(57)【要約】アルツハイマー病は、ヒトの中枢神経系の進行性疾患である。本発明は、対象から得たサンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを決定することにより、対象においてアルツハイマー病を診断する方法を提供し、好適な対照に対する少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルにおける変化は、対象においてアルツハイマー病を示す。アルツハイマー病の過程のモニタリングのための方法、アルツハイマー病を有する対象を治療する方法、及びアルツハイマー病の診断のためのキットもまた提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるアルツハイマー病を診断する方法であって、
前記対象からの循環ｍｉＲＮＡを含有するサンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを決定することを含み、ここで、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、Ｌｅｔ−７ｇ、Ｌｅｔ−７ｄ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、
好適な対照に対して決定される、正常な対象におけるｍｉＲＮＡのレベルと前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルとの差が、前記対象におけるアルツハイマー病を示す、方法。
【請求項２】
前記サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルに基づいて、前記対象におけるアルツハイマー病の有無の診断を提供することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
好適な対照に対する少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルの差を、前記対象におけるアルツハイマー病の診断に相関させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプル中のｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、Ｌｅｔ−７ｇ、Ｌｅｔ−７ｄからなる群から選択される１つのｍｉＲＮＡのレベルを決定することを含み、正常な対象におけるｍｉＲＮＡのレベルと前記ｍｉＲＮＡのレベルとの差が減少である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ｍｉＲ−３０１ａ；ｍｉＲ−５４５；並びにｍｉＲ−３０１ａ及びｍｉＲ−５４５からなる群から選択される、前記サンプル中の少なくとも１つの追加のｍｉＲＮＡのレベルを決定することを更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプル中の少なくとも２つのｍｉＲＮＡのレベルを決定することを含み、前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、Ｌｅｔ−７ｇ、Ｌｅｔ−７ｄ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプル中の少なくとも２つのｍｉＲＮＡのレベルを決定することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−５４５、ｌｅｔ７ｇ、及びｍｉＲ−１５ｂである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１５ｂ及びｍｉＲ−５４５である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−５４５、ｌｅｔ−７ｇ及びｍｉＲ−１５ｂである、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１９１及びｍｉＲ−１５ｂである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｍｉＲＮＡが、Ｌｅｔ−７ｇ及びｍｉＲ−１５ｂである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０１ａ、及びｍｉＲ−５４５である、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３０１ａ、ｌｅｔ−７ｇ、及びｍｉＲ−１５ｂである、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−５４５、及びｍｉＲ−１５ｂである、請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
（ｉ）前記対象からの循環ｍｉＲＮＡを含有するサンプル中の２つ以上のｍｉＲＮＡのレベルを決定することであって、前記ｍｉＲＮＡが、
（ａ）ｍｉＲ−５４５、ｌｅｔ７ｇ、及びｍｉＲ−１５ｂ、
（ｂ）ｍｉＲ−１５ｂ及びｍｉＲ−５４５、
（ｃ）ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−５４５、ｌｅｔ−７ｇ及びｍｉＲ−１５ｂ、
（ｄ）ｍｉＲ−１９１及びｍｉＲ−１５ｂ、
（ｅ）Ｌｅｔ−７ｇ及びｍｉＲ−１５ｂ、
（ｆ）ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０１ａ、及びｍｉＲ−５４５、
（ｇ）ｍｉＲ−３０１ａ、ｌｅｔ−７ｇ、及びｍｉＲ−１５ｂ、及び
（ｈ）ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−５４５、及びｍｉＲ−１５ｂからなる群から選択される、ことと、
（ｉｉ）前記サンプル中の前記２つ以上のｍｉＲＮＡのレベルを、正常な対象及びアルツハイマー病を有する対象において存在する同一のｍｉＲＮＡのレベルを表すデータのセットと比較することと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で行われた前記比較に基づいて、アルツハイマー病の有無について前記対象を診断することと
を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
好適な対照に対する少なくとも１つのｍｉＲＮＡの前記レベルの差が、ソフトウェア分類アルゴリズムを実行することにより決定される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルが、血液、リンパ液、尿、及び唾液からなる群から選択される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルが、無細胞サンプルである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルが、無微細小胞サンプルである、請求項１〜１７及び１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記サンプルが、血漿である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記サンプルが、血清である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
アルツハイマー病の診断を容易にするための少なくとも１つの追加試験を実行することを更に含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記追加試験が、簡易精神状態検査（ＭＭＳＥ）、ｍｉｎｉ−ｃｏｇ試験、ＡＤＡＳ−ｃｏｇ試験及び時計描画試験からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記追加試験が、アルツハイマー病に関する少なくとも１つの追加バイオマーカーを検出することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
アルツハイマー病治療薬、或いはその薬学的に許容可能な塩又はエステルを含む医薬組成物の治療的有効量を前記対象に投与することを更に含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記アルツハイマー病治療薬が、ガランタミン、リバスチグミン及びドネペジルからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ｍｉＲＮＡのレベルが、前記ｍｉＲＮＡに特異的にハイブリダイズする薬剤を使用して検出される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ｍｉＲＮＡのレベルが、増幅、ハイブリダイゼーション、及び／又は配列決定法（例えば、定量的ＰＣＲ）を使用して検出される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
対象におけるアルツハイマー病の経過を監視する方法であって、
（ａ）循環ｍｉＲＮＡを含有する対象からの第１のサンプル中の、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、Ｌｅｔ−７ｇ、Ｌｅｔ−７ｄ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを決定することと、
（ｂ）循環ｍｉＲＮＡを含有する前記対象からの第２のサンプル中の、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを決定することであって、前記第２のサンプルが、前記第１のサンプルの後に取得されることと、
（ｃ）ステップ（ａ）及び（ｂ）において決定された前記レベルを比較することであって、前記レベルがアルツハイマー病の進行を示すことと
を含む、方法。
【請求項３１】
前記サンプル中の少なくとも１つの追加のｍｉＲＮＡのレベルを測定することを更に含み、前記追加のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３０１ａ；ｍｉＲ−５４５；並びにｍｉＲ−３０１ａ及びｍｉＲ−５４５からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
対象におけるアルツハイマー病を治療する方法であって、
（ａ）前記対象からの循環ｍｉＲＮＡを含有するサンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを決定することであって、ここで、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、Ｌｅｔ−７ｇ、Ｌｅｔ−７ｄ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、好適な対照に対して決定される、正常な対象におけるｍｉＲＮＡのレベルと前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルとの差が、前記対象におけるアルツハイマー病を示すことと、
（ｂ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルの差が検出された場合に、アルツハイマー病治療薬、或いはその薬学的に許容可能な塩又はエステルを含む医薬組成物の治療的有効量を前記対象に投与することと
を含む、方法。
【請求項３３】
前記サンプル中の少なくとも１つの追加のｍｉＲＮＡのレベルを決定することを更に含み、前記追加のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３０１ａ；ｍｉＲ−５４５；並びにｍｉＲ−３０１ａ及びｍｉＲ−５４５からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
アルツハイマー病を有する対象を治療する方法であって、
（ａ）前記対象からの循環ｍｉＲＮＡを含有するサンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルが、好適な対照に対して異なる、アルツハイマー病を有する対象を特定することであって、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、Ｌｅｔ−７ｇ、Ｌｅｔ−７ｄ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されることと、
（ｂ）アルツハイマー病治療薬、或いはその薬学的に許容可能な塩又はエステルを含む組成物の治療的有効量を前記対象に投与することと
を含む、方法。
【請求項３５】
前記サンプル中の少なくとも１つの追加のｍｉＲＮＡのレベルが、好適な対照に対して異なる対象を特定することを更に含み、前記追加のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３０１ａ；ｍｉＲ−５４５；並びにｍｉＲ−３０１ａ及びｍｉＲ−５４５からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記アルツハイマー病治療薬が、ガランタミン、リバスチグミン及びドネペジルからなる群から選択される、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
対象におけるアルツハイマー病を診断するためのキットであって、
（ｉ）対象からの循環ｍｉＲＮＡを含有するサンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡの存在を選択的に検出する薬剤であって、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、Ｌｅｔ−７ｇ、Ｌｅｔ−７ｄ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される薬剤と、
（ｉｉ）前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルの決定のための使用説明書と、
を含み、好適な対照に対して決定される、正常な対象におけるｍｉＲＮＡのレベルと前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルとの差が、前記対象におけるアルツハイマー病を示す、キット。
【請求項３８】
前記サンプル中の少なくとも１つの追加のｍｉＲＮＡの存在を選択的に検出する薬剤を更に含み、前記追加のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３０１ａ；ｍｉＲ−５４５；並びにｍｉＲ−３０１ａ及びｍｉＲ−５４５からなる群から選択される、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記薬剤が、前記ｍｉＲＮＡに特異的にハイブリダイズする、請求項３７又は３８に記載のキット。
【請求項４０】
前記サンプルが、血液に由来する、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法又はキット。
【請求項４１】
前記サンプルが無細胞サンプルである、請求項４０に記載の方法又はキット。
【請求項４２】
前記サンプルが、無微細小胞サンプルである、請求項４１に記載の方法又はキット。
【請求項４３】
好適な対照に対する少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルの差が、ソフトウェア分類アルゴリズムを実行することにより決定される、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法又はキット。
【請求項４４】
正常な対象におけるｍｉＲＮＡのレベルと前記ｍｉＲＮＡのレベルとの差が減少である、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法又はキット。
【請求項４５】
前記対象が哺乳動物である、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法又はキット。
【請求項４６】
前記対象がヒトである、請求項４５に記載の方法又はキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１１年６月２７日に出願された米国特許仮出願第６１／５０１，７２０号に優先権を主張するものであり、その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、ヒトの中枢神経系の進行性疾患である。これは、典型的には高齢者における痴呆によって、方向感覚の喪失、記憶喪失、言語、計算、又は視覚−空間能力の障害を含む症状、並びに精神医学的な徴候によって顕在化する。アルツハイマー病は、脳のいくつかの領域における変質するニューロンに関連する。アルツハイマー病の神経病理は、アミロイド斑、神経原線維変化、シナプス損失及び選択的神経細胞死の存在によって特性化される。アミロイド斑は、細胞外アミロイドβペプチドの異常レベルが原因で発生し、一方神経原線維変化は細胞内高リン酸化ｔａｕタンパク質の存在に関連する。症状は、典型的には、記憶の低下でまず臨床的に顕在化し、その後他の認知機能の低下、更に異常行動に続く。世界中で約２，４００万人の人々が痴呆症を有し、その大部分（〜６０％）がアルツハイマー病に起因する（非特許文献１）。約５００万人のアメリカ人が、アルツハイマー病を有すると推定され、この数字は、２０００年から３５０％の増加を示し、今世紀半ばまでに１億４，３００万人にまで増加すると予想される。先進諸国における増大する痴呆患者数は、社会及び健康管理システムに大きな負担をかけるであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｆｅｒｒｉ  Ｃ．Ｐ．ら著、（２００５年）、Ｌａｎｃｅｔ  ３６６（９５０３）：２１１２−２１１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
初期診断は、疾患の進行を遅らせることが可能な薬剤を対象に受けさせるために、初期診断は、アルツハイマー病の治療における必須のステップである。現在、アルツハイマー病は、臨床基準の組み合わせを使用して診断され、これらは神経学的検査、精神状態検査、及び脳画像診断を含むことができる。アルツハイマー病の診断は、他の痴呆症を省くことによって行われる場合が多い。これら基準に基づいては、特に軽度及び初期アルツハイマー病を有する患者については、正確な診断が困難な場合がある。明確な診断は、脳組織の病理を検査することによってなされ得るが、これは死後に可能であるに過ぎない。したがって、診断的用途で使用され得るアルツハイマー病を示すマーカーへの要求が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、アルツハイマー病を示す新規なｍｉＲＮＡバイオマーカーを提供し、このｍｉＲＮＡバイオマーカーは対象においてアルツハイマー病を正確に診断するために使用され得る。これらバイオマーカーは、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、Ｌｅｔ−７ｇ、Ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−３０１ａ及びｍｉＲ−５４５を含む。一部の実施形態では、この方法は、好適なサンプル中の、好ましくは、血液、血漿、血清、尿、又は唾液中の細胞外の循環ｍｉＲＮＡの検出を伴う。
