(57)【要約】  本発明は、結腸直腸癌に罹患している被験体において療法の判断を下すため、ならびにＫＩＡＡ１４５６の発現レベルに基づいて、結腸直腸癌に罹患している患者の臨床転帰を予測するための方法であって、ＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルを決定することを含んでなる方法に関する。本発明はまた、ＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルの決定に十分な試薬を含んでなるキットおよびその使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
結腸直腸癌に罹患している被験体において療法の判断を下すための方法であって、前記被験体からのサンプル中のＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルを決定することを含んでなり、参照レベルと比べた場合に前記遺伝子の発現レベルが変化していれば、前記療法が前記患者に適切であることが示され、参照レベルと比べた場合に前記サンプル中のＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルが同じであれば、前記療法が前記患者に適切でないことが示される、方法。
【請求項２】
前記発現レベルの変化が、発現レベルの上昇または発現レベルの低下のいずれかである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
結腸直腸癌に罹患している患者の臨床転帰を予測するための方法であって、前記患者からのサンプルにおいてＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルを決定することを含んでなり、参照レベルと比べた場合に前記サンプル中のＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルが上昇していれば不良な臨床転帰が示され、参照レベルと比べた場合に前記サンプル中のＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルが同じかもしくは低下していれば良好な臨床転帰が示される、方法。
【請求項４】
前記臨床転帰の予測が無病生存期間および全生存期間として測定される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記患者に術前補助療法または補助療法が施されていない、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが腫瘍生検である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルが、ＫＩＡＡ１４５６遺伝子によりコードされるｍＲＮＡのレベルまたはＫＩＡＡ１４５６タンパク質のレベルを測定することにより決定される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ヒトＫＩＡＡ１４５６遺伝子の転写変異体１のｍＲＮＡレベルが決定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
患者がヒトである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者が腫瘍の外科的切除を受けている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者がＩＩ期結腸直腸癌に罹患している、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記患者が、新生物性腸閉塞、血管浸潤および／または神経周囲浸潤を示さない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＫＩＡＡ１４５６、および場合により、ハウスキーピング遺伝子または前記ハウスキーピング遺伝子によりコードされるタンパク質の発現レベルを特異的に検出することができる試薬のセットを含んでなる、キット。
【請求項１４】
前記キットの試薬が、ＫＩＡＡ１４５６のｍＲＮＡレベルおよび／またはＫＩＡＡ１４５６タンパク質のレベルを特異的に検出することができる、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記キットの試薬が、ＤＮＡまたはＲＮＡプローブおよび抗体である、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
結腸直腸癌に罹患している被験体の治療薬もしくは治療薬の組合せによる治療の必要性を決定するため、または前記被験体の臨床転帰を予測するための、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断の分野に関し、特に、前記患者からのサンプルにおける特定のバイオマーカーの発現に基づいて結腸癌患者に個別診断を提供する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
結腸直腸癌は、結腸癌または大腸癌とも呼ばれ、結腸、直腸および虫垂における癌性増殖を含む。結腸直腸癌は、世界で毎年６５５，０００人の死者を出し、西欧世界では、３番目に多い形態の癌であり、癌関連の死亡の第二の原因である。多くの結腸直腸癌が結腸の腺腫様ポリープから生じると考えられる。これらのキノコ型の増殖は通常良性であるが、経時的に癌に発達するものがある。大多数の場合、限局性結腸癌の診断は結腸鏡検査による。
【０００３】
外科的介入が初期（Ｉ期〜ＩＩＩ期）の患者の主要な治療様式である。しかしながら、腸層内への腫瘍の浸潤深度およびリンパ節の関与という点で腫瘍病期が進むと、手術のみによる治癒の可能性は低くなり、補助的な化学療法および放射線療法が必要となる。
【０００４】
検討されている、臨床上関連があると思われる分子因子の中でも以下のものに注目される：血清中の癌胎児性抗原（ＣＥＡ）および糖質抗原ＣＡ１９−９のレベル[Yamashita K, Watanabe M. Cancer Science 2009;100:195-199]、染色体１８ｑの異型接合性の欠如および高いマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）[Compton CC. et al; College of American Pathologists Consensus Statement 1999. Archives of Pathology & Laboratory Medicine 2000; 124:979-994]。
【０００５】
Yamashitaらによる最近の研究は、ＣＲＣにおける出現腫瘍マーカーの臨床的関連性を検証している[Yamashita K, Watanabe M. Cancer Science 2009;100:195-199]。患者の生存は一般に病期に依存することから、その著者らは腫瘍病期に従って可能性のある予後マーカーをまとめている。
【０００６】
予後マーカーの検出はＩＩ期において、特に、再発を防ぐために手術後に補助化学療法を受けなければならない患者、ならびに前記治療に感受性があると思われる患者の選択を改善するために重要である。この意味で、異数性、具体的には、対立遺伝子８ｐおよび１８ｑの具体的な数でＩＩ期患者の再発を予測できることが見出されている[Zhou W. et al; Lancet 2002; 359: 219-225]。さらに、デュークスＢ患者における、再発を予測する２３の変異遺伝子のプロファイルも、ｃＤＮＡマイクロアレイによるトランスクリプトーム分析の手段によって示された[Wang Y. et al; J. Clin. Oncol., 2004; 22: 1564-1571]。しかしながら、使用されたアレイプラットフォームの変動性のためにこれらの結果は一致には至らなかった。従って、同定された遺伝子発現マーカーで臨床適用に実施されたものはない。
【０００７】
ＩＩＩ期の予後マーカーもまだ同定されていない。その検出は、特に、最も強力かつ費用のかかる化学療法処置を受けなければならない患者を選択する場合に、ならびに再発を有する、また従来の療法に耐性のある患者の治療のための新たな治療標的の発見のために極めて重要となる。この意味で、原発腫瘍におけるＫ−ｒａｓ突然変異はこの病期の患者の不良な予後を示すことが実証されている[Andreyev HJ. et al; British Journal of Cancer 2001; 85: 692-696]。さらに、Ｋ−ｒａｓ突然変異によって影響を受けたＣＲＣを有する患者はＥＧＦＲ阻害による治療に不感受性であることから、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤セツキシマブまたはパニツムマブの治療効果を予測するためにこの突然変異が使用できるはずであることが判明した[Benvenuti S. et al; Cancer Research 2007; 67: 2643-2648]。この場合にも、これまでのところ、すでに臨床実施に適用されているＩＩＩ期のＣＲＣの予後マーカーはない。
【０００８】
ＩＶ期の患者では、高レベルのｐｒｅＣＡ１９−９（術前ＣＡ１９−９レベル）が不良な予後のバイオマーカーであることが検知されている。これまでに臨床適用のために確定された分子予後または応答因子はない。
【０００９】
ＩＩＩ期患者の所属リンパ節に腫瘍細胞が存在すれば、５年再発は６０％と予測される。外科的介入後のこれらの患者の化学療法による治療は再発を４０％〜５０％引き下げ、現在のところＩＩＩ期の患者に与えられる標準的医療である。
【００１０】
Ｉ期およびＩＩ期の患者はリンパ節への影響または遠隔転移がなく、従って良好な予後を持つ。疾患が限局性である場合には外科的介入の効果が高いが、２５〜３０％の割合のＩＩ期患者が再発を受け、この疾患のために死に至る。この後者の患者群では術後化学療法の利益は明らかでない。種々の研究が、補助化学療法を施されたＩＩ期患者とそれを受けなかった患者の間では生存に差がないことを実証している[J. Clin. Oncol. 1999; 17:1356-1363]。これに対して、National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Projectは、補助化学療法が特定のＩＩ期患者の生存を改善することを示している[Mamounas E. et al; J Clin Oncol 1999;17:1349-1355]。
【００１１】
ＩＩ期患者における予後マーカーの検出は、再発を受ける素因がある患者および化学療法による治療に感受性があると思われる患者を決定する際に重要である。この選択により、治療効果を得ることなく化学療法から副作用を受ける患者の数を減らすことも達成される。よって、結腸癌患者およびＩＩ期患者の臨床転帰を予測するのに有用なさらなるマーカーの必要がなお存在する。
【発明の概要】
【００１２】
第一の側面において、本発明は、結腸直腸癌に罹患している被験体において療法の判断を下すための方法であって、前記被験体からのサンプルにおいてＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルを決定することを含んでなり、参照レベルと比べた場合に前記遺伝子の発現レベルが変化していれば、前記療法が前記患者に適切であることが示される方法に関する。
【００１３】
別の側面において、本発明は、結腸直腸癌に罹患している患者の臨床転帰を予測するための方法であって、前記患者からのサンプルにおいてＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルを決定することを含んでなり、参照レベルと比べた場合に前記サンプル中のＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルが上昇していれば不良な臨床転帰が示され、参照レベルと比べた場合に前記サンプル中のＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルが同じかもしくは低下していれば良好な臨床転帰が示される方法に関する。
【００１４】
別の側面において、本発明は、ＫＩＡＡ１４５６、および場合により、ハウスキーピング遺伝子または前記ハウスキーピング遺伝子によりコードされるタンパク質の発現レベルを特異的に検出することができる試薬のセットを含んでなるキットに関する。
【００１５】
