(57)【要約】  本願発明は、患者の生体試料中のＡβオリゴマーを確実にかつ感度よく検出することができる選択的Ａβオリゴマーイムノアッセイに関する。１つの実施形態において、本発明のアッセイは、抗Ａβオリゴマー抗体のペア、１９．３と８２Ｅ１を使用して脳脊髄液（ＣＳＦ）試料中のＡβオリゴマーを検出および定量する。本発明のアッセイを用いて、アルツハイマー病（ＡＤ）患者と非ＡＤ患者とを区別することができ、および／またはＡＤ患者を彼らの疾患の重症度に従って層別化することができる。治療効力および／またはターゲット・エンゲージメントの評定のための代用エンドポイントとして結合Ａβオリゴマーを測定することができるターゲット・エンゲージメント・アッセイとして、本発明のアッセイを用いることもできる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から得た生体試料中の対象となるニューロン由来タンパク質（ＮＤＰＯＩ）のレベルを判定するための方法であって、
（ａ）ＮＤＰＯＩを有する生体試料を哺乳動物から得る段階；
（ｂ）前記生体試料と捕捉抗体／常磁性マイクロ粒子ビーズ（抗体／ＭＰビーズ）とを、ＮＤＰＯＩ／捕捉抗体／ＭＰビーズ複合体を形成するために十分な条件下で接触させる段階；
（ｃ）段階（ｂ）の前記ＮＤＰＯＩ／捕捉抗体／ＭＰビーズ複合体と蛍光標識検出抗体とを、ＰＯＩ／捕捉抗体／ＭＰビーズ／検出抗体複合体を形成するために十分な条件下で接触させる段階；および
（ｄ）段階（ｃ）の前記複合体から生成される蛍光シグナルを検出する段階（この場合、段階（ｄ）の前記蛍光シグナルがＮＤＰＯＩの量を表す）
を含む方法。
【請求項２】
前記ＮＤＰＯＩがＡβオリゴマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記捕捉抗体が、１９．３、７３０５、８２Ｅ１およびＷ０２から成る群より選択される抗Ａβオリゴマー抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記検出抗体が、８２Ｅ１、７３０５および６Ｅ１０から成る群より選択される抗Ａβオリゴマー抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記捕捉抗体が１９．３であり、および前記検出抗体が８２Ｅ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
患者から得た生体試料中の対象となるニューロン由来タンパク質（ＮＤＰＯＩ）のレベルを判定することによりアルツハイマー病を有する患者を同定するための請求項記載の方法であって、前記ＮＤＰＯＩがＡβオリゴマーであり、および０．５ｐｇ／ｍＬから１１ｐｇ／ｍＬの範囲のＡβオリゴマーレベルを有する患者がアルツハイマー病を有すると判定される方法。
【請求項８】
アルツハイマー病を処置するための治療の治療効力を判定するための方法であって、
（ａ）対象となるニューロン由来タンパク質（ＮＤＰＯＩ）を有する生体試料を患者から得る段階；
（ｂ）前記生体試料と捕捉抗体／常磁性マイクロ粒子ビーズ（抗体／ＭＰビーズ）とを、ＮＤＰＯＩ／捕捉抗体／ＭＰビーズ複合体を形成するために十分な条件下で接触させる段階；
（ｃ）段階（ｂ）の前記ＮＤＰＯＩ／捕捉抗体／ＭＰビーズ複合体と蛍光標識検出抗体とを、ＮＤＰＯＩ／捕捉抗体／ＭＰビーズ／検出抗体複合体を形成するための条件下で接触させる段階；および
（ｄ）段階（ｃ）の前記複合体から生成される蛍光シグナルであって、前記ＮＤＰＯＩの量を表す蛍光シグナルを検出する段階；
（ｅ）試験治療薬を、それを必要とする前記患者に投与する段階；
（ｆ）ＮＤＰＯＩを有する第二の生体試料を前記患者から得る段階；
（ｇ）前記患者からの前記第二の生体試料を用いて段階（ｂ）から（ｄ）を繰り返す段階；および
（ｈ）前記第二の生体試料から検出された前記蛍光シグナルと第一の生体試料からの前記シグナルとを比較する段階（この場合、前記検出される蛍光シグナルの低下が有効な治療薬を表す）
を含む方法。
【請求項９】
前記ＮＤＰＯＩがＡβオリゴマーである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記捕捉抗体が１９．３であり、前記検出抗体が８２Ｅ１である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
対象となるニューロン由来タンパク質（ＮＤＰＯＩ）に結合した治療抗体のターゲット・エンゲージメントを判定するための方法であって、
（ａ）哺乳動物に治療抗体を投与する段階；
（ｂ）ＮＤＰＯＩを有する生体試料を前記哺乳動物から得る段階；
（ｃ）前記生体試料と捕捉抗体／常磁性マイクロ粒子ビーズ（抗体／ＭＰビーズ）とを、ＮＤＰＯＩ／捕捉抗体／ＭＰビーズ複合体を形成するために十分な条件下で接触させる段階；
（ｄ）段階（ｂ）の前記ＮＤＰＯＩ／捕捉抗体／ＭＰビーズ複合体と蛍光標識検出抗体とを、ＮＤＰＯＩ／捕捉抗体／ＭＰビーズ／検出抗体複合体を形成するための条件下で接触させる段階；および
（ｅ）段階（ｃ）の前記複合体から生成される蛍光シグナルであって、前記ＮＤＰＯＩ／治療抗体のターゲット・エンゲージメントを表す蛍光シグナルを検出する段階
を含む方法。
【請求項１２】
前記ＮＤＰＯＩがＡβオリゴマーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記捕捉抗体が１９．３であり、前記検出抗体が８２Ｅ１である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中のアルツハイマー病（ＡＤ）と関連付けられるアミロイドベータ（Ａβ）オリゴマーの検出方法に関する。本発明は、ＡＤを診断するための方法およびＡＤについての処置を評価するための方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、学習および記憶に関係する脳領域内のアミロイドβ（Ａβ）斑沈着を特徴とする破壊的な神経変性疾患である。これらの大きい不溶性斑がＡＤの原因となるとかつては考えられていたが、今では、証拠が、Ａβの小さな拡散性オリゴマーが原因であり得ることを示している。アミロイド由来拡散性リガンド（ＡＤＤＬ）は、内因性Ａβオリゴマーに類似した特性を有する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成され得るＡβオリゴマーの一種である（米国特許第６，２１８，５０６号明細書、Ｋｌｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ  ２５：５６９−５８０、Ｌａｍｂｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９５：６４４８−６４５３）。Ａβオリゴマーは、ＡＤ患者の脳内に存在し、ニューロンに結合し、そしてニューロンの形態および記憶の欠損を誘導する。Ａβオリゴマーを結合する抗体を用いる研究により、ニューロンの形態と記憶の両方の向上が証明されている。
【０００３】
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に対するβ−およびγ−セクレターゼ酵素の活性を用いる、Ａβ単量体を測定するためのアッセイは公知であるが、正常対照とＡＤの両方におけるヒト液体試料、例えば脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＡβオリゴマーを特異的かつ確実に検出するアッセイは殆ど報告されていない（Ｇｅｏｒｇａｎｏｐｏｕｌｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０２：２２７３−２２７６、Ｆｕｋｕｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，２４：２７１６−２７２６、Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１０  Ｄｅｃ．３０；５（１２）：ｅｌ５７２５）。報告されているＡβオリゴマーアッセイは、多数のアプローチを用いており、それらには、バイオバーコードＰＣＲ増幅プラットホームと連結された（Ｇｅｏｒｇａｎｏｐｏｕｌｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，２００５）、オーバーラッピングエピトープＥＬＩＳＡと連結された（Ｇａｎｄｙ，ｅｔ  ａｌ，２０１０．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６８：２２０−２３０．、Ｘｉａ，ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６６：１９０−１９９）、また最初にサイズ排除クロマトグラフィーとペアにされた（Ｆｕｋｕｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０）ＡＤＤＬ特異的抗体、およびアミロイド−アフィニティーマトリックス法（Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｔａｎｇｈｅ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｌｚ．Ｄｉｓ．，Ｓｅｐ．２，ｐｉｉ：４１７３１４）、続いてのＡβ単量体に対する抗体でのオリゴマー解離および測定が挙げられる。
【０００４】
Ａβオリゴマーはまた、ＣＳＦもしくは脳のいずれかからゲル電気泳動、続いてウエスタンブロットを用いて検出されており（Ｋｌｙｕｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２８：４２３１−４２３７、Ｈｉｌｌｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３０：１０３６９−１０３７９）、またはその電気泳動手順の後に維持されるオリゴマーの分子量に依存してサイズ排除クロマトグラフィーの後に（Ｓｈａｎｋａｒ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６７０：３３−４４）検出されている。しかし、電気泳動およびブロッティング技術では、正常対照ＣＳＦ中のこれらの種を見るために必要な感度が得られない（Ｋｌｙｕｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。さらに、Ｇｅｏｒｇａｎｏｐｏｕｌｏｕによる発見は、１０００倍範囲のＡβオリゴマー濃度を実証し、この濃度をｆＭと表す。Ａβオリゴマー種は広範な分子量を表し、それ故、正確なモル濃度の指定は不確実である。Ｇｅｏｒｇａｎｏｐｏｕｌｏｕアッセイは、半定量的であり、１００ａＭの検出下限で３桁の分析ターゲット濃度範囲を提示する。報告されている方法（Ｇｅｏｒｇａｎｏｐｏｕｌｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｆｕｋｕｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｇａｎｄｙ，ｅｔ  ａｌ，２０１０）の殆どは、Ａβ単量体と比較してＡβオリゴマーからのシグナル間の選択性を評定しておらず、そのため述べられている濃度を注意深く調査する必要がある。Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ミネソタ州ミネアポリス）によって販売されているアッセイであるＸｉａアッセイ（Ｘｉａ，ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６６：１９０−１９９）は、Ａβ４０単量体と比較して彼らのＡβ１−１６二量体に対して３２０倍の選択性を主張しているが、ＣＳＦ中のＡβ単量体との交差反応性を回避するために必要な選択性を欠く。ＣＳＦ中のＡβオリゴマーは、ｆＭレベルで存在すると仮定され、ＣＳＦ  Ａβ単量体は、１．５〜２ｎＭの間で存在するので、ＣＳＦ試料中のＡβオリゴマーを選択的に測定するアッセイは、単量体に比べてＡβオリゴマーに対して排他的選択性を有さねばならない。
【０００５】
潜在的疾患バイオマーカーとしてヒトＣＳＦ中のＡβオリゴマーレベルを測定することに加えて、Ａβオリゴマーは、ＡＤを処置するための治療用モノクローナル抗体のターゲットとしても使用されている（例えば、米国特許第７，８１１，５６３号明細書、米国特許第７，７８０，９６３号明細書および米国特許第７，７３１，９６２号明細書参照）。これらの抗体は、ＣＮＳに侵入し、１）ミクログリアのＦｃ媒介活性化による触媒性ターンオーバー、２）抗体／ＡＤＤＬ複合体の脳血管系へのクリアランス、または３）抗体結合および分解酵素、例えばネプリライシン、インスリン分解酵素、プラスミン；エンドセリン転換酵素（ＥＣＥ−１および−２）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ−２、−３および−９）およびアンジオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）の侵入改善の結果として起こるＡＤＤＬの酵素的消化によって、脳から毒性ＡＤＤＬ種を排除すると考えられている。したがって、選択的Ａβオリゴマーアッセイの目的は、抗オリゴマー抗体での処置またはＡβ単量体／オリゴマー形成もしくはクリアランスを改変する他の処置の結果として起こる中枢神経系Ａβオリゴマーの薬力学的（ＰＤ）変化の測定である。加えて、抗Ａβオリゴマー抗体に結合したＡβオリゴマーの検出を特に可能にするアッセイ、すなわち、ターゲット・エンゲージメント（ＴＥ）アッセイは、処置後の治療抗体の評定のために非常に価値があるだろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６，２１８，５０６号明細書
【特許文献２】米国特許第７，８１１，５６３号明細書
【特許文献３】米国特許第７，７８０，９６３号明細書
【特許文献４】米国特許第７，７３１，９６２号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｌｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ  ２５：５６９−５８０
