(57)【要約】  本開示は、脳梗塞を患う患者において、脳機能を改善する、または脳機能の喪失を予防する、および／または運動障害を治療するもしくは予防する、および／または脳神経細胞を再生させる方法であって、対象に、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳梗塞を患う対象において脳機能を改善するまたは脳機能の喪失を予防する方法であって、対象に、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む方法。
【請求項２】
対象における脳機能の改善が、対象にける運動障害を改善する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
脳梗塞を患う対象における運動障害を治療するまたは予防する方法であって、対象に、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む方法。
【請求項４】
運動障害が、麻痺、局部麻痺、言語不明瞭、非協調運動、筋力低下、緊張低下、緊張亢進または異常不随意運動である、請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
脳梗塞を患う対象における脳神経細胞を再生させる方法であって、対象に、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む方法。
【請求項６】
脳神経が、大脳皮質にある、請求項５記載の方法。
【請求項７】
脳神経細胞が、運動皮質および／または感覚皮質にある、請求項６記載の方法。
【請求項８】
脳梗塞が、虚血性脳梗塞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
虚血性脳梗塞が、対象における中大脳動脈の閉塞に起因する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
対象に、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を、対象に、脳梗塞後、１時間と２週間の間に投与することを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
対象に、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を、脳梗塞後、２４時間以内に投与することを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
細胞がさらに、組織非特異型アルカリフォスファターゼ（ＴＮＡＰ）および／または熱ショックタンパク質９０β（ＨＳＰ９０Ｐ）およびまたはＣＤ１４６を発現する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
細胞の集団が骨髄または歯髄に由来する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を全身投与する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を、対象の脳に局所投与する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された集団および／またはそれに由来する可溶性因子を、対象の大脳に局所投与する、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
脳機能を改善する、および／または脳神経細胞を再生させるのに充分な用量の、集団および／または子孫および／またはそれに由来する可溶性因子を投与する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
集団および／または子孫および／またはそれに由来する可溶性因子を複数回投与する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
集団および／または子孫および／またはそれに由来する可溶性因子を、４以上の週毎に１回投与する、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ｋｇあたり０．１×１０６から５×１０６個の間のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ｋｇあたり０．３×１０６から２×１０６個の間のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
低用量の、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
低用量の、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫が、ｋｇあたり０．１×１０５と０．５×１０６個の間のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞が富化された集団が、オートジェネイック（ａｕｔｏｇｅｎｅｉｃ）もしくは同種異系である、および／または可溶性因子が、オートジェネイックもしくは同種異系の細胞に由来してもよい、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞が富化された集団を、投与に先立って、および／または可溶性因子を得るのに先立って培養増殖する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫細胞ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を、前記ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫細胞および／またはそれに由来する可溶性因子ならびに担体および／または賦形剤を含む組成物の形態で投与する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
脳梗塞後の対象における脳機能を改善する、または脳梗塞後の対象における運動障害を治療する、または脳梗塞後の対象における脳神経細胞を再生させるのに使用する、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子。
【請求項２９】
脳梗塞後の対象において脳機能を改善する、または脳梗塞後の対象において運動障害を治療する、または脳梗塞後の対象において脳神経細胞を再生させる医薬の製造における、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１２年６月３に出願された、「脳梗塞の影響を治療する方法」と題された米国特許出願第６１／４９３，０５７号からの優先権を主張する。その内容全体は、ここに参照により組み込まれる。
【０００２】
配列表
配列表は、本出願とともに電子出願される。配列表の内容全体は、ここに参照により組み込まれる。
【０００３】
本開示は、対象における脳梗塞の影響を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
脳梗塞は、オーストラリアでは、心臓病患後の２番目に大きな死亡原因であり、能力障害の一番大きな原因である。脳梗塞は、米国では３番目に大きな死亡原因であり、毎年、１４０，０００人以上が、脳梗塞が原因で死亡している。脳梗塞はまた、米国において、長期にわたる深刻な機能障害の一番大きな原因である。米国で２００５年から２０５０年の期間に脳梗塞に関して予想されるコストは、２．２兆米国ドルである。
【０００５】
機能障害は、脳梗生存者の７５％に影響を与え、それらの人々の雇用可能性を低下させるのに充分である。脳梗塞は、身体的、精神的、情動的に、またはそれら３つが組み合わさって、対象に影響を及ぼす可能性がある。
【０００６】
脳梗塞の結果として生じうる一部の身体的機能障害には、筋力低下、無感覚、褥瘡、肺炎、失禁、失行(学習動作の実行不能)、日常活動の実行困難、食欲喪失、言語喪失、視覚喪失、および疼痛が挙げられる。もし脳梗塞が充分に重症である、または脳幹の一部といったある特定の場所である場合には、昏睡または死亡という結果になる可能性がある。
【０００７】
脳梗塞の結果生じる情動面の問題は、脳の情動中枢の損傷、または新たな制約に対する適応の障害やフラストレーションから生じる可能性がある。脳梗塞後の情動面の障害には、鬱、不安、パニック発作、平坦な情動、(感情を表現できない)、躁、無関心、および精神病が挙げられる。
【０００８】
脳梗塞の結果生じる認識障害には、知覚障害、言語障害、会話障害、痴呆、および注意力と記憶力の障害が挙げられる。脳梗塞を患う者は、自身の機能障害に気づいていないことがあり、これは疾病失認と呼ばれる状態である。半側空間無視と呼ばれる状態では、患者は、損傷した半球の反対側でのいかなる物にも注意を向けることができない。
【０００９】
脳梗塞の患者の最高１０％が、もっとも多くは事象にひき続く１週間後で、発作を発症する。脳梗塞の重症度は、発作の尤度を増加させる。
【００１０】
脳梗塞は、脳への血液供給の障害による脳機能の喪失が、急速に発症するものである。これは、閉塞（血栓症、動脈塞栓症）、または出血（血液の漏出)に起因する虚血(血流の欠如)による可能性がある。結果として、脳の患部は機能しなくなり、その結果、対象は、半身の１つまたは複数の肢を動かすことができなくなる、会話を理解する、もしくは会話を成立させることができなくなる、または視野の片側を見ることができなくなることになりかねない。脳梗塞はしばしば、神経細胞の死という結果を生じ、死に至る可能性もある。
【００１１】
２つのよく知られた型の脳梗塞があり:(i)虚血性脳梗塞、これは、一時的または持続的な、脳への血流の閉塞によって生じ、脳梗塞の症例の８５％を占め、(ii)脳出血、これは、血管の破裂によって生じ、残りの症例の大部分を占めるものである。虚血性脳梗塞のもっとも多い原因は、中大脳動脈 (内頸動脈から下流の頭蓋内動脈)の閉塞であり、これは、大脳(例えば、大脳皮質)、例えば、運動皮質や感覚皮質を損傷させる。そうした損傷の結果、片麻痺、片側感覚脱失、そして、脳半球の損傷に依存して、言語障害または視空間障害のどちらかが生じる。
【００１２】
虚血性脳梗塞の現在の治療は、虚血性ペナンブラ、すなわち、構造の完全性は保持しているが電気的機能を喪失した、脳の中程度の低灌流領域をレスキュー（rescue）することに焦点を当ててきた。現状では、脳梗塞後の結果を改善する、臨床的に証明された治療は:
・さらなる脳梗塞を予防するアスピリン、
・閉塞を逆転させる組織プラスミノーゲン活性化因子を用いた緊急血栓溶解、
・ストロークユニット(stroke unit)での管理、および
・頭蓋内圧を低下させる半頭蓋切除、の４つしかない。
【００１３】
しかしながら、そうした治療は、進行中の神経細胞損傷を軽減しようとするだけのものであって、喪失した神経細胞または脳機能を修復するものではない。
【００１４】
一部の神経保護剤が、脳梗塞の治療における有効性について試験され、うまくいかなかったが、それらには、Ｎ−メチル−D-アスパルテート受容体拮抗薬、ナルメフェン（nalmefene）、ルベルゾール（lubeluzole）、クロメチアゾール（clomethiazole）、カルシウムチャネル遮断薬（ａ−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチルイソキサゾールー４−プロプリオン酸拮抗薬、セロトニン作動薬（例えばレピノタン（repinotan））、およびトランスメンブレンカリウムチャネル調節剤を含む）、チリラザド（tirilazad）、抗ＩＣＡＭ−Ｉ抗体、ヒト抗白血球抗体（Ｈｕ２３Ｆ２Ｇ）、抗血小板抗体（例えばアブシキマブ（abciximab））、シチコリン（citicoline）、（シチジン−５' −二リン酸コリンの外因性形態）、および塩基性線維芽細胞増殖因子が挙げられる。
【００１５】
上記のことから、脳梗塞の治療について当技術分野における要求があることは、明らかであるだろう。望ましい治療は、脳梗塞によって生じた神経損傷の少なくとも一部を修復する、および／または脳梗塞の結果としての脳機能喪失を、少なくとも一部を修復するであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許出願第６１／４９３，０５７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
上記のことから、脳梗塞の治療について当技術分野における要求があることは、明らかであるだろう。望ましい治療は、脳梗塞によって生じた神経損傷の少なくとも一部を修復する、および／または脳梗塞の結果としての脳機能喪失を、少なくとも一部を修復するであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本開示は、脳梗塞の影響の治療に有用な細胞集団の、本発明人による同定に基づいている。本明細書で例証したように、本発明人は、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫ならびに／またはそれが分泌する因子が、脳梗塞後の喪失した脳機能を修復することを示した。例示的なＳＴＲＯ−１＋細胞は、骨髄および／または歯髄に由来し、治療でのそれらを使用する以前に、培養および／または保存することができること示した。本発明人は、例えば、大脳に影響を与える虚血性脳梗塞について認められた動物モデルを用いて、脳梗塞の影響を治療する細胞および／または分泌因子の有効性を実証した。
【００１９】
例えば、本発明人は、それらが、脳梗塞後の脳機能を修復する、および／または運動障害を治療することができることを示した。本発明人はまた、ＳＴＲＯ−１＋細胞が、因子（例えばＳＤＦ−１）を分泌し、これらの因子が、神経細胞からの軸索の成長を引き起こすことを示した。理論または行動様式に拘束されるものではないが、本発明人は、これらの因子が、神経保護、血管新生、免疫調節、および／または神経可塑性に寄与する可能性があることを提案する。
【００２０】
発明人はまた、ＳＴＲＯ−１＋細胞が、神経細胞様細胞に分化することができることを示した。しかしながら、脳梗塞を患う対象の脳への注入の後に、これらの細胞で数週間を超えて生存したものはほとんどない。これらの結果は、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫ならびに／またはそれが分泌する因子が、脳梗塞後の対象自身の神経細胞の生存および／または再生に寄与していることを示している。
【００２１】
本明細書で示された知見は、脳梗塞の１つまたは複数の影響を治療する方法の根拠を提供するものである。例えば、そのような方法は、脳梗塞を患う対象に、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む。
【００２２】
本開示は、脳梗塞を患う対象において、脳機能を改善するまたは脳機能の喪失を予防する方法であって、対象に、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む方法を提供する。
【００２３】
一例では、対象における脳機能改善は、対象における運動障害を改善する。一例では、脳機能は、運動皮質機能および／または感覚皮質機能といった大脳皮質機能である。
【００２４】
本開示はさらに、または代わりに、脳梗塞を患う対象における運動障害を治療または予防する方法であって、対象に、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む方法を提供する。
【００２５】
本明細書に記載の方法の一例では、運動障害は、麻痺、局部麻痺、言語不明瞭、非協調運動、筋力低下、緊張低下、緊張亢進、または異常不随意運動である。
【００２６】
本開示はさらに、脳梗塞を患う対象において脳神経細胞を再生させる方法であって、対象に、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む方法を提供する。
【００２７】
本開示さらに、脳梗塞を患う対象において、脳萎縮症を治療する、低下させるまたは予防する方法であって、対象に、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む方法を提供する。一例では、脳萎縮症は脳梁内にある。
【００２８】
一例では、本開示の方法を実行することにより再生する脳神経細胞は、大脳皮質、例えば、運動皮質および／または感覚皮質にある。
【００２９】
一例では、脳梗塞は、虚血性脳梗塞である。
【００３０】
本開示で企図される例示的な脳梗塞は、対象における中大脳動脈の閉塞によって生じる虚血性脳梗塞である。
【００３１】
一例では、本開示の方法は、対象に、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を、脳梗塞後の１時間と１か月の間、例えば、１時間と１週間の間といった１時間と２週間の間に投与することを含む。例えば、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を、脳梗塞後の約７２時間以内に投与する。例えば、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を、脳梗塞後の約４８時間以内に投与する。
【００３２】
他の例では、方法は、対象にＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を、脳梗塞後の２４時間以内に投与することを含む。例えば、ＳＴＲＯ−１-細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を、脳梗塞の約２４時間後に投与する。
【００３３】
一例では、方法は、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉght細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む。一例では、子孫は、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞がさらに富化されている。
【００３４】
例示的な細胞および／または子孫はさらに、組織非特異型アルカリフォスファターゼ（ＴＮＡＰ）および／または熱ショックタンパク質９０β（ＨＳＰ９０Ｐ）および／またはＣＤ１４６を発現する。
【００３５】
一例では、細胞の集団は、骨髄または歯髄に由来する。
【００３６】
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子は、全身投与される。
【００３７】
代わりの例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子は、対象の脳に局所投与される。例えば、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子は、対象の大脳に局所投与される。一例では、集団および／または子孫および／または可溶性因子はさらに(または代わりに)、対象の線状体に投与される。
【００３８】
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫が富化された集団は、脳梗塞の部位から遠い部位に投与され、脳梗塞の部位、例えば、虚血性梗塞、または虚血性梗塞を取り巻く境界域に移動する。
【００３９】
本明細書記載のいずれかの例に従う例示的な方法は、脳機能を改善する、および／または脳神経細胞を再生するのに充分な用量の、集団および／または子孫および／または可溶性因子を投与することを含む。
【００４０】
一例では、方法は、有効量または治療有効量の、集団および／または子孫および／または可溶性因子を投与することを含む。
【００４１】
一例では、方法は、ｋｇあたり０．１×１０６から５×１０６個の間のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む。例えば、方法は、ｋｇあたり０．３×１０６から２×１０６個の間のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む。例えば、方法は、ｋｇあたり０．５×１０６から２×１０６個の間のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む。例えば、方法は、ｋｇあたり０．５×１０６から１．５×１０６個の間のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む。例えば、方法は、ｋｇあたり約５×１０５個のＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫、またはｋｇあたり約１．５×１０６個のＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫を投与することを含む。例えば、方法は、ｋｇあたり約１．８×１０６個のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む。
【００４２】
一例では、本明細書記載のいずれかの例に従う方法は、低用量の、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む。例えば、低用量の、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫は、ｋｇあたり０．１×１０５と０．５×１０６個の間のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を含む。
【００４３】
一例では、集団および／もしくは子孫ならびに／または可溶性因子は、複数回投与される。例えば、集団および／もしくは子孫ならびに／または可溶性因子は、４以上の週毎に１回投与される。
【００４４】
一例では、２５％未満の、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫は、対象の脳（例えば大脳）の中に、投与後２８日間残存する。例えば、１０％未満の、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫は、対象の脳（例えば大脳）に、投与後２８日間残存する。例えば、５％未満または３％未満の、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫は、対象の脳（例えば大脳）に、投与後２８日間残存する。
【００４５】
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫細胞が富化された集団は、オートジェネイック（autogeneic)もしくは同種異型であり、ならびに／または可溶性因子は、オートジェネイックもしくは同種異系細胞に由来することがある。一例では、本明細書記載のいずれかの例に従う方法は、集団および／もしくは子孫を単離もしくは富化すること、ならびに／または可溶性因子を単離することを含む。
【００４６】
本明細書記載のいずれかの例に従う方法の例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞が富化された集団は、投与に先立って、および／または可溶性因子を得るのに先立って、培養増殖されている。一例では、方法は、本明細書記載の方法はさらに、集団および／または子孫を培養することを含む。一例では、方法はさらに、集団および／または子孫を保存することを含む。
【００４７】
一例では、集団および／もしくはその子孫細胞ならびに／またはそれに由来する可溶性因子は、前記ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫細胞および／またはそれに由来する可溶性因子ならびに担体および／または賦形剤を含む組成物の形態で投与される。一例では、本明細書記載のいずれかの例に従う方法はさらに、集団および／または子孫および／または可溶性因子を、担体および／または賦形剤とともに調剤することを含む。
【００４８】
一例では、本明細書記載のいずれかの例に従う方法はさらに、治療後の対象の脳機能を試験することを含む。例えば、方法はさらに、対象の、運動および／または体力および／または会話および／または体力を試験することを含む。一例では、もし対象の脳機能が、集団および／または子孫および／または可溶性因子の投与前と比較して有意に増大しなかった場合には、方法は、さらなる用量の、集団および／または子孫および／または可溶性因子を投与することを含む。
【００４９】
一例では、治療されている対象は、霊長類、例えばヒトといった哺乳類である。
【００５０】
本開示はまた、脳梗塞後の対象における脳機能を改善する、または脳梗塞後の対象における運動障害を治療する、または脳梗塞後の対象における脳神経細胞を再生させるさいに使用する、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を提供する。
【００５１】