【０００６】
したがって、第１の態様では、本発明は、対象から得た循環ｍｉＲＮＡを含有するサンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを決定することによる、対象のアルツハイマー病を診断する方法を提供し、少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、Ｌｅｔ−７ｇ、Ｌｅｔ−７ｄ、又はこれらの組み合わせであり、好適な対照に対して決定される、正常な対象に対する少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルの差が、対象におけるアルツハイマー病を示す。例えば、一実施形態では、方法は、対象から得た循環ｍｉＲＮＡを含有するサンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを決定することを含み、少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、Ｌｅｔ−７ｇ、Ｌｅｔ−７ｄ、又はこれらの組み合わせであり、対照に対する少なくとも１つのｍｉｉＲＮＡのレベルの減少は、対象におけるアルツハイマー病を示す。必要に応じて、本方法は、サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルに基づいて、対象がアルツハイマー病の有無の診断を提供することを更に含む。一実施形態では、本方法は、好適な対照に対する少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルの差を、対象におけるアルツハイマー病の診断に相関させることを更に含んでもよい。
【０００７】
一実施形態では、方法は、サンプル中の１つのｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、Ｌｅｔ−７ｇ又はＬｅｔ−７ｄのレベルを決定することを含み、正常な対象に対する少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルの差が減少である。
【０００８】
別の実施形態では、本方法は、サンプル中の２つ以上のｍｉＲＮＡのレベルを決定することを含む。この実施形態では、方法は、サンプル中のｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−５４５、若しくはｍｉＲ−３０１ａ及びｍｉＲ−５４５のレベルを決定することを更に含んでもよい。例えば、少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、Ｌｅｔ−７ｇ、Ｌｅｔ−７ｄ、又はこれらの組み合わせから選択され得、必要に応じて、少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ
−５４５、若しくはｍｉＲ−３０１ａ及びｍｉＲ−５４５から選択され得る。一実施形態では、本方法は、ｍｉＲ−５４５、ｌｅｔ７ｇ、及びｍｉＲ−１５ｂ；ｍｉＲ−１５ｂ及びｍｉＲ−５４５；ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−５４５、ｌｅｔ−７ｇ及びｍｉＲ−１５ｂ；ｍｉＲ−１９１及びｍｉＲ−１５ｂ；Ｌｅｔ−７ｇ及びｍｉＲ−１５ｂ；ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０１ａ、及びｍｉＲ−５４５；ｍｉＲ−３０１ａ、ｌｅｔ−７ｇ、及びｍｉＲ−１５ｂ；並びにｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−５４５、及びｍｉＲ−１５ｂ、のうちのｍｉＲＮＡの組み合わせの１つのレベルを決定することを有する。
【０００９】
１つの特定の実施形態では、本方法は、対象からの循環ｍｉＲＮＡを含有するサンプル中の２つ以上のｍｉＲＮＡのレベルを決定することと、サンプル中の２つ以上のｍｉＲＮＡのレベルを、正常な対象及びアルツハイマー病を有する対象において存在する同一のｍｉＲＮＡのレベルを表すデータのセットを比較することと、この比較に基づいて、アルツハイマー病の有無として対象を診断することとを含むことができる。一部の実施形態では、２つ以上のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−５４５、ｌｅｔ７ｇ、及びｍｉＲ−１５ｂ；ｍｉＲ−１５ｂ及びｍｉＲ−５４５；ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−５４５、ｌｅｔ−７ｇ及びｍｉＲ−１５ｂ；ｍｉＲ−１９１及びｍｉＲ−１５ｂ；Ｌｅｔ−７ｇ及びｍｉＲ−１５ｂ；ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０１ａ、及びｍｉＲ−５４５；ｍｉＲ−３０１ａ、ｌｅｔ−７ｇ、及びｍｉＲ−１５ｂ；並びにｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−５４５、及びｍｉＲ−１５ｂの組み合わせを含むことができる。
【００１０】
本方法は、必要に応じて、アルツハイマー病の診断を容易にするための少なくとも１つの追加試験を実行することを含んでもよい。特定の実施形態では、追加試験は、簡易精神状態検査（ＭＭＳＥ）、ｍｉｎｉ−ｃｏｇ試験、ＡＤＡＳ−ｃｏｇ試験、及び時計描画試験の１つ以上であり得る。必要に応じて又はこれに加えて、追加試験は、アルツハイマー病についての少なくとも１つの追加バイオマーカーを検出又は評価することを含んでもよい。
【００１１】
方法は、必要に応じて、対象に少なくとも１つのアルツハイマー病治療薬の治療的有効量を投与することを含む。特定の実施形態では、アルツハイマー病治療薬は、Ｒａｚａｄｙｎｅ（登録商標）（ガランタミン）、Ｅｘｅｌｏｎ（登録商標）（リバスチグミン）、又はＡｒｉｃｅｐｔ（登録商標）（ドネペジル）であり得る。特定の実施形態では、アルツハイマー治療薬は、ドネペジル若しくはその薬学的に許容可能な塩又はエステル（例えば、ドネペジル塩酸塩）である。
【００１２】
ｍｉＲＮＡのレベルは、任意な好適な方法により検出され得る。例えば、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡに特異的にハイブリダイズする薬剤を使用して検出されてもよい。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡのレベルは、増幅法、ハイブリダイゼ―ション法、及び／又は配列決定法を使用して検出され得る。一実施形態では、ｍｉＲＮＡのレベルは、定量的ＰＣＲを使用して検出されてもよい。
【００１３】
別の態様では、本発明は、対象においてアルツハイマー病を診断する方法を提供し、本方法は、対象からの血液由来サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを測定することとであって、少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、Ｌｅｔ−７ｇ、Ｌｅｔ−７ｄ、又はこれらの組み合わせであることと、対照に対する対象におけるレベルの差を、対象におけるアルツハイマー病の診断と相関させることとを含む。一実施形態では、方法は、サンプル中のｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−５４５、若しくはｍｉＲ−３０１ａ及びｍｉＲ−５４５のレベルを測定することを更に含んでもよい。
【００１４】
別の態様では、本発明は、対象においてアルツハイマー病の経過を監視する方法を提供し、本方法は、対象からの循環ｍｉＲＮＡを含有する第１のサンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを決定することと、該対象からの循環ｍｉＲＮＡを含有する、該第１のサンプル後に得られた第２のサンプル中の該少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを決定することと、並びに第１のサンプル中で決定されたレベルを、第２のサンプル中で決定されたレベルと比較することとにより行われ、該レベルはアルツハイマー病の進行を示し、少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、Ｌｅｔ−７ｇ、Ｌｅｔ−７ｄ、又はこれらの組み合わせである。一実施形態では、方法は、サンプル中のｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−５４５、若しくはｍｉＲ−３０１ａ及びｍｉＲ−５４５のレベルを決定することを更に含んでもよい。
【００１５】
別の態様では、本発明は、対象でアルツハイマー病を治療する方法を提供し、本方法は、該対象からの循環ｍｉＲＮＡを含有するサンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを決定することであって、好適な対照に対して決定される、正常な対象に対する少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルの差は、対象においてアルツハイマー病を示すことと、少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルの差が検出された場合に、アルツハイマー治療薬を含む組成物の治療的有効量を対象に投与することとによる。一実施形態では、少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、Ｌｅｔ−７ｇ、Ｌｅｔ−７ｄ、又はこれらの組み合わせである。方法は、必要に応じて、サンプル中のｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−５４５、若しくはｍｉＲ−３０１ａ及びｍｉＲ−５４５のレベルを測定することを更に含んでもよい。
【００１６】
別の態様では、本発明は、アルツハイマー病を有する対象を治療する方法を提供し、本方法は、対象からの循環ｍｉＲＮＡを含有するサンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルが好適な対照に対して異なる（例えば、減少する）、アルツハイマー病を有する対象を特定することと、対象にアルツハイマー治療薬の治療的有効量を投与することとによる。一実施形態では、少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、Ｌｅｔ−７ｇ、Ｌｅｔ−７ｄ、又はこれらの組み合わせである。本方法は、必要に応じて、好適な対照に対して、サンプル中のｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−５４５、若しくはｍｉＲ−３０１ａ及びｍｉＲ−５４５のレベルが異なる（例えば、減少する）対象を特定することを含んでもよい。これら態様では、アルツハイマー治療薬は、Ｒａｚａｄｙｎｅ（登録商標）（ガランタミン）、Ｅｘｅｌｏｎ（登録商標）（リバスチグミン）、又はＡｒｉｃｅｐｔ（登録商標）（ドネペジル）であり得る。例示的な実施形態では、アルツハイマー病治療薬は、ドネペジル若しくはその薬学的に許容可能な塩又はエステル（例えば、ドネペジル塩酸塩）である。
【００１７】
別の態様では、本発明は、対象においてアルツハイマー病を診断するためのキットを提供し、本キットは、対象からの循環ｍｉＲＮＡを含有するサンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡの存在を選択的に検出する薬剤であって、少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、Ｌｅｔ−７ｇ、Ｌｅｔ−７ｄ、又はこれらの組み合わせである薬剤と、該少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを決定するための使用説明書とを具備し、好適な対照に対して決定される、正常な対象に対する少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルの差が、対象においてアルツハイマー病を示す。かかるキットは、必要に応じて、少なくとも１つの追加のｍｉＲＮＡの存在を選択的に検出する薬剤を具備してもよく、追加のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−５４５、若しくはｍｉＲ−３０１ａ及びｍｉＲ−５４５である。一部の実施形態では、薬剤は、ｍｉＲＮＡに特異的にハイブリダイズする。
【００１８】
本明細書に記載の方法又はキットの一部の実施形態では、対象は、哺乳類、例えばヒトであり得る。
【００１９】
本明細書に記載の方法又はキットにおいて、好適な対照に対する少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルの差は、ソフトウェア分類アルゴリズムを実行することにより決定されてもよい。
【００２０】
方法及びキットの特定の実施形態では、サンプルは、体液、例えば血液、リンパ液、尿、又は唾液であってもよい。サンプルは、無細胞サンプル及び／又は無微細小胞サンプルであり得る。一実施形態では、サンプルは血漿である。別の実施形態では、サンプルは血清である。
【００２１】
１つのｍｉＲＮＡが選択され又は使用される方法及びキットの特定の実施形態では、該ｍｉＲＮＡは、（ａ）ｍｉＲ−１９１以外のｍｉＲＮＡ、（ｂ）ｍｉＲ−１５ｂ以外のｍｉＲＮＡ、（ｃ）ｍｉＲ−１４２−３ｐ以外のｍｉＲＮＡ、（ｄ）Ｌｅｔ−７ｇ以外のｍｉＲＮＡ、及び／又はＬｅｔ−７ｄ以外のｍｉＲＮＡである。
【００２２】
サンプルがＣＳＦである方法及びキットの特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、（ａ）ｍｉＲ−１５ｂ以外のｍｉＲＮＡ、及び／又は（ｂ）ｍｉＲ−１９１以外のｍｉＲＮＡである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】ｎＣｏｕｎｔｅｒ  ｍｉＲＮＡアッセイを使用する、コホート１（２０人のアルツハイマー病（ＡＤ）又は軽度認知障害（ＭＣＩ）患者（１１人のＡＤ；９人のＭＣＩ）並びに２０人の正常対照（ＮＣ）患者）からの正規化ｍｉＲＮＡ発現の散布図である。
【図１Ｂ】ｎＣｏｕｎｔｅｒ  ｍｉＲＮＡアッセイを使用する、コホート１（２０人のアルツハイマー病（ＡＤ）又は軽度認知障害（ＭＣＩ）患者（１１人のＡＤ；９人のＭＣＩ）並びに２０人の正常対照（ＮＣ）患者）からの正規化ｍｉＲＮＡ発現の散布図である。
【図２】ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ｑＰＣＲを使用する、コホート１（２０人のＡＤ又はＭＣＩ患者並びに２０人のＮＣ患者）からの個々の候補ｍｉＲＮＡバイオマーカーの平均対照値に正規化された、線形倍率変化値の散布図である。
【図３】ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ｑＰＣＲを使用する、コホート２（２０人のＡＤ及び１７人のＮＣ患者）からの個々の候補ｍｉＲＮＡバイオマーカーの平均対照値に正規化された、線形倍率変化値の散布図である。
【図４】表１：ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社から入手される、診断、年齢、性別、ＭＭＳＥスコア及び来院番号を含むコホート１中の患者の利用可能な詳細である。
【図５】表２：ｍｉＲＮＡバイオマーカー及び正規化に使用されるｍｉＲＮＡの配列及びｍｉＲＢＡＳＥ受入番号である。
【図６】表３：コホート１サンプル（２０人のＡＤ又はＭＣＩ（１１人のＡＤ；９人のＭＣＩ）並びに２０人のＮＣ）についてのＮａｎｏｓｔｒｉｎｇとＴａｑＭａｎプラットフォームとの間の候補ｍｉＲＮＡバイオマーカーについての平均倍率変化値の相関である。
【図７】表４：コホート１サンプルのサブセット（１１人のＡＤ及び２０人のＮＣ）を使用するＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲから誘導された相対的Ｃｔ値データであり、このデータを使用して、ＡＤ患者とＮＣ患者との間を識別するための候補ｍｉＲＮＡバイオマーカーのシグネチャーパターンを生成した。
【図８】表５：ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社から入手される、診断、年齢、性別、ＭＭＳＥスコア及び来院番号を含むコホート１中の患者の利用可能な詳細である。
【図９】表６：ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ｑＰＣＲ  ｍｉＲＮＡアッセイを使用するコホート１とコホート２の間の候補ｍｉＲＮＡバイオマーカーついての平均倍率変化値（平均対照値に正規化された）である。
【図１０】表７：コホート２のサンプル（２０人のＡＤ及び１７人のＮＣ）を使用するＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲから誘導された相対的Ｃｔ値であり、これをコホート１のデータ（表４）から誘導されたシグネチャーを、ＡＤ及びＮＣ患者状態を予測するためのアルゴリズムのための入力として使用した。
【図１１Ａ】表８Ａ：アルツハイマー病を示す候補ｍｉＲＮＡバイオマーカーシグネチャーである。
【図１１Ｂ】表８Ｂ：アルツハイマー病を示す候補ｍｉＲＮＡバイオマーカーシグネチャーである。
【図１１Ｃ】表８Ｃ：アルツハイマー病を示す候補ｍｉＲＮＡバイオマーカーシグネチャーである。
【図１２Ａ】表９Ａ：＞７５％の精度を有するｍｉＲＮＡバイオマーカーシグネチャーについての精度、特異性、感度及びＡＵＣ（曲線下面積）である。
【図１２Ｂ】表９Ｂ：＞７５％の精度を有するｍｉＲＮＡバイオマーカーシグネチャーについての精度、特異性、感度及びＡＵＣ（曲線下面積）である。
【図１３】表１０：予測にコホート２のサンプルを使用する、選択された８つのｍｉＲＮＡシグネチャーの組み合わせについての精度、特異性、感度及びＡＵＣ（曲線下面積）である。
【図１４】表１１：予測にコホート２のサンプルを使用する個々のｍｉＲＮＡについての精度、特異性、感度及びＡＵＣ（曲線下面積）である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
１．概要
本発明は、アルツハイマー病を示す新規なｍｉＲＮＡバイオマーカーを提供し、このｍｉＲＮＡバイオマーカーは、対象においてアルツハイマー病を正確に診断するために使用され得る。これに加えて、アルツハイマー病の過程のモニタリングのための方法、アルツハイマー病を有する対象を治療する方法、及びアルツハイマー病を診断するためのキットが提供される。一部の実施形態では、方法は、好適なサンプル中の、好ましくは血液、血漿、血清、尿、又は唾液中の細胞外の循環ｍｉＲＮＡの検出を必然的に伴う。
２．用語の定義
【００２５】
本発明を詳細に記載する前に、本明細書で使用される特定の用語の定義が提供される。特段の断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び専門用語は、当業者により通常理解されるものと同一の意味を有する。
【００２６】
