(57)【要約】  本発明は、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質モノマー、ならびにモノマーのマルチマーを含むかまたはマルチマーからなる、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質に関する。該非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、増進された単分散度で産生可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも５ｋＤａの分子量を有する非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質であって、アミノ酸の少なくとも８０％がＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットとして存在し、Ｇｌｙがグリシンであり、そしてＸａａおよびＹａａが、独立に、任意のアミノ酸であり、前記タンパク質が配列ＧＬＡおよびＧＡＡを欠き、そして少なくとも７の計算等電点を有する、前記タンパク質。
【請求項２】
ＲＧＤモチーフ中に存在する残基以外のアスパラギン酸残基のパーセントの数が１未満である、請求項１記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質。
【請求項３】
セリンおよびスレオニンアミノ酸残基を含まない、請求項１または請求項２いずれか記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質。
【請求項４】
配列５ｋＤａ分子量あたり少なくとも１つのＸＲＧＤモチーフを含み、ＸがＤ（Ａｓｐ）およびＰ（Ｐｒｏ）またはＯ（ヒドロキシプロリン）以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜３のいずれか記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質。
【請求項５】
Ｘが、Ｙ、Ｗ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｋ、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｈ、Ｖ、Ａ、Ｇ、ＮおよびＥからなる群より選択される、請求項４記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質。
【請求項６】
非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質の各５ｋＤａ部分が、少なくとも２つのＸＲＧＤモチーフを含む、請求項４または５記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質。
【請求項７】
アミノ酸残基の５％未満がヒドロキシプロリンである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質。
【請求項８】
配列番号１に少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質の少なくとも２つの反復を含むかまたは該反復からなる、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質。
【請求項１０】
前記反復が、同じモノマー単位配列の反復である、請求項９記載のポリマー性非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質。
【請求項１１】
モノマー反復単位間の介在アミノ酸が７未満である、請求項９または請求項１０のいずれか記載のポリマー性非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載されるような、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を含む細胞支持体。
【請求項１３】
非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質でコーティングされたインプラントまたは移植片材料、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質でコーティングされた組織操作用足場、歯科製品（の一部）、創傷治癒製品（の一部）、人工皮膚マトリックス材料（の一部）および組織接着剤（の一部）からなる群より選択される、請求項１２記載の細胞支持体。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載されるような非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を含む、徐放組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載されるような非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を含む、止血組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載されるような非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を含む、皮膚充填剤組成物。
【請求項１７】
癌転移の阻害において、そして血小板凝集の防止のために、または手術後に組織接着を防止するために使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載されるような非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質。