本開示はさらに、脳梗塞後の対象における脳機能を改善する、または脳梗塞後の対象における運動障害を治療する、または脳梗塞後の対象における脳神経細胞を再生させる医薬を製造するさいの、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子の使用を提供する。
【００５２】
本開示はまた、本明細書でいずれかの例に記載の方法において、使用説明書と同梱された、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を含むキットを提供する。
【００５３】
例えば、本開示は、本明細書でいずれかの実施例に記載の方法において、組成物の使用を指示する製品情報と同梱された、集団および／または子孫および／または可溶性因子を含む組成物、を含むキットを提供する。
【００５４】
本開示はまた、本明細書記載のいずれかの例に従う方法において、使用説明書と同梱された、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を単離するまたは培養するキットを提供する。
【００５５】
本開示はまた、本明細書記載のいずれかの例に従う方法において、使用説明書とともに、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を提供することを含む方法を提供する。
【００５６】
本開示はまた、本明細書記載のいずれかの例に従う方法において、後に使用するための、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を、単離する、または単離するために用意する、または保存する、または保存するために用意することを含む方法を提供する。
【００５７】
本明細書に記載の方法は、さらなる脳梗塞の危険性を低下させる方法に準用すると解されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】成人ＢＭＭＮＣによるＴＮＡＰ（ＳＴＲＯ−３）および間葉系前駆細胞マーカー、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔの共発現を示す。ＳＴＲＯ−１  ＭＡＣＳで選別したＢＭＭＮＣのインキュベーション、およびＦＩＴＣに結合したヤギ抗マウスＩｇＭ抗体での間接標識（ｘ軸）、およびＰＥに結合したヤギ抗マウスＩｇＧで間接標識されたＳＴＲＯ−３ｍＡｂ（マウスＩｇＧ１）（ｙ軸）によって、二色免疫蛍光法およびフローサイトメトリーを行った。ドットプロットヒストグラムはリストモードデータとして収集した５×１０４個の事象を表わしている。垂直線および水平線は、同条件下で処置したアイソタイプ一致の対照抗体、１Ｂ５（ＩｇＧ）および１Ａ６．１２（ＩｇＭ）で得られた平均蛍光の１．０％未満の活性レベルに設定した。結果は、少数のＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞集団がＴＮＡＰを共発現したが（右上の象限）、一方で残りのＳＴＲＯ−１＋細胞はＳＴＲＯ−３ｍＡｂと反応しなかったことを示している。
【図２−１】培養され増殖したＳＴＲＯ−１ｂｒｉＭＰＣのＳＴＲＯ−１ｂｒ、またはＳＴＲＯ−１ｄｉｍ子孫の遺伝子発現プロファイルである。ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖した骨髄ＭＰＣの単個細胞懸濁液は、トリプシン／ＥＤＴＡ処理により調製した。細胞は、ヤギ抗マウスＩｇＭフルオレセインイソチオシアネートと一緒にインキュベーションすることにより引き続き明らかになったＳＴＲＯ−１抗体で染色した。全細胞ＲＮＡは、蛍光標識細胞分取の後に、ＳＴＲＯ−１ｄｉｍまたはＳＴＲＯ−１ｂｒｉ発現細胞の集団から精製した（Ａ）。ＲＮＡｚｏｌＢ抽出法と標準的な手順を用いて、全ＲＮＡを、各亜集団から単離し、ｃＤＮＡ合成の鋳型として使用した。多様な転写産物の発現を、従来の記述(Gronthos et al.  J Cell Sci.77( 5:1827-1835, 2003)の標準プロトコルを用いて、ＰＣＲ増幅により評価した。本研究で使用したプライマーセットを、表２に示す。増幅の後、各反応混合物を、１．５％アガロースゲル電気泳動で分析し、臭化エチジウム染色により可視化した（Ｂ）。
【図２−２】各細胞マーカーについての相対遺伝子発現を、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現を基準にして、ＩｍａｇｅＱａｎｔソフトウェアを用いて評価した（Ｃ）。
【図３】培養され増殖したＳＴＲＯ−１＋ＭＰＣのＳＴＲＯ−１ｂｒｉ子孫は、高レベルのＳＤＦ−１を発現するが、ＳＴＲＯ−１ｄｉｍの子孫はそうではない。（Ａ）ＳＴＲＯ−１＋ＢＭＭＮＣの、ＭＡＣＳで単離した調製物を、ＦＡＣＳを用い、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔおよびＳＴＲＯ−１ｄｉｍ／ｄｕｌｌの領域に従って、異なるＳＴＲＯ−１サブセットに分割した。全ＲＮＡを、各ＳＴＲＯ−１亜集団から調製し、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔサブトラクションハイブリダイゼーションライブラリを構築するのに使用した（Ｂ−Ｃ）。複製ニトロセルロースフィルター、これは、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔサブトラクテッドｃＤＮＡを用いて形質転換した細菌クローンから増幅した代表的なＰＣＲ生成物を用いてブロットした。このフィルターはその後、［３２Ｐ］デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）で標識されたＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ（Ｂ）またはＳＴＲＯ−１ｄｉｍ／ｄｕｌｌ（Ｃ）サブトラクテッドｃＤＮＡのどちらかを用いて精査した。矢印は、ヒトＳＤＦ−１に対応するｃＤＮＡ断片を含む１クローンの差次的発現を示す。（Ｄ）培養に先立って新にＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ単離したＢＭＭＮＣ  ＳＴＲＯ−１集団から調製した全ＲＮＡ中のＳＤＦ−１およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）転写物の相対発現を示す逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ分析である。ｂｐは、塩基対を示す。
【図４】ヒトＤＰＳＣは、神経細胞様細胞に分化する。（Ａ）ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで神経細胞誘導培地に応答しないことを示す顕微鏡写真のコピーである。（Ｂ）ｈＤＰＳＣが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、神経細胞誘導培地中で神経細胞表現型に分化することを示す顕微鏡写真コピーである。（Ｃ）３０ｍｓステップで−４４から３６ｍＶまで１０ｍＶごとの増加に応答して、分化したＤＰＳＣに記録された極微弱なＮａ＋電流の代表例を示すグラフ表示である。（Ｄ）電圧ステップに応答して、分化した（Ｄ）および非分化の（Ｎ．Ｄ．）ＤＰＳＣにおいて得られたピークＮａ＋電流の平均Ｉ−Ｖプロットを示すグラフ表示である。
【図５】脳梗塞のモデルを治療するのに使用する手順を図示する、一連の表示である。パネルＡは、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライドで染色して、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡｏ）の１日後の梗塞性（白色）組織を可視化した、代表的な冠状ラット脳断面を示す。パネルＢは、抗ヒトミトコンドリア抗原抗体とヘマトキリシンで染色した代表的な冠状ラット脳断面を示す。パネルＡとＢの黒のドットは、ブレグマに対して前後方向−０．４０ｍｍ、中央側方向−４．００ｍｍ、硬膜から背腹方向−５．５０ｍｍでの第１の線条体内注入、および硬膜から背腹−１．７５ｍｍでの第２の皮質内注入部位を示している。パネルＣは、治療スケジュールの図表示を示しており、このスケジュールでは、動物を、ＭＣＡｏ（０日目として表示）前に３日間訓練し、第３の訓練期間を、術前のベースライン（−１日目）として使用した。動物を無作為に割り付けて、ヒトＤＰＳＣまたは培地のみを、ＭＣＡｏの２４時間後に与えた。治療割付けに対して盲検化された調査者による行動評価を、ＭＣＡｏ後の１、７、１４、２１、および２８日目に実行した。すべての動物は、実験の継続期間をとおして、１０ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンＡの皮下注入を毎日受けた。動物を犠牲にして、それらの脳を、神経行動学的研究の終了にあたり免疫組織化学のために加工した。スケールバー＝２ｍｍ（Ａ、Ｂ）である。略語は：Ｃｘ、大脳皮質；ＤＰＳＣ、歯髄幹細胞；ＭＣＡｏ、中大脳動脈閉塞；Ｓｔｒ、線状体である。
【図６】ＭＣＡｏ後の神経行動学的結果に与える、ヒトＤＰＳＣ治療の効果を示す一連のグラフ表示である。ＭＣＡｏの後、すべての動物は、すべての行動テストにおいて機能障害を示した（１日目または７日目対−１日目）。パネルＡは、移植の４週間後に、ＤＰＳＣ治療動物が、ビヒクル治療動物と比較して、総計の神経学的スコアにおいて有意の改善を示した（ｐ＜０．０１８  群×日の交互作用、反復測定分散分析［ＡＮＯＶＡ］；それぞれ２１日目と２８日目に治療群間で  ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１；事後のフィッシャーの保護付き最小有意差法（post hoc Fisher’s protected least significant difference)）。パネルＢに示すように、ＤＰＳＣ移植群はまた、ステップテストにおいて対側前肢を使ってとられた有意に多くの歩数によって示されるように、前肢感覚運動能力の有意な改善を示した（ｐ＝０．０４５  全体の治療効果）。パネルＣはまた、ビヒクル治療群と比較して、ＤＰＳＣ移植群がまた、粘着テープ除去テストにおいて対側前肢からラベルを除去しようとする時間の有意に小さい割合を示したことを示している（ｐ＝０．０４９  全体の治療効果）。治療群間の行動遂行の差は、ロータロッド（パネルＤ）、および先細り／桟状の梁を歩行する（パネルＥ）テストにおいて、統計的な有意差に達しなかった（ｐ＞０．０５、反復測定ＡＮＯＶＡ）。脳梗塞動物は、POST-ＭＣＡｏの１日後では、旋回行動が原因で、梁歩行の課題を完遂することができなかった。データを、箱髭図としてプロットし、値の分布を可視化した。四角の中の中心のアスタリスクは、メジアンを表し、箱は、値の中央５０％（すなわち、それは第一四分位数から第三四分位数までの範囲である）。髭は、データの範囲を示し、極端な観測結果は、はずれた円で示してある。略語は：ＤＰＳＣ、歯髄幹細胞；ＭＣＡｏ、中大脳動脈閉塞である。
【図７】虚血後の脳における生存ＤＰＳＣの分布示す写真表示のコピーである。代表的な冠状ラット脳断面は、移植の４週間後の、移植されたＤＰＳＣ（個々の細胞を黒点で示す）の生存および移動のパターンを示している。断面を、ヒトミトコンドリア抗原に対して染色し、ラット脳組織からヒト細胞を検出した。目標としていた、脳梗塞病変へのＤＰＳＣの移動と、結果として生じる梗塞周辺での蓄積に注意されたい。スケールバー＝２ｍｍ、略語：Ｂ、ブレグマ；ＣＣ、脳梁；Ｃｘ、大脳皮質；ＤＧ、背側海馬の歯状回；ＬＶ、側脳室；Ｓｔｒ、線状体である。
【図８】脳梗塞の２８日後の、移植したヒトＤＰＳＣの形態を示す写真表示のコピーである。中大脳動脈閉塞の４週間後のげっ歯類脳におけるヒトＤＰＳＣ（暗灰色に染色したヒトミトコンドリア抗原陽性細胞；図の右側）の高倍率図は、梗塞核のすぐ近傍での蓄積（パネルＡ）と、ＣＣに沿った明らかな移動（パネルＢ）を示した。注入部位と脳梗塞の対側の脳半球におけるＤＰＳＣの疎な分布に注意されたい。ドットは、個々のヒトＤＰＳＣを示す。パネルＣは、一部のＤＰＳＣ由来細胞が、脳血管に生着したように見え、その形態的外観は、内皮細胞（矢印）、周皮細胞、または平滑筋細胞（矢じり形）と整合することを示す。パネルＤは、ＤＰＳＣ由来細胞の形態が、星状細胞（矢印）および神経細胞（矢じり形）を示唆していることを示している。スケールバー＝２ｍ（パネルＡ、Ｂ）および２５μｍ（パネルＣ、Ｄ、およびパネルＡ、Ｂの高倍率の挿入図＝４０）。略語：Ｂ、ブレグマ；ＣＣ、脳梁である。
【図９】病変部位と同側（ｉｐｓｉｌｅｓｉｏｎａｌ）のＣＣ萎縮に与える、ＤＰＳＣ治療の効果を示す一連の表示である。パネルＡは、ブレグマのレベルでの代表的なラット脳断面で、ブレグマでは脳の正中線（Ｌ１）および側脳室の側稜（Ｌ２）において、２つの部位がＣＣ厚の測定に使用され、両方で同側および対側脳半球が表示されている。パネルＢは、移植の４週間後に、ビヒクル治療動物と比較して、ＤＰＳＣ治療動物の病変部位と同側半球に、脳梁萎縮の減少傾向があったことを示す。Ｌ１（正中線）でのＣＣ測定に対するＬ２（同側）での測定の規格化は、統計的有意差に達しなかった（ｐ＞０．０５）。病変と反対側（contralesional）のＣＣ厚の測定に、治療群間で差異はなかった。データは、平均±標準誤差で示してある。スケールバー＝１００μｍである。略語は：ＣＣ、脳梁；Ｃｏｎｔｒａ、対側；Ｃｘ、大脳皮質；ＤＰＳＣ、歯髄幹細胞；Ｉｐｓｉ、同側；ＬＶ、側脳室、である。
【図１０】ヤギ抗マウスＩｇＭまたはＩｇＧ結合ＦＩＴＣ二次抗体を用いて検出されたアイソタイプ（ＩｇＭ、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１）陰性対照（破線）と比較して、間葉系幹細胞マーカーであるＳＴＲＯ−１、ＳＴＲＯ−４およびＣＤ１４６（実線）の陽性細胞表面発現をもつ、培養増殖された骨髄由来カニクイザルＭＰＣの単個細胞懸濁液を用いて生成した代表的なフローサイトメトリーのヒストグラムを示すグラフ表示である。代表的なヒストグラムはまた、カニクイザルＭＰＣが、単球／マクロファージ（ＣＤ１４）、造血幹／前駆体細胞（ＣＤ３４）および成熟白血球（ＣＤ４５）のマーカーに対して細胞表面発現を欠いていることを示している。アイソタイプ対照と比較して１％蛍光よりも大きいレベルは、陽性を示している。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
配列リストの手がかり
配列番号１  ＧＡＰＤＨをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号２  ＧＡＰＤＨをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号３  ＳＤＦ−１をコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号４  ＳＤＦ−１をコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号５  ＩＬ−１βをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号６  ＩＬ−１βをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号７  ＦＬＴ−１をコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号８  ＦＬＴ−１をコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号９  ＴＮＦ−αをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号１０  ＴＮＦ−αをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号１１  ＫＤＲをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号１２  ＫＤＲをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号１３  ＲＡＮＫＬをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号１４  ＲＡＮＫＬをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号１５  レプチンをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号１６  レプチンをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号１７  ＣＢＦＡ−１をコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号１８  ＣＢＦＡ−１をコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号１９  ＰＰＡＲγ２をコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号２０  ＰＰＡＲγ２をコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号２１  ＯＣＮをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号２２  ＯＣＮをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号２３  ＭｙｏＤをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号２４  ＭｙｏＤをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号２５  ＳＭＭＨＣをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号２６  ＳＭＭＨＣをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号２７  ＧＦＡＰをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号２８  ＧＦＡＰをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号２９  ネスチンをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号３０  ネスチンをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号３１  ＳＯＸ９をコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号３２  ＳＯＸ９をコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号３３  Ｘ型コラーゲンをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号３４  Ｘ型コラーゲンをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号３５  アグリカンをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号３６  アグリカンをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
【００６０】
一般的技術および選択された定義
本明細書を通じて、それ以外に具体的に述べられている場合または文脈がそれ以外に要求する場合を除いて、単一ステップへの参照、物質の組成物、ステップの群または物質の組成物の群は、１つおよび複数（すなわち一つまたは複数）の、それらのステップ、物質の組成物、ステップの群または物質の組成物の群を包含すると解されるものとする。
【００６１】
本開示の各実施例は、それ以外に具体的に述べられている場合を除き、それぞれおよびすべての他の例に準用されるものとする。
【００６２】
当業者は、本開示が、具体的に記載されたもの以外の変形および修正を許容することができることを理解するであろう。本開示がそのような変形および修正すべてを含むことを理解すべきである。本開示はまた、本明細書で参照または表示されているステップ、機能、組成物および化合物のすべてを個々にまたは集合的に、ならびに、前記ステップもしくは機能のいずれかのおよびすべての組み合わせまたはいずれか２つ以上の組み合わせを含む。
【００６３】
本開示は、本明細書に記載の具体的な実施例によって範囲を制限されるものではなく、それらの実施例は例示を目的とすることだけを意図している。機能的に等価な生成物、組成物、および方法は、明確に、本開示の範囲内にある。
【００６４】
本開示は、それ以外に表示されている場合を除き、分子生物学、微生物学、ウイルス学、ＤＮＡ組み換え技術、溶液中でのペプチド合成、固相ペプチド合成、および免疫学の従来技術を用いて過度の実験なしに実行される。そのような手順は、例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Second Edition (1989),Vol I,II，およびIIIの全部； DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford,のテキスト全体； Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed, 1984) IRL Press, Oxford，のテキスト全体、および特にその中でのGaitによる，ｐｐｌ−２２の論文； Atkinson et al, pp35-81; Sproat et al, pp 83-115; および Wu et al, pp 135-151; 4. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1985) IRL Press, Oxford，のテキスト全体； Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford,のテキスト全体; Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.),のシリーズ全体; J.F. Ramalho Ortigao, “The Chemistry of Peptide Synthesis” In: Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (Interactiva, Germany); Sakakibara, D., Teichman, J., Lien, E. Land Fenichel, R.L. (1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 73 336-342; Merrifield, R.B. (1963). J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154; Barany, G. and Merrifield, R.B. (1979) in The Peptides (Gross, E. and Meienhofer, J. eds.), vol. 2, pp. 1-284, Academic Press, New York. 12. Wunsch, E., ed. (1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Muler, E., ed.), vol. 15, 4th edn., Parts 1 and 2, Thieme, Stuttgart; Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474; Handbook of Experimental Immunology, VoIs. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); および Animal Cell Culture: Practical Approach, Third Edition (John R. W. Masters, ed., 2000), ISBN 0199637970,のテキスト全体、に記載されている。
【００６５】
