(57)【要約】【課題】新規な化粧料製剤を提供することまたは化粧料製剤を新規な化粧用途のために使用することを目的とする。【解決手段】本発明は、化粧料製剤およびその使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  Ｎ−アシル−フィトスフィンゴシンおよび
−  １，２−ペンタンジオール
を含む化粧料製剤。
【請求項２】
前記Ｎ−アシル−フィトスフィンゴシンがＮ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンである、請求項１に記載の化粧料製剤。
【請求項３】
前記製剤が、前記Ｎ−アシル−フィトスフィンゴシン以外のさらなるセラミドを含まない、請求項１または２に記載の化粧料製剤。
【請求項４】
前記Ｎ−アシル−フィトスフィンゴシンが、前記製剤中に、前記製剤全体を基準として０．０２質量％〜２質量％の濃度で存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化粧料製剤。
【請求項５】
前記１，２−ペンタンジオールが、前記製剤中に、前記製剤全体を基準として０．２質量％〜１５質量％の濃度で存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化粧料製剤。
【請求項６】
Ｎ−アシル−フィトスフィンゴシン対１，２−ペンタンジオールの比が１：１００〜１：１の範囲にある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化粧料製剤。
【請求項７】
Ｃ８／Ｃ１０−グリセロール部分エステルをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化粧料製剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の化粧料製剤の、皮膚に適用するための使用。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の化粧料製剤の、皮膚のゆるみを軽減するための使用。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の化粧料製剤の、皮膚をふっくらさせるための使用。
【請求項１１】
顔面上における、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
胸部上における、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
Ｎ−アシル−フィトスフィンゴシンを含む化粧料製剤の、皮膚のゆるみを軽減するための使用。
【請求項１４】
Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンを含む化粧料製剤の、皮膚のゆるみを軽減するための使用。
【請求項１５】
Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンを唯一のセラミドとして含む化粧料製剤の、皮膚のゆるみを軽減するための使用。
【請求項１６】
顔面上における、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
胸部上における、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンを含む化粧料製剤の、美容的豊胸のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧料製剤およびその使用に関する。
【０００２】
製剤とは、有効成分および少なくとも１種の助剤を含む調製物を意味するものと理解すべきである。助剤は、例えば溶剤であることができる。
【０００３】
したがって、化粧料製剤は、低毒性であり、かつ特定の目的に応じた物理的性質（例えば粘度）を付与することで、人体に適用できるように構成したものである。
【背景技術】
【０００４】
欧州特許第２０５１６９１号公報には少なくとも２種類のセラミドを含む組成物が記載されている。セラミドは長鎖スフィンゴイド塩基からなり、そのアミノ基は脂肪酸でアシル化されている。アルキル鎖長、不飽和度および水酸化度は各場合に変化させることができる。本願に記載されている組成物は乾燥肌の手入れに使用される。
【０００５】
欧州特許第０９９４８８８号公報には、フィトスフィンゴシンをベースとするセラミドを製造するための方法が記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の説明
本発明の目的は、新規な化粧料製剤を提供することまたは化粧料製剤を新規な化粧用途のために使用することにあった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この目的は、請求項１に記載の化粧料製剤により達成される。
【０００８】
上述した組成物はいずれも請求項１に記載の組合せを有していない。
【０００９】
