(57)【要約】  本開示は、リンカーを介してマトリックスに結合されている糖を含む、液体から、糖部分に選択的に結合する物質を分離可能な分離材、このような材料を調製する方法、液体から糖類に選択的に結合する物質を分離する方法、ならびに分離材を含む、液体から糖類に選択的に結合する物質を分離するための装置に関する。
2014531966.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
糖−Ｘ−Ｒ１−（Ｒ２−Ｒ１）ｒ−（Ｒ３−Ｒ１）ｎ−Ｅｎ−Ｆ−マトリックス  （Ｉ）
により表される糖−リンカー−マトリックスを含む分離材であって、
式中、
Ｘが、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２またはＮＲ’を表し、ここで、Ｒ’が、Ｈ、メチルまたは、アセチル（Ａｃ）、トリフルオロアセチル（ＴＦＡ）、トリクロロアセチル、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジル（Ｂｎ）、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルボニル（Ｍｏｚ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、ビニルオキシカルボニル（Ｖｏｃ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、ｐ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）、３、４−ジメトキシベンジル（ＤＭＢ）、ｐ−メトキシフェニル（ＰＭＰ）、トリフェニルメチル（Ｔｒ）、トシル（Ｔｓ）およびノシル（Ｎｓ）を含む群から選択される保護基を表し、
Ｒ１が、互いに独立して、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ１０のアルキルを表し、ここで、該アルキル基は、非置換であっても、またはハロゲン、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、シアノ、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、チオール、アシルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、ハロアルコキシカルボニルアミノもしくはアルキルスルホニルアミノを含む置換基の群から選択される、少なくとも１つの適切な置換基で置換されていてもよく、
Ｒ２が、互いに独立して、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−、−Ｎ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−、またはトリアゾリルを表し、
Ｒ３が、互いに独立して、−Ｏ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−Ｎ＝ＣＨ−または−ＣＨ＝Ｎ−を表し、
ｒが、０または１から１０の整数を表し、
ｎが０または１から６００の整数を表し、
Ｅが、−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ＝、−ＣＨ＝、−ＮＨ−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｎ＝またはトリアゾリルを表し、
Ｆが−ＮＨ−、＝Ｎ−、＝ＣＨ−、−ＣＯ−、−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−、−ＮＨ−ＮＨ−、＝Ｎ−ＮＨ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−またはトリアゾリルを表し、および
ｍが０または１を表す、
分離材。
【請求項２】
Ｘが、Ｏ、ＳまたはＮＲ’を表し、ここで、Ｒ’が水素、メチルまたは適切な保護基を表し、
Ｒ１が、互いに独立して、非置換または置換されたメチル、エチル、ｎ−もしくはイソ−プロピル、ｎ−、イソ、−、ｓｅｃ−もしくはｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−へプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニルまたはｎ−デシルを表し、ここで、置換基がハロゲン、アルキル、アミノ、ヒドロキシまたはチオールを含む置換基の群から選択され、
Ｒ２が、互いに独立して、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−、−Ｎ＝ＣＨ−または−ＣＨ＝Ｎ−を表し、
Ｒ３が、互いに独立して、−Ｏ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−Ｎ＝ＣＨ−または−ＣＨ＝Ｎ−を表し、
ｒが１を表し、
Ｅが、−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−または−Ｓ−を表し、
Ｆが−ＮＨ−、＝Ｎ−、−ＣＯ−、−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−または−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−を表し、および
ｍが１を表す、
請求項１に記載の分離材。
【請求項３】
リンカーが、
−Ｘ（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｓ−ＣＯＮＨ−、
−Ｘ（ＣＨ２）ｓ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｓ−ＣＯＮＨ−、
−Ｘ（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−（Ｏ−Ｃ２Ｈ４）ｌ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−、
−Ｘ（ＣＨ２）ｓ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−（Ｏ−Ｃ２Ｈ４）ｌ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−、
−Ｘ（ＣＨ２）ｓ−ＣＯＮＨ−、
−Ｘ（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｓ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｓ−ＣＯＮＨ−、
−Ｘ（ＣＨ２）ｓ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｓ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｓ−ＣＯＮＨ−、
−Ｘ（ＣＨ２）ｓ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−、
−Ｘ（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−、
−Ｘ（ＣＨ２）ｓ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＮＨ２）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＳＨ）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−、
を含むリンカーの群から選択される、請求項１または２に記載の分離材であって、
ここで、
ＸがＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ２を表し、ならびに
ｓが、互いに独立して１から１０の整数を表し、ならびに
ｌが、１から６００の整数を表す、
分離材。
【請求項４】
マトリックスが、合成ポリマー、ペプチドまたは多糖である、請求項１から３のいずれかに記載の分離材。
【請求項５】
マトリックスが、ポリチレン（ＰＥ）、ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ）、ポリ塩化ビニリデン（ＰＶＤＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリアクリレート、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリアクリルアミド、ポリグリシジルメタクリレート（ＰＧＭＡ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリアミド、ポリアラミド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリアリールエーテルスルホン（ＰＥＡＳ）、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡ）、エチレンビニルアルコール（ＥＶＯＨ）、ポリアミド−イミド、ポリアリールエーテルケトン（ＰＡＥＫ）、ポリブタジエン（ＰＢＤ）、ポリブチレン（ＰＢ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエーテルケトンケトン（ＰＥＫＫ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリイミド、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリメチルペンテン（ＰＭＰ）、ポリ（ｐ−フェニレンエーテル）（ＰＰＥ）、ポリウレタン（ＰＵ）、スチレンアクリロニトリル（ＳＡＮ）、ポリブテン酸、ポリ（４−アリル−安息香酸）、ポリ（グリシジルアクリレート）、ポリグリシジルメタクリレート（ＰＧＭＡ）、ポリ（アリルグリシジルエーテル）、ポリ（ビニルグリシジルエーテル）、ポリ（ビニルグリシジルウレタン）、ポリアリルアミン、ポリビニルアミンおよびこれらのコポリマーを含む群から選択される、親水性および／または疎水性の合成ポリマーから調製される、請求項５に記載の分離材。
【請求項６】
マトリックスが、ポリアクリレート（ＰＡ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）またはポリグリシジルメタクリレート（ＰＧＭＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリアリールエーテルスルホン（ＰＡＥＳ）およびこれらの組み合わせを含む群から選択される、親水性および／または疎水性の合成ポリマーから調製される、請求項４または５に記載の分離材。
【請求項７】
マトリックスが、ビーズ、フラットシート膜または中空繊維膜の形態を有する、請求項４または５に記載の分離材。
【請求項８】
フラットシートまたは中空繊維膜が、リンカーおよび糖とカップリングされる前にガスプラズマにより処理される、請求項７に記載の分離材。
【請求項９】
糖が、別の分子、タンパク質または細胞と結合可能な単糖、二糖、三糖またはオリゴ糖である、請求項１から８のいずれかに記載の分離材。
【請求項１０】
糖が血液型Ａ決定因子および／または血液型Ｂ決定因子である、請求項１０に記載の分離材。
【請求項１１】
液体から、糖類に結合する能力を有する物質を選択的に分離する方法であって、請求項１から１０のいずれかに記載の分離材を使用する、方法。
【請求項１２】
液体が全血または血液製剤である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかに記載の分離材を含む、液体から、前記分離材の糖に対する親和性を有する物質を分離するための、装置。
【請求項１４】
請求項１から１０のいずれかに記載の分離材を調製する方法であって、
（ａ）式（ＩＶ）
Ｆ１−マトリックス    （ＩＶ）
のマトリックス［式中、
Ｆ１が、Ｈ２Ｎ−、Ｎ３−、ＨＯＯＣ−、ＯＨＣ−、ＮＨ２−ＮＨ−、Ｃ≡Ｃ−
またはエポキシを表す］を提供するステップ；
（ｂ）一般式（Ｖ）
糖−Ｘ−Ｒ１−（Ｒ２−Ｒ１）ｒ−Ｙ    （Ｖ）
の糖［式中、
Ｘ、ｒ、Ｒ１およびＲ２は、請求項１または２に定義した通りであり、
Ｙが、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−Ｃ≡Ｃ、−Ｎ３、−ＮＨ−ＮＨ２または−ＯＨを表す］を提供するステップ；ならびに
（ｃ）前記糖と前記マトリックスとをカップリングするステップ、
を含む、方法。
【請求項１５】
（ｂ２）式（ＩＩＩ）
Ｒ３Ａ−Ｒ１−（Ｒ３−Ｒ１）ｎ−Ｅ１    （ＩＩＩ）
の化合物［式中、
Ｒ１、Ｒ３およびｎは請求項１または２に定義した通りであり、
Ｒ３Ａが、ＨＯＯＣ−、Ｈ２Ｎ−、Ｃ≡Ｃ−、Ｎ３−、ＮＨ２−ＮＨ−またはＯＨ−を表し、ならびに
Ｅ１が、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＯＨ、−Ｎ３、−ＮＨ−ＮＨ２または−Ｃ≡Ｃを表す］を提供する、
追加のステップを有し、ステップ（ｃ）において式（ＩＩＩ）の化合物を、まず式（ＩＶ）のマトリックスと結合させ、その後、得られた生成物を式（Ｖ）の糖とカップリングする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｃ）における糖とマトリックスとのカップリングを、溶媒としてメタノールまたはＰＥＧ−２００の存在下で実施する、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンカーを介して糖に結合されるマトリックスを含む、液体から、糖部分に選択的に結合する物質を分離可能な分離材に関する。本発明はさらに、前記分離材を調製する方法、液体から、糖類に選択的に結合する物質を分離する方法、および前記分離材を含む、液体から糖結合物質を分離するための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＰ１１６５１５９Ｂ１は、全血または血漿の処理のためのカラム、血液型Ａおよび血液型Ｂの抗体を全血または血漿から体外除去する方法、糖−リンカー−Ｏ−マトリックス製品、ならびに体外処理の間のカラムにおけるこれらの使用を対象とする。開示された糖は、血液型決定因子Ａまたは血液決定因子Ｂであるが、マトリックスはポリマー材料または多糖、特にアガロースであってよい。リンカーは、芳香族部分、ペプチド、タンパク質または多糖を担持することのできるアルキルである。
【０００３】
ＵＳ７，７００，７４６Ｂ２は、糖を含むろ過材料を開示しており、該糖は、リンカーと結合され、該リンカーはさらにアガロースマトリックスと結合され、該リンカーは、アルキルジアミンまたはアニリルアルキルアルコール誘導体である。
【０００４】