本明細書をとおして、文脈がそれ以外を要求する場合を除き、「comprise（含む）」という語、または「comprises」もしくは「comprising」といった変化形は、述べられたステップまたは要素または完全体またはステップ（複数）もしくは要素（複数）もしくは完全体（複数）の群の包含を意味するが、あらゆる他のステップまたは要素または完全体または要素もしくは完全体の群の排除を意味するものではないことが理解されるであろう。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「由来する（derived from）」の用語は、特定の完全体が、具体的な源から、その源から必ずしも直接的ではないにしても、得られうることを表示すると解されるものとする。ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞に由来する可溶性因子という文脈では、この用語は、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれらの子孫細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の間に産生される一つまたは複数の因子、例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物等などを意味すると解されるものとする。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「脳梗塞」という用語は、脳または脳幹への血流の障害による、通常、急速に発症する脳機能（複数可）の喪失を意味すると解されるものとする。障害は、例えば血栓症または塞栓症に起因する虚血（血液の不足）であり得、または出血によるものでもあり得る。一例では、脳機能の喪失は、神経細胞の死を伴う。一例では、脳梗塞は、大脳またはその領域に生じる血液の障害または喪失に起因する。一例では、脳梗塞は、２４時間を超えて持続する、または２４時間以内に死によって中断する、脳血管的原因の神経学的障害である（世界保健機関により定義されているとおり）。２４時間を超える症状の持続により、脳梗塞は、症状の持続が２４時間未満の一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）から区別される。脳梗塞の症状には、片麻痺（半身の麻痺）；片側不全麻痺（半身の脱力）；顔面の筋力低下；無感覚；感覚の低下；嗅覚、味覚、聴覚、または視覚の変化；嗅覚、味覚、聴覚または視覚の喪失；瞼の垂下（眼瞼下垂症）；眼筋の発見可能な脱力；咽頭反射の低下；嚥下能力の低下；瞳孔対光反応の低下；顔面の感覚低下；平衡の低下；眼振；呼吸数の変化；心拍数の変化；頭部を一方向へ転換する能力の低下または不可能になることを伴う胸鎖乳突筋の脱力；舌の脱力；失語症（会話するまたは言語を理解することができなくなる）；失行症（随意運動の変化）；視野欠損；記憶障害；半側無視または半側空間無視（病変とは反対の視野側空間への注意障害）；支離滅裂な思考；精神錯乱；性欲過剰な身振りの発現；病態失認（障害の存在を持続的に否定）；歩行困難；運動協調性の変化；空間識失調；不均衡；意識喪失；頭痛；および／または嘔吐が挙げられる。
【００６８】
当業者は、「大脳」が、大脳皮質（すなわち脳半球の皮質）、大脳基底核（すなわち大脳核）および辺縁系を含むことを知っているであろう。
【００６９】
「脳機能」という用語は：
・論理的思考、企画、会話の一部分、運動、情動、および問題解決（前頭葉が関連する）；
・運動、定位、認識、刺激の知覚（頭頂葉が関連する）；
・視覚処理（後頭葉が関連する）；および、
・聴覚刺激の知覚および認識、記憶、および会話（側頭葉が関連する）、を含む。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「運動障害」という用語は、脳梗塞以前と比較した、対象の移動する能力のあらゆる変化を意味すると解されるものとする。例示的な運動障害には、麻痺、局部麻痺、言語不明瞭、非協調運動、筋力低下、緊張低下、緊張亢進または異常不随意運動などが挙げられる。
【００７１】
本明細書で使用される場合、神経細胞を「再生させる」とは、対象の内在性神経細胞が、成長する（例えば、軸索を成長させる）および／もしくは分割するように誘導される、ならびに／または内在性神経幹細胞が、成長および／もしくは分割するおよび／もしくは分化して新たな神経細胞を産生するように誘導されることを意味すると解されるものとする。このことは、投与されて神経細胞を産生するように分化する細胞とは異なる。この用語は、神経細胞を再生させる方法がさらに、投与された細胞の、神経細胞または他の細胞型への分化を含んではいけないということを意味するものではない。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、脳梗塞を患う対象において脳神経細胞の再生を誘導する、および／または対象において神経細胞に分化するのに充分な量の、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫細胞が富化された集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を意味すると解されるものとする。有効量は、それだけで治療効果を提供するのに充分である必要はなく、例えば、有効量の、集団および／または細胞および／または可溶性因子の複数の投与が、治療効果を提供してもよい。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、脳梗塞を患う対象において脳機能を改善するおよび／または運動障害を治療するおよび／または脳神経細胞を再生させるのに充分な量の、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫細胞が富化された集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を意味すると解されるものとする。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「低用量」という用語は、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫の、１×１０６個より少ないがそれでも本明細書で定義されている「有効量」ならびに／または本明細書で定義される「治療有効量」であるのに十分な量を意味すると理解されるものとする。例えば、低用量は、０．５×１０６個以下の細胞、または０．４×１０６個以下の細胞、または０．３×１０６個以下の細胞または０．１×１０６個以下の細胞を含む。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「治療する(treat)」、「治療(treatment)」、「治療すること(treating)」という用語は、ある量の可溶性因子および／または細胞を投与すること、ならびに運動障害の重症度を減少させることを意味すると解されるものとする。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「予防する（prevent）」、「予防すること（preventing）」、「予防（prevention）」という用語は、ある量の可溶性因子および／または細胞を投与すること、ならびに脳梗塞後の運動障害もしくは脳機能喪失の発症もしくは進行を停止するまたは抑制するまたは遅延させることを意味すると解されるものとする。このように、本開示の方法は、脳梗塞を患う対象において運動障害または脳機能喪失を予防する方法に準用すると解されるものとする。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「可溶性因子」という用語は、水溶性であるＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫によって産生される、例えば、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、炭水化物などの、あらゆる分子を意味すると解されるものとする。そのような可溶性因子は、細胞内にありうる、および／または細胞によって分泌されうる。そのような可溶性因子は、複雑な混合物（例えば上清）および／もしくはその画分であり得る、並びに／または精製された因子であり得る。本開示の一例では、可溶性因子は、上清である、または上清中に含有される。従って、一つまたは複数の可溶性因子の投与を目的とする、本明細書のいかなる例も、上清の投与に準用されると解されるものとする。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「上清」という用語は、液状培地といった適切な培地においてＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫のｉｎ  ｖｉｖｏでの培養をおこなった後に生成される非細胞性物質をさす。典型的には、上清は、適切な条件と時間のもと、培地中で細胞を培養し、その後に遠心分離といった過程により細胞性物質を除去することによって生成される。上清は、投与前にさらなる精製ステップを経ても経なくてもよい。一例では、上清は、１０５個より少ない、さらには、１０３個より少ないといった、例えば１０４個より少ない細胞を含み、さらには例えば生細胞は含まない。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「正常または健康な個体」という用語は、脳梗塞を患っている対象を意味すると解されるものとする。
【００８０】
本明細書では、「脳梗塞の影響」という用語は、脳機能を改善させる、運動障害を治療するもしくは予防するおよび／または脳神経細胞を再生させることの１つまた複数に、文字通りの支持を含み、提供すると理解されるであろう。
【００８１】
ＳＴＲＯ−ｒ細胞または子孫細胞、およびそれに由来する上清または１つもしくは複数の可溶性因子
ＳＴＲＯ−１＋細胞は、骨髄、血液、歯髄細胞、脂肪組織、皮膚、脾臓、膵臓、脳、腎臓、肝臓、心臓、網膜、脳、毛包、腸、肺、リンパ節、胸腺、骨、靱帯、腱、骨格筋、真皮、および骨膜に見出される細胞であり、中胚葉および／または内胚葉および／または外胚葉等の生殖細胞系に分化することができる。例示的なＳＴＲＯ−１＋細胞の源は、骨髄および／または歯髄に由来する。
【００８２】
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞は、多数の細胞型、例えば、限定はされないが、脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織、筋肉組織、および線維性結合組織に分化可能な多能性細胞である。これらの細胞が迎える具体的な細胞系譜の決定および分化経路は、増殖因子、サイトカイン、および／または宿主組織によって構築される局所的な微小環境の条件等の機械的影響および／または内在性生物活性因子からの種々の影響に依存する。従って、ＳＴＲＯ−１＋多能性細胞は、分裂して、どちらも幹細胞である娘細胞を生じる非造血系前駆細胞であるか、または適切な時期に不可逆的に分化して表現型を持つ細胞（phenotypic cell）を生じる前駆細胞である。
【００８３】
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞は、神経細胞または神経細胞様細胞に分化することができる。
【００８４】
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞は、神経細胞からの軸索の成長を誘導または促進する、１つまたは複数の因子を分泌する。 
【００８５】
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞は、対象、例えば、治療を受ける対象または近縁の（related）対象もしくは非近縁の（unrelated）対象（同一種か異種かに関わらない）から得られた試料から富化される。「富化された」、「富化」という用語またはその変化形は、無処置の細胞集団（例えば、天然環境にある細胞）と比較したときに、ある特定の細胞型の割合またはいくつかの特定の細胞型の割合が増加している細胞集団を記述するために本明細書では使用される。一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞が富化された集団の割合は、少なくとも約０．１％または０．５％または１％または２％または５％または１０％または１５％または２０％または２５％または３０％または５０％または７５％のＳＴＲＯ−１＋細胞を含む。この点において、「ＳＴＲＯ−１＋細胞が富化された細胞集団」という用語は、「Ｘ％のＳＴＲ０１＋細胞を含む細胞集団」という用語に明示的な支持を与えると解されるであろう。ここでＸ％は、本明細で列挙されているようにパーセンテージである。ＳＴＲＯ−１＋細胞は、一部の例では、クローン原生コロニー、例えばＣＦＵ−Ｆ（線維芽細胞）を形成する可能性があり、またはそのサブセット（例えば５０％または６０％または７０％または７０％または９０％または９５％）がこの活性を有する可能性がある。
【００８６】
一例では、細胞集団は、選択可能な形態でＳＴＲＯ−ｒ細胞を含む、細胞の調整物から富化される。この点において、「選択可能な形態」という用語は、ＳＴＲＯ−１＋細胞の選択を可能にするマーカー（例えば細胞表面マーカー）を発現することを意味すると理解されるであろう。マーカーは、ＳＴＲＯ−１であってもよいが、しかしそうである必要はない。例えば、本明細書に記載されているおよび／または例示されているように、ＳＴＲＯ−２および／またはＳＴＲＯ−３（ＴＮＡＰ）および／またはＳＴＲＯ−４および／またはＶＣＡＭ−１および／またはＣＤ１４６および／または３Ｇ５を発現する細胞（例えばＭＰＣ）はまた、ＳＴＲＯ−１（そしてＳＴＲＯ−１強陽性（ｂｒｉｇｈｔ）である可能性がある）を発現する。従って、細胞がＳＴＲＯ−１＋であるという表示は、細胞がＳＴＲＯ−１発現によって選択されるということを意味するものではない。一例では、細胞は、少なくともＳＴＲＯ−３発現に基づいて選択され、例えばそれらはＳＴＲＯ−３＋（ＴＮＡＰ＋）である。
【００８７】
細胞またはその集団の選択への言及が、特定の組織源からの選択である必要はない。本名明細書に記載されるように、ＳＴＲＯ−１＋細胞は、非常に多様な源から選択または分離または富化されうる。とはいうものの、一部の例では、これらの用語は、ＳＴＲＯ−１＋細胞（例えばＭＰＣ）を含むあらゆる組織、または血管組織、または周皮細胞（例えばＳＴＲＯ−１＋周皮細胞）を含む組織、または本明細書に列挙される組織のいずれかまたはそれ以上のものに支持を与える。
【００８８】
一例では、細胞は、ＴＮＡＰ＋、ＶＣＡＭ−１＋、ＴＨＹ−１＋、ＳＴＲＯ−２＋、ＳＴＲＯ−４＋（ＨＳＰ−９０β）、ＣＤ４５＋、ＣＤ１４６＋、３Ｇ５＋またはそれらのあらゆる組合せからなる群から、個々に、または集合的に選択される一つまたは複数のマーカーを発現する。
【００８９】
一例では、細胞は発現する、または細胞の集団は、ＳＴＲＯ−１＋（またはＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ）およびＣＤ１４６＋を発現する間葉前駆細胞が富化されている。
【００９０】
「個々に(Individually)」とは、本開示が、列挙されたマーカーまたはマーカー群を個別に包含すること、および、個々のマーカーまたはマーカー群が本明細書に個別には列挙されていない可能性があるにもかかわらず、添付の特許請求の範囲が、かかるマーカーまたはマーカー群を互いから個別に、且つ可分的に定義してもよいことを意味している。
【００９１】
「集合的に(Collectively)」とは、本開示があらゆる数の、またはあらゆる組合せの列挙されたマーカーまたはペプチド群を含むこと、および、かかるあらゆる数の、またはあらゆる組合せの列挙されたマーカーまたはマーカー群が本明細書では具体的に一覧にされていない可能性があるにもかかわらず、添付の特許請求の範囲が、かかる組合せまたは部分的な組合せを、マーカーまたはマーカー群の他のあらゆる組合せから個別に、且つ可分的に定義してもよいことを意味している。
【００９２】
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞はＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ（ＳＴＲＯ−１ｂｒｉと同義）である。一例では、Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞は、ＳＴＲＯ−１ｄlｍまたはＳＴＲＯ−１ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ細胞と比較して優先的に富化される。
【００９３】
例えば、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞は、さらに、ＴＮＡＰ＋、ＶＣＡＭ−１＋、ＴＨＹ−１＋１、ＳＴＲＯ−２＋、ＳＴＲＯ−４＋（ＨＳＰ−９０Ｐ）、および／またはＣＤ１４６＋のうちの一つまたは複数である。例えば、細胞は、１つまたは複数の前述のマーカーに対して選択される、および／または１つまたは複数の前記マーカーを発現することが示される。この点において、マーカーを発現することが示された細胞が、具体的に試験される必要はなく、むしろ、これまで富化されたまたは単離された細胞が試験されてもよく、引き続いて使用、単離または富化された細胞もまた、同一マーカーを発現するものと、妥当に仮定されてもよい。
【００９４】
一例では、間葉系前駆細胞は、国際公開第ＷＯ２００４／８５６３０号で定義されたように、血管周囲の間葉系前駆細胞である。例えば、間葉系前駆細胞は、血管周囲細胞のマーカーを発現し、例えば細胞は、ＳＴＲＯ−１＋もしくはＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔおよび／または３Ｇ５＋である。一例では、細胞は、血管周囲の組織または臓器もしくはその一部から単離された細胞である、または以前そうであった、またはその細胞の子孫である。
【００９５】
所与のマーカーに関して「陽性（positive）」であると見なされる細胞は、用語が蛍光の強度に関連する場合、マーカーが細胞表面上に存在している程度に応じた、低（低（lo）または弱陽性（dim））レベルもしくは高（強陽性（bright、bri））レベルのマーカーどちらかを発現している場合がある。ここで、この用語は、細胞の分取過程で使用される他のマーカーの蛍光強度に関係している。低（または弱陽性もしくは微陽性（dull））および強陽性の差異は、分取されている特定の細胞集団上の使用されるマーカーとの関連で理解されるだろう。所与のマーカーに関して「陰性（negative）」であるとみなされる細胞は、必ずしもその細胞に全く存在していないわけではない。この用語は、マーカーが、前記細胞によって相対的に非常に低いレベルで発現されていること、および、検出可能な程度に標識された場合に、マーカーが非常に小さなシグナルを発すること、またはバックグラウンドレベル、例えば、アイソタイプ対照抗体を用いて（suing）検出されたレベル以上には検出不能であること、を意味する。
【００９６】
「強陽性（bright）」という用語は、本明細書で使用される場合、検出可能な程度に標識された場合に、相対的に高いシグナルを発する細胞表面上マーカーを指している。理論に制限されることを望むものではないが、「強陽性」細胞は、試料中の他の細胞よりもいっそう多くの標的マーカータンパク質（例えばＳＴＲＯ−１から識別される抗原）を発現すると提唱されている。例えば、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ細胞は、ＦＩＴＣ結合ＳＴＲＯ−１抗体で標識された場合、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析によって測定される、非強陽性細胞（ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌ／ｄｉｍ）よりも大きな蛍光シグナルを発する。例えば、「強陽性」細胞は、出発試料中に含まれる最も明るく標識された骨髄単核細胞のうちの少なくとも約０．１％を構成している。他の例では、「強陽性」細胞は、出発試料中に含まれる最も明るく標識された骨髄単核細胞のうちの少なくとも約０．１％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約１．５％、または少なくとも約２％を構成している。ある例では、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞は、「バックグラウンド」、すなわちＳＴＲＯ−１−である細胞と比較して、ＳＴＲＯ−１の細胞表面発現が２対数分（2 log magnitude）高い。比較した場合、ＳＴＲＯ−１ｄｉｍおよび／またはＳＴＲＯ−１ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ細胞は、「バックグラウンド」よりも、ＳＴＲＯ−１の細胞表面発現が２対数未満分高く、典型的には、約１対数以下分高い。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「ＴＮＡＰ」という用語は、組織非特異的アルカリホスファターゼの全てのアイソフォームを包含することが意図されている。例えば、その用語には、肝アイソフォーム（ＬＡＰ）、骨アイソフォーム（ＢＡＰ）および腎アイソフォーム（ＫＡＰ）が包含される。一例では、ＴＮＡＰはＢＡＰである。一例では、ＴＮＡＰは、本明細書で使用される場合、ブダペスト条約の規定に基づきＰＴＡ−７２８２の寄託受託番号で２００５年１２月１９日にＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるＳＴＲＯ−３抗体と結合することができる分子を指す。
【００９８】
さらに、本開示のある例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞はクローン原性のＣＦＵ−Ｆを生じさせることができる。
【００９９】
一例では、かなりの割合のＳＴＲＯ−１＋多能性細胞が、少なくとも２種類の異なる生殖細胞系に分化することができる。多能性細胞が分化決定され得る系譜の例としては、限定はされないが、骨前駆細胞；胆管上皮細胞および肝細胞への多分化能を有する肝細胞前駆細胞；乏突起膠細胞および星状膠細胞へと進行するグリア細胞前駆細胞を生じることができる神経限定細胞（neural restricted cell）；ニューロンへと進行する神経前駆細胞；心筋および心筋細胞の前駆細胞、グルコース応答性インスリン分泌膵β細胞株が挙げられる。他の系譜としては、限定はされないが、象牙芽細胞、象牙質産生細胞および軟骨細胞、並びに以下の前駆細胞：網膜色素上皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト等の皮膚細胞、樹状細胞、毛包細胞、尿細管上皮細胞、平滑筋細胞および骨格筋細胞、精巣前駆細胞、血管内皮細胞、腱、靱帯、軟骨、脂肪細胞、線維芽細胞、骨髄基質、心筋、平滑筋、骨格筋、周皮細胞、血管細胞、上皮細胞、グリア細胞、神経細胞、星状膠細胞および乏突起膠細胞が挙げられる。
【０１００】
別の例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞は、培養後、造血細胞を生じさせることができない。
【０１０１】
一例では、本細胞は治療を受ける対象から採取され、標準的な技術を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され、自己成分または同種異系成分としてその対象に投与するための上清または可溶性因子または増殖した細胞を得るために用いられる。別の例では、樹立されたヒト細胞株のうちの一つまたは複数の細胞が用いられる。別の有用な例では、非ヒト動物の（または、患者がヒトでない場合は別の種に由来の）細胞が用いられる。
【０１０２】
本開示は、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞（後者は増殖後細胞（expanded cell）とも称される）から得られる、または由来する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養から生成される上清または可溶性因子の使用も企図している。本開示の増殖後細胞は、培養条件（培地中の刺激因子の数および／または種類を含む）、継代数等に応じて、種々様々な表現型を有し得る。ある例では、子孫細胞は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０回の継代後に、親集団から得られる。もっとも、子孫細胞は、任意の回数の継代後に親集団から得ることができる。
【０１０３】
子孫細胞は任意の適切な培地中で培養することによって得ることができる。「培地」という用語は、細胞培養に関して使用される場合、細胞周辺の環境の成分を含む。培地は固体、液体、気体または相および物質の混合物であってもよい。培地には、液体の増殖培地、および細胞増殖を維持しない液体培地が含まれる。また、培地には、寒天、アガロース、ゼラチンおよびコラーゲン基質等のゼラチン質の培地も含まれる。気体培地の例としては、ペトリ皿または他の固体もしくは半固体の担体上で増殖している細胞が曝される気相が挙げられる。また、「培地」という用語は、それが未だ細胞と接触していない場合であっても、細胞培養での使用を目的としている物質を指す。すなわち、細菌培養用に調製された栄養分に富んだ液体が培地である。水または他の液体と混合されたときに細胞培養に適したものとなる粉末状混合物は、「粉末状培地」と称することもある。
