(57)【要約】  電位開口型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮｘＡ）の発現および／または機能を調節する小分子が示される。このような小分子を含有する薬学的組成物、ならびにＳＣＮｘＡの発現に関連した疾患および障害を治療するに際してのそれらの使用も示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体系における電位開口型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮｘＡ）ポリヌクレオチドまたはタンパク質のうちの１つ以上の機能および／または発現を調節する方法であって、以下の：
前記生体系を、利尿薬、非定型抗精神病薬、カリウムチャネル開口薬、カルシウムチャネル遮断薬、抗真菌薬、酸化防止剤、ＰＤＥ５阻害薬、エストロゲン作動薬（ステロイド系または非ステロイド系）、抗うつ薬、プロトンポンプ阻害薬、５ＨＴ１Ｄ受容体作動薬、催眠薬、抗潰瘍薬、５ＨＴ４作動薬、ＧＡＢＡ作動薬、抗ヒスタミン薬または同化ステロイドからなる群から選択される少なくとも１つの化合物と接触させ、それにより、前記生体系における電位開口性Ｘ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮｘＡ）ポリヌクレオチドの機能および／または発現を調節すること
を包含する方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの化合物が、ミルナシプラン、トルセミド、リスペリドン、ピナシジル、ベニジピン、ケトコナゾール、エブセレン、タダラフィル、ゼラノール、ネファザドン、ロメリジン、イカリイン、オメプラゾール、エソメプラゾール、Ｌ−６９４，２４７、ニトレンジピン、ニメタゼパム、アンレキサノクス、モサプリド、セルトラリンまたはスタノゾロール、あるいはその製薬上許容可能な塩、異性体、エナンチオマー、アイソフォーム、多形体、水和物、溶媒和物またはプロドラッグからなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの患者の細胞または組織における電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）ポリヌクレオチドまたはタンパク質のうちの１つ以上の機能および／または発現を調節する方法であって、以下の：
前記細胞または組織を、利尿薬、非定型抗精神病薬、カリウムチャネル開口薬、カルシウムチャネル遮断薬、抗真菌薬、酸化防止剤、ＰＤＥ５阻害薬、エストロゲン作動薬（ステロイド系または非ステロイド系）、抗うつ薬、プロトンポンプ阻害薬、５ＨＴ１Ｄ受容体作動薬、催眠薬、抗潰瘍薬、５ＨＴ４作動薬、ＧＡＢＡ作動薬、抗ヒスタミン薬または同化ステロイドからなる群から選択される少なくとも１つの化合物と接触させ、それにより、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの患者の細胞または組織における電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）ポリヌクレオチドの機能および／または発現を調節すること
を包含する方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの化合物が、ミルナシプラン、トルセミド、リスペリドン、ピナシジル、ベニジピン、ケトコナゾール、エブセレン、タダラフィル、ゼラノール、ネファザドン、ロメリジン、イカリイン、オメプラゾール、エソメプラゾール、Ｌ−６９４，２４７、ニトレンジピン、ニメタゼパム、アンレキサノクス、モサプリド、セルトラリンまたはスタノゾロール、あるいはその製薬上許容可能な塩、異性体、エナンチオマー、アイソフォーム、多形体、水和物、溶媒和物またはプロドラッグからなる群から選択され、それにより、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの患者の細胞または組織における電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）ポリヌクレオチドの機能および／または発現を調節する請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）の機能および／または発現が、対照と比較してｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで増大される請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記発現が、ｉｎ  ｖｉｖｏで増大される請求項５記載の方法。
【請求項７】
１つ以上の電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮｘＡ）ポリヌクレオチドの（前記ポリヌクレオチドは、アンチセンス配列、相補性配列、対立遺伝子、相同体、アイソフォーム、変異体、誘導体、突然変異体、断片またはその組合せを含む）発現を調節する１つ以上の化合物、ならびに製薬上許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項８】
前記化合物が、利尿薬、非定型抗精神病薬、カリウムチャネル開口薬、カルシウムチャネル遮断薬、抗真菌薬、酸化防止剤、ＰＤＥ５阻害薬、エストロゲン作動薬（ステロイド系または非ステロイド系）、抗うつ薬、プロトンポンプ阻害薬、５ＨＴ１Ｄ受容体作動薬、催眠薬、抗潰瘍薬、５ＨＴ４作動薬、ＧＡＢＡ作動薬、抗ヒスタミン薬または同化ステロイドからなる群から選択される請求項７記載の組成物。
【請求項９】
前記化合物が、ミルナシプラン、トルセミド、リスペリドン、ピナシジル、ベニジピン、ケトコナゾール、エブセレン、タダラフィル、ゼラノール、ネファザドン、ロメリジン、イカリイン、オメプラゾール、エソメプラゾール、Ｌ−６９４，２４７、ニトレンジピン、ニメタゼパム、アンレキサノクス、モサプリド、セルトラリンまたはスタノゾロール、あるいはその製薬上許容可能な塩、異性体、エナンチオマー、アイソフォーム、多形体、水和物、溶媒和物またはプロドラッグからなる群から選択される請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
少なくとも１つの電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮｘＡ）ポリヌクレオチドおよび／または少なくとも１つのそのコード化産物に関連した疾患を防止するかまたは治療する方法であって、以下の：
少なくとも１つの電位開口型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮｘＡ）ポリヌクレオチドの発現を調節する少なくとも１つの化合物の治療的有効量を患者に投与し、それにより少なくとも１つの電位開口型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮｘＡ）ポリヌクレオチドおよび／または少なくとも１つのそのコード化産物に関連した疾患を治療すること
を包含する方法。
【請求項１１】
前記疾患が神経学的疾患または障害である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記疾患が心臓血管性疾患または障害である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）ポリヌクレオチドに関連した疾患が、以下の：痙攣、疼痛（例えば慢性疼痛）、ナトリウムチャネル機能不全を伴う電気的興奮性減損、ナトリウムチャネル機能不全に関連した疾患または障害、電位開口型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット活性の誤調節に関連した疾患または障害（例えば麻痺、高カリウム血性周期性四肢麻痺、先天性筋緊張症、カリウム増悪性筋緊張症、Ｑ−Ｔ延長症候群３、運動終板疾患、運動失調等）、腸神経系の機能不全のための消化管疾患（例えば、結腸炎、回腸炎、炎症性腸症候群等）；高血圧症またはうっ血性心不全；交感神経および副交感神経性神経支配を伴う尿生殖器の疾患または障害（例えば、良性前立腺肥大、性交不能症）；神経筋系に関連した疾患または障害（例えば、筋ジストロフィー、多発性硬化症、癲癇、自閉症片頭痛（例えば散発性および家族性片麻痺性片頭痛等）、乳児期の重症間代性筋痙攣（ＳＭＥＩまたはドラベ症候群）、全身性癲癇熱性痙攣プラス（ＧＥＦＳ＋）等）およびＳＣＮ１Ａ関連発作障害から選択される請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
前記疾患または障害が、乳児期の重症間代性筋痙攣（ＳＭＥＩまたはドラベ症候群）、家族性片麻痺性片頭痛、全身性癲癇熱性痙攣プラス（ＧＥＦＳ＋）から選択される請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のための推定ヒットとして少なくとも１つの化合物を同定し、選択する方法であって、以下の：疾患状態に関連した標的ＳＣＮｘＡポリヌクレオチドを選択すること；利尿薬、非定型抗精神病薬、カリウムチャネル開口薬、カルシウムチャネル遮断薬、抗真菌薬、酸化防止剤、ＰＤＥ５阻害薬、エストロゲン作動薬（ステロイド系または非ステロイド系）、抗うつ薬、プロトンポンプ阻害薬、５ＨＴ１Ｄ受容体作動薬、催眠薬、抗潰瘍薬、５ＨＴ４作動薬、ＧＡＢＡ作動薬、抗ヒスタミン薬または同化ステロイドからなる群から選択される少なくとも１つの化合物に対する前記標的ポリヌクレオチドの発現系を含む細胞スクリーニングを実行すること；そして対照に比して前記標的ポリヌクレオチドのｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現を調節する前記化合物（「推定ヒット」）を同定することを包含する方法。
【請求項１６】
前記推定ヒットが、ミルナシプラン、トルセミド、リスペリドン、ピナシジル、ベニジピン、ケトコナゾール、エブセレン、タダラフィル、ゼラノール、ネファザドン、ロメリジン、イカリイン、オメプラゾール、エソメプラゾール、Ｌ−６９４，２４７、ニトレンジピン、ニメタゼパム、アンレキサノクス、モサプリド、セルトラリンまたはスタノゾロール、あるいはその製薬上許容可能な塩、異性体、エナンチオマー、アイソフォーム、多形体、水和物、溶媒和物またはプロドラッグからなる群から選択される請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年９月６日に提出された米国仮特許出願第６１／５３１，３６１号の優先権を主張し、当該米国仮特許出願は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明の実施形態は、電位開口型ナトリウムチャネルのアルファサブユニットおよび関連分子の発現および／または機能を調節する小分子を含む。
【背景技術】
【０００３】
医薬剤を用いて生体系で低発現されるタンパク質の提供は、多数の疾患状態を治療するかまたは潜在的に治療する見込みのある方法である。医学的および薬学的共同体は、多数の機構および手段によりこの型の疾患モダリティの処置に取り組んできた。一アプローチにおいて、特定の標的タンパク質に対応するｍＲＮＡの天然アンチセンス転写体（ＮＡＴ）が、標的として選択されてきた。オリゴヌクレオチドおよび／または修飾オリゴヌクレオチドは、ＮＡＴを標的にするよう、そして標的ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を「上方調節する」よう意図されている。新規のおよび／または第一線の薬学的処置を要するかまたは必要とする膨大な数の疾患状態および症状のため、タンパク質発現または低発現を調整するための新規のアプローチおよび薬剤が有意に必要とされている。
【０００４】
従来技術は、概して、遺伝子療法、アンチセンス技術、ｓｉＲＮＡ技術、ならびにタンパク質発現を調節するための小分子の使用を包含する。アンチセンス技術およびｓｉＲＮＡ技術ならびに関連特許または特許出願のほとんどが、タンパク質の発現を軽減するためのこのような「薬剤」の使用に関する。治療的標的は、しばしば、特定のタンパク質をコードするかまたは当該タンパク質に翻訳されるＲＮＡをコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡである。特許文献からの種々の開示の例が、以下で提供される。
【０００５】
米国特許第５７３９１１９号は、ムスカリン２型アセチルコリン受容体ｍＲＮＡに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの権利を請求する。投与は、記憶および学習における増大を生じる。
【０００６】
米国特許第５９８５６６３号は、インターロイキン−１５発現のアンチセンス抑制の権利を請求する。
【０００７】
米国特許第６１６５７１２号は、遺伝子の発現を転写的に調節し、組換えタンパク質の産生を増大する分子の権利を請求する。この参考文献は、タンパク質の上方調節を開示する。調節分子は、アンチセンス核酸を含み得る。調節分子は、癌遺伝子または腫瘍抑圧遺伝子をコードするコード配列の上流のプロモーター領域と結合し得る。
【０００８】
米国特許第６１６５９９０号は、結腸癌−ガストリン遺伝子と関連したｍＲＮＡを標的にするアンチセンスヌクレオチドをコードする発現ベクターの使用の権利を請求する。
【０００９】
米国特許第６３０３３７４号は、カスパーゼ３発現のアンチセンス調整の権利を請求する。アンチセンスヌクレオチドは、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ等の治療のためのカスパーゼ３をコードする核酸を標的にする。
【００１０】
米国特許第６３７６５４１号は、プロスタグランジンの上方調節を引き起こす作用物質（当該作用物質としては、インターロイキン−１、形質転換増殖因子−ベータ１、形質転換増殖因子−ベータ２、血小板由来増殖因子、レバミソール等）で患者を処置することによりプロスタグランジンの産生を「上方調節する」ことによる緑内障の治療方法の権利を請求する。本特許は、タンパク質の代わりに小分子の発現を上方調節するための薬剤の使用の一例を開示する。
【００１１】
米国特許第６４４４４６４号は、転写因子Ｅ２Ｆをコードする核酸に対して標的にされるアンチセンスヌクレオチドを開示する。
【００１２】
米国特許第６６１７１２２号は、ポリペプチド、このようなポリペプチドを発現する核酸分子、ならびに低ＨＤＬを有するヒトの治療方法であって、ＡＢＣ１ポリペプチドまたはそのコレステロール調節断片をこのようなヒトに投与することを包含する方法の権利を請求する。ＡＢＣ−１ポリペプチドは野生型ＡＢＣ−１であり、あるいはその安定性またはその生物学的活性を増大する突然変異を有する。本特許は、前記タンパク質の発現のレベルを調整（増大）する突然変異を有する候補化合物も開示する。ＡＢＣ−１タンパク質のｃＤＮＡに対するアンチセンスヌクレオチドが開示された。ＡＢＣ１を抑止する転写因子を抑制するために化合物を用いることは、ＡＢＣ１の上方調節を生じ、したがってＨＤＬレベルを上げると予期される、ということを当該参考文献は開示する。転写因子はタンパク質である。
【００１３】
米国特許第６７１０１７４号は、血管内皮細胞増殖因子のアンチセンス抑制を開示する。
【００１４】
米国特許第７１４４９９９号は、低酸素症誘導性因子１アルファ（ａＨＩＦ）発現を標的にするオリゴヌクレオチド、ならびにこのようなタンパク質の発現に関連した疾患の治療方法を開示する。この特許は、ＨＩＦ−１アルファの３’非翻訳領域と相補的であり、ヒト疾患（非乳頭状明細胞腎癌）と関連づけられるあるａＨＩＦの天然アンチセンス転写体の過剰発現を開示する。
【００１５】
米国特許第７１４８２０４号は、ＢＣＬ−Ｘ発現のアンチセンス調整物質を開示する。調整は、アポトーシスを誘導する。
【００１６】
米国特許第７１９９１０７号は、キネシン様１発現のアンチセンス調整物質を開示する。
【００１７】
米国特許第７２０２３５７号は、アシルＣｏＡコレステロールアシルトランスフェラーゼ−２の発現を調整するための、アンチセンス化合物、組成物および方法が開示される。当該化合物は、アシルＣｏＡコレステロールアシルトランスフェラーゼ−２をコードする核酸に対して標的にされるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００１８】
米国特許第７２２９９７６号は、その発現を調整するためにフォークヘッドボックスＯ１Ａをコードする核酸に対して標的にされるアンチセンスオリゴマーを開示する。
【００１９】
米国特許第７２３５５３４号は、哺乳類エストロゲン受容体（ＥＲ）アルファおよび／またはベータをコードする遺伝子およびｍＲＮＡを標的にし、受容体の応答を調整するアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示する。治療は、プラーク安定化ならびに血管損傷後の血管治癒および内皮細胞回復を改善する。
【００２０】
米国特許第７２８５２８８号は、Ｂｃｌ−２核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを開示する（遺伝子産物は腫瘍形成タンパク質Ｂｃｌ−２と相互作用することが既知である）。
【００２１】
米国特許第７３３５７６４号は、アシルｃｏＡコレステロールアシルトランスフェラーゼ−２発現のアンチセンスモジュレーターを開示する。
【００２２】
米国特許第７４０２５７４号は、癌を治療するためのアンチセンス組成物および方法を開示する。アンチセンス組成物は、被験体における標的癌細胞による取込みを可能にするヌクレアーゼ耐性主鎖を有し、１０〜４０ヌクレオチド塩基を含有し、特定配列番号２１を有するプロセシング化または前プロセシング化ヒトＳＮＡＩＬ  ＲＮＡ転写体の一領域とハイブリダイズするのに有効な塩基配列を有する実質的非荷電アンチセンス化合物を含む。
【００２３】
米国特許第７４２００５０号は、ＴＧＦ−ベータ腎臓疾患の発現を抑制するアンチセンス分子を開示する。
【００２４】
米国特許第７４２５５４５号は、Ｃ反応性タンパク質発現の調整を開示する。
【００２５】
米国特許第７４５６１54号は、ヒトアセチルコリンエステラーゼに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその使用を開示する。
【００２６】
米国特許第７５９８２２７号は、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ発現の調整を開示する。
【００２７】
米国特許第７６６２９４８号は、疼痛の治療のためのＶＲ１（カプサイシン受容体）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示する。
【００２８】
米国特許第７６７４８９５号は、ＶＥＧＦおよびＶＦＧＦ受容体遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡを開示する。
【００２９】
米国特許第７６８７６１７号は、固定化および非固定化ヌクレオチドの交互セグメントを有するオリゴヌクレオチドを開示する。
【００３０】
米国特許第７６９１９９５号は、小分子干渉ＲＮＡのin vivo産生を開示する。
【００３１】
米国特許第７７０９５４６号は、染色体ＤＮＡに対して標的化されるオリゴマーによる遺伝子発現の調整を開示する。
【００３２】
米国特許第７７０９６３０号は、結合組織増殖因子発現のアンチセンス調整を開示する。
【００３３】
米国特許第７７２３５０８号は、アポリポタンパク質（Ａ）発現の調整を開示する。
【００３４】
米国特許第７７３２４２２号は、癌の治療のためのＴＲＰＭ−２アンチセンス療法を開示する。
【００３５】
米国特許第７７３２５９０号は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２発現の調整を開示する。
