(57)【要約】本開示は、出生後線維芽細胞から心筋細胞を生成する方法を提供する。本開示は、心筋細胞の生成に使用するための細胞および組成物をさらに提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘導心筋細胞を生成する方法であって、
ヒト出生後線維芽細胞に、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇを含むリプログラミング因子を導入することを含み、前記導入が、前記出生後線維芽細胞を心筋細胞に直接リプログラミングする結果をもたらし、それによって、誘導心筋細胞を生成する、方法。
【請求項２】
前記導入が、前記出生後線維芽細胞を、前記リプログラミング因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で遺伝子改変することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸が、組換えベクターである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヌクレオチド配列が、転写調節要素に作用可能に連結される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記転写調節要素が、前記出生後線維芽細胞において機能的な構成プロモーターである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記リプログラミング因子が、外因性であり、前記導入が、前記外因性リプログラミング因子ポリペプチドを前記出生後線維芽細胞に導入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記外因性リプログラミング因子ポリペプチドが、異種タンパク質形質導入ドメインを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記誘導心筋細胞を単離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記導入が生体外で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記導入が生体内で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子改変された出生後線維芽細胞であって、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇを含むリプログラミング因子をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の外因性核酸で遺伝子改変されたヒト出生後線維芽細胞である、遺伝子改変された出生後線維芽細胞。
【請求項１２】
前記１つ以上の外因性核酸が、前記線維芽細胞のゲノムに組み込まれる、請求項１１に記載の遺伝子改変された出生後線維芽細胞。
【請求項１３】
請求項１１に記載の遺伝子改変された出生後線維芽細胞を含む、組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、液体培養培地、凍結保存剤、またはマトリックス成分を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記マトリックスが、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、フィブリノーゲン、ラミニン、グリコサミノグリカン、エラスチン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、グリカン、ポリ（乳酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレンオキシド）、セルロース、セルロース誘導体、デンプン、デンプン誘導体、ポリ（カプロラクトン）、およびポリ（ヒドロキシ酪酸）のうちの１つ以上を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１２に記載の遺伝子改変された出生後線維芽細胞に由来する、誘導心筋細胞。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法を用いて生成される、誘導心筋細胞。
【請求項１８】
請求項１６または請求項１７に記載の誘導心筋細胞を含む、組成物。
【請求項１９】
前記組成物が、液体培養培地、凍結保存剤、またはマトリックス成分を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記マトリックスが、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、フィブリノーゲン、ラミニン、グリコサミノグリカン、エラスチン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、グリカン、ポリ（乳酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレンオキシド）、セルロース、セルロース誘導体、デンプン、デンプン誘導体、ポリ（カプロラクトン）、およびポリ（ヒドロキシ酪酸）のうちの１つ以上を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
ａ）以下のうちの１つと、
ｉ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子、または
ｉｉ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇを含むリプログラミング因子をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸、
ｂ）緩衝剤と、を含む、リプログラミング組成物。
【請求項２２】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項２１に記載のリプログラミング組成物。
【請求項２３】
治療薬またはチモシンβ４をさらに含む、請求項２１に記載のリプログラミング組成物。
【請求項２４】
請求項２１に記載のリプログラミング組成物を含む、埋め込み型デバイス。
【請求項２５】
前記デバイスが、ステントである、請求項２４に記載の埋め込み型デバイス。
【請求項２６】
前記リプログラミング組成物が、制御放出性組成物である、請求項２４に記載の埋め込み型デバイス。
【請求項２７】
誘導心筋細胞を生体内で生成する方法であって、
それを必要とする個体に、有効量の請求項２１に記載のリプログラミング組成物を投与することを含み、前記リプログラミング因子が、ヒト心臓線維芽細胞が心筋細胞になるよう誘導する、方法。
【請求項２８】
前記投与が、血管内注入を介する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記投与が、心筋内送達を介する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記心筋内送達が、カテーテルを介する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記リプログラミング組成物が、固体、半固体、または液体の制御放出性組成物である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
細胞移植を必要とするレシピエント個体において細胞移植を行うための方法であって、（ｉ）ヒトドナー個体の出生後線維芽細胞から誘導心筋細胞を生成することであって、前記ドナー個体が前記レシピエント個体と免疫適合性があり、前記誘導心筋細胞が請求項１に記載の方法に従って生成されることと、（ｉｉ）前記誘導心筋細胞を前記レシピエント個体に移植することと、を含む、方法。
【請求項３３】
前記レシピエントおよび前記ドナーが、同一の個体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記レシピエントおよび前記ドナーが、異なる個体である、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本願は、２０１１年８月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／５２９，０４２号の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府支援の研究に関する記述
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によって授与された助成金第Ｕ０１  ＨＬ１００４０６号により政府の援助を受けてなされたものである。政府は、本発明において所定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
心臓疾患は、先進国における成人および小児の死亡の主な原因である。基礎病理は、典型的には、心不全を招く心筋細胞の喪失、または先天性心奇形を招く胚形成中の心筋細胞の不適切な発達である。主な目的は、喪失した心筋細胞を交換し、心機能不全を助けることである。
【０００４】
当該技術分野において、心筋細胞を生成する方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許公開第２００９／０２０８４６５号
【特許文献２】米国特許第７，６８２，８２８号
【特許文献３】米国特許公開第２０１０／００７５４２１号
【特許文献４】国際公開第２００９／１５２４８４号
【特許文献５】国際公開第２００９／１５２４８５号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）Ｃｅｌｌ  １２６：６６３、Ｉｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃｅｌｌ  １４２：３７５。
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、出生後線維芽細胞から心筋細胞を生成する方法を提供する。本開示は、心筋細胞の生成に使用するための細胞および組成物をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ−Ｆ】赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙがマウスα−ミオシン重鎖プロモーターによって駆動される遺伝子導入Ｈ９ヒト胚性幹細胞から分化した線維芽細胞を用いた結果を示す。
【図１Ｇ】同上。
【図１Ｈ−Ｊ】同上。
【図２Ａ−Ｃ】Ｈ９由来線維芽細胞（Ｈ９Ｆｓ）に、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５（集合的に「ＧＭＴ」と称される）を形質導入した結果を示す。
【図２Ｄ−Ｅ】同上。
【図２Ｆ】同上。
【図３Ａ−Ｃ】１５個の因子（１５Ｆｓ）−１個の因子、９個の因子（９Ｆｓ）−１個の因子、７個の因子（７Ｆｓ）−１個の因子、または５個の因子（５Ｆｓ）−１個の因子を形質導入してから２週間後のｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞の分析を示す。
【図３Ｄ−Ｇ】同上。
【図４Ａ−Ｃ】ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＥＳＰ１、およびＴＢＸ５を形質導入されたｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞における心臓タンパク質の発現を示す。
【図４Ｄ−Ｅ】同上。
【図４Ｆ−Ｇ】同上。
【図５Ａ−Ｃ】ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＥＳＰ１、およびＴＢＸ５を形質導入されたｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞の遺伝子発現分析を示す。
【図５Ｄ】同上。
【図５Ｅ】同上。
【図６Ａ−Ｂ】ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＥＳＰ１、およびＴＢＸ５を形質導入されたｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞における心臓プロモーターのメチル化状態分析を示す。
【図６Ｃ−Ｆ】同上。
【図７Ａ−Ｂ】ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＥＳＰ１、およびＴＢＸ５を形質導入されたｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞におけるＣａ２＋過渡状態を示す。
【図７Ｃ−Ｄ】同上。
【図８Ａ−Ｂ】ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＥＳＰ１、およびＴＢＸ５を形質導入された移植線維芽細胞の生体内リプログラミングを示す。
【図９】ヒトＥｓｒｒｇのアミノ酸配列を示す。
【図１０Ａ】図９に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図１０Ｂ】同上。
【図１１Ａ】ヒトＥｓｒｒｇイソ型のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図１１Ｂ】同上。
【図１２】様々なリプログラミング因子のアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオチド配列を示す。
【図１３】同上。
【図１４】同上。
【図１５】同上。
【図１６】同上。
【図１７】同上。
【図１８】同上。
【図１９】同上。
【図２０】同上。
【図２１】同上。
【図２２】同上。
【図２３】同上。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
定義
本明細書で互換的に使用される、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」とは、遺伝的にコードされた、および非遺伝的にコードされたアミノ酸、化学的もしくは生化学的に改変された、または誘導体化されたアミノ酸、ならびに改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る、あらゆる長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。本用語は、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を伴う、もしくは伴わない異種および相同リーダー配列を有する融合物、免疫学的にタグ付けされたタンパク質等を含むが、これらに限定されない融合タンパク質を含む。
【００１０】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体の、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、直鎖状および環状核酸、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、およびプライマーが挙げられる。
【００１１】
用語「作用可能に連結」とは、所望される機能を提供するための、分子間の機能的連結を指す。例えば、核酸の文脈における「作用可能に連結」とは、転写、翻訳等の所望される機能、例えば、発現制御配列が第２のポリヌクレオチドの転写および／または翻訳に影響を及ぼす核酸発現制御配列（プロモーター、シグナル配列、もしくは多くの転写因子結合部位）と第２のポリヌクレオチドとの間の機能的連結を提供するための、核酸間の機能的連結を指す。
【００１２】
本明細書で使用される、細胞に関する用語「単離された」とは、細胞が天然に生じる環境とは異なる環境にある、例えば、細胞が多細胞生物において天然に生じ、かつ細胞が多細胞生物から取り除かれる細胞、つまり細胞が「単離される」ことを指す。単離された遺伝子改変された宿主細胞は、遺伝子改変された宿主細胞の混合集団、または遺伝子改変された宿主細胞と、遺伝子改変されない宿主細胞とを含む混合集団に存在し得る。例えば、単離された遺伝子改変された宿主細胞は、生体外で遺伝子改変された宿主細胞の混合集団、または遺伝子改変された宿主細胞と、遺伝子改変されない宿主細胞とを含む混合生体外集団に存在し得る。
【００１３】
本明細書で使用される「宿主細胞」は、真核細胞が核酸（例えば外因性核酸）もしくは外因性ポリペプチド（複数可）のレシピエントとして使用され得る、または使用された生体内もしくは生体外細胞（例えば単細胞の実体として培養された真核細胞）を表し、外因性ポリペプチド（複数可）の導入により改変された、または核酸により遺伝子改変された原細胞の子孫を含む。単一細胞の子孫は、天然、偶発的、もしくは意図的な突然変異により、形態またはゲノムもしくは全ＤＮＡ補体が元の親と必ずしも完全に同一ではない可能性があることを理解する。
【００１４】
用語「遺伝的改変」とは、新しい核酸（すなわち、細胞に外因性である核酸）の導入後、細胞において誘導される永続的なまたは一過性の遺伝的変化を指す。遺伝的変化（「改変」）は、新しい核酸を宿主細胞のゲノムに組み込むことにより、または染色体外要素として新しい核酸を一時的にもしくは安定して維持することにより達成され得る。細胞が真核細胞である場合、永続的な遺伝的変化は、核酸を細胞のゲノムに導入することにより達成され得る。遺伝的改変の好適な方法は、ウイルス感染、トランスフェクション、抱合、原形質融合、電気穿孔、粒子ガン技術、リン酸カルシウム沈殿法、直接微量注入法等を含む。
【００１５】
本明細書で使用される、用語「外因性核酸」とは、自然界において通常もしくは天然に見られない、および／または自然界において細胞により生成されない、および／または細胞に導入される（例えば、電気穿孔、トランスフェクション、感染、リポフェクション、もしくは核酸を細胞に導入する任意の他の手段により）核酸を指す。
【００１６】
本明細書において互換的に使用される用語「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」とは、ネズミ科動物（ラット、マウス）、ヒト以外の霊長類、ヒト、イヌ科動物、ネコ科動物、有蹄動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）等を含むが、これらに限定されない哺乳類を指す。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。いくつかの実施形態では、個体は、ネズミ科動物である。
【００１７】
「治療有効量」または「有効量」とは、疾患を治療するために哺乳類または他の対象に投与されるとき、疾患に対してそのような治療をもたらすのに十分である化合物の量または細胞の数を意味する。「治療有効量」は、化合物もしくは細胞、疾患およびその重篤度、ならびに治療される対象の年齢、体重等により変動する。
【００１８】
本発明がさらに説明される前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、勿論それ自体変動し得ることを理解する。本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ制限されるため、制限することが意図されないことも理解するべきである。
【００１９】
値の範囲が提供される場合、文脈において特に明確に記載されない限り、下限値の単位の１０分の１まで、その範囲の上限値と下限値の間の各中間の値、およびその示された範囲のいずれかの他の示されたまたは中間の値が、本発明内に包含されることを理解する。これらのより狭い範囲の上限値および下限値は、より狭い範囲に独立して含まれてよく、これらも本発明内に包含され、示された範囲内でいずれかの明確に除外された境界値（ｌｉｍｉｔ）の対象となる。示された範囲が境界値の一方または両方を含む場合、これらの含まれる境界値のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
【００２０】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似するまたは等価のいずれの方法および材料も本発明の実践または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料がここで記載される。本明細書に言及される全ての刊行物は、刊行物が関連して引用される方法および／または材料を開示または説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２１】
本明細書および付属の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈に明確に記載されない限り、複数形の参照を含むことも留意されなければならない。よって、例えば、「心筋細胞（ａ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）」に対する参照は、複数のそのような心筋細胞を含み、「リプログラミング因子（ｔｈｅ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）」に対する参照は、当業者において既知の１つ以上のリプログラミング因子およびその等価物に対する参照を含む、などである。特許請求の範囲は、いずれの任意の要素も除外するように起草され得ることにさらに留意する。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の詳細説明に関連する「単に」、「唯一」等のそのような排他的用語の使用、または「否定的」な限定の使用に対する根拠として機能することが意図される。
【００２２】
明確にするために、別個の実施形態の文脈において説明される本発明のある特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことを理解する。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈において説明される本発明の様々な特徴が、別個に、またはいずれの好適なより小さな組み合わせで提供されてもよい。本発明に関する実施形態の全ての組み合わせは、本発明により具体的に包含され、それぞれの組み合わせおよび全ての組み合わせが個別にかつ明確に開示されているかのように、本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態およびそれらの要素の全ての小さな組み合わせも、本発明により具体的に包含され、それぞれのより小さな組み合わせおよび全てのより小さな組み合わせが個別にかつ明確に本明細書に開示されているかのように、本明細書に開示される。
【００２３】
本明細書で論じられる刊行物は、単に、本願の出願日の前にそれらが開示されているために提供される。本明細書において、本発明が従来の発明によりそのような刊行物に先行する権利がないという承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日付と異なる場合があり、独立して確認される必要がある。
【００２４】
詳細な説明
本開示は、出生後線維芽細胞から心筋細胞を生成する方法を提供する。本開示は、心筋細胞の生成に使用するための細胞および組成物をさらに提供する。
【００２５】
心筋細胞の生成方法
本開示は、出生後線維芽細胞から心筋細胞を生成する方法を提供する。本方法は、一般に、１つ以上のリプログラミング因子を出生後線維芽細胞に導入することを伴う。いくつかの場合では、ポリペプチド自体が出生後線維芽細胞に導入される。他の場合では、出生後線維芽細胞は、リプログラミング因子をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で遺伝子改変される。いくつかの場合では、出生後線維芽細胞は、ヒト心臓線維芽細胞である。改変は、生体内または生体外で行われ得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本方法は、次のリプログラミング因子：Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１を出生後線維芽細胞に導入することを伴う。いくつかの場合では、ポリペプチド自体が出生後線維芽細胞に導入される。他の場合では、出生後線維芽細胞は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で遺伝子改変される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本方法は、次のリプログラミング因子：Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、およびＭｙｏｃｄを出生後線維芽細胞に導入することを伴う。いくつかの場合では、ポリペプチド自体が出生後線維芽細胞に導入される。他の場合では、出生後線維芽細胞は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、およびＭｙｏｃｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で遺伝子改変される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本方法は、次のリプログラミング因子：Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇを、ならびにＮｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１のうちの１つ以上を出生後線維芽細胞に導入することを伴う。いくつかの場合では、ポリペプチド自体が出生後線維芽細胞に導入される。他の場合では、出生後線維芽細胞は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇを、ならびにＮｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドのうちの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で遺伝子改変される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本方法は、次のリプログラミング因子：Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇを出生後線維芽細胞に導入することを伴う。いくつかの場合では、ポリペプチド自体が出生後線維芽細胞に導入される。他の場合では、出生後線維芽細胞は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で遺伝子改変される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本方法は、次の５個（５個のみ）のリプログラミング因子：Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを出生後線維芽細胞に導入することを伴う。いくつかの場合では、ポリペプチド自体が出生後線維芽細胞に導入される。他の場合では、出生後線維芽細胞は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド（他の外因性ポリペプチドなし）をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で遺伝子改変される。
【００３１】
対象方法を用いて出生後線維芽細胞から生成された心筋細胞は、本明細書において、「誘導心筋細胞」と称される。Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１）等のポリペプチドは、本明細書において、集合的に「リプログラミング因子」とも称される。下に記載される実施形態のいずれかにおいて、出生後線維芽細胞に導入される「リプログラミング因子」（ポリペプチド自体として、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（複数可）としてのいずれか）は、
１）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチド、
２）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、およびＭｙｏｃｄポリペプチド、
３）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、ならびに
４）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、ならびにＮｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドのうちの１つ以上を含み得る。
【００３２】
Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、ならびにＮｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドのうちの１つ以上を含むリプログラミング因子は、例えば、
１）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、およびＢＡＦ６０ｃポリペプチド、
２）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、ＢＡＦ６０ｃ、およびＨａｎｄ２ポリペプチド、
３）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、ＢＡＦ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、およびＩｓｌ１ポリペプチド、
４）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、ＢＡＦ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、およびＮｆａｔｃ１ポリペプチド、
５）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、ＢＡＦ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、およびＳｍｙｄ１ポリペプチド、
６）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、ＢＡＦ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチド、
７）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、およびＮｋｘ２．５ポリペプチド、
８）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、およびＳｒｆポリペプチド、
９）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、およびＺｆｐｍ２ポリペプチド、ならびに
１０）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、およびＭｙｏｃｄポリペプチドを含み得る。
【００３３】
当業者は、他の組み合わせが可能であることを理解するだろう。
【００３４】
上述のように、いくつかの場合では、心筋細胞を生成する対象方法は、リプログラミング因子（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で出生後線維芽細胞を遺伝子改変することを伴う。ヌクレオチド配列によりコードされるリプログラミング因子は出生後線維芽細胞において生成され、１つ以上のリプログラミング因子の生成の結果として、遺伝子改変された線維芽細胞は分化した心筋細胞にリプログラミングされる。
【００３５】
上述のように、いくつかの場合では、心筋細胞を生成する対象方法は、リプログラミング因子（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で出生後線維芽細胞を遺伝子改変することを伴う。リプログラミング因子は出生後線維芽細胞において生成され、リプログラミング因子の生成の結果として、遺伝子改変された線維芽細胞は、分化した心筋細胞になるようにリプログラミングされる。
【００３６】
いくつかの場合では、出生後線維芽細胞は、リプログラミング因子ポリペプチド自体を宿主出生後線維芽細胞に導入することにより（例えば好適なリプログラミング因子がＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、および，ＴＧＦβ１ポリペプチドを含む場合）、改変される。リプログラミング因子ポリペプチドが（ポリペプチド自体を導入することにより、または１つ以上のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を導入することによるいずれかにより）導入された出生後線維芽細胞は、「改変された線維芽細胞」または「改変された出生後線維芽細胞」と称される。リプログラミング因子をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸が導入された出生後線維芽細胞は、「遺伝子改変された線維芽細胞」または「遺伝子改変された出生後線維芽細胞」と称される。
【００３７】
上述のように、対象方法を用いて、１つ以上のリプログラミング因子（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１のうちの１つ以上、またはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）は、出生後線維芽細胞に導入され（例えばリプログラミング因子ポリペプチド（複数可）自体が出生後線維芽細胞に導入されるか、または出生後線維芽細胞がリプログラミング因子ポリペプチド（複数可）をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で遺伝子改変される）、結果として、改変された線維芽細胞は、最初に幹細胞または前駆細胞となる線維芽細胞なしで生じても、生じなくてもよい、分化した心筋細胞にリプログラミングされる。よって、例えば、改変された、または遺伝子改変された線維芽細胞は、検出可能なレベルの初期の心臓前駆マーカーを生成しても、生成しなくてもよい。例えば、改変された、または遺伝子改変された線維芽細胞は、心臓分化前に一時的に発現される初期の心臓前駆マーカーである、検出可能なレベルのＩｓｌ１を生成しても、生成しなくてもよい。
【００３８】
生体内改変
