(57)【要約】  本発明は、ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化または生物活性を阻害することができる、ベンズオキサジアゾリルアミン構造を有する化合物、前記ｐ３８ＭＡＰＫの活性化または生物活性を阻害する手段により緩和され得る疾患、例えば、炎症性疾患または疼痛を呈する疾患の治療におけるそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬品の製造における、式（Ｉ）：
【化１】
2014532688.tif 000015
［式中、
ｎは、０または１を表し；
Ｘは、−ＣＨ２−または−Ｃ（Ｏ）−を表し；
Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｈ、ハロゲン、ＮＯ２、ＣＦ３およびＣＮからなる群から選択され；
Ｒ３およびＲ６は独立に、ハロゲン、ＯＨ、置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル、置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−６ハロアルキル、ＮＨ２、ＮＯ２およびＣＮからなる群から選択され；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ７は独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル、置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−６ハロアルキル、ＮＨ２、ＮＯ２およびＣＮからなる群から選択される］
の化合物またはその塩もしくは溶媒和物の使用。
【請求項２】
ｎが０である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｒ４、Ｒ５およびＲ７が独立にＨ、ハロゲン、ＯＨ、メチル、メトキシ、ＣＦ３、ＮＨ２、ＮＯ２およびＣＮからなる群から選択される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
Ｒ４、Ｒ５およびＲ７のうちの少なくとも１つがＨである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
Ｒ７がＨである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
Ｒ１およびＲ２が独立にＨ、Ｃｌ、ＮＯ２およびＣＦ３からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つがＮＯ２である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
Ｒ３およびＲ６が独立にハロゲン、ＯＨ、メチル、メトキシ、ＣＦ３、ＮＨ２、ＮＯ２およびＣＮからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
式（Ｉ）の化合物が式（Ｉａ）：
【化２】
2014532688.tif 000016
（式中、ｎ、Ｘ、Ｒ１〜Ｒ７は請求項１〜８に定義される通り）
の化合物またはその塩もしくは溶媒和物である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
式（Ｉ）の化合物が式（Ｉｂ）：
【化３】
2014532688.tif 000017
(式中、ｎ、Ｘ、Ｒ１〜Ｒ７は請求項１〜８に定義される通り）
の化合物またはその塩もしくは溶媒和物である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
式（Ｉａ）の化合物が
【化４】
2014532688.tif 000018
またはその塩もしくは溶媒和物からなる群から選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
式（Ｉｂ）の化合物が
【化５】
2014532688.tif 000019
またはその塩もしくは溶媒和物からなる群から選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
ｐ３８  ＭＡＰＫ関連疾患の予防および／または治療のための医薬品の製造における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
ｐ３８  ＭＡＰＫ関連疾患が、炎症性疾患、心疾患、癌、神経変性疾患、代謝性疾患および／または疼痛である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
疼痛が、炎症性疼痛、神経因性疼痛、神経変性に関連する疼痛、および多発性硬化症に関連する疼痛から選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
代謝性疾患が肥満または糖尿病である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
神経変性疾患が多発性硬化症または筋萎縮性側索硬化症である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１８】
請求項１〜１２に定義される式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物と、薬学上許容可能な担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１９】
式（Ｉ）：
【化６】
2014532688.tif 000020
［式中、
ｎは、０または１を表し；
Ｘは、−ＣＨ２−または−Ｃ（Ｏ）−を表し；
Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｈ、ハロゲン、ＮＯ２、ＣＦ３およびＣＮからなる群から選択され；
Ｒ３およびＲ６は独立に、ハロゲン、ＯＨ、置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル、置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−６ハロアルキル、ＮＨ２、ＮＯ２およびＣＮからなる群から選択され；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ７は独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル、置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−６ハロアルキル、ＮＨ２、ＮＯ２およびＣＮからなる群から選択される］
の化合物またはその塩もしくは溶媒和物
（ただし、式（Ｉ）の化合物は（５−クロロ−２−メチル−フェニル）−（７−クロロ−４−ニトロ−ベンゾ［１，２，５］オキサジアゾール−５−イル）−アミンまたは（７−クロロ−４−ニトロ−ベンゾ［１，２，５］オキサジアゾール−５−イル）−（２，５−ジメチル−フェニル）−アミンではない）。
【請求項２０】
式（Ｉ）の化合物が式（Ｉａ）：
【化７】
2014532688.tif 000021
（式中、ｎ、Ｘ、Ｒ１〜Ｒ７は請求項１９に定義される通り）
の化合物である、請求項１９に記載の化合物、またはその塩もしくは溶媒和物。
【請求項２１】
式（Ｉａ）の化合物が式（Ｉａ’）：
【化８】
2014532688.tif 000022
（式中、ｎ、Ｘ、Ｒ１〜Ｒ７は請求項２０に定義される通り）
の化合物である、請求項２０に記載の化合物、またはその塩もしくは溶媒和物。
【請求項２２】
ｎが０である、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ４、Ｒ５およびＲ７が独立にＨ、ハロゲン、ＯＨ、メチル、メトキシ、ＣＦ３、ＮＨ２、ＮＯ２およびＣＮからなる群から選択される、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ４、Ｒ５およびＲ７のうちの少なくとも１つがＨである、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ７がＨである、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒ１およびＲ２が独立にＨ、Ｃｌ、ＮＯ２およびＣＦ３からなる群から選択される、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｒ１がＮＯ２または塩素である、請求項２６に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｒ２がＨである、請求項２６または２７に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｒ３およびＲ６が独立にハロゲン、ＯＨ、メチル、メトキシ、ＣＦ３、ＮＨ２、ＮＯ２およびＣＮからなる群から選択される、請求項１９〜２８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３０】
式（Ｉ）の化合物が
【化９】
2014532688.tif 000023
からなる群から選択される、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の化合物、またはその塩もしくは溶媒和物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、ベンズオキサジアゾリルアミン構造を有する化合物、前記化合物を含んでなる組成物、およびｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化または生物活性を阻害するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｐ３８タンパク質キナーゼは、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）ファミリーとして知られるシグナル伝達分子の一ファミリー、すなわち、広範囲の刺激に応答して細胞成長、増殖、細胞死および分化などのいくつかの細胞プロセスを担うＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼファミリーのメンバーである。ｐ３８サブファミリーは、いくつかのストレス刺激、例えば、紫外線、浸透圧ショック、熱、ならびに腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）などの炎症性サイトカインに応答する。
【０００３】
ｐ３８ＭＡＰＫは、炎症、細胞分化（例えば、筋芽細胞−筋管の変換、脂肪細胞前駆体の細胞分化、胸腺細胞分化など）、種々の刺激に応答した細胞遊走（例えば、内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）により刺激される内皮細胞遊走など）の調節、ならびに細胞周期（この場合には、ｐ３８−ＭＫ２経路は、紫外線に応答するＧ２／ＭチェックポイントまたはＧ０およびＧ１／Ｓチェックポイントを調節する）などの極めて多様なプロセスに重要な役割を果たしている。
