(57)【要約】  この発明は上皮創傷の処置に関する。特に、発明は、ナルトレキソンのようなオピオイドアンタゴニストの適用に基づいて上皮創傷を処置するための方法及び製剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の創傷上皮領域への有効量のオピオイドアンタゴニストの投与を含んでなる、対象における上皮創傷を処置する方法。
【請求項２】
前記オピオイドアンタゴニストは、ナルトレキソン、ナロキソン、又はそのプロドラッグ若しくは塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オピオイドアンタゴニストを、投与に先立って製剤を製造するために薬学的に許容される担体と混合する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
担体は液体、半固体、又は固体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記オピオイドアンタゴニストを、少なくとも１０-6Ｍの濃度で液体担体と混合する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
液体担体と混合した前記オピオイドアンタゴニストを更に、投与のための半固体担体中に混入する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記製剤を少なくとも１日１回投与する、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記対象は糖尿病患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
有効量のオピオイドアンタゴニスト及び薬学的に許容される担体を含んでなる、上皮創傷を処置するための組成物。
【請求項１０】
前記オピオイドアンタゴニストは、ナルトレキソン、ナロキソン、又はそのプロドラッグ若しくは塩である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物は溶液として製剤化される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記オピオイドアンタゴニストは、少なくとも１０-6Ｍの濃度で前記溶液中に存在する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物はクリーム剤及びゲル剤として製剤化される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物はパッチ剤及び包帯剤の形態である請求項９に記載の組成物。
【請求項１５】
上皮創傷を処置するために少なくとも１つの更なる有効成分を含んでなる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１６】
オピオイド成長因子受容体（ＯＧＦｒ）は、前記上皮創傷に隣接した上皮細胞上に存在する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１１年７月２８日に出願された米国仮出願６１／５１２，５７７の優先権を主張するものであり、その全文において本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、上皮創傷の処置に関する。特に、本発明は、ナルトレキソンのようなオピオイドアンタゴニストの適用に基づく上皮創傷を処置する方法及び製剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
創傷治癒は、時間的及び空間的関係が重ね合わさって慎重に組織化された一連の事象であり、炎症、増殖、及びリモデリングの段階を含む（非特許文献１、２）。原因因子としてかかわっている創傷修復における幾つかの過程は、炎症、移動、血管新生、新血管形成、細胞増殖、肉芽組織及びコラーゲン形成、及び再上皮形成の異常を含む（非特許文献３、４、５）。
【０００４】
１型糖尿病では、創傷はしばしば治癒の正常ステージを通して中断する（非特許文献６、３）。創傷治癒障害は慢性消耗性潰瘍の形成をもたらすことがある糖尿病の主要合併症である（非特許文献１、６、７）。糖尿病は切断の主要原因であり（非特許文献６、７）、年間の下肢切断患者の５０％以上を占める。糖尿病患者の数は２０３０年までに全世界で３億人に達すると推定され、糖尿病性創傷及びそれらの合併症の負担は同時に増加すると予想される（非特許文献６）。医療的ケア及び患者の自己管理の継続は長期的合併症のリスクを低減するが、そして多数の包帯の入手可能性にもかかわらず、これらの合併症の完全に有効な予防又は処置方法はない。
【０００５】
神経伝達物質としてそれらの役割の初期の研究（非特許文献８）では、内因性オピオイドは神経及び非神経組織中に存在し、そして細胞増殖、血管新生、組織構成、細胞移動、及び免疫を含む神経調節以外の多くの機能を媒介することが示されている（非特許文献９、１０、１１、１２、１３、１４、１５）。内因性オピオイドはジノルフィン、エンケファリン、エンドルフィン、エンドモルフィン及びノシセプチンを含む。古典的オピオイド受容体はμ、δ、及びκ受容体であり；非古典的オピオイド受容体はノシセプチン受容体及びオピオイド成長因子受容体を含み、ζ（ゼータ）受容体ともいわれる（非特許文献１６）。ＯＧＦｒの内因性リガンドは［Ｍｅｔ5］−エンケファリンで、オピオイド成長因子（ＯＧＦ）とも呼ばれる。
【０００６】
ネイティブオピオイドと糖尿病との関係はある種の注目を集めている。糖尿病における循環オピオイドレベルに関する研究は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）患者が高い血漿中［Ｍｅｔ5］−エンケファリンレベルを有することを示している（非特許文献１７、１８、１９）。遺伝的肥満性糖尿病（ｄｂ／ｄｂ）マウスの血漿中の［Ｍｅｔ5］−エンケファリンレベルの上昇もまた報告されている (非特許文献２０、２１)。
【０００７】
Ｔ１Ｄのラットにおけるオピオイドアンタゴニストのナルトレキソン（ＮＴＸ）の全身及び局所適用を用いる一連の研究は、ＮＴＸによって逆転されそしてＤＮＡ合成の増加に関連する眼球表面上皮の切除後に再上皮形成の遅延を報告した（非特許文献１０、２２）。これらのデータは、Ｔ１Ｄにおける機能不全眼球創傷修復がＮＴＸによって破壊されたオピオイドペプチド−オピオイド受容体相互作用の増加に因ることを示唆する。ＯＧＦはヒト角膜（非特許文献２３）及びラット尾皮膚（非特許文献１５）における再上皮形成を抑制することが知られている。
【０００８】
内因性オピオイド、並びに古典的及び非古典的オピオイド受容体は上皮組織に存在する（非特許文献２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３）。ＯＧＦは角質層のＤＮＡ合成及び細胞再生を調節することが知られており（非特許文献２５）、一方でマウスにおけるδオピオイド受容体の欠失は皮膚分化を改変しそして創傷治癒を遅延させる（非特許文献２７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Guo et al., Journal Dent Res, 89:219-229 (2010)
【非特許文献２】Shih et al., Wound Repair Regeneration, 18:139-153 (2010)
【非特許文献３】Usui et al., Journal of Histochem Cytochem, 56:687-696 (2008)
【非特許文献４】Mustoe et al, American Journal of Surgery, 1  87:655-705 (2004)
