(57)【要約】  本願は、例えば、プロトロンビン（第ＩＩ因子）などの組換え凝固因子タンパク質を精製する方法に関する。いくつかの実施形態において、本方法は、生物活性の増大及びトロンビンのレベル低下を呈示し、それにより、プロトロンビンの安全性を高める精製プロトロンビンを提供する。また、精製組換え凝固因子タンパク質も提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え凝固因子タンパク質を精製する方法であって、以下：
ａ）前記組換え凝固因子タンパク質を含む混合物を用意するステップ；
ｂ）前記混合物を、少なくとも第１カラムを通して濾過することにより、第１カラム生成物を生成するステップ；
ｃ）前記第１カラム生成物を、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）カラムを通して濾過することにより、ＰＥＩカラム生成物を生成するステップ；及び
ｄ）前記精製組換え凝固因子タンパク質を回収するステップ
を含み、前記精製組換え凝固因子タンパク質が、約０．８／１０、０．７／１０、０．６／１０、０．５／１０又は０．４／１０未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位を含む、方法。
【請求項２】
前記組換え凝固因子タンパク質が、プロトロンビン（第ＩＩ因子）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記混合物が、バイオリアクターからの濾過混合物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ｂ）における前記濾過が、第１陰イオン交換カラムによる濾過を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１陰イオン交換カラムによる濾過が、結合及び溶出濾過を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ｂ）における前記濾過が、第２陰イオン交換カラムを通して前記第１陰イオン交換カラム生成物を濾過することにより、第２陰イオンカラム生成物を生成するステップをさらに含む、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記第２陰イオン交換カラムによる濾過が、フロースルー濾過を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｃ）における前記濾過の前に、前記第１カラム生成物及び／又は第２カラム生成物を溶媒／界面活性剤不活性化によって不活性化するステップをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ｃ）におけるポリ（エチレンイミン）カラムによる前記第１カラム生成物の濾過が、結合及び溶出濾過を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）による、前記ＰＥＩカラム生成物の濾過をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＥＩカラム生成物の濾過が、結合及び溶出濾過を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ｄ）における前記回収前にナノ濾過をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記組換えプロトロンビンタンパク質が、実質的にトロンビンを含まない、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記精製組換え凝固因子タンパク質が、約０．４／１０未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
組換え凝固因子タンパク質を精製する方法であって、以下：
ａ）組換え凝固因子タンパク質を含有する混合物を用意するステップ；
ｂ）前記混合物を、少なくとも第１陰イオン交換カラムを通して濾過することにより、第１陰イオン交換カラム生成物を生成するステップ；
ｃ）前記第１陰イオン交換カラム生成物を、溶媒／界面活性剤ウイルス不活性化で不活性化することにより、不活性化混合物を生成するステップ；
ｄ）前記不活性化混合物を、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）カラムを通して濾過することにより、ＰＥＩカラム生成物を生成するステップ；
ｅ）前記ＰＥＩカラム生成物を、疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）で濾過することにより、疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）生成物を生成するステップ；
ｆ）前記ＨＩＣ生成物を濾過するステップ；
ｇ）前記精製組換え凝固因子タンパク質を回収するステップ
を含み、前記精製組換え凝固因子タンパク質が、約０．８／１０、０．７／１０、０．６／１０、０．５／１０若しくは０．４／１０未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位を含む、方法。
【請求項１６】
前記組換え凝固因子タンパク質が、プロトロンビン（第ＩＩ因子）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記混合物が、バイオリアクターからの濾過混合物である、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
ｂ）における少なくとも第１陰イオン交換カラムによる前記濾過が、結合及び溶出濾過を含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ｂ）における前記濾過が、第２陰イオン交換カラムを通して前記第１陰イオン交換カラム生成物を濾過するステップをさらに含む、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
第２陰イオン交換カラムによる前記濾過が、フロースルー濾過を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ｄ）における前記濾過が、結合及び溶出濾過を含む、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ｅ）における前記濾過が、結合及び溶出濾過を含む、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ｆ）における前記濾過が、ナノ濾過を含む、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記組換えプロトロンビンタンパク質が、実質的にトロンビンを含まない、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記精製組換え凝固因子タンパク質が、約０．４／１０未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位を含む、請求項１５〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
組換えプロトロンビン（第ＩＩ因子）タンパク質を精製する方法であって、以下：
ａ）組換えプロトロンビンタンパク質を含有するバイオリアクターからの濾過混合物を用意するステップ；
ｂ）前記混合物を、第１陰イオン交換カラムを通して結合及び溶出濾過することにより、第１陰イオン交換カラム生成物を生成するステップ；
ｃ）前記第１陰イオン交換カラム生成物を、第２陰イオン交換カラムを通して濾過することにより、第２陰イオン交換カラム生成物を生成するステップ；
ｄ）前記第２陰イオン交換カラム生成物を、溶媒／界面活性剤ウイルス不活性化で不活性化することにより、不活性化混合物を生成するステップ；
ｅ）前記不活性化混合物を、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）カラムを通して結合及び溶出濾過することにより、ＰＥＩカラム生成物を生成するステップ；
ｆ）前記ＰＥＩカラム生成物を、疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）を通して結合及び溶出濾過することにより、ＨＩＣ生成物を生成するステップ；
ｇ）前記ＨＩＣ生成物をナノ濾過するステップ；
ｈ）前記精製組換えプロトロンビンタンパク質を回収するステップ
を含み、前記精製組換えプロトロンビンタンパク質（第ＩＩ因子）が、約０．８／１０、０．７／１０、０．６／１０、０．５／１０若しくは０．４／１０未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位を含む、方法。
【請求項２７】
前記組換えプロトロンビンタンパク質が、実質的にトロンビンを含まない、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記精製組換え凝固因子が、約０．７／１０、０．６／１０、０．５／１０若しくは０．４／１０未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位を含む、請求項２６又は請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
約０．５／１０未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位を含み、しかも、実質的にトロンビンを含まない、精製組換えプロトロンビンタンパク質（第ＩＩ因子）。
【請求項３０】
約０．４／１０未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位を含む、請求項２９に記載の精製組換えプロトロンビンタンパク質。
【請求項３１】
前記タンパク質が、凝固アッセイにおいて約７０％超の生物活性を呈示する、請求項２９又は３０に記載の精製組換えプロトロンビンタンパク質。
【請求項３２】
前記タンパク質が、自動校正トロンビン生成（ＣＡＴ）アッセイにおいて約７０％超の生物活性を呈示する、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の精製組換えプロトロンビンタンパク質。
【請求項３３】
前記タンパク質が、約２ｎｇ／ｍｌ未満のトロンビンを含む、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の精製組換えプロトロンビンタンパク質。
【請求項３４】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法によって調製される、約０．５／１０未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位を含み、しかも、実質的にトロンビンを含まない、精製組換えプロトロンビンタンパク質（第ＩＩ因子）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、例えば、プロトロンビン（第ＩＩ因子）などの組換え凝固因子タンパク質を精製する方法に関する。いくつかの実施形態において、本方法は、生物活性の増大及びトロンビンのレベル低下を呈示し、それにより、プロトロンビンの安全性を高める精製プロトロンビンを提供する。また、精製組換え凝固因子タンパク質も提供される。
【背景技術】
【０００２】
治療用途（例えば、血友病及びその他の血液障害の治療）のための凝固因子は、ヒト血漿から得ることができるが、精製は煩雑になりうる。広範な安全対策及び血液由来タンパク質製品の試験を行っても、感染性ウイルス又はプリオンの混入を排除することはできない。従って、動物由来の成分を含まない培地で増殖させた組換え細胞からヒト治療用タンパク質を生産することが非常に望ましい。多くのタンパク質は、十分に機能性の形態で生産する、すなわち、正確に翻訳後修飾するために、哺乳動物宿主を必要とすることから、上記のことは常に簡単というわけではない。
