(57)【要約】  本発明は、二重鎖標的ポリヌクレオチドを配列決定する新規方法に関する。二重鎖標的ポリヌクレオチドの２本鎖は、架橋部によって連結される。標的ポリヌクレオチドの２本鎖は、ポリヌクレオチド結合タンパク質を用いて分離され、標的ポリヌクレオチドは膜貫通ポアを用いて配列決定される。
2014531196.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重鎖標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを提供するステップであり、標的ポリヌクレオチドの２本鎖が標的ポリヌクレオチドの一方の端またはその付近で架橋部（moiety）によって連結されているステップ；
（ｂ）標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離して、標的ポリヌクレオチドの他方の鎖と架橋部によって連結されている標的ポリヌクレオチドの一方の鎖を含む一重鎖ポリヌクレオチドを提供するステップ；
（ｃ）一重鎖ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの一部が膜貫通ポアと相互作用するように一重鎖ポリヌクレオチドを膜貫通ポアを通して移動させるステップ；および
（ｄ）各相互作用の際にポアを通過する電流を測定し、それにより標的ポリヌクレオチドの配列を決定するステップ
を含み、ステップ（ｂ）の分離ステップが、標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離するポリヌクレオチド結合タンパク質とコンストラクトを接触させるステップを含む、方法。
【請求項２】
架橋部がポリマーリンカー、化学的リンカー、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
架橋部がＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはＰＥＧを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
架橋部がヘアピンループである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
一重鎖ポリヌクレオチド全体がポアを通って移動し、標的ポリヌクレオチド全体が配列決定される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ポリヌクレオチド結合タンパク質が膜貫通ポアを通る一重鎖ポリヌクレオチドの移動を制御する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ポリヌクレオチド結合タンパク質が標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離し、ポアを通る一重鎖ポリヌクレオチドの移動を制御する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質が
（ａ）ピコウイルス亜科（Picovirinae family）のウイスル由来である；
（ｂ）Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ由来である；または
（ｃ）ヘリカーゼ由来である、
前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
コンストラクトが標的ポリヌクレオチドの架橋部とは反対側の端に少なくとも１つのポリマーをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
コンストラクトが標的ポリヌクレオチドの一方の鎖にポリマーリーダーを含み、標的ポリヌクレオチドの他方の鎖にポリマーテールを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
一重鎖ポリヌクレオチドが（１）リーダーポリマー、（２）標的ポリヌクレオチドの一方の鎖、（３）架橋部、（４）標的ポリヌクレオチドの他方の鎖、および（５）テールポリマーの順序でポアを通って移動する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
コンストラクトがコンストラクトを膜にカップリングする手段をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
膜貫通ポアがタンパク質ポアまたはソリッドステートポアである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質ポアがＭｓｐまたはα−ヘモリジン（α−ＨＬ）由来である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
膜が両親媒性層またはソリッドステート層である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
膜が脂質二重層である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
コンストラクトが、ポアと相互作用するときに特有の電流を生じる１つまたは複数のマーカーをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
１つまたは複数のマーカーが脱塩基またはヌクレオチドの特異的配列である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
１つまたは複数のマーカーが架橋部の中または付近にある、請求項１７または１９に記載の方法。
【請求項２０】
１つまたは複数のマーカーがポリマーリーダーまたはポリマーテール内に位置する、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２１】
１つまたは複数のマーカーが標的ポリヌクレオチドの供給源を同定する、請求項１９から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）標的ポリヌクレオチドの２本鎖を一方の端またはその付近で連結できる架橋部；および
（ｂ）少なくとも１つのポリマー
を含む、配列決定のための二重鎖標的ポリヌクレオチドを調製するためのキット。
【請求項２３】
リーダーポリマーおよびテールポリマーを含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
リーダーポリマーおよびテールポリマーがポリヌクレオチドであり、リーダーポリマーの一部およびテールポリマーの一部が二重鎖配列を形成する、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
標的ポリヌクレオチドを膜にカップリングする手段をさらに含む、請求項２２から２４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２６】
膜貫通ポアと相互作用するときに特有の電流を生じる１つまたは複数のマーカーをさらに含む、請求項２２から２５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２７】
（ａ）標的ポリヌクレオチドの２本鎖を一方の端またはその付近で架橋部に連結するステップ；および
（ｂ）１つのポリマーを標的ポリヌクレオチドの一方の鎖に他方の端で付着させ、それにより膜貫通ポアを用いて標的ポリヌクレオチドを配列決定することができるコンストラクトを形成するステップ
を含む、配列決定のための二重鎖標的ポリヌクレオチドを調製する方法。
【請求項２８】
ポリマーがリーダーポリマーであり、方法が標的ポリヌクレオチドの他方の鎖のリーダーポリマーと同じ端にテールポリマーを付着させるステップをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
コンストラクトを膜にカップリングする手段をコンストラクトに付着させるステップをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
（ａ）架橋部が別に合成され、標的ポリヌクレオチドに化学的に付着されるもしくは酵素的にライゲーションされる；または
（ｂ）架橋部が標的ポリヌクレオチドのプロセシングにおいて作製される、
請求項２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
二重鎖標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを提供するステップであり、標的ポリヌクレオチドの２本鎖が標的ポリヌクレオチドの一方の端またはその付近で架橋部によって連結されているステップ；
（ｂ）標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離して、標的ポリヌクレオチドの他方の鎖と架橋部によって連結されている標的ポリヌクレオチドの一方の鎖を含む一重鎖ポリヌクレオチドを提供するステップ；
（ｃ）一重鎖ポリヌクレオチドと相補物とが二重鎖ポリヌクレオチドを形成するように一重鎖ポリヌクレオチドの相補物を合成するステップ；
（ｄ）架橋部を用いて二重鎖ポリヌクレオチドの２本鎖を二重鎖ポリヌクレオチドの一方の端またはその付近で連結するステップ；
（ｅ）二重鎖ポリヌクレオチドの２本鎖を分離して、架橋部によって相補物に連結されているオリジナル一重鎖ポリヌクレオチドを含むさらなる一重鎖ポリヌクレオチドを提供するステップ；
（ｆ）相補物中のヌクレオチドの一部が膜貫通ポアと相互作用するように相補物を膜貫通ポアを通して移動させるステップ；および
（ｇ）各相互作用の際にポアを通過する電流を測定し、それにより標的ポリヌクレオチドの配列を決定するステップ
を含み、ステップ（ｅ）の分離ステップが、標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離するポリヌクレオチド結合タンパク質とコンストラクトを接触させるステップを含む、方法。
【請求項３２】
（ａ）膜；（ｂ）前記膜中の複数の膜貫通ポア；（ｃ）標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離できる複数のポリヌクレオチド結合タンパク質；および（ｄ）請求項１に記載の方法を実行するための説明書を含む、二重鎖標的ポリヌクレオチドを配列決定するための装置。
【請求項３３】
（ａ）膜；（ｂ）前記膜中の複数の膜貫通ポア；および（ｃ）標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離できる複数のポリヌクレオチド結合タンパク質を含み、請求項１に記載の方法を実行するためにセットアップされている、二重鎖標的ポリヌクレオチドを配列決定するための装置。
【請求項３４】
前記膜および複数のポアを支持でき、前記ポアおよびタンパク質を用いてポリヌクレオチド配列決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；
配列決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
前記少なくとも１つのリザーバーから前記センサーデバイスに材料を制御可能に供給するように構成された流体系；および
各試料を受けるための複数の容器
を含み、前記流体系が前記容器から前記センサーデバイスに前記試料を選択的に供給するように構成されている、請求項３２または３３に記載の装置。
【請求項３５】
ステップ（ｂ）の後でステップ（ｃ）の前に、
（ｍ）一重鎖ポリヌクレオチドと相補物とが二重鎖ポリヌクレオチドを形成するように一重鎖ポリヌクレオチドの相補物を合成するステップ；
（ｎ）架橋部を用いて二重鎖ポリヌクレオチドの２本鎖を二重鎖ポリヌクレオチドの一方の端またはその付近で連結するステップ；
（ｏ）二重鎖ポリヌクレオチドの２本鎖を分離して、架橋部によって相補物に連結されているオリジナル一重鎖ポリヌクレオチドを含むさらなる一重鎖ポリヌクレオチドを提供するステップ
を場合によりさらに含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二重鎖標的ポリヌクレオチドを配列決定する新規方法に関する。標的ポリヌクレオチドの２本鎖は、架橋部（moiety）によって連結される。標的ポリヌクレオチドの２本鎖は、ポリヌクレオチド結合タンパク質によって分離される。標的ポリヌクレオチドの配列決定は膜貫通ポアを用いて実行される。
【背景技術】
【０００２】
迅速で安価な核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）配列決定技術が、幅広い応用にわたって現在必要である。既存の技術は、主にそれらが、大量の核酸を生成するための増幅技術に依存し、シグナル検出のために多量の専門的な蛍光化学物質を必要とするために、遅く高価である。
【０００３】
膜貫通ポア（ナノポア）は、ポリマーおよび種々の小分子のための直接的、電気的バイオセンサーとして大きな将来性を有する。特に、将来性のあるＤＮＡ配列決定技術としてナノポアが近年注目されている。
【０００４】
電位がナノポア全体に印加される場合、ヌクレオチドなどの分析物が一定時間バレルに一過的に存在する場合に電流が降下する。ヌクレオチドのナノポア検出は、既知のサインおよび持続時間での電流遮断をもたらす。次いでヌクレオチドの濃度は、単一のポアでの単位時間あたりの遮断事象の数（ここで事象はナノポアを通る分析物の移行である）によって決定され得る。
【０００５】
「鎖配列決定」法では、１本のポリヌクレオチド鎖がポアを通り、ヌクレオチドは直接同定される。鎖配列決定は、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するためのＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼなどのヌクレオチドハンドリング酵素（nucleotide handling enzyme）の使用を含み得る。ナノポアを通るｄｓＤＮＡの移行を制御するための酵素を用いるナノポア配列決定は、従来はｄｓＤＮＡコンストラクト（construct）の１本鎖を読み取ることだけに焦点を置いてきた。酵素がポリメラーゼとして用いられる場合、配列決定される部分は一重鎖である。これがナノポアを通して供給され、鎖の先端のプライマー／テンプレート接合部へのｄＮＴＰの付加が、一重鎖部分をナノポアを通して制御された様式で引く。刊行された文献の大部分は鎖の移動を制御するためにこの手法を用いる（Liebermanら、(2010)“Processive Replication of Single DNA Molecules in a Nanopore Catalyzed by phi29 DNA Polymerase”J. Am. Chem. Soc. 132(50): 17961-17972）。ポリメラーゼモードでは、相補鎖は配列決定することができない。発表されたとおり（Liebermanら、(2010)上記）二重鎖エキソヌクレアーゼとして酵素が用いられる場合、相補鎖のアンジッピング（unzipping）にはこの鎖の消化が付随する。したがって、この手法で相補鎖を配列決定することはできない。したがって相補鎖はナノポアによって捕捉および配列決定されることができない。このようにｄｓＤＮＡ中のＤＮＡ情報の半分だけが配列決定される。
【０００６】
より詳細には、ポリメラーゼおよびエキソヌクレアーゼ活性の両方が阻害される場合（三リン酸塩基を含まず、過剰量のＥＤＴＡを含む実行によって）、強く印加された電場によってナノポアを通して引かれると、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素がｄｓＤＮＡをアンジップすることが示されている（図１）（Liebermanら、(2010)上記）。これはアンジッピングモードと称される。アンジッピングモードは、酵素上または酵素を通したｄｓＤＮＡのアンジッピングであることを示し、重要なことに、両鎖と酵素との相互作用を破壊するためおよびハイブリダイズした鎖の間の水素結合に打ち勝つために必要とされる必要力である。従来は第二相補鎖は、効率的な酵素結合のために不可欠であると考えられた。付加的に酵素上または中で鎖をアンジップするために必要な必要力はポアを通るＤＮＡを遅くする主要な制動効果であったと考えられた。このため本発明者らは、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素がどのようにｓｓＤＮＡについての分子ブレーキとして作用でき、ｄｓＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を配列決定するために特に設計されたｄｓＤＮＡコンストラクトのヘアピンターン周辺を配列決定するためにナノポアを通る十分に制御された移動を可能にするかを記載する（図２）。従来アンジッピングモードは、分析物の遠位部分が平滑末端化されているテンプレートを用いて主に実施されてきた（図１）。小さなヘアピンが用いられる場合もあったが、ＤＮＡ設計を単純化するためだけに含まれた。従来の研究は、両方の鎖を読み取る能力を提供するための長いｄｓＤＮＡへのヘアピンの使用を考慮していなかった。これは、アンジッピング移動モデルが、ｓｓＤＮＡ領域に入った場合に（すなわちヘアピン周辺でアンチセンス鎖に沿って移動する場合−図２）ＤＮＡの移動を制御できるＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼまたは関連酵素を考慮していなかったためである。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、二重鎖標的ポリヌクレオチドの両鎖が、２本鎖が架橋部によって連結され、次いで分離される場合にナノポアによって配列決定され得ることを驚くべきことに実証した。さらに本発明者らは、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素が架橋部によって連結されたＤＮＡなどの二重鎖ポリヌクレオチドの２本鎖を分離でき、得られた一重鎖ポリヌクレオチドの膜貫通ポアを通る移動を制御できることも驚くべきことに示した。
【０００８】
架橋部で２本鎖を連結するステップによって二重鎖ポリヌクレオチドの両鎖を配列決定する能力は、多くの有利点、特にポリヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方が配列決定され得るという有利点を有する。これらの有利点は、下により詳細に考察される。
【０００９】
したがって本発明は、二重鎖標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを提供するステップであり、標的ポリヌクレオチドの２本鎖が標的ポリヌクレオチドの一方の端またはその付近で架橋部によって連結されているステップ；
（ｂ）標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離して、標的ポリヌクレオチドの他方の鎖と架橋部によって連結されている標的ポリヌクレオチドの一方の鎖を含む一重鎖ポリヌクレオチドを提供するステップ；
（ｃ）一重鎖ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの一部が膜貫通ポアと相互作用するように一重鎖ポリヌクレオチドを膜貫通ポアを通して移動させるステップ；および
（ｄ）各相互作用の際にポアを通過する電流を測定し、それにより標的ポリヌクレオチドの配列を決定または推定するステップ
を含み、ステップ（ｂ）の分離ステップが、標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離するポリヌクレオチド結合タンパク質とコンストラクトを接触させるステップを含む、方法を提供する。
【００１０】
本発明は、
−  （ａ）標的ポリヌクレオチドの２本鎖を一方の端またはその付近で連結できる架橋部および（ｂ）少なくとも１つのポリマー
を含む、配列決定のための二重鎖標的ポリヌクレオチドを調製するためのキット；
−  （ａ）標的ポリヌクレオチドの２本鎖を一方の端またはその付近で架橋部に連結するステップ；および
（ｂ）１つのポリマーを標的ポリヌクレオチドの一方の鎖に他方の端で付着させ、それにより膜貫通ポアを用いて標的ポリヌクレオチドを配列決定することができるコンストラクトを形成するステップ
を含む、配列決定のための二重鎖標的ポリヌクレオチドを調製する方法；
−  二重鎖標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを提供するステップであり、標的ポリヌクレオチドの２本鎖が標的ポリヌクレオチドの一方の端またはその付近で架橋部によって連結されているステップ；
（ｂ）標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離して、標的ポリヌクレオチドの他方の鎖と架橋部によって連結されている標的ポリヌクレオチドの一方の鎖を含む一重鎖ポリヌクレオチドを提供するステップ；
（ｃ）一重鎖ポリヌクレオチドと相補物とが二重鎖ポリヌクレオチドを形成するように一重鎖ポリヌクレオチドの相補物を合成するステップ；
（ｄ）架橋部を用いて二重鎖ポリヌクレオチドの２本鎖を二重鎖ポリヌクレオチドの一方の端またはその付近で連結するステップ；
（ｅ）二重鎖ポリヌクレオチドの２本鎖を分離して、架橋部によって相補物に連結されているオリジナル一重鎖ポリヌクレオチドを含むさらなる一重鎖ポリヌクレオチドを提供するステップ；
（ｆ）相補物中のヌクレオチドの一部が膜貫通ポアと相互作用するように相補物を膜貫通ポアを通して移動させるステップ；および
（ｇ）各相互作用の際にポアを通過する電流を測定し、それにより標的ポリヌクレオチドの配列を決定または推定するステップ
