(57)【要約】  高いＲＡ含量を有するステビア・レバウディアナを育種するための方法は、高いＲＡ含量を有する完全期の植物を親として選抜し、それらを交雑させてＦ１世代種子を生産する工程；不完全期のＦ１世代の形質を安定させる工程；戻し交配法によりＦ２世代種子を生産する工程；および場合により、さらなる戻し交配法によりＦ３世代を生産する工程を含む。【選択図】図１
2014502505.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高いＲＡ含量を有するステビア・レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）の育種方法であって：
（１）高いＲＡ含量を有する完全期の植物を親として選抜し、それらを交雑させてＦ１世代種子を生産する工程；
（２）不完全期のＦ１世代の形質を安定させる工程；および
（３）戻し交配法によりＦ２世代種子を生産する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
遠い系統からの、繁茂しており、高い葉収量、高い配糖体含量、強い抵抗性、類似した開花時期および高い結実度を有する２種類の個々の選良植物が、前記交雑育種工程において完全期のあいだに親を選抜するときの併用交雑を行うために選抜されることを特徴とする、請求項１に記載の高いＲＡ含量を有するステビア・レバウディアナの育種方法。
【請求項３】
完全期での交雑によって交雑Ｆ１世代種子を生産する前記工程において選抜およびマッチングされた雄親および雌親が無性繁殖に付され、１：１比でクローン植物のコロニーが形成されることを特徴とする、請求項１に記載の高いＲＡ含量を有するステビア・レバウディアナの育種方法。
【請求項４】
戻し交配法によりＦ２世代種子を生産する前記工程において、１：３の比で雄親および雌親のコロニーが形成されることを特徴とする、請求項１に記載の高いＲＡ含量を有するステビア・レバウディアナの育種方法。
【請求項５】
前記戻し交配法が、Ｆ１世代を雌親として使用して、親世代の雄親と戻し交配することを特徴とする、請求項１に記載の高いＲＡ含量を有するステビア・レバウディアナの育種方法。
【請求項６】
ステビア・レバウディアナにおけるＲＡ含量を改善するための育種方法であって、
（１）高いＲＡ含量を有する完全期の植物を親として選抜し、それらを交雑させてＦ１世代種子を生産する工程；
（２）不完全期のＦ１世代の形質を安定させる工程；
（３）戻し交配法によりＦ２世代種子を生産する工程；および
（４）戻し交配法によりＦ３世代種子を生産する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
遠い系統からの、繁茂しており、高い葉収量、高い配糖体含量、強い抵抗性、類似した開花時期および高い結実度を有する２種類の個々の選良植物が、前記交雑育種工程において完全期のあいだに親を選抜するときの併用交雑を行うために選抜されることを特徴とする、請求項６に記載のステビア・レバウディアナにおけるＲＡ含量を改善するための育種方法。
【請求項８】
完全期での交雑によって交雑Ｆ１世代種子を生産する前記工程において選抜およびマッチングされた雄親および雌親が無性繁殖に付され、１：１比でクローン植物のコロニーが形成されることを特徴とする、請求項６に記載のステビア・レバウディアナにおけるＲＡ含量を改善するための育種方法。
【請求項９】
戻し交配法によりＦ２世代種子を生産する前記工程において、１：３の比で雄親および雌親のコロニーが形成されることを特徴とする、請求項６に記載のステビア・レバウディアナにおけるＲＡ含量を改善するための育種方法。
【請求項１０】
前記工程（３）においてＦ１世代を雌親として使用して、親世代の雄親と戻し交配することを特徴とする、請求項６に記載のステビア・レバウディアナにおけるＲＡ含量を改善するための育種方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の種子を成長させることによって生産される、ステビア・レバウディアナ植物またはその部分。
【請求項１２】
請求項６に記載の種子を成長させることによって生産される、ステビア・レバウディアナ植物またはその部分。
【請求項１３】
請求項１に記載のステビア・レバウディアナ品種から生産される組織培養物。
【請求項１４】
請求項６に記載のステビア・レバウディアナ品種から生産される組織培養物。
【請求項１５】
請求項１に記載の植物またはその乾燥葉が、水を含む溶媒で抽出されることを特徴とする、甘味料の生産方法。
【請求項１６】
請求項６に記載の植物またはその乾燥葉が、水を含む溶媒で抽出されることを特徴とする、甘味料の生産方法。
【請求項１７】
高重量のレバウディオシドＡステビオシドを含有し、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）によって分析したとき約２０００ｂｐバンドを含有する、ステビア・レバウディアナ植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、選良ステビア・レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）の生産方法、特に、ステビア・レバウディアナにおけるレバウディオシドＡの含量を改善する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品および飲料業界では、一般に甘い食品が嗜好され、製造業者および消費者は、飲料品または食料品の甘味質を増すために、通常、砂糖を蔗糖（グラニュー糖）、果糖またはブドウ糖の形態で飲料品、食品などに添加する。殆どの消費者は砂糖の味を楽しむが、蔗糖、果糖およびブドウ糖は高カロリー甘味料である。これらの高カロリー甘味料の多くの代替品が人工甘味料または代用糖であり、それらを様々な食料品に素材として添加することができる。
【０００３】
一般的な人工甘味料としては、サッカリン、アスパルテームおよびスクラロースが挙げられる。残念なことに、これらの人工甘味料は、負の副作用と関連づけられている。そのため、人工甘味料、ならびに蔗糖、果糖およびブドウ糖を含む高カロリー甘味料の代替品として、代替天然ノンカロリーまたは低カロリーまたはカロリー控えめ人工甘味料に対する需要が高まってきている。一部の人工甘味料と同様に、これらの代替品は、匹敵する量の高カロリー甘味料より大きい甘味付与効果をもたらすので、砂糖の甘味に匹敵する甘味を実現するためにこれらの代替品のほうが少量で済む。しかし、これらの代替天然甘味料は、生産費が高い場合があり、および／または砂糖（例えば蔗糖）とは異なる呈味特性を有する場合があり、該呈味特性は、望ましくない呈味特性、例えば、口に残る甘味、遅れて発現する甘味、不快な食感、および苦味、金属味、冷涼味、渋味、甘草のような味をはじめとする異味などの多様な呈味プロファイルを場合によっては含む。
【０００４】
ステビオール配糖体は、ステビア植物（ステビア・レバウディアナ・ベルトーニ（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｂｅｒｔｏｎｉ））の葉の甘味の原因である。これらの化合物は甘味に幅があり、蔗糖より４０から３００倍甘い。それらは、熱安定性であり、ｐＨ安定性であり、発酵しない１（１  Ｂｒａｎｄｌｅ，Ｊｉｍ（２００４−０８−１９）、「ＦＡＱ−Ｓｔｅｖｉａ，Ｎａｔｕｒｅ’ｓ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｌｏｗ  Ｃａｌｏｒｉｅ  Ｓｗｅｅｔｅｎｅｒ」、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｇｒｉ−Ｆｏｏｄ  Ｃａｎａｄａ、２００６年１１月０８日検索）。それらはまた、摂取されたときに血糖反応を誘発せず、この故に、それらは、炭水化物制限ダイエット中の糖尿病患者などにとって天然甘味料として魅力的である。
【０００５】
ステビア・レバウディアナ・ベルトーニのジテルペン配糖体の化学構造を図１に提示する。その物性および官能特性は、一般にステビオシド（ＳＴＶ）およびレバウディオシドＡについてのみ、よく研究されている。ステビオシドの甘味強度は、蔗糖より約２１０倍高く、レバウディオシドＡは、２００倍から４００倍の間であり、レバウディオシドＣおよびズルコシドＡは、約３０倍である。レバウディオシドＡは、４つの主要ステビオール配糖体のうち最も好適な官能的特質を有すると考えられる（表１参照）。
【表１】
2014502505.tif 000003
【０００６】
ステビア・レバウディアナは、抽出および純化後、食品、飲料、アルコール飲料調製品、医薬品、化粧品などの分野で広く用いられている。近年、ステビア・レバウディアナの抽出物としてのステビア・レバウディアナ配糖体は、天然甘味料としておよび人工甘味料の魅力的な代替品として、よりいっそう大衆に用いられている。それらは、カロリー値が極めて低く、歯科患者および糖尿病患者に有害作用をもたらさないので、卓越した甘味付与選択肢になってきた。その潜在市場は巨大である。
【０００７】
ステビア・レバウディアナ配糖体は、主として次の９成分を含む：ステビオシド（ＳＴＶ）、レバウディオシドＡ（ＲＡ）、ルブソシド、ズルコシドＡ（ＤＡ）、レバウディオシドＣ（ＲＣ）、レバウディオシドＦ（ＲＦ）、レバウディオシドＤ（ＲＤ）、ステビオールビオシド（ＳＴＢ）およびレバウディオシドＢ（ＲＢ）。
【０００８】
ステビオールとして公知のジテルペンは、ステビオールカルボキシル水素原子をグルコースで置換してエステルを形成し、そのヒドロキシル水素をグルコースとラムノースの組み合わせで置換してエーテルを形成することによって構築されるステビア甘味配糖体のアグリコンである。２つの主要化合物ステビオシドおよびレバウディオシドＡにはグルコースのみが用いられる：ステビオシドは、ヒドロキシル部位に２つの連結されたグルコースを有し、これに対してレバウディオシドＡは３つ有し、その三分子の中央のグルコースが中心ステビオール構造に接続されている。
