(57)【要約】  生体組織中の内因性蛍光体を検出、定量化、および／または視覚化するための方法であって、ａ）多光子励起後に、サンプル中の蛍光シグナルの経時的な低下に関する情報を提供する一組の連続的な三次元または二次元画像を獲得するステップと、ｂ）蛍光シグナルの対数の線形回帰を行うことによってこれらの画像を処理することにより、前記線形回帰の勾配のサンプル中の空間分布を決定するステップと、ｃ）少なくともこの空間分布に基づいて、サンプル中の蛍光体の存在および／または体積密度もしくは表面密度に関する情報を生成するステップとにあるステップを含み、蛍光体がメラニンである、方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織中の内因性蛍光体を検出、定量化、および／または視覚化するための方法であって、
ａ）多光子励起後に、サンプル中の蛍光シグナルの経時的な低下に関する情報を提供する一組の連続的な三次元または二次元画像を獲得するステップと、
ｂ）蛍光シグナルの対数の線形回帰を行うことによってこれらの画像を処理することにより、前記線形回帰の勾配のサンプル中の空間分布を決定するステップと、
ｃ）少なくともこの空間分布に基づいて、サンプル中の蛍光体の存在および／または体積密度もしくは表面密度に関する情報を生成するステップと
を含み、
前記蛍光体がメラニンである、方法。
【請求項２】
前記一組の画像が、３枚から５枚の間の画像を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記蛍光シグナルの積分が、規則的な間隔で、特に１ｎｓから３ｎｓの間の期間に対して実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記情報が、低い値の勾配を有する画素を除外した後に生成される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記情報が、メラニンの空間分布の少なくとも１つの表示の形で生成される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
生成された前記情報が、組織中のメラニンによって占められる表面および／または体積に関する情報を提供する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
生体組織上で、ｉｎ  ｖｉｖｏで実施される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記組織が、ヒトの皮膚、再構成されたもしくは人工の皮膚、または培養中にメラニン沈着させた細胞である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
特に色素沈着促進または色素脱失である刺激および／または処置が、生体組織に及ぼす作用を評価するための方法であって、
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法を用いて組織中の色素沈着を評価するステップと、
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法を用いて、前記組織中の色素沈着の第２の評価を行うステップであり、前記組織を、光放射、特に日光、紫外線（ＵＶ）、もしくは赤外線（ＩＲ）放射、炎症応答を引き起こす刺激、および機械的作用から選択された刺激、または、特に少なくとも１種の色素沈着促進もしくは色素脱失性化粧品、たとえばルシノール、または任意の他の色素沈着調節化学薬品による処置の作用に曝した、ステップと、
前記２つの評価中に生成された情報を比較するステップと、
少なくともこの比較に基づいて、色素沈着に対する刺激または処置の作用を評価するステップとを含む方法。
【請求項１０】
特に抗色素沈着、色素沈着促進、または色素脱失である刺激および／または処置の、生体組織に対する作用を評価するための方法であって、前記組織の少なくとも２つの領域が、異なる状態で刺激に曝されかつ／または異なる状態で処置され、前記刺激または前記処置に曝される前および後に、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法を用いて得られた前記領域中のメラニンの存在および／または量に関する情報が比較される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織、特に皮膚などのケラチン材料の観察に関する。
