(57)【要約】  配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有する細胞の損傷防止に効果的なペプチド、および該ペプチドを有効成分として含む細胞の損傷防止用薬学組成物に係り、該ペプチドは、従来の天然ヒトエリスロポエチンに比べ、多種の細胞の保護活性において顕著に優れた生理活性を有するだけでなく、天然のヒトエリスロポエチンに比べて大幅に簡単な構造を有するため、組織−血管バリア（ｔｉｓｓｕｅ−ｂｌｏｏｄ  ｂａｒｒｉｅｒ）の通過が容易で、生産コストが削減されて経済的である。したがって、前記ペプチドを有効成分として含む薬剤学的組成物は、脳卒中、神経系の機械的損傷または虚血性損傷、心筋梗塞、糖尿病、心不全、末梢血管障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎炎、糖尿病性神経症、緑内障、認知症、パーキンソン病、ルー・ゲーリック病などの神経変性性疾患、急性および慢性腎機能障害などの予防または治療に有効である。【選択図】図１
2014528952.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有する細胞、組織または器官の損傷の予防または治療に効果的なペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）に由来することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に規定するペプチドを有効成分として含む細胞、組織または器官の損傷の予防用薬学組成物または治療用薬学組成物。
【請求項４】
前記細胞、組織または器官が、脊髄、脳、心臓、網膜、皮膚、筋肉、肺、肝臓、腎臓、小腸、副腎、血管、膀胱、尿道、胃、腸管、神経、睾丸、卵巣または子宮の細胞、組織または器官であることを特徴とする請求項３に記載の薬学組成物。
【請求項５】
前記損傷が、脳卒中、神経系の機械的損傷もしくは虚血性損傷、多発性硬化症、発作、低血圧、心臓麻痺、虚血症、心筋梗塞、炎症、認知機能の年齢と関連する損失、放射線損傷、大脳麻痺、神経変性性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、リー（Ｌｅｉｇｈ）病、ＡＩＤＳ性痴呆、記憶障害、筋萎縮性硬化症、アルコール中毒、気分障害、不安障害、注意力欠乏障害、自閉症、クロイツフェルトヤコブ病、脳外傷もしくは脊髄外傷もしくは虚血症、心臓−脳バイパス、慢性心不全、加齢による視力減退、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、緑内障、網膜性虚血または網膜外傷に起因したことを特徴とする請求項３に記載の薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリスロポエチン−由来のペプチドおよびそのペプチドを含む薬学組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
［背景技術］
人体は生きている間、内部または外部の絶え間ない刺激と有害要素にさらされ、個体は、その有害要素に対応し、様々なメカニズムによって、自身の体を保護する。かような有害要素は、機械化学的危険要素、低酸素症、感染など様々な要素があり、これらの様々な有害要素から身体を保護するために、個体はもとより、小さくは細胞単位において、有害要素から防御する様々なメカニズムが発見されている。かようなメカニズムによって分泌される様々な細胞因子（ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ）は、初期外部有害要素だけでなく、防御メカニズムを尽くして寿命を終える細胞が生産する二次的内部有害物質による、化学的、免疫学的損傷まで防御し、細胞壊死または細胞アポトーシス（ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｏｒ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の防止、初期損傷部位の拡散防止、新たな細胞の出現、新たな健康な組織への再生まで誘導する役割をすることもある。
【０００３】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、周知の１６５個のアミノ酸で構成された３４ｋＤａの造血性サイトカイン（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ）であり、身体内の低酸素症（ｈｙｐｏｘｉａ）に反応して腎臓で生成され、骨髄内の赤血球前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｏｆ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）を刺激し、赤血球の増加を誘発する。従って、組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）は、慢性腎不全による貧血、手術による貧血、癌や抗癌治療による貧血など、貧血を治療する薬剤として使用される（非特許文献１）。最近、ＥＰＯは、貧血治療以外に神経系の機械的損傷または虚血性損傷において注目すべき細胞保護能、組織保護能を示し（非特許文献２）、急性心筋梗塞動物モデルでも、５０％程度の組織損傷を低減させるという効果を示し、これは抗細胞アポトーシス（ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｓｉｓ）によるものとみられる（非特許文献３，４）。
【０００４】
このようなＥＰＯの貧血治療効果および細胞組織保護能とは裏腹に、ＥＰＯの投与時に発生しうる赤血球増加による血行障害および血小板活性の上昇などを呈することが明らかにされ（非特許文献５，６）、かような副作用によって、ＥＰＯの組織保護能が相殺されることがあるという問題が表れてきている。従って、赤血球増加や血小板の活性を刺激することなく、組織保護能は維持するアシアロエリスロポエチン（ａｓｉａｌｏＥＰＯ）、カルバミル化エリスロポエチン（ｃａｒｂａｍｙｌａｔｅｄ  ＥＰＯ）などのエリスロポエチン誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）、またはエリスロポエチンの一部の構造を利用したペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）に関する研究が進められている（非特許文献７〜９）。
【０００５】
前述のようにエリスロポエチンは、赤血球増加による貧血治療、神経系の細胞および組織に関する保護能、ならびに心筋組織損傷保護能など非常に重要な機能を果たすことが知られている。このように、ＥＰＯは活性が非常に高いタンパク質ではあるが、生産コストが非常に高く、ＥＰＯを末梢血管内に投与する場合、一部の標的臓器に存在する組織−血管バリア（ｔｉｓｓｕｅ−ｂｌｏｏｄ  ｂａｒｒｉｅｒ）などにより、標的臓器に輸送されず、薬物伝達に困難が伴うことが知られている（非特許文献１０〜１２）。したがって、生産コストが少なく、かつ生体組織への輸送が円滑であって効果的なヒトＥＰＯ代替物質が要求されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】１．Ｊｅｌｋｍａｎｎ，Ｗ．  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  （１９９４）  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ７２，  Ｓ３−Ｓ１０
【非特許文献２】２．Ｂｒｉｎｅｓ，Ｍ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｃｒｅｓｓｅｓ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ  ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  （２０００）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７，  １０５２６−１０５３１．
【非特許文献３】３．Ｍｏｏｎ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｅｃｌｉｎｅ  ａｆｔｅｒ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ）  （２００３）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ２００３  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ３０；１００（２０）：  １１６１２−１１６１７．
【非特許文献４】４．Ｓｉｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｆｔｅｒ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ  （２００１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８，  ４０４４−４０４９．
【非特許文献５】５．Ｗｉｅｓｓｎｅｒ，Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｉｎｆａｒｃｔ  ｖｏｌｕｍｅｓ  ｉｎ  ｐｏｌｙｇｌｏｂｕｌｉｃ  ｍｉｃｅ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  （２００１）  Ｊ．  Ｃｅｒｅｂ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．  ２１，  ８５７−８６４．  ｐｍｉｄ：１１４３５７９８
【非特許文献６】６．Ｗｏｌｆ，Ｒ．Ｆ．，  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｉｎ  ｄｏｇｓ  （１９９７）  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ７８，  １５０５−１５０９．  ｐｍｉｄ：９４２３８０３
【非特許文献７】７．Ｉｍａｉ，Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｓｉａｌｏｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）  （１９９０）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９４，  ４５７−４６２．
【非特許文献８】８．Ｌｅｉｓｔ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  ２００４；３０５：２３９−４２．
【非特許文献９】９．Ｂｒｉｎｅｓ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｏｎｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ，  ｔｉｓｓｕｅ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｔｅｒｔｉａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ２００８；  １０５：１０９２５−３０．
【非特許文献１０】１０．Ｍａｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｑｕｏｒ：ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ，  １９９７，  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．  ５１：４１６−８
