(57)【要約】  対象に由来する生物学的試料中で、少なくとも１つのバイオマーカーの発現レベルを決定することによって、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤による治療に適したがんに罹っている対象を選択する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんに罹っている対象の生物学的試料を分析する方法であって、前記対象から採取された前記生物学的試料中のバイオマーカーＧＬＩ−１、ＯＴＸ−２、ＳＨＲＯＯＭ２、ＰＤＬＩＭ３およびＳＰＨＫ１の発現レベルを決定するステップを含み、対照と比較した前記バイオマーカーの発現レベルが、前記対象がメチル−４’−トリフルオロメトキシ−ビフェニル−３−カルボン酸［６−（ｃｉｓ−２，６−ジメチル−モルホリン−４−イル）−ピリジン−３−イル］−アミドまたは２−［（Ｒ）−４−（６−ベンジル−４，５−ジメチル−ピリダジン−３−イル）−２−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−［１，２’］ビピラジニル−５’−イル］−プロパン−２−オールに応答する可能性が高いかどうかの診断上の指標を提供する方法。
【請求項２】
ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤による治療に適したがんに罹っている対象を選択する方法であって、前記対象に由来する生物学的試料中の、ＧＬＩ−１、ＯＴＸ−２、ＳＨＲＯＯＭ２、ＰＤＬＩＭ３、ＳＰＨＫ１、ＳＦＲＰ１、ＡＰＢＡ２およびＳＰＡＴＡ２０からなる群から選択される少なくとも３種のバイオマーカーの発現レベルを決定するステップを含み、それによりヘッジホッグシグナル伝達阻害剤に応答する可能性の高さを予測する方法。
【請求項３】
少なくとも４種のバイオマーカーのレベルを決定するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも５種のバイオマーカーのレベルを決定するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
メチル−４’−トリフルオロメトキシ−ビフェニル−３−カルボン酸［６−（ｃｉｓ−２，６−ジメチル−モルホリン−４−イル）−ピリジン−３−イル］−アミドまたは２−［（Ｒ）−４−（６−ベンジル−４，５−ジメチル−ピリダジン−３−イル）−２−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−［１，２’］ビピラジニル−５’−イル］−プロパン−２−オールによる治療に適したがんに罹っている対象を選択する方法であって、前記対象に由来する生物学的試料中のＳＨＲＯＯＭ２のレベルを決定するステップを含み、それによりメチル−４’−トリフルオロメトキシ−ビフェニル−３−カルボン酸［６−（ｃｉｓ−２，６−ジメチル−モルホリン−４−イル）−ピリジン−３−イル］−アミドまたは２−［（Ｒ）−４−（６−ベンジル−４，５−ジメチル−ピリダジン−３−イル）−２−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−［１，２’］ビピラジニル−５’−イル］−プロパン−２−オールに応答する可能性の高さを予測する方法。
【請求項６】
メチル−４’−トリフルオロメトキシ−ビフェニル−３−カルボン酸［６−（ｃｉｓ−２，６−ジメチル−モルホリン−４−イル）−ピリジン−３−イル］−アミドまたは２−［（Ｒ）−４−（６−ベンジル−４，５−ジメチル−ピリダジン−３−イル）−２−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−［１，２’］ビピラジニル−５’−イル］−プロパン−２−オールによる治療に適したがんに罹っている対象を選択する方法であって、前記対象に由来する生物学的試料中のＳＰＨＫ１のレベルを決定するステップを含み、それによりメチル−４’−トリフルオロメトキシ−ビフェニル−３−カルボン酸［６−（ｃｉｓ−２，６−ジメチル−モルホリン−４−イル）−ピリジン−３−イル]−アミドまたは２−［（Ｒ）−４−（６−ベンジル−４，５−ジメチル−ピリダジン−３−イル）−２−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−［１，２’］ビピラジニル−５’−イル］−プロパン−２−オールに応答する可能性の高さを予測する方法。
【請求項７】
前記ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤がメチル−４’−トリフルオロメトキシ−ビフェニル−３−カルボン酸［６−（ｃｉｓ−２，６−ジメチル−モルホリン−４−イル）−ピリジン−３−イル］−アミドまたは２−［（Ｒ）−４−（６−ベンジル−４，５−ジメチル−ピリダジン−３−イル）−２−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−［１，２’］ビピラジニル−５’−イル］−プロパン−２−オールである、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
決定する発現レベルはｍＲＮＡの発現レベルである、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
試料中の請求項１または２に記載された前記バイオマーカーの発現レベルを決定する複数の薬剤と、使用説明書とを含むキット。
【請求項１０】
がん治療を必要としている患者のがんを治療する方法であって、前記患者のバイオマーカーＧＬＩ−１、ＳＨＲＯＯＭ２、ＰＤＬＩＭ３およびＳＰＨＫ１の発現レベルが増加し、バイオマーカーＯＴＸ−２の発現レベルが低下したことに基づいて、前記患者にヘッジホッグシグナル伝達阻害剤を選択的に投与するステップを含む方法。
【請求項１１】
前記患者からの試料が、前記バイオマーカーの発現についてアッセイされ、前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥ）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記がんが、ＢＣＣ、髄芽腫、横紋筋肉腫、ＣＭＬ、骨肉腫、軟部肉腫、膵臓がん、小細胞肺がん、前立腺がん、ゴーリン症候群または乳がんである、請求項１から８および１０および１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記がんが髄芽腫である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記阻害剤が、メチル−４’−トリフルオロメトキシ−ビフェニル−３−カルボン酸［６−（ｃｉｓ−２，６−ジメチル−モルホリン−４−イル）−ピリジン−３−イル］−アミドである、請求項１から８または１０から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記阻害剤が、２−［（Ｒ）−４−（６−ベンジル−４，５−ジメチル−ピリダジン−３−イル）−２−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−［１，２’］ビピラジニル−５’−イル]−プロパン−２−オールである、請求項１から８または１０から１３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個別化療法の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘッジホッグシグナル伝達は、細胞の増殖、分化、および器官形成などの、様々な生物学的過程を組織特異的かつ投与量依存的に調節することが知られている。通常、ヘッジホッグシグナル伝達は、細胞の増殖、分化、および胚パターン形成中に厳密に制御されている。しかし、経路を恒常的に活性化する変異によって生じる、ヘッジホッグシグナル伝達経路の異常な活性は、例えば、病理学的結果を生じ得る。例として、パッチト（Ｐａｔｃｈｅｄ）の機能欠失型変異が、ゴーリン症候群（皮膚がんおよび脳がんの高いリスクを伴う遺伝性症候群、基底細胞母斑症候群（ＢＣＮＳ）としても知られる）に認められ、また、ＳｍｏおよびＧｌｉの機能獲得型変異は、基底細胞癌および神経膠芽腫に関連付けられている。基底細胞癌（ＢＣＣ）は、皮膚がんの最もよく見られる形であり、毎年、９０，０００を超えるアメリカ人が冒されている。
【０００３】
ヘッジホッグの恒常的活性化により、ＢＣＣ、髄芽腫（最もよく見られる小児期の脳腫瘍）、横紋筋肉腫、膵臓がん、小細胞肺がん、前立腺がん、および乳がんにおける腫瘍形成が促進されることが見出されている。腫瘍形成における役割の他に、ヘッジホッグシグナル伝達は、前立腺がんの転移にも関わっている。ヘッジホッグシグナル伝達は、多くの更なる種類の腫瘍種に関与している可能性があり、そのような関連性が発見され続けられることが期待されている。これは、世界中の多くのがんセンターにおいて、活発な研究がなされている分野である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、特定のバイオマーカーを使用して、ヘッジホッグシグナル伝達経路の阻害剤による治療に応答する可能性が高いがんに罹っている個体を選択することができるという発見に基づいている。具体的には、表１に記載のバイオマーカーの発現レベル、例えば、表１に記載のバイオマーカーのｍＲＮＡ発現、および／または対照と比較した、がんに罹っている個体からの試料中の、表１に記載のバイオマーカーによってコードされるタンパク質産物の量の増加または減少を使用して、その個体がヘッジホッグシグナル伝達経路の阻害剤による治療に応答するかどうかを予測することができることが発見された。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様において、本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤による治療に適したがんに罹っている対象を選択する方法であって、該対象に由来する生物学的試料中の、ＳＨＲＯＯＭ２またはＳＰＨＫ１などの、表１に記載された少なくとも１つのバイオマーカーの発現レベルを決定することにより、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤に応答する可能性の高さを予測することを含む方法を含む。