【０００４】
ｐ３８ＭＡＰＫ経路の機能不全は病因論および／または種々の病態の発生に関連づけられており、その中に関節リウマチ、乾癬、心不全、糖尿病、およびアルツハイマー病さえ見られる。最近、ｐ３８ＭＡＰＫの役割が特に多発性硬化症（ＭＳ）および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）と関連づけられた。従って、ｐ３８ＭＡＰＫは重要な治療標的となってきた。例として、呼吸器系疾患（ＥＰ１５３４２８２）、関節リウマチ、乾癬またはクローン病などの自己免疫疾患（ＷＯ２００４／０１４３８７）、疼痛（ＷＯ２００４／０２１９８８、ＵＳ２００８／００３９４６１）、心血管疾患（ＷＯ２００５／０３２５５１）の治療において、また、肥満の減量または治療（ＷＯ２００９／００７４６７６）において、種々のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の使用が記載されている。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤および炎症に対するそれらの効果に関する一般的な総説で、B. Kamiska (Kamiska B., Biochimica et Biophysica Acta, 2005, 1754, 253-262)は、抗炎症薬として関節リウマチの治療に有用である可能性のある化合物ＳＢ２０３５８０［４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−（メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン］の、ｐ３８ＭＡＰＫに対する阻害効果を記載している。
【０００５】
多発性硬化症（ＭＳ）におけるｐ３８ＭＡＰＫの役割に関して、Yasuda et al. (Yasuda et al., Cent Nerv Syst Agents Med Chem., 2011, 11(1):45)は、ｐ３８カスケードの活性化は、この疾患、ならびに脳虚血、アルツハイマー病およびパーキンソン病に関連する炎症性サイトカインを放出する。この研究ではまた、神経因性疼痛および鬱病の治療に向けた第ＩＩ相治験下にある新規なｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤も記載されている。ｐ３８αおよびｐ３８βは脳で発現され、神経変性の傷害動物モデルで頻繁に活性化されていて、生理学的特性の障害、応答遺伝子の活性化および神経毒性を生じることが知られている(Harper et al., Expert Opin. Ther. Targets, 2003, 7: 187)。Guo and Coulthard (Guo and Baht, Neurochemical Research, 2007, 32 (12) 2160; Coulthard et al., Trends in Mo. Med., 2009, 15(8):369)による研究は、ＭＳおよび虚血の動物モデルにおけるミノサイクリンの神経保護機能が一部にはｐ３８  ＭＡＰＫシグナル伝達の阻害のためであり得るということを裏付けている。他方、ｐ３８  ＭＡＰＫの活性化は、慢性実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の発症および進行ならびに再発−寛解経過に必要であり、Ｔ細胞におけるｐ３８  ＭＡＰＫ活性の阻害は、ＥＡＥの重篤度を変調するのに十分である(Noubade et al., Blood, 2011, 118(12):3290)。ＡＳＫ１（ｐ３８カスケードアクチベーター）阻害剤による経口処置は、脊髄および視神経においてＥＡＥ誘発性の炎症を抑制し(Guo et al., EMBO Mol Med, 2010, 2, 12:504)、これはグリア細胞のＴＬＲ−ＡＳＫ１−ｐ３８経路を多発性硬化症などの脱髄性障害の治療標的として確証するものである。
【０００６】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）におけるｐ３８  ＭＡＰＫの役割については、ＡＬＳに関する運動ニューロンおよび小グリア細胞におけるｐ３８  ＭＡＰＫの異常発現とその活性化の間の関係を強調すべきである(Bendotti et al., Neurodegener. Dis., 2005, 128)。さらに、ｐ３８の継続的な活性化は、ＡＬＳのトランスジェニックマウスモデル（ＳＯＤ１変異体Ｇ９３Ａ）の運動ニューロン変性に関連があるが(Tortarolo M et al., Mol Cell Neurosci., 2003, 23(2); Holasek et al., Brain Res., 2005 1045:185)、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤（ＳＢ２０３５８０）はＳＯＤ１変異体により誘導される運動ニューロンのアポトーシスを妨げる(Dewil et al., Neurobiol. Dis., 2007, 26: 332)。また、ｐ３８およびＪＮＫ１の両方が、異常なリン酸化とそれに続く神経微細線維の凝集により、家族性および散発性ＡＬＳの特徴である脊髄運動ニューロンの細胞骨格異常に関与していることも記載されている(Bendotti et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 2004, 63: 113; Ackerley et al., Mol. Cell. Neurosci., 2004, 26:354; Brownlees et al., J. Cell Sci., 2000 113: 401)。
【０００７】
ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤はすでに記載されてはいるが、前記ｐ３８  ＭＡＰＫの生物活性を阻害することによって緩和され得るｐ３８  ＭＡＰＫ関連疾患、特に、局部的神経炎症または疼痛を呈する疾患に対する治療アプローチの範囲を広げる目的で、ヒトの治療に有用であり得る、前記キナーゼを阻害するための新規な化合物を同定する必要がなおある。
【０００８】
文献ＵＳ２００５／０２８２８１８には、ユビキチンリガーゼを阻害するための複素環式化合物が記載され、前記化合物はＭＡＰキナーゼの活性を（間接的に）調節するために有用であり得ると記載されている。これらの化合物は、ベンズオキサジアゾリルフェニルアミン構造を有する分子を含む。
【０００９】
文献ＷＯ２０１０／０８３４０４は、ＭｙｃとＭａｘの会合に干渉し得る、従って、増殖性疾患の治療に有用であり得る種々のベンズオキサジアゾールに関するものである。
【００１０】
文献ＵＳ２０１０／００９９６８３は、癌治療のためのＤＮＡリガーゼ阻害剤の使用に関するものであり、それらの阻害剤の中にベンズオキサジアゾール構造を有する誘導体がいくつか見られる。
【００１１】
文献ＷＯ２００１／０５３９０およびＷＯ２０００／０４２０２２には、それぞれ慢性疼痛および増殖性疾患の治療を目的にＭＥＫキナーゼを阻害する化合物が記載されている。これらの文献には、カルボン酸から誘導された基で置換されたベンズオキサジアゾール構造を有する例が含まれている。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、ｐ３８  ＭＡＰＫを阻害することができるベンズオキサジアゾリルフェニルアミン構造を有する化合物に関する。さらに、本発明者らが行った種々のアッセイは、フェニル環の少なくとも２位と５位が置換されているベンゾ［１，２，５］オキサジアゾリルフェニルアミン構造を有する化合物は、別の置換パターンを有する化合物に比べて、ｐ３８キナーゼ阻害剤として高い活性を持つことを明確に示した。
【００１３】
よって、第一の側面において、本発明は、医薬品の製造における、式（Ｉ）：
【化１】
2014532688.tif 000002
［式中、
ｎは、０または１を表し；
Ｘは、−ＣＨ２−または−Ｃ（Ｏ）−を表し；
Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｈ、ハロゲン、ＮＯ２、ＣＦ３およびＣＮからなる群から選択され；
Ｒ３およびＲ６は独立に、ハロゲン、ＯＨ、置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル、置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−６ハロアルキル、ＮＨ２、ＮＯ２およびＣＮからなる群から選択され；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ７は独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル、置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−６ハロアルキル、ＮＨ２、ＮＯ２およびＣＮからなる群から選択される］
の化合物またはその塩もしくは溶媒和物の使用に関する。
【００１４】
別の側面では、本発明は、医薬品の製造において使用するための式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物に関する。
【００１５】
別の側面では、本発明は、ｐ３８  ＭＡＰＫ関連疾患、例えば、前記ｐ３８  ＭＡＰＫの活性化または生物活性を阻害する手段によって緩和され得る疾患の予防および／または治療のための医薬品の製造における、式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物の使用に関する。
【００１６】
別の側面では、本発明は、ｐ３８  ＭＡＰＫ関連疾患、例えば、前記ｐ３８  ＭＡＰＫの活性化または生物活性を阻害する手段によって緩和され得る疾患の予防および／または治療において使用するための式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物に関する。
【００１７】
別の側面では、本発明は、式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物と薬学上許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物に関する。
【００１８】
別の側面では、本発明は、上記で定義される式（Ｉ）の化合物に関し、ただし、この式（Ｉ）の化合物は、（５−クロロ−２−メチル−フェニル）−（７−クロロ−４−ニトロ−ベンゾ［１，２，５］オキサジアゾール−５−イル）−アミン（化合物５）または（７−クロロ−４−ニトロ−ベンゾ［１，２，５］オキサジアゾール−５−イル）−（２，５−ジメチル−フェニル）−アミン（化合物６）ではない。
