(57)【要約】ナノピペットを用いて単細胞を含む表面上に所望の材料を制御排出する方法及びシステムを提供する。あるシステムは、細胞付着及び成長の制御目的のために任意の基板上にユーザ規定のパターンを堆積するｘｙｚコントローラと組み合わせたナノピペットを有する方法及びシステムに向けるものである。他の実施例は、ナノピペットを有する方法及びシステムに向けたものであり、このナノピペットは、処理量が高く且つ細胞に対する損傷を最少にするように材料を細胞内に電気浸透注入するナノピペットの孔内の電圧差の電子制御部及びｘｙｚコントローラと組み合わされているようにする。更に他の実施例は、官能化されたナノピペットを有する方法及びシステムに向けたものであり、このナノピペットは、分子間相互作用及び単一の生体細胞内の生体分子の検出を研究するために走査型イオンコンダクタンス顕微鏡と組み合わされている。
2014513924.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上の個々の細胞を操作する操作装置において、
（ａ）マルチバレル式のナノピペットであって、このマルチバレル式のナノピペットが、
（ｉ）第１のバレル内の液体と接触するように配置した第１の電極を収容している当該第１のバレルと、
（ii）この第１のバレルに隣接する第２のバレルであって、この第２のバレル内の液体と接触するように配置した第２の電極を収容している当該第２のバレルと、
（iii ）前記第１の電極に接続され、前記第１の電極及び前記第２の電極間の電圧を制御する増幅器と
を有する当該マルチバレル式のナノピペットと、
（ｂ）このマルチバレル式のナノピペピペットに取り付けられ、サブミクロンのｘ及びｙステップでこのマルチバレル式のナノピペットの機械的移動を行うとともに、前記基板に向かう又はこの基板から離れるｚ方向でこのマルチバレル式のナノピペットを移動させるｘｙｚコントローラであって、更にユーザ規定の制御に応じて前記機械的移動を制御する電子制御部を有している当該ｘｙｚコントローラと、
（ｃ）前記第１の電極及び前記第２の電極間の電圧を制御するとともに、前記ナノピペット内の液体を排出させる必要のある所望の位置で前記第１のバレルから液体を排出させる排出電圧を前記第１の電極に印加し、且つ前記ｘｙｚコントローラが、前記所望の位置から離れる方向で前記ナノピペットの機械的移動を行ない、これにより個々の細胞が排出された液体と接触しうるようにした際に、前記排出電圧を除去するようにする回路と
を具える操作装置。
【請求項２】
請求項１に記載の操作装置において、電圧を制御する前記回路が、ピペットバイアス電圧を生じるとともに第１のバレルを流れるイオン電流を測定する低雑音増幅器を有するようにした操作装置。
【請求項３】
請求項１に記載の操作装置において、この操作装置が更に、前記ｘｙｚコントローラのサブミクロン制御のための圧電アクチュエータを具えるようにした操作装置。
【請求項４】
請求項１に記載の操作装置において、この操作装置が更に、前記所望の位置を決定するユーザ入力のためのフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）を有するようにした操作装置。
【請求項５】
請求項４に記載の操作装置において、前記フィールドプログラマブルゲートアレイは、前記基板上のパターン内にスポットを堆積するようにプログラミングされているようにした操作装置。
【請求項６】
請求項４に記載の操作装置において、前記フィールドプログラマブルゲートアレイは、前記基板上の所定の位置にある細胞を注入するようにプログラミングされているようにした操作装置。
【請求項７】
請求項６に記載の操作装置において、前記フィールドプログラマブルゲートアレイは、前記細胞内のオルガネラを注入するようにプログラミングされているようにした操作装置。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか一項に記載の操作装置において、この操作装置は、それぞれの細胞が個々の位置にある複数の細胞を含むようにした基板に動作的に接続されている操作装置。
【請求項９】
請求項８に記載の操作装置において、前記基板は、個々の細胞を単一の空洞内に収容する寸法となるように内部に規定した複数の空洞を有するようにした操作装置。
【請求項１０】
請求項９に記載の操作装置において、前記基板が、細胞を空洞内に保持するための負圧を加える貫通孔を有するようにした操作装置。
【請求項１１】
請求項１０に記載の操作装置において、前記空洞が、細胞を空洞に取り付けるための電極を具えるようにした操作装置。
【請求項１２】
サブミクロンの形態を有する所定のパターンで液体を堆積させる堆積方法において、
（ａ）液体をマルチバレル式のナノピペット内に堆積するように配置するステップであって、このナノピペットは、
（ｉ）第１のバレル内の液体と接触するように配置する第１の電極を収容する当該第１のバレルと、
（ii）この第１のバレルに隣接する第２のバレルであって、この第２のバレル内の液体と接触するように配置する第２の電極を収容する当該第２のバレルと、
（iii ）前記第１の電極に接続され、前記第１の電極及び前記第２の電極間の電圧を制御する増幅器と
を有するようにするステップと、
（ｂ）前記マルチバレル式のナノピペットに取り付けられ、サブミクロンのｘ及びｙステップでこのマルチバレル式のナノピペットの機械的移動を行うとともに、前記基板に向かう又はこの基板から離れるｚ方向でこのマルチバレル式のナノピペットを移動させるようにしたｘｙｚコントローラであって、このｘｙｚコントローラは更に、ユーザ規定の制御に応じて前記機械的移動を制御する電子制御部を有するようにする当該ｘｙｚコントローラを動作させるステップと、
（ｃ）前記第１の電極及び前記第２の電極間の電圧を制御するとともに、前記ナノピペット内の液体を排出させる必要のある所望の位置で前記第１のバレルから液体を排出させる排出電圧を前記第１の電極に印加し、且つ前記ｘｙｚコントローラが、前記所望の位置から離れる方向で前記ナノピペットの機械的移動を行なう際に、前記排出電圧を除去し、これにより前記液体が前記所定のパターンで堆積されるようにする回路を用いるステップと
を具える堆積方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の堆積方法において、前記液体が細胞付着材料を有し、堆積されたこの細胞付着材料の領域でのみ基板上に細胞を取り付けるようにする堆積方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の堆積方法において、前記細胞付着材料をラミニンとする堆積方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の堆積方法において、前記基板が均一のポリマーの頂面を具えるようにする堆積方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載の堆積方法において、前記液体が、堆積された細胞付着材料の領域でのみ前記基板上に細胞を取り付ける細胞付着材料を有しているようにするとともに、前記堆積方法は更に、培養すべき付着細胞を前記基板に被着させ、これにより前記細胞が細胞付着材料を有する領域にのみ付着されるようにするステップを具えている堆積方法。
【請求項１７】
請求項１２に記載の堆積方法において、細胞付着材料を有する領域が、１００平方ミクロン当り少なくとも約１０個のスポットの密度にあるようにする堆積方法。
【請求項１８】
請求項１２に記載の堆積方法において、この堆積方法を、ナノピペットの異なるバレルから異なる材料を堆積するのに用いるようにする堆積方法。
【請求項１９】
請求項１２〜１８の何れか一項に記載の堆積方法において、前記ナノピペットを石英から形成し、このナノピペットが約２０〜１００nmの開口を有するようにする堆積方法。
【請求項２０】
基板上の選択された細胞内に材料を注入する注入方法において、
（ａ）液体をマルチバレル式のナノピペット内に注入するように配置するステップであって、このマルチバレル式のナノピペットは、
（ｉ）第１のバレル内の液体と接触するように配置する第１の電極を収容する当該第１のバレルと、
（ii）この第１のバレルに隣接する第２のバレルであって、この第２のバレル内の液体と接触するように配置する第２の電極を収容する当該第２のバレルと、
（iii ）前記第１の電極に接続され、前記第１の電極及び前記第２の電極間の電圧を制御する増幅器と
を有するようにするステップと、
（ｂ）前記マルチバレル式のナノピペットに取り付けられ、サブミクロンのｘ及びｙステップでこのマルチバレル式のナノピペットの機械的移動を行うとともに、前記基板に向かう又はこの基板から離れるｚ方向でこのマルチバレル式のナノピペットを移動させるようにしたｘｙｚコントローラであって、このｘｙｚコントローラは更に、ユーザ規定の制御に応じて前記機械的移動を制御する電子制御部を有するようにする当該ｘｙｚコントローラを動作させるステップと、
（ｃ）前記第１の電極及び前記第２の電極間の電圧を制御するとともに、前記ナノピペット内の液体を排出させる必要のある所望の位置で前記第１のバレルから液体を排出させる排出電圧を前記第１の電極に印加し、且つ前記ｘｙｚコントローラが、前記所望の位置から離れる方向で前記ナノピペットの機械的移動を行う際に、前記排出電圧を除去し、これにより前記液体が前記細胞内に注入されるようにする回路を用いるステップと
を具える注入方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の注入方法において、この注入方法が更に、前記基板内の空洞であって、個々の細胞のみを保持する寸法とした当該空洞内に前記細胞を配置することにより、前記基板上の前記細胞を固定化するステップを具える注入方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の注入方法において、この注入方法が更に、前記細胞の固定化の援助のために前記空洞にまたがる圧力差を加えるステップを具える注入方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載の注入方法において、注入された前記材料を、ポリ核酸、抗体及び染料より成る群から選択するようにする注入方法。
【請求項２４】
基板上の個々の細胞内の検体を検出する検出装置において、
（ａ）第１の電極を収容するバレルを有するナノピペットであって、この第１の電極は、前記細胞に接触する液体内の第２の電極である基準電極と接触するように前記検体を保持するとともに、使用中に前記第１及び第２の電極間の電圧を制御する回路に接続されているようにした当該ナノピペットと、
（ｂ）前記ナノピペットに取り付けられ、サブミクロンのｘ及びｙステップで前記ナノピペットの機械的移動を行うとともに、ｚ方向でこのナノピペットを移動させるようにしたｘｙｚコントローラであって、このｘｙｚコントローラは更に、ユーザ規定の制御に応じて前記機械的移動を制御する電子制御部を有している当該ｘｙｚコントローラと
を具えており、
（ｃ）前記ナノピペットの先端部が、先端部付近の前記細胞内で内側表面上に固定された検体結合材料を有するようにした
検出装置。
【請求項２５】
請求項２４に記載の検出装置において、前記検体結合材料をタンパク質又はポリ核酸とした検出装置。
【請求項２６】
請求項２４に記載の検出装置において、前記検体結合材料を、スルホ‐ＳＭＣＣにより前記内側表面上のポリエルリジン（ＰＬＬ）被膜に結合されたタンパク質とした検出装置。
【請求項２７】
単一の生細胞内の生体分子を検出する検出方法において、
（ａ）官能化されたナノピペットを、細胞内で規定の深さに配置するステップと、
（ｂ）電流を監視して細胞膜付近のナノピペットの正確な位置を制御するステップと、
（ｃ）ナノピペットを高速度で細胞内に挿入するステップと、
（ｄ）高電圧を印加するステップと、
（ｅ）電流変化を測定して細胞内の生体分子を検出するステップと
を具え、前記官能化されたナノピペットはシステムに設けられており、更にこのシステムは、ピペットをバイアスするとともに電流測定を行う増幅器と、Ｘ、Ｙ及びＺ方向で制御を行うマイクロマニピュレータと、Ｘ、Ｙ及びＺ方向で微細制御を行う圧電アクチュエータと、構造化可能な集積回路と、高電圧源と、低電圧及び高電圧間の切換えを行うリレーとを具えているようにする検出方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の検出方法において、前記ナノピペットを抗体で官能化する検出方法。
【請求項２９】
請求項２７に記載の検出方法において、前記ナノピペットをアプタマーで官能化する検出方法。
【請求項３０】
請求項２７に記載の検出方法において、この検出方法を、免疫測定法で単一の生細胞内で用いるようにする検出方法。
【請求項３１】
請求項２７に記載の検出方法において、前記ナノピペットを受容体リガンドで官能化する検出方法。
【請求項３２】
請求項２７に記載の検出方法において、前記検出は、単一の生細胞内でのがんタンパクの検出とする検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子の単細胞注入、パターン化及び検出用のナノデバイス及びナノセンサに関するものである。
【０００２】
[関連出願の相互参照]
本出願は、２０１１年３月３日に出願された出願番号61/448,998の米国特許仮出願の優先権を主張するものであり、この米国特許仮出願の開示内容全体は、参考のためにここに導入されるものである。
【０００３】
[政府支援声明]
本発明は、米国航空宇宙局（ＮＡＳＡ）により与えられた契約番号ＮＣＣ９‐１６５及びＮＮＸ０８ＢＡ４７Ａや、米国国立衛生研究所により与えられた契約番号Ｐ０１‐ＨＧ０００２０５や、ＮＡＳＡにより与えられた契約番号ＮＮＸ０９ＡＱ４４Ａや、米国国立がん研究所により与えられた契約番号Ｕ５４ＣＡ１４３８０３の下での政府支援に基づいて達成されたものである。米国政府はこの発明に、ある権利を有するものである。
【０００４】
[配列表、コンピュータプログラム又はコンパクトディスクに関する参照]
該当なし。
【背景技術】
【０００５】
[関連技術]
本発明の幾つかの観点に関する背景情報を以下に記載する。その理由は、これらの背景技術は、本発明の詳細な説明において関連するも、必ずしも詳細に説明していない技術的な特徴に関するものである為である。すなわち、本発明で用いられる個々の部分及び方法は、以下に記載する資料に詳細に説明されており、これらの資料により、特許請求の範囲に記載した本発明の幾つかの観点を達成又は使用する上で当業者に更なる助言を与えうるものである。以下の説明は、本発明の特許請求の範囲の如何なる請求項又は説明資料の従来技術の効果に対する情報の妥当性に関し承認されたものとして解釈されるべきものではない。
【０００６】
ナノピペット技術は多くの適用分野に対して使用可能なプラットフォームであるとみられている。Actis 氏等（二人の本発明者を含む）は、ＳＴＩＮＧ（Signal Transduction by Ion Nano Gating；イオンナノゲーティングによるシグナル変換）と称される検出用プラットフォームを開発し、この場合、石英ナノピペットの最先端部を化学的な又は生物学的な受容体で官能化している（文献：Biosensors & Bioelectronics, 2010. 26(2): pp. 333-337 の“Ultrasensitive mycotoxin detection” Actis P. 氏、O. Jejelowo 氏及びN. Pourmand 氏著参照）。石英ナノピペットの最先端部におけるナノメートルスケールの開口は、付着した受容体と結合している検体に感応する領域を形成する。更に、Rodolfa 氏等は、官能化された表面上に制御析出させるのに、ナノピペットを用いることができることを確かめている（文献：Angewandte Chemie-International Edition, 2005. 44(42): pp. 6854-6859の“Two-component graded deposition of biomolecules with a double-barreled nanopipette” Rodolfa K. T.氏等著参照）。更なる研究では、無機溶媒中で、表面上に材料（物質）を堆積することが実証されている（文献：Nano Letters, 2006. 6(2): p.6 の“Nanoscale pipetting for controlled chemistry in small arranged water droplets using a double-barrel pipet” Rodolfa K. T.氏等著参照）。又ナノピペットを用いることで、個々の分子が細胞の原形質膜に与えられた（文献：Biophysical Journal, 2007. 93: pp. 3120-3131の“Nanopipette delivery of individual molecules to cellular compartments for single-molecule fluorescence tracking ” Bruckbauer A.氏等著参照）。
