(57)【要約】本発明は、多発性骨髄腫のような形質細胞疾患に対する新規な生物学的マーカーに関し、特に、前記疾患の検出用アッセイにおける診断マーカー及び予後マーカーとしてのマイクロＲＮＡの使用に関する。本発明はまた、形質細胞疾患の治療薬での治療の有効性を判定する方法、並びに前記アッセイ及び前記方法を実施するためのキットにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検個体の身体サンプル中の１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度を分析する工程と、
該濃度を、形質細胞疾患に罹患していない個体における該１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度の基準と比較する工程とを具え、
該被検個体の身体サンプル中の該１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度の該基準と比較した差異は、該被検個体が形質細胞疾患に罹患している若しくは形質細胞疾患に対する素因を有することを示唆するか、又は該患者の病状の否定的な予後を提供する、形質細胞疾患に罹患している患者若しくは形質細胞疾患に対する素因を診断する又は該患者の病状の予後を提供する方法。  
【請求項２】
被検個体の身体サンプル中の１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度を分析する工程と、
該濃度を、形質細胞疾患に罹患していない個体における該１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度の基準と比較する工程とを具え、
該被検個体の身体サンプル中の該１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度の該基準と比較した差異は、該被検個体の治療薬での治療の有効性を示す、形質細胞疾患に罹患している患者の治療薬での治療の有効性を判定する方法。
【請求項３】
前記ｍｉＲＮＡ濃度を試験管内で測定する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記形質細胞疾患が、アミロイドーシス、ワルデンシュトームマクログロブリン血症、骨硬化性骨髄腫（ＰＯＥＭＳ症候群）、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）又は形質細胞骨髄腫である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記形質細胞疾患が、形質細胞骨髄腫である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ｍｉＲＮＡ−１５ａ、ｍｉＲＮＡ−１５ｂ、ｍｉＲＮＡ−１６、ｍｉＲＮＡ−２２１、ｍｉＲＮＡ−４５１、ｍｉＲＮＡ−６３８、ｍｉＲＮＡ−７２０、ｍｉＲＮＡ−１２４６、ｍｉＲＮＡ−１３０８、ｍｉＲＮＡ−１９１５、ｍｉＲＮＡ−１９７４、ｍｉＲＮＡ−５７４−５ｐ及びｍｉＲＮＡ−７６２からなるｍｉＲＮＡ分子群より選択される１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度を分析することを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ｍｉＲＮＡ−６３８、ｍｉＲＮＡ−７２０、ｍｉＲＮＡ−１２４６、ｍｉＲＮＡ−１３０８及びｍｉＲＮＡ−１９１５からなるｍｉＲＮＡ分子群より選択される１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度を分析することを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記濃度の前記基準と比較した差異が増加であり、
ｍｉＲＮＡ−１５ａ、ｍｉＲＮＡ−１５ｂ、ｍｉＲＮＡ−１６、ｍｉＲＮＡ−２２１、ｍｉＲＮＡ−６３８、ｍｉＲＮＡ−７２０、ｍｉＲＮＡ−１２４６及びｍｉＲＮＡ−１９１５からなるｍｉＲＮＡ分子群より選択される１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度を分析することを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記基準と比較した前記ｍｉＲＮＡの濃度の増加が、該基準濃度より少なくとも５倍、１０倍、１５倍又は２０倍高い、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記濃度の前記基準と比較した差異が減少であり、ｍｉＲＮＡ−４５１及び／又はｍｉＲＮＡ−１３０８の濃度を分析することを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記基準と比較した前記ｍｉＲＮＡの濃度の減少が、該基準濃度より少なくとも５倍、１０倍、１５倍又は２０倍低い、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
配列番号１〜１３のいずれかで実質的に示されるヌクレオチド配列又はそれらの相補性配列のいずれか又はそれらの変異体若しくは断片を含むｍｉＲＮＡ分子群より選択される１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度を測定することを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記身体サンプルが血液サンプルである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記身体サンプルが血漿サンプル又は血清サンプルである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ＰＣＲを用いて前記１種又は２種以上のｍｉＲＮＡ分子を増幅する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＣＲ技術が、リアルタイムＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ及び分子ビーコンＰＣＲからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
形質細胞疾患に罹患している患者若しくは形質細胞疾患に対する素因の診断用又は該患者の病状の予後の提供用のバイオマーカーとしての、１種又は２種以上のマイクロＲＮＡの使用であって、
該１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子が、ｍｉＲＮＡ−１５ａ、ｍｉＲＮＡ−１５ｂ、ｍｉＲＮＡ−１６、ｍｉＲＮＡ−２２１、ｍｉＲＮＡ−４５１、ｍｉＲＮＡ−６３８、ｍｉＲＮＡ−７２０、ｍｉＲＮＡ−１２４６、ｍｉＲＮＡ−１３０８、ｍｉＲＮＡ−１９１５、ｍｉＲＮＡ−１９７４、ｍｉＲＮＡ−５７４−５ｐ及びｍｉＲＮＡ−７６２からなるｍｉＲＮＡ分子群から選択される、使用。
【請求項１８】
形質細胞疾患に罹患している患者若しくは形質細胞疾患に対する素因の診断用又は該患者の病状の予後の提供用のキットであって、
（i）被検個体由来のサンプル中の１種又は２種以上のマイクロＲＮＡの濃度を測定する手段と、
（ii）形質細胞疾患に罹患していない個体由来のサンプル中の該１種又は２種以上のマイクロＲＮＡの濃度の基準と、を含み、
該キットを用いて、該被検個体由来のサンプル中の該１種又は２種以上のマイクロＲＮＡの濃度の該基準濃度と比較した差異を特定することによって、該被検個体が形質細胞疾患に罹患しているか若しくは形質細胞疾患に対する素因を有することを示唆するか、又は該患者の病状の否定的な予後を提供する、キット。
【請求項１９】
形質細胞疾患に罹患している患者の治療薬による治療の有効性を判定するためのキットであって、
（i）被検個体由来のサンプル中の１種又は２種以上のマイクロＲＮＡの濃度を測定する手段と、
（ii）形質細胞疾患に罹患していない個体由来のサンプル中の該１種又は２種以上のマイクロＲＮＡの濃度の基準と、を含み、
該キットを用いて該基準濃度と比較した該被検個体由来のサンプル中の該１種又は２種以上のマイクロＲＮＡの濃度の差異を特定し、該濃度の差異が該被検個体の治療薬による治療の有効性を示す、キット。
【請求項２０】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法を実施するためのものである、請求項１８又は１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記被検個体由来のサンプルを得るためのサンプル採取手段を含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２】
一旦前記被検個体から得た前記サンプル中の前記１種又は２種以上のｍｉＲＮＡの濃度を測定するための検出手段を含む、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２３】
前記検出手段が、前記ｍｉＲＮＡを増幅するためのＰＣＲ法に使用される１個又は２個以上のプライマーを含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
関連ｍｉＲＮＡが正常コントロールより統計的に高いレベルで存在することが証明されている場合に、形質細胞疾患を有する患者のサンプルから抽出した全ＲＮＡに相当する陽性コントロールを含む、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２５】
前記陽性コントロールが、配列番号１〜１３で実質的に示されているヌクレオチド配列、又はそれらの相補性配列、又はそれらの変異体若しくは断片を含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記ｍｉＲＮＡが検出できないことが既に証明されている場合に、形質細胞疾患をもたない正常な健常者のサンプルから抽出した全ＲＮＡに相当する陰性コントロールを含む、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２７】
前記陰性コントロールが、配列番号１４若しくは１５で実質的に示されるヌクレオチド配列、又はそれらの相補性配列、又はそれらの変異体若しくは断片を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
（i）被検個体から得たサンプル中の１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度を測定する工程であって、該被検個体の該身体サンプル中の該１種又は２種以上のマイクロＲＮＡの濃度の形質細胞疾患に罹患していない個体由来のサンプル中の該１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度と比較した差異は、該被検個体が、形質細胞疾患に罹患しているか、又は形質細胞疾患に対する素因があるか、又は否定的な予後を有することを示唆する工程と、
（ii）形質細胞疾患の進行を妨げる、緩和する又は遅らせる治療薬を該被検個体に投与する工程と、
