(57)【要約】本発明は、少なくとも、１種類のグロビン、１種類のグロビンプロトマー、又は、環形動物の１種類の細胞外ヘモグロビンと、安定化溶液及び／又は臓器保存液と、を含む組成物の使用方法に関し、前記組成物は、脳死ドナーにより提供、あるいは、心臓死ドナーにより提供される臓器を保存するために、０℃から３７℃の間の温度を有するものである。本発明はまた、正常体温ＥＭＣＯ、あるいは、ダブルバルーンの三重管腔カテーテル技術、又は他の同様の技術を用いて、脳死ドナーにより提供、あるいは、心臓死ドナーにより提供される、臓器をin situで保存する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、１種類のグロビン、１種類のグロビンプロトマー、又は、環形動物の１種類の細胞外ヘモグロビンと、安定化溶液及び／又は臓器保存液と、を含む組成物の使用方法であり、上記組成物は、脳死ドナーにより提供、あるいは、心臓死ドナーにより提供される臓器を保存するために、０℃から３７℃の間の温度を有する、使用方法。
【請求項２】
上記環形動物の細胞外ヘモグロビンは、多毛環形動物の細胞外ヘモグロビンから、好ましくは、クロムシ科の細胞外ヘモグロビン及びゴカイ科の細胞外ヘモグロビンから、より好ましくは、タマシキゴカイの細胞外ヘモグロビン及びネイレス（Nereis）の細胞外ヘモグロビンから選択されることを特徴とする請求項１に記載の使用方法。
【請求項３】
上記安定化溶液は、塩、好ましくは、塩化物イオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、及びカリウムイオンを含む水溶液であり、かつ、本発明の上記組成物に６．５と７．６との間のｐＨを付与することを特徴とする請求項１又は２に記載の使用方法。
【請求項４】
上記安定化溶液は、ＮａＣｌを９０ｍＭ、グルコン酸Ｎａを２３ｍＭ、ＣａＣｌ２を２．５ｍＭ、酢酸Ｎａを２７ｍＭ、ＭｇＣｌ２を１．５ｍＭ，ＫＣｌを１２．５ｍＭ含む水溶液であり、かつ、ｐＨ７．１±０．５であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項５】
上記臓器保存液は、６．５から７．５の間のｐＨを有する水溶液であり、
（ａ）塩（好ましくは、塩化物イオン、硫酸イオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、及びカリウムイオン）、
（ｂ）糖類（好ましくは、マンニトール、ラフィノース、スクロース、グルコース、フルクトース、ラクトビオン酸、又はグルコン酸）、
（ｃ）抗酸化剤（好ましくは、グルタチオン）、
（ｄ）活性剤（好ましくは、キサンチンオキシダーゼ阻害剤、例えば、アロプリノール、乳酸塩、あるいは、ヒスチジン、グルタミン酸（又はグルタミン酸）、又はトリプトファン等のアミノ酸類、等）、及び、
（ｅ）任意に、コロイド（ヒドロキシエチルスターチ、ポリエチレングリコール、又はデキストラン等）、を含むことを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項６】
上記環形動物の細胞外ヘモグロビン、そのグロビンプロトマー、および／またはそのグロビンは、上記組成物の最終体積に対して、０．００１ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは、０．００５ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌの間、より好ましくは、１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、上記組成物は、２５０から３５０ｍＯｓｍ／Ｌの間、好ましくは、２７５から３１０ｍＯｓｍ／Ｌの間、より好ましくは、約３０２ｍＯｓｍ／Ｌの浸透圧を有することを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項７】
塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、グルコン酸ナトリウム、及び酢酸ナトリウムと、任意に１種類以上の抗酸化剤とを含む水溶液の使用方法であり、脳死ドナーにより提供、あるいは、心臓死ドナーにより提供される少なくとも１つの臓器をin situで保存するために、上記水溶液は、６．５から７．６の間の、好ましくは、７．１±０．５、好ましくは、約７．３５のｐＨを有することを特徴とする、水溶液の使用方法。
【請求項８】
上記水溶液を臓器保存液と組み合わせて使用することを特徴とする請求項７に記載の水溶液の使用方法。
【請求項９】
心臓死ドナーにより提供、又は、脳死ドナーにより提供される臓器をex situで保存する方法であって、
（ａ）請求項１から６のいずれか１項に記載の組成物、あるいは、請求項７及び８のいずれか１項に記載の水溶液を用いて、上記死亡ドナーを潅流するステップと、
（ｂ）移植のため上記臓器を摘出するステップと、次いで、
（ｃ）０℃から３７℃の間、好ましくは２℃から２５℃の間、より好ましくは約４℃の温度にて、上記臓器に応じた所定の時間、上記（ａ）のステップにて決定した組成物あるいは水溶液の中で、上記（ｂ）にて得られた上記臓器の静的又は動的潅流保存を行うステップと、を含む方法。
【請求項１０】
６．５と７．６との間のｐＨを有する組成物であり、
少なくとも、１種類のグロビン、１種類のグロビンプロトマー、又は、環形動物の１種類の細胞外ヘモグロビンと、
好ましくは、０から０．５ｍＭの間の量のカルシウムイオンと、
好ましくは、２０から１００ｍＭの間の量のＫＯＨと、
好ましくは、２０から１２５ｍＭの間の量のＮａＯＨと、
好ましくは、２０から２５ｍＭの間の量のＫＨ２ＰＯ４と、
好ましくは、３から５ｍＭの間の量のＭｇＣｌ２と、
好ましくは、５から２００ｍＭの間の量の、ラフィノース及びグルコースからから選択される少なくとも１種類の糖類と、
好ましくは、３から５ｍＭの間の量のアデノシンと、
好ましくは、２から４ｍＭの間の量のグルタチオンと、
好ましくは、０から１ｍＭの間の量のアロプリノールと、
好ましくは、１から５０ｇ／Ｌの間の量の、ヒドロキシエチルデンプン、種々の分子量のポリエチレングリコール、及びヒト血清アルブミン、から選択される少なくとも１種類の化合物と、を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、少なくとも、１種類のグロビン、１種類のグロビンプロトマー、又は、環形動物の１種類の細胞外ヘモグロビン、安定化溶液、及び／又は、臓器保存液、を含む組成物の使用方法に関し、前記組成物は、脳死ドナーにより提供、あるいは、心臓死ドナーにより提供される少なくとも１つの臓器をin situで保存するために、０℃から３７℃の間の温度を有する。
【０００２】
臓器提供とは、臓器が深刻に損傷したレシピエント（臓器披提供者）と呼ばれる患者の治療を目的として、ドナー（臓器提供者）と呼ばれる人間の体から臓器を摘出することである。
【０００３】
この提供の難しさの一つとして、臓器の保存時間という問題が残されている。実際、正常体温（３７℃）での、ドナーからの摘出前後には、臓器は、温虚血期間、すなわち、すでに臓器がドナーの血液に灌流されていないものの、未だ冷蔵されていない期間を経る。臓器は急速に悪化し、もはや酸素が供給されない。移植臓器を低体温（すなわち、約４℃）で保存する際、移植臓器のその後の機能回復を確保できる許容時間は、臓器毎に様々である。例えば、心臓あるいは肺では約４から６時間、肝臓では８から１２時間、腎臓では２４から４８時間、及び、膵臓あるいは腸では８から１０時間である。従って、移植は、臓器の機能維持を確保するために、明確に定義された期間内に実行されなければならない。
【０００４】
