(57)【要約】コア、水溶性ポリマー、およびＲＧＤペプチドを含むナノ粒子を提供する。コア、水溶性ポリマー、およびペプチドを含む温度安定性のあるナノ粒子であって、該水溶性ポリマーは、該水溶性ポリマーの第１の末端で該コアに結合し、該ペプチドは、該水溶性ポリマーの第２の末端に結合し、該ペプチドはＲＧＤアミノ酸配列を含み、該水溶性ポリマーは、該ペプチドを糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）に結合可能にするための十分な長さを有する、ナノ粒子を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コア、水溶性ポリマー、およびペプチドを含む温度安定性のあるナノ粒子であって、前記水溶性ポリマーは、前記水溶性ポリマーの第１の末端で前記コアに結合し、前記ペプチドは、前記水溶性ポリマーの第２の末端に結合し、前記ペプチドはＲＧＤアミノ酸配列を含み、前記水溶性ポリマーは、前記ペプチドを糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）に結合可能にするための十分な長さを有する、ナノ粒子。
【請求項２】
３５℃を超過する融解温度を有する請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
球体形状および１ミクロン未満の直径を有する請求項１または２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
０．１ミクロン〜１ミクロンの間の直径を有する請求項３に記載のナノ粒子。
【請求項５】
非球体である請求項１または２に記載のナノ粒子。
【請求項６】
ロッド、繊維、またはウィスカである請求項５に記載のナノ粒子。
【請求項７】
少なくとも３の、幅に対する長さのアスペクト比を有する請求項６に記載のナノ粒子。
【請求項８】
少なくとも１４日間室温で安定である請求項１〜７のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項９】
各ナノ粒子が請求項１〜８のいずれかに記載のものである複数のナノ粒子であって、０．１ミクロン〜１ミクロンの間の平均直径を有する複数のナノ粒子。
【請求項１０】
全てのナノ粒子の７５％より多くが０．１ミクロン〜１ミクロンの間の直径を有する請求項９に記載の複数のナノ粒子。
【請求項１１】
前記コアが結晶性ポリマーである請求項１〜８のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項１２】
前記コアが単一のポリマー、ブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、またはクワドブロックコポリマーである請求項１１に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
前記コアがＰＬＧＡ、ＰＬＡ、ＰＧＡ、（ポリ（ε−カプロラクトン）ＰＣＬ、ＰＬＬまたはこれらの組み合わせを含む請求項１〜８、１１、および１２のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項１４】
前記コアは生体分解性である請求項１〜８および請求項１１〜１３のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項１５】
前記コアは固体である請求項１〜８のいずかに記載のナノ粒子。
【請求項１６】
前記コアは非生体分解性である請求項１〜８および請求項１５のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項１７】
前記コアは、金、銀、プラチナ、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケル、ＺｎＳ、ＺｎＯ、Ｔｉ、ＴｉＯ２、Ｓｎ、ＳｎＯ２、Ｓｉ、ＳｉＯ２、Ｆｅ、Ｆｅ＋４、鋼、コバルト−クロム合金、Ｃｄ、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、およびＣｄＳ、チタン合金、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓ、ＧａＡｓ、セルロース、またはデンドリマー構造からなる群から選択される物質である請求項１〜８、１５、および１６のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項１８】
前記水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、炭水化物、多糖類、プルラン（ｐｕｌｌｕｌａｎｅ）、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン共マレイン酸無水物、ポリスチレン共マレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルリン酸アンモニウム（ＭＰＣ）、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリアセタール、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（β−アミノ酸）（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）および他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（ＰＯＧ）（例えば、グリセロール）、および他のポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、またはポリオキシエチル化グルコース、コロン酸（ｃｏｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄｓ）もしくは他の炭水化物ポリマー、フィコール、またはデキストラン、並びにこれらの組み合わせまたは混合物からなる群から選択される請求項１〜８および請求項１１〜１７のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項１９】
前記水溶性ポリマーはＰＥＧである請求項１８に記載のナノ粒子。
【請求項２０】
前記ＰＥＧは、１００Ｄａ〜１０，０００Ｄａの間の平均分子量を有する請求項１９に記載のナノ粒子。
【請求項２１】
前記ＰＥＧは、少なくとも１００の平均分子量を有する請求項１９に記載のナノ粒子。
【請求項２２】
前記ペプチドは、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＧＲＧＤＳ、ＧＲＧＤＳＰ、ＧＲＧＤＳＰＫ、ＧＲＧＤＮ、ＧＲＧＤＮＰ、ＧＧＧＧＲＧＤＳ、ＧＲＧＤＫ、ＧＲＧＤＴＰ、ｃＲＧＤ、ＹＲＧＤＳ、またはこれらの変異体からなる群から選択される配列を含む請求項１〜８および請求項１１〜２１のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項２３】
前記ＲＧＤペプチドはタンデムリピートされている請求項１〜８および請求項１１〜２２のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項２４】
１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の前記ＲＧＤペプチドの複製を含む請求項１〜８および請求項１１〜２３のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項２５】
前記ＲＧＤペプチドの多重複製を含む請求項１〜８および請求項１１〜２２のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項２６】
前記ＲＧＤペプチドの全ての複製が同じである請求項２５に記載のナノ粒子。
【請求項２７】
前記ＲＧＤペプチドの２つの複製が異なる配列を有する請求項２５に記載のナノ粒子。
【請求項２８】
前記水溶性ポリマーが、０．１：１〜１：１０またはそれ以上のモル比で前記コアに会合している請求項１〜８および請求項１１〜２７のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項２９】
治療化合物をさらに含む請求項１〜８および請求項１１〜２７のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項３０】
前記治療化合物が疎水性である請求項２９に記載のナノ粒子。
【請求項３１】
前記治療化合物が親水性である請求項２９に記載のナノ粒子。
【請求項３２】
前記治療化合物が前記ナノ粒子に共有的に結合し、前記ナノ粒子と非共有結合的に会合し、前記ナノ粒子と静電的相互作用を通じて会合し、または前記ナノ粒子と疎水性相互作用を通じて会合する請求項２９〜３１のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項３３】
前記治療化合物は、成長因子、サイトカイン、ステロイド、または小分子である請求項２９〜３１のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項３４】
前記治療化合物は抗癌化合物である請求項２９〜３２のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項３５】
請求項１〜８および請求項１１〜３８のいずれかに記載の前記ナノ粒子を含む薬学的組成物。
【請求項３６】
静脈内投与製剤である請求項３５に記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
凍結乾燥されたまたは粉末である請求項３５に記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
請求項１〜８および請求項１１〜３８のいずれかに記載のナノ粒子を、それを必要とする患者に、病気を治療するのに有効な量で投与するステップを含む、個人における病気を治療する方法。
【請求項３９】
前記個人は、出血性疾患を有する請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ナノ粒子は、何も投与しないまたは生理的食塩水を投与するのと比較して１５％超出血時間を減らすのに有効な量で投与される請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記出血性疾患は、凝固障害、血小板減少症、創傷治癒障害、外傷、爆傷、脊髄損傷、または大量出血の症状である請求項３９または請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年１０月１３日出願の米国仮特許出願第６１／５６４８２６号の優先権を主張し、その開示内容は、その全体が参照により組み込まれる。
【０００２】
政府の利益についての記載
本発明は、米国国立衛生研究所から与えられた助成金番号第１ＤＰ２ＯＤ００７３３８−０１号およびアメリカ合衆国国防総省から与えられた助成金番号第Ｗ８１ＸＷＨ−１１−２−００１４号の下、政府支援により行われた。米国政府は、本発明において、一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
通常、傷が発生すると、血小板が傷部位で活性化し、活性化した血小板はフィブリンおよび細胞を産生し、フィブリンは出血を止める栓を形成する（５）。制御不能の出血では、血小板は栓を形成することができない。現場および臨床では、圧迫包帯法、ＱｕｉｋＣｌｏｔ（登録商標）のような吸収性の材料、および組換え活性化因子ＶＩＩ（ｒＦＶＩＩａ）の静脈内（ＩＶ）注入を含む止血を増強させるための多くの手法があるが、前者の２つは露出された創傷に適用されるのみであり、ｒＦＶＩＩａは両方入り混じった結果を有し、冷却を必要とし、非常に高価であることが、現場でまたは外傷の部位への投与における課題となっている。明らかに、現場における投与に受け入れられる、出血を止めるための新たな手法が必要とされている。
【０００４】
大量出血は、例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）では、傷の段階における最初のステップでもある。脊髄および外傷的脳損傷の両方において、最初の観察可能な現象は、損傷のメカニズムに関わらず、大量出血である。出血を止めることができる場合には、おそらく組織を保護し、結果を向上させることができる。主な器質的損傷は傷の小さな部分であることが頻繁にある。損傷後、数時間、数日、および数週経過して発生する第２の傷プロセスは、進行および乏しい機能的結果をもたらす。それらの第２の傷プロセスを止めることは、大量の組織を保護することを意味する。組織を保護することは、よりよい機能的結果を意味する。
【０００５】
損傷の後に、止血は一連の凝固現象を通じて確立される。血小板に関する重要なステップは、それらの活性化、結合、および成長因子の宿主およびフィブリノーゲンを含む他の分子の放出を含む。血管損傷中に、コラーゲンが露出されて血小板の活性化を開始させる。血小板形態は、円盤状から星状に変化し、それらは露出したコラーゲンに付着する。いったん血小板凝集が始まると、いくつかの催炎物質が、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を含むそれらの貯留粒体から放出され、近くで循環する血小板の表面を接着性にすることを引き起こす。セロトニン、エピネフリン、およびトロンボキサンＡ２は、さらに極度の血管収縮を誘発する。最終ステップである、血餅形成は、肝臓により産生されて通常血漿に存在する巨大可溶性血漿蛋白であるフィブリノーゲンの、不溶性の糸状分子であるフィブリンへの変換である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
重篤な傷では、これらの内因的過程が不十分であり、制御不能な出血となる。これらの過程を増強し、外用の方法を以外で止血を誘発する多くの手法がある。存在する血小板を置換または増強する血小板交換が長年追及されてきた（６）。同種異系血小板の投与は、出血を止めるのに役立つことができるが、血小板は貯蔵寿命が短く、同種異系血小板の投与は移植片対宿主病、同種免疫化、および輸血関連肺傷害を引き起こし得る（６）。Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列で修飾された赤血球、アルブミンに基づくフィブリノーゲン被覆マイクロカプセル、およびリポソーム系を含む非血小板代替物は、凝固剤として研究されてきたが（７）、毒性、血栓症、および限られた効能が、これらの製品を臨床に適用する際の主な問題点である（８）。
【０００７】
ｒＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））を含む組み換え因子は、フィブリノーゲンの産生を促進することにより止血を増強することができるが、免疫原性および血栓塞栓性の合併症が避けられないリスクである（９）。それにもかかわらず、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）は、別の方法では出血が制御できない多くの外傷および外科手術の場面で臨床において使用されている（９）。その効能のデータは変わりやすいが、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎがきわめて高価であるということは変わらない。１回量のコストは約＄１０，０００であり、典型的には複数回投与が止血に影響を与えるために必要とされる（９）。
【０００８】
止血剤が複雑な外傷に有効であるためには、その系は、非毒性であること、室温（つまり、メディカルバッグ）で保存した時に安定であること、即時の静脈内投与の可能性を有すること、非特異的血栓症を避けるために傷部位に特異的な凝集特性を有していること必要とする。この系が臨床に転換可能であるためには、理想的には、それがＦＤＡによりこれまでに認可された材料で作成されることを必要とする。実際には、手ごろな価格であることも必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
コア、水溶性ポリマー、およびペプチドを含む温度安定性のあるナノ粒子であって、該水溶性ポリマーは、該水溶性ポリマーの第１の末端で該コアに結合し、該ペプチドは、該水溶性ポリマーの第２の末端に結合し、該ペプチドはＲＧＤアミノ酸配列を含み、該水溶性ポリマーは、該ペプチドを糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）に結合可能にするための十分な長さを有する、ナノ粒子を提供する。一態様では、該ナノ粒子は、３５℃を超過する融解温度を有する。種々の態様では、該ナノ粒子は、球体形状および１ミクロン未満の直径を有する。
【００１０】