を具える、形質細胞疾患に罹患している個体を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多発性骨髄腫のような形質細胞疾患に対する新規な生物学的マーカーに関し、特に、前記疾患の検出用アッセイにおける診断マーカー及び予後マーカーとしてのマイクロＲＮＡの使用に関する。本発明はまた、形質細胞疾患の治療薬での治療の有効性を判定する方法、並びに前記アッセイ及び前記方法を実施するためのキットにも関する。前記アッセイは、定性的及び／又は定量的であり、大規模なスクリーニング及び臨床試験に適合可能である。
【背景技術】
【０００２】
形質細胞は、Ｂリンパ球から産生される白血球であり、抗体を作って放出して、感染と闘う。形質細胞は、普通は血液中を循環していない；それらは通常、骨髄、リンパ節及び免疫応答が行われている領域にのみ位置する。形質細胞疾患は、モノクローナル抗体を産生できる１個の形質細胞クローンが制御不能に分裂して増殖する場合に起きる。これら異常な形質細胞は、最終的に他の形質細胞を“締め出し”始め、結果として、ウイルス、細菌及び他の感染症と闘う身体の能力が劇的に低下する。異常な形質細胞は、最終的に周囲の骨に侵入して、骨病変や血液中の異常なカルシウム量をもたらし、腎不全のような臓器障害を生じ得る。
【０００３】
一般的な形質細胞疾患としては、アミロイドーシス、ワルデンシュトームマクログロブリン血症、骨硬化性骨髄腫（ＰＯＥＭＳ症候群）、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）又は形質細胞骨髄腫が挙げられる。アミロイドーシスは、抗体又はタンパク質断片の構築に伴って抗体又はタンパク質断片が身体の臓器中に蓄積した場合に起こり、感染と闘う能力の減少をもたらす。異常な形質細胞は、制御不能に増殖して、骨髄中の複数部位で集まり、健常な血球を締め出す。対照的に、ワルデンシュトームマクログロブリン血症は、血液及び骨髄中の高いＩｇＭ抗体レベルによって特徴付けられる悪性の血液癌である。
【０００４】
骨髄腫とも呼ばれる多発性骨髄腫は、全ての血液癌のおよそ１０％及び全ての癌のおよそ１％を占める、骨髄形質細胞の悪性疾患である。２００６年の英国人口に年齢調整した多発性骨髄腫の年間発生率は１００,０００人あたり６．６人であり、従って、１年毎に３０００人の新たな個人に悪影響を及ぼす。提示に際して最も一般的な症状は、疲労、骨痛及び反復性感染であり、診断後の平均生存期間は診断後およそ３年である。骨髄腫は現在のところ不治であるが、サリドマイド及びボルテゾミブのような新薬の使用や自己幹細胞移植をはじめとする、治療における近年の進歩は、平均余命を改善することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
骨髄腫は通常、“意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症”（ＭＧＵＳ）と呼ばれるクローン性形質細胞増殖の無症候性前癌状態から進行する。ＭＧＵＳは、５０歳以上の人口の３％より多く存在し、１年ごとに約１％の割合で骨髄腫又は関連悪性腫瘍に進行する。ＭＧＵＳの多発性骨髄腫への悪性転換の原因となる一連の事象は、現在のところ、よく分かっていない。それら骨髄腫に進行する可能性が高いＭＧＵＳの罹患患者を特定できる因子がないため、患者を定期的にモニターする必要がある。従って、癌進行の危険性が最も高いそれらの患者を特定する診断方法は、患者にとって多大な利益をもたらし、早期治療及び進行改善の可能性を上昇させるであろう。よって、どの患者が多発性硬化症に進行するか予測するための信頼できる生物学的マーカーを提供する必要がある。
【０００６】
本発明のより良い理解のため、また本発明の実施形態をどのように実行し得るかを示すため、一例として、ここで、添付する線図を参照する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】健常対照者と比較した骨髄腫患者の血漿中の４個のｍｉＲＮＡの発現レベルを示す。パネルＡ〜Ｄは、Ｔａｑｍａｎ  ＲＴ−ＰＣＲによって測定したｍｉＲＮＡ−１５ａ（パネルＡ）、ｍｉＲＮＡ−１５ｂ（パネルＢ）、ｍｉＲＮＡ−１６（パネルＣ）及びｍｉＲＮＡ−２２１（パネルＤ）のレベルを表わす。ｍｉｒＶＡＮＡ  ＰＡＲＩＳキット（アンビオン社）を用いて４００μＬの血漿から全ＲＮＡに加えてｍｉＲＮＡを単離し、２０μＬの血漿に相当するものをＴａｑｍａｎマイクロＲＮＡアッセイ（ＡＢＩ社）に用いた。定量は、１００／Ｃｔとして表した。各血漿サンプルについて４回複製を行い、平均値及び標準誤差を示した。Ｎ１〜Ｎ４は、健常者である（Ｎ１＝４０歳男性、Ｎ２＝５１歳女性、Ｎ３＝６３歳女性、Ｎ４＝６４歳男性）。Ｍ１〜Ｍ３は、骨髄腫患者を表わす（Ｍ１＝７５歳男性、Ｍ２＝４４歳女性、Ｍ３＝９４歳女性）。
【図２】健常対照者と比較した骨髄腫患者の血清中の７個のｍｉＲＮＡの発現レベルを示す。ＲＮＡは、ＭＧＵＳ患者（ＭＧ、ｎ＝２０）、骨髄腫患者（Ｍ、ｎ＝２０）、非骨髄腫入院患者（ＮＨ、ｎ＝２０）及び健常対照者（Ｎ、ｎ＝１３）に由来する、プールした血清サンプルから、２つ組で抽出した。１プールあたり２つのＲＮＡ複製物が存在し、２つのＲＴ反応複製物に２回のｑＰＣＲを行った（血清１プールあたり８回の技術的反復）。エラーバーは、ＲＮＡ複製物間の標準偏差を示す。
【図３】健常対照者と比較した骨髄腫患者の血清中の４個のｍｉＲＮＡの発現レベルを示す。ＲＮＡは、ＭＧＵＳ患者（ＭＧ）、骨髄腫患者（Ｍ）、非骨髄腫入院患者（ＮＨ）及び健常対照者（Ｎ）に由来する個々の血清サンプルから、ＲＮＡを抽出した。逆転写及びｑＰＣＲに特異的ＴａｑＭａｎプライマーを用いて、４群で４個のｍｉＲＮＡの絶対発現レベル（血清１μＬあたりのコピー数）を検査した。その絶対発現レベルを群間で比較して、Ｎ群との差の倍率を示した。ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２４６及びｍｉＲ−１３０８については１群あたりｎ＝６個人であり、ｍｉＲ−１９７４については１群あたりｎ＝２個人であった。検査した各個人／ｍｉＲＮＡの組み合わせについて、２回のＲＴ反応に対して２回のｑＰＣＲを行った（４回の技術的反復）。エラーバーは、標準誤差を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の第一態様によると、被検個体の身体サンプル中の１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度を分析する工程と、該濃度を、形質細胞疾患に罹患していない個体における該１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度の基準と比較する工程とを具え、該基準と比較した該被検個体の身体サンプル中の該１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度の差異は、該被検個体が形質細胞疾患に罹患している若しくは形質細胞疾患に対する素因を有することを示唆するか、又は該患者の病状の否定的な予後を提供する、形質細胞疾患に罹患している患者若しくは形質細胞疾患に対する素因を診断する又は該患者の病状の予後を提供する方法が提供される。
【０００９】
本発明の第二態様によると、被検個体の身体サンプル中の１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度を分析する工程と、該濃度を、形質細胞疾患に罹患していない個体における該１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度の基準と比較する工程とを具え、該被検個体の身体サンプル中の該１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度の該基準と比較した差異は、該被検個体の治療薬での治療の有効性を示す、形質細胞疾患に罹患している患者の治療薬での治療の有効性を判定する方法が提供される。
【００１０】
本発明の第三態様によると、形質細胞疾患に罹患している患者若しくは形質細胞疾患に対する素因の診断用又は該患者の病状の予後の提供用のキットであって、
（i）被検個体由来のサンプル中の１種又は２種以上のマイクロＲＮＡの濃度を測定する手段と、
（ii）形質細胞疾患に罹患していない個体由来のサンプル中の該１種又は２種以上のマイクロＲＮＡの濃度の基準と、を含み、
該キットを用いて、該被検個体由来のサンプル中の該１種又は２種以上のマイクロＲＮＡの濃度の該基準濃度と比較した差異を特定することによって、該被検個体が形質細胞疾患に罹患しているか若しくは形質細胞疾患に対する素因を有することを示唆するか、又は該患者の病状の否定的な予後を提供するキットが提供される。
【００１１】
本発明の第四態様によると、形質細胞疾患に罹患している患者の治療薬による治療の有効性を判定するためのキットであって、
（i）被検個体由来のサンプル中の１種又は２種以上のマイクロＲＮＡの濃度を測定する手段と、
（ii）形質細胞疾患に罹患していない個体由来のサンプル中の該１種又は２種以上のマイクロＲＮＡの濃度の基準と、を含み、
該キットを用いて該基準濃度と比較した該被検個体由来のサンプル中の該１種又は２種以上のマイクロＲＮＡの濃度の差異を特定し、該濃度の差異が該被検個体の治療薬による治療の有効性を示すキットが提供される。
【００１２】
本発明の第五態様によると、
（i）被検個体から得たサンプル中の１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度を測定する工程であって、該被検個体の該身体サンプル中の該１種又は２種以上のマイクロＲＮＡの濃度の形質細胞疾患に罹患していない個体由来のサンプル中の該１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度と比較した差異は、該被検個体が、形質細胞疾患に罹患しているか、又は形質細胞疾患に対する素因があるか、又は否定的な予後を有することを示唆する工程と、
（ii）形質細胞疾患の進行を妨げる、緩和する又は遅らせる治療薬を該被検個体に投与する工程と、
を具える、形質細胞疾患に罹患している個体を治療する方法が提供される。
【００１３】
疾患の診断及び予後に用いられる有用なバイオマーカーの重要な特徴は、所定の疾患に対して高い感受性及び特異性を示すことである。第一に、実施例でも説明する通り、本発明者らは、驚くべきことに、マイクロＲＮＡ分子（ｍｉＲＮＡ）が末梢血液中に存在し続けられることを実証した。第二に、彼らは、これらｍｉＲＮＡが骨髄腫のような形質細胞疾患に対する確固たるバイオマーカーとして役立ち、よって、癌の状態及び前癌状態の検出並びに疾患予後に用いることができることを見出した。加えて、本発明者らは、形質細胞疾患に対するバイオマーカーとしてｍｉＲＮＡを用いることは、簡単で、再現性があり且つ安価で、患者にとっての不便性を最小にするアッセイを利用することを示した。
【００１４】
最近まで、骨髄腫及び“意義不明な単クローン性免疫グロブリン血症”（ＭＧＵＳ）のような形質細胞疾患の患者に対する定期的な非侵襲性検査としてｍｉＲＮＡを使用することの可能性は、患者に痛みが伴い、熟練施術者を必要とする手法で骨髄サンプルを採取する必要があるため、難しかった。しかしながら、本発明者らは、驚くべきことに、ｍｉＲＮＡを血漿中及び血清中で検出できることを示し、新規な非侵襲性検査への道を開いた。更に、有利なことに、ｍｉＲＮＡは、血漿中で、室温にて（少なくとも２４時間）、また凍結融解サイクルを行った場合に、安定である。このことと、本願実施例で示すデータとを加味すると、形質細胞疾患に罹患している患者に対する最小限の侵襲性診断ツールとして血液サンプル由来のｍｉＲＮＡを使用することは、明らかに可能である。