さらに別の側面では、本発明は、結腸直腸癌に罹患している被験体の治療薬もしくは治療薬の組合せによる治療の必要性を決定するため、または前記被験体の臨床転帰を予測するための、本発明によるキットの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＩＩ期ＣＲＣを有する患者の８０のサンプルにおけるＫＩＡＡ１４５６遺伝子アイソフォーム１の遺伝子発現レベル。Ａ）各腫瘍サンプル（グレーのバー）および対照正常組織（黒い線とバーで示す）のＲＱ値。Ｂ）ＲＱ法により算出し、Ｌｏｇ１０  ＲＱで示したＫＩＡＡ１４５６遺伝子発現パターン（ここで、０値は正常組織における発現であり、０未満の発現値はサイレンシングを示し、正の値は参照として用いた正常組織に対しての過剰発現を示す）。
【図２】ＫＩＡＡ１４５６発現と臨床病理的パラメーターの間の相関。Ａ）腫瘍サンプルにおけるＫＩＡＡ１４５６のＲＱ値と神経周囲浸潤の間の平均比較（ｐ＝０．００４、マン・ホイットニー検定）。Ｂ）腫瘍サンプルにおけるＫＩＡＡ１４５６ＲＱ値と診断時の腸閉塞／穿孔の間の平均比較（ｐ＝０．００３、マン・ホイットニー検定）。
【図３】ＩＩ期ＣＲＣを有する患者における転写ＫＩＡＡ１４５６遺伝子過剰発現に応じた生存率。患者をＫＩＡＡ１４５６発現に従って分類し、追跡期間にわたって無病生存率をプロットしたカプラン・マイヤー曲線（ｐ＝０．０５）。黒い実線は低ＫＩＡＡ１４５６発現を示し、グレーの破線は高ＫＩＡＡ１４５６発現を示す。
【図４】血管浸潤または神経周囲浸潤がない場合の生存率。血管浸潤または神経周囲浸潤の有無に関して患者を階層化するカプラン・マイヤー分析を行った。Ａ）、Ｂ）ＫＩＡＡ１４５６発現のＡＱ値を患者の転帰と相関させた場合の、患者の無再発生存率のカプラン・マイヤー曲線。Ｃ）、Ｄ）ＫＩＡＡ１４５６発現のＲＱ値を患者の転帰と相関させた場合の、患者の無再発生存率のカプラン・マイヤー曲線。
【図５】患者が補助化学療法を受けたかどうかによって階層化する、有意なＫＩＡＡ１４５６過剰発現に応じた生存率。Ａ）患者が化学療法を受けなかったか（ｐ＝０．０１）（Ｂ）受けたかによる、有意なＫＩＡＡ１４５６過剰発現に応じた患者の全生存率の分析。患者が化学療法を受けたか（Ｄ）受けなかったか（Ｃ）（ｐ＝０．０１２）による、有意なＫＩＡＡ１４５６過剰発現に応じた患者の無病生存率の分析。黒い実線は低レベルのＫＩＡＡ１４５５を示し、グレーの破線は高レベルのＫＩＡＡ１４５５を示す。
【図６】患者が補助化学療法を受けたか受けなかったかによって階層化する、より高いＫＩＡＡ１４５６過剰発現に応じた生存率。Ａ）ＫＩＡＡ１４５６過剰発現（任意のカットオフ点として６９パーセンタイルを設定）に従い、かつ、患者が化学療法を受けなかったか（ｐ＝０．０３１）受けたか（Ｂ）（有意性なし）によって患者が分類される、追跡期間にわたる全生存率のカプラン・マイヤー曲線。Ｃ）ＫＩＡＡ１４５６過剰発現（任意のカットオフ点として６９パーセンタイルを設定）に従い、かつ、患者が化学療法を受けなかったか（ｐ＝０．０２５）受けたか（Ｄ）（有意性なし）によって患者が分類される、追跡期間にわたる無病生存率のカプラン・マイヤー曲線。黒い実線はカットオフ点に満たないレベルのＫＩＡＡ１４５６発現を示し、グレーの破線はカットオフ点を超えるＫＩＡＡ１４５６発現レベルを示す。
【発明の具体的説明】
【００１７】
本発明者らは、結腸癌に罹患している患者の臨床転帰がＫＩＡＡ１４５６の発現レベルと密接に相関すること（図３〜６参照）およびＫＩＡＡ１４５６の発現レベルの上昇が患者の不良な臨床転帰のマーカーとなること（図３〜６参照）を見出した。これらの知見は、癌に罹患している患者が不良な転帰のリスクを持つかどうか、従って、所与の療法で治療される候補であるかどうか判断することを可能とする。
【００１８】
被験体において療法の判断を下すための方法
第一の側面において、本発明は、結腸直腸癌に罹患している被験体において療法の判断を下すための方法であって、前記被験体からのサンプルにおいてＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルを決定することを含んでなり、参照レベルと比べた場合に前記遺伝子の発現レベルが変化していれば、前記療法が前記患者に適切であることが示され、参照レベルと比べた場合に前記サンプル中のＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルが同じであれば、前記療法が前記患者に適切でないことが示される方法（以下「本発明の第一の方法」）に関する。
【００１９】
本明細書において、用語「判断を下す」とは、患者に所与の療法を施すことが好都合であるかどうか評価を行うことを意味する。当業者ならば、不利な臨床転帰を持つことが予測される患者は療法を受ける候補となり、不利な臨床転帰を持つリスクが低い患者は所望でないその療法の効果をなしで済ますことができるということが理解できるであろう。当業者に理解されるように、このような評価は通常、被験体の総て（すなわち１００パーセント）が同定されるのに適当であることを意図するものではない。しかしながら、この用語は、被験体の統計学的に有意な一部（例えば、コホート試験の一コホート）が同定できる必要がある。ある一部が統計学的に有意かどうかは、当業者ならば、難なく、例えば信頼区間の決定、ｐ値の決定、スチューデントのｔ検定、マン・ホイットニー検定などの種々の周知の統計評価ツールを用いて決定することができる。詳細は、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley and Sons, New York 1983に示されている。好ましい信頼区間は、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセントまたは少なくとも９９パーセントである。ｐ値は、好ましくは、０．１、０．０５、０．０１、０．００５または０．０００１である。より好ましくは、ある集団の少なくとも６０パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセントまたは少なくとも９０パーセントの被験体を本発明の方法により適切に同定することができる。
【００２０】
本明細書において、結腸直腸癌に関して用語「療法」とは、結腸直腸癌またはその転移の出現の、企図される任意の改善または予防を意味し、限定されるものではないが、放射線療法、化学療法、免疫療法およびそれらの組合せを含む。
【００２１】
用語「放射線療法」とは、通常、Ｘ線、γ線、中性子、陽子、および癌細胞を死滅させ腫瘍を退縮させるための他の線源からの高エネルギー放射線の使用と定義される。
【００２２】
本明細書において、用語「化学療法」とは、悪性細胞および組織に傷害性のある特定の化学剤または薬物を用いた癌の治療を意味する。結腸直腸癌の特定の場合では、慣用される化学剤としては、限定されるものではないが、白金薬、ピリミジン代謝拮抗薬、ロイコボリンおよびそれらの組合せが挙げられる。
【００２３】
用語「免疫療法」とは、予防目標および／または治療目標を達成するための免疫系の調節という概念に基づく一連の治療戦略を意味する。特定の実施態様では、免疫療法は、抗ＶＥＧＦ抗体、最も好ましくはベバシズマブの使用を含む。
【００２４】
「白金薬」とは、白金を含む任意の抗癌化合物を意味する。一つの実施態様では、抗癌薬はシスプラチン（ｃＤＤＰまたはｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）(cis- iamminedichloroplatinum(II)）、カルボプラチン、オキサリプラチン、およびそれらの組合せから選択することができる。「オキサリプラチン」（エロキサチン（Ｒ））は、シスプラチンやカルボプラチンと同系列の白金に基づく化学療法薬である。オキサリプラチンと同等のものは当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、シスプラチン、カルボプラチン、アロプラチン、ロバプラチン、ネダプラチン、およびＪＭ−２１６が挙げられる。
【００２５】
ピリミニジン(Pyriminidine)代謝拮抗薬または療法としては、限定されるものではないが、ピリミジン系代謝拮抗薬と呼ばれる治療薬系列に属するフルオロウラシル（５−ＦＵ）が挙げられる。５−ＦＵはピリミジン類似体であり、種々の細胞傷害性代謝産物に変換された後にＤＮＡおよびＲＮＡに組み込まれ、それにより、細胞周期の停止およびアポトーシスを誘導する。化学的等価物はピリミジン類似体であり、ＤＮＡ複製の混乱をもたらす。化学的等価物はＳ期で細胞周期の進行を阻害して細胞周期の混乱とその結果としてのアポトーシスをもたらす。５−ＦＵの等価物としては、例えば、Papamicheal (1999) The Oncologist 4:478-487に記載されているように、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン（ドキシフルロイジン(doxifluroidine)）、ｌ−テトラヒドロフラニル−５−フルオロウラシル（フトラフール）、カペシタビン（ゼローダ）、Ｓ−Ｉ（ＭＢＭＳ−２４７６１６、テガフールと２つのモジュレーター、５−クロロ−２，４−ジヒドロキシピリジンおよびカリウムオキソネートからなる）、ラリチトレキセド(ralititrexed)（トムデックス）、ノラトレキセド（チミタク、ＡＧ３３７）、ＬＹ２３１５１４およびＺＤ９３３１などのそれらのプロドラッグ、類似体および誘導体が含まれる。本発明の目的では、ピリミジン代謝拮抗薬は、５−ＦＵに基づく補助療法を含む。
【００２６】
カペシタビンは、３つの酵素段階と２つの中間代謝産物５’−デオキシ−５−フルオロシチジン（５’−ＤＦＣＲ）および５’−デオキシ−５−フルオロウリジン（５’−ＤＦＵＲ）からなる経路に従って腫瘍特異的酵素ＰｙｎＰａｓｅによりその活性型へと変換される、（５−ＦＵ）のプロドラッグである。カペシタビンは、Ｒｏｃｈｅにより商標ゼローダ（Ｒ）として販売されている。
【００２７】
ロイコボリン（フォリン酸）は、癌療法に用いられるアジュバントである。ロイコボリンは、化学療法薬の有効性を高めるために５−ＦＵとの相乗作用的組合せで使用される。特定の理論に縛られるものではないが、ロイコボリンの添加はチミジル酸シンターゼを阻害することにより５−ＦＵの有効性を高めると考えられる。ロイコボリンは、正常細胞を高用量の抗癌薬メトトレキサートから保護するため、ならびにフルオロウラシル（５−ＦＵ）およびテガフール−ウラシルの抗腫瘍効果を増強するために解毒薬として使用されてきた。ロイコボリンはまた、シトロボラム因子およびウェルコボリンとしても知られる。この化合物の化学表記は、Ｌ−グルタミン酸？［４［［（２−アミノ−５−ホルミルｌ，４，５，６，７，８ヘキサヒドロ４オキソ６−プテリジニル）メチル］アミノ］ベンゾイル］カルシウム塩（１：１）である。
【００２８】
「ＦＯＬＦＯＸ」は、癌治療に用いられる一種の併用療法の省略形である。この療法は、５−ＦＵ、オキサリプラチンおよびロイコボリンを含む。「ＦＯＬＦＩＲＩ」」は、癌治療に用いられる一種の併用療法の省略形であり、５−ＦＵ、ロイコボリン、およびイリノテカンを含んでなるか、あるいはまたそれらから本質的になるか、またはさらにはそれらからなる。これらの治療に関する情報は、米国国立癌研究所のウェブサイトcancer.gov（日２００８年１月１６日更新）で得られる。
【００２９】
ＦＯＬＦＯＸ／ＢＶの等価物は、組成物の１以上の成分が等価物、例えば５−ＦＵおよび／またはオキサリプラチンの等価物で置き換えられている場合を意味する。
【００３０】
「ＸＥＬＯＸ／ＢＶ」は、結腸直腸癌を治療するために用いられるもう１つの併用療法であり、カペシタビン（ゼローダ）として知られる５−ＦＵのプロドラッグを、オキサリプラチンおよびベバシズマブと組み合わせて含む。ＸＥＬＯＸ／ＢＶの等価物は、組成物の１以上の成分が等価物、例えばベバシズマブおよび／またはオキサリプラチンの等価物で置き換えられている場合を意味する。これらの治療に関する情報は、米国国立癌研究所のウェブサイトcancer.govまたはNational Comprehensive Cancer Networkのウェブサイトnccn.org（２００８年５月２７日更新）で得られる。
【００３１】
用語「結腸癌」または「結腸直腸癌」は結腸の腫瘍に関し、移行上皮癌、扁平上皮癌および腺癌などの結腸癌に一般に現れる任意の組織学的サブタイプ、表在性、筋肉浸潤性または転移性癌などの任意の臨床的サブタイプ、および任意の病期を含む。
【００３２】
結腸癌病期分類は、特定の癌の浸潤量を推定したものである。これは診断および研究目的で、また、最良の治療法を決定するために行われる。結腸直腸癌の病期分類のための体系は、局所浸潤の程度、リンパ節関与の程度および遠隔転移があるかどうかによって決まる。
【００３３】
最も一般的な病期分類体系は、American Joint Committee on Cancer（ＡＪＣＣ）から得られるＴＮＭ（腫瘍／リンパ節／転移）体系である。このＴＮＭ体系では、３つのカテゴリーに基づいて数字を割り付ける。「Ｔ」は腸壁の浸潤程度を表し、「Ｎ」はリンパ節関与の程度を表し、「Ｍ」は転移の程度を表す。癌のより広義の病期は通常、ＴＮＭ値から派生した、予後により分類されるＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶの数字で表され、高い数字ほどより進行した癌、そしておそらくはより悪い転帰を示す。この体系の詳細は表１である。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
