(57)【要約】  本発明は、インフルエンザ感染症を処置するためのインフルエンザノイラミニダーゼ阻害剤としてのオセルタミビル誘導体、および前記化合物を生産するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般構造式
【化１】
2014532633.tif 000027
（式中、Ｒ１は、Ｈ、１〜１２の鎖長を有する分岐状または非分岐状、飽和または不飽和、置換または非置換炭化水素鎖であり、
Ｒ７は、ＨまたはＯＨであり、
Ｒ８は、Ｈ、Ｒ９、ＮＨ２、ＮＨＲ９、Ｎ（Ｒ９）２またはＮＨＣＯＯＲ１であり、
Ｒ９は、１個〜４個の炭素原子の鎖長を有する分岐状または非分岐状アルキルラジカルであり、
ここで、Ｒ１およびＲ９の可能な置換基は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素、酸素、硫黄、アルコキシ、アシルオキシ、ヒドロキシル、メルカプト、シアノ、ニトロおよびチオアルコキシ基からなる群より選択されるか、または保護基でブロックされた官能基である）の化合物、ならびにその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、Ｒ／Ｓエナンチオマーおよび／またはプロドラッグ。
【請求項２】
アミドキシム（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセトアミド−５−［Ｎ−（Ｎ’−ヒドロキシ）アセチミドアミド（ａｃｅｔｉｍｉｄａｍｉｄｏ）］−３−（１−エチルプロポキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボン酸エチルエステル、もしくはヒドロキシグアニジン（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセトアミド−５−［Ｎ−（Ｎ’ヒドロキシ）−グアニジノ］−３−（１−エチルプロポキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボン酸エチルエステル、ならびに／またはそれらの薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、Ｒ／Ｓエナンチオマー、および／もしくはプロドラッグである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
医薬品として使用するための、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
一般構造式
【化２】
2014532633.tif 000028
（式中、Ｒ１，４，５は、同一でも異なっていてもよく、−Ｈ、１〜１２の鎖長を有する分岐状または非分岐状、飽和または不飽和、置換または非置換炭化水素鎖であり、
Ｒ２は、Ｈであるか、または、
【化３】
2014532633.tif 000029
ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＣＯＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、１〜１２の鎖長を有する分岐状または非分岐状、飽和または不飽和、置換または非置換炭化水素鎖からなる群より選択される置換基であり、
Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ１、ＯＣＯＯＲ１またはＣＯＯＲ１であり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｒ１、ＮＨ２、ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ１）２、ＮＨＣＯＯＲ１であり、
Ｘは、ＯＲ１、ＳＲ１、ＮＨＲ１またはＮ（Ｒ１）２であり、
Ｚは、Ｃ、Ｓ、ＳＯ、Ｐ、ＰＯを表し、
ここで、Ｒ１の可能な置換基は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素、酸素、硫黄、アルコキシ、アシルオキシ、ヒドロキシル、メルカプト、シアノ、ニトロおよびチオアルコキシ基からなる群より選択されるか、または保護基でブロックされた官能基である）の、インフルエンザ感染症を処置するためのインフルエンザノイラミニダーゼ阻害剤、およびその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、Ｒ／Ｓエナンチオマー、またはプロドラッグ。
【請求項５】
請求項１または２に記載の化合物を含み、アミドキシム（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセトアミド−５−［Ｎ−（Ｎ’−ヒドロキシ）アセチミドアミド（ａｃｅｔｉｍｉｄａｍｉｄｏ）］−３−（１−エチルプロポキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボン酸エチルエステル、またはヒドロキシグアニジン（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセトアミド−５−［Ｎ−（Ｎ’ヒドロキシ）グアニジノ］−３−（１−エチルプロポキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボン酸エチルエステル、およびそれらの薬学的に許容し得る塩、溶媒和物またはプロドラッグである、請求項４に記載のインフルエンザ感染症を処置するためのインフルエンザノイラミニダーゼ阻害剤。
【請求項６】
一般構造式
【化４】
2014532633.tif 000030
のオセルタミビルまたはその誘導体を反応させることを含む、請求項１もしくは２に記載の化合物または請求項４もしくは５に記載の阻害剤を調製するための方法であって、以下の工程：
有機溶媒中、室温で、オセルタミビルをアシルヒドロキシモイルクロリドと反応させることを少なくとも含む、方法。
【請求項７】
前記有機溶媒がジクロロメタンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物が、請求項２に記載のアミドキシム（Ｒ３＝ＯＨ）である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
オセルタミビル（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセトアミド−５−アミノ−３−（１−エチルプロポキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボン酸エチルエステルまたはその誘導体を反応させることを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または請求項４もしくは５に記載の阻害剤を調製するための方法であって、以下の工程：
ｉ）有機溶媒中、室温で、オセルタミビルをシアンブロミドと反応させること
ｉｉ）ジオキサン中、室温で、ｉで形成されたシアナミドをヒドロキシルアミンと反応させること
の少なくとも１つを含む、方法。
【請求項１０】
前記化合物が、請求項２に記載のヒドロキシグアニジン（Ｒ６＝ＮＨ２、ＮＨＲ１またはＮ（Ｒ１）２およびＲ３＝ＯＨ）である、請求項８または９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザ（ｆｌｕ）を処置するための新規なノイラミニダーゼ阻害剤およびその調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、呼吸器の重症ウイルス感染症の代表的なものである。米国だけでも、人口の１０％〜２０％がこのウイルスに毎年感染していると考えられている。ＷＨＯによれば、このウイルスは３００万人〜５００万人の人々の疾患に関わっており、このウイルスまたは二次感染のいずれかによって直接引き起こされる１年間の死亡数は、２５万〜５０万人である。不規則に発生する伝染病または流行病によって、感染レベルおよび死亡数は、著しく増加している。前世紀では、３つの主要なインフルエンザパンデミック（１９１８〜１９年のＨ１Ｎ１ウイルス（「スペインインフルエンザ」）、１９５７年のＨ２Ｎ２ウイルス、および１９６８年のＨ３Ｎ２ウイルスが、累積で約５０００万人の死亡を引き起こした。「スペインインフルエンザ」は、これまでに最も重度のパンデミックの代表的なものであり、最初の年だけで約２０００万人の人々の死亡を引き起こした。最後のパンデミックは２００９年に起こり、「メキシコインフルエンザ」（Ｈ１Ｎ１、「ブタインフルエンザ」）として知られているが、死亡数の点では比較的無害であった。しかしながら、この数年間では、特に高病原性「鳥インフルエンザウイルス」（Ｈ５Ｎ１）が、とりわけ動物からヒトに容易に伝染するという理由により、懸念材料の原因となっている。
【０００３】
現在のところ、インフルエンザを処置するかまたは感染を予防するための主な（そして承認されている）治療アプローチは２つある：
（１）ワクチン接種
（２）抗ウイルス有効成分の使用：
ａ．Ｍ２チャネル遮断薬、アダマンタン誘導体（アマンタジン、リマンタジン）
ｂ．ノイラミニダーゼ阻害剤
【０００４】
しかしながら、ノイラミニダーゼ阻害剤は、Ｍ２チャネル遮断薬よりも有意な利点を有する：
（１）インフルエンザＡおよびＢに対して有効であることから、広範囲の抗ウイルス効果があること。アダマンタン誘導体は、インフルエンザＡに対してのみ有効である；
（２）ウイルス耐性機構を強力に誘導することはほとんどないこと；
（３）優れた忍容性；
（４）呼吸器イベントを軽減する優れた効果。
【０００５】
インフルエンザウイルスは、ヌクレオカプシドを囲む外膜から構成される。糖タンパク質であるヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼは、この外膜上に位置している。ウイルスが細胞に感染して、ウイルス複製が開始した後、シアル酸で被覆された新たなウイルス粒子（いわゆるビリオン）が形成される。シアル酸がビリオンに結合している限り、それらは、その他のビリオンのヘマグルチニン残基と凝集する。これらのビリオン凝集体はもはや、その他の細胞に侵入および感染することができない。したがって、ノイラミニダーゼの機能の１つは、ビリオンが体内を自由に循環してその他の細胞に感染することができるように、ビリオンからシアル酸残基を切断することである。したがって、ノイラミニダーゼ阻害剤の使用は、インフルエンザの処置における治療アプローチの代表的なものである。
【０００６】
一方、ザナミビル、オセルタミビルおよびペラミビルなどのいくつかの非常に強力なノイラミニダーゼ阻害剤が開発され、インフルエンザの処置についての薬事承認を受けている。
【０００７】
ノイラミニダーゼ阻害剤の分野では、新たな有効成分の候補を同定するために、多くの研究および開発事業が行われている。新たなリード構造の開発の他に、オセルタミビルおよびザナミビルの公知の構造を最適化または改変することを目的とする多数の試みが続いている。すべての探究の一般的な目標は常に、有効性またはバイオアベイラビリティのいずれかが改善された化合物を得ることである。そうすることで、両方の基準を完全に満たす化合物を開発することは不可能である。しかしながら、インフルエンザに対して非常に有効な化合物をもたらす、オセルタミビルおよびザナミビルについての様々な改変が説明された。既に説明されている改変の概要を以下に示す：
【化１】
2014532633.tif 000002
【０００８】
１位：
多くの研究が、イソペンチル側鎖の改変について言及している。今では、側鎖の改変により親油性を減少または増加させるのに役立つ多くの改変が知られており、これらは、ノイラミニダーゼに対する親和性にはわずかな影響しか与えない。１加えて、イソペンチル側鎖の各位置でヒドロキシル化を行うことができることが示された。２構造的に類似するザナミビルに基づいて、種々の置換脂肪族ラジカルおよび種々の（ヒドロキシル化および非ヒドロキシル化）環状側鎖が、この位置で許容可能であることが示された。３Ｌｉらは、４６個のオセルタミビル類似化合物の合理的設計によりこのアプローチを拡張し、１位の置換がノイラミニダーゼに対する親和性を増加させるのに意味のあることを示した。また、この研究では、様々な置換基−芳香族性および脂肪族性の両方−を同定することができた。さらに、酸素を窒素で置換することができた。４これらのデータは、分子のこの位置における構造的な要件が比較的非特異的であり、種々の構造が許容されることを実証している。したがって、オセルタミビルの多くのその他の活性誘導体は、イソペンチル官能基を改変することによって合成することができ、以下の本発明の記載手順にしたがって得ることができる。