【００１５】
前記第一態様の方法は、骨髄腫のような形質細胞疾患に現在罹患しているか又は将来罹患し得る対象者の治療の最善策に関する判断を臨床医に下させるのに有用である。前記第一態様の方法は、形質細胞疾患に罹患している患者をどのように治療するかを臨床医に決定させるのに有用であるのが好ましい。加えて、前記第一態様及び第二態様の方法は、例えば、骨髄腫の治療の際のサリドマイド又はボルテゾミブといった、形質細胞疾患について推定される治療の有効性をモニターするのに有用である。従って、前記第三態様及び第四態様のキットは、臨床医が第五態様の治療を実施できるように、患者の病状の予後を提供するのに有用である。前記第三態様のキットは、形質細胞疾患について推定される治療の有効性をモニターすることに用いることもできる。このように、前記方法及び前記キットは、臨床医に形質細胞疾患治療計画を手引きすること及びそのような治療計画の有効性をモニターすることに非常に有用である。臨床医は、本発明のキットを既存の診断検査と併用して用いて、診断の精度を向上させることもできる。
【００１６】
本発明の方法及びキットを用いて、前癌及び悪性患者における進行の危険性を予測することもできる。形質細胞疾患は、例えば、アミロイドーシス、ワルデンシュトームマクログロブリン血症、骨硬化性骨髄腫（ＰＯＥＭＳ症候群）、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）又は形質細胞骨髄腫であり得る。好ましくは、形質細胞疾患が、形質細胞骨髄腫、すなわち、多発性骨髄腫である。
【００１７】
マイクロＲＮＡ分子は、普通は、標的のメッセンジャーＲＮＡ転写産物（ｍＲＮＡ）の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）中の相補性配列に結合し、大抵は遺伝子スプライシングをもたらす、非コード転写後調節因子である。ｍｉＲＮＡは、平均で約２２ヌクレオチド長のみの短いリボ核酸（ＲＮＡ）分子である。従って、本発明の方法及びキットで検出されるｍｉＲＮＡは、約１５〜３０ヌクレオチド長であるか、又は約１８〜２５ヌクレオチド長であるか、又は約２１〜２３ヌクレオチド長である。
【００１８】
本発明の方法及びキットは、ｍｉＲＢａｓｅウェブサイト(http://www.mirbase.org/)で見出すことができる公知のｍｉＲＮＡのいずれかの濃度を分析することを含み得る。ｍｉＲＢａｓｅ（リリース１８）は、現在１５８７個の成熟ヒトｍｉＲＮＡを含み、それらの全ては、より長い前駆体からプロセシングされたもので、互いにヌクレオチド配列が異なる。現在分かっていることは、各ｍｉＲＮＡが、１又は２個以上のヒト組織で発現され、特定の組織で発現される１又は２個以上の標的ＲＮＡ配列と結合することである。この１個のｍｉＲＮＡのそれ自体での又は他のｍｉＲＮＡ及び／若しくはタンパク質と組み合わさっての特定ｍＲＮＡに対する結合は、大抵は標的ｍＲＮＡの分解又はタンパク質翻訳の抑制によって、遺伝子発現のダウンレギュレーションをもたらす。
【００１９】
前記方法及びキットは、ｍｉＲＮＡ−１５ａ、ｍｉＲＮＡ−１５ｂ、ｍｉＲＮＡ−１６、ｍｉＲＮＡ−２２１、ｍｉＲＮＡ−４５１、ｍｉＲＮＡ−６３８、ｍｉＲＮＡ−７２０、ｍｉＲＮＡ−１２４６、ｍｉＲＮＡ−１３０８、ｍｉＲＮＡ−１９１５、ｍｉＲＮＡ−１９７４、ｍｉＲＮＡ−５７４−５ｐ及びｍｉＲＮＡ−７６２からなるｍｉＲＮＡ分子群より選択される１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度を分析することを含み得るのが好ましい。
【００２０】
従って、第六態様では、１種又は２種以上のマイクロＲＮＡの、形質細胞疾患に罹患している患者若しくは形質細胞疾患に対する素因の診断用又は該患者の病状の予後の提供用のバイオマーカーとしての使用であって、該１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子が、ｍｉＲＮＡ−１５ａ、ｍｉＲＮＡ−１５ｂ、ｍｉＲＮＡ−１６、ｍｉＲＮＡ−２２１、ｍｉＲＮＡ−４５１、ｍｉＲＮＡ−６３８、ｍｉＲＮＡ−７２０、ｍｉＲＮＡ−１２４６、ｍｉＲＮＡ−１３０８、ｍｉＲＮＡ−１９１５、ｍｉＲＮＡ−１９７４、ｍｉＲＮＡ−５７４−５ｐ及びｍｉＲＮＡ−７６２からなるｍｉＲＮＡ分子群から選択される使用が提供される。
【００２１】
一実施形態では、検出されるｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ−１５ａである。ｍｉＲＮＡ−１５ａの配列は、２２ヌクレオチド長であり、本明細書中で配列番号１と呼ばれ、以下の通りである。
５’−ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＡＵＡＡＵＧＧＵＵＵＧＵＧ−３’
配列番号１
従って、前記ｍｉＲＮＡは、配列番号１で実質的に示されるヌクレオチド配列、又はその相補性配列、又はそれらの変異体若しくは断片を含み得る。
【００２２】
別の実施形態では、検出されるｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ−１５ｂである。ｍｉＲＮＡ−１５ｂの配列は、２２ヌクレオチド長であり、本明細書中で配列番号２と呼ばれ、以下の通りである。
５’−ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＡＵＣＡＵＧＧＵＵＵＡＣＡ−３’
配列番号２
従って、前記ｍｉＲＮＡは、配列番号２で実質的に示されるヌクレオチド配列、又はその相補性配列、又はそれらの変異体若しくは断片を含み得る。
【００２３】
別の実施形態では、検出されるｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ−１６である。ｍｉＲＮＡ−１６の配列は、２２ヌクレオチド長であり、本明細書中で配列番号３と呼ばれ、以下の通りである。
５’−ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＧＵＡＡＡＵＡＵＵＧＧＣＧ−３’
配列番号３
従って、前記ｍｉＲＮＡは、配列番号３で実質的に示されるヌクレオチド配列、又はその相補性配列、又はそれらの変異体若しくは断片を含み得る。
【００２４】
一実施形態では、検出されるｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ−２２１である。ｍｉＲＮＡ−２２１の配列は、２３ヌクレオチド長であり、本明細書中で配列番号４と呼ばれ、以下の通りである。
５’−ＡＧＣＵＡＣＡＵＵＧＵＣＵＧＣＵＧＧＧＵＵＵＣ−３’
配列番号４
従って、前記ｍｉＲＮＡは、配列番号４で実質的に示されるヌクレオチド配列、又はその相補性配列、又はそれらの変異体若しくは断片を含み得る。
【００２５】
一実施形態では、検出されるｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ−４５１である。ｍｉＲＮＡ−４５１の配列は、２２ヌクレオチド長であり、本明細書中で配列番号５と呼ばれ、以下の通りである。
５’−ＡＡＡＣＣＧＵＵＡＣＣＡＵＵＡＣＵＧＡＧＵＵ−３’
配列番号５
従って、前記ｍｉＲＮＡは、配列番号５で実質的に示されるヌクレオチド配列、又はその相補性配列、又はそれらの変異体若しくは断片を含み得る。
【００２６】
一実施形態では、検出されるｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ−６３８である。ｍｉＲＮＡ−６３８の配列は、２５ヌクレオチド長であり、本明細書中で配列番号６と呼ばれ、以下の通りである。
５’−ＡＧＧＧＡＵＣＧＣＧＧＧＣＧＧＧＵＧＧＣＧＧＣＣＵ−３’
配列番号６
従って、前記ｍｉＲＮＡは、配列番号６で実質的に示されるヌクレオチド配列、又はその相補性配列、又はそれらの変異体若しくは断片を含み得る。
【００２７】
一実施形態では、検出されるｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ−７２０である。ｍｉＲＮＡ−７２０の配列は、１７ヌクレオチド長であり、本明細書中で配列番号７と呼ばれ、以下の通りである。
５’−ＵＣＵＣＧＣＵＧＧＧＧＣＣＵＣＣＡ−３’
配列番号７
従って、前記ｍｉＲＮＡは、配列番号７で実質的に示されるヌクレオチド配列、又はその相補性配列、又はそれらの変異体若しくは断片を含み得る。
【００２８】
一実施形態では、検出されるｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ−１２４６である。ｍｉＲＮＡ−１２４６の配列は、１９ヌクレオチド長であり、本明細書中で配列番号８と呼ばれ、以下の通りである。
５’−ＡＡＵＧＧＡＵＵＵＵＵＧＧＡＧＣＡＧＧ−３’
配列番号８
従って、前記ｍｉＲＮＡは、配列番号８で実質的に示されるヌクレオチド配列、又はその相補性配列、又はそれらの変異体若しくは断片を含み得る。
【００２９】
一実施形態では、検出されるｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ−１３０８である。ｍｉＲＮＡ−１３０８の配列は、１８ヌクレオチド長であり、本明細書中で配列番号９と呼ばれ、以下の通りである。
５’−ＧＣＡＵＧＧＧＵＧＧＵＵＣＡＧＵＧＧ−３’
配列番号９
従って、前記ｍｉＲＮＡは、配列番号９で実質的に示されるヌクレオチド配列、又はその相補性配列、又はそれらの変異体若しくは断片を含み得る。
【００３０】
一実施形態では、検出されるｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ−１９１５である。ｍｉＲＮＡ−１９１５の配列は、２０ヌクレオチド長であり、本明細書中で配列番号１０と呼ばれ、以下の通りである。
５’−ＣＣＣＣＡＧＧＧＣＧＡＣＧＣＧＧＣＧＧＧ−３’
配列番号１０
従って、前記ｍｉＲＮＡは、配列番号１０で実質的に示されるヌクレオチド配列、又はその相補性配列、又はそれらの変異体若しくは断片を含み得る。
【００３１】
一実施形態では、検出されるｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ−１９７４である。ｍｉＲＮＡ−１９７４の配列は、２０ヌクレオチド長であり、本明細書中で配列番号１１と呼ばれ、以下の通りである。
５’−ＵＧＧＵＵＧＵＡＧＵＣＣＧＵＧＣＧＡＧＡＡＵＡ−３’
配列番号１１
従って、前記ｍｉＲＮＡは、配列番号１１で実質的に示されるヌクレオチド配列、又はその相補性配列、又はそれらの変異体若しくは断片を含み得る。
【００３２】
一実施形態では、検出されるｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ−５７４−５ｐである。ｍｉＲＮＡ−５７４−５ｐの配列は、２３ヌクレオチド長であり、本明細書中で配列番号１２と呼ばれ、以下の通りである。
５’−ＵＧＡＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＡＧＵＧＵＧＵ−３’
配列番号１２
従って、前記ｍｉＲＮＡは、配列番号１２で実質的に示されるヌクレオチド配列、又はその相補性配列、又はそれらの変異体若しくは断片を含み得る。
【００３３】
一実施形態では、検出されるｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ−７６２である。ｍｉＲＮＡ−７６２の配列は、２２ヌクレオチド長であり、本明細書中で配列番号１３と呼ばれ、以下の通りである。
５’−ＧＧＧＧＣＵＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＧＡＧＣ−３’
配列番号１３
従って、前記ｍｉＲＮＡは、配列番号１３で実質的に示されるヌクレオチド配列、又はその相補性配列、又はそれらの変異体若しくは断片を含み得る。
【００３４】
本発明の方法及びキットは、配列番号１〜１３のいずれかで実質的に示されるヌクレオチド配列、又はそれらの相補性配列のいずれか、又はそれらの変異体若しくは断片を含むｍｉＲＮＡ分子の群から選択される１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度を測定することを含み得る。ｍｉＲＮＡ−１５ａ、ｍｉＲＮＡ−１５ｂ、ｍｉＲＮＡ−１６、ｍｉＲＮＡ−２２１、ｍｉＲＮＡ−６３８、ｍｉＲＮＡ−７２０、ｍｉＲＮＡ−１２４６、ｍｉＲＮＡ−４５１、ｍｉＲＮＡ−１３０８及び／又はｍｉＲＮＡ−１９１５が身体サンプル（例えば、末梢血由来の血漿又は血清）において被検個体と比較して有意に高いレベルか又は有意に低いレベルで見出される発現のパターンは、“ｍｉＲＮＡ署名”と呼ばれ得る。
【００３５】
配列番号１〜１３の相補性配列（しばしば、ｍｉＲＮＡ*、例えばｍｉＲＮＡ−１５ａ*、ｍｉＲＮＡ−１５ｂ*、ｍｉＲＮＡ−１６*、ｍｉＲＮＡ−２２１*、ｍｉＲＮＡ−４５１*、ｍｉＲＮＡ−６３８*、ｍｉＲＮＡ−７２０*、ｍｉＲＮＡ−１２４６*、ｍｉＲＮＡ−１３０８*、ｍｉＲＮＡ−１９１５*、ｍｉＲＮＡ−１９７４*、ｍｉＲＮＡ−５７４−５ｐ* 又はｍｉＲＮＡ−７６２*と呼ばれる）も検出することができる。これら相補性配列は、活性を有することも示されており、従って、形質細胞疾患用バイオマーカーとしての有用性も有する。
【００３６】
検出することができるいずれかのｍｉＲＮＡ分子の変異体及び断片は、該ｍｉＲＮＡ分子、例えば配列番号の１〜１３のヌクレオチドの短縮体又は付加体を含み得る。短縮体は、ｍｉＲＮＡの５’及び／若しくは３’末端からの少なくとも１個のヌクレオチドの除去によるか、又はｍｉＲＮＡのコア若しくは中心の内部からの１個以上のヌクレオチドの削除によって、サイズが縮小しているｍｉＲＮＡ分子を含み得る。短縮体は、ｍｉＲＮＡ分子からの少なくとも２個、３個、４個又は５個のヌクレオチドの削除を含み得る。付加体は、ｍｉＲＮＡの５’及び／若しくは３’末端への少なくとも１個のヌクレオチドの付加によるか、又はｍｉＲＮＡのコア若しくは中心内部への１個以上のヌクレオチドの導入によって、サイズが増加されたｍｉＲＮＡ分子を含み得る。短縮体は、ｍｉＲＮＡ分子への少なくとも２個、３個、４個、５個又は最高１０個のヌクレオチドの付加を含み得る。
【００３７】
少なくとも１種のｍｉＲＮＡ分子の濃度は、例えば、骨髄腫といった形質細胞疾患用の診断マーカー及び／又は予後マーカーとして役立ち得る。加えて、ｍｉＲＮＡは、良性疾患用の診断マーカー及び／又は予後マーカーとしても役立ち得る。例えば、化学療法治療計画に続く障害は、良性であり得る。本発明者らは、骨髄腫患者において多数のｍｉＲＮＡ分子の発現レベルを調べ、驚いたことに、幾つかのｍｉＲＮＡ（すなわち、ｍｉＲＮＡ−１５ａ、ｍｉＲＮＡ−１５ｂ、ｍｉＲＮＡ−１６、ｍｉＲＮＡ−２２１、ｍｉＲＮＡ−６３８、ｍｉＲＮＡ−７２０、ｍｉＲＮＡ−１２４６及び／又はｍｉＲＮＡ−１９１５）は骨髄腫患者においてコントロールと比較して過剰発現していることを観察した。同様に、本発明者らは、コントロールと比較した場合に幾つかのｍｉＲＮＡ分子（すなわち、ｍｉＲＮＡ−４５１及び／又はｍｉＲＮＡ−１３０８）が低減したこと、これらがｍｉＲＮＡ署名も形成することも見出した。従って、本発明者らは、共にｍｉＲＮＡ署名を形成するこれらｍｉＲＮＡ分子が、患者において骨髄腫又は他の形質細胞疾患の有用且つ確固たる生理学的指標を表わすことに気付いた。更に、驚くべきことに、本発明者らは、ｍｉＲＮＡ−６３８、ｍｉＲＮＡ−７２０、ｍｉＲＮＡ−１２４６、ｍｉＲＮＡ−１３０８及びｍｉＲＮＡ−１９１５が、骨髄腫患者、ＭＧＵＳ患者及び対照患者で異なる発現パターンを示したことを観察し、よって、これらｍｉＲＮＡが好ましい。従って、これらバイオマーカーの各々を予後目的及び診断目的で確実に使用できる。
【００３８】
本発明者らは、被検個体におけるｍｉＲＮＡの循環レベルは、被検個体が形質細胞疾患を患っているか又は形質細胞疾患を発症する素因があるかの示唆に富んでおり、初期段階で形質細胞疾患を検出する感度が充分高いことを証明した。加えて、ｍｉＲＮＡについてのアッセイは、良性状態と悪性状態とを区別できる。更に、本発明は、被検個体の病状が治療計画後に再発するかをモニターすることが可能である。従って、ｍｉＲＮＡ分子の濃度を測定してコントロール濃度と比較する本発明の第一態様及び第二態様の方法は、治療の前後双方において病状をモニターするための非常に信頼できる予後マーカーを提供する。従って、ｍｉＲＮＡ分子に対するアッセイは、より敏感であり、特異性の増強も提供するため、他のマーカーのアッセイを上回る実質的な改良である。加えて、ｍｉＲＮＡ分子に対するアッセイは、臨床医にはるかに多くの情報も提供し、疾患を階層化するのを助けるであろう。
【００３９】
１の特定の種類のｍｉＲＮＡ分子を検出することは、形質細胞疾患に対するバイオマーカーとしてそれ自体役立つことが理解されるであろう。更に、２種以上のｍｉＲＮＡ分子を検出することは、疾患のより確固たる診断又は予後を提供することができる。加えて、このバイオマーカーを、例えば、異常なモノクローナルパラプロテイン及び／又は血清中遊離軽鎖の検出といった、形質細胞疾患の指標となる別の生物学的マーカーのアッセイと組み合わせて用いることもできる。例えば、パラプロテイン又は軽鎖を血清又は尿の電気泳動により検出することができる。従って、１種又は２種以上のｍｉＲＮＡ分子に対するアッセイを用いて、別のマーカーの使用を補い、一層多くの情報を臨床医に提供することもできる。
【００４０】
被検個体は、例えば、ネコ、イヌ、ウマ等といった獣医学的な興味対象のいずれかの動物であってもよい。しかしながら、被検個体は、男性か女性いずれかのヒトのような哺乳動物であることが好ましい。
【００４１】
好ましくは、サンプルを被検個体から採取し、１種又は２種以上のｍｉＲＮＡ分子の濃度を測定する。前記第三態様又は第四態様のキットは、被検個体からサンプルを得るためのサンプル採取手段を含み得る。サンプル採取手段は、針又はシリンジ等を含み得る。
【００４２】
ｍｉＲＮＡは、脳脊髄液又は卵胞液のような体液及び器官液中に存在することが実証されている。しかしながら、サンプルは、その中にｍｉＲＮＡ分子が分泌されるいずれかの身体サンプルとすることもでき、例えば、リンパ液又は間質液でもよい。サンプルは尿サンプルでもよい。しかしながら、本発明者らは、非常に驚くべきことに、血液中にｍｉＲＮＡが残存することを観察した。従って、ｍｉＲＮＡ分子は、血液サンプル中で測定されるか又はアッセイされるのが好ましい。血液サンプルは、静脈のものでも動脈のものでもよい。
【００４３】
キットは、採取したサンプルを受け入れるためのサンプル収集容器を含み得る。血液サンプルは、すぐにｍｉＲＮＡ分子に対してアッセイしてもよい。あるいは、ｍｉＲＮＡアッセイを行う前に、血液を、例えば冷蔵庫内で低温にて保存しても又は更に凍結させてもよい。ｍｉＲＮＡの測定は、全血で行ってもよい。
【００４４】
しかしながら、アッセイを行う前に、血液を更に処理してもよい。例えば、クエン酸塩（クエン酸ナトリウムのような）、ヒルジン、へパリン、ＰＰＡＣＫ又はフッ化ナトリウムのような抗凝固剤を加えてもよい。従って、サンプル収集容器は、血液サンプルを凝固させない目的で抗凝固剤を含んでもよい。あるいは、血液サンプルを遠心分離又は濾過して、分析に用い得る血漿画分又は血清画分を調製してもよい。従って、ｍｉＲＮＡを血漿サンプル中又は血清サンプル中で分析又はアッセイすることが好ましい。ｍｉＲＮＡ濃度は、被検個体から採取した血清サンプル又は血漿サンプルから試験管内で測定することが好ましい。
【００４５】
“新鮮な”身体サンプルを対象者から採取した直後に分析し得ることも理解されるであろう。あるいは、サンプルを凍結し保存してもよい。次いで、サンプルを後日解凍して分析してもよい。
【００４６】
実施例で説明する通り、本発明者らは、骨髄腫に罹患した多数の患者において様々なｍｉＲＮＡの濃度をモニターし、それらを骨髄腫に罹患していない個体における同一のｍｉＲＮＡの濃度を比較した。本発明者らは、骨髄腫に罹患している患者において、本明細書中に記載するある特定のｍｉＲＮＡの濃度が実質的に有意に増加又は低下することを実証した。従って、その濃度の差異は、基準と比較して増加又は低下であり得る。骨髄腫患者におけるある特定のｍｉＲＮＡ分子の濃度が、例えば、疾患がどの程度まで進行しているか並びに被検個体の年齢及び性別といった、幾つかの因子に高度に依存することは、理解されるであろう。形質細胞疾患に罹患していない個体におけるｍｉＲＮＡの濃度は、ある程度変動する場合があるが、一定期間にわたる平均では、その濃度は実質的に一定である傾向にあることも理解されるであろう。加えて、形質細胞疾患に罹患していない１つの個体群におけるｍｉＲＮＡの濃度は、形質細胞疾患に罹患していない別の個体群におけるそれらｍｉＲＮＡの濃度と異なる場合があることが理解されるべきである。しかしながら、熟練施術者は、形質細胞疾患に罹患していない複数個体におけるある特定のｍｉＲＮＡの平均濃度をどのように測定するか知っているであろうし、これをｍｉＲＮＡの‘規定’濃度と呼ぶ。規定濃度は、第一態様〜第五態様において、上述した基準値に相当する。
【００４７】
ｍｉＲＮＡは、様々な技術によって身体サンプルから抽出することができる。簡単に言うと、これらは、サンプルへのタンパク質変性剤（トリゾール又はチオシアン酸グアニジンのような）の添加、タンパク質デブリを除く遠心分離、ＤＮＡを除去するＤＮａｓｅＩの添加、及び適切なカラムを用いたＲＮＡの抽出を含み得る。ＲＮＡサンプルを、エタノール／イソプロパノール沈殿及び／又は遠心分離濃縮によって更に濃縮してもよい。現在のところ、本発明者らにより用いられた好ましい抽出キットはアンビオン社により供給されているが、利用可能性及び／又は後に続く下流の反応における適合性に応じて、他の抽出キットを用いることもできる。
【００４８】
ＰＣＲを用いて、１種又は２種以上のｍｉＲＮＡ分子を増幅し得る。ＰＣＲ技術は、リアルタイムＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ又は分子ビーコンＰＣＲからなる群より選択し得る。ＰＣＲは、サンプル中のアッセイされるｍｉＲＮＡ分子に実質的に相補性の２個のプライマーの使用を含むことが理解されるであろう。第三及び第四態様のキットは、被検個体由来のサンプル中の１種又は２種以上のｍｉＲＮＡ分子の濃度を測定するための手段を含む。キットは、被検個体由来のサンプル中の１種又は２種以上のｍｉＲＮＡ分子の濃度を測定するための手段を収容し得る容器を含み得る。キットは、取扱説明書も含み得る。