を含み、ステップ（ｅ）の分離ステップが、標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離するポリヌクレオチド結合タンパク質とコンストラクトを接触させるステップを含む、方法；
−  （ａ）膜；（ｂ）膜中の複数の膜貫通ポア；（ｃ）標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離できる複数のポリヌクレオチド結合タンパク質；および（ｄ）本発明の方法を実行するための説明書を含む、二重鎖標的ポリヌクレオチドを配列決定するための装置；ならびに
−  （ａ）膜；（ｂ）膜中の複数の膜貫通ポア；および（ｃ）標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離できる複数のポリヌクレオチド結合タンパク質を含み、本発明の方法を実行するためにセットアップされている、二重鎖標的ポリヌクレオチドを配列決定するための装置
も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ナノポアを通る酵素制御されたｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡの移行を示す模式図である。ｓｓＤＮＡリーダーを有するｄｓＤＮＡとインキュベートされる酵素（例えば、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ）は、ｓｓＤＮＡ−ｄｓＤＮＡ接合部分に結合する。ＤＮＡ−酵素複合体は、印加された電場（applied field）においてナノポアによって捕捉される。場の下では、酵素内または上でｄｓＤＮＡの相補的プライマー鎖をアンジッピングするプロセスにおいて、ＤＮＡのテンプレート鎖は制御されて塩基ごとに酵素を通ってゆっくり外される。ｄｓＤＮＡの末端に達すると酵素はＤＮＡから外れ、それをナノポアを通して放出する。
【図２】ナノポアを通る酵素制御されたｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡの移行を示す別の模式図である。ｄｓＤＮＡは、ｄｓＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖とを連結しているヘアピンターンを有する。酵素はヘアピンに達してもＤＮＡに結合し続け、ヘアピンターンを回り、アンチセンス鎖に沿って進む。ヘアピンおよびアンチセンス領域では酵素は、ｓｓＤＮＡ分子ブレーキとして機能し、ＤＮＡを配列決定するためにナノポアを通るＤＮＡの移行を十分に制御し続ける。
【図３】ｓｓＤＮＡ領域で移動を制御する酵素の能力を用いてｄｓＤＮＡのヘアピン周辺を読み取る模式的概要を示す図である。ｄｓＤＮＡは、ナノポアによる捕捉を可能にするための５’−ｓｓＤＮＡリーダーを有する。これには、センス鎖とアンチセンス鎖とがヘアピンで繋がれているｄｓＤＮＡセクションが続く。ヘアピンは、配列決定の際に観察される（配列決定の際にセンス鎖およびアンチセンス鎖の簡便な同定をできるようにする）マーカー（例えば脱塩基（abasic）残基、図３で×印として示す）を場合により含有し得る。アンチセンス鎖の３’−末端は、約２０塩基より大きい場合にアンチセンス鎖の完全な読み取りを可能にする３’−ｓｓＤＮＡオーバーハング（ナノポアの読み取りヘッドは、酵素中のＤＮＡの先端から約２０塩基下方にある）も場合により有し得る。
【図４】Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いるＭｓｐＡナノポアを通るアンジッピングモードにおいて配列決定されたＤＮＡ−酵素−ナノポア複合体の模式図（左）およびそれらから得られた共通配列（右）を示す図である。セクション１はＤＮＡのセンスセクションを記し、セクション２はアンチセンスセクションを記す。この図は、短いｄｓＤＮＡコンストラクトのＤＮＡ配列決定を示す。このコンストラクトでは、ｄｓＤＮＡセクションはヘアピンによって繋がれておらず、酵素はＤＮＡの末端で外れ、テンプレート／センス鎖だけが配列決定される（最後の約２０塩基を除く）。
【図５】Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いるＭｓｐＡナノポアを通るアンジッピングモードにおいて配列決定されたＤＮＡ−酵素−ナノポア複合体の模式図（左）およびそれらから得られた共通配列（右）を示す図である。セクション１はＤＮＡのセンスセクションを、セクション２はアンチセンスセクションを記す。ヘアピンを有する短いｄｓＤＮＡコンストラクトのＤＮＡ配列決定。このコンストラクトでは、酵素はセンス鎖に沿って移動し、ヘアピンループを回り、アンチセンス鎖を下り、センス鎖およびアンチセンス鎖の最初の部分の両方の配列決定をできるようにする。
【図６】Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いるＭｓｐＡナノポアを通るアンジッピングモードにおいて配列決定されたＤＮＡ−酵素−ナノポア複合体の模式図（左）およびそれらから得られた共通配列（右）を示す図である。セクション１はＤＮＡのセンスセクションを、セクション２はアンチセンスセクションを記す。図５と同様に、このコンストラクトはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方の配列決定をできるようにするが、追加的３’−ｓｓＤＮＡオーバーハングは、ＤＮＡの末端から酵素が外れる前にアンチセンス鎖の全長の読み取りをできるようにする。
【図７】Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いるＭｓｐＡナノポアを通るアンジッピングモードにおいて配列決定されたＤＮＡ−酵素−ナノポア複合体の模式図（左）およびそれらから得られた共通配列（右）を示す図である。セクション１はＤＮＡのセンスセクションを、セクション２はアンチセンスセクションを記す。図５と同様に、このコンストラクトはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方の配列決定をできるようにするが、このコンストラクトはヘアピンに単一の脱塩基残基（×印として示す）を有し、センスおよびアンチセンスセクションを同定するためのＤＮＡ配列中の明確なマーカーを提供する。
【図８】ＭｓｐＡを通るＵＡ０２の共通ＤＮＡ配列を示す図である。セクション１は最初にナノポア中にあるホモポリマー５’−オーバーハングを記す。セクション２はＤＮＡ鎖のセンスセクションを記す。セクション３はターンを記す。セクション４はＤＮＡ鎖のアンチセンス領域を記す。各セクションに対応するポリヌクレオチド配列をセクション番号の下に示す。
【図９】Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いるＭｓｐＡナノポアを通るアンジッピングのためのゲノムテンプレートの模式図である。ヘアピン周辺の読み取りのために好適なｄｓＤＮＡを作出するための一般的設計概要を示す。コンストラクトは、ナノポアでの捕捉のためのリーダー配列を任意選択マーカー（例えば脱塩基ＤＮＡ）を含んで、および任意選択マーカーを含むヘアピン、およびアンチセンス鎖内へ読み取り拡張のためのテールを任意選択マーカーを含んで有する。
【図１０】ｓｓＤＮＡオーバーハング（左）とヘアピンターン（右）とをゲノムｄｓＤＮＡにライゲーションするためのアダプター設計の模式図である。Ｘ＝脱塩基ＤＮＡ。Ｃｈｏｌ＝コレステロール（cholesterol）−ＴＥＧ  ＤＮＡ修飾。
【図１１】Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いるＭｓｐＡを通る４００塩基長（mer）ヘアピンの典型的なポリメラーゼ制御ＤＮＡ移動を示す図である。センス領域＝脱塩基１から２。アンチセンス領域＝脱塩基２から３。
【図１２】ＭｓｐＡを通る４００塩基長ヘアピンの複数のポリメラーゼ制御ＤＮＡ移動由来の共通ＤＮＡ配列プロファイルを示す図である。センス領域＝脱塩基１から２。アンチセンス領域＝脱塩基２から３。
【図１３】配列決定のための代替的試料調製の模式図である。コンストラクトは標的ポリヌクレオチドおよび標的ポリヌクレオチドの２本鎖を連結している架橋部（ヘアピン）を含んで例示されている。コンストラクトは、リーダーポリマー（一重鎖配列）、テールポリマー（同様に一重鎖配列）およびリーダー内の脱塩基マーカー領域も含む。マーカーは、酵素がテンプレートを完全に平滑末端化する（すなわち必要とされるリーダーｓｓＤＮＡとは反対側を充填する）ことを防げることができる。鎖置換ポリメラーゼ（核酸結合タンパク質）は、相補的プライマーを介してまたはテールポリマーからのタンパク質プライム増幅によってのいずれかで開始して、コンストラクトの２本鎖を分離する。生じた一重鎖ポリヌクレオチドについて相補物が作製される。相補物ならびにオリジナルセンスおよびアンチセンス一重鎖ポリペプチド分析物は、第二架橋部（ヘアピン）の付加によってさらに修飾され得る。
【図１４】標的ポリヌクレオチドを含むコンストラクトの具体的調製を示す図である。
【図１５】エピジェネティックな情報の検出を補助するために増幅が試料調製の一部として追加され得る場合を示す図である。ヌクレオチドは、以下の情報：センス（オリジナル）、アンチセンス（オリジナル）、架橋部、センス（複製）、アンチセンス（複製）がポアを通じて読み取られるように構築されている。したがってメチル化塩基（ｍＣ）についての情報は４回得られる。
【図１６】ＲＮＡがどのように配列決定され得るかを示す図である。架橋部は、ＲＮＡの一片に付着され、ＤＮＡ逆相補物が逆転写酵素を介してＲＮＡに付加される。ＲＮＡが読み取られ、逆相補物のＤＮＡが続く。
【図１７】ナノポアを通るヘリカーゼ制御されたｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡの移行の模式図である。ｄｓＤＮＡは、ｄｓＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖とを連結しているヘアピンターンを有する。酵素はヘアピンに達してもＤＮＡに結合し続け、ヘアピンターンを回り、アンチセンス鎖に沿って進む。ヘアピンおよびアンチセンス領域では酵素は、ｓｓＤＮＡ分子ブレーキとして機能し、ＤＮＡを配列決定するためにナノポアを通るＤＮＡの移行を十分に制御し続ける。
【図１８】実施例４において用いられるポリヌクレオチドＭＯＮＯヘアピンコンストラクト（配列番号２９から３５）を示す図である。
【図１９】ＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ−Ｇ７７Ｓ−Ｌ８８Ｎ−Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２））を通る４００ｂｐヘアピン（図１８に示すとおり繋がれた配列番号２９から３５）の典型的なヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示す図である。センス＝領域１。アンチセンス＝領域２。
【図２０】ＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ−Ｇ７７Ｓ−Ｌ８８Ｎ−Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２））を通る４００ｂｐヘアピン（図１８に示すとおり繋がれた配列番号２９から３５）の典型的なヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の開始を示す図である。配列の最初のポリＴ領域は＊で、脱塩基ＤＮＡ塩基は＃で強調される。
【図２１】ＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ−Ｇ７７Ｓ−Ｌ８８Ｎ−Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２））を通る４００ｂｐヘアピン（図１８に示すとおり繋がれた配列番号２９から３５）の典型的なヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動のセンス領域とアンチセンス領域との間の移行を示す図である。配列のセンス領域とアンチセンス領域との間の移行領域は＊で強調され、センス領域を１で表示し、アンチセンス領域を２で表示する。
【図２２】ＤＵＯヘアピンコンストラクトを形成するための例示試料調製方法を示す図である。二重鎖ＤＮＡ分析物は、Ｙ型アダプター（このアダプターのセンス鎖（脱塩基ＤＮＡ塩基４個を介して配列番号３０に付着された配列番号２９）は５’リーダー、テザーに相補的である配列（配列番号３５、チミン残基２個および３’コレステロール（cholesterol）ＴＥＧに付着されたｉＳｐ１８スペーサー６個を配列の３’末端に有する）および脱塩基４個を含有し、アダプターのアンチセンス半分は３’ヘアピン（配列番号３１）を含有する）を二重鎖の一端におよびヘアピン（配列番号３２）を他端に含有するように接触および修飾される。Ｙ型アダプターそれ自体が３’−ヘアピン（配列番号３１）も保持し、ポリメラーゼによるかまたはライゲーションによるかのいずれかでの伸長を可能にする。この伸長は、好ましくは鎖置換活性を有する中温性ポリメラーゼによって実行される。ポリメラーゼがＹ型アダプターヘアピン（配列番号３１）の３’から伸長することから、それはアンチセンス鎖（配列番号３４）を複製し、それによりオリジナルセンス鎖（配列番号３３）を置換する。ポリメラーゼがアンチセンス鎖（配列番号３４）の末端に達すると、反対側のヘアピン（配列番号３２）を充填し、次いで反対側の一重鎖およびオリジナルセンス鎖（配列番号３３）を充填し始める。次いで伸長は、Ｙ型アダプター一重鎖（配列番号２９）の５’領域を残すために脱塩基またはスペーサー修飾のセクションによって停止される（酵素伸長を停止できる他の可能な修飾は、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはモルホリノ塩基およびｉｓｏ−ｄＣまたはｉｓｏ−ｄＧを含む）。
【図２３】ＤＵＯヘアピンコンストラクト（図２５に示すとおり繋がれた配列番号２９から３６）を調製するために実施例５で用いられた具体的な調製法を示す図である。ＰｈｉＸ１７４の約４００ｂｐ領域は、ＳａｃＩおよびＫｐｎＩ制限部位を含有するプライマー（それぞれ配列番号２７および２８）でＰＣＲ増幅された。次いで精製ＰＣＲ産物を、ＳａｃＩおよびＫｐｎＩ消化し、Ｙ型アダプター（センス鎖配列（脱塩基ＤＮＡ塩基４個を介して配列番号３０に付着された配列番号２９）は配列番号３３の５’末端にライゲーションされ、アンチセンス鎖（配列番号３１）は配列番号３４の３’末端にライゲーションされる）およびヘアピン（配列番号３３および３４を加えるために用いられた配列番号３２）は、いずれかの端をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションされた（最終ＤＮＡコンストラクトに関して図１８を参照されたい）。二重ライゲーション産物をＰＡＧＥ精製し、Ｙ型アダプターヘアピン（配列番号３１）からの伸長を可能にするためにクレノウＤＮＡポリメラーゼ、ＳＳＢおよびヌクレオチドが添加された。順調なＤＵＯ産物を選別するために、一連の不適正塩基対制限部位がアダプター配列に組み込まれ、それにより制限部位がＤＵＯ伸長プロセスによって順調に複製されている場合にだけ、酵素は分析物を切断する。
【図２４】アダプター修飾分析物（ＭＯＮＯ、Ｆｏｇ１８に示すとおり繋がれた配列番号２９〜３５）は、それらが互いに不適正塩基対であることから、ポリメラーゼの非存在下で制限酵素で消化されないことを示す図である（左のゲルを参照されたい、記号：Ｍ＝ＭｆｅＩ、Ａ＝ＡｇｅＩ、Ｘ＝ＸｍａＩ、Ｎ＝ＮｇｏＭＩＶ、Ｂ＝ＢｓｐＥＩ）。しかし、ポリメラーゼとのインキュベーションでは、注目すべき大きさの変化があり、変化した産物（ＤＵＯ、図２５に示すとおり繋がれた配列番号２９〜３６）は、今度は予測されるとおり各制限酵素で消化される（右のゲルを参照されたい、記号：Ｍ＝ＭｆｅＩ、Ａ＝ＡｇｅＩ、Ｘ＝ＸｍａＩ、Ｎ＝ＮｇｏＭＩＶ、Ｂ＝ＢｓｐＥＩ）。
【図２５】実施例６で用いられるポリヌクレオチドＤＵＯヘアピンコンストラクト（配列番号２９から３６）を示す図である。
【図２６】ＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ−Ｇ７７Ｓ−Ｌ８８Ｎ−Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２））を通るＤＵＯヘアピンコンストラクト（図２５に示すとおり繋がれた配列番号２９から３６）についての２つの典型的なヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示す図である。センスオリジナル＝領域１。アンチセンスオリジナル＝領域２。センス複製＝領域３。アンチセンス複製＝領域４。
【図２７】ＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ−Ｇ７７Ｓ−Ｌ８８Ｎ−Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２））を通るＤＵＯヘアピンコンストラクト（図２５に示すとおり繋がれた配列番号２９から３６）についての典型的なヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の拡大図である。センスオリジナル＝領域１。アンチセンスオリジナル＝領域２。センス複製＝領域３。アンチセンス複製＝領域４。
【図２８】ＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ−Ｇ７７Ｓ−Ｌ８８Ｎ−Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２））を通るヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動のときのＤＵＯヘアピンコンストラクト（図２５に示すとおり繋がれた配列番号２９から３６）のセンスオリジナル領域とアンチセンスオリジナル領域との間の典型的な移行の拡大図である。センスオリジナル＝領域１。アンチセンスオリジナル＝領域２。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
配列表の説明
配列番号１は、ＮＮＮ−ＲＲＫ変異ＭｓｐＡ単量体をコードするコドン最適化ポリヌクレチド配列を示す。
【００１３】
配列番号２（「Ｂ１」とも称する）は、ＭｓｐＡ単量体のＮＮＮ−ＲＲＫ変異体の成熟形態のアミノ酸配列を示す。変異体は、シグナル配列を欠失しており、以下の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。これらの変異はＭｓｐＡポアを通るＤＮＡ移行を可能にする。
【００１４】
配列番号３は、α−ヘモリジン−Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ（α−ＨＬ−ＮＮ；Stoddartら、PNAS、2009;106(19):7702-7707）の１つのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００１５】
配列番号４は、α−ＨＬ−ＮＮの１つのサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【００１６】
配列番号５は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。
【００１７】
配列番号６は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。
【００１８】
配列番号７から９は、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤ変異体の成熟形態のアミノ酸配列をそれぞれ示す。成熟形態は、シグナル配列を欠失している。
【００１９】
配列番号１０から１５は、ホモポリマー読み取りを例示するために用いられる配列を示す。
【００２０】
配列番号１６から３６は、実施例で用いられた配列を示す。
【００２１】
発明の詳細な説明
本開示の生成物および方法のさまざまな応用が当技術分野における具体的な必要性に適合され得ることは理解される。本明細書で用いられる用語は本発明の詳細な実施形態を記載する目的のためのみであり、限定されることを意図しないことも理解される。
【００２２】
付加的に、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が他を明確に記す場合を除いて複数の参照物を含む。したがって、例えば「１つのポア（a pore）」を参照することは、２個以上のそのようなポアを含み、「１つの核酸配列（a nucleic acid sequence）」は、２個以上のそのような配列を含むなど。
【００２３】
本明細書に引用するすべての刊行物、特許および特許出願は（上記または下記に関わらず）それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２４】
本発明の方法
本発明は、二重鎖標的ポリヌクレオチドを配列決定するための方法を提供する。方法は、標的ポリヌクレオチドの２本鎖を架橋部によって連結するステップを含む。標的ポリヌクレオチドの２本鎖は、一重鎖ポリヌクレオチドを提供するために標的ポリヌクレオチドを含むコンストラクトをポリヌクレオチド結合タンパク質と接触させるステップによって分離される。一重鎖ポリヌクレオチドは、膜貫通ポアを通って移動する。一重鎖ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの一部はポアと相互作用する。各相互作用の際にポアを通過する電流が測定され、標的ポリヌクレオチドの配列が推定または決定される。したがって標的ポリヌクレオチドは、鎖配列決定を用いて配列決定される。本方法は、本明細書において「ＭＯＮＯ」法と称される場合がある。