【０００９】
４位：
例えば、オセルタミビルの４位の改変は、Ｗａｎｇらによって評価された。６ノイラミニダーゼ親和性を最適化するために、この位置の置換は可能であることが示された。これらの置換基は、それぞれ炭素、酸素または窒素を介してシクロヘキセン骨格に連結された。
【００１０】
５位：
この位置においても、種々の改変が可能である。したがって、例えば、その有効性を失うことなく、カルボキシル官能基をその他の類似官能基（ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスホン酸アミドなど）で置換することができることが示された。７，８カルボキシル炭素を硫黄で置換して、対応するスルホン酸誘導体にすることも想定され得る。
【００１１】
６位および骨格：
さらなる改変は、オセルタミビルのシクロヘキセン骨格に関する。種々の研究グループが、元素の環状構造を変化させることなく、この中心的な構造的特徴をその他の構造で置換することに関心を寄せていた。芳香族系および５員環系は、同様の有効性を有することができることが見出された。９，１０加えて、種々の脂肪族置換基が６位で試験され、ノイラミニダーゼに対するそれらの親和性が示された。ザナミビルで行われたように、ヘテロ原子をこの環系で使用することも想定され得る。したがって、骨格の改変は、中心的な構造元素のサイズを変化させることができることだけではなく、オセルタミビルのシクロヘキセンの二重結合が必須ではないことも実証している。二重結合の数および位置の両方を検証することにより、強力なノイラミニダーゼ阻害剤がもたらされる。１０，１１
【００１２】
ノイラミニダーゼ阻害剤の開発分野における多大な開発努力により、オセルタミビルと同様の効果を有する多数のオセルタミビル類似構造が同定された。しかしながら、それらの全体的特性の点では、これらの誘導体はいずれもオセルタミビルよりも優れておらず、これらの類似体はいずれも有効成分として承認されていない。
【００１３】
治療剤の成功に重要なのはその薬物動態プロファイルであり、これは、溶解性、潜在的なプロドラッグをそれらの活性型に活性化する能力、およびタンパク質結合の形成によって影響を受ける。生理学的条件下におけるその安定性が等しく重要である。
【００１４】
有効成分が経口投与後にどの程度吸収されるかを示す、治療剤、医薬または薬物の経口バイオアベイラビリティも決定的に重要である。経口投与は、その他の投与形態と比較して、使用するのに最も容易なものの１つである。例えば、注入または注射時に必要な滅菌は不要である。加えて、投与量および適用は、吸入医薬品形態の場合よりもはるかに容易である。
【００１５】
ドイツでは、ザナミビルおよびオセルタミビルは、インフルエンザの処置について現在承認されている。オセルタミビル（Ｔａｍｉｆｌｕ（登録商標））の利用可能な経口剤形は既にあるが、ザナミビル（Ｒｅｌｅｎｚａ（登録商標））の使用は、経口投与後のバイオアベイラビリティがわずかに２％であることから、吸入のみ可能である。加えて、その他の国では、パンデミックイベントにおける静脈内投与用の救急用薬物としてペラミビルが承認されている。最近、日本では、インフルエンザの吸入療法について、ラニナミビル（Ｉｎａｖｉｒ（登録商標））が承認された。
【００１６】
パンデミックイベントの場合、経口剤形は、吸入剤形または静脈内投与剤形よりも利点を有すると思われる。
【００１７】
抗インフルエンザ薬の重大な問題は、インフルエンザウイルス、特に主要なウイルス抗原（ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ）が急速に突然変異して、既存の薬物に対する耐性を急速に生じることである。この突然変異は、インフルエンザＡウイルスで特に顕著である。インフルエンザに対するワクチンを毎年（季節毎に）調整することが必要になる突然のいわゆる「抗原不連続変異」が起こり得る。特に、近年では、Ｈ２７４Ｙ突然変異を有するオセルタミビル耐性Ａ（Ｈ１Ｎ１）の発生率が増加していることが、懸念の原因である。さらに、いくつかの公知の突然変異に次いで、さらなる新たな耐性機構が発見されている。
【００１８】
オセルタミビル（Ｔａｍｉｆｌｕ（登録商標））は、さらなるウイルス耐性に対しては効果がないはずであり、インフルエンザに対して有効な経口投与物質の有効量は不明である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
したがって、本発明の目的は、オセルタミビルの構造から出発して、オセルタミビル耐性ウイルス菌株に対しても有効なノイラミニダーゼ阻害剤を見出すことである。
【００２０】
さらに、本発明の目的は、改善された薬物動態プロファイルを示すノイラミニダーゼ阻害剤を提供することである。
【００２１】
また、本発明の目的は、優れたバイオアベイラビリティを有するノイラミニダーゼ阻害剤を提供することである。
【００２２】
これらの目的は、特許請求の範囲および本明細書に特徴が記載されている実施形態によって達成される。下位請求項および実施例は、本発明の有利な詳細を示す。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
一部の態様では、本発明の目的は、一般構造式
【化２】
2014532633.tif 000003
（式中、Ｒ１，４，５は、同一でも異なっていてもよく、−Ｈ、１〜１２の鎖長を有する分岐状または非分岐状、飽和または不飽和、置換または非置換炭化水素鎖であり、Ｒ２はＨであるか、または例えばＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．６もしくはＰａｒｋ  ａｎｄ  Ｊｏ（Ｐａｒｋ  ａｎｄ  Ｊｏ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５（２０１０），５３６−５４１）（これらの開示は、前述の説明での使用によって本明細書に組み込まれている）に記載されているような置換基、特に、
【化３】
2014532633.tif 000004
ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＣＯＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、１〜１２の鎖長を有する分岐状または非分岐状、飽和または不飽和、置換または非置換炭化水素鎖からなる群より選択される置換基であり、
Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ１、ＯＣＯＯＲ１またはＣＯＯＲ１であり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｒ１、ＮＨ２、ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ１）２、ＮＨＣＯＯＲ１であり、
Ｘは、ＯＲ１、ＳＲ１、ＮＨＲ１またはＮ（Ｒ１）２であり、
Ｚは、Ｃ、Ｓ、ＳＯ、Ｐ、ＰＯを表し、
ここで、Ｒ１の任意の置換基は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素、酸素、硫黄、アルコキシ、アシルオキシ、ヒドロキシル、メルカプト、シアノ、ニトロおよびチオアルコキシ基からなる群より選択されるか、または保護基でブロックされた官能基である）の、インフルエンザ感染症を処置するためのインフルエンザノイラミニダーゼ阻害剤、およびその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、Ｒ／Ｓエナンチオマー、またはプロドラッグによって達成される。
【００２４】
好ましい態様では、本発明は、アミドキシム（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセトアミド−５−［Ｎ−（Ｎ’−ヒドロキシ）アセチミドアミド（ａｃｅｔｉｍｉｄａｍｉｄｏ）］−３−（１−エチルプロポキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボン酸エチルエステル、またはヒドロキシグアニジン（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセトアミド−５−［Ｎ−（Ｎ’ヒドロキシ）−グアニジノ］−３−（１−エチルプロポキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボン酸エチルエステル、およびそれらの薬学的に許容し得る塩、溶媒和物またはプロドラッグである、インフルエンザ感染症を処置するための本発明のインフルエンザノイラミニダーゼ阻害剤化合物に関する。
【００２５】
オセルタミビルの基本構造に基づいて、本発明の化合物は、新たなインフルエンザノイラミニダーゼ阻害剤を提供する。
【化４】
2014532633.tif 000005
【００２６】
さらなる態様では、本発明は、一般構造式
【化５】
2014532633.tif 000006
のオセルタミビルまたはその誘導体を反応させることを含む、上記本発明の化合物を調製するための方法であって、以下の工程：
有機溶媒中、室温で、オセルタミビルをアシルヒドロキシモイルクロリドと反応させることを少なくとも含む方法に関する。
【００２７】
有機溶媒がジクロロメタンである方法が好ましい。特に好ましい態様では、本発明の方法は、上記一般構造式のアミドキシム化合物（Ｒ３＝ＯＨ）に関する。
【００２８】
任意の工程として、アルコール性水酸化物溶液で処理することによって、カルボキシル官能基（Ｒ４＝Ｈ、Ｚ＝Ｃ）中のエチルエステル官能基（Ｒ４＝ＣＨ２ＣＨ３、Ｚ＝Ｃ）の移転を行うことができる。
【００２９】
アミジニウム塩は、アミド化試薬として好ましい。好ましくは、Ｓ−ナフチル−メチル−アセト−アミジニウム−ブロミドを使用した。
【００３０】
アルコールとして、長さＣ１〜Ｃ６の飽和または不飽和、分岐状または非分岐状炭素鎖を有する有機化合物が適切であり、長さＣ１〜Ｃ６の飽和分岐状または非分岐状炭素鎖を有するアルコールが特に好ましい。最も好ましくは、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソ−プロパノールおよびｔｅｒｔ−ブタノールのアルコールが使用される。本発明の目的のために、アルコール性溶液は、本明細書では、上記定義の１つ以上のアルコールが含まれることを意味する。
【００３１】
本発明のアミドキシム（Ｒ３＝ＯＨ）の調製は、本発明にしたがって、以下の工程：有機溶媒（例えば、ジクロロメタン）中、室温で、オセルタミビルをヒドロキシモイルクロリド（例えば、アセチルヒドロキシモイルクロリド）と反応させることを少なくとも含む方法によって行われる。
【００３２】
有機溶媒は当業者に公知であり、ジクロロメタンに加えて、例えば、クロロホルム、アセトン、アセトニトリル、メタノールなどが挙げられる。
【００３３】
また、本発明は、オセルタミビル（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセトアミド−５−アミノ−３−（１−エチルプロポキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボン酸エチルエステルまたはその誘導体を反応させることを含む、本発明の化合物を調製するための方法であって、以下の工程（ｉ）有機溶媒中、室温で、オセルタミビルをシアンブロミドと反応させること（ｉｉ）ジオキサン中、室温で、ｉで形成されたシアナミドをヒドロキシルアミンと反応させることの少なくとも１つを含む方法に関する。
【００３４】
具体的には、本発明は、化合物が、上記一般構造式のヒドロキシグアニジン（Ｒ６＝ＮＨ２、ＮＨＲ１またはＮ（Ｒ１）２およびＲ３＝ＯＨ）である上記方法に関する。
【００３５】