本発明において、患者は結腸癌に罹患している被験体である。特定の実施態様では、結腸癌は、移行上皮癌、扁平上皮癌および腺癌などの結腸癌に一般に現れる任意の組織学的サブタイプ、表在性、筋肉浸潤性または転移性癌などの任意の臨床的サブタイプ、ならびにＴ０−Ｔ４、Ｎ０−Ｎ２およびＭ０−Ｍ１腫瘍を含む任意のＴＭＮ病期である。さらに、本発明はまた、いずれの病期であれ結腸癌に罹患している被験体に適用することができる（０期、ＩＡ期、ＩＢ期、ＩＩＡ期、ＩＩＢ期、ＩＩＩＡ期、ＩＩＩＢまたはＩＶ）。しかしながら、特定の実施態様では、結腸癌の病期はＩＩ期である。
【００３６】
本明細書において、用語「被験体」とは、哺乳類として分類されるあらゆる動物を意味し、限定されるものではないが、家畜および農用動物、霊長類およびヒト、例えば、人間、ヒト以外の霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、または齧歯類が挙げられる。好ましくは、患者は、年齢または人種によらずヒト男性または女性である。
【００３７】
別の特定の実施態様では、患者は、腫瘍の外科的切除を受けている。本明細書において、用語「外科的切除」とは、腫瘍と一部の組織だけが除去される局所切除または結腸もしくは直腸の一部もしくは全部が除去される切除術を含む。切除術には、限定されるものではないが、部分結腸切除術、右半結腸切除術（回結腸切除術）、腹会陰式直腸切断術、直腸Ｓ状結腸切除術、全結腸切除術および全直腸結腸切除術が含まれる。
【００３８】
Ｔ４疾患；腫瘍性閉塞または穿孔；低分化型（グレード３）腫瘍；リンパ節検索１２未満（ＡＳＣＯ推奨）；高い術前ＣＥＡレベル；血管、リンパ系および神経周囲浸潤；および米国病理学会(College of American Pathologists)の合意声明による切除断端陽性など、疾病の予後のマーカーとなるいくつかの標準的臨床リスク因子が記載されている。さらに、本発明者らは、血管浸潤がない患者（図４ＡおよびＣ）または神経周囲浸潤がない患者（図４ＢおよびＤ）、すなわち、予後がかなり良好な症例は、それらがＫＩＡＡ１４５６を過剰発現した場合には無再発生存率に有意な低下を示したことを見出したが（図４）、このことは、ＫＩＡＡ１４５６の発現が、標準的リスク因子が良好な予後を示す場合であっても、不良な臨床転帰と相関していることを示唆する。
【００３９】
よって、本発明の方法の好ましい実施態様では、患者は、臨床リスクに関連する上記の因子のうち１または複数を示さない。いっそうより好ましい実施態様では、患者は、新生物性(neoplasic)腸閉塞、血管浸潤および／または神経周囲浸潤を呈さない。
【００４０】
本明細書において「新生物性(neoplasic)腸閉塞」という表現は、消化産物の正常な通過を妨げる腸の物理的または機能的閉塞と理解される。それは小腸の十二指腸に対して遠位のいずれのレベルでも起こり得、良性または悪性新生物に関連する。
【００４１】
新生物は、新生物の結果としての異常な組織塊と理解される。新生物は、異常な細胞増殖である。この細胞クローンの増殖は、その周囲の正常組織の増殖を上回り、それらと協調しない。それは通常、しこりまたは腫瘍を生じる。新生物は良性、前悪性または悪性であり得る。
【００４２】
腸閉塞は、閉塞のレベルによって、腹痛、腹部膨満、嘔吐、吐糞症、および便秘を呈し得る。閉塞は腸の管腔内、腸壁内、または腸の外部の原因によるものであり得る（圧迫、絞扼または捻転など）。新生物性(neoplasic)腸閉塞を測定するための主要なツールは、血液検査、腹部Ｘ線、ＣＴスキャンおよび／または超音波である。腸閉塞の放射線徴候としては、腸膨満、ならびに仰臥位および直立位の腹部放射線写真での複数の（６を超える）鏡面像の存在が含まれる。注腸造影法または小腸造影法またはＣＴスキャンを用いて、閉塞のレベル、閉塞が部分的か全面的かを明らかにし、閉塞の原因の特定の助けとすることができる。腸鏡検査、経口カメラによる小腸検査、またはプッシュ式内視鏡検査がその他の診断選択肢である。
【００４３】
本明細書において「血管浸潤」という表現は、固有筋層を超えて内皮細胞を内層とする血管内に悪性細胞が存在することと理解される。ＭＲＩを用いて壁外血管浸潤を検出することができる。
【００４４】
本明細書において「神経周囲浸潤」という表現は、神経に沿った（神経周囲の）腫瘍増殖と理解される。悪性腫瘍（一般に癌腫）による神経周囲空間への浸潤は、その腫瘍が浸潤性であり、末梢神経とそれを取り巻く結合組織の間の、抵抗の低い空間に侵入することを示す。神経周囲浸潤状態は、光学顕微鏡で、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色した組織切片を検査することにより、一見して判定することができる。
【００４５】
第一段階において、本発明の第一の方法は、患者からのサンプルにおいてＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルを決定することを含む。
【００４６】
本発明で用いる場合、用語「ＫＩＡＡ１４５６遺伝子」は、ヒトＫＩＡＡ１４５６遺伝子だけでなく、チンパンジー（ＸＭ＿００１１３８３６１．１  配列番号１、ＸＭ＿００１１３８２０８．１  配列番号２、ＸＭ＿００１１３８４４９．１  配列番号３）、イヌ（ＸＭ＿５４０００２．２  配列番号４）、マウス（ＮＭ＿１７６９５２．４  配列番号５）、ラット（ＮＭ＿００１１０７３１４  配列番号６）などのような他種由来のその相同分子種も意味する。しかしながら、好ましい実施態様では、本発明による方法で決定されるＫＩＡＡ１４５６遺伝子は、ヒトＫＩＡＡ１４５６遺伝子である。
【００４７】
ヒトＫＩＡＡ１４５６遺伝子（ＦＬＪ３６９８０またはＭＧＣ４３１１３）は、８番染色体の８ｐ２２領域に位置する。この遺伝子は、単一の前駆ｍＲＮＡの選択的スプライシングから生じる２つの転写変異体またはスプライス変異体を持ち、２つのタンパク質アイソフォームを生じる。第一の転写変異体（転写変異体１）（ＮＭ＿０２０８４４．２  配列番号７）はアイソフォーム１（ＮＰ＿０６５８９５．２  配列番号８）をコードし、カノニカル配列として選択され、４５４個のアミノ酸を有し、その機能はまだ知られてないが、構造レベルでは、メチルトランスフェラーゼ活性と相同なドメインを有する。第二の転写変異体（転写変異体２）（ＮＭ＿００１０９９６７７．１、配列番号９）はアイソフォーム２（ＮＰ＿００１０９３１４７．１、配列番号１０）をコードし、このアイソフォーム２は、その５’末端でいくつかのエキソンを欠くためにアイソフォーム１と複数の違いを持つ。これらの違いはより短い５’ＵＴＲ領域を生成し、変異体１の開始コドンの後に翻訳起点を生じ、これにより、Ｎ末端において最初の１２７個のアミノ酸を欠いたアミノ酸３２８個の、より小さいタンパク質が生じる。機能的相同性ドメインを持たないこのアイソフォームの機能も未知である。好ましい実施態様では、本発明は、ＫＩＡＡ１４５６アイソフォーム１の発現レベルを決定することを含む。
【００４８】
本明細書において、用語「サンプル」とは、患者から得ることができる任意のサンプルに関する。本方法は、生検サンプル、ＦＮＡＢ(fine needle aspiration biopsy)（穿刺吸引生検）、組織、細胞または体液（血清、唾液、精液、痰、脳脊髄液（ＣＳＦ）、涙、粘液、汗、乳汁、脳抽出液、気管支洗浄液、Nechvatal et al. (J. Microbiol. Methods., 2008, 72: 124-132)により記載されているような糞便から得られる落屑上皮細胞など、患者由来のいずれのタイプの生体サンプルにも適用可能である。特定の実施態様では、前記サンプルは腫瘍組織サンプルまたはその一部である。より詳しい実施態様では、前記腫瘍組織サンプルは、結腸直腸癌に罹患している患者からの結腸直腸腫瘍組織サンプルである。前記サンプルは、従来の方法により、例えば生検など、関連の医学分野の当業者に周知の方法を使用することによって得ることができる。生検からサンプルを得るための方法としては、塊の大まかな配分(gross apportioning of a mass)、またはマイクロダイセクションまたは当技術分野で公知の他の細胞分離法が含まれる。腫瘍細胞は、さらに穿刺吸引細胞診から得ることもできる。これらのサンプルの保存および取り扱いを簡単にするために、これらをホルマリン固定してパラフィン包埋するか、またはまず凍結させ、その後、急速冷凍を可能とする極低温媒体中に浸漬することによってＯＣＴ化合物などの低温固化媒体に包埋することができる。
【００４９】
この方法は、いずれの腫瘍病期の結腸直腸癌に罹患している患者にも使用可能である。好ましい実施態様では、患者は、ＩＩ型結腸癌に罹患している患者である。
【００５０】
本明細書において、用語「発現レベル」とは、所与の遺伝子の発現の程度を測定するパラメーターの値を意味する。前記値は、対象とする遺伝子によりコードされるｍＲＮＡのレベルを測定すること、または前記遺伝子によりコードされるタンパク質の量を測定することによって決定することができる。
【００５１】
ＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルは、ＫＩＡＡ１４５６  ｍＲＮＡまたはＫＩＡＡ１４５６遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルを決定することを含む、当業者に公知の任意の方法によって決定することができる。
【００５２】
好ましい実施態様では、ＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルの決定は、ＫＩＡＡ１４５６遺伝子によりコードされるｍＲＮＡの発現レベルを測定することによって行うことができる。この目的で、生体サンプルは、物理的、化学的または機械的に組織または細胞構造を破壊する処理を施し、細胞内成分を水性または有機溶液中に放出させ、さらなる分析のために核酸を調製してもよい。核酸は、当業者に公知であり、市販されている手順によりサンプルから抽出する。次に、冷凍または新鮮サンプルから、例えば、Sambrook, Fischer and Maniatis, Molecular Cloning, a laboratory manual, (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, (1989)などの当技術分野で典型的ないずれかの方法によりＲＮＡを抽出する。好ましくは、抽出工程中のＲＮＡの分解を避けるように注意を払う。
【００５３】
特定の実施態様では、発現レベルは、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織サンプルから得られたｍＲＮＡを用いて決定する。ｍＲＮＡは保存用病理サンプルまたは生検サンプルから単離してもよく、まず、脱パラフィンを行う。脱パラフィン法の例としては、パラフィンサンプルを例えばキシレンなどの有機溶媒で洗浄することを含む。脱パラフィンサンプルは、低級アルコール水溶液で再水和することができる。好適な低級アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、およびブタノールが挙げられる。脱パラフィンサンプルは、例えば漸減濃度の低級アルコール溶液で連続洗浄することで再水和することができる。あるいは、サンプルの脱パラフィンと再水和を同時に行う。次に、サンプルを溶解させ、サンプルからＲＮＡを抽出する。
【００５４】
ＫＩＡＡ１４５６  ｍＲＮＡのレベルの決定は、ＲＴ−ＰＣＲと、その後のｑＰＣＲ、ノーザンブロット、ＲＮＡドットブロット、ＴａｑＭａｎ、タグに基づく方法、例えば、ＬｏｎｇＳＡＧＥおよびＳｕｐｅｒＳＡＧＥなどの変法を含む、ＳＡＧＥ法(serial analys is of gene expression)といった当技術分野で公知の任意の方法で行うことができる。ＫＩＡＡ１４５６  ｍＲＮＡのレベルの決定はまた、ＷＯ２０１００３０８１８、Femino et al. (Science, 1998, 280:585-590)、Levsky et al. (Science, 2002, 297:836-840)またはRaj et al. (PLoS Biology, 2006, 4:e309)に記載されているように、Ｆｌｏｗ−ＦＩＳＨ、ｑＦｉＳＨおよびダブルフュージョン（Ｄ−ＦＩＳＨ）などの変法を含む蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって行うこともできる。
【００５５】