【０００２】
本発明は、より詳細には、美容上または治療上の処置の作用を評価することを特に目的として、生体組織中のメラニンの分布、特に分布の量および／または性質を決定することを対象とした方法に関するが、これに限定するものではない。
【背景技術】
【０００３】
生体組織の色は、メラニンの量および三次元分布に密接に関連している。今日、メラニンの量および分布の特徴付けは、組織切片がフォンタナマソンで染色されたメラニンの白色光撮像および定量化による二次元形態、または画像処理後のメラニンの多光子撮像および三次元定量化による三次元形態のいずれかで実施することができる。
【０００４】
多光子顕微鏡法は、生体組織、特に高度に散乱する生きた組織の深部観察を容易にする。これは、赤外光がそれほど散乱せずかつそれほど吸収されないので組織内に赤外光がより良好に透過し、シグナルを生成するのに非線形機構を使用することによってより強力なシグナル選択基準が散乱媒体に導入されるからである。この非線形機構では、２個またはさらに数個の光子と、検出しようとする分子または構造とが、同時に相互作用する。一般に、励起ビームはサンプル中で収束し走査され、生成された非線形シグナルが、画像を得るために検出される。このタイプの画像の特殊性は、励起出力を有するシグナルの非線形依存性に起因して得られる光切片容量に基づく。励起出力密度は焦点で非常に高いので、検討中の非線形効果は、限られた焦点体積においてのみ効率的に発揮され、この本質的な性質により、サンプル中で得られたシグナルの封じ込めが確実になり、したがって、マイクロメートル程度の固有の三次元解像度を得ることが可能になる。撮像深さは組織に応じて変化し、ヒトの皮膚の場合は約１３０〜２００μｍであってもよい。
【０００５】
さらに、内因性シグナル源の使用により、この撮像技法は組織成分の標識付けを必要としない。蛍光シグナルは内因性発色団によって生成され、メラニンに加えてＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、フラビン、ケラチン、およびエラスチンを挙げることができる。
【０００６】
特許文献１は、皮膚の表皮基底層レベルにおいて高濃度のメラニンが存在することは、他の内因性蛍光体の場合よりも強力な蛍光強度があることにより反映されるという事実に基づいて、多光子顕微鏡法によって皮膚の色素沈着を評価するための方法を開示する。強力な強度を有する画素は、メラニンに起因する。とはいえ、この方法は、第１に、ケラチンなどの強力な蛍光強度も示す他の蛍光体によって乱される可能性があるので、第２に、他の内因性蛍光体の場合と同等の蛍光シグナルを示すメラニンが考慮されないので、常に満足のいくものとは限らない。
【０００７】
より具体的な方法は、メラニンの蛍光寿命を考慮することにある。事実、メラニンの蛍光寿命は、メラニンの固有の蛍光特性に依存し、かつ励起体積での蛍光強度にも蛍光体の濃度にも依存しない。メラニンは、他の内因性蛍光体の場合とは異なる２光子励起蛍光寿命を有する。この蛍光寿命は、ＦＬＩＭ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌｉｆｅｔｉｍｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ：蛍光寿命撮像）により獲得された画像に基づいて推測することができ、この技法は、非特許文献１に記載されており、経時的な蛍光シグナルの低下をモニタすることにある。特許文献２は、多光子顕微鏡法とＦＬＩＭとを組み合わせた、メラニンを視覚化するための方法について記述する。後者の技法は、蛍光寿命の良好な推測を行うために、時間および空間における蛍光シグナルの積分、すなわち時間に関して費用のかかる演算を必要とし、それによって、特に三次元撮像という状況においてこの技法を適用する可能性が制限される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】仏国特許出願公開第２９４４４２５号明細書