【非特許文献１１】１１．Ｊｕｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｏｆ  ｎｅｏｎａｔｅｓ  ｗｈｏ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ＣＮＳ  ｉｎｊｕｒｙ，  １９９９，  Ｐｅｄｉａｔｒ，  Ｒｅｓ．  ４６：５４３−５４７
【非特許文献１２】１２．Ｂｕｅｍｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｄｏｓｅ  ｎｏｔ  ｌｅａｄ  ｔｏ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｒｅｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，  ２０００，  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  Ｄｉａｌ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  １５：４２２−４３３．
【発明の概要】
【０００７】
［発明の詳細な説明］
［技術的課題］
そこで、本発明者は、天然ヒトＥＰＯと同等な効果を有しつつも、天然ＥＰＯに比べて生産コストが削減されるだけでなく、体内に存在する組織−血管バリア（ｔｉｓｓｕｅ−ｂｌｏｏｄ  ｂａｒｒｉｅｒ）の通過が容易なペプチドを製造するため、多種のヒトＥＰＯ由来ペプチドを製造およびスクリーニングした。その結果、多くのペプチド候補物質の中でも、天然ＥＰＯよりも生理活性が顕著に優れるだけでなく、組織−血管バリアの透過が容易であり、かつ生産コストが削減されて経済的なペプチドを選別し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、ＥＰＯよりも優れた生理活性を有しながらも、組織−血管バリアの透過が容易であり、かつ経済的に生産されるペプチドを提供するものである。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記ペプチドを含む細胞の損傷防止のための薬学組成物を提供することである。
【００１０】
［課題を解決する手段］
前記目的を達成するために、本発明の一側面は、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有する細胞損傷防止に効果的なペプチドを提供する。
【００１１】
本発明の他の一側面は、細胞損傷防止に効果的な前記ペプチドを有効成分として含む、細胞損傷防止用薬学組成物を提供するものである。
【００１２】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【００１３】
本発明で使用されるすべての技術用語は、別途に定義されない限り、本発明の関連分野における当業者が一般的に理解するような意味で使用される。また、本明細書には、望ましい方法や試料が記載されるが、それらと類似していたり、または同等のものも本発明の範疇に含まれる。本明細書に参考文献として記載されるすべての刊行物の内容は、本発明に全体が参照として組み込まれる。
【００１４】
本発明者は、多種のヒトＥＰＯ由来ペプチドを製造およびスクリーニングすることにより、天然のヒトＥＰＯに比べて顕著に優れた生理活性を有するペプチドを突き止め、該ペプチドは、天然ヒトＥＰＯに比べて大幅に簡単な構造を有するため、組織−血管バリア（ｔｉｓｓｕｅ−ｂｌｏｏｄ  ｂａｒｒｉｅｒ）の通過が容易であり、生産コストが削減されて経済的である。
【００１５】
したがって、本発明は、一側面において、下記一般式Ｉで示される配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有する細胞損傷防止に効果的なペプチドを提供する。
【００１６】
【化１】
2014528952.tif 000003
【００１７】
本発明に係るペプチドを表現した前記一般式Ｉは、本発明のペプチド構造を便宜的に表現するために記載されたものであり、その変形も本発明に属するということは、当業者に自明に認識されるものである。例えば、前記一般式ＩでＥＰＯ由来の配列の変形体も本発明の範囲に属するということは、当業者には自明である。
【００１８】
本発明の一具体例によれば、本発明のペプチドのＮ−末端またはＣ−末端には、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびアミノ酸で構成された群から選択される保護基がさらに結合される。
【００１９】
本発明の別の一具体例によれば、本発明のペプチドのＮ−末端またはＣ−末端は、ヒドロキシ基（−ＯＨ）またはアミノ基（−ＮＨ２）で変形されており、さらに望ましくは、ヒドロキシ基に変形されている。
【００２０】
前述のアミノ酸の変形は、本発明のペプチドの安定性を大幅に改善させる作用を果たすことができる。本明細書において、用語「安定性」は、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）安定性および保存安定性（例えば、常温保存安定性）を意味する。前記保護基は、生体内のタンパク質切断酵素の攻撃から、本発明のペプチドを保護する作用をすることができる。
【００２１】
本明細書において、用語「ペプチド」は、アミノ酸がペプチド結合によって互いに結合されて形成された線形の分子を意味する。本発明のペプチドは、当該技術分野に公知の合成方法、例えば、固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）によって製造されることができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  ｓｏｃ．  ８５：２１４９−５４  （１９６３）；  Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ，ｅｄ．，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．：ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ），１１１（１９８４））。
【００２２】
前記ペプチドは、ヒトＥＰＯから由来したものであり、それ自体として、天然ヒトＥＰＯに比べて著しく優れた神経細胞保護効果、心筋細胞保護効果、網膜細胞保護効果、および膵臓ベータ細胞保護効果を有することが明らかにされた（試験例１〜４）。
【００２３】
したがって、本発明は、別の一側面において、前記本発明に係るペプチドを含む細胞、組織、または器官の損傷の予防用薬学組成物または治療用薬学組成物を提供する。
【００２４】
また、本発明の一具体例によれば、薬剤学的な有効量の前記本発明に係るペプチド、および薬剤学的に許容可能な担体を含む、細胞、組織、または器官の損傷の予防用薬学組成物または治療用薬学組成物を提供する。
【００２５】
本明細書では「損傷」とは、神経学的症状または精神的症状、眼疾患、心血管疾患、心圧疾病、呼吸疾患、腎臓・尿道および生殖器の疾患、骨疾患、皮膚疾患、胃腸疾患、ならびに内分泌障害および代謝障害において、本発明に係るペプチドが予防的効果または治療的効果を有するようにするところの、任意のヒトの疾患を指す。特に、かような状態および疾患としては、興奮組織、例えば、中枢神経系、末梢神経系、心臓細胞や網膜組織の興奮組織（ｅｘｃｉｔａｂｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ）、例えば、脳／脊髄、心臓または網膜／目に悪影響を与える低酸素症状態が含まれる。
【００２６】
酸素を神経組織に利用させる可能性の低下は、ストレス、損傷、および最終的には神経細胞死をもたらし、本発明に係るペプチドで治療することができる。一般的に、低酸素症および／または虚血とされる状態は、脳卒中、血管閉塞、出生前後の酸素欠乏、気道閉塞、喘息、溺死寸前、一酸化炭素中毒、煙の吸入、手術および放射線治療を含む外傷、てんかん、低血糖（症）、慢性肺循環障害、肺気腫、成人呼吸窮迫症候群、低血圧ショック、敗血性ショック、超過敏反応ショック、インスリンショック、鎌状赤血球発作、不整脈、窒素麻酔、および心臓−肺移植過程で引き起こされた神経学的欠乏が含まれるが、これらに限定されるものではない。従って、本発明に係るペプチドは、様々な状態および環境において、低酸素状態から引き起こされる興奮組織（ｅｘｃｉｔａｂｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ）の欠乏を治療したり、または予防したりするために使用される。そのような疾患または状態の例としては、虚血症（心臓動脈疾患、心筋梗塞、狭心症、先天性心疾患としての弁膜性心筋症、プリンツメタル狭心症、心臓破裂、血管炎、不整脈、心筋炎、鈍器外傷、貫通外傷、コカインのような毒素）、高血圧、減圧病、線維筋肉過多形成症、動脈瘤、喘息、慢性気管支炎、肺気腫、肺塞栓症、肺血栓症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、肺炎、サルコイドーシス、１型および２型糖尿病、骨減少症、骨髄炎、無血管壊死、外傷、パジェット病、脱毛症、白斑症、糖尿病性潰瘍、火傷、末梢血管疾患、エリテマトーデス、シェーグレン症候群、リウマチ関節炎、糸球体腎炎、視覚神経炎、網膜剥離、側頭動脈炎、網膜虚血、黄斑変性、色素性網膜炎、動脈硬化、網膜症、高血圧性網膜症、網膜動脈閉鎖、網膜静脈閉鎖、糖尿病性網膜症、窒息、虚血、子癇症、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、脳外傷、脊髄外傷、てんかん、痙攣、慢性発作障害、慢性疲労症候群、急性および慢性の低浸透圧および高浸透圧症候群、ＡＩＤＳ、痴呆、感電、窒息、多発性硬化症、アルツハイマー病、脳性麻痺、脳機能の老化、記憶喪失、ＡＬＳ、発作障害、亜急性硬化性汎脳炎、脳炎、髄膜炎、硬膜下血腫、ニコチン中毒、薬物濫用および禁断、強迫性精神障害、気分障害、不安障害、うつ病、自閉症、注意力欠乏、過活動障害、認識機能障害、脊椎狭窄症、黄疸徹骨炎、ギランバレー症候群、神経根圧迫、腫瘍圧迫、熱射病、結節性硬化症、ウィルソン病、大脳および進行性核上麻痺、グアム病、レビー小体型認知症、ハンチントン病、筋緊張性退行性萎縮、フリードライヒ運動失調症およびその他の運動失調症、トゥレット症候群、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、耳鳴り、メニエール症候群、聴覚損失、外傷性損傷、糖尿病性腎疾患、ヘノッホ・シェーンライン紫斑症、重症筋無力症、皮膚筋肉炎、多発筋肉炎、ミオパチー、横紋筋融解症、ミトコンドリア病、壊死筋膜炎、薬物による二次性勃起不全、ウイルス性／細菌性／寄生虫性肝炎、肝硬変、脂肪肝、肝臓での浸潤／代謝疾患、虚血性腸疾患、炎症性腸疾患、壊死状胃腸炎、器官移植での供与者および授与者の状態、不妊症（血管性、自己免疫、子宮異常、着床障害）、内分泌機能亢進、または内分泌機能の低下などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
前記本発明に係る薬学組成物は、活性成分である本発明に係るペプチドが、心筋細胞保護効果、神経細胞保護効果、網膜細胞保護効果および膵臓ベータ細胞保護効果などを有するため、細胞損傷を防ぐことにより細胞、組織および器官損傷の予防または治療に効果がある。また、かような効果により、脳卒中、神経系の機械的損傷または虚血性損傷、心筋梗塞、網膜損傷および糖尿病を含む、細胞、組織または器官の損傷を引き起こす前記列挙された多様な疾患の予防または治療に使用され、望ましくは、脳卒中障害、多発性硬化症、発作、低血圧、心臓麻痺、虚血症、心筋梗塞、炎症、認知機能の年齢と関連する損失、放射線損傷、大脳麻痺、神経変性性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、リー（Ｌｅｉｇｈ）病、ＡＩＤＳ性痴呆、記憶障害、筋萎縮性硬化症、アルコール中毒、気分障害、不安障害、注意力欠乏障害、自閉症、クロイツフェルトヤコブ病、脳外傷もしくは脊髄外傷もしくは虚血症、心臓−脳バイパス、慢性心不全、加齢による視力減退、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、緑内障、網膜性虚血または網膜外傷と関連した機能的損傷に対する保護または修復のために使用される。