【非特許文献５】Brem et al., Arch Surg, 135:627-634 (2000)
【非特許文献６】Boulton et al., Lancet, 366:1719-1724 (2005)
【非特許文献７】O'Loughlin et al., International Journal of Lower Extremity Wounds, 9:90-102 (2010)
【非特許文献８】Akil et al., Ann Rev Neuroscience, 7:223-255 (1984)
【非特許文献９】Zagon et al., Journal of Invest Dermatology, 106:490-497 (1996)
【非特許文献１０】Zagon et al., Diabetes, 51:3055-3062 (2002)
【非特許文献１１】Zagon et al., Journal of Vascular Surgery, 37:636-643 (2003)
【非特許文献１２】Blebea et al., Journal of Vascular Surgery, 32:364-373 (2000)
【非特許文献１３】Zagon et al., Immunobiology, 216:173-183 (2011)
【非特許文献１４】Zagon et al., Immunobiology, 216:579-590 (2011)
【非特許文献１５】Wilson et al., Cell Prolif, 33:63-73 (2000)
【非特許文献１６】Corbett et al. Br. J. Pharmacol. 147 Suppl 1: S153-62 (2006)
【非特許文献１７】Fallucca et al., Metabolism, 45:1065-1068 (1996)
【非特許文献１８】Negri et al., Metabolism, 41:460-461 (1992)
【非特許文献１９】Kolta et al., Neuropeptides, 21:55-63 (1992)
【非特許文献２０】Timmers et al., Diabetes, 35:1143-1151 (1986)
【非特許文献２１】Greenberg et al. Endocrinology, 116:328-331 (1985)
【非特許文献２２】Klocek et al., Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, 23:89-102 (2007)
【非特許文献２３】Zagon et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 41:73-81 (2000)
【非特許文献２４】Cheng et al., Clin Lab Invest, 158:713-720 (2008)
【非特許文献２５】Wintzen et al., Exp Dermatol, 10:305-311 (2001)
【非特許文献２６】Tominaga Journal of Invest Dermatol, 127:2228-2235 (2007)
【非特許文献２７】Bigliardi-Qi et al., Differentiation, 74:174-185 (2006)
【非特許文献２８】Nissen et al., Experimental Dermatology, 6:222-229 (1997)
【非特許文献２９】Wenk et al., Journal of Comp Neurol, 408:567-579 (1999)
【非特許文献３０】Salemi et al., Biochem Biophys Res Commun, 338:1012-1017 (2005)
【非特許文献３１】Zagon et al., Cell Tissue Research, 246:561-565 (1986)
【非特許文献３２】Bigliardi et al., Journal of Invest Dermatol, 111:297-301 (1998)
【非特許文献３３】Kauser et al., Journal of Invest Dermatol, 120:1073-1080 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
糖尿病における創傷治癒の基礎となる病態生理及び創傷治癒が遅延する他の状況を理解すること、並びに急性及び慢性創傷治癒合併症を予防し又は少なくとも減弱させるために、この知見を処置方法にトランスレートすることが急務となっている（非特許文献３）。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
１つの実施態様では、本発明は、有効量のオピオイドアンタゴニストを、それを必要とする対象（subject）に投与することにより上皮創傷を処置する方法を対象とする。具体的な実施態様では、投与されるオピオイドアンタゴニストはナルトレキソンである。別の具体的な実施態様では、投与されるオピオイドアンタゴニストはナロキソンである。
【００１２】
別の実施態様では、本発明は、局所投与に好適な有効量のオピオイドアンタゴニスト及び薬学的に許容される担体を含有する、上皮創傷の処置のための組成物を提供する。具体的な実施態様では、組成物中のオピオイドアンタゴニストはナルトレキソンである。別の具体的な実施態様では、投与されるオピオイドアンタゴニストはナロキソンである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＳＴＺで糖尿病としたラット（ＤＢ）又は生理食塩水を与えた未処置ラット（正常）の体重（Ａ）及びグルコースレベル（Ｂ）。Ａ：体重はＳＴＺ注射に先立って（０週）、そしてその後週１回記録した。Ｂ：血糖レベルは前もって（０週）そしてＳＴＺ投与後１、４、及び８週に記録した。値は各時点で少なくとも５動物／群に対して平均±ＳＥＭを表す。**Ｐ＜０．０１及び***Ｐ＜０．００１で正常と有意差があった。
【図２】Sorensonのリン酸緩衝液（ＳＰＢ）、ＤＭＳＯ、ＫＹゼリー（ＫＹＪ）、又はNeutrogena保湿クリーム（ＭＣＮ）中に溶解したＮＴＸ（１０-4Ｍ、１０-5Ｍ、又は１０-6Ｍ）で局所処置したラット背部上の基底層における標識率のヒストグラム；対照ラットは対応する賦形薬（Vehicle）を受けた。動物はＮＴＸの３局所適用を受けた。安楽死の３及び６時間前に、動物はＢｒｄＵ（１００ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｐ．）注射を受けた。処置に対する２方向ＡＮＯＶＡ（４担体及び４濃度／担体）及び病態（糖尿病、正常）を実施した。病態に対する総合効果は認められなかった；処置はＰ＜０．００１、Ｆ＝５．５９（１５、２８８）で有意であった。データは平均±ＳＥＭを表す。各担体及び病態に対する１方向ＡＮＯＶＡに基づいて、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１及び***Ｐ＜０．００１で、賦形薬処置ラットに対するそれぞれの値と有意差があった。
【図３】Neutrogena保湿クリーム中の１０-5ＭＮＴＸ（ＭＣＮ＋ＮＴＸ）、保湿クリームのみ（ＭＣＮ＋Vehicle）、又は非処置を受けた正常及び糖尿病ラットからの背部皮膚の組織標本。切片を抗ＢｒｄＵ抗体で染色しそしてヘマトキシリンで対比染色した。ＮＴＸ処置群におけるＢｒｄＵ陽性細胞（矢印）の増加に注目。ｂｌ、基底層；ｅｐｉ、表皮；ｄｅ、真皮。棒＝１２μｍ。
【図４】正常及び糖尿病ラットの背面上に作製された全層創傷の顕微鏡写真。創傷はNeutrogena保湿クリームに溶解した１０-5ＭＮＴＸ（ＭＣＮ＋ＮＴＸ）か又は肌保湿クリーム単独（ＭＣＮ＋Vehicle）で１日３回処置し、そして創傷後０、３、５、７、及び９日目に写真撮影した。棒＝６ｍｍ。