【特許文献２】特開２００９−１４２５９７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍ．Ｓ．  Ｒｏｂｅｒｔｓら、「Ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｓｋｉｎ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ａｎｄ  ｌｉｆｅｔｉｍｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ｖｏｌ．  ７７  （２０１１）、４６９〜４８８頁）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、信頼性のある迅速で関連ある結果を得ることを可能にする、生体組織内でのメラニンの分布を三次元視覚化するための、実施するのが容易な感受性のある非侵襲的方法の利益を有する必要がある。
【００１１】
本発明の目的は、生体組織、特に表皮において、メラニンを特異的に検出しかつその三次元分布を特徴付けることを可能にする、従来技術の方法よりも簡単で迅速な方法を開発することである。
【００１２】
処置中に使用される、たとえば抗色素沈着、色素脱失、または色素沈着促進活性剤をベースにした製品の効力または無害性を検証することを可能にすることも求められている。
【００１３】
皮膚のタイプ、人口、地理的位置、またはその他の食餌などに応じてメラニンの量および分布の差を客観化するために、また、光線性黒子、そばかす（しみ）、または肝斑（妊娠中に時々現れるマスク）など、特に皮膚の色素沈着障害を特徴付けるために、特に皮膚の色素沈着を特徴付けることにも利点がある。
【００１４】
さらに、合成により再構築される新しい組織を開発するための探索という状況では、組織モデルのタイプ、特に皮膚モデルに応じてメラニンの量および分布の差を客観化することが求められている。
【００１５】
本発明は、これらの必要性のすべてまたは部分を満たすことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
したがって本発明の対象は、その態様の１つによれば、生体組織中のメラニンなどの内因性蛍光体成分を検出、定量化、および／または視覚化するための方法であって：
ａ）多光子励起後に、サンプル中の蛍光シグナルの経時的な低下に関する情報を提供する一組の連続的な三次元または二次元画像を獲得するステップと、
ｂ）蛍光シグナルの対数の線形回帰を行うことによってこれらの画像を処理することにより、前記線形回帰の勾配のサンプルにおける空間分布を決定するステップと、
ｃ）少なくともこの三次元空間分布に基づいて、サンプル中の蛍光体の存在および／または量に関する情報を生成するステップと
にあるステップを含む方法である。
【００１７】
方法は、非侵襲的であり、非治療的、美容的な状況において使用されてもよい。
【００１８】
方法は、色素沈着の評価を可能にすることができる。
【００１９】
獲得された画像は、三次元の時間的画像である。「三次元時間的画像」という用語は、経時的な一連の連続した三次元画像を意味するものとする。
【００２０】
各三次元画像は、所与の瞬間および所与の深さでのサンプル構造を表す二次元画像の積重ねに相当する。
【００２１】
各三次元または二次元画像の各画素は、ｚがサンプルの深さである空間座標（ｘ，ｙ，ｚ）によって定められてもよい。したがって各二次元画像は、獲得が所与の深さｚでのみ実施される三次元画像の特定の場合に相当する。
【００２２】
三次元画像の画素は、様々な瞬間に得られた画像の同じ空間座標を有する何組かの画素に、まとめてグループ分けされ、これらの何組かの画素を「時間的画素」と呼ぶ。
【００２３】
各画素の蛍光シグナルの値は、２光子励起蛍光シグナルの、ある時間に対する積分によって得てもよい。蛍光シグナルの積分は、特に規則的な間隔で、特に１から３ｎｓの間の期間にわたり、たとえば１、１．５、２、２．５、または３ｎｓに等しい期間で実施することができる。
【００２４】
