(57)【要約】本発明は、細菌を用いる、有毒化学物質の検出用の方法およびバイオ−キャパシター検知装置に関する。この検知プラットホームは、規定形状の金くし形キャパシター、検知素子として、生存E. coli細胞が固定化されたカルボキシ-CNTの層を含む。このバイオ−キャパシター装置を作成する方法および細胞ストレス応答を誘発する有毒化学物質を検出する方法も含まれる。本発明は、E. coli細菌が係留されたカルボキシ-CNTが固定化されたバイオ−キャパシターチップの開発を開示し、本発明は、制御パラメータとして周波数および／または振幅を含む電場を用いて、バイオチップ上で化学的に刺激された細菌の挙動および特徴を決定することを含む。
2014513551.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的化学物質の検出用のバイオ−キャパシター検知装置であって、
ａ）基板および前記基板上の金属蒸着層を含むキャパシター；
ｂ）カルボキシル化炭素ナノチューブ（カルボキシ-CNT）の層；ならびに
ｃ）前記炭素ナノチューブ(CNT)の層に固定化され、それによって、前記標的化学物質で応答するように適合できる検知素子となる生存細胞、
を含む、検知装置。
【請求項２】
前記基板が、シリコン、ガラス、溶融シリカおよびプラスチックよりなる群から選択される、請求項１の装置。
【請求項３】
前記基板がシリコンである、請求項２の装置。
【請求項４】
前記基板上の金属蒸着層が少なくともひとつのくし歯構造の電極を含む、請求項１の装置。
【請求項５】
前記電極が、金、銀、白金、パラジウム、銅およびインジウムスズオキサイド (ITO)よりなる群から選択される材料である、請求項４の装置。
【請求項６】
前記電極が金である、請求項５の装置。
【請求項７】
前記キャパシターが金くし形キャパシターである、請求項１の装置。
【請求項８】
前記炭素ナノチューブの層が、カルボキシル化多層炭素ナノチューブ（カルボキシ-CNT）である、請求項１の装置。
【請求項９】
前記生存細胞が、哺乳動物細胞、細菌細胞および特定機能の組織細胞よりなる群から選択され得る、請求項１の装置。
【請求項１０】
前記生存細胞が細菌細胞である、請求項９の装置。
【請求項１１】
前記細菌細胞が、Escherichia coli DH5α, K-12, Salmonella, PseudomonasおよびBacillus種を含む細菌細胞のいずれかの株である、請求項１０の装置。
【請求項１２】
前記細菌細胞がEscherichia coliである、請求項１１の装置。
【請求項１３】
前記標的化学物質が、酢酸、乳酸の有機カルシウム塩、プロピオン酸塩、ギ酸塩、アニオンの細胞内蓄積に影響する薬物；活性酸素種 (ROS)、H2O2、ヒドロキシルラジカル (OH)、スーパーオキシドアニオン (O2−)、有機性過酸化水素 (ROOH)、過酸化亜硝酸 (OONO)、一酸化窒素 (NO)を生じる化学物質によって誘発される酸化毒性；高濃度の溶質、NaCl、細胞のサイトゾル中のオスモライトによって誘発される浸透ストレスに影響する薬物、カルニチン、トリハロース、グリセロール、スクロース、プロリン、マンニトール、グリシン−ベタインおよびその他の遺伝毒性ストレスを生じるもの、よりなる群から選択されるストレス剤である、請求項１の装置。
【請求項１４】
着目する標的化学物質を定量的に検出する方法であって、
ａ）試験サンプルを、請求項１のバイオ−キャパシター装置に暴露するステップであって、ここに、前記試験サンプルは前記着目する標的化学物質のみを含有し、それによって、前記試験サンプルが前記バイオ−キャパシター装置に対して細胞ストレス応答を誘発できるステップ；
ｂ）交流 (AC)周波数の電位プロファイルを前記バイオ−キャパシター装置に印加するステップ；
ｃ）干渉性液状栄養素／培養培地の不存在下、nFEISにより前記バイオ−キャパシター装置の表面インピーダンス／キャパシタンスの変化を測定することによって、前記バイオ−キャパシター装置の細胞ストレス応答を観察するステップであって、前記細胞応答は着目する標的化学物質のみの存在と相関するステップ
を含む方法。
【請求項１５】
前記前記標的化学物質が、酢酸、乳酸の有機カルシウム塩、プロピオン酸塩、ギ酸塩、アニオンの細胞内蓄積；活性酸素種 (ROS)、H2O2、ヒドロキシルラジカル (OH)、スーパーオキシドアニオン (O2−)、有機性過酸化水素 (ROOH)、過酸化亜硝酸 (OONO)、酸化窒素 (NO)を生じる化学物質によって誘発される酸化毒性；細胞のサイトゾル中の高濃度の溶質、NaCl、オスモライトによって誘発される浸透ストレスに影響する薬物、カルニチン、トリハロース、グリセロール、スクロース、プロリン、マンニトール、グリシン−ベタインおよびその他遺伝毒性のストレスを生じるもの、よりなる群から選択されるストレス剤である、請求項１４の方法。
【請求項１６】
バイオ−キャパシター検知装置の製造方法であって、
ａ）基板を提供するステップ；
ｂ）金属層を前記基板に蒸着させてキャパシターを形成するステップであって、ここに、前記金属層は少なくともひとつのくし形構造の電極を含む、ステップ；
ｃ）前記キャパシター上の金属層をパターニングするステップ；
ｄ）カルボキシル化炭素ナノチューブ（カルボキシ-CNT）の層を前記キャパシターに共有結合させてカルボキシ-CNT活性化されたキャパシターを形成するステップ；
ｅ）生存細胞を前記カルボキシ-CNT活性化されたキャパシターに固定化し、それによって、前記生存細胞が標的化学物質と反応するように適合可能な検知素子となるステップであって、ここに、前記生存細胞は、前記標的化学物質によって生存細胞に課されたストレスにつき観察され得る、ステップを含む、方法。
【請求項１７】
前記基板が、シリコン、ガラス、溶融シリカおよびプラスチックよりなる群から選択される、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記電極が、金、銀、白金、パラジウム、銅およびインジウムスズオキサイド (ITO)よりなる群から選択される材料である、請求項１６の方法。
【請求項１９】
前記キャパシターが金くし形キャパシターである、請求項１６の方法。
【請求項２０】
前記生存細胞がEscherichia coliである、請求項１６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、それぞれ、全ての目的について、出典明示して本願明細書に含まれる、２０１１年５月１７日に出願された米国仮出願第61/487,225号；および２０１１年５月２０日に出願された米国仮出願第61/488,693号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、概略、全細胞細菌性バイオ−キャパシターチップテクノロジーの開発に関する。より詳しくは、細菌−キャパシター界面にて有毒化学物質により誘発される細胞ストレスを決定するための、方法および全細胞E. coliバイオ−キャパシターチップ装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
細菌のような微生物を生物学的検知素子として用いて、様々な化学物質の有毒性を決定することができる。細菌細胞への化学物質の有毒性の検知は、化学物質がヒトを含む他の生存種において毒性を誘発する可能性の予測を可能にする。ほとんどの化学物質は、生きた細胞に対して、本質的に毒性である。これらは、混合物中でスクリーニングされ、予測され得る。医薬製剤、薬物、防御剤 [defense agents]、汚染された環境および食物のサンプルから誘導された化学物質は、典型的に、酸化的、遺伝毒性、および代謝性のストレスなど、細胞損傷を誘発することによって、有害な効果を奏し、かくして、生体に有害である。
【０００４】
生きた細胞は、典型的に、毒物リスクを潜在的に評価するものとして利用して、それらが暴露されたときに、化学物質の有毒性を決定することが知られている。細菌細胞は、生物学的認識素子として理想的な選択である。なぜならば、それらは、代謝、増殖および細胞表面電荷分布を含む、細胞動力学の変化を導く有毒化学物質によるように、外部ストレス（刺激）に応答することが知られているからである。そのような応答を利用して、化学物質の毒性を予想できる。細菌細胞の毒性応答は、しばしば、様々なストレス応答の観点で決定される。典型的に、細菌のストレス応答は、毒性を誘発するのに用いる化学化合物の特性に基づき、異なるタイプに分類される。例えば、化学物質は、（ｉ）酢酸、乳酸の有機カルシウム塩、プロピオン酸塩、ギ酸塩およびアニオンの細胞内蓄積に影響する薬物のような化学物質により誘発される代謝性／酸毒性；（ｉｉ）H2O2、ヒドロキシルラジカル (OH)、スーパーオキシドアニオン (O2−)、有機性過酸化水素 (ROOH)、過酸化亜硝酸 (OONO)および一酸化窒素 (NO)のような活性酸素種 (ROS)を生じる化学物質により誘発される酸化毒性；および（ｉｉｉ）浸透ストレスを受けた細胞のサイトゾル中の高レベルのNaCl、オスモライトを含む高濃度の溶質により誘発される浸透ストレス、カルニチン、トリハロース、グリセロール、スクロース、プロリン、マンニトール、およびグリシン−ベタイン、その他の遺伝毒性ストレスを誘発するものによるなどの異なる態様による様々な細胞毒性応答ならびに様々な細胞ストレス応答を誘発する。
【０００５】
毒物の毒性または殺細胞性を検出し、測定するために様々な公知の方法がある。従来法は、細胞代謝速度（例、テトラゾリウム塩分解）および、細胞質酵素（例、乳酸デヒドロゲナーゼ）の活性を対象とする。ニュートラルレッド取込アッセイ (NR)および総細胞タンパクアッセイも、毒性を試験する２つの主要な方法論である。他の細胞毒性方法は、シリコンマイクロフィジオメータによる、培養した細胞近傍のpH変化の検出および、化合物を試験するための暴露による細胞層のバリア機能（細胞間抵抗）の測定を要件とする。