【非特許文献２】Ｌａｍｂｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９５：６４４８−６４５３
【非特許文献３】Ｇｅｏｒｇａｎｏｐｏｕｌｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０２：２２７３−２２７６
【非特許文献４】Ｆｕｋｕｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，２４：２７１６−２７２６
【非特許文献５】Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１０  Ｄｅｃ．３０；５（１２）：ｅｌ５７２５
【非特許文献６】Ｇａｎｄｙ，ｅｔ  ａｌ，２０１０．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６８：２２０−２３０．
【非特許文献７】Ｘｉａ，ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６６：１９０−１９９
【非特許文献８】Ｔａｎｇｈｅ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｌｚ．Ｄｉｓ．，Ｓｅｐ．２，ｐｉｉ：４１７３１４
【非特許文献９】Ｋｌｙｕｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２８：４２３１−４２３７
【非特許文献１０】Ｈｉｌｌｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３０：１０３６９−１０３７９
【非特許文献１１】Ｓｈａｎｋａｒ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６７０：３３−４４
【非特許文献１２】Ｘｉａ，ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６６：１９０−１９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ヒト液体試料中のＡβオリゴマーを確実にかつ感度よく検出することができるようなアッセイに備えるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、患者の生体試料、すなわち液体試料中のＡβオリゴマーを確実にかつ感度よく検出することができる選択的Ａβオリゴマーアッセイに関する。本発明のアッセイは、高選択的抗Ａβオリゴマー抗体のペア、１９．３および８２Ｅ１を使用して、脳脊髄液（ＣＳＦ）試料中のＡβオリゴマーを検出および定量する。１つの実施形態において、本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）患者と非ＡＤ患者とを区別することおよび／またはＡＤ患者を彼らの疾患の重症度に従って層別化することができる、選択的Ａβオリゴマー薬力学的（ＰＤ）アッセイである。さらにもう１つの実施形態において、本発明は、治療効力の評定のための代用エンドポイントとして結合Ａβオリゴマーを測定することができる、選択的Ａβオリゴマー・ターゲット・エンゲージメント（ＴＥ）アッセイである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａ〜1Ｃは、ＡβオリゴマーのＡＤＤＬ種に結合する抗ＡＤＤＬ抗体、１９．３の選択性（各セットの中央のバー）をＡβ単量体またはＡβ原線維と比較して示すグラフィック表示である。図１Ａは、ヒト化（ｈ３Ｂ３）および親和性成熟抗ＡＤＤＬ（１４．２、７．２、１１．４、９．２、１３．１、１７．１および１９．３）抗体ならびに３つのコンパレータ抗体（Ｃｏｍｐ１、２および３）のパネルのＡβ、ＡＤＤＬおよび原線維性ＡβへのＥＬＩＳＡ結合を示す。比較抗体２がＡＤＤＬに対して非選択的抗体であることは公知である。ＥＬＩＳＡから捕捉抗体を除去すること（ｍＡｂなし）によってこのアッセイのバックグラウンドを決定した。エラーバーは、平均の標準誤差を表している。図１Ｂは、Ａβオリゴマー（▲）またはＡβ単量体（■）のいずれかで被覆したプレートを用いる片側ＥＬＩＳＡにおける、ヒト化抗体１９．３の相対親和度および最大結合特性を示す。図１Ｃは、溶解状態で競合種が存在する状態でＥＬＩＳＡプレートに被覆されたＡβオリゴマー（▲）およびＡβ単量体（■）に対する１９．３の競合ＥＬＩＳＡおよび相対親和度を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜1Ｃは、ＡβオリゴマーのＡＤＤＬ種に結合する抗ＡＤＤＬ抗体、１９．３の選択性（各セットの中央のバー）をＡβ単量体またはＡβ原線維と比較して示すグラフィック表示である。図１Ａは、ヒト化（ｈ３Ｂ３）および親和性成熟抗ＡＤＤＬ（１４．２、７．２、１１．４、９．２、１３．１、１７．１および１９．３）抗体ならびに３つのコンパレータ抗体（Ｃｏｍｐ１、２および３）のパネルのＡβ、ＡＤＤＬおよび原線維性ＡβへのＥＬＩＳＡ結合を示す。比較抗体２がＡＤＤＬに対して非選択的抗体であることは公知である。ＥＬＩＳＡから捕捉抗体を除去すること（ｍＡｂなし）によってこのアッセイのバックグラウンドを決定した。エラーバーは、平均の標準誤差を表している。図１Ｂは、Ａβオリゴマー（▲）またはＡβ単量体（■）のいずれかで被覆したプレートを用いる片側ＥＬＩＳＡにおける、ヒト化抗体１９．３の相対親和度および最大結合特性を示す。図１Ｃは、溶解状態で競合種が存在する状態でＥＬＩＳＡプレートに被覆されたＡβオリゴマー（▲）およびＡβ単量体（■）に対する１９．３の競合ＥＬＩＳＡおよび相対親和度を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜1Ｃは、ＡβオリゴマーのＡＤＤＬ種に結合する抗ＡＤＤＬ抗体、１９．３の選択性（各セットの中央のバー）をＡβ単量体またはＡβ原線維と比較して示すグラフィック表示である。図１Ａは、ヒト化（ｈ３Ｂ３）および親和性成熟抗ＡＤＤＬ（１４．２、７．２、１１．４、９．２、１３．１、１７．１および１９．３）抗体ならびに３つのコンパレータ抗体（Ｃｏｍｐ１、２および３）のパネルのＡβ、ＡＤＤＬおよび原線維性ＡβへのＥＬＩＳＡ結合を示す。比較抗体２がＡＤＤＬに対して非選択的抗体であることは公知である。ＥＬＩＳＡから捕捉抗体を除去すること（ｍＡｂなし）によってこのアッセイのバックグラウンドを決定した。エラーバーは、平均の標準誤差を表している。図１Ｂは、Ａβオリゴマー（▲）またはＡβ単量体（■）のいずれかで被覆したプレートを用いる片側ＥＬＩＳＡにおける、ヒト化抗体１９．３の相対親和度および最大結合特性を示す。図１Ｃは、溶解状態で競合種が存在する状態でＥＬＩＳＡプレートに被覆されたＡβオリゴマー（▲）およびＡβ単量体（■）に対する１９．３の競合ＥＬＩＳＡおよび相対親和度を示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、検出法として化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｅｎｃｅ）を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ形式（Ｅｎ  Ｖｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅ  Ｒｅａｄｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）で３つの抗体ペアの感度、およびＡβオリゴマーに対するそれらの相対親和度を示すグラフィック表示である。図２Ａは、捕捉抗体としての抗Ａβオリゴマー抗体１９．３および検出抗体としての８２Ｅ１をＡβオリゴマー濃度範囲に対して図示する（ｓｈｏｗｓ  ｄｅｐｉｃｔｓ）。図２Ｂおよび２Ｃは、捕捉抗体と検出抗体の両方として、それぞれ６Ｅ１０および１９．３を図示する。１９．３ｘ８２Ｅ１サンドイッチＥＬＩＳＡペア（図２Ａ）は、Ａβオリゴマーを検出する感度が他のペア（図２Ｂおよび２Ｃ）と比較して有意に高かった。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｃは、検出法として化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｅｎｃｅ）を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ形式（Ｅｎ  Ｖｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅ  Ｒｅａｄｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）で３つの抗体ペアの感度、およびＡβオリゴマーに対するそれらの相対親和度を示すグラフィック表示である。図２Ａは、捕捉抗体としての抗Ａβオリゴマー抗体１９．３および検出抗体としての８２Ｅ１をＡβオリゴマー濃度範囲に対して図示する（ｓｈｏｗｓ  ｄｅｐｉｃｔｓ）。図２Ｂおよび２Ｃは、捕捉抗体と検出抗体の両方として、それぞれ６Ｅ１０および１９．３を図示する。１９．３ｘ８２Ｅ１サンドイッチＥＬＩＳＡペア（図２Ａ）は、Ａβオリゴマーを検出する感度が他のペア（図２Ｂおよび２Ｃ）と比較して有意に高かった。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、検出法として化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｅｎｃｅ）を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ形式（Ｅｎ  Ｖｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅ  Ｒｅａｄｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）で３つの抗体ペアの感度、およびＡβオリゴマーに対するそれらの相対親和度を示すグラフィック表示である。図２Ａは、捕捉抗体としての抗Ａβオリゴマー抗体１９．３および検出抗体としての８２Ｅ１をＡβオリゴマー濃度範囲に対して図示する（ｓｈｏｗｓ  ｄｅｐｉｃｔｓ）。図２Ｂおよび２Ｃは、捕捉抗体と検出抗体の両方として、それぞれ６Ｅ１０および１９．３を図示する。１９．３ｘ８２Ｅ１サンドイッチＥＬＩＳＡペア（図２Ａ）は、Ａβオリゴマーを検出する感度が他のペア（図２Ｂおよび２Ｃ）と比較して有意に高かった。
【図３】図３は、Ｅｒｅｎｎａ（登録商標）デジタル検出器（Ｓｉｎｇｕｌｅｘ（登録商標）、カリフォルニア州Ａｌｍｅｄａ）などの常磁性マイクロ粒子検出器を使用して測定したときの、抗Ａβオリゴマー抗体１９．３および８２Ｅ１を使用する、Ａβ単量体（▲）と比較しての、Ａβオリゴマー（■）の検出についての感度および選択性のグラフィック表示である。常磁性マイクロ粒子検出器の使用は、１９．３／８２Ｅ１抗体ペアでＡβオリゴマーを検出する感度を向上させた。
【図４Ａ】図４Ａおよび４Ｂは、ヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）試料中で検出されたＡβオリゴマーのレベルのグラフィック表示である。図４Ａは、本明細書における本発明の方法を用いる盲検評価でＡＤ患者におけるＡβオリゴマーレベルが同年齢対照、すなわち非ＡＤ、患者と比較して４倍高かったことを示す。これらの差は、集団が非ガウス性であると仮定して、二元配置ｔ検定（ｔｗｏ−ｗａｙ  ｔ−ｔｅｓｔ）およびマン・ホイットニー順位分析を用いて判定してｐ≦０．０００４まで統計的に有意であった。図４Ｂは、本明細書における本発明の方法を用いる盲検評価でＡＤ患者におけるＡβオリゴマーレベルが若年対照、すなわち非ＡＤ、患者と比較して８倍高かったことを示す。これらの群間での差もまた、図４Ａの場合と同じ統計的方法を用いてｐ値≦０．００２１まで統計的に有意であった。
【図４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、ヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）試料中で検出されたＡβオリゴマーのレベルのグラフィック表示である。図４Ａは、本明細書における本発明の方法を用いる盲検評価でＡＤ患者におけるＡβオリゴマーレベルが同年齢対照、すなわち非ＡＤ、患者と比較して４倍高かったことを示す。これらの差は、集団が非ガウス性であると仮定して、二元配置ｔ検定（ｔｗｏ−ｗａｙ  ｔ−ｔｅｓｔ）およびマン・ホイットニー順位分析を用いて判定してｐ≦０．０００４まで統計的に有意であった。図４Ｂは、本明細書における本発明の方法を用いる盲検評価でＡＤ患者におけるＡβオリゴマーレベルが若年対照、すなわち非ＡＤ、患者と比較して８倍高かったことを示す。これらの群間での差もまた、図４Ａの場合と同じ統計的方法を用いてｐ値≦０．００２１まで統計的に有意であった。
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、臨床確認されたＡＤ患者または若年対照、すなわち非ＡＤ、患者のいずれかのＣＳＦ中のＡβ単量体レベルのグラフィック表示であり、ＡＤ試料中のＡβ４２単量体レベルは相応じて低下し、Ａβ単量体レベルは不変である。これは、ＡＤ患者について観察される一般的パターンの代表であり、図４Ｂで評価した試料の病態を確証する。図５Ａは、ＡＤ  ＣＳＦ試料中のＡβ４２単量体のレベル低減を示す。これらの差は、集団が非ガウス性であると仮定して、二元配置ｔ検定（ｔｗｏ−ｗａｙ  ｔ−ｔｅｓｔ）およびマン・ホイットニー順位分析を用いて判定してｐ≦０．００２まで統計的に有意であった。図５Ｂは、Ａβ４０単量体の二群間の不変レベルを示す。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、臨床確認されたＡＤ患者または若年対照、すなわち非ＡＤ、患者のいずれかのＣＳＦ中のＡβ単量体レベルのグラフィック表示であり、ＡＤ試料中のＡβ４２単量体レベルは相応じて低下し、Ａβ単量体レベルは不変である。これは、ＡＤ患者について観察される一般的パターンの代表であり、図４Ｂで評価した試料の病態を確証する。図５Ａは、ＡＤ  ＣＳＦ試料中のＡβ４２単量体のレベル低減を示す。これらの差は、集団が非ガウス性であると仮定して、二元配置ｔ検定（ｔｗｏ−ｗａｙ  ｔ−ｔｅｓｔ）およびマン・ホイットニー順位分析を用いて判定してｐ≦０．００２まで統計的に有意であった。図５Ｂは、Ａβ４０単量体の二群間の不変レベルを示す。