【０１０４】
一例では、本開示の方法に有用な子孫細胞は、ＳＴＲＯ−３抗体で標識した磁気ビーズを用いて、ＴＮＡＰ＋ＳＴＲＯ−１＋細胞を骨髄から単離または富化し、その後、その単離細胞を培養増殖することによって得られる（適切な培養条件の例は、Gronthos et al. Blood 85: 929-940, 1995を参照）。
【０１０５】
一例では、そのような増殖後細胞（子孫）（例えば、少なくとも５回継代後）は、ＴＮＡＰ−、ＣＣ９＋、ＨＬＡクラスＩ＋、ＨＬＡクラスＩＩ−、ＣＤ１４−、ＣＤ１９−、ＣＤ３−、ＣＤllａ−ｃ−、ＣＤ３１−、ＣＤ８６−、ＣＤ３４−および／またはＣＤ８０−であり得る。しかし、可能性としては、本明細書に記載の条件とは異なる培養条件下では、種々のマーカーの発現は異なる場合がある。また、これらの表現型の細胞は増殖後の細胞集団において優勢であり得るが、一方で、そのことはこの表現型を有さない細胞の割合が小さいことを意味するものではない（例えば、わずかな比率の増殖後細胞はＣＣ９−であり得る）。一例では、増殖後細胞は異なる細胞型への分化能をまだなお有している。
【０１０６】
一例では、上清もしくは可溶性因子、または細胞それ自体を得るために用いられる消費後（expended）細胞集団が含む細胞は、そのうち少なくとも５０％といった、少なくとも２５％がＣＣ９＋である。
【０１０７】
別の例では、上清もしくは可溶性因子、または細胞それ自体を得るために用いられる増殖後細胞集団が含む細胞は、そのうち少なくとも４５％といった、少なくとも４０％がＳＴＲＯ−１＋である。
【０１０８】
さらなる例では、増殖後細胞は、ＬＦＡ−３、ＴＨＹ−１、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、３Ｇ５、ＣＤ４９ａ／ＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、インテグリンβ６−１９、トロンボモジュリン、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＥＧＦ−Ｒ、ＩＧＦ１−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ、レプチン−Ｒ（ＳＴＲＯ−２はレプチン−Ｒである）、ＲＡＮＫＬ、ＳＴＲＯ−４（ＨＳＰ−９０Ｐ）、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔおよびＣＤ１４６からなる群から集合的に、もしくは個々に選択される一つもしくは複数のマーカー、またはこれらのマーカーのあらゆる組合せを発現し得る。
【０１０９】
一例では、子孫細胞は、国際公開第ＷＯ２００６／０３２０９２号に定義および／または記載される、多能性増殖後ＳＴＲＯ−１＋多能性細胞子孫（Multipotential Expanded STRO-1+ Multipotential cells Progeny）（ＭＥＭＰ）である。子孫が由来し得るＳＴＲＯ−１＋多能性細胞が富化された集団を調製する方法は、国際公開第ＷＯ０１／０４２６８号および同第ＷＯ２００４／０８５６３０号に記載されている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏという文脈では、ＳＴＲＯ−１＋多能性細胞は完全に純粋な調製物として存在することはまれであり、通常は組織特異的分化決定済み（committed）細胞（ＴＳＣＣ）である他の細胞と一緒に存在している。国際公開第ＷＯ０１／０４２６８号は、そのような細胞を骨髄から約０．１％〜９０％の純度レベルで収集することに言及している。子孫が由来するＭＰＣを含む集団は、組織源から直接収集してもよいし、あるいは、ｅｘ  ｖｉｖｏで既に増殖させてある集団であってもよい。
【０１１０】
例えば、子孫は、それらが存在する集団の全細胞の少なくとも約０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９５％を含む、収集され、増殖していない、実質的に精製されたＳＴＲＯ−１＋多能性細胞の集団から得てもよい。このレベルは、例えば、ＴＮＡＰ、ＳＴＲＯ−４（ＨＳＰ−９０Ｐ）、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ、３Ｇ５＋、ＶＣＡＭ−１、ＴＨＹ−１、ＣＤ１４６およびＳＴＲＯ−２からなる群から個々に、または集合的に選択される少なくとも１つのマーカーが陽性である細胞を選別することによって達成することができる。
【０１１１】
ＭＥＭＰＳは、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉマーカーに対し陽性であり、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）マーカーに対し陰性であるという点で、新たに収集されたＳＴＲＯ−１＋多能性細胞と区別することができる。対照的に、新たに単離されたＳＴＲＯ−１＋多能性細胞は、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉおよびＡＬＰの両方に対し陽性である。本開示の一例では、投与される細胞のうち少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％が、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ、ＡＬＰ−の表現型を有する。さらなる一例では、ＭＥＭＰＳはＫｉ６７、ＣＤ４４および／またはＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＶＬＡ−３、α３β１マーカーのうちの一つまたは複数に対し陽性である。さらなる例では、ＭＥＭＰはＴＥＲＴ活性を示さず、および／または、ＣＤ１８マーカーに対し陰性である。
【０１１２】
ＳＴＲＯ−１＋細胞出発集団は、国際公開第ＷＯ０１／０４２６８号または同第ＷＯ２００４／０８５６３０号に記載される、いずれか一つまたは複数の組織型、すなわち、骨髄、歯髄細胞、脂肪組織および皮膚由来、あるいは、より広範に、脂肪組織、歯、歯髄、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、網膜、脳、毛包、腸、肺、脾臓、リンパ節、胸腺、膵臓、骨、靱帯、骨髄、腱および骨格筋由来であってもよい。
【０１１３】
本開示に記載の方法を実施する際、任意の所与の細胞表面マーカーを保有している細胞の分別は、複数の異なる方法によって達成できるが、例示的な方法は、結合物質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を、関係するマーカーに結合させた後、高レベル結合、または低レベル結合または結合なしのいずれかである結合を示すものを分別することに依存することは理解されるだろう。最も都合のよい結合物質は、抗体または抗体ベースの分子、例えばモノクローナル抗体であるか、またはこれらの後者の作用物質の特異性という理由からモノクローナル抗体（例えばその断片に結合する抗原を含むタンパク質）に基づいている。抗体は両方のステップに用いることができるが、他の作用物質を用いてもよく、従って、マーカーを保有している細胞、またはマーカーがない細胞を富化するために、これらのマーカーに対するリガンドを使用してもよい。
【０１１４】
抗体またはリガンドを固体の担体に付着させることで、粗分別が可能となる。一例では、分別技術は、収集される画分の生存能の保持率を最大とする。異なる効率の種々の技術が、比較的粗い分別を行うために使用可能である。使用される具体的な技術は、分別効率、随伴する細胞毒性、実施の容易さおよび速さ、並びに高性能機器および／または技巧の必要性に応じたものとなるだろう。分別の手順には、限定はされないが、抗体被膜磁気ビーズを用いた磁気分別、アフィニティークロマトグラフィーおよび固体の基盤に付着した抗体での「パニング」が含まれ得る。正確な分別を提供する技術としては、限定はされないが、ＦＡＣＳが挙げられる。ＦＡＣＳを実施するための方法は、当業者には明らかであるだろう。
【０１１５】
本明細書に記載のマーカーの各々に対する抗体は市販されており（例えば、ＳＴＲＯ−１に対するモノクローナル抗体はＲ＆Ｄシステム社、米国から購入できる）、ＡＴＣＣまたは他の預託機関から入手可能であり、および／または、当該分野で認知されている技術を用いて作製することができる。
【０１１６】
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞を単離するための方法は、例えば、ＳＴＲＯ−１の高レベル発現を認識する磁気細胞分取（ＭＡＣＳ）を利用する固相分取ステップである第一ステップを含む。所望であれば、より高レベルの前駆細胞発現をもたらすために、国際公開第ＷＯ０１／１４２６８号の特許明細書に記載される第二の分取ステップを続けることができる。この第二の分取ステップには、２つ以上のマーカーの使用が含まれ得る。
【０１１７】
ＳＴＲＯ−１＋細胞を得るための方法には、既知の技術を用いた第一富化ステップの前に、細胞の源を収集することが含まれてもよい。従って、組織が外科的に摘出される。源組織を構成する細胞は、その後分別されて、いわゆる単一細胞懸濁液にされる。この分別は、物理的手段および／または酵素的手段によって達成することができる。
【０１１８】
適切なＳＴＲＯ−１＋細胞集団を得た後、細胞を任意の適切な手段で培養または増殖させてＭＥＭＰを得ることができる。
【０１１９】
一例では、前記細胞は治療を受ける対象から採取され、標準的な技術を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され、その対象に自己または同種異系間の組成物として投与することを目的とした上清または可溶性因子または増殖後細胞を得るために用いられる。別の例では、樹立されたヒト細胞株のうちの一つまたは複数の細胞が、上清または可溶性因子を得るために使用される。別の有用な例では、非ヒト動物（または、患者がヒトでない場合は別の種に由来）の細胞が、上清または可溶性因子を得るために使用される。
【０１２０】
本開示の方法および使用は、あらゆる非ヒト動物種由来の細胞、例えば、限定はされないが、非ヒト霊長類細胞、有蹄動物、イヌ、ネコ、ウサギ、げっ歯類、トリ、および魚の細胞を用いて実施できる。本開示の方法を実施することができる霊長類細胞としては、限定はされないが、チンパンジー、ヒヒ、カニクイザル、および他のあらゆる新世界ザルまたは旧世界ザルの細胞が挙げられる。本開示の方法を実施することができる有蹄動物細胞としては、限定はされないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、水牛およびバイソンの細胞が挙げられる。本開示の方法を実施することができるげっ歯類細胞としては、限定はされないが、マウス、ラット、モルモット、ハムスターおよびスナネズミの細胞が挙げられる。本開示の方法を実施することができるウサギ種の例としては、家畜化されたウサギ、ノウサギ（jack rabbit,hare）、ワタオウサギ、カンジキウサギ、およびナキウサギが挙げられる。ニワトリ（Gallus gallus）は、本開示の方法を実施することができるトリ種の一例である。
【０１２１】
一例では、細胞はヒト細胞である。
【０１２２】
本開示の方法に有用な細胞は、使用前、または上清もしくは可溶性因子を得る前に、保存することができる。真核細胞、具体的には哺乳類細胞を保存および保管するための方法およびプロトコルは、当該技術分野において周知である（例えば、Pollard, J. W. and Walker, J. M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, Second Edition, Humana Press, Totowa, N.J.; Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, Fourth Edition, Wiley-Liss, Hoboken, N.J.を参照）。間葉系幹／前駆細胞、またはその子孫等の単離された幹細胞の生物活性を維持するためのあらゆる方法は、本開示と一緒に利用することができる。一例では、前記細胞は凍結保存を用いて維持および保管される。
【０１２３】
遺伝子改変細胞
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞は、遺伝子改変されて、例えば、関心のタンパク質を発現および／または分泌する。例えば、細胞は、運動障害または脳梗塞の他の影響の治療に有用なタンパク質、例えば、Meade et al., J Exp Stroke TransI Med 2: 22-40, 2009.に記載されている神経成長因子またはペプチドを発現するように設計される。
【０１２４】
細胞を遺伝子改変する方法は、当業者には明らかであるだろう。例えば、細胞で発現されるべき核酸は、細胞での発現を誘導するためのプロモーターと機能的に連結される。例えば、核酸は、例えば、ウイルスプロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター）またはＳＶ−４０プロモーター等の、対象の種々の細胞中で機能できるプロモーターに連結される。さらなる適切なプロモーターは当該技術分野において周知であり、本開示の本例に準用すると解されるものとする。
【０１２５】
一例では、核酸は発現コンストラクトの形態で提供される。本明細書で使用される場合、「発現コンストラクト」という用語は、細胞中で機能的に連結された核酸（例えば、レポーター遺伝子および／または対抗選択可能な（counter-selectable）レポーター遺伝子）を発現させる能力を有する核酸を指す。本開示の文脈においては、発現コンストラクトは、プラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスのサブゲノム断片もしくはゲノム断片、または異種ＤＮＡを発現可能な形態で維持および／または複製できる他の核酸を含むか、またはそれら自身であってもよいことは理解されるべきである。
【０１２６】
本開示の方法を実施するための適切な発現コンストラクトを構築するための方法は、当業者には明らかであり、例えば、Ausubel et al (In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987)または Sambrook et al (In: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001）に記載されている。例えば、発現コンストラクトの各成分は、例えばＰＣＲを用いて適切な鋳型核酸から増幅され、その後、例えばプラスミドまたはファージミド等の適切な発現コンストラクト中にクローニングされる。
【０１２７】
そのような発現コンストラクトに適切なベクターは、当該技術分野において周知であり、および／または、本明細書に記載されている。例えば、哺乳類細胞における、本開示の方法における使用に適切な発現ベクターは、例えば、ライフテクノロジーズ社（Life Technologies Corporation）より提供されるｐｃＤＮＡベクター一式のベクター、ｐＣＩベクター一式（プロメガ社（Promega））のベクター、ｐＣＭＶベクター一式（クロンテック社（Clontech））のベクター、ｐＭベクター（クロンテック社）、ｐＳＩベクター（プロメガ社）、ＶＰ１６ベクター（クロンテック社）またはｐｃＤＮＡベクター一式（インビトロジェン社（Invitrogen））のベクターである。
【０１２８】
当業者は、さらなるベクター、および例えば、ライフテクノロジー社、クロンテック社またはプロメガ社等の、そのようなベクターの供給源は承知しているだろう。
【０１２９】
単離された核酸分子またはそれを含む遺伝子コンストラクトを発現のために細胞に導入する手段は、当業者に周知である。所与の生物体に用いられる技術は、既知の優れた技術に依存する。組換えＤＮＡを細胞に導入するための手段としては、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによって媒介されるトランスフェクション、例えばリポフェクタミン（ギブコ社（Gibco）、米国メリーランド州）および／またはセルフェクチン（ギブコ社（Gibco）、米国メリーランド州）による、リポソームによって媒介されるトランスフェクション、ＰＥＧによって媒介されるＤＮＡの取り込み、エレクトロポレーション、並びに、例えばＤＮＡを被膜したタングステンまたは金粒子（アグラセタス社（Agracetus Inc.、米国ウィスコンシン州）による微小粒子照射（microparticle bombardment）が特に挙げられる。
【０１３０】
あるいは、本開示の発現コンストラクトはウイルスベクターである。適切なウイルスベクターは当該技術分野において周知であり、市販されている。核酸の運搬および宿主細胞ゲノムへの核酸の組込みを目的とした従来のウイルスベースの系としては、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。あるいは、アデノウイルスベクターが、エピソームのままの核酸を宿主細胞に導入するのに有用である。ウイルスベクターは、標的細胞および標的組織における遺伝子導入の、効率的で且つ用途の広い方法である。加えて、高い導入効率が、多くの異なる細胞型および標的組織で確認されている。
【０１３１】
例えば、レトロウイルスベクターは、通常、最大６〜１０ｋｂの外来配列パッケージング容量を有する、シス作動性長末端反復配列（ＬＴＲ）を含む。最小のシス作動性ＬＴＲであってもベクターの複製およびパッケージングには十分であり、その後、発現コンストラクトを標的細胞に組み込むのに使用され、長期発現を提供する。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳｒＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびその組合せをベースとするものが含まれる（例えば、Buchscher et al., J Virol. 56:2731-2739 (1992); Johann et al, J. Virol. 65:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al, Virol. 76:58-59 (1990); Wilson et al, J. Virol. 63:274-2318 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700; Miller and Rosman BioTechniques 7:980-990, 1989; Miller, A. D. Human Gene Therapy 7:5-14, 1990; Scarpa et al Virology 75:849-852, 1991; Burns et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:8033-8037, 1993を参照）。
【０１３２】
また、様々なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系が核酸運搬用に開発されている。ＡＡＶベクターは、当該技術分野において周知の技術を用いて容易に構築することができる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開第ＷＯ９２／０１０７０号および同第ＷＯ９３／０３７６９号；Lebkowski et al. Molec. Cell. Biol. 5:3988-3996, 1988; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press);Carter Current Opinion in Biotechnology 5:533-539, 1992; Muzyczka. Current Topics in Microbiol, and Immunol. 755:97-129, 1992; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801, 1994; Shelling and Smith Gene Therapy 7:165-169, 1994;並びにZhou et al. J Exp. Med. 779:1867-1875, 1994を参照されたい。
【０１３３】
本開示の発現コンストラクトを運搬するのに有用なさらなるウイルスベクターとしては、例えば、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルス等の痘ファミリー（pox family）のウイルス由来のもの、またはアルファウイルス属または複合（conjugate）ウイルスベクター（例えば、Fisher-Hoch et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 56:317-321, 1989に記載のもの）が挙げられる。
【０１３４】
細胞および可溶性因子の治療／予防における有用性試験
細胞もしくは可溶性因子の、脳機能を改善する、および／または運動障害を治療する、および／または脳神経細胞を再生する能力を決定する方法は、当業者には明らかであろう。
【０１３５】
例えば、細胞または可溶性因子は、神経細胞とともに培養され、細胞または可溶性因子の、軸索成長を誘導する能力が評価される、例えば顕微鏡技術。同様な試験が、例えば、本明細書で例証したように、細胞および／または可溶性因子の鶏胚の脳への注入、および軸索の成長の評価により、ｉｎ  ｖｉｖｏで実行され得る。
【０１３６】
一例では、神経細胞は、細胞および／または可溶性因子との培養に先立って、または培養時に、酸素および／またはグルコースの除去に曝露される。酸素およびグルコースの除去は、虚血のモデルである。
【０１３７】
他の例では、細胞は、例えば、ブチル化ヒドキシアニソールおよびバルプロ酸または  ５−アザシチジンまたはインドメタシンおよびイソブチルメチルキサンチンおよびインスリンを含む、神経細胞の分化を誘導する条件のもとで増殖する。神経細胞に分化する細胞は、治療に適切であると考えられる。
【０１３８】
さらなる例では、細胞または可溶性因子（例えば、因子の混合物または単一因子または因子の画分（例えば、親和性精製またはクロマトグラフィーに由来する））が、脳梗塞のモデルに投与され、脳機能、脳神経細胞の再生および／または行動障害に与える影響が評価される。
【０１３９】
非ヒト動物対象における虚血性脳梗塞を誘導する、多様な既知の技術、例えば、大動脈／大静脈閉塞、外部からの首への止血帯または血圧バンド、出血または低血圧、頭蓋内圧亢進または総頚動脈閉塞、２血管閉塞および低血圧、４血管閉塞、一側総頸動脈閉塞（一部の種でのみ）、エンドセリン１に誘導された動脈および静脈の収縮、中大脳動脈閉塞、自発脳梗塞（自然発症高血圧ラットでの）、マクロスフェア（macrosphere）血栓形成、血餅による血栓形成またはマクロスフェア血栓形成が存在する。脳出血は、脳へのコラゲナーゼの注入によりモデル化することができる。
【０１４０】
一例では、脳梗塞のモデルは、虚血性脳梗塞を誘導する中大脳動脈閉塞を含む。
【０１４１】
集団および／または子孫および／または 分泌 因子の、脳梗塞の影響を治療する能力を試験するために、集団および／または子孫および／または分泌因子が、脳梗塞の誘導後、例えば、脳梗塞後の１時間から１日以内に投与される。投与後に、脳機能および／または運動障害の評価が、例えば何回か行われる。
【０１４２】
脳機能および／または運動障害を評価する方法は、当業者には明らかであろうし、例えば、ロータロッド（rotarod）、高架式十字迷路法、オープンフィールド（open-field）、モリス水迷路、Ｔ迷路、放射状迷路、運動評価（例えば、ある期間内に覆われた領域），テールフリック（tail flick）またはＤｅ  Ｒｙｃｋの行動試験(De Ryck et al., Stroke. 20:1383-1390, 1989)が挙げられる。さらなる試験は、当業者には明らかである、および／または本明細書に記載されているであろう。
【０１４３】
他の例では、集団および／または子孫および／または分泌因子の大脳への影響は、画像化により評価される。例えば、アポトーシス、自食作用および神経血管単位は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの光画像化により検出することができ(Liu et al., Brain Res. 2011 Apr 27)、ＰＥＴ、ＭＲＩまたはＣＴを用いて、梗塞のサイズ、ペナンブラのサイズおよび／または脳損傷の範囲といった、多様な因子を評価することができる。
【０１４４】