さらに、低体温法は、保存のために不可欠な要素である。移植臓器は摘出されるとすぐに、冷却され、３７℃から４℃に急激に温度を下げられる。このため、臓器は血管を経由して保存液で洗浄された後、簡単に、確保された無菌条件下に基づき砕いた氷により低温を保ったこの保存液に浸される。組織の温度低下は、細胞代謝の低下、すなわち、停止しないものの、細胞の生存に必要な触媒酵素の機能が減速するのを招く(Belzer F.O., Southard J.H. Principles of solid-organ preservation by cold storage. Transplantation 1988; 45(4): 673-676)。４℃にされた移植臓器は、代謝が約８５％低下する。低体温法は、このように、血液循環の停止により誘発される酸素欠乏や栄養飢餓の有害な影響を抑え、組織の壊死の原因となる細胞死を遅らせることができる。
【０００５】
臓器提供の不足に直面して、より長期間に亘る、移植臓器の保存及びそれへの酸素投与は、極めて重要な関心事項である。これにより、臓器の品質を維持でき、臓器の存続を長期化でき、そして、それゆえ、移植を成功させることができる。実際には、４℃で保存された移植臓器は代謝が減少するにもかかわらず、それは、全ての好気性組織のように、未だ酸素を必要とする。
【０００６】
加えて、パーフルオロカーボン（ＰＦＣｓ）、ＨＢＯＣｓ、又はヒト血液等の、今日利用可能な代用血液の大部分は、臓器に酸素供給することができるが、任意の温度で使用することができない。特に、それらは４℃では機能又は安定しない。さらに、ＰＦＣｓは、酸素輸送能を備えていないが、酸素分圧に応じて多量の酸素を溶解することができる。よって、それらは、単純に使用することはできず、酸素供給ストレスの問題を引き起こす可能性がある。
【０００７】
驚くべきことに、本発明者らは、特定の組成物の、つまり、０℃から３７℃の間の温度を有する組成物の、心臓死ドナーにより提供、又は脳死ドナーにより提供される臓器への投与、好ましくは、体内注射による投与によって、最適な条件の下で、上記ドナーの臓器を保護し、かつ、その臓器に酸素供給でき、そのため、その臓器が上記ドナーから摘出される前に、その機能を維持できる、ということを発見した。具体的な組成物は、環形動物の細胞外ヘモグロビンと、安定化溶液及び／又は臓器保存液とを含む。上記組成物のin situでの投与により、臓器が摘出される前に、臓器の機能を最適な条件で維持することが可能になり、かつ、０から３７℃の間のいずれかの温度、好ましくは正常体温にて、上記臓器を冷却、又は、上記臓器を保持することが可能になる。本発明に係る組成物は、酸素輸送能を備えており、また、ドナーの臓器にin situで効率的に酸素供給し、その品質を保証することが可能である。最後に、本発明に係る組成物は、４℃及び３７℃の両方で安定して機能する。
【０００８】
本発明の主題は、従って、少なくとも、１種類のグロビン、１種類のグロビンプロトマー、環形動物の１種類の細胞外ヘモグロビンと、安定化溶液及び／又は臓器保存液とを含む組成物の使用であり、脳死ドナーにより提供、あるいは、心臓死ドナーにより提供される臓器を保存するために、上記組成物は、０℃から３７℃の間の温度を有する。臓器の保存は、従って、死亡直後のドナーにin situで行われる。本発明に係る組成物は、様々な移植臓器（心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、小腸、角膜等）の摘出を待つドナーに直接灌流することができる。
【０００９】
本発明の主題はまた、少なくとも、１種類のグロビン、１種類のグロビンプロトマー、又は環形動物の１種類の細胞外ヘモグロビンと、安定化溶液及び／又は臓器保存液とを含む組成物の使用方法であり、上記組成物は、０℃から３７℃の間の温度を有し、脳死ドナーにより提供、あるいは、心臓死ドナーにより提供される臓器の保存のための医薬組成物を提供する。本発明の主題はまた、１種類のグロビン、１種類のグロビンプロトマー、又は、環形動物の１種類の細胞外ヘモグロビンと、安定化溶液及び／又は臓器保存液と、を含む組成物であり、上記組成物は、０℃から３７℃の間の温度を有し、脳死ドナーにより提供、あるいは、心臓死ドナーにより提供される臓器の保存にそれが使用される。
【００１０】
本発明の主題はまた、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、グルコン酸ナトリウム、及び酢酸ナトリウムと、任意に１種以上の抗酸化剤とを含む水溶液の使用方法であり、上記水溶液は、心臓死ドナーにより提供、又は脳死ドナーによる提供される少なくとも１つの臓器をin situで保存するために、６．５から７．６の間、好ましくは、７．１±０．５、好ましくは、約７．３５のｐＨを有する。この水溶液は、臓器保存液と組み合わせることができ、すなわち、それは、臓器保存液と混合することができるということである。好ましくは、ＮａＣｌを９０ｍＭ、グルコン酸Ｎａを２３ｍＭ、ＣａＣｌ２を２．５ｍＭ、酢酸Ｎａを２７ｍＭ、ＭｇＣｌ２を１．５ｍＭ，ＫＣｌを１２．５ｍＭ含み、ｐＨ７．１±０．５であり、かつ、任意に、０から１００ｍＭの、アスコルビン酸及び／又は還元型グルタチオン型の、抗酸化剤を含む。上記溶液は、好ましくは、浸透圧が、３００から３５０の間、特に好ましくは、３０２ｍＯｓｍｏｌ／Ｌである。
【００１１】
本発明によれば、臓器保存は、ドナーの死後直ぐに実行される。死亡ドナーは、脳死の状態又は心停止の状態である。後者の場合、基準は、心臓鼓動が無い場合の臓器摘出に対して形成される。
【００１２】
脳死はまた、不可逆的な昏睡又は第４期昏睡として知られており、血液循環が持続されているにもかかわらず、脳活動の完全かつ決定的に不可逆の停止として定義されている。ドナーは、血流の活動や臓器の血管新生が一時的に持続しているにもかかわらず、脳が不可逆的に破壊されると、脳死、又は脳の死の状態になる。
【００１３】
ドナーが心停止とされるのは、蘇生措置の中止後、その心停止が不可逆である場合である。蘇生措置の中止後に心停止が不可逆であるとみなされるまでの時間は、約１分である。しかし、勧告は５分以上の期間を必要とする。
【００１４】
本発明に係る組成物は、
少なくとも、１種類のグロビン、１種類のグロビンプロトマー、又は、環形動物の１種類の細胞外ヘモグロビンと、
安定化溶液及び／又は臓器保存液と、を含む。
本発明に係る組成物は、従って、（ａ）少なくとも、１種類のグロビン、１種類のグロビンプロトマー、又は、環形動物の１種類の細胞外ヘモグロビンと、安定化溶液とを含むもの、あるいは、（ｂ）少なくとも、１種類のグロビン、１種類のグロビンプロトマー、又は、環形動物の１種類の細胞外ヘモグロビと、臓器保存液とを含むもの、あるいは、（ｃ）少なくとも、１種類のグロビン、１種類のグロビンプロトマー、又は、環形動物の１種類の細胞外ヘモグロビンと、安定化溶液及び臓器保存液とを含むもの、のいずれかである。
【００１５】
本発明に係る組成物は、従って、環形動物の細胞外ヘモグロビン、そのグロビンプロトマー、及びそのグロビンから選択される少なくとも１つの化合物を含む。
【００１６】
環形動物の細胞外ヘモグロビンは、多毛類、貧毛類、及びachaetesの環形動物の３つのクラスに存在する。細胞外ヘモグロビンが天然に細胞内に含まれていないため、基準が細胞外ヘモグロビンに対して作られ、従って、それらを化学修飾によって安定化及び機能し得るようにしなくても、循環系を自由に循環できる。
【００１７】
環形動物の細胞外ヘモグロビンは、２０００から４０００ｋＤａの間の分子量を有する巨大な生体高分子であり、４から１２の異なる種類の約２００のポリペプチド鎖からなる。このポリペプチド鎖は、一般に２つのカテゴリに分類される。
【００１８】
第１のカテゴリには、１４４から１９２の構成要素を含み、活性部位を持ち酸素と可逆的に結合可能な、いわゆる「機能性」ポリペプチド鎖が属する。これらはグロビン型の鎖で、その質量は１５から１８ｋＤａであり、脊椎動物のαおよびβ型鎖に非常によく似ている。
第２のカテゴリには、３６から４２の構成要素を含み、ほとんど、あるいは全く活性部位を持たないが、１／１２サブユニットと呼ばれるサブユニット又はプロトマーの集合を可能にする、いわゆる「構造」又は「リンカー」ポリペプチド鎖が属する。 
各ヘモグロビン分子は、六角形状二重層と呼ばれる重ねられた２つの六角形から構成される。そして、各六角形は、６つのサブユニット（又は、「１／１２サブユニット」、又は、「プロトマー」）の集合によって、それ自身が、水滴形状を形成する。天然の分子は、１２個のこれらサブユニット（１２量体又はプロトマー）から形成される。各サブユニットは、分子量が２００〜２５０ｋＤａであり、天然の分子の機能ユニットを構成する。
