(57)【要約】  モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）により駆動される上皮間葉転換（ＥＭＴ）の機構が開示される。また、がん細胞におけるＭＡＯを阻害または抑制することにより、がんを処置するための方法も開示される。新規のＭＡＯ阻害剤、たとえば、ＭＡＯの作用を破壊することによりがんを処置するのに有用な低分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、デコイ、および医薬組成物が提供される。特に、近赤外色素７８３、ＩＲ−７８０、およびＭＨＩ−１４８を、ナノ粒子内に封入しおよび封入せずに、ＭＡＯ阻害剤、たとえば、クロルジリンに共有結合的にコンジュゲートすることにより形成されるコンジュゲートのクラスが提供される。本発明の他の側面は、ナノコンジュゲートを形成するための方法、ＭＡＯ活性の変化をモニタリングすることにより、がん患者における処置の進捗をモニタリングするための方法、がんの危険性がある患者をスクリーニングするか、またはＭＡＯ活性のレベルおよび位置をアッセイすることによりがんの異なる形態を識別するための方法を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノアミンオキシダーゼＡ活性を阻害するのに有用な医薬組成物であって、
【化１】
2014525914.tif 000024
およびその塩
からなる群から選択される１つ以上の化合物を含む医薬組成物。
【請求項２】
前立腺がんを処置するのに有用な医薬組成物であって、
モノアミンオキシダーゼの活性を阻害するか、または細胞におけるモノアミンオキシダーゼの発現を抑制することが可能な、医薬として活性な薬剤と、
生理学的に許容される担体
を含む医薬組成物。
【請求項３】
前記医薬として活性な薬剤が、
【化２】
2014525914.tif 000025
およびその塩
からなる群から選択される活性薬剤である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記医薬として活性な薬剤が、モノアミンオキシダーゼ阻害剤に共有結合的にコンジュゲートされたナノ粒子色素を含む近赤外色素のナノコンジュゲートであり、前記モノアミンオキシダーゼ阻害剤と近赤外色素が、リンカーを介して連結していてもよく、連結していなくてもよい、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ナノ粒子色素が、ＩＲ−７８３、ＩＲ−７８０、ＩＲ−７８６、およびＭＨＩ−１４８からなる群から選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記モノアミンオキシダーゼ阻害剤が、
【化３】
2014525914.tif 000026
からなる群から選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記モノアミンオキシダーゼが、以下の式：
【化４】
2014525914.tif 000027
［式中、
Ｍ1は、ＯまたはＳであり；
Ｘ、Ｙ、およびＺのうちの少なくとも２つは、不飽和基、芳香族基、またはこれらの両方であってもよい基ＡおよびＢであって、さらなる炭素、酸素、または窒素原子に接合されていてもよい基ＡおよびＢへの結合に関与し；
基ＡまたはＢに結合しないＸ、Ｙ、およびＺのうちのいずれかは、水素または１〜６個の炭素原子を有する低級脂肪族基で置換されている］
を有するリンカーを介して近赤外色素に共有結合的に連結される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項８】
【化５】
2014525914.tif 000028
に従う式を有する、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記医薬として活性な薬剤が、ＭＨＩ−モクロベミド、ＭＨＩ−フェネルジン、ＭＨＩ−トラニルシプロミン、ＭＨＩ−パルギリン、ＭＨＩ−クロルジリン、ＭＨＩ−ＭＡＯＩ、およびＮＩＲ−ＭＡＯＩからなる群から選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記医薬として活性な薬剤が、モノアミンオキシダーゼ遺伝子発現のサイレンシングまたは下方調節に特異的な核酸ベースの遺伝子サイレンシング剤である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記遺伝子サイレンシング剤が、ＭＡＯ−Ａ、ＭＡＯ−Ｂ、またはこれらの両方のメッセンジャーＲＮＡをターゲットにするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
細胞傷害性薬剤をがん細胞に送達する方法であって、
前記細胞傷害性薬剤を、がん細胞により優先的に取り込まれてナノコンジュゲートを形成するナノ粒子色素にコンジュゲートすることと；
前記ナノコンジュゲートを、がん細胞に接触させること
を含む方法。
【請求項１３】
前記ナノ粒子色素が、ＩＲ−７８３、ＩＲ−７８０、およびＭＨＩ−１４８からなる群から選択されるナノ粒子色素である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞傷害性薬剤が、モノアミンオキシダーゼ阻害剤、アルキル化剤、微小管形成阻害剤、およびアロマターゼ阻害剤からなる群から選択される細胞傷害性薬剤である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
医薬剤のがん細胞へのターゲティング送達に有用なナノコンジュゲートを形成する方法であって、
ナノ粒子色素を前記医薬剤に共有結合的にコンジュゲートすることを含み、
前記医薬剤が、モノアミンオキシダーゼ阻害剤、アルキル化剤、微小管形成阻害剤、アロマターゼ阻害剤からなる群から選択される方法。
【請求項１６】
細胞におけるモノアミンオキシダーゼを阻害するか、または活性酸素分子種を低減する方法であって、
前記細胞を請求項１に記載の組成物と接触させること
を含む方法。
【請求項１７】
処置を必要とする対象における前立腺がんを処置する方法であって、
医薬として活性な薬剤を前記対象に投与すること
を含み、
前記医薬として活性な薬剤が、対象の前記がん細胞におけるモノアミンオキシダーゼを阻害または下方調節することが可能な、医薬として活性な薬剤である方法。
【請求項１８】
前記医薬として活性な薬剤が、ＭＨＩ−モクロベミド、ＭＨＩ−フェネルジン、ＭＨＩ−トラニルシプロミン、ＭＨＩ−パルギリン、ＭＨＩ−クロルジリン、ＭＨＩ−ＭＡＯＩ、ＮＩＲ−ＭＡＯＩ、およびモノアミンオキシダーゼに特異的な遺伝子サイレンシング剤からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
対象をがんの危険性についてスクリーニングするための方法であって、
対象のがんの可能性がある部位から採取された試料におけるモノアミンオキシダーゼの活性または発現レベルをアッセイすることと；
前記モノアミンオキシダーゼの活性または発現レベルを、基準と比較すること
を含み、
活性または発現レベルが前記基準より高ければ、前記対象が危険な状態にあることが示される方法。
【請求項２０】
対象における前立腺がんの異なる形態を診断または識別するための方法であって、
対象におけるモノアミンオキシダーゼの活性、発現、および位置のパターンを決定することと；
前記パターンに基づきがんの形態の診断を下すこと
を含む方法。
【請求項２１】
患者におけるがん処置の進捗をモニタリングする方法であって、
前記患者におけるモノアミンオキシダーゼの活性または発現を継続的にアッセイすることと；
前記継続的アッセイの結果を比較すること
を含み、
モノアミンオキシダーゼの活性または発現がある期間にわたり減少すれば、前記処置の好ましい進捗が示される方法。
【請求項２２】
前記患者が、前立腺がん患者であり、発光性エレメントをモノアミンオキシダーゼ阻害性エレメントにコンジュゲートしたナノコンジュゲートを含む医薬組成物で処置されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記発光性エレメントが、近赤外ナノ粒子色素である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記アッセイするステップが、前記患者の前記がんの部位において近赤外画像を撮影することにより実施される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記画像が、レーザー共焦点顕微鏡法画像である、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
連邦政府の後援による研究および開発
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられる契約番号Ｐ０１−ＣＡ９８９１２、ＤＡＭＤ−１７−０３−０２−００３３、Ｒ０１−ＣＡ１２２６０２、Ｒ０１−ＭＨ３９０８５の下で、政府の支援によりなされた。連邦政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願への相互参照
本出願は、その内容の全体が参照によりここに組み込まれる、２０１１年７月２６日に出願された仮出願第６１／５１１，９２０号において開示される発明の権利を主張する。
【発明の分野】
【０００３】
本発明は一般に、がん、特に、前立腺がんを処置するための戦略としてのモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）の阻害およびそれらの阻害剤（ＭＡＯＩ）に関する。本発明はまた、がんの造影、スクリーニング、診断、および治療の方法にも関する。加えて、本発明は、がんのバイオマーカーおよび低悪性度の前立腺がんを悪性の前立腺がんと識別するための方法にもさらに関する。
【発明の背景】
【０００４】
前立腺がんは、全ての年齢の男性におけるがんによる死亡の３番目に一般的な原因であり、７５歳を超えた男性におけるがんによる死亡の最も一般的な原因である。前立腺がんのための最新の処置には、（１）ホルモン治療、（２）化学療法、（３）放射線治療、および（４）手術が含まれる。しかし、それらは、疾患の早期段階にある患者に有効であるに過ぎない。また、これらの処置モダリティーの各々と関連する有害な副作用も認められる。さらに、進行段階の去勢抵抗性および転移性前立腺がんの患者にとって、これらの処置は、部分的に有効であるに過ぎない。
【０００５】
補助または組合せ療法は、進行性患者における転帰を改善しうる。たとえば、ＬＨ−ＲＨアゴニストによる化学的去勢または手術による去勢を伴うアンドロゲンアブレーション治療を受けた患者は、ビカルタミドのような抗アンドロゲンとの組合せにより利益を受けてきた。これらのホルモン療法が奏効しなかった患者は、選択的化学療法、たとえば、ドセタキセルおよびデノスマブ、ならびに残留内因性アンドロゲン合成を枯渇させるさらなるホルモン治療（たとえば、ＣＹＰ１７阻害剤、アビラテロン）により利益を受けることが多い。改善にもかかわらず、これらのさらなる療法は一般に、数カ月間の生存の延長が可能であるに過ぎない。
【０００６】
前立腺がんの予後および病期分類は典型的に、グリソン評価システムを用いて評価される。グリソンスコアは、その顕微鏡による外見に基づき前立腺がんに与えられる。グリソンスコアの高いがんは、侵襲性が大きく、予後が悪い。グリソンスコアは、生検試料を目視で検査し、次いで、スコアを観察された腫瘍パターンに割り当てる病理学者により決定される。しかし、グリソンシステムは、早期検出に対する著明な限界により、人間の目視による検査に完全に依存しており、誤る傾向がある。
【０００７】
上記の観点では、より多くの有効な機構ベースの療法、および、この疾患の過剰処置を回避しうるように、低悪性度の前立腺がん形態を、悪性の前立腺がん形態と識別するための、早期における非侵襲的診断法に対する切迫した、未解決の要求がある。
【発明の概要】
【０００８】
略述すると、本発明は、モノアミンオキシダーゼが、がん性細胞において示差的な発現／活性を呈示すること、およびモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）の阻害剤が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるがん細胞およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍異種移植片の成長を抑制することが可能であることの驚くべき発見に部分的に基づく。
【０００９】
ＭＡＯとは、モノアミンの酸化を触媒する酵素のファミリーである。ＭＡＯは、体内の大半の細胞型におけるミトコンドリアの外膜に結合する。ヒトでは、ＭＡＯの２つのアイソフォームであるＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂが認められる。ＭＡＯの２つの形態は、モノアミン神経伝達物質を含めた生体原性および食餌中のアミンを脱アミノ化して、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）の産生を結果としてもたらす酸化酵素の重要なペアである。ＭＡＯのアイソフォームのいずれもが、鍵となる役割を果たし、正常生理学的状態および疾患状態において多様な機能、たとえば、感情および行動の調節を果たす。ＭＡＯが神経伝達物質の活性化において果たす死活的な役割のために、ＭＡＯの機能不全（ＭＡＯ活性の過多または過少）は、多数の精神医学的および神経学的障害の一因になると考えられる。たとえば、体内の異常に高いまたは低いレベルのＭＡＯは、うつ病、統合失調症、薬物乱用、注意欠陥障害、偏頭痛、および性的成熟不全と関連している。したがって、ＭＡＯは、かつては精神医学的および神経学的障害の標的として知られていた。
【００１０】
本発明では、ＭＡＯ−Ａ活性または発現の増大は、ヒト前立腺がんの進行と相関することが予測外に発見された。たとえば、強力なＭＡＯ−Ａ阻害剤であるクロルジリンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるヒト前立腺がん細胞およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍異種移植片の成長を抑制することが可能であると裏付けられている。この知見は、ＭＡＯをがんの標的として確証する。
【００１１】
したがって、本発明の第１の側面は、以下に示す化合物１１〜１４：
【化１】
2014525914.tif 000002
【００１２】
およびその塩
からなる群から選択される新規のＭＡＯ阻害剤を対象とする。
【００１３】