集団および／または子孫および／または分泌因子の、脳神経細胞への影響もまた、評価される。例えば、脳またはその大脳領域は除去され、神経細胞の数または神経細胞のサブタイプが評価、または見積もられる。使用されるモデルに依存して、この数は、対象動物における数と比較されてもよく、またはもし限局的虚血のみが誘導される場合には、同一動物からの脳の対照領域と比較されてもよい。
【０１４５】
細胞性組成物
本開示の一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞は、組成物の形態で投与される。一例では、かかる組成物は薬剤的に許容できる担体および／または賦形剤を含む。
【０１４６】
「担体」および「賦形剤」という用語は、貯蔵、投与、および／または活性化合物の生物活性を促進するために当該技術分野において従来用いられる組成物を指す（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mac Publishing Company (1980)を参照）。担体は活性化合物のあらゆる望ましくない副作用を減らすこともできる。適切な担体は、例えば、安定であり、例えば、担体中の他の成分と反応できない。一例では、担体は、治療に使用された投与量および濃度において、重大な局所的または全身的な有害作用をレシピエントにもたらさない。
【０１４７】
本開示のための適切な担体には、従来的に使用されるものが含まれ、例えば、水、食塩水、水性デキストロース、ラクトース、リンゲル液、緩衝液、ヒアルロナンおよびグリコールは、特に（等張である場合）水剤用の、例示的な液体担体である。適切な医薬担体および賦形剤としては、デンプン、セルロース、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等が挙げられる。
【０１４８】
別の例では、担体は、例えば、その中で細胞が生育または懸濁される、培地組成物である。一例では、かかる培地組成物は、それを投与された対象においていかなる有害作用も誘導しない。
【０１４９】
例示的な担体および賦形剤は、細胞の生存能、ならびに／または脳梗塞の影響を減少、防止もしくは遅延させる細胞の能力に悪影響を及ぼさない。
【０１５０】
一例では、担体または賦形剤によって緩衝作用（buffering activity）がもたらされ、それにより細胞および／または可溶性因子が適切なｐＨに維持されることで生物活性が発現される。例えば、その担体または賦形剤はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。ＰＢＳは、魅力的な担体または賦形剤であるが、その理由は、血流中または組織もしくは組織の周辺もしくは隣接領域中への、例えば、注射による直接的な適用を目的として、本開示の組成物が液体として製造されるような場合に、ＰＢＳが細胞および因子と最小限にしか相互作用せず、細胞および因子の迅速な放出を可能とするためである。
【０１５１】
ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞は、レシピエント適合性であり、レシピエントに対し有害ではない産物に分解される足場に組み込む、または埋め込むこともできる。これらの足場によって、レシピエントである対象に移植されるべき細胞に、支持および保護がもたらされる。天然および／または合成の生分解性足場は、そのような足場の例である。
【０１５２】
種々の異なる足場が、本開示の実施において成功裏に使用され得る。例示的な足場としては、限定はされないが、生物的で、分解可能な足場が挙げられる。天然の生分解性足場としては、コラーゲン、フィブロネクチン、およびラミニン足場が挙げられる。細胞移植の足場のための適切な合成材料は、広範な細胞成長および細胞機能を支持可能なものであるべきである。そのような足場は再吸収可能なものであってもよい。適切な足場としては、例えば、Vacanti, et al. J. Fed. Surg. 23:3-9 1988; Cima, et al. Biotechnol. Bioeng. 38:145 1991; Vacanti, et al. Plast. Reconstr. Surg. 88:153-9 1991に記載されるように、ポリグリコール酸の足場；またはポリ酸無水物、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の合成高分子が挙げられる。
【０１５３】
別の例では、本細胞はゲル状足場（アップジョン社（Upjohn Company）のゼルフォーム（Gelfoam）等）に投与され得る。
【０１５４】
本明細書に記載の方法に有用な本細胞性組成物は、単独で、または他の細胞との混合物として投与されてもよい。本開示の組成物と併せて投与され得る細胞としては、限定はされないが、他の多分化能もしくは多能性を有する細胞もしくは幹細胞、または骨髄細胞が挙げられる。異なる型の細胞は、本開示の組成物と、投与の直前または少し前に混合することができ、あるいは、それらを投与前にある一定期間一緒に共培養してもよい。
【０１５５】
一例では、本組成物は、有効量または治療的もしくは予防的に有効量の細胞を含む。例えば、本組成物は、約１×１０５ＳＴＲＯ−１＋細胞／ｋｇ〜約１×１０７ＳＴＲＯ−１＋細胞／ｋｇまたは約１×１０６ＳＴＲＯ−１＋細胞／ｋｇ〜約５×１０６ＳＴＲＯ−１＋細胞／ｋｇを含む。投与されるべき細胞の正確な量は、種々の因子、例えば、患者の年齢、体重、および性別、並びに脳梗塞および／または脳梗塞の部位の範囲および重症度に依存する。
【０１５６】
一例では、低用量の細胞が対象に投与される。例示的な投与量は、ｋｇあたり約０．１×１０４と０．５×１０６個の間の細胞、例えば、ｋｇあたり約０．５×１０５と０．５×１０６個の間の細胞といった、ｋｇあたり約０．5×１０５と０．５×１０６個の間の細胞、例えば、ｋｇあたり約０．１×１０６と０．５×１０６個の間の細胞、ｋｇあたり約０．２×１０６または０．３×１０６または０．４×１０６個の細胞を含む。
【０１５７】
一部の例では、細胞は、細胞が対象の血行路に出て行くことを拒むが、細胞から分泌された因子が血行路に進入することは許すチャンバー内に含まれる。このように、本細胞が対象の血行路に因子を分泌することを可能とさせることにより、可溶性因子は対象に投与され得る。そのようなチャンバーは、対象におけるある部位に均等に埋め込むことで可溶性因子の局所レベルを増加させることができ、例えば、膵臓の中または近くに埋め込まれる。
【０１５８】
本開示の一部の例では、細胞性組成物を用いた治療の開始前に患者を免疫抑制することは、必ずしも必要であったり、望まれたりするわけではない。従って、ＳＴＲＯ−１＋細胞またはその子孫の、同種異系間、さらには異種間での移植であっても、場合によっては許容されることがある。
【０１５９】
しかし、他の場合においては、細胞治療開始前に、患者を薬理学的に免疫抑制することおよび／または細胞組成物に対する対象の免疫応答を減少させることが望ましいか、または適切であり得る。これは、全身的または局所的な免疫抑制剤の使用によって達成することができ、あるいは封入デバイスにて本細胞を送達することによって達成することもできる。本細胞は、細胞および治療因子に必要とされる栄養分および酸素を透過させるが、免疫液性因子および細胞は透過させないカプセルに封入してもよい。一例では、カプセルの材料は、アレルギーを起こしにくいもので、標的組織内に容易に且つ安定して位置し、移植された構造体にさらなる保護を与える。移植細胞に対する免疫応答を低減または除去するためのこれらおよび他の手段は、当該技術分野において周知である。代わりに、本細胞を、それらの免疫原性を低減させるために、遺伝的に改変してもよい。
【０１６０】
可溶性因子の組成物
本開示の一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の、および／もしくは子孫細胞由来の上清または可溶性因子は、例えば、適切な担体および／または賦形剤を含む組成物の形態で、投与される。一例では、担体または賦形剤は可溶性因子または上清の生物学的効果に悪影響を及ぼさない。
【０１６１】
一例では、本組成物は、可溶性因子または上清の成分、例えば、プロテアーゼ阻害剤を安定化させるための組成物を含む。一例では、プロテアーゼ阻害剤は、対象に対し有害作用を有するのに十分な量では含まれない。
【０１６２】
ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の、および／または子孫細胞由来の上清または可溶性因子を含む組成物は、例えば、培地中で、または安定な担体もしくは緩衝溶液、例えば、リン酸緩衝食塩水中で、適切な液体懸濁液として調製してもよい。適切な担体は本明細書の上記の通りである。別の例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の、および／または子孫細胞由来の上清または可溶性因子を含む懸濁液は、注射用の油状懸濁液である。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油等の脂肪油；またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル；またはリポソームが挙げられる。注射用に使用されるべき懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン等の、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。所望により懸濁液は、化合物の溶解性を増加させ、高濃度での溶液の調製を可能とさせる、適切な安定剤または作用物質を含んでもよい。
【０１６３】
無菌の注射剤は、必要とされる量の上清または可溶性因子を、上記成分のうちの一つまたは組合せと一緒に、適切な溶媒に組み入れ、必要に応じて、その後フィルター滅菌を行うことによって、調製できる。
【０１６４】
通常、分散液は、上清または可溶性因子を、基本（ｂａｓｉｃ）分散媒および上に列挙されたものから必要な他の成分を含有する無菌のビヒクルに組み入れることによって調製される。無菌注射剤調製用の無菌散剤の場合、例示的な調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、それによって、活性成分およびその予め細菌濾過した溶液由来の任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる。本開示の別の態様によれば、上清または可溶性因子は、その溶解性を増強する一つまたは複数のさらなる化合物と共に製剤化され得る。
担体または賦形剤の他の例は、例えば、Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N. Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N. Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y.に記載されている。
【０１６５】
治療組成物は、通常、製造および貯蔵の条件下では無菌且つ安定であるべきである。本組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または他の規則構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、および適切なその混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチン等の被膜の使用によって、分散の場合に必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、本組成物中に等張剤、例えば、糖類、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール等、または塩化ナトリウムを含むのが望ましい。注射用組成物の持続的吸収は、本組成物中に、吸収を遅延させる作用物質、例えば、一ステアリン酸塩およびゼラチンを含むことによってもたらされ得る。さらに、可溶性因子を、徐放性製剤、例えば徐放性ポリマーを含む組成物中に、投与してもよい。例えば、移植片およびマイクロカプセル化した送達系を含む徐放性製剤等、活性化合物は化合物を急速な放出から保護する担体と一緒に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸およびポリ乳酸ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧ）等の、生分解性、生体適合性の高分子を使用することができる。そのような製剤を調製するための多くの方法が、特許されているか、または当業者に一般的に知られている。
【０１６６】
上清または可溶性因子は、例えば、可溶性因子を除放させるために、適切な基質と併せて投与してもよい。
【０１６７】
組成物のさらなる構成要素
ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の上清または可溶性因子、ＳＴＲＯ−１＋細胞またはその子孫は、他の有益な薬物または生化学的分子（増殖因子、栄養因子）とともに投与されてもよい。他の薬剤とともに投与されるとき、それらは、単一の薬剤的組成物で、または独立した薬剤的組成物で、同時にまたは連続して、他の薬剤とともに（他の薬剤の投与の前後に）投与されてもよい。同時投与されてもよい生物活性因子には、反アポトーシス剤（例えばＥＰＯ、ＥＰＯミメチボディ、ＴＰＯ、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ、ＨＧＦ、カスパーゼ阻害剤）；抗炎症薬（例えばｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、ＴＧＦベータ阻害剤、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１阻害剤、ぺミロラスト、トラニラスト、レミケード、シロリムスおよびＮＳＡＩＤ（非ステロイド性の抗炎症薬物；例えば、テポキサリン、トルメン、スプロフェン）；免疫抑制／免疫調節剤（例えば、シクロスポリン、タクロニムスのようなカルシニューリン阻害剤；ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムス、エベロリムス）；抗増殖剤（例えばアザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；コルチコステロイド（例えばプレドニゾン、ヒドロコルチゾン）；コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン）；モノクローナル抗ＩＬ−２Ｒアルファ受容体抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ）といった抗体、（例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）；抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）；モノクローナル抗Ｔ細胞抗体ＯＫＴ３）といったポリクローナル抗Ｔ細胞抗体；反血栓形成剤（例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、ＰＰａｃｋ（デキストロフェニルアラニンプロリンアルギニンクロロメチルケトン）、抗トロンビン化合物、血小板受容体拮抗薬、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害剤および血小板阻害薬）；および抗酸化剤（例えば、プロブコール、ビタミＡ、アスコルビン酸、トコフェノール、コエンザイムＱ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、Ｎ−アセチルシステイン）とともに局所麻酔薬、などが挙げられる。
【０１６８】
一例では、本明細書に記載のいずれかの例に従う組成物は、脳機能を改善するおよび／または脳神経細胞を再生するおよび／または運動障害を治療するさらなる因子、例えば神経成長因子等を含む。
【０１６９】
代わりに、またはさらに、本明細書に記載のいずれかの例に従う細胞、分泌因子および／または組成物は、物理療法および／または言語療法といった、脳梗塞の影響の既知の治療と組み合わされる。
【０１７０】
一例では、本明細書に記載のいずれかの例に従う薬剤的組成物は、脳梗塞の影響を治療するのに使用される化合物を含む。代わりに、本明細書に記載の開示のいずれかの例に従う治療／予防の方法は、脳梗塞の影響を治療するのに使用される化合物を投与することを、さらに含む。例示的な化合物が本明細書に記載され、本開示の例に準用されると解されるものとする。
【０１７１】
他の例では、本明細書に記載のいずれかの例に従う組成物は、前駆体細胞の血管細胞への分化を誘導するまたは促進する因子を、さらに含む。例示的な因子には、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ；例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ）、およびＦＧＦが挙げられる。
【０１７２】
他の例では、本明細書に記載のいずれかの例に従う組成物は、組織特異的分化決定済み細胞（ＴＳＣＣ）、をさらに含む。この態様では、国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ２００５／００１４４５号が、ＴＳＣＣおよびＳＴＲＯ−１＋細胞の投与がＴＳＣＣの増殖の促進を導くことができることを示している。一例では、ＴＳＣＣは、血管細胞である。そうした組成物の対象への投与は、血管系産生の増加、例えば、罹患組織へ送達される栄養物の増加の誘導、を導くこともある。
【０１７３】
医療デバイス
本開示はまた、本明細書に記載のいずれかの例に従う方法において使用するための、または使用される場合の医療デバイスを提供する。例えば、本開示は、本明細書に記載のいずれかの例に従う、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫細胞および／もしくはそれからの可溶性因子ならびに／または組成物を含む、注射器またはカテーテルまたは他の適切な送達デバイスを提供する。注射器またはカテーテルは、本明細書に記載のいずれかの例に従う方法における使用説明書と同梱されていてもよい。
【０１７４】
他の例では、本開示は、本明細書に記載のいずれかの例に従う、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫細胞および／もしくはその可溶性因子ならびに／または組成物を含む、移植片を提供する。移植片は、本明細書に記載のいずれかの例に従う方法における使用説明書と同梱されてもよい。適切な移植片は、例えば、本明細書で前述した足場、ならびにＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫細胞および／またはその可溶性因子とともに形成されてもよい。
【０１７５】
投与様式
ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の上清もしくは可溶性因子、ＳＴＲＯ−１＋細胞またはその子孫は、外科的に移植、注射、送達（例えば、カテーテルまたは注射器を手段として）されてもよいし、あるいは、修復または増強を必要としている部位、例えば脂肪体に直接的または間接的に投与されてもよい。
【０１７６】
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の上清または可溶性因子、ＳＴＲＯ−１＋細胞またはその子孫は、対象の血流に送達される。例えば、ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の上清または可溶性因子、ＳＴＲＯ−１＋細胞またはその子孫は、非経口的に送達される。非経口投与の経路の例としては、限定はされないが、腹腔内、脳室内（intraventricular, intracerebroventricular）、くも膜下腔内、または静脈内が挙げられる。一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の上清または可溶性因子、ＳＴＲＯ−１＋細胞またはその子孫は、動脈内、大動脈中、心臓の心房もしくは心室中、または血管中に、例えば、静脈内に送達される。
【０１７７】
心臓の心房または心室への細胞送達の場合、肺への急速な細胞送達によって生じ得る合併症を避けるため、細胞は左心房または左心室に投与されることがある。
【０１７８】
一例では、集団および／または子孫および／またはそれに由来する可溶性因子は、頸動脈に投与される。
【０１７９】
一例では、集団および／または子孫および／またはそれに由来する可溶性因子は、対象の脳、例えば、頭蓋内に投与される。例えば、集団および／または細胞および／または可溶性因子は、大脳に投与され、および／または線状体に投与されてもよい。
【０１８０】
一例では、集団および／または細胞および／または可溶性因子は、虚血部位および／または虚血部位の辺縁に投与される。そのような部位は、当技術分野で既知の方法、例えば、磁気共鳴画像化および／またはコンピューター断層撮影および／または超音波などの方法で決定することができる。
【０１８１】
治療製剤の投与計画の選択は、いくつかの因子、例えば、血清または組織での実体（entity）の代謝回転速度、症状レベル、および実体の免疫原性に依存する。
【０１８２】
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の上清または可溶性因子、ＳＴＲＯ−１＋細胞またはその子孫は、単回急速投与量として送達される。あるいは、ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の上清または可溶性因子、ＳＴＲＯ−１＋細胞もしくはその子孫は、持続注入によって、または、例えば、１日、１週間の間隔の、もしくは週に１〜７回の投与によって、投与される。例示的な投与プロトコルは、有意な望ましくない副作用を回避する、最大の投与量または投与頻度を含むものである。週当たりの総投与量は、使用される因子／細胞のタイプおよび活性に応じて決定される。適切な投与量の決定は、臨床医によって、例えば、当該技術分野において、治療に影響を与えると知られている、もしくは疑われている、または治療に影響を与えると予想されるパラメーターまたは因子を用いて、行われる。通常、投与はやや適量未満の量から開始され、その後、あらゆる負の副作用と比較して所望の、または最適の効果が達成されるまで、小さな増加量で増加される。
【０１８３】
本開示は、以下の非限定的な実施例を含む。
【実施例】
【０１８４】
実施例１：ＳＴＲＯ−３＋細胞の選択によるＭＰＣの免疫選択
骨髄（ＢＭ）を、健康な正常成人の志願者（２０〜３５歳）から収集する。簡潔には、４０ｍｌのＢＭを、後腸骨稜から、リチウム−ヘパリン抗凝固剤含有チューブに吸引する。
【０１８５】
ＢＭＭＮＣを、従来の記述（Zannettino, A.C. et al. (1998) Blood 92: 2613-2628）の通りに、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（ニコメッドファーマ（Nycomed Pharma）、ノルウェイ、オスロ）を用いて、密度勾配分別によって調製する。４００×ｇで３０分間、４℃での遠心分離後、淡黄色の層をホールピペットで除去し、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、ＣＳＬリミテッド社（CSL Limited）、オーストラリア、ヴィクトリア州）を含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；ライフテクノロジーズ社（Life Technologies）、メリーランド州ゲイサーズバーグ）から成る「ＨＨＦ」中で３回洗浄する。
【０１８６】
続いて、ＳＴＲＯ−３＋（またはＴＮＡＰ＋）細胞を、従来の記述（Gronthos et al. (2003) Journal of Cell Science 116: 1827-1835; Gronthos, S. and Simmons, P.J. (1995) Blood 85: 929-940）の通りに、磁気細胞分取で単離した。簡潔には、およそ１〜３×１０８個のＢＭＭＮＣを、ＨＨＦ中１０％（体積／体積）正常ウサギ血清から成るブロッキング緩衝液中で、２０分間、氷上でインキュベートする。細胞を、ブロッキング緩衝液中１０μｇ／ｍｌのＳＴＲＯ−３ｍＡｂ溶液２００μｌと一緒に、氷上で１時間インキュベートする。続いて、細胞を４００×ｇでの遠心分離によってＨＨＦ中で２回洗浄する。ＨＨＦ緩衝液中１／５０希釈のヤギ抗マウスγビオチン（サザンバイオテクノロジーアソシエイツ社（Southern Biotechnology Associates）、英国、バーミンガム）を加え、細胞を氷上で１時間インキュベートする。細胞を、上記と同様に、ＭＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡ、５ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０１％アジ化ナトリウムを添加した、Ｃａ２＋およびＭｎ２＋を含まないＰＢＳ）中で２回洗浄し、最終体積０．９ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液中に再懸濁する。
