(57)【要約】本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いてＴＮＦＲ（tumor necrosis factor receptor、潰瘍壊死因子受容体）−Ｆｃ融合タンパク質を製造する方法に関する。より、具体的には高濃度の塩溶液でタンパク質試料の伝導度を調整し、前記タンパク質細胞の注入量を調整し、置換効果により切断タンパク質とＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の混合液を含む試料から活性型タンパク質を高純度で分離して製造する方法、及び前記方法により製造されたＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を高純度で分離して製造する方法、及び方法により製造されたＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質に関する 【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム及びリン酸ナトリウムからなる群から選択される少なくとも１つの塩を含む平衡化緩衝液で前平衡化された疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムに、哺乳類細胞から生産されたＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の混合液を含む試料を、クロマトグラフィーレジン体積当たり１０ｇ／Ｌ ｂｅｄ〜１４ｇ／Ｌ ｂｅｄの量で注入するステップと、
ｂ）前記平衡化緩衝液の塩と同じ塩を含む洗浄緩衝液で前記カラムを洗浄して、ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の混合液から切断型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を除去するステップと、
ｃ）前記平衡化緩衝液より塩濃度を減少させた溶出緩衝液で前記カラムから活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を溶出させるステップとを含む、
活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を製造する方法。
【請求項２】
前記ステップａ）の平衡化緩衝液が０．４５Ｍ〜０．５５Ｍクエン酸ナトリウム及び５０ｍＭ〜１００ｍＭリン酸ナトリウムを含む緩衝液である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップａ）の平衡化緩衝液が０．７０Ｍ〜０．７２Ｍ硫酸ナトリウム及び５０ｍＭ〜１００ｍＭリン酸ナトリウムを含む緩衝液である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記平衡化緩衝液がｐＨ６．５〜７．０である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記平衡化緩衝液がｐＨ６．７〜６．９であり、０．４８Ｍ〜０．５２Ｍクエン酸ナトリウム及び５０ｍＭ〜７０ｍＭリン酸ナトリウムを含む請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記平衡化緩衝液がｐＨ６．７〜６．９であり、０．７１Ｍ〜０．７２Ｍ硫酸ナトリウム及び５０ｍＭ〜７０ｍＭリン酸ナトリウムを含む請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記カラムのリガンドがブチル基、オクチル基、フェニル基及びアルキル基からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ステップａ）のＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質がｐｃＤＮＡ３．１−Ｋｏｚａｋ−ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＲＥＳ−ＧＳベクターの導入された哺乳類細胞から生産されたものである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質が、カラムに注入する前にアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び脱塩からなる群から選択される少なくとも１つの方法で部分精製されたものである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の混合液を含む試料が、注入前に５０ｍＳ／ｃｍ〜７５ｍＳ／ｃｍの伝導度を有するように調節された請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記伝導度がクエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム及び硫酸アンモニウムからなる群から選択される少なくとも１つの塩で調整されたものである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の混合液を含む試料が、注入前にクエン酸ナトリウムを用いて５０ｍＳ／ｃｍ〜５５ｍＳ／ｃｍの伝導度に調整されたものである請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の混合液を含む試料が、注入前に硫酸ナトリウムを用いて６５ｍＳ／ｃｍ〜７５ｍＳ／ｃｍの伝導度を有するように調整されたものである請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ステップｂ）の洗浄緩衝液がステップａ）の平衡化緩衝液と同じ組成である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ステップｃ）が４０ｍＳ／ｃｍ〜４７ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する溶出緩衝液で活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を溶出させるステップである請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ステップｃ）の溶出緩衝液が０．３５Ｍ〜０．４Ｍの範囲のクエン酸ナトリウムを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ステップｃ）の溶出緩衝液が０．３５Ｍ〜０．５６Ｍの範囲の硫酸ナトリウムを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶出緩衝液がｐＨ６．５〜７．０である請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記溶出緩衝液がｐＨ６．７〜６．９であり、０．３８Ｍ〜０．４Ｍクエン酸ナトリウム及び５０ｍＭ〜７０ｍＭリン酸ナトリウムを含む請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記溶出緩衝液がｐＨ６．７〜６．９であり、０．３８Ｍ〜０．４Ｍ硫酸ナトリウム及び５０ｍＭ〜７０ｍＭリン酸ナトリウムを含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法がｐＨが６．５〜７．０であり、伝導度が４ｍＳ／ｃｍ〜６ｍＳ／ｃｍの緩衝液を用いてカラムから不活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質又はＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質凝集体を含む分画を分離するステップｄ）をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ステップｄ）の緩衝液がｐＨが６．７〜６．９であり、５０ｍＭ〜７０ｍＭリン酸を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１の方法により製造された活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いてＴＮＦＲ（tumor necrosis factor receptor、潰瘍壊死因子受容体 ）−Ｆｃ融合タンパク質を製造する方法に関する。より具体的には、高濃度の塩溶液でタンパク質試料の伝導度を調整し、前記タンパク質細胞の注入量を調整し、置換効果（displacement effect）により切断タンパク質とＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の混合液を含む試料から活性型タンパク質を高純度で分離して製造する方法、及び前記方法により製造されたＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト体内 における潰瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の過発発現は自己免疫疾患を起こすことが知られている。ＴＮＦＲはＴＮＦ−α受容体であり、過剰発現したＴＮＦ−αと結合し自己免疫疾患の治療剤としての機能を果たす。また、ＴＮＦＲはヒトの免疫グロブリンＧ（IgG）のＦｃ部分と融合することによりＦｃ融合タンパク質形態で発現され、治療用タンパク質薬物として用いることができる。