【００４９】
従って、キットは、サンプルを前記被検個体から得た時点で該サンプル中の１種又は２種以上のｍｉＲＮＡの濃度を測定するための検出手段を含み得る。例えば、検出手段は、ｍｉＲＮＡを増幅するためにＰＣＲ法で用いる１個又は２個以上のプライマーを含み得る。一実施形態では、１種又は２種以上のｍｉＲＮＡ分子の検出を、アプライドバイオシステムズ社のウェブサイト（http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home.html）に記載されているように、特定のヒトｍｉＲＮＡに特異的なプライマー及びプローブセットを用いたＴａｑＭａｎ定量ＲＴ−ＰＣＲによって達成してもよい。この方法は、輪になった逆転写酵素プライマーを利用してｃＤＮＡを形成し、次いでＰＣＲ増幅用のフォワードプライマー及びリバースプライマーを形成する。定量は、２個のプライマーの間に位置してＰＣＲ反応に際し蛍光が活性化される蛍光標識プローブの使用により達成される（方法については、http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home.htmlを参照のこと）。
【００５０】
別の実施形態では、ＥｘｉｑｏｎマイクロＲＮＡ検出キット（http://www.exiqon.com/ls）を用いて、検出を達成してもよい。しかしながら、他のＲＮＡに基づく検出方法及びマイクロアレイに基づく検出方法も本発明に適用し得る。プライマーは、例えば、ｍｉＲＮＡ−１５ａ、ｍｉＲＮＡ−１５ｂ、ｍｉＲＮＡ−１６、ｍｉ−ＲＮＡ−２２１、ｍｉＲＮＡ−４５１、ｍｉＲＮＡ−６３８、ｍｉＲＮＡ−７２０、ｍｉＲＮＡ−１２４６、ｍｉＲＮＡ−１３０８、ｍｉＲＮＡ−１９１５、ｍｉＲＮＡ−１９７４、ｍｉＲＮＡ−５７４−５ｐ又はｍｉＲＮＡ−７６２といった検出されるｍｉＲＮＡ分子と同一の少なくとも部分な配列を含み得る。別の実施形態では、逆転写酵素及びＰＣＲ反応が、実施例１で示す手順を含み得る。
【００５１】
基準値は、統計的に有意な数のコントロールサンプル（すなわち、形質細胞疾患に罹患していない対象個体由来のサンプル）をアッセイすることによって得ることができる。従って、本発明の第三態様及び第四態様のキットによる基準（ii）は、（アッセイ用の）コントロールサンプルであり得る。
【００５２】
キットは、関連ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ−１５ａ、ｍｉＲＮＡ−１５ｂ、ｍｉＲＮＡ−１６、ｍｉ−ＲＮＡ−２２１、ｍｉＲＮＡ−４５１、ｍｉＲＮＡ−６３８、ｍｉＲＮＡ−７２０、ｍｉＲＮＡ−１２４６、ｍｉＲＮＡ−１３０８、ｍｉＲＮＡ−１９１５、ｍｉＲＮＡ−１９７４、ｍｉＲＮＡ−５７４−５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ−７６２）が正常なコントロール（すなわち、骨髄腫のような形質細胞疾患でない正常な健常者）よりも統計的に高い又は低いレベルで存在することが証明されている形質細胞疾患（例えば、骨髄腫）の患者のサンプル（例えば、血漿）から抽出した全ＲＮＡに相当する陽性コントロール（好ましくは、容器で提供される）を含み得る。従って、陽性コントロールのｍｉＲＮＡは、配列番号１〜１３で実質的に示すヌクレオチド配列、又はそれらの相補性配列、又はそれらの変異体若しくは断片を含み得る。
【００５３】
キットは、上記ｍｉＲＮＡが不検出であることが既に証明されている、形質細胞疾患（例えば、骨髄腫）でない正常な健常者のサンプル（例えば、血漿）から抽出した全ＲＮＡに相当する陰性コントロール（好ましくは、容器で提供される）を含み得る。ほんの一例として、ｍｉＲＮＡ−１８１ａ及びｍｉＲＮＡ−１８１ｂは、正常な健常コントロールよりも検出可能な程度に高くないレベルで存在することが見出されたが、この部類に入り得る数多くの他のｍｉＲＮＡが存在することが理解されるであろう。従って、例えば、ｍｉＲＮＡ−１８１ａ及びｍｉＲＮＡ−１８１ｂを陰性コントロールとして用いてもよい。
【００５４】
ｍｉＲＮＡ−１８１ａの配列は、２３ヌクレオチド長であり、本明細書中で配列番号１４と呼ばれ、以下の通りである。
５’−ＡＡＣＡＵＵＣＡＡＣＧＣＵＧＵＣＧＧＵＧＡＧＵ−３’
配列番号１４
【００５５】
ｍｉＲＮＡ−１８１ｂの配列は、２３ヌクレオチド長であり、本明細書中で配列番号１５と呼ばれ、以下の通りである。
５’−ＡＡＣＡＵＵＣＡＵＵＧＣＵＧＵＣＧＧＵＧＧＧＵ−３’
配列番号１５
【００５６】
従って、陰性コントロールのｍｉＲＮＡは、配列番号１４又は１５で実質的に示されるヌクレオチド配列、又はそれらの相補性配列、又はそれらの変異体若しくは断片を含み得る。
【００５７】
好ましい実施形態では、キットが、基準、陽性コントロール及び陰性コントロールを含み得る。キットは、必要に応じて、濃度の基準を提供する“スパイクイン”コントロ−ルのような更なるコントロール及び“署名”マイクロＲＮＡの各々についての更なる陽性コントロールも含むであろう。
【００５８】
従って、ほんの一例として、形質細胞疾患に罹患していない正常な健常者における署名ｍｉＲＮＡの血漿濃度は検出不能でもよく、一方、形質細胞疾患がある患者におけるある特定の署名ｍｉＲＮＡの濃度は、少なくとも５倍、１０倍、１５倍又は２０倍高くてもよい。また、一例として、形質細胞疾患におけるある特定の署名ｍｉＲＮＡの濃度の低減は、健康な患者よりも少なくとも５倍、１０倍、１５倍又は２０倍低くてもよい。
【００５９】
本発明者らは、被検個体において、ある特定のｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ−１５ａ、ｍｉＲＮＡ−１５ｂ、ｍｉＲＮＡ−１６、ｍｉ−ＲＮＡ−２２１、ｍｉＲＮＡ−６３８、ｍｉＲＮＡ−７２０、ｍｉＲＮＡ−１２４６及び／又はｍｉＲＮＡ−１９１５）の濃度が、基準濃度（実施例で説明する方法を用いて算出される）よりも統計的に高いことに気付いた。これを、本明細書では、１種又は２種以上のｍｉＲＮＡの濃度の‘増加’と呼ぶ場合がある。逆に、本発明者らは、被検個体において、ある特定の他のｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ−４５１及び／又はｍｉＲＮＡ−１３０８）の濃度が、基準濃度（実施例で説明する方法を用いて算出される）よりも統計的に低いことに気付いた。これを、本明細書では、１種又は２種以上のｍｉＲＮＡの濃度の‘低減’と呼ぶ場合がある。
【００６０】
熟練技術者は、統計的に有意な数の対照個体におけるｍｉＲＮＡの濃度及び被検個体におけるｍｉＲＮＡの濃度を測定する方法、次いで、それら数値を用いて被検個体がｍｉＲＮＡ濃度の統計的に有意な増加又は低減を有するかを決定する方法、それによって、前記被検個体が形質細胞疾患に罹患しているかを推測する方法を理解するであろう。
【００６１】
従って、本発明者らは、正常な（すなわち、コントロールの）レベルと増加した／低減したレベルとの間のｍｉＲＮＡ濃度の差異を、被検個体における形質細胞疾患の存在（又は、悪性病態の不存在）を示唆する生理学的マーカーとして用いることができることに気付いた。対象個体が基準のコントロール値のｍｉＲＮＡの‘規定’濃度よりもかなり高い（又は低い）１種又は２種以上の署名ｍｉＲＮＡ濃度の増加（又は低減）を有する場合、対象個体は、前記ｍｉＲＮＡの濃度が‘規定’濃度よりもわずかにのみ高い場合よりも、形質細胞疾患を有するリスクが高い、すなわち、より進行した病状であろうことが理解されるであろう。
【００６２】
一例として、‘規定’濃度と比較したｍｉＲＮＡの濃度の増加は、‘規定’濃度又は基準濃度よりも少なくとも５倍、１０倍、１５倍又は２０倍高くてもよい。一例として、‘規定’濃度と比較したｍｉＲＮＡの濃度の低減は、‘規定’濃度又は基準濃度よりも少なくとも５倍、１０倍、１５倍又は２０倍低くてもよい。このようなｍｉＲＮＡ濃度における変化は、被検個体が形質細胞疾患に罹患していることを暗示する。従って、臨床医は、例えば、投与される第五態様の治療薬の種類及び用量といった、必要とされる好ましい一連の治療について判断を下すことができるであろう。
【００６３】
第二態様の方法及び第四態様のキットにおいて、身体サンプルにおける１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の基準の対応濃度と比較した濃度の差異は、例えば、サリドマイドといった治療薬による患者の形質細胞疾患の治療の有効性の指標である。前記差異は、身体サンプル中の１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度における基準値と比較した増加又は低減であり得る。身体サンプル中の１種又は２種以上のマイクロＲＮＡの濃度が基準の対応濃度よりも低い実施形態では、このことが、治療薬が被検個体の形質細胞疾患の治療に成功していることを示すであろう。逆に、身体サンプル中の１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度が基準の対応濃度よりも高い実施形態の場合、このことは、治療薬が形質細胞疾患の治療に成功していないことを示すであろう。
【００６４】
本発明が、本明細書中で言及するいずれかの配列の実質的な核酸配列を含むいずれかの核酸又はそれらの変異体、誘導体若しくは類似体（それらの機能的変異体若しくは機能的断片を含む）にまで及ぶことは理解されるであろう。“実質的なヌクレオチド配列”、“機能的変異体”及び“機能的断片”という用語は、本明細書中で記載する全１３種のｍｉＲＮＡについて、本明細書で言及する配列のうちのいずれか１個のヌクレオチド配列と少なくとも４０％の同一性を有する配列、例えば、配列番号１（すなわち、ｍｉＲＮＡ−１５ａ）又は配列番号２（すなわち、ｍｉＲＮＡ−１５ｂ）として特定されるヌクレオチドと４０％の同一性を有する配列であり得る。
【００６５】
言及される配列のいずれかに対して６５％より高い、より好ましくは７０％より高い、更により好ましくは７５％より高い、より一層好ましくは８０％より高い配列同一性である配列同一性を有するヌクレオチド配列も想定される。ヌクレオチド配列が、本明細書中で言及される配列のいずれかと少なくとも８５％の同一性を有するのが好ましく、本明細書中で言及される配列のいずれかと、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、更に好ましくは少なくとも９２％の同一性、更に好ましくは少なくとも９５％の同一性、更に好ましくは少なくとも９７％の同一性、更に好ましくは少なくとも９８％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。  
【００６６】
熟練技術者は、２個のヌクレオチド配列間の同一性の比率をどのように算出するか理解しているであろう。２個のヌクレオチド配列間の同一性の比率を算出するために、その２個の配列のアラインメントを最初に用意し、続いて、配列同一性の値を算出しなければならない。２個の配列の配列同一性は、（i）例えば、ＣｌｕsｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（様々なプログラムによって実行される）又は３Ｄ比較からの構造的アラインメントといった、配列を整列させるのに用いる方法、並びに（ii）例えば、ローカル対グローバルアラインメントといったアラインメント方法によって用いられるパラメータ、用いるペアスコア行列（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、Ｇｏｎｎｅｔ等）、及び、ギャップペナルティ、例えば、関数形式及び定数、に応じて異なる値をとり得る。
