(57)【要約】外傷性脳損傷（ＴＢＩ）および軽症の外傷性脳損傷（ｍＴＢＩ）を、プロゲステロンおよびｅｎｔ−プロゲステロンを用いて処置するための組成物および方法が記載される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（ａ）プロゲステロンを含む組成物を、軽症の外傷性脳損傷（ｍＴＢＩ）に罹患している個体に１５分以内に投与する工程、
を包含する方法。
【請求項２】
前記組成物が水溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物がゲルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
以下の工程：
（ａ）ｅｎｔ−プロゲステロンを含む組成物を、軽症の外傷性脳損傷（ｍＴＢＩ）に罹患している個体に１５分以内に投与する工程、
を包含する方法。
【請求項５】
前記組成物が水溶液である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物がゲルである、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、その全体が参照により援用される、２０１１年１０月７日出願の、「Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｐｏｓｔ−Ａｃｕｔｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ  ｔｏ  Ｂｅｔｔｅｒ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎ（脳震盪に関連する良好な転帰に対するプロゲステロンおよびその鏡像異性体の予防的使用および急性後使用）」と題されたＶａｎＬａｎｄｉｎｇｈａｍらに対する米国特許出願第６１／５４４，５０２号に対して優先権の利益を請求する、「Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｐｏｓｔ−Ａｃｕｔｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｔｏ  Ｂｅｔｔｅｒ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎ（脳震盪と関連する良好な転帰に対するプロゲステロンの予防的使用および急性後使用）」と題された、２０１２年１０月５日出願の米国特許出願第１３／６４５，８５４号に対する優先権の利益を主張する。本願はまた、本願と同じ発明者らに対する、２０１２年１０月５日出願の「Ｎａｓａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｐｏｓｔ−Ａｃｕｔｅ  Ｕｓｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｉｔｓ  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｉｌｄ  Ｔｒａｕｍａｔｉｃ  Ｂｒａｉｎ  Ｉｎｊｕｒｉｅｓ（軽症の外傷性脳損傷の処置における使用のためのプロゲステロンおよび／またはその鏡像異性体のための予防的使用および急性後使用のための経鼻送達機構）」と題された米国特許出願第１３／６４５，８８１号、および「Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｐｏｓｔ−Ａｃｕｔｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｉｎ  Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｉｔｓ  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｒａｕｍａｔｉｃ  Ｂｒａｉｎ  Ｉｎｊｕｒｉｅｓ（外傷性脳損傷の処置における使用のためのプロゲステロンとその鏡像異性体とを組み合わせた予防的使用および急性後使用）」と題された、米国特許出願第１３／６４５，９２５号を参照し、その内容および開示の全体が全体として参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、脳震盪（軽症のＴＢＩ）の予備的処置および急性後処置に関する。
【０００３】
外傷性脳損傷に関連する多くの健康上の問題がある。例えば、運動選手が一度、脳震盪（一種の外傷性脳損傷（ＴＢＩ））に陥ると、その運動選手は、２回目の脳損傷を受ける可能性が４〜６倍になる。また、高齢者における転倒と関連する死亡の半分は、頭部損傷によって発生する。さらに、８０分に１人の割合で退役軍人が自殺をし、ＴＢＩ後の脳震盪後症候群（ＰＣＳ）を発症する可能性が２５倍高い。さらに、脳損傷患者の脳プラークは、アルツハイマー病患者における脳プラークと同様である。一度のＴＢＩによって、男性のアルツハイマー病のリスクは倍になり、軽症の外傷性脳損傷（ｍＴＢＩ）は、長期の神経変性障害を引き起こす最も一般的な種類のＴＢＩである。外傷性脳損傷の保健医療の推定の年間コストは、２００億ドルである。
【０００４】
米国では毎年、約１３０万の脳震盪症例が報告される。さらに２００万症例の脳震盪が報告されていないと推定される。スポーツ関連の脳震盪は、年間約６００，０００症例存在する。また、約３６０，０００人の海外軍人が脳震盪に罹患しており、その多くが簡易爆発物（ＩＥＤ）の爆発の影響に起因する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
毎年、１５０万人を超える人が外傷性脳損傷に罹患していると推定される。外傷性脳損傷に罹患する人々のうち、５０，０００人超が死亡し、さらに８０，０００人が生涯にわたって障害者になるかまたは身体障害になることが推定される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第一の広範な態様によれば、本発明は、（ａ）プロゲステロンを含有する組成物を、個体が軽症の外傷性脳損傷（ｍＴＢＩ）に罹患した１５分以内にその個体に投与する工程を包含する方法を提供する。
【０００７】
第二の広範な態様によれば、本発明は、（ａ）ｅｎｔ−プロゲステロンを含有する組成物を、個体が軽症の外傷性脳損傷（ｍＴＢＩ）に罹患した１５分以内にその個体に投与する工程を包含する方法を提供する。
【０００８】
第三の広範な態様によれば、本発明は、（ａ）組成物を個体に経鼻投与によって投与する工程を包含し、この組成物が、ｅｎｔ−プロゲステロンおよび１種以上のシクロデキストリンを含み、この組成物中のシクロデキストリンの総量に対するｅｎｔ−プロゲステロンのモル比が約１：１である、方法を提供する。
【０００９】
第四の広範な態様によれば、本発明は、（ａ）組成物を個体に経鼻投与によって投与する工程を包含し、この組成物が、ｅｎｔ−プロゲステロンおよび生体接着性ポリマーを含み、この組成物中のこの生体接着性ポリマーに対するｅｎｔ−プロゲステロンのモル比が約１：１である、方法を提供する。
【００１０】
第五の広範な態様によれば、本発明は、ｅｎｔ−プロゲステロンおよび１種以上のシクロデキストリンを含有する組成物であって、この組成物中のシクロデキストリンの総量に対するｅｎｔ−プロゲステロンのモル比が約１：１である、組成物を提供する。
【００１１】
第六の広範な態様によれば、本発明は、ｅｎｔ−プロゲステロンおよび生体接着性ポリマーを含有する組成物であって、この組成物中の生体接着性ポリマーに対するｅｎｔ−プロゲステロンのモル比が約１：１である、組成物を提供する。
【００１２】
第七の広範な態様によれば、本発明は、（ａ）ｅｎｔ−プロゲステロンを含有する組成物を、軽症の外傷性脳損傷（ｍＴＢＩ）に罹患した個体に対して投与する工程を包含し、工程（ａ）が少なくとも７日間少なくとも毎日繰り返される、方法を提供する。
【００１３】
本明細書で援用され、本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明の例示的な実施形態を図示しており、上記で示される一般的な説明および下に示される詳細な説明とともに、本発明の特徴を説明するように機能する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、アロプレグナノロン、プロゲステロンおよびｅｎｔ−プロゲステロンで処置したＴＢＩ罹患ラットの脳水分含量パーセントのグラフを示す。
【図２】図２は、アロプレグナノロン、プロゲステロンおよびｅｎｔ−プロゲステロンで処置したＴＢＩ罹患ラットのグルタチオンレダクターゼ活性のグラフを示す。
【図３】図３は、ヒトプロゲステロン受容体に対するｅｎｔ−プロゲステロンの結合のグラフを示す。
【図４】図４は、ヒトプレグナンＸ受容体媒介性の転写に対するプロゲステロンおよびｅｎｔ−プロゲステロンの効果を示しているグラフを示す。
【図５】図５は、マウスプレグナンＸ受容体媒介性の転写に対するプロゲステロンおよびｅｎｔ−プロゲステロンの効果を示しているグラフを示す。
【図６】図６は、脳が損傷された７２時間後の損傷された脳の境界域におけるＰ−糖タンパク質のタンパク質量の増大に対するプロゲステロンおよびｅｎｔ−プロゲステロンの効果を示しているグラフを示す。
【図７】図７は、脳震盪に罹患したラットおよび罹患していないラットについてのモリス水迷路試験（Ｍｏｒｒｉｓ  Ｗａｔｅｒ  Ｍａｚｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ）からの台に対する遅延のグラフを示す。
【図８】図８は、脳震盪に罹患しており、（ａ）未処置、（ｂ）シクロデキトリンで処置、（ｃ）プロゲステロンを用いて予防的に処置、および（ｄ）プロゲステロンで急性後に処置するかあるいは未処置の、ラットについてのモリス水迷路試験からの台に対する遅延のグラフを示す。
【図９】図９は、ラットのモリス水迷路試験の結果を示しているグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
用語が一般に用いられる意味とは異なる意味に用いられる場合、特段の記載のない限り、本出願人は、用語の定義として、以下に示される定義を使用する。本発明の目的に対し、ある値または特性は、特定の値、特性、条件の満足、または他の要因に、その値がその値、特性または他の要因を用いて数学的計算または論理的決定を行うことによって導かれる場合、「基づく」。本発明の目的に対し、「生体接着性ポリマー」という用語は、眼用、鼻腔用、口腔用、腸用、直腸用および膣用の処方物のバイオアベイラビリティを増大し得るポリマーを指す。生体接着性ポリマーの一例として、カルボポールが挙げられる。
【００１６】
本発明の目的に対し、「ｅｎｔ−プロゲステロン構成要素」という用語および「ｅｎｔ−Ｐｒｏｇ構成要素」という用語は、ｅｎｔ−プロゲステロンを含む送達系の構成用を指す。この構成要素は、ｅｎｔ−プロゲステロンを含む溶液であってもよい。
【００１７】
本発明の目的に対し、「個体」という用語は、哺乳動物を指す。例えば、「個体」という用語は、ヒト個体を指してもよい。
【００１８】
本発明の目的に対し、「鼻腔内送達（経鼻送達）」という用語および「鼻腔内投与（経鼻投与）」という用語は、等価な用語であって、個体の一方または両方の鼻孔を介する化学的組成物の送達または投与を指す。鼻腔内送達の例としては、鼻孔へＰｒｏｇまたはｅｎｔ−Ｐｒｏｇを含有する化学的組成物を能動的に噴霧して、個体がＰｒｏｇまたはｅｎｔ−Ｐｒｏｇを含有する化学的ミストを吸入することが挙げられる。
【００１９】
本発明の目的に対し、「軽症の外傷性脳損傷（ｍＴＢＩ）」という用語は、意識状態の低下または変更を伴う、一時的または持続的な認知、身体的および心理社会的な障害をもたらし得る、外的な機械的な力による脳に対する非変性の、先天性ではない損傷を指す。
【００２０】
本発明の目的に対し、「経鼻スプレー」という用語は、手動式のポンプの作用によって微細なミストを鼻孔に吹き込むことによるその機能を指す。
【００２１】
本発明の目的に対し、「プロゲステロン構成要素」という用語および「Ｐｒｏｇ構成要素」という用語は、プロゲステロンを含む送達系の構成要素を指す。この構成要素は、プロゲステロンを含む溶液であってもよい。
【００２２】
