(57)【要約】  本発明は、生物研究において遺伝的に安定であることが示された生非病原性膵臓壊死症ウイルスに関する。前記ウイルスに暴露された魚は、疾患の症状を表すことなく前記ウイルスについて陽性となり、前記非病原性ウイルスはまた、投与後長期間ＩＰＮに対して前記魚を保護することが示された。従って、前記ウイルスを含むワクチン及び伝染性膵臓壊死症の予防又は治療のための前記ウイルスは、本発明の一部である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生非病原性ＩＰＮＶであり、ＩＰＮＶに感受性であることを知られている宿主で少なくとも３継代後で病原性ウイルスへ戻らない、生非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項２】
請求項１に記載の生非病原性ＩＰＮＶであり、淡水中で、１２℃で、大西洋サケ幼魚に、力価２ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌで、浸漬することで投与されると、前記幼魚に、ＲＴＧ−２細胞で再単離により測定してウイルス陽性とする、生非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項３】
請求項１に記載の生非病原性ＩＰＮＶであり、淡水中で、１２℃で、大西洋サケ幼魚に、力価２ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌで、浸漬することで投与されると、前記幼魚に、非感染幼魚と比較してＩＰＮ秒に対する保護を与える、生非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項４】
請求項１に記載の生非病原性ＩＰＮＶであり、淡水中で、１２℃で、大西洋サケ幼魚に、力価２ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌで、浸漬することで投与されると、前記幼魚に、ＩＰＮ病の兆候を発現させない、生非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項５】
請求項１に記載の生非病原性ＩＰＮＶであり、前記ウイルスがＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含み、前記ＶＰ２タンパク質の位置２５２でアミノ酸はＶａｌではない、非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項６】
請求項１に記載の非病原性ＩＰＮＶであり、前記ウイルスがＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含み、前記ＶＰ２タンパク質の２５２位置でのアミノ酸残基が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；好ましくはＡｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択され；及び最も好ましくは２５２位置のアミノ酸残基がＡｓｎである、非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項７】
請求項１に記載の非病原性ＩＰＮＶであり、前記ウイルスが、配列番号１の１−４４２残基で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を持つアミノ酸配列（ただし、２５２位のアミノ酸残基はＶａｌではない）を含むタンパク質をコードする核酸を含む、非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項８】
請求項１に記載の生非病原性ＩＰＮＶであり、前記ウイルスが、配列番号１の１−４４２残基で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を持つアミノ酸配列（ただし、２５２位のアミノ酸残基は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；好ましくはＡｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択され；及び最も好ましくは２５２位のアミノ酸残基はＡｓｎである）を含むタンパク質をコードする核酸を含む、生非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項９】
請求項５乃至８のいずれか一項に記載の生非病原性ＩＰＮＶであり、前記タンパク質の２８１、２８２及び３１９位のアミノ酸残基は、それぞれＴｈｒ、Ａｓｎ及びＡｌａではない、生非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項１０】
請求項５乃至９もいずれ一項に記載の生非病原性ＩＰＮＶであり、前記タンパク質の２８１、２８２及び３１９位のアミノ酸残基は、それぞれＳｅｒ、Ａｓｐ及びＧｌｕである、生非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項１１】
請求項５乃至１０のいずれ一項に記載の生非病原性ＩＰＮＶであり、前記タンパク質の２５２、２８１、２８２及び３１９位のアミノ酸残基は、それぞれＡｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＧｌｕである、生非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項１２】
請求項５乃至１１のいずれ一項に記載の生非病原性ＩＰＮＶであり、前記タンパク質の２２１位のアミノ酸残基は、Ｔｈｒである、生非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項１３】
請求項５乃至１２のいずれ一項に記載の生非病原性ＩＰＮＶであり、前記タンパク質の２１７位のアミノ酸残基は、Ｐｒｏある、生非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項１４】
請求項５乃至１３のいずれ一項に記載の生非病原性ＩＰＮＶであり、前記タンパク質は、前記非病原性ウイルスが、ＩＰＮＶ感受性であることが知られている宿主で少なくとも３継代後に病原性ウイルスへ戻らない、生非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項１５】
請求項１に記載の生非病原性ＩＰＮＶであり、ＩＰＮＶ−Ｇ７００として帰属される（寄託番号：ＥＣＡＣＣ−Ｎｏ．１１０４１２０１）、又はこれと緊密に関連する、生非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項１６】
請求項１５に記載の生非病原性ＩＰＮＶであり、前記緊密に関連する株は、好ましくは、前記寄託された株と遺伝子型及び／又は形質的特徴が類似するものである、生非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項１７】
請求項１に記載の生非病原性ＩＰＮＶであり、力価２ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌで、淡水中に保持した大西洋サケ幼魚を１２℃で浸漬することで接種すると、
−前記幼魚をＲＴＧ−２細胞での再単離による測定でウイルス陽性とし：
−前記幼魚を免疫組織化学による測定でウイルス陰性とし：
−前記幼魚に、非感染幼魚と比較してＩＰＮＶ病に対する保護を与え；及び
−前記幼魚に、ＩＰＮ病の兆候を発現させない、生非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項１８】
請求項１に記載の生非病原性ＩＰＮＶを含むワクチン。
【請求項１９】
請求項１に記載の生非病原性ＩＰＮＶの、ワクチンとしての使用。
【請求項２０】
請求項１に記載の生非病原性ＩＰＮＶ又は請求項１８に記載のワクチンの、幼魚のＩＰＮ病に対するワクチンとしての使用。
【請求項２１】
請求項１に記載の生非病原性ＩＰＮＶ又は請求項１８に記載のワクチンの幼魚のＩＰＮ病に対するワクチンとしての使用であって、接種が浸漬又は経口投与による使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物研究において遺伝的に安定であることが示された生非病原性膵臓壊死症ウイルスに関する。前記ウイルスに暴露された魚は、疾患の症状を表すことなく前記ウイルスについて陽性となり、前記非病原性ウイルスはまた、投与後長期間ＩＰＮに対して前記魚を保護することが示された。従って、前記ウイルスを含むワクチン及び伝染性膵臓壊死症の予防又は治療のための前記ウイルスは、本発明の一部である。
【背景技術】
【０００２】
伝染性膵臓壊死症（ＩＰＮ）は、世界中のサケ科魚類の経済的に重要なウイルス性疾患である。この疾患は最初、１９５０年台に北アメリカの淡水マスに記載され、１９７０年台初期にヨーロッパでも報告された。最初ＩＰＮは、ニジマスの稚魚と幼魚に影響を与える深刻な疾患であると考えられた。しかし１９７０年台には、サケ養殖産業が拡大し始め、サケのＩＰＮ病発生率もまた増加し、その結果ＩＰＮは今では世界中のサケ養殖産業に広がっている。前記疾患による経済的損失は大きく、淡水での大西洋サケ幼魚で、淡水又は、海水へ移動後、及びスモルト後に大流行が発生することがある。
【０００３】
伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮ）は、ＩＰＮの原因物質であり、アクアビルナウイルス属、ビルナウイルス科に属する。アクアビルナウイルスは、多くの魚種に感染する広宿主域を持つ。サケとは別に、３２を超える異なる科、１１種の軟体動物及び４科の甲殻類に属する魚から単離されている。
【０００４】
ＩＰＮ遺伝子は、二重鎖ＲＮＡの２つのセグメントからなり、これらは、直径６０ｎｍの単一殻二十面体カプシドにより囲まれている。
遺伝子セグメントＡ（通常は３０９７塩基）は、ｐＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３の順で含む１０６ｋＤａの前駆体ポリタンパク質をコードし、及び感染細胞のみに見られる１５ｋＤａ非−構造ＶＰ５タンパク質をコードする。セグメントＢ（通常は２７７７塩基）は、マイナー内部ポリタンパク質ＶＰ１（９４ｋＤａ）をコードし、これはビリオン−関連ＲＮＡ−依存ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）である。
【０００５】
ほとんどの水生ビルナウイルスは、宿主又は地理的位置にかかわらず、抗原性関連であり単一の血清群Ａに属している。血清群Ａは９つの血清型Ａ１−Ａ９に区分される。Ａ１血清型は、合衆国から単離されたほとんどを含む；血清型Ａ２からＡ５は、主にヨーロッパで分離され、血清型Ａ６からＡ９はカナダで単離された。血清型Ｂは軟体動物から単離されたひとつの血清型を含む。
【０００６】
種々の血清型／遺伝子群に伴い、株の間で高度の抗原性変動と病原性及び病理学的病変の相違がある。ＩＰＮＶの病原性は、セグ面とＡに伴うものであり、特にＶＰ２構造タンパク質による。
【０００７】
ＶＰ２は主要なカプシドタンパク質（図４）であり、前記ウイルスに感染した宿主で型特異的モノクローナル抗体の産生に寄与している。このタンパク質のアミノ酸残基での変異は病原性に関連していると考えられている。実際、大西洋サケ幼魚において異なる死亡率を示す様々な場所で単離されたものの推定されたアミノ酸配列の比較により、ＩＰＮＶ属株の病原性に関与する推定モティーフが提案されてきた。
【０００８】
病原性株は通常、前記ＶＰ２配列の２１７、２２１、２４７及び５００位にトレオニン、アラニン、トレオニン／アラニン及びチロシン／ヒスチジンを持つ。さらなる研究で、病原性単離物は、Ｔｈｒ２１７及びＡｌａ２２１を持ち；中程度から軽度の病原性株はＰｒｏ２１７及びＡｌａ２２１を持ち；及びＴｈｒ２２１を含む株は、２１７位の残基にかかわらずほとんど常に非病原性である、ことが示された。
【０００９】
非病原性ウイルスに基づくワクチンを用いる鶏への能動免疫は、これまで長い間、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）により引き起こされる免疫疾患から鶏を守るための業界標準であった。このウイルスはＩＰＮＶ様のビルナウイルスであるが、ＩＢＤＶとＩＰＮＶとの重要な違いは、ＩＰＮ感染でも生存するほとんどすべての魚は前記ウイルスの長期間保持者（キャリア）となり得る、ということである。前記ＩＰＮＶキャリア状態は、感染した個々にはなにも直接の悪影響はない。持続的感染魚では、ウイルスは白血球、前腎及び脾臓に関連して見出される。キャリア魚は糞便中にウイルス排出するが、しかしこの力価は時間と共に変動し、ストレス期間で増加することが知られている。
【００１０】
ＩＰＮＶ及びＩＢＤＶなどのＲＮＡウイルスは、種々のメカニズムにより変化しやすく、前記ウイルスがワクチンを受けた魚内で複製する際により強い病原性に変化し得るリスクが常に存在すると考えられている。かかる戦略は、現場でのウイルス及び前記病気の自然経過を監視する際に警戒することを必要とする。これまで、ＩＰＮＶの前記病原性及び遺伝的安定性に影響を与える因子についての無知が、ワクチン目的のために非病原性株を使用することを排除してきた。
【００１１】