【請求項１８】
疼痛、癌療法、心臓血管疾患、心筋修復、血管新生、骨修復および再生、創傷治療、神経刺激／療法および糖尿病の治療において使用するための、請求項１４に記載されるような徐放組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載されるような非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を産生するための方法であって：
ａ）適切なプロモーターに機能可能であるように連結された、請求項１〜１１のいずれか一項に記載されるようなタンパク質をコードする核酸配列を含む、発現ベクターを調製し、
ｂ）前記発現ベクターで酵母種を形質転換し、
ｃ）前記酵母種を、適切な発酵条件下で培養して、前記核酸配列の発現を可能にし；
ｄ）場合によって、培地および／または宿主細胞から前記タンパク質を単離する
工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え的に産生される非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質、例えば非天然ゼラチン、およびその産生法の分野にある。特に、本発明は、高収量で産生可能な非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質に関する。これらの非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、一般的に用いられる発現系に見られる特定のプロテアーゼに対して改善された耐性を有する。プロテアーゼに対して高い安定性を有するため、収量が改善され、そして特定の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質の均一性が改善される。
【背景技術】
【０００２】
組換えＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質（式中、Ｇｌｙはグリシンであり、そしてＸａａおよびＹａａは、独立に任意のアミノ酸である）、例えばゼラチンに関する関心が増大している。医学的および臨床的適用において、これらのＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質が広範に使用され、そして使用に関する可能性があることは、経済的に実行可能な産生プロセスが必要であることを意味する。このため、発現特性に、そしてしたがって所望のＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質の収量に影響を及ぼす可能性がある、プロセスの可変性およびタンパク質配列の変動に関する注意深い考察が必要となってきている。
【０００３】
動物組織由来のコラーゲンを加水分解することによって得られるゼラチンなどの天然存在Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、実際には、非常に多数のペプチドおよびポリペプチドの混合物である。これらの（ポリ）ペプチドの分子量範囲は、ゼラチンが得られた組織およびプロセシング条件による。
【０００４】
原則として、特定の遺伝子は、典型的には単一のタンパク質をコードする（イントロンを含有する遺伝子以外）ため、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質の組換え産生は、すべての構成要素分子が同じ長さ（同じアミノ酸残基数）を有する産物を生じる。遺伝子のコード配列は、新生ポリペプチドの長さを決定する。分泌タンパク質はまた、典型的には、分泌中に除去されるシグナル配列（シグナルペプチド、プレタンパク質配列）も含有する。次いで、残りのポリペプチドが成熟ポリペプチドと見なされる。
【０００５】
Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、多様なプロテアーゼに感受性である。したがって、一般的に用いられる発現宿主、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）によって分泌されるＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、細胞内および細胞外プロテアーゼによる（部分的）消化のため、サイズが不均一である。
【０００６】
厳密に解釈すれば、成熟全長ポリペプチドのみが産物と見なされる。しかし、反復バイオポリマーの分野においては、しばしば、成熟ポリペプチドおよびそのタンパク質分解断片の両方が最終産物と見なされる。
【０００７】
第一の解釈において、タンパク質分解は、産物収量の有意な減少を導く可能性もあり、そして分解産物は、成熟タンパク質の精製中に重大な問題を課しうる（成熟タンパク質およびその分解産物の間の類似性のため）。第二の解釈の意味における産物は、動物由来ゼラチン：多様な長さのポリペプチドを含む産物に、ある程度の類似性を有する。しかし、この産物の不均一性は、いくつかの適用においては不都合である可能性もある。
【０００８】
