(57)【要約】  本発明は、がんを予防および／または治療するために使用されるシマリカラクトンＥ（ＳｋＥ）に関する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを予防および／または治療するためのその使用のための、下記式１：
【化１】
2014502632.tif 000003
に相当するシマリカラクトンＥ。
【請求項２】
Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／Ｅｒｋシグナル伝達経路が活性化されるがんを予防および／または治療するための、請求項１に記載のシマリカラクトンＥ。
【請求項３】
上皮性がんおよび血液がんを予防および／または治療するための、請求項１または請求項２に記載のシマリカラクトンＥ。
【請求項４】
黒色腫、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、卵巣がん、腎臓がん、腸がん、結腸がん、肺がんおよび甲状腺がんならびにＥＮＴがんから選ばれる上皮性がんを予防および／または治療するための、請求項１から３の一項に記載のシマリカラクトンＥ。
【請求項５】
黒色腫を予防および／または治療するための、請求項４に記載の、その使用のためのシマリカラクトンＥ。
【請求項６】
悪性の血液疾患から選ばれる血液がんを予防および／または治療するための、請求項１から３の一項に記載の、その使用のためのシマリカラクトンＥ。
【請求項７】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を含む骨髄増殖性症候群（ＭＰＳ）を予防および／または治療するための、請求項６に記載の、その使用のためのシマリカラクトンＥ。
【請求項８】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を予防および／または治療するための、請求項７に記載の、その使用のためのシマリカラクトンＥ。
【請求項９】
経口で、局所に、静脈内にまたは皮下に投与可能な形態である、請求項１から８の一項に記載の、その使用のためのシマリカラクトンＥ。
【請求項１０】
シマリカラクトンＥの日用量が、１０〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である、請求項１から９の一項に記載の、その使用のためのシマリカラクトンＥ。
【請求項１１】
治療期間が、連続した１日から６０日までの間である、請求項１から１０の一項に記載の、その使用のためのシマリカラクトンＥ。
【請求項１２】
シマリカラクトンＥを活性成分として、別の抗がん活性成分および少なくとも１種の薬学的に許容される添加剤と組み合わせて含むことを特徴とする医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、抗がん剤としての、より詳細には、上皮性がんおよび血液がんを予防および／または治療するためのシマリカラクトンＥ（ＳｋＥ）の使用である。
【背景技術】
【０００２】
シマリカラクトンＥは、その抗寄生虫有効性およびその低毒性で有名な、アマゾン川流域のニガキ科（Ｓｉｍａｒｏｕｂａｃｅａｅ）の植物、すなわち、クアッシアアマラ（Ｑｕａｓｓｉａ  ａｍａｒａ）植物から単離されたクアシノイドである（Ｖｉｇｎｅｒｏｎ他，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（２００５），９８巻，３５１〜３６０頁；Ｂｅｒｔａｎｉ他，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（２００５），９８巻，４５〜５４頁）。シマリカラクトンＥは、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に対するインビトロにおけるその抗マラリア活性、ネズミマラリア原虫に対するインビボにおける経口でのその抗マラリア活性、ならびにヒトにおけるこの同寄生虫の肝細胞型および生殖母細胞型に対するその抗マラリア活性について、仏国特許出願第０９  ０２９５９号に記載されている。シマリカラクトンＥは、試験株のクロロキン感受性とは無関係に、２４から６８ｎＭの間の用量で、培養物中の熱帯熱マラリア原虫の増殖の５０％を阻害することが実証されている。シマリカラクトンＥは、６５７４ｎＭの用量で、ベロ哺乳動物細胞の増殖の５０％を阻害し、このことは、シマリカラクトンＥの選択指数が１００を超えることを示している。シマリカラクトンＥはまた、この活性についての参照分子であるプリマキンを用いて得られた場合よりも７倍低い濃度で、生殖母細胞レベルを５０％低下させる。インビボにおいて、マラリアのネズミモデルに関して、シマリカラクトンＥは、腹腔内では０．５ｍｇ／ｋｇ／日および経口では１ｍｇ／ｋｇ／日の用量でそれぞれ、プラスモジウムビンケイペッテリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｎｃｋｅｉ  ｐｅｔｔｅｒｉ）の増殖の５０％を阻害する（参照分子であるクロロキンは、腹腔内に３ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、プラスモジウムビンケイペッテリの増殖の５０％を阻害する）。
【０００３】