【０００７】
Laforge 氏等は、ナノピペットの開口に形成された液液界面にまたがって電圧を印加することにより液体を送出するナノピペットに基づく電気化学的アトシリンジを開発した（文献：Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007. 104(29): pp. 11895-11900 の“Electrochemical attsyringe” Laforge F. O.氏著参照）。これにより得られる力は、液体の流れをピペット内に導入するとともにピペットから導出させる充分に強いものである。これらの電気化学的アトシリンジはこの効果を良好に用いて、フェムトリットルの水溶液を培養中の哺乳類細胞内に供給しうる。炭素ナノピペットも同様に細胞注入に効果があることが分かっている。蛍光染料を口腔扁平がん細胞内に圧力駆動注入することは、Schrlau 氏等により実証されている（文献：Nanotechnology, 2008: p. 015101-1-4 の“Carbon nanopipettes for cell probes and intracellular injection ”参照）。
【０００８】
[細胞のパターン化]
細胞の付着及び増殖を制御することは、神経科学から肝細胞研究までの生物分野における重要なテーマとして浮上した（文献：IEEE Transactions on Biomedical Engineering, 2000. 47(1): pp. 17-21 の“Aligned Microcontact Printing of Micrometer Scale Polylysine Structures for Controlled Growth of Cultured Neuronson Planar Microelectrode Arrays” James C. D.氏等著及び文献：Journal of Neuroscience Methods, 2005. 142(2): pp. 243-250の“Photo-chemically patterned polymer surfaces for controlled PC-12 adhesion and neurite guidance” Welle A. 氏等著参照）。細胞を何処で且つ如何に成長（生育）させ且つ熟成させるかを制御することにより、細胞の成長中に特定の特性を誘導させることができる。例えば、化学キューにより神経細胞分化を制御して、特定の実験に対して軸索成長の方向を予め決定させるとともにカスタマイズさせるようにすることができることは、Oliva 氏等により確かめられている（文献：Neurochemical Research, 2003. 28(11): pp. 1639-1648 の“Patterning axonal guidance molecules using a novel strategy for microcontact printing”参照）。同様に、インクジェット印刷が神経幹細胞分化を制御しうるようにすることが確かめられている（文献：Biomaterials, 2007. 28(27): pp. 3936-3943 の“Inkjet printing of macromolecules on hydrogels to steer neural stem cell differentiation”Ilkhanizadeh S. 氏等著参照）。
【０００９】
複数の方法を用いて細胞のパターン化を研究した。半導体製造技術で達成された進歩を利用することにより、単細胞を導くのに充分小さい形状を有するパターンが可能となった。最も広く用いられている細胞のパターン化成技術はミクロ接触プリンティング（μＣＰ）であり、この場合、従来のフォトリソグラフィ技術を用いてマスターモールド（型）を製造し、このマスターモールドからエラストマーのスタンプを形成する。次いで、このスタンプに生体分子を塗布し、任意の基板（サブストレート）にパターンを与えることができる（文献：Advanced Materials, 1994. 6(7-8): pp. 600-604 の“Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers” Wilbur J.L.氏等著参照）。この方法によれば、特に制御神経成長領域（アリーナ）において、細胞の成長を制御するのに多数の成功があることが確かめられている（文献：Biotechnology Progress, 2003. 19(2): pp. 243-253の“Integration of cell culture and microfabrication technology ” Park T.H.及びM.L. Shuler 氏著参照）。放射線を、マスクを介して基板に当てることにより、界面化学を変更させ、これにより特定の付着分子を適切な領域内に配置させるようにすることができる（文献：Journal of Neuroscience Methods, 2005. 142(2): pp. 243-250の“Photo-chemically patterned polymer surfaces for controlled PC-12 adhesion and neurite guidance”Welle A.氏等著参照）。更に細胞成長を制御する地理学的（トポグラフィック）キューが確かめられた。細胞が細胞と界面を形成する表面粗さを変更させることにより、付着力を制御することができる。化学的な付着キューと地理学的な付着キューとの組み合わせも、細胞分化を改善させるものとして確かめられている（例えば、文献：Journal of Neuroscience Methods, 1998. 82(2): pp. 167-173 の“Microlitho graphic determination of axonal/ dendritic polarity in cultured hippocampal neurons”Stenger D.A.氏等著参照）。これらの方法に対する欠点は、一旦パターンが設計されて製造されると、新たなマスクを設計したり、処理全体を最初から再開したりすることなしにこのパターンを変更させることができないということである。標準の半導体製造技術に頼らない、従って、製造処理により制限されないでパターン化を行う幾つかの方法が開発された。Gustavsson氏等は、１００ｐＬのドロップレットを６〜８μｍの精度で堆積させうる圧電駆動型のマイクロディスペンサを実証した（文献：Biomaterials, 2007. 28(6): pp. 1141-1151の“Neurite guidance on protein micropatterns generated by a piezoelectric microdispenser ”参照）。つけペンリソグラフィや万年筆リソグラフィによれば、Schmidt R.C.及びK.E. Healy氏により確認されているように、大きさが４０nm程度のスポットをユーザが規定した任意のパターンに堆積しうるものである（文献：Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2009. 90A(4): pp. 1252-1261の“Controlling biological interfaces on the nanometer length scale ”参照）。しかし、この技術は、所定の時間で単一のパターンのみを堆積するのに制限されている。
【００１０】
以下に説明する石英ナノピペット技術を用いることにより、基板上に堆積されるパターンがコンピュータ制御され、従って、このパターンを如何なる時にもユーザにより変更しうるようになり、互いに関連させて記録される複数のパターンを容易に堆積しうるものである。このパターンを用いて図２に示すように基板２１６に対する細胞の付着を達成することができ、この場合、付着材料が堆積されている基板上の点に細胞２１２が付着されている。
【００１１】
[細胞注入]
細胞注入方法は、歴史的に引上式ガラスマイクロピペットを用いている。従来のマイクロピペットは、代表的な細胞に比べて寸法が大きいとか、細胞の生存性が低いとか、熟練オペレータの条件及びフィードバックに欠けているとかの欠点を含む幾つかの欠点を有している（文献：IEEE Transactions on Automation Science and Engineering, 2007. 4(3): pp. 322-331の“Evaluating the effect of force feedback in cell injection ” Pillarisetti A.氏等著及び文献：Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001. 98(8): pp. 4295-4298 の“The many ways to cross the plasma membrane” Stephens D.J.及びR. Pepperkok氏著参照）。
【００１２】
上述した欠点を軽減させるための細胞注入用の多数の他の方法が開発された。電気穿孔法のような方法や、毒素ストレプトリジンＯ（ＳＬ‐Ｏ）を形成する細孔の使用が、材料を細胞内に受動伝達するために開発された（文献：Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2010. 397(8): pp. 3235-3248 の“Single-cell electroporation ” Wang M.Y.氏等著；文献：Biochemical Journal, 1986. 234(3): pp. 497-506の“Gaining access to the cytosol - the technique and some applications of electropermeabilization” Knight D.E.及びM.C. Scrutton 氏著；文献：Nucleic Acids Research, 1998. 26(7): pp. 1567-1575の“Selecting optimal oligonucleotide composition for maximal antisense effect following streptolysin O-mediated delivery into human leukaemia cells”Giles R.V.氏等著参照）。電気穿孔法は、高電圧を印加することにより細胞膜内に一時的な透過性を導入し、その後に材料を拡散しうるようにするものとして実証されている。細胞は、ある状況の下でＳＬ‐０の障害を治療する能力を呈した。どちらの場合も細胞に歪が導入され、ＳＬ‐０の障害の場合には、摂取量が〜１００kDa に制限される。
【００１３】
細胞注入の直接的な方法は、他の関係のないナノ加工構造体を用いて実証されている。ＡＦＭの先端上に製造されＤＮＡで被覆されたナノニードルが単細胞内に挿入された。注入はナノニードルからのＤＮＡの拡散により達成された（文献：Nanomedicine: Nano technology, Biology and Medicine, 2008: pp. 215-225の“High-efficiency DNA injection into a single human mesenchymal stem cell using a nanoneedle and atomic force microscopy” Sung-Woong H.氏等著参照）。同様に、細胞内で量子ドットをナノニードルに結合させるジスルフィド結合を開裂させることによりこれらの量子ドットが放出された（文献：Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007. 104(20): pp. 8218-8222 の“A cell nanoinjector based on carbon nanotubes ” Chen X.氏等著参照）。
【００１４】
[細胞内分子種の単細胞生体内検出]
細胞内記録を行う幾つかの方法が開発された。Kopelman氏及びその協力者は、pH及び一酸化窒素を細胞外監視するために化学的に修飾されたテーパ型光ファイバを適用することを開発した（文献：Science 258, 778-781, doi: 10.1126/science.1439785, 1992の“Submicrometer intracellular chemical optical fiber sensors”Tan W.氏等著及び文献：Analytical Chemistry 71, 2071-2075, doi: 10.1021/ac9901081, 1999の“Cellular Applications of a Sensitive and Selective Fiber-Optic Nitric Oxide Biosensor Based on a Dye- Labeled Heme Domain of Soluble Guanylate Cyclase” Barker S. L. R.氏等著参照）。Vo-Dihn 氏及びその協力者は、単細胞中の蛍光被検体を測定するために抗体修飾された光ファイバを分析応用することを報告している（文献：Nat Biotech 18: 764-767, 2000 の“Antibody-based nanoprobe for measurement of a fluorescent analyte in a single cell” Vo-Dihn氏等著参照）。テーパ型光ファイバを採用することによる利点の１つは、近接場走査型光学顕微鏡を用いて達成しうる高空間分解能に頼るものである。センサは、細胞に対する損傷を回避するために、顕微鏡下で注意深く操作する必要がある。これらの物理的な制約に加えて、細胞質内の多くの妨害種の為に、アフィニティ法により生体分子を選択的に検出すること自体に挑戦が行われている。つい最近では、光ファイバナノバイオセンサが、酸素サンドイッチ免疫測定法により単細胞中のがんバイオマーカーを検出するように構成された（文献：Biosensors and Bioelectronics 25: 1548-1552, 2010 の“Single living cell detection of telomerase over-expression for cancer detection by an optical fiber nanobiosensor ” Zheng X. T.及びLi C. M.氏著参照）。電気的な検出方法は、耐久性、感度、高速応答及び他の装置の構成要素との一体化において改善されている為に他の方法よりも適していることが知られている。たとえそうでも、細胞内測定用の、電気に基礎を置くセンサは多くの課題に直面している。微小電極は通常、代表的な哺乳類細胞を損傷させるほど充分に大きく（５〜１０μｍ）、少なくとも１０倍大きい卵母細胞及び胚中で測定するのに手順がしばしば制限される。最近、Hai A.氏等は細胞の内側に突出する微小電極を用いてサブシュレッショルドシナプス電位を測定した（文献：Nature Methods (2010) 7, 200-202における“In-cell recordings by extracellular microelectrodes ”参照）。Bakker E. 及びPretsch E.氏によるイオン選択性膜が被覆された微小電極を用いる良好な細胞内陽イオン及びpHセンサ（文献：TrAC Trends in Analytical Chemistry 27, 612-618 の“Nanoscale potentiometry ”参照）にもかかわらず、細胞内で生体分子を電気的に検出するのは分かりにくいままである。Lieber氏及びその協力者は、リン脂質二重層を用いて変更されたナノスケールの電界効果トランジスタ（ナノＦＥＴ）が、単細胞の浸透を達成させうるとともに細胞内電位を記録しうるようにした新規な方法を開発した（文献：Science 329, 830-834, doi: 10.1126/science.1192033, 2010の“Three-Dimensional, Flexible Nanoscale Field-Effect Transistors as Localized Bioprobes ” Tian B.氏等著参照）。しかし、単細胞の内部における生体分子の相互作用を検出するのに電気的なセンサが用いられなかった。
