(57)【要約】スプライシングアイソフォームまたはその変異体の発現をもたらす新規核酸分子を、標的指向性スプライソソーム媒介RNAトランススプライシング(SMaRT(商標))を介して生成するための方法および組成物を提供する。本方法および組成物は、標的プレmRNA分子と相互作用しかつトランススプライシング反応を媒介するように設計された、プレトランススプライシング分子(PTM)に基づいており、該トランススプライシング反応は、遺伝子アイソフォームにより誘発される各種疾患、例えばがんを治療するためのスプライシングアイソフォームをコードする新規キメラRNA分子を生成する。2014525754.tif 000007
2014525754.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つのプレトランススプライシング分子(PTM)を含み、それによって、スプライソソーム媒介RNAトランススプライシング(SMaRT)を用いるトランススプライシングを受けた場合に、非アポトーシス性細胞をアポトーシスへと導くスプライシングアイソフォームを産生する、単離された非アポトーシス性細胞。
【請求項２】
PTMが以下をさらに含む、請求項1記載の細胞：
(a)該PTMの結合を内因性プレmRNAに標的指向させる1つもしくは複数の標的結合ドメイン；
(b)分岐点と、ピリミジントラクトと、3'スプライス受容部位および5'スプライス供与部位かもしくは5'スプライス供与部位かのいずれかとを含む、3'スプライス領域；
(c)RNAスプライス部位を該標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；ならびに
(d)5'スプライス部位の片面もしくは両面に結合する1つもしくは複数の相補配列を含むセーフティ配列、
またはこれらの任意の組み合わせ。
【請求項３】
スプライシングアイソフォームが少なくとも1つのアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームを含む、請求項1記載の細胞。
【請求項４】
アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームが、Bclファミリー遺伝子、FGFR2ファミリー遺伝子、p53aファミリー遺伝子、RAD51、サバイビン(survivin)ファミリー遺伝子(サバイビンおよびサバイビン2-B)、もしくはRbファミリー遺伝子のアポトーシス誘導スプライシングアイソフォーム遺伝子産物、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項3記載の細胞。
【請求項５】
アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームが、Bcl XS、Mcl-1S、カスパーゼ-2L、カスパーゼ-9、サバイビン-2B、Fas、ハースタチン、Δ15HER2、Rac1、VEGF165b、p53、KLF6、およびRBM5のうちの少なくとも1つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項4記載の細胞。
【請求項６】
Bcl XLまたはその機能的誘導体を発現するがん細胞である、請求項4記載の細胞。
【請求項７】
がん細胞が、多発性骨髄腫、非小細胞肺がん、前立腺がん、乳がん、神経膠腫、大腸がん、肺がん、小細胞肺がん、胃がん、肝臓がん、血液がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または眼内黒色腫、子宮肉腫、卵巣がん、直腸または結腸直腸がん、肛門がん、結腸がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、外陰がん、扁平上皮がん、膣がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、食道がん、小腸がん、内分泌がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織腫瘍、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓がん、尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、CNS腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、多形性膠芽細胞腫、原発性CNSリンパ腫、骨髄腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、ブドウ膜黒色腫、精巣がん、口腔がん、咽頭がん、小児新生物、白血病、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋芽細胞腫および肉腫からなる群より選択される、請求項6記載の細胞。
【請求項８】
(a)スプライシングアイソフォームをコードする少なくとも1つのプレトランススプライシング分子(PTM)を非アポトーシス性細胞に導入する段階；および
(b) スプライソソーム媒介RNAトランススプライシング(SMaRT)を用いて、スプライシングアイソフォームをコードする少なくとも1つのPTMを、内因性プレmRNAとトランススプライシングする段階
を含み、
それによって、スプライシングアイソフォームをコードする少なくとも1つのPTMと、内因性プレmRNAとのトランススプライシングによって、機能的な転写産物が産生され、該転写産物はその後、非アポトーシス性細胞をアポトーシスへと導くスプライシングアイソフォームに翻訳される、
非アポトーシス性細胞をアポトーシス性細胞へと誘導する方法。
【請求項９】
PTMの結合を標的指向させる段階をさらに含む方法であって、該PTMが以下を含む、請求項8記載の方法：
(a)該PTMの結合を細胞の内因性プレmRNAに標的指向させる1つもしくは複数の標的結合ドメイン；
(b)分岐点と、ピリミジントラクトと、3'スプライス受容部位および5'スプライス供与部位かもしくは5'スプライス供与部位かのいずれかとを含む、3'スプライス領域；
(c)RNAスプライス部位を該標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；ならびに
(d)5'スプライス部位の片面もしくは両面に結合する1つもしくは複数の相補配列を含むセーフティ配列、
またはこれらの任意の組み合わせ。
【請求項１０】
スプライシングアイソフォームが少なくとも1つのアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームを含む、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームが、Bclファミリー遺伝子、FGFR2ファミリー遺伝子、p53aファミリー遺伝子、RAD51、サバイビンファミリー遺伝子(サバイビンおよびサバイビン2-B)、もしくはRbファミリー遺伝子のアポトーシス誘導スプライシングアイソフォーム遺伝子産物、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームが、Bcl XS、Mcl-1S、カスパーゼ-2L、カスパーゼ-9、サバイビン-2B、Fas、ハースタチン、Δ15HER2、Rac1、VEGF165b、p53、KLF6、およびRBM5のうちの少なくとも1つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項8記載の方法。
【請求項１３】
細胞が、Bcl XLまたはその機能的誘導体を発現するがん細胞である、請求項8記載の方法。
【請求項１４】
がん細胞が、多発性骨髄腫、非小細胞肺がん、前立腺がんおよび乳がんからなる群より選択され、がんが、乳がん、神経膠腫、大腸がん、肺がん、小細胞肺がん、胃がん、肝臓がん、血液がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または眼内黒色腫、子宮肉腫、卵巣がん、直腸または結腸直腸がん、肛門がん、結腸がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、外陰がん、扁平上皮がん、膣がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、食道がん、小腸がん、内分泌がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織腫瘍、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓がん、尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、CNS腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、多形性膠芽細胞腫、原発性CNSリンパ腫、骨髄腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、ブドウ膜黒色腫、精巣がん、口腔がん、咽頭がん、小児新生物、白血病、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経膠腫、横紋筋芽細胞腫および肉腫からなる群より選択される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
非アポトーシス性細胞内で発現された標的プレmRNAと、核スプライシング成分によって認識される核酸分子とを、該核酸分子の一部が該標的プレmRNAの一部とトランススプライシングされて該細胞内でキメラRNAを形成する条件下で接触させる段階を含む、非アポトーシス性細胞においてキメラRNA分子を産生させる方法であって、
該核酸分子が、
(a)該核酸分子の結合を、該細胞内で発現された標的プレmRNAに標的指向させる、1つまたは複数の標的結合ドメインであって、該細胞のゲノムのヒトアルブミンプレmRNA標的を標的とする該標的結合ドメイン；
(b)分岐点と3'スプライス受容部位とを含む3'スプライス領域；
(c)該3'スプライス領域を該標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；ならびに
(d)該標的プレmRNAとトランススプライシングされるヌクレオチド配列であって、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームをコードする該ヌクレオチド配列
を含み、該スプライシングアイソフォームが、非アポトーシス性細胞をアポトーシスへと導く、
前記方法。
【請求項１６】
非アポトーシス性細胞が、Bcl XLまたはその機能的誘導体を発現する、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
非アポトーシス性細胞が、Bcl XLヌクレオチド配列を含まないかまたはBcl XLタンパク質もしくはその機能的誘導体を発現しないかのいずれかである、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
以下を含み、細胞内の核スプライシング成分によって認識される核酸分子：
a)該核酸分子の結合を、該細胞内で発現されるアポトーシス誘導スプライシングアイソフォーム標的プレmRNAに標的指向させる、1つまたは複数の標的結合ドメイン；
b)5'スプライス部位；
c)該5'スプライス部位を該標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；
d)該5'スプライス部位の片面または両面に結合する1つまたは複数の相補配列を含むセーフティ配列；ならびに
e)該標的プレmRNAとトランススプライシングされるヌクレオチド配列。
【請求項１９】
以下を含み、細胞内の核スプライシング成分によって認識される核酸分子：
a)該核酸分子の結合を、該細胞内で発現されるアポトーシス誘導スプライシングアイソフォーム標的プレmRNAに標的指向させる、1つまたは複数の標的結合ドメイン；
b)分岐点と、ピリミジントラクトと、3'スプライス受容部位とを含む3'スプライス領域；
c)該3'スプライス領域を該標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；
d)該3'スプライス部位の片面または両面に結合する1つまたは複数の相補配列を含むセーフティ配列；および
e)該標的プレmRNAとトランススプライシングされるヌクレオチド配列。
【請求項２０】
細胞内の核スプライシング成分によって認識される核酸分子を発現する真核細胞発現ベクターであって、該核酸分子が以下を含む、真核細胞発現ベクター：
a)該核酸分子の結合を、該細胞内で発現されるアポトーシス誘導スプライシングアイソフォーム標的プレmRNAに標的指向させる、1つまたは複数の標的結合ドメイン；
b)分岐点と、ピリミジントラクトと、3'スプライス受容部位とを含む3'スプライス領域；
c)該3'スプライス領域を該標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d)該標的プレmRNAとトランススプライシングされるヌクレオチド配列。
【請求項２１】
細胞内の核スプライシング成分によって認識される核酸分子を発現する真核細胞発現ベクターであって、該核酸分子が以下を含む、真核細胞発現ベクター：
a)該核酸分子の結合を、該細胞内で発現されるアポトーシス誘導スプライシングアイソフォーム標的プレmRNAに標的指向させる、1つまたは複数の標的結合ドメイン；
b)5'スプライス部位；
c)該5'スプライス部位を該標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；ならびに
d)該標的プレmRNAとトランススプライシングされるヌクレオチド配列。
【請求項２２】
生理学的に許容される担体と請求項18〜21のいずれか一項記載の核酸分子とを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2011年8月12日に出願された米国仮特許出願第61/522,844号の恩典を主張するものであり、その開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表
本出願には、EFS-Web経由で提出された「356007-00146_ST25.txt」という名称のASCIIテキストファイルに含まれる配列表が参照により組み入れられる。このテキストファイルは2012年8月10日に作成されたものであり、1.57kbである。
【０００３】
発明の分野
本出願は、前駆体メッセンジャーRNA分子(標的プレmRNA)を標的とし、かつ関心対象のタンパク質またはポリペプチドのコード配列を含む新規核酸分子をRNAトランススプライシングを介して生成するための方法および組成物に関する。特に、本出願は、スプライソソーム媒介RNAトランススプライシングによりアポトーシスを誘導するための方法および組成物に関し、より具体的には、スプライソソーム媒介RNAトランススプライシング(SMaRT(商標))を介してアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームを発現するプレトランススプライシング分子(PTM)を含む方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
RNAスプライシング
染色体中のDNA配列は、コード領域(エクソン)を含みかつ一般には介在する非コード領域(イントロン)をも含む、プレmRNAに転写される。イントロンは、プレmRNAスプライシング(スプライシング)と呼ばれる正確なプロセスでプレmRNAから除去される(Chow et al., 1977, Cell 12:1-8; およびBerget, S. M. et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:3171-3175)。スプライシングは、いくつかの核内低分子リボ核タンパク質粒子(snRNP)と多数のタンパク質因子との協調的な相互作用として起こり、これらが集合してスプライソソームとして知られる酵素複合体を形成する(Moore et al., 1993, The RNA World, R. F. Gestland and J. F. Atkins編 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Kramer, 1996, Annu. Rev. Biochem., 65:367-404; Staley and Guthrie, 1998, Cell 92:315-326)。
【０００５】
