(57)【要約】  本発明は、広範囲ＰＣＲにより試料中に少量存在の微生物ＤＮＡを検出するための方法、システム、および組成物を提供する。本発明の方法は、ＰＣＲ試薬中に存在する内因性汚染物質から鋳型を分離するために、非細菌タギング配列を用いて標的ＤＮＡ鋳型の５’末端にタグを付ける新規の戦略に基づいている。鋳型にタグを付けるための融合プローブおよびタグ付き鋳型を増幅するためのプライマーセットもまた提供される。本発明の方法を容易にし、かつ自動化するためのシステムおよびキットもまた提供される。【選択図】図１
2014516529.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の１つまたは複数の標的微生物ＤＮＡを選択的に増幅する方法において、
複数の融合プローブと前記標的微生物ＤＮＡをハイブリダイズさせるステップであって、前記融合プローブのそれぞれが、非細菌ＤＮＡ配列を有する５’末端部分と前記標的微生物ＤＮＡの部分に相補的な配列を有する３’末端部分からなるステップと、
ハイブリダイズしていない融合プローブ、および前記標的微生物ＤＮＡの結合していない、いずれの３’末端部分も除去するステップと、
前記融合プローブおよび前記標的微生物ＤＮＡの３’末端を伸長させて、二本鎖のプライマー−伸長鋳型を形成させるステップと、
前記融合プローブの非細菌配列に相補的な非細菌配列を有する少なくとも１つのプライマーを含むプライマーセットを用いてＰＣＲ法を実施して、前記プライマー−伸長鋳型を選択的に増幅するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記除去するステップおよび伸長させるステップが、エキソヌクレアーゼＩとＫｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼの混合物を加えることを含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記融合プローブの前記５’末端部分の非細菌配列が、ウイルスＤＮＡ配列または人為的に設計された配列から選択されることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記融合プローブの前記３’末端部分の配列が、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の保存部分に相補的であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、前記標的微生物ＤＮＡが、細菌、真菌類、またはウイルスのゲノムＤＮＡから選択されることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、前記ＰＣＲ法が、標準的ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲから選択されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、前記試料が、細菌ＤＮＡ汚染に対して未処理であることを特徴とする方法。
【請求項８】
被験体の微生物感染を検出するための方法において、
前記被験体の試料に複数の融合プローブを加えるステップであって、前記融合プローブのそれぞれが、非細菌ＤＮＡ配列を有する５’末端部分と標的微生物ＤＮＡの部分に相補的な配列を有する３’末端部分からなるステップと、
前記融合プローブと試料中の微生物ＤＮＡをハイブリダイズさせるステップと、
ハイブリダイズしていない融合プローブ、および前記微生物ＤＮＡの結合していない、いずれの３’末端部分も除去するステップと、
前記融合プローブおよび前記微生物ＤＮＡの３’末端を伸長させて、二本鎖のプライマー−伸長鋳型を形成させるステップと、
前記融合プローブの非細菌配列に相補的な非細菌配列を有する少なくとも１つの順方向プライマーを含むプライマーセットを用いてＰＣＲ法を実施することにより、前記プライマー−伸長鋳型を増幅するステップと、
増幅ＰＣＲ産物を分析して、微生物の有無を判定するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項９に記載の方法において、前記試料が、細菌ＤＮＡ汚染に対して未処理であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、前記１つまたは複数の微生物が、細菌、真菌類、またはウイルスから選択されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法において、前記融合プローブの前記５’末端部分の非細菌配列が、ウイルス配列または人為的に設計された配列から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法において、前記融合プローブの前記３’末端部分の配列が、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の保存部分に相補的であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
ＰＣＲ法による選択的増幅のために、試料中の標的微生物ＤＮＡからプライマー−伸長ＤＮＡ鋳型を生成させるための融合プローブであって、前記融合プローブが、
非細菌配列を有する５’末端部分と、
標的微生物試料の部分に相補的な配列を有する３’末端部分と
からなることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の融合プローブにおいて、前記非細菌配列が、ウイルス配列であることを特徴とする融合プローブ。
【請求項１５】
請求項１３に記載の融合プローブにおいて、前記非細菌配列が、Ｍ１３順方向プライマー配列であることを特徴とする融合プローブ。
【請求項１６】
請求項１３に記載の融合プローブにおいて、前記融合プローブの前記３’末端部分の配列が、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の保存配列に相補的であることを特徴とする融合プローブ。
【請求項１７】
選択的ＰＣＲ増幅および検出のために、標的微生物ＤＮＡからプライマー−伸長ＤＮＡ鋳型を生成させるためのキットであって、
請求項１３に記載の複数の融合プローブ
を含むことを特徴とするキット。
【請求項１８】
請求項１７に記載のキットにおいて、３’→５’エキソヌクレアーゼとＫｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼの混合物をさらに含むことを特徴とするキット。
【請求項１９】
試料中の標的微生物を検出するためのシステムにおいて、
試料を受け取るための試料受取ユニットと、
試料処理ユニットと、
試料を分析するための試料分析ユニットと
を含み、前記試料処理ユニットが、
前記試料に請求項１３に記載の複数の融合プローブを加え、前記融合プローブが前記試料中の微生物ＤＮＡとハイブリダイズすることが可能になる反応条件を維持するステップと、
分解／伸長試薬を加えて、
ハイブリダイズしていない融合プローブ、および前記ハイブリダイズした標的微生物ＤＮＡの結合していない３’末端部分を除去し、
二本鎖のプライマー−伸長鋳型が生成するように、前記ハイブリダイズした融合プローブおよび標的微生物ＤＮＡの３’末端を、３’から５’方向に伸長させるステップと、
ＰＣＲ試薬を加え、反応条件を維持して前記プライマー−伸長鋳型のＰＣＲ増幅を実施するステップであって、前記ＰＣＲ試薬が、前記融合プローブの非細菌配列に相補的な配列を有する少なくとも１つのプライマーを含むステップと、
分析のための分析ユニットに処理試料を送るステップと
を実施するように構成されたコンピューター制御ユニットであることを特徴とするシステム。
【請求項２０】
請求項１９に記載のシステムにおいて、前記分析ユニットが、高分解能融解曲線分析ユニットであることを特徴とするシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２０１１年５月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／４８７，７０９号明細書の利益を主張するものであり、この仮特許出願の内容全体は参照によって本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
配列表
本出願には配列表が含まれる。
【０００３】
本発明は、分子アッセイの分野に関する。より具体的には、本発明は、微量の微生物ＤＮＡを検出するためのＰＣＲベースの方法およびそれを実施するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
理論的には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、分析物（例えば、食品試料または臨床検査材料）中の微生物を迅速に検出するための既存のすべての方法の中で潜在的に最も感度の高いものである。広範囲の病原体を検出する必要であり、かつその中にｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養するのが困難であるか、または長期間の培養を必要とする病原体がある場合に、ＰＣＲの価値が特に認識される。例えば、細菌に対して１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子などの保存遺伝子、または真菌類などの真核病原体に対して１８Ｓなどの保存遺伝子を標的とすることにより、ランダムスクリーニングまたは検出を、わずか１回のＰＣＲ反応を使用して達成することができる。しかしながら、実際には、微量の微生物を検出するために広範囲ＰＣＲを使用することには、依然として多くの課題が伴っている。微生物検出へのＰＣＲの実際的適用を制限する要因の中には、阻害物質、汚染、および実験条件に対するＰＣＲの固有の感受性が含まれる。最も困難でかつ長年の問題の１つは、ＰＣＲ試薬の内因性汚染の問題である。
【０００５】
ＰＣＲを実施するための試薬は、市販のものでさえ、細菌を供給源として得られている。そのため、試薬、具体的にはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、供給源の細菌に由来する一定レベルのＤＮＡ汚染を含有することが避けられない。汚染ＤＮＡには、通常、サーマス・アクティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）とも大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）とも同定することができない２種以上の菌株または種が含まれるが、それらは、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｄｕｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アルガリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、またはアゾトバクター・ビネランジイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）種に近い相同性を有するものであり、これらの種はすべて臨床的に重要である。その結果、従来型ＰＣＲでは、これらの汚染物質が標的微生物ＤＮＡと同時増幅されることが多く、極めて高率の偽陽性が生み出され、それによって、ＰＣＲアッセイの信頼性が顕著に低下するため、それらは臨床応用から排除されている。
【０００６】
過去２０年間、この問題を解決するために数多くの試みがなされてきた。それらの例の中には、ＵＶ照射、制限酵素消化、限外濾過、およびデオキシリボヌクレアーゼＩによる試薬の前処理が含まれる（文献２０〜２３）。不運にも、これまでのあらゆる試みは、反応条件に対する固有の制限により偽陽性を完全に除去するのに失敗するか、またはＰＣＲ反応に付随する阻害により必要な感度レベルを達成することができないかのいずれかであった。その結果、広範囲ＰＣＲは臨床には適さないと一般には考えられており、そのため、大部分の研究者は、高価で、最適化することが困難でかつ実施するのが厄介な多重ＰＣＲまたは他の非ＰＣＲ法に取り組むようになった。
【０００７】
したがって、微生物の臨床検出のためのＰＣＲ利用に関する課題を克服するための、未だ対処されていない必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００８】
上記のことを考慮して、本発明の目的は、高感度、正確、安価で、かつ実施が容易である、試料中の微生物を検出するためのＰＣＲベースの方法を提供することである。
【０００９】