【００１９】
別の側面では、本発明は、式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を製造するための方法に関する。
【００２０】
別の側面では、本発明は、患者に治療上有効な量の少なくとも１種類の式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を投与することを含んでなる、ｐ３８  ＭＡＰＫ関連疾患の治療方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ｐ３８  ＭＡＰＫの活性に対する化合物１の阻害効果を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて、種々の濃度の化合物１（または対照として使用される１０μＭの化合物５）の存在下で、基質ＭＥＦ２Ａを精製組換えｐ３８によりリン酸化した後に、これらのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥの手段により分離し、特異的抗体を用いたウエスタンブロット後にＭＥＦ２Ａリン酸化の程度を定量した。２反復で行った独立した２回の結果の平均値を、ＤＭＳＯを用いた対照に対するパーセンテージとしてグラフで示した。
【図２】図２は、ヒト単球細胞株（ＴＨＰ−１）においてＬＰＳに応答したｐ３８  ＭＡＰＫ、ＭＫ２およびＨｓｐ２７経路の種々の成分の活性化に対する化合物１の効果を示す。ＴＨＰ−１細胞を、示された用量の化合物１（１および５μＭ）とともに１時間プレインキュベートし、３０分または６０分間ＬＰＳで刺激した。これらの細胞を溶解し、細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥの手段により分離し、それらのタンパク質を、特異的抗体を用いたウエスタンブロットにより分析し（図２Ａ）、これらのフィルムを濃度測定分析により定量した。ｐ３８  ＭＡＰＫ、ＭＫ２およびＨｓｐ２７の活性化は、リン酸化されたタンパク質の量を濃度計により定量し、それらの値を各溶解液で総タンパク質レベルに関して得られた値で正規化することによって解析し（図２Ｂ）、ＤＭＳＯを用いた対照に関して得られた値を１００％として、それらを１００％に対して比例させた。
【図３】図３〜５は、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）に応答した腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）分泌およびＴＨＰ−１単球の生存率に対する化合物１（図３）、２（図４）および５（図５）の効果を示す。ヒトＴＨＰ−１単球を、ｘ軸に示された濃度でＤＭＳＯ中に溶かした化合物１、２もしくは５、またはＤＭＳＯとともに１時間プレインキュベートした後、細菌ＬＰＳで３時間刺激した。ＬＰＳに応答して培地中に分泌されたＴＮＦ−αの量をヒトＴＮＦ  ＥＬＩＳＡの手段により定量した。細胞の生存率を処理細胞をヨウ化プロピジウムで染色した後にフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）の手段により、この染色剤に陽性の細胞の量を定量することによって定量した。これらの結果は、各２反復で行った３回の独立した実験の平均であり、ＤＭＳＯを用いた対照を１００％として表す。
【図４】図３〜５は、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）に応答した腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）分泌およびＴＨＰ−１単球の生存率に対する化合物１（図３）、２（図４）および５（図５）の効果を示す。ヒトＴＨＰ−１単球を、ｘ軸に示された濃度でＤＭＳＯ中に溶かした化合物１、２もしくは５、またはＤＭＳＯとともに１時間プレインキュベートした後、細菌ＬＰＳで３時間刺激した。ＬＰＳに応答して培地中に分泌されたＴＮＦ−αの量をヒトＴＮＦ  ＥＬＩＳＡの手段により定量した。細胞の生存率を処理細胞をヨウ化プロピジウムで染色した後にフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）の手段により、この染色剤に陽性の細胞の量を定量することによって定量した。これらの結果は、各２反復で行った３回の独立した実験の平均であり、ＤＭＳＯを用いた対照を１００％として表す。
【図５】図３〜５は、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）に応答した腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）分泌およびＴＨＰ−１単球の生存率に対する化合物１（図３）、２（図４）および５（図５）の効果を示す。ヒトＴＨＰ−１単球を、ｘ軸に示された濃度でＤＭＳＯ中に溶かした化合物１、２もしくは５、またはＤＭＳＯとともに１時間プレインキュベートした後、細菌ＬＰＳで３時間刺激した。ＬＰＳに応答して培地中に分泌されたＴＮＦ−αの量をヒトＴＮＦ  ＥＬＩＳＡの手段により定量した。細胞の生存率を処理細胞をヨウ化プロピジウムで染色した後にフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）の手段により、この染色剤に陽性の細胞の量を定量することによって定量した。これらの結果は、各２反復で行った３回の独立した実験の平均であり、ＤＭＳＯを用いた対照を１００％として表す。
【図６】図６Ａは、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）に応答した腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）分泌に対する化合物１、７および８の効果を示す。ヒトＴＨＰ−１単球を、ｘ軸に示された濃度でＤＭＳＯに溶かした化合物１、７または８とともにプレインキュベートした後、細菌ＬＰＳで３時間刺激した。ＬＰＳに応答して培地中に分泌されたＴＮＦ−αの量をヒトＴＮＦ  ＥＬＩＳＡの手段により定量した。結果をＤＭＳＯを用いた対照を１００％として表す。図６Ｂは、ＬＰＳに応答したＴＮＦ−α分泌の平均阻害（ＩＣ５０）定量値を示すグラフである。
【図７】図７は、化合物３および９の、ＬＰＳに応答したＴＮＦ−α分泌の平均阻害（ＩＣ５０）定量値をそれらの効力の指標として示す比較グラフである。ＴＨＰ−１細胞を、示された用量の化合物またはＤＭＳＯで１時間プレインキュベートし、ＬＰＳで３時間刺激した。細胞上清中に分泌されたＴＮＦの量を、ヒトＴＮＦ  ＥＬＩＳＡキットを用いて定量した。結果をＤＭＳＯを用いた対照を１００％として表す。
【図８】図８は、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）に応答した腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）分泌に対する化合物１、２および１０〜１４の効果を示す。ヒトＴＨＰ−１単球は、ｘ軸に示された濃度でＤＭＳＯに溶かした試験化合物の存在下で細菌ＬＰＳで刺激した。ＬＰＳに応答して培地中に分泌されたＴＮＦ−αの量を、ＥＬＩＳＡアッセイの手段により定量した。ヒト単球でのＴＮＦ−α分泌阻害アッセイにおけるこれらの比較結果は、本発明の化合物（化合物１および２）が、構造上関連があるがフェニル環に異なる置換パターンを有する他の化合物（比較化合物１０〜１４）に比べて大きな活性を有することを示す。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、カラギーナンの足底内注射の手段によりＬｙｓＭ−ＧＲＫ２ｆ／＋マウスに誘導された痛覚過敏に対する化合物１の効果を示す。痛覚過敏誘導から７日後（図９Ａ）または６日後（図９Ｂ）、０時点での炎症型疼痛の指標として、足が熱に接触した際の足の逃避反応潜時を決定した。次に、担体（ＤＭＳＯ）または種々の濃度の化合物１をくも膜下腔内に注射し、ｘ軸で示される時点で、ｙ軸に表される足の逃避反応潜時を測定した。潜時に得られた減少率％の平均±ＳＥＭをグラフにプロットする＊＊＊、Ｐ＜０．００１。  図９Ｂは、ＬｙｓＭ−ＧＲＫ２ｆ／＋マウスにおける最低有効用量は化合物１  ０．５μｇであることを示す。
【図１０】図１０は、ＬｙｓＭ−ＧＲＫ２ｆ／＋マウスに化合物１のくも膜下腔内注射を行い、およびＦｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ  Ｂで染色した後の、注射部位周囲の細胞（脊髄星状細胞およびニューロン）を示す。射部位周囲の細胞（脊髄星状細胞およびニューロン）は、ＬｙｓＭ−ＧＲＫ２ｆ／＋マウスに化合物１のくも膜下腔内注射を行った後に死細胞または傷害細胞を決定するために、注射２日後にＦｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ  Ｂで染色した。死細胞（この染色剤に陽性と考えられる）はほとんど無かった。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、高用量のカラギーナンの足底内注射の手段によりＣ５４ＢＬ／６野生型マウスに誘導された痛覚過敏に対する化合物１の効果を示す。痛覚過敏誘導から６日後に、０時点での炎症型疼痛の指標として、足が熱に接触した際の足の逃避反応潜時を決定した。次に、担体（ＤＭＳＯ）、化合物ＳＢ２３９０６３（ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤として知られる）、または化合物１（図１１Ａ）もしくは化合物１３（図１１Ｂ）を種々の濃度でくも膜下腔内に注射し、ｘ軸で示される時点で、ｙ軸に表される足の逃避反応潜時を測定した。潜時に得られた減少率％の平均±ＳＥＭをグラフにプロットする。＊または＃  Ｐ＜０．０５；＊＊＊または＃  ＃  ＃  Ｐ＜０．００１．Ｃ）。  図１１Ｃは、１μｇの化合物１による処置から２日後の、Ｆｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ  Ｂで染色した単離脊髄の切片を示す。  図１１Ｄは、化合物１による処置から２日後の脊髄におけるＴＮＦ−αレベルを示す。ＴＮＦ−αレベルは、抗ＴＮＦ  ＥＬＩＳＡキットを用いて脊髄溶解液にて決定し、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）をグラフにプロットしたところ、化合物１によるＴＮＦ−αレベルの有意な低下が見られるが、カラギーナン＋担体で得られた炎症と有意な差はなく、このことは、化合物１による処置が末梢の炎症活性に直接的な影響を及ぼさないことを示す。  図１１Ｅは、化合物１による処置から６日後のマウス（ｎ＝８）の足の厚さを測定した進行中の炎症の測定値を示す。