【００２８】
本明細書において、用語「薬剤学的な有効量」は、前記ペプチドの生体内効果を達成するために十分な量を意味する。
【００２９】
前記の薬剤学的組成物は、当該技術分野で公知の一般的な薬剤学的剤形に製剤化される。前記の薬剤学的組成物は、経口または非経口、望ましくは非経口投与され、非経口で投与する場合には、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、腹腔内注射、局所投与、経皮投与などで投与することができる。従って、前記薬剤学的組成物は、経口投与製剤、注射剤、坐剤、経皮投与製剤、および経鼻投与製剤を含むが、これらに限定されない任意の剤形に製剤化されて投与されることもある。
【００３０】
前記それぞれの剤形に製剤化するときは、それぞれの剤形の製造に必要な薬剤学的に許容可能な担体または添加剤を付加して製造することができる。代表的には、注射剤に製剤化する場合には、当該技術分野で公知の一般的な注射剤製造方法によって製造される。前記本発明に係る注射剤は、一具体例によれば、一般的に、蒸留水に薬物を溶解させて注射剤にすることができる。本発明に係る注射剤は、患者に投与するとき、そのまま使用されることができるように、滅菌媒質に分散された形態であることもあり、投与時に注射用蒸留水を加えて、適切な濃度に分散させた後に投与する形態でもある。
【００３１】
経口投与用剤形に製剤化するときは、前記担体として、希釈剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、甘味剤、安定剤および防腐剤の中から１種以上を選択して使用することができ、添加剤としては、香料、ビタミン類および抗酸化剤の中から１種以上を選択して使用することができる。前記担体および添加剤は、薬剤学的に許容可能なものであれば、すべて可能であり、具体的には希釈剤としては、乳糖、コーンスターチ、大豆油、微晶質セルロースまたはマンニトール、滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウムまたはタルク、結合剤としては、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルセルロースが望ましい。また、崩壊剤としては、カルボキシメチルセルロースカルシウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ポラクリリンカリウムまたはクロスポビドン、甘味剤としては、白糖、果糖、ソルビトールまたはアスパルテーム、安定剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ベータ−シクロデキストリン、木蝋またはキサンタンガム、防腐剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸カリウムが望ましい。
【００３２】
前記本発明に係る薬学組成物の投与量は、製剤化方法、投与方法、患者の年齢・体重・性別、病的状態、飲食物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応過敏性のような要因により多様に決定され、成人標準男性を基準に、本発明のペプチドを０．００１〜１００μｇ／日の範囲で投与することができる。
【００３３】
［発明の効果］
前述したように、本発明に係るペプチドは、従来の天然ヒトＥＰＯに比べ、各種細胞の保護活性において、顕著に優れた生理活性を有するだけでなく、天然ヒトＥＰＯに比べ、大幅に簡単な構造を有するため、組織−血管バリア（ｔｉｓｓｕｅ−ｂｌｏｏｄ  ｂａｒｒｉｅｒ）の通過が容易であり、生産コストが削減されて経済的である。したがって、本発明に係るペプチドを有効成分として含む薬学組成物は、脳卒中、神経系の機械的損傷または虚血性損傷、心筋梗塞、網膜損傷、糖尿病など、細胞損傷と関連する多様な病気の予防や治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】心筋細胞に対して、多様な濃度別のＥＰＯおよびＭＫＸ−２で処理した後、７２時間培養し、ＭＴＴアッセイ法で細胞生存率を比較した結果を示したグラフである。
【図２】脳神経細胞を、多様な濃度別のＥＰＯおよびＭＫＸ−２で処理した後、７２時間培養し、ＭＴＴアッセイ法で細胞生存率を比較した結果を示したグラフである。
【図３】網膜神経細胞を、多様な濃度別のＥＰＯおよびＭＫＸ−２で処理した後、７２時間培養し、ＭＴＴアッセイ法で細胞生存率を比較した結果を示したグラフである。
【図４Ａ】ベータ細胞ＨＩＴ−Ｔ１５にＭＫＸ−２をそれぞれ濃度別に前処理した後、Ｈ２Ｏ２を２時間処理し、ＭＴＴアッセイ法で細胞生存率を比較した結果を示したグラフである。
【図４Ｂ】ベータ細胞ＨＩＴ−Ｔ１５にＭＫＸ−２をそれぞれ濃度別に前処理した後、Ｈ２Ｏ２を４時間処理し、ＭＴＴアッセイ法で細胞生存率を比較した結果を示したグラフである。
【図５Ａ】ベータ細胞ＩＮＳ−１にＭＫＸ−２をそれぞれ濃度別に前処理した後、Ｈ２Ｏ２を２時間処理し、ＭＴＴアッセイ法で細胞生存率を比較した結果を示したグラフである。
【図５Ｂ】ベータ細胞ＩＮＳ−１にＭＫＸ−２をそれぞれ濃度別に前処理した後、Ｈ２Ｏ２を４時間処理し、ＭＴＴアッセイ法で細胞生存率を比較した結果を示したグラフである。
【図６】脳梗塞を誘発させたスプラーグ−ドーリー（Ｓｐａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットモデルに試験薬を投与し、脳を分離し、頭頂面に沿った切片をＴＴＣ染色した後に撮影した写真である。
【図７】脳梗塞を誘発させたスプラーグ−ドーリー（Ｓｐａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットモデルに試験薬を投与し、脳を分離し、頭頂面に沿った切片をＴＴＣ染色した後、脳梗塞面積を測定した結果を図示したグラフである。
【図８】ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットから得られた培養された心筋細胞に対して、ＴＵＮＥＬアッセイの結果、ＤＡＰＩで染色された細胞と、ＴＵＮＥＬ陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を示す細胞の数をカウントし、その比率を計算した結果を図示したグラフである。
【実施例】
【００３５】
［図面の簡単な説明］
図１は、心筋細胞に対して、多様な濃度別のＥＰＯおよびＭＫＸ−２で処理した後、７２時間培養し、ＭＴＴアッセイ法で細胞生存率を比較した結果を示したグラフである。
【００３６】
ＥＰＯのグラフにおいて、下側に
【００３７】
【化２】
2014528952.tif 000004
【００３８】
マークがないものは、基準点０．１ｎＭと比較して統計的に有意でないものであり、１０００ｎＭでの３地点での
【００３９】
【化３】
2014528952.tif 000005
【００４０】
マークのうち上部の
【００４１】
【化４】
2014528952.tif 000006
【００４２】
はＭＫＸ１０００ｎＭがＭＫＸ０．１ｎＭに比べて統計的に有意であったということであり、中間の
【００４３】
【化５】
2014528952.tif 000007
【００４４】
はＭＫＸ１０００ｎＭとＥＰＯ１０００ｎＭとの間で細胞保護効果に差があるということであり、下側の
【００４５】
【化６】
2014528952.tif 000008
【００４６】
はＥＰＯ１０００ｎＭがＥＰＯ０．１ｎＭに比べて統計的に有意であるということを意味する。
【００４７】
図２は、脳神経細胞を、多様な濃度別のＥＰＯおよびＭＫＸ−２で処理した後、７２時間培養し、ＭＴＴアッセイ法で細胞生存率を比較した結果を示したグラフである。
【００４８】
図３は、網膜神経細胞を、多様な濃度別のＥＰＯおよびＭＫＸ−２で処理した後、７２時間培養し、ＭＴＴアッセイ法で細胞生存率を比較した結果を示したグラフである。
【００４９】
図４Ａは、ベータ細胞ＨＩＴ−Ｔ１５にＭＫＸ−２をそれぞれ濃度別に前処理した後、Ｈ２Ｏ２を２時間処理し、ＭＴＴアッセイ法で細胞生存率を比較した結果を示したグラフである。
【００５０】
図４Ｂは、ベータ細胞ＨＩＴ−Ｔ１５にＭＫＸ−２をそれぞれ濃度別に前処理した後、Ｈ２Ｏ２を４時間処理し、ＭＴＴアッセイ法で細胞生存率を比較した結果を示したグラフである。
【００５１】
図５Ａは、ベータ細胞ＩＮＳ−１にＭＫＸ−２をそれぞれ濃度別に前処理した後、Ｈ２Ｏ２を２時間処理し、ＭＴＴアッセイ法で細胞生存率を比較した結果を示したグラフである。
【００５２】
図５Ｂは、ベータ細胞ＩＮＳ−１にＭＫＸ−２をそれぞれ濃度別に前処理した後、Ｈ２Ｏ２を４時間処理し、ＭＴＴアッセイ法で細胞生存率を比較した結果を示したグラフである。
【００５３】
図６は、脳梗塞を誘発させたスプラーグ−ドーリー（Ｓｐａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットモデルに試験薬を投与し、脳を分離し、頭頂面に沿った切片をＴＴＣ染色した後に撮影した写真である。
【００５４】
図７は、脳梗塞を誘発させたスプラーグ−ドーリー（Ｓｐａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットモデルに試験薬を投与し、脳を分離し、頭頂面に沿った切片をＴＴＣ染色した後、脳梗塞面積を測定した結果を図示したグラフである。
【００５５】
図８は、ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットから得られた培養された心筋細胞に対して、ＴＵＮＥＬアッセイの結果、ＤＡＰＩで染色された細胞と、ＴＵＮＥＬ陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を示す細胞の数をカウントし、その比率を計算した結果を図示したグラフである。
【００５６】
［発明を実施するための形態］
以下、本発明を下記の実施例により更に具体的に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明の理解を助けるためのもので、どのような意味であれ、本発明の範囲はこれらによって限定されるものではない。
【００５７】
＜実施例＞
１．Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔの合成
従来公知の固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）によって、配列番号１のＩｌｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔペプチドを合成した。
【００５８】
前記合成されたペプチドをＭＫＸ−２と命名した。
【００５９】
＜試験例＞
実験方法と材料
１．心筋細胞の実験方法および材料
Ａ．心筋細胞の分離と培養