その後、マウスを対象とした前臨床試験によって、シマリカラクトンＥの耐用量を同定することが可能となり、Ｐｅｔｅｒｓの４日間抗マラリア抑制試験では、経口で１ｍｇ／ｋｇ／日、４日間であった（Ｃａｃｈｅｔ他，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（２００９）Ｖｏｌ．５３，Ｎｏ．１０，４３９３〜４３９８頁）。この研究はまた、シマリカラクトンＥがある特定の細胞系に及ぼす、中等度の細胞毒性作用を実証している。しかし、インビトロまたはインビボにおけるシマリカラクトンＥのいかなる抗腫瘍効果についても言及されていない。さらに、たとえ腫瘍細胞系に関するものであっても、所与の化合物の細胞毒性作用の実証は、抗がん効果を意味するものでは決してなく、この化合物がインビボで不活性であると分かるか、そうでなければそれを生物に投与できないような細胞毒性を示す可能性があることに留意するべきである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】仏国特許出願第０９  ０２９５９号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｖｉｇｎｅｒｏｎ他，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（２００５），９８巻，３５１〜３６０頁
【非特許文献２】Ｂｅｒｔａｎｉ他，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（２００５），９８巻，４５〜５４頁
【非特許文献３】Ｃａｃｈｅｔ他，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（２００９）Ｖｏｌ．５３，Ｎｏ．１０，４３９３〜４３９８頁
【非特許文献４】Ｆｉｒａｇｕａｙ他，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｅｖｅｎｔｓ  ｂｙ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ，２：１３頁，２００９
【非特許文献５】Ｂｏｒｒａｓ他，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００１，１１：４０６頁
【非特許文献６】Ｌｅｎｎｅｒｚ他，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，７  Ｄｅｃ．２０１１
【非特許文献７】ＤＯＩ：１０．１１１１／ｊ．１３６５−２１４１．２０１１．０８９６３．ｘ
【非特許文献８】Ｆｅｎｏｕｉｌｌｅ他，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１０），７０（２３）：９６５９〜７０頁
【非特許文献９】Ｇｉｏｉａ他，Ｂｌｏｏｄ，２０１１，１１８：２２１１〜２２２１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
驚いたことに、本発明者らは、シマリカラクトンＥが、がんにおいてしばしば改変されるシグナル伝達経路の１つであるＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／Ｅｒｋシグナル伝達経路の選択的阻害剤であることに気付くことができた。
【０００７】
Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／Ｅｒｋシグナル伝達経路は、既知のがん、すなわち、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、肺がんおよび甲状腺がんのうちの２０％および急性白血病の症例のうちの５０％超において活性化される。例えば、Ｒａｓ分子は、ヒトのがんのうちの１５％において突然変異し、より詳細には、Ｎ−ｒａｓ（Ｑ６１Ｌ）は、黒色腫のうちの１５から３０％において突然変異し、Ｂ−ｒａｆは、黒色腫のうちの６０％においておよび甲状腺がんのうちの３０から５０％において突然変異する。
【０００８】
Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／Ｅｒｋシグナル伝達経路の活性化は、速やかにおよび明らかに同定することが可能である。この伝達経路を同定するために使用することができる方法の１つは、フローサイトメトリーまたは「ホスホフロー」技術によるタンパク質リン酸化の分析である（Ｆｉｒａｇｕａｙ他，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｅｖｅｎｔｓ  ｂｙ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ，２：１３頁，２００９）。この技術を用いると、ＭＥＫおよびＥｒｋキナーゼのリン酸化のレベルと、それゆえ活性化とを動的にモニターすることが可能となる。
【０００９】