【図１２】図１２は、カラギーナンの足底内注射の手段によりＬｙｓＭ−ＧＲＫ２ｆ／＋マウスに誘導された痛覚過敏に対する化合物５および化合物ＳＢ２３９０６３の効果を示す。痛覚過敏の誘導から７日後に、０時点での炎症型疼痛の指標として、足が熱に接触した際の足の逃避反応潜時を決定した。次に、担体（ＤＭＳＯ）、化合物ＳＢ２３９０６３、または化合物５をくも膜下腔内に注射し、ｘ軸で示される時点で、ｙ軸に表される足の逃避反応潜時を測定した。
【図１３】図１３は、ＷＴおよびＧＲＫ２＋／−マウスの腹腔内マクロファージによるＴＮＦ−α分泌に対する化合物１の効果を示す。ＧＲＫ２＋／−腹腔内マクロファージにＬＰＳ処理を施し、上記のように、漸増用量の化合物１の存在下でＴＮＦ分泌を測定した。ＧＲＫ２＋／−マクロファージで見られた阻害は、化合物１の総ての用量で、ＷＴ細胞の場合に見られた阻害よりも大きかった。データは、各場合において、同用量の化合物１の存在下でＷＴマクロファージにおいて見られた分泌に対して示す、二反復での各ポイントの平均である。
【発明の具体的説明】
【００２２】
本発明に関して、下記の用語は以下に詳細に示される意味を有する。
【００２３】
用語「Ｃ１−６アルキル」は、１および６個の間、好ましくは、１〜３個の間（「Ｃ１−３アルキル」）の炭素原子を有し、かつ、一重結合の手段によって残りの分子に結合している脂肪族直鎖または分岐鎖基を意味する。この用語は、例えば、限定されるものではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチルなどを含む。
【００２４】
用語「Ｃ１−６ハロアルキル」は、少なくとも１つの水素原子がハロゲン原子で置換されている、上記で定義されるアルキル基を意味する。この用語は、例えば、限定されるものではないが、フルオロメチル、ブロモメチル、ヨードメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２−フルオロエチル、２−クロロエチル、１−フルオロエチル、ペンタフルオロエチル、１−フルオロプロピル、２−クロロプロピル、３−フルオロプロピル、３−クロロプロピル、１−フルオロブチル、１−クロロブチル、４−フルオロブチルを含む。ハロアルキルは、好ましくはＣＦ３である。
【００２５】
用語「Ｃ１−６アルコキシ」は−Ｏ−アルキル基を意味し、ここで、アルキルは上記で定義される通りである。アルコキシは、好ましくはメトキシである。
【００２６】
用語「ハロゲン」は、臭素、塩素、ヨウ素またはフッ素を意味する。ハロゲンは、好ましくは、フッ素または塩素である。
【００２７】
用語「シクロアルキル」は、３〜１０個の間、好ましくは３〜６個の間の炭素原子を有し、かつ、一重結合の手段によって残りの分子に結合している飽和または部分飽和単環式または多環式脂肪族基を意味し、例えば、限定されるものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロヘキシル、シクロペンチルなどを含む。
【００２８】
用語「アリール」は、炭素−炭素結合または縮合の手段によって結合された１、２または３個の芳香族核を含んでなる６〜１８個の間、好ましくは６〜１０個の間、いっそうより好ましくは６または１０個の炭素原子を有する芳香族基を意味し、例えば、限定されるものではないが、フェニル、ナフチル、ジフェニル、インデニル、フェナントリルなどを含む。
【００２９】
「複素環」とは、炭素原子と窒素、酸素および硫黄からなる群から選択される１〜５個のヘテロ原子とからなり、かつ、部分飽和もしくは完全飽和であり得る、または芳香族（「ヘテロアリール」）であり得る、３〜１０員の安定な環基、好ましくは、５員または６員環を意味する。本発明の目的では、複素環は、単環式、二環式または三環系（縮合環系を含み得る）であり得る。このような複素環の例はとしては、限定されるものではないが、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、テトラヒドロフラン、ベンズイミダゾール、ベンゾチアゾール、フラン、ピロール、ピリジン、ピリミジン、イソチアゾール、イミダゾール、インドール、プリン、キノリン、チアジアゾールが含まれる。
【００３０】
当技術分野で理解されているように、上記で定義される基には一定の置換度が存在し得る。置換基に関して、本明細書の参照は、明示されている基が１以上の利用可能な位置において１個以上の置換基で置換可能であることを示す。前記置換基には、例えば、限定されるものではないが、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、シクロアルキル、アリール、複素環、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、ＣＦ３、−Ｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）、−ＯＲｃ、−ＳＲｄ、−Ｃ（Ｏ）Ｒｅ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｆ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｇ）（Ｒｈ）、−ＯＣ（Ｏ）Ｒｉが含まれ、ここで、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、ＲｈおよびＲｉは独立に、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アリール、複素環およびトリフルオロメチルから選択される。
【００３１】
式（Ｉ）の化合物は、塩、好ましくは、薬学上許容可能な塩の形態、および溶媒和物の形態であり得る。用語「薬学上許容可能な」とは好ましくは、生理学的に耐用性があり、かつ、ヒトまたは動物に投与した際に、通常、アレルギー反応、または胃傷害、めまいなどの類似の不都合な反応を引き起こさない組成物および分子実体を意味する。「薬学上許容可能な」という表現は、それが州政府もしくは連邦政府の規制当局に承認されていること、または米国薬局方または動物、特にヒトにおける使用に関する別の一般に認知されている薬局方に含まれていることを意味する。
【００３２】
用語「溶媒和物」は、非共有結合の手段によりそれに結合されている別の分子（極性溶媒である可能性が最も高い）を有する本発明による化合物の任意の形態を意味する。溶媒和物の例としては、水和物およびアルコーラート、例えば、メタノーラートが挙げられる。溶媒和物は、好ましくは薬学上許容可能な溶媒和物である。
【００３３】
塩および溶媒和物は、当技術分野で公知の方法の手段によって製造することができる。例えば、本明細書で提供される化合物の塩は、原化合物から、従来の化学法の手段、例えば、これらの化合物の遊離形態を水または有機溶媒または両方の混合物中、好適な塩基または酸と反応させることによって作製することができる。酸付加塩の例としては、無機酸付加塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、および有機酸付加塩、例えば、一および二酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩およびｐ−トルエンスルホン酸塩が挙げられる。アルカリ付加塩の例としては、無機塩、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、マグネシウム、アルミニウムおよびリチウム塩、および有機アルカリ塩、例えば、エチレンジアミン、エタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジアルキレンエタノールアミン、トリエタノールアミンおよび塩基性アミノ酸塩が挙げられる。
【００３４】
上記の式（Ｉ）で表される本発明の化合物は、キラル中心の存在によって鏡像異性体、または多重結合の存在によって幾何異性体（例えば、Ｚ、Ｅ）を含み得る。式（Ｉ）の化合物の幾何異性体、鏡像異性体またはジアステレオ異性体およびそれらの混合物も本発明の範囲内にある。
【００３５】
式（Ｉ）の化合物
本発明の一つの側面は、医薬品の製造における、上記で定義される式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物の使用に関する。
【００３６】
特定の実施態様によれば、ｎは０である。
【００３７】
特定の実施態様によれば、ｎは１であり、かつ、Ｘは−Ｃ（Ｏ）−を表す。
【００３８】
特定の実施態様によれば、Ｒ４、Ｒ５およびＲ７は独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、置換されていてもよいＣ１−Ｃ３アルキル、置換されていてもよいＣ１−Ｃ３アルコキシ、Ｃ１−３ハロアルキル、ＮＨ２、ＮＯ２およびＣＮからなる群から選択される。特定の実施態様では、Ｒ４、Ｒ５およびＲ７は独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、メチル、メトキシ、ＣＦ３、ＮＨ２、ＮＯ２およびＣＮからなる群から選択される。
【００３９】
特定の実施態様によれば、Ｒ４、Ｒ５およびＲ７のうちの少なくとも１つはＨである。特定の実施態様では、Ｒ４、Ｒ５およびＲ７のうちの少なくとも２つはＨである。特定の実施態様では、Ｒ４、Ｒ５およびＲ７はＨである。
【００４０】
特定の実施態様によれば、Ｒ７はＨである。
【００４１】
特定の実施態様によれば、Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｈ、Ｃｌ、ＮＯ２およびＣＦ３からなる群から選択される。
【００４２】
特定の実施態様によれば、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つ、好ましくは１つは、ＮＯ２またはハロゲン、好ましくは、ＮＯ２またはＣｌである。
【００４３】
特定の実施態様によれば、Ｒ１およびＲ２の一方は、ＮＯ２またはハロゲン、好ましくは、ＮＯ２またはＣｌであり、他方は、Ｈまたはハロゲン、好ましくは、ＨまたはＣｌである。
【００４４】
特定の実施態様では、Ｒ１はＮＯ２である。
【００４５】
特定の実施態様では、Ｒ２は、Ｈまたはハロゲン、好ましくは、ＨまたはＣｌである。
【００４６】
特定の実施態様によれば、Ｒ３およびＲ６は独立に、ハロゲン、ＯＨ、置換されていてもよいＣ１−Ｃ３アルキル、置換されていてもよいＣ１−Ｃ３アルコキシ、Ｃ１−３ハロアルキル、ＮＨ２、ＮＯ２およびＣＮからなる群から選択される。特定の実施態様では、Ｒ３およびＲ６は独立に、ハロゲン、ＯＨ、メチル、メトキシ、ＣＦ３、ＮＨ２、ＮＯ２およびＣＮからなる群から選択される。特定の実施態様では、Ｒ３およびＲ６は独立に、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、メチル、メトキシ、ＣＦ３、ＮＨ２、ＮＯ２およびＣＮ；好ましくは、Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ、メチルおよびメトキシからなる群から選択される。
【００４７】
