(57)【要約】  （ａ）酸素及び炭水化物オキシダーゼ補因子の存在で、ヒドロキシル基を有する炭化水素と、酸素依存及び補因子依存の炭水化物オキシダーゼ活性を有する生物剤とを接触する工程、（ｂ）アミノ酸デヒドロゲナーゼ補因子及びアミノ酸デヒドロゲナーゼの基質アミノ酸の存在で、工程ａ）において製造された炭水化物とトランスアミナーゼ活性を有する生物剤及び補因子依存のアミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する生物剤とを接触する工程を含む方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下、
ａ）酸素及び炭水化物オキシダーゼ補因子の存在で、ヒドロキシル基を有する炭化水素と、酸素依存及び補因子依存の炭水化物オキシダーゼ活性を有するポリペプチド又はかかるポリペプチドを有するホールセル生体触媒とを接触させる工程、並びに
ｂ）アミノ酸デヒドロゲナーゼ補因子及びアミノ酸デヒドロゲナーゼの基質アミノ酸の存在で、工程ａ）において製造された炭化水素と、トランスアミナーゼ活性を有するポリペプチド又はかかるポリペプチドを有するホールセル生体触媒と、補因子依存のアミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド又はかかるポリペプチドを有するホールセル生体触媒とを接触させる工程
を含む方法であって、
ヒドロキシル基を有する炭化水素が、−（ＣＨ2）x−ＯＨ ［式中ｘは０〜４である］を含む群から選択される少なくとも１つの置換基を有する５又は６員環を含み、かつ
酸素依存及び補因子依存の炭水化物オキシダーゼ活性を有するポリペプチドが、フザリウム属（Fusarium）ＮＲＲＬ ２９０３からのガラクトースオキシダーゼのＭ１変異体、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）からのピラノースオキシダーゼ、コンドルス・クリスプス（Chondrus crispus）からのヘキソースオキシダーゼ及びそれらの相同体を含む群から選択される、前記方法。
【請求項２】
前記ヒドロキシル基を有する炭化水素が、式（Ｉ）又は（ＩＩ）
【化１】
2014516572.tif 000014
［式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦの２つまでは、それぞれ及び独立して、Ｎ、Ｓ及びＯを含む群から選択される原子であり、かつ他はＣであり、
Ｒ3は、Ｈ、ハロゲン、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、
【化２】
2014516572.tif 000015
を含む群から選択され、
ｘは０〜２０、有利には０〜４であり、かつ
Ｒ4は、Ｈ、並びに置換又は非置換のアルキル、シクロアルキル、アリール及びヘテロアリールを含む群から選択される］
によって示される化合物の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦの２つまでが、それぞれ及び独立して、Ｎ及びＯを含む群から選択される原子であり、かつ他はＣであり、
Ｒ3は、
【化３】
2014516572.tif 000016
を含む群から選択され、
ｘは０〜４であり、かつ
Ｒ4は、Ｈ、及び炭素原子１〜４個を有するアルキルを含む群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒドロキシル基を有する炭化水素が、シクロアルカノール、有利にはシクロヘキサノールである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アミノ酸デヒドロゲナーゼが、アラニンデヒドロゲナーゼである、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記トランスアミナーゼが、ビブリオ・フルビアシス（Vibrio fluvialis）及びパラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）からのω−トランスアミナーゼ並びにそれらの相同体を含む群から選択される、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記工程ｂ）を、ホルメートデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド又はかかるポリペプチドを有するホールセル生体触媒の存在で実施する、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記工程ｂ）を、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド又はかかるポリペプチドを有するホールセル生体触媒の存在で実施する、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記工程ｂ）を、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド又はかかるポリペプチドを有するホールセル生体触媒の存在で実施する、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド又はかかるポリペプチドを有するホールセル生体触媒によって製造した酸化還元因子を、ホルメートデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド又はかかるポリペプチドを有するホールセル生体触媒によって消費する、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程ａ）を、Ｈ2Ｏ2−分解活性の存在で実施する、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｈ2Ｏ2−分解活性を、カタラーゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼ／ＡＢＴＳ並びにそれらの相同体を含む群から選択されるポリペプチド又はかかるポリペプチドを有するホールセル生体触媒によって提供する、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程ａ）及びｂ）を、同一の反応混合物中で同時に実施する、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記トランスアミナーゼ活性のために必須の少なくとも１つの成分、有利にはトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチド又はかかるポリペプチドを有するホールセル生体触媒を、反応混合物に添加し、続いて、酸素依存及び補因子依存の炭水化物オキシダーゼ活性のために必須の成分を添加する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
酸素圧力のレベルが、２〜７ｂａｒ、有利には３〜５ｂａｒである、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記酸素依存及び補因子依存の炭化水素オキシダーゼ活性を有するポリペプチド、トランスアミナーゼ活性を有するポリペプチド、及び補因子依存アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを含む群から選択されるポリペプチドの１つ以上、有利には全てが生細胞に関連している、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