【００２５】
上に考察のとおり、標的ポリヌクレオチドの２本鎖を架橋部によって連結するステップは、標的ポリヌクレオチドの両鎖が膜貫通ポアによって配列決定されることを可能にする。本方法は、単一の二重鎖標的ポリヌクレオチドコンストラクトから得られる情報の量を二倍にすることから有利である。さらに相補的「アンチセンス」鎖中の配列が「センス」鎖の配列に対して必然的に直交性であることから、２本鎖の情報は情報科学的に組合せることができる。したがって本機序は、より高い信頼度の観察結果をもたらす直交性校正（proof-reading）能力を提供する。
【００２６】
さらに、本発明の方法の他の主な有利点は、
（１）欠損ヌクレオチドの補償（coverage）：一方の鎖において欠損され得る場合があるいかなる状態もその相補性領域から得られる直交性情報によって補償される可能性が高いことから、方法はいかなる欠損ヌクレオチドまたはヌクレオチド群の課題（例えば、鎖がポアを滑り通るなどの移動課題による）も実質的に最小化する。
（２）疑わしい配列モチーフの補償：配列モチーフのいかなる困難も相補鎖における直交性および対立性の情報によって補償される（異なる配列を有するものは同じ配列依存課題を有さない）。例えばこれは、電流にわずかな変化だけを生じるか、または同様の電流レベルを有する配列モチーフ（すなわち、ナノポアを通って移動する際に同様の電流遮断を生じ、それにより電流における段階変化が無いことから観察されない連続的塩基モチーフ）に特に関連する。１つの配列モチーフ由来のいかなる同様の電流レベルも、相補鎖におけるその直交性配列から得られる全く異なる電流レベルによって補償される。
【００２７】
上に考察した有利点に加えて、二重鎖ポリヌクレオチドの両鎖を読み取る概念がさらなる利益をもたらすように利用され得る多数の特別な例がある。
【００２８】
１．エピジェネティック情報
エピジェネティック情報（５−ヒドロキシメチルシトシンヌクレオチドの５−メチルシトシンなど）または天然ＤＮＡ鎖内の損傷塩基を同定できるようにすることは、幅広い応用において望ましい。現在、この情報を抽出することは、ＤＮＡ配列決定技術の大部分がその配列決定化学の一端としてＤＮＡ増幅に依存していることから困難である。この情報は、抽出され得るが、化学的処置に続く増幅を必要とし、その両方が誤りを生じる場合がある。
【００２９】
ナノポア配列決定は単一分子配列決定技術でもあり、したがってＤＮＡ増幅の必要が無く実施され得る。ナノポアは標準４ＤＮＡヌクレオチドへの修飾を検出できることが示されている。ポリヌクレオチドの両鎖を読み取るステップは、修飾塩基が別の塩基と同様に振る舞う（同様の電流シグナルを生じる）場合に、ＤＮＡ修飾を検出するステップにおいて有用であり得る。例えばメチルシトシン（ｍＣ）がチミジンと同様に振る舞う場合、ｍＣをＴと決めることに関連する誤りがある。センス鎖では、塩基がｍＣまたはＴと称される可能性がある。しかしアンチセンス鎖では対応する塩基は高い可能性を有してＧとして現れる場合がある。それにより、アンチセンス鎖を「校正」するステップによってセンス鎖中の塩基はＴであるよりもｍＣであった可能性が高い。
【００３０】
センス鎖およびアンチセンス鎖を読み取るステップは、増幅または複製の必要なく実施され得る。しかし増幅または複製は、エピジェネティック情報の検出を補助するために試料調製の一部として加えられる場合がある。ヌクレオチド鎖は、以下の情報がナノポアを通して以下の順序：センス（オリジナル）、アンチセンス（オリジナル）、−架橋部−、センス（相補）、アンチセンス（相補）で読み取られる場合に構築され得る（下に詳細に記載される）（図１５）。
【００３１】
このスキームでは、メチル化塩基についての情報は４回得られる。エピジェネティック塩基がオリジナルセンス鎖にある場合（この場合ｍＣ）、以下の情報が高い可能性で得られる：センス（オリジナル）−ｍＣ、アンチセンス（オリジナル）−Ｇ、センス（相補）−Ｃおよびアンチセンス（相補）−Ｇ。オリジナルセンス読み取りと複製センス読み取りとが異なる結果をもたらすことは明らかであるが、両アンチセンス読み取りは同じ塩基決定をもたらす。この情報は、オリジナルセンス鎖中のエピジェネティック塩基の位置を示すために用いられ得る。
【００３２】
２．ＲＮＡ−ＤＮＡ二重読み取り
同様のスキームがＲＮＡを配列決定するために用いられ得る。架橋部は、ＲＮＡの一片に付着されることができ、ＤＮＡ逆相補物は逆転写酵素を介してＲＮＡに付加される（図１６に示すコンストラクトを生じる）。
【００３３】
このスキームでは、ＲＮＡは読み取られ、逆相補物のＤＮＡ読み取りが続く。ＲＮＡおよびＤＮＡ読み取りの両方由来の情報は、ＲＮＡ配列の決定または推定の確度を上昇させるために組み合わされ得る。例えばＲＮＡ中のウラシル塩基（Ｕ）がシトシンと類似の読み取りをもたらす場合、次に対応する塩基はこの誤りを解決するために用いられ得る。対応するＤＮＡ塩基がＧである場合、ＲＮＡ塩基はＣであった可能性は高いが、しかしＤＮＡ塩基がＡと決定される場合、ＲＮＡ塩基はＵであった可能性が高い。
【００３４】
３．ホモポリマー読み取り
ホモポリマー読み取りは、単一分子ナノポア配列決定に関する問題になる可能性がある。ホモポリマー領域がポアの読み取りセクションより長い場合、ホモポリマーセクションの長さを決定することは困難である。
【００３５】
Ｐｈｉ２９がヘアピン周辺を読み取るために用いられ得ることは既に示されており、センス鎖およびアンチセンス鎖が読み取られることを可能にする。増幅は、ポリメラーゼおよび通常のＤＮＡ三リン酸のセット；ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰを用いてアンチセンス鎖を作製するために用いられ得る。ホモポリマー読み取りの問題を克服するためにアンチセンス鎖は、オリジナルｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰと組み合わされた異なる塩基を添加して合成され得る。これは、イノシン（Ｉ）などの天然塩基類似物であってもよい。塩基は、正規の天然塩基と比較して偶然の取り込みを有し、挿入率は三リン酸種の濃度を変更するステップによって制御され得る。
【００３６】
代替塩基の付加を通じて、代替塩基がホモポリマー領域の逆相補物に挿入される可能性がある。この結果が、ホモポリマーの連続がナノポアの読み取りセクションによって読み取られ得るポイントまで長さが短くなることである。例えばＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１０）のホモポリマー群は代替塩基の無作為挿入を有し、ＴＴＴＩＴＴＩＩＴＴＴＩ  （配列番号１１）（Ｉはイノシン）をもたらし得る。
オリジナルＤＮＡ＋ヘアピン（配列番号１２）：
2014531196.tif 000003
（脱塩基＝Ｘ）
通常の転換（配列番号１３）：
2014531196.tif 000004
（脱塩基＝Ｘ）
提案されたスキーム１（Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｃは類似物Ｉによって無作為に置換される）（配列番号１４）：
2014531196.tif 000005
（脱塩基＝Ｘ）
塩基類似物は一般的であってよく（Ｔ、Ｇ、ＡまたはＣを置換）、または１つの塩基に特異的であってもよい（例えばデオキシウリジン（Ｕ）はＴだけを置換する）。
提案されたスキーム２（Ｔは類似物Ｕによって無作為に置換される）（配列番号１５）：
2014531196.tif 000006
（脱塩基＝Ｘ）
【００３７】
スキーム１および２の両方で、ホモポリマーストレッチは、個々のヌクレオチドまたはヌクレオチド群が推定または決定され得るように低減されていた。センス鎖は、天然ＤＮＡ鎖であってよく、一方アンチセンス鎖は天然塩基と塩基類似物との混合物を含有する。センスおよびアンチセンス読み取り由来のデータの組合せは、オリジナルＤＮＡセクション中のホモポリマー連続の長さを推定するために用いられ得る。
【００３８】
二重鎖標的ポリヌクレオチド
本発明の方法は、二重鎖ポリヌクレオチドを配列決定するためのものである。核酸などのポリヌクレオチドは、２個以上のヌクレオチドを含む巨大分子である。ポリヌクレオチドまたは核酸は、任意のヌクレオチドの任意の組合せを含み得る。ヌクレオチドは、天然に存在するものまたは人工的であってよい。ヌクレオチドは、酸化またはメチル化されてよい。ヌクレオチドは、典型的には、核酸塩基、糖および少なくとも１つのリン酸基を含有する。核酸塩基は典型的には複素環である。核酸塩基は、これだけに限らないがプリンおよびピリミジンならびにより具体的にはアデニン、グアニン、チミン、ウラシルおよびシトシンを含む。糖は典型的には五炭糖である。ヌクレオチド糖は、これだけに限らないがリボースおよびデオキシリボースを含む。ヌクレオチドは、典型的にはリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは典型的には一リン酸、二リン酸または三リン酸を含有する。リン酸は、ヌクレオチドの５’または３’側に付着できる。
【００３９】
ヌクレオチドは、これだけに限らないがアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、５−メチルシチジン一リン酸、５−メチルシチジン二リン酸、５−メチルシチジン三リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン一リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン二リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン三リン酸、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）およびデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、５−メチル−２’−デオキシシチジン一リン酸、５−メチル−２’−デオキシシチジン二リン酸、５−メチル−２’−デオキシシチジン三リン酸、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジン一リン酸、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジン二リン酸および５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジン三リン酸を含む。ヌクレオチドは、好ましくはＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰまたはｄＣＭＰから選択される。
【００４０】
ヌクレオチドは、糖および少なくとも１つのリン酸基を含有する場合がある（すなわち核酸塩基を欠失している）。
【００４１】
ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸であってよい。標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの１本鎖にハイブリダイズしたＲＮＡの１本鎖を含む場合がある。ポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはヌクレオチド側鎖を有する他の合成ポリマーなどの当技術分野において公知の任意の合成核酸であってよい。
【００４２】
標的ポリヌクレオチドは、任意の長さであってよい。例えばポリヌクレオチドは、長さ少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００または少なくとも５００ヌクレオチド対であってよい。ポリヌクレオチドは、１０００ヌクレオチド対以上、長さ５０００ヌクレオチド対以上または長さ１０００００ヌクレオチド対以上であってよい。
【００４３】
標的ポリヌクレオチドは、任意の好適な試料中に存在する。本発明は、標的ポリヌクレオチドを含有することが公知であるまたは含有すると考えられる試料について典型的には実行される。代替的に本発明は、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの同一性を確認するために試料中でのその存在が公知であるまたは期待される試料について実行され得る。
【００４４】
試料は生物学的試料であってよい。本発明は、任意の生物または微生物から得られたまたは抽出された試料についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行されてよい。生物または微生物は典型的には始生代のもの、原核性または真核性であり、典型的には五界：植物界、動物界、菌界、モネラ界および原生生物界に属する。本発明は、任意のウイルスから得られたまたは抽出された試料についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行されてよい。試料は、好ましくは液体試料である。試料は典型的には、患者の体液を含む。試料は尿、リンパ液、唾液、粘液または羊水であってよいが、好ましくは血液、血漿または血清である。典型的には試料は、ヒト由来であるが、代替的に、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタなどの商業的に飼育される動物由来などの別の哺乳動物由来であってもよく、代替的にネコまたはイヌなどの愛玩動物であってもよい。代替的に植物由来の試料は、穀類、マメ、果実または野菜などの商品作物（例えばコムギ、オオムギ、カラスムギ、セイヨウアブラナ、トウモロコシ、ダイズ、イネ、バナナ、リンゴ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、タバコ、マメ、レンズマメ、サトウキビ、ココア、ワタ、チャ、コーヒー）から典型的には得られる。
【００４５】
試料は、非生物学的試料であってよい。非生物学的試料は、好ましくは液体試料である。非生物学的試料の例は、手術用液（surgical fluids）、水（飲料水、海水または河川水など）および検査室検査のための試薬を含む。
【００４６】
試料は、典型的にはアッセイされる前に例えば遠心分離によってまたは、不要の分子または細胞（赤血球細胞など）をろ過して除く膜を通すことによって処理される。試料は採取されてから直ちに測定されてよい。試料は、典型的にはアッセイの前に好ましくは−７０℃より低くで、保存されてもよい。
【００４７】
下により詳細に考察されるとおり標的ポリヌクレオチドが膜にカップリングされる場合、ヒトの血液からは少量の精製ＤＮＡしか得られないため、本発明の方法はヒトＤＮＡ配列決定のために特に有利である。方法は、１ｐＭ未満、１０ｐＭ未満または１００ｐＭ未満などの約０．１ｐＭから約１ｎＭまでの濃度で存在する標的ポリヌクレオチドの配列決定を好ましくは可能にする。
【００４８】
コンストラクト（構築物）
本発明の方法は、配列決定される二重鎖標的ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを提供するステップを含む。コンストラクトは、標的ポリヌクレオチドの両鎖が膜貫通ポアによって配列決定されることを典型的には可能にする。
【００４９】
コンストラクトは、標的ポリヌクレオチドの２本鎖の連結を可能にする架橋部を含む。典型的には架橋部は、標的ポリヌクレオチドの２本鎖を共有結合で連結する。架橋部が膜貫通ポアを通る一重鎖ポリヌクレオチドの移動を干渉しない限り、架橋部は標的ポリヌクレオチドの２本鎖を連結できる任意のものであってよい。好適な架橋部は、これだけに限らないがポリマーリンカー、化学的リンカー、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。好ましくは架橋部は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ（脱塩基ＤＮＡなど）、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはＰＥＧを含む。架橋部はより好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００５０】
架橋部は、最も好ましくはヘアピンループである。ヘアピンループは典型的には長さ４から１００ヌクレオチド、好ましくは長さ４から８ヌクレオチドである。
【００５１】
架橋部は、当技術分野において公知の任意の好適な手段によって標的ポリヌクレオチドコンストラクトに連結される。架橋部は、別に合成されてよく、標的ポリヌクレオチドに化学的に付着または酵素的にライゲーションされてよい。代替的に架橋部は、標的ポリヌクレオチドのプロセシングにおいて作製されてよい。
【００５２】
架橋部は、標的ポリヌクレオチドの一方の端またはその付近で標的ポリヌクレオチドに連結される。架橋部は、標的ポリヌクレオチドの末端から１０ヌクレオチド以内で標的ポリヌクレオチドに好ましくは連結される。
【００５３】
標的ポリヌクレオチドを含むコンストラクトは、標的ポリヌクレオチドの架橋部とは反対側の端に少なくとも１つのポリマーも好ましくは含む。そのようなポリマー（複数可）は、下により詳細に考察される通り本発明の配列決定法を補助する。好適なポリマーは、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ／ＲＮＡ）、修飾ＤＮＡなどの修飾ポリヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＰＥＧまたはポリペプチドを含む。
【００５４】
コンストラクトは、リーダーポリマーを好ましくは含む。リーダーポリマーは、標的ポリヌクレオチドの架橋部とは反対側の端に連結される。リーダーポリマーは、二重鎖標的ポリヌクレオチドが膜貫通ポアとまたは、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼなどのポリヌクレオチド結合タンパク質と会合することを補助し、２本鎖を分離することを補助するおよび／またはポアを通る一重鎖ポリヌクレオチドの移動を制御する。膜貫通ポアおよびポリヌクレオチド結合タンパク質は、下により詳細に考察される。
【００５５】
リーダーポリマーは、ポリヌクレオチド（ＤＮＡもしくはＲＮＡなど）、修飾ポリヌクレオチド（脱塩基ＤＮＡなど）、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＰＥＧまたはポリペプチドであってよい。リーダーポリマーは、好ましくはポリヌクレオチドであり、より好ましくは一重鎖ポリヌクレオチドである。リーダーポリマーは、上に考察されたいずれのポリヌクレオチドであってもよい。一重鎖リーダーポリマーは最も好ましくはＤＮＡの一重鎖である。リーダーポリマーは、任意の長さであってよいが、典型的には、長さ５０から１５０ヌクレオチドなどの長さ２７から１５０ヌクレオチドである。
【００５６】
二重鎖ポリヌクレオチドへの一重鎖ポリヌクレオチドのセクションの付加は、種々の方法で実施され得る。化学的または酵素学的ライゲーションは、行われ得る。付加的にＥｐｉｃｅｎｔｒｅによるＮｅｘｔｅｒａ法は好適である。本発明者らは、従来通りゲノムＤＮＡの標的領域の開始部分に相補的なセクションを含有するだけでなく、５０ポリＴセクションが付加的に先行したセンスプライマーを用いるＰＣＲ法を開発した。ポリメラーゼがポリＴセクションとは反対側の相補鎖を伸長し、それにより（通常通り）平滑末端ＰＣＲ産物が生じることを防ぐために、４個の脱塩基部位がポリＴセクションと相補的プライミングセクションとの間に付加された。これらの脱塩基部位は、ポリメラーゼがこの領域を超えて伸長することを防ぎ、そのためポリＴセクションは５’一重鎖ＤＮＡとして各増幅複製物中に残る。ポリメラーゼ伸長を停止できる可能性がある他の修飾は、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはモルホリノ塩基、ｉｓｏ−ｄＣもしくはｉｓｏ−ｄＧを含む。
【００５７】
コンストラクトは、ポリマーテール（架橋部とは反対側の端で標的ポリヌクレオチドとも連結された）を好ましくはさらに含む。ポリマーテールは、膜貫通ポアによる標的コンストラクトの配列決定を補助する。詳細にはポリマーテールは、二重鎖ポリヌクレオチドの全体（すなわち両鎖のすべて）が膜貫通ポアによって読み取られ、配列決定され得ることを典型的には確実にする。下に考察するとおりＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼなどのポリヌクレオチド結合タンパク質は、膜貫通ポアを通る一重鎖ポリヌクレオチドの移動を制御できる。典型的にはタンパク質は、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を遅くする。例えばＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼは、膜全体に印加される電位に沿ってポアを通るポリヌクレオチドの移動を遅くするブレーキのように作用する。ポリヌクレオチドは、結合タンパク質との接触がなくなると配列情報を得ることが困難であるような速度で自由にポアを通って移動する。タンパク質からポアまでに通常短い距離があることから、典型的にはおよそ２０ヌクレオチドなど（その距離におよそ等しい）の配列情報が失われる場合がある。テールポリマーは、一重鎖ポリヌクレオチドの長さをその移動が核酸結合タンパク質によって制御され得る一方で、標的ポリヌクレオチドの両鎖すべてがポアを通り、配列決定されるように「伸長」する。そのような実施形態は、配列情報が標的ポリヌクレオチド中の両鎖全体から得られ得ることを確実にする。テールポリマーは、プライマーが結合するための部位も提供し、核酸結合タンパク質が標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離することを可能にする。