これらの化合物は、新たに発見されたＭＡＯ阻害活性を有する市販の化合物である。それらは、Ａｕｒｏｒａ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｌｉｂｒａｒｙ、Ｅｎａｍｉｎｅ  ＨＴＳ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、および／またはＩｎｔｅｒｃｈｉｍ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｌｉｂｒａｒｙが含まれるがこれらに限定されない市販元から購入してよい。したがって、本発明のこの側面は、ＭＡＯ活性を阻害するために有用な組成物であって、化合物１１〜１４からなる群から選択される１つ以上の化合物を含む組成物を提供する。本発明のこの側面はまた、細胞を、化合物１１〜１４からなる群から選択される１つ以上のＭＡＯ阻害剤と接触させることにより、ＭＡＯ活性を阻害するための方法も提供する。
【００１４】
上記で開示される阻害剤に加えて、本発明はまた、がん細胞により優先的に取り込まれるナノ粒子（たとえば、近赤外色素）を、医薬として活性な薬剤（たとえば、細胞傷害性化合物）をがん細胞に送達するための送達媒体として使用してもよいことも予測外に発見した。たとえば、本発明は、近赤外色素によるナノ粒子、たとえば、ＩＲ−７８３を、活性薬剤、たとえば、上記のＭＡＯ阻害剤にコンジュゲートすることに成功し、結果として得られるナノコンジュゲートが、がん細胞によりやはり優先的に取り込まれることを裏付けた。
【００１５】
よって、本発明の第２の側面は、がん細胞を優先的または選択的にターゲットにすることが可能なナノコンジュゲートを対象とする。本発明のこの側面に従うナノコンジュゲートは、細胞傷害性化合物にコンジュゲートされたＮＩＲ色素によるナノ粒子を一般に有する。例示的なＮＩＲ色素には、たとえば、ＩＲ−７８３、ＩＲ−７８０、ＩＲ−７８６、およびＭＨＩ−１４８において見出されるコンジュゲートされたポリエン官能基であるがこれらに限定されない、コンジュゲートされたポリエン官能基を含んでよい。例示的な細胞傷害性化合物には、ＭＡＯ阻害剤、ドセタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、テモゾロミド、ゲムシタビン、アントラマイシン、カンプトテシン、トポテカン、ロニダミン、マイトマイシン、イメキソン、ダカルバジド（dacarbazide）、ＰＫ−１１１９５を含んでよいがこれらに限定されない。ＮＩＲ色素によるナノ粒子の細胞傷害性化合物へのコンジュゲーションは、当技術分野で知られる任意の適する化学的手段により達成してもよい。
【００１６】
好ましい一態様では、本発明の例示的なナノコンジュゲートが、少なくとも１つのＣおよび２つのＨ原子を含有するリンカーを介して細胞傷害性エレメント（たとえば、ＭＡＯ阻害剤）を発光性エレメント（たとえば、ＮＩＲ色素によるナノ粒子）に接合した少なくとも２つの官能基を一般に有する。好ましくは、１つの不飽和二重または三重結合を含有する少なくとも２つの不飽和構造が、１〜３、１〜５、または１〜１５個の原子による主鎖を介して１つのヘテロ環に連結される。
【００１７】
例示的なリンカーは、以下の一般的な式：
【化２】
2014525914.tif 000003
【００１８】
［式中、Ｍ1は、ＯまたはＳであり；Ｘ、Ｙ、およびＺのうちの少なくとも２つは、不飽和および／または芳香族基ＡおよびＢへの結合であって、さらなる炭素、酸素、または窒素原子を介して進む結合に関与する（示さない）。基ＡまたはＢへの結合に関与しないＸ、Ｙ、およびＺのうちのいずれかは、水素または低級脂肪族基、たとえば、Ｃ1〜Ｃ6アルキルで置換されている］
を有するリンカーである。
【００１９】
ここで用いられる、「主鎖」という用語は、２つの不飽和構造を相互に連結する原子鎖を指し、前記鎖は考慮に入れない。
【００２０】
たとえば、本発明の態様に従うコンジュゲートまたはナノ粒子封入コンジュゲート（ここでは、ナノコンジュゲートと称する）は、以下の式：
【化３】
2014525914.tif 000004
【００２１】
を有するコンジュゲートまたはナノ粒子封入コンジュゲートであってよい。
【００２２】
別の態様では、ＸとＹが上記の通りであり、Ｚが、
【化４】
2014525914.tif 000005
【００２３】
［式中、共有結合部は、芳香族環に接合されている］からなる群から選択される。本明細書中、この化合物をＭＡＯ−Ａ特異的な可逆的阻害剤であるＭＨＩ−モクロベミドと称する。
【００２４】
別の態様では、ＸとＹが上記の通りであり、Ｚが、
【化５】
2014525914.tif 000006
【００２５】
［式中、共有結合部はまた、芳香族環へも接合されている］である。本明細書中、この化合物を、ＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂ阻害剤であるＭＨＩ−フェネルジンと称する。
【００２６】
さらに別の態様では、ＸとＹが上記の通りであり、Ｚが、式：
【化６】
2014525914.tif 000007
【００２７】
［式中、共有結合部は、芳香族環を介している］を有する（±）−ｔｒａｎｓ−２−フェニルシクロプロパン−１−アミンである。本明細書中、この化合物を、ＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂ阻害剤であるＭＨＩ−トラニルシプロミンと称する。
【００２８】
さらに別の態様では、ＸとＹが上記の通りであり、Ｚが、以下の式：
【化７】
2014525914.tif 000008
【００２９】
［式中、共有結合部は、波線により示される窒素に接合されている］を有するＮ−ベンジル−Ｎ−メチルプロパ−２−イン−１−アミンである。本明細書中、この化合物を、ＭＡＯ−Ｂに対する優先性を有するＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂ阻害剤であるＭＨＩ−パルギリンと称する。
【００３０】
好ましい態様では、ＹがＳであり；Ｘが、以下の式：
【化８】
2014525914.tif 000009
【００３１】
を有する基であり、Ｚが、以下の式：
【化９】
2014525914.tif 000010
【００３２】
を有する基である。本明細書中、この化合物を、ＭＡＯ−Ａ特異的不可逆的阻害剤であるＭＨＩ−クロルジリンと称する。
【００３３】
さらに別の態様では、ＸとＹが上記の通りであり、Ｚが、以下：
【化１０】
2014525914.tif 000011
【００３４】
［式中、共有結合部は、芳香族環に接合されている］から選択されるＺである。本明細書中、この群の化合物をＭＨＩ−ＭＡＯＩと総称する。
【００３５】
ＭＨＩ−ＭＡＯＩは、ＭＨＩ−１４８の水素化アルミニウムリチウムまたはジボランによる還元と、これに続く、結果として得られるジオールとＭＡＯＩの、これに限定されないが、たとえば光延反応によって、コンジュゲート１１Ｄを生じさせるコンジュゲーションとを介して、ＭＨＩ−１４８と阻害剤から２つのステップで簡便に調製することができる。
【化１１】
2014525914.tif 000012
【００３６】
さらに別の態様では、ＹとＺが上記の通りであり、Ｘが、以下の式：
【化１２】
2014525914.tif 000013
【００３７】
［式中、共有結合部は、この分子のシクロヘキサン環に接合されている］を有するＸである。本明細書中、この群の化合物をＮＩＲ−ＭＡＯＩと総称する。
【００３８】
本発明の第３の側面は、がん性細胞を優先的にターゲットにすることが可能なＮＩＲ色素ベースのナノコンジュゲートを形成するための方法を対象とする。本発明のこの側面に従う方法は、ＮＩＲ色素によるナノ粒子を、細胞傷害性化合物に化学的にコンジュゲートするステップを一般に包含する。適切なＮＩＲ色素と細胞傷害性化合物は、上記の通りである。
【００３９】
本発明の第４の側面は、がんを処置するのに有用な医薬組成物と、この組成物を用いてがんを処置する方法を対象とする。本発明のこの側面に従う組成物は、ＭＡＯ活性を阻害することが可能な活性薬剤と、生理学的に適する担体を一般に包含する。一部の好ましい態様では、活性薬剤が、当技術分野で知られるＭＡＯ阻害剤である。例示的なＭＡＯ阻害剤には、モクロベミド、フェネルジン、トラニルシプロミン、パルギリン、およびクロルジリンを含んでよいがこれらに限定されない。また、ＭＡＯの発現を阻害するか、下方調節するか、またはサイレンシングすることが可能な核酸も有利に用いてもよい。例示的な核酸によるＭＡＯ阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス、または当技術分野で一般に知られる他の任意の種類の核酸ベースの遺伝子サイレンシング剤、たとえば、デコイ、リボザイム、およびアプタマーを含んでもよい。このような好ましい態様は、単独で用いることもでき、がん治療剤としてのここで記載される医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。
【００４０】
例示的な一態様では、ｓｈＲＮＡによるヒト前立腺がん細胞におけるＭＡＯ−Ａの遺伝子サイレンシングまたはノックダウンを、以下の通りに例示してよい。４８ウェル組織培養プレート内に、２５０ｕｌの通常培養培地中１ウェル当たり６×１０4個のヒト前立腺がん細胞を、ウイルス感染の２４時間前に播種し、細胞が感染日において約５０％のコンフルエントであるものとする。１００ｕｌの培地（ＦＢＳおよび抗生剤を伴わない）中における、４０ｕｌのレンチウイルスによるヒトｓｈＭＡＯＡ形質導入粒子（１ｍｌ当たり５×１０6個の力価）の、ポリブレン（５ｕｇ／ｍｌの最終濃度）との混合物を調製し、その後、４時間〜一晩にわたるインキュベーションのために細胞に添加した。４時間〜一晩後に培養培地を補給した。次いで、感染の４８時間後、細胞を、選択のため、２〜１０ｎｇ／ｍｌのピューロマイシンで連続２週間にわたり処置し、ピューロマイシンを補充した培地を３〜４日ごとに補給した。安定的なＭＡＯＡ−ＫＤ細胞を、ＭＡＯＡ遺伝子発現についてのウェスタンブロットおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検査で検証し、選択のため、ピューロマイシンを補充した培養培地中に同じ濃度で維持した。ヒトＭＡＯＡ  ｃＤＮＡに対するｓｈＲＮＡ配列は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製品（型番：ＮＭ＿０００２４０＿ＴＲＣＮ０００００４６００９）から適合させたＣＣＧＧＣＧＧＡＴＡＴＴＣＴＣＴＧＴＣＡＣＣＡＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＧ  ＴＴＴＴＴＧである。
【００４１】
他の好ましい態様では、活性薬剤が、上記のＮＩＲ色素ベースのコンジュゲートである。さらに他の好ましい態様では、活性薬剤が、Ａｕｒｏｒａ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｌｉｂｒａｒｙ、Ｅｎａｍｉｎｅ  ＨＴＳ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、および／またはＩｎｔｅｒｃｈｉｍ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｌｉｂｒａｒｙが含まれるがこれらに限定されない市販元から入手可能な化合物１１〜１４から選択される活性薬剤である。
【化１３】
2014525914.tif 000014
【００４２】
本発明の第５の側面は、医薬剤をがん細胞に送達する方法を対象とする。本発明のこの側面に従う方法は、この医薬剤をＮＩＲ色素にコンジュゲートするステップと；このコンジュゲートをがん細胞と接触させるステップとを一般に包含する。一部の好ましい態様では、医薬剤が、細胞傷害性薬剤である。例示的な細胞傷害性薬剤は、アルキル化剤、微小管形成阻害剤、およびアロマターゼ阻害剤を含んでよいが、これらに限定されない。
【００４３】
本発明の第６の側面は、がん細胞におけるＭＡＯ活性を阻害する方法を対象とする。本発明のこの側面に従う方法は、細胞を、阻害性薬剤と接触させるステップを一般に包含し、ここで、前記阻害性薬剤は、ＭＡＯ阻害剤、ＮＩＲ色素がＭＡＯ阻害剤にコンジュゲートされたナノコンジュゲート、およびこれらの組合せからなる群から選択される。当技術分野で知られるかまたはここで開示される、薬理学的および核酸ベース両方の任意のＭＡＯ阻害剤を有利に用いてよい。
【００４４】
前立腺がんに関する限り、ＭＡＯ−Ａが、ヒト前立腺がんにおける化学療法および放射線抵抗性と関連するのに対し、ＭＡＯ−Ｂが、ヒト前立腺がんと関連する間質細胞において固有の発現パターンを有することは、本発明のさらなる発見である。上述の通り、ＭＡＯは、モノアミン神経伝達物質および食餌中のアミンの酸化的脱アミン化を介する分解を触媒するミトコンドリア結合酵素である。ＭＡＯは、Ｘ染色体内に配置される遺伝子によりコードされる［１、２］。ＭＡＯ触媒副産物は、活性酸素分子種（ＲＯＳ）の主要な供給源である過酸化水素であって、がん細胞にＤＮＡ損傷に対する素因をもたらし、腫瘍の発生および進行を促進する過酸化水素である［３］。前立腺がん細胞における細胞内ＲＯＳレベルの調節は、前立腺がん細胞の、ホルモン、化学、および放射線療法に対する感受性に影響を及ぼしうるであろう［４］。さらに、ＭＡＯは、食餌または間質細胞区画と対比した上皮細胞区画における生理学的供給源に由来するそれらの生体原性アミン基質の存在下における、ＲＯＳの生成の一因ともなる。加えて、前立腺間質は、前立腺がんの組織検体におけるＭＡＯの形態、量、および物理的配置を変化させることにより前立腺がんを進行させることが知られているので、ヒト前立腺がんの低悪性形態を、悪性形態と識別しうる。約言すれば、ＭＡＯが、患者における前立腺がん形態をスクリーニング、診断、および識別するバイオマーカーとして用いられる可能性があることは、本発明の予測されざる発見である。ＭＡＯ−ＡとＭＡＯ−Ｂが、それらの局在化において異なるという観察に基づき、前立腺がんの上皮におけるＭＡＯ−Ａと前立腺がんに関連する間質におけるＭＡＯ−Ｂの両方をターゲットにする処置戦略もまた考案される。
【００４５】
したがって、本発明の第７の側面は、前立腺がんの異なる形態を識別する方法であって、前立腺組織におけるＭＡＯ活性および配置パターンをアッセイするステップと、前記ＭＡＯ活性および配置パターンに従い、がん形態の特徴づけを決定するステップを含む方法を対象とする。前記ＭＡＯ活性は、たとえば、以下で記載される、前立腺生検におけるＭＡＯ−Ａの発現を測定するリアルタイムＰＣＲにより決定することができる。
【００４６】
