(57)【要約】本発明は、ウリ科、特にキュウリのウドンコ病抵抗性提供遺伝子に関する。ここでは、前記抵抗性は、本発明の遺伝子の損傷によって提供される。さらに、本発明は、本発明の損傷した抵抗性付与遺伝子を含む植物、およびその種子、胚、または他の繁殖材料に関する。特に、本発明は、該抵抗性付与遺伝子によってコードされるアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、および配列番号２２、ならびに７０％超の同一性、好ましくは８０％超の同一性、より好ましくは９０％超の同一性、最も好ましくは９５％超の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される、ウドンコ病抵抗性付与遺伝子に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウドンコ病抵抗性付与遺伝子であって、該抵抗性付与遺伝子によってコードされるアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、および配列番号２２、ならびに７０％超の同一性、好ましくは８０％超の同一性、より好ましくは９０％超の同一性、最も好ましくは９５％超の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択され、かつ、該抵抗性付与遺伝子が損傷している、ウドンコ病抵抗性付与遺伝子。
【請求項２】
ウドンコ病抵抗性付与遺伝子であって、該抵抗性付与遺伝子から転写されるｃＤＮＡ配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、および配列番号２１、ならびに７０％超の同一性、好ましくは８０％超の同一性、より好ましくは９０％超の同一性、最も好ましくは９５％超の同一性を有するｃＤＮＡ配列からなる群から選択され、かつ、該抵抗性付与遺伝子が損傷している、ウドンコ病抵抗性付与遺伝子。
【請求項３】
前記損傷が、タンパク質発現産物の非存在をもたらす、前記遺伝子における１つまたは複数の変異である、請求項１または請求項２に記載のウドンコ病抵抗性付与遺伝子。
【請求項４】
前記損傷が、非機能性タンパク質発現産物をもたらす、前記遺伝子における１つまたは複数の変異である、請求項１または請求項２に記載のウドンコ病抵抗性付与遺伝子。
【請求項５】
前記損傷が、遺伝子サイレンシングである、請求項１または請求項２に記載のウドンコ病抵抗性付与遺伝子。
【請求項６】
キュウリから得られるものである、請求項１〜５のいずれかに記載のウドンコ病抵抗性付与遺伝子。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかにおいて定義される損傷したウドンコ病抵抗性付与遺伝子をそのゲノム内に含むキュウリ植物であって、前記損傷がウドンコ病抵抗性をもたらすものである、キュウリ植物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかにおいて定義される損傷したウドンコ病抵抗性付与遺伝子をそのゲノム内に含む、請求項７に記載の植物の種子、植物部分または繁殖材料であって、前記損傷が前記植物におけるウドンコ病抵抗性をもたらすものである、種子、植物部分または繁殖材料。
【請求項９】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、および配列番号２１、ならびに７０％超の同一性、好ましくは８０％超の同一性、より好ましくは９０％超の同一性、最も好ましくは９５％超の同一性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される、単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１０】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、および配列番号２２、ならびに７０％超の同一性、好ましくは８０％超の同一性、より好ましくは９０％超の同一性、最も好ましくは９５％超の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される、単離されたアミノ酸配列。
【請求項１１】
ウドンコ病抵抗性のキュウリ植物を提供するための、請求項１〜６のいずれかにおいて定義されるウドンコ病抵抗性付与遺伝子、請求項９に記載の単離されたヌクレオチド配列、または請求項１０に記載の単離されたアミノ酸配列の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）のウドンコ病抵抗性提供遺伝子に関する。ここでは、前記抵抗性は、発現またはタンパク質段階での本発明遺伝子の損傷(impairment)によって提供される。さらに、本発明は、本発明の抵抗性付与遺伝子を含む植物、およびその種子、胚、または他の繁殖材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウドンコ病（ＰＭ）は、キュウリなどのウリ科に属する植物において知られている、露地と温室との両方における主な菌類病の１つである。