【０００６】
上記方法は、定量測定を提供する非侵襲性方法であるが、共通する限界は、それらが、膜挿入物上、または培養培地中の懸濁液で増殖した細胞層を要求することである。これらのテクニックは、典型的に、毒性ガス（防御剤）の試験には適さず、それに対して有毒化学物質が試験される生きた細胞が犠牲にされるか、または、試験の間の全ての時間において栄養素培地が存在することを要求する。
【０００７】
他の方法は、細胞およびビデオ撮像分析による細胞毒性の研究を含む。しかしながら、これらは、不都合なことに、大規模なデータ加工を要求するのに、半定量的な結果しかもたらさない。市販の微生物ベースの毒性スクリーニング方法の一例は、Microtox(R)の名称で入手可能であり、それは、毒物の効果を測定するために発光性細菌を利用する。そのようなテクニックは、発光が生じる熱、部分圧および、pHのような物理的要因に対してより敏感であり、典型的に、毒性ガス（防御剤）の試験に適さず、これらも、発光性遺伝子産物を発現する細菌細胞および光測定装置への依存を要求する。
【０００８】
別の例は、電気細胞−基質インピーダンス検出 (ECIS)装置を生産する、Applied BioPhysics Inc. (ABP)により製造される市販の研究装置を利用する方法を含む。この方法は、培養培地により「接合」された電極および対電極を利用して、インピーダンス応答を測定する。このタイプのシステムには主たる欠点がある。なぜならば、培養培地またはたのいずれかの液状培地は、通常、細胞の挙動応答を変えてしまうからである。そのような場合、関連する薬剤により誘発される応答と、栄養培地中に存在する他の化学物質の複雑な混合物のものとを区別するのが困難である。典型的に、ABPのECISは、細胞応答を得るために、栄養素混合物中の標的化学物質の実際の応答に干渉し得る培養／液状培地が存在すべきことを必要とする。
【０００９】
したがって、これらの前記方法は有用であるが、不都合なことに、それらは、しばしば、培養／液状培地のような干渉性媒体がなにも存在せずに、ガスを含む有毒化物質によって特別に誘発される、細胞表面上に生じる損傷を観察して、生きた細胞に対する毒性を検出することができないことである。
【００１０】
現在、化学物質の毒性およびそのような化学物質のヒトへの影響を測定し、検出できる方法および装置のニーズが存在する。さらに、細胞毒性を生じる化学物質の潜在能力の決定のために、様々な化学物質、毒性ガス、医薬品、薬物、防御剤、環境および食物サンプルをスクリーニングするのに用いるそのような方法および装置を有することは有利であろう。さらに、これらの方法および装置は、費用対効果があり、高い感度および選択性を有し、ならびに高速応答性を有する。そのような方法および装置は、医療および臨床診断、環境モニタリング、食品産業、防御および保護において多数のアプリケーションがあり、その他多くの診断、生体工学および科学目的に適用可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、細菌−キャパシター界面にて有毒化学物質により誘発される細胞ストレスを高精度で決定するための、これらのニーズに合致する方法および装置に関する。本発明による方法および装置は、細菌−キャパシター界面にて有毒化学物質により誘発される細胞ストレスを決定するのに用いることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、標的化学物質の検出用のバイオ−キャパシター検知装置であって、基板およびその基板上の金属蒸着層を含むキャパシター；カルボキシル化炭素ナノチューブ（カルボキシ-CNT）の層；ならびに前記炭素ナノチューブ (CNT)の層に固定化されている生存細胞を含む、検知装置に関する。生存細胞は、標的化学物質と反応するように適合できる検知素子となり、生存細胞は、干渉性栄養素／培養培地なしに、生存細胞上で、標的化学物質によって課せられたストレスをモニターできる。
【００１３】
基板は、シリコン、ガラス、溶融シリカ、およびプラスチックよりなる群から選択される。好ましくは、基板はシリコンである。
【００１４】
基板上の金属蒸着層は、少なくとも１つの電極を含む。電極は、金、銀、白金、パラジウム、銅およびインジウムスズオキサイド (ITO)よりなる群から選択される材料である。より好ましくは、電極は金である。
【００１５】
好ましくは、キャパシターは、金くし形キャパシターである。
【００１６】
炭素ナノチューブの層は、カルボキシル化多層炭素ナノチューブ（カルボキシ-CNT）であり得る。
【００１７】
生存細胞は、哺乳動物細胞、細菌細胞および特定機能の組織細胞よりなる群から選択される。好ましくは、生存細胞は細菌細胞である。細菌細胞は、Escherichia coli DH5α, K-12, Salmonella, PseudomonasおよびBacillus種を含む細菌細胞のいずれかの株である。好ましくは、細菌細胞はEscherichia coliである。
【００１８】
標的化学物質は、酢酸、乳酸の有機カルシウム塩、プロピオン酸塩、ギ酸塩、アニオンの細胞内蓄積に影響する薬物；活性酸素種 (ROS)、H2O2、ヒドロキシルラジカル (OH)、スーパーオキシドアニオン (O2−)、有機性過酸化水素 (ROOH)、過酸化亜硝酸 (OONO)、一酸化窒素 (NO)を生じる化学物質により誘発される酸化毒性；細胞のサイトゾル中の高濃度の溶質、NaCl、オスモライトにより誘発される浸透ストレス；カルニチン、トリハロース、グリセロール、スクロース、プロリン、マンニトール、グリシン−ベタイン、その他の遺伝毒性ストレスを生じるもの、よりなる群から選択され得る。
【００１９】
本発明は、標的化学物質の検出用のバイオ−キャパシター検知装置であって、基板および前記基板上の金くし形層を含む金くし形キャパシター；カルボキシル化多層炭素ナノチューブ（カルボキシ-CNT）の層；ならびに前記炭素ナノチューブ(CNT)の層に固定化され、それによって、前記標的化学物質で応答するように適合できる検知素子となる生存細胞を含み、ここに、生存細菌細胞は、他の干渉性液状栄養素／培養培地なしに、乾燥条件下、生存細菌細胞上で、標的化学物質によって課せられたストレスをモニターされ得る、検知装置に関する。
【００２０】
本発明は、試験サンプルの着目する標的化学物質の存在を検出し、その量を測定し、または、確認する方法であって、前記バイオ−キャパシター検知装置を用いることを特徴とする方法に関する。
【００２１】
本発明は、着目する標的化学物質を定量的に検出する方法であって、試験サンプルをバイオ−キャパシター装置に暴露するステップであって、前記サンプルは着目する標的化学物質を含有し、それによって、前記試験サンプルは、前記バイオ−キャパシター装置に対して細胞ストレス応答を誘発することが可能であるステップ；交流 (AC)周波数の電位プロファイルを前記バイオ−キャパシター装置に印加するステップ；非ファラデー性電気化学的インピーダンス分光分析 (nFEIS)により前記バイオ−キャパシター装置の表面インピーダンス／キャパシタンスにおける変化を測定して、前記バイオ−キャパシター装置からの細胞ストレス応答を観察するステップであって、前記細胞応答は、栄養素／培養培地の干渉がなく、着目する標的化学物質の存在と相関する、ステップ、を含む方法に関する。前記バイオ−キャパシター装置は、装置上に存在するセルを有し、その試験サンプルは、前記バイオ−キャパシター装置上に存在するセルに対して細胞ストレス応答を誘発できる。
【００２２】
標的化学物質は、酢酸、乳酸の有機カルシウム塩、プロピオン酸塩、ギ酸塩、アニオンの細胞内蓄積に影響する薬物；活性酸素種 (ROS)、H2O2、ヒドロキシルラジカル (OH)、スーパーオキシドアニオン (O2−)、有機性過酸化水素 (ROOH)、過酸化亜硝酸 (OONO)、酸化窒素 (NO)を生じる化学物質により誘発される酸化毒性；細胞のサイトゾル中の高濃度の溶質、NaCl、オスモライトにより誘発される浸透ストレス；カルニチン、トリハロース、グリセロール、スクロース、プロリン、マンニトール、グリシン−ベタインおよびその他遺伝毒性ストレスを生じるもの、よりなる群から選択されるストレス剤であり得る。
【００２３】
本発明は、着目する標的化学物質を定量的に検出する方法であって、試験サンプルをバイオ−キャパシター装置に暴露するステップであって、前記試験サンプルは着目する標的化学物質を含有し、それによって、前記試験サンプルは、前記バイオ−キャパシター装置に対して細胞ストレス応答を誘発することが可能であるステップ；交流 (AC)周波数の電位プロファイルを前記バイオ−キャパシター装置に印加するステップ；干渉性培養培地のない条件下、nFEISにより前記バイオ−キャパシター装置の表面インピーダンス／キャパシタンスにおける変化を測定して、前記バイオ−キャパシター装置の細胞ストレス応答を観察するステップであって、前記細胞応答は着目する標的化学物質の存在に相関するステップ、を含む方法に関する。
【００２４】
バイオ−キャパシター検知装置を製造する方法は、基板を提供するステップ；キャパシターを形成するための金属層を基板上に蒸着させるステップ、ここに、前記金属層は少なくともひとつの電極を含み；二酸化ケイ素基板上で金属層をくし歯にパターニングして、キャパシターを作成するステップ；カルボキシル化炭素ナノチューブ（カルボキシ-CNT）の層を前記キャパシターに付着させてカルボキシ-CNT活性化されたキャパシターを形成するステップ；生存細胞を前記カルボキシ-CNT活性化されたキャパシターに固定化し、それによって、前記生存細胞が標的化学物質で応答するように適合することが可能な検知素子となるステップであって、前記生存細胞は、干渉性培養／栄養素培地の不存在下、前記細胞に対して前記標的化学物質により課せられたストレスについて観察され得るステップ、を含む方法に関する。