ほとんどの場合、スプライシング反応は同一プレmRNA分子内で起こり、これはシススプライシングと呼ばれている。独立して転写された2つのプレmRNA間のスプライシングは、トランススプライシングと呼ばれている。トランススプライシングは最初にトリパノソーマで(Sutton & Boothroyd, 1986, Cell 47:527; Murphy et al., 1986, Cell 47:517)、続いて線虫(Krause & Hirsh, 1987, Cell 49:753)、扁形動物(Rajkovic et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8879; Davis et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:21813)、および植物のミトコンドリア(Malek et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:553)で発見された。寄生虫ブルーストリパノソーマ(Trypanosoma brucei)では、すべてのmRNAが、トランススプライシングによってそれらの5'末端にスプライスリーダー(SL)RNAを獲得する。5'リーダー配列はまた、線虫カエノラブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)ではいくつかの遺伝子とトランススプライシングされる。このメカニズムは、多くの異なる転写産物に単一の共通配列を付加するのに適している。
【０００６】
スプライスリーダートランススプライシングのメカニズムは、従来のシススプライシングとほとんど同一であって、2つのホスホリル転移反応を介して進行する。最初の反応は、シススプライシングにおけるラリアット中間体に相当する、「Y」字形の分枝中間体を産生する2'-5'ホスホジエステル結合の形成を引き起こす。第2の反応であるエクソン連結は、従来のシススプライシングのように進行する。また、3'スプライス部位の配列およびいくつかのsnRNPは、トランススプライシング反応を触媒するが、シススプライシングに関与するそれらの対応物によく似ている。
【０００７】
従来のプレmRNA間のトランススプライシングは、異なるプロセスを指し、そこでは、一方のプレmRNAのイントロンが他方のプレmRNAのイントロンと相互作用して、2つの従来のプレmRNA間でスプライス部位の組換えを促進する。このタイプのトランススプライシングは、トランスジェニックマウスにおいて、内因性の定常領域に連結されたヒト免疫グロブリン可変領域配列をコードする転写産物を説明するために仮定された(Shimizu et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8020)。また、c-mybプレmRNAのトランススプライシングが実証され(Vellard, M. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2511-2515)、そして相互にトランススプライシングされたクローン化SV40由来のRNA転写産物が培養細胞および核抽出物中に検出された(Eul et al., 1995, EMBO. J 14:3226)。しかしながら、哺乳動物のプレmRNAの自然界で発生するトランススプライシングは稀な事象であると考えられる(Flouriot G. et al., 2002, J. Biol. Chem: Finta, C. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:5882-5890)。
【０００８】
インビトロトランススプライシングは、スプライシングのメカニズムを調べるためのモデルシステムとして、いくつかのグループによって使用された(Konarska & Sharp, 1985, Cell 46:165-171; Solnick, 1985, Cell 42:157; Chiara & Reed, 1995, Nature 375:510; Pasman and Garcia-Blanco, 1996, Nucleic Acids Res. 24:1638)。かなり効率のよいトランススプライシング(シススプライス類似体の30％)は、互いに塩基対を形成することができるRNA間で達成され、塩基対形成によって繋留されなかったRNAのスプライシングは10分の1にさらに減少した。明白なRNA-RNA相互作用を基質間で必要としない他のインビトロトランススプライシング反応は、Chiara & Reed (1995, Nature 375:510)、Bruzik J. P. & Maniatis, T. (1992, Nature 360:692)、およびBruzik J. P. and Maniatis, T. (1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7056-7059)によって観察された。これらの反応は非常に低レベルのスプライス産物をもたらし、かつ下流5'スプライス部位またはエクソンスプライシングエンハンサーなどの特殊な要素を必要とする。
【０００９】
プレメッセンジャーRNA(mRNA)への複数のタンパク質の結合を伴い、その後RNAを正確に切り出して再結合するように作用するスプライシング機構に加えて、第3のメカニズムは、イントロン自体による(触媒RNA分子またはリボザイムと呼ばれるものによる)RNAの切り出しおよび再結合を伴う。リボザイムの切断活性は、リボザイムに個別の「ハイブリダイゼーション」領域を作製することによって、特定のRNAを標的とした。標的RNAにハイブリダイゼーションすると、リボザイムの触媒領域はその標的を切断する。このようなリボザイム活性は、インビボでの標的RNAの不活性化または切断のために、例えば、外来もしくは異常なRNAの産生を特徴とするヒト疾患の治療のために、有用であろうことが示唆されている。このような場合には、小さいRNA分子が標的RNAにハイブリダイズするように設計され、標的RNAに結合することによって標的RNAの翻訳を防止するか、またはヌクレアーゼの活性化を介してRNAの破壊を引き起こす。アンチセンスRNAの使用もまた、特定のRNAを標的として破壊するための代替メカニズムとして提案されている。その他は、さまざまなスプライスフォーム(spliceoform)から1つを選択しようと試みている。これは、本発明の領域において、すなわちBx-Lの抗アポトーシス性アイソフォームを不活性化して、それをアポトーシス促進性アイソフォームBx-Sに変換するために、Koleらによって検討されている。BaumanとKoleは、プレmRNAのスプライス部位を利用することによって、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド(SSO)またはアンチセンスの使用を研究した。SSOによるBcl-XLからBcl-XSへのBcl-xプレmRNAスプライシングの切り換えは、がん細胞株において有効なアポトーシスおよび化学療法剤感受性(chemosensitivity)を誘導した(Bioengineered Bugs 2:125-128, 2011)。アンチセンスは潜在的応用を提供するものの、用いるアンチセンス分子の大きな特異性が存在する。アンチセンス分子または標的の比較的小さな変更は、その標的に対するプラスの効果を完全に無効し得る。これにより、アンチセンスは、本発明者の技術であるRNAトランススプライシングとは区別される。
【００１０】
テトラヒメナのグループIリボザイムを用いて、標的指向性トランススプライシングが大腸菌(E. coli)(Sullenger B. A. and Cech. T. R., 1994, Nature 341:619-622)、マウス線維芽細胞(Jones, J. T. et al., 1996, Nature Medicine 2:643-648)、ヒト線維芽細胞(Phylacton, L. A. et al., Nature Genetics 18:378-381 (1998))、およびヒト赤血球前駆細胞(Lan et al., 1998, Science 280:1593-1596)において実証された。臨床的に関連するRNAの改変技術を検討するには、Sullenger and Gilboa, 2002 Nature 418:252-8を参照されたい。
【００１１】
選択的スプライシングおよびヒト疾患
選択的スプライシングは、ヒトにおけるプロテオーム多様性の主要な源であり、したがって、ヒト疾患および治療に非常に関連があると考えられている。いくつかの重要な疾患は、シススプライシング要素または特定のトランス作用因子のいずれかの変異または変化(異常なスプライシングとそれに付随する異常なタンパク質の産生につながる)に結び付いている(Garcia-Blanco et al., 2004, Nature Biotechnology 22 (535-546))。選択的スプライシングは、単一の一次転写産物が、多様性のある、拮抗することさえある機能を有するタンパク質アイソフォームの産生をもたらす、異なる成熟mRNAを生成するプロセスである。ヒトゲノムのアノテーションは、イントロン含有転写産物の大部分が選択的にスプライシングされることを明らかにした。プレmRNAの95％は選択的にスプライシングされると推定されている。ヒト疾患における異常なスプライシングの関与が最近検討されている(Ward and Cooper, J. Pathol. 2010 Jan; 220(2):152-63; Cooper, A. Wan L, Dreyfuss G. Cell. 2009 Feb 20;136(4):777-93; Orengo JP, Cooper T.A. Adv Exp Med Biol. 2007, 623:212-23; Wang G.S., Cooper T.A. Nat. Rev. Genet. 2007 Oct; 8(10):749-61. Epub 2007 Aug 29)。選択的スプライシングの役割と程度は、Nilsen T.W., Graveley B.R. Nature 2010 Jan 28;463(7280):457-63中で検討されている。計算生物学者はRNAの複雑さに取り組んでいる(Ledford H., 2010, Nature 465:16-17, 2010)。選択的スプライシングがいかに広範であるのかすぐに認識されたが、どのフォームが異なる組織で発現されるのか誰も予測することはできなかった。
【００１２】
複雑なタンパク質をコードする遺伝子の一次転写産物は、スプライシング装置によって除去されなければならないイントロンを含有する。この装置の効率と能力は、どの時点においても除去される必要があるイントロンの数と、イントロン自体が除去されねばならない速度とを計算することによって強調される(Garcia-Blanco et al., 2004, Nature Biotechnology 22 (535-546))。RNAスプライシングはエクソンの正しい認識に依存しており、その通常の大きさは末端エクソンについて300ヌクレオチドであり、平均的な内部エクソンはたったの145ヌクレオチドの長さである。選択的スプライシングには6つの異なるタイプが知られている。稀なケースでは、全イントロンが除去されるか保持されて、非常に異なった2つのRNAをもたらす。選択的5'スプライス部位または3'スプライス部位は、異なるサイズのエクソンをもたらすことができる。1つまたは複数のエクソンの包含またはスキッピングは選択的スプライシングの一般的なタイプである。異なる転写開始部位で開始された転写産物の選択的スプライシングは、異なる第1エクソンを有する成熟RNAにつながる。3'末端のエクソンはまた、選択的スプライシングを選択的ポリアデニル化と共役させることによって、変えることができる。最後に、選択的スプライシングの稀なタイプは、2つの一次転写産物間のトランスでの反応を含む(Garcia-Blanco et al., 2004, Nature Biotechnology 22 (535-546)。
【００１３】
数種の遺伝子のスプライシングパターンは、プロラクチン受容体、Ron、Rac1、フィブロネクチン、線維芽細胞増殖因子受容体、CD44、MDM2、およびIIp45をコードするものを含めて、がんにおいて変化することが報告されている(Srebrow, A. and Kornblihtt, A.R., 2006, J Cell Sci 119:2635-2641)。RonおよびRac1などのタンパク質の特定の選択的スプライスアイソフォームは腫瘍内に蓄積することがあり、そうした腫瘍関連アイソフォームの過剰発現は培養中の細胞を形質転換するのに十分である(Singh et al., 2004, Oncogene 23:9369-9380); Zhou et al., 2003, Oncogene 22:186-197)。
【００１４】
特定のスプライスアイソフォームの、他に優先してのアップレギュレーションは、いくつかのがんに関与している。アポトーシス制御因子Bcl-Xは、2つのアイソフォームがアポトーシスに反対の影響を及ぼす場合の一例である(Boise, L.H. et al., 1993, Cell 74:597-608)。Bcl-XSはアポトーシス促進性(pro-apoptotic)であるのに対し、Bcl-XLは抗アポトーシス性である。この機能の違いは、第1コーディングエクソンにおける選択的5'スプライス部位の使用に依存している。
【００１５】
したがって、腫瘍特異的であり得る選択的スプライス変異体は、細胞増殖、運動性および化学療法剤感受性または薬物応答を含めて、がんにおける細胞プロセスに大きな影響を与え得ることは明らかである。しかし、異常なスプライシングが発がんにどの程度関与するのか、そして腫瘍に存在する一般に無秩序な細胞プロセスの反映が単にどのくらいであるのか、ほとんど不明のままである。
【００１６】
したがって、選択的RNAスプライシングアイソフォームによって媒介される疾患または障害の治療に使える可能性があるとしてRNAスプライシングを調節するための、新しい、改善された、より安全な代替手段に関して、まだ満たされていない継続的なニーズが存在している。本発明は、一般には疾患改善遺伝子スプライシングアイソフォームの発現を誘導するために、そして特に、がんを直接治療しかつ/またはがん細胞を他のがん治療薬に対してより感受性にするための手段として非アポトーシス性細胞をアポトーシス状態に誘導するように、アポトーシススプライシングアイソフォームの発現を誘導するために、トランススプライシングを使用することによって、これらおよび他のニーズに対処するものである。
【００１７】
本明細書に引用された上記の文書または参考文献の引用は、上記のいずれかが関連先行技術であると認めることを意図したものではない。日付に関するすべての記述またはこれらの文書の内容に関する表現は、本発明者が入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関していかなる承認をも構成するものではない。
【発明の概要】
【００１８】
本発明は、スプライソソームにより媒介される標的指向性RNAトランススプライシング(SMaRT(商標))を介して新規核酸分子を生成するための組成物および方法に関する。本発明の組成物は、天然の標的プレmRNA分子(以後「プレmRNA」という)と相互作用しかつ新規キメラRNA分子(以後「キメラRNA」という)の生成をもたらすスプライソソームトランススプライシング反応を媒介するように設計された、スプライシングアイソフォームを発現するプレトランススプライシング分子(以後「PTM」という)を含む。本発明の方法は、本発明のスプライシングアイソフォームPTMと天然の標的プレmRNAとを、該スプライシングアイソフォームPTMの全部または一部が該天然のプレmRNAとスプライシングされて新規キメラRNAを形成する条件下で接触させる段階を包含する。一般的に、標的プレmRNAは、それが特定の細胞型(例えば、疾患を引き起こすスプライシングアイソフォームを発現する細胞型)内で発現されるという理由で選択され、それによって、新規キメラRNAの発現を、選択された細胞型(例えば、限定するものではないが、がん細胞)に標的指向させるための手段を提供する。
【００１９】
特に、本発明の組成物は、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームを発現する少なくとも1つのPTMを含有する核酸分子を含み、該PTMは、細胞内で発現された標的プレmRNAとの、SMaRT(商標)を用いるトランススプライシングを受けた場合に、非アポトーシス性細胞をアポトーシスへと導くスプライシングアイソフォームを産生する。
【００２０】
本発明の一態様においては、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームをコードする核酸分子が提供され、ここで、該核酸分子は、a)アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームをコードする該核酸分子の結合を、細胞内で発現された標的プレmRNAに標的指向させる、1つまたは複数の標的結合ドメインを含み、ここで、該核酸分子は該細胞内の核スプライシング成分によって認識され、かつここで、該単離された核酸分子は標的プレmRNAに対して異種であるアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームをコードする。
【００２１】