本発明の目的はまた、具体的には救急医療現場において、ＰＣＲベースの分子診断法の臨床応用を可能にする試薬および診断キットを提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、臨床検査材料および他の生体試料中の微生物を検出するためにＰＣＲベースの診断アッセイを実施するためのシステムを提供することである。
【００１１】
本発明の上記の目的は、ＰＣＲ試薬中の内因性汚染に関する長年の問題を克服する、本明細書においてＰＥ−ＰＣＲと呼ばれる新規戦略により果たされる。
【００１２】
手短に言えば、ＰＥ−ＰＣＲ戦略では、内因性汚染問題を解決するためのこれまでのあらゆる努力は、汚染物質を除去または破壊する試みによってこの問題に正面から取り組んだものであると認識する。ほぼ２０年間、そのような正攻法はほとんど成功をもたらさなかった。ＰＥ−ＰＣＲでは、本発明者らは従来の考えから免れて、内因性汚染問題を巧妙に回避する間接的な手法を考案した。具体的には、ＰＥ−ＰＣＲ戦略では、いずれかのＰＣＲ試薬を反応混合物に加える前に、ＤＮＡ融合プローブを使用して標的鋳型の５’末端に非細菌配列を付加する。このようにして、標的鋳型を、それらの５’末端非細菌配列によって汚染配列と識別する。非細菌タギング配列に相補的なプライマーの助けで、タグ付き鋳型を標準的ＰＣＲにより選択的に増幅することができる。非細菌融合プライマー（別名、融合プローブ）は、５’末端タグ付き鋳型のみを増幅することになるので、細菌由来の汚染物質は問題とならなくなる。
【００１３】
したがって、本発明の第１の態様は、試料中の１つまたは複数の標的微生物ＤＮＡを選択的に増幅するための方法に関する。本発明のこの態様による方法は、非細菌配列を有する５’末端部分と標的微生物ＤＮＡ部分に相補的な配列を有する３’末端部分からなる、１つまたは複数のＤＮＡ融合プローブを利用する。この方法は、一般には、融合プローブと試料中の標的微生物ＤＮＡをハイブリダイズするステップと、ハイブリダイズしていない融合プローブおよび標的微生物ＤＮＡの結合していない３’末端部分を除去するステップと、融合プローブおよび標的微生物ＤＮＡの３’末端を伸長させて、二本鎖のプライマー−伸長鋳型を形成させるステップと、融合プローブの非細菌配列に相補的な非細菌配列を有する少なくとも１つのプライマーを含むプライマーセットを用いてＰＣＲ法を実施して、プライマー−伸長鋳型を選択的に増幅するステップとを含む。
【００１４】
本発明の第２の態様は、被験体の微生物感染を検出するための方法に関する。本発明のこの態様による方法も、上記の複数のＤＮＡプローブを必要とする。これらの方法は、一般に、被験体から採取した試料に融合プローブを加えるステップと、融合プローブと試料中の微生物ＤＮＡをハイブリダイズさせるステップと、ハイブリダイズしていない融合プローブ、および微生物ＤＮＡの結合していない、いずれの３’末端部分も除去するステップと、融合プローブおよび微生物ＤＮＡの３’末端を伸長させて、二本鎖のプライマー−伸長鋳型を形成させるステップと、融合プローブの非細菌配列に相補的な非細菌配列を有する少なくとも１つの順方向プライマーを含むプライマーセットを用いてＰＣＲ法を実施することにより、プライマー−伸長鋳型を増幅するステップと、増幅したＰＣＲ産物を分析して、微生物の有無を判定するステップとを含む。
【００１５】
本発明の第３の態様は、ＰＣＲ法による選択的増幅のために、試料中の標的微生物ＤＮＡからプライマー−伸長ＤＮＡ鋳型を生成させるための融合プローブに関する。本発明のこの態様による融合プローブは、一般に、非細菌配列を有する５’末端部分と標的微生物試料部分に相補的な配列を有する３’末端部分からなる。
【００１６】
本発明の第４の態様は、選択的なＰＣＲ増幅および検出のために、標的微生物ＤＮＡからプライマー−伸長ＤＮＡ鋳型を生成させるためのキットに関する。本発明のこの態様によるキットは、一般に、上記の複数の融合プローブならびに使用するのが容易な形式でパッケージされた３’→５’エキソヌクレアーゼとＫｌｅｎｏｗポリメラーゼの混合物を含む。
【００１７】
本発明の第５の態様は、試料中の標的微生物を検出するためのシステムに関する。本発明のこの態様によるシステムは、一般に、試料を受け取るための試料受取ユニットと、試料に試薬を加え、反応条件を維持するための試料処理ユニットと、処理試料を分析するための試料分析ユニットとを含む。試料処理ユニットは、試料に複数の融合プローブを加え、融合プローブが試料中の微生物ＤＮＡとハイブリダイズすることが可能になる条件を維持するステップと、分解／伸長試薬を加えて、ハイブリダイズしていない融合プローブおよびハイブリダイズした標的微生物ＤＮＡの結合していない３’末端部分を除去し、二本鎖のプライマー−伸長鋳型が生成するように、ハイブリダイズした融合プローブおよび標的微生物ＤＮＡの３’末端を、３’から５’方向に伸長させるステップと、ＰＣＲ試薬を加え、反応条件を維持してプライマー−伸長鋳型の増幅を実施するステップと、分析のための分析ユニットに処理試料を送るステップとを実施するように自動化されかつ構成されることが好ましい。
【００１８】
本発明の他の態様および利点は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本発明の実施形態によるＰＥ−ＰＣＲ法についての概略図を示す。
【図２】図２は、市販のポリメラーゼが細菌ＤＮＡの高感度かつ特異的な広範囲増幅に対して十分な純度がないことを示すゲル電気泳動画像を示す。
【図３】図３は、本発明の実施形態によるＰＥ−ＰＣＲ法が、汚染細菌ＤＮＡを同時増幅することなく、標的細菌ＤＮＡを特異的に増幅することができることを実証するゲル電気泳動画像を示す。（Ａ）表示量の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムＤＮＡを、融合プローブＭ１３−ＴｓｔａＧ４２２とプライマーセットＭ１３およびＴｓｔａＧ７６５を使用するＰＥ−ＰＣＲに供した。（Ｂ）黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムＤＮＡ（１００ｆｇ）を、パネルＡに記載のように（レーン１）、Ｍ１３プライマーの非存在下で（レーン２）、ＥＫ混合物（レーン３）またはＰＣＲ混合物（レーン４）の中に１００ｆｇの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムＤＮＡを加えることにより人為的に汚染させた状態でＰＥ−ＰＣＲに供した（上段パネル）。ＰＥ−ＰＣＲはまた、鋳型ＤＮＡの非存在下で実施した（レーン５）。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムＤＮＡの存在は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に特異的な染色体ＤＮＡ断片を増幅させる種特異的ＰＣＲにより確認した（下部パネル）。（Ｃ）表示量の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムＤＮＡを、融合プローブＭ１３−１６Ｓ−ｐ２０１ＦとプライマーセットＭ１３およびｐ１３７０を使用する広範囲ＰＥ−ＰＣＲのための鋳型として使用した。（Ｄ）黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムＤＮＡ（１００ｆｇ）を、パネルＣに記載のように（レーン１）、ＥＫ混合物（レーン２）またはＰＣＲ混合物（レーン３）の中に１００ｆｇの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムＤＮＡを加えることにより人為的に汚染させた状態で広範囲ＰＥ−ＰＣＲに供した（上部パネル）。広範囲ＰＥ−ＰＣＲはまた、鋳型ＤＮＡの非存在下で実施した（レーン４）。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムＤＮＡの存在は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の染色体ＤＮＡ断片を増幅させる種特異的ＰＣＲにより確認した（下部パネル）。ＮＴＣは鋳型なし対照を表す。
【図４】図４は、デオキシリボヌクレアーゼＩによるＰＣＲ試薬の前処理後における、鋳型細菌ＤＮＡの広範囲リアルタイムＰＥ−ＰＣＲ増幅と広範囲リアルタイムＰＣＲ増幅の比較を示す。（Ａ）表示量の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムＤＮＡを、ＬＣＧｇｒｅｅｎ  Ｉ  ｐｌｕｓ  ＨＲＭ色素の存在下で、融合プローブＭ１３−１６Ｓ−ｐ２０１ＦとプライマーセットＭ１３およびｐ１３７０を使用する広範囲リアルタイムＰＥ−ＰＣＲに供した。（Ｃ）あるいは、デオキシリボヌクレアーゼＩ（１Ｕおよび２．５Ｕ）により前処理された、または前処理されないＰＣＲ反応混合物を、表示量の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムＤＮＡを増幅させるためのリアルタイムＰＣＲに使用した。ＨＲ−１機器を使用するＨＲＭＡにＰＣＲ産物を供した。増幅（左側の全図）および微分プロット（右側の全図）を示した。ＮＴＣは鋳型なし対照を表す。
【図５】図５は、１２の異なる細菌種に関する、広範囲リアルタイムＰＥ−ＰＣＲおよびＨＲＭＡの融解曲線プロットを示す。１２の異なる細菌種に由来する表示量のゲノムＤＮＡを、ＬＣＧｒｅｅｎ  Ｉ  ｐｌｕｓの存在下で、融合プローブＭ１３−１６Ｓ−ｐ２０１ＦとプライマーセットＭ１３およびｐｌ３７０を使用する広範囲リアルタイムＰＥ−ＰＣＲに供した。ＨＲ−１機器を使用するＨＲＭＡにＰＣＲ産物を供し、その微分プロットを示す。ＮＴＣは鋳型なし対照を表す。
【図６】図６は、本発明の実施形態によるシステムについての概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
添付図に示されるような特定の実施形態を参照することにより、ここに本発明を詳細に記載する。特定の代表的な実施形態および実施例の観点から本発明を記載するが、本明細書に開示の実施形態は、説明のみを目的とするものであり、添付された特許請求の範囲に示される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の修正および変更が当業者によりなされ得ることが認識されよう。
【００２１】
定義
別に指示がない限り、本明細書に使用される用語はすべて、以下に与えられた意味を有し、本発明の当業者にとって用語が有する意味と概ね同じである。専門家には、当技術分野の定義および用語について、具体的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．に教示がある。記載される特定の方法論、プロトコール、試薬は変更され得るものであるため、本発明は、それらに限定されるものではないことが理解されよう。
【００２２】
本明細書に引用される刊行物はすべて、本発明に関して使用され得る組成物および方法論の記載および開示のために、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」は、ポリペプチド、前駆体、またはＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を指す。ポリペプチドは、完全長または断片の所望の活性または機能特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達、免疫原性等）が保持される限り、完全長コード配列によりコードされても、またはコード配列の任意の部分によりコードされてもよい。この用語はまた、構造遺伝子のコード領域と、遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに相当するように、任意の末端上に約１ｋｂ以上の距離にわたって、５’末端および３’末端の両方のコード領域に隣接して位置する配列とを包含する。コード領域の５’側に位置し、かつｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の３’側または下流に位置し、かつｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と呼ばれる。用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノム形態の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と名付けられた非コード配列によって割り込まれたコード領域を含有する。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子セグメントである；イントロンは、エンハンサーなどの調節エレメントを含有することができる。イントロンは、核または転写一次産物から除去または「スプライスアウト」される；したがって、イントロンはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物には存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳の間、新生ポリペプチド中のアミノ酸の配列または順序を指定するように機能する。
