(57)【要約】  本発明は、植物のグリホサート耐性を改善するための新規方法に関する。方法は、前記植物の特定のヌクレオチド配列中に1つまたは複数の特異的変異を与えるステップを包含する。この方法により操作されていない植物との比較において、この方法によって得られた植物は、(改善された)グリホサート耐性を示す。同様に提供されるのは、本発明による方法によって得られうる、その種子および植物産生物を含む(トランスジェニック)植物である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物にグリホサート耐性を付与するEPSPS酵素、好ましくは植物EPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列であって、図1に示す44位のアミノ酸の変更に対応する少なくとも1つの変異を含むことを特徴とするヌクレオチド配列。
【請求項２】
44位で変更されるアミノ酸がアスパラギンである、請求項1に記載のヌクレオチド配列。
【請求項３】
好ましくは野生型EPSPSとの比較において、44位のアミノ酸がアスパラギン酸に変更される、請求項1または2に記載のヌクレオチド配列。
【請求項４】
それ自体で、ヌクレオチド配列を、植物にグリホサート耐性を付与するEPSPS酵素をコードするようにする少なくとも1つのさらなる変異を含み、好ましくは、前記少なくとも1つのさらなる変異が、図1に示す101、106または179からなる群から選択される位置でのアミノ酸の変更に対応することを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項５】
101位で変更されるアミノ酸がグリシンであり、および/もしくは106位で変更されるアミノ酸がプロリンであり、ならびに/または179位で変更されるアミノ酸がセリンである、請求項4に記載のヌクレオチド配列。
【請求項６】
好ましくは野生型EPSPSとの比較において、101位のアミノ酸がアラニンに変更され、および/または106位のアミノ酸がロイシンに変更され、および/または179位のアミノ酸がアスパラギンに変更される、請求項4または5に記載のヌクレオチド配列。
【請求項７】
請求項1から6のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされる、植物にグリホサート耐性を付与するEPSPS酵素、好ましくは植物EPSPS酵素。
【請求項８】
細菌または植物、好ましくは作物植物、より好ましくはワタ、トマト、ジャガイモ、タマネギ、イネ、コムギ、トウモロコシ、ヒマワリ、アブラナ、キャノーラもしくはサトウダイコン由来である、請求項7に記載のEPSPS酵素。
【請求項９】
植物、好ましくは作物植物、より好ましくはワタ、トマト、ジャガイモ、タマネギ、イネ、コムギ、トウモロコシ、ヒマワリ、アブラナ、キャノーラまたはサトウダイコンにおいて発現される、請求項7または8に記載のEPSPS酵素。
【請求項１０】
請求項1から6のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項１１】
請求項10に記載のベクターを含む宿主。
【請求項１２】
請求項1から3のいずれか一項に記載の変異を、好ましくは請求項4から6のいずれか一項に記載の少なくとも1つのさらなる変異と組合せて含む請求項1から6のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列および/もしくは前記ヌクレオチド配列の断片、ならびに/または請求項7から9のいずれか一項に記載のEPSPS酵素を含む、植物もしくはトランスジェニック植物またはそれらの部分。
【請求項１３】
請求項1から3のいずれか一項に記載の変異を、好ましくは請求項4から6のいずれか一項に記載の少なくとも1つのさらなる変異と組合せて含む請求項1から6のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列をおよび/もしくは前記ヌクレオチド配列の断片、ならびに/または請求項7から9のいずれか一項に記載のEPSPS酵素を含む、請求項12に記載の植物もしくはトランスジェニック植物またはそれらの部分由来の種子。
【請求項１４】
a.EPSPS酵素、好ましくは植物EPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列であって、図1に示す44位のアミノ酸の変更に対応する少なくとも1つの変異を含むことを特徴とするヌクレオチド配列を含む植物(細胞)を提供するステップ
を含む、グリホサート耐性植物(細胞)を提供するための方法。
【請求項１５】
44位で変更されるアミノ酸がアスパラギンである、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
好ましくは野生型EPSPSとの比較において、44位のアミノ酸がアスパラギン酸に変更される、請求項14または15に記載の方法。
【請求項１７】
a.EPSPS酵素、好ましくは植物EPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列であって、図1に示す44位のアミノ酸の変更に対応する少なくとも1つの変異と、それ自体で、前記ヌクレオチド配列を、植物にグリホサート耐性を付与するEPSPS酵素をコードするようにする少なくとも1つのさらなる変異であって、好ましくは、図1に示す101、106または179からなる群から選択される位置でのアミノ酸の変更に対応する変異とを含むことを特徴とするヌクレオチド配列を含む植物(細胞)を提供するステップ
を含む、グリホサートへの耐性を有する植物(細胞)を提供するための方法。
【請求項１８】
a.EPSPS酵素、好ましくは植物EPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列を含む植物(細胞)を提供するステップ、
b.好ましくはステップa)の前記植物(細胞)における、ステップa)の前記ヌクレオチド配列に請求項1から3に記載の変異を与えるステップ
を含む、グリホサートへの耐性を有する植物(細胞)を提供するための方法。
【請求項１９】
ステップa)の前記植物(細胞)における、ステップa)の前記ヌクレオチド配列に請求項1から3のいずれか一項に記載の変異を与えるステップb)が、ステップa)のヌクレオチド配列にハイブリダイズでき、ステップa)のヌクレオチド配列に関する少なくとも1つのミスマッチであって、その位置が請求項1から3のいずれか一項に記載の変異の位置に対応するミスマッチを含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドの導入によって実施される、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
a.植物にグリホサート耐性を付与するEPSPS酵素、好ましくは植物EPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列であって、図1に示す101、106または179からなる群から選択される位置でのアミノ酸の変更に対応する少なくとも1つの変異を含むことを好ましくは特徴とするヌクレオチド配列を含む植物(細胞)を提供するステップ
b.好ましくはステップa)の前記植物(細胞)における、ステップa)の前記ヌクレオチド配列に請求項1から3に記載の変異を与えるステップ
を含む、植物(細胞)のグリホサート耐性を強化するための方法。
【請求項２１】
ステップa)の前記植物(細胞)における、ステップa)の前記ヌクレオチド配列に請求項1から3に記載の変異を与えるステップb)が、ステップa)の前記ヌクレオチド配列にハイブリダイズでき、ステップa)のヌクレオチド配列に関する少なくとも1つのミスマッチであって、その位置が請求項1から3のいずれか一項に記載の変異の位置に対応するミスマッチを含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドの導入によって実施される、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
44位で変更されるアミノ酸がアスパラギンであり、および/もしくは101位で変更されるアミノ酸がグリシンであり、および/もしくは106位で変更されるアミノ酸がプロリンであって、ならびに/または179位で変更されるアミノ酸がセリンである、請求項17から21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
好ましくは野生型EPSPSとの比較において、44位のアミノ酸がアスパラギン酸に変更され、および/または101位のアミノ酸がアラニンに変更され、および/または106位のアミノ酸がロイシンに変更され、および/または179位のアミノ酸がアスパラギンに変更される、請求項17から22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
a.請求項12に記載の植物もしくはその部分、または請求項14から23のいずれか一項に記載の方法によって得られる植物を、好ましくは、調理する、粉砕する、乾燥する、製粉する、焼く、切断する、篩にかける、削る、剥ぐ、浸漬する、洗浄する、加熱する、冷却する、粉々にするまたは湿らせることによって処理して、植物産生物を得るステップ
を含む、植物産生物を生成するための方法。
【請求項２５】
請求項1から3のいずれか一項に記載の変異を、好ましくは請求項4から6のいずれか一項に記載の少なくとも1つのさらなる変異と組合せて含む請求項1から6のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列または前記ヌクレオチド配列の断片の存在を特徴とする、請求項24に記載の方法によって得られる植物産生物、好ましくはデンプンを主成分とする産生物または植物油を主成分とする産生物。
【請求項２６】
植物のグリホサート耐性を強化するための、請求項1から6のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列および/または請求項7から9のいずれか一項に記載のEPSPS酵素の使用。
【請求項２７】
植物にグリホサート耐性を付与するEPSPS酵素、好ましくは植物EPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列であって、図1に示す101、106または179からなる群から選択される位置でのアミノ酸の変更に対応する少なくとも1つの変異を含むことを好ましくは特徴とするヌクレオチド配列を好ましくは含むグリホサート耐性植物のグリホサート耐性を強化するための、請求項1から3のいずれか一項に記載の変異の使用。
【請求項２８】
44位で変更されるアミノ酸がアスパラギンであり、および/または101位で変更されるアミノ酸がグリシンであり、および/または106位で変更されるアミノ酸がプロリンであり、および/または179位で変更されるアミノ酸がセリンである、請求項27に記載の使用。
【請求項２９】
好ましくは野生型EPSPSとの比較において、44位のアミノ酸がアスパラギン酸に変更され、および/または101位のアミノ酸がアラニンに変更され、および/または106位のアミノ酸がロイシンに変更され、および/または179位のアミノ酸がアスパラギンに変更される、請求項27または28に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリホサート耐性植物を提供するためのおよび/または植物のグリホサート耐性を強化するための新規方法に関する。方法は、特定の変異を含むEPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列を植物に与えるステップを包含する。未改変植物と比較して、この方法によって得られた植物は(改善された)グリホサート耐性を示す。同様に提供されるのは、本発明による方法によって得られうる、その種子および植物産生物を含む(トランスジェニック)植物である。
【背景技術】
【０００２】