【００３６】
米国特許第７７３７２６５号は、ＨＩＦ−１およびその治療的使用のＲＮＡｉ調整を開示する。
【００３７】
米国特許第７７４１３０５号は、アポＡ１発現の調整を開示する。
【００３８】
ＵＳ２００３／０１９１０７５は、修飾オリゴヌクレオチド−親油性オリゴヌクレオチド結合体を用いて特定器官に対して遺伝子療法（アンチセンスヌクレオチド）をターゲッティングする方法を開示する。
【００３９】
ＵＳ２００４／００３３４８０は、アポリポタンパク質Ａ１の発現を上方調節するためのレスベラトロール（３，５，４’−トリヒドロキシ−トランス−スチルベン）の使用を開示する。
【００４０】
ＵＳ２００４／０１３７４２３は、ＡＢＣＡ１−遺伝子発現を増大することにより動物におけるＨＤＬレベルを調整する作用物質を同定するための組成物および方法を開示する。
【００４１】
ＵＳ２００４／０１７５８０３は、インターフェロン−アルファ誘導化（上方調節化）遺伝子を開示する。
【００４２】
本発明は、本発明は、ＳＣＮＡ遺伝子ファミリーおよびその変異体の発現の調整を生じる既知の小分子の新規の使用を発見した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００４３】
本概要は、本発明の本質と要点を簡潔に示すために提供される。特許請求の範囲の記載の意義の解釈や、範囲の限定のためにこれを用いるべきではないという理解を前提として提示されたものである。
【００４４】
一実施形態において、本発明は、電位開口型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮｘＡ）をコードする遺伝子の発現を調節する方法であって、それを必要とする患者に、ＳＣＮｘＡ関連障害または疾患の治療のために、利尿薬、非定型抗精神病薬、カリウムチャネル開口薬、カルシウムチャネル遮断薬、抗真菌薬、酸化防止剤、ＰＤＥ５阻害薬、エストロゲン作動薬（ステロイド系または非ステロイド系）、抗うつ薬、プロトンポンプ阻害薬、５ＨＴ１Ｄ受容体作動薬、催眠薬、抗潰瘍薬、５ＨＴ４作動薬、ＧＡＢＡ作動薬、抗ヒスタミン薬または同化ステロイドからなる群から選択される少なくとも１つの活性成分を投与することを包含する方法からなる。
【００４５】
別の実施形態では、本発明は、ＳＣＮｘＡ遺伝子の発現の調整方法であって、ミルナシプラン、トルセミド、リスペリドン、ピナシジル、ベニジピン、ケトコナゾール、エブセレン、タダラフィル、ゼラノール、ネファザドン、ロメリジン、イカリイン、オメプラゾール、Ｌ−６９４，２４７、ニトレンジピン、ニメタゼパム、アンレキサノクス、モサプリド、セルトラリンまたはスタノゾロール、あるいはその製薬上許容可能な塩、異性体、エナンチオマー、アイソフォーム、多形体、水和物、溶媒和物またはプロドラッグからなる群から選択される少なくとも１つの小分子の投与を包含する方法からなる。
【００４６】
一実施形態では、当該方法は、ＳＣＮｘＡ遺伝子発現を有する生体系に対して小分子の化合物ライブラリーをスクリーニングすることを包含し、この場合、前記スクリーニングは、ＳＣＮｘＡ発現産物および／または遺伝子産物の発現を上方調節する推定ヒットを生じる。好ましい発現産物標的は、ＳＣＮ１Ａである。
【００４７】
別の実施形態では、本発明は、ＳＣＮｘＡ  ＲＮＡの機能を阻止する（前記阻止は、ＳＣＮｘＡ遺伝子産物の上方調節を生じる）方法であって、ミルナシプラン、トルセミド、リスペリドン、ピナシジル、ベニジピン、ケトコナゾール、エブセレン、タダラフィル、ゼラノール、ネファザドン、ロメリジン、イカリイン、オメプラゾール、Ｌ−６９４，２４７、ニトレンジピン、ニメタゼパム、アンレキサノクス、モサプリド、セルトラリンまたはスタノゾロール、あるいはその製薬上許容可能な塩、異性体、エナンチオマー、アイソフォーム、多形体、水和物、溶媒和物またはプロドラッグからなる群から選択される小分子を投与することを包含する方法からなり、この場合、阻止されるべきＲＮＡの機能としては、少なくとも１つの生体機能、例えば前記ＲＮＡの転写、タンパク質翻訳部位へのＲＮＡの転位、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つ以上のｍＲＮＡ種を生じるためのＲＮＡのスプライシング、ならびに酵素ＲＮＡに関与するかまたはそれにより助長され得る触媒的活性が挙げられる。
【００４８】
一実施形態は、生体系におけるＳＣＮｘＡポリヌクレオチドの機能および／または発現を調節する方法であって、ミルナシプラン、トルセミド、リスペリドン、ピナシジル、ベニジピン、ケトコナゾール、エブセレン、タダラフィル、ゼラノール、ネファザドン、ロメリジン、イカリイン、オメプラゾール、Ｌ−６９４，２４７、ニトレンジピン、ニメタゼパム、アンレキサノクス、モサプリド、セルトラリンまたはスタノゾロール、あるいはその製薬上許容可能な塩、異性体、エナンチオマー、アイソフォーム、多形体、水和物、溶媒和物またはプロドラッグからなる群から選択される小分子と前記系を接触させて、それにより、前記生体系におけるＳＣＮｘＡポリヌクレオチドの機能および／または発現を調節することを包含する方法を提供する。
【００４９】
一実施形態は、ｉｎ  ｖｉｖｏ  またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ  での患者の細胞または組織におけるＳＣＮｘＡポリヌクレオチドの機能および／または発現を調節する方法であって、ミルナシプラン、トルセミド、リスペリドン、ピナシジル、ベニジピン、ケトコナゾール、エブセレン、タダラフィル、ゼラノール、ネファザドン、ロメリジン、イカリイン、オメプラゾール、Ｌ−６９４，２４７、ニトレンジピン、ニメタゼパム、アンレキサノクス、モサプリド、セルトラリンまたはスタノゾロール、あるいはその製薬上許容可能な塩、異性体、エナンチオマー、アイソフォーム、多形体、水和物、溶媒和物またはプロドラッグからなる群から選択される小分子と前記細胞または組織を接触させ、それにより、ｉｎ  ｖｉｖｏ  またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの患者の細胞または組織におけるＳＣＮｘＡポリヌクレオチドの機能および／または発現を調節することを包含する方法を提供する。
【００５０】
別の実施形態では、ミルナシプラン、トルセミド、リスペリドン、ピナシジル、ベニジピン、ケトコナゾール、エブセレン、タダラフィル、ゼラノール、ネファザドン、ロメリジン、イカリイン、オメプラゾール、Ｌ−６９４，２４７、ニトレンジピン、ニメタゼパム、アンレキサノクス、モサプリド、セルトラリンまたはスタノゾロール、あるいはその製薬上許容可能な塩、異性体、エナンチオマー、アイソフォーム、多形体、水和物、溶媒和物またはプロドラッグからなる群から選択される小分子は、ＳＣＮｘＡポリヌクレオチド、例えば配列番号１で記述されるヌクレオチド、ならびにその任意の変異体、対立遺伝子、相同体、突然変異体、誘導体、断片および相補配列の発現を修飾する。
【００５１】
別の実施形態は、ｉｎ  ｖｉｖｏ  またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの患者の細胞または組織におけるＳＣＮ１Ａポリヌクレオチドの機能および／または発現を調節する方法であって、ミルナシプラン、トルセミド、リスペリドン、ピナシジル、ベニジピン、ケトコナゾール、エブセレン、タダラフィル、ゼラノール、ネファザドン、ロメリジン、イカリイン、オメプラゾール、Ｌ−６９４，２４７、ニトレンジピン、ニメタゼパム、アンレキサノクス、モサプリド、セルトラリンまたはスタノゾロール、あるいはその製薬上許容可能な塩、異性体、エナンチオマー、アイソフォーム、多形体、水和物、溶媒和物またはプロドラッグからなる群から選択される小分子と前記細胞または組織を接触させ、それにより、ｉｎ  ｖｉｖｏ  またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの患者の細胞または組織におけるＳＣＮ１Ａポリヌクレオチドの機能および／または発現を調節することを包含する方法を提供する。
【００５２】
一実施形態では、本発明は、ミルナシプラン、トルセミド、リスペリドン、ピナシジル、ベニジピン、ケトコナゾール、エブセレン、タダラフィル、ゼラノール、ネファザドン、ロメリジン、イカリイン、オメプラゾール、Ｌ−６９４，２４７、ニトレンジピン、ニメタゼパム、アンレキサノクス、モサプリド、セルトラリンまたはスタノゾロール、あるいはその製薬上許容可能な塩、異性体、エナンチオマー、アイソフォーム、多形体、水和物、溶媒和物またはプロドラッグからなる群から選択される小分子、ならびに製薬上許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物であって、ＳＣＮｘＡポリヌクレオチドの発現を調整する組成物を包含する。
【００５３】
別の実施形態では、小分子は、経口、皮下、筋肉内、静脈内または腹腔内で患者に投与される。
【００５４】
治療レジメンは、患者に対して少なくとも１回、小分子を投与することを含む。しかし、この処置は、一定期間にわたって複数回の投与を含むように改変することができる。この処置は、１種類以上の他の治療と併用することができる。
【００５５】
別の実施形態では、前記小分子は、特定的に選択された小分子の物理学的および／または化学的特性によって、リポソームに包入されるか、担体分子（例えばコレステロール、ＴＡＴペプチド）あるいは標的化ナノ粒子および／または抗体被覆ベシクルに付着される。
【００５６】
一実施形態では、本発明は、ＳＣＮｘＡファミリー成員のアイソフォームのうちのいずれかおよびその変異体の発現の調整であって、それを必要とする患者に、薬学的有効量の本明細書中に列挙される少なくとも１つの化合物を投与することを包含する調整を含むが、この場合、上記調整はＳＣＮｘＡ遺伝子のうちの少なくとも１つまたはそれから賛成される発現産物と関連した疾患の治療を生じる。
【００５７】
他の態様は、以下で説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、１ｕＭの濃度での小分子化合物での処置後の、ドラベ症候群関連突然変異を有する一次皮膚繊維芽細胞（陰影バー）および成体一次ケラチノサイト（中白バー）におけるＳＣＮ１Ａ  ｍＲＮＡレベルの増大を示す。
【００５９】
［配列表の説明］
配列番号１：ヒト電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）、転写変異体１、ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ寄託番号：ＮＭ＿００１１６５９６３）。
配列番号２：ヒト電位開口性ＩＩ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ２Ａ）、転写変異体１、ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ寄託番号：ＮＭ＿０２１００７．２）。
配列番号３：ヒト電位開口性ＩＩＩ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ３Ａ）、転写変異体１、ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ寄託番号：ＮＭ＿００６９２２．３）。
配列番号４：ヒト電位開口性ＩＶ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ４Ａ）、ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ寄託番号：ＮＭ＿０００３３４．4）。
配列番号５：ヒト電位開口性Ｖ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ５Ａ）、転写変異体１、ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ寄託番号：ＮＭ＿１９８０５６．２）。
配列番号６：ヒト電位開口性ＶＩＩ型ナトリウムチャネル・アルファ（ＳＣＮ７Ａ）、ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ寄託番号：ＮＭ＿００２９７６．３）。
配列番号７：ヒト電位開口性ＶＩＩＩ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ８Ａ）、転写変異体１、ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ寄託番号：ＮＭ＿０１４１９１．２）。
配列番号８：ヒト電位開口性ＩＸ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ９Ａ）、ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ寄託番号：ＮＭ＿００２９７７．３）。
配列番号９：ヒト電位開口性Ｘ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）、ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ寄託番号：ＮＭ＿００６５１４．２）。
配列番号１０：ヒト電位開口性ＸＩ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１１Ａ）、ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ寄託番号：ＮＭ＿０１４１３９．２）。
配列番号１１：ヒト電位開口型ナトリウムチャネル・アルファサブユニットＳＣＮ１２Ａ（ＳＣＮ１２Ａ）、ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ寄託番号：ＡＦ１０９７３７．１）。  提供される配列表は、すべての場合において、実際は、ＲＮＳ転写体のｃＤＮＡバージョンである。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本発明のいくつかの態様について、例示のための応用例を参照して以下に説明する。種々の特定の細部、関係、および方法は、本発明の完全な理解のために記載されていることを理解されたい。しかし、本発明を、１以上の特定の細部を用いることなく、または他の方法を用いて実施できることは、当業者には容易に理解されよう。本発明は、行為や事象の順序によって限定されず、いくつかの行為は、異なる順序で、および／または他の作用または事象と同時に発生し得る。さらに、すべての例示された行為または事象は、本発明による方法を実施するために必ずしも必要ではない。
【００６１】
本明細書に記載されるすべての遺伝子、遺伝子名、および遺伝子産物は、本明細書に記載される組成物および方法が適用される任意の種由来のホモログに対応するものとする。したがって、この用語は、以下に限定しないが、ヒトおよびマウス由来の遺伝子および遺伝子産物を包含する。特定の種に由来する遺伝子または遺伝子産物が開示される場合、この開示内容は、例示のみを意図するものであり、それが現れた文脈が明示的に示さない限り、限定として解釈すべきものではない。したがって、例えば、本明細書に開示する遺伝子であって、いくつかの実施形態においてそれが哺乳動物の核酸およびアミノ酸配列に関連するものは、以下に限定しないが、他の哺乳類、魚類、両生類、爬虫類、および鳥類を含む他の動物に由来するホモログおよび／またはオルソログ遺伝子および遺伝子産物を包含するものとする。一実施形態では、該遺伝子または核酸配列はヒト由来である。
【００６２】
［定義］
本明細書で使用される用語の選択は、特定の実施形態を説明する目的でされたものであり、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は文脈において明らかに別記されない限り、複数形の内容も含むものとする。さらに、用語「含む」、「含める」、「有する」、「もつ」またはその変化形は、本明細書および／または添付の請求項において使用される場合、用語「包含する」と同様に非排他的な意味で用いられるものとする。
【００６３】
用語「約」または「概ね」は、当業者が決定した特定の数値について許容される誤差範囲内にあることを意味し、当該誤差範囲は、部分的には、その数値がどのように測定または決定されたか、すなわち測定システムの限界に応じて決まる。例えば、「約」は、本技術分野での習慣に従って、１またはそれ以上の標準偏差内に収まっていることを意味し得る。あるいは、「約」は、所与の数値に対し、最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、さらに好ましくは最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的な系またはプロセスに関して、この用語は、ある数値に対し、１桁分（１０倍）以内、より好ましくは５倍以内、さらに好ましくは２倍以内を意味し得る。特定の数値が本明細書および特許請求の範囲に記載される場合、特に別記されない限り、特定の数値の許容される誤差範囲ないであることを意味する用語「約」が仮定されるものとする。
【００６４】
本明細書で使用される用語「ｍＲＮＡ」は、標的化された遺伝子の既知のｍＲＮＡ転写物および解明され得る他の転写物を意味する。
【００６５】
本明細書において使用される「ＳＣＮｘＡ」および「電位開口型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット」は、ファミリーの全メンバー、変異体、アレル、アイソフォーム、断片、種、コード配列および非コード配列、センスおよびアンチセンスポリヌクレオチド鎖などを包含する。ＳＣＮｘＡ遺伝子ファミリーは、１１の既知の成員からなる（ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ２Ａ、ＳＣＮ３Ａ、ＳＣＮ４Ａ、ＳＣＮ５Ａ、ＳＣＮ７Ａ（ＳＣＮ６Ａとしても既知である）、ＳＣＮ８Ａ、ＳＣＮ９Ａ、ＳＣＮ１０Ａ、ＳＣＮ１１ＡおよびＳＣＮ１２Ａ）。
【００６６】
本明細書において使用される用語「電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット、ＳＣＮ１Ａ、ＦＥＢ３、ＦＥＢ３Ａ、ＧＥＦＳＰ２、ＨＢＳＣＩ、ＮＡＣ１、Ｎａｖ１．１、ＳＣＮ１、ＳＭＥＩ、ナトリウムチャネルタンパク質脳１サブユニットアルファ、ナトリウムチャネルタンパク質１型サブユニットアルファおよび電位開口型ナトリウムチャネル・アルファサブユニットＮａｖ１．１」は、文献におけるものと同じであるとみなされるし、本出願で互換的に用いられる。
【００６７】
用語「ヌクレオチド」は、非天然のヌクレオチドとともに天然のヌクレオチドを包含する。以前には「非天然に発生する」ものと考えられていた各種ヌクレオチドが、その後天然にも見出されたことがあるのは当業者には明らかなはずである。したがって、「ヌクレオチド」は、既知のプリンおよびピリミジンヘテロ環を含む分子だけでなく、ヘテロ環アナログおよびそれらの互変異性体も含む。他の種類のヌクレオチドの例としては、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、プリン、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ６，Ｎ６−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、シュードイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシンおよびＢｅｎｎｅｒら、米国特許第５，４３２，２７２号に記載されている「非天然の」ヌクレオチドである。「ヌクレオチド」という用語は、これらの例のすべてに加えてそのアナログおよび互変異性体も包含するものとする。特に興味深いヌクレオチドは、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、およびウラシルであり、これらはヒトにおける治療および診断の用途に関連して自然に生じるヌクレオチドと考えられる。ヌクレオチドは、例えばＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２）に記載の天然の２’−デオキシ糖および２’−ヒドロキシ糖ならびにそれらのアナログを含む。