【０００３】
ＴＮＦＲ−Ｆｃは、ＴＮＦＲの２３５個のアミノ酸とヒンジを含むＦｃ部分の２３２個のアミノ酸とを融合して作成することができる。遺伝子組換え技術を用いてＴＮＦＲ−Ｆｃをニ量体で生産する場合、 生物学的活性を示す。
【０００４】
ＴＮＦＲは、４つのドメインと膜透過（transmembrane）領域を有する２３５個のアミノ酸を含んでいる。ＴＮＦＲは２２個のシステインを有し、これらのシステインは全てジスルフィド結合を形成して立体構造をなしている。しかし、動物細胞からＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を生産する場合、システインがランダムに互いに結合して天然タンパク質と同様のジスルフィド結合を形成しない。また、 ＴＮＦＲの一部が切断されて正常なＴＮＦＲ−Ｆｃ二量体が形成されないことがある。
【０００５】
誤ったジスルフィド結合を有するＴＮＦＲ−Ｆｃは、ＴＮＦ−αとの結合能力が急激に低下して適切な生物学的活性を示さない。ＴＮＦＲの一部又は全部が切断された場合もまた生物学的活性を示さないことがある。
【０００６】
よって、ＴＮＦＲ−Ｆｃ二量体を遺伝子組換え技術と動物細胞培養技術を用いて生産した場合、活性型のタンパク質、ジスルフィド結合が正常になされていない不活性型タンパク質、凝集体（aggregates）及び切断された形態（clipped form）のタンパク質を同時に生産するので、これらのタンパク質混合液から活性型タンパク質を分離する技術を必要とする。
【０００７】
治療に用いる生体分子は、ヒトに適用する前に９９％以上の純度で分離しなければならない。このような純度は、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティー（染料、金属、抗体、タンパク質Ａなど）クロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（hydrophobic interaction chromatography、ＨＩＣ）などの分離過程において必要とされる３〜４つの液体クロマトグラフィーのプロセスによって達成され得る。クロマトグラフィー過程の形態及び順序は、目的生体分子と共存する不純物の物理化学的特性に基づいて選択される。一般に、最終段階ではサイズ排除クロマトグラフィーが用いられるが、これはタンパク質凝集体を除去して最終剤形の緩衝液で精製されたタンパク質を交換することができるからである。
【０００８】
しかし、サイズ排除クロマトグラフィーは、注入できる試料の体積が限定されているので、生産性に否定的な影響をもたらす。試料のカラム注入部位が、カラム全体の体積の約５％以上である試料は、拡散帯の拡散やカラムによる溶質帯の移動時の希釈を誘発することがある。このような体積の制約は、カラム注入前に超微細濾過濃縮を用いることによって避けられる。超微細濾過濃縮過程もまた、システム内の膜又は他の物質とタンパク質の非特異的結合、チュービングとポンプによる体積損失、及び装置準備、作動、洗浄における複合性により生産性損失をもたらす。よって、疎水性相互作用クロマトグラフィーに濃縮された試料を注入して置換効果を得ることによって精製過程を単純化することができ、 産性損失を避けることができる。ただし、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いた目的タンパク質の分離方法は、その目的タンパク質の種類、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターなどにより、互いに異なった分離条件が必要となる。従来から知られている目的タンパク質の分離方法は、他の目的タンパク質又は他の条件で製造された目的タンパク質に適用できないことがよくある。よって、所望の目的タンパク質を高純度かつ高濃度で分離できる適切な条件を解明することは、タンパク質医薬品市場における重要な課題である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような背景の下、本発明者らは活性型のＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を高純度かつ高濃度で分離するために努力を重ねてきた。その結果、 従来の技術とは異なり、担体の単位体積当たり注入するタンパク質試料の量及びその伝導度を調整することにより、有機溶媒を用いずにタンパク質が変性する可能性が小さいという利点を有する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）方法を用いて、 伝導度活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質分画のみ高純度で回収できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を製造する方法を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は、前記方法により製造された活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は高濃度の塩容液を用いて試料の伝導度を調整し、タンパク質試料の注入量を調整することにより、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いてタンパク質混合液を含む試料から活性型タンパク質を分離する方法を提供する。よって、前記方法は、組換えＤＮＡ技術により動物細胞から生産された組換えタンパク質から高純度の活性型タンパク質の分離に応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のｐｃＤＮＡ３．１−Ｋｏｚａｋ−ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＲＥＳ−ＧＳをクローニングする方法を示す概略図である。
【図２】本発明のＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃをコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１−Ｋｏｚａｋ−ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＲＥＳ−ＧＳを示す切断地図（cleavage map）である。
【図３】本発明の一実施例によるクエン酸ナトリウムを用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を示す図である。
【図４】本発明の一実施例による硫酸ナトリウムを用いた疎水性相互作用クロマトグラムを  示した。
【図５】本発明の一実施例による塩化ナトリウムを用いて疎水性相互作用クロマトグラムを示した。
【図６】本発明の一実施例による各分画の疎水性相互作用ＨＰＬＣ分析を示す図である。
【図７】本発明の一実施例による各分画のサイズ排除（size exclusion、ＳＥ）−ＨＰＬＣ分析を示す図である。
【図８】本発明の一実施例による各分画のｉｎ ｖｉｔｒｏ生物学的活性を示す図である。
【図９】本発明の一実施例によるタンパク質を９．５ｇ／Ｌ ｂｅｄの量で注入した場合の疎水性相互作用クロマトグラムを示す図である。
【図１０】本発明の一実施例によるタンパク質を １３ｇ／Ｌ ｂｅｄの量で注入した場合の疎水性相互作用クロマトグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
前記目的をするための本発明の一実施態様は、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を製造する方法を提供する。
【００１５】
前記方法は、ａ）クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム及びリン酸ナトリウムからなる群から選択される少なくとも１つの塩を含む平衡化緩衝液（equilibration buffer）で前平衡化（pre-equilibration）された疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムに哺乳類細胞から生産されたＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の混合液を含む試料をクロマトグラフィーレジン体積当たり１０〜１４ｇ／Ｌ ｂｅｄの量で注入するステップと、ｂ）前記平衡化緩衝液の塩と同じ塩を含む洗浄緩衝液（wash buffer）で前記カラムを洗浄してＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の混合液から切断型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を除去するステップと、ｃ）前記平衡化緩衝液よりも低い塩濃度を有する溶出緩衝液（elution buffer）で前記カラムから活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を溶出させるステップとを含むことが好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