これらの分離材は、例えば血液抗体との結合および除去に優れた特性を示すが、性能の強化を可能にする新しい材料の提供に対する要望が依然としてある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】欧州特許第１１６５１５９号明細書
【特許文献２】米国特許第７，７００，７４６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、液体、好ましくは全血または血液成分、例えば血漿から物質を選択的に分離する、新しい分離剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一実施形態において、材料は、抗Ａ抗体および／または抗Ｂ抗体を全血または血漿から除去するように設計される。
【０００８】
本発明の一態様に従って、糖−リンカー−マトリックスを含む分離材が提供される。該糖はリンカーにグリコシド結合され、リンカーはマトリックスに結びついている。
【０００９】
本発明の一実施形態において、糖は血液型決定因子である。本発明の別の実施形態において、糖は、血液型抗体に対するリガンドである。このような血液型抗体は、抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体である。本発明のさらに別の実施形態において、マトリックスは、合成ポリマー材料、ペプチドまたは多糖である。
【００１０】
本発明の別の態様に従って、本出願に従った分離材を使用して、液体から物質を選択的に分離または除去する方法を提供する。本発明の一実施形態において、液体は全血または血漿である。
【００１１】
本発明のさらに別の態様に従って、液体から物質を選択的に分離、除去または単離する装置を提供し、該装置は本出願に従った分離剤を含む。本発明の一実施形態において、該装置は、全血または血漿から、特定の血液成分を除去するために機能する。本発明の別の実施形態において、このような血液成分は血液型抗体である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ｂは、５０μｍの壁厚を有する、プラズマアミノ官能化中空繊維膜の二光子励起顕微鏡画像を示す。さらに、相対蛍光スペクトルを示す（図１Ａ）。アミノ官能基を、フルオロフォアである４−フルオロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ−Ｆ）と反応させた。画像の面積は、１００μｍ×５０μｍである。スペクトルのｘ軸は幅をμｍで示し、ｙ軸は相対蛍光強度を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、５０μｍの壁厚を有する、プラズマアミノ官能化中空繊維膜の二光子励起顕微鏡画像を示す。さらに、相対蛍光スペクトルを示す（図１Ａ）。アミノ官能基を、フルオロフォアである４−フルオロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ−Ｆ）と反応させた。画像の面積は、１００μｍ×５０μｍである。スペクトルのｘ軸は幅をμｍで示し、ｙ軸は相対蛍光強度を示す。
【図２】図２は、糖（ＴｓＢ＿ＡＮＡ）の量と、式（ＩＩ）に従ったリンカー、６−アミノへキサン酸による初期マトリックスの官能化の量との比率に対する、力価低下（ＩｇＧおよびＩｇＭ）の依存性を示す（さらに実施例２５を参照されたい。）。ｘ軸は、マトリックス上に存在する糖（ＴｓＢ＿ＡＮＡ）の全量［μｍｏｌ／ｇ］／マトリックス上に存在するリンカー（６−ＡＨＳ）の全量［ｍｍｏｌ／ｇ］の比率を％で示す。図２Ａは、１００から３００μｍの平均粒径範囲（直径）を有するマトリックス（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１３５）に関する結果を示す。図２Ｂは、２５から９０μｍの平均粒径範囲（直径）を有するマトリックス（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１４８）に関する結果を示す。見てわかるように、使用されるマトリックスに対する、６−ＡＨＳによるマトリックスの官能化の量に関して、特定の好ましい範囲が存在し、これは、材料に固定された糖の量を増加することによって有意に改善され得るものではない。従って、最適な官能化範囲は、各マトリックスに関して決定することができる。
【図３】図３は、本発明による分離材の合成設計の典型的な例を示す。オキシラン官能基を担持するマトリックスがリンカー基の６−アミノへキサン酸に結合される。官能化されたマトリックスは、官能化糖であるＴｓＢ＿ＡＮＡに結合され、本発明による最終分離材がもたらされる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の一態様は、連結基によってマトリックスに結合された糖を含む材料を提供することである。この糖−リンカー−マトリックスは、一般式（Ｉ）
糖−Ｘ−Ｒ１−（Ｒ２−Ｒ１）ｒ−（Ｒ３−Ｒ１）ｎ−Ｅｍ−Ｆ−マトリックス  （Ｉ）
により表される。
【００１４】
この糖は、糖をマトリックスに連結する隣接基にグリコシド結合される。
【００１５】
本発明の一実施形態において、ｒ、ｎおよびｍはそれぞれ１である。別の実施形態において、ｒおよびｍは１であり、ｎは０である。さらに別の実施形態において、ｒおよびｍは１であり、ｎは２である。さらに別の実施形態において、ｒおよびｍは１であり、ｎは３である。
【００１６】
「リンカー」という表現は、本明細書において使用する場合、一般式（ＩＩ）
−Ｘ−Ｒ１−（Ｒ２−Ｒ１）ｒ−（Ｒ３−Ｒ１）ｎ−Ｅｍ−Ｆ−  （ＩＩ）
により表される、式（Ｉ）の一部を指す。
【００１７】
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２またはＮＲ’を表し、式中Ｒ’はＨ、メチルまたは適切な保護基を表す。
【００１８】
アミンに対する適切な保護基は、アセチル（Ａｃ）、トリフルオロアセチル（ＴＦＡ）、トリクロロアセチル、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジル（Ｂｎ）、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルボニル（Ｍｏｚ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、ビニルオキシカルボニル（Ｖｏｃ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、ｐ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）、３、４−ジメトキシベンジル（ＤＭＢ）、ｐ−メトキシフェニル（ＰＭＰ）、トリフェニルメチル（Ｔｒ）、トシル（Ｔｓ）またはノシル（Ｎｓ）である。
【００１９】
Ｒ１は、互いに独立して、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ１０のアルキル、例えば、メチル、エチル、ｎ−またはイソ−プロピル、ｎ−、イソ、−、ｓｅｃ−またはｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−へプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニルまたはｎ−デシル、好ましくはＣ１−Ｃ６のアルキルを表し、アルキル基は非置換であっても、またはハロゲン、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、シアノ、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、チオール、アシルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、ハロアルコキシカルボニルアミノもしくはアルキルスルホニルアミノを含む置換基の群から選択される、少なくとも１つの適切な置換基で置換されていてもよい。
【００２０】
本発明の一実施形態において、Ｒ１は互いに独立して、式−（ＣＨ２）１−１０−の、直鎖もしくは分岐鎖の非置換アルキルを表す。
【００２１】
本発明の別の実施形態において、Ｒ１の置換基の群は、アミノ、ヒドロキシ、チオールまたは塩素を含む。
【００２２】
本発明のさらに別の実施形態において、Ｒ１は、互いに独立して、置換または非置換のメチル、エチル、１−プロピル、２−プロピル、１−ブチル、２−ブチル、２−メチル−１−プロピル、ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、２−メチル−１−ブチル、３−メチル−１−ブチル、２−エチル−１−プロピル、ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、４−メチル−１−ペンチル、へプチル、２−へプチル、オクチル、２−オクチル、２−エチル−１−ヘキシルを表し、置換基は先に定義した通りである。本発明のさらに別の実施形態において、Ｒ１は、互いに独立して、直鎖の、非置換メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、へプチルまたはオクチルを表す。
【００２３】
Ｒ２は、互いに独立して、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−、−Ｎ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−またはトリアゾリルを表す。
【００２４】
本発明の一実施形態において、Ｒ２は、互いに独立して、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−、−Ｎ＝ＣＨ−または−ＣＨ＝Ｎ−を表す。本発明の一実施形態において、Ｒ２は、互いに独立して、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−、−Ｎ＝ＣＨ−または−ＣＨ＝Ｎ−を表す。本発明の別の実施形態において、Ｒ２は、互いに独立して、−ＣＯ−ＮＨ−または−ＮＨ−ＣＯ−を表す。
【００２５】
Ｒ３は、互いに独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−Ｎ＝ＣＨ−または−ＣＨ＝Ｎ−を表す。
【００２６】
ｒは、０または１から１０の整数を表す。
【００２７】
本発明の一実施形態において、ｒは０または１である。
【００２８】
ｎは０または１から６００の整数を表す。
【００２９】
本発明の一実施形態において、ｎは０または１から５の整数である。本発明の別の実施形態において、ｎは０である。本発明のさらに別の実施形態において、ｎは、５００から６００の整数を表す。
【００３０】
Ｆは−ＮＨ−、＝Ｎ−、＝ＣＨ−、−ＣＯ−、−ＣＨ２−Ｃ（ＯＨ）−、−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（ＯＨ）−、−ＮＨ−ＮＨ−、＝Ｎ−ＮＨ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−またはトリアゾリルを表す。
【００３１】
本発明の一実施形態において、Ｆは、−ＮＨ−、−ＣＯ−または−ＣＨ２−Ｃ（ＯＨ）−を表す。
【００３２】
ｍは０または１を表す。
【００３３】
本発明の一実施形態において、ｍは１である。
【００３４】
Ｅは、−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ＝、−ＣＨ＝、−ＮＨ−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｎ＝またはトリアゾリルを表す。
【００３５】
本発明の一実施形態において、Ｅは、−ＣＯ−または−ＮＨ−を表す。
【００３６】
式（Ｉ）の分離材を、例えば、官能化マトリックスおよび／または糖と、一般式（ＩＩＩ）の化合物
Ｒ３Ａ−Ｒ１−（Ｒ３−Ｒ１）ｎ−Ｅ１  （ＩＩＩ）
（式中、
Ｒ１、Ｒ３およびｎは先に定義した通りであり、
Ｒ３Ａは、ＨＯＯＣ−、Ｈ２Ｎ−、ＨＣ≡Ｃ−、Ｎ３−、ＮＨ２−ＮＨ−またはＯＨ−を表し、
Ｅ１は、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＯＨ、−Ｎ３、−ＮＨ−ＮＨ２または−Ｃ≡ＣＨを表す。）
とをカップリングすることによって調製する。
【００３７】
本発明の一実施形態において、Ｒ３Ａは、ＨＯＯＣ−またはＨ２Ｎ−を表し、Ｅ１は、−ＣＯＯＨまたは−ＮＨ２を表し、ｎは０を表す。
【００３８】
本発明の一実施形態において、Ｅ１は、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯまたは−ＮＨ２を表す。本発明の別の実施形態において、Ｅ１は、−ＮＨ２または−ＣＯＯＨを表す。
【００３９】
Ｒ３ＡおよびＥ１は、同じであっても、または異なっていてもよい。
【００４０】
本発明の一実施形態において、ｎは０であり、式（ＩＩＩ）は一般式（ＩＩＩＡ）
Ｒ３Ａ−Ｒ１−Ｅ１  （ＩＩＩＡ）
（式中、
Ｒ３Ａ、Ｒ１およびＥ１は、先に定義した通りである。）
になる。
【００４１】
本発明の別の実施形態において、式（ＩＩＩＡ）の化合物は、式（ＩＩＩＡ）の少なくとも１つのさらなる化合物と結合することができ、式（ＩＶ）のマトリックスまたは式（Ｖ）の糖と反応させる前は、これらは同じであっても、または異なっていてもよい。得られた化合物もまた一般式（ＩＩＩ）により表すことができ、式中、Ｒ３Ａ、Ｒ１、Ｒ３、ｎおよびＥ１は、先に定義した通りである。本発明の特定の実施形態において、ｎは２から１０の整数である。
【００４２】
本発明の一実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物は、一般式（ＩＶ）のマトリックス
Ｆ１−マトリックス  （ＩＶ）
（式中、
Ｆ１は、Ｈ２Ｎ−、Ｎ３−、ＨＯＯＣ−、ＯＨＣ−、ＮＨ２−ＮＨ−、ＨＣ≡Ｃ−
またはエポキシを表す。）
と反応させる。
【００４３】
本発明の一実施形態において、Ｆ１はＨ２Ｎ−、ＨＯＯＣ−またはエポキシである。さらに別の実施形態において、Ｆ１はＨ２Ｎ−またはエポキシである。
【００４４】
得られた生成物を、その後一般式（Ｖ）を有する糖
糖−Ｘ−Ｒ１−（Ｒ２−Ｒ１）ｒ−Ｙ  （Ｖ）
（式中、
Ｘ、ｒ、Ｒ１およびＲ２は先に定義した通りであり、
Ｙは、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−Ｃ≡ＣＨ、−Ｎ３、−ＮＨ−ＮＨ２または−ＯＨを表す。）
と反応させることができる。
【００４５】
本発明の一実施形態において、Ｙは−ＣＯＯＨまたは−ＮＨ２を表す。
【００４６】
本発明の別の実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物は、まず式（Ｖ）の糖と反応させ、第２ステップにおいて式（ＩＶ）のマトリックスと結合される。