本発明の別の態様では、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームPTMは、該PTMの結合を内因性の異種プレmRNAに標的指向させる1つもしくは複数の標的結合ドメイン；分岐点と、ピリミジントラクトと、3'スプライス受容部位とを含む3'スプライス領域、および/もしくは5'スプライス供与部位；該RNAスプライス部位を該標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；ならびに5'スプライス部位の片面もしくは両面に結合する1つもしくは複数の相補配列を含むセーフティ配列、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含む。
【００２２】
本発明の別の態様では、本発明の組成物は、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームを発現する少なくとも1つのPTMを含む核酸分子を含有し、ここで、該核酸分子は、細胞内の核スプライシング成分によって認識され、かつ該細胞内で豊富に発現される標的プレmRNA分子(例えば、アルブミン、apoA-1、カゼイン、アクチン、チューブリン、ミオシンおよびフィブロインを含む)と相互作用するように設計され、SMaRT(商標)を用いるトランススプライシングを受けた場合に、非アポトーシス性細胞をアポトーシスへと導く遺伝的スプライシングアイソフォームを発現する新規キメラRNA分子を産生する。
【００２３】
本発明の別の態様において、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームPTMは、該PTMの結合を、高度に発現された内因性の異種プレmRNA分子(例えば、アルブミン、apoA-1、カゼイン、アクチン、チューブリン、ミオシンおよびフィブロインを含む)に標的指向させる、1つもしくは複数の標的結合ドメイン；分岐点と、ピリミジントラクトと、3'スプライス受容部位とを含む3'スプライス領域、および/もしくは5'スプライス供与部位；該RNAスプライス部位を該標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；ならびに5'スプライス部位の片面もしくは両面に結合する1つもしくは複数の相補配列を含むセーフティ配列、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含む。
【００２４】
本発明の別の局面においては、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームを発現する少なくとも1つのPTMを含む細胞が提供され、ここで、該核酸分子は該細胞内の核スプライシング成分によって認識され、かつ標的異種プレmRNAまたは該細胞内で豊富に発現された異種標的プレmRNA分子(例えば、アルブミン、カゼイン、アクチン、チューブリン、ミオシンおよびフィブロインを含む)と相互作用するように設計され、SMaRT(商標)を用いるトランススプライシングを受けた場合に、非アポトーシス性細胞をアポトーシスへと導く遺伝的スプライシングアイソフォームを発現する新規キメラRNA分子を産生する。
【００２５】
本発明の細胞の別の態様では、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームPTMは、該PTMの結合を内因性の異種プレmRNAに標的指向させる1つもしくは複数の標的結合ドメイン；分岐点と、ピリミジントラクトと、3'スプライス受容部位とを含む3'スプライス領域、および/もしくは5'スプライス供与部位；該RNAスプライス部位を該標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；ならびに5'スプライス部位の片面もしくは両面に結合する1つもしくは複数の相補配列を含むセーフティ配列、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含む。
【００２６】
本発明の一態様では、前記細胞は、非アポトーシス性がん細胞であり、例えば、限定するものではないが、多発性骨髄腫、小細胞肺がん、前立腺がんおよび乳がんに関連したがん細胞を含む。あるいは、前記がんは以下からなる群より選択することができる：乳がん、神経膠腫、大腸がん、肺がん、小細胞肺がん、胃がん、肝臓がん、血液がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または眼内黒色腫、子宮肉腫、卵巣がん、直腸または結腸直腸がん、肛門がん、結腸がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、外陰がん、扁平上皮がん、膣がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、食道がん、小腸がん、内分泌がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織腫瘍、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓がん、尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、CNS腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、多形性膠芽細胞腫、原発性CNSリンパ腫、骨髄腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、ブドウ膜黒色腫、精巣がん、口腔がん、咽頭がん、小児新生物、白血病、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経膠腫、横紋筋芽細胞腫および肉腫。
【００２７】
本発明の別の態様では、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームを発現する少なくとも1つのPTMを含む核酸分子を発現する発現ベクターが提供され、ここで、該核酸分子は、a)該核酸分子の結合を、細胞内で発現された非アポトーシス誘導スプライシングアイソフォーム標的プレmRNAに標的指向させる、1つまたは複数の標的結合ドメイン；b)分岐点と、ピリミジントラクトと、3'スプライス受容部位とを含む3'スプライス領域；c) 3'スプライス領域を該標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；およびd)標的プレmRNAとトランススプライシングされるヌクレオチド配列をさらに含み、ここで、該核酸分子は該細胞内の核スプライシング成分によって認識される。
【００２８】
本発明の別の態様では、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームを発現する少なくとも1つのPTMを含む核酸分子を発現する発現ベクターが提供され、ここで、該核酸分子は、a)該核酸分子の結合を、細胞内で発現された非アポトーシス誘導スプライシングアイソフォーム標的プレmRNAに標的指向させる、1つまたは複数の標的結合ドメイン；b) 5'スプライス部位；c) 5'スプライス部位を該標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；およびd)標的プレmRNAとトランススプライシングされるヌクレオチド配列をさらに含み、ここで、該核酸分子は該細胞内の核スプライシング成分によって認識される。
【００２９】
本発明の上記態様のそれぞれにおいて、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームは、Bclファミリー遺伝子、FGFR2ファミリー遺伝子、p53aファミリー遺伝子、RAD51、サバイビン(survivin)ファミリー遺伝子(サバイビンおよびサバイビン2-B)、Bimファミリー遺伝子、Bcl-2ファミリー遺伝子、Apa F-1ファミリー遺伝子、プロカスパーゼファミリー遺伝子、Fasファミリー遺伝子、Rbファミリー遺伝子のアポトーシス誘導スプライシングアイソフォーム遺伝子産物、または既知のもしくは将来発見されるアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームのいずれか1つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００３０】
本発明のさらに別の局面では、非アポトーシス性細胞をアポトーシスへと導くための方法が提供され、該方法は、非アポトーシス性細胞に、スプライシングアイソフォームをコードする少なくとも1つのPTMを導入する段階であって、該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分によって認識される、段階；SMaRT(商標)を用いて、スプライシングアイソフォームをコードする少なくとも1つのPTMを、内因性の異種プレmRNAとトランススプライシングする段階を含み、ここで、スプライシングアイソフォームをコードする少なくとも1つのPTMと、内因性の異種プレmRNAとのトランススプライシングは、機能的な転写産物をもたらし、該転写産物はその後、非アポトーシス性細胞をアポトーシス性細胞へと誘導するスプライシングアイソフォームに翻訳される。
【００３１】
本発明の別の態様では、前記方法は、前記PTMの結合を標的指向させる段階をさらに含み、ここで、該PTMは、該PTMの結合を細胞の内因性異種プレmRNAに標的指向させる1つもしくは複数の標的結合ドメイン；分岐点と、ピリミジントラクトと、3'スプライス受容部位とを含む3'スプライス領域、および/もしくは5'スプライス供与部位；該RNAスプライス部位を該標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；ならびに5'スプライス部位の片面もしくは両面に結合する1つもしくは複数の相補配列を含むセーフティ配列、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００３２】
本発明のさらに別の態様では、非アポトーシス性細胞においてキメラRNA分子を生成するための方法が提供され、該方法は、該細胞内で発現された標的プレmRNAと、核スプライシング成分によって認識される核酸分子とを、該核酸分子の一部が標的異種プレmRNAの一部とトランススプライシングされて該細胞内でキメラRNAを形成する条件下で接触させる段階を含み、ここで、該核酸分子は、(a)該核酸分子の結合を該細胞内で発現された標的異種プレmRNAに標的指向させる1つまたは複数の標的結合ドメインであって、ヒトアルブミンプレmRNAを標的とする該標的結合ドメイン；(b)分岐点と3'スプライス受容部位とを含む3'スプライス領域；(c)3'スプライス領域を該標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および(d)標的プレmRNAとトランススプライシングされるヌクレオチド配列であって、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームをコードする該ヌクレオチド配列を含み、ここで、該スプライシングアイソフォームは非アポトーシス性細胞をアポトーシス性細胞へと誘導する。
【００３３】
本発明の方法の一態様では、前記スプライシングアイソフォームは少なくとも1つのアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームを含む。
【００３４】
本発明の方法の別の態様では、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームは、Bclファミリー遺伝子、FGFR2ファミリー遺伝子、p53aファミリー遺伝子、RAD51、サバイビンファミリー遺伝子(サバイビンおよびサバイビン2-B)、Bimファミリー遺伝子、Apa F-1ファミリー遺伝子、Mcl1ファミリー遺伝子、カスパーゼ2Lファミリー遺伝子、カスパーゼ-9ファミリー遺伝子、プロカスパーゼファミリー遺伝子、Fasファミリー遺伝子、ハースタチン(Herstatin)ファミリー遺伝子、Δ15HER2ファミリー遺伝子、Rac1ファミリー遺伝子、VGEF165bファミリー遺伝子、KLF6ファミリー遺伝子、Rbファミリー遺伝子のアポトーシス誘導スプライシングアイソフォーム遺伝子産物、これらの任意の組み合わせを含む。
【００３５】
本発明の方法のさらに別の態様では、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームは、Bcl XS、Mcl-1S、カスパーゼ-2L、カスパーゼ-9、サバイビン-2B、Fas、ハースタチン、Δ15HER2、Rac1、VEGF165b、p53、KLF6、およびRBM5のうちの少なくとも1つ、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００３６】
本発明の方法の一態様では、前記細胞は、非アポトーシス性がん細胞であり、例えば、限定するものではないが、多発性骨髄腫、小細胞肺がん、前立腺がんおよび乳がんに関連したがん細胞を含む。前記がんは以下からなる群より選択される：乳がん、神経膠腫、大腸がん、肺がん、小細胞肺がん、胃がん、肝臓がん、血液がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または眼内黒色腫、子宮肉腫、卵巣がん、直腸または結腸直腸がん、肛門がん、結腸がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、外陰がん、扁平上皮がん、膣がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、食道がん、小腸がん、内分泌がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織腫瘍、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓がん、尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、CNS腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、多形性膠芽細胞腫、原発性CNSリンパ腫、骨髄腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、ブドウ膜黒色腫、精巣がん、口腔がん、咽頭がん、小児新生物、白血病、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経膠腫、横紋筋芽細胞腫および肉腫。
【００３７】
本発明の方法の別の態様では、前記細胞は、例えば、限定するものではないが、Bcl-XLまたはその機能的誘導体を含む、非アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームを発現するがん細胞である。
【００３８】
本発明の方法の一態様では、前記細胞は、例えば、限定するものではないが、Bcl-XLまたはその機能的誘導体を含む、非アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームを発現しないがん細胞である。
【００３９】
本発明の組成物および方法の上記態様のそれぞれについて、いずれかの特定の作用機構に限定されるものではないが、Bcl XSスプライシングアイソフォームの誘導は、Bcl-XLスプライシングアイソフォームの産生をアンタゴナイズし、Bcl-2の産生をアンタゴナイズし、がんもしくはがん組織における腫瘍細胞量または組織量の有意な減少を引き起こすことによって、または化学療法薬に対するがんもしくはがん組織の感受性を増加させることによって、またはこれらの任意の組み合わせによって、アポトーシスを引き起こすと考えられる。
【００４０】
本発明の組成物および方法の上記態様のそれぞれについて、所望であれば、非常に豊富なまたは高度に発現されるプレmRNAを利用する態様の場合、スプライシングアイソフォームの細胞質標的指向化は、例えば、限定するものではないが、以下のi)またはii)により、達成することができる：i)前記PTMを、例えばチューブリン(エクソン1)もしくはアクチン(エクソン2)などの細胞質に豊富なまたは高度に発現されるタンパク質に標的指向させる；またはii)非常に豊富なまたは高度に発現されるプレmRNAによりコードされるタンパク質のリーダー配列は、膜貫通アンカードメイン(例えば、Santos, EB et al. Nature Med 15:338-344 March 2009に記載されるような、アミノ酸137〜212に対応するCD8膜貫通ドメイン)または当業者に公知の細胞質アンカードメインのいずれかを含めることによって、トランススプライシング反応から生じるキメラRNAが所望の膜貫通タンパク質または細胞質タンパク質を確実に生成するように、改変することができる。
【００４１】