前記ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞でＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を生産する場合、ＴＮＦＲタンパク質のシステインがランダムに結合して天然型ＴＮＦＲタンパク質と同一のジスルフィド結合が形成されなかったり、ＴＮＦＲタンパク質の一部分も切断されて正常な形態のＴＮＦＲ−Ｆｃ二量体が形成されない。よって、ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を宿主細胞から生産する場合、活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、不活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質又はＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質凝集体が含まれる混合液から野生型ＴＮＦＲタンパク質の生物学的活性と同一の又は対応する活性を有する活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質のみ分離する必要があった。本発明の前記方法は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いてＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の混合液から活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を高純度で分離することができる方法であり、活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の分離に効果的に用いることができる。
【００１７】
本発明における用語「ＴＮＦＲ（tumor necrosis factor receptor）タンパク質」とは、ＴＮＦ−αに結合する受容体タンパク質を意味する。前記ＴＮＦＲは、ＴＮＦＲＩ（ｐ５５）タンパク質又はＴＮＦＲＩＩ（ｐ７５）タンパク質を含み、好ましくはＴＮＦＲＩＩタンパク質であるが、これに限定されるものではない。前記ＴＮＦＲＩＩはＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B）と混用される。前記ＴＮＦＲＩＩタンパク質は、４つのドメインと膜透過(transmembrance)領域を有し、２３５個のアミノ酸を含むＴＮＦＲＩＩタンパク質であってもよいが、これに限定されるものではない。前記ＴＮＦＲＩタンパク質及びＴＮＦＲＩＩタンパク質に関する情報は、米国国立衛生研究所であるジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）のような公知のデータベースから得ることができ、例えば、 受託番号がＮＰ＿００１０５６又はＰ２０３３３のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
前記ＴＮＦＲタンパク質は、ヒト体内に過剰発現すると様々な疾患を起こすことが知られているＴＮＦ−αに結合する生物学的活性を有するので、それを自己免疫疾患などのＴＮＦ−αにより媒介される疾病の治療に用いることができる。これを達成するために免疫グロブリンのＦｃ領域をＴＮＦＲタンパク質に融合して半減期が延長した融合タンパク質を製造する。
【００１９】
本発明における用語「ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質」とは、ＴＮＦＲタンパク質の全部又は一部が免疫グロブリンのＦｃ領域と酵素作用により連結されたもの、又は遺伝子操作により前記２つのポリペプチドが１つのポリペプチドとして発現した結果物を意味する。前記ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質において、ＴＮＦＲタンパク質と免疫グロブリンのＦｃ領域は直接連結されたものであってもよく、ペプチドリンカーにより連結されたものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
前記ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＮＦＲタンパク質の全部又は一部を免疫グロブリンＦｃ領域と融合して作成することができ、例えば、ＴＮＦＲＩＩタンパク質の１番目〜２３５番目のアミノ酸部位とヒンジ部位を含む免疫グロブリンＦｃ領域の２３２個のアミノ酸とを融合させて製造することができるが、これに限定されるものではない。また、前記ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質は宿主細胞の発現によりコドン最適化（codon optimization）されてもよい。例えば、前記ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質は配列番号１のアミノ酸配列で定義されるＣＨＯ細胞に対してコドンを最適化したＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質であってもよいが、これに限定されるものではない。前記ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質を含み、前記配列と７０％以上の類似性、好ましくは８０％以上の類似性、より好ましくは９０％以上の類似性、さらに好ましくは９５％以上の類似性、最も好ましくは９８％以上の類似性を有するアミノ酸配列を持つタンパク質であり、実質的にＴＮＦ−αに結合する活性を有するタンパク質であればいかなるものでもよい。また、このような類似性を有する配列が前記ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質と同一の又は対応する生物学的活性を有するならば、一部の配列が欠失、修飾、置換又は付加されたタンパク質変異体のいかなる種類のものも本発明の範囲内に含まれる。また、前記ＴＮＦＲ(tumor necrosis factor receptor)−Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド配列を含み、前記配列と７０％以上の類似性、好ましくは８０％以上の類似性、より好ましくは９０％以上の類似性、さらに好ましくは９５％以上類似性、最も好ましくは９８％以上の類似性を有するヌクレオチド配列であり、実質的にＴＮＦ−αに結合する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであればいかなるものでもよい。また、このような類似性を有する配列が前記ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質と同一の又は対応する生物学的活性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であれば、一部の配列が欠失、修飾、置換又は付加されたタンパク質変異体をコードするヌクレオチド配列のいかなる形態も本発明の範囲内に含まれることは自明である。本発明の一実施例においては、ＣＨＯ細胞に特異的にコドン最適化を行った。
【００２１】
本発明における用語「免疫グロブリン（Ig）のＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域、重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び軽鎖定常領域（ＣＬ１）を除いたものであり、重鎖定常領域２（ＣＨ２）、重鎖定常領域（ＣＨ３）及びヒンジ部分を含む免疫グロブリンの一部分を意味する。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域には、天然アミノ酸配列及びその配列誘導体も含まれる。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより天然型アミノ酸配列とは異なる配列を意味する。また、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡもしくはＩｇＤ由来のＦｃ領域、又はそれらの組み合わせもしくはそれらのハイブリッド（hybrid）により生産されたＦｃ領域であってもよい。結合タンパク質の半減期を向上させることが知られているＩｇＧに由来するものであることが好ましい。ＩｇＧ１に由来するものがより好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２２】
一方、本発明における用語「組み合わせ」とは、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ領域をコードするポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドに結合形成し、ニ量体又は多量体を形成することを意味する。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥ Ｆｃフラグメントからなる群から選択される少なくとも２つのフラグメントから二量体又は多量体が形成され得る。
【００２３】