【図６】図６は、認知パフォーマンスの尺度としての精神状態短時間検査（ＭＭＳＥ）スコアと、本明細書に記載する本発明のアッセイを用いて測定したＡβオリゴマーのレベルとの相関のグラフィック表示である。図４Ｂに図示したすべての患者がこの相関に含まれた。Ａβオリゴマーの−０．７４４５ｐｇ／ｍＬでの相関は、ｐ≦０．０００１で有意であった。
【図７Ａ】図７Ａおよび７Ｂは、ターゲット・エンゲージメント・アッセイのグラフィック表示である。図７Ａは、ヒトＣＳＦ（●）またはカゼインバッファー（▲）へのスパイクによりｅｘ  ｖｉｖｏで形成された抗Ａβオリゴマー抗体１９．３／Ａβオリゴマー複合体の表示である。図７Ｂは、ヒトＣＳＦ（●）またはカゼインバッファー（▲）へのスパイクによりｅｘ  ｖｉｖｏで形成された抗Ａβオリゴマー抗体１９．３／Ａβオリゴマー複合体の表示である。抗ヒトカッパ鎖（捕捉）ｘ８２Ｅ１（検出）ターゲット・エンゲージメントＥＬＩＳＡ（実施例９）における１９．３／Ａβオリゴマー複合体の検出で分差感度が観察された。抗カッパ捕捉抗体は、抗Ａβオリゴマー抗体１９．３とヒトＣＳＦ中の内因性抗体とをあまりよく区別しなかった。
【図７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、ターゲット・エンゲージメント・アッセイのグラフィック表示である。図７Ａは、ヒトＣＳＦ（●）またはカゼインバッファー（▲）へのスパイクによりｅｘ  ｖｉｖｏで形成された抗Ａβオリゴマー抗体１９．３／Ａβオリゴマー複合体の表示である。図７Ｂは、ヒトＣＳＦ（●）またはカゼインバッファー（▲）へのスパイクによりｅｘ  ｖｉｖｏで形成された抗Ａβオリゴマー抗体１９．３／Ａβオリゴマー複合体の表示である。抗ヒトカッパ鎖（捕捉）ｘ８２Ｅ１（検出）ターゲット・エンゲージメントＥＬＩＳＡ（実施例９）における１９．３／Ａβオリゴマー複合体の検出で分差感度が観察された。抗カッパ捕捉抗体は、抗Ａβオリゴマー抗体１９．３とヒトＣＳＦ中の内因性抗体とをあまりよく区別しなかった。
【図８】図８は、２０ｍｇ／ｋｇのボーラスＩＶ用量の投与後の大槽がポートされた（ｃｉｓｔｅｒｎａ  ｍａｇｎａ  ｐｏｒｔｅｄ）アカゲザルモデルを用いて霊長類（３匹の赤毛猿）脳脊髄液（ＣＳＦ）で評定した抗ＡＤＤＬ抗体１９．３のＰＫのグラフィック表示である。投与後約２４時間の時点で、抗体１９．３は、ＣＳＦ中に１００ｎｇ／ｍＬで存在した。
【図９Ａ】図９Ａおよび９Ｂは、それぞれ、ＡβオリゴマーサンドイッチＥＬＩＳＡ、すなわち薬力学的（ＰＤ）アッセイ、およびＡβオリゴマー／抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ、すなわちターゲット・エンゲージメント・アッセイのグラフィック表示である。
【図９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂは、それぞれ、ＡβオリゴマーサンドイッチＥＬＩＳＡ、すなわち薬力学的（ＰＤ）アッセイ、およびＡβオリゴマー／抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ、すなわちターゲット・エンゲージメント・アッセイのグラフィック表示である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本願出願人は、Ａβオリゴマーの薬力学的測定法およびターゲット・エンゲージメント測定法の両方として用いるための、患者のＣＳＦ中のＡβオリゴマーを確実にかつ感度よく検出することができる方法を提供する。本発明の方法は、タウ／Ａベータ４２  ＣＳＦ比について以前に報告されている使用（Ｄｅ  Ｍｅｙｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６７：９４９−５６）に類似して、ＡＤ患者と非ＡＤ患者とを区別することおよびＡＤ患者におけるＣＮＳ  Ａβオリゴマーのレベル上昇に基づいてＡＤ病態を層別化することができる。さらに、大部分の神経毒性種を検出するＡβオリゴマーアッセイは、Ａβ単量体レベルについて観察される不良な相関と比較して、認知パフォーマンスの変化をよりよく相関させることができ、認知パフォーマンスの変化のより動的な測定法であり得る。本出願人は、末梢投与された抗Ａβオリゴマー抗体が、血液脳関門を透過してＡβオリゴマーを結合することができること、および本明細書における本発明の方法で用いたとき、ＡＤ治療の評定のための代用エンドポイントアッセイをもたらし得ることをここで初めて実証する。
【００１２】
本願出願人は、生体試料、すなわち液体試料中のニューロン由来タンパク質のレベルを検出および測定するための高感度アッセイ、およびそれらの使用を開発した。本発明の１つの実施形態において、前記ニューロン由来タンパク質はＡβオリゴマーであり、前記液体試料は脳脊髄液（ＣＳＦ）試料である。本発明の方法は、常磁性マイクロ粒子検出を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて２つの選択的抗Ａβオリゴマー抗体を用いる。Ａβオリゴマーは、生体試料中で、特にＣＳＦ中で（Ｇｅｏｒｇａｎｏｐｏｕｌｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｋｌｙｕｂｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００８）見つかっているが、公知検出方法に付随する限界（感度と選択度の両方を含む）により、患者の病態の分類にまたはＡＤ治療の開発に使用するためのＡβオリゴマーを確実に検出することはもちろん、定量することもできていない。２つの抗Ａβオリゴマー抗体、１９．３および８２Ｅ１を常磁性ミクロ粒子検出と共に使用することにより、本願出願人は、４０ｆｇ／ｍＬの検出限界まで生体試料中のＡβオリゴマーを検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを開発することができた。このアッセイを用いて、本願出願人は、若年または同年齢対照のいずれかと比較して臨床確認されたＡＤ試料中のＡβオリゴマーの非常に有意な上昇を実証する。これらの同じ試料を使用してＡβ４２およびＡβ４０単量体のレベルを測定し、ＡＤ試料中のＡβ４２単量体が対照と比較して有意に低減された一方でＡβ４０単量体レベルが不変であったことを確認した。本発明のＡβオリゴマーサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイは、Ａβオリゴマー濃度と、精神状態短時間検査（ＭＭＳＥ）として公知のＡＤ重症度を測定するために広く用いられている認知試験でのパフォーマンスとの間の有意な相関を実証した；認知スコアが高いほど（認知機能正常である３０の値まで）、ＣＳＦ中のＡβオリゴマーのレベルが低い。本発明のＡβオリゴマーサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイをさらなる患者試料に関して用いて、液体、イメージングおよび認知バイオマーカーとのさらなる相関を生じさせることができる。
【００１３】
上述の薬力学的アッセイに加えて、本出願人は、ヒトＩｇＧ２／抗Ａβオリゴマー複合体に対して選択性を有するターゲット・エンゲージメント（ＴＥ）を、それをヒトＣＳＦ試料で使用することができるように開発した。後に続く実施例において説明するように、本明細書に記載するＴＥアッセイは、非天然ヒトＩｇＧ２抗体（抗Ａβオリゴマー、ＩｇＧ２抗体）とヒトＣＳＦ中に存在する過多な内因性ＩｇＧ抗体とを選択的に区別するという難題を克服する。高選択的抗ＩｇＧ２アイソタイプ捕捉（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、アラバマ州バーミングハム、＃９０６０−０５）、ヒトＣＳＦ中に存在する内因性ＩｇＧ２種の中からＡβオリゴマーＩｇＧ２抗体／Ａβオリゴマー複合体を捕捉できる抗体を使用することにより、前記ＴＥアッセイの選択性を達成した。１９．３／ＩｇＧ２アイソタイプ抗体に結合したＡβオリゴマーの検出を市販の抗体、８２Ｅ１（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス）で遂行した。このアプローチは、バッファー中であろうと、Ａβオリゴマー抗体で処置した動物からのトランスジェニックＴｇ２５７６脳の抽出物中であろうと、または内因性抗体およびＡβオリゴマーをスパイクしたヒトＣＳＦサンプル中であろうと、１９．３−ＩｇＧ２抗体／Ａβオリゴマー複合体の信頼できる一貫した検出を可能にした。
【００１４】
Ａβオリゴマーに結合した治療用抗ＡβオリゴマーＩｇＧ２抗体の複合体を検出する類のない感度のアッセイを可能にするために、以下で薬力学的（ＰＤ）アッセイに関して説明するような磁性マイクロ粒子（ＭＰ）に抗ヒトＩｇＧ２抗体を結合させる。ＩｇＧ２アイソタイプの治療用抗Ａβオリゴマー抗体（治療用ＩｇＧ２抗体）を投与した個体から採取したＣＳＦ試料とそのＭＰ／抗ヒトＩｇＧ２複合体を混合する。この治療用抗Ａβオリゴマー抗体は、前記個体のＣＳＦ試料中に存在する一切のＡβオリゴマー種に結合することになる。このＭＰ／抗ＩｇＧ２／抗Ａβオリゴマー／Ａβオリゴマー複合体を、蛍光色素（ｆｌｕｏｒ）が付いている二次抗Ａβオリゴマー抗体、８２Ｅ１と混合する。そのＭＰ／抗ＩｇＧ２／抗Ａβオリゴマー／Ａβオリゴマー／８２Ｅ１−ｆｌｕｏｒ複合体を前記マイクロ粒子の磁性によって十分に洗浄し、８２Ｅ１−ｆｌｕｏｒ複合体をそれらのビーズから分離してバックグラウンドを減ずる。８２Ｅ１−ｆｌｕｏｒの単一分子は、投与された個体のＣＳＦ中に存在した抗Ａβオリゴマー／Ａβオリゴマー複合体の元のレベルを表す。このアッセイにより、治療用ＩｇＧ２抗体がＡβオリゴマーターゲットをエンゲージしていたという確証が可能になる（図９Ｂ）。処置中のＡβオリゴマーのクリアランスに伴って、治療用ＩｇＧ２抗体は、より少ないＡβオリゴマーをエンゲージすることになり、その結果、低減されたシグナルを提示する。かくして、前記ターゲット・エンゲージメント・アッセイは、評価される治療抗体についての効力の測定を可能にすることになる。前記薬力学的アッセイ（図９Ａ）も低減されたシグナルを提示することになり、これは、処置後などのＡβオリゴマーの低減された存在に起因すると考えられるだろう。したがって、前記薬力学的アッセイを、ＡＤの処置に使用される任意の治療薬の効力の評価についての代用エンドポイントとして使用することができる。
【００１５】
本願発明は、ＡＤ固体とヒト対照個体の両方からのＣＳＦ試料中の内因性Ａβオリゴマーを検出および定量する、高感度かつ選択的なサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイである。本発明のアッセイの開発は、Ａβ単量体および原線維の両方に比べてＡβオリゴマーに対して選択的な抗体を生産するマウスハイブリドーマの同定で始まった。本出願人が開発し（米国特許出願第６１／３６４，２１０号の優先権を主張する、同時係属出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／ＸＸＸＸＸＸ）、本明細書において１９．３と呼ぶ、この選択的抗Ａβオリゴマー抗体をＩｇＧ２アイソタイプにヒト化し、片側ＥＬＩＳＡによってＡβオリゴマーに対する親和性をさらに特徴付け、ＥＣ５０はおおよそ１．６ｎＭであった。Ａβ単量体と比較しての、溶解状態および固相中のＡＤＤＬに対する１９．３抗体の親和性のさらなる評価は、１９．３が、競合ＥＬＩＳＡ形式で評価したときにＡβオリゴマーに対しておおよそ６００倍大きい選択性を有することを実証した。Ａβオリゴマーに対する１９．３の前記感度および選択性は、Ａβオリゴマー検出についてのサンドイッチＥＬＩＳＡの潜在的有用性を示唆した。
【００１６】
検出抗体としての３つの異なる抗体１９．３、７３０５（米国特許第７，７８０，９６３号明細書、この参考文献はその全体が参照により本明細書に援用されている）および８２Ｅ１とそれらのビオチン化後に組み合わせて、１９．３抗体をＡβオリゴマーに対する潜在的捕捉試薬としてサンドイッチＥＬＩＳＡ形式で評価した。オーバーラッピングエピトープの試験では、ビオチン化１９．３を検出抗体として検査し、捕捉抗体としての１９．３とペアにした。オーバーラッピングエピトープの存在は、二量体またはより高次のＡβオリゴマーの存在を示唆する、多数のエピトープを有するＡβ構築物を示すことになる。１９．３ｘ１９．３オーバーラッピングエピトープＥＬＩＳＡは、９８ｐｇ／ｍＬのＡβオリゴマーについての検出限界（ＬｏＤ）を有した（図２Ｃ）。抗体ペア１９．３および８２Ｅ１についてのサンドイッチＥＬＩＳＡ（「１９．３ｘ８２Ｅ１サンドイッチＥＬＩＳＡ」）（図２Ａ）、ならびに１９．３ｘ７３０５サンドイッチＥＬＩＳＡ（データを示さない）、１．３ｐｇ／ｍＬの（ＬｏＤ）、Ａβオリゴマーについての４．２ｐｇ／ｍＬの信頼定量限界（ＬｏＲＱ）、そしてＡβオリゴマー／Ａβ単量体からのシグナルの比はおおよそ１，０００：１であった（これは、前記アッセイがＡβ４０単量体に比べてＡβオリゴマーに対して１，０００倍選択的であったことを示す）。本出願人は、非オーバーラッピング・エピトープ・アッセイ、すなわち、１９．３ｘ８２Ｅ１サンドイッチＥＬＩＳＡが、９８ｐｇ／ｍＬのＡβオリゴマーについての検出限界をもたらした、市販のＡβ抗体６Ｅ１０を用いる類似のアッセイについて最近発表された結果（Ｃｏｖａｎｃｅ、ニュージャージー州プリンストン）（Ｇａｎｄｙ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６８：２２０−２３０）と比較してより高感度であること（図２Ｂ）、および市販の抗体８２Ｅ１を用いるオーバラッピング・エピトープ・アッセイ（Ｘｉａ，ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６６：１９０−１９９）（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス）と比較して同等の感度があることを発見した。化学発光検出を用いて行ったサンドイッチＥＬＩＳＡ（図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ）は、Ａβオリゴマー標準物質を検出するのに十分なものであったが、ｆＭ（ｆｇ／ｍＬ）範囲のＣＳＦ  Ａβオリゴマーレベルの以前の報告は、選択的ＥＬＩＳＡベースＡβオリゴマーアッセイが、ＣＳＦ試料中のＡβオリゴマーを確実に検出および定量するために１０から１００倍高い感度を必要とすることになることを示唆した。