【図５】６ｍｍの創傷の形成後そして９日間経過観察したラット皮膚の残存欠陥（％）のヒストグラム。Ａ。非処置であった正常及び糖尿病（ＤＢ）ラット。Ｂ。Neutrogena保湿クリームに溶解した１０-5ＭＮＴＸ（ＭＣＮ＋ＮＴＸ  １ｘ；ＭＣＮ＋ＮＴＸ  ３ｘ）で１日１回（１ｘ）又は１日３回（３ｘ）処置し、又は賦形薬単独（ＭＣＮ＋Vehicle １ｘ；ＭＣＮ＋Vehicle ３ｘ）を受けた正常及び糖尿病（ＤＢ）ラット。Ｃ。ＭＣＮ＋ＮＴＸ又はＭＣＮ＋Vehicleで処置したＤＢ及び正常（Ｎ）ラットにおいて、８日での創傷閉鎖に対する収縮及び再上皮形成の寄与。値は平均±ＳＥＭを表す。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、及び***Ｐ＜０．００１；＋＋Ｐ＜０．０１で、正常又はＭＣＮ＋Vehicleと有意差があった。
【図６】６ｍｍの創傷の形成後そして９日間経過したラット皮膚の残存欠陥（％）のヒストグラム。群は、Olay保湿クリームのオイル中に溶解した１０-5ＭＮＴＸ（ＭＣＯＯ＋ＮＴＸ  ３ｘ）で１日３回（３ｘ）処置し、又は賦形薬単独（ＭＣＯＯ＋Vehicle ３ｘ）、又はＫＹゼリーに溶解した１０-5ＭＮＴＸ（ＫＹＪ＋ＮＴＸ  ３ｘ）若しくはＫＹゼリー単独（ＫＹＪ＋Vehicle ３ｘ）を受けた正常及び糖尿病ラットを含んだ。値は平均±ＳＥＭを表す。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１で、それぞれの賦形薬と有意差があった。
【図７】６ｍｍの全層創傷の作製２０日後に採集した正常及び糖尿病ラットの皮膚の顕微鏡写真。幾つかの創傷はNeutrogena保湿クリームに溶解した１０-5ＭＮＴＸ（ＭＣＮ＋ＮＴＸ）で１日３回処置し又は賦形薬単独（ＭＣＮ＋Vehicle）を受けた。切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。ｅｐｉ、表皮；ｄｅ、真皮。棒＝１２μｍ。創傷後２０日に測定した上皮厚さ（μｍ）のヒストグラム。値は平均±ＳＥＭを表す。***Ｐ＜０．００１で、Ｎ／ＭＣＮ＋Vehicleと有意差があった。
【図８】Neutrogena保湿クリームに溶解した１０-5ＭＮＴＸ（ＭＣＮ＋ＮＴＸ  ３ｘ）で１日３回（３ｘ）局所処置後、又は賦形薬単独（ＭＣＮ＋Vehicle ３ｘ）を受けた正常及び糖尿病ラットにおいて、創傷に隣接しそしてその周囲皮膚基底上皮細胞の標識率のヒストグラム；データは処置の５日又は１０日後に採集した。値は平均±ＳＥＭを表す。*Ｐ＜０．０５及び**Ｐ＜０．０１で、それらのそれぞれの賦形薬と有意差があった。
【図９】８週齢２型糖尿病（ｄｂ／ｄｂ）マウス及び野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの体重及び血糖レベル。マウスはJackson Laboratoriesで購入しそして標準実験室管理下に飼育した。尾静脈血を採取しそしてグルコースレベルをTrueTrak血糖計測器によって測定した。値は平均±ＳＥＭを表す；ｎ＝６−１０マウス／処置群。データはｔ検定を用いて解析した；Ｐ＜０．００１（***）で野生型と有意差があった。
【図１０】２型糖尿病（ｄｂ／ｄｂ）及び野生型マウスの背部に作製された５ｍｍ円形全層皮膚創傷の形成後３、６、１３、及び１５日目の残存欠陥（％）。Ｄｂ／ｄｂマウスを保湿クリーム（賦形薬）中の１０-5Ｍナルトレキソン（ＮＴＸ）、か又は賦形薬単独で処置した；野生型マウスは賦形薬だけを受けた。適用は１日３回１５日間行った。値は、各時点で少なくとも５創傷／処置群に対する平均±ＳＥＭを表す。ｐ＜０．０１（＋＋）で野生型の賦形薬値と有意差があった。Ｐ＜０．０５（*）でｄｂ／ｄｂ賦形薬値と有意差があった。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
全身又は広範囲オピオイドアンタゴニストの局所投与が健常及び糖尿病者において上皮創傷治癒を強化及び促進することができ、そして糖尿病における創傷治癒の速度遅延を健常者における速度に回復させることができることは、驚くべきことに発明者によって発見されている。従って、本発明は、ナルトレキソン及び他の全身オピオイドアンタゴニストの使用に基づいて、特に糖尿病者を含む対象における上皮創傷を処置するための治療法及び局所製剤を提供する。
【００１５】
ナルトレキソン（また本明細書では「ＮＴＸ」と略される）及びナロキソンなどの全身オピオイドアンタゴニストは、オピオイド受容体の広範囲オピオイドアンタゴニストとして公知であり、そして薬物（例えば、オピオイド）、アルコール、及びニコチンの依存症の管理に主として使用される。本明細書で特定される創傷治癒過程に対するオピオイドアンタゴニストの有益な効果は、特にナルトレキソンが皮膚の不十分な浸透剤であるという報告を考慮に入れると驚くべきことである（例えば、Stinchcomb et al., J. Pharmaceutical Sciences 91: 2571-2578, 2002）; Krishman et al., J. Pharmaceutical Sciences 99: 2724-2731, 2010を参照されたい）。
【００１６】
本明細書に開示のように、皮膚基底層のＤＮＡ合成の顕著な増加はＮＴＸに露出された糖尿病動物で認められた。少なくとも１つの内因性オピオイド系、オピオイド成長因子−オピオイド成長因子受容体（ＯＧＦ−ＯＧＦｒ）系は、サイクリン依存性阻害キナーゼ経路の増加を通して細胞増殖を持続性に調節することが知られている（Cheng et al., Molecular Biology of the Cell, 20:319-327 (2009)）。ＯＧＦ−ＯＧＦｒ軸は、Ｔ−及びＢ−細胞増殖（Zagon et al., Immunobiology, 216:173-183 (2011); Zagon et al., Immunobiology, 216:579-590 (2011)）、細胞移動（Zagon et al., American Journal of Physiology, 268:R942-R950 (1995)）、ケラチン細胞及び線維芽細胞の増殖（Zagon et al., Journal of Invest Dermatology, 106:490-497 (1996); Zagon et al., Diabetes, 51:3055-3062 (2002); Zagon et al., Journal of Vascular Surgery, 37:636-643 (2003); Blebea et al., Journal of Vascular Surgery, 32:364-373 (2000); Zagon et al., Immunobiology, 216:173-183 (2011); Zagon et al., Immunobiology, 216:579-590 (2011); Wilson et al., Cell Prolif, 33:63-73 (2000); Zagon et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 41:73-81 (2000)）、及び血管新生（ZAGON et al., Journal of Vascular Surgery, 37:636-643 (2003); Blebea et al., Journal of Vascular Surgery, 32:364-373 (2000)）を抑制することが報告されており、そのすべては糖尿病合併症の因子として関与している。
【００１７】