種々の態様では、該ナノ粒子は、０．１ミクロン〜１ミクロンの間の直径を有する。
【００１１】
種々の態様では、該ナノ粒子は、非球体、ロッド、繊維、またはウィスカである。本態様の種々の実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも３の、幅に対する長さのアスペクト比を有する。
【００１２】
種々の態様では、該ナノ粒子は、少なくとも１４日間室温で安定である。
【００１３】
複数のナノ粒子も提供され、本開示により提供される各ナノ粒子は、０．１ミクロン〜１ミクロンの間の平均直径を有する。
【００１４】
該複数のナノ粒子の種々の態様では、全てのナノ粒子の７５％より多くが０．１ミクロン〜１ミクロンの間の直径を有する。
【００１５】
種々の態様では、本開示の該ナノ粒子は、結晶性ポリマー、単一のポリマー、ブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、またはクワドブロックコポリマーであるコアを有する。種々の態様では、該コアは、ＰＬＧＡ、ＰＬＡ、ＰＧＡ、（ポリ（ε−カプロラクトン）ＰＣＬ、ＰＬＬまたはこれらの組み合わせを含む。
【００１６】
種々の態様では、該ナノ粒子のコアは、生体分解性、固体、非生体分解性である、および／または金、銀、プラチナ、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケル、ＺｎＳ、ＺｎＯ、Ｔｉ、ＴｉＯ２、Ｓｎ、ＳｎＯ２、Ｓｉ、ＳｉＯ２、Ｆｅ、Ｆｅ＋４、鋼、コバルト−クロム合金、Ｃｄ、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、およびＣｄＳ、チタン合金、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓ、ＧａＡｓ、セルロース、またはデンドリマー構造からなる群から選択される物質を含む。
【００１７】
種々の態様では、該ナノ粒子における該水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、炭水化物、多糖類、プルラン（ｐｕｌｌｕｌａｎｅ）、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン共マレイン酸無水物、ポリスチレン共マレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルリン酸アンモニウム（ＭＰＣ）、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリアセタール、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（β−アミノ酸）（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）および他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（ＰＯＧ）（例えば、グリセロール）、および他のポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、またはポリオキシエチル化グルコース、コロン酸（ｃｏｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄｓ）もしくは他の炭水化物ポリマー、フィコール、またはデキストラン、並びにこれらの組み合わせまたは混合物からなる群から選択される。種々の態様では、該水溶性ポリマーは、１００Ｄａ〜１０，０００Ｄａの間、または、少なくとも約１００の平均分子量を有するＰＥＧである。
【００１８】
種々の態様では、該ナノ粒子の該ペプチドは、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＧＲＧＤＳ、ＧＲＧＤＳＰ、ＧＲＧＤＳＰＫ、ＧＲＧＤＮ、ＧＲＧＤＮＰ、ＧＧＧＧＲＧＤＳ、ＧＲＧＤＫ、ＧＲＧＤＴＰ、ｃＲＧＤ、ＹＲＧＤＳ、またはこれらの変異体からなる群から選択される配列を含む。種々の態様では、該ペプチドは直鎖であり、他の態様では、該ペプチドは環状である。環状ペプチドは、共有結合性会合の結果として環状であるもの、および構造上の好ましさによる環状であるものが含まれることが当業者に理解される。従って、環状ペプチドは、共有結合によって環状でないものを含む。種々の態様では、該ＲＧＤペプチドはタンデムリピートされている。種々の態様では、該ナノ粒子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の該ＲＧＤペプチドの複製または該ＲＧＤペプチドの多重複製を含む。種々の態様では、該ナノ粒子における該ＲＧＤペプチドの全てが同じであり、他の態様では、該ＲＧＤペプチドの２つの複製が異なる配列を有する。
【００１９】
種々の態様では、該水溶性ポリマーが、０．１：１〜１：１０またはそれ以上のモル比で該コアに結合している。
【００２０】
種々の態様では、本開示の該ナノ粒子は、治療化合物をさらに含む。種々の態様では、該治療化合物が疎水性であり、該治療化合物が親水性であり、該治療化合物が該ナノ粒子に共有的に結合され、該ナノ粒子と非共有結合的に会合し、該ナノ粒子と静電的相互作用を通じて会合し、もしくは該ナノ粒子と疎水性相互作用を通じて会合し、該治療化合物は成長因子、サイトカイン、ステロイド、もしくは小分子であり、および／または該治療化合物は抗癌化合物である。
【００２１】
本開示の該ナノ粒子を含む薬学的組成物が提供される。種々の態様では、該薬学的組成物は、静脈内投与製剤、凍結乾燥製剤、または粉末である。
【００２２】
本開示のナノ粒子を、それを必要とする患者に、病気を治療するのに有効な量で投与するステップを含む、個人における病気を治療する方法をも提供する。種々の態様では、該個人は、出血性疾患を有する。該方法の種々の態様では、該ナノ粒子は、何も投与しないまたは生理的食塩水を投与するのと比較して１５％超出血時間を減らすのに有効な量で投与される。種々の態様では、該出血性疾患は、凝固障害、血小板減少症、創傷治癒障害、外傷、爆傷、脊髄損傷、または大量出血の症状である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
官能化されたナノ粒子は、ＦＤＡに認可された、多目的利用性を有する材料に基づいて提供される。種々の態様では、ナノ粒子は、傷の部位における出血時間を減らし、中枢神経系（ＣＮＳ）に対する外傷後の止血における役割を果たし、局部的薬物送達の手段を提供する。
【００２４】
ナノ粒子は、ポリマーコア、水溶性ポリマー、およびアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）部分の変異体に基づいて提供される。
【００２５】
Ｉ．ナノ粒子
本開示は、コア、水溶性ポリマー、およびペプチドを含むナノ粒子であって、水溶性ポリマーは、該水溶性ポリマーの第１の末端で該コアに結合し、ペプチドは、水溶性ポリマーの第２の末端に結合し、ペプチドはＲＧＤアミノ酸配列を含み、水溶性ポリマーは、ペプチドを糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）に結合可能にするための十分な長さを有する、ナノ粒子を提供する。種々の態様では、ペプチドは、直鎖または環状である。本開示の複数のナノ粒子を含む組成物において、組成物は、全てのペプチドが直鎖である、全てのペプチドが環状である、または直鎖および環状のペプチドの混合物が存在する、ナノ粒子を含むことが企図されることが理解される。
【００２６】
本開示のナノ粒子は、広い範囲の温度にわたって、本質的に同じ構造および／または本質的に同じ機能を維持する温度安定性がある。「本質的に同じ構造」および「本質的に同じ機能」により、本開示は、「本質的に同じ」とは、もとの投与量のプラスもしくはマイナス１０％、もとの投与量のプラスもしくはマイナス１０％、もとの投与量のプラスもしくはマイナス１０％、もとの投与量のプラスもしくはマイナス９％、もとの投与量のプラスもしくはマイナス８％、もとの投与量のプラスもしくはマイナス７％、もとの投与量のプラスもしくはマイナス６％、もとの投与量のプラスもしくはマイナス５％、またはもとの投与量のプラスもしくはマイナス５〜１０％、の投与量で、その使用を行うナノ粒子の性能に影響を与える変化がないことを意味すると企図する。種々の実施形態では、ナノ粒子が産生された温度に関わらず、ナノ粒子は、本質的に同じ構造および／または本質的に同じ機能を生理学的温度で維持する。生理学的温度を十分に超えて上昇した温度で本質的に同じ構造および／または本質的に同じ機能を維持するナノ粒子も企図される。上昇した温度で本質的に同じ構造および／または本質的に同じ機能を維持する性能は、例えば、滅菌処理を含むが限定されない多くの理由で重要である。一方、低温で本質的に同じ構造および／または本質的に同じ機能を維持するナノ粒子も企図される。例えば、凍結温度でまたはそれを下回る温度で本質的に同じ構造および／または本質的に同じ機能を維持するナノ粒子は、長期保存を必要とするまたは長期保存から利益がある製剤のために企図される。種々の態様では、本開示のナノ粒子は、３５℃を超過する、４０℃を超過する、４５℃を超過する、５０℃を超過する、５５℃を超過する、６０℃を超過する、６５℃を超過する、７０℃を超過する、７１℃を超過する、７２℃を超過する、７３℃を超過する、７４℃を超過する、７５℃を超過する、７６℃を超過する、７７℃を超過する、７８℃を超過する、７９℃を超過する、８０℃を超過する、融解温度を有する。
【００２７】
本開示の全態様のナノ粒子は、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、もしくは少なくとも１４日間、またはそれ以上、室温で安定である。
【００２８】
本開示のナノ粒子は、多数の異なる形のいずれをも有すると企図される。ナノ粒子の形状は、ある態様では、その産生方法の機能である。他の態様では、ナノ粒子は、その産生の処理前、処理中、または処理後に形成された形状を獲得する。種々の実施形態では、ナノ粒子は球体形状を有して提供される。様々なサイズを有する球状のナノ粒子（本明細書ではナノスフェアという）が企図され、例えば、０．１ミクロン〜０．５ミクロンの間、０．２ミクロン〜０．４ミクロンの間、０．２５ミクロン〜０．３７５ミクロンの間、０．３ミクロン〜０．３７５ミクロンの間、０．３２５ミクロン〜０．３７５ミクロンの間、０．１２ミクロン〜０．２２ミクロンの間、０．１３ミクロン〜０．２２ミクロンの間、０．１４ミクロン〜０．２２ミクロンの間、０．１５ミクロン〜０．２２ミクロンの間、０．１６ミクロン〜０．２２ミクロンの間、０．１７ミクロン〜０．２２ミクロンの間、０．１８ミクロン〜０．２２ミクロンの間、０．１９ミクロン〜０．２２ミクロンの間、０．２０ミクロン〜０．２２ミクロンの間、０．２１ミクロン〜０．２２ミクロンの間、０．１２ミクロン〜０．２１ミクロンの間、０．１２ミクロン〜０．２０ミクロンの間、０．１２ミクロン〜０．１９ミクロンの間、０．１２ミクロン〜０．１８ミクロンの間、０．１２ミクロン〜０．１７ミクロンの間、０．１２ミクロン〜０．１６ミクロンの間、０．１２ミクロン〜０．１５ミクロンの間、０．１２ミクロン〜０．１４ミクロンの間、０．１２ミクロン〜０．１３ミクロンの間、の直径を有するナノ粒子が企図される。種々の態様では、ナノ粒子は、０．０１ミクロン〜１．０ミクロン、０．０５ミクロン〜１．０ミクロン、０．０５ミクロン〜０．９５ミクロン、０．０５ミクロン〜０．９ミクロン、０．０５ミクロン〜０．８５ミクロン、０．０５ミクロン〜０．８ミクロン、０．０５ミクロン〜０．７５ミクロン、０．０５ミクロン〜０．７ミクロン、０．０５ミクロン〜０．６５ミクロン、０．０５ミクロン〜０．６ミクロン、０．０５ミクロン〜０．５５ミクロン、０．０５ミクロン〜０．５ミクロン、０．１ミクロン〜１ミクロン、０．１５ミクロン〜１．０ミクロン、０．２ミクロン〜１ミクロン、０．２５ミクロン〜１．０ミクロン、０．３ミクロン〜１ミクロン、０．３５ミクロン〜１．０ミクロン、０．４ミクロン〜１ミクロン、０．４５ミクロン〜１．０ミクロン、または０．５ミクロン〜１ミクロンの直径を有することが企図される。本開示により提供されるナノ粒子の組成物では、球状のナノ粒子は、全てが同じ直径を有する点で均質である、または、組成物における少なくとも２つのナノ粒子が異なる直径を有する点で不均質である。
【００２９】
ナノ粒子は非球体としても提供される。他のナノ粒子は、ロッド、繊維、またはウィスカの形状を有するものを含む。ロッド、繊維、またはウィスカの実施形態では、ナノ粒子は、循環からのクリアランス率を無効にする、遅らせる、または減らすための十分に高いアスペクト比を有する。
【００３０】
アスペクト比は、高いアスペクト比は長くて細い形状を示し、低いアスペクト比は短くて厚い形状を示すと当技術分野で理解される用語である。
【００３１】
本開示のナノ粒子は、幅に対する長さが、少なくとも３の、少なくとも３．５の、少なくとも４．０の、少なくとも４．５の、少なくとも５．０の、少なくとも５．５の、少なくとも６．０の、少なくとも６．５の、少なくとも７．０の、少なくとも７．５の、少なくとも８．０の、少なくとも８．５の、少なくとも９．０の、少なくとも９．５の、少なくとも１０．０の、またはそれ以上のアスペクト比を有すると企図される。企図されるナノ粒子の組成物においては、一実施形態ではナノ粒子が同じアスペクト比を有し、代替の実施形態では組成物中の少なくとも２つのナノ粒子が異なるアスペクト比を有する。ナノ粒子の組成物は、平均して、本質的に同じアスペクト比を有することによっても特徴づけられる。この例で用いられる「本質的に同じ」とは、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、または約５％までのアスペクト比における変動が包含されることを示す。さらに他の態様では、ナノ粒子の組成物が提供され、ここで、組成物におけるナノ粒子は、約１％〜２００％の間、約１％〜１５０％の間、約１％〜１００％の間、約１％〜約５０％の間、約５０％〜２００％の間、約１００％〜２００％の間、および約１５０％〜２００％の間のアスペクト比を有する。代替的には、組成物におけるナノ粒子は、約Ｘ％〜Ｙ％のアスペクト比を有し、Ｘは１から１００までであり、Ｙは１００から２００までである。
【００３２】
本開示は、複数のナノ粒子も提供する。本開示により提供される複数の球状のナノ粒子を含む組成物では、複数のナノ粒子は、０．１ミクロン〜０．５ミクロンの間、０．２ミクロン〜０．４ミクロンの間、０．２５ミクロン〜０．３７５ミクロンの間、０．３ミクロン〜０．３７５ミクロンの間、０．３２５ミクロン〜０．３７５ミクロンの間、約０．１２ミクロン、約０．１３ミクロン、約０．１４ミクロン、約０．１５ミクロン、約０．１６ミクロン、約０．１７ミクロン、約０．１８ミクロン、約０．１９ミクロン、約０．２０ミクロン、約０．２１ミクロン、約０．２２ミクロン、約０．２３ミクロン、約０．２４ミクロン、約０．２５ミクロン、約０．２６ミクロン、約０．２７ミクロン、約０．２８ミクロン、約０．２９ミクロン、約０．３０ミクロン、約０．３１ミクロン、約０．３２ミクロン、約０．３３ミクロン、約０．３４ミクロン、約０．３５ミクロン、約０．３６ミクロン、約０．３７ミクロン、約０．３８ミクロン、約０．３９ミクロン、約０．４０ミクロン、約０．４１ミクロン、約０．４２ミクロン、約０．４３ミクロン、約０．４４ミクロン、約０．４５ミクロン、約０．４６ミクロン、約０．４７ミクロン、約０．４８ミクロン、約０．４９ミクロン、約０．５０ミクロン、約０．４１ミクロン、約０．５２ミクロン、約０．５３ミクロン、約０．５４ミクロン、約０．５５ミクロン、約０．５６ミクロン、約０．５７ミクロン、約０．５８ミクロン、約０．５９ミクロン、約０．６０ミクロン、約０．６１ミクロン、約０．６２ミクロン、約０．６３ミクロン、約０．６４ミクロン、約０．６５ミクロン、約０．６６ミクロン、約０．６７ミクロン、約０．６８ミクロン、約０．６９ミクロン、約０．７０ミクロン、約０．７１ミクロン、約０．７２ミクロン、約０．７３ミクロン、約０．７４ミクロン、約０．７５ミクロン、約０．７６ミクロン、約０．７７ミクロン、約０．７８ミクロン、約０．７９ミクロン、約０．８０ミクロン、約０．８１ミクロン、約０．８２ミクロン、約０．８３ミクロン、約０．８４ミクロン、約０．８５ミクロン、約０．８６ミクロン、約０．８７ミクロン、約０．８８ミクロン、約０．８９ミクロン、約０．９０ミクロン、約０．９１ミクロン、約０．９２ミクロン、約０．９３ミクロン、約０．９４ミクロン、約０．９５ミクロン、約０．９６ミクロン、約０．９７ミクロン、約０．９８ミクロン、約０．９９ミクロン、約１．０ミクロン、またはそれ以上の平均直径を有する。
【００３３】