上で既に説明したように、オセルタミビルに基づいて示されるように本発明にしたがって行われた改変、およびその結果として本発明の方法は、例えば、上記残基で改変されているオセルタミビル誘導体、例えば、現在の技術水準で既に説明されているオセルタミビル誘導体にも適用することができ、その結果として、当業者であれば、これらが、実施例に示されている本発明の同等の実施形態であると明確に認識することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】マウスまたはヒトの血漿中での異なるｐＨ値における本発明のいくつかの化合物の安定性。
【図２】異なる培地および異なる温度における活性型３（Ａ））および活性型９（Ｂ））の安定性。
【図３】誘導体３を合計５匹のラットに静脈内投与した後の誘導体３の血漿レベル。
【図４】誘導体４を経口投与した後の誘導体３の血漿レベル。
【図５】誘導体４を経口投与した後の誘導体３および代謝産物１１の血漿レベル。
【図６】誘導体３を経口投与した後の誘導体３の血漿レベル。
【図７】誘導体２を経口投与した後の誘導体３の血漿レベル。
【図８】アミジン系ノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｄａｓｅ）阻害剤を投与した後の誘導体３の血漿レベル。
【図９】誘導体９を静脈内（ｉ．ｖ．）投与した後の誘導体９の血漿レベル。
【図１０】誘導体９を経口投与した後の誘導体９の血漿レベル。
【図１１】誘導体６を経口投与した後の誘導体９の血漿レベル。
【図１２】誘導体６を経口投与した後の誘導体９および代謝産物１２の血漿レベル。
【図１３】グアニジン系ノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｄａｓｅ）阻害剤を適用した後の誘導体９の血漿レベル。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明のノイラミニダーゼ阻害剤を合成するために、種々の合成戦略を追求したところ、非常に異なって置換された様々なオセルタミビル誘導体が同時に明らかになった。本発明の様々な有効成分につながる様々な合成経路の例を以下の概要に示す。
【化６】
2014532633.tif 000007
【００３８】
ノイラミニダーゼ阻害剤の合成の概要。Ａ）アミジン系オセルタミビル誘導体３、および対応するアミドキシム４の合成経路；Ｂ）ヒドロキシグアニジン系オセルタミビル誘導体６への合成経路；Ｃ）さらなるヒドロキシグアニジン系オセルタミビル誘導体（８）への合成経路；Ｄ）オセルタミビル−グアニジン９およびそのエステルプロドラッグ１０の構造式。
【００３９】
アミジンを合成するためのアミド化試薬として、Ｓ−ナフチル−メチル−アセト−アミジニウム−ブロミドを使用した（２、３）（Ａを参照のこと）。アミジンを調製するためのその他の試薬を使用することも可能である。オセルタミビルの前記Ｎ−置換によって、および別のチオアミジニウム塩を選択することによって、様々なアミジンがこの方法で入手可能である。アミジン官能基を作製するためのその他の公知の方法をここで使用することができる。好ましくは、アセトヒドロキシモイルクロリドを使用することによって、アミドキシム４を合成した。
【００４０】
グアニジン系化合物の合成は、Ｂ）に示されている。置換または非置換ヒドロキシグアニジンを作製するための２つの異なるコンセプトをこれによって実行した。このように、非置換ヒドロキシグアニジン６は、シアナミド５の合成を介して入手可能である。非常に異なるＯ，Ｎ−置換ヒドロキシグアニジン（８）は、タイプ７のカルバモイル−置換チオ尿素を介して合成可能である（Ｃを参照のこと）。
【００４１】
オセルタミビル−グアニジン９およびそのエステルプロドラッグ１０も示されている。この合成は、Ｓｈｉｅら［Ｓｈｉｅ，Ｊ．；Ｆａｎｇ，Ｊ．；Ｗａｎｇ，Ｓ．；Ｔｓａｉ，Ｋ．；Ｓｈｙｕｎ，Ｙ．；Ｃｈｅｎｇ，Ｅ．；Ｙａｎｇ，Ａ．；Ｈｓｉａｏ，Ｓ．；Ｓｕ，Ｃ．；Ｗｏｎｇ，Ｃ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２００７，１２９，１１８９２−９３］にしたがって成功した。
【００４２】
さらなる態様では、本発明は、一般構造式：
【化７】
2014532633.tif 000008
（式中、Ｒ１は、Ｈ、１〜１２の鎖長を有する分岐状または非分岐状、飽和または不飽和、置換または非置換炭化水素鎖であり、Ｒ７は、ＨまたはＯＨであり、Ｒ８は、Ｈ、Ｒ９、ＮＨ２、ＮＨＲ９、Ｎ（Ｒ９）２またはＮＨＣＯＯＲ１であり、
Ｒ９は、１個〜４個の炭素原子の鎖長を有する分岐状または非分岐状アルキルラジカルであり、
ここで、Ｒ１およびＲ９の可能な置換基は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素、酸素、硫黄、アルコキシ、アシルオキシ、ヒドロキシル、メルカプト、シアノ、ニトロおよびチオアルコキシ基からなる群より選択されるか、または保護基でブロックされた官能基である）の新たなオセルタミビル誘導体、ならびに適切な溶媒和物、塩、Ｒ／Ｓエナンチオマーおよび／またはプロドラッグを提供することに関する。
【００４３】
一実施形態では、本発明は、Ｌｉらによる刊行物（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ４２（１９９８），６４７−６５３）の第６４８頁に記載されている化合物ＧＳ４１１６およびＧＳ４１０９（式中、とりわけ、Ｒ１はＨまたはＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒ７はＨであり、Ｒ８はＮＨ２である）に関しない。
【００４４】
さらなる実施形態では、本発明は、Ｒ８がＮＨ２である場合に、Ｒ７がＯＨである化合物に関する。
【００４５】
さらなる実施形態では、本発明は、Ｒ７がＨであり、Ｒ８がＮＨ２である場合に、Ｒ１がＨまたはＣＨ２ＣＨ３ではない化合物に関する。
【００４６】
好ましい実施形態では、本発明は、化合物アミドキシム（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセトアミド−５−［Ｎ−（Ｎ’−ヒドロキシ）アセチミドアミド（ａｃｅｔｉｍｉｄａｍｉｄｏ）］−３−（１−エチルプロポキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボン酸エチルエステル、もしくはヒドロキシグアニジン（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセトアミド−５−［Ｎ−（Ｎ’ヒドロキシ）−グアニジノ］−３−（１−エチルプロポキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボン酸エチルエステル、ならびに／またはそれらの薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、Ｒ／Ｓエナンチオマー、および／もしくはプロドラッグに関する。
【００４７】
好ましい実施形態では、本発明は、医薬品として使用するための、好ましくはインフルエンザ感染症を処置するための上記化合物およびノイラミニダーゼ阻害剤に関し、一実施形態では、本発明の医薬品は、Ｌｉらによる刊行物（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ４２（１９９８），６４７−６５３）に記載されているように、第６４８頁に記載されている上記一般構造式の化合物ＧＳ４１１６およびＧＳ４１０９（式中、Ｒ１はＨまたはＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒ７はＨであり、Ｒ８はＮＨ２である）を包含する。Ｌｉらの記述とは反対に、本発明のグアニジン誘導体（３および９）は、インフルエンザに対して非常に優れた有効性を示す。
【００４８】
本発明にしたがって行われた実験では、アミン官能基をアミジンまたはグアニジン基で交換することにより、既存のインフルエンザ耐性機構を打倒することができることが示された。種々の抗ウイルスアッセイからの、本発明にしたがって行われた実験で得られた試験データは、アミジンおよびグアニジン誘導体が、インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）菌株に対してはオセルタミビルおよびザナミビルと同程度の効力であるが、オセルタミビル耐性インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）菌株に対しても有効であることを示している。それらはまた、種々のインフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）菌株に対しても有効である。加えて、本発明の化合物は、細胞毒性アッセイで驚くほど低い毒性、優れた溶解性、活性型で優れた活性化、および生理学的条件下で非常に優れた安定性を示す。
【００４９】
表１は、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）阻害アッセイにおける本発明の物質（３および９）の有効性を、ザナミビルおよびオセルタミビルと比較して示す。試験の詳細な説明は、方法の説明で見ることができる。
【００５０】
【表１】
2014532633.tif 000009
表１の値は、３および９の両方が、ナノモル濃度の範囲で、試験したインフルエンザＡウイルス８種のＮＡ活性を阻害することを示している。ＮＡ阻害アッセイで決定したＩＣ５０値は、ザナミビルおよびオセルタミビルのものとほぼ同程度であった。
【００５１】
オセルタミビルとは対照的に、３および９は、オセルタミビル耐性単離Ａ／３４２／２００９に対しても有効である。このウイルスについて定義される５０％阻害濃度は、ザナミビルと比較して１０倍（９）または５０倍（３）高かった。
【００５２】
ウイルス生成阻害アッセイでは、抗ウイルス効果も明らかである。試験結果を表２に示す。アミジン活性型（３）およびグアニジン活性型（９）は、ナノモル濃度の範囲で、インフルエンザウイルスＡ／Ｊｅｎａ／５２５８／２００９の力価を９０％および９５％減少させた。試験条件の詳細な説明は、方法の説明で見られる。
【００５３】
【表２】
2014532633.tif 000010
【００５４】
ｃｐＥ阻害アッセイにおいても、本発明の化合物の抗ウイルス活性の兆候がある。
【００５５】
試験で使用したウイルスの複製は、非常に顕著な細胞変性効果（ｃｐＥ）により、宿主細胞の完全破壊をもたらす。抗ウイルス活性物質を追加することによって（１００μｌ／ウェル；３パラレル／濃度、希釈係数２）、ウイルス誘導性ｃｐＥを選択的に阻害することができる。試験では、物質で処置したおよび未処置の閉細胞層に一定用量のウイルスを接種したところ、未処置ウイルス対照では、感染４８時間後に完全なｃｐＥがもたらされる。
【００５６】
【表３】
2014532633.tif 000011
【００５７】
アミジン活性型３およびグアニジン活性型９は、非細胞毒性の濃度範囲で、インフルエンザウイルスＡ／Ｊｅｎａ／５２５８／２００９およびＡ／３４２／２００９のｃｐＥを阻害し、５０％阻害濃度は、２．０μＭおよび１２．２μＭ（誘導体３）ならびに１．１μＭおよび４．１μＭ（誘導体９）であった。試験の試験条件の詳細な説明は、方法の説明で見られる。
【００５８】
本発明の化合物の別の利点は、それらの低毒性である。これに関して、ＭＤＣＫ（メイディン・ダービー・イヌ腎臓）細胞層で試験物質の５０％細胞毒性用量（ＣＣ５０）を決定するための細胞毒性アッセイにおいて、アミジン（３）およびグアニジン活性型（９）は、６．２５〜２００μｇ／ｍｌの試験濃度範囲では非毒性であることが見出された。試験条件の詳細な説明は、方法の説明で見られる。
【００５９】
本発明の化合物の別の好ましい特徴は、特に生理学的条件下におけるそれらの優れた安定性である。この試験により、各化合物は、ｐＨ２〜９の範囲内で非常に安定であることが示された（図１）。化合物のいずれについても、６時間の試験期間内では、化合物の分解は観察されなかった。
【００６０】