【００１９】
好ましくは、上記環形動物の細胞外ヘモグロビンは、多毛環形動物の細胞外ヘモグロビンから、好ましくは、クロムシ科の細胞外ヘモグロビン及びゴカイ科の細胞外ヘモグロビンから選択される。さらに好ましくは、上記環形動物の細胞外ヘモグロビンは、タマシキゴカイ（Arenicola marina）の細胞外ヘモグロビン及びネイレス（Nereis）の細胞外ヘモグロビンから選択され、より好ましくは タマシキゴカイの細胞外ヘモグロビンである。
【００２０】
本発明によれば、上記組成物はまた、環形動物の細胞外ヘモグロビンの少なくとも１種類のグロビンプロトマーを含んでいてもよい。当該プロトマーは、上述のように、ネイティブヘモグロビンの機能単位を構成している。
最後に、上記組成物はまた、環形動物の細胞外ヘモグロビンの少なくとも１種類のグロビン鎖を含んでいてもよい。このようなグロビン鎖は、特に、環形動物の細胞外ヘモグロビンのＡｘ又はＢｘ型グロビン鎖から選択することができる。
【００２１】
環形動物の細胞外ヘモグロビン及びそのグロビンプロトマーは、その固有のスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性を有し、その結果、機能するのに抗酸化物質を必要としない。これは、赤血球内に抗酸化分子が含まれ、それらがヘモグロビンと結合していない哺乳類のヘモグロビンを使用する場合とは対照的である。さらに、環形動物の細胞外ヘモグロビン、そのグロビンプロトマー、及び／又はそのグロビンは、哺乳類のヘモグロビン、特にヒトヘモグロビンとは逆に、機能するために補因子を必要としない。最後に、環形動物の細胞外ヘモグロビン、そのグロビンプロトマー、及び／又はそのグロビンは、血液型を持っておらず、そのため、免疫反応のあらゆる問題を回避することが可能になる。
【００２２】
本発明係る組成物はまた、その組成が臓器保存液と適合する安定化溶液を含んでいてもよい。この安定化溶液は、ヘモグロビン、そのプロトマー、及びそのグロビンに適した生理食塩水環境を形成し、そして、四次構造、及び、それにより、この分子の機能性が維持されるのを可能にする。上記安定化溶液によって、ヘモグロビン、そのプロトマー、及びそのグロビンは、自身の臓器への酸素投与機能を機能させることができる。
【００２３】
本発明に係る安定化溶液は、塩、好ましくは、塩化物イオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、及びカリウムイオンイオンを含む水溶液であり、本発明に係る組成物に、６．５から７．６の間のｐＨを付与する。その機能は、生理学的に注射可能な液体の機能と同様であり、かつ、それは、保存液として単独で、又は、ヘモグロビンと組み合わせて、又は市販の臓器保存液と組み合わせて使用することができる。これらの条件下で、環形動物の細胞外ヘモグロビン、そのグロビンプロトマー、及びそのグロビンは、機能を維持し、本発明に係る組成物は、０℃から３７℃にてドナーに投与され、保存されて酸化する臓器と適合する。
本明細書において、ｐＨは、特に断らない限り、周囲温度（２５℃）のものであると理解される。
【００２４】
好ましくは、上記安定化溶液は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、そしてまた、グルコン酸ナトリウム及び酢酸ナトリウムを含む水溶液であり、かつ、ｐＨが、６．５と７．６との間、好ましくは、７．１±０．５、好ましくは約７．３５である。より好ましくは、上記安定化溶液は、ＮａＣｌを９０ｍＭ、グルコン酸Ｎａを２３ｍＭ、ＣａＣｌ２を２．５ｍＭ、酢酸Ｎａを２７ｍＭ、ＭｇＣｌ２を１．５ｍＭ，ＫＣｌを１２．５ｍＭ含む水溶液であり、かつ、ｐＨ７．１±０．５であり、かつ、０から１００ｍＭの間の、アスコルビン酸及び／又は還元型グルタチオン型の、抗酸化剤を含有することができる。上記溶液は、好ましくは、浸透圧が、３００から３５０の間、好ましくは、３０２ｍＯｓｍｏｌ／Ｌである。
【００２５】
最後に、本発明に係る組成物は、臓器保存液を含んでいてもよい。この溶液により、移植臓器を構成する細胞の基礎代謝を維持することができる。これは、３つの目的を達成する。すなわち、移植臓器から動脈血を洗浄する、移植臓器が均一に所望の保存温度になるようにする、そして、虚血及び再灌流によるダメージを防ぎ、保護して、機能の再開を最適化する、という目的を達成する。臓器保存液は、それゆえ、臨床的条件を充たす。
【００２６】
臓器保存液は、６．５と７．５との間のｐＨを有する水溶液であり、塩（好ましくは、塩化物イオン、硫酸イオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、及びカリウムイオン）、糖類（好ましくは、マンニトール、ラフィノース、スクロース、グルコース、フルクトース、ラクトビオン酸（非透過性であるもの）、またはグルコン酸）、抗酸化剤（好ましくは、グルタチオン）、活性剤（好ましくは、キサンチンオキシダーゼ阻害剤、例えば、アロプリノール、乳酸塩、ヒスチジン、グルタミン酸（又はグルタメート）、又はトリプトファン等のアミノ酸類、等）、及び、任意のコロイド（ヒドロキシエチルデンプン、ポリエチレングリコール、又はデキストラン等）、を含む。
【００２７】
本発明の好ましい一実施形態によれば、臓器保存液は、以下から選択される。
【００２８】
・ウィスコンシン大学（ＵＷまたはViaspan（登録商標））の溶液。これは、浸透圧（オスモス濃度）が３２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、及び、ｐＨ７．４であり、１リットルの水に対して以下の配合を有する。
カリウムラクトビオン：１００ｍＭ
ＫＯＨ：１００ｍＭ
ＮａＯＨ：２７ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４：２５ｍＭ
ＭｇＳＯ４：５ｍＭ
ラフィノース：３０ｍＭ
アデノシン：５ｍＭ
グルタチオン：３ｍＭ
アロプリノール：１ｍＭ
ヒドロキシエチルデンプン：５０ｇ／Ｌ、
・IGL-1（登録商標）。これは、浸透圧が３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、及び、ｐＨ７．４であり、１リットルの水に対して以下の配合を有する。
ＮａＣｌ：１２５ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４：２５ｍＭ 
ＭｇＳＯ４：５ ｍＭ
ラフィノース：３０ｍＭ
カリウムラクトビオン：１００ｍＭ
グルタチオン：３ｍＭ
アロプリノール：１ｍＭ
アデノシン：５ｍＭ
ポリエチレングリコール（分子量３５ｋＤａ）：１ｇ／Ｌ
・Celsior（登録商標）。これは、浸透圧が３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、及び、ｐＨ７．３であり、１リットルの水に対して以下の配合を有する。
グルタチオン：３ｍＭ
マンニトール：６０ｍＭ
ラクトビオン酸：８０ｍＭ
グルタミン酸：２０ｍＭ
ＮａＯＨ：１００ｍＭ
塩化カルシウム二水和物：０．２５ｍＭ
ＭｇＳＯ４：１．２ｍＭ
ＫＣｌ：１５ｍＭ
塩化マグネシウム六水和物：１３ｍＭ
ヒスチジン：３０ｍＭ
・Macopharma の、SCOT 15 Multi Organes Abdominaux（登録商標）、及び、SCOT 30 Greffons Vasculaires（登録商標）。両方とも、特定の高分子量（２０ｋＤａ）のポリエチレングリコールを有する。
【００２９】
・BMPS Belzer（登録商標）、又はBelzer機灌流液、又はKPS1。特に、１００ｍＥｇ／Ｌのナトリウム、２５ｍＥｇ／Ｌのカリウムを含み、周囲温度でｐＨ７．４、及び浸透圧３００ｍＯｓｍ／Ｌを有する。
【００３０】
・Custodiol（登録商標）HTK溶液。これは、１リットルの水に対して以下の配合を有し、周囲温度でｐＨ７．２０、及び、浸透圧が３１０ｍＯｓｍ／ｋｇである。
ＮａＣｌ：１８．０ｍＭ
ＫＣｌ：１５．０ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４：９ｍＭ