本発明の目的に対し、「偽」という用語および「偽のコントロール（対照）」という用語は、手順または試験物質の実際の使用なしでその手順または処置を模倣するために用いられるコントロール（対照）群のメンバーを指す。
【００２３】
本発明の目的に対し、「噴霧可能（ｓｐｒａｙａｂｌｅ）」という用語は、手動式のポンプの作用によって微細なミストに変換される溶液を指す。
【００２４】
本発明の目的に対し、「外傷性脳損傷（ＴＢＩ）」という用語は、外部の機械力によって生じる脳に対する損傷を指す。外傷性脳損傷は、フットボール、ホッケー、野球などのスポーツを行っている間に頭部に対する衝撃に曝される、爆発に曝される、交通事故にあう、転倒して頭部を打つなどの種々の方法で生じる場合がある。
【００２５】
本発明の目的に対し、「ビヒクルコントロール（対照）」および「ビヒクル」という用語は、軽症のＴＢＩを受けて、ある薬物処方物で処置される動物を指す。
【００２６】
詳細
下の説明において、全ての比は、他に特定しない限り、重量あたりである。
【００２７】
従って、プロゲステロン（Ｐｒｏｇ）は長年、ＴＢＩの処置のための最も有望な神経保護薬物であった。プロゲステロンは、炎症性因子（ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１β）を阻害することによって損傷後の悪転帰を低減し、引き続き、脳浮腫を低減させる（１、２）。Ｐｒｏｇ処置したラットは、損傷後、神経学的重篤度スコア（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｖｅｒｉｔｙ  Ｓｃｏｒｅ）（運動および認知機能についての試験）に対して有意な改善を示した（３）。Ｐｒｏｇは、損傷後にげっ歯類の両性別で浮腫を有効に軽減する（４）。またＰｒｏｇまたはその派生物のアロプレグナノロン（ＡＬＬＯ）の投与は、損傷後の細胞死（カスパーゼ−３）および神経膠腫（ＧＦＡＰ）（５）の因子の存在を減少させる（６、７）。下式１に、プロゲステロンの構造を示す。
【化１】
2014528457.tif 000002
【００２８】
ＰｒｏＴＥＣＴの第Ｉ相および第ＩＩ相である、エモリー大学で実施したＴＢＩのＰｒｏｇの臨床試験が完了している。ＴＢＩを処置するためにＰｒｏｇを用いるこの臨床試験の結果によって、救急処置室で７２時間の連続的な静脈内Ｐｒｏｇを投与されている軽度から重度のＴＢＩ患者において死亡率の５０％低下が示された。この臨床試験は、拡張グラスゴーアウトカムスケール、およびＤｉｓａｂｉｌｉｔｙ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ（Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ）のスコアを用いて損傷３０日後の転帰を調べた。Ｐｒｏｇを投与された中等度のＴＢＩ患者は、神経ステロイドを与えられなかった患者と比較して転帰が良好であり、重篤な脳損傷のある患者では測定できる相違はほとんどなかった（８）。しかし、６カ月という長期にわたる臨床試験で、重篤なＴＢＩ患者は、Ｐｒｏｇで処置した場合、長期間、良好な神経学的転帰があったことが示された（９）。米国の国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）は、現在、１２００人の中等度から重度のＴＢＩ患者でＰｒｏｇを用いて全国的な第ＩＩＩ相臨床試験を後援している（１０）。Ｐｒｏｇは、軽度から重度の種類のＴＢＩからＩＥＤ爆発までのある軍人を急性に処置することによってその利益を発揮し得る。
【００２９】
ｍＴＢＩは、全ての頭部損傷のうち８０％より多くを占め（１１）、現在では、最も一般的な神経学的診断と認識されている（１２）。しかし、神経ステロイド、例えば、Ｐｒｏｇは、軍人の集団でみられるｍＴＢＩに相当する動物モデルでは試験されていない。イラクの米国の退役軍人のうち約２５％に相当する約３６０，０００名においては、ｍＴＢＩは、いまだに重篤で、診断未確定の損傷である場合も多いことが報告されており、この「サイレントな蔓延（ｓｉｌｅｎｔ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ）」によって、記憶喪失および抑うつなどの目に見えない問題が生じる。他の症状としては、集中力の問題、感情制御の喪失、頭痛、疲労、被刺激性、めまい、視力障害および発作が挙げられる。反復性のｍＴＢＩによって、退役軍人は、交戦地から出た後何十年も、長期の神経心理学的および神経変性障害（下で考察）のリスクが高くなる場合が多い。このような転帰の１つは、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）であって、高い率の自殺を伴っている（１３、１４）。
【００３０】
一実施形態では、ＴＢＩに罹患している軍人の最も一般的なタイプであるｍＴＢＩを考慮して、本発明は、潜在的な害から部隊を保護し、損傷後の職務への安全迅速な復帰を促進するための経鼻スプレーとして反復的かつ容易に投与され得るｅｎｔ−Ｐｒｏｇを用いる治療を提供する。
【００３１】
中等度から重度の外傷性脳損傷（ＴＢＩ）後のプロゲステロン（Ｐｒｏｇ）摂取と、脳の炎症および浮腫の減少との間の関係は十分証明されている（１５〜１７）。また、Ｐｒｏｇは、ＴＢＩについてのげっ歯類モデルで、短期の認知機能および運動協調性を改善することを補助し（５、１６、１８）、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの重篤な長期の疾患を発症する被験体のリスクを低下することが示された（１９、２０）。中等度から重度のＴＢＩ回復の間のＰｒｏｇ投与の利点に対して広範な研究があるが、通常は脳震盪として知られる、ｍＴＢＩの症状に対するＰｒｏｇの影響に関する研究は極めて限られていた。
【００３２】
軽度から重度のＴＢＩと同様に、軽度のＴＢＩは、炎症、浮腫、ならびに運動および認知の機能の低下という同様の症状を有する。特徴的な、必然ではないが、互いに排他的な軽症ＴＢＩの合併症としては、びまん性軸索損傷、および反復性損傷、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）として知られる累積的な神経学的障害を生じる状態が挙げられる（２１）。過去の研究では、軽度から重篤なＴＢＩを経験したげっ歯類およびヒトの両方における転帰の改善のためのＰｒｏｇの急性投与が支持されるが、Ｐｒｏｇは軽症のＴＢＩの処置では決して用いられていない。
【００３３】
本発明の一実施形態では、Ｐｒｏｇは、軽症の損傷後１５分以内に急性に投与される。脳震盪のげっ歯類モデルは、転帰の指標として（下に考察）記憶障害を用いて確立された（下の実施例１の試験計画および方法（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）のセクションを参照のこと）。これらの研究では、Ｐｒｏｇを処置として用いて、オスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットのビヒクル（損傷で処置なし）群および偽（麻酔および頭皮切開のみ）群と比較する。
【００３４】
実験室での研究および臨床研究によって、プロゲステロン（Ｐｒｏｇ）は、炎症性因子を阻害し、続いて脳浮腫を低減することによって、外傷性脳損傷後の転帰が悪化することを有効に低減することが実証された（１、２）−しかし、神経保護的ステロイドを用いる動物およびヒトにおける研究は、中等度および重度の脳損傷に限られていた（４、７、２２）。軽症の外傷性脳損傷は、全ての頭部損傷のうち８０％超を占め（１０）、現在では最も一般的に診断される神経学的状態である（１１）。単一の軽症の外傷性脳損傷（ｍＴＢＩ）でさえ、長期の神経学的機能不全を生じ得、男性ではアルツハイマー病（ＡＤ）を発症するリスクを倍にすることが確認された（２３）。フットボール選手、ボクサーおよびレスラーが被った損傷などの、複数の損傷の場合は、神経心理学的な能力は経時的に低下する（２４、２５）。これらの個人は、脳震盪後症候群（Ｐｏｓｔ−Ｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＰＣＳ）に陥る場合が多い（２６）。この症状としては、受傷後長年にわたる場合が多い、睡眠、記憶、注意および認知の問題が挙げられる（２７）。ｍＴＢＩに陥ったイラクおよびアフガニスタンの米国の退役軍人のうち約２５％または約３６０，０００人では（１２）、簡易爆発物（ＩＥＤ）の爆風から複数の受傷をする確率も高い。不幸にも、ｍＴＢＩの動物モデルにおいて、またはヒトにおいて、神経ステロイドの使用による研究はほとんどないかまたは全くなく、脳損傷を受傷することが多い運動選手および軍人などの高リスクの集団は残ったままである。
【００３５】
一実施形態では、本発明は、個体がｍＴＢＩに陥った後１５分以内にＰＲＯＧを急性投与するための方法を提供する。
【００３６】
データによって、上記のｍＴＢＩモデルの妥当性、およびＰｒｏｇ（予防的および急性投与後）が、ｍＴＢＩ損傷の運動および認知の後遺症を有効に処置および防止することが示される（図７および図８）。しかし、反復性のｍＴＢＩおよび未報告の単回のｍＴＢＩの後の転帰の悪さを軽減するためには、薬物は、高リスクの集団に対して反復性に投与する必要がある。Ｐｒｏｇは、ｍＴＢＩに対して十分予防的な処置ではない、男性では、精子形成を抑制し、テストステロンのジヒドロテストステロンへの変換を阻害し、生殖器官を小さくする（２３、２８、２９）。以前の研究では、Ｐｒｏｇの鏡像または鏡像異性体（ｅｎｔ−Ｐｒｏｇ）として公知の別の化合物が、従来のプロゲステロン受容体（ＰＲ）に結合するが活性化はせず、ただし、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）を介して作用し、Ｐｒｏｇと等しい効力で炎症および浮腫の因子を低減し、Ｐｒｏｇよりも抗酸化活性を増大することが示された（３０、３１）。ｅｎｔ−Ｐｒｏｇは、Ｐｒｏｇと同じ性的な副作用を有さないはずであるが、競合的にＰＲを阻害し（３０）、そのためｅｎｔ−Ｐｒｏｇを用いる１つの可能性のある帰結は、妊娠の阻止である場合がある一方で、妊婦における出産の誘導（陣痛の早期発現）の場合さえある（３２、３３）。矛盾する研究によって、Ｐｒｏｇおよび関連の化合物はまた、凝固亢進を増大し得、またそれによって血栓症の危険を増大することが示唆された（３４）。下式Ｉは、プロゲステロンの構造を示す。
【化２】
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【００３７】
以前の研究（８）からの前臨床データによって、ｅｎｔ−Ｐｒｏｇが、中等度から重度の脳損傷誘発性浮腫を、Ｐｒｏｇと同等の有効性で減少させ（図１）、グルタチオン還元酵素（抗酸化剤）活性を、Ｐｒｏｇよりも有意に高い速度で増大する（図２）ことが示された。図１によって、ｅｎｔ−Ｐｒｏｇ（１６ｍｇ／ｋｇ）が脳の水分含量（浮腫の指標）ならびにＰｒｏｇおよびその代謝物アロプレナノロン（ＡＬＬＯ）を損傷後７２時間で正規化することが示される。＊は、有意差をｐ＜０．０５で示す。図２は、ｅｎｔ−Ｐｒｏｇがグルタチオン還元酵素の抗酸化活性を、受傷７２時間後に全ての他の受傷後群と比較して有意に増大することを示す。＊＊は、有意差をｐ＜０．０１で示す。
【００３８】
ｅｎｔ−Ｐｒｏｇは、ＴＢＩ後の良好な転帰に関連する因子と関連するが、古典的なプロゲステロン受容体（ＰＲ）を活性化することはなく、実際には、これは、ＰＲに対するＰｒｏｇ結合を阻害さえする（３１）。図３は、ＰＲ結合アッセイを示す。ｅｎｔ−Ｐｒｏｇの量が増大するにつれて、ＰＲに対するＰｒｏｇの結合は減少する。発表のために現在準備されている予備的研究は、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）と呼ばれる、Ｐｒｏｇがリガンドでもある、異なる受容体を活性化することによって、ｅｎｔ−ＰｒｏｇがＴＢＩを処置する潜在的な機序を特定した。Ｐｒｏｇおよびその鏡像異性体はいずれも、ＰＸＲ媒介性の転写を同等の有効性で増大した（図４および図５）。さらに、両方の神経ステロイド処置とも、ＰＸＲ活性化Ｐ−糖タンパク質を上昇した（図６）（３５）。Ｐ−糖タンパク質は、細胞内の水を輸送する膜チャネルであり、従って、脳損傷に関連する細胞傷害性の浮腫を低減する（３６）。
【００３９】