【０００９】
重量分率の点から、ステビア植物組織中で見つけられる４つの主なステビオール配糖体は、以下である：
・５〜１０％  ステビオシド（ＳＴＶ）（砂糖の２５０〜３００倍）
・２〜１２％  レバウディオシドＡ（ＲＡ）−最も甘く（砂糖の３５０〜４５０倍）、最も苦みが少ない
・１〜２％  レバウディオシドＣ（ＲＣ）
・１／２〜１％  ズルコシドＡ．（ＤＡ）
レバウディオシドＢ、Ｄ、Ｅおよびステビオビオシド（ＳＴＢ）が微量で存在することは公知である。
【００１０】
これらの成分の味は互いに異なり、異なる消費者集団の要求に応えることができ、例えば、米国およびカナダの消費者はＲＡを好むが、日本および韓国の消費者はＳＴＶを好む。
【００１１】
現在、市販されているステビア・レバウディアナ配糖体製品は、主としてＲＡおよびＳＴＶであり、ＲＤおよび／またはＲＢを主として含有する製品はまだ無く、したがって、ステビア・レバウディアナ配糖体の抽出方法もまた、主としてＲＡおよびＳＴＶの精製および純化に集中している。
【００１２】
ステビア・レバウディアナ植物からのステビオシドをはじめとするジテルペン配糖体の一般回収プロセスが記載されている（米国特許第４，３６１，６９７号明細書）。異なる極性を有する様々な溶媒が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離手順で終わる逐次的処理に使用された。
【００１３】
ステビア・レバウディアナ植物の葉からのＲＡの回収方法は、米国特許第４，０８２，８５８号明細書に記載されている。最終精製は、液体クロマトグラフィーによって達成され、その後、水、および１から３個の炭素原子を有するアルカノール、好ましくはメタノール、での初期抽出が続く。水を初期溶媒として使用してもよいが、この段階で好ましい溶媒は、１から４個の炭素原子を有する液体ハロアルカンであることも開示されている。好ましい第二の溶媒は、１から３個の炭素原子を有するアルカノールであるが、好ましい第三の溶媒は、１から４個の炭素原子を有するアルカノールおよび場合により少量の水である。
【００１４】
Ｇｉｏｖａｎｅｔｔｏの米国特許第４，８９２，９３８号には、植物の水性抽出物が、様々な不純物を除去するために選択される一連のイオン交換樹脂にこれらの水性抽出物を通すことによって精製される、精製プロセスが開示されている。甘味配糖体は、水中に残存し、その水を蒸発させることによって回収される。利点は、すべてが水中で行われる点であるが、大部分の他のプロセスは、ある時点で溶媒の使用を伴う。欠点は、最終生成物がかなり不純である点であり、甘味配糖体の混合物は約７０％に過ぎない。残余は、主として、甘味配糖体より極性の高い材料であり、本発明者らは、それらを、多糖類（約２５％）と、甘味配糖体より極性の低い少量の黄色油性材料（約５％）との複合混合物と同定している。
【００１５】
Ｇｉｏｖａｎｅｔｔｏプロセスから得られる甘味配糖体は、常に混合物、すなわち、２つの主な（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）甘味配糖体ステビオシドおよびＲＡと２つの副次的甘味配糖体ズルコシドおよびＲＣである。
【００１６】
ステビオシドが望ましくない後味を有することは、一般に認められている。この後味は、９９％より高い純度のステビオシド試料であっても存在する。その一方で、ＲＡは、後味を有さず、蔗糖に匹敵する甘味フレーバーを有する。したがって、ＲＡは、すべてのステビア配糖体の最も望ましい官能特性を有すると認識されている。この複雑さに加えて、様々な不純物も存在し、これらの一部は望ましくないフレーバーを有する。さらに、分析を行うことが極めて難しいことが、すべての事柄を曖昧にしている。
【００１７】
ＲＡは、良質の甘味、およびステビオシドの１．３から１．５倍の甘味度を有し、然るが故に、できる限り高いＲＡ含量を有する植物を生産することが最も望ましい。さらに、ＲＡの生産費を低減させること、乾燥した葉の安定した収量を維持すること、甘味原料として優れた甘味質を有するＲＡの高い含量を有する様々なステビアを開発すること、そして同時に、その継続的供給を維持すること、およびこれらに基づく優れた甘味料を生産することが望ましい。
【００１８】
中国にステビア・レバウディアナに用いられる２つの植栽法がある：第一の方法は、無性繁殖法であり、これは、品種の純度および優良品質を維持できる点で有利である。この方法の欠点は、越冬性種子実生を秋に繁殖させ、越冬性種子根を保持し、春に栽培実生を繁殖させる場合、時間がかかり、労働集約的であり、費用がかかる点である。全生産費が高い。さらに、既存の栽培品種における比較的高いＲＡ含量にかかわらず、その葉の収量は低く、また品種のゆゆしい雑種性がある。
【００１９】
第二の栽植法は、有性繁殖に基づく。これは、無性繁殖法と比較して、実に時間がかからず、労働力がかからず、金がかからず、生産費がより低い。しかし、この繁殖法の欠点は、品種が変質しやすい点である。有性繁殖のための種子導入開始時、全ステビア・レバウディアナ配糖体含量は１０％より高いが、後にそのステビア・レバウディアナ配糖体含量が約６％へと降下する。
【００２０】
既存の繁殖法は両方とも現状のままでは望ましくないことがはっきりとわかる。２００１年１２月２６日に公開された公開番号ＣＮ１３２７７２０Ａを有する中国特許の特許明細書には、ステビア・レバウディアナの交雑種子についての育種方法が開示されており、その主な内容は、雄親として有性品種および雌親として無性挿し木品種を使用して交雑を行い、雌親の種子を回収することである。しかし、有性雄親の質が安定しておらず、無性雌親が最適化選抜されなかったので、生産される交雑種子は望ましくなかった。この方法は、栽培者および加工企業の要求にも、食品業界、飲料業界、医薬品業界、化粧品業界などの要求にも応ずることができない。公開日が２００７年６月２７日である中国特許出願公開第１９８５５７５号には、新規ハイブリッド品種を栽培するためのステビア・レバウディアナのクローン系統の雄親と雌親の系統的育種方法が開示されているが、この種子育種方法では、１集団の交雑しか行われておらず、Ｆ１世代の交雑種子が混合状態で収穫されており、それ故、やはり不安定な形質の望ましくなさがある。したがって、ステビア・レバウディアナの新規選良品種の育種は、ステビア・レバウディアナの栽植および加工に関する早急に解決が必要な技術的問題であるばかりでなく、健康な糖源を見つけ、それによって配糖体を求めるこの需要を満たす上での重要な技術的争点でもある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明の目的は、上述の欠点を未然に防ぐことまたは軽減することである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、ＲＡ含量が高いステビア・レバウディアナ品種；かかる品種を遺伝的に区別する手段；それらの特性を維持し、それによって他の品種のステビア植物と区別する方法；および本発明の植物品種の抽出物を含む甘味料組成物を提供する。
【００２３】
本発明の目的は、既存のステビア・レバウディアナ品種の欠点を克服して、高い葉収量、高い全ステビア・レバウディアナ配糖体含量、高いレバウディオシドＡ（ＲＡ）含量、強い抵抗性（すなわち、「３高および１抵抗性」）および安定した形質を有するステビア・レバウディアナの新規選良品種を育種することである。
【００２４】
上記の目的を実現するために、本発明によるステビア・レバウディアナの選良品種の選抜育種の基礎は、以下のことに基づく：１）ステビア・レバウディアナは、有性繁殖と無性繁殖の両方の能力がある形質を有する；２）無性繁殖を用いて、優良形質を安定させることができる；および３）ヘテローシス。
【００２５】
１つの態様において、本発明は、高いＲＡ含量を有するステビア・レバウディアナの育種方法であって、高いＲＡ含量を有する完全期の植物を親として選抜し、それらを交雑させてＦ１世代種子を生産する工程と、不完全期のＦ１世代の形質を安定させる工程と、戻し交配法によりＦ２世代種子を生産する工程とを含む方法を開示する；本発明は、高い葉収量、高い全配糖体含量、高いレバウディオシドＡ（ＲＡ）含量、強い抵抗性、および植物の安定した形質という利点を有する。
【００２６】
この態様において、本発明は、高いＲＡ含量を有するステビア・レバウディアナ選良品種の育種による生産方法であって、
（１）高いＲＡ含量を有する完全期の植物を親として選抜し、それらを交雑させてＦ１世代種子を生産する工程；
（２）不完全期のＦ１世代の形質を安定させる工程；および
（３）戻し交配法によりＦ２世代種子を生産する工程
を含む方法を提供する。
【００２７】
したがって、この態様において、本発明は、高いＲＡ含量を有するステビア・レバウディアナの育種方法であって、以下：高いＲＡ含量を有する完全期の植物を親として選抜し、それらを交雑させてＦ１世代種子を生産する工程と、不完全期のＦ１世代の形質を安定させる工程と、戻し交配法によりＦ２世代種子を生産する工程とを含む方法を開示する；本発明は、高い葉収量、高い全配糖体含量、高いレバウディオシドＡ（ＲＡ）含量、強い抵抗性、および植物の安定した形質という利点を有する。
【００２８】
さらなる態様において、本発明は、高いＲＡ含量を有するステビア・レバウディアナ選良品種の育種による生産方法であって、
（１）高いＲＡ含量を有する完全期の植物を親として選抜し、それらを交雑させてＦ１世代種子を生産する工程；
（２）不完全期のＦ１世代の形質を安定させる工程；
