二通りのスクリーニングデータセット（ｎ＝１およびｎ＝２）の相関性。高、低および中対照集団は、予想された場所に位置する。Ａの四角：ｎ＝２のデータセットにおいてのみ＞５０％阻害を示す７個の化合物；Ｂの四角：ｎ＝１およびｎ＝２の両方のデータセットにおいて＞５０％阻害を示す１３個の化合物；Ｃの四角：ｎ＝１のデータセットにおいてのみ＞５０％阻害を示す１個の化合物。
【００３３】
【図１０】図１０．ＨＥＫ細胞ベースのアッセイからの２，２４０個の試験化合物のスクリーニングアウトプットの可視化。プレートＩｄ（Ｘ軸）、阻害（ｎ＝１）（Ｙ軸）および阻害（ｎ＝２）（Ｚ軸）。
【図１１】異なる％阻害カットオフ値でのＨＥＫ細胞ベースのアッセイのヒット率の計算。
【図１２】ＨＥＫ細胞ベースのアッセイから同定された２１個のヒットのCellTiter-Gloアッセイからのアウトプット。
【００３４】
【図１３】（Ａ）ＨＥＫ細胞ベースのアッセイからの２１個のヒットと、CellTiter-Gloアッセイからのアウトプットとの相関性。２１個の化合物中５個が、ＨＥＫ細胞ベースとCellTiter-Gloアッセイとの間に＞５０％阻害ウィンドウを示した；（Ｂ）図８〜１２からの結果の概要。
【図１４−１】ＨＥＫ細胞ベースのアッセイにおける＞５０％のＮＩＫ阻害のプロファイルおよび＜５０％の細胞毒性を呈した９個の化合物の構造。
【図１４−２】ＨＥＫ細胞ベースのアッセイにおける＞５０％のＮＩＫ阻害のプロファイルおよび＜５０％の細胞毒性を呈した９個の化合物の構造。
【図１５】（Ａ）表形式および（Ｂ）グラフ形式での、ｎ＝３のＨＥＫ細胞ベースのアッセイからの７個のマイクロタイタープレートについてのＺ’。
【００３５】
【図１６】（Ａ）ＨＥＫ細胞ベースのアッセイについてのｎ＝２およびｎ＝３のスクリーニングアウトプットの相関性；（Ｂ）ＨＥＫ細胞アッセイおよびCellTiter-Glo細胞生存率アッセイにおける２１個のヒットに関する結果（ｎ＝１、ｎ＝２およびｎ＝３）の概要。
【図１７Ａ】（Ａ）ＨＥＫ細胞ベースのアッセイからの２１個全てのアッセイマイクロタイタープレート（ｎ＝１、ｎ＝２およびｎ＝３）の、Ｚ’、アッセイプレートにおけるヒット（少なくとも１つの試験機会において＞５０％阻害をもたらす化合物）の位置ならびに該ヒットの再現性を用いた解析。
【図１７Ｂ】（Ｂ）ＨＥＫ細胞ベースのアッセイからの２１個全てのアッセイマイクロタイタープレート（ｎ＝１、ｎ＝２およびｎ＝３）の、Ｚ’、アッセイプレートにおけるヒット（少なくとも１つの試験機会において＞５０％阻害をもたらす化合物）の位置ならびに該ヒットの再現性を用いた解析。
【図１７Ｃ】（Ｃ）ＨＥＫ細胞ベースのアッセイからの２１個全てのアッセイマイクロタイタープレート（ｎ＝１、ｎ＝２およびｎ＝３）の、Ｚ’、アッセイプレートにおけるヒット（少なくとも１つの試験機会において＞５０％阻害をもたらす化合物）の位置ならびに該ヒットの再現性を用いた解析。
【図１７Ｄ】（Ｄ）ＨＥＫ細胞ベースのアッセイからの２１個全てのアッセイマイクロタイタープレート（ｎ＝１、ｎ＝２およびｎ＝３）の、Ｚ’、アッセイプレートにおけるヒット（少なくとも１つの試験機会において＞５０％阻害をもたらす化合物）の位置ならびに該ヒットの再現性を用いた解析。
【図１７Ｅ】（Ｅ）ＨＥＫ細胞ベースのアッセイからの２１個全てのアッセイマイクロタイタープレート（ｎ＝１、ｎ＝２およびｎ＝３）の、Ｚ’、アッセイプレートにおけるヒット（少なくとも１つの試験機会において＞５０％阻害をもたらす化合物）の位置ならびに該ヒットの再現性を用いた解析。
【図１７Ｆ】（Ｆ）ＨＥＫ細胞ベースのアッセイからの２１個全てのアッセイマイクロタイタープレート（ｎ＝１、ｎ＝２およびｎ＝３）の、Ｚ’、アッセイプレートにおけるヒット（少なくとも１つの試験機会において＞５０％阻害をもたらす化合物）の位置ならびに該ヒットの再現性を用いた解析。
【図１７Ｇ】（Ｇ）ＨＥＫ細胞ベースのアッセイからの２１個全てのアッセイマイクロタイタープレート（ｎ＝１、ｎ＝２およびｎ＝３）の、Ｚ’、アッセイプレートにおけるヒット（少なくとも１つの試験機会において＞５０％阻害をもたらす化合物）の位置ならびに該ヒットの再現性を用いた解析。
【００３６】
【図１８】スクリーニングアッセイにおいて用いた試験化合物、高、低および中対照のレイアウト。
【図１９】（Ａ）および（Ｂ）ＮＩＫインヒビターとして報告された化合物の例（ＷＯ  ２００９／１５８０１１）；（Ｃ）ＮＩＫインヒビターとして報告された化合物（US 6,841,556）。
【００３７】
発明の詳細な説明
本発明は、ＩＫＫ１−ＫＤのＮＩＫ媒介リン酸化を阻害する化合物を同定するための、トランスフェクトＨＥＫ細胞を伴う細胞ベースのアッセイに関する。ＩＫＫ１−ＫＤのＮＩＫ媒介リン酸化の阻害における試験化合物の有効性を、標準的なマイクロタイタープレート形式で測定することができる。好ましい態様において、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）配置においてアッセイを実施することができる。
