(57)【要約】【課題】健康な細胞に害を及ぼすことなく、心筋の機能障害により引き起こされる損傷を予防する及び／又は逆転させる治療剤が直ちに必要とされている。【解決手段】  本発明は、対象の心臓組織において少なくとも１つのキナーゼの活性を増加させるのに十分な量の、治療有効量のビスホスホネート、そのプロドラッグ、機能的類似体、又は薬学的に有効なその塩を対象に投与することにより、心機能障害を治療、低減、及び／又は予防するための方法及び組成物を提供する。【選択図】図３
2014533691.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において心不全の影響を予防又は低減するための方法であって、前記対象の心臓組織において生物学的活性を有する少なくとも１つのキナーゼの活性を増加させるのに十分な量の、投薬量のビスホスホネート、そのプロドラッグ、機能的類似体、又は薬学的に許容されるその塩を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記活性の増加が、（ｉ）少なくとも１つのキナーゼの発現の増加、（ｉｉ）心臓組織における少なくとも１つのキナーゼのリン酸化の増加、又は（ｉｉｉ）両者の組合せを含み、前記活性の増加が、前記ビスホスホネートを投与されていない心臓組織における活性に対するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記投薬量が、毎年、半年毎、毎月、毎週、又は毎日、前記対象に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記キナーゼが、細胞外シグナル調節プロテインキナーゼ（ERK1/2）、ＩκＢキナーゼ（IKK）、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（PI 3-キナーゼ）、プロテインキナーゼＢ（Akt）、Ｊｕｎ  ＮＨ２−末端キナーゼ（JNK）、及びｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ビスホスホネートが、ゾレドロン酸、リセドロネート、アレンドロネート、シマドロネート、クロドロネート、チルドロネート、ミノドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、ピリドロネート、パミドロネート、１−フルオロ−２−（イミダゾ−［１，２−α］ピリジン−３−イル）−エチル−ビスホスホン酸、及びその機能的類似体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
硝酸薬、β−アドレナリン遮断薬、アンジオテンシン変換酵素阻害薬、カルシウムチャネル拮抗薬、降圧剤、コレステロール低下剤、利尿薬、ＡＣＥ阻害薬、強心配糖体、非ペプチド性アンジオテンシンＩＩ拮抗薬、ＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗薬、及びアスピリンからなる群から選択される少なくとも１つの他の治療剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記心不全が、高血圧症、虚血性心疾患、心毒性化合物への曝露、放射線療法、心筋炎、甲状腺疾患、ウイルス感染、薬物中毒、アルコール中毒、心膜炎、アテローム性動脈硬化症、血管疾患、肥大型心筋症、急性心筋梗塞、心室収縮機能障害、心室拡張機能障害、冠動脈バイパス手術、又は遺伝的欠陥に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記対象が、心筋梗塞を経験している、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ビスホスホネートが、前記対象における心不全の診断前に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ビスホスホネートが、前記対象における心不全の診断後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ビスホスホネートが、投薬量のビタミンＤ投与の前に、それに続いて、又はそれと同時に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
心臓組織においてキナーゼのリン酸化を増加させるための方法であって、心臓組織においてキナーゼのリン酸化を増加させる又は誘導するのに十分な量の、投薬量のビスホスホネート、そのプロドラッグ、機能的類似体、又は薬学的に許容されるその塩を投与することを含む、方法。
【請求項１３】
前記投薬量が、毎年、半年毎、毎月、毎週、又は毎日対象に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記キナーゼが、細胞外シグナル調節プロテインキナーゼ（ERK1/2）、ＩκＢキナーゼ（IKK）、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（PI 3-キナーゼ）、プロテインキナーゼＢ（Akt）、Ｊｕｎ  ＮＨ２−末端キナーゼ（JNK）、及びｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ビスホスホネートが、ゾレドロン酸、リセドロネート、アレンドロネート、シマドロネート、クロドロネート、チルドロネート、ミノドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、ピリドロネート、パミドロネート、１−フルオロ−２−（イミダゾ−［１，２−α］ピリジン−３−イル）−エチル−ビスホスホン酸、及びその機能的類似体からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[001]  本ＰＣＴ国際出願及び発明は、２０１１年１１月１６日に出願された米国仮出願第６１／５６０，３２８号の優先権を主張するものであり、その内容はあらゆる目的のため参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の背景
[002]  発明の分野
[003]  本発明は、少なくとも１つのビスホスホネート化合物を投与することにより、心不全に起因する心機能障害を低減又は阻害することに関し、より詳細には、該ビスホスホネート化合物は、心臓組織において生物学的活性を有する少なくとも１つのキナーゼの発現及び／又はリン酸化を増加させる。
【背景技術】
【０００３】
[004]  本分野の関連技術
［００５］  人口が高齢化するにつれて、心不全（「ＨＦ」）の罹患率は、流行の割合まで増大している。ＨＦは、多くの型の心疾患により引き起こされ得る。心不全の一般的な原因としては、下記のものが挙げられる：心臓の筋肉に血液を供給する動脈の狭窄（冠動脈性心疾患）、心臓の正常な機能を妨げるだけの大きさの瘢痕組織を生じる以前の心臓発作（心筋梗塞）、高血圧、過去のリウマチ熱又は出生時に存在する異常に起因する心臓弁膜症、心臓の筋肉自体の原発性疾患（心筋症）、並びに心臓の弁及び／又は筋肉自体の感染（心内膜炎及び／又は心筋炎）。これらの疾患プロセスの各々は、心臓の筋肉の収縮強度を低減することにより、あるいは器質的問題又は拡張期弛緩の減損に起因して、心室の血液で充満する能力を限定することにより、又は心腔を過剰の血液で充満させることにより、心不全をもたらし得る。