図３は、このデータは、ｅｎｔ−Ｐｒｏｇ投与を増大する条件下の最大結合能力に対する、古典的なヒトＰｒｏｇ受容体（ＰＲ）へのＰｒｏｇ結合の割合を示す。図３に示すように、ｅｎｔ−Ｐｒｏｇは、ＰＲに対するＰｒｏｇ結合を有意に阻害する。図４および図５によって、漸増濃度のＰｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇは、ルシフェラーゼ遺伝子レポーターによって測定すると、同等の有効性でヒトおよびマウスの両方でＰＸＲ媒介性の転写を増大することが示される。図６に示すように、Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇのいずれも、受傷７２時間後の脳損傷の境界領域におけるＰ−糖タンパク質（ＰＧＰ）のタンパク質を、それぞれ処置なし（ビヒクル）の群および偽群に比較して豊富にする。＊は、有意差をｐ＜０．０５で示す。
【００４０】
ｅｎｔ−Ｐｒｏｇを用いるＰＸＲの研究によって、従来のＰＲの活性がＴＢＩを有効に処置するために必要ではないことが示される。ＴＢＩの処置におけるＰｒｏｇとｅｎｔ−Ｐｒｏｇとの間の機構の相違の広範な利点および潜在的な限界を下に考察する。
【００４１】
ｍＴＢＩ動物モデルにおいてＰｒｏｇまたは他の神経ステロイドなどの治療剤を用いる研究はほとんどか全くなかった。１つのｍＴＢＩモデルで損傷を誘発するための制御された皮質刺激因子を用いて、図７に示すデータを得る。ｍＴＢＩを経験したラットは、モリス水迷路（Ｍｏｒｒｉｓ  Ｗａｔｅｒ  Ｍａｚｅ）水泳試験を用いる偽群と比較して台に対して大きい遅延を有する。これらの知見によって、ｍＴＢＩモデルは、急性の空間学習および記憶障害を引き起こすことが示される。
【００４２】
図７は、モリス水迷路試験から収集したデータを示す。これらのデータは、台に対する遅延を秒数で示す。−２４時間のポイントは、トレーニング期間に相当する。０時間は、ｍＴＢＩが導入された時点であり、損傷後最初の水泳試験は、４時間で行った。開始セクション（四分円）は、日と日の間で、および試行と試行の間で変えられた。＊は、ｐ＜０．０５での有意差を意味する。
【００４３】
提唱される研究は、動物モデルにおいてｍＴＢＩを処置するために設計されたその最初の研究である、ｍＴＢＩ動物モデルでの処置の効果を、中等度から重度のモデルで行われた有効性研究の質と比較して示している研究はほとんど行われていない。初期のｍＴＢＩ動物研究の１つは、外傷後記憶スコアをニューロンの欠失に対して関連付けた。これは、ｍＴＢＩおよび神経病理学的変化の後の認知障害の間の関連を示唆する最初の研究であった（３７）。後の研究によって、ヒトの脳震盪後症候群（Ｐｏｓｔ−Ｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＰＣＳ）で報告されたものと同様の損傷されたマウスにおける認知学習能力の永続的な障害および抑うつ様の挙動の出現が示された（３８）。この領域の文献で支持される予備データによって、ｍＴＢＩモデルが妥当であることが示される。
【００４４】
データによって、このｍＴＢＩモデルは、神経ステロイド、特にＰｒｏｇの有益な効果を示し得ることが示される。予防的に（１５分前）および急性後（１５分後）の両方に投与される場合、Ｐｒｏｇは、ビヒクル−損傷のラットと比較して、記憶能力を改善して台に対する遅延を減少する（図８）。Ｐｒｏｇに対して類似しているおかげで、ｅｎｔ−Ｐｒｏｇは、このｍＴＢＩモデルで同様に反応するはずである。
【００４５】
図８は、モリス水迷路試験から収集したデータを示す。このデータは、台に対する遅延の秒数である。プロゲステロン−処置（予防的（１時間前）と急性後（１時間後）)とビヒクルのラットとの間の有意な利点の相違は明白である。＊は、ｐ＜０．０５の有意差を意味する。
【００４６】
ＴＢＩは、一時的な機械的損傷に続いて、脳腫脹（２２、３９）、炎症（４０）および酸化的ストレス（２８）の増大によって媒介される二次的な神経細胞死によって特徴づけられる。Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇはいずれも、細胞死、脳腫脹および炎症の因子を同等に低減させる。しかし、ｅｎｔ−Ｐｒｏｇは、Ｐｒｏｇの３倍の抗酸化活性を有し、これは潜在的なｍＴＢＩの犠牲者に追加の利益を与える。ｅｎｔ−Ｐｒｏｇは、ＰＲ媒介性の転写を活性化しないが、ＰＸＲを活性化するので、脳損傷後、Ｐｒｏｇとは別の可能性のある治療となる（３１）。代替化合物の利点としては、男性におけるＰｒｏｇ処置で示された性的副作用、例えば、精子形成の抑制の低減、テストステロンからジヒドロテストステンへの変換の阻害、ならびに精巣の精巣上体およびライディッヒ細胞の大きさの減少が挙げられる（２９、３３、４１）。ｅｎｔ−Ｐｒｏｇは、ＰＲ（３１）を競合的に阻害し、従って、ＴＢＩ治療としてｅｎｔ−Ｐｒｏｇを用いることの潜在的な結果としては、妊娠女性における早産（３２、３４）、または妊娠の防止が挙げられる。また、これらは、Ｐｒｏｇまたはプレグナン誘導体が、血栓症の危険性の増大に関連するか否かに対して公開されたデータと矛盾しており、従って、試験された薬物の潜在的な高凝固性効果について試験するように研究が設計され得る（２３）。
【００４７】
本研究の成功した完了の後、臨床研究における使用の安全性を確保するための動物モデルにおける全ての必要な試験を行って、損傷を予防的に阻止する、および急性後に損傷を処置するための、鼻孔吸入物としてｅｎｔ−Ｐｒｏｇを用いることの安全性を確保してもよい。Ｐｒｏｇは、上述の副作用のために、潜在的には、損傷を防ぐために反復して用いるべきではなく、これは、反復性のｍＴＢＩをどのように効果的に処置するかを考慮した場合、疑う余地なく重要な要因である。一回のｍＴＢＩでさえ、男性でアルツハイマー病（ＡＤ）を発症するリスクを２倍に増大させることが確認され（４２）、反復性の受傷であればこれらの種類の長期リスクを増大させ、ｍＴＢＩ患者の症状の重篤度を悪化して、再受傷の際により悪転帰さえ引き起こす。ｅｎｔ−ＰｒｏｇがｍＴＢＩに関連する長期の転帰を有意に改善し得る理由は、以下にカバーされる。
【００４８】
ｍＴＢＩ後の長期の悪転帰を考察した場合、反復性の損傷のトピックは非常に関連性が高い。この理由は、各々の引き続く損傷の影響は、個々の症状の重篤度および重篤な神経学的障害を発症する可能性を指数関数的に増大するからである。Ｋａｎｅおよび共同研究者らは、反復性の損傷がＰＣＳを発症することが疑われるｍＴＢＩの犠牲者をどのように生み出すかを説明し、治療の選択肢の必要性を提唱している。彼らは、展開時間がどれほど長ければ複数の再配置の回数を増大するか、および防具の改善により、多くの軍人が多数の爆発および／または戦地以外の損傷に曝され、反復性のｍＴＢＩを引き起こしたかを考察している（４３）。不幸にも、反復性のｍＴＢＩは、診断が未確定である場合が多く、標準的なＭＲＩ脳スキャンで検出できる形態学的異常は示さない（２４、４４）。さらに、近年の知見では、アマチュアのフットボール選手に、複数のｍＴＢＩがあり、これが一回の脳震盪または脳震盪なしの個人と比較して神経心理学的な能力を低下させることが示されている（２５、２６、４５）。反復性のｍＴＢＩに陥った多くの個人がＰＣＳを経験する（４６、４７）。不幸にも、睡眠、記憶、注意力、および認知の障害を含む、ＰＣＳに関連する症状は、数年間にわたって永続する場合があり、他の場合には、一生涯にわたる可能性もある（２７、４８〜５０）。ＰＣＳの症状は現行の治療に抵抗性である場合が多い（５１）。
【００４９】
ＰＣＳは、このように処置が困難であるので、受傷後の時間の特定の急性のウインドウ内で、損傷が生じることを防ぐか、またはそれを処置するために従う治療のプロトコールを確立することが重要である。持続的なＰＣＳ症状を有する１２人のイラク戦争の退役軍人の研究では、ｍＴＢＩを有する退役軍人は、脳代謝速度の低下を示し、発話流暢性、認知処理速度、注意力および作業記憶の障害も示した（５２）。一実施形態では、本発明は、安全有効な神経ステロイド、ｅｎｔ−Ｐｒｏｇを用いて、いままで生じているＰＣＳを防ぎ得る。また、予防は、軍人の健康にも重要である。この理由は、同時に起こるｍＴＢＩおよびＰＴＳＤは、他の心理学的な健康問題：抑うつ（５３）、薬物乱用（５４）および自殺行動（５５、５６）を高率で伴っているからである。ＴＢＩに罹患している個体は、自殺を試みる機会が８．１％あるが、一般的な集団では１．９％の機会である（５７）。退役軍人保健局（Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）を通じて治療を受けている個人のうち、受傷歴のない個体と比較して、ｍＴＢＩ患者は、自殺による死亡が１．９８倍高い可能性があり、一方で、中等度から重度のＴＢＩ患者は、自殺による可能性が１．３４倍高いようであった。中等度から重度の受傷は、受傷の時点では病理学的に損傷が大きいが、軽症の受傷の心理学的な影響は、特に繰り返した場合、事実上、より悲劇的な転帰につながる場合がある（５８）。
【００５０】
自殺したナショナル・フットボール・リーグ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｏｔｂａｌｌ  Ｌｅａｇｕｅ）の選手（５９）およびレスラー（６０）、ならびにＵＳＭＣからの名誉除隊の８カ月後に自殺したイラク戦争の退役軍人の脳の近年の検査では、委縮も、挫傷も、出血も見られず、注目された唯一の状態は脳の腫脹であった。さらなる分析の際、研究によって、タウ−免疫反応性神経原線維変化（ＮＦＴ）および神経突起スレッドなどの慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）変化を表した脳組織を特定した（６１）。ｍＴＢＩ自殺の犠牲者のタウ−ＮＦＴ病理は、アルツハイマー病（ＡＤ）患者でみられる病理と極めて類似している。また、神経画像研究でも、ＡＤとＰＴＳＤとの病理の間に類似性を発見した（６２）。ＰＴＳＤとＡＤとの間、およびＡＤとｍＴＢＩの犠牲者の間の病理学的な類似性によって、ＰＴＳＤおよびｍＴＢＩの症状を区別することが困難な理由が説明され得る。ＣＴＥを伴うｍＴＢＩにも寄与するＡＤを引き起こす同じタウオパシーを考慮して、ＡＤを引き起こす高い傾向を有するＣＴＥを伴うｍＴＢＩを特定する多くの研究があった（２０、６３）。ＡＤの重篤度は、ＴＤＰ−４３の凝集を含む、異常な高リン酸化タンパク質タウ（ハイパーＰＯ４タウ）と関連していた（６４）。ＣＴＥの発症を伴う反復性のＴＢＩは、症例のうち約８３％で異常なＴＤＰ−４３の発現を引き起こす（６５）。一回のＴＢＩでさえ、男性に限るとＡＤのリスクを約２倍にする（４２）。頭部損傷後のＡＤのリスクにおける性差についての最も可能性の高い説明は、Ｐｒｏｇの役割であり、確かに、ＣＴＥ病理で特徴付けられる複数の頭部損傷を考慮に入れると、女性は、有害な長期転帰を妨げるのに十分に高レベルのＰｒｏｇを有することはない。それにもかかわらず、ｅｎｔ−Ｐｒｏｇは、長期の神経変性障害を妨げるのにＰｒｏｇと同じく有効であるか、またはＰｒｏｇよりも有効でさえあり得る。この理由は、ｍＴＢＩがＡＤを引き起こす１つの提唱される機構は、ＰＸＲの機能の低下および引き続くＰＧＰの減少によるからである（６６）。
【００５１】
ＰＸＲを活性化することによって、Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇが両方とも、偽群およびビヒクルのげっ歯類におけるレベルの約３倍までＰＧＰを増大したことが示された。ＡＤ（６５〜６７）、パーキンソン病（６８）および多発性硬化症（６９）のように、いくつかの疾患は、ＰＧＯの機能の増大から利益を得る場合がある。ＰＸＲ機構および引き続く脳のＰＧＰの活性化を増大する予防的または急性の処置は、ｍＴＢＩの悪転帰を引き起こすことを予防することによって、ｅｎｔ−Ｐｒｏｇの使用者に利益を与え、それによって、数年およびさらには数十年後の将来的な健康上の問題というリスクを排除する。ｍＴＢＩは時に診断が困難であり（同様に、患者は軽症であるとみなすものについて支援を探そうとしてない）ことを考えれば、本発明の一実施形態では、退役軍人は、海外の現役勤務にある時、予防薬として１日１回薬物を用いてもよい。当然ながら、ｅｎｔ−Ｐｒｏｇは、受傷したが、ＴＢＩの急激に増殖している二次カスケードに対して作用しているとき、受傷後急性後に用いられてもよい。使用を容易にするために、ｅｎｔ−Ｐｒｏｇは、経鼻吸入薬として用いられてもよい。経鼻吸入薬として神経ステロイドを用いるいくつかの潜在的な利点もある。