【００３８】
用語「ＮＩＫ媒介リン酸化」は、ＮＩＫタンパク質の、基質をリン酸化する能力をいう。ＮＩＫは、ＩＫＫ１タンパク質基質を、Ｓｅｒ−１７６残基で特異的にリン酸化する。本発明において、ＮＩＫ基質は、ＩＫＫ１−ＫＤとも称されるＫ４４Ａ変異を有するＩＫＫ１タンパク質である。かかる変異基質の使用は、ＩＫＫ１に、Ｓｅｒ−１７６残基における自己リン酸化ができなくさせる。
【００３９】
本発明において用いられる場合、「ＨＥＫ細胞ベースのアッセイ」は、本発明の方法おいて用いられる、ＨＥＫ細胞に添加された物質の効果を解析するための、ＮＩＫおよびその基質ＩＫＫ１−ＫＤを含有するヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞を用いるアッセイ系をいう。
【００４０】
本発明によれば、「トランスフェクトＨＥＫ細胞」とは、全長のヒトＮＩＫタンパク質をコードするＤＮＡおよび全長のＮＩＫ基質ＩＫＫ１−ＫＤタンパク質をコードするＤＮＡを含有するヒト胎児由来腎臓細胞をいう。本発明のアッセイは、トランスフェクトＨＥＫ細胞の使用を、「アクセプター」ビーズおよび「ドナー」ビーズを用いた非放射性のホモジニアス近接アッセイと組み合わせる。
【００４１】
好ましい態様において、全長のヒトＮＩＫタンパク質をコードするＤＮＡおよび全長のＩＫＫ１−ＫＤタンパク質をコードするＤＮＡのＨＥＫ細胞への挿入は、前記ＨＥＫ細胞に、全長のヒトＮＩＫタンパク質をコードするＤＮＡを含有する第一の発現ベクターおよび全長のＮＩＫ基質ＩＫＫ１−ＫＤタンパク質をコードするＤＮＡを含有する第二の発現ベクターをトランスフェクトすることによって行う。
【００４２】
代替的な態様において、ＨＥＫ細胞に、全長のヒトＮＩＫタンパク質をコードするＤＮＡおよび全長のＮＩＫ基質ＩＫＫ１−ＫＤタンパク質をコードするＤＮＡを含有する単一の発現ベクターをトランスフェクトすることができる。
【００４３】
ＨＥＫ細胞にトランスフェクトするために、当該技術において公知の任意の好適な方法を用いることができる。好ましい態様において、jetPEIトランスフェクション試薬を用いる。
ＨＥＫ細胞のトランスフェクションは、一過性または安定的であることができる。一態様において、トランスフェクションは一過性である。
【００４４】
AlphaScreenは、「アクセプター」ビーズおよび「ドナー」ビーズを用いる、非放射性ホモジニアス近接アッセイの好適な例である。頭文字のALPHAは、増幅発光近接ホモジニアスアッセイを表す。AlphaScreenは、マイクロプレート形式において生体分子的相互作用を研究するために用いられる、ビーズベースの検出システムである。ビーズに捕えられた分子の結合は、一方のビーズから他方へとエネルギーの移動を導き、最終的には発光／蛍光シグナルを生じさせる。各AlphaScreenアッセイは、２種のビーズ型、ドナービーズおよびアクセプタービーズを含有する。両ビーズ型は、非特異的結合および自己集合を最小化して、ビーズ表面に生体分子をコンジュゲートさせるための反応性アルデヒド基を提供するヒドロゲルでコーティングされる。
【００４５】
本発明の方法におけるトランスフェクトＨＥＫ細胞の使用は、ヒト細胞バックグラウンドを用いるため、ＮＩＫ媒介リン酸化活性を阻害する候補化合物を同定するために用いられる現行のアッセイと比べて、より生理学的に関連性がある。
【００４６】
ＮＩＫおよび／またはＩＫＫ１−ＫＤをコードするＤＮＡは、ＦＬＡＧ配列の添加が、ＮＩＫ基質として作用するＮＩＫタンパク質またはＩＫＫ１−ＫＤタンパク質の活性に干渉しない範囲で、さらなるＮ末端ＦＬＡＧ標識を含有してもよい。
【００４７】
本発明のトランスフェクトＨＥＫ細胞を、任意の好適な培地で適切な期間培養する。代表的な培養培地は、１０％ＦＢＳを伴ったＤＭＥＭである。トランスフェクトＨＥＫ細胞を５％ＣＯ２および３７℃＋／−２℃で培養する。ここで、かかる温度は、試験されるべき化合物が細胞を透過し、活性である場合にはＮＩＫ活性を阻害し、かつ生存細胞を維持するための最高の条件を可能にする温度である。
【００４８】
好ましくは、アッセイを、複数の試験化合物または様々な濃度での同一の試験化合物を同時に評価することができるように、マイクロタイタープレート形式で行う。好ましい態様において、３８４ウェルマイクロタイタープレートを用いる。代替的な態様において、１５３６ウェルマイクロタイタープレートを用いることができる。
【００４９】