一実施形態において、本発明は、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、または少なくとも８つの表１のバイオマーカーを選択することを含む。本発明の方法では、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤は、シクロパミン（cyclopamine）、ジェルビン（Jervine）、ＧＡＮＴ６１、パルモルファミン（purmorphamine）、ＳＡＧ、ＳＡＮＴ−２、トマチジン、ゼルンボン（zerumbone）、ＧＤＣ−０４４９；ＸＬ１３９、ＩＰＩ９２６、ＩＰＩ６０９（ＩＰＩ２６９６０９）、もしくはＢＭＳ−８３３９２３／ＸＬ１３９、またはそれらの誘導体である。一実施形態において、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤は、メチル−４’−トリフルオロメトキシ−ビフェニル−３−カルボン酸［６−（ｃｉｓ−２，６−ジメチル−モルホリン−４−イル）−ピリジン−３−イル］−アミド（化合物Ｉ）または２−［（Ｒ）−４−（６−ベンジル−４，５−ジメチル−ピリダジン−３−イル）−２−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−［１，２’］ビピラジニル−５’−イル］−プロパン−２−オール、化合物ＩＩである。本発明の方法では、がんは、ＢＣＣ、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨肉腫、軟部肉腫、髄芽腫、横紋筋肉腫、膵臓がん、小細胞肺がん、前立腺がん、ゴーリン症候群、胃食道がん、骨髄増殖性腫瘍、急性白血病、または乳がんであり得る。一実施形態では、生物学的試料は、新鮮凍結試料またはホルマリン固定パラフィン包埋組織試料などの腫瘍試料である。
【０００６】
別の態様において、本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤による治療に適した腫瘍に罹っている対象を選択する方法であって、髄芽腫に罹っている対象に由来する生物学的試料中の、表１に記載された少なくとも１つのバイオマーカーの発現レベルを決定することにより、メチル−４’−トリフルオロメトキシ−ビフェニル−３−カルボン酸［６−（ｃｉｓ−２，６−ジメチル−モルホリン−４−イル）−ピリジン−３−イル］−アミドに応答する可能性の高さを予測することを含む方法を含む。
【０００７】
本発明の方法を用いる発現レベルは、ｍＲＮＡの発現レベルを決定すること、またはタンパク質レベルを決定することを含むことができる。
【０００８】
別の態様において、本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤による治療に適したがんに罹っている対象を選択する方法であって、がんに罹っている対象に由来する生物学的試料中の、表１に記載されたヘッジホッグシグナル伝達バイオマーカーの発現レベルを決定することと、表２に記載された１種または複数の基準／標準化遺伝子のｍＲＮＡのレベルを決定することと、ヘッジホッグシグナル伝達バイオマーカーの発現レベルを基準遺伝子に対して標準化することを含む方法を含む。
【０００９】
別の態様において、本発明は、腫瘍がヘッジホッグシグナル伝達阻害剤による治療に応答を示すかどうか決定するためのキットであって、表１に記載された少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、または少なくとも８つのバイオマーカーの発現レベルを検出するための１種または複数のプローブまたはプライマーを用意することを含むキットを含む。本発明のキットは、表１に記載された１種または複数のバイオマーカーのレベルを決定するための複数の薬剤を含むことができ、さらに、表２に記載された一種または複数のバイオマーカーの発現レベルを決定するための薬剤および使用説明書を任意選択により含む。
【００１０】
一態様において、本発明のキットは、がんに罹っている対象がヘッジホッグシグナル伝達阻害剤による治療が有益であることがどうかを予測するためのキットであり得る。キットは、表１に特定された１種または複数のバイオマーカーのｍＲＮＡ発現レベルを決定するための複数の薬剤と、発現を分析しかつ患者がヘッジホッグシグナル伝達阻害剤による治療が有益であるかどうかを予測するためのスコアを生成する手段とを含む。ｍＲＮＡ発現を決定するための薬剤は、表１に特定される１種または複数のバイオマーカーに相補的なポリヌクレオチドのアレイを含むことができる。ｍＲＮＡ発現を測定するための薬剤は、定量的リアルタイムＰＣＲのための複数のＰＣＲプローブおよび／またはプライマーを含む。
【００１１】
さらに別の態様において、本発明は、表１に記載の少なくとも１つのバイオマーカーに相補的でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドプローブを含むマイクロアレイを含むことができる。
【００１２】
さらに別の態様において、本発明は、複数の単離された核酸配列を含む組成物であって、各単離された核酸配列は、次の遺伝子、ＧＬＩ−１、ＯＴＸ−２、ＳＨＲＯＯＭ２、ＰＤＬＩＭ３、ＳＰＨＫ１、ＳＦＲＰ１、ＡＰＢＡ２、およびＳＰＡＴＡ２０から選択される少なくとも１つのＲＮＡ産物とハイブリダイズし、該組成物は、遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定するために使用される、組成物を含む。
【００１３】
さらに別の態様において、本発明は、ＳＭＯ阻害薬による治療に適した髄芽腫に罹っているか罹っていると疑われる対象を選択するコンピューター製品と、表１に記載された対象に由来する試料中の少なくとも１つの遺伝子の発現レベルに相当するデータを受信する手段と、各遺伝子に対する発現値を生成する手段と、選択に関連付けられた基準発現プロファイルを含むデータベースに発現値を入力することに基づいたスコアを生成する手段であって、スコアは該対象がＳＭＯ阻害剤による治療が有益であるかどうかを予測する手段とを含むことができる。コンピューター製品は、上記の方法のいずれにおいても用いることができる。
【００１４】
「バイオマーカー」は、対象における生物学的状態の指標として役立つ分子である。本発明の主題に関して、本明細書に開示されるバイオマーカーは、発現に変化を示し、対象が、例えばＳＭＯ阻害剤のような、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤による治療を受けることが有益であるかどうかを予測する分子であり得る。
【００１５】
「ヘッジホッグ」は、一般に、ショウジョウバエのヘッジホッグタンパク質の哺乳動物相同体の任意のものを表し、少なくともソニックヘッジホッグ（ＳＨｅｄｇｅｈｏｇ）、デザートヘッジホッグ（ＤＨｅｄｇｅｈｏｇ）、およびインディアンヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）を含む。
【００１６】
本明細書で用いられる「ヘッジホッグシグナル伝達経路」は、ヘッジホッグおよびその受容体によって仲介される（またはその下流にある）、遺伝子発現の変化および他のヘッジホッグ活性に典型的な表現型の変化をもたらすシグナル伝達カスケードのことを表す。シグナル伝達経路の活性化は、ヘッジホッグシグナルの伝達に対して正の影響を与える、すなわち、ヘッジホッグが存在している場合に下流の生物学的事象に刺激を与える、ヘッジホッグシグナル伝達成分によって生じ得る。このような成分の例として、ヘッジホッグ、Ｐｔｃｈ、Ｓｍｏ、およびＧｌｉが挙げられる。ヘッジホッグ陽性（Ｈｈ＋）腫瘍は、恒常的なヘッジホッグ経路活性化をもたらす遺伝子変異を有する腫瘍であり、このヘッジホッグの活性化は腫瘍の形成と成長における主要な要因であるものと思われる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
患者の遺伝的プロファイルが、治療的処置に対する患者の応答性を決定し得ることを示唆する証拠が増えている。がんの治療に利用可能な多くの治療法があることをふまえると、例えば、特定の薬剤への応答に影響を及ぼす遺伝因子の確定は、患者に個別化された治療レジメンを提供するために使用することができる。このような個別化された治療レジメンは、選択的な治療レジメンに伴い得る関連する副作用を最小限にしながら、患者にとっての治療の有益性を最大限にする可能性をもたらす。このようにして、患者が特定の療法に応答する可能性が高いかどうかを予測するために使用することができる因子を特定する必要がある。
【００１８】
ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤を受ける患者の潜在的な臨床的有益性を最大化するためには、活性化されたヘッジホッグシグナル伝達経路を有する腫瘍を有する患者を選択できることが重要である。本明細書に記載された方法は、部分的に、表１に記載された１つまたは複数のバイオマーカーの特定に基づき、この特定は、ＳＭＯ阻害剤のようなヘッジホッグシグナル伝達阻害剤による治療が患者に有益である可能性を決定するために使用され得る。
【００１９】
本発明のバイオマーカーは、日常的な臨床試験に適用することができるように、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織検体での使用のために意図的に最適にされた。
【００２０】
ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤
本発明で用いられるヘッジホッグシグナル伝達阻害剤は、ヘッジホッグシグナル伝達経路を阻害すると知られている薬剤である。このような薬剤は、ＰｔｃｈまたはＳｕｆｕにおける機能欠失型変異、またはＨｅｄｇｅｈｏｇ、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、またはＧｌｉにおける機能獲得型変異などの表現型から生じる異常な成長状態を阻害する薬剤であり得る。ヘッジホッグ阻害剤は、当技術分野で知られており、例えば、小分子化合物、小ペプチド、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等が挙げられる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤は、小分子化合物である。いくつかの実施形態において、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤は、シクロパミンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態において、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤は、ジェルビン、ＧＡＮＴ６１、パルモルファミン、ＳＡＧ、ＳＡＮＴ−２、トマチジン、ゼルンボン、またはそれらの誘導体である。いくつかの実施形態において、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤は、ＧＤＣ−０４４９（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈおよび／またはＣｕｒｉｓから入手可能）、ＸＬ１３９、ＩＰＩ９２６（Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから入手可能）、ＩＰＩ６０９（ＩＰＩ２６９６０９）、ＢＭＳ−８３３９２３／ＸＬ１３９（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂおよび／またはＥｘｅｌｉｘｉｓから入手可能、ＴＡＫ−４４１（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ）またはＰＦ−０４４４９９１３（Ｐｆｉｚｅｒ）である。
【００２２】
更なるヘッジホッグシグナル伝達阻害剤は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３８５６８、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４４１６８、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６１５７３、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６３６９６、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３９０６５に記載され、そのすべてがその全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【００２３】
本明細書に記載されるヘッジホッグシグナル伝達阻害剤は、薬剤そのもの、その薬学的に許容される塩、その薬学的に許容されるエステル、ならびにステロ異性体、鏡像異性体、ラセミ混合物等であり得る。一実施形態において、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤は、Ｎ−［６−（ｃｉｓ−２，６−ジメチルモルホリン−４−イル）ピリジン−３−イル］−２−メチル−４’−（トリフルオロメトキシ）［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキサミドとしても知られている、２−メチル−４’−トリフルオロメトキシ−ビフェニル−３−カルボン酸［６−（ｃｉｓ−２，６−ジメチル−モルホリン−４−イル）−ピリジン−３−イル］−アミドのようなＳＭＯ阻害剤であり、国際特許出願ＷＯ２００７／１３１２０１およびＷＯ２００８／１５４２５９に開示されていて、そのすべてがその全体において参照により本明細書に組み込まれる。別の実施形態において、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤は、２−［（Ｒ）−４−（６−ベンジル−４，５−ジメチル−ピリダジン−３−イル）−２−メチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−［１，２’］ビピラジニル−５’−イル］−プロパン−２−オールであり、ＷＯ２０１０／００７１２０に開示され、そのすべてがその全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【００２４】
ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤は、式Ｉの化合物およびその薬学的に許容される塩を含む。
【００２５】
【化１】
2014516549.tif 000002
［式中、Ｙは、ＮおよびＣＲ１０から選択され、ここでＲ１０は、水素、ハロ、Ｃ１〜６アルキル、ハロ置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、ハロ置換Ｃ１〜６アルコキシおよびＯＸＮＲ１０ａＲ１０ｂから選択され、ここでＲ１０ａおよびＲ１０ｂは、水素およびＣ１〜６アルキルから独立して選択され、
Ｒ１は、シアノ、ハロ、Ｃ１〜６アルキル、ハロ置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、ハロ置換Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ６〜１０アリール、ジメチル−アミノ、Ｃ１〜６アルキル−スルファニル、およびＣ３〜８ヘテロシクロアルキルから選択され、これらは、２個までのＣ１〜６アルキル基で任意選択により置換されており、
Ｒ２およびＲ５は、水素、シアノ、ハロ、Ｃ１〜６アルキル、ハロ置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、ハロ置換Ｃ１〜６アルコキシおよびジメチルアミノから独立して選択され、
Ｒ３およびＲ４は、水素、ハロ、シアノ、Ｃ１〜６アルキル、ハロ置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシおよびハロ置換Ｃ１〜６アルコキシから独立して選択され、あるいは、Ｒ１およびＲ２、または、Ｒ１およびＲ５のいずれかは、両方が結合しているフェニルと一緒になって、Ｃ５〜１０ヘテロアリールを形成し、
Ｒ６およびＲ７は、水素、Ｃ１〜６アルキル、ハロ置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシおよびハロ置換Ｃ１〜６アルコキシから独立して選択され、ただし、Ｒ６およびＲ７は同時に水素ではなく、
Ｒ８は、水素、ハロ、Ｃ１〜６アルキル、ハロ置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシおよびハロ置換Ｃ１〜６アルコキシから選択され、
Ｒ９は、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１１および−Ｒ１１から選択され、ここでＲ１１は、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルから選択され、
ここで、Ｒ９の前記アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキルは、Ｃ１〜６アルキル、ハロ置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、ハロ置換Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ６〜１０アリール−Ｃ０〜４アルキル、Ｃ５〜１０ヘテロアリール−Ｃ０〜４アルキル、Ｃ３〜１２シクロアルキルおよびＣ３〜８ヘテロシクロアルキルから独立して選択される１から３個の基で任意選択により置換されていてもよく、
ここで、Ｒ９の前記アリール−アルキル置換基は、ハロ、Ｃ１〜６アルキル、ハロ置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、ハロ置換Ｃ１〜６アルコキシおよびメチル−ピペラジニルから独立して選択される１から３個の基で任意選択により置換されている。］
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、式Ｉ（ａ）またはその薬学的に許容できる塩のヘッジホッグシグナル伝達阻害剤を含む。
【００２７】
【化２】
2014516549.tif 000003
［式中、Ｒ１１は、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ２〜８アルケニル、Ｃ３〜１４シクロアルキル、Ｃ６〜１４アリール基、５〜１４員ヘテロアリール基、３〜１４員シクロヘテロアルキル基、Ｃ１〜８アルコキシ、ハロ、ＮＲ１３Ｒ１４、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１３Ｒ１４、Ｃ１〜８ハロアルキル、ホルミル、カルバルコキシ、Ｃ１〜８アルキルＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、ＳＯ２Ｒ１３、Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ１〜８アルキルＲ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＳＯ２ＮＲ１３Ｒ１４、ＯＣＦ３、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１３、ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１３Ｒ１４、ＣＨ２ＮＲ１３Ｒ１４、ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ１３、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＲ１３Ｒ１４、ＣＨ２ＮＨＳＯ２Ｒ１３、ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ１３、ＯＣ（Ｏ）Ｒ１３、またはＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１３であり、これらは置換していても置換していなくてもよい。
Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ６〜１４アリール基、Ｃ１〜８ハロアルキル、Ｃ１〜８アルコキシ、ハロ、ＮＨ２、ＣＮ、ＯＣＦ３、ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１３Ｒ１４、Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、ＮＲ１３Ｒ１４、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１３、ＳＯ２Ｒ１３、ＳＯ２ＮＲ１３Ｒ１４である。