【００１５】
ＳＴＩＮＧ（Signal Transduction by Ion Nano-Gating；イオンナノゲーティングによるシグナル変換）技術は、試料中のＤＮＡ、タンパク質及びマイコトキシンを検出しうるものとしても確かめられている（文献：Chem Commun (Camb), (2009), 4877-4879, doi: 10.1039/b910511eの“Nanopore DNA sensors based on dendrimer -modified nanopipettes” Fu Y.氏等著；文献：Proceedings of the National Academy of Sciences (2009) 106, 4611-4616, doi: 10.1073/pnas.0900306106 の“Label-free biosensing with functionalized nanopipette probes”Umehara S.氏等著；文献：Biosensors and Bioelectronics (2010)26, 333-337 の“Ultrasensitive mycotoxin detection by STING sensors ”Actis P.氏等著参照）。官能化された石英のナノピペットに基づいたＳＴＩＮＧ技術は、如何なるナノファブリケーション施設をも必要としない。すなわち、各プローブは容易に且つ廉価にベンチ仕様にできる。受容体分子は良好に確立された表面化学を用いて導入しうる。バイオセンシング以外には、ナノピペットプラットホームを用いて、単分子生物物理学である個々の細胞内部でのコントロールデリバリーを研究するとともに、ナノスケールで細胞を記録している（文献：Angew Chem Int Ed Engl (2005), 44, 3747-3750, doi: 10.1002/anie.200500196 の“Trapping of proteins under physiological conditions in a nanopipette”Clarke R. W.氏等著；文献Proceedings of the National Academy of Sciences (2007), 104, 11895-11900, doi: 10.1073/pnas.0705102104の“Electrochemical attosyringe ” Laforge F. O.氏等著；文献：Nanomedicine (Lond) (2006), 1, 107-114, doi: 10.2217/ 17435889.1.1.107の“Potential biomedical applications of the scanned nanopipette”Klenerman D.及びKorchev Y.氏著参照）。Vitol 氏及びその協力者は細胞内解析のためのＳＥＲＳ活性炭ナノピペットを開発した（文献：Nano technology, (2010), 015304 の“Small diameter carbon nanopipettes”Singhal R.等著参照）。外側表面のピペット先端上に金のナノ粒子を導入することによりＳＥＲＳの官能性が加えられた。ナノピペットを核内に挿入することにより得られたＳＥＲＳスペクトルはＤＮＡと関連する代表的な特性を示している。
【００１６】
しかし、生体細胞内で動作しうるナノピペットバイオセンサの必要性が当該技術分野に残っている。
【００１７】
[特定の特許及び刊行物]
２０１０年３月２５日に出願された米国特許出願公開2010/0072080（発明者：Karhanek氏等）には、ペプチド及びタンパク質を含む生体分子を検出するための官能化されたナノピペットを具える方法及び装置が開示されている。
２００９年３月２４日に発行された刊行物：Proceedings of the National Academy of Sciences, vol 106の第４６１１〜４６１６頁（Umehara 氏等著）には、官能化されたナノピペットの電極を用いる無標識リアルタイムタンパク質測定が開示されている。
２００９年に発行された刊行物：Biochemical Society Transactions, vol 37の第７０２〜７０６頁（Ying Liming氏著）は、ナノピペットについて論評しており、且つイオン、（生体分子を含む）分子及び細胞のナノセンシング及びナノマニピュレーションにこれらナノピペットを使用することについて論評している。
２０１０年に発行された刊行物：Bioanalytical Reviews 1, 177-185, doi:10.1007/sl2566-010-0013-y （Actis P.氏等著）は、核酸及び低分子タンパク質用の電気化学バイオセンサとしてナノピペット技術を適用することについて論評している。
１９９０年５月８日に発行された“Scanning Ion Conductance Microscope ”と題する米国特許ＵＳ４，９２４，０９１（発明者：Hansma氏等）には、マイクロピペットプローブを表面から一定のコンダクタンス距離に保つことにより、電解質で被覆された柔軟な非導電性表面のトポグラフィを撮像しうる走査型イオンコンダクタンス顕微鏡（ＳＩＣＭ）が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許出願公開2010/0072080
【特許文献２】米国特許US4,924,091
【特許文献３】米国特許US5,394,741
【特許文献４】米国特許US5,660,985
【特許文献５】米国特許US5,567,588
【特許文献６】米国特許US5,660,985
【特許文献７】米国特許US5,756,703
【特許文献８】米国特許US5,580,737
【特許文献９】米国特許出願公開第２００９／０３１８３６３号明細書
【特許文献１０】米国特許US6,335,440
【特許文献１１】米国特許US7,597,941
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Biosensors & Bioelectronics, 2010. 26(2): pp. 333-337
【非特許文献２】Angewandte Chemie-International Edition, 2005. 44(42): pp. 6854-6859
【非特許文献３】Nano Letters, 2006. 6(2): p.6
【非特許文献４】Biophysical Journal, 2007. 93: pp. 3120-3131
【非特許文献５】Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007. 104(29): pp. 11895-11900
【非特許文献６】Nanotechnology, 2008: p. 015101-1-4
【非特許文献７】IEEE Transactions on Biomedical Engineering, 2000. 47(1): pp. 17-21
【非特許文献８】Journal of Neuroscience Methods, 2005. 142(2): pp. 243-250
【非特許文献９】Neurochemical Research, 2003. 28(11): pp. 1639-1648
【非特許文献１０】Biomaterials, 2007. 28(27): pp. 3936-3943
【非特許文献１１】Advanced Materials, 1994. 6(7-8): pp. 600-604
【非特許文献１２】Biotechnology Progress, 2003. 19(2): pp. 243-253
【非特許文献１３】Journal of Neuroscience Methods, 2005. 142(2): pp. 243-250
【非特許文献１４】Journal of Neuroscience Methods, 1998. 82(2): pp. 167-173
【非特許文献１５】Biomaterials, 2007. 28(6): pp. 1141-1151
【非特許文献１６】Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2009. 90A(4): pp. 1252-1261
【非特許文献１７】IEEE Transactions on Automation Science and Engineering, 2007. 4(3): pp. 322-331
【非特許文献１８】Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001. 98(8): pp. 4295-4298
【非特許文献１９】Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2010. 397(8): pp. 3235-3248
【非特許文献２０】Biochemical Journal, 1986. 234(3): pp. 497-506
【非特許文献２１】Nucleic Acids Research, 1998. 26(7): pp. 1567-1575
【非特許文献２２】Nanomedicine: Nano technology, Biology and Medicine, 2008: pp. 215-225
【非特許文献２３】Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007. 104(20): pp. 8218-8222
【非特許文献２４】Science 258, 778-781, doi: 10.1126/science.1439785, 1992
【非特許文献２５】Analytical Chemistry 71, 2071-2075, doi: 10.1021/ac9901081, 1999
【非特許文献２６】Nat Biotech 18: 764-767, 2000
【非特許文献２７】Biosensors and Bioelectronics 25: 1548-1552, 2010
【非特許文献２８】Nature Methods (2010) 7, 200-202
【非特許文献２９】TrAC Trends in Analytical Chemistry 27, 612-618
【非特許文献３０】Science 329, 830-834, doi: 10.1126/science.1192033, 2010
【非特許文献３１】Chem Commun (Camb), (2009), 4877-4879, doi: 10.1039/b910511e
【非特許文献３２】Proceedings of the National Academy of Sciences (2009) 106, 4611-4616, doi: 10.1073/pnas.0900306106
【非特許文献３３】Biosensors and Bioelectronics (2010)26, 333-337
【非特許文献３４】Angew Chem Int Ed Engl (2005), 44, 3747-3750, doi: 10.1002/anie.200500196
【非特許文献３５】Proceedings of the National Academy of Sciences (2007), 104, 11895-11900, doi: 10.1073/pnas.0705102104
【非特許文献３６】Nanomedicine (Lond) (2006), 1, 107-114, doi: 10.2217/ 17435889.1.1.107
【非特許文献３７】Nano technology, (2010), 015304
【非特許文献３８】２００９年３月２４日発行のProceedings of the National Academy of Sciences, vol 106の第４６１１〜４６１６頁
【非特許文献３９】２００９年発行のBiochemical Society Transactions, vol 37の第７０２〜７０６頁
【非特許文献４０】２０１０年発行のBioanalytical Reviews 1, 177-185, doi:10.1007/sl2566-010-0013-y
【非特許文献４１】Science, 1989. 243(4891): pp. 641-643
【非特許文献４２】Virology 214, 289-293 (1995)
【非特許文献４３】Nature 341:544-546 (1989)
【非特許文献４４】The eleven-year switch of peptide aptamers, J. Biol. 7(1) 2 (2008)
【非特許文献４５】The Scanning Ion- Conductance Microscope. Science, 1989. 243(4891): pp. 641-643
【非特許文献４６】Scanning Ion-Conductance Microscope And Atomic Force Microscope. Scanning, 1990
【非特許文献４７】Angewandte Chemie-International Edition, 44: pp. 6854- 6859
【非特許文献４８】Oncogene 18(42):5727-5737 (1999)
【非特許文献４９】Genes Dev. 18(18):2269-2282 (2004)
【発明の概要】
【００２０】
以下の概要は、本発明の全ての特徴及び態様を含むものではなく、本発明がこの概要に記載した全ての特徴及び態様を含む必要があることを意味するものでもない。
【００２１】
ある態様では、本発明は、基板上でサブミクロンの形態を有する所定の位置で液体を堆積させる装置に関するものであり、この装置は、
（ａ）マルチバレル式のナノピペットであって、２つのバレルがこれらの内部に第１及び第２の電極を有し、１つのバレル内の前記第１の電極は、このバレル内の電極と接触するように前記液体を保持するとともに、使用中に前記第１及び第２の電極間の電圧を制御する回路に接続されている当該ナノピペットと、
（ｂ）このナノピペットに取り付けられ、サブミクロンのｘ及びｙステップで前記ナノピペットの機械的移動を行うとともにｚ方向でこのナノピペットを移動させるｘｙｚコントローラであって、ユーザ規定の制御に応じて前記機械的移動を制御する電子制御部を有している当該ｘｙｚコントローラと
を具えており、
（ｃ）前記電圧を制御する回路は、前記電子制御部に接続され、この回路が、前記ナノピペット内の液体を堆積させる必要のある前記所定の位置における所望の位置で前記液体に排出電圧を印加し、前記ｘｙｚコントローラが、液体を堆積させる必要のある前記所定の位置における前記所望の位置から離れる方向で前記ナノピペットの機械的移動を行う際に前記排出電圧を除去するようにした
ものである。
【００２２】
本発明のある態様では、基板が均一層を有し、この均一層上にパターン化材料が堆積されているようにする。このパターン化材料は細胞成長用の付着材料を規定しうる。
【００２３】
本発明のある態様では、前記装置は、ピペットバイアスを行うとともに前記第１のバレルを流れるイオン電流を測定する低雑音増幅器を有する、電圧を制御する回路を具えている。この装置は更に、ｘｙｚコントローラのサブミクロン制御のための圧電アクチュエータを具えることができる。この装置は更に、前記所定の位置をユーザ入力させるためのコンピュータ又はＦＰＧＡのようなプログラマブル装置を具えることができる。ＦＰＧＡは、パターン中にスポットを堆積させ、細胞が所定のパターン内に成長するようにプログラミングさせることができる。ＦＰＧＡは、所定の位置で細胞を注入するようにプログラミングしうる。この位置は、個々の細胞を適所に保持させて、細胞を走査及び注入しうるように定めることができる。所定の位置は、核又はミトコンドリアのような細胞内のオルガネラ（細胞小器官）とすることができる。