試験されるべき化合物を、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）などの好適な溶媒で溶かし、トランスフェクトＨＥＫ細胞が培養されている培養培地へ添加する。そして、細胞を、試験化合物とともに３７℃＋／−２℃および５％ＣＯ２で好ましくは２４時間インキュベートする。本発明のアッセイにおけるトランスフェクトＨＥＫ細胞セットを伴う試験化合物のインキュベートの条件が、試験されるべき化合物の、細胞膜を通した受動拡散を促進することは、当業者が理解することができる。かかる拡散は、３７℃が最大拡散である２０〜３７℃の範囲に渡って劇的に変化する（Garrick R.A. et al., Am J Physiol 1982, 243:C285-C292）。能動輸送が関与する場合、拡散の温度依存性はさらにより劇的である。かかる培養条件は、ＮＩＫインヒビターの同定のための従来のスクリーニング方法に対し、特に、一般的には２２〜２５℃で実施される昆虫Ｓｆ９細胞ベースのアッセイに対し、顕著な改善を示す。
【００５０】
一態様において、マイクロタイターアッセイプレートは、試験化合物とともに培養されたトランスフェクトＨＥＫ細胞に加え、試験化合物なしでトランスフェクトＨＥＫ細胞のみを含有するウェルを含む。かかるウェルは、試験化合物への細胞の曝露に際するＮＩＫ活性の阻害を決定するのに用いることができる、ネガティブ対照を提供する。
【００５１】
さらなる態様において、マイクロタイターアッセイプレートは、基質のＮＩＫ媒介リン酸化を阻害することが知られる化合物の存在下で培養されたトランスフェクトＨＥＫ細胞のみを含有するさらなるウェルを含む。トランスフェクトＨＥＫ細胞をＮＩＫインヒビターとして知られた化合物と一緒に含有するウェルは、ＮＩＫ活性の阻害のためのポジティブ対照を提供する。
【００５２】
ネガティブ対照と比較した、トランスフェクトＨＥＫ細胞の試験化合物への曝露に際するＮＩＫ活性の阻害または低下は、試験化合物がＮＩＫインヒビターであることの示唆である。ポジティブ対照のレベルまでＮＩＫ活性を低下させる試験化合物は、有効なＮＩＫインヒビターであると予想される。
【００５３】
試験化合物をトランスフェクトＨＥＫ細胞の培養物と好適な時間インキュベートした後に、ウェルから細胞培養培地を除去し、トランスフェクトＨＥＫ細胞を溶解する。トランスフェクトＨＥＫ細胞を溶解するために、溶解バッファーをトランスフェクトＨＥＫ細胞を含有するウェルへ添加し、これによりトランスフェクトＨＥＫ細胞から細胞溶解物を得る。
【００５４】
ＩＫＫ１−ＫＤタンパク質のＮＩＫ媒介リン酸化を阻害することができる候補化合物を同定するために、本発明では、AlphaScreenシステムなどのビーズベースの発光近接検出システムを用いる。
【００５５】
AlphaScreenは、マイクロタイタープレート形式で生体分子的相互作用を研究するために用いられる、ビーズベースの非放射性増幅発光近接ホモジニアスアッセイである。どのようにシグナルが生じるかを理解するには、ビーズを理解することから始めなければならない。各AlphaScreenアッセイは、２種のビーズ型、ドナービーズおよびアクセプタービーズを含有する。各ビーズ型は、AlphaScreen技術の鍵となる要素である化学物質の異なる組み合わせを含有する。ドナービーズは、光感作剤であるフタロシアニンを含有し、これは、６８０ｎｍでのレーザー照射に際し、周囲の酸素を、Ｏ２の励起形態である一重項酸素（１Ｏ２）に変換する。他の励起された分子と同様に、一重項酸素は、基底状態に戻る前の限られた寿命を有する。その４μ秒の半減期の間に、一重項酸素は溶液において約２００ｎｍ拡散することができる。アクセプタービーズがその近傍内にある場合、エネルギーが一重項酸素からアクセプタービーズ内のチオキセン誘導体へ移動し、その後、５２０〜６２０ｎｍで光産生が絶頂になる。アクセプタービーズの非存在下では、一重項酸素が基底状態に戻り、シグナルは生じない。
【００５６】
第一の型のビーズは、「アクセプタービーズ」と呼ばれる。アクセプタービーズは、直径約２５０ｎｍのラテックスベースのビーズである。アクセプタービーズは、チオキセン誘導体およびフルオロフォアを含有し、結合パートナーと相互作用することができる分子とコンジュゲートされている。「結合パートナー」は、例えば、アクセプタービーズを第二の種と接触させるタンパク質に特異的に結合する抗体などの分子である。分子がコンジュゲートされたアクセプタービーズおよび結合パートナーを、試料を解析するために添加するミックスを形成するために用いる。
【００５７】
本発明によると、アクセプタービーズの結合パートナーは抗リン酸−Ｓｅｒ−１７６／１８０抗体である。かかる抗体は、ＩＫＫ１−ＫＤを認識する。特に、該抗体は、ＩＫＫ１−ＫＤタンパク質のＳｅｒ−１７６残基のリン酸化形態に結合する。また、本発明によると、アクセプタービーズにコンジュゲートした分子は、プロテインＡである。プロテインＡは、抗リン酸−Ｓｅｒ−１７６／１８０抗体のＦｃ部分に特異的に結合することができる。プロテインＡにコンジュゲートしたアクセプタービーズおよび抗リン酸−Ｓｅｒ−１７６／１８０抗体は、一緒に混合すると、結果的に、アクセプター複合体（以下、「第一のミックス」としても命名する）を作製するだろう。