老化した皮膚は、特に弾力の喪失を示す。それ自体の重みの下、重力が形状の変化をもたらする。この作用に起因する美容上の問題は、例えば、乳房の下垂、眼瞼の下垂および顔の皮膚のたるみ(sagging)となって現れる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】皮膚のたるみの軽減を示す。
【図２】皮膚の凹凸の変化を示す（Ｓａパラメータ）。
【図３】皮膚のエコー輝度の変化を示す。
【図４】様々な製剤からのＮ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンのバイオアベイラビリティを示す。
【図５】上腕の皮膚の厚みの増加を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
驚くべきことに、特許請求されるＮ−アシル−フィトスフィンゴシンおよび１，２−ペンタンジオールの組合せを調製することにより、Ｎ−アシル−フィトスフィンゴシンおよび他の溶剤の組合せよりも格段に優れた化粧料製剤を得ることができることが見出された。特許請求されるＮ−アシル−フィトスフィンゴシンおよび１，２−ペンタンジオールの組合せを用いることにより、既存の配合の限界を上回る効果が得られる。
【００１２】
さらに、Ｎ−アシル−フィトスフィンゴシンおよび１，２−ペンタンジオールを組み合わせることにより、皮膚に使用するのに特に適した化粧料製剤の製造が可能になる。
【００１３】
好ましい実施形態においては、Ｎ−アシル−フィトスフィンゴシンはＮ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンである。その場合、皮膚に関し特に優れた化粧効果を得ることが可能であった。
【００１４】
さらなる実施形態においては、本製剤は、Ｎ−アシル−フィトスフィンゴシン以外のさらなるセラミドを含まない。驚くべきことに、唯一のセラミドとしてＮ−アシル−フィトスフィンゴシンのみを用いることで非常に良好な化粧効果が得られることが見出された。
【００１５】
一実施形態においては、Ｎ−アシル−フィトスフィンゴシンは、製剤中に、製剤全体を基準として０．０２質量％〜２質量％の濃度で存在する。好ましくは、Ｎ−アシル−フィトスフィンゴシンは、製剤中に、製剤全体を基準として０．１質量％〜１質量％の量で存在する。このような質量濃度を用いることにより特に良好な化粧効果を得ることができた。
【００１６】
一実施形態においては、１，２−ペンタンジオールは、製剤中に、製剤全体を基準として０．２質量％〜１５質量％の濃度で存在する。好ましくは、１，２−ペンタンジオールは、製剤中に、製剤全体を基準として０．５質量％〜１０質量％の濃度で存在する。特に好ましくは、１，２−ペンタンジオールは、製剤中に、製剤全体を基準として１質量％〜５質量％の濃度で存在する。このような質量濃度を用いることにより特に良好な化粧効果を得ることができた。
【００１７】
さらなる実施形態においては、Ｎ−アシル−フィトスフィンゴシン対１，２−ペンタンジオールの比は１：１００〜１：１の範囲にある。好ましくは、Ｎ−アシル−フィトスフィンゴシン対１，２−ペンタンジオールの比は１：２５〜１：１の範囲にある。特に好ましくは、Ｎ−アシル−フィトスフィンゴシン対１，２−ペンタンジオールの比は１：１５〜１：１の範囲にある。本製剤において、Ｎ−アシル−フィトスフィンゴシン対１，２−ペンタンジオールの比は重要である。それは、この比が特に適用性、例えば、製剤の粘度や皮膚に吸収される能力等に影響するためである。
【００１８】
化粧料製剤中に存在する好適なさらなる助剤は、例えば、エモリエント剤、乳化剤および界面活性剤、増粘剤／粘度調節剤／安定剤、ＵＶ光防御遮蔽剤、酸化防止剤、ハイドロトロープ剤（またはポリオール）、固体またはフィラー、皮膜形成剤、真珠光沢剤、脱臭および制汗有効成分、昆虫忌避剤、セルフタンニング剤、防腐剤、コンディショナー、香料、染料、生物由来の有効成分（biogenic active ingredient）、ケア用添加剤（care additive）、過脂肪剤およびさらなる溶剤である。特に、本化粧料製剤は、少なくとも１種のさらなる生物由来の有効成分を含む。生物由来の有効成分とは、例えば、トコフェロール、酢酸トコフェロール、パルミチン酸トコフェロール、アスコルビン酸、ポリフェノール、デオキシリボ核酸、コエンザイムＱ１０、レチノール、ＡＨＡ酸、アミノ酸、ヒアルロン酸、アルファ−ヒドロキシ酸、イソフラボン、ポリグルタミン酸、クレアチン（およびクレアチン誘導体）、グアニジン（およびグアニジン誘導体）、擬似セラミド、精油、ペプチド、タンパク質加水分解物、植物抽出物、ビサボロール、アラントイン、パンテノール、フィタントリオール、イデベノン、甘草抽出物、グリチルリチンおよびイデベノン、スクレログルカン、β−グルカン、サンタルビン酸およびビタミン複合体を意味するものと理解すべきである。植物抽出物の例としては、マロニエ抽出物、カミツレ抽出物、ローズマリー抽出物、クロスグリおよびアカスグリ抽出物、シラカバ抽出物、ローズヒップ抽出物、藻抽出物、緑茶抽出物、アロエ抽出物、薬用人参抽出物、イチョウ抽出物、グレープフルーツ抽出物、トウキンセンカ抽出物、キュウリ抽出物、カンファー、タイム抽出物、マンゴスチン抽出物、シスタス抽出物、テルミナリアアルジュナ抽出物、カラスムギ抽出物、オレガノ抽出物、キイチゴ抽出物、イチゴ抽出物等が挙げられる。