【００２４】
本明細書で使用される「プローブおよび／またはプライマー」は、ＲＮＡであってもＤＮＡであってもよい。ＤＮＡはｃＤＮＡであってもゲノムＤＮＡであってもいずれでもよい。ポリヌクレオチドプローブおよびプライマーは、一般に合成オリゴヌクレオチドである、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであるが、クローン化ｃＤＮＡもしくはゲノム配列またはその相補体から生成させることもできる。分析用プローブは、一般に、長さが少なくとも２０ヌクレオチドであるが、幾分短いプローブ（１４〜１７ヌクレオチド）を使用することもできる。ＰＣＲプライマーは、長さが少なくとも５ヌクレオチド、好ましくは１５ヌクレオチド以上、より好ましくは２０〜３０ヌクレオチドである。遺伝子の小さな領域が分析の標的である場合、短いポリヌクレオチドを使用することができる。遺伝子のグロス分析の場合には、ポリヌクレオチドプローブはエキソン全体またはそれ以上を含むことができる。プローブは、検出可能なシグナルを提供するために、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．，ａｎｄ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉ１１．などの多数の供給源から市販されている、酵素、ビオチン、放射性核種、フルオロフォア、ケミルミネッセンス、常磁性粒子等を用い、当技術分野で周知の手法を使用して標識することができる。
【００２５】
オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを作製するために、１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸がホスホジエステル結合を介して一方向にその隣接するペントース環の３’酸素に結合するように、モノヌクレオチドを反応させるので、ＤＮＡ分子は、「５’末端」および「３’末端」を有すると言われる。したがって、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの末端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結していない場合、「５’末端」と呼ばれ、その３’酸素が次のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に連結されていない場合、「３’末端」と呼ばれる。本明細書で使用される場合、核酸配列はまた、より大きなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの内部にあっても、５’末端および３’末端を有すると言うことができる。直鎖状または環状のいずれのＤＮＡ分子でも、個々のエレメントは、「下流」または３’側エレメントの「上流」または５’側と呼ばれる。この専門用語は、転写がＤＮＡ鎖に沿って５’から３’への形で進行するという事実を反映する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「相補的」または「相補性」は、塩基対合則によって関連したポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド配列）に関して使用される。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」の場合、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に相補的である。相補性は「部分的」であってもよく、そこでは、核酸塩基の一部のみが塩基対合則に従ってマッチしている。あるいは、核酸間で「完全な」または「全体にわたる」相補性があることもある。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に顕著な影響を及ぼす。これは、核酸間の結合に依存する増幅反応および検出方法において、特に重要となる。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「ハイブリダイゼーション」は相補的な核酸の対合に関して使用される。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合強度）は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比などの要因によって影響を受ける。その構造内に相補的な核酸の対合を含有する単一分子は、「自己ハイブリダイズする」と言われる。
【００２８】
「増幅」は、鋳型特異性を含む核酸複製の特殊な場合である。それは、非特異的な鋳型複製（すなわち、鋳型依存であるが、特定の鋳型に依存しない複製）と対比されるものである。鋳型特異性は、複製の忠実度（すなわち、適切なポリヌクレオチド配列の合成）およびヌクレオチド（リボ−またはデオキシリボ−）特異性とはここでは区別される。鋳型特異性は、「標的」特異性の点から記載されることが多い。標的配列は、他の核酸から選別されることが求められるという意味で、「標的」である。増幅手法は主としてこの選別のために設計されてきた。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、参照によって本明細書に組み込まれる、Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，１９５号明細書、同第４，６８３，２０２号明細書、および同第４，９６５，１８８号明細書の方法を指し、これらには、クローニングまたは精製することなく、ゲノムＤＮＡの混合物中の標的配列のセグメント濃度を増加させるための方法が記載されている。標的配列を増幅するためのこのプロセスは、所望の標的配列を含有するＤＮＡ混合物に２つのオリゴヌクレオチドプライマーを大過剰で導入するステップと、その後にＤＮＡポリメラーゼの存在下で熱サイクルを正確な順序で行うステップからなる。この２つのプライマーは、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。増幅を遂行するために、混合物を変性させ、次いでプライマーをターゲット分子内の相補的配列とアニーリングさせる。アニーリングに続いて、新規の相補鎖対を形成させるように、プライマーをポリメラーゼで伸長させる。変性、プライマーアニーリング、およびポリメラーゼ伸長のステップを多数回繰り返して（すなわち、変性、アニーリング、および伸長が１「サイクル」を構成し；多数の「サイクル」が存在し得る）、所望の標的配列の増幅セグメントを高濃度で取得することができる。所望の標的配列の増幅セグメントの長さは、互いに対するプライマーの相対的位置によって決定され、したがって、この長さは制御可能なパラメータである。このプロセスの反復的な側面から、この方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（以後「ＰＣＲ」）と呼ばれる。標的配列の所望の増幅セグメントが混合物中で（濃度の点から）最も優勢な配列になるため、それらは「ＰＣＲ増幅されている」と言われる。
【００３０】
本明細書で使用される用語「リアルタイムＰＣＲ」は、アッセイシグナルがＰＣＲ反応の終点で検出される従来型ＰＣＲ法とは対照的に、ＰＣＲアッセイで放出されるシグナルが、各ＰＣＲ増幅サイクルの間のアンプリコン産生の指標として反応の間モニターされる（すなわち、「リアルタイム」で）ことを意味する。リアルタイムＰＣＲは、一般に、蛍光レポーターの検出および定量に基づいている。シグナルは、反応におけるＰＣＲ産物の量に正比例して増加する。各サイクルで蛍光発光量を記録することにより、ＰＣＲ産物量の最初の顕著な増加が標的テンプレートの初期量に相関する対数期の間のＰＣＲ反応をモニターすることが可能である。「リアルタイムＰＣＲ」の全体的な説明については、Ｄｅｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１０２：３７−５１（２００２）；およびＡｌｄｅａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０：１０６０−１０６２（２００２）（リアルタイムで動力学的な定量により、ＰＣＲの対数線形期の間に測定することが可能になる、「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ」を指す）を参照されたい。
【００３１】
ＰＣＲに関しては、いくつかの異なる方法論（例えば、標識プローブとのハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマーの取り込み後のアビジン−酵素コンジュゲート検出；ｄＣＴＰまたはｄＡＴＰなどの３２Ｐ−標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸の増幅セグメントへの取り込み）により検出可能なレベルに、ゲノムＤＮＡ中の単一コピーの特定の標的配列を増幅することが可能である。ゲノムＤＮＡに加えて、いかなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列も、適切なセットのプライマー分子を用いて増幅することができる。具体的には、ＰＣＲプロセスにより生成した増幅セグメントは、それら自体、次のＰＣＲ増幅に対する効率的な鋳型である。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「ＰＣＲ産物」、「ＰＣＲ断片」、および「増幅産物」は、変性、アニーリング、および伸長のＰＣＲステップが２サイクル以上完了した後に生じる化合物の混合物を指す。これらの用語は、１つまたは複数の標的配列の１つまたは複数のセグメントの増幅があった場合を包含する。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「試料」は、その最も幅広い意味で使用される。１つの意味では、それは、任意の供給源から得られる検体または培養物ならびに生体試料および環境試料を含むことが意図される。生体試料は、動物（ヒトを含む）から取得でき、液体、固体、組織、および気体を包含する。生体試料としては、血漿、血清等の血液産物が挙げられる。環境試料としては、表面物質、土壌、水、結晶、および工業用試料などの環境材料が挙げられる。しかしながら、このような例は、本発明に適用可能な試料の種類を限定するものと解釈されるべきではない。
【００３４】
ＰＥ−ＰＣＲ戦略の全体的な説明
図１は、代表的なＰＥ−ＰＣＲ実験の作業を示す概略図である。ステップｌａから開始すると、微生物のゲノムＤＮＡなどの標的ＤＮＡ鋳型を含有する試料分析物を、過剰量の融合プローブと混合する。各融合プローブは、非細菌配列を有する５’末端部分と、それに続く、標的ＤＮＡ鋳型上の部位に相補的な配列を有する３’末端部分からなる。
【００３５】
ステップ１ｂでは、融合プローブが標的ＤＮＡ鋳型とハイブリダイズできるように（ステップ２ａ）、試料混合物を加熱してＤＮＡ鋳型を変性させる。
【００３６】
融合プローブがそれらの目的標的にハイブリダイズした時点で、３’末端エキソヌクレアーゼとＫｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼの混合物（ＥＫ混合物）を試料に加える（ステップ２ｂ）。ステップ２ａに示すように、ハイブリダイゼーション部位が鋳型の３’末端の一番端にない場合、融合プローブの非細菌部分が鋳型と結合しないので、ほつれた末端が形成されることになる。
【００３７】
ステップ３ａでは、結合していない過剰の融合プローブと共に、標的ＤＮＡの３’末端の非結合部分が、３’末端エキソヌクレアーゼにより消化除去される。エキソヌクレアーゼ消化の後、融合プローブ鎖上に５’突出部が生成する。
【００３８】
次いで、ステップ３ｂでは、Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼにより、融合プローブ鎖と鋳型鎖の両方が５’→３’方向に伸長し、平滑末端の二本鎖鋳型が形成されることになる。融合プローブから伸長した鎖は、非細菌タギング配列をその５’末端に位置させることになり、一方、標的ＤＮＡ鋳型から伸長した鎖は、非細菌タギング配列をその３’末端に位置させることになる。このプライマー伸長ステップは、ＥＫ混合物の熱不活性化により停止させることができる。
【００３９】