グリホサート(N-ホスホノメチル-グリシン)は、最も一般的に用いられる除草剤Round Up中の活性化合物である。それは、農業、園芸および造林において用いられる。典型的にはそれは散布され、葉を通じて吸収される。
【０００３】
グリホサートは、植物種に対して広く作用し、シキミ酸経路における重要な酵素であり、芳香族アミノ酸の産生のために不可欠である酵素5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素(EPSPS)の阻害を介して働く。グリホサートは、リン酸エノールピルビン酸(PEP)、天然のEPSPS酵素基質に類似する化学構造を有し、したがって酵素活性部位についてPEPと競合する。EPSPSの阻害は、アミノ酸合成を破壊し、そのため影響を受けた植物細胞を枯らす。グリホサートは、非選択的であり、雑草および作物植物の両方を枯らす。
【０００４】
除草剤としてのグリホサートの人気は、部分的には動物への低毒性による。シキミ酸経路は、植物および細菌においてだけ見出される。Monsantoは、1970年代にグリホサートを最初に特許取得した。
【０００５】
ある種の細菌型がグリホサート中で生存できたという観察結果は、いくつかの細菌性EPSPS酵素がグリホサートに非感受性であるという発見を導いた。これは、これらのグリホサート耐性細菌性EPSPS酵素を発現するMonsantoのトランスジェニックRound Upレディー(Round Up Ready)作物の開発を導いた。
【０００６】
現在Roundup Ready作物は、ダイズ、トウモロコシ(コーン(corn))、ソルガム、キャノーラ、アルファルファ、ワタおよびサトウダイコンを含む。作物に重大な影響を与えることなくグリホサートを畑に散布することができるので、これらの作物は、雑草を防除する農家の能力を大きく改善した。2005年現在、アメリカ合衆国ダイズ畑の87%がグリホサート耐性作物を植えられていた(National Agriculture Statistics Service (2005) in Acreage、Johanns,M. & Wiyatt,S.D.編、6 30、(U.S.Dept.of Agriculture、Washington,DC))。
【０００７】
しかし、Roundup Readyダイズ作物は、最良の従来種と比較して6.7%低い収量を有することが見出されている(Charles Benbrook.Evidence of the Magnitude and Consequences of the Roundup Ready Soybean Yield Drag from University-Based Varietal Trials in 1998.Ag BioTech InfoNet Technical Paper Number 1)。グリホサート耐性を植物に付与するステップは、前記植物の著しい適応コストを含む場合がある。そのような適応コストは、作物収量を減少させ、経時的なバイオマス蓄積の減少によっても表される場合がある。
【０００８】
畑条件下で植物にグリホサート耐性を与えることが見出されている重要な変異は、EPSPS酵素中の106位のプロリンをロイシンに変化させる単一ヌクレオチド変更である(P106L)。世界中の多数の雑草種がこの変異を独立に発生させているが、他の自発的変異はこれまでEPSPS中に見出されていない(Baersonら、Plant Physiol、2002年7月、129巻、1265〜1275頁、2002)。Gassertら(J.Biol.Chem 263(9)巻、4280〜4289頁)は、ペチュニアおよびトマトの5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素遺伝子の構造、発現および進化を記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】US5591616
【特許文献２】US2002138879
【特許文献３】WO95/06722
【特許文献４】米国特許第5,310,667号
【特許文献５】米国特許第5,866,775号
【特許文献６】米国特許第6,225,114号
【特許文献７】米国特許第6,248,876号
【特許文献８】WO2007073170
【特許文献９】WO2007073149
【特許文献１０】WO2009002150
【特許文献１１】WO2007073166
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】National Agriculture Statistics Service(2005)in Acreage編、Johanns,M.&Wiyatt,S.D.6 30、(U.S.Dept.of Agriculture、Washington,DC)
【非特許文献２】Charles Benbrook.Evidence of the Magnitude and Consequences of the Roundup Ready Soybean Yield Drag from University-Based Varietal Trials in 1998.Ag BioTech InfoNet Technical Paper Number 1
【非特許文献３】Baersonら、Plant Physiol、2002年7月、129巻、1265〜1275頁、2002
【非特許文献４】Gassertら(J.Biol.Chem 263(9)巻、4280〜4289頁)
【非特許文献５】Sambrookら、Molecular Cloning.A Laboratory Manual,第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1989
【非特許文献６】Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York、1987および定期更新
【非特許文献７】the series Methods in Enzymology、Academic Press、San Diego
【非特許文献８】Albert L.Lehninger、Principles of Biochemistry、at 793〜800(Worth Pub.1982)
【非特許文献９】Eschenburg,S.、Healy,M.L.、Priestman,M.A.、Lushington,G.H.およびSchonbrunn,E.(2002)How the mutation glycine96 to alanine confers glyphosate insensitivity to 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli.Planta 216、129〜135
【非特許文献１０】Krysanら、1999 The Plant Cell、11巻、2283〜2290
【非特許文献１１】Kunzeら、(1997)Advances in Botanical Research 27 341〜370
【非特許文献１２】Chandlee(1990)Physiologia Planta 79(1)105〜115
【非特許文献１３】The Plant J.2006;45:616〜629
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
グリホサートに対する(改善された)耐性を提供するEPSPS酵素を提供するのに有用なさらなる変異、ならびにその様な変異を保有しているおよび/またはその様な酵素を発現しており、それによりグリホサートの(上昇させたレベルでの)存在下で生育できる植物を同定する必要がある。そのような植物は、グリホサート耐性植物を含む先行技術植物と比較してより高い濃度のグリホサートの存在下で生育できる、またはグリホサート耐性植物を含めた先行技術植物と比較して同様濃度のグリホサートの存在下で強化された生育を示しうる。
【００１２】
さらに、先行技術のグリホサート耐性植物のグリホサート耐性をさらに強化する変異または前記先行技術のグリホサート耐性植物のグリホサート耐性に関連する適応コストを好ましくは低下させる変異を同定する必要もある。
【００１３】
上に記載の必要の少なくとも1つに応じることが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
定義
以下の記載および実施例では多数の用語が用いられる。明細書および特許請求の範囲の明確で一貫した理解をもたらすために、そのような用語に与えられる範囲を含めた、次の定義を示す。本明細書で他に定義する場合を除いて用いられる全ての技術および科学用語は本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１５】
本明細書で用いられる単数形「1つ(a)」、「1つ(an)」および「その(the)」は、他に内容が明確に示す場合を除いて複数の指示対象を含む。例えば、上で用いた「1つの(a)」DNA分子を単離するための方法は、複数の分子(例えば10個、100個、1000個、一万個、十万個、百万個またはそれを超える分子)を単離するステップを含む。
【００１６】
本発明の方法において用いられる従来技術を実行する方法は、当業者に明らかである。分子生物学、生化学、計算科学、細胞培養、組換えDNA、生物情報学、ゲノム科学、配列決定および関連分野での従来技術の実行は当業者に十分周知であり、例えば次の参考文献:Sambrookら、Molecular Cloning.A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,1987および定期更新、ならびにthe series Methods in Enzymology,Academic Press,San Diegoにおいて考察されている。
【００１７】
「栽培植物」および「野生植物」は、ヒトによって良好な農学的特徴について育種されてきた植物および野生で天然において見出される植物をそれぞれ意味する。後者において見出される遺伝子および対立遺伝子は、「野生型」とも称される。しかしEPSPS遺伝子に関しては、「栽培植物」および「野生型植物」の両方に存在する遺伝子は「野生型遺伝子」と称される。植物でのそのような野生型遺伝子のこれらの植物において通常見出されるレベルまでの発現は、「グリホサート耐性」EPSPSを与えず、「グリホサート感受性」EPSPS(下記を参照されたい)を与える。
【００１８】
本明細書において「核酸構築物」または「ベクター」は、組換えDNA技術の使用からもたらされ、外来性DNAを宿主細胞に送達するために用いられる人工核酸分子を意味すると理解される。当技術分野において周知のとおりおよび本明細書他所に記載のとおり、ベクターバックボーンは、例えばバイナリーまたはスーパーバイナリーベクター(例えばUS5591616、US2002138879およびWO95/06722を参照されたい)、共組換えベクターまたはT-DNAベクターであってよく、その中に、キメラ遺伝子が組み込まれる、または好適な転写制御配列が既に存在する場合は所望の核酸配列(コード配列、アンチセンスまたは逆方向反復配列)だけが転写制御配列の下流に組み込まれる。ベクターは、分子クローニングにおけるそれらの使用を促進するためのさらなる遺伝要素、例えば選択マーカー、マルチクローニング部位などを通常含む。
【００１９】
本明細書で用いられる「グリホサート耐性」EPSPSは、植物細胞におけるその発現が植物細胞にグリホサート耐性を付与するEPSPSを意味する。そのような植物で通常見出されるレベルで植物細胞において発現される場合(すなわち過発現に達しない場合)にグリホサート耐性を付与しなければEPSPSは、「グリホサート感受性」である。
【００２０】
本明細書で用いられる「グリホサート耐性」細胞または植物は、典型的には他の細胞または植物を枯らすまたは生育を阻害する一定濃度のグリホサートの存在下で生存または生育を継続できる細胞または植物を意味する。生育は、例えば光合成、発根の増加、高さの増加、質量の増加または新たな葉の発生を含む。
【００２１】