【０１８７】
１００μｌのストレプトアビジンミクロビーズ（ミルテニーバイオテック社（Miltenyi Biotec）；ドイツ、ベルギッシュグラートバハ）を細胞懸濁液に添加し、氷上で１５分間インキュベートする。細胞懸濁液を２回洗浄し、０．５ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁した後、ミニＭＡＣＳカラム（ＭＳ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、ミルテニーバイオテック社（Miltenyi Biotec））上に充填し、０．５ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液で３回洗浄して、ＳＴＲＯ−３ｍＡｂ（２００５年１２月１９日にアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）にＰＴＡ−７２８２の受託番号で寄託；国際公開第ＷＯ２００６／１０８２２９号を参照）と結合しなかった細胞を回収する。さらに１ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液を加えた後、カラムを磁石から取り除き、ＴＮＡＰ＋細胞を陽圧で単離する。各画分からの細胞の一定分量をストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色し、純度をフローサイトメトリーで評価することができる。
【０１８８】
実施例２：ＳＴＲＯ−３ｍＡｂによって選択された細胞はＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞である
ＳＴＲＯ−３ｍＡｂを、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞を単離する単一試薬として用いることの可能性を確認する目的の実験を設計した。
【０１８９】
ＳＴＲＯ−３（ＩｇＧ１）はＳＴＲＯ−１（ＩｇＭ）とは異なるアイソタイプであることを考慮し、ＳＴＲＯ−３のクローン原性ＣＦＵ−Ｆを同定する能力を、ＭＡＣＳを用いて単離したＳＴＲＯ−１−細胞との共発現に基づく２色ＦＡＣＳ分析によって評価した（図１）。ドットプロットヒストグラムは、リストモードデータとして収集された５×１０４個の事象を表わしている。垂直線および水平線は、同条件下で処理したアイソタイプ対応対照抗体、１Ｂ５（ＩｇＧ）および１Ａ６．１２（ＩｇＭ）で得られた平均蛍光の１．０％未満の反応性レベルに設定した。結果は、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞のうち少量の集団がＴＮＡＰを共発現したが（右上象限）、残りのＳＴＲＯ−１＋細胞はＳＴＲＯ−３ｍＡｂと反応しなかったことを示している。その後、４つの象限全てからＦＡＣＳで単離された細胞をＣＦＵ−Ｆの発生率について評価した（表１）。
【０１９０】
表１：細胞表面マーカーであるＳＴＲＯ−１およびＴＮＡＰの共発現に基づく２重染色ＦＡＣＳ分析によるヒト骨髄細胞の富化（図１参照）。ＦＡＣＳで分取した細胞を、２０％ＦＣＳを添加したαＭＥＭ中で、標準的なクローン原性条件下で培養した。データは、播種された１０５個細胞当たりの１４日目のコロニー形成細胞（ＣＦＵ−Ｆ）の平均数±標準誤差（ＳＥ）（ｎは３つの異なる骨髄穿刺液）を表わしている。これらのデータは、ヒトＭＰＣがＳＴＲＯ−１抗原を明るく共発現するＢＭのＴＮＡＰ陽性画分だけに限定されていることを示している。
【表１】
2014516715.tif 000002
【０１９１】
実施例３：ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌおよびＳＴＲＯ−１ｂｒｉ細胞の、相対遺伝子および表面タンパク質の発現
第１の組の実験では、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を適用して、蛍光標識細胞分取により単離したＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌまたはＳＴＲＯ−１ｂｒｉ集団により発現した、多様な系列関連遺伝子の遺伝子発現プロファイルを調べた（図２Ａ）。第２の組の実験では、フローサイトメトリーおよび平均チャネル蛍光分析（mean channel fluorescence analysis）を適用して、蛍光標識細胞分取により単離したＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌまたはＳＴＲＯ−１ｂｒｉ集団により発現した、多様な系統関連タンパク質の表面タンパク質発現プロファイルを調べた。
【０１９２】
全細胞ＲＮＡは、２×１０６個のＳＴＲＯ−１ｂｒまたはＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌのいずれかの分取された一次細胞、軟骨細胞ペレットおよび他の誘導培養から調製し、製造元（バイオテックスラボラトリーズ社（Biotecx Lab. Inc.）、テキサス州、ヒューストン）の奨励にもとづき、ＲＮＡｚｏｌＢ抽出方法を用いて溶解させた。各亜集団から単離したＲＮＡはその後、ファーストストランドｃＤＮＡ（First-strand cDNA）合成キット(ファルマシアバイオテック社（Pharmacia Biotech）、スウェーデン、ウプサラ)を用いて調製した、ｃＤＮＡ合成の鋳型ととして使用した。多様な転写産物の発現は、従来記述の標準プロトコル(Gronthos et al., J. Bone and Min. Res. 14:48-57, 1999)を用いて、ＰＣＲ増幅により評価した。本研究で使用されたプライマーのセットを、表２に示す。増幅の後、各反応混合物を、１．５％アガロースゲル電気泳動で分析し、臭化エチジウム染色により可視化した。ＲＮＡの完全性は、ＧＡＰＤＨの発現により評価した。
【０１９３】
各細胞マーカーの相対遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨの発現を基準にして、ＩｍａｇｅＱａｎｔソフトウェアを用いて評価した（図２Ｂ、Ｃ）。加えて、２色フローサイトメトリー分析を用いて、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖したＭＰＣのタンパク質発現プロファイルを、ＳＴＲＯ−１抗体と組み合わせて、さらに広範囲の細胞系統関連マーカーに対するそれらの発現に基づき調べた。ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌおよびＳＴＲＯ−１ｂｒｉ培養細胞の遺伝子およびタンパク質発現に基づく遺伝子の発現型のまとめを表３に示す。これらのデータは、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖したＳＴＲＯ−１ｂｒｉＭＰＣが、血管周囲細胞、例えばアンジオポエチン−１、ＶＣＡＭ−１、ＳＤＦ−１、ＩＬ−１p、ＴＮＦa、およびＲＡＮＫＬに関連するマーカーの差次的にさらに高い発現を示すことを表している。ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌおよびＳＴＲＯ−１ｂｒｉ培養した細胞のタンパク質および遺伝子発現プロファイルの間の比較を、表３と４にまとめる。
【０１９４】
サブトラクティブハイブリダイゼーション研究もまた、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ細胞により一意的に発現する遺伝子を同定するために実行した。簡潔には、ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌおよびＳＴＲＯ−１ｂｒを、上に示すように単離した（図３Ａを見られたい）。全ＲＮＡを、５つの異なる骨髄試料からプールされたＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌおよびＳＴＲＯ−１ｂｒｉ細胞から、ＲＮＡ  ＳＴＡＴ−６０システム（テルテスト社（TEL-TEST）)を用いて調製した。ファーストストランド合成は、ＳＭＡＲＴ  ｃＤＮＡ合成キット（クロンテックラボラトリーズ社（Clontech Laboratories)を用いて実行した。得られたｍＲＮＡ／一本鎖ｃＤＮＡハイブリッドは、最初の室温プロセスにおいて形成された３'および５'末端の特異的プライマー部位を用いる長距離ＰＣＲ（Advantage 2PCRキット; クロンテック社)により、製造元の仕様にもとづき、増幅した。ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ  ｃＤＮＡのＲｓａＩ消化の後、２アリコート(Aliquot)を使用して、異なる特異的アダプターオリゴヌクレオチドを、クロンテックＰＣＲ−Select  ｃＤＮＡサブトラクションキット（Clontech PCR-Select cDNA Subtraction Kit）を用いて、結合した。２回のサブトラクティブハイブリダイゼーションを、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ（テスター）およびＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌ（ドライバー）ｃＤＮＡ、およびその逆を用いて、製造元のプロトコルに従って実行した。この手順はまた、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉドライバーｃＤＮＡに対してハイブリダイズしたＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌテスターｃＤＮＡを用いて、逆に実行した。
【０１９５】
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ集団により一意的に発現する遺伝子を同定するために、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉサブトラクテッドｃＤＮＡを用いて、Ｔ／Ａクローニングベクターに結合したＳＴＲＯ―１ｂｒｉサブトラクテッドｃＤＮＡｓにより形質転換した、２００の無作為に選択された細菌クローンを含む複製低密度マイクロアレイフィルターを構築した。マイクロアレイは引き続いて、［３２Ｐ］ｄＣＴＰ標識したＳＴＲＯ−１ｂｒｉまたはＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌいずれかのサブトラクテッドｃＤＮＡを用いて精査した（図３Ｂ−Ｃ）。差次的スクリーニングにより、合計４４のクローンを同定し、これらは、ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌとＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ亜集団の間で高度に差次的に発現した。差次的に発現したクローンすべてのＤＮＡ塩基配列決定は、ただ１つのクローンが、既知の間質細胞マイトジェンの代表、すなわち、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）(Gronthos and Simmons, Blood. 85: 929-940, 1995)であることを明らかにした。興味深いことに、４４のクローンの６つが、ケモカインである間質由来因子−１（ＳＤＦ−１）に対応するＤＮＡ挿入断片を含むことがわかった。ヒトＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈt細胞における多量のＳＤＦ−１転写物は、新たに分取されたＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ、ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌ、およびＳＴＲＯ−１ｎｅｇａｔｉｖｅ骨髄亜集団から調製した全ＲＮＡの半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより確認した（図３Ｄおよび表３）。
【０１９６】
表２．ＲＴ−ＰＣＲプライマーおよびヒトｍＲＮＡの特異的増幅の条件
【表２−１】
2014516715.tif 000003
【表２−２】
2014516715.tif 000004
【０１９７】
表３.  ＳＴＲＯ−１ＢｒｉおよびＳＴＲＯ−１Ｄｕｌｌ集団における相対遺伝子発現のまとめ。逆転写ＰＣＲにより決定した、ＳＴＲＯ−１ＢｒｉとＳＴＲＯ−１M1集団の間で測定可能で差次的な発現を示した遺伝子のリストを示す。値は、ハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨを基準にした相対遺伝子発現量を表す。
【表３】
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【０１９８】
タンパク質表面発現をＳＴＲＯ−１発現の密度と関連付けるために、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖した細胞に由来する骨髄ＭＰＣの単個細胞懸濁液を、トリプシン／ＥＤＴＡ剥離により調製し、引き続いてＳＴＲＯ−１抗体とともに、広範囲の細胞系統関連マーカーを同定する抗体と組み合わせてインキュベートした。ＳＴＲＯ−１は、ヤギ抗マウスＩｇＭ−フルオレセインイソチオシアネートを用いて同定する一方、他のすべてのマーカーは、ヤギ抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ−フィコエリスリンのどちらかを用いて同定した。細胞内抗原を同定するこれらの抗体については、細胞調製物はまず、ＳＴＲＯ−１抗体をもちいて標識し、冷７０％エタノールを用いて固定して細胞膜を透過性にし、その後、細胞内抗原特異抗体とともにインキュベートした。アイソタイプ一致した対照抗体は、同一条件下で使用した。ＣＯＵＬＴＥＲ  ＥＰＩＣＳフローサイトメーターを用いて２色フローサイトメトリー分析を実行し、リストモードデータを収集した。ドットプロットは、各系統細胞マーカー（ｙ軸）およびＳＴＲＯ−１（ｘ軸）について蛍光強度のレベルを表示する５，０００個のリストモード事象を表す。垂直および水平の象限は、アイソタイプ一致した負の対照抗体を基準にして確立した。
【０１９９】
表４．  ＳＴＲＯ−１ＢｒｉおよびＳＴＲＯ−１Ｄｕｌｌ集団における相対タンパク質発現のまとめである。フローサイトメトリーにより決定したＳＴＲＯ−１ＢｒｉとＳＴＲＯ−１Ｄｕｌｌの集団の間で差次的発現を示したタンパク質のリストを示す。値は、染色の相対的な平均蛍光強度を表す。
【表４】
2014516715.tif 000006
【０２００】
実施例４：ヒト歯髄幹細胞（ｈＤＰＳＣ）は神経細胞に分化する
ＤＰＳＣおよびヒト包皮線維芽細胞の単離
ＤＰＳＣおよびヒト脱落乳歯歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）を、実質的に、Gronthos et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A 97:13625-13630, 2000の記述のとおりに単離した。簡潔には、アデレード大学ならびに医学および獣医科学ヒト対象調査委員会（Institute of Medical and Veterinary Science ヒト Subjects Research Committees）（Ｈ−７３−２００３）によって定められ承認されたガイドラインのもとで、アデレード大学の歯科医院で日常の抜歯を受けている患者からの、告知にもとづく同意を得て、廃棄された正常ヒトの埋伏した第３大臼歯を、成人（１９〜３５歳）または脱落した歯（７〜８歳）から収集した。歯は表面を清浄にし、万力を用いて割り開いて髄室を露出させた。歯髄組織は、歯冠と歯根から穏やかに分離して、その後３ｍｇ／ｍｌのＩ型コラゲナーゼと４ｍｇ／ｍｌのディスパーゼの溶液中で、１時間、３７°Ｃで消化した。単個細胞懸濁液は、細胞を７０−μＭろ過器に通すことによって得た。培養物は、単個細胞懸濁液（１〜２×１０５）の歯髄をＴ−２５フラスコで増殖培地、（２０％のウシ胎仔血清、１００μＭのｌ−アスコルビン酸２リン酸、，２ｍＭのｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したα−ＭＥＭ（（a-modification of Eagle's medium））に播種することによって樹立し、その後、５％のＣＯ２中、３７°Ｃでインキュベートした。
【０２０１】
ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）を、告知にもとづく同意を親から得て、男性新生児ドナーから得た包皮生検の外植片から、コラゲナーゼ／ディスパーゼ消化により単離した。
【０２０２】
神経誘導試験
組織培養フラスコまたはウェルは、ポリオルニチン（１０μｇ／ｍｌ最終濃度）で、終夜、室温で被覆した。フラスコおよびウェルは、水で２度洗浄し、その後、湿潤インキュベーターにおいてラミニン（５μｇ／ｍｌ最終濃度）で、終夜、３７°Ｃで被覆した。フラスコおよびウェルは、細胞を加える前に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、そしてその後、増殖培地で洗浄した。細胞を解凍し、Ｔ２５−被覆フラスコ中で、８０％コンフルエントになるまで増殖させた。細胞を、２ｍｌ／ウェル増殖培地中、１．５×１０５個／ウェルの密度で、６ウェル被覆プレートで３日間、または８ウェル被覆チャンバースライド中で２×１０３個の細胞を再播種した。細胞はその後、培地Ａまたは培地Ｂのどちらかで３週間培養した。培地Ａは、ニューロベイサルＡ培地（Neurobasal A Media）(10888-022;インビトロジェン社、米国、カリフォルニア州、カールスバッド)、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１×Ｂ２７添加剤、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍｌの上皮成長因子(EGF、100-15; ぺプロテック社（PeproTech）、米国、ニュージャージー州、ロッキーヒル）、および４０ｎｇ／ｍｌの基底線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ、番号１０４ＦＧＦＢ０１；プロスペックタニーテクノジーン社（Prospec Tany Techno Gene）、イスラエル、レホヴォト)から成る。培地Ｂは、３週間の継続期間に関して３つの別個の培地条件を含んでおり：第１のインキュベーションは、培地Ａで７日間であり、その後、ダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco's modified Eagle's medium）（ＤＭＥＭ、１２１００−０４６；インビトロジェン社)とＦ１２培地(21700-075;インビトロジェン社)の５０：５０の比の培地、ならびにインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム添加剤（ＩＴＴＳ，１１０７４５４７００１；ロッシュダイアグノスティックス社（Roche Diagnostics）、スイス、バーゼル)、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および４０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦで７日間というものであった。最終の７日間のインキュベーションは、５０：５０の比のＤＭＥＭとＦ１２培地、ＩＴＴＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンと１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、４０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ、および０．５μＭのレチノイン酸（ＲＡ、Ｒ２６２５；シグマアルドリッチ社）、米国、セントルイス）を含む培地からなっていた。対照試料は、神経細胞誘導試験の継続期間のあいだ、増殖培地中に維持された。すべての条件についての培地を、１週間に２回取り替えた。
【０２０３】
電気生理学
３週間の神経細胞分化試験の完了時には、細胞を、トリプシンにより遊離し、神経細胞分化培地または増殖培地中、２×１０４個の細胞／５００μＬの濃度で、塩酸処理したガラスカバースリップ上に再播種し、２４時間インキュベートした。全細胞パッチクランプを、室温で、コンピューターを用いたパッチクランプ増幅器（ＥＰＣ−９；ＨＥＫＡエレクトロニクス（HEKA Electronics）、ドイツ、ランブレヒト／ファルツ)と、ＰＵＬＳＥソフトウェア（ＨＥＫＡエレクトロニクス）を用いて実行した。浴溶液は（ｍＭで）、：ＮａＣｌ、１４０；ＫＣｌ、４；ＣａＣｌ２、２；ＭｇＣｌ２、２；グルコース、１０；およびＨＥＰＥＳ、１０；を含んでおり、ＮａＯＨによりｐＨ７．４に調製した。Ｋ＋チャネルを遮断しＮａ＋電流を分離するために、内液中のグルタミン酸ＫおよびＫＣｌを、等モル量のグルタミン酸ＣｓおよびＣｓＣｌで置き換えた。パッチピペットをホウケイ酸ガラスから引出し、火炎研磨した；ピペット抵抗は、２〜４ＭΩの範囲であった。示された全電圧は、ＪＰＣａｌｃ（Ｐ．Ｈ．Ｂａｒｒｙ博士の提供、ニューサウスウェールズ大学、オーストラリア、シドニー、１９９４）により見積もられた液界電位（Ｋ＋ベースおよびＣｓ＋ベースの内液について、それぞれ‐１４ｍＶと−１８ｍＶ）について補正した。保持電位は常に、‐９０ｍＶであった。
【０２０４】
鳥胚の注入
鶏卵(白色レグホン；  ＨＩＣＨＩＣＫ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、オーストラリア、べサル（Bethal）)を、卵トレーに縦において加湿インキュベーターで３７°Ｃ、およそ４０時間インキュベートし、注入に先立って１０〜１２期に到らしめた。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子導入した成人ヒトＤＰＳＣまたはＨＦＦ（５×１０３個の細胞＾Ｌ）を、成長中の鳥胚に注入した。ファーストグリーン色素（Fast green dye）（２μＬ）を細胞に加え、注入手順の間、それらを可視化した。胚は、卵を７０％エタノールで拭いて準備し、注射針を使ってアルブミンを卵から抽出し、窓を卵の頂部に開け、胚の下部にインディアンインク（Indian ink）(ウィンザー＆ニュートン（Winsor and Newton）、英国、ミドルセックス)（[１ＬのｄｄＨ２０中に７．２ｇのＮａＣｌ２、０．１７ｇのＣａＣｌ２、０．３７ｇのＫＣｌ、０．１１５ｇのＮａ２ＨＰ０４、ｐＨ７．４に調節、フィルター殺菌］のリンゲル液に１：１０で調整）を注入して、胚を可視化した。リンゲル液を胚の頂部に置き、湿度を維持した。卵黄膜を、胚の頭部周辺からタングステンワイヤーを用いて除去した。細胞を、ガラスキャピラリー針（ＧＣ１ＯＯＴＦ−１０；ＳＤＲクリニカルテクノロジー（SDR Clinical Technology）、オーストラリア、シドニー)中に置き、25ボルトに設定された、マイクロマニピュレーターおよび圧力注射器(ナリシゲ、東京)に付着させた。マイクロマニピュレーターを使用して、針を、成長中の後脳におけるロンボメア２のすぐ隣接する領域に誘導した。細胞を、圧力注射器に付属した足踏みポンプを使用して胚に注入した。ガラス針を除去し、数滴のリンゲル液を胚の頂部においた。卵を粘着テープで密封し、加湿インキュベーターに戻した。インキュベーション期間の後、胚を卵から切り出し、冷ＰＢＳ中に置いた；ＧＦＰ注入した細胞を、蛍光解剖顕微鏡を用いて可視化した。胚をその後、解剖した。頭部を、開いた本（open book)の形として、すなわち、鼻から後脳に向かって、頭部の長さを腹側に沿って切り下げた。解剖された胚を、４％ＰＦＡ中、室温で２時間、または４℃で終夜のどちらかで固定し、その後、免疫蛍光染色に先立ってＰＢＳで２回洗浄した。
【０２０５】
培養された細胞調製物の免疫細胞化学