生非病原性ＩＰＮＶに基づくワクチンの使用の代わりが、不活性化ウイルスワクチンである。死んだウイルスワクチンは、細胞培地で大規模にウイルスを成長させて調製される。ウイルスは次に回収され、前記保護抗原の免疫活性は保持するが病原性ウイルスはワクチン内には残存していないことを保証する条件下でホルマリン又を他の類似の試薬で不活性化される。前記不活性化ワクチンのための最近の戦略は高価であり、労働力集約的であり、非不活性化ウイルスの存在の危険の対象とされる。不活性化ワクチンでのワクチン投与は、経口、浸漬及び注射により与えられたニジマスで試験されてきた。感染に対する防御効果は注射により得られるのみである。しかし、多数の幼魚への注射はふ化場では実用的ではない。
【００１２】
他の意見は、保護免疫の誘導に寄与し得るウイルス粒子の一部からなるサブユニットワクチンの使用である。上で説明したように、ＶＰ２は主要なＩＰＮＶカプシドタンパク質であり、型特異的モノクローナル抗体の産生を担うものである。これは、この粒子を、サブユニットワクチンで使用するための非常に興味ある候補物とする。実際、市販オイル／グルカン−アジュバント多数注射可能ワクチン中に含まれる組み換えＶＰ２（ｒＶＰ２）でスモルト前のワクチン接種は、前記ＩＰＮ成分を含まない同じワクチンでワクチン接種された魚と比較して、自然発生のＩＰＮに対する魚保護を与える結果となった。スモルト後の大西洋サケでのＩＰＮＶに対するこの組み換えワクチンはノルウェーで市販使用が認可されている。しかし、成魚は腹腔内注射によりワクチン接種され得るが、この投与方法は、体のサイズが小さいことから幼魚には選択されない。
【００１３】
一部の生産者はまた、全ての幼魚が、生存者の自動接種の形でＩＰＮＶで意図的に感染させるべきであることを示唆するが、しかしかかる戦略の法的及び福祉的意味から離れて、これは単に海水から淡水相へ損失を移すだけであることが見出された。このことは、病原性株を自動的にワクチン接種することを考慮する際に明らかである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従来技術についての前記概略から明らかなように、魚へのＩＰＮＶ感染を制御するための改善された手段に対する要求が存在し、これは魚に非毒性であり、産業上簡便な方法で投与され得るものであり、及び投与後長期間に魚を保護できるものである。本発明により提供されるかかる改善は、病原性へ変換しないという意味で遺伝的に安定な生非病原性ＩＰＮＶを、魚に投与、好ましくは魚を浸漬することで、ＩＰＮＶを治療又を防止するために魚を処置することである。かかる非病原性ウイルスはこれまで使用されてこなかった理由は、非病原性株は病原性へ戻る可能性があることから許容される戦略とは考えられてこなかったからである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第１の側面は、ＩＰＮＶに感受性であることが知られている宿主で少なくとも３継代後に病原性ウイルスへ戻らない、生非病原性ＩＰＮＶに関する。
【００１６】
ひとつの実施態様は本発明の第１の側面による生非病原性ＩＰＮＶに関し、力価２ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌで、淡水中に保持した大西洋サケ幼魚を１２℃で浸漬することで接種すると、前記幼魚をＲＴＧ−２細胞での再単離による測定でウイルス陽性とする。
【００１７】
ひとつの実施態様は本発明の第１の側面による生非病原性ＩＰＮＶに関し、力価２ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌで、淡水中に保持した大西洋サケ幼魚を１２℃で浸漬することで接種すると、前記幼魚に、非感染幼魚と比較してＩＰＮＶ病に対する保護を与える。
【００１８】
ひとつの実施態様は本発明の第１の側面による生非病原性ＩＰＮＶに関し、力価２ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌで、淡水中に保持した大西洋サケ幼魚を１２℃で浸漬することで接種すると、前記幼魚に、ＩＰＮ病の兆候を発現させない。
【００１９】
ひとつの好ましい実施態様では、前記生非病原性ＩＰＮＶは、ＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含み、前記ＶＰ２タンパク質の２５２位での前記アミノ酸がＶａｌではない。
【００２０】
ひとつの好ましい実施態様では、前記生非病原性ＩＰＮＶは、ＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含み、前記ＶＰ２タンパク質の２５２位でのアミノ酸が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；好ましくはＡｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択され；及び最も好ましくは２５２位のアミノ酸残基はＡｓｎである。
【００２１】
ひとつの好ましい実施態様では、前記生非病原性ＩＰＮＶは、配列番号１の１−４４２残基で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を持つアミノ酸配列（ただし、２５２位のアミノ酸残基はＶａｌではない）を含むタンパク質をコードする核酸を含む。
【００２２】
ひとつの好ましい実施態様では、前記生非病原性ＩＰＮＶは、配列番号１の１−４４２残基で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を持つアミノ酸配列（ただし、２５２位のアミノ酸残基は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；好ましくはＡｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択され；及び最も好ましくは２５２位のアミノ酸残基はＡｓｎである）を含むタンパク質をコードする核酸を含む。
【００２３】
ひとつの好ましい実施態様では、前記タンパク質の２８１、２８２及び３１９位のアミノ酸残基は、それぞれＴｈｒ、Ａｓｎ及びＡｌａではない。
【００２４】
ひとつの好ましい実施態様では、前記タンパク質の２８１、２８２及び３１９位のアミノ酸残基は、それぞれＳｅｒ、Ａｓｐ及びＧｌｕである。
【００２５】
ひとつの好ましい実施態様では、前記タンパク質の２５２、２８１、２８２及び３１９位のアミノ酸残基は、それぞれＡｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＧｌｕである。
【００２６】
ひとつの好ましい実施態様では、前記タンパク質の２２１位のアミノ酸残基は、Ｔｈｒである。
【００２７】
ひとつの好ましい実施態様では、前記タンパク質の２１７位のアミノ酸残基は、Ｐｒｏある。
【００２８】
ひとつの好ましい実施態様では前記タンパク質は、前記非病原性ウイルスが、ＩＰＮＶ感受性であることが知られている宿主で少なくとも３継代後に病原性ウイルスへ戻らない。
【００２９】
ひとつの特に好ましい実施態様では、本発明の第１の側面による前記生非病原性ＩＰＮＶは、ＩＰＮＶ−Ｇ７００として帰属されるものであり（寄託番号：ＥＣＡＣＣ−Ｎｏ．１１０４１２０１）、又はこれと又は緊密に関連する株である。前記緊密に関連する株は、好ましくは、前記寄託された株と遺伝子型及び／又は形質的特徴が類似するものである。
【００３０】
ひとつの実施態様は本発明の第１の側面による生非病原性ＩＰＮＶに関し、力価２ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌで、淡水中に保持した大西洋サケ幼魚を１２℃で浸漬することで接種すると、
−前記幼魚をＲＴＧ−２細胞での再単離による測定でウイルス陽性とし：
−前記幼魚を免疫組織化学による測定でウイルス陰性とし：
−前記幼魚に、非感染幼魚と比較してＩＰＮＶ病に対する保護を与え；及び
−前記幼魚に、ＩＰＮ病の兆候を発現させない。
【００３１】
本発明の第２の側面はワクチンに関し、これは本発明の第１の側面による生非病原性ＩＰＮＶを含む。
【００３２】
本発明の第３の側面は、本発明による生非病原性ＩＰＮＶワクチンの、ワクチンとしての使用に関する。
【００３３】
本発明の第４の側面は、幼魚のＩＰＮ病に対するワクチンとしての使用のための、本発明の第１の側面による生非病原性ＩＰＮＶ又は本発明の第２の側面によるワクチンに関する。
【００３４】
本発明の第４の側面は、ＩＰＮ病に対するワクチンとして、本発明の第１の側面による生非病原性ＩＰＮＶ又は本発明の第２の側面によるワクチンに関し、ここで接種が浸漬又は経口投与による。
【００３５】
本発明の好ましい実施態様は、従属請求項に規定され、及び本発明の詳細な説明に記載されている。
【００３６】
本発明の好ましい実施態様は、より詳細に添付図面を参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、病原性Ｖ−１２４４株で感染／非感染の免疫／非免疫幼魚の累積死亡率を示す。Ｙ軸：それぞれのサンプルでの死亡幼魚パーセント（累積死亡率）を示す。Ｘ軸：
【表１】
2014513932.tif 000003
【図２】図２は、病原性Ｖ−１２４４株で感染／非感染の免疫／非免疫幼魚の累積死亡率を示す。Ｙ軸：それぞれのサンプルでの死亡幼魚パーセント（累積死亡率）を示す。Ｘ軸：
【表２】
2014513932.tif 000004
【図３】図３は、非病原性Ｇ７００株で感染／非感染させた後生存した幼魚の全数を示す。Ｙ軸：非病原性Ｇ７００株で感染／非感染させた後生存した幼魚の全数を示す。Ｘ軸：１＝非感染コントロール；２＝非病原性Ｇ７００株で感染；１−３＝平行に３つの異なる実験からのデータを表す。
【図４】図４は、ＩＰＮＶ及び、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の位置を示す。
【図５】図５は、幼魚の６ヶ月感染後病原性ウイルスへ戻った、非病原性ウイルスリバース遺伝子で作られた株から分離されたＶＰ２タンパク質の２１７及び２２１位でのアミノ酸残基を示す。位置２１７では、Ｐｒｏ又はＴｈｒアミノ酸を与える混合アミノ酸組成が存在する。位置２２１と組み合わせて、類似種プールにおいてＰｒｏＴｈｒ及びＴｈｒＡｌａの代表的例が存在する。
【図６Ａ】図６Ａは、マトリクス内での行として表されるアミノ酸残基の整列配列を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、マトリクス内での行として表されるアミノ酸残基の整列配列を示す。図６Ａ及びＢにおいて：アミノ酸残基１−５０８及び１−４４２は、それぞれ前駆体ＶＰ２及び成熟ＶＰ２タンパク質のアミノ酸配列を表す。前記ＩＰＮＶ−ＶＰ２ＰＴＡ配列は、実施例３で、幼魚の連続継代後の病原性ウイルスへの戻りが示された非病原性ウイルスのＶＰ２配列を表す（不安定）。前記Ｇ７００配列は、実施例２で、幼魚の連続継代後の病原性ウイルスへの戻りが示されなかった非病原性ウイルス（寄託番号ＥＣＡＣＣ−Ｎｏ１１０４１２０１）のＶＰ２配列を表す（安定）。前記ＮＶＩ０１５−ＴＡ配列は、参考例として含まれ、病原性ウイルスのＶＰ２配列を表す。同一の行のギャップは、非同一アミノ酸残基の位置を示す。アミノ酸の１文字又は３文字表記は図７Ａで示される。
【図７Ａ】図７Ａは、アミノ酸の１文字又は３文字表記をまとめた。
【図７Ｂ】図７Ｂは、標準遺伝子コードを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
ＩＰＮＶの理想的ワクチンは、幼魚時で長期間の保護を誘導し、病原性キャリア形成を防止するものである必要があり、多数のＩＰＮＶ血清型に有効でなる必要がある。注射は小魚には使用できず、従って早期ワクチン接種には、経口接種又は浸漬が最も好ましい経路である。
【００３９】
既に、理想的ワクチン接種のこれらの寄与は、組み換えサブユニットワクチンによるか又は不活性化ウイルスワクチンによるかのいずれかに適合することが必要であると考えられてきたが、その理由は、生非病原性ワクチンは、非病原性ウイルスが病原性ウイルスに戻ると、病原性キャリア形成及び病気を生じる可能性があるからである。
【００４０】
当該分野のこの偏見にもかかわらず、本発明の発明者は、驚くべきことに、早期に長期間保護を導き、病原性キャリア形成を防止し、多数のＩＰＮＶ血清型に対して有効であり、及び経口又は浸漬、好ましくは浸漬で接種され得る、非病原性ＩＰＮＶ株を同定した。
【００４１】
この驚くべき発見は、２つの異なる淡水魚養殖場が生産サイクルを通じて追跡したプロジェクトの結果である。選択された場所は、生産サイクルを通してＩＰＮ問題が再発した記録か、又はたとえ魚が海での魚のＩＰＮ−問題群と混合されたとしても、非常にわずかのＩＰＮ問題が記録されているかのいずれかであった。前記魚は、繁殖用ストックから頻繁なサンプリングとＩＰＮＶ分離による回収を通じてずっと追跡されていた。
【００４２】
分離される際には、前記ＩＰＮＶは、遺伝子レベルで詳細な特徴付けのために配列決定の対象とされた。その結果は、両方の場所のカテゴリーもＩＰＮウイルス持っているが、異なる遺伝子型のものであることを示した。再発ＩＰＮ問題を持つ場所は、病原性株を持ち、一方ＩＰＮ問題を持たない場所では非病原性株を持ち、これをここではＧ７００株と参照する（寄託番号ＥＣＡＣＣ−Ｎｏ１１０４１２０１）。興味あることに、前記Ｇ７００に感染した魚は、前記病原性株を持つ魚と混合してもＩＰＮを発症することから保護されているように見える。これらの知見は、この場所での株は、ＩＰＮに対する生病原性ワクチンとしての可能性を示した。