（３）戻し交配法によりＦ２世代種子を生産する工程；および
（４）戻し交配法によりＦ３世代種子を生産する工程
を含む方法を提供する。
【００２９】
したがって、この態様において、本発明は、ステビア・レバウディアナにおけるＲＡ含量を改善するための育種方法であって、以下：高いＲＡ含量を有する完全期の植物を親として選抜し、それらを交雑させてＦ１世代種子を生産する工程と、不完全期のＦ１世代の形質を安定させる工程と、戻し交配法によりＦ２世代種子を生産する工程と、その後、二次戻し交配によりＦ３世代種子を生産する工程とを含む方法を開示し；本発明は、高い葉収量、高い全配糖体含量、高いレバウディオシドＡ（ＲＡ）含量、強い抵抗性、および植物の安定した形質という利点を有する。
【００３０】
これらの方法によって生産されるおよび／または本明細書に記載する品種に由来するステビア・レバウディアナ選良品種種子、細胞、植物、生殖質、育種系列、品種および植物部分は、本発明の範囲内である。
【００３１】
本発明は、さらに、本明細書に記載の任意の植物材料から抽出および精製されたＲＡを含む天然甘味料組成物を提供する。
【００３２】
本発明は、さらに、本明細書に記載の任意の植物材料から抽出および精製されたＲＡを含む食品、飲料、栄養補助食品、機能性食品、医薬製剤、化粧品、健康製品、香辛料および調味料を提供する。
【００３３】
本発明のこれらおよび他の目的および利点は、図面および実施例と共に、本発明の好ましい実施形態の説明を検討することにより、当業者にはより明らかになるだろう。すべて本発明の概念から逸脱することなく、本発明の他の実施形態が可能であることおよび本発明の詳細を多数の点で変更できることは、当業者には理解されるであろう。したがって、以下の図面、説明および実施例は、本質的に例証的なものと見なすべきであり、限定的なものと見なすべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
単なる例として、添付の図面を参照して本発明の実施形態を説明することとする。
【図１】図１は、両親および７種類の系統種のＩＳＳＲフィンガープリントである。
【図２】図２は、両親および７種類の系統種のＩＳＳＲフィンガープリントである。
【図３】図３は、両親および７種類の系統種のＩＳＳＲフィンガープリントである。
【図４】図４は、両親および７種類の系統種のＩＳＳＲフィンガープリントである。
【図５】図５は、両親および７種類の系統種のＩＳＳＲフィンガープリントである。
【図６】図６は、ＩＳＳＲデータに基づくステビア・レバウディアナの７種類すべての系統種の、ＵＰＧＭＡを使用して生成した、フェノグラムである。
【図７】図７は、ＡＴ  ＬａｂからのステビアＨ２、Ｈ３、Ｈ４およびＨ５  ＤＮＡ分子同定報告のＩＳＳＲフィンガープリントである。
【図８】図８は、ＲＡを抽出および精製することができる母液を得るためにステビア・レバウディアナの葉からステビオール配糖体の一次抽出物を抽出する抽出プロセスのフロー図である。
【図９】図９は、ＲＡの化学構造のグラフィック表示である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明の原理を例証する添付の図面と共に、本発明の１つ以上の実施形態の詳細な説明を以下に記載する。然るが故に、この詳細な説明は、例として本発明を例証するものであり、限定として例証するものではない。この説明により、明らかに、当業者による本発明の実施および使用が可能になり、また本発明者らが本発明を実施するための最良の形態であると考えるものを含めて、本発明の幾つかの実施形態、適応、変形および代替ならびに使用が説明される。記載されるように本発明に常例的変形および適応を施すことができること、またかかる変形および適応が本発明の精神および範囲内にきちんと入ることを、明確に理解しなければならない。
【００３６】
言い換えると、かかる実施形態に関連して本発明を説明するが、本発明はいずれの実施形態にも限定されない。本発明の範囲はクレームによってのみ限定され、本発明は、非常に多くの代替、変更および等価物を包含する。本発明の完全な理解をもたらすために、非常に多くの具体的な詳細を以下の説明の中で示す。これらの詳細は、例のために記載されるものであり、これらの具体的な詳細の一部またはすべてが無くてもクレームに従って本発明を実施することができる。明瞭さのために、本発明が不必要に不明瞭にならないように本発明に関連した技術分野において公知である技術資料を記載しない。
【００３７】
本明細書において用いる一定の定義を下に記載する。後続の実施例においても、多数の用語を用いる。本明細書およびクレームの明確で一貫した理解をもたらすために、以下の定義を記載する。
【００３８】
本開示およびクレームにおいて（もしあれば）、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」をはじめとするその派生語は、述べられている整数または要素の各々を包含するが、１つ以上のさらなる整数または要素の包含を排除しない。本願において記載し、特許請求する（有性および無性）育種の工程に言及するとき、用語プロセスを方法と互換可能に用いることができる。用語レバウディオシドＡをＲＡ（またはＲｅｂ  Ａ）と互換可能に用いることができる。
【００３９】
明瞭さのために、「ステビオール配糖体」は、科学文献ではステビア、ステビオシド、およびステビア配糖体と呼ばれてきたことについて言及しておく。一般に、用語ステビオール配糖体は、ステビア植物に由来する甘味特性を有するステビオール誘導体のファミリーに適用されてきた。最近になって、用語ステビアは、植物または植物の粗抽出物を記述するためにより狭義に用いられており、一方、ステビオシドは、ステビアの葉から抽出される特異的配糖体の１つについての慣用名である。ステビオシドは、ステビオールビオシドとは異なる。測定量に関連して本明細書において用いる用語「約」は、その測定を行い、測定の目的に見合ったレベルの注意力を働かせる当業者によって予想される、その測定量の正常な変動量を指す。
【００４０】
育種家が、所望の形質（単数または複数）を有するドナー親品種を（耕種学的に優良であるが、１つ以上の形質についての所望のレベルまたは存在を欠く）反復親と交配させ、その後、得られた後代を逆行してその反復親と１回以上交配させるプロセスを「戻し交配」と呼ぶ。戻し交配を用いて、１つ以上の所望の形質を、ある遺伝的背景から所望の形質を欠く別の遺伝的背景に導入することができる。
【００４１】
生存生物の遺伝子操作を「育種」と呼ぶ。
【００４２】
本明細書において用いる用語「植物」は、種子または子実または葯が除去された植物を含めて、未成熟のまたは成熟した全植物への言及を包含する。植物を生産する種子または胚も植物であると考える。本明細書において用いる用語「植物部分」は、葉、茎、根、根尖、葯、種子、子実、胚、花粉、胚珠、花類、子葉、胚軸、莢、花、苗条、柄、組織、細胞などを包含する。
【００４３】
「植物生殖」は、「有性」または「無性」手段により遂行され得る、植物における新たな個体または子孫の生産である。有性生殖は、配偶子の融合によって子孫を生産し、その結果、その片親または両親とは遺伝的に異なる子孫が生ずる。無性生殖は、配偶子の融合なしに新たな個体を生産し、該個体は、突然変異が起こった場合を除き、その親植物と互いに遺伝子に同一である。種子植物の場合、子孫は、飛散の作用因子として使用される保護種子内に包み込まれていることがある。
【００４４】
有性生殖は、両親からの複合的特徴または遺伝子によって生産される新たな個体の創出を含む。植物の有性生殖は、一般に、花の媒体によって起こる。花の構造は、おしべとして公知の花粉を生産する雄部と、子房および卵子を含有するめしべと呼ばれる雌部とで構成されている。受粉は、有性生殖メカニズムを開始させるプロセスである。花弁は、植物から植物へと花粉を運ぶ昆虫を花に引き寄せる極めて重量な役割を果たす。風媒は、花が花弁を有さない場合に起こる。受粉の結果、種子が生産されることとなり、ほぼすべての植物がこのメカニズムによって生殖される。
【００４５】
有性生殖は、遺伝子を再配列し、染色体の数を低減させる成熟分裂と、その染色体を完全二倍体数に回復させる受精という、２つの基本プロセスを含む。これら２つのプロセス間に、様々なタイプの植物および藻類が変化するが、すべての陸生植物を含めてそれらの多くが世代交代を受け、２つの異なる多細胞構造（相）、配偶体および胞子体、がある。
【００４６】
配偶体は、各細胞内に単一の染色体セットを含有する、一倍体である多細胞構造（相）である。配偶体は、有糸分裂と呼ばれる細胞分裂のプロセスによって雄または雌配偶子（または両方）を生産する。別個の配偶体を有する維管束植物の場合、雌性配偶体は、大配偶体（大＝大きい、これらは大きい卵細胞を生産する）として公知であり、雄性配偶体は、小配偶体（小＝小さい、これらは小さい精子細胞を生産する）と呼ばれる。
【００４７】
雄性配偶子と雌性配偶子の融合（受精）は二倍体接合子を生産し、これが有糸細胞分裂によって多細胞胞子体へと発達する。
【００４８】
成熟胞子体は、成熟分裂によって胞子を生産し、この成熟分裂は、染色体ペアがもう一度分離されて個別セットを形成するので、「減数分裂」と呼ばれることもある。
【００４９】
本明細書において用いる用語「無性生殖」は、成熟分裂を含まない、または配偶子融合が無性または栄養性であると言われる、任意の生殖プロセスを意味する。配偶子融合の非存在は、かかる事象が胞子体世代または配偶体期において起こり得ることを意味する。新たな遺伝物質の欠如のため、生物はこのプロセスによって自体をクローン化し、遺伝的に同一の生物を作る。
【００５０】