本発明を説明する文脈における（特に、以下の特許請求の範囲の文脈における）用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」並びに類似の指示対象は、本明細書に別に記載がないか又は前後関係において明らかに否定されない限り、単数形及び複数形の双方をカバーするものとして解釈される。用語「含む、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「有する、ｈａｖｉｎｇ」、「含む、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、及び「含有する、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」は、特に明記されない限り、自由用語（すなわち、限定されないが、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」を意味するもの）として解釈されるべきである。本明細書での数値の範囲の列挙は、別に記載がない限り、列挙されるか、範囲内に入るそれぞれの別個の数値を個々に示す略記法として役立つよう意図されているに過ぎず、それぞれの別個の数値は、これが個々に列挙される場合、本明細書に組み込まれるものである。
【００２７】
用語「対象」とは、アルツハイマー病などの神経変性疾患、又はアルツハイマー病に直接的又は間接的に関与する任意の障害を含むＣＮＳ障害に関連する痴呆症に罹患しているか又は罹患する可能性がある動物を包含するよう意図される。対象の例としては、哺乳類、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、及び遺伝子組み換え非ヒト動物が挙げられる。特定の実施形態では、対象はヒト、例えば、アルツハイマー病又はアルツハイマー病に関連する痴呆症に罹患しているヒト、これに罹患している危険にさらされたヒト、潜在的にこれに罹患する可能性があるヒトである。
【００２８】
本明細書で使用する場合、用語「治療する」とは、対象における疾患の１つ以上の症状を緩和し、低減し又は軽減することを意味する。例えば、アルツハイマー病に関しては、用語「治療する」とは、認知障害（記憶及び／又は方向感覚の障害）若しくは全般的な機能（日常生活の活動を含む全体的機能）の障害を緩和し、低減し、又は軽減すること及び／又は全般的障害又は認知障害における進行性悪化を遅くする又は逆転させることを含む。したがって、用語「治療する」はまた、疾患又は疾患の症状の臨床所見の前に、発症を遅延させる又は予防すること及び／又は疾患の症状の発症又は悪化のリスクを低減することを包含する。
【００２９】
治療薬、又はその組み合わせの「治療的有効量」とは、対象において疾患を治療するのに十分な量である。例えば、アルツハイマー病については、治療的有効量は、アルツハイマー病のベースラインの臨床的に観察可能な徴候及び症状と比較して、観察可能な治療的有益性を提供することが示された量であり得る。
【００３０】
用語「約」又は「およそ」は、通常、所定の数値又は範囲の５％以内、又はより好ましくは１％以内を意味する。
３．アルツハイマー病に関するｍｉＲＮＡバイオマーカー
【００３１】
本発明は、「正常」である対象、すなわち、アルツハイマー病を有さない対象と比較した場合に、アルツハイマー病（ＡＤ）を有する対象から得た生物学的サンプル中に示差的に存在することが確認されたマイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」バイオマーカーに関する。サンプル中のｍｉＲＮＡバイオマーカー又はｍｉＲＮＡバイオマーカーのセットの発現のレベルの差が、統計的に有意であることが決定される場合、ｍｉＲＮＡバイオマーカー又はｍｉＲＮＡバイオマーカーのセットは、示差的に存在する。統計的有意性のための一般的試験としては、ｔ−検定、ＡＮＯＶＡ、クニスカル・ワリス検定、ウィルコクソン検定、マン・ホイットニー検定、及びオッズ比が挙げられるが、これらに限定されない。ｍｉＲＮＡバイオマーカーは、単独で又は組み合わされて、対象がアルツハイマー病の有無の相対的リスクの尺度を提供するよう使用され得る。
【００３２】
ｍｉＲＮＡは、翻訳抑制を含む異なる機構を通して遺伝子発現を調節することに関与する小型の非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、サイズが数百から数千のヌクレオチドの範囲で、長い一次ｍｉＲＮＡ転写物（「ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ」）として、最初にＤＮＡから転写される。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは酵素複合体Ｄｒｏｓｈａ−ＤＧＣＲ８により核内で処理され、ステム−ループ前駆体ｍｉＲＮＡ（「ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ」）を形成する。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、タンパク質エクスポルチン５により細胞質に輸送され、ここでこれは酵素Ｄｉｃｅｒにより開裂され、成熟（機能的）ｍｉＲＮＡを生成する。ヒトゲノムは、１３００個を超えるｍｉＲＮＡをコード化し、これは「ｍｉＲＢａｓｅ；マイクロＲＮＡデータベース」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）で分類されている。ｍｉＲＮＡ発現は、多様な細胞型及び組織型、並びに細胞外で、例えば生物学的体液で報告されている。
【００３３】
アルツハイマー病のｍｉＲＮＡバイオマーカーは、アルツハイマー病を有する対象から得た生物学的サンプル中のｍｉＲＮＡの発現のレベルを、「正常」である対象、すなわちＡＤを有さない対象から得た生物学的サンプルと比較し、示差的に存在するｍｉＲＮＡを特定することによって発見された。７つの示差的に存在するｍｉＲＮＡバイオマーカーが、この方法で特定され、驚くべきことに、これらが血漿中で測定される場合、アルツハイマー病を示すことが見出された（これらは、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉｒ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ａ、及びｍｉＲ−５４５である（表２を参照））。これらｍｉＲＮＡバイオマーカーは、対象のアルツハイマー病状態、例えば、そのアルツハイマー病状態が今までに知られていないかった対象又はアルツハイマー病に冒されていることが疑われる対象を判定するために使用されることができる。これは、対象から得た生物学的サンプル中のｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉｒ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−５４５、又はこれらの組み合わせの１つ以上のレベルを決定することにより達成され得る。正常な対象から得た生物学的サンプル中のものと比べたときのこれらｍｉＲＮＡバイオマーカーの１つ以上のレベルの差は、対象がアルツハイマー病を有することの指標である。
【００３４】
正常な対象と比べて、１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルの差を有する対象は、初期アルツハイマー病、中等度又は中期アルツハイマー病、若しくは重度又は後期アルツハイマー病を含むアルツハイマー病を有する可能性がある。一実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルは、前駆アルツハイマー病としても知られる初期アルツハイマー病の症状特徴を有する対象においてアルツハイマー病を診断するよう使用され得る。初期アルツハイマー病を有する対象は、典型的には、２４〜３０のＭＭＳＥスコアを有する。軽度の記憶喪失及び複雑な仕事を実行するための低下する能力に関する不満が、自己申告され若しくは配偶者及び／又は介護者により報告される場合が多い。
【００３５】
別の実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルは、「中等度」又は「中期」アルツハイマー病とも呼ばれる、「中等度乃至重度の認知能力の低下」を特徴とする症状を有する対象においてアルツハイマー病を診断するよう使用され得る。中等度乃至重度の認知能力の低下は、記憶における主要なギャップ及び認知機能における異常の出現を特徴とする。この段階では、日々の活動での一部の補助が示唆される。
【００３６】
別の実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルは、「中等度」又は「中期」アルツハイマー病とも呼ばれる、「重度の認知能力の低下」を特徴とする症状を有する対象においてアルツハイマー病を診断するよう使用され得る。重度の認知能力低下では、記憶障害が悪化し続け、著しい性格の変化が現れる場合もあり、冒された個人は、典型的には、慣習的な毎日の活動で高範囲の補助を必要とする。
【００３７】
別の実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルは、「重度」又は「後期」アルツハイマー病とも呼ばれる、「極めて重度の認知能力の低下」を特徴とする症状を有する対象においてアルツハイマー病を診断するよう使用され得る。後期アルツハイマー病又は極めて重度の認知能力低下は、疾患の最終段階である。個人は、典型的には、彼らの環境に反応する能力、話す能力を失い、最終的には移動を制御する能力を失う。（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ａｌｚ．ｏｒｇを参照されたい）。
【００３８】
別の実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルは、０と２６との間のＭＭＳＥスコア、例えば、０〜１０のＭＭＳＥ得点、０〜２０のＭＭＳＥスコア、０〜２６のＭＭＳＥスコア等を有する対象においてアルツハイマー病を診断するために使用され得る。「ＭＭＳＥ」とは、認知評価共同体で使用される簡易精神状態検査である。ＭＭＳＥ中に、医師又は他の医療専門家が患者に日常的な精神的技量の範囲を検査するよう設計される一連の質問を尋ねる。一般的に解答される質問としては、例えば、３人の一般的対象者の名前を思い出させ、反復させること、年、日付、季節、及び曜日を述べさせること、１００から戻って７飛びに数えること、単語「ｗｏｒｌｄ」を逆に綴ること、検査者が彼らに指示したよく知っている対象物の名前を答えること、検査者のオフィスの場所を特定させること、検査者によって述べられた後に通り言葉を反復させること、２つの連結する形の絵を写させること、並びに以下の３部分の連続した命令（例えば、１枚の紙を拾い上げ、それを半分に折り畳み、それを床に置く）に従うことが挙げられる。ＭＭＳＥ検査における最大得点は３０点である。一般的に、２７〜３０のＭＭＳＥ得点を有する患者は、認知障害を有さないと考えられ、２１〜２６のＭＭＳＥ得点を有する患者は、軽度の認知障害を有すると考えられ、１１〜２０のＭＭＳＥ得点を有する患者は、中等度認知障害を有すると考えられ、０〜１０のＭＭＳＥ得点を有する患者は、重度の認知障害を有すると考えられる。特定の実施形態では、０〜１６のＭＭＳＥ得点を有する患者は、進行した（中等度乃至重度から重度の）アルツハイマー病を有すると考えられる。
【００３９】
一実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルは、対象においてアルツハイマー病の経過をモニタリングするために使用され得る。対象のアルツハイマー病状態は、経時的に変化する可能性がある。例えば、この疾患は、経時的に悪化又は改善する場合がある。かかる悪化又は改善で、対象から得たサンプル中で検出されるように、１つ以上のｍｉＲＮＡのレベルは変化する場合がある。例えば、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉｒ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ａ、及び／又はｍｉＲ−５４５の１つ以上のレベルは、アルツハイマー病の進行で低下する。したがって、対象におけるアルツハイマー病の過程は、対象から得た第１のサンプル中の１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマオカーのレベルを決定し、対象から得た第２のサンプル中の１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルを決定することによってモニタリングされ得、ここで第２のサンプルは、第１のサンプルの後に得られる。第１のサンプル中のレベルに対する第２のサンプル中のレベルは、疾患進行を示す。例えば、第２のサンプルに対する第１のサンプルからのｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉｒ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ａ、及び／又はｍｉＲ−５４５の１つ以上のレベルの減少は、対象がアルツハイマー病を進行させたこと、又は疾患が悪化したことを示す。逆に、第２のサンプルに対して第１のサンプルからのｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉｒ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ａ、及び／又はｍｉＲ−５４５の１つ以上のレベルの増加は、疾患が改善されたことを示す。一実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーは、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、及びこれらの組み合わせである。
【００４０】
試験対象から得た生物学的サンプル中のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルが、正常対象において存在するか否かは、試験対象からのサンプル中のｍｉＲＮＡのレベルを好適な対照と比較することにより確認され得る。当業者であれば、論議されているアッセイに関する適切な対照を選択することができる。例えば、好適な対照は、既知対象、例えば、正常な対象として既知の対象、又はアルツハイマー病を有することがわかっている対象に由来する生物学的サンプルであることができる。好適な対照が正常な対象から得られる場合、好適な対照に対する試験対象におけるｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルの統計的に有意な差が、対象がアルツハイマー病を有することを示す。好適な対照がアルツハイマー病を有することがわかっている対象から得られる場合、かかる対照に匹敵するか又はこれより低いレベルはアルツハイマー病を示し、正常な対象からのサンプル中に存在するレベルの差を反映する。一実施形態では、ｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルの差は減少である。好適な対照はまた、参照標準であってもよい。参照標準は、比較のための参照レベルとして役立つことで、対象のアルツハイマー病状態を推測するために、試験サンプルは参照標準と比較され得る。参照標準は、既知の対象、例えば、正常な対象であることがわかっている対象、又はアルツハイマー病であることがわかっている対象における１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルを表すことができる。同様に、参照標準は、既知対象の集団、例えば、正常な対象であることがわかっている対象の集団、又はアルツハイマー病であることがわかっている対象の集団での１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルを表すことができる。参照標準は、例えば、複数の個体からのサンプルをプールし、プールされたサンプル中のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルを決定することにより取得され得、これによって、平均化された集団にわたる標準を作成する。かかる参照標準は、個体の集団の間でｍｉＲＮＡバイオマーカーの平均レベルを表す。参照標準はまた、例えば、決定されたｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルを複数の個体から得られた個々のサンプル中で存在するよう平均化することにより得られる場合もある。かかる標準はまた、ｍｉＲＮＡバイオマーカーの個体の集団の間の平均レベルを表す。参照標準はまた、個体の集団の間でｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルを表す。参照標準はまた、固体の集団内の既知の対象におけるｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルをそれぞれが表わしている値の集合であることができる。特定の実施形態では、対象のアルツハイマー病の状態を推測するために、試験サンプルが、かかる値の集合に対して比較され得る。特定の実施形態では、参照標準は、絶対値である。かかる実施形態では、試験サンプルは、対象のアルツハイマー病の状態を推測するために、この絶対値に対して比較され得る。一実施形態では、好適な対照に対するサンプル中の１つ以上のｍｉＲＮＡのレベル間の比較は、ソフトウェア分類アルゴリズムを実行することにより行われる。当業者であれば、議論されているアッセイに応じて適切であり得る追加の好適な対照を容易に想像することができるであろう。前述した好適な対照は例示的であり、限定的であることを意図してはいない。
【００４１】
一般的に、正常対象におけるｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉｒ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ａ、及び／又はｍｉＲ−５４５の１つ以上のレベルをそれぞれ表す好適な対照に対する、試験対象から得た生物学的サンプル中のｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉｒ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ａ、及び／又はｍｉＲ−５４５の１つ以上のレベルの減少は、試験対象がアルツハイマー病を有することを示唆するであろう。好適な対照がアルツハイマー病を有する対象におけるｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルを表す場合、一般的に、かかる対照のものに匹敵する又はそれよりも低いｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉｒ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ａ、及び／又はｍｉＲ−５４５の１つ以上のレベルは、アルツハイマー病を示す。
【００４２】
２つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルが試験対象において決定されるいくつかの例では、好適な対照に対して、１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルの減少があり、１つ以上の追加のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルの変化又は増加はない。かかる例では、正常な対象におけるｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルを表す好適な対照に対する１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルの差は、試験対象がアルツハイマー病を有することを示唆する。かかる差の決定は、本明細書で記載される、ソフトウェア分離アルゴリズムの実行により補助され得る。
４．生物学的サンプル
【００４３】
１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーの発現レベルは、対象から得た生物学的サンプル中で決定され得る。対象から得たサンプルは、対象を起源とするものである。かかるサンプルは、これが対象から採取された後に、更に処理されてもよい。例えば、ＲＮＡが、サンプルから単離されてもよい。この例では、サンプルから単離されたＲＮＡは、対象から得たサンプルでもある。１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルを決定するために有用な生物学的サンプルは、ｍｉＲＮＡ発現が細胞、組織、及び身体全体の体液中で報告されているために、本質的にいかなる供給源からも取得され得る。しかしながら、本発明の一態様では、アルツハイマー病を示す１つ以上のバイオマーカーは、対象から非侵襲的に得られたサンプル中で検出され得る。アルツハイマー病に関する既存のバイオマーカー（例えば、Ａβ１−４２、ｐ−ｔａｕ等）は、脳脊髄液（ＣＳＦ）に又は脳組織に由来のサンプルで測定される場合が多い。ＣＳＦは、最も一般的には、腰椎穿刺により採取され、これは脊柱管への出血、脊髄性頭痛、及び感染を含む危険要素に関連する痛みを伴う処置である。脳組織のサンプルでのバイオマーカー検出は、現在、生存対象でのアルツハイマー病の診断には非実際的であり、主として死後に、他の手段でなされる診断を確認するために使用される。したがって、サンプルは脳組織以外の供給源から採取されることが好ましい。本明細書に記載のｍｉＲＮＡバイオマーカーは、アルツハイマー病を示し、非侵襲的に採取される生物学的サンプル中で検出され得る。
【００４４】
好ましい実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルを決定するために使用される生物学的サンプルは、循環ｍｉＲＮＡ、例えば細胞外ｍｉＲＮＡを含有するサンプルである。細胞外ｍｉＲＮＡは、循環系からの液体、例えば血液サンプル又はリンパ液サンプル、又はＣＳＦ、尿又は唾液などの別の体液などの、体液を含む広範囲の生物学的物質中で自由に循環する。したがって、一部の実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルを決定するために使用される生物学的サンプルは、体液であり、例えば血液、そのフラクション、血清、血漿、尿、唾液、涙液、汗、精液、膣分泌液、リンパ液、気管支分泌物、ＣＳＦ等である。一部の実施形態では、サンプルは、非侵襲的に採取されるサンプルである。一部の実施形態では、サンプルは、ＣＳＦ以外の体液から採取される。
【００４５】
循環ｍｉＲＮＡは、細胞中のｍｉＲＮＡ（細胞内ｍｉＲＮＡ）、微細小胞中の細胞外ｍｉＲＮＡ（微細小胞関連ｍｉＲＮＡ）、及び細胞又は微細小胞に結合しない細胞外ｍｉＲＮＡ（細胞外、非小胞ｍｉＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルを決定するために使用される生物学的サンプル（例えば、循環ｍｉＲＮＡを含有するサンプル）は、細胞を含有してもよい。他の実施形態では、この生物学的サンプルは、無細胞又は実質的に無細胞であってもよい（例えば、血清サンプル）。このサンプルは、同様に、無微細小胞又は実質的に無微細小胞であってもよい。例えば、無微細小胞又は実質的に無ミクロ小胞であるサンプルは、サンプルの微細小胞含量が、サンプル中で非小胞ｍｉＲＮＡのレベルを正確に決定するための能力を妨害することを回避するように十分に低い。一部の実施形態では、循環ｍｉＲＮＡを含有するサンプルは、血液由来サンプルである。例示的な血液由来サンプル型としては、例えば、血漿サンプル、血清サンプル、血液サンプル等が挙げられる。他の実施形態では、循環ｍｉＲＮＡを含有するサンプルは、リンパ液サンプルである。循環ｍｉＲＮＡはまた、尿及び唾液でも見いだされ、これら供給源に由来の生物学的サンプルは、同様に、１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルを決定するために好適である。
５．サンプル中のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルの決定
【００４６】
生物学的サンプル中の１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルは、任意の好適な方法により決定され得る。サンプル中のｍｉＲＮＡのレベル又は量を測定するための任意の信頼のおける方法が使用され得る。一般的に、ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡについて既知の様々な方法により単離されたＲＮＡのサンプルなどのサンプル（そのフラクションを含む）から検出かつ定量化され得、様々な方法は、例えば、増幅に基づく法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ローリングサークル増幅等）、ハイブリダイゼーションに基づく方法（ハイブリダイゼーションアレイ（例えば、マイクロアレイ）、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ分析、ノーザンブロット分析、分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）シグナル増幅、インサイチューハイブリダイゼーション等）、及び配列決定に基づく方法（例えば、Ｉｌｌｉｍｉｎａ又はＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔプラットフォームを使用する次世代型配列決定法など）を含む。他の例示的技術としては、リボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）及び質量分析法が挙げられる。
【００４７】
一部の実施形態では、分析の前に、ＲＮＡはＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換される。ｃＤＮＡは、従来の技術を使用して、単離されたｍｉＲＮＡの逆転写により生成され得る。ｍｉＲＮＡ逆転写キットが既知であり、市販されている。好適なキットの例としては、ｍｉｒＶａｎａ（商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡ転写キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、及びＴａｑＭａｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡ転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。ユニバーサルプライマー、又はｍｉＲＮＡ特異的ステム−ループプライマーを含む特異的プライマーが既知であり、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から市販されている。一部の実施形態では、測定の前に、ｍｉＲＮＡは増幅される。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡのレベルは、増幅プロセス中に測定される。更に他の実施形態では、ｍｉＲＮＡのレベルは、測定前には増幅されない。サンプル中のｍｉＲＮＡのレベルを決定するために好適であるいくつかの例示的な方法が、以下に非常に詳細に記載される。これら方法は、例示として提供されるに過ぎず、他の好適な方法が同様に使用されてもよいことが当業者には明らかであろう。
Ａ．増幅に基づく方法
【００４８】
ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、及びローリングサークル増幅が挙げられるが、これらに限定されない、多くの増幅に基づく方法が、ｍｉＲＮＡ核酸のレベルを検出するために存在する。他の増幅に基づく技術としては、例えば、リガーゼ鎖反応、多重連結反応依存性プローブ増幅法、インビトロ転写（ＩＶＴ）、鎖置換増幅、転写仲介増幅、ＲＮＡ（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ）増幅、及び当業者に公知の他の方法が挙げられる。
【００４９】
典型的ＰＣＲ反応は、標的核酸種を選択的に増幅する複数のステップ、又はサイクルを含み、これらは標的核酸が変性される変性ステップ、ＰＣＲプライマーのセット（すなわち、順方向プライマー及び逆方向プライマー）が相補的ＤＮＡ鎖をアニーリングするアニーリングステップ、並びに熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを伸長させる伸長ステップである。これらステップを複数回繰り返すことにより、ＤＮＡ断片が増幅され、標的配列に一致するアンプリコンを生成する。典型的なＰＣＲ反応は、変性、アニーリング、及び伸長の２０以上のサイクルを含む。多くの場合、アニーリング及び伸長ステップは、同時に実行され、この場合、サイクルは２つのステップのみを含む。逆転写反応（これは、ｍｉＲＮＡに相補性を有するｃＤＮＡ配列を生じる）は、ＰＣＲ増幅の前に実行されてもよい。逆転写反応は、例えばＲＮＡベースのＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）及びプライマーの使用を含む。
【００５０】
ｍｉＲＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲのためのキットが既知であり、市販されている。好適なキットの例としては、限定されないが、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ｍｉＲＮＡ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びｍｉｒＶａｎａ（商標）  ｑＲＴ−ＰＣＲ  ｍｉＲＮＡ検出キット（Ａｍｂｉｏｎ）が挙げられる。ｍｉＲＮＡは、逆転写酵素の前のユニバーサルプライマー配列、ポリアデニル化配列、又はアダプター配列を含有する一本鎖オリゴヌクレオチドに連結され、ユニバーサルプライマー配列に相補的なプライマー、ポリ（Ｔ）プライマー、又はアダプター配列に相補的である配列を含むプライマーを使用して増幅され得る。
【００５１】
いくつかの例では、カスタムｑＲＴ−ＰＣＲアッセイは、ｍｉＲＮＡレベルの決定のために展開され得る。生物学的サンプル中、例えば体液中のｍｉＲＮＡを測定するためのカスタムｑＲＴ−ＰＣＲアッセイは、例えば、伸長された逆転写プライマー及びロックされた核酸に修飾されたＰＣＲを伴う方法を使用して展開され得る。カスタムｍｉＲＮＡアッセイは、標的配列に一致する化学的に合成されたｍｉＲＮＡの希釈系列でアッセイを行うことにより、試験され得る。これは、検出の限界及び各アッセイの定量の線形範囲の決定を可能にする。更に、標準曲線として用いられる場合、これらデータは生物学的サンプル中で測定されたｍｉＲＮＡの絶対存在量の推定を可能にする。
【００５２】
増幅曲線は、必要に応じてチェックされ、Ｃｔ値が各増幅プロットの線形範囲内で評価されていることを検証する。典型的には、線形範囲は数桁にわたる。アッセイされたそれぞれの候補ｍｉＲＮＡについて、ｍｉＲＮＡの化学的に合成された異形が得られ、希釈系列で解析され、アッセイの感度の限界、及び定量の線形範囲を決定する。相対的発現レベルが、例えば、Ｌｉｖａｋら著、「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄａｔａ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ２（−ΔΔＣ（Ｔ））  Ｍｅｔｈｏｄ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００１年）、Ｄｅｃ；２５（４）：４０２−８により記載される２（−ΔΔＣ（Ｔ））法に従って決定されてもよい。
【００５３】
一部の実施形態では、２つ以上のｍｉＲＮＡが、単一反応体積中で増幅される。例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲなどの多重式ｑ−ＰＣＲは、複数のプライマーの対及び／又は複数のプローブを使用することにより、１つの反応体積中の関心の少なくとも２つのｍｉＲＮＡの同時増幅及び定量化を可能にする。プライマー対は、各ｍｉＲＮＡに特異的に結合する少なくとも１つの増幅プライマーを含み、プローブは、これらが互いに識別可能であるように標識付けられることで、複数のｍｉＲＮＡの同時定量化を可能にする。
【００５４】
ローリングサークル増幅は、等温条件下、線形運動又は幾何学的運動のいずれかで循環したオリゴヌクレオチドプローブを複製することができるＤＮＡ−ポリメラーゼ誘起反応である（例えば、Ｌｉｚａｒｄｉら著、Ｎａｔ．Ｇｅｎ、（１９９８年）、１９（３）：２２５−２３２；Ｇｕｓｅｖら著、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、（２００１年）、１５９（１）：６３−６９；Ｎａｌｌｕｒら著、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、（２００１年）、２９（２３）：Ｅ１１８を参照）。一方がＤＮＡの（＋）鎖にハイブリダイズし、他方が（−）鎖にハイブリダイズする２つのプライマーの存在下では、鎖置換の複雑なパターンが９０分以下で各ＤＮＡ分子を、１０９個のコピーを超えて生成させる。閉環状ＤＮＡ分子のタンデムに連結したコピーは、単一のプライマーを使用して形成される場合がある。このプロセスはまた、マトリクス結合ＤＮＡを使用して実行され得る。ローリングサークル増幅に使用されるテンプレートは、逆転写され得る。この方法はまた、非常に低いｍｉＲＮＡ濃度におけるｍｉＲＮＡ配列及び発現レベルの高感度指標として使用され得る（例えば、Ｃｈｅｎｇら著、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、（２００９年）、４８（１８）：３２６８−７２；Ｎｅｕｂａｃｈｅｒら著、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．、（２００９年）、１０（８）：１２８９−９１を参照）。
Ｂ．ハイブリダイゼーションに基づく方法
【００５５】
ｍｉＲＮＡは、ハイブリダイゼーションアレイ（例えば、マイクロアレイ）、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ分析、ノーザンブロット分析、分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）シグナル増幅、及びインサイチューハイブリダイゼーションが挙げられるが、これらに限定されないハイブリダイゼーションに基づく方法を使用して検出されてもよい。
【００５６】
マイクロアレイは、多数のｍｉＲＮＡの発現レベルを同時に測定するために使用され得る。マイクロアレイは、スライドガラス上に鋭く尖ったピンでの印刷、予め作られたマスクを使用するフォトリソグラフィー、動的マイクロミラー装置を使用するフォトリソグラフィー、インクジェット印刷、又はマイクロ電極アレイ上の電気化学を含む様々な技術を使用して製造され得る。更に有用なものは、微小流体ＴａｑＭａｎ  Ｌｏｗ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ａｒｒａｙであり、これは、微小流体ｑＲＴ−ＰＣＲ反応のアレイ、並びに関連する微小流体ｑＲＴ−ＰＣＲに基づく方法に基礎を置く。
【００５７】
マイクロアレイ検出の一例では、ヒトセンスｍｉＲＮＡ配列に一致する多様なオリゴヌクレオチド（例えば、２００＋５’−アミノ−修飾−Ｃ６オリゴ）が、約２０μＭの最終濃度で、三次元のＣｏｄｅＬｉｎｋスライド（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ／Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にスポットされ、製造元の推薦に従って処理される。２０μｇのＴＲＩｚｏｌ精製された全ＲＮＡから合成された第１鎖ｃＤＮＡを、Ｅｎｚｏ  ＢｉｏＡｒｒａｙ末端標識化キット（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用して、ビオチニル化ｄｄＵＴＰで標識化する。ハイブリダイゼーション、染色、及び洗浄を、修正Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅゲノムアレイプロトコルに従って実行され得る。
【００５８】
Ａｘｏｎ  Ｂ−４０００スキャナ及びＧｅｎｅ−Ｐｉｘ  Ｐｒｏ  ４．０ソフトウェア又は他の好適なソフトウェアを使用して、画像をスキャンすることができる。バックグラウンド除去後の非陽性スポット、及びＥＣＤ手順により検出された外れ値が除去される。得られたシグナル強度値をチップ毎の中央値に正規化し、次いでこれを使用して、各ｍｉＲＮＡについての幾何平均及び標準誤差を得る。各ｍｉＲＮＡシグナルは、ログベース２に変換され得、１標本ｔ検定が実行され得る。各サンプルについての非依存的ハイブリダイゼーションが、複数回スポットされた各ｍｉＲＮＡを有するチップ上で実行され得、データのロバスト性を増加させる。
【００５９】
マイクロアレイは、疾患におけるｍｉＲＮＡの発現プロファイリングのために使用され得る。例えば、ＲＮＡは、サンプルから抽出されることができ、必要に応じてｍｉＲＮＡは、全ＲＮＡからサイズ選択される。オリゴヌクレオチドリンカーが、ｍｉＲＮＡの５’及び３’末端に結合されることができ、得られた連結産物が、ＲＴ−ＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用される。センス鎖ＰＣＲプライマーが、その５’末端に取り付けられた蛍光物質を有することができることによって、ＰＣＲ産物のセンス鎖を標識付けする。ＰＣＲ産物が変性され、次いでマイクロアレイにハイブリダイズされる。アレイ上の対応のｍｉＲＮＡ捕捉プローブ配列に相補的である標的核酸と呼ばれるＰＣＲ産物は、塩基対形成を介して、捕捉プローブ配列が固定されているスポットにハイブリダイズするであろう。その後、マイクロアレイレーザースキャナを使用して励起される場合、スポットは蛍光を発するであろう。
【００６０】
次いで、多数の陽性及び陰性対照並びにアレイデータ正規化法を使用して、各スポットの蛍光強度が、特定のｍｉＲＮＡのコピーの数に関して評価され、これが特定のｍｉＲＮＡの発現のレベルの評価を与える。
【００６１】
体液サンプルから抽出されたｍｉＲＮＡを含有する全ＲＮＡもまた、ｍｉＲＮＡのサイズ選択無しに直接的に使用されることができる。例えば、ＲＮＡは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ及び蛍光物質標識付け短鎖ＲＮＡリンカーを使用して、３’末端で標識付けされ得る。アレイ上の対応のｍｉＲＮＡ捕捉プローブ配列に相補的な蛍光物質で標識付けされたｍｉＲＮＡは、塩基対形成を介して、捕捉プローブが固定されたスポットにハイブリダイズする。次いで、多数の陽性及び陰性対照並びにアレイデータ正規化法を使用して、各スポットの蛍光強度が、特定のｍｉＲＮＡのコピーの数に関して評価され、これが特定のｍｉＲＮＡの発現のレベルの評価を与える。