【００５２】
薬物投与の経鼻経路は、薬学の科学者および臨床家から一層注目を集め続けている。この理由は、この経路は、経口送達に関連する肝臓の初回通過除去を回避し、自己投薬のために容易にアクセス可能で、適切であるからである（７０）。また、経鼻投与は、脳を標的とする薬物に特に適切である。この理由は、特定の薬物溶液は、血液脳関門（ＢＢＢ）を迂回し、鼻腔から直接中枢神経系（ＣＮＳ）に到達し得るからである（これらの薬物の取り込みは、それらの分子量および親油性に依存する（７１、７２））。
【００５３】
船酔いの処置のための開発が成功した経鼻薬物療法の例は、Ｄｅｆｅｎｓｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（防御医学研究開発）によって以前に見出された。Ｎａｖｙ  ＴｉｍｅｓのスタッフライターであるＰａｔｒｉｃｉａ  Ｋｉｍｅは、「経鼻スプレーは、船酔いの発生を防止し得る（Ｎａｓａｌ  ｓｐｒａｙ  ｍａｙ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｏｎｓｅｔ  ｏｆ  ｓｅａｓｉｃｋｎｅｓｓ）」と題した文献で、必要とされる直前に、乗り物酔い薬の予防用量を送達する経鼻スプレーを記載している。Ｋｉｍｅはさらに、船酔いの経鼻スプレーが、鼻腔で身体に容易に吸収される低濃度の活性成分スコポラミンによって有効であり得ることを報告している（濃度が低ければ薬物の副作用が軽減される）（７３）。より低濃度のｅｎｔ−Ｐｒｏｇが必要である場合があり、これは、反復投与の際に注目すべき副作用をほとんど生じない。従って、ｅｎｔ−Ｐｒｏｇの予防的な経鼻スプレーは、他の薬物および薬物送達機序に対して好ましい場合がある。
【００５４】
経鼻送達は、鼻の上皮膜の比較的高い透過性、肝臓の初回通過除去の回避により、中枢神経系を標的とする治療薬の最も魅力的な非侵襲性の経路の１つである。経鼻送達は、投与が容易であり、個人による自己投薬を可能にする。鼻の粘膜毛様体のクリアランスは、経鼻薬物送達に対する最も重要な制限要因の１つである。鼻の粘膜毛様体のクリアランスは、薬物吸収が生じる時間を大幅に制限し、持続的な薬物投与を有効に妨げ得る。しかし、特定のホルモンの鼻投与により、より完全な投与が得られたことが証明されている。一実施形態では、本発明は、より局所的な送達のためにＰｒｏｇまたはｅｎｔ−Ｐｒｏｇの経鼻送達を使用し、それによって、Ｐｒｏｇまたはｅｎｔ−Ｐｒｏｇの何らの可能性のある副作用を回避する。
【００５５】
シクロデキストリンは、デンプンの酵素分解から得られる環状オリゴ糖である。シクロデキストリンは、経鼻投与による薬物の送達を改善するために広く用いられてきた。経鼻送達の改善は、鼻の粘膜の透過性における変化、薬物溶解度の変化、および送達部位での薬物の代謝速度の変化に起因していた。本発明の組成物における使用のための適切なシクロデキストリンとしては、ヒドロキシプロピル−β−ＣＤ（ＨＰβ−ＣＤ）、ヒドロキシプロピル−γ−ＣＤ（ＨＰγ−ＣＤ）、ペルメチル−β−ＣＤ（ＰＭβ−ＣＤ）、およびスルホブチルエーテル−β−ＣＤ（ＳＢＥβ−ＣＤ）が挙げられる。本発明の一実施形態では、経鼻投与に適切な組成物の、シクロデキストリンとＰｒｏｇまたはｅｎｔ−Ｐｒｏｇとの比は、約１：１であり得る。本発明の一実施形態では、経鼻投与に適切な組成物のシクロデキストリン対Ｐｒｏｇまたはｅｎｔ−Ｐｒｏｇの比は、約２：１であり得る。
【００５６】
本発明の一実施形態では、経鼻投与に適切なＰｒｏｇまたはｅｎｔ−Ｐｒｏｇを含有する組成物は、１種以上の生体接着性ポリマーを含んでもよい。いくつかの種類のポリマー、例えば、カルボポールは、無理なく長期間、鼻粘膜上に結合して、急激な鼻クリアランスを妨げ得る。本発明の組成物で用いられ得る生体接着性ポリマーとしては、９３４、９４０、９４１、９４２、９８０および９８１が挙げられる。本発明の一実施形態では、経鼻投与に適切な組成物の、Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇの適切な溶液中の生体接着性ポリマーの割合は、０．１％であってもよい。本発明の一実施形態では、経鼻投与に適切な組成物の、Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇの適切な溶液中の生体接着性ポリマーのパーセントは、０．５％であってもよい。本発明の一実施形態では、経鼻投与に適切な組成物の、Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇの適切な溶液中の生体接着性ポリマーの割合は、１％であってもよい。
【００５７】
本発明の一実施形態では、経鼻投与に適切なＰｒｏｇまたはｅｎｔ−Ｐｒｏｇを含有する組成物は、１種以上の界面活性剤を含んでもよい。本発明の組成物中で用いられ得る界面活性剤としては、種々のポリエチレングリコール類（ＰＥＧ）が挙げられる。本発明の一実施形態では、経鼻投与に適切な組成物の、Ｐｒｏｇまたはｅｎｔ−Ｐｒｏｇの適切な溶液中の界面活性剤のパーセントは１％であってもよい。本発明の一実施形態では、経鼻投与に適切な組成物の、Ｐｒｏｇまたはｅｎｔ−Ｐｒｏｇの適切な溶液中の界面活性剤のパーセントは２％であってもよい。本発明の一実施形態では、経鼻投与に適切な組成物の、Ｐｒｏｇまたはｅｎｔ−Ｐｒｏｇの適切な溶液中の界面活性剤のパーセントは５％であってもよい。
【００５８】
本発明の一実施形態では、経鼻投与に適切なＰｒｏｇまたはｅｎｔ−Ｐｒｏｇを含有する組成物は、その組成物のｐＨを制御するための１種以上の緩衝剤を含んでもよい。本発明の組成物に用いられ得る緩衝剤としては、クエン酸およびクエン酸ナトリウム二水和物が挙げられる。本発明の一実施形態では、経鼻投与に適切な組成物の、Ｐｒｏｇまたはｅｎｔ−Ｐｒｏｇの適切な溶液中の緩衝剤のパーセントは、０．００１％であってもよい。本発明の一実施形態では、経鼻投与に適切な組成物の、Ｐｒｏｇまたはｅｎｔ−Ｐｒｏｇの適切な溶液中の緩衝剤のパーセントは、０．００５％であってもよい。
【００５９】
本発明の組成物の浸透圧は、プロピレングリコールによって制御されてもよい。
【００６０】
本発明の組成物がゲルである場合、この組成物は、ゲル化剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボポール、カルボキシメチルセルロースおよびエチルセルロースを含んでもよい。
【００６１】
本発明の組成物は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および塩化ベンザルコニウムなどの防腐剤を含んでもよい。
【００６２】
本発明の組成物に適切な溶媒としては、水、植物油およびエタノールが挙げられる。
【００６３】
過去のデータおよび予備データによって、新規な神経ステロイドであるｅｎｔ−Ｐｒｏｇが、ｍＴＢＩのための実行可能な予防的処置となる可能性を有することが示される。経鼻吸入物の使用は、ｍＴＢＩと関連する悪転帰を軽減するのに必要な濃度を下げ、望ましくない副作用を妨げるべきである。さらに、経鼻投与は、軍事状況における送達のさらに実際的な手段である。
【００６４】
一実施形態では、本発明は、予防的および急性後の経鼻治療を介する予防および処置の領域において、軽症の外傷性脳損傷（ｍＴＢＩ）を有する軍人の標準的な治療を改善する方法を提供する。本発明の一実施形態では、活性成分は、治療用のｅｎｔ−Ｐｒｏｇである。Ｐｒｏｇは、中等度から重度の脳損傷を有する患者の処置において有効であった。ｅｎｔ−Ｐｒｏｇは、潜在的に副作用が少ないｍＴＢＩを処置するのにおけるＰｒｏｇとは別の実現可能な臨床代用物であり得る。ｅｎｔ−Ｐｒｏｇは、損傷に対する悪転帰を低減し、同様にＰｒｏｇは、中等度から重度のＴＢＩの動物モデルでも悪転帰を低減するので、ｅｎｔ−Ｐｒｏｇは、軽症の損傷モデルにおいても、Ｐｒｏｇと同様に有効であり得る。ｍＴＢＩの処置においてｅｎｔ−Ｐｒｏｇを用いることに対して大きな利点があり、すなわち、薬物は、天然のＰｒｏｇに比較して、有害な副作用を有することなく、予防的にかつ定期的に用いられ得る。本発明の一実施形態では、ｅｎｔ−Ｐｒｏｇは、野外でのアクセスおよび使用を容易にして、必要な用量を減少してさらに副作用を制限するために経鼻的に送達される処方物の一部であり得る。治療剤としてｅｎｔ−Ｐｒｏｇを用いることは、損傷後の悪転帰、特に神経心理学的および神経変性障害、例としては、現在、軍人が抱いている大きな懸念である、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）および心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）（反復性の脳損傷に関連する）を低減し得る。
【００６５】
Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇは関連性があるものの、同一の化合物ではない。例えば、投与される場合、種々の副作用を有し得るＰｒｏｇと比較して、ｅｎｔ−Ｐｒｏｇは、副作用が極めて少ない高リスク集団でｍＴＢＩの予防のための安全な処置を提供することができる。
【００６６】
Ｐｒｏｇ処置の予想される利点としては脳炎症の減少、改善された行動機能、およびびまん性軸索損傷の低下が挙げられる。
【００６７】
一実施形態では、本発明は、脳震盪患者、特にスポーツに関連するおよび軍事関連の損傷、ならびに複雑な結果を伴う反復的な損傷を受けるリスクがある運動選手を迅速に処置するための方法を提供する。数人の研究者によれば、ほとんどの人々が、脳震盪が脳の損傷であることを認識しておらず、またその結果も誤解される場合が多い（７４）。軽症の頭部外傷の後のＰｒｏｇの急速投与は、野外で従うためのプロトコールを救急医療人員に提供し得る。そして、処置される軽症のＴＢＩの割合が増大することによって、大衆の認識が高まる。図９では、データポイントは、台に対する遅延を秒数で示す。０日目はヒットの日数である。０〜４日は、全て衝撃後である。開始セクション（四分円）は、日と日の間で、および試行と試行の間で変化した。図９では、「＊」は、ｐ＜０．０５での有意差を意味する。
【００６８】
一実施形態では、本発明は、点鼻薬、点眼薬および経鼻スプレーである組成物を提供する。経鼻適用のために、スプレーとして、すなわち空気中の微細な分散の形態で、または従来のポンプの手段で適用される溶液または懸濁液を用いてもよい。
【００６９】
一実施形態では、本発明は、点眼薬、点鼻薬または経鼻スプレーの形態でＰｒｏｇまたはｅｎｔ−Ｐｒｏｇを含有する組成物を提供する。経鼻スプレーは、例えば、従来のスプレースクイーズボトルまたはポンプの使用によって形成されてもよい。
【００７０】
Ｐｒｏｇまたはｅｎｔ−Ｐｒｏｇの鼻腔内投与のための薬物送達系における使用のための適切な非毒性の薬学的に許容される担体は、エストロゲンなどの他のステロイドの経鼻の薬学的処方物のために用いられる担体を含んでもよい。適切な担体の選択は、所望の特定の経鼻剤形の正確な性質、例えば、Ｐｒｏｇまたはｅｎｔ−Ｐｒｏｇが、経鼻溶液（点滴としてまたはスプレーとしての使用のため）中への処方物であるべきか否かに依存する。
【００７１】
本発明の処方物は、防腐剤および／または安定化剤を含んでもよい。これらとしては、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびそのアルカリ塩（例えば、ジアルキル塩、例えば、ジナトリウム塩、カルシウム塩、カルシウム−ナトリウム塩）、低級アルキルｐ−ヒドロキシベンゾエート、クロルヘキシジン（例えば、酢酸塩またはグルコン酸塩の形態）およびホウ酸フェニル水銀が挙げられる。他の適切な防腐剤はとしては、薬学的に有用な四級アンモニウム化合物、例えば、塩化セチルピリジニウム、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム、一般には、「セトリミド」として公知の、Ｎ−ベンジル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−｛２−［４−（２，４，４−トリメチルペンタン−２−イル）フェノキシ］エトキシ｝エタンアミニウムクロライド、一般には「塩化ベンゼトニウム」として公知、およびミリスチルピコリニウムクロライドがある。これらの化合物の各々は、０．００２〜０．０５％、例えば、０．０２％の濃度で用いられ得る（液体処方物中の重量／容積、あるいは重量／重量）。しかし、四級アンモニウム化合物内の好ましい防腐剤は、アルキルベンジルジメチルアンモニウムクロライドおよびそれらの混合物、例えば、一般には「塩化ベンザルコニウム」として公知である化合物である。