生物由来の有効成分としては、いわゆるバリア脂質（barrier lipid）も挙げることができ、その例として、セラミド、フィトスフィンゴシンおよび誘導体、スフィンゴシンおよび誘導体、スフィンガニンおよび誘導体、擬似セラミド、リン脂質、リゾリン脂質、コレステロールおよび誘導体、コレステリルエステル、遊離脂肪酸、羊毛脂および誘導体、スクワラン、スクワレンおよび類縁物質が挙げられる。本発明に関連する生物由来の有効成分としては、抗ざ瘡有効成分（例えば、過酸化ベンゾイル、フィトスフィンゴシンおよび誘導体、ナイアシンアミド、ヒドロキシ安息香酸エステル、ニコチンアルデヒド、レチノイン酸および誘導体、サリチル酸および誘導体、シトロネル酸等）および抗セルライト有効成分（例えば、キサンチン化合物（カフェイン、テオフィリン、テオブロミン、アミノフィリン等）、カルニチン、カルノシン、サリチロイルフィトスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン類、サンタルビン酸等）および抗フケ剤（例えば、サリチル酸および誘導体、ピリチオン亜鉛、硫化セレン、硫黄、シクロピロックスオラミン、ビフォナゾール、クリンバゾール、オクトピロックスおよびアクチロックス（actirox）等）および収斂剤（例えば、アルコール、アルミニウム誘導体、没食子酸、サリチル酸ピロキシジン、亜鉛塩（例えば硫酸亜鉛等）、酢酸塩、塩化物、乳酸塩��ジルコニウムクロロハイドレート等）も挙げられる。同様に、生体由来の有効成分として、美白剤、例えば、麹酸、アルブチン、ビタミンＣおよび誘導体、ヒドロキノン、ウコン油、クレアチニン、スフィンゴ脂質、ナイアシンアミド等も挙げることができる。
【００１９】
さらなる実施形態においては、化粧料製剤は、分離調整剤（partition modifier）、例えば、ベンジルアルコール、アルファ−ビサボロール、セチルアルコール、キトサン、デカノール、デシルメチルスルホキシド、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ＥＤＴＡ、エチレングリコール、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、４−デシルオキサゾリジン−２−オン、エタノール、グリセロール、ラウリン酸、ラウリルアルコール、レシチン、尿素、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ジメチルイソソルビド、ミリスチン酸イソプロピル、プロピレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、ドデシルベタイン、テルペン類（ｄ−リモネン等）、Ｎ−メチルホルムアミド、ステアリン酸、ポリエトキシエチレン、リモネンオキシド、ハイドロフォビン、３−メトキシ−３−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１，３−ブタンジオール、１，３−プロパンジオール、グリセリルモノパルミタート、酢酸ドデカノイル、エチルヘキサン酸セチル、エチルヘキサン酸ステアリル、乳酸エチル、乳酸イソブチル、アセチルクエン酸トリエチル、フィタントリオール、サリチル酸およびその誘導体、アスコルビン酸およびその誘導体、ブチレングリコール、チアゾン、ドデシル硫酸ナトリウム、ネロリドールおよび１，８−シネオール、糖脂質、中鎖トリグリセリド、分岐鎖脂肪族アルコール（オクチルドデカノール等）、タウリン、リン脂質、１，２−ペンチレングリコールおよびＣ８／Ｃ１０−グリセロール部分エステル（化学量論量未満のｎ−オクタン酸およびｎ−ドデカン酸を含む混合物でグリセロールをエステル化した生成物）、特に、例えばＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５６６１６号に記載されているＣ８／Ｃ１０−グリセロール部分エステル等を含む。このさらなる助剤を用いることにより特に良好な値を達成することができる。
【００２０】
さらなる実施形態において、化粧料製剤は、安息香酸アルキル（Ｃ１２−１５）、特にＴＥＧＯＳＯＦＴ（登録商標）ＴＮを含む。このさらなる助剤を用いることにより特に良好な値を達成することができた。
【００２１】
さらなる実施形態においては、化粧料製剤は、ＰＰＧ−１３ミリスチルエーテル、特にＴＥＧＯＳＯＦＴ（登録商標）ＡＰＭを含む。このさらなる助剤を用いることにより特に良好な値を達成することができた。
【００２２】
さらなる実施形態においては、化粧料製剤は、オクチルドデカノール、特にＴＥＧＯＳＯＦＴ（登録商標）Ｇ２０を含む。このさらなる助剤を用いることにより特に良好な値を達成することができた。
【００２３】
化粧料製剤自体に加えて、その様々な使用も特許請求する。
【００２４】
皮膚に適用するための上述の製剤の使用を特許請求する。
【００２５】
さらには、皮膚のゆるみ(slackening)を軽減するための上述の製剤の使用を特許請求する。上述した製剤を用いることにより皮膚のゆるみを大幅に軽減できたことを示すことができた。
【００２６】
さらには、皮膚をふっくらさせるための上述の製剤の使用を特許請求する。ふっくらさせることに関しても顕著な改善を達成することができた。