２−ケトグルタル酸カリウム水素化：１．０ｍＭ
塩化マグネシウム六水和物：４．０ｍＭ
ヒスチジン．ＨＣＩ．Ｈ２Ｏ：１８．０ｍＭ
ヒスチジン：１９８．０ｍＭ
トリプトファン：２．０ｍＭ
マンニトール：３０．０ｍＭ
塩化カルシウム二水和物：０．０１５ｍＭ
・Euro-Collins（登録商標）。これは、浸透圧が３５５ｍＯｓｍ／ｋｇ、及び、ｐＨ７．０であり、１リットルの水に対して以下の配合を有する。
ナトリウム：１０ｍＭ
カリウム：１１５ｍＭ
塩化物：１５ｍＭ
Ｈ２ＰＯ４−：１５ｍＭ
ＨＰＯ４２−：４２．５ｍＭ
ＨＣＯ３−：１０ｍＭ
グルコース：１９４ｍＭ
・Soltran（登録商標）これは、浸透圧が４８６ｍＯｓｍ／ｋｇ、及び、ｐＨ７．１であり、１リットルの水に対して以下の配合を有する。
ナトリウム：８４ｍＭ
カリウム：８０ｍＭ
マグネシウム：４１ｍＭ
硫酸：４１ｍＭ
マンニトール：３３．８ｇ／Ｌ
クエン酸：５４ｍＭ
グルコース：１９４ｍＭ
・Perfadex（登録商標）。これは、浸透圧が２９５ｍＯｓｍｏｌ／Ｌであり、水に以下の配合を有する。
デキストラン４０（分子量： ４０，０００）：５０ｇ／Ｌ
Ｎａ＋：１３８ｍＭ
Ｋ＋：６ｍＭ
Ｍｇ２＋：０．８ｍＭ
Ｃｌ−：１４２ｍＭ
ＳＯ４２−：０．８ｍＭ
（Ｈ２ＰＯ４−＋ＨＰＯ４２−）：０．８ｍＭ、及び
グルコース：ｍＭ
・Ringer lactate（登録商標）。これは、水に以下の配合を有し、周囲温度でｐＨ６．０から７．５の間であり、及び、浸透圧が２７６．８ｍＯｓｍｏｌ／Ｌである。
Ｎａ＋：１３０ｍＭ
Ｋ＋：５．４ｍＭ
Ｃａ２＋：１．８ｍＭ
Ｃｌ−：１１１ｍＭ
乳酸：２７．７ｍＭ
・Plegisol（登録商標）。これは、水に以下の配合を有する。
ＫＣｌ：１．１９３ｇ／Ｌ
ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ： ３．２５３ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ： ６．４３ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２：０．１７６ｇ／Ｌ
・Edouard Henriot病院の溶液。これは、水に以下の配合を有し、周囲温度で７．４に等しいｐＨであり、浸透圧が３２０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌである。
ＫＯＨ：２５ｍＭ
ＮａＯＨ：１２５ｍＭ,
ＫＨ２ＰＯ４：２５ｍＭ, 
ＭｇＣｌ２：５ｍＭ
ＭｇＳＯ４：５ｍＭ
ラフィノース：３０ｍＭ
ラクトビオン：１００ｍＭ
グルタチオン：３ｍＭ
アロプリノール：１ｍＭ
アデノシン：５ｍＭ
ヒドロキシエチルデンプン：５０ｇ／Ｌ
・Steen（登録商標）溶液。これは、低カリウム濃度のヒト血清アルブミン、デキストラン、及び、細胞外電解質を含む。
【００３１】
これらのすべての臓器保存液は、市販の製品である。
【００３２】
好ましくは、本発明に係る組成物は、（ｉ）安定化溶液と（ｉｉ）臓器保存液とを含み、（ｉｉ）は、好ましくは、上述した市販の溶液の１つであり、（ｉ）：（ｉｉ）の重量比は、０：１００と１００：０との間である。
【００３３】
好ましくは、本発明に係る組成物は ６．５と７．６との間のｐＨを有し、かつ、
少なくとも、１種類のグロビン、１種類のグロビンプロトマー、又は、環形動物の１種類の細胞外ヘモグロビンと、
好ましくは、０から０．５ｍＭの間の量のカルシウムイオンと、
好ましくは、２０から１００ｍＭの間の量のＫＯＨと、
好ましくは、２０から１２５ｍＭの間の量のＮａＯＨと、
好ましくは、２０から２５ｍＭの間の量のＫＨ２ＰＯ４と、
好ましくは、３から５ｍＭの間の量のＭｇＣｌ２と、
好ましくは、５から２００ｍＭの間の量の、ラフィノース及びグルコースからから選択される少なくとも１種類の糖類と、
好ましくは、３から５ｍＭの間の量のアデノシンと、
好ましくは、２から４ｍＭの間の量のグルタチオンと、
好ましくは、０から１ｍＭの間の量のアロプリノールと、
好ましくは、１から５０ｇ／Ｌの間の量の、ヒドロキシエチルデンプン、種々の分子量のポリエチレングリコール、及びヒト血清アルブミン、から選択される少なくとも１種類の化合物と、を含む。
【００３４】
通常、上記環形動物の細胞外ヘモグロビン、そのグロビンプロトマー、および／またはそのグロビンは、上記組成物の最終体積に対して、０．００１ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは、０．００５ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌの間、より好ましくは、１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌの間、特に、１ｍｇ／ｍｌの濃度である。
【００３５】
通常、本発明に係る組成物は、２５０から３５０ｍＯｓｍ／Ｌの間、好ましくは２７５から３１０ｍＯｓｍ／Ｌの間、好ましくは約３０２ｍＯｓｍ／Ｌの浸透圧を有する。
【００３６】
好ましくは、本発明に係る組成物は、（ｉ）環形動物の細胞外ヘモグロビン、そのグロビンプロトマー、及びそのグロビン、（ｉｉ）臓器保存液、及び（ｉｉｉ）安定化溶液を含み、ヘモグロビン量は０ｇ／Ｌから１５０ｇ／Ｌの間のであり、上記臓器保存液は、１００％に対して８×１０−３の体積比で希釈される。
【００３７】
好ましい一実施形態によれば、本発明に係る組成物の温度は、０℃か３７℃、好ましくは、２℃から３２℃、好ましくは、４℃から２５℃、より好ましくは、約４℃である。
本発明に係る組成物は、低体温条件下及び正常体温条件下（生理的温度に近い）の両方において機能可能である。
【００３８】
本発明の主題はまた、心臓死ドナーにより提供、又は、脳死ドナーにより提供される臓器をex situで保存する方法であって、以下のステップを含む方法である。
（ａ）上記死亡ドナーを、組成物を用いて灌流するステップ。当該組成物は、少なくとも、１種類のグロビン、１種類のグロビンプロトマー、又は、環形動物の１種類の細胞外ヘモグロビンと、安定化溶液及び／又は臓器保存液と、を含み、脳死ドナーにより提供、あるいは、心臓死ドナーにより提供される臓器を保存するために、０℃から３７℃の間、好ましくは２℃から５℃の間、より好ましくは、４℃の温度を有する。または、上記死亡ドナーを、水溶液を用いて灌流するステップ。当該水溶液は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、グルコン酸ナトリウム、及び酢酸ナトリウムと、任意に１種類以上の抗酸化剤とを含み、６．５から７．６の間の、好ましくは、７．１±０．５、好ましくは、約７．３５のｐＨを有する。その後、
（ｂ）移植のため上記臓器を摘出するステップ。次いで、
（ｃ）０℃から３７℃の間、好ましくは２℃から２５℃の間、より好ましくは約４℃の温度にて、上記臓器に応じた所定の時間、上記（ａ）のステップにて決定した組成物あるいは水溶液の中で、上記（ｂ）にて得られた上記臓器の静的又は動的潅流保存を行うステップ。
ここで、「上記臓器に応じた所定の時間」とは、上記のように移植される臓器に依存する固有の保存時間を意味する。
【００３９】
本発明に係る組成物は、好ましくは、注射によって、特に、血管注射によって投与される。また、正常体温体外式膜型人工肺（正常体温ＥＣＭＯ）により、すなわち、動脈カテーテル、静脈カテーテル、及びFogartyカテーテルを用いて、投与することができ、又は、ドナーの一般的な冷却のために、低体温体外式膜型人工肺（低体温ＥＣＭＯ）により投与することができる。また、ダブルバルーンの三重管腔カテーテル、又は他の同様の技術を用いて投与することができる。
正常体温ＥＣＭＯシステム又は低体温ＥＣＭＯシステムは、血液流体の体外循環のための技術である。
ダブルバルーンの三重管腔カテーテルは、部分的に、腹部臓器のin situでの冷却ために利用可能である。特に、それが大腿動脈回路に注入されると、腎循環を単離することが可能になる。本発明に係る組成物の迅速な灌流は、ダブルバルーン三重管腔カテーテルを介して行うことができる。排出経路が大腿静脈に注入されると、灌流された液状組成物の排出が可能になる。