【００４３】
前記ウイルスのさらなる特徴付けのために、Ｇ７００株の連続希釈物を、固体支持体アガロースゲル（ＳｅａＰｌａｑｕｅ）でＣＨＳＥ−２１４細胞中で増殖させた。３つのプラークが同定され、増殖させ、精製されクローン化された。このうちの２つはさらにＶＰ２遺伝子の配列決定による特徴付けの対象とされた。得られた結果は、両方のクローンのＶＰ２配列は、核酸及びアミノ酸のレベルで１００％同一であり、また最初のＧ７００株と同一であった。
【００４４】
Ｇ７００ＶＰ２遺伝子のＤＮＡ及びＲＮＡ配列は、配列番号２及び配列番号３にそれぞれ表されており；Ｇ７００前駆体及び成熟ＶＰ２タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１のアミノ酸残基１−５０８及び１−４４２により表される。これから分かるように、両方のクローンは、病原モチーフでＰｒｏ２１７Ｔｈｒ２２１を持ち、これは非病原性単離物と整合する。
【００４５】
前記Ｇ７００株が非病原性であり、生物研究で遺伝子的に安定であることを検証するために、ＩＰＮＶに感受性であることが知られている大西洋サケ幼魚を、２ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度で暴露した（実施例２）。前記ウイルスはサンプリングの前に３継代した。サンプリング後、いくらかの幼魚をストレスの対象とし、次に最終サンプリング前にさらに２８日の間観察した。死亡率が毎日記録された。
【００４６】
図３から分かるように、感染群とコントロール群の死亡率の間には有意差はなく、それらをストレスの対象とした後でさえ、統計的差は観察されなかった。組織学的に、ストレスの前後で幼魚の膵臓を含む内部器官で病理学的病変は観察されず（データは示されていない）、これはＧ７００は実際に非病原性株であることを確認した。
【００４７】
前記再分離されたウイルスのＶＰ２配列は、前記研究の開始及び終了時において前記オリジナルの単離物（Ｇ７００）のＶＰ２配列と１００％同一であり、このことは、たとえ幼魚内で連続して継代された後でもこの変異体が高い遺伝子安定性を持つことを示す。対照的に、次のこと、即ち、非病原性Ｐｒｏ２１７Ａｌａ２２１Ａｌａ２４７及び非病原性Ｐｒｏ２１７Ｔｈｒ２２１Ａｌａ２４７逆遺伝子形成株は、大西洋サケの１回の感染で病原性変異体に変化したこと、従って、前記逆遺伝子形成変異体は、生非病原性ワクチンのための候補としては適当ではないことが見出された。
【００４８】
前記Ｇ７００株について得られた知見に基づいて、前記非病原性株の遺伝子安定性に寄与するアミノ酸残基の同定に焦点を当てた研究が開始された。
【００４９】
病原性モチーフ（図６Ａ、Ｂ参照）から異なるアミノ酸残基を比較することで、次の驚くべきことが見出された、即ち、不安定非病原性株（容易に病原性変異体へ変化する）は全てＶＰ２タンパク質の位置２５２にＶａｌ残基を持ち、前記Ｇ７００株はその位置ではＡｓｎを持つ、ということである。さらに、不安定性株のそれぞれ及び全ては、ＶＰ２タンパク質の位置２８１にＴｈｒを持ち、一方でＧ７００株はこの位置でＳｅｒ残基を持つ。次のこと、即ち、不安定性非病原性株の全てはＶＰ２タンパク質の位置２８２にＡｓｎ残基を持ち、位置３１９にＡｌａ残基を持つ一方で、Ｇ７００株は位置２８２でＡｓｐ残基を持ち位置３１９でＧｌｕ残基を持つことが見出された（実施例２及び３）。
【００５０】
まとめると、前記知見は、前記Ｇ７００株は安定であり、感受性宿主内で３継代後でも病原性には変化しない、ということを示す。ＩＰＮウイルスの安定性モチーフがまた同定され、それは２５２、２８１，２８２及び３１９残基からなり、そのＡｓｎ２５２Ｓｅｒ２８１Ａｓｐ２８２Ｇｌｕ３１９は遺伝子安定性に関連し（実施例２）、一方でＶａｌ２５２Ｔｈｒ２８１Ａｓｎ２８２Ａｌａ３１９は不安定性に関連している（実施例３）。
【００５１】
さらなる研究が、大西洋サケ（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ  Ｌ．）幼魚でのＧ７００の保護効果を試験するために開始された。これに加えて、現場株の病原性が、ＩＰＮの臨床的流行を起こさないことを確認するために、ＩＰＮに最も感受性の高い発達の段階で、ワクチン接種（Ｇ７００株への暴露）されたが感染しなかった幼魚の死亡率をモニタすることで試験された（実施例１）。
【００５２】
給餌開始後４日、魚の１つの群を、２ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌのＧ７００株の投与量で浸漬することで免疫した。第２の群は、給餌開始後４日後（８日）、同じ投与量でワクチン接種した。ワクチン接種していないコントロール群と共にこれらのワクチン接種された群は、給餌開始後１４日で、病原性株の２ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌの投与量で感染させた。Ｇ７００を用いる免疫の結果として死亡率を試験するために、それぞれの群での１つのタンクは感染させずに残した。
【００５３】
サンプリングはワクチン接種前に行われ、全ての魚がこの研究の設定でＩＰＮを持たないことを確認した。第２のサンプリングは、感染直前の給餌開始後１４日で実施され、キャリア状況がワクチン接種された魚で発症したかどうかを確認した。前記サンプリングが前記感染後２及び４週で繰り返された。死亡率が毎日記録された。
【００５４】
Ｇ７００株で免疫した幼魚は感染しており、研究の期間ずっとそうであった。前記魚は、感染前は臨床的及び実験室観察（組織学を用いる）により、病気のいかなる兆候も示さなかった。
【００５５】
免疫群１は、免疫群２よりも感染に対してわずかに優れた保護を持ち、これは死亡率及び組織学から確認された。累積死亡率での違いは、群１及び２で約１．５％であり、相対パーセント生存率（ＲＰＲ）値はそれぞれ８８及び８２であり、このことは高いレベルの保護を確認するものでる。
【００５６】
群１からの、感染後１４日でサンプリングからの組織学結果は、全６のうちの１つの魚が病理学的兆候を示した。群２では、６のうち５が組織学変化を示した。これらの結果は、幼魚への給餌開始後早期に免疫することがより高い保護を与えることとなることを示唆する。
【００５７】
非ワクチン接種群は病原性株を感染させると、平均で３３％を超える死亡率を持つ。ＩＰＮによる死亡した魚の内部器官のウイルスの存在は、免疫組織化学により確認された（データは示されていない）。
【００５８】
結論として、感染させなかった免疫群は非常に低い死亡率であり（１．５％未満の累積死亡率）、組織学的／免疫組織化学的に病気に症状を全く示さなかったことから、ワクチンとして使用されたウイルス株（Ｇ７００）は明らかに非病原性である。
【００５９】
従って、本発明の第１の側面は、生非病原性膵臓壊死ウイルス（ＩＰＮＶ）に関し、これは好ましくは、ＩＰＮＶに感受性であることが知られる宿主で少なくとも３継代後でも病原性ウイルスへ変化しない。
【００６０】
ここで使用されるウイルスへ適用される用語「生」は、適切な宿主を感染させる能力を維持するウイルスを意味する（不活性化又はサブユニットワクチンとは反対に）。
【００６１】
ここで使用されるウイルスへ適用される用語「非病原性」とは、魚に侵入する能力、即ちウイルスの通常の経路で魚に浸透し、魚の体内再生成され、実質的に変化することがないけれども、前記株に感染した魚を死亡させる能力を実質的に失った、好ましくは完全に失った、ウイルス株を意味するものと理解される。
【００６２】
ウイルスに適用される「感染性」とは、ウイルスが再生産される能力を持つことを示す。前記ウイルスは病原性、非病原性であり、なお感染性であり得る。
【００６３】
用語「膵臓壊死ウイルス（ＩＰＮＶ）」は、ＩＰＮの原因物であり、アクアビルナウイルス属、ビルナウイルス科の１つである。
【００６４】
ウイルスに適用される用語「病原性」とは、前記ウイルスが病原性であって、その宿主の病気を起こすことを意味する。
【００６５】
非病原性ウイルスに適用される用語「病原性ウイルスへ戻る」とは、非病原性ウイルスが、天然に起こる過程により病原性ウイルス（前記ウイルスが宿主に病気を起こすことを意味する）へ戻る過程を意味する（通常は、ＶＰ２タンパク質の位置２１７及び／又は２２１での突然変異）。
【００６６】
好ましくは前記ウイルスは、ＩＰＮＶに感受性であることが知られる宿主で、３，５，１０，１５，２０，２５，３０，３５又は５０継代後病原性ウイルスへは戻らない。より好ましくは、前記ウイルスは、ＩＰＮＶに感受性であることが知られる宿主で、少なくとも３，５，１０，１５，２０，２５，３０，３５又は５０継代後でも病原性ウイルスへは戻らない。最も好ましくは前記ウイルスは、病原性ウイルスへ戻らない。
【００６７】
本発明の第１の側面によるひとつの実施態様では、前記宿主は大西洋サケ（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ  Ｌ．）幼魚であり、好ましくはＡｑｕａＧｅｎ品種である。
【００６８】
本発明の第１の側面による前記生非病原性ＩＰＮＶが、力価２ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌで、淡水で温度１２℃で保持した大西洋サケを浸漬することで投与される場合、ＴＧ−２細胞で再分離することで、前記幼魚をウイルス陽性にする。しかし、前記幼魚は、前記ウイルスが無症状のレベルでのみ前記幼魚に存在することを示唆する組織学化学により測定されるとウイルス陰性となる。
【００６９】
ここで使用される用語「ＴＣＩＤ５０」は、接種組織培養細胞の５０％で細胞変性効果を生じるために必要とされるウイルスの量を意味する。細胞中のウイルス感染は複雑であり、宿主細胞に多くの変化を与える結果となり、これはまとめて細胞変性効果（ＣＰＥ）として知られている。この変化は、形状変化、基板からの脱離、溶解、膜融合、膜透過性変性、封入体及びアポトーシスを含む。前記ＴＣＩＤ５０値を決定するために使用される方法は、当業者によく知られている（Ｂｅｉｔｒａｇ  ｚｕｒ  ｋｏｌｌｅｋｔｉｖｅｎ  Ｂｅｈａｎｄｌｕｎｇ  ｐｈａｒｒｎａｋｏｌｏｇｉｓｃｈｅｒ  Ｒｅｉｈｅｎｖｅｒｓｕｅｃｈｅ，  Ｋａｅｒｂｅｒ．Ｇ．，Ｖｏｌ．１６２，１９３１）。
【００７０】
前記ウイルスは無症状で前記幼魚に存在するけれども、本発明の第１の側面による前記生非病原性ＩＰＮＶは、特に本発明の前記第１の側面による前記生非病原性ＩＰＮＶへ暴露されなかった幼魚と比較して、ＩＰＮ疾患に対する保護を前記幼魚の与えることが示された。
【００７１】
さらに本発明の第１の側面による前記非病原性ＩＰＮＶを、力価２ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌで、淡水で温度１２℃で保持した大西洋サケを浸漬することで投与される場合、これは前記幼魚にＩＰＮ病の症状を全く発症させず、特に病理学的病変は、前記幼魚の膵臓を含む内部器官では観察されなかった（組織学的に。）
既に開示されたように、ＩＰＮＶは通常は２つの構造タンパク質を持ち、これらはＩＰＮＶカプシドを形成する。ＩＰＮＶのウイルスタンパク質（ＶＰ２）は、これらの２つの構造タンパク質の１つであり、型特異的モノクローナル抗体の産生に寄与することが示されている。これまで、ＶＰ２タンパク質の配列が、前記ウイルスが病原性又は非病原性かどうかを決定することが示唆されてきたが、後者の場合には、ここで、ＶＰ２タンパク質のあるアミノ酸が、前記非病原性ウイルスが病原性ウイルスへ戻るかを決定するために重要であることが示された。
【００７２】
従って、本発明の第１の側面によるひとつの実施態様では、前記非病原性ＩＰＮＶは成熟構造タンパク質（例えば成熟ＶＰ２）又はその前駆体（例えば前駆体ＶＰ２）をコードする核酸を含み、前記構造タンパク質は、前記非病原性ウイルスを、ＩＰＮＶ感受性であるとして知られている宿主で少なくとも３継代後でも病原性ウイルスへ戻さないようにするものである。
【００７３】
ここで使用される用語「核酸」とは、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、特にＲＮＡを意味する。
【００７４】
ここでウイルスへ適用される用語「構造タンパク質」とは、前記成熟ウイルスの構造成分（通常はカプシド成分）であるウイルスタンパク質を意味する。
【００７５】
ここで使用される用語「前駆体タンパク質」とは、翻訳後修飾及び／又は共翻訳的修飾でその成熟型に変化するタンパク質を意味する（例えば前駆体ＶＰ２−＞成熟ＶＰ２）。
【００７６】
前記成熟構造タンパク質は好ましくはＩＰＮＶカプシドを形成する前記２つの構造タンパク質の１つであり、より好ましくは前記ＩＰＮＶカプシドの外側部分を形成するタンパク質である。ひとつの好ましい実施態様では、前記成熟構造タンパク質は、型特異的モノクローナル抗体を前記ウイルス感染した宿主内で産生させるタンパク質である。最も好ましい実施態様では、前記構造タンパク質はＶＰ２タンパク質である。
【００７７】
さらには、既に説明したように、前記不安定非病原性株は全てＶＰ２タンパク質の２５２位置にＶａｌを持ち、前記Ｇ７００株はその位置にＡｓｎを持つ、という驚くべきことが見出された。
【００７８】
従って、本発明の第１の側面のひとつの実施態様では、前記ウイルスはＶＰ２をコードする核酸を持ち、前記ＶＰ２タンパク質の２５２位置のアミノ酸がＶａｌである。
【００７９】