他の実施形態では、出生後線維芽細胞は、１つ以上のリプログラミング因子（例えば、１）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチド、２）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、およびＭｙｏｃｄポリペプチド、３）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、または４）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、ならびにＮｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドのうちの１つ以上）をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で生体内で遺伝子改変されるか、または出生後線維芽細胞に生体内で導入される１つ以上のリプログラミング因子ポリペプチド自体（例えば、１）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチド、２）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、およびＭｙｏｃｄポリペプチド、３）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、または４）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、ならびにＮｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドのうちの１つ以上）で生体内で改変され、改変された、または遺伝子改変された線維芽細胞は、生体内で心筋細胞にリプログラミングされる。
【００３９】
リプログラミング因子（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド等のリプログラミング因子、ならびに任意に上述の１つ以上のリプログラミング因子をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸、またはリプログラミング因子ポリペプチド自体）の、出生後線維芽細胞（心臓線維芽細胞等）への生体内送達に関して、リプログラミング因子ポリペプチド、またはリプログラミング因子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（複数可）は、それを必要とする個体に血管内投与されるか、または心筋内投与を介して心臓組織に直接送達され得る。
【００４０】
本開示は、誘導心筋細胞を生体内で生成する方法を提供し、本方法は、一般に、それを必要とする個体に、有効量の対象リプログラミング組成物（以下に説明される）を投与することを伴い、リプログラミング因子は、ヒト心臓線維芽細胞が心筋細胞になるよう誘導し、それによって、誘導心筋細胞を生成する。リプログラミング組成物は、固体組成物、半固体組成物、または液体組成物であり得る。いくつかの場合では、リプログラミング組成物は、固体組成物、半固体組成物、または液体組成物であり得る制御放出性組成物である。例えば、リプログラミング組成物は、持続放出性マトリックスであり得る。
【００４１】
リプログラミング組成物の投与は、血管内注入および心筋内送達を介する手段を含む、様々な手段により達成され得る。例えば、心筋内送達は、例えば経心内膜カテーテル系を介する、カテーテルを用いて行うことができる。例えば米国特許第７，７３６，３４６号を参照。カテーテルを介する心筋内送達は、大域的、局所的、または拡散であり得る。
【００４２】
生体外改変
いくつかの実施形態では、出生後線維芽細胞は、１つ以上のリプログラミング因子（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１のうちの１つ以上、もしくはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で生体外で遺伝子改変されるか、または出生後線維芽細胞に生体外で導入される１つ以上のリプログラミング因子ポリペプチド自体（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１のうちの１つ以上、もしくはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）で改変され、改変された、または遺伝子改変された線維芽細胞は、生体外で心筋細胞になる。線維芽細胞が生体外で心筋細胞にリプログラミングされ、誘導心筋細胞を生成したら、誘導心筋細胞は個体に導入され得る。
【００４３】
例えば、いくつかの実施形態では、対象方法は、ａ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドのうちの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で、生体外で出生後線維芽細胞を遺伝子改変することであって、遺伝子改変された線維芽細胞におけるコードされたポリペプチドの生成が生体外で心筋細胞への遺伝子改変された線維芽細胞のリプログラミングをもたらし、それによって、誘導心筋細胞を生成することと、ｂ）誘導心筋細胞（複数可）を個体に導入することとを伴う。他の実施形態では、対象方法は、ａ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドのうちの１つ以上を生体外で出生後線維芽細胞に導入し、改変された線維芽細胞を生成することであって、改変された線維芽細胞が、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドのうちの１つ以上の導入の結果として、生体外で心筋細胞にリプログラミングされ、それによって、誘導心筋細胞を生成することと、ｂ）誘導心筋細胞を個体に導入することとを伴う。
【００４４】
別の例として、いくつかの実施形態では、対象方法は、ａ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、およびＭｙｏｃｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で生体外で出生後線維芽細胞を遺伝子改変することであって、遺伝子改変された線維芽細胞が生体外で心筋細胞への遺伝子改変された線維芽細胞のリプログラミングをもたらし、それによって、誘導心筋細胞を生成することと、ｂ）誘導心筋細胞（複数可）を個体に導入することとを伴う。他の実施形態では、対象方法は、ａ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、およびＭｙｏｃｄポリペプチドを生体外で出生後線維芽細胞に導入し、改変された線維芽細胞を生成することであって、改変された線維芽細胞が、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、およびＭｙｏｃｄポリペプチドの導入の結果として、生体外心筋細胞にリプログラミングされ、それによって誘導心筋細胞を生成することと、ｂ）誘導心筋細胞を個体に導入することとを伴う。
【００４５】
別の例として、いくつかの実施形態では、対象方法は、ａ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇ、ならびにＮｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドのうちの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で生体外で出生後線維芽細胞を遺伝子改変することであって、遺伝子改変された線維芽細胞が生体外で心筋細胞への遺伝子改変された線維芽細胞のリプログラミングをもたらし、それによって、誘導心筋細胞を生成することと、ｂ）誘導心筋細胞（複数可）を個体に導入することとを伴う。他の実施形態では、対象方法は、ａ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇ、ならびにＮｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドのうちの１つ以上を生体外で出生後線維芽細胞に導入し、改変された線維芽細胞を生成することであって、改変された線維芽細胞が、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇ、ならびにＮｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドのうちの１つ以上の導入の結果として、生体外で心筋細胞にリプログラミングされ、それによって、誘導心筋細胞を生成することと、ｂ）誘導心筋細胞を個体に導入することとを伴う。
【００４６】
別の例として、いくつかの実施形態では、対象方法は、ａ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で生体外で出生後線維芽細胞を遺伝子改変することであって、遺伝子改変された線維芽細胞が生体外で心筋細胞への遺伝子改変された線維芽細胞のリプログラミングをもたらし、それによって、誘導心筋細胞を生成することと、ｂ）誘導心筋細胞（複数可）を個体に導入することとを伴う。他の実施形態では、対象方法は、ａ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを生体外で出生後線維芽細胞に導入し、改変された線維芽細胞を生成することであって、改変された線維芽細胞が、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドの導入の結果として、生体外で心筋細胞にリプログラミングされ、それによって誘導心筋細胞を生成することと、ｂ）誘導心筋細胞を個体に導入することとを伴う。
【００４７】
他の実施形態では、出生後線維芽細胞は、１つ以上のリプログラミング因子（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１のうちの１つ以上、もしくはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で生体外で遺伝子改変されるか、または出生後線維芽細胞に生体外で導入される１つ以上のリプログラミング因子ポリペプチド自体（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１のうちの１つ以上、もしくはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）で改変され、改変された、または遺伝子改変された線維芽細胞は個体に導入され、改変された、または遺伝子改変された線維芽細胞は生体内で心筋細胞にリプログラミングされる。
【００４８】
よって、例えば、いくつかの実施形態では、対象方法は、ａ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドのうちの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で生体外で出生後線維芽細胞を遺伝子改変することと、ｂ）遺伝子改変された線維芽細胞を個体に導入することであって、遺伝子改変された線維芽細胞におけるＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドのうちの１つ以上の生成が生体内で心筋細胞への遺伝子改変された線維芽細胞のリプログラミングをもたらし、それによって、個体において誘導心筋細胞を生成することとを伴う。他の実施形態では、対象方法は、ａ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドのうちの１つ以上を生体外で出生後線維芽細胞に導入し、改変された線維芽細胞を生成することと、ｂ）改変された線維芽細胞（複数可）を個体に導入することであって、改変された線維芽細胞が、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドのうちの１つ以上の導入の結果として、生体内で心筋細胞にリプログラミングされ、それによって個体において誘導心筋細胞を生成することとを伴う。
【００４９】
別の例として、いくつかの実施形態では、対象方法は、ａ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、およびＭｙｏｃｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で生体外で出生後線維芽細胞を遺伝子改変することと、ｂ）遺伝子改変された線維芽細胞を個体に導入することであって、遺伝子改変された線維芽細胞におけるＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、およびＭｙｏｃｄポリペプチドの生成が生体内で心筋細胞への遺伝子改変された線維芽細胞のリプログラミングをもたらし、それによって、個体において誘導心筋細胞を生成することとを伴う。他の実施形態では、対象方法は、ａ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、およびＭｙｏｃｄポリペプチドを生体外で出生後線維芽細胞に導入し、改変された線維芽細胞を生成することと、ｂ）改変された線維芽細胞（複数可）を個体に導入することであって、改変された線維芽細胞が、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、およびＭｙｏｃｄポリペプチドの導入の結果として、生体内で心筋細胞にリプログラミングされ、それによって、個体において誘導心筋細胞を生成することとを伴う。
【００５０】
別の例として、いくつかの実施形態では、対象方法は、ａ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇ、ならびにＮｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドのうちの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で生体外で出生後線維芽細胞を遺伝子改変することと、ｂ）遺伝子改変された線維芽細胞を個体に導入することであって、遺伝子改変された線維芽細胞におけるＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇ、ならびにＮｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドのうちの１つ以上の生成が生体内で心筋細胞への遺伝子改変された線維芽細胞のリプログラミングをもたらし、それによって、個体において誘導心筋細胞を生成することとを伴う。他の実施形態では、対象方法は、ａ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇ、ならびにＮｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドのうちの１つ以上を生体外で出生後線維芽細胞に導入し、改変された線維芽細胞を生成することと、ｂ）改変された線維芽細胞（複数可）を個体に導入することであって、改変された線維芽細胞が、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇ、ならびにＮｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドのうちの１つ以上の導入の結果として、生体内で心筋細胞にリプログラミングされ、それによって、個体において誘導心筋細胞を生成することとを伴う。
【００５１】
別の例として、いくつかの実施形態では、対象方法は、ａ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で生体外で出生後線維芽細胞を遺伝子改変することと、ｂ）遺伝子改変された線維芽細胞を個体に導入することであって、遺伝子改変された線維芽細胞におけるＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドの生成が生体内で心筋細胞への遺伝子改変された線維芽細胞のリプログラミングをもたらし、それによって、個体において誘導心筋細胞を生成することとを伴う。他の実施形態では、対象方法は、ａ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを生体外で出生後線維芽細胞に導入し、改変された線維芽細胞を生成することと、ｂ）改変された線維芽細胞（複数可）を個体に導入することであって、改変された線維芽細胞が、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドの導入の結果として、生体内で心筋細胞にリプログラミングされ、それによって、個体において誘導心筋細胞を生成することとを伴う。
【００５２】
出生後線維芽細胞
リプログラミング因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で遺伝子改変される、または１つ以上のリプログラミング因子ポリペプチド自体で改変される出生後線維芽細胞は、約５日〜約７日、または約７日〜約１４日の期間で分化した心筋細胞にリプログラミングされる。例えば、出生後線維芽細胞の集団が、上述のように、リプログラミング因子ポリペプチドを導入することにより遺伝子改変されるか、または改変される場合、集団の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または７５％超（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または９８％超）は、約５日〜約７日、約７日〜約１４日、または約２週間〜約４週間の期間で、分化した心筋細胞（誘導心筋細胞）内にリプログラミングされる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、出生後線維芽細胞の集団がリプログラミング因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で遺伝子改変される場合、または出生後線維芽細胞の集団がリプログラミング因子自体を線維芽細胞に導入することによって改変される場合、集団の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または７５％超（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または９８％超）は、約５日〜約７日、約７日〜約１４日、または約２週間〜約４週間の期間で、ｃＴｎＴ＋である（すなわち、心臓トロポニンＴを発現する）。
【００５４】
いくつかの実施形態では、誘導心筋細胞を生成する対象方法は、生体内で宿主出生後線維芽細胞（または宿主出生後線維芽細胞の集団）を、リプログラミング因子（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、または上記のリプログラミング因子自体の他のセットもしくはサブセットのいずれか）をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で遺伝子改変し、遺伝子改変された出生後線維芽細胞の集団を生成することを伴う。いくつかの実施形態では、誘導心筋細胞を生成する対象方法は、リプログラミング因子ポリペプチド（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、または上記のリプログラミング因子の他のセットもしくはサブセットのいずれか）を宿主出生後線維芽細胞に導入することにより、生体内で宿主出生後線維芽細胞（または宿主出生後線維芽細胞の集団）を改変し、改変された出生後線維芽細胞の集団を生成することを伴う。
【００５５】
いくつかの実施形態では、誘導心筋細胞を生成する対象方法は、生体外で宿主出生後線維芽細胞（または宿主出生後線維芽細胞の集団）を、リプログラミング因子（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、または上述のリプログラミング因子の他のセットもしくはサブセットのいずれか）をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で遺伝子改変することと、遺伝子改変された出生後線維芽細胞の集団を生成することと、しばらくして（例えば５日〜７日、１週間〜２週間、または２週間〜４週間）、心筋細胞用に濃縮するために遺伝子改変された出生後線維芽細胞の集団を選別することとを伴う。遺伝子改変された出生後線維芽細胞の集団は、あらゆる残りの線維芽細胞を除去するために、線維芽細胞特異的マーカーの発現によって選別され得る。遺伝子改変された出生後線維芽細胞の集団は、心筋細胞特異的マーカーの発現によって選別され得る。
【００５６】
いくつかの実施形態では、誘導心筋細胞を生成する対象方法は、リプログラミング因子ポリペプチド（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、または上述のリプログラミング因子の他のセットもしくはサブセットのいずれか）を宿主出生後線維芽細胞に導入することにより、宿主出生後線維芽細胞（または宿主出生後線維芽細胞の集団）を改変することと、改変された出生後線維芽細胞の集団を生成することと、しばらくして（例えば５日〜７日、１週間〜２週間、または２週間〜４週間）、心筋細胞用に濃縮するために改変された出生後線維芽細胞の集団を選別することとを伴う。改変された出生後線維芽細胞の集団は、あらゆる残りの線維芽細胞を除去するために、線維芽細胞特異的マーカーの発現によって選別され得る。改変された出生後線維芽細胞の集団は、心筋細胞特異的マーカーの発現によって選別され得る。
【００５７】
いくつかの実施形態では、宿主出生後線維芽細胞は、リプログラミング因子（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、または上述のリプログラミング因子の他のセットもしくはサブセットのいずれか）をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で遺伝子改変されるか、またはリプログラミング因子ポリペプチド（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、または上述のリプログラミング因子の他のセットもしくはサブセットのいずれか）を宿主出生後線維芽細胞に導入することにより改変され、かつ検出可能マーカー（例えば、検出可能なシグナルを直接生成するポリペプチド、基質に作用するとき検出可能なシグナルを生成する酵素）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸でも遺伝子改変され、検出可能マーカーをコードするヌクレオチド配列は、心筋細胞特異的プロモーターに作用可能に連結される。直接的に検出可能なシグナルを提供する好適なポリペプチドは、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質等の蛍光タンパク質を含む。基質に作用するときに検出可能なシグナルを生成する好適な酵素は、例えば、ルシフェラーゼ（基質ルシフェリンに作用する）、アルカリホスファターゼ等を含む。心筋細胞特異的プロモーターは、例えば、α−ミオシン重鎖プロモーター、ｃＴｎＴプロモーター等を含む。検出可能なマーカーの発現は、誘導心筋細胞の検出に提供され得、誘導心筋細胞の選別の手段を提供することができる。
【００５８】
上述の改変または遺伝的改変のための宿主細胞として機能する出生後線維芽細胞は、様々な供給源のいずれかからであり得る。哺乳類の線維芽細胞、例えばヒト線維芽細胞、ネズミ科動物（例えばマウス）線維芽細胞、ラット線維芽細胞、ブタ線維芽細胞等が使用され得る。いくつかの実施形態では、線維芽細胞はヒト線維芽細胞である。他の実施形態では、線維芽細胞はマウス線維芽細胞である。他の実施形態では、線維芽細胞はラット線維芽細胞である。よって、「出生後線維芽細胞」とは、出生後哺乳類から得た線維芽細胞、または出生後哺乳類から得た線維芽細胞の子孫を指す。
【００５９】
出生後線維芽細胞は、様々な組織源のいずれかからであり得る。例えば、心臓線維芽細胞、包皮線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、肺線維芽細胞等である。
【００６０】
ある実施形態では、出生後線維芽細胞は心臓線維芽細胞である。ある実施形態では、出生後線維芽細胞はヒトの心臓線維芽細胞であり、ヒトの心臓線維芽細胞は、生体内または生体外であり得る。
【００６１】
線維芽細胞は、生体から得ることができる。線維芽細胞は、生体から取得した組織から得ることができる。線維芽細胞は、好適な臓器ドナーと考えられる最近死亡した個体から得ることができる。いくつかの実施形態では、個体は、個体が線維芽細胞の好適な供給源であるか否かを決定するために、様々な遺伝的障害、ウイルス感染等に関してスクリーニングされ、個体は遺伝的障害、ウイルス感染等のうちの１つ以上に基づき除外され得る。
【００６２】
好適な線維芽細胞は、線維芽細胞の特徴であるマーカーを発現し、そのようなマーカーは、例えば、ビメンチン、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ（コラーゲン合成に関与する細胞内酵素）、線維芽細胞特異的タンパク質１（例えば、Ｓｔｒｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３０：３９３を参照）、線維芽細胞表面抗原、および１型コラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞として使用される線維芽細胞は、心臓線維芽細胞であり、心臓線維芽細胞は、Ｔｈｙ１＋、ビメンチン＋として特徴付けることができ、ｃ−キットまたはｃ−キットの等価物に対して陰性でもある。
【００６３】
一般に、対象方法に従う改変または遺伝的改変のための宿主細胞として使用するのに好適である線維芽細胞は、非形質転換され（例えば正常な細胞増殖を呈する）、さもなければ正常である。
【００６４】
改変または遺伝的改変のための宿主細胞が線維芽細胞の集団である場合、線維芽細胞の集団は単離される、例えば、線維芽細胞の集団は、少なくとも約７５％の線維芽細胞、少なくとも約８０％の線維芽細胞、少なくとも約８５％の線維芽細胞、少なくとも約９０％の線維芽細胞、少なくとも約９５％の線維芽細胞、少なくとも約９８％の線維芽細胞、少なくとも約９９％の線維芽細胞、または９９％超の線維芽細胞で構成される。
【００６５】
出生後線維芽細胞は、非胚性対象、新生乳児、小児、または成人の組織に由来し得る。出生後線維芽細胞は、出生（帝王切開出生を含む）から死亡までの期間内の対象から回収された新生または出生後の組織に由来し得る。例えば、誘導心筋細胞を生成するために使用される出生後線維芽細胞は、約１０分超齢、約１時間超齢、約１日超齢、約１ヶ月超齢、約２ヶ月超齢、約６ヶ月超齢、約１歳超、約２歳超、約５歳超、約１０歳超、約１５歳超、約１８歳超、約２５歳超、約３５歳超、４５歳超、５５歳超、６５歳超、８０歳超、８０歳未満、７０歳未満、６０歳未満、５０歳未満、４０歳未満、３０歳未満、２０歳未満、または１０歳未満である対象からであり得る。
【００６６】
組織から線維芽細胞を単離する方法は当該技術分野において既知であり、いずれの既知の方法も使用され得る。非限定的な例としては、Ｉｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  １６：２３３の方法を用いて心臓線維芽細胞を得ることができる。包皮線維芽細胞は、雄個体の包皮組織（すなわち、陰茎亀頭を覆う皮膚組織、包皮陰茎）から、例えば８〜１４日齢の雄個体から得ることができる。線維芽細胞は、包皮組織を分割し、次に組織を単一細胞に分離することによって得ることができる。包皮細胞の圧着（ｃｌａｍｐ）は、物理的解離（ｄｅ−ｃｌａｍｐｉｎｇ）または例えばトリプシンを用いた酵素的消化を含む、当該技術分野において既知のいずれの手段により分離され得る。
【００６７】
上述のように、出生後線維芽細胞は、リプログラミング因子（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で遺伝子改変されるか、またはリプログラミング因子ポリペプチド自体（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド）を出生後線維芽細胞に導入することにより改変される。そのようなリプログラミング因子のアミノ酸配列は当該技術分野において既知である。リプログラミング因子をコードするヌクレオチド配列は当該技術分野において既知である。
【００６８】
リプログラミング因子
上述のように、出生後線維芽細胞は、リプログラミング因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で遺伝子改変されるか、またはリプログラミング因子ポリペプチド自体を線維芽細胞に導入することにより改変される。上述のように、出生後線維芽細胞は、１）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチド、２）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、およびＭｙｏｃｄポリペプチド、３）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、または４）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、ならびにＮｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドのうちの１つ以上等のリプログラミング因子のセットの導入により改変され得る。
【００６９】
Ｅｓｒｒｇ
Ｅｓｒｒｇポリペプチドは、結合リガンドの不在下で転写活性化因子として機能し、エストロゲン応答要素に特異的に結合する。例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：３７７７３、Ｇｒｅｓｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ９：３０３、およびＨｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２２６１８を参照。
【００７０】
様々な種からのＥｓｒｒｇポリペプチドのアミノ酸配列およびＥｓｒｒｇポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、当該技術分野において既知である。例えば、１）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ００１１２７７５７．１（ヒト４３５アミノ酸Ｅｓｒｒｇ）およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１３４２８５．２（ヒト４３５アミノ酸Ｅｓｒｒｇをコードするヌクレオチド配列）、２）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１４２９（ヒト４５８アミノ酸Ｅｓｒｒｇ）およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１４３８．２（ヒト４５８アミノ酸Ｅｓｒｒｇをコードするヌクレオチド配列）、３）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＨ７０６１９（ヒト４４２アミノ酸Ｅｓｒｒｇ）、４）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ０８２１８（ヒト３４３アミノ酸Ｅｓｒｒｇ）およびＢＣ００８２１８（ヒト３４３アミノ酸Ｅｓｒｒｇをコードするヌクレオチド配列）、５）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３６０６５（ハツカネズミ４５８アミノ酸Ｅｓｒｒｇ）およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１１９３５（ハツカネズミ４５８アミノ酸Ｅｓｒｒｇをコードするヌクレオチド配列）、６）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＤＬ１３０４１（ハツカネズミ４３５アミノ酸Ｅｓｒｒｇ）、７）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿９７６０８１（ドブネズミ４３５アミノ酸Ｅｓｒｒｇ）およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿２０３３３６（ドブネズミ４３５アミノ酸Ｅｓｒｒｇをコードするヌクレオチド配列）、８）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＱ９００２３（ドブネズミ４５８アミノ酸Ｅｓｒｒｇ）およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ３４１０１７（ドブネズミ４５８アミノ酸Ｅｓｒｒｇをコードするヌクレオチド配列）、９）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＡＡ２１４４９（ウシ４３５アミノ酸Ｅｓｒｒｇ）およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＪ０６２４７４（ウシ４３５アミノ酸Ｅｓｒｒｇをコードするヌクレオチド配列）、１０）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＡＡ２１４４８（ウシ４５８アミノ酸Ｅｓｒｒｇ）を参照。
【００７１】
いくつかの実施形態では、好適なＥｓｒｒｇ核酸は、図１０Ａおよび１０Ｂに示されるヌクレオチド配列（配列番号２）の隣接する一続きの約１０００ヌクレオチド〜約１１００ヌクレオチド（ｎｔ）、約１１００ｎｔ〜約１２００ｎｔ、または約１２００ｎｔ〜約１３０８ｎｔに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、好適なＥｓｒｒｇ核酸は、図１０Ａおよび１０Ｂに示されるヌクレオチド配列（配列番号２）の隣接する一続きの約１０００ヌクレオチド〜約１１００ヌクレオチド（ｎｔ）、約１１００ｎｔ〜約１２００ｎｔ、約１２００ｎｔ〜約１３００ｎｔ、または１３００ｎｔ〜１３７７ｎｔに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００７２】
