(57)【要約】  炭素源からｎ−ブチルアルデヒドへの変換が増強されるよう微生物が操作された、高収率でｎ−ブチルアルデヒドを生産する微生物および方法が提供される。変換工程において行うガスストリッピング工程によってｎ−ブチルアルデヒドを回収し、これにより、発酵後にのみｎ−ブチルアルデヒドを回収するよりも産生物の収率が大幅に高くなる。【選択図】図３Ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｎ−ブチルアルデヒドを生産する方法であって、
（ａ）培地中、炭素源で微生物を培養する段階であって、前記微生物が少なくとも１つの異種遺伝子を発現するよう操作され、少なくとも１つの天然遺伝子の削除によって前記炭素源からｎ−ブチルアルデヒドへの変換が可能である段階と、
（ｂ）産生された前記ｎ−ブチルアルデヒドを、ｎ−ブチルアルデヒドの累積収率が少なくとも１．５ｇ／Ｌになるようガスストリッピング工程によって前記培地から回収する段階と
を含み、前記培養する段階において前記回収する段階を実施する方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの異種遺伝子が、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、トランス−エノイル−ＣｏＡレダクターゼおよびブタナールデヒドロゲナーゼからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物が、ａｔｏＢ、ｃｒｔ、ｈｂｄおよびｂｌｄｈの発現を可能にする人工オペロンを発現するよう遺伝子改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物が、ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ｆｒｄＢＣ、ｐｔａおよびｙｑｈＤからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が減少するか消失するよう遺伝子改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ガスストリッピング工程が、毎分少なくとも１容積のスパージ速度でストリッピングガスをスパージすることを含み、前記培養の時間が２４時間以内である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記回収する段階を、４０時間の培養時間以内に累積収率が２．０ｇ／Ｌになるよう実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物が、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモノナス属（Ｚｙｍｏｎｏｍａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレシエラ属（Ｋｌｅｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）からなる群より選択される属に属する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記微生物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
気相でｎ−ブチルアルデヒドをｎ−ブタノールに還元する段階をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｎ−ブチルアルデヒドを凝縮し、液相で前記ｎ−ブチルアルデヒドをｎ−ブタノールに還元する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ｎ−ブチルアルデヒドを生産する方法であって、
（ａ）培地中、炭素源で微生物を培養する段階であって、前記微生物が少なくとも１つの異種遺伝子を発現するよう操作され、少なくとも１つの天然遺伝子の削除によって前記炭素源からｎ−ブチルアルデヒドへの変換が可能である段階と、
（ｂ）産生された前記ｎ−ブチルアルデヒドを、２４時間の培養時間以内に最大累積収率の５０％（ＭＣＹ５０）を得るのに効果的な条件下でスパージする段階を含むガスストリッピング工程によって前記培地から回収する段階と
を含み、前記培養する段階において前記回収する段階を実施する方法。
【請求項１２】
前記培養する段階が、少なくとも１８時間にわたるバッチ培養で培養することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＭＣＹ５０を２０時間以内に回収する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＭＣＹ５０が少なくとも１ｇ／Ｌである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ｎ−ブチルアルデヒドを生産する方法であって、
（ａ）培地中、炭素源で微生物を培養する段階であって、前記微生物が少なくとも１つの異種遺伝子を発現するよう操作され、少なくとも１つの天然遺伝子の削除によって前記炭素源からｎ−ブチルアルデヒドへの変換が可能である段階と、
（ｂ）産生された前記ｎ−ブチルアルデヒドを、溶解ｎ−ブチルアルデヒドを生存閾値濃度縮未満の濃度に維持するのに効果的なスパージ速度でのガスストリッピング工程によって前記培地から回収する段階と
を含み、前記培養する段階において前記回収する段階を実施する方法。
【請求項１６】
前記ガスストリッピング工程が、連続的なスパージングを用いるものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記連続的なスパージングが、毎分少なくとも１容積のスパージ速度である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶解ｎ−ブチルアルデヒドの濃度を１．０ｇ／Ｌ未満に維持する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ｎ−ブチルアルデヒドを生産する方法であって、
（ａ）炭素源で微生物を培養する段階であって、前記微生物が少なくとも１つの異種遺伝子を発現するよう操作され、少なくとも１つの天然遺伝子の削除によって前記炭素源からｎ−ブチルアルデヒドへの変換が可能である段階と、
（ｂ）産生された前記ｎ−ブチルアルデヒドを、細胞密度の純減少を少なくとも４０時間まで防ぐのに効果的なスパージ速度でのガスストリッピング工程によって培養ブロスから回収する段階と