本発明の方法の上記態様のそれぞれにおいて、トランススプライシングはSMaRTにより媒介される。別の態様では、トランススプライシングはグループIリボザイムにより媒介される。さらに別の態様では、トランススプライシングはグループIIリボザイムにより媒介される。
【００４２】
PTMの一般的な設計、構築および遺伝子操作、ならびに細胞内でトランススプライシング反応をうまく媒介するそれらの能力の実証は、米国特許第6,083,702号、第6,013,487号および第6,280,978号、ならびに特許出願第09/756,095号、第09/756,096号、第09/756,097号、第09/941,492号、米国特許出願公開第US 2006-0234247 A1号および第US 2006-0194317 A1号に詳細に記載されており、これらの各々の開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００４３】
トランススプライシングリボザイムの一般的な設計、構築および遺伝子操作、ならびに細胞内でトランススプライシング反応をうまく媒介するそれらの能力の実証は、米国特許第5,667,969号、第5,854,038号および第5,869,254号、ならびに特許出願第20030036517号に詳細に記載されており、これらの各々の開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００４４】
apoA-1または他のapoA-1変異体を発現するPTMの設計、構築および遺伝子操作、ならびに非常に豊富に発現されるプレRNA分子は、それぞれ、米国特許第7,968,334号および第7,871,795号に詳細に記載されており、これらの各々の開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００４５】
一態様では、本発明の上記組成物および方法のそれぞれについて、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームを発現するPTMは、例えば、限定するものではないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、コスミド、人工染色体(例：YAC)、プラスミド/ミニサークルベクター、またはこれらの任意の組み合わせを用いて、細胞内に導入され、ベクターそれ自体は、エレクトロポレーション、形質転換、形質導入、コンジュゲーション、トランスフェクション、感染、カチオン性脂質による膜融合、ウイルスベクター形質導入、DNA被覆マイクロプロジェクタイルによる高速ボンバードメント、リン酸カルシウム-DNA沈殿物とのインキュベーション、単一の細胞への直接マイクロインジェクション、またはこれらの任意の組み合わせを介して送達される。
【００４６】
本発明の組成物および方法の上記態様のそれぞれにおいて、PTMの発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーターもしくは組織特異的プロモーター、またはこれらの組み合わせによって制御することができ、また、単一のベクター中の1つまたは複数の異なるPTMの発現を駆動することができる、双方向性であり得る。本発明の特定の態様において、異種プロモーターはウイルス、ヒトおよび/もしくは合成プロモーター、またはこれらの組み合わせを含む。一態様では、異種ウイルスプロモーターは、マウス乳腺腫瘍ウイルス(MMTV)プロモーター、モロニーウイルス、トリ白血病ウイルス(ALV)、サイトメガロウイルス(CMV)前初期プロモーター/エンハンサー、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、アデノ随伴ウイルス(AAV)プロモーター、アデノウイルスプロモーター、およびエプスタインバーウイルス(EBV)プロモーター、レンチウイルスプロモーター、またはこれらの任意の組み合わせを含む。別の態様では、異種ヒトプロモーターは、アポリポタンパク質Eプロモーター、アルブミンプロモーター、ヒトユビキチンCプロモーター、ヒト組織特異的プロモーター、例えば肝臓特異的プロモーター(例：HCR-hATT)、前立腺特異的抗原(PSA)プロモーター、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーター、伸長因子-1α(EF-1α)プロモーター、デクチン-2プロモーター、HLA-DRプロモーター、ヒトCD4(hCD4)プロモーター、またはこれらの任意の組み合わせを含む。さらに別の態様では、合成プロモーターは、米国特許第6,072,050号に記載されるプロモーターを含み、その内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００４７】
上記態様のそれぞれにおいて、本発明の組成物および方法は、非常に豊富なまたは高度に発現されるプレmRNA、例えば、限定するものではないが、カゼイン、ミオシンおよびフィブロイン、腫瘍に特異的なもしくは腫瘍に関連した転写産物、微生物もしくは自己抗原に関連した転写産物、ウイルスもしくは酵母に関連した転写産物などを標的とする、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームPTMを含むことができる。
【００４８】
本発明のさらなる一局面では、上記態様のそれぞれにおいて、本発明の組成物および方法は、疾患または症状に直接関与するスプライシングアイソフォームを特異的に標的とするスプライシングアイソフォームPTMを含むことができるが、以下のような明示的に意図された消極的限定に基づくただし書きを有する：i)そのようなスプライシングアイソフォームは、一般的にいずれかの疾患兆候(例えば、限定するものではないが、アルツハイマー病、ニーマン・ピック病、進行性核上性麻痺、および大脳皮質基底核変性症)に関与するTauアイソフォーム(およびその機能的誘導体)、または多くの神経変性疾患においてニューロン内病変部に蓄積するタウタンパク質をコードするMAPT遺伝子の変異によって引き起こされる、Tauアイソフォームが第17染色体に連鎖した、特にパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症(FTDP-17)に関与するTauアイソフォーム(およびその機能的誘導体)を明確に除外する(Rodriguez-Martin et al., 2009, Human Mol. Genet. 18: 3266-3273)；およびii)本明細書に開示されるPTMベースの発明は、例えば、米国特許第6,013,487号に記載されるような細胞死誘導ジフテリア毒素またはそのサブユニットを含む自殺遺伝子を発現するPTMを用いてがんまたは遺伝性、自己免疫性もしくは感染性疾患を治療するためのSMaRTの使用を明確に除外する。
【００４９】
本発明の別の局面では、本発明の上記組成物の各々は、生理学的に許容される担体中に製剤化することができる。
【００５０】
いくつかの例示的な態様のこれらおよび他の局面は、以下の説明および添付の図面と併せて考慮するとき、より良く認識され、かつ理解されるであろう。しかし、以下の説明は、好ましい態様とその多数の具体的な詳細を示しているが、例示として提供され、限定としてではないことを理解すべきである。本発明の精神から逸脱することなく、その態様の範囲内で多くの変更および修飾を行うことができる。さらなる特徴は添付の図面を参照することによって理解することができ、これらの図面を以下の詳細な説明および実施例と併せて読むべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１Ａ】図1は、Bcl Xスプライシングアイソフォームのトランススプライシングを媒介するためのSMaRT(商標)の使用を模式的に示す。図1Aは、3'エクソン置換の例を示す。
【図１Ｂ】図1は、Bcl Xスプライシングアイソフォームのトランススプライシングを媒介するためのSMaRT(商標)の使用を模式的に示す。図1Bは、5'エクソン置換の例を示す。
【図１Ｃ】図1は、Bcl Xスプライシングアイソフォームのトランススプライシングを媒介するためのSMaRT(商標)の使用を模式的に示す。図1Cは、二重トランススプライシングを介する内部エクソン置換の例を示す。
【図２】図2は、Bcl X遺伝子アイソフォームPTMを発現するレンチウイルスベクターを模式的に示す。図2Aは、3'Bcl XS遺伝子アイソフォームPTMを発現するレンチウイルスベクターの模式図を示す。図2Bは、5'Bcl XS遺伝子アイソフォームPTMを発現するレンチウイルスベクターの模式図を示す。図2Cは、二重トランススプライシングBcl XS遺伝子アイソフォームPTMを発現するレンチウイルスベクターの模式図を示す。
【図３】図3は、アルブミンプレmRNA標的などの非常に豊富な転写産物を標的とし、かつ3'PTMを用いてBcl-XSアポトーシス促進性mRNAを生成する例を模式的に示す。
【００５２】
図面に示された図形は縮尺通りに描かれておらず、そして特定のセグメントまたは機能的要素の相対的なサイズは対応する配列の長さ(例えば、塩基対の数)に必ずしも比例しない。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
発明の詳細な説明
アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームまたはその変異体をコードするPTM
本発明は、スプライソソームにより媒介される標的指向性RNAトランススプライシングを介して新規核酸分子を生成するための組成物および方法に関する。本発明の組成物は、天然の標的プレmRNA分子(プレmRNA)と相互作用し、かつ新規キメラRNA分子(キメラRNA)の生成をもたらすスプライソソームトランススプライシング反応を媒介するように設計された、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームのプレトランススプライシング分子(PTM)を含む。本発明の方法は、本発明のアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームPTMと天然の標的プレmRNAとを、該アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームPTMの一部が該天然のプレmRNAとスプライシングされて新規キメラRNAを形成する条件下で接触させる段階を包含する。本発明のアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームPTMは、トランススプライシング反応から得られる新規キメラRNAが健康に良い効果を与えるタンパク質をコードし得るように、遺伝子操作される。一般的に、標的プレmRNAは、それが特定の細胞型内で発現される、という理由で選択され、それによって、新規キメラRNAの発現を、選択された細胞型に標的指向させるための手段を提供する。例えば、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームPTMは、アルブミンプレmRNAなどの、肝臓で豊富に発現されるプレmRNAを標的とすることができる。
【００５４】
本発明の上記アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームPTMの組成物および本明細書に詳述される同PTMを使用する方法の各態様において、少なくとも1つのPTMによりコードされるアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームはまた、特に、その誘導体、断片または改変体をも包含し、こうした誘導体、断片または改変体は、トランススプライシングされた場合に、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームの発現を引き起こすか、またはアルブミンなどの他の非常に豊富に発現されるタンパク質をアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームの機能を生み出すように変換するものである。天然の遺伝子型の対立遺伝子変異の結果であるか、または人工的に遺伝子操作されており、かつトランススプライシングされた場合にアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームの発現を引き起こすか、またはアルブミンなどの他の非常に豊富に発現されるタンパク質をアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームの機能を生み出すように変換する、本明細書に記載されるアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームPTMのありとあらゆるヌクレオチド変化およびその結果生じるアミノ酸多型または変形は、本発明の範囲内であることが意図される。
【００５５】
したがって、少なくとも1つのPTMによりコードされるアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームの誘導体、断片または改変体は、1個または複数個のアミノ酸残基の置換、付加または欠失が少なくとも1つのPTMによりコードされるアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームに導入されるように、1個または複数個のヌクレオチドの置換、付加または欠失をアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームのヌクレオチド配列に導入することによって、作製することができる。変異は、部位特異的変異誘発およびPCR媒介変異誘発などの、標準的な技術によって導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換が1個または複数個の予測される非必須アミノ酸残基において行われる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖をもつアミノ酸残基で置換されることである。類似の側鎖をもつアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。こうしたファミリーには、塩基性側鎖(例：リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例：アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例：グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分岐側鎖(例：トレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖(例：チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)をもつアミノ酸が含まれる。あるいは、変異は、例えば飽和変異誘発によって、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームPTMのコード配列の全部または一部に沿ってランダムに導入することができ、得られた変異体は、SMaRT(商標)を用いるトランススプライシングを受けた場合にアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームの発現を引き起こすか、またはアルブミンなどの他の非常に豊富に発現されるタンパク質をアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームの機能を生み出すように変換する変異体を同定するように、生物学的活性をスクリーニングすることができる。
【００５６】
アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームをコードするPTMは、例えば、限定するものではないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベースのベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、プラスミド/ミニサークルベクター、ウイルスベクター形質導入、エレクトロポレーション、形質転換、形質導入、コンジュゲーション、トランスフェクション、感染、カチオン性脂質による膜融合、DNA被覆マイクロプロジェクタイルによる高速ボンバードメント、リン酸カルシウム-DNA沈殿物とのインキュベーション、または単一の細胞への直接マイクロインジェクションを用いて、細胞内に導入される。アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームPTMは、分裂または非分裂体細胞内で発現される内因性のプレmRNAを標的とし、そしてトランススプライシング後に、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームの発現を引き起こすか、またはアルブミンなどの他の非常に豊富に発現されるタンパク質をアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームの機能を生み出すように変換する。