【００５８】
また、本発明によると、「第一のミックス」は、プロテインＡコーティングされたビーズおよび抗リン酸−Ｓｅｒ−１７６／１８０抗体からなるミックスである。本方法において、第一のミックスを添加し、ＮＩＫ阻害活性のために試験されるべき候補化合物の存在下で培養されたトランスフェクトＨＥＫ細胞から得られた細胞溶解物とともに、２４℃で２時間インキュベートする。
【００５９】
第二の型のビーズは、「ドナービーズ」と呼ばれる。ドナービーズもまた、直径約２５０ｎｍのラテックスベースのビーズである。ドナービーズは、光感作剤であるフタロシアニンを含有し、これは、６８０ｎｍでのレーザー照射に際し、周囲の酸素を、Ｏ２の励起形態である一重項酸素に変換する。ドナービーズは、いくつかの型の分子とコンジュゲートし、分子コーティングされたドナービーズを形成する。かかるコンジュゲートは、ドナービーズの結合パートナーとの相互作用を可能にする。かかる結合パートナーは、ドナービーズを第二の種と接触させる分子である。結合パートナーは、例えば、第二の種を特異的に認識し、特異相互作用により、分子コーティングされたドナービーズと相互作用する抗体であることができる。分子にコンジュゲートしたドナービーズおよび結合パートナーを、試料を解析するために添加するミックスを形成するために用いる。
【００６０】
本発明によると、ドナービーズの結合パートナーはビオチン化抗体である。かかるビオチン化抗体は、ＩＫＫ１−ＫＤを特異的に認識する。特に、ビオチン化抗体は、Ｓｅｒ−１７６残基を含まないタンパク質部分において、ＩＫＫ１−ＫＤタンパク質に特異的に結合する。また、本発明によると、ドナービーズにコンジュゲートしたした分子は、ストレプトアビジンである。ストレプトアビジンは、抗ＩＫＫ１−ＫＤビオチン化抗体を認識し、これと高親和性で特異的に相互作用することができる。ストレプトアビジンコーティングされたドナービーズおよび抗ＩＫＫ１−ＫＤビオチン化抗体は、一緒に混合すると、結果的に、ドナー複合体（以下、「第二のミックス」としても命名する）を作製するだろう。
【００６１】
また、本発明によると、「第二のミックス」は、ストレプトアビジンコーティングされたドナービーズと、ＩＫＫ１−ＫＤタンパク質に結合するビオチン化抗体とからなるミックスである。本方法において、第二のミックスを添加し、ＮＩＫ阻害活性のために試験されるべき候補化合物の存在下で培養されたトランスフェクトＨＥＫ細胞から得られた細胞溶解物（これは第一のミックスが以前添加されたものである）とともに、２４℃で１時間インキュベートする。
【００６２】
本発明の方法によると、第一のミックスおよび第二のミックスとともにインキュベートした後、トランスフェクトＨＥＫ細胞から得られた細胞溶解物を、６８０ｎｍでの高輝度レーザーで励起し、これは、ドナービーズ中に存在するフタロシアニン光感作剤による周囲の酸素のより励起した一重項状態への転換に続き、ストレプトアビジンコーティングされたドナービーズの表面において、一重項酸素の形成を誘導する。ドナービーズは、およそ６０，０００個の一重項酸素分子を発生させ、これは大いに増幅したシグナルをもたらす。
【００６３】
アクセプタービーズがドナービーズの近接にある場合、エネルギーは、一重項酸素からアクセプタービーズ内のチオキセン誘導体へと移動し、光が、５２０〜６２０ｎｍの範囲で生じる。アクセプタービーズがドナービーズの近接付近にない場合、エネルギーは移動されないので、シグナルも発生しない。
【００６４】
ＩＫＫ１−ＫＤタンパク質のＮＩＫ媒介リン酸化を阻害することができない試験化合物の存在下では、トランスフェクトＨＥＫ細胞溶解物は、ＩＫＫ１−ＫＤタンパク質のＳｅｒ−１７６のリン酸化形態を含有するだろう。結果的に、第一のミックスに存在する抗リン酸−Ｓｅｒ−１７６／１８０抗体は、ＩＫＫ１−ＫＤと相互作用し、アクセプター複合体は、ドナー複合体の近接付近にあるであろうから、細胞溶解物のレーザー励起に際するAlphaScreen検出システムで検出可能なシグナルを生じさせることとなる。
【００６５】
ＩＫＫ１−ＫＤタンパク質のＮＩＫ媒介リン酸化を阻害または低下することができる試験化合物の存在下では、トランスフェクトＨＥＫ細胞溶解物は、より少ないＩＫＫ１−ＫＤタンパク質のＳｅｒ−１７６のリン酸化形態を含有するだろう。結果的に、第一のミックスに存在するより少ない抗リン酸−Ｓｅｒ−１７６／１８０抗体は、ＩＫＫ１−ＫＤと相互作用し、低下した量のアクセプター複合体は、ドナー複合体の近接付近にあることとなり、これは、細胞溶解物のレーザー励起に際するAlphaScreen検出システムで検出可能なシグナルの結果的な低下または欠如を伴う。
【００６６】
AlphaScreen解析の頑強性を解析するためには、Ｚ’値を計算することが有用である。Ｚ’値は、異なる試薬、形式および器具を用いる異なるアッセイ技術の性能の比較および評価を可能にする、無次元のパラメータである。Ｚ’値は、２つのカウント母集団の標準偏差を考慮するため、シグナル／バックグラウンド比のみよりも有用なアッセイシグナルウィンドウの見積もりを提供する。典型的には、０．５よりも大きいＺ’値は、アッセイの頑強性の優良な指標と考えられる。