Ｒ１３およびＲ１４は、独立してＨ、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ２〜８アルケニル、Ｃ３〜１４シクロアルキル、Ｃ６〜１４アリール基、５〜１４員ヘテロアリール基、３〜１４員シクロヘテロアルキル基、Ｃ１〜８ハロアルキル、Ｃ１〜８アルキルＯＨ、Ｃ１〜８アルコキシ、または１つの原子上にヘテロ原子含有環が形成され得るＲ１３およびＲ１４であり、
ここで、Ｒ１１、Ｒ１３、およびＲ１４は、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ３〜１４シクロアルキル、Ｃ６〜１４アリール基、５〜１４員ヘテロアリール基、３〜１４員シクロヘテロアルキル基、Ｃ１〜８アルキルＯＨ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１〜８ハロアルキル、カルボクスＣ１〜８アルキルまたはＳＯ２Ｃ１〜８アルキル、ハロ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＦ３、ＯＨ、−ＮＨ２のうち１つまたは複数によって置換されなくても置換されてもよい。］
【００２８】
バイオマーカー
本発明のバイオマーカーは、１種または複数の表１に記載された遺伝子またはそれらの遺伝子産物を含む。表１に同定された１種または複数のバイオマーカーの発現レベルを分析することで、ヘッジホッグ経路が活性化されているがんに罹っていて、したがって例えばＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（ＳＭＯ）アンタゴニストのような、ヘッジホッグシグナル伝達経路の阻害剤による治療に応答する可能性が高い個体を選択することができる。
【００２９】
本発明のバイオマーカーには、ＧＬＩ−１、ＯＴＸ−２、ＳＨＲＯＯＭ２、ＰＤＬＩＭ３、ＳＰＨＫ１、ＳＦＲＰＩ、ＡＰＢＡ２およびＳＰＡＴＡ２０が挙げられる。ＧＬＩ−１、ＳＨＲＯＯＭ２、ＰＤＬＩＭ３、ＳＰＨＫ１、ＳＦＲＰＩ、およびＡＰＢＡ２はアップレギュレート（ｍＲＮＡ発現の増加）されるが、ＯＴＸ−２およびＳＰＡＴＡ２０はダウンレギュレート（ｍＲＮＡ発現の減少）されている。一例では、発現プロファイルは、次の遺伝子ＧＬＩ−１、ＯＴＸ−２、ＳＨＲＯＯＭ２、ＰＤＬＩＭ３、ＳＰＨＫ１、ＳＦＲＰ１、ＡＰＢＡ２、およびＳＰＡＴＡ２０のうちの１種または複数のｍＲＮＡレベルを表す値のセットであり得る。別の例では、発現プロファイルは、次の遺伝子ＧＬＩ−１、ＯＴＸ−２、ＳＨＲＯＯＭ２、ＰＤＬＩＭ３、およびＳＰＨＫ１のうちの１種または複数のｍＲＮＡレベルを表す値のセットであり得る。さらに別の例では、発現プロファイルは、ＧＬＩ−１、ＯＴＸ−２、ＳＨＲＯＯＭ２、ＰＤＬＩＭ３、ＳＰＨＫ１、ＳＦＲＰ１、ＡＰＢＡ２、およびＳＰＡＴＡ２０によってコードされる１種または複数のタンパク質またはポリペプチドを表す値のセットを含み得る。「ｍＲＮＡ発現」という句は、対照試料と比較した、がんに罹っている個体からの試料中のｍＲＮＡ発現の量の増加または減少を意味し得る。通常は、ｍＲＮＡ発現の増加または減少は、対照（例えば、対照から決定された通常のレベル）と比較して１．５倍以上（２、３、４、または５倍のような）の発現の違いを意味する。
【００３０】
試料の調製
増殖性の疾病に罹っている個体から採取された細胞の任意の適切な試験試料を用いることができる。一般に、細胞の試験試料または組織試料は、がんに罹っている対象から生検または外科的な切除によって得られる。細胞、組織、または体液の試料は、針吸引生検によって取り出すことができる。このために、注射器に取り付けられた細い針が皮膚を通して目的の組織中に挿入される。針は、通常、超音波またはコンピューター断層撮影（ＣＴ）造影を用いて、目的の部位に導かれる。いったん針が、組織中に挿入されると、細胞または体液が針を通って吸い込まれ注射器に集められるようにして、真空空間が注射器によって作り出される。細胞または組織の試料は、切開性生検またはコア生検によっても取り出され得る。このために、錐体状、円柱状、または小さな一片の組織が、目的の部位から取り出される。ＣＴ造影、超音波、または内視鏡が、このタイプの生検を導くために一般的に用いられる。より特別には、癌性の病変全体を摘出生検または外科的な切除によって取り出すことができる。本発明では、試験試料は、通常、外科的な切除の一部として取り出された細胞の試料である。
【００３１】
例えば組織の試験試料を、後の使用のために、例えばＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ；Ａｕｓｔｉｎ  Ｔｅｘ．）に保存することもでき、または急速冷凍し−８０℃で保存することができる。生検組織試料を、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、または酢酸／エタノールなどの固定液で固定することもできる。固定組織試料は、ワックス（パラフィン）またはプラスチック樹脂中に包埋することもできる。包埋組織試料（または冷凍組織試料）は薄い切片に切断することができる。ＲＮＡまたはタンパク質を、固定またはワックスに包埋された組織試料、または冷凍組織試料から抽出することもできる。いったん細胞の試料または組織の試料が、がんに罹っている対象から取り出されると、試料は、当技術分野で周知であり以下に記載される技法を用いて、ＲＮＡまたはタンパク質の単離のために処理され得る。
【００３２】
がんに罹っている患者から採取された生検からのＲＮＡの抽出の例として、例えば、その後にＣｓＣｌ遠心分離法が引き続いて行われるチオシアン酸グアニジウム溶解（Chirgwin, et al., Biochemistry 18:5294-5299, 1979）が挙げられる。単細胞からのＲＮＡは、単細胞からのｃＤＮＡライブラリーを調製するための方法（例えば、Dulac, Curr. Top. Dev. Biol. 36:245, 1998；Jena, et al., J. Immunol. Methods 190:199, 1996を参照）に記載されているように得ることができる。一実施形態において、ＲＮＡの集団は、表１および表２に詳細に述べられるように、目的の配列に濃縮させても良い。濃縮は、例えば、無作為の六量体およびプライマー特異的ｃＤＮＡ合成によって、またはｃＤＮＡ合成に基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏの転写で鋳型指示される直線的増幅を複数回繰り返すことによって、達成され得る（例えば、Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9717, 1989；Dulac, et al.上記参照；Jena, et al.上記参照）。ＲＮＡを試料から単離する他の方法は当技術分野で知られており、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、チオシアン酸グアニジニウム−フェノール−クロロホルム抽出、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｍｉｃｒｏ−ｔｏ−Ｍｉｄｉ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）ＲＮＡ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＰｏｌｙＡＴｔｒａｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  １０００（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＳＶ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴｏＴＡＬＬＹ  ＲＮＡ（商標）Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）、Ｐｏｉｙ（Ａ）Ｐｕｒｉｓｔ（商標）Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）および任意の他の方法が挙げられる。ＲＮＡ試料を抽出しかつ分析する方法は、Molecular Cloning、A Laboratory Manual (Sambrook and Russell (cd.), 3rd edition (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USAに開示されている。
【００３３】
ヘッジホッグ発現プロファイルは、新鮮組織、冷凍組織、ホルマリンで処理された組織（ＦＦＰＥ）または他の固定液で処理された組織などの、対象から採取された生体に対して実施できる。特に、試料がＦＦＰＥ試料の場合、ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ＦＦＰＥ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＦＦＰＥ切片から抽出され、無作為の六量体およびＡＢＩ’ｓ  Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡアーカイブキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いてｃＤＮＡに逆転写される。
【００３４】
腫瘍またはがんに罹っている対象は、一般的には、霊長類のような哺乳動物の対象である。例示的な実施形態では、対象はヒトである。本明細書に用いられる場合、患者および対象という用語は同義語である。
【００３５】
任意のがんまたは腫瘍は、本発明の方法に従ってスクリーニングすることができ、その例としては、それだけに限らないが、結腸がん、肺がん、膵臓がん、胃がん（gastric cancer）、前立腺がん、肝細胞癌、基底細胞癌、乳がん（breast cancer）、骨肉腫、軟部肉腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、血液がん、髄芽腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、膵臓がん、乳癌（breast carcinoma）、髄膜腫、神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、黒色腫、胃がん（stomach cancer）、食道がん、胆道がん、前立腺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、膠細胞がん、多発性骨髄腫、結腸がん、神経外胚葉性腫瘍、神経内分泌腫瘍、肥満細胞腫、ゴーリン症候群、膠腫、大腸がん、ＧＩＳＴ（消化管間質腫瘍）、胃食道がん、骨髄増殖性腫瘍および急性白血病が挙げられる。