種々の態様では、複数の球状のナノ粒子は、全てのナノ粒子のうち、７５％より多く、８０％より多く、８５％より多く、９０％より多く、９５％より多く、９６％より多く、９７％より多く、９８％より多く、または９９％より多くが、０．１ミクロン〜０．５ミクロンの間、０．２ミクロン〜０．４ミクロンの間、０．２５ミクロン〜０．３７５ミクロンの間、０．３ミクロン〜０．３７５ミクロンの間、０．３２５ミクロン〜０．３７５ミクロンの間、０．１２ミクロン〜０．２２ミクロンの間、０．１３ミクロン〜０．２２ミクロンの間、０．１４ミクロン〜０．２２ミクロンの間、０．１５ミクロン〜０．２２ミクロンの間、０．１６ミクロン〜０．２２ミクロンの間、０．１７ミクロン〜０．２２ミクロンの間、０．１８ミクロン〜０．２２ミクロンの間、０．１９ミクロン〜０．２２ミクロンの間、０．２０ミクロン〜０．２２ミクロンの間、０．２１ミクロン〜０．２２ミクロンの間、０．１２ミクロン〜０．２１ミクロンの間、０．１２ミクロン〜０．２０ミクロンの間、０．１２ミクロン〜０．１９ミクロンの間、０．１２ミクロン〜０．１８ミクロンの間、０．１２ミクロン〜０．１７ミクロンの間、０．１２ミクロン〜０．１６ミクロンの間、０．１２ミクロン〜０．１５ミクロンの間、０．１２ミクロン〜０．１４ミクロンの間、０．１２ミクロン〜０．１３ミクロンの間、０．０１ミクロン〜１．０ミクロン、０．０５ミクロン〜１．０ミクロン、０．０５ミクロン〜０．９５ミクロン、０．０５ミクロン〜０．９ミクロン、０．０５ミクロン〜０．８５ミクロン、０．０５ミクロン〜０．８ミクロン、０．０５ミクロン〜０．７５ミクロン、０．０５ミクロン〜０．７ミクロン、０．０５ミクロン〜０．６５ミクロン、０．０５ミクロン〜０．６ミクロン、０．０５ミクロン〜０．５５ミクロン、０．０５ミクロン〜０．５ミクロン、０．１ミクロン〜１ミクロン、０．１５ミクロン〜１．０ミクロン、０．２ミクロン〜１ミクロン、０．２５ミクロン〜１．０ミクロン、０．３ミクロン〜１ミクロン、０．３５ミクロン〜１．０ミクロン、０．４ミクロン〜１ミクロン、０．４５ミクロン〜１．０ミクロン、または０．５ミクロン〜１ミクロン、の直径を有することで特徴づけられる。
【００３４】
本開示は、当技術分野でよく知られ、通常行われる微細加工処理を用いて形成された本質的にあらゆる形のナノ粒子をさらに提供する。微細加工方法においては、ナノ粒子のサイズおよび形状は、設計によりあらかじめ決定される。
【００３５】
非球状の形状であるナノ粒子が利用される態様では、当技術分野でよく知られ、通常用いられる微細加工技術は、生産用に企図される。Ｄａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１２）  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ  Ｒｅｖ  Ｎａｎｏｍｅｄ  Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ４：  ５２−６５；  Ｇａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１１）  ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ５：  ８４５９−８４６５；  Ｇｒｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１１）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８：  １５１０６−１５１１１；  Ｌｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１１）  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １５４：  ８４−９２；  Ｓｌｉｎｇｅｎｂｅｒｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１２）  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｉｌｏｒｅｄ  Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．  ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．  型は、シリコン、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、または当技術分野でよく知られる他の材料のような材料から生産され、ゼラチンのようなヒドロゲルで注型する。本明細書に記載されるあらゆるポリマーが、ナノ粒子の注型に用いられる。オリジナルの型に基づいて得られた構造は、種々の態様で、２００ｎｍ〜数ミクロンのアーム長さであって、２００ｎｍ〜数ミクロンのアーム直径であるアームを有する複数アーム星型である。注型の手順であることから、注型処理は、３アーム〜数十のアームについてアームの長さおよび寸法を異ならせることができる。
【００３６】
Ａ．コア
上記ナノ粒子が提供され、コアはポリマーである。種々の態様では、コアは結晶性ポリマーである。本明細書で用いられ、当技術分野で理解される「結晶性」とは、規則的な三次元配列の分子の配置を意味するように定義される。他の態様では、ポリマーは、全ての分子が規則的な三次元配列で配置される代わりに、結晶および非晶領域の両方を含む半結晶性である。種々の態様では、コアは、単一のポリマー、ブロックコポリマー、またはトリブロックコポリマーである。具体的な態様では、コアは、ＰＬＧＡ、ＰＬＡ、ＰＧＡ、（ポリ（ε−カプロラクトン）ＰＣＬ、ＰＬＬ、セルロース、ポリ（エチレン共ビニルアセテート）、ポリスチレン、ポリプロピレン、デンドリマーに基づくポリマー、またはこれらの組み合わせを含む。
【００３７】
種々の態様では、コアは、生体分解性もしくは非生体分解性であり、または複数のナノ粒子において、生体分解性および非生体分解性のコアの組み合わせが企図されるものに形成される。種々の態様では、コアは、固体、多孔質、または中空である。複数のナノ粒子においては、固体、多孔質および／または中空コアの混合物が含まれることが想定される。
【００３８】
本開示のあらゆる態様のナノ粒子は、コアが、代替的に金、銀、プラチナ、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケル、ＺｎＳ、ＺｎＯ、Ｔｉ、ＴｉＯ２、Ｓｎ、ＳｎＯ２、Ｓｉ、ＳｉＯ２、Ｆｅ、Ｆｅ＋４、鋼、コバルト−クロム合金、Ｃｄ、ＣｄＳｅ、ＣｄＳおよびＣｄＳ、チタン合金、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓ、ＧａＡｓ、セルロース、またはデンドリマー構造からなる群から選択される物質であるものを含む。
【００３９】
ヒドロゲルのコアも提供される。一態様では、ヒドロゲルのコアは、より高い温度安定性を提供し、血管が切れにくく非特異的血栓症を誘発しにくく、より大きなナノ粒子の形成を可能とする。
【００４０】
Ｂ．水溶性ポリマー
本開示のナノ粒子が提供され、ここで、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、炭水化物、多糖類、プルラン（ｐｕｌｌｕｌａｎｅ）、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン共マレイン酸無水物、ポリスチレン共マレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルリン酸アンモニウム（ＭＰＣ）、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリアセタール、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（β−アミノ酸）（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）、および他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（ＰＯＧ）（例えば、グリセロール）、および他のポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトールもしくはポリオキシエチル化グルコース、コロン酸（ｃｏｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、もしくは他の炭水化物ポリマー、フィコール、もしくはデキストラン、並びにこれらの組み合わせまたは混合物からなる群から選択される。本開示により企図される複数のナノ粒子においては、各ナノ粒子は、種々の態様では、同じ水溶性ポリマー、または代替的に複数における少なくとも２つのナノ粒子で、それぞれが、それらに結合した異なる水溶性ポリマーを有すると企図される。
【００４１】
具体的な態様では、本開示のナノ粒子は、水溶性ポリマーがＰＥＧのものである。本態様におけるナノ粒子に関し、ＰＥＧは、１００Ｄａ〜１０，０００Ｄａ、５００Ｄａ〜１０，０００Ｄａ、１０００Ｄａ〜１０，０００Ｄａ、１５００Ｄａ〜１０，０００Ｄａ、２０００Ｄａ〜１０，０００Ｄａ、２５００Ｄａ〜１０，０００Ｄａ、３０００Ｄａ〜１０，０００Ｄａ、３５００Ｄａ〜１０，０００Ｄａ、４０００Ｄａ〜１０，０００Ｄａ、４５００Ｄａ〜１０，０００Ｄａ、５０００Ｄａ〜１０，０００Ｄａ、５５００Ｄａ〜１０，０００Ｄａ、１０００Ｄａ〜９５００Ｄａ、１０００Ｄａ〜９０００Ｄａ、１０００Ｄａ〜８５００Ｄａ、１０００Ｄａ〜８０００Ｄａ、１０００Ｄａ〜７５００Ｄａ、１０００Ｄａ〜７０００Ｄａ、１０００Ｄａ〜６５００Ｄａ、または１０００Ｄａ〜６０００Ｄａ、の間の平均分子量を有する。代替的に、ナノ粒子は、ＰＥＧが、約１００Ｄａ、２００Ｄａ、３００Ｄａ、４００Ｄａ、１０００Ｄａ、１５００Ｄａ、３０００Ｄａ、３３５０Ｄａ、４０００Ｄａ、４６００Ｄａ、５，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、または１０，０００Ｄａ、の平均分子量を有するものである。複数のナノ粒子においては、各ナノ粒子は、同じ分子量のＰＥＧ水溶性ポリマーに結合し、代替的には、複数のうち少なくとも２つのナノ粒子は、それぞれ同じ分子量を有しないＰＥＧ水溶性ポリマーに結合する、ということが企図される。
【００４２】
本開示のナノ粒子は、水溶性ポリマーが、０．１：１、０．２：１、０．３：１、０．４：１、０．５：１、０．６：１、０．７：１、０．８：１、０．９：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、またはそれ以上のモル比でコアに結合するものを含む。種々の態様では、複数が証明され、ここで、水溶性ポリマーのコアに対する比が複数における各ナノ粒子で同じであり、代替的な態様においては、複数における少なくとも２つのナノ粒子は異なる水溶性ポリマーのコアに対する比を有する。
【００４３】
ナノ粒子が水溶性ポリマーと会合する程度は、種々の態様では、選択された投与ルートにより決定される。
【００４４】
Ｃ．ペプチド
本開示のナノ粒子は、それに会合したペプチドを有することにより特徴づけられる。本開示の種々の態様では。ペプチドは直鎖または環状である。具体的な実施形態では、ペプチドは、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＧＲＧＤＳ、ＧＲＧＤＳＰ、ＧＲＧＤＳＰＫ、ＧＲＧＤＮ、ＧＲＧＤＮＰ、ＧＧＧＧＲＧＤＳ、ＧＲＧＤＫ、ＧＲＧＤＴＰ、ｃＲＧＤ、ＹＲＧＤＳ、またはこれらの変異体からなる群から選択されるコアの配列を含む。本明細書で定義されるコア配列およびコア配列の一端または両端で結合する１つまたはそれ以上の追加のアミノ酸残基を有するペプチド、本明細書で定義されるコア配列を有するペプチドであるがコアの配列における１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が代替のアミノ酸残基で置換されているペプチドであって；代替のアミノ酸残基が天然起源のアミノ酸残基または非天然起源のアミノ酸残基であるペプチド、本明細書で定義されるコア配列を有するペプチドであるがコアの配列における１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が欠損しているペプチド、またはこれらの組み合わせを含む変異体が本明細書では用いられ、ここで、追加のアミノ酸残基、アミノ酸置換、アミノ酸欠損、または変更の組み合わせは、本質的にナノ粒子の活性を変化させない。本態様で用いられる「本質的に」とは本開示の他の箇所で記載されている意味と同じである。
【００４５】
種々の態様では、ＲＧＤペプチドはタンデムリピート配列とされ、本態様の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＲＧＤペプチドの複製が企図される。他の態様では、ＲＧＤペプチド多重複製は、ランダムな繰り返し配列ではないが、同じナノ粒子に結合する。
【００４６】
ナノ粒子が複数のＲＧＤペプチドと会合する種々の態様では、本開示は、ＲＧＤペプチドの全ての複製が同じであるナノ粒子、並びにＲＧＤペプチドの２つが異なる配列を有する態様を提供する。
【００４７】
企図される複数のナノ粒子においては、ＲＧＤペプチド（またはＲＧＤペプチドの多重複製）が複数中の各ナノ粒子で同じである実施形態が提供される。代替的な態様において、複数のうち少なくとも２つのナノ粒子は１つまたはそれ以上の別個のＲＧＤペプチドとそれぞれ会合する。
【００４８】
種々の態様では、ナノ粒子のペプチドの数、つまりペプチドの密度は、血小板凝集に影響を与える。
【００４９】
Ｅ．ナノ粒子を有する他の化合物
本開示のナノ粒子は、治療化合物をさらに含むことも企図される。種々の態様では、治療化合物は疎水性であり、さらに他の態様では、治療化合物は親水性である。治療化合物がナノ粒子に共有的に結合し、ナノ粒子と非共有結合的に会合し、ナノ粒子と静電的相互作用を通じて会合し、またはナノ粒子と疎水性相互作用を通じて会合する、本開示のナノ粒子を提供する。種々の実施形態では、治療化合物は、成長因子、サイトカイン、ステロイド、または小分子である。実施形態は、１つ以上の治療化合物がナノ粒子と会合することが企図される。本態様では、ナノ粒子と会合する各治療化合物は同じであり、またはナノ粒子と会合する各治療化合物は異なる。本開示により提供される複数のナノ粒子においては、複数中の各ナノ粒子は同じ治療化合物もしくは複数の同じ治療化合物と会合し、または代替的には、複数のうち少なくとも２つのナノ粒子はそれぞれ１つまたはそれ以上の異なる治療化合物と会合する。
【００５０】