さらに、明確な突然変異または転座は、Ｅｒｋ１／２（ＭＡＰキナーゼ）経路が超活性化される病理学的状態に関連している。これらの既知の突然変異は、パイロシークエンシング（Ｂｏｒｒａｓ他，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００１，１１：４０６頁、Ｌｅｎｎｅｒｚ他，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，７  Ｄｅｃ．２０１１、ＤＯＩ：１０．１１１１／ｊ．１３６５−２１４１．２０１１．０８９６３．ｘ）によって、患者において速やかに同定することができ、パイロシークエンシングは、クローニングすることなく、速やかにシークエンシングを行い、得られたシークエンスを直接読み取るための技術であり、サンガー法を使用するシークエンシングに比べて低価格である。
【００１０】
結果として、これらの経路が構成的に活性化されている、黒色腫系および悪性の血液疾患などのがん細胞系において、シマリカラクトンＥは、より顕著な効果を有する。
【００１１】
本発明者らは、シマリカラクトンＥがインビトロにおける強力な抗増殖効果および細胞死誘導効果を有すること、より詳細には、Ｅｒｋ１／２（ＭＡＰキナーゼ）経路が超活性化される腫瘍細胞に対してそれらの効果を有することを立証した。同定されている作用機序は、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／Ｅｒｋシグナル伝達経路の阻害に関係している。Ｅｒｋ１／２（ＭＡＰキナーゼ）経路の活性化突然変異または超活性化はヒトのがんにおいてよく見出されるため、この経路を標的とすることは、癌腫学における重要な課題である。これは、Ｅｒｋ１／２キナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）の超活性化が起こる、黒色腫におけるＢ−ｒａｆについて特に当てはまる。
【００１２】
同様に、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）では、この疾患の原因である異常、ｔ（９；２２）転座の結果生じる遺伝子によってコードされているｐ２１０  ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼがＥｒｋ１／２キナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）の超活性化を誘導する。さらに、ＴＫＩ（Ｇｌｉｖｅｃ（登録商標）、Ｓｐｒｙｃｅｌ（登録商標））に耐性を示すある特定のＣＭＬ系は、ＳｒｃキナーゼであるＦｙｎおよびＬｙｎの発現および活性化の増大によるＥｒｋ１／２キナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）の激化を示す（Ｆｅｎｏｕｉｌｌｅ他，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１０），７０（２３）：９６５９〜７０頁；Ｇｉｏｉａ他，Ｂｌｏｏｄ，２０１１，１１８：２２１１〜２２２１頁）。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって、本発明の主題は、適応症として、がん、より詳細には上皮性がんおよび血液がんの予防および／または治療に関する、下記式１
【００１４】
【化１】
2014502632.tif 000002
【００１５】
に相当するシマリカラクトンＥであり、シマリカラクトンＥは、Ｅｒｋ１／２（ＭＡＰキナーゼ）経路、より詳細には、Ｒａｆキナーゼならびにその下流のキナーゼであるＭＥＫおよびＥｒｋのリン酸化を効果的に阻害する。
【００１６】
それゆえに、本発明の主題は、適応症として、黒色腫、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、腎臓がん、腸がん、結腸がん、膵臓がん、肺がんおよび甲状腺がんならびにＥＮＴがんから選ばれる上皮性がんの予防および／または治療に関するシマリカラクトンＥである。
【００１７】
本発明の主題はまた、適応症として、悪性の血液疾患、より詳細には、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を含む骨髄増殖性症候群（ＭＰＳ）から選ばれる血液がんの予防および／または治療に関するシマリカラクトンＥ、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を予防および／または治療するのにより特に適したシマリカラクトンＥの使用である。
【００１８】
適切な投与形態は、経口で投与可能な、錠剤、ソフトまたはハードゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤および経口液剤または懸濁剤などの形態、局所に、例えば、クリーム剤、ゲル剤、軟膏剤またはローション剤の形態で、静脈内に、皮下に、筋肉内に、坐剤の形態で、点眼剤の形態で、眼用ゲル剤の形態でまたは皮下に遅延放出インプラントの形態で投与可能な形態を含む。
【００１９】
活性成分であるシマリカラクトンＥを、１種または複数種の薬学的に許容される賦形剤、例えば、ゼラチン、デンプン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、アラビアゴム、マンニトール、微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロースまたは類似の成分などと混合することによって、固体組成物を錠剤形態に調製することが可能である。錠剤は、スクロースで、セルロースベースの誘導体でまたはコーティングに適した他の物質でコーティングすることができる。錠剤は、直接圧縮、乾式造粒、湿式造粒または加熱溶融法などの、当業者によく知られている種々の技術によって調製することができる。