【００２５】
基板は、シリコン、ガラス、溶融シリカ、およびプラスチックよりなる群から選択される。好ましくは、基板はシリコンである。
【００２６】
電極は、金、銀、白金、パラジウム、銅およびインジウムスズオキサイド (ITO)よりなる群から選択される材料である。好ましくは、電極は金である。キャパシターは金くし形キャパシターである。
【００２７】
炭素ナノチューブの層は、カルボキシル化多層炭素ナノチューブ（カルボキシ-CNT）である。
【００２８】
生存細胞は、哺乳動物細胞、細菌細胞および特定機能の組織細胞よりなる群から選択される。好ましくは、生存細胞は、Escherichia coli, K-12, Salmonella, PseduomonasおよびBacillus種を含む細菌細胞である。より好ましくは、細菌細胞はEscherichia coliである。
【００２９】
これらの特徴、利点および本発明の他の具体例は、本願明細書の残りの部分において、当業者に対してさらに明白となる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
本発明の、これらおよび他の特徴、局面ならびに利点は、以下の明細書、付随する特許請求の範囲および添付された図面を参照して、より一層理解されるであろう。
【００３１】
【図１】図１は、本発明の具体例によるカルボキシ-CNTフィクション化での金くし形電極キャパシターチップの活性化の代表的概要図を図示する。
【００３２】
【図２】図２は、本発明の具体例によるバイオチップを開発するためのカルボキシ-CNT活性化金くし形 (GID)キャパシターチップの生体機能化およびE. coli細胞の固定の代表的概要図を図示する。
【００３３】
【図３】図３は、（ａ）裸GID表面、（ｂ）裸GID表面のタッピングモードAFM形状像中の選択された緑線領域（1 μm長）のラインプロット表面プロファイル、（ｃ）裸GID表面の3D AFM組織分布マップ、（ｄ）カルボキシ-CNTで表面活性化されたGIDのタッピングモードAFM形状像、（ｅ）カルボキシ-CNTで活性化されたキャパシター表面上のGID電極のタッピングモードAFM形状像中の選択された緑線領域（1 μm長）のラインプロット表面プロファイル、（ｆ）カルボキシ-CNT活性化されたGID表面の3D AFM組織分布マップ、および（ｇ）本発明の具体例による固定化されたE. coli細胞を示すバイオチップの区域（走査エリア 4.2 μm2）の2DタッピングモードAFM像のタッピングモードAFM像（4.2 × 4.2 μm2 走査エリア内）を図示する。
【００３４】
【図４】図４は、本発明の具体例によるカルボキシ-CNT固定化の前後での金くし形キャパシターチップの代表的静電容量応答を図示する。
【００３５】
【図５】図５は、金くし形キャパシター表面の代表的光学顕微鏡写真を図示する：（ｉ）カルボキシ-CNTで活性化された（対象）、ならびに（ｉｉ）8.7 × 106細胞および（ｉｉｉ）1.7 × 107細胞の濃度のE. coliが固定化されたカルボキシ-CNT活性化チップ。矢印（a-c, d-fおよびg-i）は、それぞれ、本発明による、5X、10Xおよび100Xの光学解像度を示す。
【００３６】
【図６】図６は、すでにカルボキシ-CNTで活性化されたGID表面上の２つの異なる濃度のE. coli細胞が固定化されたバイオチップの代表的静電容量応答を図示する。前記静電容量応答は、本発明の具体例による栄養素／培養培地の不存在下、50-600 MHzの周波数掃引にて観察された。
【００３７】
【図７】図７は、（ａ）規定形状および寸法の各キャパシターの金くし形電極上のカルボキシ-CNTで係留することによって生存E. coli細胞が固定化されたキャパシターアレイバイオチップ；および（ｂ）本発明の具体例による栄養素／培養培地の不存在下、正常および化学物質ストレス条件における印可AC周波数下でのE. coliの応答および表面電荷分布を示すダイアグラム、の略図を図示する。
【００３８】
【図８】図８は、本発明により、栄養素／培養培地の不存在下、（ａ）１時間および（ｂ）３時間、異なる濃度の酢酸に暴露したとき、印可周波数 (300-600 MHz)の関数でE. coliキャパシターバイオチップ由来のキャパシタンス変化を図示する。
【００３９】
【図９】図９は、本発明により、栄養素／培養培地の不存在下、（ａ）１時間および（ｂ）３時間、異なる濃度のH2O2に暴露したとき、印可周波数 (300-600 MHz)の関数でE. coliキャパシターバイオチップのキャパシタンス変化を図示する。
【００４０】
【図１０】図１０は、本発明により、栄養素／培養培地の不存在下、（ａ）１時間および（ｂ）３時間、異なる濃度のNaClに暴露したとき、印可周波数 (300-600 MHz)の関数でE. coliキャパシターバイオチップのキャパシタンス変化を図示する。
【００４１】
【図１１】図１１は、栄養素／培養培地の不存在下、定常AC電気周波数 (350 MHz)にて１および３時間の処理時間、異なる濃度の（ａ）酢酸（酸ストレス）、（ｂ）H2O2（酸化ストレス）および（ｃ）NaCl（塩ストレス）の関数で、（CNT活性化センサーチップ上に固定化された）E. coli細胞の応答を図示する。挿入された表は、E. coli細胞が受けたストレスレベルのパーセント相対変化を決定するカラーコード値を示す。ストレスカラーコードスケールはストレスレベルの重篤度を示し、緑が順応／抵抗を表し、赤が本発明の具体例によるストレス／毒性を表す。
【００４２】
【図１２】図１２は、カルボキシ-CNTのみと共有結合された裸GID表面（黒で示す）；生存8.7 × 106細胞（赤）および1.74 × 107細胞（青）が固定化されたバイオチップ；ならびにカルボキシ-CNTですでに活性化されたGID表面上の加熱死1.74 × 107細胞（緑）の静電容量応答の代表的な結果を図示する。静電容量応答は、本発明の具体例による栄養素／培養培地の不存在下、300-600 MHzの周波数レンジにて観察された。
【００４３】
【図１３】図１３は、２つの同および反単位電荷により、本発明の具体例による細胞外面上で距離「r」離れた分子双極子「m」を構成する荷電雲に包まれた典型的な細胞の代表的概要図を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明によれば、新たな静電容量バイオチップが、E. coli胞細が固定化されたカルボキシ-CNT活性化金くし形 (GID)キャパシターを用いて、化学物質によって引き起こされる細胞ストレスの検出用に開発された。
【００４５】
本発明は、具体例によれば、細菌−キャパシター界面での有毒化学物質により誘発される細胞ストレスを定量する全細胞E. coliバイオ−キャパシターチップ装置の開発を記載する。開発されたテクノロジーは、検知素子（バイオ−キャパシター）として、生存細菌細胞が固定化されたカルボキシル化炭素ナノチューブ（カルボキシ-CNT）と併せて、電子金くし形電極 (GID)キャパシターの作製も記載する。提案する技術革新は、酸毒性について酢酸 (CH3COOH)、酸化毒性について過酸化水素 (H2O2)および塩ストレスについて塩化ナトリウム (NaCl)のようなモデル化学物質を用いる、潜在的な有毒化学物質の検知用のバイオ−キャパシターチップの表面特徴も開示する。このバイオ−キャパシター装置および検出方法論は、非ファラデー性電気化学的インピーダンス分光分析 (nFEIS)に基づく。提案する発明／技術および検出方法論自体は、細胞毒性を生じる化学物質の可能性の決定につき、様々な化学物質、毒性ガス、医薬品、薬物、防御剤、環境および食物のサンプルをスクリーニングするのに用い得る。
【００４６】
ひとつの具体例によれば、本発明は、標的化学物質の検出用のバイオ−キャパシター検知装置であって、基板および前記基板上の金属蒸着層を含むキャパシター；カルボキシル化炭素ナノチューブ（カルボキシ-CNT）の層；ならびに前記炭素ナノチューブ(CNT)の層に固定化され、それによって、前記標的化学物質で応答するように適合できる検知素子となる生存細胞を含み、ここに、前記生存細胞は栄養素／培養培地の不存在下、生存細胞に対して標的化学物質により課せられたストレスについて観察され得る、検知装置に関する。
【００４７】
典型的に、前記基板は、シリコン、ガラス、溶融シリカ、およびプラスチックよりなる群から選択される。好ましくは、前記基板はシリコンである。
【００４８】
基板上の金属蒸着層は、少なくともひとつのくし歯形態の電極を含む。典型的に、前記電極は、金、銀、白金、パラジウム、銅およびインジウムスズオキサイド (ITO)よりなる群から選択される材料である。より好ましくは、前記電極は金である。
【００４９】
本発明の例示的具体例によれば、チップ形態に作製されたバイオセンサーもバイオチップということができる。バイオ−キャパシター検知装置とバイオチップとは、全体を通して、交換可能に使用できる。
【００５０】
好ましくは、前記キャパシターは金くし形キャパシターである。好ましくは前記バイオ−キャパシター検知装置は、規定形状の金くし形キャパシターを含む検知プラットホームを提供する。
【００５１】
本発明の具体例によれば、炭素ナノチューブの層は、好ましくは、カルボキシル化多層炭素ナノチューブ（カルボキシ-CNT）である。
【００５２】
本発明のなお別の具体例によれば、前記生存細胞は、哺乳動物細胞、細菌細胞および特定機能の組織細胞よりなる群から選択される。好ましくは、生存細胞は細菌細胞である。細菌細胞は、Escherichia coli DH5α, K-12, Salmonella, PseudomonasおよびBacillus種を含むいずれの株であってよい。好ましくは、細菌細胞はEscherichia coliである。