酸素依存及び補因子依存の炭水化物オキシダーゼ活性を有するポリペプチド又はかかるポリペプチドを有するホールセル生体触媒と、トランスアミナーゼ活性を有するポリペプチド又はかかるポリペプチドを有するホールセル生体触媒と、アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド又はかかるポリペプチドを有するホールセル生体触媒と、酸素と、アミノ酸デヒドロゲナーゼの基質アミノ酸と、炭水化物オキシダーゼ補因子と、アミノ酸デヒドロゲナーゼ補因子と、有利にはホルメート又はグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド又はかかるポリペプチドとを有するホールセル生体触媒を含有する混合物の、ヒドロキシル基を有する炭化水素をアミノ基転移するための使用であって、
ヒドロキシル基を有する炭化水素が、−（ＣＨ2）x−ＯＨ ［式中ｘは０〜４である］を含む群から選択される少なくとも１つの置換基を有する５又は６員環を含み、
酸素依存及び補因子依存の炭水化物オキシダーゼ活性を有するポリペプチドが、フザリウム属（Fusarium）ＮＲＲＬ ２９０３からのガラクトースオキシダーゼのＭ１変異体、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）からのピラノースオキシダーゼ、コンドルス・クリスプス（Chondrus crispus）からのヘキソースオキシダーゼ及びそれらの相同体を含む群から選択される、前記使用。
【請求項１８】
ヒドロキシル基を有する炭化水素と、酸素依存及び補因子依存の炭水化物オキシダーゼ活性を有するポリペプチド又はかかるポリペプチドを有するホールセル生体触媒と、酸素と、炭水化物オキシダーゼ補因子と、トランスアミナーゼ活性を有するポリペプチド又はかかるポリペプチドを有するホールセル生体触媒と、アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドと、アミノ酸デヒドロゲナーゼ補因子と、アミノ酸デヒドロゲナーゼ又はかかるポリペプチドを有するホールセル生体触媒の基質アミノ酸と、有利にはホルメート又はグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド又はかかるポリペプチドとを有するホールセル生体触媒を含有する水性反応混合物であって、前記ポリペプチド又はホールセル生体触媒の１つ以上、有利には全てが、それぞれ目的の活性を有する相同体ポリペプチドであり、又は目的の活性を有する相同体ポリペプチドを含み、
ヒドロキシル基を有する炭化水素が、−（ＣＨ2）x−ＯＨ ［式中ｘは０〜４である］を含む群から選択される少なくとも１つの置換基を有する５又は６員環を含み、
酸素依存及び補因子依存の炭水化物オキシダーゼ活性を有するポリペプチドが、フザリウム属（Fusarium）ＮＲＲＬ ２９０３からのガラクトースオキシダーゼのＭ１変異体、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）からのピラノースオキシダーゼ、コンドルス・クリスプス（Chondrus crispus）からのヘキソースオキシダーゼ及びそれらの相同体を含む群から選択される、前記水性反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ａ）酸素及び炭水化物オキシダーゼ補因子の存在で、ヒドロキシル基を含む炭化水素と酸素依存の及び補因子依存の炭水化物オキシダーゼ活性を有する生物剤とを接触する工程、及びｂ）アミノ酸デヒドロゲナーゼ補因子及びアミノ酸デヒドロゲナーゼの基質アミノ酸の存在で、工程ａ）において製造された炭化水素とトランスアミナーゼ活性を有する生物剤及び補因子依存のアミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する生物剤とを接触する工程を含む方法であって、水性混合物が、酸素依存の及び補因子依存の炭水化物オキシダーゼ活性を有し、生物剤が、トランスアミナーゼ活性を有し、生物剤が、アミノ酸活性、酸素、アミノ酸デヒドロゲナーゼの基質アミノ酸、炭水化物オキシダーゼ補因子及びアミノ酸デヒドロゲナーゼ補因子を有し、かつ有利には生物剤が、ヒドロキシル基を含む炭化水素をアミノ基転移するためのギ酸塩又はグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する前記方法、及びかかる水性反応混合物の使用に関する。
【０００２】
再生不可能な化石燃料の時代は終わっている。化学者は、実質的に制限のない石炭、石油及び天然ガスに依存することができた一方で、数百万年にわたって海の堆積物に埋まった細菌、プランクトン、植物及び動物質によって形成されたかかる資源の利用可能性は、非常に近い将来に制限されると予想される。さらに、燃焼化石燃料は、大気中でのＣＯ2の濃度の増加に関連し、かつ気候の変化、最も特に地球温暖化に関連している。したがって、通常燃料源に由来する化学物質の製造のための次世代の方法は、再生可能な資源、すなわち容易であり、かつ地質時代の尺度に関して急速に補充可能である材料から始めなければならない。
【０００３】
工業生物工学、すなわち工業触媒としての生体触媒、例えば酵素又は生物の適用は、インプットとして化石資源を使用する多くの従来の方法に選択肢を提供する。生体触媒を再生可能な材料、しばしば別の方法で処理されるべきである農業廃棄物又はプロセス廃棄物から製造された化合物に変換することができるだけでなく、それらは、毒性化合物の使用を要求せず、かつ最後に従来のアプローチと比較して温室効果ガスの放出を低減する。
【０００４】
アンモニアの有機誘導体のアミンは、しばしば、化石炭素源から製造された化合物、例えばハロゲン化アルカン又はアルケンの転化によって製造される、バルクケミカル、例えばアニリンを含む産業上需要のある化合物の種類を示す。アミンの合成のために使用される反応は、温度限界、毒性化合物、例えばＨＣＮ、及び高価な又は環境的に危険な触媒の使用に依存する。工業的に関連のあるアミンの例は、アニリン（種々の工業薬品に対する前駆体）、リシン（必須アミノ酸）、及びジ−（アミノメチル）フラン（ＤＡＭＦ）（ポリマーの製造のために使用されるモノマー）を含む。
【０００５】
先行技術は、ＨＭＦのＤＦＦへの段階的酸化、続く対応するジオキシムの変換及び続くジオキシムのニッケル触媒化還元を含む、ＤＡＭＦ及び化学的に関連のあるアミンの合成に対する化学経路を教示している（Ｅｌ Ｈａｊｊ ｅｔ ａｌ．， １９８７）。再生可能な材料、例えば糖を基礎とした生物工学的経路が所望されている。
【０００６】
したがって、本発明の基礎をなす問題は、有利には芳香族又は脂肪族炭素環に付着したヒドロキシル基を含む化合物で出発するアミンを製造するために使用されてよいシステムを提供する事であり、その際該化合物は、化石資源をクラッキングによって得られた化合物よりも再生可能な出発材料に由来してよい。本発明の基礎をなす他の問題は、有機アミンの製造に対する全体の酵素経路、有利には先行技術において記載された反応と比較して広い基質特異性及び／又は改良された収率及び／又は生成物特異性を有するもの、及び有害な試薬及び／又は刺激がきつい反応条件を要求しないものを提供することである。
【０００７】
他の問題は、全体として０の酸化還元バランスを有するアミンの製造のための一連の反応の供給を含む。
【０００８】
本発明の基礎をなす他の問題は、中間体を精製及び／又は抽出処理する必要なしに又は溶剤の変化を有することなしに、有利には芳香族又は脂肪族炭素環に付着したヒドロキシル基を含む化合物で出発するアミンを製造するために使用されてよいシステムを提供することである。
【０００９】
本発明の基礎をなす問題は、付属の独立請求項及び従属請求項の主題によって解決される。
【００１０】
第一の態様において、本発明の基礎をなす問題は、
（ａ）酸素及び炭水化物オキシダーゼ補因子の存在で、ヒドロキシル基を有する炭化水素と、酸素依存及び補因子依存の炭水化物オキシダーゼ活性を有する生物剤とを接触する工程、
（ｂ）アミノ酸デヒドロゲナーゼ補因子及びアミノ酸デヒドロゲナーゼの基質アミノ酸の存在で、工程ａ）において製造された炭化水素とトランスアミナーゼ活性を有する生物剤及び補因子依存のアミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する生物剤とを接触する工程