【００５８】
テールポリマーは、ポリヌクレオチド（ＤＮＡもしくはＲＮＡなど）、修飾ポリヌクレオチド（脱塩基ＤＮＡなど）、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＰＥＧまたはポリペプチドであってよい。テールポリマーは、好ましくはポリヌクレオチドであり、より好ましくは一重鎖ポリヌクレオチドである。テールポリマーは、上に考察された任意のポリヌクレオチドであってよい。
【００５９】
コンストラクトは、１つまたは複数のマーカーも好ましくは含み、膜貫通ポアを通るときに特有の電流（特徴的なサイン電流）を生じる。マーカーは、ポアとの関連における一重鎖ポリヌクレオチドの位置を推定または決定することを可能にするために典型的には用いられる。例えば標的ポリヌクレオチドの両鎖の間に位置するマーカー由来のシグナルは、一方の鎖が配列決定され、他方がポアに入ろうとしていることを示す。したがってそのようなマーカーは、標的ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖とを識別するために用いられ得る。マーカー（複数可）は標的ポリヌクレオチドの供給源を同定するためにも用いられ得る。好適なマーカーは、これだけに限らないが脱塩基領域、ヌクレオチドの特異的配列、非天然ヌクレオチド、フルオロフォア（fluorophore）またはコレステロール（cholesterol）を含む。マーカーは、好ましくは脱塩基領域またはヌクレオチドの特異的配列である。
【００６０】
マーカー（複数可）は、コンストラクトのいずれの場所にも位置し得る。マーカー（複数可）は、架橋部内に位置し得る。マーカー（複数可）は、架橋部付近にも位置し得る。架橋部付近は、架橋部の１０から１００ヌクレオチド以内を好ましくは意味する。
【００６１】
マーカーは、リーダーポリマーまたはテールポリマー内にも位置し得る。
【００６２】
コンストラクトは、任意の公知の方法を用いて膜にカップリングされ得る。膜が脂質二重層などの両親媒性層である場合は（下に詳細に考察されるとおり）、コンストラクトは、膜に存在するポリペプチドまたは膜に存在する疎水性アンカーを介して膜に好ましくはカップリングされる。疎水性アンカーは、好ましくは脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブまたはアミノ酸である。
【００６３】
コンストラクトは膜に直接カップリングされ得る。コンストラクトは好ましくは膜にリンカーを介してカップリングされる。好ましいリンカーは、これだけに限らないがポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリペプチドなどのポリマーを含む。ポリヌクレオチドが膜に直接カップリングされる場合、膜と検出器との間の距離のためにポリヌクレオチドの末端まで配列決定が継続できないことから、いくらかの配列データが失われる。リンカーが用いられる場合、ポリヌクレオチドは完了まで処理され得る。リンカーが用いられる場合、リンカーはコンストラクトの任意の位置に付着され得る。リンカーは、テールポリマーでポリヌクレオチドに好ましくは付着される。
【００６４】
カップリングは、安定または一過的であってよい。ある種の応用に関してカップリングの一過的な性質は好ましい。安定カップリング分子がポリヌクレオチドの５’末端または３’末端のいずれかに直接付着された場合、二重層と酵素活性部位との間の距離のためにポリヌクレオチドの末端まで配列決定が継続できないことから、いくらかの配列データが失われる。カップリングが一過的である場合、カップリングされた端は無作為に二重層から遊離し、ポリヌクレオチドは完了まで処理され得る。安定なまたは一過的連結を膜と形成する化学基は、下により詳細に考察される。コンストラクトは、コレステロール（cholesterol）または脂肪酸アシル鎖を用いて両親媒性層または脂質二重層に一過的にカップリングされ得る。ヘキサデカン酸などの長さ６から３０までの炭素原子を有する任意の脂肪酸アシル鎖は用いられ得る。
【００６５】
好ましい実施形態では、コンストラクトは、脂質二重層などの両親媒性層にカップリングされる。合成脂質二重層へのポリヌクレオチドのカップリングは、種々の異なるテザーリング戦略で既に実行されている。これらを下の表１に要約する。
【００６６】
【表１】
2014531196.tif 000007
【００６７】
ポリヌクレオチドは、合成反応において修飾ホスホラミダイトを用いて官能基化されることができ、チオール、コレステロール（cholesterol）、脂質およびビオチン基などの反応基の付加に容易に適合される。これらのさまざまな付着化学物質は、ポリヌクレオチドに一連の付着選択肢をもたらす。さまざまな各修飾基は、わずかに異なる方法でポリヌクレオチドを繋ぎ止め、カップリングは常に永久的ではなく、二重層へのさまざまな残存時間をポリヌクレオチドにもたらす。一過的カップリングの有利点は、上に考察される。
【００６８】
ポリヌクレオチドのカップリングは、反応基がポリヌクレオチドに付加され得る限り多数の他の手段によっても達成され得る。ＤＮＡのいずれかの端への反応基の付加は既に報告されている。チオール基はポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰγＳを用いてｓｓＤＮＡの５’に付加され得る(Grant,G.P.およびP.Z.Qin (2007) "A facile method for attaching nitroxide spin labels at the 5' terminus of nucleic acids." Nucleic Acids Res 35(10):e77)。ビオチン、チオールおよびフルオロフォア（fluorophore）などの化学基のより多様な選択は、修飾オリゴヌクレオチドをｓｓＤＮＡの３’に組み込むためにターミナルトランスフェラーゼを用いて付加され得る(Kumar,A.,P.Tchenら、(1988)."Nonradioactive labeling of synthetic oligonucleotide probes with terminal deoxynucleotidyl transferase." Anal Biochem 169(2):376-82)。
【００６９】
代替的に反応基は、二重層に既にカップリングされたものに相補的なＤＮＡの短片の付加のために考慮される場合があり、付着はハイブリダイゼーションを介して達成され得る。ｓｓＤＮＡの短片のライゲーションは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼＩを用いて報告されている(Troutt,A.B.,M.G.McHeyzer-Williamsら、(1992)."Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity." Proc Natl Acad Sci U S A 89(20):9823-5)。代替的にｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡのいずれかは、天然ｄｓＤＮＡにライゲーションされることができ、次いで２本鎖は熱的または化学的変性によって分離された。天然ｄｓＤＮＡについて、ｓｓＤＮＡの１片を二重鎖の１つもしくは両方の端に、またはｄｓＤＮＡを１つまたは両方の端へのいずれかで付加できる。次いで、二重鎖が融解される際に、ｓｓＤＮＡが５’末端、３’末端もしくは両端でのライゲーションもしくは修飾のために用いられ、ｄｓＤＮＡがライゲーションのために用いられた場合、各一重鎖は５’または３’修飾のいずれかを有する。ポリヌクレオチドが合成鎖である場合、カップリング化学はポリペプチドの化学合成の際に組み込まれ得る。例えばポリヌクレオチドは、反応基が付着されたプライマーを用いて合成され得る。
【００７０】
ゲノムＤＮＡのセクションの増幅のための一般的技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いている。本明細書では、２個の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＤＮＡの同じセクションの多数の複製物が作製される場合があり、各複製物について二重鎖中の各鎖の５’は合成ポリヌクレオチドである。コレステロール（cholesterol）、チオール（thiol）、ビオチン（biotin）または脂質などの反応基を有するアンチセンスプライマーを用いるステップによって、増幅された標的ＤＮＡの各複製物は、カップリングのための反応基を含有する。
【００７１】
分離
標的ポリヌクレオチドの２本鎖は、ポリヌクレオチド結合タンパク質を用いて分離される。
【００７２】
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、好ましくはポリヌクレオチドハンドリング酵素由来である。しかし酵素は、反応を触媒しない条件下で用いられ得る。例えばＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ由来のタンパク質は、下により詳細に考察されるとおりアンジッピングモードで用いられる場合がある。
【００７３】
ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの特性と相互作用し、修飾できるポリペプチドである。酵素は、個々のヌクレオチドまたはジ−またはトリヌクレオチドなどのヌクレオチドの短い鎖を形成するように切断するステップによってポリヌクレオチドを修飾できる。酵素は特定の位置に方向付けるステップまたは移動させるステップによってポリヌクレオチドを修飾できる。ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、標的ポリヌクレオチドに結合でき、好ましくはポアを通るその移動を制御できる限り酵素活性を表す必要がない。例えば酵素は、その酵素活性を除去するように修飾されてよく、または酵素として作用することを妨げる条件下で用いられ得る。そのような条件は、下により詳細に考察される。
【００７４】
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、典型的にはピコウイルス亜科（Picovirinae）ウイルス科由来である。好適なウイルスは、これだけに限らないがＡＨＪＤ様ウイスルおよびＰｈｉ２９様ウイルスを含む。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、好ましくはＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼまたはヘリカーゼ由来である。
【００７５】
Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ由来のタンパク質は、配列番号６に示される配列またはその変種を含む。野生型Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ活性およびエキソヌクレアーゼ活性を有する。適正条件下で二重鎖ポリヌクレオチドをアンジップもできる。それ故に酵素は３種のモードで作動できる。これは下により詳細に考察される。配列番号６の変種は、配列番号６のアミノ酸配列から変化しており、ポリヌクレオチド結合活性を保持するアミノ酸配列を有する酵素である。変種は、下に考察する３種のモードの少なくとも１つで作動しなければならない。好ましくは変種は、３種すべてのモードで作動する。変種は、ポリヌクレオチドの操作を促進するならびに／または高塩濃度および／もしくは室温でのその活性を促進する修飾を含む場合がある。変種は、酵素耐塩性を改善するＦｉｄｅｌｉｔｙ  ＳｙｓｔｅｍｓのＴＯＰＯ修飾を含む場合がある。
【００７６】
配列番号６のアミノ酸配列全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも４０％相同である。より好ましくは変種ポリペプチドは、配列全体にわたって配列番号６のアミノ酸配列にアミノ酸同一性に基づいて少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であり得る。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が２００以上（例えば２３０、２５０、２７０もしくは２８０またはそれ以上）のストレッチの連続アミノ酸にわたってある場合がある（「高い相同性（hard homology）」）。相同性は、下に記載のとおり決定される。変種は、配列番号２に関連して下に考察する任意の方法で野生型配列と異なっていてよい。酵素は、下に考察するとおりポアに共有結合的に付着されてよい。
【００７７】
方法は、アンジッピングモードでＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ由来のタンパク質を用いて好ましくは実行される。本実施形態ではステップ（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）は、遊離ヌクレオチド非存在下および酵素補因子非存在下で、ポリメラーゼが印加された電圧から生じる場を伴うポアを通る一重鎖ポリヌクレオチドの移動を制御するように（アンジップされるように）実行される。本実施形態ではポリメラーゼは、一重鎖ポリヌクレオチドが印加された電圧の影響下でポアをあまりにも速く通って移動することを妨げるブレーキのように作用する。方法は、（ｅ）ポア全体に印加される電圧を、一重鎖ポリヌクレオチドがステップ（ｃ）および（ｄ）におけるものとは反対方向に（すなわち再アニールするように）ポアを通って移動し、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの一部がポアと相互作用するように低下させるステップ、ならびに（ｆ）各相互作用の際にポアを通過する電流を測定し、それによりステップ（ｄ）で得られた標的ポリヌクレオチドの配列を校正するステップを好ましくはさらに含み、ステップ（ｅ）および（ｆ）はポア全体に電圧が印加されて実行される。
【００７８】
標的ポリヌクレオチドの２本鎖は、分離されることができ、配列決定が実行される前の任意の段階で必要に応じて何度でも複製され得る。例えば、上に記載の第一標的ポリヌクレオチドコンストラクトの２本鎖を分離するステップ後に、得られた一重鎖ポリヌクレオチドに相補的な鎖は別の二重鎖ポリヌクレオチドを形成するために作製され得る。次いでこの二重鎖ポリヌクレオチドの２本鎖は、第二コンストラクトを形成するために架橋部を用いて連結され得る。これは、本明細書において「ＤＵＯ」法と称される場合がある。次いでこのコンストラクトは、本発明において用いられ得る。そのような実施形態では、生じたコンストラクト中の二重鎖ポリヌクレオチドの１本鎖は、架橋部によって連結されたオリジナル標的二重鎖ポリヌクレオチド（第一コンストラクト中）の両鎖を含有する。オリジナル標的二重鎖ポリヌクレオチドまたは相補鎖の配列は、推定または決定され得る。複製のこのプロセスは、必要に応じて何度でも反復されることができ、標的ポリヌクレオチドが実際に複数回読み取られることから追加的校正を提供する。
【００７９】
膜
任意の膜が本発明により用いられ得る。好適な膜は、当技術分野において周知である。膜は、好ましくは両親媒性層である。両親媒性層は、親水性および親油性特性の両方を有するリン脂質などの両親媒性分子から形成される層である。両親媒性分子は、合成または天然に存在するものであってよい。天然に存在しない両親媒性物質および単層を形成する両親媒性物質は当技術分野において公知であり、例えばブロックコポリマーを含む（Gonzalez-Perezら、Langmuir、2009、25、10447-10450）。ブロックコポリマーは、１本のポリマー鎖を作出するように２つ以上の単量体サブユニットが共に重合されるポリマー材料である。ブロックコポリマーは、各単量体サブユニットによって寄与される特性を典型的には有する。しかしブロックコポリマーは、個々のサブユニットから形成されたポリマーが保有しない独特の特性を有する場合もある。ブロックコポリマーは、単量体サブユニットの１つが疎水性（すなわち親油性）であるが、他のサブユニット（複数可）が水性媒体中で親水性であるように操作され得る。この場合、ブロックコポリマーは、両親媒特性を保有する場合があり、生物学的膜を模倣する構造を形成できる。ブロックコポリマーは、ジブロック（２個の単量体サブユニットからなる）である場合があるが、両親媒性物質として振る舞うさらに複雑な配置を形成するように２個を超える単量体サブユニットから構築されてもよい。コポリマーは、トリブロック、テトラブロックまたはペンタブロックコポリマーであってもよい。
【００８０】
古細菌（Archaebacterial）双極性テトラエーテル（tetraether）脂質は、天然に存在する脂質であり、脂質が単層膜を形成するように構築される。これらの脂質は一般に厳しい生物学的環境に生存する好極限性細菌、好熱菌、好塩菌および好酸菌において見出される。それらの安定性は、最終二重層の融合された性質から由来すると考えられている。一般的モチーフ親水性−疎水性−親水性を有するトリブロックポリマーを作出するステップによってこれらの生物学的実体を模倣するブロックコポリマー材料を構築することは簡単である。この材料は、脂質二重層と同様に振る舞う単量体膜を形成でき、小胞から層状膜までのさまざまな相の挙動を包含できる。これらのトリブロックコポリマーから形成される膜は、生物学的脂質膜を超えるいくつかの有利点を保持する。トリブロックコポリマーは合成されることから、正確な構築は、膜を形成するためおよびポアならびに他のタンパク質と相互作用するために必要な正確な鎖長および特性を提供するために慎重に制御され得る。
【００８１】
ブロックコポリマーは、脂質サブ材料として分類されないサブユニットから構築されてもよい、例えば疎水性ポリマーは、シロキサンまたは他の炭化水素に基づかない単量体からも作られる場合がある。ブロックコポリマーの親水性サブセクションは、低いタンパク質結合特性を有する場合もあり、未加工の生物学的試料に暴露される場合に高度に耐性である膜の作出を可能にする。頭部群ユニットは、非古典的脂質頭部群に由来することもできる。
【００８２】
トリブロックコポリマー膜は、生物学的脂質膜と比較して増大した機械的および環境的安定性、例えば作動可能なより高い温度またはｐＨの範囲も有する。ブロックコポリマーの合成特性は、幅広い応用のためにポリマーに基づく膜をカズタマイズするためのプラットホームを提供する。
【００８３】
両親媒性分子は、分析物のカップリングを促進するために化学的に修飾または官能基化され得る。
【００８４】
両親媒性層は、単層または二重層であってよい。両親媒性層は、典型的には平面状である。両親媒性層は、曲面などの非平面状であってもよい。
【００８５】
両親媒性層は、典型的には脂質二重層である。脂質二重層は細胞膜のモデルであり、さまざまな実験研究のための優れたプラットホームとして役立つ。例えば、脂質二重層は、単一チャネル記録による膜タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ調査のために用いられ得る。代替的に脂質二重層は、さまざまな物質の存在を検出するためのバイオセンサーとして用いられ得る。脂質二重層は、任意の脂質二重層であってよい。好適な脂質二重層は、これだけに限らないが平面状脂質二重層、支持された二重層またはリポソームを含む。脂質二重層は好ましくは平面状脂質二重層である。好適な脂質二重層は国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６３号（ＷＯ２００８／１０２１２１として公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）、および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に開示されている。
【００８６】
脂質二重層を形成するための方法は、当技術分野において公知である。好適な方法は実施例に開示される。脂質二重層は、脂質単層が水性溶液／空気界面にその界面に垂直である開口部のいずれかの端を通って運ばれる、モンタルおよびミューラーの方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.、1972;69:3561-3566)によって一般的には形成される。
【００８７】
モンタルおよびミューラーの方法は、それがタンパク質ポア挿入のために好適である良質な脂質二重層を形成する対費用効果が高くて比較的簡単な方法であることから一般的である。二重層形成の他の一般的方法は、チップディッピング、ペインティング二重層およびリポソーム二重層のパッチクランピングを含む。
【００８８】
好ましい実施形態では、脂質二重層は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）に記載のとおり形成される。本方法において有利には、脂質二重層は乾燥脂質から形成される。最も好ましい実施形態では、脂質二重層は、ＷＯ２００９／０７７７３４（第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号）に記載のとおり開口部で形成される。
【００８９】
別の好ましい実施形態では、膜は、ソリッドステート層である。ソリッドステート層は生物由来ではない。換言するとソリッドステート層は、生物または細胞などの生物学的環境由来でなく、またはそれから単離されず、生物学的に入手可能な構造の合成的に製造されたバージョンでもない。ソリッドステート層は、これだけに限らないがミクロ電子材料、Ｓｉ３Ｎ４、Ａ１２０３およびＳｉＯなどの絶縁材料、ポリアミドなどの有機および無機ポリマー、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）などのプラスチックまたは２要素添加硬化シリコンゴム（two-component addition-cure silicone rubber）などのエラストマーならびにガラスを含む有機材料ならびに無機材料の両方から形成され得る。ソリッドステート層はグラフェン（graphene）から形成され得る。好適なグラフェン（graphene）層は国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１０６３７号（ＷＯ２００９／０３５６４７として公開）に開示されている。