生後８週令のウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットを準備した後、成体ラットにケタミンおよびペントバルビタールを注入して死亡させた後、心臓を迅速に分離した。大動脈を利用して、逆方向に心臓方向に、３４〜３７℃にあらかじめ温めておいたＣａフリークレブス−ヘンセレイト緩衝（Ｃａ  ｆｒｅｅ  Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ  ｂｕｆｆｅｒ）溶液（ＫＨＢ）で５分間灌流させた。その後、ＫＨＢ溶液を０．１５％クラスＩＩコラゲナーゼ（ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）（クーパーバイオメディカル（Ｃｏｏｐｅｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ），マルヴァーン（Ｍａｌｖｅｒｎ），ペンシルベニア州（ＰＡ））含有ハンクス平衡塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＨＢＳＳ：ＧＩＢＣＯ，グランドアイランド（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ），ニューヨーク州（ＮＹ））に替えて３０〜４０分程度灌流させた。その後、細胞培養液（ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ）で２回繰り返して洗浄した。心室（ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）と心房（ａｔｒｉａ）とを分離し、心室組織を細かく粉砕した後、３４〜３７℃にあらかじめ温めておいたクラスＩＩコラゲナーゼ含有培養培地（ＤＭＥＭ）で満たされた振盪機（ｓｈａｋｅｒ）で５分ほど攪拌した。溶解しない結滞組織は、フィルタを介して除去され、コラゲナーゼ含有溶液を、培養培地（ＤＭＥＭ）溶液で２回繰り返して洗浄した。１０ｇの速度で滑らかに遠心分離を２分間行った。その後、上清を分離して除去した後、細胞成分を、１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ），セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ），ミズーリ州（ＭＯ））含有培養培地（ＤＭＥＭ）溶液で３回洗浄した。その後、得られた細胞を、培養培地（ＤＭＥＭ）、１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ＨＥＰＥＳ）、ＧＩＢＣＯラボラトリーズ（ＧＩＢＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），グランドアイランド（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ），ニューヨーク州（ＮＹ））、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシン（１００ＩＵ／ｍＬ、ＧＩＢＣＯ）で６０分間安定させた。
【００６０】
次に、細胞を２０×１０３細胞／ｃｍ２の密度で６−ウェルプレートに分注し、３日間ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ、１０ｕＭ、シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を培養液に加えて、繊維芽細胞と前駆細胞との増殖を阻止した（Ｌｏｋｕｔａ  ｅｔ  ａｌ，１９９４；  Ｍｉｒａｇｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ，２００６）。細胞を次の実験のために９５％Ｏ２、５％ＣＯ２、３７℃インキュベーター内で培養した。
【００６１】
Ｂ．ＭＴＴアッセイ
９６ウェルプレートに細胞を２×１０４細胞／ウェル（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、２００ｕｌずつ播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）した。このとき、細胞密度（ｃｅｌｌ  ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）を約７０〜８０％に合わせた。２４時間後、細胞の安定化がされると、２６または２８ゲージ（ｇａｚｅ）のニードル（ｎｅｅｄｌｅ）を利用してウェルの既存の培地を除去した。血清および栄養物質がないＦＢＳ２００μｌを各ウェルに投与してＥＰＯ治療群とＭＫＸ−２治療群に分けた後、ＥＰＯ治療群とＭＫＸ−２治療群は、さらに０、０．１、１、１０、１００、１００ｎＭの用量による実験群に分け、各用量別に低酸素培養（ｈｙｐｏｘｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の条件で７２時間の薬物治療後、ＭＴＴアッセイ法で細胞生存率を比較した。ＥＰＯは、エポロン注射液（東亜製薬、韓国）を使用した。各濃度に応じたすべての実験群は、それぞれ７ウェルずつ実施した。
【００６２】
既定の処理時間が経過すると、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ））に溶解した後、０．２２μｍメンブレンフィルターで滅菌濾過されたＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｍ２１２８）を１ｍｇ／ｍｌの濃度でウェル当り１００μｌずつ入れた。このとき、ＭＴＴ試薬は、ホイルに包んで光を遮断して使用した。ＭＴＴ試薬を入れたウェルプレートをインキュベーターで２時間反応させた。培養終了後、培地を除去した。培地の除去時に細胞が一緒に付いて出ないように注意した。
【００６３】
ＤＭＳＯを各ウェルに２００μｌずつ入れた。ホイルに包み、約１０分間振盪機で軽く振りながら、ホルマザン結晶が溶解されるように混ぜた。マルチピペット（１６０μｌ）で２〜３回程度ピペッティングをしてホルマザン結晶を砕いた。ＥＬＩＳＡリーダー（ｒｅａｄｅｒ）で５７０ｎｍでのＯＤ値を測定して定量的に分析した。
【００６４】
２．神経細胞の実験方法および材料
Ａ．神経細胞分離および培養
（１）プレートコーティング
ポリ−Ｌ−リジン（シグマ（ｓｉｇｍａ）  Ｐ４７０７）を、細胞を培養するプレートに入れ、インキュベーター中で１時間保管した。ポリ−Ｌ−リジンをピペットを用いて吸引した後、滅菌蒸留水で３回洗浄した。コーティングされたプレートはクリーンベンチ内で２時間以上完全に乾燥させた後、ラップに包んで冷蔵保管した。
【００６５】
（２）培地の作製
１）胎児の洗浄培地またはＨＢＳＳ（１匹当り２００ｍｌ）
ＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ、１４１７０−１１２、１８０ｍｌ）と１０％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ、１５１４０−１２２）２０ｍｌとを混合して準備した。
【００６６】
２）トリプシン溶液
０．１２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（３ｍｌ）、ＨＢＳＳ（１２ｍｌ）、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ１（シグマ（ｓｉｇｍａ）、デオキシリボヌクレアーゼ１（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ１）、Ｄ５０２５）１．５ｍｇを混合した後、シリンジを介してろ過を行った。
【００６７】
３）基本培地（ｂａｓａｌ  ｍｅｄｉａ、合計１Ｌ）
ＤＭＥＭ（ｈｇ、ＧＩＢＣＯ、１２１００−０４６）１袋、１％Ｐ／Ｓ  １０ｍｌ（ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、ＧＩＢＣＯ、１５１４０−１２２）、３．７ｇ  ＮａＨＣＯ３（炭酸水素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）、シグマ（ｓｉｇｍａ）、Ｓ５７６１）を蒸留水０．８Ｌに混合した後、シリンジを介してろ過を行った。
【００６８】
４）培養培地（合計１Ｌ）
基本培地（ｂａｓａｌ  ｍｅｄｉａ）９００ｍＬ、１０％ＦＢＳ  １００ｍＬ、インスリン（シグマ（ｓｉｇｍａ）、Ｉ９２７８−５ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ）５００μｌ、ｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ：Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ阻害剤、Ａ９８７８）７０ｍＭ  １００μｌを混合した後、シリンジを介してろ過を行った。
【００６９】
５）洗浄培地（１匹当り２０ｍｌ）
ＤＭＥＭ（ｈｇ、ＧＩＢＣＯ、１２１００−０４６）、１％Ｐ／Ｓ  ２０ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ１  ２ｍｇを混合した後、シリンジを介してろ過を行った。
【００７０】
（３）神経細胞分離および培養
妊娠１６日齢ラットの頚椎を脱臼させ、実験動物を死亡させた後、実験動物の腹部をＵ字型に切開して胎児（ｆｅｔｕｓ）が入った子宮を取り出した。その後、子宮から胎児を取り出し、胎児の洗浄培地に入れて洗浄を３回実施した。胎児の頭の部分だけを切り取り、胎児洗浄培地に入れ、さらに洗浄を３回実施した後、頭蓋骨を石灰して脳を分離した。ナイフを使用して、脳の皮質部分を切開して得た後、組織を細かく切り、あらかじめ準備しておいた胎児洗浄培地に集めた。４００ｇ、４分間遠心分離した後、上清を除去して得られたペレットに、０．０２５％トリプシンとＤＮａｓｅ１  １０ｍｌとを入れ、ペレットを壊した。この時、培養器で１５分間保持した。
【００７１】
その後、再び培養培地１５ｍｌを添加した後、４００ｇ、４分間遠心分離して上清を除去した後、得られたペレットを洗浄培地（ＤＮａｓｅ１添加）で、６ｍｌずつ２回洗浄した後、４００ｇ、４分間さらに遠心分離した。遠心分離後、上清をさらに除去した後、得られたペレットに培養培地１０ｍｌを加え、１０μｌをトリパンブルーと混合した後、血球計算盤（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で細胞計数（ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ）を実施した。用意された２４ウェルプレートにウェル当たり５００μｌずつ細胞を接種（ｓｅｅｄｉｎｇ）して４８時間培養した。この後、安定化のために、培養液を除去した後、新たな培養培地と５ｕＭ  Ａｒａ−ｃ（シトシンアラビノシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）、シグマ（ｓｉｇｍａ）、Ｃ１７６８）をそれぞれ入れた後、１４時間培養し、２４時間後にさらに培養液を除去した後、新たな培養培地を入れ、準備された実験のために９５％Ｏ２、５％ＣＯ２、３７℃インキュベーター内で培養した。
【００７２】
Ｂ．ＭＴＴアッセイ
９６ウェルプレートに細胞を２＊１０４細胞／ウェル（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、２００μｌずつ接種した。このとき、細胞密度を約７０〜８０％に合わせた。２４時間後、細胞の安定化が行われると、２６または２８ゲージのニードルを使用してウェル内の既存の培地を除去した。血清および栄養物質がないＦＢＳ２００μｌを投与し、ＥＰＯ治療群とＭＫＸ−２治療群を分けた後、ＥＰＯ治療群については、さらに血清除去（ｓｅｒｕｍ  ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）した後、ＥＰＯ非治療群、１ＩＵ／ｍｌ治療群、１０ＩＵ／ｍｌ治療群の３つに分け、それぞれをさらに神経毒性物質である０．１％  ２−メルカプトエタノールで１８時間処理した群と非処理群とに分けて比較した。同様に、ＭＫＸ−２治療群についても、血清除去後、ＭＫＸ−２非治療群、１．２ｎｇ／ｍｌ治療群、１２ｎｇ／ｍｌ治療群の３つに分け、それぞれをさらに神経毒性物質である０．１％  ２−メルカプトエタノールで１８時間処理した群と非処理群とに分けて比較した。また、陰性対照群のために、正常の培養液条件で培養した群を設定し、これらの間の比較を行った。各実験条件で、いずれも６ウェルずつ実験を行い、統計分析には、平均値と標準偏差とを用いた。ＥＰＯとＭＫＸ−２治療群は、それぞれ７２時間の薬物治療環境で培養した。ＥＰＯは、エポロン注射液（東亜製薬、韓国）を使用した。規定の処理時間が経過すると、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ））に溶解させた後、０．２２μｍメンブレンフィルターで滅菌濾過されたＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｍ２１２８）を１ｍｇ／ｍｌの濃度でウェル当り１００μｌずつ入れた。このとき、ＭＴＴ試薬は、ホイルに包んで光を遮断して使用した。ＭＴＴ試薬を入れたウェルプレートをインキュベーター内で２時間反応させた。培養終了後、培地を除去した。培地の除去時に細胞が一緒に付いて出ないように注意した。次に、ＤＭＳＯを各ウェル（ｗｅｌｌ）に２００μｌずつ入れた。ホイルに包み、約１０分間振盪機で軽く振りながら、ホルマザン結晶が良好に溶解されるように混ぜた。マルチピペット（１６０μｌ）で２、３回程度ピペッティングをしてホルマザンを壊した。ＥＬＩＳＡリーダー（ｒｅａｄｅｒ）で５７０ｎｍのＯＤ値を測定し、定量的に分析した。
