(57)【要約】感受性微生物の増殖を防止および／または阻害するための好酸球ペルオキシダーゼ組成物およびその使用方法。この組成物は、好酸球ペルオキシダーゼと、過酸化物または過酸化物の供給源と、少なくとも２種のアミノ酸とを包含する。一実施形態では、組成物は、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）と、過酸化物または過酸化物の供給源と、組成物の殺菌活性を増強する少なくとも２種のアミノ酸とを包含する。一実施形態では、過酸化物は、過酸化水素である。
2014520853.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
感受性微生物の増殖を阻害するための組成物であって、
（ａ）好酸球ペルオキシダーゼと、
（ｂ）過酸化物または過酸化物の供給源と、
（ｃ）該組成物の殺菌活性を増強する少なくとも２種のアミノ酸と
を含む、組成物。
【請求項２】
前記過酸化物が、過酸化水素である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記過酸化物の供給源が、過酸化物生成オキシダーゼである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記過酸化物の供給源が、グルコースオキシダーゼである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも２種のアミノ酸が、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−スレオニン、Ｄ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン、ベータアラニン、Ｌ−ベータ−ホモロイシン、Ｄ−ベータ−ホモロイシン、３−アミノブタン酸、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｌ−３−アミノイソ酪酸、Ｄ−３−アミノイソ酪酸、エチル３−アミノブチレート、サルコシンメチルエステル塩酸塩およびニペコチン酸ならびにこれらのアルキルエステル、薬学的に許容される塩および混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記少なくとも２種のアミノ酸が、グリシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−チロシン、ベータアラニン、Ｄ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アラニンメチルエステル、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−リシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−セリン、Ｌ−プロリンおよびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記少なくとも２種のアミノ酸が、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−プロリンおよびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記少なくとも２種の追加のアミノ酸が、グリシン、Ｌ−アラニンおよびＬ−プロリンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
塩化物、臭化物およびこれらの混合物からなる群から選択されるハロゲン化物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
約０．１〜約１，０００μｇ／ｍｌの好酸球ペルオキシダーゼを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
各アミノ酸を約０．１〜約５００ｍＭ含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
感受性微生物の増殖を阻害するための組成物であって、
（ａ）好酸球ペルオキシダーゼと、
（ｂ）過酸化物生成オキシダーゼと、
（ｃ）該組成物の殺菌活性を増強する少なくとも２種のアミノ酸と
を含む、組成物。
【請求項１３】
前記過酸化物生成オキシダーゼが、グルコースオキシダーゼである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
塩化物、臭化物およびこれらの混合物からなる群から選択されるハロゲン化物をさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記少なくとも２種のアミノ酸が、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−プロリンおよびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
約０．１〜約１，０００μｇ／ｍｌの好酸球ペルオキシダーゼを含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
約１〜約５００Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
前記アミノ酸のそれぞれを約０．１〜約５００ｍＭ含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１９】
感受性微生物を死滅させるかまたはその増殖を阻害するための方法であって、有効量の、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物と該微生物を接触させるステップを含む、方法。
【請求項２０】
ヒトまたは動物被験体における感染を処置する方法であって、有効量の、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物を感染部位に投与するステップを含む、方法。
【請求項２１】
ヒトまたは動物被験体における手術部位の感染を処置または予防する方法であって、有効量の、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物を該手術部位に投与するステップを含む、方法。
【請求項２２】
前記部位が、がん手術部位である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記がん手術部位が、結腸直腸がん手術部位である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記がん手術部位が、脳がん手術部位である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記部位が、腹腔鏡下手術部位である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記感染が、多菌感染である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記感染が、多剤耐性感染である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）請求項１〜１８のいずれか一項に記載の過酸化物生成オキシダーゼ含有組成物を含む第一の組成物と、
（ｂ）該過酸化物生成オキシダーゼの基質を含む第二の組成物と
を含む、二元組合せ物。
【請求項２８】
前記過酸化物生成オキシダーゼがグルコースオキシダーゼであり、前記基質がグルコースである、請求項２７に記載の組合せ物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２０１２年７月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／５０６，４７６号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体は、明確に本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
特許文献１および特許文献２に開示されている通り、好酸球ペルオキシダーゼを用いて、標的微生物に選択的に結合させ、過酸化物およびハロゲン化物の存在下において、望ましい微生物を除去したり、標的微生物の環境における宿主細胞および正常な微生物叢など、媒体（ｍｅｄｉｕｍ）の他の構成要素を著明に損なったりすることなく、標的微生物の増殖を阻害することができる。好酸球ペルオキシダーゼは、適切なハロゲン化物補因子（Ｘ−）および基質としての過酸化水素と共に存在すると、自然の系において微生物殺菌活性（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を示すことが、以前より公知である（非特許文献１）。しかし、好酸球ペルオキシダーゼ結合の選択的な性質ならびに治療適用、研究適用および産業適用に対するこれらの系の有用性が認識されたのは、ごく最近のことである。好酸球ペルオキシダーゼの新たに発見された選択的結合特性によれば、病原性微生物など、標的微生物が、好酸球ペルオキシダーゼに対し、正常な微生物叢のメンバーなどの望ましい微生物の結合能力よりも大きな結合能力を有する場合、その標的微生物は、好酸球ペルオキシダーゼに選択的に結合し、望ましい微生物による好酸球ペルオキシダーゼに対する結合はほとんどまたは全く生じない。過酸化物およびハロゲン化物の存在下において、標的に結合した好酸球ペルオキシダーゼは、標的微生物の表面においてハロゲン化物の酸化を触媒し、過酸化物の一重項酸素分子（１Ｏ２）への不均化を促進し、その結果、望ましい微生物または生理的媒体に対する付随的な損傷を最小としながら、標的微生物の選択的殺菌をもたらす。したがって、特許文献１および特許文献２に開示されている通り、好酸球ペルオキシダーゼは、ヒトまたは動物被験体の治療処置または予防処置において、宿主細胞および該宿主の正常な微生物叢に対する付随的な損傷を最小としながら、病原性微生物に選択的に結合してこれを死滅させる消毒剤として用いることができる。
【０００３】
該システムはまた、特に、包帯、手術用具、縫合デバイス、カテーテル、歯科器具、およびコンタクトレンズなどのような生物医学的デバイスを殺菌処理して、該生物医学的デバイスをその後ｉｎ  ｖｉｖｏで使用するとき、被験体の宿主細胞を損傷することなく標的微生物の増殖を阻害する適用において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの標的微生物の増殖を阻害する消毒剤または滅菌剤としても用いることができる。
【０００４】
特許文献３および特許文献４で開示される通り、特許文献１および特許文献２で開示される好酸球ペルオキシダーゼ殺菌系が病原性微生物の処理において高度に有効であることは判明しているが、酵母および芽胞形成微生物の有効な殺菌には、抗微生物活性増強剤が必要とされる場合がある。微生物生活環の芽胞期は、代謝休眠、およびその休止期において該微生物を破壊する環境因子に対する耐性を特徴とする。芽胞の発芽最初期は、膨満、および休眠から活性な代謝への移行を特徴とする。栄養増殖、例えば、出芽、また最終的には生殖が後続する。
【０００５】
細菌内生胞子および真菌胞子の発芽は、代謝の上昇、ならびに熱および化学反応物質に対する耐性の低下と関連する。発芽が生じるために、胞子は、環境が発育および生殖を支持するのに十分であることを感知しなければならない。アミノ酸であるＬ−アラニンが、細菌芽胞の発芽を刺激することが報告されている（非特許文献２；非特許文献３）。Ｌ−アラニンおよびＬ−プロリンはまた、真菌胞子の発芽を開始させることも報告されている（非特許文献４）。
【０００６】
グリシンおよびＬ−アラニンなどの単純α−アミノ酸は、代謝における中心的な位置を占める。α−アミノ酸のアミノ基転移または脱アミノにより、代謝および増殖に必要とされる糖原生成性炭水化物またはケトン体生成炭水化物および窒素がもたらされる。例えば、Ｌ−アラニンのアミノ基転移または脱アミノにより、解糖代謝（エンブデン−マイアーホーフ−パルナス経路）の最終生成物であるピルベートがもたらされる。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体によるピルベートの酸化により、アセチル−ＣｏＡ、ＮＡＤＨ、Ｈ＋、およびＣＯ２がもたらされる。アセチル−ＣｏＡは、トリカルボン酸回路（クレブス回路）の開始基質であり、このクレブス回路により、ミトコンドリア電子伝達鎖が始動する。アセチル−ＣｏＡはまた、脂肪酸合成のほか、ステロール合成のための最終的な炭素供給源でもある。単純α−アミノ酸により、後続する発芽および代謝活性に必要とされる窒素、ＣＯ２、糖原生成性等価物、および／またはケトン体生成等価物が供給されうる。
【０００７】
したがって、特許文献３および特許文献４は、酵母および微生物の芽胞形態に対する好酸球ペルオキシダーゼの殺菌（ｍｉｃｒｏｂｉｏｃｉｄａｌ）作用が、酵母出芽、芽胞形成微生物の発芽および恐らく栄養型（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ）微生物の代謝推進に刺激効果をもたらす特定のα−アミノ酸と組み合わせた好酸球ペルオキシダーゼで微生物を処理することにより増強されうることを開示する。この目的のために開示される代表的なα−アミノ酸として、グリシンならびにアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、リシン、フェニルアラニン、チロシンのＬ−またはＤ−鏡像異性体、ならびにこれらのアルキルエステルが挙げられる。特許文献３および特許文献４は、α−アミノ酸による酵母および微生物の芽胞形態に対する好酸球ペルオキシダーゼの殺菌活性の増強を開示するが、これらの特許は、本明細書に開示されているような、好酸球ペルオキシダーゼおよび少なくとも２種のアミノ酸の使用による、非芽胞細菌に対する好酸球ペルオキシダーゼ殺菌系の増強や抗細菌活性のさらなる増強も開示しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，８８８，５０５号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２９４，１６８号明細書