特定の実施態様によれば、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉａ）：
【化２】
2014532688.tif 000003
（式中、ｎ、Ｘ、Ｒ１〜Ｒ７、およびそれらの特定の具体例は上記で定義される通り）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物である。特定の実施態様によれば、Ｒ１は、ハロゲン、ＮＯ２およびＣＦ３からなる群から選択される。特定の実施態様では、Ｒ２はＨである。
【００４８】
特定の実施態様では、式（Ｉａ）の化合物は、式（Ｉａ’）：
【化３】
2014532688.tif 000004
（式中、ｎ、Ｘ、Ｒ１〜Ｒ７、およびそれらの特定の具体例は上記で定義される通り）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物である。特定の実施態様では、ｎは０である。特定の実施態様によれば、Ｒ１は、ハロゲン、ＮＯ２およびＣＦ３からなる群から選択される。特定の実施態様では、Ｒ２はＨである。
【００４９】
別の特定の実施態様では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉｂ）：
【化４】
2014532688.tif 000005
（式中、ｎ、Ｘ、Ｒ１〜Ｒ７、およびそれらの特定の具体例は上記で定義される通り）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物である。特定の実施態様では、ｎは０である。特定の実施態様によれば、Ｒ１は、ＮＯ２およびＣＦ３からなる群から選択される。特定の実施態様では、Ｒ２は、Ｈまたはハロゲン、好ましくは、Ｃｌである。
【００５０】
特定の実施態様によれば、式（Ｉ）の化合物は、
【表１】
2014532688.tif 000006
またはその塩もしくは溶媒和物からなる群から選択される。
【００５１】
本発明の化合物は、ｐ３８  ＭＡＰＫの活性化または生物活性の阻害剤であり、すなわち、それらはｐ３８  ＭＡＰＫの生物活性を阻害する化合物である。
【００５２】
驚くことに、本発明の化合物、すなわち、フェニル環の少なくとも２位と５位が置換されているベンゾ［１，２，５］オキサジアゾリルフェニルアミン構造を有する化合物の、ｐ３８  ＭＡＰＫの活性化を阻害する能力は、構造上関連があるがフェニル環に異なる置換パターンを有する化合物の能力よりもかなり高い。
【００５３】
特に、比較化合物７および８（実施例８参照）は、本発明の化合物１と、フェニル環における塩素置換基とメチル置換基の位置が異なるだけである。図６に示されるように、フェニル環の２位と５位に置換基を有する化合物１の、細菌ＬＰＳにより刺激されたヒトＴＨＰ−１単球においてＴＮＦ−α分泌を低減する能力は、フェニル環の異なる位置に同じ置換基を有する比較化合物７および８の能力よりもはるかに高い（１０〜１５倍強力）。
【００５４】
同様に、技術の現状に関する文献ＵＳ２００５／０２８２８１８に記載されている比較化合物９（実施例８および図７参照）は、ヒト単球におけるＴＮＦ−α分泌低減能がフェニル環の置換基が２位と５位にある本発明の化合物３よりも低い。
【００５５】
図８は、ヒト単球におけるＴＮＦ−α分泌阻害アッセイにおけるさらなる比較結果を示し、本発明の化合物（化合物１および２）の活性が、構造上関連があるがフェニル環に異なる置換パターンを有する他の化合物（比較化合物１０〜１４）に比べてより高いことを示している。
【００５６】
よって、本発明の化合物は、ｐ３８  ＭＡＰＫ関連疾患、例えば、前記ｐ３８  ＭＡＰＫの活性化または生物活性を阻害する手段によって緩和され得る疾患の予防および／または治療に使用可能である。
【００５７】
別の側面では、本発明は、上記で定義された式（Ｉ）の化合物に関し、ただし、この式（Ｉ）の化合物は、（５−クロロ−２−メチル−フェニル）−（７−クロロ−４−ニトロ−ベンゾ［１，２，５］オキサジアゾール−５−イル）−アミンまたは（７−クロロ−４−ニトロ−ベンゾ［１，２，５］オキサジアゾール−５−イル）−（２，５−ジメチル−フェニル）−アミンではない。
【００５８】
特定の実施態様では、前記式（Ｉ）の化合物は、上記で定義された式（Ｉａ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物である。一つの実施態様では、式（Ｉａ）の化合物は、式（Ｉａ’）の化合物である。
【００５９】
特定の実施態様では、Ｒ１はＮＯ２、ハロゲン、ＣＦ３またはＣＮ；好ましくは、ＮＯ２またはハロゲン、より好ましくは、ＮＯ２またはＣｌ、いっそうより好ましくは、ＮＯ２である。
【００６０】
特定の実施態様では、Ｒ２はＨである。
【００６１】
式（Ｉ）の化合物の合成
本発明の化合物は、従来の合成方法により得ることができる。一つの側面において、本発明は、式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を製造するための方法に関する。
【００６２】
特定の実施態様では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ）：
【化５】
2014532688.tif 000007
（式中、Ｙはハロゲン、好ましくはＣｌであり、かつ、Ｒ１〜Ｒ２は上記で定義される通り）
の化合物を式（ＩＩＩ）：
【化６】
2014532688.tif 000008
(式中、ｎ、ＸおよびＲ３〜Ｒ７は上記で定義される通り）
の化合物と反応させる手段によって得ることができる。
【００６３】
特定の実施態様によれば、本方法は、有機溶媒、例えば、環式または非環式エーテル（例えば、Ｅｔ２Ｏ、ｉＰｒ２Ｏ、ジオキサン、テトラヒドロフラン、メチルテトラヒドロフラン）、ハロゲン化溶媒（例えば、ジクロロメタン）、アミド（例えば、ジメチルホルムアミド）、エステル（例えば、ＥｔＯＡｃ）、ニトリル（例えば、アセトニトリル）またはそれらの混合物の存在下で実施される。この反応は好ましくは、酢酸エチルまたはジメチルホルムアミドの存在下で実施される。
【００６４】
特定の実施態様では、この反応は、３０℃〜溶媒の沸点の間の温度、好ましくは溶媒の沸点で実施される。
【００６５】
別の特定の実施態様では、ｎが１であり、かつ、Ｘが−Ｃ（Ｏ）−である式（Ｉ）の化合物はまた、式（ＩＶ）：
【化７】
2014532688.tif 000009
（式中、Ｒ１〜Ｒ２は上記で定義される通り）
の化合物を式（Ｖ）：
【化８】
2014532688.tif 000010
（式中、Ｙはハロゲン、好ましくはＣｌであり、Ｒ３〜Ｒ７は上記で定義さる通り）
の化合物と反応させる手段によって得ることができる。
【００６６】
特定の実施態様によれば、本方法は、有機溶媒、例えば、環式または非環式エーテル（例えば、Ｅｔ２Ｏ、ｉＰｒ２Ｏ、ジオキサン、テトラヒドロフラン、メチルテトラヒドロフラン）、ハロゲン化溶媒（例えば、ジクロロメタン）またはそれらの混合物の存在下で実施される。この反応は、好ましくは、テトラヒドロフランの存在下で実施される。
【００６７】
特定の実施態様では、この反応は、０〜−８０℃の間の温度、好ましくは−７８℃で実施される。
【００６８】
本発明の化合物の用途
本発明の化合物は、強力なｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤である。本発明者らにより実施された種々のアッセイは、これらの化合物は前記ｐ３８  ＭＡＰＫの基質上での活性化および活性ならびに炎症性サイトカインの分泌を低減するだけでなく、それらはまた動物モデルで痛覚過敏を軽減することを明らかに示した。よって、本発明の化合物は、ｐ３８  ＭＡＰＫ関連疾患、例えば、前記ｐ３８  ＭＡＰＫの活性化または生物活性を阻害する手段によって緩和され得る疾患の治療に使用することができる。
【００６９】
本発明に関して、「ｐ３８  ＭＡＰＫ関連疾患」または「ｐ３８  ＭＡＰＫの活性化または生物活性を阻害する手段によって緩和され得る疾患」という表現には、炎症を呈する任意のタイプの疾患、例えば、自己免疫疾患を含む炎症性疾患；心疾患；癌；神経変性疾患；糖尿病および肥満を含む代謝性疾患；ならびに疼痛を呈する疾患が含まれる［最近の総説としては、Coulthard L.R., White D.E., Jones D.L., McDermott M.F., Burchill S.A. Trends Mol. Med. 2009 Aug; 15(8):369-79参照）。前記の表現は、好ましくは炎症および／または疼痛を呈する疾患、より好ましくは炎症および／または疼痛を呈する神経変性疾患を意味する。
【００７０】
多発性硬化症（ＭＳ）は、炎症を呈する疾患であることから、「ｐ３８  ＭＡＰＫ関連疾患」または「ｐ３８  ＭＡＰＫの活性化または生物活性を阻害する手段によって緩和され得る疾患」と考えられ、また、自己免疫疾患および神経変性疾患とも考えられる。
【００７１】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、他の因子の中でも神経炎症を伴う神経筋肉型の神経変性疾患であることから、「ｐ３８  ＭＡＰＫ関連疾患」または「ｐ３８  ＭＡＰＫの活性化または生物活性を阻害する手段によって緩和され得る疾患」と考えられる。
【００７２】
よって、特定の実施態様では、本発明は、自己免疫疾患；心疾患；癌；神経変性疾患、好ましくは、局部的神経炎症を呈する神経変性疾患；代謝性疾患、例えば、糖尿病および肥満；好ましくは、疼痛および／または局部的神経炎症を呈する炎症性疾患を含む、炎症性疾患の予防および／または治療のための医薬品の製造における、式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物の使用に関する。
【００７３】
別の側面によれば、本発明は、薬剤中で使用するための式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物に関する。本発明は好ましくは、自己免疫疾患；心疾患；癌；神経変性疾患、好ましくは、局部的神経炎症を呈する神経変性疾患；代謝性疾患、例えば、糖尿病および肥満；好ましくは疼痛および／または局部的神経炎症を呈する炎症性疾患を含む、炎症性疾患の予防および／または治療において使用するための式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物に関する。
【００７４】
本明細書で使用される意味において、「炎症性疾患」という表現は、組織損傷を生じる炎症性応答の非連続的および連続的活性化により引き起こされる任意の疾患を含み；前記炎症性応答は病原体、物理的因子、化学的因子、腫瘍および細胞死により誘発され得る。自己免疫疾患は、それらが炎症成分も有する限り、例えば本明細書で使用される用語「炎症性疾患」の範囲内に入る。炎症性疾患は一般に、損傷組織に従って、例えば、（ｉ）その主要な特徴が慢性、持続性または再発性の腸炎症の存在である、とりわけ、クローン病、潰瘍性大腸炎、顕微鏡的大腸炎（膠原線維性大腸炎およびリンパ性の大腸炎を包含する）、好中球性小腸大腸炎、移植片対宿主（ＧＶＨ）病および日射性大腸炎などの疾患群を含んでなる炎症性腸疾患；（ｉｉ）関節の炎症性疾患、とりわけ、例えば、関節リウマチ、痛風性関節炎、リウマチ性多発性筋痛、腱炎および滑液包炎；（ｉｉｉ）乾癬および喘息などのその他の炎症性疾患；ならびに（ｉｖ）それらの病因が基本的に炎症でないとしても炎症成分を呈する疾患に分類される。