【００２０】
活性成分を、希釈剤と混合することによっておよび得られた混合物をソフトまたはハードゲルカプセル中に注ぐことによって、組成物をゲルカプセル形態に調製することも可能である。
【００２１】
シマリカラクトンＥの日用量は、有利には以下である：すなわち、１０〜５０ｍｇ／ｋｇ／日までのシマリカラクトンＥである。特に、これらの用量は、経口投与に適している。
【００２２】
より高いまたはより低い投与量が適切である特定の場合があり得る；そのような投与量は、本発明の範囲から逸脱しない。通常の診療によると、各患者にとって適切な投与量は、投与方法ならびに前記患者の体重および治療に対する反応に従って、医師によって決められる。
【００２３】
本発明の医薬品は、優先的に、連続した１日から６０日、好ましくは、２０から４０日まで、１日１回または複数回の服用で、好ましくは１日１回の服用で投与されることを意図する。
【００２４】
本発明はまた、シマリカラクトンＥを活性成分として、別の抗がん活性成分および少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物に関する。シマリカラクトンＥと組み合わされる抗がん活性成分は、治療される抗がん疾患に従って、当業者に知られている活性成分から選ばれる。
【００２５】
シマリカラクトンＥは、クアッシアアマラの成熟葉から、以下のステップを含むプロトコルを用いることによって単離することができる：クアッシアアマラの成熟葉を粉砕し、メタノールを用いて抽出する。この抽出物を、ｎ−ヘプタン、酢酸エチル、メタノールおよび水をベースとする二相系中に溶解させる。下相を回収し、その体積を減圧下での蒸発によって半分に減じる。この溶液を、酢酸エチルを用いて抽出する。酢酸エチルを蒸発させて除去する。得られた残渣をクロロホルム中に溶解させ、弱塩基性の水溶液を用いて洗浄する。有機相を回収し、脱水し、減圧下で濃縮する。この抽出物を酢酸エチル中に溶解させ、水を用いて洗浄する。有機相を減圧下で蒸発させ、得られた残渣を、シリカカラムを通して、酢酸エチルを用いて溶出させる。
【００２６】
得られた抽出物を、以下のプロトコルに従って精製する：抽出物を、遠心分配クロマトグラフィーにかけ、ｎ−ヘプタン、酢酸エチル、メタノールおよび水から構成されるＡｒｉｚｏｎａ  Ｈ系を使用することによって、上昇モードで分画する。２５ｍｌの試料を回収する。シマリカラクトンＥを含む試料を組み合わせ、シリカカラムクロマトグラフィーにかけ、シクロヘキサン／酢酸エチルの混合物を用い、極性を増加させて溶出を行うことによって精製する。シマリカラクトンＥを、５０／５０のシクロヘキサン／酢酸エチル混合物を用いて溶出させる。
【００２７】
上記の準備に加えて、本発明は、次に続くさらなる説明から明らかになる他の準備も含む。かかる説明は、シマリカラクトンＥの抗腫瘍特性を実証している実施例および添付の図面にも関連しており、図面においては以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】シマリカラクトンＥがＫ５６２−Ｉｍａ−ＳおよびＫ５６２−Ｉｍａ−Ｒ白血病細胞系の増殖および生存率に及ぼす効果を表すグラフである。
【図２】シマリカラクトンＥがＡ３７５およびＭｅＷｏ黒色腫細胞の増殖および生存率に及ぼす効果を表すグラフである。
【図３】ＳｋＥがＫ５６２細胞のクローン形成能に及ぼす効果を実証するグラフ（写真はＣａｎｏｎ（登録商標）デジタル装置を用いて撮影されたもの）である。
【図４】シマリカラクトンＥがＣＭＬに罹患している患者由来のＣＤ３４＋ヒト初代細胞の生存率に及ぼす効果を表すグラフである。
【図５】シマリカラクトンＥが種々のタイプの死の指標：アポトーシス死（ＰＡＲＰ切断）および自食死（ＬＣ３変換）に及ぼす動態効果を示す図である。Ｅｒｋ１／２キナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）のリン酸化のレベルも観察される。
【図６】シマリカラクトンＥがＥｒｋ１／２キナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）のリン酸化に及ぼす効果を示す図である。
【図７】シマリカラクトンＥがヌードマウスにおけるＫ５６２−Ｌｕｃ細胞の異種移植片に及ぼす効果を示す図である。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、Ｉｍａ（イマチニブ６０ｍｇ／ｋｇ）およびＳｋＥ（シマリカラクトンＥ１ｍｇ／ｋｇ）について、放出される光子の数の絶対定量化を絶対値として表す（ｃｐｍ＝カウント毎分）。
【図８】シマリカラクトンＥがヌードマウスにおけるＫ５６２−Ｌｕｃ細胞の異種移植片に及ぼす効果を示す図である。５分間取得のＢｉｏｓｐａｃｅフォトイメージャーによって行った取得（Ａ：ＰＢＳで処理したマウス、Ｂ：６０ｍｇ／ｋｇのイマチニブで処理したマウス、Ｃ：１ｍｇ／ｋｇのＳｋＥで処理したマウス）である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
実験の項
Ａ−シマリカラクトンＥを得るためのプロトコル
