(57)【要約】  本発明の側面は、ナノ粒子構築物の細胞取り込み量を評価するため、ナノ粒子構築物の標的結合量を評価するため、および所与の細胞におけるＲＮＡおよびタンパク質の量を評価するための新規方法および組成物に関する。
2014531898.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子構築物の細胞取り込みを検出する方法であって、以下：
ナノ粒子コアと、
該ナノ粒子コアに付着しており、標的分子に特異的な結合部位を含む第一の部分と、
前記ナノ粒子コアに付着しており、参照発色団を含み、取り込み制御部位を含む第二の部分と
を含むナノ粒子構築物を提供すること；
前記ナノ粒子構築物を細胞に接触させること；および、
前記細胞内の前記参照発色団のレベルを検出すること
を含む、ここで前記細胞内の前記参照発色団のレベルが、該細胞内における前記ナノ粒子構築物の細胞取り込みレベルを示す、前記方法。
【請求項２】
ナノ粒子構築物が、参照発色団を１つより多く含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
取り込み制御部位が、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはポリマーを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
参照発色団の１つまたは２つ以上が、フルオロフォアまたは量子ドットである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
結合部位および／または取り込み制御部位が、スペーサーによりナノ粒子コアに連結されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
結合部位が、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ポリヌクレオチドが、ＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ポリヌクレオチドが、ｓｓＲＮＡである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ポリヌクレオチドが、ｄｓＲＮＡである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドが、抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
結合部位が、標識される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
標識が、結合部位がその標的分子に結合すると検出される検出可能マーカーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
検出可能マーカーが、発色団である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ナノ粒子コアが、金属製である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
金属が、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケルおよびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ナノ粒子コアが、金を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ナノ粒子コアが、分解性の金を含む格子構造である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ナノ粒子の直径が、平均直径として約１ｎｍ〜約２５０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２４０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２３０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２２０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２１０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２００ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１９０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１８０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１７０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１６０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１５０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１４０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１３０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１２０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１１０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、または平均直径として約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、または平均直径として約１ｎｍ〜約１０ｎｍである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ナノ粒子構築物が、複数の結合部位を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
結合部位が、１つの標的分子に結合する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
結合部位が、複数の標的分子に結合する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
方法が、治療部分または検出部分を細胞へ送達することを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
方法が、標的分子の発現を調節することを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
細胞中でのナノ粒子構築物の標的分子への結合を検出する方法であって、以下：
ナノ粒子コアと、
該ナノ粒子コアに付着しており、第一の発色団を含み、標的分子に特異的な結合部位を含む第一の部分と、
前記ナノ粒子コアに付着しており、第二の発色団を含み、取り込み制御部位を含む第二の部分と
を含むナノ粒子構築物を提供すること；
前記ナノ粒子構築物を細胞に接触させること；および、
前記細胞内の前記の第一および第二の発色団のレベルを検出すること
を含む、ここで前記第二の発色団のレベルに対する前記第一の発色団のレベルが、細胞中での前記ナノ粒子構築物の標的分子への結合レベルを示す、前記方法。
【請求項２５】
ナノ粒子構築物が、参照発色団を１つより多く含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
取り込み制御部位が、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはポリマーを含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
参照発色団の１つまたは２つ以上が、フルオロフォアまたは量子ドットである、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
結合部位および／または取り込み制御部位が、スペーサーによりナノ粒子コアに連結されている、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
結合部位が、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ポリヌクレオチドが、ＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ポリヌクレオチドが、ｓｓＲＮＡである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ポリヌクレオチドが、ｄｓＲＮＡである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ポリペプチドが、抗体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
第一の発色団が、結合部位がその標的分子に結合すると検出される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
ナノ粒子コアが、金属製である、請求項２４〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
金属が、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケルおよびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ナノ粒子コアが、金を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ナノ粒子コアが、分解性の金を含む格子構造である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ナノ粒子の直径が、平均直径として約１ｎｍ〜約２５０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２４０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２３０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２２０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２１０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２００ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１９０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１８０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１７０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１６０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１５０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１４０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１３０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１２０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１１０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、または平均直径として約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、または平均直径として約１ｎｍ〜約１０ｎｍである、請求項２４〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
ナノ粒子が、複数の結合部位を含む、請求項２４〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
結合部位が、１つの標的分子に結合する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
結合部位が、複数の標的分子に結合する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
方法が、治療用部分または検出用部分を細胞に送達することを含む、請求項２４〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
方法が、標的分子の発現を調節することを含む、請求項２４〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
ナノ粒子コア；
該ナノ粒子コアに付着しており、標的分子に特異的な結合部位を含む第一の部分；および
前記ナノ粒子コアに付着しており、参照発色団を含み、取り込み制御部位を含む第二の部分
を含む、ナノ粒子構築物。
【請求項４６】
ナノ粒子構築物が、発色団を１つより多く含む、請求項４５に記載のナノ粒子構築物。
【請求項４７】
取り込み制御部位が、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはポリマーを介してナノ粒子コアに付着している、請求項４５または４６に記載のナノ粒子構築物。
【請求項４８】
１つまたは２つ以上の参照発色団が、フルオロフォアまたは量子ドットである、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載のナノ粒子構築物。
【請求項４９】
結合部位および／または取り込み制御部位が、スペーサーによりナノ粒子コアに連結されている、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載のナノ粒子構築物。
【請求項５０】
結合部位が、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載のナノ粒子構築物。
【請求項５１】
ポリヌクレオチドが、ＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項５０に記載のナノ粒子構築物。
【請求項５２】