【０００３】
ウドンコ病は一般に、ウドンコカビ目の多くの異なる種の菌類によって引き起こされる。この病気は、葉および茎上の白色の粉様斑点などの特有の徴候を特徴とする。一般に、下部の葉が最も影響を受けるが、ウドンコカビは、植物の、地上に露出したどの部分にも出現し得る。この病気が進行するにつれて、莫大な数の胞子が生じて、斑点は大きく厚くなり、ウドンコカビは、植物の全長の上から下、例えば茎、さらには果実へと広がる。
【０００４】
深刻な影響を受けた葉は、乾燥して砕けやすくなる、あるいは萎びて枯れる可能性がある。感染が原因で、果実は、サイズの縮小、数の減少、貯蔵性が十分である可能性の低さ、日焼け、成熟不十分、および風味不良の可能性がある。この病気はまた、植物を、他の病原体の影響を受けやすくする可能性がある。最終的には、植物は枯死する可能性がある。
【０００５】
ウドンコ病は、数ある中でも特に、菌類Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｌｉｇｉｎｅａ（最近Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ  ｘａｎｔｈｉｉと改名され、Ｏｉｄｉｕｍ  ｅｒｙｓｉｐｈｏｉｄｅｓとも称される）および／またはＥｒｙｓｉｐｈｅ  ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ  ＤＣ（最近Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍと改名され、Ｏｉｄｉｕｍ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉとも称される）によって引き起こされる可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
キュウリなどのキュウリ属植物種の経済的重要性を考慮すると、ウドンコ病抵抗性提供遺伝子を提供する、引き続いての必要性が、当技術分野において存在する。
【０００７】
当技術分野の上述の必要性を考慮すると、本発明の一目的は、特に、この必要性を満たすことである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、いくつかの目的の中でも特に、この目的は、添付の請求項１で定義されるウドンコ病抵抗性付与遺伝子によって達成される。
【０００９】
具体的には、いくつかの目的の中でも特に、本発明のこの目的は、該抵抗性付与遺伝子によってコードされるアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、および配列番号２２、ならびに７０％超の同一性、好ましくは８０％超の同一性、より好ましくは９０％超の同一性、最も好ましくは９５％超の（例えば９６％超、９７％超、９８％超、９９％超の）同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択され、かつ、該抵抗性付与遺伝子が損傷している(impaired)ウドンコ病抵抗性付与遺伝子によって達成される。
【００１０】
いくつかの目的の中でも特に、本発明の目的は、該抵抗性付与遺伝子から転写されるｃＤＮＡ配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、および配列番号２１、ならびに７０％超の同一性、好ましくは８０％超の同一性、より好ましくは９０％超の同一性、最も好ましくは９５％超の（例えば９６％超、９７％超、９８％超、９９％超の）同一性を有するｃＤＮＡ配列からなる群から選択され、かつ、該抵抗性付与遺伝子が損傷しているウドンコ病抵抗性付与遺伝子によって、さらに達成される。
【００１１】
本発明による損傷した抵抗性付与遺伝子は、ウドンコカビ目に属する菌類、例えばＳｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｌｉｇｉｎｅａ（最近Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ  ｘａｎｔｈｉｉと改名され、Ｏｉｄｉｕｍ  ｅｒｙｓｉｐｈｏｉｄｅｓとも称される）および／またはＥｒｙｓｉｐｈｅ  ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ  ＤＣなどの、葉および茎上の白色の粉様斑点によって示される菌類によって引き起こされるウドンコ病に対する、感受性の低下、さらには喪失を提供する遺伝子を示すことが意図される。
【００１２】