本発明の第１の側面の実施態様では、前記ウイルスはＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含み、前記ＶＰ２タンパク質の２５２位置でのアミノ酸残基が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；好ましくは、Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択され；最も好ましくは２５２位置のアミノ酸残基はＡｓｎである。
【００８０】
さらに、前記不安定非病原性株のそれぞれ及び全ては、ＶＰ２タンパク質の２８１位置にＴｈｒ残基を持ち、一方Ｇ７００株はこの位置でＳｅｒ残基を持つ。
【００８１】
従って、本発明による他の好ましい実施態様は、生非病原性ＩＰＮＶに関し、これは成熟ＶＰ２及び／又は前駆体ＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含み、前記タンパク質は好ましくは、前記非病原性ウイルスを、ＩＰＮＶに感受性であることが知られている宿主で少なくとも３継代後でも病原性ウイルスへ戻さず、前記成熟ＰＶ２及び／又は前駆体ＰＶ２タンパク質の２８１位置のアミノ酸が、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され：好ましくはＳｅｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；及び最も好ましくは２８１位置のアミノ酸がＳｅｒである。
【００８２】
本発明の第１の側面によるひとつの実施態様では、前記ウイルスはＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含み、前記ＶＰ２タンパク質の２８１位置のアミノ酸がＴｈｒではない。
【００８３】
次の知見が得られた、即ち、非病原性株の全ては、ＶＰ２タンパク質で２８２位置でＡｓｎを含み、３１９位置でＡｌａを含み、一方でＧ７００株は２８２位置でＡｓｐ残基、３１９位置でＧｌｕ残基を持つ。
【００８４】
従って、本発明の他の好ましい実施態様は、生非病原性ＩＰＮＶに関し、これは成熟ＶＰ２及び／又は前駆体ＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含み、前記タンパク質は好ましくは、前記非病原性ウイルスを、ＩＰＮＶに感受性であることが知られている宿主で少なくとも３継代後でも病原性ウイルスへ戻さず、前記成熟ＰＶ２及び／又は前駆体ＰＶ２タンパク質の２８２位置でもアミノ酸が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ及びＧｌｕからなる群から選択され：及び最も好ましくは成熟ＶＰ２及び／又は前駆体ＶＰ２タンパク質の２８２位置のアミノ酸がＡｓｐである。
【００８５】
本発明の第１の側面のひとつの実施態様では、前記ウイルスはＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含み、前記ＶＰ２タンパク質の２８２位置のアミノ酸がＡｓｎではない。
【００８６】
本発明による他の好ましい実施態様は、生非病原性ＩＰＮＶに関し、これは成熟ＶＰ２及び／又は前駆体ＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含み、前記タンパク質は好ましくは、前記非病原性ウイルスを、ＩＰＮＶに感受性であることが知られている宿主で少なくとも３継代後でも病原性ウイルスへ戻さず、前記成熟ＰＶ２及び／又は前駆体ＰＶ２タンパク質の３１９位置でもアミノ酸が、Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる群から選択され：及び最も好ましくは前記成熟ＶＰ２及び前駆体ＶＰ２タンパク質の３１９位置のアミノ酸がＧｌｕである。
【００８７】
本発明の第１の側面によるひとつの実施態様では、前記ウイルスは、ＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含み、前記ＶＰ２タンパク質の３１９位置でのアミノ酸がＡｌａではない。
【００８８】
ひとつの特に好ましい実施態様は、生非病原性ＩＰＮＶに関し、これは成熟ＶＰ２及び前駆体ＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含み、前記タンパク質は好ましくは、前記非病原性ウイルスを、ＩＰＮＶに感受性であることが知られている宿主で少なくとも３継代後でも病原性ウイルスへ戻さず、前記成熟ＰＶ２及び／又は前駆体ＰＶ２タンパク質が位置２１７でＰｒｏ残基を持ち；位置２２１でＴｈｒ残基を持ち；位置２５２でＡｓｎ残基を持ち；位置２８１でＳｅｒ残基を持ち；位置２８２でＡｓｐ残基を持ち；及び位置３１９でＧｌｕを持つ。
【００８９】
前記Ｇ７００前駆体及び成熟ＶＰ２タンパク質のアミノ酸配列が、配列のアミノ酸残基１−５０８及び１−４４２で表されている。
【００９０】
従って、本発明の第１の側面によるひとつの好ましい実施態様では、前記非病原性ＩＰＮＶは配列番号１のアミノ酸残基２５２−２８２で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一性を持つアミノ酸配列を含むＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含み；
−好ましくは前記残基２５２が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；より好ましくはＡｓｎ又はＧｌｎであり、最も好ましくはＡｓｎである；及び／又は
−好ましくは前記残基２８１が、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；より好ましくはＳｅｒ又はＣｙｓであり、最も好ましくはＳｅｒである；及び／又は
−好ましくは前記残基２８２が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ及びＧｌｕからなる群から選択され；最も好ましくはＡｓｐである；及び／又は
−好ましくは前記残基２１７が、Ｐｒｏであり；及び／又は
−好ましくは前記残基２２１が、Ｔｈｒであり；前記タンパク質が好ましくは、前記非病原性ウイルスを、ＩＰＮＶに感受性であることが知られている宿主で少なくとも３継代後でも病原性ウイルスへ戻さない。
【００９１】
用語「配列同一性」とは、同じ長さの２つのアミノ酸の間で、又は等しい長さの２つの塩基配列の間で同一性の程度についての定量的尺度を示す。比較される２つの配列は、ギャップの挿入又は代わりに前記タンパク質配列の末端での切り捨てを含めてできるだけ最大可能な適合となるように整列させることが必要である。配列同一性は、（Ｎｒｅｆ−Ｎｄｉｆ）＊１００／Ｎｒｅｆで計算され、ここでＮｄｉｆは、整列される際の２つの配列の非同一残基の総数であり、前記Ｎｒｅｆは前記配列の１つにおける残基の数である。ギャップは、前記特定の残基の非同一として計算される。配列同一性は、それに代えて、ＢＬＡＳＴプログラムで計算され、例えば以下のＢＬＡＳＴプログラムである（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ  １９８８、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ）。
【００９２】
本発明の１つの実施態様では、整列は、配列整列方法ＣｌｕｓｔａｌＷと、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊらの記載する既定のパラメータを用いて実行し得る（１９９４、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）。
【００９３】
本発明の第１の側面によるひとつの特に好ましい実施態様では、前記非病原性ＩＰＮＶは配列番号１のアミノ酸残基２５２−３１９で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一性を持つアミノ酸配列を含むＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含み；
−好ましくは前記残基２５２が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；より好ましくはＡｓｎ又はＧｌｎであり、最も好ましくはＡｓｎである；及び／又は
−好ましくは前記残基２８１が、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；より好ましくはＳｅｒ又はＣｙｓであり、最も好ましくはＳｅｒである；及び／又は
−好ましくは前記残基２８２が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ及びＧｌｕからなる群から選択され；最も好ましくはＡｓｐである；及び／又は
−好ましくは前記残基２３１９が、Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる群から選択され；最も好ましくはＧｌｕである；及び／又は
−好ましくは前記残基２１７はＰｒｏであり；及び／又は
−好ましくは前記残基２２１はＴｈｒであり；
前記タンパク質が好ましくは、前記非病原性ウイルスを、ＩＰＮＶに感受性であることが知られている宿主で少なくとも３継代後でも病原性ウイルスへ戻さない。
【００９４】
本発明の第１の側面のひとつの特に好ましい実施態様では、
前記非病原性ＩＰＮＶは配列番号１のアミノ酸残基２００−３１９で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一性を持つアミノ酸配列を含むＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含み；
−好ましくは前記残基２５２が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；より好ましくはＡｓｎ又はＧｌｎであり、最も好ましくはＡｓｎである；及び／又は
−好ましくは前記残基２８１が、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；より好ましくはＳｅｒ又はＣｙｓであり、最も好ましくはＳｅｒである；及び／又は
−好ましくは前記残基２８２が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ及びＧｌｕからなる群から選択され；最も好ましくはＡｓｐである；及び／又は
−好ましくは前記残基３１９が、Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる群から選択され；最も好ましくはＧｌｕである；及び／又は
−好ましくは前記残基２１７が、Ｐｒｏであり；及び／又は
−好ましくは前記残基２２１が、Ｔｈｒであり；
前記タンパク質が好ましくは、前記非病原性ウイルスを、ＩＰＮＶに感受性であることが知られている宿主で少なくとも３継代後でも病原性ウイルスへ戻さない。
【００９５】
本発明の第１の側面によるひとつの特に好ましい実施態様では、前記非病原性ＩＰＮＶは配列番号１のアミノ酸残基１５０−３１９で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一性を持つアミノ酸配列を含むＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含み；
−好ましくは前記残基２５２が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；より好ましくはＡｓｎ又はＧｌｎであり、最も好ましくはＡｓｎである；及び／又は
−好ましくは前記残基２８１が、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；より好ましくはＳｅｒ又はＣｙｓであり、最も好ましくはＳｅｒである；及び／又は
−好ましくは前記残基２８２が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ及びＧｌｕからなる群から選択され；最も好ましくはＡｓｐである；及び／又は
−好ましくは前記残基３１９が、Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる群から選択され；最も好ましくはＧｌｕである；及び／又は
−好ましくは前記残基２１７はＰｒｏであり；及び／又は
−好ましくは前記残基２２１はＴｈｒであり；
前記タンパク質が好ましくは、前記非病原性ウイルスを、ＩＰＮＶに感受性であることが知られている宿主で少なくとも３継代後でも病原性ウイルスへ戻さない。
【００９６】
本発明の第１の側面のひとつの特に好ましい実施態様では、前記非病原性ＩＰＮＶは配列番号１のアミノ酸残基１００−３１９で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一性を持つアミノ酸配列を含むＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含み；
−好ましくは前記残基２５２が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；より好ましくはＡｓｎ又はＧｌｎであり、最も好ましくはＡｓｎである；及び／又は