【００４７】
本発明の一実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物は、一般式ＨＯＯＣ−Ｒ−ＣＯＯＨのジカルボン酸、一般式Ｈ２Ｎ−Ｒ−ＮＨ２のジアミンおよび一般式Ｈ２Ｎ−ＣＨＲ−ＣＯＯＨまたはＨ２Ｎ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨのアミノ酸を含む化合物の群から選択され、式中、ｎは１から１０の整数である。
【００４８】
本発明の別の実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物は、２−アミノエタノール、３−アミノプロパノール、４−アミノブタノール、５−アミノペンタノール、６−アミノヘキサノール、７−アミノへプタノール、８−アミノオクタノール、９−アミノノナノール、１０−アミノデカノール、１，２−エチレンジアミン、１，３−プロピレンジアミン、１，４−ブチレンジアミン、１，５−ペンチレンジアミン、１，６−へキシレンジアミン、１，７−へプチレンジアミン、１，８−オクチレンジアミン、１，９−ノニレンジアミン、１，１０−デシレンジアミン、２−アミノエタンチオール、３−アミノプロパンチオール、４−アミノブタンチオール、５−アミノペンタンチオール、６−アミノヘキサンチオール、７−アミノヘプタンチオール、８−アミノオクタンチオール、９−アミノノナンチオール、１０−アミノデカンチオール、２−ヒドロキシエタン酸、３−ヒドロキシプロパン酸、４−ヒドロキシブタン酸、５−ヒドロキシペンタン酸、６−ヒドロキシヘキサン酸、７−ヒドロキシヘプタン酸、８−ヒドロキシノナン酸、９−ヒドロキシデカン酸、２−アミノエタン酸、３−アミノプロパン酸、４−アミノブタン酸、５−アミノペンタン酸、６−アミノへキサン酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノノナン酸、９−アミノシデカン酸、２−チオエタン酸、３−チオシプロパン酸、４−チオブタン酸、５−チオペンタン酸、６−チオヘキサン酸、７−チオヘプタン酸、８−チオノナン酸、９−チオデカン酸、ならびにこれらの分岐鎖異性体およびこれらの不飽和誘導体を含む化合物の群から選択される。
【００４９】
本発明のさらに別の実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物は、２−アミノエタン酸、３−アミノプロパン酸、４−アミノブタン酸、５−アミノペンタン酸、６−アミノへキサン酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノノナン酸および９−アミノデカン酸を含む化合物の群から選択される。本発明のさらに別の実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物は、６−アミノへキサン酸である。
【００５０】
本発明のさらに別の実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物は、１，２−エチレンジアミン、１，３−プロピレンジアミン、１，４−ブチレンジアミン、１，５−ペンチレンジアミン、１，６−へキシレンジアミン、１，７−へプチレンジアミン、１，８−オクチレンジアミン、１，９−ノニレンジアミンおよび１，１０−デシレンジアミンを含む化合物の群から選択される。
【００５１】
本発明のさらに別の実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物は、プロパン二酸（マロン酸）、ブタン二酸（コハク酸）、ペンタン二酸（グルタル酸）、ヘキサン二酸（アジピン酸）、ヘプタン二酸（ピメリン酸）、オクタン二酸（スベリン酸）、ノナン二酸（アゼライン酸）、デカン二酸（セバシン酸）、グルタチオンまたはジカルボキシ−ＰＥＧ（ＤＣ−ＰＥＧ）を含む化合物の群から選択される。本発明の特定の一実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物は、グルタル酸またはアジピン酸から選択される。本発明の別の特定の実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物はグルタチオンである。
【００５２】
本発明の一実施形態において、式（ＩＶ）のマトリックスは、アミノ官能基Ｆ１をこの表面に担持する。式（ＩＩＩ）の化合物のＥ１がカルボキシルである場合、Ｅは、得られた式（Ｉ）の材料においてアミドとなる。または、マトリックスのアミノ官能基は、式（ＩＩＩ）の化合物（式中、Ｅ１はカルボニルである。）と反応し、式（Ｉ）のマトリックス（式中、ＥはイミンまたはＳｃｈｉｆｆ塩基である。）を形成することができる。
【００５３】
本発明の別の実施形態において、最初のマトリックスのアミノ官能基は、アジド官能基であるＦ１に変換され、アジドは式（ＩＩＩ）の化合物の末端アルキンＥ１とのクリックケミストリー反応に適切であり、トリアゾリル基であるＥをもたらす。
【００５４】
本発明のさらなる実施形態において、式（ＩＶ）のマトリックスのＦ１はカルボキシル基であり、このカルボキシル基は式（ＩＩＩ）の化合物のアミン官能基Ｅ１と反応し、アミド基であるＥをもたらす。
【００５５】
またさらなる実施形態において、式（ＩＶ）のマトリックスは、この表面にアルキン部分を担持する。マトリックス表面のアルキン基は、式（ＩＩＩ）の化合物のアジド基Ｅ１による環化付加によって、トリアゾリル基であるＥに変換される。
【００５６】
またさらなる実施形態において、式（ＩＶ）のマトリックスは、この表面にヒドラジン官能基Ｆ１を担持する。ヒドラジン連結は、その後、ヒドラジンと、式（ＩＩＩ）の化合物のカルボキシル官能基Ｅ１との反応により形成される。または、ヒドラジン基は、式（ＩＩＩ）の化合物のＥ１として存在することができ、一方、マトリックスは、この表面にアクセス可能なカルボキシル基を担持する。
【００５７】
さらにある実施形態において、式（ＩＶ）のマトリックスは、この表面にヒドラジン官能基Ｆ１を担持する。ヒドラゾン連結は、その後、ヒドラジンと、式（ＩＩＩ）の化合物のカルボニル官能基Ｅ１との反応により形成される。または、ヒドラジン基は、式（ＩＩＩ）の化合物のＥ１として存在することができ、一方、マトリックスは、この表面にアクセス可能なカルボニル基を担持する。
【００５８】
またさらなる実施形態において、式（ＩＶ）のマトリックスは、この表面にエポキシ官能基Ｆ１を担持する。第２級アミン官能基は、マトリックス上のエポキシ官能基と式（ＩＩＩ）の化合物の第１級アミノ官能基Ｅ１との反応により形成される。
【００５９】
または、式（ＩＶ）のマトリックス上のエポキシ官能基は、Ｅ１のチオール官能基と反応し、チオエーテルであるＥおよび−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−であるＦをもたらすことができる。
【００６０】
【表１】
2014531966.tif 000003
表Ｉ：式（ＩＶ）のマトリックスと式（ＩＩＩ）の化合物とのさまざまな組み合わせの反応スキーム。記号「●」はマトリックスを表す。マトリックスに結合された化合物は、式（ＩＩＩ）もしくは（ＩＩＩＡ）の化合物または前記化合物と式（Ｖ）の糖とのカップリング生成物である。従って、Ｅ１だけを示し、残りの分子は記号「◆」により表す。ここに示した反応は、式（ＩＩＩ）もしくは（ＩＩＩＡ）の化合物またはこれらの糖結合型の間の連結を形成するさまざまな可能性を表す。
【００６１】
本発明の一実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物を使用して、式（ＩＩＩ）の化合物を、まずマトリックス（ＩＶ）その後糖（Ｖ）と連続的にカップリングすること、またはこの逆によって、式（Ｉ）の糖−リンカー−マトリックスを直接合成することができる（表ＩＩ）。
【００６２】
式（ＩＩＩ）の化合物は、少なくとも２つの式（ＩＩＩＡ）の化合物（式中、Ｒ３ＡおよびＥ１は異なり、式（ＩＩＩＡ）の化合物のＲ３Ａと式（ＩＩＩＡ）の別の化合物のＥ１との間の反応を可能にする方法で選択される。）を反応させることによって形成できる。式（ＩＩＩＡ）の化合物は同じであっても、または異なっていてもよい。
【００６３】
本発明の一実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物を形成し、続いて式（ＩＶ）のマトリックスおよび式（Ｖ）の糖に、それぞれ、残りの基Ｒ３Ａおよび残りの基Ｅ１によって結合させる。
【００６４】
本発明の一実施形態において（表ＩＩ）、式（ＩＩＩ）の化合物は、前述のように、第１ステップにおいて、Ｒ３Ａによって式（ＩＶ）の糖に結合され、第２の式（ＩＩＩ）の化合物は、Ｅ１によってマトリックスに結合される。第２ステップにおいて、リンカーは、それぞれの生成物を、残りの末端官能基Ｒ３ＡおよびＥ１によって結合することによって形成される。本発明の特定の一実施形態において、糖に結合された式（ＩＩＩ）の化合物は、マトリックスに結合された式（ＩＩＩ）の化合物と同じであってよい。本発明の別の特定の実施形態において、糖に結合された式（ＩＩＩ）の化合物は、マトリックスに結合された式（ＩＩＩ）の化合物とは異なってもよい。
【００６５】
本発明のさらに別の実施形態において、式（ＩＩＩ）の第１の化合物は糖に結合され、次いで、遊離のＥ１基を有する結合された化合物を、少なくとも１つの追加の式（ＩＩＩ）の化合物に反応させる。得られた分子をその後、式（ＩＶ）のマトリックスと反応させる（表ＩＩ）。例えば、第１の式（ＩＩＩ）の化合物は糖と結合してもよく、得られた化合物は、この遊離の末端にアミン官能基を有する。このアミン官能基は、その後ジカルボン酸と反応し、結合されたジカルボン酸の遊離のカルボキシ官能基を式（ＩＶ）のマトリックスのアミン基に結合させる。
【００６６】
【表２】
2014531966.tif 000004
表ＩＩ：式（Ｉ）の材料に至るためのカップリング戦略の略図。「化合物１」または「化合物２」という用語は、式（ＩＩＩ）の化合物を指す。「化合物１」および「化合物２」は、同じであっても、または異なっていてもよい。「糖」という用語は、式（Ｖ）の糖化合物を指す。「マトリックス」という用語は、式（ＩＶ）のマトリックスを指す。
【００６７】
本発明のさらに別の実施形態において、糖に結合されている式（ＩＩＩ）の化合物は遊離のカルボキシ基を有し、該遊離のカルボキシ基はその後、ジアミンである第２の式（ＩＩＩ）の化合物に結合し、リンカーの伸長をもたらす。残りの遊離のアミノ基はその後、例えば、末端カルボキシ基をもたらすジカルボン酸と反応でき、該末端カルボキシ基はその後、この表面にアミノ基を有するマトリックスに結合することができる。または、遊離のアミノ基は、式（ＩＶ）のマトリックス（式中、Ｆ１はカルボキシまたはエポキシである。）に直接結合することができる。
【００６８】
本発明の別の実施形態において、少なくとも２つの式（ＩＩＩ）の化合物は、引き続いて、式（ＩＶ）のマトリックスに結合し、その後、得られた生成物が糖に結合する（表ＩＩ）。少なくとも２つの式（ＩＩＩ）の化合物は、第１ステップにおいて互いにさらに結合することもでき、その後式（ＩＶ）のマトリックスと連結し、次いで式（Ｖ）の糖と結合する。
【００６９】
さらに別の実施形態において、式（Ｉ）の生成物は、式（ＩＩＩ）の化合物を式（Ｖ）の糖に反応させ、次いで得られた分子を式（ＩＶ）のマトリックスに反応させる、またはこの逆によって形成される（表ＩＩ）。
【００７０】
本発明の別の実施形態において、式（Ｉ）の生成物は、式（Ｖ）の糖を式（ＩＶ）のマトリックスに反応させることによって形成される。カップリングは、糖（Ｖ）の官能基Ｙとマトリックス（ＩＶ）の官能基Ｆ１とを反応させることによって達成される。
【００７１】
本発明の一実施形態において、Ｆ１はアミノ官能基であり、Ｙはカルボキシであり、Ｆとしてアミドをもたらす。別の実施形態において、Ｆ１はアジドであり、Ｙはアルキンであり、Ｆはトリアゾールである。
【００７２】
本発明の一実施形態において、式（Ｉ）の糖−リンカー−マトリックスを含む分離剤を提供し、糖は、
−Ｘ（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｓ−ＣＯＮＨ−、
−Ｘ（ＣＨ２）ｓ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｓ−ＣＯＮＨ−、
−Ｘ（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−（Ｏ−Ｃ２Ｈ４）ｌ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−、
−Ｘ（ＣＨ２）ｓ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−（Ｏ−Ｃ２Ｈ４）ｌ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−、
−Ｘ（ＣＨ２）ｓ−ＣＯＮＨ−、
−Ｘ（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｓ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｓ−ＣＯＮＨ−、
−Ｘ（ＣＨ２）ｓ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｓ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｓ−ＣＯＮＨ−、
−Ｘ（ＣＨ２）ｓ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−、
−Ｘ（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−、
−Ｘ（ＣＨ２）ｓ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＮＨ２）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＳＨ）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−、
（式中、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ２を表し、
ｓは、互いに独立して１から１０の整数を表し、
ｌは、１から６００の整数を表す。）
を含むリンカーの群から選択されるリンカーを介してマトリックスに連結される。
【００７３】
本発明の一実施形態において、ＸはＯまたはＮである。本発明の別の実施形態において、ＸはＯである。
【００７４】
本発明のまたさらなる実施形態において、糖がリンカー、
−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）３−ＣＯＮＨ−