【００６７】
アラインメントを作成すると、２個の配列間の同一性の比率を算出する多数の様々な方法が存在する。例えば、１つは、（i）最短配列の長さ；（ii）アラインメントの長さ；（iii）配列の平均長；（iv）非ギャップ位置の数；又は（v）突出部を除く等価な位置の数、によって同一性の数を分類し得る。更に、配列同一性の比率は、強力に長さ依存的でもあることが理解されるであろう。従って、一対の配列がより短くなるほど、偶然に起こると予想され得る配列同一性は高くなる。
【００６８】
従って、タンパク質又はＤＮＡ配列の正確なアラインメントは、複雑なプロセスであることが理解されるであろう。本発明に従ってタンパク質又はＤＮＡのマルチプルアラインメントを作成するために、一般的なマルチプルアラインメントプログラムであるＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら, １９９４, Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, ２２, ４６７３−４６８０点 Ｔｈｏｍｐｓｏｎら, １９９７, Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, ２４, ４８７６−４８８２）が好ましいやり方である。ＣｌｕｓｔａｌＷに適するパラメータは、次の通りであり得る：ＤＮＡアラインメントについて：Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１５．０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝６．６６、及びＭａｔｒｉｘ＝Ｉｄｅｎｔｉｔｙ。タンパク質アラインメントについて：Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１０．０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．２、及びＭａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔである。ＤＮＡ及びタンパク質アラインメントについては：ＥＮＤＧＡＰ＝−１、及びＧＡＰＤＩＳＴ＝４である。当業者は、最適な配列アラインメントのためにこれらパラメータ及び他のパラメータを変更する必要があり得ることに気付くであろう。
【００６９】
好ましくは、２個のヌクレオチド配列間の同一性の比率の算出は、次いで、(Ｎ／Ｔ)*１００としてこのようなアラインメントから算出することができ、ここで、Ｎは、それら配列が同一残基を共有する位置の数であり、Ｔは、突出を除きギャップを含めて比較した位置の総数である。従って、２個の配列間の同一性の比率を算出する最も好ましい方法は、（i）適切な一組のパラメータ、例えば、上で示すもの、を用いたＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて配列アラインメントを用意することと、（ii）Ｎ及びＴの値を次式：- 配列同一性＝(Ｎ／Ｔ)*１００に挿入することと、を含む。
【００７０】
類似配列を特定する別の方法は、当業者に公知であろう。例えば、実質的に類似するヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下で配列番号１〜１５で示す配列又はそれらの相補体とハイブリダイズする配列によってコードされるであろう。ストリンジェントな条件によって、ヌクレオチドが、およそ４５℃の３×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中に続くおよそ２０〜６５℃の０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で少なくとも１回の洗滌で、フィルター固定したＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズすることを意味する。あるいは、実質的に類似するポリペプチドは、本明細書中に記載する配列と、少なくとも１個のアミノ酸で異なり得るが、５個未満のアミノ酸、１０個未満のアミノ酸、２０個未満のアミノ酸、５０個未満のアミノ酸又は１００個未満のアミノ酸で異なり得る。
【００７１】
遺伝コードの縮退により、本明細書中に記載するあらゆる核酸配列は、それによりコードされるタンパク質の配列に実質的に影響することなく変化する又は変化させられて、それらの機能的変異体を提供できることが明らかである。適切なヌクレオチド変異体は、配列内部で同一のアミノ酸をコードする様々なコドンの置換によって変更された配列を有し、よってサイレント変化を生じるものである。他の適切な変異体は、相同なヌクレオチド配列を有するが、配列の全て又は一部を含み、置換されるアミノ酸と類似する生物物理学的特性の側鎖を有するアミノ酸をコードする様々なコドンの置換によって変更されて、保存的変化を生じるものである。例えば、小型で非極性の疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン及びメチオニンが挙げられる。大型で非極性の疎水性アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが挙げられる。極性で中性のアミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられる。正電荷を持つ（塩基性の）アミノ酸としては、リジン、アルギニン及びヒスチジンが挙げられる。負電荷を持つ（酸性の）アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。従って、アミノ酸は、類似の生物物理学的特性を有するアミノ酸で置き換えてもよいことが理解され、熟練技術者は、これらアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を知っているであろう。
【００７２】
本発明の第一態様によると、被検個体の身体サンプル中の１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度を分析する工程と、該濃度を、形質細胞疾患に罹患していない個体における１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度の基準と比較する工程とを具え、該基準と比較した該被検個体の身体サンプル中の１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度の差異は、該被検個体が形質細胞疾患に罹患している若しくは形質細胞疾患に対する素因を有することを示唆するか又は該患者の病状の否定的な予後を提供する、形質細胞疾患に罹患している患者若しくは形質細胞疾患に対する素因を診断するか又は前記患者の病状の予後を提供する方法が提供される。
【００７３】
本発明の更なる態様によると、形質細胞疾患に罹患している患者若しくは形質細胞疾患に対する素因の診断用又は該患者の病状の予後の提供用のキットであって、
（i）被検個体由来のサンプル中の１種又は２種以上のマイクロＲＮＡの濃度を測定する手段と、
（ii）形質細胞疾患に罹患していない個体由来のサンプル中の１種又は２種以上のマイクロＲＮＡの濃度の基準と、を含み、
該キットを用いて該基準濃度と比較した該被検個体由来のサンプル中の１種又は２種以上のマイクロＲＮＡの濃度の差異を特定することによって、該被検個体が形質細胞疾患に罹患しているか若しくは形質細胞疾患に対する素因を有することを示唆するか、又は該患者の病状の否定的な予後を提供するキットが提供される。
【００７４】
本発明の別の態様によると、
（i）被検個体から得たサンプル中の１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度を測定する工程であって、形質細胞疾患に罹患していない個体由来のサンプル中の１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度と比較した該被検個体の該身体サンプル中の１種又は２種以上のマイクロＲＮＡの濃度の差異は、該被検個体が、形質細胞疾患に罹患しているか、形質細胞疾患に対する素因があるか又は否定的な予後を有することを示唆する該工程と、
（ii）形質細胞疾患の進行を妨げる、緩和する又は遅らせる治療薬を該被検個体に投与する工程と、
を具える、形質細胞疾患に罹患している個体を治療する方法が提供される。
【００７５】
前記方法及びキットは、ｍｉＲＮＡ−１５ａ、ｍｉＲＮＡ−１５ｂ、ｍｉＲＮＡ−１６及びｍｉＲＮＡ−２２１からなるｍｉＲＮＡ分子群より選択される１種又は２種以上のマイクロＲＮＡ分子の濃度を分析することを含み得ることが好ましい。
【００７６】
本明細書（添付する特許請求の範囲、要約及び図面を含む）中で記載する全ての特徴及び／又はこのように開示されるあらゆる方法又はプロセスの全ての工程は、少なくとも幾つかのそれら特徴及び／又は工程が相互排他的である組み合わせを除き、あらゆる組み合わせで上記態様のいずれとも組み合わせることができる。
【実施例】
【００７７】
［実施例１］
＜材料及び方法＞
［１．サンプル収集］
この研究のため、本発明者らは、１０人の患者の標的が各々ＩｇＧ骨髄腫、ＩｇＡ骨髄腫及び軽鎖のみの骨髄腫である３０人の新たに診断された骨髄腫患者を採用した。これら患者の各々を、診断時及び治療完了後に全部で６０の分析を行って分析した２０人のＭＧＵＳ患者及び２０人の健常対照者からサンプルを得た。可変性を斟酌するためであるが、関与する仕事量が実行可能でもあったため、この数の患者を選択した。このプロジェクトの間にＭＧＵＳ患者のいずれかが骨髄腫に進行する場合、本発明者らは、彼らのｍｉＲＮＡレベルの変化を長期的に追跡する。
【００７８】
骨髄腫、ＭＧＵＳ及び健常対照者全てを、定期的な全血球数並びにクレアチニン、カルシウム、アルブミン、ＬＤＨ、ＣＲＰ、β２−マイクロブロブリン及び免疫グロブリンレベルを含む生化学的プロフィールと共に血清／尿電気泳動及び無血清軽鎖検出によって評価して、免疫不全麻痺を評価した（Ｋｙｌｅ, Ｒ.Ａ. ａｎｄ Ｒａｊｋｕｍａｒ, Ｓ.Ｖ. （２００８） Ｂｌｏｏｄ, １１１（６）: ２９６２−７２；ＭｃＫｅｎｎａ, Ｒ.Ｗ., ｅｔ ａｌ., Ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ ｎｅｏｐｌａｍｓ, ｉｎ ＷＨＯ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒｓ ｏｆ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅｓ, Ｓ.Ｈ. Ｓｗｅｒｄｌｏｗ, ｅｔ ａｌ., Ｅｄｉｔｏｒｓ. ２００８, Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ：Ｌｙｏｎ. ｐ. ２００−２０３）。骨髄腫及びＭＵＧＳがある患者に骨髄生検及び全骨格検査を行って、標準的慣行通りに彼らの病状を分類した。この情報を、匿名の様式で、実験結果と関連付けた。