【００５７】
別の態様では、例えば、レンチウイルスベクター(SINベースのまたはインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター；以下でより具体的に説明される)は、図2に示すように、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームをコードするPTMを発現させるために使用することができる。さらに別の態様では、アデノ随伴ウイルスベクター、例えばAAV血清型1-11は、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームをコードするPTMを発現させるために使用することができる。あるいは、例えば、肝細胞などの特定の組織が標的とされるような場合には、キメラアデノ随伴ベクター、例えばAAV-DJ (Grim et al., 2008, J Virol. 82: 5887; その全内容は参照により本明細書に組み入れられる)を用いて、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームをコードするPTMを発現させることができる。さらに他の態様では、本出願人の同時係属中の国際特許出願第PCT/US2009/054378号(その内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる)により具体的に記載されるレンチウイルス-アデノ随伴ハイブリッドベクターがアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームをコードするPTMに用いられる。
【００５８】
以下、特に添付の図面を参照すると、本発明の一態様では、Bcl XL抗アポトーシス性アイソフォームを発現しているがん細胞における一般的なベクターを用いたBcl XSアポトーシス促進性スプライシングアイソフォームPTMの発現の模式図が図1A、1Bおよび1Cに示され、より具体的には、以下の実施例1に詳述される。本発明のさらに別の態様では、レンチウイルスベクターを用いたBcl XSアポトーシス促進性スプライシングアイソフォームPTMの発現の模式図が図2に示され、より具体的には、以下の実施例2に詳述される。さらに別の態様では、アルブミンを標的とするBcl XSアポトーシス促進性スプライシングアイソフォームPTMの発現が図3に示され、より具体的には、以下の実施例3に詳述される。
【００５９】
本発明のPTMは、内因性のプレmRNAに特異的に結合するように設計された標的結合ドメイン；分岐点と、ピリミジントラクトと、3'スプライス受容部位とを含む3'スプライス領域、および/または5'スプライス供与部位；ならびに該RNAスプライス部位を該標的結合ドメインから分離するスペーサー領域を含む。さらに、本発明のPTMは、トランススプライシングされた場合にアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームの発現を引き起こすか、またはアルブミンなどの他の非常に豊富に発現されるタンパク質をアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームの機能を生み出すように変換する、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームをコードする任意のヌクレオチド配列を含むように操作することができる。
【００６０】
好ましい態様では、翻訳されるアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームPTMは、SMaRT(商標)を用いるトランススプライシングを受けた場合に、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームの発現を引き起こすか、またはアルブミンなどの他の非常に豊富に発現されるタンパク質をアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームの機能を生み出すように変換する。本発明の方法は、本発明のPTMと、天然の内因性プレmRNAとを、該PTMの一部が該天然の内因性プレmRNAの一部とトランススプライシングされて新規キメラmRNAを形成する条件下で接触させる段階を包含する。
【００６１】
したがって、本発明のPTMは、(i)該PTMの結合をプレmRNAに標的指向させる1つまたは複数の標的結合ドメイン；(ii)分岐点と、ピリミジントラクトと、3'スプライス受容部位とを含む3'スプライス領域、および/または5'スプライス供与部位；ならびに(iii)該RNAスプライス部位を該標的結合ドメインから分離するスペーサー領域を含む。さらに、上述したように、PTMは、トランススプライシングされた場合にアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームの発現を引き起こすか、またはアルブミンなどの他の豊富に発現されるタンパク質をアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームを生成するように変換する、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォーム(例えば、Bclファミリー遺伝子、FGFR2ファミリー遺伝子、p53ファミリー遺伝子、RAD51、サバイビンファミリー遺伝子(サバイビンおよびサバイビン2-B)、もしくはRbファミリー遺伝子のアポトーシス誘導スプライシングアイソフォーム遺伝子産物、またはこれらの任意の組み合わせを含む)をコードする任意のヌクレオチド配列を含むように操作される。
【００６２】
PTMの標的結合ドメインは、少なくとも15〜30ヌクレオチドの1つまたは2つの結合ドメインを含むことができる；または選択された内因性プレmRNAの標的領域に相補的でかつアンチセンス方向の、最長で数百ヌクレオチドの、米国特許公開第US 2006-0194317 A1号(その内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる)に記載されるような、長い結合ドメインを有する。これは結合の特異性を付与し、かつ核のスプライソソームプロセシング機構が、PTMの一部を内因性プレmRNAの一部とトランススプライシングすることができるように、内因性プレmRNAを空間にしっかりと固定する。第2の標的結合領域は、該分子の3'末端に配置することができ、本発明のPTMに組み込むことができる。絶対的な相補性が、好ましいものの、必須ではない。本明細書で言及される、内因性プレmRNAの一部に「相補的」な配列とは、内因性プレmRNAとハイブリダイズして安定な二重鎖を形成することができるように十分な相補性を有する配列を意味する。これは、アンチセンスおよび関連するスプライススイッチングオリゴヌクレオチドと比べて、本発明のRNAトランススプライシング技術が有する重要な利点である。ハイブリダイズする能力は相補性の程度と核酸の長さの両方に依存する(例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照されたい)。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、それはRNAとの塩基ミスマッチを多く含むことができ、しかも依然として安定な二重鎖を形成することができる。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を測定するための標準的な手法を用いることによって、ミスマッチの許容程度を確認することができる。スプライシングアイソフォーム標的特異的結合ドメインの例としては、例えば、限定するものではないが、以下が挙げられる：i)ヒトbcl-211遺伝子(Ensemble Gene ID: BCL2L1 - ENSG00000171552)Bcl-211-rBD1: 120bp, 結合領域-400から-281ヌクレオチド, Ensemble転写産物ID: BCL2L1-002, ENST00000376055、以下のSEQ ID NO.1に示される：
2014525754.tif 000003
；ヒトbcl-211遺伝子Bcl-211-rBD2: 120bp, 結合領域-530から-411ヌクレオチド, Ensemble転写産物ID: BCL2L1-002, ENST00000376055、以下のSEQ ID NO.2に示される：
2014525754.tif 000004
；ヒトアルブミンPTM標的特異的結合ドメイン、以下の実施例3でSEQ ID NO.3に示される；およびii)マウスアルブミンPTM標的特異的結合ドメイン、以下の実施例3でSEQ ID NO.4に示される。
【００６３】
結合はまた、他のメカニズムを介して、例えば、三重らせん形成またはタンパク質/核酸相互作用(例えば、PTMが、特定のRNA結合タンパク質、すなわち特定の標的内因性プレmRNAに結合したタンパク質を認識するように操作される)を介して、達成することができる。あるいは、本発明のPTMは、二次構造、例えばRNA分子内のヌクレオチド間の分子内塩基対合から生じるヘアピン構造を認識するように設計することができる。
【００６４】
PTM分子はまた、分岐点と、ピリミジントラクトと、3'スプライス受容AG部位とを含む3'スプライス領域、および/または5'スプライス供与部位を含有する。RNAスプライシングに用いられる5'スプライス供与部位および3'スプライス領域のコンセンサス配列は当技術分野で周知である(Moore, et al., 1993, The RNA World, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p.303-358を参照されたい)。また、5'スプライス供与部位および3'スプライス領域として機能する能力を維持する改変型コンセンサス配列は、本発明の実施に使用することができる。簡単に説明すると、5'スプライス部位のコンセンサス配列は、AG/GURAGU(ここでA＝アデノシン、U＝ウラシル、G＝グアニン、C＝シトシン、R＝プリン、および/＝スプライス部位)である。3'スプライス部位は3つの別個の配列要素からなる：分岐点または分岐部位、ポリピリミジントラクト、および3'コンセンサス配列(YAG)。哺乳動物における分岐点のコンセンサス配列は、YNYURAC(Y＝ピリミジン)である。下線のAは分岐形成部位である。ポリピリミジントラクトは分岐点とスプライス受容部位との間に位置し、分岐点の利用および3'スプライス部位の認識のために重要である。
【００６５】
スプライス部位を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域もまた、PTMに含まれる。スペーサー領域は、スプライシングされていないPTMのいかなる翻訳もブロックする終止コドン、および/または標的プレmRNAとのトランススプライシングを促進する配列などの特徴をもつことができる。
【００６６】
本発明の好ましい態様では、結合ドメインの「セーフティ」設計もまた、非特異的トランススプライシングを防止するために、スペーサー、結合ドメイン、またはPTMの他の位置に組み込まれる。スペーサー配列は、比較的弱い相補性によってPTMの3'および/または5'スプライス部位の要素を覆うPTMの領域であり、それによって非特異的トランススプライシングを防止する。PTMは、PTMの結合/標的指向部分がハイブリダイゼーションした場合に、3'および/または5'スプライス部位が曝露されて、十分に活性になるように設計される。「セーフティ」配列は、PTMの分岐点、ピリミジントラクト、および/または3'スプライス部位(スプライシング要素)の片面または両面に弱く結合するか、あるいはスプライシング要素それ自体の一部に結合することができる、シス配列の1つまたは複数の相補的ストレッチからなる(または第2の別個の核酸鎖であり得る)。この「セーフティ」配列の結合は、スプライシング要素が活性になるのを防止する(すなわち、U2 snRNPまたは他のスプライシング因子がPTMスプライス部位認識要素に結合するのをブロックする)。「セーフティ」配列の結合は、標的プレmRNAへのPTMの標的結合領域の結合によって破壊され、こうしてPTMスプライシング要素を露出して活性化する(標的内因性プレmRNAとトランススプライシングするためにそれらを利用できるようにする)。
【００６７】
追加の特徴は、翻訳可能なタンパク質をコードするヌクレオチド配列の後または前のいずれかで、PTM分子に付加することができ、そうした特徴には、例えば、スプライシングを高めるためのポリアデニル化シグナルもしくは5'スプライス配列、追加の結合領域、「セーフティ」配列の自己相補的な領域、追加のスプライス部位、または該分子の安定性を調節しかつ分解を防ぐための保護基などが含まれる。本発明のPTMに組み込むことができる、さらなる特徴には、スプライシングされていないプレmRNAの発現を防止するための、結合ドメインとスプライス部位との間の領域における終止コドンまたは他の要素が含まれる。本発明の別の態様では、PTMは、3'標的イントロンまたはエクソンへの結合を促進するために、かつ固定の真正(authentic)シス5'スプライス部位(U5および/またはU1結合部位)をブロックするために、翻訳可能なタンパク質をコードするヌクレオチド配列から下流に第2のアンチセンス結合ドメインを追加して作製することができる。また、トランススプライシングされた産物の発現のための二重トランススプライシング反応を必要とするPTMを作製することも可能である。このようなPTMは、RNA修復のために有用であり得る内部エクソンを置き換えるために使用することができる。3'ヘアピン構造、環状化RNA、ヌクレオチド塩基修飾、または合成類似体などのさらなる要素は、核局在化およびスプライソソーム取り込み、ならびに細胞内安定性を促進するまたは容易にするために、PTMに組み込むことができる。
【００６８】
本発明のPTMは、例えば体細胞または生殖細胞などの標的細胞において、新規mRNAまたは新規キメラmRNAのいずれかを産生するように設計された方法で使用することができる。本発明の方法は、標的細胞に、当業者によって用いられる任意の形態(例えば、RNA分子、RNAベクター、またはRNA分子に転写されるDNAベクター)であり得るPTMを送達することを含み、ここで、該PTMは、内因性のプレmRNAに結合し、かつトランススプライシング反応を媒介し、その結果、内因性プレmRNAの一部とスプライシングによりつなぎ合わされたPTM分子の一部を含むRNAまたはキメラRNAの形成をもたらす。
【００６９】
本発明のPTMは、ウイルスベクター(例：レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス(「AAV」)、アデノウイルス、ポックスウイルスベクター、EBV、HSV、狂犬病ウイルス、AAVとレンチウイルスベクターを含むハイブリッドベクターなど)、または非ウイルスベクター(例：例えばミニサークルDNAベクター(Chen et al., 2005, Hum Gene Ther 16:126-131)を含むプラスミドDNAベクター、トランスポゾン送達システム、ファージ、またはPTM RNA分子など)を用いて送達することができる。
【００７０】