【００６７】
明らかなＮＩＫ阻害活性を有する候補分子が検出されたら、これらを細胞毒性「カウンタースクリーニング」アッセイにかけることが適切であり得、これは、細胞毒性効果につき、または、他の手段（明らかなインヒビター）によって組換えＮＩＫおよび基質タンパク質の発現に干渉することにつき阻害活性を示す分子を、真正のインヒビターから区別するのに役立ち得る。好適なアッセイは、CellTiter-Glo細胞生存率アッセイであり得る。
【００６８】
したがって、本明細書には、ＮＩＫ活性を阻害する化合物を同定する方法が提供され、該方法は以下を含む：
（ａ）培養培地においてＮＩＫをコードするＤＮＡおよびＩＫＫ１−ＫＤをコードするＤＮＡを含有するＨＥＫ細胞（以下、トランスフェクトＨＥＫ細胞）を提供すること；
（ｂ）該トランスフェクトＨＥＫ細胞を、試験されるべき候補分子有り無し両方で、３７℃＋／−２℃の温度で、５％ＣＯ２の存在下、２４時間インキュベートすること；
（ｃ）前記培養培地を除去すること；
（ｄ）前記細胞を溶解すること；
（ｅ）前記細胞溶解物にアクセプター複合体、続いてドナー複合体を添加すること；
（ｆ）レーザー照射により前記細胞溶解物を励起させること；ならびに
（ｇ）ビーズベースの発光近接検出システムを用いて、細胞溶解物のレーザー励起に伴って生じるシグナルを計測すること
を含む、
ここで、試験化合物の存在下で培養されたトランスフェクトＨＥＫ細胞に由来する細胞溶解物から得られたシグナルの低下または欠如は、ＩＫＫ１−ＫＤのＮＩＫ媒介リン酸化の阻害を示し、前記アクセプター複合体は分子コーティングされたビーズおよび前記ＩＫＫ１−ＫＤタンパク質に結合する結合パートナーを含み、前記ドナー複合体は、分子コーティングされたビーズおよび前記ＩＫＫ１−ＫＤタンパク質に結合する結合パートナーを含む。
【００６９】
代替的な態様において、試験化合物の非存在下で培養されたトランスフェクトＨＥＫ細胞に由来する細胞溶解物から得られたシグナルと比較した、試験化合物の存在下で培養されたトランスフェクトＨＥＫ細胞に由来する細胞溶解物から得られたシグナルの低下は、ＩＫＫ１−ＫＤのＮＩＫ媒介リン酸化の低下の示唆である。
【００７０】
好ましい態様において、ＮＩＫをコードするＤＮＡおよびＩＫＫ１−ＫＤをコードするＤＮＡのＨＥＫ細胞への挿入は、前記ＨＥＫ細胞に、ＮＩＫをコードするＤＮＡを含有する第一の発現ベクターおよびＩＫＫ１−ＫＤをコードするＤＮＡを含有する第二の発現ベクターをトランスフェクトすることにより行う。
【００７１】
一態様において、アクセプター複合体の分子コーティングされたビーズは、プロテインＡコーティングされたビーズであり、アクセプター複合体の結合パートナーは、ＩＫＫ１−ＫＤのＳｅｒ−１７６残基のリン酸化形態に特異的に結合する抗体である。
【００７２】
一態様において、ドナー複合体の分子コーティングされたビーズは、ストレプトアビジンコーティングされたビーズであり、ドナー複合体の結合パートナーは、ＩＫＫ１−ＫＤタンパク質に結合するビオチン化抗体である。
【００７３】
一態様において、ビーズベースの発光近接検出システムは、AlphaScreen検出システムである。
【００７４】
一態様において、本方法は、細胞毒性アッセイにおいてＮＩＫ阻害活性を示している候補分子を試験する工程をさらに含み、これにより細胞毒性効果に関連するＮＩＫ阻害活性を有する候補分子を、細胞毒性効果に関連しないＮＩＫ阻害活性を有する候補分子から区別することを可能にする。
【００７５】
例
例１：試薬確認パイロット研究
材料および方法
ＨＥＫ細胞（ＨＥＫ２９３Ａ、Invitrogen R705-07）をｈＮＩＫ１−ｆｌ−ＷＴ−ｐＦｌａｇＮおよび／またはＩＫＫ１−ＫＤ−ｐＦｌａｇＮプラスミド（Weizmann Institute, IsraelのDavid Wallach教授から厚意で提供された）で、jetPEIトランスフェクション試薬（PEQLAB Biotechnologie GmbH）を用いて、二重または一重のいずれかでトランスフェクトした。トランスフェクション対照は、バッファーおよび非トランスフェクト対照を含んだ。jetPEIの供給元のプロトコールを用いて、１０ｍｌ培地を含有するＴ７５フラスコにおいて、約１×１０６個のＨＥＫ細胞を、２０μｇの総ＤＮＡで各条件（一重トランスフェクション、二重トランスフェクション、または非トランスフェクト対照）についてトランスフェクトした。そして細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間および４８時間インキュベートした。細胞を洗浄し、トリプトシン処理し、そして３８４ウェルマイクロタイタープレート（２５μｌ、５，０００細胞／ウェル）へ分配した。