【００６８】
本明細書において使用される用語「調節」は、遺伝子の発現における増大（刺激）または減少（阻害）を意味する。「発現を調節すること」という用語は、さらに、ＲＮＡの発現または翻訳を阻止することにより所定のタンパク質の発現を増強するかまたは低減することを意味する。タンパク質発現増強の場合、当該薬剤は、抑圧遺伝子、例えば腫瘍抑圧遺伝子または任意の他の遺伝子産物、あるいはタンパク質産物の下方調節または低発現を生じる突然変異化遺伝子の発現を遮断し得る。タンパク質発現低減の場合、当該薬剤は、所定の遺伝子の発現を直接遮断し得るし、またはその遺伝子から転写されるＲＮＡの崩壊促進に関与し得る。
【００６９】
ポリヌクレオチド配列の文脈において使用される場合に用語「変異型」は、野生型遺伝子に関連するポリヌクレオチド配列を包含する。この定義は、例えば「アレル」、「スプライス」、「種」または「多型」変異型も含み得る。スプライス変異型は、基準の分子と有意な同一性を有し得るが、一般にｍＲＮＡプロセシングの際のエクソンの選択的スプライシングによる、より多いまたは少ない数のポリヌクレオチドを有する。対応するポリペプチドは、追加的機能ドメインまたはドメインの欠損を有し得る。種の変異型は、１つの種から他の種へ変化するポリヌクレオチド配列である。本発明における特定の有用性は、野生型遺伝子産物の変異型である。変異型は、核酸配列における少なくとも１つの変異から生じることができ、変化したｍＲＮＡまたはその構造または機能が変化していても変化していなくてもよいポリペプチドを生じ得る。任意の所与の天然または組み換え遺伝子は、対立形態を有さない場合も、１つ有する場合も、多数有する場合もある。変異型を生じる通常の変異変化は、一般に天然の欠失、追加またはヌクレオチドの置換に帰する。これらの型の変化のそれぞれは、単独でまたは他との組み合わせで１回または複数回、所与の配列に生じ得る。
【００７０】
得られたポリペプチドは、一般に相互に比較して顕著なアミノ酸同一性を有する。多型変異型は、所与の種の個体間での特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列における変異型である。多型変異型は、「単一ヌクレオチド多型」（ＳＮＰ）またはポリヌクレオチド配列が１塩基によって変化している単一塩基変異も包含できる。ＳＮＰの存在は、例えば、易罹患性対抵抗性である病態についてのある傾向を有する特定の集団についての指標であり得る。
【００７１】
「誘導体」ポリペプチドまたはペプチドは、例えばグリコシル化、ポリエチレングリコール化、リン酸化、硫酸化、還元／アルキル化、アシル化、化学的カップリングまたは穏やかなホルマリン処理によって修飾されたものである。誘導体は、以下に限定されないが放射性同位元素、蛍光または酵素標識を含む検出可能な標識を含むために直接または間接的のいずれかで修飾もされ得る。
【００７２】
本明細書において使用される用語「動物」または「患者」とは、例えばヒト、ヒツジ、エルク、シカ、ミュールジカ、ミンク、哺乳動物、サル、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、鳥類、ニワトリ、爬虫類、魚類、昆虫およびクモ類を含む意味である。
【００７３】
「哺乳動物」は、典型的には医療的ケアの下にある温血哺乳動物（例えばヒトおよび家畜）を含む。例として、ヒトのみならず、ネコ、イヌ、ウマ、ウシおよびヒトが挙げられる。
【００７４】
「治療」または「処置」は、（ａ）哺乳動物において病状が生じることを予防するステップ、具体的にはそのような哺乳動物が前病気状態におかれているが、病状が生じているとまだ診断されていない場合；（ｂ）病状を抑制するステップ、例えばその進行を止めるステップ；および／または（ｃ）病状を軽減するステップ、例えば病態の退行を所望の終点に至るまで生じさせるステップ、を含む哺乳動物における病気に対する処置を含む。治療は、疾患の症状の回復（例えば疼痛または不快感の緩和）も含み、そのような回復は、疾患に直接効果を与える場合または与えない場合がある（例えば原因、伝染、発現など）。
【００７５】
「神経疾患または障害」とは、神経系および／または視覚系のあらゆる疾患または障害を指す。「神経疾患または障害」は、中枢神経系（脳、脳幹、小脳）、末梢神経系（脳神経を含む）、および自律神経系（その一部は中枢神経系および末梢神経系の両方に位置する）が関与する疾患または障害を含む。神経学的障害の例としては、頭痛、昏迷および昏睡、痴呆、発作、睡眠障害、外傷、感染症、新生物、神経眼科学、運動障害、脱髄性疾患、脊髄障害および末梢神経の障害、筋肉および神経筋肉接合部が挙げられるが、これらに限定されない。嗜癖および精神病としては双極性障害および精神分裂病（これらに限定されない）が挙げられ、神経学的障害の定義に含まれる。本発明の小分子、薬学的組成物および方法を用いて処置され得るいくつかの神経学的障害、症候、徴候および症候群を以下に列挙する：後天性てんかん性失語症、急性散在性脳脊髄炎、副腎白質ジストロフィー、加齢黄斑変性症、脳梁欠損症、失認症、アイカルディ症候群、アレクサンダー病、アルパース病、交代性片麻痺、アルツハイマー疾患、脳血管性痴呆、筋萎縮性側索硬化症、無脳症、アンジェルマン症候群、血管腫症、無酸素症、失語症、失行症、くも膜嚢胞、くも膜炎、アーノルド・キアリ奇形、動静脈奇形、アスペルガー症候群、毛細血管拡張性運動失調症、注意欠陥多動性障害、自閉症、自律神経機能障害、背中の痛み、バッテン病、ベーチェット病、ベル麻痺、良性特発性眼瞼けいれん、良性限局性異常、筋萎縮症、良性頭蓋内圧亢進症、ビンスワンガー病、眼瞼けいれん、ブロッホ・サルズバーガー症候群、腕神経叢損傷、脳膿瘍、脳損傷、脳腫瘍（多形性膠芽腫を含む）、脊髄腫瘍、ブラウンセカール症候群、カナバン病、手根管症候群、カウザルギー、中枢性疼痛症候群、橋中心髄鞘崩壊、頭部の障害、脳動脈瘤、脳動脈硬化症、萎縮脳、脳性巨人症、脳性麻痺、シャルコー・マリー・トゥース病、化学療法誘発性神経障害と神経因性疼痛、キアリ奇形、舞踏病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、慢性疼痛、慢性局所疼痛症候群、コフィンローリー症候群、遷延性植物状態を含む昏睡状態、先天性顔面麻痺、大脳皮質基底核変性症、頭蓋の動脈炎、頭蓋骨早期癒合症、クロイツフェルト・ヤコブ病、蓄積外傷疾患、クッシング症候群、巨大細胞性封入体症、サイトメガロウイルス感染症、ダンシングアイズ・ダンシングフィート症候群（眼球クローヌス・ミオクローヌス運動失調）、ダンディ・ウォーカー症候群、ドーソン病、ド・モルシア症候群、デジェリン−クルムプケ麻痺、認知症、皮膚筋炎、糖尿病性神経障害、びまん性硬化症、ドラベ症候群、自律神経障害、書字障害、失読症、ジストニア、早期乳児てんかん性脳症、エンプティセラ症候群、脳炎、脳瘤、脳三叉神経領域血管腫症、てんかん、エルブ麻痺、本態性振戦、ファブリー病、ファール症候群、失神、家族性けいれん性麻痺、熱性けいれん、フィッシャー症候群、フリードライヒ失調症、前頭側頭認知症およびその他の「タウオパチー」、ゴーシェ病、ゲルストマン症候群、巨細胞性動脈炎、巨細胞性封入体病、球様細胞白質萎縮症、ギラン・バレー症候群、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症、ハレルフォルデンスパッツ病、頭部外傷、頭痛、片側顔面けいれん、遺伝性痙性対麻痺、遺伝性多発神経炎性失調、耳帯状疱疹、帯状疱疹、平山病、ＨＩＶ関連認知症および神経障害（ＡＩＤＳの神経学的症状も）、全前脳症、ハンチントン病および他のポリグルタミンリピート病、水無脳症、水頭症、副腎皮質機能亢進症、低酸素症、免疫介在性脳脊髄炎、封入体筋炎、色素失調症、幼児型フィタン酸蓄積症、乳児型レフサム病、乳児痙攣、炎症性筋疾患、頭蓋内の嚢胞、頭蓋内圧亢進、ジュベール症候群、カーンズ・セイヤー症候、ケネディ病、キンズボーン症候群、クリッペル・ファイル症候群、クラッベ病、クーゲル・ウエランダー病、クールー、ラフォラ病、ランバート・イートン症候群、ランドウ・クレフナー症候群、外側延髄（ウォレンバーグ）症候群、学習障害、リー病、レノックス・ガストー症候群、レッシュナイハン症候群、大脳白質萎縮症、レビー小体型認知症、滑脳症、閉じ込め症候群、ルー・ゲーリッグ病（すなわち運動ニューロン疾患または筋萎縮性側索硬化症）、腰椎椎間板疾患、ライム病−神経学的後遺症、マチャド・ジョセフ病、大脳症、巨大脳髄症、メルカーソン・ローゼンタール症候群、メニエール病、髄膜炎、メンケス病、異染性白質ジストロフィー、小頭症、片頭痛、ミラーフィッシャー症候群、軽度の脳卒中、ミトコンドリアミオパシー、メビウス症候群、モノマー性筋萎縮症、運動ニューロン疾患、もやもや病、ムコ多糖症、多発梗塞性痴呆、多巣性運動ニューロパチー、多発性硬化症および他の脱髄性疾患、起立性低血圧を伴う多系統萎縮症、筋ジストロフィー、重症筋無力症、ミエリン代謝異常によるびまん性硬化症、乳児型ミオクロニー脳症、ミオクローヌス、筋疾患、先天性ミオトニア、ナルコレプシー、神経線維腫症、悪性症候群、ＡＩＤＳの神経学的症状、狼瘡の神経学的後遺症、神経性筋緊張病、神経セロイドリポフスチン症、神経細胞遊走障害、ニーマン・ピック病、オサリバン・マクラウド症候群、後頭神経痛、潜在性脊椎閉鎖不全症、大田原症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、視神経炎、起立性低血圧、使い過ぎ症候群、感覚異常、神経変性疾患または障害（パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、認知症、多発性硬化症、および神経細胞死に関連する他の疾患および障害）、先天性パラミオトニア、腫瘍随伴性疾患、発作、パリーロンベルク症候群、ペリツェウスメルツバッハー病、周期性麻痺、末梢神経障害、痛みを伴う神経障害および神経因性疼痛、遷延性植物状態、広汎性発達障害、光くしゃみ反射、フィタン酸蓄積症、ピック病、挟まれた神経、下垂体腫瘍、多発性筋炎、孔脳症、ポリオ後症候群、帯状疱疹後神経痛、感染後脳脊髄炎、起立性低血圧、プラダーウィリ症候群、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性顔面半側萎縮症、進行性多巣性白質脳症、進行性硬化性ポリオジストロフィー、進行性核上性麻痺、偽脳腫瘍、ラムゼイ・ハント症候群（Ｉ型および11型）、ラスムッセン脳炎、反射性交感神経性ジストロフィー症候群、レフサム病、反復運動障害、反復ストレス障害、むずむず脚症候群、レトロウイルス関連脊髄症、レット症候群、ライ症候群、舞踏病、サンドホフ病、シルダー病、裂脳症、中隔視神経異形成症、乳���期の重症間代性筋痙攣性癲癇、揺さぶられっ子症候群、帯状疱疹、シャイ・ドレーガー症候群、シェーグレン症候群、睡眠時無呼吸症候群、ソトス症候群、痙縮、二分脊椎、脊髄損傷、脊髄腫瘍、脊髄性筋萎縮症、スティッフパーソン症候群、脳卒中、スタージ・ウェーバー症候群、亜急性硬化性全脳炎、皮質下動脈硬化性脳症、シデナム舞踏病、失神、脊髄空洞症、遅発性ジスキネジア、テイ・サックス病、側頭動脈炎、係留脊髄症候群、トムセン病、胸郭出口症候群、疼痛チック、トッドの麻痺、トゥレット症候群、一過性脳虚血発作、伝達性海綿状脳症、横断性脊髄炎、外傷性脳損傷、振戦、三叉神経神経痛、熱帯性痙性不全対麻痺、結節性硬化症、血管性痴呆（多発梗塞性痴呆）、側頭動脈炎を含む脈管炎、フォンヒッペル・リンドウ病、ウォレンバーグ症候群、ウェルドニッヒ・ホフマン病、ウエスト症候群、むち打ち症、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、およびゼルウィガー症候群を含む。
【００７６】
心臓血管性疾患または障害は、虚血を引き起こし得るかまたは心臓の再還流により引き起こされる障害を含む。例としては、アテローム硬化症、冠動脈疾患、肉芽腫性心筋炎、慢性心筋炎（非肉芽腫性）、原発性肥大性心筋症、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、末梢血管性疾患、静脈血栓塞栓症、肺塞栓症、卒中、狭心症、心筋梗塞、心停止により引き起こされる心臓血管性組織損傷、心臓バイパスにより引き起こされる心臓血管性組織損傷、心原性ショック、ならびに当業者に既知であるか、あるいは心臓または血管系の機能不全または組織損傷を伴う関連症状、特にＳＣＮ１Ａ活性化に関連した組織損傷（これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＶＳ疾患としては、アテローム硬化症、肉芽腫性心筋炎、心筋梗塞、心臓弁膜症に派生する心筋繊維症、梗塞を伴わない心筋繊維症、原発性肥大性心筋症および慢性心筋炎（非肉芽腫性）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
ナトリウムチャネル機能不全に関連した疾患または障害の例としては、悪性高体温症、筋無力症、発作性運動失調、神経障害性および炎症性疼痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、過剰驚愕症、ＳＭＥＩ、ＦＥＢ３、家族性片麻痺性片頭痛３型、筋緊張症、例えば低および高カリウム血性周期性麻痺、先天性筋緊張症およびカリウム増悪性筋緊張症、ならびに心不整脈、例えばＱＴ延長症候群が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
標的：一実施形態において、調整のための標的は、電位開口型ナトリウムチャネル・アルファサブユニットファミリー成員（ＳＣＮｘＡ）の核酸配列、例えばＳＣＮｘＡ転写および／または翻訳および／または調整に関連したセンスおよび／またはアンチセンス非コードおよび／またはコード配列ならびにタンパク質配列（これらに限定されない）を含む。好ましい標的は、ＳＣＮ１Ａチャネルである。
【００７９】
電位感受性イオンチャネルは、細胞興奮性に関する基礎、ならびにイオン発生膜電位を介して上方を伝達する能力を提供する膜貫通タンパク質の一クラスである。電位開口型ナトリウムチャネルは、ほとんどの電気的興奮性細胞、例えばニューロン、心臓細胞および筋肉における活動電位の発生および伝播に関与する。電気的活動は、膜の脱分極により誘発され、これが、ナトリウムイオンに関して高選択的である膜貫通チャネルを開口する。異なる組織におけるナトリウムベースの活動電位は類似しているが、しかし、多数の構造的および機能的に別個のナトリウムチャネルが存在し、ナトリウムチャネルをコードする多数の遺伝子がクローン化されている、ということを電気生理学的試験は実証している。ＳＣＮ１Ａ遺伝子は、電位開口型ナトリウムチャネルの遺伝子ファミリー（ＳＣＮｘＡファミリー）に属する。
【００８０】
電位開口型ナトリウムチャネルは、神経細胞および筋肉における活動電位の発生に重要な役割を果たす。アルファサブユニット（ＳＣＮｘＡ）はチャネルの主要構成成分であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞中で発現される場合、イオン流を発生するのに十分である。しかしながら、事実上、電位開口型ナトリウムチャネルは２つの付加的調節ベータサブユニットを含む。これらのサブユニットの役割は、主に、ナトリウム電流の不活性化に影響を及ぼすことにより、ナトリウムチャネル局在化および密度、ならびに動態特性を改変することである。ＳＣＮ１Ｂ遺伝子における突然変異は、ＧＥＦＳ+プラス、ブルガダ症候群および心臓伝導障害（非特異的）と関連づけられる。ＳＣＮ３Ｂにおける突然変異もブルガダ症候群と関連し、ＳＣＮ４Ｂにおける突然変異はＱＴ延長症候群−１０を引き起こす。
【００８１】
一実施形態では、小分子は、ミルナシプラン、トルセミド、リスペリドン、ピナシジル、ベニジピン、ケトコナゾール、エブセレン、タダラフィル、ゼラノール、ネファザドン、ロメリジン、イカリイン、オメプラゾール、Ｌ−６９４，２４７、ニトレンジピン、ニメタゼパム、アンレキサノクス、モサプリド、セルトラリンまたはスタノゾロール、あるいはその製薬上許容可能な塩、異性体、エナンチオマー、アイソフォーム、多形体、水和物、溶媒和物またはプロドラッグからなる群から選択され、ＳＣＮｘＡファミリー成員と関連する疾患または障害を防止するかまたは処置するために用いられる。薬剤で、および／または当該化合物を用いて得られる幹細胞から再生される細胞／組織で処置され得る電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）媒介性疾患および障害の例を以下に示す：神経学的疾患または障害、痙攣、疼痛（例えば慢性疼痛）、ナトリウムチャネル機能不全を伴う電気的興奮性減損、ナトリウムチャネル機能不全に関連した疾患または障害、電位開口型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット活性の誤調節に関連した疾患または障害（例えば麻痺、高カリウム血性周期性四肢麻痺、先天性筋緊張症、カリウム増悪性筋緊張症、Ｑ−Ｔ延長症候群３、運動終板疾患、運動失調等）、腸神経系の機能不全のための消化管疾患（例えば、結腸炎、回腸炎、炎症性腸症候群等）；心臓血管性疾患または障害（例えば、高血圧症、うっ血性心不全等）；交感神経および副交感神経性神経支配を伴う尿生殖器の疾患または障害（例えば、良性前立腺肥大、性交不能症）；神経筋系に関連した疾患または障害（例えば、筋ジストロフィー、多発性硬化症、癲癇、自閉症片頭痛（例えば散発性および家族性片麻痺性片頭痛等）、乳児期の重症間代性筋痙攣（ＳＭＥＩ）またはドラベ症候群、全身性癲癇熱性痙攣プラス（ＧＥＦＳ＋）等）およびＳＣＮ１Ａ関連発作障害。
【００８２】
一実施形態では、小分子は、ＳＣＮ１Ａのポリヌクレオチドを上方調節する。ＳＣＮ１Ａ標的は、ＳＣＮ１Ａの変異体；ＳＣＮ１Ａの突然変異体、例えばＳＮＰ；ＳＣＮ１Ａの非コード配列；対立遺伝子、アイソフォーム、断片等を含む。好ましくは、小分子は、ミルナシプラン、トルセミド、リスペリドン、ピナシジル、ベニジピン、ケトコナゾール、エブセレン、タダラフィル、ゼラノール、ネファザドン、ロメリジン、イカリイン、オメプラゾール、Ｌ−６９４，２４７、ニトレンジピン、ニメタゼパム、アンレキサノクス、モサプリド、セルトラリンまたはスタノゾロール、あるいはその製薬上許容可能な塩、異性体、エナンチオマー、アイソフォーム、多形体、水和物、溶媒和物またはプロドラッグからなる群から選択される。
【００８３】
本発明の実施形態によれば、標的核酸分子はＳＣＮ１Ａポリヌクレオチドのみに限定されず、ＳＣＮ１Ａの任意のアイソフォーム、受容体、相同体、非コード領域など（例えばＳＣＮｘＡファミリー）にも及ぶ。
【００８４】
別の実施形態では、小分子は、以下に限定されないが変異体、対立遺伝子、相同体、突然変異体、誘導体、断片およびそれらの相補配列を含むＳＣＮ１Ａ標的を調整する。
【００８５】
別の実施形態では、小分子は、電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）の発現を調整し、電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）（配列番号１）の発現および／または機能を調整する。
【００８６】
選択的ＲＮＡ転写物は、ＤＮＡの同じゲノム領域から生成され得る。これらの選択的転写物は、通常「スプライス変異型」として周知である。さらに具体的には、「プレｍＲＮＡ変異型」は、イントロンおよびエクソン配列の両方を含むゲノムＤＮＡから生成される転写体である。
【００８７】