【０００３】
第ＩＩ因子（プロトロンビン）は、血液凝固に必要な凝固因子である。外因性（又は組織因子）血液凝固経路において、組織因子は、凝固カスケードをトリガーするが、ここで、プロトロンビンは、第Ｘａ因子、第Ｖａ因子、リン脂質、及びＣａ２＋イオンの存在下で、活性化形態、すなわち、第ＩＩａ因子（トロンビン）になる。トロンビンは、複数の経路を介し、フィブロネクチンをフィブリンクロットに変換し、別の凝結促進経路に参加することによって、出血を止める働きをする。
【０００４】
組換えプロトロンビンタンパク質の生産及び精製の際に、トロンビンは、目的物質由来不純物として存在する可能性がある。遊離トロンビンのレベルは、生成物の安全性を高めるために低レベルに維持しなければならない。さらに、組換えプロトロンビンは、Ｎ末端ドメイン中に１０γカルボキシグルタミン酸「Ｇｌａ残基」を含有する。これらの残基は、上記タンパク質とリン脂質の結合（プロトロンビンのトロンビンへの活性化に必須条件である）を媒介するＣａ２＋イオンをキレート化すると考えられる。
【発明の概要】
【０００５】
本願の発明者らは、高レベルのγカルボキシル化グルタミン酸残基を有し、しかもトロンビン混入が低い組換え精製プロトロンビンを提供する精製方法が必要であることをみいだした。
【０００６】
本発明は、前述の必要性を満たすための凝固タンパク質の精製方法を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、組換え凝固因子タンパク質を精製する方法が提供される。これらの方法は、好適には、組換え凝固因子タンパク質を含む混合物を用意することを含む。この混合物を、少なくとも第１カラムを通して濾過することにより、第１カラム生成物を生成する。第１カラム生成物を、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）カラムを通して濾過することにより、ＰＥＩカラム生成物を生成し、精製した組換え凝固因子タンパク質を回収する。好適には、精製組換え凝固因子タンパク質は、約０．５／１０未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位を含む。いくつかの実施形態では、組換え凝固因子タンパク質は、プロトロンビン（第ＩＩ因子）である。
【０００８】
好適には、この混合物は、バイオリアクターからの濾過混合物である。いくつかの例示的実施形態では、混合物の濾過は、第１陰イオン交換カラムによる濾過、好適には、結合及び溶出濾過を含む。いくつかの実施形態では、第１カラム生成物は、第２陰イオン交換カラム、好適には、フロースルー濾過を通して濾過することができる。
【０００９】
いくつかの実施形態では、第１カラムは、ポリ（エチレンイミン）カラムによる濾過の前に、溶媒／界面活性剤不活性化によって不活性化した生成物である。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレンイミン）カラムによる濾過は、結合及び溶出濾過である。好適には、ＰＥＩカラム生成物は、例えば、結合及び溶出濾過の疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）を通し、濾過する。いくつかの実施形態では、本方法は、回収前にナノ濾過を含んでもよい。
【００１０】
好適な実施形態では、組換えプロトロンビンタンパク質は、実質的にトロンビンを含まず、約０．８／１０、０．７／１０、０．６／１０、０．５／１０若しくは０．４／１０未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位を含む。
【００１１】
別の実施形態では、組換え凝固因子タンパク質（例えば、プロトロンビン（第ＩＩ因子））を精製する方法が提供される。本方法は、好適には、組換え凝固因子タンパク質を含有する混合物を用意するステップと、少なくとも第１陰イオン交換カラム（例えば、結合及び溶出濾過）を通してこの混合物を濾過することにより、第１陰イオン交換カラム生成物を生成するステップを含む。第１陰イオン交換カラム生成物を、溶媒／界面活性剤ウイルス不活性化で不活性化することにより、不活性化混合物を生成する。好適には、不活性化混合物を、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）カラム（例えば、結合及び溶出濾過）を通して濾過することによって、ＰＥＩカラム生成物を生成した後、ＰＥＩカラム生成物を、疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）を通して濾過することにより、ＨＩＣ生成物を生成する。いくつかの実施形態では、次に、ＨＩＣ生成物を濾過（例えば、ナノ濾過）してから、精製組換え凝固因子タンパク質を回収する。いくつかの実施形態では、精製組換え凝固因子タンパク質は、約０．８／１０、０．７／１０、０．６／１０、０．５／１０若しくは０．４／１０未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位を含む。特定の実施形態では、ＰＥＩカラムによる濾過の前に、第１陰イオン交換カラム生成物を、第２陰イオン交換カラムを通して濾過すること（例えば、フロースルー濾過）により、第２陰イオン交換カラム生成物を生成する。次に、第２陰イオン交換カラム生成物を、ＰＥＩカラムを通して濾過することにより、ＰＥＩカラム生成物を生成する。
【００１２】
好適には、組換えプロトロンビンタンパク質は、実質的にトロンビンを含まず、しかも、好適には、約０．８／１０、０．７／１０、０．６／１０、０．５／１０若しくは０．４／１０未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位を含む。
【００１３】
別の実施形態では、組換えプロトロンビン（第ＩＩ因子）タンパク質を精製する方法が提供される。本方法は、好適には、組換え凝固因子タンパク質を含むバイオリアクターからの濾過混合物を用意するステップ、第１陰イオン交換カラムを通して混合物を結合及び溶出濾過することにより、第１陰イオン交換カラム生成物を生成するステップ、第１陰イオン交換カラム生成物を、第２陰イオン交換カラムを通してフロースルー濾過することにより、第２陰イオン交換カラム生成物を生成するステップ、第２陰イオン交換カラム生成物を溶媒／界面活性剤ウイルス不活性化で不活性化することにより、不活性化混合物を生成するステップ、不活性化混合物を、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）カラムを通して結合及び溶出濾過することにより、ＰＥＩカラム生成物を生成するステップ、ＰＥＩカラム生成物を、疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）を通して結合及び溶出濾過することにより、ＨＩＣ生成物を生成するステップ、ＨＩＣ生成物をナノ濾過するステップ、並びに精製組換えプロトロンビンタンパク質を回収するステップを含む。
【００１４】
好適には、精製組換えプロトロンビンタンパク質（第ＩＩ因子）は、約０．８／１０、０．７／１０、０．６／１０、０．５／１０若しくは０．４／１０未満のγカルボキシル化グルタミン酸部位を含み、好適には、実質的にトロンビンを含まない。
【００１５】
また別の実施形態では、精製された組換えプロトロンビンタンパク質（第ＩＩ因子）が提供される。好適には、このタンパク質は、約０．８／１０、０．７／１０、０．６／１０、０．５／１０若しくは０．４／１０未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位を含み、好適には、実質的にトロンビンを含まない。
【００１６】
いくつかの実施形態では、精製組換えプロトロンビンは、凝固アッセイにおいて約７０％超の生物活性、及び／又は自動校正トロンビン生成（ＣＡＴ）アッセイにおいて、約７０％超の生物活性を示す。好適には、このタンパク質に含まれるトロンビンは、約２ｎｇ／ｍｌに満たない。
【００１７】
別の実施形態、これら実施形態の特徴及び利点、並びに様々な実施形態の構造及び操作について、添付の図面を参照にしながら、以下に詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本明細書に開示する精製方法の一例のフローチャートを示す。
【図２】プロトロンビンのドメインアーキテクチャを示し、Ｎ末端Ｇｌａドメイン中の１０個のγカルボキシル化グルタミン（Ｇｌａ）酸残基を表示する。
【図３】組換えプロトロンビンのＣｌｏｔ及びＣＡＴバイオアッセイにおける相対効力（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性）に対する翻訳後カルボキシル化の程度を示す。
【図４】ポリ（ＰＥＩ）カラムを用いた濾過の関数としてのＣＡＴバイオアッセイの結果を示す。
【図５】組換え第ＩＩ因子の断片Ｋ１（５Ａ）及びＫ２（５Ｂ）でのグルタミン酸（Ｇｌａ）のγカルボキシル化を示す。
【図６】組換え第ＩＩ因子の断片Ｋ１３（Ｎ３７３）のグリコプロフィールを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書に示し、説明する特定の実施内容は、例であり、それ以外に、本願の範囲を何ら制限する意図はないことを理解すべきである。
【００２０】
本明細書において参照する公開特許、特許出願、ウェブサイト、会社名、及び科学文献は、その各々を参照として組み込むことが明示的かつ個別に示されているのと同じ程度まで、それらの全文を本明細書に参照として組み込むものとする。本明細書に引用するいずれかの参照文献と、本明細書の特定の教示内容の間に何らかの矛盾が生じた場合には、後者を優先するものとする。同様に、単語又はフレーズの当分野で理解される定義と、本明細書で具体的に教示される単語又はフレーズの定義の間に何らかの矛盾が生じた場合も、後者を優先するものとする。
【００２１】
本明細書で用いられるように、本文の内容が明らかに別のことを指示するのでない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、それらが指す用語の複数形も含むものとする。「約」という用語は、本明細書において、およそ、ほぼ、概算で、又は前後を意味するのに用いられる。用語「約」が、数値範囲と一緒に用いられるとき、記載する数値より上及び下まで境界を拡大することによってその範囲を改変する。一般に、用語「約」は、本明細書において、記載する数値より上及び下に、２０％の分散で変更するのに用いられる。
【００２２】
別に定義されていない限り、本明細書で用いる技術及び科学用語は、本発明が関連する分野の当業者によって一般に理解されている意味を有する。本明細書では、当業者には公知の様々な方法論及び材料を参照する。組換えＤＮＡ技術の一般原理を記載する標準的参照文献としては、以下：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，”ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（１９９５）；及びＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｅｄ．，“Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，”ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）があり、これら各々の開示内容は、その全部を参照として本明細書に組み込むものとする。
【００２３】