好適なＥｓｒｒｇ核酸はＥｓｒｒｇポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、いくつかの実施形態では、好適なＥｓｒｒｇポリペプチドは、図９（配列番号１）に示されるアミノ酸配列の隣接する一続きの約３５０アミノ酸（ａａ）〜約４００ａａ、または約４００ａａ〜４３５ａａに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、好適なＥｓｒｒｇポリペプチドは、図９に示されるアミノ酸配列（配列番号１）の隣接する一続きの約３５０アミノ酸（ａａ）〜約４００ａａ、または約４００ａａ〜約４３５ａａに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。コードされたＥｓｒｒｇポリペプチドは、例えば、特にエストロゲン応答要素に対して生物学的に活性である。
【００７３】
好適なＥｓｒｒｇ核酸はＥｓｒｒｇポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、いくつかの実施形態では、好適なＥｓｒｒｇポリペプチドは、ａ）図１１Ａおよび１１Ｂ（配列番号７）に示される３４３アミノ酸配列の隣接する一続きの約３００アミノ酸（ａａ）〜約３４３ａａ、ｂ）図１１Ａおよび１１Ｂ（配列番号４）に示される４４２アミノ酸配列の隣接する一続きの約４００アミノ酸（ａａ）〜約４４２アミノ酸、ｃ）図１１Ａおよび１１Ｂ（配列番号６）に示される隣接する一続きの４５７アミノ酸配列の約４００アミノ酸〜約４５７アミノ酸、またはｄ）図９（配列番号１）に示されるアミノ酸配列の隣接する一続きの約４００アミノ酸〜約４３５アミノ酸に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、好適なＥｓｒｒｇポリペプチドは、ａ）図１１Ａおよび１１Ｂ（配列番号７）に示される３４３アミノ酸配列の隣接する一続きの約３００アミノ酸（ａａ）〜約３４３ａａ、ｂ）図１１Ａおよび１１Ｂ（配列番号４）に示される４４２アミノ酸配列の隣接する一続きの約４００アミノ酸〜約４４２アミノ酸、ｃ）図１１Ａおよび１１Ｂ（配列番号６）に示される４５７アミノ酸配列の隣接する一続きの約４００アミノ酸〜約４５７アミノ酸、またはｄ）図９（配列番号１）に示されるアミノ酸配列の隣接する一続きの約４００アミノ酸〜約４３５アミノ酸に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。コードされたＥｓｒｒｇポリペプチドは、例えば、特にエストロゲン応答要素に対して生物学的に活性である。
【００７４】
Ｇａｔａ４
Ｇａｔａ４ポリペプチドは、多くの遺伝子のプロモーター領域に存在するＧＡＴＡモチーフを認識し、それに結合する（例えば、コンセンサス配列５’−ＡＧＡＴＡＧ−３’を認識し、それに結合する）ＧＡＴＡファミリーの亜鉛フィンガー転写因子のメンバーである。例えば、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １５５：２１９を参照。様々な種からのＧａｔａ４ポリペプチドのアミノ酸配列およびＧａｔａ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は当該技術分野において既知である。例えば、１）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２０４３．２（ヒトＧａｔａ４アミノ酸配列およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２０５２（ヒトＧａｔａ４をコードするヌクレオチド配列、２）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３２１１８（ハツカネズミＧａｔａ４アミノ酸配列）およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００８０９２（ハツカネズミＧａｔａ４をコードするヌクレオチド配列）、３）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿６５３３３１（ドブネズミＧａｔａ４アミノ酸配列）およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１４４７３０（ドブネズミＧａｔａ４をコードするヌクレオチド配列）、４）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＩ６３５７５（ゼブラフィッシュＧａｔａ４アミノ酸配列およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ８８６６６４（ゼブラフィッシュＧａｔａ４をコードするヌクレオチド配列、ならびに５）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ７１１０１．１（アフリカツメガエルＧａｔａ４アミノ酸配列）およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０７１１０７（アフリカツメガエルＧａｔａ４をコードするヌクレオチド配列）を参照。
【００７５】
いくつかの実施形態では、好適なＧａｔａ４核酸は、図１３に示されるヌクレオチド配列（配列番号９）の隣接する一続きの約９００ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、約１０００ｎｔ〜約１１００ｎｔ、約１１００ｎｔ〜約１２００ｎｔ、または約１２００ｎｔ〜１３２９ｎｔに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、好適なＧａｔａ４核酸は、図１３に示されるヌクレオチド配列（配列番号９）の隣接する一続きの約９００ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、約１０００ｎｔ〜約１１００ｎｔ、約１１００ｎｔ〜約１２００ｎｔ、または約１２００ｎｔ〜１３２３ｎｔに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００７６】
好適なＧａｔａ４核酸はＧａｔａ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、いくつかの実施形態では、好適なＧａｔａ４ポリペプチドは、図１２に示されるアミノ酸配列（配列番号８）の隣接する一続きの約３５０アミノ酸（ａａ）〜約４００ａａ、または約４００ａａ〜４４２ａａに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、好適なＧａｔａ４ポリペプチドは、図１２に示されるアミノ酸配列（配列番号８）の隣接する一続きの約３５０アミノ酸（ａａ）〜約４００ａａ、または約４００ａａ〜４４１ａａに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。コードされたＧａｔａ４ポリペプチドは生物学的に活性であり、例えば、プロモーターに存在するＧＡＴＡモチーフを認識し、それに結合し（例えば、コンセンサス配列５’−ＡＧＡＴＡＧ−３’を認識し、それに結合する）、かつＧＡＴＡモチーフを含むプロモーターに作用可能に連結される遺伝子の転写を活性化する。
【００７７】
いくつかの実施形態では、Ｇａｔａ４ポリペプチドに機能的に等価であるポリペプチド（またはそのような機能的等価物をコードするヌクレオチド配列）が使用される。例えば、いくつかの実施形態では、Ｇａｔａ５ポリペプチド（またはＧａｔａ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）が使用される。他の実施形態では、Ｇａｔａ６ポリペプチド（またはＧａｔａ６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）が使用される。
【００７８】
Ｇａｔａ５ポリペプチドのアミノ酸配列およびＧａｔａ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は当該技術分野において既知である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号１）ＮＰ＿５３６７２１（ヒトＧａｔａ５アミノ酸配列）およびＮＭ＿０８０４７３（ＮＰ＿５３６７２１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、２）ＮＰ＿０３２１１９（ハツカネズミＧａｔａ５アミノ酸配列）およびＮＭ＿００８０９３（ＮＰ＿０３２１１９アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、ならびに３）ＮＰ＿００１０１９４８７（ドブネズミＧａｔａ５アミノ酸配列）およびＮＭ＿００１０２４３１６（ＮＰ＿００１０１９４８７アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）を参照。
【００７９】
Ｇａｔａ６ポリペプチドのアミノ酸配列およびＧａｔａ６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は当該技術分野において既知である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号１）ＮＰ＿００５２４８（ヒトＧａｔａ６アミノ酸配列）およびＮＭ＿００５２５７（ＮＰ＿００５２４８アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、２）ＮＰ＿０６２０５８（ドブネズミＧａｔａ６アミノ酸配列）およびＮＭ＿０１９１８５（ＮＰ＿０６２０５８アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、３）ＮＰ＿０３４３８８（ハツカネズミＧａｔａ６アミノ酸配列）およびＮＭ＿０１０２５８（ＮＰ＿０３４３８８アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）を参照。
【００８０】
いくつかの実施形態では、Ｇａｔａ４ポリペプチドの好適な機能的等価物は、Ｇａｔａ５ポリペプチドまたはＧａｔａ６ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドである。
【００８１】
いくつかの実施形態では、Ｇａｔａ４ポリペプチドの機能的等価物をコードする好適なヌクレオチド配列は、Ｇａｔａ５ポリペプチドまたはＧａｔａ６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００８２】
Ｍｅｆ２ｃ
Ｍｅｆ２ｃ（筋細胞特異的エンハンサー因子２ｃ）は、多くの筋特異的遺伝子の調節領域に存在する、ＭＥＦ２要素（例えばコンセンサス配列：５’−ＣＴ（Ａ／ｔ）（ａ／ｔ）ＡＡＡＴＡＧ−３’）（配列番号２０）に特異的に結合する転写活性因子である。例えば、Ａｎｄｒeｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２３２４６を参照。Ｍｅｆ２ｃは、１つ以上の翻訳後修飾、例えばＳｅｒ−５９およびＳｅｒ−３９６に対するリン酸化、Ｌｙｓ−３９１に対するｓｕｍｏ化、およびＬｙｓ−４に対するアセチル化を含み得る。
【００８３】
様々な種からのＭｅｆ２ｃポリペプチドのアミノ酸配列およびＭｅｆ２ｃポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は当該技術分野において既知である。例えば、１）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿００１０５６６９２（ドブネズミＭｅｆ２ｃアミノ酸配列）およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿００１０５６６９２（ドブネズミＭｅｆ２ｃをコードするヌクレオチド配列）、２）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０７９５５８．１（ハツカネズミＭｅｆ２ｃイソ型２アミノ酸配列）およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２５２８２（ハツカネズミＭｅｆ２ｃイソ型２をコードするヌクレオチド配列）、３）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１１６４００８（ハツカネズミＭｅｆ２ｃイソ型１アミノ酸配列）およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１７０５３７（ハツカネズミＭｅｆ２ｃイソ型１をコードするヌクレオチド配列）、４）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１１２４４７７（ヒトＭｅｆ２ｃイソ型２アミノ酸配列）およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１３１００５（ヒトＭｅｆ２ｃイソ型２をコードするヌクレオチド配列）、５）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２３８８（ヒトＭｅｆ２ｃイソ型１アミノ酸配列）およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２３９７（ヒトＭｅｆ２ｃイソ型１をコードするヌクレオチド配列）を参照。
【００８４】
いくつかの実施形態では、好適なＭｅｆ２ｃ核酸は、図１５に示されるヌクレオチド配列（配列番号１１）の隣接する一続きの約９００ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、約１０００ｎｔ〜約１１００ｎｔ、約１１００ｎｔ〜約１２００ｎｔ、約１２００ｎｔ〜１３００ｎｔ、または約１３００ｎｔ〜１３９２ｎｔに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００８５】
いくつかの実施形態では、好適なＭｅｆ２ｃ核酸は、図１７に示されるヌクレオチド配列（配列番号１３）の隣接する一続きの約９００ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、約１０００ｎｔ〜約１１００ｎｔ、約１１００ｎｔ〜約１２００ｎｔ、約１２００ｎｔ〜１３００ｎｔ、または約１３００ｎｔ〜１４２２ｎｔに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００８６】
好適なＭｅｆ２ｃ核酸は、Ｍｅｆ２ｃポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、いくつかの実施形態では、好適なＭｅｆ２ｃポリペプチドは、図１４に示されるアミノ酸配列（配列番号１０）の隣接する一続きの約３５０アミノ酸（ａａ）〜約４００ａａ、または約４００ａａ〜４６３ａａに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。コードされたＭｅｆ２ｃポリペプチドは生物学的に活性であり、例えば、プロモーターにおいてＭＥＦ２Ｃ要素を認識し、それに結合し、かつプロモーターに作用可能に連結される遺伝子の転写を活性化する。
【００８７】
好適なＭｅｆ２ｃ核酸はＭｅｆ２ｃポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、好適なＭｅｆ２ｃポリペプチドは、図１６に示されるアミノ酸配列（配列番号１２）の隣接する一続きの約３５０アミノ酸（ａａ）〜約４００ａａ、または約４００ａａ〜４７３ａａに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。コードされたＭｅｆ２ｃポリペプチドは生物学的に活性であり、例えば、プロモーターにおいてＭＥＦ２Ｃ要素を認識し、それに結合し、かつプロモーターに作用可能に連結される遺伝子の転写を活性化する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、Ｍｅｆ２ｃポリペプチドに機能的に等価であるポリペプチド（またはそのような機能的等価物をコードするヌクレオチド配列）が使用される。例えば、いくつかの実施形態では、Ｍｅｆ２ａポリペプチド（またはＭｅｆ２ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）が使用される。他の実施形態では、Ｍｅｆ２ｂポリペプチド（またはＭｅｆ２ｂポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）が使用される。他の実施形態では、Ｍｅｆ２ｄポリペプチド（またはＭｅｆ２ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）が使用される。
【００８９】
Ｍｅｆ２ａ、Ｍｅ２ｂ、およびＭｅｆ２ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と同様、Ｍｅｆ２ａ、Ｍｅ２ｂ、およびＭｅｆ２ｄポリペプチドのアミノ酸配列が既知である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：１）ＮＰ＿００５５７８．２（ヒトＭｅｆ２ａイソ型１アミノ酸配列）およびＮＭ＿００５５８７（ＮＰ＿００５５７８．２アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、２）ＮＰ＿００１１２４３９８．１（ヒトＭｅｆ２ａイソ型２アミノ酸配列）およびＮＭ＿００１１３０９２６（ＮＰ＿００１１２４３９８．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、３）ＮＰ＿００１１２４３９９．１（ヒトＭｅｆ２ａイソ型３アミノ酸配列）およびＮＭ＿００１１３０９２７（ＮＰ＿００１１２４３９９．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、４）ＮＰ＿００１１２４４００．１（ヒトＭｅｆ２ａイソ型４アミノ酸配列）およびＮＭ＿００１１３０９２８（ＮＰ＿００１１２４４００．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、５）ＮＰ＿００１１３９２５７．１（ヒトＭｅｆ２ｂイソ型ａアミノ酸配列）およびＮＭ＿００１１４５７８５（ＮＰ＿００１１３９２５７．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、６）ＮＰ＿００５９１０．１（ヒトＭｅｆ２ｂイソ型ｂアミノ酸配列）およびＮＭ＿００５９１９（ＮＰ＿００５９１０．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、７）ＮＰ＿０３２６０４．２（ハツカネズミＭｅｆ２ｂイソ型１アミノ酸配列）およびＮＭ＿００８５７８（ＮＰ＿０３２６０４．２アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、８）ＮＰ＿００１０３８９４９．１（ハツカネズミＭｅｆ２ｂイソ型２アミノ酸配列）およびＮＭ＿００１０４５４８４（ＮＰ＿００１０３８９４９．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、９）ＮＰ＿００５９１１．１（ヒトＭｅｆ２ｄアミノ酸配列）およびＮＭ＿００５９２０（ＮＰ＿００５９１１．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、ならびに１０）ＮＰ＿５９８４２６．１（ハツカネズミＭｅｆ２ｄアミノ酸配列）およびＮＭ＿１３３６６５（ＮＰ＿５９８４２６．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）を参照。
【００９０】
いくつかの実施形態では、Ｍｅｆ２ｃポリペプチドの好適な機能的等価物は、Ｍｅｆ２ａポリペプチド、Ｍｅｆ２ｂポリペプチド、またはＭｅｆ２ｄポリペプチドのアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドである。
【００９１】
いくつかの実施形態では、Ｍｅｆ２ｃポリペプチドの機能的等価物をコードする好適なヌクレオチド配列は、Ｍｅｆ２ａポリペプチド、Ｍｅｆ２ｂポリペプチド、またはＭｅｆ２ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００９２】
Ｔｂｘ５
Ｔｂｘ５（Ｔ−ｂｏｘ転写因子５）は、いくつかの遺伝子のプロモーター領域において、Ｔ−ｂｏｘ（例えば、コンセンサス配列５’−（Ａ／Ｇ）ＧＧＴＧＴ−３’を有する要素）に結合し、それを認識する転写因子であり、かつそのようなプロモーターに作用可能に連結される遺伝子の転写を活性化する。
【００９３】
様々な種からのＴｂｘ５ポリペプチドのアミノ酸配列およびＴｂｘ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は当該技術分野において既知である。例えば、１）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ７０５９２．１（ヒトＴｂｘ５アミノ酸配列）、およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｙ０９４４５（ヒトＴｂｘ５をコードするヌクレオチド配列）、２）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００１８３（ヒトＴｂｘ５アミノ酸配列）、およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００１９２（ヒトＴｂｘ５をコードするヌクレオチド配列）、３）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１００９９６４．１（ドブネズミＴｂｘ５アミノ酸配列）、およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１００９９６４（ドブネズミＴｂｘ５をコードするヌクレオチド配列、４）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３５６６７（ハツカネズミＴｂｘ５アミノ酸配列）、およびＮＭ＿０１１５３７（ハツカネズミＴｂｘ５をコードするヌクレオチド配列）、５）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０７９１７０（アフリカツメガエルＴｂｘ５アミノ酸配列）、およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０８５７０１（アフリカツメガエルＴｂｘ５をコードするヌクレオチド配列）を参照。
【００９４】
いくつかの実施形態では、好適なＴｂｘ５核酸は、図１９に示されるヌクレオチド配列（配列番号１５）の隣接する一続きの約９００ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、約１２００ｎｔ〜１３００ｎｔ、約１３００ｎｔ〜約１４００ｎｔ、または約１４００ｎｔ〜約１５００ｎｔ、または約１５００ｎｔ〜１５４２ｎｔに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００９５】
いくつかの実施形態では、好適なＴｂｘ５核酸は、図２１に示されるヌクレオチド配列（配列番号１７）の隣接する一続きの約９００ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、約１２００ｎｔ〜１３００ｎｔ、約１３００ｎｔ〜約１４００ｎｔ、または約１４００ｎｔ〜約１５００ｎｔ、または約１５００ｎｔ〜１５５７ｎｔに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００９６】
好適なＴｂｘ５核酸は、Ｔｂｘ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、好適なＴｂｘ５ポリペプチドは、図１８に示されるアミノ酸配列（配列番号１４）の隣接する一続きの約３５０アミノ酸（ａａ）〜約４００ａａ、約４００ａａ〜約５００ａａ、または約５００ａａ〜５１３ａａに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、好適なＴｂｘ５ポリペプチドは、図２０に示されるアミノ酸配列（配列番号１６）の隣接する一続きの約３５０アミノ酸（ａａ）〜約４００ａａ、約４００ａａ〜約５００ａａ、または約５００ａａ〜５１８ａａに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。コードされたＴｂｘ５ポリペプチドは生物学的に活性であり、例えば、プロモーターにおいてＴｂｘ５結合部位（例えば、コンセンサス配列５’−（Ａ／Ｇ）ＧＧＴＧＴ−３’を有する要素）を認識し、それに結合し、かつプロモーターに作用可能に連結される遺伝子の転写を活性化する。
【００９７】
好適なＴｂｘ５核酸はＴｂｘ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、いくつかの実施形態では、好適なＴｂｘ５ポリペプチドは、図２０に示されるアミノ酸配列（配列番号１６）の隣接する一続きの約３５０アミノ酸（ａａ）〜約４００ａａ、または約４００ａａ〜約５００ａａ、約５００ａａ〜５１８ａａに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。コードされたＴｂｘ５ポリペプチドは生物学的に活性であり、例えば、プロモーターにおいてＴｂｘ５結合部位（例えば、コンセンサス配列５’−（Ａ／Ｇ）ＧＧＴＧＴ−３’を有する要素）を認識し、それに結合し、かつプロモーターに作用可能に連結される遺伝子の転写を活性化する。
【００９８】
Ｍｅｓｐ１
いくつかの実施形態では、好適な背側中胚葉タンパク質１（Ｍｅｓｐ１）核酸は、図２３に示されるヌクレオチド配列（配列番号１９）の隣接する一続きの約６００ヌクレオチド〜約８００ヌクレオチド（ｎｔ）、または８０４ｎｔに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００９９】
好適なＭｅｓｐ１核酸はＭｅｓｐ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、いくつかの実施形態では、好適なＭｅｓｐ１ポリペプチドは、図２２に示されるアミノ酸配列（配列番号１８）の隣接する一続きの約２００アミノ酸（ａａ）〜約２５０ａａ、または約２５０ａａ〜２６８ａａに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。コードされたＭｅｓｐ１ポリペプチドは生物学的に活性である。
【０１００】
リプログラミング因子Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｅｓｐ１、Ｔｂｘ５、およびＥｓｒｒｇをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸の導入は、出生後線維芽細胞を心筋細胞にリプログラミングするのに十分であることが分かった。よって、出生後線維芽細胞は、線維芽細胞を幹細胞、または前駆細胞を出生後線維芽細胞にリプログラミングするであろう誘導因子（例えば、いずれの他の外因性ポリペプチド、いずれの他の外因性ポリペプチドをコードするいずれの他の核酸）を導入する必要なく、心筋細胞になるようリプログラミングされ得る。例えば、対象方法は、外因性Ｓｏｘ２ポリペプチド、外因性Ｏｃｔ−３／４ポリペプチド、外因性ｃ−Ｍｙｃポリペプチド、外因性Ｋｌｆ４ポリペプチド、外因性Ｎａｎｏｇポリペプチド、または外因性Ｌｉｎ２８ポリペプチドのいずれかを出生後線維芽細胞に導入することを必要とせず、かつそれを伴わない。対象方法は、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ−３／４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇのいずれか、または線維芽細胞を幹細胞もしくは前駆細胞にリプログラミングするであろういずれの他のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（複数可）を出生後線維芽細胞に導入することを必要とせず、かつそれを伴わない。
【０１０１】
上述のように、誘導心筋細胞を生成するために、出生後線維芽細胞は、１つ以上のリプログラミング因子をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で遺伝子改変される。誘導心筋細胞は、１つ以上の心筋細胞特異的マーカーを発現し、心筋細胞特異的マーカーは、心臓トロポニンＩ、心臓トロポニン−Ｃ、トロポミオシン、カベオリン−３、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖−２ａ、ミオシン軽鎖−２ｖ、リアノジン受容体、サルコメアα−アクチニン、Ｎｋｘ２．５、コネキシン４３、および心房性ナトリウム利尿因子を含むが、これらに限定されない。誘導心筋細胞は、サルコメア構造を呈することもできる。誘導心筋細胞は、心筋細胞特異的遺伝子ＡＣＴＣ１（心臓α−アクチン）、ＡＣＴＮ２（アクチニンａ２）、ＭＹＨ６（α−ミオシン重鎖）、ＲＹＲ２（リアノジン受容体２）、ＭＹＬ２（ミオシン調節軽鎖２、心室イソ型）、ＭＹＬ７（ミオシン調節軽鎖、心房イソ型）、ＴＮＮＴ２（トロポニンＴ２型、心臓）、およびＮＰＰＡ（ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ａ型）、ＰＬＮ（ホスホランバン）の増加した発現を呈する。Ｃｏｌ１ａ２（コラーゲン１ａ２）等の線維芽細胞マーカーの発現は、ｉＣＭが由来する線維芽細胞と比較して、誘導心筋細胞において下方調節される。
【０１０２】
心筋細胞に特異的な様々なマーカーの発現は、従来の生化学法または免疫化学法（例えば酵素結合免疫吸着測定法、免疫組織化学的アッセイ等）により検出される。別の方法としては、心筋細胞特異的マーカーをコードする核酸の発現が評価され得る。細胞における心筋細胞特異的マーカーをコードする核酸の発現は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）またはハイブリダイゼーション分析、いずれのマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡを増幅、検出、および分析するために、過去に一般的に使用されてきた分子生物学的方法により確認され得る。心筋細胞に特異的なマーカーをコードする核酸配列は既知であり、ＧｅｎＢａｎｋ等の公共のデータベースを通して利用可能であり、よって、プライマーまたはプローブとして使用するために必要とされるマーカー特異的配列は容易に決定される。
【０１０３】
誘導心筋細胞は、自発的収縮を呈することもできる。誘導心筋細胞が自発的収縮を呈するか否かは、標準的な電気生理学的法（例えばパッチクランプ）を用いて決定され得、好適な方法は実施例において記載される。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、誘導心筋細胞は、自発的Ｃａ２＋振動を呈することができるＣａ２＋振動は、標準的な方法、例えば、様々なカルシウム感受性染料のいずれかを用いて検出され得る。細胞内Ｃａ２＋イオン検出染料は、ｆｕｒａ−２、ｂｉｓ−ｆｕｒａ２、ｉｎｄｏ−１、Ｑｕｉｎ−２、Ｑｕｉｎ−２ＡＭ、ベンゾチアザ−１、ベンゾチアザ−２、ｉｎｄｏ−５Ｆ、Ｆｕｒａ−ＦＦ、ＢＴＣ、Ｍａｇ−Ｆｕｒａ−２、Ｍａｇ−Ｆｕｒａ−５、Ｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１、ｆｌｕｏ−３、ｒｈｏｄ−２、ｒｈｏｄ−３、ｆｕｒａ−４Ｆ、ｆｕｒａ−５Ｆ、ｆｕｒａ−６Ｆ、ｆｌｕｏ−４、ｆｌｕｏ−５Ｆ、ｆｌｕｏ−５Ｎ、オレゴングリーン４８８  ＢＡＰＴＡ、カルシウムグリーン、カルセイン、Ｆｕｒａ−Ｃ１８、カルシウムグリーン−Ｃ１８、カルシウムオレンジ、カルシウムクリムゾン、カルシウムグリーン−５Ｎ、マグネシウムグリーン、オレゴングリーン４８８  ＢＡＰＴＡ−１、オレゴングリーン４８８  ＢＡＰＴＡ−２、Ｘ−ｒｈｏｄ−１、Ｆｕｒａレッド、Ｒｈｏｄ−５Ｆ、Ｒｈｏｄ−５Ｎ、Ｘ−Ｒｈｏｄ−５Ｎ、Ｍａｇ−Ｒｈｏｄ−２、Ｍａｇ−Ｘ−Ｒｈｏｄ−１、Ｆｌｕｏ−５Ｎ、Ｆｌｕｏ−５Ｆ、Ｆｌｕｏ−４ＦＦ、Ｍａｇ−Ｆｌｕｏ−４、エクオリン、デキストラン抱合体、またはこれらの染料のいずれかのいずれの他の誘導体、およびその他（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅのカタログもしくはインターネットサイトを参照、Ｎｕｃｃｉｔｅｌｌｉ，ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４０：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｌａｍｂｅｒｔ，ｅｄ．，Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １１４），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）、Ｗ．Ｔ．Ｍａｓｏｎ，ｅｄ．，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｎｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），２００５，Ｄ．Ｇ．Ｌａｍｂｅｒ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ．も参照）を含むが、これらに限定されない。
【０１０５】
出生後線維芽細胞への外因性リプログラミング因子ポリペプチドの導入
いくつかの実施形態では、出生後線維芽細胞への外因性リプログラミング因子ポリペプチドの導入は、出生後線維芽細胞を外因性リプログラミング因子ポリペプチドと接触させることにより達成され、外因性リプログラミング因子ポリペプチドは細胞に取り込まれる。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、外因性リプログラミング因子ポリペプチドのそれぞれは、タンパク質形質導入ドメインを含む。非限定的な例としては、外因Ｇａｔａ４ポリペプチド、外因性Ｍｅｆ２Ｃポリペプチド、外因性Ｔｂｘ５ポリペプチド、外因性Ｍｅｓｐ１ポリペプチド、および外因性Ｅｓｒｒｇポリペプチドのうちの１つ以上は、タンパク質形質導入ドメインに共有結合的に、または非共有結合的に連結される。
【０１０７】