この段階で、鋳型は、識別配列でタグが付けられており、ＰＣＲにより増幅する準備が整っている。タグ付きの鋳型のみが増幅することを保証するために、ステップ４でＰＣＲを実行するために使用されるプライマーセットには、非細菌タギング配列に相補的である少なくとも１つの順方向プライマー（図１では、ｎｏｎ−ｂａｃ−Ｆとして示される）および融合プローブの下流にある標的ＤＮＡ鋳型上の配列に相補的な逆方向プライマー（図１では、ｂａｃ−Ｒとして示される）が含まれなければならない。
【００４０】
上記に概説したＰＥ−ＰＣＲ戦略は単純であり、何ら他の試薬前処理を必要とすることなく、単一反応容器中で実施することができる。これは、内因性細菌ＤＮＡ汚染の長年の問題を解決するターンキー解決策を提供し、かつ既存のＰＣＲプロトコールと適合する。この戦略に基づいて、本発明者らは種々の方法、システム、組成物、およびキットを考案した。ＰＥ−ＰＣＲ戦略は、ＰＣＲ産物の定量および特性評価をさらに行うための任意の分析法と併せて、有利に使用することができることが当業者には認識されよう。この戦略の代表的な適用の一部として、細菌、ウイルス、または真菌の感染を初期に検出するための臨床検査材料の分子診断法を挙げることができる。他の適用としては、法医学用途、生物兵器の検出、または考古学試料の定量を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
融合プローブ
一般に、本発明の実施形態による融合プローブは、好ましくは順方向プライマーである。それは２つの成分を有し、一方は非細菌配列をコードし、他方は標的ＤＮＡの一部に相補的な配列をコードする。非細菌配列は、ＰＣＲ試薬中の内因性細菌汚染物質を識別するためのタギング配列として役立つ。相補的配列は、ハイブリダイゼーション条件下で標的ＤＮＡに融合プローブを結合させるターゲティング配列として役立つ。
【００４２】
有効な融合プローブを設計するための規則は、当技術分野で一般に公知である。融合プローブは、５’末端の非細菌ＤＮＡ配列と微生物標的配列に相補的な配列からなる。ＰＣＲ増幅中にヒトゲノムＤＮＡの存在する可能性があるため、５’末端の非細菌ＤＮＡ配列は、ヒトゲノムＤＮＡ配列に相補的でないことが優先される。同様の戦略が、他の種に由来する試料中の細菌ＤＮＡ検出に関連する用途に適用される。３’末端の細菌ＤＮＡ配列は、微生物ＤＮＡ中に普遍的に存在する標的遺伝子配列に相補的である。３’細菌配列のＴｍは、最低３７℃で、最大９５℃である。非ヘアピン配列などのプライマー設計の一般規則が、配列選択のために適用される。
【００４３】
タギング配列は、非細菌の供給源に由来する配列であっても、人為的に設計された配列であってもよい。一部の好ましい実施形態では、タギング配列は、ウイルスの配列、好ましくはＭ１３ファージに由来する配列である。
【００４４】
ターゲティング配列は、融合プローブを特定の標的鋳型に結合させる独自配列であっても、融合プローブを広範囲の微生物ＤＮＡに結合させる保存配列であってもよい。一部の代表的な実施形態では、ターゲティング配列は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に由来する保存配列であることが好ましい。
【００４５】
融合プローブは、化学合成を含むが、これに限定されない、当技術分野で周知の任意の方法によって製作することができる。
【００４６】
検出方法
試料中に少量で存在する微生物ＤＮＡは、検出方法および検出機器の制限のために、検出するのが困難である。試料中に少量存在のＤＮＡを検出するための標準的ＰＣＲの使用では、ノイズが多いバックグラウンドの海から標的ＤＮＡ鋳型を選択的に増幅することが含まれる。十分大量に標的ＤＮＡ鋳型を複製することにより、その後に、それらを容易に検出することが可能になる。上記のような融合プローブは、標的ＤＮＡとバックグラウンドノイズおよび望ましくない汚染とを効果的に識別する方法を提供し、それによって、標的ＤＮＡが選択的に増幅されることが可能になる。いったん増幅されれば、増幅核酸産物を特徴づけるために、いくつかの分析ツールを適用することができる。
【００４７】
したがって、本発明の実施形態による、被験体の微生物感染を検出するための方法は、一般に、被験体から採取した試料に融合プローブを加えるステップと、融合プローブと試料中の微生物ＤＮＡをハイブリダイズさせるステップと、ハイブリダイズしていない融合プローブ、および微生物ＤＮＡの結合していない、いずれの３’末端部分も除去するステップと、融合プローブおよび微生物ＤＮＡの３’末端を伸長させて、二本鎖のプライマー−伸長鋳型を形成させるステップと、融合プローブの非細菌配列に相補的な非細菌配列を有する少なくとも１つの順方向プライマーを含むプライマーセットを用いてＰＣＲ法を実施することによりプライマー−伸長鋳型を増幅するステップと、増幅ＰＣＲ産物を分析して、微生物の有無を判定するステップとを含むことになる。
【００４８】
例えば、血液、尿、脳脊髄液、唾液、喀痰等の被験体の体液から、試料を採取することが好ましい。被験体から採取される試料のタイプは特に限定されないが、一般に、被験体の罹患が疑われる臨床症状のタイプに対応する。例えば、好ましい実施形態では、試料は、菌血症の罹患が疑われる被験体に由来する血液試料である。別の好ましい実施形態では、試料は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養が困難な細菌感染の罹患が疑われる被験体に由来する脳脊髄液である（例えば、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））。
【００４９】
試料の調製には、通常、微生物からＤＮＡを遊離させる必要がある。微生物ＤＮＡの遊離／抽出のための方法は、当技術分野で一般に公知であり、試料を調製するために有利に使用することができる。しかしながら、そのような調製ステップは、アッセイの用途および特定の目的によっては、必ずしも必要とは限らない。
【００５０】
融合プローブと標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションは、最初に、それらが一本鎖ＤＮＡに変性するように標的ＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）超に試料を加熱し、次に結合およびアニーリングが起き得るようにＴｍ未満に徐々に冷却することにより一般に達成される。また、適切なハイブリダイゼーション条件は、当技術分野では公知であり、当業者によりルーチン的に決定することができる。
【００５１】
過剰の融合プローブおよび標的ＤＮＡの結合していない３’末端部分の除去は、３’エキソヌクレアーゼにより遂行することができる。好ましい実施形態では、３’エキソヌクレアーゼは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｅｘｏ  Ｉである。他の３’エキソヌクレアーゼも適切に使用することができる。
【００５２】
鋳型の伸長は、５’→３’ポリメラーゼの使用により遂行することができる。好ましい実施形態では、５’→３’Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼが使用される。
【００５３】
３’エキソヌクレアーゼおよび３’→５’ポリメラーゼは、便宜のために単一混合物（ＥＫ混合物）で提供することができる。エキソヌクレアーゼとポリメラーゼの最適比が、融合プローブの設計ならびに使用される特定のエキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼに依存することは、当業者には認識されよう。そのような比は、ルーチン的な最適化実験により決定することができ、臨床現場にその検出方法を展開させる前に、好ましくは行われるべきである。エキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼの活性を終結させるためには、クエンチング剤を加えてもよく、試料を単純に加熱して酵素を不活性化してもよい。
【００５４】
ＰＣＲ法は、市販のＴａｑポリメラーゼと、融合プローブのタギング配列に相補的な配列を有する少なくとも１つの順方向プライマーを含む一組のプライマーとを使用する標準的ＰＣＲであることが好ましい。他の従来型ＰＣＲプロトコールも、そのプロトコールがプライマー−伸長鋳型に適合する限り、適切に使用することができる。これらの従来型ＰＣＲを実施するための方法は、当技術分野で一般に公知であり、当業者が本発明のＰＥ−ＰＣＲ戦略で使用できるように適合させることができる。例えば、リアルタイムＰＣＲを使用して、プライマー−伸長鋳型を増幅すると同時に微生物ＤＮＡの存在量を定量化することもできる。
【００５５】
最後であるがおろそかにできないこととして、増幅ＰＣＲ産物は、当技術分野で公知であるいくつもの従来の分析法によって分析でき、それらの起源を特徴づけ、同定することができる。例えば、融解曲線分析を増幅ＰＣＲ産物に適用して、融解曲線プロファイルを生成することができる。異なる微生物に由来するＤＮＡは、それらの多様なヌクレオチド内容のために、一般に、独自の融解曲線プロファイルを有することになる。これらの融解曲線プロファイルは、試料の起源を同定のための一種の「フィンガープリント」として役立てることができる。
【００５６】
使用することができる他の分析法としては、これらに限定されないが、配列決定、マイクロアレイアッセイ、質量分析法、高分解能融解分析を含む融解曲線、変性ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動法、アガロースおよび／またはポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ヘテロ二本鎖移動度アッセイ（ＨＭＡ）、およびＮＭＲ分光法が挙げられる。
【００５７】
システムおよびキット
本発明によるＰＥ−ＰＣＲを実施するためには、融合プローブと、過剰のプローブを除去し、ハイブリダイズしたプローブ／鋳型を伸長させる試薬とが、従来型ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲ用の試薬に加えて必要になる。したがって、本発明のキットは、複数の予め作製した融合プローブおよび分解／伸長試薬（例えば、ＥＫ混合物）を、これらに限定されないが、バイアルまたはカートリッジなどの好都合なパッケージの中に含むことになる。キットは、その使用を教示する取扱説明書またはＰＣＲ増幅を促進するための追加の試薬をさらに含むことができる。
【００５８】
ハイスループット分析を容易にするために、さらに自動システムを構築して、本発明の検出方法を実施することができる。図６に、本発明の代表的なシステムの概略図を示す。
【００５９】
図６を参照すると、本発明の実施形態によるシステムには、分析される試料を受け取るための試料受取ユニット１、種々の試薬を試料に加え、適切な反応条件を維持するように構成された処理ユニット２がある。例えば、微生物ＤＮＡを試料リザーバー３から取り出し、反応チャンバー４および５の中に入れ、そこに融合プローブおよびＥＫ混合物を加えてプライマー−伸長鋳型を形成させることができる。次いで、ＰＣＲチャンバー６の中で、プライマー−伸長鋳型をＰＣＲにより増幅することができる。次いで、ＰＣＲ反応チャンバーを試料分析ユニット７に移動させることができる。
【００６０】
この処理ユニットは、いくつかの異なる様式で構成することができる。処理ユニットを実行する代表的な手段は、一連のマイクロコンピュータ制御のアクチュエータであっても、ミクロ流体装置であってもよい。分析ユニットも、適用される特定の分析モードに応じて、いくつもの様式で実行することができる。例えば、それは、質量分析計、ＤＮＡ塩基配列決定装置、キャピラリー電気泳動装置、または融解温度解析装置であってもよい。本発明のシステムは、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）製のＢＤ  Ｍａｘ（商標）システムなどの既存の自動ＰＣＲシステムから適合させることが好ましい。
【００６１】
さらに、非自動システムは既製コンポーネントを使用して組み立てることができる。例えば、代表的な実施形態では、試料処理は手作業で、または別個の試料処理／調製ユニットで実施することができる。ＰＣＲ反応は、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）製のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０システムなどの標準サーモサイクラーを使用して実施することができる。種同定分析は、ＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ（登録商標）３２システム（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，Ｕｔａｈ）を使用する高分解能融解曲線分析により実施することができる。