【００５３】
本発明のなお好ましい具体例において、細菌細胞は生物学的認識素子として理想的な選択である。なぜならば、それらは、代謝、増殖および細胞表面電荷分布を含む、変化した細胞動態に導く有毒化学物質によるような外部ストレス（刺激）に応答することが知られているからである。そのような応答を用いて、化学物質の毒性を予測することができる。細菌細胞の毒性応答は、しばしば、様々なストレス応答の観点で定量される。典型的に、細菌におけるストレス応答は、毒性を誘発する化学化合物の特性に基づき異なるタイプに分類される。
【００５４】
本発明によれば、前記標的化学物質は、典型的に、（ｉ）酢酸、乳酸の有機カルシウム塩、プロピオン酸塩、ギ酸塩およびアニオンの細胞内蓄積に影響する薬物のような化学物質により誘発される代謝性／酸毒性；（ｉｉ）H2O2、ヒドロキシルラジカル (OH)、スーパーオキシドアニオン (O2−)、有機性過酸化水素 (ROOH)、過酸化亜硝酸 (OONO)および酸化窒素 (NO)のような活性酸素種 (ROS)を生じる化学物質により誘発される酸化毒性；および（ｉｉｉ）浸透ストレスを受けた細胞のサイトゾル中の高レベルのNaCl、オスモライトを含む高濃度の溶質により誘発される浸透ストレスカルニチン、トリハロース、グリセロール、スクロース、プロリン、マンニトール、およびグリシン−ベタイン、その他の遺伝毒性ストレスを誘発するものによるなどの異なる態様による様々な細胞毒性応答ならびに様々な細胞ストレス応答を誘発し得るストレス剤である化学物質である。
【００５５】
なお別の好ましい具体例において、本発明は、標的化学物質の検出用のバイオ−キャパシター検知装置であって、基板および前記基板上の金くし形層を含む金くし形キャパシター；カルボキシル化多層炭素ナノチューブ（カルボキシ-CNT）の層；ならびに、前記炭素ナノチューブ(CNT)の層に固定化され、それによって、前記標的化学物質で応答するように適合できる検知素子となる生存細胞を含み、ここに、前記生存細菌細胞は、栄養素／培養培地の不存在下、標的化学物質により前記生存細菌細胞に対して課せられたストレスにつき観察され得る、検知装置に関する。
【００５６】
なおさらなる別の好ましい具体例において、本発明は、試験サンプル中の着目する標的化学物質の存在を検出し、その量を測定し、または確認する方法であって、前記バイオ−キャパシター検知装置を用いることを特徴とする方法に関する。
【００５７】
なおさらなる別の具体例において、本発明は、着目する標的化学物質を定量的に検出する方法であって、試験サンプルをバイオ−キャパシター装置に暴露するステップであって、ここに、前記試験サンプルは前記着目する標的化学物質のみを含有し、それによって、前記試験サンプルが前記バイオ−キャパシター装置に対して細胞ストレス応答を誘発できるステップ；交流 (AC)周波数の電位プロファイルを前記バイオ−キャパシター装置に印加するステップ；前記バイオ−キャパシター装置の細胞ストレス応答を、干渉性液状栄養素／培養培地の不存在下、nFEISにより前記バイオ−キャパシター装置の表面インピーダンス／キャパシタンスの変化を測定することによって観察するステップであって、前記細胞応答は着目する標的化学物質のみの存在と相関するステップ、を含む方法に関する。
【００５８】
インピーダンスバイオチップは、２つの群：非ファラデー性およびファラデー性に分けられることは当業者に周知である。非ファラデー性バイオチップは、典型的に、キャパシタンスバイオチップまたはバイオ−キャパシタンスチップとして知られ、本明細書の全体を通して交換可能に使用できる。
【００５９】
ラット好塩基球細胞へのGHz周波数での照射の効果は、本質的に、主に熱的であると示されることが当業者に知られている。したがって、この効果を考慮して、E. coliバイオチップセンサーでのストレス応答は、好ましくは、キャパシタンス測定の間に熱的影響が発生しないことを保障する600 MHz未満の印可AC電気周波数でのみ観察された。より好ましくは、静電容量応答は約50から約600 MHzの周波数掃引にて観察された。
【００６０】
さらなるなお別の好ましい具体例において、本発明は、着目する標的化学物質を定量的に検出する方法であって、干渉性栄養素／培養培地なしに、試験サンプルを前記バイオ−キャパシター装置に暴露するステップであって、ここに、前記試験サンプルは着目する標的化学物質を含有し、それによって、試験サンプルは細胞ストレス応答バイオ−キャパシター装置に対して細胞ストレス応答を誘発できるステップ；交流 (AC)周波数の電位プロファイルをバイオ−キャパシター装置に印可するステップ；nFEISにより前記バイオ−キャパシター装置の表面インピーダンス／キャパシタンスの変化を測定することによって、前記バイオ−キャパシター装置の細胞ストレス応答を観察するステップであって、前記細胞応答は、栄養素／培養培地の干渉なくして、乾燥条件下、着目する標的化学物質の存在と相関するステップ、を含む方法に関する。
【００６１】
本発明の好ましい具体例によれば、平面キャパシターアレイはくし形マイクロ電極で作られ、液状培地を含有するための隔離された培養容器に入れられた電極対と対照的に、好ましくは、カルボキシル化炭素ナノチューブ(CNT)で予備-活性化される。
【００６２】
本発明の最も好ましい具体例によれば、前記キャパシター電極上に存在する細菌の細胞活性の測定は、好ましくは、いかなる栄養素／培養培地も存在しない乾燥条件下で行われる。培養培地またはその他いずれの液状培地も、典型的に、細胞の挙動応答を変化させ、かくして、当該薬剤によって誘発される応答と、栄養素培地に存在する他の化学物質の複雑な混合物に由来するものとを区別することを困難にする。当該分野の以前の方法は、概略、細胞応答を得るためには、培養／液状培地が存在することを要求するが、これは、栄養素混合物中の標的化学物質の実際の応答に干渉する。
【００６３】
本発明のなおさらなる別の好ましい具体例において、前記細菌細胞は、分散液もしくは懸濁液中で増殖するか、または電極上に物理的に付着した細胞とは対照的に、キャパシター上に存在するCNTに共有結合されている。
【００６４】
本発明によれば、「抵抗変化」または「電圧変化」とは対照的に、キャパシタンスまたは周波数変化を測定して細胞活性をプローブする。
【００６５】
生存細菌細胞は、金くし形 (GID)キャパシター（バイオ−キャパシター）のような電子変換素子と連結されていれば、干渉性液状栄養素／培養培地が存在せず、与えられた細菌−キャパシター界面にての有毒化学物質により発生された細胞表面電荷分布および表面キャパシタンス／インピーダンスによる非侵襲性細胞毒性情報を伝達できる。細菌細胞の毒性応答は、しばしば、様々なストレス応答の観点で定量される。細菌のストレス応答は、毒性を誘発する化学化合物の特性に基づき、異なるタイプに分類される。例えば、活性酸素種 (ROS)を生じる薬物のような酸化ストレスを誘発する化学物質ならびに、その他浸透ストレス、遺伝毒性ストレスその他細胞ストレス応答を誘発するものである。
【００６６】
細菌は、交流 (AC)電場下、様々な細胞ストレスに応答し、外部ストレスに対する細菌の電気応答の変化が、乾燥条件（無液状栄養素／培養培地）における非ファラデー性電気化学的インピーダンス分光分析 (nFEIS)により捕捉または観察され得る。本発明の具体例によれば、生体検知表面（バイオチップ）としてのGID電極上に生きた細菌細胞を係留することによって毒性化学物質の影響を検出できる。有毒化学物質が、干渉性栄養素／培養培地が存在しない乾燥されたセンサー表面上の細菌細胞に暴露されると、細胞はこれらの化学物質に応答し、表面電荷分布に変化を与えて、それをAC電気周波数掃引に対してnFEISにより測定する。その結果、センサー／細菌表面上に存在する前電荷は、分極し、緩和し、それは特定周波数に依存する。毒性／ストレス化学物質に対するセンサー表面上の細菌細胞の応答の変化を観察できる。キャパシターセンサー表面の感度も炭素ナノチューブ(CNT)のような高反応性ナノ材料で修飾することを含む、特定の表面化学によって促進される。なぜならば、CNTは、電子化学検知の幅広いアプリケーションに対して、独特の構造的、電子的および機械的特性を有するからである。
【００６７】
本発明の好ましい具体例によれば、生存細菌への化学物質の毒性を検出して、ヒト細胞の使用を防止するための倫理観に則した、そのような化学物質のヒトへの影響を予測するための新規方法が開示される。提案する発明は、具体例によれば、化学物質により誘発される毒性の検出用の以前から利用可能なテクニックに関連する課題の全てを、信号促進のためのカルボキシ-CNTと共に、電子キャパシターチップ上に細菌細胞を単に固定化することによって、簡便にする。発がん性化学物質（発がん物質）、人工化学物質（生体異物）のような危険な化学物質への急速かつ短期暴露後の毒性の検出または観察は、実際に細胞を害することなく、キャパシター−細菌界面にての急速過程における表面キャパシタンス／インピーダンスの変化を単に測定する。本発明の好ましい具体例において、バイオ−キャパシター装置は、液状栄養素／培養培地を要せず、数分間以内に疑わしい化学物質の毒性情報を与え、倫理規則にも則している。これは、バイオ−キャパシター装置を伝統的な毒性検出技術よりも優れたものにする。さらに、このバイオ−キャパシター装置は、無標識である利点を有し、小サイズかつ安価なので、適当である。
【００６８】