によってマトリックスに連結される、式（Ｉ）の分離剤を提供する。
【００７５】
本発明のまたさらなる実施形態において、糖がリンカー、
−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）４−ＣＯＮＨ−
によってマトリックスに連結される、式（Ｉ）の分離剤を提供する。
【００７６】
本発明のさらに別の実施形態において、糖がリンカー、
−Ｏ−（ＣＨ２）８−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）３−ＣＯＮＨ−
によってマトリックスに連結される、式（Ｉ）の分離剤を提供する。
【００７７】
本発明のさらに別の実施形態において、糖がリンカー、
−Ｏ−（ＣＨ２）８−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）４−ＣＯＮＨ−
によってマトリックスに連結される、式（Ｉ）の分離剤を提供する。
【００７８】
本発明のさらなる実施形態において、糖がリンカー、
−Ｏ−（ＣＨ２）８−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−
によってマトリックスに連結される、式（Ｉ）の分離剤を提供する。
【００７９】
本発明のまたさらなる実施形態において、糖がリンカー、
−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−
によってマトリックスに連結される、式（Ｉ）の分離剤を提供する。
【００８０】
本発明のさらに別の実施形態において、アミノへキサン酸が、オキシラン基を含有するメタクリレートの架橋コポリマーに基づくエポキシド官能化マトリックス、例えば、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１３５または１４８に、水溶液中で上昇ｐＨにおいて結合され、次いで、該ビーズがＮＨＳおよびＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）によりＰＥＧ−２００中で活性化され、活性化ビーズがその後、遊離アミノ官能基を有する式（Ｖ）の糖、例えばＴｓＢ＿ＡＮＡまたはＴｓＢ＿ＡＰと反応する、式（Ｉ）の分離剤を提供する。
【００８１】
本発明の別の実施形態において、式（Ｉ）の分離材に存在する、特定の比の式（Ｖ）の糖対式（ＩＩ）のリンカーを有する分離材を提供する利益を立証することができる。図２Ａおよび２Ｂを見てわかるように、抗体価の低下（ＩｇＧおよびＩｇＭ）は、このような比に基づく最適条件を有し、この最適条件は、ある程度までマトリックスに結合された糖の全量から独立している。１．５ｍｌの血漿を用いた試験（実施例２５）において、中程度の平均粒径を有するＭｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１３５などのビーズに対して、最適条件は、４％から１３％の糖／連結基（μｍｏｌ／ｇマトリックス）の範囲であることが示された。いくらか小さい平均粒径を有するＭｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１４８などのビーズに関して、最適条件は、４％から８％の範囲である。
【００８２】
本発明の一実施形態において、カップリング反応を、カルボキシル官能基とアミン官能基を連結することによって実施する。前記のようなアミド結合の形成を、当業者に公知の任意の手順に従って実施することができる。共通方法としては、カルボン酸のカルボジイミドによる活性化が挙げられ、従ってアミンへのカップリングが容易になる。カルボジイミドを使用するアミドの形成は直接的であるが、対象を複雑にする幾つかの副反応を含む。カルボン酸はカルボジイミドと反応し、鍵となる中間体のＯ−アシル尿素を生成し、該アシル尿素は、活性化脱離基を有するカルボン酸エステルとも称することができる。Ｏ−アシル尿素はその後アミンと反応し、所望のアミドおよび副生成物の尿素を得る。収率を上げ、副反応を減少させるために、多くの場合添加剤が加えられる。これらの物質は、Ｏ−アシル尿素と反応して、反応性が低く、ラセミ化の危険性が低い活性エステルを形成することができる。
【００８３】
適切なカルボジイミドの例としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）が挙げられる。
【００８４】
適切な添加剤の例としては、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）が挙げられる。ＨＯＢｔおよびＨＯＡｔの代替は、エチル２−シアノ−２−（ヒドロキシイミノ）アセテート（商品名Ｏｘｙｍａ  Ｐｕｒｅ）であり、これは爆発性ではなく、ＨＯＢｔとＨＯＡｔとの中間の反応性を有する。
【００８５】
近年の反応スキームはいずれのカルボジイミドもすべて省き、非求核性アニオンのウロニウムまたはホスホニウムの塩（テトラフルオロホスフェートまたはヘキサフルオロホスフェート）、例えば、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＡＴＵ）、Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−１，１，３，３−テトラメチルウラニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）として、活性エステルを導入している。Ｏｘｙｍａ  Ｐｕｒｅのカップリング添加剤の２種のウロニウム型は、ＣＯＭＵおよびＴＯＴＵ試薬としても入手可能である。
【００８６】
本発明の一実施形態において、トリアゾール形成によりカップリング反応を実施する。アルキンアジドヒュスゲン環化付加（ａｌｋｙｎｅ  ａｚｉｄｅ  Ｈｕｉｓｇｅｎ  ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ）としても公知である、アジドおよびアルキンからのトリアゾールの形成は、１，３−環化付加として実施される。
【００８７】
ヒュスゲン１，３−双極性環化付加の有名な変形は、銅（Ｉ）触媒による変形であり、有機アジドおよび末端アルキンが一体となり、唯一の生成物として１，２，３−トリアゾールの１，４−位置異性体がもたらされる。この反応は、銅（Ｉ）触媒アジドアルキン環化付加（ｃｏｐｐｅｒ（Ｉ）−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ａｚｉｄｅ−Ａｌｋｙｎｅ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ）（ＣｕＡＡＣ）と呼ばれる。銅（Ｉ）の市販の供給源、例えば、臭化第一銅またはヨウ化第１銅を使用してこの反応を実施することは可能であるが、該反応は、銅（ＩＩ）（例えば、硫酸銅（ＩＩ））および還元剤（例えば、アスコルビン酸ナトリウム）の混合物を使用して、Ｃｕ（Ｉ）をその場で生成するとさらによく反応する。Ｃｕ（Ｉ）は水性溶媒中で不安定なので、特に、トリス−（ベンジルトリアゾールメチル）アミン（ＴＢＴＡ）を使用する場合、安定化リガンドが反応結果の改善に有効である。該反応は、さまざまな溶媒ならびに水と、アルコール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ｔＢｕＯＨ、ジオキサン、アセトンおよびこれらの混合物とを含む、さまざまな（部分的に）混和性の有機溶媒との混合物中で実施可能である。
【００８８】
さらに、該反応は、銅の代わりにルテニウムにより触媒させることが可能である。ルテニウム触媒１，３−双極性アジドアルキン環化付加（ＲｕＡＡＣ）は、１，５−トリアゾールをもたらす。末端アルキンだけが反応するＣｕＡＡＣとは異なり、ＲｕＡＡＣでは、末端および内部アルキンの両方が反応に参加可能である。
【００８９】
アジド官能基は、標準的手順に従って得ることができる。例えば、アジド官能基は、アミン官能基と、アゾ転移化合物、例えば、トリフルオロメタンスルホニルアジドまたはイミダゾール−１−スルホニルアジドなどとを反応させることによって得ることができる。
【００９０】
または、アジドは、アルキルまたはベンジルの塩化物、臭化物もしくはトシル化物とアジドナトリウムとを、水溶液中で、およびマイクロ波を適用することにより反応させることによって形成可能である。
【００９１】
アルキンは、標準的手順によって得ることができる。近接する二ハロゲン化アルキルまたはハロゲン化ビニルの脱ハロゲン化水素により調製される。金属アセチリドは、第１級ハロゲン化アルキルと結合させることができる。フリッツ・バッテンバーグ・ビーチェル転移（Ｆｒｉｔｓｃｈ−Ｂｕｔｔｅｎｂｅｒｇ−Ｗｉｅｃｈｅｌｌ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）によって、アルキンは臭化ビニルから調製される。アルキンは、アルデヒドからコーリー・フックス反応（Ｃｏｒｅｙ−Ｆｕｃｈｓ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を使用して調製でき、またはアルデヒドもしくはケトンからセイファース・ギルバート増炭反応（Ｓｅｙｆｅｒｔｈ−Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｈｏｍｏｌｏｇａｔｉｏｎ）により調製できる。アルキンジッパー反応において、末端アルキンが、強塩基を用いた処理により内部アルキンから発生する。
【００９２】
本発明の一実施形態において、各反応ステップの反応溶媒は、単一の溶媒または水、アルコール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ｔＢｕＯＨ、アセトン、１，４−ジオキサン、メタノール、ＰＥＧ−２００もしくはこれらの混合物から選択される２以上の溶媒の混合物である。
【００９３】
本発明の一実施形態において、式（ＩＩＩ）のリンカー化合物と式（ＩＶ）のマトリックスとのカップリング反応は、水溶液中で、好ましくは約１０から１３の高ｐＨにおいて実施される。本発明のさらに別の実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物と式（ＩＶ）のマトリックスとの前記カップリングは、ホウ酸塩−ＫＣｌ緩衝液中で実施される。
【００９４】
本発明の一実施形態において、式（Ｖ）の糖と式（ＩＩＩ）の化合物とのカップリングは、メタノールまたはＰＥＧ−２００中で実施され、式（ＩＩＩ）の化合物はさらに式（ＩＶ）のマトリックスに結合され得る。別の実施形態において、前記カップリング反応はＰＥＧ−２００中で実施される。
【００９５】
「糖」という用語は、本発明においてこれ自体または式（Ｖ）の範囲内で使用する場合、単糖類、二糖類、オリゴ糖類または多糖類を指す。本発明に関連して、この用語は、別の分子、タンパク質または細胞に対する生物学的または任意の他の種類の親和性を有する分子またはこれらの誘導体を含有する炭水化物としてさらに定義することができる。本発明の一実施形態において、「糖」という用語は、二糖、三糖、四糖または五糖を指す。
【００９６】
本発明による糖類は、糖タンパク質中のタンパク質、糖脂質の脂質に連結する他の糖類も含んでよい。さらに、本発明による糖類は、酵素的合成により生成でき、化学的合成、組み換え技術、天然源からの単離により生成でき、またはこれらの組み合わせにより生成できる。
【００９７】
本発明の一実施形態において、糖は、単糖、例えば、アラビノース、リキソース、リボース、リブロース、キシロース、キシルロース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、これらそれぞれのウロン酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース、フクロース、デオキシリボース、ラムノースまたはこれらの組み合わせもしくは改変型であってよい。改変は、糖のヒドロキシル基またはｎ−アセチル基の１または複数に存在してよい。さらに、二−、三−、四−および五糖類およびこれより大きいオリゴ糖類は、上記単糖類の組み合わせによって形成でき、リンカーにグリコシド結合された糖は、リンカー部分に対してα−またはβ−配置を有する。
【００９８】
本発明の別の実施形態において、「糖」という用語は、本明細書において単独または式（Ｖ）の範囲内で使用する場合、二糖、例えばスクロース、ラクチュロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、イソマルトースまたはセロビオースである。
【００９９】
本発明のさらに別の実施形態において、「糖」という用語は、本明細書において単独または式（Ｖ）の範囲内で使用する場合、三糖である。三糖類は、２つのグリコシド結合により連結された３つの単糖からなるオリゴ糖類である。二糖類と類似して、各グリコシド結合は、単糖類に内在する任意のヒドロキシル基間に形成され得る。さまざまな結合の組み合わせ（位置化学）および立体化学（アルファ−またはベータ−）が、同じ単糖部分間であっても可能であり、異なる化学的特性および物理的特性を有するジアステレオ異性体である三糖類（ｔｒｉａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）をもたらす。
【０１００】
本発明の一実施形態において、糖は、糖のＧａｌαｌ−３Ｇａｌ型である。本発明の特定の実施形態において、糖は、血液型決定因子である。
【０１０１】
このような糖類の例は、Ｇａｌαｌ−３Ｇａｌ型の糖類であり、特に、血液型決定因子Ａ（α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→２）−［α−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−（１→３）］−Ｄ−Ｇａｌ）およびＢ（α−１−Ｆｕｃ−（１→２）−［α−Ｄ−Ｇａｌ−（１→３）］−Ｄ−Ｇａｌ）を含む。これらの型の糖類は、例えば、移植前または後に、それぞれの血液型抗体を結合するため、従って、患者の血液または血漿中の抗体濃度を低下させる、または血液から前記抗体を単離するために採用できる。
【０１０２】
本発明のさらなる実施形態において、「糖」という用語は、これ自体または式（Ｖ）の範囲内で、毒素、ウイルス、細菌および／または細胞に特異的な炭水化物構造を意味し、任意のこのような材料の除去または単離のための分離材の調製に使用可能である。病原体、毒素、ウイルス、細菌および細胞に特異的なこのような糖類は以前から文献に記載されており、本出願に記載のものに従ったマトリックスに同様に有効に結合させることができる。該分離材を使用し、その後、タンパク質、ペプチド、毒素、ウイルス、細胞および／または細菌を、全血、血漿、培養培地、食品、水または他の材料から精製、単離または除去することができる。
【０１０３】