クアッシアアマラの葉を、仏領ギアナのＲｅｍｉｒｅ−Ｍｏｎｔｊｏｌｙにおいて採収した。標本（ＧＢ３０１２）を採収し、その植物学的同定をギアナのＣａｙｅｎｎｅＨｅｒｂａｒｉｕｍにおいて確認した。
【００３０】
シマリカラクトンＥを、クアッシアアマラから、以下のプロトコルを使用することによって単離した：クアッシアアマラの乾燥した成熟葉１ｋｇを粉砕し、６ｌのメタノールを用いて２４時間抽出し、この抽出を２回行って、２００ｇの抽出物を得る。この抽出物のうちの５０ｇを、ｎ−ヘプタン、酢酸エチル、メタノールおよび水が３／２／３／２の比率で構成される二相系２ｌ中に溶解させる。最も重い相を濃縮して５００ｍｌにし、それに５００ｍｌの水を加える。この溶液を、１ ｌの酢酸エチルを用いて抽出する。酢酸エチルを減圧下で蒸発させて除去する。得られた残渣を１．５ ｌのクロロホルム中に溶解させ、０．００１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いて４回洗浄する。有機相を回収し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、減圧下で濃縮して、３．３ｇの抽出物を得る。この抽出物を５００ｍｌの酢酸エチル中に溶解させ、５００ｍｌの水を用いて洗浄する。有機相を減圧下で蒸発させ、得られた残渣を、短いシリカカラムに通して、酢酸エチルを用いて急速に溶出させる。酢酸エチルを蒸発させて除去した後、１．０ｇの抽出物を得る。この抽出物を遠心分配クロマトグラフィー（１ｌの回転子が装備されているＫｒｏｍａｔｏｎ装置）にかけ、ｎ−ヘプタン、酢酸エチル、メタノールおよび水が１／３／１／３の比率で構成されるＡｒｉｚｏｎａ  Ｈ系を使用することによって、上昇モード、１６℃の温度で分画する。溶媒の流量は２５ｍｌ／分であり、回転子速度は１０００ｒｐｍであり、溶出の間には、４０バールの圧力を維持するように変化させる。抽出物（１．０ｇ）を４０ｍｌのＡｒｉｚｏｎａ  Ｈ系中に溶解させ、ろ過して注入する。２５ｍｌの試料を回収する。試料を組み合わせて、画分Ｆ１（１２０ｍｇ）を得る。この画分をシリカカラムクロマトグラフィーにかけ、シクロヘキサン／酢酸エチルの混合物を用い、極性を増加させて溶出を行うことによって精製する。シマリカラクトンＥ（１０ｍｇ）を、５０／５０のシクロヘキサン／酢酸エチル混合物を用いて溶出させる。植物からの収率は０．００４％である。
【００３１】
シマリカラクトンＥを、質量分析によって、ＮＭＲおよび赤外分光法によってならびにその旋光度によって特性決定した。結晶が重水素化メタノールから得られたため、分子のＸ線画像も得られた。シマリカラクトンＥの物理化学的特性は、以下の通りである。
APCIMS, 579 (MH+), 561 (MH+-H2O).
1H NMR (CDCl3, 500 MHz), δ 6.19 (m, 1H, H-15), 6.17 (s, 1H, H-3), 5.19 (dd, J = 2.6, 11.7 Hz, 1H, H-6), 4.75 (d, J = 5.1 Hz, 1H, H-11), 4.70 (d, J = 2.6 Hz, 1H, H-7), 4.65 (d, J = 7.4 Hz, 1H, H-17a), 4.19 (s, 1H, H-1), 3.83 (s, 1H, H-12), 3.70 (d, J = 7.4 Hz, 1H, H-17b), 3.37 (d, J = 11.5 Hz, 1H, H-5), 2.51 (m, 1H, H-24), 2.48 (m, 1H, H-19), 2.45 (m, 1H, H-14), 2.43 (m, 1H, H-9), 2.08 (s, 3H, H-30), 1.79 (m, 2H, H-21a, H-26a), 1.61 (m, 1H, H-26b), 1.53 (m, 1H, H-21b), 1.45 (s, 3H, H-28), 1.35 (s, 3H, H-29), 1.21 (d, J = 7.0 Hz, 3H, H-20), 1.19 (d, J = 7.0 Hz, 3H, H-25), 1.01 (t, J = 7.4 Hz, 3H, H-22), 0.99 (t, J = 7.4 Hz, 3H, H-27).
13C NMR (CDCl3, 125 MHz), δ 196.5 (C-2), 176.2 (C-23), 175.2 (C-18), 166.5 (C-16), 163.0 (C-4), 126.5 (C-3), 82.8 (C-7), 81.8 (C-1), 80.0 (C-13), 79.8 (C-12), 74.2 (C-11), 70.9 (C-17), 69.1 (C-6), 67.3 (C-15), 52.7 (C-14), 50.4 (C-10), 46.1 (C-8), 45.9 (C-5), 41.3 (C-24), 41.3 (C-19), 41.1 (C-9), 27.2 (C-26), 26.7 (C-21), 26.1 (C-30), 22.8 (C-28), 16.7 (C-20), 15.6 (C-25), 12.5 (C-29), 11.7 (C-22), 11.5 (C-27).
IR (KBr, cm-1): 2965, 2926, 2855, 1766, 1738, 1722, 1667.
[α]D26= +94° (c = 0.35, CHCl3).