【００６２】
読者が本発明の詳細で完全な認識を得ることをさらに助けるために、以下の例示的な具体的実施例を提供する。
【実施例】
【００６３】
ＰＥ−ＰＣＲによる少量存在細菌の広範囲検出
いくつかの「ｌｏｗ−ＤＮＡ」およびＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが商用供給源から入手可能である。出発点として、４種の市販ｌｏｗ−ＤＮＡまたはＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが汎用プライマーセットｐ２０１−ｐｌ３７０を使用する、細菌ＤＮＡの広範囲増幅に適していないことを実証するために、本発明者らは最初にそれらを調べた。
【００６４】
これらのポリメラーゼを用いて、本発明者らは、代表的なスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）細菌のゲノムＤＮＡを１００ｆｇ（細菌ゲノムの２０コピーに等しい）含有する試料および「鋳型なし対照」（ＮＴＣ）を増幅するために古典的ＰＣＲを実施した。図２に示すように、相当な量の増幅ＤＮＡ産物がＮＴＣ反応で見出され、試料反応との判別が不可能であった。この結果により、市販のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲ試薬が、フェムトグラムレベルの検出限界が通常必要とされる臨床現場の中で、広範囲の細菌ＤＮＡを検出するのに十分な純度ではないことが確認される。
【００６５】
ＰＥ−ＰＣＲ戦略の原理証明として、段階希釈した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のゲノムＤＮＡを、この戦略による分析に供した。具体的には、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の翻訳伸長因子Ｔｕ（Ｔｕｆ）遺伝子をＰＥ−ＰＣＲ増幅の標的として選択した。５’末端にＭ１３順方向プライマーを有し、かつ３’末端にＴｕｆ配列（受入番号ＡＦ２９８７９６）を有する融合プローブ（Ｍ１３−ＴｓｔａＧ４２２）を設計した（表１）。Ｍ１３−ＴｓｔａＧ４２２と鋳型ＤＮＡをアニーリングした後、ＥＫ混合物を反応に加え、結合していない融合プローブを分解し、プライマー伸長を開始させた。次いで、Ｍ１３およびＴｕｆゲノム配列に対応する下流プライマーＴｓｔａＧ７６５を使用して、プライマー伸長産物をＰＣＲ増幅に供した。その結果、試料中の１０コピーの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムに等しい５０ｆｇの細菌ＤＮＡを用いて、３９１ｂｐの単一ＰＣＲ産物を得た。これに対して、ＮＴＣ対照では、ＰＣＲ産物は観察されなかった（図３Ａ）。この結果は、本発明者らのＰＥ−ＰＣＲがフェムトグラムの範囲まで正確かつ高感度であることを示す。
【００６６】
ＰＣＲ試薬および酵素の細菌ＤＮＡ汚染を模倣するために、１００ｆｇの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムＤＮＡを、ＥＫ混合物とＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ−ＰＣＲ反応混合物の中にそれぞれ添加した。鋳型細菌ＤＮＡがプライマー伸長の間に存在した場合のみ、相当な量のＰＥ−ＰＣＲ産物が生成した（図３Ｂ、レーン１）。ＮＴＣ反応でも（図３Ｂ、レーン５）、ＰＣＲがＭ１３プライマーの非存在下で実施された場合にも（図３Ｂ、レーン２）、ＰＣＲ産物は生成しなかった。注目すべきことには、ＰＥ−ＰＣＲは、添加細菌ＤＮＡを同時増幅することなく、鋳型細菌ＤＮＡの増幅を促進した。
【００６７】
ＥＫ混合物またはＰＣＲ反応混合物（図３Ｂ、レーン３および４）中の添加ＤＮＡの存在は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の種特異的ＰＣＲにより確認された（図３Ｂ、下部パネル）。これらのデータは、ＰＣＲ試薬および酵素中の汚染細菌ＤＮＡが鋳型細菌ＤＮＡの特異的増幅を妨害しないことを示し、本発明者らのＰＥ−ＰＣＲ戦略の原理証明を提供する。
【００６８】
細菌ＤＮＡの広範囲増幅におけるＰＥ−ＰＣＲの実現可能性を示すために、本発明者らは、種々の細菌種の間で高度に保存される１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の広範囲ＰＥ−ＰＣＲのための汎用融合プローブＭ１３−１６Ｓ−ｐ２０１Ｆを設計した。段階希釈した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムＤＮＡを、いかなる汚染除去前処理も適用することなく、融合プローブＭ１３−１６Ｓ−ｐ２０１Ｆ、Ｍ１３順方向プライマー、ｐｌ３７０逆方向プライマー（表１）、およびルーチン的に使用されるＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｔｅｃｈ）を使用する広範囲ＰＥ−ＰＣＲに供した。２３７ｂｐの単一ＰＣＲ産物が得られ、２コピーの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムＤＮＡに等しい、わずか１０ｆｇの鋳型ＤＮＡが、ＰＥ−ＰＣＲにより検出することができる。ＮＴＣ反応では、ＰＣＲ産物は観察されなかった（図３Ｃ）。これに応じて、いくつかの臨床的に重要な細菌種由来のゲノムＤＮＡが試験され、広範囲ＰＥ−ＰＣＲにより増幅可能であることが示された。
【００６９】
本発明者らはまた、ＥＫ混合物とＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ−ＰＣＲ混合物のそれぞれの中に、１００ｆｇの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムＤＮＡを加えることにより、細菌ＤＮＡ汚染を模倣した。予想通りに、１００ｆｇの鋳型細菌ＤＮＡの存在下では、陽性のＰＥ−ＰＣＲシグナルが得られたが（図３Ｄ、レーン１）、人為的に汚染させた状態およびＮＴＣ反応では、ＰＣＲ産物は生成されなかった（図３Ｄ、レーン２〜４）。さらに、反応混合物中の添加ＤＮＡの存在は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の種特異的ＰＣＲにより確認された（図３Ｄ、下部パネル）。これらのデータをまとめると、本発明者らのＰＥ−ＰＣＲ戦略により、ＰＣＲ試薬による内因性汚染の存在下でも、細菌ＤＮＡの広範囲検出が可能になることが証明される。これは、これまでは達成できなかった成果である。
【００７０】
本発明者らの戦略の検出限界を探求するために、１００ｆｇから１０ｆｇに及ぶ、種々の濃度の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムＤＮＡを、広範囲ＰＥ−ＰＣＲに供した。鋳型細菌ＤＮＡの１００、５０、２５、および１０ｆｇに対する陽性ＰＣＲシグナルを得る確率はそれぞれ、１００％、９５％、６５％、および５５％であった（ｎ＝２０）。したがって、広範囲ＰＥ−ＰＣＲは容易に実施できて、検出限界および特異性を損なわずに鋳型細菌ＤＮＡを特異的に増幅する。
【００７１】
ＰＥ−ＰＣＲと融解曲線分析を結合することによる特異的検出
本発明者らのＰＥ−ＰＣＲ戦略の能力をさらに増強するために、本発明者らは、上記の広範囲ＰＥ−ＰＣＲ検出方法の中にリアルタイムＰＣＲおよびＨＲＭＡを組み込むようにプロトコールを改変した。実証するために、段階希釈した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムＤＮＡを、ＨＲＭ色素ＬＣＧｒｅｅｎ  Ｉ  ｐｌｕｓの存在下で広範囲リアルタイムＰＥ−ＰＣＲに供した。増幅プロットにより示されるように、１０ｆｇの鋳型ＤＮＡはアンプリコン特異的な増幅をもたらし、ＮＴＣ反応では、ＰＣＲ産物は生成しなかった（図４Ａおよび４Ｂ）。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＰＣＲアンプリコン中の独自のヌクレオチド内容は、特有の微分プロットを生成したが、ＮＴＣ反応の場合には、融解ピークは観察されなかった。鋳型ＤＮＡの１００、５０、２５、および１０ｆｇに対する陽性ＰＣＲシグナルを得る確率はそれぞれ、１００％、９０％、５０％、および３０％であった（ｎ＝１０）。
【００７２】
比較のために、ＰＣＲ試薬をデオキシリボヌクレアーゼＩで前処理した後、プライマー対ｐ２０１およびｐ１３７０を使用する、鋳型黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムＤＮＡの広範囲ＰＣＲ増幅を行った。増幅および微分プロットにより示されるように（図４Ｃ）、デオキシリボヌクレアーゼＩの添加はＰＣＲ増幅を顕著に阻害した。１Ｕのデオキシリボヌクレアーゼでは、内因性の汚染ＤＮＡは完全には除去されなかった。デオキシリボヌクレアーゼＩの濃度を２．５Ｕに増加させると、ＰＣＲ阻害がさらに起こり、細菌ＤＮＡの広範囲ＰＣＲ増幅に対する検出限界が妨害を受けた。
【００７３】
本発明者らの戦略をさらに検証するために、本発明者らは、広範囲リアルタイムＰＥ−ＰＣＲを適用して、さらなる１２の一般的な細菌種を分析した（表２）。微分プロットおよび融解温度を使用するＰＣＲ産物のＨＲＭＡは、細菌種の大部分を容易に識別した（図５および表２）。この手法を使用すると、鋳型の配列決定を大体省略することができ、節約と便宜を計ることができる。
【００７４】
材料および方法
材料
ｅｘｏ  ＩおよびＫｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から購入した。ＬＣＧｒｅｅｎ  Ｉ  ｐｌｕｓ試薬セットおよびＨＲ−１機器は、Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，ＵＴ）から購入した。ＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｒｏｔｅｃｈ（Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）から購入した。Ｆａｓｔ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）から購入した。「ｌｏｗ−ＤＮＡ」Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｋａｒａ（Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）から購入した。ＵＬＴＲＡＴＯＯＬＳ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｂｉｏｔｏｏｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）から購入した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒキャピラリーは、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入した。デオキシリボヌクレアーゼＩは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入した。細菌株は、以前に記載された臨床分離株であった（参考文献１１）。プライマー配列および融合プローブ配列の完全な表を、表１に示す。
【００７５】
細菌ゲノムＤＮＡの単離
一晩培養の細菌懸濁液（４ｍｌ）を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ペレットを、４ｍｌの溶液Ｉ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、および４０μｇ／ｍｌリソスタフィン）に再懸濁した。この細菌懸濁液を３７℃で２分間インキュベートし、２８０μｌの２０％  ＳＤＳならびに４０μｌのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）およびＲＮアーゼＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を含有する反応緩衝液を細菌懸濁液に加え、５５℃で一晩インキュベートした。フェノール／クロロホルム抽出の後、上清を清潔な微量遠心機チューブに移し、ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。７５％エタノールで２回洗浄した後、ＤＮＡペレットを、定量およびその後のＰＣＲアッセイのために水に再懸濁した。
【００７６】
ＰＥ−ＰＣＲ