活性型３および９について、さらなる安定性試験を１４日間行ったところ、両化合物は、生理学的なｐＨの下では、４℃および室温（ＲＴ）の両方で試験期間にわたって安定であることが示された（図２）。溶液中での保存安定性は、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で測定した。この目的のために、化合物を５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７，４）またはＡｑｕａ  ｂｉｄｅｓｔに溶解し、室温（ＲＴ）（ｐＨ７．４）で、または冷蔵庫内に４℃（ｐＨ７．４またはＡｑｕａ  ｂｉｄｅｓｔ）で試験期間にわたって保存した。１２時間後、１日後、２日後、４日後、７日後および１４日後に、ＨＰＬＣによって活性型の濃度を測定した。
【００６１】
マウスおよびヒトの血漿を用いたその他の試験により、エステル官能基（すべてのプロドラッグにおいて、カルボキシ官能基のエチルエステル）は、血漿酵素によって速やかに開裂されることが示された。エステル開裂は、生体内活性化における重要な工程であり、これらのインキュベーションによってこれを証明することができた。活性型３および９は、血漿酵素によって代謝されない。
【００６２】
本発明の化合物の特定の利点は、それらの優れた溶解性である。化合物（２、３、６および１０）のほとんどが、研究したｐＨ値すべてにおいて、＞５０ｍＭの濃度で可溶性である（表４）。加えて、すべての物質が、ｐＨ値２において５０ｍＭ超で可溶性であることが見出された。したがって、すべての化合物は、胃内の酸性環境で非常によく溶解すると考えられる。加えて、しかしながら、より溶解性の低い物質（４、９）でも、すべてのｐＨ値において２０ｍＭ超で可溶性である。このように、すべての化合物が非常に優れた溶解特性を示しており、これは、それらを有効成分として使用することに関して好ましい要素である。したがって、例えば、経口投与形態に加えて、救急医療で必要とされる液体投与形態（注射、注入）もあり得る。
【００６３】
【表４】
2014532633.tif 000012
【００６４】
本発明の化合物の別の利点は、化合物が、非常に穏やかな血漿タンパク質結合のみを形成するという事実である。行った実験により、すべての試験化合物は、４０％未満のタンパク質結合を有することが示された（表５）。タンパク質結合が９０％超の場合にのみ、臨床的に関連する医薬品の相互作用のリスクが増加することから、今回開発したプロドラッグおよび活性型のタンパク質結合による臨床的に関連する相互作用は予想されない。
【００６５】
【表５】
2014532633.tif 000013
【００６６】
加えて、活性型オセルタミビル−アミジン（３）およびオセルタミビル−グアニジン（９）の両方のタンパク質結合をヒト血漿で調べた。この目的のために、４％アルブミン溶液に代えてヒト血漿を使用した。タンパク質結合は、測定した化合物３では３．７±１．４％および化合物９では８．６±３．０％であった。予想どおり、これらの値は、４％アルブミン溶液で得られた値よりもいくらか高く、アルブミンに加えてその他の血漿タンパク質（例えば、α１酸性糖タンパク質）の存在が原因である。
【００６７】
本発明の化合物の別の特定の利点は、既に確立したプロドラッグのコンセプトを使用することができるという事実である。エステルとして、カルボン酸を従来の形態で使用する。アミジンおよびグアニジン官能基について、現在十分に確立されているＮ−ヒドロキシコンセプトも使用した。記載されるプロドラッグ形態は、経口投与または非経口投与後における活性型の持続放出の観点からも興味深いものである。
【００６８】
プロドラッグについて、安定性、溶解性および活性型への活性化に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を行った。これらの結果により、化合物は十分な安定性、非常に優れた溶解性を示すこと、および活性型への活性化は様々な酵素調製物において良好な程度に起こることが示された。
【００６９】
細胞内酵素調製物によって、プロドラッグのそれらの活性型への活性化をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定した。酵素調製物として、ヒトおよびブタの肝臓組織由来の９０００ｇ上清、ミクロソームおよびミトコンドリアを使用した。インキュベーション混合物は、５００μＭプロドラッグ、５００μＭ  ＮＡＤＨ、１Ｕエステラーゼおよび０．３ｍｇの酵素調製物を１５０μｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）に溶解したものから構成されていた。インキュベーションは、振盪水浴中、３７℃で３０分間行った。１５０μｌのアセトニトリルを追加することによって、インキュベーションを終了した。続いて、試料を１０分間振盪し、沈殿したタンパク質を１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。ＨＰＬＣによって、上清を測定した。
【００７０】
得られた変換速度を表６に示す。
【００７１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行った活性化研究により、開発したプロドラッグはすべて、活性型３および９に変換したことが示された（表４）。すなわち、ヒトおよびマウスの血漿における安定性研究で示されたように、エステル開裂が起こり、加えてこれらのインキュベーションでは、アミドキシムまたはＮ−ＯＨ−グアニジンの還元を検出することができた。要約すると、化合物２、４、６および１０は、活性型３および９の適切なプロドラッグであると言うことができる。この研究は、化合物の生体内活性化が起こるという一般的な証明のみを提供する。変換速度は、ｉｎ  ｖｉｖｏで有意に高いはずである。
【００７２】
【表６】
2014532633.tif 000014
【００７３】
プロドラッグ２および１０について、カルボン酸エチルエステルの酵素加水分解をより詳細に分析した。ブタ肝臓由来の非特異的カルボキシルエステラーゼを酵素源として使用した。インキュベーション混合物は、２００μｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した２００μＭプロドラッグおよび３Ｕエステラーゼを含有していた。インキュベーションは、３７℃で６０分間行った。ＨＰＬＣによって、試料を１５分毎に分析した。
【００７４】
インキュベーションにより、両プロドラッグは、エステラーゼによってそれらの各活性型に活性化されることが示された。変換速度は、０．８３±０．１４ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質（プロドラッグ２）および１．３５±０．１５ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質（プロドラッグ１０）であった。
【００７５】
本発明の化合物の特定の利点は、それらの優れたバイオアベイラビリティである。
【００７６】
ラットの動物研究において、新たに開発したノイラミニダーゼ阻害剤をそれらの経口バイオアベイラビリティに関して試験した。これによって、すべての試験化合物は、それらが消化管から吸収されてそれらの活性型に代謝されることを示す。明確にするために、ノイラミニダーゼ阻害剤４および６の代謝を示す。
【化８】
2014532633.tif 000015
【００７７】
オセルタミビルアミドキシム誘導体（２、３および４）のバイオアベイラビリティ
最も高い血漿レベルは、オセルタミビルアミドキシム誘導体４の投与後に得られた。経口投与後、μモル範囲の活性型３の血漿レベルを、６時間の試験期間全体にわたって測定した。加えて、誘導体４を低スケールで投与した後、活性型３に代謝される中間代謝産物１１を検出することができた。アミドキシム誘導体４のバイオアベイラビリティは３１．３％であると決定した。３の血漿半減期は約１１２分間である（表２）。現在承認されている経口バイオアベイラビリティを有する唯一のノイラミニダーゼ阻害剤は、オセルタミビル（Ｔａｍｉｆｌｕ（登録商標））である。ラットの動物研究により、この化合物の経口バイオアベイラビリティは３６％であり、血漿半減期は４４分間であることが示された。［Ｅ．Ｊ．Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｂｉｄｇｏｏｄ，Ｋ．Ｃ．Ｃｕｎｄｙ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  １９９７，４１（９），１９４９−１９５２］。
【００７８】
したがって、新たに開発した本発明の化合物４は、バイオアベイラビリティの点では同程度である。この化合物の決定的な利点は、一方では、半減期が延長していること（これは、長時間作用する血漿レベルを可能にする）であり、他方では、オセルタミビル耐性インフルエンザ菌株に対する有効性が明らかに優れていることである。
【００７９】
同様に、その他の化合物（２、３）の投与は検出可能な血漿レベルの誘導体３を示したが、しかしながら、これらは４の投与後よりも低かった。
【００８０】
誘導体３の静脈内投与の結果を以下の表および図３に示す。
【００８１】
誘導体３の静脈内投与後の全血漿レベルの平均値
2014532633.tif 000016
【００８２】
誘導体４の経口投与は、以下の血漿レベルの誘導体３をもたらした。
【００８３】
誘導体４の経口投与後の誘導体３の全血漿レベルの平均値
2014532633.tif 000017
【００８４】
図４は、この結果をグラフで示す。
【００８５】
誘導体４の経口投与後、誘導体１１が代謝産物として検出される。これは、図５からも推測することができる。
【００８６】
誘導体４の経口投与後の中間代謝産物１１の全血漿レベルの平均値
2014532633.tif 000018
【００８７】
誘導体３の経口投与は、以下の血漿レベルをもたらす。図６も参照のこと。
【００８８】
誘導体３の経口投与後の誘導体３の全血漿レベルの平均値
2014532633.tif 000019
【００８９】
誘導体２の経口投与は、以下の血漿レベルをもたらす。図７も参照のこと。
【００９０】
誘導体２の経口投与後の誘導体３の全血漿レベルの平均値
2014532633.tif 000020
【００９１】
図８および以下の表は、アミジン系ノイラミニダーゼ阻害剤（２、３および４）の投与からの結果の概要を示す。
【００９２】
【表７】
2014532633.tif 000021
ＡＵＣ＝曲線下面積（ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ）；ｔｍａｘ＝最大血漿レベルが測定された時間。
ｃｍａｘ＝決定された最大血漿濃度；ＭＲＴ＝平均滞留時間（Ｍｅａｎ  Ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ  Ｔｉｍｅ）
ｔ１／２＝血漿半減期；血漿半減期ｔ１／２と同様に、ＭＲＴ（平均滞留時間：Ｍｅａｎ  Ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ  Ｔｉｍｅ）は、体内における物質の滞留時間の尺度である。それは古典的な薬物動態の値であり、ＡＵＭＣ（１次モーメント曲線下面積：ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｍｏｍｅｎｔ  ｃｕｒｖｅ）をＡＵＣ（曲線下面積：ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ）で割ることによって得られる。
【００９３】
オセルタミビルヒドロキシグアニジン誘導体（６、９、１０）のバイオアベイラビリティ
血漿試料の分析により、すべての試験誘導体の投与後に、検出可能な血漿レベルの誘導体９が６時間にわたって提供された。しかしながら、オセルタミビルアミドキシム誘導体との比較では（ａを参照のこと）、測定した血漿レベルは驚くほど低かった。３桁のナノモル範囲内で誘導体９の血漿濃度を測定したところ、誘導体４と比較して約１０倍低い。誘導体６の投与後、活性型９に代謝される中間代謝産物１２を検出することができた。
【００９４】
ヒドロキシグアニジン誘導体６のバイオアベイラビリティは、１．７％であると決定した。９の血漿半減期は、約９８分間である。その他の試験したグアニジン系オセルタミビル誘導体（９、１０）の経口バイオアベイラビリティは、誘導体６と有意差がない。
【００９５】
【表８】
2014532633.tif 000022
【００９６】