したがって、タンパク質分解の防止は、産物の収量および品質の両方に有益であろう。タンパク質分解は、特定のプロテアーゼ遺伝子の不活性化によって、または産物におけるこれらのプロテアーゼのターゲット部位を排除することによって、回避可能である。両方のアプローチの例が文献中に見られうる。ＥＰ９２６５４３およびＷｅｒｔｅｎら  １９９９（Ｙｅａｓｔ  １５，  １０８７−１０９６）は、メチロトローフ酵母ピキア・パストリスを用いたＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質の産生法であって、マウスＩ型コラーゲン（２１ｋＤａおよび２８ｋＤａ計算ＭＷをコードする、ＣＬＯ１Ａ１ペプチドおよび５３ｋＤａ  ＣＯＬ１Ａ２）およびラットＩＩＩ型コラーゲン（ＣＯＬ３Ａ１）のらせんドメイン断片（Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレット反復からなる）に対応するＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質が産生される、前記方法を記載する。発酵ｐＨなどの要因は、特定の場合、発現される産物の安定性に影響を及ぼすことが見出された。発現される配列において特定のプロテアーゼに関するターゲット部位が存在することもまた関連すると考えられた。
【０００９】
ＵＳ  ２００６／０２４１０３２において、最小の（増加した）レベルのＸＲＧＤモチーフを持ち、そして前記ＸＲＧＤモチーフの特定の分布を持つＸＲＧＤリッチ・ゼラチン様タンパク質が開示されており、これは医学的およびバイオテクノロジー的適用において、細胞接着および細胞結合に非常に適していることが見出された。該特許に記載される細胞結合ペプチドは、優れた細胞付着特性を有する。しかし、分解されやすい点が、特定のＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を多量に産生する能力を限定する要因となってきている。ＥＰ２１１２９９７において、改善された安定性を有するＸＲＧＤリッチ・ゼラチンタンパク質が開示されている。これは、配列において、ＸＲＧＤモチーフ中のＸとして、特定のアミノ酸残基（Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ）の使用を回避することによって達成された。しかし、組換え産生ゼラチン様Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質の安定性をさらに改善することが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＥＰ９２６５４３
【特許文献２】ＵＳ  ２００６／０２４１０３２
【特許文献３】ＥＰ２１１２９９７
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｗｅｒｔｅｎら  １９９９（Ｙｅａｓｔ  １５，  １０８７−１０９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
大部分の発現系におけるプロテアーゼは知られていない。これらのプロテアーゼのターゲットおよびその基質特異性に関しては、さらにより少ない情報しか入手可能でない。したがって、大部分の場合、タンパク質分解攻撃に耐性である配列を、実験的に決定しなければならない。本特許出願において、本発明者らは、以前は同定されていなかったタンパク質分解ターゲット部位を排除することによって、改善された収量および品質で産生可能な、新規Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を開示する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、少なくとも５ｋＤａの分子量を有する非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質であって、アミノ酸の少なくとも８０％がＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットとして存在し、Ｇｌｙがグリシンであり、そしてＸａａおよびＹａａが、独立に、任意のアミノ酸であり、前記タンパク質が配列ＧＬＡおよびＧＡＡを欠き、そして少なくとも７の計算等電点を有する、前記タンパク質を提供する。
【００１４】
好ましくは、非天然タンパク質は、本質的に完全にＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットからなる。これらの非天然タンパク質の配列は、天然存在ゼラチンに類似であり、すべての第三のアミノ酸としてグリシン残基を有し、そしてＸａａおよびＹａａ位、特にＹａａ位に比較的高い比率でプロリン残基を有する。本発明者らは、驚くべきことに、本発明記載のタンパク質が、付随するタンパク質分解産物を低レベルしか伴わずに、高収量で微生物によって分泌されることを見出した。
【００１５】
多様な最終使用適用のため、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質中にＲＧＤモチーフを含むことが好適である。本発明記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、したがって、好ましくはＲＧＤ配列がリッチである。したがって、１つの態様において、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、１またはそれより多いＲＧＤモチーフを含む。ＲＧＤリッチの定義を以下に示すが、例えば約３００アミノ酸の長さを持つゼラチンに関しては、少なくとも２つのＲＧＤモチーフ、より好ましくは少なくとも３つのＲＧＤ、そして特に少なくとも４またはそれより多いＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。
【００１６】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明の組換え非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質が、特定の微生物における組換え体産生の間、そしてそれに続く単離および精製法の間、より安定であることを見出した。この結果、断片はより少なくしか付随せず、ゼラチンポリペプチドの望ましい分子種がより高い収量で生じる。