好ましい実施態様では、遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは多くの場合、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により決定される。検出は個々のサンプルまたは組織マイクロアレイで行うことができる。さらにより好ましい実施態様では、ＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルは、ヒトＫＩＡＡ１４５６遺伝子の転写変異体１のｍＲＮＡレベルを測定することにより決定される。
【００５６】
種々のサンプル間のｍＲＮＡ発現の値を正規化するために、試験サンプルにおける対象とするｍＲＮＡの発現レベルを対照ＲＮＡの発現と比較することができる。本明細書において、「対照ＲＮＡ」とは、その発現レベルが非腫瘍形成細胞に対して腫瘍細胞で変化しないかまたは限られた量でしか変化しないＲＮＡに関する。好ましくは、対照ＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子に由来し、構成的に発現され、必須の細胞機能を行うタンパク質をコードするｍＲＮＡである。本発明で使用するための好ましいハウスキーピング遺伝子としては、β−２−ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＰＳＭＢ４（プロテアソームサブユニット，β型，４）、ユビキチン、トランスフェリン受容体、１８−ＳリボソームＲＮＡ、シクロフィリン、チューブリン、βアクチンおよびチロシン３−モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質（ＹＷＨＡＺ）が挙げられる。好ましい実施態様では、対照ＲＮＡは、β−２−ミクログロブリンｍＲＮＡである。一つの実施態様では、相対的遺伝子発現定量値は、比較Ｃｔ法に従い、内在遺伝子対照およびＲＮＡ対照（健康ドナー由来の正常組織および／または同じ患者由来の腫瘍に隣接する正常組織）としてのβ−２−ミクログロブリン、リボゾーム１８Ｓ  ＲＮＡ、ＧＡＰＤＨおよびＰＳＭＢ４を較正物質として用いて算出される。最終的な結果は、式２−（ΔＣｔサンプル−ΔＣｔ較正物質）に従って求められ、式中、較正物質およびサンプルのΔＣＴ値は、使用した３つのハウスキーピング遺伝子の幾何平均値から標的遺伝子のＣＴ値を差し引くことによって求められる。
【００５７】
別の実施態様では、ＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルは、ＫＩＡＡ１４５６タンパク質の発現を測定することによって決定される。ＫＩＡＡ１４５６タンパク質の発現レベルの決定は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットまたは免疫蛍光などの免疫学的技術によって行うことができる。ウエスタンブロットは、変性条件下でのゲル電気泳動により予め分離され、膜、一般にニトロセルロース上に固定されたタンパク質を、特異的抗体および現像系（例えば、化学発光）とともにインキュベートすることによって検出することに基づく。免疫蛍光による分析は、顕微鏡による発現および細胞内局在の分析のために標的タンパク質に特異的な抗体の使用を必要とする。一般に、被験細胞を予めパラホルムアルデヒドで固定し、非イオン性洗剤で透過処理を施す。ＥＬＩＳＡは酵素で標識した抗原または抗体の使用に基づき、これにより、標的抗原と標識抗体の間で形成された結合体が酵素活性を持つ複合体を形成することとなる。前記成分のうちの一方（抗原または標識抗体）が支持体に固定されているので、抗体−抗原複合体もその支持体に固定され、従って、その酵素により、例えば分光光度法または蛍光測定法によって検出可能な生成物に変換される基質を添加すればそれが検出できる。この技術は標的タンパク質の正確な位置決定またはその分子量の決定を可能とするものではないが、様々な生体サンプル（血清、血漿、組織ホモジネート、核除去後上清、および腹水など）中の標的タンパク質の極めて特異的かつ高感度の検出を可能とする。好ましい実施態様では、ＫＩＡＡ１４５６タンパク質は、コーティングスライド上に固定化された生体サンプルの薄層切片を用い、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析によって検出される。次に、これらの切片を、パラフィン組織サンプルに由来する場合には脱パラフィンし、抗原を賦活化させる処理を施す。検出は個々のサンプルまたは組織マイクロアレイで行うことができる。
【００５８】
標的タンパク質に高い親和性で結合することが知られる抗体または試薬はいずれも、標的タンパク質の量を検出するために使用可能である。しかしながらやはり、抗体、例えば、ポリクローナル血清、ハイブリドーマ上清またはモノクローナル抗体、抗体フラグメント、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’  ｙ  Ｆ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖ、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディーおよびヒト化抗体の使用が好ましい。
【００５９】
さらに別の実施態様では、ＫＩＡＡ１４５６タンパク質発現レベルの決定は、患者サンプルがアセンブルされた組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を構築し、ＫＩＡＡ１４５６タンパク質の発現レベルを免疫組織化学技術によって決定することにより行うことができる。本方法の再現性を維持するために、免疫染色強度は、２人の異なる病理学者により評価し、均一かつ明確なカットオフ基準を用いてスコア化することができる。不一致は同時再評価により解決することができる。簡単に述べれば、免疫染色の結果は、腫瘍細胞での発現と各マーカーの特定のカットオフを考慮して、陰性発現（０）と陽性発現、そして、低発現（１＋）と中程度の発現（２＋）と高発現（３＋）として記録することができる。一般基準として、カットオフは再現性の補助および可能であれば生体事象の解釈を目的として選択した。
【００６０】
ＫＩＡＡ１４５６タンパク質の発現レベルの決定は、正常個体（すなわち、結腸癌の診断を持たない者）または同じ患者からの正常組織（すなわち、腫瘍細胞を持たない組織）に由来するサンプルの集合において測定されたＫＩＡＡ１４５６のタンパク質発現レベルの中央値または平均値に相当し得る参照値と相関させる必要がある。ひと度この中央値が確定されれば、患者の腫瘍組織で発現されたこのマーカーのレベルをこの中央値と比較し、「低い」もしくは「低下」、「正常」もしくは「同じ」、または「高い」もしくは「上昇」のレベルを割り付けることができる。特定の実施態様では、参照値に対して少なくとも１．１倍、１．５倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはそれを超えるような、参照値を上回るタンパク質発現の増加は、発現の「上昇」とみなされる。特定の実施態様では、参照値に対して少なくとも０．９倍、０．７５倍、０．２倍、０．１倍、０．０５倍、０．０２５倍、０．０２倍、０．０１倍、０．００５倍またはそれより低い、参照値を下回るタンパク質発現の減少は、発現の「低下」と見なされる。本明細書において、用語「同じ発現レベル」とは、参照値と実質的に変わらない発現レベルを意味する。例えば、検討下のサンプル中での発現は、それらのレベルの違いが０．１％以下、０．２％以下、０．３％以下、０．４％以下、０．５％以下、０．６％以下、０．７％以下、０．８％以下、０．９％以下、１％以下、２％以下、３％以下、４％以下、５％以下、６％以下、７％以下、８％以下、９％以下、１０％以下、またはその決定に使用される試験方法に関連する誤差と同じパーセンテージ値以下である場合に、参照サンプルと同じであるとみなされる。
【００６１】
被験者間変動（例えば、年齢、人種などに関する側面）のため、ＫＩＡＡ１４５６の絶対的参照値を確定することは極めて難しい（そうでなくても、実用上不可能）。従って、特定の実施態様では、「上昇」、「低下」または「同じ」ＫＩＡＡ１４５６発現に関する参照値は、正常被験者（すなわち、結腸癌の診断を持たない者）から単離されたサンプルの群をＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルに関して検定することを含む従来の手段によってパーセンタイルを算出することにより決定される。その後、レベルの「上昇」は、好ましくは、ＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルが正常集団の５０パーセンタイルに等しいかまたはそれを超える、例えば、正常集団の６０パーセンタイルに等しいかまたはそれを超える、正常集団の７０パーセンタイルに等しいかまたはそれを超える、正常集団の８０パーセンタイルに等しいかまたはそれを超える、正常集団の９０パーセンタイルに等しいかまたはそれを超える、および正常集団の９５パーセンタイルに等しいかまたはそれを超える発現レベルであるサンプルに割り付けることができる。
【００６２】
好ましい実施態様では、ＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルは、上述の方法のいずれかを用いて、ＫＩＡＡ１４５６アイソフォームＩのタンパク質レベルを測定するか、またはＫＩＡＡ１４５６遺伝子の転写変異体１のｍＲＮＡレベルを測定することによって決定される。より好ましい実施態様では、ＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルは、ヒトＫＩＡＡ１４５６アイソフォームＩのタンパク質レベルを測定するか、またはヒトＫＩＡＡ１４５６遺伝子の転写変異体１のｍＲＮＡレベルを測定することによって決定される。
【００６３】
ひと度ＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルが決定されれば、本発明の第一の方法は、前記発現レベルを参照サンプルと比較することを含む。
【００６４】
ＫＩＡＡ１４５６遺伝子によりコードされるｍＲＮＡの発現レベルの決定は、正常被験者（すなわち、結腸癌の診断を持たない者）または同じ患者からの正常組織（すなわち、腫瘍細胞を持たない組織）に由来するサンプルの集合において測定されたＫＩＡＡ１４５６遺伝子によりコードされるｍＲＮＡの発現レベルの中央値に相当する参照値と相関させる必要がある。いずれの場合でも、それは異なる数のサンプルを含み得る。
【００６５】
ひと度比較が行われれば、本発明の第一の方法は、その発現レベルが前記参照レベルと比べて変化しているかどうかに基づいて、患者に療法を施すことが好都合かどうかを判断することを可能とする。
【００６６】
本明細書において、用語「発現レベルの変化」とは、参照レベルと比べた場合に、サンプルにおけるまたはサンプルを介した、核酸配列の発現活性および／またはその核酸配列の発現から生じるタンパク質の量のレベルの上昇またはレベルの低下を意味する。発現レベルの変化が参照レベルに対して上昇しているか、低下しているか、または同じであるかによって、ＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルは、参照サンプルに対して「低い」もしくは「低下」、「正常」、または「高い」もしくは「上昇」と割り付けることができる。特定の実施態様では、参照値に対して少なくとも１．１倍、１．５倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはそれを超えるような、参照値を上回るｍＲＮＡの発現レベルの増加は、発現の「上昇」とみなされる。特定の実施態様では、参照値に対して少なくとも０．９倍、０．７５倍、０．２倍、０．１倍、０．０５倍、０．０２５倍、０．０２倍、０．０１倍、０．００５倍またはそれより低い、参照値を下回るｍＲＮＡの発現レベルの低下は、発現の「低下」とみなされる。
【００６７】
好ましい実施態様では、発現レベルの上昇は、ある療法が前記患者に適切であることを示す。別の好ましい実施態様では、発現レベルの低下は、ある療法が前記患者に適切でないことを示す。
【００６８】
患者の臨床転帰を予測するための方法
第二の側面において、本発明は、結腸直腸癌に罹患している患者の臨床転帰を予測するための方法であって、前記患者からのサンプルにおいてＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルを決定することを含んでなり、参照レベルと比べた場合に前記サンプル中のＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルが上昇していれば不良な臨床転帰が示され、参照レベルと比べた場合に前記サンプル中のＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルが同じかもしくは低下していれば良好な臨床転帰が示される方法（以下「本発明の第二の方法」）に関する。