「タンパク質形質導入ドメイン」またはＰＴＤとは、脂質二分子層、ミセル、細胞膜、小器官膜、もしくは小胞膜の横断を容易にするポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または有機もしくは無機の化合物を指す。別の分子に結合されたＰＴＤは、分子が膜を横断する、例えば細胞外空間から細胞内空間、または細胞質ゾルから小器官内に行くのを容易にする。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、リプログラミング因子ポリペプチドのアミノ末端に共有結合的に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、リプログラミング因子ポリペプチドのカルボキシル末端に共有結合的に連結される。
【０１０８】
例示的なタンパク質形質導入ドメインは、最小ウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを含むＨＩＶ−１  ＴＡＴの残基４７〜５７に対応する、配列番号２１）、細胞への直接侵入に十分であるいくつかのアルギニンを含むポリアルギニン配列（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０〜５０のアルギニン）、ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００２  Ｊｕｎｅ；９（６）：４８９−９６）、ドロソフィラアンテナペディアタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２００３；５２（７）：１７３２−１７３７）、切り詰められたヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２１：１２４８−１２５６，２００４）、ポリリシン（Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９７：１３００３−１３００８）、ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号２２）、トランスポータン（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２３）、ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号２４）、およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２５）を含むが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤは、これらに限定されないが、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２１）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２６）、３個のアルギニン残基〜５０個のアルギニン残基のアルギニンホモポリマーを含み、例示的なＰＴＤドメインアミノ酸配列は、これらに限定されないが、次の：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２１）、ＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号２６）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号２７）、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号２８）、およびＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号２９）のうちのいずれかを含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、外因性リプログラミング因子ポリペプチド（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドのうちの１つ以上）は、３個のアルギニン残基〜５０個のアルギニン残基、例えば３〜６個のアルギニン残基、６〜１０個のアルギニン残基、１０〜２０個のアルギニン残基、２０〜３０個のアルギニン残基、３０〜４０個のアルギニン残基、４０〜５０個のアルギニン残基のアルギニンホモポリマーを含む。いくつかの実施形態では、外因性リプログラミング因子ポリペプチドは、リプログラミング因子ポリペプチドのアミノ末端で共有結合的に連結された（例えばペプチド結合により）６個のＡｒｇ残基を含む。いくつかの実施形態では、外因性リプログラミング因子ポリペプチドは、リプログラミング因子ポリペプチドのカルボキシル末端で共有結合的に連結された（例えばペプチド結合により）６個のＡｒｇ残基を含む。
【０１１０】
宿主出生後線維芽細胞に導入される外因性リプログラミング因子ポリペプチドは、例えば、少なくとも約７５％の純度、少なくとも約８０％の純度、少なくとも約８５％の純度、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度、少なくとも約９８％の純度、少なくとも約９９％の純度、または９９％超の純度に精製され、例えば、細胞に導入されるリプログラミング因子（複数可）以外のタンパク質を含まず、かつ細胞に導入されるリプログラミング因子（複数可）以外の巨大分子を含まない。
【０１１１】
出生後線維芽細胞の遺伝的改変
いくつかの実施形態では、出生後線維芽細胞への外因性リプログラミング因子ポリペプチド（例えば、１）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチド、２）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、およびＭｙｏｃｄポリペプチド、３）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、または４）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、ならびにＮｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドのうちの１つ以上）の導入は、出生後線維芽細胞を、リプログラミング因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の外因性核酸で遺伝子改変することにより達成される。以下の考察では、リプログラミング因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の外因性核酸は、一般的に、「１つ以上の外因性核酸」と称される。
【０１１２】
上述の外因性リプログラミング因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の外因性核酸は、組換え発現ベクターであり得、好適なベクターは、例えば、組換えレトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノウイルス；レトロウイルス発現ベクター、レンチウイルス発現ベクター、核酸発現ベクター、およびプラスミド発現ベクターを含む。いくつかの場合では、１つ以上の外因性核酸は、宿主出生後線維芽細胞およびその子孫のゲノムに組み込まれる。他の場合では、１つ以上の外因性核酸は、宿主出生後線維芽細胞およびその子孫において、エピソーム状態で持続する。いくつかの場合では、リプログラミング因子をコードする核酸の内因性の天然型が既に細胞に存在する場合があるが、リプログラミング因子の発現を増加させるために、さらなる「外因性遺伝子」が宿主出生後線維芽細胞に付加される。他の場合では、外因性リプログラミング因子をコードする核酸は、出生後線維芽細胞内の内因性リプログラミング因子をコードする核酸によってコードされるポリペプチドと１つ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有するリプログラミング因子ポリペプチドをコードする。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、出生後線維芽細胞は、５つの別個の発現構築物（発現ベクター）で遺伝子改変され、それぞれが１つのリプログラミング因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、出生後線維芽細胞は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドをコードする２つ、３つ、または４つの別個の発現構築物（発現ベクター）で遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、単一の発現構築物は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドの５つ全てをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、リプログラミング因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の外因性核酸は、生体外で単一の出生後線維芽細胞（例えば、単一の出生後線維芽細胞宿主細胞）に導入される。他の実施形態では、リプログラミング因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の外因性核酸は、生体外で出生後線維芽細胞の集団（例えば宿主出生後線維芽細胞の集団）に導入される。いくつかの実施形態では、リプログラミングポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の外因性核酸は、生体内で出生後線維芽細胞（例えば、単一の出生後線維芽細胞または出生後線維芽細胞の集団）に導入される。
【０１１５】
出生後線維芽細胞の集団がリプログラミング因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の外因性核酸で遺伝子改変される（生体外または生体内で）場合、１つ以上の外因性核酸は、出生後線維芽細胞の全集団の２０％超、例えば、２５％、３０％、３５％、４０％、４４％、５０％、５７％、６２％、７０％、７４％、７５％、８０％、９０％、または２０％を超える他のパーセントの細胞に導入され得る。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、リプログラミング因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸は、遺伝子改変された宿主出生後線維芽細胞において１つ以上のリプログラミング因子ポリペプチドの生成を提供する発現構築物である。いくつかの実施形態では、発現構築物は、ウイルス性構築物、例えば、組換えアデノ関連ウイルス構築物（例えば米国特許第７，０７８，３８７号を参照）、組換えアデノウイルス構築物、組換えレンチウイルス構築物等である。
【０１１７】
好適な発現ベクターは、ウイルス性ベクター（例えば、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルスに基づくウイルス性ベクター（例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３５：２５４３  ２５４９，１９９４、Ｂｏｒｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ６：５１５  ５２４，１９９９、Ｌｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ  ９２：７７００  ７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ５：１０８８  １０９７，１９９９、国際公開第９４／１２６４９号、国際公開第９３／０３７６９号、国際公開第９３／１９１９１号、国際公開第９４／２８９３８号、国際公開第９５／１１９８４号、および国際公開第９５／００６５５号を参照）、アデノ関連ウイルス（例えば、Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９：８１  ８６，１９９８、Ｆｌａｎｎｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９４：６９１６  ６９２１，１９９７、Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３８：２８５７  ２８６３，１９９７、Ｊｏｍａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ４：６８３  ６９０，１９９７、Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：６４１  ６４８，１９９９、Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ５：５９１  ５９４，１９９６、国際公開第９３／０９２３９号のＳｒｉｖａｓｔａｖａ、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２−３８２８、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４−１６５、およびＦｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３−１０６１７を参照）、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９４：１０３１９  ２３，１９９７、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：７８１２  ７８１６，１９９９を参照）、レトロウイルスベクター（例えば、ネズミ科動物白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにＲｏｕｓ肉腫ウイルス、Ｈａｒｖｅｙ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳房腫瘍ウイルス等のレトロウイルスに由来するベクター）等を含むが、これらに限定されない。
【０１１８】
多くの好適な発現ベクターが当業者に既知であり、多くが商業的に入手可能である。次のベクターは例として提供される；真核生物宿主細胞に関して、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかしながら、宿主細胞と適合性がある限り、いずれの他のベクターをも使用することができる。
【０１１９】
利用される宿主／ベクター系により、構成的および誘導性のプロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーター等を含む、いくつかの好適な転写および翻訳制御要素のうちのいずれかが、発現ベクターにおいて使用され得る（例えばＢｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６−５４４を参照）。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、リプログラミング因子をコードするヌクレオチド配列（例えば、Ｇａｔａ４をコードするヌクレオチド配列、Ｍｅｆ２ｃをコードするヌクレオチド配列、Ｔｂｘ５をコードするヌクレオチド配列）は、制御要素、例えばプロモーター等の転写制御要素に作用可能に連結される。転写制御要素は、真核細胞、例えば哺乳類細胞において機能的である。好適な転写制御要素は、プロモーターおよびエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは構成的に活性である。他の実施形態では、プロモーターは誘導性である。
【０１２１】
好適な真核生物プロモーター（真核細胞において機能的であるプロモーター）の非限定的な例としては、ＣＭＶ即時初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスからの長末端反復配列（ＬＴＲ）、およびマウスメタロチオネイン−Ｉを含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、リプログラミング因子をコードするヌクレオチド配列は、心臓特異的転写調節要素（ＴＲＥ）に作用可能に連結され、ＴＲＥはプロモーターおよびエンハンサーを含む。好適なＴＲＥは、次の遺伝子に由来するＴＲＥを含むが、これらに限定されない：ミオシン軽鎖−２、α−ミオシン重鎖、ＡＥ３、心臓トロポニンＣ、および心臓アクチン。Ｆｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５：５６０−５６６、Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５２：４９２−５０５、Ｌｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７６：５８４−５９１、Ｐａｒｍａｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：１８７０−１８８５、Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ２２：６０８−６１７、およびＳａｒｔｏｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４０４７−４０５１。
【０１２３】
適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。発現ベクターは、翻訳開始のリボソーム結合部位および転写ターミネーターも含み得る。発現ベクターは、発現を増幅するための適切な配列も含み得る。
【０１２４】
好適な哺乳類発現ベクター（哺乳類の宿主細胞における使用に好適な発現ベクター）の例としては、組換えウイルス、プラスミド等の核酸ベクター、細菌人工染色体、酵母人工染色体、ヒト人工染色体、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物発現カセットが挙げられるが、これらに限定されない。リプログラミング因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を駆動するための好適なプロモーターの例としては、レトロウイルス長末端反復配列（ＬＴＲ）要素、構成的プロモーター（ＣＭＶ、ＨＳＶ１−ＴＫ、ＳＶ４０、ＥＦ−１α、β−アクチン等）、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）、および誘導性プロモーター（Ｔｅｔオペレーター要素を含むもの等）を含むが、これらに限定されない。いくつかの場合では、哺乳類発現ベクター（複数可）は、外因性リプログラミング因子ポリペプチドに加えて、遺伝子導入された、もしくは感染した細胞の識別または選択を容易にするマーカー遺伝子をコードする。マーカー遺伝子の例としては、蛍光タンパク質、例えば、強化された緑色蛍光タンパク質、Ｄｓ−Ｒｅｄ（ＤｓＲｅｄ：イソギンチャクモドキ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ）種の赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）；Ｂｅｖｉｓ  ａｎｄ  Ｇｌｉｃｋ（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：８３）、黄色蛍光タンパク質、ｍＣｈｅｒｒｙ、およびシアノ蛍光タンパク質をコードする遺伝子、ならびに選択薬剤に耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子、例えばネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２５】
好適なウイルス性ベクターの例としては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルスに基づくウイルス性ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。好適なレトロウイルス系ベクターの例は、ネズミ科動物モロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）に基づくベクターであるが、他の組換えレトロウイルス、例えば、トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス、ネズミ肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス、テナガザル（Ｇｉｂｂｏｎ  Ａｂｅ）白血病ウイルス、マソン・ファイザー・サルウイルス、またはＲｏｕｓ肉腫  ウイルスも使用され得る（例えば米国特許第６，３３３，１９５号を参照）。
【０１２６】
他の場合では、レトロウイルス系ベクターは、レンチウイルス系ベクター（例えばヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、またはネコ科免疫不全ウイルス（ＦＩＶ））である。例えば、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７３（６）：４９９１−５０００（ＦＩＶ）、Ｎｅｇｒｅ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２６１：５３−７４（ＳＩＶ）、Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２：２６３−２６７（ＨＩＶ）を参照。
【０１２７】
組換えレトロウイルスは、標的細胞への侵入を補助するために、ウイルス性ポリペプチド（例えばレトロウイルスｅｎｖ）を含み得る。そのようなウイルス性ポリペプチドは、当該技術分野において十分に確立されているおり、例えば米国特許第５，４４９，６１４号を参照。ウイルス性ポリペプチドは、多数の種に由来する細胞（元の宿主種外の細胞を含む）への侵入を補助する両種指向性ウイルス性ポリペプチド、例えば両種指向性ｅｎｖであり得る。ウイルス性ポリペプチドは、元の宿主種外の細胞への侵入を補助する異種指向性ウイルス性ポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、ウイルス性ポリペプチドは、元の宿主種の細胞への侵入を補助する同種志向性ウイルス性ポリペプチド、例えば同種志向性ｅｎｖである。
【０１２８】
レトロウイルスの細胞への侵入を補助することができるウイルス性ポリペプチドの例としては、ＭＭＬＶ両種指向性ｅｎｖ、ＭＭＬＶ同種志向性ｅｎｖ、ＭＭＬＶ異種指向性ｅｎｖ、水疱性口内炎ウイルス−ｇタンパク質（ＶＳＶ−ｇ）、ＨＩＶ−１  ｅｎｖ、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）ｅｎｖ、ＲＤ１１４、ＦｅＬＶ−Ｃ、ＦｅＬＶ−Ｂ、ＭＬＶ  １０Ａ１  ｅｎｖ遺伝子、およびそれらの変異体を含む（キメラを含む）が、これらに限定されない。例えば、Ｙｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，Ｐｔ  Ａ：９９−１１２（ＶＳＶ−Ｇ）、米国特許第５，４４９，６１４号を参照。いくつかの場合では、ウイルス性ポリペプチドは、発現、または強化された受容体への結合を促進するために遺伝子改変される。
【０１２９】
一般に、組換えウイルスは、ウイルス性ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を産生細胞に導入することにより生成される。いくつかの場合では、産生細胞は、外因性遺伝子を発現しない。他の場合では、産生細胞は、１つ以上の外因性遺伝子、例えば、１つ以上のｇａｇ、ｐｏｌ、もしくはｅｎｖ  ポリペプチドおよび／または１つ以上のレトロウイルスｇａｇ、ｐｏｌ、もしくはｅｎｖポリペプチドをコードする遺伝子を含む「パッケージング細胞」である。レトロウイルスパッケージング細胞は、ウイルス性ポリペプチド、例えば標的細胞への侵入を補助するＶＳＶ−ｇをコードする遺伝子を含み得る。いくつかの場合では、パッケージング細胞は、１つ以上のレンチウイルスタンパク質、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、またはｎｅｆをコードする遺伝子を含む。いくつかの場合では、パッケージング細胞は、Ｅ１ＡもしくはＥ１Ｂ等のアデノウイルスタンパク質、または他のアデノウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む。例えば、パッケージング細胞によって供給されるタンパク質は、レトロウイルス由来タンパク質（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ等）、レンチウイルス由来タンパク質（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、およびｎｅｆ等）、ならびにアデノウイルス由来タンパク質（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ等）であり得る。多くの例では、パッケージング細胞は、ウイルスベクターが由来するウイルスとは別のウイルスに由来するタンパク質を供給する。
【０１３０】
パッケージング細胞系は、いずれの容易に遺伝子導入可能な細胞系を含むが、これらに限定されない。パッケージング細胞系は、２９３Ｔ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ、またはＨｅＬａ細胞系に基づき得る。パッケージング細胞は、ウイルスパッケージングに必要とされるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子において欠損するパッケージウイルスベクタープラスミドに使用されることが多い。そのようなウイルスベクタープラスミドによってコードされるタンパク質から欠けているタンパク質またはポリペプチドを供給することができるいずれの細胞が、パッケージング細胞として使用され得る。パッケージング細胞系の例としては、白金−Ｅ（Ｐｌａｔ−Ｅ）、白金−Ａ（Ｐｌａｔ−Ａ）、ＢＯＳＣ  ２３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １１５５４）、およびＢｉｎｇ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １１２７０）を含むが、これらに限定されない。例えば、Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，７：１０６３−１０６６、Ｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２４：３２４−３２９、米国特許第６，９９５，００９号を参照。市販のパッケージング系、例えば、Ａｍｐｈｏ−Ｐａｋ２９３細胞系、Ｅｃｏ−Ｐａｋ２−２９３細胞系、ＲｅｔｒｏＰａｃｋ  ＰＴ６７細胞系、およびＲｅｔｒｏ−Ｘ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（全てＣｌｏｎｔｅｃｈから入手可能）も有用である。
【０１３１】
レトロウイルス構築物は、様々なレトロウイルス、例えば、ＭＭＬＶ、ＨＩＶ−１、ＳＩＶ、ＦＩＶ、または本明細書に記載される他のレトロウイルスに由来し得る。レトロウイルス構築物は、特定のウイルスの１サイクルを超える複製に必要な全てのウイルス性ポリペプチドをコードし得る。いくつかの場合では、ウイルス侵入の効率は、他の因子または他のウイルス性ポリペプチドの追加により改善される。他の場合では、レトロウイルス構築物によってコードされるウイルス性ポリペプチドは、１サイクルを超える複製を支持しない（例えば、米国特許第６，８７２，５２８号）。そのような状況では、他の因子または他のウイルス性ポリペプチドの追加がウイルスの侵入を容易にするのに役立ち得る。例示的な実施形態では、組換えレトロウイルスは、ＶＳＶ−ｇポリペプチドを含むが、ＨＩＶ−１ｅｎｖポリペプチドを含まないＨＩＶ−１ウイルスである。
【０１３２】
レトロウイルス構築物は、プロモーター、多重クローニング部位、および／または耐性遺伝子を含み得る。プロモーターの例としては、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ１α、β−アクチン、レトロウイルスＬＴＲプロモーター、および誘導性プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。レトロウイルス構築物は、パッケージングシグナル（例えば、ＭＦＧベクターに由来するパッケージングシグナル、ｐｓｉパッケージングシグナル）も含み得る。当該技術分野において既知のいくつかのレトロウイルス構築物の例としては、ｐＭＸ、ｐＢａｂｅＸ、またはそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２４：３２４−３２９を参照。いくつかの場合では、レトロウイルス構築物は、自己不活性化レンチウイルスベクター（ＳＩＮ）ベクターである（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（１０）：８１５０−８１５７を参照）。いくつかの場合では、レトロウイルス構築物は、ＬＬ−ＣＧ、ＬＳ−ＣＧ、ＣＬ−ＣＧ、ＣＳ−ＣＧ、ＣＬＧ、またはＭＦＧである。Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（１０）：８１５０−８１５７、Ｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２４：３２４−３２９、Ｒｉｖｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），ＰＮＡＳ，９２：６７３３−６７３７。ウイルスベクタープラスミド（または構築物）は、レトロウイルス系としてｐＭＸｓ、ｐＭｘｓ−ＩＢ、ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ、ｐＭＸｓ−ｎｅｏ（ｐＭＸｓ−ＩＢは、ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏのピューロマイシン耐性遺伝子の代わりにブラストサイジン耐性遺伝子を保持するベクターである）（Ｋｉｍａｔｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３），Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，３１：１００７−１０１４、ＭＦＧ  Ｒｉｖｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９２：６７３３−６７３７）、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８：３５８７−３５９６）、ＬＬ−ＣＧ，ＣＬ−ＣＧ，ＣＳ−ＣＧ、ＣＬＧ（Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２：８１５０−８１５７）等、ならびにアデノウイルス系としてｐＡｄｅｘ１（Ｋａｎｅｇａｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３：３８１６−３８２１）等を含む。例示的な実施形態では、レトロウイルス構築物は、ブラストサイジン（例えばｐＭＸｓ−ＩＢ）、ピューロマイシン（例えばｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ）、またはネオマイシン（例えばｐＭＸｓ−ｎｅｏ）を含む。例えば、Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８：３５８７−３５９６を参照。
【０１３３】
パッケージング細胞から組換えウイルスを生成する方法およびその使用は、十分に確立されており、例えば、米国特許第５，８３４，２５６号、第６，９１０，４３４号、第５，５９１，６２４号、第５，８１７，４９１号、第７，０７０，９９４号、および第６，９９５，００９号を参照。多くの方法は、パッケージング細胞系へのウイルス性構築物の導入から始まる。ウイルス構築物は、これらに限定されないが、リン酸カルシウム法、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３−７４１７）、電気穿孔法、微量注入法、Ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション等を含む、当該技術分野において既知のいずれの方法、および本明細書に記載されるいずれの方法により、宿主線維芽細胞に導入され得る。
【０１３４】
リプログラミング因子をコードする１つ以上の核酸は、細胞の非ウイルス性に基づくトランスフェクション等の様々な周知の技法を用いて、宿主細胞に導入され得る。例示的な態様では、構築物は、ベクターに組み込まれ、宿主細胞に導入される。細胞への導入は、これらに限定されないが、電気穿孔、リン酸カルシウム媒介導入、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソーム媒介導入、微量注入法、微粒子発射媒介導入（ナノ粒子）、カチオン性ポリマー媒介導入（ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等）、または細胞融合等の当該技術分野において既知のいずれの非ウイルス性に基づくトランスフェクションにより実施され得る。トランスフェクションの他の方法は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｈｉｌｙｍａｘ（商標）、Ｆｕｇｅｎｅ（商標）、ｊｅｔＰＥＩ（商標）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）、およびＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）等のトランスフェクション試薬を含む。
【０１３５】
さらなるポリペプチド
いくつかの実施形態では、対象方法は、出生後線維芽細胞に、リプログラミング因子Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇ、ならびに外因性Ｎｋｘ２−５ポリペプチド、外因性Ｓｍｙｄ１ポリペプチド、外因性Ｍｙｏｃｄポリペプチド、外因性Ｂａｆ６０ｃポリペプチド、外因性Ｓｒｆポリペプチド、外因性Ｉｓｌ１ポリペプチド、外因性Ｈａｎｄ２ポリペプチド、外因性Ｚｆｐｍ２ポリペプチド、外因性Ｎｆａｔｃ１ポリペプチド、および外因性ＴＧＦβ１ポリペプチドのうちの１つ以上を導入することを伴う。いくつかの実施形態では、対象方法は、出生後線維芽細胞に、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇ、ならびに外因性Ｎｋｘ２−５ポリペプチド、外因性Ｓｍｙｄ１ポリペプチド、外因性Ｍｙｏｃｄポリペプチド、外因性Ｂａｆ６０ｃポリペプチド、外因性Ｓｒｆポリペプチド、外因性Ｉｓｌ１ポリペプチド、外因性Ｈａｎｄ２ポリペプチド、外因性Ｚｆｐｍ２ポリペプチド、外因性Ｎｆａｔｃ１ポリペプチド、および外因性ＴＧＦβ１ポリペプチドのうちの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（複数可）を導入することを伴う。