【００１７】
サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの感度を増すために、本出願人は、サンドイッチＥＬＩＳＡ複合体からアンカップリングされる蛍光タグ付き検出抗体の検出を用いて常磁性マイクロ粒子検出システム、特にＥｒｅｎｎａ（登録商標）システム（Ｓｉｎｇｕｌｅｘ（登録商標）、カリフォルニア州Ａｌｍｅｄａ）で２つの抗体ペアの性能を評価した。１９．３ｘ８２Ｅ１サンドイッチＥＬＩＳＡの性能を、１９．３ｘ８２Ｅ１抗体ペアがＡＤ  ＣＳＦ試料中のＡβオリゴマーシグナルを同年齢対照試料またはより若年の対照試料のいずれかと比較してより高レベルで検出できるように向上させた。より具体的には、アッセイＬｏＤがおおよそ３０倍、０．０４ｐｇ／ｍＬに向上した一方で、ＬｏＲＱは１０倍、０．４２ｐｇ／ｍＬに向上した。類似して、Ａβオリゴマー／Ａβ単量体比も５，０００：１へと向上された。このアッセイで測定したとき、ＡＤ  ＣＳＦ試料は、ＡＤ患者に特有である、低減されたＡβ４２レベルおよび不変のＡβ４０レベルを有した。まとめると、常磁性マイクロ粒子検出システムを用いる１９．３ｘ８２Ｅ１サンドイッチＥＬＩＳＡは、ヒトＣＳＦ中のＡβオリゴマー種を確実にかつ特異的に測定することができた。
【００１８】
本明細書において用いる場合の用語「Ａβオリゴマー」は、単量体種の自己会合の結果として生ずる、Ａβ単量体の多量体種を指す。Ａβ４０のＡβオリゴマーが報告されているが、Ａβオリゴマーは主としてＡβ４２の多量体である。Ａβオリゴマーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの合成Ａβ単量体の凝集の結果として生ずるまたはヒト脳もしくは体液からのＡβ種の単離／抽出の結果として生ずる二量体、三量体、四量体およびより高次の種のダイナミックレンジを含み得る。ＡＤＤＬは、Ａβオリゴマーの１種である。
【００１９】
本明細書において用いる場合の用語「ニューロン由来タンパク質」または「対象となるニューロン由来タンパク質」は、本明細書における本発明のアッセイによって測定することとなる脳内のニューロンの中でおよび／またはニューロンによって生成されるタンパク質を指す。本願発明の１つの実施形態において、ニューロン由来タンパク質は、ヒトの脳脊髄液（ＣＳＦ）試料中に存在するＡβオリゴマーである。このタンパク質は、ニューロン以外の細胞または組織におけるＡβから形成され得る他のＡβオリゴマーと区別される。
【００２０】
本明細書において用いる場合の用語「ＡＤＤＬ」または「アミロイドβ由来拡散性リガンド」または「アミロイドβ由来痴呆化リガンド」は、２つ以上のＡβタンパク質単量体を含む神経毒性、可溶性、球状、非原線性オリゴマー構造を指す。より高次のオリゴマー構造をＡβ４２からばかりでなく、可溶性非原線維性Ａβオリゴマー構造を安定的に形成できる任意のＡβタンパク質、例えば、Ａβ４３またはＡβ４０からも得ることができる。米国特許第６，２１８，５０６号明細書および国際公開第０１／１０９００号パンフレット。
【００２１】
本明細書において用いる場合の用語「Ａβ原線維」または「原線維」または「原線維性アミロイド」は、チオフラビンＳなどの色素とのそれらの複屈折のためヒトおよびトランスジェニックマウス脳組織において検出される、Ａβの不溶性種を指す。Ａβ単量体から成る線維様構造を形成するＡβ種は、βプリーツシートを含む。これらの種は、ＡＤ脳において見つけられる細胞外アミロイド斑構造の直接前駆体であると考えられる。
【００２２】
本明細書において用いる場合の用語「Ａβ４０単量体」または「Ａβ４２単量体」は、無細胞環境または細胞環境におけるアミロイドタンパク質前駆体（ＡＰＰ）に対するβ−セクレターゼおよびγ−セクレターゼによる酵素的切断、すなわちアスパラギン酸プロテアーゼ活性の直接産物を指す。β−セクレターゼによるＡＰＰの切断は、Ａｓｐ１（切断後のＡβペプチド配列についてのナンバリング）で始まるＡβ種を生成するが、γ−セクレターゼは、主として残基４０または４２のいずれかで、ＡβのＣ末端を遊離させる。
【００２３】
本明細書において用いる場合の用語「捕捉抗体」または「Ａβオリゴマー捕捉抗体」または「抗ヒトＩｇＧ２捕捉抗体」は、本明細書におけるアッセイにおいて捕捉抗体として使用する抗体を指す。本明細書において用いる場合の捕捉抗体は、液体試料中の測定および／または検出されるＡβオリゴマーまたはＡβオリゴマー／抗体複合体に結合する。本発明の１つの実施形態において、捕捉抗体は、抗Ａβオリゴマー抗体１９．３であり、検出される複合体は、１９．３／Ａβオリゴマーである。もう１つの実施形態において、捕捉抗体は、抗ヒトＩｇＧ２捕捉抗体であり、検出される複合体は、ＩｇＧ２／１９．２／Ａβオリゴマーである。
【００２４】
本明細書において用いる場合の用語「ＩｇＧ」または「ＩｇＧ２」は、抗体分子として機能する任意のタンパク質を指す。各ＩｇＧは、４つのペプチド鎖−２本の重鎖γと２本の軽鎖から成る。各ＩｇＧは、２つの抗原結合部位を有する。ヒトには４本のＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、２、３および４）があり、これらはそれらの血清存在度の順に名付けられている（ＩｇＧ１が最も存在度が高い）。ヒンジ領域の構造が、前記４つのＩｇＧクラスの各々にその特有の生物学的プロファイルを与える。
【００２５】
本明細書において用いる場合の用語「カッパ軽鎖」は、抗原結合ドメインと定常領域の両方を含有する、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の部分を指す。抗体分子１つにつき２本の軽鎖があり、これらは、染色体２または２２にそれぞれコードされているカッパ型またはラムダ型のいずれかのものであり得る。２本のカッパ軽鎖が２本の重鎖と共にＢ細胞内で生産され、ジスルフィド結合によって組み立てられて完全ＩｇＧ抗体分子を形成し、分泌されて体液性免疫防御システムの一部として機能することになる。
【００２６】
本明細書において用いる場合の用語「生体試料」または「液体試料」は、組織または脊椎動物と比較して、任意のタイプの液体を指す。本明細書におけるアッセイにおいて使用することができる典型的な例は、血液、尿、涙、唾液、および本発明の１つの実施形態において使用する脳脊髄液である。すべての他の種類の体液も、Ａβオリゴマーが存在するならば使用することができる。
【００２７】
本明細書において用いる場合の用語「アルツハイマー病」または「ＡＤ」または「アミロイド形成性障害」は、ダウン症候群、レビー小体型認知症、パーキンソン病、全臨床アルツハイマー病、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害、早期発症型アルツハイマー病（ＥＯＤ）、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）、アルツハイマー病に起因する認知症の進行認知障害によるもの（Ｊａｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｅｍｅｎｔ．，Ｍａｙ  ７（３）：２５７−２６２）およびＡｐｏＥ４対立遺伝子の存在に関連付けられる疾患を含む（しかしこれらに限定されない）疾患範囲からの脳内でのＡβ斑または神経原線維のもつれの形成および沈着に関連付けられるニューロンの変性の結果として生ずる認知症または認知障害の範囲を指す。
【００２８】
本明細書において用いる場合の用語「ＬｏＤ」の「検出限界」は、Ａβオリゴマーの不在を除き同一である試料より上の検出することができる最低濃度でのアッセイの感度を指す。Ａβオリゴマー不在下でのシグナルを「バックグラウンド」と定義する。本明細書において用いる場合、ＡβオリゴマーについてのＬｏＤを、前記バックグラウンドの平均より上の≧３標準偏差と定義した。
【００２９】
本明細書において用いる場合の「信頼定量下限」または「ＬＬｏＲＱ」は、バックルラウンドと確実にかつ再現可能に区別することができる最低濃度を示すための変動係数との組み合わせでのアッセイの感度を指す。この限界は、典型的に、感度の下端でのアッセイの実働範囲を規定し、および≧３の測定値を通して≦２０％の変動係数をもたらす濃度である。
【００３０】
選択的抗Ａβオリゴマー捕捉抗体の同定および特徴付け
Ａβオリゴマーに対して選択的かつ特異的なアッセイを開発するために、本出願人は、先ず、ＡＤＤＬ、非原線維性のＡβオリゴマー種に対して選択的でもあり、特異的でもある抗体を同定しようと努めた。フロイントアジュバント（第一および第二ワクチン、皮下的に）または不完全フロイントアジュバント（すべて後続ワクチン接種、腹腔内）のいずれかと１：１混合されたＡＤＤＬ  Ａβオリゴマー種でマウスを免疫することによって、抗ＡＤＤＬマウスモノクローナル抗体、３Ｂ３を生成した（米国特許第７，８１１，５６３号および同第７，７８０，９６３号明細書）。各注射は、１９４±２５μｇ全タンパク質と等価の精製ＡＤＤＬから成った。最高力価血清を有するマウスからの脾臓をポリエチレングリコールの存在下でＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させ、９６ウェルプレートにプレーティングした。５％ＣＯ２を用いて３７℃で１０日間、２００μＬのヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）選択培地中で細胞を培養した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補足したイスコフ変性ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を第１０日に１回、前記培養物に供給し、培養上清を第１４日に除去して、片側ＥＬＩＳＡを用いて陽性、Ａβオリゴマー抗体含有、ウェルについてスクリーニングした（実施例？）。抗体３Ｂ３を、Ａβ単量体またはＡβ原線維と比較してＡＤＤＬを優先的に結合するその能力に基づき、さらなる開発のために選択した（図１Ａ）。
【００３１】
マウスクローン１１／３Ｂ３をヒトＩｇＧ２抗体に変換し、１９．３と呼んだ。Ａβオリゴマー結合ドメインをコードする３Ｂ３の可変重および軽鎖ドメイン領域をシークエンシングし、これらのＣＤＲをコードする生成されたｃＤＮＡをヒトＩｇＧ２コンテキストに導入した。ｐＦａｂ３Ｄファージ・ディスプレイ・ベクター内に導入された３Ｂ３の可変重および軽鎖ドメインを用いて親和性成熟ライブラリーを生成した。それらのライゲーション産物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１細胞にトランスフェクトし、生産されたファージ培養上清を滴定し、濃縮し、ファージ・ライブラリー・パニング用のアリコートにした。その後、ビオチン化Ａβオリゴマーを使用してファージ・ライブラリー・パニングを行った。ビオチン化Ａβオリゴマーに結合したファージを溶出させ、大腸菌ＴＧ１細胞に再び添加した。前記Ａβオリゴマーと同じ方法（実施例１）を用いて、しかしＮ末端ビオチン化Ａβ４２ペプチド（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ、カリフォルニア州サニーヴェール）で出発して、ビオチン化Ａβオリゴマーを調製した。上で説明したＡβ単量体、ＡβオリゴマーおよびＡβ原線維差分結合ＥＬＩＳＡでの分析にファージ上清（約１００μＬ）を直接使用した。
【００３２】
３Ｂ３の軽鎖親和性成熟ライブラリーから生成された抗Ａβオリゴマー抗体１９．３は、２０１０年７月１４日出願の米国特許出願第６１／３６４，２１０号の優先権を主張する同時係属出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／ＸＸＸＸＸＸＸにおいて記載および特徴付けされており、および本明細書において用いる場合は以下のものを含む単離された抗体である：
下記配列（配列番号１）を有する軽鎖可変領域
2014521089.tif 000002
下記配列（配列番号２）を有する重鎖可変領域
2014521089.tif 000003
および
下記配列（配列番号３）を有する重鎖定常領域
2014521089.tif 000004
2014521089.tif 000005
抗Ａβオリゴマー抗体１９．３のＡβオリゴマー選択性
Ａβ４０単量体と比較してＡβオリゴマーに対する１９．３の結合能を確認するために、別々のＡβオリゴマーまたはＡβ４０単量体被覆プレートと共通の抗体滴定曲線を用いて片側ＥＬＩＳＡを完了した（図１Ｂ）。１９．３のＥＣ５０（半最大全Ａβオリゴマー結合の測度）は、ＡβオリゴマーおよびＡβ４０についてそれぞれ１．６ｎＭおよび４．３ｎＭであった。この形式で、１９．３抗体は、Ａβ４０単量体と比較してＡβオリゴマーに対しておおよそ３倍大きい最大結合を明示し、その上、その能力はおおよそ３．７倍大きかった。図１Ｂに示すように、１９．３は、Ａβ４０単量体と対比してＡβオリゴマーに対して、両方が独立してアッセイプレート表面に固定化されているとき、より大きい親和度を有した。したがって、本明細書において同定される抗Ａβオリゴマー抗体１９．３は、Ａβ４０単量体に比べてＡβオリゴマーを、各々が独立してアッセイプレートに結合しているとき、選択的に結合するが、本出願人は、ＡβオリゴマーとＡβ単量体種の両方が、溶解状態でまたはアッセイプレート上に固定化されて、体液または組織試料中で見いだされるであろうように同時に存在するときの１９．３の相対結合特性をさらに比較しようと努めた。
【００３３】