本発明の別の実施形態において、式（Ｉ）の糖−リンカー−マトリックスは、一般に腫瘍またはがんの抗原と称される、細胞表面の糖脂質および糖タンパク質に由来する炭水化物構造を含み、本発明に従って生成可能である。このような抗原は、例えば、前立腺、乳房、腸または皮膚のがんと関連のある抗体により認識され得る。このような材料を使用して、その後、例えば、このような腫瘍抗原結合抗体を、全血、血漿から、細胞培養培地またはそこから抗体を単離することが必要とされる任意の他の培地から単離することができる。分離材から溶出後、抗体を、前記がん疾患の治療、例えばがんの免疫療法治療に使用することができる。
【０１０４】
適切なマトリックス材料すべてが、本発明による式（Ｉ）の糖−リンカー−マトリックスの作製に適用できる。「マトリックス」という用語は、本明細書において一般にまたは式（Ｖ）の範囲内で使用する場合、合成ポリマー、ペプチドまたは多糖を表すことができる。
【０１０５】
本発明の一実施形態において、「マトリックス」という用語は多糖を表す。適切な多糖類は、例えば、セルロース、ニトロセルース、キトサン、コラーゲン、デンプンおよび架橋多糖ゲル、例えばアガロース、ＳｅｐｈａｄｅｘもしくはＳｅｐｈａｒｏｓｅである。多糖マトリックスの誘導体の調製方法は古くから公知であり、例えば、ＵＳ４，４１１，８３２またはＵＳ３，９４７，３５２に記載されている。
【０１０６】
本発明の別の実施形態において、「マトリックス」という用語はペプチドマトリックスを表し、式（ＩＶ）の官能基Ｆ１が、このようなペプチドマトリックスの必須部分であり得る。ペプチドマトリックスは、例えば、細胞のインビトロ培養および生体材料適用に有用な巨視的膜に自己組織化する、特定のペプチドの能力により生成され得る。このようなペプチドマトリックスの例は、例えば、米国特許第５，６７０，４８３号明細書、同第５，９５５，３４３号明細書、同第６，５４８，６３０号明細書および同第６，８００，４８１号明細書に記載され、これらは、疎水性残基および親水性残基を交互に有する両親媒性ペプチドおよびこれらから得られた巨視的膜に関する。ＵＳ２００５／０１８１９７３には、巨視的膜に形成され得る自己組織化ペプチドも開示されている。
【０１０７】
合成ポリマーマトリックスは、親水性および疎水性の合成ポリマーならびにこれらの組み合わせを含む。該ポリマーは、ポリチレン（ＰＥ）、ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ）、ポリ塩化ビニリデン（ＰＶＤＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリアクリレート、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリアクリルアミド、ポリグリシジルメタクリレート（ＰＧＭＡ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリアミド、ポリアラミド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリアリールエーテルスルホン（ＰＥＡＳ）、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡ）、エチレンビニルアルコール（ＥＶＯＨ）、ポリアミド−イミド、ポリアリールエーテルケトン（ＰＡＥＫ）、ポリブタジエン（ＰＢＤ）、ポリブチレン（ＰＢ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエーテルケトンケトン（ＰＥＫＫ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリイミド、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリメチルペンテン（ＰＭＰ）、ポリ（ｐ−フェニレンエーテル）（ＰＰＥ）、ポリ−ウレタン（ＰＵ）、スチレンアクリロニトリル（ＳＡＮ）、ポリブテン酸、ポリ（４−アリル−安息香酸）、ポリ（グリシジルアクリレート）、ポリグリシジルメタクリレート（ＰＧＭＡ）、ポリ（アリルグリシジルエーテル）、ポリ（ビニルグリシジルエーテル）、ポリ（ビニルグリシジルウレタン）、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、前記ポリマーのコポリマーまたは官能基の導入により修飾されたこれらのポリマーのいずれかを含む群から選択することができる。
【０１０８】
本発明の一実施形態において、合成マトリックスは、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリアクリレート、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリアクリルアミド、ポリグリシジルメタクリレート（ＰＧＭＡ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリアリールエーテルスルホン（ＰＡＥＳ）またはエチレンビニルアセテート（ＥＶＡ）およびこれらの組み合わせから選択されるポリマーを含む。
【０１０９】
本発明の別の実施形態において、合成マトリックスは、ポリアクリレート、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）またはポリグリシジルメタクリレート（ＰＧＭＡ）から選択されるポリマーを含む。
【０１１０】
本発明のさらに別の実施形態において、合成マトリックスは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリアリールエーテルスルホン（ＰＡＥＳ）およびこれらの組み合わせから選択されるポリマーを含む。
【０１１１】
本発明の一態様に従って、マトリックスこれ自体の合成材料は、特異的官能基Ｆ１を担持し、該官能基Ｆ１は、式（ＩＩＩ）の分子とのカップリングに必要である。例えば、多くの官能化ビーズは市販されており、当業者には公知である。
【０１１２】
別の実施形態において、ポリマー材料は、分子とマトリックスとのカップリングに適切な官能基を欠いている。これは、フラットシートまたは中空繊維膜に関して特に真実である。このような場合、ポリマー官能化ステップが必要である。例えば、アルカン鎖、例えばポリエチレンなどからなる合成材料は、分子とのカップリングに適切な官能基を含まない。従って、適切な官能基が、ポリマー合成後に化学的に導入されなければならない。ポリマー修飾の可能性は、公知の方法であるプラズマ官能化であり、これは、適切なガスプラズマを選択することにより、官能基をポリマーに導入させる。この方法は、例えば、アンモニアプラズマの使用を含み、アミノ官能基が、処理されたポリマー表面に形成される。従って、例えば、ポリエチレンをアンモニアプラズマにより処理することにより、一定量のアミノ官能基を担持するポリエチレンマトリックスがもたらされる。これらのアミノ基は、後でリンカーの適切な官能基、例えばカルボキシル基と反応可能である。または、マトリックスポリマーはプラズマ活性化により官能化され、カルボン酸基を得ることができる。
【０１１３】
連続的に半透過性中空繊維膜を官能化する方法が、例えばＵＳ２００７／０２９６１０５Ａ１に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。半透過性中空繊維膜は、多くても３００ｍｂａｒの圧力を有する第１の真空密閉チャンバー、前駆体ガス導入前に多くとも０．０５ｍｂａｒの圧力を有する真空密閉プラズマ点火チャンバーおよび多くとも３００ｍｂａｒの圧力を有する最終真空密閉チャンバーならびに任意の前記チャンバーの間に配置された、任意のさらなる真空密閉チャンバーを含み、すべてのチャンバーが連続的に順次連結された真空系を介して供給される。半透過性中空繊維膜基材が、官能基を含有する前駆体ガスが導入され、中にあるすべての残気が置き換えられた真空密閉プラズマ点火チャンバーに到達すると、半透過性中空繊維膜基材はプラズマ点火に供され、前駆体ガス中の前記官能基は、位置選択的および均一にろ液側、即ち膜外層および半透過性中空繊維膜基材の細孔表面の少なくとも一部に結合される。
【０１１４】
前記方法において、前駆体ガスより導入される、含まれる官能基は、アミノ、カルボキシル、アルデヒド、エステル、エポキシ、ヒドロキシルまたはスルホン酸の基であってよい。
【０１１５】
前駆体ガスは、ジアミノシクロヘキサン（ＤＡＣＨ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）またはアンモニアであってよい。最終的に、ヘリウム、窒素、アルゴン、水素またはこれらの混合物などのキャリアガスは、これらのプラズマ点火チャンバーへの添加前またはこれらの添加と関連して前駆体ガスと混合される。
【０１１６】
前記方法において、真空密閉チャンバー中の圧力は、５から３００ｍｂａｒ、好ましくは０．０３から５ｍｂａｒであり、真空密閉プラズマ点火チャンバー中の圧力は、前駆体ガス導入前に０．０００１から０．０５ｍｂａｒである。前駆体ガスの導入後、真空密閉プラズマ点火チャンバーの圧力は、０．００５から１０ｍｂａｒ、好ましくは１．３ｍｂａｒである。
【０１１７】
前記方法の一実施形態において、プラズマ点火の間の点火周波数は、１ｋＨｚから１３．５６ＭＨｚまたは１３．５６ＭＨｚの倍数またはマイクロ波周波数である。出力は５０から１４０Ｗおよび電極の電圧は５０−５００Ｖである。
【０１１８】
本方法は、１０から２０μｍｏｌアミノ官能基／ｇ中空繊維膜の密度を可能にする。
【０１１９】
本発明の別の実施形態において、例えばビーズの形態の、エポキシ基を担持するポリマーをアンモニアで処理し、リンカーを前記ポリマーマトリックスにカップリングするためのアミノ官能基が得られる。本発明のまたさらなる実施形態において、エポキシ基を担持するポリマーは、リンカーに直接結合され、リンカーは少なくとも１つの求核性官能基、例えばアジドまたはアミノ部分を担持する。
【０１２０】
式（ＩＶ）のマトリックスは、ビーズ、フラットシート膜、中空繊維膜の形態または１つの装置中で異なる形状の組み合わせで使用可能である。
【０１２１】
適切なビーズは、例えば、当業者に公知の市販の樹脂である。本発明の一実施形態において、Ｔｏｓｏｈ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＡＦ  ＡｍｉｎｏまたはＥｐｏｘｙ６５０−Ｍが使用可能である。Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）は、高い機械的安定性および化学的安定性を組み込んだメタクリル系ポリマーである。Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＡＦ−Ｅｐｏｘｙ６５０−Ｍは、アフィニティクロマトグラフィー用の活性化支持体樹脂であり、８００μｍｏｌ／ｇのエポキシド官能化を有する。この製品は、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＨＷ−６５の高密度エポキシ官能化により調製される。この材料は、低分子量種がマトリックスに結合される場合に特に有用である。粒径分布は、４０から９０μｍの間である。別の適切なマトリックスはＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＡＦ−Ａｍｉｎｏ６５０−Ｍであり、これは、アフィニティクロマトグラフィー用の反応性支持体樹脂であり、１００μｍｏｌ／ｍＬのアミノ官能基を有する。この製品は、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＨＷ−６５上にアミノ基を導入することによって調製される。アミノ活性化材料は、カルボキシル基またはホルミル基を有するリガンドを固定することができる。別の市販のマトリックスは、１００μｍｏｌ／ｍＬのカルボン酸官能基を有する、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＡＦ−Ｃａｒｂｏｘｙ６５０Ｍである。
【０１２２】
別の市販のマトリックス材料は、ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ  Ｉｍｍｏｂｅａｄ（商標）３５０である。このビーズは、１００μｍｏｌ／ｇのオキシラン基を担持する、メタクリレートの架橋コポリマーであり、オキシラン基は、さまざまな酵素の共有結合固定化に適切である。多孔質ビーズは低拡散限界を有するように特に設計され、低拡散限界は、高い特異的活性で酵素の固定が可能である。粒径分布は３００から７００μｍの間である。
【０１２３】
さらなる市販のマトリックス材料は、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１３５である。該マトリックスは、１６６μｍｏｌ／ｇのオキシラン基を含有する、メタクリレートの架橋コポリマーである。中央細孔径は４０から６０ｎｍの間であり、一方、粒径範囲は１００から３００μｍ、平均約２１０μｍまたは製品によって２００から５００μｍであり得る。本発明の一実施形態において、使用するマトリックスは、平均粒径範囲１００−３００μｍを有する。別の市販のマトリックス材料は、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１４８であり、これはＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１３５に対応するが、径がより小さい。ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１４８の平均粒径は約６０μｍである。本発明の一態様において、マトリックス粒子の平均径は５０μｍから約２００μｍの範囲である。
【０１２４】
本発明の一態様に従って、式（Ｖ）の糖類は、式（ＩＩ）のリンカーを介して血漿分離膜の外表面に固定される。血漿分離に適切な膜は、当分野において公知であり、例えばＥＰ１８７５９５６Ａ１またはＥＰ１８７５９５７Ａ１に記載されており、すべて参照により本明細書に組み込まれる。本発明による製品を調製するために有効に使用可能な血漿分離膜は、非対称血漿分離膜であり、これは全領域の血漿タンパク質およびリポタンパク質に対して高い透過性を示し、高い篩係数である＞０．９０により反映される。血漿分離において、分離された血漿分画中に全血漿タンパク質を有し、しかし一方、血液細胞および細胞残屑などの血液のより大きな血球成分が膜に保有されることが望ましい。さらに、このような血漿分離膜は、膜の高い表面多孔性および全孔隙率を示し、高いろ過性能を達成しなければならない。さらに、このような血漿分離膜は、親水性の、自発的湿潤性膜構造、長期安定ろ過のための低汚染性および低タンパク質吸着により特徴付けられるべきである。このような血漿分離膜は、血液と接触する滑らかな表面を有し、従って、血液処理中の溶血を回避する、または最小にすることが好ましい。該膜は、処理期間全体にわたって、一定の篩特性およびろ過挙動を示さなくてはならない。該膜は、高い生体適合性、低いまたは全く無い補体活性化および低い血栓形成をさらに示さなければならない。