スプライシングでの１つ以上のエクソンもしくはイントロン領域またはそれらの一部分の切除において、プレｍＲＮＡ変異型は、より小さな「ｍＲＮＡ変異型」を生成する。これらのｍＲＮＡ変異型は、「選択的スプライス変異型」としても周知である。プレｍＲＮＡ変異型のスプライシングが生じない場合には、プレｍＲＮＡ変異型はｍＲＮＡ変異型と同一である。
【００８８】
変異型は、転写を開始するまたは終止するための選択的シグナルの使用を通じても生成され得る。プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡは、２以上の開始コドンまたは終止コドンを有し得る。選択的開始コドンを使用するプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ由来の変異型は、プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの「選択的開始変異型」として周知である。選択的終止コドンを使用するこれらの転写物は、プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの「選択的終止変異型」として周知である。選択的終止変異型の特定の１種類は、機械的な転写による「ポリＡ終止シグナル」のうちの１つの代替選択から生じる、多数の転写物が生成される「ポリＡ変異型」であり、それにより特有なポリＡ部位で終結する転写物が生成される。本発明の文脈において、本明細書に記載される種類の変異型も標的核酸の実施形態である。
【００８９】
特定の典型的な標的セグメントの特定の配列が本明細書に記載されているが、当業者はこれらが本発明の範囲内の具体的実施形態を例示し説明するために利用できることを理解されよう。追加の標的セグメントは、本開示を考慮して当業者によって容易に特定される。
【００９０】
さらなる実施形態において、本明細書において同定する「好ましい標的セグメント」は、電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）ポリヌクレオチドの発現を調節する追加的化合物の選別において使用され得る。「調節物質」は、電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）をコードする核酸分子またはその対応するタンパク質の発現を減少または増大させる化合物である。選別方法は、電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）のセンスまたは天然アンチセンスポリヌクレオチドをコードする核酸分子の好ましい標的セグメントまたはその対応するタンパク質を１つまたは複数の候補調節物質に接触させるステップ、および電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）ポリヌクレオチドをコードする核酸分子またはその対応するタンパク質の発現を減少または増大させる１つまたは複数の候補修飾物質を選択するステップを含む。１以上の候補調節物質が、電位開口型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮｘＡ）ポリヌクレオチドをコードする核酸分子の発現を調節できる（例えば減少させるまたは増大させる）ことが一度示されれば、次いで調節物質は、電位開口型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮｘＡ）ポリヌクレオチドの機能のさらなる調査研究において、または本発明による研究、診断もしくは治療剤としての使用のために用いられ得る。
【００９１】
本発明に従って用いられる小分子は、周知の合成方法により好都合に且つ慣例的に製造され得る。このような合成の任意のその他の手段も用いられ得る；小分子の実際的合成は、十分に当業者の力量内であるし、あるいはこのような分子は商業的売主または供給元から入手され得る。本発明の方法に用いられる好ましい方法の各々が既知の製剤であり、有効薬剤成分製造業者から購入または入手可能である。さらに、このような薬剤は公表済みの合成方法を有し、合成化学の当業者は既知の経路によりこのような薬剤を合成し得るし、あるいは当業者は新規の合成方法を企画し得る。これらの薬剤ならびにその物理学的および塩形態は、プロドラッグを作るために標準化学的手段により改変され得る。このようなプロドラッグは、エステルおよび／またはその他の化学誘導体および／または修飾を包含し、この場合、投与時に、プロドラッグは剤形（製剤）中の既知の有効薬学的成分に開裂する。これらの薬剤は、期間中に、既知の活性代謝物質に代謝され得るし、このような代謝物質は本発明の範囲内に含まれる。本発明はさらに、製剤のエナンチオマーおよび／またはジアステレオマー、種々の塩形態、例えばナトリウムおよびカリウム塩、ならびにこのような物質の水和物および溶媒和物を包含する。本発明はさらに、任意の適切な剤形での製剤またはその塩の各々の非晶質形態の使用を包含する。特定の製剤がアミン部分を含有する場合、本発明はさらに、このような物質の酸塩を含み、この場合、対イオンは、ハリド塩、例えば塩化物または臭化物等から選択される。結晶形態のこのような有効薬学的成分を調製するために、再結晶化法およびその他の既知の精製方法が利用され得る。
【００９２】
宿主細胞または生物体中への小分子の移入、ならびにＲＮＡまたはタンパク質上方調節または下方調節時のその効力の確定は、当該技術分野で周知のいくつかの方法により査定され得る。例えば、ＳＣＮ１Ａ繊維芽細胞および／またはケラチノサイトまたはその他の細胞型が所望に応じて、本明細書中の特的の検定のために選択され、増殖される。実験の１日前に、細胞を約４×１０４／ウェルの密度で増殖培地中の２４ウェルプレート中にプレート化して、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。翌日、２４ウェルプレート中の培地を新鮮な増殖培地（１ｍl／ウェル）に取り替え、細胞は小分子化合物を投与される。化合物ストックは、１ｍＭの濃度でＤＭＳＯ中で調製される。実験時点で、１ｍＭストック溶液は、増殖培地中で１ｕＭの濃度に希釈される。ＤＭＳＯの１０００分の１希釈液が、対照ウェルのために用いられる。３７℃および５％ＣＯ２で２４〜４８時間インキュベーション後、培地が除去され、メーカーの使用説明書に従ってＳＶ総ＲＮＡ単離系（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｚ３１０５）を用いて、ＲＮＡが細胞から抽出される。メーカーのプロトコールに記載されたようにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１７５４−２５０）を用いて実施される逆転写反応に、６００ナノグラムの精製総ＲＮＡが付加される。この逆転写反応からのｃＤＮＡを用いて、ＡＢＩ  Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現ミックス（カタログ番号４３６９５１０）を、ならびにＡＢＩにより設計されるプライマー／プローブを用いる実時間ＰＣＲにより遺伝子発現をモニタリングする（ヒトＳＣＮ１Ａに関する検定Ｈｓ００３７４６９６＿ｍl、Ｈｓ００８９７３５０＿ｍlまたはＨｓ００８９７３４１＿ｍl）。以下のＰＣＲサイクルが用いられる：５０℃で２分、９５℃で１０分、（９５℃で１５秒、６０℃で１分）を４０サイクル。ＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ実時間ＰＣＲ系（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）使用。１８Ｓに関する検定は、ＡＢＩ（カタログ番号４３１９４１３Ｅ）により作製される。化合物で処置後の遺伝子発現における倍率変化は、化合物−およびビヒクル処置試料間の１８Ｓ正規化ｄＣｔ値における差に基づいて算定される。
【００９３】
小分子の付加後のＲＮＡの発現も、酵素活性またはレポータータンパク質活性を測定することによって検出し得る。例えば、当該遺伝子とレポーターが常に同一レベルで発現されるよう、当該遺伝子とそのポリ（Ａ）シグナルとの間レポーターコード領域を自己複製プラスミドに挿入することにより、遺伝子からのコード領域を用いてモデル制御遺伝子を組み立て得る。個々の小分子の効果は、レポーター遺伝子の調節を観察することによって評価される。本発明の方法において有用なレポーター遺伝子としては、アセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）、およびそれらの誘導体が挙げられる。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシンおよびテトラサイクリンに耐性を付与する多重選択マーカーを利用可能である。レポーター遺伝子の調節を測定するための方法は、当技術分野においてよく知られており、以下に限定されないが蛍光定量的方法（例えば蛍光分光法、蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）、蛍光顕微鏡）、抗生物質耐性判別法が含まれる。
【００９４】
ＳＣＮｘＡタンパク質およびｍＲＮＡ発現は、当業者に既知の方法および本明細書中の他の箇所に記載された方法を用いて検定され得る。例えば免疫組織化学的検定を用いて、タンパク質レベルを概算し得る。これを達成するために、適切な増殖条件を用いて、２４ウェルプレート中で細胞を増殖させる。小分子化合物付加の４８時間後、培地を除去し、カルシウムおよびマグネシウムを含有しないダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｍｅｄｉａｅｃｈ、カタログ番号２１−０３１−ＣＶ）で細胞を３回洗浄する。次いで、ＰＢＳを捨て、１００％メタノール  ３００μｌを用いて、−２０℃で１５分間、２４ウェルプレート中で細胞を固定する。メタノールを除去し、ＰＢＳで洗浄した後、２１℃で５分間、３％過酸化水素（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、  カタログ番号Ｈ３２５−１００）とともに細胞をインキュベートする。細胞をＰＢＳで５分間３回洗浄して、次に、２１℃で３０分間、ＰＢＳ中１％でのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−９６４７）  ３００μｌとともにインキュベートする。細胞をＰＢＳで５分間３回洗浄して、次に、２１℃で３０分間、アビジン溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＳＰ−２００１）３００μｌとともにインキュベートする。細胞をＰＢＳで３回、手短にすすぎ、次に、２１℃で３０分間、ビオチン溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＳＰ−２００１）とともにインキュベートする。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次に、ＰＢＳ／ＢＳＡ  ０．１％中で１：２５０で希釈されたラットＳｃｎ１ａ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ２４８２０；ラットＳｃｎ１ａ、ヒトＳＣＮ１ＡおよびマウスＳｃｎ１ａを認識することが知られている）のＣ末端アミノ酸１４９１〜１５０８に対応する合成ペプチド（ＥＥＱＫＫＹＹＮＡＭＫＫＬＧＳＫＫＰ）に対して産生されるウサギ抗体３００μｌ／ウェルとともに、４℃で一晩インキュベートする。２１℃で５分間プレートを平衡させた後、細胞をＰＢＳで各々５分間３回洗浄して、次に、ＰＢＳ／ＢＳＡ  ０．１％中で１：２００希釈されたヤギ抗ウサギ抗体とともに、２１℃で３０分間インキュベートする。細胞をＰＢＳで５分間３回洗浄して、次に、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ試薬Ａ＋Ｂ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＰＫ−６１０１）  ３００μｌとともに３０分間インキュベートする；Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ試薬Ａ＋Ｂ溶液を２１℃で調製した３０分後に、５ｍｌのＰＢＳに２滴の試薬Ａを、次いで２滴の試薬Ｂを引き続いて付加し、混合することにより、細胞とともにインキュベートする。細胞を２１℃でＰＢＳで各々５分間３回洗浄し、次に、細胞が染色されるまで、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）ペルオキシダーゼ基質溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＳＫ−４１０５）とともにインキュベートする；ＤＡＢペルオキシダーゼ基質溶液を再構成した後、１ｍｌのＩｍｍＰＡＣＴ（商標）ＤＡＢ希釈液を３０μｌのＩｍｍＰＡＣＴ（商標）ＤＡＢ色原体濃縮液と混合することにより、細胞に付加する。この時点で、細胞をＰＢＳで３回、手短に洗浄し、３００μｌのＰＢＳを各ウェル中に残す。Ｄｅｌｌ  Ｌａｔｉｔｕｄｅ  Ｄ６３０ラップトップのスクリーン上のニコンデジタル表示装置と接続されたニコンＤＳ−Ｒｉ１カメラを装備したニコンＥｃｌｉｐｓｅＴＳ１００倒立顕微鏡を用いて、２４ウェルプレートのプレート内側で直接、細胞の染色を分析する。ニコンカメラＮＩＳ−ＥｌｅｍｅｎｔｓＤ３．０で提供されるソフトウェアを用いて、個々のウェルの写真を撮る。
【００９５】
さらに、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）により、ＳＣＮ１Ａタンパク質を定量し得る。これを達成するために、適切な増殖条件を用いて、２４ウェルプレート中で細胞を増殖させる。小分子化合物付加の４８時間後、培地を除去し、カルシウムおよびマグネシウムを含有しないダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｍｅｄｉａｅｃｈ、カタログ番号２１−０３１−ＣＶ）で細胞を３回洗浄する。次いで、ＰＢＳを捨て、１００％メタノール  １００μｌを用いて、−２０℃で１５分間、２４ウェルプレート中で細胞を固定する。メタノールを除去し、ＰＢＳで洗浄した後、２１℃で５分間、３％過酸化水素（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、カタログ番号Ｈ３２５−１００）とともに細胞をインキュベートする。細胞をＰＢＳで５分間３回洗浄して、次に、２１℃で３０分間、ＰＢＳ中１％でのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−９６４７）  １００μｌとともにインキュベートする。細胞をＰＢＳで５分間３回洗浄して、次に、２１℃で３０分間、アビジン溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＳＰ−２００１）３００μｌとともにインキュベートする。細胞をＰＢＳで３回、手短にすすぎ、次に、２１℃で３０分間、ビオチン溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＳＰ−２００１）とともにインキュベートする。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次に、ＰＢＳ／ＢＳＡ  ０．１％中で１：２５０で希釈されたラットＳｃｎ１ａ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ２４８２０；ラットＳｃｎ１ａ、ヒトＳＣＮ１ＡおよびマウスＳｃｎ１ａを認識することが知られている）のＣ末端アミノ酸１４９１〜１５０８に対応する合成ペプチド（ＥＥＱＫＫＹＹＮＡＭＫＫＬＧＳＫＫＰ）に対して産生されるウサギ抗体１００μｌ／ウェルとともに、４℃で一晩インキュベートする。２１℃で５分間プレートを平衡させた後、細胞をＰＢＳで各々５分間３回洗浄して、次に、ＰＢＳ／ＢＳＡ  ０．１％中で１：２００希釈されたヤギ抗ウサギ抗体とともに、２１℃で３０分間インキュベートする。細胞をＰＢＳで５分間３回洗浄して、次に、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ試薬Ａ＋Ｂ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＰＫ−６１０１）  ３００μｌとともに３０分間インキュベートする；Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ試薬Ａ＋Ｂ溶液を２１℃で調製した３０分後に、５ｍｌのＰＢＳに２滴の試薬Ａを、次いで２滴の試薬Ｂを引き続いて付加し、混合することにより、細胞とともにインキュベートする。細胞を２１℃でＰＢＳで各々５分間３回洗浄し、次に、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｎ３０１）とともにインキュベートする；上清が青色に変わった後、それを新しい９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ  ｏｎｅ、  カタログ番号６５１２１）に移して、１Ｍ硫酸を付加する。Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ分光計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を読み取る。一次抗体としてウサギ抗マウスＩｇＧ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ６７０９）で染色されたウェル中で読み取ったバックグラウンドシグナルを、すべてのＳＣＮ１Ａおよびアクチン読取値から差し引く。ウサギ抗アクチン抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１８０１）を用いる。ＳＣＮ１Ａシグナルを各条件に関するアクチンシグナルに対して正規化し、各実験変異体に関する正規化値を比較する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本発明の小分子を用いて処置した試料（例えばｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞または組織）中のＳＣＮ１Ａの発現（例えばｍＲＮＡまたはタンパク質）を、対照試料におけるＳＣＮ１Ａ発現との比較によって評価する。例えば、タンパク質または核酸の発現を、当業者に周知の方法を用いて、擬似処置したまたは未処置の試料における発現と比較することができる。あるいは、必要な情報に応じて、対照不活性分子で処置した試料との比較を行うことができる。別の実施形態では、処置試料対未処置試料におけるＳＣＮ１Ａタンパク質または核酸の発現の差異を、処置試料対未処置試料における異なる核酸（研究者が適切とみなした任意の標準的な核酸、例えばハウスキーピング遺伝子）の発現の差異と比較することができる。
【００９７】
観察された差異は、対照との比較に用いるために、望ましい形式、例えば比率または割合の形式で表わし得る。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した試料中のＳＣＮ１ＡのｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルは、未処置試料または対照の核酸で処置した試料と比較して約１．２５倍〜約１０倍以上の割合で増減する。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ１ＡのｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルは、少なくとも約１．２５倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０倍かそれ以上の割合で増減する。