細菌は、AC電場下、様々な細胞ストレスに応答し、外部ストレスに対する細菌の電気応答はnFEISにより捕捉または観察され得ることが当業者に知られている。これは、生きた細菌細胞を生体検知表面（バイオチップ）としてのGID電極上に係留することによって達成できる。有毒化学物質がセンサー表面上のこれらの細菌細胞に暴露されると、細胞はこれらの化学物質に応答し、AC電気周波数掃引に対してnFEISにより測定できる、表面電荷分布を生じる。その結果、センサー表面上の全電荷は分極し、緩和し、それは特定周波数に依存する。毒性／ストレス化学物質に対するセンサー表面上の細菌細胞の応答の変化が観察できる。センサー表面の感度は、炭素ナノチューブ(CNT)のような高反応性ナノ材料で修飾することを含む、様々な表面化学により増進できる。それらを電気化学検知における幅広いアプリケーション用の非常に魅力ある材料にする、独特の構造的、電子的および機械的特性を有するからである。最近、CNTは、スーパーキャパシター用の電極材料として用いられ、大量の反応場に重要であり、大電荷貯蔵容量およびキャパシタンスを提供する微視的および巨視的多孔構造、電気化学的挙動、サイズならびに表面積のため、非常に注目されている。CNTは、印加ac-電気周波数下、電極−ナノチューブ界面にて空間電荷分極を示し、高速充／放電能のため、優れた電力密度を有する。
【００６９】
本発明の好ましい具体例において、化学物質の毒性を定量する新規方法、すなわち、バイオ検知素子として活性化されたGIDキャパシター上にE. coli細菌が固定化されたカルボキシ-CNT活性化された金くし形キャパシターを利用し、nFEISによりいかなる媒介物の関与も要しない無標識かつ非侵襲性手法が開示される。本発明の具体例によれば、センサー表面の感度は、典型的に、単壁CNTよりも毒性の低いカルボキシ-機能化多壁CNTで、キャパシター上に共有活性化することによって促進される。発がん性化学物質（発がん物質）および人工化学物質（生体異物）のような有毒化学物質の毒性挙動は、バイオ−キャパシターの細菌−キャパシター界面にて急速に検出できる。提案する検出方法論はnFEISに基づき、それを用いて、細胞毒性を引き起こす化学物質の可能性の決定につき、様々な化学物質、毒性ガス、医薬品、薬物、防御剤、環境および食物サンプルをスクリーニングできる。
【００７０】
本発明の典型的な具体例によれば、前記方法および装置は、細胞毒性を引き起こす化学物質の可能性の決定につき、様々な化学物質、毒性ガス、医薬品、薬物、防御剤、環境および食物サンプルをスクリーニングすることができるであろう。
【００７１】
本発明の具体例によれば、好ましくは、酢酸、H2O2およびNaClをモデル化学物質として採用してバイオチップを試験し、それらの応答をnFEISによりAC電場下で観察した。異なるストレス下でのE. coli細胞の電気特性は、無標識かつ非侵襲性様式で、印可周波数 (300-600 MHz)の関数として、表面キャパシタンスの変化に基づき研究した。正常条件下でのE. coliバイオチップの静電容量応答は、463および582 MHz周波数にて特徴的分散ピークを示した。これらの識別特性ピークの変形は、液状栄養素／培養培地の不存在下、静電容量バイオチップ上のE. coliに対する化学物質の毒性を決定する。E. coli細胞は、166-498 mM (1-3%) 酢酸に感応し、非常に影響されて、キャパシタンス応答が減少する。H2O2に暴露されたE. coliバイオチップは、低い濃度 (<2%)にて順応応答を示すが、高いレベル(882 mM, 3%)にて、細胞中の酸化毒性によりキャパシタンス応答は減少する。しかしながら、E. coli細胞は、塩ストレスに抵抗する傾向があるので、高NaClレベル (513-684 mM, 3-4%)にはさほど影響されない。我々の結果は、特定周波数でのバイオチップ応答が化学物質により課せられたストレスの重篤度を決定することを可能にし、もしかすると、細胞毒性の指標として未知化学物質を観察するのに適用できることを実証した。
【００７２】
本発明のさらなるなお好ましい具体例において、バイオ−キャパシター検知装置の製造方法であって、基板を提供するステップ；金属層を前記基板に蒸着させてキャパシターを形成するステップであって、ここに、前記金属層は少なくともひとつのくし形構造の電極を含む、ステップ；前記キャパシター上の金属層をパターニングするステップ；カルボキシル化炭素ナノチューブ（カルボキシ-CNT）の層を前記キャパシターに共有結合させてカルボキシ-CNT活性化されたキャパシターを形成するステップ；生存細胞を前記カルボキシ-CNT活性化されたキャパシターに固定化し、それによって、前記生存細胞が標的化学物質と反応するように適合可能な検知素子となるステップであって、ここに、前記生存細胞は、前記標的化学物質によって生存細胞に課されたストレスにつき観察され得る、ステップを含む、方法が開示される。
【００７３】
典型的に、前記基板は、シリコン、ガラス、溶融シリカ、およびプラスチックよりなる群から選択される。好ましくは、前記基板はシリコンである。
【００７４】
本発明の具体例によれば、前記電極は、典型的に、導電性材料、例えば、金、銀、白金、パラジウム、銅およびインジウムスズオキサイド (ITO)よりなる群から選択される材料である。好ましくは、前記電極は金である。前記キャパシターは金くし形キャパシターである。
【００７５】
炭素ナノチューブの層は、好ましくは、カルボキシル化多層炭素ナノチューブ（カルボキシ-CNT）である。
【００７６】
本発明の具体例によれば、前記生存細胞は、典型的に、哺乳動物細胞、細菌細胞および特定機能の組織細胞よりなる群から選択される。好ましくは、前記生存細胞は、Escherichia coli, SalmonellaおよびK-12を含む細菌細胞である。より好ましくは、前記細菌細胞はEscherichia coliである。
【００７７】
パターニングGIDアレイ電極パターニングおよびキャパシターアレイの作製
本発明によれば、前記基板は、シリコン、ガラス、溶融シリカおよびプラスチックよりなる群から選択され得る。GIDアレイ電極を、ネガティブフォトリソグラフィー技術を用いてSiO2基板表面上にパターニングした。この方法において、前記金属層は、デュアルトーンフォトレジストAZ5214Eを用いてパターニングするべきである。2 μm厚のAZ5214Eフォトレジストを、リフトオフ法用のマスクの助けを借りて、溶媒として純粋アセトン中でパターニングした。このステップの後、50-60 nmサイズの非常に薄いタングステン層を重ねて、DCスパッタ蒸着によるSiO2膜上の金の付着を向上させ、約200-210 nm厚の金層を蒸着した。各電極の寸法は、長さ800 μm、幅40 μm、２つの電極間距離40 μmとする。各キャパシターセンサーは、全表面積が3 mm2以内の24-くし形金電極を含有する。表面キャラクタリゼーションは、タッピングモードの原子間力顕微鏡 (AFM, Nanoscope)および光学顕微鏡写真により行う。
【実施例】
【００７８】
本発明の具体例において、図１はカルボキシ-CNTフィクション化での金くし形電極キャパシターチップの活性化の代表的概要図を図示する。図１によれば、GID電極キャパシターアレイ上へのカルボキシ-CNTの固定化方法が本発明の具体例により示される。
【００７９】
GID電極キャパシターアレイ上へのカルボキシ-CNTの固定化
くし形金電極アレイ静電容量チップをプラズマ清浄に付し、エタノールで徹底的に洗浄し、N2ガス流で乾燥した。
【００８０】
本発明で使用できるCNTは、特に限定されないが、市販品であるか、当業者に知られているいずれかの従来法により調製できる。典型的に、CNTは、その表面および／または両端をカルボキシル化して本発明に使用する。
【００８１】
キャパシターチップ上へのカルボキシ-CNTの共有固定化について当業者に知られたいずれかの手順を用いることができ、出典明示により本明細書に含まれるとみなされる。
【００８２】
裸GID電極キャパシターアレイチップを、エタノール中の1 mM 95%システアミン (Sigma-Aldrich)の溶液に２４時間浸漬した。そのチップを取り出し、エタノールで洗浄し、N2ガス流で乾燥した。SH基で金表面上に形成したシステアミンの自己組織化モノレイヤー (SAM)は、自由-NH2基を含有し、それらを用いて、カルボキシル化多層炭素ナノチューブ（カルボキシ-CNT）を共有結合した。このため、100 μLの99.9%ジメチルスルホキシド (Sigma-Aldrich)中1 mg/mLカルボキシ-CNT (ArryR, Germany)を、等量の、200 mMの1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸 (EDC)および100 mMのN-ヒドロキシスクシンイミド (NHS)の混合物と混合し、超音波プローブ (Vibra cell 75043)を用いて、１０秒間隔後の１０秒パルスの交互サイクルを５分間、超音波照射した。カルボキシ-CNT懸濁液を室温にて４時間インキュベートする。約5 μLのこの懸濁液を、システアミン自己組織化モノレイヤーで予め活性化されたSiO2ウェハー上のキャパシターのアレイ中の各キャパシターの面積3 mm2を覆う各GID電極上に滴下する。キャパシターチップを、次いで、カルボキシ-CNTの共有結合のため、気密加湿室で２４時間インキュベートした。キャパシターアレイを、次いで、まず、水中50% DMSOで洗浄し、その後、アセトンで洗浄して、痕跡量の未結合カルボキシ-CNT除去し、N2ガスで乾燥したカルボキシ-CNT固定化されていないキャパシターアレイを、比較のための対照として用いた。
【００８３】
本発明の具体例において、図２は、バイオチップを開発するためのカルボキシ-CNT活性化された金くし形 (GID)キャパシターチップの生体機能化およびE. coli細胞の固定の代表的概要図を図示する。図２に関して、カルボキシ-CNT活性化されたGIDキャパシターアレイ上にE. coli細胞を固定化する方法が、本発明の好ましい具体例により示される。典型的に、当業者に知られたいずれの細菌株も、本発明により用いることができる。好ましくは、前記細菌株はE. coli DH5αである。