蛍光シグナルの低下の勾配は、蛍光寿命の対数の線形回帰によって得ることができる。方法は、限られた数の三次元時間的画像、たとえば獲得時間と精度との間でうまく折り合いをつけた３枚から５枚の間の画像の獲得しか必要としなくてもよい。対数の線形回帰により得られた勾配の使用は、獲得枚数のこの限定を容易にする。
【００２５】
ＦＬＩＭ技術と比較して、本発明は、時間的獲得数を低減させ、方法の実施を容易にかつ迅速にする。ＦＬＩＭ技術は、蛍光寿命の推定をより良好にできるようにするが、三次元画像の解像度の劣化を伴う非常に長い獲得時間（約３０秒）が必要であり、本発明による方法は、より迅速であり、三次元視覚化または定量化を得るのに特に有利であると同時に、顕微鏡の理論的解像度と均等な解像度が保持される。
【００２６】
所与のサンプルの座標（ｘ，ｙ，ｚ）の時間的画素に対する全獲得時間は、ＦＬＩＭで数ｍｓであった代わりに約０．２８μｓである。
【００２７】
各時間的画素に対する時間的獲得数は、たとえば４枚に等しく、各画素ごとに、２枚の獲得の間で、特に２ｎｓの規則的な間隔で、２光子励起蛍光シグナルが時間に対して積分される。
【００２８】
本発明による方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができるが、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏサンプルでも実施することができる。
【００２９】
本発明は、獲得方法および画像処理方法の素早さを改善する。本発明によって、組織の３Ｄ特徴付けが可能になり、ｉｎ  ｖｉｖｏ適用が高スループットで可能になる。
【００３０】
組織は、ヒトケラチン材料からなるものであってもよい。「ケラチン材料」という用語は、特に毛髪、まつ毛、眉毛、皮膚、爪、粘膜、頭皮を意味するものとする。
【００３１】
本発明による生体組織、特にケラチン材料は、天然または人工であってもよく、サンプルはたとえば、ヒトの皮膚、または再構築されたもしくは人工の皮膚である。
【００３２】
生体組織は、培養中にメラニン沈着させた細胞であってもよい。
【００３３】
情報は、少なくとも１つの画像、特に二次元または三次元画像の形で生成されてもよい。
【００３４】
生成された情報は、前記組織中のメラニンにより占められる表面および／または体積に関する情報、および組織の他の構成成分と比較したその３Ｄ分布に関する情報を提供してもよい。
【００３５】
本発明の対象は、その態様の別のものによれば、特に色素沈着促進、色素脱失、または抗色素沈着である刺激および／または処置が、生体組織に及ぼす作用を評価するための方法であって：
−  前述の方法を用いて生体組織の色素沈着を評価するステップと、
−  サンプルを：光放射、特に日光、紫外線（ＵＶＡおよび／またはＵＶＢ）、または赤外線（ＩＲ）放射、炎症応答を引き起こす刺激、および機械的作用（引張り、圧力、剥離、解離、脱落、摩耗）から選択された刺激に、あるいは特に少なくとも１種の色素沈着、色素脱失、または抗色素沈着製品による処置に曝すステップと、
−  前述の方法を用いた生体組織の色素沈着の第２の評価を行うステップと、
−  ２つの評価中に生成された情報を比較するステップと、
−  少なくともこの比較に基づいて、色素沈着に対する刺激または処置の作用を評価するステップと
にあるステップを含む方法である。
【００３６】
処置は、非治療的であってもよく、特に美容的であってもよい。
【００３７】
処置は：製品、特に化粧品の付着、注入、摂取、または吸入から選択されてもよい。
【００３８】
処置は、栄養補助食品および／または医薬品の摂取に該当してもよい。処置は、生体組織を：製品、特に化粧品の付着、注入、摂取、または吸入、あるいは栄養補助食品および／または医薬品の摂取から選択された処置に曝すことを含んでいてもよい。
【００３９】
「化粧品」という用語は、１９９３年６月１４日付けの指令書９３／３５／ＥＥＣ、補正指令書７６／７６８／ＥＥＣにおいて定義された製品を意味するものとする。
【００４０】
製品は、色素脱失作用を有していてもよい。したがって処置は、任意の色素沈着調節化学薬品の付着を含んでいてもよい。
【００４１】