を含み、前記培養する段階において前記回収する段階を実施する方法。
【請求項２０】
前記スパージ速度が、少なくとも２４時間にわたって細胞密度の純増加をもたらすのに効果的なものである、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１１年１１月３日に出願された本発明者らの同時係属中の米国仮特許出願第６１／５５５２６７号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明の分野は、精密化学品の生産、特に微生物によるｎ−ブチルアルデヒドの生産である。
【背景技術】
【０００３】
毎年１，０００万トンを超えるオキソ化学品が、可塑剤、凍結防止製品、航空機および鉄道の着氷防止製品、溶媒、油圧油、塗料、潤滑剤、化粧品、精密化学品および医薬品を含めた多様な工業製品および消費製品の合成に消費されている。現在、Ｃ３〜Ｃ１５オキソ化学品の生産するための主要な技術は、オキソ合成またはオキソプロセスとしても知られるヒドロホルミル化である。この触媒化学工程は、高温高圧条件下でオレフィン（炭素同士の二重結合をもつ炭化水素）にホルミル基および水素原子を付加するものである。プロピレン由来のＣ４オキソ化学品が世界のオキソ化学品消費量のほぼ７３％を占めている。Ｃ４オキソ化学品の生産には出発物質としてプロピレンが必要であることから、この工程は持続可能なものではない。現在用いられている製造工程に必要な高温高圧条件を維持するための実質的なエネルギーコストは、全体のエネルギー効率を制限しており、したがって、環境に悪いものであると考えられる。
【０００４】
したがって、糖およびセルロースなどの再生可能資源の生物学的変換を用いてＣ４オキソ化学品を生産する新たな方法が開発されており、ごく最近では活用もされている。いくつかある利点のなかでも特に、バイオマス由来の基質がＣＯ２を自然に固定し、カーボンニュートラルなオキソ化学品生産工程がもたらされることに注目するべきである。
【０００５】
オキソ化学品を生産するまた別の方法では、微生物の代謝工学により目的とする化学品を産生させる。例えば、様々なクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種（遺伝子が変化していないもの）を培養して１−ブタノールを産生させる。しかし、このような既知の工程のすべてまたはほとんどが１−ブタノールの分離を必要とするため、回収コストが高い。選択されたクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の菌株の代謝を操作して、他の生成物よりも多くなるよう１−ブタノールの発現を増大させることが行われているが、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の代謝経路を制御するのに利用できる遺伝的手段がないことが、この方法の進歩の妨げとなっている。クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の代謝工学に伴う困難を回避するため、他の種よりも理解が進み改変が容易である、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）および出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含めた様々な代替微生物種が考慮されてきた。
【０００６】
クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）に伴う困難にもかかわらず、Ｋｏｕｂａらは米国特許出願公開第２０１２／０２０９０２１号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で、組換えソルベント生成細菌および組換え微生物を用いたｎ−ブチルアルデヒドの生産方法を教示している。Ｋｏｕｂａらはこの出願で、（１）組換え細菌を培養し、（２）発酵終了時に、生じたｎ−ブチルアルデヒドを培地から単離するという、組換えクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）を用いた２段階の方法について記載している。このような方法は少なくとも概念的には望ましいものであるが、依然として欠点がいくつかみられる。特に、Ｋｏｕｂａのシステムでのｎ−ブチルアルデヒドの収率は比較的低い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ｎ−ブチルアルデヒドを生産する様々なシステムおよび方法が当該技術分野で知られているが、そのすべてまたはほとんどに欠点が１つ以上みられる。その結果、依然として、微生物によりｎ−ブチルアルデヒドを生産する改善されたシステムおよび方法を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、微生物がｎ−ブチルアルデヒドを産生するよう遺伝子操作された微生物、方法およびシステムに関するものである。このような産生は様々な糖類、特にグルコースの代謝的変換から得られるアセチル−ＣｏＡのモル収率向上に基づくのが最も好ましい。次いで、このように産生されたアセチル−ＣｏＡを一連の（好ましくは組換え）酵素を用いて濃縮し、次いで、この濃縮物を複数の段階を経てｎ−ブチルアルデヒドに還元する。ｎ−ブチルアルデヒドがさらに分解されるのを防ぐために、１種類以上の微生物アルコールデヒドロゲナーゼを減少させるか除去するのがさらに好ましい。
【０００９】
さらに特に好ましい態様では、産生されたｎ−ブチルアルデヒドをスパージ工程によって取り出すとともに、（ａ）これまでに知られていないｎ−ブチルアルデヒドの累積収率、（ｂ）２４時間以内でのＭＣＹ５０、（ｃ）１．０ｇ／Ｌ以下の溶解したｎ−ブチルアルデヒド濃度および／または（ｄ）少なくとも２４時間にわたる細胞密度の純増加が達成されるように微生物を培養する。
【００１０】
特に好ましい１つの態様では、ｎ−ブチルアルデヒドを生産する方法には、培地中、炭素源で微生物（例えば、好ましくはエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモノナス属（Ｚｙｍｏｎｏｍａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレシエラ属（Ｋｌｅｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）またはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ））を培養する段階が含まれ、ここでは、微生物は少なくとも１つの異種遺伝子を発現するよう操作され、少なくとも１つの天然遺伝子の削除によって炭素源からｎ−ブチルアルデヒドへの変換が可能である。また別の段階では、産生されたｎ−ブチルアルデヒドを、ｎ−ブチルアルデヒドの累積収率が少なくとも１．５ｇ／Ｌになるようガスストリッピング工程によって培地から回収し、ここでは、培養段階において回収段階を実施する。