例えばEPSPSは、植物にグリホサート耐性を付与する場合にグリホサート耐性である。例えばEPSPSの同じレベルの発現でグリホサート耐性EPSPSを保有している植物は、グリホサート耐性EPSPSを保有していない植物が生育を停止するまたは枯れるレベルより少なくとも5%、10%、20%、30%または40%高いグリホサートのレベルで生存または生育を継続する。
【００２２】
一実施形態ではグリホサート耐性(植物)細胞は、50μM(もしくは50mg/l)以上のグリホサートを含有する培養培地で生育および分裂でき、好ましくはグリホサート耐性細胞は、100μM(もしくは100mg/l)以上のグリホサート、200μM(もしくは200mg/l)、300μM(もしくは300mg/l)または400μ(もしくは400mg/l)グリホサートなどを含有する培養培地で増殖および分割できる。さらに好ましくはグリホサート耐性細胞は、500μM(もしくは500mg/l)以上のグリホサート、600μM(もしくは600mg/l)などを含有する培養培地で生育および分裂できる。本発明の目的のために用語「グリホサート」は、N-ホスホノメチルグリシン(その任意の塩を含む)の任意の除草性有効形態および植物においてグリホサートアニオンの産生を生じる他の形態を含む。
【００２３】
本出願で定義される、「グリホサート耐性」は、当分野においてグリホサート寛容とも一般に称される。
【００２４】
タンパク質(またはオルソログもしくは変異体などの変種および断片)に関して「機能性」は、植物中の遺伝子の発現レベルを改変するステップ(例えば過発現またはサイレンシング)によって(定量的および/または定性的)特徴を改変する遺伝子および/またはコードされたタンパク質の能力を意味する。例えば植物種Xから得られた仮想タンパク質の機能性は、種々の方法によって検査されうる。好ましくはタンパク質が機能性である場合、植物種Xにおいてタンパク質をコードしている遺伝子の(例えば遺伝子サイレンシングベクターを用いる)サイレンシングは、特徴の低下または抑制を導く一方で感受性植物での過発現は強化された耐性を導く。同様に機能性タンパク質での相補性は特徴の回復または付与を可能にする。当業者は機能性の検査に困難を有さない。
【００２５】
用語「遺伝子」は、細胞内でRNA分子(例えばmRNA)に転写され、好適な制御領域(例えばプロモーター)に作動可能に連結された領域(転写領域)を含むDNA配列を意味する。したがって遺伝子は、プロモーター、例えば翻訳開始に関与する配列を含む5'リーダー配列、(タンパク質)コード領域(cDNAまたはゲノムDNA)および例えば転写終結点を含む3'非翻訳配列などのいくつかの作動可能に連結した配列を含みうる。「遺伝子の発現」は、適切な制御領域(具体的にはプロモーター)に作動可能に連結したDNA領域が、生物学的に活性な(すなわち生物学的に活性なタンパク質またはペプチド(もしくは活性ペプチド断片)に翻訳されうるあるいはそれ自体が活性である(例えば転写後遺伝子サイレンシングまたはRNAi)RNAに転写される工程を意味する。特定の実施形態での活性タンパク質は、構成的に活性なタンパク質を意味する。コード配列は、好ましくはセンス方向であり所望の生物学的に活性なタンパク質またはペプチドもしくは活性ペプチド断片をコードしている。遺伝子サイレンシング手法では、DNA配列は、好ましくはアンチセンスDNAまたは逆方向反復DNAの形態で標的遺伝子の短い配列をアンチセンスでもしくはセンスおよびアンチセンス方向で含んで存在する。「異所性発現」は、遺伝子が通常発現されない組織における発現を意味する。
【００２６】
本明細書で開示される核酸は、ピリミジンおよびプリン塩基、好ましくはシトシン、チミンおよびウラシルならびにアデニンおよびグアニンそれぞれの任意のポリマーまたはオリゴマーを含みうる(その全体が全ての目的のために本明細書に参照により組み込まれるAlbert L.Lehninger、Principles of Biochemistry、at 793〜800(Worth Pub.1982)を参照されたい)。本開示は、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはペプチド核酸成分および、これらの塩基のメチル化、ヒドロキシメチル化またはグリコシル化形態などのそれらの任意の化学的変種を検討する。ポリマーまたはオリゴマーは組成物中で不均一または均一であってよく、天然に存在する供給源から単離されてよくまたは人為的にもしくは合成的に産生されてもよい。したがって用語「単離」は、天然に存在する供給源または人為的なもしくは合成的な産生物からの単離を意味する。ヌクレオチド配列は、例えばBACクローンなどの宿主生物にクローニングするステップによって単離されうる。典型的にはヌクレオチド配列が単離される場合、それは新たに単離されたヌクレオチド配列に天然で直接隣接するヌクレオチド配列の最大で500、好ましくは最大で250、より好ましくは最大で100、より好ましくは最大で50または最も好ましくは最大で20隣接ヌクレオチドを含む。付加的に核酸は、DNAもしくはRNAまたはこれらの混合物であってよく、ホモ二重鎖、ヘテロ二重鎖およびハイブリッド状態を含む1本鎖または2本鎖形態で持続的にまたは一過的に存在できる。
【００２７】
本発明による植物は、ウリ科(Cucurbitaceae)、イネ科(Gramineae)、ナス科(Solanaceae)またはキク科(Asteraceae)(キク科(Compositae))、トウモロコシ/コーン(ゼア(Zea)種)、コムギ(コムギ属(Triticum)種)、オオムギ(例えばホルデウム・ブルガレ(Hordeum vulgare))、カラスムギ(例えばアベナ・サティバ(Avena sativa))、ソルガム(ソルガム・バイカラー(Sorghum bicolor))、ライムギ(セカレ・ケレアレ(Secale cereale))、ダイズ(グリシン(Glycine)種、例えばG.マックス(G. max))、ワタ(ゴシッピウム(Gossypium)種、例えばG.ヒルスツム(G. hirsutum)、G.バーバデンセ(G. barbadense))、アブラナ(Brassica)種(例えば、B.ナプス(B. napus)、B.ジュンセア(B. juncea)、B.オレラセア(B. oleracea)、B.ラパ(B. rapa)など)、ヒマワリ(ヘリアンサス・アヌス(Helianthus annus))、ベニバナ、ヤムイモ、キャッサバ、アルファルファ(メディカゴ・サティバ(Medicago sativa))、イネ(オリザ(Oryza)種、例えばO.サティバ(O. sativa)インディカ栽培品種群またはジャポニカ栽培品種群)、飼料草、トウジンビエ(ペニセタム属(Pennisetum)種、例えばP.グラウクム(P. glaucum))、樹木種(マツ(Pinus)属、ポプラ、モミ、プランタインなど)、チャ、コーヒー、アブラヤシ、ココナッツ、(エンドウ、ズッキーニ、マメ(例えばインゲンマメ属(Phaseolus)種など)、トウガラシ、キュウリ、アーティチョーク、アスパラガス、ナス、ブロッコリ、ニンニク、リーキ、レタス、タマネギ、ラディッシュ、カブ、トマト、ジャガイモ、芽キャベツ、ニンジン、カリフラワー、チコリ、セロリ、ホウレンソウ、エンダイブ、フェンネル、ビートなどの)野菜種、多肉果結実植物(ブドウ、モモ、プラム、イチゴ、マンゴー、リンゴ、プラム、サクランボ、アンズ、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、柑橘、キウィ、イチジク、レモン、ライム、ネクタリン、ラズベリー、スイカ、オレンジ、グレープフルーツなど)、観賞植物種(例えば、バラ(Rose)、ペチュニア(Petunia)、キク(Chrysanthemum)、ユリ(Lily)、ガーベラ(Gerbera)種)、ハーブ(ミント、パセリ、バジル、タイムなど)、木質樹(例えば、ポプラ(Populus)、ヤナギ(Salix)、カシ(Quercus)、ユーカリ(Eucalyptus)の種)、繊維種(例えば、アマ(リナム・ウシタティッシマム(Linum usitatissimum))およびアサ(カンナビス・サティバ(Cannabis sativa))などを含む。
【００２８】
「組換え植物」または「組換え植物部分」または「トランスジェニック植物」は、全ての細胞では遺伝子が発現されない場合もあるが、全ての細胞および植物部分において同じ遺伝子座でキメラ遺伝子を含む植物または植物部分(例えば種子もしくは果実もしくは葉)である。
【００２９】
用語「配列決定」は、核酸試料中、例えばDNAまたはRNAのヌクレオチドの順序(塩基配列)を決定するステップを意味する。サンガー配列決定法および、454またはSolexa technologiesによって提供される次世代配列決定技術などの多数の技術が利用可能である。
【００３０】
配列番号1〜8は、図1に示すEPSPSの関連領域に基づく、トウモロコシ(配列番号1)、イネ(配列番号2)、コムギ(配列番号3)、トマト(配列番号4)、アラビドプシス(配列番号5)、タマネギ(配列番号6)、サルモネラ(配列番号7)および大腸菌(E.coli)(配列番号8)。配列番号1〜8の任意の配列間の意図的ではない任意の差異および図1に示す対応する配列に関して、図1に示す配列が主要なものであり、そのような意図的ではない任意の差異の補正のための基礎としてみなされるべきであることを本明細書に記載する。
【００３１】
アミノ酸に関して次の一般的略名が本明細書全体を通じて用いられる場合がある。
Ala A  アラニン
Arg R  アルギニン
Asn N  アスパラギン
Asp D  アスパラギン酸(アスパラギン酸(Aspartate))
Cys C  システイン
Gin Q  グルタミン
Glu E  グルタミン酸(グルタミン酸(Glutamate))
Gly G  グリシン
His H  ヒスチジン
lie I  イソロイシン
Leu L  ロイシン
Lys K  リジン
Met M  メチオニン
Phe F  フェニルアラニン
Pro P  プロリン
Ser S  セリン
Thr T  スレオニン
Trp W  トリプトファン
Tyr Y  チロシン
Val V  バリン
Asx B  アスパラギン酸またはアスパラギン
Glx Z  グルタミン酸またはグルタミン
Xaa X  任意のアミノ酸(場合により任意のアミノ酸を意味して用いられる)
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、図1に示す44位のアミノ酸の変更に対応するEPSPSコード配列中に新たに同定された変異に関する。好ましい実施形態ではこの変更は、前記EPSPSコード配列中の少なくとも1つのさらなる変異と、好ましくは図1に示す101、106および179からなる群から選択される位置でのアミノ酸の変更に対応するさらなる変異と組み合わされる。当業者に明確に理解されるとおり図1は、葉緑体標的シグナルを欠失している成熟タンパク質を示し、他の図はそのような標的シグナルを含む完全なタンパク質を示す。したがって当業者は、EPSPS酵素をコードしているヌクレオチド配列においてまたはEPSPS酵素のアミノ酸配列においてのいずれでも、例えば図1のデータによる種々のEPSPS遺伝子の配列を配列比較するステップによって本発明による対応する位置および変異を決定するステップに問題を有さない。
【００３３】
トマトプロトプラストを含むプロトプラストを含む種々の植物材料での実験の際に、グリホサートを含む培地で生育できる植物材料(例えばカルス)が得られ、植物材料(例えばカルス)は生育を維持する限りこの除草剤に対して耐性であると考えられた。
【００３４】
これらの様々なグリホサート耐性材料由来のEPSPS遺伝子は、当業者に利用可能な方法を用いて配列決定された。新規の予測外の変異がEPSPSについてのコード領域中に同定され、遺伝材料中のこの変異は図1に示すコードされたEPSPS酵素の44位のアミノ酸の変更を導く。この変異を保有している植物(細胞)は(強化された)グリホサート耐性を示すことが見出された。実際に、さらに驚くべきことに、植物(細胞)の既存のグリホサート耐性が、前記植物に存在するEPSPSコード配列中の44位に上で同定された変異を導入するステップによってさらに強化されうることが見出された。例えば、具体的には元のEPSPS酵素中の図1に示す101、106および179からなる群から選択される位置にアミノ酸変更を導く変異を有することによってグリホサート耐性を付与するEPSPSコード配列を発現している植物のグリホサート耐性は、図1に示す44位にアミノ酸の変更を導く変異の導入によってさらに強化されうる。換言すると新たに同定された変異は、EPSPS酵素における他の周知の変異のグリホサート耐性付与能力を強化するために有利に用いられうる。