本発明による方法は、色素脱失、抗色素沈着、または色素沈着促進活性剤の効力または無害性を評価するために使用されてもよい。活性剤は、治療目的のため、たとえばヒドロキノンもしくはレチノイドであってもよく、かつ／または美容目的であってもよい。
【００４２】
本発明による方法は、ある製品、たとえば皮膚コルチコイドの色素沈着に対する副作用を評価するために使用されてもよい。
【００４３】
本発明の対象は、その態様の別のものによれば、特に抗色素沈着、色素沈着促進、または色素脱失である刺激および／または処置の、生体組織に対する作用を評価するための方法であって、組織の少なくとも２つの領域が、異なる状態で刺激に曝されかつ／または異なる状態で処置され、前記刺激または前記処置に曝される前および後に前述の方法を用いて得られた前記領域のメラニンの存在および／または量に関する情報が比較される、方法である。
【００４４】
製品の作用を試験するために、製品のプラセボによる処置後になされた評価と、この製品による処置後になされた評価とを比較してもよい。
【００４５】
プラセボは、たとえば、処置に使用される製品の場合と同じ美容媒体であるが、対応する活性剤は含まない。
【００４６】
美容化合物で処置した個体の生体組織または人工もしくは再構築された皮膚のサンプルにおけるメラニンの分布の評価を実施し、美容化合物のプラセボで処置した同じ個体の生体組織または人工もしくは再構築された皮膚の同じサンプルにおけるメラニンの分布の評価と比較することが、可能である。
【００４７】
処置は、製品、特に化粧品の付着に相当してもよい。製品は、たとえば、クリーム、ローション、軟膏、油、粉末の形をとってもよく、このリストは限定するものではない。
【００４８】
製品は、生体組織、特に再構築されたまたは人工の皮膚に付着される担体、たとえばパッチ、ドレッシング、包帯、またはマスクに含有されていてもよい。
【００４９】
製品は、生体組織中のメラニンの量および／または分布に作用を及ぼすことのみ意図される色素沈着または色素脱失性製品でなくてもよい。したがって製品は、たとえば生体組織をメークアップし、湿潤させ、または保護すること、特に日光から保護すること、または生体組織を修復することと同時に、生体組織内のメラニンの量および／または分布に影響を及ぼすことが意図されてもよい。したがって製品は、様々な化合物、特に生体組織のメラニンに作用することが意図される活性剤以外の活性剤を含有していてもよい。
【００５０】
方法は、生体組織内のメラニンの視覚化を可能にしてもよく、たとえば、皮膚の表皮の様々な層におけるメラニンの分布を知ることを可能にしてもよい。
【００５１】
本発明の別の対象は、その態様の別のものによれば、処置、特に非治療的処置であって、上記にて定義された方法を用いて実証されたメラニンに対する処置の作用に言及する処置を促進させる方法である。
【００５２】
本発明の別の対象は、その態様の別のものによれば、製品の販売中、たとえば広告でまたは包装上で、製品の効力が上記にて定義された方法を用いて検証されたという事実を参照することにあるステップを含む方法である。
【００５３】
本発明は、それを実施する非限定的な例の以下の記述を読むことから、および添付図面の図を吟味することから、より良く理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明による方法の様々なステップを示す図である。
【図２】本発明による方法で使用されてもよい多光子デバイスの例を、図式的にかつ部分的に表す図である。
【図３Ａ】本発明による画像獲得の例を示す図である。
【図３Ｂ】本発明による画像獲得の例を示す図である。
【図３Ｃ】本発明による画像獲得の例を示す図である。
【図３Ｄ】本発明による画像獲得の例を示す図である。
【図４Ａ】サンプル内の蛍光の時間的変化の様々な例を示す図である。
【図４Ｂ】サンプル内の蛍光の時間的変化の様々な例を示す図である。
【図５】固定深さの皮膚サンプルの切片に関する蛍光寿命のパラメトリック表示を示す図である。
【図６】本発明による方法を用いて得られた、皮膚サンプル中のメラニン分布の二次元マスクを示す図である。
【図７】本発明による方法を用いて得られた、皮膚サンプル中のメラニン分布の三次元マスクを示す図である。