【００１１】
最も好ましくは、異種遺伝子がアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、トランス−エノイル−ＣｏＡレダクターゼおよび／またはブタナールデヒドロゲナーゼであるか、微生物が、ａｔｏＢ、ｃｒｔ、ｈｂｄおよびｂｌｄｈの発現を可能にする人工オペロンを発現するよう遺伝子改変されている。さらに一般的には、微生物がｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ｆｒｄＢＣ、ｐｔａおよび／またはｙｑｈＤの発現が減少するか消失するよう遺伝子改変されているのが好ましい。
【００１２】
本発明を限定するわけではないが、ガスストリッピングでは、毎分少なくとも１容積のスパージ速度でストリッピングガスをスパージすることを用い、ここでは、培養時間は２４時間以内である。回収段階は４０時間の培養時間以内に累積収率が２．０ｇ／Ｌになるよう実施するのがさらに好ましい。さらに、ｎ−ブチルアルデヒドを気相でｎ−ブタノールに還元し得る、あるいはｎ−ブチルアルデヒドをストリッピングガスから凝縮し液相でｎ−ブタノールに還元することが考慮される。
【００１３】
１つの観点から言えば、本発明者らはほかにも、培地中、微生物を炭素源で培養してｎ−ブチルアルデヒドを産生させる方法を考慮し、ここでは、微生物は少なくとも１つの異種遺伝子を発現するよう操作され、少なくとも１つの天然遺伝子の削除によって炭素源からｎ−ブチルアルデヒドへの変換が可能である。また別の段階では、産生されたｎ−ブチルアルデヒドを、２４時間の培養時間以内に最大累積収率の５０％（ＭＣＹ５０）を得るのに効果的な条件下でスパージする段階を含むガスストリッピング工程によって培地から回収し、ここでは、培養段階において回収段階を実施する。培養段階を少なくとも１８時間にわたるバッチ培養とし、ＭＣＹ５０を２０時間以内に回収する（例えば、ＭＣＹ５０が少なくとも１ｇ／Ｌとなる場合）のが最も好ましい。
【００１４】
また別の観点から言えば、本発明者らはほかにも、培地中、微生物を炭素源で培養してｎ−ブチルアルデヒドを産生させる方法を考慮し、ここでは、微生物は少なくとも１つの異種遺伝子を発現するよう操作され、少なくとも１つの天然遺伝子の削除によって炭素源からｎ−ブチルアルデヒドへの変換が可能である。のちの段階では、産生されたｎ−ブチルアルデヒドを、溶解ｎ−ブチルアルデヒドを生存閾値濃度縮未満の濃度に維持するのに効果的なスパージ速度でのガスストリッピング工程によって培地から回収し（例えば、連続的なスパージングを用いて）、ここでは、培養段階において回収段階を実施する。前述の場合と同様に、（連続的な）スパージングを毎分少なくとも１容積のスパージ速度とし、かつ／または溶解ｎ−ブチルアルデヒド濃度を１．０ｇ／Ｌ以下に維持するのが一般に好ましい。
【００１５】
したがって、本発明者らは、炭素源で微生物を培養する段階を含む、ｎ−ブチルアルデヒドを生産する方法も考慮し、ここでは、微生物は少なくとも１つの異種遺伝子を発現するよう操作され、少なくとも１つの天然遺伝子の削除によって炭素源からｎ−ブチルアルデヒドへの変換が可能である。のちの段階では、産生されたｎ−ブチルアルデヒドを、細胞密度の純減少を少なくとも４０時間まで防ぐのに効果的なスパージ速度でのガスストリッピング工程によって培養ブロスから回収し、ここでは、培養段階において回収段階を実施する。スパージ速度は、少なくとも２４時間にわたって細胞密度の純増加をもたらすのに効果的なものであるのが最も好ましい。
【００１６】
以下の好適な実施形態の詳細な説明および同じ数字が同じ構成要素を表す添付図面から、本発明の様々な目的、特徴、態様および利点がさらに明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】グルコースからｎ−ブチルアルデヒドへ変換する操作された代謝経路の例を示す略図である。
【図２Ａ】代謝を操作した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＢ１０および宿主細胞ＥＢ１１によるグルコースからのｎ−ブチルアルデヒド産生（ｇ／Ｌ）の結果を表す棒グラフの例である。
【図２Ｂ】代謝を操作した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＢ１１およびＥＢ１３によるグルコースからのｎ−ブチルアルデヒド産生（ｇ／Ｌ）の結果を表す棒グラフの例である。
【図３Ａ−Ｃ】毎分０、１および２容積（ＶＶＭ）のスパージ速度での発酵槽（培地）のｎ−ブチルアルデヒド濃度と時間およびｎ−ブチルアルデヒドの累積収率（スパージングガス中）（ｇ／Ｌ）と時間（時間）との関係を示すパフォーマンスグラフである。
【図４】様々な濃度のｎ−ブチルアルデヒドにおける１マイクロリットル当たりのコロニー形成単位と時間（時間）との関係として表した、本発明の一実施形態によるｎ−ブチルアルデヒドの毒性を示すグラフである。
【図５】ＯＤ６００の細胞密度をスパージ速度０、１および２ＶＶＭでの６００ナノメートルにおける吸光度と時間（時間）との関係として表したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明者らは、様々な炭素源からｎ−ブチルアルデヒドを産生するよう操作された微生物を作製または培養するとともに、発酵反応時に発酵槽を（好ましくは不活性ガスで）スパージすることによって、ｎ−ブチルアルデヒドの収率の増大が得られることを発見した。
【００１９】
この方法では、産生物が蓄積せず、その結果、工程終了時に回収されることを理解するべきである。代わりに、発酵時のスパージングを用いてｎ−ブチルアルデヒドを追い出すが、このことが予想外にも、生産速度を増大させ、生存時間および／または操作微生物による産生時間を延ばすと思われた。その結果、培養培地に産生物が蓄積する場合よりも累積収率が有意に高くなった。発酵時のスパージングは、変動する速度または一定の速度で、連続的なものであっても不連続的なものであってもよく、あるいはその適切な組合せであってもよい。