ポリヌクレオチドが、ｓｓＲＮＡである、請求項５１に記載のナノ粒子構築物。
【請求項５３】
ポリヌクレオチドが、ｄｓＲＮＡである、請求項５１に記載のナノ粒子構築物。
【請求項５４】
ポリペプチドが、抗体である、請求項５０に記載のナノ粒子構築物。
【請求項５５】
結合部位が、標識される、請求項４５〜５４のいずれか一項に記載のナノ粒子構築物。
【請求項５６】
標識が、結合部位がその標的に結合すると検出される検出可能マーカーである、請求項５５に記載のナノ粒子構築物。
【請求項５７】
検出可能マーカーが、発色団である、請求項５６に記載のナノ粒子構築物。
【請求項５８】
ナノ粒子コアが、金属製である、請求項４５〜５７のいずれか一項に記載のナノ粒子構築物。
【請求項５９】
金属が、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケルおよびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項５８に記載のナノ粒子構築物。
【請求項６０】
ナノ粒子コアが、金を含む、請求項５９に記載のナノ粒子構築物。
【請求項６１】
ナノ粒子コアが、分解性の金を含む格子構造である、請求項４５〜６０のいずれか一項に記載のナノ粒子構築物。
【請求項６２】
ナノ粒子の直径が、平均直径として約１ｎｍ〜約２５０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２４０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２３０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２２０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２１０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２００ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１９０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１８０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１７０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１６０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１５０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１４０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１３０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１２０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１１０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、または平均直径として約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、または平均直径として約１ｎｍ〜約１０ｎｍである、請求項４５〜６１のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項６３】
構築物が、複数の結合部位を含む、請求項４５〜６２のいずれか一項に記載のナノ粒子構築物。
【請求項６４】
結合部位が、１つの標的分子に結合する、請求項６３に記載のナノ粒子構築物。
【請求項６５】
結合部位が、複数の標的分子に結合する、請求項６３に記載のナノ粒子構築物。
【請求項６６】
治療用部分または検出用部分を細胞に送達する方法であって、請求項４５〜６５のいずれか一項に記載のナノ粒子構築物を前記細胞へ送達することを含む、前記方法。
【請求項６７】
標的分子の発現を調節する方法であって、請求項４５〜６５のいずれか一項に記載のナノ粒子構築物を細胞に送達することを含む、前記方法。
【請求項６８】
ナノ粒子；
標的分子に特異的な結合部位を含む部分；および
参照発色団を含む部分
を含むキット。
【請求項６９】
使用指示書をさらに含む、請求項６８に記載のキット。
【請求項７０】
ポリヌクレオチドが、ｓｓＤＮＡである、請求項７に記載の方法。
【請求項７１】
ポリヌクレオチドが、ｓｓＤＮＡである、請求項３０に記載の方法。
【請求項７２】
ポリヌクレオチドが、ｓｓＤＮＡである、請求項５１に記載のナノ粒子構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１１年９月１１日に出願された米国特許仮出願第６１／５３３，２３８号、名称「ｍＲＮＡ標的の細胞内定量検出」に対して、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張し、その全開示を参照により本明細書に組み込むものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、粒子の細胞取り込みをモニタリングするための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ナノ粒子構築物などの構築物を細胞へ送達することは、多くの治療的および診断的アプローチの主要な側面である。例えば、ナノ粒子構築物は、化学療法用薬剤などの薬剤の送達や、細胞における生体分子と結合してその発現を調節し、細胞におけるＲＮＡやタンパク質などの分子のレベルを評価するために使用可能なオリゴヌクレオチドや抗体などの結合部位を送達するために使用可能である。
【０００４】
ナノ粒子構築物の送達を含む多数の応用において、送達の有効性を決定するためおよび／または構築物の所要レベルを評価するためなど、構築物の細胞取り込み量を決定することは重要である。同一のナノ粒子構築物が、異なる細胞タイプに異なる速度で進入する。従って、同一の構築物が、細胞タイプの違いによって異なる効果を有する可能性がある。構築物の細胞取り込みレベルを正確に測定すること、および異なる細胞タイプ間の細胞取り込みを比較することは困難である。一般に、構築物の効果が細胞間で異なるのは細胞取り込みの違いによるのかどうかを調べ、取り込みを標準化するために、分析測定法が必要とされる。金属粒子に関しては、そのような測定法の例として、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）が挙げられる。ＩＣＰ−ＭＳを使用すれば、細胞に存在する金、銀、鉄などの金属の量を測定し、細胞内に存在する構築物の濃度と効果を関連させることが可能となる。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書では、ナノ粒子構築物の細胞取り込みを測定するための新規方法および組成物を説明する。本発明のある側面は、ナノ粒子構築物の細胞取り込みを検出する方法であって、ナノ粒子コアと、該ナノ粒子コアに付着しており、標的分子に特異的な結合部位を含む第一の部分と、該ナノ粒子コアに付着しており参照発色団を含む、取り込み制御部位を含む第二の部分とを含むナノ粒子構築物を提供すること、該ナノ粒子構築物を細胞に接触させること、および該細胞内の該参照発色団のレベルを検出することを含み、該細胞内の該参照発色団のレベルが、該細胞内における該ナノ粒子構築物の細胞取り込みレベルを示すものである、前記方法に関する。
【０００６】
ある実施態様では、前記ナノ粒子構築物が２つ以上の参照発色団を含む。ある実施態様では、前記取り込み制御部位がポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはポリマーを含む。ある実施態様では、前記参照発色団の１つ以上がフルオロフォアまたは量子ドットである。ある実施態様では、前記結合部位および／または前記取り込み制御部位がスペーサーにより前記ナノ粒子コアに連結されている。
【０００７】
ある実施態様では、前記結合部位がポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドが結合部位として作用するある実施態様では、前記ポリヌクレオチドがＲＮＡまたはＤＮＡである。ある実施態様では、結合部位として作用するポリヌクレオチドがｓｓＲＮＡである。ある実施態様では、結合部位として作用するポリヌクレオチドがｄｓＲＮＡである。ある実施態様では、結合部位として作用するポリヌクレオチドがｓｓＤＮＡである。ポリペプチドが結合部位として作用するある実施態様では、前記ポリペプチドが抗体である。
【０００８】
ある実施態様では、前記結合部位が標識されている。ある実施態様では、前記標識は、前記結合部位がその標的分子に結合すると検出される検出可能マーカーである。ある実施態様では、前記検出可能マーカーが発色団である。
【０００９】
ある実施態様では、前記ナノ粒子構築物のナノ粒子コアが金属製である。ある実施態様では、前記金属が、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケルおよびそれらの混合物からなる群から選択される。ある実施態様では、前記ナノ粒子コアが金を含む。ある実施態様では、前記ナノ粒子コアが分解性の金を含む格子構造体である。
【００１０】
ある実施態様では、前記ナノ粒子の直径が、平均直径として約１ｎｍ〜約２５０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２４０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２３０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２２０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２１０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２００ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１９０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１８０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１７０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１６０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１５０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１４０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１３０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１２０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１１０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、または平均直径として約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、または平均直径として約１ｎｍ〜約１０ｎｍである。
【００１１】
ある実施態様では、前記ナノ粒子構築物が複数の結合部位を含む。ある実施態様では、前記結合部位が１つの標的分子に結合する。他の実施態様では、前記結合部位が複数の標的分子に結合する。
ある実施態様では、前記方法が治療用または検出用部分を細胞へ送達することを含む。
ある実施態様では、前記方法が標的分子の発現を調節することを含む。
【００１２】
本発明の他の側面は、細胞中でのナノ粒子構築物の標的分子への結合を検出する方法であって、ナノ粒子コアと、該ナノ粒子コアに付着しており第一の発色団を含む、標的分子に特異的な結合部位を含む第一の部分と、該ナノ粒子コアに付着しており第二の発色団を含む、取り込み制御部位を含む第二の部分とを含むナノ粒子構築物を提供すること、該ナノ粒子構築物を細胞に接触させること、および該細胞内の該第一および第二の発色団のレベルを検出することを含み、該第二の発色団のレベルに対する該第一の発色団のレベルが、細胞中での該ナノ粒子構築物の標的分子への結合レベルを示すものである、前記方法に関する。
【００１３】
ある実施態様では、前記ナノ粒子構築物が２つ以上の参照発色団を含む。ある実施態様では、前記取り込み制御部位がポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはポリマーを含む。ある実施態様では、前記参照発色団の１つ以上がフルオロフォアまたは量子ドットである。ある実施態様では、前記結合部位および／または前記取り込み制御部位がスペーサーにより前記ナノ粒子コアに連結されている。
【００１４】
ある実施態様では、前記結合部位がポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドが結合部位として作用するある実施態様では、前記ポリヌクレオチドがＲＮＡまたはＤＮＡである。ある実施態様では、結合部位として作用するポリヌクレオチドがｓｓＲＮＡである。ある実施態様では、結合部位として作用するポリヌクレオチドがｄｓＲＮＡである。ある実施態様では、結合部位として作用するポリヌクレオチドがｓｓＤＮＡである。ポリペプチドが結合部位として作用するある実施態様では、前記ポリペプチドが抗体である。
【００１５】
細胞における標的分子でのナノ粒子構築物の結合を検出する方法のある実施態様では、前記第一の発色団は、前記結合部位がその標的分子に結合すると検出される。
ある実施態様では、前記ナノ粒子構築物のナノ粒子コアが金属製である。ある実施態様では、前記金属が、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケルおよびその混合物からなる群から選択される。ある実施態様では、前記ナノ粒子コアが金を含む。ある実施態様では、前記ナノ粒子コアが分解性の金を含む格子構造体である。
【００１６】