【図８】従来技術の方法を用いて得られた、皮膚サンプル中のメラニン分布の二次元マスクを示す図である。
【図９Ａ】処置の前および後の皮膚サンプル中のメラニンの量を示す図である。
【図９Ｂ】処置の前および後の皮膚サンプル中のメラニンの量を示す図である。
【図９Ｃ】処置の前および後の皮膚サンプル中のメラニンの量を示す図である。
【図９Ｄ】処置の前および後の皮膚サンプル中のメラニンの量を示す図である。
【図１０Ａ】メラニンの量による、ヒトの皮膚のフォトタイプＩからＩＶの特徴付けを示す図である。
【図１０Ｂ】メラニンの量による、ヒトの皮膚のフォトタイプＩからＩＶの特徴付けを示す図である。
【図１０Ｃ】メラニンの量による、ヒトの皮膚のフォトタイプＩからＩＶの特徴付けを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明による方法のステップ１は、多光子顕微鏡法による、生体組織サンプルの様々な深さでの何組かの二次元時間的画像の獲得にあるものであってもよい。
【００５６】
各画素は、たとえばＴＣＳＰＣ（ｔｉｍｅ−ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ：時間相関単一光子計数）光子計数デバイスを使用する、２光子励起蛍光シグナルの、ある時間に対する積分によって得ることができる。
【００５７】
多光子顕微鏡法デバイスの使用により、生体組織画像獲得ステップの自動化を可能にすることができる。
【００５８】
三次元時間的画像は、特に、様々な深さでの二次元時間的画像の積重ねから生成してもよい。各積重ねは、数十枚の二次元時間的画像、たとえば５０枚から１００枚の間の画像、特に６５枚から８０枚の間の画像を含んでいてもよい。
【００５９】
ステップ２では、座標（ｘ，ｙ，ｚ）の各画素ごとに、その対数を計算することによって時間の関数としての蛍光強度の変動について調査する。対数は、蛍光寿命に関連するその勾配を推定するために、線形回帰を用いて引き続き調節される。
【００６０】
したがって、得られたデータは、蛍光強度の対数の線形回帰により得られた勾配の画像によって表すことができる。
【００６１】
パラメトリック画像とも呼ばれる勾配画像は、２つのタイプの画素：低勾配により特徴付けられた画素、および高勾配の値により特徴付けられた画素を含有する。高い値の勾配を有する画素はメラニンに起因するものであり、これはケラチンやＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ＦＡＤなどの表皮細胞の、他の内因性蛍光体と比較して、短い寿命を有する。
【００６２】
事実、メラニンは、２つの蛍光寿命によって特徴付けられる。その主要な１つは非常に短く、０．１〜０．２ｎｓ（ナノ秒）程度である。メラニンのもう１つの蛍光寿命は、より少なくより長く、０．７から１．４ｎｓの間である。比較によれば、ケラチンやＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ＦＡＤなどの表皮細胞の、他の内因性蛍光体は、主としてより長い蛍光寿命を有し、１．５ｎｓよりも長い。
【００６３】
ステップ３は、メラニンに該当する画素を勾配画像から抽出することにある。表面フィルタリングはたとえば各二次元画像に適用され、メラノソームのサイズが考慮されるが、すなわちノイズを除去しメラニンをより特異的に検出するために約１μｍ２の参照表面積と比較される。
【００６４】
サンプル中のメラニンの存在および／または量に関する情報は、たとえば、低い値の勾配を有する蛍光シグナルおよび１μｍ２未満のサイズを有する構造を排除した後に生成される。
【００６５】
情報は、メラニンの空間分布の少なくとも１つの表示の形で、特に、サンプルの１つの深さでのメラニンマスクに対応した二次元画像の形で生成されてもよい。
【００６６】
勾配を計算するステップ２および関連あるマスクをフィルタリングするステップ３は、所与の深さに該当する二次元画像の全体で実施され、三次元の積重ねの各画像ごとに繰り返してもよい。
【００６７】
方法は、メラニンマスクの三次元画像を形成する二次元表示の積重ねを得ることを可能にする。
【００６８】