生検試料は、Ｔｒｉｚｏｌ中でホモジナイズし、ＲＮＡを単離するものとする。次に、１ｕｇの全ＲＮＡを、２５ｕｌの容量中で逆転写させ、次いで、２ｕｌの試料（ｃＤＮＡ）を２０ｕｌへと１／１０に希釈し、５ｕｌのこの試料を、ＭＡＯ  Ａ測定のための鋳型として用いる。別の２ｕｌを、１００ｕｌへと１／５０に希釈し、５ｕｌのこの試料を、リボソームＲＮＡ対照鋳型に用いる。
【００４７】
ヒトＭＡＯ  Ａ特異的プライマーのプライマー配列は、以下：
ＭＡＯ  Ａ  Ｅ１Ｆ１６８  ＧＴＧ  ＴＣＡ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＧＣＡ  ＴＧＧ  ＡＧＡ  １８８
ＭＡＯ  Ａ  Ｅ２Ｒ２８１  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＡＧＡ  ＧＴＴ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ２６１
１１３ｂｐのＰＣＲ産物
の通りでありうる。
【００４８】
１８ｓのリボソームＲＮＡのプライマー配列は、以下：
Ｆ１５６５  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＣＣＣ  ＧＡＧ  ＡＴＴ  ＧＡＧ  ＣＡ
Ｒ１８１６  ＴＡＧ  ＴＡＧ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＧＣＧ  ＧＴＧ  ＴＧ
２５３ｂｐのＰＣＲ産物
の通りである。
【００４９】
ＰＣＲ条件：摂氏９５度×４分間の１サイクル
９５度×３０秒間
６０度×３０秒間
７２度×３０秒間の４０サイクル。
【００５０】
当業者は、上記の例が、例示のためだけのものであり、現在のところ知られているかまたは将来発明される他の測定法もまた、ＭＡＯ活性を決定するために用いてもよいことを認識するであろう。
【００５１】
本発明の第８の側面は、がんの危険性について患者をスクリーニングする方法であって、患者におけるＭＡＯ活性をアッセイするステップと、前記活性を基準と比較するステップと、この比較に基づき危険性のレベルを決定するステップを含む方法を対象とする。前記ＭＡＯ活性は、たとえば、以下で記載される、前立腺生検におけるＭＡＯ−Ａの発現を測定するリアルタイムＰＣＲにより決定することができる。
【００５２】
生検試料は、Ｔｒｉｚｏｌ中でホモジナイズし、ＲＮＡを単離するものとする。次に、１ｕｇの全ＲＮＡを、２５ｕｌの容量中で逆転写させ、次いで、２ｕｌの試料（ｃＤＮＡ）を２０ｕｌへと１／１０に希釈し、５ｕｌのこの試料を、ＭＡＯ  Ａ測定のための鋳型として用いる。別の２ｕｌを、１００ｕｌへと１／５０に希釈し、５ｕｌのこの試料を、リボソームＲＮＡ対照鋳型に用いる。
【００５３】
ヒトＭＡＯ−Ａ特異的プライマーのプライマー配列は、以下：
ＭＡＯ−Ａ  Ｅ１Ｆ１６８  ＧＴＧ  ＴＣＡ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＧＣＡ  ＴＧＧ  ＡＧＡ  １８８
ＭＡＯ−Ａ  Ｅ２Ｒ２８１  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＡＧＡ  ＧＴＴ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ２６１
１１３ｂｐのＰＣＲ産物
の通りでありうる。
【００５４】
１８ｓのリボソームＲＮＡのプライマー配列は、以下：
Ｆ１５６５  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＣＣＣ  ＧＡＧ  ＡＴＴ  ＧＡＧ  ＣＡ
Ｒ１８１６  ＴＡＧ  ＴＡＧ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＧＣＧ  ＧＴＧ  ＴＧ
２５３ｂｐのＰＣＲ産物
の通りである。
【００５５】
ＰＣＲ条件：摂氏９５度×４分間の１サイクル
９５度×３０秒間
６０度×３０秒間
７２度×３０秒間の４０サイクル。
【００５６】
当業者は、上記の例が、例示のためだけのものであり、現在のところ知られているかまたは将来発明される他の測定法もまた、ＭＡＯ活性を決定するために用いてもよいことを認識するであろう。
【００５７】
本発明の第９の側面は、がんを処置する方法を対象とする。本発明のこの側面に従う方法は、がん細胞におけるＭＡＯを阻害することが可能な医薬剤を対象に投与するステップを一般に包含する。本発明のこの側面に従う方法により処置してもよいがんの種類には、前立腺がん、脳腫瘍、結腸がん、侵襲性線維腫症を含んでよいがこれらに限定されない。医薬剤は、上記の組成物、ナノコンジュゲート、または阻害剤のうちのいずれかであってもよい。好ましい態様では、がんは前立腺がんである。さらに好ましい態様では、前立腺がんの処置が、第１の、上皮内のＭＡＯ−Ａをターゲットにする医薬として活性な薬剤をクロルジリンと共に投与し、第２の、間質内のＭＡＯ−Ｂをターゲットにする医薬として活性な薬剤をデプレニルと共に投与するステップを包含してもよい。前記第１および第２の医薬として活性な薬剤は、それらが、それぞれの組織型におけるそれぞれのＭＡＯアイソフォームを阻害するのに有効である限りにおいて、異なる薬剤であってもよく、同じ薬剤であってもよい。
【００５８】
本発明の第１０の側面は、ＮＩＲ色素ベースのナノコンジュゲートを含む医薬組成物で処置されているがん患者における処置の進捗をモニタリングする方法を対象とする。本発明のこの側面に従う方法は、患者の継続的ＮＩＲ画像を得るステップと、前記処置の進捗を決定するために、前記継続的ＮＩＲ画像を比較するステップを一般に包含する。コンジュゲートの前立腺腫瘍の成長および転移に対する効果は、造影およびＩＨＣ解析により決定することができる。前記造影は、たとえば、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  ２００測定器により行うことができる。このシステムは、研究者がリアルタイムの非侵襲的造影を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞および遺伝子活性をモニタリングおよび記録することを可能とする。システムには、生物発光系と蛍光系の両方、およびモダリティー間で容易に切り替える能力が組み込まれる。また、レーザースキャナーも、内部光源の単一視野による拡散光断層再構成のための３Ｄ表面トポグラフィーを提示する。極低温冷却された２６ｍｍの正方ＣＣＤを用いて感受性を最大化しながら、バックグラウンドノイズを最小化する。スキャンは一般に、４ｃｍｓ〜２５ｃｍｓの範囲の５つの視野の選択肢を完了するのに１〜１０分間を要する。
【００５９】
本発明の第１１の側面は、細胞内のＲＯＳレベルを調節する方法を対象とする。本発明のこの側面に従う方法は、細胞を、ＭＡＯ阻害性薬剤と接触させるステップを一般に包含する。適切なＭＡＯ阻害性薬剤は、上記のＭＡＯ阻害剤、ナノコンジュゲート、または医薬組成物のうちのいずれであってもよい。これらの薬剤は、単独で用いることもでき、ミトコンドリア指向型抗酸化剤、たとえば、リポ酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−カルニチン、およびＮ−アセチル−Ｌ−システインと組み合わせて用いることもできる。
【００６０】
本発明の他の側面および利点は、以下の詳細な説明および付属の特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｂは、ＭＡＯ−ＡがノックダウンされたＭＣＰ３細胞を注射されたマウス（ＰＴＥＮおよびｐ５３が二重ＫＯされたマウス細胞系、黒丸を参照されたい）では、腫瘍異種移植片の成長速度が、ＷＴ  ＭＣＰ３細胞（白丸）と比較してはるかに低減されたことを示す。ＭＡＯ−ＡノックダウンＭＣＰ３前立腺がん細胞（１×１０6個の細胞）をマウスに注射したところ、腫瘍成長が認められなかったのに対し、ＷＴ  ＭＣＰ３細胞を注射されたマウスでは、著明な数の腫瘍が見出された。図１Ｃは、ＭＡＯ−Ａの発現が、ヒトおよびマウスのがん細胞における細胞増殖プロファイルと相関することを示す。ＭＡＯ−Ａの発現を操作された２×１０4個のヒトまたはマウス前立腺がん細胞を播種し、細胞数を６日間にわたり連続でカウントした。実験は、三連で実施した。ｓｈＭＡＯ−Ａ：ｓｈＲＮＡのレンチウイルス感染によるＭＡＯ−Ａノックダウン。
【図１Ｂ】（続葉）
【図１Ｃ】（続葉）
【図２】図２は、クロルジリン−ＮＩＲ色素コンジュゲートのための合成スキーム、およびナノクロルジリンの調製を示す。
【図３】図３は、本発明の例に従う新規のＭＡＯ−Ａ阻害剤を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｄは、宿主におけるＭＡＯ−Ａノックアウトにより、マウスＦ９奇形癌異種移植片の成長が妨げられることを示す。１×１０5個のマウスＦ９奇形癌細胞を、ＷＴ（Ｎ＝９）およびＭＡＯ−Ａ  ＫＯ（Ｎ＝９）マウスに皮下注射した。*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１。
【図４Ｂ】（続葉）
【図４Ｃ】（続葉）
【図４Ｄ】（続葉）
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、宿主におけるＭＡＯ−Ａノックアウトにより、マウスＭＣＰ３前立腺癌異種移植片の成長が阻害されることを示す。１×１０5個のマウスＭＣＰ３前立腺癌細胞を、ＷＴ（Ｎ−４）およびＭＡＯ−Ａ  ｎｅｏ  ＫＯ（Ｎ＝５）マウスに皮下注射した。*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１。
【図５Ｂ】（続葉）
【図６】図６Ａ〜６Ｄは、マウスＭＣＰ３前立腺癌細胞におけるＭＡＯ−Ａノックダウンにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍異種移植片の成長が阻害されることを示す。１×１０6個のＷＴおよびＭＡＯ−Ａ−ＫＤマウスＭＣＰ３前立腺癌細胞を、それぞれ、６匹（ＷＴ細胞）および４匹（ＭＡＯ−Ａ−ＫＤ細胞）ずつのＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。*ｐ＜０．０５。
【図７Ａ】図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、および７Ｄは、８８例の患者に由来する前立腺がん組織（各患者から２つずつの中核部）からなる組織マイクロアレイにおけるＭＡＯ−ＡのおよびＭＡＯ−Ｂの免疫組織化学染色を示す。９Ａは、基底細胞タンパク質であるＭＡＯ−Ａはがん細胞において発現するが、これは検体の良性およびがん性領域における最小限の間質反応であることを示す。これに対し、９Ｂは、間葉細胞タンパク質であるＭＡＯ−Ｂの、正常およびがん性前立腺上皮細胞における発現は最小限にとどまったが、前立腺がんに関連する間質細胞における発現の増大を伴うことを示す。前立腺間質細胞は、前立腺がん上皮の成長および進行ならびに前立腺上皮のクローン発生を誘導することが知られているので、ＭＡＯ−Ｂもまた、治療的介入のための有効な間質標的として考えることができるであろう。９Ｃは、ヒトの骨におけるＭＡＯ−Ａ陽性染色が強い前立腺がん細胞から、ＭＡＯ−Ａが、前立腺がんの骨転移についての優れた標的でありうることが示唆されることを示す。９Ｄは、正常前立腺上皮細胞もまた、ＭＡＯ−Ａを発現させたが、ＭＡＯ−Ｂは発現させなかった（データは示さない）ことを示す。
【図７Ｂ】（続葉）
【図７Ｃ】（続葉）
【図７Ｄ】（続葉）
【図８】図８は、ＮＩＲ色素であるＩＲ−７８３−ドセタキセルコンジュゲートの簡略な合成スキームを示す。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｅは、ＩＲ−７８３−ドセタキセルが、ヒト前立腺がん細胞（Ｃ４−２、ＰＣ−３）、膵臓がん細胞（ＭＩＡ−ＰａＣａ２）および腎臓がん細胞（ＳＮ１２Ｃ、パネルａを参照されたい）に取り込まれることが見出されたが；このＮＩＲ−ドセタキセルコンジュゲートが、ヒト正常前立腺上皮細胞（Ｐ６９）およびヒト胎児由来腎臓２９３細胞に取り込まれることは見出されなかった（パネルｂを参照されたい）ことを示す。細胞傷害作用アッセイにより、このＮＩＲ−ドセタキセルコンジュゲートが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ヒトがん細胞系のパネルに対して、濃度依存的に成長阻害性効果を及ぼしたことを示す（パネルｃを参照されたい）。ヒト腎臓がん（ＳＮ１２Ｃ）および正常胎児由来腎臓細胞（ＨＦＫ２９３）をモデルとして用いて、本発明者らは、この色素−薬物コンジュゲートが、ＳＮ１２Ｃを死滅させるのに、親薬物であるドセタキセルと同等の有効性を有するが、ＨＦＫ２９３細胞の場合はそうでなく、色素−薬物コンジュゲートが、がんには侵入するが正常細胞には侵入しないという示唆と符合する結果を観察した。
【図９Ｂ】（続葉）
【図９Ｃ】（続葉）
【図９Ｄ】（続葉）
【図９Ｅ】（続葉）
【図１０】図１０は、ＭＨＩ−クロルジリンをもたらす例示的な合成経路を示す。
【図１１】図１１、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（上左）、化合物１０（上右）、ＤＡＰＩ（下左）、および重合せ（下中央で処置されたＣ４−２Ｂ前立腺がん細胞の例示的な共焦点画像を示す。明視野画像は、上中央に示す。
【図１２】図１２は、ＭＨＩ−クロルジリン１０についての例示的なＭＡＯ−Ａ阻害曲線を示す。化合物１０を、１×１０6個の前立腺Ｃ４−２Ｂ細胞と共に、３７℃  ２０分間プレインキュベートした。次いで、ＭＡＯ  Ａ基質であるＣ−１４セロトニンを、インキュベーション溶液に、３７℃で２０分間にわたり添加した。インキュベーションの経過後、反応生成物を抽出し、放射能をカウントした。ＭＡＯ−Ａ活性は、タンパク質１ｍｇ当たり２０分間当たりに形成される生成物６９．６ｎＭとして表した。阻害剤である化合物１０の存在を伴わない場合の活性は、１００％とみなした。
【図１３】図１３は、正常（Ａ）、グリソンパターン３（Ｂ）および５（Ｃ）、ならびに骨転移性（Ｄ）ヒト前立腺腺癌の臨床試料の代表的な免疫組織化学染色が、グレードの高いＰＣａおよび骨転移性ＰＣａにおいて、ＭＡＯ−Ａ発現の増大を示したことを示す。拡大率は、それぞれ、４００倍（Ａ〜Ｃ）および２００倍（Ｄ）である。
【図１４】図１４  ＭＡＯ−Ａは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるヒトＰＣａ腫瘍異種移植片の成長を決定する。左パネル（Ａ〜Ｂ）：無胸腺ヌードマウス（Ｎ＝８）のベースラインで限定されたＭＡＯ−Ａの発現を呈示するヒトＰＣ−３細胞における安定的なＭＡＯ−Ａの過剰発現が、腫瘍異種移植片の成長（Ａ）および腫瘍重量（Ｂ）を増強した。右パネル（Ｃ〜Ｄ）：ヒトＡＲＣａＰＭ細胞におけるＭＡＯ−ＡのｓｈＭＡＯ−Ａによるノックダウン（ＫＤ）が、無胸腺ヌードマウス（Ｎ＝５）のＷＴおよびＭＡＯ−Ａ−ＫＤ細胞である、ｓｈＣｏｎおよびｓｈＭＡＯ−Ａにおける腫瘍異種移植片の成長を消失させた（Ｃ〜Ｄ）。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。