【００１７】
この単分散度は、少なくとも７、好ましくは少なくとも８、より好ましくは少なくとも９、そして特に１０またはそれより大きい計算等電点を有する非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質でより改善されることもまた見出された。
【００１８】
好ましくは、本発明記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質はまた、ＲＧＤモチーフ中に存在する残基とは別に、低いアスパラギン酸残基含量も有する。好ましくは、ＲＧＤモチーフ中に存在する残基以外のアスパラギン酸残基のパーセントの数は１未満である。
【００１９】
組換え非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質中の１またはそれより多いＲＧＤ配列には、プロリン（Ｐ）またはヒドロキシプロリン（Ｏ）が先行しないこともまた好ましい。
【００２０】
本発明の１つの態様において、配列５ｋＤａ分子量あたり少なくとも１つのＸＲＧＤモチーフを含み、ＸがＤ（Ａｓｐ）およびＰ（Ｐｒｏ）またはＯ（ヒドロキシプロリン）以外の任意のアミノ酸である、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を提供する。
【００２１】
好ましくは、Ｘは、Ｙ、Ｗ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｋ、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｈ、Ｖ、Ａ、Ｇ、ＮおよびＥからなる群より選択され、特にＥである。好ましくは、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質の各５ｋＤａ部分は、少なくとも２つのＸＲＧＤモチーフを含む。
【００２２】
非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質配列（ならびにこれらのいずれかの変異体および断片）の高いそして安定した発現レベルは、遺伝子操作された微生物において得られうる。選択された微生物において、これらのタンパク質は高収量で分泌される。特に適切な微生物は、操作された核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）によって修飾された、メチロトローフ酵母である。これらの修飾酵母は、高収量で、人工的なＲＧＤを含む非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を産生するため、大規模発酵を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、宿主細胞（ＣＢＳ  ７４３５）、ならびにＩＣＰ３およびその変異体ＩＣＰ３−ｖａｒ６およびＩＣＰ３−ｖａｒ８を産生する株の代表的な培養上清のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。矢印は成熟タンパク質を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
一般的な定義
非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、連続するＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットを含むセグメントを含み、Ｇｌｙがグリシン残基であり、そしてＸａａおよびＹａａが、独立に任意のアミノ酸残基である、ポリペプチドである。非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、天然に見られうる配列の構成要素を含んでもよい。ゼラチンは、動物由来のＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質の周知のクラスを構成するが、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質はまた、原核生物においても見られうる。
【００２５】
しばしば、用語「コラーゲン」、「コラーゲン関連」、「コラーゲン由来」等もまた、当該技術分野において用いられるが、本説明の残りを通じて、用語「ゼラチン」または「ゼラチン様」タンパク質が用いられるであろう。天然ゼラチンは、５，０００〜最大４００，０００ダルトンを超える範囲のＭＷを持つ個々のポリマーの混合物である。
【００２６】
用語「細胞接着」および「細胞付着」は、交換可能に用いられる。
用語「ＲＧＤ配列」および「ＲＧＤモチーフ」および「Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ」は、交換可能に用いられる。用語「ＲＧＤリッチ」は、本明細書において、少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むアミノ酸配列を指す。用語「ＲＧＤリッチ」は、本発明の背景において、分子あたりのアミノ酸総数のあるパーセントとして計算される、ＲＧＤモチーフの特定のレベルが存在し、そしてアミノ酸配列中に、多かれ少なかれ、特定の規則正しいＲＧＤ配列の分布があることを意味する。ＲＧＤ配列のレベルは、パーセントとして表現されうる。このパーセントは、ＲＧＤモチーフの数をアミノ酸総数で割って、そして結果に１００を乗じることによって計算される。また、ＲＧＤモチーフの数は、１、２、３、・・・等で始まる整数である。
【００２７】