【特許文献３】米国特許第５，３８９，３６９号明細書
【特許文献４】米国特許第５，４５１，４０２号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ、１９６８年、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、９５巻：２１３１〜２１３８頁
【非特許文献２】Ｈｉｌｌｓ，  １９５０，  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４：３８
【非特許文献３】Ｈａｌｖｏｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｕｒｃｈ，  １９５７，  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２１：１１２
【非特許文献４】Ｙａｎａｇｉｔａ、Ａｒｃｈ．  Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．、１９５７年、第２６巻、３２９頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
本発明は、好酸球ペルオキシダーゼ組成物ならびに該組成物を用いて細菌感染など、微生物感染を殺菌するまたは阻害するための方法を提供する。
【００１１】
本発明の一態様では、感受性微生物の増殖を阻害するための組成物が提供される。
【００１２】
一実施形態では、組成物は、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）と、過酸化物または過酸化物の供給源と、組成物の殺菌活性を増強する少なくとも２種のアミノ酸とを包含する。一実施形態では、過酸化物は、過酸化水素である。一実施形態では、過酸化物の供給源は、過酸化物生成オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ））である。
【００１３】
別の実施形態では、組成物は、好酸球ペルオキシダーゼと、過酸化物生成オキシダーゼと、組成物の殺菌活性を増強する少なくとも２種のアミノ酸とを包含する。
【００１４】
本発明の組成物に適したアミノ酸は、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−スレオニン、Ｄ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン、ベータアラニン、Ｌ−ベータ−ホモロイシン、Ｄ−ベータ−ホモロイシン、３−アミノブタン酸、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｌ−３−アミノイソ酪酸、Ｄ−３−アミノイソ酪酸、エチル３−アミノブチレート、サルコシンメチルエステル塩酸塩およびニペコチン酸、ならびにこれらのアルキルエステル、薬学的に許容される塩および混合物を包含する。一実施形態では、少なくとも２種のアミノ酸は、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−プロリンおよびこれらの混合物から選択される。一実施形態では、少なくとも２種の追加のアミノ酸は、グリシン、Ｌ−アラニンおよびＬ−プロリンである。
【００１５】
特定の実施形態では、組成物は、塩化物、臭化物およびこれらの混合物からなる群から選択されるハロゲン化物をさらに包含する。一実施形態では、ハロゲン化物は、臭化物（例えば、ＮａＢｒ、ＫＢｒ）である。
【００１６】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、約０．１〜約１，０００μｇ／ｍＬの好酸球ペルオキシダーゼを包含する。特定の実施形態では、本発明の組成物は、各アミノ酸を約０．１〜約５００ｍＭ包含する。グルコースオキシダーゼを包含する特定の実施形態のため、組成物は、約１〜約５００Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼを包含する。
【００１７】
他の態様では、本発明は、組成物を用いるための方法を提供する。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、感受性微生物を死滅させるまたはその増殖を阻害するための方法を提供する。この方法では、微生物は、有効量の本発明の組成物と接触させられる。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、ヒトまたは動物被験体における感染を処置するための方法を提供する。この方法では、有効量の本発明の組成物は、感染部位に投与される。
【００２０】
さらなる一実施形態では、本発明は、ヒトまたは動物被験体における手術部位の感染を処置または予防するための方法を提供する。この方法では、有効量の本発明の組成物は、手術部位に投与される。有利に処置することのできる代表的な手術部位は、とりわけがん手術部位（例えば、結腸直腸がん手術部位、脳がん手術部位）および腹腔鏡下手術部位を包含する。
【００２１】
上記の方法では、多菌（ｐｏｌｙｍｉｃｒｏｂｉａｌ）感染および多剤耐性感染を有利に処置することができる。
【００２２】
本発明のさらなる一態様では、二元組合せ物が提供される。一実施形態では、組合せ物は、水性培地に、本発明の好酸球ペルオキシダーゼ組成物を含む第一の組成物と、過酸化物生成オキシダーゼの基質を含む第二の組成物とを包含する。組合せ物の一実施形態では、過酸化物生成オキシダーゼはグルコースオキシダーゼであり、基質はグルコースである。
【００２３】
本発明の上記の態様およびそれに伴う利点の多くは、添付の図面と併せて解釈しつつ次の詳細な記載を参照することによってより良く理解するようになるのと同じように、より容易に認めるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、３，３’，５，５’−ジメチルベンジジンの酸化によりＮ−ブロモタウリンを定量（６５０ｎｍにおける吸光度）するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおける、ｐＨ（５．５、６．５および７．５）および臭化物濃度（０．２、２、２０ｍＭ）に応じたブタ好酸球ペルオキシダーゼ（ｐ−ＥＰＯ）活性を比較するグラフである（ｐ−ＥＰＯ  ５４ｎｇ／ｍＬ、Ｈ２Ｏ２  ０．１ｍＭ、１０分間アッセイ）。
【図２】図２は、ｐＨ６．５における臭化物濃度（０．５、１、２、４、８、１６ｍＭ）に応じた好酸球ペルオキシダーゼ（ｐ−ＥＰＯ）活性を比較するグラフである（ｐ−ＥＰＯ  ５４ｎｇ／ｍＬ、Ｈ２Ｏ２  ０．１ｍＭ、１０分間アッセイ）。
【図３】図３は、３，３’，５，５’−ジメチルベンジジンの酸化によりＮ−ブロモタウリンを定量（６５０ｎｍにおける吸光度）するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおける、ｐＨ（５．５、６．５および７．５）および過酸化水素濃度（４、１１、３３、１００、３００、８９０μＭ）に応じた好酸球ペルオキシダーゼ（ｐ−ＥＰＯ）活性を比較するグラフである（ｐ−ＥＰＯ  ５４ｎｇ／ｍＬ、臭化物２ｍＭ、１０分間アッセイ）。
【図４】図４は、過酸化水素供給源としてグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）を用いた、３，３’，５，５’−ジメチルベンジジンの酸化によりＮ−ブロモタウリンを定量（６５０ｎｍにおける吸光度）するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおける、ｐＨ（６．５および７．５）および臭化物濃度（０、０．０２、０．２、２、２０ｍＭ）に応じた好酸球ペルオキシダーゼ（ｐ−ＥＰＯ）活性を比較するグラフである（ｐ−ＥＰＯ  ５４ｎｇ／ｍＬ、ＧＯ  １０ｎｇ／ｍＬ、グルコース３３０ｍＭ、１０分間アッセイ）。
【図５】図５Ａ〜５Ｈは、グルコース濃度（５Ａおよび５Ｂ、グルコースなし；５Ｃおよび５Ｄ、＋１０ｍＭグルコース；５Ｅおよび５Ｆ、＋５０ｍＭグルコース；５Ｇおよび５Ｈ、＋２００ｍＭグルコース）に応じた、好酸球ペルオキシダーゼ（ｐ−ＥＰＯ）活性を実証するＳ．ａｕｒｅｕｓ培養物の画像である。アリコート（１０μｌの酵素溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ  ｐ−ＥＰＯ）を、室温で基質溶液（１．０ｍＬ＋／−グルコース）に添加し（最終［ｐ−ＥＰＯ］は１μｇ／ｍＬであり、最終ＫＢｒは１ｍＭである）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（１０μＬ、１０９ＣＦＵ／ｍＬ）を用いて接種し（最終［Ｓ．ａｕｒｅｕｓ］は１０７ＣＦＵ／ｍＬである）、５分間室温でインキュベートし、０．１ｍＬを蒔く。
【図６】図６は、好酸球ペルオキシダーゼ（ｐ−ＥＰＯ）組成物に関する、ｐＨ（５．５、６．５および７．５）および臭化物濃度（０、２、１０ｍＭ）に応じたＳ．ａｕｒｅｕｓ殺菌（ｋｉｌｌ）を比較するグラフである（ｐ−ＥＰＯ  ２．７μｇ／ｍＬ、ＧＯ  ０．５μｇ／ｍＬ、グルコース３３０ｍＭ、１５分間アッセイ）。
【図７】図７は、好酸球ペルオキシダーゼ（ｐ−ＥＰＯ）組成物に関する、ｐＨ（５．５、６．５および７．５）および臭化物濃度（０．２、２、６ｍＭ）に応じたＳ．ａｕｒｅｕｓ殺菌を比較するグラフである（ｐ−ＥＰＯ  ２．７μｇ／ｍＬ、ＧＯ  ０．５μｇ／ｍＬ、グルコース３３０ｍＭ、１５分間アッセイ）。
【図８】図８は、インキュベーション時間（０〜２４時間）に応じた、対照およびｐ−ＥＰＯ／ＧＯ組成物（０．１ｍＭ  ＫＢｒ）についての、トリプチックソイブロス（ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ）（３７℃）におけるＳ．ａｕｒｅｕｓの増殖動態を比較するグラフである。
【図９】図９は、インキュベーション時間（０〜２４時間）に応じた、対照およびｐ−ＥＰＯ／ＧＯ組成物（１．０ｍＭ  ＫＢｒ）についての、トリプチックソイブロス（３７℃）におけるＳ．ａｕｒｅｕｓの増殖動態を比較するグラフである。
【図１０】図１０は、パーセント（０、２０、４０、６０、８０、１００％）培地（ＷｉｌｌｉａｍのＥ、ＷＥ；Ｅａｇｌｅの最小必須培地、ＥＭＥＭ）に応じた、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ殺菌アッセイにおけるｐ−ＥＰＯ／ＧＯの生物活性を比較するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、好酸球ペルオキシダーゼと、好酸球ペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するために単独でまたは組み合わせて働く少なくとも２種のアミノ酸とを用いる、細菌感染を死滅させるまたは阻害するための組成物および方法を対象とする。本発明の実施では、過酸化物および臭化物または塩化物の存在下において、有効量の好酸球ペルオキシダーゼおよび少なくとも２種のアミノ酸と微生物を接触させて、微生物の増殖を阻害または微生物を死滅させることにより、感受性微生物は、殺菌または阻害される。
【００２６】
本発明の一態様では、感受性微生物の増殖を阻害するための組成物が提供される。一実施形態では、組成物は、好酸球ペルオキシダーゼと、過酸化物または過酸化物の供給源と、少なくとも２種のアミノ酸とを含む。組み合わせたアミノ酸は、組成物の殺菌活性を増強する。本明細書に用いられているように、用語「感受性微生物」は、本発明の好酸球ペルオキシダーゼ組成物により有利に殺菌される、あるいはその増殖が阻害される微生物を指す。代表的な感受性微生物は、下記および実施例２〜４に記載されている。
【００２７】
一実施形態では、過酸化物は過酸化水素である。他の適した過酸化物は下に記載される。
【００２８】
別の一実施形態では、組成物は、過酸化物の供給源を包含する。代表的な過酸化物の供給源は、過酸化物生成オキシダーゼを包含する。適した過酸化物の供給源および過酸化物生成オキシダーゼは下に記載される。一般に、過酸化物生成オキシダーゼは、オキシダーゼの基質の存在下において、毎分１ｍｌ当たり１００ｐｍｏｌ〜５０μｍｏｌの過酸化物の生成に有効な量で存在する。一実施形態では、過酸化物生成オキシダーゼは、グルコースオキシダーゼである。この実施形態のため、基質は、グルコースである。特定の実施形態では、組成物は、約１〜約５００Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼを包含する。
【００２９】