本発明における用語「ハイブリッド（hybrid）」とは、単鎖免疫グロブリンＦｃ領域に存在する異なる起源の少なくとも２つの免疫グロブリンＦｃフラグメントをコードする 配列を意味する。本発明においては、様々な形態のハイブリッドが可能である。すなわち、前記ドメインのハイブリッドはＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥ Ｆｃ及びＩｇＤ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４からなる群から選択される１つ〜４つのドメインで構成することができ、ヒンジを含んでもよい。一方、ＩｇＧもまたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスに分けられ、本発明においては、それらの組み合わせ及びそれらのハイブリッド化も含まれる。
【００２４】
前記ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質は、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを哺乳類細胞に導入して発現させることにより得ることができ、例えば、変異したＧＳ（glutamine synthetase）酵素及びＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを哺乳類細胞に導入して得ることができるが、これに限定されるものではない。
【００２５】
前記変異したＧＳ酵素は、野生型ＧＳ酵素のアミノ酸配列において２９９番目であるグリシン（G）のアルギニン（R）への置換を含む配列を有する酵素であり、本発明のＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、前記変異したＧＳ酵素を含んでもよい。例えば、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｋｏｚａｋ−ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＲＥＳ−ＧＳベクターが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２６】
本発明においては、ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む代表的な発現ベクターとしてｐｃＤＮＡ３．１−Ｋｏｚａｋ−ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＲＥＳ−ＧＳベクターを用い、これをＣＨＯ細胞に形質導入してＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を発現させた。前記方法で得られたＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質には、活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、切断型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、不活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質又は／及びＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質凝集体のような様々な形態のＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の混合物が含まれる。よって、そこからＴＮＦ−αに結合する生物学的活性を有する活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質のみ分離する必要性がある。本発明の製造方法を用いる場合には、前記活性型融合タンパク質及び凝集体をそれぞれ異なる分画で得ることができるので、活性型融合タンパク質のみ高純度で得ることができる。
【００２７】
本発明の前記活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を製造する方法は、ａ）平衡化緩衝液で前平衡化した疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムに ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の混合液を含む試料を注入する工程を含む。
【００２８】
前記ステップａ）は、 平衡化緩衝液で前平衡化した疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムに前記試料を注入するステップである。
【００２９】
前記カラムの前平衡化は、クロマトグラフィーのカラムレジンが平衡緩衝化されるように高濃度の塩容液を前記カラムに処理して行う。
【００３０】
前記高濃度の塩容液の例としては、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム及びリン酸ナトリウムからなる群から選択される少なくとも１つの塩を含む緩衝液が挙げられるが、本発明の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）のカラムを緩衝化できるものであれば、前記塩溶液の種類は特に限定されない。その例としては、クエン酸ナトリウム又は硫酸ナトリウムを塩として用いることができるが、これらに限定されるものではない。前記平衡緩衝液がクエン酸ナトリウムを塩として含むものであれば、その濃度は０．４５〜０．５５Ｍであってもよく、５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウムをさらに含んでもよいが、これらに限定されるものではない。また、硫酸ナトリウムを塩として含むものであれば、その濃度は０．７０〜０．７２Ｍであってもよく、５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウムをさらに含んでもよいが、これらに限定されるものではない。また、前記平衡化緩衝液のｐＨは６．５〜７．０であることが好ましいが、これらに限定されるものではない。前記平衡化緩衝液はｐＨ６．７〜６．９の０．４８〜０．５２Ｍクエン酸ナトリウム及び５０〜７０ｍＭリン酸ナトリウムを含む緩衝液、又はｐＨ６．７〜６．９の０．７１〜０．７２Ｍ硫酸ナトリウム及び５０〜７０ｍＭリン酸ナトリウムを含む緩衝液であることがより好ましく、ｐＨ６．８の０．５Ｍクエン酸ナトリウム及び５０ｍＭリン酸ナトリウムを含む緩衝液、又はｐＨ６．８の０．７２Ｍ硫酸ナトリウム及び５０ｍＭリン酸ナトリウムを含む緩衝液であることが最も好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
本発明の一実施例においては、ｐＨ６．８の０．５Ｍクエン酸ナトリウム及び５０ｍＭリン酸ナトリウムを含む緩衝液とｐＨ６．８の０．７２Ｍ硫酸ナトリウム及び５０ｍＭリン酸ナトリウムを含む緩衝液を平衡化緩衝液として用いた。
【００３２】
本発明における用語「疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）」とは、生体分子の精製過程に用いられ、これはタンパク質表面と疎水性相互作用クロマトグラフィー吸着剤の可逆的相互作用に基づくものである。イオン交換クロマトグラフィーやサイズ排除クロマトグラフィーに比べて、イソ型（isoform）タンパク質と同程度の等電点又は分子量を有する不純物の分離に卓越している。
【００３３】
前記疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）のカラムで用いることのできるリガンドの種類は、本発明の活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の分離に用いることのできるリガンドであれば、その種類は特に限定されるものではないが、例えば、ブチル基、オクチル基、フェニル基及びアルキル基を含むことができる。前記リガンドとしては、ブチル基又はフェニル基であることが好ましく、ブチル基であることがより好ましいが、これらに限定されるものではない。本発明の一実施例においては、ブチルリガンドを含むＧＥヘルスケア社のＢｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを用いた。前記Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗは、高度に架橋された４％アガロースマトリックスにブチルリガンドがエーテル結合によりカップリングされた９０μｍのサイズのビーズに基づいたものであり、高い化学的、物理的及び熱的安定性を有する。担体の高い疎水性により、親水性タンパク質を分離するのに用いることができる。
【００３４】
活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を製造する本発明の方法は、ａ）前記前−平衡緩衝化されたカラムにＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の混合液を含む試料を注入するステップを含む。
【００３５】