【００２７】
ふっくらさせると同時にゆるみを軽減することにより、リフトアップ効果を達成することができる。
【００２８】
この使用の好ましい変形形態においては、本化粧料製剤を顔面に適用する。この場合、特に眼瞼および頬領域において非常に良好な結果を達成することができた。
【００２９】
この使用のさらなる好ましい変形形態においては、本化粧料製剤を胸部に適用する。この場合も非常に良好な結果を得ることができた。
【００３０】
リフトアップ効果が得られるだけでなく、さらに標的化したシェーピングを起こすこともできる。
【００３１】
Ｎ−アシル−フィトスフィンゴシンを含む化粧料製剤の、皮膚のゆるみを軽減するための使用も特許請求する。この化粧料製剤中に存在する助剤として、例えば溶剤、したがって例えば１，２−ペンタンジオールを用いることができる。この使用の好ましい変形形態においては、助剤は１，２−ペンタンジオールである。
【００３２】
さらに、Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンを含む化粧料製剤の、皮膚のゆるみを軽減するための使用を特許請求する。この場合も、化粧料製剤中に存在する助剤として、例えば溶剤、したがって、例えば１，２−ペンタンジオールを用いることができる。この使用の好ましい変形形態においては、助剤は１，２−ペンタンジオールである。
【００３３】
さらに、Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンを唯一のセラミドとして含む化粧料製剤の、皮膚のゆるみを軽減するための使用を特許請求する。この場合も、この化粧料製剤中に存在する助剤として、例えば溶剤、したがって、例えば１，２−ペンタンジオールを用いることができる。この使用の好ましい変形形態においては、助剤は１，２−ペンタンジオールである。
【００３４】
直前の３つの段落に記載した使用は、好ましくは顔面および胸の範囲で行われる。
【００３５】
Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンを含む化粧料製剤の、美容豊胸（cosmetic breast enlargement）のための使用も特許請求する。この場合も、化粧料製剤中に存在する助剤として、例えば溶剤、したがって例えば１，２−ペンタンジオールを用いることができる。この使用の好ましい変形形態においては、助剤は１，２−ペンタンジオールである。
【００３６】
以下の実施例は本発明を例示により説明するものであり、実施例に特定する実施形態に本発明を制限することを全く意図しておらず、本発明の出願の範囲は、明細書および特許請求の範囲全体により定まる。
【実施例】
【００３７】
実施例１：Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンがヒト皮膚線維芽細胞における遺伝子発現に与える影響の調査
本実施例は、Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンが線維芽細胞（正常ヒト皮膚線維芽細胞、ＮＨＤＦ)における遺伝子発現に与える影響を調査するものである。
【００３８】
この目的のために、最初に、CellSystems（登録商標） Biotechnologie Vertrieb GmbHより入手した初代ヒト皮膚線維芽細胞（新生児皮膚由来ヒト皮膚線維芽細胞、ＨＤＦ）（凍結品、Lifeline Cell Technology）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Invitrogen Ltd, UK）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）（１００×）（PAA Laboratories GmbH）、１％Ｌ−グルタミン（１００×）（Invitrogen Ltd）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（５０００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび５０００μｇ／ｍＬストレプトマイシン／ｍＬ（Invitrogen Ltd）を添加したアール塩を含む最小必須培地（ＭＥＭ）（ＥＭＥＭ）（PAA Laboratories GmbH）にて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。遺伝子発現を調査するために、細胞を６ウェルプレートに播種し、サブコンフルエント状態になるまで（最大６０％）培養した。
【００３９】
次いで細胞から培地を取り除き、Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンを含む新鮮な培地と交換した。溶媒（vehicle）としてメタノールを使用し、培地中の溶媒の最終濃度を０．０５％（ｖ／ｖ）とした。培地中のＮ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンの最終濃度を５μＭとした。対照として、有効成分を添加せずに培地（溶媒）のみで培養を行った。すべての培養を２回ずつ実施した（２種の異なるドナーに由来する細胞を用いた）。