種々の態様では、治療化合物は抗癌化合物であり、具体的な実施形態では、治療化合物は、ナイトロジェンマスタード、例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、およびクロランブシルを含むが限定されないアルキル化剤；ニトロソ尿素化合物、例えば、限定されることなく、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、およびセムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）；エチレンイミン／メチルメラミン、例えば、トリエチレン（ｔｈｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅ）メラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホラミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン）；スルホン酸アルキル、例えば、限定されることなく、ブスルファン；トリアジン、例えば、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）；葉酸類似体を含む代謝抵抗物質、例えば、メトトレキサートおよびトリメトレキサート；ピリミジン類似体、例えば、限定されることなく、５−フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、２，２’−ジフルオロデキシシチジン；プリン類似体、例えば、限定されることなく、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２’−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、および２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ）；例えば、限定されることなく、パクリタキセルのような有糸分裂阻害剤を含む天然物；限定されることなくビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、およびビノレルビン、タキソテール、エストラムスチン、並びにエストラムスチンリン酸塩を含むビンカアルカロイド；エピポドフィロトキシン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｏｔｏｘｉｎ）例えば、限定されることなく、エトポシドおよびテニポシド；抗生物質、例えば、限定されることなく、アクチノマイシン（ａｃｔｉｍｏｍｙｃｉｎ）Ｄ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ、およびアクチノマイシン；酵素、例えば、限定されることなく、Ｌ−アスパラギナーゼ；生物学的応答調節物質、例えば、限定されることなく、インターフェロン−α、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、およびＧＭ−ＣＳＦ；限定されることなく、シスプラチンおよびカルボプラチンのようなプラチナ配位化合物を含む種々の作用剤；アントラセンジオン（ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｄｉｏｎ）、例えば、限定されることなく、ミトキサントロン；置換された尿素、例えば、限定されることなく、ヒドロキシ尿素；限定されることなく、Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）およびプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体；副腎皮質抑止剤、例えば、限定されることなく、ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）およびアミノグルテチミド；限定されることなく、例えば、プレドニゾンおよび同等物、デキサメタゾン、並びにアミノグルテチミドのような副腎皮質ステロイドアンタゴニストを含むホルモンおよびアンタゴニスト；プロゲスチン、例えば、限定されることなく、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢���メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール；エストロゲン、例えば、限定されることなく、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール同等物；抗エストロゲン、例えば、限定されることなく、タモキシフェン；プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン／同等物を含むアンドロゲン；抗アンドロゲン、例えば、限定されることなく、フルタミド、性腺刺激ホルモン放出ホルモン類似体、およびロイプロリド；非ステロイド性抗アンドロゲン、例えば、限定されることなく、フルタミド；葉酸抑制剤；チロシンキナーゼ阻害薬、例えば、限定されることなく、ＡＧ１４７８および放射線増感化合物、からなる群から選択される。
【００５１】
種々の態様では、治療化合物は、ＡＧ１４７８、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール（ａｃｏｄａｚｏｌｅ）、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アンボマイシン（ａｍｂｏｍｙｃｉｎ）、アメタントロン、アミホスチン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン（ａｚｏｔｏｍｙｃｉｎ）、バチマスタット、ベンゾデパ（ｂｅｎｚｏｄｅｐａ）、ビカルタミド、ビスアントレン、ビスナフィドジメシラート（ｂｉｓｎａｆｉｄｅ  ｄｉｍｅｓｙｌａｔｅ）、ビゼレシン、ブレオマイシン、ブレキナル、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カペシタビン、カラセミド（ｃａｒａｃｅｍｉｄｅ）、カルベチマー（ｃａｒｂｅｔｉｍｅｒ）、カルボプラチン、カルムスチン、カルビシン、カルゼルシン、セデフィンゴール（ｃｅｄｅｆｉｎｇｏｌ）、セレコキシブ、クロランブシル、シロレマイシン（ｃｉｒｏｌｅｍｙｃｉｎ）、シスプラチン、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、デキソルマプラチン（ｄｅｘｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）、デザグアニン（ｄｅｚａｇｕａｎｉｎｅ）、デザグアニンメシレート、ジアジクオン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロロキシフェン、ドロロキシフェン、ドロモスタノロン、ズアゾマイシン（ｄｕａｚｏｍｙｃｉｎ）、エダトレキサート、エフロミチン（ｅｆｌｏｍｉｔｈｉｎｅ）、エルサミトルシン（ｅｌｓａｍｉｔｒｕｃｉｎ）、エンロプラチン（ｅｎｌｏｐｌａｔｉｎ）、エンプロマート（ｅｎｐｒｏｍａｔｅ）、エピプロピジン（ｅｐｉｐｒｏｐｉｄｉｎｅ）、エピルビシン、エルブロゾール（ｅｒｂｕｌｏｚｏｌｅ）、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エストラムスチン、エストラムスチン、エタニダゾール、エトポシド、エトポシド、エトプリン（ｅｔｏｐｒｉｎｅ）、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルロシタビン（ｆｌｕｒｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フォスキドン（ｆｏｓｑｕｉｄｏｎｅ）、フォストリエシン、フルベストラント、ゲムシタビン、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イルモホシン（ｉｌｍｏｆｏｓｉｎｅ）、インターロイキンＩＩ（組換えインターロイキンＩＩまたはｒＩＬ２を含むＩＬ−２）、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−ｎ１、インターフェロンアルファ−ｎ３、インターフェロンベータ−１ａ、インターフェロンガンマ−Ｉｂ、イプロプラチン（ｉｐｒｏｐｌａｔｉｎ）、イリノテカン、ランレオチド、レトロゾール、ロイプロリド、リアロゾール、ロメテレキソール、ロムスチン、ロソキサントロン、マソプロコール、メイタンシン、メクロレタミンハイドロクロライド（ｈｙｄｒｏｃｈｌｒｉｄｅ）、メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メト���レキサート、メトプリン（ｍｅｔｏｐｒｉｎｅ）、メツレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン（ｍｉｔｏｃａｒｃｉｎ）、ミトクロミン（ｍｉｔｏｃｒｏｍｉｎ）、ミトギリン、ミトマルシン（ｍｉｔｏｍａｌｃｉｎ）、マイトマイシン、ニトスパー（ｎｉｔｏｓｐｅｒ）、ミトタン、ミトキサントロン、ミコフェノール酸、ネララビン、ノコダゾール、ノガラマイシン、オームナプラチン（ｏｒｍｎａｐｌａｔｉｎ）、オキシスラン（ｏｘｉｓｕｒａｎ）、パクリタキセル、ペグアスパルガーゼ、ペリオマイシン（ｐｅｌｉｏｍｙｃｉｎ）、ペンタムスチン（ｐｅｎｔａｍｕｓｔｉｎｅ）、ペプロマイシン、ペルホスファミド（ｐｅｒｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ピポブロマン、ピポスルファン、ピロキサントロンヒドロクロリド（ｐｉｒｏｘａｎｔｒｏｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、プリカマイシン、プロメスタン（ｐｌｏｍｅｓｔａｎｅ）、ポルフィマー、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロカルバジン、ピューロマイシン、ピューロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン（ｒｉｂｏｐｒｉｎｅ）、ログレチミド（ｒｏｇｌｅｔｉｍｉｄｅ）、サフィンゴール、サフィンゴール、セムスチン、シムトラゼン（ｓｉｍｔｒａｚｅｎｅ）、スパルホサート（ｓｐａｒｆｏｓａｔｅ）、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン（ｓｐｉｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）、スピロプラチン（ｓｐｉｒｏｐｌａｔｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌール（ｓｕｌｏｆｅｎｕｒ）、タリソマイシン、タモキシフェン、テコガラン（ｔｅｃｏｇａｌａｎ）、テガフール、テロキサントロン（ｔｅｌｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン（ｔｅｒｏｘｉｒｏｎｅ）、テストラクトン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、トポテカン、トレルニフェン（ｔｏｒｅｒｎｉｆｅｎｅ）、トレストロン（ｔｒｅｓｔｏｌｏｎｅ）、トリシリビン（ｔｒｉｃｉｒｉｂｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリメトレキサート、トリプトレリン、ツブロゾール（ｔｕｂｕｌｏｚｏｌｅ）、ウラシルマスタード、ウレデパ（ｕｒｅｄｅｐａ）、バプレオチド、ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｌｉｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン硫酸塩、ビンデシン、ビネピジン、ビングリシネート（ｖｉｎｇｌｙｃｉｎａｔｅ）、ビンレウロシン（ｖｉｎｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）、ビノレルビン、ビンロシジン（ｖｉｎｒｏｓｉｄｉｎｅ）、ビンゾリジン（ｖｉｎｚｏｌｉｄｉｎｅ）、ボロゾール（ｖｏｒｏｚｏｌｅ）、ゼニプラチン（ｚｅｎｉｐｌａｔｉｎ）、ジノスタチン、ゾレドロネート、およびゾルビシンからなる群から選択される。これらおよび他の抗悪性腫瘍治療薬が、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，  １０ｔｈ  ｅｄ．，  ２００１に記載される。
【００５２】
種々の態様では、治療化合物は、グルココルチコイド；カリクレイン阻害剤；コルチコステロイド（例えば、限定されることなく、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、またはトリアムシノロンアセトニド（ｔｒｉａｍｃｉｎａｌｏｎｅ  ａｃｅｔｉｎｉｄｅ））；抗炎症剤（例えば、限定されることなく、非コルチコステロイド抗炎症性化合物（例えば、限定されることなく、イブプロフェンまたはフルビプロベン（ｆｌｕｂｉｐｒｏｂｅｎ））；ビタミンおよびミネラル（例えば、限定されることなく、亜鉛）；抗酸化剤（例えば、限定されることなく、カロチノイド（例えば、限定されることなく、ゼアキサンチンまたはルテインのようなキサントフィルカロテノイド））、並びに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）活性を阻害する薬剤、例えば、限定されることなく、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、インフリキシマブＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、セルトリズマブ（ＣＩＭＺＩＡ（登録商標））、ゴリムマブ（ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標））、およびエタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））からなる群から選択される抗炎症薬である。
【００５３】
種々の態様では、治療化合物は、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦｙ、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポイエチン、幹細胞因子、およびエリスロポイエチンである。
【数１】
2014528483.tif 000002
【００５４】
抗凝血剤を用いる方法もまた提供される。例えば、限定されることなく、プラビックス、アスピリン、ワルファリン、ヘパリン、チクロピジン、エノキサパリン、クマジン、ジクマロール、アセノクマロール、クエン酸、レピルジンおよびこれらの組み合わせを含む。
【００５５】
本態様の方法は、これらの抗凝固薬剤の影響を克服し、これは手術に極めて役立つ。
【００５６】
ＩＩ．  薬学的組成物
本開示は、本開示のナノ粒子を含む薬学的組成物を提供する。種々の態様では、薬学的組成物は単位用量製剤である。種々の態様では、薬学的組成物は静脈内投与製剤である。種々の態様では、薬学的組成物は凍結乾燥されたまたは粉末である。種々の態様では、薬学的組成物はポリアクリル酸をさらに含む。
【００５７】
種々の態様では、局所的な製剤を提供する。内用および外用が提供される。局所投与用薬学的組成物は、任意に担体を含み、溶液、乳濁液、軟膏、またはゲルベースとして製剤化される。ベースは、例えば、任意に１つまたはそれ以上の以下を含む：ペトロラタム、ラノリン、ポリエチレングリコール、みつろう、鉱油、水およびアルコールのような希釈剤、並びに乳化剤および安定化剤。増粘剤は、任意に、局所的投与のための薬学的組成物中に存在する。ある態様では、溶剤は製剤中にあり、溶剤は、例えば、限定されることなく、ＭＭＰ、ＤＭＳＯ、または類似の化合物を含む。
【００５８】
本開示は、ナノ粒子の送達のために、１ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜９００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜８００ｍ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜７００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜６００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜４００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜３００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜７５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜９００ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ〜８００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ〜７００ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ〜６００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以上で製剤化された薬学的組成物を提供する。
【００５９】
１回量の投与並びに複数回投与量の投与が提供される。複数回投与量の投与は、２回目の投与量が最初の投与後の数分、数時間、数日、数週または数月以内に投与されるものを含む。方法では
【００６０】
ＩＩＩ．  使用
