(57)【要約】  本発明は、一態様では、核酸構築物を含む植物をインキュベート又は生育する工程を含む、植物においてアポリポプロテインを製造する方法であって、前記核酸構築物が、アポリポプロテイン融合タンパク質をコードする核酸配列を含むか、該核酸配列からなるか、又は実質的に該核酸配列からなり、前記アポリポプロテイン融合タンパク質が、植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導する融合タンパク質パートナーを含んでおり、好ましくは、前記インキュベート又は生育する工程の前に、前記核酸構築物が植物に導入又は浸潤される、前記方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸構築物を含む植物をインキュベート又は生育する工程を含む、植物においてアポリポプロテインを製造する方法であって、
前記核酸構築物が、アポリポプロテイン融合タンパク質をコードする核酸配列を含むか、該核酸配列からなるか、又は実質的に該核酸配列からなり、前記アポリポプロテイン融合タンパク質が、植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導する融合タンパク質パートナーを含んでおり、
好ましくは、前記インキュベート又は生育する工程の前に、前記核酸構築物が植物に導入又は浸潤される、前記方法。
【請求項２】
前記核酸構築物が、
植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導する融合タンパク質パートナーをコードする第１の核酸配列であり、必要により、１以上の非天然の繰り返し配列モチーフを更に含む第１の核酸配列；
必要により、内部でペプチド結合が特異的に切断され得るアミノ酸リンカーをコードする第２の核酸配列；及び
アポプロテインをコードする第３の核酸配列
を含んでおり、前記第１、第２及び第３の核酸配列が、互いに作動可能に連結されている、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記核酸配列が、植物細胞の小胞体にタンパク質を誘導する融合タンパク質パートナー、好ましくはシグナルペプチドをコードする核酸配列を更に含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記植物からアポリポプロテイン融合タンパク質を含むタンパク質顆粒を回収する追加の工程を含んでおり、好ましくは、前記工程が、
（i）植物材料をホモジナイズする工程；
（ii）ホモジナイズした植物材料を低速、好ましくは約２００×ｇで遠心分離する工程；
（iii）ホモジナイズした植物材料を工程（ii）よりも高速、好ましくは約６０００×ｇで遠心分離する工程；及び
（iv）融合タンパク質を含むタンパク質顆粒をペレット分画に回収する工程
を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
アポリポプロテイン融合タンパク質を可溶化する更なる工程を含んでおり、
好ましくは、前記可溶化工程が、還元剤、好ましくはβ−メルカプトエタノールと、非イオン性界面活性剤、好ましくはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と、必要により塩、好ましくは塩化ナトリウムとを含むか、それらからなるか、又は実質的にそれらからなる混合物の使用を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記融合タンパク質パートナーからアポリポプロテインを放出する更なる工程を含んでおり、
好ましくは、前記工程において、プロテアーゼ、好ましくはＴＥＶプロテアーゼ、又はタンパク質スプライシング手段、好ましくはインテインが、前記融合タンパク質パートナーからアポリポプロテインを放出するために用いられる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
放出されたアポリポプロテインを精製する更なる工程を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記工程が、
（i）アポリポプロテイン融合タンパク質を固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーカラムと接触し、プロラミンタンパク質を固定化する工程；
（ii）アポリポプロテインを溶出する工程；及び
（iii）逆相クロマトグラフィー、好ましくは逆相逆相高速タンパク質液体クロマトグラフィーを利用して、溶出したアポリポプロテインを精製する工程
を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導するプロラミンタンパク質、好ましくはγ−ゼインをコードする第１の核酸配列；
必要により、スペーサー、好ましくは切断認識部位をコードする第２の核酸配列；及び
アポリポプロテインをコードする第３の核酸配列
を含むか、それらからなるか、又は実質的にそれらからなる核酸構築物であって、
前記第１、第２、及び第３の核酸配列が互いに作動可能に連結している、前記核酸構築物。
【請求項１０】
前記核酸配列の転写を調節する調節ヌクレオチド配列を更に含む、請求項９記載の核酸構築物。
【請求項１１】
請求項９又は請求項１０記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項１２】
（i）植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導するプロラミンタンパク質、好ましくはγ−ゼインをコードするアミノ酸配列であって、必要により、１以上の非天然繰り返し配列モチーフをコードするアミノ酸配列を更に含む、前記アミノ酸配列；
（ii）必要により、内部でペプチド結合が特異的に切断され得るリンカーをコードするアミノ酸配列；及び
（iii）アポリポプロテインをコードするアミノ酸配列
を含むか、それらからなるか、又は実質的にそれらからなる融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項９記載の核酸配列、又は請求項１０記載の核酸構築物、又は請求項１１記載のベクター、又は請求項１２記載の融合タンパク質を含む、植物又はそれに由来する植物材料。
【請求項１４】
請求項１２記載の融合タンパク質を含む、植物タンパク質顆粒。
【請求項１５】
前記アポリポプロテインが、その変異体、好ましくはアポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法、請求項９記載の核酸配列、請求項１０記載の核酸構築物、請求項１１記載のベクター、請求項１２記載の融合タンパク質、請求項１３記載の植物、又は請求項１４記載の植物タンパク質顆粒。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質顆粒（protein body）中に蓄積することにより、植物においてアポリポプロテインを製造する方法に関する。前記方法を実行するための核酸配列、核酸構築物（核酸コンストラクト）、ベクター、発現ベクターなども開示される。
【背景技術】
【０００２】
健康なヒトでは、通常、コレステロールの送達と除去はバランスがとれている。ヒトが高レベルの低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）と低レベルの高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）とを有するとき、バランスが崩れると、除去されるよりも多くのコレステロールが動脈に堆積する結果となる。アテローム性動脈硬化症が、コレステロールの繰り返しの堆積により発症し、動脈の狭窄又は閉塞を導く。アポリポプロテインＡ１（ＡｐｏＡ１）は、ＨＤＬの主要なタンパク質成分であり、コレステロールの恒常性に重要な役割を果たしており、研究により、ＡｐｏＡ１及びＨＤＬが、この病気に対して保護的な役割を果たし得ることが示唆されている。
【０００３】
ヒトにおいて、ＡｐｏＡ１は、肝臓細胞及び腸細胞で非グリコシル化プレ−プロ−タンパク質として産生される。１８アミノ酸のプレ断片は、タンパク質が細胞から遊離する前に除去され、６アミノ酸のプロ断片は、分泌後、血漿内で未知のプロテアーゼによって切断され、成熟の２４３アミノ酸タンパク質を残す。アポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏ（ＡｐｏＡ１−Ｍ）は、１９８０年に発表されたヒトＡｐｏＡ１の最初に開示された変異体であった。それは、アルギニン１７３がシステインに置換された変異体であることを特徴としている。この変異を有する個体は、ＨＤＬコレステロールレベルが顕著に減少し、アテローム性動脈硬化症から「保護」され得る。この保護作用のメカニズムは、１つのα−ヘリックスの損失及び疎水性残基の増大した露出暴露を伴う、ＡｐｏＡ１−Ｍの構造上の改変によるものと考えられる。この構造により、分子の柔軟性が増大し、通常のＡｐｏＡ１と比べて容易に脂質と結合する。
【０００４】
アポリポプロテイン及びその変異体の治療的使用は、経済的に十分な量の前記アポリポプロテインを調製できる方法を欠くことにより、制限されている。特に、アポリポプロテインの組換え体の製造は、その両親媒性、自動凝集及び分解によって困難である。
【０００５】
既存の原核及び真核の発現系の生化学的、技術的、経済的な制限により、異種タンパク質に対する新しく最適化された製造系を開発する点に実質的な興味を生み出している。そのため、植物発現系が、組換えタンパク質を製造するのに使用され得る。しかし、作物種の選択、組織の選択、発現及び回収戦略、並びに翻訳後プロセスなどの多くの変数を、植物をベースとする製造系の開発及び工業化の間、考慮しなければならない。従って、植物をベースとする製造系の開発は容易ではなく、最終的に開発された系が、選択されたタンパク質を有効に（特に工業規模で）製造する系となるかは確実ではない。特に、植物発現系から組換えタンパク質を精製する場合、しばしば問題に遭遇する。これは、植物の組換えタンパク質の製造において、最も顕著なボトルネックの一つである。植物固体は、典型的に大きく、高密度であり、約１０〜２０質量％で比較的高い。これらの問題の全ては、植物の組換えタンパク質の工業生産に照らして、特に深刻であり、複数の又は複雑な工程が、その方法を不適当にしているかもしれない。
【０００６】
アポリポプロテインの現在の製造系は、臨床試験又は治療用途に必要とされるレベルでアポリポプロテインを製造できない。また、組換えアポリポプロテインは、発現及び製造、特に工業的に有用な規模で発現及び製造するのが難しいタンパク質である。本発明によって提供される方法は、この要求を満たす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の要約
本発明は、植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導するプロラミンタンパク質、好ましくはγ−ゼインをコードする核酸配列を利用する、植物をベースとする発現系でアポリポプロテインを製造する方法を提供する。好適には、プロラミンとの融合タンパク質としてのアポリポプロテインの発現により、植物中でアポリポプロテインの発現が増大する。プロラミンに１以上の非天然（non-naturally occuring）繰り返し配列モチーフを追加することにより、そのモチーフ（単数又は複数）を有しないプロラミンの使用に比べて、アポリポプロテインの発現レベルが増大し得る。植物タンパク質顆粒中でのアポリポプロテインの有効な発現により、組換えアポリポプロテイン融合タンパク質の回収が容易となる。本明細書に記載される方法は、工業規模で実質的に精製された形態でアポリポプロテインを得るために利用され得る。従って、前記方法は、実質的に精製されたアポリポプロテインを製造するのに有用であり、タンパク質の大量生産に容易に拡張可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様では、核酸構築物を導入又は浸潤した（infiltrated）植物をインキュベート又は生育する工程であって、前記核酸構築物が、植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導する融合タンパク質パートナーを含む、アポリポプロテイン融合タンパク質をコードする核酸配列を含むか、該核酸配列からなるか、又は実質的に該核酸配列からなる、前記工程を含む、植物においてアポリポプロテインを製造する方法が提供される。
【０００９】
第１の態様では、核酸構築物を含む植物をインキュベート又は生育する工程であって、前記核酸構築物が、植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導する融合タンパク質パートナーを含む、アポリポプロテイン融合タンパク質をコードする核酸配列を含むか、該核酸配列からなるか、又は実質的に該核酸配列からなる、前記工程を含む、植物においてアポリポプロテインを製造する方法が提供される。前記方法において、好ましくはインキュベート又は生育工程の前に、前記核酸構築物が植物に導入又は浸潤される。
【００１０】
更なる態様では、（ａ）植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導するプロラミンタンパク質、好ましくはγゼインをコードする核酸配列とアポリポプロテインをコードする核酸配列とを含むか、それらからなるか、又は実質的にそれらからなり、それらが互いに作動可能に連結している核酸構築物を導入した植物をインキュベートする工程；及び（ｂ）前記植物において融合タンパク質としてアポリポプロテインを発現できる条件下で前記植物をインキュベートする工程を含む、植物においてアポリポプロテインを製造する方法が提供される。
【００１１】
更なる態様では、植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導するプロラミンタンパク質、好ましくはγゼインをコードする核酸配列とアポリポプロテインをコードする核酸配列とを含むか、それらからなるか、又は実質的にそれらからなり、それらが互いに作動可能に連結している核酸構築物の使用を含む、植物においてアポリポプロテインを発現する方法が提供される。
【００１２】
更なる態様では、（ａ）植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導するプロラミンタンパク質、好ましくはγゼインをコードする核酸配列とアポリポプロテインをコードする核酸配列を含むか、それらからなるか、又は実質的にそれらからなり、それらが作動可能に互いに連結している核酸構築物を含む植物を提供する工程；及び（ｂ）前記植物において融合タンパク質としてアポリポプロテインを発現できる条件下で前記植物をインキュベートする工程を含む、植物においてアポリポプロテインを発現する方法が提供される。
【００１３】
一実施態様では、前記植物への導入又は浸潤工程が、インキュベート又は生育工程の前に行われる。
【００１４】
一実施態様では、前記方法に使用される核酸構築物は、植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導するタンパク質をコードする第１の核酸配列であって、必要により１以上の非天然繰り返し配列モチーフをコードする核酸配列を更に含む第１の核酸配列；必要により、内部でペプチド結合が特異的に切断され得るアミノ酸リンカーをコードする第２の核酸配列；及びアポリポプロテインをコードする第３の核酸配列を含んでおり、前記第１、第２及び第３の核酸配列が互いに作動可能に連結している。
【００１５】
前記方法の一実施態様又は上記の実施態様の組み合わせにおいて、核酸配列が、融合タンパク質を植物細胞の小胞体に誘導するペプチド、好ましくはシグナルペプチドをコードする（第４の）核酸配列を更に含んでいる。
【００１６】
一実施態様又は上記の実施態様の組み合わせにおいて、前記方法は、植物から融合タンパク質を含むタンパク質顆粒を回収する工程であって、好ましくは（i）植物材料をホモジナイズする工程；（ii）ホモジナイズされた植物材料を低速、好ましくは約２００×ｇで遠心する工程；（iii）必要により、ペレット分画を除去する工程；（iv）ホモジナイズされた植物材料を工程（ii）よりも高速、好ましくは約６０００×ｇで遠心する工程；及び（v）融合タンパク質を含むタンパク質顆粒をペレット分画に回収する工程で構成される追加の工程を含んでいる。
【００１７】
一実施態様又は上記の実施態様の組み合わせにおいて、前記方法は、融合タンパク質を可溶化する更なる工程を含んでおり、好ましくは、前記可溶化工程が、還元剤（好ましくはβ−メルカプトエタノール）と非イオン性界面活性剤（好ましくはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）と必要により塩（好ましくは塩化ナトリウム）とを含むか、それらからなるか、又は実質的にそれらからなる混合物の使用を含んでいる。
【００１８】
一実施態様又は上記の実施態様の組み合わせにおいて、前記方法は、前記融合タンパク質からアポリポプロテインを放出する更なる工程を含んでおり、前記工程において、好ましくは、プロテアーゼ（好ましくはＴＥＶプロテアーゼ）又はタンパク質スプライシング手段（好ましくはインテイン）が、前記融合タンパク質からアポリポプロテインを放出するために用いられる。
【００１９】
一実施態様又は上記の実施態様の組み合わせにおいて、前記方法は、放出されたアポリポプロテインを精製する更なる工程を含んでいる。
【００２０】
一実施態様又は上記の実施態様の組み合わせにおいて、前記精製工程は、（i）融合タンパク質を固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーカラムと接触し、プロラミンタンパク質を固定化する工程；（ii）アポリポプロテインを溶出する工程；及び（iii）逆相クロマトグラフィー、好ましくは逆相逆相高速タンパク質液体クロマトグラフィーを用いて、溶出されたアポリポプロテインを更に精製する工程を含んでいる。
【００２１】
更なる態様では、植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導するタンパク質をコードする第１の核酸配列であり、必要により１以上の非天然繰り返し配列モチーフをコードする核酸配列を更に含む第１の核酸配列；必要により、内部でペプチド結合が特異的に切断され得るアミノ酸リンカーをコードする第２の核酸配列；及びアポリポプロテインをコードする第３の核酸配列を含むか、それらからなるか、又は実質的にそれらからなり、前記第１、第２及び第３の核酸配列は互いに作動可能に連結している核酸構築物が提供される。
【００２２】
一実施態様又は上記の実施態様の組み合わせにおいて、核酸構築物は、核酸配列の転写を調節する調節ヌクレオチド配列を更に含んでいる。
【００２３】
更なる態様では、（i）植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導するプロラミンタンパク質、好ましくはγ−ゼインをコードするアミノ酸配列；（ii）必要により、切断認識部位をコードするアミノ酸配列；及び（iii）アポリポプロテインをコードするアミノ酸配列を含むか、それらからなるか、又は実質的にそれらからなる融合タンパク質が提供される。