いくつかの実施形態では、組換え凝固因子タンパク質を精製する方法が提供される。好適な実施形態では、本方法は、組換え凝固因子タンパク質を含む混合物を用意するステップを含む。この混合物を、少なくとも第１カラムを通して濾過することにより、第１カラム生成物を生成する。次に、第１カラム生成物を、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）カラムを通して濾過することによって、ＰＥＩカラム生成物を生成する。その後、精製した組換え凝固因子タンパク質をＰＥＩカラム生成物から回収する。
【００２４】
実施形態例では、精製される組換え凝固因子タンパク質は、ヒトプロトロンビン（第ＩＩ因子）である。用語「プロトロンビン」、「第ＩＩ因子」、「組換えプロトロンビン」及び「組換え第ＩＩ因子」は、全体を通して置換え可能に用いられる。本明細書に記載の方法を用いて、別の組換え凝固因子タンパク質を精製することもでき、このようなタンパク質として、例えば、第ＶＩ因子及び第ＩＸ因子がある。
【００２５】
本明細書で用いる、「組換え凝固因子タンパク質」は、原核及び真核生物発現系の両方を含むあらゆる好適な発現系を用いて、又はファージディスプレイ方法を用いて、作製される凝固因子ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質を指す（例えば、Ｄｏｗｅｒら、国際公開第９１／１７２７１号パンフレット及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、国際公開第９２／０１０４７号パンフレット；並びに米国特許第５，９６９，１０８号明細書を参照；尚、これらの文献は、その全文を参照として本明細書に組み込むものとする）。用語「タンパク質」及び「（複数の）タンパク質」は、全体を通して置換え可能に用いられることを理解すべきである。
【００２６】
本明細書で用いる用語「ペプチド」又は「ポリペプチド」は、好ましくは、α−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、Ｌアミノ酸、及びこれらの組合せの、規定順序の連結から形成されるポリマー、及びその組合せを指す。１つのアミノ酸残基と次の残基との連結は、アミド結合又はペプチド結合と呼ばれる。タンパク質は、複数のポリペプチドサブユニットを有するポリペプチド分子である。その違いは、ペプチドが一般に短く、ポリペプチド／タンパク質が、一般に長いアミノ酸鎖であることである。用語「タンパク質」は、また、糖タンパク質及びリポタンパク質などの誘導体化分子、さらには、より低い分子量のポリペプチドも包含するものとする。「アミノ酸配列」、及び「ポリペプチド」又は「タンパク質」などの類似用語は、表示したアミノ酸配列を、列挙したタンパク質分子に関連する完全なネイティブアミノ酸配列に限定することを意図するわけではない。
【００２７】
細菌、植物、酵母、昆虫及び哺乳動物細胞などの様々な宿主細胞を用いて、組換え凝固因子タンパク質を作製する方法は、公知である。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）、他の細菌宿主、酵母、並びに様々な高等真核細胞、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及び骨髄腫細胞系などを用いたタンパク質の発現のために、多数の発現系が入手可能である。
【００２８】
手短には、所望の凝固因子タンパク質をコードする天然又は合成核酸は、一般に、ＤＮＡ又はｃＤＮＡをプロモータ（構成性若しくは誘導性のいずれか）に機能的に連結した後、発現カセットへの組込みを行うことによって達成される。カセットは、原核又は真核細胞系のいずれへの複製及び組込みにも好適でありうる。典型的発現カセットは、転写及び翻訳ターミネータ、開始配列、並びにタンパク質をコードするＤＮＡの発現の調節に有用なプロモータを含む。クローン化遺伝子の高レベルの発現を達成するためには、最低限、転写を指令する強力なプロモータ、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、及び転写／翻訳ターミネータを含む発現カセットを構築することが望ましい。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の場合、これは、Ｔ７、ｔｒｐ、ｌａｃ、若しくはλプロモータなどのプロモータ、リボソーム結合部位及び転写終結シグナルを含む。真核細胞の場合には、制御配列は、免疫グロブリン遺伝子由来のプロモータ及びエンハンサー、ＳＶ４０、サイトメガロウイルス、並びにポリアデニル化配列を含むことができ、また、スプライスドナー及びアクセプター配列を含んでもよい。カセットは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のための、塩化カルシウム形質転換又はエレクトロポレーション、また、哺乳動物細胞のためのリン酸カルシウム処理、又はエレクトロポレーション若しくはリポフェクションなどの公知の方法によって、選択した宿主細胞に移入することができる。カセットによって形質転換した細胞は、カセットに含まれる遺伝子、例えば、ａｍｐ、ｇｐｔ、ｎｅｏ及びｈｙｇ遺伝子により賦与される抗生物質耐性によって、選択することができる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、組換え凝固因子タンパク質は、例えば、米国特許第７，８４２，４７７号明細書及び同第７，９８９，１９３号明細書（その各々の開示内容は、その全文を参照として本明細書に組み込むものとする）に記載のように作製されるヒトプロトロンビン（第ＩＩ因子）である。米国特許第７，８４２，４７７号明細書及び同第７，９８９，１９３号明細書は、組換えプロトロンビンの作製に有用な核酸配列、プラスミド及び宿主細胞を開示している。
【００３０】
精製方法の一例を図１に示し、本明細書でさらに詳しく説明する。
【００３１】
全体を通して用いる「精製する」、「精製」又は「精製した」という用語は、所望の組換えタンパク質（単数又は複数）が、別のタンパク質、産物若しくは構造物を少なくとも約７５％含まない、別のタンパク質、産物若しくは構造物を少なくとも約８０％含まない、別のタンパク質、産物若しくは構造物を少なくとも約９０％含まない、より好適には、別のタンパク質、産物若しくは構造物を少なくとも約９５％含まない、最も好適には、別のタンパク質、産物若しくは構造物を少なくとも約９８％含まないように、所望の組換えタンパク質（単数又は複数）を別のタンパク質又は不要な産物若しくは構造物から取り出す（又は不要な産物若しくは構造物を所望のタンパク質から除去する）方法を指すのに用いる。
【００３２】
全体を通して説明する精製方法によって、不要な宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）及び別の構造物（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）などの構造物、並びに組換え凝固因子タンパク質の不要な形態、望ましくない形態、若しくは非最適形態が、所望の最終組換えタンパク質又はタンパク質から、好適に除去される。
【００３３】
本明細書で用いる「濾過（すること）」という用語は、溶液又は混合物中の不要な、若しくは望ましくない成分が濾材によって除去されるように、組換えタンパク質を含む混合物を、濾材と接触させて配置することを意味する。組換えタンパク質を含む「混合物」はまた、多くの場合、バッファー若しくは別の液体媒質中に、様々なＨＣＰ、核酸、タンパク質の組換え形態などの別のタンパク質を含んでいてもよい。
【００３４】
いくつかの実施形態では、組換え凝固因子タンパク質の混合物は、バイオリアクターからの濾過混合物の生成物であるか、又はバイオリアクター、又は組換え凝固因子タンパク質を作製するのに用いられる他の方法の直接生成物であってもよい。
【００３５】
本明細書に開示する方法で用いる濾材の例としては、各種紙フィルター、織り繊維、ポリマーを基材とするカラム濾材、アガロース、デキストラン及び天然濾材、並びに当分野では公知の他の濾材がある。好適には、濾材は、ポリマーを基材とする濾材、並びにアガロース又はデキストランを基材とする濾材であり、例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）及びポリ（エチレンイミン）濾材である。
【００３６】
いくつかの実施形態例では、組換え凝固因子を含む混合物は、第１陰イオン交換カラム（すなわち、アガロース濾材を用いて調製されるクロマトグラフィー又は濾過カラム）を用いて濾過する。好適な陰イオン交換カラムの例として、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）カラム、例えば、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムがあり、これらは、高度に架橋した４％アガロース、ビーズサイズが約４５〜１６５μｍの範囲の球体ビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を含む。このようなカラムを調製する方法（使用する濾材の量、カラムを保持及び調製するための装置を含む）、並びにこれらのカラムを用いて混合物を濾過する方法は、当業者には公知である。このような方法は、好適には、予め決定した量の混合物のカラムへの添加、カラムを平衡又は洗浄するためのバッファー若しくは他の媒質の添加、並びに予め決定した流量でカラムにバッファー若しくは洗浄媒質を通過させることを含む。
【００３７】
いくつかの実施形態例では、第１陰イオン交換カラムを通して混合物を濾過した後、第２陰イオン交換カラムで濾過する。好適には、使用する第１及び第２陰イオン交換カラムは、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムである。いくつかの実施形態では、追加の陰イオン交換カラムを用いることもできる。例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個などの陰イオン交換カラムを通して、混合物を濾過することができる。また、別のタイプのカラム又は濾材を用いて、組換え凝固因子タンパク質を含む混合物を最初に濾過することもできる。
【００３８】
濾過から得られる生成物は、本明細書では、濾過に用いられるカラムの種類に応じて、「生成物」、「カラム生成物」、「陰イオン交換カラム生成物」又は「ＰＥＩカラム生成物」と称する。陰イオン交換カラムによる濾過は、フロースルー濾過又は結合及び溶出濾過のいずれであってもよい。本明細書で用いる「フロースルー型」濾過は、混合物をカラムに添加し、好ましくは、これに続いて、バッファー若しくは洗浄液を添加した後、混合物をカラムに通過させる濾過を指す。濾過から得られる生成物（「カラム生成物」）は、非結合生成物としてカラムを通過する物質である。不要な、又は望ましくないあらゆる成分（例えば、ＤＮＡ、タンパク質、細胞産物など）は、カラム上に保持される。
【００３９】
本明細書で用いる「結合及び溶出」濾過若しくは濾過すること、又は「結合及び溶出する」とは、カラムを用いた濾過を指し、ここで、混合物をカラムに添加し、好適には、続いて、洗浄若しくは平衡バッファーを添加する。所望の物質は、初めにカラムに保持される（すなわち、カラム媒質に結合するか、又はこれによって保持される）が、不要若しくは望ましくない成分は、カラムを通過する。次に、好適なバッファーを用いた溶出によって、カラムから所望の生成物（すなわち、初めにカラムに結合した物質）を溶出させる。このような実施形態において、カラム生成物は、カラムを通過して、保持されなかった混合物の不要な若しくは望まない成分の除去後に回収される物質である。
【００４０】