【００７２】
本発明の一実施形態によれば、安全な復帰のために必要な時間を短縮するだけでなく、将来の軽症ＴＢＩも防御し得る、ＴＢＩに陥った運動選手のための処置ストラテジーが提供される。
【００７３】
ｅｎｔ−Ｐｒｏｇを投与することは、潜在的なｍＴＢＩが引き起こす前に投与するための安全な予防的処置である。経鼻（ＩＮ）投与は、経鼻スプレー、点滴およびゲルに対する薬学的研究におけるシフトに起因して腹腔内（ＩＰ）投与よりも副作用が少ない場合があり、薬物投与の経鼻経路は、薬学の科学者および臨床家からますます注目を集め続けている。この理由は、この経路は、経口送達に関連する肝臓の初回通過除去を回避し、自己投薬に関して容易にアクセス可能で、適切であるからである（７０）。また、経鼻投与は、脳を標的とする薬物に特に適切である。この理由は、特定の薬物溶液は、血液脳関門（ＢＢＢ）を迂回し、鼻腔から直接中枢神経系（ＣＮＳ）に到達し得るからである（これらの薬物の取り込みは、それらの分子量および親油性に依存する（７１、７５）。経鼻送達は、薬物の脳レベルを増大するが、全身濃度は低下し、従って、有害な副作用は少なくなるはずである。
【００７４】
数人の研究者らによれば、ほとんどの人々が、脳震盪が脳の損傷であることを認識しておらず、またその結果も誤解される場合が多い（７４）。ｅｎｔ−Ｐｒｏｇが安全な処置として確立されれば、この神経ステロイドの反復性の投与は、短期および長期の転帰の悪化を防ぎ、健康管理の費用を低減する（７６）。
【００７５】
一実施形態では、本発明は、ｍＴＢＩに罹患している個人の可能性がある、コンタクトスポーツまたは武力の行使などの活動に関与する個人に対する予防的なｅｎｔ−Ｐｒｏｇ投与の方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ｍＴＢＩに罹患している個人を正確に処置するための方法を提供する。ｍＴＢＩに罹患しているリスクが高いこのような運動選手および軍人の集団に関しては、ｅｎｔ−Ｐｒｏｇが必要に応じて処置のために容易に利用可能にされ得る。経鼻送達系、静脈内（ＩＶ）送達などを含めてｅｎｔ−Ｐｒｏｇのための種々の送達システムを用いて、個体のための有効な処置ストラテジーを提供してもよい。急性の処置ストラテジーに関して、ｅｎｔ−Ｐｒｏｇの経鼻投与は、取り込みの時間を短くし、脳に到達するｅｎｔ−Ｐｒｏｇの濃度を増す場合がある。Ｐｒｏｇの使用を上回るｅｎｔ−Ｐｒｏｇの使用の利点は、ｅｎｔ−Ｐｒｏｇは全身の副作用が少ないということである。
【００７６】
本発明の多くの実施形態を詳細に記載してきたが、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲から逸脱することなく、改変および変形が可能であることが理解される。さらに、本開示における全ての例は、本発明の多くの実施形態を示すが、非限定的な例として示されるものであり、従って、そのように例示される種々の態様を限定すると解釈されるべきではないことが理解されるべきである。
【００７７】
実施例
実施例１
特定の目的
３つの特定の目的を、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、行動試験および分子分析によって試験する：（１）びまん性軸索損傷の減少を評価するため、Ｐｒｏｇ処置動物の損傷した脳のＭＲ画像を撮影し、ビヒクル対象群と損傷の２４時間および５日後に比較する。右の前頭皮質における病変の大きさおよび右の前頭皮質を側頭皮質に接続する神経突起のびまん性軸索損傷は、ビヒクル対象群と比較して処置で低減されると仮定される。（２）またこの動物は、水迷路（学習、記憶および不安様行動および平均台（運動協調性）を含む、損傷後最初の５日間にわたる行動試験を受けた。Ｐｒｏｇ処置群の動物は、ビヒクル対象群の動物よりも良好な損傷後機能を達成すると仮定される。（３）２４時間で、および行動試験（５日）の完了後、動物を屠殺して、それらの脳組織をタンパク質組成について分析した。以前の研究では、Ｐｒｏｇは、ＴＢＩに続く炎症性カスケードを促進する、Ｂｃｌ−２、ＩＬ−１βおよびＣｘｃｌ−１０（５０、７７）の３つの特定の遺伝子を下方制御した。従って、動物の剖検は、上記の遺伝子によってコードされるタンパク質、同様に、タンパク質ホスホ−τ（ＴＢＩ後に伝統的には上方制御される）の増殖の評価を包含する（２０）。Ｐｒｏｇ処置群における動物の損傷された壊死組織は、これらの炎症性シグナル伝達因子をより低濃度で含むことが予想される。
【００７８】
本実施例における試験の結果は、損傷後のＰｒｏｇ処置が、急性に投与される場合に軽症のＴＢＩを処置するのに有効であることを示し得る。
【００７９】
試験計画および方法
動物およびプロゲステロンの処置：６０匹のオスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを（１）軽症のＴＢＩおよびＰｒｏｇを受ける処置群、（２）軽症のＴＢＩを受けるビヒクル群、および（３）外科的な対照として有用な偽群の３群に均等に分ける（ｎ＝２０）。処置群における動物は、術後１５分間、Ｐｒｏｇの腹腔内投与（１６ｍｇ／ｋｇ）をされる。
【００８０】
ビヒクル処置群は、同じ１５分の時点で２．５％シクロデキストリンを与えられる。偽群は、注射を与えられない。３０匹の動物（ｎ＝１０／群）は、５日の行動試験および受傷５日後の炎症性因子の分子分析を受ける。１８匹の動物（ｎ＝６／群）を、炎症因子の２４時間の受傷後分析に用いる。１２匹の動物（ｎ＝４／群）を、受傷後２４時間および５日の両方でＭＲＩを用いて評価する。
【００８１】
脳震盪の軽症外傷性脳損傷モデル（Ｍｉｌｄ  Ｔｒａｕｍａｔｉｃ  Ｂｒａｉｎ  Ｉｎｊｕｒｙ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎ）：術前に、動物を最初イソフルラン（２−クロロ−２−（ジフルオロメトキシ）−１，１，１−トリフルオロ−エタン）導入を用いて４分間麻酔する。動物の頭皮を剃毛して、イソプロパノールおよびベタジンで清浄にする。術中、麻酔をイソフルランで維持する。正中切開を行って、頭皮を内側前頭板の上にまくる。６ｍｍ直径、１ｍｍ厚のゴムのヘルメットを頭骨上に固定する。次に、動物を、第六頸椎で、金属台上で腹臥位に両側に固定する。動物の頭部を、フォームパッド上に置く。５ｍｍの金属衝撃部材を備える電気制御の損傷デバイスを、ゴムヘルメット上に置く。垂直から１１度の角度で６．２ｍ／ｓの衝撃速度を用いて、びまん性軸索損傷を誘発するには頭部の回転を要する、ヒトの脳震盪で起こるのと同様の、閉鎖型の頭部損傷を引き起こす。３回の閉鎖式の頭部衝撃をゼロ、３０分および６０分の以下の時点で行う。動物を加熱したケージに戻した後、連続的な衝撃のために再度麻酔する。偽群の動物には、衝撃を与えずに頭皮切開を行い、脳震盪のラットと同じ期間麻酔下に維持する。
【００８２】
行動試験
モリス水迷路：１３３ｃｍの直径の丸いタンクを、不透明な水で６４ｃｍの深さまで満たす。台（１１ｃｍ×１１ｃｍ）を２ｃｍの深さまで浸漬して、東北四分円の中心のプールの壁から約２８ｃｍに置く。各々の動物を、再訓練し、次いで５日間試験する。各試行の最初に、ラットをプールに入れて、台に達するまで泳がせる。各々のラットの能力は、台に対する遅延、台への通路の長さ、およびラットがほとんど外縁上かまたはタンクの中心付近で泳いだかによって測定する。水迷路試験は、空間学習、記憶および不安を評価する。
【００８３】
平均台：この試験では湾曲した台および直線状の台の２つの平均台を使用し、両方とも４ｃｍ〜１ｃｍの段階的な幅である。動物を術後初日で開始する５連続日で試験する。げっ歯類が平均台を渡るのにかかる時間およびそれらのスリップの回数を記録する。平均台は、運動制御およびバランスを評価する。
【００８４】
磁気共鳴画像化：２１テスラの磁石を用いて動物での損傷および処置の形態学的効果を試験する。麻酔導入は、閉鎖式導入チャンバ中でイソフルランガスを用いて１．０〜２．５％（ｖ／ｖ）で行う。４〜５分内に動物を導入チャンバから取り出して、１．０〜１．５（ｖ／ｖ）％のガス流量を維持して動物の鼻に導入しながら、ＭＲＩスキャナの内側に入れる。典型的なＭＲ画像化時間は約１時間である。拡散テンソル画像化ＭＲソフトウェアを用いて、軸索異方性（原形質膜の損傷に相当する）の測定によってびまん性軸索損傷を評価する。
【００８５】
拡散強調ＭＲソフトウェアを用いて、脳浮腫および病変の大きさを評価する。ＭＲ画像を受傷２４時間および５日後に撮る。Ｐｒｏｇ処置の効果は、ビヒクルコントロールの画像と比較した場合確認される。
【００８６】
組織収集および分析：受傷の３時間および２４時間後に、動物をＣＯ２で安楽死させて、損傷部位の周縁部から切り出して脳サンプルを収集する。炎症性タンパク質組成物の分析を、ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡを用いて行う。
【００８７】
統計学的分析：一元ＡＮＯＶＡ、ｔ検定およびＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ事後検定の使用を用いて、全ての実験群を比較した場合、ｐ＜０．０５で有意差設定を決める。
【００８８】
上記の研究によって、軽症のＴＢＩに罹患しているヒトで急性にＰｒｏｇを用いるための基礎が得られる。高リスクの集団（運動選手および軍人）が特定されれば、Ｐｒｏｇは、必要とされる処置に容易に利用可能できる。さらに、この経鼻送達法は、この経路が、取り込みの時間を短くし、全身の副作用が少ない脳の濃度を特に増大することを考慮して、これらの高リスク集団のための処置ストラテジーとしてＰｒｏｇをさらに改善することにこだわっている。
【００８９】
実施例２
要約
Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇは、オスのおよびメスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに対して鼻腔内で（ＩＮ）および腹腔内（ＩＰ）の両方で投与される。これらの神経ステロイドは、２、４および８週間の間、毎日の処置として用いられる。ビヒクル（ビヒクル処置）および偽（未処置）のラットを用いて、神経ステロイド処置ラットの転帰を比較する。オスのおよびメスのげっ歯類における性的副作用、同様にオスのげっ歯類における凝固効果もまた検討される。
【００９０】
特定の目的１
反復した神経ステロイド処置後のオスの性機能を評価する
処置後のオスの性機能を評価するために、げっ歯類を評価し、ビヒクル対象群に対して２週および４週の終わりに比較する。オスのげっ歯類を、２週間および４週間にわたり１６ｍｇ／ｋｇおよび３２ｍｇ／ｋｇの両方で、毎日ＰｒｏｇでＩＰ処置およびＩＮ処置した、２週間および４週間にわたり１６ｍｇ／ｋｇおよび３２ｍｇ／ｋｇの両方で毎日ｅｎｔ−ＰｒｏｇでＩＰ処置およびＩＮ処置した、２週間および４週間にわたり毎日ビヒクルで処置した、ならびに２週間および４週間にわたり偽（未処置）、の２０の群に分ける（ｎ＝３）。血清のジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）対テストステロンの比、精巣上体精子濃度、ならびに精巣、精巣上体および前立腺という相対生殖器官重量を測定する。Ｐｒｏｇとは異なり、ｅｎｔ−Ｐｒｏｇは、ＤＨＴ濃度を下げないことを確認することが重要である：ＤＨＴは、若い男性における性活動の主な予測因子であることが示された（７８）、これは、前立腺機能を調節する（７９）、そして低いＤＨＴレベルは、低い精液量および運動性の低下と関連している（８０）。性機能は、Ｐｒｏｇ処置したげっ歯類よりもｅｎｔ−Ｐｒｏｇ処置したげっ歯類で有意に良いこと、およびこれらの神経ステロイドの副作用の相違は、両方の濃度の増大および処置の長さとともに悪化されることが仮定される。
【００９１】
特定の目的２
処置後の血液凝固評価