ある実施態様では、前記ナノ粒子の直径が、平均直径として約１ｎｍ〜約２５０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２４０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２３０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２２０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２１０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２００ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１９０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１８０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１７０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１６０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１５０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１４０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１３０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１２０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１１０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、または平均直径として約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、または平均直径として約１ｎｍ〜約１０ｎｍである。
【００１７】
ある実施態様では、前記ナノ粒子構築物が複数の結合部位を含む。ある実施態様では、前記結合部位が１つの標的分子に結合する。他の実施態様では、前記結合部位が複数の標的分子に結合する。
ある実施態様では、前記方法が治療用または検出用部分を細胞へ送達することを含む。
ある実施態様では、前記方法が標的分子の発現を調節することを含む。
【００１８】
本発明の他の側面は、ナノ粒子コアと、該ナノ粒子コアに付着しており、標的分子に特異的な結合部位を含む第一の部分と、該ナノ粒子コアに付着しており参照発色団を含む、取り込み制御部位を含む第二の部分とを含むナノ粒子構築物に関する。
ある実施態様では、このナノ粒子構築物が、２つ以上の発色団を含む。ある実施態様では、前記１つ以上の参照発色団がフルオロフォアまたは量子ドットである。
ある実施態様では、前記取り込み制御部位がポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはポリマーを介して前記ナノ粒子コアに付着している。
【００１９】
ある実施態様では、前記結合部位および／または前記取り込み制御部位がスペーサーにより前記ナノ粒子コアに連結されている。ある実施態様では、前記結合部位がポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドが結合部位として作用するある実施態様では、前記ポリヌクレオチドがＲＮＡまたはＤＮＡである。ある実施態様では、結合部位として作用するポリヌクレオチドがｓｓＲＮＡである。ある実施態様では、結合部位として作用するポリヌクレオチドがｄｓＲＮＡである。ある実施態様では、結合部位として作用するポリヌクレオチドがｓｓＤＮＡである。ポリペプチドが結合部位として作用するある実施態様では、前記ポリペプチドが抗体である。
【００２０】
ある実施態様では、前記結合部位が標識されている。ある実施態様では、この標識は、前記結合部位がその標的に結合すると検出される検出可能マーカーである。ある実施態様では、標識として作用する前記検出可能マーカーが発色団である。
ある実施態様では、前記ナノ粒子コアが金属製である。ある実施態様では、前記金属が、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケルおよびその混合物からなる群から選択される。ある実施態様では、前記ナノ粒子コアが金を含む。ある実施態様では、前記ナノ粒子コアが分解性の金を含む格子構造である。
【００２１】
ある実施態様では、前記ナノ粒子の直径が平均直径として約１ｎｍ〜約２５０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２４０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２３０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２２０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２１０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２００ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１９０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１８０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１７０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１６０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１５０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１４０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１３０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１２０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１１０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、または平均直径として約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、または平均直径として約１ｎｍ〜約１０ｎｍである。
【００２２】
ある実施態様では、前記ナノ粒子構築物が複数の結合部位を含む。このナノ粒子構築物のある実施態様では、前記結合部位が１つの標的分子に結合する。他の実施態様では、前記結合部位が複数の標的分子に結合する。
【００２３】
本発明のさらなる側面は、治療用または検出用部分を細胞に送達する方法であって、上記組成物のナノ粒子構築物を細胞に送達することを含む、前記方法に関する。
本発明のさらなる側面は、ナノ粒子と、標的分子に特異的な結合部位を含む部分と、参照発色団を含む部分とを含むキットに関する。ある実施態様では、前記キットは使用指示書をさらに含む。
【００２４】
本発明の限定の各々は、本発明の様々な実施態様を含むことが可能である。従って、任意の一つの要素または要素の組合わせを含む本発明の限定の各々が、本発明の各側面に含まれることが可能であると期待される。本発明の応用は、以下の説明の記載や図面の例示の詳細な構造や成分の構成に限定されるものではない。本発明は、他の実施態様も可能であり、様々な方法で実行または実施可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
添付の図面は、実際の寸法通りに描かれたものではない。図面において、異なる図面におけるそれぞれ同一または略同一の成分は同様の符号により示される。理解しやすいように、全ての成分が全ての図面において標識されているわけではない。
【図１】図１は、治療および／または検出用二本鎖部分を含むナノ粒子構築物の非限定的例を示す。
【００２６】
【図２】図２は、治療および／または検出用二本鎖部分と、参照発色団を有する取り込み制御オリゴヌクレオチドとを含むナノ粒子構築物の非限定的例を示す。
【図３】図３は、Ｃｙ３発色団を有する取り込み制御オリゴヌクレオチドが、異なるバッチの調製物において一定のレベルで負荷されることを示している。
【００２７】
【図４】図４は、取り込み標準化シグナルへ頑健性を付与するために、複数の取り込み制御オリゴヌクレオチドが、同一のナノ粒子構築物に組み込み可能であることを示している。この非限定的例では、例えば、Ｃｙ５およびＣｙ３発色団が示される。これらの発色団は、異なる調製物の間で同一なナノ粒子構築物を得るために、ナノ粒子に一定に負荷可能である。
【図５】図５は、Ｃｙ５およびＣｙ３標識オリゴヌクレオチドを含むナノ粒子構築物の異なる製剤の細胞取り込みを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
本発明の側面は、ナノ粒子構築物の細胞取り込みレベルを評価するため、ナノ粒子構築物の標的結合レベルを評価するため、および所与の細胞におけるＲＮＡやタンパク質のレベルを評価するための新規方法および組成物に関する。本発明は、少なくとも部分的には、ナノ粒子構築物に付加可能であり、発色団を含有する取り込み制御部位の開発に基づいている。前記取り込み制御部位の発色団からの蛍光などのシグナルの検出により、ナノ粒子構築物の細胞取り込みレベルを評価することが可能である。いくつかの側面では、ナノ粒子構築物が複数の発色団を含む場合には、ナノ粒子構築物の細胞取り込みレベルおよび／または標的結合レベルの評価には、２つ以上の発色団の蛍光シグナルなどのシグナルのレベルの比較を含むことが可能である。
【００２９】
本発明の応用は、以下の説明の記載や図面の例示の詳細な構造や成分の構成に限定されるものではない。本発明は、他の実施態様も可能であり、様々な方法で実行または実施可能である。また、本明細書で使用される表現および用語は、記載の目的であって、限定するものとみなされるべきではない。本明細書で使用される「含む」、「備える」、「有する」、「含有する」、「関与する」およびその語尾変化形は、その前に挙げられた項目およびその均等物ならびに追加の項目を含むことを意図するものである。
【００３０】
本発明の側面は、ナノ粒子構築物に関する。ナノ粒子構築物とは、１つ以上の他の部分に付加したナノ粒子コアを意味する。本明細書で使用されるナノ粒子は、ナノメーター程度の平均直径を有する粒子である（すなわち、約１ｎｍと約１マイクロメートルとの間）。例えば、いくつかの例では、前記ナノ粒子の直径は、平均直径として約１ｎｍ〜約２５０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２４０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２３０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２２０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２１０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２００ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１９０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１８０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１７０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１６０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１５０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１４０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１３０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１２０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１１０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、平均直径として約１ｎｍ〜約１０ｎｍ、平均直径として約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ、平均直径として約５〜約５０ｎｍ、平均直径として約１０〜約３０ｎｍ、平均直径として約１０〜１５０ｎｍ、平均直径として約１０〜約１００ｎｍ、平均直径として約１０〜約５０ｎｍ、平均直径として約３０〜約１００ｎｍ、または平均直径として約４０〜約８０ｎｍである。
【００３１】
本明細書で使用されるナノ粒子コアとは、追加の部分を有さない、ナノ粒子構築物のナノ粒子成分を意味する。いくつかの例では、前記ナノ粒子コアが金属製である。前記ナノ粒子コアは任意の金属を含むことが可能であると理解されるべきである。金属のいくつかの非限定的例としては、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケルおよびその混合物が挙げられる。ある実施態様では、前記ナノ粒子コアが金を含む。例えば、前記ナノ粒子コアは、分解性の金を含む格子構造であってもよい。また、ナノ粒子は半導体や磁性材料を含んでもよい。
【００３２】
本発明の側面に適合するナノ粒子の非限定的例は、米国特許第７，２３８，４７２号、米国特許公報第２００３／０１４７９６６号、米国特許公報第２００８／０３０６０１６号、米国特許公報第２００９／０２０９６２９号、米国特許公報第２０１０／０１３６６８２号、米国特許公報第２０１０／０１８４８４４号、米国特許公報第２０１０／０２９４９５２号、米国特許公報第２０１０／０１２９８０８号、米国特許公報第２０１０／０２３３２７０号、米国特許公報第２０１１／０１１１９７４号、国際特許公報第ＷＯ２００２／０９６２６２号、国際特許公報第ＷＯ２００３／０８５３９号、国際特許公報第ＷＯ２００６／１３８１４５号、国際特許公報第ＷＯ２００８／１２７７８９号、国際特許公報第ＷＯ２００８／０９８２４８号、国際特許公報第ＷＯ２０１１／０７９２９０号、国際特許公報第ＷＯ２０１１／０５３９４０号、国際特許公報第ＷＯ２０１１／０１７６９０、国際特許公報第ＷＯ２０１１／０１７４５６号に記載されており、参照により本明細書に取り込むものである。本発明に関するナノ粒子は、当該分野で公知の手段により合成可能であるか、あるいは市販されている。例えば、ナノ粒子の販売業者のいくつかの非限定的例としては、Ted Pella, Inc.（Redding, CA）、Nanoprobes, Inc.（Yaphank, NY）、Vacuum Metallurgical Co,. Ltd.（Chiba, Japan）、およびVector Laboratories, Inc.（Burlington, CA）が挙げられる。