【００８４】
カルボキシ-CNT活性化されたGIDキャパシターアレイ上へのE. coli細胞の固定化方法
活発に増殖するE. coli細胞を新鮮なLuria Bertani (LB)培地に接種し、対数増殖中期 [mid-logarithmic growth phase]まで増殖させた。細胞を、次いで、1000×gにて３分間遠心分離により収穫し、リン酸緩衝食塩水 (PBS) pH 7.2で３回洗浄し、前記細胞を再度同じ緩衝液に懸濁させた。細胞濃度は、連続希釈し、寒天平板上にプレートした後、コロニー計測することによって決定した。
【００８５】
カルボキシ-CNT活性化GIDキャパシターアレイチップを、まず、滅菌蒸留水ですすぎ、純窒素で乾燥し、100 mMのEDCおよび50 mMのNHSの混合物で２時間インキュベートした。そのチップを、次いで、取り出し、蒸留水で徹底的に洗浄し、PBS緩衝液中、8.7×106および1.74×107の２つの異なる濃度コロニー形成単位 (CFU)を含有する5 μLの細菌懸濁液で、それぞれ、２時間インキュベートした。異なる濃度の細菌細胞の固定化後に、光学顕微鏡写真を撮った。
【００８６】
E. coli（バイオチップ）が固定化されたGIDキャパシターチップに対するストレス化学物質の暴露
バイオチップを、まず、PBS緩衝液で洗浄し、加湿室中、37℃にて１時間プレインキュベートした。バイオチップの一連のキャパシターアレイに対し、モデルとして酢酸 (0-498 mM)、過酸化水素 (0-882 mM)および塩化ナトリウム (0-684 mM)のような、5 μLの異なる濃度の３種のストレス化学物質を、各キャパシター上で、１時間および３時間、それぞれ、すでにカルボキシ-CNTで活性化され、かつ、E. coli細胞が固定化されたキャパシターのアレイにおいて、37℃にてインキュベートした。このステップの後、前記バイオチップをPBS緩衝液、pH 7.2で洗浄し、即座に乾燥して、緩衝液を除去し、前記細胞周囲の湿度および細胞の応答を、いかなる液状栄養素／培養培地もなしに、細胞の応答を直接観察した。
【００８７】
インピーダンス／キャパシタンス測定
インピーダンス／キャパシタンス応答は、nFEISによるバイオチップ表面への化学物質処理前後で測定した。まず、前記キャパシタンス／インピーダンスは、（ａ）裸GID-キャパシター（ブランク）、（ｂ）カルボキシ-CNTでの活性化後、（ｃ）E. coli細胞でのバイオコンジュゲーション後、そして、最後は、（ｄ）異なる濃度および時間での異なるストレス化学物質に対するバイオチップの暴露後、を含む全てのステップの後に続けて測定した。
【００８８】
本発明のなお好ましい具体例によれば、図３は、（ａ）裸GID表面、（ｂ）裸GID表面のタッピングモードAFM形状像における選択された緑線領域（1 μm長）のラインプロット表面プロファイル、（ｃ）裸GID表面の3D AFM組織分布マップ、（ｄ）カルボキシ-CNTでGID表面活性化されたタッピングモードAFM形状像、（ｅ）カルボキシ-CNTで表面活性化されたキャパシター上のGID電極のタッピングモードAFM形状像における選択された緑線領域（1 μm長）のラインプロット表面プロファイル、（ｆ）カルボキシ-CNT活性化されたGID表面の3D AFM組織分布マップ、（ｇ）固定化されたE. coli細胞を示すバイオチップの区域（走査エリア 4.2 μm2）2DタッピングモードAFM像、のタッピングモードAFM像（4.2 × 4.2 μm2 走査エリア内）を図示する。
【００８９】
対照のため、バイオチップを、ストレス化学物質の代わりに、PBS緩衝液のみで処理し（ブランク）、ネガティブ対照実験を、加熱死E. coli細胞を含有するバイオチップを用いて行った。このため、固定化E. coli細胞(1.74 × 107)を含有するバイオチップを、気密予備加熱加湿室中、95℃にて５分間の加熱処理に付し、その後、-70℃にて5分間急速冷凍し、25℃にて15分間解凍した。上記の処理プロセスを３回繰返し、最終的に、前記バイオチップをN2ガス下で乾燥した。金くし形電極間におけるキャパシタンス応答を、50 MHzから1 GHzの周波数レンジ中で、ネットワークアナライザ (Karl-Suss PM-5 RF Probe Station and Agilent-8720ES)を用いて測定した。ネットワークアナライザは、SOLT (short-open-load-through)方法を用いて較正した。インピーダンス値は、分析のため、MATLABRソフトウェアにエクスポートした。３回の実験の絶対キャパシタンス値を有効周波数（ｆ）レンジ (300-600 MHz)にて抽出し、標準偏差を誤差として示した。
【００９０】
AFM像および光学顕微鏡写真によるバイオチップ センサー表面のキャラクタリゼーション
なお別の本発明の好ましい具体例によれば、図４は、カルボキシ-CNT固定化前後の金くし形キャパシターチップの代表的静電容量応答を図示する。カルボキシ-CNTの共有結合前後のGID電極キャパシターの表面組織分布AFM像を図3a-fに示す。裸GID電極表面は、様々な直径 (〜100-200 nm)サイズのナノ粒子の分布を呈示する（図1aおよびb）。金ナノ粒子のAFM 3D形状マップ像は、走査した4.2 × 4.2 μm2 GID電極表面積内で、高低の変化を示した（図1c）。カルボキシ-CNTの共有固定化による活性化された裸GID電極表面をAFM像（図3d-f）で確認した。GID表面上へのCNTの共有固定化後、カルボキシ-CNTの直径を50-70 nmから変化していることを決定した（図3e)。カルボキシ-CNT活性化GID電極表面のAFM 3D形状マップ像は、固定化されたカルボキシ-CNTの分布および変化する高低を示した。裸GIDキャパシター表面の応答は、弱く帯電し、カルボキシ-CNTでのセンサー表面の活性化は、かなり高度に帯電した表面に変化した（図4）。活性化されたセンサー表面は、次いで、バイオチップの開発のために生体機能化に付した。
【００９１】
なお別の本発明の好ましい具体例において、図５は、金くし形キャパシター表面の代表的光学顕微鏡写真：（ｉ）カルボキシ-CNT活性化されたもの（対照）、ならびに、（ｉｉ）8.7 × 106細胞および（ｉｉｉ）1.7 × 107細胞の濃度のE. coliが固定化されたカルボキシ-CNT活性化チップを図示する。列 (a-c, d-fおよびg-i)は、それぞれ、5X、10Xおよび100Xの光学解像度を示す。
【００９２】
カルボキシ-CNTで表面活性化されたGIDキャパシターは、２つの異なる濃度のE. coli DH5α細胞（８．７×１０６および１．７４×１０７ CFU）を固定化することによって、生体機能化した。E. coli細胞の固定化前後のカルボキシ-CNT活性化電極表面の光学顕微鏡写真を調べた（図5a-i）。チップの顕微鏡観察は、GID表面上に密にかつ共有的に固定化されたE. coli細胞を示した。チップのSiO2表面上の非特異的吸着も観察し、それは、PBS緩衝液でチップを繰り返し洗浄した後も共有的に固着されていた。より高い細胞濃度は、密に固定化された金電極表面をもたらし、それは、より低い細胞密度で固定化されたものとは明らかに識別された（図5d-i）。固定化されたE. coli細胞を示すバイオチップの区域の2D AFM像は図3gに示される。
【００９３】
本発明のさらなるなお別の具体例において、図6は、すでにカルボキシ-CNTで活性化されたGID表面上に２つの異なる濃度のE. coli細胞が固定化されたバイオチップの代表的静電容量応答を図示する。静電容量応答は、50-600 MHzの周波数掃引で観察した。生存E. coli細胞のキャパシタンス応答を、走査AC電気周波数 (50 MHzから1 GHz)の関数で測定し、キャパシタンス応答の増加に依存する細胞密度を観察した（図6）。低い周波数 (50-200 MHz)にて、キャパシタンス応答はあまり細胞濃度に依存しないが、印可周波数が200 MHzを超えると、それは細胞濃度により依存するようになる（図6）。さらに、１．７４×１０７CFUを超えるより高い細胞濃度は、SiO2表面に対してより非特異的な吸着を示した。１．７４×１０７CFUの細胞濃度が、SiO2表面上への最小限の非特異的吸着で比較的増強された応答を生じ、この濃度をAC電場下での異なるストレスに対する細胞応答の研究に選んだ。キャパシタンスは、50 MHzから600 MHzまで周波数の増加に伴い、減少した。以前の研究において、ラット好塩基球細胞へのGHz周波数での照射の効果は、本質的に熱的であることが示された。したがって、E. coliバイオチップセンサーでのストレス応答は、キャパシタンス測定の間に熱的影響が発生しないことを保障する600 MHz未満の印可AC電気周波数でのみ観察された。より好ましくは、静電容量応答は約50から約600 MHzの周波数掃引にて観察された。
【００９４】
なお別の本発明の好ましい具体例において、図７は、（ａ）規定形状および寸法の各キャパシターの金くし形電極上にカルボキシ-CNTで係留することによって生存E. coli細胞が固定化されたキャパシターアレイバイオチップ；および（ｂ）本発明の具体例による栄養素／培養培地の不存在下、正常および化学物質ストレス条件における印可AC周波数下でのE. coliの応答および表面電荷分布を示すダイアグラム、の略図を図示する。
【００９５】
培養培地の不存在下（乾燥条件下）バイオチップ表面に固定化されたE. coli細胞による化学物質ストレスに対する電気応答