【００９８】
ＳＣＮ１Ａタンパク質またはｍＲＮＡ発現における変化のほかに、Ｎａｖ１．１チャネルの機能における変化を定量し得る。例えば、小分子化合物によるＳＣＮ１Ａ上方調節により誘導されるナトリウム電流振幅における変化は、解離海馬介在ニューロンで測定され得る。これを達成するために、９５％Ｏ２および５％ＣＯ２で継続的に酸素供給した緩衝液中でプロナーゼで、次いでテルモリシンで消化することにより、海馬ＧＡＤ陽性双極性細胞（ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン）を１１〜１６日齢ラットから解離させる。解離細胞を組織培養皿中でプレート化して、選択された小分子化合物で２４時間処理した後、電気生理学的記録を取る。ＥＰＣ−９パッチ−クランプ増幅器（ＨＥＫＡ）を伴う全細胞パッチ−クランプ技法を用いて、電流を記録する。モデルＰ−９７フラミング・ブラウンマイクロピペットプラー（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を用いて、パッチピペットを作製する。ＰＵＬＳＥプログラム（バージョン７．５；ＨＥＫＡ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ）を用いて、刺激およびデータ獲得を実施する。電圧クランプ実験のために、（ｍｍで）１９．１のＮａＣｌ、１９．１のテトラエチルアンモニウムクロリド、０．９５のＢａＣｌ２、１．９０のＭｇＣｌ２、５２．４のＣｓＣｌ、０．１のＣｄＣｌ２、０．９５のＣａＣｌ２、９．５２のＨＥＰＥＳ、１１７のグルコース、ｐＨ３．５を含有する還流緩衝液を、蠕動ポンプを用いて細胞上を絶えず還流させる。パッチピペットは、以下のもの（ｍｍで）を含有する：１５７のＮ−メチル−ｄ−グルカミン、１２６のＨＣｌ、０．９０のＮａＣｌ、３．６０のＭｇＣｌ２、９．０１のＥＧＴＡ、１．８０のＡＴＰ−Ｎａ２、９．０１のＨＥＰＥＳ、４．５０のクレアチン−ホスフェート、ｐＨ７．２。細胞を−１００ｍＶで保持し、−６０ｍＶから−１５ｍＶまでの脱分極ステップを５ｍＶ増分で適用する。最大電流密度を測定し、処置および非処置ニューロン間で比較する。
【００９９】
さらに、海馬介在ニューロンにおいてＳＣＮ１Ａ上方調節により誘導されるナトリウム電流特質の変化を査定し得る。９５％Ｏ２および５％ＣＯ２で継続的に酸素供給した緩衝液中でプロナーゼで、次いでテルモリシンで消化することにより、海馬ＧＡＤ陽性双極性細胞（ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン）を１１〜１６日齢ラットから解離させる。解離細胞を組織培養皿中でプレート化して、選択された小分子化合物で２４時間処理した後、電気生理学的記録を取る。ＥＰＣ−９パッチ−クランプ増幅器（ＨＥＫＡ）を伴う全細胞パッチ−クランプ技法を用いて、電流を記録する。モデルＰ−９７フラミング・ブラウンマイクロピペットプラー（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を用いて、パッチピペットを作製する。ＰＵＬＳＥプログラム（バージョン７．５；ＨＥＫＡ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ）を用いて、刺激およびデータ獲得を実施する。電圧クランプ実験のために、（ｍｍで）１９．１のＮａＣｌ、１９．１のテトラエチルアンモニウムクロリド、０．９５のＢａＣｌ２、１．９０のＭｇＣｌ２、５２．４のＣｓＣｌ、０．１のＣｄＣｌ２、０．９５のＣａＣｌ２、９．５２のＨＥＰＥＳ、１１７のグルコース、ｐＨ３．５を含有する還流緩衝液を、蠕動ポンプを用いて細胞上を絶えず還流させる。パッチピペットは、以下のもの（ｍｍで）を含有する：１５７のＮ−メチル−ｄ−グルカミン、１２６のＨＣｌ、０．９０のＮａＣｌ、３．６０のＭｇＣｌ２、９．０１のＥＧＴＡ、１．８０のＡＴＰ−Ｎａ２、９．０１のＨＥＰＥＳ、４．５０のクレアチン−ホスフェート、ｐＨ７．２。細胞を−１００ｍＶで保持し、−６０ｍＶから−１５ｍＶまでの脱分極ステップを５ｍＶ増分で適用する。ｇ＝ＩＮａ／（Ｖ−ＥＮａ）（式中、ＩＮａは、電位Ｖで測定されるピークナトリウム電流を表し、ＥＮａは、平衡電位を表す）による電流／電圧環系から、活性化曲線（伝導度／電圧関係）を算定する。ボルツマン関数を正規化活性化および不活性化曲線に適合させて、曲線特性を確定する。電流減衰を単一指数関数と適合させることにより、不活性化時間定数を評価する。活性化および不活性化プロフィールを処置および非処置細胞間で評価して、処置が電流特性を変えたが否かを確定する。電流固定実験のために、細胞を・・・-８０ｍＶに保持して、１０ｐＡの増分で適用して８００ｍｓパルス後に、それらの発射パターンを記録する。電極緩衝液は、以下のものを（ｍｍで）含有する：１３５のグルコン酸カリウム、２０のＫＣｌ、２のＭｇＣｌ２、２のＡＴＰＮａ２、０．３のＧＴＰ−Ｎａおよび１０のＨＥＰＥＳ、０．２のＥＧＴＡ、ｐＨ７．３。還流緩衝液は、以下のものを（ｍｍで）含有する：１４０のＮａＣｌ、５のＫＣｌ、２のＣａＣｌ２、１のＭｇＣｌ２、１０のＨＥＰＥＳおよび１０のグルコース、（ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整）。流入−流出関係（活動電位数／導入ｐＡ）、活動電位半値幅、スパイク波振幅およびスパイク減衰を測定し、処置および非処置海馬抑制性介在ニューロン間で比較する。全細胞パッチ記録に関して上記したものと同じ溶液およびプロトコールを用いて、ｏｕｔｓｉｄｅ／ｏｕｔパッチ形状で単一チャネル電流記録を実施する。
【０１００】
小分子化合物で処置することにより誘導されるＳＣＮ１Ａ上方調節も、細胞内ナトリウムレベルに影響を及ぼし得る。このような変化を、以下の実験で査定し得る。細胞を９６ウェルプレート中で増殖させて、種々の濃度の小分子化合物を投与する。４８時間後、細胞をロック緩衝液（８．６ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５．６ｍＭ  ＫＣｌ、１５４ｍＭ  ＮａＣｌ、５．６ｍＭ  グルコース、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．３ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０００１ｍＭ  グリシン、ｐＨ７．４）で洗浄する。細胞内部に染料を負荷する前に、蛍光バックグラウンドを測定する。３７℃で１時間、ロック緩衝液（５０μｌ／ウェル）中に１０μＭ  ＳＢＦＩ−ＡＭ（Ｎａ＋と結合する染料）、０．０４％プルロニックＦ−１２７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  ＯＲ，  ＵＳＡ）および２．５ｍＭ  プロベネシドを有する染料とともに細胞をインキュベートすることにより、染料を細胞内部に負荷する。この時点で、ロック緩衝液（１５０μｌ／ウェル）中の２．５ｍＭ  プロベネシドで２回、細胞を洗浄する。負荷細胞を含有するプレートを、読取器、例えばＦＬＥＸステーション（商標）ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）の内側に置く。染料を負荷した細胞を、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍで励起させる；発光シグナルを５０５ｎｍで記録する。この時点で、シグナル基線を測定する。シグナル基線を測定後、モネンシン（ＥＭＤ，  Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ，  ＵＳＡ、カタログ番号４７５８９５）またはグラミシジン（ＥＭＤ，  Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ，  ＵＳＡ、カタログ番号３６８０２０−２５ＭＧ）を、陽性対照として細胞とともに個々のウェルに付加する。ＴＴＸ（１ｕＭ）処置を、陰性対照として用いる。次いで、ビヒクル対照と比較した場合の活性化合物で前処置した細胞における形質膜での活性ＳＣＮ１Ａの相対的発現を確立する。エクセル・ソフトウェアを用いて５０５ｎｍ対３４０ｎｍ／３８０ｎｍでの発光の比として、シグナルを算定する。
【０１０１】
ナトリウムレベルに及ぼすＳＣＮ１Ａ上方調節の作用も、単一細胞で査定し得る。細胞を、カバーガラス上で、または９６ウェルプレート中で増殖させて、種々の濃度の小分子化合物を投与する。４８時間後、細胞をロック緩衝液（８．６ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５．６ｍＭ  ＫＣｌ、１５４ｍＭ  ＮａＣｌ、５．６ｍＭ  グルコース、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．３ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０００１ｍＭ  グリシン、ｐＨ７．４）で洗浄する。細胞内部に染料を負荷する前に、蛍光バックグラウンドを測定する。３７℃で１時間、ロック緩衝液（５０μｌ／ウェル）中に１０μＭ  ＳＢＦＩ−ＡＭ（Ｎａ＋と結合する染料）、０．０４％プルロニックＦ−１２７および２．５ｍＭ  プロベネシドを有する染料とともに細胞をインキュベートすることにより、染料を負荷する。この時点で、ロック緩衝液（１５０μｌ／ウェル）中の２．５ｍＭ  プロベネシドで２回、細胞を洗浄する。９６ウェルプレート中またはカバーガラス上の細胞を、励起および発光のためのＨｇランプおよび適切なフィルターを装備した落射蛍光顕微鏡（Ｏｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｎｃ，  Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，  ＶＴ，  ＵＳＡ、カタログ番号Ｘ−Ｆ０４−２、またはＣｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｒｐ，  Ｂｅｌｌｏｗｓ  Ｆａｌｌｓ，  ＶＴ，  ＵＳＡ、カタログ番号７９００１）下に置く。染料を負荷した細胞を、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍで励起させる；発光シグナルを５０５ｎｍで記録する。シグナル基線を測定後、モネンシン（ＥＭＤ，  Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ，  ＵＳＡ、カタログ番号４７５８９５）またはグラミシジン（ＥＭＤ，  Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ，  ＵＳＡ、カタログ番号３６８０２０−２５ＭＧ）を、陽性対照として細胞とともに個々のウェルに付加する。形質膜での活性ＳＣＮ１Ａの相対的上方調節を確立するために、活性化合物で前処置した細胞をビヒクル対照と比較する。落射蛍光顕微鏡と接続したカメラによりデータを収集し、適切なソフトウェアを用いて定量する。エクセル・ソフトウェアを用いて、５０５ｎｍ発光対３４０ｎｍ／３８０ｎｍの比を算定することにより、生シグナルを処理する。
【０１０２】
細胞検定のほかに、特定疾患状態の動物モデルを利用し得る。各場合に、特定の標的疾患または症状に基づいて動物を選択する。動物は、ＳＣＮ１Ａポリペプチドまたはその変異体を発現ことが既知であるかまたは発現し得る。本発明の化合物は、診断、治療および予防のために、ならびに研究用試薬およびキットの構成要素として利用され得る。さらに、遺伝子発現を調整し得る化合物は、特定の遺伝子の機能を解明するため、または生物学的経路の種々の成員間の機能を区別するために、しばしば当業者に用いられる。本明細書中で列挙される疾患のいずれかを処置するための医薬品の製造における化合物の使用は、特許請求する本発明の一特徴である。
【０１０３】
キットおよび診断ならびに種々の生物学的系における使用のために、本発明の化合物は、単独でまたは他の化合物もしくは治療薬との併用のいずれかで、細胞中および組織中で発現される遺伝子の部分的または全体的な相補配列の相互依存的発現パターンを解明するための示差的および／または組合せ分析におけるツールとして有用である。
【０１０４】
本明細書において使用される用語「生物学的系」または「系」は、電位開口型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮｘＡ）ファミリーの遺伝子の産物を発現する、または発現できるようにされる任意の生物体、細胞、細胞培養物または組織と定義される。これらは、以下に限定されないが、ヒト、遺伝子導入動物、細胞、細胞培養物、組織、異種移植片、移植物およびそれらの組み合わせを含む。
【０１０５】
非限定的な一例として、１以上のアンチセンス化合物で処置した細胞中または組織中の発現パターンを、このような化合物で処置していない対照細胞または組織と比較して、生じたパターンを遺伝子発現レベルの差異について分析する。それらが、例えば検査される遺伝子の疾患関連性、シグナル伝達経路、細胞内局在性、発現レベル、大きさ、構造または機能などに関連するからである。これらの分析は、刺激されたまたは刺激されていない細胞で、発現パターンに影響する他の化合物の存在下または非存在下で実施することができる。
【０１０６】
当技術分野において周知の遺伝子発現分析方法の例としては、ＤＮＡアレイまたはマイクロアレイ、ＳＡＧＥ（遺伝子発現の連続的分析）、ＲＥＡＤＳ（消化ｃＤＮＡの制限酵素増幅）、ＴＯＧＡ（総遺伝子発現分析）、タンパク質アレイおよびプロテオミクス、発現された配列タグ（ＥＳＴ）配列決定、サブトラクティブＲＮＡフィンガープリンティング（ＳｕＲＦ）、サブトラクティブクローニング、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション）技術および質量分析法などが挙げられる。
【０１０７】
治療については、電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現を調節することによって治療され得る疾患または障害を有すると推測される動物（好ましくはヒト）は、本発明による化合物を投与することによって治療される。例えば、限定を意図しない一実施形態において、該方法は、治療を必要とする動物に治療上有効な量の電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）調節物質を投与するステップを含む。本発明の電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）調節物質は、電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）の活性を効果的に調節するか、または電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）タンパク質の発現を調節する。一実施形態においては、動物における電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）の活性または発現は、対照と比較して約１０％阻害される。好ましくは、動物におけるＳＣＮ１Ａの活性または発現が、約３０％阻害される。より好ましくは、動物における電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）の活性または発現が、５０％またはそれを超えて阻害される。したがって小分子化合物は、電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）のｍＲＮＡの発現を、対照と比較して少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％調節する。
【０１０８】
一実施形態において、電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）の活性または発現および／または動物においては、対照と比較して約１０％増大する。好ましくは動物における電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）の活性または発現は、約３０％増大する。より好ましくは動物における電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）の活性または発現は、５０％またはそれを超えて増大する。したがって当該化合物は、電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）のｍＲＮＡの発現を、対照と比較して少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％調節する。
【０１０９】
例えば電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）の発現の低減または増大は、動物の血液、脂肪組織、肝臓または任意の他の体液、組織または器官において測定し得る。好ましくは、分析される前記体液、組織または器官中に含まれる細胞は、電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）ペプチドをコードする核酸分子および／または電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）タンパク質それ自体を含む。
【０１１０】
本発明の化合物は、有効量の化合物を適切な薬学的に許容される希釈剤または担体に加えることによって医薬組成物において利用され得る。本発明の化合物および方法の使用は、予防的にも有用であり得る。
【０１１１】
本発明の化合物は、取り込み、分散および／または吸収の補助ために、例えばリポソーム、受容体−標的分子、経口、直腸、局所または他の製剤として、他の分子、分子構造または化合物の混合物と、混合、封入、コンジュゲート化または他の方法で結合され得る。このような取り込み、分散および／または吸収を補助する製剤の調製を教示する代表的米国特許としては、以下に限定されないが、米国特許第５，１０８，９２１号；第５，３５４，８４４号；第５，４１６，０１６号；第５，４５９，１２７号；第５，５２１，２９１号；第５，５４３，１６５号；第５，５４７，９３２号；第５，５８３，０２０号；第５，５９１，７２１号；第４，４２６，３３０号；第４，５３４，８９９号；第５，０１３，５５６号；第５，１０８，９２１号；第５，２１３，８０４号；第５，２２７，１７０号；第５，２６４，２２１号；第５，３５６，６３３号；第５，３９５，６１９号；第５，４１６，０１６号；第５，４１７，９７８号；第５，４６２，８５４号；第５，４６９，８５４号；第５，５１２，２９５号；第５，５２７，５２８号；第５，５３４，２５９号；第５，５４３，１５２号；第５，５５６，９４８号；第５，５８０，５７５号；および第５，５９５，７５６号が挙げられ、それぞれが本明細書に参照として組み込まれる。
【０１１２】
一実施形態では、本発明の実行は、その処置を必要とする患者への前記の化合物のうちの少なくとも１つを投与することを包含する：ミルナシプラン、トルセミド、リスペリドン、ピナシジル、ベニジピン、ケトコナゾール、エブセレン、タダラフィル、ゼラノール、ネファザドン、ロメリジン、イカリイン、オメプラゾール、エソメプラゾール、Ｌ−６９４，２４７、ニトレンジピン、ニメタゼパム、アンレキサノクス、モサプリド、セルトラリンまたはスタノゾロール、あるいはその製薬上許容可能な塩、異性体、エナンチオマー、アイソフォーム、多形体、水和物、溶媒和物またはプロドラッグ。
【０１１３】
本発明の化合物は、ヒトを含む動物への投与において生物学的に活性な代謝産物またはその残渣を（直接または間接的に）提供できる、任意の薬学的に許容される塩、エステルもしくはそのようなエステルの塩、または任意の他の化合物を包含する。
【０１１４】