【００２４】
本発明のある態様では、細胞の基板は、個々の細胞を単一の空洞内に収容するために規定したこれら空洞をこの基板が有するようにすることにより細胞を保持するようにしてある。空洞は、細胞を空洞内に保持するための負圧を加える貫通孔を有するようにしうる。又空洞は、細胞をこの空洞に引き付けるための電極を有することができる。更に空洞は、ナノピペットが細胞と接触している間に、且つこのナノピペットが細胞内に注入されている間に、個々の細胞を固定位置に保持する作用を行うことができる。
【００２５】
本発明のある態様は、サブミクロンの形態を有する所定のパターンで基板上に液体を堆積させる方法を有するものであり、この方法は、
（ａ）液体をマルチバレル式のナノピペット内に堆積するように配置するステップであって、このマルチバレル式のナノピペットの少なくとも２つのバレルがこれらの内部に第１及び第２の電極を有し、１つのバレル内の前記第１の電極は、このバレル内の電極と接触するように前記液体を保持するとともに、使用中に前記第１及び第２の電極間の電圧を制御する回路に接続されているようにするステップと、
（ｂ）前記ナノピペットに取り付けられたｘｙｚコントローラを動作させてサブミクロンのｘ及びｙステップで前記ナノピペットの機械的移動を行うとともにｚ方向でこのナノピペットを移動させ、前記ｘｙｚコントローラは更に、ユーザ規定の制御に応じて前記機械的移動を制御する電子制御部を有しており、前記の動作により前記ナノピペットを前記所定のパターンで移動させるステップと、
（ｃ）前記電子制御部に接続された、電圧を制御する前記回路を用いて、この回路が、前記ナノピペット内の液体を堆積させる必要のある前記所定のパターンにおける所望の位置で前記液体に排出電圧を印加し、前記ｘｙｚコントローラが、液体を堆積させる必要のある前記所定のパターンにおける前記所望の位置から離れる方向で前記ナノピペットの機械的移動を行う際に前記排出電圧を除去するようにするステップと
を具えるものである。これらの方法は更に、前述した装置の特定例に応じて実施することができる。
【００２６】
本発明のある態様は、上述した装置を用いて基板上の細胞内に材料を注入する方法を有するものである。これらの方法は、基板内の空洞であって、個々の単細胞のみを保持する寸法とした当該空洞内に前記細胞を配置することにより、前記基板上の前記細胞を固定化するステップを有することができる。この固定化は、細胞を適所に保持するために電圧を細胞に印加するか、又は前記細胞の固定化の援助のために前記空洞にまたがる圧力差を加えるステップを有するようにしうる。細胞には、ポリ核酸、抗体及び染料を含む、ナノピペットの孔内にある種々の材料を注入することができる。
【００２７】
本発明のある態様は、単細胞内の検体を測定する装置を有するものであり、この装置は、
（ａ）第１の電極を収容するバレルを有するナノピペットであって、この第１の電極は、前記細胞に接触する液体内の第２の電極である基準電極と接触するように前記検体を保持するとともに、使用中に前記第１及び第２の電極間の電圧を制御する回路に接続されているようにした当該ナノピペットと、
（ｂ）前記ナノピペットに取り付けられ、サブミクロンのｘ及びｙステップで前記ナノピペットの機械的移動を行うとともにｚ方向でこのナノピペットを移動させるようにしたｘｙｚコントローラであって、このｘｙｚコントローラは更に、ユーザ規定の制御に応じて前記機械的移動を制御する電子制御部を有している当該ｘｙｚコントローラと
を具えており、
（ｃ）前記ナノピペットの先端部が、先端部付近の前記細胞内で内側表面（内面）上に固定された検体結合材料を有するようにした
ものである。官能化したナノピペットの先端部で検体を検出する上述した種類のものには、個々のセル内に又はその付近にこの先端部を挿入することも含まれる。この先端部は、特に検出又は測定している検体に結合させるためのタンパク質又はポリ核酸のような検体結合材料で官能化されている。検体を結合させることにより、ナノピペットの先端部におけるナノ細孔を通る電流の流れに影響を及ぼす。検体を検出するタンパク質は、ナノピペットの内側表面上のＰＬＬ被膜に結合されたスルホ（sulfo）‐ＳＭＣＣにより先端部に固定させることができる。ナノピペットの先端部は抗体又はアプタマーにより、或いは検出すべきリガンドに対する受容体により官能化させることができる。上述した装置は、免疫測定法で単一の生細胞の内部で用いることができる。
【００２８】
従って、本発明の装置は、種々の適用分野に対し種々の形態で形成しうる。各々の場合、高感度のｘｙｚコントローラに取り付けられたナノピペットが装置に含まれる。
【００２９】
ある態様では、本発明は、基板上の個々の細胞を操作する装置を有するものであり、この装置は、
（ａ）マルチバレル式のナノピペットであって、（ｉ）第１のバレル内の液体と接触するように配置した第１の電極を収容している当該第１のバレルと、（ii）この第１のバレルに隣接する第２のバレルであって、この第２のバレル内の液体と接触するように配置した第２の電極を収容している当該第２のバレルと、（iii ）前記第１の電極に接続され、前記第１の電極及び前記第２の電極間の電圧を制御する増幅器とを有する当該マルチバレル式のナノピペットと、
（ｂ）このマルチバレル式のナノピペピペットに取り付けられ、サブミクロンのｘ及びｙステップでこのマルチバレル式のナノピペットの機械的移動を行うとともに、前記基板に向かう又はこの基板から離れるｚ方向でこのマルチバレル式のナノピペットを移動させるｘｙｚコントローラであって、更にユーザ規定の制御に応じて前記機械的移動を制御する電子制御部を有している当該ｘｙｚコントローラと、
（ｃ）前記第１の電極及び前記第２の電極間の電圧を制御するとともに、前記ナノピペット内の液体を排出させる必要のある所望の位置で前記第１のバレルから液体を排出させるのに充分な電圧である排出電圧を前記第１の電極に印加し、且つ少なくとも、前記ｘｙｚコントローラが、前記所望の位置から離れる方向で前記ナノピペットの機械的移動を行う際に、前記排出電圧を除去するようにする回路と
を具えるようにする。
【００３０】
ある態様では、本発明は、検出を、単一の生細胞内の特定のがんタンパクの検出とする装置を有する。
【００３１】
ある態様では、本発明は、電圧を制御する前記回路が、ピペットバイアス電圧を生じるとともに第１のバレルを流れるイオン電流を電流測定する低雑音増幅器を有するようにした装置を有するようにする。
【００３２】
ある態様では、本発明は、ｘｙｚコントローラのサブミクロン制御のための圧電アクチュエータを具える装置を有するようにする。ある態様では、本発明は、前記所望の位置を決定するユーザ入力のためのフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）を有するようにする。ある態様では、本発明は、前記ＦＰＧＡが前記基板上のパターン内にスポットを堆積するようにプログラミングされている装置を有するようにする。ある態様では、本発明は、前記ＦＰＧＡが前記基板上の所定の位置にある細胞を注入するようにプログラミングされている装置を有するようにする。ある態様では、本発明は、前記ＦＰＧＡが前記細胞内のオルガネラを注入するようにプログラミングされている装置を有するようにする。
【００３３】
ある態様では、本発明は、それぞれの細胞が個々の位置にある複数の細胞を含むようにした基板に動作的に接続された装置を有するようにする。ある態様では、本発明は、個々の細胞をそれぞれ単一の空洞内に収容する複数の空洞を規定した基板を有するようにする。ある態様では、本発明は、細胞を空洞内に保持するための負圧を加える貫通孔を基板が有するようにした装置を有するようにする。ある態様では、本発明は、細胞を空洞に取り付けるための電極を空洞が具えるようにした装置を有するようにする。
【００３４】
ある態様では、本発明は、サブミクロンの形態を有する所定のパターンで液体を堆積させる方法を有するものであり、この方法は、
（ａ）液体をマルチバレル式のナノピペット内に堆積するように配置するステップであって、このナノピペットは、（ｉ）第１のバレル内の液体と接触するように配置する第１の電極を収容する当該第１のバレルと、（ii）この第１のバレルに隣接する第２のバレルであって、この第２のバレル内の液体と接触するように配置する第２の電極を収容する当該第２のバレルと、（iii ）前記第１の電極に接続され、前記第１の電極及び前記第２の電極間の電圧を制御する増幅器とを有するようにするステップと、
（ｂ）前記マルチバレル式のナノピペットに取り付けられ、サブミクロンのｘ及びｙステップでこのマルチバレル式のナノピペットの機械的移動を行うとともに基板に向かう又はこの基板から離れるｚ方向でこのマルチバレル式のナノピペットを移動させるようにしたｘｙｚコントローラであって、このｘｙｚコントローラは更に、ユーザ規定の制御に応じて前記機械的移動を制御する電子制御部を有するようにする当該ｘｙｚコントローラを動作させるステップと、
（ｃ）前記第１の電極及び前記第２の電極間の電圧を制御するとともに、前記ナノピペット内の液体を排出させる必要のある所望の位置で前記第１のバレルから液体を排出させる排出電圧を前記第１の電極に印加し、且つ前記ｘｙｚコントローラが、前記所望の位置から離れる方向で前記ナノピペットの機械的移動を行う際に、前記排出電圧を除去し、これにより前記液体が前記所定のパターンで堆積されるようにする回路を用いるステップと
を具えるようにする。
【００３５】
ある態様では、本発明は、前記液体が細胞付着材料を有し、堆積されたこの細胞付着材料の領域でのみ基板上に細胞を取り付けるようにする上述した方法を有するようにする。ある態様では、本発明は、前記細胞付着材料がラミニンである上述した方法を有するようにする。ある態様では、本発明は、基板が均一のポリマーの頂面を具える上述した方法を有するようにする。ある態様では、本発明は、前記液体が、堆積された細胞付着材料の領域でのみ基板上に細胞を取り付ける細胞付着材料を有しているようにするとともに、更に培養すべき付着細胞を基板に被着させ、これによりこれら細胞が細胞付着材料を有する領域にのみ付着されるようにするステップを具えているようにする上述した方法を有するものである。
【００３６】
ある態様では、本発明は、細胞付着材料を有する領域は、１００平方ミクロン当り少なくとも約１０個のスポットの密度にあるようにする上述した方法を有するようにする。ある態様では、本発明は、ナノピペットの異なるバレルから異なる材料を堆積する上述した方法を用いるようにする当該方法を有するものである。
【００３７】
ある態様では、本発明は、ナノピペットを石英から形成し、このナノピペットが約２０〜１００nmの開口を有するようにする上述した方法を有するものである。
【００３８】
ある態様では、本発明は、基板上の選択された細胞内に材料を注入する方法を有するものであり、この方法は、
（ａ）液体をマルチバレル式のナノピペット内に注入するように配置するステップであって、このマルチバレル式のナノピペットは、（ｉ）第１のバレル内の液体と接触するように配置する第１の電極を収容する当該第１のバレルと、（ii）この第１のバレルに隣接する第２のバレルであって、この第２のバレル内の液体と接触するように配置する第２の電極を収容する当該第２のバレルと、（iii ）前記第１の電極に接続され、前記第１の電極及び前記第２の電極間の電圧を制御する増幅器とを有するようにするステップと、
（ｂ）前記マルチバレル式のナノピペットに取り付けられ、サブミクロンのｘ及びｙステップでこのマルチバレル式のナノピペットの機械的移動を行うとともに基板に向かう又はこの基板から離れるｚ方向でこのマルチバレル式のナノピペットを移動させるようにしたｘｙｚコントローラであって、このｘｙｚコントローラは更に、ユーザ規定の制御に応じて前記機械的移動を制御する電子制御部を有するようにする当該ｘｙｚコントローラを動作させるステップと、
（ｃ）前記第１の電極及び前記第２の電極間の電圧を制御するとともに、前記ナノピペット内の液体を排出させる必要のある所望の位置で前記第１のバレルから液体を排出させる排出電圧を前記第１の電極に印加し、且つ前記ｘｙｚコントローラが、前記所望の位置から離れる方向で前記ナノピペットの機械的移動を行う際に、前記排出電圧を除去し、これにより前記液体が前記細胞内に注入されるようにする回路を用いるステップと
を具えるようにする。
【００３９】
ある態様では、本発明は、基板内の空洞であって、個々の細胞のみを保持する寸法とした当該空洞内に前記細胞を配置することにより、前記基板上の前記細胞を固定化するステップを更に具える上述した方法を有するようにする。
【００４０】
ある態様では、本発明は、前記細胞の固定化の援助のために前記空洞にまたがる圧力差を加えるステップを更に具える上述した方法を有するようにする。
【００４１】
ある態様では、本発明は、注入された前記材料を、ポリ核酸、抗体及び染料より成る群から選択するようにする上述した方法を有するようにする。
【００４２】
ある態様では、本発明は、基板上の個々の細胞内の検体を検出する装置を有するものであり、この装置は、
（ａ）第１の電極を収容するバレルを有するナノピペットであって、この第１の電極は、前記細胞に接触する液体内の第２の電極である基準電極と接触するように前記検体を保持するとともに、使用中に前記第１及び第２の電極間の電圧を制御する回路に接続されているようにした当該ナノピペットと、
（ｂ）前記ナノピペットに取り付けられ、サブミクロンのｘ及びｙステップで前記ナノピペットの機械的移動を行うとともにｚ方向でこのナノピペットを移動させるようにしたｘｙｚコントローラであって、このｘｙｚコントローラは更に、ユーザ規定の制御に応じて前記機械的移動を制御する電子制御部を有している当該ｘｙｚコントローラと
を具えており、
（ｃ）前記ナノピペットの先端部が、先端部付近の前記細胞内で内側表面上に固定された検体結合材料を有するようにした
ものである。
【００４３】
ある態様では、本発明は、前記検体結合材料をタンパク質又はポリ核酸とした装置を有するようにする。
【００４４】
ある態様では、本発明は、検体結合材料を、スルホスクシンイミジル‐４‐(Ｎ‐マレイミドメチル)シクロヘキサン‐１‐カルボキシラート（ Sulfo‐ＳＭＣＣ）により前記内側表面上のポリ‐Ｌ‐リジン（ＰＬＬ）被膜に結合されたタンパク質とした装置を有するようにする。
【００４５】
ある態様では、本発明は、単一の生細胞内の生体分子を検出する方法を有するものであり、この方法は、
（ａ）官能化されたナノピペットを、細胞内で規定の深さに配置するステップと、
（ｂ）電流を監視して細胞膜付近のナノピペットの正確な位置を制御するステップと、
（ｃ）ナノピペットを高速度で細胞内に挿入するステップと、
（ｄ）高電圧を印加するステップと、
（ｅ）電流変化を測定して細胞内の生体分子を検出するステップと
を具え、官能化されたナノピペットはシステムに設けられており、更にこのシステムは、ピペットをバイアスするとともに電流測定を行う増幅器と、Ｘ、Ｙ及びＺ方向で制御を行うマイクロマニピュレータ（極微操作装置）と、Ｘ、Ｙ及びＺ方向で微細制御を行う圧電アクチュエータと、構造化可能な集積回路と、高電圧源と、低電圧及び高電圧間の切換えを行うリレーとを具えているようにする。
【００４６】
ある態様では、本発明は、ナノピペットを抗体で官能化する上述した方法を有するようにする。ある態様では、本発明は、ナノピペットをアプタマーで官能化する上述した方法を有するようにする。
【００４７】
ある態様では、本発明は、免疫測定法では単一の生細胞内で用いるようにした上述した方法を有するものである。ある態様では、本発明は、ナノピペットを受容体リガンドで官能化する上述した方法を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、現在の堆積及び細胞注入システムを示す線図である。
【図２】図２は、この現在のシステムでダブルバレル型ピペットを用いて行う細胞透過を示す線図である。
【図３】ナノピペットの先端部から排出される液体の量を時間に対して示しており、排出レートは時間に対し直線的であることを示しているグラフ線図である。