【００９０】
膜貫通ポア
膜貫通ポアは、水和イオンが印加された電位によって膜の一方の側から膜の他方の側へ流れるように駆動されるようにする構造である。
【００９１】
膜貫通ポアは、好ましくは膜貫通タンパク質ポアである。膜貫通タンパク質ポアは、分析物などの水和イオンが膜の一方の側から膜の他方の側へ流れるようにするポリペプチドまたはポリペプチドの集積物である。本発明では膜貫通タンパク質ポアは、水和イオンが印加された電位によって膜の一方の側から他方へ流れるように駆動されるようにするポアを形成できる。膜貫通タンパク質ポアは、ヌクレオチドなどの分析物が膜（脂質二重層など）の一方の側から他方へ流れるように好ましくはする。膜貫通タンパク質ポアは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドがポアを通って移動されることを可能にする。
【００９２】
膜貫通タンパク質ポアは、単量体またはオリゴマーであってよい。ポアは、いくつかの反復サブユニット（６、７または８サブユニット）から好ましくは作られる。ポアはより好ましくは七量体または八量体ポアである。
【００９３】
膜貫通タンパク質ポアは、イオンが通って流れることができるバレルまたはチャネルを典型的には含む。ポアのサブユニットは、典型的には中央軸を取り囲み、膜貫通βバレルもしくはチャネルまたは膜貫通αヘリックス束もしくはチャネルに鎖を供する。
【００９４】
膜貫通タンパク質ポアのバレルまたはチャネルは、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸などの分析物との相互作用を促進するアミノ酸を典型的には含む。これらのアミノ酸は、バレルまたはチャネルの狭窄部付近に好ましくは位置する。膜貫通タンパク質ポアは、アルギニン、リシンもしくはヒスチジンなどの１つもしくは複数の正に荷電したアミノ酸またはチロシンもしくはトリプトファンなどの芳香族アミノ酸を典型的には含む。これらのアミノ酸は、ポアとヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸との間の相互作用を典型的には促進する。
【００９５】
本発明による使用のための膜貫通タンパク質ポアは、β−バレルポアまたはα−ヘリックス束ポアから生じ得る。β−バレルポアは、β−鎖から形成されるバレルまたはチャネルを含む。好適なβ−バレルポアは、これだけに限らないが、α−ヘモリジン（hemolysin）、炭疽毒素およびロイコシジン（leukocidin）などのβ−毒素、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリン（porin）（Ｍｓｐ）、例えばＭｓｐＡ、外膜ポリン（porin）Ｆ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリン（porin）Ｇ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡおよびナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）などの細菌の外膜タンパク質／ポリン（porin）を含む。α−ヘリックス束ポアは、α−ヘリックスから形成されたバレルまたはチャネルを含む。好適なα−ヘリックス束ポアは、これだけに限らないが内膜タンパク質ならびに、ＷＺＡおよびＣｌｙＡ毒などのα外膜タンパク質を含む。膜貫通ポアは、Ｍｓｐ由来またはα−ヘモリジン（α−ＨＬ）由来である場合がある。
【００９６】
膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはＭｓｐに由来し、好ましくはＭｓｐＡに由来する。そのようなポアはオリゴマーであり、典型的にはＭｓｐ由来の７、８、９または１０個の単量体を含む。ポアは、同一の単量体を含むＭｓｐ由来のホモオリゴマーポアであってよい。代替的にポアは、少なくとも１個の他とは異なる単量体を含むＭｓｐ由来のヘテロオリゴマーポアであってもよい。ポアは、Ｍｓｐ由来の共有結合で付着した２個以上の単量体を含む１個または複数のコンストラクトも含む場合がある。好適なポアは、米国仮特許出願第６１／４４１，７１８号（２０１１年２月１１日出願）に開示されている。好ましくはポアは、ＭｓｐＡまたはその相同体もしくはパラログ由来である。
【００９７】
Ｍｓｐ由来の単量体は、配列番号２に示す配列またはその変種を含む。配列番号２はＭｓｐＡ単量体のＮＮＮ−ＲＲＫ変異体である。それは次の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。配列番号２の変種は、配列番号２のものから変化し、ポアを形成する能力を保持しているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ポアを形成する変種の能力は、当技術分野において公知の任意の方法を用いてアッセイされ得る。例えば変種は、他の適切なサブユニットと共に脂質二重層に挿入されることができ、ポアを形成するためにオリゴマー化するその能力は測定され得る。サブユニットを脂質二重層などの膜に挿入するための方法は、当技術分野において公知である。例えばサブユニットは、脂質二重層に拡散し、脂質二重層に結合するステップおよび機能的状態に会合するステップによって挿入されるように脂質二重層を含有する溶液中に精製された形態で懸濁され得る。代替的にサブユニットは、M.A.Holden,H.Bayley.J.Am.Chem.Soc.2005、127、6502-6503および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に記載の「ピックアンドプレース」法を用いて膜に直接挿入され得る。
【００９８】
好ましい変種は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５０３０１号（米国仮特許出願第６１／４４１，７１８号から優先権を主張する）に開示されている。特に好ましい変種は、これだけに限らないが次の置換（複数可）：Ｌ８８Ｎ；Ｌ８８Ｓ；Ｌ８８Ｑ；Ｌ８８Ｔ；Ｄ９０Ｓ；Ｄ９０Ｑ；Ｄ９０Ｙ；Ｉ１０５Ｌ；Ｉ１０５Ｓ；Ｑ１２６Ｒ；Ｇ７５Ｓ；Ｇ７７Ｓ；Ｇ７５Ｓ、Ｇ７７Ｓ、Ｌ８８ＮおよびＱ１２６Ｒ；Ｇ７５Ｓ、Ｇ７７Ｓ、Ｌ８８Ｎ、Ｄ９０ＱおよびＱ１２６Ｒ；Ｄ９０ＱおよびＱ１２６Ｒ；Ｌ８８Ｎ、Ｄ９０ＱおよびＱ１２６Ｒ；Ｌ８８ＳおよびＤ９０Ｑ；Ｌ８８ＮおよびＤ９０Ｑ；Ｅ５９Ｒ；Ｇ７５Ｑ；Ｇ７５Ｎ；Ｇ７５Ｓ；Ｇ７５Ｔ；Ｇ７７Ｑ；Ｇ７７Ｎ；Ｇ７７Ｓ；Ｇ７７Ｔ；Ｉ７８Ｌ；Ｓ８１Ｎ；Ｔ８３Ｎ；Ｎ８６Ｓ；Ｎ８６Ｔ；Ｉ８７Ｆ；Ｉ８７Ｖ；Ｉ８７Ｌ；Ｌ８８Ｎ；Ｌ８８Ｓ；Ｌ８８Ｙ；Ｌ８８Ｆ；Ｌ８８Ｖ；Ｌ８８Ｑ；Ｌ８８Ｔ；Ｉ８９Ｆ；Ｉ８９Ｖ；Ｉ８９Ｌ；Ｎ９０Ｓ；Ｎ９０Ｑ；Ｎ９０Ｌ；Ｎ９０Ｙ；Ｎ９１Ｓ；Ｎ９１Ｑ；Ｎ９１Ｌ；Ｎ９１Ｍ；Ｎ９１Ｉ；Ｎ９１Ａ；Ｎ９１Ｖ；Ｎ９１Ｇ；Ｇ９２Ａ；Ｇ９２Ｓ；Ｎ９３Ｓ；Ｎ９３Ａ；Ｎ９３Ｔ；Ｉ９４Ｌ；Ｔ９５Ｖ；Ａ９６Ｒ；Ａ９６Ｄ；Ａ９６Ｖ；Ａ９６Ｎ；Ａ９６Ｓ；Ａ９６Ｔ；Ｐ９７Ｓ；Ｐ９８Ｓ；Ｆ９９Ｓ；Ｇ１００Ｓ；Ｌ１０１Ｆ；Ｎ１０２Ｋ；Ｎ１０２Ｓ；Ｎ１０２Ｔ；Ｓ１０３Ａ；Ｓ１０３Ｑ；Ｓ１０３Ｎ；Ｓ１０３Ｇ；Ｓ１０３Ｔ；Ｖ１０４Ｉ；Ｉ１０５Ｙ；Ｉ１０５Ｌ；Ｉ１０５Ａ；Ｉ１０５Ｇ；Ｉ１０５Ｑ；Ｉ１０５Ｎ；Ｉ１０５Ｓ；Ｉ１０５Ｔ；Ｔ１０６Ｆ；Ｔ１０６Ｉ；Ｔ１０６Ｖ；Ｔ１０６Ｓ；Ｎ１０８Ｐ；Ｎ１０８Ｓ；Ｄ９０ＱおよびＩ１０５Ａ；Ｄ９０ＳおよびＧ９２Ｓ；Ｌ８８ＴおよびＤ９０Ｓ；Ｉ８７ＱおよびＤ９０Ｓ；Ｉ８９ＹおよびＤ９０Ｓ；Ｌ８８ＮおよびＩ８９Ｆ；Ｌ８８ＮおよびＩ８９Ｙ；Ｄ９０ＳおよびＧ９２Ａ；Ｄ９０ＳおよびＩ９４Ｎ；Ｄ９０ＳおよびＶ１０４Ｉ；Ｌ８８ＤおよびＩ１０５Ｋ；Ｌ８８ＮおよびＱ１２６Ｒ；Ｌ８８Ｎ、Ｄ９０ＱおよびＤ９１Ｒ；Ｌ８８Ｎ、Ｄ９０ＱおよびＤ９１Ｓ；Ｌ８８Ｎ、Ｄ９０ＱおよびＩ１０５Ｖ；Ｄ９０Ｑ、Ｄ９３ＳおよびＩ１０５Ａ；Ｎ９１Ｙ；Ｎ９０ＹおよびＮ９１Ｇ；Ｎ９０ＧおよびＮ９１Ｙ；Ｎ９０ＧおよびＮ９１Ｇ；Ｉ０５Ｇ；Ｎ９０Ｒ；Ｎ９１Ｒ；Ｎ９０ＲおよびＮ９１Ｒ；Ｎ９０Ｋ；Ｎ９１Ｋ；Ｎ９０ＫおよびＮ９１Ｋ；Ｎ９０ＱおよびＮ９１Ｇ；Ｎ９０ＧおよびＮ９１Ｑ；Ｎ９０ＱおよびＮ９１Ｑ；Ｒ１１８Ｎ；Ｎ９１Ｃ；Ｎ９０Ｃ；Ｎ９０Ｗ；Ｎ９１Ｗ；Ｎ９０Ｋ；Ｎ９１Ｋ；Ｎ９０Ｒ；Ｎ９１Ｒ；Ｎ９０ＳおよびＮ９１Ｓ；Ｎ９０ＹおよびＩ１０５Ａ；Ｎ９０ＧおよびＩ１０５Ａ；Ｎ９０ＱおよびＩ１０５Ａ；Ｎ９０ＳおよびＩ１０５Ａ；Ｌ８８ＡおよびＩ１０５Ａ；Ｌ８８ＳおよびＩ１０５Ｓ；Ｌ８８ＮおよびＩ１０５Ｎ；Ｎ９０ＧおよびＮ９３Ｇ；Ｎ９０Ｇ；Ｎ９３Ｇ；Ｎ９０ＧおよびＮ９１Ａ；Ｉ１０５Ｋ；Ｉ１０５Ｒ；Ｉ１０５Ｖ；Ｉ１０５Ｐ；Ｉ１０５Ｗ；Ｌ８８Ｒ；Ｌ８８Ａ；Ｌ８８Ｇ；Ｌ８８Ｎ；Ｎ９０ＲおよびＩ１０５Ａ；Ｎ９０ＳおよびＩ１０５Ａ；Ｌ８８ＡおよびＩ１０５Ａ；Ｌ８８ＳおよびＩ１０５Ｓ；Ｌ８８ＮおよびＩ１０５Ｎ；Ｌ８８Ｃ；Ｓ１０３Ｃ；Ｉ１０５Ｃ；Ｄ１３４Ｒを含むものを含む。
【００９９】
上に考察した具体的な変異に加えて、変種は他の変異も含み得る。配列番号２のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同である。より好ましくは変種は、配列全体にわたって配列番号２のアミノ酸配列にアミノ酸同一性に基づいて少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同である。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が１００以上（例えば１２５、１５０、１７５もしくは２００またはそれ以上）のストレッチの連続アミノ酸にわたってある場合がある（「高い相同性」）。
【０１００】
相同性を決定するために当技術分野における標準的方法が用いられ得る。例えばＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を算出するために用いられ得るＢＥＳＴＦＩＴプログラム（例えばその初期設定で用いられる）を提供する（Devereuxら、(1984) Nucleic Acids Research 12、387-395頁）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、相同性を算出するためまたは配列を列挙するために（等価残基または対応する配列を同定するステップなど（典型的にはその初期設定で））用いられ得る、例えばAltschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300；Altschul,S.Fら、(1990) J Mol Biol 215:403-10に記載のとおり。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公開で入手可能である。
【０１０１】
配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＮＮＮ−ＲＲＫ変異体である。変種は、ＭｓｐＡと比較してＭｓｐＢ、ＣまたはＤ単量体中の任意の変異を含み得る。ＭｓｐＢ、ＣおよびＤの成熟形態は配列番号７から９に示される。詳細には変種は、ＭｓｐＢに存在する次の置換：Ａ１３８Ｐを含む場合がある。変種は、ＭｓｐＣに存在する次の置換：Ａ９６Ｇ、Ｎ１０２ＥおよびＡ１３８Ｐの１つまたは複数を含む場合がある。変種はＭｓｐＤに存在する次の置換：Ｇ１の欠失、Ｌ２Ｖ、Ｅ５Ｑ、Ｌ８Ｖ、Ｄ１３Ｇ、Ｗ２１Ａ、Ｄ２２Ｅ、Ｋ４７Ｔ、Ｉ４９Ｈ、Ｉ６８Ｖ、Ｄ９１Ｇ、Ａ９６Ｑ、Ｎ１０２Ｄ、Ｓ１０３Ｔ、Ｖ１０４Ｉ、Ｓ１３６ＫおよびＧ１４１Ａの１つまたは複数を含む場合がある。変種は、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤ由来の１つまたは複数の変異および置換の組合せを含み得る。
【０１０２】
アミノ酸置換は、上に考察したものに加えて配列番号２のアミノ酸配列に作出され得る（例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０置換まで）。保存的置換は、アミノ酸を同様の化学構造、同様の化学的特性または同様の側鎖容積を有する他のアミノ酸で置き換える。導入されるアミノ酸は、それらが置き換えるアミノ酸と同様の極性、親水性、疎水性、塩基性度、酸性度、中性度または電荷を有してよい。代替的に保存的置換は、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入する場合がある。保存的アミノ酸変更は、当技術分野において周知であり、下の表２に定義のとおり２０種の主なアミノ酸の特性に従って選択され得る。アミノ酸が同様の極性を有する場合、これは表３におけるアミノ酸側鎖についてのハイドロパシースケールを参照することによっても決定され得る。
【０１０３】
【表２】
2014531196.tif 000008
【０１０４】
【表３】
2014531196.tif 000009
【０１０５】
配列番号２のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基は、上に記載のポリペプチドから追加的に欠失され得る。１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基までまたはそれ以上が欠失され得る。
【０１０６】
変種は、配列番号２の断片を含み得る。そのような断片は、ポア形成活性を保持する。断片は、長さ少なくとも５０、１００、１５０または２００アミノ酸であってよい。そのような断片は、ポアを生成するために用いられ得る。断片は、配列番号２のポア形成ドメインを好ましくは含む。断片は、配列番号２の残基８８、９０、９１、１０５、１１８および１３４の１つを含まなければならない。典型的には断片は、配列番号２の残基８８、９０、９１、１０５、１１８および１３４のすべてを含む。
【０１０７】
１つまたは複数のアミノ酸は、上に記載のポリペプチドに代替的または追加的に付加され得る。伸長は、配列番号２のアミノ酸配列またはそのポリペプチド変種もしくは断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に与えられ得る。伸長は極めて短い（例えば長さ１から１０アミノ酸）場合がある。代替的に伸長はより長くても（例えば５０または１００アミノ酸まで）よい。担体タンパク質は、本発明によるアミノ酸配列に融合され得る。他の融合タンパク質は、下により詳細に考察される。
【０１０８】
上に考察したとおり変種は、配列番号２から変更され、ポアを形成する能力を保持しているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。変種は、ポア形成に関与する配列番号２の領域を典型的には含有する。β−バレルを含有するＭｓｐのポア形成能力は、各サブユニットのβシートによって与えられる。配列番号２の変種は、β−シートを形成する配列番号２中の領域を典型的には含む。１つまたは複数の修飾が、得られる変種がポアを形成する能力を保持する限り、β−シートを形成する配列番号２の領域に作出され得る。配列番号２の変種は、置換、付加または欠失などの１つまたは複数の修飾をα−ヘリックスおよび／またはループ領域内に好ましくは含む。
【０１０９】
Ｍｓｐ由来の単量体は、それらの同定または精製を支援するために、例えばヒスチジン残基（ｈｉｓｔタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグもしくはフラッグタグの付加によって、または（細胞からのそれらの分泌を促進するためのシグナル配列の付加によってポリペプチドが天然でそのような配列を含有しない場合に）修飾され得る。遺伝子タグを導入するための別法は、ポア上の天然のまたは操作された位置にタグを化学的に反応させることである。この例は、ポアの外側に操作されたシステインにゲルシフト試薬を反応させることである。これは、ヘモリジンヘテロ−オリゴマーを分離するステップのための方法として実証されている(Chem Biol.1997 Jul;4(7):497-505)。
【０１１０】
Ｍｓｐ由来の単量体は、明示標識（revealing label）で標識され得る。明示標識は、ポアが検出されるようにする任意の好適な標識であってよい。好適な標識は、これだけに限らないが蛍光分子、放射性同位元素（例えば１２５Ｉ、３５Ｓ）、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよびリガンド（ビオチンなど）を含む。
【０１１１】
Ｍｓｐ由来の単量体は、Ｄ−アミノ酸を用いても生成され得る。例えばＭｓｐ由来の単量体は、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含み得る。これは、そのようなタンパク質またはペプチドを生成するための当技術分野における従来法である。
【０１１２】
Ｍｓｐ由来の単量体は、ヌクレオチド識別を促進するために１つまたは複数の特異的修飾を含有する。Ｍｓｐ由来の単量体は、他の非特異的な修飾をそれらがポア形成を干渉しない限り含有できる。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分野において公知であり、Ｍｓｐ由来の単量体の側鎖に作出され得る。そのような修飾は、例えばアルデヒドとの反応に続くＮａＢＨ４での還元によるアミノ酸の還元的アルキル化、メチルアセトイミデート（methylacetimidate）でのアミジン化または無水酢酸でのアシル化を含む。
【０１１３】
Ｍｓｐ由来の単量体は、当技術分野において公知の標準的方法を用いて生成され得る。Ｍｓｐ由来の単量体は、合成的にまたは組換え手段によって作出され得る。例えばポアはｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成され得る。ポアを生成するための好適な方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に考察されている。ポアを膜に挿入するための方法は考察されている。
【０１１４】
膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはα−ヘモリジン（α−ＨＬ）由来でもある。野生型α−ＨＬポアは、７個の同一単量体またはサブユニットから形成される（すなわち七量体である）。α−ヘモリジン−ＮＮの１個の単量体またはサブユニットの配列は配列番号４に示されている。膜貫通タンパク質ポアは、配列番号４に示す配列またはその変種をそれぞれ含む７個の単量体を好ましくは含む。配列番号４のアミノ酸１、７から２１、３１から３４、４５から５１、６３から６６、７２、９２から９７、１０４から１１１、１２４から１３６、１４９から１５３、１６０から１６４、１７３から２０６、２１０から２１３、２１７、２１８、２２３から２２８、２３６から２４２、２６２から２６５、２７２から２７４、２８７から２９０および２９４はループ領域を形成する。配列番号４の残基１１３および１４７はα−ＨＬのバレルまたはチャネルの狭窄の一部を形成する。
【０１１５】
そのような実施形態では、配列番号４に示す配列またはその変種をそれぞれ含む７個のタンパク質または単量体を含むポアは、本発明の方法において好ましくは用いられる。７個のタンパク質は、同じ（ホモ七量体）または異なっていて（ヘテロ七量体）よい。
【０１１６】
配列番号４の変種は、配列番号４のものから変化したアミノ酸配列を有し、ポア形成能力を保持しているタンパク質である。ポアを形成する変種の能力は、当技術分野において公知の任意の方法を用いてアッセイされ得る。例えば変種は、他の適切なサブユニットと共に脂質二重層に挿入されることができ、ポアを形成するためにオリゴマー化するその能力は決定され得る。サブユニットを脂質二重層などの膜に挿入するための方法は当技術分野において公知である。好適な方法は上に考察されている。
【０１１７】
変種は、核酸結合タンパク質への共有結合付着または相互作用を促進する修飾を含み得る。変種は、核酸結合タンパク質への付着を促進する１つまたは複数の反応性システイン残基を好ましくは含む。例えば変種は、配列番号４の位置８、９、１７、１８、１９、４４、４５、５０、５１、２３７、２３９および２８７ならびに／またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端の１つまたは複数にシステインを含み得る。好ましい変種は、配列番号４の位置８、９、１７、２３７、２３９および２８７の残基のシステインでの置換を含む（Ａ８Ｃ、Ｔ９Ｃ、Ｎ１７Ｃ、Ｋ２３７Ｃ、Ｓ２３９ＣまたはＥ２８７Ｃ）。変種は、好ましくは国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）、または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に記載の変種のいずれか１つである。
【０１１８】
変種は、ヌクレオチドとの任意の相互作用を促進する修飾も含み得る。
【０１１９】