【００６２】
いくつかのタイプのマイクロアレイが用いられることができ、これらは、限定されないが、スポットしたオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、組立式オリゴヌクレオチドマイクロアレイ又はスポットしたロング・オリゴヌクレオチドマイクロアレイが挙げられる。
【００６３】
ｍｉＲＮＡはまた、ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を使用して、増幅無しに検出され得る。この技術は、溶液中でハイブリダイズする２つの核酸系プローブ（例えば、レポータープローブ及び捕捉プローブ）を用いる。ハイブリダイゼーション後に、過剰のプローブが除去され、プローブ／標的複合体が、製造元のプロトコルに従って分析される。ｎＣｏｕｎｔｅｒ  ｍｉＲＮＡ分析キットは、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能であり、これは高い特異性で類似性が高いｍｉＲＮＡ間を識別することが可能である。
【００６４】
ｍｉＲＮＡはまた、分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）シグナル増幅を使用して検出されることもできる（例えば、Ｕｒｄｅａ著、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（１９９４年）、１２：９２６−９２８を参照）。ｂＤＮＡシグナル増幅に基づいたｍｉＲＮＡアッセイは、市販されている。１つのこのアッセイは、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）２．０  ｍｉＲＮＡ  Ａｓｓａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）である。
【００６５】
ノーザンブロット及びインサイチューハイブリダイゼーションもまた、ｍｉＲＮＡを検出するよう使用されてもよい。ノーザンブロット及びインサイチューハイブリダイゼーションを実行するための好適な方法は、当該技術分野において公知である。
Ｃ．配列決定に基づく方法
【００６６】
先進の配列決定法が、利用可能なものとして同様に使用され得る。例えば、ｍｉＲＮＡは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）  Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（例えば、ＨｉＳｅｑ、ＨｉＳｃａｎ、ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｚｅｒ、又はＭｉＳｅｑシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用するＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−Ｂｙ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ又はＴｒｕＳｅｑ法）を使用して検出され得る。ｍｉＲＮＡはまた、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｇｕｌｌｉｆｏｒｄ、ＣＴ）、又は半導体配列決定の他の好適な方法を使用して検出され得る。
Ｄ．追加のｍｉＲＮＡ検出ツール
【００６７】
質量分析法は、ＲＮａｓｅマッピングを使用して、ｍｉＲＮＡを定量化するよう使用されることができる。単離されたＲＮＡは、ＭＳによるその分析又はタンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）アプローチの前に、高い特異性を有するＲＮＡエンドヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅｓ）（例えば、ＲＮａｓｅ  Ｔ１で、これは全ての非修飾グアノシン残基の３’側で開裂する）で酵素的に分解されることができる。開発された最初のアプローチは、ＥＳＴ−ＭＳに直接結合する逆相ＨＰＬＣにより分解されるエンドヌクレアーゼのオンラインのクロマトグラフィー分離を利用した。転写後修飾の存在は、ＲＮＡ配列に基づいて予想されるものからの質量シフトにより明らかにされることができる。次いで、転写後修飾ヌクレオシドの配列配置を突き止めるために、異常質量／電荷値のイオンがタンデムＭＳ配列決定のために単離され得る。
【００６８】
マトリクス補助レーザー脱着／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＡ）もまた、転写後修飾ヌクレオシドについての情報を取得するための分析的アプローチとして使用されてきた。ＭＡＬＤＩに基づくアプローチは、分離ステップによるＥＳＩに基づくアプローチとは差別化され得る。ＭＡＬＤＩ−ＭＳでは、質量分析法は、ＭｉＲＮＡを分離するよう使用される。
【００６９】
限定された量の無傷のｍｉＲＮＡを分析するために、オーダーメードのナノスプレーイオン源、Ｎａｎｏｖｏｌｕｍｅ  Ｖａｌｖｅ（Ｖａｌｃｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、及びスプリットレスナノＨＰＬＣシステム（ＤｉＮａ，ＫＹＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を装備した、線形イオントラップ−円形トラップハイブリッド質量分析計（ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又はタンデム四重極飛行時間型質量分析計（ＱＳＴＡＲ（登録商標）  ＸＬ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用することにより、ナノＥＳＩ−ＭＳに結合した毛管ＬＣのシステムが用いられることができる。分析対象物／ＴＥＡＡがナノ−ＬＣトラップカラム上に充填され、脱塩され、その後濃縮される。無傷のｍｉＲＮＡがトラップカラムから溶出され、Ｃ１８毛管カラムに直接注入され、極性が増大する溶媒の勾配を使用してＲＰ−ＨＰＬＣによりクロマトグラフィーにかける。クロマトグラフィーの溶出物は、イオンが負の極性モードでスキャンされることを可能にするイオン化電圧を使用して、毛管カラムに取り付けられた噴霧器先端部から噴霧される。
【００７０】
ｍｉＲＮＡ検出及び測定の追加の方法としては、例えば、鎖侵入アッセイ（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）、ｃＤＮＡ、ＭＴＤＮＡ（メタリックＤＮＡ；Ａｄｖａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｓｋａｔｏｏｎ、ＳＫ）、及びＵＳ  Ｇｅｎｏｍｉｃにより開発されたものなどの単一分子法が挙げられる。表面酵素反応をナノ粒子増幅されたＳＰＲ画像撮影法（ＳＰＲＩ）と組み合わせる新規なアプローチを使用して、マイクロアレイフォーマットにおいて多数のｍｉＲＮＡが検出されることが可能である。ポリ（Ａ）ポリメラーゼの表面反応は、ロックされた核酸（ＬＮＡ）のマイクロアレイ上でハイブリダイズされたｍｉＲＮＡ上にポリ（Ａ）テールを生成する。次いでＤＮＡ修飾ナノ粒子が、ポリ（Ａ）テールに吸着され、ＳＰＲＩで検出される。この超高感度ナノ粒子で増幅されたＳＰＲＩ方法は、アトモルレベルにおけるｍｉＲＮＡプロファイリングに使用され得る。
Ｅ．増幅又は非増幅のｍｉＲＮＡの検出
【００７１】
特定の実施形態では、標識、染料、又は標識付けプローブ及び／又はプライマーを使用して、増幅又は非増幅のｍｉＲＮＡを検出する。当業者であれば、検出法の感度及び標的の存在量に基づいていずれの検出法が適切であるかを認識するであろう。検出法の感度及び標的の存在量に応じて、検出前に増幅が必要であることも必要でないこともある。当業者であれば、ｍｉＲＮＡ増幅が好ましい場合の検出法を認識されるであろう。
【００７２】
プローブ又はプライマーは、標準（Ａ、Ｔ又はＵ、Ｇ及びＣ）塩基、又は修飾塩基を含んでもよい。修飾塩基としては、限定されないが、ＡＥＧＩＳ塩基（Ｅｒａｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられ、これは、例えば米国特許第５，４３２，２７２号、同第５，９６５，３６４号、及び同第６，００１，９８３号で記載された。ある態様では、塩基は、天然型ホスホジエステル結合又は異なる化学結合により結合される。異なる化学結合としては、限定されないが、ペプチド結合又はロックされた核酸（ＬＮＡ）結合が挙げられ、これは、例えば米国特許第７，０６０，８０９号で記載されている。
【００７３】
他の態様では、増幅反応中に存在するオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーは、時間の関数として、生成される増幅産物の量のモニタリングに適する。ある態様では、異なる一本鎖対二本鎖特性を有するプローブが、核酸を検出するよう使用される。プローブとしては、５’−エキソヌクレアーゼアッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎ（商標））プローブ（米国特許第５，５３８，８４８号を参照）、ステム−ループ分子ビーコン（例えば、米国特許第６，１０３，４７６号及び同第５，９２５，５１７号を参照）、ステムレス又は線形ビーコン（例えば、国際公開第９９２１８８１号、米国特許第６，４８５，９０１号及び同第６，６４９，３４９号を参照）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子ビーコン（例えば、米国特許第６，３５５，４２１号及び同第６，５９３，０９１号を参照）、線形ＰＮＡビーコン（例えば、米国特許第６，３２９，１４４号を参照）、非ＦＲＥＴプローブ（例えば、米国特許第６，１５０，０９７号）、Ｓｕｎｒｉｓｅ（商標）／ＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒＢ（商標）プローブ（例えば、米国特許第６，５４８，２５０号を参照）、ステム−ループ及びデュプレックスＳｃｏｒｐｉｏｎ（商標）プローブ（例えば、米国特許第６，５８９，７４３号を参照）、バルジループプローブ（例えば、米国特許第６，５９０，０９１号を参照）、プソイド・ノット・プローブ（例えば、米国特許第６，５４８，２５０号を参照）、サイクリコン（米国特許第６，３８３，７５２号を参照）、ＭＧＢ  Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）プローブ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヘアピンプローブ（米国特許第６，５９６，４９０号）、ＰＮＡライトアッププローブ、アンチプライマークエンチプローブ（Ｌｉら著、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５３：６２４−６３３（２００６））、自己集合ナノ粒子プローブ、並びに例えば米国特許第６，４８５，９０１号に記載されるフェロセン修飾プローブが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
特定の実施形態では、増幅反応中のプライマーの１つ以上は、標識を含むことができる。更に他の実施形態では、異なるプローブ又はプライマーは、互いに識別可能である検出可能な標識を含む。一部の実施形態では、プローブ又はプライマーなどの核酸は、２つ以上の識別可能な標識で標識付けされてもよい。
【００７５】
一部の態様では、標識は、１つ以上のプローブに付着され、（ｉ）検出可能なシグナルを提供すること；（ｉｉ）第２の標識と相互作用し、第２の標識により提供される検出可能なシグナルを変更すること、例えばＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）；（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーションを安定化すること、例えば二本鎖形成；並びに（ｉｖ）結合複合体のメンバー又は親和性セット、例えば親和性、抗体−抗原、イオン結合型錯体、ハプテンリガンド（例えば、ビオチン−アビジン）を提供すること、の１つ以上を有する。更に他の態様では、標識の使用は、既知の標識、結合、結合基、試薬、反応条件、並びに分析及び精製法を用いる多数の既知の技術のいずれか１つを使用して達成されることができる。
【００７６】
ｍｉＲＮＡは、直接又は間接法により検出され得る。直接検出法においては、１つ以上のｍｉＲＮＡは、核酸分子に結合する検出可能な標識により検出される。かかる方法では、ｍｉＲＮＡは、プローブへの結合の前に標識付けされてもよい。したがって、結合は、プローブに結合される標識付ｍｉＲＮＡについてのスクリーニングにより検出される。プローブは、必要に応じて、反応体積内のビーズに結合する。
【００７７】
特定の実施形態では、核酸は標識付プローブとの直接結合により検出され、その後プローブが検出される。本発明の一実施形態では、増幅ｍｉＲＮＡなどの核酸は、所望の核酸を捕捉するためのプローブと抱合されたＦｌｅｘＭＡＰ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用して検出される。いくつかの方法は、例えば、蛍光標識で修飾されたポリヌクレオチドプローブ又は分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）検出での検出を伴ってもよい。
【００７８】
他の実施形態では、核酸は、間接検出法により検出される。例えば、ビオチニル化プローブがストレプトアビジンコンジュゲート化染料と組み合わされ、結合した核酸を検出してもよい。ストレプトアビジン分子は、増幅ｍｉＲＮＡ上のビオチン標識に結合し、結合したｍｉＲＮＡがストレプトアビジン分子に付着した染料分子を検出することにより検出される。一実施形態では、ストレプトアビジンコンジュゲート化染料分子は、Ｐｈｙｃｏｌｉｎｋ（登録商標）ストレプトアビジンＲ−フィコエリスリン（ＰＲＯｚｙｍｅ）を含む。他のコンジュゲート化染料分子は、当業者に公知である。
【００７９】
標識としては、検出可能な蛍光、化学発光信号、又は生物発光信号を発生し又は消光する発光化合物、光散乱化合物、及び光吸収化合物が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．著、「Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、（１９９２年）及びＧａｒｍａｎ  Ａ．著、「Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｒｉｎｇ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、（１９９７年）を参照）。レポーター蛍光物質とクエンチャー蛍光物質とを含む二重標識付蛍光ラベルが、一部の実施形態において使用される。蛍光物質の対は、これらが容易に識別され得るように異なる発光スペクトルを有するように選択されることが理解されるであろう。
【００８０】
特定の実施形態では、標識は、二本鎖のハイブリダイゼーションを増強し、安定化させ、又はこれに影響を及ぼすハイブリダイゼーション安定化部分、例えば、挿入剤又は挿入染料（限定されないが、臭化エチジウム及びＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎが挙げられる）、小溝結合剤、及び架橋官能基である（例えば、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎら編集、「“ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、（１９９６年）を参照）。
【００８１】
他の実施形態では、ｍｉＲＮＡＳを定量化するためにハイブリダイゼーション及び／又は連結反応に基づく方法が使用される場合があり、これらはオリゴヌクレオチド連結反応（ＯＬＡ）法及び標的核酸にハイブリダイズし、識別可能なプローブが未結合のプローブから分離されることを可能にする方法が挙げられる。例としては、米国特許公開第２００６／００７８８９４号で開示されるＨＡＲＰ様プローブが使用され、ｍｉＲＮＡの量を測定することができる。かかる方法では、プローブと標的化核酸との間のハイブリダイゼーションの後に、プローブは、ハイブリダイズされたプローブをハイブリダイズされないプローブから識別するよう修飾される。その後、プローブが増幅及び／又は検出されることができる。一般的に、プローブ不活性化領域は、プローブの標的ハイブリダイゼーション領域内のヌクレオチドのサブセットを含む。その標的核酸にハイブリダイズしないＨＡＲＰプローブの増幅又は検出を低減し又は防止するために、すなわち、標的核酸の検出を可能にするために、ハイブリダイゼーション後のプローブ不活性化ステップが、その標的化核酸配列にハイブリダイズされないＨＡＲＰプローブと対応のハイブリダイズされないＨＡＰＲプローブ間で識別することができる薬剤を使用して実行される。この薬剤は、ハイブリダイズされないＨＡＲＰプローブが増幅されることができないように、これを不活性化又は修飾することができる。
【００８２】
プローブ連結反応を使用して、ｍｉＲＮＡを定量化することもできる。多重連結反応依存性プローブ増幅法（ＭＬＰＡ）技術（Ｓｃｈｏｕｔｅｎら著、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３０：ｅ５７、（２００２年））では、標的核酸上で互いに隣接して直ちにハイブリダイズするプローブの対は、標的核酸の存在により誘起されて、互いに連結される。一部の態様では、ＭＬＰＡプローブは、近接するＰＣＲプライマー結合部位を有する。ＭＬＰＡプローブは、連結される場合、特異的に増幅され、したがって、ｍｉＲＮＡバイオマーカーの検出及び増幅を可能にする。
６．ｍｉＲＮＡバイオマーカーを使用するアルツハイマー病状態の検出
【００８３】
本明細書に記載のｍｉＲＮＡバイオマーカーは、診断試験で個々に又は組み合わされて使用され、対象のアルツハイマー病状態を評価することができる。疾患状態とは、アルツハイマー病の存在又は不在を含む。疾患状態はまた、アルツハイマー病の経過のモニタリング、例えば、疾患進行のモニタリングを含むこともある。対象のアルツハイマー病状態に基づいて、例えば、追加診断試験又は治療的処置を含む追加処置が指示され得る。
【００８４】