【０００４】
[006]  心血管疾患は、西欧諸国において死因の第１位であり、１０００万人を超える推定年間死亡者数を生じる。そのような疾患、例えば慢性高血圧症（高血圧）、左室肥大（心臓の拡大）、及び心筋虚血（心臓細胞の傷害）は、最終的に心不全に至り得る。
【０００５】
[007]  高血圧症の結果の１つは、一般的には肥大である。心肥大は、心臓のサイズの増加である。ヒトにおいて、肥大は、血圧又は血液量の増加（血行動態的過負荷）の結果として増加した作業に対する心筋（心臓の筋肉）の代償性応答である。心筋の肥大は、拡大した心臓の代謝要求量の増加に起因して、ますます害を及ぼすものとなり得る。さらに、虚血性心疾患及び心不整脈が発症する場合があり、死亡のリスクを増加させる。心不整脈は、インパルス形成、インパルス伝導、又は両者の組合せの異常から発生し得る。インパルスの形成及び伝導の調節は、自律神経系、心臓イオンチャネル、及び心臓ギャップ結合の間の複雑な相互作用を伴う。
【０００６】
[008]  ギャップ結合は、２つの隣り合った細胞の細胞質画分を直接接続する細胞膜の特殊化した領域である。心筋細胞において、ギャップ結合は介在板、すなわち、隣接心筋細胞の規則性脱分極の協調を助ける、接している心筋細胞の端部に位置する特有のミクロドメインに密集する。ギャップ結合チャネルは、２つの隣り合った細胞の各々により与えられる２つのヘミチャネル（コネクソン）から構成される。各コネクソンは、コネキシンと呼ばれる６つのタンパク質から成り立っている。異なるタイプのコネキシン（Ｃｘ）の分布は、心臓全体にわたり様々である。ギャップ結合チャネルは、ねじれ運動により開閉状態間を切り替えることができる。電気的インパルスの伝導は、ギャップ結合を介して起こり、それゆえ、正常に機能するギャップ結合は、正常な伝導及びひいては心臓の正常なリズムのための必要条件である。ギャップ結合の秩序の撹乱は、後天性及び遺伝性両方のミオパチーの、一般的で高度に不整脈源性の特色である。さらに、ギャップ結合の動的リモデリングが虚血の際に起こり、潜在的に致死性の不整脈を促進する。
【０００７】
[009]  これまで、抗不整脈薬の開発は、主に自律神経系又はイオンチャネルのいずれかに焦点を当てており、ギャップ結合の安定性を変容させ得る医薬品は、ほとんど注目されていなかった。さらに、現在利用可能な薬物には、負の副作用を伴わないものはない。詳細には、負の作用は、２つの大まかなカテゴリー：多くの薬物で見られる普通の種類の副作用（例えば、アレルギー、不眠症、胃腸障害等）及び不整脈誘発に分けられる。抗不整脈薬に関する主な課題をもたらすのは不整脈誘発であり、その理由は、イオンチャネルモジュレーターは、多くの場合、１つの不整脈を抑制する一方で別の不整脈を促進するからである。不整脈誘発は、心不整脈を引き起こすことを単純に意味し、そのため、不整脈を解消するどころか、これらの薬物は実際には不整脈をもたらし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
[0010]  それゆえ、健康な細胞に害を及ぼすことなく、心筋の機能障害により引き起こされる損傷を予防する及び／又は逆転させる治療剤が直ちに必要とされている。現在の薬物の使用を限定する重大な副作用に起因して、全く異なる作用機序を有する新たなクラスの薬物が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
[0011]  本発明は、心機能障害及びそれに関連する疾患を治療するための方法及び組成物を包含し、該組成物は、少なくとも１つのビスホスホネート化合物又はそのプロドラッグを、心臓組織において少なくとも１つのキナーゼの発現を有効に増加させる及び／又は心臓組織においてキナーゼのリン酸化を有効に増加させる量で含む。そのようなキナーゼの発現及び／又はリン酸化の増加は、下記のものを包含する以下の利点のうちの少なくとも１つを呈し得る：心臓介在板の規則的な集合を維持すること、コネキシン４３の脱リン酸化を低減すること、コネキシン４３の不均質発現を低減すること、情報伝達ギャップ結合を介する心筋細胞間の電気的及び化学的両方の情報伝達を維持すること、並びに／又はギャップ結合透過性を低減すること。
【００１０】
[0012]  一態様では、本発明は、肥大、心不全、虚血性心疾患、心房細動、虚血再灌流傷害、進行性収縮機能障害、及び心不整脈を治療するための方法であって、心臓組織キナーゼの発現及び／又はリン酸化を増加させる治療量の、治療有効量のビスホスホネート、そのプロドラッグ、その機能的類似体、又は薬学的に有効なその塩をほ乳類に投与し、それにより、心不整脈及び／又は心臓介在板構造の変容を低減することを含む、方法を包含する。
【００１１】
[0013]  本発明の別の態様は、ビスホスホネート又はそのプロドラッグと、薬学的に許容される担体又は希釈剤とを含む医薬組成物に関する。ビスホスホネート化合物としては、ゾレドロン酸、リセドロネート、アレンドロネート、シマドロネート、クロドロネート、チルドロネート、ミノドロネート、ＷＯ１０／３３９８１、ＷＯ１０／３３９８０及びＷＯ１０／３３９７８に記載のビスホスホネート化合物、エチドロネート、イバンドロネート、ピリドロネート、パミドロネート、並びにその機能的類似体を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００１２】
[0014]  なおさらなる態様では、本発明は、治療有効量の少なくとも１つのビスホスホネート、そのプロドラッグ、その機能的類似体、又は薬学的に有効なその塩を含む治療の方法及び薬剤であって、治療有効量が、心臓組織においてキナーゼのリン酸化を活性化及び／又は増加させるのに十分なものである、治療の方法及び薬剤を提供する。キナーゼは、細胞外シグナル調節プロテインキナーゼ（ERK1/2）、ＩκＢキナーゼ（IKK）、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（PI 3-キナーゼ）、プロテインキナーゼＢ（Akt）、Ｊｕｎ  ＮＨ２−末端（termina）キナーゼ（JNK）、カゼインキナーゼ−１、及びｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）からなる群から選択される１つ又は複数を含み得る。
【００１３】
[0015]  本発明のさらなる態様は、少なくとも毎日、毎週、毎月、又は毎年、予防的投薬量として又は心不全の診断後のいずれかで、ビスホスホネート化合物を投与することに関する。投与されるビスホスホネート化合物の量は、患者の心不全を治療又は予防するのに有効な量である。その量は、投与方式、化合物を投与する頻度に依存し、約０．０１ｕｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例えば、毎日の経口投薬量は、約１０ｕｇ／ｋｇ〜約２００ｕｇ／ｋｇの範囲であり得、毎年の静脈内用量は、約０．００２〜約２０．０ｍｇ／ｋｇであり得る。