【図１５】図１５は、宿主におけるＭＡＯ−Ａの前立腺がんの成長に対する効果を示す。１×１０5個のマウス前立腺癌ＴＲＡＭＰＣ−２細胞を、ＷＴ（Ｎ＝６）およびＭＡＯＡ  ＫＯ（Ｎ＝４）マウスの、マウス１匹当たり３カ所ずつの注射部位に皮下注射した。ＭＡＯ−Ａ  ｎｅｏマウスに皮下注射されたマウス前立腺癌ＴＲＡＭＰＣ−２（神経内分泌表現型）は、ＰＣａの成長速度の著明な低減を示し、これにより、宿主におけるＭＡＯ−Ａが前立腺がんの成長の速度の決定において果たす鍵となる役割が示唆される。腫瘍発生率（Ａ）および腫瘍容量（Ｂ）を、腫瘍の進行および腫瘍重量（Ｃ）と共に決定した。
【図１６】スクランブル／ＭＡＯ−Ａ−ＫＤヒトＡＲＣａＰＭまたはＣ４−２  Ｐｃａ細胞を脛骨内注射されたマウスにおける骨破壊（１３〜１９週間後）の代表的なＸ線（Ａ）およびマイクロＣＴ（Ｂ）。白色の矢印は、溶骨性病変を指示する。
【図１７】ＭＡＯ−Ａが、ヒトＰＣａ細胞におけるＥＭＴを誘導する。左パネル（Ａ〜Ｂ）：ＰＣ−３細胞におけるＭＡＯ−Ａの過剰発現が、Ｅ−カドヘリンを抑制し、ビメンチン、Ｎ−カドヘリン、およびＴｗｉｓｔ１を上方調節し（Ａ）、細胞の遊走および浸潤を増大させた（Ｂ）。右パネル（Ｃ〜Ｅ）：ＡＲＣａＰＭ細胞におけるＭＡＯＡのｓｈＲＮＡによるノックダウンが、Ｅ−カドヘリンを増大させ、Ｎ−カドヘリンおよびＴｗｉｓｔ１を下方調節し（Ｃ）、細胞の遊走および浸潤を低減させ（Ｄ）、細胞の形状を変化させた（Ｅ）。**ｐ＜０．０１．拡大率は、２００倍である。
【図１８】ＭＡＯ−Ａが、ヒトＰＣａ細胞におけるＨＩＦ１α発現を増強する。（Ａ）ＭＡＯ−Ａの過剰発現が、低酸素状態（０．５％のＯ２）下で、ＨＩＦ１αレベルを上昇させ、（Ｂ）ＰＣ−３細胞における２４時間にわたる低酸素状態に応答する、活性化ＨＩＦ１αにより調節されたＶＥＧＦＡ、グルコース輸送体１（Ｇｌｕｔ１）、Ｓｎａｉｌ２、およびＴｗｉｓｔ１のｍＲＮＡ発現。相対ｍＲＮＡ発現は全て、正常酸素状態下における対照のＰＣ−３細胞により標準化した。**ｐ＜０．０１。
【図１９】ＭＡＯ−Ａが、ＰＣ−３腫瘍異種移植片におけるＮＩＲ色素の取込みを増強した。（Ａ）対照（左脇腹）およびＭＡＯ−Ａ過剰発現（右脇腹）ＰＣ−３細胞を皮下移植されたヌードマウスの、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける代表的なＭＨＩ−１４８ＮＩＲ造影（腹腔内注射、１０ナノモル／２０ｇ）。矢印は、腫瘍への異種移植片を指し示す。（Ｂ）腫瘍組織は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＮＩＲ造影による強いシグナルを表示したが、腫瘍器官は、これを表示しなかった。（Ｃ）腫瘍重量で除した全発光（５匹のマウス）を決定することにより、（Ａ）における腫瘍ＮＩＲ強度の定量化。*ｐ＜０．０５。
【図２０】図２０（Ａ）は、正常、Ｇ３、およびＧ５のヒト患者試料におけるＥ−ｃａｄ、Ｖｉｍ、およびＭＡＯ−Ａの免疫組織化学を示す。（Ｂ）は、ＭＡＯ−Ａ過剰発現ＰＣ−３細胞におけるＭＡＯ−Ａ、Ｅ−ｃａｄ、Ｖｉｍ、Ｎ−ｃａｄ、およびＴｗｉｓｔ１のウェスタンブロットを示す。（Ｃ）は、対照およびＭＡＯ−Ａ過剰発現ＰＣ−３細胞におけるＥ−ｃａｄプロモーターのＬｕｃアッセイを示す。（Ｄ）は、ＭＡＯ−ＫＤ  ＬＮＣａＰ細胞におけるＭＡＯ−ＡおよびＥ−ｃａｄのウェスタンブロット、ＭＡＯ−Ａ−ＫＤ  ＬＮＣａＰ細胞におけるＶｉｍおよびＮ−ｃａｄのリアルタイムＰＣＲを示す。（Ｅ）は、ＭＡＯ−Ａを操作されたＰＣ−３およびＬＮＣａＰ細胞の遊走アッセイを示す。（Ｆ）は、ＭＡＯ−Ａを操作されたＰＣ−３およびＬＮＣａＰ細胞の浸潤アッセイを示す。
【図２１】図２１（Ａ）は、ＭＡＯ−Ａ過剰発現ＰＣ−３細胞における核内ＨＩＦ１ａのウェスタンブロットを示す。（Ｂ）は、ＭＡＯ−Ａ過剰発現ＰＣ−３細胞におけるＨＩＦ１αのウェスタンブロットを時間依存的に示す。（Ｃ）ＭＡＯ−Ａ過剰発現ＰＣ−３細胞におけるＳｎａｉｌ２、Ｔｗｉｓｔ１、ＶＥＧＦＡ、Ｇｌｕｔ１、およびＨＩＦ１αのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを示す。（Ｄ）ＭＡＯ−Ａ−ＫＤ  ＬＮＣａＰ細胞におけるＨＩＦ１αの時間依存的なウェスタンブロット。（Ｅ）は、ＭＡＯ−Ａ−ＫＤ  ＬＮＣａＰ細胞におけるＳｎａｉｌ２、Ｔｗｉｓｔ１、ＶＥＧＦＡ、Ｇｌｕｔ１、およびＨＩＦ１αのリアルタイムＲＥ−ＰＣＲを示す。
【図２２】（Ａ）：ＭＧ−１３２で処置されたＭＡＯ−Ａ過剰発現ＰＣ−３細胞におけるＨＩＦ１α−ＯＨおよびＨＩＦ１αのウェスタンブロット。（Ｂ）ＤＭＯＧ処置を施されたＭＡＯ−Ａ過剰発現ＰＣ−３細胞におけるＶＥＧＦＡおよびＧｌｕｔ１のリアルタイムＰＣＲ。（Ｃ）低酸素状態下のＭＡＯ−Ａ発現ＰＣ−３細胞におけるＲＯＳ測定のＦＡＣＳ。（Ｄ）低酸素状態下でＮＡＣ処置を施されたＭＡＯ−Ａ過剰発現ＰＣ−３細胞におけるＨＩＦ１αのウェスタンブロット。（Ｅ）低酸素状態下でＮＡＣ処置を施されたＭＡＯ−Ａ過剰発現ＰＣ−３細胞におけるＴｗｉｓｔ１、ＶＥＧＦＡ、およびＧｌｕｔ１のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ。（Ｆ）は、ＮＡＣおよびＤＭＯＧ処置の両方を施されたＭＡＯ−Ａ過剰発現ＰＣ−３細胞におけるＨＩＦ１αのウェスタンブロットを示す。（Ｇ）は、ＮＡＣ処置下におけるＭＯ−Ａ過剰発現ＰＣ−３細胞の例示的な細胞増殖曲線を示す。
【図２３】図２３（Ａ）は、ＭＡＯ−Ａを操作されたＰＣ−３およびＬＮＣａＰ細胞におけるＶＥＧＦのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよびＥＬＩＳＡを示す。（Ｂ）は、ＶＥＧＦ処置を施されたＰＣ−３細胞におけるｐＡｋｔおよびｐＦｏｘＯ１のウェスタンブロットを示す。（Ｃ）ＭＡＯ−Ａを操作されたＰＣ−３およびＬＮＣａＰ細胞におけるｐＡｋｔおよびｐＦｏｘＯ１のウェスタンブロットを示す。（Ｄ）ＭＡＯ−Ａ過剰発現／ＮＲＰ−１−ＫＤ  ＰＣ−３細胞におけるＮＲＰ−１、ｐＡｋｔ、およびｐＦｏｘＯ１のウェスタンブロット。（Ｅ）ＭＡＯ−Ａ過剰発現ＰＣ−３腫瘍異種移植片におけるＨ＆Ｅ、ＶＥＧＦ、およびＮＲＰ−１の免疫組織化学を示す。（Ｆ）は、ＭＡＯ−Ａ過剰発現およびＮＲＰ−１−ＫＤ  ＰＣ−３細胞における遊走および浸潤アッセイを示す。（Ｇ）は、ＭＡＯ−Ａ過剰発現ＰＣ−３およびＮＲＰ−１−ＫＤ  ＰＣ−３細胞の例示的な細胞増殖曲線を示す。（Ｈ）は、ＭＡＯ−Ａ過剰発現ＰＣ−３細胞、ＶＥＧＦ処置を施されたＰＣ−３細胞、およびＮＲＰ−１−ＫＤ  ＰＣ−３細胞における核内ＦｏｘＯ１のウェスタンブロットを示す。
【図２４】（Ａ）ＭＡＯ−Ａを操作されたＰＣ−３およびＬＮＣａＰ細胞におけるＴｗｉｓｔ１  ｍＲＮＡまたはプロモーターのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよびｌｕｃアッセイ。（Ｂ）ＦｏｘＯ１を操作されたＰＣ−３細胞におけるＴｗｉｓｔ１のウェスタンブロットおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ。（Ｃ）は、ＰＣ−３細胞におけるＷＴ／Ｈ２１５Ｒ  ＡＡＡ  ＦｏｘＯ１構築物によるＴｗｉｓｔ１プロモーターのｌｕｃアッセイを示す。（Ｄ）は、Ｔｗｉｓｔ１プロモーター内のＦｏｘＯ１結合部位の特徴づけを異なる種間で示す。（Ｅ）は、ＰＣ−３細胞におけるＦｏｘＯ１構築物によるＷＴ／Ｍｕｔ  Ｔｗｉｓｔ１プロモーターのｌｕｃアッセイを示す。（Ｆ）ＭＡＯ−Ａ過剰発現ＰＣ−３細胞におけるＷＴ／Ｍｕｔ  Ｔｗｉｓｔ１プロモーターのｌｕｃアッセイを示す。（Ｇ）ＭＡＯ−Ａ過剰発現ＰＣ−３細胞におけるＦｏｘＯ１結合部位のＣｈＩＰアッセイ。（Ｈ）は、ノックダウン対ＭＯＡ−Ａ阻害の比較を示す。
【図２５Ａ】図２５（Ａ）は、ＭＡＯ−Ａ−ＫＤ  ＬＮＣａＰ、Ｃ４−２、ＡＲＣａＰm、およびＭＣＰ３腫瘍異種移植片の腫瘍発生率、腫瘍容量、および腫瘍重量を示す。（Ｂ）は、ＭＡＯ−Ａ−ＫＤ  ＬＮＣａＰおよびＣ４−２腫瘍異種移植片のＭＡＯ−Ａ活性を示す。（Ｃ）〜（Ｅ）は、ＭＡＯ−Ａ−ＫＤ  ＬＮＣａＰおよびＣ４−２腫瘍異種移植片におけるＨ＆Ｅ、ＭＡＯ−Ａ、Ｅ−ｃａｄ、Ｖｉｍ、ＨＩＦ１α、およびＶＥＧＦの免疫組織化学を示す。（Ｄ）は、ＭＡＯ−Ａ−ＫＤ  ＬＮＣａＰおよびＣ４−２腫瘍異種移植片における腫瘍ミトコンドリアのＲＯＳ測定を示す。
【図２５Ｂ】（続葉）
【図２５Ｃ−Ｅ】（続葉）
【図２６】図２６（Ａ）は、Ｇ３およびＧ５のヒト患者試料におけるＭＡＯ−Ａ、ＨＩＦ１α、ＶＥＧＦＡ、ＦｏｘＯ１、ｐＦｏｘＯ１、およびＴｗｉｓｔ１の免疫組織化学を示す。（Ｂ）は、免疫組織化学データの統計学的解析を示す。
【図２７】図２７は、ＭＡＯ−Ａにより駆動されるＥＭＴ機構の概略表示を示す。
【発明の詳細な説明】
【００６２】
定義
ここで別段に示されない限り、ここで用いられる全ての用語は、その用語が本発明の当業者にとって有する意味を有する。実施者は、特に、当技術分野による定義および用語について、最新の教科書を参照するように指示される。しかし、記載される特定の方法、プロトコール、および試薬は変化してよいので、本発明がこれらに限定されないことを理解されたい。
【００６３】
「処置」とは、目的が標的とされた病理学的状態または障害を防止または緩徐化する（減殺する）ことである、治療的処置と予防的または防止的方策の両方を指す。処置を必要とする患者には、既に障害を有する患者のほか、障害を有しやすい患者または障害を防止すべき患者が含まれる。
【００６４】
モノアミン阻害剤の「治療的有効量」とは、とりわけ、言明した目的を実行するのに十分な量である。「有効量」は、言明した目的との関連で、経験的に、かつ、日常的なやり方で決定してよい。
【００６５】
ここで用いられる「担体（Carrier）」または「担体（Carriers）」には、使用される用量および濃度で、これに曝露される細胞または哺乳動物に対して非毒性な医薬として許容される担体、賦形剤、または安定化剤が含まれる。生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝された滅菌水溶液であってよい。生理学的に許容される担体の例には、緩衝剤、たとえば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸；アスコルビン酸を含めた抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、たとえば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、たとえば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、たとえば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリシン；単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含めた他の炭水化物；キレート化剤、たとえば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、たとえば、マンニトールまたはソルビトール；塩形成対イオン、たとえば、ナトリウム；ならびに／または非イオン性界面活性剤が含まれる。
【００６６】
近年の研究は、ＭＡＯ−Ａの増大が、前立腺がんの進行と関連することを示している［５］が、これに対し、ＭＡＯ−Ａの薬理学的な阻害またはレンチウイルスによるｓｈＲＮＡを介するＭＡＯ−Ａのサイレンシングにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける前立腺がん細胞およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍異種移植片の成長が著明に低減されている［６〜８］。さらに、本発明者らのデータは、ＭＡＯ−Ａが、Ｅ−カドヘリン（上皮マーカー）発現の減退、ビメンチン（間葉マーカー）レベルの上方調節のほか、前立腺がん細胞の浸潤および遊走の増大を促進することにより、ヒト前立腺がん細胞における上皮間葉転換（ＥＭＴ）を誘導することを示した。これらの結果は、ＭＡＯ−Ａの発現が、前立腺がん細胞の転移可能性と相関しうることを示唆する。まとめると、この証拠は、ＭＡＯ−Ａの、ヒト前立腺がんを処置するための新規の潜在的な標的としての役割を強く支持する。
【００６７】
本発明者らは、マウスに注射したところ、モノアミンオキシダーゼＡ（ＭＡＯ−Ａ）ノックダウン（ＫＤ）前立腺がん細胞が成長しなかったことを見出した。この結果は、ＷＴの前立腺がん細胞と劇的に異なった（図１を参照されたい）。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドにある合計１０匹の野生型（ＷＴ）マウスを用いた。マウス６匹に、Ｃ５７マウス株由来のＷＴ  ＭＣＰ３（ＰＴＥＮ／ｐ５３二重ノックアウト）前立腺癌細胞を、マウス１匹当たり４カ所ずつ合計２４カ所、注射した。マウス１匹当たり４カ所ずつの部位として、マウス４匹の合計１６カ所の部位に、ＭＡＯ−Ａノックダウン（ＫＤ）ＭＣＰ３細胞を注射した。腫瘍の数は、表示日においてカウントした。腫瘍発生率を、注射された部位の総数で除した検出可能な腫瘍の総数と定義する。図１に示す通り、ＭＡＯ−ＡノックダウンＭＣＰ３細胞（黒丸）を注射されたマウス腫瘍異種移植片における腫瘍成長速度の、ＷＴ  ＭＣＰ３細胞（白丸）との比較。ＭＡＯ−ＡノックダウンＭＣＰ３（ＰＴＥＮとｐ５３の二重ＫＯ）前立腺がん細胞（１×１０6個の細胞）をマウスに注射したところ、腫瘍成長が認められなかったのに対し、ＷＴ  ＭＣＰ３細胞を注射されたマウスでは、著明な数の腫瘍が見出された。
【００６８】
本発明の１つの側面は、ＭＡＯ−Ａ阻害剤であるクロルジリンを、ＮＩＲ色素に化学的にコンジュゲートすることによりがん細胞および組織に送達しうる方法である。ＮＩＲ色素−クロルジリンコンジュゲートは、がんによっては取り込まれるが、正常細胞によっては取り込まれず、したがって、このＭＡＯＩの全身毒性が回避されると予測される。レーザー走査共焦点顕微鏡法を用いて、ナノクロルジリンの細胞（ＬＮＣａＰ、Ｃ４−２、およびＡＲＣａＰM前立腺がん細胞系）内への細胞内取込みおよび局在化を決定することができる。このクラスのＮＩＲ色素は、有機アニオン輸送ペプチドを介してがん細胞に容易に取り込まれうる。図１０および１１は、ドセタキセルのＮＩＲ色素（ＩＲ−７８３）コンジュゲートであるＩＲ−７８３−ドセタキセルが、ヒト前立腺がん細胞、膵臓がん細胞、および腎臓がん細胞へは取り込まれるが、ヒト前立腺上皮細胞またはヒト胎児由来腎臓細胞へは取り込まれなかったことが見出されたことから、このようなＮＩＲ色素−化学療法剤コンジュゲートは、がん細胞には侵入するが、正常細胞には侵入しないことが示唆されることを示す。