【００７５】
好ましい実施態様では、本発明は、神経変性疾患の予防および／または治療のための医薬品の製造における式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物の使用に関する。好ましい実施態様では、神経変性疾患は、多発性硬化症または筋萎縮性側索硬化症である。
【００７６】
本明細書で用いる場合、用語「疼痛」は一般に、神経系を有する総ての生物が経験し得る、不快な（他覚的）感覚体験および（自覚的）感情体験を意味する。疼痛は組織損傷に関連する体験であり、急性疼痛または慢性疼痛と呼ぶことができる。急性疼痛は、急な組織損傷（例えば、火傷または切傷）により生じる。組織損傷に応答した自然の防御機構であり、損傷した身体部位の使用を避け、有痛性刺激を取り除く。これに対し、慢性疼痛は３ヶ月以上持続し、その損傷が治癒した後であっても患者の生活の質に大きな変化をもたらし得る[Foley, Pain, Cecil Textbook of Medicine 100-107, J.C. Bennett and F. Plum eds., 20th ed., Goldman Bennet 1996]。本発明の化合物はまた、圧迫神経、外科手術、癌または関節炎などの組織損傷に対する炎症性応答に一般に帰因する炎症性疼痛の治療および／または予防のためにも使用することができる[Brower, Nature Biotechnology 2000; 18: 387-391]。炎症性疼痛を有するほとんどの患者は、連続的な疼痛を感じるのではなく、むしろ炎症部位を動かした際により大きな疼痛を感じる。特定の実施態様では、本発明の化合物は、以下の疼痛関連障害：慢性疼痛、神経因性疼痛、歯痛、術後痛、リウマチ性疼痛、骨関節炎性疼痛、腰痛、内臓痛、癌による疼痛、神経痛、片頭痛、神経障害、糖尿病性神経障害関連疼痛、座骨神経障害関連疼痛、ＨＩＶ関連神経障害、帯状疱疹後神経痛、線維筋痛症、神経線維損傷に関連する疼痛、虚血に関連する疼痛、神経変性に関連する疼痛、心臓発作に関連する疼痛、心臓発作後疼痛、多発性硬化症に関連する疼痛、炎症性障害に関連する疼痛、炎症性腸疾患に関連する疼痛、膀胱炎に関連する疼痛、火傷に関連する疼痛、乾癬に関連する疼痛のうちの１つのの治療および／または予防に使用される。本発明の化合物は好ましくは、以下の疼痛関連障害：神経因性疼痛、神経変性に関連する疼痛および多発性硬化症に関連する疼痛の治療および／または予防に使用される。
【００７７】
本明細書に関して用いる場合、用語「治療」は、前述の疾患の１つを緩和もしくは除去する、または前記疾患に関連する１以上の症状を軽減もしくは除去するための本発明の化合物の投与を意味する。用語「治療」はまた、その疾患の生理学的後遺症を緩和または除去することも包含する。本明細書で用いる場合、用語「予防」は、疾患またはその発症前の病態の発症または進展を予防、最小化または妨害する本発明の化合物の能力を意味する。
【００７８】
本発明の化合物は、併用療法を提供するために本発明の前記化合物以外の少なくとも別の薬物と併用することができる。少なくとも別の薬物は、その組成物の一部であってもよいし、または同時にもしくは異なる時間に相当するための別個の組成物として提供してもよい。特定の実施態様によれば、少なくとも別の薬物は、抗炎症または鎮痛化合物である。実質的に、いずれの抗炎症または鎮痛化合物も本発明の化合物と併用可能である。本発明の化合物と併用可能な前記抗炎症化合物の例示的な限定されない例としては、限定されるものではないが、非ステロイド系抗炎症薬、例えば、アミノアリールカルボン酸誘導体（例えば、フルフェナム酸、ニフルム酸など）、アリール酢酸誘導体（例えば、ジクロフェナク、インドメタシン、オキサメタシンなど）、アリール酪酸誘導体（例えば、ブチブフェンなど）、アリールカルボン酸誘導体（例えば、ケトロラクなど）、アリールプロピオン酸誘導体（例えば、イブプロフェン、ケトプロフェンなど）、ピラゾール類（例えば、ジフェナミゾールなど）、ピラゾロン類（例えば、フェニルブタゾンなど）、アセチルサリチル酸誘導体（例えば、アセチルサリチル酸など）、チアジンカルボキサミド（例えば、イソキシカム、ピロキシカムなど）、その他（例えば、セレコキシブ、インフリキシマブ、ロフェコキシブなど）；ステロイド系抗炎症薬（例えば、ベタメタゾン、コルチゾン、メチルプレドニゾロンなど）などが挙げられる。同様に、本発明の化合物と併用可能な鎮痛化合物の例示的な限定されない例としては、限定されるものではないが、アセチルサリチル酸、アセチルサリチル酸カルシウム、ペリソキサール、サリチル酸ナトリウムなどが挙げられる。前記抗炎症または鎮痛化合物のさらなる例示は、The Merck Index, 第13版, “Therapeutic Category and Biological Activity Index”の節に見出すことができる。
【００７９】
本発明の医薬組成物
本発明の化合物は、被験体に投与するために好適な医薬組成物として処方される。よって、別の側面では、本発明は、治療上有効な量の、少なくとも１種類の本発明の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を少なくとも１種類の薬学上許容可能な担体とともに含んでなる医薬組成物、以下「本発明医薬組成物の」に関する。前記医薬組成物は、被験体への投与および／または適用に有用である。
【００８０】
本明細書で用いる場合、用語「被験体」は哺乳類種のメンバーを意味し、限定されるものではないが、飼育動物、霊長類およびヒトが含まれ、前記被験体は好ましくは、年齢または人種にかかわらず男性または女性である。
【００８１】
本発明に関して「治療上有効な量」は、所望の効果（この特定の場合では、ｐ３８  ＭＡＰＫ関連疾患の治療および／または予防である）を達成するのに必要な本発明の化合物の量と理解される。本発明の医薬組成物中に存在し得る本発明の化合物の量は、広範囲で変更可能である。投与すべき治療上有効な量は一般に、他の因子の中でも、治療を受ける被験体、その被験体の年齢、その被験体の病態、前記被験体が罹患している疾患の重篤度、選択される投与形、投与経路および頻度などによって異なる。このため、投与する用量は状況に応じて当業者により調整される。
【００８２】
本明細書で用いる場合、用語「薬学上許容可能な担体」は、それが州政府もしくは連邦政府の規制当局に承認されていなければならない、または米国薬局方もしくは動物、特にヒトにおける使用に関する別の一般に認知されている薬局方に挙げられていなければならない担体を意味する。用語「担体」は、それとともに本発明の化合物を投与しなければならない希釈剤、補助アジュバント、賦形剤またはビヒクルを意味し、前記担体は本発明の前記化合物と明らかに適合しなければならない。好適な医薬担体は“Remington's Pharmaceutical Sciences” by E.W. Martin, 1995.に記載されている。
【００８３】
医薬組成物の例としては、経口、局所または非経口投与用の任意の固体組成物（錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤など）または液体組成物（溶液、懸濁液またはエマルション）が挙げられる。
【００８４】
本組成物が指示される病態の治療のため、本発明の医薬組成物中に含まれる有効成分（本発明の化合物）は、ヒトまたは動物の身体において本発明の前記化合物をその作用部位に接触させるいずれの手段によって投与してもよい。よって、本発明の医薬組成物は、任意の好適な投与経路、例えば、経口経路、非経口経路（例えば、皮下経路、筋肉内経路、腹腔内経路、くも膜下腔内経路、静脈内経路など）、直腸経路、局所的経路などを介して投与することができ、このために、所望の投与形を処方するのに必要な薬学上許容可能な担体が含められる。経口医薬投与形の例示的な限定されない例としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、溶液、懸濁液などが挙げられ、これらは結合剤、希釈剤、崩壊剤、滑沢剤、湿潤剤などの好適な従来の担体を含むことができ、当業者に公知の従来の方法によって調製することができる。本発明の医薬組成物はまた、好適な投与形において、例えば、無菌溶液、懸濁液または凍結乾燥品の形態で非経口投与に適合させることもでき、この場合、本発明の前記医薬組成物は、バッファー、界面活性剤などの好適な薬学上許容可能な担体を含み、当業者に公知の従来の方法によって調製することができる。本発明の医薬組成物の他の投与形としては、エアゾール、点眼剤、軟膏などが挙げられ、そのための好適な薬学上許容可能な担体が使用される。いずれにせよ、薬学上許容可能な担体は、選択された医薬投与形に応じて選択される。薬物の種々の医薬投与形、およびそれを得るために必要な薬学上許容可能な担体、ならびにその製造方法に関する総説は、例えば、“Tratado de Farmacia Galenica”, C. Fauli i Trillo, 1993, Luzan 5, S.A. Ediciones, Madrid; and in Remington’s Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 第20版, Williams & Wilkins PA, USA (2000)に見出すことができる。
【００８５】
本発明の医薬組成物は、式（Ｉ）の２種類以上の化合物またはその塩もしくは溶媒和物の組合せを含有することができる。
【００８６】
本発明の医薬組成物は、少なくとも１種類の本発明の化合物を、場合により本発明の前記化合物以外の少なくとも別の薬物とともに含有することができる。特定の実施態様によれば、少なくとも別の薬物は抗炎症または鎮痛化合物である。実質的にいずれの抗炎症または鎮痛化合物も本発明の化合物と併用可能である。前記抗炎症および鎮痛化合物の例示的な限定されない例は上記で定義されている。
【実施例】
【００８７】
本発明による式（Ｉ）の化合物は、以下に実施例で詳細に述べる製造戦略で製造することができる。使用するすべての試薬は市販されている。
【００８８】
化合物５および６は市販されている。
【００８９】
実施例１：（５−クロロ−２−メチル−フェニル）−（７−ニトロ−ベンゾ［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）−アミン（化合物１）の合成