人間によって用いられる最も一般的な植物生殖形態は種子であるが、多数の無性法が用いられおり、該無性法は、通常は天然プロセスの増進であり、例えば、挿し木、接ぎ木、芽接ぎ、取り木、株分け、根茎もしくは根、匍匐枝、ひこばえ（吸器）の切断、および実験室組織クローン化による人工繁殖が挙げられる。無性法は、多くの場合、種子からは実現しない個々の所望の特性を有する栽培品種を繁殖させるために用いられる。果樹繁殖は、所望の栽培品種（クローン）を、取り木によって繁殖された同じくクローンである台木に、芽接ぎまたは接ぎ木することによって行われることが多い。
【００５１】
園芸では、「挿し木」は、母植物から節間部の下で切り取られた枝であって、その後、多くの場合、ホルモンを含有する発根用液剤または粉剤を利用して発根される枝である。完全な根が形成され、葉が新たに発芽し始めたら、そのクローンは、母植物と遺伝的に同一の自給自足植物である。例としては、新たな植物を生産するためのブラックベリー（クロミキイチゴ（Ｒｕｂｕｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ））、アフリカスミレ（セントポーリア（Ｓａｉｎｔｐａｕｌｉａ））、バーベナ（クマツヅラ属（Ｖｅｒｂｅｎａ））の茎からの挿し木が挙げられる。挿し木の関連使用は、茎または芽を別の茎に接合する接ぎ木である。園芸店は、リンゴをはじめとする、類縁果実の４種類以上の品種を生産することができる接ぎ木された幹を有する木を売り出している。接ぎ木の最も一般的な使用法は、既に出根している植物上での栽培品種の繁殖であり、時としてその台木は、植物を矮小化するためにまたは根を損傷させる病原体から植物を防護するために使用される。栄養繁殖植物はクローンであるので、植物研究の重要なツールである。
【００５２】
交配のために、親（Ｐ）および子孫（最終世代）Ｆ１＝親の子、Ｆ２＝孫、Ｆ３＝ひ孫、などを有する。
【００５３】
本明細書において用いる「ヘテローシス」、または雑種強勢、または異系交配向上は、ハイブリッド子孫における任意の生物学的品質の機能改善または増加である。ヘテローシスから派生した形容詞がヘテローシスの（ｈｅｔｅｒｏｔｉｃ）である。ヘテローシスは、その親の遺伝的寄与を混合することからの優良子孫の発生である。これらの効果は、メンデル遺伝による場合もあり得、または非メンデル遺伝による場合もあり得る。その成長速度、その高さおよび一般的頑強性で顕示されるような生物の生理的活力は、配偶子におけるその生物が構成された接合に関する相違度と正の相関関係がある。接合している接合子間の差が大きいほど、少なくとも一定限度内では、概して刺激量が多い。
【００５４】
ヘテローシスは、近交弱勢とは反対のものである。近交弱勢は、同型接合性に起因して有害な形質を有する子孫をもたらす。ハイブリッドが、有害な結果となる完全に適合性でないその親からの形質を受け継ぐとき、ヘテローシスの逆が、外交弱勢である。異なるヘテローシス群からの近交系間の交配は、結果として、同じヘテローシス群またはパターンの中の近交系からのＦ１ハイブリッドより有意に強いヘテローシスを有する活発なＦ１ハイブリッドをもたらす。ヘテローシス群は、近交系列を分類するために植物育種家によって作られ、相互循環選抜によって漸進的に改善され得る。
【００５５】
植物間の関係を研究するための系統発生学的マーカーとしての、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースのＲＡＰＤ（ランダム増幅多型ＤＮＡ法）またはＩＳＳＲ（相互単純配列反復）変異は、明確に確立されている（ＭｏｒｇａｎｔｅおよびＯｌｉｖｉｅｒｉ、１９９３２（２  Ｍｏｒｇａｎｔｅ，Ｍ．およびＯｌｉｖｉｅｒｉ，Ａ．Ｍ．１９９３．ＰＣＲ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ  ａｓ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３：１７５−１８２）：Ｇｈｉｓｌａｉｎら、１９９９３（３  Ｇｕｐｔａ，Ｍ．、Ｃｈｙｉ，Ｙ．Ｓ．、Ｒｏｍｅｒｏ−Ｓｅｖｅｒｓｏｎ，Ｊ．およびＯｗｎ，Ｊ．Ｌ．１９９４．Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍａｒｋｅｒｓ  Ｆｒｏｍ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｏｆ  ｓｉｍｐｌｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｅａｔｓ．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８９：９９８−１００２））。然るが故に、ここではＲＡＰＤフィンガープリントデータとＩＳＳＲフィンガープリントデータの両方を単独でかつ併用して、独特に育種されたステビア栽培品種内での遺伝的多様性レベルを検査することができる。
【００５６】
電場での高分子の分離は、電気泳動と呼ばれる。電気泳動によるタンパク質の非常に一般的な分離方法は、支持媒体として不連続ポリアクリルアミドゲルを、および該タンパク質を変性させるためにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を使用する。この方法は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）と呼ばれる。最も一般的に用いられているシステムは、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）法とも呼ばれる。ＳＤＳ（ラウリル硫酸塩とも呼ばれる）は、アニオン性洗浄剤であり、これは、その分子を溶解したとき、広いｐＨ範囲内の正味負電荷を有することを意味する。ポリペプチド鎖は、その相対分子質量に比例している量のＳＤＳを結合する。ＳＤＳ上の負電荷は、タンパク質の複合構造の大部分を破壊し、電場ではアノード（正の電荷を有する電極）に強く引き寄せられる。
【００５７】
ポリアクリルアミドゲルは、小さい分子と同様の速さで泳動しないように大きい分子を抑制する。電荷対質量比は、ＳＤＳ変性ポリペプチド間でほぼ同じであるので、タンパク質の最終分離は、ポリペプチドの相対分子量の差にほぼ完全に依存する。均一密度のゲルの場合、タンパク質の相対泳動距離（Ｒｆ、このｆは下付き文字）は、その質量のｌｏｇに反比例する。質量が分かっているタンパク質を未知のものと同時に泳動させると、Ｒｆと質量の関係をプロットすることができ、未知タンパク質の質量を推定することができる。
【００５８】
ここではＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質分離を用いて、相対分子質量を推定することができ、試料中の主なタンパク質の相対存在量を決定することができ、画分の中でのタンパク質の分布を決定することができる。タンパク質試料の純度を評定し、分画または精製手順の進行を追跡することができる。ウエスタンブロッティング、二次元電気泳動およびペプチドマッピングなどの専門技術を用いて、遺伝子産物を検出することができ、それらの間の類似性を見出すことができ、タンパク質のアイソザイムを検出および分離することができる。
【００５９】
本発明において同定に用いるＲＡＰＤ法は、ＤＮＡ分析法の１つであり、複数のプライマーを使用するＰＣＲ反応（ポリメラーゼ連鎖反応）において使用するプライマーと同じまたは類似した配列の間に挟まれたＤＮＡ領域内の増幅されたＤＮＡパターンを電気泳動によって分析する方法である。加えて、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）は、長鎖アルキル基を有する第四級アンモニウム塩であり、核酸などのポリアニオンと不溶性複合体を形成するため、核酸の単離に利用することができる。
【００６０】
ＤＮＡの差に基づいて品種を分類する手段では、ゲノムＤＮＡをＣＴＡＢによって植物から個別に単離し、リボ核酸（ＲＮＡ）を除去し、そしてプライマーミックスの使用によりＰＣＲ法によって得たＰＣＲ増幅産物を、アガロースゲル電気泳動法によって得たＤＮＡフィンガープリントの差によって区別する。
【００６１】
比較的高い濃度のレバウディオシドＡを含有する品種を交雑育種し、選抜する。これが、本願において記載し、特許請求する育種方法の目標である。
【００６２】
本明細書において記載される「より高い」または「高い」ＲＡは、本願において記載し、特許請求する新規品種における、野生型ステビア・レバウディアナと比較して多いＲＡ含量を指す。少なくとも、これは、５重量％より多いＲＡを指す。さらに好ましくは、これは、１０重量％より多いＲＡを指す。さらにいっそう好ましくは、これは、１５重量％より多いＲＡを指す。
【００６３】
本明細書において「高いＲＡ含量を有する完全期の植物を親として選抜し、それらを交雑してＦ１種子を生産する」工程の中で与える完全は、親植物株における望ましいＲＡレベルを指す。本明細書に記載される逐次交雑プログラムの中で、ＲＡの基礎レベルは逐次的に増加することとなる。好ましくは、１つの態様の中では、野生型ステビア・レバウディアナに存在するＲＡの量を少なくとも有する親を指す。さらに好ましくは、野生型より多いＲＡ含量を有する親植物を選抜する。
【００６４】
ステビアは自己不適合性であり、標的植物を前記種子から常に得ることができるとは必ずしも言えないが、本願に記載するＤＮＡ同定によって標的植物を容易に選抜することができ、必要に応じて、下記実施例１に従ってそれを他の高品質ステビア品種と交雑育種し、選抜を行うと、高濃度のレバウディオシドＡを含有する植物を容易に得ることができる。
【００６５】
以下では、育種プロセス、その特性などを具体的に説明する。しかし、本発明は、これらの育種プロセスおよび栽培方法に限定されない。
【００６６】