【０１２５】
さらに、中空繊維膜は、１００から５００μｍの範囲の内径を有することが好ましい。内径の狭さは、高すぎる壁せん断速度をもたらし、繊維内の圧力降下が増すので、内径の狭さは不利である。他方では、内径が広すぎた場合、この場合は低すぎるせん断速度をもたらし、低すぎるせん断速度は、低い膜間圧において溶血の危険性が増す。本発明に有利に使用可能な血漿分離膜は、２０から１５０μｍの範囲の壁厚を有する。より低い壁厚は作製の間および血漿分離モジュールこれ自体におけるこの使用の間に繊維の機械的特性が低下するため不利である。より高い壁厚は、転相工程の実施に時間間隔の増加を必要とし、不安定な工程条件および不安定な膜をもたらすので不利である。さらに、膜は、０．１から１μｍの範囲の選択的分離層の細孔径を有さなければならない。より小さい平均細孔径は、多孔質構造の全血漿タンパク質の通過が不完全であるため不利である。
【０１２６】
本発明の別の実施形態において、糖類をカップリングさせるためのマトリックスとして機能できる中空繊維膜は、当分野において公知の血液透析、血液ろ過または血液透析ろ過用途の膜である。本発明においてマトリックスとして機能できる中空繊維膜は、ＥＰ２１１３２９８Ａ１、ＥＰ２２８１６２５Ａ１またはＥＰ２２２８１２６Ａ１に記載されており、すべてが参照により本明細書に組み込まれる。本発明の一実施形態において、膜は、ポリスルホンまたはポリエーテルスルホンおよびこれらと低分子量および／または高分子量のポリビニルピロリドンとのブレンドに基づく。これらの一実施形態において、１００ｋＤａより低い分子量を有する低分子量成分および１００ｋＤａ以上の分子量を有する高分子量成分からなるポリビニルピロリドンが使用可能である。
【０１２７】
本発明の一実施形態において、概して血液接触層である、本発明によるプラズマ処理または限外ろ過の中空繊維膜マトリックスの内層または内腔は、本発明による糖により官能化されない。糖は、リンカーを介して中空繊維の外層に結合され、場合により、内層と外層を連結する層の少なくとも一部、即ち膜の細孔にさらに結合される。従って、糖による官能化は、外部ろ液層のみ、および場合により膜の外層と内層を連結する細孔表面構造の少なくとも一部に存在する。このような配置は、例えば血液型抗体の全血からの除去に適用でき、血漿だけが内層から外層へ通過でき、一方血液タンパク質は膜の内腔側に残存する。血漿は、外層へ拡散または移動するので、血漿に含有される抗体は、特異的マトリックスにより支持された抗原により結合される。
【０１２８】
血液精製用途において、膜上に存在する活性化部位またはリガンドは、特定の血液構成要素、例えば血小板を活性化することができる。他の血液構成要素、例えば、白血球、赤血球およびタンパク質は、膜の血液側のこのようなリガンドまたは活性化部位に、ある程度付着され得る。本発明による官能化膜を使用した場合、血小板、白血球、赤血球およびタンパク質が膜上の活性化部位に接触しないので、これらの望ましくない反応は有意に低下または回避される。
【０１２９】
本発明の別の態様は、本発明に従って官能化された膜を含む、拡散および／または分離および／またはろ過装置である。このような装置の例は、透析装置、血液ろ過装置および限外ろ過装置である。このような装置は概して、管状部分品および端末キャップを含むハウジングからなる。中空繊維膜の束は通常、密閉材が、繊維の空洞により形成される第１流入空間と外側で膜を囲む第２流入空間の間に提供される方法で、ケーシング中に配列される。このような装置の例は、ＥＰ０８４４０１５Ａ２、ＥＰ０３０５６８７Ａ１およびＷＯ０１／６０４７７Ａ２に開示されており、すべてが参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３０】
本発明の別の実施形態において、分離材は、官能化ビーズを含む。該ビーズは、管状部分品および端末キャップを含むハウジングからなるカラムに梱包されてよい。
【０１３１】
本発明の別の態様は、これらの物質と分離材の糖部分との選択的反応により、液体から選択的に物質を除去するための本発明の分離材の使用である。
【０１３２】
一実施形態において、本発明の分離材は、血液型Ａおよび／または血液型Ｂの抗体の血液、血漿または任意の他の血液製剤からの体外除去に使用される。分離材は、さまざまなタイプの臓器移植の過程において、移植の前、間および最終的に後にレシピエントの治療の一部として使用することができる。血液型Ａおよび／または血液型Ｂの抗体の除去は、ドナーとレシピエントの間の血液型不適合の問題を最小にするために必要である。移植術を待っている、受けているまたは受け続けている患者の全血または血漿のいずれかを、分離材を通過させることができる。分離材はさらに、血液型適合移植にも使用可能であり、同じ血液型のドナーおよびレシピエントであるが、血液型亜型が異なることに関連する問題を処理できる。
【０１３３】
さらなる実施形態において、分離材は、糖タンパク質、糖ペプチド、ウイルスおよび／または細菌を全体的または部分的に、全血、血漿、血液製剤、細胞培養培地、食品、水または他の材料から、精製、単離または除去するために使用される。「血液製剤」という表現は、本明細書において使用する場合、輸血に使用するためにドナーから収集される血液の任意の成分を指す。大部分の血液製剤は、特定の処理をされた成分、例えば赤血球、血漿または血小板からなる。さらに特定の例としては、例えば、クリオプレシピテート（ｃｒｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）、ＰＦ２４、新鮮凍結血漿または寒冷上清成分（ｃｒｙｏｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）が挙げられる。
【０１３４】
本発明の別の実施形態において、分離材は、抗体を全血または血漿から単離するために使用され、前記抗体は、例えば、前立腺、乳房、腸または皮膚のがんと関連のある腫瘍抗原またはがん抗原に結合する。分離材から溶出後、抗体は、前記がん疾患を、例えば医薬的活性試薬の作製により治療するために使用可能である。分離材はまた、がんの免疫療法治療の際に、全血または血漿から過剰な抗体を除去するために使用可能である。
【０１３５】
一実施形態において、本発明の分離材は、血漿交換型用途に使用される。本発明のさらなる実施形態において、分離材は、血液透析、血液透析ろ過または血液ろ過型の用途に使用される。本発明の分離材は、これらの目的のために従来型の膜の代わりに、しかし同様の様式で使用可能である。当業者は、必要な操作方法を容易に導き出すと思われる。
【０１３６】
本発明の別の態様は、本発明の分離材の生物学的処理用途、血漿分画およびタンパク質溶液の調製への使用である。本発明の膜は、これらの目的のために、従来これらの目的のために使用された膜の代わりに使用可能である。当業者は、意図される用途に適切な操作方法を容易に導き出すと思われる。
【０１３７】
上記特長およびこれ以降記載の特長は、指定の組み合わせだけでなく、他の組み合わせまたはこれ自体でも、本発明の範囲を逸脱することなく使用可能であることを理解されるであろう。
【０１３８】
本発明を、下記の実施例においてさらに詳細に説明する。この実施例は、本発明の範囲を限定する意図のものではなく、本発明の特定の実施形態の単なる例示である。
【実施例】
【０１３９】
［実施例１］
エポキシ−官能化マトリックスとグルタル酸との反応および血液型Ｂ三糖のカップリング
本発明の分離材を、式（ＩＶ）に従ったエポキシ樹脂と式（ＩＩＩ）に従ったグルタル酸および式（Ｖ）に従った血液型Ｂ三糖誘導体（「ＴｓＢ＿ＡＰ」）との反応により作製する。エポキシ官能基を担持するさまざまな市販のビーズ、特にＴｏｓｏｈ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌｓ（登録商標）ＡＦ−Ｅｐｏｘｙ６５０−Ｍ、ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ  Ｉｍｍｏｂｅａｄ（商標）３５０またはＭｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１３５が、分離材の調製方法に使用可能である。
【０１４０】
【化１】
2014531966.tif 000005
【０１４１】
第１反応ステップにおいて、エポキシ官能基はカルボン酸に対して非反応性であるので、エポキシ樹脂をアンモニアと反応させ、対応するβ−アミノアルコールを得る。
【０１４２】
次のステップにおいて、アミドの形成を実施する。グルタル酸のカルボキシル基を、例えば、活性Ｏ−アシル尿素中間体を形成する水溶性カルボジイミド１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）により活性化させる。ＥＤＣによる初期活性化後、カルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ）と反応させ、活性エステルを形成させ、これを、基材の表面の第１級アミノ基と結合させる。
【０１４３】
最終ステップにおいて、遊離アミノ官能基を担持する糖部分を、マトリックスに結合されたグルタル酸の遊離カルボキシル官能基と結合させる。市販の血液型Ｂ決定因子三糖のアミノプロピル誘導体ＴｓＢ＿ＡＰ（Ｄｅｘｔｒａ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｅａｒｌｅｙ  Ｇａｔｅ  Ｗｈｉｔｅｋｎｉｇｈｔｓ  Ｒｏａｄ、Ｒｅａｄｉｎｇ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）をマトリックスに付着させる。アミドの形成は、第１ステップに記載したように達成する。
【０１４４】
［実施例２］
アミノ官能化マトリックスとアジピン酸との反応および血液型Ｂ三糖のカップリング
本発明の分離材を、遊離第１級アミノ官能基を有するマトリックスを使用することによって作製する。従って、アミノ官能基を、ジカルボン酸、例えばアジピン酸に、前処理なしに直接結合可能である。第１級アミノ官能基担持マトリックスとして、市販のビーズＴｏｓｏｈ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌｓ（登録商標）ＡＦ−Ａｍｉｎｏ６５０−Ｍを使用する。または、中空繊維膜は、アンモニアプラズマ処理によってアミノ官能基により官能化することができる。
【０１４５】
第１反応ステップにおいて、ジカルボン酸としてアジピン酸のカップリングを、上記実施例１のように実施する。次のステップにおいて、遊離のアミノ官能基を有する式（Ｖ）の糖を、アジピン酸の残りのカルボキシル基に結合させる。市販の血液型Ｂ決定因子三糖のＮ−（２−アミノエチル）ノナン−１−アミド誘導体をここで使用する（「ＴｓＢ＿ＡＮＡ」、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｌｔｄ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃｕｌｈａｍ  Ｅｓｔａｔｅ、Ｃｕｌｈａｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）。アミドの形成は、第１ステップに記載したように達成する。
【０１４６】
【化２】
2014531966.tif 000006
【０１４７】
［実施例３］
エポキシ官能化マトリックスとアミノヘキサン酸との反応および血液型Ｂ三糖のカップリング
本発明の分離材を、エポキシ官能基を有するビーズ（Ｔｏｓｏｈ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌｓ  ＡＦ−Ｅｐｏｘｙ６５０−Ｍ、ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ  ＩＢ−３５０またはＭｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１３５）を使用することによって作製する。従って、アミノ官能基を有する式（ＩＩＩ）の化合物を、マトリックスのエポキシ官能基と直接反応させることができる。ここで、式（ＩＩＩ）の化合物はアミノヘキサン酸である。アミノ官能基は、エポキシの開環をもたらし、一方同時に、炭素−窒素結合が形成される。第２ステップにおいて、アミノヘキサン酸の残りの遊離カルボキシ官能基を、遊離アミノ官能基を有する式（Ｖ）の糖（「ＴｓＢ＿ＡＮＡ」、実施例２を参照されたい。）に結合させることができる。
【０１４８】
【化３】
2014531966.tif 000007
【０１４９】
［実施例４］
アミノ官能化マトリックスと血液型Ｂ三糖との反応
本発明の分離材を、アミノ官能基を有するビーズ（例えば、Ｔｏｓｏｈ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌｓ（登録商標）ＡＦ−Ａｍｉｎｏ６５０−Ｍ）を使用して作製する。ここで、式（Ｖ）の糖のカルボキシ官能基を、マトリックス（ＩＶ）のアミノ官能基に直接結合させる。
【０１５０】
【化４】
2014531966.tif 000008
【０１５１】
［実施例５］
レソルシノール試験
マトリックスに結合された糖、例えば実施例１から４の三糖の量の定量分析を、Ｍｏｎｓｉｇｎｙらによるレソルシノール試験（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７５，１９８８，５２５−５３０）によって実施する。３ｍｇの乾燥ＴｓＢ−ビーズを、２００μＬの蒸留水、２００μＬのレソルシノール水溶液（１０ｍＬの水中６０ｍｇのレソルシノール）および１ｍＬの硫酸７５％と一緒にガラス管に入れる。この混合物を撹拌し、９０℃に３０分間加熱し、その後ウォーターバス中で３０分間、光の不在下で冷却し、その後遠心分離機にかける。糖含有量を、溶液の吸光度を５０３ｎｍでＵＶ／ＶＩＳ分光計において測定し、ブランクを差し引き、あらかじめ作成した較正曲線に対して結果を評価することにより計算する。
【０１５２】
［実施例６］
高分子電解質滴定
式（ＩＩＩ）の化合物と式（ＩＶ）のマトリックスとの間のカップリング反応の分析を、式（ＩＩＩ）の化合物のカップリングにより存在する電荷を定量化することによって実施する。使用する高分子電解質は、陽イオン性ポリジアリルジメチル塩化アンモニウム（ポリ−ＤＡＤＭＡＣ）および陰イオン性ナトリウムポリエチレンスルホネートである。高分子電解質滴定を、ＢＴＧ  Ｍｕｔｅｋ  ＰＣＤ−０３  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｈａｒｇｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを用いて実施する。