Ｂ−生物学的活性
Ｂ１−材料および方法
使用する薬物を、事前に、純粋なＤＭＳＯ中に１０００倍希釈しておく（ＤＭＳＯの最終濃度：０．１％）。
Ｂ１−１．ＸＴＴ細胞生存率の測定
この試験は、細胞生存率の指標を表す、ミトコンドリアのコハク酸デヒドロゲナーゼの活性を測定する。この酵素は、ＸＴＴをオレンジ色のホルマザンに変換する。０日目に、Ｋ５６２−Ｉｍａ−Ｓ（Ｉｍａに感受性である）、Ｋ５６２−Ｉｍａ−Ｒ（Ｉｍａに耐性である）、Ａ３７５またはＭｅＷｏ細胞を、９６−ウェルマイクロプレートに１５０００細胞／ウェル（１００μｌ）で播種し、シマリカラクトンＥの濃度を増加させて［５０〜５００ｎＭ］刺激する。２４または４８時間後、５０μｌのテトラゾリウム（ＸＴＴ試薬）を各ウェルに加え、４９０ｎｍでの光学密度を、３０分毎に２から４時間読み取る。得られた値は、ミトコンドリアの代謝の指標であり、生存細胞の割合（％）を評価することが可能となる。各条件を、体系的に３回繰り返して行う。
Ｂ１−２．Ｋ５６２細胞のクローン形成能の評価
メチルセルロース（４０％Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ（登録商標）、１％Ｌ−グルタミン、５％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）および５４％ＩＭＤＭ（イスコフ改変ダルベッコ培地））のアリコートを、３７℃で１時間加熱する。４００μｌのＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地）、処理薬（１μＭイマチニブ、１００、２５０または５００ｎＭのＳｋＥ）を含有する５％のＦＣＳおよび２００μｌの培地中１０３個のＫ５６２細胞を、各アリコートに加える。次いで、各条件について、得られた５００μｌの懸濁液を、２４−ウェルプレートのうちの３ウェルに沈降させる。未処理条件は、対照としての役割を果たす。プレートを、３７℃で７から１０日間インキュベートする。７５μｌのＭＴＴテトラゾリウム塩（Ｒｏｃｈｅ）（２．５ｍｇ／ｍｌ）を、各ウェルに加える。代謝的に活性な細胞によって、ＭＴＴテトラゾリウム塩が開裂し、紫色を呈するホルマザン結晶になる。３７℃で４時間のインキュベーション後、ウェルを写真撮影し、Ｉｍａｇｅ  Ｊプログラムを使用して、クローンを定量化する。
Ｂ１−３．細胞死測定
以下のプロトコルに従って、シマリカラクトンＥの効果に伴う細胞死のタイプの特性決定を行う。
【００３２】
・アポトーシス（Ｉ型細胞死）は、カスパーゼ活性をアッセイすることによって詳しく調査する。カスパーゼは、このタイプのプロセスに関与するシステインプロテアーゼである。アポトーシスを、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム共標識によっても定量化する。アネキシンＶをミトコンドリアのレベルで表面化する細胞が、アポトーシスを受けている細胞である。
【００３３】
・自食死（ＩＩ型細胞死）は、カテプシン活性をアッセイすることによって分析する。これらのプロテアーゼについては、小嚢に含まれる細胞内物質の分解に関与する（オートファゴリソソーム）。ＩＩ型細胞死は、電子顕微鏡での撮像によっても実証することができる。
【００３４】
・最後に、ウェスタンブロット（タンパク質移動）を、アポトーシス（ＰＡＲＰおよびカスパーゼの切断）または自食死（ＬＣ３−ＩのＬＣ３−ＩＩへの変換およびカテプシンの活性化）の誘導に対して特異的な抗体を使用して行う。
Ｂ１−４．ヌードマウスにおけるＫ５６２−Ｌｕｃ細胞の異種移植片
異種移植片に使用する系は、ルシフェラーゼをコードする遺伝子を安定的に発現するＫ５６２−Ｌｕｃ系である。５％のＦＣＳを含有し、ピルビン酸ナトリウムおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補充し、１０μＭブラストサイジン（プラスミドがコードするルシフェラーゼをプロセシングする細胞の選択を可能にする抗生物質）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で、この系を培養する。
【００３５】
各注射あたり、１０６個のＫ５６２−Ｌｕｃ細胞を、２００μｌの培地、７０％ＰＢＳおよび３０％マトリゲル中に調製する。各ヌードマウスの各脇腹に、皮下注射を１回行う。マウスに１００μｌの腹腔内注射を週３回行う。群に応じて、これらの動物に、ＰＢＳまたはイマチニブ（６０ｍｇ／ｋｇ）またはＳｋＥ（１ｍｇ／ｋｇ）を投与する。
【００３６】
腫瘍増殖の評価を週１回行う。
【００３７】