ＡβオリゴマーとＡβ単量体の両方が存在するであろうｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＳＦ試料をより正確に表すために、Ａβ４０単量体の存在下でのＡβオリゴマーに対する１９．３の親和度を競合ＥＬＩＳＡ形式で試験した（図１Ｃ）。１ウェルにつき５０ｐｍｏｌのＡβオリゴマーの調製物で先ず被覆し、次に２ｎＭの最終濃度の１９．３抗体を各ウェルに添加することによって、ＥＬＩＳＡプレートを調製した。１９．３のこの濃度、すなわち２ｎＭは、片側ＥＬＩＳＡで決定されたＡβオリゴマー結合についてのＥＣ５０濃度を表す（図１Ｂ）。Ａβオリゴマー被覆表面から１９．３を競合的に除去するために滴定曲線にＡβ４０単量体を加えることで、５．５μＭのＥＣ５０を得た。１ウェルにつき１００ｐｍｏｌのＡβ４０単量体を使用してＥＬＩＳＡプレートを被覆し、Ａβオリゴマーを使用して抗体結合について競合させたとき、ＥＣ５０は８．７ｎＭであった。これは、１９．３が、Ａβ４０単量体と比較して、溶解状態ででも固相中ででもＡβオリゴマーに対して高い親和度を有することを示した。したがって、Ａβオリゴマーから１９．３の５０％を置換するために必要なＡβ４０の濃度は、Ａβ４０に結合している１９．３を置換するために必要なＡβオリゴマーの濃度よりおおよそ６００倍高かった。１５００ｐＭのＡβ単量体と比較して、０．２００ｐＭまでのＡβオリゴマーの濃度がＡＤ患者からのＣＳＦ中で報告されている（Ｇｅｏｒｇａｎｏｐｏｕｌｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０２：２２７３−２２７６）。それ故、抗体１９．３は、Ａβ単量体のバックグラウンドレベルより高いＡβオリゴマーを検出するために必要とされることになる選択度を有するように見えた。その１９．３抗体と、ＡＤ脳においてＡβオリゴマーを検出するためのＥＬＩＳＡ形式で以前に報告されている検出抗体、８２Ｅ１（Ｘｉａ，ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６６：１９０−１９９）とを、さらなるアッセイ開発のためにカップリングさせた。８２Ｅ１（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＩＢＬ），Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス）を捕捉抗体と検出抗体の両方として使用したとき、８２Ｅ１／８２Ｅ１  ＥＬＩＳＡ、この抗体は、ヒトＣＳＦでの使用に必要なレベルより低い選択性を有した（データを示さない）。
【００３４】
ＡβオリゴマーサンドイッチＥＬＩＳＡにおけるＡβオリゴマー選好性抗体
サンドイッチＥＬＩＳＡ形式での捕捉および検出抗体ペア（表１）のスクリーニングにおいて、捕捉抗体としての１９．３と７３０５、抗Ａβオリゴマー抗体（２０Ｃ２、米国特許第７，７８０，９６３号明細書（この参考文献はその全体が参照により本明細書に援用されている））または８２Ｅ１（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＩＢＬ），Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス）のいずれかとの組み合わせは、Ａβオリゴマー標準曲線においてカゼイン・ブロッキング・バッファー中で同等に動作し、各々が４ｐｇ／ｍＬより下の検出限界（ＬｏＤ）を与えた（図２Ａ）。捕捉抗体と検出抗体の両方としての抗Ａβオリゴマー抗体の使用はＡβオリゴマーアッセイとして報告されているが、感度および選択性の絶対レベルがいずれも報告されておらず（６Ｅ１０／６Ｅ１０；Ｇａｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６８：２２０−２３０）、または選択性がヒトＣＳＦ中のＡβオリゴマーを測定するためのアッセイに望まれるものより低かった（８２Ｅ１／８２Ｅ１；Ｘｉａ，ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６６：１９０−１９９）。
【００３５】
ＧａｎｄｙもＸｉａもヒトＣＳＦ中でのＡβオリゴマーの検出を報告していないが、６Ｅ１０に関する本出願人の社内研究（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｗｏｒｋ）および８２Ｅ１に関してＩＢＬによって発表されたレポートは、それらの感度がヒトＣＳＦ中のＡβオリゴマー検出に必要な範囲であり得ることを示唆した。本出願人は、捕捉抗体と検出抗体の両方への同一抗体、例えば６Ｅ１０／６Ｅ１０（図２Ｂ）および１９．３／１９．３（図２Ｃ）の使用、ならびに捕捉抗体としてのみ１９．３を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイペア（図２Ａ、８２Ｅ１検出を用いる）を本明細書において比較した。表１に示すように、６Ｅ１０／６Ｅ１０および１９．３／１９．３は両方とも、１９．３／７３０５または１９．３／８２Ｅ１のいずれかと比較しておおよそ１００倍低減された感度を明示した。発光検出技術（ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌプレートリーダー、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いる１９．３／８２Ｅ１  ＥＬＩＳＡ（図２Ａ）は、おおよそ１．３ｐｇ／ｍＬのＬｏＤを生じさせた。このアッセイ形式において、ＡβオリゴマーのＬＬｏＲＱは４．２ｐｇ／ｍＬであり（この最低測度で２０％未満の変動係数を有し）、およびこのアッセイは、Ａβ４０単量体と比較してＡβオリゴマーシグナルに対しておおよそ１０００倍選択的であった。このアッセイを用いてＡβオリゴマーパラメータを評価したが、それは、以前の推定値（Ｇｅｏｒｇａｎｏｐｏｕｌｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｐｒｏｃ，．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０２：２２７３−２２７６）と一致するレベルでヒトＣＳＦ中のＡβオリゴマーレベルを確実に検出するために十分な感度ではなかった。この１９．３ｘ８２Ｅ１サンドイッチＥＬＩＳＡは、ヒト体液中の分析物を検出するためにより高い感度を有すると報告されている常磁性マイクロ粒子検出イムノアッセイプラットホーム（Ｅｒｅｎｎａ（登録商標）、Ｓｉｎｇｕｌｅｘ（登録商標）、カリフォルニア州アラミダ）へと進歩した。
【００３６】
表１
【表１】
2014521089.tif 000006
１１９．３ｘ８２Ｅ１と比較して低減された感度
２ヒトＣＳＦ中の許容できないバックグラウンド（フィブリノゲン交差反応性）
３１９．３ｘ８２Ｅ１と比較して低減された選択性
【００３７】
感度が向上したＡβオリゴマー選択的サンドイッチＥＬＩＳＡ
常磁性マイクロ粒子検出イムノアッセイシステム、Ｅｒｅｎｎａ（登録商標）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｎｇｕｌｅｘ（登録商標）、カリフォルニア州Ａｌｍｅｄａ）を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡで１９．３と７３０５（１９．３ｘ７３０５）の抗体ペアと、１９．３と８２Ｅ１（１９．３ｘ８２Ｅ１）の抗体ペアの両方を評価して、ヒトおよび非ヒト霊長類液体試料中のＡβオリゴマーの測定についてのアッセイ感度がさらに向上し得るかどうかを判定した。本発明の１つの実施形態では、ヒトＣＳＦ試料を使用してイムノアッセイを行った。
【００３８】
常磁性マイクロ粒子イムノアッセイ、例えばＥｒｅｎｎａ（登録商標）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍは、生体試料中にナノモル濃度（ｎＭ）範囲で存在するバイオマーカー、例えばＡβ４０およびＡβ４２に使用されているが、かかるイムノアッセイシステムが、フェムトモル濃度（ｆＭ）範囲でＣＳＦ試料中に存在するバイオマーカー、例えば本明細書におけるＡβオリゴマーを特異的にかつ確実に検出できることは、本明細書における本出願人の研究より前に実証されていない。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本出願人は、請求項記載のアッセイの特異性および感度が、選択され、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて使用される抗ＡＤＤＬ抗体ペアの特異性および感度に起因することができると考え、それを実証した。類似して、本出願人は、請求項記載のアッセイを例証するためにＥｒｅｎｎａ（登録商標）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを使用しているが、匹敵する感度を有する他の検出システムを本発明の方法において用いることができる可能性がある。
【００３９】
Ｅｒｅｎｎａ（登録商標）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｎｇｕｌｅｘ（登録商標）、カリフォルニア州Ａｌｍｅｄａ）を使用し、１９．３抗体をＥｒｅｎｎａ（登録商標）マイクロ粒子（ＭＰ）ビーズに共有結合でカップリングさせて（以後、「１９．３／ＭＰビーズ」と呼ぶ）、１９．３ｘ７３０５サンドイッチＥＬＩＳＡを行った。その後、標準曲線のＡβオリゴマーまたはＡβ４０単量体のいずれかを含有するバッファーと１９．３／ＭＰビーズを混合した。得られた１９．３／ＭＰビーズ／ＡβオリゴマーまたはＡβ４０複合体（以後「Ａβオリゴマー複合体」と呼ぶ）を洗浄し、蛍光タグ付き７３０５または８２Ｅ１検出抗体のいずれかをそのＡβオリゴマー複合体に結合させた。単一分子計数が可能な有標検出技術を用いる前記Ｅｒｅｎｎａ（登録商標）計器（米国特許第７，５７２，６４０号明細書参照）は、蛍光標識検出抗体をサンドイッチＥＬＩＳＡからのその放出後に測定した。表２に示すように、バッファー中のＡβオリゴマー標準物質の２倍希釈を用いる１９．３ｘ７３０５アッセイからのデータは、蛍光シグナルの線形二倍希釈（検出事象平均）と一致した。ニートアカゲザルＣＳＦ、すなわち、標準曲線のＡβオリゴマーを導入したＣＳＦによって生成されたシグナルは、タグ付き７３０５抗体の結合に起因する蛍光シグナルが両方の場合に等価であるが、１９．３ｘ８２Ｅ１サンドイッチアッセイが、全標準曲線にわたってスパイクされたＡβオリゴマーを検出できることを明示した。７３０５を検出抗体として使用するアッセイ形式では、これは、バッファーのみの場合にＡβオリゴマーを検出するために十分であるＡβオリゴマー希釈系列の範囲にわたって飽和している非特異的バックグラウンド（アカゲザルＣＳＦ中に存在する何らからのもの）があることを示した。その後、その蛍光シグナルは、１９．３抗体カップリングが不在の場合でさえ、裸のマイクロ粒子に対するものと同一であること（データを示さない）が判明し、これは、７３０５抗体交差反応性に起因する非特異的シグナルとも一致した。
【００４０】
表２
【表２】
2014521089.tif 000007
【００４１】
７３０５検出抗体を８３Ｅ１に置き換えてＥｒｅｎｎａ（登録商標）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して開発したＡβオリゴマー選択的サンドイッチＥＬＩＳＡの第二の実施形態も蛍光タグにカップリングさせた。表３に示すように、前記アッセイのこの実施形態は、ニートアカゲザルＣＳＦとＡβオリゴマー枯渇アカゲザルＣＳＦの両方における非特異的シグナルを排除し、これにより、７３０５抗体が非特異的シグナル源であったという確信がさらに裏付けられた。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、１９．３／７３０５抗体ペアについて観察された高いバックグラウンドシグナルは、１９．３／８２Ｅ１抗体ペアについて観察されなかった、ＭＰビーズへのＣＳＦフィブリノゲン結合に起因すると考えられた。Ａβオリゴマー選択的サンドイッチＥＬＩＳＡのこの実施形態は、０．０４ｐｇ／ｍＬのＡβオリゴマー標準物質のＬｏＤ、０．４２ｐｇ／ｍＬのＬＬｏＲＱ、およびＡβ４０単量体に比べてＡβオリゴマーに対するアッセイの５，０００倍の選択性を生じさせた（図３）。これらの発見に基づき、本出願人は、さらなる最適化にこのアッセイ形式を選択した。
【００４２】
表３
【表３】
2014521089.tif 000008
【００４３】
薬力学的（ＰＤ）アッセイ
上の発見を用いて、本出願人は、ＣＳＦ試料中のＡβオリゴマーのレベルを検出および測定するための、１９．３および８２Ｅ１抗体ペアを使用する、選択的ＡβオリゴマーサンドイッチＥＬＩＳＡを開発した。このアッセイは、生産を阻害するための、クリアランスを増加させるための、またはＡβオリゴマーレベルを別様に修飾するための処置後の分析物、すなわちＡβオリゴマー、レベルの変化（図９Ａ）を評定するためにそれを使用するため、従来的には、薬力学的（ＰＤ）アッセイと呼ばれることになる。このＰＤアッセイは、ＡＤ患者と非ＡＤ患者とを区別するために使用することもでき、すなわち診断的であることもあり、疾患の進行をモニターするために使用することもでき、すなわち予後的であることもあり、またはＡβオリゴマー濃度を変化させる疾患修飾処置の治療可能性をモニターするために使用することもできる。
【００４４】
前記ＰＤアッセイは、実施例７で説明するように、常磁性マイクロ粒子（ＭＰ）ビーズにカップリングさせた１９．３抗体（ＭＰビーズ／１９．３）をＥＬＩＳＡプレート上のウェル内に配置する。そのウェルにヒトＣＳＦまたはＡβオリゴマー標準物質（Ｔｒｉｓバッファーおよびウシ血清アルブミンに添加した希釈系列で）のいずれかを添加した。ウェル内に存在する一切のＡβオリゴマーに１９．３／ＭＰビーズが結合し、過剰な溶液を洗浄除去した。アッセイバッファー（１％トリトンＸ−１００、ｄ−デスチオビオチン、ＢＳＡを有するＴｒｉｓバッファー）中の検出抗体としての蛍光標識８２Ｅ１を、その洗浄したＭＰビーズ／１９．３／Ａβオリゴマー複合体に添加し、そのＡβオリゴマー複合体を結合するようにインキュベートした。得られたＭＰビーズ／１９．３／Ａβオリゴマー／８２Ｅ１複合体を溶出バッファーで洗浄し、蛍光標識８２Ｅ１抗体を一切の非結合抗体と共に溶出させた。溶液が流れ、レーザーによって励起される常磁性マイクロ粒子検出器、例えば、Ｅｒｅｎｎａ（登録商標）計器での検出は、検出される分子、すなわちＡβオリゴマーと等価の蛍光シグナルを生成および測定する単一分子の検出を可能にする（蛍光タグが特異的波長の光子を放射する）。Ａβ単量体と比較して、Ｅｒｅｎｎａ（登録商標）計器で測定したときのＡβオリゴマーの標準曲線を図３に示す。
【００４５】