本発明による損傷した抵抗性付与遺伝子は、変異遺伝子である。本発明の遺伝子の変異は、様々な機構を介して、損傷をもたらすことができる。例えば、タンパク質をコードするＤＮＡ配列の変異は、変異した、短縮された、または非機能性のタンパク質をもたらすことができる。非コードＤＮＡ配列の変異は、選択的スプライシング、翻訳、またはタンパク質輸送を引き起こすことができる。あるいは、タンパク質への翻訳に利用可能なｍＲＮＡの量を決定する、遺伝子の転写活性の変化をもたらす変異は、低レベルのタンパク質またはタンパク質の非存在をもたらすことができる。さらに、遺伝子機能の損傷は、翻訳後、すなわちタンパク質段階で引き起こすことができる。
【００１３】
本発明による損傷はまた、本明細書で提供する配列番号と比較して、タンパク質段階で変異している遺伝子を含むキュウリ植物におけるウドンコ病抵抗性を観察すること、あるいは、本明細書で提供する配列番号の発現が認められないことによって示される。
【００１４】
損傷はまた、本明細書では、非機能性遺伝子またはタンパク質として示される。本発明の遺伝子の機能は、まだ特定されていないが、非機能性遺伝子またはタンパク質は、植物におけるウドンコ病抵抗性（非機能性）またはウドンコ病感受性（機能性）を確かめることによって容易に決定することができる。ウドンコ病抵抗性（非機能性）植物は、本明細書で提供する配列番号と比較してタンパク質段階で変異している遺伝子を含むこと、あるいは、本明細書で提供する配列番号の発現が認められないことによって示される。
【００１５】
機能性および非機能性の遺伝子またはタンパク質は、相補性実験を使用して決定することもできる。例えば、本発明の遺伝子またはタンパク質のいずれかを用いてウドンコ病抵抗性のキュウリ植物を形質転換することは、遺伝子またはタンパク質が機能性である場合にはウドンコ病感受性のキュウリ植物をもたらすことになるのに対し、遺伝子またはタンパク質が非機能性である場合には、キュウリ植物は、抵抗性のままとなる。
【００１６】
本発明によれば、本発明のウドンコ病抵抗性付与遺伝子は、本発明の遺伝子が損傷した場合に、ウドンコ病抵抗性を提供する。本発明による損傷は、本明細書で配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、または配列番号２２として特定される、機能性または非変異タンパク質の非存在または減少によって示すことができる。当技術分野では、転写段階、翻訳段階、またはタンパク質段階で遺伝子の損傷をもたらす、多くの機構が知られている。
【００１７】
例えば、転写段階での損傷は、プロモーター、エンハンサー、および開始、終止、またはイントロンスプライシング配列などの転写調節配列における１つまたは複数の変異の結果であり得る。これらの配列は一般に、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、または配列番号２１によって表されるコード配列の５’、３’または内部に位置する。損傷はまた、本発明の遺伝子の欠失、再編成、または挿入によって提供することもできる。
【００１８】
翻訳段階での損傷は、未成熟終止コドンまたは他のＲＮＡ→タンパク質制御機構（スプライシングなど）、あるいは、例えばタンパク質フォールディングもしくは細胞内輸送に影響を与える翻訳後修飾によって提供することができる。タンパク質段階での損傷は、タンパク質の短縮、タンパク質のミスフォールド、またはタンパク質−タンパク質相互作用の妨害によって提供することができる。
【００１９】
根本的な機構にかかわらず、本発明による損傷は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、または配列番号２２による機能性タンパク質の減少または非存在によって示される。
【００２０】
好ましい実施形態によれば、本発明による損傷は、タンパク質発現産物の非存在をもたらす、本発明の遺伝子における１つまたは複数の変異によって提供される。示した通り、こうした変異は、転写または翻訳段階での不完全な発現を引き起こす可能性がある。
【００２１】
別の好ましい実施形態によれば、本発明による損傷は、非機能性タンパク質発現産物をもたらす、本発明の遺伝子における１つまたは複数の変異によって引き起こされる。非機能性タンパク質発現産物は、例えば、未成熟終止コドン、誤った翻訳もしくは翻訳後プロセシングによって、または挿入、欠失、もしくはアミノ酸変化によって、もたらすことができる。
【００２２】
本発明の遺伝子の損傷はまた、分子生物学的方法を使用して、例えばｓｉＲＮＡを使用する遺伝子サイレンシングまたは本発明の遺伝子のノックアウトによって実現することもできる。核酸を他のヌクレオチドにランダムに変化させることが可能なＥＭＳまたは他の変異原性化学物質に基づく方法も、本発明の文脈内であると意図される。こうした変異の検出は一般に、高感度融解曲線分析またはヌクレオチド配列決定に基づくＴＩＬＬＩＮＧ手順を含む。