【００４０】
２４時間培養後、培地を取り除き、RNeasy Lysis Buffer（Qiagen）を加えて細胞を溶解させた。製造業者の指示に従い全ＲＮＡの単離を行った。まとめると、RNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いることにより全ＲＮＡを単離した。SmartSpec Plus（Biorad）を用いた分光測定によりＲＮＡ濃度を求めた。Agilent 2100 Bioanalyzerを使用し、6000 Nano LabChip試薬セット（Agilent Technologies, Inc.）を用いてＲＮＡの精製度および完全性を確認した。次の処理に使用するまでＲＮＡ試料を−８０℃で保管した。
【００４１】
Affymetrix HGU133 plus 2.0 GeneChips（Affymetrix）を使用し、全ＲＮＡ２μｇを用いて遺伝子発現解析を行った。この目的のために、２種の異なるドナーに由来するＲＮＡをプールした。製造業者（AFFYMETRIX, INC.）の指示に従い、標準物質のデータの評価を含む発現解析を行った。
【００４２】
驚くべきことに、線維芽細胞をＮ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンで処理することにより、真皮の細胞外マトリックスを強化し、したがって、皮膚を引き締め、弾性および張りを生じさせるために特に重要な一連の遺伝子の発現が制御され、その結果として、皮膚のゆるみを大幅に軽減することができ、皮膚をふっくらさせることができることが判明した。遺伝子およびＮ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンによる制御の程度を表１に示す。
【００４３】
【表１】
2014532675.tif 000002
【００４４】
一方では、真皮の細胞外マトリックスの形成および強化に特に重要な一連の遺伝子の発現が制御されていた。ＡＣＡＮは、プロテオグリカンつまり細胞外マトリックスの成分等をコードする。ＣＯＬ１０Ａ１およびＣＯＬ１１Ａ１は異なるコラーゲンのサブユニットをコードする。したがって、コラーゲン細線維の形成が増加する方向に影響を与える。ＩＴＧＡ２遺伝子産物は、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンの受容体の構成要素および他の細胞外マトリックスの重要な構成要素である。これは、新たに形成される細胞外マトリックスの組織化に特に重要である。ＨＡＰＬＮ１は、細胞外マトリックス内でプロテオグリカンモノマーおよびヒアルロン酸の集合体を安定化させる架橋タンパク質（bridging protein）をコードする。ＭＭＰ３は、細胞外マトリックスの様々な分子を分解する酵素をコードする。Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンがＭＭＰ３の発現を低下させることにより、細胞外マトリックスの分解が防止される。最後に、ＩＧＦ１、ＬＥＰおよびＦＧＦ１８は、重要なシグナル伝達機能を有する増殖因子またはホルモン様分子をコードし、これらは真皮マトリックスの構造、したがって、皮膚の張り、締まり(compactness)および弾力に好ましい影響を与える。
【００４５】
したがって、実施例１から、Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンが、皮膚のゆるみの軽減および皮膚をふっくらさせることに非常に適していることが明らかである。
【００４６】
実施例２：Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンが脂肪細胞における遺伝子発現に与える影響の調査
本実施例においては、分化したヒト脂肪細胞における遺伝子発現にＮ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンが与える影響を調査した。
【００４７】
細胞、培地および試薬はPromoCellより入手した。PromoCellのプロトコルに従い培養を行った。特段の指定がない限り、細胞の培養は３７℃、５％ＣＯ２条件下で行った。最初に、２種の異なるドナーの皮下脂肪に由来する増殖性の初代ヒト白色前駆脂肪細胞（ＨＷＰ）を専用の前駆脂肪細胞増殖培地で１００％コンフルエントになるまで培養した。次いで培地を専用分化培地に交換し、この培地で細胞を７２時間培養した。次いで終末分化させるために培地をさらなる培地（Adipocyte Nutrition Medium）に交換した。細胞をこの培地でさらに１２日間培養し、３日毎に培地を交換した。最後に培地を細胞から取り除き、Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンを含む新鮮な培地と交換した。溶媒としてメタノールを使用し、培地中の溶媒の最終濃度を０．０５％（ｖ／ｖ）とした。培地中のＮ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンの最終濃度は２．５μＭとした。対照として、有効成分を使用せずに培地（溶媒）のみで培養を行った。すべての培養を２回ずつ実施した（２種の異なるドナーに由来する細胞を用いた）。