【００３３】
結合部位
前記ナノ粒子構築物のナノ粒子コアは、１つ以上の部分に付加していてもよい。いくつかの例では、前記ナノ粒子コアは、細胞における標的分子に結合する特異性を有する結合部位を含む部分に付加している。結合部位は、細胞上の特定の標的分子に結合可能であれば如何なる部位でもよい。例えば、結合部位は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または小分子であってもよい。いくつかの側面では、結合部位は、ＲＮＡやＤＮＡなどのポリヌクレオチドである。例えば、ＲＮＡを含む結合部位は、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、または細胞における標的分子に結合する特異性を有する他の任意のＲＮＡ分子であってもよいし、ｓｓＤＮＡまたは細胞における標的分子に結合する特異性を有する他の任意のＤＮＡ分子であってもよい。他の例では、結合部位は、細胞における標的分子に結合する特異性を有する、抗体などのポリペプチドである。
【００３４】
いくつかの側面では、前記結合部位は標識されていない。他の側面では、前記結合部位が、検出可能マーカーなどで標識されている。例えば、前記結合部位は、フルオロフォアなどの発色団で標識されていてもよい。いくつかの側面では、結合部位の標識化により、細胞における結合事象の検出が可能となるが、これは、細胞における標的分子に結合部位が結合することでシグナルが測定可能となるからである。例えば、前記ナノ粒子構築物は、細胞における標的の定量的検出に使用可能なナノフレアであってもよい。ナノフレアとは、参照により全体を本明細書に取り組む、米国特許公報第２０１０／０１２９８０８号や国際特許公報第ＷＯ／２００８／０９８２４８号（ＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５３６０３号）にさらに記載されているような、オリゴヌクレオチドの三次元構成物を意味する。ナノフレアにおけるオリゴヌクレオチドの構成が、細胞取り込みや、ヌクレアーゼ分解への耐性や、標的への結合に応じた検出可能シグナルの放出を可能とする。重要なことは、シグナル剤と失活剤が近接しているためにナノフレアのシグナルが失活していることである。細胞内で対象となる標的分子とハイブリッドを形成しそれに結合することで、前記シグナルが放出される。ナノ粒子構築物は、１つ以上の標的分子に結合可能な複数の結合部位を含んでもよい。
【００３５】
前記結合部位は、治療用または検出用部位であってもよい。本明細書で使用される治療用部位は、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡを含むＤＮＡやＲＮＡなどのポリヌクレオチド、三重鎖形成オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチド、アプタマー、抗体などの生物製剤や薬剤の送達のためなど治療目的のために細胞に投与される部位である。検出用部位は、診断的目的などでＲＮＡやタンパク質を検出するために細胞に投与される部位である。
【００３６】
取り込み制御部位
本発明に関するナノ粒子構築物は、取り込み制御部位を含む部分に付加されている。本明細書で使用される取り込み制御部位とは、参照発色団および発色団を前記ナノ粒子コアに連結する付加手段を意味する。例えば、取り込み制御部位は、前記参照発色団をナノ粒子コアに付加するためのポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはポリマーを含んでもよい。前記取り込み制御部位がポリヌクレオチドであるナノ粒子構築物において、いくつかの例では、前記ポリヌクレオチドは細胞のトランスクリプトームに標的を有さない。他の例では、前記ポリヌクレオチドは細胞のトランスクリプトームに標的を有する。例えば、前記ポリヌクレオチドは、ＧＡＰＤＨやβアクチンなどの細胞内のハウスキーピング遺伝子に結合可能である。
【００３７】
前記取り込み制御部位は、細胞でのナノ粒子構築物の相対取り込み量を決定するために使用される参照発色団を含有している。いくつかの例では、前記取り込み制御部位がナノ粒子構築物の細胞取り込みを変化させることが可能である。しかしながら、それを全ての構築物に存在させることが、サンプル中の全ての細胞にわたる均一な取り込みを保障するであろう。前記取り込み制御部位は、細胞の健康状態に影響しないように合成可能である。他の実施態様では、前記取り込み制御部位は、治療効果を有するように合成可能である。前記参照発色団は、結合部位の一部として使用可能な他の発色団に対して干渉しない。
【００３８】
取り込み制御部位は、検出に好適な任意の発色団を含有することが可能である。さらに、複数の発色団が各ナノ粒子コアに付加していてもよく、それにより取り込み比較の頑健性が向上する。前記複数の発色団が異なる取り込み制御部位に存在する場合は、個々の取り込み制御部位の存在およびその細胞取り込みへの寄与をそれぞれ決定することが可能となる。
【００３９】
ナノ粒子構築物の細胞取り込みおよび／または標的結合の測定
本発明の側面は、取り込み制御部位を含むナノ粒子構築物の合成、およびナノ粒子構築物の細胞取り込みを測定するための取り込み制御部位の使用に関する。例えば、本発明に関するナノ粒子構築物は、ナノ粒子コアに付着している１つ以上の結合部位と、ナノ粒子コアに付着している参照発色団を含む１つ以上の取り込み制御部位とを有することが可能である。前記結合部位は、標識されていてもされていなくてもよい。前記結合部位が標識されていない場合には、前記参照発色団の検出が、細胞により取り込まれた、結合部位を含むナノ粒子構築物のレベルを評価するための手段を提供する。従って、標識が結合部位の治療または診断目的を妨害する可能性がある場合など、結合部位を標識することが好ましくない実施態様では、結合部位および取り込み制御部位の両方が同一のナノ粒子構築物に付加しているので、取り込み制御部位を、結合部位の細胞送達レベルを評価するために使用可能である。
【００４０】
本発明の他の側面は、細胞中の標的分子へのナノ粒子構築物の結合を測定するために取り込み制御部位を使用することに関する。いくつかの側面では、前記結合部位は、オリゴヌクレオチドがその標的分子に結合すると検出される発色団を含むオリゴヌクレオチドである、上記したナノフレアの例でのように前記結合部位が標識されている。標識された結合部位は、抗体などのポリペプチドまたは小分子であってもよい。ナノフレアなどのナノ粒子構築物を、合成、キャラクタリゼーション、細胞移入したら、標的の結合によりナノフレアから発する蛍光シグナルなどのシグナルの部分を正確に求めるために、取り込み制御部位上の参照発色団からのシグナルをナノフレアのシグナルから減算または除算することにより、細胞タイプ間での標的の結合および／または遺伝子発現レベルの定性的および定量的比較が可能となる。
【００４１】
ナノ粒子構築物上の１つ以上の発色団を検出することを含む、本明細書に記載の方法は、ナノ粒子構築物の細胞取り込みの評価のため、ナノ粒子構築物による標的結合の測定のため、および細胞中のＲＮＡやタンパク質などの標的分子のレベルの測定のためのより非侵入的なアプローチである。細胞や細胞可溶化物中のＲＮＡレベルを測定するためのＲＴＰＣＲや細胞中に存在する金属の量を検出するためのＩＣＰ−ＭＳなどの従来の方法とは対照的に、本明細書に記載した方法は、フローサイトメトリーや画像による分析などの技法を利用する。平均値として遺伝子発現を測定するために細胞集団の溶解を必要とするＲＴＰＣＲと違って、本明細書に記載のナノ粒子構築物を使用すると、ＲＮＡのレベルを個々の生きた細胞内で測定可能となる。さらに、ＲＮＡレベルの差を、既存のタンパク質に基づく集団分析・選別と同様の、しかしより広範な方法で、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）に使用可能である。
【００４２】
ＦＡＣＳは、通常フローサイトメトリーにより集団における細胞を分別するために使用される。一般的な選別方法のひとつでは、細胞表面タンパク質に関して集団を調査する。典型的には、細胞上の膜結合タンパク質を、蛍光色素結合抗体で標識、洗浄後、ＦＡＣＳにより分析する。対象となる抗原を有する細胞は、目的の膜タンパク質のない細胞と比較した場合、強い蛍光を示す。これらの蛍光性細胞は、その後蛍光シグナルの低い集団から機械的に分別される。
【００４３】
生きた細胞のＲＮＡ含有量に基づくＦＡＣＳは困難であるが、ＦＡＣＳは一般に限られた数の細胞表面タンパク質および細胞透過性色素による試験法に基づくので、大変強力な技法である。対照的に、ナノ粒子構築物はトランスクリプトーム全体を調査する。本明細書に記載するナノ粒子構築物は、前例のないレベルの生きた細胞の遺伝子型キャラクタリゼーションおよび細胞選別を可能とし、その結果研究者や臨床医によって大変有用なツールとなる。
【００４４】
本明細書に記載の方法は、試験管内、生体外、あるいは生体内で行うことが可能であり、例えば、培養物中のヒト細胞などの培養物中の哺乳動物細胞が挙げられる。
標的細胞（例えば、哺乳動物の細胞）を、脂質（例えば、カチオン性脂質）やリポソームなどの送達試薬の存在下に接触させる。
本発明の他の側面は、哺乳動物の細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、哺乳動物の細胞をナノ粒子構築物に接触させることを含む、前記方法を提供する。
【００４５】
前記取り込み制御部位は、細胞内および細胞間の生物学的に重要なシグナルの定量化を可能とする
従来のナノフレアなどのナノ粒子構築物は、細胞内におけるバックグラウンドの蛍光のため細胞内ＲＮＡレベルを正確に定量化することが不可能であるという限界があった。本明細書では、ナノ粒子構築物を用いた相対的ＲＮＡ定量化が、ナノ粒子構築物の結合部位に付加した発色団とは異なる発色団を含有する取り込み制御部位を含むようにナノ粒子構築物を修飾することにより達成される。参照発色団のシグナルを、結合部位に付加した発色団のシグナルから減算または除算することにより、結合部位の結合特異的シグナルの測定が可能となる。いくつかの例では、前記取り込み制御部位は、ＧＡＰＤＨやβアクチンなどの標的遺伝子に結合するオリゴヌクレオチドを含み、一方前記結合部位は対象となる遺伝子に結合するので、蛍光シグナルの比較により相対的な遺伝子レベルが得られる。他の例では、前記取り込み制御部位は細胞内の遺伝子に結合しない。前記参照発色団は、ナノ粒子構築物の細胞取り込みレベルの評価を可能とし、かつバックグラウンドの蛍光の減算を可能とすることで、標的結合シグナルの標準化を可能とする。
【００４６】
標識されたナノフレアなどのナノ粒子構築物の使用に関する他の限界は、細胞タイプ間で遺伝子発現レベルを正確に比較することが不可能なことであった。ナノフレアなどのナノ粒子構築物は、異なる細胞タイプによっても、集団の個々の細胞内においても異なる速度で取り込まれ分解される。ナノフレアから検出された蛍光は、原理的には細胞における生物学的に重要な結合事象を反映するべきであるが、ナノフレアのより大量の細胞取り込みと分解が細胞内の蛍光シグナルを増加させ、結合事象シグナルと区別不可能な高いレベルのバックグラウンドを引き起こす。取り込み、分解、標的結合事象の寄与を相互に取り除くために、本明細書に記載する方法および組成物は、参照発色団から検出された蛍光を減算することによる、結合部位により検出されたシグナルの標準化を含む。ＲＮＡ標的化ナノフレアと同様の取り込みおよび安定性を有する、取り込み制御部位を含むナノ粒子構築物の合成を本明細書に記載する。
【００４７】
取り込み制御部位および結合部位の標識化
本発明に関する取り込み制御部位は、細胞中での検出を可能とするための発色団を含む。１つの細胞は、１つ以上の取り込み制御部位と１つ以上の参照発色団とを有してもよい。発色団の非限定的な例としては、フルオロフォアと量子ドットが挙げられる。オリゴヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の手段に従って発色団で標識することが可能である。標識化部位としては、蛍光、比色、放射性、量子ドット、ＮＩＲ活性、磁性、触媒、酵素、タンパク質、質量タグおよび化学発光剤が挙げられる。
【００４８】
いくつかの例では、前記発色団はフルオロフォアである。フルオロフォアの非限定的な例としては、１，８−ＡＮＳ（１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸）、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（１，８−ＡＮＳ）、５−（および６）−カルボキシ−２’，７’−ジクロロフルオレセイン（ｐＨ９．０）、５−ＦＡＭ（ｐＨ９．０）、５−ＲＯＸ（５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、トリエチルアンモニウム塩）、５−ＲＯＸ（ｐＨ７．０）、５−ＴＡＭＲＡ、５−ＴＡＭＲＡ（ｐＨ７．０）、５−ＴＡＭＲＡ−ＭｅＯＨ、６ＪＯＥ、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン（ｐＨ９．０）、６−カルボキシローダミン６Ｇ（ｐＨ７．０）、６−カルボキシローダミン６Ｇ塩酸塩、６−ＨＥＸ・ＳＥ（ｐＨ９．０）、６−ＴＥＴ・ＳＥ（ｐＨ９．０）、７−アミノ−４−メチルクマリン（ｐＨ７．０）、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン（ｐＨ９．０）、
【００４９】
アレクサ３５０、アレクサ４０５、アレクサ４３０、アレクサ４８８、アレクサ５３２、アレクサ５４６、アレクサ５５５、アレクサ５６８、アレクサ５９４、アレクサ６４７、アレクサ６６０、アレクサ６８０、アレクサ７００、アレクサフルオル４３０抗体抱合体（ｐＨ７．２）、アレクサフルオル４８８抗体抱合体（ｐＨ８．０）、アレクサフルオル４８８ヒドラジド−水、アレクサフルオル５３２抗体抱合体（ｐＨ７．２）、アレクサフルオル５５５抗体抱合体（ｐＨ７．２）、アレクサフルオル５６８抗体抱合体（ｐＨ７．２）、アレクサフルオル６１０Ｒ−フィコエリトリン・ストレプトアビジン（ｐＨ７．２）、アレクサフルオル６４７抗体抱合体（ｐＨ７．２）、アレクサフルオル６４７Ｒ−フィコエリトリン・ストレプトアビジン（ｐＨ７．２）、アレクサフルオル６６０抗体抱合体（ｐＨ７．２）、アレクサフルオル６８０抗体抱合体（ｐＨ７．２）、アレクサフルオル７００抗体抱合体（ｐＨ７．２）、