本発明は、Bcl遺伝子の具体的な例を用いて本明細書に例示されているが、1つまたは複数の疾患または障害の原因となる他の選択的にスプライシングされる遺伝子を、本発明の組成物および方法によって調節することができる。特に、本明細書に例示されたBcl遺伝子に関連するBcl-xL [Bcl-2由来タンパク質BaxおよびBakをアンタゴナイズしかつ阻害することによって抗アポトーシス性であり、腫瘍に血管を形成する血管成長を誘導し(血管新生)、かつ化学療法剤耐性を促進する]およびBcl-xS [Bcl-xLおよびBcl-2タンパク質に直接結合して、それを阻害またはアンタゴナイズすることによってアポトーシス促進性であり、かつUVおよびγ照射ならびに化学療法剤(エトポシド、5-フルオロウラシル、シスプラチン、5-フルオロデオキシウリジンおよびドキソルビシン、またはこれらの任意の組み合わせを含む)による治療に対するがん細胞の感受性を促進する]スプライシングアイソフォームに加えて、異なる機能を有するスプライス変異体を発現するがん細胞の増殖、生存および化学療法剤耐性に関与する選択的にスプライシングされる遺伝子の他の例としては、例えば、限定するものではないが、以下が挙げられる：Mcl-1遺伝子(Mcl-1Lアイソフォームは抗アポトーシス性で、化学療法剤耐性を促進する；およびMcl-1Sアイソフォームはアポトーシス促進性で、Mcl-1Lをアンタゴナイズする)；カスパーゼ-2遺伝子(カスパーゼ-2Lアイソフォームはアポトーシス促進性であり、カスパーゼ-2Sアイソフォームは抗アポトーシス性で、化学療法剤から保護する)；カスパーゼ-9遺伝子(カスパーゼ-9アイソフォームはアポトーシス促進性であり、カスパーゼ-9Bアイソフォームは抗アポトーシス性で、アポトソーム形成を阻害する)；サバイビン遺伝子(サバイビンアイソフォームは抗アポトーシス性であり、サバイビン-2Bアイソフォームはアポトーシス促進性で、サバイビンをアンタゴナイズする)；Fas遺伝子(Fasアイソフォームはアポトーシスシグナル伝達を媒介する；およびFasExo8DelアイソフォームはFas媒介アポトーシスを阻害し、かつ特定のがんにおいてアップレギュレートされる)；HER2遺伝子(HER2アイソフォームはがん細胞の増殖および生存を促進する；ハースタチン(Herstatin)アイソフォームはアポトーシス促進性で、HER2の可溶性ドミナントネガティブ阻害剤である；およびΔ15HER2アイソフォームはアポトーシス促進性で、HER2の可溶性ドミナントネガティブ阻害剤である)；Rac1遺伝子(Rac1アイソフォームは細胞増殖および細胞骨格再構築を調節する；およびRac1bアイソフォームはGDP/GTP交換の速度を増加させ、かつ構成的活性化をもたらし、培養中の細胞を形質転換し、腫瘍組織においてもっぱら発現される)；VEGF遺伝子(VEGFAアイソフォームはVEGF受容体1および2の活性化を通して血管新生を促進し、多くのがんでアップレギュレートされる；およびVEGF165bアイソフォームはVEGF受容体2の競合的阻害を通して血管新生を阻害する)；p53遺伝子(p53アイソフォームは腫瘍抑制因子である；および転写因子p47アイソフォームはp53腫瘍抑制因子をアンタゴナイズする)；KLF6遺伝子(KLF6アイソフォームは腫瘍抑制因子であり、転写因子KLF6-SV1アイソフォームはKLF6をアンタゴナイズし、かつ特定のがんでアップレギュレートされる)；Bim遺伝子アイソフォーム(BimLは抗アポトーシス性であり、Bimsはア���トーシスを促進することができる)；およびRBM5スプライシングに関連する遺伝子アイソフォーム、またはこれらの任意の組み合わせ。
【００７１】
上記に示されるがん関連スプライシングアイソフォームに加えて、異なる機能を有するスプライス変異体を発現する疾患または障害に関与する遺伝子の他の例としては、例えば、限定するものではないが、以下が挙げられる：脊髄性筋萎縮症(SMA)のSMN2スプライシング、網膜色素変性症のPRPF31スプライシング、網膜色素変性症のPRPF8スプライシング、網膜色素変性症のHPRP3スプライシング、網膜色素変性症のPAP1スプライシング、軟骨毛髪形成不全症(劣性)のRMRPスプライシング、筋萎縮性側索硬化症(ALS)のTARDBPスプライシング、またはこれらの任意の組み合わせ。
【００７２】
レンチウイルスベクター
上述した本発明のPTMを発現させるために、多くの入手可能なベクターシステムのどれを使用してもよいが、以下はレンチウイルスベクターを用いたアポトーシス誘導PTMの発現のより具体的な説明である。
【００７３】
別の好ましい態様では、本発明の上記組成物および方法のそれぞれの場合に、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームを発現するPTMは、例えば、特定のレンチウイルスベクター構築物(例えば、限定するものではないが、組込み可能なLV、組込み欠損LV、自己不活性化LV、アデノウイルス-LVハイブリッド、アデノ随伴ウイルス-LVハイブリッド、またはこれらの任意の組み合わせを含む)を用いて、細胞に導入される。
【００７４】
本発明の別の態様では、本発明のLV-PTMのレンチウイルスベクターには、限定するものではないが、霊長類に感染するウイルス(HIV-1、HIV-2、サル免疫不全ウイルス(SIV))および非霊長類に感染するウイルス(ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ビスナ・マエディウイルス(VV)、ジェンブラナ(Jembrana)病ウイルス(JDV))に分けることができるレンチウイルスが含まれる。
【００７５】
本発明のさらに別の局面において、レンチウイルスベクターが発現のために使用されるような場合には、本発明は、本発明のアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームPTM構築物を作製するためのパッケージング細胞株、およびパッケージング細胞株を作製する方法を提供する。一態様では、組換えレンチウイルスパッケージング細胞を産生する方法が提供され、該方法は、細胞に、該パッケージング細胞内で発現可能な核酸、形質導入能力のあるウイルス様粒子を産生する核酸配列、および該パッケージング細胞内で関心対象の配列を発現可能な少なくとも1つの核酸分子を導入することを含み、ここで、該パッケージング細胞は、関心対象の核酸配列を発現する、形質導入能力のあるウイルス様粒子を産生する。
【００７６】
上記のレンチウイルスベクター、本発明のアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームPTM構築物を発現する該レンチウイルスベクターを含有する薬学的組成物、および該レンチウイルスベクターを使用する方法のそれぞれにおいて、レンチウイルスベクターは、例えば、限定するものではないが、以下の1つまたは複数をさらに含む：機能的に活性なレンチウイルスRNAパッケージング要素をコードする核酸配列、機能的な中央ポリプリントラクト(cPPT)、中央終結配列(CTS)および3'LTR近位ポリプリントラクト(PPT)をコードする核酸配列、および/または非タンパク質もしくはタンパク質ベースのマーカーもしくはタグをコードする核酸配列。特定の態様では、本発明のレンチウイルスベクターは、図2に示したレンチウイルスベクター構築物の1つもしくは複数、またはそれらの任意の組み合わせを含む。図2は、本発明のLV PTM構築物の非限定的な例を示す。
【００７７】
特に、本発明のLV-PTM構築物は、5'LTRおよび3'LTR；該5'LTRに機能的に連結された第1の核酸配列(本明細書では「ペイロード」(payload)ともいう)；ならびに該5'LTRに機能的に連結された第2の核酸配列を含み、ここで、第1の核酸配列および第2の核酸配列の転写は該5'LTRにより駆動される。「ペイロード」は、ウイルス産生の間にレンチウイルスベクターのRNAバージョンをパッケージングするために必要なパッケージングシグナルとは区別されるベクターの部分である。特定の態様では、最小パッケージング配列を使用することができる。
【００７８】
本発明のLV-PTMベクターは、機能的に活性なレンチウイルスRNAパッケージング要素をコードする核酸配列をさらに含む。全長レンチウイルスRNAは非共有結合二量体としてウイルス粒子に選択的に組み込まれる。ウイルス粒子へのRNAパッケージングは、RNAとGagタンパク質のヌクレオキャプシドタンパク質(NC)ドメインとの間の特異的相互作用に依存する。自然界では、ウイルスキャプシドへのHIVゲノムRNAの組込み(エンキャプシデーション(encapsidation)という)は、Gag開始コドンのすぐ上流に位置しかつゲノムパッケージングに重要な4つのステムループ構造(SL1〜SL4)に折りたたまれた、いわゆるPsi領域を必要とする。特に、SL1は、キッシング(kissing)複合体の形成(おそらくRNAのビリオンパッケージングの前提条件)を介してインビトロRNA二量体化を媒介するGCリッチなループである、二量体化開始部位(DIS)を含有する。追加のシス作用性配列もまた、RNAパッケージングに寄与することが示されている。これらの要素のいくつかは、SL4を含めて、Gag遺伝子の最初の50ヌクレオチド(nt)に位置するのに対し、その他の要素は、スプライス供与部位(SD1)の上流に位置し、実際には、SL1の約240nt上流を含む、ゲノムの最初の350〜400ntをカバーするより大きな領域にマッピングされる。SL1-4領域は、RNAパッケージングに不可欠の単純な配列の一例である。その他のこうした配列は当業者に公知である。
【００７９】
LV-PTM構築物はまた、機能的な中央ポリプリントラクト(cPPT)/cTSおよび3'LTR近位ポリプリントラクト(PPT)をコードする核酸配列を含む。HIVと他のレンチウイルスは、当技術分野で知られているように、非分裂細胞内で複製するというユニークな特性を有する。この特性は、ウイルスDNAが宿主細胞の核膜を通過することを可能にする核内輸送経路の使用に依存している。HIV逆転写では、プラス鎖合成の中央の開始および終了に連続する中央鎖置換イベントがプラス鎖オーバーラップ、つまり中央DNAフラップを作り出す。この中央DNAフラップは、HIV逆転写の間に中央ポリプリントラクト(cPPT)と中央終結配列(CTS)によってシスで制御された中央鎖置換イベントと共に、2つの別個の半ゲノム断片によって作成された三本鎖DNAの領域である。すべてのレンチウイルスゲノムに存在する、ポリプリントラクトシス活性配列(cPPT)の中央コピーは、下流プラス鎖の合成を開始する。3'PPTで開始された上流プラス鎖セグメントは、鎖転移の後、ゲノムの中央まで進み、別個の鎖置換イベント後に終了する。HIV逆転写のこの最後のイベントは、中央終結配列(CTS)によって制御される。
【００８０】
LV-PTMベクターでは、ペイロードの転写は5'LTRにより駆動される。5'LTRは、全長の抗原配列をコードする核酸を含むペイロードの転写、ならびにパッケージング配列の転写を駆動するのに十分な基礎活性を有する。5'LTRは、当技術分野で知られているような、HIVの種々の株およびクレードに由来し、強力な基礎プロモーター様機能について最適化することができる。特に、HIV-1クレードE由来の5'LTRは、強力な基礎プロモーター活性を示すことができる。HIVのさまざまな株およびクレードは当技術分野で公知であり、本発明のレンチウイルスPTMベクターを作製するために使用され得る。それらには、例えば、限定するものではないが、以下が挙げられる：HIV-1グループ：M(メジャー)(A、B、C、D、E、F、G、H、I、およびJ)；O(アウトライアーまたは「アウトグループ」)、これはカメルーン、ガボン、およびフランスで現在見出される比較的まれなグループである；およびNと指定された第3のグループ(新グループ)、ならびにこれらのいずれかの循環組換え形態。5'LTRはさらに、ペイロードの発現を駆動する。HIV Revタンパク質は、哺乳動物細胞においてスプライシングされていないまたは部分的にスプライシングされたウイルス転写産物の核から細胞質への輸送を指令する。RevはRNA結合ドメインを含有し、該ドメインは標的転写産物上に存在するRREに結合する。搬出活性は、核外搬出シグナルとして同定された、遺伝学的に定義されたエフェクタードメインによって媒介される。
【００８１】
本発明のLV-PTM構築物は、少なくとも1つの、必要に応じて2つ以上の、関心対象のヌクレオチド配列(第2のPTM、第3のPTMなど)を含むことができる。2つ以上の関心対象のヌクレオチド配列を発現させるためには、ベクターゲノム内に2つ以上の転写単位が、関心対象の各ヌクレオチド配列に対して1つずつ、存在し得る。こうした場合には、ポリシストロン性(または本明細書で用いるとき「マルチシストロン性」)のメッセージ中の第2の(および後続の)コード配列の翻訳のために1つまたは複数の内部リボソーム侵入部位(IRES)またはFMDV 2A様配列を使用することが好ましい(Adam et al., 1991, J. Virol. 65:4985；その全内容は参照により本明細書に組み入れられる)。IRES/2Aはウイルス起源(例えば、EMCV IRES、PV IRES、またはFMDV 2A様配列など；その全内容は参照により本明細書に組み入れられる)または細胞起源(例えば、限定するものではないが、FGF2 IRES、NRF IRES、Notch 2 IRESまたはEIF4 IRESなど)であってよい。
【００８２】
さらに、本発明のLV-PTM構築物の特定の態様では、関心対象の第2のヌクレオチド配列または「ペイロード」配列はまた、以下をコードするヌクレオチド配列を含むことができる：酵素、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ホルモン、抗体、抗酸化分子、操作された免疫グロブリン様分子、一本鎖抗体、融合タンパク質、免疫共刺激分子、免疫調節分子、標的タンパク質のトランスドミナントネガティブ変異体、毒素、条件付き毒素(conditional toxin)、抗原、腫瘍抑制タンパク質および成長因子、膜タンパク質、血管新生促進および抗血管新生タンパク質およびペプチド、血管作動性タンパク質およびペプチド、抗ウイルスタンパク質、ならびにこれらの誘導体(例えば、結合されたレポーター基を有するもの)。関心対象のヌクレオチド配列はまた、プロドラッグ活性化酵素をコードすることもできる。研究の場で使用される場合、関心対象のヌクレオチド配列はまた、例えば、限定するものではないが、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、または抗生物質(例えば、とりわけ、アンピシリン、ネオマイシン、ブレオマイシン、ゼオシン、クロラムフェニコール、ハイグロマイシン、カナマイシンなど)に対する耐性遺伝子などの、レポーター遺伝子をコードすることができる。関心対象のヌクレオチド配列はまた、アンチセンスRNA、低分子干渉RNA(siRNA)、もしくはリボザイムとして機能するもの、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【００８３】
本発明のさらに別の態様では、本発明のレンチウイルスベクターはまた、HIV LTRの転写エレメントを除去することによって、例えばいわゆる自己不活性化(SIN)ベクターの構成などに、改変することができる。ウイルスゲノムの3'末端から、組み込まれたプロウイルスの両方のU3領域を生成する、逆転写のモダリティは、いわゆる自己不活性化(SIN)ベクターの作製を可能にすることによって、このタスクを容易にする。自己不活性化は、ベクターRNAを産生するために使用されたDNAの3'長鎖末端反復(LTR)のU3領域における破壊の導入(例えば、欠失、変異およびエレメント挿入を用いる)に依存する。逆転写の間に、この欠失はプロウイルスDNAの5'LTRに移行される。LTRの転写活性を無効にするために十分な配列が除去される場合は、形質導入された細胞における全長ベクターRNAの産生が止まる。これは、複製能のあるレンチウイルス(RCL)が出現するリスクを最小限に抑える。さらに、それは、ベクター組込み部位の近傍にある細胞のコード配列が、3'LTRのプロモーター活性のためにまたはエンハンサー効果を介して、異常に発現される可能性を低減する。最後に、導入遺伝子(transgene)を駆動する内部プロモーターとLTRとの間の潜在的な転写干渉がSIN設計によって防止される。SINベースのレンチウイルスベクターの一例は、米国特許第6,924,144号に記載されており、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。本発明のSINベースのレンチウイルスベクターの非限定的な代表例は、本明細書に記載される図2に具体的に示した構築物の1つもしくは複数またはそれらの任意の組み合わせから作製することができる。
【００８４】
さらに別の態様では、本発明のレンチウイルスベクターはまた、本発明のLV-PTM構築物が1つまたは複数のインスレーター(insulator)要素を含むように改変することができる。インスレーター配列の非限定的な例は、α-グロビン遺伝子座に基づくものであり得、例えば、米国特許出願公開第0057725号(その全内容は参照により本明細書に組み入れられる)に開示されるようなニワトリHS4を含む。
【００８５】
最後に、レンチウイルスベクターは宿主ゲノムに組み込まれるが、それらは、HIV pol遺伝子のインテグラーゼ機能を破壊することによって、組込み欠損ベクターとして作製することができる。このベクターシステムは自然界では一過性であり、細胞が分裂するにつれてベクターは徐々に失われ、それゆえに、追加のセーフティ層を提供する。さらに、組込み欠損ベクターはまた、内因性遺伝子の挿入変異誘発および活性化または破壊のはるかに低いリスクを示すと考えられる。
【００８６】
本発明のさらに別の態様では、本発明のLV-PTM構築物はさらに、レンチウイルスのインテグラーゼ機能が部位特異的変異誘発によって欠失および/または無効にされているレンチウイルスベクターを含む。挿入変異誘発はオンコレトロウイルスベクターを用いた臨床試験で観察されており、これは、すべての組込み型ベクターの遺伝毒性の詳細な研究を促した。いくつかのワクチン応用のための最も直接的なアプローチは、組込みの可能性を回避すると考えられる。非組込み型レンチウイルスベクターは、インテグラーゼ遺伝子を変異させることによって、またはLTRの付着配列(attachment sequence)を改変することによって開発されている。特に、研究された変異のうち、触媒ドメインにおけるD64V置換は頻繁に使用されている。というのは、それがプロウイルスDNA合成に影響を与えることなくインテグラーゼ遺伝子の強力な阻害を示すからである。この変異は導入効率を組込み型ベクターよりもほんのわずかに低下させるが、残留組込みは低ベクター用量で組込み型ベクターよりも約1000倍低いと報告されている。記載された別の変異のD116Nは、対照ベクターよりも約2000倍低い残留組込みをもたらした。いくつかの場合に、インテグラーゼ(IN)欠損SIN LVの単回投与は、ベクターの組込みの非存在下で有意な免疫応答を誘発し、ワクチン開発のための安全かつ有用な戦略であり得ることが示されている。したがって、レンチウイルスベクターをエピソームの形態で存在できるようにするが、まだ導入遺伝子の発現を提供することができる改変は、本発明の範囲内に明確に包含される。