変種は、生物（例えば細菌ブドウ球菌（Staphylococcus））によって天然で発現される天然に存在する変種であってよい。代替的に変種は、大腸菌（Escherichia coli）などの細菌によってｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたは組換え的に発現されてもよい。変種は、組換え技術によって生成される天然に存在しない変種も含む。配列番号４のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同である。より好ましくは変種ポリペプチドは、配列全体にわたって配列番号４のアミノ酸配列にアミノ酸同一性に基づいて少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同である。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が２００以上（例えば２３０、２５０、２７０もしくは２８０またはそれ以上）のストレッチの連続アミノ酸にわたってある場合がある（「高い相同性」）。相同性は上に考察のとおり決定され得る。
【０１２０】
アミノ酸置換は、上に考察したものに加えて配列番号４のアミノ酸配列に作出され得る（例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０置換まで）。保存的置換は、上に考察の通り作出され得る。
【０１２１】
配列番号４のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基は、上に記載のポリペプチドから追加的に欠失され得る。１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基までまたはそれ以上が欠失され得る。
【０１２２】
変種は、配列番号４の断片を含み得る。そのような断片はポア形成能力を保持する。断片は、長さ少なくとも５０、１００、２００または２５０アミノ酸であってよい。断片は、配列番号４のポア形成ドメインを好ましくは含む。断片は典型的には配列番号４の残基１１９、１２１、１３５、１１３および１３９を含む。
【０１２３】
１つまたは複数のアミノ酸は、上に記載のポリペプチドに代替的にまたは追加的に付加され得る。伸長は、配列番号４のアミノ酸配列またはその変種もしくは断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に与えられ得る。伸長は極めて短い（例えば長さ１から１０アミノ酸）場合がある。代替的に伸長は、より長くても（例えば５０または１００アミノ酸まで）良い。担体タンパク質は、ポアまたは変種に融合されてもよい。
【０１２４】
上に考察したとおり、配列番号４の変種は、配列番号４のものから変更され、ポアを形成する能力を保持しているアミノ酸配列を有するサブユニットである。変種は、ポア形成に関与する配列番号４の領域を典型的には含有する。β−バレルを含有するα−ＨＬのポア形成能力は、各サブユニットのβシートによって与えられる。配列番号４の変種は、β鎖を形成する配列番号４の領域を典型的には含む。β鎖を形成する配列番号４のアミノ酸は上に考察されている。１つまたは複数の修飾が、得られる変種がポアを形成する能力を保持する限りβ−鎖を形成する配列番号４の領域に作出され得る。配列番号４のβ鎖領域に作られ得る具体的な修飾は、上に考察されている。
【０１２５】
配列番号４の変種は、置換、付加または欠失などの１つまたは複数の修飾をα−ヘリックスおよび／またはループ領域内に好ましくは含む。α−ヘリックスおよびループを形成するアミノ酸は、上に考察されている。
【０１２６】
変種は、上に考察のとおり、その同定または精製を支援するために修飾され得る。
【０１２７】
α−ＨＬ由来のポアは、Ｍｓｐ由来のポアに関連して上に考察のとおり作出され得る。
【０１２８】
いくつかの実施形態では膜貫通タンパク質ポアは、化学的に修飾される。ポアは、任意の方法および任意の部位で化学的に修飾され得る。膜貫通タンパク質ポアは、１つもしくは複数のシステインへの分子の付着（システイン連結）、１つもしくは複数のリシンへの分子の付着、１つもしくは複数の非天然アミノ酸への分子の付着、エピトープの酵素修飾または末端の修飾によって好ましくは化学的に修飾される。そのような修飾を実行するための好適な方法は、当技術分野において周知である。膜貫通タンパク質ポアは、任意の分子の付着によって化学的に修飾され得る。例えばポアは、色素またはフルオロフォアの付着によって化学的に修飾され得る。
【０１２９】
ポア中の任意の数の単量体は、化学的に修飾され得る。１つまたは複数（２、３、４、５、６、７、８、９または１０個など）の単量体は、上に考察のとおり好ましくは化学的に修飾される。
【０１３０】
システイン残基の反応性は、隣接残基の修飾によって増強され得る。例えば近接アルギニン、ヒスチジンまたはリシン残基の塩基性基は、システインチオール基のｐＫａをより反応性のＳ−基のものに変化させる。システイン残基の反応性は、ｄＴＮＢなどのチオール保護基によって保護され得る。これらは、リンカーが付着する前にポアの１つまたは複数のシステイン残基と反応できる。
【０１３１】
（ポアが化学的に修飾される）分子は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に開示のとおりポアに直接付着され得るか、またはリンカーを介して付着され得る。
【０１３２】
移動
本発明の方法では一重鎖ポリヌクレオチドは、膜貫通ポアを通って移動される。膜貫通ポアを通って一重鎖ポリヌクレオチドが移動するステップは、ポリペプチドがポアの一方の側から他方へ移動するステップを意味する。ポアを通る一重鎖ポリヌクレオチドの移動は、電位もしくは酵素作用または両方によって駆動または制御され得る。移動は、一方向性であってよく、後退および前進の両方が可能であってもよい。
【０１３３】
ポリペプチド結合タンパク質は、ポアを通る一重鎖ポリヌクレオチドの移動を制御するために好ましくは用いられる。このタンパク質は、ポリヌクレオチドの２本鎖を分離する好ましくは同じタンパク質である。より好ましくはこのタンパク質は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼである。Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの３種のモードは、上に考察のとおり、ポアを通る一重鎖ポリヌクレオチドの移動を制御するために用いられ得る。好ましくはＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチドを分離し、生じた一重鎖ポリヌクレオチドの膜貫通ポアを通る移動を制御する。
【０１３４】
いくつかの実施形態では標的ポリヌクレオチド全体（架橋部によって標的ポリヌクレオチドの他方の鎖に連結された標的ポリヌクレオチドの一方の鎖を含む一重鎖ポリヌクレオチドとして）がポアを通って移動する。それ故に標的ポリヌクレオチド全体がポアを通って移動され、配列決定される。他の実施形態では標的ポリヌクレオチドの一部だけがポアを通って移動する。標的ポリヌクレオチドの一部だけがポアを通って移動するそのような実施形態は、次の：
（ｉ）標的ポリヌクレオチドの一方の鎖の一部（例えばＤＮＡのセンス鎖の一部）
（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの一方の鎖のすべて（例えばＤＮＡのセンス鎖のすべて）
（ｉｉｉ）一方の鎖のすべて（例えばＤＮＡのセンス鎖のすべて）および第二鎖の一部（例えばＤＮＡのアンチセンス鎖の一部）
のとおりであってよい。
【０１３５】
一方の鎖の一部だけ、または一方の鎖のすべておよび他方の鎖の一部がポアを通って移動する実施形態では、オリジナル２本鎖（すなわちセンス鎖およびアンチセンス鎖）のどちらが完全にまたは部分的にポアを通って移動するかは重要ではない。さらにセンス鎖およびアンチセンス鎖がポアを通る移動の順序は問題ではない。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、上に考察および図１３に示すとおり、二重鎖分析物の２本鎖を連結するステップ、および２本の連結された鎖を一重鎖標的ポリヌクレオチドに分離するステップの後に一重鎖標的ポリヌクレオチドに対する相補鎖が第二コンストラクトを形成するように作製される。第二コンストラクトの２本鎖は、本明細書に記載のとおり一緒に連結され得る。第二コンストラクトの相補鎖は、次いで一重鎖標的ポリヌクレオチドから分離される。この状況では、オリジナル一重鎖標的ポリヌクレオチドは、ポアを通って移動でき、および／または相補鎖はポアを通って移動できる。いくつかの例では相補鎖だけが配列決定される。上に記載のとおり、分離および相補鎖作製のこのプロセスは、必要に応じて何度でも反復され得る。これは、本明細書において「ＤＵＯ」法と称される場合がある。
【０１３７】
コンストラクトがリーダーポリマーおよびテールポリマーをさらに含む場合、標的ポリヌクレオチドの２本鎖が分離されるステップの後に作出された一重鎖標的ポリヌクレオチドは、（１）リーダーポリマー；（２）標的ポリヌクレオチドの一方の鎖；（３）架橋部；（４）標的ポリヌクレオチドの他方の鎖；および（５）テールポリマーの順序でポアを通って好ましくは移動する。これは、「ＭＯＮＯ」法により作出されたコンストラクトを配列決定するステップの例である。
【０１３８】
代替的実施形態ではＤＵＯ法により生成されたコンストラクトは、（１）リーダーポリマー；（２）標的ポリヌクレオチドの第一鎖；（３）第一架橋部；（４）標的ポリヌクレオチドの第二鎖；（５）第二架橋部；（６）標的ポリヌクレオチドの第二鎖の相補物；（７）第一架橋部の相補物；（８）標的ポリヌクレオチドの第一鎖の相補物；および（９）テールポリマーの順序でポアを通る。０
【０１３９】
二重鎖標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法
本発明の方法は、一重鎖ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの一部が膜貫通ポアと相互作用するように一重鎖ポリヌクレオチドを膜貫通ポアを通して移動させるステップを含む。
【０１４０】
方法は、上に考察したとおり任意の好適な膜、好ましくは脂質二重層系（ポアが脂質二重層中に挿入されている）を用いて実行され得る。方法は、（ｉ）ポアを含む人工二重層、（ｉｉ）ポアを含む単離された天然に存在する脂質二重層、または（ｉｉｉ）挿入されたポアを有する細胞を用いて典型的には実行される。方法は、人工脂質二重層を用いて好ましくは実行される。二重層は、ポアに加えて他の膜貫通タンパク質および／または膜内タンパク質ならびに他の分子を含んでもよい。好適な装置および条件は、本発明の配列決定実施形態に関連して下に考察される。本発明の方法は、典型的にはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行される。
【０１４１】
本発明は、二重鎖標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法を提供する。上に考察のとおりポリヌクレオチドは、２対以上のヌクレオチドを含む巨大分子である。ヌクレオチドは、上に考察した任意のものであってよい。ポリヌクレオチドは好ましくは核酸である。
【０１４２】
これらの方法は、ポアを通過する電流について有する異なる影響に基づいて類似する構造のヌクレオチドを識別するために膜貫通タンパク質ポアが用いられ得ることから可能である。個々のヌクレオチドは、ポアと相互作用する際のそれらの電流振幅から一分子レベルで同定され得る。ヌクレオチドは、電流がそのヌクレオチドについて特異的な様式でポアを通って流れる場合（すなわちヌクレオチドに関連する特有の電流がポアを通って流れることが検出される場合）にポアに存在する。標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの逐次的同定は、ポリヌクレオチドの配列が推定または決定されることを可能にする。
【０１４３】
方法は、（ａ）標的ポリヌクレオチドを含むコンストラクトを提供するステップであって、標的ポリヌクレオチドの２本鎖が架橋部によって連結されるステップ；（ｂ）コンストラクトを核酸結合タンパク質と接触させることによって標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離するステップ；（ｃ）得られた一重鎖ポリヌクレオチドを膜貫通ポアを通して移動させるステップ；ならびに（ｄ）各相互作用の際にポアを通過する電流を測定し、それにより標的ポリヌクレオチドの配列を決定するまたは推定するステップを含む。それにより方法は、標的ポリヌクレオチドを配列決定するために、ヌクレオチドが個々にバレルまたはチャネルを通る際の標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの一部の膜貫通ポアセンシングを含む。上に考察のとおりこれは鎖配列決定である。
【０１４４】
標的ポリヌクレオチドの全体または一部だけが本方法を用いて配列決定され得る。ポリヌクレオチドは任意の長さであってよい。例えばポリヌクレオチドは、長さ少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００または少なくとも５００ヌクレオチド対であってよい。ポリヌクレオチドは、長さ１０００ヌクレオチド対以上、５０００ヌクレオチド対以上または１０００００ヌクレオチド対以上であってよい。ポリヌクレオチドは天然に存在するまたは人工的であってよい。例えば本方法は、製造されたオリゴヌクレオチドの配列を変化させるために用いられ得る。方法は、典型的にはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行される。
【０１４５】
一重鎖ポリヌクレオチドは、膜のいずれの側でポアと相互作用してもよい。一重鎖ポリヌクレオチドはポアと任意の方法および任意の部位で相互作用してよい。
【０１４６】
一重鎖ポリヌクレオチド中のヌクレオチドとポアとの間の相互作用の際に、ヌクレオチドはヌクレオチドに特異的な様式でポアを通って流れる電流に影響を与える。例えば特定のヌクレオチドは、特定の平均時間について特定の程度にポアを通って流れる電流を低下させる。換言すると、ポアを通って流れる電流は、特定のヌクレオチドに特有である。対照実験は、特定のヌクレオチドがポアを通って流れる電流に有する効果を決定するために実行され得る。試験試料について本発明の方法を実行するステップから得られる結果は、次いで標的ポリヌクレオチドの配列を決定または推定するために、そのような対照実験由来のものと比較され得る。
【０１４７】
配列決定法は、任意の好適な膜／ポア系（ポアは膜に挿入されている）を用いて実行され得る。方法は、天然に存在するまたは合成の脂質を含む膜を用いて典型的には実行される。膜は典型的にはｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成される。好ましくは方法は、ポアを含む単離された、天然に存在する膜またはポアを発現している細胞を用いては実行されない。好ましくは方法は、人工膜を用いて実行される。膜は、ポアに加えて他の膜貫通および／または膜内タンパク質ならびに他の分子を含み得る。
【０１４８】
膜は、イオン、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの流れに障害を形成する。好ましくは膜は、脂質二重層などの両親媒性層である。本発明による使用のために好適な脂質二重層は上に記載されている。
【０１４９】
本発明の配列決定法は、典型的にはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行される。
【０１５０】
配列決定法は、ポアが膜に挿入されている膜／ポア系を調査するために好適である任意の装置を用いて実行され得る。方法は、膜貫通ポアセンシングに好適である任意の装置を用いて実行され得る。例えば装置は、水性溶液および、チャンバーを２つのセクションに分離する障壁を含むチャンバーを含む。障壁はポアを含有する膜が形成される開口部を有する。
【０１５１】
配列決定法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２号に記載の装置を用いて実行され得る。
【０１５２】
本発明の方法は、ヌクレオチド（複数可）との相互作用の際にポアを通過する電流を測定するステップを含む。したがって装置は、電位を印加でき、膜およびポアを通る電気シグナルを測定できる電気回路も含む。方法は、パッチクランプまたは電圧クランプを用いても実行され得る。方法は、電圧クランプの使用を好ましくは含む。
【０１５３】
本発明の配列決定方法は、ヌクレオチドとの相互作用の際にポアを通過する電流の測定を含む。膜貫通タンパク質ポアを通るイオン電流を測定するための好適な条件は、当技術分野において公知であり、実施例で開示される。方法は、膜およびポア全体に印加される電圧と共に典型的には実行される。用いられる電圧は典型的には、−４００ｍＶから＋４００ｍＶまでである。好ましくは用いられる電圧は、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶおよび０ｍＶから選択される下限値および＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋４００ｍＶから独立に選択される上限値を含む範囲内である。用いられる電圧は、より好ましくは１００ｍＶから２４０ｍＶまでの範囲内、最も好ましくは１６０ｍＶから２４０ｍＶまでの範囲内である。印加される電位を増加させることによってポアによるさまざまなヌクレオチド間の識別を向上させることは可能である。
【０１５４】
配列決定方法は、任意のアルカリ金属塩化物塩の存在下で典型的には実行される。上に考察した例示的装置では、塩はチャンバー中の水性溶液中に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）またはフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物が典型的には用いられる。ＫＣｌ、ＮａＣｌおよびフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物は好ましい。塩濃度は飽和であってよい。塩濃度は、典型的には０．１から２．５Ｍまで、０．３から１．９Ｍまで、０．５から１．８Ｍまで、０．７から１．７Ｍまで、０．９から１．６Ｍまでまたは１Ｍから１．４Ｍまでである。塩濃度は、好ましくは１５０ｍＭから１Ｍまでである。高塩濃度は、高い信号対雑音比を提供し、通常の電流変動のバックグラウンドに対してヌクレオチドの存在を示す電流が同定されることを可能にする。低塩濃度は、ヌクレオチド検出が酵素の存在下で実行される場合に用いられる場合がある。これは以下により詳細に考察される。
【０１５５】
方法は、緩衝剤の存在下で典型的には実行される。上に考察した例示的装置では、緩衝剤はチャンバー中の水性溶液に存在する。任意の緩衝剤が本発明の方法において用いられ得る。典型的には、緩衝剤はＨＥＰＥＳである。別の好適な緩衝剤はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤である。方法は、４．０から１２．０まで、４．５から１０．０まで、５．０から９．０まで、５．５から８．８まで、６．０から８．７までまたは７．０から８．８までまたは７．５から８．５までのｐＨで典型的には実行される。用いられるｐＨは好ましくは約７．５である。
【０１５６】
方法は、０ｏＣから１００ｏＣまで、１５ｏＣから９５ｏＣまで、１６ｏＣから９０ｏＣまで、１７ｏＣから８５ｏＣまで、１８ｏＣから８０ｏＣまで、１９ｏＣから７０ｏＣまでまたは２０ｏＣから６０ｏＣまでで実行され得る。方法は典型的には室温で実行される。方法は、約３７℃などの酵素機能を支持する温度で場合により実行される。
【０１５７】
上に記載のとおり、良好なヌクレオチド識別は温度が上昇すると低塩濃度で達成され得る。溶液温度の上昇に加えて、酵素活性に好適である条件を維持しながら溶液のコンダクタンスを増加させるために使用され得る多数の他の戦略がある。そのような１つの戦略は、塩溶液の２つの異なる濃度（酵素側に塩の低塩濃度および反対側に高濃度）を分割するために脂質二重層を用いることである。この手法の一例は膜のｃｉｓ側に２００ｍＭ  ＫＣｌおよびｔｒａｎｓチャンバーに５００ｍＭ  ＫＣｌを用いることである。これらの条件では、ポアを通るコンダクタンスは、通常条件下でのおよそ４００ｍＭ  ＫＣｌに相当すると予測され、酵素はｃｉｓ側に置かれた場合に２００ｍＭを経験するだけである。非対称性塩条件を用いることで考えられる別の利益は、ポアにわたって導入される浸透圧傾斜である。水のこの基本的な流れは、検出のためにポア内へヌクレオチドを引くために用いられ得る。同様の効果が、ショ糖、グリセロールまたはＰＥＧなどの中性浸透圧調節物質を用いて達成され得る。別の可能性は、比較的低いレベルのＫＣｌを含む溶液を用い、酵素活性を破壊しにくい追加的電荷輸送種（charge carrying species）に依存することである。
【０１５８】
分析される標的ポリヌクレオチドは、大量の溶液中で結合タンパク質によって作用されることからポリヌクレオチドを保護するために公知の保護化学物質と組み合わされ得る。次いでポアは、保護化学物質を除去するために用いられ得る。これは電位が印加された下で、ポア、結合タンパク質もしくは酵素にハイブリダイズされない保護基を用いるステップ（ＷＯ２００８／１２４１０７）によって、またはポアにごく接近して保持された場合に結合タンパク質もしくは酵素によって除去される保護化学物質を用いるステップ（J Am Chem Soc. 2010 Dec 22;132(50):17961-72）のいずれかによって達成され得る。
【０１５９】
本発明の鎖配列決定法は、標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離するためにポリヌクレオチド結合タンパク質を用いる。より好ましくはポリヌクレオチド結合タンパク質は、ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動も制御する。そのようなタンパク質の例は上に示され、考察される。