興味深いことに、Ｔ１Ｄ患者並びに２型糖尿病マウス（Ｔ２Ｄ）はＯＧＦ（［Ｍｅｔ5］エンケファリン）レベルの増加を有する（Fallucca et al., Metabolism, 45:1065-1068 (1996); Negri et al., Metabolism, 41:460-461 (1992); Kolta et al., Neuropeptides, 21:55-63 (1992); Timmers et al., Diabetes, 35:1143-1151 (1986); Greenberg et al. Endocrinology, 116:328-331 (1985)）ことから、糖尿病は細胞複製の阻害に関与しているオピオイドペプチドの増加を伴うことを示唆する。それ故、いずれの特定の理論に限定されるのもではないが、過剰のＯＧＦ−ＯＧＦｒ相互作用は糖尿病で認められるように創傷閉鎖を遅延させる。その上、ＮＴＸによるこの活性の遮断は、少なくとも部分的に関連過程を正常状態へ回復させるのに関与する。
【００１８】
創傷治癒遅延に関連する病態は、糖尿病（１型／インスリン依存性糖尿病、及び２型／非インスリン依存性糖尿病）、肥満、対象の加齢、冠状動脈疾患、末梢血管疾患、創傷感染、癌、並びに免疫系障害及び免疫抑制又は放射線療法を含む免疫抑制を含む。対象にいずれかのこれらの病態が存在する場合に創傷治癒を促進するために、ＮＴＸ又はナロキソンなどのオピオイドアンタゴニストの投与の使用は本明細書の開示によって包含される。発明者らは、オピオイドアンタゴニストの投与が健常者においても創傷治癒を促進し；それ故に本発明の方法及び組成物は上皮創傷処置の向上が望まれるいずれの状態においても有利であり得ることを発見している。限定されるのもではないが、オピオイドアンタゴニストはオピオイド成長因子受容体（ＯＧＦｒ）との相互作用を通して部分的に創傷治癒を促進すると考えられる。従って、１つの実施態様では、本明細書で提供される方法及び組成物は、ＯＧＦｒが上皮創傷に隣接し又はそれを形成する上皮細胞上に存在し又は発現する上皮創傷に投与される。
【００１９】
本明細書に示される研究はＴ１Ｄ及びＴ２Ｄの両方のモデル動物における創傷治癒改善を確認し；このように本明細書で提供される方法及び組成物は、いずれの形の糖尿病者における上皮創傷の処置に適用できる。
【００２０】
開示方法を用いて処置されることができる被験体は、糖尿病又は非糖尿病被験体であり得るいずれもの哺乳動物被験体、特にヒト対象、イヌ、ネコ及びウマを含む。
【００２１】
本開示に従って有効に処置されることができる上皮創傷は、表皮（５上皮層：基底層、有棘層、顆粒層、淡明層、及び角質層のいずれかなど）中の細胞及び組織を含む表皮創傷；皮膚の真皮中の細胞及び組織を含む真皮創傷；及び内臓及び体腔の上皮層などの体の内部上皮表面を含む創傷を含む。このように、本発明の方法及び組成物は、皮膚擦過傷などの表面創傷、真皮及び表皮の損傷にかかわる創傷、並びにまた外科手術後の切開の強化閉鎖などの内部又は表面下創傷を処置するのに使用できる。
【００２２】
「上皮創傷の処置」は、創傷閉鎖、創傷収縮、成熟及びリモデリング、線維形成及び肉芽組織形成、及び／又は再上皮形成を促進、増殖及び／又は強化することを意味する。
【００２３】
「オピオイドアンタゴニスト」は、オピオイド受容体に結合し、そして拮抗する（シグナリングを阻止又は阻害する）。オピオイドアンタゴニストは、ナロルフィン、レバロルファン、シプロジム、ナルトリンドール、ノルビナルトルフィミン、ブプリノフィン、ナルトレキソン及びナロキソンを含む。好ましいオピオイドアンタゴニストはオピオイド受容体に親和性を有するが、しかしそれを活性化しないアンタゴニストである。好ましいオピオイドアンタゴニストの例はナルトレキソン及びナロキソンを含む。
【００２４】
本発明の目的のために、ナルトレキソン及びナロキソンの両方、並びにその薬学的に許容される塩（例えば、ナルトレキソン塩酸塩、及びナロキソン塩酸塩）及びそのプロドラッグは、上皮創傷の処置に好適である。
【００２５】
ナルトレキソンのＩＵＰＡＣ名は１７−（シクロプロピルメチル）−４，５α−エポキシ−３，１４−ジヒドロキシモルフィナン−６−オンである。ナルトレキソンは置換オキシモルホンとされ、ここでは第三級アミンメチル−置換基はメチルシクロプロパンで置換される。ナロキソンもまたジヒドロキシモルフィナン−６−オンとして知られている。
【００２６】
ナルトレキソン及びナロキソンの「プロドラッグ」は、ナルトレキソン及びナロキソンと比べて不活性又はより低活性型で投与される薬理化合物を意味し；そして投与後インビボでナルトレキソン又はナロキソンに変換される。幾つかの実施態様では、プロドラッグは３つの酵素工程以下でナルトレキソン又はナロキソンに変換される。具体的な実施態様では、プロドラッグは１つ又は２つの酵素工程でナルトレキソン又はナロキソンに変換される。ナルトレキソンのプロドラッグの例は、Stinchcomb et al., J. Pharmaceutical Sciences 91: 2571-2578, (2002)に記載された鎖長において２−７炭素の長鎖ナルトレキソン−３−アルキルエステルプロドラッグを、並びにValiveti et al., Pharmaceutical Res. 22: 981-989 (2005)に記載されたエステル、カルボナート及びカルバマートプロドラッグを含む。これらの文献の全内容は参照することにより本明細書に組み入れられる。
【００２７】
上皮創傷を処置する治療方法は、処置を目的とする対象の上皮領域へ有効量のナルトレキソン及び／又は別の全身オピオイドアンタゴニストの投与を含む。例えば、皮膚創傷の処置は、対象の皮膚創傷領域へ有効量のナルトレキソン及び／又は別の全身オピオイドアンタゴニストの局所投与を含む。
【００２８】
局所投与は、例えば、ワイプ、吸収性フィルム、ドロッパー、スプレーなどの塗布器を用いて、又はパッチのような創傷包帯の使用を通して創傷上に又は周囲に直接塗布し、塗り、又は展着することを含む。
【００２９】
オピオイドアンタゴニストは薬学的に許容される担体と組み合わされ、そして簡便な局所投与用に製剤化されることができる。本明細書で使用されるように、薬学的に許容される担体は、溶媒、分散媒、等張剤などを含む。いずれの簡便な媒体、薬剤、希釈剤又は担体が、レシピエントに又は溶解性若しくはオピオイドアンタゴニストの治療効果に有害である場合を除いて、その使用は妥当である。担体は、液体、半固体、例えばペースト、ゼリー若しくはクリーム、又は固体担体であってよい。担体の例は、水、食塩水、アルコール、蔗糖、ゲル、脂質、リポソーム、レジン、多孔質マトリックス、結合剤、充填剤、コーティング剤、保存剤など、又はその組み合わせを含む。オピオイドアンタゴニストは、いずれの簡便な及び実用的な方法によっても、例えば、混和、溶解、懸濁、乳化、カプセル化、吸収などによって担体と結合することができ、そして、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、軟膏、ゲル、ゼリー、クリーム、包帯、局所投与に好適なパッチなどのような製剤に作られることができる。
【００３０】
具体的な実施態様では、ナルトレキソン又はナロキソンのようなオピオイドアンタゴニストは溶液又は懸濁液として製剤化され、そして液滴の形態で局所適用される。オピオイドアンタゴニスト（ナルトレキソン又はナロキソンなど）が可溶性の局所適用に好適ないずれの溶液も、例えば滅菌水、Sorensonリン酸緩衝液がとりわけ使用されることができる。
【００３１】
別の具体的な実施態様では、オピオイドアンタゴニストは、水性クリーム添加剤中で提供され、ゲル、クリーム又は軟膏として創傷皮膚領域に適用されることができる。本実施態様によれば、オピオイドアンタゴニストは液体担体（水又はSorensonリン酸緩衝液など）中で先ず可溶化され、次いで皮膚クリーム又はゲル製品と混和されることができる。
【００３２】