好酸球ペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するため、本発明の組成物は、少なくとも２種のアミノ酸を包含する。適したアミノ酸は、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−スレオニン、Ｄ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン、ベータアラニン、Ｌ−ベータ−ホモロイシン、Ｄ−ベータ−ホモロイシン、３−アミノブタン酸、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｌ−３−アミノイソ酪酸、Ｄ−３−アミノイソ酪酸、エチル３−アミノブチレート、サルコシンメチルエステル塩酸塩およびニペコチン酸、ならびにこれらのアルキルエステル、薬学的に許容される塩および混合物からなる群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも２種のアミノ酸は、グリシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−チロシン、ベータアラニン、Ｄ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アラニンメチルエステル、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−リシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−セリン、Ｌ−プロリンおよびこれらの混合物からなる群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも２種のアミノ酸は、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−プロリンおよびこれらの混合物からなる群から選択される。下に記載の通り、特定の実施形態では、組成物は、少なくとも３種のアミノ酸を包含する。一実施形態では、組成物は、グリシン、Ｌ−アラニンおよびＬ−プロリンを包含する。本発明の組成物は、各アミノ酸を約０．１〜約５００ｍＭ包含する。
【００３０】
好酸球ペルオキシダーゼは、その殺菌活性に影響を及ぼす基質としてハロゲン化物を利用する。本発明の組成物の投与部位が、望ましい活性速度の達成に十分なハロゲン化物基質を有さない場合、組成物は、塩化物、臭化物およびこれらの混合物など、ハロゲン化物をさらに包含する。
【００３１】
好ましい一実施形態では、本発明の組成物は、好酸球ペルオキシダーゼと、過酸化物生成オキシダーゼと、好酸球ペルオキシダーゼおよびオキシダーゼと組み合わされて組成物の殺菌活性を増強する少なくとも２種のアミノ酸を包含する。上に記す通り、代表的な過酸化物生成オキシダーゼは、グルコースオキシダーゼを包含し、代表的なアミノ酸は、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−プロリンおよびこれらの混合物を包含し、組成物は、塩化物、臭化物およびこれらの混合物から選択されるハロゲン化物をさらに包含してよい。
【００３２】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明の組成物が、著明な殺滅および／または微生物増殖阻害を達成するよう、相対的に低濃度の好酸球ペルオキシダーゼを有利に包含しうることを見出した。相対的に低濃度の好酸球ペルオキシダーゼは、その選択性を増加させ、その毒性を限定する。本発明の組成物は、約０．１〜約１００μｇ／ｍＬの好酸球ペルオキシダーゼを包含することができる。本発明の組成物は、より高濃度の好酸球ペルオキシダーゼを包含してもよい。特定の実施形態では、組成物は、約０．１〜約５００μｇ／ｍＬの好酸球ペルオキシダーゼを包含する。他の実施形態では、組成物は、約０．１〜約１，０００μｇ／ｍＬの好酸球ペルオキシダーゼを包含する。さらなる実施形態では、組成物は、約１０〜約１０，０００μｇ／ｍＬの好酸球ペルオキシダーゼを包含する。他の実施形態において、組成物は、約１００〜約５０，０００μｇ／ｍＬ、特定の実施形態では、最大約１００，０００μｇ／ｍＬの好酸球ペルオキシダーゼを包含することができる。本発明の代表的な組成物の殺菌効果を、実施例２〜４に記載する。
【００３３】
本発明の他の態様では、本発明の好酸球ペルオキシダーゼ組成物を用いるための方法が提供される。
【００３４】
一実施形態では、本発明は、感受性微生物を死滅させるまたはその増殖を阻害するための方法を提供する。この方法では、微生物は、有効量の本発明の組成物と接触させられる。
【００３５】
別の実施形態では、本発明は、ヒトまたは動物被験体における感染を処置するための方法を提供する。この方法では、有効量の本発明の組成物は、感染部位に投与される。
【００３６】
さらなる一実施形態では、本発明は、ヒトまたは動物被験体における手術部位の感染を処置または予防する方法を提供する。この方法では、有効量の本発明の組成物は、手術部位に投与される。手術部位の性質は限定的ではない。本発明の組成物は、あらゆる手術部位に有利な殺菌活性を示す。代表的な手術部位は、がん手術部位を包含する。がん手術部位は、がん性腫瘍が除去されたいずれかの部位を包含する。一実施形態では、がん手術部位は、結腸直腸がん手術部位である。別の実施形態では、がん手術部位は、脳がん手術部位である。脳がん手術部位など、特定の手術部位のため、組成物は、切開後および閉鎖前（ｐｒｅ−ｃｌｏｓｕｒｅ）に投与することができる。本発明の組成物により有利に処置することのできる他の適した手術部位は、腹腔鏡下手術部位を包含する。
【００３７】
本発明の組成物および方法は、多菌感染および多剤耐性感染の処置に有効である。
【００３８】
本発明の実施では、過酸化物生成オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ）を包含する好酸球ペルオキシダーゼ組成物のため、好酸球ペルオキシダーゼ組成物は、好ましくは、オキシダーゼの基質（例えば、グルコース）を包含する組成物の投与とは別々に、処置しようとする部位に投与される。投与の順序は重要でない；好酸球ペルオキシダーゼ組成物は、基質組成物の投与の前に投与しても、後に投与してもよい。よって、さらなる一態様では、本発明は、水性培地に本発明の好酸球ペルオキシダーゼ組成物を含む第一の組成物と、水性培地に過酸化物生成オキシダーゼの基質を含む第二の組成物とを包含する二元組合せ物を提供する。
【００３９】
上に記す通り、特定の実施形態では、本発明は、ヒトまたは非ヒト哺乳類被験体における、微生物感染と組成物の直接的な接触が可能な部位（例えば、手術部位）での感受性感染の局所的処置に適したｉｎ  ｖｉｖｏ消毒剤として有効な酸化酵素組成物（例えば、ＥＰＯ／ＧＯ系）を提供する。
【００４０】
本発明の組成物は、酸化酵素系に不適な環境となりうるｉｎ  ｓｉｔｕ（例えば、創傷部位および手術部位）における微生物の阻害に有効である。
【００４１】
本発明者らは、研究過程において、最も厳しい環境（即ち、ｉｎ  ｓｉｔｕの創傷部位および手術部位）において頑強かつ有効となる殺菌系を提供するよう探求した。問題の解決において、本発明者らは、驚くべきことに、酵素組成物における特定のアミノ酸の組合せの包含が、系の殺菌効果を増強したことを発見した。
【００４２】
ｉｎ  ｓｉｔｕ環境は、血清および内在性血清タンパク質の存在のために、厳しい環境である。このような血清タンパク質は、酸化酵素を損なう、身体の自然防御の一部である酵素を包含する。特定の実施形態では、本発明の組成物は、酸化酵素：好酸球ペルオキシダーゼおよび過酸化物生成オキシダーゼを包含する。血清タンパク質は、組成物の酸化酵素に対し活性であり、その活性を阻害する。
【００４３】
本明細書に記載されている通り、酸化酵素系（例えば、ＥＰＯ／ＧＯ）に加えて、本特許請求の範囲に係る発明の組成物は、特定のアミノ酸の中から選択される少なくとも２種の追加のアミノ酸を包含する。組成物のアミノ酸は、酵素系を保護するよう機能する。アミノ酸構成要素は、犠牲的様式で機能し、ｉｎ  ｓｉｔｕにおける一時的な保護的効果をもたらし、酵素系に操作の時間窓（ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｗｉｎｄｏｗ  ｏｆ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）を与える。組成物のアミノ酸がｉｎ  ｓｉｔｕ環境により消尽されると、酸化酵素系の効果は減少する。理論に縛られることなく、組成物のアミノ酸は、過酸化物生成オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ）を保護すると考えられる。
【００４４】
ｉｎ  ｓｉｔｕでの微生物の阻害における組成物の効果は、かなりの部分、特定のアミノ酸の組合せが組成物の酵素系にもたらす保護に起因する。
【００４５】
本発明の組成物、使用および方法に有用なアミノ酸とは対照的に、本技術分野（例えば、米国特許第５，３８９，３６９号および同第５，８８８，５０５号）において記載されている組成物のアミノ酸は、組成物の酵素系を保護するよう機能しない。むしろ、先行技術の組成物におけるアミノ酸は、死滅させようとする微生物を標的化することにより殺菌活性を増強するのに有効である。米国特許第５，３８９，３６９号は、酵母および芽胞微生物の代謝および生活環を記載する。記載の系におけるアミノ酸は、微生物の代謝経路に進入する。真菌および細菌胞子は、発芽を誘導するシグナル伝達として特定のアミノ酸の存在を検出し、これにより胞子に、ハロペルオキシダーゼ（ｈａｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）殺菌作用に対する感受性を付与する。この先行技術は、厳しいｉｎ  ｓｉｔｕ環境から好酸球ペルオキシダーゼ酵素系を保護するためのアミノ酸の使用を教示または示唆することができない。
【００４６】
実施例３に記載されている通り、標的病原体の臨床分離菌に対する本発明の代表的な好酸球ペルオキシダーゼ製剤（Ｃ−１０１）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を、同様に構成されたミエロペルオキシダーゼ製剤（Ｅ−１０１）と比較した。ＭＩＣ９０（最小阻害濃度）および分布データに基づき、Ｅ−１０１およびＣ−１０１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性は、試験した全微生物で高度に類似していた（表１および２を参照）。両製剤間の高レベルの類似性は、Ｅ−１０１およびＣ−１０１のＭＩＣを株毎に１対１で（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ）解析した散布図解析によっても反映された。９種の分離菌を例外として、Ｅ−１０１およびＣ−１０１のＭＩＣは、検査したあらゆる株で同じであった。ＭＩＣ差に直面した突出（ｂｒｅａｋｏｕｔ）株は次の通りである：（ａ）７株は、Ｅ−１０１  ＭＩＣよりも１倍加希釈物分低い（ｏｎｅ  ｄｏｕｂｌｉｎｇ  ｄｉｌｕｓｉｏｎ  ｌｏｗｅｒ  ｔｈａｎ  ｔｈｅ  Ｅ−１０１  ＭＩＣ）Ｃ−１０１  ＭＩＣを有し、これらの株は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉのそれぞれ１株およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの４株からなり、（ｂ）２株（共にＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、Ｃ−１０１  ＭＩＣよりも１倍加希釈物分低いＥ−１０１  ＭＩＣを有した。この結果は、下の表１、２ａおよび２ｂに表記する。
【００４７】
実施例４に記載されている通り、選択グラム陽性およびグラム陰性ＡＴＣＣ微生物に対する本発明の代表的な好酸球ペルオキシダーゼ溶液（Ｃ−１０１）の時間殺菌を、同様に構成されたミエロペルオキシダーゼ製剤（Ｅ−１０１）と比較した。
【００４８】
Ｃ−１０１およびＥ−１０１に対して検査した微生物毎の時間殺菌曲線の作成に用いた要約のデータを、それぞれ表３および４に示す。
【００４９】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１３に関して、Ｃ−１０１およびＥ−１０１の時間殺菌動態は同様であった。検査したＣ−１０１またはＥ−１０１の濃度にかかわらず、４時間以内に殺菌活性（出発接種材料と比較して、ＣＦＵ’ｓ／ｍｌ単位で＞３ｌｏｇ１０減少として定義）を達成した。
【００５０】
Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１２に関して、４時間以内のＣ−１０１およびＥ−１０１の殺菌活性は、１６、６４および２５６μｇ／ｍｌの濃度でのみ達成された。いずれの製剤においても、０．０６および０．２５μｇ／ｍｌの濃度それぞれで、２４時間における致死（Ｃｉｄａｌｉｔｙ）は達成されなかった（表３および４）。両方の製剤の１および４μｇ／ｍｌの濃度において、２４時間における致死が達成された。
【００５１】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２９２１２に関して、０．０６μｇ／ｍｌを除く検査したあらゆる濃度の各製剤により殺菌活性が達成された。この最低濃度において、どちらの製剤も、２４時間後であっても致死を達成しなかった（表３および４）。
【００５２】
Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ２７８５３に関して、Ｃ−１０１およびＥ−１０１は両者共に、検査したあらゆる濃度において、４時間までに殺菌があった。
【００５３】
時間殺菌動態試験により例証される通り、本発明者らは、驚くべきことに、６４μｇ／ｍＬの好酸球ペルオキシダーゼ濃度における殺菌動態を比較することにより実証される通り、Ｃ−１０１が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＥ．ｃｏｌｉの殺菌に関して、対応するミエロペルオキシダーゼ組成物Ｅ−１０１よりも大いにより有効であることを発見した。表３および４を参照すると、Ｃ−１０１は、０．０３時間の時点までにＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＥ．ｃｏｌｉを効果的に死滅させたが（表３を参照）、Ｅ−１０１は、４時間後にようやく同一レベルの殺菌を達成した（表４を参照）。
【００５４】
本発明の組成物および方法の代表的な実施形態をさらに後述する。
【００５５】