【００３５】
したがって本発明の特定の態様は、特定の位置のアミノ酸の変更に対応する前記EPSPSコード配列中の4個の異なる変異に関する。一般にこれらの変異は、明細書以下の部分において変異A、B、CおよびDと称される場合がある。
【００３６】
変異A
EPSPSコード配列中の最初の変異は、変異Aと称される場合があり、図1に示すEPSPS酵素中の44位のアミノ酸の変更を導き、例えば前記変異を有さない同じEPSPSコード配列と比較してグリホサート耐性を導く。例えば、好ましくは、EPSPSコード配列中の変異によって変更される44位のアミノ酸は、図1に示す植物のアミノ酸配列において示されるとおりアスパラギン(N)である(換言すると44位の元のアミノ酸は本発明により変更され、元のアミノ酸はアスパラギンである場合がある)。したがって好ましくはこの変異は、アスパラギン(N)ではないEPSPSコード配列中の44位のアミノ酸を生じる。
【００３７】
44位のアミノ酸、好ましくはアスパラギン(N)は、グリホサート耐性を与えるステップにおいて有用である限り本発明により任意の他のアミノ酸に変更されうるが、好ましくはEPSPSコード配列は、再び図1に示すとおり、44位のアミノ酸、好ましくはアスパラギンのアスパラギン酸(D)への変更を導く変異を含む。
【００３８】
したがって好ましい実施形態ではEPSPSコード配列は、それまで前記位置に存在したアミノ酸と無関係に、44位のアミノ酸がアスパラギン(D)であるEPSPS酵素をコードする。
【００３９】
変異B
第二変異(この変異について変異Bとして述べられる場合がある)は、図1に示すEPSPS酵素中の101位のアミノ酸の変更を導き、例えば、前記変異を有さない同じEPSPSコード配列と比較してグリホサート耐性を導く。例えば、好ましくは、EPSPSコード配列中の変異によって変更される101位のアミノ酸は、図1に示す植物のアミノ酸配列において示されるとおりグリシン(G)である(換言すると101位の元のアミノ酸は本発明により変更され、元のアミノ酸はグリシンである場合がある)。したがって好ましくはこの変異は、グリシン(G)ではないEPSPSコード配列中の101位のアミノ酸を生じる。図17の大腸菌EPSPSアミノ酸配列では変異Bは96位のアミノ酸の変更に対応する。
【００４０】
101位のアミノ酸、好ましくはグリシン(G)は、グリホサート耐性を与えるステップにおいて有用である限り任意の他のアミノ酸に変更されうるが、好ましくはEPSPSコード配列は、再び図1に示すとおり、101位のアミノ酸、好ましくはグリシンのアラニン(A)への変更を導く変異を含む。
【００４１】
したがって好ましい実施形態ではEPSPSコード配列は、それまで前記位置に存在したアミノ酸と無関係に、101位のアミノ酸がアラニン(A)であるEPSPS酵素をコードする。
【００４２】
G101A変異の構造は、101位のアラニンが(PEPのKmでの対応する増加が付随して)PEP結合部位へのグリホサートの結合を立体的に妨げることを明らかにした(Eschenburg,S.、Healy,M.L.、Priestman,M.A.、Lushington,G.H.およびSchonbrunn,E.(2002)How the mutation glycine96 to alanine confers glyphosate insensitivity to 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli.Planta 216、129〜135を参照されたい)。
【００４３】
変異C
第三変異(この変異について変異Cとして述べられる場合がある)は、図1に示すEPSPS酵素中の106位のアミノ酸の変更を導き、例えば、前記変異を有さない同じEPSPSコード配列と比較してグリホサート耐性を導く。例えば、好ましくは、EPSPSコード配列中の変異によって変更される106位のアミノ酸は、図1に示す植物のアミノ酸配列において示されるとおりプロリン(P)である(換言すると106位の元のアミノ酸はプロリンである場合があり、アミノ酸は変更されうる)。したがって好ましくはこの変異は、プロリン(P)ではないEPSPSコード配列中の106位のアミノ酸を生じる。
【００４４】
106位のアミノ酸、好ましくはプロリン(P)は、グリホサート耐性を与えるステップにおいて有用である限り任意の他のアミノ酸に変更されうるが、好ましくはEPSPSコード配列は、再び図1に示すとおり、106位のアミノ酸、好ましくはプロリンのロイシン(L)への変更を導く変異を含む。
【００４５】
したがって好ましい実施形態ではEPSPSコード配列は、それまで前記位置に存在したアミノ酸と無関係に、106位のアミノ酸がロイシン(L)であるEPSPS酵素をコードする。
【００４６】
変異D
第四変異(新たに同定された)(この変異について変異Dとして述べられる場合がある)は、図1に示すEPSPS酵素中の179位のアミノ酸の変更を導き、例えば、前記変異を有さない同じEPSPSコード配列と比較してグリホサート耐性を導く。例えば、好ましくは、EPSPSコード配列中の変異によって変更される179位のアミノ酸は、図1に示す植物のアミノ酸配列において示されるとおりセリン(S)である(換言すると179位の元のアミノ酸はセリンである場合があり、アミノ酸は変更されうる)。したがって好ましくはこの変異は、セリン(S)ではないEPSPSコード配列中の179位のアミノ酸を生じる。
【００４７】
179位のアミノ酸、好ましくはセリン(S)は、グリホサート耐性を与えるステップにおいて有用である限り任意の他のアミノ酸に変更されうるが、好ましくはEPSPSコード配列は、再び図1に示すとおり、179位のアミノ酸、好ましくはセリンのアスパラギン(N)への変更を導く変異を含む。
【００４８】
したがって好ましい実施形態ではEPSPSコード配列は、それまで前記位置に存在したアミノ酸に無関係に、179位のアミノ酸がアスパラギン(N)であるEPSPS酵素をコードする。
【００４９】
種々の生物のEPSPS酵素の種々の(アミノ酸またはそのようなアミノ酸をコードする核酸)配列は、図1〜図22のいずれかに示され、図4〜図22の大部分において図1で44、101、106および179と称されるアミノ酸位置は下線で示される。図1を参照して本明細書で記載される変異が、任意のEPSPSコード配列および/または任意の生物のEPSPS酵素(例えば、図に示すもの)における対応する位置に存在/導入されうることは当業者によって理解される。他の配列における対応する位置は図1に示す配列の比較によって容易に確かめられる。これは、関連する生物(具体的には植物)からEPSPSタンパク質の配列を取得するステップ、A.タリアナ(A.thaliana)タンパク質との配列比較を実施するステップおよびN44、G101、P106およびS179に対応するアミノ酸位置を同定するステップによってなされうる。図4以後に示す配列は葉緑体標的シグナルを含み、図1は葉緑体標的シグナルを欠失している成熟タンパク質を示す。
第一の態様では本発明は、植物(細胞)にグリホサート耐性を付与するEPSPS酵素、好ましくは植物EPSPS酵素をコードする(単離された)ヌクレオチド配列であって、図1に示す44位のアミノ酸の変更に対応する少なくとも1つの変異を含むことを特徴とするヌクレオチド配列を提供する。
【００５０】
したがってEPSPSコード配列中の44位のアミノ酸は、好ましくはアスパラギン(N)ではない。
【００５１】
好ましくは44位で変更されるアミノ酸はアスパラギンである。好ましくは44位のアミノ酸は、3.50以下のpI(等電点)を有するタンパク新生アミノ酸、アスパラギン酸またはグルタミン酸、好ましくはアスパラギン酸に変更される。換言すると本発明による(グリホサート耐性を与える)EPSPS酵素中の44位のアミノ酸は、好ましくはアスパラギン酸またはグルタミン酸、好ましくはアスパラギン酸である。
【００５２】
好ましくは前記変更は、例えばグリホサート耐性が導入されるおよび/または強化される植物から得られた1つの/その(a/the)野生型EPSPS酵素との比較による。
【００５３】
図1に示す44位でのこの特定のアミノ酸変更(3.50以下のpI(等電点)を有するタンパク新生アミノ酸、アスパラギン酸またはグルタミン酸、好ましくはアスパラギン酸への変更)が、得られるEPSPS酵素によって付与されるグリホサート耐性に関して有利な結果を与えるおよび/あるいは対応する野生型EPSPSまたは44位のアミノ酸がアスパラギン酸もしくはグルタミン酸以外のアミノ酸であるEPSPS酵素と比較してその通常の基質に対して改善された活性を有するEPSPS酵素を導くことが見出された。
【００５４】
したがって、前記ヌクレオチド配列を(例えば前記植物中に存在する元の配列の変更によって)保有している植物(細胞)は、(強化された)グリホサート耐性を示しうる。本発明のコンテクストでは植物(細胞)のグリホサート耐性は、典型的には野生型植物(細胞)を枯らすまたは生育を阻害する一定濃度のグリホサートの存在下で生存するまたは生育を継続する前記植物(細胞)の能力を意味する。好ましくは前記植物(細胞)は、そのような状況下で通常のまたはわずかに低下した生育(例えば20%以下の質量蓄積減少)を維持する。
【００５５】
植物(細胞)のグリホサート耐性を強化するステップは、(例えばグリホサート耐性EPSPSを保有していない)前記植物(細胞)の生存および/または生育を通常阻害するグリホサートの濃度より高い濃度のグリホサートの存在下で生存するまたは生育を継続する能力を前記植物(細胞)に付与するステップを意味する。これは、強化されたグリホサート耐性を有する植物(細胞)を提供する。換言すると例えば変異の存在によって一定レベルのグリホサートへの耐性を示す植物は、44位での変異の存在によってより高い濃度のグリホサートへの耐性を示しうる。
【００５６】
例えば、参照グリホサート耐性植物(細胞)が、最大50μM(または50mg/l)グリホサートを含有する培養培地で生育だけできる場合、強化されたグリホサート耐性を有する植物(細胞)は50μM(もしくは50mg/l)を超えるグリホサート、例えば55μM(もしくは55mg/l)以上のグリホサート、100μM(もしくは100mg/l)、200μM(もしくは200mg/l)または300μM(もしくは300mg/l)グリホサートなどを含有する培養培地でも生育できる。参照グリホサート耐性植物(細胞)が100μM(または100mg/l)グリホサートを含有する培養培地で生育できる場合、強化されたグリホサート耐性を有する植物(細胞)は100μM(もしくは100mg/l)を超えるグリホサート、例えば110μM(もしくは110mg/l)以上のグリホサート、200μM(もしくは200mg/l)、300μM(もしくは300mg/l)または400μM(もしくは400mg/l)グリホサートなどを含有する培養培地でも生育できる。グリホサートの濃度を増加させた条件下で生育する植物(細胞)の強化された能力は、図1に示す44位のアミノ酸の変更を導く変異の導入によって提供でき、好ましくは改善されたEPSPS酵素中の前記アミノ酸はアスパラギン酸である。
【００５７】
本発明のコンテクストにおいて生育は、例えば光合成、発根の増加、高さの増加、バイオマスの増加、新たな葉の発生、作物の発育および/または作物収穫量の増加を含む。例は下に詳述される。
【００５８】
しかし植物(細胞)の強化されたグリホサート耐性は、特定の濃度のグリホサート存在下でそのような植物(細胞)の通常示される生存および/または生育と比較した前記濃度のグリホサート存在下での植物(細胞)の生存の増加および/または生育の増加も意味しうる。換言すると例えば変異の存在によってグリホサートへの一定レベルの耐性を示す植物は、本明細書に詳述する44位の変異の存在によって特定の濃度のグリホサートの存在下で増加した生存または生育を示す。