用語「薬学的に許容される塩」は、本発明の化合物の生理学的かつ薬学的に許容される塩：すなわち親化合物の所望の生物学的活性を保持しており、望ましくない毒物学的な効果を与えない塩を指す。
【０１１５】
本発明は、本発明の化合物を含む医薬組成物および製剤も含む。本発明の医薬組成物は、局所または全身処置のいずれが望ましいかおよび治療される場所に応じて種々の方法で投与され得る。投与は、局所（点眼および膣および直腸を含む粘膜送達を含む）、肺、例えば噴霧吸入器による場合を含む粉末剤またはエアロゾルの吸入または吹送法によって；気管内、鼻腔内、上皮性および経皮性）、経口または非経口の投与であり得る。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射もしくは注入；または頭蓋内、例えば髄腔内もしくは脳室内投与を含む。
【０１１６】
中枢神経系の組織の治療のために、例えば脳脊髄液への注射または注入によって投与を行うことができる。
【０１１７】
本発明の化合物を中枢神経系の細胞に投与することが意図される場合、投与は、本発明の化合物の血液脳関門通過を促進できる１種以上の薬剤を用いて行うことができる。投与は、注射により速やかに行うことも、あるいは遅い速度での注入または徐放製剤の投与によって一定時間にわたって行うこともできる。
【０１１８】
本発明の化合物はまた、望ましい製剤や薬力学的特性を与える薬剤とリンクしたもの、または結合したものまたは組合せたものとすることができる。例えば、当該化合物を、トランスフェリン受容体に対する抗体などの血液脳関門の通過または輸送を促進するために当技術分野で公知の任意の物質に結合させて、静脈注射によって投与することができる。浸透圧による血液脳関門の破壊は、例えば、以下に限定されないが、メソエリスリトール、キシリトール、Ｄ（＋）ガラクトース、Ｄ（＋）ラクトース、Ｄ（＋）キシロース、ズルシトール、ミオイノシトール、Ｌ（−）フルクトース、Ｄ（−）マンニトール、Ｄ（＋）グルコース、Ｄ（＋）アラビノース、Ｄ（−）アラビノース、セロビオース、Ｄ（＋）マルトース、Ｄ（＋）ラフィノース、Ｌ（＋）ラムノース、Ｄ（＋）メリビオース、Ｄ（−）リボース、アドニトール、Ｄ（＋）アラビトール、Ｌ（−）アラビトール、Ｄ（＋）フコース、Ｌ（−）フコース、Ｄ（−）リキソース、Ｌ（＋）リキソース、およびＬ（−）リキソースを含む糖の注入、または、以下に限定されないが、グルタミン、リジン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、チロシン、バリン、タウリンを含むアミノ酸の注入によって達成することができる。血液脳関門の通過を増強するための方法および材料は、例えば米国特許第４，８６６，０４２，号、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ  ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ」、第６，２９４，５２０号、「Ｍａｔｅｒｉａｌ  ｆｏｒ  ｐａｓｓａｇｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ」、および第６，９３６，５８９号、「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ」に記載されており、これらは参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる。
【０１１９】
本発明の化合物は、その取り込み、分散および／または吸収を助けるため、他の分子、分子構造、または化合物の混合物（例えば、リポソーム、受容体を標的化した分子、経口製剤、直腸製剤、局所製剤、または他の製剤）と混合、カプセル化、結合、または会合させ得る。例えば、カチオン性脂質は、化合物の取り込みを容易にする製剤に含まれ得る。取り込みを容易にすることが判明している組成物の１つは、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、ベセスダ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから入手可能）である。
【０１２０】
局所投与のための医薬組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴薬、坐薬、噴霧剤、液薬および粉末剤を含み得る。従来の薬学的担体、液剤、粉末剤または油性基剤、増粘剤などは必要であるかまたは望ましい場合がある。コーティングされたコンドーム、手袋なども有用である場合がある。
【０１２１】
本発明の医薬製剤は、便利に単位投与の形態で提供されてもよく、製薬業界において周知の技術により調製され得る。そのような技術は、活性成分を、１種以上の薬学的担体または一種以上の賦形剤と結合させるステップを含む。通常、製剤は、活性成分を均一かつ均質に液体担体もしくは微粉化した固体担体またはその両方と結合させるステップ、次いで必要な場合は生成物を成形するステップによって製する。
【０１２２】
本発明の組成物は、以下に限定されないが、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、ソフトゲル、坐薬および浣腸などの任意の多くの可能な剤形に製剤され得る。本発明の組成物は、水性懸濁剤、非水性または混合媒体としても製剤され得る。水性懸濁剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む懸濁剤の粘度を上げる物質をさらに含めることができる。懸濁剤は、安定剤も含み得る。
【０１２３】
本発明の医薬組成物は、限定しないが、液剤、乳剤、泡状製剤およびリポソーム含有製剤を含む。本発明の医薬組成物および製剤は、１以上の浸透促進剤、担体、賦形剤または他の活性成分もしくは不活性成分を含み得る。
【０１２４】
典型的には乳剤は、１つの液剤が他に通常直径０．１μｍを超える液滴の形態で分散された不均一系である。乳剤は、分散相に加えて追加の成分を含有でき、活性剤は水相中、油相中またはそれ自体としての分離相中に溶液として存在できる。マイクロエマルジョンは、本発明の実施形態として含まれる。乳剤およびそれらの使用は、当技術分野においてよく知られており、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されている。
【０１２５】
本発明の製剤は、リポソーム製剤を含む。本発明において使用される用語「リポソーム」は、球状の単数または複数の二重層に配置された両親媒性脂質から成る小胞を意味する。リポソームは、親油性物質および送達される組成物を含有する水性の内部から形成された膜を有する単層膜または多重膜ビヒクルである。
【０１２６】
リポソームは、「立体的に安定化された」リポソームも含み、用語は本明細書における使用で１種以上の特殊な脂質を含むリポソームを意味する。リポソームに組み込まれた場合、これらの特殊化された脂質は、そのような特殊な脂質を欠いているリポソームと比較して増強された循環寿命を有するリポソームを生じる。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームのビヒクル形成脂質部分の一部が１種以上の糖脂質を含むか、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）成分などの１種以上の親水性ポリマーで誘導体化されていたものである。リポソームおよびそれらの使用は、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されている。
【０１２７】
本発明の医薬製剤および組成物は、界面活性剤もさらに含み得る。薬剤製品、製剤および乳剤における界面活性剤の使用は、当技術分野においてよく知られている。界面活性剤およびのそれらの使用は、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載され、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２８】
一実施形態では、本発明は、小分子の効率的な送達を行うために各種浸透促進剤を使用する。非親油性薬剤の細胞膜を超える拡散の補助に加えて、浸透促進剤は親油性薬剤の浸透性も促進する。浸透促進剤は、５つの広いカテゴリ、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤および非キレート非界面活性剤のうちの１つに属するものとして分類され得る。浸透促進剤およびそれらの使用は、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２９】
当業者であれば、製剤がそれらの目的とする使用法、すなわち投与経路に応じて通常通り設計されることを理解されよう。
【０１３０】
局所投与のための好ましい製剤には、本明細書中に列挙される使用のための本発明の化合物が、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤などの局所送達剤と混合されているものを含まれる。好ましい脂質およびリポソームには、中性のもの（例えばジオレオイル−ホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性のもの（例えばジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）、およびカチオン性のもの（例えばジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が含まれる。
【０１３１】
局所または他の投与のため、本発明の化合物を、リポソーム中に包入するか、またはそれらリポソーム、特にカチオン性リポソームと複合体を形成させ得る。あるいは、化合物を、脂質と、具体的にはカチオン性脂質と複合体化させ得る。好ましい脂肪酸およびエステル、薬学的に許容されるそれらの塩ならびにそれらの使用は、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されている。
【０１３２】
経口投与用の組成物および製剤は、粉剤もしくは顆粒剤、微粒子剤、ナノ粒子剤、水溶液中もしくは非水溶液中の懸濁剤もしくは液剤、カプセル、ゲルカプセル、サシェ剤、錠剤またはミニ錠剤を含む。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が、望ましい場合がある。好ましい経口製剤は、本発明の化合物が１種以上の浸透促進界面活性剤およびキレート剤と共に投与されるものである。好ましい界面活性剤は、脂肪酸および／またはエステル、またはそれらの塩、胆汁酸および／またはそれらの塩を含む。好ましい胆汁酸／塩および脂肪酸ならびにそれらの使用は、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。同様に好ましいのは、浸透促進剤の組み合わせ、例えば胆汁酸／塩との組み合わせでの脂肪酸／塩である。特に好ましい組み合わせは、ラウリン酸ナトリウム塩、カプリン酸およびＵＤＣＡである。さらなる浸透促進剤は、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルを含む。本発明の化合物は、噴霧乾燥された粒子を含む顆粒形態またはマイクロまたはナノ粒子を形成するように複合体化されて経口送達され得る。
【０１３３】
非経口、髄腔内または脳室内投与のための組成物および製剤は、バッファー剤、希釈剤および他の適切な添加剤（限定しないが浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容される担体または賦形剤など）も含んでいてもよい滅菌水性溶液を含み得る。
【０１３４】
本発明の特定の実施形態は、１種以上の化合物および１種以上の他の活性薬学的成分を含有する医薬組成物を提供する。そのような活性薬学的成分の例としては、以下に限定されないが、本発明の化合物での処置を必要とする患者の症状を処置するために有用である任意の活性成分を包含する。２つ以上の併用化合物は、一緒にまたは逐次的に用いられ得る。
【０１３５】
他の関連する実施形態において、本発明の組成物は、第１の核酸に標的化される１以上の化合物、および第２の核酸標的に標的化される１以上の付加的化合物を含み得る。例えば、第１の標的は、電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）の特定のアンチセンス配列であり、第２の標的は他のヌクレオチド配列由来の領域であり得る。あるいは、本発明の組成物は、同じ電位開口性Ｉ型ナトリウムチャネル・アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）核酸またはタンパク質標的の異なる領域を調整する２種以上の化合物を含有し得る。２種以上の組み合わされた化合物は、一緒にまたは逐次的に使用することができる。
【０１３６】
治療用組成物の処方およびそれらのその後の投与（投薬）は、当業者の技能の範囲内であると考えられる。投薬は、数日間から数カ月間継続する、または治療が効果的になるかもしくは病態の減退が達成されるまでの治療過程において、治療される病態の重症度および応答性に応じて決まる。最適な投薬レジメンは、患者の身体での薬剤蓄積の測定値から算出され得る。当業者であれば、最適投与量、投薬方法および反復頻度を容易に決定できる。最適な投与量は、個々の活性薬学的成分の相対的効力に応じて変動し得るし、一般的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの動物モデルにおいて効果的であると判明したＥＣ５０に基づいて概算され得るし、認可された且つ市販の薬剤の各々に関する処方情報からも確定され得る。概して、投与量は、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜約１００ｍｇであり、１日に、１週間に、または１カ月に１回もしくは複数回投与され得る。当業者であれば、測定された滞留時間および体液または組織中の薬剤の濃度に基づいて投薬の反復頻度を容易に概算できる。治療の成功に続いて、病態の再発を予防するために患者に維持療法を受けさせることが望ましい場合があり、ここで、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜約１００ｍｇの維持用量で、１日１回または複数回で投与される。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、患者は、体重１ｋｇ当たり少なくとも約１ｍｇ、少なくとも約２ｍｇ、少なくとも約３ｍｇ、少なくとも約４ｍｇ、少なくとも約５ｍｇ、少なくとも約６ｍｇ、少なくとも約７ｍｇ、少なくとも約８ｍｇ、少なくとも約９ｍｇ、少なくとも約１０ｍｇ、少なくとも約１５ｍｇ、少なくとも約２０ｍｇ、少なくとも約２５ｍｇ、少なくとも約３０ｍｇ、少なくとも約３５ｍｇ、少なくとも約４０ｍｇ、少なくとも約４５ｍｇ、少なくとも約５０ｍｇ、少なくとも約６０ｍｇ、少なくとも約７０ｍｇ、少なくとも約８０ｍｇ、少なくとも約９０ｍｇ、または少なくとも約１００ｍｇである薬剤の投与量で処置される。
【０１３８】
本発明の種々の実施形態が上記されているが、それらは単に例示の目的で提示されたものであって、限定を意図したものでないことは理解されるべきである。本発明の精神および範囲から逸脱することなく本明細書における開示内容にもとづいて、開示された実施形態に対してさまざまな変更を加えることができる。したがって本発明の範囲は、上記の実施形態のいずれによっても限定されるべきではない。
【０１３９】
本明細書中で言及される全ての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。本出願中で引用する全ての刊行物および特許文書は、それぞれ個々の刊行物または特許文書が個々に記載された場合と同程度にあらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。出願人らは、本明細書における種々の参考文献の引用によって、いずれかの特定の参考文献が出願人らの発明の「先行技術」であることを認めるものではない。発明の組成物および方法の実施形態は、以下の実施例において例示される。
実施例
【０１４０】
以下の限定を意図しない実施例は、本発明の選択された実施形態を例示するものである。提示される構成部分の要素の割合を変えることや代替物は当業者に明らかであり、本発明の実施形態の範囲内であることは理解されよう。
【０１４１】
以下の化合物を用いて、ＳＣＮ１Ａ  ｍＲＮＡのレベルの調整を査定した：
ａ）ミルナシプランＨＣｌ（１Ｒ（Ｓ），２Ｓ（Ｒ）［−２−（アミノメチル）−Ｎ，Ｎ−ジエチル−１−フェニルシクロプロパンカルボキサミドヒドロクロリド）；
ｂ）トルセミド（１−イソプロピル−３−［（４−ｍ−トルイジノ−３−ピリジル−スルホニル］尿素）；
ｃ）リスペリドン（３−［２−［４−（６−フルオロ−１，２−ベンズイソキサゾール−３−イル）−１−ピペリジニル］−エチル］−６，７，８，９−テトラヒドロ−２−メチル−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン）；
ｄ）ピナシジル（Ｎ−シアノ−Ｎ’ピリジン−４−イル−Ｎ’’−（１，２，２−トリメチルプロピル）グアニジン）；
ｅ）ベネジピンＨＣｌ（５−Ｏメチル−３Ｏ−［（３Ｒ）−１−（フェニルメチル）ピペリジン−３−イル］２，６−ジメチル−４−（３−ニトロフェニル）−１，４−ジヒドロピリジン−３，５−ジカルボキシレート）；
ｆ）ケトコナゾール（１−［４−（４−｛［（２Ｒ，４Ｓ）−２−（２，４−ジクロロフェニル）−２−（１Ｈ−イミダゾール−１−イルメチル）−１，３−ジオキソラン−４−イル］メトキシ｝フェニル）ピペラジン−１−イル］エタン−１−オン）；
ｇ）エブセレン（２−フェニル−１，２−ベンゾセレナゾール−３−オン）；
ｈ）タダラフィル（（６Ｒ−トランス）−６−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−メチル−ピラジノ［１’，２’：１，６］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン）；
ｉ）ゼラノール（（３Ｓ，７Ｒ）−７，１４，１６−トリヒドロキシ−３−メチル−３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２−デカヒドロ−１Ｈ−２−ベンズオキサシクロテトラデシン−１−オン）；
ｊ）ネファザドンＨＣｌ（２−［３−［４−（３−クロロフェニル）−１−ピペラジニル］プロピル］−５−エチル−２，４−ジヒドロ−４−（２−フェノキシエチル）−３Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−オンモノヒドロクロリド；
ｋ）ロメリジンジヒドロクロリド（１−［ビス（４−フルオロフェニル）メチル］−４−［２，３，４−トリメトキシフェニルメチル］ジヒドロクロリド）；
ｌ）イカリイン（５−ヒドロキシ−２−（４−メトキシフェニル）−８−（３−メチルブト−２−エニル）−７−［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）オキサン−２−イル］オキシ−３−［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−メチルオキサン−２−イル］オキシクロメン−４−オン）；
ｍ）オメプラゾールマグネシウム（６−メトキシ−２−（（４−メトキシ−３，５−ジメチルピリジン−２−イル）メチルスルフィニル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾールＭｇ）；
ｎ）エソメプラゾールマグネシウム（（Ｓ）−６−メトキシ−２−［（４−メトキシ−３，５−ジメチルピリジン−２−イル）メチルスルフィニル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾールＭｇ）；