【００４０】
次に本発明を、以下の実施例によって説明するが、本発明は以下に限定されるものではない。
【００４１】
〔実施例１〕
＜材料及び方法＞
《保存液中のM101の製造と使用》
M101（HEMO2life（登録商標）、Hemarina SA、フランス）は、タマシキゴカイヘモグロビンの緩衝液であり、保健当局の仕様に合わせて生物学的生成物の抽出の標準的な手順を用いて作製した。精製されたタンパク質は、−８０℃で凍結させ、その後、実験の前に４℃で解凍し、次の保存液で希釈した。保存液は、UW（ViaSpan（登録商標）、Bristol Myers Squibb、ベルギー）、HTK（Custodiol（登録商標）、ドイツ）、IGL（IGL-1（登録商標）、Georges Lopez、フランス）、Celsior（Celsior（登録商標）、Genzyme、フランス）、Ringer Lactate（RL、Aguettant、フランス）、又はPerfadex（Perfadex（登録商標）、Vitrolife、スウェーデン）である。
【００４２】
《M101の機能解析》
（酸素固定）
まず、M101を、UW溶液に添加した（１ｇ／Ｌ）。上記溶液から酸素を除くためにＮ２ガスを使用した。もう一つは、上記溶液にLLC- PK1細胞を加えた。そして、このように準備した２つを密閉シールした。M101の機能は、分光測光法（参考文献[35]参照）によりモニターし、これにより、オキシヘモグロビン及びデオキシヘモグロビンの特徴付けが可能となる。吸光スペクトルは、３９０−６５０ｎｍの範囲にわたって記録された（UVmc2、Safas、モナコ）。溶存Ｏ２（ｄＯ２）は、Ｏ２センサー（Metler、Toledo、フランス）を使用して確認した。
【００４３】
（SOD活性）
M101のSOD活性を、OberleyとSpitzにより修正されたニトロブルーテトラゾリウム（NBT）アッセイ（参考文献[36]参照）により評価した。簡単に言うと、スーパーオキシドは、カタラーゼ及びDETAPACの存在下で、キサンチン及びキサンチンオキシダーゼにより生成された。NBTの減少が、560nmの分光測光により検出された。Cu/Zn-SOD複合体を不活性化するために、実験開始前にKCNを１時間４℃で添加した。ウシ赤血球に由来するCu/Zn-SOD複合体を、コントロール（Calbiochem）として用いた。吸光度の減少は、捕捉活性の増加を示す。スーパーオキシドアニオン産生の阻害率は、以下の式、［(A0-A1) / A0x100］を用いて、算出した。ここで、A0は、コントロールの吸光度であり、A1は、試料の吸光度である。
【００４４】
《M101の構造解析》
M101を溶液に加え（１ｇ／Ｌ）、その構造を、HPLCシステム（Dionex、フランス）及び１ｃｍ×３０ｃｍのSuperose 6Cカラム（フラクションレンジ５−５０００ｋＤａ、GE Healthcare、フランス）を使用して、４℃にて固定した自動サンプラ―を用いた、定組成ゲル濾過により経時的にモニターした。流速は、０．５ｍｌ／分であり、溶出液は、２５０−７００ｎｍのレンジを超えてフォトダイオード検出器でモニターされた。溶出曲線を得て、Chromeleon（登録商標）ソフトウェア（Dionex）を使用して処理した。
解離曲線が、時間0（At0）でのM101ピークの面積を用いた時刻t（At）でのM101ピークの面積の正規化によって得られ、そして、時間の関数としてプロットした。Prism GraphPadソフトウェア（GraphPadソフトウェア、USA）を、線形プロファイル（f(At/At0) =- kd.t、 T 1/2= 1 / (2.kd)）における曲線、又は、単一指数プロファイル（f(At/At0) = a.exp [-kd.t]）における曲線を調整するために使用した。受容性を、ベストの相関係数を用いて判定した。解離定数（kd）及び半減期（T 1/2）を、ベストの調整曲線（線形の又は単一指数の）、から推定した。
【００４５】
《４℃での細胞の実験》
LLC-PK1ブタ近位尿細管細胞（CL-101、ATCC, LGC規格、フランス）を、参考文献[37]に記載されているように、培養した。冷虚血性病変は、任意の方法でM101を補充した保存液（UW、HTK、IGL、Celsior、RL、又はPerfadex）中で、大気雰囲気下で、4℃で、単層の細胞を保存することにより、シミュレートした。
アッセイは以下の通りである。
・壊死：乳酸脱水素酵素（LDH）の放出を、in vitroでの毒性アッセイキットを使用してテストした。
・アポトーシス：カスパーゼ３活性を、蛍光カスパーゼ３アッセイキット（R & D Systems、フランス）を用いて測定した。
・生存率：代謝活性を、MTTテストを用いて測定した。
・エネルギー含量：細胞内ATPを、アデノシン5'三リン酸（ATP）生物発光用テストキットを用いて測定した。キットは、製造業者のガイドラインに従って使用した。反応は、マルチラベルリーダー（Victor 3、Perkin-Elmer、フランス）を用いて定量した。
各パラメータでは、結果は、病変（コントロール）の前に細胞にて測定された値に対する、冷却保存された細胞において測定された値の百分率として表される。
【００４６】
《in vivoでの外科手術手順及び実験グループ》
ラージホワイトタイプのオスのブタ（INRA/GEPA、Surgeres、フランス）を、人間と動物の研究のための生命倫理委員会のフランスの勧告に従って参考文献[4]の記載に基づき用意した。右腎を摘出し、冷虚血性病変を注入し移植前２４時間維持した。この時間は、United Network for Organ Sharing for renal allograftsによって収集された冷虚血時間よりわずかに長いため（１９．６±８．４ｈ、２０００年、参考文献[43]参照）、選択された。左腎は、移植状況における腎臓の質量を模倣するために、摘出した。外科チームは、プロトコルが使用されていることを知らなかった。血管吻合の時間は３０±５分であり、失血は最小限であり、術後合併症は全く認められなかった。以下の４つのグループを観察した。
（１）UW：UWを用いた臓器保存
（２）UW＋M101：UWにM101を５ｇ／Ｌ補充したもの
（３）HTK：HTK
（４）HTK＋M101：HTKにM101を５ｇ／Ｌ補充したもの
コントロールとして、疑似手術を行った動物を用いた。
【００４７】
《機能パラメータ》
ブタは、利尿（ｍｌ／２４ｈ）の、血中クレアチン濃度（ｍｏｌ／Ｌ）の、排泄ナトリウム画分（％）の、及びタンパク（ｇ／２４ｈ）の測定のために、代謝ケージに入れた（参考文献[3-5]参照）。
【００４８】
《形態学的観察》
生検は、再灌流後の７日目、１４日目、及び１ヶ月に行った。ボーダー損失（Border loss）と管腔内剥離とを、６点の半定量的スケールを使用して評価した。０は、異常なし、１は、腎臓サンプルの２５％未満に影響するわずかな病変がある、２は、病変は腎臓サンプルの２５−５０％に影響を与える病変がある、３は、腎臓サンプルの５１−７５％に影響を与える病変がある、４は、７５％より多くの腎臓サンプルに影響を与える病変がある、５は、広範な壊死病変及び腎病変がある、ことを示す（参考文献[38]参照）。
間質浸潤の定量には、Banffの分類を適用した（参考文献[39]参照）。０は、細管に、炎症単核細胞が無い、１は、細管断面積あたり、あるいは、１０細管細胞あたり、１から４の単核細胞の病巣がある、２は、細管断面積あたり５から１０の病巣がある、及び、３は、細管断面積あたり１０以上の単核細胞の病巣がある、を示す。尿細管間質性線維症を、Picrosirius染色（参考文献[40]参照）を用いて測定した。
免疫組織化学を、 ED1+細胞及びCD3+細胞（SouthernBiotech、USA）の浸潤を測定するために使用した。定量的評価を、５−１０の高電圧フィールド（200X）にて実行した。
【００４９】
《統計学的方法》