【００２４】
更なる態様では、前記核酸配列、又は前記核酸構築物、又は前記ベクター、又は前記融合タンパク質を含む、植物又はそれ由来の植物材料が提供される。適切には、植物又は植物材料は、形質転換又は浸潤された植物又は植物材料である。
【００２５】
更なる態様では、融合タンパク質を含む植物タンパク質顆粒が提供される。
【００２６】
更なる態様では、植物細胞においてアポリポプロテインを発現及び／又は製造するための核酸配列、又は核酸構築物、又はベクターの使用が提供される。
【００２７】
植物においてアポリポプロテインを製造する方法（単数又は複数）に関連する上記の実施態様及びその組み合わせもまた、上記の更なる側面の実施態様として記載される。
【００２８】
本明細書に記載の方法を用いると、アポリポプロテインが、プロラミンタンパク質、好ましくはγ−ゼインをコードする核酸配列に融合するとき、増大したレベルで、植物中で発現でき、植物中でタンパク質顆粒の形成を誘導する。プロラミン中に１以上の非天然繰り返し配列モチーフが存在すると、アポリポプロテインの発現レベルを更に増大させることができる。
【００２９】
タンパク質顆粒中の再構成アポリポプロテインの高度な発現により、植物に存在し得るタンパク質分解活性及び酵素活性からタンパク質を保護する。
【００３０】
再構成アポリポプロテイン融合タンパク質を含むタンパク質顆粒は、高密度を保持し、アポリポプロテインタンパク質の回収を単純化し得る。
【００３１】
前記方法の下流の回収及び精製プロトコールは、現在の再構成アポリポプロテインを調製するための手法よりも単純で、安価であり得る。
【００３２】
前記方法は、実質的に精製されたアポリポプロテインを工業規模で製造するために利用され得る。
【００３３】
定義
本願の範囲内で使用される技術用語及び表現には、一般的に植物学及び分子生物学の関連技術で共通に適用される意味が付与される。以下の用語の全ての定義が、本願の完全な内容に適用する。語「含む（comprising）」は、他の要素又は工程を排除しておらず、不定冠詞「ある（a）」又は「ある（an）」は、複数を排除していない。単一の工程により、特許請求の範囲に記載された幾つかの特徴を有する機能を実現し得る。特性（attribute）又は数値と結びつく用語「実質的に」「約」「およそ」等は、特に特性又は数値を正確に定義する。所定の数値又は範囲に関連する用語「約」は、その所定の数値又は範囲の２０％以内、１０％以内、又は５％以内にある数値又は範囲を意味する。
【００３４】
「相同性、同一性又は類似性」は、配列アラインメントにより比較された２つのポリペプチド間又は２つのポリヌクレオチド分子間の配列類似度を意味する。比較される２つの別々のポリヌクレオチド配列間の類似度は、相当する位置で同一である又は一致するヌクレオチドの数の関数である。％同一性の単位で表される類似度は、目視検査及び数学的計算によって決定し得る。或いは、２つのポリヌクレオチド配列の％同一性は、Devereuxら（Nucl. Acids Res. 12:387, 1984）によって開示され、ウィスコンシン大学遺伝学コンピュータグループ（ＵＷＧＣＧ）から利用できるＧＡＰコンピュータプログラム バージョン６．０を用いて、配列情報を比較することによって決定し得る。ＧＡＰプログラムの典型的な初期パラメータは、（1）ヌクレオチドの単項比較マトリックス（同一の場合の１と非同一の場合の０を含む）、並びに編者Schwartz及びDayhoff、Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp.353-358, 1979によって開示されるようなGibskov及びBurgess, Nucl. Acids Res 14:6745, 1986の重み付き比較マトリックス；（2）各ギャップに対する３．０のペナルティー及び各ギャップ中の各記号に対する０．１０のペナルティーを含んでおり；（3）末端ギャップには何らのペナルティーも含まない。配列比較の当業者に既知の様々なプログラムが、代替的に利用できる。
【００３５】
用語「上流」は、線状ポリヌクレオチド配列に沿った参照要素に関する相対的な方向／位置を意味し、ポリヌクレオチド配列の５’末端に向かう方向／位置を意味する。「上流」を「参照要素の５’末端」に置き換えて使用してもよい。
【００３６】
用語「下流」は、線状ポリヌクレオチド配列に沿った参照要素に関する相対的な方向／位置を意味し、ポリヌクレオチド配列の３’末端に向かう方向／位置を意味する。「下流」を「参照要素の３’末端」に置き換えて使用してもよい。
【００３７】
「断片」又は「欠損」（例えば、欠損タンパク質）は、ポリペプチドのアミノ酸配列の任意の部分を包含し、対象の翻訳後の酵素又はポリペプチドの少なくとも１つの構造的又は機能的特徴を保持する。
【００３８】
「融合タンパク質」には、異なるタンパク質由来のペプチド配列が、１以上のペプチド結合によって互いに共有結合したタンパク質が含まれる。「融合タンパク質パートナー」は、植物中でタンパク質顆粒の形成を誘導する融合タンパク質の一部分を意味する。
【００３９】
用語「作動可能に連結される」とは、機能的な転写単位を製造するための、異なるＤＮＡ要素、断片、又は配列の結合を意味する。
【００４０】
用語「精製」及び「単離」及びそれらの文法的なバリエーションは、完全であれ部分的であれ、混合物から少なくとも１つの不純物を分離又は除去し、それにより組成物中のアポリポプロテインの純度を向上することを意味する。
【００４１】
用語「形質転換」は、細胞に外因性の遺伝材料を導入することにより生ずる、細胞の遺伝材料の変化を意味する。当該分野において多くの方法が植物を形質転換するために利用でき、その全てが本明細書に包含され、例えば、微粒子銃法、遺伝子銃法、アグロバクテリウム媒介形質転換、ウィルスベクター媒介形質転換、電気穿孔法（エレクトロポレーション）が挙げられる。トランスジェニック植物は、遺伝的に形質転換した植物細胞を再生することにより作製し得る。
【００４２】
「アグロ浸潤（アグロインフィルトレーション）」又は「浸潤（インフィルトレーション）」は、植物中で一過性の遺伝子発現を誘導するか、所望のタンパク質を製造する方法である。一態様では、その技術は、植物の葉の下面へのアグロバクテリウム細胞の懸濁液の注入に関し、所望の遺伝子を植物細胞に輸送する。真空の浸潤は、非常に多くのアグロバクテリウム細胞を植物組織に導入する別の方法である。この方法において、葉片、葉又は植物全体が、懸濁液を含む容器に沈められ、その容器が真空チャンバに置かれる。このようにして真空が適用され、それにより空気が気孔を介して排出する。真空が解除されると、圧力差により、懸濁液が気孔を介して植物組織中に強制的に取り込まれる。
【００４３】
用語「植物」は、ライフサイクル又は成長の任意の段階の任意の植物及びその子孫を意味する。植物は、天然物、変異体、非天然物又はトランスジェニック植物であってもよく、それらに由来してもよい。
【００４４】
用語「植物細胞」は、植物の構造的及び生理的な単位を意味する。植物細胞は、細胞壁のないプロトプラスト、単離された単一細胞、培養細胞、２以上の細胞集団の形態であってもよく、限定されないが、植物組織、植物器官又は植物全体などの高度に組織化された単位の一部であってもよい。
【００４５】
用語「植物材料」は、植物から入手される又は入手できる任意の固体又は液体の組成物、又はそれらの組み合わせを意味し、例えば、葉、幹、根、花又は花の部分、果実、花粉、卵細胞、接合子、種子、挿し木、分泌物、抽出物、細胞又は組織培養物、又は植物の他の任意の部分又は産生物などが挙げられる。一実施態様では、植物材料は、葉、例えば、緑葉であるか、又はそれに由来する。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
植物においてアポリポプロテインを製造する方法は、植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導するタンパク質であって、プロラミン、好ましくはγ−ゼインである前記タンパク質をコードする核酸配列；及びアポリポプロテインをコードする核酸配列を含んでおり、前記核酸配列が互いに作動可能に連結している核酸構築物を導入した植物をインキュベートする第１の工程を含んでいる。
【００４７】
アポリポプロテインをコードする核酸配列は、任意の哺乳類（例えば、ヒト）のアポリポプロテインを含むアポリポプロテインの核酸配列と実質的な相同性（すなわち、配列類似性）又は実質的な同一性を有する核酸配列を包含し、プロ−アポリポプロテイン及びプレ−プロ−アポリポプロテインをコードする任意の核酸配列も包含する。本明細書では、用語「プロ−アポリポプロテイン」は、翻訳後に切断されるポリペプチドを含むアポリポプロテインポリペプチドを意味する。用語「プレ−プロ−アポリポプロテイン」は、ポリペプチド鎖の細胞内輸送を容易にするＮ−末端シグナル配列を付加的に含む、プロ−アポリポプロテイン分子を意味する。
【００４８】
アポリポプロテインの種類も本発明に包含され、その種類としては、例えば、アポリポプロテインＡ、アポリポプロテインＡＩ、アポリポプロテインＡＩＩ、アポリポプロテインＡ−ＩＶ、アポリポプロテインＡ−Ｖ、アポリポプロテインＢ、アポリポプロテインＢ−１００、アポリポプロテインＢ−４８、アポリポプロテインＣ−Ｉ、アポリポプロテインＣ−ＩＩ、アポリポプロテインＣ−ＩＩＩ、アポリポプロテインＣ−ＩＶ、アポリポプロテインＤ、アポリポプロテインＥ、アポリポプロテインＦ、アポリポプロテインＨ及びアポリポプロテインＬが挙げられる。アポリポプロテインをコードする例示的な核酸配列は、当該分野で周知であり、一般的に多様な哺乳類源（ヒト、ブタ、ウシ、ヒツジなど）から容易に入手できる。好ましい実施態様では、アポリポプロテインは、アポリポプロテインＡ１、好ましくはヒトアポリポプロテインＡ１である。別の好ましい実施態様では、アポリポプロテインは、アポリポプロテインＡ１−Ｍｉｌａｎｏである。これらのアポリポプロテインの核酸配列及びアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋなどのデータベースで広く入手できる。
【００４９】
一実施態様では、アポリポプロテインＡ１−Ｍｉｌａｎｏの成熟ペプチドの核酸配列は、植物での発現に最適化されたコード配列であり、配列番号１に記載の配列を含むか、該配列からなるか、実質的に該配列からなるか、又はその変異体、断片若しくは相同体である。一実施態様では、アポリポプロテインＡ１−Ｍｉｌａｎｏの成熟ペプチドの核酸配列は、配列番号２に記載の配列を含むか、該配列からなるか、実質的に該配列からなるか、又はその変異体、断片又は相同体である。
【００５０】
アポリポプロテイン変異体も本発明に包含され、例えば、種々の天然及び／又は合成の変異及び改変、例えば、限定されないが、点変異、欠失変異、フレームシフト変異及び化学改変が見出されているヒトアポリポプロテインが挙げられる。本発明では、好ましい実施態様において、アポリポプロテイン変異体が、植物において製造された変異アポリポプロテイン、好ましくはアポリポプロテインＡＩ−Ｍｉｌａｎｏである。遺伝的多型を含むアポリポプロテインの他の変異体も知られており、本発明の範囲に包含される。発現されるアポリポプロテインは、モノマー、ダイマー又はトリマーの形態であってもよい。
【００５１】
アポリポプロテインの変異体は、アミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を有していてもよく、それにより静的変異（サイレント変異）が生じ、機能的に等価なタンパク質を生成する。二次的な基質の結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性における類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換をなし得る。例えば、負に荷電されたアミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ；正に荷電されたアミノン酸としては、リシン及びアルギニンが挙げられ；類似の親水性値を有する非荷電の極性頭部基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン及びチロシンが挙げられる。例えば、以下の表に従って同類置換を行ってもよい。２列目の同じブロックのアミノ酸、好ましくは３列目の同じ行のアミノ酸は、互いに置換し得る。
【００５２】
【表１】
2014502498.tif 000002
【００５３】
アポリポプロテイン変異体を作製するための、アポリポプロテインをコードする核酸配列への変異は、当業者に既知の種々の核酸改変技術を用いて行ってもよく、例えば、部位特異的変異誘発法、標的変異誘発法、ランダム変異誘発法、有機溶剤の添加、遺伝子シャッフリング又はこれらの組み合わせ並びに当業者に既知の他の手段などが挙げられる。
【００５４】
アポリポプロテインの変異体は、その変異体が由来するアポリポプロテインの天然又は野生型に対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。アポリポプロテインの変異体は、天然又は野生型アポリポプロテインの生物学的及び／又は免疫学的活性を示すアポリポプロテインの変異体であってもよい。本明細書では、語句「アポリポプロテインの生物学的活性」は、アポリポプロテイン様ポリペプチドが、天然又は野生型アポリポプロテインと実質的に同じか、又は類似である、少なくとも１つの生物学的活性を有することを意味する。本明細書では、語句「アポリポプロテインの免疫学的活性」は、アポリポプロテイン変異体の天然又は野生型アポリポプロテインに対する特異的な抗体との交差反応能を意味する。このような抗体の例は、ＵＳ６，８２８，１１４に記載され、そこには、ＡｐｏＡ１と特異的に反応するモノクローナル抗体が記載されており、ＵＳ６，０９６，５１６には、アポリポプロテインＢ−１００に拮抗するマウス抗体が記載されている。
【００５５】
アポリポプロテインの活性は、当該分野で知られた方法を用いて好適に測定され得る。具体例として、哺乳類でのコレステロール逆輸送の改善能が測定され得る。コレステロール逆輸送能力の測定は、ジミリストイルホスファジンコリン（ＤＭＰＣ）とアポリポプロテインとの会合動態の計算によって決定し得る（Biochem. Biophys. Acta (1997) 1344:139を参照）。簡単にいえば、ＤＭＰＣを、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０及び０．２５ｍＭ ＥＤＴＡに０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁する。アポリポプロテイン、２ｍＭ ５’−５’ジチオビスニトロベンゾエート（ＮｂＳ）含有緩衝液、及びＤＭＰＣ懸濁液を２４℃で１０分インキュベートし、０．４ｍｇ／ｍｌのＤＭＰＣ終濃度及び５．２ｍＭのタンパク質濃度を有するように混合する。混合物の濁度（吸光性）の変化は、脂質−タンパク質の会合の変化を反映しており、その変化後、３２５ｎｍでの吸光性を測定する。対照として、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール又は１０ｍＭ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む還元緩衝液を用いて、同じ試験を繰り返し得る。
【００５６】
また、本発明は、アポリポプロテイン又はその断片をコードする核酸配列の使用を包含する。核酸配列は、アポリポプロテイン又はその変異体をコードする限り、天然アポリポプロテインと同一でなくてもよい。従って、核酸配列は、アポリポプロテインの天然コード配列と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、８５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有していてもよい。好ましい実施態様では、本発明で使用されるアポリポプロテインをコードする核酸配列は、植物でのコドンの用法に従って、あるコドンを代替的なコドンに置換することにより、植物での発現を最適化している。
【００５７】
また、植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導するタンパク質をコードする核酸配列は、本発明の方法で使用される。タンパク質顆粒は、正しいフォールディング及び生物学的活性を保持しつつ、貯蔵タンパク質を真核細胞内に濃縮するように進化した植物の種子の天然構造である。タンパク質顆粒は、バクテリア由来の封入体の幾つかの特性を共有する。タンパク質顆粒は、高密度であり、疎水性相互作用によって密にパッキングされた多量の凝集タンパク質を含んでいる。貯蔵タンパク質は、シグナルペプチドを介して、小胞体の内腔に挿入し得、小胞体由来のタンパク質顆粒と呼ばれる特定の細胞小器官を発達する小胞体中、又はタンパク質貯蔵液胞中のいずれかで組み立てられる。植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導するタンパク質はプロラミンであり、それは改変プロラミン又は１以上のプロラミンドメインを包含する。適切には、プロラミンは、トウモロコシプロラミンである。α及びγ−ゼインは、トウモロコシプロラミンの２つの非限定的な例である。α−及びγ−ゼインは、粗面小胞体の細胞質側の膜結合ポリソームで生合成され、内腔で組み立てられ、小胞体由来のタンパク質顆粒に捕捉される。
【００５８】
適切なプロラミンとしては、限定されないが、α−ゼイン（例えば、トウモロコシα−ゼインの２２ｋＤａのＮ−末端断片）、γ−ゼイン、αグリアジン及びコメｒＰ１３タンパク質が挙げられる。
【００５９】
好ましい実施態様では、植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導するタンパク質は、γゼイン、好ましくはトウモロコシγ−ゼインであり、４つの特徴的なドメイン：i）１９アミノ酸のペプチドシグナル、ii）８単位のヘキサペプチドＰＰＰＶＨＬを含む繰り返しドメイン（５３ａａ）、iii）プロリン残基が他のアミノ酸に置換されたＰｒｏＸドメイン（２９ａａ）、iv）疎水性システインリッチの（疎水性システインに富む）Ｃ−末端ドメインで構成される。
【００６０】
１以上の天然繰り返し配列モチーフは、植物細胞中のアポリポプロテインの発現レベルを改善し得るγ−ゼインに組み込んでもよく、それに置換してもよい。天然繰り返し配列モチーフの一例として、ＰＰＰＶＨＬ以外のモチーフが挙げられる。非天然繰り返し配列モチーフ（単数又は複数）が置換される場合、繰り返しドメイン又はＰｒｏＸドメイン又はこれらのドメインの両方が、非天然配列モチーフを作製するために変異される。繰り返し配列は、非天然配列モチーフであるため、天然γ−ゼイン（例えば、天然トウモロコシγゼイン）配列中に存在しないだろう。一実施態様では、非天然繰り返し配列モチーフ（単数又は複数）は、γ−ゼインの繰り返しドメインに組み込まれるか、それに置換される。他の実施態様では、非天然繰り返し配列モチーフ（単数又は複数）は、γ−ゼインのＰｒｏＸドメインに組み込まれる。他の実施態様では、非天然繰り返し配列モチーフ（単数又は複数）は、γ−ゼインの繰り返しドメイン及びＰｒｏＸドメインに組み込まれる。好ましい実施態様では、非天然繰り返し配列モチーフ（単数又は複数）は、γ−ゼインの繰り返しドメイン及びＰｒｏＸドメインを実質的に構成する断片に置換される。このような断片の例としては、γ−ゼインの少なくともアミノ酸残基２２〜１０９、２２〜１１０、２２〜１１１、２２〜１１２、２２〜１１３、２２〜１１４又は２２〜１１５を含むか、該アミノ酸残基からなるか、又は実質的に該アミノ酸残基からなる断片が挙げられる。すなわち、融合タンパク質パートナーのＮ末端は、γ−ゼインのシグナルペプチド、すなわち、第一にγ−ゼインの１０５〜１１５アミノ酸を含んでおり、それは、前記のとおり様々な置換を有する。