この方法を用いて得られた三次元メラニンマスクに基づいて、その密度および／またはその空間分布を計算することによりメラニンを特徴付けることが可能である。
【００６９】
計算に素早さがあるなら、この方法はスクリーニング法に使用されてもよい。
【００７０】
蛍光寿命を測定するためのシステムと組み合わせた任意の公知の多光子顕微鏡システムは、上記方法を実施するのに使用されてもよい。
【００７１】
使用される励起波長は、７００ｎｍから１０００ｎｍの間、好ましくは約７６０ｎｍであってもよい。この波長範囲は、組織の蛍光構成成分のほとんどを撮像するのを可能にする。
【００７２】
図２は、本発明による方法に使用されてもよい多光子デバイス１００の例を、図式的にかつ部分的に表す。
【００７３】
多光子デバイス１００は、たとえば、Ｊｅｎｌａｂ社により開発されたＤｅｒｍａＩｎｓｐｅｃｔ（登録商標）タイプのものである。
【００７４】
デバイス１００は、フェムト秒レーザ１０、たとえばチタン−サファイヤ（Ｔｉ：Ｓａ）レーザであって、赤外線波長範囲に調整することができかつ８０ＭＨｚ程度の反復速度で１００フェムト秒程度のパルスを供給できるものを含む。レーザ１０は、「ＸＹスキャナ」の形をしたレーザビーム走査デバイス１２に向けられた赤外ビーム１１を放出する。レーザビームの走査は、走査デバイス１２の２つのガルバノメトリックミラーの角運動によって得ることができる。次いでビームはダイクロイックミラー１４によって反射され、対物レンズ１５を用いてケラチン材料１３上に集束する。したがって２つのガルバノメトリックミラーにより、ビームの伝搬方向（ｚ軸）に直交する平面（ｘ，ｙ）内での焦点の走査が可能になる。
【００７５】
圧電デバイスは、対物レンズ１５を並進させること、したがってケラチン材料１３で集束する平面を変化させるのを可能にする。このように、獲得した画像の重ね合わせによってケラチン材料中のメラニンの三次元分布を再構成することが可能である。
【００７６】
このようにするために、次いで焦点で生成されたシグナルを検出してもよく、すなわち励起対物レンズ１５を通したエピ収集によって検出することができる。第１のダイクロイックミラー１４は、生成された多光子シグナル、特にケラチン材料１３に由来する自己蛍光（ＡＦ）の選択を可能にする。
【００７７】
次いで第２のダイクロイックミラー１６は、たとえば二次高調波発生（ＳＨＧ）に対応する、他の多光子シグナルからの自己蛍光（ＡＦ）シグナルの分離を可能にする。いずれにせよ、シグナルはスペクトルフィルタ１７を通過し、光子計数検出器（ＴＣＳＰＣ：  ｔｉｍｅ−ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ（時間相関単一光子計数））１８、１９に到達し、したがって組み合わされた画像、たとえばＡＦ／ＳＨＧ画像を生成することが可能になる。
【００７８】
第１および第２の検出器１８および１９は、シグナルの獲得および処理のために電子デバイス２０に送信されるシグナル１８ａおよび１９ａの発生を可能にする。
【実施例１】
【００７９】
ヒトの皮膚のｉｎ  ｖｉｖｏ観察
試験中、三次元画像を、ヒトの前腕に関してｉｎ  ｖｉｖｏで連続的に得たが、１枚の三次元画像は、励起波長７６０ｎｍおよび４０ｘ／１．３ＮＡ対物レンズを備えるＤｅｒｍａＩｎｓｐｅｃｔ（登録商標）デバイスを使用して得られた、皮膚の表面から２．３４６μｍに及ぶ深さで獲得された７０枚の二次元画像を含む積重ねからなるものであった。
【００８０】
図３Ａから図３Ｄは三次元画像を時系列で示し、健康なボランティアの前腕の皮膚に関してｉｎ  ｖｉｖｏで獲得された、皮膚の表面から５０μｍの深さにある表皮の基底層に近い、４枚の二次元時間的画像のみ示されている。各時間的画像ごとに、蛍光シグナルを２ｎｓの時間に対して積分した。
【００８１】
実験条件下、メラニンを含有するサンプルの点に関し、放出された蛍光光子の大多数は、最初の時間獲得中に収集される。メラニンの濃度が高くなると、この最初の獲得による光子数も多くなる。最初の時間的チャネルに相当する図３Ａの矢印Ｉは、強度基準に基づいて、高メラニン濃度のエリアを示す。このレベルで、高濃度のメラニンは、他の内因性蛍光体の場合よりも強力な強度の蛍光シグナルを生成する。
【００８２】