平均±SEM又はSDを示す。in vitroのデータは、Dunnettテストを用いて比較した。２つのグループ間の比較には、インビボでのデータに対して、Mann-Whitney Uテストを用いた（UW＋M101と比較したUWと、HTK＋M101と比較したHTKとの比較を実行した）。Spearmanテストを用いて相関を測定し、及びANOVAテストを用いて、テストに使用された溶液におけるM101の効果の依存性を測定した。SPSSソフトウェア（IBM、USA）、及びGraphpadソフトウェア（Graphpad、USA）を、統計分析のために使用した。ｐ＜０．０５０で有意差ありとした。
【００５０】
＜結果＞
《M101の機能》
（酸素結合）
UWを用いた溶液中のM101分子は、Ｎ２を用いたバブリングにより、又はLLC-PK1細胞を追加したことにより、酸素が除去（脱酸素化）されている。細胞を用いて得られたデータは、Ｎ２を用いたものと同じ結果を与える。周囲の大気条件の下では、UWに溶解されたM101は、ＨｂＯ２構造（酸素正常状態）になっている。調製物は、次いで密封され、 O2は細胞（低酸素症）によって消費された。低酸素状態の７５分後、M101のスペクトルは、ソレー帯のシフト、ベータ及びアルファ帯の減少、及び約５５５ｎｍの吸光度の増加を伴い、デオキシヘモグロビンの配置へと徐々に変化する（データは示さず）。完全な脱酸素化は、低酸素状態の９０分後に発生し、スペクトルは、最小４２８ｎｍのソレー帯、及び最大５５５ｎｍである頭打ちを示す。すなわち、これは、デオキシヘモグロビン誘導体のスペクトル特性である。試料中の酸素がM101の第１スペクトルへのリターンをもたらすため、この状態は、可逆的である。ｄＯ２の測定は、吸光スペクトルと相関がある（データは示さず）。
【００５１】
（SOD活性（データは示さず））
M101は、NBT形成の完全阻害剤（９３．５±１．１％）を用いた、効果的な抗酸化剤である。Cu/Zn-SOD酵素活性の特異的阻害剤であるＫＣＮが、完全にM101の捕捉能力を抑制するため、この活性は、Cu/Zn-SODに関連する。
【００５２】
市販の保存液中で安定しているM101（データは示される））
M101の安定性を、UW、HTK 、IGL、Celsior、RL、及びPerfadex中にて分析した。M101の解離定数及び半減期により、それが長期間安定であることが示された。
【００５３】
《冷蔵により引き起こされる病変に対する、M101によるin vitroでの細胞の保護（データは示さず）》
標準溶液にて腎臓上皮細胞を保つに当たって、UWは、非常に有害であった。LDH放出による細胞生存率の評価により、CSの１２時間後の細胞生存率の減少が示された。カスパーゼ３の有意な活性は検出されなかった。代謝活性及びATP含量は、LDH放出と共に減少した。
M101は、これらの事象を抑制する。０．３１２ｇ／Ｌであるが、２４時間後に構造及び代謝の完全性とエネルギー含量とを有意に向上させるためには、十分であった。総保護が１．２５ｇ／ＬのM101にて達成された（LDH放出：６±８％、MTTテスト：７１±１３％、ATP含量：７８± ２３％）。 細胞エネルギー含量は、２．５ｇ／Ｌ以上の濃度にて増加する（ATP含量＞コントロールに対して１２０％ ） 。M101は、時間依存的に腎臓細胞を保護した。細胞の完全性は、２４時間で１．２５ｇ／Ｌ、３６時間で２．５ｇ／Ｌ、４８時間で５ｇ／Ｌ、及び７２時間で１０ｇ／Ｌ、完全に保たれた（LDH放出＜２０％）。
実験は、他の溶液、つまり、RL、Perfadex、HTK、IGL、及びCelsiorで再現された。 UWの場合、これらの溶液で細胞を保存することにより、構造的及び／又は機能的な細胞の損傷が引き起こされる。次の２種類の結果が得られた。(１)UWと同じ方法で、細胞をRLに冷却保存したもの（これは、より少ない範囲に）、及び、Perfadexに冷却保存したもの、これら両方は、構造的及び機能的な損傷を呈した。（２）細胞を、HTK、IGL、又はCelsiorに冷却保存したものは、機能的な病変のみ呈した。各溶液において、M101の補充は、細胞の完全性及び細胞の機能の両方を保護する（LDH放出＜２０％、すべての条件下及びMTTテストで５０−１００％）。
【００５４】
《M101を用いたより迅速なin vivoでの移植器官の腎機能の回復》
UW＋M101の混合液を用いて保存された腎臓を移植したブタは、１日目に、尿産生を再開し（UWに対する２日目と比較した）、そして、早くも、４日目には安定した尿の生産レベルに回復した（データは示さず。ｐ＝０．０１６）。HTKのグループでは、同等に利尿が回復した。UWのグループでの血清クレアチニンのレベルは、３日目にピークに達する高レベルを示し、その後、低速減少した。UW＋M101の動物では、１日目に、ピークに達する有意に低い値を示し、そして、７日目に移植前のレベルを回復した（全ての時点でｐ＝０．００９、データは示さず）。HTKの動物は、１日目に、高い血清クレアチニンのピークを示した後、プレ移植レベルを超える緩やかな回復が続いたが、他方、HTK＋M101の動物は、１日目にはるかに低いピークであり（ｐ＝０．００９）、速くも１１日目に移植前のレベルに回復した。ナトリウム再吸収の測定により、溶液単独の場合と比較してM101を用いて保存された腎臓では、より高い性能レベルが示された。
【００５５】
《M101を用いた移植臓器においてよりよく完全に保存された組織》
刷子縁の損失及び細胞脱離、すなわち、典型的なIRIの細管病変、の評価により、７日目及び１４日目のUWの移植においてかなりの損傷が明らかになった。月１で安定した。UW＋M101中に保存された腎臓は、少ない範囲に病変を示した。HTKのグループはM101を使用して、組織学的病変の改善に類似した傾向を示した。
【００５６】
《M101を用いた腎臓における炎症の著しい減少》
フォローアップを通じてUWの移植においてかなりの免疫反応の関与があることが示された。UW＋M101に保存された腎臓は、初期から少しの免疫浸潤を示し、その後、炎症の減少の兆候を示した。２つのHTKのグループは、低レベルの浸潤を示した。３ヵ月の時点の、自然免疫細胞（ED1+）及び適応能力のある免疫細胞（CD3+）の浸潤により、溶液単独を用いた場合と比べてM101を用いて保存された腎臓における浸潤レベルの減少が明らかになる。
【００５７】
《M101の補給による結果の改善》
ブタを、３ケ月の時点で、すなわち本発明者らが、このモデル（ブタ）における慢性線維症の発症を確認した時点（参考文献[41、42]参照）で、屠殺した。UWの移植臓器における間質性線維症及び尿細管萎縮（ＩＦＴＡ）の進行は、広範囲に広がる（２３％）一方で、M101の補充により、上記疾病は有意に減少した（１１％、ｐ＝０．０４９）。HTKの腎臓はまた、かなりのIFTAの進行を示した（２５％）。ここでも、M101の添加により、著しく疾病の進行が減少した（１０％、ｐ＝０．０３８）。
【００５８】
HTK及びUWの２つのグループが、高レベルの血清クレアチニン及び高レベルの蛋白尿を示していたことにより、組織学的損傷は、機能の慢性的な（長期にわたる）喪失と関連することがわかる。２つの溶液において、M101の補充が大幅にこれらのレベルを低下させた。
【００５９】
《初期及び３ヶ月後の優れた結果と相関したM101の補充》
他の統計分析により、M101の補充は、３日目のクレアチニンレベル（Ｒ２＝０．７５、Ｐ＝０．０００１）、及び、３日目のナトリウム排泄量（Ｒ２ ＝０．７４、Ｐ＝０．０００１）と負の相関があることが示された。加えて、本発明者らは、M101の補充はまた、クレアチニン（Ｒ２ ＝０．７５、Ｐ＝０．０００１）、蛋白尿（Ｒ２＝０．５５、Ｐ＝０．０１３）、及び線維症（Ｒ２＝０．７８、ｐ＝０．０００１）の長期（３ヶ月）の結果と負の相関があると結論付けた。
ANOVAは、M101と、３日目のクレアチニン血中レベル（ｐ＝０．００１）及びナトリウム再吸収（ｐ＝０．０４）の初期の結果に用いた溶液と、に相互関係があるが、しかし、３ヶ月後のM101の長期の影響は、使用される溶液に依存しない、ことを明らかにした（データは示さず）。
【００６０】
〔参考文献〕
[1] Salahudeen AK. Cold ischemic injury of transplanted kidneys: new insights from experimental studies. American journal of physiology. 2004 Aug;287(2):F181-7.