特に好ましい一実施形態において、本発明の組成物および方法は、細菌および真菌を包含する広範囲の病原性微生物に対する好酸球ペルオキシダーゼ抗微生物活性の増強を示す消毒剤として用いられる。一態様では、本発明の組成物および方法は、ヒトまたは非ヒト哺乳類被験体における、例えば、皮膚、眼、耳、口、鼻および副鼻腔路（ｓｉｎｕｓ  ｐａｓｓａｇｅｓ）、外傷部位、および手術部位などの感染のような、微生物感染と本発明の組成物との直接的な接触が可能な部位での感受性感染の局所的処置に非常に適している。宿主組織との接触に使用するため、消毒系は、病原性微生物に対し選択的親和性を示す二原子酸素添加好酸球ペルオキシダーゼの使用に基づく。従って、高効力の殺菌作用は、それに伴い宿主組織を破壊することも正常な微生物叢を崩壊させることもなく、標的微生物を対象とすることができる；即ち、消毒作用は、標的微生物に選択的かつ限局的である。
【００５６】
このように、一実施形態では、本発明は、好酸球ペルオキシダーゼと、過酸化物および塩化物または臭化物の存在下において好酸球ペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するよう単独でまたは組み合わせて働く少なくとも２種のアミノ酸とを含む、感受性微生物の増殖を阻害するための組成物を提供する。過酸化水素または過酸化水素の供給源および塩化物または臭化物を組成物の使用部位において別途十分な量で利用できない場合、組成物は、これらを追加的に含むことができる。関係する一実施形態では、本発明は、ヒトまたは動物被験体における感染部位に、好酸球ペルオキシダーゼと、好酸球ペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するよう単独でまたは組み合わせて働く少なくとも２種のアミノ酸とを含む組成物を投与するステップを含む、かかる処置を必要とする該被験体を処置する方法を提供する。繰り返すが、組成物は、感染部位における天然に存在する量を補充するため、過酸化水素または過酸化水素の供給源および塩化物または臭化物を追加的に含むことができる。
【００５７】
他の実施形態では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、特に、包帯、手術用具、縫合デバイス、カテーテル、歯科器具、およびコンタクトレンズなど、生物医学的デバイスが、殺菌または滅菌を必要とし、該デバイスが、その後に宿主組織と接触されることになる適用において、感受性微生物の増殖を阻害するための組成物および方法を提供する。このように、本発明の高効力好酸球ペルオキシダーゼ製剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ殺菌または滅菌調製物として役立つことができる。過酸化水素の利用可能性の期間を限定することにより、好酸球ペルオキシダーゼ増強製剤は、宿主組織と接触する前の材料またはデバイスの殺菌、さらには滅菌を保証するよう十分に強力に作製することができる。これら高効力製剤の使用に関連する正常な微生物叢および宿主組織に対するいかなる潜在的な毒性も、過酸化物が枯渇すると終わり、従って、製剤で処理した材料またはデバイスは、追加の洗浄や解毒なしで宿主組織と接触させることができる。
【００５８】
よって、一実施形態では、本発明は、過酸化水素および塩化物または臭化物の存在下において、好酸球ペルオキシダーゼと、好酸球ペルオキシダーゼの殺菌活性を増強するよう単独でまたは組み合わせて働く少なくとも２種のアミノ酸とを含む組成物と微生物を接触させるステップを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて感受性微生物を死滅させるまたはその増殖を阻害するための方法を提供する。
【００５９】
本発明の代表的な組成物は、（１）好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）と、（２）少なくとも２種の活性増強アミノ酸と、必要に応じて（３）過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）またはＨ２Ｏ２の供給源と、（４）塩化物または臭化物とを含む。
【００６０】
本発明における有用な好酸球ペルオキシダーゼは、ハロゲン化物（即ち、塩化物、臭化物またはヨウ化物）または擬ハロゲン化物（例えば、チオシアネート）が、電子供与体または還元剤であり、過酸化物が、電子受容体（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｒｅｃｅｉｖｅｒ）または酸化剤であるハロゲン化物：過酸化水素酸化還元酵素である。好酸球ペルオキシダーゼ溶液の酵素活性は、リン酸ナトリウム緩衝液における過酸化水素の存在下でのグアヤコールとの反応により決定することができる。反応は、４７０ｎｍにおける強い吸光度を有する産物を生成する。活性は、参照標準品と比較した吸光度の増加の動態から決定される。好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）活性は通例、グアヤコールユニット／ｍＬ（ＧＵ／ｍＬ）で表され、１ミリリットル当たりのＥＰＯマイクログラム（μｇ／ｍＬ）としても表される。ＥＰＯのμｇからＧＵへの変換は、ＥＰＯ  １μｇ当たり０．３７５ＧＵに基づく。比活性は、その活性および総タンパク質濃度から計算され、ＧＵ／ｍｇタンパク質で表される。本発明の組成物において用いられる好酸球ペルオキシダーゼの有用な量は、組成物が用いられる条件、使用環境および望ましい結果に応じて広く変動する。多くの目的のため、本発明の組成物は、一般に、少なくとも約０．０５μｇ／ｍｌ（０．０５５ＧＵ／ｍｌ）の好酸球ペルオキシダーゼを含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、約１〜約５０，０００μｇ／ｍｌの好酸球ペルオキシダーゼ（即ち、約１．１〜約５５，０００ＧＵ／ｍｌ）、より好ましくは、約５〜約１０，０００μｇ／ｍｌの好酸球ペルオキシダーゼ（即ち、約５．５〜約１１，０００ＧＵ／ｍｌ）、さらにより好ましくは、約１０〜約５，０００μｇ／ｍｌの好酸球ペルオキシダーゼ（即ち、約１１〜約５，５００ＧＵ／ｍｌ）を含む。
【００６１】
本明細書に詳細に記載されている少なくとも２種の活性増強アミノ酸の包含は、感受性微生物に対するオキシダーゼ−好酸球ペルオキシダーゼ系の殺菌能力を大幅に増大させる。本発明の実施において有用なアミノ酸は、単独でまたは組み合わせて、かつ、過酸化物および塩化物または臭化物の存在下で用いると、感受性微生物に対する好酸球ペルオキシダーゼ抗微生物系の抗微生物活性を増強するアミノ酸である。少なくとも２種のアミノ酸は、系の好酸球ペルオキシダーゼ活性に有害作用を生じないならびに組成物および方法の使用環境において望ましくない作用も生じない濃度で用いられる。
【００６２】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−スレオニン、Ｄ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン、ベータアラニン、Ｌ−ベータ−ホモロイシン、Ｄ−ベータ−ホモロイシンなどのベータアミノ酸、３−アミノブタン酸、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｌ−３−アミノイソ酪酸、Ｄ−３−アミノイソ酪酸およびエチル３−アミノブチレートと共に、例えば、Ｌ−アラニンメチルエステル、Ｄ−アラニンメチルエステル、Ｌ−リシンメチルエステル二塩酸塩、グリシンメチルエステル塩酸塩、Ｌ−プロリンメチルエステル塩酸塩、Ｌ−バリンエチルエステル塩酸塩およびエチル２−アミノプロパノアート（２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏａｔｅ）などのこれらのアルキルエステルならびにサルコシンメチルエステル塩酸塩およびニペコチン酸などのＮ置換アミノ酸からなる群から選択される少なくとも２種のアミノ酸を含む。
【００６３】
他の実施形態では、本発明の組成物は、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−スレオニン、Ｄ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンおよびＤ−バリンならびにこれらのアルキルエステルからなる群から選択される少なくとも２種のアミノ酸を含む。
【００６４】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、好酸球ペルオキシダーゼと、好酸球ペルオキシダーゼ殺菌活性を増強するよう単独でまたは組み合わせて働く少なくとも３種のアミノ酸とを含む。したがって、一部の実施形態では、本発明の組成物は、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−スレオニン、Ｄ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン、ベータアラニン、Ｌ−ベータ−ホモロイシン、Ｄ−ベータ−ホモロイシンなどのベータアミノ酸、３−アミノブタン酸、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｌ−３−アミノイソ酪酸、Ｄ−３−アミノイソ酪酸およびエチル３−アミノブチレートと共に、例えば、Ｌ−アラニンメチルエステル、Ｄ−アラニンメチルエステル、Ｌ−リシンメチルエステル二塩酸塩、グリシンメチルエステル塩酸塩、Ｌ−プロリンメチルエステル塩酸塩、Ｌ−バリンエチルエステル塩酸塩およびエチル２−アミノプロパノアートなどのこれらのエステルならびにサルコシンメチルエステル塩酸塩およびニペコチン酸などのＮ置換アミノ酸からなる群から選択される少なくとも３種のアミノ酸を含む。
【００６５】
さらにまた他の実施形態では、本発明の組成物は、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−スレオニン、Ｄ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンおよびＤ−バリンならびにこれらのエステルからなる群から選択される少なくとも３種のアミノ酸を含む。本発明のこの態様の目下の好ましい一代表例では、本発明の組成物は、好酸球ペルオキシダーゼと、好酸球ペルオキシダーゼの抗微生物活性を増強するのに有効な量のアミノ酸グリシン、Ｌ−アラニンおよびＬ−プロリンとを含む。
【００６６】
本発明の組成物において用いられるアミノ酸の有用な量は、組成物における好酸球ペルオキシダーゼの量、使用環境に存在する条件に応じて変動する。多くの目的のために、本発明の組成物は、一般に、約０．０１〜約５００ｍＭ、より好ましくは、約０．１〜約１００ｍＭ、さらにより好ましくは、約０．３〜約５０ｍＭの本発明の各アミノ酸を含む。
【００６７】
本発明の好酸球ペルオキシダーゼ組成物の消毒活性は、過酸化物および塩化物または臭化物がハイポハライト（ｈｙｐｏｈａｌｉｔｅ）（ハイポハライド（ｈｙｐｏｈａｌｉｄｅ））を生成する反応と、過酸化物およびハイポハライト（ハイポハライド）が一重項分子酸素を生成する反応とを含むため、本発明の組成物の活性は、抗微生物活性の部位における、適した過酸化物およびハロゲン化物の存在に依存する。一部の状況では、過酸化物（例えば、過酸化水素）は、例えば、天然に存在する微生物叢の活性により、抗微生物活性の部位に存在することができ、十分な量の塩化物は、生理的環境（ｍｉｌｉｅｕ）に存在して、変換反応における補因子として作用することができる。これらの状況では、追加の過酸化物やハロゲン化物を投与する必要はなく、本発明の組成物に包含される必要もない。他の状況では、微生物処理部位に過酸化水素および／またはハロゲン化物を追加的に提供することが必要であるかまたは望まれ得る。したがって、本発明の組成物は、所望ならば、過酸化物またはｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで過酸化物を生成することのできる作用物質および塩化物または臭化物を追加的に含みうる。
本発明の組成物および方法において有用な過酸化物には、式：
Ｒ−ＯＯＨ
［式中、Ｒは、水素、または１〜３個の炭素原子を有する短鎖のアルキル基である］の過酸化水素、アルキルヒドロペルオキシド、および、ボロペルオキシドまたは過酸化尿素などの無機過酸化物が挙げられる。有機過酸化物の酸化活性は一般に、以下：
Ｒ＝Ｈ＞＞ＣＨ３＞ＣＨ３ＣＨ２＞ＣＨ３（ＣＨ２）２
の通り、Ｒ鎖長が長くなると低下する。
【００６８】
本発明の組成物において用いられる、本明細書において好ましい過酸化物は、過酸化水素である。また、ｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて過酸化水素を生成することが可能な作用物質を組成物に組み入れることによって、過酸化水素が殺菌活性部位において利用可能にすることもできる。この目的で特に有用な作用物質には、例えば、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、およびガラクトースオキシダーゼなどのオキシダーゼが挙げられる。
【００６９】
ｉｎ  ｖｉｖｏで適用される本発明の組成物に過酸化水素を直接に組み入れる場合、用いられる量は、最大の消毒活性を提供するように設計することが好ましい。宿主細胞および組織、ならびに正常な微生物叢に対する損傷は、高いＨ２Ｏ２の曝露期間における直接的な接触を回避することにより回避される。したがって、本発明の組成物は、組成物１ｍｌ当たり約１ｎモル〜約１０μモルの過酸化水素、より好ましくは、組成物１ｍｌ当たり約５ｎモル〜約５μモルの過酸化水素、また最も好ましくは、組成物１ｍｌ当たり約１０ｎモル〜約１μモルの過酸化水素を含みうる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて過酸化水素物を生成することが可能な作用物質、例えば、過酸化物生成オキシダーゼは、抗微生物活性部位において存在する過酸化水素量の動的な制御に特に有用である。このような作用物質は、安定的で低レベルのＨ２Ｏ２濃度を供給および維持することにより、組成物の抗微生物活性を最大化する。したがって、このような作用物質が用いられる量は、該作用物質の性質および所望の効果に高度に依存するが、抗微生物活性部位において利用可能なハロゲン化物の種類および濃度に応じて、毎分液体１ｍｌ当たり約１ｐモル〜約１μモルの定常状態レベルの過酸化水素を生成可能であることが好ましい。製剤を殺菌性−滅菌液として用いる場合は、オキシダーゼおよびその基質を、必要とされる滅菌期間にわたり持続する、比較的高い定常状態濃度のＨ２Ｏ２を供給するように調整することができる。消毒−滅菌作用は、オキシダーゼ基質の枯渇により、またはオキシダーゼ分解速度に比例して終結する。代表例として述べると、オキシダーゼがグルコースオキシダーゼであり、その基質がグルコースである場合、本発明の組成物は、約０．０５〜約３，０００Ｕ／ｍｌ、より好ましくは、約０．１〜約１，０００Ｕ／ｍｌ、またさらにより好ましくは、約１〜約５００Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼと、約０．１〜約１，０００ｍＭ、より好ましくは、約０．５〜約８００ｍＭ、またさらにより好ましくは、約１〜約５００ｍＭのグルコースとを含みうる。