他の具体的な実施態様では、オピオイドアンタゴニストは、皮膚への局所適用に好適なパッチ又は包帯の形態で固体担体と組み合わされ又はそれに取り込まれる。幾つかの実施態様では、製剤又は皮膚製品は持続放出又は改良安定性のような特性を有するように作られる。例えば、ナルトレキソンを含有する高分子マトリックス組成物は、持続放出を達成するために皮膚に局所適用されることができる。
【００３３】
オピオイドアンタゴニストを含有する組成物は、著しい毒性、不適合性、不安定性、刺激作用、アレルギー反応などなしに、上皮創傷上又はその周囲へ接触して用いるのに好適な更なる成分、添加剤又は担体を含むことができる。溶媒、基剤、溶解補助剤、懸濁化剤、増粘剤、乳化剤、安定剤、緩衝剤、等張調整剤、無痛化剤、保存剤、矯正剤、芳香剤、着色剤、添加剤、結合剤、平滑剤、界面活性剤、吸収促進剤、分散剤、保存剤、可溶化剤などの添加剤を必要に応じて製剤に加えることができる。
【００３４】
本開示のオピオイドアンタゴニスト含有製剤又は組成物は、限定されるものではないが、抗感染症薬、抗生物質、抗ウイルス薬、抗炎症薬、抗ヒスタミン薬を含む抗アレルギー薬、血管収縮薬、血管拡張薬、局所麻酔薬、鎮痛薬、眼圧低下薬、免疫調節薬、抗酸化剤、ビタミン及びミネラル、内因性オピオイドなどを分解するプロテアーゼ及びペプチダーゼなどを含む上皮創傷を処置するための他の有効成分又は活性剤を含むことができる。具体的な実施態様では、オピオイドアンタゴニスト含有製剤はまた、糖尿病者の創傷皮膚への局所投与のためのインスリンを含む。
【００３５】
本発明のオピオイドアンタゴニスト組成物は、それを必要とする対象に対して対象の創傷上皮組織を処置するための有効量が投与される。特定個人に対する組成物の有効量は、創傷のサイズ及び深度、適用される製剤のタイプ、投与頻度、及び処置期間によって決めることができる。本発明に従って、創傷上皮領域へ幾つかの異なる担体（液体又は半固体）を通して適用されるとき、液体中に比較的低い濃度（例えば、少なくとも１０-6Ｍ、少なくとも１０-5Ｍ、又は少なくとも１０-4Ｍ〜５ｘ１０-4Ｍ）、又はこれらの値間の範囲に下げたいずれかの濃度に溶解したナルトレキソンのようなオピオイドアンタゴニストは、創傷治癒を顕著に促進する。真皮／表皮創傷に対して、連日適用、好ましくは１日１〜３回適用が好ましい。創傷領域へ適用される製剤中のオピオイドアンタゴニストの最終濃度は、液体か又は半固体を問わず、少なくとも０．００３％（ｗ／ｗ）、最高５−１０％（ｗ／ｗ）、及び一般的に０．１％〜５％（ｗ／ｗ）の範囲である。
【００３６】
本発明は、限定されるものではないが、更に下記の実施例によって説明される。
【実施例】
【００３７】
材料及び方法
動物及び糖尿病の誘導
雄Sprague-Dawleyラット（〜１５０ｇ）はCharles River Laboratories (Wilmington, MA)から購入し、そして標準実験室条件で飼育した；水及び餌料は自由摂取とした。すべての実験はThe Pennsylvania State University College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committeeのガイドラインに準拠した。
【００３８】
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、２連日での４０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシン（ＳＴＺ，Sigma, St. Louis, MO）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって誘導した （Klocek et al., Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, 23:89-102 (2007); Havel et al.,
Diabetes, 49:244-252 (2000)）。この投薬計画は、７２−９６ｈ以内に１００％の動物でインスリン依存性糖尿病を誘導し；＞３５０ｍｇ／ｄｌを示す血糖レベルのラットを糖尿病（ＤＢ）と見なした。血糖レベルは、ＳＴＺの投与前、及び高血糖の誘導後１、４、及び８週にTrue Track（登録商標）Smart System 血糖計測器 （Home Diagnostics, Ft. Lauderdale, FL） を用いて尾静脈からモニターした。当量の滅菌食塩水の注射を受けた対照動物は「正常」とした。すべてのラットの重量を週１回測定した。
【００３９】
材料及び方法−実験Ｉ．ナルトレキソン及び非創傷皮膚
ナルトレキソン適用
正常（ｎ＝２４）及び糖尿病（ＤＢ）ラット（ｎ＝２４）は、ＳＴＺ又は生理食塩水の注射後８週にランダム化し、そしてＮＴＸ（Sigma-Aldrich, Indianapolis, IN）を全身（３０ｍｇ／ｋｇ、０８００ｈにｉ．ｐ又は皮下（ｓ．ｃ．））又は局所に０７００、１２００、及び１７００ｈに１日３回投与した。局所適用では、ＮＴＸは、Sorensonリン酸緩衝液（ＳＰＢ）、ＫＹゼリー（ＫＹＪ）（K-Y, Personal Products Company, McNeil-PPC, Inc., Skillman, NJ）、Neutrogena保湿クリーム（ＭＣＮ）（Neutrogena Corporation, Los Angeles, CA）、又はＤＭＳＯ（VWR, Philadelphia, PA）に溶解した。ＮＴＸは、１０-4Ｍ、１０-5Ｍ又は１０-6Ｍの投薬量で滅菌水に溶解し、そして各々の担体へと完全混合し（１：１、ｖ／ｖ）；０．５ｍｌの生理食塩水はそれぞれの賦形薬対照としての機能を果たす対応する担体に混合した。
【００４０】
ＮＴＸ又は賦形薬処置の前日に、各ラットの背面の８ｘ８ｃｍ面積を剃り、そして４つの円（約２０ｍｍ直径）をマジックインクで作製し、その後の局所適用及び／又は皮膚採取の位置を指示した。アプリケータスティックを用いて、ＮＴＸ又は賦形薬を含有する１ｍｌの担体をマークのない領域内に入れた。ＮＴＸ製剤の適用は種々の位置にランダム化した。各動物は、３つの異なる濃度でＮＴＸを、並びに同じ担体で賦形薬を投与し；幾らかのラットは担体へ生理食塩水だけを投与し、又は未処置であった。
【００４１】
ＤＮＡ合成
ＤＮＡ合成を受ける細胞を評価するために、ラットに、Euthasol（Virbac, Fort Worth, TX）で安楽死の３及び６ｈ前に、１００ｍｇ／ｋｇのＢｒｄＵ（Sigma-Aldrich）をｉ．ｐ．注射した。皮膚の適切な領域を切除し、１０％緩衝ホルマリン中に固定し、そしてパラフィン切片（６μｍ）を抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ（Invitrogen, Carlsbad, CA）で染色した。上皮基底層中のＢｒｄＵ染色細胞を、２切片／標本を用いて２５０Ｘ倍率で４つの０．１ｍｍグリッドにおいて計測し；３組織標本を各担体中の各投薬量で解析した。
【００４２】
材料及び方法−実験ＩＩ．ナルトレキソン及び創傷治癒
全層皮膚創傷
実験の第２セットにおいて、正常（ｎ＝７０）及びＤＢ（ｎ＝７０）Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは、１２−１４週齢でそしてＳＴＺの注射の８週後に創傷を受けた。８ラット／処置投薬計画を３独立実験のコースにわたって評価した。ラットの背部を剃り、そして創傷を常に位置決めするために領域（２０ｍｍ直径）をマーカーで縁取りした。動物を、ケタミン（６０ｍｇ／ｋｇ）、キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）、及びアセプロマジン（１ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．注射によって麻酔し、そして６ｍｍの全層輪状切除皮膚創傷を、Acupunch（Acuderm Inc., Fort Lauderdale, FL）を用いて皮筋のレベルまでマークのない領域の中心に作った。ラット当り３つの創傷は、第１の創傷が動物の頭蓋の後方で後頭切痕の５ｃｍ後方にそして正中線から１ｃｍ離れて作るように標準化した。第２の創傷は、動物の頭蓋の後方で後頭切痕の７ｃｍ後方に、そして第１の創傷と反対側で正中線から１ｃｍ離れて作製した。第３の創傷は、動物の頭蓋基底において後頭切痕の９ｃｍ後方にそして第１の創傷と同じ側で正中線から１ｃｍ離れて入れた。日周リズムの影響を最小化するために、０８００−０９００ｈ間に外科処置を行なった。