AlphaScreen SureFire ＩＫＫα（リン酸−Ｓｅｒ−１７６／１８０）アッセイキット（PerkinElmer、カタログ番号TGRKAS10K）をAlphaScreen ＩｇＧ検出キット（プロテインＡ）（PerkinElmer、カタログ番号6760617M）と一緒に用いて、ＩＫＫ１−ＫＤタンパク質のＮＩＫ媒介リン酸化の検出を行った。培地除去およびＨＥＫトランスフェクト細胞の溶解の後、５μｌ／ウェルのアクセプターミックス（抗リン酸−Ｓｅｒ−１７６／１８０抗体およびプロテインＡにコンジュゲートしたアクセプタービーズを含有する）を添加し、プレートを室温で２時間インキュベートした。読む（PerkinElmer, Envision 2103 Multilabel Reader）前に、２μｌ／ウェルのドナーミックス（ストレプトアビジンコーティングされたドナービーズおよびビオチン化抗体を含有する）を添加し、マイクロタイタープレートを室温で１時間インキュベートした。さらなる対照において、２つの一重トランスフェクトされた調整物（ｈＮＩＫ１−ｆｌ−ＷＴ−ｐＦｌａｇＮまたはＩＫＫ１−ＫＤ−ｐＦｌａｇＮプラスミド）からのＨＥＫ細胞溶解物を混合し、そして上述のとおり解析した。
【００７６】
結果
上記の実験からの結果を、図１に示す。
結果は、ＩＫＫ１−ＫＤ−ＦｌａｇＮが、２４時間および４８時間トランスフェクションの両方でｈＮＩＫ１−ｆｌ−ｗｔ−ＦｌａｇＮ媒介リン酸化を経ることを明らかに実証する。ｈＮＩＫ１−ｆｌ−ｗｔ−ＦｌａｇＮまたはＩＫＫ１−ＫＤ−ＦｌａｇＮタンパク質の非存在下では、AlphaScreenシグナルが観察されなかった。
【００７７】
例２：免疫細胞化学によるＩＫＫ１−ＫＤ−ｐＦｌａｇＮの存在の確認
ＩＫＫ１−ＫＤ−ＦｌａｇＮがｈＮＩＫ１−ｆｌ−ｗｔ−ＦｌａｇＮ媒介リン酸化を経ることが実証されたので、ＮＩＫおよびＩＫＫ−１の両方の存在を確認すべく、蛍光イメージングを行った。
【００７８】
材料および方法
ＨＥＫ細胞を、上述のとおりに二重トランスフェクトした。３０時間後に、細胞をアセトンで固定した。免疫細胞化学研究では、抗ＮＩＫ−Ｔ５５９抗体（Santa Cruz、カタログ番号sc-12957）および抗ＩＫＫα−Ｃ末端抗体（Santa Cruz、カタログ番号sc-7121）およびAlexa-488二次抗体（Invitrogen）を用いた。核は、ＤＡＰＩで染色した。
【００７９】
結果
図２において示された結果は、ＩＫＫ１−ＫＤ−ＦｌａｇＮの存在を実証する。これらの結果は非最適化実験からではあったものの、これらは、ＨＥＫ細胞ベースのアッセイが実行可能だったことの早期示唆を示した。
【００８０】
例３：jetPEIを伴うトランスフェクション効率の確認
材料および方法
ＨＥＫ細胞を、０〜１０μｇ／ｍｌ総ＤＮＡの範囲にわたって、二重トランスフェクトした（ｈＮＩＫ１−ｆｌ−ＷＴ−ｐＦｌａｇＮおよびＩＫＫ１−ＫＤ−ｐＦｌａｇＮプラスミドを伴う、１：１比）。用いたjetPEIトランスフェクション試薬の量は、一定だった（２μｌ／ｍｌ細胞懸濁液）。トランスフェクションに際し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間のインキュベーションを伴いつつ、細胞を３８４ウェルマイクロタイタープレート（１０，０００細胞／ウェルを含有する５０μｌ／ウェル）へ直ちに分配した。上述のとおり、リン酸化ＩＫＫ１−ＫＤ−ＦｌａｇＮを、AlphaScreen SureFire ＩＫＫΑ（リン酸−Ｓｅｒ−１７６／１８０）の読取値を用いて検出した。AlphaScreen SureFireの読取値を伴う用量反応実験を、ＮＩＫを阻害することが知られた分子である化合物Ａについて行った。
【００８１】
結果
上記実験からの結果を、図３に示す。
二重jetPEIトランスフェクトＨＥＫ細胞は、AlphaScreenアッセイで検出されたように、ＩＫＫ１−ＫＤ−ＦｌａｇＮのリン酸化をもたらす。ＤＮＡ負荷が増えると、jetPEIの量が限られてきたことによる高ＤＮＡ濃度での非効率なトランスフェクションにほぼ確実に起因して、AlphaScreenシグナルにおける減少が観察される。化合物Ａは、トランスフェクションを０．１２５μｇ／ｍｌの総ＤＮＡ負荷で行う場合の、許容可能なプロファイルを提供する。
【００８２】
例４：jetPEIトランスフェクトＨＥＫ細胞を伴う化合物プロファイリング
材料および方法