【００１４】
[0016]  有効な治療は、駆出率の増加、拡張及び／又は収縮機能の増加、血行動態の改善、不整脈の低減、並びに心拍変動の改善により示すことができ、これらはすべて、当業者が公知の利用可能な試験体制を用いて試験することができる。
【００１５】
[0017]  本発明のなおさらなる態様は、心血管イベント、例えば脳卒中、心不全、心血管死、心筋梗塞、狭心症の悪化、心停止、又は血行再建術の必要性の予防用医薬の製造における、単独又は他の心臓治療剤と併せてのビスホスホネート化合物の使用に関し、他の心臓治療剤としては、硝酸薬、β−アドレナリン遮断薬、カルシウムチャネル拮抗薬、降圧剤、コレステロール低下剤、利尿薬、ＡＣＥ阻害薬、非ペプチド性アンジオテンシンＩＩ拮抗薬、ＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗薬、及びアスピリンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１６】
[0018]  本発明の別の態様は、心血管疾患及びそれに関連する疾患を治療する方法に関し、ここで、対象は、ビタミンＤ（コレカルシフェロール又はエルゴカルシフェロール）を、約５０，０００〜１２５，０００ＩＵの範囲の投薬量で、単回又は複数回投薬量として投与される。ビタミンＤは、ビスホスホネート化合物の前に、それに続いて、又はそれと同時に投与され得る。
【００１７】
[0019]  本発明の最後の態様は、心不全及びその負の副作用を治療又は予防するためのキットであって、心不全の症状を治療、低減、又は予防するための治療有効量の、少なくとも１回用量のビスホスホネート又はそのプロドラッグを含む、キットに関する。キットは、ビスホスホネートによる治療より前、その間、及びその後に摂取するための、十分な１日投薬量のビタミンＤを、任意選択により包含し得る。
【００１８】
[0020]  本発明の他の態様、目的、特色、及び利点は、本発明の好ましい実施形態を例示する以下の詳細な説明から、当業者には明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】[0021]試験動物におけるビスホスホネート投与及び疑似（ＳＨＡＭ）処置後の、心筋溶解物におけるＥＲＫの発現及びそれに続くリン酸化に関する結果を示すイムノブロットである。
【図２】[0022]ビスホスホネートの投与及び疑似（ＳＨＡＭ）又はＴＡＣ処置後の、心筋溶解物におけるＥＲＫの発現及びそれに続くリン酸化に関する結果を示すイムノブロットである。
【図３】[0023]図２のキナーゼレベルのデンシトメトリー分析を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
[0024]  本発明は、以前に用いられた化合物が一般的に伴う有害な作用を最小化又は軽減しつつ、心不整脈、心収縮性の減少、異常な拡張期又は収縮期コンプライアンス、１回拍出量の低減、及び心拍出量の減少等の状態を包含する心不全を治療するための組成物及び方法を対象とする。
【００２１】
[0025]  ビスホスホネートは、ピロリン酸類似体である化合物のクラスであり、破骨細胞骨吸収の増加により引き起こされる骨格障害を治療するために、３０年にわたり用いられている（Rosen, 2005）。骨ページェット病の治療における使用を認可された最初の化合物は、エチドロネートであった。これに続き、アレンドロネート、リセドロネート、及びイバンドロネートのようなより強力な窒素含有ビスホスホネートが認可され、これらはすべて、閉経後骨粗鬆症のための第一選択の療法となっている。これらの薬剤は、経口及び静脈内を包含する複数の方式により送達することができる。
【００２２】
[0026]  ビスホスホネートは、骨粗鬆症に対する現在の選択薬であり、その理由は、それらが、骨折率並びに付随する身体障害を低減するからである（Rosen, 2005）。２つのタイプの骨粗鬆症性骨折（脊椎及び股関節部）が死亡率の増加と関係するが、近年まで、この疾患の治療にビスホスホネートを用いる臨床試験により、死亡率の低減が示されることはなかった。近年、臨床研究が行われ、そこでは、股関節部骨折の外科的修復から９０日以内の患者が無作為化されて、ベースライン時及びその後毎年、ゾレドロン酸又はプラセボのいずれかを与えられ、主要応答変数は、新たな臨床骨折率であった（Colon-Emericら 2004）。その試験は良好な転帰をもたらし、すべての臨床骨折のリスクが３５％低減した（Lylesら 2007）。さらに、ゾレドロン酸を与えられた患者では、プラセボ対象と比較して、２８％の死亡率の低減が観察された。
【００２３】
[0027]  別の興味深い研究は、ハッチンソン−ギルフォード−プロジェリア症候群（HGPS）を有することの影響を示す遺伝子改変マウスの使用について記載していた。この疾患であると診断された人は、普通、高齢者の身体のように、小さく脆弱な身体を有する。後に、その状態は、皮膚の多皺、アテローム性動脈硬化症、及び心血管系の問題を引き起こす。早期老化、成長遅延、血管疾患、脱毛、及び骨粗鬆症を遅らせる目的で、マウスをプラバスタチン及びゾレドロン酸により処理した（Varela 2008）。組合せで、これらの療法は、寿命の中央値を１０１日から１７９日まで増加させると報告された。
【００２４】
[0028]  これらの研究の結果を見て、本発明者らは、ビスホスホネートは死亡率の低減の原因となり得、低減した死亡率とビスホスホネートとの関連性は、おそらく、その発現及び／又はリン酸化の増加を包含する心臓組織キナーゼの活性に関すると理論化した。マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）等のキナーゼのそのような発現及び／又はリン酸化の増加は、心臓介在板の規則的な集合を維持すること、コネキシン４３の脱リン酸化を低減すること、コネキシン４３の不均質発現を低減すること、情報伝達ギャップ結合を介する心筋細胞間の電気的及び化学的両方の情報伝達を維持すること、並びに／又はギャップ結合透過性の低減を包含する、心臓組織に有益な多数の活動を誘導する。
【００２５】
[0029]  このギャップ結合チャネルを介する細胞間の物質の流れは、ギャップ結合細胞内情報伝達（GJIC）として公知であり、これは、細胞代謝、増殖、及び細胞から細胞へのシグナル伝達の調節において重要な役割を果たす。ＧＪＩＣ調節又は結合のゲーティングの方式は、ギャップ結合、とりわけ、心室内に位置する主要な（principle）ギャップ結合であるコネキシン４３から構成されるギャップ結合について、広く研究されている。詳細には、コネキシン４３の細胞質カルボキシ末端ドメインの特定の部位のリン酸化における変化が、ギャップ結合チャネルの開閉のために極めて重要であるようである。コネキシン４３のカルボキシ末端ドメインは、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡ（PKA）、プロテインキナーゼ−Ｃ（PKC）、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ（PKG）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）及びチロシンキナーゼを包含する複数のプロテインキナーゼに対する推定リン酸化部位を含有し、ここで、キナーゼによるそのようなリン酸化は、ギャップ結合の調節に直接的又は間接的に関与し、それはギャップ結合チャネルの鋭く制御されたゲーティングとなる。重要なことに、コネキシン４３ギャップ結合分布のリモデリング及び全体的なコネキシン４３レベルの低減は、ヒトの心臓の虚血性、肥大型及び他の心筋症疾患の一般的な特色であることが見出された。