通常のＰＥ−ＰＣＲは、１本の反応チューブ内で実施した。手短に言えば、アニーリングステップは、８μｌのＨ２０、５μｌの融合プローブ（２ｎｇ／μｌ）、５μｌの指定濃度の細菌ゲノムＤＮＡ、および２μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液を含有する、２０μｌのアニーリング混合物からなった。この反応混合物を５分間、９５℃に加熱し、３７℃で保持した。３μｌのＨ２０、１μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、５μｌのｄＮＴＰ（２ｍＭ）、１μｌのＫｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）、および１μｌのｅｘｏ  Ｉ（２０Ｕ／μｌ）からなる、１１μｌのＥＫ混合物をアニーリング混合物に加え、３７℃で２時間インキュベートした。８０℃で２０分間熱不活性化した後、１４μｌのＨ２０、２μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、１μｌの順方向プライマーＭ１３（５μΜ）、１μｌの逆方向プライマー（５μΜ）、および１μｌのＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）を反応混合物に加えて、５０μｌにした。ＰＣＲサイクリング条件は、９５℃で１０分間の１サイクル、９５℃で１５秒間の４５サイクル、および６０℃で１分間とした。添加の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムＤＮＡを検出するために、Ｍ１３および逆方向プライマーを、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムＤＮＡ断片を特異的に増幅する（参考文献４３）ＳＡ−ＦおよびＳＡ−Ｒのプライマーセット（表１）に取り替えた。
【００７７】
リアルタイムＰＥ−ＰＣＲのために、融合プローブの結合およびプライマー伸長の間、反応を比例的に８μｌに縮小した。次いで、１．５μｌのＨ２０、２μｌの１０×ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２μｌの１０×ＬＣＧｒｅｅｎ  Ｉ  ｐｌｕｓ、０．８μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、０．４μｌの順方向プライマーＭ１３（５μΜ）、０．４μｌの逆方向プライマー（５μΜ）、および０．５μｌのＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）を加えて、反応混合物を２０μｌにし、キャピラリーチューブに移した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  １．５機器を使用してリアルタイムＰＣＲを実施し、ＰＣＲサイクリング条件を、２０℃／秒の遷移速度にて、９５℃で１０分間の１サイクル、９５℃で１５秒間の４５サイクル、および６０℃で１分間とした。
【００７８】
高分解能融解曲線の取得および分析
増幅産物を含有するガラスキャピラリーを、ＨＲ−１機器（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に移し、ＰＣＲ断片を０．３℃／秒の速度にて６４〜９６℃で融解した。０％〜２０％の蛍光で曲線を重ねるための蛍光正規化および温度重ね合わせを含むＨＲ−１ソフトウェアで、融解プロファイルを評価した。
【００７９】
汚染除去および広範囲ＰＣＲ増幅のためのデオキシリボヌクレアーゼＩの前処理
２μｌの１０×ＢＳＡ、２μｌのｄＮＴＰ（２ｍＭ）、２μｌの１０×ＬＣＧｒｅｅｎ  Ｉ  ｐｌｕｓ、１μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、０．５μｌのＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）を含有するＰＣＲ試薬を、３７℃で３０分間、デオキシリボヌクレアーゼＩ（１Ｕまたは２．５Ｕ）とインキュベートした。８５℃で１５分間、デオキシリボヌクレアーゼＩを熱不活性化した後、１μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、２μｌの順方向プライマーｐ２０１（５μΜ）、２μｌの逆方向プライマーｐ１３７０（５μΜ）、および５μｌの鋳型ＤＮＡを加えて、反応混合物を２０μｌにした。ＰＣＲサイクリング条件は、２０℃／秒の遷移速度にて、９５℃で１０分間の１サイクル、９５℃で１５秒間の４５サイクル、および６０℃で１分間とした。
【００８０】
代表的な診断キット
好ましい適用では、菌血症または敗血症を検査するための臨床診断アッセイのベースとして、ＰＥ−ＰＣＲを使用することができる。以下の表に、そのような診断キットに含まれ得る試薬を収載する。
2014516529.tif 000003
2014516529.tif 000004
2014516529.tif 000005
【００８１】
参考文献
以下の参考文献はそれぞれ参照により本明細書に援用される。
１．  Ｒｉｃｅ  ＴＷ，  Ｂｅｒｎａｒｄ  ＧＲ  （２００５）  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｓｅｐｓｉｓ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  ５６：  ２２５−２４８．
２．  Ｗｅｉｌｅ  Ｊ，  Ｋｎａｂｂｅ  Ｃ  （２００９）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｔｒｅｎｄｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．  Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ３９４：  ７３１−７４２．
３．  Ｋｌｏｕｃｈｅ  Ｍ，  Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  Ｕ  （２００８）  Ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄｓｔｒｅａｍ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．
Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  ４６：  ８８８−９０８．
４．  Ｗａｎｇ  Ｑ，  Ｗａｎｇ  Ｓ，  Ｂｅｕｔｉｎ  Ｌ，  Ｃａｏ  Ｂ，  Ｆｅｎｇ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４８：  ２０６６−２０７４．
５．  Ａｎｔｈｏｎｙ  ＲＭ，  Ｂｒｏｗｎ  ＴＪ，  Ｆｒｅｎｃｈ  ＧＬ  （２０００）  Ｒａｐｉｄ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ  ｂｙ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ２３  Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３８：  ７８１−７８８．
６．  Ｔｉｓｓａｒｉ  Ｐ，  Ｚｕｍｌａ  Ａ，  Ｔａｒｋｋａ  Ｅ，  Ｍｅｒｏ  Ｓ，  Ｓａｖｏｌａｉｎｅｎ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ａｃｃｕｒａｔｅ  ａｎｄ  ｒａｐｉｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ：  ａｎ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｙ．  Ｌａｎｃｅｔ  ３７５：  ２２４３０．
７．  Ｔｓａｌｉｋ  ＥＬ，  Ｊｏｎｅｓ  Ｄ，  Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  Ｂ，  Ｗａｒｉｎｇ  Ｌ，  Ｌｉｅｓｅｎｆｅｌｄ  Ｏ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ｔｏ  ｄｉａｇｎｏｓｅ  ｂｌｏｏｄｓｔｒｅａｍ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｄｍｉｔｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ  ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｓｅｐｓｉｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４８：  ２６−３３．
８．  Ｔｓｅｎｇ  ＣＰ，  Ｃｈｅｎｇ  ＪＣ，  Ｔｓｅｎｇ  ＣＣ，  Ｗａｎｇ  Ｃ，  Ｃｈｅｎ  ＹＬ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｂｒｏａｄ−ｒａｎｇｅ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ａｆｔｅｒ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｒｅａｇｅｎｔｓ：  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４９：  ３０６−３０９．
９．  Ｒｅｎｏ  ＷＬ  ３ｒｄ，  ＭｃＤａｎｉｅｌ  ＤＯ，  Ｔｕｒｎｅｒ  ＷＷ  Ｊｒ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＭＤ  （２００１）  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｍｉａ．  Ａｍ  Ｓｕｒｇ  ６７：  ５０８−５１２．
１０．  Ｓｌｅｉｇｈ  Ｊ，  Ｃｕｒｓｏｎｓ  Ｒ，  Ｌａ  Ｐｉｎｅ  Ｍ  （２００１）  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ  ｉｎ  ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ  ｉｌｌ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  １６Ｓ  ｒＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２７：  １２６９−１２７３．
１１．  Ｃｈｅｎｇ  ＪＣ，  Ｈｕａｎｇ  ＣＬ，  Ｌｉｎ  ＣＣ，  Ｃｈｅｎ  ＣＣ，  Ｃｈａｎｇ  ＹＣ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｆｔｅｒ  ｂｒｏａｄ−ｒａｎｇｅ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ．  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５２：  １９９７−２００４．
１２．  Ｗｏｎ  Ｈ，  Ｒｏｔｈｍａｎ  Ｒ，  Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  Ｐ，  Ｈｓｉｅｈ  ＹＨ，  Ｋｅｃｏｊｅｖｉｃ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｒａｐｉｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｉｎ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｂｏｔｔｌｅｓ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  ｂｒｏａｄ−  ｂａｓｅｄ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４８：  ３４１０−  ３４１３．
１３．  Ｙａｎｇ  Ｓ，  Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  Ｐ，  Ｒｏｔｈｍａｎ  Ｒ，  Ｈｓｉｅｈ  ＹＨ，  Ｈａｒｄｉｃｋ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｒａｐｉｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｔｈｒｅａｔ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４７：  ２２５２−２２５５．