疾患状態を正確に予測するための診断試験の力は、一般的に、アッセイの精度、アッセイの感度、アッセイの特異性、又は「曲線下面積」（ＡＵＣ）、例えば受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）下面積に関して測定される。本明細書で使用する場合、精度とは、誤分離されたサンプルのフラクションの尺度である。精度は、サンプルの総数（例えば試験集団における）で割った正確に分類されたサンプルの総数として計算され得る。感度は、試験で陽性であると予測される「真陽性」の尺度であり、アルツハイマー病サンプルの総数で割った正確に特定されたアルツハイマー病サンプルの数として計算され得る。特異性は、試験で陰性と予測される「真陰性」の尺度であり、正常サンプルの総数で割った正確に特定された正常サンプルの数として計算され得る。ＡＵＣは、感度対偽陽性率（１−特異性）のプロットである、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）下面積の尺度である。ＡＵＣがより大きいほど、試験の予測値はより強力である。試験の有用性の他の役に立つ尺度としては、陽性として試験する実際の陽性のパーセンテージである「陽性予測値」、及び陰性として試験する実際の陰性のパーセンテージである「陰性予測値」が挙げられる。好ましい実施形態では、異なるアルツハイマー病状態を有する対象から得た１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルは、適切な対照に対して判定される、正常な対象に対して、少なくともｐ≦０．０５、例えば、ｐ≦０．０５、ｐ≦０．０１、ｐ≦０．００５、ｐ≦０．００１等の統計的に有意な差を示す。他の好ましい実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲＮＡバイオマーカーを個別に又は組み合わせて使用する診断試験は、少なくとも約７５％の精度、例えば、少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％又は約１００％の精度を示す。他の実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲＮＡバイオマーカーを個別に又は組み合わせて使用する診断試験は、少なくとも約７５％の特異性、例えば、少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％又は約１００％の特異性を示す。他の実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲＮＡバイオマーカーを個別に又は組み合わせて使用する診断試験は、それぞれ少なくとも約７５％の特異性及び感度、例えば、少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％又は約１００％の特異性及び感度を示す。他の実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲＮＡバイオマーカーを個々に又は組み合わせて使用する診断試験は、それぞれ少なくとも約７５％の特異性及び感度、例えば少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％又は約１００％の特異性及び感度（例えば、少なくとも約８０％の特異性及び少なくとも約８０％の感度、若しくは例えば、少なくとも約８０％の特異性及び少なくとも約９５％の感度）を示す。
【００８５】
表２に列挙したそれぞれのバイオマーカーは、正常な対象と比較して、アルツハイマー病を有する対象から得た生物学的サンプル中で示差的に存在し、故に、それぞれは、試験対象におけるアルツハイマー病の判定を容易にする上で個々に有用である。かかる方法は、対象から得たサンプル中のバイオマーカーのレベルを決定することを伴う。サンプル中のバイオマーカーのレベルの決定は、任意の適切な方法、例えば、本明細書に記載される方法を使用して、サンプル中のバイオマーカーのレベルを測定し、検出し、又は検定することを含むことができる。サンプル中のバイオマーカーのレベルの決定はまた、サンプル中のバイオマーカーのレベルを測定し、検出し、又は検定したアッセイの結果を検討することも含む。方法はまた、サンプル中のバイオマーカーのレベルを好適な対照と比較することを伴う。好適な対照を使用して評価された、正常対象におけるものに対するバイオマーカーのレベルでの変化は、対象のアルツハイマー病状態を示す。対象が特定のアルツハイマー病状態を有するとして分類されるものより高い又は低いバイオマーカーの量を表すバイオマーカーの診断量が使用され得る。例えば、バイオマーカーが、正常個体に比較してアルツハイマー病を有する個体に由来のサンプル中でダウンレギュレートされる場合、診断カットオフ値より低い測定量は、アルツハイマー病の診断を提供する。一般的に、表２中の個々のｍｉＲＮＡバイオマーカーは、正常個体から採取されたサンプルに対してアルツハイマー病サンプル中でダウンレギュレートされる。当該技術分野において十分に理解されているように、アッセイにおいて使用される特定の診断カットオフ値を調整することは、必要に応じて診断アッセイの感度及び／又は特異性を調整することを可能にする。特定の診断カットオフ値は、異なるアルツハイマー病状態を有する対象からの統計的に有意な数のサンプルにおいてバイオマーカーの量を測定し、所望のレベルの精度、感度、及び／又は特異性でカットオフ値を引くことによって、決定されることができる。特定の実施形態では、診断カットオフ値は、本明細書に記載される分類アルゴリズムの補助で決定され得る。
【００８６】
したがって、方法は、対象からの循環ｍｉＲＮＡを含有するサンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを決定することにより、対象においてアルツハイマー病を診断するために提供され、好適な対照に対して決定される、正常な対象に対する少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルの差は、対象におけるアルツハイマー病を示す。少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、Ｌｅｔ−７ｇ、及びＬｅｔ−７ｄの１つ以上を含むことが好ましく、必要に応じて、ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−５４５、若しくはｍｉＲ−３０１ａ及びｍｉＲ−５４５を含む。例えば、本発明は、対象から得た循環ｍｉＲＮＡを含有するサンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルを決定する方法を提供し、対照に対する少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルの減少は、対象におけるアルツハイマー病を示す。
【００８７】
必要に応じて、方法は、サンプル中の１つ以上のｍｉＲＮＡのレベルに基づいて、対象がアルツハイマー病の有無の診断を提供することを更に含んでもよい。これに加えて又は代わりに、方法は、適切な対照に対して少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベル又はレベル（複数）における差を、対象におけるアルツハイマー病の診断と相関させることを更に含んでもよい。一部の実施形態では、かかる診断は、対象に直接的に提供されても、又はこれが対象のケアに関与する別の当事者に提供されてもよい。
【００８８】
本明細書に示すように、個々のｍｉＲＮＡバイオマーカーは、アルツハイマー病のための診断的用途で有用であるが、ｍｉＲＮＡバイオマーカーの組み合わせは、単独で使用される場合のｍｉＲＮＡバイオマーカーよりもアルツハイマー病状態のより大きな予測値を提供する場合がある。具体的に言うと、複数のｍｉＲＮＡバイオマーカーの検出は、診断試験の精度、感度、及び／又は特異性を増加させることができる。例示的なｍｉＲＮＡバイオマーカー及びバイオマーカー組み合わせを表８Ａ〜８Ｃに示す。７５％の全体的精度を示すｍｉＲＮＡバイオマーカー及びバイオマーカー組み合わせを表９Ａ〜９Ｂに示す。本発明は、これら表に記載される個々のバイオマーカー及びバイオマーカー組み合わせ、並びに本明細書に記載の方法及びキットでのこれらの使用を含む。
【００８９】
したがって、方法は、対象からの循環ｍｉＲＮＡを含有するサンプル中の２つ以上のｍｉＲＮＡのレベルを決定することによる、対象においてアルツハイマー病を診断するために提供され、適切な対照に対して決定される、正常な対象に対するｍｉＲＮＡのレベルの差は、対象におけるアルツハイマー病を示す。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、Ｌｅｔ−７ｇ、及びＬｅｔ−７ｄの１つ以上を含むことが好ましく、必要に応じて、ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−５４５、若しくはｍｉＲ−３０１ａ及びｍｉＲ−５４５を含む。２つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーの例示的な組み合わせとしては、例えば、ｍｉＲ−５４５、ｌｅｔ７ｇ、及びｍｉＲ−１５ｂ；ｍｉＲ−１５ｂ及びｍｉＲ−５４５；ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−５４５、ｌｅｔ−７ｇ及びｍｉＲ−１５ｂ；ｍｉＲ−１９１及びｍｉＲ−１５ｂ；Ｌｅｔ−７ｇ及びｍｉＲ−１５ｂ；ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０１ａ、及びｍｉＲ−５４５；ｍｉＲ−３０１ａ、ｌｅｔ−７ｇ、及びｍｉＲ−１５ｂ；並びにｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−５４５、及びｍｉＲ−１５ｂが挙げられる。
【００９０】
更に、対象からの循環ｍｉＲＮＡを含有するサンプル中の２つ以上のｍｉＲＮＡのレベルを決定し、２つ以上のｍｉＲＮＡのレベルを、正常な対象及びアルツハイマー病を有する対象において存在する同一のｍｉＲＮＡのレベルを表すデータのセットに比較し、この比較に基づいてアルツハイマー病を有する又は有さないとして対象を診断することによって、対象でアルツハイマーを診断する方法も提供される。かかる方法では、データのセットは、対象からのサンプルとの比較のために適切な対照又は参照基準として役立つ。対象からのサンプルのデータのセットとの比較は、分類アルゴリズムによって補助され、分類アルゴリズムは、サンプル中の２つ以上のｍｉＲＮＡの集合レベルと、正常な対象又はアルツハイマー病を有する対象において存在する同一のｍｉＲＮＡのレベルとの間で統計的に有意な差が存在するか否かを計算する。
７．アルツハイマー病状態を定量化するための分類アルゴリズムの生成
【００９１】
一部の実施形態では、「既知サンプル」などのサンプルを使用して生成されるデータは、分類モデルを「学習する」するよう今度は使用することができる。「既知サンプル」とは、事前分類されたサンプル、例えば、正常な対象に由来する、又はアルツハイマー病を有する対象に由来するとして分類されたサンプルである。この範囲に由来のデータ及び分類モデルを形成するために使用されるデータは、「トレーニングデータセット」とも呼ばれることができる。一旦学習されると、分離モデルは、未知サンプルを使用して発生した範囲に由来のデータにおけるパターンを認識することができる。次いで分類モデルを使用して、未知サンプルをクラスに分類することができる。これは、例えば、特定の生物学的サンプルがある生物学的状態に関連するかどうかを（病的対非病的）予測する上で有用であり得る。
【００９２】
一部の実施形態では、分類モデルを形成するよう使用されるトレーニングデータセットのためのデータは、定量的ＰＣＲから（例えば、ΔΔＣｔ法を使用して得られるＣｔ値）、又はマイクロアレイ分析（例えば、ｍｉＲＮＡ発現アッセイ、例えばｎＣｏｕｎｔｅｒ  ｍｉＲＮＡ発現アッセイからの総カウント又は正規化カウント）などの高スループット発現プロファイリングから直接的に取得され得る。
【００９３】
分類モデルは、データ中に存在する客観的パラメータに基づいて、データの量をクラスに分離しようとする任意の好適な統計的分類（又は学習）法を使用して形成されることができる。分類法は、教師付き分類又は教師無し分類のいずれであってもよい。教師付き分類法及び教師無し分類処理の例は、Ｊａｉｎ著、「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」、ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ，第２２巻  １番、２０００年１月に記載され、この教示は参照により組み込まれる。
【００９４】
教師付分類では、既知のカテゴリーの例を含有するトレーニングデータは、学習機構に提示され、学習機構は、既知のクラスのそれぞれを確定する関係性の１つ以上のセットを学習する。次いで新しいデータが学習機構に適用され、これが更に、学習された関係性を使用して、新しいデータを分類する。教師付分類プロセスの例としては、線形回帰処理（例えば、多重線形回帰（ＭＬＲ）、部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰及び主成分回帰（ＰＣＲ））、二進決定ツリー（例えば、ＣＡＲＴ−分類及び回帰ツリーなどの再帰的分離処理）、誤差逆伝播網などの人工神経回路網、判別解析（例えば、ベイズ分類器又はフィッシャー解析）、ロジスティック分類器、及び支援ベクトル分類器（支援ベクトルマシン）が挙げられる。
【００９５】
他の実施形態では、作成される分類モデルは、教師無し学習法を使用して形成され得る。教師無し分類は、トレーニングデータセットがそこから誘導された範囲を事前分類することなく、トレーニングデータセットにおける類似性に基づいて、分類を学習しようとする。教師無し学習法は、クラスター解析を含む。クラスター解析は、互いに非常に類似するメンバーと、他のクラスターと非常に異なるメンバーを理想的には有するべきである「クラスター」又はグループに分けようとする。次いで、データ項目間の距離を測定する若干の距離測定基準を使用して、類似性が測定され、これがより近いデータ項目を一緒にクラスター化する。クラスター化技術としては、マッキーンのＫ平均アルゴリズム及びコホーネンの自己組織化マップアルゴリズムが挙げられる。
【００９６】
生物学的情報を分類する際の使用が記載されている学習アルゴリズムは、例えば、国際特許公開第０１／３１５８０号（Ｂａｒｎｈｉｌｌら著、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｕｓｅ  ｔｈｅｒｅｏｆ」）、米国特許公開第２００２  ０１９３９５０  Ａ１号（Ｇａｖｉｎら著、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｒ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒａ」）、米国特許出願第２００３  ０００４４０２  Ａ１号（Ｈｉｔｔら著、「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔａｔｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｈｉｄｄｅｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｆｒｏｍ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄａｔａ」）、及び米国特許出願第２００３  ００５５６１２５  Ａ１号（Ｚｈａｎｇ及びＺｈａｎｇ著、「Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄａｔａ」）で記載されている。前述の特許出願の内容は、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９７】
分類モデルは、任意の好適なディジタルコンピュータ上で形成されかつ使用され得る。好適なディジタルコンピュータとしては、Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＴＭ又はＬｉｎｕｘ（登録商標）ＴＭベースのオペレーティングシステムなどの任意の標準的又は特殊なオペレーティングシステムを使用するマイクロ、小型、又は大型コンピュータが挙げられる。
【００９８】
トレーニングデータセット（複数可）及び分類モデルは、ディジタルコンピュータにより実行され又は使用されるコンピュータコードによって表されることができる。コンピュータコードは、光ディスク又は磁気ディスク、スティック、テープ等を含む任意の好適なコンピュータ読み取り可能なメディア上に記憶されることができ、Ｃ、Ｃ＋＋、ｖｉｓｕａｌ  ｂａｓｉｃ等の任意の好適なコンピュータプログラミング言語で記述することができる。
【００９９】
上述された学習アルゴリズムは、アルツハイマー病についてのｍｉＲＮＡバイオマーカーのための分類アルゴリズムを展開するために使用され得る。分類アルゴリズムは、今度は、単独で又は組み合わされて使用されるバイオマーカーについての診断値（例えば、カットオフ点）を提供することにより、診断試験で使用され得る。
８．追加診断試験
【０１００】
アルツハイマー病を示すｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルは、対象におけるアルツハイマー病の単独型診断的指標として使用されてもよい。必要に応じて、本方法は、アルツハイマー病の診断を容易にする少なくとも１つの追加試験の実施を含んでもよい。例えば、アルツハイマー病の診断を容易にするために、１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルを決定することに加えて、他の試験が実行されてもよい。アルツハイマー病の診断を容易にするために臨床現場で使用される任意の他の試験又は試験の組み合わせが、本明細書に記載のｍｉＲＮＡバイオマーカーと併せて使用されることができる。
【０１０１】
例えば、臨床医は、対象から得たサンプル中の１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルを決定することに加えて、精神状態試験を実行することができる。かかる試験としては、簡易精神状態検査（ＭＭＳＥ）、ｍｉｎｉ−ｃｏｇ試験、ＡＤＡＳ−ｃｏｇ試験、及び／又は時計描画試験を挙げることができるが、これらに限定されない。これら試験は、アルツハイマー病の診断を容易にするために、臨床現場では日常的に使用されている。
【０１０２】
同様に、例えば、ＭＲＩ又はＣＴスキャンなどの脳画像撮影試験が実施されてもよい。これら試験は、主として、脳内の腫瘍、脳卒中、液体などアルツハイマー病に類似した症状を引き起こす場合がある他の状態を除外するために実行される。
【０１０３】
神経学的検査が対象において実行される場合もあり、対象の反射、協調運動、筋力、眼球運動、言語行動、及び／又は感覚などの状態が試験される。
【０１０４】
対象はまた、アルツハイマー病を発症する高いリスクを有する可能性がある対象を示す遺伝因子についてスクリーニングされる場合もある。対象は、同様に、アルツハイマー病を示す少なくとも１つの他のバイオマーカーの存在、不在、又はレベルについてスクリーニングされてもよい。
９．治療方法
【０１０５】
対象が本明細書に記載の方法によりアルツハイマー病と診断される場合の一部の実施形態では、本発明は、アルツハイマー病を有すると特定されたかかる対象を治療する方法を更に提供する。したがって、一実施形態では、本発明は、対象においてアルツハイマー病を治療する方法に関し、方法は、対象から得た１つ以上のｍｉＲＮＡレベルを決定することであって、好適な対照に対して決定される、正常な対象に対する少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルの差が対象におけるアルツハイマー病を示すことと、対象にアルツハイマー病治療薬の治療的有効量を投与することとを含む。別の実施形態では、本発明は、アルツハイマー病を有する対象を治療する方法に関し、方法は、対象から得たサンプル中の１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルが、好適な対照に対して決定される、正常な対象のものと異なる（例えば減少する）対象において、対象がアルツハイマー病を有することを特定することと、対象にアルツハイマー病治療薬の治療的有効量を投与することとを含む。