【００４３】
第１の実験から選択された投薬量及び担体を用いての、〜０.１ｍｌのＮＴＸ又は賦形薬を含有する担体の局所投与を創傷直後に開始し（１日当り１回だけ薬剤を受けたそれらのラットでは０８００ｈ、そして１日に３回適用を受けたそれらのラットでは０８００、１２００，１６００ｈに）；対照ラットは１日に１回か又は３回賦形薬による担体を受けた。正常及びＤＢ群中の幾らかの動物は創傷してしかし未処置であった。
【００４４】
写真撮影
創傷サイズは、表面から２０ｃｍにセットされた三脚に搭載されたデジタルカメラで画像を捉えることによりモニターし；定規は各創傷毎に写真撮影した。動物は写真撮影のために麻酔なしで手で拘束した。写真は、手術直後及び３、５、７、９、及び１１日目に取った。各創傷の面積はImage ProPlus 6.2 （Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD）を用いて解析した。百分率残存創傷はすべてのラットに対して各時点で算出した。８日時点で、創傷閉鎖はまた、Pietramaggiori and colleagues （Pietramaggiori et al., J Surg Res 160:169-177 (2010)）に従って、元の創傷面積の百分率として収縮、再上皮化、及び開放創を測定することにより定量化した。収縮、再上皮化、及び開放創面積の総計は、元の創傷サイズの１００％均等化で規定した（Yannas I., Tissue and Organ Regeneration in Adults. New York: Springer, 2001）。
【００４５】
ＤＮＡ合成及び組織病理
細胞増殖は、上記のように創傷後５及び７日目にＢｒｄＵで評価した。上皮基底層中の標識及び非標識細胞の数は２５０Ｘ倍率で４つの０．１ｍｍグリッドにおいて計測し、並びに隣接のそして０．５ｍｍ周囲領域から創傷部位の縁までサンプリングした。１日３回ＭＣＮ＋賦形薬又はＭＣＮ＋ＮＴＸを投与する３正常及び３ＤＢラットにはＢｒｄＵを注射した。
【００４６】
創傷の作製後２０日目に、幾らかのラットを安楽死させ、そして元の創傷領域並びに２０ｍｍ直径円を包囲する創傷の周囲の組織を切除しそして１０％中性緩衝化ホルマリン中で固定した。組織はパラフィン包埋のために処理し；切片はヘマトキシリン及びエオジンで染色した。肉芽組織を覆う上皮の厚さは接眼マイクロメータで測定した。７−８創傷／処置群からの５測定／切片を２５０Ｘ倍率で評価した。
【００４７】
データ解析
体重及びグルコース測定結果はスチューデント両側ｔ検定で解析した。欠陥（例えば、百分率残存創傷、収縮）の面積測定結果、上皮の厚さ、及びＤＮＡ標識率は、Newman-Keuls検定を用いて行ったその後の予定比較で分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて評価した。
【００４８】
結果
実験Ｉ．ナルトレキソン及び非創傷皮膚
全ラットはＳＴＺの注射後７２ｈ以内に高血糖性となり、正常及びＤＢ動物の血糖レベルはそれぞれ１１９±４及び５６９±９  ｍｇ／ｄＬであった（図１）。ＤＢラットの体重は、ＳＴＺの注射後１週で開始して実験期間を通して継続した正常コホートから８％〜２８％減少した（図１）。ＤＢ群中のラットにはインスリンを与えなかった。高血糖で死んだ動物はいなかった。
【００４９】
正常ラットの皮膚上皮の基底細胞における８．１±０．３％のＢｒｄＵ標識率比較して、ｉ．ｐ．又はｓ．ｃ．経路による３０ｍｇ／ｋｇのＮＴＸの全身注射はそれぞれ１７２％及び５１％だけＢｒｄＵ標識率を上昇させた。ＤＢ動物の皮膚中の８．１±０．５％の標識率に対して、ＮＴＸのｉ．ｐ．及びｓ．ｃ．注射はそれぞれ１８１％及び５９％のＢｒｄＵ取込を増加させた。
【００５０】
異なる特性（例えば、吸収、密度）を有した４種の異なる担体に溶解したＮＴＸ（１０-4Ｍ〜１０-6Ｍ）の局所適用の効果を正常及びＤＢラットで調べた（図２）。４担体のいずれに溶解した局所ＮＴＸも、正常ラットのベースラインレベルから一貫してＤＮＡ合成を上昇させた（４３−１３２％）。ＳＰＢ中でのＮＴＸの投与を受けた動物はベースライン値と比べて皮膚中へのＢｒｄＵ取込の最低レベルの増加（４３−５６％）を示したが、一方でＭＣＮ中での異なる投薬量のＮＴＸで処置したラットは、ベースラインから幾らかの最大変化（７３−１３２％）を示した。ＤＢラットでは、ＮＴＸの全３投薬量への局所露出は、ＫＹＪ（１０３−１４７％）又はＭＣＮ（８５−８９％）中で送達されたとき、標識率をベースラインレベルから顕著に上昇させた。ＤＢラットにＳＰＢ中で送達された１０-4及び１０-5Ｍの濃度でのＮＴＸはＢｒｄＵの取込に効果はなかった。ＤＭＳＯだけと組み合わせたオピオイドアンタゴニストは１０-4及び１０-5Ｍの濃度で有効であった。
【００５１】
ＮＴＸの局所適用が全身効果を有するかを調べるために、幾らかのラットを  ＭＣＮ＋ＮＴＸ（１０-5Ｍ）又はＭＣＮ＋賦形薬によりそれらの背部の異なる位置で処置した。ＭＣＮ＋ＮＴＸで処置した皮膚は、ＭＣＮ＋賦形薬の投与を受けた同じ動物の創傷に対する８．１±０．７％と比べて、１８．０±０．９％の標識率を有し；別々の非処置ラットの基底上皮は８．２±０．５％の標識率を有した。
【００５２】
肉眼で及び組織学的手段の両方による皮膚の検査は、賦形薬又はいずれの担体中のいずれもの投薬量のＮＴＸを受けた正常及びＤＢラットで類似の外見を示した。処置皮膚の組織形態学はいずれの薬剤にも露出されなかった動物と同等であった（図３）。
【００５３】
実験ＩＩ。ナルトレキソン及び全層創傷
第１の実験からの標識率データに基づいて、２つの局所送達システム、ＫＹＪ及びＭＣＮに適用された１０-5ＭでのＮＴＸを、全層創傷治癒に対するオピオイドアンタゴニスト遮断の影響を調べるその後の実験に選択した。正常及びＤＢラットは図１と同様の体重及びグルコースパターンを呈した。全ラットは問題なく創傷処置に耐容性であった（例えば、正常な食餌摂取量）。
【００５４】
正常及び糖尿病創傷治癒
６ｍｍトレフィンを用いて計算した創傷サイズは２８.３ｍｍ2で、１０％より多く偏位した創傷は解析に含ませなかった。健常及びＤＢラットでの創傷閉鎖の評価から、ＤＢ動物の残存創傷の面積は、健常ラットに対して手術後５、７、及び９日目に２４％、４４％、及び１３２％大きかったことを示した（図５Ａ）。
【００５５】
ＮＴＸの適用数及び創傷治癒の効果
正常及びＤＢラットの全層創傷の治癒に対するＮＴＸの局所適用の効果を調べるために、ＮＴＸの連日適用の数が決定的に重要な意味を持つかを検討する研究を開始した（図４、５）。正常ラットに対してＭＣＮ中での１０-5ＭＮＴＸの単回及び３回の連日処方の３日以内に、創傷面積はＭＣＮ＋賦形薬を受けた動物に対してそれぞれ３０％及び１１％減少した（図５Ｂ）。ＮＴＸ処置正常動物で３、５、７、及び９日目の創傷サイズはＭＣＮ＋賦形薬を受けたコホートよりも小さく、１回及び３回の連日処方に対してそれぞれ３１−８２%及び１１−２３％の範囲で変動する減少を示した；全データは９日目の１日３回群の値を除いて統計的に有意であった。ＭＣＮ＋ＮＴＸの１日１回適用を受けたＤＢ動物はまた賦形薬に露出されたＤＢラットと比べて創傷サイズの減少を有したが、しかし５及び７日目にそれぞれわずか３２％及び４２％の減少を記録した。しかしながら、ＤＢ動物については、１日３回投与したＭＣＮ＋ＮＴＸは一貫して創傷閉鎖を促進し、この群はＭＣＮ＋賦形薬で処置したＤＢラットから１３％〜５７％減少した平均残存創傷を示した。