【図４Ａ】図４Ａは、パターン化されたスポットのアレイを示す上面写真である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、スルホローダミンを用いたパターン化スポットのアレイの蛍光画像を示す疑似３Ｄグラフである。
【図５】図５は、現在のナノインジェクション装置を示す一連の写真であり、図５Ａはカルボキシフルオレセインをヒーラ細胞内に注入した状態を示す写真であり、これは細胞及びナノピペットの明視野像であり、矢印がナノピペットの先端部を示しており、図５Ｂも図５Ａにおけるような細胞注入状態を示す写真であり、この図５Ｂは注入後のヒーラ細胞及びナノピペットの蛍光画像を示す。
【図６】図６は、セルシフター（Cell Shifter：登録商標）の製造を示す一連の図であり、図６Ａはシリコン窒化物層をシリコンウエハ上に堆積した状態を示す図であり、図６Ｂは窒化物層を貫通する深い反応性イオンエッチングを示す図であり、図６Ｃは裏側のＫＯＨエッチングを示す図であり、図６Ｄはガラスウエハに接着したシリコンウエハを示す図であり、図６Ｅは最終装置においてプラスチックリングを表面に取り付けた状態を示す図である。
【図７】図７は、培養チャンバと、真空状態適用設備とを示す最終装置の写真であり、この装置がペニー硬貨よりも小さいことを表すためにペニー硬貨を示してあり、この装置を用いて細胞を培養リング内で培養しうるとともに、負圧を加えることにより貫通孔上に固定させるようにしうるものである。
【図８】図８は、セルシフター上に固定した１０mmのポリスチレンビーズの蛍光画像を示す写真である。
【図９Ａ】図９Ａは、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡（ＳＩＣＭ）を用いた地理学的写像を示す画像図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、細胞に亘る位置に対するナノピペットの先端部の高さ変化を示す地理学的写像のグラフ線図である。
【図１０】図１０は、ナノピペットセンサによるＨＰＶ１８Ｅ６抗原の選択的検出を示す線図であり、印加電圧は−４００ｍＶであり、抗原は時間０で加えたものである。
【図１１】図１１は、ヒーラ細胞溶解物に対するナノピペットセンサの応答を示す棒グラフである。
【図１２】図１２は、ナノピペットセンサによる単細胞内のがんタンパクの検出を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
[概説]
ここには、３次元移動用のロボット機構に取り付けられたナノピペットを有し、このナノピペットから基板上に材料を制御堆積するのに有効なシステムであって、細胞成長を制御するか、又は個々の細胞表面又は細胞の内部における生化学的マーカーをナノピペットの先端部で検出するか、又はナノピペットの内容物を単細胞内に注入するようにするシステムを開示する。化学的な堆積に用いる場合、ナノピペットの開口の寸法を小さくすることにより、パターンの鮮明度を単一細胞レベルよりも低い解像度とする。このシステムでは更に、パターン堆積するための基礎として走査型イオンコンダクタンス顕微鏡（ＳＩＣＭ）を用いる。従って、パターンはユーザにより予め規定することができ、このパターンを、その後にソフトウェアを制御することにより、フォトリソグラフィ技術又は何れの種類のパターンの前処理を必要とすることなく設定することができる。これにより、任意のユーザ規定パターンの一定で急速な開発を試験管内細胞培養で且つ解像度を失うことなく迅速に且つ効率的に評価できるようになる。ここに開示するシステムは、細胞付着及び成長を制御する生物学的研究に適用しうるものである。
【００５０】
ＳＩＣＭ装置は、軟質の非導電性の表面の地理学的形状を撮像するために従来考案されている（例えば、文献「Science, 1989. 243(4891): pp. 641-643 」の“The Scanning Ion-Conductance Microscope” Hansma P.K.氏等著参照）。このような従来技術の装置は、ＸＹＺ走査、Ｚ帰還及び制御論理を用いている（Ｚは走査表面に対し直交方向であるとみなされる）。
【００５１】
本発明の他の態様は、細胞の固定化及び注入方法を含むハイスループット（高処理能力）の細胞注入のためのナノピペットを有するシステムに向けたものである。本発明の実施例は、ナノピペット及び電気浸透注入を用いて、細胞に対する損傷を最少となるように任意の材料を細胞内に注入することに向けたものである。電気浸透注入は、ナノピペットから所望の化合物を取り出すためのナノ細孔である開口にまたがる電圧及びイオン電流を変化させることを含むものである。細胞の注入及び排出の効率を高くするためのダブルバレル型のナノピペットも開示する。
【００５２】
又、細胞内に完全に自動化して注入するために、細胞を所定のアレイで固定化するように形成したセルシフターも開示する。セルシフターは、単一の細胞を所定の位置に保つように、好ましくは各位置が単一の細胞を含むこれらの位置のアレイに単一の細胞を保ようにすることができる、凹所開口のような３次元形状部を有する。この技術の実施例は、材料を単一の生体細胞内に導入する方法又は細胞内部の免疫測定法を含むハイスループットの単一細胞研究用の手段として用いることができる。他の実施例は、高分子ビーズを有する構造体を固定化することを含むものである。
【００５３】
又、ナノピペットを生体材料に亘って走査する装置と、現在のナノピペットセンサとを一体化する方法及び装置をも開示する。個々の生体細胞内部の分子間相互作用を研究するために、ここで述べるナノピペットセンサを走査型イオンコンダクタンス顕微鏡（ＳＩＣＭ）と結合させることができる。細胞は、固定化又は前処理を必要とせずに成長培地内で調べることができる。細胞の寸法に対してナノピペットの寸法を小さくすることと、浸透状態を制御することとを組み合わせることにより、細胞の生存率を最大にする。この技術の適用には、単一細胞レベルよりも低くなる生体内分析を含むものである。他の適用は、個々の細胞内の生体分子を連続的に監視すること、例えば、タンパク質の発現を監視する免疫測定法を可能にすることである。
【００５４】
[定義]
他の規定をしない限り、ここで用いる全ての技術的な及び科学的な用語は、本発明に属する当業者により通常理解されるのと同じ意味を有するものである。ここで記載するのと類似する又は等価な如何なる方法及び材料も本発明の実行又は検査に用いうるものであるが、好適な方法及び材料のみを説明する。一般に、細胞及び分子の生物学及び化学の技術やこれらと関連して用いられる用語は、当該技術分野で周知であり且つ一般的に用いられているものである。特に規定していないある実験的手法は一般的に、当該技術分野で周知で、この明細書全体で引用し且つ説明した種々の一般的な且つより特定の参考文献に記載されているような従来の方法に応じて実行されるものである。明瞭とするために、以下の用語を規定する。
【００５５】
用語「ナノピペット」は、ここでは、ナノスケールとした、すなわち０．０５nm〜約５００nm、好ましくは約（＋又は−２０％）５０nmとした円錐状の先端部開口（すなわち、ナノ細孔）を有する中空の自己支持型で、不活性で、非生物学的な構造体を言及するために用いている。この中空構造体は、ガラス又は石英とすることができ、その内部に又はナノ細孔の一方の側に、ナノ細孔開口を通る流体を保持するのに適している。ナノピペットの内部は検体の非特異的結合を最小にするように選択又は変更されている。この内部は、ナノピペット内の溶液に接触する電極を挿入しうる寸法となっている。ナノピペットは、ガラス又は石英の毛細管のレーザープリングにより製造するのが好ましい。ナノピペットは、１０〜１００nm程度の内径と、２００〜８００nm程度の外径と、約１０μｍの代表的な長さとを有している。これらの寸法は、特定の適用分野に適した寸法であり、ナノ細孔の寸法の制御は重視すべき事項である。「マルチバレル式のナノピペット」は、代表的に共通の壁部を共有する２つ以上の平行な孔を有するナノピペットである。孔は、代表的に径方向で離間した同軸となっているが、同心とすることができる。これらは、一般的に入手しうるマルチボア（登録商標）毛細管から形成しうる。
【００５６】
用語「ナノ細孔」は、ここでは、単一分子検出器として用いうる電気絶縁膜内の小さい孔を言及するために用いている。検出原理は、電圧をこの膜の両端間に印加した際にナノ細孔を通るイオン電流を監視することに基づくものである。好適なナノ細孔開口は、約（１０％の範囲内の）２０及び１００nm間のものである。
【００５７】
用語「電流検出回路」又は「電圧を制御する回路」は、可制御増幅器と高感度の電圧及び電流検出器とを有する既知の電気回路及び装置を言及するものである。これらは、１０〜１００００ピコアンペアのベースライン電流に基づいて１〜１０ピコアンペア程度の電流変化を検出する何らかの感応装置を有することができる。この用語は更に、時間に応答するとともに、温度に比較的依存しないか又は温度変化を補償する回路を言及するものである。回路は、既知の電圧が供給される入力端を有する必要がある。電圧クランプ増幅器及びトランスインピーダンス増幅器を有する感応検出回路は既知である。この場合、用語「電圧クランプ」は、１つの入力端を可変コマンド（指令）電圧の点に接続し、他の１つの入力端を測定電圧の点に接続した差動増幅器と、帰還回路とを用いた回路を言及するものである。電圧クランプは負帰還を用いてシステムをコマンド電圧に維持する。この場合、コマンド電圧は、信号発生器から得られる交流電圧信号のような所定の交流信号である。出力電流は入力電圧の変化を追随し、電流の僅かな変化を検出しうる。
【００５８】
用語「電気浸透流」は、ここではその通常の意味において、ナノピペットの表面に形成される電気二重層に対する印加電界の影響を言及するものである。ナノピペットの先端部の内側表面に配置されたイオンは、充分に強い電界の下でナノピペットから強制的に取り出され、同時に少量の溶液が先端部から強制的に取り出される。電気浸透が液体を排出させ、一方、電気泳動が液体又はゲルのような培地内の荷電粒子を移動させる。電気浸透は、毛細管又は他の何らかの流体管にまたがる印加電圧により誘起される。
【００５９】
用語「ラミニン」は、ここではその通常の意味において、基底膜（basal lamina：以前は不適切にbasement membrane と称されていた）内の主要タンパク質、すなわち、殆どの細胞及び臓器に対するタンパク質のネットワークファンデーションを言及するものである。ラミニンは、細胞の分化、移動、付着や、表現型及び生存に影響を及ぼす基底膜の重要な且つ生物学的に活性な部分である。又、ラミニンは、５つ、３つ及び３つの遺伝的バリアントでそれぞれみられるα鎖、β鎖及びγ鎖を含む三量体タンパク質である。又、ラミニンは、細胞組織の維持及び生存にとって極めて重要なものである。ラミニンが欠乏することにより、筋肉を不適切に組織化し、これにより筋ジストロフィー、致命的な水疱形成性皮膚疾患（接合部型表皮水疱症）及び腎臓濾過の不良（ネフローゼ症候群）の一形態をもたらすおそれがある。ラミニンは、細胞外環境に対する細胞間相互作用の研究のために細胞培養に用いられる。例えば、ラミニン‐１１１は主要基板であり、生体内及び試験管内の双方でこの主要基板に沿って神経軸索が成長する。例えば、この主要基板は、網膜神経節細胞の熟成が網膜から視蓋までの途中で起きる経路を設定する。この主要基板は細胞培養実験における基板としてもしばしば用いられる。
【００６０】
用語「がんタンパク」は、ここではその通常の意味において、がん遺伝子によりコード化されたタンパク質を言及するものであり、これらにはがんと関連するものとして知られたウイルスタンパク質を含みうるものである（例えば、文献「Virology 214, 289-293 (1995)」の“Dimerization of Human Papillomavirus E7 Oncoprotien in Vivo ” Clemens氏等参照）。細胞質のがんタンパクは代表的に大きく、正常な細胞内には少量だけ存在し、従って、腫瘍状態とのみ関連させる必要はないが、ウイルスのがん遺伝子によりコード化されたタンパク質と、これに対応する、宿主細胞内の相同｛そうどう｝タンパク質との双方をここでは、がんタンパクと称する。これらには、ＭＹＣ、ＢＣＬ２、変異したｐ５３、ＤＥＫ、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７等が含まれる。
【００６１】
用語「細胞付着材料」は、ここでは、例えば、実際上、細胞を細胞外マトリックス内の特定の化合物に付着させる（細胞付着として知られた処理の）タンパク質のような材料を言及するものである。基板付着分子（ＳＡＭ）内のアミノ酸の幾らかは細胞外マトリックスの化合物に結合し、他のアミノ酸は細胞の表面上のインテグリンに結合する。インテグリン分子は２つのアミノ酸鎖より成り、一方のアミノ酸鎖は細胞骨格内のアクチンフィラメントに接続されており、他方のアミノ酸鎖はＳＡＭに接続されている。これにより、細胞外マトリックス内の外部活動が細胞の形状及び移動に影響を及ぼすようにしうる。これらのアミノ酸鎖は他のＳＡＭにも連結して互いの作用に影響を及ぼすようにしうる。
【００６２】
用語「フィールドプログラマブルゲートアレイ」は、ここでは、製造後に顧客又は設計者により構成されるように設計された、従って、「フィールドプログラマブル」である集積回路を言及するものである。フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）の構成は一般に、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）に対して用いられているのに類似しているハードウェア記述言語（ＨＤＬ）を用いて特定される。ＦＰＧＡは、「論理ブロック」と称されているプログラマブル論理構成要素と、ブロックを「互いに配線接続」させる再構成可能な相互接続の階層とを有しており、これは（多くの）異なる構成で相互配線接続しうる多くの（変更可能な）論理ゲートと幾分似ている。論理ブロックは、複雑な組み合わせ機能を実行するか、又は単にＡＮＤ及びＸＯＲのような簡単な論理ゲートを実行するように構成しうる。殆どのＦＰＧＡでは、論理ブロックが、簡単なフリップフロップ又はメモリのより完全なブロックとしうるメモリ素子をも有する。
【００６３】
用語「ｘｙｚコントローラ」は、ｘ及びｙ次元、代表的に平坦表面、及びｚ方向、代表的に垂直、として知られている３次元で移動する機械装置を言及するものである。ｘｙｚコントローラは、原子プローブ顕微鏡のような種々のマイクロスケール分野で用いるものとして既知である（典型的なｘｙｚコントローラに関する更なる詳細のために、例えば、“Atomic probe microscope ”と題する米国特許ＵＳ５，３９４，７４１（発明者：Kajimura氏等）参照）。
【００６４】
用語「排出電圧」は、以下に更に説明するように、現在のナノピペットにおいて、溶液を含む孔と外部の溶液との間に印加する電圧を言及するものであり、この電圧により孔からのイオンの流れを生ぜしめる、すなわち溶液内の原子種を排出させる。すなわち、現在の装置では、ナノピペットの孔からの排出は、電気浸透により生じるものであり、このことは、何を排出するかであること以外でナノピペットの特性にこの排出が依存することを意味する。流体は、他の孔内にあるカウンター電極に対し正にバイアスされた電極を収容する孔から排出される。以下に例示するように、０．１〜１００Ｖの電圧をダブルバレル型のナノピペットの２つの孔にまたがるように印加して、排出を達成する。排出される材料の量は、時間と印加電圧の大きさとに依存する。説明のために、低電圧を０．０１〜１Ｖとし、高電圧を１〜１００Ｖとする。単一の孔のピペットを用い、細胞の外部の電極に対して高電圧を印加する場合、電圧が細胞膜を通過する必要があり、損傷を生ぜしめるおそれがある。従って、単一の孔のピペットを用いるよりもダブルの孔のピペットを用いるのが好ましい。
【００６５】
用語「低雑音増幅器」、すなわち当該技術分野で既知のＬＮＡは、種々の増幅器の１つを言及するものであり、この増幅器は、（例えば、アンテナにより捕捉される）極めて弱い信号を増幅するのに用いる電子増幅器である。この増幅器は通常、検出装置に極めて接近させて配置され、フィードラインにおける損失を低減させるようになっている。ＬＮＡを用いる場合、代表的に、受信チェーン回路の後段からの雑音の影響は、ＬＮＡの利得に基づいて減少され、一方ＬＮＡ自体の雑音は受信信号内に直接投入される。従って、ＬＮＡは、所望信号電力を上昇させるのと同時に加わる雑音及び歪みをできるだけ少なくし、この信号の回復がシステム中の後の段階で可能となるようにする必要がある。良好なＬＮＡは、（１dBのような）低いＮＦを有しするとともに（２０dBのような）充分大きな利得を有し、且つ充分大きな相互変調及び圧密点（ＩＰ３及びＰ１dB）を有する必要がある。