各動物に、覚醒中、３０ｍｇ／ｍｌのルシフェリン（Ｃａｌｌｉｐｅｒ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を１００μｌ注射する。５分後、動物の麻酔を、１分間当たりおよびＯ２１リットル当たり５％イソフルランの吸入によって行う。次いで、動物を１群５匹でフォトンイメージャーの中に移動し、そこでは、麻酔を２％イソフルランで維持する。ルシフェリンは、腫瘍細胞によって発現されるルシフェラーゼによって分解される。この分解は光子の放出を伴い、これがフォトンイメージャーによって測定される。
【００３８】
腫瘍のサイズおよび代謝活性は、光子放出の強度によって評価することができる。
Ｂ２−結果
Ｂ２−１．種々の腫瘍細胞系の増殖の阻害および生存率の低下
Ｋ５６２−Ｉｍａ−ＳおよびＫ５６２−Ｉｍａ−Ｒ腫瘍系を、パン−カスパーゼ阻害剤（アポトーシス阻害剤）である最大有効濃度（５０μＭ）のｚ−Ｖａｄ−ｆｍｋ（Ｚｖａｄ）の非存在下または存在下で、シマリカラクトンＥの濃度を増加させて（０、１００または２５０ｎＭ）、４８時間インキュベートする。
【００３９】
結果を図１に提示する。
【００４０】
２種の白血病系は、シマリカラクトンＥの効果に感受性であり、シマリカラクトンＥの効果は、カスパーゼ阻害剤の存在下で改変されず、それによって、シマリカラクトンＥの存在下での細胞の生存率の減少は、アポトーシスを必要としないことが実証される。
【００４１】
次いで、Ａ３７５およびＭｅＷｏ黒色腫細胞を、増加させた用量のシマリカラクトンＥの存在下で処理する。４８時間後、細胞をＸＴＴ試験に供する。Ａ３７５細胞は、Ｂ−ｒａｆ腫瘍遺伝子におけるＶ６００Ｅ突然変異を有しており、これはＥｒｋ経路の構成的な活性化によって反映される。興味深いことに、Ａ３７５細胞は、Ｂ−ｒａｆ突然変異を有さないＭｅＷｏ細胞よりもさらに一層、シマリカラクトンＥに感受性である。
【００４２】
結果を図２に提示する。
【００４３】
ＳｋＥがＫ５６２細胞のクローン形成能に及ぼす効果は、図３にも実証されている。クローン形成能とは、単離された細胞からコロニーを形成する能力を表し、がん細胞に固有の特性である。それゆえに、ＳｋＥは、２から４倍低い濃度で、キメラタンパク質ＢＣＲ−ＡＢＬに直接作用するイマチニブ（病理学的状態ＣＭＬに対する対照処理）と同じくらい効果的に、Ｋ５６２細胞のクローン形成能を阻害する能力があることが観察される。
Ｂ２−２．ＣＭＬに罹患している患者由来のＣＤ３４＋ヒト初代細胞の生存の阻害
ＣＭＬに罹患している患者由来の初代細胞（精製したＣＤ３４＋  Ｂｃｒ−Ａｂｌ＋）を、変化させた濃度のシマリカラクトンＥの存在下で、４８時間インキュベートし、次いで、ＸＴＴ比色試験を使用して、細胞生存率を定量化する。イマチニブ（Ｉｍａ）を、Ｂｃｒ−Ａｂｌ＋の細胞死誘導のための陽性対照として使用する。
【００４４】
結果を図４に提示する。
【００４５】
細胞代謝を阻害することについて、５００ｎＭの濃度のシマリカラクトンＥは、イマチニブと同じくらい効果的であることが判明する。最大有効半量（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍｕｍ  ｅｆｆｅｃｔ）は、シマリカラクトンＥの１００ｎＭの用量に対して得られる。
Ｂ２−３．Ｅｒｋ１／２キナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）リン酸化の阻害
Ｋ５６２−Ｉｍａ−Ｓ（Ａ）細胞およびＫ５６２−Ｉｍａ−Ｒ（Ｂ）細胞を、２５０ｎＭのシマリカラクトンＥで、変化させた期間処理する。次いで、ウェスタンブロット分析用に、細胞を分解させ、タンパク質抽出物を調製する。最後に、種々の抗−ＰＡＲＰ、ＬＣ３ｂ、ｐ−Ｅｒｋ１／２、Ｅｒｋ１／２およびＨＳＰ６０抗体の存在下で、膜をインキュベートする。図５は、シマリカラクトンＥが、イマチニブ−感受性細胞およびイマチニブ−耐性細胞の両方において、Ｅｒｋタンパク質の全般的な発現を改変することなく、Ｅｒｋ１／２キナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）リン酸化を阻害することを示している。シマリカラクトンＥのこの効果は、アポトーシスが起こらない場合（ＰＡＲＰの切断が起こらない）および自食作用が起こらない場合（ＬＣ３の改変が起こらない）に生じる。
【００４６】
次いで、Ｋ５６２−Ｉｍａ−Ｓ細胞を、２５０ｎＭのシマリカラクトンＥまたは１０μＭのＵ０１２６（ＭＥＫ１／２の特定の阻害剤、Ｅｒｋ１／２（ＭＡＰキナーゼ）リン酸化および活性化に関与しているキナーゼ）の存在下で、１時間処理する。次いで、ウェスタンブロット分析用に、細胞を分解させ、タンパク質抽出物を調製する。次いで、ｐ−Ｅｒｋ１／２、Ｅｒｋ１／２およびＨＳＰ６０抗体の存在下で、膜をインキュベートする。図６Ａは、２５０ｎＭの濃度のシマリカラクトンＥが、４０倍高い濃度のＵ０１２６と同じくらい効果的であることを示しており、Ｕ０１２６は、インビトロでＥｒｋ１／２（ＭＡＰキナーゼ）の活性を遮断するために、現在最も広く使用されているＭＥＫ１／２阻害剤である。