特に、「ＲＧＤリッチ」は、本明細書において、アミノ酸総数に関連したＲＧＤモチーフのパーセントが少なくとも０．４であり、そしてアミノ酸配列が２５０アミノ酸またはそれより多くを含む場合、２５０アミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含有する、アミノ酸配列を指す。好ましくは、ＲＧＤモチーフのパーセントは、少なくとも０．６であり、より好ましくは少なくとも０．８であり、より好ましくは少なくとも１．０であり、より好ましくは少なくとも１．２であり、より好ましくは少なくとも１．５であり、そして最も好ましくは少なくとも１．８である。好ましくは、「ＲＧＤリッチ」は、分子量５ｋＤａあたり少なくとも１つのＲＧＤ配列を有するポリペプチドを指す。本発明の背景において、分子量は、特に一次アミノ酸配列の、計算分子量を指し、したがって、本ポリペプチドが組換え的に産生される特定の宿主微生物のありうる翻訳後修飾は考慮に入れない。本明細書に示す好ましい微生物のうち、特に酵母において、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質の翻訳後修飾はまったく起こらないと仮定される。本非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、ＲＧＤ配列を含まない５ｋＤａ部分を含有しないことが好ましい。
【００２８】
少なくとも０．４より大きいＲＧＤモチーフのパーセントは、２５０アミノ酸あたり少なくとも１つのＲＧＤ配列より多くに相当する。ＲＧＤモチーフの数は整数であり、したがって、０．４％の特徴を満たすためには、２５１アミノ酸からなるアミノ酸配列が、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のＲＧＤリッチＧＸＹタンパク質は、２５０アミノ酸あたり少なくとも２つのＲＧＤ配列、より好ましくは、２５０アミノ酸あたり少なくとも３つのＲＧＤ配列、最も好ましくは、２５０アミノ酸あたり少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。さらなる態様において、本発明記載のＲＧＤリッチゼラチン様タンパク質は、３０ｋＤの計算分子量あたり少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは３０ｋＤあたり少なくとも６つのＲＧＤモチーフを含む。
【００２９】
「ＸａａおよびＹａａ位におけるプロリン残基の比較的大きな比率」は、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットの少なくとも３分の１が、プロリン残基を含有することを意味する。
【００３０】
「断片」は、より長い核酸またはポリペプチド分子の部分である。
「天然」または「自然」コラーゲンまたはコラーゲン性ドメインは、天然に、例えばヒトまたは他の哺乳動物において見られる核酸またはアミノ酸配列を指す。
【００３１】
本発明記載の「非天然ポリペプチドまたはタンパク質」は、コラーゲンなどの天然分子の部分である同じ長さのポリペプチド配列とある度合いの相同性を有しうる。しかし、組換え非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質自体は、天然には生じない。
【００３２】
用語「タンパク質」または「ポリペプチド」または「ペプチド」は、交換可能に用いられ、そしてアミノ酸鎖からなる分子を指し、特定の作用様式、サイズ、三次元構造または起源には関わりない。単離タンパク質は、天然環境で見られないタンパク質であり、例えば培地から精製されたタンパク質である。
【００３３】
用語「支持体」または「細胞付着支持体」は、本明細書において、細胞付着および／または増殖を容易にするために使用可能な任意の支持体、例えば培養プレート、マイクロキャリアー（例えばマイクロキャリアービーズ）、ステント、インプラント、プラスター等を指す。
【００３４】
用語「実質的に同一な」、「実質的同一性」または「本質的に類似の」または「本質的類似性」は、２つのポリペプチドが、デフォルトパラメータでＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて対に整列された場合、少なくとも６０％、７０％、８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、または９７％、そして特に少なくとも９８％、９９％、またはそれより多いアミノ酸配列同一性を含むことを意味する。配列整列および配列同一性パーセントに関するスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，  ９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  ９２１２１−３７５２，  ＵＳＡより入手可能なＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージ、バージョン１０．３などのコンピュータプログラムを用いて、またはＥｍｂｒｏｓｓＷＩＮ（例えばバージョン２．１０．０）を用いて、決定可能である。２つの配列間で配列同一性を比較するため、例えばＥｍｂｏｓｓＷＩＮプログラム「ｗａｔｅｒ」で用いられる、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ＴＦ，  Ｗａｔｅｒｍａｎ  ＭＳ（１９８１）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ  １４７（１）；１９５−７）などの局所整列アルゴリズムを用いることが好ましい。デフォルトパラメータは、タンパク質用のＢｌｏｓｕｍ６２置換マトリックスを用い、ギャップ開始ペナルティ１０．０およびギャップ伸長ペナルティ０．５である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  １９９２，  ＰＮＡＳ  ８９，  ９１５−９１９）。