【００７３】
３．網膜神経細胞の実験方法および材料
Ａ．網膜の神経細胞の分離と培養
（１）プレートコーティング
ポリ−Ｄ−リジン（シグマ（ｓｉｇｍａ）  Ｐ７２８０）を入れ、細胞を培養するプレートに入れ、インキュベーター中で２時間保管した。ポリ−Ｄ−リジンをピペットを用いて吸引した後、滅菌蒸留水で３回洗浄した。コーティングされたプレートはクリーンベンチ内で２時間以上完全に乾燥させた後、ラップに包んで冷蔵保管した、
（２）培地の作製
１）溶液１
次のような組成の培地（５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１１６ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０９６ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２０、１９．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．１５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２３．８ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、３ｇ／Ｌウシ血清アルブミン、１０ｍｇ／Ｌフェノール−レッド）と１０％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ、１５１４０−１２２）２０ｍｌを混合して準備した。
【００７４】
２）トリプシン溶液
０．１２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（３ｍｌ）、溶液１（１２ｍｌ）、０．１ｍｇ／ｍｌＤＮａｓｅ１（シグマ（ｓｉｇｍａ）、デオキシリボヌクレアーゼ１（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ１）、Ｄ５０２５）１．５ｍｇを混合した後、シリンジを介してろ過を行った。
【００７５】
３）溶液１での停止溶液（ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）
溶液１にＤＮＡｓｅ（１００００Ｕ／７．５ｍｌウシパンクレアーゼタイプＩＩ）、大豆トリプシンインヒビター（タイプ１−Ｓ、５ｍｇ／７．５ｍｌ）、０．１９ｍＭ  ＭｇＳＯ４を入れて作った。
【００７６】
４）最小必須培地（合計１Ｌ）
基本培地（ｂａｓａｌ  ｍｅｄｉａ）９００ｍＬ、１０％ＦＢＳ  １００ｍＬ、９１ｍｇ／Ｌ硫酸ゲンタマイシン、２．３ｍｇ／ＬアンフォテリシンＢ、５ｍＭグルコースを混合した後、シリンジを介してろ過を行った。
【００７７】
（３）網膜神経細胞分離および培養
生後３日齢のラット眼球を摘出し、網膜を取り出して溶液１に入れた。網膜組織をトリプシンにより３７℃で１０分間処理した後、１８０ｇで５分間遠心分離した。遠心分離後、上清は捨て、集めた組織を停止溶液（ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に入れた。塊になった組織をピペットで砕いた後、さらに１８０ｇで５分間遠心分離した。分離された細胞を１×１０６細胞／ｍＬで、１０％ＦＢＳ−ＭＥＭと混合した。用意された９６ウェルプレートにウェル当たり１００μｌずつ細胞を接種し、２４時間培養した。
【００７８】
その後、安定化のために、培養液を除去した後、新たな培養培地と５ｕＭ  Ａｒａ−ｃ（シトシンアラビノシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）、シグマ（ｓｉｇｍａ）、Ｃ１７６８）をそれぞれ入れた後、４８時間培養し、４８時間後にさらに培養液を除去した後、新たな培養培地を入れ、準備された実験のために９５％Ｏ２、５％ＣＯ２、３７℃インキュベーター内で培養した。さらに４８時間後、培養液を除去した後、新たな培養培地を入れ、準備された実験のために９５％Ｏ２、５％ＣＯ２、３７℃インキュベーター内で培養した。
【００７９】
Ｂ．ＭＴＴアッセイ
９６ウェルプレートに細胞を２×１０４細胞（ｃｅｌｌｓ）／ウェル、２００μｌずつ接種した。このとき、細胞密度を約７０〜８０％に合わせた。２４時間後、細胞安定化が行われると、２６または２８ゲージのニードルを使用して、ウェル内既存の培地を除去した。血清および栄養物質がないＦＢＳ２００μｌを投与し、ＥＰＯ治療群とＭＫＸ−２治療群とに分けた後、ＥＰＯ治療群とＭＫＸ−２治療群は０、０．１、１、１０、１００、１０００ｎＭの用量による実験群に分けた。それぞれ７２時間の薬物治療環境で培養され、生存している網膜の神経細胞は、蛍光物質が含有されたＭＴＴアッセイを利用して、それを蛍光分析装置を用いて定量的に分析した。ＥＰＯは、エポロン注射液（東亜製薬、韓国）を使用した。各濃度による細胞群は、両群それぞれ７ウェルについて実施した。規定の処理時間が経過すると、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ））に溶解させた後、０．２２μｍメンブレンフィルターで滅菌濾過されたＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｍ２１２８）を１ｍｇ／ｍｌの濃度でウェル当り１００μｌずつ入れた。このとき、ＭＴＴ試薬は、ホイルに包んで光を遮断して使用した。ＭＴＴ試薬を入れたウェルプレートをインキュベーターで２時間反応させた。
【００８０】
培養終了後、培地を除去した。培地の除去時に細胞が一緒に付いて出ないように注意した。次に、ＤＭＳＯを各ウェルに２００μｌずつ入れた。その後、ホイルに包み、約１０分間振盪機で軽く振りながらホルマザン結晶が良好に溶解するように混ぜた。マルチ−ピペット（１６０μｌ）で２〜３回程度ピペッティングをしてホルマザンを壊した。
【００８１】
その後、ＥＬＩＳＡリーダーで５７０ｎｍのＯＤ値を測定して定量的に分析した。
【００８２】
４．膵臓ベータ細胞の実験方法および材料
Ａ．膵臓小島細胞培養
ハムスター由来のインスリン分泌細胞株であるＨＩＴ−Ｔ１５細胞（７５〜７７回経過（ｐａｓｓａｇｅ））とラット由来のインスリン分泌細胞株であるＩＮＳ−１細胞（１８〜２０回経過（ｐａｓｓａｇｅ））を使用した。ＨＩＴ−Ｔ１５細胞の培養に使用された培地は、ＲＰＭＩ−１６４０に１０％ＦＢＳ、ならびに１００ユニット（ｕｎｉｔｓ）／ｍｌのペニシリンおよび１００ｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加して使用した。ＩＮＳ−１細胞の培養に使用された培地は、ＲＰＭＩ−１６４０に１０％ＦＢＳおよび１ｍＭピルベート、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１００ユニット（ｕｎｉｔｓ）／ｍｌペニシリンおよび１００ｇ／ｍｌのストレプトマイシンを混合して使用した。二つのベータ細胞株は、９５％の湿度が維持される３７℃、５％ＣＯ２環境で培養した。細胞密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）が約７０〜８０％に達すると、ＰＢＳ（リン酸生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ））で洗浄し、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを処理して継代培養した。
【００８３】
Ｂ．ＭＴＴアッセイ
ベータ細胞株を２４−ウェル（ｗｅｌｌ）プレートに１×１０５細胞／ウェル（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）で分注して、２４時間培養し、細胞密度が約７０〜８０％なるように合わせた。２４時間後、既存の培地を除去し、０．５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地で交換した後、６時間培養し、増殖と分化とを停止状態にした。ＭＫＸ−２はＤＭＳＯに溶解させ、０、０．１２、１．２、１２、６０、１２０ｎｇ／ｍｌの濃度で、Ｈ２Ｏ２処理１時間前に前処理した。対照群には、ＤＭＳＯ  ０．００１％で処理して比較した。ＭＫＸ−２処理１時間後、Ｈ２Ｏ２を２時間または４時間処理して反応させた。各ウェル（ｗｅｌｌ）に、ＰＢＳ緩衝液に溶解したＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）溶液を添加し、２〜３時間反応後、ウェル（ｗｅｌｌ）の底に形成されたホルマザンが散らばらないように上清を除去し、ＤＭＳＯ  ２５０μｌを添加して溶解させ、ＥＬＩＳＡリーダー（ｒｅａｄｅｒ）（モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）  Ｅｘａｘ，サニーベール（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ），カリフォルニア州（ＣＡ））を使用して５４０ｎｍ（ｒｅｆ．６５０ｎｍ）で吸光度を測定した。吸光度の値を定量的に分析して、状態的な細胞成長抑制率を求めた。
【００８４】
５．脳梗塞の動物実験方法および材料
Ａ．実験動物および脳梗塞の実験モデル
本実験ではスプラーグ−ドーリー（Ｓｐａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）（ＳＤ）のラットを実験に使用した。実験動物は体重が２８０ｇから３３０ｇであり、すべてコアテック社（Ｋｏａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）（ソウル（Ｓｅｏｕｌ），韓国（Ｋｏｒｅａ））から購入した。使用されたラットの数は、全部で３９匹であり、１３匹は対照群として使用し、残りの２６匹はＭＫＸ−２治療群１３匹、そしてエリスロポエチン（ＥＰＯ）治療群１３匹とした。
【００８５】
脳梗塞を誘発するために、左側の中脳動脈を一時的に閉塞した後に再灌流させる方法を採用し、コイズミ法を変形して作製された動脈内細糸閉鎖法（ｉｎｔｒａｌｕｍｉｎａｌ  ｆｉｌａｍｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を用いた。ＳＤラットを７０％亜酸化窒素（ｎｉｔｒｏｕｓ  ｏｘｉｄｅ）と３０％酸素（ｏｘｙｇｅｎ）の混合ガスと一緒にイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）（誘導３％、外科的処理２％（３％  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ２％  ｆｏｒ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ））で麻酔させた。手術時、首の中央部からやや左側に偏って切開し、周囲の迷走神経が損傷されないように、左側の総頸動脈を慎重に剥離した。
【００８６】
左側の総頸動脈をブラックシルク（ｂｌａｃｋ  ｓｉｌｋ）（３．０）で引き上げ、同じ側の外頸動脈と内頸動脈とを剥離し、左側の外頸動脈を先に結紮した後、内頸動脈を引き上げた。シリコン樹脂（Ｓｉｌｉｃｏｎ  ｒｅｓｉｎ）（キサントプレン（Ｘａｎｔｏｐｒｅｎ）；バイエルデンタル（Ｂａｙｅｒ  Ｄｅｎｔａｌ），大阪（Ｏｓａｋａ），日本（Ｊａｐａｎ））であらかじめコーティングした２０ｍｍ長の４−０ナイロン糸（ｎｙｌｏｎ  ｔｈｒｅａｄ）（エシロン（Ｅｔｈｉｌｏｎ）；エシコン（Ｅｔｈｉｃｏｎ）  ノルダーシュテット（Ｎｏｒｄｅｒｓｔｅｄｔ），ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））を外頸動脈に開けた孔を介して押入れ、左側中脳動脈の起始部を閉塞した。挿入後、外頸動脈と残ったナイロン糸（ｎｙｌｏｎ  ｔｈｒｅａｄ）とを一緒に結紮し、出血やナイロン糸（ｎｙｌｏｎ  ｔｈｒｅａｄ）が押し出されるのを防止した。手術過程は出血なしに１５分以内に行われた。２時間が経過した後、左側の総頸動脈を介した完全な再灌流が行われるよう、ナイロン糸（ｎｙｌｏｎ  ｔｈｒｅａｄ）を除去した。