【００７０】
臭化物または塩化物を本発明の組成物に組み入れる場合、具体的な適用において用いられる臭化物または塩化物の使用、選択、および量は、所望の治療効果、過酸化物の利用能、および他の因子など、各種の因子に依存する。塩化物は、大半の生理学的媒体において、ハロゲン化物補因子として制限のない程度に十分なレベルで存在するので、塩化物の外部供給源は一般に必要とされない。塩化物の外部供給源が望ましい場合、用いられる塩化物量は、生理学的条件を近似する、溶液１ｍｌ当たり約１０μモル塩化物〜約１５０μモル塩化物の範囲内に収まることが好ましい。組み入れる場合、本発明の組成物は、液体組成物１ｍｌ当たり約１ｎモル臭化物〜約２０μモル臭化物、より好ましくは、液体組成物１ｍｌ当たり約１０ｎモル臭化物〜約１０μモル臭化物、また最も好ましくは、液体組成物１ｍｌ当たり約１００ｎモル臭化物〜約１μモル臭化物を含みうる。
【００７１】
ハロゲン化物の過酸化物との比は、有効な殺菌環境の構築における重要な考慮事項である。したがって、上記の微生物攻撃の位置（ｓｉｔｕｓ）における有効レベルのハロゲン化物および過酸化物を確実にすることに加えて、最適な殺菌活性をもたらすハロゲン化物：過酸化物比で本発明の方法を実施することが好ましい。例えば、ハロゲン化物が、Ｃｌ−（塩化物）である場合、Ｃｌ−の過酸化物との比は、好ましくは、殺菌活性の環境における約１〜約４０，０００、より好ましくは、約５０〜約４０，０００、最も好ましくは、約２００〜約４０，０００の範囲内に維持される。ハロゲン化物が、Ｂｒ−（臭化物）である場合、Ｂｒ−の過酸化物との比は、好ましくは、殺菌活性の環境における約０．１〜約４，０００、より好ましくは、約０．５〜約２，０００、最も好ましくは、約１〜約１，０００の範囲内に維持される。
【００７２】
本発明の代表的な製剤を、実施例１に記載されている通りに評価した。製剤は、米国特許第７１０８９９７（Ｂ２）号から改変したｉｎ  ｖｉｔｒｏ好酸球ペルオキシダーゼアッセイにおいて、ｐＨ、臭化物濃度、過酸化水素濃度およびグルコースオキシダーゼ濃度に関して評価した。評価の結果を図１〜４に例示する。
【００７３】
上に記す通り、本発明の製剤は、酵素製剤および基質製剤を組み合わせることにより調製することができる。
【００７４】
代表的な酵素製剤は、リン酸ナトリウム（２０ｍＭ、ｐＨ６．５）、塩化ナトリウム（１５０ｍＭ）、臭化カリウム（２ｍＭ）およびＴＷＥＥＮ８０（０．１％、ｖ／ｖ）中の好酸球ペルオキシダーゼ（ｐ−ＥＰＯ、２．５ｍｇ／ｍＬ）、グルコースオキシダーゼ（０．５ｍｇ／ｍＬ）、Ｌ−アラニン（２０ｍＭ）、Ｌ−プロリン（２０ｍＭ）およびグリシン（２０ｍＭ）の溶液である。
【００７５】
代表的な基質製剤は、リン酸ナトリウム（２０ｍＭ、ｐＨ６．５）、塩化ナトリウム（１５０ｍＭ）、臭化カリウム（２ｍＭ）およびＴＷＥＥＮ８０（０．０２％、ｖ／ｖ）中のグルコース（１００ｍＭ）の溶液である。
【００７６】
説明目的の例として、抗微生物（または抗感染）溶液としての使用に適した組成物は、約１〜５０，０００μｇ／ｍｌ（即ち、約１．１〜約５５，０００ＧＵ／ｍｌ）の好酸球ペルオキシダーゼ、０．１〜５００μｍｏｌ／ｍＬ（即ち、０．１〜５００ｍＭ）のグリシン、０．１〜５００μｍｏｌ／ｍＬ（即ち、０．１〜５００ｍＭ）のＬ−プロリン、０〜１００μｍｏｌ／ｍＬ（即ち、０〜１００ｍＭ）のＬ−アラニン、０．０１〜５００ユニットのグルコースオキシダーゼおよび５０〜５００ｍＥｑ／Ｌの臭化物を含むことができる。上記の組成物は、１〜５００μｍｏｌ／ｍＬ（即ち、１〜５００ｍＭ）のグルコースまたはデキストロースと組み合わされ、液状殺菌薬または滅菌溶液として用いられる。組合せは、先ずＥＰＯ組成物を感染部位に適用し、続いてグルコースまたはデキストロース組成物を適用することにより行うことができ、あるいはその逆も可能である。
【００７７】
本発明の組成物および方法は、好ましくは、正常な微生物叢に対する損傷を最小限としながら、広域スペクトルにわたる病原性微生物の増殖を阻害するのに用いることができる。実施例において示される通り、本発明の組成物は、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｃ群、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｆ群、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｇ群、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ａｃｉｎｔｏｂａｃｔｅｒ属種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ、およびＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａなど、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方に対する阻害において高度に効果的である。加えて、本発明の組成物は、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属種およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属種などの細菌、またＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属種、およびＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属種などの真菌など、芽胞形成微生物の阻害においても有用である。それらの広域スペクトルにわたる活性のために、一部の実施形態において、本発明の組成物は、多菌感染（ｐｏｌｙｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の処置において用いると有利でありうる。多菌性疾患は複数の感染因子を伴い、複合、合併、混合、二重、二次的、相乗作用的、併発、多菌性、または共感染であると称する。多菌性疾患には、例えば、膿瘍と関連する感染症、ＡＩＤＳ関連の日和見感染症、結膜炎、胃腸炎、肝炎、多発性硬化症、中耳炎、歯周病、呼吸器疾患、および性器感染症が含まれる。加えて、本発明の組成物は、従来の抗生物質療法に関与する作用機構とは全く異なる作用機構により作用するので、一部の実施形態において、本発明の組成物はまた、ＭＲＳＡ（メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ＶＲＳＡ（バンコマイシン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、ＶＲＥ（バンコマイシン耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ペニシリン耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、ＰＲＳＰ（ペニシリン耐性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、イソニアジド／リファンピン耐性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ならびにＥ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの他の抗生物質耐性菌株などの多剤耐性病原体により少なくとも部分的には引き起こされる感染症の処置においても高度に有用である。本明細書では、このような細菌に、「抗生物質耐性」菌もしくは「薬剤耐性」菌もしくは「多剤耐性」菌として、または当技術分野において十分に理解されている他の類似の用語により言及する。
【００７８】
本明細書で用いられる「正常な微生物叢」という用語は、健康な宿主の体表面の内部またはその上において、共生レベルで正常に生息する細菌を意味する。正常な微生物叢には、例えば、ヒト被験体の口腔、腸、または膣における細菌の乳酸ファミリー、例えば、口腔内におけるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ）、および母乳哺育された乳児の腸、外性器、前部尿道、および膣におけるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属種（例えば、ティシエ桿菌およびデーデルライン（Ｄｏｄｅｒｌｅｉｎ）桿菌）が含まれる。宿主の正常な微生物叢を構成する微生物は、周知である（例えば、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ」、上掲、ニューヨーク、３４〜３６および１６１頁を参照されたい）。本発明の好酸球ペルオキシダーゼは、正常な微生物叢に優先して、多くの病原性細菌および病原性真菌に選択的に結合することが見出されている。ｉｎ  ｖｉｖｏの適用では、宿主から正常な微生物叢を除去するには無効な量の好酸球ペルオキシダーゼにより宿主を処置することが好ましい。消毒−殺菌のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける適用では、すべての栄養形態および酵母形態の完全な殺菌を確保するのに十分に高濃度の好酸球ペルオキシダーゼを用いることができる。このような条件下では、宿主組織との接触前にＨ２Ｏ２またはＨ２Ｏ２生成系を消尽させることにより、宿主組織および正常な微生物叢に対する損傷が回避される。
【００７９】
代表的な好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）製剤の生物活性を、実施例２に記載し、図５〜１０に例示する。
【００８０】
実施例２に記載されているアッセイは、ｐＨが５．５である場合、添加した臭化物が重要でなかったことを明示する。標準アッセイ条件が、ＮａＣｌ濃度１５０ｍＭのリン酸緩衝食塩水を用いたことに留意することが重要である。多くの文献が、低ｐＨにおけるＥＰＯによる塩化物の利用を報告する。しかし、臭化物イオンが緩衝液または微生物に存在しないことを保証するステップは採用されなかった。ｐＨ≧６．５において、臭化物添加なしでは殺菌が観察されなかったことに留意されたい。
【００８１】
これらの試験は、２種の酵素、ｐ−ＥＰＯおよびＧＯが、複合培地（ＴＳＢ）において中性ｐＨ（ｐＨ７．４）で増殖を制御できることを実証した。ＴＳＢにおけるグルコース濃度は、約３０ｍＭ（生理的グルコースは約５ｍＭ）である。最初の試験は、低い濃度の（０．１ｍＭ）臭化物を用い、次に、再度より高い濃度の（１．０ｍＭ）臭化物を用いた。より高い臭化物濃度において、ｐ−ＥＰＯ／ＧＯ（≧０．２μｇ／ｍＬ）は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ増殖を完全に阻止した。これらの結果は、中性ｐＨにおけるより高い濃度の臭化物の必要性を実証する。
【００８２】
本発明の組成物は一般に、ある量の好酸球ペルオキシダーゼ、ならびに、過酸化物およびハロゲン化物の存在下において、感受性微生物を死滅させるかまたはそれらの増殖を阻害するのに有効な少なくとも２つのアミノ酸を含む。組成物は、薬学的に許容されるキャリアもさらに含みうる。一部の実施形態において、組成物は、液体キャリア中において供給されると好都合な場合がある。任意の液体キャリアを、それが好酸球ペルオキシダーゼの選択的結合能または酵素活性に著明に干渉しないことを条件に、一般にこの目的に用いることができる。代替的に、組成物は、液体に可溶化すると活性化する固体形態で提供することもできる。
【００８３】
上記の通り、本発明の組成物は、過酸化物、または、上記において詳述したオキシダーゼなど、過酸化物を生成することが可能な作用物質もさらに含みうる。オキシダーゼ−好酸球ペルオキシダーゼ系は二元製剤としての構築に有用であり、その二元製剤において、組成物の複数の活性作用物質（ｔｈｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ）が、使用時にいっしょにするための２つの別々の部分に製剤化される。例えば、二元製剤の１つの部分は、オキシダーゼ、好酸球ペルオキシダーゼ、および少なくとも２つの活性を増強するアミノ酸、例えば、グリシン、Ｌ−アラニン、およびＬ−プロリンを含有する溶液を含みうる。二元製剤の第２の部分は、オキシダーゼの基質、例えば、グルコースオキシダーゼの場合におけるグルコースもしくはデキストロース、または分子状酸素Ｏ２を含みうる。該基質は、例えば、固体ウェハーの形態で提供することができる。物品、例えば、手術用具またはコンタクトレンズを殺菌する場合、該基質ウェハーは、殺菌される品目と共に殺菌チャンバー内に入れることができる。好酸球ペルオキシダーゼ、活性増強用アミノ酸、およびオキシダーゼを添加して殺菌を開始する。一部の実施形態において、オキシダーゼ基質の可溶化およびオキシダーゼによる利用を促進するため、好酸球ペルオキシダーゼ組成物は、アルコールもさらに含みうる。この系は、反応を駆動するのに十分な基質が存在する限りにおいて、持続的な殺菌作用をもたらす。