【００６１】
非天然繰り返し配列モチーフの非限定的な例としては、(ＰＰＰＶＡＬ)ｎ又は(Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ)ｎ；(ＰＰＰＶＥＬ)ｎ又は(Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅｕ)ｎ；(ＰＰＰＡＰＡ)ｎ又は(Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ)ｎ；及び(ＰＰＰＥＰＥ)ｎ又は(Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ)ｎ又はこれらの２以上の組み合わせ（式中ｎ＝１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１５、１〜２０又は１〜２５など）が挙げられる。好ましい実施態様では、ｎ＝７又は８である。アラニン及びグルタミン酸に加えて、他のアミノ酸（例えば、限定されないが、スレオニン）もプロリンリッチの非天然繰り返し配列に使用し得る（例えば、（ＰＰＰＶＴＬ））。
【００６２】
別の実施態様では、２以上の異なる非天然繰り返し配列モチーフの組み合わせ、例えば、(ＰＰＰＶＡＬ)ｎと(ＰＰＰＶＥＬ)ｎ；又は(ＰＰＰＡＰＡ)ｎと(ＰＰＰＥＰＥ)ｎ；又は(ＰＰＰＶＡＬ)ｎと(ＰＰＰＶＥＬ)ｎと(ＰＰＰＡＰＡ)ｎ；又は(ＰＰＰＶＥＬ)ｎと(ＰＰＰＡＰＡ)ｎと(ＰＰＰＥＰＥ)ｎ；又は(ＰＰＰＶＡＬ)ｎと(ＰＰＰＶＥＬ)ｎと(ＰＰＰＡＰＡ)ｎと(ＰＰＰＥＰＥ)ｎは、繰り返しドメイン、ＰｒｏＸドメイン又はその両方に使用し得る。
【００６３】
一実施態様では、γゼインの繰り返しドメイン中の(ＰＰＰＡＰＡ)ｎ配列は、配列番号６に記載の配列を含むか、該配列からなるか、又は実質的に該配列からなる。
【００６４】
一実施態様では、γゼインの繰り返しドメイン中の(ＰＰＰＥＰＥ)ｎ配列は、配列番号７に記載の配列を含むか、該配列からなるか、又は実質的に該配列からなる。
【００６５】
一実施態様では、γゼインの繰り返しドメイン中の(ＰＰＰＶＥＬ)ｎ配列は、配列番号８に記載の配列を含むか、該配列からなるか、又は実質的に該配列からなる。
【００６６】
一実施態様では、γゼインの繰り返しドメイン中の(ＰＰＰＶＡＬ)ｎ配列は、配列番号９に記載の配列を含むか、該配列からなるか、又は実質的に該配列からなる。
【００６７】
一実施態様では、γゼインの繰り返しドメイン中の(ＰＰＰＶＴＬ)ｎ配列は、配列番号１０に記載の配列を含むか、該配列からなるか、又は実質的に該配列からなる。
【００６８】
一実施態様では、γゼインのＰｒｏＸドメイン中の(ＰＰＰＡＰＡ)ｎ配列は、配列番号１１に記載の配列を含むか、該配列からなるか、又は実質的に該配列からなる。
【００６９】
一実施態様では、γゼインのＰｒｏＸドメイン中の(ＰＰＰＥＰＥ)ｎ配列は、配列番号１２に記載の配列を含むか、該配列からなるか、又は実質的に該配列からなる。
【００７０】
非天然繰り返し配列モチーフ（単数又は複数）は、γ−ゼインの繰り返しドメイン及び／又はＰｒｏＸドメインの５’又は３’−末端に位置してもよい。非天然繰り返し配列モチーフ（単数又は複数）は、γ−ゼインの繰り返しドメイン及び／又はＰｒｏＸドメインの５’及び３’−末端に位置してもよい。適切な実施態様では、非天然繰り返し配列モチーフ（単数又は複数）は、γ−ゼインの繰り返しドメイン及び／又はＰｒｏＸドメイン内に位置してもよい。適切には、前記植物細胞は、融合タンパク質をコードする核酸の非存在下ではタンパク質顆粒を産生しない。
【００７１】
一実施態様では、トウモロコシγゼインは、配列番号３に記載の核酸配列又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでいる。他の実施態様では、γゼインの断片のアミノ酸配列は、配列番号５に記載の配列を含むか、又はその変異体、断片又は相同体である。これらの配列の突然変異体（mutant）、変異体（variant）、断片及び相同体は、本発明に包含される。
【００７２】
適切には、前記植物細胞は、融合タンパク質をコードする核酸の非存在下ではタンパク質顆粒を産生しない。
【００７３】
適切には、タンパク質顆粒誘導配列は、植物細胞の小胞体にタンパク質を誘導する配列を更に含んでいる。その配列は、しばしばリーダー配列又はシグナルペプチドと称され、融合タンパク質が発現される同じ植物か、異なる植物に由来し得る。シグナルペプチドの例としては、１９残基のγ−ゼインシグナルペプチド配列（ＷＯ２００４００３２０７参照）；１９残基のα−グリアジンのシグナルペプチド配列又は２１残基のγ−グリアジンのシグナルペプチド配列（例えば、Plant Cell (1993) 5:443-450及びEMBO J (1984)3(6), 1409-11415参照）が挙げられる。同様に、他の植物由来の機能的シグナルペプチドも文献に報告されている。シグナルペプチドは、γゼイン及び／又はアポリポプロテインに元々備わるシグナルペプチドであってもよい。シグナルペプチドをコードする核酸は、シグナルペプチドがタンパク質のＮ−又はＣ−末端で発現されるように、核酸構築物中に位置してもよい。一実施態様では、シグナルペプチドは、Ｎ−末端で発現される。
【００７４】
従って、一実施態様では、植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導するタンパク質（例えば、プロラミン、トウモロコシプロラミン、γ−ゼイン又はトウロモロコシγ−ゼイン）をコードする核酸配列；アポリポプロテイン（例えば、ＡｐｏＡ１又はＡｐｏＡ１ Ｍｉｌａｎｏ）をコードする核酸配列；必要により、γ−ゼインシグナルペプチド配列をコードする核酸配列；及び必要により、スペーサーをコードする核酸配列を含む核酸分子が、本明細書に記載される。適切には、前記核酸配列が互いに作動可能に連結している。
【００７５】
γ−ゼインとの実質的な相同性（すなわち、配列同一性）又は実質的な同一性を有する変異体も本明細書に包含される。γ−ゼインポリヌクレオチドの変異体は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１１１１８８４に報告された配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。また、この用語は、γ−ゼインとの実質的な相同性（すなわち、配列同一性）又はその実質的な同一性を有するγ−ゼイン断片も包含する。γ−ゼイン変異体は、γ−ゼインの生物学的活性及び／又は免疫学的活性を示す変異体であってもよい。本明細書では、語句「γ−ゼインの生物学的活性」は、γ−ゼイン変異体が、天然γ−ゼインと実質的に同一又は類似の、少なくとも１つの生物活性を有することを意味する。本明細書では、語句「γ−ゼインの免疫学的活性」は、γ−ゼイン変異体の天然γ−ゼインに対する特異的な抗体との交差反応能を意味する。γ−ゼインの変異体は、天然γ−ゼインタンパク質のアミノ酸に加えてアミノ酸を含んでいてもよく、必ずしも天然アミノ酸の全アミノ酸を含んでいなくてもよい。γ−ゼインは、γ−ゼインタンパク質の断片であってもよく、前記断片は、植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導するタンパク質をコードする核酸配列を含んでいる。従って、具体例として、γ−ゼインは、タンパク質γ−ゼインの繰り返しドメインの全部若しくは一部、又はＰｒｏＸドメインの全部若しくは一部をコードしてもよい。
【００７６】
γ-ゼインの変異体は、アミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を有していてもよく、それによりサイレント変異（静的変異）が生じ、機能的に等価なタンパク質を生成する。二次的な基質の結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性における類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換をなし得る。例えば、負に荷電されたアミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ；正に荷電されたアミノン酸としては、リシン及びアルギニンが挙げられ；類似の親水性値を有する非荷電の極性頭部基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン及びチロシンが挙げられる。例えば、以下の表に従って同類置換を行ってもよい。２列目の同じブロックのアミノ酸、好ましくは３列目の同じ行のアミノ酸は、互いに置換し得る。
【００７７】
【表２】
2014502498.tif 000003
【００７８】
適切には、アポリポプロテイン及びγ−ゼインを含む融合タンパク質が植物細胞で発現されるように、核酸配列が互いに作動可能に連結されている。一実施態様では、核酸配列は、５’末端にアポリポプロテインを含み、３’末端にγ−ゼインを含んでいる。他の実施態様では、核酸配列は、３’末端にアポリポプロテインを含み、５’末端にγ−ゼインを含んでいる。
【００７９】
適切には、核酸分子は、植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導する核酸配列とアポリポプロテインをコードする核酸配列との間に、リンカー配列を含んでいる。前記リンカー配列は、作動可能に連結してもよい。一実施態様では、リンカー配列は、内部で１以上のペプチド結合が特異的に切断され得るアミノ酸リンカーをコードする。従って、リンカー配列は、２つのタンパク質を互いに分離し得るような、酵素又はインテインに対する認識部位などとして機能し得る。リンカーは、１以上のペプチド結合を特異的に切断し得る任意の物質によって切断され得る。有利には、リンカーは、融合タンパク質からアポリポプロテインを分離でき、次に必要ならばアポリポプロテインを精製し、それにより実質的に相同的な組換えアポリポプロテインタンパク質を提供できる。適切には、アポリポプロテインは、内部で切断されておらず、そのため、アポリポプロテインの断片は生成していない。適切には、アポリポプロテインは、そのＮ−末端又はＣ−末端に余分なアミノ酸を残すことなく切断される。一実施態様では、エンテロキナーゼはアポリポプロテインを内部で切断するため、融合タンパク質をエンテロキナーゼで切断しない。
【００８０】
融合タンパク質を切断し、アポリポプロテインを放出する好ましい方法は、内部でペプチド結合が特異的に切断され得るアミノ酸リンカーを介して、融合パートナーのＮ−末端が、アポリポプロテインのＣ−末端と連結されるように、融合タンパク質を設計する方法であり、前記アミノ酸リンカーは、融合タンパク質の他の部位には存在しない。この方法は、特定のアミノ酸配列、例えば、特定の認識配列を参照することにより、切断手段を選択し得るという利点を有する。リンカーは、１以上のペプチド結合の直接的かつ特異的な切断に絶対的に必要な最小限の配列以上を包含してもよい。リンカーは、２つの核酸配列の結合の結果として生じてもよい。この実施態様では、各配列は、ライゲーションが開始されて切断可能なリンカー、例えば、切断可能な認識部位を形成できる多くのヌクレオチドを含んでいる。
【００８１】
一実施態様では、エンテロキナーゼがアポリポプロテインを内部で切断するため、融合タンパク質をエンテロキナーゼで切断しない。しかし、この切断部位は、特にプロテアーゼを切断に使用せず、化学物質やインテインなどで代用する場合、アポリポプロテインの発現を改善するために使用され得る。他の実施態様では、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)プロテアーゼＶ８としても知られるＧｌｕ−Ｃエンドプロテアーゼで融合タンパク質を切断しない。このプロテアーゼは、セリンプロテアーゼであり、ペプチド結合のＣ−末端をグルタミン酸残基に選択的に切断する。また、このプロテアーゼは、グルタミン酸残基よりも１００〜３００倍遅い速度でアルパラギン酸残基を切断する。しかし、このプロテアーゼの切断認識部位の存在により、γ−ゼイン単独の使用に比べて、アポリポプロテインの発現レベルが低減し得る。
【００８２】
融合タンパク質を切断し、アポリポプロテインを放出する好ましい方法は、融合タンパク質の他の部位では生じない酵素切断に対する特異的な認識部位を含むアミノ酸配列を介して、融合パートナーのＮ−末端が、アポリポプロテインのＣ−末端と連結されるように、融合タンパク質を設計する方法である。この方法は、認識配列を参照することにより、切断酵素を選択し得るという利点を有する。認識部位は、直接的な切断に絶対的に必要な最小限度の配列以上を包含してもよい。認識部位は、２つの核酸配列の結合の結果として生じてもよい。この実施態様では、各配列は、連結が開始されて切断可能な認識部位を形成できる多くのヌクレオチドを含んでいる。
【００８３】
本明細書に記載される核酸配列は、植物に最適化された配列であってもよい。
【００８４】
プロテアーゼは、リンカー中の１以上のペプチド結合を特異的に切断するために使用してもよい。プロテアーゼは、Ａｌａ−Ｃエンドプロテアーゼであってもよい。他の実施態様では、プロテアーゼは、Ｇｌｕ−Ｃエンドプロテアーゼであり、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)プロテアーゼＶ８としても知られる。このプロテアーゼは、セリンプロテアーゼであり、ペプチド結合のＣ−末端をグルタミン酸残基に選択的に切断する。また、このプロテアーゼは、グルタミン酸残基よりも１００〜３００倍遅い速度でアスパラギン酸残基で切断する。
【００８５】
更なる実施態様では、植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導するタンパク質をコードする核酸配列と切断認識部位との間にリンカー配列を追加してもよい。他の実施態様では、切断認識部位及びアポリポプロテインとの間にリンカー配列を追加してもよい。リンカーは、切断効率を向上するために機能し得る。リンカー配列の非限定的な例としては、アミノ酸リンカー(Ｇｌｙ)5又は(Ｇｌｙ4Ｓｅｒ)3が挙げられる。
【００８６】
他の実施態様では、プロテアーゼはＴＥＶプロテアーゼである。ＴＥＶプロテアーゼは、高度に部位特異的なシステインプロテアーゼであり、タバコエッチウィルス(Tobacco Etch Virus)で見出される。このプロテアーゼに対する最適な切断認識部位は、配列Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−(Ｇｌｙ／Ｓｅｒ)であり、切断はＧｌｎ残基とＧｌｙ／Ｓｅｒ残基の間で生じる。
【００８７】
従って、適切なリンカーの非限定的な例としては、Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−(Ｇｌｙ／Ｓｅｒ)、(Ｇｌｙ)ｘ（式中、ｘは２、３、４、５、６、７、８、９又は１０又はそれ以上である）、又は(Ｇｌｙ4Ｓｅｒ)ｙ（式中、ｙは２、３、４、５、６、７、８、９又は１０又はそれ以上である）が挙げられる。一実施態様では、リンカーは(Ｇｌｙ)4である。他の実施態様では、リンカーは(Ｇｌｙ4Ｓｅｒ)3である。更なる実施態様では、アポリポプロテインをコードする配列は、前記リンカーの３’末端に位置する。
【００８８】
好ましい実施態様では、切断認識部位を切断するために使用されるプロテアーゼは、ＴＥＶプロテアーゼである。ＴＥＶプロテアーゼは高度に部位特異的なシステインプロテアーゼであり、タバコエッチウィルス(Tobacco Etch Virus)で見出される。このプロテアーゼに対する最適な切断認識部位は、配列Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−(Ｇｌｙ／Ｓｅｒ)（ＥＮＬＹＦＱ(Ｇ／Ｓ)）であり、切断はＧｌｎ残基とＧｌｙ／Ｓｅｒ残基の間で生じる。一実施態様では、Ｇｌｕ−Ｃエンドプロテアーゼ又はペプスタチン感受性アスパルチル（ＰＡＰＡ）プロテアーゼに対する切断認識部位が、ＴＥＶプロテアーゼと共に使用される。一実施態様では、植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導するタンパク質と切断認識部位との間にリンカー、例えば、(Ｇｌｙ)5又は(Ｇｌｙ4Ｓｅｒ)3が存在し得る。
【００８９】
他の実施態様では、２つのタンパク質を分離するために非タンパク質分解性手段を使用してもよい。従って、例えば、インテインを使用してもよい。種々の異なるインテインが当該分野で知られており、所定の条件下、例えば、還元条件下で切断を生じさせることができる。従って、一実施態様では、アミノ酸リンカーはインテインをコードしてもよい。インテインは、種々のバクテリア種−例えば、シネコシスティス種(Synechocystis sp．)又はマイコバクテリウム種(Mycobacterium sp.)−例えば、マイコバクテリウム ゼノピ(Mycobacterium xenopi)などに由来してもよい。インテインは、サッカロミセス種(Saccharomyces sp.)−例えば、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)などに由来してもよく、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)液胞膜ＡＴＰアーゼインテインであってもよい。一実施態様では、インテインは、マイコバクテリウム ゼノピ(Mycobacterium xenopi)ジャイレースＡインテインである。アミノ酸リンカーが必要でなくてもよい場合、融合タンパク質からアポリポプロテインを分離するため、化学物質を使用してもよい。
【００９０】
本明細書に記載される核酸配列は、植物に最適化された配列であってもよい。
【００９１】
更なる実施態様では、本発明の方法に使用される核酸構築物は、植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導するタンパク質をコードする第１の核酸配列であり、必要により１以上の非天然繰り返し配列モチーフをコードする核酸配列を更に含む第１の核酸配列；必要により、内部のペプチド結合が特異的に切断され得るアミノ酸リンカーをコードする第２の核酸配列；及びアポリポプロテインをコードする第３の核酸配列を含んでおり、前記第１、第２、及び第３の核酸配列が互いに作動可能に連結している。必要により、前記核酸配列の転写を調節する調節ヌクレオチド配列も含まれる。
【００９２】