個人における病気を治療する方法は、本開示のナノ粒子を、それを必要とする患者に、病気を治療するのに有効な量で投与するステップを含むことを提供する。種々の態様では、個人は、出血性疾患を有する。ナノ粒子が、何も投与しないまたは生理的食塩水を投与するのと比較して１５％超、２０％超、２５％超、または３０％超、出血時間を減らすのに有効な量で投与される方法が提供される。種々の態様では、該方法は、出血性疾患が、凝固障害、後天的な血小板機能欠陥、先天的な血小板機能欠陥、先天的なタンパクＣまたはＳ欠失、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、ファクターＩＩ欠失、ファクターＶ欠失、ファクターＶＩＩ欠失、ファクターＸ欠失、ファクターＸＩＩ欠失、血友病Ａ、血友病Ｂ、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、フォンビルブランド病（タイプＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ）、巨核細胞／血小板欠失の症状であるものに使用される。種々の態様では、方法は、病気が、化学療法および種々の薬剤での他の治療から生じる血小板減少症、放射線治療、手術、事故による失血、並びに他の特定の病気状態であるものに提供される。種々の態様では、方法は、病気が、再生不良性貧血、血小板減少症をもたらす乳がん転移性腫瘍に関連付けられた特発性血小板減少性紫斑病を含む特発性または免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）、新生児ループス症を含む全身性エリテマトーデス、血小板減少症をもたらす転移性腫瘍、巨脾症、ファンコーニ症候群、ビタミンＢ１２欠失、葉酸欠失、メイ‐ヘグリン異常、ヴィスコット・アルドリッチ症候群、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ＨＩＶに関連付けられたＩＴＰおよびＨＩＶ関連−血栓性血小板減少性紫斑病；慢性肝臓疾患；血小板減少症に関連付けられた骨髄異形成症候群；発作性夜間ヘモグロビン尿症、Ｃ７Ｅ３  Ｆａｂ（アブシキシマブ）治療後の急性重度血小板減少症；母体由来同種免疫の血小板減少症を含む同種免疫の血小板減少症；抗リン脂質抗体および血栓症に関連付けられた血小板減少症；自己免疫の血小板減少症；カルボプラチン誘発血小板減少症、ヘパリン誘発血小板減少症を含む薬剤誘発免疫血小板減少症；胎児血小板減少症；妊娠性血小板減少症；ヒューズ症候群；狼瘡様の血小板減少症；事故的および／または大量の失血；骨髄増殖性疾患；悪性腫瘍を有する患者における血小板減少症；癌患者における血栓性血小板減少性紫斑病／溶血性尿毒症症候群として顕在化された血栓性細小血管症を含む血栓性血小板減少性紫斑病；自己免疫溶血性貧血；潜在性空腸憩室穿孔；赤血球糸無形成症；自己免疫血小板減少症；流行性ネフロパシー；リファンピシン関連急性腎不全；パリス−トルソー血小板減少症；新生児同種免疫血小板減少症；発作性夜間ヘモグロビン尿症；胃癌における血液学的な変化；幼児期溶血性尿毒症症候群；並びに肝炎ＡウイルスおよびＣＭＶ関連血小板減少症を含むウイルス感染に関する血液学的な徴候、であるものに提供される。種々の態様では、方法は、病気が、血小板減少症をもたらすＡＩＤＳの治療から生じるものに提供される。種々の態様では、ＡＩＤＳの治療はＡＺＴの投与である。
【００６１】
種々の態様では、治療を受ける個人は、創傷治癒障害、外傷、爆傷、脊髄損傷、出血性卒中、ＴＰＡ投与後の大量出血、または多くの病気でみられるが特に早産において深刻である心室内大量出血を患っている。
【実施例】
【００６２】
（実施例１）
出血を制御するためのナノ粒子を試験するための最初のモデルは、フルオレセインを投与してＵＶライトでそれを励起することにより微小血管を露出させて傷つけ、微小血管にダメージを与えて血小板の活性化を誘発する、ハムスターの懸垂体の準備であった。血餅の形成時間を記録した。
【００６３】
最初のナノ粒子は、分子量１０，０００ｇ／ｍｏｌの４−アームＰＥＧであった。ＰＥＧ分子は、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）で活性化され、ＲＧＤを末端に結合した。このナノ粒子は、活性化した血小板間のブリッジとして作用し、血餅形成時間を減少させると考えられたが、それは劇的に出血を悪化させることがわかった。
【００６４】
この結果に基づいて、より大きな分子量のＰＥＧが粒子間を架橋することが提案されたが、ＰＥＧが大きくなると、ペプチドを露出するのに好ましくない立体構造をとる。よって、コアを基にする系が、ペプチドの表出を促進するように、および血餅形成に関与するために活性化した血小板間を架橋するのに十分に大きくなるように設計された。
（実施例２）
【００６５】
ナノ粒子の分解率は、分子量およびグリコール酸に対する乳酸部分の割合を介して調節される。ＦＤＡで認可された製品におけるその使用以外でＰＬＧＡを用いる１つの主要な魅力は、それを薬物送達に使用できることであり、これにより薬物送達技術を合成血小板プラットフォームに活用する。ＰＬＬは、ＰＥＧがＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）に基づいて伝統的な結合化学を用いて結合できる遊離アミンを提供する。ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＬＬにＰＥＧを結合する１つの魅力は、複数のＰＥＧアームを結合できることである。複数の分岐は、表面の分離の傾向を増加させ、より大きな官能基部分の露出を導く。ＰＥＧは、ナノ粒子を親水性にし、血流を通って移動し、肝臓でナノ粒子が収集される傾向を低減することを可能にする。ＰＥＧは、非毒性、非血栓形成性物質であり、ナノ粒子を標的と特異的に結合させることができる。ＲＧＤ部分またはその変異は、活性化された血小板と結合する機能と凝固作用の増強を提供する。ＲＧＤペプチドまたはその変異体の１つ（ＲＧＤＳ、ＧＲＧＤＳ）での化学修飾は、他の系における血小板作用の増強を示した。ＲＧＤ部分は、多くの系でみられ、血小板では血小板が活性化されるときに現れ、傷部位で血小板の凝集を生じさせるフィブリノーゲンを放出する。
【００６６】
１Ｈ−ＮＭＲ、ＵＶ−ｖｉｓ、アミノ酸分析、および動的光散乱法を含む種々のツールが、ナノ粒子を特徴づけるために用いられた。この分析から、ナノ粒子のコアは約１７０ｎｍであり、ＰＥＧの分子量を１５００Ｄａ〜８０００Ｄａに変化させることにより、ＰＥＧアームの長さは９０〜１５０ｎｍに変化したことが示された。ＲＧＤ部分（ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、およびＧＲＧＤＳ）の３つの変異体が用いられ、カップリング効率は全てのペプチドについて約３５％であった。
（実施例３）
【００６７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系は、後の分析を容易にするためにＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒグリーンを用いて標識された血小板での、合成血小板の凝固効果のハイスループットスクリーニングのために開発された。本質的に、この分析は、前もってＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒで標識された血小板を活性化すること、および撹拌状態でポリマー系にて修飾された表面に結合する数をみることを含む。この分析は、コラーゲンで検証された。この系は、効果的にかつ独立してＰＥＧ分子量およびＲＧＤモチーフ（つまり、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、およびＧＲＧＤＳ）を変更させることができた。
【００６８】
予備的な研究では、ＰＥＧ４６００およびＧＲＧＤＳペプチドで増強された、活性化したナノ粒子結合は、効果的な接着および凝集をもたらした。フランキングアミノ酸をＲＧＤモチーフに導入することにより、活性状態の立体構造が得られることが確立された。この生体活性は、次第にＲＧＤ部分のインテグリン親和性に影響を与え、細胞付着を増加させる。ＧＲＧＤＳペプチドは、活性化した血小板の良好な結合および接着を提供することが示された。
【００６９】
他者によるこれまでの研究は、ペプチドの長さが、その温度安定性並びに産生コストに影響し得るということを示した。これらの合成血小板は、それらの現場における投与を円滑にするために、室温で安定となるように設計された。
（実施例４）
【００７０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの最適化に続き、ナノ粒子の効能の試験が、大腿動脈の部分的な断絶モデルで行われた。約２０ｍｇ／ｍｌの粒子を静脈内に注入し、凝固時間を測定するために血流を撮像した。
【００７１】
ＰＥＧ４６００およびＧＲＧＤＳペプチドで官能化されたナノ粒子の全身投与は、大腿動脈における凝固時間を半減させた。切除された血餅の走査型電子顕微鏡観察は、凝固と密に関連付けられた合成血小板（赤い矢印でマークされている）を示した。重要なことに、ＣＮＳまたは肺における粒子の蓄積または血栓症と関連付けられる発作や呼吸疾患のサインを含む有害な効果はみられなかった。生体内分布のデータは、非結合の合成血小板が２４時間以内になくなったことを示し、傷のありまたはなしで差はみられなかった。これらのデータは、合成血小板が積極的に凝固を増強させ、ＣＮＳ外傷後の止血の役割の研究に重要なツールとなることを証明する。
（実施例５）
【００７２】
ＣＮＳへの器質的外傷後に最初に観察された現象は、微小血管の破断であった。この現象の後には、損傷後の数時間および数日にわたって生じる乏血、無酸素症、遊離基生成、および興奮毒性を含む傷段階が続く。最初の大量出血を止めることができるのであれば、二次変性を阻害して組織と機能を保護できるのかということに関する疑問が発生した。
【００７３】
大量出血の程度は、ヒトにおけるＣＮＳ外傷後の機能の不足の程度と相互に関連があるとされている。げっ歯類モデルにおける傷の程度でも関連付けられる。止血を誘発する現行の薬物はＣＮＳ外傷後の発作の発生のリスクを有しているので、大量出血を止めることに目を向ける文献は限られている一方、早期の臨床上の根拠が、ｒＦＶＩＩａを投与することにより止血を誘導することが治療効果を向上させるということを示唆している。この結果は、ｒＦＶＩＩａよりもより有効な出血を止める手段が治療効果を有意に向上させるための可能性を有するということを示唆する。
【００７４】
最終的に、ナノ粒子は、傷部位で血餅に結合される。ＣＮＳの傷に関し、この結果は、プラットフォームが、神経保護を提供するために、局所化された、標的化された薬物送達のために提供されることを意味する。
【００７５】
ナノ粒子に組み込むことができる複数の因子がある。ナノ粒子コアの製造に似た技術を用いて、多くのＣＮＳ負傷および病気で神経を保護することが他者により示された毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）を送達するＰＬＧＡをベースとしたナノ粒子を、合成血小板コアの概略の直径で調製した。これらのナノ粒子は１４日間ナノグラム量のＣＮＴＦを送達し、成長因子は生物活性があった。ＣＮＴＦで充填したナノ粒子は２０日を超える送達を示す。
【００７６】
他者による結果もまた、複数の損傷モデルにおける、ＰＬＧＡ粒子からのグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の送達、並びに炎症の低減、血管の漏出減少の補助、ＣＮＳ損傷後の保護を提供することに関連するステロイドである、トリアムシノロンの送達を証明した。
（実施例６）
【００７７】
ポリ（乳酸共グリコール酸）−ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＧＡ−ＰＬＬ）ブロックコポリマーコアからなるナノ粒子は、ＲＧＤ官能基で終了したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）アームに結合された。ＰＬＧＡ−ＰＬＬに対するＰＥＧの結合は１−ＮＭＲを用いて確認された。ナノ粒子は単一の乳濁溶剤蒸発技術を用いて製造され、そのサイズは走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）により確認された。その後のＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧナノ粒子に対するＧＲＧＤＳの結合は、アミノ酸（ＡＡ）分析を用いて定量化された。動的光散乱法は、球体の流体力学量を測定するために用いられた。
（実施例７）
【００７８】
ナノ粒子は、ＨＰＬＣを介して、４４４／５３８ｎｍの励起および発光の波長のペアを用いて検出され得るクマリン６（Ｃ６）で、ナノ粒子コアを充填することにより追跡された。これは、ナノ粒子の生体内分布の定量化を可能にする。Ｃ６は粒子のサイズや動作を変化させず、Ｃ６はかなり疎水性のため９９％が７日間ＰＬＧＡコアに残存する。
（実施例８）
【００７９】
本開示は、ＣＮＳにおける外傷のためのナノ粒子の適用を提供する。予備的な証拠によると、ナノ粒子は、血餅に集積する。ＣＮＳ外傷の場合では、このことは、血液脳関門（ＢＢＢ）が損なわれた領域で、ＣＮＳに粒子があるであろうということを意味する。
【００８０】
トリアムシノロンは、炎症および血管封鎖の制御を助ける性能並びに神経組織を保護する性能を有する。さらに、ＰＬＧＡ粒子を送達した。酢酸トリアムシノロンは、その結果、単一の乳濁液処理を用いてカプセル化し、ＨＰＬＣを用いて放出を定量化する。
（実施例９）
【００８１】
事前の研究では、大腿動脈損傷モデルが使用された。出血への治療の効果のシンプルな評価を可能とする非常に明確なモデルである。鈍的外傷モデルにおけるナノ粒子の効能を測定するために、並びにナノ粒子の凝固におけるメカニズムおよび効果に関する臨床データを得るために、肝臓損傷モデルが、経時的な凝固の評価と組み合わせて用いられる。
【００８２】
雄のスプラーグドーリーラットをイソフルランで麻酔をかけた。動物の温度は温熱パッドを用いて維持され、温度プローブを用いて実験中にわたってモニターされた。血圧の測定および採血のために動脈カテーテルを使用し、試験される薬剤を投与するために静脈カテーテルを使用した。腹腔を開き、続いて肝臓の中葉を上大静脈から１．３ｃｍで鋭く切断した。腔をすぐに閉じ、実験用薬剤を送達した。
【００８３】
血液サンプルは、損傷直前、損傷後５分、損傷後３０分で採取された。動物は、６０分間または死に至るまで維持された。６０分経過後、失血量を測定するために予め計量したスポンジを用いて腹腔における血液を収集した。全ての主要な臓器を、組織学およびナノ粒子の生体内分布のために収集した。
【００８４】
本研究からのデータは、ナノ粒子の効能、安全性、メカニズムにおける重要なデータを提供する。ナノ粒子が有意に増強された止血を示さない場合、末端ペプチドを、活性化された血小板への結合を増強させるために変化させる。
（実施例１０）
【００８５】
外傷性脳障害（ＴＢＩ）の研究のために、雄のスプラーグドーリーラットにおける制御式皮質衝撃（ＣＣＩ）モデルを用いた。ＣＣＩモデルは、生理学的に関連のある病気および行動学的結果を、高い定量化可能な系で組み合わせる。重症のモデルは、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ精測衝撃装置（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｉｍｐａｃｔｏｒ  ｄｅｖｉｃｅ）により、２ｍｍの深さの衝撃で次に用いた。
【００８６】
この傷は、ロータロッド試験（ｒｏｔｏｒｏｄ  ｔｅｓｔ）およびモーリス水迷路試験（ＭＷＭ）を用いて定量化され、損傷の大きさ、グリオーシス、陽性の神経組織の量を含む組織学的結果と関連づけられた重要な運動および認知障害をもたらす。
【００８７】
本研究では、どのように有効にナノ粒子が外傷性脳障害に続く大量出血を止めるのか、およびどのように止血の誘発が回復に影響するのかを測定した。
【００８８】
この手法は、局所的にステロイドを送達する、つまり静脈内投与のための簡易な投与ルートも提供した。因子が血液脳関門を通過することができす、短い半減期を有し、副作用を起こし得るため、これらの因子を送達するための現行の手法は埋込ポンプおよびカテーテルに焦点があてられている。しかしながら、ＣＮＳにおけるインプラント可能なカテーテルは、特に外傷により傷ついた患者にとってリスクを伴う。
【００８９】
簡易な投与であるが有効な標的システムは、神経栄養の投与に関連付けられた多くの送達の問題を軽減する。
（実施例１１）
【００９０】
ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）アーム［１］と結合されたポリ（乳酸共グリコール酸）−ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＧＡ−ＰＬＬ）ブロックコポリマーから合成された。本明細書に記載のナノ沈殿法を用いて、球状のナノ粒子を製造した。デキサメタゾンを溶剤に溶解し、適切な量のポリマーも溶解して薬剤に混合した。薬剤／ポリマー溶液は、回転している１×ＰＢＳ内にピペットで滴下した。得られた溶液は、室温で約２０分間蓋をせずに撹拌することができた。ナノスフェアの撹拌物が硬化した後、ｐＨを３．０〜２．７に下げる調整をして凝集を誘発した。このｐＨの範囲は、凝集を生じさせるのに有用であることがわかった。ナノスフェアを、遠心分離により精製し（５００ｇ、３分、３×）、脱イオン水に再懸濁し、凍結し、凍結乾燥器で凍結乾燥した。１０ｍｇのナノスフェアを１ｍＬの１×ＰＢＳに溶解することを３回繰り返すことにより、放出の研究を行った。
【００９１】
ナノスフェアの大きさを動的光散乱法（ＤＬＳ）により測定した。立体構造のサイズと形態を走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）により測定した。スフェアをＤＭＳＯに溶解し、ＵＶ−Ｖｉｓ上で流すことにより、薬物の量を測定した。放出研究データを種々の時点で蓄積し、ナノ粒子の外にデキサメタゾンが経時的にどのように溶出するのかを測定するためにＵＶ−Ｖｉｓにかけた。