本発明の範囲内の品種は、以下の品種説明情報に記載するすべての形質について均一性および安定性を示した。十分な同型接合性および表現型安定性レベルを確保するように植物タイプの均一性に注意深く配慮して、それらを十分な世代数、自家受粉させた。それらの品種を増加させ、均一性について観察し続けた。異なる形質は観察されなかった、または予想されない。
【００６７】
遺伝子マーカープロファイル
表現型観察に加えて、植物をその遺伝子型によって同定することもできる。同じ品種または類縁品種の植物を同定することができるまたは植物の系統を判定または検証するために使用することができる遺伝子マーカープロファイルによって、植物の遺伝子型を特性づけすることができる。遺伝子マーカープロファイルは、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、ＲＡＰＤ、任意プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）、ＤＮＡ増幅フィンガープリント法（ＤＡＦ）、配列特性化増幅領域（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ  ：ＳＣＡＲ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、マイクロサテライトとも呼ばれる単純配列反復（ＳＳＲ）、または一塩基多型（ＳＮＰ）などの技術によって得ることができる。
【００６８】
これらの目的に使用する特定のマーカーはいずれの特定のマーカーセットにも限定されないが、品種を区別する手段となる任意のタイプのマーカーおよびマーカープロファイルを含むことが想定される。遺伝子マーカープロファイルは、育種、および戻し交配変換（ｂａｃｋｃｒｏｓｓ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）の発現にも有用である。
【００６９】
戻し交配変換は、ＤＮＡ配列が戻し交配によって導入されると起こる。戻し交配変換は、少なくとも２回の戻し交配、少なくとも３回の戻し交配、少なくとも４回の戻し交配、少なくとも５回戻し交配またはそれ以上を含めて、少なくとも２回以上の戻し交配で形質または遺伝子座が変換された植物を生産することができる。分子マーカー利用育種または選抜を用いて、戻し交配変換を達成するために必要な戻し交配数を低減させることができる。例えば、戻し交配変換を２回ほども少ない回数の戻し交配で行ことができることを実証している、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄａｔａ、Ａｕｇｕｓｔ  １９９４、Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ、ＯｒｅｇｏｎにおけるＯｐｅｎｓｈａｗ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｍａｒｋｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂａｃｋｃｒｏｓｓ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇを参照されたい。
【００７０】
戻し交配変換法の複雑さは、移入される形質のタイプ（単一遺伝子、または非連鎖遺伝子と比較して密接に連鎖している遺伝子）、形質の発現レベル、遺伝のタイプ（細胞質または核）、優性または劣性形質発現、およびその交配に含める親のタイプに依存する。比較的分類しやすい単一遺伝子については、戻し交配法が有効であり、比較的管理しやすいことは、当業者には理解される。戻し交配変換によって移入することができる望ましい形質としては、不稔性（核および細胞質型）、稔性回復、栄養強化、耐乾燥性、窒素利用能、改変脂肪酸プロファイル、低フィチン酸塩、産業増進、病害抵抗性（細菌、真菌またはウイルス）、害虫抵抗性、および除草剤抵抗性が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
戻し交配変換は、優性対立遺伝子の移入に起因することもあり、または劣性対立遺伝子の移入に起因することもある。対象となる形質を含有する後代の選抜は、優性対立遺伝子に関連した形質についての直接選抜によって達成される。劣性対立遺伝子によって移入される形質についての後代の選抜は、どの植物が劣性対立遺伝子を有するかを判定するために第一戻し交配世代の成長および自家受粉を必要とする。劣性形質は、対象となる遺伝子座の存在を判定するために、連続する戻し交配世代に関して追加の後代試験を必要とし得る。最後の戻し交配世代を通常は自家受粉させて、移入される形質（単数または複数）について純粋な育種後代を得るが、形質が安定して遺伝子移入される戻し交配変換を、反復親へのさらなる戻し交配と形質についての続く選抜によって維持することもできる。
【００７２】
対象となる形質についての選抜と共に、反復親の表現型について後代を選抜する。この戻し交配は、近親交配の１形態であり、連続する戻し交配後に反復親の特徴が自動的に回復される。
【００７３】
系統育種は、所望される１つ以上の望ましい特性であって、２つの元親が一切提供しない所望の特性を有する２つの遺伝子型の交配で開始し、他の源を育種集団に含めることができる。本系統法では、優良植物を自家受精させ、連続する雑種世代において選抜する。次の雑種世代では、近親交配の結果として同型接合対立遺伝子状態がその異型接合対立遺伝子状態に取って代わる。自家受粉および選抜の連続する雑種世代：Ｆ１、Ｆ２および場合によりＦ３を実行する。かかる近親交配後、連続する雑種世代は、開発品種の種子を増加させるのに役立つこととなる。
【００７４】
戻し交配変換集団を作るために用いることに加えて、戻し交配を系統育種と併用することもできる。前に論じたように、戻し交配を用いて、ある品種（ドナー親）から１つ以上のとりわけ望ましい形質を、全体的にみて良好な耕種学的特性を有するが、この望ましい形質（単数または複数）を欠く開発品種（反復親）に移入することができる。しかし、同じ手順を用いて、反復親の遺伝子型に後代を移行させることができるが、同時に、早期に戻し交配を停止させて自家受精および選抜を進めることにより非反復親の多くの成分を保持することができる。例えば、ダイズ品種を別の品種と交配して、第一世代後代植物を生産することができる。その後、第一世代後代植物をその親品種の一方に戻し交配することができる。新規開発品種が、反復親の特質の多くを有し、しかもなおドナー親の所望の特質の幾つかを有するように、後代を自家受粉させ、選抜する。
【００７５】
戻し交配法によるＦ２世代種子の生産
（１）親の選抜
ステビア・レバウディアナは、自家不稔性の他家受粉植物であるので、ステビア・レバウディアナ集団の遺伝子構成は常に異型接合型のものであり、有性子孫の遺伝は容易に安定化されず、有利な変異と有害な変異の両方を同時に保持し、これは、個々の選良植物の選抜に課題を提起する。中国および外国の様々な植栽地域各地における異なる成長期のステビア・レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎ）の個々の植物の特性、特徴、生長期間、開花時期、抵抗性および適応性（ａｄａｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）に従って、個別管理のために、本著者らは、それらを観察し、モニターして、高い葉収量、葉中の高い配糖体含量、および強い抵抗性を有する個々の選良植物を選抜した。
【００７６】
（２）種子を生産するための完全期における交雑
１．本年および以前の数年に選抜した個々の選良植物から選抜し、マッチングし、組み合わせるとき、繁茂しており、高い葉収量、強い抵抗性、類似した開花時期、高い結実度ならびに高い全配糖体およびＲＡ含量を有する２種類の個々の選良植物を、組み合わせ交雑試験（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）を行うことが可能な限り遠い遠縁の系統から選抜した。
２．翌年、組み合わせおよび植物に従って本年に植物から収穫した種子を栽培品種菜園に播種し、圃場観察を行い、記録し、葉の収量および含量を判定し、それらから良好な組み合わせを雄親および雌親として選抜した。
３．無性繁殖は優良形質を維持できるという原理に従って、良好な組み合わせを選抜した雄親および雌親を無性繁殖に付して、それらの優良形質を維持し、雄親および雌親の個々の植物のクローン化系列を形成した。選抜し、マッチングした良好な組み合わせの雄親および雌親のクローン化系列の、好ましい約１：１比でのコロニーを形成して、それら２系列の集団交雑を行い、Ｆ１世代交雑種子を混合状態で収穫した。
【００７７】
（３）無性繁殖による形質の安定化
繁茂しており、高い葉収量、強い抵抗性、類似した開花時期、高い結実度ならびに高い全配糖体およびＲＡ含量を有する個々の植物を、収穫したＦ１世代から、上記の工程における方法を用いることにより選抜し、その後、無性繁殖を行ってそれらの優良形質を維持した。
【００７８】
（４）優良Ｆ１世代を、それらの形質を安定させた後、雌親として使用し、元の無性雄親を雄親として使用して戻し交配を行い、好ましくは約１：３の比での該雄親および該雌親のコロニーを形成し、Ｆ２世代種子を収穫して標的品種を得た。
【００７９】
他の既存品種と比較して、本発明は以下の利点を有する：
１．交雑Ｆ２ステビア・レバウディアナの特性が次のとおりである：立ち性の枝および茎、倒伏抵抗性、繁茂ならびに大きく広い葉。
２．新規交雑Ｆ２ステビア・レバウディアナ品種の優良品質が以下のとおりである：
−−他の品種のものと比べて大きく増加される、中国エーカー当たりの乾燥葉の高い収量；
−−全配糖体含量およびＲＡ含量も有性品種のものに比べて大きく増加される；