従って、前記核酸配列の転写を調節する種々の調節ヌクレオチド配列も含まれ得る。これらとしては、転写調節因子が挙げられ、それは、植物の成長過程の特定の時期の特定の細胞又は組織、例えば、栄養組織又は生殖組織でしか活性でない。このような一例は、プロモーターであり、それは、典型的には上流に位置し、二重鎖ＤＮＡ断片に作動可能に連結するポリヌクレオチド要素／配列を意味する。適切なプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ及び様々な因子を含む転写複合体を誘致することにより、核酸配列の転写を活性化し、ＲＮＡ合成を開始できる。プロモーターは、天然遺伝子に近接の領域に完全に由来してもよく、異なる天然プロモーター又は合成ＤＮＡセグメントに由来する異なる要素で構成してもよい。一実施態様では、ある組織で１以上のポリヌクレオチドの発現が好ましい場合、組織特異的な発現を利用でき、有利であり得る。成長制御下の組織特異的プロモーターの例としては、ある組織、例えば、栄養組織（例えば、根、葉）又は生殖組織（例えば、果実、胚珠、種子、花粉、雌しべ（ピストル）、花又は任意の胚組織）などで転写のみ（又は専ら転写のみ）を開始できるプロモーターが挙げられる。生殖組織特異的プロモーターの例としては、例えば、葯特異的、胚珠特異的、胚特異的、胚乳特異的、外皮特異的、種子及び種皮特異的、花粉特異的、花弁特異的、又はこれらの組み合わせであってもよい。適切な葉特異的プロモーターとしては、Ｃ４植物（トウモロコシ）由来のピルベートオルトホスフェートジキナーゼ（ＰＰＤＫ）プロモーター、トウモロコシ由来のｃａｂ−ｍ１Ｃａ＋２プロモーター、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)myb関連遺伝子プロモーター（Ａｔｍｙｂ５）、リブロースビホスフェートカルボキシラーゼ（ＲＢＣＳ）プロモーター（例えば、葉及び光環境下で生育した苗で発現されるトマトＲＢＣＳ１、ＲＢＣＳ２及びＲＢＣＳ３Ａ遺伝子、トマト果実の成長過程で発現されるＲＢＣＳ１及びＲＢＣＳ２、又は葉身及び葉鞘の葉肉細胞で殆ど排他的に高レベルで発現されるリブロースビホスフェートカルボキシラーゼプロモーター）が挙げられる。適切な老化特異的プロモーターとしては、果実の熟成、葉の老化及び落葉の間に活性であるトマトプロモーター、システインプロテアーゼをコードする遺伝子のトウモロコシプロモーターが挙げられる。適切な葯特異的プロモーターを使用し得る。当業者に既知の適切な根優先プロモーターを選択してもよい。適切な種子優先プロモーターとしては、種子特異的プロモーター（種子の成長の間活性であるプロモーター、例えば、種子の貯蔵タンパク質のプロモーター）及び種子−発芽プロモーター（種子の発芽の間活性であるプロモーター）が挙げられる。このような種子優先プロモーターとしては、限定されないが、Ｃｉｍ１（サイトカイニン誘導メッセージ）；ｍｉｌｐｓ（ミオ−イノシトール−１−ホスフェートシンターゼ）；Ｚｍ−４０としても知られるｍＺＥ４０−２；ｎｕｃｌｃ；及びｃｅｌＡ（セルロースシンターゼ）などが挙げられる。Ｇｌｏｂ−１は、胚特異的プロモーターである。双子葉植物の場合、種子特異的プロモーターとしては、限定されないが、マメβ−ファセオリン、ナピン（napin）、β−コング��シニン、ダイズレクチン、クルシフェリンなどが挙げられる。単子葉植物の場合、種子特異的プロモーターとしては、限定されないが、トウモロコシ１５ｋＤａゼインプロモーター、２２ｋＤａゼインプロモーター、２７ｋＤａゼインプロモーター、ｇ−ゼインプロモーター、２７ｋＤａ γ−ゼインプロモーター（例えば、ｇｚｗ６４Ａプロモーター、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｓ７８７８０参照）、ワキシープロモーター、シュランケン１プロモーター、シュランケン２プロモーター、グロブリン１プロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｌ２２３４４参照）、Ｌｔｐ２プロモーター、ｃｉｍプロモーター、トウモロコシｅｎｄ１及びｅｎｄ２プロモーター、ｎｕｃ１プロモーター、Ｚｍ４０プロモーター、ｅｅｐ１及びｅｅｐ２；ｌｅｃ１、チオレドキシンＨプロモーター；ｍｌｉｐ１５プロモーター、ＰＣＮＡ２プロモーター；及びシュランケン−２プロモーターが挙げられる。誘導プロモーターの例としては、病原菌の攻撃、嫌気条件、上昇した温度、光、乾燥、低温、又は高い塩濃度に応答するプロモーターが挙げられる。病原菌誘導プロモーターとしては、病原菌の感染後に誘導される病原菌関連タンパク質（ＰＲタンパク質）（例えば、ＰＲタンパク質、ＳＡＲタンパク質、β−１，３−グルカナーゼ、キチナーゼ）由来のプロモーターが挙げられる。
【００９３】
植物プロモーターに加えて、他の適切なプロモーターは、バクテリア起源に由来してもよく、例えば、オクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター及びＴｉプラスミドに由来する他のプロモーター）であってもよく、ウィルスプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓ及び１９ＳＲＮＡプロモーター、タバコモザイクウィルスの構成プロモーター、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）１９Ｓ及び３５Ｓプロモーター、ゴマノハグサモザイクウィルス３５Ｓプロモーター）に由来してもよい。調節配列は、植物において機能的である転写終結配列を含んでいてもよい。また、調節配列は、植物において機能的である翻訳エンハンサーを含んでいてもよい。エンハンサーは、転写活性化因子などの転写調節タンパク質を誘致できる核酸配列であり、プロモーター活性を増大することにより、転写活性を増大する。適切なエンハンサーは、対象の天然プロモーター（同種起源）に近接の領域に由来してもよく、非天然構造（異種起源）に由来してもよく、対象の任意のプロモーターに作動可能に連結し、プロモーターの活性又は組織特異性を増大し得る。転写単位の配向に関し、任意の配向で作動するエンハンサーもある。例えば、エンハンサーは、プロモーター及び核酸構築物を含む転写単位の上流又は下流に位置してもよい。
【００９４】
組換えアポリポプロテインの発現に使用される植物宿主細胞は、植物から抽出される又は抽出可能な細胞であってもよく、植物外で培養される培養植物細胞であってもよい。従って、一実施態様では、植物は、植物細胞、例えば、培地又は植物外で成長された植物細胞（例えば、インビトロで成長された植物細胞又は細胞塊など）である。植物の非限定的な例としては、単子葉植物及び双子葉植物、例えば、作物、観賞植物、非栽培植物又は野生植物が挙げられる。更なる例としては、商用又は農業用の植物、例えば、作物（特に、ヒトの食料又は動物の餌に用いられる作物）、木材−又はパルプ−製造用樹木、野菜植物、果実植物及び観賞植物が挙げられる。
【００９５】
１以上の核酸分子を植物、例えば、単子葉植物及び双子葉植物に導入（例えば、形質転換又は浸潤）する手法が、当該分野で知られている。核酸分子（単数又は複数）、ベクター、構築物などを植物に導入するために、いかなる方法を使用してもよい。具体例として、構築物（単数又は複数）でコートされた微粒子を利用する微粒子銃法又は遺伝子銃法、アグロバクテリウム媒介形質転換［例えば、A.ラジオバクター(A. radiobacter)、A.リゾゲネス(A. rhizogenes)、A.ルビ(A. rubi)又はA.ツメファシエンス(A. tumefaciens)］、ウィルスベクター媒介形質転換、電気穿孔法及びアグロバクテリウム細胞による浸潤（アグロ浸潤とも称される）によって植物に導入してもよい。一実施態様では、植物細胞のアグロバクテリウム媒介形質転換が使用される。他の実施態様では、アグロ浸潤を使用し、核酸を植物全体、無傷植物、又はその一部に導入する。アグロ浸潤は、当該分野で知られた方法及び装置により、減圧下又は真空下で実行され得る。
【００９６】
核酸を植物に導入することにより、核酸によってコードされるタンパク質が安定に発現し得る。典型的には、安定な発現により、核酸が宿主ゲノムに組み込まれ、トランスジェニック植物を作り出すであろうし、核酸は次世代へと伝えられるだろう。核酸を植物に導入することにより、核酸によってコードされるタンパク質が一時的に発現し得る。一時的な発現は、必ずしも宿主ゲノムへの核酸の組み込みに依存しない。典型的には、アグロバクテリウム細胞を浸潤したタバコ植物を５日、１０日、１５日又は２０日又はそれ以上インキュベートした後、植物の一部分を採取し、組換え産生タンパク質を回収する。両方の形式の発現が、本発明では想定される。
【００９７】
核酸が導入された植物はインキュベートされ、選択的マーカー遺伝子が使用されているなら、必要により選択して子孫が得られる。これらの子孫は、トランスジェニック種子を製造するために使用してもよく、或いは他の植物とともに繁殖してもよい。このような子孫から得られる種子は、発芽し、栽培し、当初導入した核酸を含む子孫の次世代を調製するために使用してもよい。植物由来の未成熟の胚又は胚発生カルスを、出発材料として使用してもよい。これらの方法は、ありふれたものであり、当業者に公知である。一旦、植物が成長したら、ヌクレオチド配列が発現される組織を採取し、本明細書に記載の方法を用いて回収する。幾つかの実施態様では、生存を延長しようとする条件下で植物をインキュベートすることが望まれ得る場合、核酸を植物に導入する方法により、植物が健康的でなくなるかもしれない。幾つかの実施態様では、核酸を導入してから５日、１０日、１５日又は２０日後又はそれ以降に植物組織を採取することが望まれ得る。
【００９８】
更なる実施態様では、核酸配列、核酸構築物、又はベクターなどは、ウィルス起源などの遺伝子サイレンシングサプレッサーをコードする核酸配列を含んでいる。一実施態様では、遺伝子サイレンシングサプレッサーは、ハヴェルリバーウィルス(Havel river virus)(HaRV)、ピアーラテントウィルス(Pear latent virus)(PeLV)、リシアンサスネクローシスウィルス(Lisianthus necrosis virus)、ブドウヴァインアルジェリアンラテントウィルス(Grapevine Algerian latent virus)、ペラルゴニウムネクロティックスポットウィルス(Pelargonium necrotic spot virus)(PeNSV)、シンビジウムリングスポットウィルス(Cymbidium ringspot virus)(CymRSV)、アーチチョークモトルドクリンクルウィルス(Artichoke mottled crinkle virus)(AMCV)、カーネーションイタリアンリングスポットウィルス(Carnation Italian ringspot virus)(CIRV)、レタスネクロティックスタントウィルス(Lettuce necrotic stunt virus)、ライスイエローモトルウィルス(rice yellow mottle virus)(RYMV)、ジャガイモウィルスＸ(potato virus X)(PVX）、アフリカンキャッサバモザイクウィルス(African cassava mosaic virus)(ACMV)、キュウリモザイクウィルス(Cucumber mosaic virus)(CMV)、キュウリネクロティックウィルス(Cucumber necrosis virus)(CNV)、ジャガイモウィルスＹ(potato virus Y)(PVY）、タバコエッチウィルス(tobacco etch virus)(TEV)、及びトマトブッシースタントウィルス(Tomato bushy stunt virus)(TBSV)又はこれらの２以上の組み合わせから選択されるウィルスの遺伝子サイレンシングサプレッサーである。本発明に使用し得る遺伝子サイレンシングサプレッサーの例としては、限定されないが、ライスイエローモトルウィルス(rice yellow mottle virus)(RYMV)のｐ１タンパク質、ジャガイモウィルスＸ(potato virus X)(PVX)のｐ２５タンパク質、アフリカンキャッサバモザイクウィルス(African cassava mosaic virus)(ACMV)のＡＣ２タンパク質、キュウリモザイクウィルス(cucumber mosaic virus)(CMV)の２ｂタンパク質、１９ｋＤａのキュウリネクローシスウィルス(Cucumber necrosis virus)(CNV)のｐ１９タンパク質、ジャガイモウィルスＹ(potato virus Y)(PVY)、タバコエッチウィルス(tobacco etch virus)(TEV)及びトマトブッシースタントウィルス(Tomato bushy stunt virus)(TBSV)のヘルパーコンポーネントプロテアーゼ(helper-component proteinase)(HcPro)が挙げられる。一実施態様では、遺伝子サイレンシングサプレッサーは、タバコエッチウィルス(tobacco etch virus)(TEV)のＨｃＰｒｏである。他の実施態様では、遺伝子サイレンシングサプレッサーは、トマトブッシースタントウィルス(Tomato bushy stunt virus)(TBSV)のｐ１９タンパク質である。従って、更なる実施態様では、植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導するタンパク質をコードする第１の核酸配列であり、必要により非天然繰り返し配列モチーフをコードする核酸配列を更に含む第１の核酸配列；アポリポプロテインをコードする第２の核酸配列；及び必要により、内部のペプチド結合が特異的に切断され得るアミノ酸リンカーをコードする第３の核酸配列を含んでおり；前記第１、第２及び第３の核酸配列が、お互い、及び必要により、前記核酸配列（単数又は複数）の転写を調節する調節ヌクレオチド配列、及び必要により、適切にはウィルス起源の遺伝子サイレンシングサプレッサーをコードする発現可能な核酸に作動可能に連結している、核酸構築物が提供される。代替的な実施態様では、遺伝子サイレンシングサプレッサーをコードする発現可能な核酸は、植物又は植物細胞に導入される別個の第２の核酸分子又は第２の核酸の一部であり得、アポリポプロテインを産生する植物又は植物細胞において共発現される。
【００９９】
例えば、安定な植物の形質転換を以下のように実行し得る。ベクターをアグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)に輸送する。Draperら（1988）の方法「In: Plant Genetic Transformation and Gene Expression. A Laboratory Manual（編者Draper, J., Scott, R., Armitage, P.及びWalden, R.）、Blackwell Scientific Publications」に従って、タバコ［ニコチアナベンサミアナ(Nicotiana benthamiana)又はN.タバカム(N. tabacum)］葉片を形質転換する。再生植物を、２００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む培地上で選択し、温室に移す。最も高い導入遺伝子産物レベルを有する形質転換タバコ植物を培養し、Ｔ１世代を得る。生育した葉（約１２ｃｍ長）を採取し、直ぐに液体窒素で凍結し、更なる実験のため−８０℃で貯蔵する。
【０１００】
植物宿主細胞は、穀類作物（例えば、小麦、燕麦、大麦、トウモロコシ、ライ麦、ライ小麦、米、粟、モロコシ、キノア、アマランス、ソバ）；飼料作物（例えば、アルファルファ、ベッチ、クローバーなどを含む飼料草及び飼料双子葉植物）；油糧種子作物（例えば、綿花、紅花、ヒマワリ、大豆、キャノーラ、菜種、亜麻、ピーナッツ及び油やし）；木の実（例えば、クルミ、カシュー、ヘーゼルナッツ、ピーカン、アーモンドなど）；サトウキビ、ココナッツ、ナツメヤシ、オリーブ、テンサイ、茶及びコーヒー；木材−又はパルプ−製造用樹木；野菜作物、例えば、マメ科植物（例えば、豆、エンドウ豆、レンズ豆、アルファルファ、ピーナッツ）、レタス、アスパラガス、アーチチョーク、セロリ、ニンジン、ダイコン、アブラナ属（例えば、キャベツ、ケール、マスタード及び他の葉状アブラナ属、ブロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ、カブ、コールラビ）、ウリ科植物（例えば、キュウリメロン、夏カボチャ、冬カボチャ）、アリウム属（例えば、タマネギ、ニンニク、リーキ（leek）、シャロット、チャイブ）、ナス科の構成物（例えば、トマト、ナス、ジャガイモ、ペッパー、ホオズキ）及びアカザ科の構成物（例えば、ビート、チャード、ホウレンソウ、キノア、アマランス）；果物、例えば、リンゴ、ナシ、柑橘類（例えば、オレンジ、ライム、レモン、グレープフルーツなど）、核果（例えば、アプリコット、ピーチ、プラム、ネクタリン）、バナナ、パイナップル、ブドウ、キウイフルーツ、パパイヤ、アボカド、及びベリー；並びに観賞植物、例えば、観賞顕花植物、観賞樹木及び低木、観賞地被植物、及び観賞草であってもよい。さらに、双子葉植物の例としては、限定されないが、キャノーラ、綿花、ジャガイモ、キノア、アマランス、ソバ、紅花、大豆、テンサイ及びヒマワリ亜が挙げられ、より適切には、大豆、キャノーラ及び綿花である。さらに、単子葉植物の例としては、限定されないが、小麦、燕麦、大麦、トウモロコシ、ライ麦、ライ小麦、米、観賞草及び飼料草、モロコシ、粟、サトウキビが挙げられる。
【０１０１】
植物宿主細胞は、以下の科の１つからの種を含む、単子葉植物又は双子葉植物又は植物細胞系であることもできるし、それに由来することもできる：キツネノマゴ科(Acanthaceae)、ネギ科(Alliaceae)、ユリズイセン科(Alstroemeriaceae)、ヒガンバナ科(Amaryllidaceae)、キョウチクトウ科(Apocynaceae)、ヤシ科(Arecaceae)、キク科(Asteraceae)、メギ科(Berberidaceae)、ベニノキ科(Bixaceae)、アブラナ科(Brassicaceae)、パイナップル科(Bromeliaceae)、アサ科(Cannabaceae)、ナデシコ科(Caryophyllaceae)、イヌガヤ科(Cephalotaxaceae)、アカザ科(Chenopodiaceae)、イヌサフラン科(Colchicaceae)、Cucurbitaceae(ウリ科)、ヤマノイモ科(Dioscoreaceae)、マオウ科(Ephedraceae)、コカノキ科(Erythroxylaceae)、トウダイグサ科(Euphorbiaceae)、マメ科(Fabaceae)、シソ科(Lamiaceae)、アマ科(Linaceae)、ヒカゲノカズラ科(Lycopodiaceae)、アオイ科(Malvaceae)、メランチウム科(Melanthiaceae)、バショウ科(Musaceae)、フトモモ科(Myrtaceae)、ヌマミズキ科(Nyssaceae)、ケシ科(Papaveraceae)、マツ科(Pinaceae)、オオバコ科(Plantaginaceae)、イネ科(Poaceae)、バラ科(Rosaceae)、アカネ科(Rubiaceae)、ヤナギ科(Salicaceae)、ムクロジ科(Sapindaceae)、ナス科(Solanaceae)、イチイ科(Taxaceae)、ツバキ科(Theaceae)またはブドウ科(Vitaceae)。