【００２３】
本発明は、ヌクレオチド段階またはアミノ酸段階で、７０％超、好ましくは８０％超、より好ましくは９０％超、最も好ましくは９５％超の配列同一性を有するヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関する。
【００２４】
配列同一性は、本明細書では、本発明の配列の完全長に対して同一の連続的に並んだヌクレオチドまたはアミノ酸の数を、本発明の配列の全長のヌクレオチドまたはアミノ酸の数で割り、１００％を掛けたものと定義される。
【００２５】
例えば、配列番号１に対して８０％の同一性を有する配列は、配列番号１５の１７８２ヌクレオチドの全長に対して１４２６の同一の連続的に並んだヌクレオチドを含む（すなわち、１４２６／１７８２＊１００％＝８０％）。
【００２６】
本発明によれば、本発明の遺伝子は、キュウリから得られる。
【００２７】
別の実施態様によれば、本発明は、そのゲノム内に本発明の損傷したウドンコ病抵抗性付与遺伝子を含む、すなわち、植物が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、および配列番号２２、ならびに７０％超の同一性、好ましくは８０％超の同一性、より好ましくは９０％超の同一性、最も好ましくは９５％超の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される機能性タンパク質を発現しないキュウリ植物に関する。
【００２８】
一般に、好ましくは、本発明の植物は、本発明の損傷した遺伝子についてホモ接合となる、すなわち、該抵抗性付与遺伝子から転写されるｃＤＮＡ配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、および配列番号２１、ならびに７０％超の同一性、好ましくは８０％超の同一性、より好ましくは９０％超の同一性、最も好ましくは９５％超の同一性を有するｃＤＮＡ配列からなる群から選択される、２つの損傷したウドンコ病抵抗性付与遺伝子を含むこととなる。
【００２９】
本発明の植物の利益、すなわち、キュウリ植物におけるウドンコ病抵抗性を提供することを考慮すると、本発明はまた、１つまたは複数の本発明のウドンコ病抵抗性付与遺伝子、すなわち、損傷したウドンコ病抵抗性付与遺伝子（ここでは、前記抵抗性付与遺伝子から転写されるｃＤＮＡ配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、および配列番号２１、ならびに７０％超の同一性、好ましくは８０％超の同一性、より好ましくは９０％超の同一性、最も好ましくは９５％超の同一性を有するｃＤＮＡ配列からなる群から選択される）を含む、種子、植物部分、または繁殖材料を含む本発明のウドンコ病抵抗性のキュウリ植物を提供することが可能な、種子、植物部分、または繁殖材料に関する。
【００３０】
さらに別の実施態様によれば、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、および配列番号２１、ならびに７０％超の同一性、好ましくは８０％超の同一性、より好ましくは９０％超の同一性、最も好ましくは９５％超の同一性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される、単離されたヌクレオチド配列に関する。
【００３１】
さらに別の実施態様によれば、本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、および配列番号２２、ならびに７０％超の同一性、好ましくは８０％超の同一性、より好ましくは９０％超の同一性、最も好ましくは９５％超の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される、単離されたアミノ酸配列に関する。
【００３２】
本発明はまた、ウドンコ病抵抗性のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）を提供するための、１つまたは複数の本発明のウドンコ病抵抗性付与遺伝子、１つまたは複数の本発明の単離されたヌクレオチド配列、または１つまたは複数の本発明の単離されたアミノ酸配列の使用に関する。示した通り、本発明の使用は、発現段階またはタンパク質段階での本発明に記載する遺伝子の損傷に基づくものであり、また、ウドンコ病抵抗性の存在または非存在の決定と任意に組み合わせて、かつ／または、相補性試験と組み合わせて、本発明で提供されるｃＤＮＡおよびアミノ酸配列によって容易に決定することができる。
【００３３】
本発明を、本発明の好ましい実施形態の以下の実施例において、さらに説明することとする。実施例では、以下のような図に関して言及する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】選択したキュウリ生殖質におけるＣｓＫＩＰ２の相対的発現レベルを示す図である。トランスポゾンの非存在下（−）または存在下（＋）での群ごとの発現の平均値を、標準偏差エラーバーを含めて追加している。バーの色は、計算を行うのに使用される参照遺伝子を示す。
