(57)【要約】  部分的多重ゲノムまたは完全多重ゲノムを有するトウモロコシ植物または植物部位が提供される。また、前記植物または植物部位を作製して使用する方法、及びこれらを含む製造物も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に例示されるような部分的多重ゲノムまたは完全多重ゲノムを有するトウモロコシ植物。
【請求項２】
少なくとも４３本の染色体を有するトウモロコシ植物であって、同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、前記トウモロコシ植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物と少なくとも同じくらいに稔性であるトウモロコシ植物。
【請求項３】
部分的多重ゲノムまたは完全多重ゲノムを有するトウモロコシ植物であって、同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、前記トウモロコシ植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物の種子重量よりも少なくとも１０％大きい種子重量によって特徴づけられるトウモロコシ植物。
【請求項４】
部分的多重ゲノムまたは完全多重ゲノムを有するトウモロコシ植物であって、同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、前記トウモロコシ植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物の総乾燥重量よりも少なくとも３０％大きい総乾燥重量によって特徴づけられるトウモロコシ植物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の植物を親先祖として有するハイブリッド植物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の植物を含む作付け地。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の植物の種子を含む種まき地。
【請求項８】
同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、前記植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物の種子重量よりも少なくとも１０％大きい種子重量を有する、請求項２または４に記載の植物。
【請求項９】
同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、前記植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物の総乾燥重量よりも少なくとも３０％大きい総乾燥重量を有する、請求項２または３に記載の植物。
【請求項１０】
同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、前記植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物のＣＯ２取り込みよりも大きいＣＯ２取り込みを示す、請求項２〜４のいずれかに記載の植物。
【請求項１１】
同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、前記植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物と少なくとも同じくらいに稔性である、請求項３または４に記載の植物。
【請求項１２】
１代目、２代目または３代目のものである、請求項１１に記載の植物。
【請求項１３】
遺伝子非組換えである、請求項１〜４のいずれかに記載の植物。
【請求項１４】
前記稔性が、植物あたりの種子の数；種子結実アッセイ；配偶子稔性アッセイ；およびアセトカルミン花粉染色の少なくとも１つによって決定される、請求項２または１１に記載の植物。
【請求項１５】
３倍体である、請求項１〜５のいずれかに記載の植物。
【請求項１６】
４倍体である、請求項１〜５のいずれかに記載の植物。
【請求項１７】
２倍体トウモロコシまたは４倍体トウモロコシとの交雑繁殖が可能である、請求項１〜４のいずれかに記載の植物。
【請求項１８】
自殖体である、請求項５に記載のハイブリッド植物。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれかに記載の植物の植物部位。
【請求項２０】
種子である、請求項１９に記載の植物部位。
【請求項２１】
請求項１〜５のいずれかに記載の植物または請求項１９もしくは２０に記載の植物部位の加工された製造物。
【請求項２２】
食品、飼料、薬草補助物、飲料、接着剤、建設資材、バイオディーゼルおよびバイオ燃料からなる群から選択される、請求項２１に記載の加工された製造物。
【請求項２３】
前記食品または飼料は、サイレージ、ひき割りトウモロコシ、コーンフレーク、ポレンタおよびポップコーンからなる群から選択される、請求項２２に記載の加工された製造物。
【請求項２４】
請求項１〜５のいずれかに記載の植物または請求項１９もしくは２０に記載の植物部位から製造される粗びき粉。
【請求項２５】
（ａ）請求項１〜５のいずれかに記載の植物の穀粒を収穫すること、および
（ｂ）オイルを前記穀粒から抽出すること
を含む、オイルを製造する方法。
【請求項２６】
前記オイルをバイオディーゼルに加工することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜５のいずれかに記載の植物または請求項１９もしくは２０に記載の植物部位の単離された再生可能な細胞。
【請求項２８】
培養における少なくとも５代の継代にわたるゲノム安定性を示す、請求項２７に記載の細胞。
【請求項２９】
分裂組織、花粉、葉、根、根端、葯、めしべ、花、わら、種子または茎に由来する、請求項２７に記載の細胞。
【請求項３０】
請求項２７〜２９のいずれかに記載の再生可能な細胞を含む組織培養物。
【請求項３１】
請求項１〜５のいずれかに記載の植物を自家繁殖または交雑繁殖することを含む、トウモロコシ種子を産生する方法。
【請求項３２】
植物育種技術を使用してハイブリッド植物を開発する方法であって、請求項１〜４のいずれかに記載の植物を自家繁殖および／または交雑繁殖のための育種材料の供給源として使用することを含む方法。
【請求項３３】
（ａ）請求項１〜５のいずれかに記載の植物または請求項１９もしくは２０に記載の植物部位の穀粒を収穫すること；および
（ｂ）前記穀粒を加工してトウモロコシ粗びき粉を製造すること
を含む、トウモロコシ粗びき粉を製造する方法。
【請求項３４】
部分的多重ゲノムまたは完全多重ゲノムを有するトウモロコシ種子を作製する方法であって、トウモロコシ種子を、一時的に加えられた磁場のもとでＧ２／Ｍ細胞周期阻害剤と接触させ、それにより、部分的多重ゲノムまたは完全多重ゲノムを有するトウモロコシ種子を作製することを含む方法。
【請求項３５】
前記Ｇ２／Ｍ細胞周期阻害剤は微小管重合阻害剤を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記微小管重合阻害剤は、コルヒチン、ノコダゾール、オリザリン、トリフルラリンおよび硫酸ビンブラスチンからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記種子を接触前に超音波処理することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも４３本の染色体を有するトウモロコシ植物の代表的種子のサンプルであって、同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、前記トウモロコシ植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物と少なくとも同じくらいに稔性であり、ブダペスト条約に従ってＮＣＩＭＢにＮＣＩＭＢ４１９７３で寄託されているサンプル。
【請求項３９】