いくつかの実施形態例では、第１陰イオン交換カラム（例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）カラム）による混合物の濾過は、陰イオン交換カラム生成物を得るために結合及び溶出濾過を含む。好適には、混合物を濾過するのに、第２陰イオン交換カラムを用いた場合、第２陰イオン交換（例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標））カラムは、フロースルー濾過を含む。陰イオン交換カラムによるいずれの追加濾過も、必要に応じて、結合及び溶出濾過又はフロースルー濾過を含むことができる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本方法はさらに、溶媒／界面活性剤不活性化によって第１カラム生成物（すなわち、第１陰イオン交換カラムの生成物、又は２つの陰イオン交換カラムを用いる場合、第２陰イオン交換カラムの生成物）を不活性化して、不活性化混合物を形成することも含む。好適には、この不活性化は、例えば、ポリ（エチレンイミン）カラムを用いた、いずれか別の濾過の前に行う。好適には、不活性化は、ウイルスの脂質コーティングにおける分子同士の相互作用を切断するための界面活性剤の使用を含む。好適には、脂質コートと界面活性剤の間に凝集反応が急速に起こる環境を形成する溶媒を用いる。界面活性剤及び溶媒の例は、当分野では公知であり、例えば、界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００がある。
【００４２】
好適には、不活性混合物を少なくとも１つのポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）カラムで濾過することによって、ＰＥＩカラム生成物を生成する。好適な実施形態では、ポリ（エチレンイミン）カラムを介した不活性化混合物の濾過は、結合及び溶出濾過を含む。
【００４３】
本明細書に記載の方法で使用するポリ（エチレンイミン）カラムの例として、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ（商標）ＸＷＰ  ５００  Ｐｏｌｙ  ＰＥＩ−３５（ポリ（エチレンイミン））カラム（ＰｏｌｙＰＥＩ）がある。このようなカラム例には、疎水性ポリマーに結合したポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）（ＡＶＡＮＴＯＲ（商標）、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）が含まれる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本方法はさらに、１つ以上の陰イオン交換カラム、好適にはＰｈｅｎｙｌ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムを通して、ＰＥＩカラム生成物を濾過するステップを含む。いくつかの実施形態では、疎水性相互作用によるＰＥＩカラム生成物の濾過は、結合及び溶出濾過を含む。また、ＰＥＩ濾過に続き、他のカラム濾過を用いて、組換え凝固因子タンパク質をさらに精製した後、回収することもできる。
【００４５】
好適な実施形態では、精製した組換え凝固タンパク質の回収前に、混合物をナノ濾過する。いくつかの実施形態では、ナノ濾過は、ＰＥＩカラムによる濾過後に行ってもよく（すなわち、ＰＥＩカラム生成物をナノ濾過する）、別の実施形態では、ナノ濾過は、疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）又は別の好適なカラムによるＰＥＩカラム生成物の濾過後に行ってもよい（すなわち、ＨＩＣ生成物をナノ濾過する）。ナノ濾過方法及びナノ濾過用の濾材の例は、当分野では公知であり、好適には、孔径が約１ｎｍの膜を使用する。ナノ濾過膜は、好適には、１０００原子質量単位（ダルトン）未満の分画分子量（ＭＷＣＯ）を有する。
【００４６】
本明細書に記載する方法によって、好適には、実質的にトロンビンを含まない組換え凝固タンパク質、好適には、プロトロンビン（第ＩＩ因子）を生成する。本明細書に記載のように、組換えプロトロンビンからのトロンビンの除去（又は存在するトロンビンの量の好適レベルまでの低減）によって、最終タンパク質製品の安全性を高める。本明細書で用いられる「実質的にトロンビンを含まない」とは、最終生成物が、タンパク質生成物の総質量に基づき、約２０％未満のトロンビン、好適には約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．１％未満、約０．０５％未満、約０．０１％未満、約０．００５％未満又は約０．００１％未満のトロンビンを含有することを示すのに用いる。好適には、最終生成物中のトロンビンの量は、約１０ｎｇ／ｍｌ未満のトロンビン、より好適には約９ｎｇ／ｍｌ未満のトロンビン、約８ｎｇ／ｍｌ未満のトロンビン、約７ｎｇ／ｍｌ未満のトロンビン、約６ｎｇ／ｍｌ未満のトロンビン、約５ｎｇ／ｍｌ未満のトロンビン、約４ｎｇ／ｍｌ未満のトロンビン、約３ｎｇ／ｍｌ未満のトロンビン、約２ｎｇ／ｍｌ未満のトロンビン、又は約１ｎｇ／ｍｌ未満のトロンビンである。
【００４７】
十分に機能性の組換えヒト凝固因子を多量に生成する上での大きな障害の１つは、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子及びプロテインＣに存在するＧｌａドメインにある。このドメインは、カルボキシル基の添加によって翻訳後に修飾されるグルタミン酸残基を含有する。これらの因子の生成は、それらの過剰発現のために、低カルボキシル化、従って、不活性のタンパク質が生じることによって、阻害される。Ｇｌａ修飾は、γグルタミルカルボキシラーゼ（ＧＣＣＸ）と呼ばれるビタミンＫ依存性酵素の作用の結果である（例えば、国際公開第８８／０３９２６号パンフレット；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４（５０３８）：１６３４−１６３６，１９９１を参照）。
【００４８】
図２に示すように、組換えプロトロンビンは、Ｎ末端ドメインに１０の「Ｇｌａ残基」を含む。これらは、タンパク質の生物学的活性に影響を与えるγカルボキシル化グルタミン酸（Ｇｌａ）残基である。これらの残基は、トロンビンへのプロトロンビン活性化の必須条件である、リン脂質膜とタンパク質の結合を媒介するＣａ２＋イオンをキレート化すると考えられる。
【００４９】
ヒト第ＩＩ因子（プロトロンビン）の場合、十分に機能性のプロトロンビンを得るためには、１０Ｇｌｕ残基のうち少なくとも８つを正確に修飾しなければならない（Ｍａｌｈｏｔｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２７９−２８７，１９８５；Ｓｅｅｇｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗａｌｚ‘Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ’，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）。数種の異なる系、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞及びワクチンウイルス発現系を用いて、ｒｈＦＩＩの高生産レベルを達成するために多大な努力がなされてきた（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：６７２９−６７３４，１９８７；Ｒｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １４（２）：２２２−２３３，１９９１；Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３８（２）：１２９−１３６，１９９５；Ｈｅｒｌｉｔｓｃｈｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．８（３）：３５８−３６４，１９９６；Ｒｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１０：２１４−２２５，１９９７）。組換え第ＩＩ因子の作製方法の例は、例えば、米国特許第７，８４２，４７７号明細書及び同第７，９８９，１９３号明細書（各々の開示内容は、その全文を参照として本明細書に組み込むものとする）に開示されている。
【００５０】
本明細書に記載する方法に従って精製される組換え凝固因子タンパク質（好適にはプロトロンビン（第ＩＩ因子））は、１０のうち約１（１／１０）未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸（Ｇｌａ）部位を含む。すなわち、全タンパク質サンプルに対する平均を考慮すると、タンパク質中の１０のグルタミン酸部位のうち、好適には、１／１０未満のＧｌａ部位がγ−カルボキシル化されていない、すなわち、平均して、１／１０未満のγ−カルボキシル化グルタミン酸（Ｇｌａ）部位が欠損している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、好適には、サンプルの平均で、約０．９／１０未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位、より好適には、約０．８／１０未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位、約０．７／１０未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位、約０．６／１０未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位、約０．５／１０未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位、約０．４／１０未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位、約０．３／１０未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位、約０．２／１０未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位、約０．２／１０未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位を含むか、又は欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位を一切含まないプロトロンビンを提供する。
【００５１】
本明細書に記載するように、本発明者らは、開示する方法によって、実質的にトロンビンを含まず、かつ約０．５／１０未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位を含むプロトロンビン（第ＩＩ因子）等の精製組換え凝固因子タンパク質が作製されることをみいだした。これらの精製組換え凝固因子タンパク質の生物活性を試験することによって、欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位の数の減少は、Ｃｌｏｔ及びＣＡＴアッセイで測定されるような生物活性の増大と相関することを明らかにする（Ｃｌｏｔ及びＣＡＴアッセイの実施例での説明を参照）。図３を参照されたい。実施例に記載するように、この相関は、上記アッセイによって測定可能な１００％生物活性を示す対照標準と比較して、約７０％超、好適には約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％超、又は約１００％生物活性である、精製タンパク質の生物活性を提供する。
【００５２】
活性増大の理由に関するいずれの理論に拘束される意図はないが、ポリ（ＰＥＩ）カラムを用いた濾過による組換え凝固タンパク質の精製によって、含まれる欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位の数が減少した（すなわち、０．５未満の欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位）組換え凝固因子タンパク質が提供されると考えられる。