−好ましくは前記残基２８１が、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；より好ましくはＳｅｒ又はＣｙｓであり、最も好ましくはＳｅｒである；及び／又は
−好ましくは前記残基２８２が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ及びＧｌｕからなる群から選択され；最も好ましくはＡｓｐである；及び／又は
−好ましくは前記残基３１９が、Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる群から選択され；最も好ましくはＧｌｕである；及び／又は
−好ましくは前記残基２１７が、Ｐｒｏであり；及び／又は
−好ましくは前記残基２２１が、Ｔｈｒであり；
前記タンパク質が好ましくは、前記非病原性ウイルスを、ＩＰＮＶに感受性であることが知られている宿主で少なくとも３継代後でも病原性ウイルスへ戻さない。
【００９７】
本発明の第１の側面によるひとつの特に好ましい実施態様では、前記非病原性ＩＰＮＶは配列番号１のアミノ酸残基１００−３５０で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一性を持つアミノ酸配列を含むＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含み；
−好ましくは前記残基２５２が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；より好ましくはＡｓｎ又はＧｌｎであり、最も好ましくはＡｓｎである；及び／又は
−好ましくは前記残基２８１が、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；より好ましくはＳｅｒ又はＣｙｓであり、最も好ましくはＳｅｒである；及び／又は
−好ましくは前記残基２８２が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ及びＧｌｕからなる群から選択され；最も好ましくはＡｓｐである；及び／又は
−好ましくは前記残基３１９が、Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる群から選択され；最も好ましくはＧｌｕである；及び／又は
−好ましくは前記残基２１７はＰｒｏであり；及び／又は
−好ましくは前記残基２２１はＴｈｒであり；
前記タンパク質が好ましくは、前記非病原性ウイルスを、ＩＰＮＶに感受性であることが知られている宿主で少なくとも３継代後でも病原性ウイルスへ戻さない。
【００９８】
本発明の第１の側面のひとつの特に好ましい実施態様では、前記非病原性ＩＰＮＶは配列番号１のアミノ酸残基５０−３５０で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一性を持つアミノ酸配列を含むＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含み；
−好ましくは前記残基２５２が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；より好ましくはＡｓｎ又はＧｌｎであり、最も好ましくはＡｓｎである；及び／又は
−好ましくは前記残基２８１が、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；より好ましくはＳｅｒ又はＣｙｓであり、最も好ましくはＳｅｒである；及び／又は
−好ましくは前記残基２８２が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ及びＧｌｕからなる群から選択され；最も好ましくはＡｓｐである；及び／又は
−好ましくは前記残基３１９が、Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる群から選択され；最も好ましくはＧｌｕである；及び／又は
−好ましくは前記残基２１７が、Ｐｒｏであり；及び／又は
−好ましくは前記残基２２１が、Ｔｈｒであり；
前記タンパク質が好ましくは、前記非病原性ウイルスを、ＩＰＮＶに感受性であることが知られている宿主で少なくとも３継代後でも病原性ウイルスへ戻さない。
【００９９】
本発明の第１の側面によるひとつの特に好ましい実施態様では、前記非病原性ＩＰＮＶは配列番号１のアミノ酸残基５０−４００で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一性を持つアミノ酸配列を含むＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含み；
−好ましくは前記残基２５２が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；より好ましくはＡｓｎ又はＧｌｎであり、最も好ましくはＡｓｎである；及び／又は
−好ましくは前記残基２８１が、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；より好ましくはＳｅｒ又はＣｙｓであり、最も好ましくはＳｅｒである；及び／又は
−好ましくは前記残基２８２が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ及びＧｌｕからなる群から選択され；最も好ましくはＡｓｐである；及び／又は
−好ましくは前記残基３１９が、Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる群から選択され；最も好ましくはＧｌｕである；及び／又は
−好ましくは前記残基２１７はＰｒｏであり；及び／又は
−好ましくは前記残基２２１はＴｈｒであり；
前記タンパク質が好ましくは、前記非病原性ウイルスを、ＩＰＮＶに感受性であることが知られている宿主で少なくとも３継代後でも病原性ウイルスへ戻さない。
【０１００】
本発明の第１の側面のひとつの特に好ましい実施態様では、前記非病原性ＩＰＮＶは配列番号１のアミノ酸残基１−４４２で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一性を持つアミノ酸配列を含むＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含み；
−好ましくは前記残基２５２が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；より好ましくはＡｓｎ又はＧｌｎであり、最も好ましくはＡｓｎである；及び／又は
−好ましくは前記残基２８１が、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；より好ましくはＳｅｒ又はＣｙｓであり、最も好ましくはＳｅｒである；及び／又は
−好ましくは前記残基２８２が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ及びＧｌｕからなる群から選択され；最も好ましくはＡｓｐである；及び／又は
−好ましくは前記残基３１９が、Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる群から選択され；最も好ましくはＧｌｕである；及び／又は
−好ましくは前記残基２１７が、Ｐｒｏであり；及び／又は
−好ましくは前記残基２２１が、Ｔｈｒであり；
前記タンパク質が好ましくは、前記非病原性ウイルスを、ＩＰＮＶに感受性であることが知られている宿主で少なくとも３継代後でも病原性ウイルスへ戻さない。
【０１０１】
本発明の第１の側面によるひとつの特に好ましい実施態様では、前記非病原性ＩＰＮＶは配列番号１のアミノ酸残基１−５０８で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一性を持つアミノ酸配列を含むＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含み；
−好ましくは前記残基２５２が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；より好ましくはＡｓｎ又はＧｌｎであり、最も好ましくはＡｓｎである；及び／又は
−好ましくは前記残基２８１が、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；より好ましくはＳｅｒ又はＣｙｓであり、最も好ましくはＳｅｒである；及び／又は
−好ましくは前記残基２８２が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ及びＧｌｕからなる群から選択され；最も好ましくはＡｓｐである；及び／又は
−好ましくは前記残基３１９が、Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる群から選択され；最も好ましくはＧｌｕである；及び／又は
−好ましくは前記残基２１７はＰｒｏであり；及び／又は
−好ましくは前記残基２２１はＴｈｒであり；
前記タンパク質が好ましくは、前記非病原性ウイルスを、ＩＰＮＶに感受性であることが知られている宿主で少なくとも３継代後でも病原性ウイルスへ戻さない。
【０１０２】
本発明の第１の側面のひとつの特に好ましい実施態様では、前記非病原性ＩＰＮＶは配列番号１のアミノ酸残基１−４４２で表されるアミノ酸配列又は配列番号１の残基１−５０８で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一性を持つアミノ酸配列を含むＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含む；ただし：
−残基２５２が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；最も好ましくはＡｓｎである；
−残基２８１が、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；最も好ましくはＳｅｒである；
−残基２８２が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ及びＧｌｕからなる群から選択され；最も好ましくはＡｓｐである；及び
−残基２２１がＴｈｒである。
【０１０３】
さらに、位置２５２のアミノ酸がバリンでないことが好ましい。
【０１０４】
これまで説明したように、中程度から軽度の病原性株は、成熟ＶＰ２内にＰｒｏ２１７及びＡｌａ２２１を持ち；及び位置２１７の残基にかかわらずＴｈｒ２２１を含む株はほとんど常に非病原性である。
【０１０５】
従って、本発明の第１の側面によるひとつの実施態様は、生非病原性感染性膵臓壊死ウイルスであり；前記ウイルスは、前駆体ＶＰ２タンパク質及び／又は成熟ＰＶ２タンパク質をコードする核酸を含み、前記タンパク質は、好ましくは、前記非病原性ウイルスを、ＩＰＮＶに感受性であることが知られている宿主で少なくとも３継代後でも病原性ウイルスへ戻さず；前記前駆体ＰＶ２タンパク質及び／又はＶＰ２タンパク質が好ましくは、位置２１７でＰｒｏ残基を持ち及び／又は位置２２１でＴｈｒ残基を持ち、より好ましくは少なくとも位置２２１でＴｈｒを持つ。
【０１０６】
ひとつの実施態様では、前駆体ＶＰ２タンパク質及び／又はＶＰ２タンパク質の位置２１７のアミノ酸はＴｈｒ残基ではなく、及び／又は前駆体ＶＰ２タンパク質及び／又はＶＰ２タンパク質の位置２２１のアミノ酸はＡｌａ残基ではない。
【０１０７】
本発明によるひとつの好ましい実施態様では、前記成熟ＶＰ２タンパク質及び／又は前駆体ＰＶ２タンパク質は、配列番号１のアミノ酸残基２００−３１９で表されるアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸残基２００−３１９で表されるアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸残基１５０−３１９で表されるアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸残基１００−３１９で表されるアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸残基１００−３５０で表されるアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸残基５０−３００で表されるアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸残基５０−３５０で表されるアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸残基５０−４００で表されるアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸残基１−４４２で表されるアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸残基１−５０８で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一性を持つアミノ酸配列を含むＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含み；ただし：
−残基２５２が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；より好ましくはＡｓｎ又はＧｌｎであり、最も好ましくはＡｓｎである；及び／又は