少なくとも４３本の染色体を有するトウモロコシ植物の代表的種子のサンプルであって、同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、前記トウモロコシ植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物と少なくとも同じくらいに稔性であり、ブダペスト条約に従ってＮＣＩＭＢにＮＣＩＭＢ４１９７３で寄託されているサンプル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、部分的多重ゲノムまたは完全多重ゲノムを有するトウモロコシ植物およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）は、コーン（ｃｏｒｎ）またはミエリー（ｍｉｅｌｉｅ／ｍｅａｌｉｅ）としても知られているものであり、先史時代のメソアメリカの先住民によって栽培品種化された穀物である。葉の茂った茎が、カーネル（ｋｅｒｎｅｌ；粒）と呼ばれる種子を含有する穂をもたらす。トウモロコシの粒は専門的には果実であり、しかし、野菜またはデンプンとして調理で使用される。トウモロコシは１０本の染色体を有する（ｎ＝１０）。これらの染色体の合計長さが１５００ｃＭである。トウモロコシ染色体のいくつかは、「染色体瘤」として知られているもの、すなわち、暗く染まる非常に反復性の異質染色質ドメインを有する。個々のこぶがトウモロコシおよびブタモロコシの両方の系統の中で多型である。
【０００３】
トウモロコシは、総生産量の９０パーセント超を占める、合衆国における最も広範囲に生産されている飼料穀物である。およそ８０００万エーカーの土地にトウモロコシが植えられている。この作物の大部分が家畜飼料として使用される；残りが、デンプン、甘味料（例えば、高果糖コーンシロップなど）、トウモロコシ油、および、燃料として使用されるためのエタノールを含めて、多数の食品および工業製品に加工される。
【０００４】
トウモロコシおよびコーンミール（粉砕乾燥トウモロコシ）が世界の多くの地域で主食となっている。トウモロコシが１６世紀にポルトガル人によってアフリカに持ち込まれたが、トウモロコシは現在、アフリカの最も重要な主食作物となっている。トウモロコシの粗びき粉が、トウモロコシパンおよび他の焼き物製造物を作るために小麦粉の代用物として同様に使用される。トウモロコシはデンプンの主要な供給源である。コーンスターチ（トウモロコシ粉）が、家庭の調理において、また、多くの工業化された食品製造物において主要な成分である。トウモロコシはまた、調理油（トウモロコシ油）およびトウモロコシグルテンの主要な供給源である。トウモロコシデンプンは加水分解し、酵素処理して、シロップ（特に、高果糖コーンシロップなど）、甘味料を製造することができ、また、発酵させ、蒸留して、穀物アルコールを製造することもできる。トウモロコシは時には、ビールのためのデンプン源として使用される。合衆国内では、人が消費するためのトウモロコシの使用量が、この国で産出される量の約１／４０を占める。合衆国およびカナダにおいて、トウモロコシはほとんどが、家畜用飼料として、飼い葉、サイレージ（切り刻まれた緑色トウモロコシ茎の発酵によって製造されるもの）または穀物として栽培される。トウモロコシの粗びき粉はまた、いくつかの市販用動物食品製造物の重要な成分である。
【０００５】
古典的育種、遺伝子工学および他の農業慣行を使用してトウモロコシ収量を増大させようとする様々な試みが、この技術分野において広く知られている。
【０００６】
例えば、穀物およびストーバの形態でのバイオマスの生産が従来的には、肥料、殺虫剤および選抜育種の使用によって増大させられてきた。肥料の適用および害虫の排除は、増大したバイオマスをもたらしているが、これらすべての方法の有効性が植物の遺伝子構成によって制限される。逆に、選抜育種は多くの場合、近交弱勢の結果として、生産力、収量および植物サイズにおける低下とともに終わる。
【０００７】
遺伝子改変（ＧＭ）トウモロコシは、２００９年に商用栽培された１１のＧＭ作物のうちの１つである。合衆国およびカナダでは１９９７年から栽培されているが、合衆国のトウモロコシ作物の８５％が２００９年では遺伝子改変型であった。遺伝子改変トウモロコシはまた、ブラジル、アルゼンチン、南アフリカ、カナダ、フィリピン、スペインにおいて、また、より小さい規模ではあるが、チェコ共和国、ポルトガル、エジプトおよびホンジュラスにおいて商用栽培されている。しかしながら、１０年間を超える合衆国における遺伝子操作トウモロコシの使用は、迫り来る食料不足を和らげ得るであろうという様々な主張にもかかわらず、作物収量に対する影響をほとんど有してこなかった。
【０００８】
2014520567.tif 000002
【発明の概要】
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本明細書中に例示されるような部分的多重ゲノムまたは完全多重ゲノムを有するトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物が提供される。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、少なくとも４３本の染色体を有するトウモロコシ植物であって、同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、前記トウモロコシ植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物と少なくとも同じくらいに稔性である前記トウモロコシ植物が提供される。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、部分的多重ゲノムまたは完全多重ゲノムを有するトウモロコシ植物であって、同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、前記トウモロコシ植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物の種子重量よりも少なくとも１０％大きい種子重量によって特徴づけられる前記トウモロコシ植物が提供される。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、部分的多重ゲノムまたは完全多重ゲノムを有するトウモロコシ植物であって、同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、前記トウモロコシ植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物の総乾燥重量よりも少なくとも３０％大きい総乾燥重量によって特徴づけられる前記トウモロコシ植物が提供される。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本発明の植物を親先祖として有するハイブリッド植物が提供される。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本発明の植物を含む作付け地が提供される。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本発明の植物の種子を含む種まき地が提供される。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の植物は、同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、当該植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物の種子重量よりも少なくとも１０％大きい種子重量を有する。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の植物は、同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、当該植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物の総乾燥重量よりも少なくとも３０％大きい総乾燥重量を有する。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の植物は、同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、当該植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物の単位葉面積あたりＣＯ２取り込みよりも大きい単位葉面積あたりＣＯ２取り込みを示す。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の植物は、同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、当該植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物と少なくとも同じくらいに稔性である。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の植物は遺伝子非組換えである。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、稔性が、