[2] Salahudeen AK. Cold ischemic injury of transplant organs: some new strategies against an old problem. Am J Transplant. 2004 Jan;4(1):1.
[3] Faure JP, Baumert H, Han Z, Goujon JM, Favreau F, Dutheil D, et al. Evidence for a protective role of trimetazidine during cold ischemia: targeting inflammation and nephron mass. Biochemical pharmacology. 2003 Dec 1;66(11):2241-50.
[4] Hauet T, Goujon JM, Vandewalle A, Baumert H, Lacoste L, Tillement JP, et al. Trimetazidine reduces renal dysfunction by limiting the cold ischemia/reperfusion injury in autotransplanted pig kidneys. J Am Soc Nephrol. 2000 Jan;11(1):138-48.
[5] Jayle C, Favreau F, Zhang K, Doucet C, Goujon JM, Hebrard W, et al. Comparison of protective effects of trimetazidine against experimental warm ischemia of different durations: early and long-term effects in a pig kidney model. American journal of physiology. 2007 Mar;292(3):F1082-93.
[6] Simmons MN, Schreiber MJ, Gill IS. Surgical renal ischemia: a contemporary overview. The Journal of urology. 2008 Jul;180(1):19-30.
[7] Kosieradzki M, Rowinski W. Ischemia/reperfusion injury in kidney transplantation: mechanisms and prevention. Transplantation proceedings. 2008 Dec;40(10):3279-88.
[8] Favreau F, Thuillier R, Cau J, Milin S, Manguy E, Mauco G, et al. Anti-thrombin therapy during warm ischemia and cold preservation prevents chronic kidney graft fibrosis in a DCD model. Am J Transplant.  Jan;10(1):30-9.
[9] Giraud S, Thuillier R, Belliard A, Hebrard W, Nadeau C, Milin S, et al. Direct thrombin inhibitor prevents delayed graft function in a porcine model of renal transplantation. Transplantation. 2009 Jun 15;87(11):1636-44.
[10] Dragun D, Hoff U, Park JK, Qun Y, Schneider W, Luft FC, et al. Ischemia-reperfusion injury in renal transplantation is independent of the immunologic background. Kidney Int. 2000 Nov;58(5):2166-77.
[11] Koo DD, Welsh KI, Roake JA, Morris PJ, Fuggle SV. Ischemia/reperfusion injury in human kidney transplantation: an immunohistochemical analysis of changes after reperfusion. The American journal of pathology. 1998 Aug;153(2):557-66.
[12] Cassie S, Masterson MF, Polukoshko A, Viskovic MM, Tibbles LA. Ischemia/reperfusion induces the recruitment of leukocytes from whole blood under flow conditions. Free Radic Biol Med. 2004 May 1;36(9):1102-11.
[13] Belzer FO, Southard JH. Principles of solid-organ preservation by cold storage. Transplantation. 1988 Apr;45(4):673-6.
[14] Maathuis MH, Leuvenink HG, Ploeg RJ. Perspectives in organ preservation. Transplantation. 2007 May 27;83(10):1289-98.
[15] Minor T, Sitzia M, Dombrowski F. Kidney transplantation from non-heart-beating donors after oxygenated low-flow machine perfusion preservation with histidine-tryptophan-ketoglutarate solution. Transpl Int. 2005 Jan;17(11):707-12.
[16] Matsumoto S, Kuroda Y. Perfluorocarbon for organ preservation before transplantation. Transplantation. 2002 Dec 27;74(12):1804-9.
[17] Rousselot M, Delpy E, Drieu La Rochelle C, Lagente V, Pirow R, Rees JF, et al. Arenicola marina extracellular hemoglobin: a new promising blood substitute. Biotechnology journal. 2006 Mar;1(3):333-45.
[18] Rousselot M, Le Guen D, Zal F. Novel dissociation mechanism of a polychaetous annelid extracellular haemoglobin. FEBS J. 2006 Apr;273(7):1582-96.
[19] Zal F, Green BN, Lallier FH, Vinogradov SN, Toulmond A. Quaternary structure of the extracellular haemoglobin of the lugworm Arenicola marina: a multi-angle-laser-light-scattering and electrospray-ionisation-mass-spectrometry analysis. European journal of biochemistry / FEBS. 1997 Jan 15;243(1-2):85-92.
[20] Toulmond A. Blood oxygen transport and metabolism of the confined lugworm Arenicola marina (L.). The Journal of experimental biology. 1975 Dec;63(3):647-60.
[21] Toulmond A, Tchernigovtzeff C. Ventilation and respiratory gas exchanges of the lugworm Arenicola marina (L.) as functions of ambient PO2 (20-700 torr). Respiration physiology. 1984 Sep;57(3):349-63.
[22] Ahlenstiel T, Burkhardt G, Kohler H, Kuhlmann MK. Improved cold preservation of kidney tubular cells by means of adding bioflavonoids to organ preservation solutions. Transplantation. 2006 Jan 27;81(2):231-9.
[23] McCord JM. Oxygen-derived free radicals in postischemic tissue injury. The New England journal of medicine. 1985 Jan 17;312(3):159-63.
[24] Chabasse C, Bailly X, Rousselot M, Zal F. The multigenic family of the extracellular hemoglobin from the annelid polychaete Arenicola marina. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 2006 Jul;144(3):319-25.
[25] Royer WE, Jr., Omartian MN, Knapp JE. Low resolution crystal structure of Arenicola erythrocruorin: influence of coiled coils on the architecture of a megadalton respiratory protein. J Mol Biol. 2007 Jan 5;365(1):226-36.
[26] Favreau F, Thuillier R, Cau J, Milin S, Manguy E, Mauco G, et al. Anti-thrombin Therapy During Warm Ischemia and Cold Preservation Prevents Chronic Kidney Graft Fibrosis in a DCD Model. Am J Transplant. 2009 Dec 2.
[27] Bernhardt WM, Gottmann U, Doyon F, Buchholz B, Campean V, Schodel J, et al. Donor treatment with a PHD-inhibitor activating HIFs prevents graft injury and prolongs survival in an allogenic kidney transplant model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2009 Nov 23.
[28] Bos EM, Leuvenink HG, Snijder PM, Kloosterhuis NJ, Hillebrands JL, Leemans JC, et al. Hydrogen Sulfide-Induced Hypometabolism Prevents Renal Ischemia/Reperfusion Injury. J Am Soc Nephrol. 2009 Jul 23.