【００８４】
本発明の組成物は、単独で、または１つもしくは複数の他の治療剤と組み合わせて投与することができる。本発明の組成物と組み合わせて用いうる、さらなる代表的な治療剤は、例えば、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、および／もしくは抗寄生虫剤などの抗生物質または消毒剤を包含する。一部の実施形態において、さらなる治療剤は、１つまたは複数のペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、セファマイシン、カルバペネム、モノバクタム、アミノグリコシド、グリコペプチド、キノロン、テトラサイクリン、マクロライド、および／またはフルオロキノロンでありうる。一部の実施形態において、さらなる治療剤は、ヨウ素、銀、銅、クロルヘキシジン、ポリヘキサニド、ビグアニド、キトサン、および／または酢酸でありうる。本発明の１つまたは複数のさらなる治療剤は、同じ組成物の一部として組み込むこともでき、個別に投与することもできる。
【００８５】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける適用の場合、消毒用組成物は、ヒト被験体および動物被験体を含めた温血動物に対して、任意の有効な、薬学的に許容される形態、例えば、局所、口腔、鼻腔スプレー、吸入用エアゾール、または微生物感染部位へと活性好酸球ペルオキシダーゼを送達するのに有効な他の任意の様式など、局所用剤形、洗浄用剤形、経口用剤形、膣内用剤形、または坐剤用剤形において投与することができる。投与経路は、感染微生物との消毒用組成物の直接的な接触が得られるように設計することが好ましい。本発明の一態様において、本発明の組成物は、例えば、歯肉、眼、耳、皮膚、創傷、膣領域、鼠径部領域、褥瘡、火傷；医用包帯材、おむつ、または水分を帯びる可能性がある他の被覆物下にある領域など、感染を受けやすい、ヒト被験体または動物被験体の領域へと送達または局所投与される。
【００８６】
局所適用の場合、薬学的に許容されるキャリアは、液体、クリーム、発泡体、ローション、軟膏、懸濁液、坐剤、またはゲルの形態をとることが可能であり、水性溶媒または有機溶媒、緩衝剤、乳化剤、ゲル化剤、保湿剤（ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｅｒ）、安定化剤、界面活性剤、湿潤剤、防腐剤、持続放出剤、および少量の保湿剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）、金属イオン封鎖剤、色素、香料、ならびに局所投与用の薬学的組成物において一般に用いられる他の成分もさらに含みうる。加えて、本発明の組成物は、被験体に適用される包帯材または被覆物に含浸させることもできる。
【００８７】
本発明の別の実施形態において、本発明の組成物は、特に、医療デバイスまたはコンタクトレンズが、患者または装着者と接触して用いられることが意図される場合、該デバイスおよびレンズなどの消毒または滅菌など、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける適用のために特別に設計することができる。この種類の適用の場合、組成物は、液体、クリーム、発泡体、ローション、またはゲルの形態で提供すると好都合な場合があり、乳化剤、界面活性剤、緩衝剤、保湿剤、防腐剤、およびこの種類の組成物において一般に見出される他の成分と共に提供することができる。本発明の組成物を微生物感染防止部位へと送達するために、縫合糸、包帯、およびガーゼなどの吸収性材料に該組成物を含浸させることもでき、ステープル、ジッパー、およびカテーテルなど、固相材料の表面に該組成物をコーティングすることもできる。この種類の他の送達系は、当業者には容易に明らかである。
【００８８】
上記において詳細に説明した通り、過酸化物生成用のオキシダーゼ、該オキシダーゼの基質、およびハロゲン化物など、他の成分も、所望に応じて組み入れることができる。加えて、該成分は、単一の製剤へと製剤化することもでき、特定の適用のため所望される場合、その後の使用のときに混合される二元製剤へと個別化することもできる。単一製剤の場合、ハロゲン化物、オキシダーゼ、オキシダーゼ用の補欠分子族、オキシダーゼ用の還元基質、または分子状酸素など、適用部位において利用可能である必要な系成分の１つを製剤から除外し、尚早の反応および系成分の枯渇を回避することが好ましい。
【００８９】
上記は、以下の代表的な実施例との関連でより十分に理解することができるが、これらは例示を目的として示されるものであり、限定を目的として示されるものではない。
【実施例】
【００９０】
（実施例１）
代表的な好酸球ペルオキシダーゼ製剤
本実施例では、代表的な好酸球ペルオキシダーゼ製剤について記載する。米国特許第７１０８９９７（Ｂ２）号から改変したｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、ｐＨ、臭化物濃度、過酸化水素濃度およびグルコースオキシダーゼ濃度に関してこの製剤を評価した。好酸球ペルオキシダーゼは、ｐ−ＥＰＯ（ブタ好酸球ペルオキシダーゼ、Ｌｏｔ  Ｒ１０２３０７、Ｅｘｏｘｅｍｉｓ、Ｉｎｃ．、ネブラスカ州オマハ）であった。
【００９１】
ｐＨ対臭化物濃度
図１に示す通り、ｐ−ＥＰＯは、Ｎ−ブロモタウリンの生成を触媒する。ｐ−ＥＰＯは過酸化水素から次亜臭素酸（ｈｙｐｏｂｒｏｍｏｕｓ  ａｃｉｄ）の生成を触媒し、次に次亜臭素酸はタウリンの遊離アミン基と反応してＮ−ブロモタウリンを生成するため、この反応は間接的である可能性がある。Ｎ−ブロモタウリンの定量は、ヨウ化カリウムの存在下における色素３，３’，５，５’ジメチルベンジジンの酸化により達成される。図１において明らかな通り、この反応は、≧２ｍＭ臭化物の存在下、ｐＨ６．５において最適である。しかし、これが酵素の触媒作用速度のみならず、タウリン臭素化の速度も反映しうることに留意することが重要である。ｐＨ≦６．５においても、ｐ−ＥＰＯ触媒作用において臭化物イオンに代えて塩化物イオンを用いてよい（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．（２００１年）３５８巻、２３３〜２３９頁）。反応は、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）およびＴＷＥＥＮ８０（０．０２％、ｖ／ｖ）を含有するリン酸Ｎａ（２０ｍＭ）により緩衝化されるため、吸光度の値は、Ｎ−ブロモタウリンおよび／またはＮ−クロロタウリンの量を反映しうる。
【００９２】
ｐＨ６．５における臭化物濃度
ｐＨ６．５において、触媒作用の速度は、２〜１６ｍＭの臭化物濃度で支持される（図２）。
【００９３】
ｐＨ対過酸化水素濃度
ｐＨ６．５において、触媒作用の速度は、１００〜３００μＭの過酸化水素濃度において最高であり；ｐＨ５．５において、３００μＭ過酸化水素で高い速度が観察される（図３）。
【００９４】
過酸化水素の供給源としてグルコースオキシダーゼを用いた反応速度
過酸化水素供給源としてグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）を用いてＮ−ブロモタウリン反応を調査した。過酸化水素の代わりにグルコースオキシダーゼおよびグルコースを反応混合物に添加した。５．４／１（ｗ／ｗ）のｐ−ＥＰＯ／ＧＯ比でグルコースオキシダーゼを用い、先行データは、過酸化水素が０．０３〜０．３ｍＭである場合、ｐ−ＥＰＯが最も効率的であることを示唆した。図４に示す通り、これらの条件を用いると、臭化物が２ｍＭである場合に反応は最も急速であった。過酸化水素の代わりにＧＯを用いた場合、ｐＨ依存性はより不明確であったが、過酸化水素を用いた反応と比較してより低収量（６５０ｎｍにおける吸光度）であったことに留意されたい（図１）。
【００９５】
（実施例２）
代表的な好酸球ペルオキシダーゼ製剤の生物活性
本実施例において、代表的な好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）製剤の生物活性を記載する。
【００９６】
ｐＨ６．５における生物活性ｖｓ．グルコース濃度
ｐ−ＥＰＯ生物活性を探索するために、懸濁液／中和殺菌アッセイ（Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ／Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｌｌ  Ａｓｓａｙ）におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの生存を用いた。過酸化水素供給源としてグルコースオキシダーゼを用い、様々なグルコース濃度の存在下における生存（室温で５分間）を測定した（図５Ａ〜５Ｈ）。グルコース濃度≧５０ｍＭにおける高い殺菌が明らかである（図５Ｅ〜５Ｈ）。
【００９７】
本実施例において、他に特段の定めがない限り、ストック酵素溶液は、リン酸ナトリウム（２０ｍＭ）、塩化ナトリウム（１５０ｍＭ）、臭化カリウム（様々な濃度）およびＴＷＥＥＮ８０（０．０２％、ｖ／ｖ）中のｐ−ＥＰＯ（２．７ｍｇ／ｍＬ）、グルコースオキシダーゼ（０．５ｍｇ／ｍＬ）、Ｌ−アラニン（１６．８ｍＭ）、Ｌ−プロリン（２１．６ｍＭ）およびグリシン（２１．６ｍＭ）であり；基質溶液は、リン酸ナトリウム（２０ｍＭ）、塩化ナトリウム（１５０ｍＭ）、臭化カリウム（様々な濃度）およびＴＷＥＥＮ８０（０．０２％、ｖ／ｖ）中のグルコース（様々な濃度）であり；試料希釈緩衝液は、リン酸ナトリウム（２０ｍＭ、ｐＨ６．５）、塩化ナトリウム（１５０ｍＭ）、臭化カリウム（２ｍＭ）およびＴＷＥＥＮ８０（０．１％、ｖ／ｖ）であった。
【００９８】
ｐＨ対臭化物濃度
このアッセイでは、臭化物濃度が２ｍＭであった場合、調査した各ｐＨで殺菌が観察された（図６）。Ｎ−ブロモタウリン生成を用いたより初期の観察（図１）と一致して、ｐＨが５．５であった場合、添加した臭化物は、重要でなかった。しかし、ｐＨ≧６．５において、臭化物を添加しないと殺菌は観察されなかった（図６）。
【００９９】
ｐＨ対臭化物濃度
０．２、２．０および６ｍＭの臭化物を添加した以外は、上記の試験（図６）を反復する。総合すると、これらのデータは、与えられた臭化物が０．２〜１０ｍＭの範囲内である場合、その絶対濃度が重要でないことを示唆する。しかし、ｐＨ値が中性もしくは中性超に近づくにつれ、≧２ｍＭにおける臭化物の維持はより安全となる。
【０１００】
トリプチックソイブロス（ＴＳＢ）におけるＳ．ａｕｒｅｕｓの増殖動態
新鮮な一晩Ｓ．ａｕｒｅｕｓ培養物のアリコート（各１０μＬ）を、０．１ｍＭ  ＫＢｒを含有する０．５ｍＬのトリプチックソイブロス（３７℃）をそれぞれ含有する７本のチューブへの接種に用いた。チューブを２時間インキュベートし（３７℃）、その後、ｐ−ＥＰＯ（１００μｇ／ｍＬ  最終）、ＧＯ（１９μｇ／ｍＬ  最終）またはｐ−ＥＰＯ／ＧＯ（１００／１９、ｗ／ｗ）を、０．１、１、１０、１００μｇ／ｍＬ（最終ｐ−ＥＰＯ濃度として報告）の濃度で添加した（図８における矢印）。λ＝６００ｎｍにおける光学密度測定により、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの増殖をモニターした。図８により明らかな通り、増加濃度のｐ−ＥＰＯ／ＧＯ（≧１μｇ／ｍＬ）は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの増殖を遅らせた。グルコースオキシダーゼ（１９μｇ／ｍＬ）は単独で、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ増殖を遅らせた。これはまた、ｐ−ＥＰＯ／ＧＯ（１００μｇ／ｍＬ）用量のＧＯ濃度であり、よって、ｐ−ＥＰＯの添加効果を実証する（白三角のＧＯ単独と、黒丸のｐ−ＥＰＯ／ＧＯとを比較）。
【０１０１】
第二の試験において、新鮮な一晩Ｓ．ａｕｒｅｕｓ培養物のアリコート（各１０μＬ）を、０．５ｍＬのトリプチックソイブロス（３７℃）をそれぞれ含有する８本のチューブへの接種に用いたが、そのうち７本は、１．０ｍＭ  ＫＢｒも含有した。チューブを１．５時間インキュベートし（３７℃）、その後、ｐ−ＥＰＯ（２０μｇ／ｍＬ  最終）、ＧＯ（３．８μｇ／ｍＬ  最終）またはｐ−ＥＰＯ／ＧＯ（１００／１９、ｗ／ｗ）を、０．０２、０．２、２、２０μｇ／ｍＬ（最終ｐ−ＥＰＯ濃度として報告）の濃度で添加した（矢印）。λ＝６００ｎｍにおける光学密度により、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの増殖を測定した。このより高い臭化物濃度において、ｐ−ＥＰＯ／ＧＯ（≧０．２μｇ／ｍＬ）は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ増殖を完全に阻止した（図９）。これらの試験は、十分な臭化物濃度において、ｐ−ＥＰＯ／ＧＯが、中性ｐＨの複合培地（ＴＳＢ、ｐＨ約７．４）における生存率を阻止することができることを実証した。ＴＳＢ中のグルコース濃度は約３０ｍＭであった。
【０１０２】
哺乳類細胞の培養に用いた培地の存在下におけるｐ−ＥＰＯ／ＧＯの生物活性
基質溶液をＷｉｌｌｉａｍのＥ（ＷＥ）またはＥａｇｌｅの最少必須（ＥＭＥＭ）培地で希釈したことを除き、上記の通りにアッセイを行った。基質溶液（ｐＨ７．５）は、１１ｍＭグルコース、２ｍＭ  ＫＢｒであった。最終ｐ−ＥＰＯ濃度は、２．７μｇ／ｍＬであった。殺菌アッセイは、室温で１５分間であった。
【０１０３】
図１０に示す通り、培養培地を基質溶液と４０〜１００％培養培地となるよう混合した場合、効力は失われた。図１０において、０％は、基質溶液のみを表す。
【０１０４】
（実施例３）
標的病原体の臨床分離菌に対する、代表的な好酸球ペルオキシダーゼ製剤（Ｃ−１０１）およびミエロペルオキシダーゼ製剤（Ｅ−１０１）の比較ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性