を含む方法によって解決される。
【００１１】
第一の態様の一実施態様において、ヒドロキシル基を有する炭化水素は、−（ＣＨ2）x−ＯＨ［式中ｘは０〜４である］を含む群から選択される少なくとも１つの置換基を有する５又は６員環を含有する。
【００１２】
第一の態様の一実施態様において、ヒドロキシル基を有する炭化水素は、式（Ｉ）又は（ＩＩ）
【化１】
2014516572.tif 000002
［式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦの２つまでは、それぞれ及び独立して、Ｎ、Ｓ及びＯを含む群から選択される原子であり、かつ他はＣであり、
Ｒ3は、Ｈ、ハロゲン、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、
【化２】
2014516572.tif 000003
を含む群から選択され、
ｘは０〜２０、有利には０〜４、より有利には１〜２であり、
Ｒ4は、Ｈ、並びに置換又は非置換のアルキル、シクロアルキル、アリール及びヘテロアリールを含む群から選択される］
によって示される化合物の群から選択される。
【００１３】
第一の態様の一実施態様において、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦの２つまでは、それぞれ及び独立して、Ｎ及びＯを含む群から選択される原子であり、かつ他はＣであり、
Ｒ3は、
【化３】
2014516572.tif 000004
を含む群から選択され、
ｘは０〜４、より有利には１〜２であり、
Ｒ4は、Ｈ、及び炭素原子１〜４個を有するアルキルを含む群から選択される。
【００１４】
第一の態様の一実施態様において、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦは全てＣ原子である。
【００１５】
第一の態様の一実施態様において、ヒドロキシル基を有する炭化水素は、シクロアルカノール、有利にはシクロヘキサノールである。
【００１６】
第一の態様の一実施態様において、酸素依存及び補因子依存の炭水化物オキシダーゼ活性は、フザリウム属（Fusarium） ＮＲＲＬ ２９０３からのガラクトースオキシダーゼのＭ１変異体、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）からのピラノースオキシダーゼ、コンドルス・クリスプス（Chondrus crispus）からのヘキソースオキシダーゼ及びそれらの相同体を含む群から選択された酵素によって提供された活性である。
【００１７】
第一の態様の一実施態様において、アミノ酸デヒドロゲナーゼは、アラニンデヒドロゲナーゼである。
【００１８】
第一の態様の一実施態様において、トランスアミナーゼは、ビブリオ・フルビアシス（Vibrio fluvialis）及びパラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）並びにそれらの相同体からのω−トランスアミナーゼを含む群から選択される。
【００１９】
第一の態様の一実施態様において、工程ｂ）は、ホルメートデヒドロゲナーゼ活性を有する生物剤の存在で実施される。
【００２０】
第一の態様の一実施態様において、工程ｂ）は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する生物剤の存在で実施される。
【００２１】
第一の態様の一実施態様において、アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する生物剤によって製造される酸化還元因子は、ホルメート又はグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する生物剤によって消費される。
【００２２】
第一の態様の一実施態様において、工程ａ）は、Ｈ2Ｏ2−分解活性の存在で実施される。
【００２３】
第一の態様の一実施態様において、Ｈ2Ｏ2−分解活性は、カタラーゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼ／ＡＢＴＳ並びにそれらの相同体を含む群から選択される生物剤によって提供される。
【００２４】
第一の態様の一実施態様において、工程ａ）及びｂ）は、同一の反応混合物中で同時に実施される。
【００２５】
第一の態様の一実施態様において、トランスアミナーゼ活性のために必須の少なくとも１つの成分、有利にはトランスアミナーゼ活性を有する生物剤を、反応混合物に添加し、続いて、酸素依存及び補因子依存の炭水化物オキシダーゼ活性のために必須の成分を添加する。
【００２６】
第一の態様の一実施態様において、酸素圧力のレベルは、２〜７ｂａｒ、有利には３〜５ｂａｒである。
【００２７】
第一の態様の一実施態様において、酸素依存及び補因子依存の炭化水素オキシダーゼ活性を有する生物剤、トランスアミナーゼ活性を有する生物剤、ホルメート又はデヒドロゲナーゼ活性を有する生物剤、及び補因子依存アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する生物剤を含む群から選択される１つ以上、有利には全ての生物剤は、生細胞に関連する。
【００２８】
第二の態様において、本発明の基礎をなす問題は、酸素依存及び補因子依存の炭化水素オキシダーゼ活性を有する生物剤、トランスアミナーゼを有する生物剤、アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する生物剤、酸素、アミノ酸デヒドロゲナーゼの基質アミノ酸、炭化水素オキシダーゼ補因子、及びアミノ酸デヒドロゲナーゼ補因子、並びに有利にはヒドロキシル基を有する炭化水素をアミノ基転移するためのホルメート又はグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する生物剤を含む混合物の使用によって解決され、その際、１つ以上、有利には全ての生物剤は、目的の活性を有する異種ポリペプチドであり、又は該ポリペプチドを含む。
【００２９】
第三の態様において、本発明の基礎をなす問題は、ヒドロキシル基を有する炭化水素、酸素依存及び補因子依存の炭化水素オキシダーゼ活性を有する生物剤、酸素、炭水化物オキシダーゼ補因子、トランスアミナーゼを有する生物剤、アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する生物剤、アミノ酸デヒドロゲナーゼ補因子、アミノ酸デヒドロゲナーゼの基質アミノ酸、及び有利にはホルメート又はグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する生物剤を含む水性反応混合物によって解決され、その際、１つ以上、有利には全ての生物剤は、目的の活性を有する異種ポリペプチドであり、又は該ポリペプチドを含む。
【００３０】
第三の態様の好ましい一実施態様において、明記されたそれぞれの生物剤は、目的の活性を有する１つ以上の異種活性ポリペプチドを含む全ての細胞生体触媒であり、有利には１つ以上の異種活性ポリペプチドを有する全ての細胞生体触媒は、全ての目的の活性を有する。
【００３１】
本発明の第二及び第三の態様の他の実施態様は、本発明の第一の態様の実施態様を含む。
【００３２】
本発明は、ヒドロキシル基を有する炭化水素の酸化及び続くアミノ基転移を触媒するために使用されてよい反応の順序が存在する驚くべき発見に基づき、その際、該ヒドロキシル基は、アミノ基に転化され、全体的に生物工学的触媒に基づく。さらに、本発明は、驚くべきことに、全てのこれらの反応が、互いに完全に相容性であり、かつ同一の反応容器中で、均一緩衝系を使用して同時に実施されてよいことが見出されている。さらに、本発明は、驚くべきことに、全体として電子の添加又は除去なしに実施してよい反応の適した順序を見出している。
【００３３】