【００４７】
図６Ｂに提示されている実験では、誘導可能なＨＥＫ−Ｒａｆ１−ＥＲ細胞を使用した。これらの細胞は、エストロゲン受容体の制御下で、Ｒａｆキナーゼを発現する。したがって、Ｒａｆの発現を、タモキシフェンの存在下で誘導することができる。細胞を、増加させた用量のシマリカラクトンＥまたはＵ０１２６とともに、３０分間プレインキュベートし、次いで、１μＭのタモキシフェンで１時間処理する。次いで、ウェスタンブロット分析用に、細胞を分解させ、タンパク質抽出物を調製する。最後に、種々の抗体（ｐ−Ｅｒｋ１／２、Ｅｒｋ１／２およびＨＳＰ６０）の存在下で、膜をインキュベートする。シマリカラクトンＥおよびＵ０１２６は、Ｒａｆ１−依存性Ｅｒｋ１／２（ＭＡＰキナーゼ）リン酸化を阻害する。これらの結果は、シマリカラクトンＥが、Ｅｒｋ１／２（ＭＡＰキナーゼ）経路を、ＭＥＫ１／２のレベルでまたはその上流で遮断することを示している。
Ｂ２−４．ヌードマウスにおけるＫ５６２−Ｌｕｃ細胞の異種移植片
ヌードマウスにおけるＫ５６２−Ｌｕｃ細胞の異種移植片の結果を、図７および図８に提示する。
【００４８】
図８は、６０ｍｇ／ｋｇのイマチニブで処理したマウス（参照処理）および１ｍｇ／ｋｇのＳｋＥで処理したマウスと比較して、ＰＢＳで処理したマウス（対照処理）に、大きい腫瘍が認められることを示している。
【図１】
2014502632.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年5月3日(2012.5.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを予防および／または治療するためのその使用のための、下記式１：
【化１】
2014502632.tif 000012
に相当するシマリカラクトンＥ。
【請求項２】
Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／Ｅｒｋシグナル伝達経路が活性化されるがんを予防および／または治療するための、請求項１に記載の、その使用のためのシマリカラクトンＥ。
【請求項３】
上皮性がんおよび血液がんを予防および／または治療するための、請求項１または請求項２に記載の、その使用のためのシマリカラクトンＥ。
【請求項４】
黒色腫、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、卵巣がん、腎臓がん、腸がん、結腸がん、肺がんおよび甲状腺がんならびにＥＮＴがんから選ばれる上皮性がんを予防および／または治療するための、請求項１から３の一項に記載の、その使用のためのシマリカラクトンＥ。
【請求項５】
黒色腫を予防および／または治療するための、請求項４に記載の、その使用のためのシマリカラクトンＥ。
【請求項６】
悪性の血液疾患から選ばれる血液がんを予防および／または治療するための、請求項１から３の一項に記載の、その使用のためのシマリカラクトンＥ。
【請求項７】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を含む骨髄増殖性症候群（ＭＰＳ）を予防および／または治療するための、請求項６に記載の、その使用のためのシマリカラクトンＥ。
【請求項８】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を予防および／または治療するための、請求項７に記載の、その使用のためのシマリカラクトンＥ。
【請求項９】
経口で、局所に、静脈内にまたは皮下に投与可能な形態である、請求項１から８の一項に記載の、その使用のためのシマリカラクトンＥ。
【請求項１０】
シマリカラクトンＥの日用量が、１０〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である、請求項１から９の一項に記載の、その使用のためのシマリカラクトンＥ。
【請求項１１】
治療期間が、連続した１日から６０日までの間である、請求項１から１０の一項に記載の、その使用のためのシマリカラクトンＥ。
【請求項１２】
シマリカラクトンＥを活性成分として、別の抗がん活性成分および少なくとも１種の薬学的に許容される添加剤と組み合わせて含むことを特徴とする医薬組成物。
【国際調査報告】
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