【００４８】
６時間培養した後、培地を細胞から取り除き、RNeasy Lysis Buffer (Qiagen)を加えて細胞を溶解させた。製造業者の指示に従い全ＲＮＡの単離を行った。まとめると、RNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いることにより全ＲＮＡを単離した。SmartSpec Plus（Biorad）を用いた分光測定によりＲＮＡ濃度を求めた。Agilent 2100 Bioanalyzerを使用し、6000 Nano LabChip試薬セット（Agilent Technologies, Inc.）を用いてＲＮＡの精製度および完全性を確認した。次の処理に使用するまでＲＮＡ試料を−８０℃で保管した。
【００４９】
Affymetrix HGU133 plus 2.0 GeneChips（Affymetrix）を使用し、全ＲＮＡ２μｇを用いて遺伝子発現解析を行った。この目的のために、２種の異なるドナーに由来するＲＮＡをプールした。製造業者（Affymetrix）の指示に従い、標準物質のデータの評価を含む発現解析を行った。
【００５０】
驚くべきことに、分化した脂肪細胞をＮ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンで処理することにより、皮膚の皮下脂肪組織に貯蔵される脂肪の生合成に特に重要な一連の遺伝子の発現が制御されたことが見出された。ここで認められた制御パターンは、貯蔵される脂肪の生合成（脂質合成）が増加したことを示している。インビボ試験（以下参照）において認められた効果すなわち皮膚の平滑化および皮膚のたるみの軽減はこのような機構により説明することができる。新たに形成される脂肪によって皮膚はある程度ふっくらする。
【００５１】
表２に遺伝子およびＮ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンによるその制御の程度を示す。
【００５２】
【表２】
2014532675.tif 000003
【００５３】
脂質代謝に関連する遺伝子に関しては、ＬＩＰＣ、ＦＡＳおよびＡＣＡＣＡが特に注目に値する。最初に挙げたものはリパーゼをコードする。この酵素は一般にトリグリセリドの分解を触媒する。本実施例においては、遺伝子ＬＩＰＣが試験物質により下方制御されたことから、皮下脂肪組織が蓄積したと仮定することができる。ＦＡＳは脂肪酸シンセターゼ酵素をコードし、ＡＣＡＣＡはアセチル−コエンザイムＡカルボキシラーゼをコードする。いずれもトリグリセリド生合成の鍵となる酵素である。対応する遺伝子がいずれも試験物質により上方制御されているので、ここでも脂肪組織の蓄積に好ましい影響が与えられたと仮定することができる。ＣＥＢＰＢ、ＰＰＡＲＧおよびＰＰＡＲＧは、脂質の生合成を制御することで特に知られている転写因子をコードする。ここでもやはり、この制御パターンによって脂肪形成（脂質合成）が刺激されたことが示される。
【００５４】
これらの脂質代謝に関連する遺伝子に加えて、脂肪細胞中で増殖因子またはホルモン様物質をコードする一連の遺伝子の発現も制御されていた。本実施例の場合は、ＬＥＰ、ＬＥＰＲおよびＡＤＩＰＯＱがその例に相当する。これらはいずれも真皮の細胞外マトリックスの新たな形成および強化の制御に重要である。この点に関して言えば、脂肪細胞により形成されるこれらの因子が生体内で細胞間情報伝達機構を介して皮膚構造の強化に寄与すると推測することができる。
【００５５】
結論として、実施例２においても、Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンが皮膚のゆるみを軽減し皮膚をふっくらさせることに極めて適していることがはっきりと示される。
【００５６】
実施例３：Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンによる皮膚のたるみおよび肌の凹凸の軽減ならびにエコー輝度の上昇
製剤中のＮ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンを局所適用することにより、皮膚のたるみ、皮膚の凹凸および皮膚のエコー輝度(echogenicity)というパラメータが改善されることを、ヒトを対象とした研究で確認した。
【００５７】
パネルは閉経後の健康な７０歳以下の白人女性被験者６０人で構成された（平均年齢５９．４歳）。製剤を顔面に塗布した。溶媒製剤（溶媒）およびＮ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシン製剤（Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシン）をそれぞれ３０人ずつの被験者に塗布した。比較用製剤の役割を果たす本発明によらない溶媒製剤の場合、Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシン０．２質量％に替えてさらに水０．２質量％を追加した。
【００５８】