【０１５３】
マトリックス上の陰イオン性官能基の場合、１００ｍｇを６０ｍＬの０．００１Ｍ  ポリ−ＤＡＤＭＡＣ溶液と共に、ｐＨ１２において一晩撹拌する。１ｍＬの反応溶液をその後、ＰＣＤ−０３において０．００１Ｎのナトリウムポリエチレンスルホネートを用いて滴定する。
【０１５４】
［実施例７］
エポキシビーズにおけるエポキシ官能基のβ−アミノアルコールへの変換
エポキシビーズ（それぞれ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ  Ｅｐｏｘｙ６５０Ｍ、Ｃｈｉｒａｌｖｉｓｉｏｎ  Ｉｍｍｏｂｅａｄｓ  Ｔ２−１５０およびＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１３５）を、エポキシ官能基をβ−アミノアルコールに変換するために、一晩室温において、３２．０ｗｔ−％のアンモニア溶液と共にインキュベートした。ビーズ１グラム当たり、８ｍＬのアンモニア溶液を適用した。次のステップにおいて、該ビーズをガラスフィルタ上で逆浸透水を用いて中性ｐＨまですすいだ。
【０１５５】
［実施例８］
アミノ官能化ビーズとジカルボン酸のカップリング手順
式（ＩＩＩ）のジカルボキシル化合物とアミノ官能化ビーズとのカップリングのために、ビーズの初期官能化に関して３倍過剰のジカルボン酸、例えば、グルタル酸、アジピン酸またはグルタチオンを、０．５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ５．４に溶解し、その後、６倍過剰のカップリング試薬、例えばＥＤＣまたはＤＩＣをＮＨＳと組み合わせて加えた。該ビーズを、一晩室温において、このカップリング溶液と共にインキュベートし、最終的に、逆浸透水を用いてガラスフィルタ上ですすいた。ビーズ上のカルボン酸基の濃度を、高分子電解質滴定によって決定した。実施例８および９の結果を下記の表ＩＩＩに要約する。
【０１５６】
【表３】
2014531966.tif 000009
【０１５７】
［実施例９］
グルタル酸とアミノ化ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１３５とのカップリング
実施例７の１ｇのビーズ（ＲｅｌｉＺｙｍ（商標）ＥＸＥ１３５、１当量、１６６μｍｏｌ／ｇ）を、５ｍＬの０．１Ｍ  ＭＥＳバッファー、ｐＨ５．４中の６６．２ｍｇのグルタル酸（３当量）および１９２ｍｇのＥＤＣ（６当量）の溶液に加えた。このビーズを回転台の上で２４時間室温において撹拌し、その後、逆浸透水でビーズをすすいだ。カルボキシ官能基によるビーズの官能化を、高分子電解質滴定で決定し、１１９μｍｏｌ／ｇビーズであった。
【０１５８】
［実施例１０］
６−アミノへキサン酸とＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１３５とのカップリング
５ｍＬの０．１Ｍ  ホウ酸−ＫＣｌ緩衝液（ｐＨ１３）中の、エポキシ官能基を担持する１ｇのビーズＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１３５（１当量、１６６μｍｏｌ／ｇ）を、６５．７ｍｇの６−アミノへキサン酸（３当量）と、２４時間、４０℃において反応させ、その後、すすぎステップを実施した。カルボキシ官能基によるビーズの官能化を、高分子電解質滴定で決定し、１５４μｍｏｌ／ｇビーズであった。
【０１５９】
［実施例１１］
血液型決定因子Ｂ三糖類と、マトリックス（ＩＶ）および式（ＩＩＩ）の化合物のカップリング生成物とのカップリング
ビーズの初期官能化に対して等モル量の血液型決定因子Ｂ三糖を、０．１ＭのＭＥＳ−緩衝液、ｐＨ５．４に溶解した。この溶液に、２当量のカップリング剤ＥＤＣを加え、その後、実施例８のビーズを加え、室温において一晩インキュベートし、逆浸透水で最終すすぎステップを実施し、血液型Ｂ三糖類で官能化されたビーズ（ＴｓＢ−ビーズ）を得た。ビーズのｇ当たりの三糖のμｍｏｌの単位の、ＴｓＢによるビーズの官能化を、レソルシノール試験により分析した（表ＩＶ）。
【０１６０】
【表４】
2014531966.tif 000010
【０１６１】
［実施例１２］
ＴｓＢ＿ＡＮＡとグルタル酸官能化ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１３５ビーズのカップリング
６．１μｍｏｌのＴｓＢ＿ＡＮＡを、０．５ｍＬの０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ５．４に溶解した。この溶液に、９６ｍｇのＥＤＣ（ビーズの初期官能化に対して３当量）を加え、その後、４０ｍｇの実施例９の官能化ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１３５ビーズを加え、回転台の上で２４時間室温において撹拌し、逆浸透水で最終すすぎステップを実施し、ＴｓＢ−官能化ビーズを得た。糖によるビーズの官能化を、レソルシノール試験により決定し、８．５μｍｏｌ  ＴｓＢ＿ＡＮＡ／ｇビーズであった。
【０１６２】
［実施例１３］
ＴｓＢ＿ＡＮＡと、ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１３５ビーズに結合した６−アミノへキサン酸とのカップリング
６．１μｍｏｌのＴｓＢ＿ＡＮＡを、０．５ｍＬの０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ５．４に溶解した。この溶液に、９６ｍｇのＥＤＣ（ビーズの出発官能化に対して３当量）を加え、その後、４０ｍｇの実施例１０の官能化ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１３５ビーズを加え、回転台の上で２４時間室温において撹拌し、逆浸透水で最終すすぎステップを実施し、ＴｓＢ−官能化ビーズを得た。糖によるビーズの官能化を、レソルシノール試験により決定し、２５．９μｍｏｌ  ＴｓＢ＿ＡＮＡ／ｇビーズであった。
【０１６３】
［実施例１４］
ＴｓＢ  ＡＰと、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ  Ｅｐｏｘｙ６５０Ｍビーズに結合したグルタル酸とのカップリング
１３１．３ｍｇのＴｓＢ＿ＡＰ（１当量）を、７ｍＬのリン酸緩衝液、ｐＨ５．４に溶解した。この溶液に、７０．４ｍｇのＤＩＣ（３当量）を加え、その後、１６１．７ｍｇの実施例８の官能化Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＡＦ  Ｅｐｏｘｙ６５０Ｍビーズを加え、回転台の上で２４時間室温において撹拌し、逆浸透水で最終すすぎステップを実施し、ＴｓＢ−ビーズを得た。
【０１６４】
［実施例１５］
ＴｓＢ＿ＡＮＡと、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ  Ｅｐｏｘｙ６５０Ｍビーズに結合したグルタル酸とのカップリング
７２５ｍｇのＮＨＳ、０．９８１ｍＬのＤＩＣおよび０．８９３ｍＬのジイソプロピルエチルアミンを、２５ｍＬの１，４−ジオキサンに溶解した。０．５ｇの実施例８の官能化Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＡＦ  Ｅｐｏｘｙ６５０Ｍビーズを、２．５ｍＬの活性化溶液に加え、回転台の上で３時間室温において撹拌した。このビーズを、次いで５ｍＬの１，４−ジオキサンおよび１５ｍＬのＤＭＳＯで洗浄した。２ｍＬのＤＭＳＯ中１４．４ｍｇのＴｓＢ＿ＡＮＡをビーズに加え、その後、この懸濁液を回転台の上で３時間室温において撹拌し、ビーズを逆浸透水ですすいだ。糖によるビーズの官能化を、レソルシノール試験により決定し、４３．４μｍｏｌ  ＴｓＢ＿ＡＮＡ／ｇビーズであった。
【０１６５】
［実施例１６］
ＴｓＢ＿ＡＮＡと、グルタル酸官能化Ｃｈｉｒａｌｖｉｓｉｏｎ  Ｉｍｍｏｂｅａｄ（商標）Ｔ２−１５０ビーズとのカップリング
４．３ｍｇのＴｓＢ＿ＡＮＡ（０．１当量）を、２ｍＬのリン酸緩衝液、ｐＨ５．４に溶解した。この溶液に、１８．９ｍｇのＤＩＣ（３当量）を加え、その後、０．５ｇｍｇの実施例８の官能化Ｉｍｍｏｂｅａｄ（商標）Ｔ２−１５０ビーズ（１等量）を加え、回転台の上で２４時間室温において撹拌し、逆浸透水で最終すすぎステップを実施し、ＴｓＢ−ビーズを得た。糖によるビーズの官能化を、レソルシノール試験により決定し、７．１μｍｏｌ  ＴｓＢ＿ＡＮＡ／ｇビーズであった。
【０１６６】
［実施例１７］
ＴｓＢ−ビーズによる抗体価の低下
０．５ｍＬの血液型Ａ血漿を、２０ｍｇの、実施例１１−１５の湿潤ＴｓＢ−ビーズ（およそ５ｍｇの乾燥ビーズに相当する。）に加え、３７℃において１２０分、回転台の上でインキュベートした。プローブ（ｐｒｏｂｅ）をその後遠心分離（１０分、１０００ｇ）処理し、上清を、ゲル試験アッセイを用いたＩｇＭ抗体価の決定に使用した。ゲル試験アッセイは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販されている（ＮａＣｌ，  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｓｔ  ａｎｄ  Ｃｏｌｄ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ（「ＮａＣｌ  カード」）；Ｃｏｏｍｂｓ  Ａｎｔｉ−ＩｇＧ（「Ｃｏｏｍｂｓカード」））。従って、プローブの段階希釈液を調製した。５０μＬの血漿または血漿希釈液それぞれを、ＮａＣｌカード中５０μＬの赤血球Ｂと混合し、１５分間室温においてインキュベートした。次のステップにおいて、このプローブを、ＩＤ−遠心分離機（ＤｉａＭｅｄ  ＡＧ）において遠心分離処理し、ゲルカードを凝集に関して評価した。
【０１６７】
同様に、ＩｇＧ抗体価を決定した。まず、プローブの段階希釈液を調製した。その後、５０μＬの血漿または血漿希釈液それぞれを、Ｃｏｏｍｂｓカード中５０μＬの赤血球Ｂと混合し、１５分間室温においてインキュベートした。次のステップにおいて、このプローブを、ＩＤ−遠心分離機（ＤｉａＭｅｄ  ＡＧ）において遠心分離処理し、ゲルカードを凝集に関して評価した。
【０１６８】
表ＶからＸＩＶは、ビーズの結果を要約する。
【０１６９】
【表５】
2014531966.tif 000011
【０１７０】
【表６】
2014531966.tif 000012
【０１７１】
【表７】
2014531966.tif 000013
【０１７２】
【表８】
2014531966.tif 000014
【０１７３】
【表９】
2014531966.tif 000015
【０１７４】
【表１０】
2014531966.tif 000016
【０１７５】
【表１１】
2014531966.tif 000017
【０１７６】
【表１２】
2014531966.tif 000018
【０１７７】
【表１３】
2014531966.tif 000019
【０１７８】
【表１４】
2014531966.tif 000020
【０１７９】
［実施例１８］
ＴｓＢ＿ＡＮＡの段階希釈液を用いた抗体価低下試験
６５．７ｍｇの６−アミノへキサン酸（３当量）を、５ｍＬの０．１Ｍ  ホウ酸−ＫＣｌ緩衝液、ｐＨ１０中の１ｇ（０．１６７ｍｍｏｌ、１当量）のエポキシドビーズ（ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１３５）の懸濁液に加えた。ｐＨを１３に調整後、混合液を、４０℃において２４時間撹拌し、その後ろ過し、蒸留水ですすいだ。ビーズ上のカルボン酸官能基の濃度を、高分子電解質滴定により決定し、０．１６７ｍｍｏｌ／ｇであり、これは、エポキシ官能基の完全変換に相当する。
【０１８０】
２４０ｍｇ（２．０９ｍｍｏｌ）のＮＨＳおよび３２５μＬ（２．０９ｍｍｏｌ）のＤＩＣを、１０ｍＬの１，４−ジオキサンに溶解した。０．２５ｇのビーズ（４２μｍｏｌ、１当量）を、５当量のＮＨＳおよびＤＩＣを含有する１ｍＬの活性化溶液に加えた。混合液を、回転台の上で３時間室温において撹拌し、その後、ビーズを５ｍＬの１，４−ジオキサンおよび１５ｍＬのＤＭＳＯですすいだ。
【０１８１】
活性化ビーズと三糖とのカップリングのために、ＤＭＳＯ中のＴｓＢ＿ＡＮＡストック溶液を調製した。従って、８．７２μｍｏｌ、６．０ｍｇのＴｓＢ＿ＡＮＡを、１ｍｌのＤＭＳＯに溶解した。このストック溶液から出発し、４種の異なる量のＴｓＢ＿ＡＮＡを用いた４種の異なるカップリング反応を実施した。この反応条件を、表ＸＶに要約する。
【０１８２】
【表１５】
2014531966.tif 000021
【０１８３】
従って、該ビーズを、ＴｓＢストック溶液と対応する体積のＤＭＳＯとの混合物に加え、その後、回転台の上で２４時間室温において撹拌し、逆浸透水ですすいだ。レソルシノール試験により、三糖とビーズとの１００％カップリングが示された。
【０１８４】
これら４種の糖官能化ビーズを用いて、ＩｇＭおよびＩｇＧの力価低下試験を、実施例１７に記載のように実施した。結果を、表ＸＶＩに要約する。
【０１８５】
【表１６】
2014531966.tif 000022
【０１８６】
［実施例１９］
中空繊維膜のプラズマ官能化
外殻径３２０μｍおよび壁厚５０μｍを有する１０００ｍの多孔質ポリアリールエーテルスルホン（ｐｏｌｙａｒｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ）−ポリビニルピロリドン中空繊維膜を、真空密閉プラズマ点火チャンバーに、速度５−２０ｍ／分で送り込んだ。前記点火チャンバーに、アンモニアからなる圧力０．２５ｍｂａｒの前駆体ガスを、アミン含有炭水化物薄膜が膜の多孔質表面に被覆されるように導入した。プラズマを、１３．５６ＭＨｚのパルスＲＦパワー、１００Ｗを用いて励起した。このプラズマ処理後、アミノ基の密度を高分子電解質滴定により測定し、２０μｍｏｌ／ｇの値を得た。
【０１８７】
図１は、５０μｍの壁厚を有する、中空繊維膜の二光子励起顕微鏡実験の結果を示す。プラズマ官能化により形成された膜のアミノ官能基は、まずフルオロフォア、ここでは４−フルオロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ−Ｆ）と反応した。励起は、一光子励起に必要なエネルギーより比較的低いエネルギーの二光子により起こる。各光子は、分子を励起するために必要なエネルギーのおよそ半分のエネルギーを担持する。励起は、通常２つの励起光子のいずれかより高いエネルギーにおいて、蛍光光子のその後の放射をもたらす。画像は、アミノ官能基が壁の外表面および近接２０μｍ内に存在することを示す。従って、壁の４０％が、アミノ官能基により官能化されている。
【０１８８】
［実施例２０］
ミニモジュールの調製