【００５９】
例えば、50μM(または50mg/l)グリホサートを含有する培養培地で生育する参照グリホサート耐性植物(細胞)が、50日後に90%の生存率および50日間あたり乾燥重量100gの生育速度を示す場合、50μM(もしくは50mg/l)グリホサートを含有する培養培地で生育する強化されたグリホサート耐性を有する植物(細胞)は増加した生存および/または増加した生育を示しうる。同様に100μM(または100mg/l)グリホサートを含有する培養培地で生育する参照グリホサート耐性植物(細胞)が、一定の生存率および一定の生育速度を示す場合、100μM(もしくは100mg/l)グリホサートを含有する培養培地で生育する強化されたグリホサート耐性を有する植物(細胞)は増加した生存および/または増加した生育を示しうる。
【００６０】
好ましい実施形態では本発明によるおよび本明細書に開示されるEPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列は、植物にグリホサート耐性を付与するEPSPS酵素をコードするようにする前記ヌクレオチド配列それ自体への少なくとも1つのさらなる変異であって、好ましくは図1に示す101、106または179からなる群から選択される位置でのアミノ酸の変更に対応する変異を含むことをさらに特徴とする。したがってEPSPSコード配列では、101位のアミノ酸は好ましくはグリシン(G)ではなく、106位のアミノ酸は好ましくはプロリン(P)ではなく、および/または179位のアミノ酸は好ましくはセリン(S)ではない。
【００６１】
例えばEPSPS酵素にグリホサート耐性を付与する変異(例えば図1に示す101位、106または179位に対応する)をそのアミノ酸配列中に有するEPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列は、本明細書に開示する44位のアミノ酸の変更に対応する少なくとも1つのさらなる変異を含んで本発明により提供されうる。
【００６２】
好ましい実施形態では101位で変更されるアミノ酸はグリシンである。
好ましい実施形態では106位で変更されるアミノ酸はプロリンである。
好ましい実施形態では179位で変更されるアミノ酸はセリンである。
【００６３】
好ましくは101位のアミノ酸はアラニンに変更される。
好ましくは106位のアミノ酸はロイシンに変更される。
好ましくは179位のアミノ酸はアスパラギンに変更される。
【００６４】
換言すると、本発明により好ましくは101位のアミノ酸はアラニンである、または106位のアミノ酸はプロリンである、または179位のアミノ酸はアスパラギンである。図1に示すEPSPS酵素の44位で、好ましくはアスパラギン酸またはグルタミン酸、好ましくはアスパラギン酸との組合せにおいて、これらの特定のアミノ酸(変更)は、得られるEPSPS酵素によって付与されるグリホサート耐性に関して有利な結果を与えるおよび/または、対応する野生型EPSPSともしくは前記位置で好ましいアミノ酸以外に変更されるEPSPSと比較して通常の基質に対して改善された活性を有するEPSPS酵素を導くことが見出された。
文献および実践では、EPSPS酵素のアミノ酸配列における同一のアミノ酸位置を称するために、具体的には異なる生物のアミノ酸配列が配列比較される場合に異なる番号が用いられる。本記載において用いられる番号に関して不明確さを避けるために本発明者らは、トウモロコシ(コーン)、イネ、コムギ、トマト、アラビドプシス、タマネギ、サルモネラおよび大腸菌のEPSPS酵素アミノ酸配列の関連する領域が配列比較および番号付けされる図1を提出する。さらに、重要なアミノ酸を強調した。本明細書で開示および参照するアミノ酸位置は図1に関連する。
【００６５】
本記載において(または特許請求の範囲において)アミノ酸位置44、101、106および/または179を参照する場合、当業者に理解されるとおり、図1に示すアミノ酸配列を有するEPSPSタンパク質に実質的に相同性である(例えば図1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質にその全長にわたって少なくとも70%のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは84%、88%、92%、95%、98%もしくは99%同一性を有する)および/または機能性である(換言するとEPSPS酵素活性を有する)アミノ酸配列中の前記44、101、106および/または179位に類似する位置でのアミノ酸の変更も意味するとして解釈される。
【００６６】
例えば、ジャガイモまたはヒマワリのEPSPSの関連領域は図1に示されていないが、それらは図1に開示の配列と当業者に周知の方法により配列比較されうる(例えばthe CLC Bio Main Workbench package(www.clcbio.com)を用いて)。例えば、EPSPS酵素活性を有し、配列スレオニン(T)-バリン(V)-バリン(V)-アスパラギン酸(D)-アスパラギン酸(D)-ロイシン(L)-ロイシン(L)-アスパラギン(N)を含むジャガイモEPSPS酵素のアミノ酸配列は、図1に示す40〜47位に対応する。この配列が図1に示す44位に対応する位置での変更、すなわちアスパラギンの替わりにアスパラギン酸を含むことから、それは本発明に一致する。
【００６７】
本発明者らは、EPSPS酵素における変異の限定要因がそれらがEPSPS酵素に付与する生化学的活性の低下でありうることを理解する。例えばサルモネラにおけるT42M変異はその通常の基質(PEP)に対する親和性を25倍低下させるが、グリホサートに対する26倍高い寛容を与える。この適応罰(fitness penalty)は、そのような変異体遺伝子が畑(field)条件下での通常の生育に十分ではないことを意味する場合がある。同様にRoundup Readyダイズ作物は、最高の従来種と比較して6.7%低い収量を示す(Charles Benbrook.Evidence of the Magnitude and Consequences of the Roundup Ready Soybean Yield Drag from University-Based Varietal Trials in 1998.Ag BioTech InfoNet Technical Paper Number 1)。
【００６８】
変異Aを(すなわち44位に、好ましくは上に記載のとおり)単独でまたは他の変異(グリホサート耐性を与える、好ましくは本明細書に記載の変異)と組合せて有するEPSPS変異体を含むことは、グリホサートに対する(改善された)耐性を導くと考えられる。これは、酵素活性を(さらに)阻害せず、またはさらに酵素活性を改善した。変異A(44位)とグリホサート耐性を付与する別の変異(例えば変異B(101位)、変異C(106位)または変異D(179位))との組合せが、変異A単独および前記別の変異単独に基づいて予測されうるものを超えてグリホサート耐性を強化することを見出したことは特に予想外であった。
【００６９】
例えば、EPSPS酵素が植物(細胞)にグリホサート耐性を付与するようにする変異、好ましくは図1に示す101、106または179からなる群から選択される位置でのアミノ酸の変更に対応する変異を含むEPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列は、その通常の基質に対して増大した活性を有する場合があるまたは(EPSPS酵素をコードする前記ヌクレオチド配列中に44位のアミノ酸の変更に対応する前記変異が提供されない場合と比較して)グリホサートに対してより良く耐性であるEPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列を得るために、本明細書に開示の44位のアミノ酸の変更に対応するさらなる変異を含んで提供されうる。例えば前記増大した活性は、その通常の基質に対するEPSPS酵素の親和性の1.5、2、4または5倍の増大を包含する。理論に束縛されることなく、本発明者らは前記効果が、グリホサートに対する酵素の親和性の低下および/またはその通常基質への酵素の親和性の増大を導くEPSPS酵素の活性部位における変更に関する可能性があると考える。
【００７０】
米国特許第5,310,667号、第5,866,775号、第6,225,114号および第6,248,876号において開示のものまたはグリホサート耐性を示す天然EPSPS変種などの他の変異化または改変EPSPSも本発明と組合せて用いられうる。付加的に細菌由来グリホサート耐性EPSPS変種(例えば葉緑体輸送ペプチドとの融合後)も本発明と組合せて用いられうる。
【００７１】
当業者に理解されるとおり変異は、エチルメタンスルホン酸(EMS)またはヌクレオチド配列に(無作為に)変異を導入できる他の化合物などの変異原性化合物の適用によって本明細書に定義のEPSPSをコードするヌクレオチド配列に導入されうる。前記変異原性化合物または前記他の化合物は、EPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列に変異を保持する植物細胞を作製するステップのための手段として用いられうる。本発明による変異を保持する植物細胞は、次いで配列決定の手段によって選択されうる。
【００７２】
代替的に本発明によるEPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列への変異の導入は、植物に転移DNA(T-DNA)、例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)などのある種の細菌の腫瘍導入(Ti)プラスミドのT-DNAの導入によって行われる。本発明による44位のアミノ酸変更を、任意選択で本明細書に記載の別の変異と組合せて含むEPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列を含むT-DNA要素は、前記植物に導入でき、本発明による方法によって得られた(強化された)グリホサート耐性を有する植物(細胞)を導く(例えばKrysanら、1999 The Plant Cell、11巻、2283〜2290を参照されたい)。同様の有利点が転位因子挿入の使用から得られうる(例えばKunzeら、(1997)Advances in Botanical Research 27 341〜370またはChandlee(1990)Physiologia Planta 79(1)105〜115を参照されたい)。
【００７３】
好ましくは本発明によるEPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列に変異を導入するステップは、例えばWO2007073170、WO2007073149、WO2009002150およびWO2007073166に記載の相同組換えまたはオリゴ指定変異(ODM)に基づく技術などのゲノム工学技術によって導入される。ODMを適用するステップによってEPSPSをコードするヌクレオチド配列中の特定のヌクレオチドは変更でき、それにより本発明による変異が導入されうる。
【００７４】
本発明は、本明細書に記載の本発明によるヌクレオチド配列によってコードされ、植物にグリホサート耐性を付与するEPSPS酵素、好ましくは植物EPSPS酵素も提供する。そのようなEPSPS酵素は細菌または植物由来である。しかし、EPSPS酵素または前記EPSPS酵素をコードするヌクレオチドが作物植物、より好ましくはワタ、トマト、ジャガイモ、タマネギ、イネ、コムギ、トウモロコシまたはヒマワリ由来であることは、その際にEPSPS酵素が農業において最も用いられる植物の天然EPSPS酵素にさらに良く類似する場合があることから好ましい。そのようなより天然のEPSPS酵素は、作物植物が農業においてより高い作物収量を生成するようにできる。
【００７５】