塗布期間は１２週間とし、１日２回、朝および夜に塗布を行った。測定点は、塗布開始前（Ｔ０）、４週間後（Ｔ４）、８週間後（Ｔ８）および１２週間後（Ｔ１２）とした。したがって、４週間を超える期間をＴ４−Ｔ０と称する。
【００５９】
製剤の組成を次の表３に示す。
【００６０】
【表３】
2014532675.tif 000004
【００６１】
製剤の調製には、当業者に知られている慣用の製剤化方法を用いた。
【００６２】
測定は調温調湿室（２４±２℃、相対湿度５０±１０）内で行った。被験者には、測定の１２時間前から測定前まで塗布を中止し、測定の３時間前に洗顔するように指示した。
【００６３】
皮膚のたるみを皮膚科医が目視および触覚によって評価することにより４段階の尺度（０＝たるみなし、１＝最小限のたるみ、２＝中程度のたるみ、３＝たるみ最大）で判定した。
【００６４】
皮膚の凹凸はPrimos Pico３Ｄ光学センサー（GF Messtechnik GmbH）を用いて測定した。Primos Picoは高速かつ高精度のデータ収集を可能にするマイクロミラーを基づく、デジタルバンド投射を利用している。複数のバンドを皮膚表面に投射し、この投影像を規定の三角測量角度からＣＣＤカメラを用いて記録する。バンドの位置およびすべての登録された画像点のグレースケールから測定対象物のトポグラフィーを算出する。測定範囲は４０×３０ｍｍ２であり、横方向分解能６３μｍ、垂直方向分解能≧４μｍ、精度は≧６μｍである。データ収集は７０ｍｓ未満で行う。平均粗さＳａを求めた。これは記録した画像の皮膚の凹凸の算術平均を反映する。
【００６５】
DermaScan（登録商標）C超音波スキャナを用いて皮膚のエコー輝度を測定した。この機器はトランスデューサから超音波を放射する物理的原理に基づくものである。超音波ビームが皮膚内の構造が異なる層に衝突すると、その一部は透過し、一部は反射する。これにより、振幅の異なる反射音波が生成する。これらの強度をマイクロプロセッサで検知する。DermaScan（登録商標）C Version 3（Cortex Technology, Denmark）は高周波数（２０ＭＨｚ）の超音波を放射する高解像度スキャナである。この周波数を用いることにより、組織構造を、距離分解能６０μｍ、横方向分解能２００μｍで深さ１５ｍｍまで観測することが可能になる。エコー輝度はＢスキャンモードで記録した（単位：％）。この機器を用いて皮膚層の厚みを測定する。音波の強度は組織の厚みに依存する。基本的に、皮膚は若い方が、老化した皮膚よりも厚みがある。組織の厚みを増加させる処置の効果は皮膚の厚みが増加することによって示される。
【００６６】
図１に皮膚のたるみの軽減を示す。
【００６７】
１２週間の期間中（Ｔ１２〜Ｔ０）、皮膚のたるみが着実に軽減されたことが溶媒群およびＮ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシン群の両方で認められ、各場合において、皮膚のたるみの軽減は、すべての時点でＮ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシン群の方が顕著であった。
【００６８】
図２に皮膚の凹凸の変化を示す（Ｓａパラメータ）。
【００６９】
調査期間全体を通して、Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシン群の皮膚の凹凸は一層着実に軽減されていったが、溶媒群においては皮膚の凹凸は全く改善されなかった。
【００７０】
図３に皮膚のエコー輝度の変化を示す。
【００７１】
４週間後（Ｔ４−Ｔ０）、溶媒群およびＮ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシン群の両方においてエコー輝度がわずかに低下したことが分かった。溶媒製剤は調査期間が進んでも初期値と比較すると改善が認められなかったが、Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシン群のエコー輝度は着実に改善されていた。
【００７２】
図１〜３に示した結果は、Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンを製剤中に使用することにより、皮膚のたるみの軽減、皮膚の凹凸の軽減および皮膚のエコー輝度の増加を達成できることを示す。
【００７３】
実施例４：１，２−ペンタンジオールを含む製剤によるＮ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンのバイオアベイラビリティの増加
ブタ皮膚モデルを用いて経皮吸収性を検討する過程で、化粧料製剤に１，２−ペンタンジオールを添加することによってＮ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンの皮膚浸透性が増大することが示された。実際には、この検討は、例えばS. Richert, A. Schrader, K. Schrader, Int. J. Cosmet. Sci. 2003, 25, 5-13.に記載されている現行のプロトコルに従い実施した。
【００７４】
調査した製剤を以下の表４にまとめる。
【００７５】
【表４】
2014532675.tif 000005
【００７６】