【００６９】
本明細書において、「臨床転帰を予測する」とは、腫瘍学で使用され、当業者に公知のいずれのエンドポイント測定値を用いて行ってもよい。疾患の展開を表すのに有用なエンドポイントパラメーターとしては、以下のものが含まれる。
【００７０】
・無病生存期間（本明細書において、最後の化学療法クールの日から再発、死亡または最後の追跡調査の日までの期間を意味する）
・全生存期間（本明細書において、試験登録から死亡または打切りまでの期間を意味する）
・無病進行率（本明細書において、試験期間中、疾病再発の無い完全緩解状態の患者の割合を表す）
・客観的奏功率（本発明において、完全奏功または部分奏功が見られた治療患者の割合を表す）
・腫瘍管理率（本発明において、完全奏功、部分奏功、軽度奏功または６か月以上の安定期間が見られる治療患者の割合に関する）
・無進行生存期間（本明細書において、治療の開始から最初に癌増殖が測定されるまでの期間と定義される）
・６か月無進行生存率またはＰＦＳ６率（本明細書において、療法の開始後最初の６か月に進行の無い患者のパーセンテージに関する）および
・生存期間中央値（本明細書において、試験に登録された患者の半数が生存している期間に関する）
【００７１】
一つの実施態様において、臨床転帰の予測は、無病生存期間および／または全生存期間として測定される。
【００７２】
当業者に理解されるように、臨床転帰の予測は通常、診断を受ける被験者の１００％に正確でなくてもよい。しかしながら、この用語は、被験者の統計学的に有意な一部が十分に予後できることを必要とする。ある一部が統計学的に有意かどうかは、当業者ならば、難なく、例えば信頼区間の決定、ｐ値の決定、スチューデントのｔ検定、マン・ホイットニー検定などの種々の周知の統計評価ツールを用いて決定することができる。詳細は、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley and Sons, New York 1983に示されている。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％である。ｐ値は、好ましくは、０．２、０．１、および０．０５である。
【００７３】
第一の工程において、本発明の第一の方法は、前記患者からのサンプルにおいてＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルを決定することを含んでなる。
【００７４】
用語「発現レベル」、「患者」、「サンプル」、「ＫＩＡＡ１４５６遺伝子」、「結腸直腸癌」は上記で詳細に記載されており、本発明の第二の方法に関しても同じ意味で用いられる。
【００７５】
好ましい実施態様では、ＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルは、ＫＩＡＡ１４５６遺伝子によりコードされるｍＲＮＡのレベルまたはＫＩＡＡ１４５６タンパク質のレベルを測定することにより決定される。さらに別の実施態様では、ＫＩＡＡ１４５６の発現レベルは、ヒトＫＩＡＡ１４５６遺伝子の転写変異体１のｍＲＮＡレベルを測定することにより決定される。この決定は、上述の方法のいずれかを用いて行うことができる。
【００７６】
別の実施態様では、ＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルの決定が行われるサンプルは腫瘍生検である。
【００７７】
別の実施態様では、患者はヒト患者である。別の実施態様では、患者は腫瘍の外科的切除を受けている。さらに別の実施態様では、患者はＩＩ期結腸直腸癌に罹患している。用語「外科的切除」および「ＩＩ期」は、上記に定義されている。
【００７８】
さらに別の実施態様では、本発明による方法は、さらなる臨床リスク因子を示さない患者で行われる。好ましい実施態様では、患者は、新生物性(neoplasic)腸閉塞、血管浸潤および／または神経周囲浸潤を示さない。
【００７９】
本発明者らは、結腸直腸癌患者の臨床転帰の予測マーカーとしてのＫＩＡＡ１４５６遺伝子発現レベルの値は、術後に補助化学療法または放射線療法を施されていない患者では上昇するという所見を得た。本発明の実施例４に示されるように、補助化学療法を施されていない患者の予後は、前記遺伝子の過剰発現を伴う患者で根本的に不良である（全生存期間に関してはｐ＝０．０１０、無再発生存期間に関してはｐ＝０．０１２）（図５Ａと５Ｃ、および６Ａと６Ｃ）。これらの違いは化学療法を施されている患者では見られず、このような患者の場合、予後は両症例ともはるかに良好である（図５Ｂと５Ｄ、および６Ｂと６Ｄ）。従って、さらに別の実施態様では、患者は、術前補助療法または補助療法を施されてない。
【００８０】
本明細書において、用語「補助療法」は、検出可能な総ての疾患が取り除かれたが、潜伏する疾患のために統計学的再発リスクが残っている場合に、通常術後に施される追加治療に関する。本明細書において、用語「術前補助療法」とは、手術を受ける前に癌の大きさまたは範囲を縮小すること、従って、手順をより容易に、成功しやすくし、腫瘍の大きさおよび範囲が縮小されなかった場合に起こったはずのより広範囲の手術の結果を軽減することを目的とする、術前に癌患者に施す全身薬剤処置または放射線療法を意味する。
【００８１】
第二の工程において、本発明による方法は、サンプル中のＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルを参照レベルと比較することを含む。用語「発現レベル」および「参照レベル」は上記で詳細に記載されており、本発明の第二の方法に関しても同じ内容で用いられる。
【００８２】
最後に、本発明の第二の方法は、患者が不良な臨床転帰を持つか良好な臨床転帰を持つかをＫＩＡＡ１４５６遺伝子の相対的発現レベルに基づいて判断することをさらにを含んでなり、参照レベルと比べた場合に前記サンプル中のＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルが上昇していれば不良な臨床転帰が示され、参照レベルと比べた場合に前記サンプル中のＫＩＡＡ１４５６遺伝子の発現レベルが同じかもしくは低下していれば良好な臨床転帰が示される。
【００８３】
用語「発現レベルの低下」、「発現レベルの上昇」、「同じ発現レベル」および「参照レベル」は上記で詳細に記載されており、本発明の第二の方法に関しても同じ内容で用いられる。
【００８４】
用語「不良な臨床転帰」とは、既知の診断方法を用いて、または腫瘍学で使用され当業者に公知の、上記で定義されたような任意のエンドポイント測定値を用いて決定した場合の、障害に関連する臨床症状の任意の悪化またはその頻度の増加を意味する。
【００８５】
用語「陽性臨床転帰」とは、既知の診断方法を用いて、または腫瘍学で使用され当業者に公知の、上記で定義されたような任意のエンドポイント測定値を用いて決定した場合の、障害に関連する臨床症状の任意の改善またはその頻度の減少を意味する。
【００８６】
キットおよびその使用
別の側面において、本発明は、本明細書に記載の方法論の実装形態において有用なキットに関する。
【００８７】
本発明において、「キット」とは、輸送および保存が可能なように包装された本発明の方法を実施するために必要な種々の試薬を含有する製品と理解される。キットの成分を包装するのに好適な材料としては、クリスタル、プラスチック（ポリエチレン、ポリプロピレン、およびポリカーボネートなど）、ボトル、バイアル、紙、および封筒などが含まれる。さらに、本発明のキットは、キットの中にある種々の成分の同時、逐次または個別使用のための説明を含み得る。前記説明は印刷書類の形態であってもよいし、または電子保存媒体（磁気ディスク、およびテープなど）ならびに光媒体（ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ）など、被験者が読める説明書を保存できる電子支援の形態であってもよい。それに加えてまたはその代わりに、媒体は、前記説明を提供するインタネットアドレスを含んでもよい。
【００８８】
よって、本発明のキットは、ＫＩＡＡ１４５６の発現レベルを特異的に検出することができる薬剤セットと、場合により、ハウスキーピング遺伝子または前記ハウスキーピング遺伝子によりコードされるタンパク質を検出するための試薬を含んでなる。特定の実施態様では、検出されるＫＩＡＡ１４５６由来のアイソフォームは、アイソフォームＩである。
【００８９】
「遺伝子の発現レベルの決定を可能とする試薬」とは、ｍＲＮＡレベルの決定の手段またはタンパク質レベルの決定の手段の双方によって遺伝子の発現レベルの決定を可能とする化合物または化合物セットを意味する。よって、第一のタイプの試薬は、前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるプローブを含む。第二のタイプの試薬は、マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質と特異的に結合する化合物を含み、好ましくは、抗体を含むが、それらは特異的アプタマーであってもよい。好ましい実施態様では、ＫＩＡＡ１４５６遺伝子型の発現レベルの決定を可能とする試薬は、キットを形成する試薬の総量の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を少なくとも含んでなる。
【００９０】
本発明のキットの特定の実施態様では、そのキットの試薬は、ＫＩＡＡ１４５６のｍＲＮＡレベルおよび／またはＫＩＡＡ１４５６タンパク質のレベルを特異的に検出することができる核酸である。ＫＩＡＡ１４５６遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができる核酸は、前記遺伝子のｍＲＮＡ（またはそれらの対応するｃＤＮＡ）の断片の特異的増幅のための１対以上のプライマーオリゴヌクレオチドであり得る。
【００９１】
好ましい実施態様では、本発明のキットの第一の成分は、ＫＩＡＡ１４５６遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができるプローブを含んでなる。
【００９２】
キットに含まれる、前記核酸とハイブリダイズすることができるプローブは、例えば、ホスホジエステル結合がホスホロチオエート結合、メチルイミン結合、メチルホスホネート結合、ホスホルアミダート結合、グアニジン結合などで置換されている核酸、ヌクレオチドのリボースが別のヘキソースで置換されている核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などのハイブリダイゼーション能を維持する核酸またはその類似体であり得る。プローブの長さは７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、１００ヌクレオチドであり得、１０〜１０００ヌクレオチドの範囲、好ましくは１５〜１５０ヌクレオチドの範囲、より好ましくは１５〜１００ヌクレオチドの範囲で異なり、一本鎖核酸または二本鎖核酸であり得る。
【００９３】
種々の標的遺伝子に対する特異的プローブの選択は、それらが標的核酸と特異的に結合し、無関係の遺伝子とのハイブリダイゼーションが最小となるように実施される。しかしながら、ある特定のｍＲＮＡに独特でない２０ヌクレオチドのプローブが存在する。従って、前記配列に対するプローブは、無関係の遺伝子のｍＲＮＡに見られる同じ配列と交差ハイブリダイゼーションを示すことになる。さらに、用いる条件で（二次構造のためにまたはそのアレイの支持体との相互作用のために）標的遺伝子と特異的にハイブリダイズしないプローブも存在する。このタイプのプローブは、アレイに含むべきでない。よって、当業者ならば、特定のアレイに組み込もうとするプローブを、それらをアレイに組み込む前に最適化しなければならないことに気づくであろう。プローブの最適化は一般に、特定の標的ポリヌクレオチドの異なる領域に対する複数のプローブを含むアレイを生成することによって行われる。このアレイをまず、単離された形態の標的核酸を含有するサンプルと接触させ、次に、複雑な核酸混合物と接触させる。従って、標的核酸と特異性の高いハイブリダイゼーションを示すが、複雑なサンプルとのハイブリダイゼーションが低いかまたはハイブリダイズしないプローブが、本発明のアレイに組み込むために選択される。また、検討しようとする各プローブに対するハイブリダイゼーション対照をアレイに含むことができる。好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーション対照は、プローブの中央領域に変更された場所を含む。検討するプローブとそのハイブリダイゼーション対照の間に高レベルのハイブリダイゼーションが見られる場合には、そのプローブはアレイに含めない。