紡糸工程後の膜束の調製は、実験に適切な方法で繊維束を調製するために必要である。第１の工程ステップは、１５０の繊維をこの末端近くで単繊維により固定することである。該繊維束を、ハウジング内に移す。その後、繊維束を規定の長さの２０ｃｍに切断する。次の工程ステップは、繊維束をポッティングキャップ（ｐｏｔｔｉｎｇ  ｃａｐ）に移すことからなる。ポッティングキャップを機械的に固定し、ポッティングチューブ（ｐｏｔｔｉｎｇ  ｔｕｂｅ）を、ポッティングキャップに乗せる。その後、繊維の末端を閉じる。光学制御により、すべての繊維を確実に充分閉止する。その後、ミニモジュールを真空乾燥オーブンに一晩入れる。その後、ポッティングをポリウレタンを用いて実施する。ポッティング後、ポリウレタンが少なくとも１日の間硬化可能であることが確実でなければならない。次の工程ステップにおいて、ポッティングされた膜束を、規定の長さに切断する。最終工程ステップは、繊維束の光学制御からなる。この工程ステップの間、切断の質（切断が平滑であるか、またはナイフによるいずれかの損傷があるか）およびポッティングの質（紡糸工程の開口繊維の数がポッティングされた繊維で減少したか、またはポリウレタンが存在しないなんらかの目視可能な空隙があるか）を制御する。光学制御後、膜束を乾燥して保存し、その後膜束をさまざまな実験に使用する。
【０１８９】
［実施例２１］
フィルタの調製
フィルタ（＝透析装置）は、有効表面積１．４ｍ２を有する約８，０００から１０，０００の繊維を含む。フィルタは、流体を透析するための２つのコネクタと、それぞれが１つの中央血液コネクタを有する、両端に適用されるキャップとを備えた、円筒形ハウジングを特徴とする。製造工程（巻き付け後）は、下記の主なステップに分けることができる：
（Ａ）切断束（長さ約３０ｃｍ）を、特殊な束鉤爪（ｂｕｎｄｌｅ  ｃｌａｗ）を有するハウジングに移す；
（Ｂ）束の両端を、閉鎖工程により閉鎖する；
（Ｃ）繊維を、ポリウレタン（ＰＵＲ）を用いてハウジング内においてポッティングする；
（Ｄ）繊維を開口するために末端を切断する；
（Ｅ）キャップを血液コネクタに、超音波溶接を使用して溶接する；
（Ｆ）最終処理は、すすぎ、完全性試験、最終乾燥を含む；
（Ｇ）フィルタを、滅菌バッグに梱包し、蒸気滅菌する。
【０１９０】
［実施例２２］
グルタル酸とアミノ官能化中空繊維膜とのカップリング
実施例１９の中空繊維と式（ＩＩＩ）の化合物とのカップリングのために、３０ｇのグルタル酸および３０ｇのＥＤＣを、１５００ｍＬの０．２５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ５．４に溶解した。この溶液を使用して、それぞれ１５０繊維を有する４つのミニモジュールを官能化した。カップリングを、該溶液を４つのミニモジュールの中を流速８５ｍＬ／分で室温において１６時間循環させることによって実施した。その後、該モジュールを、４０Ｌの逆浸透水ですすぎ、最終的に乾燥させた。官能化を、高分子電解質滴定により測定し、９．４μｍｏｌ／ｇであった。
【０１９１】
［実施例２３］
ＴｓＢと、中空繊維膜に結合したグルタル酸とのカップリング
血液型Ｂ三糖（ＴｓＢ）と実施例２２の中空繊維（２００ｍｇ）とのカップリングのために、１０μｍｏｌ（２．５当量）のＴｓＢ＿ＡＰおよびＴｓＢ＿ＡＮＡそれぞれと、２５μｍｏｌのカップリング剤ＥＤＣとを、１７ｍＬの０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ５．４に、各ミニモジュール用に溶解した。カップリングを、連続流条件で、流速６ｍＬ／分で室温において２４時間実施した。その後、該モジュールを、１．５Ｌの逆浸透水ですすぎ、最終的に乾燥させた。
【０１９２】
［実施例２４］
ＴｓＢ−中空繊維を用いた抗体価低下試験
実施例２３の１５０の中空繊維を含むミニモジュールを、１０ｍＬの血液型Ａのヒト血漿および１０ｍＬのＮａＣｌ溶液の混合物で、調節されたフード（ｔｅｍｐｅｒｅｄ  ｈｏｏｄ）において３７℃で２時間、流速２．５ｍＬ／時および４０％のろ過で潅流させた。プローブを、得られたプールから採取し、これを用いて、ＩｇＭ抗体価の決定をＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製のゲル試験アッセイ（上を参照されたい。）により実施した。従って、プローブの段階希釈液を調製した。５０μＬの血漿または血漿希釈液それぞれを、ＮａＣｌカード中５０μＬの赤血球Ｂと混合し、１５分間室温においてインキュベートした。次のステップにおいて、このプローブを、ＩＤ−遠心分離機（ＤｉａＭｅｄ  ＡＧ）において遠心分離処理し、ゲルカードを凝集に関して評価した。
【０１９３】
同様に、ＩｇＧ抗体価を決定した。まず、プローブの段階希釈液を調製した。その後、５０μＬの血漿または血漿希釈液それぞれを、Ｃｏｏｍｂｓカード中５０μＬの赤血球Ｂと混合し、１５分間室温においてインキュベートした。次のステップにおいて、このプローブを、ＩＤ−遠心分離機（ＤｉａＭｅｄ  ＡＧ）において遠心分離処理し、ゲルカードを凝集に関して評価した。
【０１９４】
結果を下記の表ＸＶＩＩおよびＸＶＩＩＩに要約する。これらは、リンカーが長いほど、より有効な力価低下がもたらされることを示している。
【０１９５】
【表１７】
2014531966.tif 000023
【０１９６】
【表１８】
2014531966.tif 000024
【０１９７】
［実施例２５］
異なるマトリックス、リンカー濃度および反応条件に基づく、ＴｓＢを含む分離材を用いた抗体価低下の比較
実施例２５Ａ：可変量の糖を有するＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１３５
（Ａ）リンカーのカップリング
６５．７ｍｇの６−アミノへキサン酸（３当量）を、５ｍＬの０．１Ｍ  ホウ酸−ＫＣｌ緩衝液、ｐＨ１０中の１ｇ（０．１６７ｍｍｏｌ、１当量）のエポキシドビーズ（ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１３５）の懸濁液に加えた。０．１Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを１３に調整後、混合物を、４０℃において２４時間撹拌し、その後ろ過し、蒸留水ですすいだ。ビーズ上のカルボン酸官能基の濃度を、高分子電解質滴定により決定し、１６５μｍｏｌ／ｇビーズであった。
【０１９８】
（Ｂ）活性化ステップ
１４．４ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および２４．０ｍｇの１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド＊ＨＣｌ（ＥＤＣ、３当量）を、１ｍＬのポリエチレングリコール２００（ＰＥＧ−２００）に、０．２５ｇのステップ（Ａ）のビーズ（０．１６７ｍｍｏｌ、１当量）と一緒に溶解した。混合物を、回転台の上で３時間室温において撹拌し、その後ろ過し、２０ｍｌのＰＥＧ−２００ですすいだ。
【０１９９】
（Ｃ）糖のカップリング
ステップ（Ｂ）の活性化ビーズと三糖とのカップリングのために、さまざまな量（３．３ｍｇ、２．３ｍｇ、１．７ｍｇ、１．４ｍｇ）のＴｓＢ＿ＡＮＡを、下記の表ＸＩＸに示すように調製し、０．５ｍｌのＰＥＧ−２００に溶解した。４種の異なる量のＴｓＢ＿ＡＮＡを用いた４種の異なるカップリング反応を実施した。混合物を、それぞれ回転台の上で２４時間室温において撹拌し、その後ろ過し、蒸留水ですすいだ。変換の程度、即ち糖のカップリング率を含めて、他の反応条件をＸＩＸに要約する。２０ｍｇの湿潤ＴｓＢ−ビーズ（５ｍｇの乾燥材料に相当する。）および１．５ｍＬのヒト血漿を用いて、上記のように力価低下を実施した。
【０２００】
【表１９】
2014531966.tif 000025
【０２０１】
実施例２５Ｂ：一定量の糖および可変反応パラメーターを有するＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１３５
（Ａ）リンカーのカップリング
６５．７ｍｇの６−アミノへキサン酸（３当量）を、５ｍＬの０．１Ｍ  ホウ酸−ＫＣｌ緩衝液、ｐＨ１０中の１ｇ（０．１６７ｍｍｏｌ、１当量）のエポキシドビーズ（ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１３５）の懸濁液に加えた。０．１Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを１０または１３に調整後、混合物を、４０℃または５５℃において６時間または２４時間、それぞれ撹拌し、その後ろ過し、蒸留水でｐＨが中性になるまですすいだ。ビーズ上のカルボン酸官能基の濃度を、高分子電解質滴定により決定した。結果を表ＸＸに示す。
【０２０２】
（Ｂ）活性化ステップ
１４．４ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および２４．０ｍｇの１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド＊ＨＣｌ（ＥＤＣ、３当量）を、１ｍＬのポリエチレングリコール２００（ＰＥＧ−２００）に、０．２５ｇのステップ（Ａ）のビーズ（０．１６７ｍｍｏｌ、１当量）と一緒に溶解した。混合物を、回転台の上で３時間室温において撹拌し、その後ろ過し、２０ｍｌのＰＥＧ−２００ですすいだ。
【０２０３】
（Ｃ）糖のカップリング
ステップ（Ｂ）の活性化ビーズと三糖とのカップリングのために、３ｍｇ（±０．１）のＴｓＢ＿ＡＮＡを調製し、０．５ｍｌのＰＥＧ−２００にそれぞれ溶解した。基本的に同じ量のＴｓＢ＿ＡＮＡを用いた６種の異なるカップリング反応を、表ＸＸに示すように実施した。混合物を、それぞれ回転台の上で２４時間室温において撹拌し、その後ろ過し、蒸留水ですすいだ。変換の程度、即ち糖のカップリング率を含めて、他の反応条件を表ＸＩＸに要約する。２０ｍｇの湿潤ＴｓＢ−ビーズ（５ｍｇの乾燥材料に相当する。）および１．５ｍＬのヒト血漿を用いて、上記のように力価低下を実施した。
【０２０４】
【表２０】
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【０２０５】
実施例２５Ｃ：可変量の糖を含むＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１４８
（Ａ）リンカーのカップリング
８５．８ｍｇの６−アミノへキサン酸（３当量）を、５ｍＬの０．１Ｍ  ホウ酸−ＫＣｌ緩衝液、ｐＨ１０中の１ｇ（０．２１８ｍｍｏｌ、１当量）のエポキシドビーズ（ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１４８）の懸濁液に加えた。４ｍＬの０．１Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを１３に調整後、混合物を、４０℃において２４時間撹拌し、その後ろ過し、蒸留水でｐＨが中性値に達するまですすいだ。ビーズ上のカルボン酸官能基の濃度を、高分子電解質滴定により決定し、２８５μｍｏｌ／ｇビーズであった。
【０２０６】
（Ｂ）活性化ステップ
１４．４ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および２４．０ｍｇの１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド＊ＨＣｌ（ＥＤＣ、３当量）を、１ｍＬのポリエチレングリコール２００（ＰＥＧ−２００）に、０．２５ｇのステップ（Ａ）のビーズ（０．２８５ｍｍｏｌ、１当量）と一緒に溶解した。混合物を、回転台の上で３時間室温において撹拌し、その後ろ過し、２０ｍｌのＰＥＧ−２００ですすいだ。
【０２０７】
（Ｃ）糖のカップリング
ステップ（Ｂ）の活性化ビーズと三糖とのカップリングのために、さまざまな量（３．０ｍｇ、２．２ｍｇ、１．９ｍｇ、１．６ｍｇ）のＴｓＢ＿ＡＮＡを、下記の表ＸＩＸに示すように調製し、０．５ｍｌのＰＥＧ−２００に溶解した。４種の異なる量のＴｓＢ＿ＡＮＡを用いた４種の異なるカップリング反応を実施した。混合物を、それぞれ回転台の上で２４時間室温において撹拌し、その後ろ過し、蒸留水ですすいだ。変換の程度、即ち糖のカップリング率を含めて、他の反応条件を表ＸＸＩに要約する。２０ｍｇの湿潤ＴｓＢ−ビーズ（５ｍｇの乾燥材料に相当する。）および１．５ｍＬのヒト血漿を用いて、上記のように力価低下を実施した。
【０２０８】
【表２１】
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【０２０９】
実施例２５Ｄ：一定量の糖および可変反応パラメーターを有するＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１４８
（Ａ）リンカーのカップリング
８５．８ｍｇの６−アミノへキサン酸（３当量）を、５ｍＬの０．１Ｍ  ホウ酸−ＫＣｌ緩衝液、ｐＨ１０中の１ｇ（０．１６７ｍｍｏｌ、１当量）のエポキシドビーズ（ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＸＥ１４８）の懸濁液に加えた。４ｍＬのＮａＯＨを用いてｐＨを１０または１３に調整後、混合物を、４０℃または５５℃において６時間または２４時間、それぞれ撹拌し、その後ろ過し、蒸留水でｐＨが中性になるまですすいだ。ビーズ上のカルボン酸官能基の濃度を、高分子電解質滴定により決定した。結果を表ＸＸＩＩに示す。
【０２１０】
（Ｂ）活性化ステップ
１４．４ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および２４．０ｍｇの１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド＊ＨＣｌ（ＥＤＣ、３当量）を、１ｍＬのポリエチレングリコール２００（ＰＥＧ−２００）に、０．２５ｇのステップ（Ａ）のビーズ（０．２８５ｍｍｏｌ、１当量）と一緒に溶解した。混合物を、回転台の上で３時間室温において撹拌し、その後ろ過し、２０ｍｌのＰＥＧ−２００ですすいだ。
【０２１１】
（Ｃ）糖のカップリング
ステップ（Ｂ）の活性化ビーズと三糖とのカップリングのために、３ｍｇ（±０．１）のＴｓＢ＿ＡＮＡを調製し、０．５ｍｌのＰＥＧ−２００にそれぞれ溶解した。基本的に同じ量のＴｓＢ＿ＡＮＡを用いた６種の異なるカップリング反応を、表ＸＸに示すように実施した。混合物を、それぞれ回転台の上で２４時間室温において撹拌し、その後ろ過し、蒸留水ですすいだ。変換の程度、即ち糖のカップリング率を含めて、他反応条件を表ＸＩＸに要約する。２０ｍｇの湿潤ＴｓＢ−ビーズ（５ｍｇの乾燥材料に相当する。）および１．５ｍＬのヒト血漿を用いて、上記のように力価低下を実施した。
【０２１２】
【表２２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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