本発明の方法は、広い範囲の化合物を転化するために使用されてよい。好ましい一実施態様において、本明細書において使用される"ヒドロキシル基を有する炭化水素"の用語は、Ｃ−Ｃ結合によって連結した２個の炭素原子を有し、かつ有利には炭素原子に付着している少なくとも１つのヒドロキシル基を有する任意の有機化合物に関する。好ましい一実施態様において、かかる炭化水素の炭素鎖は、環状及び直鎖のアルカン、アルケン、アルキン、アルキル又はアルケニルアリール、及びアルキル又はアルケニルヘテロアリールを含む群から選択される。
【００３４】
好ましい一実施態様において、ヒドロキシル基を有する炭化水素は、式（ＩＩＩ）
【化４】
2014516572.tif 000005
［式中、Ｒ5及びＲ6は、それぞれ及び独立して、任意の化学群及び有利には芳香族環の一部である］によって示される化合物の群から選択される。
【００３５】
好ましい一実施態様において、ヒドロキシル基を有する炭化水素は、式（ＩＶ）
【化５】
2014516572.tif 000006
［式中、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7のそれぞれは、それぞれ及び独立して、Ｈ、ハロゲン、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、
【化６】
2014516572.tif 000007
を含む群から選択され、
ｘは０〜２０、有利には０〜４であり、
Ｒ4は、Ｈ、並びに置換又は非置換のアルキル、シクロアルキル、アリール及びヘテロアリールを含む群から選択され、
芳香族環の１個又は２個までの炭素原子は、それぞれ及び独立して、Ｎ、Ｏ及びＳを含む群から選択された原子によって置換されてよい］によって示される化合物の群から選択される。
【００３６】
最も好ましい一実施態様において、ヒドロキシル基を有する炭化水素はＨＭＦである。
【００３７】
好ましい一実施態様において、本明細書において使用される"生物剤"は、特定の活性を有する任意の生物又は生物起源の分子に関する。より好ましい一実施態様において、生物剤は、精製又は単離された活性生物高分子、最も有利にはペプチド又はポリペプチドであり、ここで本明細書において使用される"単離された"という用語は、特定の好ましい一実施態様において、単離又は精製手順を受け、かつその内因性の環境、例えばそれぞれの野生型細胞の内部よりも高い純度で存在する生物学的高分子に関する。他のより好ましい実施態様において、生物剤は、かかる生物学的高分子を含む、又は生物学的高分子に関連する全体の細胞生体触媒である。例えば、生物学的高分子は、細胞の内側に位置し、又は細胞膜に、例えばサイトゾルと接触している膜の内側で、又は環境と接触している膜の外側で付着してよい。好ましい一実施態様において、炭水化物オキシダーゼ活性は、炭水化物オキシダーゼ又はそれらの相同体によって提供される。他の好ましい実施態様において、トランスアミナーゼ活性は、トランスアミナーゼ又はそれらの相同体によって提供される。他の好ましい実施態様において、カタラーゼ活性は、カタラーゼ又はそれらの相同体によって提供される。他の好ましい実施態様において、アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性、有利にはアラニンデヒドロゲナーゼ活性は、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、有利にはアラニンデヒドロゲナーゼ、又はそれらの相同体によって提供される。他の好ましい実施態様において、ホルメートデヒドロゲナーゼ活性は、ホルメートデヒドロゲナーゼ又はそれらの相同体によって提供される。他の好ましい実施態様において、グルコースデヒドロゲナーゼ活性は、グルコースデヒドロゲナーゼ又はそれらの相同体によって提供される。他の好ましい実施態様において、生物剤は、ポリペプチド、有利には単離されたポリペプチド、又はホールセル（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ）の生体触媒である。生物剤は、その性質にかかわらず、固定されてよい。
【００３８】
好ましい一実施態様において、本明細書において使用される"補因子の存在"という用語は、活性及び／又は酵素の活性又は高められた活性のために要求される補因子が、存在し、溶液中でどちらも有さず、及び／又は該活性及び／又は酵素に密接に関連することを意味する。
【００３９】
含まれる活性と相容性のある反応条件、より有利には特定のｐＨ、緩衝液、緩衝液濃度等が選択されるべきであることが明らかである。好ましい一実施態様において、緩衝液、有利にはリン酸ナトリウムの濃度は、２５ｍＭより高く、有利には２５〜２５０ｍＭ、より有利には４０〜２２０ｍＭ、最も有利には９０〜１６０ｍＭであり、ｐＨは５〜９、有利には６．５〜８．５である。
【００４０】
好ましい一実施態様において、本明細書において使用される"活性"は、化学的反応又は生物学的反応を触媒する能力をいう。言い換えれば、化学的反応又は生物学的反応は、適した活性が存在する場合に、より急速に平衡状態に達する。好ましい一実施態様において、活性は、触媒活性ポリペプチド又はかかるポリペプチドを含む細胞によって示される。
【００４１】
最も好ましい一実施態様において、生物剤は生物細胞である。当業者は、目的の生物活性を示すために使用されてよい広い範囲の生物細胞をよく知っている。例えば、前記細胞は、原核細胞、有利には細菌細胞、例えばエシェリキア属、コリネバクテリウム属又はシュードモナス属の細胞、最も有利には大腸菌細胞であってよい。生物細胞は、原核細胞、有利には単細胞原核細胞、最も有利には真菌生物細胞、例えばカンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）又はピキア・パストリス（Pichia pastoris）であってもよい。当業者は、生物学又は他の目的の活性を示す遺伝的に変更した細胞に使用されてよい広い範囲の技術をよく知っている。
【００４２】
本発明の工程ａ）は、炭水化物オキシダーゼ活性を有する生物剤の使用を含む。好ましい一実施態様において、本明細書において使用される"炭水化物オキシダーゼ活性"の用語は、炭水化物、有利には少なくとも１つのヒドロキシル基を有する５又は６員環構造を少なくとも一時的に形成することができる炭水化物を酸化することができる酵素活性を言い、少なくとも１つのヒドロキシル基は、酸化され、有利にはカルボニル基によって置換される。特定の一実施態様において、本明細書において使用される"工程ａ）において製造された炭化水素"の用語は、工程ａ）に関連する特定の条件下で炭水化物オキシダーゼ活性を有する生物剤と接触される炭化水素が、炭水化物オキシダーゼ活性を有する作用剤と最初に相互作用する機会を有し、続いて炭水化物オキシダーゼ活性と相互反応することによって改質された炭化水素が、工程ｂ）に関連する特定の試薬と反応するために処理されてよいことを意味する。これは、工程ｂ）に関連する特定の試薬及び活性が、工程ａ）が生じる理由で存在しないことを要しない。
【００４３】
当業者は、特に、適したポリペプチドを細胞宿主中に、標準の分子生物学技術を使用して遺伝子工学によって導入することによって、適した活性を有する生物剤を製造する方法を知っている。さらに、当業者は、ホールセル触媒としてかかる細胞を使用する方法、又は目的の活性を有する多少単離されたポリペプチドを製造するための出発材料としてそれらを使用する方法を知っている。最終的に、当業者は、かかる活性を保存し、又は例えば適切な方法での必須の補因子の添加、緩衝剤、及びｐＨ及び温度条件の調整による化学的反応を触媒するために補因子を使用する方法をよく知っている。かかる条件を見出すことは、通常の実験である。
【００４４】
好ましい一実施態様において、炭水化物オキシダーゼ活性は、酸素依存の炭水化物オキシダーゼ活性であり、すなわち、酸化剤としての分子酸素の存在に依存する。当業者は、例えば、水溶液を解したガス状酸素を泡立たせることによって、又は水溶液の酸素放出剤を添加することによって、水溶液中で酸素を供給するために使用されてよい方法を認識している。
【００４５】