誘導体９の静脈内投与の結果を以下の表および図９に示す。
【００９７】
誘導体９の静脈内投与後の全血漿レベルの平均値
2014532633.tif 000023
【００９８】
誘導体９の経口投与は、以下の血漿レベルをもたらす。図１０も参照のこと。
【００９９】
誘導体９の経口投与後の誘導体９の全血漿レベルの平均値
2014532633.tif 000024
【０１００】
誘導体６の経口投与は、以下の血漿レベルをもたらす。図１１も参照のこと。
【０１０１】
誘導体６の経口投与後の誘導体９の全血漿レベルの平均値
2014532633.tif 000025
【０１０２】
誘導体６の経口投与後、誘導体１２が代謝産物として検出される。これは、図１２からも推測することができる。
【０１０３】
誘導体６の経口投与後の中間代謝産物１２の全血漿レベルの平均値
2014532633.tif 000026
【０１０４】
図１３は、グアニジン系ノイラミニダーゼ阻害剤（６、９、１０）の投与の結果の概要を示す。
【０１０５】
材料および方法：実施形態
合成
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセトアミド−５−（Ｎ−アセチミドアミド（ａｃｅｔｉｍｉｄａｍｉｄｏ））−３−（１−エチルプロポキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボン酸エチルエステルヒドロブロミド（２）
１ｇのオセルタミビル（３．２ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのエタノールに溶解し、混合物を０℃に冷却する。１．０４ｇのＳ−（ナフチルメチル）アセチミドブロミド（ａｃｅｔｉｍｉｄｏｂｒｏｍｉｄ）（１．１当量）をこの溶液に追加し、次いで、室温で１時間撹拌する。続いて、混合物を真空で濃縮し、約８０ｍｌの水に溶解する。この溶液を少しのジエチルエーテルで洗浄し、真空で濃縮する。この時点では、生成物（８５％）は少量の親化合物を依然として含有するが、これは、カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、５〜１０％）のみによって除去することができる。収量：９６０ｍｇ（７１％）（白色の固体）。
ＤＣ：Ｒｆ＝０．６５（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，９：１）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）：
δ／ｐｐｍ＝０．７９（ｔ，３Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），０．８５（ｔ，３Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），１．２３（ｔ，３Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），１．４４（ｍｃ，４Ｈ），１．８３（ｓ，３Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ），２．３３（ｍｃ，１Ｈ），２．６７（ｄｄ，２Ｊ＝１７．６Ｈｚ，３Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ），３．４２（ｑｕｉｎ，３Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８２（ｍｃ，１Ｈ），４．０５（ｍｃ，１Ｈ），４．１７（ｑ，３Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），４．３５，（ｍｃ，１Ｈ），６．６９（ｍｃ，１Ｈ），８．０４（ｂｒ  ｄ，３Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），８．６３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），９．２５，９．３５（２ｘｂｒ  ｓ，１Ｈ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝３５４［Ｍ＋Ｈ］＋
【０１０６】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセトアミド−５−（Ｎ−アセチミドアミド（ａｃｅｔｉｍｉｄａｍｉｄｏ））−３−（１−エチルプロポキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボン酸（３）
１０ｍｌのＭｅＯＨに溶解したオセルタミビルのアミジンエチルエステル（２１７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を１．５ｍｌの１ＭメタノールＫＯＨ（３当量）と混合し、出発物質がＤＣでもはや検出されなくなるまで４０℃で１時間撹拌する。この溶液を水で希釈し、１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ値を７〜８に調整する。この溶液を濃縮乾固し、次いで、逆相フラッシュクロマトグラフィー（ＲＰ−１８カラム、溶離液：水、検出：ヨウ素チャンバー）によって残留物を精製する。凍結乾燥後、生成物を白色の粉末として単離する。
収率：８８％（白色の微粉末）。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３００ＭＨｚ）：
δ／ｐｐｍ＝０．８４（ｔ，３Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），０．８９（ｔ，３Ｊ＝７．４Ｈｚ），３Ｈ，１．３８−１．６３（ｍ，４Ｈ），２．０３（ｓ，３Ｈ），２．２３（ｓ，３Ｈ），２．４３（ｍｃ，１Ｈ），２．８２（ｄｄ，２Ｊ＝１７．５Ｈｚ，３Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ，），３．５３（ｑｕｉｎ，３Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），３．９３−４．０９（ｍ，２Ｈ），４．３６ｍｃ，１Ｈ），６．７１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝３４８［Ｍ＋Ｎａ］＋，３２６［Ｍ＋Ｈ］＋．
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ１６Ｈ２７Ｎ３Ｏ４［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：３２６．２０７４３、実測値：３２６．２０７３７。
【０１０７】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセトアミド−５−［Ｎ−（Ｎ’−ヒドロキシ）アセチミドアミド（ａｃｅｔｉｍｉｄａｍｉｄｏ）］−３−（１−エチルプロポキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボン酸エチルエステル（４）
４６５ｍｇのオセルタミビル（１．４９ｍｍｏｌ）、２９０ｍｇのＤＩＰＥＡ（３８９μｌ、１．５当量）を５ｍｌのジクロロメタンに溶解し、０℃に冷却する。新たに調製したアセトヒドロキシモイルクロリド（２０９ｍｇ、１．５当量）をこの溶液にゆっくりと追加（滴下）する。混合物を室温で４時間撹拌し、１５ｍｌの水と混合し、さらに１時間撹拌し、次いで、分離漏斗で分離する。所望のアミドキシムの収量を増加させるために、ジクロロメタンで水相を４回抽出する。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で脱水し、真空で濃縮する。シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９：１）によって、粗生成物を精製する。
収率：７０％（無色の結晶性固体）
ＤＣ：Ｒｆ＝０．２９（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，９：１）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）：
δ／ｐｐｍ＝０．８０（ｔ，３Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），０．８５（ｔ，３Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），１．２３（ｔ，３Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），１．４３（ｍｃ，４Ｈ），１．８０（ｓ，３Ｈ），１．９５（ｓ，３Ｈ），２．３８（ｍｃ，１Ｈ），２．６２（ｄｄ，２Ｊ＝１７．４Ｈｚ，３Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ），３．４０（ｑｕｉｎ，３Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．６５（ｍｃ，１Ｈ）３．７８（ｄｄ，２Ｊ＝１７．４Ｈｚ，３Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），４．１５（ｑ，３Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），４．１９（ｍｃ，１Ｈ），６．６７，（ｍｃ，１Ｈ），６．８１（ｂｒ  ｄ，１Ｈ，３Ｊ＝９．１Ｈｚ），７．９９（ｄ，１Ｈ，３Ｊ＝８．６Ｈｚ），９．７３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝３９２［Ｍ＋Ｎａ］＋，３７０［Ｍ＋Ｈ］＋，３５４［Ｍ−ＯＨ＋Ｈ］＋．
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ１８Ｈ３１Ｎ３Ｏ５［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：３７０．２３３６５、実測値：３７０．２３３７９。
【０１０８】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセトアミド−５−［Ｎ−（Ｎ’ヒドロキシ）グアニジノ］−３−（１−エチルプロポキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボン酸エチルエステル（６）
２１３ｍｇのシアナミド（０．６ｍｍｏｌ）を５ｍｌの無水ジオキサンに溶解し、正確に１当量の遊離ヒドロキシルアミン（２０ｍｇ）を追加する。それを室温で３０分間撹拌し、濃縮し、ジクロロメタンおよびジエチルエーテルの追加および除去を数回行った後に、白色の固体が得られる。
収量：２２２ｍｇ（１００％）（白色の固体）
ＤＣ：Ｒｆ＝０．２０（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ，６：４）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）：
δ／ｐｐｍ＝０．８０（ｔ，３Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ），０．８４（ｔ，３Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），１．２４（ｔ，３Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），１．４０（ｍ，４Ｈ），１．８３（ｓ，３Ｈ），１．９９−２．０７（ｍ，１Ｈ），２．８６（ｄｄ，２Ｊ＝１６．７Ｈｚ，３Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），３．３８（ｑｕｉｎ，３Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），３．４９（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），４．０１，（ｍ，１Ｈ），４．１４（ｑ，３Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），４．２４（ｍ，１Ｈ），４．９２（ｓ，２Ｈ），６．６４（ｍ，１Ｈ），７．７２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．７９（ｄ，３Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）：