【００３６】
バイオマーカーの発現の検出
一例において、方法は、遺伝子ＧＬＩ−１、ＯＴＸ−２、ＳＨＲＯＯＭ２、ＰＤＬＩＭ３、ＳＰＨＫ１、ＳＦＲＰ１、ＡＰＢＡ２およびＳＰＡＴＡ２０のうちの１種または複数の発現を決定することを含む。目的の遺伝子配列は、遺伝子、例えば、遺伝子から転写されたＲＮＡまたは遺伝子によってコードされるポリペプチドを特異的に検出するために使用することができる薬剤を用いて検出することが可能である。
【００３７】
一実施形態において、方法は、例えば、少なくとも１０、１５、２５または４０のヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、ＧＬＩ−１、ＯＴＸ−２、ＳＨＲＯＯＭ２、ＰＤＬＩＭ３、ＳＰＨＫ１、ＳＦＲＰ１、ＡＰＢＡ２およびＳＰＡＴＡ２０の核酸配列のコード配列の一部に相補的なコード配列のすべてに至るまたはほぼすべてであるヌクレオチド配列を含む核酸プローブを用意することと；癌細胞を有する哺乳動物からの組織試料を得ることと；該核酸プローブを、厳密な条件下で髄芽腫に罹っている患者から採取された生検から得たＲＮＡに接触させることと（例えばノーザンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ、ＰＣＲなど）；ＲＮＡとハイブリダイゼーションを行ったプローブの量を決定することとを含む。核酸は、ＲＮＡの濃縮および／または増幅中もしくはその後で標識されてもよい。
【００３８】
バイオマーカーＧＬＩ−１、ＯＴＸ−２、ＳＨＲＯＯＭ２、ＰＤＬＩＭ３、ＳＰＨＫ１、ＳＦＲＰ１、ＡＰＢＡ２およびＳＰＡＴＡ２０は、対立遺伝子変異体および他のファミリーメンバーを含む天然の配列も含むことを意図している。本発明のバイオマーカーは、コードの縮重から生じる記載された配列に相補的な配列も含み、また本発明の遺伝子と十分に相同な配列および厳密な条件下で本発明の遺伝子とハイブリダイズする配列をも含む。
【００３９】
ハイブリダイゼーションの条件は、当業者に知られており、Molecular Biology, John Wiley and Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6の現在のプロトコールに見出すことができる。高度に厳密なハイブリダイゼーションの条件の好ましい非限定的な例は、約摂氏４５℃で６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中においてハイブダイズし、続いて摂氏５０〜６５℃で、０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回または数回洗浄することである。「十分な相同性」で、第１および第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列が共通の構造ドメインもしくはモチーフおよび／または共通の機能活性を共有するように、第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列に対して十分なまたは最低限の数の同一のまたは同等のアミノ酸残基（例えば、類似した側鎖を有するアミノ酸残基）またはヌクレオチドを含む、バイオマーカーのアミノ酸またはヌクレオチド配列を意味する。例えば、共通の構造ドメインを有し、ドメインのアミノ酸配列中を通じて、少なくとも約５０％の相同性、少なくとも約６０％の相同性、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、および少なくとも約９０〜９５％の相同性を有するものは、本明細書で、十分に相同性があると定義される。さらに、少なくとも約５０％の相同性、少なくとも約６０〜７０％の相同性、少なくとも約７０〜８０％、少なくとも約８０〜９０％、および少なくとも約９０〜９５％の相同性を有し、かつ共通の機能活性を有するアミノ酸、またはヌクレオチド配列は、本明細書で、十分に相同性があると定義される。
【００４０】
配列の比較および２つの配列間のパーセント相同性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて実現され得る。配列の比較のために使用される数学的アルゴリズムの、好ましい非限定的な例は、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68であって、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77のように修正されたものである。このようなアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチドの探索は、ＮＢＬＡＳＴプログラムでスコア＝１００、語長＝１２として行われ、本発明のＴＲＬ核酸分子に相同のヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質の探索は、ＸＢＬＡＳＴプログラムでスコア＝５０、語長＝３として行われ、表１、２および／または表３に記載された遺伝子／オリゴヌクレオチドによってコードされたタンパク質配列に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的のためにギャップアライメントを得るために、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Research 25(17):3389-3402に記載されるように、ギャップＢＬＡＳＴを使用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照のこと。配列の比較のために用いられる数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Myers and Miller, CABIOS (1989)のＡＬＩＧＮアルゴリズムである。アミノ酸配列を比較するためＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合、ＰＡＭＩ２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを用いることができる。
【００４１】
本発明は、ヘッジホッグ経路の活性化に帰因するがんに罹っている対象から採取された腫瘍生検中の、ＧＬＩ−１、ＯＴＸ−２、ＳＨＲＯＯＭ２、ＰＤＬＩＭ３、ＳＰＨＫ１、ＳＦＲＰ１、ＡＰＢＡ２およびＳＰＡＴＡ２０の１つまたは数種の遺伝子の発現を測定することを含む。発現レベルは分析され、ヘッジホッグ経路活性化を示す腫瘍に罹っている患者に対してそうではない患者を識別するために用いることができるスコアを生成するために用いられ得る。
【００４２】
一実施形態において、本発明の方法は、表１に記載されたＧＬＩ−１、ＯＴＸ−２、ＳＨＲＯＯＭ２、ＰＤＬＩＭ３、ＳＰＨＫ１、ＳＦＲＰ１、ＡＰＢＡ２およびＳＰＡＴＡ２０のいずれか１つを測定することを含む。別の実施形態において、本発明の方法は、表１に記載された少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、または少なくとも８つの遺伝子を測定することを含む。
【００４３】
一例では、表１からの１つの遺伝子、例えばＧＬＩ−１の発現レベルが測定される。別の例では、表１からの２つの遺伝子、例えばＧＬＩ−１およびＯＴＸ−２の発現レベルが測定される。さらに別の例では、表１からの３つの遺伝子ＧＬＩ−１、ＯＴＸ−２、およびＳＨＲＯＯＭ２の発現レベルが測定される。さらに別の例では、表１からの４つの遺伝子ＧＬＩ−１、ＯＴＸ−２、ＳＨＲＯＯＭ２またはＰＤＬＩＭ３の発現レベルが測定される。さらに別の例では、表１からの５つの遺伝子ＧＬＩ−１、ＯＴＸ−２、ＳＨＲＯＯＭ２、ＰＤＬＩＭ３およびＳＰＨＫ１の発現レベルが測定される。
【００４４】
【表１】
2014516549.tif 000004
【００４５】
本発明のバイオマーカーは、その発現レベルまたは遺伝子産物が予測バイオマーカーとして役立つ表１に特定された遺伝子の任意の組み合わせもまた含む。本発明のバイオマーカーは、それらの遺伝子配列も含めて、（上に記載されたように）当技術分野で知られており、すなわち、例えばＧＬＩ−１（ＧＬＩファミリージンクフィンガー１（GLI family zinc finger 1）；Nature 332:371-374(1988)）、ＯＴＸ−２（オルトデンティクルホメオボックス２（Orthodenticle homeobox 2）；EBO J. 12:2735-2747(1993)）、ＳＨＲＯＯＭ２（Ｓｈｒｏｏｍファミリーメンバー２（Shroom family member 2）；Hum. Mol. Genet. 4:373-382(1995)）、ＰＤＬＩＭ３（ＰＤＺおよびＬＩＭドメイン３（PDZ and LIM domain 3）；J. Cell Biol. 139:507-515(1997)）、ＳＰＨＫ１（スフィンゴシンキナーゼ１（sphingosine kinase 1）；Gene 251:19-26(2000)）、ＳＦＲＰ１（分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質１（secreted frizzled-related protein 1）；Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:6770-6775(1997)）、ＡＰＢＡ２（アミロイドベータ（Ａ４）先駆体タンパク質結合、ファミリーＡ（amyloid beta (A4) precursor protein-binding, family A）；J. Biol. Chem. 272:31459-31464(1997)）、ＳＰＡＴＡ２０（精子形成関連２０（spermatogenesis associated 20）；Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99(26), 16899-16903 (2002)）についてである。