【００５６】
明白な創傷閉鎖、創傷収縮、及び再上皮化に加えて、治癒に寄与する２つの主要機構（Pietramaggiori et al., Journal of Surgical Research, 160:169-177 (2010); Yannas, Tissue and Organ Regeneration in Adults, New York: Springer (2001)）をＭＣＮ群で８日目に解析した（図５Ｃ）。ＭＣＮ＋賦形薬を受けたＤＢラットはＭＣＮ＋賦形薬で処置した正常ラットよりも８２％大きい開放創を有し、そして創傷収縮率は３８％減少した；しかしながら、再上皮化はこれらの２群間で同程度であった。ＭＣＮ＋ＮＴＸを受けたＤＢラットは、ＭＣＮ＋賦形薬投与正常動物と全パラメータ（即ち、創傷サイズ及び収縮、再上皮化）と類似していたが、ＭＣＮ＋ＮＴＸで処置したＤＢ動物の開放創のサイズ及び創傷収縮はＭＣＮ＋賦形薬で処置したＤＢ動物の半分であった。
【００５７】
創傷閉鎖に対するＮＴＸの効果が特有のタイプの保湿クリーム (即ち Neutrogena)に依存するかを調べるために、幾らかの動物をOlayオイル（ＭＣＯＯ）（Procter & Gamble, Cincinnati, OH）中のＮＴＸで処置した。ＭＣＯＯ＋賦形薬に１日３回露出した正常ラットと比べて、ＭＣＯＯ中での１０-5ＭＮＴＸを受けたそれらのラットは５、７、及び９日目に２４〜６５％小さい残存創傷を有した。ＭＣＯＯ＋ＮＴＸを１日３回受けたＤＢ動物は、５、７、及び９日目にＭＣＯＯ＋賦形薬を受けた対応群よりも３３−８０％小さい創傷を有した。
【００５８】
ＮＴＸの作用が保湿クリームだけに依存したかの問題に取り組むために、正常及びＤＢラットをＫＹＪ中のＮＴＸで１日３回処置した（図６）。ＫＹＪ＋ＮＴＸを受けた正常動物の創傷は、ＫＹＪ＋賦形薬で処置した創傷に対して３及び５日目に１０−１７％小さかった。ＫＹＪ中の賦形薬を受けたＤＢラットと対照的に、ＫＹＪ＋ＮＴＸに１日３回露出されたＤＢ動物は、３、５、７、及び９日目に１５〜６５％小さい創傷を有した。
【００５９】
組織病理
手術後２０日での創傷領域の全体病理をヘマトキシリン／エオジン染色で評価した（図７）。賦形薬又はＮＴＸを受けた正常及びＤＢラット間の上皮の全般構造は類似しているようであった（例えば、壊死細胞の不存在）。しかしながら、正常ラット中の２４．６±１．６μｍの肉芽組織を覆う上皮の幅と比べて、賦形薬を受けたＤＢラットは４４％減少を有した。ＮＴＸで処置した正常動物、並びにＮＴＸを受けたＤＢラットは、賦形薬を受けた正常動物に対して上皮の厚さが異ならなかった。
【００６０】
ＤＮＡ合成
ＤＢマウスでの創傷治癒に対してＮＴＸ作用機構を解明始めるために、そしてＮＴＸは細胞増殖を標的とするという既報（Zagon et al., Journal of Invest Dermatology, 106:490-497 (1996); Zagon et al., Diabetes, 51:3055-3062 (2002); Zagon et al., Journal of Vascular Surgery, 37:636-643 (2003); Blebea et al., Journal of Vascular Surgery, 32:364-373 (2000); Zagon et al., Immunobiology, 216:173-183 (2011); Zagon et al., Immunobiology, 216:579-590 (2011); Wilson et al., Cell Prolif, 33:63-73 (2000)）を踏まえて、賦形薬又はＭＣＮ中の１０-5ＭＮＴＸを１日３回受けた正常及びＤＢラットは創傷後５及び１０日目にＢｒｄＵ標識化を評価し（図８）；創傷部位に隣接した及びその周囲の皮膚を評価した。ＭＣＮ＋ＮＴＸは創傷に隣接した皮膚の基底上皮中のＤＮＡ合成を変化させたが、しかしＤＢ及び正常ラットの両方において周囲領域では変化しなかった。ＤＢラットでは、ＭＣＮ＋ＮＴＸで処置したラットは創傷に隣接した皮膚において、５及び１０日目にそれぞれ標識率において７２％及び３６％増加を有した。正常動物では、賦形薬を受けたコホートと比べて、正常ラットの創傷に隣接した皮膚に位置する標識細胞において、５及び１０日目にそれぞれ３０％及び６９％の増加があった。
【００６１】
実験ＩＩＩ
２型糖尿病及び全身肥満モデルにおいて創傷治癒に対するオピオイドアンタゴニストの効果を研究するために、創傷治癒を野生型とＬｅｐｒdb（ｄｂ／ｄｂともいわれる）変異マウス間で比較した。糖尿病自然突然変異（Ｌｅｐｒdb）にホモ接合性のマウスは、凡そ３〜４週齢の識別可能な肥満となった。血漿インスリンレベルは１０〜１４日目に上昇し始めるようになり、そして血糖レベルは４〜８週に上昇し始めるようになった。これらのマウスは野生型マウスと比べて創傷治癒遅延を示した。
【００６２】
マウスはJackson Laboratoriesから購入し、そして標準実験室管理下に飼育した。８週齢２型糖尿病（ｄｂ／ｄｂ）マウス及び野生型Ｃ５７Ｂｌ／６の体重及び血糖レベルを取得した（図９）。尾静脈血を取りそしてグルコースレベルをTrueTrak 血糖計測器で測定した。値は平均±ＳＥＭを表す；ｎ＝６−１０マウス／処置群。データはｔ検定を用いて解析した；ｐ＜０．００１（***）で野生型と有意差があった。図９に示されるように、８週齢ｄｂ／ｄｂマウスは野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスよりも有意に高い体重及び血糖レベルを有した。
【００６３】
創傷治癒を検討するために、５ｍｍの円形全層皮膚創傷をｄｂ／ｄｂ及び野生型マウスの背部で作製した。Ｄｂ／ｄｂマウスを保湿クリーム（賦形薬）中の１０-5Ｍナルトレキソン（ＮＴＸ）か、又は賦形薬単独で処置し；野生型マウスは賦形薬単独を受けた。適用は１日３回１５日間行った。図１０に見られるように、ｄｂ／ｄｂマウスは、野生型に比べて創傷形成後３、６、及び１３日目に有意に高い百分率残存欠陥を示した。しかしながら、ＮＴＸで処置したｄｂ／ｄｂマウスは、６、１３、及び１５日目にだけ賦形薬で処置したｄｂ／ｄｂマウスに対して創傷治癒における有意な改善を示した。ｐ＜０．０１（＋＋）で野生型賦形薬値と有意差があった。ｐ＜０．０５（*）でｄｂ／ｄｂ野生型賦形薬値と有意差があった。
【００６４】
これらの研究は、局所ＮＴＸ処置が１型糖尿病に加えて２型糖尿病の創傷治癒を改善することを示す。加えて、ｄｂ／ｄｂマウスはまた一般的に肥満のモデルでもあり、この研究は局所オピオイドアンタゴニストが糖尿病者の創傷を処置するためだけでなく、同様に健常者の創傷の処置に対しても有利であることを示す。
【００６５】
考察
ラットが高血糖、体重減少、及び創傷治癒不良などの糖尿病のヒトで認められる代表的な生理的特徴を発現したＴ１Ｄの良く特徴付けられたモデル（Zagon et al., Diabetes, 51:3055-3062 (2002); Klocek et al., Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, 23:89-102 (2007); Havel et al., Diabetes, 49:244-252 (2000)）を用いての、この研究での主要知見は、オピオイドアンタゴニストＮＴＸとインターフェースする内因性オピオイド−オピオイド受容体の破壊が、Ｔ１Ｄ動物、並びに正常（非糖尿病）コホートの皮膚の基底上皮細胞におけるＤＮＡ合成を増加させ得ることである。細胞増殖に対するＮＴＸの効果は、非毒性で、比較的短時間作用型であり、そして濃度（局所適応された１００倍範囲以内で）あるいは投与経路（全身又は局所）に依存しなかった。薬物をもつ担体の下にある細胞はＢｒｄＵ標識が上昇し、しかしＮＴＸ適用から遠い基底上皮細胞はそうではなかったので、局所送達で投与されたＮＴＸは、ＤＮＡ合成に影響を及ぼすように局在化した。