E. coli細胞 (１．７４  ×  １０７CFU)が固定化されたカルボキシ-CNT活性化キャパシター表面を、酢酸（酸または代謝性ストレス）、H2O2（酸化ストレス）およびNaCl（塩ストレス）のような化学物質を含む様々な濃度の３種のモデルストレスで１および３時間処理した。電気応答を測定する前に、化学物質処理バイオチップを洗浄し、温和に乾燥して、バイオチップ上の細胞周りの痕跡量の水分を除去した。これは、細胞によって結合または吸収された化学物質のみが考慮されるようにした。異なるストレスに対する細胞の電気応答は、300から600 MHzのAC電気周波数掃引を印可した後、を用いて観察された。異なるストレスに対する濃度および時間依存応答は、いかなる液状培地も存在しない化学物質−細胞相互作用のみの状況で分析された。バイオチップ応答は、細胞ストレス応答を誘発する正常な生理学的レベルを超えるモデル化学物質の濃度で試験した。なおさらなる別の本発明の好ましい具体例において、図８は、本発明により、（ａ）１時間および（ｂ）３時間、異なる濃度の酢酸に暴露したとき、印可周波数 (300-600 MHz)の関数でE. coliキャパシターバイオチップ由来のキャパシタンス変化を図示する。図8aおよびbは、試験化学物質とインキュベートしたキャパシターバイオチップのアレイおよび有害化学物質とのE. coli細胞の応答の概要図を示す。
【００９６】
バイオチップは、まず、AC電気周波数掃引を印可することによって試験し、有効周波数 (300-600 MHz)にてデータを抽出した。印可周波数の関数としてキャパシタンス応答は、正常条件下（未処理細胞）で、463および582 MHz周波数にて、２つの特異的分散ピークを示した（図8a）。463および582 MHz周波数にて特徴的な分散ピークを示さない加熱死E. coliのバイオチップを用いて独立した対照実験を行うと、生存細胞のみが、前記分散ピークを示すことを示した（図12）。これら２つのピークは、対照／正常条件下の固定化E. coliの細胞活性の識別特性を表す。
【００９７】
E. coliバイオチップを異なる濃度の酢酸で処理して、センサー応答をプローブした。特徴的分散ピークは、酢酸の初期１時間処理によって課されたストレスのため、減少した。細胞の静電容量応答は、酢酸の濃度およびその暴露時間（１時間および３時間）の増加に伴って減少する傾向があった（図8aおよびb）。キャパシタンスの減少は、細胞膜を通す酢酸の輸送活性と細胞機能を損なう酢酸の低pHとの組合せに起因し、そして、細胞の増殖可能性および生存能力を低めるであろう。
【００９８】
細胞応答は、低周波数（<350 MHz）にて初期１時間は酢酸濃度に依存しないが、高い周波数にて、静電容量応答の大きさが認識された。観察された未処理細胞（対照）由来の463および582 MHz周波数にての特徴的な分散ピークは、初期１時間処理の酢酸ストレスのため、減少した。しかしながら、３時間の酢酸ストレス後、前記細胞は明確な応答パターンを呈示し、166 mM (1%)を超える酢酸の濃度は、463 MHzにて持続的な分散液ピークを持つ同様の応答を示しつつ、582 MHzは減少した（図8b）。これらの結果は、463 MHzおよび582 MHzの持続的な分散ピークによって証拠付けられるように、細胞は、時間をかけて（３時間）、酢酸により及ぼされたストレスに順応する傾向にあることを示した。３時間の酢酸暴露後、細胞は、あり、毒性のための初期１時間暴露とは違って、166 mM (1%)を超える酢酸に対してより敏感であった。
【００９９】
本発明のなお別の具体例において、図９は、（ａ）１時間および（ｂ）３時間、異なる濃度のH2O2に暴露したとき、印可周波数 (300-600 MHz)の関数でE. coliキャパシターバイオチップでのキャパシタンスの変化を図示する。本発明により、酸化ストレスに対するE. coliバイオチップ応答が観察された。バイオチップセンサー表面を、それぞれ、１時間および３時間、異なる濃度のH2O2 (0-882 mM, 0-3%)で処理した。294 mM (1%)のH2O2で処理したE. coli細胞は、暴露時間とは無関係な無視し得るキャパシタンス応答の変化を生じたが、463および582 MHzの特徴的な分散ピークの消失が１時間で観察され、それらは３時間にて持続された。それは、細胞が、３時間にわたるストレスに順応したという事実に一致する（図9aおよびb）。図9bから、細胞が、588 mM (2%)のH2O2で、より高いキャパシタンス応答を示し、この応答は、882 mM (3%)で３時間の暴露にて、目立って減少する傾向にあり、582 MHzにて特徴的分散液ピークを消失したことが観察された。この結果は、E. coli細胞が294 mM (1%) H2O2により発生した低レベルの酸化毒性に抵抗したことを示した。一方、588 mM (2%) H2O2濃度にて、細胞は、酸化剤に対して順応応答を呈し、それは、低レベルのH2O2への暴露は、細菌細胞をさらなる毒性用量のH2O2に対する暴露に抵抗性にすることを示す（図9b）。しかしながら、より高いレベル（882 mM, 3%のH2O2）でさえ、センサーチップはかなり減少したキャパシタンス応答を呈し、細胞は、３時間の暴露にて588 mM (2%)のH2O2と反対に、882 mM (3%)により引き起こされたより高いレベルの酸化毒性でのストレスに対抗できなかったことを示唆する。
【０１００】
なおさらなる別の本発明の好ましい具体例において、図１０は、（ａ）１時間および（ｂ）３時間、異なる濃度のNaClで暴露したとき、印可周波数 (300-600 MHz)の関数で、E. coliキャパシターバイオチップ由来のキャパシタンスの変化を図示する。CNT活性化センサーバイオチップを、細胞に対して毒性ではないが、より高いレベルにて塩／浸透ストレスを誘発し得るなお別の化学物質で処理することによって、さらに試験した。様々な濃度のNaCl (0-684 mM, 0-4%)をバイオチップでインキュベートして、塩ストレス応答を研究した。細胞は、初期１時間の処理にて、0-513 mM NaCl (0-3%)濃度に対して温和な順応応答を受け、それらの細胞は、684 mM (4%)のNaCl濃度で塩ストレスを受ける傾向にある（図10a）。さらに、１時間の塩暴露にて、特徴的な分散ピークは目立たなかった。１から３時間の延長した細胞の暴露にて、342 mM (2%)を超える塩濃度は塩ストレスを誘発することが分かったが、細胞は低めの濃度 (171-342 mM, 1-2%)にて、塩ストレスにより影響されなかった（図10b）。
【０１０１】
本発明のなおさらなる別の具体例において、図１１は、定常AC電気周波数 (350 MHz)にて１および３時間の処理時間、異なる濃度の（ａ）酢酸（酸ストレス）、（ｂ）H2O2（酸化ストレス）および（ｃ）NaCl（塩ストレス）の関数で、（CNT活性化センサーチップ上に固定化された）E. coli細胞の応答を図示する。挿入された表は、E. coli細胞が受けたストレスレベルのパーセント相対変化を定量するカラーコード値を示す。ストレスカラーコードスケールはストレスレベルの重篤度を示し、緑が順応／抵抗を表し、赤が本発明の具体例によるストレス／毒性を表す。
【０１０２】
化学物質によって負荷されたストレスの重篤度およびカラーコードの確認
化学物質によって負荷されたストレスの重篤度を目視検査のため、カラーコード化した（図11）。赤色および緑色は、それぞれ、毒性および非毒性を示す。色の強度は、毒性の重篤度を示す。例えば、真っ赤は重度の毒性を示し、緑は順応応答を示す。結果は、酢酸での処理がキャパシタンス応答を減少させ、それは、時間をかけて（1-3時間）、酢酸により重度に影響された細胞（図11a中、赤で示される）であることの指標である。対照的に、H2O2は、初期の１時間暴露にて、順応応答を呈し（図11b中緑で示される）、より高い濃度 (882 mM, 3%)にて３時間で、細胞は、高いH2O2により課された酸化ストレスにより影響される傾向があり（図11b）、882 mM (3%) H2O2が細胞に対して毒性であることを示唆する。同様の応答が、様々な塩濃度で処理した細胞で観察された。初期１時間のNaCl暴露にて、細胞は、表面電荷分布を増大させるように順応する傾向にあり、かくして、キャパシタンスを増加させることがわかった。しかしながら、３時間の暴露後、キャパシタンスは、塩ストレスのため、342 mM (2%)より高いレベルのNaClで減少する傾向にある（図11c）。結果から、細胞は、酢酸またはH2O2で見られるものと比較して、NaClにはさほど影響されず、細胞は高い塩レベルに耐え得ることが明らかである。この結果は、E. coliにつき1.1 M (〜6.5%) NaClまでの塩耐性レベルが報告され、細胞は浸透耐性に関して高い塩濃度まで順応する傾向にあるという以前の研究に一致する。
【０１０３】
本発明の別の具体例において、図１２は、カルボキシ-CNTのみと共有結合された裸GID表面（黒で示す）；生存8.7 × 106細胞（赤）および1.74 × 107細胞（青）が固定化されたバイオチップ；ならびにカルボキシ-CNTですでに活性化されたGID表面上の加熱死1.74 × 107細胞（緑）の静電容量応答の代表的な結果を図示する。静電容量応答は、300-600 MHzの周波数レンジにて観察された。
【０１０４】
本発明のさらなるなお別の具体例によれば、図１３は、２つの同および反単位電荷により、本発明の具体例による細胞外面上で距離「r」離れた分子双極子「m」を構成する荷電雲に包まれた典型的な細胞の代表的概要図を図示する。結果は、細菌バイオチップによるAC電場下、ストレス化学物質に対する細菌細胞の変化した挙動を示した。開発したE. coliベースの静電容量バイオセンサーの基本的仮説は、以下である。複雑な細菌細胞表面は、表面のイオン化側鎖で構成される陽および陰電荷ならびに、外膜上の繊毛タンパク質からなる。典型的な細菌細胞、例えば、球状タンパク質は、典型的に、電気双極子を構成する表面電荷を呈示する。細菌細胞 (E. coli)のこの最も簡便な分子双極子は、ベクトル距離r離れた大きさが+qおよび-qの反対符号の電荷対からなる。分子双極子モーメントmは、等式m = qrで与えられる（図13）。本発明の具体例によれば、固体表面上に固定化されている細菌細胞は、いずれかの毒性化学物質に暴露されたとき、ストレス条件を受ける。なぜならば、外膜は、有毒化学物質との相互作用により壊れやすく、さらには崩壊されて、変化した表面電荷分布を呈示するからである。