【００６９】
ナノクロルジリンのＭＡＯ−Ａ活性を阻害する能力を決定する。ＭＡＯ−Ａ阻害曲線を、前立腺がん細胞であるＬＮＣａＰ、Ｃ４−２、およびＡＲＣａＰM細胞系について取得し、クロルジリンそれ自体のＭＡＯ−Ａ阻害曲線と比較した。これらの細胞系は、中程度〜高度なＭＡＯ−Ａ活性を有する。ナノクロルジリンのＩＣ50を決定し、クロルジリンのＩＣ50と比較する。
【００７０】
ナノクロルジリンおよびＮＩＲ色素（ＩＲ−７８３、ＩＲ−７８０、およびＭＨＩ−１４８）−クロルジリンの、ＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂの阻害に対する効果について研究する。マウスにおけるＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂ阻害曲線を作製する。ＩＣ50を決定する。
【００７１】
ナノクロルジリンおよびＮＩＲ色素−クロルジリンコンジュゲートの局在化、ならびにその腫瘍成長に対する効果について研究するため、前立腺細胞をマウスに注射する。例示的な１つの実験では、マウスを、（ａ）ＮＩＲ色素−クロルジリンによるナノクロルジリン、（ｂ）クロルジリンそれ自体、および（３）色素だけのそれぞれを個別に注射される３つの群に分ける。ナノクロルジリンの配置を造影し、腫瘍の成長（サイズ、数、および重量）をモニタリングし、３つの群からの結果を比較した。
【００７２】
実験の結果は、ナノクロルジリンの腫瘍成長に対する効果を裏付けた。クロルジリンナノコンジュゲートの有効性を確立したら、当業者は、他のパラメータ、たとえば、ＭＡＯ−Ａ活性および腫瘍成長の阻害に要請される濃度を、日常的な実験を介して容易に決定しうることを認識するであろう。
【００７３】
そのＮＩＲ色素−ＭＡＯＩコンジュゲートを含めたＭＡＯ−Ａ阻害剤は、単独で用いてもよく、または腫瘍の成長および転移に対する既存の処置、たとえば、（ａ）手術による去勢；（ｂ）放射線  （ｃ）ドセタキセル；（ｄ）アビラテロンと組み合わせて用いてもよい。
【００７４】
さらに、このクロルジリン−色素コンジュゲートは、有効量のクロルジリン−色素コンジュゲートを含む組成物を患者に投与することにより、前立腺がんを処置するための方法および前立腺がんの進行を診断およびモニタリングするための方法と共に用いてもよい。
【００７５】
細胞内のクロルジリン−色素コンジュゲートナノ粒子（ナノクロルジリン）のデザイン、
合成、封入、および試験
１．ＩＲ−７８３によるナノ粒子色素コンジュゲート
クロルジリン−色素コンジュゲートの調製。本発明者らは、近赤外（ＮＩＲ）蛍光ヘプタメチンシアニン色素であるＩＲ−７８３のクラスを、クロルジリンコンジュゲーションのための候補物質として同定した（１）（図２を参照されたい）。近赤外色素であるＩＲ−７８３は、市販されており、ｐ−チオアニリン２との単一ステップの反応で前駆体３に容易に転換することができる。クロルジリン−ＭＡＯ−Ａ複合体の結晶構造についての本発明者らのモデル化研究［９］に基づき、本発明者らは、この化合物を前駆体３にコンジュゲートするのに必要とされるリンカーでアミンの窒素を修飾しうるが、その阻害効力には影響を及ぼさないことを決定した。誘導体であるクロルジリン酸９を調製するための合成手順を、図２に概括する。合成は、市販されているプロパルギルアミン４および３−（２，４−ジクロロフェノキシ）プロパナール５から９をもたらす一連の還元的アミン化反応からなる。２つの構成要素である３と９のコンジュゲーションは、十分に確立された合成ステップの連鎖により達成することができる。ＩＲ−７８３と同様に、このコンジュゲートは、７５０〜７８０ｎｍで励起されると、８２０〜８６０ｎｍにおいて強い発光を示すことが予測される。この強い発光は、ＮＩＲ造影により容易に読み取ることができる。
【００７６】
クロルジリン−色素コンジュゲートのナノ粒子内の封入。クロルジリン−色素コンジュゲートの水溶性を達成し、それらの腫瘍への送達を増強するために、本発明者らは、それらを水中で自由に分散可能な平均サイズ２２ｎｍのリン酸／ケイ酸カルシウムナノ粒子内に封入する［１０］。この封入工程は、色素の光物理的特性にわずかな変化しか結果としてもたらさない。このような封入法は、Ａｄａｉｒにより、疎水性色素の細胞への送達の有効な手段として報告されている［１１］。リン酸カルシウムは、中程度のＣａ2+イオンの濃度は、細胞に対して毒性でなく、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても毒性でないために、ナノ粒子封入のための優れたマトリックスである（ヒトの骨および歯において見出される）。リン酸カルシウムは、ｐＨ５．５未満では溶解してカーゴを放出するが、ｐＨ７．４では安定であることが示された［１２］。加えて、このマトリックスの粒子は、水性媒体中を自由に分散する。
【００７７】
典型的に、このようなナノ粒子は、油中水マイクロエマルジョン中のケイ酸二ナトリウムの存在下において、塩化カルシウムとリン酸水素二ナトリウムの水中での共沈殿を用いて調製する［１１、１３］。クロルジリン−色素コンジュゲートのナノ粒子内の封入は、沈殿時において、それをマイクロエマルジョンに添加することにより達成される。この工程は、サイズ２２〜３０ｎｍのナノの粒子のコロイド懸濁液としてのナノクロルジリンをもたらす。その特徴づけは、ナノ粒子懸濁液のサイズ分布、形状、および分散のコロイド状態を、透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を用いて解析することによりなされる。
【００７８】
ナノクロルジリンによるＭＡＯ−Ａ活性阻害の決定。本発明者らは、ヒト前立腺がん細胞系であるＬＮＣａＰ（非転移性細胞系）、２つの転移性細胞系であるＣ４−２およびＡＲＣａＰｍにおける阻害曲線を作製することにより、ナノクロルジリンのＭＡＯ−Ａ活性を阻害する能力について研究する。ＩＣ50を決定する。これらの細胞系全ては、中程度〜高度なＭＡＯ−Ａ活性を示す。Ｓｈｉｈ研究室では、ＭＡＯ−Ａ阻害アッセイをｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて日常的に実施している。
【００７９】
ナノクロルジリンががん細胞のミトコンドリアをターゲットにするかどうかの決定。  本発明者らは、レーザー走査共焦点顕微鏡法を用いて、ナノクロルジリンの細胞内の取込みおよび局在化を決定する。コンジュゲート内の近赤外色素部分は、コンジュゲートをミトコンドリアに誘導する配向基として用いられる。ミトコンドリアの酸化還元電位は、がんと正常細胞で異なることが示されている。
【００８０】
ヒトがん細胞系（非転移性細胞系であるＬＮＣａＰ、２つの転移性細胞系であるＣ４−２、ＡＲＣａＰM）について調べる。陰性対照としては、正常ヒト前立腺上皮細胞（Ｐ６９およびＮＰＥ）、正常ヒト前立腺線維芽細胞（ＮＰＦ）を用いる。
【００８１】
以下の研究は、ナノクロルジリンで処置した後、前立腺がんの成長が、著明に低減されることを示すと予期される。転帰は、腫瘍成長の速度、サイズ、および重量における低減により決定する。本発明者らは、ナノクロルジリンが、クロルジリンそれ自体より少ない副作用でより有効であると予測する。加えて、ナノクロルジリンを診断ツールに用いる場合、本発明者らは、ＭＡＯ−Ａを、前立腺がんについてのバイオマーカーとしても確立し、さらに、本発明者らは、ナノクロルジリンの取込みを造影することにより、処置期間における前立腺がんの進行も追跡する。
【００８２】
２．ＭＨＩ色素によるナノ粒子コンジュゲート
ＭＨＩ−クロルジリンの合成：色素であるＭＨＩ−１４８をクロルジリンとコンジュゲートすることを介し、図１０に概括される一連の合成ステップにより、ＭＨＩ−クロルジリンを調製した。適正な長さのリンカーをデザインして、色素のクロルジリンの阻害効力に対する負の影響を最小化した。
【００８３】
ＭＨＩ−クロルジリンの調製は、市販されている２，４−ジクロロフェノール１で開始した。この化合物を、標準的な条件下（ＮａＯＨ、Ｈ2Ｏ）で、１，３−ジブロモプロパンによりアルキル化させた。次いで、生成物２を、ＤＭＦ中でＮａＮ3と反応させて、アジド３をもたらし、これを、さらなる精製を伴わないＭＴＢＥ中の溶液として次のステップにかけた。３の溶液を、Ｂｏｃ2Ｏの存在下における触媒としての活性炭上でＰｄを用いる低Ｈ2圧下で水和させ、カルバメート４を結果として形成させた。この化合物を、乾燥ＤＭＦ中でＮａＨを用いて、臭化プロパルギルによりアルキル化させ、Ｂｏｃで保護されたアルキン５を生成させた。ＤＣＭ中でＴＦＡを用いる酸性条件下で、Ｂｏｃ保護基を除去した。生成物６を、１−ブロモ−３−チオアセチルプロパン７で再度アルキル化させ、低収量ではあるが、８を結果として形成させた。塩酸メタノール中でアセチル保護基の除去を実行したところ、中間体９がもたらされた。次いで、この中間体を、ＥＤＣおよび４−ＤＭＡＰを用いて、ＭＨＩ−１４８色素とカップリングさせて、生成物であるＭＨＩ−クロルジリン１０をもたらした。この生成物を、逆相ＨＰＬＣを用いて精製し、その識別を質量分析により確認した。
【００８４】
生細胞におけるＭＨＩ−クロルジリンの造影：先行研究は、近赤外ヘプタメチンシアニン色素であるＩＲ−７８３およびＭＨＩ−１４８が、トランスジェニックマウスの腫瘍異種移植片および自然発生腫瘍におけるがん細胞では保持されるが、正常細胞では保持されないことを示した。さらに、これら２つの色素もまた、７５０〜７８０ｎｍで励起されると８２０〜８６０ｎｍにおいて強い発光を示し、これは、ＮＩＲ造影装置およびレーザー走査共焦点顕微鏡により容易に検出および画像化することができる。ここで、本発明者らは、造影装置としてのＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０共焦点顕微鏡の使用を講じた。コンジュゲートの細胞内の取込みは不確実であったが、構造が類似しているため、ＭＨＩ−クロルジリンコンジュゲートは、ＮＩＲ色素それ自体と同様の蛍光特性を有すると予測された。したがって、レーザー走査共焦点顕微鏡によるＮＩＲ造影を用いて、ＭＨＩ−クロルジリンのヒト前立腺上皮がん細胞（Ｃ４−２Ｂ）内の取込みについて検査した。この細胞系は、その高レベルのＭＡＯ−Ａ発現のために選択した。
【００８５】
予備的研究において、本発明者らは、ＩＲ−７８３色素が生細胞のミトコンドリア内に共局在化することを見出した。新たに合成されたＭＨＩ−クロルジリン１０による造影研究を実行した（図１１）。この化合物もまた、Ｃ４−２Ｂ  ＰＣａ細胞内の急速な蓄積を示し、ミトコンドリア特異的色素との共染色により決定される通り、ミトコンドリア内に局在化した。
【００８６】
ＭＨＩ−クロルジリン１０の阻害活性について調べるために、放射性標識された基質を用いて、Ｃ４−２Ｂ細胞において標準的なＭＡＯ  Ａ阻害アッセイを実行した。結果は、本発明者らのデザインしたコンジュゲート１０が、２．１８×１０-5Ｍの平均ＩＣ50でＭＡＯ  Ａ活性を阻害することを明確に示す（図１２）。コンジュゲート１０の活性は、クロルジリンそれ自体の活性より小さい（データは示さない）が、現在進行中のｉｎ  ｖｉｖｏにおける研究には十分である。
【００８７】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるナノクロルジリンの機能  −  マウスにおけるその配置および腫瘍成長の阻害
マウスにおけるナノクロルジリンの配置および腫瘍の進行に対するその効果について研究する。本発明者らは、ヒトＬＮＣＡＰ非転移性前立腺がん細胞（１×１０6個）を、（１）ナノクロルジリン：特定の目的１ｂからの結果を用いて、ほぼ１００％のＭＡＯ−Ａ活性を阻害するのに要請される濃度；（２）クロルジリンそれ自体（陽性対照、ＭＡＯ−Ａ活性を１００％阻害するために１０ｍｇ／ｋｇ）；（３）色素それ自体（陰性対照、ナノクロルジリンと同じ濃度）と共に、免疫不全ヌードマウスに注射する。研究のこの部分には、合計１８匹のマウスが要請される（各群につき６匹ずつ）。
【００８８】
次いで、本発明者らは、１カ月間にわたり隔日で腫瘍の位置を造影し、腫瘍成長（サイズ、数）をモニタリングする。腫瘍は、ＮＩＲ造影により位置特定する。Ｏｌｅｎｙｕｋのラボは、ＮＩＲ造影において広範な経験を有し、必要とされる装置は、Ｎｏｒｒｉｓがんセンターで入手可能である。本発明者らの仮説が正しいとすれば、ナノクロルジリンは、前立腺がん内に配置され、腫瘍成長は低減されるであろう。３０日間の経過後、マウスを屠殺し、腫瘍（なおも腫瘍が認められる場合）および正常前立腺組織内のＭＡＯ−Ａ活性を決定する（この実験の詳細については、先行研究の図１を参照されたい）。本研究により、ナノクロルジリンの診断および治療のための潜在的な有用性が裏付けられるであろう。
【００８９】
ナノクロルジリンの、マウスにおける前立腺がんの転移に対する効果についての研究。
【００９０】
転移の可能性を有するヒト前立腺がん細胞であるヒトＣ４−２、ＡＲＣａＰｍ、（１×１０6個の細胞）を、マウスに注射し、同じ３群のマウスを用い、手順および実験も、特定の目的２ａで記載されるのと同じであるものとする。腫瘍の成長速度およびサイズならびに位置を決定する。腫瘍の骨における存在または非存在が転移の指標として検査されるであろう。合計３６匹のマウスを用いる（各細胞系につき１８匹ずつのマウスで３つの処置群を伴う；２つの転移性細胞系）。
【００９１】
単独でまたは腫瘍の成長および転移に対する既存の処置と組み合わせたナノクロルジリンのマウスにおける効果。
【００９２】
進行性前立腺がんのための第一選択処置は、アンドロゲンアブレーション治療（ＡＤＴ）である。残念ながら、ＡＤＴの奏効の持続期間は、限定されており（約１８カ月間）、患者は最終的に、去勢抵抗性を発症する。去勢抵抗性ＰＣＡの患者のための第一選択処置は通常、微小管阻害剤であるドセタキセルによる化学療法である。近年、ＦＤＡは、ドセタキセル治療が奏効しない去勢抵抗性患者を処置するための特異的ＣＹＰ１７阻害剤であるアビラテロンを承認した。本研究は、単独または腫瘍成長に対するこれらの処置法のうちの１つと組み合わせたナノクロルジリンの効果について評価する。ナノクロルジリンは、ＩＮＲ造影で非侵襲的に読み取りうるので、各処置の予後を容易に決定することができる。
【００９３】
ヒトＬＮＣＡＰ細胞（非転移性前立腺がん細胞系）：代替的に、ＡＲＣａＰｍ（転移の可能性を伴う）を、免疫不全ヌードに注射する。次に、マウスを、Ａで記載される通りに３群に分ける。腫瘍の位置、サイズ、病変数は、１日目〜３０日目において隔日で決定する。３１日目に、マウスを屠殺し、腫瘍および宿主のＭＡＯ活性を決定する。
【００９４】
Ａ：（群Ｉ）アンドロゲンアブレーション治療（去勢）**を伴うナノクロルジリン（１ｍｇ／ｋｇ*）