−残基２８１が、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ及びＣｙｓからなる群から選択され；より好ましくはＳｅｒ又はＣｙｓであり、最も好ましくはＳｅｒである；及び／又は
−残基２８２が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ及びＧｌｕからなる群から選択され；より好ましくはＡｓｐである；及び／又は
−残基３１９が、Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる群から選択され；最も好ましくはＧｌｕである；及び／又は
−残基２１７はＰｒｏであり；及び／又は
−残基２２１はＴｈｒであり；
前記タンパク質が好ましくは、前記非病原性ウイルスを、ＩＰＮＶに感受性であることが知られている宿主で少なくとも３継代後でも病原性ウイルスへ戻さない。
【０１０８】
ひとつの好ましい実施態様では、前記配列同一性は、少なくとも８５％配列同一、少なくとも９０％配列同一、少なくとも９５％配列同一及び１００％配列同一性からなる群から選択される。
【０１０９】
ひとつの特に好ましい実施態様では、前記成熟ＶＰ２及び／又は前駆体ＰＶ２タンパク質は、配列番号１の残基１−４４２で表されるアミノ酸配列を含む。
【０１１０】
特に好ましい実施態様では、前記成熟ＶＰ２タンパク質は配列番号１の残基１−４４２で表されるアミノ酸配列からなり、前記前駆体ＶＰ２タンパク質は配列番号１−５０８で表されるアミノ酸配列からなる。
【０１１１】
Ｇ７００株の前駆体ＶＰ２及び成熟ＶＰ２アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸残基１−５０８及び１−４４２に表されており；ここで使用されるアミノ酸の番号付与のために便宜的参照が与えられている。当業者は、他の前駆体ＶＰ２及び成熟ＶＰ２タンパク質の対応する位置を容易に識別するであろう。
【０１１２】
既に説明したように、ＩＰＮＶのゲノムセグメントはｐＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３の順で１０６ｋＤａ前駆体ポリタンパク質をコードしている。タンパク質をコードする核酸を参照する場合、理解されるべきことは、タンパク質がポリタンパク質の一部であるポリタンパク質をコードする核酸がまた含まれていることを意味する、ということである。
【０１１３】
ポリタンパク質の形でタンパク質をコードする核酸の場合には、前記ウイルスはまた、前記ポリタンパク質を別々のタンパク質に分離するための手段を含むことが好ましい。従って、本発明の１つの実施態様では、前記ＩＰＮＶウイルスはさらに、ＮＳ−プロテアーゼをコードする核酸、例えばＶＰ４タンパク質をコードする核酸を含む。場合により、前記ポリタンパク質を別々のタンパク質に分離するための手段は前記宿主内に存在し得る。
【０１１４】
さらに、核酸が前駆体タンパク質（例えばｐＶＰ２）をコードしている場合、前記ウイルスがまた前記前駆体を成熟型（例えばｍＶＰ２）に変換させる手段を含むことが好ましい。場合により、前記前駆体を成熟型に変換させる手段が、宿主内に存在し得る。
【０１１５】
本発明の第１の側面による特に好ましい実施態様は、Ｇ７００株（ＩＰＮＶ−Ｇ７００）に関し、これは寄託番号ＥＣＡＣＣ番号１１０４１２０１又はこれに緊密に関連する株の関する。
【０１１６】
「緊密に関連する株」とは、前記寄託された株に遺伝子的及び／又は表現型的特徴が類似する株を意味する。特にこの用語は、実質的に同じ機能を維持するウイルスのわずかな変性型を含む。従って、例えば数個のアミノ酸又は塩基の付加、除去又は変更は、前記ウイルスの機能活性に非常にわずかな効果を与えるだけである。
【０１１７】
本発明の第１の側面の最も好ましい実施態様は、ＥＣＡＣＣ番号１１０４１２０１として寄託されたＧ７００株（ＤＰＮＶ−Ｇ７００）に関する。
【０１１８】
他の特に好ましい実施態様は、本発明の第１の側面による非病原性ＩＰＮＶに関し、これを、力価２ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌで、温度１２℃で、淡水での大西洋サケ幼魚を浸漬することで投与される場合、
−前記幼魚を、ＲＴＧ−２細胞で再分離することで測定してウイルス陽性とし；
−前記幼魚を、免疫組織化学により測定してウイルス陰性とし；
−前記幼魚を、好ましくは非感染幼魚に比較して、ＩＰＮ病に対して保護を与え；及び
−前記幼魚にＩＰＮ病の兆候を全く起こさせることがない。
【０１１９】
他の特に好ましい実施態様は、本発明の第１の側面による非病原性ＩＰＮＶに関し、これを、力価２ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌで、温度１２℃で、淡水での大西洋サケ幼魚を浸漬することで投与される場合、
−前記幼魚を、ＲＴＧ−２細胞で再分離することで測定してウイルス陽性とし；
−前記幼魚を、免疫組織化学により測定してウイルス陰性とし；
−前記幼魚を、好ましくは本発明の第１の側面の前記生非病原性ＩＰＮＶに暴露されていない幼魚に比較して、ＩＰＮ病に対して保護を与え；及び
−前記幼魚にＩＰＮ病の兆候を全く起こさせることがない。
【０１２０】
上で説明したように、Ｇ７００株に感染させた幼魚は、病原性株を持つ魚と混合した場合でもＩＰＮ病発症から保護されているように見える。この知見は、この現場株について、ＩＰＮに対する生非病原性ワクチンとしての可能性を明らかにした。
【０１２１】
従って、本発明の第２の側面はワクチンに関し、これは本発明の第１の側面の生非病原性ＩＰＮＶを含む。
【０１２２】
本発明の第３の側面は、本発明の第１の側面の前記生非病原性ＩＰＮＶのワクチンとしての使用に関する。
【０１２３】
本発明の第３の側面のひとつの好ましい実施態様では、本発明の第１の側面による前記生非病原性ＩＰＮＶは、幼魚及び／又はスモルト及び／又は魚のＩＰＮ病に対するワクチンとしての使用のためであり；より好ましくは幼魚のＩＰＮ病に対するワクチンである。
【０１２４】
本発明の第３の側面によるひとつの特に好ましい実施態様では、本発明の第１の側面による前記生非病原性ＩＰＮＶはＩＰＮ病に対する幼魚のワクチンのためである。
【０１２５】
本発明の第３の側面によるひとつの好ましい実施態様では、前記ワクチンは、浸漬又は経口で投与され；より好ましくは幼魚を浸漬又は経口投与することで投与される。
【０１２６】
本発明の第３の側面の他の好ましい実施態様では、前記幼魚は、前記非病原性ＩＰＮＶでワクチン接種した後少なくとも１０日の間は病原性ＩＰＮＶのない環境に維持される。
【０１２７】
本発明の第３の他の好ましい実施態様では、前記ウイルス又はワクチンは、幼魚に給餌を始めて遅くとも４日で投与される。
【０１２８】
本発明の第３の側面の他の好ましい実施態様では、ウイルス投与量が１ｘ１０４ＴＣＩＤ５０／ｍｌから１ｘ１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ；より好ましくは、５ｘ１０４ＴＣＩＤ５０／ｍｌから５ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ；より好ましくは１ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌから５ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌの範囲であり；及び最も好ましくは２ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌである。
【０１２９】
本発明はまたＩＰＮ棒の予防及び治療にための、本発明の第１の側面の生非病原性ＩＰＮＶ；又は本発明の第２の側面のワクチンに関する。
【０１３０】
本発明はまたＩＰＮ病の予防及び治療にための、本発明の第１の側面の生非病原性ＩＰＮＶ；又は本発明の第２の側面のワクチンに関し、投与が、注射、浸漬又飼料添加物により、好ましくは浸漬又は飼料添加物として、最も好ましくは浸漬による。
【０１３１】
本発明はまた、魚及び／又は幼魚の、特に幼魚のＩＰＮＶ病に予防及び治療のための、本発明の第１の側面による生非病原性ＩＰＮＶ；又は本発明の第２の側面によるワクチンに関する。
【０１３２】
本発明はまた、幼魚のＩＰＮＶの予防及び治療のための、本発明の第１の側面による生非病原性ＩＰＮＶ；又は本発明の第２の側面によるワクチンに関し、前記幼魚が、前記非病原性ＩＰＮＶでワクチン接種した後少なくとも１０日の間は病原性ＩＰＮＶのない環境に維持される。
【０１３３】
本発明はまた、幼魚のＩＰＮＶ病の予防及び治療のための本発明の第１の側面による生非病原性ＩＰＮＶ；又は本発明の第２の側面によるワクチンに関し、前記ウイルス又はワクチンは、幼魚に給餌を始めて遅くとも４日で投与される。
【０１３４】
本発明はまた、幼魚のＩＰＮＶ病の予防及び治療のための本発明の第１の側面による生非病原性ＩＰＮＶ；又は本発明の第２の側面によるワクチンに関し、ウイルス投与量が１ｘ１０４ＴＣＩＤ５０／ｍｌから１ｘ１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ；より好ましくは、５ｘ１０４ＴＣＩＤ５０／ｍｌから５ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ；より好ましくは１ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌから５ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌの範囲であり；及び最も好ましくは２ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌである。
【０１３５】
これまで、本発明は、説明の方法及び理解を明確にするという目的で詳細に記載されたが、当業者には、同様に、本発明は、広く均等な範囲の条件、処方及びその他のパラメータを変更することで実施され得ること、及びかかる修正又は変更は添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている、ということは明らかである。
【実施例】
【０１３６】
以下の実施例は本発明を製造し使用することを説明することを意味する。これらは本発明をいかなる意味でも限定することを意図するものではない。
【０１３７】
実施例１
ＩＰＮ−ワクチンの効果
ワクチン株
前記ワクチン株は、ここではＧ７００株と参照され、海の中の一歳魚から収集されたＩＰＮＶの現場単離物であった。前記ウイルスが単離された魚は臨床的に健康であり、ＩＰＮに罹患していなかった。前記ワクチン株は、ＲＴＧ−２細胞内で増殖させ、ＣＨＳＥ−２１４細胞で増量させた（力価：２．０ｘ１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１つのタンクにつき投与量：２．０ｍｌ、Ｌ−１５媒体を用いて１０ｍｌに希釈）。
【０１３８】
ＩＰＮＶ感染材料
ＩＰＮＶの感染株は、病原性Ｖ−１２４４株であった。この株をＲＴＧ−２細胞中で増殖させ、ＣＨＳＥ細胞で増量させた（力価：９．８ｘ１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１タンク当たりの投与量：２０ｍｌ）。
【０１３９】
試験被験物
使用された魚は野生サケ幼魚であり、合計約１５６０匹であり、Ｒａｕｍａ川由来であった。卵は、１０年以上の間、生遺伝子バンクＨａｕｋｖｉｋ、Ｓ−Ｔｒｏｎｄｅｌａｇに保存されている繁殖用魚からのものであった。卵はＶＥＳＯＶｉｋａｎ孵化場で孵化させ、給餌開示に合わせて研究所に移動された。魚はＳ−２００２により給餌された。
【０１４０】
実験の際の環境パラメータ
水質：淡水
温度：１２±１℃
酸素濃度：出口で最小８ｍｇ／Ｌ
流量：十分なｐＯ２を確保するための濃度に維持される（１分間に１タンク当たり０．１Ｌ）。
2014513932.tif 000005
結果、細胞培地によるウイルスの再単離及びＲＴ−ＰＣＲ
免疫群１Ａ−Ｄ及び２Ａ−Ｄと同様に非免疫群（３Ａ−Ｅ）を実験１４日での感染の前にサンプリングした。前記免疫群は、ＲＴＧ−２細胞での再単離後にＩＰＮＶについて陽性となった。これは陽性ＲＴＰＣＲ結果で確認された。非免疫群は、細胞培地及びＴＲ−ＰＣＲで陰性であった（表１）。
【０１４１】
前記サンプリングは、実験２８日後に繰り返された。前記結果は、免疫及び／又は感染群（群１Ａ−Ｄ、２Ａ−Ｄ、３Ａ−Ｃ）は前記ウイルスに陽性であった。非免疫及び非感染群（３Ｄ−Ｅ）は細胞培地で陰性であった。しかし１２サンプルの２つはＰＣＲで陽性となった（表１）。
【０１４２】
実験４２日での最後のサンプリングは、免疫群１及び２（１Ａ−Ｄ及び２Ａ−Ｃ）で陽性となったが、群２のサンプルの７つはＰＣＲで陽性が見出された。同様に、非免疫／感染群（３Ａ−Ｃ）での１８のサンプルの４はまたＰＣＲで陽性が認められたが、ウイルス再単離では陽性ではなかった。前記陰性コントロール（３Ｄ−Ｅ）は全て、細胞培地及びＲＴ−ＰＣＲで陰性であった（表１）。
【０１４３】
【表３】
2014513932.tif 000006
幼魚のウイルス再単離結果は異なる時点でサンプリングされた。ホモジネートが、細胞培地（ＲＴＧ−２）で接種して試験され、及びＣＰＥについて観察し、次いでＲＴ−ＰＣＲにより検証された。括弧内の数は、ＲＰ−ＰＣＲによってのみ陽性となった結果を表す（ＰＣＲは細胞培地よりも高感度である）。