【００５０】
アロフィコシアニン（ｐＨ７．５）、ＡＭＣＡ抱合体、アミノクマリン、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、ＡＴＴＯ６４７、ＢＣＥＣＦ（ｐＨ５．５）、ＢＣＥＣＦ（ｐＨ９．０）、ＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）、ＢＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＢＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＢＯＢＯ−１−ＤＮＡ、ＢＯＢＯ−３−ＤＮＡ、ボディパイ６５０／６６５−Ｘ・ＭｅＯＨ、ボディパイＦＬ抱合体、ボディパイＦＬ・ＭｅＯＨ、ボディパイＲ６ＧＳＥ、ボディパイＲ６Ｇ・ＭｅＯＨ、ボディパイＴＭＲ−Ｘ抗体抱合体（ｐＨ７．２）、ボディパイＴＭＲ−Ｘ抱合体、ボディパイＴＭＲ−Ｘ・ＭｅＯＨ、ボディパイＴＭＲ−Ｘ・ＳＥ、ボディパイＴＲ−Ｘファラシジン（ｐＨ７．０）、ボディパイＴＲ−Ｘ・ＭｅＯＨ、ボディパイＴＲ−Ｘ・ＳＥ、ＢＯＰＲＯ−１、ＢＯＰＲＯ−３、カルセイン、カルセイン（ｐＨ９．０）、
【００５１】
カルシウムクリムゾン、カルシウムクリムゾンＣａ２＋、カルシウムグリーン、カルシウムグリーン−１  Ｃａ２＋、カルシウムオレンジ、カルシウムオレンジＣａ２＋、カルボキシナフトフルオレセイン（ｐＨ１０．０）、カスケードブルー、カスケードブルーＢＳＡ（ｐＨ７．０）、カスケードイエロー、カスケードイエロー抗体抱合体（ｐＨ８．０）、ＣＦＤＡ、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、ＣＩ−ＮＥＲＦ（ｐＨ２．５）、ＣＩ−ＮＥＲＦ（ｐＨ６．０）、シトリン、クマリン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＣｙＱＵＡＮＴ  ＧＲ−ＤＮＡ、ダンシルカダベリン、ダンシルカダベリン・ＭｅＯＨ、
【００５２】
ＤＡＰＩ、ＤＡＰＩ−ＤＮＡ、ダポキシル（２−アミノエチル）スルホンアミド、ＤＤＡＯ（ｐＨ９．０）、Ｄｉ−８ＡＮＥＰＰＳ、Ｄｉ−８−ＡＮＥＰＰＳ−脂質、ＤｉＩ、ＤｉＯ、ＤＭ−ＮＥＲＦ（ｐＨ４．０）、ＤＭ−ＮＥＲＦ（ｐＨ７．０）、ＤｓＲｅｄ、ＤＴＡＦ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｅＣＦＰ（強化シアン蛍光タンパク質）、ｅＧＦＰ（強化緑色蛍光タンパク質）、エオシン、エオシン抗体抱合体（ｐＨ８．０）、エリスロシン−５−イソチオシアネート（ｐＨ９．０）、臭化エチジウム、エチジウムホモダイマー、エチジウムホモダイマー−１−ＤＮＡ、ｅＹＦＰ（強化黄色蛍光タンパク質）、ＦＤＡ、ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣ抗体抱合体（ｐＨ８．０）、ＦｌＡｓＨ、
【００５３】
フルオ−３、フルオ−３・Ｃａ２＋、フルオ−４、フルオロルビー、フルオレセイン、フルオレセイン・０．１ＭＮａＯＨ、フルオレセイン抗体抱合体（ｐＨ８．０）、フルオレセインデキストラン（ｐＨ８．０）、フルオレセイン（ｐＨ９．０）、フルオロ−エメラルド、ＦＭ１−４３、ＦＭ１−４３・脂質、ＦＭ４−６４、ＦＭ４−６４、２％ＣＨＡＰＳ、フラレッド・Ｃａ２＋、フラレッド・高Ｃａ、フラレッド・低Ｃｏ、フラ−２・Ｃａ２＋、フラ−２・高Ｃｕ”、フラ−２・Ｃｕなし、ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）、ＨｃＲｅｄ、ヘキスト３３２５８、ヘキスト３３２５８−ＤＮＡ、ヘキスト３３３４２、インド−１・Ｃａ２＋、インド−１、Ｃａフリー、インド−１・Ｃａ飽和、ＪＣ−１、ＪＣ−１（ｐＨ８．２）、リスアミンローダミン、ＬＯＬＯ−１−ＤＮＡ、ルシファーイエロー・ＣＨ、
【００５４】
ライソセンサーブルー、ライソセンサーブルー（ｐＨ５．０）、ライソセンサーグリーン、ライソセンサーグリーン（ｐＨ５．０）、ライソセンサーイエロー（ｐＨ３．０）、ライソセンサーイエロー（ｐＨ９．０）、ライソトラッカーブルー、ライソトラッカーグリーン、ライソトラッカーレッド、マグネシウムグリーン、マグネシウムグリーン・Ｍｇ２＋、マグネシウムオレンジ、マリーナブルー、ｍＢａｎａｎａ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ミトトラッカーグリーン、ミトトラッカーグリーンＦＭ・ＭｅＯＨ、ミトトラッカーオレンジ、ミトトラッカーオレンジ・ＭｅＯＨ、ミトトラッカーレッド、ミトトラッカーレッド・ＭｅＯＨ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＰｌｕｍ、ｍＲＦＰ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ＮＢＤ−Ｘ、ＮＢＤ−Ｘ・ＭｅＯＨ、ニューロトレース５００／５２５、緑色蛍光ニッスル染色−ＲＮＡ、ナイルブルー・ＥｔＯＨ、ナイルレッド、ナイルレッド−脂質、ニッスル、
【００５５】
オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン４８８抗体抱合体（ｐＨ８．０）、オレゴングリーン５１４、オレゴングリーン５１４抗体抱合体（ｐＨ８．０）、パシフィックブルー、パシフィックブルー抗体抱合体（ｐＨ８．０）、フィコエリトリン、ピコグリーンｄｓＤＮＡ定量化試薬、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＰＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−１−ＤＮＡ、ＰＯＰＯ−３、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化プロピジウム−ＤＮＡ、Ｒ−フィコエリトリン（ｐＨ７．５）、ＲｅＡｓＨ、レゾルフィン、レゾルフィン（ｐＨ９．０）、Ｒｈｏｄ−２、Ｒｈｏｄ−２・Ｃａ２＋、ローダミン、ローダミン１１０、ローダミン１１０（ｐＨ７．０）、ローダミン１２３・ＭｅＯＨ、ローダミングリーン、ローダミンファロイジン（ｐＨ７．０）、ローダミンレッド−Ｘ抗体抱合体（ｐＨ８．０）、ローダミングリーン（ｐＨ７．０）、
【００５６】
ロドールグリーン抗体抱合体（ｐＨ８．０）、サファイア、ＳＢＦＩ−Ｎａ＋、ナトリウムグリーン・Ｎａ＋、スルホローダミン１０１・ＥｔＯＨ、ＳＹＢＲグリーンＩ、ＳＹＰＲＯルビー、ＳＹＴＯ１３−ＤＮＡ、ＳＹＴＯ４５−ＤＮＡ、ＳＹＴＯＸブルー−ＤＮＡ、テトラメチルローダミン抗体抱合体（ｐＨ８．０）、テトラメチルローダミン・デキストラン（ｐＨ７．０）、テキサスレッド−Ｘ抗体抱合体（ｐＨ７．２）、ＴＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＴＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＴＯＴＯ−１−ＤＮＡ、ＴＯＴＯ−３−ＤＮＡ、ＴＲＩＴＣ、Ｘ−Ｒｈｏｄ−１・Ｃａ２＋、ＹＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＹＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＹＯＹＯ−１−ＤＮＡ、ＹＯＹＯ−３−ＤＮＡが挙げられる。
【００５７】
他のタイプの検出可能マーカーや標識も、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公報第２０１０／０１２９８０８号に詳述されるように、本発明の側面に適合可能であることを理解すべきである。
本発明の側面に適合するクエンチング部位としては、ダブシル、マラカイトグリーン、ＱＳＹ７、ＱＳＹ９、ＱＳＹ２１、ＱＳＹ３５、アイオワブラックおよびブラックホールクエンチャー、タンパク質およびペプチドが挙げられる。前記ナノ粒子コアは、他のクエンチング部位の不在下であるいはその存在とともに、クエンチャーとして作用することも可能である。
【００５８】
ナノ粒子への部分の付加
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、小分子などの取り込み制御部位および結合部位を含む本発明に関する部分は、当該分野で公知の任意の手段によりナノ粒子コアに付加可能である。オリゴヌクレオチドをナノ粒子に付加する方法は、米国特許公報第２０１０／０１２９８０８号に詳細に記載されており、参照により組み込まれる。
【００５９】
ナノ粒子には、ポリヌクレオチドを付加するために官能性が付与されてもよい。代替または追加として、前記ポリヌクレオチドに官能性を付与することも可能である。官能性付与の一つの機構は、アルカンチオール法であり、金ナノ粒子または他の金属、半導体、磁性材料を含むナノ粒子への付加の前に、オリゴヌクレオチドの３’または５’末端にアルカンチオール官能基を導入する。そのような方法は、例えばWhitesides, Proceedings of the Robert A. Welch Foundation 39th Conference On Chemical Research Nanophase Chemistry, Houston, Tex., pages 109-121 (1995), and Mucic et al. Chem. Commun. 555-557 (1996) に記載されている。オリゴヌクレオチドは、参照により組み込まれる米国特許第５，４７２，８８１号に記載されように、ホスホロチオエート基や、参照により組み込まれるBurwell, Chemical Technology, 4, 370-377 (1974) and Matteucci and Caruthers, J. Am. Chem. Soc., 103, 3185-3191 (1981) に記載される置換アルキルシロキサンなどの他の官能基を使用してナノ粒子への付加することも可能である。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、５’−または３’−チオヌクレオシドを末端とすることによりナノ粒子に付加される。他の例では、参照により組み込まれる、米国特許第６，３６１，９４４号、第６，５０６，５６９号、第６，７６７，７０２号、第６，７５０，０１６号、国際特許第ＷＯ１９９８／００４７４０号、第ＷＯ２００１／０００８７６号、第ＷＯ２００１／０５１６６５号、第ＷＯ２００１／０７３１２３号に記載されように、エイジングプロセスを使用して、ポリヌクレオチドをナノ粒子に付加する。
【００６０】
いくつかの例では、前記取り込み制御部位および／または前記結合部位は、金−チオール結合などの共有結合により前記ナノ粒子コアに付着している。スペーサー配列を付加サイトと取り込み制御部位および／または結合部位の間に含むことも可能である。ある実施態様では、スペーサー配列は、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリマーまたはオリゴエチレンであるかそれらを含む。
【００６１】
ナノ粒子構築物は、多数の化学作用により設計可能である。例えば、ＤＴＰＡ（ジチオールホスホラミダイト）結合を使用することが可能である。ＤＴＰＡは、チオールによりフレアの細胞内放出を抑制し、シグナル・ノイズ比を向上することが可能である。
【００６２】
ポリヌクレオチド
「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書では、複数のヌクレオチドを意味するよう互換可能に使用される（すなわち、リン酸塩基と、置換ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））または置換プリン（例えばアデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））のどちからである交換可能な有機塩基とに結合した糖（例えばリボースまたはデオキシリボース）を含む分子）。本明細書で使用されるこの用語は、オリゴリボヌクレオチドならびにオリゴデオキシリボヌクレオチドを意味する。この用語には、さらに、ポリヌクレオシド（すなわち、ポリヌクレオチドからリン酸塩を除いたもの）や任意の他の有機塩基を含有するポリマーを含んでもよい。核酸分子は、既存の核酸源（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）から得ることも可能であるが、好ましくは合成品である（例えば、核酸合成により生成される）。ある実施態様では、前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＬＮＡ分子である。
【００６３】
ナノ粒子コアに付加したポリヌクレオチドは、一本鎖でも二本鎖でもよい。二本鎖ポリヌクレオチドは、本明細書では二重鎖とも呼ぶ。本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、２つの別々な相補的核酸鎖を含むことができる。
本明細書で使用される「二重鎖」は、相補的配列が互いに水素結合している二本鎖の核酸分子を含むものである。相補的配列には、センス鎖およびアンチセンス鎖が含まれる。アンチセンスのヌクレオチド配列は、効果的な標的遺伝子抑制を仲介するために、標的遺伝子と同一であるか十分に同一である（例えば、標的遺伝子配列に少なくとも約９８％同一、９６％同一、９４％、９０％同一、８５％同一、または８０％同一）。
【００６４】
二本鎖のポリヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖であってもよく、これはオーバーハングしている一本鎖配列がなく、末端が揃っていることを意味する。他の実施態様では、二本鎖のポリヌクレオチドの二本の鎖は異なる長さを有し、１つ以上の一本鎖オーバーハングを形成する。本発明の二本鎖のポリヌクレオチドは、ミスマッチおよび／またはループやバルジを含有することが可能である。ある実施態様では、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％にかけて二本鎖である。ある実施態様では、本発明の二本鎖のポリヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５以下のミスマッチを含有する。
【００６５】
本発明に関するポリヌクレオチドは、糖部位、ホスホジエステル結合、および／または塩基で修飾可能である。本明細書で使用される「糖部位」には、ペントース、リボースおよびデオキシリボースなどの天然の修飾されていない糖、修飾された糖および糖類似物が含まれる。糖部位の修飾には、ヒドロキシル基をハロゲン、ヘテロ原子、脂肪族基で置換することが含まれ、ヒドロキシル基に例えばエーテル、アミン、チオールなどの官能性を付与することが挙げられる。