【０１３６】
Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と同様、当該技術分野において既知である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：
１）ＡＡＲ８８５１１．１（ヒトＢＡＦ６０ｃ、アミノ酸配列）、およびＡＹ４５０４３１（ＡＡＲ８８５１１．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、
２）ＡＡＲ８８５１０．１（ヒトＢＡＦ６０ｃ、アミノ酸配列）、およびＡＹ４５０４３０（ＡＡＲ８８５１０．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、
３）ＮＰ＿０６８８０８（ヒトＨａｎｄ２アミノ酸配列）、およびＮＭ＿０２１９７３（ＮＰ＿０６８８０８アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、
４）ＮＰ＿００４３７８．１（ヒトＮＫＸ２−５アミノ酸配列）、およびＮＭ＿００４３８７（ＮＰ＿００４３７８．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
５）ＮＰ＿００１１５９６４８．１（ヒトＮＫＸ２−５アミノ酸配列）、およびＮＭ＿００１１６６１７６（ＮＰ＿００１１５９６４８．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
６）ＮＰ＿００１１５９６４７．１（ヒトＮｋｘ２−５アミノ酸配列）、およびＮＭ＿００１１６６１７５（ＮＰ＿００１１５９６４７．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
７）ＮＰ＿００２１９３．２（ヒトＩｓｌ１アミノ酸配列）、およびＮＭ＿００２２０２（ＮＰ＿００２１９３．２アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、
８）ＮＰ＿００１１３９７８５．１（ヒトＭｙｏｃｄアミノ酸配列）、およびＮＭ＿００１１４６３１３（ＮＰ＿００１１３９７８５．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、
９）ＮＰ＿００１１３９７８４．１（ヒトＭｙｏｃｄアミノ酸配列）、およびＮＭ＿００１１４６３１２（ＮＰ＿００１１３９７８４．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、
１０）ＮＰ＿７０５８３２．１（ヒトＭｙｏｃｄアミノ酸配列）、およびＮＭ＿１５３６０４（ＮＰ＿７０５８３２．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、
１１）ＮＰ＿９３８０１５．１（ヒトＳｍｙｄ１アミノ酸配列）、およびＮＭ＿１９８２７４（ＮＰ＿９３８０１５．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、
１２）ＮＰ＿００３１２２．１（ヒトＳｒｆアミノ酸配列）、およびＮＭ＿００３１３１（ＮＰ＿００３１２２．１アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
１３）ＮＰ＿０３６２１４（ヒト亜鉛フィンガータンパク質多型２（Ｚｆｐｍ２）アミノ酸配列）およびＮＭ＿０１２０８２（ＮＰ＿０３６２１４アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
１４）ＮＰ＿７６５９７８（活性化Ｔ細胞、細胞質１、イソ型Ａ；Ｎｆａｔｃ１、イソ型Ａのヒト核因子）、およびＮＭ＿１７２３９０（ＮＰ＿７６５９７８アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、ＮＰ＿００６１５３．２（ヒトＮｆａｔｃ１、イソ型Ｂ）、およびＮＭ＿００６１６２（ＮＰ＿００６１５３アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、ＮＰ＿７６５９７５（ヒトＮｆａｔｃ１、イソ型Ｃ）、およびＮＭ＿１７２３８７（ＮＰ＿７６５９７５アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、ＮＰ＿７６５９７６（ヒトＮｆａｔｃ１、イソ型Ｄ）、およびＮＭ＿１７２３８８（ＮＰ＿７６５９７６アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、およびＮＰ＿７６５９７７（ヒトＮｆａｔｃ１、イソ型Ｅ）、およびＮＭ＿１７２３８９（ＮＰ＿７６５９７７アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、
１５）ＮＰ＿００４６０３（ヒト形質転換増殖因子−β１型、イソ型１）、およびＮＭ＿００４６１２（ＮＰ＿００４６０３アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）、ＮＰ＿００１１２４３８８（ヒト形質転換増殖因子−β１型、イソ型２）、ならびにＮＭ＿００１１３０９１６（ＮＰ＿００１１２４３８８アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）を参照。
【０１３７】
Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、前述のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つに示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３８】
Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、前述のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つに示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１３９】
さらなる因子
出生後線維芽細胞は、上述のように改変されるか、または遺伝子改変され得、培養系に添加することができる１つ以上のさらなる因子と接触させることもでき、例えば１つ以上のさらなる因子が培養培地に添加剤として含まれ得る。
【０１４０】
そのようなさらなる因子の例としては、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤（例えば、Ｈｕａｎｇｆｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：７９５−７９７、Ｈｕａｎｇｆｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１２６９−１２７５を参照）、ＤＮＡ脱メチル化剤（例えば、Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  ４５４，４９−５５を参照）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２：５２５−５２８を参照）、Ｌ型カルシウムチャネル作動薬（例えば、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）３：５６８−５７４を参照）、Ｗｎｔ３ａ（例えば、Ｍａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ  １３４：５２１−５３３を参照）、ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３：４７５−４７９を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４１】
一例として、チモシンβ４（Ｔβ４）が使用され得る。Ｔβ４のアミノ酸配列は当該技術分野において既知である。例えば、アミノ酸配列ＭＳＤＫＰＤＭＡＥＩＥＫＦＤＫＳＫＬＫＫＴＥＴＱＥＫＮＰＬＰＳＫＥＴＩＥＱＥＫＱＡＧＥＳ（配列番号３０、ヒトＴβ４）を含むポリペプチド、またはヒトＴβ４に対して少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一性であるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが使用され得る。
【０１４２】
ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、ヒストン上の［イプシロン］−Ｎ−アセチルリジンアミノ酸からアセチル基を除去するクラスの酵素である。例示的なＨＤＡＣは、クラスＩ  ＨＤＡＣ：ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８およびクラスＩＩ  ＨＤＡＣ：ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７Ａ、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０のものを含む。Ｉ型哺乳類ＨＤＡＣは、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、およびＨＤＡＣＩ１を含む。ＩＩ型哺乳類ＨＤＡＣは、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、およびＨＤＡＣ１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、クラスＩまたはクラスＩＩのＨＤＡＣを選択的に阻害する。
【０１４３】
ＨＤＡＣ阻害剤の好適な濃度は、使用される特定のＨＤＡＣ阻害剤により、約０．００１ｎＭ〜約１０ｍＭの範囲である。ＨＤＡＣの濃度は、０．０１ｎＭ〜１０００ｎＭの範囲であり得る。
【０１４４】
好適なＨＤＡＣ阻害剤は、ヒストンの脱アセチル化においてＨＤＡＣ酵素活性を阻害するあらゆる薬剤を含む。好適なＨＤＡＣ阻害剤は、カルボン酸塩ＨＤＡＣ阻害剤、ヒドロキサム酸ＨＤＡＣ阻害剤、ペプチド（例えば環状テトラペプチド）ＨＤＡＣ阻害剤、ベンズアミドＨＤＡＣ阻害剤、求電子性ケトンＨＤＡＣ阻害剤、ハイブリッド極性ＨＤＡＣ阻害剤、および短鎖脂肪酸ＨＤＡＣ阻害剤を含むが、これらに限定されない。
【０１４５】
好適なＨＤＡＣ阻害剤は、トリコスタチンＡおよびその類似体、例えばトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ならびにトリコスタチンＣを含む（Ｋｏｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，５６：１３５９−１３６４）。
【０１４６】
好適なペプチドＨＤＡＣ阻害剤は、例えば、オキサムフラチン［（２Ｅ）−５−［３−［（フェニルスルホニル）アミノフェニル］−ペント−２−エン−４−イノヒドロキサム酸（ｉｎｏｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８：２４６１−２４７０）、トラポキシンＡ（シクロ−（Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−ピペコリニル−Ｌ−２−アミノ−８−オキソ−９，１０−エポキシ−デカノイル）（Ｋｉｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２４２９−２２４３５）、ＦＲ９０１２２８、デプシペプチド（（１Ｓ，４Ｓ，７Ｚ，１０Ｓ，１６Ｅ，２１Ｒ）−７−エチリデン−４，２１−ジイソプロピル−２−オキサ−１２，１３−ジチア−５，８，２０，２３−テトラザビシクロ（ｔｅｔｒａｚａｂｉｃｙｃｌｏ）［８．７．６］トリコス（ｔｒｉｃｏｓ）−１６−エン−３，６，９，１９，２２−ペントン）（Ｎａｋａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）．Ｅｘ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２４１：１２６−１３３）、アピシジン、環状テトラペプチド［シクロ−（Ｎ−Ｏ−メチル−Ｌ−トリプトファニル−Ｌ−イソロイシニル−Ｄ−ピペコリニル−Ｌ−２−アミノ−８−オキソデカノイル）］（Ｄａｒｋｉｎ−Ｒａｔｔｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９３：１３１４３−１３１４７）、アピシジンＩａ、アピシジンＩｂ、アピシジンＩｃ、アピシジンＩＩａ、およびアピシジンＩＩｂ（国際公開第９７／１１３６６号）、ＨＣ−毒素、環状テトラペプチド（Ｂｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，７：１９４１−１９５０）、ならびにクラミドシン（Ｂｏｓｃｈら、上記）を含む。
【０１４７】
好適なＨＤＡＣ阻害剤は、ヒドロキサム酸系のハイブリッド極性化合物（ＨＰＣ）、例えば、サリチルヒドロキサム酸（ＳＢＨＡ）（Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，３０：７６１−８）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）（Ｒｉｃｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９５：３００３−７）、アゼラインビスヒドロキサム酸（ＡＢＨＡ）（Ａｎｄｒｅｗｓら、上記）、アゼライン−１−ヒドロキサメート−９−アニリド（ＡＡＨＡ）（Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，１１：２０６９−８３）、Ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサミド（ＣＢＨＡ）（Ｒｉｃｈｏｎら、上記）、６−（３−クロロフェニルウレイド）カルポ（ｃａｒｐｏｉｃ）ヒドロキサム酸，３−Ｃｌ−ＵＣＨＡ）（Ｒｉｃｈｏｎら、上記）、ＭＷ２７９６（Ａｎｄｒｅｗｓら、上記）、ＭＷ２９９６（Ａｎｄｒｅｗｓら、上記）、ヒドロキサム酸誘導体ＮＶＰ−ＬＡＱ−８２４（Ｃａｔｌｅｙら（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２：２６１５、およびＡｔａｄｊａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：６８９）、ならびにＣＢＨＡ（ｍ−カルボキシ桂皮酸（ｃｉｎｎａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）ビスヒドロキサム酸）を含む。
【０１４８】
好適なＨＤＡＣ阻害剤は、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）化合物、例えば、酪酸ナトリウム（Ｃｏｕｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７９），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４：１７１６−２３）、イソ吉草酸塩（ＭｃＢａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．，５３：１３５７−６８）、バルプロ酸、吉草酸塩（ＭｃＢａｉｎら、上記）、４−フェニル酪酸（４−ＰＢＡ）（Ｌｅａ  ａｎｄ  Ｔｕｌｓｙａｎ，（１９９５），Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：８７９−３）、フェニル酪酸（ＰＢ）（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９：２７６６−９９）、プロピネート（ＭｃＢａｉｎら、上記）、ブチルアミド（Ｌｅａ  ａｎｄ  Ｔｕｌｓｙａｎ、上記）、イソブチルアミド（Ｌｅａ  ａｎｄ  Ｔｕｌｓｙａｎ、上記）、フェニル酢酸塩（Ｌｅａ  ａｎｄ  Ｔｕｌｓｙａｎ、上記）、３−ブロモプロピオン酸塩（Ｌｅａ  ａｎｄ  Ｔｕｌｓｙａｎ、上記）、トリブチリン（Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６０：７４９−５５）、酪酸アルギニン、イソブチルアミド、およびバルプロ酸塩を含む。
【０１４９】
好適なＨＤＡＣ阻害剤は、ベンズアミド誘導体、例えば、ＭＳ−２７５［Ｎ−（２−アミノフェニル）−４−［Ｎ−（ピリジン−３−イル−メトキシカルボニル）アミノメチル］ベンズアミド］（Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６：４５９２−７）、およびＭＳ−２７５の３’−アミノ誘導体（Ｓａｉｔｏら、上記）、ならびにＣＩ−９９４を含む。
【０１５０】
さらなる好適なＨＤＡＣ阻害剤は、ＢＭＬ−２１０（Ｎ−（２−アミノフェニル）−Ｎ’−フェニル−オクタンジアミド）、デプデシン（例えば（−）−デプデシン）、ヌルスクリプト（４−（１，３−ジオキソ−１Ｈ，３Ｈ−ベンゾ［デ］イソキノリン−２−イル）−Ｎ−ヒドロキシブタンアミド）、スクリプタイド、スラミンナトリウム、酪酸ピバロイルオキシメチル（Ｐｉｖａｎｅｘ，ＡＮ−９）、トラポキシンＢ、ＣＩ−９９４（すなわち、Ｎ−アセチルジナリン）、ＭＧＣＤ０１０３（Ｎ−（２−アミノフェニル）−４−［［（４−ピリジン−３−イルピリミジン−２−イル）アミノ］メチル］ベンズアミド）、ＪＮＪ１６２４１１９９（Ｒ−３０６４６５、例えば、Ａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９７：１３４４）、ツバシン、Ａ−１６１９０６、プロキサミド、オキサムフラチン、３−Ｃｌ−ＵＣＨＡ（６−（３−クロロフェニルウレイド）カプロンヒドロキサム酸）、およびＡＯＥ（２−アミノ−８−オキソ−９，１０−エポキシデカン酸）を含む。
【０１５１】
好適なＤＮＡメチル化阻害剤は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害剤であり、５−デオキシ−アザシチジン（ＤＡＣ）、５−アザシチジン（５−アザ−ＣＲ）（Ｖｉｄａｚａ）、５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ＣｄＲ、デシタビン）、１−［β］−Ｄ−アラビノフラノシル−５−アザシトシン、ジヒドロ−５−アザシチジン、ゼブラリン（（１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−１，２−ジヒドロピリミジン−２−オン）、シネファンギン（例えば、ＩｎＳｏｌｕｔｉｏｎ（商標）シネファンギン）、および５−フルオロ−２’−デオキシシチシン（ｃｙｔｉｃｉｎｅ）（ＦｄＣｙｄ）を含むが、これらに限定されない。好適な非ヌクレオシドＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒｓｅ）阻害剤（例えば、プロカイン以外）の例としては、（−）−エピガロカテキン−３−没食子酸塩（ＥＧＣＧ）、ヒドララジン、プロカインアミド、プサムマプリンＡ（Ｎ，Ｎ”−（ジチオジ−２，１−エタンジイル）ビス［３−ブロモ−４−ヒドロキシ−ａ−（ヒドロキシイミノ）−ベンゼンプロパンアミド）、およびＲＧ１０８（２−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）プロピオン酸）が挙げられる。
【０１５２】
好適なヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）阻害剤は、ＳＣ−２０２６５１（２−（ヘキサヒドロ−４−メチル−１Ｈ−１，４−ジアゼピン−１−イル）−６，７−ジメトキシ−Ｎ−（１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル）−４−キナゾリンアミン）、カエトシン（Ｇｒａｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：１４３）、ＢＩＸ−０１２９４（２−（ヘキサヒドロ−４−メチル−１Ｈ−１，４−ジアゼピン−１−イル）−６，７−ジメトキシ−Ｎ−［１−（フェニルメチル）−４−ピペリジニル］−４−キナゾリンアミン３塩酸）、３−デアザネプラノシン（Ｇｌａｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ＢＢＲＣ  １３５：６８８）等を含むが、これらに限定されない。
【０１５３】
遺伝子改変された宿主細胞
本開示は、単離された遺伝子改変された宿主細胞を含む、遺伝子改変された宿主細胞を提供し、対象遺伝子改変された宿主細胞は、リプログラミング因子ポリペプチド（例えば、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇリプログラミング因子、またはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇを含むサブセット）をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の外因性核酸を含み（それらで遺伝子改変され）、リプログラミング因子のセットは、例えば、１）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチド、２）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、およびＭｙｏｃｄポリペプチド、３）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、ならびに４）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、ならびにＮｋｘ２．５、Ｓｒｆ、Ｚｆｐｍ２、Ｍｙｏｃｄ、Ｂａｆ６０ｃ、Ｈａｎｄ２、Ｉｓｌ１、Ｎｆａｔｃ１、Ｓｍｙｄ１、およびＴＧＦβ１ポリペプチドのうちの１つ以上を含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、対象遺伝子改変された宿主細胞は、生体外である。いくつかの実施形態では、対象遺伝子改変された宿主細胞は、ヒト細胞であるか、またはヒト細胞に由来する。本開示は、対象遺伝子改変された宿主細胞の子孫をさらに提供し、子孫は、由来する対象遺伝子改変された宿主細胞と同じ外因性核酸を含み得る。本開示は、対象遺伝子改変された宿主細胞を含む組成物をさらに提供する。
【０１５５】
本開示は、単離された遺伝子改変された宿主細胞を含む、遺伝子改変された宿主細胞を提供し、対象遺伝子改変された宿主細胞は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇリプログラミング因子をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の外因性核酸、またはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｅｓｒｒｇを含むサブセットを含む（それらで遺伝子改変された）。いくつかの実施形態では、対象遺伝子改変された宿主細胞は、生体外である。いくつかの実施形態では、対象遺伝子改変された宿主細胞は、ヒト細胞であるか、またはヒト細胞に由来する。本開示は、対象遺伝子改変された宿主細胞の子孫をさらに提供し、子孫は、由来する対象遺伝子改変された宿主細胞と同じ外因性核酸を含み得る。本開示は、対象遺伝子改変された宿主細胞を含む組成物をさらに提供する。
【０１５６】
遺伝子改変された出生後線維芽細胞
いくつかの実施形態では、対象遺伝子改変された宿主細胞は、遺伝子改変された出生後線維芽細胞である。よって、本開示は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、またはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセットをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の外因性核酸を含む（それらで遺伝子改変された）遺伝子改変された出生後線維芽細胞を提供する。いくつかの実施形態では、対象遺伝子改変された出生後線維芽細胞は生体外である。いくつかの実施形態では、対象遺伝子改変された出生後線維芽細胞は、ヒト細胞であるか、またはヒト細胞に由来する。本開示は、対象遺伝子改変された出生後線維芽細胞の子孫をさらに提供し、子孫は、由来する対象遺伝子改変された出生後線維芽細胞と同じ外因性核酸を含み得る。本開示は、対象遺伝子改変された出生後線維芽細胞を含む組成物をさらに提供する。
【０１５７】
遺伝子改変された誘導心筋細胞
本開示は、対象遺伝子改変された宿主細胞に由来する心筋細胞（「誘導心筋細胞」）をさらに提供する。対象誘導心筋細胞は、対象遺伝子改変された出生後線維芽細胞に由来するため、対象誘導心筋細胞は遺伝的にも改変される。よって、本開示は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、またはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセットをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の外因性核酸を含む遺伝子改変された心筋細胞を提供する。いくつかの実施形態では、対象遺伝子改変された心筋細胞は、生体外である。いくつかの実施形態では、対象遺伝子改変された心筋細胞は、ヒト細胞であるか、またはヒト細胞に由来する。本開示は、対象遺伝子改変された心筋細胞の子孫をさらに提供し、子孫は、由来する対象遺伝子改変された心筋細胞と同じ外因性核酸を含み得る。本開示は、対象遺伝子改変された心筋細胞を含む組成物をさらに提供する。
【０１５８】
組成物
本開示は、対象遺伝子改変された宿主細胞（例えば、対象遺伝子改変された出生後線維芽細胞、対象遺伝子改変された出生後線維芽細胞の子孫、対象誘導心筋細胞、対象誘導心筋細胞の子孫）を含む組成物を提供する。対象組成物は、対象遺伝子改変された宿主細胞を含み、いくつかの実施形態では、成分が遺伝子改変された宿主細胞の意図される使用に一部基づき選択される、１つ以上のさらなる成分を含む。好適な成分は、塩、緩衝剤、安定剤、プロテアーゼ阻害剤、細胞膜および／または細胞壁保持化合物（例えばグリセロール、ジメチルスルホキシド等）、細胞に適切な栄養培地等を含むが、これらに限定されない。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、対象組成物は、対象遺伝子改変された宿主細胞およびマトリックス（「対象遺伝子改変された細胞／マトリックス組成物」）を含み、対象遺伝子改変された宿主細胞は、マトリックスに関連する。用語「マトリックス」とは、遺伝子改変された細胞がそれ自身結合するか、または細胞複合体を形成するために付着するいずれの好適な担体材料を指す。いくつかの実施形態では、マトリックスまたは担体材料は、後の用途に所望される３次元形態で既に存在する。例えば、ウシ心膜組織は、コラーゲンで架橋され、脱細胞化され、光固定（ｐｈｏｔｏｆｉｘｅｄ）されるマトリックスとして使用される。
【０１６０】
例えば、マトリックス（「生体適合性基質」とも称される）は、対象への移植に好適である材料である。生体適合性基質は、一旦対象に移植されると、毒性または有害作用をもたらさない。一実施形態では、生体適合性基質は、修復または置換を必要とする所望される構造に成形され得る表面を有するポリマーである。ポリマーは、修復または置換を必要とする構造の一部にも成形され得る。生体適合性基質は、細胞が結合し、成長できる支持的フレームワークを提供することができる。
【０１６１】
好適なマトリックス成分は、例えば、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、フィブリノーゲン、ラミニン、グリコサミノグリカン、エラスチン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、グリカン、ポリ（乳酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレンオキシド）、セルロース、セルロース誘導体、デンプン、デンプン誘導体、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ムチン等を含む。いくつかの実施形態では、マトリックスは、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、フィブリノーゲン、ラミニン、およびエラスチンのうちの１つ以上を含み、非タンパク質性ポリマーをさらに含み得、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）。ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、セルロース、セルロース誘導体、デンプン、およびデンプン誘導体のうちの１つ以上をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、マトリックスは、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、フィブリノーゲン、ラミニン、およびエラスチンのうちの１つ以上を含み、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、またはグリカンをさらに含み得る。マトリックスがコラーゲンを含む場合、コラーゲンは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲン、およびそれらの組み合わせを含み得る。
【０１６２】
マトリックスは、ヒドロゲルであり得る。好適なヒドロゲルは、２つ以上のモノマーのポリマー、例えばホモポリマーであるか、または複数のモノマーを含むヘテロポリマーである。好適なヒドロゲルモノマーは、次を含む：乳酸、グリコール酸、アクリル酸、１−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、エチルメタクリレート（ＥＭＡ）、プロピレングリコールメタクリレート（ＰＥＭＡ）、アクリルアミド（ＡＡＭ）、Ｎ−ビニルピロリドン、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）、グリシジルメタクリレート（ＧＤＭＡ）、グリコールメタクリレート（ＧＭＡ）、エチレングリコール、フマル酸等。一般的な架橋剤は、テトラエチレングリコールジメタクリレート（ＴＥＧＤＭＡ）およびＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを含む。ヒドロゲルは、ホモポリマーであり得るか、または前述のポリマーのうちの２つ以上のコポリマーを含み得る。例示的なヒドロゲルは、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）およびポリ（プロピレンオキシド）（ＰＰＯ）のコポリマー、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ−１２７（公称式ＥＯ１００−ＰＯ６５−ＥＯ１００のＰＥＯとＰＰＯの二官能性ブロックコポリマーであり、式中、ＥＯはエチレンオキシドであり、ＰＯはプロピレンオキシドである）、ポロキサマー４０７（ポリ（エチレングリコール）の２つの親水性ブロックに隣接するポリ（プロピレングリコール）の中心ブロックからなるトリブロックコポリマー）、１２，５００ダルトンの公称分子量を有し、ＰＥＯ：ＰＰＯ比が２：１のポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）コポリマー、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）系ヒドロゲル（ＰＮＩＰＡＡｍ系ヒドロゲル）、ＰＮＩＰＡＡｍ−アクリル酸コポリマー（ＰＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＡＡｃ）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（ビニルピロリドン）等を含むが、これらに限定されない。
【０１６３】
対象遺伝子改変された細胞／マトリックス組成物は、１つ以上のさらなる成分をさらに含み得、好適なさらなる成分は、例えば、成長因子、抗酸化剤、栄養トランスポーター（例えばトランスフェリン）、ポリアミン（例えば、グルタチオン、スペルミジン等）等を含む。
【０１６４】
対象遺伝子改変された細胞／マトリックス組成物における細胞密度は、約１０２細胞／ｍｍ３〜約１０９細胞／ｍｍ３、例えば、約１０２細胞／ｍｍ３〜約１０４細胞／ｍｍ３、約１０４細胞／ｍｍ３〜約１０６細胞／ｍｍ３、約１０６細胞／ｍｍ３〜約１０７細胞／ｍｍ３、約１０７細胞／ｍｍ３〜約１０８細胞／ｍｍ３、または約１０８細胞／ｍｍ３〜約１０９細胞／ｍｍ３の範囲であり得る。
【０１６５】
マトリックスは、様々な形態のいずれかを取ることができるか、または比較的非結晶であり得る。例えば、マトリックスは、シート、シリンダー、球体等の形態であり得る。
【０１６６】
埋め込み型デバイス
本開示は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドまたはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセットを含むリプログラミング組成物を含む埋め込み型デバイス（血管内ステント、足場、グラフト（例えば大動脈グラフト）、人工心臓弁、冠状動脈シャント、ペースメーカー電極、心内膜リード線等）を提供する。本開示は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、またはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセットをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を含むリプログラミング組成物を含む埋め込み型デバイスをさらに提供する。リプログラミング組成物（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドポリペプチドを含む、またはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を含む）は、埋め込み型デバイスの表面上にコーティングされるか、または埋め込み型デバイスのリザーバ内に収容され得る。リプログラミング組成物が埋め込み型デバイスのリザーバ内に収容される場合、リザーバは、リプログラミング組成物が装置から溶出できるように構成される。