本実施例では、標的病原体の臨床分離菌に対する本発明の代表的な好酸球ペルオキシダーゼ製剤（Ｃ−１０１）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を、同様に構成されたミエロペルオキシダーゼ製剤（Ｅ−１０１）と比較する。
【０１０５】
ＭＩＣ９０（最小阻害濃度）および分布データに基づき、Ｅ−１０１およびＣ−１０１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性は、試験したあらゆる微生物に関して高度に類似していた（表１および２を参照）。両製剤間の高レベルの類似性は、Ｅ−１０１およびＣ−１０１のＭＩＣが株毎に１対１で解析される散布図解析によっても反映された。９種の分離菌を除き、Ｅ−１０１およびＣ−１０１  ＭＩＣは、検査したあらゆる株に対して同じであった。ＭＩＣ差に直面した突出株は次の通りであった：（ａ）７株は、Ｅ−１０１  ＭＩＣよりも１倍加希釈物分低いＣ−１０１  ＭＩＣを有し、これらの株は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉのそれぞれ１株およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの４株で構成されており、（ｂ）２株（共にＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、Ｃ−１０１  ＭＩＣよりも１倍加希釈物分低いＥ−１０１  ＭＩＣを有した。
【０１０６】
Ｃ−１０１およびＥ−１０１製剤。ストックＣ−１０１酵素溶液：２０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ６．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＮａＢｒ、１６．８ｍＭ  Ｌ−アラニン、２１．６ｍＭ  Ｌ−プロリン、２１．６ｍＭグリシン、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０中の２．４ｍｇ／ｍＬブタ好酸球ペルオキシダーゼ（ｐＥＰＯ）、０．５ｍｇ／ｍＬ  ＧＯ。ストックＣ−１０１基質溶液：２０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ６．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＮａＢｒ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０およびグルコース（３００ｍＭ  最終）。
【０１０７】
ストックＥ−１０１酵素溶液：２０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ６．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１６．８ｍＭ  Ｌ−アラニン、２１．６ｍＭ  Ｌ−プロリン、２１．６ｍＭグリシン、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０中の２．４ｍｇ／ｍＬブタミエロペルオキシダーゼ（ｐＭＰＯ）、０．５ｍｇ／ｍＬ  ＧＯ。ストックＥ−１０１基質溶液：２０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ６．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０およびグルコース（３００ｍＭ  最終）。
【０１０８】
ＭＩＣ検査のために、０．０００８〜８．０μｇ／ｍＬペルオキシダーゼの範囲の倍加希釈物を調製した。
【０１０９】
微生物。近年（２０１０〜２０１１年）の非重複（ｎｏｎ−ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）、非連続的（ｎｏｎ−ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ）臨床分離菌を評価した。不偏的なサーベイランスコレクションから分離菌をランダムに選択して、下の多量の分離菌に基づく全体的な母集団の代表とした。
【０１１０】
【化１】
2014520853.tif 000003
評価した分離菌の概略を別表１に提示する。
【０１１１】
方法。ブロス微量希釈により、ＣＬＳＩの規定する方法論（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｈａｔ  Ｇｒｏｗ  Ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ；Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  −  第９版。ＣＬＳＩ文書Ｍ７−Ａ９。ＣＬＳＩ、ペンシルベニア州ウェイン、２０１２年１月）に従って全分離菌を検査した。ＴＳＯＰ．ＭＩＣＲＯ．０１３５．ＵＳ、方法Ｂ（「Ｐａｎｅｌ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｅｒｉａｌ  ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ  ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ  ｉｎ  ｔｕｂｅｓ」）（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｍｅｄｉｎｅｔ、Ｉｎｃ．ＥＭＩ．０１３５．方法Ｂ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｒｏｔｈ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｐａｎｅｌｓ．改訂１、バージニア州シャンティリー、２０１０年３月に承認）に従ってパネルを作製した。２×適切なブロスおよび２×薬物濃度によりパネルを作製し、凍結せずに同日中に用いた。ＴＳＯＰ．ＭＩＣＲＯ．００３１．ＵＳ（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｍｅｄｉｎｅｔ、Ｉｎｃ．ＥＭＩ．００３１．方法Ｂ．Ｂｒｏｔｈ  Ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ  ＭＩＣ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｆｒｏｚｅｎ  Ｐａｎｅｌｓ．改訂１、バージニア州シャンティリー、２０１０年３月に承認）に従ってＭＩＣ検査を行った。
【０１１２】
品質管理（ＱＣ）。８．０〜０．００８μｇ／ｍＬの範囲において、ＴＳＯＰ．ＭＩＣＲＯ．００３１．ＵＳに従ってＥ−１０１およびＣ−１０１のＭＩＣ検査を行った。ＱＣ株は、ＡＴＣＣ  ２９２１３  Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（０．０１〜０．０３ｍｇ  ｐＭＰＯ／Ｌ）およびＡＴＣＣ  ２５９２２  Ｅ．ｃｏｌｉ（０．１５〜０．５ｍｇ  ｐＭＰＯ／Ｌ）を包含した。別表２を参照されたい。
【０１１３】
全ＭＩＣ検査の結果は、検査の各日における適切なＡＴＣＣ対照株に対するＣＬＳＩ推奨のＱＣ範囲に基づく、許容される標準内に収まった。ＣＬＳＩ規定の方法論に従って、全ＱＣ分離菌においてコロニー計数を行った。
【０１１４】
結果を下の表１、２ａおよび２ｂに表記する。
【０１１５】
表１．Ｅ−１０１およびＣ−１０１に対して評価した臨床分離菌のＭＩＣ（ｍｇ  ｐＭＰＯ／Ｌ）プロファイル
【０１１６】
【表１】
2014520853.tif 000004
１ｎ＜１０の場合、ＭＩＣ５０／ＭＩＣ９０は計算することができない。
【０１１７】
表２ａ．Ｃ−１０１に対して評価した臨床分離菌のＭＩＣ（ｍｇ  ｐＭＰＯ／Ｌ）分布
【０１１８】
【表２ａ】
2014520853.tif 000005
表２ｂ．Ｅ−１０１に対して評価した臨床分離菌のＭＩＣ（ｍｇ  ｐＭＰＯ／Ｌ）分布
【０１１９】
【表２ｂ】
2014520853.tif 000006
別表１．Ｃ−１０１およびＥ−１０１に対して評価した分離菌のＭＩＣ（ｍｇ  ｐＭＰＯ／Ｌ）データ
【０１２０】
【化２】
2014520853.tif 000007
【０１２１】
【化３】
2014520853.tif 000008
【０１２２】
【化４】
2014520853.tif 000009
１ＮＴＮ＝鼻咽頭／咽喉／鼻
２ＢＡＬ＝気管支肺胞洗浄液。
【０１２３】
別表２．ＱＣ微生物コロニー計数
別表２．ＱＣ微生物コロニー計数
【０１２４】
【化５】
2014520853.tif 000010
（実施例４）
選択グラム陽性およびグラム陰性ＡＴＣＣ微生物に対する、代表的な好酸球ペルオキシダーゼ（Ｃ−１０１）溶液およびミエロペルオキシダーゼ（Ｅ−１０１）溶液の比較時間殺菌試験
本実施例では、選択グラム陽性およびグラム陰性ＡＴＣＣ微生物に対する本発明の代表的な好酸球ペルオキシダーゼ溶液（Ｃ−１０１）の時間殺菌を、同様に構成されたミエロペルオキシダーゼ製剤（Ｅ−１０１）と比較する。
【０１２５】
Ｃ−１０１およびＥ−１０１製剤。ストックＣ−１０１酵素溶液：２０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ６．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＮａＢｒ、１６．８ｍＭ  Ｌ−アラニン、２１．６ｍＭ  Ｌ−プロリン、２１．６ｍＭグリシン、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０中の２．４ｍｇ／ｍＬブタ好酸球ペルオキシダーゼ（ｐＥＰＯ）、０．５ｍｇ／ｍＬグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）。ストックＣ−１０１基質溶液：２０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ６．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＮａＢｒ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０およびグルコース（３００ｍＭ  最終）。
【０１２６】
ストックＥ−１０１酵素溶液：２０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ６．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１６．８ｍＭ  Ｌ−アラニン、２１．６ｍＭ  Ｌ−プロリン、２１．６ｍＭグリシン、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０中の２．４ｍｇ／ｍＬブタミエロペルオキシダーゼ（ｐＭＰＯ）、０．５ｍｇ／ｍＬ  ＧＯ。ストックＥ−１０１基質溶液：２０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ６．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０およびグルコース（３００ｍＭ  最終）。
【０１２７】
ＭＩＣ検査のために、０．０００８〜８．０μｇ／ｍＬペルオキシダーゼの範囲の倍加希釈物を調製した。
【０１２８】
微生物。選択したＡＴＣＣ微生物Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１３、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１２、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ２７８５３に対し、Ｃ−１０１およびＥ−１０１溶液を検査した。
【０１２９】
方法。ＣＬＳＩ文書Ｍ２６−Ａ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ、Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ、ＣＬＳＩ、ペンシルベニア州ウェイン、２０１２年１月）に特定されている時間殺菌方法により、全分離菌を検査した。ＣＬＳＩ文書Ｍ７（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｈａｔ  Ｇｒｏｗ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ；Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  −  第９版、ＣＬＳＩ、ペンシルベニア州ウェイン、２０１２年１月）に従って分離菌を調製した同日に、パネルを調製した。対照の計数と比較した、指定の時点におけるＣＦＵのＬｏｇ１０低下としてデータを記録した。
【０１３０】
品質管理（ＱＣ）。対照（化合物なしの接種材料）の細菌数を、時間に対して記録した（ＣＬＳＩ  Ｍ１００）（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ；Ｔｗｅｎｔｉｅｔｈ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＣＬＳＩ、ペンシルベニア州ウェイン、２０１２年１月）。
【０１３１】
Ｃ−１０１およびＥ−１０１に対する、検査した微生物毎の時間殺菌曲線の作成に用いた概略データを、それぞれ表３および４に提示する。
【０１３２】
表３．選択したＱＣ微生物に対するＣ−１０１の時間殺菌動態（ＣＦＵ／ｍＬ）
【０１３３】
【化６】
2014520853.tif 000011
表４．選択したＱＣ微生物に対するＥ−１０１の時間殺菌動態（ＣＦＵ／ｍＬ）
【０１３４】
【化７】
2014520853.tif 000012