【００５３】
別の実施形態では、組換え凝固因子を精製する別の方法が提供される。好適には、本方法は、組換え凝固因子タンパク質を含む混合物を用意することを含む。この混合物を、少なくとも第１陰イオン交換カラムを通して濾過することにより、第１陰イオン交換カラム生成物を得る。第１陰イオン交換カラム生成物を溶媒／界面活性剤ウイルス不活性化で不活性化することによって、不活性化混合物を生成する。不活性化混合物を、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）カラムを通して濾過することにより、ＰＥＩカラム生成物を得る。ＰＥＩカラム生成物を、疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）を通して濾過することにより、ＨＩＣ生成物を得る。ＨＩＣ生成物をさらに濾過する。その後、精製組換え凝固因子タンパク質を回収する。
【００５４】
好適には、組換え凝固因子タンパク質は、プロトロンビン（第ＩＩ因子）であるが、本方法は、別の組換え凝固因子タンパク質まで容易に広げることができる。
【００５５】
いくつかの例示的な実施形態では、組換え凝固因子タンパク質を含む最初の混合物は、バイオリアクターからの濾過混合物である。
【００５６】
いくつかの実施形態では、少なくとも第１陰イオン交換カラムによる濾過は、結合及び溶出濾過を含み、また、第２陰イオン交換カラムを通して、第１陰イオン交換カラム生成物を濾過するステップをさらに含んでもよい。追加の陰イオン交換カラムを用いることもできる。好適には、第２陰イオン交換カラムによる濾過は、フロースルー濾過を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態例では、ＰＥＩフィルターによる陰イオン交換カラム生成物の濾過は、結合及び溶出濾過を含む。また、ＰＥＩカラム生成物の濾過は、好適には、疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）も含む。いくつかの実施形態では、ＨＩＣ生成物の濾過は、ナノ濾過を含む。
【００５８】
本明細書に記載する方法は、組換え第ＩＩ因子の回収後にさらなる濾過を含んでもよく、このような濾過として、例えば、最終生成物の限外濾過又は膜分離法がある。
【００５９】
全体を通じて説明するように、精製方法によって、好適には、トロンビンを実質的に含まない組換えプロトロンビンタンパク質が得られる。さらに、組換え凝固因子タンパク質は、好適には、約１／１０未満の欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位、より好適には、約０．９／１０未満の欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位、約０．８／１０未満の欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位、約０．７／１０未満の欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位、約０．６／１０未満の欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位、約０．５／１０未満の欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位、約０．４／１０未満の欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位、約０．３／１０未満の欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位、約０．２／１０未満の欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位、約０．２／１０未満の欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位を含むか、又は欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位を一切含まない。
【００６０】
別の実施形態例では、組換えプロトロンビン（第ＩＩ因子）タンパク質を精製する別の方法が提供される。図１は、方法の一例のフローチャート１００を示す。好適には、組換えプロトロンビンタンパク質を含むバイオリアクターからの濾過混合物を用意する（１０２）。いくつかの実施形態では、この混合物は、バイオリアクター回収物の深層濾過の生成物であってよい。
【００６１】
この混合物を、結合及び溶出濾過を用いて、第１陰イオン交換カラム（好適には、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム）を通して濾過する（１０４）ことにより、第１陰イオン交換カラム生成物を得る。第１陰イオン交換カラム生成物は、好適には、フロースルー濾過を用いて、第２陰イオン交換カラム（好適には、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム）を通して濾過する（１０６）ことにより、第２陰イオン交換カラム生成物を生成する。１０８では、第２陰イオン交換カラム生成物を、溶媒／界面活性剤ウイルス不活性化で不活性化することにより、不活性化混合物を生成する。
【００６２】
次に、不活性化混合物を、好適には、結合及び溶出濾過を用いて、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）カラムを通して濾過する（１１０）ことにより、ＰＥＩカラム生成物を生成する。次に、ＰＥＩカラム生成物を、好適には、結合及び溶出濾過を用いて、疎水性相互作用カラム（例えば、フェニルＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム）を通して濾過する（１１２）ことにより、ＨＩＣ生成物を生成する。次に、ＨＩＣ生成物をナノ濾過して（１１４）、精製組換えプロトロンビンタンパク質を回収する（１１６）。
【００６３】
本明細書に記載するように、好適には、精製組換えプロトロンビンタンパク質は、実質的にトロンビンを含まず、しかも、約０．５／１０未満の欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位、より好適には、約０．４／１０未満の欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法は、前述のステップから構成され、前述したものを越える追加的介入ステップは一切許容されない。別の実施形態では、本明細書に記載する方法は、前述したステップからほぼ構成される。このような実施形態において、組換えタンパク質の物理的若しくは化学的性質を改変するステップの追加は、こうした方法に対する重要な変更とみなされるため、前述のステップからほぼ構成される方法からは除外される。
【００６５】
本明細書に記載する方法における濾過の順序及び回数は変更することができ、その場合でも、所望の生物活性、低レベルのトロンビン、及び減少したレベルの欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位を有する、所望の精製組換え凝固因子タンパク質が達成される。
【００６６】
さらに別の実施形態例では、精製組換えプロトロンビンタンパク質（第ＩＩ因子）が提供される。好適には、精製組換え第ＩＩ因子タンパク質は、約１／１０未満のγ−カルボキシル化グルタミン酸部位を含み、しかも、トロンビンを実質的に含まない。
【００６７】
好適には、精製組換え第ＩＩ因子タンパク質は、約０．９／１０未満の欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位、より好適には約０．８／１０未満の欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位、約０．７／１０未満の欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位、約０．６／１０未満の欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位、約０．５／１０未満の欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位、約０．４／１０未満の欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位、約０．３／１０未満の欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位、約０．２／１０未満の欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位、約０．１／１０未満の欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位を含むか、又は欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位を一切含まない。
【００６８】
本明細書に記載のように、組換え第ＩＩ因子タンパク質は、タンパク質生成物の全質量に基づいて、好適には約２０％未満のトロンビン、好適には約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．１％未満、約０．０５％未満、約０．０１％未満、約０．００５％未満又は約０．００１％未満のトロンビンを含む。好適には、精製組換え第ＩＩ因子タンパク質は、約１０ｎｇ／ｍｌのトロンビン、より好適には約９ｎｇ／ｍｌのトロンビン、約８ｎｇ／ｍｌのトロンビン、約７ｎｇ／ｍｌのトロンビン、約６ｎｇ／ｍｌのトロンビン、約５ｎｇ／ｍｌのトロンビン、約４ｎｇ／ｍｌのトロンビン、約３ｎｇ／ｍｌのトロンビン、約２ｎｇ／ｍｌのトロンビン、又は約１ｎｇ／ｍｌのトロンビンを含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、精製組換えプロトロンビンタンパク質は、対照標準と比較して、凝固アッセイ（クロットアッセイ）において約５０％超の生物活性を呈示する。好適には、精製組換えプロトロンビンタンパク質は、凝固アッセイにおいて約６０％超の生物活性、より好適には、凝固アッセイにおいて約７０％超の生物活性、凝固アッセイにおいて約７５％超の生物活性、凝固アッセイにおいて約８０％超の生物活性、凝固アッセイにおいて約８５％超の生物活性、凝固アッセイにおいて約９０％超の生物活性、又は凝固アッセイにおいて約９５％超の生物活性を呈示する。
【００７０】
いくつかの実施形態例では、精製組換えプロトロンビンタンパク質は、対照標準と比較して、自動校正トロンビン生成（ＣＡＴ）アッセイにおいて約５０％超の生物活性を呈示する。好適には、精製組換えプロトロンビンタンパク質は、ＣＡＴアッセイにおいて約６０％超の生物活性、より好適には、ＣＡＴアッセイにおいて約７０％超の生物活性、ＣＡＴアッセイにおいて約７５％超の生物活性、ＣＡＴアッセイにおいて約８０％超の生物活性、ＣＡＴアッセイにおいて約８５％超の生物活性、ＣＡＴアッセイにおいて約９０％超の生物活性、又はＣＡＴアッセイにおいて約９５％超の生物活性を呈示する。
【００７１】
いくつかの実施形態例では、精製第ＩＩ因子タンパク質は、凝固アッセイ（クロットアッセイ）において約５０％超の生物活性を呈示し、かつ自動校正トロンビン生成（ＣＡＴ）アッセイにおいて約５０％超の生物活性を呈示する。
【００７２】
また、本明細書に記載するいずれか方法によって調製される、組換えプロトロンビンタンパク質（第ＩＩ因子）が提供される。好適には、これらの第ＩＩ因子タンパク質は、約０．５／１０未満の欠損γ−カルボキシル化グルタミン酸部位を含み、実質的にトロンビンを含まない。
【００７３】
本明細書に記載する方法及び応用に対して、これら実施形態のいずれの範囲を逸脱することなく、他の好適な変更及び改変を実施できることは、当業者には容易に理解されよう。以下の実施例は、説明の目的で本明細書に含まれるにすぎず、限定を意図するものではない。