（群ＩＩ）ナノクロルジリン単独（１ｍｇ／ｋｇ*）
（群ＩＩＩ）去勢単独**
Ｂ：（群Ｉ）ドセタキセル（毎日、１５ｍｇ／ｋｇ）
（群ＩＩ）ナノクロルジリン単独（１ｍｇ／ｋｇ*）、
（群ＩＩＩ）ドセタキセル（１５ｍｇ／ｋｇ）、ナノクロルジリン（１ｍｇ／ｋｇ*）
Ｃ：（群Ｉ）新薬（アビラテロン、１８０ｍｇ／ｋｇ）毎日
（群ＩＩ）ナノクロルジリン単独（１ｍｇ／ｋｇ*）、
（群ＩＩＩ）新薬（アビラテロン、１８０ｍｇ／ｋｇ）およびナノクロルジリン（１ｍｇ／ｋｇ*）
*用いられるナノクロルジリンの濃度は、特定の目的１ｂから得られる結果に基づき調整する。
【００９５】
去勢群には、適正な無菌および殺菌法を伴うイソフルラン麻酔下で経陰嚢去勢を実施する。合計１０８匹のマウスを用いる。
【００９６】
ハイスループットスクリーニングから得られる他の新規のＭＡＯ−Ａ阻害剤によるナノ粒子コンジュゲートの合成
ここで開示される他の新規のＭＡＯ−Ａ阻害剤を、本発明の方法および処置において用いるために、任意にコンジュゲートしてもよい。とりわけ、４つの新規の高アフィニティーＭＡＯ−Ａ阻害剤１１〜１４の例を以下に示す。これらは、近赤外色素、たとえば、ＩＲ−７８３とコンジュゲートしてもよい。新規のナノ粒子ベースのＭＡＯ−Ａ阻害剤を生成させるために、フェノール官能性（−ＯＨ）は、リンカーの接合およびその後の蛍光前駆体３によるこれらの分子の誘導体化のための実行可能な選択肢を提示する。
【００９７】
ＭＡＯ−Ａは、ＨＩＦ１αを安定化させ、ＶＥＧＦを介するＴｗｉｓｔ１の活性化を増強することにより、前立腺がんにＥＭＴを付与する
グリソンスコアが高い前立腺癌は侵襲性であり、ＭＡＯ−Ａ発現の上昇を呈示する低分化度の腫瘍である。本発明者らは、ＭＡＯ−Ａの鍵となる機能が、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を促進することであることを見出した。ＥＭＴとは、細胞接着の減退、Ｅ−カドヘリン発現の抑制、および細胞移動性の増大を特徴とする細胞発生過程である。がんの関係では、ＥＭＴの促進が、細胞の浸潤、遊走、および転移可能性の増大と相関し、よって、ＭＡＯ−ＡのＥＭＴ促進効果は、ＭＡＯ−Ａ活性をがんと関連付ける。より具体的に、本発明者らは、ヒト前立腺がん細胞におけるＭＡＯ−Ａの過剰発現が、Ｅ−カドヘリン（上皮マーカー）の減退を誘導し、ビメンチン／Ｎ−カドヘリン（間葉マーカー）を上方調節し、細胞の遊走および浸潤を増大させることを見出した  これに対し、ＭＡＯ−Ａのノックダウンは、ヒト前立腺がん細胞におけるＥＭＴを妨げる。
【００９８】
いかなる特定の理論にも束縛されずに述べると、本発明者らは、以下の実験による観察を提示して（図２０〜２６）、ＭＡＯ−Ａ活性とその多様ながん促進効果との関連を機構との関連で説明する。
【００９９】
まず、本発明者らは、ＭＡＯ−Ａが、プロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）活性を低減し、細胞内のＲＯＳレベルを上昇させることにより、ＨＩＦ１αの安定性を増強することを見出した。次いで、本発明者らは、前立腺がん細胞を、ＲＯＳスカベンジャー（Ｎ−アセチルシステイン）で処置することにより、ＭＡＯ−Ａにより誘導されるＨＩＦ１α発現が減衰し、また、これにより、ＭＡＯ−Ａにより増強される細胞増殖も減少することを見出した。さらに、本発明者らはまた、ＭＡＯ−Ａが、低酸素状態に応答したＶＥＧＦおよびその受容体であるニューロピリン１（ＮＲＰ１）の活性化を媒介し、これが、Ａｋｔ／ＦｏｘＯ１シグナル伝達経路を刺激し、そのリン酸化に続く核外輸送を促進することにより、ＦｏｘＯ１活性を低減することも見出した。本発明者らは、ＦｏｘＯ１が、Ｔｗｉｓｔ１の転写リプレッサーとして作用し、Ｔｗｉｓｔ１プロモーターの近位領域内の応答エレメントに結合することもさらに発見した。Ｔｗｉｓｔ１は、複数のがんにおけるがん遺伝子であることが知られており、腫瘍の転移に関与している。図２７は、この機構についてまとめる。
【０１００】
重要なことは、この機構が、グリソンスコアが高いがんにおいて顕示され、グリソンスコアの低いがんと比較して、著明により多くのＨＩＦ１α、ＶＥＧＦ、およびＴｗｉｓｔ１の発現を呈示するが、より少ないＦｏｘＯ１の核局在化を呈示することである。したがって、ＭＡＯ−Ａ、ＨＩＦ１α、ＶＥＧＦ、およびＴｗｉｓｔ１の発現レベルは、グリソンスコアが高いがんを、グリソンスコアの低いがんと客観的に識別するためのバイオマーカーとして用いられる。
【実施例】
【０１０１】
以下の例は、本発明の特定の態様および側面を裏付け、さらに例示するために提示されるものであり、それらの範囲を限定するものとしてはみなされないものとする。このような例は、用いられてもよいものの典型であるが、代替的に、当業者に知られる他の手順も使用してもよい。さらに言えば、当業者は、不要な実験なしに、ここでの教示に基づき、さらなる態様を容易に想定および創出することができる。
【０１０２】
例１
宿主実験１におけるＭＡＯ−Ａ  ＫＯ：ＷＴおよびＭＡＯ−Ａ  ＫＯマウスにおけるマウスＦ９奇形癌の腫瘍異種移植片
注射された細胞数：１×１０5個。マウス数：ＷＴ（Ｎ＝９）およびＭＡＯ−Ａ  ＫＯ（Ｎ＝９）。腫瘍注射部位数：ＷＴ（２×９＝１８）およびＭＡＯ−Ａ  ＫＯ（２×９＝１８）。腫瘍発生率：ＷＴ（１１／１８＝６１．１％）およびＭＡＯ−Ａ  ＫＯ（３／１８＝１６．７％）。腫瘍成長：ＷＴ＞ＭＡＯ−Ａ  ＫＯ（ｐ＜０．０５）。腫瘍重量：ＷＴ＞ＭＡＯ−Ａ  ＫＯ（ｐ＜０．０５）
例２
宿主実験２におけるＭＡＯ−Ａ  ＫＯ：ＷＴおよびＭＡＯ−Ａ  ＫＯマウスにおけるマウスＭＣＰ３（ｐｔｅｎ／ｐ５３二重ＫＯ）前立腺腫瘍異種移植片
注射された細胞数：１×１０6個。マウス数：ＷＴ（Ｎ＝３）およびＭＡＯ−Ａ  ＫＯ（Ｎ＝３）。腫瘍注射部位数：ＷＴ（４×３＝１２）およびＭＡＯ−Ａ  ＫＯ（４×３＝１２）。腫瘍発生率：ＷＴ（１１／１２＝９１．７％）およびＭＡＯ−Ａ  ＫＯ（１０／１２＝８３．３％）。腫瘍成長：ＷＴ＞ＭＡＯ−Ａ  ＫＯ（ｐ＜０．０５）。腫瘍重量：ＷＴ＞ＭＡＯ−Ａ  ＫＯ（ｐ＝０．２５）
例３
宿主実験３におけるＭＡＯ−Ａ  ＫＯ：ＷＴおよびＭＡＯＡ  ＫＯマウスにおけるマウスＭＣＰ３前立腺腫瘍異種移植片
注射された細胞数：１×１０5マウス数：ＷＴ（Ｎ＝４）およびＭＡＯ−Ａ  ＫＯ（Ｎ＝５）。腫瘍注射部位数：ＷＴ（３×４＝１２）およびＭＡＯ−Ａ  ＫＯ（３×５＝１５）。腫瘍発生率：ＷＴ（１０／１２＝８３．３％）およびＭＡＯ−Ａ  ＫＯ（０／１５＝０）。腫瘍成長：ＭＡＯ−Ａ  ＫＯマウスにおけるＭＣＰ３腫瘍成長は見られない。
【０１０３】
例４
腫瘍実験１におけるＭＡＯ−Ａ  ＫＤ：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるマウスＷＴおよびＭＡＯ−Ａ−ＫＤ  ＭＣＰ３前立腺腫瘍異種移植片
注射された細胞数：１×１０6個。マウス数：ＷＴ  ＭＣＰ３細胞のためのマウス（Ｎ＝６）およびＭＡＯ−Ａ−ＫＤ  ＭＣＰ３細胞のためのマウス（Ｎ＝４）。腫瘍注射部位数：ＷＴ  ＭＣＰ３細胞（４×６＝２４）およびＭＡＯ−Ａ−ＫＤ  ＭＣＰ３細胞（４×４＝１６）。腫瘍発生率：ＷＴ  ＭＣＰ３細胞（２１／２４＝８７．５％）およびＭＡＯ−Ａ−ＫＤ  ＭＣＰ３細胞（０／１６＝０）。腫瘍成長：腫瘍内にＭＡＯ−Ａ  ＫＤを含む場合、腫瘍成長は見られない。
【０１０４】
例５
腫瘍実験２におけるＭＡＯ−Ａ  ＫＤ：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるマウスＷＴおよびＭＡＯ−Ａ−ＫＤ  ＭＣＰ３前立腺腫瘍異種移植片
注射された細胞数：１×１０6個。マウス数：ＷＴ  ＭＣＰ３細胞のためのマウス（Ｎ＝６）およびＭＡＯ−Ａ−ＫＤ  ＭＣＰ３細胞のためのマウス（Ｎ＝６）。腫瘍注射部位数：ＷＴ  ＭＣＰ３細胞（３×６＝１８）およびＭＡＯ−Ａ−ＫＤ  ＭＣＰ３細胞（３×６＝１８）。腫瘍発生率：７月１６日現在、ＷＴ  ＭＣＰ３細胞（１５／１８＝８３．３３％）およびＭＡＯ−Ａ−ＫＤ  ＭＣＰ３細胞（０／１８＝０）。
【０１０５】
例６
ＭＨＩ−クロルジリンの合成および前立腺がんの進行におけるＭＡＯ−Ａの役割
一般的な合成：別段に言明しない限り、全ての試薬および溶媒は、市販元から得、そのまま用いた。水分感受性試薬を伴う全ての反応は、無水溶媒およびフレームドライ処理されたガラス器具により、アルゴン雰囲気下で実行した。吸湿性の液体を、シリンジを介して移し、ゴム隔膜を介して反応槽に導入した。回転式蒸発器を３０〜１５０ｍｍＨｇで用いて、反応生成物溶液を濃縮した。シリカゲル（２３０〜４００のメッシュ）上で、試薬グレードの溶媒を用いてカラムクロマトグラフィーを実施した。解析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、あらかじめコーティングされたガラス支持プレート（０．２５ｍｍ、シリカゲル６０、Ｆ−２５４、ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）上で実施した。解析用ＨＰＬＣは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−１０Ａ  ＶＰポンプおよびＳｈｉｍａｄｚｕ  ＳＰＤ  １０Ａ  ＶＰ  ＵＶ−ｖｉｓ波長可変型検出器を用いるＭｉｃｒｏｓｏｒｂ−ＭＶ  Ｃ8逆相カラム（２５０×４．６ｍｍ、Ｖａｒｉａｎ）上で実施した。調製用ＨＰＬＣによる精製は、Ｃ8逆相調製用カラム（Ｇｒａｃｅ  Ｄａｖｉｓｏｎ）で実行した。調製用逆相ＨＰＬＣのための流量は、４ｍＬ／分であった。全ての場合において、０．１％の水性トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中で５％〜９５％の勾配のアセトニトリルを、溶離液として用いた。水（１８ΜΩ）は、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ水精製システムから得、全ての緩衝液は、０．２μｍで濾過した。核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、表示の溶媒中でＶａｒｉａｎ  ４００ＭＨｚ測定器により収集した。ピーク位置は、テトラメチルシラン（０ｐｐｍ）のシグナルからのダウンフィールドにあり、実験において用いられる溶媒の不完全な重水素化から生じるシグナル（ＣＤＣｌ3：７．２６ｐｐｍ、またはＤＭＳＯ−Ｄ6の多重項の中心線：２．５０ｐｐｍ）を基準とする、１００万分の１（ｐｐｍ）単位の化学シフト（δ）で報告する。炭素１３の化学シフトは、ｐｐｍ単位で、実験において用いられる溶媒の炭素１３シグナル（ＣＤＣｌ3：７７．０ｐｐｍ、またはＤＭＳＯ−Ｄ6の多重項の中心線：３９．５１ｐｐｍ）を基準とするδ値として報告する。カップリング定数（Ｊ）は、ヘルツ（Ｈｚ）で報告する。以下の略号：一重項（ｓ）、二重項（ｄ）、三重項（ｔ）、二重項の二重項（ｄｄ）、多重項（ｍ）を用いる。質量スペクトルは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５２０飛行時間質量分析器から得た。
【０１０６】
（１）ＭＨＩ−クロルジリンの合成：
１−（３−ブロモプロポキシ）−２，４−ジクロロベンゼン（２）の合成：
【化１４】
2014525914.tif 000015
【０１０７】
２，４−ジクロロフェノール１（４．１ｇ、２５ミリモル）、１，３−ジブロモプロパン（１０ｇ、５０ミリモル）と水酸化ナトリウム（１．０ｇ）水（４ｍＬ）溶液の混合物を、還流で１．５時間にわたり撹拌した。水酸化ナトリウム（１．０ｇ）水（６ｍＬ）溶液を添加し、混合物をさらに１．５時間にわたり還流させた。冷却後、反応混合物をクロロホルム（５０ｍＬ）で抽出し、水（３０ｍＬずつ３回）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空中で蒸発させた。粗生成物を得（１０．４９ｇ）、次いで、シリカゲルカラム（７９．１６ｇ）により精製した。収率：１０．７％（０．７９４ｇ）。
【０１０８】
１−（３−アジドプロポキシ）−２，４−ジクロロベンゼン（３）の合成：
【化１５】
2014525914.tif 000016
【０１０９】
攪拌バー、サーモウェル内の熱電対、およびスリーブを有するゴム隔膜による止栓を装備した２５ｍＬの丸底フラスコ内の６．０ｍＬのＤＭＦ中における１−（３−ブロモプロポキシ）−２，４−ジクロロベンゼン溶液（６００ｍｇ、２．１１ミリモル）に、２３４．０ｍｇ（３．６０ミリモル）のＮａＮ3を室温で添加した。Ｎ2圧力下で一晩にわたり混合物を撹拌した。灰白色の懸濁液の形成が観察された。２０μＬの反応混合物を、０．５ｍＬのＭＴＢＥと０．５ｍＬの水で分配し、ＭＴＢＥ層を、ＴＬＣ（シリカゲル、１００％のヘキサン）に用いた。反応混合物の残りは、ＭＴＢＥと水で分配した。水層は、ＭＴＢＥで洗浄した。ＭＴＢＥ層は、水とＮａＨＣＯ3で連続的に洗浄し、次いで、さらに精製することなく、次のステップで用いた。
【０１１０】
ｔｅｒｔ−ブチル３−（２，４−ジクロロフェノキシ）プロピルカルバメート（４）の合成：
【化１６】
2014525914.tif 000017
【０１１１】
前のステップから得られるＭＴＢＥ層を、攪拌バーおよびスリーブを有するゴム隔膜による止栓を装備した５００ｍＬの丸底フラスコに移した。Ｎ2雰囲気中で、Ｂｏｃ2（５７１．０ｍｇ、２，６１６ミリモル）およびＰｄ／Ｃ（５１８ｍｇ）を添加した。Ｎ2を、Ｈ2で注意深く置きかえた。ゴム風船を用いて系を陽圧下に保った。ＴＬＣ（シリカゲル、出発材料を検出するための１００％ヘキサンおよび生成物を検出するためのＭＴＢＥ：ヘキサン＝１：１、ニンヒドリン染色）を用いて、反応工程を追跡した。Ｎ2圧力下で２１時間にわたり混合物を撹拌した。ガラス製マイクロファイバーおよびＣｅｌｉｔｅ  ５４５を介して、反応混合物を真空下で濾過した。濾過物をＭＴＢＥと水で分配した。水層は、ＭＴＢＥで洗浄した。ＭＴＢＥ層は、水、生理食塩液、およびＮａＨＣＯ3で連続的に洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。処理後、粗生成物（９９１．２ｍｇ）を得、シリカゲルカラムで精製した。収率：１１．４％（７７．３ｍｇ）。
【０１１２】
ｔｅｒｔ−ブチル３−（２，４−ジクロロフェノキシ）プロピル（プロパ−２−イニル）カルバメート（５）の合成：
【化１７】
2014525914.tif 000018
【０１１３】