【０１０２】
適切な種としては、アベルモスクス属(Abelmoschus)、アビエス属(Abies)、アセル属(Acer)、アグロスチス属(Agrostis)、アリウム属(Allium)、アルストロメリア属(Alstroemeria)、アナナス属(Ananas)、アンドログラフィス属(Andrographis)、アンドロポゴン属(Andropogon)、アルテアポリポプロテイニア属(ArteApolipoproteinia)、アルンド属(Arundo)、アトローパ属(Atropa)、ベルベリス属(Berberis)、ベタ属(Beta)、ビクサ属(Bixa)、ブラシカ属(Brassica)、カレンデュラ属(Calendula)、カメリア属(Camellia)、カンプトテカ属(Camptotheca)、カンナビス属(Cannabis)、カプシクム属(Capsicum)、カルタムス属(Carthamus)、カタランサス属(Catharanthus)、ケファロタクスス属(Cephalotaxus)、クリサンセマム属(Chrysanthemum)、シンコナ属(Cinchona)、キトルルス属(Citrullus)、コフィア属(Coffea)、コルチカム属(Colchicum)、コリウス属(Coleus)、ククアポリポプロテイン属(CucuApolipoprotein)、ククルビタ属(Cucurbita)、キノドン属(Cynodon)、ダツラ属(Datura)、ダイアンサス属(Dianthus)、ジギタリス属(digitalis)、ディオスコレア属(Dioscorea)、エラエイス属(Elaeis)、エフェドラ属(Ephedra)、エリアンサス属(Erianthus)、エリスロキシルム属(Erythroxylum)、ユーカリプタス属(Eucalyptus)、フェスツカ属(Festuca)、フラガリア属(Fragaria)、ガランツス属(Galanthus)、グリシン属(Glycine)、ゴシピウム属(Gossypium)、ヘリアンサス属(Helianthus)、ヘベア属(Hevea)、ホルデウム属(Hordeum)、ヒヨスチアムス属(Hyoscyamus)、ジャトロファ属(Jatropha)、ラクツカ属(Lactuca)、リナム属(Linum)、ロリウム属(Lolium)、ルピナス属(Lupinus)、リコペルシコン属(Lycopersicon)、リコポディウム属(Lycopodium)、マニホット属(Manihot)、メディカゴ属(Medicago)、メンタ属(Mentha)、アポリポプロテインカンツス属(Apolipoproteincanthus)、ムサ属(Musa)、ニコチアナ属(Nicotiana)、オリザ属(Oryza)、パニクム属(Panicum)、パパベル属(Papaver)、パルテニウム属(Parthenium)、ペンニセツム属(Pennisetum)、ペチュニア属(Petunia)、ファラリス属(Phalaris)、フレウム属(Phleum)、ピヌス属(Pinus)、ポア属(Poa)、ポインセチア属(Poinsettia)、ポプルス属(Populus)、ラウオルフィア属(Rauwolfia)、リシヌス属(Ricinus)、ロサ属(Rosa)、サッカルム属(Saccharum)、サリクス属(Salix)、サンギナリア属(Sanguinaria)、スコポリア属(Scopolia)、セカレ属(Secale)、ソラヌム属(Solanum)、ソルガム属(Sorghum)、スパルティナ属(Spartina)、スピナキア属(Spinacea)、タナセタム属(Tanacetum)、タクサス属(Taxus)、テオブロマ属(Theobroma)、トリチコセカレ属(Triticosecale)、トリチクム属(Triticum)、ウニオラ属(Uniola)、ベラトルム属(Veratrum)、ビンカ属(Vinca)、ヴィティス属(Vitis)およびゼア属(Zea)のメンバーが例示できる。
【０１０３】
他の適切な種としては、パニクム種(Panicum spp.)、ソルガム種(Sorghum spp.)、アポリポプロテインカンサス種(Apolipoproteincanthus spp.)、サッカルム種(Saccharum spp.)、エリアンサス種(Erianthus spp.)、ポプルス種(Populus spp.)、アンドロポゴン・ゲラルディイ(Andropogon gerardii)(ビッグブルーステム)、ペンニセツム・プルプレウム(Pennisetum purpureum)(力芝)、ファラリス・アルンディナケア(Phalaris arundinacea)(クサヨシ)、キノドン・ダクティロン(Cynodon dactylon)(バミューダグラス)、フェスツカ・アルンディナケア(Festuca arundinacea)(鬼牛の毛草)、スパルティナ・ペクティナタ(Spartina pectinata)(プレーリーコード草)、メディカゴ・サティウァ(Medicago sativa)(アルファルファ)、アルンド・ドナックス(Arundo donax)(ジャイアントリード)、セカレ・ケレアレ(Secale cereale)(ライ麦)、サリクス種(Salix spp.)(ヤナギ)、ユーカリプタス種(Eucalyptus spp.)(ユーカリノキ)、トリチコセカレ(Triticosecale)(トリチクム(triticum)--小麦.タイム.ライ麦)、タケ、ヘリアンサス・アンヌス(Helianthus annuus)(ヒマワリ)、カルタムス・ティンクトリウス(Carthamus tinctorius)(ベニバナ)、ジャトロファ・クルカス(Jatropha curcas)(ジャトロファ)、リキヌス・コムムニス(Ricinus communis)(ヒマシ)、エラエイス・ギネエンシス(Elaeis guineensis)(ヤシ)、リヌム・ウシタティッシムム(Linum usitatissimum)(アマ)、ブラッシカ・ユンケア(Brassica juncea)、ベタ・ブルガリス(Beta vulgaris)(テンサイ)、マニホット・エスクレンタ(Manihot esculenta)(キャッサバ)、リコペルシコン・エクスレンタム(Lycopersicon esculentum)(トマト)、ラクツカ・サティバ(Lactuca sativa)(レタス)、ムサ・パラディシアカ(Musa paradisiaca)(バナナ)、ソラヌム・ツベロスム(Solanum tuberosum)(ジャガイモ)、ブラシカ・オレラシア(Brassica oleracea)(ブロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ)、カメリア・シネンシス(Camellia sinensis)(茶)、フラガリア・アナナッサ(Fragaria ananassa)(イチゴ)、テオブロマ・カカオ(Theobroma cacao)(ココア)、コフィア・アラビカ(Coffea arabica)(コーヒー)、ヴィティス・ヴィニフェラ(Vitis vinifera)(ブドウ)、アナナス・コモサス(Ananas comosus)(パイナップル)、カプシクム・アンヌウム(Capsicum annum)(唐辛子およびシシトウ)、アリウム・セパ(Allium cepa)(タマネギ)、ククアポリポプロテイン・メロ(CucuApolipoprotein melo)(メロン)、ククアポリポプロテイン・サティウス(CucuApolipoprotein sativus)(キュウリ)、ククルビタ・マクシマ(Cucurbita maxima)(スカッシュ)、ククルビタ・モスカータ(Cucurbita moschata)(スカッシュ)、スピナキア・オレラケア(Spinacea oleracea)(ホウレンソウ)、シトルルス・ラナタス(Citrullus lanatus)(スイカ)、アベルモスクス・エスクレンツス(Abelmoschus esculentus)(オクラ)、Solanum melongena(ソラナム・メロンゲーナ)(ナス)、ロサ種(Rosa spp.)(バラ)、ディアンツス・カリオフィルス(Dianthus caryophyllus)(カーネーション)、ペチュニア種(Petunia spp.)(ペチュニア)、ポインセチア・プルケリマ(Poinsettia pulcherrima)(ポインセチア)、ルピナス・アルブス(Lupinus albus)(ルピナス)、ウニオラ・パニクラータ(Uniola paniculata)(燕麦)、ベントグラス(アグロスチス種(Agrostis spp.))、ポプルス・トレムロイデス(Populus tremuloides)(アスペン)、ピヌス種(Pinus spp.)(マツ)、アビエス種(Abies spp.)(モミ)、アセル種(Acer spp.)(カエデ)、ホルデウム・ウルガレ(Hordeum vulgare)(大麦)、ポア・プラテンシス(Poa pratensis)(ブルーグラス)、ロリウム種(Lolium spp.)(ライグラス)及びフレ��ム・プラテンセ(Phleum pratense)(オオアワガエリ)、パニクム・ウィルガツム(Panicum virgatum)(スイッチグラス)、ソルガム・ビカラー(Sorghum bicolor)(ソルガム、スーダングラス)、アポリポプロテインカンサス・ギガンテウス(Apolipoproteincanthus giganteus)(アポリポプロテインカンサス)、サッカルム種(Saccharum sp.)(エネルギーケイン)、ポプルス・バルサミフェラ(Populus balsamifera)(ポプラ)、ゼア・マイス(Zea mays)(コーン)、グリシン・マックス(Glycine max)(大豆)、ブラッシカ・ナプス(Brassica napus)(カノーラ)、トリチクム・アエスチウム(Triticum aestivum)(小麦)、ゴシピウム・ヒルスツム(Gossypium hirsutum)(綿)、オリザ・サティバ(Oryza sativa)(米)、ヘリアンサス・アンヌス(Helianthus annuus)(ヒマワリ)、メディカゴ・サティウァ(Medicago sativa)(アルファルファ)、ベタ・ブルガリス(Beta vulgaris)(テンサイ)又はペンニセツム・グラウクム(Pennisetum glaucum)(トウジンビエ)が例示できる。
【０１０４】
特に適切な実施態様では、植物宿主細胞は、天然タバコ植物、変異タバコ植物、非天然タバコ植物又はトランスジェニックタバコ植物であってもよく、それらに由来してもよい。タバコ植物は、ニコチアナ属の植物であって、N.ルスチカ(N. rustica)及び/又はN.タバカムを含むニコチアナ属の種々の種を含む。他の種としては、N.アカウリス(N. acaulis)、N.アクミナタ(N. acuminata)、N.アクミナタ・変種マルチフロラ(N. acuminata var. multiflora)、N.アフリカナ(N. africana)、N.アラタ(N. alata)、N.アムプレキシカウリス(N. amplexicaulis)、N.アレントシ(N. arentsii)、N.アテヌアタ(N. attenuata)、N.ベナビデシ(N. benavidesii)、N.ベンサミアナ(N. benthamiana)、N.ビゲロビ(N. bigelovii)、N.ボナリエンシス(N. bonariensis)、N.カビコラ(N. cavicola)、N.クレベランジ(N. clevelandii)、N.コルジフォリア(N. cordifolia)、N.コリンボサ(N. corymbosa)、N.デブネイ(N. debneyi)、N.エクセルシオル(N. excelsior)、N.フォルゲチア(N. forgetiana)、N.フラグランス(N. fragrans)、N.グラウカ(N. glauca)、N.グルチノサ(N. glutinosa)、N.グッドスピーディ(N. goodspeedii)、N.ゴセイ(N. gossei)、N.ハイブリッド(N.hybrid)、N.イングルバ(N. ingulba)、N.カワカミ(N. kawakamii)、N.ナイチアナ(N. knightiana)、N.ラングスドルフィ(N. langsdorffii)、N.リネアリス(N. linearis)、N.ロンギフロラ(N. longiflora)、N.マリチマ(N. maritima)、N.メガロシホン(N. megalosiphon)、N.ミエルシ(N. miersii)、N.ノクチフロラ(N. noctiflora)、N.ヌジカウリス(N. nudicaulis)、N.オブツシフォリア(N. obtusifolia)、N.オシデンタリス(N. occidentalis)、N.オシデンタリス・亜種ヘスペリス(N. occidentalis subsp. hesperis)、N.オトホラ(N. otophora)、N.パニクラータ(N.paniculata)、N.パウシフロラ(N. pauciflora)、N.ペツニオイデス(N. petunioides)、N.プルムバギニフォリア(N. plumbaginifolia)、N.クアドリバルビス(N. quadrivalvis)、N.ライモンジ(N. raimondii)、N.レパンダ(N. repanda)、N.ロスラタ(N. rosulata)、N.ロスラタ・亜種イングルバ(N. rosulata subsp. ingulba)、N.ロツンジホリア(N. rotundifolia)、N.セトケリ(N. setchellii)、N.シムランス(N. simulans)、N.ソラニフォリア(N. solanifolia)、N.スペガジニ(N. spegazzinii)、N.ストクトニ(N. stocktonii)、N.スアベオレンス(N. suaveolens)、N.シルベストリス(N. sylvestris)、N.タバカム(N. tabacum)、N.チルシフロラ(N. thyrsiflora)、N.トメントサ(N. tomentosa)、N.トメントシホルアポリポプロテイン(N. tomentosiforApolipoprotein)、N.トリゴノフィラ(N. trigonophylla)、N.アンブラチカ(N. umbratica)、N.アンドゥラタ(N. undulata)、N.ベルチナ(N. velutina)、N.ウィガンジオイデス(N. wigandioides)及びN.xサンデラエ(N. x sanderae)が挙げられる。
【０１０５】
栽培品種若しくは優良栽培品種であるか、又はそれらに由来する植物宿主細胞の使用も考えられる。変種または栽培品種の非限定的な例は、BD 64、CC 101、CC 200、CC 27、CC 301、CC 400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、Coker 176、Coker 319、Coker 371 Gold、Coker 48、CD 263、Denzizli、DF911、Galpaoタバコ、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、HB 04P、K 149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY10、KY14、KY 160、KY 17、KY 171、KY 907、KY907LC、KTY14xL8 LC、Karabaglar、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY 14xL8、Narrow Leaf Madole、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、OXFORD 207、'Perique'タバコ、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight 172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、TI 1406、TI 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR (Tom Rosson) Madole、Turkish Samson、VA 309、VA359、DAC、Mata、Fina、PO2、BY-64、AS44、RG17、RG8、HB04P、Basma Xanthi BX 2A、Coker 319、Hicks、McNair 944 (MN 944)、Burley 21、K149、Yaka JB 125/3、Kasturi Mawar、NC 297、Coker 371 Gold、PO2、Wislica、Simmaba、Turkish Samsun、AA37-1、B13P、交配種BU21 x Hoja Parado 97株からのF4、Samsun、PO1、LA B21、LN KY171、TI 1406、Basma、Galpao、Perique、Beinhart 1000-1又はPeticoである。N.タバカム栽培品種の非限定的な例は、AA37-1、B13P、Xanthi(Mitchell-Mor)、KTRD#3ハイブリッド107、Bel-W3、79-615、Samsun Holmes NN、KTRDC#2ハイブリッド49、KTRDC#4ハイブリッド110、Burley 21、BY-64、KTRDC#5 KY 160 SI、KTRDC#7 FCA、KTRDC#6 TN 86 SI、Coker 371 Gold、K 149、K 326、K 346、K 358、K 394、K 399、K 730、KY 10、KY 14、KY 160、KY 17、KY 8959、KY 9、KY 907、MD 609、McNair 373、NC 2000、PG 01、PG 04、M066、PO1、PO2、PO3、RG 11、RG 17、RG 8、Speight G-28、TN 86、TN 90、VA 509、AS44、Banket A1、Basma Drama B84/31、Basma I Zichna ZP4/B、 Basma Xanthi BX 2A、Batek、Besuki Jember、C104、Coker 319、Coker 347、Criollo Apolipoproteinionero、DAC Mata Fina、Delcrest、Djebel 81、DVH 405、Galpao Comum、HB04P、 Hicks Broadleaf、Kabakulak Elassona、Kasturi Mawar、Kutsage E1、KY 14xL8、 KY 171、LA BU 21、McNair 944、NC 2326、NC 71、NC 297、NC 3、PVH 03、PVH 09、 PVH 19、PVH 2110、Red Russian、Samsun、Saplak、Simmaba、Talgar 28、Turkish Samsun、Wislica、Yayaldag、NC 4、TR Madole、Prilep HC-72、Prilep P23、Prilep PB 156/1、Prilep P12-2/1、Yaka JK-48、Yaka JB 125/3、TI-1068、KDH-960、TI-1070、 TW136、Samsun NN、Izmir、Basma、TKF 4028、L8、TKF 2002、TN90、GR141、Basma xanthi、GR149、GR153、Petit Havana又はXanthi NNである。