１４．  Ｃｏｒｌｅｓｓ  ＣＥ，  Ｇｕｉｖｅｒ  Ｍ，  Ｂｏｒｒｏｗ  Ｒ，  Ｅｄｗａｒｄｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｖ，  Ｋａｃｚｍａｒｓｋｉ  ＥＢ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｓｓｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ  ＰＣＲ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３８：  １７４７−１７５２．
１５．  Ｍｕｈｌ  Ｈ，  Ｋｏｃｈｅｍ  ＡＪ，  Ｄｉｓｑｕｅ  Ｃ，  Ｓａｋｋａ  ＳＧ  （２０１０）  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  １６Ｓ  ｒＤＮＡ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ．  Ｄｉａｇｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ６６：  ４１−４９．
１６．  Ｂｏｔｔｇｅｒ  ＥＣ  （１９９０）  Ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ．  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ３６：  １２５８−１２５９．
１７．  Ｈｕｇｈｅｓ  ＭＳ，  Ｂｅｃｋ  ＬＡ，  Ｓｋｕｃｅ  ＲＡ  （１９９４）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３２：  ２００７−２００８．
１８．  Ｍａｉｗａｌｄ  Ｍ，  Ｄｉｔｔｏｎ  Ｈ−Ｊ，  Ｓｏｎｎｔａｇ  Ｈ−Ｇ，  ｖｏｎ  Ｋｎｅｂｅｌ  Ｄｏｅｂｅｒｉｔｚ  Ｍ  （１９９４）  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｉｎ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｗｈｉｃｈ  ｏｃｃｕｒｓ  ｄｕｒｉｎｇ  
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  ｆｏｒ  Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ５Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ８：  １１−１４．
１９．  Ｓｏｎｔａｋｋｅ  Ｓ，  Ｃａｄｅｎａｓ  ＭＢ，  Ｍａｇｇｉ  ＲＧ，  Ｄｉｎｉｚ  ＰＰ，  Ｂｒｅｉｔｓｃｈｗｅｒｄｔ  ＥＢ  （２００９）  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｂｒｏａｄ  ｒａｎｇｅ  １６Ｓ  ｒＤＮＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７６：  ２１７−２２５．
２０．  Ｏｕ  ＣＹ，  Ｍｏｏｒｅ  ＪＬ，  Ｓｃｈｏｃｈｅｔｍａｎ  Ｇ  （１９９１）  Ｕｓｅ  ｏｆ  ＵＶ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｒｅｄｕｃｅ  ｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １０：  ４４２−４４６．
２１．  Ｐａｎｄｉｔ  Ｌ，  Ｋｕｍａｒ  Ｓ，  Ｋａｒｕｎａｓａｇａｒ  Ｉ，  Ｋａｒｕｎａｓａｇａｒ  Ｉ  （２００５）  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｕｓｉｎｇ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５４：  ５３９−５４２．
２２．  Ｇｌｕｓｈｋｏｖ  ＳＡ，  Ｂｒａｇｉｎ  ＡＧ，  Ｄｙｍｓｈｉｔｓ  ＧＭ  （２００９）  Ｄｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３９３：  １３５−１３７．
２３．  Ｓｉｌｋｉｅ  ＳＳ，  Ｔｏｌｃｈｅｒ  ＭＰ，  Ｎｅｌｓｏｎ  ＫＬ  （２００８）  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｄｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅ  ｆａｌｓｅ−  ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｑＰＣＲ．  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７２：  ２７５−２８２．  
２４．  Ｐｈｉｌｉｐｐ  Ｓ，  Ｈｕｅｍｅｒ  ＨＰ，  Ｉｒｓｃｈｉｃｋ  ＥＵ，  Ｇａｓｓｎｅｒ  Ｃ  （２０１０）  Ｏｂｓｔａｃｌｅｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｆｏｒ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  １６Ｓ  ｒＤＮＡ：  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｔｙ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｄｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．  Ｔｒａｎｓｆｕｓ  Ｍｅｄ  Ｈｅｍｏｔｈｅｒ  ３７：  ２１−２８．
２５．  Ｌｉ  Ｄ，  Ｌｉｕ  Ｂ，  Ｃｈｅｎ  Ｍ，  Ｇｕｏ  Ｄ，  Ｇｕｏ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  １４  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｅｒｏｇｒｏｕｐｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８２：  ７１−７７．
２６．  Ｄｉｅｒｋｅｓ  Ｃ，  Ｅｈｒｅｎｓｔｅｉｎ  Ｂ，  Ｓｉｅｂｉｇ  Ｓ，  Ｌｉｎｄｅ  ＨＪ，  Ｒｅｉｓｃｈｌ  Ｕ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ａ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ  ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅｓｕｍｅｄ  ｓｅｐｓｉｓ．  ＢＭＣ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １１  ：  １２６．
２７．  Ｗａｌｌｅｔ  Ｆ，  Ｎｓｅｉｒ  Ｓ，  Ｂａｕｍａｎｎ  Ｌ，  Ｈｅｒｗｅｇｈ  Ｓ，  Ｓｅｎｄｉｄ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｇａｌ  ＤＮＡ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ．  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  １６：  ７７４−７７９．
２８．  Ｌｅｈｍａｎｎ  ＬＥ，  Ｈｕｎｆｅｌｄ  ＫＰ，  Ｓｔｅｉｎｂｒｕｃｋｅｒ  Ｍ，  Ｂｒａｄｅ  Ｖ，  Ｂｏｏｋ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｓｔｒｅａｍ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｂｙ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ｓｅｐｓｉｓ．  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ３６：  ４９−５６．
２９．  Ｓｔｅｉｎｍａｎ  ＣＲ，  Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒ  Ｂ，  Ｎｕｏｖｏ  ＧＪ，  Ｒｕｍｏｒｅ  ＰＭ，  Ｙｕ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｄｏｍａｉｎ−  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｆｒｏｍ  ｈｏｓｔ  ＤＮＡ  ａｔ  ｔｈｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｌｅｖｅｌ：  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２４４：  ３２８−３３９．
３０．  ＭｃＣａｂｅ  ＫＭ，  Ｚｈａｎｇ  Ｙ−Ｈ，  Ｈｕａｎｇ  Ｂ−Ｌ，  Ｅａｇａｒ  ＥＡ，  ＭｃＣａｂｅ  ＥＲＢ  （１９９９）  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒ  ｐａｉｒ．  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｔａｂ  ６６：  ２０５−２１１．
３１．  Ｗｏｏ  ＰＣ，  Ｌａｕ  ＳＫ，  Ｔｅｎｇ  ＪＬ，  Ｔｓｅ  Ｈ，  Ｙｕｅｎ  ＫＹ  （２００８）  Ｔｈｅｎ  ａｎｄ  ｎｏｗ：  ｕｓｅ  ｏｆ  １６Ｓ  ｒＤＮＡ  ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｆｏｒ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  １４：  ９０８−９３４．
３２．  Ｃｈｅｒｋａｏｕｉ  Ａ，  Ｅｍｏｎｅｔ  Ｓ，  Ｃｅｒｏｎｉ  Ｄ，  Ｃａｎｄｏｌｆｉ  Ｂ，  Ｈｉｂｂｓ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂｒｏａｄ−ｒａｎｇｅ  １６Ｓ  ｒＤＮＡ  ＰＣＲ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｐｕｒｐｏｓｅｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７９：  ２２７−２３１．
３３．  Ｃｈａｍｐｌｏｔ  Ｓ，  Ｂｅｒｔｈｅｌｏｔ  Ｃ，  Ｐｒｕｖｏｓｔ  Ｍ，  Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＥＡ，  Ｇｒａｎｇｅ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｕｌｔｉｓｔｒａｔｅｇｙ  ＤＮＡ  ｄｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｏｆ  ＰＣＲ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５  ：  ｅｌ３０４２．
３４．  Ｓｐａｎｇｌｅｒ  Ｒ，  Ｇｏｄｄａｒｄ  ＮＬ，  Ｔｈａｌｅｒ  ＤＳ  （２００９）  Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒｏａｄ  ｒａｎｇｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｗ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４：  ｅ７０１０．
３５．  Ｔｒｅｖｉｎｏ  Ｓ，  Ｍａｈｏｎ  ＣＲ  （２０００）  Ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ．  Ｉｎ：  Ｍａｈｏｎ  ＣＲ，  Ｍａｎｕｓｅｌｉｓ  Ｇ，  ｅｄｉｔｏｒｓ．  
Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：  Ｗ．Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ｐｐ．９９８−  １００８．