【００８７】
中脳動脈の閉塞／再潅流させた直後、既定の動物実験群によって、それぞれの実験動物に０．９％生理食塩水、ＭＫＸ−２  ３．６μｇ／ｋｇまたはエリスロポエチン３０００ｉｕ／ｋｇ（エポロン、東亜製薬（株））を、左側外頸静脈を介して再灌流させた後、即座に投与した。左側中脳動脈閉塞／再潅流手術および薬物投与が終わって２４時間が経過後、ラットを死亡させた。手術前後、ラットの飼料および水の摂取を自由にした。
【００８８】
Ｂ．脳梗塞の体積測定
脳梗塞の部位を決定するために２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド（２，３，５−ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＴＴＣ）染色を用いた。
【００８９】
まず、ラットにゾレチル（ｚｏｌｅｔｉｌｅ）とロムパン（ｒｏｍｐｕｎ）とを筋肉内注射して安楽死させ、脳は、頭蓋骨から慎重に分離させ、１分間冷却された０．９％生理食塩水に浸しておいた。その後、ロデントブレインマトリックス（ｒｏｄｅｎｔ  ｂｒａｉｎ  ｍａｔｒｉｘ）（ＲＢＭ−４０００Ｃ．  ＡＳＩインスツルメンツ（ＡＳＩ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ），ウォリン（Ｗａｒｒｉｎ），ミシガン州（ＭＩ）．米国（ＵＳＡ））を使用して、大脳前頭極（ｆｒｏｎｔａｌ  ｐｏｌｅ）から１ｍｍになるところから、２ｍｍ間隔で頭頂面に沿って切片を調製した。
【００９０】
切片は２％２，３，５−ＴＴＣ（シグマ（Ｓｉｇｍａ），セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ），ミズーリ州（ＭＯ），米国（ＵＳＡ））を含むリン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒ）（ＰＢ）に室温で１時間保管し、その後、１０％リン酸緩衝ホルマリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｆｏｒｍａｌｉｎ）で固定した。それぞれの実験群の固定された頭頂面切片を撮影した写真を図６に示した。
【００９１】
図６は、脳梗塞を誘発させたスプラーグ−ドーリー（Ｓｐａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットモデルに試験薬物を投与した後、脳を分離し、頭頂面に沿った切片をＴＴＣ染色後に撮影した写真である。
【００９２】
脳梗塞面積は、ライカＱウィンプログラムを備えた画像解析装置（ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｚｅｒ  ｗｉｔｈ  ＬｅｉｃａＱｗｉｎ  ｐｒｏｇｒａｍ）（ライカイメージマイクロシステムイメージソリューション社（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｌｔｄ．），ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ），イングランド（Ｅｎｇｌａｎｄ））で測定し、体積（ｍｍ３）は、切片の梗塞体積（＝切片の梗塞面積×厚さ）の和として計算し、各実験群の平均と標準偏差とを求めた。
【００９３】
６．心筋細胞アポトーシス実験
Ａ．心筋細胞の分離と培養
生後８週令のウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットを準備した後、成体ラットをケタミンとペントバルビタールを注入して死亡させた後、心臓を迅速に分離した。大動脈を利用して、逆方向に心臓方向に、３４〜３７℃にあらかじめ温めておいたＣａフリークレブス−ヘンセレイト緩衝（Ｃａ  ｆｒｅｅ  Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ  ｂｕｆｆｅｒ）溶液（ＫＨＢ）で５分間灌流させた。その後、ＫＨＢ溶液を０．１５％クラスＩＩコラゲナーゼ（ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）（クーパーバイオメディカル（Ｃｏｏｐｅｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ），マルヴァーン（Ｍａｌｖｅｒｎ），ペンシルベニア州（ＰＡ））含有ハンクス平衡塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＨＢＳＳ：ＧＩＢＣＯ，グランドアイランド（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ），ニューヨーク州（ＮＹ））に替えて３０〜４０分程度灌流させた。その後、細胞培養液（ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ）で２回繰り返して洗浄した。心室（ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）と心房（ａｔｒｉａ）とを分離し、心室組織のみを分離して細かく粉砕した後、３４〜３７℃にあらかじめ温めておいたクラスＩＩコラゲナーゼ（ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）含有培養培地（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）で満たして振盪機（ｓｈａｋｅｒ）で５分ほど攪拌した。溶解しない結滞組織は、フィルタを介して除去され、コラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）含有溶液を、培養培地（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）溶液で２回繰り返して洗浄した。１０ｇの速度で滑らかに遠心分離を２分間行った後、上清を分離して除去した。その後、細胞成分は１％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）（ＦＢＳ；シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ），セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ），ミズーリ州（ＭＯ））を含有する培養培地（ＤＭＥＭ）溶液で３回洗浄した。その後、得られた細胞は、培養培地（ＤＭＥＭ）、１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ＨＥＰＥＳ）、ＧＩＢＣＯラボラトリーズ（ＧＩＢＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），グランドアイランド（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ），ニューヨーク州（ＮＹ））、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（１００ＩＵ／ｍＬ、ＧＩＢＣＯ）で６０分間安定させた。細胞は、２０×１０３細胞／ｃｍ２の密度で６−ウェルプレート（ｗｅｌｌ  ｐｌａｓｔｅ）に分注し、３日間ブロモデオキシウリジン（Ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）（ＢｒｄＵ、１０ｕＭ、シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を培養液に加えて、繊維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）と前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）の増殖を阻止した（Ｌｏｋｕｔａ  ｅｔ  ａｌ，１９９４；  Ｍｉｒａｇｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ，２００６）。
【００９４】
細胞は、次の実験のために９５％Ｏ２、５％ＣＯ２、３７℃インキュベーター内で培養した。
【００９５】
Ｂ．ＴＵＮＥＬアッセイ
ＭＫＸ−２処理のために培養細胞を対照群と実験群に分け、処理をする前に、両群のいずれも、ＦＢＳが含まれていない培養液に替えた。処理時間は、対照群、実験群とも０、１２、２４時間に分け、ＭＫＸ−２の濃度は０．１および０．０１ｎｇ／μｌに分けて処理した。対照群および実験群いずれも、細胞自然死（アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ））を誘導するため、ＭＫＸ−２を処理する３０分前に０．０３％Ｈ２Ｏ２を投与した。
【００９６】
６−ウェルプレート（ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）の中にカバーグラス（ｃｏｖｅｒ  ｇｌａｓｓ）を入れ、その上で、培養された細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ））で洗浄し、１００％エタノールで室温で５秒固定させた後、ＰＢＳでさらに洗浄した。新しく作った透過溶液（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００＋０．１％クエン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ））を入れ、３７℃のインキュベーターで１０分間処理した。その後、ＰＢＳで５分間２回洗浄し、インサイチュ細胞死検出キット（Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ）（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））に含まれているラベル（ｌａｂｅｌ）溶液と酵素溶液との混合液を、各カバーグラスごとに３０μｌ滴下した後、パラフィルム（ｐａｒａｆｉｌｍ）でそっと覆った。３７℃インキュベーターで１時間反応させ、ＰＢＳで５分間２回洗浄した後、ＤＡＰＩ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を１０分間室温で処理した。ＰＢＳで洗浄後、蛍光顕微鏡を用いて観察しながら、任意に選択された１０カ所を選定した後、ＤＡＰＩで染色された細胞と、ＴＵＮＥＬ陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を示す細胞との数をカウントし、その比率を計算した。
【００９７】
結果
１．心筋細胞でのペプチドＭＫＸ−２の細胞保護効果
前記心筋細胞の分離および培養によって得られた心筋細胞を、９６ウェルプレートに各ウェル当りの細胞を２×１０４細胞／ウェル、２００μｌずつ接種し、２４時間後に細胞安定化がなされると、２６または２８（２６  ｏｒ  ２８）ゲージのニードルを使用して、ウェルに既存の培地を除去した。
【００９８】
血清および栄養物質がないＦＢＳ２００μｌを投与し、ＥＰＯ治療群とＭＫＸ−２群とを分けた後、ＥＰＯ治療およびＭＫＸ−２治療群は０、０．１、１、１０、１００、１０００ｎＭの用量による実験群に分けた。それぞれ７２時間の薬物治療後、ＭＴＴアッセイ法で細胞生存率を比較した。その結果を図１に示した。
【００９９】
図１は、心筋細胞に対して、ＥＰＯおよびＭＫＸ−２を多様な濃度で処理し、７２時間培養後、ＭＴＴアッセイ法で細胞生存率を比較した結果を示したグラフである。
【０１００】