【００２６】
[0030]  本発明は、心筋細胞間の情報伝達に関するそのような問題点に対処し、それにより心臓介在板の規則的な集合を維持する、ビスホスホネート化合物の群を包含する治療を提供すると理論化される。
【００２７】
[0031]  定義
[0032]  本明細書で用いられる用語「ビスホスホネート」は、中央の酸素が炭素で置き換えられた内在性ピロリン酸の類似体である、任意の化合物を意味する。用語「ビスホスホネート」は、そのプロドラッグ及びアミノビスホスホネートを包含する。ビスホスホネートとしては、以下の化合物：ゾレドロン酸、リセドロネート、アレンドロネート、シマドロネート、クロドロネート、チルドロネート、ミノドロネート、ＷＯ１０／３３９８１、ＷＯ１０／３３９８０及びＷＯ１０／３３９７８に記載のビスホスホネート化合物、エチドロネート、オルパドロネート、ネリドロネート、イバンドロネート、ピリドロネート、又はパミドロネート、その機能的類似体、並びにそのプロドラッグが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２８】
[0033]  本明細書で用いられる用語「ゾレドロン酸」は、その遊離酸、すなわち１−ヒドロキシ−２−（イミダゾール−１−イル）エタン−１，１−ジホスホン酸、並びに任意の薬学的に許容されるその塩及び水和物、及びその結晶化のために用いられる他の溶媒から形成されるその溶媒和物を包含することが意図される。１−ヒドロキシ−２−（イミダゾール−１−イル）エタン−１，１−ジホスホン酸及びその薬理学的に許容される塩、水和物、及び溶媒和物は、文献から周知である。それらは、当技術分野で公知の手順、例えば米国特許第４，９３９，１３０号に記載のもの等により調製することができる。米国特許第４，７７７，１６３号及び第４，６８７，７６７号も参照されたい。最後３つの特許の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２９】
[0034]  本明細書で用いられる用語「心不全」は、心臓を、安静時若しくは運動時に正常な血液拍出量を維持すること又は正常な心充満圧の環境において正常な心拍出量を維持することができない状態にする、心機能の減損を意味する。約４０％以下の左室駆出率は、心不全を示唆する（比較として、約５５％〜６０％の百分率の駆出率は、正常である）。心不全を有する患者は、頻呼吸、胸水、安静時及び運動時の疲労、収縮機能障害、心房細動、並びに浮腫のような周知の臨床的症状及び徴候を示す。相対的な重症度及び疾患進行は、身体診察、心エコー検査、放射性核種イメージング、侵襲的血行動態モニタリング、磁気共鳴血管造影、及びトレッドミル運動負荷試験を酸素摂取量の研究と組み合わせたもののような周知の方法を用いて評価される。
【００３０】
[0035]  本明細書で用いられる用語「虚血性心疾患」は、心筋の酸素要求と酸素供給の充足性との間の不均衡により生じる任意の障害を意味する。虚血性心疾患のほとんどの事例は、アテローム性動脈硬化症又は他の血管障害において起こるような、冠動脈の狭窄により生じる。
【００３１】
[0036]  本明細書で用いられる用語「心筋梗塞」は、虚血性疾患の結果、心筋のある領域が瘢痕組織で置き換えられる、プロセスを意味する。
【００３２】
[0037]  本明細書で用いられる用語「心筋細胞」は、心臓の筋肉細胞の少なくとも１つの表現型の特徴を示す心筋細胞系統における任意の細胞を指す。そのような表現型の特徴としては、心臓タンパク質の発現又は電気生理学的特徴を挙げることができる。本明細書で用いられる場合、用語「心筋細胞」及び「筋細胞」は交換可能である。
【００３３】
[0038]  本明細書で用いられる用語「心筋症」は、何らかの理由による、心筋（すなわち、実際の心臓の筋肉）の機能の低下を意味する。心筋症を有する人は、多くの場合、不整脈及び／又は突然心臓死のリスクがある。心筋症は、一般的に、外因性心筋症及び内因性心筋症に分類することができる。外因性心筋症は、原発性病変が心筋自体の外にある心障害である。ほとんどの心筋症は、基礎にある心筋傷害が、虚血等の外因性の要因に起因することから、外因性である。外因性心筋症の例としては、虚血性心筋症及び全身性疾患に起因する心筋症が挙げられる。虚血性心筋症は、心筋への不適正な酸素送達に起因する心臓の筋肉の衰弱であり、冠動脈疾患が最も一般的な原因である。内因性心筋症は、心臓の筋肉の衰弱が、特定可能な外的原因に起因しない心障害である。内因性心筋症としては、拡張型心筋症（DCM）、肥大型心筋症（HCM又はHOCM）、不整脈源性右室心筋症（ARVC）、及び拘束型心筋症（RCM）が挙げられる。
【００３４】
[0039]  本明細書で用いられる用語「心筋傷害」は、心臓の筋組織への傷害を意味する。それは、心筋梗塞、心虚血／再灌流、心毒性化合物、又は他の原因から発生し得る。心筋傷害は、臨床病理学の観点から、急性傷害又は非急性傷害のいずれかであり得る。いずれの場合も、それは心組織の損傷を伴い、典型的に、構造応答又は代償性応答を生じる。
【００３５】
[0040]  本明細書で用いられる用語「虚血」は、一般的に血管における要因に起因し、結果として組織（例えば、心組織）の損傷又は機能障害を伴う、血液供給の制限を意味する。再灌流傷害とは、虚血の期間の後、組織への血液供給が回復したときに引き起こされる組織の損傷を指す。血液からの酸素及び栄養素の不存在は、循環の回復が、正常な機能の回復ではなく、酸化ストレスの誘導による炎症及び酸化的損傷を生じる状態を引き起こす。
【００３６】
[0041]  本明細書で用いられる用語「心臓のリモデリング」は、心筋傷害の後の、代償性応答又は病的応答を意味する。心臓のリモデリングは、心臓障害における臨床転帰の、鍵となる決定因子と見なされる。それは、心筋細胞肥大、線維芽細胞増殖、及び細胞外マトリックス（ECM）タンパク質の沈着の増加を伴う、心腔壁の構造的再配置を特徴とする。
【００３７】
[0042]  本明細書で用いられる用語「治療する」は、ビスホスホネート化合物の投与が、治療中の心不全の進行を、治療の不在下で起こるであろう疾患進行に対して、統計的に有意な様式で遅らせる又は阻害することを意味する。疾患進行の評価には、左室駆出率、運動性能及び上に列挙したような他の臨床検査、並びに生存率及び入院率、イベント率又は複合エンドポイントのような周知の兆候を用い得る。治療が、疾患進行を統計的に有意な様式で遅らせる又は予防するかどうかは、当技術分野で周知の方法により決定され得る。
【００３８】