チャンバースライドを４％  ＰＦＡで３０分間、室温で固定し、その後、ＰＢＳと０．１％ツイン２０(Tween 20)（シグマアルドリッチ社）（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄した。培養物を（ＰＢＳ−Ｔ中１０％馬血清）３０分間、室温でブロックし、その後、一次抗体（１：１００ネスチン（６１１６５８；ＢＤバイオサイエンス社(BD Biosciences)、米国、サンディエゴ）；１：５００のポリシアル酸中性細胞接着分子（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ）（Ｔ．Ｓｅｋｉ博士からの贈与）、１：５００のβ−ＩＩＩチューブリンクローン、ＴＵＪ１（ＭＭＳ−４３５Ｐ，１ｍｇ／ｍｌ；コーヴァンス（Covance）、米国、ニュージャージー州、プリンストン)；１：２００のＮＦ−Ｍ（１３−０７００，０．５ｍｇ／ｍｌ；ザイメド(Zymed)、カリフォルニア州、サンフランシスコ）；１：５００のＮＦ−Ｈ（ＡＢ１９９１；ケミコン(Chemicon)、テメキュラ(Temecula)、米国、カリフォルニア州）とともに、ブロッキング溶液中、４℃で終夜、インキュベートした。マウス、ヤギ、およびウサギ（Ｉｇ）対照を、同一条件下で治療した。洗浄後、二次抗体（１：２００ヤギ抗マウスアレクサ４８８(Alexa 488)［Ａ１１０２９，１．５ｍｇ／ｍｌ；ジャクソンイミノサーチラボラトリーズ（Jackson Immunoresearch Laboratories)、米国、ペンシルベニア州、ウェストグローブ］；１：２００ヤギ抗ウサギアレクサ４８８(Alexa 488)［Ａ１１０３４，２ｍｇ／ｍｌ［モレキュラープローブ社(Molecular Probes Inc.)、米国、オレゴン州、ユージーン、］）を、ブロッキング溶液に、２時間、室温で、暗所にて加えた。最後に、スライドを洗浄し、プロロングゴールド褪色防止剤(Prolong gold antifade)と４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ，Ｐ３６９３１；インビトロジェン）とともにカバースリップをつけた。
【０２０６】
結果
図４に示すように、ｈＤＰＳＣが、神経細胞誘導培地中で増殖するとき、それらは、ナトリウム電流を誘導する生物物理学的性質をもつ、複数突起（multiprocess)をもつ神経細胞様細胞に分化する。さらに、ｈＤＰＳＣを鶏胚の脳に移植する場合、それらは、神経細糸を発現する神経細糸に分化する。
【０２０７】
実施例４：  ｈＤＰＳＣ治療は、げっ歯類モデルにおいて脳梗塞後の前肢運動機能を改善する
ｈＤＰＳＣの治療有効性を、虚血性脳梗塞を生じる中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）のラットモデルにおいて評価した。ＭＣＡＯは、ヒトにける虚血性脳梗塞の最も多くみられる提示であり、ＭＣＡＯのこの前臨床的なげっ歯類モデルは、ヒトの状態を簡潔に再現できるものである。このモデルでは、ＭＣＡＯは、ナイロン繊維を内頸動脈に挿入して、内頸動脈の末梢にある中大脳動脈を閉塞するまで押し込むことにより生じる。
【０２０８】
方法
ヒトＤＰＳＣの培養と調製
ヒトＤＰＳＣｓを、歯髄組織の消化により、成人の埋伏（予想位置に完全に出現することができなかった）第三臼歯から単離し、蛍光マーカー緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とともにレトロウイルスによって遺伝子導入した。３〜５継代のＤＰＳＣをウシ胎仔血清中、１０％ジメチルスルホキシド中で冷凍保存した。細胞を解凍して、脳内移植での使用に先立って少なくとも１回継代した。ＤＰＳＣｓを、２０％のウシ胎仔血清、１００ＤＭのＬ−アスコルビン酸二リン酸（和光(Wako)、バージニア州、リッチモンド）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加した□ＭＥＭ(modified Eagle’s medium)（シグマアルドリッチ社、セントルイス、http://www.sigmaaldrich.com）中、３７°Ｃ、５％のＣＯ２中で培養した。細胞を、トリプシンで分離し、添加剤なしに、マイクロリットルあたり１．５×１０５個の細胞の密度で、□ＭＥＭ中に再懸濁した。細胞の生存率を、トリパンブルー色素排除法で決定した。
【０２０９】
げっ歯類の中大脳動脈閉塞と脳内移植
５４匹の体重３００±２０ｇの成体雄スプレイグドーリー(Sprague-Dawley)ラットを、餌と水に自由に取れる状態で、１２時間の明／暗周期で養った。
【０２１０】
ラットを、イソフランで麻酔して、腔内近位中大脳動脈閉塞（ＭＣＡｏ）を通じて一時的な局所脳虚血にさらした［実質的にはAspey et al., Neuropathol Appl Neurobiol., 26: 232-242, 2000およびSpratt et al., J Neurosci Methods 155: 285-290, 2006に記述のとおり］。直腸温度  温度を、過熱パッドで３７±１°Ｃに維持し、血液酸素飽和度と心拍数をモニターし、パルス酸素濃度計（モデル８５００ＡＶ；ノニンメディカル社(Nonin Medical)、ミネソタ州、プリマス）を用いて、生理学的パラメータの範囲内に維持した。簡潔には、右総頸動脈、外頸動脈（ＥＣＡ）、内頸動脈（ＩＣＡ）、および口蓋動脈を、鈍的切開を通じて露出させ、その後にＥＣＡの焼灼と結紮をおこなった。シリコーン被覆した先端（直径０．３５ｍｍ、長さ５ｍｍ）をもつ４−０単繊維のナイロン糸（ダイネック社(Dynek)、オーストラリア、南オーストラリア州、ヘンドン）を、ＥＣＡの断端からＩＣＡを通じて、右中大脳動脈（ＭＣＡ）の起始部まで進めた。糸をその場に固定し、切開を閉じた。閉塞の２時間後、ラットを再び麻酔し、糸を引き抜いて再潅流可能とした。ラットを、手術から回復するにまかせ、短時間の間尻尾で吊して対側前肢屈曲と、床上での旋回行動とについて評価し、２時間でのＭＣＡｏを実証した。ＭＣＡｏの２４時間後、動物を無作為に選択し、ヒトＤＰＳＣ（ｎ＝３１）またはビヒクル（ｎ＝２３）治療を付した（治療スケジュールを示した図５を参照されたい）。全容積４μｌの細胞懸濁液液（６×１０５個の細胞）を、２つの定位座標（ブレグマに対して前後方向、中央側方向；硬膜から背腹方向）において同側実質に：２μｌを線状体に（−０．４０，＋４．００；−５．５０ｍｍ）そして残りの２μｌを大脳皮質に（−０．４０，＋４．００；−１．７５ｍｍ）、定位フレーム（コップフインスツルメンツ社（Kopf Instruments）、カリフォルニア州、タジャンガ）を用いて注入した（１μＥ/分）。ビヒクル動物を、αＭＥＭ（α-modified Eagle’s medium）をビヒクルとして投与して、同様に治療した。すべての動物に、１０ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンＡの皮下注入を毎日付した（ノバルティス社(Novartis)、スイス、バーゼル）。
【０２１１】
２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド染色
２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）染色を実行し、虚血を確認した。未使用の脳を、２ｍｍの薄片に切断し、２％のＴＴＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中、３７°Ｃで１０分間、暗所でインキュベートした。脳の断面を、ＬｉＤＥ２１０フラットベッドスキャナ（キヤノン、東京）を用いてカラー画像化した。
【０２１２】
機能性評価
動物を、ＭＣＡｏに先立って、３日連続で訓練し、第３の期間（□１日目）を、術前ベースラインとして使用した。行動の盲検化評価を、ＭＣＡｏ後の、１日目（ＤＰＳＣ移植に先立つ）、７、１４、２１、および２８日目の明期（ｌｉｇｈｔ  ｃｙｃｌｅ）に実行した（各テストで試行回数３回）（図１Ｃ）。ＭＣＡｏ前の神経行動学的訓練に失敗した（その訓練中、動物は、各テストにおいてベースラインスコアに達しなかった）、およびＭＣＡｏの少なくとも１週間後に機能障害がわずかもしくは無し、または非常に深刻、のどちらかを示した動物は排除した。実験は、無作為の治療割り当ておよび盲検化した成績評価を用いて行った。これらは、脳梗塞治療学術産業円卓会議（Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR)）および同様なガイドランで承認されたものである。
【０２１３】
ニューロスコア（Ｎｅｕｒｏｓｃｏｒｅ）
各動物についてのＭＣＡｏ後における全体の神経学的機能障害を、従来研究から修正されたスコア化システムを用いて評価した[Barry et al., Brain Res, 1389: 143-151, 2011; Bederson Stroke 17: 472-476, 1986;およびThal et al., J. Neurol. Sci, 286: 150-159, 2008]。スコアが高いほど、神経学的障害が大きいことを表わしている。
【０２１４】
粘着テープ剥離テスト
粘着ラベル（１５ｍｍ２）を、ラットの前足の内側面に貼り付けた[Bouet et al., Nat Protoc 4: 1560-1564, 2009]。粘着性ラベルを対側または同側の前足に置く順序は、無作為化した。テストケージに戻すと、各足から粘着ラベルをはがそうとするのに費やした時間とラベルを除去するのに使った全時間（最高２分を割り当てた）を記録した。ラベルを除去する（または除去しようとする）のに費やした継続時間を、かかった全時間のパーセンテージとして表した。
【０２１５】
足踏みテスト
各ラットを、片手を用いて固くしばりつけ、胴体と後足ともう一方の手をわずかに持ち上げて前足の１つを動かないようにし、拘束されなかった他の前足で体重を支えるようにした［Schallert et al., Exp Neurol, 64: 33-43, 1979］。ラットをその後、横に（３０ｃｍ）動かして、体重をさえる前足が逆手方向に足踏みして体の動きに合わすようにした。前足のテストの順序は無作為化した。各前肢を使って実行される足踏みの数を記録した。
【０２１６】
ロータロッド（Ｒｏｔａｒｏｄ）
ラットを、１８×１ｍｍのロッドの、電動回転する集合体からなるロータロッド装置上に置いた［２８］。動物は、回転速度が２分以内に０から２４ｒｐｍに加速するにつれ、装置上の歩行を要求される。動物が試行を完了した、装置から落下した、または連続２回の回転に対して横木上を歩行しようとせずに横木を握って回転した時間を記録した。
【０２１７】
棚状(Ledged)／先細り(Tapered)梁の歩行
動物に、高位置にあって、終端の暗箱に向かう方向に沿って先細りになった梁を横断することを要求し［Schallert T, Woodlee MT. Orienting and placing. In: Whishaw IQ, Kolb B, eds.The Behavior of the Laboratory Rat: A Handbook with Tests. Oxford, U.K.: Oxford University Press 2005;129-140］，それらの実行をビデオテープに記録した。下部が張り出した（underhanging）棚（上梁表面の２ｃｍ下）で後肢を滑らす回数を、梁を横断するのに要した歩数の合計に対するパーセンテージとして計算した。梁の歩行は、脳梗塞動物の旋回行動のせいでＭＣＡｏの１日後では完遂しなかった。
【０２１８】
免疫組織学と画像化
神経行動学的評価の終わりにあたって、ラットを深麻酔し、１，０００Ｕのヘパリンを心臓に直接注入し、氷冷食塩水、その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、４％（重量／体積）パラホルムアルデヒドで経心腔的潅流した。脳を除去し、同一定着剤を用い、４℃で終夜、後固定した。生存ヒトＤＰＳＣの比色検出のために、脳をパラフィンに埋め込み、連続的な５＾ｍ冠状断片に切断した。断片は、ＰＢＳ中、３％正常ウマ血清を用いてブロックし、ＰＢＳ中で２回洗浄し、その後、マウス抗ヒトミトコンドリア（１：１，５００；ミリポア社（Millipore）、ビレリカ）、続いてビオチン化抗マウスＩｇＧ（１：２５０；ベクターラボラトリーズ社（Vector Laboratories)、カリフォルニア州、バーリンガム）そしてストレプトアビジンセイヨウワサビペルオキシダーゼ共役抗体（１：１，０００；サーモサイエンティフィック社（Thermo Scientific），イリノイ州、ロックフォード）とともにインキュベーションした。抗体を、ブロッキング溶液中で希釈した。抗体染色を、３，３−ジアミノベンジジン（シグマアルドリッチ社）で可視化した。明視野画像を取り込み、ナノズーマーデジタルパソロジーシステム（NanoZoomer Digital Pathology System）（浜松ホトニクス、静岡、日本）を用いて分析した。移植の４週間後のげっ歯類脳（ｎ＝３）に残存している移植細胞の数を、５＾ｍ冠状断片の１枚おきに計数し、移植細胞の分布を分析した。
【０２１９】
二重免疫蛍光研究のために、１００＾ｍ浮遊性の断片を、０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳ中、１０％正常ウマ血清でブロックした後、ヒトＤＰＳＣｓを、ヤギ抗ＧＦＰ（１：２５０；ロックランド社（Rockland）、ギルバーツヴィル、ペンシルベニア州）を用いて、成熟神経細胞を、マウス抗神経細胞核（ＮｅｕＮ；１：５００；ミリポア社）を用いて、または星状細胞を、ウサギ抗グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；１：２５０；ＤＡＫＯ社、デンマーク、グロストラップ）を用いて同定した。他に使用した一次抗体は、マウス抗β−ＩＩＩチューブリン（１：５００；ミリポア社）、マウス抗ネスチン（１：１００；アブカム社（Abcam）、英国、ケンブリッジ）、マウス抗ポリシリアル酸中性細胞接着分子（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ；１：２００；ミリポア社）およびマウス抗Ｏ４（１：５００；シグマアルドリッチ社）であった。二次抗体は、Ｃｙ２共役抗ヤギＩｇＧ、Ｃｙ３共役抗ウサギＩｇＧ、またはＣｙ３共役抗マウスＩｇＧ（１：３００；ジャクソンイミノリサーチラボラトリーズ社(Jackson Immunoresearch Laboratories)、ペンシルベニア州、ウエストグローヴ）のどちらかであった。抗体は、ブロッキング溶液で希釈した。すべての断片を、プロロングゴールド褪色防止剤（インビトロジェン社、カリフォルニア州、カールスバッド）とともにマウントした。ＮｅｕＮまたはＧＦＡＰを共発現したＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを評価するため、倍率Ｄ４０でのｚスタック（ｚ−ｓｔａｃｋ）画像を、ＤＰＳＣ移植（ｎ＝３の動物）の段階での同側半球における２つの皮質領域と３つの線条体領域からなる５つの野で撮影した。共焦点画像を、ＴＣＳ  ＳＰ５共焦点顕微鏡で連続的に取り込み、そのＬＡＳ  ＡＦソフトウェア（ライカマイクロシステムズ（Leica Microsystems）、ヴェッツラー）を用いて画像処理した。ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いて、正射影を実行した。
【０２２０】
脳梁厚の測定
ブレグマのレベル、およびブレグマ±０．１ｍｍのレベルでのパラフィン断片を０．１％のクレシルバイオレット(cresyl violet)（ＤＰＳＣ治療についてｎ＝６、ビヒクル治療についてｎ＝２）で染色した。脳梁厚の測定を、正中線（２つの半球の中点）と、脳の両半球の脳室の側稜とで行った。測定は、対応する正中線測定のパーセンテージとして表現し、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ画像化ソフトウェア（カールツァイス社（Carl Zeiss）、ドイツ、オーバーコッヘン）を用いて行った。
【０２２１】
統計分析
分析は、ジェンスタット（ＧｅｎＳｔａｔ）（13th edition; VSN International, Hemel Hempstead, U.K.）を用いて実行した。行動テストのスコアに与える治療の影響を、反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析し、それには、個々のラット間の連続測定の間の相関を説明するグリーンハウスガイザー補正(Greenhouse-Geisser correction)と、ラットの初期能力において考えうる差異を許容する共変量としての脳梗塞前データの調整も行った。もし初期ＡＮＯＶＡが有意であった場合には、事後のフィッシャーの保護付き最小有意差検定(post hoc Fisher’s protected least significant difference （ＬＳＤ） test)を実行した。差異は、ｐ＜０．０５で統計的に有意であると考えられた。データは、Ｒ（version 2.10.1;Ｒディベロプメントコアチーム(R Development Core Team）、オーストリア、ウィーン）を使用して箱型プロットで示すか、またはプリズム（Prism）（version 5.02,グラフパッドソフトウェア社（GraphPad Software, Inc.)、サンディエゴ）を用いて棒グラフで表した。報告した値は平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）である。
【０２２２】
結果
移植ヒトＤＰＳＣは、脳梗塞の前肢の感覚運動の回復を促進する
限局性脳虚血後のヒトＤＰＳＣ治療の、神経行動学的機能を時間とともに改善する能力を調査した。ＤＰＳＣ治療後の有害な影響は、罹患率(Morbidity rate)または死亡率(mortality rate)に関して対照と比較して認められなかった。脳内移植の後に得られた死亡率は、両治療群で同程度（近似的に９％）であった。
【０２２３】
臨床的に関連する、片側性ＭＣＡｏげっ歯類モデルは、げっ歯類脳の同側半球中の側背線状体とそれを覆っている前頭／頭頂の皮質にかなりの虚血性損傷を引き起こす。その結果、動物は、脳梗塞後１日目で１１．７±０．４ポイントのニューロスコアの増加で示される、神経行動学的障害を発症する（図６Ａ）。加えて、足踏みテストにおいて、顕著な前肢体性感覚および運動の非対称性を示した（図６Ｂ；ＭＣＡｏ後１日目で対側前肢がとった足踏み数の８２．２±６．６％の低下）および粘着テープ剥離テスト（図６Ｃ；ＭＣＡｏ後１日目での対側前肢から外部刺激を除去しようとするのに要した時間の９３．７±２．８％の低下）。
【０２２４】
実験的脳梗塞が生じると、運動平衡と運動協調の喪失もまた、ロータロッドテストにおいて認められた（図６Ｄ；ＭＣＡｏ後１日目においてロータロッド上で費やした時間の５３．０±２．０％の低下）。
【０２２５】
脳梗塞に冒された動物は、ＭＣＡｏ後１日目で、梁を歩行する間に、病変と反対側の後肢の足滑りに、後肢の非対称性を示した（図６Ｅ、２１．７±６．２％の増加）。同側四肢は、脳梗塞後の正常な神経行動学的機能を有していた。
【０２２６】
すべての動物は、脳梗塞後４週間にわたって、神経行動学的機能の漸進的回復を示した（図６）。ＤＰＳＣ治療動物は、ビヒクル治療群と比較して、有意に促進された全体的な神経行動学的機能（図６Ａ；ｐ＜０．０１８  群×日の交互作用、反復測定ＡＮＯＶＡ）と有意に低いニューロスコアを示し、特に、脳梗塞後２１日目（ｐ＜０．０５、事後のフィッシャーの保護付き最小有意差検定、および２８日目（ｐＯ．０１）で、そうであった。肢に特異的な神経行動学的研究においては、ＤＰＳＣ治療動物は、ビヒクル対照と比較して、有意に促進された対側（脳梗塞に冒された）前肢の感覚運動の回復を、足踏みテスト（図６Ｂ；ｐ＜０．０４５  全体の群効果）と、粘着テープ剥離テスト（図２Ｃ；ｐ＜０．０４９  全体の群効果）において示した。総合すると、ＤＰＳＣ治療動物は、測定されたすべての日で、対側前肢の使用において、脳梗塞後の障害の減少を示した。
【０２２７】
治療群の間で同側肢機能の有意な差異は存在しなかった。ロータロッド（図６Ｄ）と棚状／先細り梁の歩行における動作（図６Ｅ）テストは、治療群間に統計的に有意差がなかった（ｐ＜０．０５）。促進された機能改善に四肢間で差異があることについて考えられる一つの説明は、このげっ歯類ＭＣＡｏモデルにより、げっ歯類脳における前肢機能に関する感覚運動皮質の表現に、この領域への選択的血管供給のせいでさらに大きな破壊が生じたということである［Salo et al., Soc Neurosc Abstr 13: 1268, 1987］。これを支持して、本研究における動物では、足踏みおよび粘着テープ剥離テストで測定したように、深刻な前肢機能の喪失が存在したが、しかしＭＣＡｏ直後の先細り／棚状梁の歩行で評価されたように、後肢機能のより劇的でない障害が存在した。ロータロッド走行と梁歩行は、運動協調と後肢機能をそれぞれ評価し［Hicks et al., Cell stem Cell, 5: 139-140, 2009］、そしてこれらの試験は、脳梗塞後の欠陥を同定するには充分敏感ではない可能性がある。ビヒクル治療動物と比較して、ＤＰＳＣ治療後の促進された機能改善は、前肢の４週間にわたる分析で明らかになったが、しかし後肢機能ではそうではなかった。
【０２２８】
代わりの説明が、動物が学習した補償的な運動行動に関係することもあり得る。ロータロッド走行および先細り／棚状梁歩行のテストでは、試験の反復を通じて、げっ歯類が、脳梗塞に冒されていない四肢または尻尾への偏向を用いて、脳梗塞に冒された肢の機能喪失を補償するという新たな方法を学習することがあり得る［Schaar et al., Exp Transl Stroke Med, 2: 13, 2010］。足踏みおよび粘着テープ剥離テストにより測定したように、前肢特異的な作業は、脳梗塞後の感覚運動機能の喪失を克服する補償行動の使用を最小限にすることが可能である。
【０２２９】
前述のデータは、ｈＤＰＳＣ移植が、脳梗塞後の宿主神経系の正常機能に影響を及ぼし、対照動物と比較して、神経学的機能の改善をもたらしたことを示している。理論または行動様式に拘束されるものではないが、この改善は、脳梗塞後の脳内での神経可塑性変化を通じて生じた可能性がある。例えば、上に示したように、ＳＴＲＯ−１＋細胞はＳＤＦ−１（ＣＸＣＬ−１２）を発現する。ｈＤＰＳＣはまた、このケモカインを発現することを示した。さらに、ｈＤＰＳＣは、これらの動物が後の時点で有意な機能改善を示したにもかかわらず、鶏胚頭部への移植後の宿主の三叉神経節から軸索を化学誘因する。
【０２３０】
移植後４週間での虚血性脳におけるＤＰＳＣの生存
ＤＰＳＣ移植後の神経行動学的研究からの知見は、神経学的スコアと前肢の感覚運動機能において、後の時点で頂点となる効能を示した。引き続く研究は、これらの知見を説明する基本的細胞メカニズムが、脳梗塞脳へのＤＰＳＣ移植後の神経細胞の置き換えによるものであったのかどうかを調査した。例えば、頂点となる効能が認められた研究終了時点で生存していたドナー細胞の数を決定した。げっ歯類脳の個々のＤＰＳＣを、ラット組織と交差反応しないヒトミトコンドリア抗原に対する特異抗体を用いて可視化した。標識した細胞の数を、冠状脳断片の１枚おきに、つまり１０μηι間隔で、手で計数した。移植後４週間で各動物の脳に同定されたヒトミトコンドリア陽性細胞の合計数は、９，４５８から２２，３９４個の範囲の細胞であった（表５）。これは、残存ヒトＤＰＳＣの平均数１３，８０７〜４，２９３個と、当初に移植した６×１０５個の細胞の平均生存率２．３±０．７％を与えた。我々のデータは、虚血脳後におけるＤＰＳＣ由来細胞が少数であったにもかかわらず、細胞移植が成功し、結果として長期生存率をもたらしたことを示した。
【０２３１】
理論と行動様式に拘束されるものではないが、当初移植したｈＤＰＳＣの平均２．３％しか、脳梗塞の２８日後まで生存していないので、神経細胞の置き換えが、ｈＤＰＳＣが神経学的機能を改善する作用の主要メカニズムである可能性は低い。しかしながら、そのような神経細胞の置き換えが、治療効果の一部を提供することもありうる。この改善の原因となりうる代わりのまたはさらなるメカニズムには、神経保護、血管新生、免疫調節そして神経可塑性が挙げられる。
【０２３２】
表５：  移植したヒトＤＰＳＣの４週間後での生存
【表５】
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【０２３３】
目的とされた、脳梗塞病変へのＤＰＳＣｓの移動
虚血ラット脳への移植後の、ヒトＤＰＳＣの空間分布も分析した。移植後２４時間では、ＤＰＳＣｓは、注入部位の周囲に集塊をなしているのが認められた。４週間後では、ヒトミトコンドリア標識した細胞が、梗塞核の周囲領域に支配的であるのが認められ（図７、８Ａ、８Ｂ）、これは、移植した細胞が移植部位から選択的に虚血性梗塞に向かって移動し、虚血境界域（ＩＢＺ）に局在化したことを示している。少数のＤＰＳＣが、細胞移植部位の対側の半球（図７、８Ａ、８Ｂ）と、脳梁（図８Ｂ）に観察された。細胞は、４週間の期間にわたり、対側脳半球内に少なくとも４ｍｍ移動した。ＤＰＳＣ由来細胞は、病変部位と同側半球に比較して少数が対側半球に広範囲に分布し、対側半球の特定の標的領域内へのＤＰＳＣの明瞭な移動は存在しなかった。まれに、ＤＰＳＣ由来細胞は、内皮細胞（図４Ｃ、矢印）、周皮細胞、または平滑筋細胞（図４Ｃ、矢じり形）と整合する形態的外観をもつ脳微小血管の壁に取り込まれた、またはその周囲にあった。