【００２０】
発酵培地から追い出した後、溶液中に閉じ込めること、溶媒に溶解もしくは吸着させることまたは吸着によって固体収着剤に吸着させることなどを含む様々な方法を用いてｎ−ブチルアルデヒドを回収することができる。次いで、このようにして回収した産生物を商品として販売する、あるいは酸化、還元または濃縮によって所望の製品に変換することができる。
【００２１】
ほかにも、操作微生物は、ｎ−ブチルアルデヒドを産生するよう改変された、様々な細菌、藍細菌および真菌を含めた様々な微生物から作製することができることを理解するべきである。好適な操作微生物はこのほか、ｎ−ブチルアルデヒドを試薬として用いて下流の反応を阻害することにより、ブチルアルデヒド産生物の収率をさらに増大させるよう改変されている。適切な炭素源としては、様々なタンパク質、炭水化物および脂質（いずれも純物質または混合物）ならびに任意の合成または人工のその混合物（例えば、細胞抽出物、バイオマス、バイオソリッドなど）が挙げられる。
【００２２】
上記に鑑み、本発明の１つの好ましい態様では、組換え微生物、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）がｎ−ブチルアルデヒドの産生を可能にする遺伝子群を発現することを一般に考慮する。最も典型的には、組換え発現にはアセチル−ＣｏＡアセチトランスフェラーゼ（ａｃｅｔｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子の発現、ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子の発現、クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子の発現、トランス−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子の発現および／またはブタナールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子の発現が含まれる。図１に典型的な操作された代謝経路を示す。
【００２３】
したがって、操作微生物細胞が、ｎ−ブチルアルデヒドを産生するのに必要な生来の酵素と異種の酵素の任意の組合せを含むことを理解するべきである。例えば、細胞は、生来もしくは異種のアセチル−ＣｏＡアセチトランスフェラーゼ（ａｃｅｔｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）酵素、生来もしくは異種のヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、生来もしくは異種のクロトニル−ＣｏＡヒドラターゼ、生来もしくは異種のトランス−エノイル−ＣｏＡレダクターゼおよび／または生来もしくは異種のブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼを含み得る。より具体的には、アセチル−ＣｏＡアセチトランスフェラーゼ（ａｃｅｔｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）は、アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡへの変換を触媒することができる任意の酵素であり得る。いくつかの実施形態では、アセチル−ＣｏＡアセチトランスフェラーゼ（ａｃｅｔｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）はＥ．Ｃ．番号が２．３．１．９である。例示的なアセチル−ＣｏＡアセチトランスフェラーゼ（ａｃｅｔｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をコードする１つの遺伝子が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ａｔｏＢ（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿４１６７２８．１．ＮＣ＿０００９１３．２）である。同様に、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒することができる任意の酵素であり得る。いくつかの実施形態では、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼはＥ．Ｃ．番号が１．１．１．１５７である。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ｈｂｄ（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３４９３１４．１．ＮＣ＿００３０３０．１）である。クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼは、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒することができる任意の酵素であり得る。いくつかの実施形態では、クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼはＥ．Ｃ．番号が４．２．１．５５である。クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼの例がクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ｃｒｔ（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿３４９３１８．１．ＮＣ＿００３０３０．１）である。トランス−エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒することができる任意の酵素であり得る。いくつかの実施形態では、トランス−エノイル−ＣｏＡレダクターゼはＥ．Ｃ．番号が１．３．１．３８である。トランス−エノイル−ＣｏＡレダクターゼの例がトレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）ｔｅｒ（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿９７１２１１  ＮＣ＿００２９６７．９）である。ブタナールデヒドロゲナーゼは、ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへの変換を触媒することができる任意の酵素であり得る。いくつかの実施形態では、ブタナールデヒドロゲナーゼはＥ．Ｃ．番号が１．２．１．５７である。ブタナールデヒドロゲナーゼの例がクロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔ��ｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）ＮＩ−４ｂｌｄｈである。