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１３に関して、Ｃ−１０１およびＥ−１０１の時間殺菌動態は同様であった。検査したＣ−１０１またはＥ−１０１の濃度にかかわらず、４時間以内に殺菌活性（出発接種材料と比較した、ＣＦＵ／ｍｌにおける＞３ｌｏｇ１０減少として規定）が達成された。
【０１３５】
Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１２に関して、１６、６４および２５６μｇ／ｍｌの濃度のみにおいて、４時間以内にＣ−１０１およびＥ−１０１殺菌活性が達成された。それぞれ０．０６および０．２５μｇ／ｍｌ濃度のいずれかの製剤に関して、２４時間で致死は達成されなかった（表３および４）。両製剤の１および４μｇ／ｍｌの濃度において、２４時間で致死が達成された。
【０１３６】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２９２１２に関して、０．０６μｇ／ｍｌを除く検査したあらゆる濃度の各製剤により殺菌活性が達成された。この最低濃度においては、２４時間後であってもどちらの製剤も致死を達成しなかった（表３および４）。
【０１３７】
Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ２７８５３に関して、Ｃ−１０１およびＥ−１０１は両者共に、検査したあらゆる濃度において４時間までに殺菌性であった。
【０１３８】
時間殺菌動態試験により決定される通り、Ｃ−１０１およびＥ−１０１は、検査した４種の微生物に対し非常に類似した殺菌活性を示した。
【０１３９】
本発明の好ましい実施形態を例示および記載してきたが、それらに対し、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更を行ってよいことが認められよう。
【０１４０】
独占的な権利または特権が請求されている本発明の実施形態は、添付の特許請求の範囲に規定される。
【図５Ａ】
2014520853.tif 000013
【図５Ｂ】
2014520853.tif 000014
【図５Ｃ】
2014520853.tif 000015
【図５Ｄ】
2014520853.tif 000016
【図５Ｅ】
2014520853.tif 000017
【図５Ｆ】
2014520853.tif 000018
【図５Ｇ】
2014520853.tif 000019
【図５Ｈ】
2014520853.tif 000020
【図１】
2014520853.tif 000021
【図２】
2014520853.tif 000022
【図３】
2014520853.tif 000023
【図４】
2014520853.tif 000024
【図６】
2014520853.tif 000025
【図７】
2014520853.tif 000026
【図８】
2014520853.tif 000027
【図９】
2014520853.tif 000028
【図１０】
2014520853.tif 000029
【手続補正書】
【提出日】平成26年3月11日(2014.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
感受性微生物を死滅させるかまたはその増殖を阻害するための組成物であって、
（ａ）好酸球ペルオキシダーゼと、
（ｂ）過酸化物または過酸化物の供給源と、
（ｃ）アミノ酸であるグリシン、Ｌ−アラニン、およびＬ−プロリンの混合物と
を含む、組成物。
【請求項２】
前記過酸化物が、過酸化水素である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記過酸化物の供給源が、過酸化物生成オキシダーゼである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記過酸化物の供給源が、グルコースオキシダーゼである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
塩化物、臭化物およびこれらの混合物からなる群から選択されるハロゲン化物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
約０．１〜約１，０００μｇ／ｍｌの好酸球ペルオキシダーゼを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
各アミノ酸を約０．１〜約５００ｍＭ含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
約１〜約５００Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
感受性微生物を死滅させるかまたはその増殖を阻害するための方法であって、有効量の、請求項１に記載の組成物と該微生物とを接触させるステップを含む、方法。
【請求項１０】
ヒトまたは動物被験体における感染を処置するための請求項１に記載の組成物であって、感染部位に投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項１１】
ヒトまたは動物被験体における手術部位の感染を処置または予防するための請求項１に記載の組成物であって、該手術部位に投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項１２】
前記部位が、がん手術部位である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記がん手術部位が、結腸直腸がん手術部位である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記がん手術部位が、脳がん手術部位である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記部位が、腹腔鏡下手術部位である、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記感染が、多菌感染である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１７】
前記感染が、多剤耐性感染である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１８】
（ａ）好酸球ペルオキシダーゼ；過酸化物生成オキシダーゼ；ならびにアミノ酸であるグリシン、Ｌ−アラニン、およびＬ−プロリンの混合物を含む第一の組成物と、
（ｂ）該過酸化物生成オキシダーゼの基質を含む第二の組成物と
を含む、二元組合せ物。
【請求項１９】
前記過酸化物生成オキシダーゼがグルコースオキシダーゼであり、前記基質がグルコースである、請求項１８に記載の組合せ物。
【請求項２０】
前記第一の組成物、前記第二の組成物、または該第一の組成物および該第二の組成物の両方が、ハロゲン化物を含む、請求項１８に記載の組合せ物。
【請求項２１】
前記ハロゲン化物が、臭化物、塩化物、またはそれらの混合物である、請求項２０に記載の組合せ物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明のさらなる一態様では、二元組合せ物が提供される。一実施形態では、組合せ物は、水性培地に、本発明の好酸球ペルオキシダーゼ組成物を含む第一の 組成物と、過酸化物生成オキシダーゼの基質を含む第二の組成物とを包含する。組合せ物の一実施形態では、過酸化物生成オキシダーゼはグルコースオキシダーゼであり、基質はグルコースである。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
感受性微生物の増殖を阻害するための組成物であって、
（ａ）好酸球ペルオキシダーゼと、
（ｂ）過酸化物または過酸化物の供給源と、
（ｃ）該組成物の殺菌活性を増強する少なくとも２種のアミノ酸と
を含む、組成物。
（項目２）
前記過酸化物が、過酸化水素である、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記過酸化物の供給源が、過酸化物生成オキシダーゼである、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記過酸化物の供給源が、グルコースオキシダーゼである、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記少なくとも２種のアミノ酸が、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン無水物、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン無水物、馬尿酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−スレオニン、Ｄ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｄ−バリン、ベータアラニン、Ｌ−ベータ−ホモロイシン、Ｄ−ベータ−ホモロイシン、３−アミノブタン酸、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｄ−２，３−ジアミノプロピオン酸一塩酸塩、Ｌ−３−アミノイソ酪酸、Ｄ−３−アミノイソ酪酸、エチル３−アミノブチレート、サルコシンメチルエステル塩酸塩およびニペコチン酸ならびにこれらのアルキルエステル、薬学的に許容される塩および混合物からなる群から選択される、項目１に記載の組成物。
（項目６）
前記少なくとも２種のアミノ酸が、グリシン、Ｄ−イソロイシン、Ｌ−チロシン、ベータアラニン、Ｄ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アラニンメチルエステル、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−リシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−セリン、Ｌ−プロリンおよびこれらの混合物からなる群から選択される、項目１に記載の組成物。
（項目７）
前記少なくとも２種のアミノ酸が、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−プロリンおよびこれらの混合物からなる群から選択される、項目１に記載の組成物。
（項目８）
前記少なくとも２種の追加のアミノ酸が、グリシン、Ｌ−アラニンおよびＬ−プロリンである、項目１に記載の組成物。
（項目９）
塩化物、臭化物およびこれらの混合物からなる群から選択されるハロゲン化物をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目１０）
約０．１〜約１，０００μｇ／ｍｌの好酸球ペルオキシダーゼを含む、項目１に記載の組成物。
（項目１１）
各アミノ酸を約０．１〜約５００ｍＭ含む、項目１に記載の組成物。
（項目１２）
感受性微生物の増殖を阻害するための組成物であって、
（ａ）好酸球ペルオキシダーゼと、
（ｂ）過酸化物生成オキシダーゼと、
（ｃ）該組成物の殺菌活性を増強する少なくとも２種のアミノ酸と
を含む、組成物。
（項目１３）
前記過酸化物生成オキシダーゼが、グルコースオキシダーゼである、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
塩化物、臭化物およびこれらの混合物からなる群から選択されるハロゲン化物をさらに含む、項目１２に記載の組成物。
（項目１５）
前記少なくとも２種のアミノ酸が、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−プロリンおよびこれらの混合物からなる群から選択される、項目１２に記載の組成物。
（項目１６）
約０．１〜約１，０００μｇ／ｍｌの好酸球ペルオキシダーゼを含む、項目１２に記載の組成物。
（項目１７）
約１〜約５００Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼを含む、項目１３に記載の組成物。
（項目１８）
前記アミノ酸のそれぞれを約０．１〜約５００ｍＭ含む、項目１２に記載の組成物。
（項目１９）
感受性微生物を死滅させるかまたはその増殖を阻害するための方法であって、有効量の、項目１〜１８のいずれか一項に記載の組成物と該微生物を接触させるステップを含む、方法。
（項目２０）
ヒトまたは動物被験体における感染を処置する方法であって、有効量の、項目１〜１８のいずれか一項に記載の組成物を感染部位に投与するステップを含む、方法。
（項目２１）
ヒトまたは動物被験体における手術部位の感染を処置または予防する方法であって、有効量の、項目１〜１８のいずれか一項に記載の組成物を該手術部位に投与するステップを含む、方法。
（項目２２）
前記部位が、がん手術部位である、項目２０または２１に記載の方法。
（項目２３）
前記がん手術部位が、結腸直腸がん手術部位である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記がん手術部位が、脳がん手術部位である、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記部位が、腹腔鏡下手術部位である、項目２０または２１に記載の方法。
（項目２６）
前記感染が、多菌感染である、項目２０または２１に記載の方法。
（項目２６）
前記感染が、多剤耐性感染である、項目２０または２１に記載の方法。
（項目２７）
（ａ）項目１〜１８のいずれか一項に記載の過酸化物生成オキシダーゼ含有組成物を含む第一の組成物と、
（ｂ）該過酸化物生成オキシダーゼの基質を含む第二の組成物と
を含む、二元組合せ物。
（項目２８）
前記過酸化物生成オキシダーゼがグルコースオキシダーゼであり、前記基質がグルコースである、項目２７に記載の組合せ物。
【国際調査報告】
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