本発明によるEPSPS酵素は、植物、好ましくは作物植物、より好ましくはワタ、トマト、ジャガイモ、タマネギ、イネ、コムギ、トウモロコシ、ヒマワリ、サトウダイコンまたはアブラナ属種で発現されうる。
【００７６】
ワタは、ゴシッピウム種、例えばG.ヒルスツム、G.バーバデンセを含み、トマトは、ソラナム・リコペルシクム(Solanum lycopersicum)種を含み、ジャガイモはソラナム・チュベルソサム(Solanum tubersosum)種を含み、タマネギはアリウム(Allium)種、具体的にはアリウム・セパ(Allium cepa)種を含み、イネはオリザ・サティバ(Oryza sativa)種、例えばO.サティバ・インディカ(栽培種群またはジャポニカ栽培種群およびオリザ・グラベリマ(Oryza glaberrima)種を含み、コムギはT.モノコッカム(T. monococcum)およびT.ジコッコイデス(T. dicoccoides)を含むトリチカム種を含み、トウモロコシ/コーンはゼア種を含み、ヒマワリはヘリアンサス・アヌスを含み、アブラナ種はキャノーラ、アブラナ、カリフラワー、ブロッコリ、キャベツ、B.ナプス、B.ジュンセア、B.ラパおよびB.オレラセアを含み、ならびにサトウダイコンはベータ・ブルガリス(Beta vulgaris)を含む。
【００７７】
本発明は、本発明によるヌクレオチド配列を含むベクターおよびそのようなベクターを含む宿主も提供する。前記ベクターは、本発明によるヌクレオチドを植物細胞などの別の細胞に転移するために用いられうる。様々な種類のベクターは、プラスミド、バクテリオファージおよび他のウイルス、コスミドならびに人工染色体を含む。
【００７８】
同様に提供されるのは、本発明によるヌクレオチド配列および/もしくはその断片ならびに/または本発明によるEPSPS酵素を含む植物もしくはトランスジェニック植物またはそれらの部分である。前記断片は、断片がEPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列由来であることを決定するために少なくとも十分な長さであり、さらに本発明による変異Aを、好ましくは(EPSPS酵素をコードする完全なヌクレオチド配列中にある場合に)グリホサート耐性を植物に付与する少なくとも1つのさらなる変異と組合せて含む。好ましくは前記少なくとも1つのさらなる変異は、本明細書に記載および本発明による変異B、変異Cおよび/または変異Dを含む。
【００７９】
例えば断片は、少なくとも10、30、100、500連続ヌクレオチドの長さを有しうる。当業者は、そのような断片が本明細書に記載の変異を含むかどうかを決定するステップに問題を有さない。例えば当業者は、断片をEPSPSコード配列と配列比較するステップによってそれを行うことができる。
【００８０】
トランスジェニック作物植物は、人為的に挿入された(すなわち前記1つまたは複数の遺伝子は受粉を通じては最初に獲得されていない)1つまたは複数の遺伝子を含有する。したがって非トランスジェニック植物は、人為的に挿入された1つまたは複数の遺伝子を含有しない。同様に提供されるのは、本発明によるヌクレオチド配列および/もしくはそれらの断片ならびに/または本発明によるEPSPS酵素を含む上に記載の植物もしくはトランスジェニック植物またはそれらの部分由来の種子である。
【００８１】
前記断片は、断片がEPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列由来であることを決定するために少なくとも十分な長さであり、少なくとも本発明による変異A(44位)をさらに含む。
【００８２】
断片は、例えば少なくとも10、30、100、500連続ヌクレオチドの長さを有する。当業者は、そのような断片が本明細書に記載の変異を含むかどうかを決定するステップに問題を有さない。例えば当業者は、断片をEPSPSコード配列と配列比較するステップによってそれを行うことができる。
【００８３】
別の態様では本発明は、グリホサート耐性植物(細胞)を提供するための方法に関し、方法は、
a)EPSPS酵素、好ましくは植物EPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列であって、図1に示す44位のアミノ酸の変更に対応する少なくとも1つの変異を含むことを特徴とするヌクレオチド配列を含む植物(細胞)を提供するステップ
を含む。
【００８４】
上に記載の方法では、好ましくは野生型EPSPSに比較して44位で変更されるアミノ酸はアスパラギンであり、および/または44位のアミノ酸はアスパラギン酸に変更されることは好ましい。換言すると図1に示す44位のアミノ酸は好ましくはアスパラギン酸である。
【００８５】
さらに別の態様では、本発明はグリホサートに対する耐性を有する植物(細胞)を提供するための方法に関し、方法は
a)EPSPS酵素、好ましくは植物EPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列であって、図1に示す44位のアミノ酸の変更に対応する少なくとも1つの変異と、それ自体で、前記ヌクレオチド配列を、植物にグリホサート耐性を付与するEPSPS酵素をコードするようにする少なくとも1つのさらなる変異とを含み、好ましくは前記少なくとも1つのさらなる変異が、図1に示す101、106または179からなる群から選択される位置でのアミノ酸の変更に対応することを特徴とするヌクレオチド配列を含む植物(細胞)を提供するステップ
を含む。
【００８６】
さらに別の態様では、本発明はグリホサートに対する耐性を有する植物(細胞)を提供するための方法に関し、方法は
a.EPSPS酵素、好ましくは植物EPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列を含む植物(細胞)を提供するステップ
b.好ましくはステップa)の前記植物における、ステップa)の前記ヌクレオチド配列に図1に示す44位のアミノ酸の変更に対応する変異を与えるステップ
を含む。
【００８７】
したがって好ましくはそれにより、EPSPSコード配列中の44位にアスパラギン(N)ではないアミノ酸を生じる(例えば変異を有さない同じEPSPSコード配列と比較してグリホサート耐性を導く)変異が提供される。
【００８８】
さらに別の態様では本発明は、植物(細胞)のグリホサート耐性を強化するための方法に関し、方法は、
a)植物にグリホサート耐性を付与するEPSPS酵素、好ましくは植物EPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列であって、図1に示す101、106または179からなる群から選択される位置でのアミノ酸の変更に対応する少なくとも1つの変異を含むことを好ましくは特徴とするヌクレオチド配列を含む植物(細胞)を提供するステップ
b)好ましくはステップa)の前記植物(細胞)における、ステップa)の前記ヌクレオチド配列に図1に示す44位のアミノ酸の変更に対応する変異を与えるステップ
を含む。
【００８９】
したがって好ましくはそれにより、EPSPSコード配列中の44位にアスパラギン(N)ではないアミノ酸を生じる(例えば変異を有さない同じEPSPSコード配列と比較してグリホサート耐性を導く)変異は提供される。
【００９０】
EPSPS酵素、好ましくは植物EPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列中に、図1に示す44位のアミノ酸の変更に対応する変異を与えるステップは、標的ヌクレオチド交換(Targeted Nucleotide Exchange)(TNE)によって、(すなわちステップa)のヌクレオチド配列にハイブリダイズでき、ステップa)のヌクレオチド配列に対してミスマッチを含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドであって、ミスマッチの位置がEPSPS酵素、好ましくは植物EPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列の図1に示す44位のアミノ酸の変更に対応する変異の位置に対応する少なくとも1つのオリゴヌクレオチドの導入によって)実施されうる。
【００９１】
例えば電気穿孔法またはPEG媒介オリゴヌクレオチド取り込み(PEG-mediated oligonucleotide uptake)によって細胞に導入された時点で、そのようなオリゴヌクレオチドは、変更されるヌクレオチド配列の相補配列(すなわちEPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列中の標的遺伝子座)とハイブリダイズ(塩基対)できる。オリゴヌクレオチド中にミスマッチを計画的に設計するステップによって、ミスマッチは標的ゲノム配列中の対応する位置にヌクレオチド転換を与えうる。これは、図1に示す44位のアミノ酸の変更に対応する変異の提供をもたらしうる。同様に計画的に設計されたミスマッチの種類に応じて、これは図1に示す101、106および/または179位のアミノ酸の変更に対応する変異の提供をもたらしうる。
【００９２】
オリゴヌクレオチドは、10〜500ヌクレオチドの間、好ましくは15〜250ヌクレオチド、より好ましくは10〜200ヌクレオチドの間、最も好ましくは15〜150ヌクレオチドの間の長さを有しうる。オリゴヌクレオチドは、(好ましくはミスマッチから1ヌクレオチド上流または下流に位置する)ロックド核酸(LNA)を含有できる。オリゴヌクレオチドは、代替的または追加的にプロピニル化塩基を含有できる。TNE法は本出願者らの特許公開WO2007073166、WO2007073170、WO2009002150に記載されている。オリゴヌクレオチドは、少なくとも4個、少なくとも3、3、2または1個のホスホロチオエート結合を5'末端および/または3'末端に、両端にまたはミスマッチに隣接してさらに含有できる。
【００９３】
上に記載の方法において、44位で変更されるアミノ酸はアスパラギンであり、および/または44位のアミノ酸はアスパラギン酸に変更され、および/または101位で変更されるアミノ酸はグリシンであり、および/または106位で変更されるアミノ酸はプロリンであり、および/または179位で変更されるアミノ酸はセリンであり、および/または101位のアミノ酸はアラニンに変更され、および/または106位のアミノ酸はロイシンに変更され、および/または179位のアミノ酸はアスパラギンに変更されることがさらに好ましい(「本発明によって包含される変異の特定の組合せ」の表題の下に記載される変異の特定の組合せも参照されたい)。
【００９４】
本発明による方法によって提供される植物は、それらに由来するさらなる植物およびまたは植物産生物の産生のために用いられうる。用語植物産生物は、植物生育から得られる材料を意味し、粉砕された、製粉された、または未処理である、他の材料と混合された、乾燥された、凍結されたなどのいずれかである果実、葉、植物器官、植物脂肪、植物油、植物デンプン、植物タンパク質画分を含む。一般にそのような植物産生物は、例えば本発明によるヌクレオチドの存在によって認識されうる。
本発明は、植物産生物を生成するための方法であって、
a)本発明によるヌクレオチドおよび/もしくは本発明によるEPSPS酵素を含む植物もしくはトランスジェニック植物またはそれらの部分、あるいは本発明による任意の方法によって得られる植物を加工するステップ
を含む方法も提供する。
【００９５】
上に記載の方法では、加工が、植物産生物を得るために、調理する、粉砕する、乾燥する、製粉する、焼く、切断する、篩いにかける、削る、剥ぐ、浸漬する、洗浄する、加熱する、冷却する、粉々にするまたは湿らせることによって実施されることが好ましい。
【００９６】
同様に提供されるのは、上に記載の方法によって得られる植物産生物であり、好ましくはデンプンを主成分とする産生物または植物油を主成分とする産生物であり、本発明によるヌクレオチドおよび/またはその断片の存在を特徴とする。
【００９７】
デンプンを主成分とする産生物は、トマトピューレ、小麦粉または任意の他のデンプン含有産生物などの産生物を含みうる。植物油を主成分とする産生物は、オリーブ油、ヒマワリ油または任意の他の植物油含有産生物などの産生物を含みうる。