【０１６７】
本開示は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドまたはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセットを含むリプログラミング組成物を含む埋め込み型デバイス（血管内ステント、足場、グラフト（例えば大動脈グラフト）、人工心臓弁、冠状動脈シャント、ペースメーカー電極、心内膜リード線等）を提供する。本開示は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、またはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセットをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を含むリプログラミング組成物を含む埋め込み型デバイスをさらに提供する。リプログラミング組成物（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含む、またはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を含む）は、埋め込み型デバイスの表面上にコーティングされるか、または埋め込み型デバイスのリザーバ内に収容され得る。リプログラミング組成物が埋め込み型デバイスのリザーバ内に収容される場合、リザーバは、リプログラミング組成物が装置から溶出できるように構成される。
【０１６８】
埋め込み型デバイスが個体の部位にあるとき、リプログラミング組成物中の核酸またはポリペプチドは埋め込み型デバイスを離れ、ポリペプチドまたは核酸が埋め込み型デバイスの部位の、またはその付近の線維芽細胞に侵入する。よって、対象埋め込み型デバイスは、個体に移植されるとき、リプログラミング因子、またはそれをコードする核酸を移植部位の、またはその付近の線維芽細胞に導入するために提供され得、それによって、心筋細胞への線維芽細胞のリプログラミングを提供することができる。例えば、対象埋め込み型デバイスがステントである場合、ステントは、リプログラミング因子またはそれをコードする核酸がステントから溶出し、環状動脈血管床の線維芽細胞に侵入し、線維芽細胞を心筋細胞にリプログラミングする環状動脈に移植され得る。
【０１６９】
本開示は、リプログラミング組成物を含むステントを提供する。血管内ステントは、例えば自己拡張型ステント、バルーン拡張型ステント、およびステントグラフトを含む。
【０１７０】
場合によっては、対象埋め込み型デバイスは、埋め込み型デバイス（例えばステント）の表面に固定される第１のポリマー材料（第１の層）内に組み込まれるリプログラミング組成物と、第１のポリマー材料に固定される第２のポリマー材料（例えばバリア層）とを含み、第２のポリマー材料は、リプログラミング組成物に存在するポリペプチドまたは核酸の溶出速度を制御する。例として、第１のポリマー材料はフルオロポリマーを含み得、第２のポリマー材料はアクリルを含み得る。
【０１７１】
場合によっては、対象埋め込み型デバイスは、埋め込み型デバイス（例えばステント）の表面上にコーティングされるポリマー層（第１の層）内に組み込まれるリプログラミング組成物と、リプログラミング組成物内に含まれるポリペプチまたは核酸を埋め込み型デバイスから放出する速度を低下させるためのポリマー層の少なくとも一部上にバリア層とを含む。ポリマー層は、ポリ（メチルメタクリレート）またはポリ（ブチルメタクリレート）を含み得、ポリ（エチレンＣＯ−酢酸ビニル）をさらに含み得る。バリアは、ポリマーまたは無機材料を含み得る。
【０１７２】
第１の層に好適なポリマー材料は、ポリウレタン、ポリエステルウレタン、シリコーン、フルオロポリマー、エチレン酢酸ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、トリメチレンカーボネート、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバレレート、ポリジオキサノン、ポリイミノカーボネート、ポリオルトエステル、エチレンビニルアルコールコポリマー、Ｌ−ポリアクチド、Ｄ，Ｌ−ポリアクチド、ポリグリコシド、ポリカプロラクトン、ラクチドとグリコリドのコポリマー、ポリメチルメタクリレート、ポリ（ｎ−ブチル）メタクリレート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、エラストマー、およびそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。
【０１７３】
代表的なエラストマーは、熱可塑性エラストマー材料、ポリエーテル−アミド熱可塑性エラストマー、フルオロエラストマー、フルオロシリコーンエラストマー、スチレン（ｓｙｔｒｅｎｅ）−ブタジエンゴム、ブタジエン−スチレンゴム、ポリイソプレン、ネオプレン（ポリクロロプレン）、エチレン−プロピレンエラストマー、クロロ−スルホン化ポリエチレンエラストマー、ブチルゴム、ポリスルフィドエラストマー、ポリアクリレートエラストマー、ニトリル、ゴム、ポリエステル、スチレン、エチレン、プロピレン、ブタジエン、およびイソプレン、ポリエステル熱可塑性エラストマー、ならびにそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。
【０１７４】
バリア層は、生体適合性（すなわち、その存在は身体から有害応答を引き起こさない）である。バリア層は、約５０オングストローム〜約２０，０００オングストロームの範囲の厚さを有し得る。バリアは、主に無機材料を含み得る。しかしながら、いくつかの有機化合物（例えば、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニリデン、ナイロン６−６、パーフルオロポリマー、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン２，６−ナフタレンジカルボキシレート、およびポリカーボネート）がバリアに組み込まれ得る。バリア内での使用に好適な無機材料は、無機元素（アルミニウム、クロム、金、ハフニウム、イリジウム、ニオビウム、パラジウム、白金、タンタル、チタン、タングステン、ジルコニウムを含む純金属、およびこれらの金属の合金等）、ならびに無機化合物（無機ケイ化物、酸化物、窒化物、および炭化物等）を含むが、これらに限定されない。一般に、バリアの材料における薬物の溶解度は、ポリマー担体における薬物の溶解度より大幅に低い。また、一般に、バリアの材料における薬物の拡散性は、ポリマー担体における薬物の拡散性より大幅に低い。
【０１７５】
バリアは、生分解性（すなわち、身体の作用によって無害な化合物に分解することができる）であっても、そうでなくてもよい。非生分解性バリア材料が使用され得るが、いくつかの生分解性材料がバリアとして使用され得る。例えば、ヒドロキシアパタイト、炭酸ヒドロキシアパタイト、リン酸３カルシウム、β−リン酸３カルシウム、リン酸８カルシウム、非結晶リン酸カルシウム、およびオルトリン酸カルシウム等のリン酸カルシウムが使用され得る。リン酸カルシウム等のあるカルシウム塩（焼き石膏）も使用され得る。バリアの生分解性は、下層である第１の層からの薬物放出を制御するための追加機構として作用することができる。
【０１７６】
第１の層を埋め込み型デバイスの表面上に固定する方法、およびバリア層を第１層に固定する方法は、当該技術分野において既知である。例えば、米国特許第７，６９５，７３１号および第７，６９１，４０１号を参照。
【０１７７】
上述のように、いくつかの実施形態では、対象埋め込み型デバイスは、リプログラミング組成物を収容するリザーバを含む。例えば、いくつかの実施形態では、対象埋め込み型デバイスは、体組織、臓器、または液体に接触するための少なくとも１つの表面を有し、埋め込み型デバイスは、接触表面を有する基材と、接触表面の少なくとも一部上に薬物溶出コーティング剤とを含み、コーティング剤は、ポリマーを通して分散されるゼオライトを有するポリマーから構成され、ゼオライトの多孔質構造は、放出剤およびリプログラミング組成物を収容するリザーバを含む。放出剤は、トリガー条件が満たされるまで、治療用材料がリザーバから出るのを防止する。トリガー条件は、体液との放出剤の接触、放出剤に近いｐＨの変化等であり得る。
【０１７８】
単独で、または組み合わせでの使用に好適な生分解性ポリマーは、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、例えば、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（ラクチド−ＣＯ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリアクチド（ＰＬＡ）、およびポリグリコシド（ＰＧＡ）、ならびに放出速度を微調整するための異なる速度の上記のそれらの組み合わせおよびブレンド、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＰＬＡ−ＰＥＧ、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＬＡ、ポリ無水物、トリメチレンカーボネート、ポリオルトエステル、ポリアスピリン、ポリホスファゲン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｇｅｎｅｓ）、およびチロジン（ｔｙｒｏｚｉｎｅ）ポリカーボネート；天然および合成のヒドロゲル材料、例えば、コラーゲン、デンプン、キトサン、ゼラチン、アルギン酸塩、デキストラン、ビニルピロリドン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ＰＶＡ−ｇ−ＰＬＧＡ、ＰＥＧＴ−ＰＢＴコポリマー（ポリアクティブ）、メタクリレート、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ（プルロニック）、ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＡＡコポリマー、ならびにＰＬＧＡ−ＰＥＯ−ＰＬＧＡを含むが、これらに限定されない。本発明の実施形態に従うポリマーマトリックスは、単独で、または組合せで、次の生安定性ポリマーのいずれかを含み得る：ポリウレタン、ポリメチルメタクリレートコポリマー、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ）、ポリアミド、およびポリウレタンとシリコーンのコポリマー。
【０１７９】
リプログラミング組成物
本開示はリプログラミング組成物を提供する。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、対象リプログラミング組成物は、１）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、もしくはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセットの混合物、または２）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド、もしくはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセットをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸のいずれかを含む。リプログラミング組成物は、ポリペプチドまたは核酸に加えて、塩類（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４等）、緩衝剤（例えば、トリス緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）等）、可溶化剤、洗剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０等の非イオン性洗剤）、プロテアーゼ阻害剤、グリセロール等のうちの１つ以上を含み得る。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、対象リプログラミング組成物は、１）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５ポリペプチド、もしくはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセットの混合物、または２）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５ポリペプチド、もしくはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセットをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸のいずれかを含む。リプログラミング組成物は、ポリペプチドまたは核酸に加えて、塩類（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４等）、緩衝剤（例えば、トリス緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）等）、可溶化剤、洗剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０等の非イオン性洗剤）、プロテアーゼ阻害剤、グリセロール等のうちの１つ以上を含み得る。
【０１８２】
対象リプログラミング組成物は、上述の対象埋め込み型デバイスに含まれ得る。対象リプログラミング組成物は、個体に直接投与され得る。対象リプログラミング組成物は、出生後線維芽細胞を心筋細胞にリプログラミングするのに有用であり、このリプログラミングは生体外または生体内で実行され得る。心筋細胞への出生後線維芽細胞のリプログラミングは、以下に記載される様々な心臓障害を治療するために使用され得る。
【０１８３】
対象リプログラミング組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含み得る。好適な賦形剤ビヒクルは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、およびそれらの組み合わせである。加えて、所望される場合、ビヒクルは、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤等の補助物質を含み得る。そのような投薬形態を調製する実際の方法は、既知であるか、または当業者には明らかであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５を参照。投与される組成物または薬剤は、いかなる事象において、治療される対象において所望される状態を達成するのに適切な量の対象抗体を含む。
【０１８４】
ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤等の薬学的に許容される賦形剤は、一般に容易に入手可能である。さらに、ｐＨ調節剤および緩衝剤、張度調節剤、安定剤、湿潤剤等の薬学的に許容される補助物質は、一般に容易に入手可能である。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、対象リプログラミング組成物は、制御放出（本明細書において「持続放出」とも称される）製剤として製剤化される。使用に好適な制御放出組成物は、固体組成物、半固体（例えばゲル）組成物、および流体（例えば液体）組成物を含む。持続放出調製物は、当該技術分野において周知の方法を用いて調製され得る。持続放出調製物の好適な例としては、マトリックスが成形物品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である、抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ヒドロゲル、ポリアクチド、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。持続放出調製物に含まれるポリペプチドまたは核酸の潜在的な生物活性の喪失、および潜在的な活性の変化は、適切な添加剤の使用により、水分含量を制御することにより、および特定のポリマーマトリックス組成物を開発することにより防止することができる。
【０１８６】
対象リプログラミング組成物は、１つ以上の治療薬、例えば、心臓疾患または状態を治療するための治療薬をさらに含み得る。対象リプログラミング組成物に含まれ得る治療薬は、例えば、ジギタリス、スタチン、抗血小板剤、抗凝固剤、カルシウムチャネル遮断薬、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、血管拡張薬、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬、β遮断薬等を含み得る。
【０１８７】
有用性
出生後線維芽細胞をリプログラミングする対象方法は、誘導心筋細胞集団を生成するのに有用であり、その誘導心筋細胞は、人工心臓組織を生成するための分析アッセイおよび治療方法において使用され得る。
【０１８８】
分析アッセイ
対象方法は、分析アッセイ用に心筋細胞を生成するために使用され得る。分析アッセイは、例えば、疾患の治療において心筋細胞の有効性を決定するための、疾患の（例えば、心臓病）のヒト以外の動物モデルへの心筋細胞の導入、心臓障害の治療に使用するのに好適な候補薬剤を識別するためのスクリーニング法における心筋細胞の使用等を含む。いくつかの場合では、対象方法を用いて生成された心筋細胞は、試験薬剤の毒性、または薬物最適化を評価するために使用され得る。
【０１８９】
動物モデル
いくつかの実施形態では、対象方法を用いて生成された心筋細胞は、ヒト以外の心臓障害の動物モデルに導入され得、障害の寛解に対する心筋細胞の作用が、ヒト以外の動物モデル（例えば、ラットモデル、モルモットモデル、マウスモデル等のゲッ齒類モデル、ヒト以外の霊長類モデル、ウサギ類のモデル等）において試験され得る。例えば、ヒト以外の障害の動物モデルにおける心臓障害に対する対象方法を用いて生成された心筋細胞の作用は、心筋細胞を、ヒト以外の動物モデルの疾患心臓組織内、その付近、またはその周囲に導入することにより試験され得、もしあれば、心臓機能に対する導入された心筋細胞の作用が評価され得る。心臓機能を評価する方法は、当該技術分野において周知であり、いずれのそのような方法が使用され得る。
【０１９０】
薬物／薬剤のスクリーニングまたは識別
対象方法を用いて生成された心筋細胞は、そのような細胞またはその様々な子孫の特徴に影響を及ぼす薬物もしくは試験薬剤（例えば、溶剤、小分子薬物、ペプチド、オリゴヌクレオチド）、または環境条件（例えば、培養条件もしくは操作）をスクリーニングするために使用され得る。例えば、米国特許第７４２５４４８号を参照。薬物または試験薬剤は、最適な個々の小分子（例えば前の薬物スクリーニングからのリード化合物）であり得るか、またはいくつかの場合では、スクリーニングされた薬物もしくは試験薬剤は、コンビナトリアルライブラリ、例えば、いくつかの化学「構成要素」を組み合わせることにより、化学合成または生物学的合成のいずれかにより生成された多様な化学化合物の集合に由来する。例えば、ポリペプチドライブラリ等の直鎖状コンビナトリアル化学ライブラリは、所与の化合物の長さ（例えばポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）について、あらゆる可能な方法で一連のアミノ酸を組み合わせることにより形成される。非常に多くの試験薬剤（例えば化学化合物）が化学構成要素のそのようなコンビナトリアル混合を通して合成され得る。実際、理論的に、１００の互換性のある構成要素の系統的なコンビナトリアル混合は、１憶のテトラマー化合物または１００億のペンタマー化合物の合成をもたらす。例えば、Ｇａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  ３７（９），１２３３を参照。コンビナトリアル化学ライブラリの調製およびスクリーニングは、当該技術分野において周知である。コンビナトリアル化学ライブラリは、例えば、Ｈｏｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０，６９０９に記載されるヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチド等のダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６：２６６１に記載される小化合物ライブラリの類似体有機合成、Ｃｈｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１，１３０３に記載されるオリゴカルバメート、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５９：６５８に記載されるペプチジルホスホネート、および例えばチアゾリジノンおよびメタチアザノン（米国特許第５，５４９，９７４号）、ピロリジン（米国特許第５，５２５，７３５号および第５，５１９，１３４号）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）を含む小有機分子ライブラリを含むが、これらに限定されない。
【０１９１】
多くのコンビナトリアルライブラリは、例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、Ａｓｉｎｅｘ（Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）、Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ＣｈｅｍＳｔａｒ，Ｌｔｄ．（Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）、３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ）、およびＭａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）から商業的に入手可能である。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、対象方法を用いて生成された心筋細胞を試験薬剤と接触させ、もしあれば、心筋細胞の生物学的活性に対する試験薬剤の作用を評価し、心筋細胞の生物学的活性に対して作用を有する試験薬剤は、心臓障害または状態を治療するための候補薬剤である。例えば、関心の試験薬剤は、試験薬剤の不在における生物学的活性と比較して、心筋細胞の生物学的活性を、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または１０倍超増加させるものである。関心の試験薬剤は、心臓障害または状態を治療するための候補薬剤である。いくつかの実施形態では、接触は生体外で行われる。他の実施形態では、接触は、例えばヒト以外の動物の生体内で行われる。
【０１９３】
「生物学的活性」は、例えば、マーカー発現（例えば、心筋細胞特異的マーカー発現）、受容体結合、イオンチャネル活性、収縮活性、および電気生理学的活性のうちの１つ以上を含む。
【０１９４】
例えば、いくつかの実施形態では、もしあれば、心筋細胞マーカーの発現に対する試験薬剤の作用が評価される。心筋細胞マーカーは、例えば、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、サルコメアミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、Ｎ−カドヘリン、β−アドレナリン受容体（β１−ＡＲ）、転写因子のＭＥＦ−２ファミリーのメンバー、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、ミオグロビン、および心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）を含む。
【０１９５】
別の例としては、もしあれば、心筋細胞の電気生理学に対する試験薬剤の作用が評価される。電気生理学は、心筋細胞様作動電位に関するパッチクランプ分析により研究され得る。Ｉｇｅｌｍｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．４３７：６６９，１９９９、Ｗｏｂｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２７：７５２，１９９５、およびＤｏｅｖｅｎｄａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．３２：８３９，２０００を参照。
【０１９６】
別の例として、いくつかの実施形態では、もしあれば、リガンド開口型イオンチャネル活性に対する試験薬剤の作用が評価される。別の例として、いくつかの実施形態では、もしあれば、電位開口型イオンチャネル活性に対する試験薬剤の作用が評価される。イオンチャネル活性に対する試験薬剤の作用は、標準的なアッセイを用いて、例えば、細胞内イオン（例えば、Ｎａ＋、Ｃａ２＋、Ｋ＋等）のレベルを測定することにより、容易に評価される。イオンの細胞内濃度における変化は、流入がチャネルによって制御されるイオンに適切な指標を用いて検出され得る。例えば、イオンチャネルがカリウムイオンチャネルである場合、カリウム検出染料が使用され、イオンチャネルがカルシウムイオンチャネルである場合、カルシウム検出染料が使用されるなどである。
【０１９７】
好適な細胞内Ｋ＋イオン検出染料は、Ｋ＋結合イソフラン酸ベンゾフラン等を含むが、これに限定されない。好適な細胞内Ｃａ２＋イオン検出染料は上記に列挙される。
【０１９８】
本明細書に記載されるアッセイにおける試験薬剤の作用は、生体外細胞培養物または生体内のいずれかにおいて、マーカー発現、受容体結合、収縮活性、または電気生理学等の、対象方法を用いて生成された心筋細胞の表現型または活性を観察するためのいずれの標準的なアッセイを用いて評価され得る。例えば、米国特許第７４２５４４８号を参照。例えば、薬学的候補は、当該技術分野において既知のいずれの方法を用いて、それらが収縮の程度または頻度を増加させる、または減少させるか否か等の、収縮活性に対するその作用に関して試験される。作用が観察される場合、化合物の濃度は、半有効量（ＥＤ５０）を決定するために滴定され得る。
【０１９９】
試験薬剤／薬物毒性
対象方法を用いて生成された心筋細胞は、試験薬剤または薬物、例えば心筋細胞に対して薬理学的作用を有するように設計された試験薬剤もしくは薬物の毒性、例えば心筋細胞以外の細胞に対して作用を有するように設計されるが、意図されない結果として心筋細胞に影響を及ぼす可能性がある試験薬剤もしくは薬物の毒性を評価するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本開示は、ヒト対象またはヒト以外（例えばネズミ科動物、ウサギ類、ヒト以外の霊長類）の対象において、薬物、試験薬剤、または他の因子の毒性作用を評価するための方法を提供し、対象方法を用いて生成された１つ以上の心筋細胞を、薬物、試験薬剤、または他の因子の用量と接触させることと、毒性または心毒性のマーカーについて、接触させた心筋細胞を評価することとを含む。
【０２００】
対象方法を用いて生成された心筋細胞に対する試験薬剤または薬物の毒性または有害作用を調査するために、当該技術分野において既知のいずれの方法も使用され得る。細胞毒性または心毒性は、あるマーカーおよび受容体の細胞生存率、生存時間、形態、および発現に対する作用により決定され得る。例えば、心筋細胞壊死の生化学的マーカー（例えば、心臓トロポニンＴおよびＩ（ｃＴｎＴ、ｃＴｎＩ））は、対象方法を用いて生成された心筋細胞における薬物誘導毒性または有害反応を評価するために使用され得、細胞外流体（例えば細胞培養培地）におけるそのようなマーカーの存在は、壊死を示すことができる。例えば、Ｇａｚｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓｏｎ（２００５）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  １（４）：７１５−７２５を参照。別の例としては、乳酸脱水素酵素は、対象方法を用いて生成された心筋細胞における薬物誘導毒性または有害反応を評価するために使用される。例えば、Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＡＡＴＥＸ  １４，Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｉｓｓｕｅ：４５７−４６２を参照。別の例では、染色体ＤＮＡに対する薬物の作用は、ＤＮＡ合成または修復を測定することにより決定され、対象方法を用いて生成された心筋細胞における薬物誘導毒性または有害反応を評価するために使用され得る。また別の例では、［３Ｈ］−チミジンもしくはＢｒｄＵ組み込みの速度、程度、および／またはタイミングは、対象方法を用いて生成された心筋細胞における薬物誘導毒性または有害反応を評価するために調査され得る。さらに別の例では、中期スプレッドにより決定される姉妹染色分体交換の速度または性質の調査は、対象方法を用いて生成された心筋細胞における薬物誘導毒性または有害反応を評価するために使用され得る。例えば、Ａ．Ｖｉｃｋｅｒｓ（ｐｐ  ３７５−４１０  ｉｎ  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７）を参照。さらに別の例では、イオン開口型チャネル（例えばカルシウム開口型チャネル）の電気生理学または活性を測定するためのアッセイは、対象方法を用いて生成された心筋細胞における薬物誘導毒性または有害反応を評価するために使用され得る。また別の例では、収縮活性（例えば収縮の頻度）は、対象方法を用いて生成された心筋細胞における薬物誘導毒性または有害反応を評価するために使用され得る。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、本開示は、ヒトまたはネズミ科動物の対象における薬物毒性のリスクを減少させるための方法を提供し、対象方法を用いて生成された１つ以上の心筋細胞を、薬物、試験薬剤、または医薬物質の用量と接触させることと、毒性に関して、接触させた１つ以上の分化した細胞をアッセイすることと、アッセイが接触させた細胞における毒性に関して陰性である場合、対象に医薬物質を処方する、または投与することとを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、ヒトまたはネズミ科動物の対象における薬物毒性のリスクを減少させるための方法を提供し、対象方法を用いて生成された１つ以上の心筋細胞を医薬物質の用量と接触させることと、毒性に関して、接触させた１つ以上の分化した細胞をアッセイすることと、アッセイが接触させた細胞における毒性に関して低いリスクを示す、またはリスクを示さない場合、対象に医薬物質を処方する、または投与することとを含む。
【０２０２】
細胞を用いた治療方法
対象の改変されたまたは遺伝子改変された線維芽細胞は、そのような治療を必要とする個体を治療するために使用され得る。同様に、対象誘導心筋細胞は、そのような治療を必要とする個体を治療するために使用され得る。対象改変された、もしくは遺伝子改変された線維芽細胞、または対象誘導心筋細胞は、レシピエント個体（治療を必要とする個体）に導入され得、対象改変された、もしくは遺伝子改変された線維芽細胞、または対象誘導心筋細胞のレシピエント個体への導入は、個体における状態または障害を治療する。よって、いくつかの実施形態では、対象治療方法は、それを必要とする個体に、対象改変された、または遺伝子改変された線維芽細胞の集団を投与することを伴う。いくつかの実施形態では、対象治療方法は、それを必要とする個体に、対象誘導心筋細胞の集団を投与することを伴う。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞移植を必要とするレシピエント個体にそれを行うための方法を提供し、本方法は、一般に、（ｉ）ドナー個体から得た線維芽細胞から誘導心筋細胞を生成することであって、ドナー個体はレシピエント個体と免疫適合性であることと、（ｉｉ）誘導心筋細胞のうちの１つ以上をレシピエント個体に移植することとを伴う。いくつかの実施形態では、レシピエント個体とドナー個体は、同一の個体である。いくつかの実施形態では、レシピエント個体とドナー個体は、同一の個体ではない。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞移植を必要とするレシピエント個体にそれを行うための方法を提供し、本方法は、一般に、（ｉ）宿主出生後線維芽細胞を、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド（もしくはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で遺伝子改変することであって、宿主出生後線維芽細胞はドナー個体から得られ、ドナー個体はレシピエント個体と免疫適合性であることと、（ｉｉ）遺伝子改変された出生後線維芽細胞のうちの１つ以上をレシピエント個体に移植することとを伴う。いくつかの実施形態では、レシピエント個体とドナー個体は、同一の個体である。いくつかの実施形態では、レシピエント個体とドナー個体は、同一の個体ではない。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞移植を必要とするレシピエント個体にそれを行うための方法を提供し、本方法は、一般に、（ｉ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド（またはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）を、宿主出生後線維芽細胞に導入することによって、宿主出生後線維芽細胞を改変することであって、宿主出生後線維芽細胞はドナー個体から得られ、ドナー個体はレシピエント個体と免疫適合性であることと、（ｉｉ）改変された出生後線維芽細胞のうちの１つ以上をレシピエント個体に移植することとを伴う。いくつかの実施形態では、レシピエント個体とドナー個体は、同一の個体である。いくつかの実施形態では、レシピエント個体とドナー個体は、同一の個体ではない。
【０２０６】
誘導心筋細胞を生成する対象方法は、人工心臓組織を生成する、例えばそれを必要とする哺乳類対象に移植するのに有用である。いくつかの実施形態では、対象治療方法は、それを必要とする個体に対象人工心臓組織を投与することを伴う。