７２時間後、０ｎＭを基準に、細胞生存率を１００％と基準を定めたとき、０．１ｎＭの治療のときは初期と大きな違いを見せなかったが、１ｎＭの濃度では両治療群の両方が減少する傾向を示し、両群間の差はなかった。その後、１０ｎＭの濃度ではＭＫＸ−２群がＥＰＯ治療群に比べて、細胞生存率で優位性を呈し（１０２．６７＋３．２２％対９４．５２＋４．３６％、ｐ＝０．００２）、１００ｎＭ（１１２．２８＋２．１７％対１０２．６４＋２．６９％、ｐ＜０．００１）、１０００ｎＭ（１１５．０５＋０．９０％対１０６．９７＋１．９９％、ｐ＝０．００１）治療群でも、比較優位性を呈した。
【０１０１】
２．神経細胞でのペプチドＭＫＸ−２の細胞保護効果
前記神経細胞の分離と培養によって得られた神経細胞を９６ウェルプレートに各ウェル当りの細胞を２＊１０４細胞／ウェル、２００μｌずつ接種し、２４時間後、細胞の安定化が行われると、２６または２８ゲージのニードルを使用して、ウェルに既存の培地を除去した。
【０１０２】
血清および栄養物質がないＦＢＳ２００μｌを投与してＥＰＯ治療群とＭＫＸ−２群とを分けた後、ＥＰＯ治療群は、さらに血清除去後にＥＰＯ非治療群、１ＩＵ／ｍｌ治療群、１０ＩＵ／ｍｌ治療群に分け、それぞれをさらに神経毒性物質である０．１％  ２−メルカプトエタノールを１８時間処理した群と非処理群とに分けて比較した。同様に、ＭＫＸ−２治療群でも、血清除去後、ＭＫＸ−２非治療群、１．２ｎｇ／ｍｌ治療群、１２ｎｇ／ｍｌ治療群群に分け、それぞれをさらに神経毒性物質である０．１％  ２−メルカプトエタノールを１８時間処理した群と非処理群とに分けて比較した。また、陰性対照のために、正常培養液条件で培養された群を設定し、これらの間の比較を行った。それぞれ７２時間の薬物治療環境で培養され、生存している神経細胞は、蛍光物質が含有されたカルセイン−ＡＭアッセイを利用し、それを、蛍光分析装置を用いて定量的に分析した。ＥＰＯ  １ＩＵ／ｍｌは１０ｎｇ／ｍｌであり、ＥＰＯ  １０ｎｇ／ｍｌとＭＫＸ−２  １．２ｎｇ／ｍｌとは共に０．５４ｎＭで同じ濃度に合わせて実施した。その結果を図２に示した。
【０１０３】
図２は、心筋細胞をＥＰＯおよびＭＫＸ−２をそれぞれ濃度別に処理し、７２時間培養後、ＭＴＴアッセイ法で細胞生存率を比較した結果を示したグラフである。
【０１０４】
７２時間後、正常培養した群の細胞生存率を１００％に定めたとき、ＥＰＯを処理した群では、ＥＰＯを処理していない群に比べて約２倍の高い有意な細胞生存率の上昇を示した。増加したＥＰＯ濃度により、細胞生存率も上昇するという様相を示した（非治療群：ＥＰＯ（１ＩＵ／ｍｌ）：ＥＰＯ（１０ＩＵ／ｍｌ）＝１８．６０％：４１．６４％：４８．５７％）。ＭＫＸ−２処理群も類似の結果を示し（非治療群：ＭＫＸ−２（１．２ｎｇ／ｍｌ）：ＭＫＸ−２（１２ｎｇ／ｍｌ）＝１８．６０％：４６．０５％：５２．８５％）、両群間の差に統計的意義はなかった。
【０１０５】
２−メルカプトエタノールに暴露された神経細胞は、暴露されていない嗅覚神経細胞に比べて５０％ほどの高い細胞死亡率を示した。
【０１０６】
２−メルカプトエタノールへの曝露後、ＥＰＯを１Ｕ／ｍｌで処理した場合、非治療群に比べて、細胞の生存率には有意な上昇はなかった（５．８９％：６．９８％、ｐ＝０．１９）。１０Ｕ／ｍｌを処理した場合、統計的に有意なレベルの神経細胞保護効果を示した（５．８９％：１１．７０％、ｐ＝０．０２）。
【０１０７】
ＭＫＸ−２を１．２ｎｇ／ｍｌ処理した群では、非治療群に比べて細胞生存率の有意な上昇を示した（５．８９％：２５．７２％、ｐ＝０．００５）。１２ｎｇ／ｍｌ治療群でも神経細胞保護効果を示した（５．８９％：２４．１２％、ｐ＝０．００７）。ＥＰＯ治療群との比較では、それぞれの濃度において、いずれもＥＰＯに比べて優れた細胞生存率を示した（ｐ＜０．００１、Ｐ＝０．００２）。
【０１０８】
３．網膜神経細胞のペプチドＭＫＸ−２の細胞保護効果
前記の網膜神経細胞の分離および培養によって得られた網膜神経細胞を、９６ウェルプレートに各ウェル当りの細胞を２×１０４細胞／ウェル（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、２００μｌずつ接種し、２４時間後、細胞安定化がなされると、２６または２８（２６  ｏｒ  ２８）ゲージのニードルを使用して、ウェルに既存の培地を除去した。
【０１０９】
血清および栄養物質がないＦＢＳ２００μｌを投与し、ＥＰＯ治療群とＭＫＸ−２治療群とを分けた後、ＥＰＯ治療群とＭＫＸ−２治療群は０、０．１、１、１０、１００、１０００ｎＭの用量による実験群に分けた。それぞれ７２時間の薬物治療環境で培養され、生存している網膜の神経細胞は、ＭＴＴアッセイを利用して、それを、蛍光分析装置を用いて定量的に分析した。その結果を図３に示した。
【０１１０】
図３は、網膜神経細胞を、ＥＰＯおよびＭＫＸ−２をそれぞれ濃度別に処理し、７２時間培養後、ＭＴＴアッセイ法で細胞生存率を比較した結果を示したグラフである。
【０１１１】
７２時間後、０ｎＭを基準に、細胞生存率を１００％と基準を定めたとき、０．１ｎＭ、１ｎＭ治療のときには、両群とも０ｎＭ基準より細胞の生存率は上昇したが、両群とも統計的意義はなかった。その後、１０ｎＭの濃度では両群とも、細胞の生存率は０ｎＭと比較して有意に上昇したが、ＭＫＸ−２治療群とＥＰＯ治療群との間の統計的意義はなかった（１２８．０３％対１１８．６２％、ｐ＝０．０６５）。１００ｎＭ治療群では、両群とも細胞保護能を示したが、ＭＫＸ−２治療群がＥＰＯ治療群に比べて、細胞生存率で優位性を示し（１４４．４１％対１２７．６％、ｐ＝０．００２）、１０００ｎＭ群でもＭＫＸ−２遅漏群で比較優位性を示した（１４９．８０％対１２４．７７％、ｐ＝０．００１）。
【０１１２】
４．膵臓ベータ細胞でのペプチドＭＫＸ−２の細胞保護効果
前述した内容通り、膵島ベータ細胞株であるＨＩＴ−Ｔ１５とＩＮＳ−１細胞とを培養して２４−ウェルプレート（ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）にそれぞれウェル（ｗｅｌｌ）当たり１×１０５細胞／ウェル（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を分注して安定化させた。その後、実験当日、既存の培地を慎重に除去した後、残った少量の培地まで洗浄する。その後、０．５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地で６時間培養し、増殖と分化とを停止させる。ＭＫＸ−２治療群と、ＭＫＸ−２を溶解するときに使用されたＤＭＳＯのみを同一用量入れた対照群とを分けた後、ＭＫＸ−２治療群は０、０．１２、１．２、１２、６０、１２０ｎｇ／ｍｌの用量で処理し、ストレスを与えるためにＨ２Ｏ２（１００Ｍ）を２時間または４時間処理した後、ＭＴＴアッセイ法で細胞生存率を比較した。その結果を図４および図５に示した。
【０１１３】
図４は、ベータ細胞ＨＩＴ−Ｔ１５をそれぞれ濃度別のＭＫＸ−２で前処理し、その後、Ｈ２Ｏ２で２時間（図４Ａ）または４時間（図４Ｂ）処理した後、ＭＴＴアッセイ法で細胞生存率を比較した結果を示したグラフである。
【０１１４】
図５は、ベータ細胞ＩＮＳ−１をそれぞれ濃度別のＭＫＸ−２で前処理し、その後、Ｈ２Ｏ２で２時間（図５Ａ）または４時間（図５Ｂ）処理した後、ＭＴＴアッセイ法で細胞生存率を比較した結果を示したグラフである。
【０１１５】
Ｈ２Ｏ２処理２時間または４時間後に、０ｎＭを基準に、細胞生存率を１００％として基準を定めたとき、０．１２および１．２ｎｇ／ｍｌの治療では、両ベータ細胞はいずれも、初期のＭＫＸ−２を処理していない場合と比較して統計的な違いが見られなかった。しかし、ＭＫＸ−２を処理していない場合と比較して、ＨＩＴ−Ｔ１５細胞では１２、６０および１２０ｎｇ／ｍｌの濃度で統計的に有意に細胞生存率が上昇し（Ｈ２Ｏ２２時間処理時：７８．５％＋０．９２（１２ｎｇ／ｍｌ）、９２．３％＋５．２４（６０ｎｇ／ｍｌ）、１０４．１％＋２．８７（１２０ｎｇ／ｍｌ）対７１％＋１．４４（未処理）；  Ｈ２Ｏ２４時間処理時：５９．５７％＋２．０９（１２ｎｇ／ｍｌ）、６７．１９％＋１．０５（６０ｎｇ／ｍｌ）、８４．７３％＋４．８２（１２０ｎｇ／ｍｌ）対５２．４６％＋１．２０（未処理））、ＩＮＳ−１細胞では６０および１２０ｎｇ／ｍｌで統計的に有意に細胞生存率が上昇した（Ｈ２Ｏ２２時間処理時：８６．４％＋４．７９（６０ｎｇ／ｍｌ）、９５．０％＋４．５３（１２０ｎｇ／ｍｌ）対７７．６％＋１．０２（未処理）；  Ｈ２Ｏ２４時間処理時：６４．３９％＋１．６５（６０ｎｇ／ｍｌ）、８３．６０％＋５．７６（１２０ｎｇ／ｍｌ）対５８．２６％＋２．５６（未処理））。
【０１１６】
５．脳梗塞の動物実験でのＭＫＸ−２の組織保護効果
前記の脳梗塞モデル動物を用いた実験方法によって、各実験群について、陰性対照群、ＭＫＸ−２治療群、エリスロポエチン治療群（陽性対照群）をそれぞれ比較した。
【０１１７】
陰性対照群は、左側中脳動脈（ｍｉｄｄｌｅ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｒｔｅｒｙ）の閉塞後、２時間が経過した後、閉塞を誘導したナイロン糸（Ｎｙｌｏｎ  ｔｈｒｅａｄ）を除去して完全な再灌流が行われるように誘導した後、直ちに０．９％の生理食塩水を投与した。ＭＫＸ−２治療群は、同じ過程を行った後、０．９％生理食塩水の代わりにＭＫＸ−２  ３．６μｇ／ｋｇを投与し、エリスロポエチン治療群は、エリスロポエチン３０００ＩＵ／ｋｇ（エポロン、東亜製薬（株））を投与した。
【０１１８】
各群はともに２４時間が経過した後、上述した方法で実験動物を死亡させた後、脳を摘出し、上述の方法により脳梗塞の量を測定した。その結果を図７にグラフをもって示した。
【０１１９】
図７は、脳梗塞を誘発させたスプラーグ−ドーリー（Ｓｐａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットモデルに試験薬物を投与した後、脳を分離し、頭頂面に沿った切片をＴＴＣ染色させた後、脳梗塞面積を測定した結果を図示したグラフである。
【０１２０】
２４時間後、０．９％生理食塩水を投与した陰性対照群の脳梗塞様相は３１８．７０＋２９．６４ｍｍ３であり、エリスロポエチン治療群の脳梗塞様相は２４６．２７＋３７．５２ｍｍ３、ＭＫＸ−２群の脳梗塞様相は１５９．２４＋２７．７８ｍｍ３であった。陰性対照群に比べ、エリスロポエチン治療群は脳梗塞の量が有意に減少したことを確認することができた（３１８．７０＋２９．６４ｍｍ３対２４６．２７＋３７．５２ｍｍ３、ｐ＝０．０５）。陰性対照群に比べ、ＭＫＸ−２治療群も脳梗塞の量が有意に減少したことが確認できた（３１８．７０＋２９．６４ｍｍ３対１５９．２４＋２７．７８ｍｍ３、ｐ＜０．００１）。エリスロポエチン治療群とＭＫＸ−２治療群との比較では、エリスロポエチン治療群よりもＭＫＸ−２治療群の方が、脳梗塞の量において有意にさらに減少し、比較優位性を示すことが確認できた（２４６．２７＋３７．５２ｍｍ３対１５９．２４＋２７．７８ｍｍ３、ｐ＝０．０５）。
【０１２１】
６．心筋細胞アポトーシス実験でのＭＫＸ−２の細胞保護効果
前記の心筋細胞アポトーシス実験を用いた実験方法により、各実験群について、対照群、ＭＫＸ−２  ０時間治療群、１２時間治療群、２４時間治療群に分けて、ＭＫＸ−２治療群は、それぞれ０．０１ｎｇ／μＬ、０．１ｎｇ／μＬの二つの治療群に分けて実験を行った。対照群は、基準時点、１２時間後および２４時間後にＤＡＰＩで染色された細胞と、ＴＵＮＥＬ陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を示す細胞との数をカウントし、その比率を計算した。同じ方法でＭＫＸ−２治療群は０．０１ｎｇ／μＬ、０．１ｎｇ／μＬ濃度で処理し、０時間、１２時間、２４時間の治療後、ＤＡＰＩで染色された細胞とＴＵＮＥＬ陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を示す細胞との数をカウントし、その比率を計算した。その結果を図８に示した。
【０１２２】
図８は、ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットから得られる培養された心筋細胞に対して、ＴＵＮＥＬアッセイの結果、ＤＡＰＩで染色された細胞とＴＵＮＥＬ陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を示す細胞との数をカウントし、その比率を計算した結果を図示したグラフである。