神経ステロイドの凝固効果を評価するために、血清サンプルを２、４および８週の各々の終わりに採取する。げっ歯類を、目的の項目について上記で列挙される、同じ２０の群に分ける（ｎ＝３）。血液を凝固時間に基づいて評価する。凝固を引き起こすＰｒｏｇおよびＰｒｏｇ−関連化合物のリスクは、市販の経口避妊薬に関与する研究で主に探索された。いくつかの研究では、凝固亢進のリスクは、主にエストロゲンに起因し得ることが示唆されるが、他の研究では、Ｐｒｏｇは、障害の遺伝的素因を伴うものに関してリスクを増大することが示唆される（８１、８２）。Ｐｒｏｇが、いくつかの凝固亢進効果を有すると仮定すれば、ｅｎｔ−Ｐｒｏｇ群について凝固する時間は、Ｐｒｏｇ群についての時間よりも長くなると仮定される。さらに、凝固する時間の相違は、神経ステロイドの濃度および処置の時間の両方とともに増大する。ＩＮ群はＩＰ群よりも副作用が少ないことも期待される。
【００９２】
ＤＨＴおよびテストステロンの収集／分析
血漿ＤＨＴおよびテストステロンのレベルは、キット製造業者が提供する標準的なプロトコールによってＤＲＧ  ＥＬＩＳＡキットを用いてＥＬＩＳＡ方法によって測定する。
【００９３】
精巣上体の精子濃度の収集および測定
精巣上体の精子濃度は、Ｒ．Ｂａｌおよび共同研究者（８４）が引用した改変Ｔｕｒｋ法（８３）によって決定する。右の精巣上体を細かく切って、等張の生理食塩水中で、室温で４時間インキュベートさせる。その溶液を濾過して、キャピラリーチューブ中に吸引し、希釈率を測定する。次いで溶液を血球系カウントチャンバに移して、光学顕微鏡の助けを借りて精子細胞をカウントする。
【００９４】
生殖器官の収集および秤量
処置の時点で、男性を安楽死させる。精巣、精巣上体および腹側前立腺を取り出して、結合している結合組織を除去して秤量する。生殖器官の相対重量を、総体重に対して計量することによって算出する。
【００９５】
凝固時間に関する血清：血液を処置の休止後に収集する。血漿を単離して、外因性および内因性の凝固時間をアッセイする。ＰｒａｔｔおよびＭｏｎｒｏｅ（８５）が記載したマイクロプレートベースの血液凝固アッセイを、３０μＬの血漿および３０μＬの緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％ポリエチレングリコール、ｐＨ７．４）を、マイクロプレートのウェルに添加して、これを次に２５℃で２分間インキュベートすることによって行う。凝固は、プロトロンビン時間の試験（外因性の凝固カスケード）については２５ｍＭのＣａＣｌ２中に５％のトロンボプラスチンの３０μｍＬ１、および活性化部分トロンボプラスチン時間の試験（内因性の凝固カスケード）については３０μＬの活性化部分トロンボプラスチン試薬を添加することによって開始する。血漿の濁度の増大は、動力学的なマイクロプレートリーダーを用いて４０５ｎｍの吸光度の変化によって測定する。
【００９６】
オスとメスの交配
本研究の開始時点で、メスのげっ歯類は６３日齢である。最初の２週間の間、膣のスメアを採取してげっ歯類の受胎能力を確認する。３週目の最初の日、１匹の未処置のげっ歯類を、各々のメスのげっ歯類と交配する。交配期間の間、毎朝、メスのげっ歯類を精子プラグまたは膣スメア中の精子の存在について検査し、精子が存在する場合、そのメスのげっ歯類の妊娠を試験する。妊娠していないメスはオスのげっ歯類に戻す。この手順をさらに６週間継続する（８６）。メスのげっ歯類を、流産の兆候に関して毎日モニターする。生まれた同腹仔を生存度の兆候について検査する。
【００９７】
安楽死
処置の終了時に、ラットをＣＯ２によって安楽死させる。
【００９８】
統計学的分析
一元ＡＮＯＶＡ、ｔ検定およびＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ事後検定を用いて、各々の計画内の全ての実験群を比較した場合、ｐ＜０．０５で有意差を決定する。
【００９９】
実施例３
特定の目的１
プロゲステロンおよびその鏡像異性体を用いる予防的および急性後処置が、軽症の外傷性脳損傷に対する応答を改善する腹腔内の用量および時間を決定する。
ｍＴＢＩのためのｅｎｔ−Ｐｒｏｇ処置の有効性を決定して、天然のＰｒｏｇ処置と比較する。中等度から重度のＴＢＩのモデルでのこれらの２つの神経ステロイドでの過去の研究に基づいて、損傷後１時間で１６ｍｇ／ｋｇのＩＰ用量は、ｍＴＢＩ後の最適防御を提供するという仮定がなされる。予防的処置に関して、Ｐｒｏｇの最適のバイオアベイラビリティを得るための時間枠を示す以前の研究に基づくｍＴＢＩの誘導の前の１時間と１５分との間を考慮した場合、この同じ投薬量が、最も有益である。さらに、Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇは、予防的投与で見られる大きい有効性でもって、ｍＴＢＩに対する応答を等しく改善するという仮説がなされる。ｍＴＢＩは、ラットにおいて、電気制御した衝撃材によって頭骨の右前頭板に対して閉鎖式頭部外傷を与える新規な動物モデルを用いて誘導される。ラットを腹腔内（ＩＰ、以前の研究で用いられた標準方法）注射し、３つの異なる濃度のＰｒｏｇまたはｅｎｔ−Ｐｒｏｇを用いて、予防投与および急性後投与のための最適投薬量を決定する。薬物が有効である、予防的処置のための時間のウインドウを確立する。行動試験、画像（浮腫）、血清および脳薬物濃度、血清バイオマーカー濃度および病理学的な脳タンパク質（細胞死、脱髄および炎症のマーカー）の量を分析する。この特定の目的からの所見によって、有効性の基準を確立する。この理由は、これらは、それぞれ、損傷の前後の薬物投与の用量および時間に関連しているからである。予備的研究によって、ＩＰ  Ｐｒｏｇは、ｍＴＢＩの前におよび後に投与された場合、行動上の転帰を改善することが実証された。この目的で行われた研究によって、ｅｎｔ−Ｐｒｏｇが、特に、予防薬としてヒトに繰り返して用いられた場合と比較して、何らの副作用に限定されると想定すれば、ｍＴＢＩの処置に関してＰｒｏｇと同じくらい防御的であるか否かを決定できるようになる。薬物の合成、処方および薬物動態の研究も、この特定の目的において概説する。
【０１００】
特定の目的２
プロゲステロンおよびその鏡像異性体を用いる予防的および急性後処置が、軽症の外傷性脳損傷に対する応答を改善する鼻腔内の用量を決定する。
Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇの鼻腔内（ＩＮ）投与の有効性を、この実施例の特定の目的１において分析したＩＰの有効性と比較する。以前の研究によって、ＩＮ薬物投与で、良好な中枢神経系の送達が達成され、ＩＰ投与よりも、有効に血液脳関門を横切ることが示された。ＩＮ投薬における有意な減少は、本実施例の特定の目的１において確立された最適のＩＰ投薬量に比較して等価な正の応答を有すると仮定される。さらに、ＩＮで投与された投薬量の４倍の減少によって、本実施例の特定の目的１で確立された最適のＩＰ投薬量よりも統計学的に高い有効性が示されると仮定される。特定の目的１では、Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇは、等価な正の応答を誘導し、予防的な投与は、急性後処置よりも有利であると仮定される。ラットは、特定の目的１においてと同様にｍＴＢＩの誘導の前後にＰｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇを投与される。Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇは、特定の目的１で概説される有効性に関して時間の予防的および急性後のウインドウ内で投与される。両神経ステロイドとも、この実施例の特定の目的１で特定された最も有効なＩＰ濃度でＩＮ投与される。本実施例の特定の目的１で概説されるバイオアベイラビリティ研究に基づいて、両方の薬物とも最も有効なＩＰ濃度よりも２倍低い濃度で投与される。本実施例の特定の目的１で記載されるものと同一の試験方法は、この目的でのＩＮ投与後の有効性を確立することである。最終的な目標は、脳循環からの吸収を最大にして、全身循環への送達を最小にするＩＮ薬物投与の最適の用量を決定し、同時に脳浮腫、細胞死および脱髄を軽減することである。この目的は、ＩＮ投与がＩＰ投与よりも有効にＰｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇを脳に送達するか否か、および損傷の前対後で投与された場合、どの送達方法がより脳保護的であるかを決定するように計画される。さらに、特定の目的１と同様に、特定の目的２の実験は、ｅｎｔ−ＰｒｏｇおよびＰｒｏｇが、ｍＴＢＩの処置で等しく有効であるか否かを決定することを助ける。
【０１０１】
特定の目的３
プロゲステロンおよびその鏡像異性体を用いる予防的および急性後処置が、反復性の軽症の外傷性脳損傷に関連する病理を低減する程度を決定する。
反復性のｍＴＢＩの動物モデルにおけるＰｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇの有効性を決定する。特定の目的２において確立された最適のＩＮ用量は、傷害を４回反復したｍＴＢＩモデルと比較した場合、単回の損傷後に見られる予防的および急性後の防御を等しく維持する。ラットは、４連続週の間毎週１回衝撃を与えられる。Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇは、特定の目的２で決定された最適時間および用量でＩＮ送達される。処置は、特定の目的１および２で考察されたように予防的におよび急性後に投与される。ラットは、初回の損傷、最初の２回の損傷、最初の３回の損傷または４回全ての損傷の損傷群について、様々な回数の処置を受ける。磁気共鳴画像化は、形態学的効果に関する処置の有効性（損傷および浮腫の領域）を評価し、行動試験は、各損傷後の運動および認知の機能に関して処置の有効性を評価する。側頭葉脳切片をタウノパシーおよびＡβアミロイドについて、最終の損傷時点の７２時間および１４日後に評価する。この特定の目的は、Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇが妥当な処置の選択肢であるか否か、およびそれでどの薬物がそれぞれのｍＴＢＩのモデルで堅調であるかを確認するように計画される。また、凝固に関連する薬物安全性研究も、この特定の目的において概説される。
【０１０２】
実施例４
軽症の外傷性脳損傷モデル
術前に、動物を４分間（外科の準備の間にげっ歯類を軽度に鎮静するのに必要な最小時間）の最初のイソフルラン導入で麻酔する。動物の頭皮を剃毛して、イソプロパノールおよびベタジンで清浄にする。術中、麻酔をイソフルランで維持する。正中切開を行って、頭皮を内側前頭板の上にまくる。６ｍｍ直径、１ｍｍ厚のゴムのヘルメットを頭骨上に固定して、骨ろうで安定にする。次に、動物を、第六頸椎および第七頸椎で定位固定装置の加熱金属台上で腹臥位に固定する。動物の頭部を、フォームパッド上に置く。５ｍｍの金属衝撃部材を用いる電気制御の損傷デバイスを、ゴムヘルメット上に置く。垂直から１１度の角度で６．２ｍ／ｓの衝撃速度を用いて、ヒトの脳震盪で起こるのと同様の、閉鎖型の頭部損傷を引き起こす。次いで、動物の頭皮を縫合して、鎮痛を与える。次いで、動物を加熱したケージに戻して、３０分間回復させ、この時点で食物および水を与える。偽群の動物には、衝撃を与えずに頭皮切開を行い、脳震盪のラットと同じ期間麻酔下に維持する。
【０１０３】
特定の目的
プロゲステロンおよびその鏡像異性体を用いる予防的および急性後処置が、軽症の外傷性脳損傷に対する応答を改善する腹腔内の用量および時間を決定する。
神経ステロイド、Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇの腹腔内投与が、単回のｍＴＢＩの処置において予防的に投与された場合、最も有益であると仮定する。軽度から重度のＴＢＩのモデルを用いる過去の研究によって、Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇの両方の１６ｍｇ／ｋｇのＩＰが、損傷の７２時間後に境界領域内で、浮腫、炎症、酸化的ストレスおよび細胞死を低減する最も有益な濃度であることが示される（１、２）。ｍＴＢＩは機械的損傷を引き起こすことは少なく、従って、中等度から重度の脳損傷よりも病理学的な応答は少ない。これらの理由のために、１６ｍｇ／ｋｇの投与は、最高の濃度として投与され、より低いＩＰ濃度（４および８ｍｇ／ｋｇ）が、ＴＢＩの軽症モデルで同じ有益な効果を達成し得るか否かを決定する。認知挙動（空間学習および記憶および不安）、運動性行動（平衡）ならびに損傷の血清および脳のバイオマーカーを分析した場合、用量応答曲線は、薬物用量有効性に基づいて展開される。