炭水化物オキシダーゼ活性は、酸素を除いて、補因子に依存してもよい。本発明の好ましい一実施態様において、本明細書において使用される"補因子"の用語は、目的の活性を有する分子に密接に関連し、又はかかる分子と、有利には基質として一時的に相互作用する酸化還元因子を言う。好ましい一実施態様において、炭水化物オキシダーゼは、酸化剤として、すなわち基質のヒドロキシル基の酸化に対して放出される電子を減らすために、その補因子を使用する。本発明の他の好ましい実施態様において、炭水化物オキシダーゼ補因子は、銅又はフラビン補因子、より有利にはＦＡＤ+である。他の好ましい実施態様において、補因子は、ＦＡＤ+、ＮＡＤ+及びＮＡＤＰ+を含む群から選択される。
【００４６】
本発明の工程ｂ）は、トランスアミナーゼ活性を有する生物剤の使用を含む。好ましい一実施態様において、本明細書において使用される"トランスアミナーゼ"は、カルボニル基のアミン基への転化を触媒することができる活性を言う。好ましい一実施態様において、本明細書において使用される"アミノ基転移活性"は、ヒドロキシル基を有する炭水化物の、アミン基を有する炭水化物への転化を触媒することができる活性を言い、その際アミン基はヒドロキシル基に置き換えられる。
【００４７】
工程ｂ）は、アミノ酸デヒドロゲナーゼ活性の関与も要求する。好ましい一実施態様において、本明細書において使用される"アミノ酸デヒドロゲナーゼ"は、アミン基を含む酸、すなわちアミノ酸、有利にはアラニンの、酸への転化を触媒することができる活性を言い、その際アミノ基はカルボニル基に置き換えられる。最も好ましい一実施態様において、アミノ酸デヒドロゲナーゼは、アラニンのピルベートへの転化を触媒するアラニンデヒドロゲナーゼである。最も好ましい一実施態様において、アミノ酸デヒドロゲナーゼは、補因子に依存する。好ましい一実施態様において、アミノ酸デヒドロゲナーゼ補因子は、ＮＡＤＨである。
【００４８】
最終的に、工程ｂ）は、ホルメート又はグルコースデヒドロゲナーゼ活性を含んでもよい。好ましい一実施態様において、本明細書において使用される"ホルメートデヒドロゲナーゼ活性"は、ホルメートをＣＯ2に転化できる活性を言い、その際ホルメートデヒドロゲナーゼ補因子は還元される。好ましい一実施態様において、ホルメートデヒドロゲナーゼ補因子は、ＮＡＤ+である。好ましい一実施態様において、本明細書において使用される"グルコースデヒドロゲナーゼ活性"は、グルコースを酸化できる活性を言い、その際ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが生成される。ホルメート又はグルコースデヒドロゲナーゼの使用は、それぞれ、ホルメート又はグルコースの存在を要求する。
【００４９】
好ましい一実施態様において、本明細書において使用される"−ＣＲ4Ｏ"の用語は、Ｒ4が水素である場合にアルデヒド置換基を、又はＲ4が有機置換基である場合にケト置換基を言い、その際Ｃは炭素原子２個に共有結合する。
【００５０】
本発明の特に長所は、アルコールを酸化及びアミノ基転移するために工夫された反応の順序が、正味の酸化還元バランスが０であるように選択されてよい、すなわち全体として、電子及び／又は酸化した又は還元した酸化還元補因子の添加又は除去を要求しないことである。これは、酸化型で、ホルメートを酸化するためのホルメートデヒドロゲナーゼによって又はグルコースを酸化するためのグルコースデヒドロゲナーゼによって使用される補因子を放出する、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、有利にはアラニンデヒドロゲナーゼを使用することによって達せられる。しかしながら、酸化及びアミノ基転移は、炭水化物オキシダーゼ、トランスアミナーゼ及びアミノ酸デヒドロゲナーゼを含む群からの酵素以外の酵素なしに実施されてもよい。
【００５１】
本発明は、Ｈ2Ｏ2−分解活性の存在で工程ａ）を実施することが有利であることが見出されている。好ましい一実施態様において、本明細書において使用されている"Ｈ2Ｏ2−分解活性"の用語は、提供された水溶液中で存在するＨ2Ｏ2の量を減少する任意の活性を言う。当業者は、Ｈ2Ｏ2−分解活性を提供するために使用されてよい無機、有機又はさらに生物起源の多くの触媒をよく知っている。
【００５２】
さらに、本発明は、存在する全ての一連の反応、すなわち５以上の独立した化学反応が、互いに関連して全体に相容性であり、当業者が特に中間体を精製するために成分を添加又は混合する必要なしに同一の反応容器中で同時に全ての反応を実施することが可能である。
【００５３】
好ましい一実施態様において、明確に、例えば名前又は受託番号又は実際の"〜の相同体"の用語によって、又は暗に、例えば機能の特徴によって、この適用に関連しているアミノ酸配列又は核酸配列の相同体は、本発明の範囲内である。好ましい一実施態様において、本発明において使用される"相同体"の用語は、それぞれ、アミノ酸配列又は核酸配列に関して６０、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％同一である、アミノ酸配列又は核酸配列を含む。好ましい一実施態様において、アミノ酸配列に関する"相同体"の用語は、有利には、前記配列同一性に加えて、基準配列に関して１つ以上の保存的アミノ酸変化を含むアミノ酸配列を含む。好ましい一実施態様において、アミノ酸配列又は核酸配列の"相同体"の用語は、有利には、前記配列同一性に加えて、それぞれ、アミノ酸配列又は核酸配列の活性部分及び／又は断片、及びそれらの配列又は活性部分及び／又は断片を含む融合構成体を含む。好ましい一実施態様において、本明細書において使用される"活性部位"の用語は、それぞれ、完全長未満のアミノ酸配列又は完全長未満のアミノ酸配列のためのコードであるアミノ酸配列又は核酸配列を言い、その際、それぞれアミノ酸配列又はコードされるアミノ酸配列は、例えば炭水化物オキシダーゼ、ω−トランスアミナーゼ、カタラーゼ、ホルメートもしくはグルコースデヒドロゲナーゼ又はアミノ酸デヒドロゲナーゼとして、少なくともいくつかのその必須の生物活性を保持している。好ましい一実施態様において、本明細書において使用される"少なくともいくつかのその必須の生物活性を保持している"の用語は、問題のアミノ酸配列が、バックグラウンド活性を超える及びそれらとは異なる生物活性を有し、かつ前記活性を特徴付ける動的パラメータ、より特にｋcat及びＫMが、特異的基質に関して関連する分子によって示された値の大きさの有利には３以内、より有利には２以内、最も有利には１以内であることを意味する。好ましい一実施態様において、核酸の"相同体"の用語は、有利には厳しい条件下で、基準の核酸にハイブリダイズする相補的ストランドの核酸を含む。ハイブリダイゼーション反応の厳しさは、当業者によって容易に決定でき、かつ一般に、プローブの長さ、洗浄温度及び塩濃度に依存する経験的な計算値である。一般に、プローブが長くなれば固有のアニーリングのためにより高い温度を必要とする一方で、プローブが短くなればより低い温度を必要とする。一般に相補的ストランドに再アニールするための変性したＤＮＡの能力に依存するハイブリダイゼーションは、それらの溶融温度未満の環境で存在する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなれば、使用されてよい相対温度も高くなる。結果として、より高い相対温度は、反応条件をより厳しくする傾向がある一方で、より低い温度はそうではない。ハイブリダイゼーション反応の厳しさの追加の詳細及び説明について、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９５）を参照せよ。好ましい一実施態様において、本明細書において使用される核酸配列の"相同体"の用語は、遺伝子コードの縮退と直結して、参考の核酸配列と同一のアミノ酸配列をエンコードする任意の核酸配列を言う。
【００５４】
本発明の好ましい一実施態様において、本明細書において使用される"生体細胞に関連する"の用語は、それ自体特徴付けられた生物剤が、細胞の内側に位置した、又は細胞の表面にもしくは細胞の膜に付着したポリペプチドであることを意味する。最も好ましい一実施態様において、ポリペプチドは、膜タンパク質に融合される。