植物あたりの種子の数；
種子結実アッセイ；
配偶子稔性アッセイ；および
アセトカルミン花粉染色
の少なくとも１つによって決定される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の植物は３倍体である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の植物は４倍体である。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の植物は、２倍体トウモロコシまたは４倍体トウモロコシとの交雑繁殖が可能である。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の植物は自殖体である。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本発明の植物の植物部位が提供される。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記植物部位は種子または穀粒である。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本発明の植物または植物部位の加工された製造物が提供される。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記加工された製造物は、食品、飼料、薬草補助物、飲料、接着剤、建設資材、バイオディーゼルおよびバイオ燃料からなる群から選択される。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記食品または飼料は、サイレージ、ひき割りトウモロコシ、コーンフレーク、ポレンタおよびポップコーンからなる群から選択される。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本発明の植物または植物部位から製造される粗びき粉が提供される。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、
（ａ）上記植物の穀粒を収穫すること、および
（ｂ）オイルを穀粒から抽出すること
を含む、オイルを製造する方法が提供される。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、オイルをバイオディーゼルに加工することを含む。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本発明の植物または植物部位の単離された再生可能な細胞が提供される。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞は、培養における少なくとも５代の継代にわたるゲノム安定性を示す。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞は、分裂組織、花粉、葉、根、根端、葯、めしべ、花、わら、種子、穀粒または茎に由来する。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、上記再生可能な細胞を含む組織培養物が提供される。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本発明の植物を自家繁殖または交雑繁殖することを含む、トウモロコシ種子を産生する方法が提供される。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、植物育種技術を使用してハイブリッド植物を開発する方法であって、本発明の植物を自家繁殖および／または交雑繁殖のための育種材料の供給源として使用することを含む方法が提供される。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、
（ａ）植物または植物部位の穀粒を収穫すること；および
（ｂ）穀粒を加工してトウモロコシ粗びき粉を製造すること
を含む、トウモロコシ粗びき粉を製造する方法が提供される。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、部分的多重ゲノムまたは完全多重ゲノムを有するトウモロコシ種子を作製する方法であって、トウモロコシ種子を、一時的に加えられた磁場のもとでＧ２／Ｍ細胞周期阻害剤と接触させ、それにより、部分的多重ゲノムまたは完全多重ゲノムを有する前記トウモロコシ種子を作製することを含む方法が提供される。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記Ｇ２／Ｍ細胞周期阻害剤は微小管重合阻害剤を含む。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記微小管重合阻害剤は、コルヒチン、ノコダゾール、オリザリン、トリフルラリンおよび硫酸ビンブラスチンからなる群から選択される。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法は、上記種子を接触前に超音波処理することを含む。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、少なくとも４３本の染色体を有するトウモロコシ植物の代表的種子のサンプルであって、同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、前記トウモロコシ植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物と少なくとも同じくらいに稔性であり、ブダペスト条約に従ってＮＣＩＭＢにＮＣＩＭＢ４１９７３で寄託されているサンプルが提供される。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、少なくとも４３本の染色体を有するトウモロコシ植物の代表的種子のサンプルであって、同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、前記トウモロコシ植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物と少なくとも同じくらいに稔性であるトウモロコシ植物のサンプルが提供され、ただし、少なくとも４３本の染色体を有するトウモロコシ植物の前記サンプルはブダペスト条約に従ってＮＣＩＭＢにＮＣＩＭＢ４１９７３で寄託されている。
【００４５】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない
【図面の簡単な説明】
【００４６】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００４７】
【図１】図１は、示された２倍体ハイブリッドおよび３倍体ハイブリッドの１０００個種子重量（ｇｒ）、ならびに、雌性２倍体親の１０００個種子重量（ｇｒ）を示す棒グラフである。
【００４８】
【図２】図２は、本発明のいくつかの実施形態の２倍体トウモロコシ（ＥＸＰＭ１００）および３倍体トウモロコシ（ＥＸＰＭ１０４）における累積光合成を示すグラフである。
【００４９】
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の教示に従って生じさせたトウモロコシ種子の画像である。図３Ａは、雄性２倍体親の種子、および、この２倍体雄性体のゲノム多重化によって生じさせた４倍体雄性体の種子を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明の教示に従って生じさせたトウモロコシ種子の画像である。図３Ｂは２倍体ハイブリッドおよび３倍体ハイブリッドの種子を示す。
【００５０】
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ〜図４Ｂは、示された２倍体ハイブリッドおよび３倍体ハイブリッドならびに雌性２倍体親の１０００個種子重量（ｇｒ）を示すグラフである。
【００５１】
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａ〜図５Ｂは、本発明の教示に従って生じさせたトウモロコシ種子を示すグラフである。
【００５２】
【図６】図６は、本発明のいくつかの実施形態の２倍体トウモロコシおよび４倍体トウモロコシにおける累積光合成を示すグラフである。