【００２４】
他の好ましい実施形態では、ｎ−ブチルアルデヒドの産生に直接関与しない遺伝子が発現してｎ−ブチルアルデヒドの産生量／リットルを増大させ、平衡反応の好ましいバランスをもたらし得ることを理解するべきである。例えば、細胞は、ｎ−ブチルアルデヒドへの産生経路の代謝駆動力をもたらす生来または異種のギ酸デヒドロゲナーゼを含み得る。ＣＯ２の産生とそれに続く減少が可逆反応を防ぐ。ギ酸デヒドロゲナーゼは、ギ酸からＣＯ２への変換を触媒することができる任意の酵素であり得る。いくつかの実施形態では、ギ酸デヒドロゲナーゼはＥ．Ｃ．番号が１．２．１．２である。例示的なギ酸デヒドロゲナーゼをコードする１つの遺伝子がカンジダ・ボイジニ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）ｆｄｈ（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＦ００４０９６、ＡＪ２４５９３４、ＡＪ０１１０４６、ＤＱ４５８７７７）である。ほかにも適切な改変および細胞系が国際公開第２０１２／１２５６８８Ａ２号、欧州特許第２０８４２８７Ｂ１号、米国特許第８１８８２５０Ｂ２号、米国特許出願公開第２０１１０２８１３１４Ａ１号、米国特許出願公開第２０１２００６４５９０Ａ１号、国際公開第２０１２００４４６０Ａ２号、国際公開第２０１２０４５０２２Ａ２号、国際公開第２０１２０６１６５３Ａ２号、国際公開第２０１２０６１６５３Ａ９号、国際公開第２０１２０９９９３４Ａ２号、国際公開第２０１２１０９１７６Ａ２および国際公開第２０１２１２５６８８Ａ２に記載されており、上記文献はすべて参照により本明細書に組み込まれる。
【００２５】
したがって、考慮される細胞でのアルコール産生量が、対応する未改変の細胞よりも有意に減少することに留意するべきである。アルコール産生量は、未改変の対照細胞での産生量よりも質量％または体積％で約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または約９５％以上少ないのが好ましい。アルコール産生量が約９９％少ないのがさらに好ましく、考慮される組換え宿主細胞が検出可能なアルコールを産生しないのが最も好ましい。いくつかの実施形態では、１つ以上のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子をノックアウトするか、別の方法で機能できないようにする。全アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子をノックアウトするか、別の方法で機能できないようにするのがさらに好ましい。
【００２６】
微生物細胞に関しては、組換え改変およびｎ−ブチルアルデヒド産生が可能である限り、特定の生物体が本発明に不可欠であるというわけではないことを理解するべきである。したがって、適切な生物体には、様々な細菌、藍細菌または真菌が含まれる。例えば、いくつかの実施形態の微生物は、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）からなる群より選択される属に属するものであり得る。特に好ましい実施形態では、微生物は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シネココッカス・エロンガータス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）または出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００２７】
組換え微生物は当業者に既知の任意の方法を用いて調製することができ、改変には特定の酵素経路の活性を増加または減少させるのに必要であると考えられる１つ以上の遺伝子の挿入または削除が含まれ得ることが理解されよう。いくつかの実施形態では、本発明の方法に変異微生物を用いてもよく、必要に応じてこれをさらに改変し組換えてもよい。したがって、適切な改変としては、欠損のある発現パターンをもたらすランダム変異誘発、１つ以上の酵素の過剰発現を制御する適切な制御エレメントを有する染色体外（通常、プラスミドまたはファージミド）核酸、１つ以上の酵素の過剰発現を制御する適切な制御エレメントのゲノム挿入などが挙げられる。
【００２８】
したがって、ｎ−ブチルアルデヒドの実際の生産に関して、適切な方法には、炭素源を用いてｎ−ブチルアルデヒドを産生することができる条件下で本明細書に記載の操作微生物を発酵させることが含まれることが考慮される。同時に、このようにして産生されたｎ−ブチルアルデヒドを、周知のガスストリッピング法（例えば、培地に不活性ガスをスパージする）を用いて回収して精製し、次いで、周知の方法（例えば、濃縮）を用いて精製する。最も典型的には、微生物で産生されるｎ−ブチルアルデヒドの濃度［グラム／リットル］は、微生物で産生されるアルコールの濃度［グラム／リットル］よりも高い。例えば、アルコールの濃度に対するｎ−ブチルアルデヒドの濃度の比が少なくとも８０：２０である。この比は９０：１０、９５：５または９９：１であるのがさらに好ましい。
【００２９】
炭素源は、選択する微生物に適した任意の適切な炭素源、例えばグルコース、フルクトース，スクロース，デンプン，セルロース，ヘミセルロース，グリセロール，二酸化炭素，タンパク質および／またはアミノ酸などのなどであり得る。このほか、上記炭素源の任意の組合せおよび／または他の適切な炭素源を用いてもよい。当業者は、選択する微生物の種類に基づいて適切な炭素源を容易に選択することができるであろう。しかし、特に好ましい炭素源としては、カーボンニュートラルな炭素源が挙げられる。したがって、適切な選択肢の中でも特に、様々な加水分解物（ヘミセルロース加水分解物、タンパク質加水分解物など）および粗糖が炭素源として挙げられよう。
【実施例】
【００３０】