【０１０６】
用語「アルツハイマー病治療薬」とは、例えば、アルツハイマー病の治療に、米国食品及び医薬品局により承認された物質を含む。かかる物質は、例えば、Ｒａｚａｄｙｎｅ（登録商標）（ガランタミン）、Ｅｘｅｌｏｎ（登録商標）（リバスチグミン）、又はＡｒｉｃｅｐｔ（登録商標）（ドネペジル）であり得る。例示的な実施形態では、アルツハイマー病治療薬は、ドネペジル若しくはその薬学的に許容可能な塩又はエステル（例えば、ドネペジル塩酸塩）である。
【０１０７】
アルツハイマー病治療薬は、医薬組成物を使用して対象に投与され得る。好適な医薬組成物は、ガランタミン、リバスチグミン、ドネペジル若しくは前述のいずれかの薬学的に許容可能な塩又はエステル（例えば、ガランタミン臭化水素酸塩、リバスチグミン酒石酸塩、ドネペジル塩酸塩）を含む医薬組成物などの、アルツハイマー病治療薬（若しくはその薬学的に許容可能な塩又はエステル）、及び必要に応じて薬学的に許容可能な担体を含む。特定の実施形態では、これら組成物は、必要に応じて、１つ以上の追加治療薬を更に含む。
【０１０８】
本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容可能な塩」とは、妥当な医学的範囲内で、過度の毒性、刺激性又はアレルギー反応性等がなく、ヒト及び下等動物の組織と接触する使用に好適であり、妥当な利益／リスク比率に見合う塩を指す。アミン、カルボン酸、及び他のタイプの化合物の薬学的に許容可能な塩は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、６６：１−１９、（１９７７年）（参照により本明細書に組み込む）で、薬学的に許容可能な塩を詳細に記載している。塩は、本発明の化合物の最終的単離及び精製の間にインサイチューで調製され得るか、又は遊離塩基又は遊離酸官能基を適切な試薬と反応させることにより、別個に調製され得る。例えば、遊離塩基官能基は、適切な酸と反応され得る。更には、化合物が酸性部分を運ぶ場合には、好適なその薬学的に許容可能な塩としては、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウム又はカリウム塩などの金属塩、及びアルカリ土類金属塩、例えばカルシウム又はマグネシウム塩が挙げられる。
【０１０９】
本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容可能なエステル」とは、インビボで加水分解し、ヒト体内で容易に分解し、親化合物又はその塩を容易に放出するエステルを指す。好適なエステル基としては、例えば、薬学的に許容可能な脂肪族カルボン酸、特に、各アルキル及びアルケニル部分が好都合に６個以下の炭素原子を有する、アルカン酸、アルケン酸、シクロアルカン酸及びアルカンジオン酸から誘導されたものが挙げられる。
【０１１０】
上述のように、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体を更に含んでもよい。用語担体とは、所望の特定の投与形態を調製するために適した、いかなる及び全ての溶媒、希釈剤、又は他の液体ビヒクル、分散助剤又は懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、防腐剤、固体結合剤、滑沢剤等が挙げられる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８０年）は、医薬組成物の調剤で使用される様々な担体及びこれらの調製のための既知の技術を開示する。薬学的に許容可能な担体として役立つことができる材料のいくつかの例としては、限定されないが、乳糖、グルコース及びショ糖などの糖、コーンスターチ、馬鈴薯デンプンなどのデンプン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体、トラガカント末、麦芽、ゼラチン、タルク、ココアバター及び坐剤用ワックスなどの賦形剤、ピーナッツオイル、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油などの油、ポリエチレングリコールなどのグリコール、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル、寒天、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、アルギニン酸、発熱性物質フリー水、等張生理食塩水、リンガー溶液、エチルアルコール、及びリン酸塩緩衝溶液が挙げられ、並びにラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなどの他の非毒性の適合性滑沢剤、並びに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、風味剤及び芳香剤、防腐剤及び抗酸化剤もまた、配合者の判断に従って、組成物中に存在することができる。
【０１１１】
本発明での使用のための組成物は、所望のアルツハイマー病治療薬の任意の濃度を有するよう調剤されてもよい。好ましい実施形態では、組成物は、これがアルツハイマー病治療薬の治療的有効量を含むように調剤される。
１０．ｍｉＲＮＡバイオマーカーを検出するためのキット
【０１１２】
別の態様では、本発明は、対象においてアルツハイマー病状態を診断するためのキットを提供し、このキットは、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１６ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ａ、及びｍｉＲ−５４５、並びにこれらの組み合わせの１つ以上のレベルを決定するために有用である。一実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１４２−３ｐからなる群から選択される。キットは、対象から得たサンプル中でアルツハイマー病の診断に役立つｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡのグループの存在を選択的に検出するよう適合された材料及び試薬を含んでもよい。例えば、一実施形態では、キットは、ｍｉＲＮＡに特異的にハイブリダイズする試薬を含むことができる。かかる試薬は、例えばプローブ又はプライマーである、ｍｉＲＮＡの検出に好適な形態の核酸分子であることができる。キットは、例えば、ｑＰＣＲ反応において１つ以上のｍｉＲＮＡを検出するよう使用され得る試薬である、１つ以上のｍｉＲＮＡを検出するためのアッセイの実行に有用な試薬を含むことができる。キットは、同様に、１つ以上のｍｉＲＮＡの検出に有用なマイクロアレイを含んでもよい。
【０１１３】
他の実施形態では、キットは、ラベル又は製品添付文書の形態で、適切な操作パラメータのための使用説明書を封入することができる。例えば、使用説明書は、サンプルを収集する方法、サンプル中の１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルを決定する方法、サンプル中の１つ以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルを対象のアルツハイマー病状態に相関させる方法に関する情報又は注意表示を含むことができる。
【０１１４】
別の実施形態では、キットは、参照標準、適切な対照として使用される、又は試験サンプル中のｍｉＲＮＡバイオマーカーを検出するためのアッセイの校正のために使用されるｍｉＲＮＡバイオマーカーサンプルを備えた１つ以上の容器を収容することができる。
【０１１５】
本発明は、以下の実施例により更に例示され、実施例は、限定するものと解釈されるべきではない。本明細書を通して引用された全ての参考文献、特許及び公開された特許出願は、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１１６】
実施例１：候補ｍｉＲＮＡバイオマーカーの特定及び妥当性確認
本試験の目的は、ヒト血液の血漿分画からｍｉＲＮＡプロファイルを生成し、アルツハイマー病（ＡＤ）と診断された患者と正常対照（ＮＣ）との間でｍｉＲＮＡ含量及び発現レベルで有意な差があるかどうかを判定するためのものである。
【０１１７】
ヒト血漿サンプルをＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｌａｎｏ  Ｂｅａｃｈ、Ｃａ−ＵＳＡ）から購入した。コホート１は、１１人のＡＤ患者、９人の軽度認知障害（ＭＣＩ）患者、及び２０人のＮＣ患者からのサンプルを含有した。コホート１中の患者についての年齢、性別、診断、及び簡易精神状態検査（ＭＭＳＥ）スコアを表１に提供している。全ＲＮＡを血漿サンプル（１ｍＬ）から抽出し、以下に記載されるように、抽出効率及び正規化のために、ｓｐｉｋｅ−ｉｎ合成ｍｉＲＮＡ（Ａｔｈ−１５９ａ及びＮｅｇ−Ａ）を対照に加えた。
【０１１８】
次いで各サンプルを、以下に記載のように、ｎＣｏｕｎｔｅｒ  ｍｉＲＮＡ発現アッセイ（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ−ＵＳＡ）を三通りで使用する高スループット発現プロファイリングに使用した。正規化及びバックグラウンド補正の後に、最終線形カウントを、ＡＤ／ＭＣＩ及びＮＣサンプルの双方について平均化し、倍率変化値を決定した。候補ｍｉＲＮＡは、ＡＤ／ＭＣＩ及びＮＣサンプル中の平均発現値の間の少なくとも１．５倍の差を有するもの、並びに平均正規化カウントが＞２００を有するものを選択した。ｍｉＲＮＡ  １０６ａ（Ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ）を、全てのＡＤ／ＭＣＩ及びＮＣサンプルにわたって最小の変化を示した潜在的内因性対照として特定した。
【０１１９】
１００を超える平均発現カウントを少なくとも有する（バックグラウンドに対して有意に発現されていると考えられる）特定された２２７個のｍｉＲＮＡが存在した。２２７個のｍｉＲＮＡの中で、少なくとも１．５倍の差を有し、かつ＞２００の正規化線形カウントの平均値を有する１３個のｍｉＲＮＡを特定した（図１Ａ及び１Ｂ）。これらは、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−６００、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７４ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９７５を含んだ。
【０１２０】
次いで、高スループットＮａｎｏｓｔｒｉｎｇプラットフォームを使用して特定された候補ｍｉＲＮＡバイオマーカーを、ステム−ループＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ｑＰＣＲ  ｍｉＲＮＡアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ）を使用して妥当性確認した。全ての４０個のコホート１サンプルについて全ＲＮＡの１：１０希釈を行い、以下に記載されるように、各サンプルでＴａｑＭａｎアッセイを実行した。Ａｔｈ−１５９ａ（ｓｐｉｋｅ−ｉｎ）及びｍｉＲ−１０６ａ（内因性ｍｉＲＮＡ）値を、分析のΔΔＣｔ法（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ）を使用して全てのサンプルにわたって値を正規化するために用いた。試験した１３個のｍｉＲＮＡのうちで、６個のｍｉＲＮＡの存在を確認することができなかった。これらは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−６００、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７４ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９７５を含んだ。
【０１２１】
残りの７つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ａ及びｍｉＲ−５４５）は、ＮａｎｏｓｔｒｉｎｇとＴａｑＭａｎにより記録された平均倍率変化の間で非常に強い相関性を示した（図２、表３）。ｍｉＲＮＡ配列及びｍｉＲＢａｓｅ受入番号を表２で提供する。例えば、ｍｉＲ−１９１は、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析によると、ＡＤサンプル中で〜３．１倍までダウンレギュレートされ、一方、これはＴａｑＭａｎ分析により、〜３．７倍までダウンレギュレートされたことを確認した（表３を参照）。この親密な傾向を、全ての残りのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１５ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ａ及びｍｉＲ−５４５）にわたって観察した。全ての倍率変化は、＜０．００５のｐ値を有した。
【０１２２】
ＴａｑＭａｎ分析により立証され得なかった全ての候補ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１２６を除いて）が、５００未満の正規化線形カウント（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇによって決定された）を有したことは注目すべきことである。一方、妥当性確認されたｍｉＲＮＡのそれぞれの平均カウントは、３，０００よりも高かった。このことは、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ実験により高い閾値を設定することが、偽陽性候補の数を少なくするために有用な場合があることを示唆する。
材料及び方法
全ＲＮＡ抽出
【０１２３】
記載されるように（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｐ．Ｓ．ら著、ＰＮＡＳ、２００８年７月２９日）、修正ｍｉＲｖａｎａ  ＰＡＲＩＳプロトコル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ；ＡＭ  １５５６）を使用して全ＲＮＡを抽出した。１ｍＬのヒト血漿を、等量の２×変性緩衝液に加え、次いで０．０５μＭのＡｔｈ−１５９ａ及び４０ｐＭのＮｅｇ−Ａ（ＵＵＧＵＧＧＣＧＡＧＣＧＧＡＡＵＧＧＡＡＵ）（正規化及び抽出効率対照に使用される合成ｍｉＲＮＡ）の１０μｌでスパイクした。フェノール抽出を二回実行し、プロトコル推奨（ＡＭ１５５６）に従って、全ＲＮＡを７０μｌの水中で最終的に溶出した。
ｍｉＲＮＡの高スループット発現プロファイリング
【０１２４】
４５μｌの精製した全ＲＮＡを、９μｌまで濃縮し、これをｎＣｏｕｎｔｅｒ  ｍｉＲＮＡ発現アッセイ（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ−ＵＳＡ）のためのテンプレートとして使用した。３μｌの濃縮全ＲＮＡを三通りで全てのサンプル用の出発量として使用して、サンプル調製を推奨されたように（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ；Ｃ−０００９−０２）行った。回収された全ＲＮＡの量が、Ｎａｎｏｄｒｏｐなどの標準的スペクトルベースの機器を使用して確実に検出するために不十分であったために、３μｌの濃縮全ＲＮＡを、全てのＮａｎｏｓｔｒｉｎｇに基づくアッセイのための出発材料として使用する等体積アプローチを採用した（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｐ．Ｓ．ら著、ＰＮＡＳ、２００８年７月２９日；１０５（３０）：１０５１３−８でも利用された）。６５℃で１６時間にわたる一晩のハイブリダイゼーションに、反応を組み立てた。翌日、製造元のプロトコルにより推奨されるように、サンプルをｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｐｒｅｐ  Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ−ＵＳＡ、ｖ．２００８１００３）を通して処理し、その後ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ−ＵＳＡ、ｖ．２００８１００９）を通して処理した。アナライザの分解能を６００  ＦＯＶｓに設定した。推奨されるように（ｎＣｏｕｎｔｅｒ  ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓガイドライン）、データをエクセル上にダウンロードし解析した。簡単に言うと、まず初めに、提供された陽性アッセイ対照を使用して、データをレーン間のばらつきに関して正規化した。これが最高カウントの１００個のｍｉＲＮＡエクスプレッサを使用して、グローバル平均正規化に続いた。次いでそれぞれの正規化値をチェックし、これが、そのレーンについて記録されたバックグラウンドシグナルの平均よりも少なくとも２ＳＤｓ高いことを確実にした。それ以下のいかなる値も０に換算した。個々のｍｉＲＮＡに関する全てのＡＤ／ＭＣＩ及びＮＣサンプル発現値の平均を取ることにより、倍率変化値を計算した。
ＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲを使用する候補バイオマーカーｍｉＲＮＡの妥当性確認
【０１２５】