【００９４】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は当業者により容易に決定され、一般に、プローブ長、洗浄温度、および塩濃度に応じた経験的な推定である。一般に、長いプローブほど適切なアニーリングに高い温度を必要とし、短いプローブほど低温でよい。ハイブリダイゼーションは一般に、相補鎖がそれらの融点より低い環境に存在する場合に、変性したＤＮＡが再アニーリングする能力によって決まる。プローブと、ハイブリダイズ可能な配列との間に望まれる相同性の程度が高いほど、使用可能な相対的温度は高い。結果として、相対的温度が高いほど反応条件はよりストリンジェントとなり、温度が低いほどストリンジェンシーが低くなる傾向となる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照。
【００９５】
「ストリンジェント条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、本明細書で定義されるように、一般に、（１）洗浄に低いイオン強度と高い温度、例えば、５０℃にて０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを用いるか；（２）ハイブリダイゼーション中に、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ６．５（７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム含有）とともにホルムアミドなどの変性剤（例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド）を４２℃で用いるか；または（３）５０％ホルムアミド、５倍ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５倍デンハート液、音波処理済みサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸を４２℃で用い、４２℃、０．２倍ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミド中で洗浄した後、５５℃で、ＥＤＴＡを含有する０．１倍ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を行う。
【００９６】
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989が記載しているように定義することができ、上記のものよりも低いストリンジェントの洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェント条件の例は、３７℃にて、２０％ホルムアミド、５倍ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５倍デンハート液、１０％デキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍｌ変性断片化サケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液中、一晩のインキュベーションと、その後の約３７〜５０℃にて１倍ＳＳＣ中でのフィルター洗浄である。当業者ならば、プローブ長などの要因を適正化するために必要に応じて温度、イオン強度をどのように調節すればよいかが分かるであろう。
【００９７】
別の好ましい実施態様では、本発明のキットを形成するプローブまたは抗体はアレイに結合される。
【００９８】
これらのマイクロアレイは、支持体に空間的に分布され安定結合された複数の核酸を含んでなる（例えば、バイオチップ）。これらの核酸は、発現が検出される遺伝子の特定の部分配列と相補的な配列を有するので、前記核酸とハイブリダイズずることができる。本発明の方法では、核酸アレイを含んでなるマイクロアレイを試験対象の患者から単離された核酸調製物と接触させる。マイクロアレイとこの核酸調製物とのインキュベーションを、ハイブリダイゼーションに好適な条件下で行う。次に、支持体に保持されなかった核酸を除去した後に、ハイブリダイゼーションパターンを検出し、これが分析サンプルの遺伝的プロファイルに関する情報を提供する。マイクロアレイはサンプル中に存在する核酸の質的および量的双方の情報を提供することができるが、本発明は量的情報を提供することができるアレイおよび方法論の使用を必要とする。
【００９９】
本発明は、プローブのタイプに関して、また、使用する支持体のタイプに関して様々なアレイを企図する。
【０１００】
好ましい実施態様では、アレイは、一定長のまたは５〜５０ヌクレオチドの範囲で可変の長さの、標的核酸の部分配列と相補的な複数のプローブを含む。アレイはある特定の長さの特定のｍＲＮＡの特異的プローブを総て含むこともできるし、またはｍＲＮＡの異なる領域から選択されるプローブを含むこともできる。各プローブを、変異した塩基（好ましくは、プローブの中央部分で）を持つプローブで並行してアッセイする。このアレイをアレイのプローブと相補的な配列を有する核酸を含有するサンプルと接触させ、各プローブとの、また、対応するハイブリダイゼーション対照とのハイブリダイゼーションのシグナルを決定する。プローブとそのハイブリダイゼーション対照とのハイブリダイゼーションのシグナルの間に大きな違いが見られるプローブを選択する。最適化プロセスは、ハイブリダイゼーションアレイが、アレイのプローブと相補的な配列を含まないサンプルとハイブリダイズされる、第二工程の最適化を含み得る。この第二工程の選択の後、閾値レベルよりも低いハイブリダイゼーションシグナルを有するプローブが選択される。従って、両方の制御を通過した、すなわち、標的核酸との最小レベルの非特異的ハイブリダイゼーションかつ最大レベルの特異的ハイブリダイゼーションを示すプローブが選択される。
【０１０１】
本発明のマイクロアレイは、特定された病態生理学的状態を示すポリヌクレオチドの特異的プローブを含むだけでなく、正規化対照、発現レベル対照およびハイブリダイゼーション対照という３つのタイプであり得る一連の対照プローブも含む。
【０１０２】
正規化対照は、分析される核酸の調製物に加える標識参照配列と完全に相補的なオリゴヌクレオチドである。ハイブリダイゼーション後の正規化対照に由来するシグナルは、ハイブリダイゼーション条件の変動、マーカーの強度、検出効率、および異なるマイクロアレイ間でハイブリダイゼーションシグナルの変動をもたらし得る別の一連の因子の指標となる。好ましくは、このアレイの残りのプローブから検出されたシグナルを対照プローブにより生じたシグナルで割って測定値を正規化する。事実上、いずれのプローブも正規化対照として使用できる。しかしながら、ハイブリダイゼーション効率はヌクレオチドの組成およびプローブの長さによって異なることが知られている。従って、好ましい正規化プローブは、アレイ中に存在するプローブの平均長に相当するものであるが、それらはアレイ中に存在する残りのプローブを反映する一定範囲の長さを含むように選択することができる。正規化プローブは、アレイ中に存在する残りのプローブのヌクレオチドの平均組成を反映するように設計することができる。好ましくは、限られた数の正規化プローブが、それらが好適にハイブリダイズするように、すなわち、それらが二次構造を持たず、アレイのいずれのプローブとも配列類似性を示さないように選択される。これらの正規化プローブは、アレイの構造に関連したハイブリダイゼーション効率の変動を効果的に制御するよう、アレイのいずれの場所にあってもよく、またはアレイの複数の場所にあってもよい。正規化対照は好ましくは、アレイのコーナーおよび／またはアレイの中央にあってもよい。
【０１０３】
発現対照は、分析されるサンプルにおいて構成的に発現される遺伝子と特異的にハイブリダイズするプローブである。これらの発現レベル対照は、細胞の生理学的状態および代謝活性の対照となるように設計される。発現レベル対照と標的核酸の発現レベルとの共分散を調べると、発現レベルの変動が発現レベルの変化によるものか、それとも細胞における全転写率またはその全般的代謝活性の変化によるものかが示される。よって、細胞の生存能に不可欠な特定の代謝産物に欠乏を持つ細胞の場合には、標的遺伝子の発現レベルと対照の発現レベルの両方に低下が見られると予想される。他方、標的遺伝子と対照遺伝子の発現に増加が見られれば、それはおそらく細胞の代謝活性の増加によるものであって、標的遺伝子の発現の増加の違いによるものではない。β−２−ミクログロブリン、ユビキチン、リボゾームタンパク質１８Ｓ、シクロフィリンＡ、チロシン３−モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質（ＹＷＨＡＺ）、ＰＳＭＢ４（プロテアソームサブユニット，β型，４）、トランスフェリン受容体、チューブリン、β−アクチン、およびＧＡＰＤＨのような必須の細胞機能を発揮するタンパク質をコードする遺伝子など、構成的発現遺伝子に相当するプローブはいずれの使用可能である。好ましい実施態様では、発現レベル対照は、ＧＡＰＤＨ、チロシン３−モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質（ＹＷＨＡＺ）、リボゾームタンパク質１８Ｓ、ユビキチン、β−アクチンおよびβ−２−ミクログロブリンである。
【０１０４】
ハイブリダイゼーション対照は、標的遺伝子に対するプローブと発現レベル対照または正規化対照に対するプローブの両方に対するものを含むことができる。誤差対照は、１または数個のヌクレオチドに突然変異を含む、すなわち、標的遺伝子の対応するヌクレオチドとはハイブリダイズしないヌクレオチドを特定の場所に含むこと以外は、標的遺伝子に対するプローブと同一のオリゴヌクレオチドのプローブである。ハイブリダイゼーション対照は、好適なハイブリダイゼーション条件を適用した場合に、標的遺伝子がハイブリダイゼーション対照ではない特異的プローブとハイブリダイズするか、または低い効率でしかハイブリダイズしないように選択される。ハイブリダイゼーション対照は好ましくは、プローブの中央に１箇所または数箇所の改変された場所を含む。従って、ハイブリダイゼーション対照は、サンプル中の核酸との非特異的ハイブリダイゼーションの程度または正確に相補的な配列を含有するものとは異なるプローブとの交差ハイブリダイゼーションの程度の指標となる。
【０１０５】
また、選択された対照遺伝子の部分配列と相補的なプローブである増幅対照およびサンプル調製対照も、細菌遺伝子のプローブなど、それらがその試験対象の生体サンプル中に通常見られないために、本発明のアレイに含むことができる。ＲＮＡサンプルには、選択された対照プローブとハイブリダイズする既知量の核酸を添加する。前記プローブとのハイブリダイゼーションを判定することで、それらの調製の際の核酸の回収程度が示されるとともに、サンプル処理中にそれらの核酸に生じた変化が推定される。
【０１０６】
好適な特異性を示すプローブセットおよび対照プローブがひと度提供されれば、前者をアレイの既知の場所に配置し、これにより、ハイブリダイゼーション工程と検出工程の後に、陽性ハイブリダイゼーションシグナルが検出されるアレイの座標から、陽性ハイブリダイゼーションシグナルと特定の遺伝子の間の相関を確立することができる。
【０１０７】
マイクロアレイは、フォトリソグラフィーｉｎ  ｓｉｔｕ合成法(Fodor et al., 1991, Science, 767-773)の手段による、何千というオリゴヌクレオチドを含む高密度アレイであり得る。このタイプのプローブは通常、冗長型であり、すなわち、それらは検出される各ｍＲＮＡについて数個のプローブを含む。好ましい実施態様では、これらのアレイは、１００００個／平方センチメートル未満のプローブを含有する低密度アレイまたはＬＤＡである。前記低密度アレイでは、異なるプローブを固相支持体（例えば、クリスタル表面、膜）の異なる場所にピペットにより手動で適用する。プローブの固定に用いる支持体は、プラスチック、セラミックス、金属、ゲル、膜、クリスタルなどを含む多様な材料から得ることができる。これらのマイクロアレイは、当業者に公知のいずれの方法論を用いて得てもよい。
【０１０８】
ハイブリダイゼーション後、非ハイブリダイズ核酸が検出工程においてシグナルを発し得る場合には、前記の非ハイブリダイズ核酸を除去するために洗浄工程が必要である。洗浄工程は、当業者に公知の方法および溶液を用いて行われる。
【０１０９】
核酸の標識が直接検出可能でない場合には、アレイに結合された標的核酸を含んでなるマイクロアレイを、検出可能なシグナルを生じる反応を引き起こすのに必要な系の他の成分と接続することができる。例えば、標的核酸をビオチンで標識する場合、このアレイを、ビオチンとストレプトアビジンの間で結合が生じるような好適な条件で、蛍光試薬結合ストレプトアビジンと接触させる。このマイクロアレイを検出可能なシグナルを生じる系とともにインキュベートした後、そのアレイに非特異的に結合した総ての分子を除去するために洗浄工程を行う必要がある。これらの洗浄条件は、当業者によって、検出可能なシグナルを生じる当業者に周知の系に応じた好適な条件を用いて決定される。