【００３５】
用語「含む」は、言及する部分、工程または構成要素の存在を明記すると解釈されるものとするが、１またはそれより多いさらなる部分、工程または構成要素の存在を排除しない。
【００３６】
さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素への言及は、１であり、そして１のみの要素があることを文脈が明らかに必要としない限り、１より多い要素が存在する可能性を排除しない。不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、したがって、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【００３７】
「モノマー」は、ポリペプチド単位（またはそれをコードする核酸配列）であって、該単位を直線方式で反復して、より長いポリペプチドを生じることによって、「マルチマー」（または交換可能に用いられる「ポリマー」）を生成するように使用可能な前記単位を指す。モノマー単位は、好ましくは、介在するアミノ酸を伴わずに反復されるが、場合によって、１、２、３、４、５、またはそれより多い連結アミノ酸がモノマー単位間に存在してもよい。
【００３８】
用語「改善された安定性」は、タンパク質が、酵母発現宿主の通常の培養条件下、およびタンパク質が単離される通常の条件下で、天然存在構造由来の対応する配列と比較して、加水分解されないか、または、好ましくは少なくとも１０％またはそれより多く、より低い度合いに加水分解されることを意味する。
【００３９】
「三重らせんを含まない」構造は、円二色スペクトルにおいて、コラーゲン三重らせんに特徴的な陽性ピークが本質的に存在しないことを指す。円二色分光法は、Ｗｅｒｔｅｎら（２００１，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １４：４４７−４５４）に記載されるように実行可能である。
【００４０】
発明の詳細な説明
驚くべきことに、高収量の改善された非常に安定したペプチドまたはポリペプチドを得ることが可能であることが見出された。これは、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質の産生プロセスを経済的に実行可能にする、非常に大きな利点を有する。本発明はしたがって、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質に関する。本タンパク質の安定性は、ゼラチンが用いられている適用、特にゼラチン／Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質の完全性に頼る適用に有益である。ポリペプチドはまた、いかなる健康関連リスクも示さず、これは、これらが低い抗原性しか持たないためであり、すなわちこれらのポリペプチドは、ウイルス、プリオン等の病原性因子を伝達するリスクを最小限にしか伴わずに使用可能である。本発明は、臨床的、医学的および／またはバイオテクノロジー的適用において用いるのに非常に適したペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に、特にゼラチンまたはゼラチン様タンパク質に、関する。例えば、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）分子を循環中に維持する血漿増補液としての使用に関心が持たれ、そしてこれは本タンパク質が好適に適している適用である。また、特に、止血剤、皮膚充填剤および細胞接着における使用が関心領域である。１つの態様において、本発明は、例えばＵＳ２００６／０２４１０３２に記載されるものなど、特に配列番号２として該特許中に示される配列など、既知のＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ−ＲＧＤを含むポリペプチドに比較した際、改善された特性を有する、細胞結合ペプチドまたはポリペプチドに関する。
【００４１】
本発明の非天然タンパク質は、天然存在配列とは異なるが、コラーゲンにある程度の相同性を示しうる。したがって、該非天然タンパク質配列が、天然コラーゲンアミノ酸配列と５０％を超える相同性を示すことも可能である。Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質中のアミノ酸の三連構造の大部分、好ましくは少なくとも８０％は、配列Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａを有するべきであるが、場合による逸脱した三連構造、例えばＡ−ＸａａＹａａ（Ａ＝アラニン）は、必要な特性を改変しない。Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットのかなりの数は、配列Ｇｌｙ−Ｘａａ−ＰまたはＧｌｙ−Ｐ−Ｙａａ（式中、Ｐはプロリンである）を有するべきである。好ましくは、半数を超えるＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットは、プロリン残基を含有する。好ましくはシステインは回避される。
【００４２】
本発明にしたがって、優れた細胞付着特性を持ち、そして改善された安定性、改善された細胞付着および組織支持特性などの利点を示す、組換えゼラチンを提供する。
１つの態様において、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、配列番号１に少なくとも６０％の配列同一性を有する。この配列はまた、本明細書において、ＩＣＰモノマーとも称される。
【００４３】