【図２】プライマーＩＤ３およびＩＤ４を用いて増幅し、ゲル電気泳動（２％アガロース、１０ｖ／ｃｍ、４０分）によって視覚化した、ＣｓＫＩＰ２のＤＮＡフラグメントを示す図である。
【図３】ＣｓＫＩＰ２ゲノムＤＮＡにおけるトランスポゾン様因子の非存在（上鎖）および存在（下鎖）を有する系統のｃＤＮＡ配列アラインメントを示す図である。ここでは、トランスポゾン様因子が存在する系統から得られたｃＤＮＡにおける７２ｂｐ欠失が認識できる。プライマー結合位置は、ボールドイタリック文字で示す。
【図４】ウドンコ病に感受性のＣｓＫＩＰ９アレルおよびウドンコ病抵抗性のＣｓＫＩＰ９アレルのアミノ酸アラインメントを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
（実施例）
（実施例１：抵抗性／感受性に対するＣｓＫＩＰ２発現レベルおよびアレル変異型の寄与についてのキュウリ生殖質選別）
（導入）
遺伝子の機能化の損傷は、様々な機構によって引き起こすことができる。タンパク質をコードするＤＮＡ配列の変異は、特性の変化を伴う機能喪失型アレルまたは遺伝子の原因であり得る。あるいは、タンパク質への翻訳に利用可能なｍＲＮＡの量を決定する、遺伝子の転写活性の変化は、低レベルの利用可能なタンパク質をもたらすことができる。さらに、遺伝子機能の損傷は、翻訳後に、すなわちタンパク質段階で引き起こすことができる。
【００３６】
本実施例では、ＣｓＫＩＰ２のコード配列における変異（欠失）が、ウドンコ病抵抗性を提供することが示される。
【００３７】
（材料および方法）
ウドンコ病抵抗性レベルが様々である合計１２種のキュウリ生殖質系統を、分析のために選択した。種子を、標準の温室条件下で発芽させた。胚軸を、播種の７日後に局所的ウドンコ病菌単離体で感染させ、続いて、播種の１４日後に最初の本葉を感染させた。播種の２８日後（胚軸の感染の２１日および１４日後）に、反応表現型の評価を実施し、表現型を、１〜９の尺度で記録した。ここでは、１は「十分に感受性」であり、９は「十分に抵抗性」である。
【００３８】
感染させた植物の材料を、標準の手順（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ社、ＲＮＡ  Ｐｌａｎｔ）によるその後のＲＮＡ単離のために収集した。ＲＮＡ単離に続いて、１μｇの全ＲＮＡインプットを用いて、逆転写酵素（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ社）と組み合わせて標準のＯｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを使用して、ｃＤＮＡ合成を行った。
【００３９】
ＣｓＫＩＰ２の発現レベルを、ゲノムＤＮＡから得られる産物サイズとは大きく異なるｃＤＮＡに特有のサイズを伴うエキソン５からエキソン７までのＤＮＡフラグメントを増幅するＣｓＫＩＰ２特異的なＰＣＲプライマー対（表１、ＩＤ１  ＩＤ２）を用いて決定した。さらに、内部基準として機能する対照フラグメントを、３つの異なるハウスキーピング遺伝子、すなわち、伸長因子１−アルファ（ＥＦ−１、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａオルソログＡｔ１ｇ０７９２０．１）、タンパク質ホスファターゼ２ａサブユニットａ２（ＰＤＦ２、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａオルソログＡｔ３ｇ２５８００．１）、およびヘリカーゼドメイン含有タンパク質１（ＨＥＬ１、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａオルソログＡｔ１ｇ５８０５０．１）から増幅した。
【００４０】
ＰＣＲ増幅中のｄｓＤＮＡの特異的リアルタイム検出のために、ＰＣＲ反応混合物に、０．５×濃度で、ＬＣＧｒｅｅｎ（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を添加した。ΔΔＣｔ法を使用して、計算を行った。
【００４１】
ＣｓＫＩＰ２を用いるアレル変異型の検出のために、ｃＤＮＡ内の特定の領域を標的にした。この領域は、トランスポゾン様因子（エキソン１１トランスポゾン）を含むと疑われている。ＣｓＫＩＰ２のエキソン９（部分的）、１０、および１１（部分的）を特異的に増幅するために設計されたプライマー（表１、ＩＤ３  ＩＤ４））を、このフラグメントの検出のために使用した。
【表１】
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【００４２】