【００４６】
本発明の方法で、１種または複数の表１に記載されているような遺伝子の発現レベルが測定され、分析され、対照に比較される。比較のための対照は、当業者によって決定し得る。一例では、対照は、カットオフ値としての役割を果たす値を選ぶことによって決定される。例えば、値は、ヘッジホッグ活性化を有する（ヘッジホッグ＋）試験試料とヘッジホッグ活性化を示さない（ヘッジホッグ−）試料とを識別する値であり得る。別の例では、本発明のバイオマーカーの遺伝子発現プロファイルは、対照と比較される（健康な人またはヘッジホッグで活性化された腫瘍から採取された試料中でバイオマーカーの発現が有ること）。
【００４７】
本発明の特定の実施形態では、対照は予め定められ、ヘッジホッグ経路活性化によって生じる腫瘍を有する対象を選択するために用いることができるスコアが生成される。発現閾値は、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤に応答するはずである個体を選択するために用いることができる。
【００４８】
別の例では、対照は、１種または複数の（下に記載されるような）比較的一定の遺伝子発現レベルを示す遺伝子である標準化遺伝子を含むことができる。標準化遺伝子は、アッセイされたＲＮＡの量の違いと用いられたＲＮＡの品質の可変性の双方を訂正する（標準化する）。したがって、アッセイは、通常、表２に示される標準化遺伝子などの特定の標準化遺伝子の発現を測定しかつ取り込む。
【００４９】
【表２】
2014516549.tif 000005
【００５０】
本発明の方法の一つでは、表１の遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、または８個の遺伝子）の発現が測定され、通常、表２に記載された１つの対照遺伝子の発現レベルまたは４、３もしくは２個の対照遺伝子の平均によって標準化された後に、発現値に変換される。これらの発現値は、スコアを生成するために用いられ、次にスコアは、どの対象がヘッジホッグ活性化された腫瘍を有し、したがってヘッジホッグシグナル伝達阻害剤による治療が有益である可能性が高いかを選択するために、カットオフと比較される。一例では、ＧＬＩ−１、ＯＴＸ−２、ＳＨＲＯＯＭ２、ＰＤＬＩＭ３およびＳＰＨＫ１のうち最終的に２、３、４または５つの遺伝子すべてのｍＲＮＡレベルが測定され、ｍＲＮＡ値が、表２に記載された１つの対照遺伝子の発現レベルまたは４、３もしくは２個の対照遺伝子の平均によって標準化された後に、発現値に変換される。本発明の標準化遺伝子、ＵＢＡ  ｓｎｄ  ＷＷＥ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １（ＨＵＷＥＩ）、Ｌａ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ１（ＬＡＲＰ１）、Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  １，ｓｏｌｕｂｌｅ（ＳＯＤＩ）、および本発明のＹＭＥＩ−ｌｉｋｅ１（ＹＭＥ１Ｌ１）は、それらの遺伝子配列も含めて当技術分野で知られており、例えば、ＮＣＢＩによって提供された遺伝子配列受託番号が上に記載されている。
【００５１】
本発明のバイオマーカーは、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）などの当技術分野で知られている任意の方法を用いて測定することができる。方法は、当技術分野で知られていて上に記載されている任意の技術、例えば、Ｑｉａｇｅｎのような商業的製造者による精製キット、緩衝剤セット、およびタンパク質分解酵素を用いて、ｍＲＮＡを単離することを含む。逆転写ステップは、通常、状況および発現プロファイリングの目的に応じて、特異的プライマー、無作為の六量体、またはオリゴｄＴプライマーを用いて、プライムされ、誘導されたｃＤＮＡは、それから、次のＰＣＲ反応における鋳型として用いることができる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲを、次に、例えば商業的に入手可能な機器を用いて、実施することができる。
【００５２】
単離されたｍＲＮＡは、マイクロアレイ解析、定量的（「リアルタイム」）ＰＣＲ、ノーザンブロット法、ヌクレアーゼプロテクションアッセイなどの当技術分野で知られている任意の方法を用いてさらに分析することができる。一例では、二重に標識された蛍光発光プローブによって（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いて）ＰＣＲ産物蓄積を測定するリアルタイム定量ＰＣＲが用いられる。リアルタイムＰＣＲは、各標的配列に対する内部競合剤が標準化のために用いられる定量的競合ＰＣＲと、試料中に含まれた標準化遺伝子、またはＲＴ−ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を用いる定量的比較ＰＣＲとの双方に適合性がある。更なる詳細については、Held et al, Genome Research 6:986-994 (1996)を参照のこと。リアルタイムＰＣＲアッセイでは、陽性反応は、蛍光シグナルの蓄積によって、検出される。Ｃｔ（サイクル閾値）は、蛍光シグナルが閾値を超える（すなわちバックグラウンド量を超える）のに必要なサイクル数として定義される。Ｃｔレベルは、試料中の標的核酸の量に反比例する（すなわち、Ｃｔレベルが低いほど、試料中の標的核酸の量は大きくなる）。大部分のリアルタイムアッセイは、４０サイクルの増幅を経る。
【００５３】
他の例では、遺伝子ＧＬＩ−１、ＯＴＸ−２、ＳＨＲＯＯＭ２、ＰＤＬＩＭ３、ＳＰＨＫ１、ＳＦＲＰ１、ＡＰＢＡ２およびＳＰＡＴＡ２０のうち１種または複数に対応する１種または複数のプローブを含むマイクロアレイが用いられる。マイクロアレイの使用により、標識された標的核酸のハイブリダイゼーションパターンがアレイの表面に生成される。検出の特定の方法は、標的核酸の特定の標識に基づいて選択され、結果として生じる標識された核酸のハイブリダイゼーションパターンを、様々なやり方で視覚化し検出することができる。代表的な検出手段として、シンチレーション測定、オートラジオグラフィー、蛍光測定、熱量測定、発光測定、光錯乱等が挙げられる。
【００５４】
別の例では、遺伝子ＧＬＩ−１、ＯＴＸ−２、ＳＨＲＯＯＭ２、ＰＤＬＩＭ３、ＳＰＨＫ１、ＳＦＲＰ１、ＡＰＢＡ２およびＳＰＡＴＡ２０のうち１種または複数に対応する１種または複数のプローブを含むことができるＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ａｒｒａｙ（ＴＬＤＡ）カードを用いることができる。この方法は、同時リアルタイムＰＣＲ反応を行うマイクロ流体カードを用いる。
【００５５】
一例では、検出の方法は、商業的に入手可能なアレイスキャナー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆ．）、例えばｔｈｅ４１７．ＴＭ．Ａｒｒａｙｅｒ、ｔｈｅ  ４１８．ＴＭ．Ａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒまたはｔｈｅ  Ａｇｉｌｅｎｔ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙ．ＴＭ．Ｓｃａｎｎｅｒなどを用いる。このスキャナーは、インターフェースと使いやすいソフトウェアツールを備えたシステムコンピュータから制御される。出力は、様々なソフトウェアアプリケーション中に直接インポートされるかまたは様々なソフトウェアアプリケーションによって直接読まれてよい。スキャニング装置は、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号および米国特許第５，４２４，１８６号に記載されている。
【００５６】
バイオマーカー遺伝子産物の発現検出
ＧＬＩ−１、ＯＴＸ−２、ＳＨＲＯＯＭ２、ＰＤＬＩＭ３、ＳＰＨＫ１、ＳＦＲＰ１、ＡＰＢＡ２およびＳＰＡＴＡ２０のうち１種または複数によってコードされるタンパク質産物の存在の検出は、当技術分野で知られている任意の適切な方法を用いてなされることができる。例えば、抗体を用いて、目的の特定のタンパク質を検出するために使用することができる目的の薬剤が例としてある。本発明で有用なポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体を生成する方法が当業者に知られており、また例えば、Dymecki, et al., (J. Biol. Chem. 267:4815, 1992)；Boersma and Van Leeuwen, (J. Neurosci. Methods 51:317, 1994)；Green, et al., (Cell 28:477, 1982)；およびArnheiter, et al., (Nature 294:278, 1981)に見出すことができる。一実施形態では、免疫測定法が細胞試料中のタンパク質のレベルを定量化するために使用され得る。本発明は、特定のアッセイ（測定法）の手順に限られるものではなく、したがって、均一な手順と不均一な手順と双方を含むことが意図されている。
【００５７】
本発明に従って実施し得る代表的な免疫測定法には、蛍光偏光免疫測定法（ＦＰＩＡ）５蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ネフェロ阻害免疫測定法（nephelometric inhibition immunoassay）（ＮＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、および放射免疫測定法（ＲＩＡ）が挙げられる。インジケーター部分または標識群は、対象の抗体に結合させることができ、測定装置および適合する免疫測定法の手順の利用可能性によってしばしば決定される方法の様々な使用の必要性に合致するように選択される。上に記した様々な免疫測定法を実施するにあたって用いられる一般的な技術は、当業者に知られている。
【００５８】