【００６６】
用語「圧電アクチュエータ」は、当該技術分野で既知のように、圧電変換器を言及するものである。能動素子は、基本的にその２つの対向面に電極が取り付けられた分極材料片である（すなわち、ある部分の分子が正に荷電され、他の部分の分子が負に荷電されている）。電界がこの材料にまたがって印加されると、分極分子自体が電界と整列され、その結果材料の分子又は結晶構造内に双極子が誘起される。この分子の整列により、材料の寸法を変化させる。現在の装置に関しては、変換器が極めて小規模で微細移動を達成するのに用いられている。
【００６７】
用語「ポリ核酸」は、一本鎖とした又は（部分的に）二本鎖としたＤＮＡ又はＲＮＡの何らかのオリゴマー又はポリマー或いはその合成類似化合物を言及するものであり、ここで用いるものとしては、ポリ核酸は、ワトソン・クリック型塩基対に基づく特異性を有する相補鎖に結合しうるものとする。
【００６８】
用語「抗体」は、抗原結合部を通る結合特異性を有する何らかの抗体又は抗体フラグメント（断片）を言及するものである。例えば、抗体の抗原結合機能は、抗体全長のフラグメントにより実行しうることが確かめられている。抗体の用語「抗原結合部」に包含される結合フラグメントの例には、
（ｉ）Fab フラグメント、すなわちＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨＩ領域より成る１価のフラグメント、
（ii）F(ab´)2フラグメント、すなわちヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合された２つのFab フラグメントを有する２価のフラグメント、
（iii ）ＶＨ及びＣＨＩ領域より成るFdフラグメント、
（iv）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨ領域より成るFvフラグメント、
（ｖ）ＶＨ領域より成るdAb フラグメント（文献「Nature 341:544-546 (1989)」Ward氏等著参照）、
（vi）分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）
が含まれる。
【００６９】
用語「アプタマー」は、特定の標的分子に結合するポリヌクレオチド又はペプチドを言及するものである。代表的なアプタマーには、例えば、“Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX ”と題する米国特許ＵＳ５，５６７，５８８（発明者：Gold氏等）に記載されているように、ＳＥＬＥＸプロトコルから取り出されるアプタマーが含まれるものであり、修飾ヌクレオチドを含むＳＥＬＥＸ同定のオリゴヌクレオチドは例えば、リボースの２´位置、ピリミジンの５位置及びプリンの８位置で化学的に修飾されたヌクレオチドを誘導体含むオリゴヌクレオチドを開示している米国特許ＵＳ５，６６０，９８５、種々の２´修飾ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドを開示する米国特許ＵＳ５，７５６，７０３及び２´‐アミノ（２´‐ＮＨ２）基板と、２´‐フルオロ（２´‐Ｆ）基板と、２´‐Ｏ‐メチル（２´‐ＯＭｅ）基板との何れか１つ又は何れかの組み合わせで修飾された１つ以上のヌクレオチドを含む特異性の高いオリゴヌクレオチドを開示する米国特許ＵＳ５，５８０，７３７に記載されている。ペプチドアプタマーはコンビナトリアル認識タンパク質である。ペプチドアプタマーは、文献：The eleven-year switch of peptide aptamers, J. Biol. 7(1) 2 (2008)（Colas 氏著）に記載されているように、酵母ツーハイブリッド法を用いて、種々の調節経路内に含まれる広範囲の細胞、ウイルス及び細菌の標的タンパク質に結合するように選択されている。ペプチドアプタマーは、“Peptide aptamer for neutralizing the binding of platelet antigene specific antibodies and diagnostic and therapeutic applications containing the same ”と題する米国特許出願公開第２００９／０３１８３６３号明細書に記載されている。
【００７０】
用語「染料」は、他の物質組成物又は混合物に色を付ける組成物を言及するものである。好適な染料は蛍光性化合物である。この定義にはエネルギー移動染料も含まれるものである。又、米国特許ＵＳ６，３３５，４４０で規定されている又は用いられているような、キサンテン染料、不斉ベンゾキサンテン染料、ローダミン染料、フルオレセリン染料、４，７‐ジクロロローダミン染料、カルボキシフルオレセイン染料、カルボキシローダミン染料、カルボキシＲ１１０染料、カルボキシＲ６Ｇ染料、カルボキシ‐Ｘ‐ローダミン染料、シアニン染料、フタロシアニン染料、スクアレイン染料及びＣｙ５染料をも含まれるものであり、この米国特許も参考のためにここに開示したものである。
【００７１】
（一般的方法及び装置）
第１の態様では、本発明は、細胞を制御して付着及び成長させる目的で、任意の基板上にユーザ規定のパターンを堆積するシステムを包含する。この手法には、制御による堆積を周囲環境内で非官能化表面上に実行しうるという利点がある。このようなパターン化された基板は、細胞培養法を成功させるとともに、所定のパターンに対する細胞の付着及び生存性を良好にするのに用いられる。
【００７２】
[基板をパターン化するのに適した装置]
上述したシステムは、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡（ＳＩＣＭ）に対するシステムにより例示されるコンピュータ制御システムを有する。ＳＩＣＭの基本動作は、当該技術分野で充分理解されている（例えば、文献：The Scanning Ion- Conductance Microscope. Science, 1989. 243(4891): pp. 641-643, Hansma P.K.氏等著及び文献：Scanning Ion-Conductance Microscope And Atomic Force Microscope. Scanning, 1990, Prater C.B.氏等著参照）。簡潔に言えば、基本的なＳＩＣＭは、電解質が裏込めされているとともに電解槽内に浸漬された単一のピペットより成っている。ナノピペット内には電極が配置されており、この電解槽内にはこの電極からある距離だけ離して接地電極が配置されている。ナノピペットの開口が表面に対し垂直な方向で基板に近づくと、所定の間ピペットのオリフィスを通って流れる電流が「電流のスクイージング」により低減される。この電流の降下分が帰還信号として作用してナノピペットの高さを制御することができ、この制御は表面の上方の所定の距離で行うことができる。その後、ナノピペットを表面に亘って走査すると、基板の地理学的な画像を示すことができる。
【００７３】
以下で説明するように、この装置の特徴を、単細胞を注入するか又は単細胞内で結合する分子を測定するための関連装置内に導入することができる。
【００７４】
図１は現在の装置を示す線図であり、この現在の装置を本発明により細胞注入のために特注した修正済みのＳＩＣＭ（走査型イオンコンダクタンス顕微鏡）内に設け得るようにする。この現在の装置は、膜の浸透に対する微調整のためにｚ方向において帰還制御される位置決めに依存する。この現在の装置によれば、ダブルバレル型のナノピペット１０２が、圧電ｘｙｚコントローラ１０４と、この圧電ｘｙｚコントローラに動作的に接続された圧電コントローラ１０６とを有するｘｙｚ制御部分に取り付けられている。圧電ｘｙｚコントローラ１０４は極めて微小な移動に対し用いられるものであり、より粗い移動のためにステッピングモータによるマイクロマニピュレータ（図示せず）上に装着されている。圧電制御回路はＤＡＱカード１１４を介してコンピュータ１１６に接続されている。ＤＡＱカード１１４は、ナノピペット内の電極１１０に接続された電子センサ及び増幅器に接続されている。（第１に孔に結合した第２の孔内の基準電極１２２は、図示するように接地されている。）ＳＩＣＭモジュールは更に、ピペットバイアス及び電流測定のために、低雑音増幅器１０８（例えば、Axopatch 200B, Molecular Devices, Sunnyvale, CA ）を有している。この増幅器は、図示するようにＤＡＱカード１１４を介してナノピペット内の電極１１０に接続されている。図１の装置は、増幅器１０８に信号を供給するヘッドステージ増幅器１１２を有し、増幅器１０８がＤＡＱ（データ収集）カード１１４に信号出力する。適切なＤＡＱカードは市販されている。（National Instruments社製の）ＤＡＱカードのボードは、例えば、内臓タイマと、８チャネル入力端を有する１２ビットのアナログ‐デジタル変換器（ＡＤＣ）と、２つのデジタル‐アナログ変換器（ＤＡＣ）と、２４個のＴＴＬレベル論理入力端とより成るマルチファンクションのプラグ‐アンド‐プレイであるアナログ及びデジタル入出力ボードである。
【００７５】
コンピュータコントローラ１１６にインターフェース接続された（ＦＰＧＡである）ＤＡＱカードは、圧電ｘｙｚコントローラを介してナノピペットの移動を制御する回路にも接続されている。１つのｘｙｚコントローラは、Ｘ、Ｙ及びＺ方向で粗調整するためのマイクロマニピュレータ１０６（例えば、ＭＰ‐２８５）である。この場合、このマイクロマニピュレータは、Ｘ、Ｙ及びＺ方向で（２〜３nm内で位置決め可能な）微調整を行うための圧電アクチュエータ１０４とシステムのハードウェア制御のためのＦＰＧＡとに結合されている。システムは更に、低雑音の高電圧源１１８（例えば、A-M Systems 社のModel 2100 Isolated Pulse Stimulator）と、帰還制御に必要とする低電圧（約０．０１〜１Ｖ）及び電気泳動材料の排出（図２）に必要とする高電圧間で切換えを行うカスタムリレー１２０とで修正されている。システムは、例えば、LabＶＩＥＷ 内に書き込まれたユーザコード化ソフトウェアを用いて制御される。LabＶＩＥＷ はNational Instruments社から入手でき、このLabＶＩＥＷ は、フローチャートに似せる直感的なグラフィカルアイコン及びワイヤを用いる高度な測定、検査及び制御システムを開発するのに用いられるグラフィカルプログラミング環境である。従って、ユーザは、ナノピペットのｘｙｚ運動の所定のパターンと、所定の時間長の間所定の位置で材料を排出させる電圧変化とを設計しうる。LabＶＩＥＷ 又は他の従来のソフトウェアは現在の装置により提供し、ナノピペットからの検出及び排出とナノピペットの運動とを制御する。
【００７６】
ピペットの孔からの材料の排出は、適切な緩衝材（バッファ）及び所望の材料が裏込めされたダブルバレル型ナノピペットを用いて実行される。適切な緩衝材はリン酸塩、クエン酸塩、又は分子の研究で日常的に用いられている他の何らかの緩衝材を含むものである。排出電圧は、電源１１８から生ぜしめられる電圧を変化させることにより電極１１０及び１２２間に印加される。
【００７７】
所望の材料を排出させるためには、種々の電解質溶液をナノピペットの孔内に用いることができる。細胞をパターン化する場合、細胞付着パターンを形成するのに所望の材料が用いられる。以下に説明するように、所望の材料は応用分野に応じて変えることができる。この所望の材料は、既知のように溶解電解質、すなわち自由イオンを含む電解質溶液内で孔内に浮遊される。代表的なイオンには、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、塩化物、リン酸塩及び重炭酸塩が含まれる。しかし、他のイオン種を用いることもできる。所望の材料は代表的に液体であり、この場合、所望の材料と溶液中のイオンとが設けられる。所望の材料自体は、ヒト血漿又はその他の体液、溶液、試水等のような電解質とすることができる。電解質はイオン電流を伝える必要があり、この機能に対しては、約１０〜１００ｍＭ、好ましくは約１００ｍＭの正及び負イオン種が必要となると考えられている。現在の装置では、ナノピペットの内部及び試料材料に同じ又は異なる電界質を採用しうる。電解質溶液内には種々の塩を用いることができる。これらはカチオン（正に荷電されたイオン）及びアニオン（負イオン）より成り、従って、生成物は電気的に中性（正味の電荷が無い）である。これらの成分イオンは、塩化物（ＣＦ）のような無機や、酢酸塩（ＣＨＣＯＯ−）のような有機にしたり、フッ化物（Ｆ−）のような単原子イオンや、硫酸塩（ＳＯ４２−）のような多原子イオンにしたりすることができる。種々の塩が存在する。水中で溶解した場合に水酸化物イオンを生じるように加水分解する塩は塩基性塩であり、水中でヒドロニウムイオンを生じるように加水分解する塩は酸性塩である。中性塩は、酸性塩でも塩基性塩でもない塩である。溶融塩や、溶解塩（例えば、水中の塩化ナトリウム）を含む溶液は、電気を通しうるために電界質と称される。
【００７８】
排出すべき所望の材料には、小分子、代謝物、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、アミノ酸、染料、ポリマー、ナノ粒子が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７９】
ナノピペットは、石英を用いて製造しうる。ダブルバレル型ピペットによれば、小さなメニスカスをピペットの先端部を横切るように形成し、シングルバレル型ピペットでは通常であるように外部接地電極の必要性を排除するという利点を生じる。更に、回路はピペットの２つのバレル間に形成される為、先端部は空中でＳＩＣＭとして機能でき、従って、ナノピペットの先端部を乾燥表面に接近させることができるようになる。従来では、２００５年に発行された文献：Angewandte Chemie-International Edition, 44: pp. 6854- 6859 の“Two-component graded deposition of biomolecules with a double-barreled nanopipette” Rodolfa氏等著に開示されているように、電気浸透力及び比較的高い電圧を用いて、材料をナノピペットの先端部から排出させうるようにしている。ナノピペットは、結晶質の石英よりも廉価な溶融シリカ又は非晶質の石英から形成するのが好ましい。しかし、結晶質の石英を用いることができる。セラミックス及びガラスセラミックスや、ホウケイ酸ガラスも用いることができるが、精度は石英ほど良好ではない。用語「石英」は、上述した特定の材料や、適用可能なセラミック、ガラスセラミック又はホウケイ酸ガラスを含むことを意図及び規定するものである。現在のナノピペットの製造には、種々のガラス又は石英を用いることができることに注意すべきである。主として考慮することは、直径が小さい開口に材料が引き込まれる能力である。或いはまた、ナノピペットは、他のシリコン酸化物、金属（例えば、アルミニウ）酸化物、炭素（“Tubular carbon nano/micro structures and method of making same”と題する米国特許ＵＳ７，５９７，９４１参照）等のような他の非導電性材料から製造することができる。
【００８０】
ある実施例では、基板上で細胞をパターン化するのにシステムを用いる。このパターン化は、ナノピペットの高さ及び位置を制御するようにプログラミングされたソフトウェアを用いて制御する。このソフトウェア内には所定のパターンをローディングしておく。ナノピペットは、所定の領域で、パターン化すべき基板の表面に向けてゆっくり降下させる。ピペットのメニスカスが一旦基板と接触すると、リレーが増幅器を分離させ、所定の時間の間高電圧を印加する。その時間が経過した後、ピペットの先端部を迅速に後退させ、このピペットの先端部にまたがる電圧を、抵抗を介して大地に放電させ、増幅器をピペットに再接続する。次にこの先端部を次の個所に移動させ、パターン全体が堆積されるまで処理を繰り返す。排出レートは、印加電圧とこの印加電圧の持続時間との双方に依存する（図３における排出量対時間のグラフを参照されたい）。