（実施例１２）
【００９２】
中間処理ステップに必要な最も短い時間の測定により、収量および産生物の作成時間が有意に減少した。沈殿後に遠心分離してＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧを収集することにより収量は有意に増加した。収量は、ナノ沈殿ナノ粒子形成法によっても有意に増加し、さらにナノ粒子収集のためのポリ（アクリル酸）コアセルベート沈殿技術を用いた場合にも増加した。
【００９３】
いったんＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧが合成されると、ＧＲＧＤＳのような活性状態のペプチドはポリマーに結合されることを必要とする。
【００９４】
クワドブロックコポリマー（ＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧ−ペプチド）を用いた場合、スフェアの収量は極めて低くなった。ペプチドはポリマーの最も高価な部分だったので、トリブロック（ＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧ）からスフェアを形成し、その後スフェア自身にペプチドを会合する方法を採用した。
【００９５】
ペプチドのトリブロックナノ粒子への結合は、約５０％の結合有効性（リジンに対するアルギニンの割合として計算）を導いた。
【００９６】
しかしながら、アミノ酸分析前におけるナノスフェアの過剰な洗浄ステップは、１１％の結合有効性でペプチドの有意な損失を導くことが分かった。１ｇバッチナノスフェアの反応物をスケールアップすると、結合有効性は本質的に０％に低下した。よって、クワドブロックコポリマー全体を作成可能とし、少なくとも比較可能な収量で、タイトな径分布を有するナノ粒子を産生する方法を探求した。
【００９７】
この手法は、ナノ粒子を形成する前でのクワドブロックコポリマーの製造をもたらした。クワドブロック結合有効性は約８０％であったが、ポリ（アクリル酸）ありおよびなしで、ナノ沈殿技術を用いたナノスフェア形成後には１３％に低下した。最終的には、ペプチドの添加の直前にポリマーをＤＭＳＯ中のＣＤＩで再活性化することによりクワドブロックを作成した。このステップは、５０％（ｎ＝３）を超えるまでにペプチドの結合を増加させた。
【００９８】
乳濁方法
乳濁方法は、直径が３２６〜３６１ｎｍのスフェアの作成に成功する。
【００９９】
乳濁方法は、５％ＰＶＡの脱イオン水５０ｍｌ中でナノスフェアを撹拌−硬化する。この方法で用いるナノスフェアの産生をスケールアップすることは、撹拌硬化のために大量の溶液を必要とする。この観測は、これまでの方法では粒子を形成した後の結合ステップのためにペプチドを加えたという事実と合わせて、適切なカップリング効率を得るためには、大量のペプチドが大量の溶液のために必要であるということを意味する。
【０１００】
ナノ沈殿法のスケールダウンしたバージョンに関しては、１０ｍｌＰＢＳでの撹拌硬化がペプチドの同時結合とともに行われた。このステップでは、十分な量のペプチドを添加する。ナノ沈殿法は、製造後のカップリング反応を必要とせずにクワドブロックコポリマーでのナノ粒子の形成にも役立つ。
【０１０１】
粒子の均一性、粒子の凝集、ナノ粒子を再懸濁する際の課題、および凍結乾燥後の再懸濁の課題を含む、ナノ粒子で特定される多くの根本的な問題がある。
【０１０２】
これらの課題に対処するための多くの手法をグループは提案した。例えば、凍結乾燥後の小さなナノ粒子を再懸濁するためにリオプロテクタントを有することができる。（Ｓａｕａｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｔｒａｕｍａ  ３８，  １８５  （１９９５）），  Ｃｈａｍｐｉｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｔｒａｕｍａ  ５４，  Ｓ１３  （２００３））。他の者は、粒子を凝集するためにポリ（アクリル酸）の使用と合わせてナノ沈殿技術を通じて、リオプロテクタントを溶液に添加する必要性が回避されたということを見出した。
【０１０３】
ナノ沈殿
ナノ沈殿法は、一貫したサイズのスフェアを作成するために、アセトニトリルのような水混和性の溶剤に溶解したポリマーの滴状での添加を用いる（Ｒｅｇｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｏｌ  Ｓｃａｎｄ  Ｓｕｐｐｌ  １１０，  ７１  （１９９７）；  Ｌｅｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  ９，  ４５７  （２０００）；  Ｂｌａｊｃｈｍａｎ，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ５，  １７  （１９９９）；  Ｌｅｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  １１４，  ４９６  （２００１））。
【０１０４】
ポリ（アクリル酸）コアセルベート沈殿
（Ｒｅｇｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）；  Ｋｉｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｔｉｆ  Ｃｅｌｌｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔ  Ｉｍｍｏｂｉｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３４，  ５３７  （２００６））から変更した本方法は、ナノ粒子の収量を増加させ、これまでに観察された遠心分離および凍結乾燥ステップ中のスフェアの凝集を低減するために採用された。沈殿は、５００ｇ未満の穏やかな遠心分離で可能となる。
【０１０５】
サイズの再現性は、このように、均質なサイズ分布を作成するために、ソニケーション状態に大きく依存する乳濁液およびナノ沈殿の単体の方法を超えて有利であることが大いに示された。ＳＥＭ画像は、ナノ粒子の形態およびサイズの均一性を示す。ヒストグラムインレー（ｉｎｌａｙ）をナノ粒子直径の１００回の測定から作成し、サイズ分布が約２３６．１ｎｍ＋／−５６．６ｎｍを中心とすることを示す。
【０１０６】
ＰＡＡでコートされたナノ沈殿合成血小板を作成する方法
ＰＬＧＡ（Ｒｅｓｏｍｅｒ５０３Ｈ）をＥｖｏｎｉｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓから購入した。ポリ−ｌ−リジンおよびＰＥＧ（約４６００Ｄａ  ＭＷ）をＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。全ての試薬はＡＣＳグレードであり、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧコブロックポリマーを、これまでに記載した（Ｌａｖｉｋ  ｅｔ  ａｌ）標準的なバイオコンジュゲーション技術を用いて作成した。
【０１０７】
クワドブロック結合
ＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧを、無水ＤＭＳＯに溶解して、１００ｍｇ／ｍｌの濃度とした。２つのモルの同等物のＣＤＩをＰＥＧ基を再活性化するために添加し、１時間撹拌した。２５ｍｇのオリゴペプチド（ＧＲＧＤＳまたはＧＲＡＤＳＰ）を１ｍｌＤＭＳＯに溶解し、撹拌しているポリマー溶液に添加した。この混合物を３時間反応させ、その後透析チューブに移した（ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ  ２ｋＤａ  ＭＷＣＯ）。透析用の水は、タイプＩのＤ．Ｉ．水で３０分ごとに４時間交換した。生成物はその後、液体窒素中で急速に凍結され、２日間乾燥凍結された。
【０１０８】
ナノ沈殿
得られたクワドブロックコポリマーＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧ−ＧＲＧＤＳを、その後アセトニトリルで２０ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解した。この溶液を、撹拌する量のＰＢＳに滴状で加えた。一般的なルールは、アセトニトリルの２倍量のＰＢＳを用いることである。水混和性溶剤として形成された沈殿ナノ粒子は、分散する。しかしながら、開始クワドブロックを３００ｍｇよりも多い量にスケールアップするための、アセトニトリルでの沈殿量のプライミングは、自然な凝集の形成を低減させたことが分かった。溶剤：水の比は、沈殿量における最終濃度が２：１  ＰＢＳ：アセトニトリルとなるように、沈殿処理を通して調整された。その後、粒子を３時間撹拌−硬化した。その後、粒子を１５０００ｇの遠心分離を用いて収集し、ＰＢＳで３回洗浄した。代替的に、粒子をコアセルベート沈殿方法を用いて収集した。
【０１０９】
コアセルベート沈殿
ドライポリ（アクリル酸）のひとかたまりの同等物を撹拌している粒子懸濁液に添加した。その後、１％ｗ／ｖのｐＡＡを、凝集が生じるまで、撹拌している懸濁液に添加した。凝集を観察するために、ｐＡＡの各添加後にほんのしばらく撹拌をとめた。５分後、凝集した粒子を５００ｇの遠心分離により収集し、１％ｐＡＡで３回洗浄した（洗浄と洗浄の間に５００ｇ、２分、４Ｃで遠心分離）。最後の洗浄で、粒子をＤ．Ｉ．水に再懸濁し、急速に凍結し、最後の水の量に応じて２〜５日間凍結乾燥した。
【０１１０】
再懸濁
粒子を集め、１×ＰＢＳで２０ｍｇ／ｍｌの濃度に再懸濁した。粒子をボルテックスまたは再懸濁し、代替的には、ボルテックスし、プローブソニケーター（ＶＣＸ−１３０、Ｓｏｎｉｃｓ＆Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．）を用いて５０Ｊの総エネルギーとなるように４Ｗで短時間超音波処理した。
（実施例１３）
【０１１１】
爆発は、戦闘関連の傷の７９％を占める現代の紛争における主要な傷の原因である。制御不能な出血は、戦場の外傷における死の主因となる。負傷後、止血は、血小板活性を含む一連の凝固現象を通じて確立される。しかしながら、重篤な傷では、これらのプロセスは不十分であり、制御不能な出血をもたらす。即時の処置は、重篤な外傷と関連付けられた死亡率を最小限にする最も有効な手段の１つであり、今のところ現場で唯一の可能な処置は、圧迫包帯法および露出した創傷に有効な吸収性の材料であるが、内部の傷に使用することはできない。圧迫包帯法および止血を補足するために医療従事者により現場で適用できる治療を必要とする。
【０１１２】
本明細書に記載のナノ粒子は、上述のように、大腿動脈傷モデルにおける出血時間を半減する。これらのナノ粒子は、本質的に合成血小板として作用し、室温で安定であり、静脈内に投与することができる。それらは出血を止めることができるので、爆発後の生存性を向上できるのかどうか、並びに、よりよい機能的な結果をもたらすことになる組織の保護ができるのかどうか、を判断するための爆傷のモデルに用いられる。
【０１１３】
ナノ粒子の準備
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）アームを有するポリ（乳酸共グリコール酸）に基づくナノ粒子および活性化した血小板を標的とするＲＧＤペプチドを製造した。合成血小板のＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧ−ＧＲＧＤＳまたはＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧ−ＧＲＡＤＳＰは以前記載した手順を用いて合成した。ポリマーは、注入後（１％ｗ／ｗで充填）に、粒子を追跡するために用いる蛍光色素であるクマリン−６（Ｃ６）を含むアセトニトリルに２０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解される。この溶液を、アセトニトリルの２倍の量の撹拌しているＰＢＳに滴状で添加した。水混和性の溶剤が置換された時に、沈殿したナノ粒子を形成する。その後、粒子を３時間撹拌−硬化した。ドライポリ（アクリル酸）（ｐＡＡ）（Ｓｉｇｍａ、ＭＷ＝１，８００）のひとかたまりの同等物を撹拌する粒子懸濁液に添加した。その後、凝集が発生するまで、１％ｗ／ｖのｐＡＡを撹拌している懸濁液に約１０ｍｌ添加する。５分後、凝集した粒子を５００ｇの遠心分離で収集し、１％のｐＡＡ（洗浄と洗浄の間に２５０ｇ、２分、４Ｃで遠心分離）で３回洗浄した。最後の洗浄で、粒子を脱イオン水で１０ｍｇ／ｍｌに再懸濁し、液体窒素中で急速に凍結し、３日間凍結乾燥した。後述するコアセルベート沈殿方法を用いて粒子を収集した。
【０１１４】
ＲＯＴＥＭ分析を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで、および２０ｐｓｉでの身体全体への爆傷マウスモデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏで、粒子の特徴を明らかにした。スプラーグドーリーラットの血液を用い、生理的食塩水、ＧＲＧＤＳが結合した、またはナノ粒子対照の、ＧＲＡＤＳＰが結合したナノ粒子のいずれかの存在下でＲＯＴＥＭ’ｓ  ＮＡＴＥＭ試験を用いて凝固分析を行った。血液収集方法（心臓穿刺術）には、高感度なＮＡＴＥＭ試験で変動性を最小限にするために厳密に追従した。全ての動物の処置は、Ｃａｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物管理使用委員会（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により設定されたガイドラインに従って承認され、着手された。
【０１１５】
ナノ粒子を準備する第２の手法は、ポリマー（ＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧ−ＧＲＧＤＳ）を最初に作成し、その後ナノスフェアに形づくった。
【０１１６】
動物モデル
爆傷の傷モデルを以下のように作成した。配置したカスタムメイドの衝撃波管を爆発の過度の圧力を発生させるために用いた。絶縁シートを加圧室とピーク圧を達成するチューブの間に配置する。爆発に曝されている間、圧力対時間のプロファイルが、爆発圧力源に対する軸上に配置された圧電センサ（モデル１３７Ａ２２  Ｆｒｅｅ−Ｆｉｅｌｄ  ＩＣＰ  Ｂｌａｓｔ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｓｅｎｏｒ，  ＰＣＢ  Ｐｉｅｚｏｔｒｏｎｉｃｓ）を用いて測定されるであろう。１つのセンサー（モデル１０２２Ａ０６  ＩＣＰ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｓｅｎｓｏｒ，  ＰＣＢ  Ｐｉｅｚｏｔｒｏｎｉｃｓ）を、発生させた圧力波に対して垂直に配置される内側ねじ付きチューブ管に設置し、発生させた圧力時間プロファイルについても測定するであろう。携帯アナログ−デジタルデータ取得システム（モデルＤＡＳＨ  ８ＨＦ、Ａｓｔｒｏ−Ｍｅｄ  Ｉｎｃ．）は、全ての圧力トランスデューサーから１チャンネルあたり２５０ｋＨｚでデータを収集する。
【０１１７】
爆発に曝される前に、２匹のマウスにケタミン／キシラジン溶液で麻酔をかけた。麻酔下の間、マウスを計量し、その後、爆発に対する生理学的な反応を収集するために、後ろの右脚を、電気カミソリを用いた後直線縁のカミソリで毛をそった。麻酔をかけた動物を温熱パッドの上に置いた。ＭｏｕｓｅＯｘ生理学的モニタリングシステムに接続された腿用クリップセンサーが毛をそった後の脚に配置された。マウスを麻酔薬の注入後２０分間モニターし、その後、カスタムメイド制止ハーネス（図１）に配置し、身体全体を爆発に曝した。
【０１１８】
爆発に曝された後、動物を移動させ、温熱パッドに戻し、１時間の評価期間の間モニタリングするために、腿用クリップを再度適用した。ＭｏｕｓｅＯｘシステムは、いくつかの生理学的なパラメータ、例えば、心拍数、呼吸数、酸素飽和度、パルス膨張、呼吸膨張を収集するために用いられた。爆発の１０分以内に、尾静脈を介して静脈内に治療薬（合成血小板、５０ｕｌの２０ｍｇ／ｍｌ乳酸リンゲル溶液；ナノ粒子対照、ＧＲＡＤＳＰ粒子、５０ｕｌの２０ｍｇ／ｍｌ乳酸リンゲル溶液；ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ、５０ｕｌ；乳酸リンゲル、５０ｕｌ；または治療なし）が投与された。
【０１１９】