以下の実施例では、ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ｆｒｄＢＣおよびｙｑｈＤ遺伝子がノックアウトされａｔｏＢ−ｈｂｄ−ｃｒｔ−ｔｅｒ−ｂｌｄｈ−ｆｄｈ遺伝子を含む操作大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株によって、グルコースからｎ−ブチルアルデヒドを生産することを示す。ｎ−ブチルアルデヒド産生のためにこのように操作宿主株である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＢ１０は、ｌａｃＩｑが導入されｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ｆｒｄＢＣおよびｙｑｈＤ遺伝子がノックアウトされるようにＸＬ−１  ｂｌｕｅから形質導入された、Ｆ’を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１１３（ｒｒｎＢＴ１４  ΔｌａｃＺＷＪ１６  ｈｓｄＲ５１４  ΔａｒａＢＡＤＡＨ３３  ΔｒｈａＢＡＤＬＤ７８）誘導体である。ＥＢ１０のｐｔａをさらに削除してこの菌株をさらに最適化し、ＥＢ１２を得た。
【００３１】
したがって、菌株は以下のような特徴を有するものであり得る：ＥＢ１０：ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ｆｒｄＢＣおよびｙｑｈＤがノックアウトされたＢＷ２５１１３、ＥＢ１１：ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ｆｒｄＢＣおよびｙｑｈＤがノックアウトされたＢＷ２５１１３（ｐＥＢ７３、ｐＩＭ８、ｐＣＳ１３８）、ＥＢ１２：ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ｆｒｄＢＣ、ｙｑｈＤおよびｐｔａがノックアウトされたＢＷ２５１１３、ＥＢ１３：ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ｆｒｄＢＣ、ｙｑｈＤおよびｐｔａがノックアウトされたＢＷ２５１１３（ｐＥＢ７３、ｐＩＭ８、ｐＣＳ１３８）。
【００３２】
この具体例では、３種類のプラスミドを構築し、ｎ−ブチルアルデヒドの産生に用いた。第一のプラスミドは、ａｔｏＢ−ｃｒｔ−ｈｂｄ−ｂｌｄｈ遺伝子を過剰発現させるために構築した、λＰＬプロモーターおよびｌａｃオペレーター配列を持つ人工オペロンを有する。第二のプラスミドは、ｔｅｒ遺伝子をλＰＬプロモーターおよびｌａｃオペレーター配列とともに有する。第三のプラスミドは、ｆｄｈ遺伝子をλＰＬプロモーターおよびｌａｃオペレーター配列とともに有する。ＥＢ１０およびＥＢ１２細胞を全３種類のプラスミドを含むよう形質転換させ、それぞれＥＢ１１およびＥＢ１３を形成した。得られたｎ−ブチルアルデヒド産生操作株をそれぞれ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＢ１１およびＥＢ１３と命名した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＢ１０およびＥＢ１１を回転振盪機（２５０ｒ．ｐ．ｍ．）上、ＬＢ培地３ｍｌを含む試験管で、必要に応じてアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で一晩前培養した。一晩培養物を同じ抗生物質を加えた新たな培地５ｍｌで１：１００に希釈した。新たな培地は、２％グルコースを添加したテリフィックブロス（ＴＢ）（水１リットル当たり、トリプトン１２ｇ、酵母抽出物２４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４２．３１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４１２．５４ｇ、グリセロール４ｍｌ）である。細胞を回転振盪機（２５０ｒ．ｐ．ｍ．）上、３７℃で一晩、ＯＤ６００が０．４〜０．６になるまで増殖させ、次いで好気的にさらに１〜２時間、０．１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。培養物を試験管から１０ｍｌのＢＤバキュテナー密閉チューブに移した。酸素を排気しＮ２に入れ替えた。回転振盪機（２５０ｒ．ｐ．ｍ．）上、３７℃で一晩、発酵を２４時間進行させた。
【００３３】
バイオリアクターでのｎ−ブチルアルデヒド生産：バイオリアクターでのｎ−ブチルアルデヒド生産のための発酵にはＥＢ１２株を用いた。しかるべき抗生物質を含有するＬＢに一晩培養物を播種し、回転振盪機上、２５０ｒｐｍ、３７℃で増殖させた。５リットルの攪拌タンクバイオリアクター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｕｐｐａｕｇｅ、ＮＹ、ＵＳＡ）中、２．０リットルの稼動体積を用いてｎ−ブチルアルデヒド発酵を実施した。バイオリアクターに一晩前培養物２３ｍｌを播種し、ｎ−ブチルアルデヒド産生経路に関与する酵素の発現を誘導するために０．１ｍＭのＩＰＴＧを播種時に加えた。攪拌機の速度を上げる（２００ｒｐｍから５００ｒｐｍに）ことにより、好気性段階での溶存酸素（ＤＯ）を空気飽和に対して２０％に維持した。細胞を好気性条件下、吸光度が約ＯＤ６００＝０．８に達するまで３０℃でバッチ方式にて増殖させた。次いで、攪拌を３５０ｒｐｍに設定し、（ｉ）嫌気性条件に切り替える、（ｉｉ）ｎ−ブチルアルデヒドのｉｎ  ｓｉｔｕガスストリッピングを実施するという２つの目的で、定められたｖｖｍ（毎分液体１体積当たりのガスの体積）の窒素をバイオリアクターに通気した。嫌気性に切り替えるとき、グルコース濃度を１０〜２０ｇ／Ｌに維持するためグルコース溶液の断続的な線形的供給（５００ｇ／リットル）を開始した。蒸発したｎ−ブチルアルデヒドをグラハム冷却器を用いて凝縮した後、水（４℃）を満たした３つの連続したトラップに通した。５Ｍ  ＮａＯＨ溶液の自動添加により、ｐＨを常に６．８に調節した。定められた時点で、発酵試料を収集して細胞増殖、ｎ−ブチルアルデヒド産生量およびグルコース濃度を測定し、トラップの水を交換した。分析した菌株によって産生されたアルコール化合物をＧＣ−ＭＳにより同定した。このシステムはモデル６８９０ＮネットワークＧＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、モデル７８８３Ｂ注入器およびオートサンプラー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ならびにモデル５９７３ネットワーク質量選択検出器（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を備えたものであった。ヘリウム（１ｍｌ／分）をキャリヤガスとしてＤＢ−５ｍｓキャピラリーカラム（３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。オーブン温度は３０℃／分で７５℃（２．６分）から２００℃になるようプログラムされている。注入器および検出器は２５０℃に維持されている。溶媒抽出によりアルコール化合物を単離する。ＧＣ標準グレードのトルエン（Ｆｌｕｋａ）１５０μｌを用いて遠心分離した後、培養ブロスの上清３００マイクロリットルを抽出する。試料１μｌをスプリット比３０：１のスプリット注入法で注入する。