不活性雰囲気（Ｎ２）中、溶媒としての酢酸エチル（２５ｍＬ）中、４−クロロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾフラザン（ＮＢＤ−Ｃｌ；４０７ｍｇ、２ｍｍｏｌ）および５−クロロ−２−メチルアニリン（５７８ｍｇ、４ｍｍｏｌ）の混合物を、還流下で加熱しながら（浴温＝１２０℃）２４時間、磁気撹拌した。この時間が経過したところで、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１５ｍＬ）を加えた後、得られた混合物を抽出漏斗に注ぎ、抽出溶媒としてエチルエーテル（３×１５ｍＬ）を用いて液液抽出法を行った。有機相をブライン（４５ｍＬ）で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、それをデカントし、真空濃縮して赤みがかった粗抽出物を得、これを固定相としてシリカゲルおよび溶出剤としてジクロロメタンを用いるクロマトグラフィーにより精製し、１０３ｍｇの化合物（クロロメチルアニリンが混入）を得、これを溶媒としてメタノール−水（１：１）を用いる結晶化により再び精製し、３１ｍｇの赤色固体を得た。
【００９０】
実施例２：４−クロロ−２−（７−ニトロ−ベンゾ［１，２，５］オキサジアゾール−４−イルアミノ）−フェノール（化合物２）の合成
化合物２は、５−クロロ−２−メチルアニリンの代わりに２−アミノ−４−クロロフェノールを用いること以外は、実施例１に記載されているものと同様の方法に従って得た。
【００９１】
実施例３：（２，５−ジフルオロ−フェニル）−（７−ニトロ−ベンゾ［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）−アミン（化合物３）の合成
化合物３は、５−クロロ−２−メチルアニリンの代わりに２，５−ジフルオロ−アニリンを用い、反応溶媒として酢酸エチルの代わりにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを用いること以外は、実施例１に記載されているものと同様の方法に従って得た。
【００９２】
実施例４：５−クロロ−Ｎ−（７−クロロ−ベンゾ［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）−２−メトキシ−ベンズアミド（化合物４）の合成
この化合物は、以下の３段階からなる方法を用いて得た。
【００９３】
工程１：ＮＢＤ−Ｃｌの還元。酢酸（４ｍＬ）、酢酸エチル（２ｍＬ）および水（０．４ｍＬ）中、ＮＢＤ−Ｃｌ（２００ｍｇ、１ｍｍｏｌ）の溶液を５０℃に加熱した後、金属鉄（２８０ｍｇ、５０．２ｍｍｏｌ）で処理した。得られた混合物を８０℃で３０分間磁気撹拌した後、室温まで放冷した。その後、この混合物をセライトで濾過し、酢酸エチルで溶出した。濾液を飽和重炭酸ナトリウム水溶液で処理し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、デカントし、最後に真空濃縮して橙赤色がかった粗固体を得、これを、固定相としてシリカゲルおよび溶出剤としてジクロロメタンを用いるクロマトグラフィーにより精製し、１１３ｍｇの化合物を得た（収率＝６６％）。
【００９４】
工程２：酸塩化物の取得。不活性雰囲気（Ｎ２）下、ベンゼン（０．８ｍＬ）中、５−クロロ−２−メトキシ安息香酸（１２４ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化チオニル（０．１７０ｍＬ、２．３１ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を不活性雰囲気下、ベンゼン中、還流下で４時間撹拌した。次に、未反応ベンゼンおよび塩化チオニルを蒸発させて無色の油状物を得、これをそのまま次の合成工程に付した。
【００９５】
工程３：アミド化。不活性雰囲気下、テトラヒドロフラン（１ｍＬ）中、工程１で得られたアニリン（１０２ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）の−７８℃に冷却した溶液に、市販のｎ−ブチルリチウム溶液（ヘキサン中１．６モル）（０．４ｍＬ、０．６１ｍｍｏｌ）を滴下したところ、添加後に黒色への変色が見られた。５分後、この溶液に、テトラヒドロフラン（０．５ｍＬ）中、工程２で得られた塩化アシルの溶液を加えた。得られた混合物を−７８℃で３０分間撹拌し、さらに３０分間、室温まで温めた。次に、この反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液（１５ｍＬ）を加え、この溶媒を真空下で蒸発させた。得られた粗物質に溶媒としてジクロロメタン（２×１５ｍＬ）を用いて抽出を行い、有機抽出液を水酸化ナトリウム水溶液（１Ｍ）（３０ｍＬ）で洗浄し、再びブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、デカントし、真空濃縮し、得られた粗物質を固定相としてシリカゲルおよび溶出剤としてヘキサン−酢酸エチル（７：３）の混合物を用いるクロマトグラフィーにより精製し、２０ｍｇの化合物を得た（収率＝１０％）。
【００９６】
実施例５：ｐ３８  ＭＡＰＫによるＭＥＦ−２リン酸化の阻害
このアッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ｐ３８  ＭＡＰＫによるＭＥＦ２−Ａリン酸化に対する本発明の化合物の効果を定量するために行った。
【００９７】
この目的で、簡単に述べれば、活性型の組換えｐ３８（１ｎＭ）およびＭＥＦ２Ａ（１０ｎＭ）をキナーゼバッファー中で５分間、種々の濃度の化合物１とともにインキュベートした。タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、特異的抗体である抗Ｐ−ＭＥＦ２Ａ（Ｔ３１２）を用い、ｐ３８の活性をリン酸化されたＭＥＦ２Ａとして測定した。これらの結果の平均を、２反復で行った２回の独立した実験の、対照（ＤＭＳＯ）に対するパーセンテージとしてグラフで示した。比較のため、化合物５を１０μＭの濃度で用いた。
【００９８】
最後に、これらの各化合物の十分な濃度範囲を用い、この生化学的機能の阻害に関する化合物の有効性の指標として、各アッセイ化合物に関するこの反応のｉｎ  ｖｉｔｒｏ平均阻害濃度（ＩＣ５０）を決定した（データは示されていない）。各場合において得られたＩＣ５０の結果を表１および図１に示す。
【００９９】
【表２】
2014532688.tif 000011
【０１００】
実施例６：ヒト単球におけるＬＰＳに応答したｐ３８  ＭＡＰＫの活性化およびその活性の阻害
このアッセイは、種々の濃度の前記化合物で処理したヒト単球細胞株（ＴＨＰ−１）(American Type Culture Collection: http://www.atcc.org/)におけるｐ３８  ＭＡＰＫの活性化およびその活性に対する化合物１の効果を分析するために行った。
【０１０１】
簡単に述べると、密度約１０６細胞／ｍｌの、前記ＴＨＰ−１細胞株由来ヒト単球細胞を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた種々の濃度（１μＭおよび５μＭ）の化合物１の不在下または存在下、１〜１０ｍｇ／ｍｌの間の濃度（バッチに応じて可変）の細菌ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｌ２６５４）で１時間刺激した。ＤＭＳＯを対照として用いた。これらの細胞を１００ｍＭ  ｐＨ７．５  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー、２００ｍＭ  ＥＤＴＡ、１μＭベンズアミジン、１０ｍｇ／ｍｌ  ＳＴＩ（ダイズトリプシン阻害剤）、１０ｍｇ／ｍｌバシトラシン、８０ｍＵ／ｍｌアプロチニン、１００μＭフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）およびｐｈｏｓＳＴＯＰ（Ｒｏｃｈｅ、Ｒｅｆ．＃０４９０６８４５００１）中に溶解させた。次に、サンプルを、ウエスタンブロットを特異的抗体とともに用いて分析した。簡単に述べると、ｐ３８  ＭＡＰＫの活性化は、活性化ループ（ＴＧＹ）内でリン酸化されたｐ３８  ＭＡＰＫの量を、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔ１８０−Ｙ１８２−ｐ３８抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｒｅｆ．＃９２１１）を用いたウエスタンブロットの手段によって濃度計により定量し、それらの値を各溶解液の全ｐ３８  ＭＡＰＫレベルに関して得られた値で正規化することによって分析した。同様に、ｐ３８  ＭＡＰＫの活性は、前記リン酸化タンパク質を標的とする特異的抗体：抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔ３３４−ＭＫ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｒｅｆ．＃３０４１）および抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ７８−ＨＳＰ２７（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｒｅｆ＃２４０５）を用いたウエスタンブロットの手段により分析された、そのＭＫ２基質およびＨｓｐ２７基質のリン酸化の濃度測定により定量し、それらの値を各溶解液の全ｐ３８  ＭＡＰＫレベルに関して得られた値で正規化した。
【０１０２】
ウエスタンブロット結果を図２Ａに示す。図中、「Ｐ−ｐ３８」は、活性化ループ（ＴＧＹ）内でリン酸化されたｐ３８  ＭＡＰＫであり、「全ｐ３８」は、全ｐ３８  ＭＡＰＫであり、「Ｐ−ＭＫ２」は、リン酸化されたＭＫ２であり、「Ｐ−ＨＳＰ２７」は、リン酸化されたＨｓｐ２７である。
【０１０３】
ウエスタンブロットで得られた結果を化合物の不在下（ＤＭＳＯ、１００％）で分泌されたＴＮＦ−αに対して正規化し、図２Ｂに示す。この図では、化合物１の存在下でのｐ３８  ＭＡＰＫの活性化の低下、従って、ＭＫ２基質およびＨｓｐ２７基質のリン酸化の低下が示される。得られた結果は、化合物１の存在は、ヒト単球細胞においてｐ３８の活性化およびそのシグナルのその基質への伝達の両方を阻害できることを示し、このことは、前記化合物が効果的なｐ３８  ＭＡＰＫ経路阻害剤であることを示唆する。
【０１０４】
実施例７：ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害化合物の存在下でのＬＰＳに応答したＴＮＦ−αの分泌および単球の生存
このアッセイは、ヒト単球（ＴＨＰ−１）における細菌リポ多糖（ＬＰＳ）に応答した腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）分泌に対する、また、前記化合物の存在下での前記ＴＨＰ−１単球の生存に対する、本発明の化合物の効果を分析するために行った。
【０１０５】