【００７９】
研究目的での血液及び骨髄サンプルの提供に対する倫理的及びＲ＆Ｄ承認を有する“ブライトン血液疾患研究”と名付けられた既存の研究プロジェクト（整理番号０９／０２５／ＣＨＥ及び０９／Ｈ１１０７／１）の下で、同意を得た被検者から、臨床サンプルを得た。これらサンプルを人体組織管理庁からライセンスの許諾を受けて保存し、臨床試験実施基準を常時順守した。サンプルを、承認された標準操作手順書に従って、訓練を受けた施術者により診療室又は瀉血室で収集し、４時間以内に処理して、ロイヤル・サセックス郡病院から指名された技術者により医学研究所（サセックス大学キャンパス内）まで車で輸送した。サンプルは、人体組織管理庁のガイドラインの通り、匿名にし、符号化して、非常用発電機を用いて−８０℃で冷凍庫内に保存した。
【００８０】
［２．全ゲノムプロファイリングを用いたｍｉＲＮＡのスクリーニング］
前記プロジェクトのこの部分の目的は、健常対照者に対してＭＧＵＳ患者及び骨髄腫患者において特異的にアップレギュレートされる特定ｍｉＲＮＡを同定することであった。マイクロアレイを用いることにより、全８８５個の既知ｍｉＲＮＡを同時にスクリーニングして、どれが特異的にアップレギュレートされるかを決定することができる。今日までに既知のヒトｍｉＲＮＡほぼ全部（８８５／９６．２％、ｍｉＲＢａｓｅバージョン１３．０；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ, Ｓ., ｅｔ ａｌ. （２００８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ, ３６（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ): Ｄ１５４−８）及び正規化のための１０個の“スパイクイン”コントロールを含むため、Ｅｘｉｑｏｎマイクロアレイスライドを用いた。加えて、アレイ全体で、各ｍｉＲＮＡスポットを４回複製し、各スパイクインコントロールを４８回複製した。本発明者らはＥｘｉｑｏｎアレイを用いて既にかなり成功しており既存の設備を用いて所内で実験を行うことができることから、このマイクロアレイを用いた。Ｓｏｌｅｘａ（イルミナ社）又は類似するプラットフォームを用いた“ディープシークエンシング”は、この多数のサンプルに対して費用効率が高いと思われなかった。  
【００８１】
［３．マイクロアレイデータの統計的及び生物情報学的解析］
ＧｅｎｅＰｉｘＰｒｏ(７．０)並びに２つの方法、つまり（i）ロバストマルチアレイ平均化（ＲＭＡ）（Ｉｒｉｚａｒｒｙ, Ｒ.Ａ., ｅｔ ａｌ.(２００３) Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ, ３１(４):ｅ１５）及び（ii）遺伝子チップＲＭＡ（ＧＣＲＭＡ）（Ｗｕ, Ｚ.Ｊ., ｅｔ ａｌ. （２００４） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ９９：９０９−９１７）を用いて正規化した得たマイクロＲＮＡ発現データを用いて画像解析を行った。仮説検定のための経験ベイズアプローチ（Ｓｍｙｔｈ, Ｇ.Ｋ. （２００４） Ｓｔａｔ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ, ３：Ａｒｔｉｃｌｅ ３）を実装するバイオコンダクターのＬｉｍｍａパッケージを用いて、示差発現解析を行った。ｍｉＲＮＡは、特異的に調整したｐ値及び両方の正規化方法に対するログオッズ閾値を満たす場合にのみ、示差的に発現されていると定義した。これは、健常対照者と比較してＭＧＵＳ患者及び骨髄腫患者において有意にアップレギュレートされた一組のｍｉＲＮＡをもたらす。この一組のｍｉＲＮＡを、階層的クラスタ分析を用いて更に解析し、これらｍｉＲＮＡが関連した発現プロフィールを有することを見出した。アップレギュレートしたｍｉＲＮＡの機能を、ｍｉＲＮＡ標的推測法とＧｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙデータベース及びＫＥＧＧパスウェイデータベースで利用可能な機能データとを統合するマイクロＲＮＡ及びｍＲＮＡの統合解析（ＭＭＩＡ）（Ｎａｍ, Ｓ., ｅｔ ａｌ. （２００９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ, ３７（ウェブサーバー刊行物):Ｗ３５６−６２）のようなツールを用いて解析した。この解析は、正常対照者と比較してＭＧＵＳ患者及び３群の骨髄腫患者において有意且つ一貫してアップレギュレートしＴａｑｍａｎＲＴ−ＰＣＲによって更に実験的に実証することができる１組の（又は２組以上の）候補ｍｉＲＮＡを提供した。
【００８２】
［４．Ｔａｑｍａｎ定量ＲＴ−ＰＣＲによる結果の確認］
上記でもたらされたデータセットから、本発明者らは、マイクロアレイ解析によって有意にアップレギュレートした４個のマイクロＲＮＡの発現を確認し定量した。検証は、精製した全ＲＮＡに対する逆転写酵素反応に続き、特定の成熟ヒトｍｉＲＮＡに特異的なプライマーセットを用いたＴａｑｍａｎ定量ＲＴ−ＰＣＲによって実施した。プライマー／プローブセットはアプライドバイオシステムズ社から購入した（http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home.html）。
【００８３】
逆転写酵素反応及びＰＣＲ反応を次の通りに実施した：同容量の抽出ＲＮＡ（５μＬ／反応＝抽出容量の１／２０）を、ＴａｑＭａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット及びｍｉＲＮＡ特異的ステムループ構造ＲＴプライマー（アプライドバイオシステムズ社）を用いて１５μＬのＲＴ反応物（４．１６μＬのＨ２Ｏ、１．５μＬの１０×Ｒｅｖeｒｓｅ−Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎバッファー、０．１９μＬのＲＮａｓｅ阻害剤（２０ユニット／μＬ）、０．１５μＬの１００ｍＭのｄＮＴＰ類（ｄＴＴＰを含む）、１μＬのＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、及び５μＬのインプットＲＮＡからなる）中で、１６℃で３０分間、４２℃で３０分間及び８５℃で５分間インキュベーションし、次いで４℃に維持することによって、逆転写させた。リアルタイムＰＣＲ用に、１μＬのＴａｇＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙ（２０×）、１０μＬのＴａｑＭａｎ  ２×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧ無し）及び７．６７μＬのＨ２Ｏを含む２０μＬの反応物中で、１．３３μＬのＲＴ産物を鋳型として用いた。９５℃で１０分間、続いて、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間にて４０サイクルの条件を用いて、リアルタイムＰＣＲをＭｘ３００５Ｐ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（ストラタジーン社）で実施した。全てのＰＣＲ反応を三連で実行させた。閾値サイクル（ＣＴ）は、蛍光が一定の閾値を超えた時点のサイクル数として定義した。
【００８４】
アプライドバイオシステムズ社から供給されたループ構造のＲＴプライマー及びプローブセットは、特定のｍｉＲＮＡに対する精巧な特異性を与えた。本発明者らは、これらＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを用いた幅広い経験を有し、結果のセクションで議論するデータは、それらを、２．９〜３．６ｎｇ／μＬの全ＲＮＡ収量を有する４００μＬの血漿から単離したｍｉＲＮＡに対して用いることができることを示す。ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲは、マイクロアレイデータを確認するだけでなく、スパイクインコントロールを用いることにより、各サンプル中のｍｉＲＮＡレベルに関する定量的データも提供する。この一連の実験の最後に、本発明者らは、形質細胞疾患におけるバイオマーカーとしての可能性を示した少なくとも４個のｍｉＲＮＡのアップレギュレーションを確認して定量することを目的とした。
【００８５】
［５．ｍｉＲＮＡバイオマーカーの検証］  
前記プロジェクトの次の段階は、１０人のＭＧＵＳ患者及び１０人の健常対照者に加えて３０人の骨髄腫患者（１０人のＩｇＧ骨髄腫、１０人のＩｇＡ骨髄腫、及び１０人の軽鎖のみの骨髄腫）の更なる群に対して、４群の各々についてそれらｍｉＲＮＡのうちの５個を選択して検査した。これは、患者の診断における４個の“署名”ｍｉＲＮＡの使用を検証するのに役立った。
【００８６】
［６．既存の危険指標及び癌進行に関連するｍｉＲＮＡバイオマーカーの解析］
癌の進行を予測するための診断ツールとしてのｍｉＲＮＡの有効性を評価するため、本発明者らは、特定のｍｉＲＮＡの発現と、診断で日常的に行われる上述のようなＭＧＵＳ及び骨髄腫における既存の疾患マーカー及び予後マーカーとの間の相関性を探した。ｍｉＲＮＡ署名と疾患状態との間の有意な関連性を検出するために、統計的に考慮して、研究を行うのに必要な適切なサンプルサイズを決定した。加えて、本発明者らは、それらデータを、細胞遺伝学的異常、末端器官障害又は骨疾患の存在、患者の年齢、治療に対する応答、及び臨床成績全体をはじめとする他の疾患関連因子と相関させた。
【００８７】
［結果］
結果は、末梢血の血漿からマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を単離して、Ｔａｑｍａｎ定量ＲＴ−ＰＣＲにより特定のｍｉＲＮＡのレベルを正確に定量することが可能であることを示す。図１に示すように、結果は、健常対照被検者が、検査した５個のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ−１５ａ、ｍｉＲＮＡ−１５ｂ、ｍｉＲＮＡ−１６、ｍｉＲＮＡ−１８１ａ及びｍｉＲＮＡ−２２１）を検出できないレベルで発現することを示す。しかしながら、驚くべきことに、骨髄腫である患者は、末梢血の血漿中でこれらｍｉＲＮＡの各々を高レベルで発現し、ｍｉＲＮＡ−１６は特に高く現れる（図１を参照）。
【００８８】
従って、これらデータは、末梢血の血漿からｍｉＲＮＡを容易に単離し同定するのが可能であること、健常対照者と比較して骨髄腫である患者において特定のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ−１５ａ、ｍｉＲＮＡ−１５ｂ、ｍｉＲＮＡ−１６、ｍｉＲＮＡ−１８１ａ及びｍｉＲＮＡ−２２１）が有意にアップレギュレートされたことを明らかに実証する。
【００８９】
［実施例２］