【００６６】
糖部位の修飾には、「メチル化」と呼ぶ２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが含まれる。いくつかの例では、本発明に関するポリヌクレオチドは、修飾された糖部位または未修飾の糖部位のどちらか一方だけを含有してもよく、あるいは他の例では、ポリヌクレオチドは修飾された糖部位と未修飾の糖部位を含有する。
【００６７】
いくつかの例では、修飾ヌクレオモノマーには、糖または主鎖修飾リボヌクレオチドが含まれる。修飾リボヌクレオチドは、例えば５’−（２−アミノ）プロピルウリジンや５’−ブロモウリジンなどの５’−位を修飾されたウリジンやシチジン、例えば８−ブロモグアノシンなどの８−位を修飾されたアデノシンやグアノシン、例えば７−デアザ−アデノシンなどのデアザヌクレオチド、例えばＮ６−メチルアデノシンなどのＮ−アルキル化ヌクレオチドなどの天然に存在しない塩基を含有してもよい。また、糖修飾リボヌクレオチドは、その２’−ＯＨ基を、Ｈ、アルコキシ（ＯＲ）、Ｒすなわちアルキル、ハロゲン、ＳＨ、ＳＲ、アミノ（ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２など）、またはＣＮ基（ここでＲは低級アルキル、アルケニル、またはアルキニル）で置換してもよい。ある実施態様では、修飾リボヌクレオチドは、そのホスホジエステル基がそれに隣接する、ホスホロチオエート基などの修飾基により置換されたリボヌクレオチドに結合されていてもよい。
【００６８】
いくつかの側面では、２’−Ｏ−メチル修飾は、二本鎖の核酸へのインターフェロン応答などの細胞ストレス応答を低減するのに有益であろう。修飾された糖としては、Ｄ−リボース、２’−Ｏ−アルキル（２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチルなど）、すなわち２’−アルコキシ、２’−アミノ、２’−Ｓ−アルキル、２’−ハロ（２’−フルオロなど）、２’−メトキシエトキシ、２’−アリルオキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−プロパルギル、２’−プロピル、エチニル、エテニル、プロペニル、およびシアノ等が挙げられる。糖部位は、また、ヘキソースであってもよい。
【００６９】
「アルキル」という用語は、直鎖アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなど）、分岐鎖アルキル基（イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチルなど）、シクロアルキル（脂環式）基（シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル）、アルキル置換シクロアルキル基、シクロアルキル置換アルキル基などの飽和脂肪族基を含む。ある実施態様では、直鎖または分岐鎖アルキルは、主鎖に６個以下の炭素原子を有し（例えば、直鎖ではＣ１〜Ｃ６、分岐鎖ではＣ３〜Ｃ６）、より好ましくは４個以下炭素原子を有する。同様に、環構造中に３〜８個の炭素原子を有するシクロアルキルが好ましく、環構造中に５または６個の炭素を有するものがより好ましい。Ｃ１〜Ｃ６という用語は、１〜６個の炭素原子を含有するアルキル基を含む。
【００７０】
特に明記しない限り、アルキルという用語は、「非置換アルキル」および「置換アルキル」の両方を含み、後者は、炭化水素主鎖の１つ以上の炭素上の水素を置換する独立して選択された置換基を有するアルキル部位を意味する。そのような置換基の例としては、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボン酸塩、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシ、リン酸塩、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、アルキルアリールアミノなど）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、ウレイドなど）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボン酸塩、硫酸塩、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、芳香族またはヘテロ芳香族部位が挙げられる。シクロアルキルは、例えば上記の置換基でさらに置換されていてもよい。「アルキルアリール」または「アリールアルキル」部位は、アリールで置換されたアルキル（例えば、フェニルメチル（ベンジル））である。「アルキル」とう用語は、天然および非天然アミノ酸の側鎖も含む。「ｎ−アルキル」という用語は、直鎖（すなわち、分岐していない）非置換アルキル基を意味する。
【００７１】
「アルケニル」という用語は、上記のアルキルと長さおよび可能な置換基が類似しているが、少なくとも１つ二重結合を含有する不飽和脂肪族基を含むものである。例えば、「アルケニル」という用語としては、直鎖アルケニル基（例えば、エチレニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニルなど）、分岐鎖アルケニル基、シクロアルケニル（脂環式）基（シクロプロペニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル）、アルキルまたはアルケニル置換シクロアルケニル基、シクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルケニル基が挙げられる。ある実施態様では、直鎖または分岐鎖アルケニル基は、主鎖に６個以下の炭素原子を有する（例えば、直鎖ではＣ２〜Ｃ６、分岐鎖ではＣ３〜Ｃ６）。同様に、シクロアルケニル基は、環構造に３〜８個の炭素原子を有してもよく、より好ましくは環構造に５または６個の炭素を有する。Ｃ２〜Ｃ６という用語は、２〜６個の炭素原子を含有するアルケニル基を含むものである。
【００７２】
特に明記しない限り、アルケニルという用語は、「非置換アルケニル」および「置換アルケニル」の両方を含み、後者は、炭化水素主鎖の１つ以上の炭素上の水素を置換する独立して選択された置換基を有するアルケニル部位を意味する。そのような置換基の例としては、アルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボン酸塩、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシ、リン酸塩、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、アルキルアリールアミノなど）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、ウレイドなど）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボン酸塩、硫酸塩、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、芳香族またはヘテロ芳香族部位が挙げられる。
【００７３】
「アルキニル」という用語は、上記のアルキルと長さおよび可能な置換基が類似しているが、少なくとも１つ三重結合を含有する不飽和脂肪族基を含むものである。例えば、「アルキニル」という用語は、直鎖アルキニル基（例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニルなど）、分岐鎖アルキニル基、およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルキニル基を含む。ある実施態様では、直鎖または分岐鎖アルキニル基は主鎖中に６個以下の炭素原子を有する（例えば、直鎖でＣ２〜Ｃ６、分岐鎖でＣ３〜Ｃ６）。Ｃ２〜Ｃ６という用語は、２〜６個の炭素原子を含有するアルキニル基を含む。
【００７４】
特に明記しない限り、アルキニルという用語は、「非置換アルキニル」および「置換アルキニル」の両方を含み、後者は、炭化水素主鎖の１つ以上の炭素上の水素を置換する独立して選択された置換基を有するアルキニル部位を意味する。そのような置換基の例としては、アルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボン酸塩、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシ、リン酸塩、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、アルキルアリールアミノなど）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、ウレイドなど）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボン酸塩、硫酸塩、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、芳香族またはヘテロ芳香族部位が挙げられる。
【００７５】
炭素数が特に明記されていない限り、本明細書で使用される「低級アルキル」は、主鎖構造に１〜５個の炭素原子を有する上記で定義したアルキル基を意味する。「低級アルケニル」および「低級アルキニル」は、例えば、２〜５個の炭素原子の鎖長を有する。
【００７６】
「アルコキシ」という用語は、酸素原子に共有結合した、置換および非置換アルキル、アルケニルおよびアルキニル基を含むものである。アルコキシ基の例としては、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペントキシ基が挙げられる。置換アルコキシ基の例としては、ハロゲン化アルコキシ基が挙げられる。アルコキシ基は、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボン酸塩、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシ、リン酸塩、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、アルキルアリールアミノなど）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、ウレイドなど）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボン酸塩、硫酸塩、アルキルスルホミル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、芳香族またはヘテロ芳香族部位などの独立して選択された基で置換されていてもよい。ハロゲン置換アルコキシ基の例としては、限定するものではないが、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、クロロメトキシ、ジクロロメトキシ、トリクロロメトキシが挙げられる。
【００７７】
「疎水性修飾」という用語は、全体の疎水性が増加するが、塩基がほぼ通常のワトソン・クリック相互作用を依然形成可能であるように塩基を修飾することを意味する。塩基修飾の非限定的例としては、フェニル、４−ピリジル、２−ピリジル、インドリル、イソブチル、フェニル（Ｃ６Ｈ５ＯＨ）；トリプトファニル（Ｃ８Ｈ６Ｎ）ＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ）、イソブチル、ブチル、アミノベンジル；フェニル；ナフチルなどの５位のウリジンおよびシチジンの修飾が挙げられる。
【００７８】
「ヘテロ原子」という用語には、炭素や水素以外の任意の元素の原子が含まれる。ある実施態様では、好ましいヘテロ原子は、窒素、酸素、硫黄、リンである。「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」という用語は、−ＯＨまたは−Ｏ−（適切な対イオンを有する）を有する基を含む。「ハロゲン」という用語は、フッ素、臭素、塩素、ヨウ素などを含む。「ペルハロゲン化」という用語は、一般に全ての水素がハロゲン原子で置換されている部位を意味する。
【００７９】
「置換された」という用語は、前記部位に配置可能であり意図した機能を分子が実行することを可能とする、独立して選択された置換基を含む。置換基の例としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、（ＣＲ’Ｒ”）０〜３ＮＲ’Ｒ”、（ＣＲ’Ｒ”）０〜３ＣＮ、ＮＯ２、ハロゲン、（ＣＲ’Ｒ”）０〜３Ｃ（ハロゲン）３、（ＣＲ’Ｒ”）０〜３ＣＨ（ハロゲン）２、（ＣＲ’Ｒ”）０〜３ＣＨ２（ハロゲン）、（ＣＲ’Ｒ”）０〜３ＣＯＮＲ’Ｒ”、（ＣＲ’Ｒ”）０〜３Ｓ（Ｏ）１〜２ＮＲ’Ｒ”、（ＣＲ’Ｒ”）０〜３ＣＨＯ、（ＣＲ’Ｒ”）０〜３Ｏ（ＣＲ’Ｒ”）０〜３Ｈ、（ＣＲ’Ｒ”）０〜３Ｓ（Ｏ）０〜２Ｒ’、（ＣＲ’Ｒ”）０〜３Ｏ（ＣＲ’Ｒ”）０〜３Ｈ、（ＣＲ’Ｒ”）０〜３ＣＯＲ’、（ＣＲ’Ｒ”）０〜３ＣＯ２Ｒ’、または（ＣＲ’Ｒ”）０〜３ＯＲ’基（各Ｒ’およびＲ”はそれぞれ独立して水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ２〜Ｃ５アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５アルキニル、またはアリール基であるか、Ｒ’とＲ”とが一緒にベンジリデン基または−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２−基である）が挙げられる。
【００８０】
「アミン」または「アミノ」という用語は、窒素原子が少なくとも１つの炭素またはヘテロ原子に共有結合している化合物または部位を含む。「アルキルアミノ」という用語は、窒素が少なくとも１つの追加のアルキル基に結合している基および化合物を含む。「ジアルキルアミノ」という用語は、窒素原子が少なくとも２つの追加のアルキル基に結合している基を含む。
【００８１】
「エーテル」という用語は、２つの異なる炭素原子またはヘテロ原子に結合している酸素を含有する化合物または部位を含む。例えば、この用語には、他のアルキル基に共有結合した酸素原子に共通結合したアルキル、アルケニル、またはアルキニル基を意味する「アルコキシアルキル」が含まれる。
【００８２】