本発明における用語「ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の混合液を含む試料」は、ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を含む細胞の培養上清（cell culture supernatant）、前記細胞の破砕物（cell extract）、又は部分精製された上清や破砕物であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を宿主細胞で生産する場合、活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の一部分が欠失した切断型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、ジスルフィド結合が正常に形成されていない不活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質又は／及びＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質凝集体の混合物が前記培養上清や細胞破砕物に含まれる。
【００３６】
前記ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質は、 前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入された哺乳類細胞で発現され、この上清が回収されたものが好ましい。次に、これを再び疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに注入する前に、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び脱塩からなる群から選択される少なくとも１つの方法で部分精製することができるが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
本発明における用語「部分精製」とは、クロマトグラフィーのような分画方法（fractionation procedure）を少なくとも１つ行った後にも、目的とする活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質以外の他のタンパク質も存在する状態を意味する。本発明の一実施態様においては、タンパク質Ａクロマトグラフィーを用いて培養上清の部分精製を行った。
【００３８】
前記ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の混合液は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムの注入前に高濃度の塩溶液で伝導度が調整された混合タンパク質試料であってもよい。前記塩溶液としては、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム及び硫酸アンモニウムからなる群から選択される塩を含む溶液であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記高濃度の塩溶液で処理したＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質試料は、５０〜７５ｍＳ／ｃｍの範囲内で調整することが好ましい。
【００３９】
前記高濃度の塩溶液がクエン酸ナトリウムを含む溶液である場合は、伝導度は５０〜５５ｍＳ／ｃｍの範囲内で調整することが好ましく、硫酸ナトリウムを含む溶液を用いる場合は６５〜７５ｍＳ／ｃｍの伝導度に調整することが好ましいが、これらに限定されるものではない。前記タンパク質試料は、０．４５〜０．５５Ｍのクエン酸ナトリウムの濃度を有するのが好ましく、０．４８〜０．５２であることがより好ましく、０．５Ｍであることが最も好ましい。また、前記タンパク質試料は ０．７０〜０．７２Ｍの硫酸ナトリウム濃度を有するのが好ましく、０．７１〜０．７２であることがより好ましく、０．７２Ｍであることが最も好ましい。また、前記タンパク質試料のｐＨは６．５〜７．０であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
本発明の一実施態様においては、クエン酸ナトリウムを含む塩溶液を用いて前記ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質試料の伝導度を５０〜５２ｍＳ／ｃｍとなるように調整したが、ここでクエン酸ナトリウムの最終濃度は０．５Ｍであった。また、硫酸ナトリウムを含む塩溶液を用いて前記試料を６５〜７５ｍＳ／ｃｍの伝導度となるように調整したが、ここで硫酸ナトリウムの最終濃度は０．７２Ｍであった（実験例１）。また、本発明においては、前記クエン酸ナトリウムや硫酸ナトリウム以外に、塩化ナトリウムを塩として用いて疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を行った。しかし、塩化ナトリウムの濃度を０．７５Ｍ〜１．５Ｍと高くしても活性型ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質がカラムに結合せず、フロースルー分画に回収され（図３〜５）、用いる塩の種類及び濃度の範囲も本発明の方法において重要な要素であることが確認された。
【００４１】
前記ステップａ）においては、 置換効果によりタンパク質の分離が容易に行えるようにＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質混合液をクロマトグラフィーレジン積当たり１０〜１４ｇ／Ｌ ｂｅｄの量で注入することができる。
【００４２】
本発明における用語「置換効果（displacement effect）」とは、相対的に高い結合力を有する分析物が高濃度で存在する場合に、低い結合力の分析物はカラムレジンに保持されずに早く溶出する現象を意味する。本発明の目的分析物質である活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質は、不活性型タンパク質及びタンパク質凝集体とは疎水性の程度の差が大きいので、伝導度の調整だけでも容易に分離することができる。しかし、切断型タンパク質及と活性型タンパク質間の疎水性の若干の差により、従来の疎水性相互作用クロマトグラフィーの分析条件で切断型タンパク質から活性型タンパク質を容易に分離することができる。本発明は、タンパク質試料の注入量を クロマトグラフィーレジン体積当たり１０〜１４ｇ／Ｌ ｂｅｄの範囲内で調整する、前記置換効果により、活性型タンパク質からの切断型タンパク質分画の除去が可能になることを特徴とする。クロマトグラフィーレジン体積当たり１２〜１４ｇ／Ｌ ｂｅｄの量でタンパク質試料を注入することがより好ましい。本発明の一実施態様においては、タンパク質注入量による置換効果を比較した。タンパク試料を１０ｇ／Ｌ ｂｅｄ未満である９．５ｇ／Ｌ ｂｅｄの量で注入した場合は、切断型ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質分画と活性型ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質分画が容易に分離されなかった。それに対して、１３ｇ／Ｌ ｂｅｄの量で注入した場合は、切断型分画と活性型分画が明確に区分された（実験例５，図９及び図１０）。
【００４３】
また、本発明の方法は、ｂ）洗浄緩衝液で前記カラムを洗浄し、切断型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の分画を分離して製造するステップを含む。
【００４４】
前記洗浄緩衝液は、平衡化緩衝液と同じ組成でもよいが、これに限定されるものではない。前記洗浄緩衝液を用いてカラムを洗浄する際に、切断型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質が溶出する。ここで、溶出するピークを本発明においてはピーク１と命名した。
【００４５】
本発明の一実施態様においては、平衡化に用いた平衡化緩衝液でカラムを洗浄して切断型タンパク質を除去した。ここで、使用した平衡化緩衝液は、ｐＨ６．８で、０．５Ｍクエン酸ナトリウム及び５０ｍＭリン酸ナトリウムを含む緩衝液、又はｐＨ６．８で、０．７２Ｍ硫酸ナトリウム及び５０ｍＭリン酸ナトリウムを含む緩衝液であった。
【００４６】
また、本発明は、ｃ）前記平衡化緩衝液より塩濃度を減少させた溶出緩衝液を用いて前記カラムから活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を溶出させるステップを含む。
【００４７】
疎水性相互作用クロマトグラフィーにおいて、分子の疎水性が大きいほど、カラムに結合させるために要求される塩は少なくなる。 活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質と非活性型又は凝集体ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質間に 疎水性の差があるため、塩の濃度を調節することによって不活性型又は凝集体ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質から活性型タンパク質を分離することができる。よって前記ステップは、平衡化緩衝液より塩濃度の低い融合緩衝液を用いてを活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質と疎水性リガンド間の相互作用を減少させ、カラムから活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を分離させるステップである。本発明においては、活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を含むピークをピーク２と命名する。