（結果）
それに続くＣｓＫＩＰ２の発現研究およびアレル変異(allelic variation)の検出のために、ウドンコ病試験由来の選択した１２種の生殖質系統を作製した。ゲノムＤＮＡ内の、ウドンコ病抵抗性の原因因子であると疑われているトランスポゾン様因子の存在または非存在を行い、その後、発現に対するその効果を調べるために、発現研究を開始した。
【００４３】
選択された植物から得られる葉材料におけるＣｓＫＩＰ２の発現を、対照遺伝子に基づいて決定した。結果は、得られたデータに基づく、発現の一般的影響を示さない。概して、観察される発現レベルは、類似している（図１）。
【００４４】
発現レベルの決定後、トランスポゾン様因子におけるアレル変異を調べた。プライマーＩＤ３およびＩＤ４を用いて増幅されたフラグメントは、１９９ｂｐまたは１２７ｂｐサイズの不定の(variable)フラグメントを生じた（図２）。より小さなフラグメントは、もっぱら抵抗性の植物においてみられ、これは、ゲノムＤＮＡにおけるトランスポゾンの存在と相関していた。
【００４５】
これらのフラグメントの配列は、ゲノムＤＮＡにおけるトランスポゾンの本来の位置を中心とする、エキソン１１における７２ｂｐ欠失を除いて、非常に類似していることが判明した（図３）。
【００４６】
（結論）
抵抗性における遺伝子発現の関与を評価するために、感染させたキュウリ植物由来の葉材料におけるＣｓＫＩＰ２の発現分析を実施した。概して、発現レベルは、抵抗性の植物と感受性の植物において類似していた。
【００４７】
ゲノムＤＮＡ内のＣｓＫＩＰ２遺伝子のエキソン１１中にみられるトランスポゾン様因子の存在は、ＣｓＫＩＰ２の発現レベルと相関しないことも判明した。
【００４８】
ゲノムＤＮＡ内のトランスポゾン様因子の存在は、ウドンコ病に対する植物の抵抗性と関連することが判明した。感受性の植物と比較して、ゲノムＤＮＡ内にトランスポゾン様因子を有する抵抗性の植物は、ｃＤＮＡ内のエキソン１１中の７２ｂｐの欠失を示した。
【００４９】
ＲＮＡの正確なスプライシング（すなわち、イントロンからエキソンを分離すること）を担う機構は、トランスポゾン様因子を、コード配列の一部（すなわち７２ｂｐ）と共に、ＲＮＡからスプライスするようである。ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳後、７２ｂｐ欠失ｍＲＮＡは、２４アミノ酸残基欠失を有するタンパク質をもたらす。２４アミノ酸残基欠失タンパク質産物（すなわち抵抗性の植物由来のＣｓＫＩＰ２）は、その宿主因子としての機能を失っていると考えられる。
【００５０】
（実施例２：抵抗性／感受性に対するＣｓＫＩＰ９アレル変異型の寄与についてのキュウリ生殖質選別）
５種のキュウリ植物のＣｓＫＩＰ９のｃＤＮＡ配列を決定した。下の表２は、試験された植物およびそのウドンコ病抵抗性をまとめて示す。
【表２】
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【００５１】
これらのｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を、図４に示す通りに並べた。ＣｓＫＩＰ９（配列番号２）の２８４位でのアスパラギン（Ｎ）のアスパラギン酸（Ｄ）によるアミノ酸置換（ＬＥＥＮからＬＥＥＤ）は、観察されたウドンコ病抵抗性と相関することが判明した。
【００５２】
（実施例３：非機能性ＣｓＫＩＰ９を有するウドンコ病抵抗性キュウリ植物）
ウドンコ病抵抗性のキュウリ植物のｃＤＮＡ配列ＣｓＫＩＰ９が決定され、エキソン３におけるアミノ酸置換が明らかになった。具体的には、機能性ＣｓＫＩＰ９のエキソン３の最初のアミノ酸（配列番号２の６１〜６３位）のコード配列は、グルタミン酸（Ｅ）-ロイシン（Ｌ）-メチオニン（Ｍ）［ＥＬＭ］である。しかし、特定されたウドンコ病抵抗性キュウリ植物では、この配列は、アラニン（Ａ）-スレオニン（トレオニン）（Ｔ）-イソロイシン（Ｉ）［ＡＴＩ］に変異しており、ＣｓＫＩＰ９におけるこの置換が、観察されたウドンコ病抵抗性と相関することが示唆された。
【００５３】
本明細書で同定された、ウドンコ病抵抗性を提供する遺伝子を、下の表３にまとめて示す。提供されるｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は、その機能型の、すなわち、タンパク質段階で（例えば変異によって）損傷したまたは発現段階で損傷した場合にウドンコ病抵抗性を提供する、ウドンコ病抵抗性遺伝子である。
【表３】
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【００５４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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