【００５５】
最も好ましい一実施態様において、ヒドロキシル基を含む炭化水素はＨＭＦであり、かつ炭水化物オキシダーゼは、有利にはフザリウム属ＮＲＲＬ ２９０３（Ｅｓｃａｌｅｔｔｅｓ＆Ｔｕｒｎｅｒ、２００８）からのガラクトースオキシダーゼのＭ１変異体又はファネロカエテ・クリソスポリウムからのピラノースオキシダーゼ又はコンドルス・クリスプスからのヘキソースオキシダーゼ又はそれらの任意の相同体であり、かつトランスアミナーゼは、ビブリオ・フルビアシス又はパラコッカス・デニトリフィカンスのトランスアミナーゼ、又はそれらの相同体である。
【００５６】
本発明を、さらに、次の図及び制限のない実施例によって例証し、さらなる特徴、実施態様、態様及び本発明の利点が採用されてよい。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、本発明の一連の反応を説明する図を示す。
【図２】図２は、ＨＭＦに加えて、実施例１において記載されている種々の酸化された成分、及び実施例５において記載されている続くアミノ基転移を示す。
【図３】図３は、フザリウム属ＮＲＲＬ ２９０３からのガラクトースオキシダーゼのＭ１変異体によって触媒化された酸化反応に関してｐＨ及び緩衝液濃度を最適化することを意図した試験的実験の結果を示す。
【図４】図４は、フザリウム属ＮＲＲＬ ２９０３からのガラクトースオキシダーゼのＭ１変異体によって触媒化された酸化反応に関して酸素圧力を最適化することを意図した試験的実験の結果を示す。
【図５】図５ａ及び５ｂは、ベンジルアミンの形成、続くベンジルアルコールの酸化及びアミン化を証明する質量分析結果を示す。
【図６】図６は、ＤＡＭＦの形成、続くＨＭＦの酸化及びアミン化を証明するＮＭＲデータを示す。
【００５８】
実施例１：炭水化物オキシダーゼによるヒドロキシル基を有する種々の環状化合物の酸化
ＨＭＦに加えて、種々のヒドロキシル基を有する環状化合物（図２）を、以下のように炭水化物オキシダーゼ酸化させる。対応するオキシダーゼのホールセルの調合物（２０ｍｇ凍結乾燥させた乾燥質量）を、対応するリン酸緩衝液［１ｍＬ；標準状態：ガラクトースオキシダーゼ：１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ（３ｍｇ／ｍＬ）；ピラノース及びヘキソースオキシダーゼ：１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ＝８．１ｍＭ ＦＡＤ］中で、３０℃及び１２０ｒｐｍで２０分間再懸濁した。その後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ、＃Ｐ８１２５）（３０μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）（３０μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）及びそれぞれの炭化水素、例えばＨＭＦ（５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を添加し、そしてその反応混合物を、プレキシガラスシリンダー（長さ２７ｃｍ×直径１０ｃｍ）からなる酸素装置に移した。その装置を、約１分間酸素（工業銘柄）で満たし、そして４ｂａｒまで加圧した。全体の装置を室温で、１７０ｒｐｍで２０時間振盪した（ＭＧ５バイアルの垂直位置）。カタラーゼについて同様に、ストック溶液［単球菌からのカタラーゼ（約１７００００Ｕ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃６０６３４）、コリネバクテリウム・グルタミクムからのカタラーゼ（＞５０００００Ｕ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃０２０７１）］の２０μＬを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及び２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）の代わりに使用した。
【００５９】
凍結乾燥させたホールセルとして大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）での組み換え型で使用され、かつ実施例７において記載されたように得られた種々の炭水化物オキシダーゼ、より詳述すれば、フザリウム属ＮＲＲＬ ２９０３からのガラクトースオキシダーゼ（Ｍ１変異体）（Ｅｓｃａｌｅｔｔｅｓ ｅｔ ａｌ．、２００８）、ファネロカエテ・クリソスポリウムからのピラノースオキシダーゼ又はコンドルス・クリスプスからのヘキソースオキシダーゼは、ＨＭＦ、ベンジルアルコール及びオルト−ヒドロキシベンジルアルコールを含む種々の環状基質のヒドロキシ基を、対応するカルボニル基に転化することを示した。
【００６０】
実施例２：ｐＨ及び緩衝液濃度に対する酸化工程の依存性
反応を、リン酸緩衝液中での水溶液中で、フザリウム属ＮＲＲＬ ２９０３からのガラクトースオキシダーゼのＭ１変異体を使用して、標準条件下、すなわちＨＭＦ４０ｍｍｏｌ、ガラクトースオキシダーゼのホールセル調合物１０ｍｇ、ＡＢＴＳ（３０μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（３０μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）及び１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７で、実施した。酸素圧力は４ｂａｒであった。最適ｐＨはガラクトースオキシダーゼについて７．０であった（第２表、図３）。カタラーゼについて同様に、ストック溶液［単球菌からのカタラーゼ（約１７００００Ｕ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃６０６３４）、コリネバクテリウム・グルタミクムからのカタラーゼ（＞５０００００Ｕ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃０２０７１）］の２０μＬを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及び２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）の代わりに使用した。
【００６１】
同様の一連の実験を実施し、そしてピラノースオキシダーゼを使用した場合に、最適ｐＨ値が８．０であることを示した。しかしながら、酸化は、双方の酵素の場合に、５．０〜９．０の広いｐＨ範囲にわたって生じる。
【００６２】
実施例３：酸化工程に対する種々の緩衝液濃度の効果
種々の実験を、種々の濃度の緩衝液を使用したことを除いて、実施例１において記載されたように標準条件下で実施した。より高い緩衝液濃度が、転化における増加を導いたことを示した（図３）。
【表１】
2014516572.tif 000008
【００６３】
実施例４：酸化工程に対する高レベルの酸素の効果
試験的実験を、適用された酸素圧力に対する反応の依存性を調べるために実施した。より詳述すれば、２種の基質、ベンジルアルコール及びフルフリルアルコールの４０ｍｍｏｌを、実施例１において記載されたようなガラクトースオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（３０μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）及びＡＢＴＳ（３０μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）を１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７中で酸化させた。高圧での酸素の適用は、４ｂａｒで最適であったことを示した（図４）。
【００６４】