【００４８】
前記溶出緩衝液は、平衡化緩衝液及び洗浄緩衝液より塩濃度を有する緩衝液であり、その伝導度は４０〜４７ｍＳ／ｃｍであってもよい。クエン酸ナトリウムを含む溶出緩衝液を用いる場合、前記溶出緩衝液も０．３５〜０．４Ｍの濃度のクエン酸ナトリウムを含んでもよく、０．３８〜０．４Ｍであることがより好ましく、０．４Ｍの濃度のクエン酸ナトリウムを含むことが最も好ましいが、これらに限定されるものではない。また、硫酸ナトリウムを含む溶出緩衝液を用いる場合、前記溶出緩衝液は０．３５〜０．５６Ｍの濃度の硫酸ナトリウムを含んでもよく、０．３８〜０．４Ｍであることがより好ましく、０．４Ｍの濃度の硫酸ナトリウムを含むことが最も好ましいが、これらに限定されるものではない。また、前記溶出緩衝液は５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウムをさらに含んでもよいが、これらに限定されるものではない。本発明の一実施態様においては、ｐＨ６．８の０．４Ｍクエン酸ナトリウム及び５０ｍＭリン酸ナトリウムを含む溶出緩衝液と、ｐＨ６．８の０．４Ｍ硫酸ナトリウム及び５０ｍＭリン酸ナトリウムを含む溶出緩衝液を用いた。前記溶出緩衝液のｐＨは６．５〜７．０の範囲であってもよいが、これらに限定されるものではない。 ステップｃ）を行った後の伝導度は４０〜４７ｍＳ／ｃｍであった。
【００４９】
前記活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を製造する方法は、ｄ）カラムから不活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質又はＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質凝集体を含む分画を分離するステップをさらに含んでもよい。
【００５０】
前記ステップは、前記溶出緩衝液より減少した塩の濃度を含む緩衝液、又はクエン酸ナトリウムや硫酸ナトリウムが含まれない緩衝液を用いて不活性型タンパク質及び凝集体タンパク質を含む分画を溶出させるステップである。この時に溶出するピークを本発明においてはピーク３と命名する。ここで、使用される緩衝液はｐＨ６．５〜７．０であり、０〜０．１Ｍクエン酸ナトリウム又は０〜０．１Ｍ硫酸ナトリウムを有するものあってもよいが、これらに限定されるものではない。また、前記緩衝液は６．５〜７．０の範囲のｐＨ を有するものであってもよいが、これらに限定されるものではない。また、前記緩衝液は、４〜６ｍＳ／ｃｍの伝導度、５０〜７０ｍＭのリン酸ナトリウム又は／及びｐＨ６．７〜６．９のｐＨを有するものであってもよいが、これらに限定されるものではない。本発明の一実施態様においては、ｐＨ６．８である５０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む緩衝液を使用し、伝導度を４〜６ｍＳ／ｃｍに調整した。
【００５１】
前述したように、本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて切断型、凝集体、不活性型及び活性型タンパク質の混合物から活性型タンパク質を分離する方法を提供する。前記方法は前記カラムに注入される試料の伝導度を高濃度の塩容液で調整してその注入量を高めることによって、置換効果により相対的に結合力が低い切断型タンパク質を活性型タンパク質から除去できることを特徴とする。また、前記方法は疎水性相互作用クロマトグラフィーの特定の塩の濃度を調節することによって、目的とする活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を高濃度で分離して製造できることを特徴とする。
【００５２】
本発明の一実施態様によれば、２９９番目のアミノ酸が置換されたＧＳ及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを動物細胞であるＣＨＯ細胞に形質転換し（実施例１〜４）、そこからＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を得た。次に、活性型ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を分離するために、疎水性相互作用クロマトグラフィーを行った（実験例１）。本発明の方法によりＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を分離する場合、切断型ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質、活性型ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質凝集体がそれぞれピーク１、２及び３に分離された（図３、図６及び図７）。また、タンパク質試料を１２ｇ／Ｌ ｂｅｄ以上の量で疎水性相互作用クロマトグラフィーに注入する際に、９．５ｇ／Ｌ ｂｅｄ以下の量で注入した時には分離しなかった切断型タンパク質に相当するピークが活性型タンパク質のピークから分離され（図９及び図１０）、得られた活性型タンパク質のピークに相当する分析物の活性は純粋な活性型のものと同レベルであることが示された（図８）。ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ二量体を精製する周知の方法によると、２種類の分画、すなわち活性型タンパク質を含む分画と、不活性型、凝集体及び切断されたタンパク質を全て含む分画とに分離された。しかし、３種類の分画、すなわち切断タンパク質を多量に含む分画、活性型タンパク質を含む分画、不活性型タンパク質及びタンパク質凝集体を含む分画に分離されたとう報告は未だなされてない。本発明においては、前記３種類の分画に分離され、前記活性は活性型ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃタンパク質を含み、分画の活性は純粋な活性型のものと同レベルであり、従来の技術より高い純度で活性型ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を製造できることを示した。
【００５３】
よって、本発明の方法は、従来の方法では分離が難しかった切断型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を除去することにより、生物学的活性を有する活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を高純度で精製するのに用いることができる（例えば、エタネルセプト（etanercept））。
【００５４】
本発明の他の実施態様は、前記方法により製造された活性型ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
【００５５】
前記方法及びＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の説明については前述した通りである。
【００５６】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例はあくまで本発明を例示するためのものであり、本発明がこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００５７】
実施例１：ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子の合成
組換えタンパク質発現ベクターシステムで生産された組換えタンパク質の発現レベルを確認するために、目的タンパク質としてＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を用いた。
【００５８】
前記融合タンパク質をコードする遺伝子（配列番号２）が次の基準を満たすようにＧｅｎｅＡｒｔ社に依頼して合成した。（１）ＴＮＦＲのシグナル配列を含むようにする。（２）ＴＮＦＲアミノ酸の１番目〜２３５番目のアミノ酸まで発現するようにする。（３）ＣＨＯ細胞に形質感染できるようにＣＨＯ細胞に対してコドン最適化する。（４）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐｃＤＮＡ３．１ベクターに挿入することを考慮して、５’末端には制限酵素ＮｈｅＩ部位を、３’末端には制限酵素ＮｏｔＩ部位を有するようにする。
【００５９】
前記合成された融合タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は最終的にＶｅｃｔｏｒＮＴＩプログラムを用いて分析した。
【００６０】
実施例２：ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターの作成
一般的な組換えタンパク質発現システムであるＤＨＦＲシステムを得るために、ハムスターのＤＨＦＲ（dihydrofolate reductase）遺伝子をクローニングした。
【００６１】