【０２０７】
対象治療方法は、破損した心臓組織（例えば虚血性心臓組織、損傷した心臓組織）を置換するのに有用である。対象方法が誘導心筋細胞を個体に導入する（移植する）ことを伴う場合、同種または自己移植が行われ得る。
【０２０８】
本開示は、個体における心臓障害を治療する方法を提供し、本方法は、一般に、それを必要とする個体に、治療有効量のａ）対象方法を用いて調製された誘導心筋細胞の集団、ｂ）対象方法を用いて調製された遺伝子改変された出生後線維芽細胞の集団、ｃ）対象方法を用いて調製された改変された出生後線維芽細胞の集団、またはｄ）対象方法を用いて調製された人工心臓組織を投与することを伴う。
【０２０９】
例えば、いくつかの実施形態では、対象方法は、ｉ）上述のように、生体外で誘導心筋細胞を生成することと、ｉｉ）それを必要とする個体に誘導心筋細胞を導入することとを含む。他の実施形態では、対象方法は、ｉ）宿主出生後線維芽細胞を、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド（またはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で遺伝子改変することと、ｉｉ）遺伝子改変された出生後線維芽細胞をそれを必要とする個体に導入することとを含む。
【０２１０】
他の実施形態では、対象方法は、ｉ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド（またはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）を、宿主出生後線維芽細胞に導入することによって、宿主出生後線維芽細胞を改変することと、ｉｉ）改変された出生後線維芽細胞を、それを必要とする個体に導入することとを含む。
【０２１１】
他の実施形態では、対象方法は、ｉ）ａ）上述のように誘導心筋細胞を生成すること、およびｂ）人工心臓組織を形成するために、誘導心筋細胞をマトリックスと関連させることによって、人工心臓組織を生成することと、ｉｉ）人工心臓組織を、それを必要とする個体に導入することとを含む。他の実施形態では、対象は、ｉ）ａ）宿主出生後線維芽細胞を、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド（またはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で遺伝子改変すること、およびｂ）人工心臓組織を形成するために、遺伝子改変された出生後線維芽細胞をマトリックスと関連させることによって、人工心臓組織を生成することと、ｉｉ）それを必要とする個体に人工心臓組織を導入することとを含む。他の実施形態では、対象は、ｉ）ａ）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド（またはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）のうちの１つ以上を、宿主出生後線維芽細胞に導入すること、およびｂ）人工心臓組織を形成するために、改変された出生後線維芽細胞をマトリックスと関連させることによって、人工心臓組織を生成することと、ｉｉ）それを必要とする個体に人工心臓組織を導入することとを含む。人工心臓組織は、個体の既存の心臓組織内、その上、またはその周囲に導入され得る。
【０２１２】
対象方法を用いた治療を必要とする個体および／またはドナー個体は、先天性心臓欠陥を有する個体、変性筋疾患に罹患する個体、虚血性心臓組織をもたらす状態に罹患する個体、例えば冠動脈疾患を有する個体等を含むが、これらに限定されない。いくつかの例では、対象方法は、変性筋疾患もしくは状態、例えば、家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、または虚血性心筋症の原因となる冠動脈疾患を治療するのに有用である。いくつかの例では、対象方法は、心臓もしくは心臓血管の疾患または障害、例えば心臓血管疾患、動脈瘤、アンギナ、不整脈、粥状動脈硬化、脳血管発作（脳卒中）、脳血管疾患、先天性心臓疾患、うっ血性心不全、心筋炎、冠状動脈弁疾患（ｖａｌｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ）、拡張型動脈疾患（ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｉｌａｔｅｄ）、拡張障害、心内膜炎、高血圧（血圧上昇）、心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、虚血性心筋症の原因となる冠動脈疾患、僧帽弁逸脱症、心筋梗塞（心発作）、または静脈血栓塞栓症を有する個体を治療するのに有用である。
【０２１３】
対象方法で治療するのに好適な個体は、これに限定されないが、虚血性心臓組織をもたらす状態を含む心臓状態を有する個体（例えば、ヒト等の哺乳類対象、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット等のヒト以外の実験哺乳類対象）、例えば冠動脈疾患を有する個体等を含む。いくつかの例では、治療に好適な個体は、心臓もしくは心臓血管の疾患または状態、例えば心臓血管疾患、動脈瘤、アンギナ、不整脈、粥状動脈硬化、脳血管発作（脳卒中）、脳血管疾患、先天性心臓疾患、うっ血性心不全、心筋炎、冠状動脈弁疾患（ｖａｌｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ）、拡張型動脈疾患（ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｉｌａｔｅｄ）、拡張障害、心内膜炎、高血圧（血圧上昇）、心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、虚血性心筋症の原因となる冠動脈疾患、僧帽弁逸脱症、心筋梗塞（心発作）、または静脈血栓塞栓症に罹患している。いくつかの例では、対象方法で治療するのに好適な個体は、変性筋疾患、例えば家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、または虚血性心筋症の原因となる冠動脈疾患を有する個体を含む。
【０２１４】
哺乳類宿主への投与に関して、対象方法を用いて生成された誘導心筋細胞の集団、または遺伝子改変された出生後線維芽細胞の集団は、薬学的組成物として製剤化され得る。薬学的組成物は、生理学的に許容される担体（すなわち、心筋細胞の活性に干渉しない非毒性材料）をさらに含む、減菌水溶液もしくは非水性溶液、懸濁液、またはエマルジョンであり得る。当業者に既知のあらゆる好適な担体が対象薬学的組成物において採用され得る。担体の選択は、投与される物質の性質（すなわち細胞または化学化合物）に一部依存する。代表的な担体は、生理学的生理食塩水溶液、ゼラチン、水、アルコール、天然油もしくは合成油、糖類溶液、グリコール、オレイン酸エチル等の注入可能な有機エステル、またはそのような材料の組み合わせを含む。任意に、薬学的組成物は、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、および／もしくは不活性ガス、ならびに／または他の活性成分等の、防腐剤および／または他の添加剤をさらに含み得る。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、誘導心筋細胞集団、改変された出生後線維芽細胞の集団、または遺伝子改変された出生後線維芽細胞の集団は、マイクロカプセル封入を含む既知のカプセル封入技術に従いカプセル封入される（例えば米国特許第４，３５２，８８３号、第４，３５３，８８８号、および第５，０８４，３５０号を参照）。心筋細胞、改変された出生後線維芽細胞、または遺伝子改変された出生後線維芽細胞がカプセル封入される場合、いくつかの実施形態では、心筋細胞、改変された出生後線維芽細胞、または遺伝子改変された出生後線維芽細胞は、米国特許第５，２８４，７６１号、第５，１５８，８８１号、第４，９７６，８５９号、第４，９６８，７３３号、第５，８００，８２８号、およびＰＣＴ特許出願国際公開第９５／０５４５２号に記載されるマイクロカプセル封入によりカプセル封入される。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、誘導心筋細胞集団、改変された出生後線維芽細胞の集団、または遺伝子改変された出生後線維芽細胞の集団は、以下に記載されるように、マトリックスに存在する。
【０２１７】
誘導心筋細胞集団、改変された出生後線維芽細胞の集団、または遺伝子改変された出生後線維芽細胞の集団の単位投薬形態は、約１０３細胞〜約１０９細胞、例えば約１０３細胞〜約１０４細胞、約１０４細胞〜約１０５細胞、約１０５細胞〜約１０６細胞、約１０６細胞〜約１０７細胞、約１０７細胞〜約１０８細胞、約１０８細胞〜約１０９細胞を含み得る。
【０２１８】
誘導心筋細胞集団、改変された出生後線維芽細胞の集団、または遺伝子改変された出生後線維芽細胞の集団は、日常的な手順に従い凍結保存され得る。例えば、凍結保存は、好適な増殖培地、１０％の血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン等）、および７．５％のジメチルスルホキシドを含み得る「凍結」培地に約１００万〜１０００万個の細胞に対して行うことができる。細胞は遠心分離される。成長培地は吸引され、凍結培地と交換される。細胞は球体として再懸濁される。細胞は、例えば容器を−８０℃に設置することにより、ゆっくり凍結される。細胞を、３７℃の浴槽中で旋回することにより解凍し、新しい増殖培地に再懸濁し、上述のように成長させる。
【０２１９】
人工心臓組織
いくつかの実施形態では、対象方法は、ａ）出生後線維芽細胞の集団を生体外で心筋細胞にリプログラミングすることであって、例えば出生後線維芽細胞がマトリックスに存在し、誘導心筋細胞の集団が生成されることと、ｂ）誘導心筋細胞の集団を個体の既存の心臓組織内、またはその上に移植することとを含む。よって、本開示は、生体外で人工心臓組織を生成し、生体内に人工心臓組織を移植する方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象方法は、ａ）出生後線維芽細胞の集団を心筋細胞に生体外でリプログラミングし、誘導心筋細胞の集団を生成することと、ｂ）誘導心筋細胞をマトリックスと関連させ、人工心臓組織を形成することと、ｃ）人工心臓組織を個体の既存の心臓組織内、またはその上に移植することとを含む。
【０２２０】
人工心臓組織は、それを必要とする個体に同種または自己移植するために使用され得る。人工心臓組織を生成するために、出生後線維芽細胞と接触するマトリックスが提供され得、出生後線維芽細胞は、上述の対象方法を用いて心筋細胞にリプログラミングされる。これは、このマトリックスが好適な容器に移動され、細胞を含有する培養培地の層が上に設置される（出生後線維芽細胞のリプログラミングの前またはリプログラミング中）ことを意味する。用語「マトリックス」は、この文脈において、対応する細胞複合体、すなわち人工組織を形成するために、細胞自身結合するか、または付着することができるあらゆる好適な担体材料を意味するように理解されるべきである。いくつかの実施形態では、マトリックスまたは担体材料は、それぞれ、後の用途に所望される３次元形態で既に存在する。例えば、ウシ心膜組織は、コラーゲンで架橋され、脱細胞化され、光固定（ｐｈｏｔｏｆｉｘｅｄ）されるマトリックスとして使用される。
【０２２１】
例えば、マトリックス（「生体適合性基質」とも称される）は、細胞集団が堆積することができる対象に移植するのに好適である材料である。生体適合性基質は、一旦対象に移植されると、毒性または有害作用をもたらさない。一実施形態では、生体適合性基質は、修復または置換を必要とする所望される構造に成形され得る表面を有するポリマーである。ポリマーは、修復または置換を必要とする構造の一部にも成形され得る。生体適合性基質は、細胞が結合し、成長できる支持的フレームワークを提供する。次に、培養された細胞集団は、細胞−細胞相互作用に必要な適切な介在距離を提供する生体適合性基質上で成長させることができる。
【０２２２】
ポリペプチドまた核酸を用いた治療方法
本開示は、線維芽細胞を生体内で心筋細胞にリプログラミングする方法を提供する。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、本方法は、一般的に、生体内で線維芽細胞をリプログラミング組成物と接触させることを伴う。上述のように、リプログラミング組成物は、１）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド（もしくはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）、または２）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド（もしくはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸のいずれかを含む。上述のように、対象リプログラミング組成物は、１つ以上のさらなる成分を含み得る。対象リプログラミング組成物は、治療部位に、またはその付近に、例えば心臓に、またはその周囲に個体に投与され得る。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、本方法は、一般に、生体内で線維芽細胞をリプログラミング組成物と接触させることを伴う。上述のように、対象リプログラミング組成物は、１）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド（もしくはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）の混合物、または２）Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチド（もしくはＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、およびＥｓｒｒｇポリペプチドを含むリプログラミング因子のサブセット）をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸のいずれかを含む。上述のように、対象リプログラミング組成物は、１つ以上のさらなる成分を含み得る。対象リプログラミング組成物は、治療部位に、またはその付近に、例えば心臓に、またはその周囲に個体に投与され得る。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、リプログラミング組成物は、それを必要とする個体に埋め込み型デバイスと関連して導入される。よって、いくつかの実施形態では、本開示は、線維芽細胞を生体内で心筋細胞にリプログラミングする方法を提供し、本方法は、一般に、対象埋め込み型デバイス（対象リプログラミング組成物を含む）を、それを必要とする個体に導入することを伴い、埋め込み型デバイスは、治療部位に、またはその付近に、例えば心臓に、またはその周囲に導入される。
【０２２６】
対象方法を用いた治療を必要とする個体および／またはドナー個体は、先天性心臓欠陥を有する個体、変性筋疾患に罹患する個体、虚血性心臓組織をもたらす状態に罹患する個体、例えば冠動脈疾患を有する個体等を含むが、これらに限定されない。いくつかの例では、対象方法は、変性筋疾患もしくは状態、例えば、家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、または虚血性心筋症の原因となる冠動脈疾患を治療するのに有用である。いくつかの例では、対象方法は、心臓疾患または心臓血管疾患、例えば心臓血管疾患、動脈瘤、アンギナ、不整脈、粥状動脈硬化、脳血管発作（脳卒中）、脳血管疾患、先天性心臓疾患、うっ血性心不全、心筋炎、冠状動脈弁疾患（ｖａｌｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ）、拡張型動脈疾患（ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｉｌａｔｅｄ）、拡張障害、心内膜炎、高血圧（血圧上昇）、心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、虚血性心筋症の原因となる冠動脈疾患、僧帽弁逸脱症、心筋梗塞（心発作）、または静脈血栓塞栓症を有する個体を治療するのに有用である。
【０２２７】
対象方法で治療するのに好適な個体は、これに限定されないが、虚血性心臓組織をもたらす状態を含む心臓状態を有する個体（例えば、ヒト等の哺乳類対象、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット等のヒト以外の実験哺乳類対象）、例えば冠動脈疾患を有する個体等を含む。いくつかの例では、治療に好適な個体は、心臓疾患もしくは心臓血管疾患または状態、例えば心臓血管疾患、動脈瘤、アンギナ、不整脈、粥状動脈硬化、脳血管発作（脳卒中）、脳血管疾患、先天性心臓疾患、うっ血性心不全、心筋炎、冠状動脈弁疾患、拡張型冠動脈疾患、拡張障害、心内膜炎、高血圧（血圧上昇）、心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、虚血性心筋症の原因となる冠動脈疾患、僧帽弁逸脱症、心筋梗塞（心発作）、または静脈血栓塞栓症に罹患している。いくつかの例では、対象方法で治療するのに好適な個体は、変性筋疾患、例えば家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、または虚血性心筋症の原因となる冠動脈疾患を有する個体を含む。
【実施例】
【０２２８】
次の実施例は、本発明をどのように行い、使用するかの完全な開示および説明と共に当業者に提供するために提示されるものであり、発明者がその発明と見なすものの範囲を制限することが意図されず、またそれらが、以下の実験が行われた全ての、または唯一の実験であることを表すことも意図されない。使用される数字に関して（例えば量、温度等）、正確さを確実にするよう努力がなされたが、ある程度の実験誤差および偏差が考慮されるべきである。特に記載のない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気、または大気付近である。標準的な略語、例えば、ｂｐ（塩基対（複数可））、ｋｂ（キロベース（複数可））、ｐｌ（ピコリットル（複数可））、ｓまたはｓｅｃ（秒（複数可））、ｍｉｎ（分（複数可））、ｈまたはｈｒ（時間（複数可））、ａａ（アミノ酸（複数可））、ｋｂ（キロベース（複数可））、ｂｐ（塩基対（複数可））、ｎｔ（ヌクレオチド（複数可））、ｉ．ｍ．（筋肉内（的））、ｉ．ｐ．（腹腔内（的））、ｓ．ｃ．（皮下（的））等が使用される場合がある。
【０２２９】
実施例１：定義された因子による機能的心筋細胞へのヒト線維芽細胞の直接リプログラミング
この研究では、心筋細胞が、完全に分化したヒト線維芽細胞から直接リプログラミングされた。心臓リプログラミングは、最初に、心臓プロモーターによって駆動される蛍光リポーターを含むヒトＥＳ細胞由来線維芽細胞を用いて行われた。多くの主な発達性心臓調節因子がスクリーニングされた。５個の転写因子の特定の組み合わせがヒトＥＳ細胞由来線維芽細胞から、ならびにヒト胎児心臓線維芽細胞および新生児包皮線維芽細胞からも直接機能的心筋細胞を迅速かつ効率的に生成するのに十分であることが分かった。
【０２３０】
材料および方法
ヒト胚性幹細胞培養および線維芽細胞分化
α−ミオシン重鎖（αＭＨＣ）−ｍＣｈｅｒｒｙ安定Ｈ９ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞（Ｋｉｔａ−Ｍａｔｓｕｏら、２００９）を、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のマトリゲル（増殖因子減少、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）コーティングされた６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．）上で成長させ、ディスパーゼ消化後、継代した。線維芽細胞分化に関して、胚様体（ＥＢ）は、７日間、低接着プレートに懸濁された酵素的に分散されたヒトＥＳ細胞から形成され、次に、ゼラチンコーティングされた皿上で平板培養され、さらに７日間、培地（ＤＭＤＭ／２０％ＦＢＳ）中で培養された。移動細胞を採取し、４０−μｍの細胞ストレーナー（ＢＤ）で濾過した。αＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ−／Ｔｈｙ１＋細胞選別に関して、細胞は、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）抱合された抗Ｔｈｙ１抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共にインキュベートされ、蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）Ａｒｉａ２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて蛍光活性化細胞選別により選別された。精製された線維芽細胞は、低血清成長補給物（ＬＳＧＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＭ１０６中でさらに培養され、１：３の分割比で、トリプシン消化により継代された。６〜１２の継代数の線維芽細胞は、レトロウイルスによるリプログラミング用に使用された。
【０２３１】
ヒト胚幹細胞からの心筋細胞分化
心筋細胞は、マトリックスサンドイッチ法により、αＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ安定したＨ９ヒトＥＳ細胞から分化された。簡潔に、未分化Ｈ９ヒトＥＳ細胞をバーゼン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により単一細胞に解離し、ｍＴｅＳＲ１培地中の１×１０６細胞をマトリゲルコーティングされた６ウェルプレートの各ウェルに播種した。細胞が約８０％のコンフルエントになったとき、細胞をｍＴｅｓＲ１中のマトリゲルでコーティングした。マトリゲルおよびアクチビンＡ（ＳｔｅｍＲＤ）を含むＲＰＭＩ／Ｂ２７は、細胞が１００％のコンフルエントに達したとき、心臓分化を開始させるために使用された。培地は、分化第１日目に、Ｂｍｐ４およびβ−線維芽細胞増殖因子（βＦＧＦ）（Ｒ＆Ｄ）を含むＲＰＭＩ／Ｂ２７に交換され、次に５日目に、ＲＰＭＩ／Ｂ２７完全補給物に交換され、培地を３日毎に交換した。ｍｃｈｅｒｒｙ＋ＥＳ細胞由来心筋細胞の収縮は、８日目から観察され、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ２により２１日目〜２８日目に選別された。
【０２３２】
分子クローニングおよびレトロウイルス（ＲＶ）感染
レトロウイルスは、記載されるように（Ｋｉｔａｍｕｒａら、２００３、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，２００６）生成された。簡潔に、ｐＭＸレトロウイルスベクターを構築するために、候補遺伝子のコード領域をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、ｐＭＸベクターにサブクローニングした。ｐＭＸレトロウイルスベクターは、ウイルスを生成するために、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）と共にＰｌａｔ−Ｅ細胞に遺伝子導入された。ウイルスを含む上清のプールが、形質導入のために使用された。２４時間後、培地をＤＭＥＭ／Ｍ１９９培地と交換し、２〜３日毎に交換した。レトロウイルスの形質導入効率を改善するために、精製された線維芽細胞にレンチウイルスを最初に形質導入して、レトロウイルス用のマウス受容体Ｓｌｃ７ａ１を発現させた（Ｖｅｒｒｅｙら、２００４）。この戦略は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）がレトロウイルスにより導入される線維芽細胞の異なるバッチにおいて、５０〜７０％の形質導入効率をもたらした。
【０２３３】
テトラサイクリン誘導系に関して、製造者の推奨に従い、Ｒｅｔｒｏ−Ｘ  Ｔｅｔ−ＯＮ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が使用された。ｐＲｅｔｒｏ−Ｘ−Ｔｉｇｈｔ−ｃＤＮＡベクターを構築するために、ＥＧＦＰ、ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＥＳＰ１、およびＴＢＸ５のコード領域をＰＣＲにより増幅し、ｐＲｅｔｒｏ−Ｘ−Ｔｉｇｈｔ−ＰｕｒｏＲベクターにサブクローニングした。ウイルスを生成するために、ｐＲｅｔｒｏ−Ｘ−Ｔｅｔ−Ｏｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ−ＮｅｏＲ、またはｐＲｅｔｒｏ−Ｘ−ｔｉｇｈｔ−ｃＤＮＡレトロウイルスベクター、ならびにパッケージング構築物ｐＧａｇ／ＰｏｌおよびｐＶＳＶ−Ｇをリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に遺伝子導入し、ウイルスを含む上清を４８時間後に回収した。細胞に、一晩、５μｇ／ｍｌのポリブレンを補充したＲｅｔｒｏ−Ｘ−Ｔｅｔ  ＯＮおよびＲｅｔｒｏ−Ｘ−Ｔｉｇｈｔ−ｃＤＮＡを形質導入し、ピューロマイシンおよびネオマイシンの陽性選択により精製した。ドキシサイクリン（１００ｎｇ／ｍｌ）が、遺伝子誘導のために使用された。
【０２３４】
ＦＡＣＳ分析および選別
ｍＣｈｅｒｒｙ発現分析に関して、細胞は、培養した皿から単一細胞に消化され、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて、ＦＡＣＳ  ＬＳＲ−ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分析された。αＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ／ｃＴｎＴ発現に関して、細胞は、１５分間、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定され、サポニンで透過性にされ、抗ｄｓＲｅｄおよび抗心臓トロポニンＴ（抗ｃＴｎＴ）抗体、続いてＡｌｅｘａ５８５および６４７で抱合された二次抗体で染色された。
【０２３５】
細胞移植
レトロウイルス感染の翌日、線維芽細胞を採取した。非肥満糖尿病重度複合免疫不全（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ）マウスにおいて、左側開胸を行い、１０６の培養した細胞を左心室に注入した。２〜８週間後、免疫組織化学検査用に心臓を切除するか、または単一心筋細胞単離のために解離した。
【０２３６】
免疫細胞化学
細胞は、室温で１５分間、４％のパラホルムアルデヒドで固定され、サポニンで透過性にされ、遮断され、サルコメアα−アクチニン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ビメンチン（Ｐｒｏｇｅｎ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）（ＡｂＣａｍ）、ｃＴｎＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、または心臓ミオシン重鎖（ＭＨＣ）（ＡｂＣａｍ）に対する一次抗体と共に、その後、Ａｌｅｘａ４８８または５９４（Ｍｏ分子プローブ）、および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で抱合された二次抗体と共にインキュベートされた。
【０２３７】
組織学
細胞注入された心臓における免疫組織化学研究に関して、心臓は、一晩、０．４％のパラホルムアルデヒドで固定され、ＯＣＴ化合物に埋め込まれ、液体窒素中で凍結された。（Ｉｅｄａら、２０１０、Ｉｅｄａら、２００９）。心臓は、両心室を見せるため、７−μｍ切片に垂直に切られた。切片は、ＧＦＰまたはα−アクチニンに対する一次抗体で、Ａｌｅｘａ４８８または５９４およびＤＡＰＩで抱合された二次抗体で染色された。
【０２３８】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡが細胞から単離され、定量的逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）が、ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）：ＡＣＴＣ１（Ｈｓ０１１０９５１５＿ｍ１）、ＡＣＴＮ２（Ｈｓ００１５３８０９＿ｍ１）、ＮＰＰＡ（Ｈｓ００３８３２３０＿ｇ１）、ＭＹＨ６（Ｈｓ００４１１９０８＿ｍ１）、ＭＹＬ７（Ｈｓ００２２１９０９＿ｍ１）、ＭＹＬ２（Ｈｓ００１６６４０５＿ｍ１）、ＴＮＮＴ２（Ｈｓ００１６５９６０＿ｍ１）、ＡＴＰ２Ａ２（Ｈｓ０１５６６０２８＿ｇ１）、ＰＬＮ（Ｈｓ００１６０１７９＿ｍ１）、ＲＹＲ２（Ｈｓ００８９２８４２＿ｍ１）を用いて、ＡＢＩ  ７９００ＨＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に対して実施された。ｍＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤＨ（Ｈｓ０２７５８９９１＿ｇ１）ｍＲＮＡと比較することにより、基準化された。
【０２３９】
全トランスクリプトームショットガン配列決定
ヒトゲノム網羅的遺伝子発現分析は、全トランスクリプトームショットガン配列決定を用いて実施された。αＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ＋Ｈ９由来心筋細胞（ＣＭ）がＦＡＣＳによって回収された。５個の因子を形質導入されたｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞およびｍＣｈｅｒｒｙ−細胞は、培養の２および４週間後、ＦＡＣＳによって回収された。ＲＮＡは、ＰｉｃｏＰｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（Ａｒｃｔｕｒｕｓ）を用いて抽出された。マイクロアレイ分析は、標準的なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅｃｈｉｐプロトコルに従い、独立した生物学的サンプルから３つ組で実施された。データは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｐｏｗｅｒ  Ｔｏｏｌ（ＡＰＴ、バージョン１．８．５）を用いて分析された。線形モデルは、Ｒ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒのｌｉｍｍａパッケージ（Ｓｍｙｔｈ，２００４）を用いて推定される群効果およびその関連する有意性を導くためにサンプル群の各遺伝子に対して適合された。調整されたｔ統計および関連するｐ値が計算された。Ｐ値は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法により偽陽性率を制御することにより多重試験に関して調節された。遺伝子アノテーションは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（２００７年１１月１２日バージョン）から検索された。差次的遺伝子発現は、統計／閾値の組み合わせを用いて定義された。少なくとも１つの比較において差次的に発現した遺伝子（ＦＤＲ−ａｄｊ  ｐ＜０．０００１）は、図４Ｆに示される。
【０２４０】
クロマチン免疫沈降アッセイ
クロマチン免疫沈降は、ヒトＥＳ細胞由来線維芽細胞、ｉＣＭ、およびヒトＥＳ細胞分化ＣＭに対して実施された。免疫沈降は、製造者の指示に従い、Ｉｍｐｒｉｎｔクロマチン免疫沈降キット（Ｓｉｇｍａ）を用いて行われた。３ｍＨ３Ｋ２７および３ｍＨ３Ｋ４に対する抗体はＡｃｔｉｖｅ  ｍｏｔｉｆからであり、正常なウサギＩｇＧはＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからであった。
【０２４１】
亜硫酸水素塩ゲノム配列決定
亜硫酸水素塩治療は、製造者の推奨に従い、Ｅｐｉｔｅｃｔ亜硫酸水素塩キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて実施された。ＰＣＲプライマーは下に列挙される：ＭＹＨ６−センス：ＧＧＧＡＧＧＡＡＴＧＴＧＴＴＴＡＡＧＧＡＴＴＡＡＡＡＡ（配列番号３１）、ＭＹＨ６−アンチセンス：ＴＡＣＡＡＡＡＣＡＴＣＣＣＡＣＣＣＣＡＡＡＣＣＴＣ（配列番号３２）。ＭＹＨ７−センス：ＡＴＴＧＧＴＴＧＴＴＴＧＴＧＧＴＴＴＴＧＧＴＧＧＴ（配列番号３３）、ＭＹＨ７−アンチセンス：ＴＡＡＡＡＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＣＣＣ（配列番号３４）。ＮＰＰＡ−センス：ＡＡＴＴＡＧＧＧＧＡＧＴＴＧＧＧＴＡＴＴＡＧＴＴＡＡＧ（配列番号３５）、ＮＰＰＡ−アンチセンス：ＣＣＣＡＣＴＴＣＡＡＡＡＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡ（配列番号３６））。増幅された生成物は、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングされた。無作為に選択されたクローンは、各遺伝子についてＭ１３順方向およびＭ１３逆方向プライマーで配列決定された。
【０２４２】
Ｃａ２＋撮像
Ｃａ２＋撮像は、標準的なプロトコルに従い実施された。簡潔に、細胞を、３７℃で３０分間、Ｆｌｕｏ−４−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、洗浄し、室温でさらに３０分間インキュベートし、染料を脱エステル化した。Ｆｌｕｏ−４標識された細胞は、３７℃でＭｉＣＡＭ０２（ＳｃｉＭｅｄｉａ）を用いて、Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ（Ｚｅｉｓｓ）により分析された。
【０２４３】
統計分析
群間の相違は、スチューデントのｔ検定またはＡＮＯＶＡを用いて、統計的有意性について検証された。０．０５未満のＰ値は有意であると見なされた。
【０２４４】
結果
ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５は、ヒト線維芽細胞を心筋細胞または心筋細胞様細胞にリプログラミングするのに不十分である。