「塩基」という用語には、公知のプリンおよびピリミジンヘテロ環塩基、デアザプリン、およびそれらの類似物（ヘテロ環置換類似物など、例えば、アミノエチオキシフェノキサジン）、誘導体（例えば、１−アルキル、１−アルケニル、ヘテロ芳香族、１−アルキニル誘導体）、互変異性体が含まれる。プリンの例としては、アデニン、グアニン、イノシン、ジアミノプリン、キサンチン、それらの類似物（例えば、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニンまたは７−ジアザキサンチン）および誘導体が挙げられる。ピリミジンの例としては、チミン、ウラシル、シトシン、それらの類似物（例えば、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、５−（１−プロピニル）ウラシル、５−（１−プロピニル）シトシン、４，４−エタノシトシン）が挙げられる。好適な塩基の他の例としては、２−アミノピリジンおよびトリアジンなどの非プリニル塩基および非ピリミジニル塩基が挙げられる。
【００８３】
いくつかの側面では、本発明のポリヌクレオチドのヌクレオモノマーは、修飾ＲＮＡヌクレオチドなどのＲＮＡヌクレオチドである。
「ヌクレオシド」という用語には、糖部位、好ましくはリボースまたはデオキシリボースに共有結合している塩基が含まれる。好ましいヌクレオシドの例としては、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドが含まれる。ヌクレオシドには、遊離カルボキシル基、遊離アミノ基、または保護基を含んでもよいアミノ酸またはアミノ酸類似物に結合した塩基も含まれる。好適な保護基は、当該分野で周知である（P. G. M. Wuts and T. W. Greene, 'Protective Groups in Organic Synthesis', 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1999参照）。
【００８４】
「ヌクレオチド」という用語には、リン酸基またはリン酸類似物をさらに含むヌクレオシドが含まれる。
本明細書で使用される「連結」という用語は、隣接しているヌクレオモノマーに共有結合している天然の未修飾ホスホジエステル部位（−Ｏ−（ＰＯ２−）−Ｏ−）を含む。本明細書で使用される「置換連結」という用語は、隣接しているヌクレオモノマーと共有結合している天然のホスホジエステル基の任意の類似物または誘導体を含む。置換連結には、ホスホジエステル類似物、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｐ−エチオキシホスホジエステル、Ｐ−エトキシホスホジエステル、Ｐ−アルキルオキシホスホトリエステル、メチルホスホネート、および例えばアセタールやアミドなどのリン非含有連結が含まれる。そのような置換連結は当該技術分野において公知である（例えば、Bjergarde et al. 1991. Nucleic Acids Res. 19:5843; Caruthers et al. 1991. Nucleosides Nucleotides. 10:47）。ある実施態様では、ホスホロチオエート連結などの非加水分解性連結が好ましい。
【００８５】
いくつかの側面では、本発明のポリヌクレオチドは、３’および５’末端を含む（環状オリゴヌクレオチドを除く）。ポリヌクレオチドの３’および５’末端は、例えば３’または５’連結を修飾することによりヌクレアーゼから実質的に保護することが可能である（例えば、米国特許第５，８４９，９０２号および国際特許第ＷＯ９８／１３５２６号）。オリゴヌクレオチドに「ブロッキング基」を導入することにより、抵抗性を付与することが可能である。本明細書で使用される「ブロッキング基」という用語は、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオモノマーに合成用保護基またはカップリング基（例えば、ＦＩＴＣ、プロピル（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３）、グリコール（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）リン酸塩（ＰＯ３２−）、ホスホン酸水素塩、またはホスホラミダイト）のどちらかとして付加可能な置換基（例えば、ＯＨ基以外）を意味する。「ブロッキング基」には、修飾ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドエキソヌクレアーゼ耐性構造などの、オリゴヌクレオチドの５’および３’末端を保護する「末端ブロッキング基」または「エキソヌクレアーゼブロッキング基」も含まれる。
【００８６】
末端ブロッキング基の例としては、キャップ構造（例えば、７−メチルグアノシンキャップ）、例えば３’−３’または５’−５’末端逆位を有する逆位ヌクレオモノマー（例えば、Ortiagao et al. 1992. Antisense Res. Dev. 2:129参照）、メチルホスホネート、ホスホラミダイト、非ヌクレオチド基（例えば、非ヌクレオチドリンカー、アミノリンカー、抱合体）等が含まれる。３’末端ヌクレオモノマーは、修飾糖部位を含むことができる。３’末端ヌクレオモノマーは、オリゴヌクレオチドの３’−エキソヌクレアーゼ分解を阻止するブロッキング基で任意に置換可能な３’−Ｏを含む。例えば、３’−ヒドロキシルは、３’→３’ヌクレオチド間結合によりヌクレオチドへエステル化可能である。例えば、アルキルオキシラジカルは、メトキシ、エトキシ、またはイソプロポキシ、好ましくはエトキシであってもよい。任意に、３’末端で３’→３’結合したヌクレオチドは、置換連結により結合することも可能である。ヌクレアーゼ分解を低減するために、最も５’側の３’→５’連結は、例えばホスホロチオエートやＰ−アルキルオキシホスホトリエステル連結などの修飾された連結であってもよい。好ましくは、最も５’側の２つの３’→５’連結が、修飾された連結である。任意に、５’末端ヒドロキシ部位は、例えばリン酸塩、ホスホロチオエート、またはＰ−エトキシリン酸塩などのリン含有部位でエステル化されてもよい。
【００８７】
いくつかの側面では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むことが可能である。
いくつかの側面では、隣接するポリヌクレオチドの少なくとも一部分は、例えばホスホロチオエート連結などの置換連結により連結されている。置換連結が存在することにより、それらの血清タンパク質への高い親和性のために、薬物動態を向上することが可能となる。
【００８８】
いくつかの側面では、アンチセンス（ガイド）配列は、「モルホリノオリゴヌクレオチド」を含むことができる。モルホリノオリゴヌクレオチドは非イオン性であり、ＲＮアーゼＨ非依存機構により機能する。モルホリノオリゴヌクレオチドの４種類の塩基（アデニン、シトシン、グアニン、およびチミン／ウラシル）の各々は、６員環のモルホリン環に連結している。モルホリノオリゴヌクレオチドは、例えば非イオン性ホスホロジアミド酸塩サブユニット間連結により、４つの異なるサブユニットタイプを結合することにより形成される。モルホリノオリゴヌクレオチドによりもたらされる利点としては、ヌクレアーゼ耐性（Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. 1996. 6:267)、標的化予想可能 (Biochemica Biophysica Acta. 1999. 1489:141)、 細胞における活性 の信頼性 (Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:63)、配列特異性が高いこと (Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:151)、非アンチセンス活性の抑制 (Biochemica Biophysica Acta. 1999. 1489:141)、浸透圧性またはスクレープ送達の簡易性 (Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:291)が挙げられる。モルホリノオリゴヌクレオチドは、高用量での低毒性という利点もある。モルホリノオリゴヌクレオチドは、Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:187 に詳述されている。ポリヌクレオチドの修飾は、米国特許公報第２０１０／０１２９８０８号に詳述されており、参照により組み込まれる。
【００８９】
ポリペプチド
いくつかの例では、前記結合部位はポリペプチドである。本明細書で使用される「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は互換的に使用され、従ってポリペプチドという用語はポリペプチド全長を意味するよう使用することも可能であり、ポリペプチド全長のフラグメントを意味するよう使用することも可能である。ポリペプチドは、合成ポリペプチドであってもよい。本明細書で使用される「合成」という用語は、人工的に調製されたことを意味する。合成ポリペプチドは、合成されたもので、自然に産生されたポリペプチド分子ではない（例えば、動物や生命体内で産出されたのではない）ポリペプチドである。天然ポリペプチド（例えば、内因性ポリペプチド）の配列が合成ポリペプチドの配列と同一であってもよいが、後者は少なくとも１つの合成工程を使用し調製されたものであることが理解されるであろう。
【００９０】
ポリペプチドは、細胞中のポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであってもよい。ある実施態様では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは検出可能な標識に付加されている。
【００９１】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、ジスルフィド結合により相互結合された少なくとも２つの重鎖（Ｈ鎖）と２つの軽鎖（Ｌ鎖）を含むことが可能なタンパク質を意味する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略す）と重鎖定常領域とからなる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３つのドメインからなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略す）と軽鎖定常領域とからなる。軽鎖定常領域はＣＬという１つのドメインからなる。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる高頻度可変性の領域にさらに分割され、それらの間には、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存される領域が存在する。ＶＨおよびＶＬはそれぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端へＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番に配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲからなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体システムの第一成分（Ｃ１ｑ）などの、宿主の組織や因子への免疫グロブリンの結合を仲介することができる。
【００９２】
本明細書で使用される抗体の「抗原結合性フラグメント」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つ以上の部分を意味する。抗体の抗原結合性機能は、  により発揮されることが示されている。抗体の「抗原結合性フラグメント」という用語に含まれる結合性フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価型フラグメント）、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含有する２価型フラグメント）、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一の腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ラクダ科動物の重鎖抗体（例えばＶＨＨ）などの、ＶＨドメイン重鎖抗体の可変ドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）の抗原結合性フラグメントを含むポリペプチド構築物が挙げられる。また、Ｆｖフラグメントの２つのドメインである、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によりコードされているが、それらは組換え法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域がペアをなして一価型の分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている、例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 が参照できる）を形成している単一タンパク質鎖を作製可能である合成リンカーにより結合可能である。そのような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合性部分」という用語内に含有されることが意図される。これらの抗体フラグメントは、参照により本明細書に組み込まれるJ. Goding, Monochlonal Antibodies: Principles and Practice, pp 98-118 (N.Y. Academic Press 1983) に記載されるタンパク質断片化法などの従来の手順や、組換え核酸の発現などの当業者に公知の他の技法によりにより得られるものである。フラグメントは、無処置の抗体と同様の方法で有用性に関してスクリーニングされる。
【００９３】
本発明の単離された抗体には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、ＩｇＥなど様々な抗体アイソタイプが含まれる。本明細書で使用される「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によりコードされた抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を意味する。本発明の抗体は全長であっても、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤまたはＩｇＥの抗体定常および／または可変ドメインなどの抗原結合性フラグメントだけを含んでいても、あるいはＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦｖフラグメントからなっていてもよい。
【００９４】
抗体は、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体、またはポリクロナール抗体およびモノクロナール抗体の混合物であってもよい。本発明の抗体は、本明細書に開示の方法や当該分野で公知の様々な技法により生成可能である。本明細書で使用される「モノクロナール抗体」という用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を意味する。モノクロナール抗体は、あるエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。モノクロナール抗体は、あるエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。「ポリクロナール抗体」という用語は、特定の抗原に特異的に結合する活性のある抗体の混合物を含む抗体分子の調製物を意味する。
【００９５】
他の実施態様では、抗体は組換え抗体であってもよい。本明細書で使用される「組換え抗体」という用語は、他の種の免疫グロブリン遺伝子を導入した動物（例えばマウス）から単離された抗体、遺伝子改変抗体、宿主細胞に形質移入した組換え発現ベクターを使用して発現した抗体、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離した抗体などの組換え手段により調製、発現、作製または単離した抗体、免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む任意の他の手段により調製、発現、作製または単離した抗体を含むことを意図する。
【００９６】
治療法
本発明の側面は、治療的および／または診断的使用のためのナノ粒子構築物の対象への送達に関する。前記粒子は、単独で、例えば食塩水などの液体や粉末などの生体内投与のために適切な医薬担体中で投与してもよい。また、それらは、投与装置内でまたはより大きな担体粒子と一緒に送達されてもよい。前記粒子は、製剤化することができる。本発明の製剤は、薬学的に許容し得る溶液として投与してもよく、それには通常、薬学的に許容し得る濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性担体、アジュバント、および任意に他の治療成分を含むことができる。ある実施態様では、本発明に関するナノ粒子構築物は、ローション（例えばアクアフォー）などの物質と混合され対象の皮膚へ投与され、それによって前記ナノ粒子構築物は対象の皮膚を介して送達される。当該分野で公知のナノ粒子の送達の任意の方法が本発明の側面に適合可能であることを理解すべきである。
【００９７】
治療での使用のために、前記粒子の有効量を、粒子を所望の細胞へ送達する任意の態様により、対象に投与可能である。医薬組成物の投与は、当業者に公知の任意の手段により達成できる。投与経路としては、限定されるものではないが、経口、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、粘膜、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、点眼、膣内、経皮、直腸、および直接注射が挙げられる。
【００９８】
キット
他の側面では、本発明は、前記した組成物を１つ以上含むキットに関する。本明細書で使用される「キット」は、典型的には本発明の組成物を１つ以上および／または例えば前記したような本発明に関する他の組成物を含む包装体または集合体である。キットの各組成物は、適宜、液体の形態（例えば、溶液）または固体の形態（例えば、乾燥粉末）で提供することが可能である。いくつかの場合では、組成物のいくつかは、例えばキットに任意に含まれている適切な溶媒等を添加することにより、（例えば、活性形態へ）構成可能または加工可能であってもよい。本発明に関する他の組成物の例としては、限定するものではないが、例えばサンプルおよび／または対象に対して特定の使用のために組成物の成分を、例えば使用、投与、修飾、組立、保管、包装、調製、混合、希釈および／または保存するための、溶媒、界面活性剤、希釈剤、塩、緩衝剤、乳化剤、キレート剤、充填剤、抗酸化剤、結合剤、増量剤、保存剤、乾燥剤、抗菌剤、針、ジリンジ、包装材料、管、ボトル、フラスコ、ビーカー、皿、フリット、フィルター、リング、クランプ、ラップ、パッチ、容器、テープ、接着剤等が挙げられる。
【００９９】
ある実施態様では、本発明に関するキットは、金を含むナノ粒子コアなどの１つ以上のナノ粒子コアを含む。キットは、細胞中の１つ以上の標的分子に特異性を有するポリヌクレオチドやポリペプチドなどの結合部位を１つ以上含むことも可能である。キットは、１つ以上のタイプの発色団を含むことができる取り込み制御部位を１つ以上含むことも可能である。
【０１００】
本発明のキットは、ある場合には、本発明の組成物と関連して提供される任意の形態の使用指示書を、当業者がそれらの使用指示書が本発明の組成物と関連しているものであることを認識するであろう方法で含むものである。例えば、前記使用指示書は、組成物および／またはキットに関連する他の組成物の使用、修飾、混合、希釈、保存、投与、組立、保管、包装および／または調製のための使用指示書であってもよい。ある場合には、前記使用指示書は、例えばサンプルに対して例えば特定の使用のための組成物の使用のための使用指示書を含んでもよい。前記使用指示書は、任意の様式で提供される、例えば、筆記または出版されたもの、言語によるもの、聴覚的（例えば、電話による）、デジタル、光学、視覚（例えばビデオテープ、ＤＶＤなど）または電子通信（インターネット、ウェブによる通信など）など、そのような使用指示書を含む適切な媒体として当業者により認識可能な任意の形態で提供可能である。
【０１０１】
ある実施態様では、本発明は、本明細書に記載された本発明の１つ以上の実施態様を促進する方法に関する。本明細書で使用される「促進する」とは、商業活動の全ての方法を含むものであり、限定されずに、本明細書に記載される本発明のシステム、装置、機器、物品、方法、組成物、キットなどと関連する、販売、広告、譲渡、認可、契約、指示、教育、研究、輸入、輸出、交渉、資金調達、融資、売買、売却、転売、流通、修理、交換、保証、告訴、特許取得等が含まれる。促進方法は、限定されるものではないが、個人、ビジネス（公営または私営）、パートナーシップ、企業、信託、契約または下請け機関、専門学校や大学などの教育機関、研究機関、病院または他の医療機関、政府機関などの任意の者により行うことが可能である。促進行為には、明らかに本発明に関する任意の形態の通信（例えば、書面、口頭および／または電子通信、例えば限定するものではないが、電子メール、電話、インターネット、ウェブに基づくものなど）を含むことができる。
【０１０２】
実施態様のある組み合わせでは、促進の方法は１つ以上の使用指示書を含むことができる。本明細書で使用される「使用指示書」は、使用指示書を含む個々の内容（例えば、使用法、手引き、注意、ラベル、メモ、ＦＡＱすなわち「よくある質問」など）を定義するものであり、典型的には、本発明についてまたはそれに関するおよび／または本発明の包装に関する説明書を含むものである。使用指示書には、例えば本明細書で説明したようにそれらの使用指示書が本発明に関するものであると使用者が明確に認識する任意の方法で提供される限り、（例えば、口頭、電子、聴覚的、デジタル、光学的、視覚的など）任意の形態の指示用通信も含むことも可能である。
【０１０３】
本発明を以下の例によってさらに説明するが、それらは本発明を限定するものであると解釈すべきではない。本出願にわたって言及した全ての参照（参考文献、特許公報、公開特許出願、および共同出願中の特許出願など）の内容全体が、本明細書に参照により明確に組み込まれる。
【０１０４】
例
例１：参照発色団を有する取り込み制御オリゴヌクレオチドを含むナノ粒子構築物の設計
図２に示す取り込み制御を有するナノフレアを以下の手順で合成した。０．７ＯＤ／ｍＬの３’−ＤＴＰＡ捕獲鎖オリゴおよび０．３ＯＤ／ｍＬの５’−Ｃｙ３および３’−ＤＴＰＡを有する取り込み制御鎖を直径１３ｎｍの金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）とボルテックスおよび短時間の超音波処理により混合した。次に、１．５６μＬ／ｍＬの１０％ツイーン２０をオリゴ／ＡｕＮＰ混合物に添加しボルテックスした。１５６μＬ／ｍＬの０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）を混合物に添加しボルテックスした。最後に、３９０μＬ／ｍＬの２ＭＮａＣＬを混合物に添加しボルテックスした。この混合物を１０秒間超音波処理し、常温低速度で一晩回転振とう機にかけた。翌日、混合物を、２５分間１５ｋｒｐｍで４連続遠心分離工程によりＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋フリー）により洗浄した。各遠心分離工程の間に、上澄みを吸引し、ＡｕＮＰペレットを新しいＰＢＳに再懸濁し、これを、ペレットが完全にコロイド状になるよう超音波処理した。最後の遠心分離工程の後に、オリゴヌクレオチド機能化ＡｕＮＰを小量のＰＢＳ（開始量の約１／１０）に再懸濁した。ＡｕＮＰは、５２４ｎｍでの吸光度を紫外可視分光光度法により求め定量した。
【０１０５】
その後、５’−Ｃｙ５標識オリゴの機能化ＡｕＮＰへの二重鎖化を、以下の手順で行った。ＡｕＮＰに対して５０倍過剰の標識オリゴを機能化ＡｕＮＰに添加した。この混合物を短時間ボルテックスし、超音波処理後、６５℃で１時間インキュベートした。その後、すぐにサンプルを氷水浴に移して２〜６℃へ急冷し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、混合物を、１５分間室温で、１５ｋｒｐｍで４連続遠心分離工程によりＰＢＳ中で洗浄し、全ての非二重鎖化オリゴを除去した。各遠心分離工程の間に、上澄みを吸引し、ＡｕＮＰペレットを新しいＰＢＳに再懸濁し、これを、ペレットが完全にコロイド状になるよう超音波処理した。最後の遠心分離工程の後に、得られたナノフレアをＰＢＳ中に所望の濃度で再懸濁した。
【０１０６】
例２：Ｃｙ３発色団を有する取り込み制御オリゴヌクレオチドを、異なるバッチの調製物において一定のレベルで負荷する。
ある実施態様では、ナノ粒子のバッチ内およびバッチ間での正確な比較を可能とするために、異なるバッチのナノ粒子において取り込み制御部位の負荷を均一とすることが重要である。
【０１０７】
それぞれ特有の捕獲配列を有する５つのバッチを合成し、ＡｕＮＰに対するＣｙ３取り込み制御オリゴヌクレオチドの負荷をキャラクタリゼーションした。図３に示すように、Ｃｙ３取り込み制御オリゴヌクレオチドの定量化は、公知の濃度の最終機能化ナノ粒子を１２５ｍＭのＫＣＮで処置してＡｕＮＰを酸化し機能化オリゴヌクレオチドを遊離させることにより行った。ＡｕＮＰに対する負荷は、これらのサンプルにおけるＣｙ３の蛍光を測定し、遊離Ｃｙ３取り込み制御オリゴヌクレオチドから得られた標準曲線と比較して求めた。全ての蛍光測定値は、シナジー４蛍光プレートリーダーを使用して得た。
【０１０８】
例３：複数の取り込み制御オリゴヌクレオチドをナノ粒子構築物へ組み込むことで、取り込み標準化シグナルに頑健性を付与する
２つのバッチのナノ粒子を合成し、各ナノ粒子に負荷したＣｙ３−およびＣｙ５−標識オリゴヌクレオチドの相対数に関してキャラクタリゼーションした。Ｃｙ３−およびＣｙ５−標識オリゴヌクレオチドの定量化は、公知の濃度の機能化ナノ粒子を１２５ｍＭのＫＣＮで処置してＡｕＮＰを酸化し機能化オリゴヌクレオチドを遊離させることにより行った。ＫＣＮ処置後のＣｙ５およびＣｙ３の蛍光を図４に示す。全ての蛍光測定値は、Horiba/Jobin-Y von Fluorolog3モジュラー分光蛍光光度計により得た。これらのサンプルからの蛍光は、Ｃｙ３−およびＣｙ５−標識オリゴヌクレオチドの両方を公知の濃度で含む標準曲線と比較した。このチャートは、バッチ間のＣｙ３およびＣｙ５の相対蛍光における一貫性を示した（図４）。Ｃｙ５およびＣｙ３発色団は共に、ナノ粒子に均一に負荷され、異なる調製物間で同一のナノ粒子構築物を作製できることが示された。
【０１０９】
例４：Ｃｙ５−およびＣｙ３−標識オリゴヌクレオチドを含有するナノ粒子構築物の異なる製剤の細胞取り込み
特有の捕獲鎖配列を有するナノ粒子の２つのバッチを上述の方法により合成した。ＭＣＦ−７細胞（ＭＥＭ、１０％熱失活したＦＢＳ、２％Ｌ−グルタミン、２％ペニシリン／ストレプトマイシン）を９６ウエルプレートに１５，０００細胞／ウェルで播種した。細胞が完全にプレート表面に付着した後に、２ｎＭ原液（ＰＢＳ）からの機能化ナノ粒子を、ナノ粒子の最終濃度が１００μＬの細胞培地中１００ｐＭであるように各ウェルに添加した。プレートを手で旋回させて、溶液を混合した。各プレートは、３７℃で１６時間インキュベートした。ナノ粒子と共にインキュベートした後、細胞培地を吸引し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。細胞を３０μＬ／ウェルのトリプシンで細胞がプレートから離脱するまでトリプシン処理した。９０μＬの培地を、単分散の細胞サンプルを得るためにピペットで激しく移すことで各ウェルに添加し戻した。Ｃｙ５およびＣｙ３発光のデータを分析し、各フルオロフォアからの蛍光を測定した（図５）。プレートは、Millipore Guava 8HTフローサイトメーターで読み込み、データはIncyte software suiteを使用して分析した。各発色団の相対的な取り込みは、蛍光活性化細胞選別により求めた（図５）。細胞タイプ毎の予測した発色団レベルを使用して、第二の発色団の取り込みを標準化した。このように定量することで、異なる実験条件または任意の他の可変要因にわたって測定値の標準化が可能となる。このシステムは、抗体、ｓｉＲＮＡ、アプタマーおよび化学療法剤などの様々な治療的負荷の相対的な送達のモニターや定量に使用可能である。
【０１１０】
均等物
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施態様に対する多くの均等物を認識、あるいは単なる通常の実験法によって確認することが可能であろう。そのような均等物は、以下の請求の範囲に含まれることが意図されるものである。
本明細書に開示された特許文書を含む全ての参考文献は、その全体が参照により組み込まれるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2014531898.tif 000009
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