【実施例】
【００７４】
実施例１：カラムクロマトグラフィーに関する材料及び方法
以下は、全体を通して説明するカラムクロマトグラフィーに関連する材料及び方法の例である。
【００７５】
Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ結合及び溶出クロマトグラフィー（Ｑ  Ｂ＆Ｅ）
Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）（ＱＦＦ  Ｂ＆Ｅ）を２５ｍＭクエン酸塩、３０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化した後、ロードする。順化培地をｐＨ６．０にｐＨ調節した後、２００ｃｍ／時の線形速度で、樹脂Ｌ当たり４〜１１グラムの生成物をロードする。次に、カラムを再平衡化した後、２５ｍＭクエン酸塩、１７３ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０で洗浄する。洗浄後、カラムを２５ｍＭクエン酸塩、３０８ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０までの段階で溶出させる。
【００７６】
Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗフロースルークロマトグラフィー（Ｑ  ＦＴ）
Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムをフロースルー方式で操作する。カラムを２５ｍＭクエン酸塩、４００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化した後、２００ｃｍ／時の線形速度で、生成物をロードする。ローディングは、典型的に、樹脂Ｌ当たり２〜６グラムのタンパク質とする。ローディングの後、カラムを平衡バッファーで洗浄することにより、非結合生成物を収集する。
【００７７】
ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ（商標）ＸＷＰ  ５００  ＰｏｌｙＰＥＩ−３５結合及び溶出クロマトグラフィー（ＰｏｌｙＰＥＩ）
疎水性ポリマー（ＰｏｌｙＰＥＩ）（ＡＶＡＮＴＯＲ（商標）、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）に結合されたＢＡＫＥＲＢＯＮＤ（商標）ＸＷＰ  ５００  Ｐｏｌｙ  ＰＥＩ−３５（ポリ（エチレンイミン））カラム（ポリ（エチレンイミン）を含むカラム）（ＰＥＩ）を１２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４％（ｗ／ｗ）クエン酸塩、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．５で前平衡化した後、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４％（ｗ／ｗ）クエン酸塩、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．５で平衡化する。次に、カラムを１４０ｃｍ／時で樹脂Ｌ当たり５〜１２グラムのタンパク質をロードする。カラムを平衡バッファー、続いて、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４％（ｗ／ｗ）クエン酸塩、１．０４Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．５で洗浄する。次に、１Ｍから１．６〜２．１Ｍ塩化ナトリウムまでの直線勾配で溶出させる。
【００７８】
Ｐｈｅｎｙｌ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ結合及び溶出クロマトグラフィー（Ｐｈｅｎｙｌ  ＨＰ）
カラムを２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、４％（ｗ／ｗ）クエン酸塩、１Ｍ硫酸ナトリウム、ｐＨ６．５で平衡化する。ＰＥＩカラムからの溶出液を１Ｍ硫酸ナトリウムまで調節した後、１００ｃｍ／時で樹脂Ｌ当たり１〜１２グラムのタンパク質をロードする。カラムを再平衡化した後、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．４％（ｗ／ｗ）クエン酸塩、０．７５Ｍ硫酸ナトリウム、ｐＨ６．５で洗浄する。カラムを０．７５から０Ｍ硫酸ナトリウムまでの勾配で溶出させる。
【００７９】
ハイドロキシアパタイト結合及び溶出クロマトグラフィー（ＣＨＴ）
低レベルのリン酸ナトリウム（１０〜５０ｍＭ）と、様々なレベルの塩化ナトリウム（０．１〜１Ｍ  ＮａＣｌ）を含有するｐＨ６．５のバッファーで、カラムを平衡化する。カラムに、１００ｃｍ／時で、樹脂Ｌ当たり５〜１０グラムのタンパク質をロードする。ローディングの後、低リン酸バッファーと、様々な濃度の塩化ナトリウムでカラムを平衡化する。次に、ｐＨ６．５で２００〜４００ｍＭリン酸ナトリウムまでのリン酸濃度の増加直線勾配で生成物を溶出させる。
【００８０】
実施例２：プロトロンビンの精製
組換えヒトプロトロンビン（第ＩＩ因子）（ｒｈＦＩＩ）タンパク質をＣＨＯ細胞において発現させてから、好適には、４つのクロマトグラフィーステップ、溶媒／界面活性剤ウイルス不活性化ステップ、ナノ濾過ステップ、及び最終製剤化のための限外濾過／透析濾過ステップを含む方法で精製する。図１の概略図に、精製方法の一例の概略を示す。図１に示すｒｈＦＩＩ精製方法は、ベンチスケールからスケールアップすることによって、５０Ｌバイオリアクター及び５００Ｌバイオリアクターを精製する。
【００８１】
表１に、代表的５０Ｌ精製から得られた関連カラム及び収率データをまとめる。分析する様々なサンプルの複雑な性質のために、３つの濃度方法を用いて、カラム性能を評価した。２８０ｎｍで測定した吸光度による全タンパク質濃度は、サンプル中の全タンパク質の基準を提供する。これは最も単純な方法であり、これらのサンプルが比較的純粋である（すなわち、ＨＣＰレベルが低い無色のサンプル）であるため、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗフロースルーカラム（Ｑ  ＦＴ）後のサンプルに、この方法を用いる。より時間のかかる第２の方法は、ＲＰ−ＨＰＬＣ方法であり、この方法を用いて、プロセス中間サンプルのいずれかにおけるｒｈＦＩＩの濃度を測定することができる。この濃度方法は、早期カラムにロードされるｒｈＦＩＩの質量の基準を提供するため、主に粗サンプル（最初の２つのカラムからのロード及びプール）のために選択した。ｒｈＦＩＩ精製方法の性能を測定するのに用いられる最終濃度アッセイは、プロトロンビナーゼアッセイであり、これは、活性ｒｈＦＩＩの濃度を測定する。
【００８２】
【表１】
2014525475.tif 000003
【００８３】
表１からわかるように、様々な濃度測定の結果、様々なカラムについて、特にサンプルが、後のカラムより、はるかに粗製である捕捉カラムにおいて、非常に異なる段階収率が得られた。予想通り、ＲＰ−ＨＰＬＣ濃度を用いた捕捉カラムについて計算した収率は、プロトロンビナーゼアッセイを用いて計算した収率よりはるかに低く、これは、生成物関連ではないか、又は所望の生成物より活性の低い不純物の除去がなされたことを示している。他方で、全タンパク質濃度を用いたＰｈｅｎｙｌ  ＨＰカラムについて計算した収率は、プロトロンビナーゼアッセイ濃度から計算した収率と非常に類似しており、これは、このカラムからのロード及びプールが非常に純粋であることを示している。
【００８４】
表２に、同じ５０Ｌ精製からの中間（ｉｎ−ｐｒｏｃｅｓｓ）生成物をまとめる。表２からわかるように、最初の２つのイオン交換カラムでは、プロセス関連不純物、特に、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）及びＤＮＡの大部分が除去され、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＦＦフロースループールは、ほとんどが生成物及び生成物関連変種である。
【００８５】
他方で、ＨＰ−ＩＥＣプレピーク値によって測定される生成物関連変種、特に、γカルボキシル化変種のレベルは、最初の２つのカラムにわたって比較的不変のままである。最初の２つのカラム後のＩＥＣ−ＨＰＬＣプレピークの典型的レベルは、４０％前後であるが、次に、これをＰｏｌｙＰＥＩカラムにロードして、完全にγカルボキシル化した生成物を濃縮させる。これは、直線塩化ナトリウム勾配を用いて、γカルボキシル化部位の少ない（すなわち、欠損γカルボキシル化部位がより多い）生成物（勾配の早期に溶出する）を、γカルボキシル化のレベルがより高い生成物（これは勾配の後期に溶出する）から分離することによって達成される。
【００８６】
【表２】
2014525475.tif 000004
【００８７】
５０Ｌ精製溶出ピークを約０．５〜１．０カラム容量画分で分画し、モックプールを作製した後、ＨＰ−ＩＥＣで分析した。表３に、個別の画分、並びに個別の画分から作製したモックプールについてのＨＰ−ＩＥＣプレピークレベルを記載する。表３からわかるように、後期溶出画分及び後期溶出画分を含むプールは、より低いレベルのＨＰ−ＩＥＣプレピークであったが、これは、より高いレベルのγカルボキシル化と相互に関係している。インプロセス制御（ＩＰＣ）戦略を用いて、溶出ピークを分画し、ＨＰ−ＩＥＣによりモックプールを分析して、＜２５％プレピークを含む最も包括的なプールを展開させた。このＩＰＣ制御戦略は、タンパク質が、所望の規格：＜３０％ＨＰ−ＩＥＣプレピークを満たすことを可能にした。というのは、残りのカラム（Ｐｈｅｎｙｌ  ＨＰ）は、γカルボキシル化のレベルが異なる材料を分離しないからである。この特定のランでは、モックプール３（画分８〜１８）を展開させた。厳密に制御したＨＰ−ＩＥＣプレピークレベルの結果、最終原薬材料は、欠損γカルボキシル化のレベルが低く（１０部位のうち平均０．３８（０．３８／１０）がγカルボキシル化を欠損）、しかも、ＣＬＯＴ及びＣＡＴバイオアッセイの両方で高度に活性であった。
【００８８】
【表３】
2014525475.tif 000005
【００８９】
実施例３：組換え第ＩＩ因子のペプチドマッピング
この実施例では、ＣＨＯ細胞系に発現させた組換えヒト第ＩＩ因子タンパク質のペプチドマッピング分析を説明する。
【００９０】
ヒト組換え第ＩＩ因子は、グルタミン酸（Ｇｌａ）のγカルボキシル化、グリコシル化、及び起こりうる断片化などの数種の重要な翻訳後修飾（ＰＴＭ）を含む。これらは、第ＩＩ因子の機能に有意に寄与することから、薬物開発の際にはこれらの修飾をモニターすることが望ましい。
【００９１】
ペプチドマッピング分析のために、タンパク質サンプルをタンパク質分解酵素で処理することにより、ペプチド断片を生成し、これらを分離した後、ＨＰＬＣ−ＭＳによって同定する。対照標準との比較により、組換え第ＩＩ因子サンプルに対するペプチドマッピングアッセイを使用して、それらの一次構造を確認すると共に、ＰＴＭを検出することができる。
【００９２】
材料及び方法
本方法は、ジスルフィド結合決定アッセイから派生するものである。手短には、組換え第ＩＩ因子サンプルをＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）と一緒にインキュベートして、存在しうる全ての遊離チオールをキャップした後、グアニジンと混合することにより、タンパク質構造を変性させる。中性ｐＨで、タンパク質をエンドプロテイナーゼリシルエンドペプチダーゼ（Ｌｙｓ−Ｃ）とインキュベートすることによって、消化方法を実施する。逆相ＵＰＬＣによってＬｙｓ−Ｃ断片を分離した後、Ｔｈｅｒｍｏ  ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計によって分析する。