【０１２３】
０時間、１２時間、２４時間後に対照群のＴＵＮＥＬ陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）細胞数／ＤＡＰＩ染色細胞数はそれぞれ３．７４＋０．６７％、６５．５２＋５．０９％、６８．１３＋２．２７％であり、０時間と比較して１２時間（３．７４＋０．６７％対６５．５２＋５．０９％、ｐ＜０．００１）および２４時間（３．７４＋０．６７％対６８．１３＋２．２７％、ｐ＜０．００１）で統計的に有意に増加した。ＭＫＸ−２  ０．０１ｎｇ／μＬ治療群の０時間、１２時間、２４時間後にＴＵＮＥＬ陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）細胞数／ＤＡＰＩ染色の細胞数は、１０．１２＋２．０３％、３５．８２＋３．９５、４４．１６＋３．３４％であり、０時間と比較して１２時間（１０．１２＋２．０３％対３５．８２＋３．９５％、ｐ＜０．０５）および２４時間（１０．１２＋２．０３％対４４．１６＋３．３４％、ｐ＜０．０５）で統計的に有意に増加した。ＭＫＸ−２  ０．１ｎｇ／μＬ治療群の０時間、１２時間、２４時間後のＴＵＮＥＬ陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）細胞数／ＤＡＰＩ染色の細胞数は、５．３８＋２．３６％、４４．３５＋３．９１％、４７．９７＋２．８５％であり、０時間と比較して１２時間（５．３８＋２．３６％対４４．３５＋３．９１％、ｐ＜０．０５）および２４時間（５．３８＋２．３６％対４７．９７＋２．８５％、ｐ＜０．０５）で統計的にやはり同様の結果を示している。
【０１２４】
基準時点での対照群、ＭＫＸ−２  ０．０１ｎｇ／μＬ治療群、ＭＫＸ−２  ０．１ｎｇ／μＬ治療群間のＴＵＮＥＬ陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）細胞数／ＤＡＰＩ染色細胞数の差は、統計的に有意ではなかった。しかし、１２時間の治療時点で、対照群と比べ、ＭＫＸ−２  ０．０１ｎｇ／μＬ治療群（６５．５２＋５．０９％対３５．８２＋３．９５、ｐ＜０．０５）、ＭＫＸ−２  ０．１ｎｇ／μＬ治療群（６５．５２＋５．０９％対４４．３５＋３．９１％、ｐ＜０．０５）は、統計的に有意な差を示した。２４時間の治療時点でも、対照群と比べ、ＭＫＸ−２  ０．０１ｎｇ／μＬ治療群（６８．１３＋２．２７％対４４．１６＋３．３４％、ｐ＜０．０５）、ＭＫＸ−２  ０．１ｎｇ／μＬ治療群（６８．１３＋２．２７％対４７．９７＋２．８５％、ｐ＜０．０５）は統計的に有意な差を示した。１２時間の治療時点および２４時間の治療時点でのＭＫＸ−２  ０．０１ｎｇ／μＬ治療群、ＭＫＸ−２  ０．１ｎｇ／μＬ治療群の間には、両群間で統計的に有意な差がなかった。
【０１２５】
以上の結果は、ＭＫＸ−２の細胞保護機能が、抗アポトーシス（ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｓｉｓ）のメカニズムによってなされることを示唆する。
【図１】
2014528952.tif 000009
【図２】
2014528952.tif 000010
【図３】
2014528952.tif 000011
【図４Ａ】
2014528952.tif 000012
【図４Ｂ】
2014528952.tif 000013
【図５Ａ】
2014528952.tif 000014
【図５Ｂ】
2014528952.tif 000015
【図６】
2014528952.tif 000016
【図７】
2014528952.tif 000017
【図８】
2014528952.tif 000018
【配列表】
2014528952000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年5月14日(2014.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
Ｂ．ＭＴＴアッセイ
９６ウェルプレートに細胞を２×１０４細胞／ウェル（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、２００ｕｌずつ播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）した。このとき、細胞密度（ｃｅｌｌ  ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）を約７０〜８０％に合わせた。２４時間後、細胞の安定化がされると、２６または２８ゲージ（ｇａｚｅ）のニードル（ｎｅｅｄｌｅ）を利用してウェルの既存の培地を除去した。血清および栄養物質がないＰＢＳ２００μｌを各ウェルに投与してＥＰＯ治療群とＭＫＸ−２治療群に分けた後、ＥＰＯ治療群とＭＫＸ−２治療群は、さらに０、０．１、１、１０、１００、１００ｎＭの用量による実験群に分け、各用量別に低酸素培養（ｈｙｐｏｘｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の条件で７２時間の薬物治療後、ＭＴＴアッセイ法で細胞生存率を比較した。ＥＰＯは、エポロン注射液（東亜製薬、韓国）を使用した。各濃度に応じたすべての実験群は、それぞれ７ウェルずつ実施した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
Ｂ．ＭＴＴアッセイ
９６ウェルプレートに細胞を２＊１０４細胞／ウェル（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、２００μｌずつ接種した。このとき、細胞密度を約７０〜８０％に合わせた。２４時間後、細胞の安定化が行われると、２６または２８ゲージのニードルを使用してウェル内の既存の培地を除去した。血清および栄養物質がないＰＢＳ２００μｌを投与し、ＥＰＯ治療群とＭＫＸ−２治療群を分けた後、ＥＰＯ治療群については、さらに血清除去（ｓｅｒｕｍ  ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）した後、ＥＰＯ非治療群、１ＩＵ／ｍｌ治療群、１０ＩＵ／ｍｌ治療群の３つに分け、それぞれをさらに神経毒性物質である０．１％  ２−メルカプトエタノールで１８時間処理した群と非処理群とに分けて比較した。同様に、ＭＫＸ−２治療群についても、血清除去後、ＭＫＸ−２非治療群、１．２ｎｇ／ｍｌ治療群、１２ｎｇ／ｍｌ治療群の３つに分け、それぞれをさらに神経毒性物質である０．１％  ２−メルカプトエタノールで１８時間処理した群と非処理群とに分けて比較した。また、陰性対照群のために、正常の培養液条件で培養した群を設定し、これらの間の比較を行った。各実験条件で、いずれも６ウェルずつ実験を行い、統計分析には、平均値と標準偏差とを用いた。ＥＰＯとＭＫＸ−２治療群は、それぞれ７２時間の薬物治療環境で培養した。ＥＰＯは、エポロン注射液（東亜製薬、韓国）を使用した。規定の処理時間が経過すると、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ））に溶解させた後、０．２２μｍメンブレンフィルターで滅菌濾過されたＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｍ２１２８）を１ｍｇ／ｍｌの濃度でウェル当り１００μｌずつ入れた。このとき、ＭＴＴ試薬は、ホイルに包んで光を遮断して使用した。ＭＴＴ試薬を入れたウェルプレートをインキュベーター内で２時間反応させた。培養終了後、培地を除去した。培地の除去時に細胞が一緒に付いて出ないように注意した。次に、ＤＭＳＯを各ウェル（ｗｅｌｌ）に２００μｌずつ入れた。ホイルに包み、約１０分間振盪機で軽く振りながら、ホルマザン結晶が良好に溶解されるように混ぜた。マルチピペット（１６０μｌ）で２、３回程度ピペッティングをしてホルマザンを壊した。ＥＬＩＳＡリーダー（ｒｅａｄｅｒ）で５７０ｎｍのＯＤ値を測定し、定量的に分析した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
Ｂ．ＭＴＴアッセイ
９６ウェルプレートに細胞を２×１０４細胞（ｃｅｌｌｓ）／ウェル、２００μｌずつ接種した。このとき、細胞密度を約７０〜８０％に合わせた。２４時間後、細胞安定化が行われると、２６または２８ゲージのニードルを使用して、ウェル内既存の培地を除去した。血清および栄養物質がないＰＢＳ２００μｌを投与し、ＥＰＯ治療群とＭＫＸ−２治療群とに分けた後、ＥＰＯ治療群とＭＫＸ−２治療群は０、０．１、１、１０、１００、１０００ｎＭの用量による実験群に分けた。それぞれ７２時間の薬物治療環境で培養され、生存している網膜の神経細胞は、蛍光物質が含有されたＭＴＴアッセイを利用して、それを蛍光分析装置を用いて定量的に分析した。ＥＰＯは、エポロン注射液（東亜製薬、韓国）を使用した。各濃度による細胞群は、両群それぞれ７ウェルについて実施した。規定の処理時間が経過すると、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ））に溶解させた後、０．２２μｍメンブレンフィルターで滅菌濾過されたＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｍ２１２８）を１ｍｇ／ｍｌの濃度でウェル当り１００μｌずつ入れた。このとき、ＭＴＴ試薬は、ホイルに包んで光を遮断して使用した。ＭＴＴ試薬を入れたウェルプレートをインキュベーターで２時間反応させた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
血清および栄養物質がないＰＢＳ２００μｌを投与し、ＥＰＯ治療群とＭＫＸ−２群とを分けた後、ＥＰＯ治療およびＭＫＸ−２治療群は０、０．１、１、１０、１００、１０００ｎＭの用量による実験群に分けた。それぞれ７２時間の薬物治療後、ＭＴＴアッセイ法で細胞生存率を比較した。その結果を図１に示した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
血清および栄養物質がないＰＢＳ２００μｌを投与してＥＰＯ治療群とＭＫＸ−２群とを分けた後、ＥＰＯ治療群は、さらに血清除去後にＥＰＯ非治療群、１ＩＵ／ｍｌ治療群、１０ＩＵ／ｍｌ治療群に分け、それぞれをさらに神経毒性物質である０．１％  ２−メルカプトエタノールを１８時間処理した群と非処理群とに分けて比較した。同様に、ＭＫＸ−２治療群でも、血清除去後、ＭＫＸ−２非治療群、１．２ｎｇ／ｍｌ治療群、１２ｎｇ／ｍｌ治療群群に分け、それぞれをさらに神経毒性物質である０．１％  ２−メルカプトエタノールを１８時間処理した群と非処理群とに分けて比較した。また、陰性対照のために、正常培養液条件で培養された群を設定し、これらの間の比較を行った。それぞれ７２時間の薬物治療環境で培養され、生存している神経細胞は、蛍光物質が含有されたカルセイン−ＡＭアッセイを利用し、それを、蛍光分析装置を用いて定量的に分析した。ＥＰＯ  １ＩＵ／ｍｌは１０ｎｇ／ｍｌであり、ＥＰＯ  １０ｎｇ／ｍｌとＭＫＸ−２  １．２ｎｇ／ｍｌとは共に０．５４ｎＭで同じ濃度に合わせて実施した。その結果を図２に示した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
血清および栄養物質がないＰＢＳ２００μｌを投与し、ＥＰＯ治療群とＭＫＸ−２治療群とを分けた後、ＥＰＯ治療群とＭＫＸ−２治療群は０、０．１、１、１０、１００、１０００ｎＭの用量による実験群に分けた。それぞれ７２時間の薬物治療環境で培養され、生存している網膜の神経細胞は、ＭＴＴアッセイを利用して、それを、蛍光分析装置を用いて定量的に分析した。その結果を図３に示した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
2014528952.tif 000019
【国際調査報告】
2014528952.tif 000020
2014528952.tif 000021
2014528952.tif 000022
2014528952.tif 000023
2014528952.tif 000024