【０１０４】
薬物安定性を、４℃と２５℃との両方で保管した場合、６カ月間にわたって試験する。最適の薬物処方物を確立した後、薬物動態プロフィールを、各々の投与経路について脳および血清中の各々の薬物のバイオアベイラビリティについて作成する。
【０１０５】
実施例５
薬物の処方物および安定性
計画
２．２５％のβ−シクロデキストリン（β−ＣＤ）を含有するｄＨ２Ｏ＋薬物（Ｐｒｏｇまたはｅｎｔ−Ｐｒｏｇ）、カルボポール（１％がＨ２Ｏに含有される）＋薬物、２．２５％のβ−ＣＤを含有するｄＨ２Ｏ＋カルボポール＋薬物、の３種類の処方物を開発する。Ｐｒｏｇ−β−ＣＤ複合体は、市販されており（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．）、カルボポールは、公知の経鼻吸収の増強因子（８７〜８９）であり、従って、Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇのバイオアベイラビリティを潜在的に増大する。カルボポールが水に添加され、薬物−ＣＤ封入の複合体の必要な量が、超音波によって分散される。これらのポリマー性の分散は、磁気スターラーで６０分間撹拌されて、ｐＨは、トリエタノールアミンを添加することによって７．０に調節される。最も可溶性の処方物を決定するために、少量のアリコートをとって、溶液の沈殿／不安定性に相当する動的光散乱の変化を定量する。また、規定される処方物の薬物安定性も、１年間にわたってモニターする。要するに、各々の処方物のストック溶液を、４℃および２５℃で保管する。少量のアリコート（１ｍＬ）を、溶液の沈殿／不安定性を示す動的光散乱の変化について１４日毎に試験する。
【０１０６】
実施例５
ＥＬＩＳＡを用いるＰｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇのバイオアベイラビリティの薬物動態学的研究
被験体
脳に対するＰｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇの両方の薬物送達の薬物動態学的パラメーターを決定するために、２７匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、各々２８０ｇで用いる（表１を参照のこと）。この実施例では、動物に脳損傷は行わない。
【表１】
2014528457.tif 000004
【０１０７】
計画
Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇのバイオアベイラビリティを、固相酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて血清のＰｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇの量を測定することによって決定する。上記の実施例５で決定した最適の処方物が、１６ｍｇ／ｋｇを用いてＩＰ送達およびＩＮ送達について投与される。１群のラットには、絶対的なバイオアベイラビリティを算出するために、非経口溶液（１６ｍｇ／ｋｇ）の静脈（伏在静脈）注射を与える。連続尾静脈血液採取を、投与の３０分、６０分、１２０分、２４０分および３００分後に行う。血漿を２，０００ｒｐｍでの遠心分離によって分離し、薬物含量は、製造業者のプロトコールによって、ＥＬＩＳＡキット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｌａｂａｓａｓ，  ＣＡ）を用いることによって決定する。要するに、このアッセイは、試験サンプルの中の薬物と薬物−ＨＲＰ複合体との間の競合結合の原理に基づく。薬物動態のパラメーター（０〜３００分の濃度時間の曲線下面積（ＡＵＣ）、ピーク濃度（Ｃｍａｘ）、およびビヒクル後のピーク濃度に達する時間（ｔｍａｘ）、Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇ投与）を算出する。ＩＰまたはＩＮ投与の後のバイオアベイラビリティの絶対値は、ＩＰまたはＩＮのＡＵＣをＩＶのＡＵＣで割ることによって決定される。群の計画の分析に関しては上記の表１を参照のこと（全部で２７匹の動物）。
【０１０８】
被験体
ｍＴＢＩのモデルでＩＰ送達した場合のＰｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇの最適の有効用量を決定するために、２８０グラムでの１７６匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットのモデルを用いる。
【０１０９】
計画
群（２セット）は、偽、ビヒクル（上記で概説された処方物の研究で決定）、Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇを含む。セット１由来の群は、ｍＴＢＩの１時間前に単回のＩＰ注射を受け、セット２は、ｍＴＢＩの１時間後に単回のＩＰ注射を受ける。１時間後のＩＰ注射は、Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇの両方を用いた場合、中等度から重度のＴＢＩで有益であることが示された。予備的データによって、Ｐｒｏｇは、損傷の１時間前に投与された場合、有益であることが示される。しかし、損傷により近い予防の時点で動物の追加を伴う別のストラテジーが必要な場合がある。バイオアベイラビリティの研究によって、薬物投与の時点に変化を引き起こすことが補助される。各々の設定は、１６ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇの３種類の異なるＩＰ濃度のＰｒｏｇまたはｅｎｔ−Ｐｒｏｇのうちの１つを投与される動物から構成される。
【０１１０】
分子研究
血清分析
血清は、動物の尾静脈からの連続吸引を用いて受傷３、６、２４および４８時間後に収集する。タンパク質を処理して、ＥＬＩＳＡ分析を、ＳＢＤＰ−１５０およびＧＦＡＰの抗体を用いて行う。これらの血清バイオマーカーの両方とも血液脳関門（ＢＢＢ）の完全性の喪失に相当する。また、ＳＢＤＰ−１５０およびＧＦＡＰは、それぞれ神経細胞および星状細胞の構造の完全性の喪失に相当する（９０、９１）。全ての血清サンプルを、調製および分析のためにＢａｎｙａｎ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，Ｉｎｃ．に送る（Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ，ＦＬ．，Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｏｆ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎを参照のこと）。薬物濃度の血清分析は、Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−ＰｒｏｇのＥＬＩＳＡキット（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を用いて受傷の１、６、２４および４８時間後に全ての群由来の各々の動物で行う。ｍＴＢＩは、軽度の内部出血を引き起こすので、血液は、損傷の前にも、受傷後１時間の前にも採取しない。
【０１１１】
脳組織分析
衝撃の境界領域および海馬由来の脳組織をパンチ生検によって収集する。サンプルを、以下などの細胞死のマーカーについての抗体を用いてタンパク質およびウエスタン分析のために処理する、カスパーゼ３、脱髄マーカー、ミエリン塩基性タンパク質、および炎症性マーカー、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１β。損傷の全てのマーカーを、受傷後６時間および４８時間で分析する。要するに、全てのサンプルを収集して、ホモジナイズして、ＴＰｅｒ（組織タンパク質抽出試薬）中で１時間、５％のプロテアーゼカクテルインヒビターとともにインキュベートする。タンパク質濃度は、２８０ｎｍでＮａｎｏＤｒｏｐを用いて分光光度的に決定する。各々のサンプルからの等しいタンパク質濃度を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いて分けて、ＰＶＤＦ膜に転写する。適切な一次抗体および二次抗体を、各々のサンプルに加えて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒを、検出およびデータ分析に用いる。境界組織分析を正当化して、ニューロンの死滅および炎症という二次カスケードを決定する。損傷の衝撃が前頭葉に対するものである場合、びまん性軸索損傷がニューロン死および炎症を引き起こす程度を決定するのには海馬の逆行性の分析が必要である（４２、９２）。予備的データによって、ｍＴＢＩが記憶障害を引き起こすことが示される。
【０１１２】
この知見はさらに、これらの研究における海馬の分析を正当化する。
【０１１３】
画像化研究
ナトリウム拡散ＭＲＩは、脳浮腫のレベルを決定するために受傷の６、２４および４８時間後に各々の処置群由来の動物で行う。拡散テンソルＭＲＩ（施設および装置を参照のこと）を、各々の群由来の動物で行い、同じ時点でびまん性軸索損傷を定量する。下の表２は、分子研究で用いられる動物の分析を示す（全部で９６匹の動物）。
【表２】
2014528457.tif 000005
【０１１４】
脳組織分析に関して４８時間（ｎ＝４／群）生存した同じ動物を、血清バイオマーカー研究、血清薬物濃度研究およびＭＲＩ研究に用いる。
【０１１５】
認知および運動行動の研究
Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇ処置に関連する機能的転帰における改善を、空間学習および記憶（モリス水迷路試験（Ｍｏｒｒｉｓ  Ｗａｔｅｒ  Ｍａｚｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ））、不安様行動（高架式十字迷路法（Ｅｌｅｖａｔｅｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍａｚｅ））および平衡（ビーム・アンド・ロータロッド（Ｂｅａｍ  ａｎｄ  Ｒｏｔｏｒｏｄ））を分析することによって決定する。行動試験の概説に関しては施設および装置のページを参照のこと。要するに、ｍＴＢＩの誘導４８時間前に開始して、各日に２つの前臨床試験を行う。ｍＴＢＩの後、各々の方法を用いる試験を４時間で開始して、５日間、２４時間ごとに行う。下の表３は、行動研究で用いられる動物の分析を示す（合計＝８０匹の動物）。
【表３】
2014528457.tif 000006
【０１１６】
実施例８
特定の目的
プロゲステロンおよびその鏡像異性体での予防的および急性後処置が軽症の外傷性脳損傷に対する応答を改善する鼻腔内の用量を決定する。
【０１１７】
仮説
神経ステロイド、Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇの予防的な鼻腔内投与は、単回のｍＴＢＩを処置する場合、最適の腹腔内用量よりも低濃度で有益である。
【０１１８】
論理的根拠
ＴＢＩの処置のための経鼻吸入物の使用は新規である。Ｐｒｏｇは、ラットでのドーパミン作動性のニューロンの活性を検討するための経鼻吸入物として用いられており（９２）、ホルモン代替療法および避妊薬での使用のためのＰｒｏｇの経鼻送達に現在興味がもたれている（９３）。薬剤の経鼻投与は、短い時間で身体の中でより高濃度の薬物を達成しながら、脳で利用可能な化合物の量を増大させ、全身循環のレベルを低下することが示されている。さらに経鼻投与によって、所望の効果がより低濃度で達成され、引き続き、吸入化合物と全身で関連する潜在的な有害な副作用が有意に低減される（７２、７３）。これらの有益な理由のために、近年、多くの一般使用薬（すなわち、インフルエンザワクチンおよびインスリン）が経鼻投与用に開発されている。この目的のために、Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇの両方とも、脳のバイオアベイラビリティを改善して、全身循環のレベルを低下する、経鼻送達系に濃縮される。経鼻吸入物は、軍人および他の高リスクの職業および活動（すなわち、スポーツイベント）の野外展開のかなり実際的な手段である。