【００８１】
上述した装置を用いる場合、５０pL/s〜１００pL/sの少量をナノピペットから排出させることができる。排出量はこれらの量よりも少なくすることもできるが、その量は光学顕微鏡の解像度を超えてしまう。排出量はオイル、例えば、ミネラルオイルの槽内で適切なポリマー表面上に排出させることにより決定した。先端部と基板との間で接触する適切な液体には、有機液体ポリマー（例えば、オイル）及びシリコンベースのポリマー、例えば、シリコーンが含まれる。シリコーンの一例はポリジメチルシロキサンである。排出量を計算する場合、オイルドロップ（油滴）を半球形状とみなした。排出量は、印加電圧の時間に対し直線状に現れる。直径３μｍの小さなスポット寸法のスポットを堆積することができる。図４は、平均のスポット直径が４＋８μｍ又は４−８μｍであるスルホローダミンのパターン化スポットのアレイの例を示す。ここに示した結果は、個々のナノピペットを表し、パラメータはこれらのデータに対する線形フィットにより得られるとともにナノピペット間で変えることができる。それにもかかわらず、標準化されたアレイ印刷の場合、ドロップレットをオイル中に排出させることにより各ナノピペットを容易に校正することができる。更に、バレルにまたがるバイアスを反転させることにより、異なるバレルから異なる材料を制御可能に排出させることができる。各バレルに別々の材料を装填することにより、多層パターンを、一回のパターン化の実行で予め登録したように設定しうる。
【００８２】
細胞を培養のために付着させる必要がある基板上のパターンは、タンパク質、有機ポリマーを含むポリマー又はバイオポリマーを用いることによりこの基板上に規定しうる。パターン化は、個別の細胞成長を行い得る多数の分離領域を規定するように用いるのが好ましい。パターン化材料の例には、ポリリシン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び表面接着分子、例えば、フィブロネクチン又はラミニンが含まれるが、これらに限定されるものではない。パターンの堆積は、量子ドットと電解質溶液との混合により確認しうる。パターンは、例えば、蛍光顕微鏡法を用いて堆積を視覚化するとともに、印刷エラーをチェックすることにより評価することができる。次に、堆積が行われた基板をセルフマスキング工程で洗浄する。この洗浄工程の場合、マスキング分子に対する適切な緩衝材を用いることができる。マスキングに対して用いる分子の例には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が含まれる。パターンの規定後、基板を細胞培地内に入れることができる。細胞は培地内に分散させて基板上に定着させることができる。数時間の培養後、予め温めておいた培地を用いて細胞をそっとすすぎ洗いして、基板にしっかり付着していない如何なる細胞も除去する。細胞の付着は、質と量との双方で査定される。
【００８３】
[細胞の注入]
他の実施例では、処理量が高く且つ細胞に対する損傷を最少にするように、材料を単一生細胞内に電気浸透注入するために現在のナノピペットシステムを用いる。この手法の利点は、注入が高度に自動化され、注入量を正確に制御でき、細胞の生存率が高くなるということである。更に、システムの全自動化の可能性を高める細胞固定化のために細胞のふるい分け装置を以下に説明する。細胞の注入は、適切な緩衝材及び注入すべき材料が裏込めされた（図２に示す）ダブルバレル型ナノピペットを用いて実行しうる。適切な緩衝材には、リン酸塩、クエン酸塩又は分子生物学の研究で通常用いられている他の如何なる緩衝材も含まれる。注入すべき材料には、小分子、代謝物、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、アミノ酸が含まれるが、これらに限定されるものではない。図２は、バレル２０４及び２０６と、これらのバレル内にそれぞれ１つずつ入れられた電極２０８及び２１０とを有するダブルバレル型のピペット２０２を用いる細胞透過を示している。ピペット２０２は、図１に示されているように圧電コントローラに取り付けられる。ダブルバレル型のピペットによれば、一方のバレルを、接地電極（図１における電極１２２を参照）として作用しうる他方のバレルに対してバイアスし、シングルバレル型のピペットでは一般的であるような外部接地電極の必要性を排除するという利点を生じる。このピペットによれば、シングルバレル型のピペット及び外部の接地電極の場合に生じるおそれのある何れの電気穿孔の影響をも除外するという更なる利点が得られる。ナノピペットの先端部からの排出レートは、印加電圧とこの印加電圧の持続時間との双方に依存する（図３）。排出量は、ピペットの先端部をミネラルオイル内に浸漬した場合、１００Ｖとした印加電圧の時間に対し直線状に現れる。ミネラルオイルは、排出材料のドロップレット寸法を測定することにより校正する目的のためにのみ用いた。ミネラルオイルには排出材料が含まれる。その理由は、水溶液はミネラルオイル内に溶解できないためである。
【００８４】
電源１１８に接続されたバレル２０２から細胞２１２内に材料を注入するのは、図１で上述した且つカスタムソフトウェアを用いて制御される回路を用いることにより実行される。注入は、細胞２１２の細胞質領域内に行うものとして示してあるが、観測される核２１４内の注入も達成しうる。細胞は、図６に示すように形成しうる固体の支持体２１６上に載せる。細胞株からの細菌、真菌、獣類、哺乳類の細胞を含む細胞を注入の目的に用いることができる。この注入は、ナノピペットを細胞膜の５０〜２００nmの範囲に、好ましくは約１００nmまでゆっくり降下させ、ここで帰還状態に入れるとともに停止させることにより達成させる。次に、このナノピペットを０．５〜２μｍの範囲で、好ましくは０．９〜１．２μｍの範囲内で迅速に降下させ細胞膜に侵入させる。降下させているナノピペットの速度は５０〜２００μｍ／秒、好ましくは８０μｍ／秒の範囲とすることができる。低電圧帰還システムをナノピペットから切り離し、高電圧源を高電圧リレーにより所定の時間の間接続する。帰還のための低電圧には、２Ｖよりも低い、好ましくは１Ｖよりも低い電圧が含まれる。帰還のための高電圧には、０．５Ｖよりも高い、好ましくは１Ｖよりも高い電圧が含まれる。これら２つの電源を用い、一方の電源は、−１〜＋１Ｖの範囲の電源を有するナノピペットを配置するためのものであり、他方の電源は−１００Ｖ〜＋１００Ｖの範囲の電源を導入するためのものである。代表的な細胞注入は約５〜３０Ｖの範囲で行われるが、これらの電圧は、排出が再現可能であり電圧が細胞を損傷させない限り変えることができる。次に、抵抗を介してナノピペットを放電させ、このナノピペットを高速度で後退させる。図５は、染料のカルボキシフルオレセインをヒーラ細胞内に注入した一例を示す。細胞の損傷が無いことがすぐに視覚化され、蛍光発光が数分の間細胞壁部内に閉じ込められる（図５）。
【００８５】
[細胞基板のパターン化]
本発明の他の態様は、規則的なアレイのビーズを含む細胞又は分子構造の固定化のために設計及び製造したセルシフターに向けたものである。細胞を規則的なアレイに固定することにより、このアレイの各要素を順次にアドレスするようにＳＩＣＭを制御することができ、これによりオペレータが各細胞に別々に個別注入する必要性を低減させるようにする。セルシフターは、半導体製造技術を用いて製造する（図６Ａ〜６Ｅ）。簡潔に言えば、シリコンの塩（例えば、シリコン窒化物）の５００〜１０００nmの層、好ましくは約７５０nmの層６０２をシリコンウエハ６０４の表面上に堆積する。シリコンウエハは２００〜１０００μｍ、好ましくは３００〜６００μｍの厚さとすることができる。１〜５μｍ、好ましくは２〜３μｍの孔６０６を、反応性イオンエッチングを用いて適切なピッチのアレイでシリコンの塩の層を貫通するようにエッチング形成する。適切なピッチは５０μｍよりも大きくし、好ましくは１００μｍのピッチとする。信用（fiduciary ）マーク（図示せず）をアレイの１つの隅部内にエッチング形成し、ＳＩＣＭのアライメントに対して用いうるようにする。次に、ウエハの裏面６０８を適切なアルカリ（例えば、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム）によりエッチングして、孔の下側にチャンバ６１０を形成するとともに、このチャンバに負圧を与えるための溝６１２を形成する。次に、シリコンウエハをガラスウエハ６１４に接着して、エッチング形成したチャンバ及び溝を封止する。装置は対称的に設計されている為、装置の両対向面に２つのアレイが存在する。装置は、アレイ上のシリコンの塩を取り外し、バーブ（barb）６１６を取り付け、これに真空ラインを取り付ける。他のアレイを囲んで、プラスチックリング６１８を適切なポリマーを用いて取り付け、これを細胞培養チャンバとして作用させ、細胞を細胞培地内に浸漬させる。適切なポリマーには、シリコンポリマー、例えば、シリコーンを含む有機ポリマーが含まれる。シリコーンの一例は、ポリジメチルシロキサンである。装置は、ポリマーを含む（しかしポリマーに限定されない）分子を固定させるのに用いることができる。分子はビーズ６２０内に含めることができる。細胞又は分子は、負圧を装置の貫通孔に与えることにより固定化される。細胞は、例示的なビーズ６２０により示すように、孔により規定されたアレイに配置される。
【００８６】
一例として、１０μｍの蛍光ポリスチレンビーズ（黄緑吸収：５０５；放出：５１５）を用いて装置を検査した。これらのビーズはほぼ哺乳類細胞の寸法となっており、装置を検査するための良好なモデルを提供するものである。これらのビーズは、負圧を装置の貫通孔に与えることにより良好に固定された。丁寧な洗浄後、全ての貫通孔は各孔上に単一のポリスチレンビーズを固定していることが観察された（図６Ｅ）。他の例では、セルシフターを用いてヒーラ細胞を固定化させた。細胞は、０．１ＭのＰＢＳ内に浮遊させ、負圧を貫通孔に与えることにより良好に固定された。
【００８７】
[単細胞内の分子検出]
本発明の他の態様は、図１に示すように、ｘｙｚ制御注入装置と結合され且つセンサとして作用するように官能化されたナノピペットの組み合わせに向けたものである。ナノピペットセンサは、極めて幾何学的にテーパ型光ファイバに類似しており、これらは同じレーザープリング処理で製造しうるが、変換メカニズムは基本的に異なるものである。光ファイバによる生物学的検出は、蛍光的に標識が付された検体の検出に依存するか、又はナノピペットセンサの読出しが純粋に電気的であり、生体分子の標識化が必要としないＥＬＩＳＡのような読出しに依存する。ナノピペットセンサの感度は、円錐形状としたナノピペットの先端部で最大として、この先端部のオリフィスの寸法及び幾何学的形状はバイオセンサの性能に欠かせないように形成する。ナノスケールの寸法とした先端部の開口における永続的な結合からのゲーティングによりナノピペットの電気信号に対する明瞭な変化を生ぜしめる。次に、この電気的な変化を、簡単な電気機械機構により実時間で如何なる標識も必要とすることなしに検出する。走査型イオンコンダクタンス顕微鏡（ＳＩＣＭ）で利用されているように、光ファイバのように、ナノピペットセンサを、高空間解像度を達成する圧電アクチュエータと一体化させることができる。ナノピペットセンサとＳＩＣＭとのこの組み合わせは、複数の細胞及び単一の細胞を含む表面の地理学的写像に用いる。他の適用は、無標識のバイオセンサを用いて、単一生細胞内の、タンパク質及び核酸を含む分子及び代謝物を検出することにある。ある実施例では、単一生細胞内で免疫測定法を実行しうる。他の適用は、単一のがん細胞内のがんタンパクを検出することにある。他の適用は、実時間及びナノスケールの解像度で単細胞内の生物活性を測定することにある。これは、例えば、単細胞内のタンパク質‐タンパク質の相互作用を研究するのに用いうる。
【００８８】
図９Ａは、ここで具体化した技術を用いた細胞の地理学的写像を示す画像図である。細胞９０２内の分子の検出は、ナノピペットセンサ９０４を調査細胞内に規定の深さまで挿入するために、高精度のナノマニピュレータと電流帰還ループとに依存する。ナノピペット９０４が細胞の表面に近づくと、単一の孔とその内部の電極９０６とを有するピペット９０４を流れるイオン電流が、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡で利用されている周知の効果である「電流のスクイージング」により減少する。このイオン電流を監視することにより、図１に示すような帰還回路及びｘｙｚコントローラを用いて細胞膜の約２００nm以内でナノピペットの正確な位置を決定且つ制御できる。更に、帰還機構により、ナノピペットの先端部が細胞膜を除いて何とも接触せず、この先端部が他の構造体又は基板と接触することによる破壊のおそれを回避する。細胞は、適切なポリマーの層で被覆された平坦な表面９０８（例えば、ペトリ皿、スライドガラス）上に配置しうる。適切なポリマーには、シリコンポリマー、例えば、シリコーンを含む有機ポリマーが含まれる。シリコーンの一例は、ポリジメチルシロキサンである。細胞には、リン酸塩緩衝材、クエン酸塩緩衝材を含む（しかし、これらには限定されない）適切な緩衝材で被覆することができる。電気浸透流をナノピペットバレルから外方に向ける際には、ナノピペットセンサを正電圧（例えば、＋１００ｍＶ〜＋１０００ｍＶ、好ましくは＋５００ｍＶよりも高い電圧）でバイアスすることができる。この構成によれば、何らかの細胞残屑又は分子が培地内に存在してセンサと作用し合ったり、この構成の性能に悪影響を及ぼしたりすることを回避する。帰還ループは、電流がその初期値の７０〜９９％、好ましくは９９％よりも多く減少されるまで、約１０nmのステップでセンサを降下させる。細胞膜の上方のこの初期位置決め後に、ナノピペットを約２μｍ、好ましくは１μｍだけ、５０〜２００μｍ／秒、好ましくは８０〜１５０μｍ／秒の範囲の速度で細胞内に挿入する。センサは極めて高速度で挿入させて、細胞に対する妨害を低減させるとともに細胞の生存率を最大にする。ナノピペットのベースライン電流及び細胞の生存率に何らかの顕著な変化を生ぜしめることなく、同じ細胞上で複数の浸透を実行しうる。センサが一旦細胞内に挿入されると、２５０ｍＶ〜５００ｍＶの振幅及び１〜１０Hz、好ましくは４Hzよりも高い周波数を有するＡＣ電圧をナノピペットセンサに印加して検出を実行する。
【００８９】
現在のナノピペットセンサは、現在の装置の構成要素を検出するために用いられている官能化されたナノピペットを有する。これらの官能化されたナノピペットは、２０１０年３月２５日に公開された“Functionalized Nanopipette Biosensor”と題する米国特許出願公開ＵＳ２０１０／００７２０８０に発明者のうちの２人により記載されている。この米国特許出願公開は参考のために記載したものである。簡潔に言えば、ナノピペットは、ポリマー、多糖類を含む分子や、抗体、ペプチド及びバイオポリマーを含む（しかし、これらに限定されない）生体分子に対する化学結合により官能化させることができる。これらのセンサは、その内側表面上でポリアクリル酸（ＰＡＡ）、すなわちアクリル酸単位のポリマーで被覆することができる。ＰＡＡの化学式は（Ｃ３Ｈ４Ｏ２）ｎである。中性のｐＨでの水溶液内では、ＰＡＡの側鎖の多くがこれらのタンパク質を失い、負電荷を得る。これにより、ＰＡＡをポリ電解質とする。表面は更に、多糖又はタンパク質に結合するように官能化させる。ナノピペットセンサに対する結合の検出は、電流整流に基づいている。この検出は、荷電したナノ細孔が、非対称的な電流出力に対する対称的な入力電圧に応答した場合の効果を言及している。拡散電気二重層の厚さが孔の大きさと同程度である場合、ナノ細孔表面上の固定された荷電種と溶液内のイオン種との間の静電相互作用がナノピペットの選択透過性を変える。整流係数γは、特定の正電圧で測定した電流と、大きさは同じであるが極性を逆とした電圧で測定した電流との間の比の対数として規定される。
【数１】
2014513924.tif 000003
【００９０】
この計数は、ナノピペットの整流特性の、従って、センサ表面上の固定電荷の有効な指標である。負に荷電された石英のナノ細孔は負の電流整流（γ＜０）を示す。ポリエルリジン、デンドリマー、アミノシラン及びキトサンのような荷電した官能化層でナノ細孔の表面を修飾することにより整流を反転させる（γ＞０）ことができる。