【０１１０】
得られたハイブリダイゼーションパターンはいくつかの異なる方法で可視化または検出することができ、前記検出はマイクロアレイで使用されるタイプの系によって行われる。よって、ハイブリダイゼーションパターンの検出は、シンチレーション計数、オートラジオグラフィー、蛍光シグナルの測定、熱量計による測定、および光シグナルの検出などの手段によって行うことができる。
【０１１１】
検出工程の前に、マイクロアレイを一本鎖ＤＮＡに特異的なエンドヌクレアーゼで処理することができ、これにより、アレイに非特異的に結合したＤＮＡが除去され、アレイのプローブと試験対象のサンプルの核酸とのハイブリダイゼーションから生じた二本鎖ＤＮＡがそのまま残る。この処理に好適なエンドヌクレアーゼとしては、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングマメヌクレアーゼなどが含まれる。標的核酸が直接検出可能な分子で標識されないアッセイ（例えば、標的核酸がビオチン化されるアッセイ）においてエンドヌクレアーゼ処理が行われる場合には、マイクロアレイを検出可能なシグナルを生じる系の他のメンバーと接触させる前にエンドヌクレアーゼ処理を行う。
【０１１２】
ハイブリダイゼーションおよびおそらくはその後の洗浄および処理工程の後に、ハイブリダイゼーションパターンを検出および定量し、アレイ内の各ハイブリダイゼーション点に相当するシグナルを、末端標識された既知数の核酸により発せられたシグナルに相当する参照値と比較して、マイクロアレイのある特定の点においてハイブリダイズした各核酸のコピー数の絶対値を得る。
【０１１３】
ＫＩＡ１４５６タンパク質の発現レベルを決定する場合には、本発明のキットは、前記タンパク質に特異的な少なくとも１つの抗体を含んでなる。
【０１１４】
この目的で、De Wildt et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:989-994; Lueking et al. (1999) Anal. Biochem. 270:103-111; Ge et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28, e3, I-VII; MacBeath and Schreiber (2000) Science 289:1760-1763;ＷＯ０１／４０８０３およびＷＯ９９／５１７７３Ａ１に記載されているものなどの抗体アレイが有用である。アレイの抗体としては、高い親和性でリガンドに結合することができる任意の免疫薬剤（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む）、ならびに抗原結合部位を有する、抗体に類似の分子（Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、シングルドメイン抗体またはＤＡＢＳ、Ｆｖ、およびｓｃＦｖなど）が含まれる。前記抗体を作製するための技術は当業者に極めてよく知られており、Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al, John Wiley & Sons (1992))により記載されている方法が含まれる。
【０１１５】
アレイの抗体は、例えば、市販のロボットシステム（例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ  ＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓまたはＢｉｏｒｏｂｏｔｉｃｓにより生産されているもの）を用いて高速で適用することができる。アレイの支持体はニトロセルロース、プラスチック、クリスタルであってもよいし、または例えば、アクリルアミド、アガロースまたは別のポリマーのような多孔質材料であってもよい。別の実施態様では、本発明のタンパク質を検出するために、特異的抗体を産生する細胞を使用することができる（アレイフィルター中でそれらを培養することによる）。抗体の発現を誘導した後、これらの抗体は、フィルター内の、産生細胞が局在されたアレイの場所に固定される。
【０１１６】
抗体のアレイを標識された標的と接触させ、固定された抗体に対するその標的の結合レベルを決定することができる。標的が標識されない場合には、サンドイッチ型アッセイを使用することができ、この場合には、支持体に固定されたポリペプチドに結合する、ポリペプチドに特異的な第二の標識抗体を用いる。アレイの各点における、サンプル中に存在するポリペプチドの量の定量は、発現プロファイルとしてデータベースに保存することができる。抗体のアレイは二反復で生産し、これを用いて２つの異なるサンプルの結合プロファイルを比較することができる。
【０１１７】
抗原を検出することができ、ＫＩＡＡ１４５６タンパク質またはその変異体に特異的に結合することができる抗体またはそのフラグメントは、例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、抗体フラグメントＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’  ｙ  Ｆ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖ、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディーおよびヒト化抗体である。
【０１１８】
好ましい実施態様では、本キットの試薬は、ＤＮＡもしくはＲＮＡプローブまたは抗体である。
【０１１９】
前記試薬、具体的にはプローブおよび抗体は、場合により支持体への前記プローブまたは抗体の固定を容易にするために処理を施した、膜、プラスチックまたはガラスなどの固相支持体に固定することができる。ＫＩＡＡ１４５６タンパク質もしくはその変異体と特異的に結合することができる抗体セット、および／またはＫＩＡＡ１４５６遺伝子と特異的にハイブリダイズされるプローブを少なくとも含んでなる前記固相支持体は、アレイ技術の手段による発現レベルの検出のために使用することができる。
【０１２０】
本発明のキットは場合により、ハウスキーピング遺伝子によりコードされるポリペプチドまたは前記ハウスキーピング遺伝子によりコードされるｍＲＮＡを検出するための付加的試薬を含んでなってもよい。前記付加的試薬が利用できることで、異なるサンプル（例えば、試験サンプルと対照サンプル）で得られた測定値の正規化が可能となり、種々のバイオマーカーの発現の違いが、相対的発現レベルの真の違いではなくサンプル中の総タンパク質量の違いによるものであるということが排除される。２以上のハウスキーピング遺伝子が使用可能である。本明細書において、ハウスキーピング遺伝子は、構成的に発現され、必須の細胞機能を遂行するタンパク質をコードする遺伝子に関する。本発明で使用するための好ましいハウスキーピング遺伝子としては、β−２−ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＰＳＭＢ４（プロテアソームサブユニット，β型，４）、ユビキチン、トランスフェリン受容体、１８−ＳリボソームＲＮＡ、シクロフィリン、チューブリン、βアクチンおよびチロシン３−モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質（ＹＷＨＡＺ）が含まれる。
【０１２１】
別の実施態様では、本発明は、結腸直腸癌に罹患している被験体の臨床転帰を予測するための前記キットの使用に関し、前記薬剤が参照値に比べて高い発現レベルのＫＩＡＡ１４５６遺伝子を検出すれば、その被験体の臨床転帰は不良である。
【０１２２】
ＫＩＡＡ１４５６の発現レベルを検出するための方法ならびに標準的参照値も決定するための方法は従前に記載されている。
【０１２３】
別の側面において、本発明は、結腸直腸癌の診断のためまたは結腸直腸腫瘍の病期を決定するための本発明のキットの使用に関する。
【０１２４】
以下の実施例は単に例示のために示され、本発明の範囲を限定するとみなされるべきでない。
【実施例】
【０１２５】
方法論
患者のサンプル
ＫＩＡＡ１４５６遺伝子アイソフォーム１のｍＲＮＡ発現レベルの分析を、２０００年〜２００５年の間にマドリッドのラパス大学病院で手術を受けた患者から合計９８のＩＩ期結腸直腸癌腫瘍組織サンプルで行った。ラパス大学病院の倫理委員会は本試験を承認した。ラパス大学病院の病理部は、ＡＪＣＣおよびＵＩＣＣにより確立された判定基準に従ってサンプルの局所レベルで病期を調べ、決定した。質の良いＲＮＡを有するために合計８０のサンプルを次の統計分析のために選択した。試験に含まれる腫瘍の一部に隣接する正常組織１０サンプルのプールと正常組織４サンプルのプールを正常組織参照として用いた。
【０１２６】
これら８０例の臨床病理変数を十分に確立された判定基準に従って決定し、表２にまとめる。
【０１２７】
【表２】
2014513975.tif 000003
【０１２８】
患者の観察期間は３か月〜１０９か月の範囲であり、追跡調査の中央値は５９か月であった。分析時、８０名の患者のうち２１名が再発を示しており（２６．２％）、１２名（１５％）が死亡していた。
【０１２９】
合計２８名の患者（３５％）が補助化学療法を受けず、残り（５２名、６５％）がフルオロピリミジン（ＵＦＴ−ＬＶまたはゼローダ）による単剤療法を受けた。
【０１３０】
パラフィンヒト組織サンプルからの全ＲＮＡの単離
パラフィン臨床サンプルからの全ＲＮＡの抽出のための出発材料は各７ミクロンの１０切片であった。ＲＮＡを単離する前の工程として、組織切片を脱パラフィンし、キシロールおよび漸減アルコール（１００％、９０％および７０％）を通す手段によって再水和させた。次に、ＲＮＡを単離するために、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ  ＲＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｏ）を製造者の説明書に従って用いた（ＲＮＡの精製に加えて夾雑ゲノムＤＮＡの痕跡を除去するためのＤＮアーゼによる処理を含む）。
【０１３１】
逆転写およびリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
ｃＤＮＡを得るための出発材料は、患者の組織サンプルからの全ＲＮＡ１μｇであった。逆転写は、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて３７℃で２時間行った。次に、各ｃＤＮＡを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて３反復で分析した。ＰＣＲは、Ｔａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ反応混合物（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行い、これは発光を標準化するために試薬ＲＯＸを含んでいた。ＫＩＡＡ１４５６遺伝子アイソフォーム１の特異的増幅のために用いたプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからＴａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（アッセイＩＤ：Ｈｓ００３３２７４７＿ｍ１）として購入した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能な情報により、前記プローブがアイソフォーム１だけを認識し、アイソフォーム２は認識しないことが確認された。
【０１３２】
β−２ミクログロブリン（ＩＤ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：Ｈｓ９９９９９９０７＿ｍ１）、ＰＳＭＢ４（ＩＤ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：_filter2=all&group1=noValue_limit_sets&SearchRequest.Common.QueryText=PSMB4&adv_kw_filter1=all&species=Homo+sapiens&adv_query_text3=&adv_query_text2=&adv_query_text1=&adv_boolean3=AND&adv_boolean2=AND&batchSpecies=&adv_boolean1=AND&chkBatchQueryText=false&kwfilter=all&SearchRequest.Common.PageNumber=1&formatType=default&ASSAY_ATTRIBUTE=40_Inventoried&"Ｈｓ００１６０５９８＿ｍ１）またはＧＡＰＤＨ（ＩＤ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）遺伝子を内部対照として増幅した。これら３つの遺伝子の安定性は極めて高いことから、これら３つの遺伝子の幾何平均を正規化因子として選択した。ＰＣＴ温度サイクルは、９５℃で１０分、９５℃で１５秒および６０℃で１分の４０サイクルであった。