【００３４】
産生されたアルコール化合物は水素炎イオン化検出器を備えたガスクロマトグラフによって定量した。このシステムはモデル７８９０Ａガスクロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびモデル７６９３オートサンプラー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であった。アルコール化合物の分離はＤＢ−ＦＦＡＰキャピラリーカラム（３０ｍ、内径０．３２ｍｍ、膜厚０．２５μｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により実施する。最初にＧＣオーブン温度を２分間、８５℃で保持してから、４５℃／分の勾配で２３５℃まで上昇させ、３分間保持した。キャリヤガスにはヘリウムを使用し、注入口圧を１４ｐ．ｓ．ｉ．（約９７ｋＰａ）とした。注入器および検出器を２２５℃に維持した。試料１μｌをスプリット比２５：１で注入した。内部標準物質には１−ペンタノールを用いる。ＥＢ１０と産生株ＥＢ１１とを比較した結果の例を図２Ａに示し、産生株ＥＢ１３のｐｔａをさらにノックアウト変異させた効果（産生株ＥＢ１１との比較）を図２Ｂに示す。容易にわかるように、操作菌株のＥＢ１１株を含むブロスではｎ−ブチルアルデヒド（２２７ｍｇ／Ｌ）を産生させることができたが、ＥＢ１０のみを含むブロスでは産生させることができなかった。さらに、ｐｔａ（ホスホトランスアセチラーゼまたはリン酸アセチルトランスフェラーゼ）の削除によって、産生レベルが予想外にも著しく増加していることが容易にわかる。
【００３５】
図３Ａ〜３Ｃは、スパージ速度０、１および２ＶＶＭにおける発酵槽で産生されたｎ−ブチルアルデヒドの濃度とＥＢ１３を用いた培養時間およびｎ−ブチルアルデヒドの累積収率と培養時間との関係を示している。図３Ａを参照すると、スパージングは行われていない（０ＶＶＭ）。発酵槽のｎ−ブチルアルデヒドの濃度は、約２０時間後に最大約０．２０〜０．２５ｇ／Ｌに達した後、約４０時間後までにゼロになるまで減少している。図３Ｂ〜３Ｃでは、スパージ速度はそれぞれ１ＶＶＭおよび２ＶＶＭであり、発酵槽に存在するｎ−ブチルアルデヒドの最大濃度は、２０時間以内では、スパージングを行っていない場合とほぼ同じ約０．２０〜０．２５ｇ／Ｌである。実施例に記載した結果および図２に示した結果は、この観察結果と一致している。すなわち、２４時間の培養時間後にｎ−ブチルアルデヒドが０．２２７ｇ／Ｌ回収された。
【００３６】
しかし、再び図３Ｂ〜３Ｃを参照すると、発酵時のスパージングによってｎ−ブチルアルデヒドの累積収率が著しく増加している。例えば、スパージ速度１ＶＶＭでは、総累積収率が、スパージングを行っていない場合の見かけの最大濃度を上回っている。この例では、約９０時間にわたるスパージングによって産生物を収集しており、総収率は約１．９ｇ／Ｌである。スパージ速度２ＶＶＭでは、同じ長さの時間にわたって産生物を収集しているが、最大累積収率（ＭＣＹ）は約２．２５ｇ／Ｌである。
【００３７】
発酵培地におけるこの見かけの最大濃度０．２０〜０．２５ｇ／Ｌという値は、いささか驚くべき値である。ｎ−ブチルアルデヒドの水への溶解度は約７０ｇ／Ｌであり、当然のことながら、発酵槽のｎ−ブチルアルデヒドの最大濃度はこれより相当大きい最大値まで直線的に増加することが予想されるであろう。ほかにも驚くべきことに、不活性ガスを培地にスパージすると、ｎ−ブチルアルデヒドの溶解度が高いにもかかわらず、相当量のｎ−ブチルアルデヒドが追い出される。したがって、適宜スパージングを行うことにより、望ましい高い質量収率を達成することができる。特に図３Ｃを参照すると、約２０時間後に最大累積収率の半分（ＭＣＹ５０）が得られており、これは発酵槽でｎ−ブチルアルデヒドが最大濃度に達するのとほぼ同じ時間であることを理解するべきである。したがって、２ＶＶＭで同時にスパージングを行うと、同じ長さの時間で約５倍の産生物が得られ、その後約７０時間にわたってさらに５倍の産生物が回収される。
【００３８】
図４を参照すると、操作大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の１μＬ当たりのコロニー形成単位数が、様々な濃度のｎ−ブチルアルデヒド（ＮＢＡＬ）を蒸発を防ぐ密閉チューブに加えた後の時間の関数として示されている。加えなかった場合を含めたいずれの場合も、約２４時間にコロニー形成単位数が最小値に達する（例えば、細胞に生存能がなくなる）傾向がみられる。１．０ｇ／Ｌの濃度では、グラフは５時間後にコロニー形成単位のわずかな純増加を示しているが、濃度は１．２ｇ／Ｌであり、４．５時間後でも純減少を示している。ここに挙げたデータは、細胞の最大ｎ−ブチルアルデヒド産生量および最大生存時間がみられるｎ−ブチルアルデヒドの生存閾値濃度縮が存在することを示唆するものである。本発明による同時スパージング法を用いて得られたｎ−ブチルアルデヒド収率の増大は、生存能の分析結果と一致すると思われる。
【００３９】
図５は、ＯＤ６００の細胞密度をスパージ速度０、１および２ＶＶＭでの時間（時間）と６００ｎｍにおける吸光度との関係として表したものである。いずれの場合も、データから１５時間後に細胞密度が増加していることがわかる。しかし、２４時間後、０ＶＶＭでスパージした試料では細胞密度の著明な減少がみられるのに対して、１ＶＶＭおよび２ＶＶＭの試料では細胞密度が増加し続けているのがわかる。約４０時間後、１ＶＶＭおよび２ＶＶＭの試料では引き続き純増加がみられ、８９時間後、１ＶＶＭの試料では純減少がみられるが、２ＶＶＭの試料では引き続き純増加がみられる。
【００４０】