【００９１】
(例１：材料及び方法)
［ダブルバレル型ナノピペットの製造］：ナノピペットは外径を１．２mmとし、内径を０．９mmとしたシータ石英キャピラリー（Sutter Instrument 社のQT120-90-7.5）から製造した。この場合、このキャピラリーは、約５０nmの内径を有するナノピペットを製造する２ラインプログラムでプログラミングしたＰ‐２０００レーザプラ―（Sutter Instrument 社）を用いてプリング処理した。使用したパラメータは、Heat 650、Fil 4 、Vel 20、Del 170 及びPul 0と、Heat 750、Fil 4 、Vel 40、Del 170 及びPul 200とした。その結果のナノピペットの先端部は約５０nmの内径を有した。
［細胞培養］：（研究室に保たれていた）ヒーラ細胞を、ＰＤＭＳの薄肉層で被覆されたペトリ皿上で３７℃で５％のＣＯ２内で、１０％のウシ胎仔血清、１％のピルビン酸ナトリウム及び１％のPen/Strep/Glu （ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した（３７℃、５％のＣＯ２）。
［試薬］：ポリエルリジン（ＰＬＬ；１９３２０‐Ａ）をElectron Microscopy Sciences社（Hatfield, PA所在）から購入した。ダルベッコ変法イーグル培地（ＭＴ１００１７ＣＶ）、ウシ胎仔血清（ＢＷ１４５０２Ｆ）、ピルビン酸ナトリウム（ＢＷ１３１１５Ｅ）及びPen/Strep/Glu （ＳＶ３００８２０１）はFisher社から購入した。ポリジメチルシロキサンはDow Corning 社から購入した（Sylgard（登録商標）１８４シリコンエラストマーキット）。ｐＨ７．４の（ＢＳＡ，Ｑドット）ＰＢＳ溶液は標準の方法を用いて調製した。水性試薬は、１８ＭΩcm-1よりも大きい抵抗値としたMilliQ水を用いて調製した。
［電気浸透排出用測定機構］：この機構は、ピペットバイアス及び電流測定のための低雑音増幅器（Sunnyvale, CA 所在のMolecular Devices 社製のAxopatch 200B ）と、Ｘ、Ｙ及びＺ方向における粗調整のためのマイクロマニピュレータ（ＭＰ‐２８５）と、Ｘ、Ｙ及びＺ方向における微調整のための圧電アクチュエータと、システムのハードウェア制御のためのＦＰＧＡ（National Instruments社製）とから構成した。このシステムは更に、低雑音高電圧源（A-M Systems 社製のModel 2100 Isolated Pulse Stimulator）と、帰還制御に必要とする低電圧及び電気泳動材料の排出に必要とする高電圧間で切換えを行うカスタムリレーとで修正する。このシステムはLabＶＩＥＷ 内に書き込まれたカスタムコード化ソフトウェアを用いて制御される。
【００９２】
(例２：ナノピペットセンサを用いた単細胞生体内免疫測定法)
（実験項）
［測定機構］：基準電極を分極させるにはナノピペットを流れる電流が小さすぎる為、２電極機構を用いた。作用電極として機能するナノピペットセンサには作業緩衝材が裏込めされているとともに、Ag/AgCl電極が挿入されている。バルク溶液内には他のAg/AgCl電極が配置されており、この電極が補助／基準電極として機能している。これらの双方の電極が、DigiData 1322Aデジタイザを有するAxopatch 700B 増幅器（Molecular Devices 社製）と、pClamp 10 ソフトウェアを具えるＰＣ（Molecular Devices 社製）とに接続されている。このシステムは、室温で行われた測定の間はかくはんしない状態に維持した。
［試薬］：ポリエルリジン（ＰＬＬ；１９３２０‐Ａ）をElectron Microscopy Sciences社（Hatfield, PA所在）から購入した。ポリクローナル抗体ＨＰＶ１６ Ｅ６ （Ｃ‐１９）及びＨＰＶ１８ Ｅ６ はSanta Cruz Biotechnology社（Santa Cruz, CA所在）から購入した。ダルベッコ変法イーグル培地（ＭＴ１００１７ＣＶ）、ウシ胎仔血清（ＢＷ１４５０２Ｆ）、ピルビン酸ナトリウム（ＢＷ１３１１５Ｅ）及びPen/Strep/Glu （ＳＶ３００８２０１）はFisher社から購入した。ポリジメチルシロキサンはDow Corning 社から購入した（Sylgard（登録商標）１８４シリコンエラストマーキット）。ｐＨ７．４のＰＢＳ溶液は標準の方法を用いて調製した。水性試薬は、１８ＭΩcm-1よりも大きい抵抗値としたMilliQ水を用いて調製した。
［ナノピペットセンサの製造］：ナノピペットは、フィラメント、１．０mmの外径及び０．７０mmの内径を有する石英キャピラリー（Sutter Instrument 社のQF100-70-5）から製造した。この場合、このキャピラリーは、約５０nmの内径を有するナノピペットを製造するようにプログラミングしたＰ‐２０００レーザプラ―（Sutter Instrument 社）を用いてプリング処理した。使用したパラメータは、Heat 700、Fil 4 、Vel 60、Del 150 及びPul 192とした。その結果のナノピペットの先端部は３７〜８２nmの範囲の内径を有し、平均の内径は５６nmのとした。
［抗体の固定］：抗体は、以下のステップにより固定させた。最初に、水中のポリエルリジンの０．０１％溶液をナノピペットに入れ、続く３分の間の４６００rpm での遠心分離によりその内部を被覆した。この遠心分離ステップは、ナノピペットの最先端部にこの溶液を与えるのに役立つ。過剰のＰＬＬ溶液を除去した後、このナノピペットを１２０℃で１時間の間焼いてＰＬＬ被膜を安定化させた。次に、ナノピペットにスルホ‐ＳＭＣＣ溶液（２mg／ml、１０ｍＭ ＥＤＴＡ 、５０ｍＭ ＰＢＳ ）を充填して、３分の間の４６００rpm で遠心分離させ、次いで１時間の間室温でインキュベートした。次に、ナノピペットを０．０１Ｍ ＰＢＳ ですすぎ洗いし、少なくとも３時間の間遠心分離させ、未反応の如何なるスルホ‐ＳＭＣＣ分子をも除去した。スルホ‐ＳＭＣＣには、ＰＬＬアミノ基と反応して、チオエーテル結合を介する抗体架橋に対し得られるマレイミド基を残すアミン反応性Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドを含む。次に、ナノピペットを抗体溶液（１０μｇ/ml IgＧ、ＰＢＳ、１時間、３７℃）に対してインキュベートした。次に、抗体官能化が行われたナノピペットをＰＢＳで少なくとも３回すすぎ洗いするとともに遠心分離させて、結合されていない如何なる抗体をも除去するとともに先端部全体に亘る電解質の充填が平滑に行われようにする。
［細胞の融解］：ヒーラ細胞を、成長培地（１０％のＤＭＳＯ）内に約１０６個の細胞を含むアリコート内に凍結させた。解凍後、細胞をペレットに沈降させ、浮遊物を捨て、１００μＬのＰＢＳ溶液中で再び懸濁状態にした。細胞膜を溶解させるのにコバリス（Covaris ：登録商標）をＳシリーズのSonoLAB (登録商標)ソフトウェアにより制御して用いた。条件は、６０秒間で、５％のデューティサイクル、２００のサイクル／バーストとした。細胞溶解物を５分間の間４０００ｒｐｍで遠心分離させ、細胞残屑から生体分子を分離させた。バイアルを２時間以内で氷の中に入れて用い、プロテアーゼ阻害を最少にした。
［走査型イオンコンダクタンス顕微鏡］：ＳＩＣＭを社内で組立てた。これは、電流増幅器（Molecular Instruments 社のMulticlamp 700B ）、粗調整のためのマイクロマニピュレータ（Sutter Instruments社のMP-285）及び微調整のための圧電アクチュエータ（Physik Instrumente社のNanoCube（登録商標））に基づいている。この機構を、この分野に対し特に社内開発したユーザカスタマイズソフトウェア（LabＶＩＥＷ ）を用いて制御した。
［細胞培養］：（研究室に保たれていた）ヒーラ細胞を、ＰＤＭＳの薄肉層で被覆されたペトリ皿上で３７℃で５％のＣＯ２内で、１０％のウシ胎仔血清、１％のピルビン酸ナトリウム及び１％のPen/Strep/Glu を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した（３７℃、５％のＣＯ２）。
【００９３】
［細胞内タンパク質の検出］
現在のナノピペットセンサは細胞内のがんタンパクを生体外で選択的に検出しうる。最初に、種々のＨＰＶ遺伝子型を識別するためのナノピペットセンサの選択性を調査した。プローブセンサを、ＨＰＶ１８Ｅ６をターゲッティングする抗体で官能化するとともに、制御プローブにはＨＰＶ１６Ｅ６を入れた。ＨＰＶ１８Ｅ６は、人間内の「悪性」タンパク質として知られている。文献：Oncogene 18(42):5727-5737 (1999)の“The human papilloma virus (HPV)- 18 E6 oncoprotein physically associates with Tyk2 and impairs Jak-STAT activation by interferon- alpha ”（Li氏等著）を参照されたい。更に、ＨＰＶ１６Ｅ６は、文献：Genes Dev. 18(18):2269-2282 (2004)の“Identification of a novel telomerase repressor that interacts with the human papillomavirus type-16 E6/E6-AP complex”（Gewin 氏等著）に記載されている。双方のセンサを、１００pg/mLのＨＰＶ１８Ｅ６抗原を含む溶液内に浸漬させた。特定のタンパク質‐タンパク質の相互作用により、プローブセンサの電流振幅を、段階的なブロックエイド（blockade）を経て瞬時的に減少させた（図１０）。ナノピペットセンサの開口のごく近くでのこれらの逐次結合が局部的なインピーダンスを変化させ、従って、記録されるイオン電流に段階的な変化を生ぜしめる。これらの永久的なブロックエイドは、電気特性がＨＰＶ１８のタンパク質Ｅ６抗原により乱されない制御センサでは見られない。更に、これらのブロックエイドは分子移動により生ぜしめられるものとも識別しうる。その理由は、ナノピペットを移動するタンパク分子は、マイクロ秒レンジの持続時間を有する短くて瞬時的なブロックを発生する為である。
【００９４】
次に、細胞溶解物内のナノピペットセンサの選択性を検出した。連続希釈を約１０６個のヒーラ細胞を含むアリコートによって実行してセンサの感度を決定した。３５０，０００ｘの希釈では、ＨＰＶ１６Ｅ６で官能化されている以外何もしていない裸のナノピペットでは如何なる変化も得られないが、ＨＰＶ１８Ｅ６で修飾されたナノピペットセンサに対しては測定電流が７％だけ変化することが検出された（図１１）。制御センサは依然として１０倍多く濃縮した試料に応答しないが、プローブセンサ内の測定電流はその初期値の２３％だけ降下した。その結果を以下の表１に集約してある。
【００９５】
【表１】
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【００９６】
印加電圧は、非特異的吸着を回避しない場合に制限する極めて重要な役割を奏するために示したものであるが、この問題は、図１１が３５００Ｘの細胞溶解物の希釈度に対し且つそれよりも低い値で、信号が非特異的吸着から顕著に上昇したことを示している通り、濃縮溶液内で顕著となる為に常に考慮する必要がある。図１１は、ヒーラ細胞溶解物を異なる濃度で加えた後の測定電流に関する変化をもパーセントで示している。印加電圧はｐＨ７．４のＰＢＳ溶液中で−５００ｍＶとした。
【００９７】
単細胞内のがんタンパクは、所定の深さに対するナノピペットセンサをプローブセル内に挿入するのに、高精度のナノマニピュレータ及び電流帰還ループに依存する。ナノピペットが細胞の表面に近づくにつれ、このナノピペットを通るイオン電流は、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡で利用されている周知の効果である「電流のスクイージング」により減少する。イオン電流を監視することにより、細胞膜の約２００nm以内でナノピペットの正確な位置を決定及び制御することができる。更に、帰還機構により、ナノピペットの先端部が細胞膜を除く他の如何なるものとも接触せず、この先端部が他の構造体又は基板と接触することによりこの先端部が破壊する可能性が回避される。ヒーラ細胞は、ＰＤＭＳの層で被覆され且つ完全培地で被覆されたペトリ皿上に配置した。
【００９８】
電気浸透流がナノピペットのバレルから外方に向けられた際に、ナノピペットセンサは＋５００ｍＶでバイアスした。この構造によれば、培地内に存在し、センサと作用し合ってその性能に悪影響を及ぼす如何なる細胞残屑又は分子をも回避する。帰還ループは、電流がその初期値の９２％減少されるまで、センサを１０nmのステップで降下させる。細胞膜の上方のこの初期の位置決め後、ナノピペットを１００μｍ／秒の速度で２μｍだけ細胞内に挿入した。センサは極めて高速度で挿入させて、細胞に対する妨害を低減させるとともに細胞の生存率を最大にする。ナノピペットのベースライン電流及び細胞の生存率に何らかの顕著な変化を生ぜしめることなく、同じ細胞上で複数の浸透を実行しうる。センサが一旦細胞内に挿入されると、２５０ｍＶの振幅及び５Hzの周波数を有するＡＣ電圧をナノピペットセンサに印加して検出を実行した。
【００９９】
図１２は、ヒーラ細胞内に挿入されたナノピペットセンサの応答特性を示す。裸のナノピペットをヒーラ細胞内に挿入した際に、ベースライン電流には顕著な変化が検出されないが、ＨＰＶ１８Ｅ６をターゲッティングする抗体で官能化された制御センサでは５％の減少が検出された。ヒーラ細胞は、ＨＰＶ１８でのみ影響されることが知られている。このことは、アンチＨＰＶ１８Ｅ６で官能化されたナノピペットセンサを有するヒーラ細胞の浸透により確認された。ＨＰＶ１８Ｅ６のがんタンパクの特定の検出によりヒーラ細胞内での検出後に８％の電流降下が測定された。これらの結果は、ナノピペット技術が個々の細胞内のタンパク質‐タンパク質の相互作用の研究を、如何なる標識化の必要性も無く可能にしうるということを示すものである。
【０１００】
(例３：石英のナノピペットを用いる制御式電気浸透による細胞のパターン化)
ポリリシン及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて細胞に対するパターンを規定した。ナノピペットのバレル内には、１mg/ml のラミニンを用い、これを３５mmのペトリ皿内のＰＤＭＳ基板上に直接堆積した。パターンの堆積は、電解質溶液と量子ドットとの混合により確認した。次に、堆積を可視化するとともに印刷中のエラーを検査する蛍光顕微鏡法を用いてこれらのパターンを評価した。次に、基板をセルフマスキング工程において１mg/ml のＢＳＡで洗浄した。パターンを規定した後、基板を細胞培地内に浸漬させた。ヒーラ細胞は、用いるのが容易であるとともにこれらのロバスト性の為にこれらの研究におけるモデル細胞として用いた。細胞は培地内に分散されているとともに、基板上に定着
された。数時間の培養後、予め温めておいた培地を用いて細胞をそっとすすぎ洗いして、基板にしっかり付着していない如何なる細胞も除去した。細胞の付着は、質と量との双方で査定した。
【０１０１】
（結論）
上述した特定の説明は本発明を例示した説明であり、本発明の範囲を制限するものとみなすべきではなく、本発明は、特許請求の範囲に記載した文字通りの及び等価の範囲により規定されるものである。ここに記載した特許文献及び非特許文献の何れも、明瞭に述べられていないが当業者により理解される本発明のある態様を実行するのに有効な方法及び材料の詳細を伝達するためのものである。必要に応じ参照した方法又は材料を記載するとともに可能化する目的のために、これらの文献の各々が明確に且つ単独に参考のために導入され且つここに含まれる場合と同程度にこれらの特許文献及び非特許文献を参考のためにここに導入するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図７】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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