【０１０６】
植物宿主細胞は、組換えアポリポプロテインの発現及び／又は活性を改善するために改変してもよい。宿主細胞は、例えば、アポリポプロテインの形成を更に促進するシャペロンタンパク質を含むように改変してもよい。宿主細胞は、アポリポプロテインの発現をより効率的に制御するためにリプレッサータンパク質を含むように、又は更に発現レベルを改善するためにエンハンサータンパク質を含むように改変してもよい。
【０１０７】
植物においてアポリポプロテインを製造する方法は、前記植物において、融合タンパク質としてアポリポプロテインを発現できる条件下で前記植物を生育する第２の工程を含んでいる。従って、アポリポプロテインポリペプチドは、融合タンパク質として該ポリペプチドを発現させるのに適切な培養条件下で形質転換された植物細胞をインキュベートすることによって調製される。得られたポリペプチドは、タンパク質顆粒の形態で植物細胞の小胞体に発現される。
【０１０８】
アポリポプロテインの発現は、細胞中のアポリポプロテインポリペプチドをコードするmRNAの量を検出することによって測定してもよく、それは、例えば、PCR又はノーザンブロットによって定量することができる。試料中のアポリポプロテインポリペプチドの量の変化を測定する場合、公知の技術を用いて細胞中のアポリポプロテインポリペプチドを定量するため、抗アポリポプロテイン抗体の使用によるアポリポプロテインの検出を利用できる。或いは、アポリポプロテインの生物学的活性を測定することができる。
【０１０９】
融合タンパク質を含むタンパク質顆粒を回収するために、種々の方法を使用してもよい。組換えタンパク質顆粒様集積体は、特定の融合タンパク質に関する所定の密度を有する。所定の密度は、典型的には、ホモジネート中に存在する実質的に全部の内因性宿主細胞タンパク質の密度を超え、典型的には約１．１〜約１．３５ｇ／ｍｌである。この高密度のタンパク質顆粒は、多量体として集積し、蓄積する組換え融合タンパク質の一般的な能力に起因し得る。タンパク質顆粒は、植物において発現する場合、典型的には約１ミクロンの直径を有する球形の形状であり、周囲の膜を有する。
【０１１０】
密度によるタンパク質顆粒の回収は、典型的には、遠心機を用いて行われる。遠心分離は、密度勾配を与える溶質［例えば塩（例えば塩化セシウム）又は糖（例えばショ糖）］の存在下で行ってもよい。ホモジネート中に異なる密度の領域を形成し、比較的高い濃度のタンパク質顆粒を含む領域と、比較的低い濃度のタンパク質顆粒を含む領域とを提供してもよい。タンパク質顆粒の少ない領域を比較的高い濃度のタンパク質顆粒を含む領域から分離することにより、前記融合タンパク質を回収してもよい。本明細書に記載されるように、融合タンパク質を含むタンパク質顆粒の単離の前に、タンパク質顆粒を回収するか、又は１以上の試薬で処理するか、又は１以上の手順に供することができる。幾つかの実施態様では、回収したタンパク質顆粒は、融合タンパク質の単離を必要とすることなく、そのまま用いられる。
【０１１１】
幾つかの実施態様では、１回の低速遠心分離工程で、ペレットの形態でタンパク質顆粒を十分に回収し得る。従って、具体例として、４℃、２００×ｇで１０分間の遠心分離で十分であり得る。他の実施態様では、低速遠心分離工程を１以上の高速遠心分離工程と組み合わせた２以上の遠心分離工程を行ってもよい。従って、具体例として、固形物及び細胞の破片を除去するための４℃、約２００×ｇ、１０分間の遠心分離工程と、融合タンパク質をペレットに回収するための、例えば４℃、約６０００×ｇ、１０分間の高速遠心分離工程とを組み合わせてもよい。
【０１１２】
この遠心分離工程に続いて、必要により、タンパク質顆粒の可溶化の前に、タンパク質顆粒を濃縮及び富化するための更なる任意の遠心分離工程と共に、界面活性剤（例えば、非イオン性界面活性剤）を含む溶液での１以上の洗浄工程を行ってもよい。更なる任意の遠心分離工程は、洗浄の合間に行ってもよい。一実施態様では、使用される界面活性剤はトリトンＸ−１００であり、適切には１％トリトンＸ−１００である。他の実施態様では、更なる遠心分離工程が４℃、約６０００×ｇで１０分間行われ、これは洗浄の合間に行ってもよい。
【０１１３】
従って、本発明の一実施態様では、本方法は、植物又は植物材料から融合タンパク質を含むタンパク質顆粒を回収する追加の工程（c）であって、前記工程（c）は、好ましくは、（i）植物材料をホモジナイズする工程；（ii）ホモジナイズした植物材料を、低速、好ましくは約２００×ｇで遠心分離する工程；（iii）ホモジナイズした植物材料を工程（ii）よりも高速、好ましくは約６０００×ｇで遠心分離する工程；及び（iv）融合タンパク質を含むタンパク質顆粒をペレット分画に回収する工程を含む。
【０１１４】
ペレット分画に含まれる融合タンパク質を可溶化するため、種々の緩衝液及び試薬を使用してもよい。具体例として、洗剤及び／又は還元剤を含む水性緩衝液に周囲の膜を溶出することによって、回収したタンパク質顆粒からアポリポプロテインを含む融合タンパク質を得てもよい。還元剤の例としては、２−メルカプトエタノール、チオグリコール酸、チオグリコール酸塩、ジチオトレイトール（DTT）、亜硫酸塩又は亜硫酸水素イオンが挙げられる。洗剤の例としては、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、イオン性洗剤（例えば、デオキシコール酸塩及びラウロイルサルコシン)、非イオン性洗剤（例えば、ツイーン20、Nonidet P-40及びオクチルグルコシド）及び双性イオン洗剤（例えばCHAPS）が挙げられる。結合したアポリポプロテインを破壊しアンフォールドしないように条件が選択される。
【０１１５】
適切な可溶化条件を同定するために試験され得る変数としては、ｐＨ、塩、洗剤、還元剤並びに他の変数、例えば、成分比、時間及び温度が挙げられる。一実施態様では、尿素、ジチオトレイトール及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンを含む緩衝液を用い、適切には１：１０（ｗ／ｖ）のタンパク質顆粒：緩衝液比で可溶化を行うことができる。タンパク質顆粒は、終夜室温で緩衝液と共にインキュベートしてもよく、及び／又は細胞破砕機と共にインキュベートしてもよい。緩衝液の所望のｐＨに応じて、種々の緩衝液を用いることができる。ｐＨ範囲を調節するために使用できる緩衝液成分の非限定的な例としては、アセテート、シトレート、ヒスチジン、ホスフェート、アンモニウム緩衝液、例えば、酢酸アンモニウム、スクシナート、MES、CHAPS、MOPS、MOPSO、HEPES、トリスなど、並びにこれらのトリス−リンゴ酸−NaOHの組み合わせ、マレエート、クロロアセテート、ホルメート、ベンゾエート、プロピオナート、ピリジン、ピペラジン、ADA、PIPES、ACES、BES、TES、トリシン、ビシン、TAPS、エタノールアミン、CHES、CAPS、メチルアミン、ピペリジン、ホウ酸、炭酸、乳酸、ブタネアン二酸、ジエチルマロン酸、グリシルグリシン、HEPPS、HEPPSO、イミダゾール、フェノール、POPSO、コハク酸、TAPS、アミン系のベンジルアミン、トリメチルアミン、ジメチルアミン、エチルアミン、フェニルアミン、エチレンジアミン又はモホリンが挙げられる。一実施態様では、緩衝液のｐＨは約８である。他の実施態様では、緩衝液は、還元剤（好ましくはβメルカプトエタノール）と、非イオン性界面活性剤（好ましくはTriton X-100）と、必要により塩（好ましくは塩化ナトリウム）とを含む、５０ｍＭトリスｐＨ９である。他の実施態様では、緩衝液は、約２０ｍＭのβ−メルカプトエタノールと、約１％のTriton X-100と、約５００ｍＭの塩化ナトリウムとを含む、約５０ｍＭトリスｐＨ９である。
【０１１６】
従って、本発明の方法は、融合タンパク質を可溶化する更なる工程（d）であって、前記可溶化工程が、好ましくは、還元剤、非イオン性界面活性剤及び必要により塩を含むか、それらからなるか、又は実質的にそれらからなる混合物の使用を含む、前記工程を含んでいてもよい。必要により、次の方法工程の前に、例えば、４℃、約１６０００×ｇで１０分間、調製物を遠心分離してもよい。
【０１１７】
アポリポプロテインタンパク質を含む分離可溶化融合タンパク質を回収する。この工程で、アポリポプロテインタンパク質は、そのまま用いてもよい。好ましくは、アポリポプロテインタンパク質は、さらに処理される。
【０１１８】
従って、一実施態様では、本方法は前記融合タンパク質からアポリポプロテインを放出する更なる工程を含んでいる。融合タンパク質からのアポリポプロテインの切断は、本明細書に記載される。
【０１１９】
更なる実施態様では、本方法は、切断工程に続いて、切断／放出されたアポリポプロテインを精製する追加の工程（f）を含んでいる。従って、一実施態様では、このように精製された組換えアポリポプロテインは、例えばSDS-PAGE又はELISAによって測定される他のポリペプチドを実質的に含まない。他の実施態様では、精製されたアポリポプロテインは、例えばSDS-PAGEまたはELISAによって測定されるとおり、１００ｐｐｍ未満の宿主タンパク質、適切には９０ｐｐｍ未満、８０ｐｐｍ未満、７０ｐｐｍ未満、６０ｐｐｍ未満、５０ｐｐｍ未満、４０ｐｐｍ未満、３０ｐｐｍ未満、２０ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満又は５ｐｐｍ未満の宿主タンパク質を含むアポリポプロテイン組成物であるとみなされる。本発明によって製造される又は製造可能なアポリポプロテインは、その配列が由来する天然タンパク質の比活性の少なくとも５０％、６０％又は７０％、最も適切には少なくとも８０％、９０％、９５％又は１００％の比活性を有し得る。
【０１２０】
タンパク質精製には、負に荷電し、吸着剤又は固相を横切る又は通過する水溶液中のカチオンとの交換のための遊離カチオンを有する「陽イオン交換樹脂」を用いてもよい。下記のように、陽イオン交換樹脂を形成するのに適切な任意の負に荷電したリガンド、例えば、カルボキシレート、スルホネートなどを用いることができる。市販の陽イオン交換樹脂としては、限定されないが、例えば、スルホネート系の基を有する樹脂（例えば、GEヘルスケア社製のMonoS、MiniS、Source 15S及び3OS、SP Sepharose Fast Flow（登録商標）、SP Sepharose High Performance、Tosoh社製のToyopearl SP-650S及びSP-650M、BioRad社製のMacro-Prep High S、Pall Technologies社製のCeramic HyperD S、Trisacryl M及びLS SP及びSpherodex LS SP）；スルホエチル系の基を有する樹脂（例えば、EMD社製のFractogel SE、Applied Biosystems社製のPoros S-10及びS-20）；スルホプロピル系の基を有する樹脂（例えば、Tosoh社製のTSK Gel SP 5PW及びSP-5PW-HR、Applied Biosystems社製のPoros HS-20及びHS 50）；スルホイソブチル系の基を有する樹脂（例えば、（EMD社製のFractogel EMD SO3"）；スルホキシエチル系の基を有する樹脂（例えば、Whatman社のSE52、SE53及びExpress-Ion S）、カルボキシメチル系の基を有する樹脂（例えば、GEヘルスケア社製のCM Sepharose Fast Flow、Biochrom Labs社製のHydrocell CM、BioRad社製のMacro-Prep CM、Pall Technologies社製のCeramic HyperD CM、Trisacryl M CM、Trisacryl LS CM、ミリポア社製のMatrx Cellufme C500及びC200、Whatman社製のCM52、CM32、CM23及びExpress-Ion C、Tosoh社製のToyopearl CM-650S、CM-650M及びCM-650C）；スルホン酸及びカルボン酸系の基を有する樹脂（例えば、J.T. Baker社製のBAKEPVBOND Carbpxy-Sulfon）；カルボン酸系の基を有する樹脂（例えば、J.T Baker社製のWP CBX、Dow Liquid Sepations社製のDOWEX MAC-3、Sigma-Aldrich社製のAmberlite Weak Cation Exchangers、DOWEX Weak Cation Exchanger及びDiaion Weak Cation Exchangers並びにEMD社製のFractogel EMD COO-）；スルホン酸系の基を有する樹脂（例えば、Biochrom Labs社製のHydrocell SP、Dow Liquid Sepations社製のDOWEX Fine Mesh Strong Cation Resin、J.T. Baker社製のUNOsphere S、WP Sulfonic、Sartorius社製のSartobind S膜、Sigma-Aldrich社製のAmberlite Strong Cation Exchangers、DOWEX Strong Cation及びDiaion Strong Cation Exchanger）；並びにオルトホスフェート系の基を有する樹脂（例えば、Whatman社製のPl 1）を含む。
【０１２１】
タンパク質精製には、正に荷電し、従って１以上の正に荷電した結合リガンドを有する「陰イオン交換樹脂」を用いることができる。吸着剤又は固相に結合した、陰イオン交換樹脂を形成するのに適切な任意の正に荷電したリガンド、例えば、第四級アミノ基を用いることができる。市販の陰イオン交換樹脂としては、Applied Biosystems社製のDEAEセルロース、Poros PI 20、PI 50、HQ 10、HQ 20、HQ 50、D 50、Sartorius社製のSartobind Q、（GEヘルスケア社製の）MonoQ、MiniQ、Source15Q及び3OQ、Q、DEAE及びANX Sepharose Fast Flow、Q Sepharose high Performance、QAE SEPHADEX（登録商標）及びFAST QSepharose（登録商標）、J.T. Baker社製のWP PEI、WP DEAM、WP QUAT、Biochrom Labs社製のHydrocell DEAE及びHydrocell QA、Biorad社製のUNOsphere Q、Macro-Prep DEAE及びMacro-Prep High Q、Pall Technologies社製のCeramic HyperD Q、ceramic HyperD DEAE、Trisacryl M及びLS DEAE、Spherodex LS DEAE、QMA Spherosil LS、QMA Spherosil M及びMustang Q、Dow Liquid Separations社製のDOWEX Fine Mesh Strong Base Type I and Type II Anion Resins及びDOWEX MONOSPHER E77、弱塩基アニオン、ミリポア社製のIntercept Q膜、Matrex Cellufme A200、A500、Q500及びQ800、EMD社製のFractogel EMD TMAE、Fractogel EMD DEAE及びFractogel EMD DMAE、Sigma-Aldrich社製のAmberiite weak strong anion exchangers type I and II、DOWEX weak and strong anion exchangers type I and II、Diaion weak and strong anion exchangers type Iand II、Duolite、Tosoh社製のTSKゲルQ及びDEAE 5PW及び5PW-HR、Toyopearl SuperQ-650S、650M及び650C、QAE-550C及び650S、DEAE-650M及び650C、Whatman社製のQA52、DE23、DE32、DE51、DE52、DE53、Express-Ion D及びExpress-Ion Qが挙げられる。
【０１２２】
「アフィニティークロマトグラフィー」は、タンパク質精製の別の方法であり、通常、空間的相補性と、結合部位における１種以上の化学的相互作用、例えば、静電力、水素結合、疎水性力及びファンデルワールス力との組み合わせでタンパク質が生物学的に特異的なリガンドに可逆的かつ特異的に結合する分離方法を意味する。これらの相互作用は、例えば、等電点、疎水性又はサイズなどの分子の一般的特性によるのではなく、タンパク質とリガンドとの間の特異的相互作用、例えば、エピトープに対する免疫グロブリン結合、免疫グロブリンに対するプロテインA結合、生物学的反応修飾剤とその細胞表面受容体との間の相互作用の結果による。多くの場合、生物学的に特異的なリガンドも、タンパク質又はポリペプチドであり、固相、例えばビーズに固定できる。
【０１２３】
「混合モードイオン交換樹脂」は、タンパク質精製の別の方法であり、陽イオン部分、陰イオン部分又は疎水性部分で共有結合的に改変された固相を意味する。混合モードイオン交換樹脂の例としては、BAKERBOND ABX (登録商標)（J. T. Baker社；ニュージャージー州フィリップスバーグ）、セラミックヒドロキシアパタイトタイプI及びII並びにフルオリドヒドロキシアパタイト（BioRad社；カリフォルニア州ハーキュリーズ）並びにMEP及びMBI HyperCel（Pall Corporation社；ニューヨーク州イーストヒルズ）が挙げられる。疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（又は「ＨＣＩＣ」）は、混合モードクロマトグラフィープロセスの一種であり、混合物中のタンパク質が、添加塩（例えば、離液性塩）の非存在下で弱い疎水性相互作用によって、イオン化可能なリガンドに結合する。混合モードは、結合のためのあるモード及び溶離のためのもう１つのモードを意味する。例えば、ＨＣＩＣに有用な固相は、その分離能力のために、チオフィリック作用の特性を組み合わせた（すなわち、チオフィリッククロマトグラフィーの特性を利用する）リガンドである疎水性基及びイオン化可能基を含む。従って、本発明の方法に用いる吸着剤は、中性（生理学的）又は弱酸性のｐＨ、例えばｐＨ約５〜１０、好ましくはｐＨ約６〜９．５でイオン化可能であり、弱い疎水性のリガンドを含む。このｐＨでは、リガンドは主に非荷電であり、弱い非特異的疎水性相互作用によってタンパク質に結合する。ｐＨが低下すると、そのｐＨシフトにより、リガンドは電荷を獲得し、溶質に対する帯電反発によって、疎水性結合は破壊される。ＨＣＩＣに使用するための適切なリガンドの例としては、任意のイオン化可能な芳香族又は複素環構造（例えば、ピリジン構造、例えば、２−アミノメチルピリジン、３−アミノメチルピリジン及び４−アミノメチルピリジン、２−メルカプトピリジン、４−メルカプトピリジン又は４−メルカプトエチルピリジン、メルカプト酸、メルカプトアルコール、イミダゾリル系、メルカプトメチルイミダゾール、２−メルカプトベンゾイミダゾール、アミノメチルベンゾイミダゾール、ヒスタミン、メルカプトベンゾイミダゾール、ジエチルアンモプロピルアミン、アミノプロピーノルホリン、アミノプロピルイミダゾール、アミノカプロン酸、ニトロヒドロキシ安息香酸、ニトロチロシン／エタノールアミン、ジクロロサリチル酸、ジブロモチラミン、クロロヒドロキシフェニル酢酸、ヒドロキシフェニル酢酸、チラミン、チオフェノール、グルタチオン、ビスルフェート及び色素並びにそれらの誘導体が挙げられる。