１時間の評価期間の前に動物が死亡した場合には、組織学的分析のために組織を素早く収集した。１時間の評価期間動物が生存していた場合、ケタミン／キシラジンを過剰に投与し、後述のように４％パラホルムアルデヒドを灌流し、その後、組織学的分析のために組織を収集した。急性期における生存性が長期の生存性と相互に関連があるかどうかを測定するために、および合成血小板またはナノ粒子対照の投与と関連付けられた合併症があるかどうかをみるために、動物の小さな同齢集団は負傷後３週間まで生存することができた。
【０１２０】
爆傷を行う者および治療薬を投与する者は、治療の知識はなく、死亡も、治療の知識のない者により別個に記録された。注入しない群（ｎ＝３）を参照として含めたが、統計には含めなかった。生存性をオッズ比（ＳＡＳ）間のカイ二乗検定で二項分布ロジスティック回帰を用いて分析した。
【０１２１】
合成血小板または制御が投与され得る前に、マウスの爆発モデルを検証しなければならなかった。致死率の研究を、１５ＰＳＩの爆発の暴露に、動物を曝すことにより開始した。この群からの全てのマウスは１時間の評価期間中生存した。このようにして、過剰な圧力を増加させ、マウスの第２の群を２０ＰＳＩの圧力に曝した。このレベルでは、４０％の致死率を測定した。動物の第３の群を２５ＰＳＩの過剰な圧力に曝すと、動物の９０％が爆発に曝された後の最初の１時間以内に死亡したことがわかった。
【０１２２】
生理学的なパラメータは、健康状態の低下を示す、より高い圧力に曝された動物に関する一貫性を示した。２５ＰＳＩの過剰な圧力に曝されたマウスは、全ての他の群と比較して、最も低いレベルの酸素飽和度を有することがわかった。
【０１２３】
肺の傷の大きさは、肺のうちエオシンのみで染色された部分を用いて定量化された。肺部分のそれぞれにおける３つの関心領域（ＲＯＩ）を撮像した。エオシンは、正帯電性の組織を染色する負帯電性の分子である。特に、赤血球を周辺組織と容易に見分けることができる特有の明赤色に染色し、肺における大量出血の程度を明らかにする簡易な手段を提供する。
【０１２４】
これらの３つのエオシンの画像は、白黒に変換されて、光学濃度の読取り値を、肺組織における大量出血のレベルを測定するために収集する。損傷領域のパーセンテージが算出された後、有意性が測定され、平均±ＳＥＭとして報告された。特に、２０ｐｓｉで肺の傷における有意な増加がある。この観察は、生理学的な発見並びに爆発モデルの致死率と十分に相互に関連があり、このことに基づいて、２０ｐｓｉの過剰な圧力が、爆発の傷の後に生存しているものの合成血小板の効果を試験するのに適切であろうということを決定した。
【０１２５】
分析
２０ｐｓｉに対する暴露の１時間後に、生存した動物を、経心的に生理的食塩水（０．９％塩化ナトリウム）を灌流した後４％ホルムアルデヒドを含む固定剤溶液により殺処分した。全ての主要な臓器（肺、脳、腎臓、肝臓、ＧＩ）を収集し、１５％スクロースを含む固定剤溶液中に保存した。４８時間後、肺をＯＣＴ包埋剤中に置き、ドライアイスでの凍結を可能とした。サンプルをその後切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、並びに「エオシンのみ」で染色した。エオシンのみの部分は、肺の傷を定量化するために用いられた。肺組織部分のそれぞれにおける３つの関心領域（ＲＯＩ）について撮像した。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて、画像をグレースケールに変換し、肺組織における大量出血のレベルを測定するために、光学濃度読取り値を収集した。図１は、どのように各部分が分析されたのかについての一例を示す。損傷領域のパーセンテージが算出された後、有意性が測定され、平均±ＳＤとして報告された。組織学的統計分析を、ｐ＜０．０５で有意差ありとする事後ＬＳＤ検定（ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ＬＳＤ  ｔｅｓｔ）に続いて２元配置分散分析（ｔｗｏ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）により算出した。
【０１２６】
肝臓、腎臓、脾臓、肺、および脳を生体内分布分析のために回収し、凍結乾燥した。臓器全体の乾燥重量を記録して、１００〜２００ｍｇの乾燥組織をホモジナイズし（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ２４）、アセトニトリル中にて３７Ｃで一晩インキュベートした。これは、組織に存在するいかなる合成血小板をも溶解し、有機溶剤溶液におけるＣ６を残した。その後、チューブを１５，０００ｇで１０分間遠心分離して固体成分を取り除き、上清をＨＰＬＣで試験した。移動相は８０％のアセトニトリルおよび２０％水溶液（８％酢酸）であった。固定相はＷａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８  Ｃｏｌｕｍｎ、１００Å、５μｍ、３．９ｍｍ×１５０ｍｍであった。蛍光検出器（４５０／４９０ｎｍ  ｅｘ／ｅｍ）上の過飽和にしたサンプルを希釈し、再度流した。公知のＣ６の充填および粒子の注入量に基づき、データを注入した粒子の％として表した。
【０１２７】
スプラーグドーリーラットの血液を用い、生理的食塩水、ＧＲＧＤＳが結合した合成血小板、またはナノ粒子対照の、ＧＲＡＤＳＰが結合したナノ粒子のいずれかの存在下でＲＯＴＥＭ’ｓ  ＮＡＴＥＭ試験を用いて凝固分析を行った。血液収集方法（心臓穿刺術）には、高感度なＮＡＴＥＭ試験で変動性を最小限にするために厳密に追従した。全ての動物の処置は、Ｃａｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物管理使用委員会（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により設定されたガイドラインに従って承認され、着手された。
【０１２８】
５ｍｌのシリンジに、１×ＰＢＳで調製した３．８％クエン酸ニナトトリウム０．５ｍｌを充填した。ケタミン：キシラジンのげっ歯類用混合液（９０：１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）でラットに麻酔をかけ、心拍を触診した。その後、出血（ｆｌａｓｈ）が生じるまで、吸引しながら針をゆっくりと進めた。４．５ｍｌの血液を採取し、１：９（溶液：血液）の割合で抗凝固剤溶液で混合した。所与の処理（ｇｉｖｅｎ  ｒｕｎ）のために、一杯の血液は、３００μｌのクエン酸塩添加血液、２０μｌｓｔａｒＴＥＭ試薬（０．２ｍＭ塩化カルシウム）、２０μｌの合成血小板（１．２５または２．５ｍｇ／ｍｌ）、からなる、合計３４０μｌのサンプルであった。凝固試験の時間依存性を明らかにするために、実験設計は、１回（ｓｉｎｇｌｅ）約１．２ｃｃの一定量の血液で、４つのＮＡＴＥＭ試験のブロックが同時に行われるように作成され、生理的食塩水は４つの試験のうちの１つに常に含まれて、直接比較が可能となるようにした。分析された主な結果は、凝固時間、血餅形成時間、およびＲＯＴＥＭにより定義される最大血餅硬度であった。生データを、一般化線形モデルを用いて、ブロックとしての実行時間および群間のＴｕｋｅｙ比較にて分析した。考慮された主な結果は、標準ＲＯＴＥＭパラメーター凝固時間（ＣＴ）、血餅形成時間（ＣＦＴ）、２つの合計（ＣＴ＋ＣＦＴ）、および最大血餅硬度（ＭＣＦ）を含む。ＣＴは、分析のスタートから最初の血餅が検出されるまで（厚さ＝２ｍｍ）の時間として定義される。ＣＦＴは、最初の血餅（厚さ＝２ｍｍ）と２０ｍｍの血餅厚さが検出されるまでの間の時間として定義される。ＭＣＦは、血餅が試験の継続時間中に達する最大の厚さ（ｍｍで）として定義される。
【０１２９】
結果
２０ｐｓｉの爆発に曝されて合成血小板を投与された２１の動物のこれらの結果においては、唯一１匹の動物が１時間の時点になる前に死亡した。この結果は、注入しない制御群よりも有意によりよいものである。生存したものをオッズ比（ＳＡＳ）間のカイ二乗検定で二項分布ロジスティック回帰を用いて分析した。合成血小板対非注入のオッズ比は、１．２４〜１４３の９５％の信頼区間で１３．３である。
【０１３０】
合成血小板の初期の研究では、非生存モデルを使用した。この研究では、動物は、ナノ粒子制御群および合成血小板群ともに爆発後３週間まで維持された（１群あたりｎ＝７）。合成血小板３週間の群における１匹の動物のみが１時間経過後に死亡し、その死には、喘ぎ呼吸、発作の徴候または閉塞された血管の他の徴候のような、粒子の投与由来の合併症の徴候はみられなかった。さらに、その動物は弱り、負傷後１日で安楽死させた。ナノ粒子制御群の２匹の動物は、３週間の時点まで生存しなかった。
【０１３１】
対照群および治療群における予備的な組織学的分析では、活性状態の合成血小板治療群は、肺の傷のレベルが低かったことを証明した。２０μｇ／ｍｌ濃度は、大量出血のための現行の臨床治療法であるＮｏｖｏＳｅｖｅｎおよびかき混ぜた血小板と比較して、傷の減少したレベルをもたらした。肺の傷データの傾向は、合成血小板群でみられた生存性の増加に関連する傷（赤血球）の減少を伴う生存データと十分に相互に関連がある。
【０１３２】
爆発後１時間での合成血小板およびナノ粒子制御の生体内分布（ｎ＝３）は、粒子が、肺、脾臓、および肝臓における最も大きなパーセンテージで組織全体にわたっていることを示す。ナノ粒子対照群では、それぞれ肺の約１０％である。合成血小板群では、より低いパーセンテージであったが、この研究のｎ数は低いままであり、研究は継続しているので、少ない量で継続しているかどうか、または対照と数をより一致させているかどうかをみるのは興味深いであろう。偽物（非爆発）マウスにおける合成血小板またはナノ粒子対照の生体内分布は、互いに類似している。
【０１３３】
血液単体または生理的食塩水（ｎ＝２）と比較して、凝固時間プラス血餅形成時間が合成血小板で減少した。この研究に用いた投与量は、爆発モデルで使用した２０ｍｇ／ｍｌと十分に相互に関係がある１．２５ｍｇ／ｍｌであった。生理的食塩水の追加は、血液のみの制御と比較して、実際に凝固時間を減少させたようであり、この追加は凝固段階を活性化させることを示唆するが、ｎは低く、研究をさらに検証しなければならない（ｎ＝２で、この日付に関し、ｐ＝０．４）。
【０１３４】
せん断弾性強度（ｓｈｅａｒ  ｍｏｄｕｌｕｓ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）は、血液のみの血餅のせん断弾性強度（ｐ＝０．７６）を再現しているようである。ナノ粒子対照は、せん断弾性強度を減少させるようであり、不活性状態のペプチドナノ粒子は、血餅形成を中断させるかもしれないことを示唆し、そのことは、ナノ粒子対照でわずかに増加した致死率を説明し得た。
【０１３５】
この研究に関する発見に基づき、大きな動物（ブタ）の肝臓の傷についての研究が開始された。予備的なデータは、合成血小板が大きな動物モデルにおける失血を減らし、ブタへの投薬量が予想よりもはるかに低くなる（３ｍｇ／ブタ１匹と同じくらいの低さ）ことを示唆する。ラットに関しては、トリブロックの最適な投薬量は２０ｍｇ／ｍｌ（０．５ｍｌの合成血小板注入）であった。クワドブロックバージョンでは、２．５ｍｇ／ｍｌ（０．５ｍｌ投与）であった。
（実施例１４）
【０１３６】
活性化血小板を標的とする止血剤ナノ粒子の静脈内投与は、いくつかの展望とさまざまな課題を有する多くのグループにより調査された。血栓赤血球とよばれる赤血球（ＲＢＣ）に結合したＲＧＤは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで展望を示したが、血小板減少性の霊長類における持続出血時間は有意には減少しなかった。フィブリノーゲンγ鎖ドデカペプチド（ＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ）を担持する、他者により使用されたフィブリノーゲンでコーティングされたアルブミン微粒子、「Ｓｙｎｔｈｏｃｙｔｅ」およびリポソームは、血小板減少性のウサギにおける出血モデルにおいて成功を示した。しかしながら、Ｓｙｎｔｈｏｃｙｔｅは、通常のウサギにおける出血の治療においては非有効的であり、リポソームは、まだこの目的のためには研究されていないようである。
【０１３７】
この研究から、いくつかのことは明確である。まず、もし粒子が大きすぎるかまたは免疫原性物質を担持場合、それらは非特異的血栓症を発生させるかもしれない。凝固系はあまりに複雑なので、血小板代替物２１に関して発表された一式のガイドラインにおいて、ＦＤＡにより承認された、潜在的治療法を完全に評価するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究に一致して、機能的に直接的な結果を有する多様な出血モデル（および種）を用いる。血栓形成促進性の潜在性、免疫原性、および付加剤に起因する毒性は安全基準の中にあり、効能基準はｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験の組（ｂａｔｔｅｒｙ）に基づく。
【０１３８】
ナノ粒子の準備
ＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧトリブロックポリマーは、カルボベンゾキシ−保護側アミン側基（Ｓｉｇｍａ  Ｐ４５１０）を有するポリ（Ｅ−ｃｂｚ−Ｌ−リジン）（ＰＬＬ−ｃｂｚ）ＰＬＬおよびＰＬＧＡ（Ｒｅｓｏｍｅｒ  ５０３１１）で開始して、段階的な結合反応を用いて合成された。この結合反応は、ｃｂｚ群に対応する３つのピークサインを調べるために、ＵＶ−Ｖｉｓを用いて確認された。ＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ｃｂｚをＨＢｒで脱保護した後、ＰＬＬ−ＮＨ３上の遊離アミンをＣＤＩ活性化ＰＥＧと５：１のモル過剰量で反応させた。複合化トリブロックコポリマーＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧ（ＣＤＩ活性化ＰＥＧ末端基を有する）を、注入後（１％ｗ／ｗで充填）に粒子を追跡するために用いる蛍光色素であるクマリン−６（Ｃ６）を含むアセトニトリルに２０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。この溶液を、アセトニトリルの２倍の量の撹拌しているＰＢＳに滴状で添加した。水混和性の溶剤が置換された時に、沈殿したナノ粒子を形成する。その後、ナノ粒子は、ＧＲＧＤＳまたは保存的に置換されたＧＲＡＤＳＰペプチドと結合し、１つのステップで３時間撹拌−硬化した。その後、ナノ粒子を後述するコアセルベート沈殿法を用いて収集した。
【０１３９】
ドライポリ（アクリル酸）（ｐＡＡ）（Ｓｉｇｍａ、ＭＷ＝１，８００）のひとかたまりの同等物を、撹拌している粒子懸濁液に添加した。その後、ｐＡＡの１％ｗ／ｖ溶液を、撹拌している懸濁液に、凝集が発生するまで、約１０ｍｌ加えた。５分後、凝集ナノ粒子を遠心分離により収集し、３回洗浄した。ナノ粒子を約１０ｍｌの脱イオン水に再懸濁し、液体窒素中で急速に凍結し、３日間凍結乾燥した。ナノ粒子を２０ｍｇ／ｍｌの濃度にｌ×ＰＢＳで再懸濁し、短時間超音波処理した（ＶＣＸ−１３０、Ｓｏｎｉｃｓ＆Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．）。
【０１４０】
ナノ粒子を、動的光散乱法（９０Ｐｌｕｓ、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｍｏｒａｔｉｏｎ）および走査電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓ４５００）を用いてサイズ分布および多分散性に関する特徴を明らかにした。ＤＬＳデータを、９０Ｐｌｕｓソフトウェアにより算出した有効な直径として表示した。ＳＥＭ画像をＩｍａｇｅＪソフトウェアで分析した。ＰＬＬ、ＰＥＧ、おおびペプチドリガンドの成功した結合を紫外分光法、１Ｈ−ＮＭＲおよびアミノ酸分析ＨＰＬＣ（それぞれＢｉｏＲａｄ、Ｖａｒｉａｎ、およびＳｈｉｍａｄｚｕ）を用いて確認した。トリブロック構造を分析するためにクロロホルムを用いて、ＰＥＧ冠状シェル（ｃｏｒｏｎａｌ  ｓｈｅｌｌ）２７を確認するために重水素化水を用いて、１Ｈ−ＮＭＲを行う。アミノ酸分析を、Ｗ．Ｍ．Ｋｅｃｋ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）により行った。
【０１４１】
凝固分析
スプラーグドーリーラットの血液を用いる凝固分析は、以下のように行われた。
【０１４２】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ肝臓の傷モデル