最初の実験において、４つの化合物の段階希釈をアッセイプレートに移動した［スニチニブ、化合物Ａ、化合物Ｂおよび化合物Ｃ］。JetPEI二重トランスフェクトＨＥＫ細胞（１０，０００細胞／ウェルを含有する５０μｌ）をマイクロタイタープレートへ分配し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間および４８時間インキュベートした。そしてプレートを処理し、例１で記載したとおりに、リン酸化ＩＫＫ１−ＫＤ−ＦｌａｇＮをAlphaScreen SureFire ＩＫＫΑ（リン酸−Ｓｅｒ−１７６／１８０）読取値を用いて検出した。化合物Ｃ、化合物Ａおよび化合物Ｂについての第二の実験を、２４時間の時点のみにおいて行った。同一の化合物に対し、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイ（Promega、カタログ番号G7570）を用いて、細胞生存率アッセイを行った。簡単に、トランスフェクトＨＥＫ細胞を、ＮＩＫ阻害活性について試験されるべき候補化合物の存在下で培養する。培地を除去した後、トランスフェクトＨＥＫ細胞を溶解した。細胞溶解物を含有する各ウェルへ、アッセイキットにおいて提供されたCellTiter-Glo試薬を１０μｌ添加し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、Envision 2103 Multilabel Readerを用いてプレートを読んだ。CellTiter-Gloアッセイは、培養物における生存細胞の数を、代謝的に活性な細胞の存在を示唆するＡＴＰの存在する量に基づいて決定することを許容する。
【００８３】
結果
最初の実験の結果を、図４（Ａ）および（Ｂ）に示す。化合物Ａおよび化合物ＢがｈＮＩＫ１−ｆｌ−ｗｔ−ＦｌａｇＮインヒビターとしてみえる一方で、化合物Ｃがアッセイにおいて不活性であったことに注目すべきである。スニチニブは、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎシグナルを阻害するようにはみえなかった。これらの結果は、実験２において確認された（図４（Ｃ）を参照のこと）。これらの化合物についての用量反応曲線は、勾配、最小および最大AlphaScreenシグナルの意味において詳細に定義された。
化合物を、図４（Ｄ）に示された細胞生存率アッセイにおいてもまた査定した。１０μＭ未満の試験化合物の濃度ではシグナル変化が観察されず、これは、図４（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）において示された効果が化合物細胞毒性に起因しないことを示唆する。
【００８４】
例５：jetPEIトランスフェクトＨＥＫ細胞のＤＭＳＯ耐性
３７℃および５％ＣＯ２での２４時間インキュベーションを伴ってＤＭＳＯへ曝露された場合の、ＨＥＫ細胞の生存率を調査した。
【００８５】
材料および方法
トランスフェクトＨＥＫ細胞（１０，０００細胞／ウェルを含有する５０μｌ）を、３７℃および５％  ＣＯ２で２４時間の間、３８４ウェルマイクロタイタープレートにおいて０〜１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯへ曝露した。CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイを、例４で記載したとおり行った。
【００８６】
結果
上記実験からの結果を、図５に示す。
図５において示された結果は、トランスフェクトＨＥＫ細胞が、細胞生存率の最小損失で、最大０．５％ｖ／ｖのＤＭＳＯへの２４時間の曝露に耐えることができることを実証する。
【００８７】
例６：Ｚ’およびAlphaScreenシグナル安定性決定
Ｚ’およびAlphaScreenシグナル安定性を決定した。
【００８８】
材料および方法
ＨＥＫ細胞ベースのアッセイを、３８４ウェルマイクロタイタープレートにおいて行った。各プレートは、４個の対照カラム（６４ウェル）、および総じて２，２４０個のスクリーニングされた試験化合物（ChemBridge Library）を１０μＭで含有する２０個のカラム（３２０ウェル）を含有した。
ネガティブ対照（高対照）として、０．１％ｖ／ｖのＤＭＳＯを３２ウェルへと添加した。図１８に描写されたプレートレイアウトを用いて、ポジティブ低対照（１００％阻害）として、１０μＭの化合物Ａを１６ウェルへと添加し、ポジティブ中対照（５０％阻害）として、１μＭの化合物Ａを１６ウェルへと添加した。
既に記載したとおり、AlphaScreen SureFire読取値を用いて、３時間および１６時間後にシグナル検出を得た。
【００８９】
結果
上記実験からの結果を、図６に示す。
AlphaScreen detection試薬の添加後３時間および１６時間の両方で、Ｚ’は＞０．５だった。
【００９０】
例７：マイクロタイタープレートにおけるＤＭＳＯおよび対照化合物研究
ＨＥＫ細胞ベースのアッセイを２，２４０個の試験化合物へ曝露する前に、アッセイ性能を、中、低および高対照とともにＤＭＳＯウェルを含有するマイクロタイタープレートにおいて試験した。
【００９１】
材料および方法
例６に記載されたアッセイプロトコールを行った。プレートレイアウトは、図１８において示す。中および低対照ウェルは、夫々１μＭおよび１０μＭの化合物Ａを含有した。高対照ウェルおよび３５２試験ウェルは、０．１％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含有した。