【０１２４】
一実施態様では、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーを使用する。これは、タンパク質と金属イオンとの配位共有結合に基づく分離方法である。タンパク質は、実質的に金属イオンに対する異なるアフィニティー範囲をもたらす幅広い種類のアミノ酸組成を有する。様々なタンパク質を分離するために、幾つかの異なる種類の固定化金属イオンカラムが開発されている（例えば、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｃｄ、Ｎｉ又はＺｎ）。従って、一実施態様では、プロラミン、好ましくはγ−ゼインタンパク質が、金属イオンカラムに固定化される。他の実施態様では、固定化ニッケルカラムが使用される。
【０１２５】
他の実施態様では、逆相クロマトグラフィーが使用されるが、それは、非極性固定相を用いるクロマトグラフ法を意味する。他の実施態様では、高速逆相タンパク質液体クロマトグラフィーが使用される。
【０１２６】
他の実施態様では、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーと逆相クロマトグラフィーとの組み合わせが使用される。適切には、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーが最初に使用され、続いて、逆相クロマトグラフィーが使用される。
【０１２７】
また、当該分野で開示されるアポリポプロテインの精製方法を、本明細書に記載の方法の代わりに使用してもよく、本明細書に記載の方法に加えて使用してもよい。具体例として、WO9811140には、アポリポプロテインを精製するための主要な水溶液に用いられる組成物であって、第１及び第２のポリマー材料を含み、前記第１及び第２のポリマー材料が前記主要な水溶液に固定化可能であり、前記第２のポリマー材料が両親媒性かつ水溶性である、前記組成物が開示されている。アポリポプロテインを精製する方法は、アポリポプロテインと前記組成物と水とを混合する工程と、得られた主要な水溶液を、形成された相を実質的に分離するのに十分な期間、維持する工程と、前記第２のポリマー材料及びアポリポプロテインの大部分を含む相を取り出す工程と、その後、アポリポプロテインから前記第２のポリマー材料を分離する工程とを含んでいる。
【０１２８】
一実施態様では、植物においてアポリポプロテインを製造する方法は、（a）植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導するプロラミンタンパク質、好ましくはγ−ゼインをコードする核酸配列とアポリポプロテインをコードする核酸配列とを含むか、それらからなるか、又は実質的にそれらからなり、前記核酸配列が互いに作動可能に連結している核酸構築物で植物を形質転換する工程；（b）前記植物において融合タンパク質としてアポリポプロテインを発現できる条件下で前記植物を生育する工程；（c）前記植物から前記融合タンパク質を含むタンパク質顆粒を回収する工程；（d）前記融合タンパク質を可溶化する工程；（e）前記融合タンパク質からアポリポプロテインを放出する工程；及び（f）放出されたアポリポプロテインを精製する工程を含んでいる。
【０１２９】
更なる態様は、本明細書に記載のように、前記核酸配列と、前記核酸配列の転写を調節する調節ヌクレオチド配列とを含む核酸構築物に関する。この構築物は、１以上のアポリポプロテイン核酸を含む、二重鎖の組換えＤＮＡ断片であってもよい。
【０１３０】
更なる態様は、前記核酸配列又は核酸構築物を含むベクターに関する。適切なベクターとしては、限定されないが、染色体外複製可能なエピソーム、例えば、環状二重鎖ＤＮＡプラスミド；線状化二重鎖ＤＮＡプラスミド；及び他の任意の起源のベクターなどが挙げられる。ベクターとしては、細菌及び／又は植物の形質転換に適したベクターが挙げられる。本明細書に記載の核酸配列又は構築物を含むベクターは、細胞に導入されるとき、前記細胞のゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（単数又は複数）と共に複製されるプラスミド、コスミド又は植物ベクターであってもよい。基本的な細菌又は植物ベクターは、適切には、広宿主域複製起点；選択マーカー；及び、アグロバクテリウム形質転換のため、アグロバクテリウムを媒介して植物染色体へ輸送するためのT-DNA配列を含む。異種配列の植物ゲノムへの組み込みを可能にするのに適した配列も使用し得る。これらとしては、トランスポゾン配列等、Ｃｒｅ／ｌｏｘ配列、相同組換えのための宿主ゲノム断片、及び植物ゲノムへのランダム挿入を可能にするＴｉ配列が挙げられる。
【０１３１】
本明細書に記載の融合タンパク質を発現するのに特に有用であり得る発現ベクターを作るため、プロモーターをベクターに組み込んでもよい。適切な発現ベクターとしては、染色体外複製が可能なエピソーム、例えば、環状二重鎖ＤＮＡプラスミド；線状化二重鎖ＤＮＡプラスミド；及び他の機能的に同等な任意の起源の発現ベクターが挙げられる。発現ベクターは、アポリポプロテイン核酸又はアポリポプロテイン核酸構築物などに作動可能に連結されるプロモーターを少なくとも含む。プロモーターは、アポリポプロテイン核酸に直接的に連結してもよく、核酸、例えば、融合タンパク質の１以上の成分をコードする核酸が中間に介在してもよい。
【０１３２】
核酸配列、核酸構築物、核酸ベクターなどの製造において、それらの種々の断片を、種々の処理条件、例えば、ライゲーション、制限酵素消化、ＰＣＲ、インビトロ変異誘発、リンカー及びアダプター付加などに供してもよい。従って、アポリポプロテイン発現のための構築物に用いられるDNAに、ヌクレオチド移行、転換、挿入、欠失などを行ってもよい。制限酵素消化、クレノウ平滑末端処理、ライゲーションなどのための方法は、当業者に公知であり、例えば、Maniatisら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）に記載されている。
【０１３３】
他の態様では、（i）植物においてタンパク質顆粒の形成を誘導するプロラミンタンパク質、好ましくはγ−ゼインをコードするアミノ酸配列；（ii）切断認識部位をコードするアミノ酸配列；及び（iii）アポリポプロテインをコードするアミノ酸配列を含んでおり、前記第１、第２及び第３のアミノ酸配列が互いに作動可能に連結している融合タンパク質が開示される。融合タンパク質は、植物細胞における安定な小胞体由来のタンパク質顆粒に蓄積される。
【０１３４】
更なる態様では、本明細書に記載の核酸配列、核酸構築物、ベクター又は融合タンパク質を含む植物又は植物材料が開示される。
【０１３５】
更なる態様では、本発明の方法によって製造される又は製造可能なアポリポプロテインが開示される。
【０１３６】
本発明によって製造される又は製造可能な組換えアポリポプロテイン又はアポリポプロテインを含み、かつ所望の純度を有するタンパク質顆粒の凍結乾燥製剤又は水溶液の形態の製剤は、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) を参照）と混合することによって、貯蔵のために調製してもよい。許容される担体、賦形剤又は安定剤としては、用いられる量及び濃度でレシピエントに毒性がなく、緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、オリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖、二糖及び他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体；又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【０１３７】
また、組換えアポリポプロテインは、公知の方法を用いてＰＥＧ化又はポリエチレングリコールに結合させることができる。ＰＥＧ化アポリポプロテインは、インビボでより安定であり得、治療を必要とする哺乳動物に投与されるとき、体内でより長い半減期をもたらす。一般的に、他の薬学的に重要なポリペプチドに用いる方法と同様な方法を用いて医薬組成物を処方し、投与してもよい。組換えアポリポプロテインは、凍結乾燥形態で保存し、投与の直前に滅菌水で再構成し、静脈内に投与してもよい。好ましくは、医薬製剤は、治療される特定の疾患のための所定用量滴定実験によって測定される用量で投与される。
【０１３８】
以下の実施例は例として提供されるものであり、限定のために提供されるものではない。特記しない限り、本発明は、分子生物学、植物生物学及び植物育種の慣用の手法及び方法を用いる。
【実施例】
【０１３９】
実施例１−材料及び方法
クローニング及び浸潤
γ−ゼイン野生型遺伝子、その断片及び変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物を、それぞれアポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏをコードする合成配列にライゲーションする。γ−ゼインの断片又は変異体が用いられる場合、その断片又は変異体に天然γ−ゼインシグナルペプチドが存在するとき、核酸構築物は、更に５’末端に天然γ−ゼインシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実験では、プロテアーゼ切断部位を含むリンカーをコードする合成核酸配列も、γ−ゼインコード配列とアポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏコード配列との間に位置して、構築物中に含まれる。アポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏのコード配列は、植物での発現に最適化されている。タバコ植物細胞における核酸構築物の発現をｍｉｎ３５Ｓプロモーターが促進する部位で、核酸構築物をベクターにクローニングする。
【０１４０】
クローニングした核酸構築物を含むベクターを、アグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumafaciens)Ａｇｌ１株に導入する。アグロバクテリウム細胞を、ロータリーシェーカー上でＯＤ６００が１．６を超えるまで、２８℃、２５０ｒｐｍで増殖する。増殖後、細菌を、４℃、８，０００ｇで１５分遠心分離することによって回収し、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2及び５ｍＭ（２−（ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸、ＭＥＳ）を含む浸潤溶液に再懸濁し、最終的にｐＨを５．６、ＯＤ６００を２にする。
【０１４１】
植物［ニコチアナベンサミアナ(Nicotiana benthamiana）］を、通常条件下で生育し、個々の葉を、シリンジを用い、標準法によって浸潤する。葉を注意深く逆さにし、背軸面を暴露し、細菌懸濁液を含む１ｍＬ無針シリンジを用いて、その葉の細胞内スペースに圧力で浸潤する。浸潤後６日から１０日で、熱シールポーチ中に葉片を回収し、シールし、ドライアイス層の間に少なくとも１０分置く。
【０１４２】
タンパク質顆粒の回収
タバコ葉を液体窒素中で粉砕し、抽出緩衝液（新鮮葉材料１ｇ当たり、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８、２００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び任意のプロテアーゼインヒビター（アプロチニン、ペプスタチン、ロイペプチン、フッ化フェニルメチルスルホニル及びＥ６４［（Ｎ−（Ｎ−（Ｌ−３−トランス−カルボキシオキシラン−２−カルボニル）−Ｌロイシル）−アグマチン）を用いてホモジナイズする。ホモジネートを４℃で２０分撹拌し、次いで遠心分離する（２４０００ｒｐｍ、２０分、４℃）。この材料を、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈで重力によって濾過し、遠心分離し（２００×ｇ、１０分、４℃）、続いて更に遠心分離する（６０００×ｇ、１０分、４℃）。ペレット分画を１％トリトンＸ−１００で洗浄し、２０分撹拌し、続いて更に遠心分離する（１５００×ｇ、１０分、４℃）。
【０１４３】
ウェスタンブロット分析
１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでタンパク質を分離し、セミドライ装置を用いてニトロセルロース膜（０．２２ｐｔＭ）に移行する。膜をγ−ゼイン特異的抗体（Ludevidら（1985）Plant Sci. 41: 41-48.）と共にインキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼ共役抗体と共にインキュベートする。免疫反応性バンドを増強化学発光（ＥＣＬウェスタンブロットシステム、Amersham社）によって検出する。
【０１４４】
ＥＬＩＳＡアッセイ
可溶性葉タンパク質抽出物及び部分的に精製された融合タンパク質についてのアポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏの定量のためにＥＬＩＳＡアッセイを行う。マイクロタイタープレート（MaxiSorp、Nalgene Nunc International社）に、リン酸緩衝化生理食塩水ｐＨ７．５（ＰＢＳ）で希釈した可溶性タンパク質（１００μｌ）を負荷し、終夜４℃でインキュベートする。ウェルを３回洗浄後、ＰＢＳ−Ｔ（０．１％ツイーン２０を含むＰＢＳ）中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用い、室温で１時間特異的結合をブロックする。このプレートをアポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏ抗血清と共に２時間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、ペルオキシダーゼ共役二次抗体と共に２時間インキュベートする。一次抗体及び二次抗体を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔで希釈する。ＰＢＳ−Ｔでよく洗浄した後、過酸化水素を含む基質緩衝液を用い、３７℃で酵素反応を行う。１０分後に２Ｎ硫酸を用いてこの反応を停止させ、Multiskan EX分光光度計（Labsystems社）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定する。アポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏ抗血清を用いて得た検量線から、植物抽出物中の抗原濃度を外挿する。
【０１４５】
タンパク質顆粒中に蓄積された融合タンパク質の可溶化
可溶化のために選択された緩衝液中で、融合タンパク質を終夜室温でインキュベートする。
【０１４６】
融合タンパク質の切断
アポリポプロテインのＮ末端で余分なアミノ酸を残すことなくアポリポプロテインを切断するため、種々様々な切断剤を分析する。切断は、５０ｍＭトリス ｐＨ８．０中、３０℃で３時間行う。試験用の切断剤は、エンテロキナーゼ、Ｘａ因子、ＴＥＶプロテアーゼ及びインテインである。
【０１４７】
放出されたアポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏの精製
アポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏを２０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．６に再懸濁し、ＰＤ １０カラム（Sephadex G-25M、Amersham Pharmacia社）で脱塩する。脱塩したタンパク質抽出物を、ニッケルを利用してγ−ゼインを結合する逆相固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーに供する。アポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏをカラムから溶出する。カラム上に融合タンパク質を負荷するために利用されるローディングバッファーは、５０ｍＭ トリス ｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含んでいる。AKTA Explorer逆相RESOURCE １ｍＬ逆相高速タンパク質液体クロマトグラフィーを利用する、逆相逆相高速タンパク質液体クロマトグラフィーに溶出したアポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏを供する。２％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸及び２０ｍＭ β−メルカプトエタノールを含む第１緩衝液並びに８０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸及び２０ｍＭ β−メルカプトエタノールを含む第２緩衝液を用いる。流速を１ｍｌ／分に調整し、０〜６０％の緩衝液（８０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸及び２０ｍＭ β−メルカプトエタノール）の１０ＣＶの勾配並びに６０〜１００％の緩衝液（８０％アセトニトリル、０．１％ＴＣＡ及び２０ｍＭ β−メルカプトエタノール）の２０ｍＣＶの勾配を用いる。１ｍｌ＋０．５ｍｌの容量で分画を溶出する。溶離分画におけるアポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏの存在は、１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、及びアポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏ抗血清を用いるイムノブロット検出によって評価する。陽性分画を脱塩し、５ Ｋ ＮＭＷＬ遠心濾過機（BIOMAX、Millipore社）で濃縮する。
【０１４８】
実施例２−アポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏ−γ−ゼイン融合タンパク質の発現レベル
γ−ゼイン−エンテロキナーゼ−アポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏ融合タンパク質構築物（γ−ゼイン−ＡｐｏＡ１）を上記のとおり調製し、アグロバクテリウムによるアグロ浸潤を用いてタバコ植物に形質転換する。総タンパク質を抽出し、γ−ゼイン−特異的抗体を用いるウェスタンブロットによって定量する。γ−ゼインを含まない同一条件下で発現したアポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏを用いる対照実験も実施する（ＡｐｏＡ１）。３回のアグロ浸潤事象の平均の発現レベルは次のとおりである。