ヒトＣＳＦ中のＡβオリゴマー
実施例６の１９．３ｘ８２Ｅ１  Ａβオリゴマー選択的サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、ヒトＣＳＦ試料中のＡβオリゴマーの内因性レベルを測定した（図４Ａおよび４Ｂ）。２つの別々の試料コホートにおいて、Ａβオリゴマーの存在により生成される蛍光シグナルは、若年または健常同年齢対照のいずれかと比較して、（２５未満のＭＭＳＥスコアを用いてＡＤほぼ確実と臨床診断された）ＡＤ  ＣＳＦ中で有意に高かった。観察されたＡβオリゴマーの絶対レベルは、ｐ＜０．０００４のｔ−検定、二元配置マン・ホイットニー・スコア（ｔ−ｔｅｓｔ，ｔｗｏ  ｗａｙ  Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｓｃｏｒｅ）で、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（カリフォルニア州ソラナビーチ）からのＣＳＦ試料中、ＡＤ（Ｎ＝２０）では２．１＋／−０．６１ｐｇ／ｍＬおよび同年齢対照（Ｎ＝１０）では０．５３＋／−０．２６ｐｇ／ｍＬであった（図４Ａ）。観察されたＡβオリゴマーの絶対レベルは、ｐ＜０．００２１のｔ−検定、二元配置マン・ホイットニー・スコアで、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ（ニューヨーク州ヒックスヴィル）からのＣＳＦ試料中、ＡＤ（Ｎ＝１０）では１．６６＋／−０．５ｐｇ／ｍＬおよび対照（Ｎ＝１０）では０．２４＋／−０．０５ｐｇ／ｍＬであった（図４Ｂ）。これらの２つのコホート（診断ＡＤ  ＣＳＦ試料の９０％）を併せると０．４２ｐｇ／ｍＬのＬＬｏＲＱより上であったが、同年齢対照の２０％しかまたは若年対照の１０％しかこの限界より上でなかった。すべての値は、０．０４ｐｇ／ｍＬのＬｏＤより上であった。Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎから得たＣＳＦ試料中のＡβ４０およびＡβ４２単量体レベルを測定し（それぞれ図５Ａおよび５Ｂ）、それらは、Ａβ４０についてはＡＤ  ＣＳＦと対照ＣＳＦ間で同等であった（図５Ａ）が、Ａβ４２についてはＡＤ試料において有意に低減された（図５Ｂ）。これは、ＡＤ  ＣＳＦの特徴として以前に報告されており（Ｄｅ  Ｍｅｙｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６７．９４９−９５６；Ｊａｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．９：１１９−１２８）、これらの試料の正確な診断を確証した。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本出願人は、ＡＤ  ＣＳＦ試料中のより低いＡβ４２レベルは、ＡＤ脳のアミロイド沈着物中でのＡβ４２の保持に起因すると考える。これらの観察された差を特異的に検出および定量できることは、これらのバイオマーカーをＡＤについての診断および予後判定手段として使用できることを示唆する。
【００４６】
診断アッセイについては、本明細書における本発明のアッセイから検出されるシグナル、すなわち、Ａβオリゴマーレベルは、典型的に、非ＡＤ患者について観察されるシグナルと比較してＡＤ患者について３倍を超えて高く（レベル＞０．５ｐｇ／ｍＬに）なるだろう。これは、同年齢対照と比較してＡＤ  ＣＳＦ中のＡβオリゴマーのレベルが４倍高かった図４Ａと、ＡＤ  ＣＳＦ中のＡβオリゴマーのレベルが８倍高かった図４Ｂの両方に示したデータと一致する。このデータは、早期病期で患者を同定するための本発明のＡβオリゴマーアッセイ（すなわち、予後アッセイ）の使用も支持する。年齢は、ＡＤの発現の最大リスク因子であり、ＡＤと同年齢対照間で観察される差は、ＡＤと若年対照間より小さかった。類似して、Ａβオリゴマー予後アッセイについては、２５未満のＭＭＳＥを有する患者は、対照と比較してＡＤ  ＣＳＦ中でのほうがおおよそ２倍低い、Ａβ４２単量体について検出されたシグナルと比較して、≧０．５ｐｇ／ｍＬの検出Ａβオリゴマーシグナル（２５より上のＭＭＳＥ／正常を有する患者より４から８倍高い）を有するだろう。図６は、≦２５のＭＭＳＥスコアをカットオフとして用い（Ｍｕｎｇａｓ，Ｄ．，１９９１，Ｇｅｒｉａｔｒｉｃｓ  ４６（７）：５４−５８）、それより上の患者を「正常健常」と見なし、それより下の患者を軽度認知障害がある、またはＡＤを有すると見なす場合、０．５ｐｇ／ｍＬのＡβオリゴマーレベルより上の患者は、２５未満のＭＭＳＥスコアを有する可能性が高いと予想されることになることを示唆している。
【００４７】
ターゲット・エンゲージメント（ＴＥ）アッセイ
類似して、上の発見を用いて、本出願人は、抗Ａβオリゴマー１９．３、ＩｇＧ２、抗体、すなわち、治療用抗体で処置した患者からのＣＳＦ試料中の結合Ａβオリゴマーのレベルを検出および定量するための、抗ヒトＩｇＧ２抗体ｘ８２Ｅ１抗体ペアを使用する、選択的サンドイッチＥＬＩＳＡを開発した。このアッセイは、治療用（捕捉）抗体にｉｎ  ｖｉｖｏで結合したＡβオリゴマーを測定するためにそれを使用するため、従来的には、ターゲット・エンゲージメント・アッセイ（ＴＥアッセイ）と呼ばれることになる。したがって、このＴＥアッセイを用いて、治療用抗体に結合したＡβオリゴマーのレベルを測定して、その治療因子によるＡβオリゴマーのエンゲージメントを確認することができる。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本出願人は、治療用抗Ａβオリゴマー抗体に結合したＡβオリゴマーのレベルは、ある期間にわたって該治療因子で処置を受けた被験体からのＣＳＦ試料におけるほうが低くなると考える。投与後に増加するまたは不変である結合Ａβオリゴマーのレベルは、その治療因子がＡＤの処置に適さないことを示唆することになる。あるいは、単にＡβオリゴマーを離隔し、それらを治療用抗体に結合させることによる場合には、脳内のニューロンとの相互作用低減のため、急性パフォーマンスに関して恩恵を得ることができる。しかし、この恩恵をＡβオリゴマー自体の変化と関連付けることはできない。ターゲット・エンゲージメント・アッセイは、最低でも、ＣＳＦ中のＡβオリゴマーをエンゲージする治療用抗体の能力を評定することになる。
【００４８】
ヒトＣＳＦマトリックス内にＡβオリゴマーをエンゲージするＡβオリゴマー特異的抗体の能力を実証するために、本出願人は、２０ｍ／ｋ（１００ｎｇ／ｍＬ、図８）をＩＶ投与した赤毛猿において２４時間の時点で存在すると考えられるレベルまで抗Ａβオリゴマー抗体１９．３にスパイクすることによりヒトＣＳＦ中で１９．３／Ａβオリゴマー複合体を生成した。この１９．３スパイクヒトＣＳＦ試料に、内因性Ａβオリゴマー濃度（０．１〜５．０ｐｇ／ｍＬ）に合せて（図４Ａおよび４Ｂ）、およびまた正常範囲より有意に上にそれらを上昇させて、両方で、漸増量のＡβオリゴマー標準物質を添加した。ヒトＣＳＦ中で形成された１９．３ｘＡβオリゴマー複合体を、ヒトカッパ軽鎖に対する抗体またはヒトＩｇＧ２に対する抗体のいずれかで被覆された９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上に捕捉し、その後、ＰＤアッセイのために行ったようにビオチン化８２Ｅ１（ｂ８２Ｅ１）で検出した（図３Ａ）。抗Ａβオリゴマー抗体１９．３は、バッファー中の抗ヒトカッパおよび抗ヒトＩｇＧ２の両方によって十分に認識された（▲、図７Ａおよび７Ｂ）。この抗体は、これらの両方の特徴を有するからである。図７Ａ（●、ＣＳＦ）に示すように、捕捉抗体として抗ヒトＩｇＧ２をおよび検出抗体として８２Ｅ１を使用して１９．３／Ａβオリゴマー複合体を検出および測定するアッセイは、捕捉抗体として抗ヒトカッパを使用するアッセイと比較してヒトＣＳＦ中で有意に良好な感度を生じさせる結果となった（●、ＣＳＦ、図７Ｂ）。両方のアッセイは、カゼインバッファー中で同等の感度を有した。１９．３／Ａβオリゴマー複合体を捕捉するための抗ヒトカッパの使用は、結果としてより低い感度をもたらし、１００ｎｇ／ｍＬ  １９．３に結合する４２ｐｇ／ｍＬ  ＡβオリゴマーのＬｏＤとなった。おそらくこれは、抗ＩｇＧ２を使用するアッセイ形式についてより高い感度をもたらす結果となったＩｇＧ２種と比較して、ヒトＣＳＦ中のカッパ軽鎖を有するＩｇＧ種のより高いバックグラウンドレベルのためである。ヒトまたは実験動物のいずれかへの治療用抗体として１９．３または関連ＩｇＧ２抗Ａβオリゴマー抗体の投与後、投与レベルの０．１〜０．２％の治療用抗体がＣＳＦ中で提示されると予想されるだろう（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，２００５，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  Ｆｌｕｉｄ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。ＣＳＦ中に存在する治療用抗体は、利用可能なＡβオリゴマーに結合されることになり、１９．３（ＩｇＧ２）／Ａβオリゴマー複合体は、その抗ヒト１９．３、ＩｇＧ２、抗体によって抗ＩｇＧ２捕捉抗体で捕捉されることになり、そしてその後、そのＡβオリゴマー複合体が８２Ｅ１で検出されることになる。このプラットホームの感度は、上記ＰＤアッセイで用いた常磁性マイクロ粒子検出システム、例えばＥｒｅｎｎａ（登録商標）イムノアッセイシステム（Ｓｉｎｇｕｌｅｘ（登録商標）、カリフォルニア州アラメダ）を使用すると向上する可能性が高いだろう。
【００４９】
ある期間にわたっての抗Ａβオリゴマー抗体での治療的処置後、１９．３／Ａβオリゴマー複合体について検出されるシグナルは、（処置前レベルと比較して）低減されることになると予想される。これらの複合体について急性に測定した場合であろうと、一定期間の治療的処置後に測定した場合であろうと、結合したＡβオリゴマーの量は、ターゲット、すなわちＡβオリゴマーとエンゲージした治療用抗体の割合を表し、その治療用抗体の効力の代理として役立てることができよう。
【００５０】
実施例
以下の略号を本明細書において用いる：Ａｂ：抗体；Ａβ：アミロイドベータタンパク質；ＡＤ：アルツハイマー病；ＡＤＤＬ：アミロイドβ由来拡散性リガンド；ａＭ：アトモル濃度；ＣＳＦ：脳脊髄液；ＤＥ平均：検出事象平均；ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド；ＨＦＩＰ：１，１，１，３，３，３ヘキサフルオロ−２−プロパノール；ＨＭＷ：高分子量；ＬＭＷ：低分子量；ＬｏＤ：検出限界；；ＬＬｏＲＱ：信頼定量下限。
【実施例１】
【００５１】
ＡＤＤＬ調製およびＡβ
Ａβ４０およびＡβ４２（アミロイドβペプチド１−４０、アミロイドβペプチド１−４２）は、カリフォルニア州サニーヴェールのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏ．から入手した。Ａβ４２をミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの１，１，１，３，３，３ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）に溶解して、凝集用の「シード」として作用し得る任意の既存二次構造を排除した。ＨＦＩＰを蒸発により除去し、Ａβ４２被膜を形成した。そのＡβ４２ペプチド被膜（１００％ＨＦＩＰ溶媒からドライダウンさせた１ｍｇ  Ａβ４２）を４４μＬのＤＭＳＯに溶解し、穏やかに混合しながらそれに１．９５６μＬの冷Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールズバッド、Ｃａｔ＃ＭＥ１０００１４Ｌ１）を添加し、室温で１８から２４時間インキュベートした。試料を１４，２００ｇで１０分間、室温で遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、４，０００ｒｐｍで１５分間、４℃でのスピンにより０．５ｍＬカラムＹＭ−５０フィルターチューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード；Ｃａｔ＃ＵＦＣ５０５０９６、０．５ｍＬ）に通して濾過した。フィルター挿入体を反転させることによってフィルター上残留物を回収し、新たな採取チューブに入れ、４，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離した。タンパク質濃縮物をＢｒａｄｆｏｒｄ  Ａｓｓａｙ（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ、Ｃａｔ＃＿２３２３６）によって濾過前に測定し、（Ａβ単量体分子量（ＭＷ４５１３）に基づいて計算した）μＭとして報告した。すべての試料を使用するまで−８０℃で保管した。
【実施例２】
【００５２】
抗ＡＤＤＬ抗体の選択
Ａ．ヒト化抗体ライブラリーのパニング
ヒト化抗ＡＤＤＬ抗体、ｈ３Ｂ３の親和性成熟ライブラリー（米国特許第７，８１１，５６３号および同第７，７８０，９６３号明細書参照）を構築し、その中の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の一部をランダム突然変異誘発に付した。全ＣＤＲ３領域をカバーするために、２つのサブライブラリーを造った。一方のライブラリーは、親重鎖可変領域と軽鎖ＣＤＲ３の左半分における突然変異アミノ酸とから成り、他方は、親重鎖可変領域と軽鎖ＣＤＲ３の右半分における突然変異アミノ酸とから成った。類似した戦略を３つのサブライブラリーに関する重鎖ＣＤＲランダム突然変異誘発に用いた。
【００５３】