【０１６０】
一重鎖配列決定のための２つの戦略は、印加される電位に沿ってまたは反対に、ｃｉｓからｔｒａｎｓへのおよびｔｒａｎｓからｃｉｓへの両方で膜貫通ポアを通る一重鎖ポリヌクレオチドの移行である。鎖配列決定のための最も有利な機構は、印加された電位の下でのナノポアを通る一重鎖ポリヌクレオチドの制御された移行である。二重鎖ポリヌクレオチドに進行性または前進的に作用するエキソヌクレアーゼは、印加される電位下で残存する１本鎖を供給するためにポアのｃｉｓ側で、または逆電位下でｔｒａｎｓ側で用いられ得る。同様に、二重鎖ポリヌクレオチドを巻き戻すヘリカーゼも同様の様式で用いられ得る。印加された電位に対する鎖移行を必要とする配列決定応用にも可能性があるが、ポリヌクレオチドは逆電位または無電位で酵素によって最初に「捕捉」されなければならない。電位をかけ、次いで結合後に切り換えると鎖はｃｉｓ  からｔｒａｎｓへポアを通過し、電流によって伸長された配置で維持される。一重鎖ポリヌクレオチドエキソヌクレアーゼまたは一重鎖ポリヌクレオチド依存性ポリメラーゼは、印加される電位とは反対にｔｒａｎｓからｃｉｓへ制御された段階的様式で、直近に移行された一重鎖をポアを通して後ろへ引く分子モーターとして作用できる。代替的に一重鎖ＤＮＡ依存性ポリメラーゼは、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を遅くする分子ブレーキとして作用できる。
【０１６１】
最も好ましい実施形態では鎖配列決定は、Ｍｓｐ由来のポアおよびＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて実行される。方法は、（ａ）二重鎖標的ポリヌクレオチドコンストラクトを提供するステップ；（ｂ）鎖が分離され、ポリメラーゼがＭｓｐポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御し、標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの一部がポアと相互作用するように、標的ポリヌクレオチドをＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼと相互作用させるステップ；および（ｃ）各相互作用の際にポアを通過する電流を測定し、それにより標的ポリヌクレオチドの配列を推定または決定するステップを含み、ステップ（ｂ）および（ｃ）はポア全体に電圧を印加して実行される。
【０１６２】
標的ポリヌクレオチドがＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼおよびＭｓｐ由来のポアと接触される場合、標的ポリヌクレオチドは最初にＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼと複合体を形成する。電圧がポア全体に印加されると、標的ポリヌクレオチド／Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ複合体は、ポアと複合体を形成し、ポアを通る一重鎖ポリヌクレオチドの移動を制御する。
【０１６３】
本実施形態は、３つの予測外の有利点を有する。第一に標的ポリヌクレオチドが商業的に価値のある速度でポアを通って移動し、有効な配列決定を可能にする。標的ポリヌクレオチドは、Ｍｓｐポアをヘモリジンポアを通るよりもより速く移動する。第二に、増大した電流範囲がポリヌクレオチドがポアを通って移動する際に観察され、より容易に配列が推定または決定されるようにする。第三に、特定のポアおよびポリメラーゼが一緒に用いられる場合に減少した電流変動が観察され、それにより信号対雑音比を増加させる。
【０１６４】
上に記載の任意のポリヌクレオチドが配列決定され得る。
【０１６５】
ポアは、上に考察の任意のポアであってよい。ポアは、配列番号２に示す配列またはその変種を含む８個の単量体を含む場合がある。
【０１６６】
上に考察のとおり、野生型Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ活性およびエキソヌクレアーゼ活性を有する。それは適正な条件下で二重鎖ポリヌクレオチドをアンジップもできる。それ故に酵素は、３種のモード（上に考察のとおり）で作動できる。本発明の方法は、ＭｓｐポアおよびＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを好ましくは含む。Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼは、二重鎖標的ポリヌクレオチドを好ましくは分離し、得られた一重鎖ポリヌクレオチドのポアを通る移動を制御する。
【０１６７】
上に考察した任意の系、装置または条件は、この好ましい実施形態により用いられ得る。塩濃度は、典型的には０．１５Ｍから０．６Ｍまでである。塩は好ましくはＫＣｌである。
【０１６８】
キット
本発明は、配列決定のために二重鎖標的ポリヌクレオチドを調製するためのキットも提供する。キットは、（ａ）標的ポリヌクレオチドの２本鎖を連結できる架橋部および（ｂ）少なくとも１つのポリマーを含む。
【０１６９】
好ましい実施形態ではキットは、リーダーポリマーおよびテールポリマーをさらに含む。リーダーポリマーおよびテールポリマーは、上に詳細に記載されている。リーダーポリマーおよびテールポリマーがポリヌクレオチドである場合、リーダーポリマーおよびテールポリマーは単一ユニットとして提供され得る。このユニットでは、リーダーポリマーの一部およびテールポリマーの一部は二重鎖を形成する。この二重鎖領域は、典型的には長さ５から２０ヌクレオチド対であってよい。このユニットの二重鎖部分の端は二重鎖標的ポリヌクレオチドに連結される。２個の二重鎖ポリヌクレオチドを連結するための好適な方法は、当技術分野において公知である。リーダーポリマーおよびテールポリマーの残部は、一重鎖ポリヌクレオチドのままである。
【０１７０】
キットは、膜貫通ポアと相互作用する場合に特有の電流を生成する１つまたは複数のマーカーも好ましくはさらに含む。そのようなマーカーは上に詳細に記載されている。
【０１７１】
キットは、標的ポリヌクレオチドを膜にカップリングさせる手段も好ましくは含む。標的ポリヌクレオチドを膜にカップリングさせる手段は上に記載されている。カップリングさせる手段は、反応基を好ましくは含む。好適な反応基は、これだけに限らないがチオール、コレステロール、脂質およびビオチン基を含む。
【０１７２】
キットは、脂質二重層を形成するために必要なリン脂質などの膜の構成部をさらに含んでよい。
【０１７３】
本発明の方法に関連して上に考察された任意の実施形態は、本発明のキットに等しく適用可能である。
【０１７４】
本発明のキットは、上に述べた任意の実施形態が実行されるようにする１つまたは複数の他の試薬または器具を追加的に含んでよい。そのような試薬または器具は、次の：好適な緩衝剤（複数可）（水性溶液）、対象から試料を得るための手段（容器もしくは、針を含む器具など）、ポリヌクレオチドを増幅および／もしくは発現するための手段、上に定義の膜または電圧もしくはパッチクランプ装置、の１つまたは複数を含む。試薬は、液体試料が試薬を再懸濁するように乾燥状態でキット中に存在する場合がある。キットは、キットが本発明の方法において用いられ得るようにする説明書、またはいずれの患者に方法が用いられ得るかに関する詳細も場合により含む場合がある。キットは、場合によりヌクレオチドを含み得る。
【０１７５】
配列決定のための標的ポリヌクレオチドを調製する方法
本発明は、配列決定のための二重鎖標的ポリヌクレオチドを調製する方法も提供する。本方法は、標的ポリヌクレオチドを配列決定することができるコンストラクトを作製する。本方法では標的ポリヌクレオチドの２本鎖が架橋部によって連結され、ポリマーは標的ポリヌクレオチドの一方の鎖の他の端に付着される。ポリマーは、好ましくはリーダーポリマーであり、方法は標的ポリヌクレオチドの他方の鎖に（すなわちリーダーポリマーと同じ端に）テールポリマーを付着させるステップも好ましくはさらに含む。リーダーポリマーおよびテールポリマーは、上に詳細に考察されている。
【０１７６】
方法は、コンストラクトに膜をカップリングさせる手段をコンストラクトに付着させるステップも好ましくはさらに含む。そのような手段は上に記載されている。
【０１７７】
架橋部は、別に合成されることができ、次いで標的ポリヌクレオチドに化学的に付着または酵素的にライゲーションされ得る。そのようにするための手段は当技術分野において公知である。代替的に架橋部は、標的ポリヌクレオチドのプロセシングにおいて作製され得る。再度、好適な手段は当技術分野において公知である。
【０１７８】
配列決定のための標的ポリヌクレオチドを調製する好適な方法は、実施例３で例示される。
【０１７９】
装置
本発明は、二重鎖標的ポリヌクレオチドを配列決定するための装置も提供する。装置は、（ａ）膜；（ｂ）膜中の複数の膜貫通ポア；（ｃ）標的ポリヌクレオチドの２本鎖を分離できる複数のポリヌクレオチド結合タンパク質；および（ｄ）本発明の方法を実行するための説明書を含む。装置は、アレイまたはチップなどのポリヌクレオチド分析のための任意の従来装置であってよい。本発明の方法に関連して上に考察された任意の実施形態は、本発明のキットに等しく適用可能である。
【０１８０】
装置は、本発明の方法を実行するために好ましくはセットアップされている。
【０１８１】
Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼなどの好適な核酸結合タンパク質は、上に記載されている。
【０１８２】
装置は、
膜および複数のポアを支持でき、ポアおよびタンパク質を用いてポリヌクレオチド配列決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；
配列決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
少なくとも１つのリザーバーからセンサーデバイスに材料を制御可能に供給するように構成された流体系；および
各試料を受けるための複数の容器を好ましくは含み、
流体系は、容器からセンサーデバイスに試料を選択的に供給するように構成されている。装置は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００７８９号（ＷＯ２０１０／１２２２９３として公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／００２２０６号（未公開）または国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５６７９号（ＷＯ００／２８３１２として公開）において記載の任意のものであってよい。
【０１８３】
次の実施例は本発明を例示する。
【実施例１】
【０１８４】
ｄｓＤＮＡヘアピン周辺読み取り
ｓｓＤＮＡに沿って分子ブレーキとして作用するだけでなく、ｄｓＤＮＡセクションに沿っても機能的にも通過するＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素の能力は、ｄｓＤＮＡコンストラクトのヘアピンターン周辺を読み取るために利用されることができ、センス鎖およびアンチセンス鎖両方のＤＮＡ／ＲＮＡ配列決定を可能にする。図３は、ヘアピンターンを有するｄｓＤＮＡコンストラクトのセンス鎖およびアンチセンス鎖両方がＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素でどのように配列決定され得るかを例示する。Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼに基づくこの実行では、ｄｓＤＮＡコンストラクトは、印加された電場の下でのナノポアによる捕捉を可能にするために５’−ｓｓＤＮＡリーダーを含有する。これには、ヘアピンターンによって連結されたｄｓＤＮＡセクションが続く。ヘアピンターンは、アンチセンス鎖領域からのセンス鎖領域の同定を補助するために特徴的な電流サインを作るマーカー（図３の×）を場合によりターンに含有し得る。現在の実行では、読み取りヘッドが酵素の約２０塩基下方にありＤＮＡの端からそれが外れる場合に、最後の約２０塩基は配列決定されないことから、コンストラクトはアンチセンス鎖領域の末端までの読み取りを可能にするために３’−ｓｓＤＮＡ伸長も場合により含有し得る。
【０１８５】
２個のｄｓＤＮＡセクションを連結するヘアピンターンは、これだけに限らないがＤＮＡ／ＲＮＡのセクション、修飾ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＰＥＧ、他のポリマーリンカーまたは短い化学的リンカーで作出できる。ヘアピンリンカーを別に合成し、ｄｓＤＮＡに化学的に付着もしくは酵素的にライゲーションできる、またはゲノムＤＮＡのプロセシングにおいて作製できる。
【０１８６】
方法
ＤＮＡ：４個の別々のＤＮＡコンストラクトを図４〜７に示すとおり合成ＤＮＡから調製した（表４）。
【０１８７】
【表４】
2014531196.tif 000010
【０１８８】
すべてのＤＮＡはＰＡＧＥ精製乾燥ペレットとしてIｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入し、純水中に最終濃度１００μＭに溶解した。短いｄｓＤＮＡコンストラクトをＵＺ０８をＵＺ１２にハイブリダイズするステップによって調製した（表４）。ハイブリダイズするために等量の１００μＭ  ＤＮＡ溶液を合わせて混合し、ホットプレートで９５℃に加熱し、１０分間、９５℃に保持し、次いで約２時間かけてゆっくり室温に冷却した。これは、５０μＭのハイブリダイズしたＤＮＡ複合体の最終溶液をもたらす。ＵＺ０７、ＵＡ０２およびＭＳ２３ＤＮＡコンストラクトは４Ｔターンを有するヘアピンである（表４）。センス領域とアンチセンス領域とをハイブリダイズするために、１００μＭ  ＤＮＡ溶液をホットプレートで９５℃に加熱し、１０分間、９５℃に保持し、次いで試料を冷蔵庫に置くステップによって急速に４℃に冷却した。急速冷却は、分子間ハイブリダイゼーションを超えて分子内ヘアピン形成を増強する。プロセスは、１００μＭのハイブリダイズしたＤＮＡヘアピンの最終溶液をもたらす。
【０１８９】
ＭｓｐＡ生成：精製ＭｓｐＡ（ＮＮＮＲＲＫ）オリゴマーをｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で作出した。精製したオリゴマーを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルから適切なオリゴマーバンドを切断するステップによって得て、次いでＴＥ緩衝液中に再溶媒和した。
【０１９０】
アンジッピング実験：１，２−ジフィタノイル−グリセロ−３−ホスホコリン脂質（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）二重層に挿入された単一のＭｓｐＡナノポアから電気計測値を得た。二重層は、モンタル−ミューラー技術によって開口部直径約１００μｍ、厚さ２０μｍのＰＴＦＥフィルム（Ｄｅｌｒｉｎ  ｃｈａｍｂｅｒｓ注文生産）で形成され、２個の１ｍＬ緩衝溶液に分けた。すべての実験は、４００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８．０のＳｔｒａｎｄ  ＥＰ緩衝液中で実行した。単一チャネル電流を１４４０Ａデジタイザーを備えたＡｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を緩衝溶液に繋ぎ、ｃｉｓコンパートメント（ナノポアおよび酵素／ＤＮＡの両方が添加されている）をＡｘｏｐａｔｃｈ  ｈｅａｄｓｔａｇｅのアースに繋ぎ、ｔｒａｎｓコンパートメントをｈｅａｄｓｔａｇｅの探査電極に繋ぐ。
【０１９１】
ＤＮＡコンストラクトおよびＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ；１５０μＭ）をｓｔｒａｎｄ  ＥＰ緩衝液１００μＬに添加し、５分間予備インキュベートした（ＤＮＡ＝１μＭ、酵素＝２μＭ）。ＭｓｐＡナノポアでの複合体の捕捉およびアンジッピングを開始するためにこの予備インキュベーション混合物を電気生理学チャンバーのｃｉｓコンパートメント中の緩衝液９００μＬに添加した（ＤＮＡ＝０．１μＭ、酵素＝０．２μＭ最終濃度をもたらす）。１回の実験では１種類のＤＮＡだけを系に添加した。アンジッピング実験を＋１８０ｍＶの一定電位で実行した。
【０１９２】
結果：
ヘアピンを有するまたは有さないｄｓＤＮＡコンストラクトをＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いてＭｓｐＡナノポアを通してアンジッピングした際に、特徴的で一致しているポリメラーゼ制御ＤＮＡ移動を観察した（図４〜７）。図４〜７は、ナノポアを通る分析物の複数の単一移行から得られた）示した各ＤＮＡコンストラクトについての共通ＤＮＡ配列プロファイルを示す。
【０１９３】
ヘアピンを有さないｄｓＤＮＡコンストラクト（ＵＺ０８＋ＵＺ１２）は、小数の配列依存状態（典型的には約１０、図４）を示す。これは、酵素がＤＮＡの３’−末端から外れる（読み取りヘッドの約２０塩基上方）前に、ナノポアの読み取りヘッドを通過するｄｓＤＮＡセクション中の３１塩基の内の約１０〜１５塩基と一致し、最後の約２０塩基はブレーキが掛からずにナノポアを通って移行する（解読には速すぎる）。
【０１９４】
ＵＺ０７（表４）は、ＵＺ０８＋ＵＺ１２と同じＤＮＡ配列を含有するが、センス鎖とアンチセンス鎖とを繋ぐ４Ｔターンを有するヘアピンコンストラクトである。ＵＺ０７から得られた共通配列（図５）は、ＵＺ０８＋ＵＺ１２と同じ初期プロファイルを共有するが、ＵＺ０８＋ＵＺ１２  ｄｓＤＮＡについてよりも多くの配列状態（典型的には＞３０）を示す（図４）。これは、酵素がセンス鎖のヘアピンを回り、アンチセンス鎖に沿って進んでいること示す。これはセンス鎖全体およびアンチセンス鎖の一部の下方読み取りを可能にする（３’−末端から酵素が外れる前の最後の約２０塩基は除く）。
【０１９５】
ＵＡ０２（表４）は、ＵＺ０７と同じ配列を有するが、コンストラクトの３’−末端に非相補性ｓｓＤＮＡの追加の２５塩基の付加を有する。ＵＡ０２（図６）から得られた共通配列は、ＵＺ０７によくマッチする配列プロファイルを示す（図５）が、末端に追加的な約２０個の状態を有する。３’−末端の追加的な２５塩基は、ＤＮＡの末端（読み取りヘッドの約２０塩基上方）から上鎖酵素が外れる前にアンチセンスの全長が読み取られるようにする。図８は、ＵＡ０２からの共通配列、最初にナノポアにあるホモポリマー５’−オーバーハング（セクション１）、センス（セクション２）、ターン（セクション３）およびアンチセンス（セクション４）領域を示す。
【０１９６】
マーカーは、ヘアピンターン内または付近に置かれることができ、配列決定される際に特徴的なシグナルを生成し、未知のＤＮＡ配列のセンス領域およびアンチセンス領域の簡便な同定をできるようにする。ＭＳ２３（表４）は、ＵＺ０７と同じ配列を有するだけでなく、センス鎖とアンチセンス鎖とを分離するヘアピンの４Ｔターン中に脱塩基マーカーの付加を有する。ＭＳ２３から得られた共通配列（図７）は、ＵＺ０７によくマッチする配列プロファイルを示すが（図５）、脱塩基がナノポア読み取りヘッドをこの時点で通過することの結果として、ターン領域中で電流が変化した大きな上向きスパイクを有する（＊で示す）。電流におけるこの大きな上向きスパイクは、通常の塩基と比較してナノポア狭窄における脱塩基の低下したイオン遮断の特徴であり、それによってセンス領域とアンチセンス領域とが分離される明確なシグナルを提供する。
【０１９７】
要約：
これらの実験は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼが、ｓｓＤＮＡセクションに沿う効率的な分子ブレーキとして作用するその能力によってｄｓＤＮＡコンストラクトのヘアピンターン周辺を読み取れることを実証する。
【０１９８】
本実行におけるＭｓｐＡナノポアの読み取りヘッドは、Ｐｈｉ２９酵素への入口のＤＮＡから約２０塩基下方にある。結果として酵素がＤＮＡ鎖の末端に至って基質を放出すると、残りの約２０塩基は解析／配列決定されるには速すぎる未制御の様式でナノポアを通って移行する。しかし場合により３’−伸長（５’から３’読み取り方向で）を、アンチセンス鎖全体の完全な配列決定をできるようにする読み取り距離を伸長するためにＤＮＡコンストラクトに付加できる。
【０１９９】
特徴的な電流サインを生成するマーカーを、配列のセンス領域およびアンチセンス領域の同定を補助するために場合によりＤＮＡコンストラクトのヘアピンターン中または付近に置くことができる。マーカーは、これだけに限らないが、通常塩基の独自の未知の配列モチーフまたは代替的電流サインを生成する非天然もしくは修飾塩基であってよい。
【実施例２】
【０２００】
ゲノムＤＮＡのｄｓＤＮＡヘアピン周辺読み取り
Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いるヘアピン周辺の読み取りは、ライゲーションされたヘアピンを有する長いゲノムｄｓＤＮＡに拡大適用できる（図９）。図９は、ヘアピン周辺の読み取りのために好適なｄｓＤＮＡを作出するための一般的設計概要を示す。コンストラクトは、リーダー配列を有し、場合によりナノポアでの捕捉のためのマーカー（例えば脱塩基ＤＮＡ）、および場合によりマーカーを伴うヘアピン、およびアンチセンス鎖での読み取りを伸長するためのテールを（場合によりマーカーを伴って）有する。
【０２０１】
方法：
ＤＮＡ：ＰｈｉＸ１７４ＲＦ１ゲノムＤＮＡの４００塩基対セクションを、定義された制限部位を含有するＰＣＲプライマーを用いて増幅した。４００ｂｐ断片のＫａｓＩおよびＭｌｕＩ制限エンドヌクレアーゼ消化後に、相補的末端を含有するＤＮＡアダプターをライゲーションした（図１０）。望ましい生成物はＰＡＧＥ精製によって最終的に単離し、Ａ２６０ｎｍでの吸光度によって定量した。