【０１４９】
γ−ゼイン−アポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏについて、発現レベルは、約３〜６ｇ γ−ゼイン−アポリポプロテイン Ａ１ Ｍｉｌａｎｏ／ｋｇ新鮮重である。
【０１５０】
γゼインを含まないアポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏについて、発現レベルは、約２〜４ｇ アポリポプロテイン／ｋｇ新鮮重である。
【０１５１】
これらの平均結果に基づけば、γ−ゼインを含まないアポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏの発現レベルより、γ−ゼイン−アポリポプロテイン Ａ１ Ｍｉｌａｎｏの発現が最大約５０％高いということが結論付けられる。
【０１５２】
実施例３−γゼインにおける種々の非天然繰り返し配列モチーフの分析
種々の非天然繰り返し配列モチーフを用いて、γ−ゼイン−アポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏ融合構築物を調製する。以下の構築物を用いる：γ−ゼインペプチドのみ（γ−ゼイン−ｗｔ）；γ−ゼイン−(ＰＰＰＶＡＬ)ｎ；γ−ゼイン−(ＰＰＰＶＥＬ)ｎ；γ−ゼイン−(ＰＰＰＡＰＡ)ｎ；及びγ−ゼイン−(ＰＰＰＥＰＥ)ｎ。
【０１５３】
アグロバクテリウムによるアグロ浸潤を用いて、種々のタバコ植物に構築物を別々に形質転換する。総タンパク質を抽出し、γ−ゼイン−特異的抗体を用いるウェスタンブロットによって定量する。４回のアグロ浸潤事象の平均の発現レベルは次のとおりである。
【０１５４】
【表３】
2014502498.tif 000004
【０１５５】
結果は、アポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏを含まないγ−ゼインに対する相対的な定量化として表される。
【０１５６】
試験した４つの非天然繰り返し配列モチーフのうち、３つ（γ−ゼイン−(ＰＰＰＶＡＬ)ｎ、γ−ゼイン−(ＰＰＰＡＰＡ)ｎ及びγ−ゼイン−(ＰＰＰＥＰＥ)ｎは、γ−ゼイン−ｗｔ単独と比べて、アポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏの発現レベルを顕著に増大する。
【０１５７】
γ−ゼイン−(ＰＰＰＡＰＡ)ｎ及びγ−ゼイン−(ＰＰＰＥＰＥ)ｎの融合タンパク質の可溶性抽出物をトランスジェニックタバコ植物の葉から得て、低速（約１５００×ｇ）で遠心分離する。沈殿したタンパク質を緩衝液に再懸濁し、可溶化する。２回の試行にわたる可溶化後の収量は次のとおりである。
【０１５８】
【表４】
2014502498.tif 000005
【０１５９】
γ−ゼイン−(ＰＰＰＡＰＡ)ｎ及びγ−ゼイン−(ＰＰＰＥＰＥ)ｎの使用は、γ−ゼイン−ｗｔの使用と比べて、アポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏの可溶化収量を顕著に増大し、γ−ゼイン−(ＰＰＰＡＰＡ)ｎは、アポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏの可溶化収量を約７倍まで増大する。
【０１６０】
試験した全てのγゼインペプチドは、上清のタンパク質の明らかな損失を伴わない低速遠心分離後のペレットタンパク質の回収に見られるような、高密度構造での融合タンパク質の蓄積を可能にする。
【０１６１】
実施例５−融合タンパク質を含むタンパク質顆粒の回収
アポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏ融合タンパク質顆粒を回収するため、以下の方法を用いる。
【０１６２】
タバコ葉を液体窒素中で粉砕し、抽出緩衝液（新鮮葉材料１ｇ当たり、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８、２００ｍＭジチオトレイトール（DTT）及び任意のプロテアーゼインヒビター（アプロチニン、ペプスタチン、ロイペプチン、フッ化フェニルメチルスルホニル及びＥ６４［（Ｎ−（Ｎ−（Ｌ−３−トランス−カルボキシオキシラン−２−カルボニル）−Ｌロイシル）−アグマチン］を用いてホモジナイズする。ホモジネートを２０分撹拌し、２０分遠心分離し（２４０００ｒｐｍ、４℃）、２０分撹拌する。この混合物を、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈの１層を介して、重力によって濾過する。更なる遠心分離工程（４℃、２００×ｇで１０分）で固形物及び細胞の破片を除去し、第２の遠心分離工程（４℃、６０００×ｇで１０分）によってペレットに融合タンパク質を回収する。続いて、１％トリトンＸ−１００で１回洗浄し、２０分撹拌し、更なる遠心分離工程（４℃、１５００×ｇで１０分）を行う。この方法も、タンパク質顆粒の濃縮及び富化を可能にする。
【０１６３】
実施例６−タンパク質顆粒中に蓄積された融合タンパク質の可溶化
融合タンパク質を可溶化するため、種々の緩衝液を試験する。試験される変数としては、ｐＨ、塩、洗剤、尿素、還元剤、比率、時間及び温度が挙げられる。融合タンパク質を可溶化するために本実験で見出される一連の条件は、タンパク質顆粒：緩衝液比が１：２（ｗ／ｖ）で５０ｍＭ トリスｐＨ８、２０ｍＭ β−メルカプトエタノール、１％トリトンＸ−１００及び５００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液である。タンパク質顆粒を、終夜室温で緩衝液と共にインキュベートする。この条件での可溶化収量は約９５％である。
【０１６４】
実施例７−融合タンパク質の切断
アポリポプロテインＡ１ ＭｉｌａｎｏのＮ末端で余分なアミノ酸を残すことなくアポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏを融合タンパク質から切断するため、種々様々な切断剤を分析する。５０ｍＭ トリスｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ中、終夜室温で切断を行う。非タンパク質分解性の切断剤を使用する場合、緩衝液は、１×プロテアーゼインヒビターカクテル、ＥＤＴＡフリー（Roche社）を含んでいてもよい。種々の融合タンパク質と組み合わせて試験される切断剤としては、エンテロキナーゼ、Ｘａ因子、ＴＥＶプロテアーゼ及びインテインが挙げられる。
【０１６５】
(Ｇｌｙ)5リンカーを含むγ−ゼイン−Ｇｌｕは、ＴＥＶプロテアーゼで切断され、良好な切断が生じる。
【０１６６】
(Ｇｌｙ)5リンカーを含むγ−ゼイン−ＰＡＰＡは、ＴＥＶプロテアーゼで切断され、良好な切断が生じる。
【０１６７】
(Ｇｌｙ4Ｓｅｒ)3リンカーを含むγ−ゼインは、インテインで切断され、良好な切断が生じる。
【０１６８】
(Ｇｌｙ)×５リンカーとγ−ゼイン(ＰＰＰＶＥＬ)ｎ又はγ−ゼイン−(ＰＰＰＡＰＡ)ｎとを含む核酸構築物と共にＴＥＶプロテアーゼを使用する場合、ＴＥＶプロテアーゼは融合タンパク質からアポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏを切断する。更なる分析により、リンカーの存在は、ＴＥＶプロテアーゼを利用する良好な切断に重要ではないことが示される。
【０１６９】
(Ｇｌｙ4Ｓｅｒ)3リンカーとγ−ゼインとを含む核酸構築物と共にインテインを使用する場合、インテインの使用により、融合タンパク質からアポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏが切断される。
【０１７０】
実施例８−切断されたアポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏタンパク質の精製
アポリポプロテインＡ１ Ｍｉｌａｎｏの所望の純度をもたらす方法を同定するため、種々のクロマトグラフ法を試験する。固定化金属アフィニティークロマトグラフィーの使用を含む第１の工程の後、以下の条件での高速逆相タンパク質液体クロマトグラフィーの使用を含む第２の工程を行う。
【０１７１】
【表５】
2014502498.tif 000006
【０１７２】
本明細書に引用又は記載した全ての文献は、本願の出願日以前に開示された関連情報を提供する。ここでの記載は、本発明者が、そのような開示に先行しないものと認めるものとして解釈してはならない。上記の明細書に記載のすべての公報は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本発明の種々の改変及び変形が可能であることは当業者に明らかであろう。特定の好ましい実施態様と関連して本発明を詳細に説明してきたが、特許請求される本発明が、このような特定の実施態様に過度に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際、本発明を実施するための記載されたモードの種々の改変は、細胞生物学、分子生物学及び植物生物学又は関連分野の当業者には明らかであり、以下の請求項の範囲内であるものとする。
【０１７３】
配列の概要
配列番号１
植物における発現に最適化されたヒトアポリポプロテインAI-Milano成熟ペプチドのＤＮＡ配列
gatgaaccaccacaatctccttgggatagggttaaggatcttgctactgtgtacgtggatgtgcttaaggattctggaagggattacgtttctcagtttgagggatctgctcttggaaagcagcttaaccttaagcttctcgataactgggattctgtgacttctactttctctaagctcagagagcaacttggaccagttactcaagagttctgggataacctcgaaaaagagactgaaggactcagacaagagatgtctaaggatctcgaagaggttaaggctaaggttcagccatacctcgatgatttccagaagaagtggcaagaagagatggaactctaccgtcaaaaggttgaaccacttagggctgaacttcaagaaggtgctaggcaaaagcttcatgagcttcaagagaagctttctccacttggagaagaaatgagagatagggctagggctcatgttgatgctcttaggactcatcttgctccatactctgatgaacttaggcaatgtcttgctgctagacttgaggctcttaaagaaaatggtggagctaggcttgctgaatatcacgctaaggctactgagcatctttctacactttccgagaaggctaaaccagctcttgaagatcttaggcagggacttcttccagttcttgagtctttcaaggtgtccttcttgtctgctcttgaagagtacactaagaagctcaacactcagtaa
【０１７４】
配列番号２
植物における発現に最適化されたヒトアポリポプロテインAI-Milano成熟ペプチドのアミノ酸配列
DEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQCLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ*
【０１７５】
配列番号３
Zea mays γゼインのＤＮＡ配列（Genbank登録番号NM_001111884）
1 gcaccagttt caacgatcgt cccgcgtcaa tattattaaa aaactcttac atttctttat
61 aatcaacccg cactcttata atctcttctc tactactata ataagagagt ttatgtacaa
121 aataaggtga aattatgtat aagtgttctg gatattggtt gttggctcca tattcacaca
181 acctaatcaa tagaaaacat atgttttatt aaaacaaaat ttatcatata tcatatatat
241 atatatacat atatatatat atatataaac cgtagcaatg cacgggcata taactagtgc
301 aacttaatac atgtgtgtat taagatgaat aagagggtat ccaaataaaa aacttgttcg
361 cttacgtctg gatcgaaagg ggttggaaac gattaaatct cttcctagtc aaaattgaat
421 agaaggagat ttaatctctc ccaatcccct tcgatcatcc aggtgcaacc gtataagtcc
481 taaagtggtg aggaacacga aacaaccatg cattggcatg taaagctcca agaatttgtt
541 gtatccttaa caactcacag aacatcaacc aaaattgcac gtcaagggta ttgggtaaga
601 aacaatcaaa caaatcctct ctgtgtgcaa agaaacacgg tgagtcatgc cgagatcata
661 ctcatctgat atacatgctt acagctcaca agacattaca aacaactcat attgcattac
721 aaagatcgtt tcatgaaaaa taaaataggc cggacaggac aaaaatcctt gacgtgtaaa
781 gtaaatttac aacaaaaaaa aagccatatg tcaagctaaa tctaattcgt tttacgtaga
841 tcaacaacct gtagaaggca acaaaactga gccacgcaga agtacagaat gattccagat
901 gaaccatcga cgtgctacgt aaagagagtg acgagtcata tacatttggc aagaaaccat
961 gaagctgcct acagccgtct cggtggcata agaacacaag aaattgtgtt aattaatcaa
1021 agctataaat aacgctcgca tgcctgtgca cttctccatc accaccactg ggtcttcaga
1081 ccattagctt tatctactcc agagcgcaga agaacccgat cgacaccatg agggtgttgc
1141 tcgttgccct cgctctcctg gctctcgctg cgagcgccac ctccacgcat acaagcggcg
1201 gctgcggctg ccagccaccg ccgccggttc atctaccgcc gccggtgcat ctgccacctc
1261 cggttcacct gccacctccg gtgcatctcc caccgccggt ccacctgccg ccgccggtcc
1321 acctgccacc gccggtccat gtgccgccgc cggttcatct gccgccgcca ccatgccact
1381 accctactca accgccccgg cctcagcctc atccccagcc acacccatgc ccgtgccaac
1441 agccgcatcc aagcccgtgc cagctgcagg gaacctgcgg cgttggcagc accccgatcc
1501 tgggccagtg cgtcgagttc ctgaggcatc agtgcagccc gacggcgacg ccctactgct
1561 cgcctcagtg ccagtcgttg cggcagcagt gttgccagca gctcaggcag gtggagccgc
1621 agcaccggta ccaggcgatc ttcggcttgg tcctccagtc catcctgcag cagcagccgc
1681 aaagcggcca ggtcgcgggg ctgttggcgg cgcagatagc gcagcaactg acggcgatgt
1741 gcggcctgca gcagccgact ccatgcccct acgctgctgc cggcggtgtc ccccactgaa
1801 gaaactatgt gctgtagtat agccgctggc tagctagcta gttgagtcat ttagcggcga
1861 tgattgagta ataatgtgtc acgcatcac
【０１７６】
配列番号４
配列番号３の翻訳アミノ酸配列
MRVLLVALALLALAASATSTHTSGGCGCQPPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHVPPPVHLPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQLQGTCGVGSTPILGQCVEFLRHQCSPTATPYCSPQCQSLRQQCCQQLRQVEPQHRYQAIFGLVLQSILQQQPQSGQVAGLLAAQIAQQLTAMCGLQQPTPCPYAAAGGVPH
【０１７７】
配列番号５
γ−ゼインの断片のアミノ酸配列
MRVLLVALALLALAASATSTHTSGGCGCQPPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHVPPPVHLPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ
【０１７８】
配列番号６
(PPPAPA)nのアミノ酸配列
MRVLLVALALLALAASATSTHTSGGCGCQPPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHVPPPVHLPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ
【０１７９】
配列番号７
(PPPEPE)nのアミノ酸配列
EPAPPPEPEPPPEPEPPPEPEPPPEPEPPPEPEPPPEPEPPPE
【０１８０】
配列番号８
(PPPVEL)nのアミノ酸配列
VELPPPVELPPPVELPPPVELPPPVELPPPVELPPPVEVPPPVE
【０１８１】
配列番号９
(PPPVAL)nのアミノ酸配列
VALPPPVALPPPVALPPPVALPPPVALPPPVALPPPVAVPPPVA
【０１８２】
配列番号１０
(PPPVTL)nのアミノ酸配列
VTLPPPVTLPPPVTLPPPVTLPPPVTLPPPVTLPPPVTVPPPVT
【０１８３】
配列番号１１
(PPPAPA)nのアミノ酸配列
PPPAPAPPPAPAPPPAPCPCPAPAPPPCP
【０１８４】
配列番号１２
(PPPEPE)nのアミノ酸配列
PPPEPEPPPEPEPPPEPCPCPEPEPPPCP
【配列表】
2014502498000001.app
【国際調査報告】
2014502498.tif 000007
2014502498.tif 000008
2014502498.tif 000009
2014502498.tif 000010