ｍ／ｚ＝７４１［２Ｍ＋Ｈ］＋，３９３［Ｍ＋Ｎａ］＋，３８６，３７１［Ｍ＋Ｈ］＋．
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ１７Ｈ３０Ｎ４Ｏ５［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：３７１．２２８９０、実測値：３７１．２２９１１
【０１０９】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセトアミド−５−［Ｎ−（Ｎ’−ｎ−ヘキシルオキシカルボニル）チオウレイド］−３−（１−エチルプロポキシ）−シクロヘキサ−１−エン−１−カルボン酸エチルエステル（７）
５００ｍｇのオセルタミビル（１．６ｍｍｏｌ）を５０ｍｌの無水ジクロロメタンに溶解し、等モル量のヘキシルオキシカルボニルイソチオシアナート（約０．５Ｍジクロロメタン溶液）をゆっくりと滴下する。室温で２時間撹拌した後、１％ＨＣｌ、水、ＮａＣｌ溶液でそれを洗浄する。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を脱水し、ロータリーエバポレータで濃縮する。粗生成物を細粉化することもできるし、またはシクロヘキサンで洗浄することもでき、これによって次の反応にとって十分に純粋なものになる。元素分析のために、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｃｙ／ＥｔＯＡｃ、６：４）によって、化合物をさらに精製した。
収量：６００ｍｇ（７５％）（白色〜黄色っぽい固体）
ＤＣ：Ｒｆ＝０．２０（Ｃｙ／ＥｔＯＡｃ，６：４）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）：
δ／ｐｐｍ＝０．７９（ｔ，３Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），０．８４（ｔ，３Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ），０．８７（ｔ，３Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），１．２３（ｔ，３Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．３０（ｍｃ，６Ｈ），１．４５（ｍｃ，４Ｈ），１．５７（ｍｃ，２Ｈ）１．８０（ｓ，３Ｈ），２．３０（ｄｄ，１Ｈ，２Ｊ＝１７．８Ｈｚ，３Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．９０（ｄｄ，１Ｈ，２Ｊ＝１７．８Ｈｚ，３Ｊ＝５．０Ｈｚ），３，４３（ｑｕｉｎ，１Ｈ，３Ｊ＝５．４Ｈｚ），４．０７（ｍｃ，４Ｈ），４．１６（ｑ，２Ｈ，３Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．５５（ｍｃ，１Ｈ），６．７４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．９１（ｂｒ  ｄ，１Ｈ，３Ｊ＝８．０Ｈｚ），９．９８（ｄ，１Ｈ，３Ｊ＝７．６Ｈｚ），１０．９０（ｓ，１Ｈ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）：
ｍ／ｚ＝５００［Ｍ＋Ｈ］＋，４８３，４１２
【０１１０】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセトアミド−５−［Ｎ−（Ｎ’−ｎ−ヘキシルオキシカルボニル）−（Ｎ”−（２−メトキシプロパン−２−イル）オキシ）グアニジノ］−３−（１−エチルプロポキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボン酸エチルエステル（８）
３５８ｍｇのオセルタミビルヘキシルチオ尿素（０．７２ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの無水ジクロロメタンに溶解し、１５１ｍｇのＯ−（２−メトキシプロパン−２−イル）ヒドロキシルアミン（２当量）、２５１μｌのＤＩＰＥＡ（２当量）、２７６ｍｇのＥＤＣＩ（２当量）を追加する。混合物を室温で１．５日間撹拌し、濃縮し、シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、０〜２％）によって処理する。
ＤＣ：Ｒｆ＝０．３９（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，９８：２）
収量：３７４ｍｇ（９１％）（白色の固体）（これを−２０℃で保存する）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）：
δ／ｐｐｍ＝０．８３（ｍｃ，９Ｈ）１．２７（ｍｃ，１２Ｈ），１．２７（ｍｃ，１２Ｈ），１．４５（ｍｃ，４Ｈ），１．５７（ｍｃ，２Ｈ），１．８０（ｓ，３Ｈ），２．３０（ｄｄ，１Ｈ，２Ｊ＝１８．１Ｈｚ，３Ｊ＝７．１Ｈｚ），２．９０（ｄｄ，１Ｈ，２Ｊ＝１８．１Ｈｚ，３Ｊ＝５．２Ｈｚ），３．０６（ｓ，３Ｈ），３．４３（ｑｕｉｎ，１Ｈ，３Ｊ＝５．６Ｈｚ），４．０６（ｍｃ，４Ｈ），４．１６（ｑ，２Ｈ，３Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．５５（ｍｃ，１Ｈ），６．７４（ｓ，１Ｈ），７．９１（ｄ，１Ｈ，３Ｊ＝８．１Ｈｚ），９．９８（ｄ，１Ｈ，３Ｊ＝７．８Ｈｚ），１０．９０（ｓ，１Ｈ）．
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ２８Ｈ５０Ｎ４Ｏ８［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値：５７１．３７０１４、実測値：５７１．３７０３４。
【０１１１】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセトアミド−５−（Ｎ−グアニジノ）−３−（１−エチルプロポキシ）シクロヘキサ−１−エン−１−カルボン酸（９）
Ａ）阻害剤およびプロドラッグの薬物動態特性決定
１．アミジン活性型（３）およびそのプロドラッグ（２、４）ならびにグアニジン活性型（９）およびそのプロドラッグ（６、１０）の６時間にわたる安定性研究
５０ｍＭカリウムリン酸緩衝液中、０．２ｍＭの濃度で、安定性試験を行った。この目的のために、２ｍＭ原液を１０ｍＭカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で調製し、各ｐＨ値のリン酸緩衝液で１：１０希釈した。ｐＨ２．０、７．４および９．０で、各化合物を試験した。この目的のために、ＨＰＬＣによって試料を３０分毎に分析し、安定性を６時間にわたって試験した。ｔ＝０分の濃度を１００％として設定した。
【０１１２】
加えて、ヒトおよびマウスの血漿で、前記物質を試験した。この目的のために、６３０μｌの血漿と、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した各化合物の２ｍＭ原液７０μｌとを混合した。インキュベーションは、振盪水浴中、３７℃で実施した。１５分、３０分、４５分、６０分、９０分および１２０分の時点において、１００μｌの試料を取り出し、１００μｌのアセトニトリルを追加することによって、インキュベーションを終了した。試料を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ／１０分）し、ＨＰＬＣによって上清を検査した。
【０１１３】
以下のＨＰＬＣ法を使用して、安定性研究を分析した。
【０１１４】
ＨＰＬＣ法
ＨＰＬＣ−システム  Ｗａｔｅｒｓ  Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ  ７１７ｐｌｕｓ、Ｗａｔｅｒｓ６００制御器、Ｗａｔｅｒｓ６００ポンプ、Ｗａｔｅｒｓ２４８７  Ｄｕａｌ  λ吸光度検出器およびＥＺＣｈｒｏｍ  Ｅｌｉｔｅ  Ｃｌｉｅｎｔ／サーバ記録および分析ソフトウェア（バージョン２．８．３）
カラム：            ＲＰ−ｓｅｌｅｃｔ  Ｂガードカラム（４ｘ４ｍｍ）を備えるＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ  ６０  ＲＰ−ｓｅｌｅｃｔ  Ｂ（１２５ｘ４ｍｍ、５μｍ）。
流量：              １ｍｌ／分
溶離液：            ３、９の場合には６０％１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／０．１％ＴＦＡ  ｐＨ３．０
４０％ＭｅＯＨ、
２、４、６、１０の場合には５０％１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／０．１％ＴＦＡ  ｐＨ３．０
５０％ＭｅＯＨ
実行時間：          ７．５分間
検出：              ２３０ｎｍ
注入量：            １０μｌ
保持時間：          ４      ４．２±０．１分間
９      ４．４±０．２分間
３      ４．５±０．２分間
６      ４．６±０．１分間
２      ４．８±０．１分間
１０    ３．７±０．１分間
【０１１５】
アミジン活性型（３）およびグアニジン活性型（９）の２週間にわたる安定性研究
ｐＨ７．４における研究：
０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で、溶解形態の保存安定性を測定した。この目的のために、化合物を５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．４）またはａｑｕａ  ｂｉｄｅｓｔに溶解し、調査期間にわたって室温（ＲＴ）（ｐＨ７．４）で、または冷蔵庫内に４℃（ｐＨ７．４またはａｑｕａ  ｂｉｄｅｓｔ）で保存した。１２時間後、１日後、２日後、４日後、７日後および１４日後に、ＨＰＬＣによって活性型の濃度を測定した。
【０１１６】
２．試験化合物の溶解性アッセイ
異なるｐＨ値における溶解性の測定：
異なるｐＨ値（２．０、７．４および９．０）のリン酸緩衝液で、化合物の溶解性を測定した。この目的のために、数ｍｇの化合物を計量し、５０ｍＭ溶液の各ｐＨ値の５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４緩衝液の一定容量と混合した。化合物が完全に溶解しなかった場合、懸濁液を３０分間振盪した。続いて、１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することによって、未溶解部分を除去し、ＨＰＬＣによって上清の濃度を測定した。
【０１１７】
３．アミジン活性型（３）およびそのプロドラッグ（２、４）ならびにグアニジン活性型（９）およびそのプロドラッグ（６、１０）のタンパク質結合の測定
３つの異なる濃度（１０、２５、および５０μＭ）で、血漿タンパク質結合を行った。タンパク質溶液として、４％アルブミン溶液を使用した。各場合において、１０倍濃縮した物質の溶液５０μｌを４５０μｌのタンパク質溶液にピペッティングした。インキュベーションは、振盪水浴中、３７℃で１５分間行った。続いて、試料を限外ろ過ユニット（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ５００、１０ｋＤａカットオフ）に移し、１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。ＨＰＬＣによって、ろ液を分析した。加えて、各濃度について対照を設けた（これは、タンパク質で処理せず、遠心分離しなかった）。しかしながら、タンパク質の上清を含まない別の対照をろ過ユニットで遠心分離したところ、このプロドラッグは膜によって保持されないことが示され、この手順を検証するのに使用した。
【０１１８】