【００９３】
データ及び論考
表４に示すように、２５のＬｙｓ−Ｃ断片が同定され、これらは、第ＩＩ因子配列の約７５％を占めている。唯一の有意なギャップは、その領域に切断部位が欠失しているために、残基５７〜２００を含んでいる。対照標準から生成された全てのフラグメントを分離して、ＭＳ測定を可能にするのに、９０ｍｉｎのＨＰＬＣ勾配が十分有効であることがわかった。
【００９４】
【表４】
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2014525475.tif 000007
【００９５】
一次構造の確認以外に、このアッセイは、組換え第ＩＩ因子の重要なＰＴＭをモニターするのに用いることもできる。図５Ａ及び５Ｂは、組換え第ＩＩ因子対照標準が、断片Ｋ１及びＫ２の両方で高いＧｌａレベルを含むことを示し、図６は、断片Ｋ１３のグリコシル化プロフィールを示す。これらの質量スペクトルに基づき、抽出したイオンクロマトグラムを用いて、様々な種のおおよその割合（％）を計算することができる。
【００９６】
これらの結果は、組換え第ＩＩ因子についてのペプチドマッピングアッセイを提供するものであり、これは、タンパク質の一次構造を確認するだけではなく、Ｇｌａレベル及びグリコシル化プロフィールなどのあらゆる修飾をモニターすることもできる。
【００９７】
実施例４：ＰｏｌｙＰＥＩクロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーでのトロンビン低減
ポリ（ポリ（エチレンイミン））（ＰｏｌｙＰＥＩ）（ＡＶＡＮＴＯＲ（商標）、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ  ＮＪ）は、弱陰イオン交換樹脂であり、これは、溶媒−界面活性剤ウイルス不活性化処理後の組換え第ＩＩ因子精製プロセスにおいて、結合及び溶出カラムとして作動させる。このクロマトグラフィー濾過は、残留溶媒−界面活性剤を除去すると考えられている。また、この濾過は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）も２桁で除去し、ＤＮＡクリアランスに寄与すると共に、トロンビンを除去し、また、勾配形式のランであれば、高度にカルボキシル化し（すなわち、欠損γカルボキシル化グルタミン酸部位のレベルが低い）、かつ高度に活性の組換え第ＩＩ因子を富化できることがわかっている。
【００９８】
樹脂を２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．４％クエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．５で平衡化した後、組換え第ＩＩ因子を陰イオン交換カラムに、５〜１２ｇ／Ｌ樹脂の負荷容量までロードする。このクロマトグラフィーステップを１４０ｃｍ／時の線形速度で実施する。次に、カラムを同じバッファーですすぎ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．４％クエン酸ナトリウム、１．０４Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．５で洗浄した後、１２カラム容量について、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．４％クエン酸ナトリウム、１．６６Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５で洗浄した。
【００９９】
溶出プロフィールは、数個のフロントショルダーを有する幅広のピークを示す。溶出の間、個別の画分（サイズが約０．５カラム容量の画分）を収集した後、イオン交換（ＩＥＸ）ＨＰＬＣプレピーク分析に付す。上記勾配で早期に溶出する画分は、高いＩＥＣプレピークのｒｈＦＩＩを含んでおり、これは、不完全なカルボキシル化（及び低生物活性）を示すものである。これらを最終生成物プールから排除する。プレピーク含有率が低い組換え第ＩＩ因子を含む（後に溶出する）画分のみを合わせることにより、溶出液プールが、プレピーク含有率＜２５％（ペプチドマッピングによって決定される、５％未満の欠損（すなわち、０．５／１０未満の欠損）カルボキシル化グルタミン酸残基に相当する）の組換え第ＩＩ因子を含むようにする。
【０１００】
電荷変種の分離
組換え第ＩＩ因子は、Ｎ末端ドメイン中に１０個のいわゆる「Ｇｌａ−残基」を含む（図２を参照）。これらは、タンパク質の生物活性に直接関連すると考えられるγカルボキシル化グルタミン酸（グルタミン酸塩）残基である。これらの残基は、Ｃａ２＋イオンをキレート化すると考えられており、これらのイオンは、組換え第ＩＩ因子のトロンビンへの活性化に必須条件である、リン脂質膜へのタンパク質の結合を媒介する。
【０１０１】
翻訳後修飾と生物活性との関係を調べるために、オルトゴナル法により電荷変種の分取を実施した。個別の画分を生物活性試験並びに質量分析法及びＩＥＸ  ＨＰＬＣによる翻訳後修飾の分析に付した。初めに、（１）Ｑ捕捉陰イオン交換クロマトグラフィー、（２）フロースルー方式のＱセファロースクロマトグラフィー、（３）フロースルー方式のフェニル−セファロースでの疎水性相互作用クロマトグラフィー及び（４）結合−溶出方式のポリ（ＰＥＩ）クロマトグラフィーのシーケンスによって、組換え第ＩＩ因子を９８．６％純度まで精製した。
【０１０２】
「電荷変種」、すなわち、Ｇｌａ−ドメインに様々な程度のカルボキシル化を含む組換え第ＩＩ因子の種を分離する能力について、数種の樹脂を評価した。最善の方法は、いずれも直線勾配溶出方式で操作するヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（ＣＨＴ）（表５）及びポリＰＥＩ（ＰＰＥＩ）上での陰イオン交換クロマトグラフィー（表６）であることがわかった。いずれのクロマトグラフィー方法についても、溶出中に個々の画分を収集して、（ｉ）ＩＥＸ  ＨＰＬＣによって決定されるそれらのプレピーク、（ｉｉ）質量分析ペプチドマッピングによる、それらのカルボキシル化／翻訳後修飾の程度、（ｉｉｉ）クロットアッセイ（Ｃｌｏｔ  Ａｓｓａｙ）、及び（ｉｖ）自動校正トロンビン生成（ＣＡＴ）アッセイでの生物活性について分析した。
【０１０３】
クロットアッセイは、組換え第ＩＩ因子を添加したとき、クロット形成を開始するのに要する時間を測定する。この方法では、組織因子、リン脂質及びＣａ２＋イオンの存在下で、組換え第ＩＩ因子を第ＩＩ因子欠失血漿（第ＩＩ因子以外のすべての必要な凝固因子を含む血漿）に添加することによって、クロット形成を刺激する。ＡＣＬ  ＴＯＰ凝固分析装置は、クロット形成の開始によって起こる血漿サンプルの光学密度の増加を検出することにより、クロット形成を測定する。アッセイにおける設定閾値までの光学密度の上昇を観察するのに要する時間、すなわち、プロトロンビンクロット時間（又はＰＴクロット時間）を計器によって記録すると、これは、試験サンプル中に存在する活性トロンビンを形成することができる第ＩＩ因子の量と直接比例する。各試験サンプルを計器により４倍に希釈した後、各希釈物のクロット形成を開始する時間を計器により決定する。次に、サンプルのクロット時間を計器によりプロットし、各アッセイについて同じ方法で作成した対照標準曲線と比較し、対数変換した後、平行線分析法を用いて、類似性を評価する。サンプルと対照標準曲線が平行である（同等の勾配を有する）ならば、対照標準曲線及び試験サンプル曲線の切片の比によって、第ＩＩ因子試験サンプルの効力を決定する。組換え第ＩＩ因子試験サンプルの効力も、ＷＨＯ  Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＮＩＢＳＣから）との比較により比活性（ＩＵ／ｍｇ）として記録する。
【０１０４】
自動校正トロンビン生成（ＣＡＴ）アッセイは、組換え第ＩＩ因子のトロンビン生成能力を決定するのに用いられるトロンビン生成アッセイである。サンプルを４つの濃度に希釈し、各サンプル希釈物を３回繰り返して測定する。第ＩＩ因子を欠失した乏血小板血漿及び「トリガー溶液」（組織因子、Ｃａ２＋、リン脂質小胞）をサンプルに添加する。第ＩＩ因子欠失血漿、アッセイバッファー、及びデータ補正のためのアミド分解剤（トロンビンキャリブレータ）を用いて、キャリブレータウェルを調整する。次に、緩徐な蛍光発生トロンビン基質を全ウェルに添加する。プロトロンビンがトロンビンに変換されると、トロンビンは、蛍光基質を切断する。切断された基質は、蛍光を発し、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを備えるＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒによって、この蛍光を検出する。各アッセイウェルの蛍光を２０秒毎に６０分間測定する。４つの濃度の各サンプルについて、組換え第ＩＩＩ因子のＥｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ＥＴＰ）を測定する。サンプルの相対効力を勾配比法によって測定する。４つの濃度の各々に対しＥＴＰの値をプロットすることによって、各サンプルの勾配を計算する。最良適合線を作成し、各サンプルの勾配を与える。サンプルの勾配を対照標準の勾配と比較し、結果を相対効力パーセントとして表示する。相対効力パーセントを用いて、血漿由来のＷＨＯ第ＩＩ因子国際標準に対する組換え第ＩＩ因子サンプルの比活性を決定する。
【０１０５】
【表５】
2014525475.tif 000008
【０１０６】
【表６】
2014525475.tif 000009
【０１０７】
相対活性と欠損Ｇｌａ（Ｘ／１０）との関係を示す図３から明らかなように、Ｃｌｏｔ及びＣＡＴバイオアッセイにおいて、翻訳後カルボキシル化の程度と、相対効力（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性）の間に強い相関関係がみとめられる。これは、高度にカルボキシル化した生成物を生成することを目的とした、組換え第ＩＩ因子の上流及び下流の組合せ処理におけるプロセス制御の利点を示している。
【０１０８】
精製過程での組換え第ＩＩ因子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性をＣＡＴバイオアッセイによってモニターすると、表７に示すように、ＰｏｌｙＰＥＩクロマトグラフィーステップ後に、有意な「活性化」がみとめられる。
【０１０９】
【表７】
2014525475.tif 000010
【０１１０】
ＰｏｌｙＰＥＩクロマトグラフィー中に取り出した「洗浄画分」を、このカラムからの精製溶出液に再添加すると、図４に示すように、生物活性の低下をみとめることができ、これは、このカラムが、阻害性混入物を除去する可能性を示している。
【０１１１】
組換え第ＩＩ因子の同様の「活性化」は、結合−溶出方式で作動させる場合、ブルーセファロース、フェニルセファロース及びカプト・アドヘア（ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ）などの他のクロマトグラフィー樹脂でも達成することができる。
【０１１２】