【０１４４】
結果、死亡率
死亡率は、毎日記録され、死亡した魚（ある場合には）を毎日タンクから除いた。結果は図１及び図２に示される。
【０１４５】
実施例２
病原性及び遺伝子的安定性
ワクチン株のプラーク精製
ＩＰＮＶのプラークは、固体支持体としてアガロースゲル（ＳｅａＰｌａｑｕｅ）を用いてＣＨＳＥ−２１４細胞中でＧ７００株の段階希釈播種により得られた。３つのプラークが同定され、増殖させ、精製してクローン化した。これらの２つを、さらに前記ＶＰ２遺伝子の配列決定により特徴付けた。
【０１４６】
得られた結果は、両方のクローンのＶＰ２配列は塩基配列及びアミノ酸配列の１００％同一性を示し、オリジナルのＧ７００株と同一であった。前記クローンは、ウイルスモチーフでＰｒｏ２１７Ｔｈｒ２２１を持ち、低病原性単離物と整合していた。しかし、前記２つの１つのみを続く感染実験で用いた。
【０１４７】
Ｇ７００ＶＰ２の核酸配列が配列番号２に表され、Ｇ７００成熟ＶＰ２タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸残基１−４４２で表される。
【０１４８】
非病原性及び遺伝子的安定性
幼魚の感染は、既存の規制（生ウイルスワクチンの文章化のための一般ヨーロッパ薬局方モノグラフに基づく）の要求に合致する公認実験施設であるＶｅｓｏ−Ｖｉｋａｎで行われた。ＩＰＮＶに感受性であることが知られるＡｑｕａＧｅｎ繁殖種の大西洋サケが用いられた。幼魚は、給餌開始の時点でウイルス溶液に暴露された（感染）。最初の目的は、前記幼魚を６回前記ウイルスを継代させることであったが、幼魚の利用可能性の季節により３回の継代のみが実施できた。研究は、非連続的実験ブロックとして、次々に実験作業（次の実験に使用するためにウイルス再単離及び増殖）を行った。それぞれの実験は、それぞれの容器に１００幼魚の３つの平行実験を含む。１００幼魚を含む第４容器はまた、バックグラウンド死亡率に対するコントロールとして含まれた。ウイルス投与量は、約２ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌであり、給餌開始後約６日で浸漬により投与された。第１のサンプリングは、ウイルス暴露に続く２１日で行われた。サンプリング後、第１及び第３の実験ブロックで、幼魚をストレスの対象とした（１０分間容器内回りのネトペン（ｎｅｔｐｅｎ）の動きと組み合わせて容器内の水量を低下させ；これを毎日１週間続ける）。これらの幼魚は、最終サンプリングまで２８日以上観察された。死亡率は毎日記録された。
【０１４９】
図３は、それぞれの実験ブロックの終了時での全死亡率を示す。第１実験では、ストレスの前後で、コントロール群及び免疫群の両方で僅かなバックグラウンドを超える死亡率を示した。ストレス後、しかしながら、コントロールと比較して感染群で平均してさらに５匹の幼魚が死亡したが最終的には約９０％の幼魚が生存し、感染群とコントロールとの間には有意差（ｐ＝０．０５）は見られなかった。第２及び第３実験では、いずれの群でもほとんど幼魚は死亡せず、ストレスの対象とされた後（第３実験）でも、統計差は観察されなかった。
【０１５０】
組織学的に、病理学的病変は、ストレス前後で、幼魚の膵臓を含む内部器官で全く観察されなかった。さらに、前記ウイルスが再単離されたにもかかわらず、ＩＰＮウイルスは、免疫幼魚の全てにおいて免疫組織化学により検出されなかった。このことは、前記ウイルスは、無症状レベルで幼魚に存在したことを示唆する。再単離されたウイルスのＶＰ２配列は、この研究の前後で前記単離物（Ｇ７００）と１００％同一であった。ストレスの前の第２及び第３継代において、しかし、位置３３６でロイシンからフェニルアラニンの突然変異が観察された。これは保存突然変異であり、これは前記重要なモチーフの外に属することから、前記ウイルスの病原性には影響を与えない。これは、前記単離物に伴う低死亡率により支持される。また、前記突然変異は、第３実験で幼魚のストレスに続いて戻ったことも留意すべきである。
【０１５１】
実施例３
病原性及び遺伝子的不安定
細胞及びウイルス
Ｃｈｉｎｏｃｋサケ胚（細胞（ＣＨＳＥ−２１４；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１６８１）を、２０℃で、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｍｅｄｐｒｏｂｅ）、２ｍＬのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び５０μｇｍ−１ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＬ−１５培地（Ｓｉｇｎｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中に維持された。ニジマス生殖細胞（ＲＴＧ−２；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−５５）を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン及び５０μｇｍ−１ゲンタマイシンを含むＬ−１５培地中で増殖された。
【０１５２】
ウイルス単離物をＴＲＧ−２中で、１００μｌウイルス保存溶液（−２０℃、３０％黒請求項ロール中保存、力価約１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を、７０％コンフルーエントＴ−１６２ｃｍ２細胞培地フラスコ内で、接種して増殖させた。広範な細胞変性効果が見え、感染後５〜７日後、上澄みを回収した。細胞培地上澄みを、２５００ｘｇで１０分間遠心分離し、滅菌ろ過（０．２２μｌ）した後得られた。感染力価は、ＣＨＳＥ−２１４細胞の終点希釈により決定され、及び前記ＴＣＩＤ５０はＫａｒｂａｒの方法で評価された（１９３１  Ｂｅｉｔｒａｇｅ  ｚｕｒ  ｋｏｌｌｅｋｔｉｖｅｎ  Ｂｅｈａｎｄｌｕｎｇ  ｐｈａｒｍａｋｏｌｏｇｉｓｃｈｅｒ  Ｒｅｉｈｅｎｖｅｒｓｕｃｈｅ．Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａｒｍａｋｏｌ  １６２：４８０−４８３）。
【０１５３】
全長ｃＤＮＡクローンの構築
ＮＶＩ−０１５ＲＮＡセグメントＡ及びＢの全コード及び非−コード領域の全長ｃＤＮＡクローンの生成は、Ｙａ０及びＶａｋｈａｒｉａにより記載される手順に従って実施した（１９９８．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｃｌｏｎｅｄ  ｃＤＮＡ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８９１３−８９２０）。組み換えＩＰＮＶ  Ｓｐ単離物ｒＮＶＩ−１５ＰＡ（又はｒＮＶＩ１５ＶＰ２とされる）をＳｏｎｇらに記載されたように生成した（（２００５  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７９：１０２８９−１０２９９）。この組み換え単離物は、ｒＮＶＩ−１１５ＴＡ（又はｒＮＶＩ１５とされる）及びＳｐ１０３の５’末端から由来する。これは、親の単離物Ｓｐ１０３Ｐｒｏ２１７Ａｌａ２４７に類似する病原性モチーフを持つウイルス子孫の回復という結果を与えた（２００５．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７９：１０２８９−１０２９９）。Ｓｐ１０３は、ＩＰＮの流行現場から得られたＩＰＮＶ単離物であり、中程度から程度の死亡率の原因となる（２００５．  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ＶＰ５  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３４２：１３−２５；２００４．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３２２：３１−４０）。組み換えｒＮＶＴ１５ＰＡウイルスは、ＣＨＳＥ−２１４細胞で２回プラーク精製を行い、次にＴＲＧ−２細胞で増殖させて保存物を得た。前記ウイルスの核酸は、完全に配列決定され、細胞適用により注目すべき突然変異が起こっていなことを保証する。
【０１５４】
この遺伝子組み換えウイルス株は、ＲＴＧ−２単層で増殖させた。前記上澄みを回収し、２５００ｘｇで１０分間遠心分離して滅菌ろ過（０．２２μｌ）した。ＱＩＡａｍｐｍｉｎｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたＲＮＡ抽出を。製造者の指示書に従い行った。生成クローンが正しい残基を持つことを保証するために、セグメントＡ及びＢの遺伝子が、Ｙａｏ及びＶａｋｈａｒｉによる記載により配列決定し、前記クロマトグラムを解析した（１９９８．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｃｌｏｎｅｄ  ｃＤＮＡ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２：８９１３−８９２０）。
【０１５５】
プラーク精製アッセイ
ＶＰ２の残基２２１で前記最終突然変異ウイルスを生成するために、我々は、得られたＰｒｏＡｌａＡｌａ組み換えウイルスを、１０回（継代）ＣＨＳＥ−２１４細胞で継代させた（（２００５．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７９：１０２８９−１０２９９）。次に前記単離物を、細胞培地上澄みの１０倍希釈（１０−３から１０−８）で６ウェルプレートでＴＲＧ−２単層に接種することで精製した。室温で１時間後、前記接種物を除去し、細胞を０．８％ＳｅａＰａｌｑｕｅ  Ａｇａｒｏｓｅ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）で、５％のＦＢＳと１％のＬ−グルタミンを含む２ｘＬ−１５培地（Ｓｉｇｍａ）中に折り重ねた。細胞を１５℃で４日間インキュベーションし、細胞変性効果（ＣＰＥ）で形成されたプラークを、３ｍｍパンチ生検（Ｍｉｌｔｅｘ）を前記プラークへ前記アガーを貫通させて集めた。前記プラークは続いてＲＴＧ−２単層上に接種し、１５℃で完全にＣＰＥが観察されるまでインキュベーションした。次に上澄みを回収して、２５００ｘｇで１０分間遠心分離して滅菌ろ過した（０．２２μｌ）。ＲＮＡを、製造者の指示書の従い、ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキットを用いて抽出した。それぞれのウイルスのセグメントＡ及びＢの完全配列が前記説明したように決定された。クロマトグラフを検査して、Ｔｈｒ２２１をコードする「クリーン」ＡＴＴが前記研究で使用されたことを保証した。ｒＮＶＴ１５ＰＡに比較して前記ウイルスの全遺伝子で他の突然変異は見出されなかった。感染の前に、前記単離物をＲＴＧ−２細胞で１回継代することで増殖させた。
【０１５６】
持続的感染大西洋サケ幼魚の集団確立
前記感染は、Ｎｏｒｗａｙ、ＮａｍｓｏｓのＶＥＳＯ  Ｖｉｋａｎ研究施設で行われた。これは、ＶＥＳＯ  Ｖｉｋａｎ孵化施設で孵化させたＡｑｕｑＧｅｎ株の合計１０２０大西洋サケ「Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ  Ｌ）幼魚を含む大規模研究の一部であり、これら幼魚は本実験に含まれる。前記幼魚は最近給餌開始され（Ｍｉｃｒｏ  ０１５、Ｅｗｏｓ）、平均体重は０．２グラム（ｎ＝２０）であった。幼魚を４つの容器に分け、それぞれ２５０匹幼魚を含む。１週間の訓化期間後、感染先立ち幼魚を一日飢餓状態とした。
【０１５７】
魚は、５ｘ１０４ＴＣＩＤ５０／ｍｌの投与量でｒＮＶＴ１５ＰＴで、合計容量４リットル（タンク１）中に親戚させて感染させた。１つのコントロールタンクは、細胞培地を添加することで擬似感染とした（タンク２）。水は感染中通気した。３時間後、水容量は２リットルに減らし通常の流れに戻した。毎日、死亡率を記録し、死亡魚を回収し−７０℃で凍結した。感染後１０日それぞれのタンクから１０匹の魚をサンプリングし、この最初のサンプリング後、１月に一回、感染後６月まで１０匹の魚をサンプリングした。
【０１５８】
持続的感染魚からの再単離されたウイルス
保存料なしで−７０℃で保存された幼魚をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１：５、重量／体積）に加えてストマッカーでホモジナイズした。１００μｌのこのホモジネートを、２−メルカプトエタノール（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）を含む６００μｌＲＬＴ緩衝液へ移した。ホモジネートの残りを１：２で、２ｍＭのＬ−グルタミン及び５０μｇｍｌ−１ゲンタマイシンを含むＬ−１５培地に希釈した。２５００ｘｇで１０分間短く遠心分離した後、２４ウェルプレート中で成長させたＴＲＧ−２細胞に、最終希釈１％及び０．１％で摂取し、１５℃で１週間インキュベーションした。第１継代からの細胞培地を新たな単層を感染させるために使用した。前記サンプルは、ＣＰＥが、前記第２継代の１週間インキュベーション後に見られない場合に陰性と考えた。ＲＮＡを、細胞培地上の全ての陰性サンプルについての魚ホモジネートから、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の指示書に従い使用して、単離し、及びＳａｎｔｉらの記載の方法に少し修正して従い、ＲＴ−ＰＣＲを実施して、２２４−ｂｐＩＰＮＶ−特異的ＤＮＡ断片を増幅した（２００４  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３２２：３１−４０）。前記ＰＣＲ増幅物をアファロースゲル電気泳動により分離し、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｓａｆｅ  ＤＮＡゲル染色（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）で染色して可視化した。