【００５３】
【図７Ａ】図７Ａは、ハイブリッド２倍体トウモロコシおよびハイブリッド３倍体トウモロコシの種子の画像である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ハイブリッド２倍体トウモロコシおよびハイブリッド３倍体トウモロコシの種子の画像である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ハイブリッド２倍体トウモロコシおよびハイブリッド３倍体トウモロコシの種子の画像である。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ハイブリッド２倍体トウモロコシおよびハイブリッド３倍体トウモロコシの種子の画像である。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、部分的多重ゲノムまたは完全多重ゲノムを有するトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物およびその使用に関する。
【００５５】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。また、本明細書中において用いられる表現法および用語法は説明のためであって、限定として見なされるべきでないことを理解しなければならない。
【００５６】
トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．）およびコーンミール（粉砕乾燥トウモロコシ）が世界の多くの地域で主食となっている。世界の人口が幾何級数的に増大し続けるので、大きな圧力が、植物収量を増大させることに置かれている。
【００５７】
選抜育種が、植物における農学的および経済的に重要な表現型形質（例えば、収量、穀物油割合など）を改善するために、または改善することを試みるために何世紀にもわたって用いられている。一般的に言えば、選抜育種は、目的とする１つまたは複数の表現型形質に基づいて次世代の親として役立つための個体を選択することを伴う。しかしながら、そのような表現型選抜はしばしば、目的とするそのような表現型（１つまたは複数）に影響し得る非遺伝的要因によって複雑になる。同様に、作物収量を遺伝子工学によって増大させようとする様々な試みはほんのわずかな成功をもたらしただけであった。
【００５８】
本発明者らは今回、ゲノム的に安定であり、かつ、稔性である植物をもたらす、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）における誘導されたゲノム多重化のための新規な手順を設計した。多倍数体植物（例えば、４倍体および３倍体）は、望ましくないゲノム変異を有しておらず、また、２倍体ゲノムを有する同質遺伝子型祖先植物のものよりも大きい成長力および大きい総植物収量によって特徴づけられる（表５（下記）を参照のこと）。これらの新しい形質が、より良好な気候順応性、ならびに、生物的ストレスおよび非生物的ストレスに対するより大きい耐性に寄与しているかもしれない。さらに、本発明の誘導された多倍数体植物を使用して花粉不稔化によって生じさせられるハイブリッドトウモロコシ種子（または、本明細書中では交換可能に使用されるような穀粒）は、世界的なトウモロコシ収量を雑種強勢による発現のために数十パーセント増大させるかもしれない。加えて、本発明のいくつかの実施形態の多倍数体植物は、ゲノム多重化後のすでに初期世代（例えば、１代目、２代目、３代目または４代目）に由来する同質遺伝子型の２倍体祖先植物の稔性に対して同程度の稔性またはより良好な稔性を示し、このことは、稔性を改善するためのさらなる育種を不要にしている。
【００５９】
したがって、本発明の１つの局面によれば、少なくとも４３本の染色体を有するトウモロコシ植物であって、同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、前記トウモロコシ植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物と少なくとも同じくらいに稔性である前記トウモロコシ植物が提供される。
【００６０】
さらなる局面または代替となる局面によれば、部分的多重ゲノムまたは完全多重ゲノムを有する植物であって、同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、前記植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物の種子重量よりも少なくとも１０％大きい種子重量によって特徴づけられる前記植物が提供される。
【００６１】
さらなる局面または代替となる局面によれば、部分的多重ゲノムまたは完全多重ゲノムを有するトウモロコシ植物であって、同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、前記トウモロコシ植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物の総乾燥重量よりも少なくとも３０％大きい総乾燥重量によって特徴づけられる前記トウモロコシ植物が提供される。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、用語「トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物」は、人間または動物の食物または飲料物のために、あるいは、原料、食品補充物または化学品の供給源として従来的に栽培されるトウモロコシを示す。トウモロコシ植物は自然界では２倍体である（２Ｎ＝２０）。
【００６３】
数多くの市販品種が入手可能であり、これらには、下記の品種が含まれるが、それらに限定されない：
Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ｖａｒ．ａｍｙｌａｃｅａ（これは典型的には、コーンフラワーを生産するために使用される）
Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ｖａｒ．ｅｖｅｒｔａ（これは典型的には、ポップコーンを製造するために使用される）
Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ｖａｒ．ｉｎｄｅｎｔａｔａ（デントコーン）
Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ｖａｒ．ｉｎｄｕｒａｔａ（フリントコーン）
Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ｖａｒ．ｓａｃｃｈａｒａｔａおよびＺｅａ  ｍａｙｓ  ｖａｒ．ｒｕｇｏｓａ（スィートコーン）
Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ｖａｒ．ｃｅｒａｔｉｎａ（ワキシーコーン）
Ｚｅａ  ｍａｙｓ（アミロトウモロコシ）
Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ｖａｒ．ｔｕｎｉｃａｔａ  Ｌａｒｒａｎａｇａ  ｅｘ  Ａ．Ｓｔ．Ｈｉｌ（ポッドコーン）
Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ｖａｒ．ｊａｐｏｎｉｃａ（ストライプドトウモロコシ）
【００６４】
「植物」は、植物全体またはその一部（例えば、種子、トウモロコシの実を取った後の茎や葉（例えば、茎、わら、葉）、組織など）、加工物または非加工物（例えば、種子、粗びき粉、茎、乾燥組織、ケーキ、油など）、再生可能な組織培養物またはそれから単離される細胞を示す。いくつかの実施形態によれば、植物の用語はまた、本明細書中で使用される場合、本明細書中下記においてさらに定義および説明されるように、誘導された多倍数体植物の１つをその先祖の少なくとも１つとして有するハイブリッドを示す。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、「部分的多重ゲノムまたは完全多重ゲノム」は、少なくとも１つの染色体の付加、部分的染色体セット（＜１０）の付加、染色体セット（Ｎ＝１０）の付加、または、４倍体植物（４Ｎ）またはそれ以上の植物を生じさせるゲノムの完全な多重化を示す。
【００６６】
１つの具体的な実施形態によれば、多倍数体植物は３Ｎである。
【００６７】
１つの具体的な実施形態によれば、多倍数体植物は４Ｎである。
【００６８】
１つの具体的な実施形態によれば、多倍数体植物は５Ｎである。
【００６９】