あるいは、ウエスタンブロット解析法など他の方法を用いることができ、ウエスタンブロット解析法はポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を電気泳動的に分離することを含み、分離されたタンパク質を染色した後に、それぞれのタンパク質の相対量は、その光学濃度を評価することによって、定量化され得る。あるいは、ドットブロットアッセイ、ＦＡＣＳ、または免疫組織化学的検査など他の方法を用いることができる。
【００５９】
通常、本発明のバイオマーカーに対して生成された抗体は、例えば、発蛍光団、酵素、ビオチン、化学発光分子、生物発光分子、ジゴキシゲニン、アビジン、ストレプトアビジン、または放射性同位元素などのレポーター分子を用いて標識できる目的のタンパク質の存在を視覚化するために用いることができる。
【００６０】
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明のマーカーポリペプチドに対して生成された抗体のパネルを用いることを意図している。
【００６１】
データ分析
試料の分析操作を容易にするために、デバイスの読取り装置によって得られたデータはデジタルコンピューターを用いて分析することができる。通常は、デバイスからのデータの受信と保存のため、ならびに、例えば、バックグラウンドの減算、対照が適切に働いたのを確認すること、シグナルの正規化、ハイブリダイズされた標的の量を決定するための蛍光データの解釈、バックグラウンドの正規化などの、集められたデータの分析および報告のために、コンピューターは適切にプログラムされる。
【００６２】
キット
本発明は、本明細書に記載されているバイオマーカーの発現レベルを決定するためのキットをさらに提供する。キットは、誰がヘッジホッグシグナル伝達阻害剤による治療が有益であるかを決定するために有用であり得る。キットは、試験試料の遺伝子発現を測定するために用いることができる表１に特定された遺伝子のプローブを含み得る。一実施形態では、コンピューターシステムのメモリにロードされることが可能な発現プロファイル分析ソフトウェアを含み、測定された発現値をリスクスコアに変換することができるコンピューター読取り可能媒体を、キットは含む。キットは、核酸対照、緩衝剤、および使用説明書をさらに含むことができる。
【００６３】
投与
本明細書に記載されたヘッジホッグシグナル伝達阻害剤は、本明細書に記載されているような活性化されたヘッジホッグシグナル伝達経路を有すると判断された個体に基づいて単独かまたは１種または複数の治療剤と組み合わせて、当技術分野で知られている通常の許容できる様式のうちのいずれかによって、治療有効量を、選択的に投与し得る。治療有効量は、疾病の重さ、対象の年齢と相対的な健康、用いられる化合物の効力および他の要因に応じて大幅に異なり得る。
【００６４】
当業者は、本明細書に記載されているものに類似しているかまたは同等であって、本発明の実施に用いることができる多くの方法および材料を認めるであろう。実際、本発明は、記載されている方法または材料に限定されるものでは全くない。本発明のために、次の項が以下に定義される。
【実施例１】
【００６５】
多重遺伝子ヘッジホッグシグネチャーは最初、４０のＦＦＰＥ髄芽腫（ＭＢ）検体を分析することにより開発された。同一症例由来の適合する新鮮凍結検体はＹ−Ｊ  Ｃｈｏおよび同僚たち（Y-J Cho et al、JCO、2010）により記載された通りに前もってプロファイリングされ、それぞれ個々の症例は、その遺伝子発現プロファイルに基づいてヘッジホッグ活性化されているまたは非ヘッジホッグ活性化のいずれかであることが判定された。ヘッジホッグ陽性（Ｈｈ＋）対ヘッジホッグ陰性（Ｈｈ−）腫瘍において差次的に発現される３２の候補遺伝子のパネルおよび別の２２の潜在的正規化遺伝子が、入手可能なプロファイリング研究の複合データセットから選択された。差次的Ｈｈ＋対Ｈｈ−発現を示したすべての候補遺伝子は評価されたすべてのプロファイリング研究で一致していた。これらの候補遺伝子のＲＴ−ＰＣＲアッセイが開発され、ＦＦＰＥ検体において使用するために最適化された。ＦＦＰＥ検体型でロバスト発現を示さなかった候補遺伝子は、さらに使用することから除外された。ヘッジホッグ＋対ヘッジホッグ−腫瘍において１０のアップレギュレートされたおよび８つのダウンレギュレートされた遺伝子プラス５つの対照遺伝子についてＦＦＰＥにおけるロバスト性能を有するアッセイがさらに選択され、単回アッセイフォーマットと比べてより経済的組織消費を与えるＴＬＤＡカード上に集められた。次に、２３の候補遺伝子のこのパネルは、既知のヘッジホッグ活性化状態にある４０のＦＦＰＥ検体において解析された。
【００６６】
ヘッジホッグ活性化状態の予測において最小エラーを有し、最小数の遺伝子を伴う最適モデルが、エラスティクネット（Ｅｌａｓｔｉｃ  Ｎｅｔ）法を使用して選択された（J.Friedman, T.Hastie, and R.Tibshirani, J. of Statistical Software, 2008）。２つの最適モデル、１つは５遺伝子シグネチャーを有し、もう１つは８遺伝子シグネチャーを有する、は５倍交差検定において類似する性能を示した。これらのモデルにより、それぞれ５または８遺伝子のいずれかの発現レベルに基づいて所与の試料についてヘッジホッグ＋である可能性スコアの計算が可能になる。カットオフは、試験試料についてのヘッジホッグ＋対ヘッジホッグ−状態を判定する可能性スコアに基づいて確立された。
【００６７】
さらに、単一遺伝子（ＳＰＨＫ１、ＯＴＸ２、ＳＦＲＰ１、ＰＤＬＩＭ３またはＳＨＲＯＯＭ２）を使用してヘッジホッグ活性化状態を予測することが調査され、ヘッジホッグ＋対ヘッジホッグ−の選択をするためのこれらの遺伝子ごとのカットオフは、このセットの４０の髄芽腫腫瘍を使用して確立された。
【００６８】
５−と８−遺伝子モデルの両方ならびに単一遺伝子モデルは、２５の髄芽腫腫瘍の独立した試料セットにおいてさらに外部的に検証された。２５件の患者すべてが、１３件は古典的組織診断、９件は結節性／線維形成性組織診断、２件は大細胞型／未分化組織診断を含めて、病理学的に確かめられた診断を受けた。２５件の患者のうち、１３件が男性、１２件が女性であった。２４患者由来の組織検体は診断時に収集され、１患者は化学療法処置後に収集された。診断時のこれら２５患者の年齢中央値は３歳で６ヶ月から１６年の幅があった。これらの２５髄芽腫症例由来のＦＦＰＥ検体は、５−遺伝子および８−遺伝子モデルによりヘッジホッグ活性化状態を決定する本発明の方法によって解析された。ＦＦＰＥ試料と同じ時点で収集された同じ２５患者由来の適合する新鮮凍結腫瘍組織検体は、ＧｅｎｅＣｈｉｐヒトゲノムＵ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して遺伝子発現プロファイリングに供された。２５患者は、Ｙ−Ｊ  Ｃｈｏおよび彼の同僚たち（YJ Cho et al. JCO, 2010）により記載された髄芽腫の遺伝子プロファイルベースの分子細分類に基づいてサブグループｃ３（ヘッジホッグ活性化サブクラス）または非サブグループｃ３腫瘍に分類された。
【００６９】
２５患者中８件がサブグループｃ３、ヘッジホッグ活性化腫瘍を有しており、１７件が非ヘッジホッグ活性化腫瘍を有していると判定された。２５件の髄芽腫患者のこの分子分類は、本発明の方法によるＦＦＰＥ腫瘍検体の解析に先立って実施された。したがって、本発明の方法により解析されたＦＦＰＥ検体は、既知のヘッジホッグ活性化状態を有していると見なされた。８つの遺伝子（ＧＬＩ−１、ＯＴＸ−２、ＳＨＲＯＯＭ２、ＰＤＬＩＭ３、ＳＰＨＫ１、ＳＦＲＰ１、ＡＰＢＡ２およびＳＰＡＴＡ２０）の発現レベルに基づいて、予測モデルを使用して、所与の試料についてヘッジホッグ＋である可能性スコア（０〜１００％）を計算した。前もって特定された可能性カットオフに基づいて、それぞれの検体は、ヘッジホッグ活性化されているまたは非ヘッジホッグ活性化のいずれかであることが判定された。８検体はヘッジホッグ活性化されたとされ、残りの１７検体は非ヘッジホッグ活性化とされて、これらの試料の既知のヘッジホッグ活性化状態と１００％の一致を示した。さらに、１７非ヘッジホッグ活性化腫瘍についての中央可能性スコアは０．９％であり、０．２％〜３．１％の範囲であった。８ヘッジホッグ活性化腫瘍についての中央可能性スコアは８７．０％であり、７０．９％〜９６．６％の範囲であった。陰性と陽性症例間の中央可能性スコアのかなりの差は、８遺伝子モデルによるヘッジホッグ＋対ヘッジホッグ−判定のロバスト性を示唆していた。
【００７０】
５遺伝子（ＧＬＩ−１、ＯＴＸ−２、ＳＨＲＯＯＭ２、ＰＤＬＩＭ３、ＳＰＨＫ１）の発現レベルおよび関連予測モデルに基づいて、２５検体ごとに可能性スコアが計算され、前もって特定されたカットオフと比較された。次に、腫瘍ごとにヘッジホッグ活性化状態が判定され、再び既知のヘッジホッグ活性化状態と１００％一致していた。１７の非ヘッジホッグ活性化腫瘍についての中間可能性スコアは０．７％で、０．１％〜３．０％の範囲であり、８つのヘッジホッグ活性化腫瘍では８７．９％で、６９．１％〜９７．６％の範囲であり、ヘッジホッグ状態判定の５−遺伝子モデルと類似するロバスト性を実証している。
【００７１】
単一遺伝子、ＳＰＨＫ１、ＯＴＸ２、ＳＦＲＰ１、ＰＤＬＩＭ３またはＳＨＲＯＯＭ２の発現レベルに基づいて、２５の髄芽腫症例に対してヘッジホッグ＋またはヘッジホッグ−の選択が遺伝子ごとに前もって特定された閾値に基づいて行われた。２５の腫瘍ごとにＳＰＨＫ１、ＯＴＸ２またはＳＦＲＰ１により行われたヘッジホッグ選択は、既知のヘッジホッグ活性化状態と完全に一致し、ヘッジホッグ＋選択８件およびヘッジホッグ−選択１７件であった。ＰＤＬＩＭ３に基づいて、２４／２５の正しい選択が行われた。１つのヘッジホッグ＋腫瘍が誤ってヘッジホッグ−にされ、予測の感度は８７．５％であり特異度は１００％であった。ＳＨＲＯＯＭ２に基づいて行われた予測により、２２／２５の正確な選択では感度７５％、特異度９４％であることが示された。２件のヘッジホッグ＋腫瘍が誤ってヘッジホッグ−にされ、１件のヘッジホッグ−腫瘍がヘッジホッグ＋にされた。したがって、関連する遺伝子の複合測定に頼る多重遺伝子モデルに加えて、多重遺伝子ヘッジホッグシグネチャー内の単一遺伝子は、髄芽腫についてのヘッジホッグ活性化状態を判定するのに単独で顕著な予測力を示した。本研究は、本発明の方法におけるこれらの遺伝子のそれぞれを使用して、髄芽腫のヘッジホッグ活性化状態を判定することができることを確証している。
【００７２】