細胞密度のデータは生存能分析および収率のデータと一致すると思われる。特に、２４時間後のＭＣＹ５０は、最大速度でｎ−ブチルアルデヒドを活発に産生している生存細胞に一致すると思われる。２４時間後、ｎ−ブチルアルデヒド産生は最大収率に達するまで継続する。
【００４１】
ｎ−ブチルアルデヒド産生時にスパージングを行うとｎ−ブチルアルデヒドの収率が大幅に増大することは明らかである。特定の方法または機序に束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、ｎ−ブチルアルデヒドの産生によって最小収率を超える産生の持続が阻害されると推測する。この最小収率はスパージングを行わないシステムにおけるｎ−ブチルアルデヒドの最大濃度とほぼ同じであり、ｎ−ブチルアルデヒドの溶解度を考慮に入れた場合に予想される値よりもかなり低い。
【００４２】
そこで、ｎ−ブチルアルデヒド産生の阻害を回避することに関して、様々な方法が考慮される。データはスパージ速度の増大に伴ってＭＣＹが増大することを示していると思われることから、スパージ速度を２ＶＶＭよりも速くすればＭＣＹがさらに増大するであろうという結論に達するのが当然であろう。したがって、少なくとも２．０ＶＶＭ、より典型的には少なくとも２．５ＶＶＭ、最も典型的には少なくとも３．０ＶＶＭのスパージ速度が適当であると考えられる。
【００４３】
また別の方法は、スパージングを行った場合にｎ−ブチルアルデヒド産生物が産生されて液相に溶解すれば、産生物が追い出されるのは気液界面であるということを理解することである。この界面の気体と液体の表面比が増大すれば、追い出される産生物の量が増加すると予想することができる。スパージ速度が増大すれば（かつ／またはスパージの形態が異なれば）泡が小さくなり、気体と液体の表面比が増大すると考えられる。同様に、攪拌翼の速度を増大させれば気泡が細かくなり、同じく気体と液体の表面比が増大すると考えられる。ここに挙げた方法を任意に組み合わせれば、産生物の量、産生物の産生速度またはその両方が増大するはずである。
【００４４】
単にスパージ工程を改変する以外にも、データは、ｎ−ブチルアルデヒドのＭＣＹを増大させる可能性のある他の解決法を示唆している。改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの微生物では、温度変化が産生速度に影響を及ぼし得る。発酵槽の温度を低くすれば、速度が低下するものの、組み換え遺伝子産生物の量が増加する可能性がきわめて高い。おそらく、最大の収率を得るのに所与の発酵槽温度に最適なスパージ速度が存在するであろう。これとは逆に、温度をｎ−ブチルアルデヒドの沸点またはその前後のレベルまで上昇させ、このような条件下で増殖し得る代謝を操作した微生物を選択することが可能である。これはむしろ蒸留反応に近いものとなり、ｎ−ブチルアルデヒドは気相またはその付近で産生されて、自然に溶液から出ていくと考えられる。このことはほかにも、発酵槽の産生物濃度を低く維持し、前述の毒性作用が起こる可能性を減少させるのに役立つ可能性がある。システムの温度によっては、適切な速度でスパージすることが、産生物を追い出すのに役立つ可能性も考えられる。
【００４５】
しかるべきスパージングプロトコルを用いれば、システムの圧力を変化させることができる。例えば、容器内の圧力を低下させてｎ−ブチルアルデヒドの放出を増大させることができる。スパージングガスの圧力も低下させるか、断続的なスパージ工程を用いるか、この２つの方法を組み合わせて、最適なＭＣＹを得ることができる。
【００４６】
以上の例はバッチ発酵法を用いるものである。代わりに連続発酵法を用いることも考えられ、この方法では、発酵槽から使用済みの培地を取り出すのと同じ速度で反応器に新鮮な液体（培地）を導入すると同時に、反応器をスパージする。この例では、使用済みの培地に産生物と微生物細胞の両方が含まれている。次いで、発酵槽自体から産生物を収集するとともに、使用済みの培地を再びスパージして残留している産生物を取り出す。その結果、培地の産生物濃度を生存閾値濃度縮未満に維持することが可能となる。
【００４７】
発酵槽の設計自体を改変し、産生物を異なる方法で収集することが可能である。例えば、薄膜発酵槽または中空糸発酵槽を用いれば培地中に産生物が得られ、次いでこれをスパージして取り出すことが可能である。あるいは、操作微生物をゲル培地またはアルギン酸タイプの培地（例えば、国際公開第２０１２／００４４６０号を参照）に固定化し、微生物を含有する培地に培地を連続的に通過させ、その直後にスパージングを行うことが可能である。これにより産生物が培地とともに連続的に微生物を流れ去り、ほぼ即座に追い出されるため、操作微生物が産生物の濃度増大から受ける影響を最小限に抑えられる。あるいは、発酵の進行に合わせて、産生物を含有する液相をスパージ工程中の別の容器に送り込むことが可能である。
【００４８】
さらに、ｎ−ブチルアルデヒドを吸着する分子篩などの成分またはｎ−ブチルアルデヒドを優先的に溶解させ水と混和しない分配液で培地自体を補強することが考慮される。このような操作には微生物からｎ−ブチルアルデヒドを除去する効果があると考えられ、これは培地からｎ−ブチルアルデヒドを除去すればＭＣＹが増大するという概念を踏まえたものである。
【００４９】
既に記載した改変以外にも数多くの改変を、本明細書の本発明の概念から逸脱することなくさらに実施することが可能であることが、当業者には明らかなはずである。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨における場合を除いて、本発明が限定されることはない。さらに、明細書および特許請求の範囲の両方を解釈する際には、いずれの用語も文脈に合致する可能な限り最も広い意味で解釈されるべきである。特に、「含む（「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）」という用語は、要素、成分または段階に非排他的に言及するものとして、すなわち、言及されている要素、成分または段階が明確に言及されていない他の要素、成分または段階とともに存在するか、用いられるか、組み合わせられることを示すものとして解釈されるべきである。本明細書の請求項が、Ａ、Ｂ、Ｃ、．．．およびＮからなる群より選択される少なくとも１つのものに言及する場合、その文章は、その群のうちＡとＮやＢとＮなどではなく、１つの要素のみを必要とするものとして解釈されるべきである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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