３６．  Ｌｉｎ  ＪＨ，  Ｔｓｅｎｇ  ＣＰ，  Ｃｈｅｎ  ＹＪ，  Ｌｉｎ  ＣＹ，  Ｃｈａｎｇ  ＳＳ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｒａｐｉｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４６：  １０９０−１０９７．
３７．  Ｔａｊｉｒｉ−Ｕｔａｇａｗａ  Ｅ，  Ｈａｒａ  Ｍ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，  Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｍ，  Ｗａｋｉｔａ  Ｔ  （２００９）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｒａｐｉｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｒｏｕｔｉｎｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｎｏｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４７：  ４３５−４４０．
３８．  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  Ｔ，  Ｂｉｂｂｙ  Ｓ，  Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ  Ｄ，  Ｂｅｌｆｉｏｒｅ  Ｔ，  Ｌａｍｂｉｅ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔ  ｃｕｒｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ  ｇｅｎｅ．  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １０７：  ２０１７−２０２８．
３９．  Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ＡＪ，  Ｉｎｍａｎ−Ｂａｍｂｅｒ  Ｊ，  Ｇｉｆｆａｒｄ  ＰＭ，  Ｈｕｙｇｅｎｓ  Ｆ  （２００８）  Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｐａ  ｒｅｐｅａｔ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５４：  ４３２−４３６．
４０．  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ＭＰ，  Ｒｅｌｌｅｒ  ＬＢ，  Ｍｕｒｐｈｙ  ＪＲ，  Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ  ＫＡ  （１９８３）  Ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ：  Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ５００  ｅｐｉｓｏｄｅｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ  ａｎｄ  ｆｕｎｇｅｍｉａ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ．  Ｉ．  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ．  Ｒｅｖ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ５：  ３５−  ５３．
４１．  Ｒｅｌｌｏ  Ｊ，  Ｑｕｉｎｔａｎａ  Ｅ，  Ｍｉｒｅｌｉｓ  Ｂ，  Ｇｕｒｇｕｉ  Ｍ，  Ｎｅｔ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ  ｉｎ  ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ  ｉｌｌ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ９：  ２２−２５．
４２．  Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ＪＬ，  Ｓａｎｆｏｒｄ  ＬＮ，  Ｗｉｔｔｗｅｒ  ＣＴ  （２０１０）  Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＤＮＡ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇ  １０：  ２１９−２４０．
４３．  Ｍａｒｔｉｎｅａｕ  Ｆ，  Ｐｉｃａｒｄ  ＦＪ，  Ｒｏｙ  ＰＨ，  Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ  Ｍ，  Ｂｅｒｇｅｒｏｎ  ＭＧ  （１９９８）  Ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ−ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３６：  ６１８−６２３．
【図１】
2014516529.tif 000006
【図２】
2014516529.tif 000007
【図３Ａ】
2014516529.tif 000008
【図３Ｂ】
2014516529.tif 000009
【図３Ｃ】
2014516529.tif 000010
【図３Ｄ】
2014516529.tif 000011
【図４】
2014516529.tif 000012
【図５】
2014516529.tif 000013
【図６】
2014516529.tif 000014
【配列表】
2014516529000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年1月17日(2014.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の１つまたは複数の標的細菌ＤＮＡを選択的に増幅する方法において、
複数の融合プローブと前記標的微生物ＤＮＡをハイブリダイズさせるステップであって、前記融合プローブのそれぞれが、ウイルス配列または人為的に設計された配列から選択される非細菌ＤＮＡ配列を有する５’末端部分と細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の部分に相補的な配列を有する３’末端部分からなるステップと、
ハイブリダイズしていない融合プローブ、および前記標的細菌ＤＮＡの結合していない、いずれの３’末端部分も除去するステップと、
前記融合プローブおよび前記標的細菌ＤＮＡの３’末端を伸長させて、二本鎖のプライマー−伸長鋳型を形成させるステップと、
前記融合プローブの非細菌配列に相補的な非細菌配列を有する少なくとも１つのプライマーを含むプライマーセットを用いてＰＣＲ法を実施して、前記プライマー−伸長鋳型を選択的に増幅するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記除去するステップおよび伸長させるステップが、エキソヌクレアーゼＩとＫｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼの混合物を加えることを含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記融合プローブの前記３’末端部分の配列が、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の保存部分に相補的であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記ＰＣＲ法が、標準的ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲから選択されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、前記試料が、細菌ＤＮＡ汚染に対して未処理であることを特徴とする方法。
【請求項６】
被験体の細菌感染を検出するための方法において、
前記被験体の試料に複数の融合プローブを加えるステップであって、前記融合プローブのそれぞれが、ウイルス配列または人為的に設計された配列から選択される非細菌ＤＮＡ配列を有する５’末端部分と細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の部分に相補的な配列を有する３’末端部分からなるステップと、
前記融合プローブと試料中の細菌ＤＮＡをハイブリダイズさせるステップと、
ハイブリダイズしていない融合プローブ、および前記細菌ＤＮＡの結合していない、いずれの３’末端部分も除去するステップと、
前記融合プローブおよび前記細菌ＤＮＡの３’末端を伸長させて、二本鎖のプライマー−伸長鋳型を形成させるステップと、
前記融合プローブの非細菌配列に相補的な非細菌配列を有する少なくとも１つの順方向プライマーを含むプライマーセットを用いてＰＣＲ法を実施することにより、前記プライマー−伸長鋳型を増幅するステップと、
増幅ＰＣＲ産物を分析して、細菌の有無を判定するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法において、前記試料が、細菌ＤＮＡ汚染に対して未処理であることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項６に記載の方法において、前記融合プローブの前記３’末端部分の配列が、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の保存部分に相補的であることを特徴とする方法。
【請求項９】
ＰＣＲ法による選択的増幅のために、試料中の標的細菌ＤＮＡからプライマー−伸長ＤＮＡ鋳型を生成させるための融合プローブであって、前記融合プローブが、
ウイルス配列または人為的に設計された配列から選択される非細菌配列を有する５’末端部分と、
細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の部分に相補的な配列を有する３’末端部分と
からなることを特徴とする融合プローブ。
【請求項１０】
請求項９に記載の融合プローブにおいて、前記非細菌配列が、Ｍ１３順方向プライマー配列であることを特徴とする融合プローブ。
【請求項１１】
請求項９に記載の融合プローブにおいて、前記融合プローブの前記３’末端部分の配列が、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の保存配列に相補的であることを特徴とする融合プローブ。
【請求項１２】
選択的ＰＣＲ増幅および検出のために、標的微生物ＤＮＡからプライマー−伸長ＤＮＡ鋳型を生成させるためのキットであって、
請求項９に記載の複数の融合プローブ
を含むことを特徴とするキット。
【請求項１３】
請求項１２に記載のキットにおいて、３’→５’エキソヌクレアーゼとＫｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼの混合物をさらに含むことを特徴とするキット。
【請求項１４】
試料中の標的細菌を検出するためのシステムにおいて、
試料を受け取るための試料受取ユニットと、
試料処理ユニットと、
試料を分析するための試料分析ユニットと
を含み、前記試料処理ユニットが、
前記試料に請求項９に記載の複数の融合プローブを加え、前記融合プローブが前記試料中の細菌ＤＮＡとハイブリダイズすることが可能になる反応条件を維持するステップと、
分解／伸長試薬を加えて、
ハイブリダイズしていない融合プローブ、および前記ハイブリダイズした標的細菌ＤＮＡの結合していない３’末端部分を除去し、
二本鎖のプライマー−伸長鋳型が生成するように、前記ハイブリダイズした融合プローブおよび標的微生物ＤＮＡの３’末端を、３’から５’方向に伸長させるステップと、
ＰＣＲ試薬を加え、反応条件を維持して前記プライマー−伸長鋳型のＰＣＲ増幅を実施するステップであって、前記ＰＣＲ試薬が、前記融合プローブの非細菌配列に相補的な配列を有する少なくとも１つのプライマーを含むステップと、
分析のための分析ユニットに処理試料を送るステップと
を実施するように構成されたコンピューター制御ユニットであることを特徴とするシステム。
【請求項１５】
請求項１４に記載のシステムにおいて、前記分析ユニットが、高分解能融解曲線分析ユニットであることを特徴とするシステム。
【国際調査報告】
2014516529.tif 000015