製剤の調製には、当業者に知られている慣用の製剤化方法を用いた。
【００７７】
図４に、様々な製剤からのＮ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンのバイオアベイラビリティを示す。
【００７８】
これらの結果は、製剤中でＮ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンを１，２−ペンタンジオールと併用することによってバイオアベイラビリティを増加させることが可能であることを示している。バイオアベイラビリティは、製剤中に存在する有効成分のうち、その後実際に生体にも吸収される割合に関する情報を提供するため、化粧料製剤の重要な要素である。したがって、バイオアベイラビリティが高いことは明らかな利点となる。例えば、バイオアベイラビリティが高い場合、製剤中に含有させなければならない有効成分の量を低減することができる。
【００７９】
実施例４の結果は、Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンおよび１，２−ペンタンジオールの併用が１，２−ペンタンジオールを含まない対応する製剤と比較して明らかに有利であることを示している。
【００８０】
実施例５：Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンを用いた上腕の皮膚のゆるみの軽減
皮膚のエコー輝度というパラメータで定量可能な上腕の皮膚のゆるみが製剤中のＮ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンを局所適用することにより軽減されることをヒトの研究で実証した。
【００８１】
パネルは閉経後の健康な７０歳以下の白人女性被験者で構成された。被験者の上腕の皮膚のエコー輝度は最大で６０％であった（DermaScan（登録商標）C、Ｂスキャンモード）。製剤を上腕に塗布した。溶媒製剤（溶媒）および異なる濃度のＮ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンを含む製剤（Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシン）をそれぞれ１６人ずつの被験者に塗布した。比較用製剤の役割を果たす本発明によらない溶媒製剤においては、Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンを対応する質量％の水に置き換えた。
【００８２】
塗布期間は１２週間とし、１日２回、朝および夜に塗布を行った。測定点は、塗布開始前（Ｔ０）、４週間後（Ｔ４）、８週間後（Ｔ８）および１２週間後（Ｔ１２）とした。したがって、４週間を超える期間をＴ４−Ｔ０と称する。
【００８３】
製剤の組成を以下の表３に示す。
【００８４】
【表５】
2014532675.tif 000006
【００８５】
製剤の調製には、当業者に知られている慣用の製剤化方法を用いた。
【００８６】
測定は調温調湿室（２４±２℃、相対湿度５０±１０）内で行った。被験者には、測定の１２時間前から測定前まで塗布を中止し、測定３時間前から上腕を洗わないよう指示した。
【００８７】
DermaScan（登録商標）C超音波スキャナを用いて皮膚のエコー輝度を測定することにより皮膚のゆるみを測定した。エコー輝度をＢスキャンモードで記録し、％で表した。この処置による皮膚のゆるみを軽減する効果はエコー輝度（％）の増加で示され、したがって、皮膚の厚みの増加と関連する。
【００８８】
図５に上腕の皮膚の厚みの増加を示す。
【００８９】
Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシン０．０５％で処置した結果として、初期値と比較すると、４、８および１２週間後のそれぞれにおいて皮膚のエコー輝度の増加が認められた。Ｎ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシン０．０２％を用いた処置においては、増加はさほど著明ではなく、８週間後になってようやく測定値に現れた。溶媒製剤による処置では皮膚のエコー輝度は増加せず、それどころか、各場合の各時点において皮膚のエコー輝度が低下した。
【００９０】
この結果は、製剤中で０．０２％または０．０５％のＮ−ヘキサノイル−フィトスフィンゴシンを使用することにより、使用した溶媒製剤と比較して上腕のエコー輝度を増加させることが可能であることを示している。上腕のエコー輝度の増加は、上腕の皮膚のゆるみが軽減されたことを意味している。
【図１】
2014532675.tif 000007
【図２】
2014532675.tif 000008
【図３】
2014532675.tif 000009
【図４】
2014532675.tif 000010
【図５】
2014532675.tif 000011
【国際調査報告】
2014532675.tif 000012
2014532675.tif 000013
2014532675.tif 000014
2014532675.tif 000015
2014532675.tif 000016
2014532675.tif 000017