加えて、２つの活性型（オセルタミビル−アミジン（３）およびオセルタミビル−グアニジン（９））のタンパク質結合をヒト血漿で調べた。この目的のために、４％アルブミン溶液に代えてヒト血漿を使用した。タンパク質結合は、化合物３では３．７±１．４％であり、化合物９では８．６±３．０％であると決定した。予想どおり、これらの値は、４％アルブミン溶液で得られた値よりもいくらか高く、アルブミンの他にその他の血漿タンパク質（例えば、α１酸性糖タンパク質）の存在が原因である。
【０１１９】
４．種々のプロドラッグ（２、４、６、１０）の生体内活性化の調査
様々な細胞内酵素系によるプロドラッグの活性化の測定：
細胞内酵素調製物によって、プロドラッグのそれらの活性型への活性化をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定した。酵素調製物として、ヒトおよびブタの肝臓組織由来の９０００Ｇ上清、ミクロソームおよびミトコンドリアを使用した。インキュベーション混合物は、５００μＭプロドラッグ、５００μＭ  ＮＡＤＨ、１Ｕエステラーゼおよび０．３ｍｇの酵素調製物を１５０μｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）に溶解したものから構成されていた。インキュベーションは、振盪水浴中、３７℃で３０分間行った。１５０μｌのアセトニトリルを追加することによって、インキュベーションを終了した。その後、試料を１０分間振盪し、１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することによって、沈殿したタンパク質を除去した。ＨＰＬＣによって、上清を測定した。
【０１２０】
活性型（３／９）およびプロドラッグ（２、４／６、１０）の測定のためのＨＰＬＣ法
ＨＰＬＣシステム  Ｗａｔｅｒｓ  ｅ２６９５  ＸＣ分離モジュールを備えるＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣシステム、
Ｗａｔｅｒｓ  ２９９８フォトダイオードアレイ検出器およびＥｍｐｏｗｅｒ２ソフトウェア
カラム：          Ｃ１８ガードカラム（４ｘ４ｍｍ）を備えるＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ  ６０  ＲＰ−ｓｅｌｅｃｔ  Ｂ（１２５ｘ４ｍｍ、５μｍ）
流量：            １ｍｌ／分
移動相：          ７０％１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／０．１％ＴＦＡ  ｐＨ６．５
３０％ＭｅＯＨ
実行時間：        １２分間
検出：            ２１０ｎｍ
注入容量：        １０μｌ
保持時間：          ３      ４．８±０．２分間
９      ４．７±０．２分間
１０  ２４．８±０．４分間
６    ２５．２±０．３分間
４    ２６．６±０．３分間
２    ２６．６±０．３分間
【０１２１】
抗ウイルス活性
化学発光ベースのノイラミニダーゼ（ＮＡ）−阻害アッセイにおける抗ウイルス活性の測定
以下のインフルエンザウイルスを研究に使用した：
Ｈ１Ｎ１ウイルス：Ａ／Ｊｅｎａ／５２５８／２００９、Ａ／Ｊｅｎａ／５５５５／０９、Ａ／ＨＨ／１５８０／０９、Ａ／３４２／２００９（オセルタミビル耐性）
Ｈ２Ｎ３ウイルス：香港／８／６８、サクソニー／６／０２、ベルリン／１０／０４、ラインラント−プファルツ／３９１１／０３。
【０１２２】
市販のＮＡ−Ｓｔａｒキット（Ｔｒｏｐｉｘ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）を使用して、試験化合物３および９ならびに対照物質によるウイルスノイラミニダーゼの阻害を調べた。
【０１２３】
製造業者の推奨にしたがって、この後の阻害アッセイのための試験ウイルスの最適希釈物を予備試験で最初に測定した。この目的のために、ノイラミニダーゼ阻害剤（ＮＡＩ）の非存在下で、ウイルス懸濁液をＮＡ−Ｓｔａｒ緩衝液（希釈係数３）で希釈した。続いて、５０％阻害濃度を決定するためのＮＡ阻害アッセイでは、４０：１のシグナルバックグラウンド比をもたらすウイルス希釈物を使用した。
【０１２４】
ウイルス対照６個／プレートのＮＡ阻害アッセイでは、２５μｌのアッセイ緩衝液、または試験物質（３パラレル／希釈物）もしくは対照物質（２パラレル／希釈物）を含むアッセイ緩衝液中２５μｌを、９６ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェルにアプライした。次いで、２５μｌのウイルス希釈物を各ウェルに追加した。３７℃での２０分間のインキュベーション時間の後、アッセイ緩衝液で基質を１：５００希釈し、１０μｌを各ウェルにそれぞれ追加した。３０分後、プレートリーダ（マイクロタイタープレートルミノメータ、Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｇｙ）で、化学発光の測定を実施した。アッセイ評価のために、６個の未処置ウイルス対照について測定した化学発光の平均をＮＡ活性の１００％の値とし、前記物質で処置した個々のウェルの相対ＮＡ活性の計算に使用した。続いて、２回の独立したアッセイの得られた平均用量反応曲線から、ＥＸＣＥＬの線形補間によって、試験物質および対照物質の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を計算した。
【０１２５】
ウイルス生成（ＶＹ）阻害アッセイにおける試験物質の抗ウイルス活性の測定
細胞：                ＭＤＣＫ細胞
インフルエンザウイルス：ａ）Ａ／Ｊｅｎａ／５２５８／２００９（流行性Ｈ１Ｎ１；オセルタミビル感受性）
ｂ）Ａ／３４２／２００９（Ｈ１Ｎ１；オセルタミビル耐性）
【０１２６】
抗ウイルス剤を追加することによって（１００μｌ／ウェル；３パラレル／濃度／試験物質および２パラレル／濃度／対照物質、希釈係数１０）、ウイルス複製を選択的に阻害することができる。これは、上清中のウイルス力価の減少に基づいて、実験的に測定することができる。
【０１２７】
このアッセイでは、２日齢の閉細胞単層に一定用量のウイルスを接種したところ、３個の未処置ウイルス対照では、感染４８時間後に不完全な細胞変性効果がもたらされる。３７℃で１時間インキュベーションした後、各ウェルを３回連続して洗浄することによって、細胞に結合しなかったウイルスを除去し、１００μｌの試験培地（細胞およびウイルス対照）または前記物質の希釈物を追加した。３７℃で４８時間インキュベーションした後、上清のウイルス力価を測定するために、各ウェルの上清を回収した。
【０１２８】
ウイルス力価の測定は、マイクロタイタープレート中、２日齢のＭＤＣＫ細胞単層で実施した。この目的のために、最初に、ＶＹ阻害アッセイからの上清から、対数連続希釈物（最大希釈係数１０；最大希釈１０−７）を作製した。これらを細胞に接種し（それぞれ４ウェル／ウイルス希釈物）、３７℃で４日間インキュベーションした。この期間の間に、細胞変性効果が形成された。クリスタルバイオレットホルマリン溶液で細胞を固定および染色した後、ライトボックス上で目視評価を行った。
【０１２９】
続いて、Ｒｅｅｄ  ａｎｄ  Ｍｕｅｎｃｈにしたがってウイルス力価を計算した。力価の減少を計算するために、３個のウイルス対照のウイルス力価の平均を１００％とした。
【０１３０】
ｃｐＥ阻害アッセイにおける試験物質の抗ウイルス活性の測定
アッセイで使用したウイルスの複製は、非常に顕著な細胞変性効果（ｃｐＥ）により、宿主細胞の完全破壊をもたらす。抗ウイルス活性物質を追加することによって（１００μｌ／ウェル；３パラレル／濃度、希釈係数２）、ウイルス誘導性ｃｐＥを選択的に阻害することができる。アッセイでは、未処置のおよび物質で処置した閉細胞層に一定用量のウイルスを接種したところ、未処置ウイルス対照では、感染４８時間後に完全なｃｐＥがもたらされる。この時点において、クリスタルバイオレット／ホルマリン溶液で残りの接着細胞を固定および染色した。色素を溶出した後、Ｄｙｎａｔｅｃｈプレートリーダで、ウイルス誘導性ｃｐＥの阻害を測光定量した。
【０１３１】
物質で処置したおよび未処置のウイルス感染細胞の光学密度を細胞対照の平均光学密度（１００％として設定したもの）と比較することによって、抗ウイルス効果の計算を行った。２回の実験の平均用量反応曲線に基づいて、ＥＸＣＥＬの線形補間によって、ウイルス誘導性ｃｐＥの形成を５０％阻害した希釈（ＩＣ５０）を計算した。
【０１３２】
ＭＤＣＫ（メイディン・ダービー・イヌ腎臓）細胞層における試験物質の５０％細胞毒性用量（ＣＣ５０）を決定するための細胞毒性アッセイ
ＭＤＣＫ細胞をマイクロタイタープレートに播種し、５％ＣＯ２、３７℃および湿度９５％のインキュベータ内で４８時間インキュベーションして、閉細胞層を形成した。この目的のために、培地を除去し、前記物質を種々の濃度（１００μｌ／ウェル、３パラレル／濃度、希釈係数２）で培養培地にアプライした。対照値の測定のために（６個の未処置細胞対照）、１００μｌの培地をそれぞれ使用した。物質を投与してインキュベーションした７２時間後に、クリスタルバイオレット／メタノールで細胞の染色を行う。色素を溶出した後、Ｄｙｎａｔｅｃｈ製のプレートフォトメータで各ウェルの光学密度（ＯＤ）を測定し（５５０／６３０ｎｍ）、細胞対照の平均と比較した。対照の平均を１００％とした。
【０１３３】
動物研究
動物の取り扱い／準備
体重約３００〜３５０ｇのスプラーグドーリー（ＳＤ）ラットを実験開始前に１０日間馴化し、一定温度（２０℃）および湿度５０％の空調室内に置いた。この部屋では、明暗周期は１２時間であった。暗期は毎日１８時に始まり、６時に明期に切り替わった。馴化期間の間は、サイズ３の標準的なケージ（長さ：４２ｃｍ、幅２６ｃｍ、高さ：１５ｃｍ）内にラットを置き、実験開始の３日前に、同一環境条件の特別な実験室に移した。ラットには、自由に維持食（ラットおよびマウス用の維持食；Ｎｏ．１３２０；Ａｌｔｒｏｍｉｎ）および水道水を与えた。
【０１３４】
本明細書に記載される動物実験は、Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｒｕｒａｌ  Ａｒｅａｓ  ｏｆ  Ｓｃｈｌｅｓｗｉｇ−Ｈｏｌｓｔｅｉｎによる承認後に、実験動物の取り扱いおよび使用についての「ＮＩＨガイドライン」および対応する規定にしたがって行った。
【０１３５】
静脈内投与（ｉ．ｖ．）を受けたラットの大腿静脈および大腿動脈にカテーテルを埋め込んだ。物質の経口投与のみを受けたラットには、静脈内カテーテルのみを挿入した。
【０１３６】
ペントバルビタール（６０ｍｇ／ｋｇ腹腔内（ｉ．ｐ．））でラットを麻酔し、麻酔深度が不十分な場合にはジエチルエーテルでさらに麻酔した。頸部および右鼠径部を悌毛した後、ラットを仰臥位にして電気加熱ステージ（ＥＢＥＲＬＥ，ｔｙｐｅ５２１０２）上に置いて体温を維持し、後肢を固定した。鼠径部に沿って、長さ約１．５ｃｍの切開を施した。続いて、大腿動脈、大腿静脈および大腿神経の血管束を長さ約１ｃｍに切開した。
【０１３７】
大腿静脈の分離後、木綿糸をその周囲近くに設置し、血管を堅く縛ることによって可逆的に閉塞した。末端方向に約５ｍｍの血管を２番目の糸で縛って鬱血を作り出した。血管用ハサミを用いて、鬱血領域内の血管に小さな切開を施し（末端結紮から鬱血の全長の約１／３）、ヘパリン溶液（２５０ＩＵ／ｍｌ）を充填したポリエチレンチューブ（長さ：２６ｃｍ；ＩＤ：０．５８ｍｍ、ＯＤ０．９６ｍｍ）を、容器拡張器を用いて大静脈近くに３ｃｍ挿入した。近接および末端の糸で、カテーテルを血管に固定した。
【０１３８】
大腿静脈とは対照的に、最初に、末端結紮によって大腿動脈を閉塞し、次いで、糸を堅く縛ることによって近くに閉じ込めた。ここでも、上記のようにカテーテルを埋め込んだ。動脈の内径が小さいため、ポリエチレンチューブ（長さ：２６ｃｍ、ＩＤ：０．５８ｍｍ、ＯＤ０．９６ｍｍ）および長さ３ｃｍの溶接ポリエチレンチューブ（ＩＤ：０．２８ｍｍ、ＯＤ：０．６１ｍｍ）からなる特製の動脈カテーテルを使用した。
【０１３９】
カテーテルを組み入れた後、動物を腹臥位にして、幅５ｍｍの切開を頸部に施した。金属のロッドおよびチューブを用いて、ワイヤーピンでシールされたカテーテルを頸部の突起から引き抜き、木綿糸で頸部を固定し、長さ約３ｃｍに切断した。