実施例５：酸化反応混合物中でのヒドロキシル基を有する種々の環状化合物の酸化方法のワンポットアミノ基転移
２０時間の実施例１における反応混合物のインキュベーションに続いて、トランスアミナーゼ、Ｌ−アラニン、アラニンデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨ及び対応する循環系（前記参照）からなるアミノ基転移反応混合物を添加し、そしてさらに２０時間振盪した。ＤＦＦを、ビブリオ・フルビアス（Ｖｆ−ωＴＡ）又はパラコッカス・デニトリフィカンス（ｐＣＲ６）トランスアミナーゼからの組み換えトランスアミナーゼを使用してアミノ基転移した（トランスアミナーゼの詳細についてＷＯ ２０１０／０８９１７１号を参照）。
【００６５】
トランスアミナーゼを、凍結乾燥されたホールセル調合物として（大腸菌中で組み換えて）使用し、枯草菌からのアラニンデヒドロゲナーゼを使用する前に精製し、そしてホルメートデヒドロゲナーゼを、Ｃｏｄｅｘｉｓ（＃２４．１１、Ｈ６２４１１．０１）から得た（実施例７を参照）。
【００６６】
反応条件は以下であった：
フザリウム属ＮＲＲＬ ２９０３からのガラクトースオキシダーゼのホールセルの調合物（２０ｍｇ、凍結乾燥させた乾燥質量）を、リン酸ナトリウム緩衝液（５００μＬ、１００ｍＭ、ｐＨ＝７．０、３ｍｇ／ｍＬ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ）中で３０℃及び１２０ｒｐｍで３０分間再懸濁した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（１５μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）、ＡＢＴＳ（１５μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）及びＨＭＦ（５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を添加し、そしてその反応混合物を、酸素装置（垂直位置、室温、４ｂａｒＯ2、１７０ｒｐｍ）中に２０時間置いた。その反応混合物をエッペンドルフバイアルに移した。ビブリオ・フルビアスからのω−トランスアミナーゼのホールセルの調合物（２０ｍｇ、凍結乾燥させた乾燥質量）のＰi−緩衝液（５００μＬ、１００ｍＭ、ｐＨ＝７．０、２ｍＭ ＰＬＰ、２００ｍｍｏｌ Ｌ−アラニン、１４０ｍｍｏｌギ酸アンモニウム）中での溶液を添加し、続いて、ホルメートデヒドロゲナーゼ（２０μＬ、Ｃｏｄｅｘｉｓ）及び枯草菌からの精製したアラニンデヒドロゲナーゼ（２０μＬ、７．５ｍｇ タンパク質／ｍＬ）を添加した。その反応混合物を、３０℃及び１２０ｒｐｍで水平位置で２０時間振盪した。その装置を、約１分間酸素で満たし、そして４ｂａｒまで加圧した。その反応を、炭水化物オキシダーゼを使用して、ピラノース及びヘキソースオキシダーゼを再生成させた。その反応条件は、ｐＨ値を８に調整し、そしてＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏではなく１ｍＭ ＦＡＤを添加したことを除いて、同一であった。
【００６７】
この実施例は、アミノ基転移反応が、酸化反応混合物の条件と完全に相容性であることを示す。使用したトランスアミナーゼに関係なく、ＨＭＦは、２０時間の反応後に８０％より多い、より詳述すればＶｆ−ωＴＡ又はｐＣＲ６トランスアミナーゼを使用した場合に８１％及び８３％の収率でＤＡＭＦに添加された。他の化合物を酸化し、そして第３表において示された合計の組合せ収量でアミノ基転移した。酸化工程中に形成されたＤＦＦは、ＤＡＭＦに量的に転化された。残りのＨＭＦはアミノ基転移を抑制しなかったが、しかし対応するヒドロキシメチルアミンに転化された。類似のやり方で、ＨＭＦを全てのトランスアミナーゼによって［５−（アミノメチル）フラン−２−イル］メタノール（ＡＭＦＭ）に転化した。転化率及び生成物の同一性をＧＣ−ＭＳを使用して測定した。
【表２】
2014516572.tif 000009
【００６８】
実施例６：炭水化物オキシダーゼによる同時酸化及びヒドロキシル基を含む種々の環状化合物のアミノ基転移
ＨＭＦを基質として使用し、そしてファネロカエテ・クリソスポリウムからのピラノースオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びＡＢＴＳ、ビブリオ・フルビアスからのω−トランスアミナーゼ、ホルメートデヒドロゲナーゼ及び枯草菌からのアラニンデヒドロゲナーゼを含む全ての試薬を開始時点で適切に添加したことを除いて、実施例１において記載されたのと同一の実験構成を加えた。１ｍＭ ＦＡＤが存在し、そのｐＨは８であった。その反応を２４時間続行させた。
【００６９】
その反応を、炭水化物オキシダーゼを使用して、ヘキソースオキシダーゼを同一の反応条件下で再生成させた。
【００７０】
実施例７：酸化生成物の単離を含む、ホルメートデヒドロゲナーゼの不在／存在での、代わりのトランスアミナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼによる酸化及びアミノ基転移
酸化反応を，実施例１において記載されているように、基質として第４表において示した化合物１、２及び３を使用して実施した。しかしながら、下流反応、より詳述すればアミノ基転移を、同一の反応容器中で同時に実施しないが、酸化反応の生成物を、ＥｔＯＡｃ（２×５００μＬ）を使用して抽出することによって単離し、転化をＧＣ−ＦＩＤを使用して測定し、そして溶剤を空気の正の流れによって除去した。続いて、容器中に残っている酸化生成物を、提出した明細書の実施例５において記載されているように実施したアミノ基転移工程のために改良して使用し、第５表においてまとめられた結果を得た。
【００７１】
５つの実験を、それぞれの基質で実施し、ここで第一の実験（項目１、６及び１１）をそれぞれ標準条件、すなわち特許明細書において記載されている条件下で実施し、第二の反応を、等モルのＮＡＤＨ補因子の存在でホルメートデヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）を使用せずに実施し、第三の反応を、枯草菌からのアラニンデヒドロゲナーゼではなくウシ肝からのグルタミン酸デヒドロゲナーゼを使用して実施した。代わりのトランスアミナーゼ、すなわちアルカリゲネス・デニトリフィカンス（Alcaligenes denitrificans）Ｙ２ｋ−２からのω−トランスアミナーゼ（Ａｄ−ωＴＡ）及びシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０（Ｇｅｎｅ ＰＰ５１８２、ｐＣＲ７）からのω−トランスアミナーゼ］をそれぞれ実験４及び５において使用した。さらに、他のアミノ酸デヒドロゲナーゼ、カンジダ・ユチリス（Candida utilis）からのグルタミン酸デヒドロゲナーゼを実験５において使用した。
【００７２】
示されたデータは、同一の反応容器において本発明の反応の順序を実施することが適していることを示す。さらに、代わりのトランスアミナーゼ及びアミノ酸デヒドロゲナーゼを使用してよい。最終的に、ホルメートデヒドロゲナーゼの存在はさらに適した特徴である。
【表３】
2014516572.tif 000010
【００７３】
【表４】
2014516572.tif 000011
ａ）転化をＧＣ−ＦＩＤ（酸化）及びＧＣ−ＭＳ（第二工程）を使用して測定した；
ｂ）＋は、ＦＤＨを転化し、−は、ＦＤＨを添加しなかった；
ｃ）Ａｌａ−ＤＨは枯草菌からのアラニンデヒドロゲナーゼであり、ＢＬ−Ｇｌｕ−ＤＨはウシ肝からのグルタミン酸デヒドロゲナーゼであり、ＣＵ−Ｇｌｕ−ＤＨはカンジダ・ユチリスからのグルタミン酸デヒドロゲナーゼであり、Ｖｆ−ωＴＡはビブリオ・フルビアスからのω−トランスアミナーゼであり、Ａｄ−ωΤＡはアルカリゲネス・デニトリフィカンスＹ２ｋ−２からのω−トランスアミナーゼであり、ｐＣＲ７はシュードモナス・プチダＫＴ２４４０（Ｇｅｎｅ ＰＰ５１８２、ｐＣＲ７）からのω−トランスアミナーゼである；