致命的な傷モデルにおける生存性を増強させるためのナノ粒子の効能を評価するために、肝臓の傷モデルを、Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２８およびＨｏｌｃｏｍｂ  ｅｔ．  ａｌ．  ２９から適用し、以下に記載する。傷モデルは、Ｃａｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物管理使用委員会（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により設定されたガイドラインに従って承認され、着手された。この研究に関して記録された主な結果は、１時間での生存性および予め計量されたガーゼで測定される失血量を含む。
【０１４３】
外科手術用スプラーグドーリーラット（２２５〜２７５ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）は、腹腔内ケタミン：キシラジン（それぞれ９０：１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔をかけた。１０分後、毛をそって背臥位で温熱パッド上に配置した。腹部にアクセスし、携帯焼灼器を用いて、肝臓の中葉の肝上大静脈から半径１．３ｃｍをアーチでマークした。いったんマークすると、尾静脈を露出し、生理的食塩水を流した２４Ｇ×３／４”  Ｅｘｃｅｌ  Ｓａｆｅｌｅｔ  Ｃａｔｈｅｔｅｒでカテーテル挿入をした。その後、肝臓の中葉をマークしたラインに沿って切除し、創傷クリップで腹部を閉じ、カテーテルのデッドボリュームをクリアにするために流す０．２ｃｃの生理的食塩水に続いて、０．５ｃｃの急速投与治療液を即時に投与した。
【０１４４】
ラットは、１時間、または、呼吸と明白な心拍の両方がなくなることにより確認される死に至るまで出血させることとした。失血量を測定する前に、全てのラットはペントバルビタールナトリウムの致命的な投与量を注入された（ｉ．ｖ．）。その後腹部を再度開き、予め計量したガーゼで血液を収集した。これは、通常、発生する出血をさらに引き起こすので、肝臓に対する血餅の付着物を最後に収集した。切除した肝臓を計量し、１０％緩衝ホルマリン溶液で固定した。残りの肝臓、腎臓、脾臓、肺、および付着した血餅を回収し、同様に１０％緩衝ホルマリンで保存した。
【０１４５】
手順と統計
治療は、注入なし（ｎ＝３）、生理的食塩水（ｎ＝１７）、かき混ぜたＮＰ（ｎ＝１５）、および止血ＧＲＧＤＳ−ＮＰ（ｎ＝２０）を含んだ。粒子の治療剤をＰＢＳに２０ｍｇ／ｍｌとなるように再懸濁した。施術者は、治療および全ての失血の測定の知識はなく、死亡は、治療の知識のない第２の者により別個に記録された。注入しない群（ｎ＝３）を参照として含めたが、統計には含めなかった。Ｔｕｋｅｙ比較とともにＡＮＯＶＡを用いて失血データを分析した（Ｍｉｎｉｔａｂ）。生存性をオッズ比（ＳＡＳ）間のカイ二乗検定で二項分布ロジスティック回帰を用いて分析した。予備的な研究に基づくパワー（ｐｏｗｅｒ）解析は、生存性データの有意性に関し、１群あたりｎ＝１５を示した（アルファ＝０．０５、ベータ＝０．２、オッズ比＝３）。
【０１４６】
生体内分布
肝臓、腎臓、脾臓、肺、および付着した血餅を回収し、生体内分布分析のために凍結乾燥した。臓器全体の乾燥重量を記録して、１００〜２００ｍｇの乾燥組織をホモジナイズし（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ２４）、アセトニトリル中にて３７Ｃで一晩インキュベートした。これは、組織に存在するいかなるナノ粒子をも溶解し、有機溶剤溶液におけるＣ６を残した。その後、チューブを１５，０００ｇで１０分間遠心分離して固体成分を取り除き、上清をＨＰＬＣで試験した。移動相は８０％のアセトニトリルおよび２０％水溶性（８％酢酸）であった。蛍光検出（４５０／４９０ｎｍ  ｅｘ／ｅｍ）を用いるとともに、固定相はＷａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８  Ｃｏｌｕｍｎ、１００Ａ、５ｇｍ、３．９ｍｍ×１５０ｍｍであった。粒子における公知のＣ６の充填および注入量に基づき、データを注入した粒子のパーセント（％）として表した。傷の表面を撮像するために、肝臓の切除された部分に付着する血餅を洗浄して、高解像度（１２００ｄｐｉ）フラットベッドスキャナー（Ｃａｎｎｏｎ  ＣａｎｏＳｃａｎ  ＬｉＤＥ  ７００Ｆ）に直接載せ、傷表面を撮像した。肝臓にまだ付着している付着血餅を１０％ホルマリンで固定し、一晩スクロースに浸し、凍結して２０ミクロン厚さの低温切片にした。切片をその後ＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ  ＤＡＰＩで染色して、肝細胞の核を染め、倒立蛍光顕微鏡で撮像した（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ｚ１）。各群あたりいくつかの血餅を１０％ホルマリンで固定し、エタノールを用いて連続ステップで脱水し、走査ＡＣＳ  Ｐａｒａｇｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮像するためにそれらを準備した。その後、これらを無水ヘキサメチルジシラザンで一晩乾燥し、スパッタコートした。サンプルを載置し、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓ４５００電界放射ＳＥＭで、５ｋｘの倍率にて撮像した。
【０１４７】
結果
粒子合成および特徴の明確化  以下のＢｅｒｔｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．  ２２’  ２３’  ３１３のカルボベンゾキシ保護側アミン側基を有するポリ（Ｅ−ｃｂｚ−Ｌ−リジン）ＰＬＬおよびＰＬＧＡ（Ｒｅｓｏｍｅｒ  ５０３Ｈ）で開始して、ＰＬＧＡ−ＰＬＬ−ＰＥＧトリブロックポリマー段階的な結合反応を用いて合成した。このステップの結合有効性は、ＵＶ−ｖｉｓで測定されたＰＬＬ：ＰＬＧＡが約３０〜４０％のモル比である。側基を脱保護した後、ＰＬＬ上の遊離アミンをＣＤＩ活性化ＰＥＧで反応させた。このＰＥＧは、ナノ粒子まわりに親水性シェルを作成し、血液循環でそれらがより長い滞留時間を有することが可能となる。重水素化クロロホルムおよび重水素化水における１１−１−ＮＭＲは、予想される表面ペグ化構造を検証するために行われた。スペクトルから、ペグ化の割合は１：１０（ＰＥＧ：ＰＬＧＡ）モル比であることが算出された。重水素化水では、ＰＥＧのピークは他のピークに対して大幅に大きくなり、水溶液環境で、ナノ粒子のＰＥＧ−コロナ構造を確認する。ナノ粒子コアのサイズおよび分布（ＳＥＭによる）および水溶液環境（ＤＬＳによる）においては、４００ｎｍおよび４２０ｎｍ付近でそれぞれ均一に分散される。ＳＥＭからＤＬＳにかけてのサイズの増加は、ＰＥＧアームにより作成される水和殻により説明され得る。Ｃ６充填の結果として（約５〜１０％）、サイズにおけるわずかな増加がみられ、ＧＲＧＤＳまたは結合したＧＲＡＤＳＰペプチドに基づいたサイズにおける有意な変化はない。
【０１４８】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ傷モデルの開発  中葉の損傷の後に、ラットは、生理的食塩水、かき混ぜた（ＧＲＡＤＳＰ）、または止血剤（ＧＲＧＤＳ−共益）ナノ粒子のいずれかを投与された。液体の投与は出血に影響を与え得るので、生理的食塩水をベースライン対照として用いる。我々の予備的な結果に基づくと、我々は、切除した肝臓の質量および体重は、出血結果と十分に相互に関連し、Ｈｏｌｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．  ２９と同様であるということを発見し、ラットの体重（２２５〜２７５ｇ）および肝臓切除術（体重の０．８〜１．２％）に関する組み入れ基準に厳密に固執することを選んだ。研究の結論では、この組み入れ基準は、体重に基づくラット間の変動性を低減することがわかった。しかしながら、肝臓切除の質量は出血結果と有意に相互に関連があるままであった（ｐ＝０．０００４）。切除した肝臓の質量および治療がＡＮＯＶＡモデルに含まれる場合、治療は出血結果と有意に相互に関連がないままであった（ｐ＝０．１１３）。
【０１４９】
この研究のもっとも重要な部分の１つは、ナノ粒子の投与が鈍的外傷の負傷後の生存性の向上を導いたかどうかを測定することであった。止血剤、ＧＲＧＤＳナノ粒子の投与は、致命的な肝臓負傷後の生存性を有意に向上した。具体的には、ＧＲＧＤＳ−ＮＰは、８０％に生存性のオッズを増加させる。これは、生理的食塩水群における４７％（ｐ＝０．０４０、オッズ比（ＯＲ）＝４．５、９５％  ＣＩ  １．１〜１９．２）およびかき混ぜたＮＰ群の４０％（ｐ＝０．０１９、ＯＲ＝６、９５％  ＣＩ  １．３〜２７．０）と比較する。ＧＲＧＤＳ−ＮＰの投与は、この致命的負傷からの生存性の機会をほぼ２倍にする。失血  我々の以前の研究２２から、ＧＲＧＤＳ−ＮＰが出血を減らすことがわかっている。この研究では、我々は、実験の最後に体腔の血液を吸収するために使用したガーゼの重量変化を通して失血量を測定した。この方法から、失血のデータを得るが、これまでの研究で認められた良好な解像度は失われる。このモデルで総失血量を測定することは、生存時間の影響によって複雑になる。失血率は、このモデルの生存性についてのよりよい指標となるかもしれないが、傷モデルは、ラットの小さくて閉じた腔で維持されるので、失血を動力学的に測定することはできない。それにもかかわらず、最小の失血を示すＧＲＧＤＳ−ＮＰと生存性とが相互に関連するという失血における傾向がみられた。失血が減少する方向に向かうこの傾向は、統計的には有意ではないが（１３＝０．０５５２）、ＧＲＧＤＳ−ＮＰが出血の緩和を通じて生存性を向上させているということを示唆する。約３５％の血液量のロスが臨界閾値となることも考えられ、それを超えると急速に致死率が増加している。
【０１５０】
傷表面の撮像
我々のＧＲＧＤＳ−ＮＰが傷部位を標的としており、血餅内に蓄積しているということの検証を補助するために、我々は蛍光顕微鏡およびＳＥＭを含むいくつかの方法を用いて傷表面を撮像した。蛍光化合物クマリン−６（Ｃ６）を充填したナノ粒子が、血餅と融合され、傷内に発見される。傷表面は、傷の本質を表すのに役立つフラットベッドスキャナー用いることでも特徴が明らかとなる。モデル開発中の傷の目視観察から、大部分の出血は、中葉の傷を横断する２〜４の主要な血管を通して発生するということは明らかである。
【０１５１】
生体内分布
ＧＲＧＤＳ−ＮＰに関しては、注入投与量の３１．１％が血餅で発見され、これに対しかき混ぜたＮＰ群はたった６．８％である。試験した血餅および組織のナノ粒子の総回収率は、ＧＲＧＤＳ−ＮＰおよびかき混ぜたＮＰ群に関しそれぞれ５３．７％および２９．６％であった；回収されない部分は流れた血に位置されているようであるが、活性化状態にて血餅中に加わってはおらず、または血漿循環に留まっているようである。各群の肺で発見される比較的高いパーセンテージのナノ粒子、２０．８％および２０．６％（それぞれＧＲＧＤＳおよびかき混ぜたもの）があり、低いパーセンテージは試験された他の臓器で発見された（２％未満）。
【０１５２】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  凝固モデル
投与研究は、クエン酸塩添加のラットで、回転式トロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ）を用いて行われた。この分析では、異なる濃度のナノ粒子を含む２０ｉｌｌ量のＰＢＳを、分析を始める直前に３００ｉｌｌ量の血液に添加した。生理的食塩水に加えて、試験したナノ粒子の濃度は、ＧＲＧＤＳおよびかき混ぜたナノ粒子群に関し、０．６２５、１．２５、２．５、５．０、および２０ｍｇ／ｍｌを含んだ。かき混ぜた群における試験された全ての濃度において、ＣＴ＋ＣＦＴは増加し、ＭＣＦは生理的食塩水と比較して減少した。１．２５および２．５ｍｇ／ｍｌの濃度のＧＲＧＤＳ−ＮＰでは、ＭＣＦは増加した。同様に、凝固時間は１．２５ｍｇ／ｍｌおよび５．０ｍｇ／ｍｌの群で減少したが、他は増加した。これは、最適な投与量、血液中で約７３．５〜２９４ｇｇ／ｍ１または２５０ｇの雄のラットに関し５．２〜２０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子で治療した時に、より早くより厚い血餅形成を暗示しており、６８．６ｍｌ／ｋｇ血液量３２と考えられる。
【０１５３】
凝固パラメーターに最も好ましい影響を有するとして、１．２５および２．５ｍｇ／ｍｌ濃度の濃度がさらに調査された。各試験ブロックに関し、対照としての生理的食塩水とともに、乱塊実験方法が用いられた。２．５ｍｇ／ｍｌＧＲＧＤＳ−ＮＰ投与は、生理的食塩水の対照と比較して、有意に凝固時間を減少させ（ｐ＝０．０４３７）、差に有意性はなかったものの（ｎ＝３ラット、各治療投与レベルで３重に測定）、ＭＣＦを増加させる方向に向かう傾向を有した。２．５ｍｇ／ｍｌのＧＲＧＤＳ−ＮＰ投与は生理的食塩水対照と比較して有意に凝固時間を減少させ（ｐ＝０．０４３７）、統計的な有意性はなかったものの、ＭＣＦを増加させる方向に向かう傾向を有した。興味深いことに、かき混ぜたＮＰ群もまた、凝固時間を減少させ、ＭＣＦを増加させるようであったが、その差は生理的食塩水またはＧＲＧＤＳ治療のいずれかと有意に異なるものではなかった。
【０１５４】
止血剤ナノ粒子の投与は、１時間の生存性を増加させた  早期の処置は、外傷後の生存性の可能性を向上するために重要であり、我々は本研究における早期の処置の効果がわかる。試験された全ての群に関し、２０分の空白があり、その後、生存性のオッズが向上すると同時に、約３５％の血量の危機的な失血量、それを下回ると９５％のラットが生存した。
【０１５５】
ほぼ２倍の数のラットが、対照と比較して、止血剤ナノ粒子の投与で１時間生存する。この結果は、統計的に有意であり、臨床上すばらしいことである。これまでに我々は、これらの止血剤ナノ粒子が室温で安定であり、制御された傷モデルにおける出血を減少させるということがわかっていたが、主要な疑問の１つは、この失血の減少が出血の致命的外傷モデルにおける生存性に影響を与えるかどうかであった。肝臓の傷モデルは、最も再現性がありフィールド（ｆｉｅｌｄ）２８’  ２９’  ３３と比較可能なものの１つである。ＧＲＧＤＳ−ＮＰで生存性にほぼ２倍の増加がみられることは、それらが出血を減少させるのみならず、重要な入院前の空白における生存性に影響を与えるレベルでそれを行うことを確認する。
【０１５６】
腎臓、脾臓、および非損傷肝臓で発見されたきわめて少量のナノ粒子を有するかき混ぜたＮＰ群と比較して、付着した肝臓血餅で発見された４．５倍高い量のＧＲＧＤＳ−ＮＰがあり、それらの傷標的性能が確認される。注入されたナノ粒子の約２０％が、治療群に関わらず、肺で発見された。肺血潅流により肺におけるいくらかの基礎レベルのナノ粒子が収集時間に臓器に残ったままであることが予想され、未処理のラットにおける予備的研究により注入した投与量２２のわずか５〜１０％を占めることを予想する。これらの発見は、この傷モデル３４の大きな出血（ｈｅｍｏｎｈａｇｉｃ）の性質に付随して、ナノ粒子が肺における血栓塞栓に蓄積し得たことを示すかもしれない。しかしながら、特に注目される興味深いことは、生存性がむしろ反対の、有害な影響を受けていないと思われることである。よって、これらの血栓は生理的食塩水対照にも存在することを示すことが推論され、いずれの臨床症状３４’  ３５も有しないかもしれない微小塞栓として存在するかもしれない。さらなる研究は、肺における粒子の凝集のリスクを評価すること、および、例えば、肺血潅流、組織の酸素化、または血液ガスレベルをモニタリングすることにより、どの機能の影響をそれらが有し得るのかを測定することを目的とするかもしれない。これらのナノ粒子の静脈内投与容易性は、有害な機能の結果を有することなく、それらの有効な傷標的と結びつき、臨床上のこの療法への転換のよい徴候となる。
【０１５７】
失血の低減に向う傾向は、機能性治療対対照で観察された。しかしながら、ラットにおける外傷モデルにおける血液収集の方法は制限され、感度は最善の状態で中程度である。よって、統計的有意性が分析され得るこの領域での群間に差がないことは驚くべきことではない。このモデルは失血における差に対して鋭い感受性はなく、失血に関するこの傾向は、この研究のキーポイントとなる生存性の結果と十分に相互に関連する。
【０１５８】
凝固時間におけるナノ粒子の効果は、投与量依存性であり、試験した効果的な投与は、１４７μｇ／ｍの血液濃度（粒子質量／血液量）に対する２．５ｍｇ／ｍｌの群であった。ナノ粒子は凝固時間を低減し、血餅硬度を増加させる傾向にあるというｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発見に基づき、生存性を増加させるために、より急速な血餅形成と血餅硬度の増加が、失血量の低減と生存性の増加をもたらしたという仮説が立てられた。
【国際調査報告】
2014528483.tif 000003
2014528483.tif 000004