−−他の品種より強い病害抵抗性および強い病虫害抵抗性を伴う、高い抵抗性。
【００８０】
本明細書に記載される新規選良品種を栽培するためのステビア・レバウディアナのクローン化系列の雄親および雌親の１つの系統的育種方法は、以下の関連および発見に基づく：
・ステビア・レバウディアナは、有性繁殖と無性繁殖の両方の能力がある形質を有する、
・優良形質を安定させるために無性繁殖を使用すること、
・ヘテローシス−−「３高および１抵抗性」の育種目標に焦点を合わせ、首尾よく固守すれば、古いステビア・レバウディアナ品種を新しいもので首尾よく置き換えることができ、それらの品質を首尾よく改善することができる
・新規組み合わせを選抜することができ、新規ステビア・レバウディアナ品種を市場の需要に応じて栽培することができる。
【００８１】
ステビア・レバウディアナの新規交雑種のこの栽培は、費用がかからず、効率が優れているので、有性栽培および無性栽培の既存のすべての品種が、必然的に、ステビア・レバウディアナの新規交雑品種によって部分的にまたは完全に置き換えられることとなり、多くの経済的利点および社会的利点を栽培者、加工企業および国にもたらすこととなる。
【００８２】
本発明のこの態様の特定の実施形態を、本発明のプロセスの説明を通して以下で例証することとする。
【００８３】
親の選抜
ステビア・レバウディアナは、自家不稔性の他家受粉植物であるので、ステビア・レバウディアナ集団の遺伝子構成は常に異型接合型のものであり、有性子孫の遺伝は容易に安定化されず、有利な変異と有害な変異の両方を同時に保持し、これは、個々の選良植物を選抜する我々に課題と可能性をもたらす。中国および外国の様々な植栽地域各地における異なる成長期のステビア・レバウディアナの個々の植物の特性、特徴、生長期間、開花時期、抵抗性および適応性に従って、既存の有性および無性植物の形質と比較するために、本発明者らは、それらを観察し、モニターして、高い葉収量、葉中の高い配糖体含量、および強い抵抗性を有する個々の選良植物を選抜し；４種類の植物（それらの通し番号は、それぞれ０１、０２、０３および０４であった）を選抜して個別管理を行い；個々の選良植物各々を３回試験し、選抜された個々の選良植物の信頼性を保証するためにデータの平均値をとった。（４種類の個々の植物の含量および葉収量と既存の有性および無性植物のものとの比較の結果）。
【００８４】
種子を生産するための完全期における交雑
１．翌年、個々の選良植物０１、０２、０３および０４の植物区から収穫した種子を栽培品種菜園に播種し、圃場観察を行い、記録し、葉の収量および含量を判定した。（４種類の個々の植物の含量および葉収率の比較の結果）。
【００８５】
２．無性繁殖の使用により優良形質を維持できるという理論に従って、個々の選良植物０１、０２、０３および０４の良好な組み合わせを無性繁殖に付して、それらの優良形質を維持し、雄親および雌親の個々の植物のクローン化系列を形成した。選抜し、マッチングした良好な組み合わせの雄親および雌親のクローン化系列の、好ましくは約１：１比でのコロニーを形成し、（植物数および植物距離）これら２系列の集団交雑を行い、Ｆ１世代交雑種子を混合状態で収穫した。一定量（数）の優良Ｆ１世代を選抜し、それらの種子を栽培品種菜園に播種し、ＲＡ含量、全配糖体含量および葉収量の平均値を決定し、その後、それらを、雄親、雌親および交雑Ｆ１世代のＲＡ含量、全配糖体含量および葉収量と比較し、（比較結果）交雑Ｆ１世代の上記指数のすべてが、雄親および雌親両方と比較して有意に改善され、既存の有性および無性品種と比較してよりいっそう大きく改善されることが判明した。
【００８６】
３．優良Ｆ１世代を無性繁殖および個別管理に付して、それらの優良形質を安定させた。
【００８７】
４．優良Ｆ１世代交雑種子を安定させた後に雌親として使用し、元の無性雄親を雄親として使用して戻し交配を行い、戻し交配により種子を生産するときには好ましくは約１：３の比での該雄親および該雌親のコロニーを形成し、そのＦ２世代種子を収穫して標的品種を得た。一定量（数）の優良Ｆ２世代を選抜し、ＲＡ含量、全配糖体含量および葉収量の平均値を決定し、その後、それらを、元の無性雄親および交雑Ｆ１世代のＲＡ含量、全配糖体含量および葉収量と比較し、（比較結果）交雑Ｆ２世代の上記指数のすべてが、元の無性雄親およびＦ１世代と比較して有意に改善され、既存の有性および無性品種と比較してよりいっそう大きく改善されることが判明した。
【００８８】
戻し交配法によるＦ３世代種子の生産
（１）親の選抜
ステビア・レバウディアナは、自家不稔性の他家受粉植物であるので、ステビア・レバウディアナ集団の遺伝子構成は常に異型接合型のものであり、有性子孫の遺伝は容易に安定化されず、有利な変異と有害な変異の両方を同時に保持し、これは、個々の植物を選抜する我々に課題と可能性をもたらす。中国および外国の様々な植栽地域各地における異なる成長期のステビア・レバウディアナの個々の植物の特性、特徴、生長期間、開花時期、抵抗性および適応性に従って、個別管理のために、本著者らは、それらを観察し、モニターして、高い葉収量、葉中の高い配糖体含量、および強い抵抗性を有する個々の選良植物を選抜した。
【００８９】
（２）種子を生産するための完全期における交雑
1)本年および以前の数年に選抜した個々の選良植物から選抜し、マッチングし、組み合わせるとき、繁茂しており、高い葉収量、強い抵抗性、類似した開花時期、高い結実度ならびに高い全配糖体およびＲＡ含量を有する２種類の個々の選良植物を、組み合わせ交雑試験を行うことが可能な限り遠い遠縁の系統から選抜した。
2)翌年、組み合わせおよび植物に従って同年に植物から収穫した種子を栽培品種菜園に播種し、圃場観察を行い、記録し、葉の収量および含量を判定し、それらから品種組み合わせを雄親および雌親として選抜した。
3)無性繁殖は優良形質を維持できるという発見に従って、良好な組み合わせを選抜した雄親および雌親を無性繁殖に付して、それらの優良形質を維持し、雄親および雌親の個々の植物のクローン化系列を形成した。選抜し、マッチングした良好な組み合わせの雄親および雌親のクローン化系列の、好ましい約１：１比でのコロニーを形成して、それら２系列の集団交雑を行い、Ｆ１世代交雑種子を混合状態で収穫した。
【００９０】
（３）無性繁殖による形質の安定化
繁茂しており、高い葉収量、強い抵抗性、類似した開花時期、高い結実度ならびに高い全配糖体およびＲＡ含量を有する個々の植物を、Ｆ１世代から、上記の工程における方法を用いることにより選抜し、その後、無性繁殖を行ってそれらの優良形質を維持した。
【００９１】
（４）優良Ｆ１世代をそれらの形質の安定化後に雌親として使用し、元の無性雄親を雄親として使用して戻し交配を行い、好ましくは約１：３の比での該雄親および該雌親のコロニーを形成し、Ｆ２世代種子を収穫した。
【００９２】
（５）収穫したＦ２世代を雌親として使用し、元の無性雄親を雄親として使用して戻し交配を行い、好ましくは約１：３の比での該雄親および該雌親のコロニーを形成し、Ｆ３世代種子を収穫して標的品種を得た。
【００９３】
他の既存品種と比較して、本発明は以下の利点を有する：
１．交雑Ｆ３ステビア・レバウディアナの特性が次のとおりである：立ち性の枝および茎、倒伏抵抗性、繁茂ならびに大きく広い葉。
【００９４】
２．新規交雑Ｆ３ステビア・レバウディアナ品種の優良品質が次のとおりである：他の品種のものと比べて大きく増加される、中国エーカー当たりの乾燥葉の高い収量；全配糖体含量およびステビア・レバウディアナＡ（ＲＡ）含量も有性栽培品種のものに比べて大きく増加される；ならびに他の品種より強い病害抵抗性および強い病虫害抵抗性を示す高い抵抗性。
【００９５】
新規選良種を栽培するためのステビア・レバウディアナのクローン化系列の雄親および雌親の系統的育種方法は、以下の発見に基づく：
・ステビア・レバウディアナは、有性繁殖と無性繁殖の両方の能力がある形質を有する、
・優良形質を安定させるために無性繁殖を使用すること、
・ヘテローシス；「３高および１抵抗性」の育種目標に焦点を合わせ、首尾よく固守すれば、古いステビア・レバウディアナ品種を新しいもので首尾よく置き換えることができ、それらの品質を首尾よく改善することができる
・新規組み合わせを選抜することができ、新規ステビア・レバウディアナ品種を市場の需要に応じて栽培することができる。
【００９６】
ステビア・レバウディアナの新規交雑種のこの栽培は、費用がかからず、効率が優れているので、有性栽培および無性栽培の既存のすべての品種が、必然的に、ステビア・レバウディアナの新規交雑品種によって部分的にまたは完全に置き換えられることとなり、多くの経済的利点および社会的利点が結果として生ずることとなる。
【００９７】
本発明のこの態様の特定の実施形態を、本発明のプロセスの説明を通して以下で例証することとする。
【００９８】
１．親の選抜
ステビア・レバウディアナは、自家不稔性の他家受粉植物であるので、ステビア・レバウディアナ集団の遺伝子構成は常に異型接合型のものであり、有性子孫の遺伝は容易に安定化されず、有利な変異と有害な変異の両方を同時に保持し、これは、個々の植物の選抜に課題と可能性をもたらす。中国および外国の様々な植栽地域各地における異なる成長期のステビア・レバウディアナの個々の植物の特性、特徴、生長期間、開花時期、抵抗性および適応性に従って、既存の有性および無性植物の形質と比較するために、本著者らは、それらを観察し、モニターして、高い葉収量、葉中の高い配糖体含量、および強い抵抗性を有する個々の選良植物を選抜し；４種類の植物（それらの通し番号は、それぞれ０１、０２、０３および０４であった）を選抜して個別管理を行い；個々の選良植物各々を３回試験し、選抜された個々の選良植物の信頼性を保証するためにデータの平均値をとった。（４種類の個々の植物の含量および葉収量と既存の有性および無性植物のものとの比較の結果）。
【００９９】