[0043]  本明細書で用いられる用語「類似体」は、基準となる分子と構造的に類似しているが、基準となる分子の特定の置換基を代替の置換基で置き換えることにより、標的化及び制御された様式で修飾されている、分子を意味する。基準となる分子と比較して、類似体は、同じ、同様の、又は改善された有用性を示すことが、当業者には予期される。改善された特質（例えば、標的分子に対するより高い結合親和性）を有する既知化合物の変異体を同定するための、類似体の合成及びスクリーニングは、製薬化学で周知の手法である。
【００３９】
[0044]  本明細書で用いられる用語「予防する」は、鬱血性心不全を発症するリスクがあるほ乳類において、心不全の発症を最小化する又は部分的若しくは完全に阻害することを意味する。ビスホスホネートの投与により心不全が最小化又は予防されるかどうかの決定は、公知の方法によりなされる。
【００４０】
[0045]  本明細書で用いられる用語「治療有効量」は、本明細書で定義される心不全の１つ若しくは複数の症状を寛解、軽減若しくは解消する、又は心不全の１つ若しくは複数の症状の発症を予防する若しくは遅延させる、化合物又は化合物の組合せの量を意味する。
【００４１】
[0046]  本明細書で用いられる用語「薬学的に許容される」は、その担体、希釈剤、賦形剤、及び／又は塩が、製剤のその他の成分と適合性があり、患者にとって有害でないものでなければならないことを意味する。化合物の薬学的に許容される塩の例としては、アルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム）のような適切な塩基、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウム）、アンモニウム、及びＮＲ’４＋（式中、Ｒ’は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルである）に由来する塩が挙げられる。アミノ基の薬学的に許容される塩としては、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、ラクトビオン酸、フマル酸及びコハク酸のような有機カルボン酸；メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、イセチオン酸、ベンゼンスルホン酸及びｐ−トルエンスルホン酸のような有機スルホン酸；並びに塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸及びスルファミン酸のような無機酸；の塩が挙げられる。ヒドロキシル基を有する化合物の薬学的に許容される塩は、前記化合物のアニオンを、Ｎａ＋、ＮＨ４＋又はＮＲ’４＋（式中、Ｒ’は、例えばＣ１〜４アルキル基である）のような好適なカチオンと組み合わせて成り立っている。
【００４２】
[0047]  本明細書で用いられる用語「ビタミンＤ」は、任意の形態のビタミンＤ、並びにビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール又はカルシフェロール）及びビタミンＤ３（コレカルシフェロール）を含む機能的に活性な類似体；カルシジオール、ジヒドロタキステロール及びカルシトリオールを含むホルモン；ドキセルカルシフェロール及びパリカルシトールを含むビタミンＤ類似体又は代謝産物を意味する。
【００４３】
[0048]  本明細書で用いられる用語「プロドラッグ」は、化学的又は代謝的に開裂可能な基を有し、ｉｎ  ｖｉｖｏの生理的条件下で、生物学的に活性なビスホスホネート化合物となる、ビスホスホネート化合物の生物学的に不活性な誘導体を意味する。好ましくは、プロドラッグは、十分に親水性かつ親油性であり、化学的に安定であり、標的組織への進入後に、十分な速度で容易に加水分解され得るプロモイエティ（promoiety）を包含する。
【００４４】
[0049]  本明細書で用いられる用語「心臓組織」としては、心臓の心筋（心筋細胞、心臓の筋線維、結合組織（筋内膜）、神経線維、毛細血管、及びリンパ管を包含する）、心臓の心内膜（内皮、結合組織、及び脂肪細胞を包含する）、心臓の心外膜（弾性線維結合組織、血管、リンパ管、神経線維、脂肪組織、及び扁平上皮細胞から成り立っている中皮膜を包含する）、並びに心臓内に見出されるさらなる任意の結合組織（心膜を包含する）、血管、リンパ管、脂肪細胞、前駆細胞（例えば、サイドポピュレーション前駆細胞）、及び神経組織が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４５】
[0050]  ビスホスホネートは、治療有効量のビスホスホネート活性成分を、任意選択により投与のために好適な無機又は有機の、固体又は液体の薬学的に許容される担体と併せて又はそれらと混合して、含有する医薬組成物の形態で用いられることが好ましい。
【００４６】
[0051]  医薬組成物は、例えば、経口、直腸、エアロゾル吸入若しくは鼻腔内投与のような経腸性組成物；静脈内若しくは皮下投与のような非経口組成物；又は例えばパッシブな若しくはイオントフォレーシスによる経皮投与用組成物であってもよい。好ましくは、医薬組成物は、静脈内投与用のものである。医薬組成物は、直接冠動脈内注射又は血管内若しくは心臓内デバイスからの溶出用のものであってもよい。
【００４７】
[0052]  詳細な投与方式及び投薬量は、患者の詳細、とりわけ、年齢、体重、ライフスタイル、活動レベル、例えば閉経後等のホルモン状態、及び骨ミネラル密度を必要に応じて考慮して、担当医により選択され得る。
【００４８】
[0053]  ビスホスホネート化合物の直接冠動脈内注射又は標的化血管内若しくは心臓内送達のための時期及び場所は、治療されている障害に依存し得る。好ましい一実施形態では、急性心筋梗塞（AMI）の際のビスホスホネート治療は、好ましくは、インターベンションによる再灌流時の、危険にさらされた心筋に供給する冠動脈への少なくとも１回の急性直接注射を包含する。代替的な実施形態では、心臓移植後のビスホスホネート治療は、心移植術後及びその後定期的な、すべての冠動脈への直接注射を包含し得る。そのような患者は、しばしば、生検及び他の診断的又は治療的処置のためにカテーテルを挿入されるが、これらのカテーテル挿入は、これらの障害におけるビスホスホネート療法の標的化送達のための自然な機会を提供し得る。別の代替的な実施形態では、心筋炎のビスホスホネート治療は、診断時及びその後定期的に、冠動脈内注射により実施され得る。さらに別の代替的な実施形態では、心筋症及びＨＦの様々な原因に対するビスホスホネート療法は、単回（１回）治療又は定期的治療のいずれかとして施され得る。
【００４９】
[0054]  単回用量単位形態の製剤は、好ましくは約１％〜約９０％のビスホスホネート酸活性成分を含有し、単回用量単位形態でない製剤は、好ましくは約０．１％〜約２０％を含有する。腸内及び非経口投与用の医薬調製物は、例えば、糖衣錠、錠剤又はカプセル剤、さらにはアンプル剤のような投薬単位形態である。それらは、それ自体公知の様式で、例えば、従来の混合、造粒、糖剤化、溶解、又は凍結乾燥プロセスによって調製される。
【００５０】