当分野において公知の方法を用いる親和性成熟にヒト化３Ｂ３（ｈ３Ｂ３）を付した。ｈ３Ｂ３可変領域をＦａｂディスプレイベクター（ｐＦａｂ３Ｄ）にクローニングした。このベクターに、重および軽鎖についての可変領域を定常領域のＣＨ１ドメインおよびカッパ定常領域にそれぞれ合うようにインフレームで挿入した。Ｆａｂ３Ｄでは、ｍｙｃエピトープおよび６つの連続ヒスチジンアミノ酸がＣＨ１配列の後に続き、その後、ディスプレイ用のファージｐＩＩＩタンパク質に連結されている。ＰＣＲプライマー内に造られた変性オリゴヌクレオチド配列を使用して、重および軽鎖ＣＤＲ３中のすべての位置をランダム突然変異誘発した。物理的サイズを適応させるために、サブライブラリーを各々５〜６アミノ酸に焦点を合わせて構築した。ヒト３Ｂ３（Ｈ３Ｂ３）のベクターＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして使用して、突然変異ＰＣＲプライマー（表４）で重鎖と軽鎖の両方を増幅させた。ＰＣＲ増幅後、合成したＤＮＡ断片を１．３％アガロースゲル上で泳動させ、プライマーを除去し、可変断片：軽鎖可変クローニングについてはＢｓｉＷＩおよびＸｂａＩクローニング部位、重鎖可変クローニングについてはＸｈｏＩおよびＡｐａＩを制限酵素で消化した。
【００５４】
表４
【表４】
2014521089.tif 000009
【００５５】
ｐＦａｂ３Ｄファージ・ディスプレイ・ベクターに関する親和性成熟ライブラリーを構築するために、ｐＦａｂ３Ｄ−３Ｂ３  ＤＮＡを同じ制限酵素ペアで消化し、精製し、重鎖または軽鎖可変領域のＰＣＲ断片をＴ４リガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）で一晩、１６℃でライゲートした。その後、それらのライゲーション産物を大腸菌ＴＧ１エレクトロポレーション・コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンタクララ）にトランスフェクトし、その細菌培養物のアリコートをＬＢ寒天−カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）プレートにプレーティングしてライブラリーサイズを滴定した。残りの培養物を、大腸菌ライブラリーストックのためにカルベニシリンを有する大きいプレートにプレーティングして３０℃で一晩インキュベートするか、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド、１０１１ｐｆｕ／ｍＬ）に室温および３７℃で１０分間インキュベートすることによって感染させた。その後、カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）を有する２ＴＹ培地を添加し、振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。その後、カナマイシン（７０μｇ／ｍＬ）を添加し、振盪しながら一晩、３０℃で培養物を増殖させた。ファージ培養上清を滴定し、２０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）／ＮａＣｌでの沈殿によって濃縮し、ＰＢＳに再懸濁させ、０．２２μｍフィルターで滅菌し、ファージ・ライブラリー・パニング用のアリコートを作った。
【００５６】
その後、表５に要約するようにファージ・ライブラリー・パニングを行った。
【００５７】
表５
【表５】
2014521089.tif 000010
【００５８】
ファージ表面への非特異的結合を低減させるために、Ｆａｂディスプレイ・ファージ・ライブラリーからのインプットファージ（１００μＬ、約１０１１−１２ｐｆｕ）を９００μＬのブロッキング溶液（ＰＢＳ中の３％脱脂粉乳）でブロックした。磁気分離器内の２００μＬのビーズ懸濁液を回収し、上清を除去することによって、ストレプトアビジン被覆ビーズを調製した。その後、それらのビーズを１ｍＬのブロッキング溶液に懸濁させ、３０分間、回転ミキサにかけた。非特異的ストレプトアビジン結合ファージを除去するために、ブロッキングされたファージライブラリーをブロッキングされたストレプトアビジン被覆ビーズと混合し、３０分間、回転ミキサにかけた。その選択解除プロセスからのファージ懸濁液を２００μＬの抗原が入っている新たなチューブに移し、１０％ｂＡＤＤＬを添加し、抗体と抗原を結合させるために２時間インキュベートした。インキュベーション後、その混合物をブロッキングされたストレプトアビジン被覆ビーズに添加し、回転ミキサで１時間インキュベートして、ストレプトアビジンビーズ上にＡｂ／Ａｇ複合体を捕捉した。１０％ｂＡＤＤＬ／ファージ複合体を捕捉したビーズをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で５回洗浄し、その後、ＰＢＳのみで２回洗浄した。結合ファージをｂＡＤＤＬから２００μＬの１００ｍＭ  ＴＥＡで溶出させ、２０分間インキュベートした。その後、溶出ファージを５０ｍＬチューブに移し、１００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で中和し、０．６〜０．８の間のＯＤ６００ｎｍを有する１０ｍＬの大腸菌ＴＧ１細胞に添加した。振盪しながら１時間、３７℃でのインキュベーション後、培養アリコートをＬＢ寒天−カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）プレートにプレーティングして、アウトプットファージ数を滴定し、残存細菌を遠心分離し、５００μＬ  ２ｘＹＴ培地（Ｔｅｋｎｏｖａ、カリフォルニア州ホリスター）で懸濁させ、１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンおよび１％グルコースが入っているバイオアッセイＹＴ寒天プレート（Ｔｅｋｎｏｖａ、カリフォルニア州ホリスター）にプレーティングした。それらのバイオアッセイプレートを一晩、３０℃で増殖させた。
【００５９】
各パニングラウンド後、単一コロニーをランダムに選び取って９６ウェルプレートでファージを生産した。９６ウェルプレート内でのファージ調製の手順は、ファージ沈殿段階を用いなかったことを除き、上で説明したものに類似していた。１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび０．１％グルコースを有する１２０μＬの２ｘＹＴ培地（１６ｇ  Ｂａｃｔｏ−トリプトン、１０ｇ  Ｂａｃｔｏ−酵母エキス、５ｇ  ＮａＣＬ（すべて、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州フランクリンレイク）、１Ｌ（オートクレーブ）にするためのｄｄＨ２Ｏ）中で増殖中のコロニーが入っている培養プレートを、４５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃のＨｉＧｒｏ（登録商標）振盪機（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ミシガン州アナーバー）で一晩インキュベートした。ファージ上清（約１００μＬ）を、上で説明したＡβＤＤＬ結合ＥＬＩＳＡでの分析に直接用いた。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートさせた抗Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウィスコンシン州ウォーケショー）でＡＤＤＬへのファージの結合を検出した。
【実施例３】
【００６０】
ＡβオリゴマーおよびＡβ４０に対する１９．３  ＥＣ５０決定
高タンパク質結合プレートをＰＢＳ中の１００ｐｍｏｌ／ウェル  Ａβ４０または５０ｐｍｏｌ／ウェル  Ａβオリゴマーのいずれかで、一晩、４℃で被覆した。翌日、プレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で５回洗浄し、一晩、カゼイン・ブロッキング・バッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０でブロッキングした。実施例２において同定した１９．３抗体を０から１５μｇ／ｍＬでの１２点３倍希釈系列で試験した。２時間、室温でのインキュベーション後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼコンジュゲート型抗ヒトＩｇＧ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を０．０８μｇ／ｍＬで添加した。４５分間、室温でのインキュベーション後、プレートを洗浄し、Ｔｒｏｐｉｘ  ＣＤＰ  ｓｔａｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）を添加した。３０分後にＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）プレートリーダーで発光を検出した（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）ソフトウェアを用いて曲線フィットを完了した。
【実施例４】
【００６１】
ＡβオリゴマーおよびＡβ単量体での競合結合アッセイ
ＡβオリゴマーおよびＡβ単量体での競合結合アッセイにより、１９．３抗体を使用してＡβオリゴマーに対する結合の選好を実証した。カゼイン・バッファー・ブロッキング段階まで、上の実施例３のようにＡβオリゴマープレートを調製した。１００ｐｍｏｌ／ウェルを使用して、同様にＡβ４０単量体被覆プレートを調製した。実施例２からの１９．３抗体を４ｎＭ（上の実施例３で決定したとおりのＡβオリゴマーについてのＥＣ５０）で各ウェルのカゼイン・ブロッキング・バッファー・マトリックスに塗布し、振盪しながら３０分間、室温でＡβオリゴマーまたはＡβ４０と相互作用させた。ＡβオリゴマーまたはＡβ４０のいずれかについての、１０μＭで出発する１２点３倍濃度曲線を抗体含有ウェルに適用した。Ａβオリゴマーで被覆したプレートについては、Ａβ４０をウェルに添加した；Ａβ４０プレートについては、Ａβオリゴマーをウェルに添加した。それらのプレートを１時間半、室温でインキュベートした。残留抗体結合の検出とＥＣ５０計算の両方を上の実施例３において判定した。
【実施例５】
【００６２】
ＥｎｖｉｓｉｏｎプラットホームでのサンドイッチＥＬＩＳＡ
Ａ．Ａβオリゴマーアッセイ：サンドイッチＥＬＩＳＡを前記競合Ａβオリゴマー調製またはヒトＣＳＦに適用した。１９．３Ａβオリゴマー選好性抗体を一晩、４℃で重炭酸ナトリウムバッファー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＃２８３８２、マサチューセッツ州ウォルサム）中、１ウェルにつき０．５μｇで被覆した。翌日、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ−Ｔ）でそれらのウェルを洗浄し、０．１％Ｔｗｅｅｎを添加したＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＃３７５２８、マサチューセッツ州ウォルサム）中、２００μＬ／ウェルのカゼインバッファーで一晩、４℃でブロッキングした。Ａβオリゴマー標準物質またはＳＥＣ画分をカゼインバッファーで希釈し、１００μＬ／ウェルで添加した。標準曲線の線形範囲内のシグナルを与える希釈物を計算に使用した。翌日、プレートをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ビオチン−８２Ｅ１（ＩＢＬ、番号１０３２６、カナダ国オンタリオ州トロント）を１時間、室温でカゼインバッファー中１００μＬ／ウェルで添加した。それらのプレートを再びＰＢＳ−Ｔで洗浄し、Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ−ＡＰ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＃３１００２、マサチューセッツ州ウォルサム）を３０分間、室温で添加した。最後に、追加のＰＢＳ−Ｔ洗浄後、Ｔｒｏｐｉｘ（登録商標）ＣＤＰ（登録商標）−Ｓｔａｒ化学発光基質（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）、カリフォルニア州カールズバッド）を３０分間、添加した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）プレートリーダーで発光を定量した。
【００６３】
Ｂ．Ａβ単量体アッセイ：Ａβ４０（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏ、カリフォルニア州サニーヴェール）を１，１，１，３，３，３ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）に溶解した。そのＨＦＩＰを蒸発によって除去し、その後、乾燥させたペプチド被膜をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）に再溶解した。ＥＬＩＳＡおよび／または試薬のビオチン化を行うための標準法は、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ，Ｌａｎｅ  Ｄ（１９８８））で見つけることができる。市販抗体、例えば６Ｅ１０、１２Ｆ４およびＧ２１０（Ｃｏｖａｎｃｅ、ニュージャージー州プリンストン）を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡプロトコルを用いるＡβ単量体の検出方法は、以前に報告されている（Ｓａｎｋａｒａｎａｙａｒａｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．．３２８：１３１−１４０）。
【実施例６】
【００６４】
ヒトＣＳＦ試料
臨床確認されたＡＤ、若年対照、または同年齢対照患者からのＣＳＦ試料をＢｉｏＲｅｃｌａｍａｔｉｏｎ（ニューヨーク州ヒックスヴィル）またはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｍｅｄ（カリフォルニア州ソラナビーチ）から購入した。一般に是認されている精神状態短時間検査（ＭＭＳＥ）を用いて認知診断を行った。ＡＤ  ＣＳＦにおいて不変であるか有意に低減されると報告されているＥＬＩＳＡ（実施例５Ｂ）によるＡβ４０およびＡβ４２単量体のそれぞれの測定によって、試料の性質を確認した。
【実施例７】
【００６５】
非ヒト霊長類における１９．３の薬力学的分析