【０１５９】
配列決定
ＲＮＡは、ホモジネーション後−７０℃で保存された２−メルカプトエタノールを含むＲＬＴ緩衝液に保存されたホモジネートから単離された（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）。ＲＴ−ＰＣＲは、Ｑｉａｇｅｎ  ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔを用いて、製造者の指示書に従い、０．５μｇＲＮＡ及びそれぞれ１５ｐｍｏｌのプライマーＡ−Ｓｐ５００Ｆ及びＡ−Ｓｐ１６８９Ｒ（２００４  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３２２：３１−４０）を用いて、合計反応容積２５μｌとなるようにして、４００−ｂｐＩＰＮＶ特異的ＤＮＡ断片を増幅した。サイクル条件は、５０℃で３０分、９０℃で１５分、次いで９４℃４５秒、５７℃４５秒、７２℃で２分、最後に７２℃で１０分を４０サイクルであった。ＰＣＲ増幅物はアガロースゲル電気泳動で分離し、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｓａｆｅ  ＤＮＡゲル染色で染色して分析した。
【０１６０】
アガロースゲルからの前記ＤＮＡ断片を精製するために、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｐｒｅｐ  Ｆｒｅｅｚ  Ｎ’  Ｓｑｕｅｅｚｅ  ＤＮＡ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を製造者の指示書の従い使用した。回収ＤＮＡは市販の配列決定サービス（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  ｏｐｅｏｎ）により、プライマーＡ−Ｓｏ５００Ｆ（２００４．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３２２：３１−４０）を用いて実施された。配列データは、ＶｅｃｔｒｏｎＮＴＩソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を用いて分析した。
【０１６１】
クローニング及び配列決定
位置２１７及び２２１での塩基の異なる混合を持つ４つのサンプルがクローニング及び配列決定のために選ばれた。配列決定ステップからのＴａｑポリメラーゼ増幅ＰＣＲ生成物を、ＴＯＰＯ（登録商標）Ｖｅｃｔｏｒ内に、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）内に、製造者の指示書に従い、クローニングした。前記ＯｎｅＳｈｏｔ（登録商標）Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を前記手順に従い移し、５０μｌを、白青選択のためのジメチルホルムアミド中４０μｌ４０ｍｇ  Ｘ−ｇａｌ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を含む、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有の前加熱アガープレート上に広げ、３７℃で３０分間プレインキュベーションした。８０−９６の白色コロニーをそれぞれのペトリ皿から選択し、それを１５０ｍｇアンピシリン（ＧＡＴＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含む９６ウェルアガープレートのそれぞれのウェルに入れた。プラスミドを分離し、市販の配列決定会社、ＧＡＴＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社により配列決定された。拝謁データは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェアを用いて分析された。
【０１６２】
結果
低病原性ＩＰＮＶ株ウイルスの構築
感染のために使用した単離物は、位置２１７、２２１及び２４７；ＰｒｏＴｈｒＡｌａのアミノ酸組み合わせを持っていた。位置２５２，２８１、２８２及び３１９のアミノ酸はＶａｌＴｈｒＡｌａであった。
【０１６３】
詳細には、オリジナルの構成ｐＵＣ１９ＮＶＩ１５ＶＰ２及びｐＵＣ１９ＮＶＩ１５Ｂの組み合わせを含む構成物は、ＮＶＩ−１５ＰＡで回復する結果となり（２００５．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７９：１０２８９−１０２９９）、これは続いて１０回継代して、ＶＰ２の位置２２１で突然変異を生じ（Ａｌａ２２１Ｔｈｒ）、ｒＮＶＴ１５ＰＴ単離物のプラーク精製後、ＰｒｏＴｈｒＡｌａアミノ酸の組み合わせを回復した、ことになる。
【０１６４】
前記回復されたウイルスの遺伝子ＲＮＡは、ＴＲ−ＰＣＲ精製後に分析され、前記ＲＴ−ＰＣＲ生成物の配列決定は、前記ＶＰ２及びＶＰ１領域で予想された突然変異を確認した。さらに、両方のウイルスのセグメントＡの完全塩基配列が決定され、これらはいかなる他の望ましくない置換を示さなかった。
【０１６５】
幼魚の持続感染
この研究で使用された感染投与量は、標準感染研究（２００４．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３２２：３１−４０）で使用されるものよりも低いが、これは幼魚の持続的感染と高い生存魚数（＞９５）を保持するためによる。実験の間全てのサンプリングされた魚の９４％が持続的に感染された。
【０１６６】
感染幼魚からのＩＰＮＶの再単離及び特徴付け
前記魚が感染し、持続的に感染していることを記録するために、感染後１−６月から３０日ごとに幼魚を回収した。その都度１０匹の魚を細胞培地及びＲＴ−ＰＣＲを用いて試験した。全体のＩＰＮＶは培地から再単離され、前記３つの群の９４％でＲＴ−ＰＣＲで検出された。ウイルス再分離又はＲＴ−ＰＣＲのいづれかで、全ての魚が感染後６月でも陽性であった。
【０１６７】
急性感染から持続的感染への進展は、ウイルスの超可変領域の遺伝子的複雑性を増加させ、特にＨＣＶ（（２０００．Ｔｈｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｉｒａｌ  ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ２８８：３３９−３４４．ｄｏｉ：８４４５［ｐｉｉ］）について記載されており、これは擬似種の伸展の結果となる。前記ＶＰ２タンパク質の超可変領域（アミノ酸位置１８０〜３６０）のウイルス遺伝子の複雑性及び前記持続期間の個々の魚での全ての突然変異を決定する目的で、全てのサンプリング時点でそれぞれの群からそれぞれ５匹から分離されたＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲで増幅され、及びＰＣＲ−増幅物をゲル電気泳動で精製され、配列が決定された。これは、前記ＰｒｏＴｈｒＡｌａ株は、ＰｒｏＴｈｒＡｌａ（感染単離物）及び新たなＴｈｒＡｌａＴｈｒ変異体の組み合わせを生じ、ＩＰＮＶの高病原性の戻った株を表す。
【図１】
2014513932.tif 000007
【図２】
2014513932.tif 000008
【図３】
2014513932.tif 000009
【図４】
2014513932.tif 000010
【図５】
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【図６ａ】
2014513932.tif 000012
【図６ｂ】
2014513932.tif 000013
【図７Ａ】
2014513932.tif 000014
【図７Ｂ】
2014513932.tif 000015
【配列表】
2014513932000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年1月24日(2013.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生非病原性ＩＰＮＶであり、ＩＰＮＶに感受性であることを知られている宿主で少なくとも３継代後で病原性ウイルスへ戻らず、
前記ウイルスは、成熟ＶＰ２タンパク質又は前駆体ＶＰ２タンパク質をコードする核酸を含み、前記タンパク質の位置２５２、２８１、２８２及び３１９のアミノ酸残基が、それぞれＡｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＧｌｕである、生非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項２】
請求項１に記載の生非病原性ＩＰＮＶであり、淡水中で、１２℃で、大西洋サケ幼魚に、力価２ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌで、浸漬することで投与されると、前記幼魚に、ＲＴＧ−２細胞で再単離により測定してウイルス陽性とする、生非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項３】
請求項１に記載の生非病原性ＩＰＮＶであり、淡水中で、１２℃で、大西洋サケ幼魚に、力価２ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌで、浸漬することで投与されると、前記幼魚に、非感染幼魚と比較してＩＰＮ秒に対する保護を与える、生非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項４】
請求項１に記載の生非病原性ＩＰＮＶであり、淡水中で、１２℃で、大西洋サケ幼魚に、力価２ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌで、浸漬することで投与されると、前記幼魚に、ＩＰＮ病の兆候を発現させない、生非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項５】
請求項１に記載の生非病原性ＩＰＮＶであり、前記ウイルスが、配列番号１の１−４４２残基で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を持つアミノ酸配列（ただし、２５２位、２８１位、２８２位及び３１９位のアミノ酸残基は、それぞれＡｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＧｌｕである）を含むタンパク質をコードする核酸を含む、生非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項６】
請求項１に記載の生非病原性ＩＰＮＶであり、前記タンパク質の２２１位のアミノ酸残基は、Ｔｈｒである、生非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項７】
請求項１に記載の生非病原性ＩＰＮＶであり、前記タンパク質の２１７位のアミノ酸残基は、Ｐｒｏある、生非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項８】
請求項１に記載の生非病原性ＩＰＮＶであり、ＩＰＮＶ−Ｇ７００として帰属される（寄託番号：ＥＣＡＣＣ−Ｎｏ．１１０４１２０１）、又は前記寄託された株と類似の遺伝子型及び／又は表現型の株である、生非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項９】
請求項１に記載の生非病原性ＩＰＮＶであり、力価２ｘ１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌで、淡水中に保持した大西洋サケ幼魚を１２℃で浸漬することで接種すると、
−前記幼魚をＲＴＧ−２細胞での再単離による測定でウイルス陽性とし：
−前記幼魚を免疫組織化学による測定でウイルス陰性とし：
−前記幼魚に、非感染幼魚と比較してＩＰＮＶ病に対する保護を与え；及び
−前記幼魚に、ＩＰＮ病の兆候を発現させない、生非病原性ＩＰＮＶ。
【請求項１０】
請求項１に記載の生非病原性ＩＰＮＶを含むワクチン。
【請求項１１】
請求項１に記載の生非病原性ＩＰＮＶの、ワクチンとしての使用。
【請求項１２】
請求項１に記載の生非病原性ＩＰＮＶ又は請求項１０に記載のワクチンの、幼魚のＩＰＮ病に対するワクチンとしての使用。
【請求項１３】
、
請求項１に記載の生非病原性ＩＰＮＶ又は請求項１０に記載のワクチンの幼魚のＩＰＮ病に対するワクチンとしての使用であって、接種が浸漬又は経口投与による、使用。
１４．
【請求項１４】
寄託番号ＥＣＡＣＣ−Ｎｏ１１０４１２０１の生非病原性ＩＰＮＶ。
【国際調査報告】
2014513932.tif 000016
2014513932.tif 000017
2014513932.tif 000018