高スループットＮａｎｏｓｔｒｉｎｇプラットフォームを使用して特定された候補ｍｉＲＮＡバイオマーカーを、今度はステム−ループＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ）を使用することで妥当性確認した。簡単に言うと、ＲＴプライマープールを、１×ＴＥ中０．０５×の最終濃度で、特異的ｍｉＲＮＡ  ＲＴプライマー（ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−１９７５、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−５４５、ｍｉＲ−１２７４、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−６００、ｍｉＲ−４５３、ｍｉＲ−５６３、ｍｉＲ−１０６ａ及びａｔｈ−１５９ａ）で作成した。ｍｉＲＮＡ特異的プライマー及びプローブは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓから購入した。１５μｌのＲＴ反応を、６μｌのＲＴプライマープール、０．３μＬのｄＮＴＰＳ（１００ｍＭ）、３μｌのＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ  ＲＴ（５０Ｕ／μｌ）、１．５μｌの１０×逆転写緩衝液及び０．２μｌのＲＮＡｓｅＩＮ（２０Ｕ／μｌ）並びに水を含有するよう組み立てた。全ての逆転写成分をｍｉＲＮＡ  ＲＴキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ；＃４３６６５９６）中に封入した。３μｌの全ＲＮＡ（１：１０希釈）を各サンプルについてのテンプレートとして加え、反応を氷上で５分間インキュベートし、その後１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、酵素不活性化のために８５℃で５分間インキュベートした。次いで反応を４℃で保管した。次いで、前増幅プライマーの第２のプールを、１×ＴＥ中０．２×の最終濃度で混合した同一のアッセイについてのそれぞれのＰＣＲプライマープローブ（２０×）で作成した。前増幅反応を、２×前増幅マスターミックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ；＃４３９１１２８）、３．７５μｌのカスタム前増幅プライマープール及び水を含有するよう組み立てた（反応体積を２２．５μｌに構成した）。次いで２５μｌのＲＴ産物を加え、前増幅プログラムを通してサイクルさせた［９５℃で１０分間、５５℃で２分間、及び７２℃で２分間、９５℃で１５秒間及び６０℃で４分間の１２サイクルが続いた］。これが、９９．９℃で１０分間のインキュベーションに続き、次いで１７５μｌの０．１×ＴＥ（ｐＨ８．０）を加えることで反応を希釈し、反転して混合した。次いで、２μｌの前増幅産物を、ＡＢＩ７５００機器で、標準プロトコル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ；Ｐ／Ｎ  ４３６４０３１−Ｒｅｖ  ｄ））に従って、個々の標準ＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲ反応（二通り）に使用した。均一な解析のために、０．２のマニュアル閾値及び単一試験における全ての反応についての自動ベースライン（ＳＤＳ  ２．４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ）を設定することにより、Ｃｔ値を計算した。
【０１２６】
ΔΔＣｔ法（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ、更にＬｉｖａｋ  ＫＪ、Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ  ＴＤ著、「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄａｔａ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ２（−ΔΔＣ（Ｔ））Ｍｅｔｈｏｄ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ、（２００１年）１２月；２５（４）：４０２−８を参照）を、内因性対照として使用したｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ及びａｔｈ−１５９ａの双方の幾何平均、並びに全ての個々の値を補正するよう使用されるＮＣ患者の平均相対的Ｃｔ値と共に、解析に使用した。次いで線形倍率変化を計算し、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ−ＵＳＡ）を使用してプロットした。（注：コホート２についてのシグネチャー妥当性確認（表２を参照）を上記のように正確に実行したが、ＲＴ及び前増幅プライマープールは、シグネチャー及び正規化対照特異的プライマー（ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−５４５、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ及びａｔｈ−１５９ａ）のみを使用して調製した。ｍｉＲＮＡ−特異的プライマー及びプローブは、カタログ番号０００４６４（ｍｉＲ−１４２−３ｐ）、００１２８９（ｍｉＲ−５４５）、０００３８０（ｌｅｔ−７ｄ）、０００４９０（ｍｉＲ−１９１）、０００５２８（ｍｉＲ−３０１ａ）、０００３８３（ｌｅｔ−７ｇ）、０００３９０（ｍｉＲ−１５ｂ）、０００５７８（ｍｉＲ−１０６ａ）、及び０００３３８（ａｔｈ−１５９ａ）で、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した）。
実施例２：シグネチャー生成及び予測モデル構築
【０１２７】
コホート１中のＡＤサンプルとＮＣサンプルの間で有意に異なる発現を有する（倍率変化＞１．５、ｐ値≦０．００５）として特定かつ妥当性確認されたｍｉＲＮＡを、予測モデル構築のために選択した。コホート１中のＡＤ（ｎ＝１１）及びＮＣ（ｎ＝２０）サンプルのそれぞれからの７つのｍｉＲＮＡ（ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−５４５、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ）の発現値を、シグネチャー構築モデルのための入力として使用した。特に、コホート１のＴａｑｍａｎ  ｑＰＣＲから得られた７つのｍｉＲＮＡのそれぞれに関する相対的Ｃｔ値（観測された個々のｍｉＲＮＡのＣｔ値からＡｔｈ−１５９ａ及びｍｉＲ−１０６ａのＣｔ値の幾何平均を減算したもの）を使用して、ＡＤをＮＣサンプルから分離するための線形分類器を構築した（相対的Ｃｔ値は表４に示す）。全ての可能な７つのｍｉＲＮＡの非ゼロサブセット（１２７個のシグネチャー）を、線形判別分析（ＬＤＡ）に使用した。ＬＤＡについては、ＭＡＳＳソフトウェアパッケージを、Ｒバージョン２．１２．２のウィンドウズ（登録商標）のインプリメントにおいて使用した（Ｖｅｎａｂｌｅｓ，Ｗ．Ｎ及びＲｉｐｌｅｙ，Ｂ．Ｄ著、（２００２年）、Ｍｏｄｅｒｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｗｉｔｈ  Ｓ）、第４版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。ＩＳＢＮ  ０−３８７−９５４５７−０）。パッケージのソースコードは、ｈｔｔｐ：／／ｃｒａｎ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ＭＡＳＳ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで入手可能である。他の好適なソフトウェアパッケージを使用し又は展開してもよい。曲線下面積（ＡＵＣ）数もまた、ソフトウェアパッケージの「検証」（ソースコードは、ｈｔｔｐ：／／ｃｒａｎ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで入手可能であり；更にＭａｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．及びＮ．Ｅ．Ｇｒａｈａｍら著、「Ａｒｅａｓ  ｂｅｎｅａｔｈ  ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ（ＲＯＣ）  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｌｅｖｅｌｓ（ＲＯＬ）  ｃｕｒｖｅｓ：Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ」、Ｑ．Ｊ．Ｒ．Ｍｅｔｅｏｒｏｌ。Ｓｏｃ．３０、（１９８２年）、２９１−３０３も参照）を使用するＲ（バージョン２．１２．２）で計算した。他の適切なソフトウェアパッケージも使用し又は展開することができる。
【０１２８】
予測精度、感度、特異性及びＡＵＣを算定するよう使用されるサンプルコード及び入力ファイルの説明は、以下に記載される。このコードは、３つのｍｉＲＮＡ（「ｍｉＲ−５４５」、「ｌｅｔ−７ｇ」、「ｍｉＲ−１５ｂ」）の代表的シグネチャーを使用してＡＤ又はＮｏｒｍａｌなどの未知サンプルを分類する方法を示す。７つの妥当性確認されたｍｉＲＮＡの任意の組み合わせに基づいて分類を実行するためのコードも同様であり、これら７つのｍｉＲＮＡの任意の組み合わせに基づいたシグネチャーが使用され得ることが理解されるべきである。７つの妥当性確認されたｍｉＲＮＡから選択される任意の組み合わせ又は個々のｍｉＲＮＡについては、コホート１から得られたトレーニングデータに基づいて、ＬＤＡモデルの係数値を決定することにより線形判別モデルを構築することができる。一旦、コホート１に基づいてモデルを決定すれば、そのサンプルが得られた個体がＡＤの個体であるか、又は正常な固体であるかを任意の新しいサンプルについて予測することができる。新しいサンプルについて予測を行うために、シグネチャーにおけるそれぞれ個々のｍｉＲＮＡについてのｍｉＲＮＡ発現レベルを決定することが必要である。これら値に基づいて、モデルは、新しいサンプルがＡＤを有する個体からであることの（「経験的」）確率に戻るであろう。この確率のカットオフ値がモデルの感度及び特異性を決定する。我々の予測のために、０．５の閾値で、精度、感度及び特異性を決定した（すなわち、サンプルがＡＤである確率が０．５よりも大きい場合、我々のモデルは、これをＡＤとして分類した）。
【０１２９】
例示的な入力ファイルは、ｔｒａｉｎ．ｔｘｔ．、Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ．ｔｘｔ．、ｔｒａｉｎ＿ａｎ．ｔｘｔ．及びｖａｌｉｄａｔｉｏｎ＿ａｎ．ｔｘｔ．の形であり得る。「ｔｒａｉｎ．ｔｘｔ」は、行列の形でコホート１に関する発現プロファイルを含有するファイルであり、行はサンプルであり、列はｍｉＲＮＡである。第１の行はｍｉＲＮＡの名称を含有し、第１の列はサンプルの名称を含有する。「ｔｒａｉｎ＿ａｎ．ｔｘｔ」ファイルは、サンプルの注釈を含有する。２つの列があり、第１の列はサンプルの名称を含有し、第２の列はサンプルの注釈を含有す（この場合、「ｎｏｒｍａｌ」と「ＡＤ」である）。ファイル「ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ．ｔｘｔ」及び「ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ＿ａｎ．ｔｘｔ」は、正確に同一のフォーマットで、コホート２に対いてのデータ及び注釈を含有する。変数ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ＄ｃｌａｓｓ及びｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ＄ｐｏｓｔｅｒｉは、コホート２からのサンプルの予測された注釈及び対応の確率を含有する。
【０１３０】
予測精度、感度、特異性及びＡＵＣ数を算定するために使用され得る例示的なコードは以下の通りである。
ｒｅａｄ．ｆｉｌｅ  ＜−  ｆｕｎｃｔｉｏｎ（ｆｉｌｅ，ｉｎｖ）
｛
ｄａｔａ．ｔｍｐ＝ｒｅａｄ．ｃｓｖ（ｆｉｌｅ，ｓｅｐ＝“￥ｔ”，ｈｅａｄｅｒ＝Ｔ）
ｍａｔ  ＜−  ｍａｔｒｉｘ（０，    ｎｒｏｗ＝ｎｒｏｗ（ｄａｔａ．ｔｍｐ），  ｎｃｏｌ＝ｎｃｏｌ（（ｄａｔａ．ｔｍｐ））−１）
ｒｏｗｎａｍｅｓ（ｍａｔ）＝ｄａｔａ．ｔｍｐ［，１］
ｃｏｌｎａｍｅｓ（ｍａｔ）＝ｃｏｌｎａｍｅｓ（ｄａｔａ．ｔｍｐ）［２：ｎｃｏｌ（ｄａｔａ．ｔｍｐ）］
ｆｏｒ（ｉ  ｉｎ  １：ｎｒｏｗ（ｄａｔａ．ｔｍｐ））
｛
ｍａｔ［ｉ，］＝ａｓ．ｎｕｍｅｒｉｃ（ｄａｔａ．ｔｍｐ［ｉ，２：ｎｃｏｌ（ｄａｔａ．ｔｍｐ）］）
｝
ｉｆ（ｉｎｖ＝＝Ｔ）  ｛ｍａｔ＝ｔ（ｍａｔ）  ｝
ｍａｔ
｝
ｌｉｂｒａｒｙ（ＭＡＳＳ）
ｌｉｂｒａｒｙ（ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
ｔｒａｉｎ＝ｒｅａｄ．ｆｉｌｅ（“ｔｒａｉｎ．ｔｘｔ”，Ｆ）
ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ＝ｒｅａｄ．ｆｉｌｅ（“ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ．ｔｘｔ”，Ｆ）
ｔｒａｉｎ＿ａｎ＝ｒｅａｄ．ｔａｂｌｅ（“ｔｒａｉｎ＿ａｎ．ｔｘｔ”）
ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ＿ａｎ＝ｒｅａｄ．ｔａｂｌｅ（“ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ＿ａｎ．ｔｘｔ”）
ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ＿ａｎ＝ａｓ．ｆａｃｔｏｒ（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ＿ａｎ［，１］）
ｔｒａｉｎ＿ａｎ＝ａｓ．ｆａｃｔｏｒ（ｔｒａｉｎ＿ａｎ［，１］）
ｏｂｓ＝ＮＵＬＬ
ｏｂｓ［ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ＿ａｎ＝＝“ｎｏｒｍａｌ”］＝０
ｏｂｓ［ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ＿ａｎ＝＝“ＡＤ”］＝１
ｓｅｔ＝ｃ（“ｍｉＲ．５４５”，“ｌｅｔ．７ｇ”，“ｍｉＲ．１５ｂ”）
ｔｒａｉｎ＿ｓｐ＝ｔｒａｉｎ［，ｓｅｔ］
ｌｄａｔｒａｉｎ＝ｌｄａ（（ｔｒａｉｎ＿ｓｐ），ｔｒａｉｎ＿ａｎ）
ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ＿ｓｐ＝ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ［，ｓｅｔ］
ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ＝  ｐｒｅｄｉｃｔ（ｌｄａｔｒａｉｎ，ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ＿ｓｐ）
ｔｂ＝ｔａｂｌｅ（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ＿ａｎ，ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ＄ｃｌａｓｓ）
ｎｒ＝ｔｂ［１，１］＋ｔｂ［２，２］
ａｃｃｕｒａｃｙ＝ｎｒ／ｓｕｍ（ｔｂ）
ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ＝ｔｂ［１，１］／（ｔｂ［１，１］＋ｔｂ［１，２］）
ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ＝ｔｂ［２，２］／（ｔｂ［２，１］＋ｔｂ［２，２］）  
ａｕｃ＝ｒｏｃ．ａｒｅａ（ｏｂｓ，ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ＄ｐｏｓｔｅｒｉ［，１］）＄Ａ
【０１３１】
７つの妥当性確認されたｍｉＲＮＡの任意の組み合わせに基づいた分類を実行するために、上記に示したものと類似するサンプルコードが使用され得る。あるいは、予測に有用な、又は予測精度、感度特異性及びＡＵＣをデータセットから算定するために有用な他のソフトウェアコードが、上述のサンプルコードに代えて使用されてもよい。
実施例３：対象の状態を正常又はアルツハイマー病を有すると予測するｍｉＲＮＡバイオマーカー
【０１３２】
実施例２に記載の７つの妥当性確認されたｍｉＲＮＡ（ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０１ａ及びｍｉＲ−５４５）の全ての非ゼロサブセットを使用する予測モデルの性能を、ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ，Ｉｎｃ．から入手した、２０人のＡＤ及び１７人のＮＣ患者を含有する第２のコホート（「コホート２」）からのヒト血漿サンプルの分類結果に基づいて評価した。コホート２中の患者についての年齢、性別、診断、及びＭＭＳＥスコアが表５に提供されている。予測モデルの性能を、精度、特異性、感度及び曲線下面積（ＡＵＵ）数に基づいて評価した。
【０１３３】
実施例１に記載の通りに、それぞれのコホート２サンプルからの５００μｌの血漿だけを使用して、全ＲＮＡ抽出を実行し、続いてＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ｑＰＣＲ分析を行った。非常に親密に複製されているシグネチャーｍｉＲＮＡに関する２つのコホート間の倍率変化と、優れたｐ値とで、我々は有意な相関性を達成した（図６、表６）。
【０１３４】
次いで、コホート２サンプルのそれぞれからの候補ｍｉＲＮＡ（ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０１ａ及びｍｉＲ−５４５）のそれぞれに関する相対的Ｃｔ値（（観測された個々のｍｉＲＮＡのＣｔ値からＡｔｈ−１５９ａ及びｍｉＲ−１０６ａのＣｔ値の幾何平均を減算したもの）をｓｉｇｉｎｅｃｈａ−ｍｉＲＮＡ予測アルゴリズムのための入力として使用し（表７）、これを上述のようにコホート１のデータに基づいて展開した。全ての可能性のあるシグネチャーを表８に列挙する。＞７５％の精度を有するシグネチャーを表９に示し、一方＞８９％の精度を有するシグネチャーを表１０に示す。全体のシグネチャー制度を誤分類されたサンプル（ＡＤ又はＮＣ）の分画として算定した。感度は、真陽性を特定するための予測モデルの能力を特徴付け、本試験では、これをＡＤサンプルの総数で割った正確に特定されたＡＤサンプルの数として算定した。一方、特異性は、ＮＣサンプルの総数で割った正確に分類されたＮＣサンプル（真陰性）の数であった。感度対偽陽性率（１−特異性）のプロットである、ＡＵＣを受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線下面積として算定した。ＲＯＣ曲線は、予測確率についての閾値を変化させることにより生成した。
【０１３５】
ｍｉＲ−５４５、ｌｅｔ−７ｇ及びｍｉＲ−１５ｂの組み合わせは、最高の特異性（９４．１％）、感度（９５％）及びＡＵＣ（０．９５３）を与えた。シグネチャー組み合わせは、２つのｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１５ｂ及びｍｉＲ−５４５）から７つのｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−５４５、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１５ｂ及びｍｉＲ−１４２−３ｐ）の範囲であった（表９Ａ〜９Ｂを参照）。これに加えて、個々のｍｉＲＮＡについてのシグネチャー精度も検討した（表１１）。シグネチャー精度は、組み合わせシグネチャーに比べて個々のｍｉＲＮＡについては低かった。特異性に関して最適な単独形ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ−３０１ａであって、双方ともに１００％の特異性を有した。しかし、ｍｉＲ−１４２−３ｐは、ｍｉＲ−３０１ａについての２５％の感度に比較すると、より良好な感度（６５％）を有した。Ｌｅｔ−７ｇ及びｍｉＲ−１９１は、９５％で最適感度を有したが、ｍｉＲ−１９１だけが７６％の富化特異性を有した。ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ｂ及びｌｅｔ−７ｄは、単独形ｍｉＲＮＡの最適な全体的精度を有した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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