ｅ）酸化反応工程の転化；
ｆ）誘導されたＧＣ−ＭＳ試料及びＨＰＬＣ−ＵＶ−解析によって測定された、ジアミンへの転化が得られる；
ｇ）転化を誘導されたＧＣ−ＭＳ−試料によって測定した。
【００７４】
実施例８：ホルメートデヒドロゲナーゼの代わりにグルコースデヒドロゲナーゼ、及び酸化／アミノ基転移反応のための他の基質の使用
種々の基質（第６表を参照）を、グルコースデヒドロゲナーゼ（Ｘ−ｚｙｍｅｓ、＃Ｂ４Ａ、２０Ｕ）、塩化アンモニウム（２００ｍＭ、５等量）及びグルコース（１４０ｍＭ、２．８等量）］をＦＤＨ及びギ酸アンモニウムの代わりに使用したことを除いて、実施例６に記載のように酸化及びアミノ基転移反応させた。
【００７５】
特にハロゲン置換基を有する追加の基質を、本発明の方法を使用して酸化及びアミノ基転移させてよいことが証明されている。
【表５】
2014516572.tif 000012
【００７６】
実施例９：分析方法
誘導なしのＨＰＬＣ−ＵＶ測定法のための試料調合
反応混合物を、９５℃まで１０分間加熱して、酵素を沈澱し、ＭｅＣＮで１／１に希釈し、そして延伸した（１３０００ｒｐｍ、３分）。試料１００μＬを取り、０．１％ＴＦＡを含むＨ2Ｏ／ＭｅＣＮ １ｍＬで１／１に希釈し、そして次の構成を使用してＨＰＬＣ−ＵＶ分析した。カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＬＵＮＡ ５μｍ Ｃ１８（２） １００ Ａ（２５０×４．６０ｍｍ）；炉温度：３０℃、流量：０．２５ｍＬ／分、溶出剤Ａ：Ｈ2Ｏ（０．１％ ＴＦＡ）、溶出剤Ｂ：ＭｅＣＮ（０．１％ ＴＦＡ）；勾配：０〜４分 ３０％ Ｂ、４〜３０分 ３０〜１００％ Ｂ、３０〜３６ 分 １００％ Ｂ、３６〜４６分 ３０％ Ｂ。
【００７７】
ＧＣ−ＭＳ測定のための試料誘導
試料５００μＬをＤＭＡＰ（５００μＬ、ＭｅＯＨ中で１０％）で処理した。クロロギ酸エチル（２００μＬ）を添加し、そしてその混合物を６０℃及び３００ｒｐｍで２時間インキュベートした。ジクロロメタン（２×５００μＬ）での抽出及びＮａ2ＳＯ4上での合した有機相の乾燥は、次の条件下でＧＣ−ＭＳ分析した試料を得た：キャリヤーガスとして流量０．５５ｍＬ／分でヘリウムガスを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ ９７５Ｃ質量選択検出器（Ｅｌ ７０ｅＶ）及びＨＰ−５−ＭＳカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍフィルム）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ７８９０Ａ ＧＣシステム。次の温度プログラムを使用した：１００℃、０．５分間保持、１０℃／分、３００℃まで。
【００７８】
ＨＰＬＣ−ＵＶ測定のためのＦＭＯＣ誘導
試料調合を、ガラスＨＰＬＣバイアル中でのＦＭＯＣ誘導体の形成、ホウ酸塩緩衝液ｐＨ９の添加、ＦＭＯＣ試薬の添加、及びＥＶＡの添加によるＦＭＯＣ試薬過剰量の除去、希釈緩衝液の添加を含む標準方法で実施した。続いて、試料を、次の条件を使用してＨＰＬＣ分析した。カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＬＵＮＡ ５μｍ Ｃ１８（２） １００ Ａ（２５０×４．６０ｍｍ）；炉温度：３０℃、流量：０．５ｍＬ／分、溶出剤Ａ：Ｈ2Ｏ（０．１％ ＴＦＡ）、溶出剤Ｂ：ＭｅＣＮ（０．１％ ＴＦＡ）；勾配：０〜２分 ３０％ Ｂ、２〜１５分 ３０〜１００％ Ｂ、１５〜２５分 １００％ Ｂ、２５〜３０分 ３０％ Ｂ。
【００７９】
実施例１０：酵素の調合
遺伝子を、最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔによって合成し、そしてアンピシリン耐性を有するｐＭＡＬベクター中で導入した。タンパク質コード化挿入を、Ｎｄｅｌ及びＸｈｏｌ制限酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社製）によって切断し、そしてｐＥＴ２１発現ベクター中でＴ４ Ｌｉｇａｓｅ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社製）によってライゲーションした。オキシダーゼを使用した場合に、酵素を、次のようにｐＥＴ１６ｂ又はｐＥＴ２１ａプラスミド構成物を使用して製造した：１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを追加し、それぞれのプラスミドを含む大腸菌株ＢＬ２１を成長するために使用したＬＢ寒天プレートから新しい単コロニーを、同量のアンピシリンを追加した一昼夜培養液５０ｍｌに植えた。１２０ｒｐｍ及び３０℃で一昼夜の前記培養液のインキュベートに続いて、一昼夜の培養液４ｍｌを、３ｌフラスコ中で同一の培地の６００ｍｌに植えた。そのフラスコを３７℃及び１２０ｒｐｍで０．６のＯＤ５５０に達するまで、すなわち約２〜４時間振盪した。続いて、それぞれの酵素の発現を、０．６ｍｌのＩＰＴＧ（イソブチル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド、２３８ｍｇ／ｍｌ）の添加によって、続いて２０℃及び１２０ｒｐｍで激しい撹拌下で一昼夜インキュベートすることによって誘導した。そして、細胞を、８０００ｒｐｍ及び４℃で２０分間遠心沈澱させた。上澄みを処分し、ペレットを生理学的ＮａＣｌ溶液を使用して洗浄し、遠心沈澱させ、そして凍結乾燥させた。
【００８０】
他の酵素を使用した場合に、ｐＡＳＫ−ＩＢＡ３５＋（ＩＢＡ Ｂｉｏｔａｇｎｏｌｏｇｙ社、Ｇｅｒｍａｎｙ）プラスミド骨格を含む構造を使用した。１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを追加し、それぞれのプラスミドを含む大腸菌株ＢＬ２１を成長するために使用したＬＢ寒天プレートから新しい単コロニーを、同量のアンピシリンを追加した一昼夜培養液５０ｍｌに植えた。１８０ｒｐｍ及び３０℃で一昼夜の前記培養液のインキュベートに続いて、一昼夜の培養液を、５ｌフラスコ中で同一の培地の２ｌに植えた。そのフラスコを３７℃及び１２０ｒｐｍで０．６のＯＤ５５０に達するまで、すなわち約２〜４時間振盪した。続いて、それぞれの酵素の発現を、０．２ｍｌのアンヒドロテトラサイクリン（２ｍｇ／ｍｌ）の添加によって、続いて３０℃及び１８０ｒｐｍで激しい撹拌下で２時間インキュベートすることによって誘導した。そして、細胞を、５０００ｒｐｍ及び４℃で２０分間遠心沈澱させた。上澄みを処分し、ペレットを生理学的ＮａＣｌ溶液を使用して洗浄し、遠心沈澱させ、そして凍結乾燥させた。
【００８１】
アラニンデヒドロゲナーゼの場合に、凍結乾燥細胞４ｇを、リン酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）中で再懸濁し、そして超音波（１秒パルスの後に４秒インキュベート、合計１０分間繰り返す）を使用して溶解させた。細胞溶解物を２回遠心沈澱させ（１６０００ｒｐｍ、２０分、４℃）、シリンジフィルターを使用して濾過し、そして床堆積５ｍｌを有するＨｉｓトラップカラムを適用した。タンパク質結合を、非特異的に、２０ｍＭイミダゾールを含むリン酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭ ＮａＣｌ）を適用することによって取り除いた。タンパク質を、同一の緩衝液を使用して、５０ｍＭ〜８０ｍＭの勾配のイミダゾールを適用しながら、続いて、１５０ｍＭイミダゾールを含む同一の緩衝液６０ｍｌの適用によって、溶出した。純粋な酵素を含む画分をため、リン酸緩衝液に対して透析してイミダゾールを除去し、そしてＶｉｖａｓｐｉｎ管で濃縮し、そして４０００ｒｐｍで遠心分離した。
【００８２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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