ｏ）Ｌ−６９４，２４７（メタンスルホンアミド、Ｎ−［４−［［５−［３−（２−アミノエチル）−１Ｈ−インドール−５−イル］−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル］メチル］フェニル］；
ｐ）ニトレンジピン（（ＲＳ）−エチルメチル２，６−ジメチル−４−（３−ニトロフェニル）−１，４−ジヒドロピリジン−３，５−ジカルボキシレート）；
ｑ）ニメタゼパム（２−メチル−９−ニトロ−６−フェニル−２，５−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−５，８，１０，１２−テトラエン−３−オン）；
ｒ）アンレキサノクス（２−アミノ−７−イソプロピル−５−オキソ−５Ｈ−クロメノ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸）；
ｓ）モサプリドシトレート（４−アミノ−５−クロロ−２−エトキシ−Ｎ−［［４−［（４−フルオロフェニル）メチル］−２−モルホリニル］メチル］−ベンズアミド２−ヒドロキシ−１，２，３−プロパントリカルボキシレート）；
ｔ）セルトラリンヒドロクロリド（（１Ｓ，４Ｓ）−４−（３，４−ジクロロフェニル）−Ｎ−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−アミン）および
ｕ）スタノゾロール（１７β−ヒドロキシ−１７−メチル−５α−アンドロスタノ［３，２−ｃ］−ピラゾール）。
実施例１．小分子化合物での処置後にドラベ関連突然変異を保有する一次ヒト繊維芽細胞におけるＳＣＮ１Ａ  ｍＲＮＡの上方調節
【０１４２】
実施例１では、ドラベ関連ＳＣＮ１Ａ突然変異を保有する一次ヒト皮膚繊維芽細胞を、最終濃度１ｕＭで小分子化合物で処置した。以下のデータは、２４〜４８時間処置後、これらの化合物がＳＣＮ１Ａ  ｍＲＮＡを上方調節し得た、ということを示す。
材料と方法
小分子化合物によるドラベ関連突然変異を保有する一次ヒト繊維芽細胞の処置
【０１４３】
Ｎ．Ｋｅｎｙｏｎ博士（マイアミ大学）により培養中に導入されたドラベ関連ＳＣＮ１Ａ突然変異を保有する一次ヒト皮膚繊維芽細胞を、ａ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１２５６１−０５６）＋１０％ＦＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、カタログ番号：３５−０１５ＣＶ）＋１％抗菌性抗生物質（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１５２４０−０６２）からなる増殖培地中で、３７ｏＣおよび５％ＣＯ２で増殖させた。実験の１日前に、約４ｘ１０４／ウェルの密度で細胞を増殖培地中の２４ウェルプレート中でプレート化して、３７ｏＣおよび５％ＣＯ２で一晩、インキュベートした。翌日、２４ウェルプレート中の培地を新鮮な増殖培地（１ｍｌ／ウェル）に変えて、細胞に小分子化合物を投与した。化合物はすべて、商業的供給元から入手可能であった。化合物ストックを、１ｍＭの濃度でＤＭＳＯ中に調製した。実験のその時点で、１ｍＭストック溶液を増殖培地中で１ｕＭの濃度に希釈した。ＤＭＳＯの１０００分の１希釈液を、対照ウェルのために用いた。３７ｏＣおよび５％ＣＯ２で２４〜４８時間のインキュベーション後、培地を除去し、メーカーの使用説明書に従ってＳＶ総ＲＮＡ単離系（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｚ３１０５）を用いて、細胞からＲＮＡを抽出した。メーカーのプロトコールに記載されたようにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１７５４−２５０）を用いて実施される逆転写反応に、６００ナノグラムの精製総ＲＮＡを付加した。この逆転写反応からのｃＤＮＡを用いて、ＡＢＩ  Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現ミックス（カタログ番号４３６９５１０）およびＡＢＩにより設計されるプライマー／プローブ（ヒトＳＣＮ１Ａに関する検定Ｈｓ００３７４６９６＿ｍ１、Ｈｓ００８９７３５０＿ｍ１またはＨｓ００８９７３４１＿ｍ１）を用いる実時間ＰＣＲにより、遺伝子発現をモニタリングした。３つの検定すべてを用いて得られた結果は、非常に良く似ていた（データは示されていない）。以下のＰＣＲサイクルを用いた：５０℃で２分、９５℃で１０分、（９５℃で１５秒、６０℃で１分）を４０サイクル。ＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ実時間ＰＣＲ系（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）使用。１８Ｓに関する検定を、ＡＢＩ（カタログ番号４３１９４１３Ｅ）により作製した。化合物で処置後の遺伝子発現における倍率変化を、化合物−およびビヒクル処置試料間の１８Ｓ正規化ｄＣｔ値における差に基づいて算定した。
結果
【０１４４】
結果は、異なる化学的性質を有する小分子化合物が、ドラベ関連突然変異を保有する一次皮膚繊維芽細胞においてＳＣＮ１Ａ  ｍＲＮＡを２〜４倍上方調節し得る、ということを示した（表１）。
実施例２．小分子化合物での処置後の成人一次ヒトケラチノサイトにおけるＳＣＮ１Ａ  ｍＲＮＡの上方調節
【０１４５】
実施例２では、一次ヒトケラチノサイトを、最終濃度１ｕＭで小分子化合物で処置した。以下のデータは、２４〜４８時間処置後、これらの化合物がＳＣＮ１Ａ  ｍＲＮＡを上方調節し得た、ということを示す。
材料と方法
小分子化合物による一次ヒトケラチノサイトの処置
【０１４６】
ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号Ｃ−１２００３）またはＬｉｆｅＬｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，  ＭＤ、カタログ番号ＦＣ−００２５）からの成人一次ヒトケラチノサイトを、メーカーから供給された増殖培地中で、３７ｏＣおよび５％ＣＯ２で増殖させた。実験の１日前に、約４ｘ１０４／ウェルの密度で細胞を増殖培地中の２４ウェルプレート中でプレート化して、３７ｏＣおよび５％ＣＯ２で一晩、インキュベートした。翌日、２４ウェルプレート中の培地を新鮮な増殖培地（１ｍｌ／ウェル）に変えて、細胞に小分子化合物を投与した。化合物はすべて、商業的供給元から入手可能であった。化合物ストックを、１ｍＭの濃度でＤＭＳＯ中に調製した。実験のその時点で、１ｍＭストック溶液を増殖培地中で１ｕＭの濃度に希釈した。ＤＭＳＯの１０００分の１希釈液を、対照ウェルのために用いた。３７ｏＣおよび５％ＣＯ２で２４〜４８時間のインキュベーション後、培地を除去し、メーカーの使用説明書に従ってＳＶ総ＲＮＡ単離系（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｚ３１０５）を用いて、細胞からＲＮＡを抽出した。メーカーのプロトコールに記載されたようにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１７５４−２５０）を用いて実施される逆転写反応に、６００ナノグラムの精製総ＲＮＡを付加した。この逆転写反応からのｃＤＮＡを用いて、ＡＢＩ  Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現ミックス（カタログ番号４３６９５１０）およびＡＢＩにより設計されるプライマー／プローブ（ヒトＳＣＮ１Ａに関する検定Ｈｓ００３７４６９６＿ｍ１、Ｈｓ００８９７３５０＿ｍ１またはＨｓ００８９７３４１＿ｍ１）を用いる実時間ＰＣＲにより、遺伝子発現をモニタリングした。３つの検定すべてを用いて得られた結果は、非常に良く似ていた（データは示されていない）。以下のＰＣＲサイクルを用いた：５０℃で２分、９５℃で１０分、（９５℃で１５秒、６０℃で１分）を４０サイクル。ＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ実時間ＰＣＲ系（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）使用。１８Ｓに関する検定を、ＡＢＩ（カタログ番号４３１９４１３Ｅ）により作製した。化合物で処置後の遺伝子発現における倍率変化を、化合物−およびビヒクル処置試料間の１８Ｓ正規化ｄＣｔ値における差に基づいて算定した。
結果
【０１４７】
結果は、異なる化学的性質を有する小分子化合物が、成人一次ケラチノサイトにおいてＳＣＮ１Ａ  ｍＲＮＡを２〜５倍上方調節し得る、ということを示した（表１）。
【０１４８】
表１は、１ｕＭの濃度の小分子化合物での処置後のドラベ関連突然変異を保有する一次皮膚繊維芽細胞（カラム１）および成人一次ケラチノサイト（カラム２）におけるＳＣＮ１Ａ  ｍＲＮＡレベルの倍率増大を示す。Ａｖｇ：平均上方調節；ＳＴＥ：平均の標準誤差。
【表１】
2014525446.tif 000003
実施例３：免疫組織化学によるＳＣＮ１Ａタンパク質の定量
【０１４９】
この実験の目的は、免疫組織化学と呼ばれる技法を用いて異なる細胞におけるＳＣＮ１Ａタンパク質発現を上方調節するそれらの能力によって化合物を等級付けすることである。
【０１５０】
材料および方法：  ＳＣＮ１Ａタンパク質を、免疫組織化学により細胞内部で検出する。これを達成するために、適切な増殖条件を用いて、細胞を２４ウェルプレート中で増殖させる。小分子細胞付加の４８時間後、培地を除去し、カルシウムおよびマグネシウムを含有しないダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｍｅｄｉａtｅｃｈ、カタログ番号２１−０３１−ＣＶ）で細胞を３回洗浄する。次いで、ＰＢＳを捨て、１００％メタノール  ３００μｌを用いて、−２０℃で１５分間、２４ウェルプレート中で細胞を固定する。メタノールを除去し、ＰＢＳで洗浄した後、２１℃で５分間、３％過酸化水素（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、カタログ番号Ｈ３２５−１００）とともに細胞をインキュベートする。細胞をＰＢＳで５分間３回洗浄して、次に、２１℃で３０分間、ＰＢＳ中０.１％でのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−９６４７）  ３００μｌとともにインキュベートする。細胞をＰＢＳで５分間３回洗浄して、次に、２１℃で３０分間、アビジン溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＳＰ−２００１）３００μｌとともにインキュベートする。細胞をＰＢＳで３回、手短にすすぎ、次に、２１℃で３０分間、ビオチン溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＳＰ−２００１）とともにインキュベートする。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次に、ＰＢＳ／ＢＳＡ  ０．１％中で１：２５０で希釈されたラットＳｃｎ１ａ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ２４８２０；ラットＳｃｎ１ａ、ヒトＳＣＮ１ＡおよびマウスＳｃｎ１ａを認識することが知られている）のＣ末端アミノ酸１４９１〜１５０８に対応する合成ペプチド（ＥＥＱＫＫＹＹＮＡＭＫＫＬＧＳＫＫＰ）に対して産生されるウサギ抗体３００μｌ／ウェルとともに、４℃で一晩インキュベートする。２１℃で５分間プレートを平衡させた後、細胞をＰＢＳで各々５分間３回洗浄して、次に、ＰＢＳ／ＢＳＡ  ０．１％中で１：２００希釈されたヤギ抗ウサギ抗体とともに、２１℃で３０分間インキュベートする。細胞をＰＢＳで５分間３回洗浄して、次に、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ試薬Ａ＋Ｂ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＰＫ−６１０１）  ３００μｌとともに３０分間インキュベートする；Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ試薬Ａ＋Ｂ溶液を２１℃で調製した３０分後に、５ｍｌのＰＢＳに２滴の試薬Ａを、次いで２滴の試薬Ｂを引き続いて付加し、混合することにより、細胞とともにインキュベートする。細胞を２１℃でＰＢＳで各々５分間３回洗浄し、次に、細胞が染色されるまで、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）ペルオキシダーゼ基質溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、  カタログ番号ＳＫ−４１０５）とともにインキュベートする；ＤＡＢペルオキシダーゼ基質溶液を再構成した後、１ｍｌのＩｍｍＰＡＣＴ（商標）ＤＡＢ希釈液を３０μｌのＩｍｍＰＡＣＴ（商標）ＤＡＢ色原体濃縮液と混合することにより、細胞に付加する。この時点で、細胞をＰＢＳで３回、手短に洗浄し、３００μｌのＰＢＳを各ウェル中に残す。Ｄｅｌｌ  Ｌａｔｉｔｕｄｅ  Ｄ６３０ラップトップのスクリー��上のニコンデジタル表示装置と接続されたニコンＤＳ−Ｒｉ１カメラを装備したニコンＥｃｌｉｐｓｅＴＳ１００倒立顕微鏡を用いて、２４ウェルプレートのプレート内側で直接、細胞の染色を分析する。ニコンカメラＮＩＳ−ＥｌｅｍｅｎｔｓＤ３．０で提供されるソフトウェアを用いて、個々のウェルの写真を撮る。
実施例４：酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によるＳＣＮ１Ａタンパク質の定量
【０１５１】
この実験の目的は、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）と呼ばれる技法を用いて異なる細胞におけるＳＣＮ１Ａタンパク質発現を上方調節するそれらの能力によって化合物を等級付けすることである。
【０１５２】
材料と方法：細胞により産生されるＳＣＮ１Ａの量を、ＥＬＩＳＡにより定量する。これを達成するために、適切な増殖条件を用いて、２４ウェルプレート中で細胞を増殖させる。小分子化合物付加の４８時間後、培地を除去し、カルシウムおよびマグネシウムを含有しないダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｍｅｄｉａtｅｃｈ、カタログ番号２１−０３１−ＣＶ）で細胞を３回洗浄する。次いで、ＰＢＳを捨て、１００％メタノール  １００μｌを用いて、−２０℃で１５分間、２４ウェルプレート中で細胞を固定する。メタノールを除去し、ＰＢＳで洗浄した後、２１℃で５分間、３％過酸化水素（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、カタログ番号Ｈ３２５−１００）とともに細胞をインキュベートする。細胞をＰＢＳで５分間３回洗浄して、次に、２１℃で３０分間、ＰＢＳ中０.１％でのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−９６４７）  １００μｌとともにインキュベートする。細胞をＰＢＳで５分間３回洗浄して、次に、２１℃で３０分間、アビジン溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＳＰ−２００１）３００μｌとともにインキュベートする。細胞をＰＢＳで３回、手短にすすぎ、次に、２１℃で３０分間、ビオチン溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＳＰ−２００１）とともにインキュベートする。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次に、ＰＢＳ／ＢＳＡ  ０．１％中で１：２５０で希釈されたラットＳｃｎ１ａ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ２４８２０；ラットＳｃｎ１ａ、ヒトＳＣＮ１ＡおよびマウスＳｃｎ１ａを認識することが知られている）のＣ末端アミノ酸１４９１〜１５０８に対応する合成ペプチド（ＥＥＱＫＫＹＹＮＡＭＫＫＬＧＳＫＫＰ）に対して産生されるウサギ抗体１００μｌ／ウェルとともに、４℃で一晩インキュベートする。２１℃で５分間プレートを平衡させた後、細胞をＰＢＳで各々５分間３回洗浄して、次に、ＰＢＳ／ＢＳＡ  ０．１％中で１：２００希釈されたヤギ抗ウサギ抗体とともに、２１℃で３０分間インキュベートする。細胞をＰＢＳで５分間３回洗浄して、次に、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ試薬Ａ＋Ｂ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＰＫ−６１０１）  ３００μｌとともに３０分間インキュベートする；Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ試薬Ａ＋Ｂ溶液を２１℃で調製した３０分後に、５ｍｌのＰＢＳに２滴の試薬Ａを、次いで２滴の試薬Ｂを引き続いて付加し、混合することにより、細胞とともにインキュベートする。細胞を２１℃でＰＢＳで各々５分間３回洗浄し、次に、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｎ３０１）とともにインキュベートする；上清が青色に変わった後、それを新しい９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ  ｏｎｅ、カタログ番号６５１２１）に移して、１Ｍ硫酸を付加する。Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ分光計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を読み取る。一次抗体としてウサギ抗マウスＩｇＧ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ６７０９）で染色されたウェル中で読み取ったバックグラウンドシグナルを、すべてのＳＣＮ１Ａおよびアクチン読取値から差し引く。ウサギ抗アクチン抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１８０１）を用いる。ＳＣＮ１Ａシグナルを各条件に関するアクチンシグナルに対して正規化し、各実験変異体に関する正規化値を比較する。
実施例５：アクチンｍＲＮＡの定量
【０１５３】
この実験の目的は、実時間ＰＣＲと呼ばれる技法を用いて異なる細胞におけるアクチンｍＲＮＡに及ぼす任意の作用を、ＳＣＮ１Ａ  ｍＲＮＡを上方調節する化合物が有していないということを保証することである。
【０１５４】