１つの具体的な実施形態によれば、多倍数体植物は６Ｎである。
【００７０】
１つの具体的な実施形態によれば、多倍数体植物は７Ｎである。
【００７１】
１つの具体的な実施形態によれば、多倍数体植物は８Ｎである。
【００７２】
１つの具体的な実施形態によれば、多倍数体植物は９Ｎである。
【００７３】
１つの具体的な実施形態によれば、多倍数体植物は１０Ｎである。
【００７４】
１つの具体的な実施形態によれば、多倍数体植物は１１Ｎである。
【００７５】
１つの具体的な実施形態によれば、多倍数体植物は１２Ｎである。
【００７６】
１つの具体的な実施形態によれば、誘導された多倍数体植物は、ゲノム多重のハプロイド植物でない。
【００７７】
述べられたように、多重化により、不完全な染色体セット（＜１Ｎ）の付加、または、代わりに、不完全に多重化された染色体セットの付加が生じ得る。
【００７８】
したがって、１つの具体的な実施形態によれば、本発明の多倍数体植物は、少なくとも４３本の染色体を含む。
【００７９】
述べられたように、多倍数体植物は、同じ（同一の）発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、前記多倍数体植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ；Ｎ＝２０）植物と少なくとも同じくらいに稔性である。
【００８０】
本明細書中で使用される場合、用語「稔性」は、有性生殖することができることを示す。稔性は、この技術分野で広く知られている様々な方法を使用してアッセイすることができる。代替において、稔性は、種子を結実することができることとして定義される。下記のパラメーターが、稔性を明らかにするためにアッセイされる場合がある：種子（穀粒）の数；種子結実アッセイ、配偶子の稔性が、スクロース基材上などでの花粉発芽によって明らかにされる場合がある；および、代替において、または、加えて、稔性の花粉が染色されるアセトカルミン染色。
【００８１】
述べられたように、本発明のいくつかの実施形態の多倍数体植物は、ゲノム多重化後のすでに初期世代（例えば、１代目、２代目、３代目または４代目）に由来する同質遺伝子型の２倍体祖先植物の稔性に対して同程度の稔性（例えば、＋／−約１０％または２０％）を示し、このことは、さらなる育種を不要にしている。
【００８２】
本明細書中で使用される場合、用語「安定な」または用語「ゲノム安定性」は、数世代を通して変わらないままであり、一方、植物が、下記パラメーター：収量、稔性、バイオマス、成長力のうちの少なくとも１つにおける実質的な低下を示さない、染色体または染色体複製体の数を示す。１つの具体的な実施形態によれば、安定性が、典型的な子孫を生じさせ、これにより、多様性を強健に、かつ、一貫して保つこととして定義される。
【００８３】
本発明の１つの実施形態によれば、ゲノム多重植物は、起源植物に対して、すなわち、２倍体トウモロコシに対して同質遺伝子型である。ゲノム多重植物は、量においてではなく、質において２倍体植物と実質的に同じゲノム組成を有する。
【００８４】
１つの具体的な実施形態によれば、植物（またはそれに由来する細胞培養物）は、少なくとも２代、３代、５代、１０代またはそれ以上の培養継代または世代にわたるゲノム安定性を示す。本発明のいくつかの実施形態によれば、成熟したゲノム多重植物は、同じ条件のもとで成長し、かつ同じ発達段階であるその同質遺伝子型２倍体祖先と少なくともほぼ同じ（＋／−１０％）数の種子を有する；代替において、または、加えて、ゲノム多重植物は、アセトカルミンによって染色される少なくとも９０％の稔性花粉を有する；代替において、または、加えて、種子の少なくとも９０％がスクロース上で発芽する。
【００８５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、多倍数体植物は、同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、前記多倍数体植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ植物の種子重量よりも少なくとも７％大きい、１０％大きい、２０％大きい、３０％大きい、４０％大きい、５０％大きい、６０％大きい、７０％大きい、８０％大きい、９０％大きい、１００％大きい、１２０％大きい、１５０％大きい、または、２００％大きい種子重量を有する。
【００８６】
種子重量は一定量の種子（例えば、１０００個）について測定することができ、または、ただ１個の種子あたりについて測定することができる。
【００８７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、多倍数体植物は、同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、前記多倍数体植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ植物の総乾燥重量よりも少なくとも２０％大きい、２５％大きい、３０％大きい、４０％大きい、５０％大きい、６０％大きい、７０％大きい、８０％大きい、９０％大きい、１００％大きい、１２０％大きい、１５０％大きい、または、２００％大きい総乾燥重量を有する。
【００８８】
乾燥重量は植物成長の尺度として使用される。植物が土壌から抜かれ、どのような土であれ、緩く付着する土が洗い落とされる。植物は、低熱（例えば、１００℃）に設定されるオーブンで一晩乾燥される。植物は乾燥環境において冷やされ、その後、重量測定される。
【００８９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、多倍数体植物は、同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、前記多倍数体植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ植物の（単位葉面積あたり）ＣＯ２取り込みよりも大きい（単位葉面積あたり）ＣＯ２取り込みを示す（下記の実施例の節に記載されるＣＯ２取り込みアッセイによって求められる場合、１０％大きい、２０％大きい、５０％大きい、７０％大きいまたはそれ以上である（単位葉面積あたり）ＣＯ２取り込みを示す）。ＣＯ２取り込みを植物成長速度の尺度として測定する様々な方法がこの技術分野において知られており、下記の実施例の節に記載される。
【００９０】
本発明のゲノム多重植物の形質（例えば、稔性、収量、バイオマスおよび成長力）を特徴づけるために行われる比較アッセイが典型的には、その同質遺伝子型祖先（以降、「２倍体祖先植物」）との比較において、両者が、同じ発達段階のものであり、かつ、両者が、同じ生育条件のもとで成長させられるときに行われる。
【００９１】
１つの具体的な実施形態によれば、ゲノム多重植物は、同じ発達段階であり、かつ、同じ生育条件のもとで成長させられる２倍体トウモロコシ同質遺伝子型祖先植物の穀粒タンパク質含有量と少なくとも類似するような穀粒タンパク質含有量によって特徴づけられる。１つの具体的な実施形態によれば、穀粒タンパク質含有量が、同じ発達段階であり、かつ、同じ生育条件のもとで成長させられる同質遺伝子型祖先植物の穀粒タンパク質含有量の約０％〜２０％で増減する。
【００９２】
１つの具体的な実施形態によれば、ゲノム多重植物は、同じ発達段階であり、かつ、同じ生育条件のもとで成長させられる２倍体トウモロコシ同質遺伝子型祖先植物の生育面積あたり穀粒収量と少なくとも類似するような生育面積あたり穀粒収量によって特徴づけられる。１つの具体的な実施形態によれば、生育面積あたり穀粒収量が、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％またはそれ以上でさえも、８０％、９０％、１００％、２００％、２５０％、３００％、４００％または５００％多くなる。１つの具体的な実施形態によれば、生育面積あたり穀粒収量が、同じ発達段階であり、かつ、同じ生育条件のもとで成長させられる同質遺伝子型祖先植物の生育面積あたり穀粒収量よりも０．１倍〜５倍、０．３倍〜５倍、０．４倍〜２．５倍、１倍〜５倍、２倍〜３倍、または、２倍〜２．５倍大きくなる。
【００９３】