【００８７】
本発明のさらに別の態様では、本発明のLV-PTM構築物は、シュードタイピングされたレンチウイルスベクターをさらに含む。ビリオンの「シュードタイピング」は、関心対象のレンチウイルスベクターと、別のウイルスの少なくとも1つのエンベロープタンパク質または細胞表面分子をコードするヘルパーベクターとの両方を、パッケージング細胞に同時トランスフェクトすることによって達成される(例えば、米国特許第5,512,421号を参照されたい；そのテキスト全体は参照により本明細書に組み入れられる)。レンチウイルスベクターをシュードタイピングするために一般に使用される1つのウイルスエンベロープタンパク質は、ラブドウイルスに由来する、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質G(VSV-G)である。使用することができる他のウイルスエンベロープタンパク質としては、例えば、狂犬病ウイルス糖タンパク質Gおよびバキュロウイルスgp-64が挙げられる。シュードタイピングの使用は、用いる異種ウイルスのウイルス侵入メカニズムの要素を含めることによって、レンチウイルスベクター粒子の宿主細胞範囲を拡大する。本発明で用いるための例えばVSV-Gによる、レンチウイルスベクターのシュードタイピングは、VSV-Gエンベロープタンパク質を含む膜によって囲まれたヌクレオキャプシド内に封入されたレンチウイルスベクター核酸を含むレンチウイルス粒子をもたらす。ヌクレオキャプシドは、好ましくは、レンチウイルスベクターに通常関連するタンパク質を含有する。取り囲んでいるVSV-Gタンパク質含有膜は、レンチウイルスベクターをパッケージングするために用いられたプロデューサー細胞からのその退出時に、ウイルス粒子の一部を形成する。本発明の一態様では、レンチウイルス粒子はHIVに由来し、VSV-Gタンパク質でシュードタイピングされる。VSV-Gタンパク質を含有するシュードタイピングされたレンチウイルス粒子は、両種性ウイルスベクターよりも高い効率で多種多様な細胞型に感染することができる。宿主細胞の範囲には、ヒト、げっ歯類、魚、両生類および昆虫など、哺乳動物種と非哺乳動物種の両方が含まれる。
【００８８】
VSV-Gシュードタイピングは皮膚形質導入に最も効率的であると記載されているにしても、LVを使用することの大きな利点は、ビリオンエンベロープを置換および/または改変することによって、特定の組織または細胞にベクターを標的指向させることが可能であることである。LVは、LVに追加の柔軟性を与える広範囲のウイルスエンベロープ糖タンパク質と著しく適合性がある；研究されたウイルスエンベロープ糖タンパク質の例をいくつか挙げると、狂犬病、モコラ(Mokola)、LCMV、ロスリバー、エボラ、MuLV、バキュロウイルスGP64、HCV、センダイウイルスFタンパク質、ネコ内在性レトロウイルスRD114改変型、ヒト内在性レトロウイルス、セネカウイルス、GALV改変型、およびHAインフルエンザ糖タンパク質、またはこれらの組み合わせがある。エンベロープ全体の改変または置換に加えて、異なる細胞型を標的とするためのLVプラットフォームの柔軟性は、細胞特異的リガンドのディスプレイを介してLV粒子の表面をリファインすることによってさらに実証された。ワクチンへの応用の場合、シュードタイピングエンベロープとしてのVSV-Gは、例えば、広い向細胞性(樹状細胞を含む)およびヒト集団での低い既存の免疫など、いくつかの重要な利点を与える。抗VSV-G免疫は反復ベクター投与を妨げないようであるが、VSV-Gは、例えば複数のベクター投与の場合には、必要に応じて、他のエンベロープによって最終的に置き換えることができる。
【００８９】
さらに別の態様では、本発明は、5'LTRおよび3'LTR；該5'LTRに機能的に連結された第1の核酸配列；ならびに該5'LTRに機能的に連結された第2の核酸配列を含む本明細書で上述したLV-PTM構築物を含有し、かつ「薬学的に許容される担体」または「遺伝的アジュバント」(genetic adjuvant)をさらに含有する、薬学的組成物を包含し、ここで、第1の核酸配列および第2の核酸配列の転写は該5'LTRによって駆動される。「薬学的に許容される担体」としては、限定するものではないが、PBS、バッファー、水、TRIS、他の等張液、またはベクターのウイルス成分を損傷しないように最適化された溶液が挙げられる。
【００９０】
上述したレンチウイルスベクターは、疾患の治療的処置のために、ならびに本明細書に記載した他の理由のために、宿主細胞内に導入することができる。したがって、本発明は、本発明によるベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞の単離、および/またはそのような細胞もしくはそれに由来する細胞株の培養中の維持は、日常的なことになっており、当業者がよく精通していることである。「宿主細胞」は、どのような細胞であってもよく、好ましくは、真核細胞である。望ましくは、宿主細胞は抗原提示細胞である。そのような細胞としては、限定するものではないが、皮膚線維芽細胞、腸上皮細胞、内皮細胞、上皮細胞、樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、ランゲルハンス細胞、単球、粘膜細胞などが挙げられる。好ましくは、宿主細胞は、真核生物の多細胞生物種の細胞であり(例えば、単細胞の酵母細胞とは対照的)、さらに好ましくは、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞である。
【００９１】
したがって、本発明は、例えば、患者の特定の体細胞または生殖細胞においてアポトーシススプライシングアイソフォームまたはその変異体を産生するためのSMaRT(商標)技術の使用を記載する。これは、アポトーシススプライシングアイソフォームまたはその変異体をコードするPTMを、体細胞または生殖細胞中の1つまたは複数の内因性プレmRNAとトランススプライシングすることによって達成される。標的プレmRNA転写産物には、構成的に発現されているもの、またはアップもしくはダウンレギュレートされているものが含まれる。
【００９２】
あるいは、遺伝子またはPTMは、例えばLox部位を組込み型ベクターに組み込み、かつCreリコンビナーゼを発現させることにより、切除することができ、または、例えばステージ-(系統-、組織-)特異的siRNAもしくはマイクロRNAによって標的とされる配列を追加の安全対策として組み込むことによって、サイレンシングすることができる。
【００９３】
使用方法
本発明の組成物および方法は、疾患を引き起こすスプライシングアイソフォームまたは他の非常に豊富に発現されるプレmRNA標的(例えば、アルブミンなど)を、疾患を引き起こさないスプライシングアイソフォームの発現で置換するように設計される。本発明の方法は、本発明のスプライシングアイソフォームPTMと、天然の標的プレmRNAとを、該スプライシングアイソフォームPTMの全部または一部が該天然のプレmRNAとスプライシングされて新規キメラRNAを形成する条件下で接触させる段階を含む。一般的に、標的プレmRNAは、それが特定の細胞型(例えば、疾患を引き起こすスプライシングアイソフォームを発現する細胞型)内で発現される、という理由で選択され、それによって、新規キメラRNAの発現を、選択された細胞型(例えば、限定するものではないが、がん細胞)に標的指向させるための手段を提供する。
【００９４】
より具体的には、非アポトーシス性細胞をアポトーシス性細胞に誘導するための方法が提供され、該方法は、非アポトーシス性細胞に、スプライシングアイソフォームをコードする少なくとも1つのPTMを導入する段階；SMaRT(商標)を用いて、スプライシングアイソフォームをコードする少なくとも1つのPTMを、内因性のプレmRNAとトランススプライシングする段階を含み、ここで、スプライシングアイソフォームをコードする少なくとも1つのPTMと、内因性のプレmRNAとのトランススプライシングは、機能的な転写産物を産生し、該転写産物はその後、非アポトーシス性細胞をアポトーシス性細胞へと誘導するスプライシングアイソフォームに翻訳される。同様の効果が、PTMを直接非アポトーシス性アイソフォームとスプライシングすることによって達成され得る。
【００９５】
前記方法は、前記PTMの結合を標的指向させる段階をさらに含み、ここで、該PTMは、該PTMの結合を細胞の内因性プレmRNAに標的指向させる1つもしくは複数の標的結合ドメイン；分岐点と、ピリミジントラクトと、3'スプライス受容部位とを含む3'スプライス領域、および/もしくは5'スプライス供与部位；該RNAスプライス部位を該標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；ならびに5'スプライス部位の片面もしくは両面に結合する1つもしくは複数の相補配列を含むセーフティ配列、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００９６】
本発明のいくつかの態様では、前記方法は、非アポトーシス性細胞においてキメラRNA分子を産生させる段階を含み、該細胞内で発現された標的プレmRNAと、核スプライシング成分によって認識される核酸分子とを、該核酸分子の一部が該標的プレmRNAの一部とトランススプライシングされて該細胞内でキメラRNAを形成する条件下で接触させることを含む；ここで、該核酸分子は、(a)該核酸分子の結合を、該細胞内で発現された標的プレmRNAに標的指向させる、1つまたは複数の標的結合ドメイン(ここで、該標的結合ドメインは細胞ゲノムのヒトアルブミンプレmRNA標的を標的とする)；(b)分岐点と3'スプライス受容部位とを含む3'スプライス領域；(c) 3'スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および(d)標的プレmRNAとトランススプライシングされるヌクレオチド配列(ここで、該ヌクレオチド配列はアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームをコードする)を含み、該スプライシングアイソフォームは非アポトーシス性細胞をアポトーシス性細胞へと誘導する。
【００９７】
上で説明したように、本発明の方法の一態様において、本発明の1つまたは複数のPTMによって標的とされるスプライシングアイソフォームは、Bclファミリー遺伝子、FGFR2ファミリー遺伝子、p53aファミリー遺伝子、RAD51、サバイビンファミリー遺伝子(サバイビンおよびサバイビン2-B)、もしくはRbファミリー遺伝子の少なくとも1つのアポトーシス誘導スプライシングアイソフォーム遺伝子産物、またはこれらの任意の組み合わせを含む。本発明の方法の特定の態様では、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームは、Bcl XS、Mcl-1S、カスパーゼ-2L、カスパーゼ-9、サバイビン-2B、Fas、ハースタチン、Δ15HER2、Rac1、VEGF165b、p53、KLF6、およびRBM5のうちの少なくとも1つ、またはこれらの任意の組み合わせ、またはこれらの成分を含む。
【００９８】
いずれにしても、どのスプライシングアイソフォームプレmRNAが標的として選択されるかにかかわらず、本発明のスプライシングアイソフォームPTMは、所望の組織特異性を達成するために、特定の組織を特に好むベクター、組織特異的プロモーター、および/またはがん特異的プロモーターの組み合わせを用いることによって、所望の標的組織において優先的または排他的に発現される。例示として、組織特異的標的指向性スプライシングアイソフォームPTMは、例えば、限定するものではないが、以下を含む：i)肝臓がんを治療または改善するためのBcl XSアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームPTMを発現するLVベクターの使用、ここで、該PTMの発現は肝臓特異的または腫瘍特異的プロモーターによって駆動される；ii)肺がんまたは乳がんを治療または改善するためのBcl XSアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームPTMを発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの使用、ここで、該PTMの発現はサイトメガロウイルス(CMV)構成的プロモーターとp53がん特異的プロモーターの組み合わせによって駆動される；およびiii)前立腺がんを治療または改善するためのアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームPTMを発現するプラスミドまたはミニサークルベースのベクターの使用、ここで、該PTMの発現は長い前立腺がん特異的抗原プロモーターまたはオステオカルシンプロモーターによって駆動される。
【００９９】
したがって、本発明のPTM構築物は、Bcl XSアポトーシス誘導スプライスアイソフォームを発現し、かつBcl XLプレmRNAを標的とするか、または非常に豊富なプレmRNA転写産物としてアルブミンを特異的に標的とするPTMを用いて例示されているが、本発明の組成物および方法の上記態様のそれぞれは、他の非常に豊富なまたは高度に発現されるプレmRNA、例えば、限定するものではないが、カゼイン、ミオシンおよびフィブロイン、腫瘍に特異的なもしくは腫瘍に関連した転写産物、微生物もしくは自己抗原に関連した転写産物、ウイルスもしくは酵母に関連した転写産物、またはこれらの任意の組み合わせを標的とするPTMを含むことができる。同様に、本発明のLV PTM構築物は、ApoA-1を発現し、非常に豊富なプレmRNA転写産物としてアルブミンを特異的に標的とするPTMを用いて例示されているが、PTMにより発現され得る関心対象のタンパク質またはポリペプチドのコード配列としては、例えば、限定するものではないが、第VIII因子タンパク質、サイトカイン、成長因子、インスリン、ホルモン、酵素、抗体、ポリペプチド、またはこれらの任意の組み合わせを挙げることができる。
【０１００】
薬学的組成物
本発明の薬学的組成物は、薬学的および/または治療的に有効な量の少なくとも1つの本発明の核酸構築物、プラスミドベクター、ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レンチウイルスベクターシステム、ウイルス粒子/ウイルスストック、または宿主細胞(すなわち、作用物質)を含有する。本発明の一態様では、単位用量あたりの本発明の作用物質の有効量は、関心対象の遺伝子の検出可能な発現を引き起こすのに十分な量である。本発明の別の態様では、単位用量あたりの作用物質の有効量は、処置される疾患または症状の有害作用(重症度、持続時間、または症状の程度を含む)を予防し、治療し、または有害作用から保護するのに十分な量である。
【０１０１】
本発明の薬学的組成物の投与は、「予防」または「治療」目的のいずれであってもよい。予防的に提供される場合、本組成物はどのような症状にも先立って提供される。本組成物の予防的投与は、処置される疾患または症状のその後の有害な作用(重症度、持続時間、または症状の程度を含む)を予防または改善するのに役立つ。治療的に提供される場合、本組成物は処置される疾患の症状の発症時(または直後)に提供される。
【０１０２】
本発明のさらに別の態様では、すべての治療的、予防的および診断的使用のために、上述した本発明のレンチウイルスベクター、レンチウイルスベクターシステム、ウイルス粒子/ウイルスストック、または宿主細胞(すなわち、作用物質)のうちの1つまたは複数、ならびに他の必要な試薬および適切なデバイスおよび付属品は、容易に入手可能で使いやすいように、キットの形態で提供することができる。そのようなキットは、本発明のレンチウイルスベクターと、薬学的に許容される担体および/または遺伝的アジュバントとを含むインビトロまたはインビボ投与用の薬学的組成物；ならびにキットの使用説明書を含む。
【０１０３】
ベクターは、単位剤形で都合よく提供され、そして従来の製薬技術によって調製され得る。そのような技術は、有効成分と薬学的担体または賦形剤を会合させる工程を含む。一般的には、製剤は、有効成分と液状担体を均一かつ密接に会合させることによって調製される。非経口投与に適した製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および意図するレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含み得る、水性および非水性滅菌注射液；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含み得る、水性および非水性滅菌懸濁液を包含する。製剤は、単回量または複数回量容器、例えば密閉アンプルおよびバイアルで提供することができる。即時注射溶液および懸濁液は、当業者によって一般に使用されるDNAプラスミドプライミング化合物および/または精製されたウイルスベクター化合物の精製された核酸調製物から調製することができる。好ましい単位用量製剤は、投与される成分の1回量もしくは単位、またはその適切な画分を含有するものである。当然のことながら、特に上述した成分に加えて、製剤はまた、当業者によって一般に使用される他の作用物質を含んでもよい。