材料と方法：  適切な培養条件で増殖させた細胞から、総ＲＮＡを収穫する。これを達成するために、小分子化合物付加の４８時間後、培地を除去し、メーカーの使用説明書に従ってＳＶ総ＲＮＡ単離系（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｚ３１０５）、またはＲＮｅａｓｙ  総ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４１８１）を用いて、ＲＮＡを細胞から抽出する。メーカーのプロトコールに記載されたようにＶｅｒｓｏ  ｃＤＮＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＢ１４５３Ｂ）または高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（カタログ番号４３６８８１３）またはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１７５４−２５０）を用いて実施される逆転写反応に、６００ナノグラムのＲＮＡを付加する。この逆転写反応からのｃＤＮＡを用いて、ＡＢＩ  Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現ミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ、カタログ番号４３６９５１０）を、ならびにＡＢＩにより設計されるアクチン用のプライマー／プローブを用いる実時間ＰＣＲにより遺伝子発現をモニタリングする（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現検定：ヒトアクチン  カタログ番号Ｈｓ９９９９９９０３＿ｍ１＊、サルアクチン  カタログ番号Ｒｈ０３０４３３７９＿ｇＨまたはマウスアクチン  カタログ番号Ｍｍ００６０７９３９＿ｓ１＊）。以下のＰＣＲサイクルを用いた：５０℃で２分、９５℃で１０分、（９５℃で１５秒、６０℃で１分）を４０サイクル。ＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ実時間ＰＣＲ機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）使用。アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置後の遺伝子発現における倍率変化を、処置および模擬トランスフェクト化試料間の１８Ｓ正規化ｄＣｔ値における差に基づいて算定する。
実施例６：免疫組織化学によるアクチンタンパク質の定量
【０１５５】
この実験の目的は、免疫組織化学により観察されるようなＳＣＮ１Ａタンパク質を上方調節する化合物がどれも、同一条件下で検出されるアクチンタンパク質に如何なる作用も及ぼさない、ということを保証することである。アクチンタンパク質の量がＳＣＮ１Ａを上方調節する化合物により変えられない場合、アクチンは正規化のための対照としてＳＣＮ１Ａタンパク質のＥＬＩＳＡ定量に用い得る、と推測する。
【０１５６】
材料および方法：免疫組織化学的検定により、アクチンタンパク質を細胞内部で検出する。これを達成するために、小分子化合物付加の４８時間後、培地を除去し、カルシウムおよびマグネシウムを含有しないダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｍｅｄｉａtｅｃｈ、カタログ番号２１−０３１−ＣＶ）で細胞を３回洗浄する。次いで、ＰＢＳを捨て、１００％メタノール  ３００μｌを用いて、−２０℃で１５分間、２４ウェルプレート中で細胞を固定する。メタノールを除去し、ＰＢＳで洗浄した後、２１℃で５分間、３％過酸化水素（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、カタログ番号Ｈ３２５−１００）とともに細胞をインキュベートする。細胞をＰＢＳで５分間３回洗浄して、次に、２１℃で３０分間、ＰＢＳ中０．１％でのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−９６４７）  ３００μｌとともにインキュベートする。細胞をＰＢＳで５分間３回洗浄して、次に、２１℃で３０分間、アビジン溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＳＰ−２００１）３００μｌとともにインキュベートする。細胞をＰＢＳで３回、手短にすすぎ、次に、２１℃で３０分間、ビオチン溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＳＰ−２００１）とともにインキュベートする。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次に、ＰＢＳ／ＢＳＡ  ０．１％中で１：２５０で希釈されたヒトアクチン（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１８０１；ベータおよびガンマヒト、マウスおよびラットアクチンを認識することが知られている）の残基３５０〜４５０内から得られる合成ペプチドに対して産生されるウサギ抗体３００μｌ／ウェルとともに、４℃で一晩インキュベートする。２１℃で５分間プレートを平衡させた後、細胞をＰＢＳで各々５分間３回洗浄して、次に、ＰＢＳ／ＢＳＡ  ０．１％中で１：２００希釈されたヤギ抗ウサギ抗体とともに、２１℃で３０分間インキュベートする。細胞をＰＢＳで５分間３回洗浄して、次に、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ試薬Ａ＋Ｂ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＰＫ−６１０１）  ３００μｌとともに３０分間インキュベートする；Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ試薬Ａ＋Ｂ溶液を２１℃で調製した３０分後に、５ｍｌのＰＢＳに２滴の試薬Ａを、次いで２滴の試薬Ｂを引き続いて付加し、混合することにより、細胞とともにインキュベートする。細胞を２１℃でＰＢＳで各々５分間３回洗浄し、次に、細胞が染色されるまで、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）ペルオキシダーゼ基質溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＳＫ−４１０５）とともにインキュベートする；ＤＡＢペルオキシダーゼ基質溶液を再構成した後、１ｍｌのＩｍｍＰＡＣＴ（商標）ＤＡＢ希釈液を３０μｌのＩｍｍＰＡＣＴ（商標）ＤＡＢ色原体濃縮液と混合することにより、細胞に付加する。この時点で、細胞をＰＢＳで３回、手短に洗浄し、３００μｌのＰＢＳを各ウェル中に残す。Ｄｅｌｌ  Ｌａｔｉｔｕｄｅ  Ｄ６３０ラップトップのスクリーン上のニコンデジタル表示装置と接続されたニコンＤＳ−Ｒｉ１カメラを装備したニコンＥｃｌｉｐｓｅＴＳ１００倒立顕微鏡を用い���、２４ウェルプレートのプレート内側で直接、細胞の染色を分析する。ニコンカメラＮＩＳ−ＥｌｅｍｅｎｔｓＤ３．０で提供されるソフトウェアを用いて、個々のウェルの写真を撮る。
実施例７：海馬錐体細胞においてＳＣＮ１Ａ上方調節により誘導されるナトリウム電流振幅の変化
【０１５７】
この実験の目的は、小分子化合物により上方調節されるＳＣＮ１Ａタンパク質が、ドラベ症候群において影響を及ぼされることが示されている海馬ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンにおけるナトリウム電流の振幅を増大する、ということを保証することである。
【０１５８】
材料と方法：９５％Ｏ２および５％ＣＯ２で継続的に酸素供給した緩衝液中でプロナーゼで、次いでテルモリシンで消化することにより、海馬ＧＡＤ陽性双極性細胞（ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン）を１１〜１６日齢ラットから解離させる。解離細胞を組織培養皿中でプレート化して、選択された小分子化合物で２４時間処理した後、電気生理学的記録を取る。ＥＰＣ−９パッチ−クランプ増幅器（ＨＥＫＡ）を伴う全細胞パッチ−クランプ技法を用いて、電流を記録する。モデルＰ−９７フラミング・ブラウンマイクロピペットプラー（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を用いて、パッチピペットを作製する。ＰＵＬＳＥプログラム（バージョン７．５；ＨＥＫＡ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ）を用いて、刺激およびデータ獲得を実施する。
【０１５９】
電圧クランプ実験のために、（ｍｍで）１９．１のＮａＣｌ、１９．１のテトラエチルアンモニウムクロリド、０．９５のＢａＣｌ２、１．９０のＭｇＣｌ２、５２．４のＣｓＣｌ、０．１のＣｄＣｌ２、０．９５のＣａＣｌ２、９．５２のＨＥＰＥＳ、１１７のグルコース、ｐＨ７．３５を含有する還流緩衝液を、蠕動ポンプを用いて細胞上を絶えず還流させる。パッチピペットは、以下のもの（ｍｍで）を含有する：１５７のＮ−メチル−ｄ−グルカミン、１２６のＨＣｌ、０．９０のＮａＣｌ、３．６０のＭｇＣｌ２、９．０１のＥＧＴＡ、１．８０のＡＴＰ−Ｎａ２、９．０１のＨＥＰＥＳ、４．５０のクレアチン−ホスフェート、ｐＨ７．２。細胞を−１００ｍＶで保持し、−６０ｍＶから−１５ｍＶまでの脱分極ステップを５ｍＶ増分で適用する。最大電流密度を測定し、処置および非処置ニューロン間で比較する。
実施例８：海馬錐体細胞においてＳＣＮ１Ａ上方調節により誘導されるナトリウム電流特性の変化
【０１６０】
この実験の目的は、小分子化合物により上方調節されるＳＣＮ１Ａタンパク質が、ドラベ症候群において影響を及ぼされることが示されている海馬ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンにおけるナトリウム電流の特性を変えない、ということを保証することである。
【０１６１】
材料と方法：９５％Ｏ２および５％ＣＯ２で継続的に酸素供給した緩衝液中でプロナーゼで、次いでテルモリシンで消化することにより、海馬ＧＡＤ陽性双極性細胞（ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン）を１１〜１６日齢ラットから解離させる。解離細胞を組織培養皿中でプレート化して、選択された小分子化合物で２４時間処理した後、電気生理学的記録を取る。ＥＰＣ−９パッチ−クランプ増幅器（ＨＥＫＡ）を伴う全細胞パッチ−クランプ技法を用いて、電流を記録する。モデルＰ−９７フラミング・ブラウンマイクロピペットプラー（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を用いて、パッチピペットを作製する。ＰＵＬＳＥプログラム（バージョン７．５；ＨＥＫＡ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ）を用いて、刺激およびデータ獲得を実施する。
【０１６２】
電圧クランプ実験のために、（ｍｍで）１９．１のＮａＣｌ、１９．１のテトラエチルアンモニウムクロリド、０．９５のＢａＣｌ２、１．９０のＭｇＣｌ２、５２．４のＣｓＣｌ、０．１のＣｄＣｌ２、０．９５のＣａＣｌ２、９．５２のＨＥＰＥＳ、１１７のグルコース、ｐＨ７．３５を含有する還流緩衝液を、蠕動ポンプを用いて細胞上を絶えず還流させる。パッチピペットは、以下のもの（ｍｍで）を含有する：１５７のＮ−メチル−ｄ−グルカミン、１２６のＨＣｌ、０．９０のＮａＣｌ、３．６０のＭｇＣｌ２、９．０１のＥＧＴＡ、１．８０のＡＴＰ−Ｎａ２、９．０１のＨＥＰＥＳ、４．５０のクレアチン−ホスフェート、ｐＨ７．２。細胞を−１００ｍＶで保持し、−６０ｍＶから−１５ｍＶまでの脱分極ステップを５ｍＶ増分で適用する。ｇ＝ＩＮａ／（Ｖ−ＥＮａ）（式中、ＩＮａは、電位Ｖで測定されるピークナトリウム電流を表し、ＥＮａは、平衡電位を表す）による電流／電圧環系から、活性化曲線（伝導度／電圧関係）を算定する。ボルツマン関数を正規化活性化および不活性化曲線に適合させて、曲線特性を確定する。電流減衰を単一指数関数と適合させることにより、不活性化時間定数を評価する。活性化および不活性化プロフィールを処置および非処置細胞間で評価して、処置が電流特性を変えたが否かを確定する。
【０１６３】
電流固定実験のために、細胞を・・・８０ｍＶに保持して、１０ｐＡの増分で適用して８００ｍｓパルス後に、それらの発射パターンを記録する。電極緩衝液は、以下のものを（ｍｍで）含有する：１３５のグルコン酸カリウム、２０のＫＣｌ、２のＭｇＣｌ２、２のＡＴＰＮａ２、０．３のＧＴＰ−Ｎａおよび１０のＨＥＰＥＳ、０．２のＥＧＴＡ、ｐＨ７．３。還流緩衝液は、以下のものを（ｍｍで）含有する：１４０のＮａＣｌ、５のＫＣｌ、２のＣａＣｌ２、１のＭｇＣｌ２、１０のＨＥＰＥＳおよび１０のグルコース、（ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整）。流入−流出関係（活動電位数／導入ｐＡ）、活動電位半値幅、スパイク波振幅およびスパイク減衰を測定し、処置および非処置海馬抑制性介在ニューロン間で比較する。
【０１６４】
単一チャネル電流記録を、全細胞パッチ記録に関して上記したものと同じ溶液およびプロトコールを用いて、ｏｕｔｓｉｄｅ／ｏｕｔパッチ形状で実施する。
実施例９：細胞内ナトリウムレベルに及ぼすＳＣＮ１Ａ上方調節の作用
【０１６５】
この実験の目的は、細胞中のＳＣＮ１Ａタンパク質の上方調節がナトリウムの細胞内レベルにおける変化をもたらすか否かを検査することである。小分子化合物を投与後に異なる量のＳＣＮ１Ａを発現する細胞に、Ｎａ＋に特異的な染料を負荷する。細胞内部のＮａ＋濃度変化に関する陽性対照として、Ｎａ＋イオン透過担体であるモネンシンおよびグラミシジンを用いる。
【０１６６】
材料と方法：細胞を９６ウェルプレート中で増殖させて、種々の濃度の小分子化合物を投与する。４８時間後、細胞をロック緩衝液（８．６ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５．６ｍＭ  ＫＣｌ、１５４ｍＭ  ＮａＣｌ、５．６ｍＭ  グルコース、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．３ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０００１ｍＭ  グリシン、ｐＨ７．４）で洗浄する。細胞内部に染料を負荷する前に、蛍光バックグラウンドを測定する。３７℃で１時間、ロック緩衝液（５０μｌ／ウェル）中に１０μＭ  ＳＢＦＩ−ＡＭ（Ｎａ＋と結合する染料）、０．０４％プルロニックＦ−１２７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  ＯＲ，  ＵＳＡ）および２．５ｍＭ  プロベネシドを有する染料とともに細胞をインキュベートすることにより、染料を細胞内部に負荷する。この時点で、ロック緩衝液（１５０μｌ／ウェル）中の２．５ｍＭ  プロベネシドで２回、細胞を洗浄する。負荷細胞を含有するプレートを、読取器、例えばＦＬＥＸステーション（商標）ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）の内側に置く。染料を負荷した細胞を、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍで励起させる；発光シグナルを５０５ｎｍで記録する。この時点で、シグナル基線を測定する。シグナル基線を測定後、モネンシン（ＥＭＤ，  Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ，  ＵＳＡ、カタログ番号４７５８９５）またはグラミシジン（ＥＭＤ，  Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ，  ＵＳＡ、カタログ番号３６８０２０−２５ＭＧ）を、陽性対照として細胞とともに個々のウェルに付加する。ＴＴＸ（１ｕＭ）処置を、陰性対照として用いる。次いで、ビヒクル対照と比較した場合の活性化合物で前処置した細胞における形質膜での活性ＳＣＮ１Ａの相対的発現を確立する。エクセル・ソフトウェアを用いて５０５ｎｍ対３４０ｎｍ／３８０ｎｍでの発光の比として、シグナルを算定する。
実施例１０：単一細胞中のナトリウムレベルに及ぼすＳＣＮ１Ａ上方調節の影響
【０１６７】
この実験の目的は、細胞中のＳＣＮ１Ａタンパク質の上方調節が個々の細胞中のナトリウムの細胞内レベルにおける変化をもたらすか否かを検査することである。小分子化合物を投与後に異なる量のＳＣＮ１Ａを発現する細胞に、Ｎａ＋に特異的な染料を負荷する。細胞内部のＮａ＋濃度変化に関する陽性対照として、Ｎａ＋イオン透過担体であるモネンシンおよびグラミシジンを用いる。
【０１６８】
材料と方法：細胞を、カバーガラス上で、または９６ウェルプレート中で増殖させて、種々の濃度の小分子化合物を投与する。４８時間後、細胞をロック緩衝液（８．６ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５．６ｍＭ  ＫＣｌ、１５４ｍＭ  ＮａＣｌ、５．６ｍＭ  グルコース、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．３ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０００１ｍＭ  グリシン、ｐＨ７．４）で洗浄する。細胞内部に染料を負荷する前に、蛍光バックグラウンドを測定する。３７℃で１時間、ロック緩衝液（５０μｌ／ウェル）中に１０μＭ  ＳＢＦＩ−ＡＭ（Ｎａ＋と結合する染料）、０．０４％プルロニックＦ−１２７および２．５ｍＭ  プロベネシドを有する染料とともに細胞をインキュベートすることにより、染料を負荷する。この時点で、ロック緩衝液（１５０μｌ／ウェル）中の２．５ｍＭ  プロベネシドで２回、細胞を洗浄する。９６ウェルプレート中またはカバーガラス上の細胞を、励起および発光のためのＨｇランプおよび適切なフィルターを装備した落射蛍光顕微鏡（Ｏｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｎｃ，  Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，  ＶＴ，  ＵＳＡ、カタログ番号Ｘ−Ｆ０４−２、またはＣｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｒｐ，  Ｂｅｌｌｏｗｓ  Ｆａｌｌｓ，  ＶＴ，  ＵＳＡ、カタログ番号７９００１）下に置く。染料を負荷した細胞を、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍで励起させる；発光シグナルを５０５ｎｍで記録する。シグナル基線を測定後、モネンシン（ＥＭＤ，  Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ，  ＵＳＡ、カタログ番号４７５８９５）またはグラミシジン（ＥＭＤ，  Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ，  ＵＳＡ、カタログ番号３６８０２０−２５ＭＧ）を、陽性対照として細胞とともに個々のウェルに付加する。形質膜での活性ＳＣＮ１Ａの相対的上方調節を確立するために、活性化合物で前処置した細胞をビヒクル対照と比較する。落射蛍光顕微鏡と接続したカメラによりデータを収集し、適切なソフトウェアを用いて定量する。エクセル・ソフトウェアを用いて、５０５ｎｍ発光対３４０ｎｍ／３８０ｎｍの比を算定することにより、生シグナルを処理する。
【０１６９】
本発明を１つ以上の実施形態に関して例示および説明してきたが、本明細書および添付図面の解釈および理解に基づき、当業者は等価の変更および改変に想到できよう。加えて、本発明の特定の特性がいくつかの実施形態のうちの１つにだけ関連して開示されている場合があるが、そのような特性は、他の実施形態の１以上の他の特性と、任意の所与のまたは特定の用途のために望ましくかつ有利であり得るように組み合わせることができる。
【０１７０】
開示内容の要約により、技術的開示内容の性質を読者が速やかに確認できるであろう。この要約は、以下の特許請求の範囲の範囲または意味を解釈または限定するために使用されないとの理解を前提として提示されたものである。
【図１】
2014525446.tif 000004
【国際調査報告】
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2014525446.tif 000006
2014525446.tif 000007