対照遺伝子ＨＵＷＥ１、ＬＡＰＲ１、ＳＯＤ１およびＹＭＥ１Ｌ１は、ヘッジホッグ活性化状態に基づいて髄芽腫（ＭＢ）腫瘍を分類する遺伝子の発現を正規化するために選択された。理想的には、対照遺伝子は調査中のすべての腫瘍組織において安定的におよび類似するレベルで発現されるのがよい。いくつかの研究によれば、βアクチンおよびＧＡＰＤＨなどの広く使用されている対照遺伝子でもある種の状況下では不適であることが示されている。さらに、新鮮凍結ＭＢ腫瘍検体の入手可能な外部プロファイリング研究からの複合データセットでは、これらの広く使用されている対照遺伝子は、発現レベルが約ｌｇ２＞８のヘッジホッグ経路遺伝子と比べてｌｇ２＞１１よりも大きな非常に高い発現レベルを示した。このようにして、ヘッジホッグ経路遺伝子に類似する発現レベルを有する対照遺伝子が選択された。発現レベルがｌｇ２＜８のプローブセットいずれも本研究ではＲＴ−ＰＣＲ解析により首尾よく検出されなかった。
【００７３】
対照の選択のための重要な基準は、解析されたすべてのデータセットにわたる遺伝子の不変性に主に基づいている。分散のパーセント係数は、４パーセント未満に設定された。正規化遺伝子は、＜８０ｂｐアンプリコンサイズを用いたアッセイを設計することが可能かどうか、次にロバスト発現を最適化されたアッセイを用いてＦＦＰＥ試料において実証することができるかどうかに基づいてさらに選択された。
【００７４】
表３に示されている例となるプローブが利用可能である。
【００７５】
【表３】
2014516549.tif 000006
【００７６】
ＳＦＲＰ１に対する例となるプローブには、フォワードプライマー５’−ＣＣＡＡＴＧＣＣＡＣＣＧＡＡＧＣＣ−３’（配列番号１）およびリバースプライマー５−ＴＣＡＣＡＧＧＧＡＧＧＡＣＡＣＡＣＣＧ−３’（配列番号２）およびＦＡＭが含まれる。ＳＰＡＴＡ２０に対する例となるプローブには、フォワードプライマー５’−ＣＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＡＣＡ−３’（配列番号３）およびリバースプライマー５’−ＣＡＣＣＡＧＴＧＧＣＡＧＧＴＧＧＡＧＴＡ−３’（配列番号４）およびＦＡＭが含まれる。
【実施例２】
【００７７】
髄芽腫を有する患者を含む成人がん患者は、進行中の第Ｉ相、メチル−４’−トリフルオロメトキシ−ビフェニル−３−カルボン酸［６−（ｃｉｓ−２，６−ジメチル−モルホリン−４−イル）−ピリジン−３−イル］−アミドの安全性および耐容性を評価し、成人患者に対するメチル−４’−トリフルオロメトキシ−ビフェニル−３−カルボン酸［６−（ｃｉｓ−２，６−ジメチル−モルホリン−４−イル）−ピリジン−３−イル］−アミドの最大投与可能量を評価するためのメチル−４’−トリフルオロメトキシ−ビフェニル−３−カルボン酸［６−（ｃｉｓ−２，６−ジメチル−モルホリン−４−イル）−ピリジン−３−イル］−アミドの用量漸増試験に登録された。試験開始に先立って収集された保存記録ＦＦＰＥ腫瘍検体は、この試験における３件の登録髄芽腫患者からの本発明の方法による解析に利用可能である。２００ｍｇのメチル−４’−トリフルオロメトキシ−ビフェニル−３−カルボン酸［６−（ｃｉｓ−２，６−ジメチル−モルホリン−４−イル）−ピリジン−３−イル］−アミドの一日量を用いて処置された１件の患者は２か月の処置後ＲＥＣＩＳＴ基準による部分応答（ＰＲ）を達成し、前記応答は疾病進行までの４か月間維持された。測定可能な病変のない他の転移性髄芽腫患者は１５００ｍｇの一日量を用いて処置され、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）により測定された代謝部分応答を示し、この応答は疾病再発までの７か月間持続した。第三の患者は、一日量２００ｍｇでのメチル−４’−トリフルオロメトキシ−ビフェニル−３−カルボン酸［６−（ｃｉｓ−２，６−ジメチル−モルホリン−４−イル）−ピリジン−３−イル］−アミド処置のわずか５２日後急激に進行した。
【００７８】
８−遺伝子および５−遺伝子予測モデルに基づいて、本発明の方法を使用してこれら３件の患者について腫瘍のヘッジホッグ活性化状態を判定した。２件の応答者はヘッジホッグ活性化腫瘍を有すると判定され、非応答者由来の腫瘍は非ヘッジホッグ活性化と呼ばれた。さらに、単一遺伝子、ＳＰＨＫ１、ＯＴＸ２、ＳＦＲＰ１、ＰＤＬＩＭ３またはＳＨＲＯＯＭ２それぞれが使用されて、遺伝子ごとの前もって決められたカットオフに基づいてヘッジホッグ活性化状態を判定した。単一遺伝子のそれぞれにより、２件の応答者と１件の非応答者に対してそれぞれ同じヘッジホッグ活性化と非ヘッジホッグ活性化選択が行われた。３件の患者のうち、１件の患者だけが、ＰＴＣＨ１およびＳＭＯ遺伝子の追加の変異解析に利用可能な十分な腫瘍組織試料があった。代謝部分応答を達成し本発明の方法によりヘッジホッグ＋と呼ばれたこの患者は、ＰＴＣＨ１遺伝子に体細胞変異を有することが分かった。不活化するＰＴＣＨ１変異は、髄芽腫においてヘッジホッグ経路を構成的に活性化する主要機序として同定されていた。したがって、このＰＴＣＨ１変異を同定すれば、この患者におけるヘッジホッグ経路活性化およびヘッジホッグシグナル伝達阻害剤に対する観察された臨床活性の機序的基礎が提供され、本発明の方法による知見がさらに確認される。
【実施例３】
【００７９】
本発明の方法を使用して、診断が病理学的に確認されている４０の髄芽腫の別のパネルについてヘッジホッグ活性化状態を検証した。４０症例のうち、２６件が古典的髄芽腫組織診断、１２件が結節性／線維形成性組織診断、１件は大細胞型／未分化組織診断を受けた。これらの症例に関連する他の人口統計データは入手できなかった。これらの腫瘍のヘッジホッグ活性化状態は、Ｙ−Ｊ  Ｃｈｏおよび彼の同僚たち（YJ Cho et al. JCO, 2010）により記載されたアフィメトリック遺伝子発現プロファイリング法により予め特徴付けられていた。１５症例におけるヘッジホッグ活性化選択および残りの２５症例における非ヘッジホッグ活性化選択は、８−遺伝子モデル、５−遺伝子モデルおよび単一遺伝子、ＳＰＨＫ１、ＯＴＸ２、ＳＦＲＰ１、ＰＤＬＩＭ３またはＳＨＲＯＯＭ２のそれぞれに基づいて本発明の方法によりＦＦＰＥ腫瘍検体において検証された。
【実施例４】
【００８０】
ヘッジホッグ活性化髄芽腫に加えて、基底細胞癌（ＢＣＣ）は、ヘッジホッグ経路の構成的活性化をもたらすヘッジホッグ経路遺伝子の変異または遺伝子病変により大部分が推進される別のがん型である。最も蔓延している皮膚がんであるＢＣＣに罹っている患者のうち９０％以上が、ＰＴＣＨ１遺伝子に不活化する変異を有するまたはそれほど頻繁ではないが、ＳＭＯの活性化変異などの他のヘッジホッグ経路遺伝子の遺伝子病変のいずれかを有することが分かった。進行中の第Ｉ相、メチル−４’−トリフルオロメトキシ−ビフェニル−３−カルボン酸［６−（ｃｉｓ−２，６−ジメチル−モルホリン−４−イル）−ピリジン−３−イル］−アミド、すなわちＳＭＯにアンタゴニスト作用を及ぼすヘッジホッグシグナル伝達阻害剤の用量漸増試験において、成人ＢＣＣ患者が他の固形腫瘍を有する患者の間に登録された。登録されたＢＣＣ患者から診断時に収集された記録保存腫瘍検体に、直接的塩基配列決定によるＰＴＣＨ１およびＳＭＯの変異解析が実施された。生殖系列ＰＴＣＨ１変異が同定された２件のゴーリン症候群患者を含む、６件のＢＣＣ患者が、ＰＴＣＨまたはＳＭＯのいずれかに変異を有することが分かった。本発明の方法を使用して、これらの患者由来のＢＣＣ腫瘍のヘッジホッグ活性化状態を判定した。５−遺伝子と８−遺伝子モデルの両方を用いて、６件の症例すべての可能性スコアは前もって特定されたカットオフよりも上であり、したがって全員がヘッジホッグ活性化されたと呼ばれた。これらの６件の患者のうち、２件はメチル−４’−トリフルオロメトキシ−ビフェニル−３−カルボン酸［６−（ｃｉｓ−２，６−ジメチル−モルホリン−４−イル）−ピリジン−３−イル］−アミド処置により確認された部分応答を達成し、２件は６ヶ月を超える間疾病は安定しており、その他の２件はどんな臨床活動であれ観察するには短すぎる可能性のある２か月未満の療法後の有害事象のせいでメチル−４’−トリフルオロメトキシ−ビフェニル−３−カルボン酸［６−（ｃｉｓ−２，６−ジメチル−モルホリン−４−イル）−ピリジン−３−イル］−アミドを中断した。陽性変異において示された一貫性から、本発明の方法によりＰＴＣＨ１／ＳＭＯおよびヘッジホッグ＋が選択されたが、別のがん型で本発明の方法をさらに検証する。本発明の方法は、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤療法から優先的に利益を得る可能性のある同じ下線付きヘッジホッグ変異推進された病因を有する他の腫瘍型を同定するために使用することができる。
【実施例５】
【００８１】
タンパク質レベルでのＧＬＩ−１およびＳＦＲＰ−１発現の免疫組織化学（ＩＨＣ）解析は、PA Northcott et al., JCO, 2010）に記載されていた。これらの２つのタンパク質マーカー由来の陽性ＩＨＣ染色の存在は、Ｈｈ＋髄芽腫を同定する手段として使用することができることが示唆されていた。ＧＬＩ−１およびＳＦＲＰ−１は両方とも本発明の方法に記載されている個別の遺伝子である。ＧＬＩ−１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）およびＳＦＲＰ−１（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）のタンパク質産物に対する抗体を使用して、Ｈｈ活性化状態が本発明の方法により判定されている４０の髄芽腫ＦＦＰＥ組織検体がＩＨＣ解析にかけられた。スライド上の腫瘍内容物内のＧｌｉ−１の核染色またはＳＦＲＰ−１の細胞質染色のいずれかのいかなるレベルを有する検体でもＨｈ陽性と呼ばれた。適切な細胞位置における両マーカー由来の染色がない検体はＨｈ陰性と呼ばれた。ＩＨＣ法によりおよび本発明の方法により判定されるＨｈ活性化状態は、試験されたすべての症例で一致しており、前記２つの方法間で１００％一致していた。さらに、Ｇｌｉ−１とＳＦＲＰ−１  ＩＨＣ染色間の高度な一致が観察された。このデータにより、本発明の方法がさらに確証されただけでなく、本発明の方法に記載される個々のマーカーが転写レベルだけではなくタンパク質レベルでも発現できることも確かめられた。
【配列表】
2014516549000001.app
【国際調査報告】
2014516549.tif 000007
2014516549.tif 000008
2014516549.tif 000009