【０１０４】
ベクターは、例えば、経口(口腔および舌下を含む)、直腸、非経口、エアロゾル、鼻腔内、筋肉内、皮下、静脈内、腹腔内、眼内、頭蓋内、皮内、経皮(皮膚パッチ)、局所、腫瘍内、または対象の身体の関節もしくは他の領域への直接注入など、さまざまな経路を介して投与することができる。ベクターは、同様に、溶液、エマルションおよび懸濁液、ミクロスフェア、粒子、微粒子、ナノ粒子、およびリポソームを含むがこれらに限定されない、種々の形態で投与することができる。投与すべきLV製剤の適切な量は、対象または患者のさまざまな物理的特性、例えば、患者の年齢、肥満度指数(体重)、性別、健康状態、免疫能力などに基づいて、当業者によって決定される。同様に、投与量は投与経路に応じて変化する。一例として、筋肉内注射は約0.1mL〜1.0mLの範囲であり得る。当業者は、個々の患者において所望の「有効レベル」を達成するために、使用される組成物の正確な製剤化のための適切な用量、スケジュール、および投与方法を容易に決定することができる。
【０１０５】
本発明のベクターは、経口(口腔および舌下を含む)、直腸、非経口、エアロゾル、鼻腔内、静脈内、皮下、皮内、腫瘍内および局所を含むがこれらに限定されない、さまざまな経路を介して投与することができる。
【０１０６】
以上、一般的に説明されている本発明は、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。これらの実施例は、本発明の特定の局面および態様を例示する目的のためにのみ含められるのであって、本発明を限定することを意図したものではない。本出願のどこかで言及される特許、特許出願、特許公報、または科学論文の内容は、その全体が本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１０７】
実施例1
スプライソソーム媒介RNAトランススプライシング(SMaRT)は、治療目的のタンパク質の産生を特定の細胞型または器官に制限することができる、いくつかのRNAベース技術の1つである。この実施例は、BclプレmRNAの選択的スプライシングを含む。Bclの事例は、トランス作用要素の違いがスプライス変異体の決定的な差異にどのように影響するかを示す。Bclには2つのアイソフォームがある；これらのうち1つはヒトがんにおいて極めて重要な役割を果たしている。これら2つのアイソフォームの不均衡は、アポトーシスに影響を与えることによって、いくつかのヒトのがんに関与している。抗アポトーシス性Bcl-XLは、いくつかのヒトがん、すなわち多発性骨髄腫、小細胞肺がん、前立腺がんおよび乳がんにおいてアップレギュレートされており、それは特に転移のリスク増加と関連している。アポトーシス促進性Bcl-XSは、形質転換された細胞ではダウンレギュレートされている。しかしながら、Bcl-XSの強制的な過剰発現は、乳がん細胞を治療薬に対して感受性にする。
【０１０８】
この実施例では、SMaRTを用いてBcl-XLをBcl-XSに変換し、それによって腫瘍関連表現型を、細胞死をもたらすアポトーシスに関連した通常の表現型に変換する。SMaRTの使用は、がんの主な原因に対処するための、または疾患プロセスを回避して分子的常態に戻すための、強力な治療的アプローチを提供する。
【０１０９】
Bcl-Xの5'選択的スプライス部位の下流端または上流端でのスプライシングは、それぞれBcl-XLまたはBcl-XSをもたらす。Bcl-XLは抗アポトーシス性であり、多種多様な化学療法剤に対する耐性を付与する。それはまた、腫瘍の血管新生にも関与している。Bcl-XSはアポトーシス促進性であることが示されており、Bcl-2およびBcl-XLをアンタゴナイズすることができる。
【０１１０】
図1に示すように、SMaRTは、Bcl-XSの産生を駆動し、それによって、アポトーシスを刺激することができる。SMaRTを利用するための3つの異なるアプローチが存在し得る。これらには、標的プレmRNAと、3'スプライス部位もしくは5'スプライス部位とのトランススプライシング、または3'スプライス部位および5'スプライス部位両方の組み合わせを用いるトランススプライシングが含まれ、トランススプライシングの好ましいタイプは特定の細胞および/またはがんによって経験的に決定される。トランススプライシングの3つ全ての形態の非限定的な例が図1に提示され、図1は、Bcl Xスプライシングアイソフォームのトランススプライシングを媒介するためのSMaRTの使用を模式的に示している。特に、図1Aは、3'エクソン置換の例を示している。PTMはイントロン1に結合し、かつ正常なエクソン2および3をトランススプライシングによりつなぎ合わせて、結果的にBcl-XSアポトーシス促進性mRNAをもたらす(BDは結合ドメインを表す；ssはスプライス部位を表す)。図1Bは、5'エクソン置換の例を示しており、ここではPTMがイントロン2に結合し、かつ正常なエクソン1および2をトランススプライシングによりつなぎ合わせて、結果的にBcl-XSアポトーシス促進性mRNAをもたらす。図1Cは、二重トランススプライシングを介した内部エクソン置換の例を示している。二重トランススプライシングPTMは、2つの結合ドメイン(BD1およびBD2)、3'および5'スプライス部位(ss)の両方、ならびに正常なエクソン2を含有する。プレmRNA標的とPTMとの間(すなわち、標的プレmRNAの5'ssとPTM(rxn. #1)の3'ssとの間)と、これに続く得られた中間体RNA種(すなわち、メッセージ)の5'ssと標的(rxn. #2)の3'ssとの間の連続した第2のトランススプライシングイベントの成功した二重トランススプライシングは、結果的にBcl-XSアポトーシス促進性mRNAをもたらす。
【０１１１】
実施例2
この実施例では、肝臓がんを治療または改善するための、Bcl XSアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームをコードするPTMを発現するLVベクターの使用を示し、ここで、PTMの発現は肝臓特異的プロモーターによって駆動される。
【０１１２】
多数のベクターおよび方法のいずれかを用いて、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームを発現するPTMを発現させることができるが、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームを発現するPTMを細胞に導入するためのベクターおよび方法の代表的な例としては、例えば、限定するものではないが、以下が挙げられる：レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、プラスミド/ミニサークルベクター、ウイルスベクター形質導入、エレクトロポレーション、形質転換、形質導入、コンジュゲーション、トランスフェクション、感染、カチオン性脂質による膜融合、DNA被覆マイクロプロジェクタイルによる高速ボンバードメント、リン酸カルシウム-DNA沈殿物とのインキュベーション、または単一の細胞への直接マイクロインジェクションなど。
【０１１３】
いずれにしても、どのスプライシングアイソフォームプレmRNAが標的として選択されるかにかかわらず、アポトーシス誘導Bcl XSスプライシングアイソフォームPTMは、所望の組織特異性を達成するために、特定の組織を特に好むベクター、および/または組織特異的プロモーターを用いることによって、所望の標的組織において優先的または排他的に発現される。組織特異的標的指向性スプライシングアイソフォームPTMは、例えば、限定するものではないが、以下を含む：i)肝臓がんを治療または改善するための、Bcl XSアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームPTMを発現するLVベクターの使用、ここで、該PTMの発現は肝臓特異的または腫瘍特異的プロモーターによって駆動される；ii)肺がんまたは乳がんを治療または改善するための、Bcl XSアポトーシス誘導スプライシングアイソフォームPTMを発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの使用、ここで、該PTMの発現はサイトメガロウイルス(CMV)構成的プロモーターとp53がん特異的プロモーターの組み合わせによって駆動される；およびiii)前立腺がんを治療または改善するための、アポトーシス誘導スプライシングアイソフォームPTMを発現するプラスミドまたはミニサークルベースのベクターの使用、ここで、該PTMの発現は長い前立腺がん特異的抗原プロモーターまたはオステオカルシンプロモーターによって駆動される。
【０１１４】
この特定の実施例では、図2は、Bcl X遺伝子アイソフォームPTMを発現するレンチウイルスベクターを模式的に示している。特に、図2Aは、3'エクソン置換PTMを発現するレンチウイルスベクターの模式図を示している。図2Bは、5'エクソン置換PTMを発現するレンチウイルスベクターの模式図を示している。図2Cは、二重トランススプライシングPTMを発現するレンチウイルスベクターの模式図を示している。それぞれの場合に、肝臓がん患者の所望のがん組織に形質導入するための、Bcl XS遺伝子アイソフォームPTMを発現するレンチウイルスベクターの使用は、Bcl-XL遺伝子アイソフォーム[通常はi) Bcl-2由来タンパク質BaxおよびBakをアンタゴナイズして阻害することにより抗アポトーシス特性を示し、ii)腫瘍に血管を形成する血管成長を誘導し(血管新生)、そしてiii)化学療法剤耐性を促進する]からBcl-XS遺伝子アイソフォーム[Bcl-XLおよびBcl-2タンパク質に直接結合してそれを阻害またはアンタゴナイズすることによってアポトーシス促進性を示し、そしてUVおよびγ照射ならびに化学療法剤(エトポシド、5-フルオロウラシル、シスプラチン、5-フルオロデオキシウリジンおよびドキソルビシン、またはこれらの任意の組み合わせを含む)による治療に対するがん細胞の感受性を促進する]への効率的な用量依存的変換をもたらす。
【０１１５】
実施例3
がん治療 - SMaRTベースの戦略
この実施例では、スプライシング異常のメカニズムに対処するためのSMaRTの使用は、治療的介入のまったく新しい分野を切り開く可能性があることを示す。これらには、Bcl-XLが関与するがん、すなわち多発性骨髄腫、小細胞肺がん、前立腺がんおよび乳がんが含まれる。BclプレmRNAに加えて、標的は、他のヒトがんに関与する他のスプライスアイソフォームに対して存在する。これらのスプライスアイソフォームとしては、例えば、カスパーゼ2、カスパーゼ9、fas、HER-2、Rac-1、p53、KLF-6およびVEGFが挙げられる。
【０１１６】
特に、この実施例では、高レベルの発現を達成し、それによってレシピエント細胞においてより迅速かつ効率的なアポトーシスの状態を誘導するように、豊富に発現される標的mRNAへのBcl-XSスプライシングアイソフォームの特異的標的指向化を実証する。
【０１１７】
ヒト血漿プロテオームでは、タンパク質の分解は、a1-アンチトリプシン(3.8％)、a2-マクログロブリン(3.6％)、免疫グロブリンA(3.4％)、トランスフェリン(3.3％)、Hpタイプ2-1(2.9％)、IgM(1.98％)、バイオマーカー(10％)、およびアルブミン(54.3％)である。これはトランススプライシングの標的としてアルブミンを選択するための理論的根拠を提供する。ヒトアルブミンは血漿中で最も豊富なタンパク質である(ヒト：35〜50mg/ml；マウス：20〜30mg/ml)。アルブミンはまた、ヒト肝臓において最も豊富な転写産物である；ヒト肝臓は12グラム/日を産生する。
【０１１８】
アルブミンとのトランススプライシングのアプローチは、cDNA/組換えタンパク質療法に比べて、いくつかの潜在的な利点を提供する。内因性制御 - トランススプライシングされた産物の内因性制御を保持し、トランススプライシングのレベルは標的プレmRNAのレベルに関係する。本明細書に記載のSMaRT戦略を用いると、Bcl-XSスプライシングアイソフォームは、肝臓特異的プロモーターと1つまたは複数の細胞質標的指向ドメインとを含めることによって、肝細胞で産生される。最小化した異所性発現では、トランススプライシングは、標的プレmRNAが発現される所で、発現される時にのみ起こる。内因性タンパク質の産生は、組換えタンパク質の高用量/高速排除と比較して、安定したBcl-XSスプライシングアイソフォームのレベルを提供する。
【０１１９】
Bcl-XSスプライシングアイソフォームとアルブミンとのトランススプライシング
野生型ヒトBcl-XSスプライシングアイソフォームと、高度に発現されるまたは豊富な標的プレmRNAとのトランススプライシングは、ヒトBcl-XSスプライシングアイソフォームタンパク質の発現を増加させる1つの方法である。高度に発現される内因性プレmRNA分子の代表的な例としては、例えば、アルブミン、カゼイン、アクチン、チューブリン、ミオシンおよびフィブロインが挙げられる。標的プレmRNAのより多い量は、より高いトランススプライシング効率をもたらす。図3は、3'PTMを用いて、アルブミンプレmRNAのような非常に豊富な転写産物を標的として、Bcl-XSアポトーシス促進性mRNAを産生させる一例を模式的に示している。PTMは、標的特異的結合ドメイン、トランススプライシングドメイン、続いて正常なコード配列(開始「ATG」コドンのない、エクソン1〜3)を含有する。標的特異的結合ドメインの非限定的な例は、i)以下でSEQ ID NO.3に示されるヒトアルブミンPTM標的特異的結合ドメイン；およびii)以下でSEQ ID NO.4に示されるマウスアルブミンPTM標的特異的結合ドメインである。
【０１２０】
ヒトアルブミン結合ドメイン(135bp)：
2014525754.tif 000005
【０１２１】
マウスアルブミン結合ドメイン(279bp)：
2014525754.tif 000006
【０１２２】
非転移性肝細胞がんの進行症例を有する患者に、(例えば、肝組織特異的または腫瘍特異的プロモーターを用いたレンチウイルスベースの発現ベクターを使用して)ヒトBcl-XSスプライシングアイソフォームPTMを投与すると、アルブミン標的プレmRNAとのトランススプライシングが起こり、そしてBcl-XSスプライシングアイソフォームPTMがATG開始コドンを獲得して、機能的なトランススプライシングされたアポトーシス促進性のキメラmRNAを生成し、該キメラmRNAは、翻訳、プロセシングおよび分泌の結果、機能的なアポトーシス促進性のキメラBcl-XSタンパク質を産生する。トランススプライシング反応の結果、キメラのアルブミン-Bcl-XS遺伝子アイソフォーム融合タンパク質が産生され、これは、Bcl-XLおよびBcl-2タンパク質に直接結合してそれらを阻害またはアンタゴナイズすることによりアポトーシス促進活性を示し、それによって、患者の進行症例の非転移性肝細胞がんにおいて腫瘍細胞量または組織量の低減をもたらす。
【０１２３】
また、キメラのアルブミン-Bcl-XS遺伝子アイソフォーム融合タンパク質のアップレギュレーションおよび発現増加は、UVおよびγ照射ならびに化学療法薬による治療に対するがん細胞の感受性化を促進するため、UVおよびγ照射ならびに/または1種もしくは複数種の化学療法薬(例えば、エトポシド、5-フルオロウラシル、シスプラチン、5-フルオロデオキシウリジンおよびドキソルビシン(またはこれらの組み合わせ)を含む)による患者の進行症例の非転移性肝細胞がんの同時またはその後の治療は、患者の進行症例の非転移性肝細胞がんにおいて腫瘍細胞量または組織量の用量依存的減少をもたらす。
【０１２４】
以上、本発明のいくつかの態様を説明してきたが、前述は単なる例示であって限定的なものではなく、例としてのみ提示されていることは、当業者には明らかである。多くの改変および他の態様は、当業者の知識の範囲内であって、本発明およびその均等物の範囲内に入るものと考えられる。当然のことながら、本発明に対する変形は当業者には容易に明らかであり、本発明はこうした代替物を含むことが意図される。さらに、多くの変更が当業者には容易に想起されるので、本発明を、説明および記載した正確な構成および操作に限定することは望ましくなく、したがって、すべての適切な変更および均等物は本発明の範囲内に入るものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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