【０２３４】
移植されたヒトＤＰＳＣは、神経細胞と星状細胞にＩｎ  Ｖｉｖｏで分化した
虚血脳の４週間後でのヒトミトコンドリア抗原陽性細胞の形態を、次に調べた。細胞は、星様の外観を示す星状細胞と整合する形態を有しているように見えたが（図８Ｄ、矢印）、一方、推定された神経細胞は、長い突起を示した（図８Ｄ、矢じり形）。これらの表現型を検証するため、二重免疫蛍光分析と共焦点画像化を使用した。移植したヒトＤＰＳＣはこれまで、レトロウイルスによって遺伝子導入されてＧＦＰを発現し、これにより、ＮｅｕＮまたはＧＦＡＰのどちらかで共標識して、成熟した神経細胞または星状細胞をそれぞれ同定することが可能であった。神経膠瘢痕内の細胞におけるＧＦＰ発現をともなうＧＦＡＰの共局在により、ＤＰＳＣ由来細胞が星状細胞に分化したことを確証した。同側の梗塞周辺皮質領域内で、ＮｅｕＮおよびＧＦＰ二重陽性細胞は、移植したＤＰＳＣｓの神経細胞への分化を示した。虚血後の同側脳半球での星状細胞と神経細胞の分布は、一様ではなかった。線条体領域のＩＢＺでは、ＤＰＳＣ由来星状細胞が支配的であった（５１．０±８．６％ＧＦＡＰ／ＧＦＰ二重陽性細胞、ＧＦＰ単一標識細胞のパーセンテージとして表現）が、その一方で、比較して、より少ない割合のＤＰＳＣ由来神経細胞が存在した（８．７±６．１％ＮｅｕＮ／ＧＦＰD細胞）。梗塞周辺皮質領域では、星状細胞と神経細胞の割合は同様であるように見えた（それぞれ、３８±０．６％ＧＦＡＰ／ＧＦＰ細胞および３２．１±１．８％ＮｅｕＮ／ＧＦＰ細胞）。線状体内のＩＢＺに沿って見つかった移植ＤＰＳＣは大部分、星状細胞に分化し、星状細胞神経膠瘢痕に取り込まれるように見えた。線状体と比較して、皮質の梗塞周辺領域に存在するより多くのＤＰＳＣ由来神経細胞があった。興味深いことに、梗塞周辺皮質領域のＧＦＰ細胞およそ３分の１もまた、初期／中間神経細胞マーカーであるβ−ＩＩＩチューブリンで標識された。しかしながら、ＩＢＺに沿った神経膠瘢痕内では、多数のＧＦＰ細胞もまた、神経前駆体マーカーであるネスチンを共発現した。皮質でのネスチン／ＧＦＰ細胞の証拠は、ほとんど存在しなかった。少数のＧＦＰ細胞はまた、梗塞周辺皮質において、移動性神経芽細胞マーカーであるＰＳＡ−ＮＣＡＭに対して陽性であった。まれな事象では、ＤＰＳＣ由来の稀突起膠細胞（０４／ＧＦＰ細胞）が、移植の４週間後で、げっ歯類脳に認められた。
【０２３５】
ＤＰＳＣ治療が脳梗塞後の脳梁萎縮を減少させた
脳梗塞発作後の、脳梁を介した大脳半球間の結合の喪失に与えるＤＰＳＣ治療の影響もまた調査した。脳梗塞後の４週間では、ビヒクル治療群と比較して、ＤＰＳＣ治療動物における同側脳梁萎縮に、有意な減少は存在しなかった（ＤＰＳＣ治療、６７．６±１２．５％、対応する正中線ＬＩ測定のパーセンテージとして表現したＬ２測定；ビヒクル治療、５６．６±３．０％；ｐ＞．０５）（図９）。ＤＰＳＣ治療脳では、同側半球での脳梁厚は、より良く保存されている傾向を示し、病変と反対側の（脳梗塞に冒されていない）半球の同様な脳梁厚に達していた。対側脳半球における脳梁厚に、治療群の間で差異はなかった（ＤＰＳＣ治療、６６．１±１４．０％；ビヒクル治療、６６．５±１．６％）。
【０２３６】
実施例５：カニクイザルＳＴＲＯ−３＋ＭＰＣの評価
サル骨髄前駆細胞（カニクイザル由来；ｃｙｎｏ−ＭＰＣ）は、雌のカニクイザルから収集したおよそ１５ｍｌの骨髄穿刺液から単離した。骨髄穿刺液懸濁液は、フィコール密度勾配遠心を用いて分離し、洗浄して無核細胞（赤血球）を除去した。有核細胞を計数し、その後、ＣＡ１２抗体（抗ＳＴＲＯ−３）およびダイナルビーズ(Dynalbeads)を付着することにより分別した。抗体およびビーズの付着した細胞は、ＭＰＣ−１磁石の磁場により陽性選択した。陽性選択を受けた細胞を計数し、Ｔフラスコに増殖培地（Growth Medium)において継代（ｐ．）０で播種した。事前選択、陽性、および陰性の細胞を、コロニー形成試験（ＣＦＵ−Ｆ）に使用した。
【０２３７】
ｃｙｎｏ−ＭＰＣ細胞に、増殖培地(Growth Media)により栄養を与えた。すべての培養物（ｐ．０〜ｐ．５）に、所望のコンフルエンスに達するまで、２〜４日ごとに栄養を与えた。細胞を、その後、継代し、ＨＢＳＳ洗浄、およびさらにコラゲナーゼに続いてトリプシン／バーゼン液を用いて収集した。ｐ．１の細胞を計数し、Ｔフラスコに播種した。ｐ．１のｃｙｎｏ−ＭＰＣが所望のコンフルエンスに達した時、細胞を収集し、速度制御冷凍庫に保存した。
【０２３８】
継代１の凍結保存ｃｙｎｏ−ＭＰＣを解凍してＴフラスコに播種した（ｐ．２）。ｐ．２の細胞をセルファクトリー(Cell Factory)にて継代してｐ．３とした。ｐ．３の細胞を収集し、セルファクトリーにおいてｐ．４に継代した。余分のｐ．３の細胞は、凍結保存した。ｐ．４の細胞を６×セルファクトリーにおいて継代しｐ．５とした。ｐ．５のｃｙｎｏ−ＭＰＣが所望のコンフルエンスに達した時、細胞を収集し、速度制御冷凍庫を用いて凍結保存した。細胞は、５０％αＭＥＭ（ＡｌｐｈａＭＥＭ）、４２．５％プロフリーズ(Profreeze)、および７．５％ＤＭＳＯ中で凍結保存した。試料を、ＣＦＵ−Ｆ試験、ＦＡＣＳ、無菌、マイコプラズマ、および内毒素について試験した。
【０２３９】
培養したｃｙｎｏ−ＭＰＣの免疫表現型をフローサイトメトリー分析した代表的な結果を図１０に示す。示されるように、これらの細胞は、ＳＴＲＯ−１＋、ＳＴＲＯ−４＋およびＣＤ１４６＋である。
【０２４０】
実施例６  非ヒト霊長類iｎｈｐ）ＤＰＳＣの予期的単離：
磁気ビーズ分取の使用することで、希少なＤＰＳＣを線維骨髄組織から精製することが可能になる。歯髄組織の採取と酵素消化の後、１個の成人第３臼歯から、およそ１〜２×１０＾個の細胞を収集することができる。この観点から、複数の歯に由来するプールされた細胞を、同一の動物から収集することができる。非ヒト霊長類歯髄の単個細胞懸濁液は、我々がこれまで非ヒト霊長類骨髄細胞と反応することを示してきた、ヒトＭＰＣ関連抗原に対する抗体とともにインキュベートする（図１０）が、それらの抗体には、ＳＴＲＯ−１（マウスＩｇＭ抗ヒトＭＰＣ；ディベロプメンタルスタディーズハイブリドーマバンク（Developmental Studies Hybridoma Bank）、アイオワ大学、米国、アイオワ州、アイオワシティー）；ＣＤ１４６（マウスＩｇＧ２ａ抗ヒトＣＤ１４６／ＭＵＣ−１８；９）；またはＳＴＲＯ−４（マウスＩｇＧ１抗ヒト熱ショックタンパク質−β）などが挙げられる。標識した歯髄細胞を、他のヒツジ抗マウスＩｇＧ結合またはラット抗マウスＩｇＭ結合磁気ダイナビーズ（Dynabeads）（細胞１個あたり４個のビーズ：ダイナル社（Dynal）、ノルウェー、オスロ）とともに、インキュベートする。磁気ビーズ陽性細胞を、製造元の推奨プロトコルに従って、ＭＰＣ−１磁気粒子濃縮器（MPC-1 magnetic particle concentrator)（ダイナル社）を用いて収集する。ＳＴＲＯ−１、ＳＴＲＯ−４またはＣＤ１４６ビーズ陽性細胞を、増殖培地ｃｍ２あたり約３×１０４個の細胞で播種し、初代培養物を通常の増殖培地（２０％（体積／体積）のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ｍＭのＬ−アスコルビン酸２リン酸、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したα−ＭＥＭ）で生成した。約９０％のコンフルエンスに達した後、初代ＤＰＳＣは、ｃｍ２あたり約０．５〜１×１０４個の細胞のプレーティング濃度で、継代培養されることになる。
【０２４１】
実施例７  ｎｈｐＤＰＳＣコロニー出現頻度の評価：コロニー形成線維芽細胞実験の使用
ｎｈｐＤＰＳＣを精製する単一試薬としてのＳＴＲＯ−１、ＳＴＲＯ−４またはＣＤ１４６抗体の効率を評価する。分画しない、ならびにＳＴＲＯ−１、ＳＴＲＯ−４またはＣＤ１４６陽性および陰性選択された細胞画分を、通常の増殖培地において、ウェルあたり０．３、１．０および３．０×１０４個の細胞で３とおり、６ウェル培養プレートに播種し、３７℃で５％ＣＯ２および＞９０％の湿度で１２日間、インキュベートする。＞５０個の細胞の集塊が、線維芽細胞様コロニー（ＣＦＵ−Ｆ）として記録された。ＣＦＵ−Ｆのコロニー形成の出現率が最高となる抗体選択プロトコルを用いて、機能評価研究のためのＧＬＰグレードのｎｈｐＤＰＳＣを生成する。
【０２４２】
実施例８  ｎｈｐＤＰＳＣの特性評価
フローサイトメトリ―分析は、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖したＤＰＳＣの免疫表現型を特性評価するものである。異なる細胞継代での、間葉および非間葉幹細胞に関連する表面マーカーの発現を、上述のとおり評価する。同種異系ｎｈｐＤＰＳＣを使用して虚血性脳梗塞治療するさい、これらの細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで混合リンパ球反応において、またはマイトジェン刺激リンパ球とともに共培養されたときに、活性化した免疫細胞を抑制する免疫調節能力を評価する（例えば、Wada et al., J Cell Physiol., 219: 667-676, 2009に記述のとおり）。
【０２４３】
それらの由来元と類似の能力を含む、中胚葉および外胚葉組織を発生させるＤＰＳＣの能力は、これらの細胞の品質証明となる特徴である。異なる細胞系統にｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化するＤＰＳＣの能力を、誘導条件下で培養することにより調査する。eｘ  ｖｉｖｏで増殖したｎｈｐＤＰＳＣを用いて、骨芽細胞（鉱質沈着物のアリザリンレッド染色）、脂肪細胞（脂肪滴のオイルレッド染色）および軟骨細胞（硫酸化プロテオグリカンおよびＩＩ型コラーゲン発現のトルイジン染色）への、複数系統へ分化する能力を、（例えば、Grontos et al., J Cell Sci., 116: 1827-2835, 2003に記述のとおりに）評価する。
【０２４４】
ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖し、ＧＦＰで前標識されたｎｈｐＤＰＳＣの単個細胞懸濁液をさらに、重度に障害された免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウス（ｎ＝３）の背側表面に、約８週の期間、セラミックヒドロキシアパタイト／リン酸三カルシウム（ＨＡ／ＴＣＰ）粒子を担体ビヒクルとして組み合わせて皮下移植する。移植後８週間で、レシピエント動物を、組織学的分析のために犠牲して移植組織を回収することになる。
【０２４５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｎｈｐＤＰＳＣの神経細胞への分化の評価を、上記のとおり神経誘導培養条件下で、ポリオルニチンで被覆したチャンバースライド内で実行する。
【０２４６】
リアルタイムＰＣＲおよび免疫組織化学を用いて、初期（ＮｅｕｒｏＤ、ネスチン、ＮｅｕＮ、ｂ−ＩＩＩチューブリン）および後期（ＧＦＡＰ、神経細糸中鎖および重鎖）の遺伝子およびタンパク質発現を評価する。
【０２４７】
パッチクランプを実行し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、分化したｎｈｐＤＰＳＣが活動電位を生じさせる能力を決定する。
【０２４８】
加えて、ＧＦＰ標識したｎｈｐＤＰＳＣの神経原生および神経可塑性の可能性を、これらの細胞を鶏胚に、例えば上述のように、ｉｎ  ｏｖｏで注入することにより決定する。
【０２４９】
移植したＧＦＰ標識ＤＰＳＣの電気生理学的性質を、移植後７〜１４日において、脳組織の３００ｍｍ断面上に電圧依存のナトリウムおよびカリウムチャネルの存在を測定することにより評価する。
【０２５０】
集合的に、これらの研究は、非ヒト霊長類の前治療研究において脳梗塞を治療するのに使用される同種異系のｎｈｐＤＰＳＣ集団を定義する。
【０２５１】
実施例９：  ｎｈｐＤＰＳＣを使用した、虚血性脳梗塞の非ヒト霊長類モデルにおける運動機能の改善
複雑な認識能力、大きな社会的複雑性および脳機構の複雑さの観点で、ヒトと非ヒト霊長類の間の類似性は、神経性病患や障害を研究する良いモデルとなる。
【０２５２】
虚血性脳梗塞の非ヒト霊長類モデルは、ナイロン繊維による内頸動脈の閉塞を用いたＭＣＡＯ方法により生成する（例えば、Freret et al., J Cereb Blood Flow Metab., 28: 786-796, 2008の記述のとおり）。非ヒト霊長類モデルは、旧世界ザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）であるカニクイザルに生成する。以下は、虚血性脳梗塞の研究のための実験計画プログラムである：
（ｉ）ベースラインの神経行動学的テストを、すべての動物について脳梗塞に先立って実行する。
（ｉｉ）虚血性脳梗塞のＭＣＡＯモデルを誘導する。
簡潔には、サルを麻酔し、挿管し、機械的に人工呼吸器にかけ、血中酸素濃度、深部体温、血圧、ＥＣＧ、および頭蓋内血流のレーザードップラー流量測定を集中的にモニタリングする。経験豊富な神経外科医によるきめ細かい手術を実行し、外内頸動脈の分岐での右総頸動脈を露出させる。外頸動脈と他の分岐動脈を焼灼して、内頸動脈に沿って中大脳動脈の起始部までの繊維の滑らかな通過を保証する。径０．５４ｍｍ長さ３ｍｍの、シリコーンゴムで被覆したナイロン繊維を内頸動脈に挿入し、中大脳動脈の閉塞を示す抵抗が感じられるまで進める。繊維は、結索糸でその場に保持する。ＭＣＡＯの３時間後、シリコーンゴム被覆ナイロン繊維を引抜くと、その結果、再灌流が生じ、この過程が、ヒトにおける中大脳動脈虚血性脳梗塞を近似する。
（ｉｉｉ）ＭＲＩをＭＣＡＯ後の７日以内に実行し、適切なサイズと部位の虚血性脳梗塞が生じたかどうかを決定する。
（ｉｖ）細胞治療計画は、脳梗塞の１週間後における、５×１０５個または１．５×１０６個のｎｈｐＤＰＳＣ、または培地のみ（細胞なし）の線条体内注入を伴う３つの群を含む。げっ歯類の場合のように、頭蓋内圧の上昇に由来する罹患率のせいで、脳梗塞後の大脳内に安全に注入することができる液体の体積に関して制限がある。これは、ママカクザルにおいては１２μＬであると見積もられている。このように、すべての線条体内注入は１２μＬであって、細胞密度を変化させることになるであろう。すでに述べたように、サルを麻酔し、定位頭蓋内注入のために頭蓋に穿頭孔を開ける。
（ｉｖ）神経行動学的テストを、実験継続の６週間にわたって毎週、実行する。ＭＣＡ虚血性脳梗塞後の感覚運動障害の程度を適切に調査するために、以下のテストを使用する：Ｍｏｎｋｅｙ  ＣＡＮＴＡＢ（登録商標）（CAmbridge Neurophysiological Test Automated Battery）、ニューロスコア（Neuroscore）、ヒルアンドバレー階段（Hill-and-Valley Staircase）および触覚前肢刺激（Tactile forelimb stimulation）テスト（例えば、Bihel et al., J Cereb Blood Flow Metab., 30: 273-285, 2010に記述のとおり）。
（ｖｉ）脳梗塞の６週間後に研究完了。
【０２５３】
実施例１０：移植ｎｈｐＤＰＳＣとＮＨＰ脳組織との間の相互作用
１０．１虚血性ペナンブラのレスキュー：
虚血性脳梗塞に周辺には、死の危険にあるが蘇生の可能性のある虚血性ペナンブラという領域が存在する。ＳＴＲＯ−１−細胞治療は、この虚血性ペナンブラと相互作用してもよく、そしてそれ故に、脳梗塞のサイズを制限する。
【０２５４】
サルに麻酔をかけ、．０Ｔシーメンストリオスキャナー（Siemens Trio scanner）内にうつ伏せに置き、Ｔ２−Ｗターボスピンエコー（turbo-spin echo）画像（Ｔ２ＷＩ、ＴＲ／ＴＥ＝４８００／８６ｍｓ）を、視野（１８０×１８０ｍｍ）および平面分解能０．５×０．５の画像収集マトリクスで収集する。スライス厚２ｍｍ、間隔０．２ｍｍで１２とおりのＴ２ＷＩ冠状画像を収集する。Ｔ２ＷＩによる梗塞の容積を、サルに対してシーメンスＭＲＩソフトウェア（Siemens MRI software）を用いて描出することになる。
【０２５５】
１０．２  ＮＨＰ脳梗塞脳における神経置き換えと結合性
梗塞は、一方の脳半球の神経細胞およびグリアのおよそ２／３の喪失という結果をもたらす。この一連の調査の目的は：（１）生存ｎｈｐＤＰＳＣの数、（２）神経細胞またはグリアに分化するｎｈｐＤＰＳＣの数、および（３）ｎｈｐＤＰＳＣ由来神経細胞が機能的結合を形成するかどうか、を決定することである。このために、ｎｈｐＤＰＳＣは、ＧＦＰを発現するようにレトロウイルスによって遺伝子導入され、移植に先立って、ＢｒｄＵ（約２０μＭで２４時間）中で核標識のために培養される。これらの２つの標識法は、宿主脳内に移植したｎｈｐＤＰＳＣの正式の同定法を提供する。
【０２５６】
神経表現型に分化したｎｈｐＤＰＳＣの数は、特定の容積中のｎｈｐＤＰＳＣの密度を確立することにより、立体的に見積もられる。げっ歯類の研究から、われわれは、ｈＤＰＳＣが４週間で、注入の部位（これは、脳表面上の瘢痕から明らかである）から前後のどちらかの方向へ、脳梗塞の部位内におよそ１ｍｍ移動することを見出した。このように、注入部位への前後軸における８ｍｍ厚のサル脳には、脳梗塞の６週間後までに、移植したヒト細胞の大部分が含まれる。この軸に沿った、１００ｍｍの一連の冠状断面が取られる（治療動物あたり、約４×１０３ｍｍの組織幅で１００ｍｍ＝４０の冠状断面）。無作為抽出プロトコルを（イメージＪ（Ｉｍａｇｅ  Ｊ）を用いて）組立て、標準化された組織容積におけるＢｒｄＵ−陽性細胞の数を計数する。陽性染色したヒト細胞の直接的な３次元計数を、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ＭＲＣ−１０００ＵＶ共焦点顕微鏡（アデレードマイクロスコピー（Adelaide Microscopy））を用いて実行する。共焦点顕微鏡は、ＧＦＰ陽性またはＢｒｄＵ陽性ｎｈｐＤＰＳＣが、分化した細胞（例えば、神経細線維中鎖（ＮＦ−Ｍ）またはβ−ＩＩＩチューブリンに対する抗体を用いる神経細胞、グリア原線維酸性タンパク質すなわちＧＦＡＰ、またはチロシンヒドロキシラーゼを発現する星状細胞）により発現した細胞質抗原と共局在することを同定した。
【０２５７】
サル脳梗塞に移植したｎｈｐＤＰＳＣ由来の神経細胞の電気生理学的性質もまた、評価する。第一に、げっ歯類脳梗塞脳から単離された、単一ｎｈｐＤＰＳＣ由来神経細胞の生物物理学性質を評価する。簡潔には、動物の頭部を切断し、脳を取り出して、氷冷した含酸素生理食塩水中に置く。脳切片３００〜５００ｍｍ厚を、振動式組織スライサーを用いて切断し、洗浄して、その後、トリプシンとコラゲナーゼの混合物により酵素消化する。単一神経細胞を、組織の穏やかなピペット操作により得て、洗浄し、コラーゲン処理したガラスのカバースリップ上に置く。２４時間の回収の後、細胞を全細胞パッチクランプのために使用する。ｎｈｐＤＰＳＣ由来の神経細胞は、ＧＦＰ陽性細胞として同定される。適切な電圧プロトコルとチャネル阻害剤を使用して、これらの細胞により発現する電圧感受性チャネルの型を同定する。
【０２５８】
ｎｈｐＤＰＳＣ由来の神経細胞が、活動電位（ＡＰ）を発生させ他の神経細胞との結合を形成する能力を、パッチクランプおよび脳切片内の細胞の画像化により調査する。脳切片の２５０〜４００ｍｍの厚を、注入部位の近傍でビブラトームにより切断する。室温および一定の酸化での１時間の回収の後、蛍光付属品、ＩＲおよびＤＩＣオプティクスを備えたＢＸ５１ＷＩオリンパス正立顕微鏡に搭載した記録チャンバーに、個々の切片を移す。ｎｈｐＤＰＳＣを、最初、ＧＦＰ蛍光を用いて同定し、その後、ＩＲフィルター（７２０〜８５０ｎｍ）とＲｏｌｅｒａ−ＸＲ  ＩＲ高感度カメラを用いて可視化する。脳切片における神経細胞の全細胞パッチクランプを、ＥＰＣ−１０コンピューター制御増幅装置と関連機器を使用して実行する。ＡＰは、脱分極電流の注入により誘発され、電流クランプモードで記録される。
【０２５９】
ｎｈｐＤＰＳＣにより発生したＡＰが、密着結合またはシナプス結合を通じて周囲の神経細胞に伝搬することができるかどうかを調査するために、パッチクランプと併せて、Ｆｕｒａ−２蛍光を用いて細胞内Ｃａ２−濃度の変化を可視化する。簡潔には、脳切片を膜透過性Ｆｕｒａ−２ＡＭとともに載せ、洗浄し、記録チャンバー内に置く。移植したｎｈｐＤＰＳＣ由来の神経細胞を、ＧＦＰ蛍光により同定し、ＩＲを用いてパッチクランプする。蛍光の設定はその後、Ｆｕｒａ−２測定に適切なものへと変更する。ＡＰは、脱分極電流の受け渡しによりｎｈｐＤＰＳＣにより誘発され、蛍光は、周囲のげっ歯類の宿主神経細胞において測定する。
【０２６０】
１０．３  神経可塑性を調査する、非ヒト霊長類脳梗塞脳の機能的磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）および拡散テンソル画像法（ＤＴＩ）：
これらの技術は、対照サルと比較した、ｎｈｐＤＰＳＣ治療後の神経可塑性の非侵襲的調査を可能にする。虚血性脳梗塞モデルでは、ｆＭＲＩを用いて、前肢の運動制御を評価し、ｎｈｐＤＰＳＣ治療後に運動皮質のより大きな活性化が存在するかどうかを決定する。ｆＭＲＩ研究は、治療の３〜６週間後に開始する。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年2月4日(2014.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳梗塞を患う対象における脳神経細胞を再生させる医薬の製造における、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を含む治療薬。
【請求項２】
脳神経が、大脳皮質にある、請求項１記載の治療薬。
【請求項３】
脳神経細胞が、運動皮質および／または感覚皮質にある、請求項２記載の治療薬。
【請求項４】
脳梗塞を患う対象において脳機能を改善するまたは脳機能の喪失を予防する、請求項１記載の治療薬。
【請求項５】
脳梗塞を患う対象において運動障害を治療するまたは予防する、請求項１記載の治療薬。
【請求項６】
脳梗塞が、虚血性脳梗塞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の治療薬。
【請求項７】
治療薬は、脳梗塞後、１時間と２週間の間に投与されるものとする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の治療薬。
【請求項８】
治療薬は、脳梗塞後、２４時間以内に投与されるものとする、請求項７記載の治療薬。
【請求項９】
細胞の集団は、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／またはその子孫および／またはそれに由来する可溶性因子が富化されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の治療薬。
【請求項１０】
細胞の集団が、骨髄または歯髄に由来する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の治療薬。
【請求項１１】
治療薬は、全身投与される、または対象の脳に局所投与されるものとする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の治療薬。
【請求項１２】
治療薬は、複数回投与されるものとする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の治療薬。
【請求項１３】
治療薬は、４以上の週毎に１回投与されるものとする、請求項１２記載の治療薬。
【請求項１４】
ｋｇあたり０．１×１０６から５×１０６個の間のＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫を含む、またはｋｇあたり０．３×１０６から２×１０６個の間のＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫を含む、またはｋｇあたり０．１×１０５と０．５×１０６個の間のＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の治療薬。
【請求項１５】
ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞が富化された集団を、投与に先立って、および／または可溶性因子を得るのに先立って培養増殖した、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の治療薬。
【国際調査報告】
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