攪拌バーおよびスリーブを有するゴム隔膜による止栓を装備した２０ｍＬのバイアル内でＡｒ圧力下にある０．８ｍＬのＤＭＦ中におけるｔｅｒｔ−ブチル３−（２，４−ジクロロフェノキシ）プロピルカルバメート溶液（７７．３ｍｇ、０．２４ミリモル）に、ＮａＨ（１１．９ｍｇ、０．３０ミリモル）を、氷冷浴で冷却しながら添加した。反応混合物を常時Ａｒ雰囲気下で保った。トルエン中の臭化プロパルギル（４４．５ｍｇ、０．３０ミリモル）を添加した。反応混合物を室温で撹拌した。次に、反応混合物の小部分（１０〜１５μＬ）を、３５０μＬのＭＴＢＥと３５０μＬの水で分配し、ＭＴＢＥ層を、ＴＬＣ（シリカゲル、ヘキサン：ＭＴＢＥ＝１：１）に用いた。反応混合物の残りは、２０ｍＬのＭＴＢＥと２０ｍＬの水で分配した。水層は、２０ｍＬのＭＴＢＥで洗浄した。ＭＴＢＥ層は、水、生理食塩液、およびＮａＨＣＯ3で連続的に洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。粗生成物をシリカゲルカラム（１．２３ｇ）で精製した。収率：２７．４％（２３．７ｍｇ）。
【０１１４】
Ｎ−（３−（２，４−ジクロロフェノキシ）プロピル）プロパ−２−イン−１−アミニウム  ２，２，２−トリフルオロ酢酸（６）の合成：
【化１８】
2014525914.tif 000019
【０１１５】
攪拌バーを装備した２０ｍＬのバイアル内の６００μＬのＤＭＦ中におけるｔｅｒｔ−ブチル３−（２，４−ジクロロフェノキシ）プロピル（プロパ−２−イニル）カルバメート溶液（２３．７ｍｇ、６６．１マイクロモル）に、６００μＬのＴＦＡを、室温で撹拌しながら添加した。０．５時間後、ＴＬＣ（ＭＴＢＥ：ヘキサン＝１：１、ニンヒドリン染色）は、反応の完了を示した。揮発性物質は、蒸発させた。残留物は、ＡＣＮと共に、３回にわたり共蒸発させ、次いで、さらに精製することなく、次のステップで用いた。
【０１１６】
生成物の構造は、ＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳにより実証した。
【０１１７】
Ｓ−３−ブロモプロピルエタンチオエート（７）の合成：
【化１９】
2014525914.tif 000020
【０１１８】
ガラス製スリーブ内の熱電対、磁気攪拌機、アルゴン注入口（中央のステム）を有するビグリューカラム、およびスリーブを有するゴム隔膜による止栓を装備した２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコを組み立て、Ａｒ流下でヒートガンにより乾燥させた。約１１０〜１２０ｍＬの無水ＤＭＦを、Ａｒ下でカニューレを介して添加した。ＡｃＳＫ（１１．６８ｇ、１０２．３ミリモル）を、氷冷ＭｅＯＨ浴で冷却しながら、フラスコに少量ずつ添加した。反応は、約−１０℃で７時間にわたり続行した。１６５ｍＬの水を添加することにより、反応をクエンチングした後で、氷冷ＭｅＯＨ浴を除去した。反応混合物を、３００ｍＬのＭＴＢＥと７００ｍＬの水で分配した。水層は、２００ｍＬのＭＴＢＥで洗浄した。ＭＴＢＥ層は、水、生理食塩液、およびＮａＨＣＯ3で連続的に洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。収率：９８．７％（１９．１ｇ）。
【０１１９】
Ｓ−３−（（３−（２，４−ジクロロフェノキシ）プロピル）（プロパ−２−イニル）アミノ）プロピルエタンチオエート（８）の合成：
【化２０】
2014525914.tif 000021
【０１２０】
攪拌バーを装備した５ｍＬのバイアル内、１００μＬのＡＣＮ中のＮ−（３−（２，４−ジクロロフェノキシ）プロピル）プロパ−２−イン−１−アミニウム  ２，２，２−トリフルオロ酢酸（２．１４ｍｇ、０．０５ミリモル）溶液に、１２．１ｍｇ（０．０９ミリモル）のＫ2ＣＯ3および１４２．４ｍｇ（０．７２０ミリモル）のＳ−３−ブロモプロピルエタンチオエートを添加した。油浴中で５０℃まで加熱しながら、混合物を撹拌した。ＴＬＣ（シリカゲル、出発材料を検出するためのＭＴＢＥ：ヘキサン＝９：１およびチオ酢酸試薬の消費を検出するためのＭＴＢＥ：ヘキサン＝１：９）を実施して、反応工程を追跡した。攪拌バーを装備した２０ｍＬのバイアル内、８００μＬのＡＣＮ中のＮ−（３−（２，４−ジクロロフェノキシ）プロピル）プロパ−２−イン−１−アミニウム  ２，２，２−トリフルオロ酢酸（１７．１ｍｇ、０．０５ミリモル）溶液に、１２０．０ｍｇ（０．８７０ミリモル）のＫ2ＣＯ3および９５．２ｍｇ（０．４８ミリモル）Ｓ−３−ブロモプロピルエタンチオエートを添加した。５０℃の油浴で５時間にわたり加熱しながら、混合物を撹拌した。２つの反応の反応混合物を組み合わせ、濾過し、蒸発させた。粗生成物（１６８．４ｍｇ）を得、ヘキサンと共に３回にわたり共蒸発させて、ＡＣＮを除去した。シリカゲルカラム（１．２５ｇ）を用いて、粗生成物を精製した。収率：１４％（２．６ｍｇ）。
【０１２１】
生成物の構造は、ＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳにより実証した
３−（（３−（２，４−ジクロロフェノキシ）プロピル）（プロパ−２−イニル）アミノ）プロパン−１−チオール（９）の合成：
【化２１】
2014525914.tif 000022
【０１２２】
攪拌バーを装備した２０ｍＬのバイアルへ、２００μＬのＡＣＮ中のＳ−３−（（３−（２，４−ジクロロフェノキシ）プロピル）（プロパ−２−イニル）アミノ）プロピルエタンチオエート（１．１７ｍｇ、３．１０マイクロモル）溶液を添加し、蒸発させ、次いで、ＭｅＯＨと共に３回にわたり共蒸発させて、ＡＣＮを除去した。ＭｅＯＨ／ＨＣｌ（２００μＬ）をバイアルに添加し、次いで、バイアルを８５℃の油浴で６時間にわたり加熱した。反応混合物を蒸発させ、ＭｅＯＨで３回にわたり、かつ、ＡＣＮで３回にわたり連続的に共蒸発させ、次いで、さらに精製することなく、次のステップで用いた。
【０１２３】
ＭＨＩ１４８−クロルジリンコンジュゲート（１０）の合成：
【化２２】
2014525914.tif 000023
【０１２４】
攪拌バーを装備した２０ｍＬのバイアルへ、ＭＨＩ−１４８（４．７ｍｇ、６．２ミリモル）およびＥＤＣ（１．５〜２．４ｍｇ、７．８〜１２ミリモル）の後、１．５ｍｇのＤＭＡＰ（１２ミリモル）を添加した。ＡＣＮ（４００μＬ）を添加して溶液を作製した。前のステップの反応混合物を、室温で２００μＬのＡＣＮが入ったバイアルに滴下させて移した。反応混合物を、ＨＰＬＣ（ＧＲＡＣＥ  Ｄａｖｉｓｏｎ  Ａｐｏｌｌｏ  Ｃ8  ５ｕカラム、２５０ｍｍ×１０ｍｍ）で精製した。
【０１２５】
ＰＣａの進行におけるＭＡＯＡの役割についての機構的探索。
【０１２６】
本発明者らの予備的データは、ＭＡＯ−Ａが、前立腺がん（ＰＣａ）の骨への転移と緊密に関連することを示唆し、ＭＡＯ−Ａタンパク質の発現が、ＰＣａの骨転移において、正常およびグリソンスコアの低いがん性上皮の場合と比べて上昇したことを初めて裏付ける（図１３）。
【０１２７】
ヒトの骨転移性ＰＣ−３およびＡＲＣａＰM  ＰＣａ細胞におけるＭＡＯ−Ａ発現レベルの操作は、マウスにおける腫瘍成長の変化を結果としてもたらした。野生型ＭＡＯ−Ａ過剰発現ＰＣ−３細胞が、その成長を増強したのに対し、レンチウイルスによるｓｈＲＮＡを介する特異的サイレンシングを伴うＡＲＣａＰM細胞は、完全にマウスにおけるこの浸潤性で骨転移性のＰＣａ腫瘍の成長を消失させた（図１４）。これらの結果は、ＭＡＯ−Ａが、骨および内臓器官に転移する傾向が高いＰＣａ腫瘍を処置するための理想的な治療標的である可能性を提起する。
【０１２８】
マウス前立腺癌であるＴＲＡＭＰＣ−２（神経内分泌表現型）をＭＡＯＡ  ｎｅｏマウスに皮下注射した本発明者らの実験は、ＰＣａの成長速度の著明な低減を示し（図１５）、これにより、宿主におけるＭＡＯＡが、前立腺がんの成長速度の決定において果たす鍵となる役割が示唆される。
【０１２９】
とりわけ、骨の微小環境ではまた、２つの去勢抵抗性ヒトＰＣａ細胞系であるＡＲＣａＰMおよびＣ４−２におけるＭＡＯ−Ａのノックダウンも、がんにより誘導される溶骨性病変による局所性骨破壊を著明に低減した（図１６）。
【０１３０】
機構的に述べると、ＭＡＯ−Ａは、Ｅ−カドヘリン（上皮マーカー）発現の減退、ビメンチン−Ｎ−カドヘリン（間葉マーカー）の上方調節、ならびにＰＣ−３細胞への遊走および浸潤の増大（図１７Ａ〜Ｂ）を促進することにより、ヒトＰＣａ細胞における上皮間葉転換（ＥＭＴ）を誘導するのに対し、ＭＡＯＡのノックダウンは、ヒトＡＲＣａＰM細胞におけるＥＭＴを妨げることが見出された（図１７Ｃ〜Ｅ）。ＥＭＴプログラムの活性化は、ＰＣａ細胞の局所性成長および遠隔性播種を、骨格および軟組織に方向付ける可能性がある。これらのデータは、ＭＡＯ−Ａの発現およびその下流におけるシグナル伝達の軸は、転移性ＰＣａの発生およびそれと関連するＥＭＴ表現型への関与性が高い可能性があることを示唆する。
【０１３１】
本発明者らはまた、ＭＡＯ−Ａの過剰発現が、低酸素状態誘導性因子１α（ＨＩＦ１α）の発現を増強することも観察し、また、ＰＣａの進行および転移を促進することが知られている選り抜きのＨＩＦ１αの標的遺伝子、たとえば、ＶＥＧＦおよびＥＭＴ促進遺伝子（Ｓｎａｉｌ２およびＴｗｉｓｔ１）が、ＰＣａ細胞内のＭＡＯ−Ａによって影響を受けることも観察した（図１８）。低酸素状態は、ＨＩＦ１α依存性の関与性遺伝子の上方調節を介して、腫瘍の血管新生および生存応答のほか、浸潤および転移を増大させる。多くの充実性腫瘍の顕徴である慢性の低酸素状態は、活性酸素分子種レベルの上昇を伴うことが多く、当初のＥＭＴから最終的な有機栄養性のコロニー形成まで、転移過程の各段階に影響を及ぼすことが示唆されている。したがって、このデータは、ヒトＰＣａの骨および他の軟組織への転移の媒介におけるＭＡＯ−Ａの役割への重要な機構的洞察をさらに提示する。
【０１３２】
近赤外（ＮＩＲ）発光の極大を伴う蛍光ヘプタメチンシアニンのクラス、たとえば、近年同定されたＭＨＩ−１４８色素は、非毒性であり、腫瘍特異的ターゲティングおよび造影モダリティーとしての二重の機能を有する。部分的に低酸素状態により媒介されるこれらの色素は、とりわけ、がんでは保持されるが、正常細胞では保持されず、また、腫瘍異種移植片のほか、トランスジェニックマウスの自然発生腫瘍でも保持される。本発明者らは、ＭＡＯ−Ａ過剰発現ＰＣ−３腫瘍異種移植片におけるＭＨＩ−１４８ＮＩＲ色素の取込みの増強を示した（図１９）。これは、全身性宿主毒性を最小限とするＰＣａ療法のための新たな薬剤としての相乗作用性腫瘍ターゲティング能を獲得した新規のＰＣａを指向するＭＡＯ−Ａ阻害剤の開発および検証を可能とするであろう。
【０１３３】
本発明を、特定の例示的な態様および例との関連において記載してきたが、ここで開示される態様は、例示だけを目的とするものであり、当業者は、以下の特許請求の範囲において示される本発明の精神および範囲から逸脱することなしに、多様な改変および変更を行いうることが察知されるであろう。
【０１３４】
参考文献
以下の参考文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３５】
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【図１Ａ】
2014525914.tif 000029
【図１Ｂ】
2014525914.tif 000030
【図１Ｃ】
2014525914.tif 000031
【図２】
2014525914.tif 000032
【図３】
2014525914.tif 000033
【図４Ａ】
2014525914.tif 000034
【図４Ｂ】
2014525914.tif 000035
【図４Ｃ】
2014525914.tif 000036
【図４Ｄ】
2014525914.tif 000037
【図５Ａ】
2014525914.tif 000038
【図５Ｂ】
2014525914.tif 000039
【図６】
2014525914.tif 000040
【図７Ａ】
2014525914.tif 000041
【図７Ｂ】
2014525914.tif 000042
【図７Ｃ】
2014525914.tif 000043
【図７Ｄ】
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【図８】
2014525914.tif 000045
【図９Ａ】
2014525914.tif 000046
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
2014525914.tif 000048
【図９Ｄ】
2014525914.tif 000049
【図９Ｅ】
2014525914.tif 000050
【図１０】
2014525914.tif 000051
【図１１】
2014525914.tif 000052
【図１２】
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【図１３】
2014525914.tif 000054
【図１４】
2014525914.tif 000055
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2014525914.tif 000058
【図１８】
2014525914.tif 000059
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2014525914.tif 000062
【図２２】
2014525914.tif 000063
【図２３】
2014525914.tif 000064
【図２４】
2014525914.tif 000065
【図２５Ａ】
2014525914.tif 000066
【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ−Ｅ】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年3月28日(2014.3.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノアミンオキシダーゼＡ活性を阻害するのに有用な医薬組成物であって、
【化１】
2014525914.tif 000074
およびその塩
からなる群から選択される１つ以上の化合物を含む医薬組成物。
【請求項２】
前立腺がんを処置するのに有用な医薬組成物であって、
医薬として有効な量の、モノアミンオキシダーゼの活性を阻害するか、または細胞におけるモノアミンオキシダーゼの発現を抑制することが可能な医薬として活性な薬剤と、
生理学的に許容される担体
を含む医薬組成物。
【請求項３】
前立腺がんを処置するのに有用な医薬組成物であって、医薬として活性な量の、それぞれ近赤外（ＮＩＲ）ナノ粒子色素にコンジュゲートしたモノアミンオキシダーゼ阻害剤を含む１つ以上のナノコンジュゲートを含み、前記モノアミンオキシダーゼ阻害剤が
【化２】
2014525914.tif 000075
、クロルジリンおよびその塩
からなる群から選択され、前記ナノ粒子色素がＩＲ−７８３、ＩＲ−７８０、ＩＲ−７８６、およびＭＨＩ−１４８からなる群から選択される、医薬組成物。