１つの具体的な実施形態によれば、ゲノム多重植物は、同じ発達段階であり、かつ、同じ生育条件のもとで成長させられる２倍体トウモロコシ同質遺伝子型祖先植物の植物あたり穀粒収量と少なくとも類似するような植物あたり穀粒収量によって特徴づけられる。１つの具体的な実施形態によれば、植物あたり穀粒収量が、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％またはそれ以上でさえも、８０％、９０％、１００％、２００％、２５０％、３００％、４００％または５００％多くなる。１つの具体的な実施形態によれば、植物あたり総穀粒収量が、同じ発達段階であり、かつ、同じ生育条件のもとで成長させられる同質遺伝子型祖先植物の植物あたり総穀粒収量よりも０．１倍〜５倍、０．３倍〜５倍、０．４倍〜２．５倍、１倍〜５倍、２倍〜３倍、または、２倍〜２．５倍大きくなる。
【００９４】
本発明の植物は、当該植物に対して同質遺伝子型である２倍体植物よりも大きいバイオマス、収量、穀粒収量、生育面積あたり穀粒収量、穀粒タンパク質含有量、穀粒重量、ストーバ収量、種子結実、染色体数、ゲノム組成、油分割合、成長力、虫害抵抗性、殺虫剤抵抗性、干ばつ耐性および非生物的ストレス耐性の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはすべてによって特徴づけられる。
【００９５】
１つの具体的な実施形態によれば、本明細書中に例示されるような部分的多重ゲノムまたは完全多重ゲノムを有するトウモロコシ植物が提供される。
【００９６】
１つの具体的な実施形態によれば、植物は、本明細書中に例示されるような多倍数体である。
【００９７】
したがって、１つの実施形態によれば、４倍体植物は、Ｚ１−２０１１系２倍体を同質遺伝子型の祖先体として有するＺ１（１３）−２０１１またはＺ１（１２）−２０１１である。
【００９８】
本発明の教示を使用して、本発明者らは、誘導された多倍数体である数多くの植物品種を生じさせることができた。したがって、１つの具体的な実施形態によれば、少なくとも４３本の染色体を有するトウモロコシ植物の代表的種子のサンプルであって、同じ発達段階であるとき、かつ、同じ条件のもとで成長したとき、前記トウモロコシ植物に対して同質遺伝子型である２倍体トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ）植物と少なくとも同じくらいに稔性であり、ブダペスト条約に従って、ＮＣＩＭＢにＮＣＩＭＢ４１９７３で２０１２年５月１８日に寄託されているサンプルが提供される。
【００９９】
Ｚ１（１３）−２０１１またはＺ１（１２）−２０１１のハイブリッド３倍体もまた提供され、ただし、この場合、雌性親がＮ２−２０１１である。したがって、ハイブリッド３倍体のＨＦ１コードＥＸＰＭ１０４は、親の雄性４倍体として、Ｚ１（１３）−２０１１を有する；ハイブリッド３倍体のＨＦ１コードＥＸＰＭ１１０は、親の雄性４倍体として、Ｚ１（１２）−２０１１を有する。
【０１００】
別の実施形態によれば、４倍体植物は、Ｚ５−２０１１系２倍体を同質遺伝子型の祖先体として有するＺ５（６）−２０１１またはＺ５（８）−２０１１である。
【０１０１】
Ｚ５（６）−２０１１またはＺ５（８）−２０１１のハイブリッド３倍体もまた提供され、ただし、この場合、雌性親がＮ２−２０１１である。
【０１０２】
したがって、ハイブリッド３倍体のＨＦ１コードＥＸＰＭ２０８は、親の雄性４倍体として、Ｚ５（６）−２０１１を有する；ハイブリッド３倍体のＨＦ１コードＥＸＰＭ２１１は、親の雄性４倍体として、Ｚ５（８）−２０１１を有する。
【０１０３】
別の実施形態によれば、４倍体植物は、Ｚ５−２０１１系２倍体を同質遺伝子型の祖先体として有するＺ５（３９）−２０１１、Ｚ５（２２）−２０１１、Ｚ５（８）−２０１１またはＺ５（３１）−２０１１である。
【０１０４】
Ｚ５（３９）−２０１１、Ｚ５（２２）−２０１１、Ｚ５（８）−２０１１またはＺ５（３１）−２０１１のハイブリッド３倍体もまた提供され、ただし、この場合、雌性親がＮ５−２０１１である。
【０１０５】
したがって、ハイブリッド３倍体のＨＦ１コードＥＸＰＭ３０３は、親の雄性４倍体として、Ｚ５（３９）−２０１１を有する；ハイブリッド３倍体のＨＦ１コードＥＸＰＭ３０７は、親の雄性４倍体として、Ｚ５（２２）−２０１１を有する；ハイブリッド３倍体のＨＦ１コードＥＸＰＭ３０９は、親の雄性４倍体として、Ｚ５（８）−２０１１を有する；ハイブリッド３倍体のＨＦ１コードＥＸＰＭ３１０は、親の雄性４倍体として、Ｚ５（３１）−２０１１を有する。
【０１０６】
１つの具体的な実施形態によれば、植物は遺伝子非組換えである。
【０１０７】
別の実施形態によれば、植物は、例えば、本明細書中下記においてさらに記載されるように、栽培のための害虫抵抗性または形態学的形質を与える異種遺伝子を発現させることによって遺伝子組換えである。
【０１０８】
本発明のゲノム多重植物種子を、下記で記載されるように、コルヒチン処理の改善された方法を使用して作製することができる。
【０１０９】
したがって、本発明の１つの局面によれば、部分的多重ゲノムまたは完全多重ゲノムを有するトウモロコシ種子を作製する方法であって、トウモロコシ種子を、一時的に加えられた磁場のもとでＧ２／Ｍ細胞周期阻害剤と接触させ、それにより、部分的多重ゲノムまたは完全多重ゲノムを有する前記トウモロコシ種子を作製することを含む方法が提供される。
【０１１０】
典型的には、Ｇ２／Ｍ周期阻害剤は微小管重合阻害剤を含む。
【０１１１】
微小管周期阻害剤の例には、コルヒチン、コルセミド、トリフルラリン、オリザリン、ベンゾイミダゾールカルバマート類（例えば、ノコダゾール、オンコダゾール、メベンダゾール、Ｒ１７９３４、ＭＢＣ）、ｏ−イソプロピルＮ−フェニルカルバマート、クロロイソプロピルＮ−フェニルカルバマート、アミプロホスメチル、タキソール、ビンブラスチン、グリセオフルビン、カフェイン、ビス−ＡＮＳ、メイタンシン、ビンブラスチン、硫酸ビンブラスチンおよびポドフィロトキシンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１２】
Ｇ２／Ｍ阻害剤が、さらなる有効成分（例えば、酸化防止剤、界面活性剤およびヒストンなど）を含む場合がある処理溶液に含まれる。
【０１１３】
種子を、Ｇ２／Ｍ周期阻害剤を含む処理溶液により処理しながら、植物はさらに、少なくとも７００ガウス（例えば、１３５０ガウス）の磁場に約２時間にわたって供される。種子は磁場チャンバ（例えば、実施例１に記載される磁場チャンバなど）に置かれる。示された時間の後で、種子が磁場から取り出される。
【０１１４】
処理溶液に対する種子の浸透性を改善するために、種子はＧ２／Ｍ周期阻害剤との接触の前に超音波処理（例えば、４０ｋＨｚで１０分〜２０分）に供される。
【０１１５】
湿った種子が処理に対してより良好に応答する場合があり、したがって、種子は処理開始時に水溶液（例えば、蒸留水）に浸されることができる。
【０１１６】
１つの具体的な実施形態によれば、処理の全工程が、暗所において、室温（約２３℃〜２６℃）またはより低い温度（例えば、超音波（ＵＳ）段階については）で行われる。
【０１１７】
したがって、１つの具体的な実施形態によれば、種子が室温で水に浸され、その後、蒸留水におけるＵＳ処理に供される。
【０１１８】
浸透すると、種子は、処理溶液を含有する容器に置かれ、磁場が照射される。Ｇ２／Ｍ周期阻害剤濃度の例示的範囲が下記の表１に提供される。処理溶液はさらに、ＤＭＳＯ、界面活性剤、酸化防止剤およびヒストンを下記に列挙される濃度で含む場合がある。
【０１１９】
種子が磁場から取り出されると、種子は、Ｇ２／Ｍ周期阻害剤による２回目の処理に供される。最後に、種子は洗浄され、適切な生育苗床に播種される。必要な場合には、実生がＡｃａｄａｉｎ（商標）（Ａｃａｄｉａｎ  ＡｇｒｉＴｅｃｈ）およびＧｉｂｅｒｌｌｏｎの存在下で成長させられる（後者は、Ｇ２／Ｍ周期阻害剤としてビンブラスチンにより処理されるときに使用される）。
【０１２０】
上記方法は、植物全体または植物部位（例えば、本明細書中に記載される植物部位など）に対して実行される場合があり、必ずしも種子に限定されなくてもよいことが理解されるであろう。
【０１２１】
上記教示を使用して、本発明者らはゲノム多重トウモロコシ植物を樹立している。
【０１２２】
樹立されると、本発明の植物は有性繁殖させることができ、または、組織培養技術を使用することなどによって無性繁殖させることができる。
【０１２３】
本明細書中で使用される場合、表現「組織培養物」は、トウモロコシを生じさせることができる植物細胞または植物部位を示し、これには、植物プロトプラスト、植物カルス、植物凝集塊、ならびに、植物において無傷である植物細胞、または、植物の一部分、例えば、種子、葉、茎、わら、花粉、根、根端、葯、胚珠、花弁、花、胚、繊維およびさくなどが含まれる。
【０１２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養細胞は、培養における少なくとも２代、３代、４代、５代、７代、９代または１０代の継代にわたるゲノム安定性を示す。