【００９８】
本発明は、植物のグリホサート耐性を強化するための本発明によるヌクレオチド配列および/または本発明によるEPSPS酵素の使用も提供する。例えばそのようなヌクレオチド配列は、植物(細胞)に導入されてよく、それにより(強化された)グリホサート耐性をもたらす。
【００９９】
本発明の別の態様は、植物、好ましくは植物EPSPS酵素にグリホサート耐性を付与するEPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列であって、好ましくは、図1に示す101、106または179からなる群から選択される位置でのアミノ酸の変更に対応する少なくとも1つの変異を含むことを特徴とするヌクレオチド配列を含むグリホサート耐性植物のグリホサート耐性を強化するための、図1に示す44位のアミノ酸の変更に対応する変異の使用に関する。
【０１００】
換言すると44位のアミノ酸の変更に対応する変異の使用は、44位のアミノ酸の変更を含み、したがって好ましくは44位のアミノ酸はアスパラギン酸であり、それにより(強化された)グリホサート耐性をもたらす。さらに換言すると前記使用は、本発明による44位のアミノ酸の変更が(強化された)グリホサート耐性をもたらすという情報の使用を含む。
上に記載の使用に関して、44位で変更されるアミノ酸がアスパラギンであり、および/または101位で変更されるアミノ酸がグリシンであり、および/または106位で変更されるアミノ酸がプロリンであり、および/または179位で変更されるアミノ酸がセリンであり、および/または44位のアミノ酸がアスパラギン酸に変更され、および/または101位のアミノ酸がアラニンに変更され、および/または106位のアミノ酸がロイシンに変更され、および/また179位のアミノ酸がアスパラギンに変更されることが好ましい。前記変更は好ましくは野生型EPSPSに比較される。
【０１０１】
同様に提供されるのは、グリホサートに対して耐性のEPSPS酵素での酵素活性の回復または改善のための上に記載の変異の使用である。例えば44位のアミノ酸、好ましくはアスパラギンから別のアミノ酸(好ましくはアスパラギン酸)への変更を導く変異は、既にグリホサートへの耐性を示している酵素中に通常基質PEPに対する酵素の活性をさらに改善するためにそれを導入するステップで用いられうる。好ましくは101位のアミノ酸、好ましくはグリシンから別のアミノ酸(好ましくはアラニン)への変更を導く変異および/または106位のアミノ酸、好ましくはプロリンから別のアミノ酸(好ましくはロイシン)への変更を導く変異および/または179位のアミノ酸、好ましくはセリンから別のアミノ酸(好ましくはアスパラギン)への変更を導く変異は、既にグリホサートへの耐性を示している酵素中に通常基質PEPに対する酵素の活性をさらに改善するために(追加的に)導入されうる。
【０１０２】
下に、本発明により用いられうる変異A、B、CおよびDの特定の組合せが記載される。
【０１０３】
本発明によって包含される変異の特定の組合せ
(変異A+B)
好ましい実施形態では、EPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列は、44位のアミノ酸の変更を導く変異および101位のアミノ酸の変更を導く変異を含む。好ましい実施形態では44位で変更されるアミノ酸はアスパラギンである。別の好ましい実施形態では101位で変更されるアミノ酸はグリシンである。さらなる好ましい実施形態では44位で変更されるアミノ酸はアスパラギンであり、101位で変更されるアミノ酸はグリシンである。好ましくは、44位のアミノ酸の変更を導く前記ヌクレオチド配列における変異はアミノ酸アスパラギン酸への変更を導く、すなわちアスパラギン酸が44位に存在する。好ましくは、101位のアミノ酸の変更を導く前記ヌクレオチド配列における変異はアミノ酸アラニンへの変更を導く、すなわちアラニンが101位に存在する。好ましくは、44位のアミノ酸の変更を導く前記ヌクレオチド配列における変異はアミノ酸アスパラギン酸への変更を導き(すなわちアスパラギン酸が44位に存在する)同時に101位のアミノ酸の変更を導く前記ヌクレオチド配列における変異はアミノ酸アラニンへの変更を導く(すなわちアラニンが101位に存在する)。
【０１０４】
(変異A+C)
別の好ましい実施形態では、EPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列は、44位のアミノ酸の変更を導く変異および106位のアミノ酸の変更を導く変異を含む。好ましい実施形態では44位で変更されるアミノ酸はアスパラギンである。別の好ましい実施形態では106位で変更されるアミノ酸はプロリンである。さらなる好ましい実施形態では44位で変更されるアミノ酸はアスパラギンであり、106位で変更されるアミノ酸はプロリンである。好ましくは、44位のアミノ酸の変更を導く前記ヌクレオチド配列における変異はアミノ酸アスパラギン酸への変更を導く、すなわちアスパラギン酸が44位に存在する。好ましくは、106位のアミノ酸の変更を導く前記ヌクレオチド配列における変異はアミノ酸ロイシンへの変更を導く、すなわちロイシン(L)が106位に存在する。好ましくは、44位のアミノ酸の変更を導く前記ヌクレオチド配列における変異はアミノ酸アスパラギン酸への変更を導き(すなわちアスパラギン酸が44位に存在する)同時に106位のアミノ酸の変更を導く前記ヌクレオチド配列における変異はアミノ酸ロイシンへの変更を導く(すなわちロイシン(L)が106位に存在する)。
【０１０５】
(変異A+D)
別の好ましい実施形態では、EPSPS酵素をコードするヌクレオチド配列は、44位のアミノ酸の変更を導く変異および179位のアミノ酸の変更を導く変異を含む。好ましい実施形態では44位で変更されるアミノ酸はアスパラギンである。別の好ましい実施形態では179位で変更されるアミノ酸はセリンである。さらなる好ましい実施形態では44位で変更されるアミノ酸はアスパラギンであり、179位で変更されるアミノ酸はセリンである。好ましくは、44位のアミノ酸の変更を導く前記ヌクレオチド配列における変異はアミノ酸アスパラギン酸への変更を導く、すなわちアスパラギン酸が44位に存在する。好ましくは、179位のアミノ酸の変更を導く前記ヌクレオチド配列における変異はアミノ酸アスパラギン(D)への変更を導く、すなわちアスパラギンが179位に存在する。好ましくは、44位のアミノ酸の変更を導く前記ヌクレオチド配列における変異はアミノ酸アスパラギン酸への変更を導き(すなわちアスパラギン酸が44位に存在する)同時に179位のアミノ酸の変更を導く前記ヌクレオチド配列における変異はアミノ酸アスパラギンへの変更を導く(すなわちアスパラギンが179位に存在する)。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】トウモロコシ(配列番号1)、イネ(配列番号2)、コムギ(配列番号3)、トマト(配列番号4)、アラビドプシス(配列番号5)、タマネギ(配列番号6)、サルモネラ(配列番号7)および大腸菌(配列番号8)由来のEPSPSの関連領域を配列比較した図であり、重要なアミノ酸は強調されている。本明細書で開示および参照されるアミノ酸位置は図1に示される。図に示すとおり、44、101、106および179位として本明細書で開示および参照されるアミノ酸位置は、配列番号1におけるそれぞれ43、99、104および177位に、配列番号2におけるそれぞれ44、101、106および179位に、配列番号3におけるそれぞれ44、101、106および179位に、配列番号4におけるそれぞれ44、101、106および179位に、配列番号5におけるそれぞれ44、101、106および179位に、配列番号6におけるそれぞれ30、87、92および165位に、配列番号7におけるそれぞれ42、95、100および169位に、配列番号8におけるそれぞれ42、95、100および169位に関する。図1は、葉緑体標的シグナルを欠失している成熟タンパク質を示す。
【図２】A.タリアナEPSPS変種を用いた大腸菌における相補性アッセイの結果を示すグラフである。図2の凡例を下に示す。(1)N44D P106L(2)S179N(3)P106L(4)野生型(5)N44D(6)P106L S179N(7)空
【図３】葉緑体標的シグナル(配列番号9)を含む完全なアラビドプシスEPSPSアミノ酸配列を示す図である。関連アミノ酸に下線を付ける。図に示すとおり、44、101、106および179位として本明細書で開示および参照されるアミノ酸位置は、配列番号9におけるそれぞれ120、177、182および255位に関する。
【図４】完全なアラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)EPSPS ORF(配列番号10)を示す図である。
【図５】変異N44Dに対応するA358Gを含む完全なアラビドプシス・タリアナEPSPS ORF(配列番号11)を示す図である。
【図６】変異P106Lに対応するC545Tを含む完全なアラビドプシス・タリアナEPSPS ORF(配列番号12)を示す図である。
【図７】変異N44DおよびP106Lにそれぞれ対応するA358GおよびC545Tを含む完全なアラビドプシス・タリアナEPSPS ORF(配列番号13)を示す図である。
【図８】変異S179Nに対応するG902Aを含む完全なアラビドプシス・タリアナEPSPS ORF(配列番号14)を示す図である。
【図９】変異P106LおよびS179Nにそれぞれ対応するC545TおよびG902Aを含む完全なアラビドプシス・タリアナEPSPS ORF(配列番号15)を示す図である。
【図１０】変異N44DおよびS179Nにそれぞれ対応するA358GおよびG902Aを含む完全なアラビドプシス・タリアナEPSPS ORF(配列番号16)を示す図である。
【図１１】変異G101Aに対応するG530Cを含む完全なアラビドプシス・タリアナEPSPS ORF(配列番号17)を示す図である。
【図１２】変異N44DおよびG101Aにそれぞれ対応するA358GおよびG530Cを含む完全なアラビドプシス・タリアナEPSPS ORF(配列番号18)を示す図である。
【図１３】完全なトマトEPSPSヌクレオチド配列(配列番号19)を示す図である。
【図１４】完全なトマトEPSPS2ヌクレオチド配列(配列番号20)を示す図である。
【図１５】完全なトマトEPSPS1アミノ酸配列を示す図である。関連アミノ酸に下線を付ける(配列番号21)。図に示すとおり、44、101、106および179位として本明細書で開示および参照されるアミノ酸位置は、配列番号21におけるそれぞれ118、175、180および253位に関する。
【図１６】完全なトマトEPSPS2アミノ酸配列を示す図である。関連アミノ酸に下線を付ける(配列番号22)。図に示すとおり、44、101、106および179位として本明細書で開示および参照されるアミノ酸位置は、配列番号22におけるそれぞれ120、177、182および255位に関する。
【図１７】完全な大腸菌EPSPSアミノ酸配列を示す図である。関連アミノ酸に下線を付ける(配列番号23)。図に示すとおり、44、101、106および179位として本明細書で開示および参照されるアミノ酸位置は、配列番号23におけるそれぞれ43、96、101および170位に関する。
【図１８】完全なワタEPSPSアミノ酸配列を示す図である。関連アミノ酸に下線を付ける(配列番号24)。図に示すとおり、44、101、106および179位として本明細書で開示および参照されるアミノ酸位置は、配列番号24におけるそれぞれ121、178、183および256位に関する。
【図１９】完全なトウモロコシEPSPSアミノ酸配列を示す図である。関連アミノ酸に下線を付ける(配列番号25)。図に示すとおり、44、101、106および179位として本明細書で開示および参照されるアミノ酸位置は、配列番号25におけるそれぞれ46、102、107および180位に関する。
【図２０】完全なイネEPSPSアミノ酸配列を示す図である。関連アミノ酸に下線を付ける(配列番号26)。図に示すとおり、44、101、106および179位として本明細書で開示および参照されるアミノ酸位置は、配列番号26におけるそれぞれ115、172、177および250位に関する。