【０２０２】
分析の簡易化のために、各アダプター片は規定の脱塩基マーカーを含有し、それによりＤＮＡのナノポアを通る進行は追跡できた。すべてのプライマーおよびアダプターの配列を表５に示す。
【０２０３】
【表５】
2014531196.tif 000011
【０２０４】
ＭｓｐＡ生成：実施例１を参照されたい。
【０２０５】
アンジッピング実験：実施例１を参照されたい。
【０２０６】
ゲノムＤＮＡコンストラクトを、ｓｔｒａｎｄ  ＥＰ緩衝液１００μＬ中のＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、１５０μＭ）とインキュベートし、５分間予備インキュベートした（ＤＮＡ＝５ｎＭ、酵素＝２μＭ）。この予備インキュベーション混合物を、ＭｓｐＡナノポア中の複合体の捕捉およびアンジッピングを開始するために電気生理学チャンバーのｃｉｓコンパートメント中の緩衝液９００μＬに添加した（ＤＮＡ＝０．５ｎＭ、酵素＝０．２μＭの最終濃度をもたらす）。１回の実験では１種類のＤＮＡだけを系に加えた。アンジッピング実験は、＋１８０ｍＶの一定電位で実行した。
【０２０７】
結果；
Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを含むＭｓｐＡナノポアに加えた４００塩基長−Ｎｏ３（３’コレステロールＴＥＧを有する）（表６）は、ＤＮＡのアンジッピングおよび、多数の配列依存的状態を有する１〜３分間継続したポリメラーゼ制御ＤＮＡ移動を生じた（図１１および１２）。センス鎖の先端、ヘアピンターンの中央、およびアンチセンス鎖の末端の脱塩基マーカーは、配列の別々のセクションを容易に同定できるようにする。図１１および１２は、明確な３個の脱塩基ピークを示し、長いゲノムＤＮＡにライゲーションしたヘアピン周辺を読み取る能力を実証し、それによりｄｓＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖両方を配列決定する。
【０２０８】
【表６】
2014531196.tif 000012
【実施例３】
【０２０９】
配列決定のための試料調製
ＰｈｉＸ１７４ＲＦ１ゲノムＤＮＡの４００塩基対セクションを、定義された制限部位を含有するＰＣＲプライマーを用いて増幅した。４００ｂｐ断片のＫａｓＩおよびＭｌｕＩ制限エンドヌクレアーゼ消化後に、相補的末端を含有するＤＮＡアダプターをライゲーションした。所望の生成物をＰＡＧＥ精製によって最終的に単離し、Ａ２６０ｎｍでの吸光度によって定量した。
【０２１０】
分析の簡便のために、各アダプター片は規定の脱塩基マーカーを含有し、それによりＤＮＡのナノポアを通る進行を追跡できた。すべてのプライマーおよびアダプターの配列を下に示す（Ｘ＝脱塩基修飾）。
ＫａｓＩセンスプライマー
TTTTTTTTTTGGCGCCCTGCCGTTTCTGATAAGTTGCTT（配列番号２１）
ＭｌｕＩアンチセンスプライマー
AAAAAAAAAAACGCGTAAACCTGCTGTTGCTTGGAAAG（配列番号２２）
ＫａｓＩセンスアダプター
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTXXXXTTTTTTTTTTGGCTAACAAACAAGAAACATAAACAGAATAG（配列番号２３）
ＫａｓＩアンチセンスアダプター
GCGCCTATTCTGTTTATGTTTCTTGTTTGTTAGCCTTTTTTXXXXTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT（配列番号２４）
ＭｌｕＩ  ＨＰ
CGCGCTATTCTGTTTATGTTTCTTGTTTGTTAGCCXXXXGGCTAACAAACAAGAAACATAAACAGAATAG（配列番号２５）
コンストラクトは図１０に示す。
【０２１１】
上のアダプターが脱塩基部位の代わりに非相補性塩基を含有する場合、アンチセンスＹ型アダプターのｓｓＤＮＡセクションに相補的なプライマーおよび鎖置換ポリメラーゼ（Ｐｈｉ２９またはクレノウなど）を用いて分析物を開くことが可能である。プライマーおよびＹ型アダプター相補性領域が制限部位も含有する場合、増幅後に別のヘアピンをライゲーショすることができ、テンプレートをさらに拡大するためにプロセスを反復できる。これは、分子を２回配列決定する能力を与える；完全なｄｓＤＮＡアンジッピングモードでのオリジナルセンス−アンチセンス、次いで完全なｓｓＤＮＡアンジッピングモードでの増幅されたセンス鎖−アンチセンス鎖。
【０２１２】
ＤＮＡアダプターの標的ＤＮＡへのライゲーションは、既に十分に記載されており、これは未だに最も良く知られた技術である。アダプターのライゲーションは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１を用いる一重鎖ライゲーションによってまたはＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるアニールされたアダプターの二重鎖ライゲーションによってのいずれかで生じ得る。標的二量体およびアダプター二量体の形成を防ぐために、標的は最初にクレノウｅｘｏ−などのポリメラーゼを用いてｄＡテール化されてよい。
【０２１３】
より近年では、人工トランスポゾン（Ｎｅｘｔｅｒａ  ｓｙｓｔｅｍなど）での進歩は、ＤＮＡを断片化しながら同時に急速に高速化するアダプター付着に将来性を示し始めている。理論では同様の手法が、ＤＮＡ内に合致する配列がある限りＣｒｅ  ＬｏｘＰ  ｓｙｓｔｅｍ（ＮＥＢ）などの相同的組換えを用いて達成できる。化学的ライゲーションにおける進歩も近年改善され、非天然トリアゾール連結を含有するＤＮＡ鎖の順調な増幅による最大の成功を実証している(SagheerおよびBrown、2009)。化学的ライゲーションについて、ＤＮＡの５’または３’のいずれかの修飾は、好適な反応基を含むために通常最初に必要とされる。基は、修飾ｄＮＴＰおよびターミナルトランスフェラーゼを用いて３’に容易に付加できる。ＤＮＡの５’末端の修飾も実証されているが、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いるチオール基にこれまで限定されてきた。化学的手段を介したＤＮＡの５’への分子の直接カップリングに関するいくつかの成功は、カルボイイミドカップリングを用いて実証され、そのようなキットは商業的に入手可能である。しかし副生物がこの化学に伴ってしばしば問題になる。
【実施例４】
【０２１４】
ヘリカーゼを用いるゲノムＤＮＡのｄｓＤＮＡヘアピン周辺読み取り
ヘアピンによってライゲーションされた、繋がれた長いゲノムｄｓＤＮＡからなるＤＮＡ鎖周辺の読み取りをヘリカーゼ酵素を用いて調査した（図１７）。用いたコンストラクトは、ナノポアでの捕捉のための任意選択マーカーを含むリーダー配列、任意選択マーカーを含むヘアピン、ならびに伸長された読み取り配列および末端に付着されたコレステロールテザーを有するテールを有する。
【０２１５】
方法：
センス鎖とアンチセンス鎖とを連結するために架橋ヘアピン（配列番号３２）を一方の端にライゲーションした。合成Ｙアダプターを酵素がナノポアに結合し、通り抜けられるようにライゲーションした：このアダプターのセンス鎖（４個の脱塩基ＤＮＡ塩基を介して配列番号３０に付着した配列番号２９、図１８を参照されたい）は５’リーダー、テザー配列に相補的である配列（配列番号３５、配列の３’末端に２個のチミジン残基および３’コレステロールＴＥＧに付着した６個のｉＳｐ１８スペーサーを有する）および４個の脱塩基を含有する。アダプターのアンチセンス半分も、後のＤＵＯ分析物への転換のための分子内プライマーとして作用する３’ヘアピン（配列番号３１、図２２開始テンプレートを参照されたい）を有する。ＭＯＮＯ分析物ＤＮＡをＰｈｉＸ１７４の約４００ｂｐ領域（センス鎖配列＝配列番号３３およびアンチセンス鎖配列＝配列番号３４）を用いて調製した。目的の領域をＳａｃＩおよびＫｐｎＩ制限部位を含有するプライマー（それぞれ配列番号２７および２８）でＰＣＲ増幅した。次いで精製ＰＣＲ生成物をＳａｃＩおよびＫｐｎＩ消化し、Ｙ型アダプター（センス鎖配列（４個の脱塩基ＤＮＡ塩基を介して配列番号３０に付着した配列番号２９）を配列番号３３の５’末端にライゲーションし、アンチセンス鎖（配列番号３１）を配列番号３４の３’末端にライゲーションする）およびヘアピン（配列番号３３と３４とを合わせるために用いられた配列番号３２）をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いていずれかの末端にライゲーションした（最終ＤＮＡコンストラクトに関して図１８を参照されたい）。生成物は５％ＴＢＥ  ＰＡＧＥゲルから精製し、破砕および浸漬法（crush and soak method）によってＴＥ緩衝液に溶出した。
【０２１６】
ＭｓｐＡ生成：変異体ＭｓｐＡポアＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ−Ｇ７７Ｓ−Ｌ８８Ｎ−Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）の精製ＭｓｐＡオリゴマーをｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で作出した。精製したオリゴマーを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルから適切なオリゴマーバンドを切断するステップ、次いでＴＥ緩衝液中に再溶媒和させるステップによって得た。
【０２１７】
ヘリカーゼ実験−１，２−ジフィタノイル−グリセロ−３−ホスホコリン脂質（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）二重層に挿入された単一のＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ−Ｇ７７Ｓ−Ｌ８８Ｎ−Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２））から電気計測値を得た。二重層は、モンタル−ミューラー技術によって開口部直径約１００μｍ、厚さ２０μｍのＰＴＦＥフィルム（Ｄｅｌｒｉｎ  ｃｈａｍｂｅｒｓ注文生産）で形成し、２個の１ｍＬ緩衝溶液に分けた。すべての実験は、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１０ｍＭフェロシアン化カリウム、１０ｍＭフェリシアン化カリウム、ｐＨ８．０で印加電位＋１４０ｍＶで実行した。単一チャネル電流を１４４０Ａデジタイザーを備えたＡｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。白金電極を緩衝溶液に繋ぎ、ｃｉｓコンパートメント（ナノポアおよび酵素／ＤＮＡの両方が添加されている）をＡｘｏｐａｔｃｈ  ｈｅａｄｓｔａｇｅのアースに繋ぎ、ｔｒａｎｓコンパートメントをｈｅａｄｓｔａｇｅの探査電極に繋ぐ。
【０２１８】
ＭｇＣｌ２およびｄＴＴＰをそれぞれ１０ｍＭおよび５ｍＭの最終濃度を得るようにｃｉｓチャンバーに添加する前に単一ポアを得た。ＤＮＡ（図１８に示すとおり繋いだ配列番号２９〜３５）をｃｉｓチャンバーに０．１ｎＭの最終濃度に添加する前にデータを５分間、＋１４０ｍＶで取り、さらに５分間データを取った。ヘリカーゼをｃｉｓチャンバーに１００ｎＭの最終濃度で添加し、すべてのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を＋１４０ｍＶで記録した。
【０２１９】
結果：
４００ｂｐセンス／アンチセンスヘアピンコンストラクト（図１８に示すとおり繋いだ配列番号２９〜３５）は、ＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ−Ｇ７７Ｓ−Ｌ８８Ｎ−Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２））にヘリカーゼと共に添加された場合、ＤＮＡのアンジッピングおよびヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を多数の配列依存状態と共にもたらした（図１９から２１）。４００ｂｐセンス／アンチセンスヘアピンコンストラクト（図１８に示すとおり繋いだ配列番号２９〜３５）は、センス鎖の先端のポリＴ領域および脱塩基ＤＮＡ塩基（図２０においてそれぞれ＊および＃で強調される）が観察され得るように、配列の先端の容易な同定をできるようにするヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を生成する。したがってヘリカーゼが４００ｂｐヘアピンの移動およびアンジッピングを制御できたことを示すことができた。センス領域とアンチセンス領域との間の速度における明確な変化は、酵素がコーナーを通り過ぎた点を強調し、これらの領域間（図２１、センス領域（１）読み取りからアンチセンス領域（２）読み取りでの変化を＊で示す）の有用なマーカーである。速度におけるこの変化はヘアピンターンに印をつけるためのマーカーの必要性を排除する。これは、ヘリカーゼで長いゲノムＤＮＡにライゲーションされたヘアピン周辺を読み取る能力、およびそれによりｄｓＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖両方を配列決定する能力を実証する。
【実施例５】
【０２２０】
ＤＵＯポリヌクレオチドヘアピン鎖の生成
センス鎖およびアンチセンス鎖由来の情報を連結させるステップがＤＮＡの一方の端に合成ヘアピンをライゲーションするステップによって可能であることは既に実証されている。これは、同時に１個の分子から天然センス鎖およびアンチセンス鎖の読みをもたらすために役立ち、単一の位置を判定するために２回の機会を得ることから塩基判定をより正確にする。
【０２２１】
センス鎖とアンチセンス鎖とを連結するために架橋ヘアピン（配列番号３２）を一方の端にライゲーションできる。酵素結合およびナノポアへの通り抜けを可能にするために合成Ｙ−アダプターにライゲーションすることもできる：このアダプターのセンス鎖（４個の脱塩基ＤＮＡ塩基を介して配列番号３０に付着した配列番号２９、図２２開始テンプレートを参照されたい）は、５’リーダー、テザー配列に相補的である配列（配列番号３５、チミン残基２個および３’コレステロールＴＥＧに付着したｉＳｐ１８スペーサー６個を配列の３’末端に有する）および脱塩基４個を含有し、アダプターのアンチセンス半分は後のＤＵＯ分析物への転換のために分子内プライマーとして作用する３’ヘアピン（配列番号３１）も含有する（図２２開始テンプレートを参照されたい）。
【０２２２】
架橋ヘアピン（配列番号３２）がライゲーションされる場合、合成Ｙ−アダプターにライゲーションすることもできる：このアダプターのセンス鎖（４個の脱塩基ＤＮＡ塩基を介して配列番号３０に付着した配列番号２９、図２２開始テンプレートを参照されたい）は、５’リーダー、テザー配列に相補的である配列（配列番号３５、チミン残基２個および３’コレステロールＴＥＧに付着したｉＳｐ１８スペーサー６個を配列の３’末端に有する）および脱塩基４個を含有し、アダプターのアンチセンス半分は分子内プライマーとして作用する３’ヘアピン（配列番号３１図、図２２の開始テンプレートを参照されたい）を含有し、これは、Ｙアダプターの３’末端に結合する鎖置換ポリメラーゼを用いて全体（センスおよびアンチセンスに連結している）を複製するステップによってテンプレートをさらに伸長する好機を本発明者らにもたらす（図２２のステップ２）。Ｙ型およびヘアピンアダプターは、不適正塩基対制限部位（制限消化に非感受性、図２３の上図を参照されたい）を含有する。分析物が次に充填され、伸長される場合（図２２ステップ２から３を参照されたい）、制限部位は完了し（図２３の下図を参照されたい）、それにより完全に充填された分析物（図２５に示すとおり繋いだ配列番号２９〜３６）は順調な充填を確認するために部位特異的制限エンドヌクレアーゼを用いて消化できる。
【０２２３】
ＤＵＯ分析物は、上の実施例４に開示したＭＯＮＯ分析物から調製した。二重ライゲーションＭＯＮＯ  ＰＡＧＥ精製分析物（図１８に示すとおり繋いだ配列番号２９〜３５）を、クレノウＤＮＡポリメラーゼ、ＳＳＢおよびヌクレオチドとさらにインキュベートし、Ｙ型アダプターヘアピン（配列番号３１）からの伸長を可能にした。順調なＤＵＯ生成物（図２５に示すとおり繋いだ配列番号２９〜３６）について選別するために、一連の不適正塩基対制限部位をアダプター配列に組み込み、それによりＤＵＯ伸長プロセスによって制限部位複製が順調に複製された場合にだけ酵素は分析物を切断する（図２３を参照されたい、ＭＯＮＯ分析物を上図およびＤＵＯ分析物を下図）。
【０２２４】
図２４は、図２３上図に示すとおり互いに不適正塩基対であることから、ポリメラーゼの非存在下でアダプター修飾分析物（ＭＯＮＯ、配列番号２９〜３５）は制限酵素で消化されないことを示す（図２４の左のゲルを参照されたい、記号：Ｍ＝ＭｆｅＩ、Ａ＝ＡｇｅＩ、Ｘ＝ＸｍａＩ、Ｎ＝ＮｇｏＭＩＶ、Ｂ＝ＢｓｐＥＩ）。しかしポリメラーゼとのインキュベーションでは、注目すべき大きさの変化があり、変化した生成物（ＤＵＯ）は各制限酵素で予測されるとおり消化される（図２４の右のゲルを参照されたい、記号：Ｍ＝ＭｆｅＩ、Ａ＝ＡｇｅＩ、Ｘ＝ＸｍａＩ、Ｎ＝ＮｇｏＭＩＶ、Ｂ＝ＢｓｐＥＩ）。これは、記載の方法を用いてＤＵＯ生成物を生成できることを示す（図２５に示すとおり繋いだ配列番号２９〜３６）。
【実施例６】
【０２２５】
ヘリカーゼを用いるｄｓＤＮＡ  ＤＵＯポリヌクレオチドヘアピン周辺読み取り
オリジナルセンス鎖（配列番号３３）およびアンチセンス鎖（配列番号３４）ならびに複製センス鎖および複製鎖（配列番号３６）からなるＤＵＯヘアピンコンストラクト（図２５に示すとおり繋いだ配列番号２９〜３６）周辺のヘリカーゼ酵素を用いる読み取りを調査した。
【０２２６】
方法：本実験において用いたＤＮＡコンストラクトは上の実施例５に開示の方法によって生成した。
【０２２７】
ＭｓｐＡ生成：ＭｓｐＡポアＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ−Ｇ７７Ｓ−Ｌ８８Ｎ−Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を実施例４に記載の方法によって生成した。
【０２２８】
アンジッピング実験：１，２−ジフィタノイル−グリセロ−３−ホスホコリン脂質（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）二重層に挿入された単一のＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ−Ｇ７７Ｓ−Ｌ８８Ｎ−Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）から、緩衝液（４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１０ｍＭフェロシアン化カリウム、１０ｍＭフェリシアン化カリウム、ｐＨ８．０）中、印加電位＋１４０ｍＶで実施例４に記載のとおり電気計測を得た。
【０２２９】
最初に、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）およびｄＴＴＰ（５ｍＭ）をｃｉｓコンパートメントに加え、対照実験を５分間行った。２番目に、ＤＮＡコンストラクト（０．１ｎＮ、図２５に示すとおり繋いだ配列番号２９〜３６）をｃｉｓコンパートメントに加え、対照実験をさらに５分間行った。最後にヘリカーゼ（１００ｎＭ）を電気生理学チャンバーに加えてヘリカーゼ活性を開始させた。すべてのアンジッピング実験は一定電位＋１４０ｍＶで実行した。
【０２３０】
結果：
ヘリカーゼと共にＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ−Ｇ７７Ｓ−Ｌ８８Ｎ−Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２））に加えた場合にＤＵＯヘアピンコンストラクト（図２５に示すとおり繋いだ配列番号２９〜３６）は、ＤＮＡのアンジッピングおよびヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を多数の配列依存状態と共にもたらした（図２６から２８）。図２６は、２つの典型的なヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示し、オリジナルセンスセクション、オリジナルアンチセンスセクション、複製センス領域および複製アンチセンスセクションに対応する領域は１から４とそれぞれ表示される。図２７は図２６からのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の内の１つの拡大図を示し、図２８はオリジナルセンス鎖とアンチセンス鎖との間の移行の別の拡大図を示す。アンチセンス鎖と比較したセンス鎖のヘリカーゼ制御移動での速度の変化は、明確に観察できる（図２６〜２８）。速度のこの変化は、ヘアピンターンに印をつけるためのマーカーの必要性を排除する。これは、ＤＵＯヘアピンコンストラクト（図２５に示すとおり繋いだ配列番号２９〜３６）周辺を、およびそれによりｄｓＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖両方の配列を２回読み取る能力を実証する。単一の位置を判定するために４回の機会を得ることからこれは塩基判定をより正確にする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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