具体的には、ハムスターのＤＨＦＲ遺伝子を得るために、突然変異型（mutant  type）のハムスターＤＨＦＲ遺伝子を有するｐＳＶＡ３ベクター（ATCC 77273）を購入して該当ＤＨＦＲ遺伝子を鋳型として用いて、点突然変異（point mutation）法を行って野戦型のＤＨＦＲ遺伝子を得た。また、ＩＲＥＳ塩基配列は、該当ＤＮＡ配列を有するＣｌｏｎｔｅｃｈベクター（Cat. #6029-1, PT3267-5）からＰＣＲ反応により得た。
【００６２】
前記得たＤＨＦＲ遺伝子と配列内リボソーム進入部位（Internal ribosome entry site、ＩＲＥＳ）配列をｐＣＲ２．１ベクターにクローニングし、ｐＣＲ２．１−ＩＲＥＳ−ＤＨＦＲの形態の発現ベクターを作成した。
【００６３】
実施例１で得られたＴＮＦＲ−Ｆｃが挿入されたｐｃＤＮＡ３．１−ＴＮＦＲ−Ｆｃベクターと前記得られたｐＣＲ２．１−ＩＲＥＳ−ＤＨＦＲベクターをそれぞれ制限酵素であるＳａｌＩ及びＸｂａＩで切断し、連結して最終的にＴＮＦＲ−Ｆｃが挿入されたｐｃＤＮＡ３．１−ＴＮＦＲ−Ｆｃ−ＩＲＥＳ−ＤＨＦＲ発現ベクターを得た。カナマイシン抵抗性遺伝子を有するベクターへのクローニングのために、ＣｌｏｎｔｅｃｈのｐＡＣ−ＧＦＰベクター（#632483）からカナマイシン抵抗性遺伝子を得てＫａｎ／Ｎｅｏ遺伝子を導入した。前記ベクターは、ＴＮＦＲ−Ｆｃ遺伝子の転写開始部位にＫｏｚａｋ配列及び抗生剤選別マーカーとしてのＫａｎ／Ｎｅｏ遺伝子を有するベクターであり、ＣＨＯ細胞株を用いた組換えタンパク質発現量の比較のために４種の異なる発現ベクターシステムのクローニングに対する基本骨格として用いられた。
【００６４】
実施例３：ハムスターのＧＳ遺伝子のクローニング及び哺乳類のタンパク質発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−Ｋｏｚａｋ−ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＲＥＳ−ＧＳの製造
ＧＳ ＤＮＡを得るためにハムスター細胞株であるＣＨＯ ＤＧ４４（Invitrogen, 12609-012）を培養し、その後ＴＲＩＺＯＬ試薬（Invitrogen）を用いて全ＲＮＡを得た。得られた全ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲを行ってｃＤＮＡを得て、前記得られたｃＤＮＡを鋳型とし、下記ＧＳ遺伝子を得るためのプライマー対（GS SalI-F primer, GS XbaI-R primer）を用いてＰＣＲを行い（９４℃、５分間の変性を行い、９４℃、３０秒間の変性、５０℃、３０秒間のアニーリング、７２℃、９０秒間の伸長を２５回繰り返し、７２℃、７分間の伸長を行う）ＰＣＲ産物を得た。
ＧＳ ＳａｌＩ−Ｆ：５’−ｇｔｃｇａｃａｔｇｇｃｃａｃｃｔｃａｇｃａａｇｔｔｃｃｃ−３’（配列番号３）
ＧＳ ＸｂａＩ−Ｒ：５’−ｔｃｔａｇａｔｔａｇｔｔｔｔｔｇｔａｔｔｇｇａａａｇｇｇ−３’（配列番号４）
【００６５】
前記得られたＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルに電気泳動し、その後該当バンドを切断してＱｕｉａｇｅｎ Ｃｌｅａｎｉｎｇ ｋｉｔ（#28204）を用いてクリーンアップした。次に、この産物を遺伝子クローニングベクターであるｐＧＥＭＴベクター（Promega, USA）に挿入した。前記ＰＣＲ産物が挿入されたｐＧＥＭＴベクターをＴＯＰ１０細胞に導入して計１０個のｃｏｌｏｎｙを得た。塩基配列（配列番号５）及び前記塩基配列によりコードされるアミノ酸配列（配列番号６）を分析した。その結果、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋによって公知されているハムスターＧＳ遺伝子（GenBank: X03495.1）によりコードされるアミノ酸配列と１つのアミノ酸が異なることが確認された。前記クローニングしたＧＳ遺伝子は、野生型ＧＳ酵素のアミノ酸配列において２９９番目のアミノ酸がグリシン（Glycine, G）からアルギニン（Arginine, R）への置換を含む配列を含むＧＳ酵素をコードする。
【００６６】
前記ｐＧＥＭＴ−ＧＳをＳａｌＩ及びＸｂａＩ制限酵素を処理して得た断片を、ＳａｌＩ及びＸｂａＩ制限酵素で予め切断しておいたＴＯＰＯ−ＩＲＥＳ−ＤＨＦＲベクターに挿入してｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＩＲＥＳ−ＧＳ遺伝子を得た。
【００６７】
次に、ＴＮＦＲ−Ｆｃ遺伝子とＩＲＥＦ−ＧＳ遺伝子を結合するために、それぞれＸｈｏＩとＸｂａＩで切断したＴＮＦＲ−Ｆｃ−ＩＲＥＳ−ＤＨＦＲ遺伝子とＩＲＥＳ−ＧＳ断片をライゲーションして、 ｋｏｚａｋ−ＴＮＦＲ−Ｆｃ−ＩＲＥＳ−ＧＳベクター（「ＩＲＥＳ−ＧＳベクター」）を作成した（図１）。図１は本発明に用いられるｐｃＤＮＡ３．１−Ｋｏｚａｋ−ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＲＥＳ−ＧＳをクローニングする方法を示す概略図である。また、前記ベクターの模式図は図２に示した。
【００６８】
実施例４：疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に適用するための試料の製造
リポフェクタミン（lipofectamine 2000; Invitrogen）を用いて、ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃを生産する遺伝子を含むｐｃＤＮＡ３．１−Ｋｏｚａｋ−ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＲＥＳ−ＧＳベクターをチャイニーズハムスター（Chinese hamster ovary、ＣＨＯ）細胞株に導入した。前期導入ＣＨＯ細胞株を１０％ウシ胎児血清（fetal bovine serum; FBS）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Dulbecco’s  Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12）培地を用いて、前記遺伝子導入ＣＨＯ細胞株をフラスコ又はバイオリアクターで培養した。培養液をデプスフィルタ（depth filter）で濾過して細胞を除去し、再度精密濾過法（microfiltration）を行って細胞断片を除去した。前記培養上清を回収し、プロテインＡクロマトグラフィーで部分精製を行った。精製分画のｐＨは１００ｍＭクエン酸又はリン酸（ｐＨ２．１） を用いて３．６〜３．８の範囲内で調整した。
【００６９】
１Ｍクエン酸ナトリウム及び７５ｍＭリン酸ナトリウムの溶液は（ｐＨ６．８）約１：１の体積比で混合した。伝導度が常温で５０〜５２ｍＳ／ｃｍになるまで前記溶液を攪拌しながら添加した。添加後に０．２μｍのフィルタを用いて混合液を濾過した。
【００７０】
実験例１：疎水性相互作用クロマトグラフィー
実験例１−１：クエン酸ナトリウムを用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー
ガラスカラムにＢｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（GE Healthcare）を８ｃｍ以上の高さに充填した。０．５Ｍクエン酸ナトリウム及び５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）（緩衝液Ｉと命名する）、及び ５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）（緩衝液Ｊと命名する）を製造した。
【００７１】
充填したカラムに３カラム体積の平衡化緩衝液（equilibrium buffer）である緩衝液Ｉを少しずつ注入してカラムを平衡化した。平衡化完了後、実施例４で製造した溶液をカラムに対してカラム１リットル当たり１２グラム以上の量でカラムに注入した。注入完了後、２カラム体積の洗浄緩衝液である緩衝液Ｉでカラムを洗浄した。ここで、溶出する分画をピーク１と命名した。
【００７２】
次に、溶出緩衝液を緩衝液Ｉ（８０％）と緩衝液Ｊ（２０％）の組成となるように製造し、前記緩衝液で伝導度を調整した。ＵＶ検出器のシグナルが増加したら、分画を回収した。ここで、溶出する分画をピーク２と命名した。ピーク２は１．５〜３．５カラム体積の量で回収された。
【００７３】
次に、前記緩衝液が（１００％）の緩衝液Ｊ組成となるようにし、その後緩衝液Ｊの３カラム体積でカラムを洗浄した。ここで、溶離する分画をピーク３と命名した。
【００７４】
前記疎水性相互作用クロマトグラフィーの結果として図３のクロマトグラムを得た。図３に示すように、ピーク１、ピーク２及びピーク３に分けた。ピーク１は切断された形態で含んでおり、ピーク２は活性型、ピーク３は不活性型とタンパク質の凝集体を含むことが確認された。
【００７５】
実験例１−２：硫酸ナトリウムを用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー
カラムをＢｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗで１０ｃｍ以上の高さに充填した。０．７２Ｍ硫酸ナトリウム及び５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）（以下、「緩衝液Ｓ」）及び５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（以下、「緩衝液Ｊ」）を製造した。