【０１１９】
試験計画
経鼻投与による薬物用量の応答
被験体
ｍＴＢＩのモデルでＩＮ送達した場合のＰｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇの最適用量を決定するために、１７６匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを２８０グラムで用いる。
【０１２０】
計画
ＩＮ投与に関する用量応答は、特定の目的１で概説したのと同じ最適薬物処方物、動物群および処置時点を用いて確認する。ＩＰと比較したＩＮ投与された薬物濃度の相違は、過去のデータでは、ＩＮで投与された所定の親油性薬物の投与が低濃度であるほど、ＩＰ送達の高濃度よりも、脳に薬物を送達するさらに有効な手段であることが示されたことを考慮に入れると、この研究では有意に低いＩＮ濃度をＩＮで与える。特定の目的１で確立された各々の薬物について最も有効なＩＰ用量を、ＩＮ投与のための出発ポイントとして用いる。この出発濃度から、Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇの両方とも、特定の目的１で概説されるバイオアベイラビリティ研究の結果に基づいて２つのより低濃度まで希釈される。ＩＮとＩＰの有効性の間で統計学的比較を行って到達可能なＩＮがｍＴＢＩを処置するために有利であるか否かを決定する。
【０１２１】
分子研究
上記の表１は、分子研究で用いた動物の分析を示す。動物の使用および計画は実施例７と同じである。
【０１２２】
血清分析
これらの研究は、実施例７と同じ計画で行う。
【０１２３】
脳組織分析
これらの研究は、実施例７と同じ計画で行う。
【０１２４】
画像化研究
これらの研究は、実施例７と同じ計画で行う。
【０１２５】
認知および運動行動の研究
これらの研究は、実施例７と同じ計画で行う。上記の表２は、認知および運動行動の研究で用いられる動物の分析を示す。用いられる動物および計画は実施例７と同じである。
【０１２６】
実施例９
特定の目的
プロゲステロンおよびその鏡像異性体による予防的および急性後処置が、反復性の軽症の外傷性脳損傷に関連する病理を低減する程度を決定する。
【０１２７】
仮説
４回の反復性のｍＴＢＩの各々の前の神経ステロイド、Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−Ｐｒｏｇの予防的な鼻腔内投与は、行動の異常を防止し、長期の転帰の悪さに関連する病理学的マーカーを減少させる。
【０１２８】
論理的根拠
試験計画
反復性ｍＴＢＩのための神経ステロイド投与
神経ステロイド有効性研究
反復性ｍＴＢＩは、限定するものではないが、以下を含めて、初期の行動異常に関連していた、記憶障害、平衡性欠陥および抑うつ／不安障害（５０）。反復性のｍＴＢＩは、自殺率の増大が認められるＡＤ患者でみられるのと同様の早発性認知症を引き起こすと仮定されている（５４、５７）。ＡＤ患者の側頭葉でみられるのと同様、反復性のｍＴＢＩの個体は、ＴＤＰ−４３−陽性のタウオパシー（６４）およびＡβアミロイドのレベル上昇があった（２０、６２）。この目的での研究は、各々のｍＴＢＩを予防的にまたは急性後の段階で処置して、Ｐｒｏｇまたはｅｎｔ−Ｐｒｏｇが行動および分子病理に対して反復性のＴＢＩの影響を緩和し得るか否かを決定するように設計する。
【０１２９】
被験体
Ｐｒｏｇおよびｅｎｔ−ＰｒｏｇのＩＮ投与が、反復性のｍＴＢＩのモデルで予防的であるかおよび／または防御的であるかを決定するために、２０８匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを２８０グラムで秤量して用いる。
【０１３０】
計画
動物を、最初の損傷のみに関連する処置、第一および第二の損傷に関連する処置、第一、第二および第三の損傷に関連する処置、第四の損傷に関連する処置の４つの別の群に分ける。特定の目的１および２と同様に、いくつかの群では、予防的処置のみ（特定の目的２で確立された最適ＩＮ投与時間）および他の急性後処置のみを受ける。特定の目的２において予防的および急性後処置の両方について確立された最も有効なＩＮ投薬量を、全ての動物群に対して投与する。
【０１３１】
分子研究
血清分析
これらの研究を、特定の目的１と同じ計画で行い、各々の連続損傷後の分析を含む。
【０１３２】
脳組織分析
衝撃の境界領域および海馬由来の脳組織を、特定の目的１で前述したように収集して処理する。ウエスタン分析は、高リン酸化タウの抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．）、ＴＤＰ−４３（ＧｅｎＴｅｘ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ．）、およびＡβアミロイド（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて行う。全ての病理学的マーカーを、４週間の損傷期間の７２時間後（ｎ＝４／群）、および１４日後（ｎ＝４／群）に分析する。
【０１３３】
画像化研究
これらの研究を、特定の目的１と同じ計画で行い、これには、各々の連続損傷後の分析が含まれる。
【０１３４】
認知および運動行動の研究
前の目的で概説され、施設および装置で考察された同じ行動研究は、この特定の目的で用いられる。しかし、行動分析は、第四および最終の損傷の指定された時点後７２時間の中で動物がどんなに多くの損傷を受けようとも、４週間の研究計画全体を通じて動物の各々の群について継続中である。各々の群についてｎ＝８を、行動の分析に用いる。これらの同じ動物を、上記で概説された分子分析に用いる。
【０１３５】
副作用研究
薬物を複数回投与する。高リスクの職業について予防的ｅｎｔ−Ｐｒｏｇを潜在的に毎日使用すること、およびｅｎｔ−Ｐｒｏｇが生殖系および血液凝固に関連する特定可能な副作用に起因してＰｒｏｇよりも安全に送達可能であり得ることを考えれば、この目的の研究は、神経ステロイドが、複数回投与された時、副作用を有するか否かを決定し、Ｐｒｏｇとｅｎｔ−ｐｒｏｇとを比較するものである。この目的の実験は、４週間の時間枠にまたがって１、２、３または４回の薬物処置を受ける動物群で安全の問題を比較するために設計される。同じ回数の薬物注射を急性後処置のための予防薬として投与することを考えれば、予防方式で処置する場合、可能性のある有害な副作用のみを、評価する。この目的での安全性研究を用いて、血液凝固で投与される薬物の影響を確立してもよい。組織が種々の時点で収集され得る、生殖系の安全性の特徴付けのために、より多数の動物を用いて将来の研究を行わなければならない。
【０１３６】
被験体
血清凝固分析：本研究では、各々の処置群および偽群について、各損傷の６、２４および４８時間後に動物の半分から、血液を収集する。血漿を、外因性および内因性の凝固時間について単離およびアッセイする。全ての動物群から得た血漿凝固時間を比較して、神経ステロイド処置が複数回の処置後の凝固を増大するか否かを確認する。要するに、ＰｒａｔｔおよびＭｏｎｒｏｅ（８５）に記載されるマイクロプレートベースの血液凝固アッセイを、３０μｌの血漿および３０μｌの緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｐＨ７．４）マイクロプレートのウェルに添加することによって行い、このマイクロプレートを次に２５℃で２分間インキュベートする。凝固は、プロトロンビン時間試験（外因性の凝固カスケード）については、２５ｍＭのＣａＣｌ２に含有される５％トロンボプラスチンの３０μｌ、および活性化部分トロンボプラスチン時間試験（内因性凝固カスケード）については３０μｌの活性化部分トロンボプラスチン試薬を添加することによって開始する。血漿の濁度の増大は、４０５ｎｍの吸収を変化することによって測定する。
【０１３７】
下の表４では、この目的において、分子、認知および運動行動および安全の研究で用いられる動物の分析を示す。（合計＝２０８匹の動物）。
【表４】
2014528457.tif 000007
【０１３８】
実施例１、２、３、４、５、６、７、８および９の統計学的手法
実施例１、２、３、４、５、６、７、８および９の別の手法
薬物処方物
鼻腔内投与のために薬物溶解度を改善するためには多くの処方方式が利用可能である。Ｐｒｏｇを可溶化するためのシクロデキストリンおよびカルボポールの過去の使用に基づけば、これらの２つの化合物は、ｅｎｔ−Ｐｒｏｇを可溶化するために有用であると考えられる。しかし、ＰＥＧは、Ｐｒｏｇを可溶化し、鼻腔内送達を介する脳取り込みを増強する能力を有する。ＰＥＧは、有害な副作用は報告されていない。従って、ＰＥＧは、溶媒として用いられ得る。
【０１３９】
マーカー
主に、主な研究者および共同研究者らの実験室、ならびに協力者（Ｂａｎｙａｎ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，Ｉｎｃ．）の過去の実験の知見に基づき、血清バイオマーカーおよび脳の病理マーカーを分析のために選択した。しかし、ｍＴＢＩ後に調整され得る、多くの他の血清および脳のマーカーがある（すなわち、ｐ５３、ＮＦκβ、Ｓ−ニトロソシステイン、ＭＡＰ−２）。特定の目的３におけるアルツハイマー様の病理の脳病理マーカーに関して、この分野の研究における多くの以前に報告された知見に基づいて、これらが最高の選択肢であると考えられる。
【０１４０】
分析手法
反復性の軽症の外傷性脳損傷の本発明者らの１つのモデルは、同じ時点（７２時間および１４日）でのみ、１、２または３回目のｍＴＢＩのいずれかに陥った（その後にそれらの動物は４回目および最終のｍＴＢＩを受ける）、動物の脳病理学的マーカーを評価することを目的とする。この計画による問題は、所定の回数の損傷後の分析の時点が有意に異なるということである。この計画の利点は、これによって、所定の回数の損傷後、より長期間、有害なマーカーの量の増大を示すか否かを決定することが可能になるということである。
【０１４１】
実施例１０
経鼻溶液
本発明の一実施形態による経鼻溶液の例を、下に記載する。１％のＴｗｅｅｎ８０を、ｅｎｔ−Ｐｒｏｇの溶液と組み合わせてもよい。次いで、その混合物を、５０ｍＬの総容積にするのに十分な等張性生理食塩水の量と組み合わせる。この溶液を０．２ミクロンのＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターを通過させることによって滅菌する。
【０１４２】
実施例１１
経鼻ゲル
本発明の一実施形態による経鼻ゲルの例を下に記載する。２５０ｍＬの等張性生理食塩水を、８０℃まで加熱して、１．５ｇのメトセル（Ｍｅｔｈｏｃｅｌ）を撹拌しながら添加する。得られた混合物を室温で２時間放置する。次いで、１００ｍｇのｅｎｔ−プロゲステロンを、１ｍｇのＴｗｅｅｎ  ８０と一緒に混合する。ｅｎｔ−プロゲステロン／Ｔｗｅｅｎの混合物および総容積を５００ｍｌにするのに十分な量の等張性生理食塩水をこのゲルに添加して、徹底的に混合する。
【０１４３】
引用文献
以下の引用文献は、上で引用され、参照により本明細書に援用される。
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【０１４４】
本発明は、特定の実施形態を参照して開示してきたが、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の領域および範囲から逸脱することなく、記載した実施形態に対する多くの改変、変更および変形が可能である。従って、本発明は、記載の実施形態に限定されないものとし、ただし、添付の特許請求の範囲およびその等価物の文言で規定される全範囲を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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