[0055]  例えば、経口投与用の医薬調製物は、活性成分を固体担体と組み合わせ、適切な場合には、生じた混合物を造粒し、所望又は必要であれば、好適な添加物の添加後に、混合物又は造粒物を錠剤又は糖衣錠コアへと加工することにより得ることができる。好適な担体は、とりわけ、糖類、例としてラクトース、サッカロース、マンニトール又はソルビトール、セルロース調製物のようなフィラー、及び／又はリン酸カルシウム、例としてリン酸三カルシウム又はリン酸水素カルシウム、さらには例としてトウモロコシ、小麦、米又はジャガイモデンプンを用いたデンプンペースト、ゼラチン、メチルセルロースのような結合剤、及び／又はポリビニルピロリドン、並びに所望であれば上記のデンプン、またカルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天又はアルギン酸のような崩壊剤、若しくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムである。添加物は、とりわけ、流動調節剤及び滑沢剤、例としてケイ酸、タルク、ステアリン酸若しくはその塩、例えばステアリン酸マグネシウム若しくはステアリン酸カルシウム、及び／又はポリエチレングリコールである。糖衣錠コアは、耐胃液性であってもよい好適なコーティングを施され、中でも、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール及び／若しくは二酸化チタンを任意選択により含有する濃厚糖溶液、又は好適な有機溶媒若しくは溶媒混合物中のラッカー溶液、又は、耐胃液性のコーティングを生じさせるために、アセチルセルロースフタレート若しくはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートのような好適なセルロース調製物の溶液が用いられる。着色物質又は顔料を、例えば識別の目的で又は活性成分の異なる用量を示すために、錠剤又は糖衣錠コーティングに添加してもよい。
【００５１】
[0056]  他の経口投与可能な医薬調製物は、ゼラチン製の乾燥充填カプセル、さらにはゼラチン及び可塑剤、例えばグリセロール又はソルビトールから作製された軟密封カプセルである。乾燥充填カプセルは、活性成分を造粒物の形態で、例えば、ラクトース等のフィラー；デンプン等の結合剤；及び／又はタルク若しくはステアリン酸マグネシウム等の流動促進剤、及び適切な場合には安定剤と混合して、含有し得る。軟カプセルでは、活性成分は、脂肪油、パラフィン油又は液体ポリエチレングリコールのような好適な液体に溶解又は懸濁させることが好ましく、安定剤を添加することも可能である。
【００５２】
[0057]  非経口製剤は、とりわけ、注射用流体であり、動脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、皮内、皮下、又は好ましくは静脈内のような様々な様式で有効である。そのような流体は、好ましくは、例えば活性成分を単独で又は薬学的に許容される担体と併せて含有する凍結乾燥調製物から、使用前に調製することができる等張水溶液又は懸濁液である。医薬調製物は、滅菌されていてもよく、及び／又は、添加物、例えば保存料、安定剤、湿潤剤及び／又は乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節するための塩及び／又は緩衝剤を含有していてもよい。
【００５３】
[0058]  経皮適用に好適な製剤は、有効量のビスホスホネート活性成分を担体とともに包含する。有利な担体としては、宿主の皮膚の通過を補助するための、吸収性の薬理学的に許容される溶媒が挙げられる。特徴的には、経皮デバイスは、裏当て部材と、化合物を任意選択により担体とともに含有する貯蔵部と、任意選択により、宿主の皮膚の活性成分を制御された所定の速度で長時間にわたり送達するための速度制御バリアと、デバイスを皮膚に固定するための手段とを含む、バンデージの形態である。
【００５４】
[0059]  ビスホスホネート化合物を送達する方法は、インターベンション技術を用いて局所的な又は標的化された様式で送達され得る。これは、複数の臨床的背景において直接冠動脈注射により遂行され得る。一実施形態では、ビスホスホネートは、急性心筋梗塞（AMI）の際、再灌流のための緊急インターベンションを受けている患者の冠動脈に直接注入され得る。この状況において、ビスホスホネート化合物の直接冠動脈内注入は、再灌流及び治癒に伴う炎症又は再灌流傷害に対して、梗塞サイズに対して、心不全等、後遺症の発症に対して、又は臨床転帰に対して、重要な作用を有し得る。代替的な実施形態では、ビスホスホネート化合物は、心移植術の後、冠動脈に（例えば、左主及び右冠動脈を介して）注射され得る。時期、投薬量、及び投薬間隔は、ビスホスホネートが治療又は予防しようとする疾患、並びにビスホスホネートが投与される臨床的背景に基づいて決定されることが見込まれる。
【００５５】
[0060]  加えて、局所又は標的化薬物送達方法は、ビスホスホネート化合物を、ナノ粒子、ステント、ミクロスフェア、又は別のタイプの、療法の標的化及び局所送達を実行するのに適切なサイズ、形状及び他の特徴を有する粒子のような担体と結合させることを包含し得る。関係するデバイス又は送達ビヒクルは、好ましくは、血管内又は心臓内設置用に設計される。これらの方法は、デバイス又は送達ビヒクルが、ビスホスホネート化合物の経時的な送達を促進するように設計される方法を包含し得る。そのような方法としては、生体吸収性ポリマーと結合した又はもっぱらそれから構築された、血管内又は心臓内プロテーゼを挙げることができるがこれらに限定されない。あるいは、ビスホスホネートは、耐久性又は生体吸収性であってもよい別の物質から溶出させることもできる。
【００５６】
[0061]  一部の適用では、例えば、リポソーム又は他のカプセル材料媒体へ活性薬剤をカプセル化することにより、又は例えば共有結合、キレート化又は結合配位によって、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質及び多糖から選択されるような好適な生体分子へ活性化合物を固着させることにより、「ベクター化（vectorized）」形態のビスホスホネート化合物を利用することが有利であり得る。
【００５７】
[0062]  別の態様では、ビスホスホネート化合物は、心臓又は血管系内にあるパッチから、膜又は他のバリアを介して、経時的に放出され得る。さらに、ビスホスホネート化合物は、ヒドロゲルコーティングされた又は他の薬物溶出バルーンの配備によるものを包含する、血管ペービング（paving）又はヒドロゲルからの溶出により送達され得る。
【００５８】
[0063]  なおさらには、ビスホスホネート化合物は、心血管障害の治療に現在用いられているデバイスと組み合わせてもよい。例えば、ビスホスホネート化合物は、抗再狭窄薬と組み合わせて又は単独で、急性心筋梗塞（AMI）の治療時に設置される薬物溶出ステントから溶出させることができる。
【００５９】