【００６６】
ＮＴＸは純粋なオピオイドアンタゴニストでそして直接生物作用はないので（(Blumberg et al., Agonist and Antagonist Actions of Narcotic Analgesic Drugs, 110-119 (1973); Sawynok et al., Life Science, 25:1621-1632 (1979))、オピオイドペプチド−オピオイド受容体インターフェースの妨害によるＤＮＡ合成のアップレギュレーションは、ヒト及び動物皮膚上皮に存在する１つ又はそれ以上の内因性オピオイド（Zagon et al., Journal of Invest Dermatology, 106:490-497 (1996)）がインタクトであり、そしてＴ１Ｄに関連する病態生理的病状下にＤＮＡ合成の持続的活性レプレッサーとして機能することを示す。幾つかの研究は、Ｔ１Ｄ動物の上皮（例えば、眼球表面）が、正常以下のレベルのＤＮＡ合成を有することを報告している（Zago）etes, 51:3055-3062 (2002)）が、糖尿病動物の皮膚における上皮細胞の基底層は正常ラットと同等のＤＮＡ合成速度を有した点は興味深く、糖尿病の誘導の少なくとも２か月後に細胞複製事象の異常は皮膚において明らかではなかったことを示唆する。
【００６７】
これらの初期の実験に基づいて、発明者らは、Ｔ１Ｄ及びＴ２Ｄ動物の全層皮膚創傷の修復に対するこの薬剤の効果を特性化した。閉鎖速度の評価は、糖尿病動物の創傷が正常動物よりも治癒するのが顕著に遅いこと、及びこれらの担体中に入れる局所ＮＴＸが正常動物と同等のそしてしばしばそれを超えるレベルまで創傷閉鎖の速度を回復させることを示した。糖尿病動物は、正常コホートと比べて創傷収縮を顕著に減少させていたが、しかし、局所ＮＴＸを受けたＴ１Ｄ及びＴ２Ｄ動物は正常被験体と同等であった。局所ＮＴＸを受けた糖尿病動物の閉鎖創傷の構造的外見は正常動物に類似していたことで、創傷修復の増加速度は異常な形態学的事象を伴わないことを示した。ＮＴＸの１日１回の適用はＤＢラットの皮膚創傷閉鎖の速度を増加するのに十分であったが、１日３回の適用はより優れていた。
【００６８】
本明細書に示される局所送達に対するＮＴＸの成功使用は、この薬物が全身的波及を有するかという問題をもたらす。ＮＴＸは、経皮送達で治療的用量に達するのに必要な物理化学的性質を持たないと示唆されている小さな親水性分子である（Wermeling et al., Proc Natl Acad Sci USA, 105:2058-2063 (2008); Stinchcomb et al., Journal of Pharm Science, 91:2571-2578 (2002)）が、しかし受動拡散によって迅速にヒト及び動物細胞に入ることが知られている（Cheng et al., American Journal of Physiology, 297:R844-R852 (2009)）。本明細書に提示された研究は、ＮＴＸが局在性であるが全身作用を持たなかったこと、ＤＮＡ合成は送達部位だけで変化したことを示す。その上、発明者らは、非毒性で、創傷修復に関して極めて有効な非常に低濃度のＮＴＸを用いた。このように、臨床で創傷の処置に対する局所ＮＴＸの適用を考えると、これらの研究は、これが生体適合性、並びに毒性のないこと及び全身作用の点から見て実行可能性があることを示す。加えて、コンプライアンスの問題は、このオピオイドアンタゴニストの局所的効果によって最小化し得る。
【００６９】
オピオイドアンタゴニストが、糖尿病で記録された皮膚創傷治癒の遅延速度を正常動物に回復させることができるという本知見は、Ｔ１Ｄラットの角膜再上皮化に関する既報と幾つかの類似点を有する（Zagon et al., Diabetes, 51:3055-3062 (2002); Klocek et al., Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, 23:89-102 (2007)）。これらは：ｉ）局所及び全身ＮＴＸ送達経路の効果、ｉｉ）ＮＴＸの類似の（例えば、１０-5Ｍ）に対する反応、ｉｉｉ）糖尿病及び正常動物の両方に対して創傷閉鎖速度のＮＴＸ誘導増加、ｉｖ）最適治癒速度を達成するためのＮＴＸの１日複数回適用の必要性、及びｖ）ＮＴＸ作用の主標的としてのＤＮＡ合成を含む。しかしながら、創傷治癒に対するＮＴＸの効果について糖尿病及び正常動物の皮膚と角膜間の幾つかの違いは認められ得る。第１に、角膜創傷治癒は眼球表面上皮に限定され、そして再上皮化に依存している。対照的に、全層皮膚創傷修復は上皮及び実質の両方に関連し、そして収縮は修復で主要な役割を果たす。第２に、角膜においてＮＴＸの担体は抗生物質を含んでいたが、一方で本研究では抗生物質は用いられなかったが、抗生物質及び／又は他の追加成分の封入は本明細書に記載の発明で意図される。両研究は、それがＤＮＡ合成及び創傷治癒に関するとき、オピオイドペプチド−オピオイド受容体相互作用増大がＴ１Ｄに起こることを示し、そしてこのインターフェースの遮断は高血糖環境において皮膚、並びに角膜創傷の修復遅延を逆転させることが示される。
【００７０】
本結果は、オピオイド受容体遮断が、糖尿病で存在するように創傷治癒遅延を正常レベルに逆転させることができることから、内因性オピオイド系は創傷治癒遅延に寄与することを示す。本研究における糖尿病ラットのグルコースレベルはヒトと比べて異常に高いだけでなく、高血糖の期間は３か月間持続し、糖尿病病態の大きさを際立たせた。データは、そのようなコントロール不良糖尿病にもかかわらず、創傷治癒は局所ＮＴＸで修復し得ることを示唆する。この知見は、ＮＴＸの作用が非常に強力な可能性があること、そしてオピオイド受容体相互作用は一貫して高いグルコースレベルを有する動物においてＮＴＸにより破壊されることができるという証拠を提供する。
【００７１】
創傷治癒障害は、Ｔ１Ｄ及びＴ２Ｄの両方における主要合併症である（Guo et al., Journal Dent Res, 89:219-229 (2010); Boulton et al., Lancet, 366:1719-1724 (2005);O'Loughlin et al., International Journal of Lower Extremity Wounds, 9:90-102 (2010); Usui et al., Journal of Histochem Cytochem, 56:687-696 (2008)）。本明細書に記載の研究は、この疾患の主役としてのオピオイドペプチド及びオピオイド受容体を特定することにより、糖尿病の合併症の病因及び病原因子に関するパラダイムシフトを表す。ＮＴＸは、薬物中毒（例えば、薬物乱用、たばこ、ギャンブル）の処置においてはるかに高い投薬量で使用されるＦＤＡ承認薬物であることを認識することが重要である（Kirchmayer et al., Addiction, 97:1241-1249 (2002); Swift, American Journal of HealthSyst Pharm, 64:S12-S22 (2007)）。加えて、進行中の第Ｉ相臨床試験は、糖尿病性角膜症の処置で眼における局所ＮＴＸの安全性を評価しており、そしてこれまでの結果はＮＴＸに毒性がないことを示す。全身効果ではなく局所効果をもつ局所適用における小投薬量のＮＴＸの使用は、疼痛管理にオピオイドを使用している患者に対してもいずれの潜在的有害事象を排除する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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