実施例１で得られたデータに基づき、本発明者らは、骨髄腫の診断及び予後に用いることができる診断キットを開発した。このキットは、関連の陽性コントロール及び陰性コントロールと共に、骨髄腫の“署名”を提供する適切なｍｉＲＮＡを含むＰＣＲアッセイが予め組み込まれているマイクロ流体カード（又は９６ウェル／３６４ウェルプレート）を含む。署名ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１５ａ、ｍｉＲＮＡ−１５ｂ、ｍｉＲＮＡ−１６及び／又はｍｉＲＮＡ−２２１から選択されるｍｉＲＮＡのいずれか又は全部とすることができる。適切な陽性コントロールは、署名ｍｉＲＮＡ、すなわち、ｍｉＲＮＡ−１５ａ、ｍｉＲＮＡ−１５ｂ、ｍｉＲＮＡ−１６及び／又はｍｉＲＮＡ−２２１のいずれか又は全部と一致するであろう。陰性コントロールは、ｍｉＲＮＡ−１８１ａ及び／又はｍｉＲＮＡ−１８１ｂである。
【００９０】
前癌状態ＭＵＧＳから骨髄腫への進行の前兆となるｍｉＲＮＡも更に含めることができる。ＮＨＳ診断研究所において通常雇用され得る施術者は、キット又は機械を用いて血漿から全ＲＮＡを単離し、次いでその全ＲＮＡサンプルをマイクロ流体カード（又は９６ウェルプレート）にアプライし、それを定量ＲＴ−ＰＣＲ機に入れる。すると、定量ＲＴ−ＰＣＲ機は必要な反応（実施例１で説明するような）を行い、プレートの各ウェルから蛍光シグナルの相対レベルを検出する。そして、熟練した施術者は、このデータをまとめて臨床医に提示し、彼／彼女の診断を補助する。
【００９１】
［実施例３］
本発明者らは、本発明を用いて、シクロホスファミド、サリドマイド及びデキサメタゾンのような治療薬での多発性骨髄腫の治療の有効性を判定することができると考える。骨髄腫に罹患している患者に、臨床医の判断に応じた用量でのシクロホスファミド、サリドマイド及びデキサメタゾンの標準的治療を含む併用療法で投与する。血液サンプルを患者から採取し、次いで、様々な署名ｍｉＲＮＡの濃度を評価するのに用いて、これらの値を記録する。１ヶ月後、第二の血液サンプルを患者から採取し、同じｍｉＲＮＡの濃度を測定する。ある特定のｍｉＲＮＡの濃度が経時的に同一であるか又は増加する場合、臨床医は、治療計画が成功していないことが分かり、よって、用量を増やすか又は別の治療計画を試みることができる。
【００９２】
［実施例４］
＜方法＞
［ＲＮＡ抽出］
アンビオンｍｉＲＶａｎａ  ＰＡＲＩＳキットをメーカーの使用説明書に従って用いて、全ＲＮＡ抽出を行った。
【００９３】
［マイクロアレイ］
メーカーの使用説明書に従って、アジレントヒトｍｉＲＮＡ  ８×１５Ｋマイクロアレイ（Ｖ３、ｍｉＲＢａｓｅバージョン１２．０）を行った。回転式のＵＶＰ  ＨＢ−１０００オーブンでアジレントハイブリダイゼーションチャンバーを用いて、ハイブリダイゼーションを行った。アクソンＧｅｎeＰｉｘ  ４０００Ｂマイクロアレイスキャナーを用いてスライドをスキャンし、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ６．０を用いて解析した。
【００９４】
［定量ＰＣＲ］
アプライドバイオシステムズ社のＴａｑＭａｎ  ｍｉＲＮＡアッセイをｑＰＣＲに用いた。アプライドバイオシステムズ社のＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて逆転写（ＲＴ）を行い、特異的なループ構造のＲＴプライマーでＴａｑｍａｎアッセイを準備した。各ＴａｑＭａｎアッセイで準備した特異的プライマー／プローブの組み合わせ及びアプライドバイオシステムズ社のＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ, Ｎｏ ＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧを用いて、ｑＰＣＲを行った。絶対定量用に、シグマジェネシス社製の合成ｍｉＲＮＡをスタンダードとして用いた。血清由来の１つのＲＮＡ調整物あたり２回のＲＴ反応及び２回のｑＰＣＲを行った（合計で４回の技術反復）。各スタンダードについて、１回のＲＴ反応及び３回のｑＰＣＲ反応を行った（合計で３回の技術的反復）。
【００９５】
＜患者及び対照者のサンプル＞
Ｎ、ＮＨ、ＭＧ及びＭと呼ぶ４群の血清サンプルに対して、下記の実験を行った。Ｎ（“健常”）サンプルを、ＭＧＵＳ病状又は骨髄腫病状の存在の見込みがない年齢の正常な入院していない人々（平均年齢４７歳）から採取した。ＮＨ（“正常な入院者”）サンプルを入院している非ＭＧＵＳ患者／非骨髄腫患者（平均年齢７７歳）から採取した。ＭＧ（ＭＧＵＳ）サンプルをＭＧＵＳに罹患している患者から採取し、Ｍ（骨髄腫）サンプルを多発性骨髄腫に罹患している患者から採取した。マイクロアレイ及び最初のｑＰＣＲを用いて各群でどのようなｍｉＲＮＡが発現されるかを検出するため、個人の血清サンプルをプールした。ＮＨ群、ＭＧ群及びＭ群について２０人の個人サンプルをプールし、Ｎ群について１３人の個人サンプルをプールした。プールした血清サンプルから、アンビオン社のｍｉＲＶａｎａ  ＰＡＲＩＳキットを用いて、ＲＮＡを２つ組で抽出した。この２つ組をＮ１／Ｎ２、ＮＨ１／ＮＨ２等と呼んだ。２つ組の各々について、アジレント社のＨｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡアレイを行い（合計で８つのアレイ）、各群で発現したｍｉＲＮＡを検出した。アレイで検出したｍｉＲＮＡについて、アプライドバイオシステムズ社のＴａｑＭａｎ  ｍｉＲＮＡ  ｑＰＣＲキットを用いて、各プール中の各ｍｉＲＮＡの発現を評価した。これに続いて、個人の血清サンプルから調製したＲＮＡについて検査すべきｍｉＲＮＡのサブセットを選択した。
【００９６】
＜結果＞
［プールしたサンプルに対するｍｉＲＮＡマイクロアレイ］
表１に示すように、アジレント社のＨｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡアレイによって９個のｍｉＲＮＡを検出した。
【００９７】
【表１】
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【００９８】
各々を少なくとも２つの複製物で検出した。各アレイはｍｉＲＮＡ１個あたり１６のスポットを含み、その５つ以上のスポットがバックグラウンドレベルを明らかに上回った場合、ｍｉＲＮＡを検出すべきものとした。アレイ間の技術的変動を補正するノーマライザーとして使用する既知の内部コントロールが存在しなかったため、これらｍｉＲＮＡのレベルを、アレイデータを用いてグループ間で比較しなかった。
【００９９】
［プールしたサンプルに対するｑＰＣＲ］
この実験の主たる目的は、マイクロアレイ結果を検証し、ｍｉＲＮＡ発現のパターンが様々なより定量的技術を用いた場合と同様であることを確認することであった。アレイについて検出した９個のｍｉＲＮＡのうちの７個についてＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲアッセイが利用可能であった。これら７つのアッセイを、アレイを用いたプールした血清由来の複製ＲＮＡサンプル（すなわち、Ｎ１／Ｎ２等）の各々に対して試験した。各プールしたサンプルに対して２の逆転写酵素複製及び２のＰＣＲ複製を行って、各プールに対して合計で８の複製物を生じた。図２は、全７個のｍｉＲＮＡが各群の両方の複製物で検出されたこと、各患者群に対してｍｉＲＮＡの発現パターンが異なることを示す。逆転写及びｑＰＣＲに特異的ＴａｑＭａｎプライマーを用いて、７個のｍｉＲＮＡの相対発現レベルを４セットの複製物で検査した。本発明者らは、幾つかのｍｉＲＮＡの発現レベルがＭ及び／又はＭＧＵＳ患者で増加したこと（ｍｉＲ-６３８、ｍｉＲ-７２０、ｍｉＲ-１２４６及びｍｉＲ-１９１５）、また、そのレベルが他のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ-４５１及びｍｉＲ-１３０８）に対して低減していることが分かって驚いた。これらの結果は、これらｍｉＲＮＡが、様々な疾患状態についての確固たるバイオマーカーとして役立ち得ることを意味する。サンプル間の発現の差異の正確な定量は、ノーマライザーｍｉＲＮＡを欠くために不可能であるが、ｑＰＣＲ検査間の技術的変動が最小限であるため、これらの差異が真の生物学的差異を反映しそうであると思われる。
【０１００】
［個々のサンプルに対する絶対ｑＰＣＲ］
ノーマライザーｍｉＲＮＡの不存在下で、群間の正確な発現の差異を測定するため、絶対定量を行って、血清１μＬあたりの各ｍｉＲＮＡのコピー数を測定した。同じ群の個人間の一貫した差異が必要であるため、本発明者らは、４個のｍｉＲＮＡについて絶対ｍｉＲＮＡレベルの大規模な分析を開始した。最初に選択した４個のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−１３０８及びｍｉＲ−１９７４であった。先の実験についてプールを形成した患者由来の２００μＬの血清から、それぞれＲＮＡを調製した。絶対定量は、比較のために未知のサンプルと並行して実行されるスタンダードサンプルを必要とする。用いるスタンダードは、例えば、合成的に産生されるｍｉＲＮＡといった、既知濃度の対象ｍｉＲＮＡとしなければならない。合成ｍｉＲＮＡを数桁の範囲にわたって希釈して、これら希釈物を未知のサンプルと同様に扱う（ＲＴ工程に続きｑＰＣＲ）。スタンダードサンプルを用いて、サイクル閾値（Ｃｔ）−コピー数曲線を描き、未知のサンプルのＣｔをこれと比較してコピー数を与える。次いで、個々のコピー数を群間で比較して、発現の差異を示す。
【０１０１】
図３は、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２４６及びｍｉＲ−１３０８について１群あたり６人の個人（合計２４人）を用いた現在までの結果を示す（個人／ｍｉＲＮＡの組み合わせあたり４回の技術的反復）。予想した通り、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２４５及びｍｉＲ−１３０８の発現のパターンは、プールしたサンプルを用いた場合と比較して個人のサンプルを用いた場合と同様であった。ｍｉＲ−１９７４については、これまでのところ、１群あたり２人の個人だけを検査した。
【０１０２】
［結論］
本発明者らは、マイクロアレイとＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲの双方を用い、対照者と比較して、６個のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−６３８、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−１３０８及びｍｉＲ−１９１５）が患者群由来の血清中で特異的な発現パターンで発現されることを示した。これらｍｉＲＮＡのうちの３個（ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２４５及びｍｉＲ−１３０８）について、これら異なる発現パターンが、個々の患者において確認された。示された特異的パターンは、骨髄腫患者、ＭＧＵＳ患者及び対照患者の間で相違し、これは、これらを予後目的及び診断目的のバイオマーカーとして用いることができることを示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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