[0064]  別の実施形態では、本発明は、ビスホスホネート化合物、詳細にはゾレドロン酸の投与前に、対象が適正なビタミンＤのレベルを有することを確実にすることに関する。ビタミンＤのレベルは、カルシジオール（25-ヒドロキシビタミンD）のレベルを決定する簡単な血液検査により、容易に決定することができる。ビタミンＤの単位用量は、特定の形態、投与の日数、患者の年齢及び状態、並びに決定されたビタミンＤ欠乏のレベルにより決定される。例えば、コレカルシフェロールは、約４００〜５０００ＩＵの単位錠剤用量又は約５０，０００単位／ｃｃ〜１００，０００単位／ｃｃの筋肉内形態であってもよく；エゴカルシフェロール（egocalciferol）は、約４００〜５０，０００ＩＵの単位カプセル用量であってもよく；経口カルシトリオールは、約０．１０〜約１ｍｃｇの用量であってもよく、これは少なくとも１日１回又は複数回投与で投与することができ；カルシジオール又はドキセルカルシフェロールは、これらはどちらもビタミンＤ類似体であるが、約３００〜２０００ＩＵの用量単位で投与され得る。
【００６０】
[0065]  さらに別の実施形態では、本発明は、ビスホスホネート、ある形態のビタミンＤ、及び任意選択によりカルシウムを、実質的に均質な混合物として包含する製剤に関し、ここで、溶液又は固体の単位用量は、単回用量で投与することができる。単回用量は、ビスホスホネート化合物に応じて、毎日、毎月若しくは毎年、又は間にいくらかの間隔を置いて、投与することができる。
[0066]
【実施例】
【００６１】
[0067]  実施例１
[0068]  ヒドロキシアパタイトに対する親和性及びＦＦＰＰ酵素阻害を決定するための異なるビスホスホネートの試験
【００６２】
[0069]  ヒドロキシアパタイト（HAP）親和性
[0070]  ヒドロキシアパタイトに対するミネラル親和性を、異なるビスホスホネート化合物のクロマトグラフィープロファイリングにより評価した。ヒドロキシアパタイト（HAP）セラミック球（直径２０ｍｍ、BioRad）を、０．６６×６．５ｃｍガラスカラム（Omnifit（登録商標））に詰めた。ＨＡＰカラムを、ｐＨ６．８の１ｍＭ  ＫＰＯ３のランニングバッファーによるＷａｔｅｒｓ  ６５０Ｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（FPLC）（Millipore）に取り付けた。各化合物を、ｐＨ６．８の１ｍＭ  ＫＰＯ３バッファー中で調製し、４００μモルを、ＦＰＬＣシステムに注入した。ビスホスホネート化合物を、１ｍＭから１０００ｍＭまで濃度が上昇するリン酸バッファーの勾配で溶出させ、Ｗａｔｅｒｓ  ４８４  ＵＶ吸光度検出器（Millipore）により、その最適波長にて検出した。表１に記載した結果は、各化合物のＨＡＰ保持プロファイル、及び一部の化合物がより長い保持時間を有することを示す。明らかに、ゾレドロニック（zoledronic）及びアレンドロネートが最長の保持時間を有し、それにより、最大のヒドロキシアパタイトに対する親和性を有する。
【００６３】
[0071]  ＦＰＰＳ阻害
[0072]  窒素含有ビスホスホネート化合物の主な分子標的である、ヒトファルネシルピロリン酸シンターゼ（FPPS）のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの阻害について、化合物を評価した。ＦＰＰＳの阻害は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける骨吸収の阻害と相関する。したがって、ＦＰＰＳ阻害は、ビスホスホネート化合物の効力の指標である。組換えヒトＦＰＰＳを、Ｄｕｎｆｏｒｄら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、５１：２１８７頁〜２１９５頁（2008）に記載の通りに発現させ、精製した。動態分析については、純粋ＦＰＰシンターゼ４０ｎｇ（１ｐｍｏｌ）を、５ＯｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．７、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ、及び２０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有するバッファーの最終体積１００μｌ中でアッセイした。標準反応物において、基質、ＧＰＰ及びＩＰＰ（14C-IPP、４００ＫＢｑ／μｍｏｌ）の濃度は、それぞれ１０μＭであった。反応物は、適切な濃度の適切なビスホスホネート化合物も含有していた。反応は、酵素希釈バッファー（１０ｍＭ HEPES pH 7.5、５００ｍＭ NaCl、５％グリセロール、２ｍＭ TCEP、２０μｇ／ｍＬ BSA）中の２μｇ／ｍＬの酵素を添加することで開始させ、３７℃にて適切な時間にわたり進行させた。次に、反応混合物をリグロイン０．４ｍＬで抽出して、未使用の基質から反応生成物を分離し、徹底的に混合した後、リグロイン上相の０．２ｍＬを汎用シンチラント４ｍＬと合わせた。最終ＩＣ５０値を計算した。これらのデータは、表１に示されているが、本明細書に記載されたビスホスホネート化合物の酵素阻害活性を実証し、また、ゾレドロネート、Ｏｘ−１４、及びミノドロネートが、ＦＰＰＳ酵素活性の５０％を阻害するのにそれぞれ４．１ｎＭ、２．５ｎＭ及び１．９ｎＭを要することを示すことで、それらが最も有効な阻害効力（IC50）を呈することを示している。
【００６４】
【表１】
2014533691.tif 000003
【００６５】
[0073]  実施例２
[0074]  心筋組織におけるＥＲＫの発現及び活性化に対するビスホスホネートの作用の測定
【００６６】
[0075]  方法及び材料
[0076]  ビスホスホネート化合物
[0077]  ゾレドロン酸（Zometa（登録商標）、Reclast（登録商標））骨密度維持剤
ＩＵＰＡＣ：（１−ヒドロキシ−２−イミダゾール−１−イル−１−ホスホエチル）ホスホン酸
ＭＦ：Ｃ５Ｈ１０Ｎ２Ｏ７Ｐ２／Ｅｎｔｒｅｚ  ＰＣＣｏｍｐｏｕｎｄ  ＣＩＤ：６８７４０
【００６７】
【化１】
2014533691.tif 000004
[0078]  ゾレドロン酸は、閉経後骨粗鬆症、骨ページェット病の治療のため、及び多発性骨髄腫及び前立腺癌のようなある特定の癌を有する患者における骨格合併症の予防のために、ＦＤＡに認可されている。
【００６８】
[0079]  Ｏｘ−１４
[0080]  １−フルオロ−２−（イミダゾ−［１，２−α］ピリジン−３−イル）−エチル−ビスホスホン酸は、ＷＯ１０／３３９７８に記載の通り調製し、以下の構造を有する：
【００６９】
【化２】
2014533691.tif 000005
【００７０】
[0081]  ゾレドロン酸／Ｏｘ−１４の活性
[0082]  ゾレドロン酸の試験用量は５００ｕｇ／ｋｇであり、Ｏｘ−１４の試験用量はゾレドロン酸のモル当量であった。すべての用量は、皮下投与した。各薬物（ゾレドロン酸及びOx-14）の１０ｍＭストック溶液を調製し、次に、滅菌生理食塩水で１０倍に段階希釈し、最終濃度０．１ｍＭとした。したがって、最終ストック濃度は、ゾレドロン酸については０．０２７４ｍｃｇ／マイクロリットルであり、Ｏｘ−１４については０．０３９１ｍｃｇ／マイクロリットルであった。そのため、２５ｇのマウスの場合、ゾレドロン酸１２．５ｍｃｇを投与して、５００ｍｃｇ／ｋｇの用量を達成した。０．１ｍＭストックのゾレドロン酸４５６マイクロリットルの注射が、適切な用量であった。同様に、モル当量のＯｘ−１４  ４５６マイクロリットルの注射により、１７．８ｍｃｇ（７１２ｕｇ／ｋｇ）を送達した。