２．種子を生産するための完全期における交雑
1)翌年、個々の選良植物０１、０２、０３および０４の植物区から収穫した種子を栽培品種菜園に播種し、圃場観察を行い、記録し、葉の収量および含量を判定した。（４種類の個々の植物の含量および葉収率の比較の結果）。
2)無性繁殖の使用により優良形質を維持できるという理論に従って、個々の選良植物０１、０２、０３および０４の良好な組み合わせを無性繁殖に付して、それらの優良形質を維持し、雄親および雌親の個々の植物のクローン化系列を形成した。選抜し、マッチングした良好な組み合わせの雄親および雌親のクローン化系列の、好ましくは約１：１比でのコロニーを形成し、（植物数および植物距離）これら２系列の集団交雑を行い、Ｆ１世代交雑種子を混合状態で収穫した。所望の量（数）の優良Ｆ１世代を選抜し、それらの種子を栽培品種菜園に播種し、ＲＡ含量、全配糖体含量および葉収量の平均値を決定し、その後、それらを、雄親、雌親および交雑Ｆ１世代のＲＡ含量、全配糖体含量および葉収量と比較し、（比較結果）Ｆ１世代の上記指数のすべてが、雄親および雌親両方と比較して有意に改善され、既存の有性および無性品種と比較してよりいっそう大きく改善されることが判明した。
【０１００】
３．優良Ｆ１世代を無性繁殖および個別管理に付して、それらの優良形質を安定させた。
【０１０１】
４．優良Ｆ１世代を安定させた後に雌親として使用し、元の無性雄親を雄親として使用して戻し交配を行い、戻し交配により種子を生産するときには好ましくは約１：３の比での該雄親および該雌親のコロニーを形成し、そのＦ２世代種子を収穫して標的品種を得た。一定量（数）の優良Ｆ２世代を選抜し、ＲＡ含量、全配糖体含量および葉収量の平均値を決定し、その後、それらを、元の無性雄親および交雑Ｆ１世代のＲＡ含量、全配糖体含量および葉収量と比較し、（比較結果）Ｆ２世代の上記指数のすべてが、元の無性雄親およびＦ１世代と比較して有意に改善され、既存の有性および無性品種と比較してよりいっそう大きく改善されることが判明した。
【０１０２】
５．Ｆ２世代の交雑種子を雌親として使用し、元の無性雄親を雄親として使用して戻し交配を行い、戻し交配により種子を生産するときには好ましくは約１：３の比での該雄親および該雌親のコロニーを形成し、Ｆ３世代種子を収穫して標的品種を得た。一定量（数）の優良Ｆ３世代を選抜し、ＲＡ含量、全配糖体含量および葉収量の平均値を決定し、その後、それらを、元の無性雄親および雌親として使用した交雑Ｆ２世代のＲＡ含量、全配糖体含量および葉収量と比較し、（比較結果）Ｆ２世代の上記指数のすべてが、元の無性雄親および雌親としてのＦ２世代と比較して有意に改善され、既存の有性および無性品種と比較してよりいっそう大きく改善されることが判明した。
【０１０３】
雌親として使用した上述のＦ２世代交雑種子を、好ましくは、優良形質を有するＦ２世代から選抜し、それらの形質を無性繁殖および個別管理によって安定させた。
【０１０４】
天然甘味料組成物
砂糖に匹敵する呈味プロファイルを有する天然甘味料組成物が望ましい。さらに、生産費用が高すぎない組成物が好ましい。かかる組成物を、例えば飲料および食料製品に添加して、甘味を期待している消費者を満足させることができる。甘味付与目標を個別注文に合わせるために特定のステビオール配糖体を選択的に抽出するプロセスを本明細書に記載する。
【０１０５】
ステビア属は、南アメリカ、中央アメリカおよびメキシコ原産の約２４０種の植物から成り、幾つかの種は、アリゾナ、ニューメキシコおよびテキサスほどのはるか北部でも見つけられる。それらは、最初にスペインの植物学者で物理学者のＰｅｔｒｕｓ  Ｊａｃｏｂｕｓ  Ｓｔｅｖｕｓ（Ｐｅｄｒｏ  Ｊａｉｍｅ  Ｅｓｔｅｖｅ）によって研究され、彼の姓が、ラテン語化された語ステビアの起源である。
【０１０６】
ステビオール配糖体は、非常に有効な甘味特性を有する。実際には、これらの化合物は甘味に幅があり、蔗糖より３８０倍まで甘い。それらは、安全であり、非毒性であり、熱安定性であり、ｐＨ安定性であり、発酵せず、この故に、食品および飲料の製造の際に非常に営利的に使用できる。さらに、それらは、摂取されたとき血糖反応を誘発せず（それらは、ゼロカロリー、ゼロ炭水化物およびゼロ血糖指数であり）、この故に、炭水化物制限ダイエット中の糖尿病患者にとって、および健康代替品を求めている誰にとっても、天然甘味料として極めて魅力的である。血糖指数、すなわちＧＩは、いかに速く食品が血糖値を上昇させるかを測るものである。血糖のゼロ変動をもたらす食品を選ぶことは、長期健康のためならびに心疾患および糖尿病のリスクを低減させるための重要要素である。然るが故に、本発明の天然甘味料組成物の使用は、甘蔗糖、テンサイ糖および他の糖に勝る莫大な利点を有する。
【０１０７】
典型的に、ステビオール配糖体は、ステビア・レバウディアナ・ベルトーニの葉を熱水またはアルコール（エタノールもしくはメタノール）で抽出して得られる；この得られた抽出物は、すべての活性成分に加えて葉の色素、可溶性多糖類および他の不純物を含有する暗色微粒子溶液である。幾つかのプロセスは、抽出を行う前にクロロホルムまたはヘキサンなどの溶媒で葉から「グリース」を除去する。ステビオール配糖体の単離（ｉｓｏｔａｔｉｏｎ）のための多数の抽出特許があり、かかるプロセスは、多くの場合、それらの抽出特許を、溶媒、溶媒に加えて脱色剤、吸着およびカラムクロマトグラフィー、イオン交換樹脂、および個々の配糖体の選択的沈殿に基づくものにカテゴリー分けしたものである。限外濾過、金属イオン、ＣＯ２での超臨界流体抽出、およびゼオライトでの抽出物分類を用いる方法が、より最近の一連の特許の中で見つけられる。
【０１０８】
２００７年の第６８回合同食品添加物専門家会議（Ｊｏｉｎｔ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｆｏｏｄ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ（「ＪＥＣＦＡ」）の会合で、ステビオール配糖体は、ステビア・レバウディアナ・ベルトーニの葉から得られる産物と定義された。ＪＥＣＦＡにより述べられているように、典型的な製造は、熱水での葉の抽出で始まり、その水性抽出物を吸着樹脂に通して捕捉し、成分ステビオール配糖体を濃縮する。その樹脂をメタノール中で洗浄して配糖体を遊離させ、その生成物をメタノールで再結晶させる。イオン交換樹脂をこの精製プロセスに使用してもよい。最終生成物を一般には噴霧乾燥させる。表２（本開示の末尾）により、化学名、構造、アッセイ方法、および９つの主要配糖体の溶出時間を示す試料クロマトグラムを含む、ステビオール配糖体の製品モノグラフを記載する。
【０１０９】
ステビアの葉から（母液を生ずる）配糖体抽出物を単離するために用いた抽出プロセスの好ましい工程を以下に記載する。図８に示すように、ステビアの葉（１２）を乾燥させ、乾燥したステビアの葉を一定容積の水（１４）中で撹拌（１６）して、その乾燥したステビアの葉から甘味配糖体を遊離させる。好ましくは、約１容積から約１５容積の間の水を使用して、その乾燥した葉から甘味配糖体を遊離させる。さらにいっそう好ましくは、約１２容積の水を使用して、その乾燥した葉から甘味配糖体を遊離させる。水−葉混合物を約１０分から約１時間の間の時間、さらに好ましくは、約２５分から約３５分の間の時間にわたって撹拌する（１６）。撹拌（１６）の後、水−葉混合物を排液し、濾液を回収する（１８）。撹拌（１６）と濾液回収（１８）のサイクルを合計約５サイクル繰り返す。この５サイクルの間に、水−葉混合物を合計約１時間から約５時間の間の時間、さらに好ましくは、合計約２時間から約３時間の間の時間にわたって撹拌する。
【０１１０】
１つの実施形態では、各撹拌／回収サイクルについて、水−葉混合物を、約５℃から約５０℃の間、さらに好ましくは、約２０℃から約３０℃の間の温度を有する環境で撹拌する（１６）。撹拌／回収サイクルの完了後、水−葉混合物のｐＨを、先ず、約ｐＨ８．０に調整する（２０）。次に、そのｐＨ調整した水／葉混合物を約３０分から約２時間の間の時間にわたって放置する。次に、水−葉混合物のｐＨの二回目の調整（２２）を行って約ｐＨ７．０にする。その後、水−葉混合物を濾過（２４）して、水性濾液を得る。次に、その水性濾液をイオン交換カラム（２６）にかけて、水性濾液を精製し、除染する。この水性濾液を精製および除染するために他の方法も使用できることは、当業者には理解されるだろう。その後、吸着樹脂床を使用して、水性濾液を脱塩および脱色（２８）し、濃縮（３０）する。この水性濾液を濃縮するために他の方法も使用できることは、当業者には理解されるだろう。濃縮されたステビオール配糖体を含有する濾液を吸着床（３４）から、吸着樹脂床をエタノール（３２）、好ましくは約７０％エタノール（３２）ですすぐことによって遊離させる。
【０１１１】
本発明の甘味料組成物は（本明細書に記載するプロセスによって調製した１つ以上の配糖体を含み）、数ある中でも、様々な食料製品、飲料、医薬製剤、化学工業製品の調製に使用することができる。甘味料組成物の例示的利用／使用としては、（ａ）缶詰食品、保存果実、調理済みの食品、スープをはじめとする、食料製品、（ｂ）コーヒー、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、ヨーグルト飲料、食事代替飲料ならびにアルコールドリンク、例えばブランディー、ウイスキー、ウォッカおよびワインなどの飲料；（ｃ）調理済み、焼き済み、あるいは加工済みにかかわらず、穀物に基づく品物、例えば、パンおよびパスタ、クッキー、ペストリー；（ｄ）脂肪に基づく製品−−例えば、マーガリン、スプレッド（乳製品含有および乳製品不含）、ピーナッツバター、ピーナッツスプレッドおよびマヨネーズ；（ｄ）製菓類−−例えば、チョコレート、キャンディー、タフィー、チューイングガム、デザート、乳製品不含トッピング（例えば、Ｃｏｏｌ  Ｗｈｉｐ（登録商標））、シャーベット、乳製品含有および乳製品不含シェイク、アイシングおよび他の詰め物、（ｅ）薬物および医薬製剤、特に、コーティングおよび着香；（ｆ）化粧品および健康利用、例えば練り歯磨きへの甘味付与用；ならびに（ｇ）様々な食料製品、例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、ケチャップ、マリナード、ステーキソース、ドレッシング、マヨネーズ、酢、粉末酢、冷凍デザート、肉製品、魚肉製品、ポテトサラダ、瓶詰および缶詰食品、果実および野菜のための調味料が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