【０１３３】
ＫＩＡＡ１４５６発現の相対的定量値を、２−ΔΔＣｔ法と２−ΔＣｔ法[Livak KJ, Schmittgen TD: Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-delta delta c(t)) method. Methods (San Diego, Calif 2001; 25:402-408]の両方で算出した。２−ΔΔＣｔ法(User Bulletin No. 2 of Applied Biosystems (P/N 4303859)）（以下「ＲＱ」と呼ぶ）は、腫瘍組織サンプルにおいて標準化されたＫＩＡＡ１４５６遺伝子発現を、参照サンプル（この場合、隣接する正常組織サンプル）における同じ遺伝子の標準化された発現に対して算出することからなる。このデータは、参照遺伝子の幾何平均を用いて、対照正常組織サンプルに対して標準化したＫＩＡＡ１４５６の「発現倍率の変化」（ＲＱ）として表される。
【０１３４】
２−ΔＣｔ法（以下「ＡＱ」と呼ぶ）は、腫瘍サンプルの標準化レベルを、対照正常組織サンプルと関連づけることなく使用することからなる。このデータは、参照遺伝子の幾何平均で標準化して１０２を掛けた検討遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの相対的レベルとして示す。
【０１３５】
統計分析
データ管理はコンピューターソフトウエアＳＰＳＳ、バージョン１５．０（Ｉｎｃ，Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）によって行い、分析は総てＲフリーウェア統計パッケージ（バージョン２．９．１）（Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ，２００９）を用いて行った。
【０１３６】
生存期間は、診断から死亡までの経過時間と定義され、無再発生存期間は、診断から最初の再発までの経過時間と理解される（患者の総てが死亡または再発するわけではないので、いずれの場合にも適切な打切りが存在する）。
【０１３７】
各遺伝子で、生存期間と無再発生存期間の両方について、遺伝子発現のカットオフは、予測値が最大となった（正規化後）遺伝子発現点として決定した。これは、感度と特異性の理想的な組合せを提供すると思われる、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）が最大となった時に達成されると理解された。
【０１３８】
ＲＯＣ曲線は、各場合において、死亡（または再発）の指標とＡｎｄｅｒｓｅｎ−Ｇｉｌｌモデル（ＡＧモデル）[Andersen PK, Gill RD. Annals of Statistics 1982; 10:1100-1120; Andersen PK. et al; Statistical Models based on Counting Processes. New York: Springer-Verlag, 1993]から得られた予測値を用いて作成した。これまでの分析段階では、遺伝子発現（特に、「過少」発現および「過剰」発現の場合）の値の任意のカテゴリー化ならびに決定された共変量（特に、年齢および病理学的グレード）のカテゴリーに対して、リスクが比例していない可能性があることが見出された。この動機に関して、一貫した推定を得るために、本発明者らはＡＧモデルを用いた。このモデルによれば、リスクの説明に役立ち得る時間依存性変数の評価が可能となる。この場合、生存期間の曲線の推定は、Ａａｌｅｎ−Ｊｏｈａｎｓｅｎ推定法によって行い、次に、累積遷移強度のＮｅｌｓｏｎ−Ａａｌｅｎ推定法[Andersen PK. et al; Statistical Models based on Counting Processes. New York: Springer-Verlag, 1993]から作成した。Ｂｏｒｇａｎ[Borgan O. Encyclopaedia of Biostatistics. John Wiley & Sons, 1998]は、この推定法がマトリックス型のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ推定法を超えるものではないことを示している。
【０１３９】
次に、本発明者らは、遺伝子発現値（正規化後）がカットオフを上回る、また下回る総てのサンプルについて、生存曲線（全生存期間および無再発生存期間の両方）を、対象とする共変量により階層化して表した。これらの曲線の間の統計的な差をHarrington and Fleming’s G-rho family [Harrington DP, Fleming TR. Biometrika 1982; 69:553-566]により検定した。
【０１４０】
生存期間に対する遺伝子発現の影響を評価して可能性のある交絡因子を制御するために、いくつかのＡＧモデル[Andersen PK, Gill RD. Annals of Statistics 1982; 10:1100-1120; Andersen PK. et al; Statistical Models based on Counting Processes. New York: Springer-Verlag, 1993]を当てはめた。総ての場合で、本発明者らは、偽陽性の存在をノンパラメトリックブーストラップ法[Efron B, Tibshirani R. An introduction to the Bootstrap. Nueva York, London: Chapman and Hall, 1993]により制御した。
【０１４１】
実施例１
ＩＩ期結腸直腸癌患者におけるＫＩＡＡ１４５６遺伝子アイソフォーム１の転写発現レベル
定量的ＰＣＲを行った後、β２−ミクログロブリン対照遺伝子のＣｔが２７．３未満であるサンプルを選択した（それより大きい値は不良なＲＮＡ品質を示すため）。最終的に、入手可能な９８のサンプルのうち８０が良質の内因性遺伝子増幅を示し、ＫＩＡＡ１４５６の転写レベルを調べるために分析するものとした（図１Ａ）。腫瘍レベルを、参照として用いる正常組織のプールと比較することにより、有意なサイレンシングが１７例で見られ（２１％、ＲＱ＜０．５）、また、３０のサンプルで対照正常組織に比べて有意な過剰発現があった（３８％、ＲＱ＞１，５）のに対し、残りの例（３３、すなわち４１％）では、正常組織と変わりがなかったことが検出された（図１Ｂ）。
【０１４２】
実施例２
腫瘍組織における臨床病理的パラメーターとＫＩＡＡ１４５６の発現レベルの間の相関
臨床サンプルにおける利用可能な臨床病理的パラメーターとＫＩＡＡ１４５６の発現レベルの間の相関を分析した後、神経周囲浸潤（ｐ＝０．００４）および腸閉塞症候群（ｐ＝０．００３）との統計学的に有意な相関が存在することが判明した（それぞれ図２Ａおよび２Ｂ）。
【０１４３】
神経周囲浸潤の存在は、まだ十分に検討されておらず、それらがそのような値を持つと確定できるに至っていない予後値を有する因子のカテゴリーに相当する。
【０１４４】
新生物性腸閉塞の予後値については様々な分析法があり、著者らはこの閉塞を、長期生存の低下を伴う良好な臨床予測因子であることを主張している[Ratto C. et al;  Diseases of the Colon and Rectum 1998;41:1033-1049]。本発明者らの患者系列において、本発明者らは、これらのデータを確認して、新生物性閉塞と不良な予後との間の統計的有意性を見出した（データは示されていない）。
【０１４５】
実施例３
ＩＩ期患者におけるＫＩＡＡ１４５６発現の予後値の分析
臨床サンプルにおけるＫＩＡＡ１４５６過剰発現の予後値の分析
ＫＩＡＡ１４５６過剰発現が患者の予後に適切であるかどうかを調べた（図３）。それはＲＱ値が１．５を超える場合に過剰発現として確定された（全生存期間の場合、感度１００％、特異性８１％、無病生存期間の場合、感度９５％、特異性６６％）。
【０１４６】
図３に示されるように、ＫＩＡＡ１４５６過剰発現と無再発生存期間として測定される患者の再発との間には、統計学的に有意な関係が見られる（ｐ＝０．０５）。
【０１４７】
臨床サンプルにおけるより大きなＫＩＡＡ１４５６過剰発現例の予後値の分析
ＩＩ期病態を有する特定の患者はより不良な予後を有することが知られている。これらは、以下の臨床リスク因子：Ｔ４疾患；腫瘍性閉塞または穿孔；低分化型（グレード３）腫瘍；リンパ節検索１２未満（ＡＳＣＯ推奨）；高い術前ＣＥＡレベル；血管、リンパ系および神経周囲浸潤；および米国病理学会(College of American Pathologists)の合意声明による切除断端陽性のうち少なくとも１つを有する患者である。これらの因子に関して、血管浸潤（図４ＡおよびＣ）または神経周囲浸潤（図ＢおよびＤ）が存在しない患者、すなわち、はるかに良好な予後を有する症例が、ＫＩＡＡ１４５６を過剰発現する場合に無再発生存期間に有意な短縮を示すことが判明し（図４）、標準的リスク因子が良好な予後を示す場合であっても、ＫＩＡＡ１４５６が不良な臨床転帰と相関していることを示唆した。
【０１４８】
従って、これらのデータは総て、ＫＩＡＡ１４５６遺伝子アイソフォーム１過剰発現がＩＩ期患者の不良な予後を示すことを実証し、この遺伝子がＩＩ期ＣＲＣにおける予後マーカーとして提案される。
【０１４９】
実施例４
ＩＩ期ＣＲＣ患者におけるＫＩＡＡ１４５６発現の予測値の検討
前節で得られた結果は、ＫＩＡＡ１４５６がこれらの患者において予後マーカーとして機能し得ることを示す。しかしながら、すでに示したように、この病期の患者に関してもっと関心があるのは、従来の補助化学療法の処置に対してより感受性の高い患者を選択し、その生存期間を改善する治療効果を得ることができる予測因子を同定することである。このタイプの奏功予測因子はまだ得られていないので、これらのＩＩ期結腸直腸癌患者における補助療法に関する一貫した選択基準はなく、化学療法を施す必要があるかないかは極めて疑問視されている(J. Clin. Oncol. 1999, 17:1356-1363 and Mamounas et al.; J. Clin. Oncol. 1999, 17:1349-1355)。術後に化学療法を行わない場合に比べて化学療法を行った場合に達成される生存期間の延長は良くて２〜４％であると推定される。
【０１５０】
本発明者らの患者系列では、処置を受けた患者および処置を受けなかった患者両方の再発および死亡に関する情報を得ることができるので、本発明者らは、化学療法による処置がこれらの患者の生存期間を改善することを確認しようとした。
【０１５１】
従って、以下の試験目的は、術後の補助化学療法を受けたかどうかによって患者を階層化すること、およびＫＩＡＡ１４５６発現に応じてこれらの患者の予後調査を行うことからなった。ＫＩＡＡ１４５６発現のカットオフ点は、ＫＩＡＡ１４５６のＲＱ値では有意な過剰発現、また、ＡＱ値では６９パーセンタイル（全生存期間）、６４パーセンタイル（無病生存期間）に応じて選択した。
【０１５２】
図５に示されるように、補助化学療法を受けていない患者の予後は、遺伝子の過剰発現を伴う患者では急激に悪化する（結腸癌からの生存についてはｐ＝０．０１、無再発生存についてはｐ＝０．０１２）（図５Ａおよび５Ｃ）。これらの違いは化学療法を受けた患者では見られず、予後は両場合ともはるかに良好である（図５Ｂおよび５Ｄ）。
【０１５３】
これらのデータは、ＫＩＡＡ１４５６のＡＱ値に関して６９パーセンタイル（全生存期間）および６４パーセンタイル（無病生存期間）というカットオフ点を用いた場合に確認されたものである（図６）。処置を受けていない患者は、ＫＩＡＡ１４５６の過剰発現時に、全生存期間（ｐ＝０．０３）と無病生存期間（ｐ＝０．０２５）の両方に有意な低下を示した。この場合にも、化学療法を施された患者では、これらの違いは見られない。
【０１５４】
性別、年齢、病理学的グレード、血管浸潤および神経周囲浸潤、閉塞／穿孔に関して調整した多変量解析は、有意な独立予後因子としてＫＩＡＡ１４５６発現を示した（無再発生存期間では、ＨＲ４．６８、ｐ＝０．０５９、全生存期間では、ＨＲ４．８、ｐ＝０．０７８）。
【０１５５】
これらの結果は、ＫＩＡＡ１４５６発現が、ＩＩ期ＣＲＣ患者における予測因子として使用可能であることを実証する。これまで再発（一般に２０〜３０％）を示す２０〜３０％という小パーセンテージのＩＩ期ＣＲＣ患者の同定が可能でなかったので、この知見は有用である。
【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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