【０１２５】
植物組織培養物を作製する方法および植物を組織培養物から再生させる技術がこの技術分野では広く知られている。例えば、そのような技術が下記によって示される：Ｖａｓｉｌ、１９８４、Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ、第Ｉ巻、第ＩＩ巻、第ＩＩＩ巻、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｇｒｅｅｎ他、１９８７、Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ、１９８９、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇｅｌｖｉｎ他、１９９０、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｅｖａｎｓ他、１９８３、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、ＭａｃＭｉｌｌｉａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＫｌｅｅ他、１９８７、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．、３８：４６７〜４８６。
【０１２６】
組織培養物を、種子、葉、茎、花粉、根、根端、葯、胚珠、花弁、花および胚からなる群から選択される組織の細胞またはプロトプラストから作製することができる。
【０１２７】
本発明の植物はまた、本発明のトウモロコシ植物の特徴の少なくともいくつかを示す新規な植物または植物系統を作製するために、他のトウモロコシ植物と一緒に植物育種（すなわち、自家繁殖または交雑繁殖）において使用され得ることが理解されるであろう。
【０１２８】
これらのいずれかを別の植物と交雑することから生じる植物を、本発明のゲノム多重植物の特徴および何らかの他の所望される形質を示すさらなる栽培品種を作製するために、系統育種、形質転換および／または戻し交雑において利用することができる。この技術分野で広く知られている分子的手順または生化学的手順を用いるスクリーニング技術を、求められる重要な商業的特徴がそれぞれの育種世代において保たれることを保証するために使用することができる。
【０１２９】
戻し交雑の目標は、反復親系統におけるただ１つの形質または特徴を変化させるか、または置き換えることである。このことを達成するために、反復親系統のただ１つの遺伝子が、所望される遺伝子の残りの本質的にすべてを保持しながら、したがって、最初の系統の所望される生理学的構成および形態学的構成を保持しながら、非反復系統に由来する所望される遺伝子により置換されるか、または補われる。具体的な非反復親の選定は戻し交雑の目的に依存するであろう。主要な目的の１つが、何らかの商業的に望ましい農学的に重要な形質を植物に加えることである。正確な戻し交雑プロトコルは、適切な試験プロトコルを決定するためにその都度変化させられるか、または加えられる特徴または形質に依存するであろう。戻し交雑法は、移されている特徴が優性対立遺伝子であるときには簡略化されるが、劣性対立遺伝子もまた移される場合がある。この場合には、所望される特徴が首尾よく移されたかを明らかにするために子孫の試験を導入することが必要であるかもしれない。同様に、導入遺伝子を、下記のような当業者に広く知られている様々な確立された形質転換法のいずれかを使用して植物に導入することができる：Ｇｒｅｓｓｅｌ、１９８５、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ  Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｃｒｏｐｓ：Ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｔ  Ｒｅａｌｉｔｉｅｓ、Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｆｏｒｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ、Ｌ  ｖａｎ  Ｖｌｏｔｅｎ−Ｄｏｔｉｎｇ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈｕｆｔｎｅｒ，Ｓ．Ｌ．他、１９９２、Ｒｅｖｉｓｉｎｇ  Ｏｖｅｒｓｉｇｈｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｌａｎｔｓ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｋｌｅｅ，Ｈ．他、１９８９、Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ：Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ；およびＫｏｎｃｚ，Ｃ．他、１９８６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。
【０１３０】
自殖を、この技術分野において広く知られている様々な技術を使用することによって行うことができる。典型的には、種子が回収され、植えられる。その後、生じた植物が、求められている形質（１つまたは複数）について評価され、所望される形質を有する植物が再び自家受粉され、種子が集められ、植えられる。このプロセスが、所望される形質を有する自殖系統が次々と開発されるまで十分な数の世代にわたって繰り返される。そのような自殖系統は、ハイブリッド４倍体トウモロコシまたはハイブリッド３倍体トウモロコシを作製するために使用される。
【０１３１】
本発明の植物またはハイブリッド植物は、目的とする形質を導入するなどのために、例えば、ストレス（例えば、生物的または非生物的）に対する高まった抵抗性などを導入するために遺伝子改変され得ることが理解されるであろう。
【０１３２】
したがって、本発明は、新規なゲノム多重植物およびゲノム多重栽培品種、ならびに、それらを作製するための種子および組織培養物を提供する。
【０１３３】
本発明の植物は自家繁殖させることができ、あるいは、２倍体もしくは４倍体のトウモロコシ、または、様々な倍数体のトウモロコシ（例えば、本明細書中に記載されるような誘導された高倍数性トウモロコシ）、または、他のトウモロコシ種と交雑繁殖させることができる。
【０１３４】
したがって、本発明ではさらに、本明細書中に記載されるようなゲノム多重植物を親先祖として有するハイブリッド植物が規定される。ハイブリッド３倍体の例は、上記の説明、および以下の実施例の欄において与えられる。
【０１３５】
１つの具体的な実施形態によれば、本発明では、本発明の多倍数体トウモロコシを親先祖として有するハイブリッド植物が規定される。
【０１３６】
本発明ではさらに、本発明の植物またはハイブリッド植物の種子を少なくとも１０％、２０％、５０％または１００％（たとえば、１０％〜１００％）含む種子袋が規定される。
【０１３７】
本発明ではさらに、本発明の植物またはハイブリッド植物のいずれかを含む作付け地が規定される。
【０１３８】
本発明ではさらに、本発明の植物またはハイブリッド植物の種子のいずれかを含む種まき地が規定される。
【０１３９】
本発明ではさらに、本発明の植物またはその一部分の製造物および加工製造物が意図される。
【０１４０】
本明細書中で使用される場合、「加工製造物」は、機械的変化または化学的変化を受けている本発明のトウモロコシ植物またはその一部分を示す。
【０１４１】
加工製造物の例には、食品、飼料、薬草補助物、飲料物、化学品、建設材料、バイオディーゼルおよびバイオ燃料が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４２】
１つの具体的な実施形態によれば、製造物は、多重化について定性的に評価することができる植物の細胞またはその成分（例えば、ＤＮＡなど）を含む。
【０１４３】
非限定的な列挙を構成する下記の製造物または使用のどれもが、本発明の教示によって意図される。コーンフラワー、デンプン、粗びき粉およびその製造物（例えば、ポレンタ）、ポップコーン、ひき割りトウモロコシ、サイレージ、アルコール飲料。動物用飼料、ベーキングスナック食品、非アルコール性飲料、建築資材、缶詰用物／パッカー（ｃａｎｎｅｒｓ／ｐａｃｋｅｒｓ）、シリアル、化学品。調味料、菓子類、油脂、配合乳製品、燃料アルコール、家庭用必要品、アイスクリーム、冷凍デザート、ジャム、ゼリー砂糖煮、肉製品、紙および関連製品、シロップおよび甘味料、織物（衣類、敷物類、寝具）、タバコ、ポリマー複合材（ＨａｒｖｅｓｔＦｏｒｍ（商標））、堆肥可能プラスチック、プラスチックフォーム、不凍剤、医薬品、組換え発現のための宿主システム（例えば、ワクチン、酵素、細胞外マトリックスタンパク質）。