本発明の天然甘味料組成物をプレミックスおよびサッシェに調合することができる。その後、かかるプレミックスを多種多様な食品、飲料および栄養補助食品に添加することができる。その精製された天然甘味料組成物は、１つの好ましい形態では、卓上甘味料であり得る。
【０１１３】
代替実施形態において、本発明の甘味料組成物は（本明細書に記載するプロセスによって調製された１つ以上の配糖体を含み）、二次的甘味付与成分をさらに含む。二次的甘味付与成分は、好ましくは、蔗糖、エリトリトール、果糖、ブドウ糖、麦芽糖、乳糖、コーンシロップ（好ましくは、高果糖）、キシリトール、ソルビトールまたは他の糖アルコール、イヌリン、ミラクリン、モナチン（ｍｏｎｅｔｉｎ）、タウマチンおよびこれらの組み合わせ、ならびにまた非天然甘味料、例えばアスパルテーム、ネオテーム、サッカリン、スクラロースおよびこれらの組み合わせから成る群より選択される。好ましくは、５０％カロリー低減卓上製品についての二次的甘味付与成分（好ましくは、蔗糖）のブレンドに対する比は、好ましくは、２４．７：１である。かかる天然甘味料組成物は、食料製品および飲料に容易に添加することができ、または卓上甘味料として使用することができる。二次的甘味付与成分のブレンドに対する比は、さらに好ましくは、約５：１から１：１の間である。天然甘味料組成物を単独で使用することができ、または本明細書に記載の他の二次的甘味料、ならびに／または１つ以上の有機およびアミノ酸、フレーバーおよび／もしくは着色剤と併用することができる。
【０１１４】
本明細書に記載するプロセスおよび組成物の形態は、本発明の好ましい実施形態を構成するものであるが、本発明がこれらのまさにその形態に限定されないことは理解されたい。上で説明した様々な実施形態を併用してさらなる実施形態を得ることができることは、当業者には明らかであろう。本発明のシステム、方法、ノードおよび成分ならびに概念を最良に利用するために、必要に応じて、本組成物、方法およびプロセス（それらの特定の成分を含む）の態様を変更することができる。これらの態様は、特許請求する本発明の完全に範囲内と考えられる。例えば、上で説明した様々な方法は、幾つかの行為を省くことができ、他の行為を含むことができ、および／または例証実施形態に示すものとは異なる順序で行為を実行することができる。
【０１１５】
さらに、本明細書に教示する方法における様々な行為を、例証および説明するものとは異なる順序で行うことができる。加えて、その方法は、幾つかの行為を省くことができ、および／または追加の行為を用いることができる。
【０１１６】
上の説明にかんがみて、本発明のシステム、方法および物品に対してこれらおよび他の変更を行うことができる。一般に、後続の特許請求の範囲において用いる用語が、本明細書および特許請求の範囲に開示する特定の実施形態に本発明を限定すると解釈すべきでなく、かかる特許請求の範囲に権利が与えられる等価物の全範囲と共にすべての可能な実施形態を包含すると解釈すべきである。したがって、本発明は、本開示によって限定されず、その代り、本発明の範囲は、完全に後続の特許請求の範囲によって決定されることとなる。
【０１１７】
本明細書において言及するすべての出版物、特許および特許出願は、本発明が属する当業者のレベルを示す。かかるすべての出版物、特許および特許出願は、各々が参照により本明細書に援用されていると具体的におよび個々に示されているのと同程度に、引証のために参照により本明細書に援用されている。
【０１１８】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例証するものである。
【実施例】
【０１１９】
【実施例１】
【０１２０】
植物材料：
番号２（Ｈ５または高ＳＴＶ＃２）、番号３（Ｒｕｎｄｅ  ＃４）、番号４（Ｃｈｉｎａ  Ａ  ＃３）、番号５（Ｒｕｎｄｅ  ＃１７）、番号７（Ｈ４またはＲｕｎｄｅ  ＃１）、番号８（Ｍｏｒｉｔａ  ＃２）、番号９（Ｈ３またはＲｕｎｄｅ  ＃１８）を、番号１（Ｗａｉｍａｏ  ＃３）と番号６（Ｍｏｒｉｔａ  ＃３）を交配した後に得た。番号９系統種のＩＳＳＲフィンガープリントは、番号８が親と同じであるが、番号２、番号３、番号４、番号５、番号７および番号９はすべて親と異なることを示した（図１〜５を参照のこと）。
【０１２１】
方法：
Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを使用して、両親および７つの系統種のステビアの葉からゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡの収量および品質をＵＶ／ｖｉｓ分光光度計、および１．０％アガロースゲルでの電気泳動によって確認した。
【０１２２】
ジヌクレオチド、テトラヌクレオチドまたはペンタヌクレオチドリピートに基づき、１２５のうちの９のＩＳＳＲプライマーが、ステビア系統種のすべてのＤＮＡの明確で再現性のある断片を生じさせた。ＰＣＲ反応混合物は、２０μＬ容積中、３０ｎｇ／μＬゲノムＤＮＡ２．０μＬ、１０×緩衝液２．０μＬ、２５ｍＭ／Ｌ、ｄｄＨ２Ｏ１２．６μＬ、１０ｐｍｏｌ／ｕＬプライマー１．０μＬ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  １．０μＬ、２５ｍＭ  Ｍｇ２＋  １．２μＬ、５ｕ／μＬ  Ｔａｑポリメラーゼ０．２μＬから成った。
【０１２３】
増幅プロトコルは、次のとおりであった：予備反応を９４℃で２分間の初期変性で開始させ、続いて９４℃で１０秒、３６℃で３０秒そして７２℃で６５秒を４０サイクル行った。これらの反応の後、７２℃で１０分伸長させ、最終的に４℃で保存した。増幅ＩＳＳＲ産物と６×ブロモフェノールブルーを、５Ｖ／ｃｍで泳動させる２％アガロースゲルでの電気泳動によって分離した。エチジウムブロマイドでの染色後、ＵＶトランスイルミネータでバンドパターンを可視化した。類似度指数を計算し、９系統種のＩＳＳＲ分析のバンドパターンに基づいて合意樹を作成した。
【０１２４】
結果：
８は親と同じであったが２、３、４、５、７および９は親と異なり、これらは、クラスター分析の結果と類似していた（図６）。
【０１２５】
Ｍ：ＤＮＡマーカー（上から下へ：２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ）。
結果は、２０００ｂｐへのバンドが無く、最大バンドが約１５００ｂｐであることを示した。
【０１２６】
これらの分析結果から、５と７が最も近い系統発生的関係を有し、それに３と４、次いで８と９が続き、１と６が最後であると判定することができる。
【０１２７】
１と６を雌親と考えると、後代の中で番号５と７が最も遠い系統発生的関係を有し、５と７が最も近い系統的関係を有することがわかる。
【実施例２】
【０１２８】
−−ＧＬＧステビアＨ２、Ｈ３、Ｈ４およびＨ５ＤＮＡ分子同定レポート（ＡＴ  Ｌａｂ）
説示：
Ａ：Ｍｏｒｉｔａ  ＃２として；
Ｂ：Ｈ３母（Ｂ６）として；
Ｃ：Ｈ５父として；
Ｄ：Ｍｏｒｉｔａ  ＃３として；
Ｅ：Ｈ４として；
Ｆ：Ｈ５として；
Ｇ：Ｈ３母（Ｂ４）として；
Ｈ：Ｈ３母（Ｊ３）として；
Ｉ：Ｈ２として；
Ｊ：Ｈ３として；
Ｋ：ＤＣ＃１として；
Ｌ：Ｃ１として。
結果：図７。
【実施例３】
【０１２９】
−ステビア・レバウディアナの葉からのステビオール配糖体の抽出−
高いレバウディオシドＡ含量を有することが分かっている１ｋｇのステビアの葉を、撹拌遠心機中のｐＨ７．３を有する２ｋｇの室温の水に浸漬した。それらの葉を０．５時間撹拌した。甘味水を濾過し、濾液を回収し、このプロセスを合計５浸漬／分離サイクル繰り返した。甘味水濾過溶液のｐＨをおおよそ３０グラムの水酸化カルシウムでｐＨ８．０に調整した。約１時間の静止時間の後、５０グラムのＦｅＣｌ３を甘味水濾過溶液に添加して、さらにｐＨ７．０に調整した。その溶液を濾過し、得られた濾液は、３２５ｎｍで約６８±２％の透過率を有した。濾液を樹脂床に流し、７５％のエタノールを使用することにより樹脂床から配糖体を溶出させた。溶出物を固形分４５〜５０％に濃縮し、その後、真空乾燥させた。この乾燥溶出物をステビア抽出物またはステビア一次抽出物（ＳＰＥ）と呼ぶ。
【図１】
2014502505.tif 000004
【図２】
2014502505.tif 000005
【図３】
2014502505.tif 000006
【図４】
2014502505.tif 000007
【図５】
2014502505.tif 000008
【図６】
2014502505.tif 000009
【図７】
2014502505.tif 000010
【図８】
2014502505.tif 000011
【図９】
2014502505.tif 000012
【国際調査報告】
2014502505.tif 000013
2014502505.tif 000014
2014502505.tif 000015
2014502505.tif 000016
2014502505.tif 000017