【００７１】
[0083]  第１の用量を０日目に横行大動脈縮窄術（TAC）の直前に与え、第２の同等用量をプロトコールの３日目に投与した。
【００７２】
[0084]  横行大動脈縮窄術（TAC）は、以前に記載された（Rockmanら 1991）通りに実施した。簡潔には、成体の野生型雌マウスに、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）との混合物の０．１ｍｌ腹腔内注射により麻酔をかけた。解剖顕微鏡（モデルZDX-80、Scope Instruments, San Diego, CA）下、各動物を背臥位に置き、頸部正中切開を行って気管を露出させた。気管内挿管が成功した後、動物を、０．２ｍｌの１回換気量及び１１０呼吸／分の呼吸速度の従量式齧歯類人工呼吸器（Harvard Apparatus, Inc., South Natick, MA）に接続した。次に、小切開により、胸骨左縁上部の第二肋間において、胸腔に入れた。ＴＡＣは、７−０ナイロン縫合糸を２７ゲージ針に結び付け、直径０．４ｍｍの狭窄を生じたら、針を取り除くことにより実施した。これにより、６５〜７０％の再生可能な縮窄が生じた。ＴＡＣの後、気胸を排気し、動物から抜管し、回復させた。疑似（ｓｈａｍ）手術動物は、ＴＡＣなしで同じ外科的処置を受けた。
【００７３】
[0085]  心筋キナーゼ発現及びリン酸化の免疫検出を、試験動物の心臓（TACあり又はなし）からの心筋溶解物抽出物において実施した。心筋キナーゼ及びそのリン酸化を、抗ＥＲＫ及び抗ホスホ−ＥＲＫ抗体を用いた、心筋抽出物からの免疫沈降後のキナーゼに対するイムノブロッティングにより検出した。総ＥＲＫ及びリン酸化ＥＲＫに対応する免疫反応性の定量化を、デンシトメトリーにより行った。
【００７４】
[0086]  図１は、試験動物がすべて疑似（ｓｈａｍ）動物であった、つまりＴＡＣ結紮を適用しなかった場合の、ビスホスホネートを用いた結果を示す。明白に、動物が生理食塩水、ゾレドロン酸、又はＯｘ  １４のいずれを投薬されたかにかかわらず、ＥＲＫの発現のレベルは変化しなかった。しかしながら、ゾレドロン酸を投与された疑似（ｓｈａｍ）動物は、利用可能なＥＲＫキナーゼのリン酸化の増加を示し、ゾレドロン酸がＥＲＫの活性を刺激したことが示唆される。
【００７５】
[0087]  図２に記載した結果を考察すると、ビスホスホネートを投与された動物は、ＴＡＣ処置の後、ＥＲＫの発現のレベルを有意に増加させたことが明らかである。なおさらには、リン酸化のレベルはＴＡＣ条件の動物において増加し、Ｏｘ−１４を投与された動物において大幅に増加した。また、図１においてと同様、ゾレドロン酸処理された疑似（ＳＨＡＭ）群がリン酸化のレベルの増加を呈したことも明らかであり、それは、Ｏｘ−１４処理された疑似（ＳＨＡＭ）群では同程度に明らかではなかった。上流の受容体又は下流の標的のいずれを包含するシグナル伝達経路が存在するかにかかわらず、ＥＲＫの発現及び／又はリン酸化の増加は、心臓組織における代償性活動の誘導において役割を果たし得る機構であるように思われる。
【００７６】
[0088]  図３は、デンシトメトリー分析によるｐＥＲＫ／ｔＥＲＫ比率の定量化を示す。値は、生理食塩水処理された疑似（ＳＨＡＭ）動物に対する増加倍数として表す。明らかに、ゾレドロン酸を投与された疑似（ＳＨＡＭ）群ではほぼ７倍の活性の増加、Ｏｘ−１４を投与された疑似（ＳＨＡＭ）群では約３倍の増加があり、これらはどちらも、図２に示すＥＲＫのリン酸化の増加に起因する。興味深いことに、ゾレドロン酸投与されたＴＡＣ群では、生理食塩水投与されたＴＡＣ群に対して、顕著な倍数の活性の増加はなかった。しかしながら、Ｏｘ−１４投与されたＴＡＣ群では、生理食塩水疑似（ＳＨＡＭ）群に対して、約５倍の増加があり、その活性は、ゾレドロン酸投与されたＴＡＣ群の活性の約２倍であった。結果は、ビスホスホネートが、心臓組織におけるキナーゼ活性に対する誘導要素として働く能力を有することを示す。
【００７７】
[0089]  参考文献
[0090]  本明細書で引用されるすべての参考文献は、ここであらゆる目的のため参照により本明細書に組み込まれる。
[0091]  Colon-Emeric C, Caminis J, Suh TT, Pieper CF, Janning C, Magaziner J, Adachi J, Rosario-Jansen T, Mesenbrink P, Horowitz ZD, Lyles KW The HORIZON Recurent Fracture Trial: Design of a clinical trial in the prevention of subsequestn fractures in elders after low trauma hip fracture repair.  Curr Med Opin Res., 2004; 20:903-910.
[0092]  Lyles KW, Colon-Emeric CS, Magaziner JS, Adachi JD, Pieper CF, Mautalen C, Hylstrup L, Recknor C, Nordsletten L, Moore KA, Lavecchia C, Zhang J, Mesenbrink P, Hodgson PK, Abrams K, Orloff JJ, Horowitz Z, Eriksen EF, Boonen S. Zoledronic acid and clinical Fractures and Mortality after Hip Fracture.  N Engl J Med., 2007; 357:1799-1809.
[0093]  Rockman HA, Ross R, Harris AN, et al., Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy.  PNAS, 1991; 88:8277-8281.
[0094]  Rosen, CJ. Postmenopausal Osteoporosis.  N Engl J Med, 2005; 353:595-603.
[0095]  Varela I, Pereira S, Ugalde AP, Navarro CL, Suarez MF, Cau P, Cadinanos J, Osorio FG, Foray N, Cobo J, de Carlos F, Levy N, Freije JMP, Lopez-Otin C., Combined treatment with statins and aminobisphosphonates extends longevity in a mouse model of human premature aging.  Nature Medicine, 2008; 14:767-772.
【図１】
2014533691.tif 000006
【図２】
2014533691.tif 000007
【図３】
2014533691.tif 000008
【国際調査報告】
2014533691.tif 000009