【０１４０】
再び仰臥位にして、３〜４回の二重ボタン穴縫合で皮下脂肪および次いで表皮を最初に縫い合わせ、Ｂｅｔａｉｓａｄｏｎｎａ（登録商標）溶液で消毒した。翌日、３００μｌのヘパリン溶液（２５０ＩＵ／ｍｌ）で、カテーテルを朝晩にそれぞれ洗浄した。手術したラットは、カテーテルを挿入した日から、寸法が高さ：２０ｃｍ、幅：２２ｃｍ、および長さ：２５ｃｍのプレキシグラス製実験ケージ、またはサイズ３の標準的なケージ内に個々に置いた。
【０１４１】
カテーテルを挿入した動物は、手術後に１日間実験室内に置き、そして個々にそれらの実験ケージ内に置いた。試験化合物の適用は、手術後２日目に行った。実験の日、試験１時間前にラットを計量し、３００μｌのヘパリン溶液で動脈カテーテルを洗浄した。続いて、化合物の静脈内（ｉ．ｖ．）投与または経口投与を行った。
【０１４２】
動物研究の実施
オセルタミビル誘導体３を１０ｍｇ／ｋｇの濃度で５匹のラットに静脈内投与した。５匹または６匹のラットに対して、５０ｍｇ／ｋｇの投与量で、ノイラミニダーゼ阻害剤（２、４）の経口投与を行った。加えて、誘導体３を３匹のラットに経口投与（５０ｍｇ／ｋｇ）した。経口投与は、アラビアゴム（１０％ｗ／ｖ）を含む懸濁液または溶液として経管栄養によって実施した。
【０１４３】
オセルタミビル誘導体９を１０ｍｇ／ｋｇの濃度で５匹のラットに静脈内投与した。４匹または５匹のラットに対して、５０ｍｇ／ｋｇの用量で、ノイラミニダーゼ阻害剤（６、１０）の経口投与を行った。加えて、誘導体９を３匹のラットに経口投与（５０ｍｇ／ｋｇ）した。経口投与は、アラビアゴム（１０％ｗ／ｖ）を含む懸濁液または溶液として経管栄養によって行った。
【０１４４】
血漿試料は、静脈内（ｉ．ｖ．）投与後５分、１０分、２０分、４５分、９０分、１５０分、２４０分および３６０分の時点で採取し、経口投与後３０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分、２４０分および３６０分の時点で採取した。この目的のために、各場合において、インスリン注射器を使用して３００μｌの全血を採取し、ＥＤＴＡ−ｃｏａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅｓ  ＣＢ  ３００（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ）に移した。各回収後、１００μｌの０．９％生理食塩水または６０分間毎にヘパリン溶液（２５０ＩＵ／ｍｌ）でそれを洗浄した。血液試料を簡単に振盪し、遠心分離（４℃；１４０００Ｕ／分；１０分間）まで氷上に置いた。続いて、試料を−８０℃で凍結した。
【０１４５】
薬物投与の６時間後に、ギロチンで断頭することによって屠殺を行った。続いて、器官を取り出した。すべての器官を消毒し、ドライアイスで冷却した２−メチルブタンで凍結した。肝臓、腎臓および肺を回収した。
【０１４６】
血漿試料の分析
血漿試料を加工し、ＨＰＬＣによって分析した。この目的のために、血漿試料を室温で解凍した。各場合において、８０μｌのメタノール（＋０．２％ＴＦＡ）を調製し、続いて、８０μｌの血漿試料をピペッティングした。試料を４５分間振盪して、血漿タンパク質を沈殿させた。試料を−８０℃で凍結し、解凍し、さらに１５分間振盪した。試料を１３，０００ＲＰＭで１５分間遠心分離し、上清をＨＰＬＣバイアルに移した。各場合において、５０μｌをＬＣ／ＭＳによる測定に使用した。
【０１４７】
以下のＬＣ／ＭＳ法を使用して、動物研究を評価した。
ＬＣ／ＭＳ法
ＨＰＬＣシステム：Ａｇｉｌｅｎｔ１１００バイナリポンプ、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ダイオードアレイ検出器、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ウェルプレートオートサンプラ、脱ガス装置Ｇ１３２２Ａ
カラム：          ＲＰ−ｓｅｌｅｃｔを備えるＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ  ６０  ＲＰ−ｓｅｌｅｃｔ  Ｂ（１２５ｘ３ｍｍ、５μｌ）；Ｂガードカラム（４ｘ４ｍｍ）
質量分析計        Ｅｓｑｕｉｒｅ−ＬＣ
インターフェイス：ＥＳＩ（電子衝突イオン化）
ネブライザー：    ０．２８ＭＰａ（４０．０ｐｓｉ）
乾性ガス：        ８．０ｍｌ／分
乾燥温度：        ３５０℃
ＨＶキャピラリー  ５０００Ｖ
移動相：Ａ        ０．１％ＴＦＡのａｑｕａ  ｂｉｄｅｓｔ溶液（ｐＨ２．５）
Ｂ        ０．１％ＴＦＡのＭｅＯＨ溶液
勾配プロファイル：時間      Ａ［％］      Ｂ［％］
０      ５５          ４５
８      ２５          ７５
１０    ２５          ７５
１１    ５５          ４５
１７    ５５          ４５
流量：            ０．３ｍｌ／分
実行時間：        １７分間
検出：            ＰＤＡ（１９０〜４００ｎｍ）
注入量：          ５０μｌ
保持時間：
３      ５．１±０．３分間
９      ５．１±０．３分間
１１    ５．２±０．３分間
１２    ５．２±０．３分間
【０１４８】
参考文献
1.Hanessian, S.; Wang, J.; Montgomery, D.; Stoll, V.; Stewart, K. D.; Kati, W.; Maring, C.; Kempf, D.; Hutchins, C.; Laver, W. G. Design, synthesis, and neuraminidase inhibitory activity of GS-4071 analogues that utilize a novel hydrophobic paradigm. Bioorg Med Chem Lett 2002, 12, 3425-9.
2.Du, Q. S.; Wang, S. Q.; Chou, K. C. Analogue inhibitors by modifying oseltamivir based on the crystal neuraminidase structure for treating drug-resistant H5N1 virus. Biochem Biophys Res Commun 2007, 362, 525-31.
3.Masuda, T.; Shibuya, S.; Arai, M.; Yoshida, S.; Tomozawa, T.; Ohno, A.; Yamashita, M.; Honda, T. Synthesis and anti-influenza evaluation of orally active bicyclic ether derivatives related to zanamivir. Bioorg Med Chem Lett 2003, 13, 669-73.
4.Li, Y.; Zhou, B.; Wang, R. Rational design of Tamiflu derivatives targeting at the open conformation of neuraminidase subtype 1. J Mol Graph Model 2009, 28, 203-19.
5.D'Souza, C.; Kanyalkar, M.; Joshi, M.; Coutinho, E.; Srivastava, S. Search for novel neuraminidase inhibitors: Design, synthesis and interaction of oseltamivir derivatives with model membrane using docking, NMR and DSC methods. Biochim Biophys Acta 2009, 1788, 1740-51.
6.Wang, S. Q.; Cheng, X. C.; Dong, W. L.; Wang, R. L.; Chou, K. C. Three new powerful oseltamivir derivatives for inhibiting the neuraminidase of influenza virus. Biochem Biophys Res Commun 401, 188-91.
7.Carbain, B.; Collins, P. J.; Callum, L.; Martin, S. R.; Hay, A. J.; McCauley, J.; Streicher, H. Efficient synthesis of highly active phospha-isosteres of the influenza neuraminidase inhibitor oseltamivir. ChemMedChem 2009, 4, 335-7.
8.Shie, J. J.; Fang, J. M.; Wang, S. Y.; Tsai, K. C.; Cheng, Y. S.; Yang, A. S.; Hsiao, S. C.; Su, C. Y.; Wong, C. H. Synthesis of tamiflu and its phosphonate congeners possessing potent anti-influenza activity. J Am Chem Soc 2007, 129, 11892-3.
9.Smee, D. F.; Huffman, J. H.; Morrison, A. C.; Barnard, D. L.; Sidwell, R. W. Cyclopentane neuraminidase inhibitors with potent in vitro anti-influenza virus activities. Antimicrob Agents Chemother 2001, 45, 743-8.
10.Zhang, J.; Wang, Q.; Fang, H.; Xu, W.; Liu, A.; Du, G. Design, synthesis, inhibitory activity, and SAR studies of hydrophobic p-aminosalicylic acid derivatives as neuraminidase inhibitors. Bioorg Med Chem 2008, 16, 3839-47.
11.Albohy, A.; Mohan, S.; Zheng, R. B.; Pinto, B. M.; Cairo, C. W. Inhibitor selectivity of a new class of oseltamivir analogs against viral neuraminidase over human neuraminidase enzymes. Bioorg Med Chem 19, 2817-22.
【図１】
2014532633.tif 000031
【図２】
2014532633.tif 000032
【図３】
2014532633.tif 000033
【図４】
2014532633.tif 000034
【図５】
2014532633.tif 000035
【図６】
2014532633.tif 000036
【図７】
2014532633.tif 000037
【図８】
2014532633.tif 000038
【図９】
2014532633.tif 000039
【図１０】
2014532633.tif 000040
【図１１】
2014532633.tif 000041
【図１２】
2014532633.tif 000042
【図１３】
2014532633.tif 000043
【国際調査報告】
2014532633.tif 000044
2014532633.tif 000045
2014532633.tif 000046
2014532633.tif 000047
2014532633.tif 000048
2014532633.tif 000049