最後に、疎水性相互作用クロマトグラフィーを、結合−溶出方式で操作するフェニルセファロースＨＰ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で実施した。このカラムは、断片Ｉ、トロンビン、残留混入宿主細胞タンパク質及びＤＮＡを除去するのに役立つ。硫酸ナトリウムをリオトロピック塩として用い、２部のロード調節バッファー（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．４％クエン酸ナトリウム、１Ｍ硫酸ナトリウム、１．８６Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．５）を３部のＰｏｌｙＰＥＩ溶出液に添加することによって、ロード調製を実施する。２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．４％クエン酸ナトリウム、１．０Ｍ硫酸ナトリウム、ｐＨ６．５で、フェニルセファロースカラムを平衡化してから、調節済ｒｈＦＩＩを３〜１０ｇ／Ｌ樹脂の容量までカラムにロードする。続いて、カラムを同じバッファーですすいだ後、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．４％クエン酸ナトリウム、０．７５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．５で洗浄する。溶出は、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．４％クエン酸ナトリウム、ｐＨ６．５までの直線勾配で、６ＣＶにわたって実施する。疎水性相互作用カラムから溶出した組換え第ＩＩ因子は、透析濾過又は当業者には公知の他の好適な方法によって、回収、濃縮及び製剤化して、最終精製組換え第ＩＩ因子生成物を得る。
【０１１３】
トロンビンスパイク研究から、ｐｏｌｙＰＥＩ上での陰イオン交換クロマトグラフィーが、調製物中のトロンビン含量を低減する上で有用であることがわかっている。市販のトロンビン（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＨＴ  ３５６４Ａ；３０５９単位／ｍｇ）をＰｏｌｙＰＥＩカラムのロードに添加した後、カラムフロスルー（非結合画分）、洗浄及び溶出画分中のトロンビン含量を測定した。トロンビン活性については色素原及び蛍光アッセイの両方を使用した。
【０１１４】
出発材料は、Ｑフロースルーカラムから回収して、溶媒−界面活性剤で処理した組換え第ＩＩ因子であった。５６．６７ｇのこの材料（濃度２．８ｍｇ／ｍｌ）に１ｕｇのトロンビンを添加した後、ＰｏｌｙＰＥＩカラムに直接ロードし、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．４％クエン酸塩、ｐＨ６．５中で平衡化した。カラムを２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１．０４Ｍ  ＮａＣｌ、０．４％クエン酸塩、ｐＨ６．５で洗浄した後、１．８６Ｍ  ＮａＣｌ（同じバッファー中）までの直線勾配で、１２カラム容量にわたって溶出させた。溶出液ピークを収集した。
【０１１５】
カラムロードにおいて、トロンビン含量を７０ｎｇ／ｍｌとして決定した（発色アッセイを用いて）。溶出液画分中、トロンビン含量は、より高感度の蛍光アッセイについて、定量限界を下回る（＜１．８７６ｎｇ／ｍｌ）ことがわかった。カラム洗浄画分中に、トロンビンは全く検出されなかった。トロンビンは、このカラムからのフロースルー（非結合画分）中にしか検出することはできず、ここでは、３．６ｎｇ／ｍｌとして測定された。この結果（及び反復実験からのデータ）は、この方法で用いたバッファー条件下で、トロンビンは、ｐｏｌｙＰＥＩカラムに結合せず、非常に堅く結合する組換え第ＩＩ因子から分離されることを示している。
【０１１６】
実施例５：直線勾配溶出方式でＰｏｌｙＰＥＩを用いたＩＥＣプレピーク含量の制御
組換え第ＩＩ因子について観察されたイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）プレピークは、いわゆる「Ｇｌａドメイン」における１０個のグルタミン酸残基のカルボキシル化の程度を示すものである。高いＩＥＣプレピークは、大きな割合（％）のカルボキシル化グルタミン酸残基欠損分子を示しており、これは、より低い生物活性と相互に関係している。
【０１１７】
弱陰イオン交換樹脂ＰｏｌｙＰＥＩ上での直線勾配溶出は、選択的に富化され、高度にカルボキシル化され、かつ高度に活性の組換え第ＩＩ因子の生成を可能するが、これは、非カルボキシル化タンパク質と比較して、勾配の後期に溶出する。溶出の間、画分を収集し、ＩＥＸ  ＨＰＬＣによって分析する。高いＩＥＣプレピークを示す早期溶出画分は、溶出液プール中に混合しない。
【０１１８】
カラムロードは、Ｑ  Ｂ＆Ｅ及びＱ  ＦＴクロマトグラフィー、続いて溶媒−界面活性剤処理後のタンパク質調製物である。この材料のＩＥＣプレピークは、３９．６％として決定された。ＰｏｌｙＰＥＩ樹脂を、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．４％クエン酸塩、ｐＨ６．５で平衡化した。４．１ｇの組換え第ＩＩ因子（濃度１．２ｇ／Ｌ）を、１４０ｃｍ／時の流量で、カラムにロードした（０．４８ＬのＣＶで）。カラムを同じバッファーですすいでから、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１．０４Ｍ  ＮａＣｌ、０．４％クエン酸塩、ｐＨ６．５で洗浄した後、１．８６Ｍ  ＮａＣｌまでの直線勾配で、１２カラム容量にわたって溶出させた。勾配溶出中に、個々に容量０．５ＣＶ（約２５０ｍｌ）を含む画分を収集し、ＩＥＸ  ＨＰＬＣによって分析した。
【０１１９】
表８は、個々の溶出液画分について、ＩＥＸ  ＨＰＬＣにより決定したプレピークを示す。
【０１２０】
【表８】
2014525475.tif 000011
【０１２１】
画分８〜１８を合わせることによって、２４．９％のＩＥＣプレピークを有する溶出液プールを形成した。Ａ２８０ＵＶ吸光度により決定されるステップ収率は、５５．３％であり、ＰＴａｓｅアッセイにより決定されるものは、７８．５％であった。
【０１２２】
実施例６：プロトロンビン精製方法のスケールアップ
実施例１に記載したｒｈＦＩＩ精製方法を、５００Ｌバイオリアクターを精製するようにスケールアップした。表９に、５００Ｌ精製からのカラム性能データをまとめる。５０Ｌ精製と同様のローディングを維持するために、カラムをほぼ１０の倍率で作製した。
【０１２３】
【表９】
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【０１２４】
表１０は、プロセス中間体中の不純物レベルを示す。既述した５０Ｌ精製と同様に、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦフロースルーカラム後のγカルボキシル化のレベルは、約３３．５％ＨＰ−ＩＥＣプレピークであり、これをγカルボキシル化の富化のためにＰｏｌｙＰＥＩカラムにロードした。同様の操作条件下での５００Ｌスケールの精製と５０Ｌスケールの精製及びベンチスケール精製でのクロマトグラフィー挙動を比較すると、ＰｏｌｙＰＥＩ上での非常に頑健な分離が明らかである。全てのスケールで、複数の早期溶出種をみとめることができる。しかし、各早期溶出種の相対量は、ＰｏｌｙＰＥＩカラムにロードされる材料によって異なる。表１０に、５００Ｌスケール精製からの個別画分及びモックプールについてのＨＰ−ＩＥＣプレピークをまとめる。より小さいスケールのラン（５０Ｌ及びベンチスケールラン）と同様に、早期溶出画分と、より早期の画分を含むモックプールは、より高レベルのプレピークを有したが、これは、より高レベルの欠損γカルボキシル化に相当する。このランについては、モックプール＃２（画分２〜１５）をフェニルクロマトグラフィーまで展開させた。
【０１２５】
【表１０】
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【０１２６】
表１２に、代表的５０Ｌ及び５００Ｌバッチの生成物品質をまとめる。最終原薬は、全てのプロセス関連不純物（ＨＣＰ、ＤＮＡ）並びに全ての生成物関連不純物（凝集物、断片、γカルボキシル化変種、及びシアル化変種）についての放出規格を満たし、その結果、凝固バイオアッセイで高度に活性の生成物が得られた。
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【０１２７】
実施例７：ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによるγカルボキシル化変種の濃縮
ＰｏｌｙＰＥＩクロマトグラフィーに代わるものとして、ヒドロキシアパタイトを、γカルボキシル化種を濃縮する能力について調べた。組換え第ＩＩ因子は、ヒドロキシアパタイトと強力に結合し、塩化ナトリウムを１Ｍの濃度まで増加しても溶離しない。しかし、リン酸イオン濃度の増加によって、組換え第ＩＩ因子をヒドロキシアパタイトカラムから好適に溶出させることができる。表１１に、ベンチスケールのヒドロキシアパタイトランをまとめる。
【０１２８】
全てのランについてロード材料は同じであり、３７．９％ＨＰ−ＩＥＣプレピークを含有したが、これは、より低い平均レベルのγカルボキシル化を有する材料に相当する。リン酸勾配で溶出した３つのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーランの全てで、フロントショルダーが観察されるが、これは、ＰｏｌｙＰＥＩクロマトグラフィー上での塩化ナトリウム勾配中の組換え第ＩＩ因子の挙動と酷似している。これらのランを各々分画し、モックプールを作製した。プール１は、早期溶出画分の大部分を含有し、プール２は、主要ピークの大部分を含むものであった。完全溶出ピークのモックプールも作製した（プール１及び２を混合）。プールのサンプルをＨＰ−ＩＥＣによって試験することにより、ＨＰ−ＩＥＣプレピークのレベルを決定した。
【０１２９】
表１１からわかるように、早期溶出画分を含むプール（早期／プール＃１及び完全／プール１及び２）は、主要プール（＃２）より高いレベルのＨＰ−ＩＥＣプレピークを有していた。これは、ＰｏｌｙＰＥＩ上での陰イオン交換クロマトグラフィーで起こるγカルボキシル化の濃縮と類似している。荷電変種の分離を塩化ナトリウム勾配で行う陰イオン交換クロマトグラフィーとは違い、ヒドロキシアパタイトにおける分離への塩化ナトリウムの作用は、はるかに微小である。例えば、ｒｈＦＩＩは、０．１Ｍ塩化ナトリウムと比較して、１Ｍ塩化ナトリウムの存在下では、リン酸勾配においてより早期に溶出する。しかし、主要プールにおける類似のピーク形状及びＨＰ−ＩＥＣプレピークレベルに基づき、γカルボキシル化変種の分離に対する影響は無視できるほどのものである。このことは、ｒｈＦＩＩとヒドロキシアパタイト同士のメカニズム又は相互作用が、多モードであり、いくつかのイオン相互作用を含むことを示している。
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【０１３０】
また、カラムローディング、滞留時間、及びリン酸勾配の作用も調べた。この決定のために、ローディングを樹脂Ｌ当たり１０グラムの組換え第ＩＩ因子から、樹脂Ｌ当たり５グラムの組換え第ＩＩ因子に減少し、滞留時間を２倍（６分から１２分）にして、リン酸勾配を１０カラム容量にわたって１５０ｍＭ減少した。これらの条件下で、より低いレベルのγカルボキシル化を含む早期溶出ショルダーはさらに分離された。また、複数のショルダーが観察されたことから、早期溶出材料は、様々なレベルの欠損γカルボキシル化を含んでいるようである。これらの操作条件の変化のどれが、分離増大の原因であったのかは不明であるが、恐らく、それぞれの変化が、分離の改善に寄与したのであろう。
【０１３１】
本明細書において、特定の実施形態を示し、説明してきたが、特許請求の範囲は、記載及び図示した部分の特定の形態若しくは構成に限定されるわけではない。本明細書では、例示的実施形態を開示し、特定の用語を使用しているが、これらは、一般的かつ記述的意味でのみ用いられ、限定を目的とするものではない。実施形態の変更及び変形は、以上の教示内容に照らして可能である。従って、具体的に記載したのとは別のやり方で、実施形態を実施してもよいことは、理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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