【図２１】完全なコムギEPSPSアミノ酸配列を示す図である。関連アミノ酸に下線を付ける(配列番号27)。図に示すとおり、44、101、106および179位として本明細書で開示および参照されるアミノ酸位置は、配列番号27におけるそれぞれ110、167、172および245位に関する。
【図２２】完全なヒマワリEPSPSアミノ酸配列を示す図である。関連アミノ酸に下線を付ける(配列番号28)。図に示すとおり、44、101および106位として本明細書で開示および参照されるアミノ酸位置は、配列番号28におけるそれぞれ118、175および180位に関する。
【図２３】トランスジェニックアラビドプシス株におけるグリホサート寛容、平均実生重量の比(+Gly/-Gly)を示すグラフである。図23の凡例を下に示す。(1)野生型EPSPS遺伝子(2)変異N44Dを有するEPSPS(3)変異P106Lを有するEPSPS(4)変異P106LおよびN44Dを有するEPSPS(1)(5)変異P106LおよびN44Dを有するEPSPS(2)(6)変異P106LおよびN44Dを有するEPSPS(3)(7)変異N44DおよびS179Nを有するEPSPS
【実施例１】
【０１０７】
EPSPS酵素への変異Aの適用は前記EPSPS酵素によって付与されるグリホサート耐性を強化する。
本発明者らは、EPSPS酵素における44位のアスパラギンのアスパラギン酸への変更に対応する変異(N44D変異)がグリホサートへの耐性を有するEPSPS酵素を提供できるかどうかを検査した。N44D変異をEPSPSに単独でおよび、前記EPSPS酵素にグリホサート耐性を付与する他の変異と組み合わせて導入するステップによってこれを検査した。EPSPS酵素の101位のグリシンのアラニンへの変更に対応する変異(G101A)、EPSPS酵素の106位のプロリンのロイシンへの変更に対応する変異(P106L)およびEPSPS酵素の179位のセリンのアスパラギンへの変更に対応する変異(S179N)があった。
【０１０８】
構築物
全ての実験は、アラビドプシス・タリアナEPSPS(At2g45300)翻訳領域(図4〜図12を参照されたい)を利用した。アラビドプシスEPSPSアミノ酸配列を図3に示す。
【０１０９】
最初に、この配列を合成的に合成し(www.geneart.com)、BamHIおよびEcoRI部位に隣接してベクターにクローン化した。次いでこれを部位特異的変異誘発(www.geneart.com)によって導入した変異N44D(A350G)、G101A(G530C)、P106L(C545T)およびS179N(G902A)の導入のための基礎構築物として用いた。次の二重変異体も構築した。
- N44D+G101A、
- N44D+P106L、
- N44D+S179N、および
- P106L+S179N
【０１１０】
これらの各EPSPS変種を次いで1576bp EcoRI-BamHI断片としてベクターpET302NT HIS(Invitrogen、product K630203)にクローン化し、EPSPS変種を6xHisタグに癒合し、大腸菌中においてIPTGで誘導できるタンパク質発現を可能にした。これらの構築物を相補性アッセイのために大腸菌発現株BL21 pLYS(Invitrogen)に導入した。
【０１１１】
相補性アッセイ
内在性細菌性EPSP合成AroAの活性の阻害によって、大腸菌はグリホサートを補充した最少M9増殖培地で増殖できない。細菌増殖はグリホサート耐性植物EPSPS遺伝子の相補性によって回復されうる。
A.タリアナEPSPS変種を含有する大腸菌株を100μg/mlカルベニシリン(Duchefa)を含有するLB培地10mlで一晩増殖させた。次いで株を同じ培地中に4倍希釈し、さらに4時間増殖させた。次いで各培養物のOD600を測定し、培養物1.5mlを4000rpmで10分間遠心分離した。細菌沈殿をM9培地(12.8g/l Na2HPO4、3.0g/l KH2PO4、0.5g/l NaCl、1.0g/l NH4Cl、2.0g/lグルコース、0.4940g/l MgSO4.7H2O、15mg/l CaCl2.2H2O、10mg/lチアミンおよび10mg/l FeSO4.7H2O)500μlに再懸濁し、1mM IPTGおよび100μg/mlカルベニシリンおよび30mMグリホサートを含むM9培地10mlに0.1のOD600となるように接種するために用いた。各株について同一の培養物をグリホサートを含まずに作製し、これらを選択を行わない各株の増殖を評価するために用いた。次いで培養物を25℃で増殖させ、細菌増殖を評価するためにOD600を経時的に測定した(図2を参照されたい)。
【０１１２】
結果
相補性アッセイの結果を図2に示す。予測されたとおり、空のpET302NT Hisベクターを含有する株はグリホサートの存在下で増殖できなかった一方で、P106L変異を含有する株は十分なレベルの耐性を示した。野生型(WT)EPSPS酵素の過発現は、後半時点では恐らく高いタンパク質発現レベルによるグリホサートの滴定によって細菌増殖を補完できた。換言すると恐らく前記後半時点では、発現された全てのEPSPS酵素を不活性化するためにはグリホサートの量がもはや十分ではなかった。
【０１１３】
結果は、N44D変異単独でグリホサートへのいくらかの耐性を示しうるが、P106Lと組み合わせた場合は18時間の増殖後に耐性レベルを2.5倍に強化できたことを示した。これは、N44Dが好ましくはグリホサート耐性を改善できる第2の変異として用いられうることを示唆する。同様の結果は変異A(この場合N44D)を上に記載の他の変異と組み合わせた場合に得られる場合がある。同様にS179N変異単独によって十分な耐性が付与されたが、これがP106L変異と組み合わされた場合にはEPSPS酵素は不活性であった。
【実施例２】
【０１１４】
変異N44DおよびP106Lを含有するEPSPS遺伝子は、アラビドプシスで発現される場合にグリホサートへの強化された寛容を付与する
大腸菌アッセイを用いた実施例1では、本発明者らは、それ自体におけるN44D変異がグリホサートへの寛容を提供するが、例えばP106L変異と組み合わされた場合にグリホサート寛容が強く強化されることを示すことができた。本実施例の目的は、N44D変異が植物において同じ効果を示すことを実証することであり、したがってアラビドプシス・タリアナでのグリホサート耐性についての多数の変異体EPSPS遺伝子の効果を検査した。
【０１１５】
変異体EPSPS遺伝子を含有するバイナリーベクターの構築
大腸菌で検査した(実施例1を参照されたい)変異化アラビドプシスEPSPS遺伝子をバイナリーベクターpEARLEYGATE100(The Plant J.2006;45:616〜629)にクローン化した。簡潔にはEPSPS遺伝子を完全な翻訳領域を含むBamHIおよびSacI断片として単離し、次いでバイナリーベクターに存在する同じ固有の部位に挿入した。これは、EPSPS遺伝子が構成的35Sプロモーターによって発現されるT-DNAを保有し、植物の選択のために用いられうるBAR遺伝子(グルホシネートへの耐性を付与する)も保有している一連のバイナリーベクターをもたらした。この一連のバイナリーベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス株GV2260に電気穿孔し、細菌クローンを当業者に周知の方法を用いて100μg/mlスペクチノマイシンを含有するLB培地で選択した。
【０１１６】
アラビドプシス・タリアナの形質転換
アラビドプシス・タリアナの種子(ecotype Colombia)を土壌に播種し、発芽した時点で単一の実生を5cm x 5cmポットに置き、最初の花部(influorescence)が出現するまで生育させた。この段階で次いで植物をフローラルディップ法(floral dip method)を用いて形質転換した。簡潔にはアグロバクテリウム株を100μg/mlスペクチノマイシンを含有する50ml液体LB培地、28℃で一晩増殖させ、次いでこの培養物を4000rpmで10分間遠心分離した。次いで沈殿を0.02% Silwet(Lehle Seeds)を含有する5%ショ糖溶液に再懸濁した。アラビドプシス植物をこの培養物に浸漬し、次いで暗所、25℃で一晩インキュベートした。次いで植物を温室でさらに生育させ、7日後に浸漬手順を繰り返した。次いで植物を結実(次いで土壌で発芽させる)させた。形質転換アラビドプシス実生の選択のために、グルホシネートの溶液(0.1mg/mlグルホシネートアンモニウム+0.005% silwet)を調製し、実生に散布した。7日後に生存している実生を同定し、成熟まで生育させ、種子を回収した。
【０１１７】
トランスジェニックアラビドプシス株のコピー数の測定
本発明者らはT-DNAコピー数を概算するためにトランスジェニック株の種子について分離実験を実施した。各トランスジェニック株由来の種子を2%次亜塩素酸塩溶液で滅菌し、滅菌水で洗浄した。次いで1株あたり種子およそ100個を0.1mg/mlグルホシネートアンモニウムを含有するMS20培地に置き、生存している実生の数を20日後に記録した。グルホシネートに対して3:1(耐性:感受性)に分離された単一のT-DNAコピーを有する株をさらなる表現型検査のために選択した。
【０１１８】
トランスジェニックアラビドプシス株のグリホサート寛容
トランスジェニックアラビドプシス株由来の種子を滅菌し、次いで0.1mg/mlグルホシネートアンモニウムおよび+/-400μMグリホサートを含有するMS20培地に置き、4週間生育させた。この後、実生を生育プレートから除き、平均実生重量を測定した。各株についてのグリホサート耐性の程度をグリホサート存在下での平均実生重量をグリホサート非存在下で見出された平均実生重量で割ることによって決定した。この分析の結果を図23に示す。
【０１１９】
植物での、すなわちアラビドプシス由来のデータは、本発明者らが大腸菌増殖アッセイにおいて見出した耐性を確認する。N44D変異だけを含有するEPSPS遺伝子の過発現は、EPSPS非変異化WT形態と比較してグリホサート耐性を導く。EPSPS P106L遺伝子の過発現が相応の耐性を与えたが、これは変異P106LおよびN44Dの両方を含むEPSPSを発現している3個の独立株において強化できた。S179N変異からのデータは、N44Dと組み合わされた場合にも変異は耐性を付与することを示す。
【図３】
2014516517.tif 000002
【図４】
2014516517.tif 000003
【図５】
2014516517.tif 000004
【図６】
2014516517.tif 000005
【図７】
2014516517.tif 000006
【図８】
2014516517.tif 000007
【図９】
2014516517.tif 000008
【図１０】
2014516517.tif 000009
【図１１】
2014516517.tif 000010
【図１２】
2014516517.tif 000011
【図１３】
2014516517.tif 000012
【図１４】
2014516517.tif 000013
【図１５】
2014516517.tif 000014
【図１６】
2014516517.tif 000015
【図１７】
2014516517.tif 000016
【図１８】
2014516517.tif 000017
【図１９】
2014516517.tif 000018
【図２０】
2014516517.tif 000019
【図２１】
2014516517.tif 000020
【図２２】
2014516517.tif 000021
【図２３】
2014516517.tif 000022
【図１】
2014516517.tif 000023
【図２】
2014516517.tif 000024
【配列表】
2014516517000001.app
【国際調査報告】
2014516517.tif 000025
2014516517.tif 000026
2014516517.tif 000027