【請求項４】
前記モノアミンオキシダーゼ阻害剤が前記ＮＩＲ色素に、少なくとも１つのＣおよび２つのＨ原子を含むリンカーを介してコンジュゲートしている、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ナノ粒子色素が、ＩＲ−７８３またはＭＨＩ−１４８である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記モノアミンオキシダーゼ阻害剤が、
【化３】
2014525914.tif 000076
からなる群から選択される、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記モノアミンオキシダーゼが、以下の式：
【化４】
2014525914.tif 000077
［式中、
Ｍ1は、ＯまたはＳであり；
Ｘ、Ｙ、およびＺのうちの少なくとも２つは、不飽和基、芳香族基、またはこれらの両方であってもよい基ＡおよびＢであって、さらなる炭素、酸素、または窒素原子に接合されていてもよい基ＡおよびＢへの結合に関与し；
基ＡまたはＢに結合しないＸ、Ｙ、およびＺのうちのいずれかは、水素または１〜６個の炭素原子を有する低級脂肪族基で置換されている］
を有するリンカーを介して近赤外色素に共有結合的に連結される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項８】
【化５】
2014525914.tif 000078
に従う式を有する、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記医薬として活性な薬剤が、ＭＨＩ−モクロベミド、ＭＨＩ−フェネルジン、ＭＨＩ−トラニルシプロミン、ＭＨＩ−パルギリン、ＭＨＩ−クロルジリン、ＭＨＩ−ＭＡＯＩ、およびＮＩＲ−ＭＡＯＩからなる群から選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記医薬として活性な薬剤が、モノアミンオキシダーゼ遺伝子発現のサイレンシングまたは下方調節に特異的な核酸ベースの遺伝子サイレンシング剤である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記遺伝子サイレンシング剤が、ＭＡＯ−Ａ、ＭＡＯ−Ｂ、またはこれらの両方のメッセンジャーＲＮＡをターゲットにするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
細胞傷害性薬剤をがん細胞に送達する方法であって、
前記細胞傷害性薬剤を、がん細胞により優先的に取り込まれてナノコンジュゲートを形成するナノ粒子色素にコンジュゲートすることと；
前記ナノコンジュゲートを、がん細胞に接触させること
を含む方法。
【請求項１３】
前記ナノ粒子色素が、ＩＲ−７８３、ＩＲ−７８０、およびＭＨＩ−１４８からなる群から選択されるナノ粒子色素である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞傷害性薬剤が、モノアミンオキシダーゼ阻害剤、アルキル化剤、微小管形成阻害剤、およびアロマターゼ阻害剤からなる群から選択される細胞傷害性薬剤である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
医薬剤のがん細胞へのターゲティング送達に有用なナノコンジュゲートを形成する方法であって、
ナノ粒子色素を前記医薬剤に共有結合的にコンジュゲートすることを含み、
前記医薬剤が、モノアミンオキシダーゼ阻害剤、アルキル化剤、微小管形成阻害剤、アロマターゼ阻害剤からなる群から選択される方法。
【請求項１６】
細胞におけるモノアミンオキシダーゼを阻害するか、または活性酸素分子種を低減する方法であって、
前記細胞を有効な量の１つ以上の以下の化合物と接触させること
【化６】
2014525914.tif 000079
を含む方法。
【請求項１７】
処置を必要とする対象における前立腺がんを処置する方法であって、
医薬として活性な薬剤を前記対象に投与すること
を含み、
前記医薬として活性な薬剤が、対象の前記がん細胞におけるモノアミンオキシダーゼを阻害または下方調節することが可能な、医薬として活性な薬剤である方法。
【請求項１８】
前記医薬として活性な薬剤が、ＭＨＩ−モクロベミド、ＭＨＩ−フェネルジン、ＭＨＩ−トラニルシプロミン、ＭＨＩ−パルギリン、ＭＨＩ−クロルジリン、ＭＨＩ−ＭＡＯＩ、ＮＩＲ−ＭＡＯＩ、およびモノアミンオキシダーゼに特異的な遺伝子サイレンシング剤からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
対象をがんの危険性についてスクリーニングするための方法であって、
対象のがんの可能性がある部位から採取された試料におけるモノアミンオキシダーゼの活性または発現レベルをアッセイすることと；
前記モノアミンオキシダーゼの活性または発現レベルを、基準と比較すること
を含み、
活性または発現レベルが前記基準より高ければ、前記対象が危険な状態にあることが示される方法。
【請求項２０】
対象における前立腺がんの異なる形態を診断または識別するための方法であって、
対象におけるモノアミンオキシダーゼの活性、発現、および位置のパターンを決定することと；
前記パターンに基づきがんの形態の診断を下すこと
を含む方法。
【請求項２１】
患者におけるがん処置の進捗をモニタリングする方法であって、
前記患者におけるモノアミンオキシダーゼの活性または発現を継続的にアッセイすることと；
前記継続的アッセイの結果を比較すること
を含み、
モノアミンオキシダーゼの活性または発現がある期間にわたり減少すれば、前記処置の好ましい進捗が示される方法。
【請求項２２】
前記患者が、前立腺がん患者であり、発光性エレメントをモノアミンオキシダーゼ阻害性エレメントにコンジュゲートしたナノコンジュゲートを含む医薬組成物で処置されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記発光性エレメントが、近赤外ナノ粒子色素である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記アッセイするステップが、前記患者の前記がんの部位において近赤外画像を撮影することにより実施される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記画像が、レーザー共焦点顕微鏡法画像である、請求項２４に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
本発明を、特定の例示的な態様および例との関連において記載してきたが、ここで開示される態様は、例示だけを目的とするものであり、当業者は、以下の特許請求の範囲において示される本発明の精神および範囲から逸脱することなしに、多様な改変および変更を行いうることが察知されるであろう。
以下に出願当初の請求項を実施の態様として付記する。
（１）
モノアミンオキシダーゼＡ活性を阻害するのに有用な医薬組成物であって、
【化２３】
2014525914.tif 000080
およびその塩
からなる群から選択される１つ以上の化合物を含む医薬組成物。
（２）
前立腺がんを処置するのに有用な医薬組成物であって、
モノアミンオキシダーゼの活性を阻害するか、または細胞におけるモノアミンオキシダーゼの発現を抑制することが可能な、医薬として活性な薬剤と、
生理学的に許容される担体
を含む医薬組成物。
（３）
前記医薬として活性な薬剤が、
【化２４】
2014525914.tif 000081
およびその塩
からなる群から選択される活性薬剤である、（２）に記載の組成物。
（４）
前記医薬として活性な薬剤が、モノアミンオキシダーゼ阻害剤に共有結合的にコンジュゲートされたナノ粒子色素を含む近赤外色素のナノコンジュゲートであり、前記モノアミンオキシダーゼ阻害剤と近赤外色素が、リンカーを介して連結していてもよく、連結していなくてもよい、（２）に記載の医薬組成物。
（５）
前記ナノ粒子色素が、ＩＲ−７８３、ＩＲ−７８０、ＩＲ−７８６、およびＭＨＩ−１４８からなる群から選択される、（４）に記載の医薬組成物。
（６）
前記モノアミンオキシダーゼ阻害剤が、
【化２５】
2014525914.tif 000082
からなる群から選択される、（４）に記載の医薬組成物。
（７）
前記モノアミンオキシダーゼが、以下の式：
【化２６】
2014525914.tif 000083
［式中、
Ｍ1は、ＯまたはＳであり；
Ｘ、Ｙ、およびＺのうちの少なくとも２つは、不飽和基、芳香族基、またはこれらの両方であってもよい基ＡおよびＢであって、さらなる炭素、酸素、または窒素原子に接合されていてもよい基ＡおよびＢへの結合に関与し；
基ＡまたはＢに結合しないＸ、Ｙ、およびＺのうちのいずれかは、水素または１〜６個の炭素原子を有する低級脂肪族基で置換されている］
を有するリンカーを介して近赤外色素に共有結合的に連結される、（４）に記載の医薬組成物。
（８）
【化２７】
2014525914.tif 000084
に従う式を有する、（７）に記載の医薬組成物。
（９）
前記医薬として活性な薬剤が、ＭＨＩ−モクロベミド、ＭＨＩ−フェネルジン、ＭＨＩ−トラニルシプロミン、ＭＨＩ−パルギリン、ＭＨＩ−クロルジリン、ＭＨＩ−ＭＡＯＩ、およびＮＩＲ−ＭＡＯＩからなる群から選択される、（４）に記載の医薬組成物。
（１０）
前記医薬として活性な薬剤が、モノアミンオキシダーゼ遺伝子発現のサイレンシングまたは下方調節に特異的な核酸ベースの遺伝子サイレンシング剤である、（２）に記載の医薬組成物。
（１１）
前記遺伝子サイレンシング剤が、ＭＡＯ−Ａ、ＭＡＯ−Ｂ、またはこれらの両方のメッセンジャーＲＮＡをターゲットにするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、（１０）に記載の医薬組成物。
（１２）
細胞傷害性薬剤をがん細胞に送達する方法であって、
前記細胞傷害性薬剤を、がん細胞により優先的に取り込まれてナノコンジュゲートを形成するナノ粒子色素にコンジュゲートすることと；
前記ナノコンジュゲートを、がん細胞に接触させること
を含む方法。
（１３）
前記ナノ粒子色素が、ＩＲ−７８３、ＩＲ−７８０、およびＭＨＩ−１４８からなる群から選択されるナノ粒子色素である、（１２）に記載の方法。
（１４）
前記細胞傷害性薬剤が、モノアミンオキシダーゼ阻害剤、アルキル化剤、微小管形成阻害剤、およびアロマターゼ阻害剤からなる群から選択される細胞傷害性薬剤である、（１２）に記載の方法。
（１５）
医薬剤のがん細胞へのターゲティング送達に有用なナノコンジュゲートを形成する方法であって、
ナノ粒子色素を前記医薬剤に共有結合的にコンジュゲートすることを含み、
前記医薬剤が、モノアミンオキシダーゼ阻害剤、アルキル化剤、微小管形成阻害剤、アロマターゼ阻害剤からなる群から選択される方法。
（１６）
細胞におけるモノアミンオキシダーゼを阻害するか、または活性酸素分子種を低減する方法であって、
前記細胞を（１）に記載の組成物と接触させること
を含む方法。
（１７）
処置を必要とする対象における前立腺がんを処置する方法であって、
医薬として活性な薬剤を前記対象に投与すること
を含み、
前記医薬として活性な薬剤が、対象の前記がん細胞におけるモノアミンオキシダーゼを阻害または下方調節することが可能な、医薬として活性な薬剤である方法。
（１８）
前記医薬として活性な薬剤が、ＭＨＩ−モクロベミド、ＭＨＩ−フェネルジン、ＭＨＩ−トラニルシプロミン、ＭＨＩ−パルギリン、ＭＨＩ−クロルジリン、ＭＨＩ−ＭＡＯＩ、ＮＩＲ−ＭＡＯＩ、およびモノアミンオキシダーゼに特異的な遺伝子サイレンシング剤からなる群から選択される、（１７）に記載の方法。
（１９）
対象をがんの危険性についてスクリーニングするための方法であって、
対象のがんの可能性がある部位から採取された試料におけるモノアミンオキシダーゼの活性または発現レベルをアッセイすることと；
前記モノアミンオキシダーゼの活性または発現レベルを、基準と比較すること
を含み、
活性または発現レベルが前記基準より高ければ、前記対象が危険な状態にあることが示される方法。
（２０）
対象における前立腺がんの異なる形態を診断または識別するための方法であって、
対象におけるモノアミンオキシダーゼの活性、発現、および位置のパターンを決定することと；
前記パターンに基づきがんの形態の診断を下すこと
を含む方法。
（２１）
患者におけるがん処置の進捗をモニタリングする方法であって、
前記患者におけるモノアミンオキシダーゼの活性または発現を継続的にアッセイすることと；
前記継続的アッセイの結果を比較すること
を含み、
モノアミンオキシダーゼの活性または発現がある期間にわたり減少すれば、前記処置の好ましい進捗が示される方法。
（２２）
前記患者が、前立腺がん患者であり、発光性エレメントをモノアミンオキシダーゼ阻害性エレメントにコンジュゲートしたナノコンジュゲートを含む医薬組成物で処置されている、（２１）に記載の方法。
（２３）
前記発光性エレメントが、近赤外ナノ粒子色素である、（２２）に記載の方法。
（２４）
前記アッセイするステップが、前記患者の前記がんの部位において近赤外画像を撮影することにより実施される、（２３）に記載の方法。
（２５）
前記画像が、レーザー共焦点顕微鏡法画像である、（２４）に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成26年5月9日(2014.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
前立腺がんを処置するのに有用な医薬組成物であって、
治療的に有効量の、モノアミンオキシダーゼの活性を阻害するか、または細胞におけるモノアミンオキシダーゼの発現を抑制することが可能な医薬として活性な薬剤と、
生理学的に許容される担体
を含む医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
前立腺がんを処置するのに有用な医薬組成物であって、治療的に有効量の、それぞれ近赤外（ＮＩＲ）ナノ粒子色素にコンジュゲートしたモノアミンオキシダーゼ阻害剤を含む１つ以上のナノコンジュゲートを含み、前記モノアミンオキシダーゼ阻害剤が
【化２】
2014525914.tif 000085
、クロルジリンおよびその塩
からなる群から選択され、前記ナノ粒子色素がＩＲ−７８３、ＩＲ−７８０、ＩＲ−７８６、およびＭＨＩ−１４８からなる群から選択される、医薬組成物。
【国際調査報告】
2014525914.tif 000086
2014525914.tif 000087
2014525914.tif 000088
2014525914.tif 000089
2014525914.tif 000090
2014525914.tif 000091