【０１４４】
本発明ではまた、加工製造物または製造物を製造する方法が意図される。
【０１４５】
例えば、
（ａ）本発明の植物の穀粒を収穫すること；および
（ｂ）トウモロコシ粗びき粉を製造するように穀粒を加工すること
を含む、トウモロコシ粗びき粉を製造する方法が提供される。
【０１４６】
代替的に、
（ａ）本発明の植物の穀粒を収穫すること、および
（ｂ）オイルを穀粒から抽出すること
を含む、オイルを製造する方法が提供される。
【０１４７】
本出願から成熟する特許の存続期間の期間中には、多くの関連する製造物が開発されることが予想され、加工された製造物の用語の範囲は、すべてのそのような新しい技術を先験的に包含することが意図される。
【０１４８】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０１４９】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０１５０】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０１５１】
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
【０１５２】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０１５３】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０１５４】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０１５５】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０１５６】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０１５７】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０１５８】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１５９】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａ��ｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１６０】
実施例１
多倍数体トウモロコシの作製
実験手順
すべての段階を暗所で行った。
【０１６１】
種子を、水で満たされた容器において約２５℃で約２時間浸した。
【０１６２】
種子を清浄な網袋に移し、蒸留水が満たされた超音波槽の中に約２３℃〜約２６℃で置いた。超音波（約４０ｋＨｚ）を約５分間〜約２０分間加えた。温度を２６℃未満で保った。種子の袋を、（下記で記載される）処理溶液を含有する容器の中に約２５℃で入れた。容器を（下記で記載される）磁場チャンバの中に置き、約２時間インキュベーションした。種子を袋から取り出し、プラスチックトレーの上の紙タオル層の上に置いた。処理溶液で浸された紙タオルの第２の層をカバーとして使用した。種子を約２５℃で約１２時間〜約４８時間インキュベーションし、全インキュベーション期間にわたって湿ったままにしておいた。種子を清浄な容器の中に集め、水（ｐＨ＝７）により洗浄した。２５ｐｐｍの２０：２０：２０微量元素肥料が補充された土壌の実生用トレーを準備した。処理された種子をトレーに播種し、約２０℃〜約２５℃の日中温度範囲、約１０℃〜約１７℃の夜間範囲および約４０％の最小湿度を使用する育成場に移動させた。
【０１６３】
ビンブラスチンを使用するときには、播種直後に０．５％〜１．５％のＧＩＢＥＲＬＬＯＮを加えた。ＡＣＡＤＩＮ（商標）（Ａｃａｄｉａｎ、ＡｇｒｉＴｅｃｈ）により、その後３週間にわたって週に２回、種子を処理した。
【０１６４】
処理溶液：
ＤＭＳＯ  ０．５％
ＴｒｉｔｏｎＸ１００  ５滴／Ｌ
微小管重合阻害剤
酸化防止剤
ヒストン  ５０〜１００ｕｇ／ｍｌ
ｐＨ＝６
・軟水化された窒素非含有水において調製する。
＊直ちに使用する。
【０１６５】
2014520567.tif 000003
【０１６６】
磁場の詳細
磁場チャンバは、互いに１１ｃｍ離れて位置する２枚の磁石板からなった。２つの磁石によって形成される磁場は、その中心軸において１３５０ガウスの最小強度を有するらせん形状の磁場である。種子を、（上記で記載されるような）処理溶液で満たされたステンレスチール槽の中に網袋に入れて置き、槽を磁石チャンバの中に入れた。
【０１６７】
実施例２
３倍体ハイブリッドトウモロコシ
４倍体の雄性体を実施例１の方法に従って生じさせた。これらの４倍体雄性体を３倍体ハイブリッド作製のために使用した。２倍体植物を交雑における雌性親として使用した。交雑の詳細が、下記の表２、表４および表５に記載される。
【０１６８】
具体的には、表２は、Ｎ２−２０１１を雌性親植物として有し、Ｚ１（１２）−２０１１またはＺ１（１３）−２０１１を４倍体雄性親として有する３倍体植物に関する。
【０１６９】
2014520567.tif 000004
【０１７０】
穀粒重量および光合成効率が図１および図２に例示される（ＥＸＰＭ１００、ＥＸＰＲＭ１０４が図２おいて明らかにされる）。
【０１７１】
下記の表３には、二酸化炭素取り込みおよび乾物生産量が、同じ雌性親を有する２倍体ハイブリッドに対する３倍体ハイブリッドについてまとめられる。
【０１７２】
2014520567.tif 000005
【０１７３】
下記の表４は、Ｎ２−２０１１を雌性親植物として有し、Ｚ５（６）−２０１１またはＺ５（８）−２０１１を４倍体雄性親として有する３倍体植物に関する。
【０１７４】
表４および図３Ａ〜図３Ｂは、雌性２倍体親および雄性４倍体親の種子に対するハイブリッド３倍体種子の構造的特徴を提供する。
【０１７５】
2014520567.tif 000006
【０１７６】
図４Ａ〜図４Ｂは、３倍体ハブリッドの穀粒に対する２倍体親および４倍体親の穀粒の相対的重量を示すグラフである。雑種強勢が示される。
【０１７７】
下記の表５は、Ｎ５−２０１１を雌性親植物として有し、Ｚ５（３９）−２０１１、Ｚ５（２２）−２０１１、Ｚ５（８）−２０１１またはＺ５（３１）−２０１１を４倍体雄性親として有する３倍体植物に関する。表５はさらに、４倍体雄性親および３倍体ハイブリッドについての穀粒特性を提供する。図５Ａ〜図５Ｂはハイブリッド種子の相対的重量（「１０００個種子重量」）を示す。
【０１７８】
2014520567.tif 000007
【０１７９】
図６は、２倍体雄性親（２倍体−Ｚ５−２０１１）および４倍体植物（Ｚ５（８）−２０１１）の光合成効率を示す。
【０１８０】
表６は、４倍体Ｚ５（８）−２０１１（実施例１に記載されるように作製された）の総ＣＯ２取り込みおよび乾物生産量を２倍体の同質遺伝子型植物との比較で記載する。
【０１８１】
2014520567.tif 000008
【０１８２】
図７Ａ〜図７Ｂは、上記の表５で詳しく記載されるように、ハイブリッド３倍体トウモロコシに対するハイブリッド２倍体の穀粒を示す。
【０１８３】
ＦＡＣＳによって立証されるような雄性系統の倍数性が下記の表７に示される。
【０１８４】
2014520567.tif 000009
【０１８５】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０１８６】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【図２】
2014520567.tif 000010
【図６】
2014520567.tif 000011
【図１】
2014520567.tif 000012
【図３Ａ】
2014520567.tif 000013
【図３Ｂ】
2014520567.tif 000014
【図４Ａ−４Ｂ】
2014520567.tif 000015
【図５Ａ−５Ｂ】
2014520567.tif 000016
【図７Ａ】
2014520567.tif 000017
【図７Ｂ】
2014520567.tif 000018
【図７Ｃ】
2014520567.tif 000019
【図７Ｄ】
2014520567.tif 000020
【国際調査報告】
2014520567.tif 000021
2014520567.tif 000022
2014520567.tif 000023