霊長類ＣＳＦ中の１９．３の存在を確認するために、大槽がポートされた赤毛猿のコホートにおいて抗Ａβオリゴマー抗体１９．３についての研究を行った。６匹のサル（雄３匹／雌３匹）に抗体１９．３（２０ｍｇ／ｋｇ）の単回静脈内ボーラスを投与した。ＣＳＦ試料を大槽ポート（ｃｉｓｔｅｒｎａ  ｍａｇｎａ  ｐｏｒｔ）から様々な時点で採取し、ＣＳＦ中の抗体１９．３の濃度を抗ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡアッセイで決定した。本出願人は、抗体１９．３が霊長類ＣＳＦに入ることができ、最初の２４時間の間、濃度が上昇し、約１００ｎｇ／ｍＬでピークに達することを発見した。この濃度が、ターゲット・エンゲージメント・アッセイの開発のためにヒトＣＳＦにスパイクした抗Ａβオリゴマー抗体１９．３のレベルを導いた。
【実施例８】
【００６６】
ＡβオリゴマーサンドイッチＥＬＩＳＡ常磁性マイクロ粒子ベースイムノアッセイ
常磁性マイクロ粒子ベースのイムノアッセイプラットホーム（Ｅｒｅｎｎａ（登録商標）イムノアッセイシステム、Ｓｉｎｇｕｌｅｘ（登録商標）、カリフォルニア州Ａｌｍｅｄａ）を使用してＡβオリゴマーサンドイッチＥＬＩＳＡを行って、ヒト試料またはＡβオリゴマー標準物質中のオリゴマーレベルを決定した。捕捉用のマイクロ粒子（ＭＰ）は、１ｍｇのＭＰにつき１２．５μｇの捕捉試薬、Ａβオリゴマー抗体１９．３を結合させることによって調製した（下記方法を参照されたい）。それらの１９．３結合ＭＰをアッセイバッファー（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｄ−デスチオビオチン、０．１％ウシ血清アルブミンを有するＴｒｉｓバッファー）中１００μｇ／ｍＬに希釈し、（３％ウシ血清アルブミンを含有するＴｒｉｓバッファーで希釈した）１００ｕＬのＣＳＦ試料または標準物質に１００ｕＬで添加し、その後、２時間、２５℃でインキュベートした。それらのＭＰを磁性ベッドによって保持し、アッセイ希釈剤を使用してＴＨｙｄｒｏｆｌｅｘプレートウォッシャー（Ｔｅｃａｎ、スイス国メンネドルフ）を使用する単一洗浄段階で未結合材料を除去した。Ａｌｅｘａ蛍光標識検出抗体、８２Ｅ１（下記実施例のとおりに調製したもの）を５００ｐｇ／ｍＬの最終濃度に希釈し、０．２μｍフィルター（Ｐａｌｌ  ４１８７、ニューヨーク州フォートワシントン）に通して濾過した。その抗体を２０μＬ／ウェルの個々の試料粒子に添加した。それらのＥＬＩＳＡプレートをＪｉｔｔｅｒｂｕｇ（Ｂｏｅｋｅｌ、ペンシルバニア州フィースターヴィル）で振盪しながら１時間、２５℃でインキュベートした。ウェルをアッセイバッファーで４回洗浄し、一切の未結合検出試薬を除去した。ＭＰ／１９．３／Ａβオリゴマー／８２Ｅ１複合体を新たなプレートに移し、バッファーを吸引除去し、１０μＬ／ウェルの溶出バッファーを添加し、その後、Ｊｉｔｔｅｒｂｕｇにおいて速度５で振盪しながら５分間、２５℃でインキュベートした。溶出したｆｌｕｏｒ標識検出抗体８２Ｅ１を、１０μＬ／ウェルの中和バッファーが入っている３８４プレートに移し、常磁性マイクロ粒子検出器（Ｅｒｅｎｎａ（登録商標）、Ｓｉｎｇｕｌｅｘ（登録商標）、カリフォルニア州アラメダ）を用いて１ウェルあたりの読取り時間６０秒で読み取った。
【００６７】
Ａ．捕捉抗体標識
１．Ａβオリゴマー抗体（１９．３）のダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（ＭＰビーズ）への結合：磁石を使用して５０μＬダイナビーズから上清を除去する。５μｇの１９．３を含有する２００μＬの抗体結合・洗浄バッファー、例えばＲＩＰＡバッファー［＃９８０６、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、マサチューセッツ州ベヴァリー］にダイナビーズを懸濁させる。回転させながら室温で１０分間、インキュベートする。１９．３／ＭＰビーズ複合体から磁石で上清を除去する。その複合体を２００μＬの結合・洗浄バッファーで洗浄する。
【００６８】
２．Ａβオリゴマー抗体（１９．３）のダイナビーズ（ＭＰビーズ）へのカップリング：使用する直前に、コンジュゲーションバッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７〜９））中の５ｍＭ  ＢＳ３溶液（スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）、Ｃａｔ．＃２１５８０  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ウォルサム）を作る；２５０μＬのこの溶液が試料（５μｇ  １９．３／５０μＬ  ＭＰビーズ複合体）ごとに必要とされる。１９．３とカップリングしたＭＰビーズ（１９．３／ＭＰビーズ）を２００μＬのコンジュゲーションバッファーで２回洗浄する。磁石の上に置き、上清を廃棄する。その１９．３／ＭＰビーズを２５０μＬの５ｍＭ  ＢＳ３に再懸濁させる。傾斜／回転させながら３０分間、室温でインキュベートする。１２．５μＬのクエンチングバッファー（１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５））を添加することにより架橋反応をクエンチし、傾斜／回転させながら室温で１５分間インキュベートする。それらの架橋ＭＰビーズを２００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄する。上記アッセイプロトコルでのような使用のためにアッセイバッファー中１００μｇ／ｍＬにＭＰビーズを希釈する。
【００６９】
Ｂ．検出抗体標識
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６の８２Ｅ１へのカップリング：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）に匹敵する蛍光タグに、その製造業者のプロトコルに従って、８２Ｅ１をカップリングさせた。簡単に言うと、８２Ｅ１を１ｍｇ／ｍＬに希釈し、十分の一の容量の１Ｍ重炭酸ナトリウムバッファーを添加した。この８２Ｅ１溶液（１００μＬ）をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６色素のバイアルに添加し、そのバイアルに蓋をし、穏やかに反転させてその色素を溶解し、室温で１時間撹拌した。カラムをスピンさせて一切の非標識蛍光タグを検出抗体から分離し、この間にそのカラムにＣｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｃ（ＢｉｏＧｅｌ（登録商標）Ｐ−３０、ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）精細サイズ排除精製樹脂を負荷する。ゲルバッファーを排液した後、１００μＬの１９．３／ＭＰビーズおよび色素反応容量をスピンカラムの頂部の樹脂の中央に添加し、ゲルベッドに吸収させた。そのカラムに室温で１００μＬの溶出バッファー（０．２ｍＭアジ化ナトリウムを有する、０．０１Ｍリン酸カリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）をゆっくりと添加した。追加の溶出バッファーを添加し、カラムを実行するときに照明して染色された／タグ付きの抗体の前面を見えるようにした。第一カラム色素ラインは、標識抗体である。遊離色素はカラムベッドに残存し、そのスピンカラムを廃棄する。
【００７０】
ヒトＣＳＦ試料をＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ（ニューヨーク州ヒックスヴィル）から得、解凍後、氷上で保持した。そのＣＳＦ試料を０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＣＳＦに添加して１：５０希釈した２．５％Ｔｗｅｅｎ−２０ストック）で処理した後、試料採取した。試料またはＡβオリゴマー標準物質を、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を有するＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）に添加して希釈した。１９．３とカップリングしているＭＰを、ＴＢＳ／０．１％ＢＳＡ／１．０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するアッセイバッファー中１００μｇ／ｍＬの最終濃度に希釈した。９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬの試料／標準物質および１００μＬの１９．３被覆ＭＰを添加した。試料をＭＰと共に６０分間、室温（ＲＴ）でインキュベートし、ＴＢＳ／０．１％ＢＳＡ／１．０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ＭＰ再懸濁バッファーの添加後、磁気分離を用いて１回洗浄した。蛍光標識検出抗体、８２Ｅ１を１ウェルにつき２０μＬで添加し、３０分間、室温でインキュベートし、その後、磁気分離を用いてＭＰ再懸濁バッファーで４回洗浄した。蛍光タグを検出抗体８２Ｅ１から溶出させ、５分間、室温でインキュベートした。溶出物を中和バッファーが入っているマイクロプレートに移し、１ウェルあたりの読取り時間６０秒で磁性マイクロ粒子（ＭＰ）を読取ることができる検出装置、例えばＥｒｅｎｎａ（登録商標）計器（Ｓｉｎｇｕｌｅｘ（登録商標）、カリフォルニア州Ａｌｍｅｄａ）に移した。
【実施例９】
【００７１】
Ａβオリゴマー複合体サンドイッチＥＬＩＳＡターゲット・エンゲージメント（ＴＥ）アッセイ
治療用抗体と共に使用するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで形成された抗体／Ａβオリゴマー複合体を検出するためのターゲット・エンゲージメント・アッセイとして使用するためのＡβオリゴマー複合体サンドイッチＥＬＩＳＡを行って、ターゲット・エンゲージメントを証明することまたは１９．３／Ａβオリゴマー複合体を低減させる治療用抗体の効力を実証することができる。抗ヒトＩｇＧ２または抗ヒトカッパ（両方ともＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、アラバマ州Ｂｉｒｍｉｎｇｎａｍからのもの）のいずれかを、４℃で一晩、重炭酸ナトリウムバッファー（ＢｕｐＨ  Ｃａｒｂｏｎａｔｅ−Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｐａｃｋ、＃２８３８２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）中、１ウェルにつき０．５μｇで被覆した。翌日、それらのウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ−Ｔ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）で洗浄し、０．１％Ｔｗｅｅｎを有するＰＢＳ中の２００μＬ／ウェルのカゼインバッファーを添加して一晩、摂氏４度（４°Ｃｅｌｃｉｕｓ）でブロックした。１９．３抗体を微量遠心管（Ａｘｙｇｅｎ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ユニオンシティー、ＭＣＴ−１７５−Ｌ−Ｃ）の中のカゼインバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）またはヒトＣＳＦに０．１００μｇ／ｍＬでスパイクした。１９．３レベルを一定に保ってＡβオリゴマーを様々な濃度でスパイクして、標準曲線を得た。抗体（１９．３）／Ａβオリゴマー複合体の形成を可能にするために試料を４℃で一時間撹拌させた。１００μＬ試料／ウェルを抗ヒトＩｇＧ２または抗ヒトカッパ被覆プレート（ｎ＝３）に塗布し、プレート振盪器を用いて一晩、４℃でインキュベートした。翌日、それらのプレートをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ビオチン−８２Ｅ１（ＩＢＬ、ミネソタ州ミネアポリス、番号１０３２６）を１００μＬ／ウェルで添加し、１時間、室温で、カゼイン・ブロッキング・バッファー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、ミズーリ州セントルイス）、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で１：５０００希釈した。それらのプレートを再びＰＢＳ−Ｔで洗浄し、Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ−ＡＰ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム、＃３１００２）をカゼインバッファーで１：２０，０００希釈し、その後、３０分間、室温で添加した。追加のＰＢＳ−Ｔ洗浄後に３０分間、Ｔｒｏｐｉｘ  ＣＤＰ  ｓｔａｒ発光基質（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー、Ｔ２２１４）を塗布した。ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）で発光を定量した。
【図１Ａ】
2014521089.tif 000011
【図１Ｂ】
2014521089.tif 000012
【図１Ｃ】
2014521089.tif 000013
【図２Ａ】
2014521089.tif 000014
【図２Ｂ】
2014521089.tif 000015
【図２Ｃ】
2014521089.tif 000016
【図３】
2014521089.tif 000017
【図４Ａ】
2014521089.tif 000018
【図４Ｂ】
2014521089.tif 000019
【図５Ａ】
2014521089.tif 000020
【図５Ｂ】
2014521089.tif 000021
【図６】
2014521089.tif 000022
【図７Ａ】
2014521089.tif 000023
【図７Ｂ】
2014521089.tif 000024
【図８】
2014521089.tif 000025
【図９Ａ】
2014521089.tif 000026
【図９Ｂ】
2014521089.tif 000027
【配列表】
2014521089000001.xml
【国際調査報告】
2014521089.tif 000032