ヒト細胞における心臓リプログラミングの成功を視覚化するために、赤色蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）がマウスαＭＨＣプロモーター（αＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ）により駆動される、遺伝子導入Ｈ９ヒトＥＳ細胞から分化された線維芽細胞が使用された（Ｋｉｔａ−Ｍａｔｓｕｏら、２００９）。前の結果と一致し、ｍＣｈｅｒｒｙは鼓動する心筋細胞においてのみ発現されたが、ヒトＥＳ細胞分化後の線維芽細胞を含む他の細胞の種類では発現されなかった（図１Ａ〜１Ｄ）。ＦＡＣＳにより選別された９６％のｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞は、心臓トロポニンＴを発現した（図１Ｆ）。したがって、Ｈ９ヒトＥＳ細胞由来線維芽細胞（Ｈ９Ｆ）からの心筋細胞の誘導は、リポーター系蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により定量的に分析され得る。
【０２４５】
心筋細胞の汚染を避けるために、ヒトＥＳ細胞誘導体は、抗体抗Ｔｈｙ１（心臓線維芽細胞（Ｈｕｄｏｎ−Ｄａｖｉｄら、２００７）のマーカーの１つ）で染色され、Ｔｈｙ１＋／ｍＣｈｅｒｒｙ−線維芽細胞はＦＡＣＳによって選別された（図１Ｇ〜１Ｈ）。ＦＡＣＳ精製後、Ｔｈｙ１＋／ｍＣｈｅｒｒｙ−細胞の全ては、他の線維芽細胞マーカーＰｒｏｌｙｌ−４−ヒドロキシラーゼβおよびビメンチンを発現したが、それらのうちのいずれも分化した心筋細胞の特定のサルコメアマーカーである心臓トロポニンＴを発現しなかった（図１Ｉ〜１Ｊ）。
【０２４６】
図１Ａ〜Ｊ。（Ａ）線維芽細胞はａＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ  Ｈ９  ＥＳ細胞から分化された。（Ｂ）ｍＣｈｅｒｒｙは鼓動するＣＭにおいてのみ発現された（Ｃ、Ｄ）。９６％のｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞は、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）＋ＣＭであった（Ｆ）が、ｃＴｎＴ＋ＣＭの半分のみがｍＣｈｅｒｒｙを発現した（Ｅ）。Ｇ）Ｈ９  ＥＳ細胞由来線維芽細胞（Ｈ９Ｆ）の分化およびリプログラミングのスキーム。Ｈ〜Ｊ）細胞選別機により精製されたＴｈｙ１＋／ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｈ９Ｆの全てが線維芽細胞マーカーＰｒｏｌｙｌ−４−ヒドロキシラーゼｂおよびビメンチンに関して陽性であったが、それらのうちのいずれもｃＴｎＴを発現しなかった。
【０２４７】
マウス線維芽細胞と同じように（Ｉｅｄａら、２０１０）、３個の転写因子（ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５）がヒト線維芽細胞を心筋細胞にリプログラミングするのに十分であるか否かを試験した。ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５（集合的に「ＧＭＴ」と称される）は、レトロウイルスによってＨ９Ｆに良好に導入された。ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞は、３個の因子のレトロウイルス感染４週間後でも、Ｈ９Ｆにおいてほとんど観察されなかった。２〜５個のｍｃｈｅｒｒｙ＋細胞のみが１０５開始細胞中に現れた（図２Ａ）。ｍＣｈｅｒｒｙ＋および心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）＋細胞は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）の存在下でも、３個の因子の形質導入２週間後に、ＦＡＣＳによって検出されなかった（図２Ｂ〜Ｃ）。ＴＳＡ、バルプロ酸、およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤５−アザ−２’−デオキシシチジンを含む、ｉＰＳＣリプログラミングを改善することが報告された後成的修飾因子の阻害剤は、ＧＭＴによるヒトＣＭの変換を促進するのに十分ではなかった。同じ否定的な結果は、ヒト皮膚線維芽細胞において一貫して観察された。心臓ミオシン重鎖（ＭＨＣ）およびトロポニンＴは、３個の因子のレトロウイルスを形質導入した皮膚線維芽細胞において発現されなかった。これらの否定的な結果は、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５がヒト線維芽細胞を心筋細胞に効率的にリプログラミングするのに十分ではないことを示した。
【０２４８】
ヒト線維芽細胞をリプログラミングする心臓誘導因子のスクリーニング
潜在的な心臓リプログラミング因子を選択するために、マイクロアレイデータは、心臓線維芽細胞よりマウス心筋細胞においてより多く発現される転写因子および後成的リモデリング因子を識別するために再分析された（Ｉｅｄａら、２００９）。それらの中で、突然変異したとき、重度の発達性心臓欠損および胚致死を呈した１６個の転写因子または活性化補助因子が選択された。自己分泌または傍分泌の成長因子が心臓リプログラミングを改善することができるか否かを評価するために、３個の成長因子も含まれた。Ｔｈｙ１＋／ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｈ９Ｆにおいて、単独で、または組み合わせで各遺伝子の十分な発現を可能にするために、各因子は別個にレトロウイルスベクターにサブクローニングされた（Ｔａｋａｈａｓｉら、２００７）
【０２４９】
Ｔｈｙ１＋／ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｈ９Ｆに、前に報告されるように（Ｉｅｄａら、２０１０）、１９個全ての因子を発現するレトロウイルスの混合物、またはＧＦＰレトロウイルス（陰性対照）を形質導入した。ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞は、ＧＦＰレトロウイルス感染２週間後、またはいずれのウイルス感染なしの２週間の培養後、これらのＨ９Ｆにおいて観察されなかった。逆に、ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞は、早ければ１９個の因子のレトロウイルス感染から３〜４日後に観察され、その集団は、レトロウイルス形質導入７〜１０日後に劇的に増加し（図２Ｄおよび２Ｅ）、１９個の因子が一部の細胞において心臓濃縮αＭＨＣ遺伝子を良好に活性化したことを示す。これらの結果は、心臓リプログラミングがマウス線維芽細胞よりヒト線維芽細胞において長い時間を必要とし得ることも示した。したがって、レトロウイルス形質導入２週間後がＦＡＣＳによりリプログラミング効率を評価する時間点として選択された。
【０２５０】
１９個の因子のうちのどれが心臓遺伝子発現を活性化するのに重要であるかを決定するために、各個別の因子は、１９個のプールから順次除去された。例えば、１９個の因子と比較して、ＦＬＩ１またはＳＯＸ１７またはＷＮＴ５Ａを欠く１８個の因子プールは、増加した数のｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞を生成し（図２Ｄ〜２Ｆ）、ＦＬＩ１、ＳＯＸ１７、およびＷＮＴ５Ａが心臓リプログラミングを阻害し、したがって、プールから除去されるべきであることを示唆する。
【０２５１】
図２Ａ〜Ｆ。Ａ）ＧＭＴを形質導入したＨ９Ｆにおいてｍｃｈｅｒｒｙ＋細胞が稀に観察された。ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞（Ｂ）またはＴｎＴ＋細胞（Ｃ）のいずれも、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤トリコスタチンＡ（ＴｓＡ）の存在下でも、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５形質導入２週間後、ＦＡＣＳにより検出されなかった。Ｄ〜Ｆ）心臓誘導因子のスクリーニングは、１９個の因子（１９Ｆ）から開始された。Ｄ）１９Ｆもしくは１９Ｆ−ＦＬＩ１またはＭＹＯＣＤのレトロウイルス形質導入１０日後のａＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞の代表的な写真。Ｅ）１９Ｆまたは１９Ｆ−１個の因子を形質導入してから４、７、または１０日後のＨ９ＦにおけるｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞の数の要約。Ｆ）１９個の因子プールから個別の因子を除去したａＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞誘導に対する作用。
【０２５２】
これらの３個の因子（ＦＬＩ１、ＳＯＸ１７、およびＷＮＴ５Ａ）ならびにＩＧＦ２を除去した後、１５個の因子は、最大１０．３％のｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞のパーセンテージにおいて劇的な増加をもたらした（図３Ａ）。注目すべきは、７個の因子（ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＭＥＳＰ１、ＮＫＸ２．５、ＳＲＦ、ＭＹＯＣＤ、およびＺＦＰＭ２）を欠くこれらの１４個の因子プールは、ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞の収率を大幅に減少させ（図３Ａ〜Ｂ）、一方、有意でないｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞の変化は、他の８個の因子がこの１５個の因子設定において不要であることを示唆する。６個の因子（ＢＡＦ６０Ｃ、ＨＡＮＤ２、ＩＳＬ１、ＮＦＡＴＣ１、ＳＭＹＤ１、およびＴＧＦβ１）は、除去されたが、ＭＥＦ２ＣおよびＴＢＸ５は、マウス心筋細胞リプログラミングにおいて主要な因子であるため、ＭＥＦ２ＣおよびＴＢＸ５は、さらに９個の因子のスクリーニングを行うために維持された。
【０２５３】
ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＥＳＰ１、およびＴＢＸ５は、ヒト線維芽細胞から心筋細胞を効率的に誘導するのに十分である
ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光に加えて、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）の発現もこの回からＦＡＣＳによって検証された。９個および７個の因子プールから１個の因子を除くさらに２回が行われ（図３Ｃおよび３Ｄ）、取り除いたときに、トリリプログラミングされたｍＣｈｅｒｒｙ＋およびｃＴｎＴ＋細胞の効率を増加した、またはその効率を減少させなかったものを除去する。５個の因子（ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＥＳＰ１、およびＴＢＸ５）は、心臓線維芽細胞からｍＣｈｅｒｒｙ＋およびｃＴｎＴ＋細胞を効率的に誘導するのに十分であったことが分かった。これらの５個の因子のうちのいずれか１個を除去することにより、ｍＣｈｅｒｒｙ＋および／またはｃＴｎＴ＋細胞の誘導効率が大幅に減少した（図３Ｅ）。これらの５個の因子の組み合わせは、形質導入２週間後、線維芽細胞の約２４．７％がａＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙリポーターを活性化するよう（図３Ｆ）、そして線維芽細胞の約１６．４％がｃＴｎＴ＋細胞になるよう（図３Ｇ）効率的に誘導した。これらのデータは、５個の因子が全てヒト線維芽細胞において心臓遺伝子発現を効率的に誘導するのに必要であることを示した。ＭＹＯＣＤおよびＺＦＰＭ２は、１個の因子のみを除去した７個の因子のスクリーニングにおいて不要であったが（図３Ｄ）、５個の因子のリプログラミング効率は、７個の因子の効率より大幅に低かった。これらの７個の因子の組み合わせは、レトロウイルス感染２週間後、５７．５±１１．０％の細胞がｃＴｎＴを発現した、全線維芽細胞の１７．１±１０．８％がａＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙリポーターを活性化するよう（図３Ｆ）、そして全線維芽細胞の１２．２±８．９％がｃＴｎＴ＋細胞になるよう（図３Ｇ）効率的に誘発した。
【０２５４】
図３Ａ〜Ｇ。Ａ）１５個の因子（１５Ｆ）または１５Ｆ−ＧＡＴＡ４もしくはＨＡＮＤ２の形質導入２週間後のｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞の分析に関するＦＡＣＳプロット。Ｂ）１５個の因子プールから個別の因子を除去したａＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞誘導に対する作用。Ｃ〜Ｅ）９個の因子（９Ｆ、Ｃ）、７個の因子（７Ｆ、Ｄ）、または５個の因子（５Ｆ、Ｅ）のプールから個別の因子を除去したａＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞（上段）およびＴｎＴ＋細胞（下段）誘導に対する作用。Ｆ〜Ｇ）５個の因子の形質導入２週間後のｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞（Ｆ）およびｃＴｎＴ＋細胞（Ｇ）の分析に関するＦＡＣＳプロット。
【０２５５】
次に、心臓タンパク質がｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞において発現されるかを決定するために、免疫細胞化学が使用された。予想通り、５個の因子で誘導された大半のｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞は、心臓ミオシン重鎖（ｃＭＨＣ）を発現した（図４Ａ）。ｃＭＨＣに加えて、半分を超えるｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞がｃＴｎＴ（図４Ｂ）、およびサルコメアα−アクチニン（α−アクチニン）を発現し、Ｈ９−ＣＭに類似するサルコメア構造（図４Ｃ）を明確に画定し、ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞がいくつかの心筋細胞特異的マーカーを発現したことを示す。レトロウイルス感染４週間後、濃縮されたミトコンドリアおよび典型的なサルコメアが、電子顕微鏡を用いることによって、これらの７個の因子のリプログラミング細胞において観察された（図４Ｆ）。リプログラミングされた細胞におけるサルコメアの平均長は、１．０８±０．３２μｍであった（図４Ｇ）。同じことが胎児ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）および新生児ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）に関してもあてはまる。ＨＣＦおよびＨＤＦは、５個の因子およびｄｓＲｅｄが形質導入され、レトロウイルス感染２週間後、ｃＭＨＣおよびｃＴｎＴ２を発現した（図４Ｄ〜Ｅ）。これらのデータは、ヒト誘導ＣＭ様細胞（ｉＣＭ）が７個の定義された因子ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＥＳＰ１、ＭＹＯＣＤ、ＴＢＸ５、およびＺＦＰＭ２により生体外で直接線維芽細胞から迅速かつ確実に生成され得ることを示した。
【０２５６】
図４Ａ〜Ｇ。Ａ〜Ｃ）αＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ＋誘導心筋細胞（ｉＣＭ）は、形質導入２週間後、明確なサルコメア機構を伴って、心臓ミオシン重鎖（ｃＭＨＣ）、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、およびα−アクチニンを発現した。Ｄ〜Ｅ）５個の因子およびｄｓＲｅｄが形質導入されたヒト胎児心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）（Ｄ）およびヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＨＣＦ）（Ｅ）は、心臓ＭＨＣおよびＴｎＴを発現した。（Ｆ）レトロウイルス感染４週間後、７個の因子のリプログラミングされた細胞では、電子顕微鏡を用いることによって、濃縮されたミトコンドリアおよび典型的なサルコメアが観察された。スケールバーは１μｍを表す。（Ｇ）リプログラミングされたｉＣＭにおけるサルコメアの長さの要約。
【０２５７】
誘導心筋細胞は遺伝子発現において心筋細胞のようである
ＦＡＣＳによる定量的アッセイにより、Ｈ９Ｆからの心筋細胞誘導の時間経過が分析された。ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞は、早ければ誘導３日後に観察され、７日目で最大１０．９±２．３％の数字に徐々に増加し、１４日目で１９．３±４．１％、そして１４日目〜２１日目で最高レベルに達した（図５Ａ）。良好にリプログラミングされた細胞は、リプログラミングされなかった線維芽細胞より増殖が少なく、ＤＭＥＭ／Ｍ１９９培地での培養３週間後、多くの死亡ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞が存在し、よって、時間と共に、ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞は細胞の総数に対するパーセンテージが減少したことが観察された。一貫して、全細胞中のｃＴｎＴ＋細胞、およびα−ＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞のパーセンテージは、それぞれ、１４日目に最大１３．２±２．２％および５６．０±１．６％に数字が有意に増加し、その後時間と共に減少した（図５Ｂおよび５Ｃ）。
【０２５８】
他の心臓遺伝子がｍＣｈｅｒｒｙ＋誘導心筋細胞（ｉＣＭ）において濃縮されるかを決定するために、ｍＣｈｅｒｒｙ＋ｉＣＭは、５個の因子の形質導入２、３、および４週間後に選別され、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により、心筋細胞特異的遺伝子の遺伝子発現を、Ｈ９由来線維芽細胞（Ｈ９Ｆ）および心筋細胞（Ｈ９−ＣＭ）と比較した。ＡＣＴＣ１（心臓α−アクチン）、ＡＣＴＮ２（アクチニンａ２）、ＭＹＨ６（α−ミオシン重鎖）、ＭＹＬ２（ミオシン制御軽鎖２、心室イソ型）、ＭＹＬ７（ミオシン制御軽鎖２、心房イソ型）、ＴＮＮＴ２（トロポニンＴ２型、心臓）、ＮＰＰＡ（ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ａ型）、ＰＬＮ（ホスホランバン）、およびＲＹＲ２（リアノジン受容体２）を含む心筋細胞特異的遺伝子は、ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞において、時間依存様式で有意に上方制御されたが、ｑＰＣＲによりＨ９Ｆにおいて検出されなかった（図５Ｄ）。具体的には、ＡＣＴＣ１、ＭＹＨ６、ＴＮＮＴ２、ＮＰＰＡ、およびＡＴＰ２Ａ２は、心筋細胞と同じレベルで、ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞において高度に発現された。これらのデータは、５個の因子は線維芽細胞から心筋細胞への変換を迅速かつ効率的に誘導することができるが、突然変異は数週間にわたって生じたゆっくりしたプロセスであったことを示した。５個のリプログラミング因子の総遺伝子発現は、Ｈ９−ＣＭよりｉＣＭ、特にＨ９−ＣＭにおいて検出不可であったＭＥＳＰ１において約１００倍高く上方制御されたことに留意しておくことは重要である。
【０２５９】
図５Ａ〜Ｅ。Ａ）異なる時間点での５個の因子の形質導入（ｎ＝３）後の全細胞中のαＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞のパーセントのＦＡＣＳ分析。Ｂ）異なる時間点での５個の因子の形質導入（ｎ＝３）後の全細胞中のｃＴｎＴ＋細胞のパーセントのＦＡＣＳ分析。Ｃ）異なる時間点での５個の因子の形質導入（ｎ＝３）後のαＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞中のｃＴｎＴ＋細胞のパーセントのＦＡＣＳ分析。Ｄ〜Ｅ）Ｈ９Ｆ、誘導心筋細胞（ｉＣＭｓ）（形質導入２週間（Ｗ）、３Ｗ、４Ｗ後）、およびＨ９−ＣＭにおける、ＡＣＴＣ１、ＡＣＴＮ２、ＭＹＨ６、ＭＹＬ２、ＭＹＬ７、ＴＮＮＴ２、ＮＰＰＡ、ＡＴＰ２Ａ２、ＰＬＮ、およびＲＹＲ２を含む心臓特異的遺伝子、ならびに線維芽細胞濃縮遺伝子ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ５Ａ２およびＦＮ１の発現レベル。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１対関連対照。
【０２６０】
ｍＣｈｅｒｒｙ＋ｉＣＭ、Ｈ９−ＣＭ、およびＨ９Ｆの漸進的な広範囲の遺伝子発現パターンは、ＲＮＡ−Ｓｅｑとも呼ばれる全トランスクリプトームショットガン配列決定と比較された。
【０２６１】
線維芽細胞は、定義された転写因子により心筋細胞様状態に後成的にリプログラミングされる
ｉＣＭが心筋細胞様クロマチン状態を得たかを決定するために、我々は、ＡＣＴＣ１、ＡＣＴＮ２、ＴＮＮＴ２、ＲＹＲ２、およびＰＬＮを含む心臓特異的遺伝子、ならびに線維芽細胞濃縮遺伝子ＣＯＬ１Ａ１のプロモーター領域におけるヒストン改変の濃縮を分析した。それぞれ、不活性または活性のクロマチンを転写的に特徴付けるリジン２７（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）およびリジン４（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）のトリメチル化ヒストンＨ３の濃縮が、クロマチン免疫沈降、続いてｑＰＣＲにより、Ｈ９Ｆ、２週間のｍＣｈｅｒｒｙ＋ｉＣＭ、およびＨ９由来ＣＭにおいて分析された（図６Ａ）。リプログラミング後、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３は、ｉＣＭにおいて分析された全ての心臓特異的遺伝子のプロモーターで有意に濃縮され、ＣＯＬ１Ａ１のプロモーターで枯渇された。ｉＣＭにおけるＡＣＴＣ１、ＴＮＴ２、およびＣＯＬ１Ａ１のプロモーター領域上のＨ３Ｋ４ｍｅ３濃縮レベルは、Ｈ９由来ＣＭのものと同等であり、一方、ｉＣＭにおけるＣＯＬ１Ａ１のプロモーターでのＨ３Ｋ２７ｍｅ３は、Ｈ９Ｆと比較して、ＣＭにおけるレベルに増加した。これらの結果は、Ｈ９Ｆ由来ｉＣＭが少なくとも一部の心臓特異的および線維芽細胞濃縮遺伝子において心筋細胞に類似するクロマチン状態を得たことを示唆した。
【０２６２】
特定の遺伝子座のＤＮＡメチル化状態は、心臓線維芽細胞からｉＣＭへのリプログラミングの安定性も反映する。したがって、亜硫酸水素塩ゲノム配列決定は、Ｈ９Ｆ、２週間のｍＣｈｅｒｒｙ＋  ｉＣＭ、およびｍＣｈｅｒｒｙ＋Ｈ９−ＣＭにおけるＭＹＨ６、ＭＹＨ７、およびＮＰＰＡのプロモーター領域において実施された。３つの心臓プロモーターの領域は、これらの遺伝子の心筋細胞特異的発現から予測されるように、Ｈ９Ｆにおいて過剰メチル化されたが、Ｈ９−ＣＭに類似して、ｉＣＭにおいて比較的脱メチル化された（図６Ｂ）。これらの結果は、ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＥＳＰ１、およびＴＢＸ５によるリプログラミングが心筋細胞様状態への線維芽細胞ゲノムの後成的再設定を誘導したことを示した。
【０２６３】
リプログラミング事象の安定性をさらに評価するために、これらのリプログラミング因子の導入遺伝子発現がドキシサイクリンの存在によって制御される、ドキシサイクリン誘導性レトロウイルス系が生成された。Ｈ９Ｆは、ＲＶＸ−ｔｅｔＯｎ−ＧＦＰおよびＲＶＸ−ｒｔＴＡを含むレトロウイルスの混合物が形質導入され、ピューロマイシンおよびジェネテシンは、この系の発現動態を決定するために使用された、これらの２重形質導入された細胞を精製するために使用された（図６Ｃ）。ＧＦＰは、ドキシサイクリン誘導後１日以内に迅速かつ確実に発現され、ドキシサイクリンを取り除いたとき、直ぐに減少し、７日以内に消失したことが確認された（図６Ｄ）。Ｈ９Ｆは、ＲＶＸ−ｒｔＴＡと共に、誘導性ＲＶＸ−ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＥＳＰ１、ＭＹＯＣＤ、ＴＢＸ５、およびＺＦＰＭ２を含むレトロウイルスのプールが形質導入され、その後ドキシサイクリンで処理された（図６Ｅ）。αＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙは、早ければドキシサイクリン投与３日後にＨ９Ｆにおいて誘導され、一方、ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞は、ドキシサイクリンの不在下、Ｈ９Ｆにおいて観察されなかったことが分かった。ドキシサイクリンは、２週間の培養後に取り除かれ、細胞は、その後、リプログラミング因子の外因性発現を完全に除去するために、ドキシサイクリンなしで１週間培養された。リプログラミングされたｉＣＭは、ドキシサイクリンを取り除いた後、αＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ発現を維持し、サルコメア構造を有し（図６Ｆ）、線維芽細胞は、リプログラミング因子に２週間曝露された後、安定してｉＣＭにリプログラミングされたことを示唆する。
【０２６４】
図６Ａ〜Ｆ。Ａ）ＭＹＨ６、ＭＹＨ７、およびＮＰＰＡのプロモーターは、Ｈ９Ｆ、αＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ＋ｉＣＭ（誘導２週間後）、およびｍＣｈｅｒｒｙ＋Ｈ９−ＣＭにおけるＤＮＡメチル化状態に関して、亜硫酸水素塩ゲノム配列決定を用いて分析された。空白の丸は非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを示し、閉じられた丸はメチル化ＣｐＧを示す。Ｂ）ＡＣＴＣ１、ＡＣＴＮ２、ＲＹＲ２、ＴＮＮＴ２、ＰＬＮ、およびＣＯＬ１Ａ１のプロモーターは、Ｈ９Ｆ、ｉＣＭ、およびＨ９−ＣＭにおけるリジン２７または４（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３もしくはＨ３Ｋ４ｍｅ３）のヒストンＨ３のトリメチル化状態に関して、ＣｈＩＰによって分析された。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１対関連対照。Ｃ）ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性レトロウイルス系の発現動態を試験するための戦略のスキーム表示。Ｄ）Ｄｏｘ添加前（Ｄｏｘなし）、Ｄｏｘ添加１日後（＋Ｄｏｘ）、およびＤｏｘを取り除いた７日後（−Ｄｏｘ）のＬＶＸ−ｔｅｔＯｎ−ＧＦＰおよびＬＶＸ−ｒｔＴＡで感染させたＨ９Ｆの画像。Ｅ）ヒト心臓リプログラミングのためのリプログラミング因子の一時的な必要条件を決定するための戦略のスキーム。Ｆ）Ｄｏｘを取り除いた１週間後のヒトｉＣＭにおけるｍＣｈｅｒｒｙ、α−アクチニン、およびＤＡＰＩの免疫蛍光染色。ｉＣＭは、αＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ発現を維持し、ａ−アクチニン陽性サルコメア構造を有した。スケールバーは２０μｍを表す。
【０２６５】
誘導心筋細胞は心臓生理学的機能を呈する
ｉＣＭが心筋細胞の機能的性質特徴を保有したかを決定するために、細胞内Ｃａ２＋過渡状態が培養２〜４週間後にｉＣＭにおいて分析された。これらのｍＣｈｅｒｒｙ＋ｉＣＭおよびｍＣｈｅｒｒｙ−細胞における同時Ｃａ２＋振動は観察されなかった。しかしながら、電場刺激により、誘導４週間後の約２０％のＨ９Ｆ由来ｍＣｈｅｒｒｙ＋ｉＣＭは、Ｈ９−ＣＭにおけるＣａ２＋過渡状態に類似する定期的なＣａ２＋過渡状態を生成した（図７Ａおよび７Ｂ）。
【０２６６】
電気生理学的性質は、パッチクランプによる細胞内単一細胞再コード化により特徴付けされた。活動電位は、カルシウム電流はｉＣＭにおいて尚欠落したが、ナトリウム電流は測定された、４週間のリプログラミングされたαＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ＋ｉＣＭにおいて記録されなかった。レトロウイルス誘導１０週間後、αＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ＋ｉＣＭの静止膜電位は、成人ＣＭのレベルに類似する、−７３．４±８．４ｍＶ（ｎ＝６）に過分極された。典型的な心房活動電位は、αＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ＋ｉＣＭにおいて良好に誘発され（図７Ｃ）、そのナトリウム電流、カルシウム電流、内向き整流、および遅延整流カリウム電流が測定された（図７Ｄ）。したがって、ｉＣＭへのヒト線維芽細胞のリプログラミングは、遺伝子発現、後成的リプログラミング、および心筋細胞の機能的性質特徴における変化と関連した。
【０２６７】
図７Ａ〜Ｄ。Ａ）電場刺激により、Ｃａ２＋最小（Ｍｉｎ）および最大（Ｍａｘ）レベルで示されるＣａ２＋過渡状態は、Ｆｌｕｏ−４によりＨ９Ｆ由来ａＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ＋ｉＣＭにおいて観察された。Ｂ）リプログラミングされたｉＣＭから記録されたＣａ２＋過渡状態の典型的な痕跡は、Ｈ９  ＥＳ細胞（Ｈ９−ＣＭ、Ｄ６６）から分化した心筋細胞から記録された痕跡に類似する。Ｃ）典型的な心房活動電位は、誘導１０週間後のαＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ＋ｉＣＭにおいて再コード化された。Ｄ）ナトリウム電流、カルシウム電流、内向き整流、および遅延整流カリウム電流は、誘導１０週間後のαＭＨＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ＋ｉＣＭにおいて測定された。
【０２６８】
５個の因子が形質導入された移植線維芽細胞は生体内でリプログラミングされる
５個の因子が形質導入された線維芽細胞が生体内の心臓の生来の環境において心筋細胞特異的遺伝子を発現するようにリプログラミングされ得るか否かを検証した。Ｈ９Ｆはウイルス形質導入１日後に採取され、免疫抑制されたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの心臓に注入された。蛍光で容易に識別されるように、心臓線維芽細胞を、５個の因子およびＧＦＰレトロウイルス、またはＧＦＰレトロウイルスのみ（陰性対照）のいずれかで感染させた。ＧＦＰで感染させた心臓線維芽細胞は、α−アクチニンを発現せず、心筋細胞変換が陰性対照において生じなかったことを確認した（図８Ａ）。ウイルス感染からたった１日後に心臓に注入されたにも関わらず、５個の因子およびＧＦＰが形質導入されたＨ９Ｆのサブセットは、移植２週間後のマウスの心臓においてα−アクチニンを発現し、サルコメア構造を有した（図８Ｂ）。リプログラミングされたヒトｉＣＭは、ヒト原子核陽性染色によりさらに確認された。これらの結果は、ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＥＳＰ１、およびＴＢＸ５が形質導入された線維芽細胞が生体内移植時から２週間以内に心筋細胞にリプログラミングされ得ることを示唆した。
【０２６９】
図８Ａおよび８Ｂ。５個の因子が形質導入された移植された心臓線維芽細胞は、生体内で心筋細胞にリプログラミングされ得る。ＧＦＰ（Ａ）またはＧＦＰを有する５個の因子（Ｂ）で感染させたＨ９Ｆは、感染１日後にＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの心臓に移植され、組織学的切片により視覚化された。誘導ＧＦＰ＋ｉＣＭのサブセットは、α−アクチニン（赤）を発現し、サルコメア構造を有したことに留意する。
【０２７０】
参考文献
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【０２７１】
本発明は、その特定の実施形態に関して説明されてきたが、様々な変更を行うことができ、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく等価物が置換され得ることを当業者は理解するべきである。加えて、多くの修正は、本発明の目的、趣旨、および範囲に対して、特定の状況、材料、物質の組成物、プロセス、プロセス工程（複数可）に適合するように行われ得る。全てのそのような修正は付属の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【図１Ａ−Ｆ】
2014525268.tif 000002
【図１Ｇ】
2014525268.tif 000003
【図１Ｈ−Ｊ】
2014525268.tif 000004
【図２Ａ−Ｃ】
2014525268.tif 000005
【図２Ｄ−Ｅ】
2014525268.tif 000006
【図２Ｆ】
2014525268.tif 000007
【図３Ａ−Ｃ】
2014525268.tif 000008
【図３Ｄ−Ｇ】
2014525268.tif 000009
【図４Ａ−Ｃ】
2014525268.tif 000010
【図４Ｄ−Ｅ】
2014525268.tif 000011
【図４Ｆ−Ｇ】
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【図５Ａ−Ｃ】
2014525268.tif 000013
【図５Ｄ】
2014525268.tif 000014
【図５Ｅ】
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【図６Ａ−Ｂ】
2014525268.tif 000016
【図６Ｃ−Ｆ】
2014525268.tif 000017
【図７Ａ−Ｂ】
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【図７Ｃ−Ｄ】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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