【００７６】
前記充填したカラムに３カラム体積の緩衝液Ｓを少しずつ注入してカラムを平衡化した。平衡化完了後、１．２Ｍ硫酸ナトリウム及び５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を用いて硫酸ナトリウムの最終濃度を０．７２Ｍに調整したタンパク質溶液をカラム１リットル当たり１１グラム以上の量でカラムに適用した。前記タンパク質溶液は、６５〜７５ｍＳ／ｃｍの範囲の伝導度を有するものであった。注入完了後、２カラム体積の緩衝液Ｓでカラムを洗浄した。次に、緩衝液Ｓの組成を３０カラム体積で１００％から３０％に減少させ、次いで３カラム体積で３０％から０％に減少させた。前記疎水性相互作用クロマトグラフィーの結果として得られたクロマトグラムを図４に示した。
【００７７】
その結果、図４に示すように、ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は０．７２Ｍ硫酸ナトリウムの濃度でカラムへの吸着が観察された。
【００７８】
これらの結果は、クエン酸ナトリウム以外に、硫酸ナトリウムを本発明の塩として用いて活性型ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を分離できることを意味するものである。
【００７９】
実験例１−３：塩化ナトリウムを用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
カラムをＢｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗで１０ｃｍ以上の高さに充填した。０．７５Ｍ塩化ナトリウム及び５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ 緩衝液（ｐＨ７．２）（以下、「緩衝液Ｘ」）、１．０Ｍ塩化ナトリウム及び５０ｍＭ トリストリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）（以下、「緩衝液Ｙ」）、１．５Ｍ塩化ナトリウム及び５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）（以下、「緩衝液Ｚ」）、及び５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）（以下、「緩衝液Ｔ」）を製造した。
【００８０】
前記充填したカラムに３カラム体積の緩衝液Ｘを少しずつ注入してカラムを平衡化した。平衡化完了後、１．５Ｍ塩化ナトリウム及び５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて塩化ナトリウムの最終濃度を０．７５Ｍに調整したタンパク質溶液をカラム１リットル当たり４グラム以上の量でカラムに適用した。注入完了後、２カラム体積の緩衝液Ｘでカラムを洗浄した。次に、前記緩衝液Ｘの組成を２０カラム体積で１００％から０％に減少させた。また、緩衝液Ｙと緩衝液Ｚにおいても前記と同様の過程を行った。前記による疎水性相互作用クロマトグラフィーを行った結果として得られたクロマトグラムを図５に示した。
【００８１】
図５に示すように、ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は高濃度の塩化ナトリウム塩溶液を用いた場合でもカラムに吸着せず、フロースルー分画で回収されることが示された。
【００８２】
前記のような結果は、本発明の活性型ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は単に伝導度を調整するだけでは分離されず、用いられる特定の塩の種類及び濃度が重要であることを示す結果である。
【００８３】
実験例２：疎水性相互作用ＨＰＬＣ
実施例１−１の各ステップで得られた試料に対して疎水性相互作用ＨＰＬＣ（hydrophobic interaction high performance liquid chromatography）に適用した。疎水性相互作用ＨＰＬＣでは、Ｂｕｔｙｌ ＮＰＲカラム（Tosoh Bioscience）を使用し、移動相Ａは１．８Ｍ硫酸アンモニウム、１００ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）を用い、移動相Ｂは１００ｍＭリン酸ナトリウム溶液 （ｐＨ７．０）を用いた。 初期の５分間を移動相Ａの組成を１ｍｌ／ｍｉｎで１００％となるように維持し、４５分間で移動相Ａの組成が１００％から０％になるように線形勾配を与えた。前記結果を図６に示した。
【００８４】
図６から分かるように、ピーク１ではピーク１の分画が優勢であるが、ピーク２が混合している。ピーク２は活性型の単一の分画のみ含むことが示された。ピーク３では活性型の分画がなく、ピーク３の分画のみ優勢であった。
【００８５】
前記のような結果は、本発明のＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質の製造方法は、活性型の形態のタンパク質のみ効果的に分離するのに使用できることを示すものである。
【００８６】
実験例３：サイズ排除（size-exclusion; SE）ＨＰＬＣ
実験例１−１の各ステップで得られた試料に対してＳＥ−ＨＰＬＣを行った。ＳＥ−ＨＰＬＣは、タンパク質のサイズにより分離する方法であり、切断タンパク質や凝集体を保持時間（retention time）により分離することができる。ＴＳＫ−ＧＥＬ３０００ＳＷＸＬカラム（Tosoh Bioscience; 7.8 mm ID * 30 cm H）をＰＢＳにより１ｍｌ／ｍｉｎの流速で平衡化し、２０μｇのタンパク質を注入してタンパク質を分析した。その結果を図７に示す。
【００８７】
図７に示されるように、ピーク１にはメインピークの次の小さいピークが観察されたが、これは相対的にサイズの小さい切断された形態を示す。ピーク２ではＳＥ−ＨＰＬＣにおいて単一のピークが検出された。ピーク３ではメインピークより先に２つのピークが溶出したが、これらはタンパク質の凝集体であることを示す。
【００８８】
この結果は、本発明のＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質製造方法が、ＴＨＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質混合液から活性型ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質のみ効率的に分離するのに使用できる方法であることを示すものである。
【００８９】
実験例４：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ生物学的活性
実験例１−１のピーク２とピーク３の分画とＴＮＦ−αとの結合を確認した。ピーク２分画又はピーク３分画を適宜希釈し、抗ＩｇＦｃ抗体がコーティングされた固体表面に結合させた。その後、ＴＮＦ−αで処理してピーク２及びピーク３分画がＴＮＦ アルファと結合することをＨＲＰで発色させて確認した。その結果を図８に示した。
【００９０】
その結果、図８から分かるように、基準結合単位（binding unit）を１００としたとき、ピーク２は１００に相当する値を示すのに対して、ピーク３は２０以下の値を示すので、本発明の方法を行った場合、活性型と不活性型を相互に効果的に分離できることが示された。
【００９１】
実験例５：疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）におけるタンパク質注入量による置換効果の比較
実験例１−１と同一の試料、同一の方法で、単位カラム体積当たりの試料の注入量のみ変更して分析した。実験例１−１においては実施例４で製造した溶液を１２ｇ／Ｌ ｂｅｄでカラムに注入したのに対して、本実験例においてはそれぞれ９．５ｇ／Ｌ ｂｅｄと１３ｇ／Ｌ ｂｅｄの容量で注入して分離分析した。その結果をそれぞれ図９及び図１０に示す。
【００９２】
図９に示すように、相対的に少ない量を注入した場合（９．５ｇ／Ｌ ｂｅｄ）、切断型タンパク質分画であるピーク１がピーク２から分離されなかった。それに対して、図6に示すように、多い量を注入した場合（１３ｇ／Ｌ ｂｅｄ）、切断型タンパク質分画であるピーク１が活性型タンパク質分画であるピーク２から明確に分離された。
【００９３】
前記結果は、本発明のＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質の精製において、注入するタンパク質の量が活性型タンパク質の効果的な分離において重要な要素であることを示すものである。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年2月17日(2014.2.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
図９に示すように、相対的に少ない量を注入した場合（９．５ｇ／Ｌ ｂｅｄ）、切断型タンパク質分画であるピーク１がピーク２から分離されなかった。それに対して、図１０に示すように、多い量を注入した場合（１３ｇ／Ｌ ｂｅｄ）、切断型タンパク質分画であるピーク１が活性型タンパク質分画であるピーク２から明確に分離された。
【国際調査報告】
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