図４Ａおよび図４Ｂは、メラニンを含むサンプルの点に該当した画像の画素と、メラニンを含まないサンプルの点に該当した画素とに関する、時間的発生曲線（図４Ａ）と線形回帰を用いた蛍光強度の対数調整（図４Ｂ）との例を示す。
【００８３】
図５、図６、および図８は、５０μｍの深さでのヒトの皮膚の二次元表示に該当する。図５は、蛍光強度の対数の線形回帰によって得られた勾配のパラメトリック画像を示す。画像は、２つのタイプの画素：低勾配により特徴付けられる画素と、高い勾配値により特徴付けられる画素であって、先に記述された理由でメラニンに起因するものを有する。
【００８４】
図６は、メラニンに起因する画素の抽出によって図５から得られたメラニンの二次元マスクを示し、それに対して図８は、蛍光強度に基づくだけの従来技術の方法によって得られた結果を示す。
【００８５】
図５および図８を比較した場合、メラニンの存在は図８により過小評価されることが観察されるが、それは強力な画素だけがメラニンに起因するからである。
【００８６】
三次元の積重ねの各二次元画像ごとに、各画素に対応する時間の関数としての、蛍光強度の対数の勾配の計算と、対応する二次元マスクのフィルタリングとを繰り返し、図７に示されるように、関連あるメラニンマスクを三次元的に視覚化するようにし、かつその分布を、角質層も含めた表皮全体にわたって三次元的に特徴付けるようにする。
【００８７】
以下に続く実施例２および実施例３に対応する試験は、この方法により実施し、メラニンの量の差を実証した。
【実施例２】
【００８８】
皮膚コルチコイドによる処置の評価
皮膚コルチコイドによる処置の前および後の皮膚の、同じエリアに関し、前述のＤｅｒｍａＩｎｓｐｅｃｔ（登録商標）顕微鏡を使用して、観察を実施した。
【００８９】
図９Ａは、処置前の皮膚のエリアのサンプルの、蛍光の生の画像を示し、図９Ｃは、本発明による方法を用いて得られた、対応するメラニンマスクを示す。
【００９０】
皮膚は、皮膚コルチコイドで処置する（閉鎖状態で）。
【００９１】
図９Ｂおよび図９Ｄは、処置の３週間後のサンプルと、本発明による方法を用いて得られた対応するメラニンマスクとの、蛍光の生の画像を示す。
【００９２】
本発明の方法によれば、メラニンの特異的検出が可能になり、図８Ｃおよび図８Ｄに示されるマスクの比較はメラニンの量の低下を実証し、したがって、皮膚中のメラニンの三次元定量化を介して皮膚コルチコイドにより誘発された修正の、より良好な評価が可能になる。
【実施例３】
【００９３】
ヒト皮膚フォトタイプＩからＩＶの特徴付け
ヒトの皮膚を、日光に曝されたときのその反応に応じて、６つのフォトタイプに分類する。浅黒い皮膚（フォトタイプＶおよびＶＩ）は、より多くのメラニンを有してＵＶ光線を自然にスクリーニングする。本発明による方法では、非常に白い色から穏やかな褐色に及ぶ皮膚に対応したフォトタイプＩからＩＶの、構成成分である色素沈着のより良好な分析が可能になる。
【００９４】
図１０Ａおよび図１０Ｂは、様々なフォトタイプの皮膚サンプルと、本発明による方法を用いて得られた対応するメラニンマスクとに関する、蛍光の生の画像を示す。
【００９５】
図１０Ｂのマスクに基づいて、フォトタイプを有するメラニンの量の増加を実証する図１０Ｃの比較グラフを得るためにメラニンの３Ｄ密度を計算した。
【００９６】
フォトタイプＩに該当する図１０Ｂのマスクにより示されるように、本発明による方法は、低濃度であってもメラニンの存在の定量化を可能にする。したがって方法は、メラニンを含有する任意のタイプの組織に使用することができる。
【符号の説明】
【００９７】
１０  フェムト秒レーザ
１１  赤外ビーム
１２  走査デバイス
１３  ケラチン材料
１４  第１のダイクロイックミラー
１５  対物レンズ
１６  第２のダイクロイックミラー
１７  スペクトルフィルタ
１８  光子計数検出器
１９  光子計数検出器
２０  電子デバイス
１００  多光子デバイス
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【国際調査報告】
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