[29] Hosgood SA, Nicholson ML. Hydrogen sulphide ameliorates ischaemia-reperfusion injury in an experimental model of non-heart-beating donor kidney transplantation. The British journal of surgery. 2009 Dec 23.
[30] Kumar S, Allen DA, Kieswich JE, Patel NS, Harwood S, Mazzon E, et al. Dexamethasone Ameliorates Renal Ischemia-Reperfusion Injury. J Am Soc Nephrol. 2009 Sep 24.
[31] Yoshida J, Ozaki KS, Nalesnik MA, Ueki S, Castillo-Rama M, Faleo G, et al. Ex vivo Application of Carbon Monoxide in UW Solution Prevents Transplant-Induced Renal Ischemia/Reperfusion Injury in Pigs. Am J Transplant.  Feb 25.
[32] Companiesandmarkets.com. Organ Preservation Solutions - A Global Strategic Business Report. 2010 [cited; Available from: http://www.companiesandmarkets.com/Summary-Market-Report/organ-preservation-solutions-a-global-strategic-business-report-317184.asp
[33] Pereira-Sampaio MA, Favorito LA, Sampaio FJ. Pig kidney: anatomical relationships between the intrarenal arteries and the kidney collecting system. Applied study for urological research and surgical training. The Journal of urology. 2004 Nov;172(5 Pt 1):2077-81.
[34] Giraud S, Favreau F, Chatauret N, Thuillier R, Maiga S, Hauet T. Contribution of Large Pig for Renal Ischemia-Reperfusion and Transplantation Studies: The Preclinical Model. Journal of Biomedicine and Biotechnology. in press.
[35] Assendelft, ed. Spectrophotometry of haemoglobin derivatives. Assen, The netherlands: Charles C Thomas Publisher, Royal Vangorcum LTD 1970.
[36] Oberley LW, Spitz DR. Assay of superoxide dismutase activity in tumor tissue. Methods Enzymol. 1984;105:457-64.
[37] Dutheil D, Rioja-Pastor I, Tallineau C, Goujon JM, Hauet T, Mauco G, et al. Protective effect of PEG 35,000 Da on renal cells: paradoxical activation of JNK signaling pathway during cold storage. Am J Transplant. 2006 Jul;6(7):1529-40.
[38] Hauet T, Goujon JM, Baumert H, Petit I, Carretier M, Eugene M, et al. Polyethylene glycol reduces the inflammatory injury due to cold ischemia/reperfusion in autotransplanted pig kidneys. Kidney international. 2002 Aug;62(2):654-67.
[39] Solez K, Colvin RB, Racusen LC, Haas M, Sis B, Mengel M, et al. Banff 07 classification of renal allograft pathology: updates and future directions. Am J Transplant. 2008 Apr;8(4):753-60.
[40] Grimm PC, Nickerson P, Gough J, McKenna R, Stern E, Jeffery J, et al. Computerized image analysis of Sirius Red-stained renal allograft biopsies as a surrogate marker to predict long-term allograft function. J Am Soc Nephrol. 2003 Jun;14(6):1662-8.
[41] Favreau F, Rossard L, Zhang K, Desurmont T, Manguy E, Belliard A, et al. Expression and modulation of translocator protein and its partners by hypoxia reoxygenation or ischemia and reperfusion in porcine renal models. American journal of physiology. 2009 Jul;297(1):F177-90.
[42] Thuillier R, Favreau F, Celhay O, Macchi L, Milin S, Hauet T. Thrombin inhibition during kidney ischemia-reperfusion reduces chronic graft inflammation and tubular atrophy. Transplantation. 2010 Sep 27;90(6):612-21.
[43] Fotakis G, Timbrell JA. In vitro cytotoxicity assays: comparison of LDH, neutral red, MTT and protein assay in hepatoma cell lines following exposure to cadmium chloride. Toxicol Lett. 2006 Jan 5;160(2):171-7.
[44] Gallucci S, Matzinger P. Danger signals: SOS to the immune system. Current opinion in immunology. 2001 Feb;13(1):114-9.
[45] El-Zoghby ZM, Stegall MD, Lager DJ, Kremers WK, Amer H, Gloor JM, et al. Identifying specific causes of kidney allograft loss. Am J Transplant. 2009 Mar;9(3):527-35.
[46] Copeland JW, Beaumont BW, Merrilees MJ, Pilmore HL. Epithelial-to-mesenchymal transition of human proximal tubular epithelial cells: effects of rapamycin, mycophenolate, cyclosporin, azathioprine, and methylprednisolone. Transplantation. 2007 Mar 27;83(6):809-14.
[47] Nankivell BJ, Chapman JR. Chronic allograft nephropathy: current concepts and future directions. Transplantation. 2006 Mar 15;81(5):643-54.
[48] t Hart NA, van der Plaats A, Faber A, Leuvenink HG, Olinga P, Wiersema-Buist J, et al. Oxygenation during hypothermic rat liver preservation: an in vitro slice study to demonstrate beneficial or toxic oxygenation effects. Liver Transpl. 2005 Nov;11(11):1403-11.
[49] Kuroda Y, Kawamura T, Suzuki Y, Fujiwara H, Yamamoto K, Saitoh Y. A new, simple method for cold storage of the pancreas using perfluorochemical. Transplantation. 1988 Sep;46(3):457-60.
[50] Fujino Y, Kuroda Y, Suzuki Y, Fujiwara H, Kawamura T, Morita A, et al. Preservation of canine pancreas for 96 hours by a modified two-layer (UW solution/perfluorochemical) cold storage method. Transplantation. 1991 May;51(5):1133-5.
[51] Yoshikawa T, Suzuki Y, Fujino Y, Kakinoki K, Li S, Goto T, et al. Detailed analysis of mucosal restoration of the small intestine after the cavitary two-layer cold storage method. Am J Transplant. 2005 Sep;5(9):2135-42.
[52] Farrar D, Grocott M. Intravenous artificial oxygen carriers. Hosp Med. 2003 Jun;64(6):352-6.
[53] Cataldi A. Cell responses to oxidative stressors. Current pharmaceutical design.16(12):1387-95.
[54] Hosgood SA, Mohamed IH, Nicholson ML. The two layer method does not improve the preservation of porcine kidneys. Med Sci Monit.17(1):BR27-33.
[55] Rolles K, Foreman J, Pegg DE. A pilot clinical study of retrograde oxygen persufflation in renal preservation. Transplantation. 1989 Aug;48(2):339-42.
[56] Kakehata J, Yamaguchi T, Togashi H, Sakuma I, Otani H, Morimoto Y, et al. Therapeutic Potentials of an Artificial Oxygen-Carrier, Liposome-Encapsulated Hemoglobin, for Ischemia/Reperfusion-Induced Cerebral Dysfunction in Rats. Journal of pharmacological sciences.  Sep 11.
[57] Spahn DR, Kocian R. Artificial O2 carriers: status in 2005. Current pharmaceutical design. 2005;11(31):4099-114.
[58] Regner KR, Nilakantan V, Ryan RP, Mortensen J, White SM, Shames BD, et al. Protective effect of Lifor solution in experimental renal ischemia-reperfusion injury. The Journal of surgical research. 2010 Dec;164(2):e291-7.
[59] Jouan L, Taveau JC, Marco S, Lallier FH, Lamy JN. Occurrence of two architectural types of hexagonal bilayer hemoglobin in annelids: comparison of 3D reconstruction volumes of Arenicola marina and Lumbricus terrestris hemoglobins. J Mol Biol. 2001 Jan 26;305(4):757-71.
[60] Weber RE, Vinogradov SN. Nonvertebrate hemoglobins: functions and molecular adaptations. Physiol Rev. 2001 Apr;81(2):569-628.
[61] Patel S, Spencer CP. Studies on the Haemoglobin of Arenicola Marina. Comp Biochem Physiol. 1963 Feb;16:65-82.
【国際調査報告】
2014516981.tif 000002
2014516981.tif 000003
2014516981.tif 000004
2014516981.tif 000005
2014516981.tif 000006
2014516981.tif 000007
2014516981.tif 000008
2014516981.tif 000009