【００９２】
結果
図７（Ａ）において示された結果は、ＨＥＫ細胞ベースのアッセイ性能がＺ’＞０．５で許容されたことを実証する。マイクロタイターのＤＭＳＯの解析は、液体処理におけるバリエーションにより生じた、比較的少数の偽陽性を示す（図７（Ｂ）を参照のこと）。
【００９３】
例８：２，２４０個の試験化合物のミニスクリーニング（ｎ＝１およびｎ＝２）
材料および方法
図１８のスクリーニングレイアウトを用いて、例４において記載されたアッセイプロトコールに倣った。二通りのデータセットを提供するために、１４個の３８４ウェルマイクロタイタープレートをスクリーニングした。各マイクロタイタープレートは、３５２個の試験化合物を含有した。二通りのアッセイを同日に行った点以外は、これらはアッセイの再現性を評価することを可能にするための独立したデータセットだった。
【００９４】
結果
上記実験からの結果を、図８〜１１に示す。
図９に示された結果は、ｎ＝１およびｎ＝２のデータセットの間の優良な相関性を示す。高対照において、中および低対照よりも高い変動が観察された。全プレートからのデータをまた、プレート（Ｘ軸）、阻害（ｎ＝１）（Ｙ軸）および阻害（ｎ＝２）（Ｚ軸）の３−Ｄプロットにおいて可視化した（図１０を参照のこと）。
【００９５】
図１１に示された結果は、パーセント阻害閾値の増加は、ヒットが両方の試験機会において活性である確率を増加させることを示唆する。５０％阻害閾値では、６５％のヒットが両方の試験機会において活性だった。７０％阻害閾値では、８１％のヒットが両方の試験機会において活性だった。９０％阻害閾値では、全てのヒットがｎ＝１およびｎ＝２の試験機会の両方において活性だった。
【００９６】
例９：CellTiter-Gloアッセイにおけるヒット化合物の査定
細胞毒性およびアッセイの干渉効果から生じるヒットを同定すべく、スクリーニングを行った。総じて２１個のヒット（＞５０％阻害をもたらす化合物）を、CellTiter-Gloアッセイにおいてプロファイリングした。
【００９７】
材料および方法
CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイを、例４に記載されるとおり行った。
【００９８】
結果
CellTiter-Gloアッセイにおいて、２１個のヒット化合物は、広範な細胞毒性プロファイルを呈した（図１２を参照のこと）。ＨＥＫ細胞ベースのアッセイ結果における細胞毒性およびＮＩＫ阻害平均との間の相関性を、図１３（Ａ）に示す。
【００９９】
図１３（Ｂ）に示された結果は、ＨＥＫ細胞ベースのアッセイにおけるヒットであった２１個の化合物の大部分が、有意な細胞毒性効果を生じさせることを実証した。したがって、これらの化合物が、真正のＮＩＫインヒビターであることは疑わしい。
【０１００】
＞５０％のＮＩＫ阻害および＜５０％の細胞毒性を伴うプロファイルを呈した９個の化合物の構造を、図１４に示す。
【０１０１】
結論として、査定した２１個の化合物のうち９個の化合物が、＞５０％のｈＮＩＫ１−ｆｌ−ｗｔ−ＦｌａｇＮ阻害および＜５０％の細胞毒性を伴うプロファイルを呈した。現法のＨＥＫ細胞ベースのアッセイは、細胞毒性を呈しないようにみえる、ＮＩＫ活性（ＩＫＫ１−ＫＤ−ＦｌａｇＮ基質に対して）の推定上のインヒビターを検出することを可能にする。
【０１０２】
例１０：２，２４０個の化合物のスクリーニングにおけるＨＥＫ細胞ベースのアッセイ（ｎ＝３）
材料および方法
上述したとおりのスクリーニングを繰り返した。
【０１０３】
結果
上記実験からの結果を、図１５〜１７に示す。
スクリーニングされた７個のマイクロタイタープレートのうち１個が、予想よりも低く、かつ、プレートの左／右手側における対照集団のバリエーションが予想よりも多かったことによる、Ｚ’０．３５を有した。残りの６個のプレートは、Ｚ’＞０．５９を有した。以前活性であることが示されたヒット化合物の全２１個（図１３（Ｂ）を参照のこと）は、ｎ＝３のデータセットにおいて類似の傾向を示した（図１６（Ｂ）を参照のこと）。
【０１０４】
ヒットの再現性を決定すべく、プレートごとの解析を三通りのデータセットについて行った（図１７を参照のこと）。
図１７におけるデータは、５個のプレートについて予測されたよりも低いＺ’にも拘らず、最も活性な化合物は、一般に、再現性があることを示唆する。
【０１０５】
参考文献リスト
【表１】
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【０１０６】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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