簡単に述べると、密度約１０６細胞／ｍｌのヒト単球細胞株ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ）由来細胞を、種々の濃度（０．００１、０．０１、０．１、１、１０および１００μＭ）でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた本発明の化合物の存在下で４時間、１ｍｇ／ｍｌ濃度の細菌ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｆ．＃Ｌ２６５４）で刺激した。ＬＰＳに応答して培地に分泌されたＴＮＦ−αの量を、製造者の説明書に従い、ＥＬＩＳＡアッセイ（ＢｉｏＴｒａｋ、Ｒｅｆ．＃ ＲＰＮ２７５８、ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）の手段によって定量した。細胞生存率は、処理済み細胞をヨウ化プロピジウム（１ｍｇ／ｌ）で染色した後にフローサイトメトリーＦＡＣＳ（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を行い、この染色剤に対する陽性細胞の量を求める（ソフトウエアＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏ）ことにより定量した。得られた結果を表２および図３〜５に示す。
【０１０６】
【表３】
2014532688.tif 000012
【０１０７】
ＩＣ５０：平均阻害濃度［ある生物学的または生化学的機能の５０％阻害を生じる化合物濃度］。ＴＤ５０：平均毒性用量［サンプルの細胞の５０％の死滅を生じる化合物用量］。ｎ＝各規模を決定するために行った独立した実験数。
【０１０８】
得られた結果は、本発明の化合物が、細菌ＬＰＳにより刺激されたヒトＴＨＰ−１単球においてＴＮＦ−α分泌を低減できることを明らかに示す。
【０１０９】
実施例８：ＬＰＳに応答したＴＮＦ−α分泌の比較アッセイ
これらのアッセイは、ヒト単球（ＴＨＰ−１）における細菌リポ多糖（ＬＰＳ）に応答した腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）分泌に対する本発明の化合物（化合物１、２および３）の効果を、構造上関連があるがフェニル環に異なる置換パターンを有する化合物と比較するために行った。実施例７に記載したものと同様の条件を用いた。
【０１１０】
化合物１と対応する位置異性体（化合物７および８）の間の比較アッセイにおいて得られた結果を表３および図６に示す。
【０１１１】
【表４】
2014532688.tif 000013
【０１１２】
化合物３と対応する位置異性体（技術の現状を示す文献ＵＳ２００５／０２８２８１８に記載の化合物９）の間の比較アッセイにおいて得られた結果を表４および図７に示す。
【０１１３】
【表５】
2014532688.tif 000014
【０１１４】
本発明の化合物１および２と構造上関連があるがフェニル環に異なる置換パターンを有する他の化合物（比較化合物１０〜１４）の間の比較アッセイにおいて得られた結果を図８に示す。
【０１１５】
得られた結果は、本発明の化合物、すなわち、フェニル環の少なくとも２位と５位が置換されている化合物の、細菌ＬＰＳにより刺激されたヒトＴＨＰ−１単球においてＴＮＦ−α分泌を低減する能力が、フェニル環に異なる置換パターンを有する化合物、すなわち、フェニル環の２位および５位が置換されていない化合物の能力よりも相当大きいことを明らかに示す。
【０１１６】
実施例９：マウスに誘導された痛覚過敏に対するｐ３８  ＭＡＰＫ阻害化合物の効果
このアッセイは、マウスに誘導された痛覚過敏に対する化合物１および５の効果を分析するために行った。
【０１１７】
実施例９Ａ
このアッセイを行うため、従前に記載されているプロトコールに従った[Willemen HL, et al., Microglial/macrophage GRK2 determines duration of peripheral IL-1beta-induced hyperalgesia: contribution of spinal cord CX3CR1, p38 and IL-1 signaling. Pain. 2010 Sep; 150(3):550-60;およびEijkelkamp N, et al., (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20147541; J. Neurosci. 2010 Feb 10; 30(6):2138-49]。簡単に述べると、８個体の雌ＬｙｓＭ−ＧＲＫ２ｆ／＋マウス（各群マウス２個体、各条件につき足４本）に、足に炎症型痛覚過敏を誘導するために、カラギーナン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、生理食塩水中１％溶液５ｍＬ）の足底内注射を施した。カラギーナン注射から７日後に、０時点（Ｔ＝０）での炎症型疼痛の指標として、足を熱に接触させた際の足の逃避反応潜時を測定した。次に、担体（２０％ＤＭＳＯ）または種々の濃度（５μＬの２０％ＤＭＳＯ中、０．１５、０．５および１．５μｇ）の化合物１をくも膜下腔内に注射した。
【０１１８】
その後、種々の時点（化合物の注射から０．５、１、２、４、６、８、１０、２４、４８および９６時間後）で足の逃避反応潜時を測定した。得られた結果を図９Ａに示す。見て取れるように、用量０．５および１．５μｇでの化合物１の投与は、マウスに誘導された痛覚過敏のほぼ完全な低減をもたらし、これは化合物の投与から９６時間後まで維持された。０．３μｇの用量では持続的鎮痛作用は得られなかったことから、このモデルでの最低効果用量は化合物１  ０．５μｇであると確認された（図９Ｂ）。
【０１１９】
さらに、注射部位（くも膜下腔内）における化合物１の潜在毒性を測定した。図１０に示されるように、くも膜下腔内に注射した化合物１に関して注射部位に神経毒性の徴候は検出されなかった。
【０１２０】
実施例９Ｂ
高用量のカラギーナンの投与は、野生型マウスに痛覚過敏および長期炎症を誘導することが知られている。簡単に述べると、１６個体のＣ５４ＢＬ／６系統の雌野生型マウス（各群マウス４個体、各条件につき足８本）に、足に炎症型痛覚過敏を誘導するために、カラギーナン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、生理食塩水中２％溶液２０μＬ）の足底内注射を施した。カラギーナンの注射から６日後に、０時点（Ｔ＝０）での炎症型疼痛の指標として、足を熱に接触させた際の足の逃避反応潜時を測定した。次に、既知のｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２３９０６３［トランス−４−［４−（４−フルオロフェニル）−５−（２−メトキシ−４−ピリミジニル）−１Ｈ−イミダゾール−１−イル］シクロヘキサノール］（５μＬの２０％ＤＭＳＯ中５μｇ）、担体（２０％ＤＭＳＯ）、または種々の濃度（５μＬの２０％ＤＭＳＯ中、０．５、１．０および１．５μｇ）の化合物１をくも膜下腔内に注射した。得られた結果を図１１Ａに示す。見て取れるように、化合物１の投与は、高用量のカラギーナンによる炎症性疼痛の誘導に応答したＣ５７ＢＬ／６系統の野生型マウスに持続的鎮痛作用をもたらし、０．５μｇの用量で一過性の効果をもたらし、１および１．５μｇの用量で持続的鎮痛作用（少なくとも５日）をもたらした。生理食塩水で処置した対照マウスの熱感受性は化合物１によって影響を受けなかった（図１１Ｂ）。比較として、化合物１３はカラギーナン誘導性の痛覚過敏に対して鎮痛作用を示さなかった（図１１Ｂ）。
【０１２１】
化合物１の潜在的神経毒性を検討するため、前記化合物のくも膜下腔内処置から２日後に脊髄を単離し、切片をＦｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ  Ｂで染色した（図１１Ｃ）。Ｆｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ  Ｂに対する陽性細胞の存在は見られず、脊髄の形態は、１μｇの化合物１のくも膜下腔内注射によっては影響を受けなかったが、このことは、炎症性痛覚過敏に対する化合物１の有益な効果は、脊髄に対する神経毒性作用により媒介されるものではないことを示唆する。
【０１２２】
細胞培養実験は、化合物１がＬＰＳ誘導性のＴＮＦ−α産生を阻害することを示した（図３）。化合物１で処置した後にｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＴＮＦ−αレベルが抑制されるかどうかを明らかにするために、前記化合物による、くも膜下腔内処置から２日後に脊髄を単離し、ＴＮＦ−αレベルをＥＬＩＳＡで分析した。カラギーナンの足底内注射は脊髄のＴＮＦ−αに有意な増加を招き、その後の化合物１による、くも膜下腔内処置はＴＮＦ−αレベルを有意に低下させる（図１１Ｄ）。見て取れるように、化合物１単独ではＴＮＦ−α分泌に影響を及ぼさなかった（図１１Ｄ）。化合物１による処置から６日後に、マウスの足厚は増大し、このことは、化合物１による処置が末梢の炎症活性に直接影響しないことを示唆する（図１１Ｅ）。
【０１２３】
実施例９Ｃ
マウスに誘導された痛覚過敏に対する化合物５の効果を評価するために、実施例９Ａで化合物１に関して記載したものと同様のプロトコールに従った。ただし、このプロトコールで、カラギーナンの注射から７日後に、既知のｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２３９０６３（５μＬの２０％ＤＭＳＯ中５μｇ）、担体（２０％ＤＭＳＯ）、または化合物５（５μＬの２０％ＤＭＳＯ中４μｇ）をくも膜下腔内に注射した。得られた結果を図１２に示す。見て取れるように、化合物５の投与は、マウスに誘導された痛覚過敏に軽減をもたらし、これは化合物５の投与から８日後に検出することができ、ＳＢ２３９０６３により生じた効果よりもかなりの改善である。
【０１２４】
実施例１０：ＷＴおよびＧＲＫ２＋／−マウスの腹腔内マクロファージにおけるＬＰＳ誘導性のＴＮＦ−α分泌に対する化合物１の効果
化合物１による、ＧＲＫ２＋／−マウスの腹腔内マクロファージにおけるＴＮＦ−α分泌の阻害を検討した。図１３において見て取れるように、ＧＲＫ２＋／−マクロファージに対する化合物１の効果の方が大きいことは、炎症病態を有する患者由来の免疫系細胞で見られるように(Vroon A, Kavelaars A, Limmroth V, Lombardi MS, Goebel MU, Van Dam AM, Caron MG, Schedlowski M, Heijnen CJ., J Immunol., 2005, 174(7), 4400-6)、ＧＲＫ２レベルの低い細胞ほどこのような阻害に感受性が高いことを示し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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