【０１０５】
本発明によれば、細胞ストレスを誘発する化学物質の影響をnFEISにより決定するための生物学的認識素子として、生存E. coli細胞に結合した非侵襲性、無標識静電容量バイオチップ（バイオチップ）が開発された。本発明によれば、モデル化学物質を用いて、（ａ）代謝性ストレスすなわち酸ショックを誘発する酢酸、（ｂ）・OH発生により酸化毒性に寄与する過酸化水素、および（ｃ）塩／浸透ストレスを誘発する塩化ナトリウムなどで、E. coliバイオチップの応答を試験した。異なる化学物質に対する濃度依存性様式の個別の応答は、所与の化学物質の毒性についての知見を提供した。
【０１０６】
生きた細胞は、異なる電気特性を有する材料の複雑な空間配置からなる。典型的に、細菌は、（ミトコンドリアの不存在下）酸化的リン酸エステル化が生じる細胞膜を有する。細菌の細胞膜は細胞壁に取り囲まれ、それは剛直であり、細胞を浸透溶解または外部環境摂動から保護することが当業者に知られている。グラム陰性菌において、外膜はリポ多糖類およびタンパク質で作られる。細胞膜は、多くのタンパク質を含有する脂質二重層からなり、そこでは、脂質分子がその極性基を水性環境に向かって外側に向き、それらの疎水性炭化水素鎖が内側に向いて膜内部を形成するように配向している。細胞内側は膜被覆微粒子および多くの溶解荷電分子を含有する。細胞膜は、典型的に、高度に絶縁性であるが、細胞内部は高度に導電性である。細菌細胞の観察された絶縁特性は、薄い絶縁膜に含有され、さらに多孔導電性細胞壁で取り囲まれている導電性細胞質コアからなるモデルに基づき説明できる。
【０１０７】
典型的に、キャパシターセンサー表面の感度は、裸GIDキャパシターセンサーを用いて試験された。本発明の好ましい具体例によれば、これらのセンサーの感度は、ここで記載されるように、カルボキシ-CNTによりGID表面を活性化することによって増進した。キャパシタンス応答のレベルは、数桁増進されることが観察された（図4）。したがって、全ての実験は、E. coli細胞が固定化されたカルボキシ-CNT活性化センサーチップを用いて行った。ここで、２つのE. coli濃度(8.7×106および1.74×107)の固定化を選択した。なぜならば、これらの濃度は、SiO2表面への非特異的吸着が最小だからである。細胞濃度をさらに増加させても、単に、センサー表面上への非特異的吸着を増やしただけであった。このため、チップ作成過程中、非特異的吸着を防止するための付随的なステップ、例えば、SU-8のようなフォトレジストポリマーによりSiO2-表面を不動態化して、細菌細細胞の有効な固定化を可能にし、感動を増進することができるGID領域開口部のみを残すことが必要である。
【０１０８】
本発明のなおさらなる別の具体例において、この方法は細菌を用いることを例示するが、この方法は、他の細胞（細菌またはほ乳類）または特定機能の組織に拡張して、外部刺激に対する応答をプローブすることができる。
【０１０９】
典型的に、低周波数にて、キャパシタンス応答は、ほとんど細胞濃度／ストレスに依存しないが、300 MHzの印可周波数を超えるとより依存するようになる。AC電気周波数場に暴露された細胞は、細胞壁の表面の内側および外側の双方でイオン層の移動を有効に生じ、電気的に分極することが、当業者に知られている。この分極は、典型的に、外部および境界表面に作られる電荷の形成をもたらし（図7b）、300 MHzを超えてキャパシタンスの減少したレベルに影響を与え、かくして、緩和挙動が観察された（図8-10）。
【０１１０】
特徴的分散ピークが、AC電場 (300-600 MHz)に暴露したとき、未処理細胞（463および582 MHz周波数での対照）から観察された。これらの特徴的分散ピークの出現は、対照条件下、生存E. coliの存在／付着の明らかな指標である。酢酸、H2O2およびNaClでの異なるストレスで細胞が処理されると、細胞表面は、これらのストレスと相互作用し、順応／有害応答に向かう感度を示した。細菌細胞とストレスとの相互作用は、最もあり得ることとして、正味の表面電荷の減少を生じ、これは、特徴的分散ピークの消失を引き起こす。これは最もあり得ることである。なぜならば、ストレス環境の暴露されたとき、細胞の膜機能が損失し、その結果、膜はイオンに対してより多孔質になり、余計な細胞質タンパク質ミスフォールディングも引き起こすからである。応答は300-600 MHzの周波数掃引に対して動的なので、特定周波数でのバイオチップの応答をモニターすることが可能であった。したがって、350 MHzの周波数を任意で選択し、絶対キャパシタンス値を抽出して、モデルストレス化学物質に対して、それらの濃度および時間に関し、E. coli細胞の個別の応答を明らかにした。化学物質によって負荷されたストレスの重篤度を、目視検査のため、カラーコード化した（図11a-c）。
【０１１１】
これらの結果は、酢酸での処理は、キャパシタンス応答の減少を生じ、それは、時間（1-3時間）をかけて酢酸により、細胞が重度に影響されたこと（図11a中、赤で示される）の指標である。対照的に、H2O2は、初期１時間暴露にて、順応応答を呈示すが（図6b中、緑で示される）、882 mM (3%)で３時間にて、細胞は、高H2O2により課された酸化ストレスにより影響され（図11b）、882 mM (3%) H2O2は細胞に対して毒性であることを示唆する。同様の応答が、様々な塩濃度で処理された細胞で観察された。初期１時間のNaCl暴露にて、細胞は、表面電荷分布を増大させて、かくして、キャパシタンスを増加させることによって順応する傾向にあることが分かった。しかしながら、暴露の３時間後、キャパシタンスは、342 mM (2%)のNaClよりも高いレベルでは、塩ストレスのため、減少する傾向にある（図11c）。これらの結果から、細胞は、酢酸やH2O2で見られるほど、NaClによってはあまり影響されず、細胞は高い塩レベルに耐え得るが、高い酢酸やH2O2には耐えられないことが明らかである。この結果は、E. coliにつき1.1 M (〜6.5%) NaClまでの塩耐性レベルが報告され、細胞は浸透耐性に関して高い塩濃度まで順応する傾向にあるという以前の研究に一致する。
【０１１２】
典型的に、E. coliは、様々なストレッサーに対する応答において細菌エンベロープの維持、順応および保護に関与する。E. coliにおけるエンベロープストレス応答は、典型的に、毒性化合物の流出で順応応答を律し、未確認機構により他のエンベロープ摂動から保護する、BaeSおよびBaeR（BaeSRレギュロン）のような膜局在化タンパク質からなる二成分系により調節されることが当業者に知られている。
【０１１３】
本発明のなお好ましい具体例において、化学物質を誘発するストレスの影響をモニターするためのバイオチップ上の生物学的認識素子としてのE. coli細胞の挙動が非侵襲性方法で検出できる。
【０１１４】
生体系に対する化学物質の毒性の検出のための新規方法の開発は、E. coliが固定化されたカルボキシ-CNT活性化GIDキャパシターアレイチップを用いる。検出方法論は、細菌細胞に対して化学物質により課せられたストレスをモニターするためのnFEIS技術に基づく。この研究で開発されたバイオチップを用いることは、化学物質の毒性を理解し、非毒性のものから区別するのに有効な手段である。バイオ−キャパシター検知装置はセンサープラットホームを提供し、それは、本質的に毒性ガスを含み、ストレス／毒性応答を誘発する標的化学物質のキャラクタリゼーションにも使用できる。E. coliバイオチップの開発の興味深い特徴は、E. coliの活性の識別特性として463および582 MHzの分散ピークであり、これらの周波数でのキャパシタンスレベルの変化はストレス化学物質の有毒性を決定するであろう。
【０１１５】
すでに説明した本発明は、多くの利点を有する。開発したバイオチップを用いる主たる利点のうちのひとつは、処理後即座にバイオチップ表面を単に適当な緩衝液で洗い流し、乾燥条件下または干渉性液状栄養素／培養培地なしにキャパシタンスを測定することによって、非特異的信号を回避できることである。開発された検出方法論およびバイオチップは、したがって、ストレス剤の異なる物理形態（気相、固相、液相を含む）の試験において、これらの方法および装置を特別に価値あるものにする利点を見いだし、潜在的な毒性の決定および環境汚染および食物サンプルをモニターするスクリーニングにまで拡張できる。しかしながら、（ａ）金くし形電極のよりよい設計、（ｂ）形状、（ｃ）細胞のSiO2表面への非特異的吸着を防止するため、チップ作成中、SiO2表面上への蒸着不動態化層形成の付随するステップが要求される、（ｄ）表面化学、（ｅ）シグナル対ノイズ比、および（ｆ）バイオ−化学アッセイ条件により感度を向上させることを強調する必要のある努力はあまりない。
【０１１６】
本願の上記または下記の記載および図面は、本発明による１以上の目下の好ましい具体例に着目し、いくつかの代表的な任意の特徴および／または代替的な具体例も記載する。明細書および図面は、例示が目的で、限定するものではない。当業者は、変形、修正および代替を認識するであろう。そのような変形、修正および代替も本発明の範囲内である。項の題名は簡潔なものであり、利便性目的のみである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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