１つの態様において、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質はまた、配列番号１またはその断片に、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、そしてより好ましくは少なくとも９０％またはそれより多いアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも９２％、９５％、９６％、９８％、９９％配列同一性またはそれより多くを有するアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなるタンパク質と定義可能である。「断片」は、１０００アミノ酸未満、例えば８００、６００、５００、３００、２５０、２００、１００、５０、３０またはそれより少ない連続アミノ酸の部分であるが、好ましくは少なくとも１０、１５または２０アミノ酸である。
【００４４】
１つの態様において、本発明は、少なくとも５ｋＤａの分子量を有し、そして分子量５ｋＤａあたり少なくとも１つのＲＧＤ配列を含む、非天然組換え産生Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を提供する。好ましくは、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、少なくとも１５ｋＤａ、好ましくは少なくとも２０ｋＤａ、そしてより好ましくは少なくとも２５ｋＤａの計算分子量を有する。
【００４５】
好ましくは、５ｋＤａの非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質の各部分は、少なくとも１つのＲＧＤ配列を含む。好ましくは、分子量は、２００ｋＤａ未満、より好ましくは１５０ｋＤａ未満である。こうした非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、さらに改善された安定性を有することが見出された。
【００４６】
本発明の非天然タンパク質を得るため、例えば天然ゼラチン配列をコードする核酸配列を部位特異的突然変異誘発によって修飾して、本明細書に定義するようなＲＧＤモチーフを有する配列を得てもよい。もちろん、単純に、連続Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａモチーフ、例えば少なくとも５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、２００、３００またはそれより多い連続Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａモチーフを含むアミノ酸配列を設計することも可能であり、それによって、少なくとも１つであるが、好ましくはそれより多いＲＧＤモチーフが配列中に含まれる。こうして設計されたポリペプチドは、（ルーチンの分子生物学技術を用いて）これらをコードする核酸配列を作製し、そして組換え宿主細胞においてこれらを発現することによって、作製可能である。好ましくは、ＲＧＤモチーフのスペーシングは、少なくとも約０、１０、１５、２０、２５、３０またはそれより多い介在アミノ酸が存在するようなものである。配列中にいくつかのＲＧＤモチーフが存在する場合、これらは、考慮中の適用に応じて、規則的にまたは不規則にスペーシングされていてもよい。
【００４７】
好ましくは、ＸＲＧＤモチーフは、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａモチーフの一部であり、すなわちＧｌｙ−Ｘａａ−ＹａａトリプレットはＲＧＤモチーフ（単数または複数）によって破壊されない。例えば、配列ＧｌｙＸａａＹａａ−ＧｌｙＸａａＹａａ−ＧｌｙＸａａＲ−ＧＤＹａａ−ＧｌｙＸａａＹａａ−ＧｌｙＸａａＹａａにおいて、ＲＧＤモチーフは、連続するＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットを破壊しない。
【００４８】
非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質中に、少なくとも１つのＸＲＧＤモチーフ（ＸはＤまたはＰまたはＯではない）があることもまた好ましい。より好ましくは、２より多い、例えば３、４、５、６またはそれより多いＸＲＧＤモチーフが、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質中に存在してもよく、ここでＸは再び、Ｄ、ＰまたはＯを除く任意のアミノ酸である。
【００４９】
さらなる態様において、本発明は、グリコシル化されていない非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質に関する。グリコシル化は、好ましくは、免疫反応が望ましくない適用に関しては防止されるべきである。好ましい態様において、本発明記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）およびスレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）残基を含まない。アミノ酸配列におけるセリンおよびスレオニンの欠如は、例えば、酵母細胞培養を用いたバイオテクノロジー産生系において、グリコシル化を防止する有効な方法でありうると考えられる。
【００５０】
非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質モノマーは、一端または両端、例えばＮおよび／またはＣ末端で、さらなるアミノ酸を含んでもよい。例えば、１、２、３、６、９、１２、１５またはそれより多いアミノ酸が存在してもよい。これらは、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットの形であってもよい。末端、特にＣ末端のさらなるアミノ酸は、例えばＣ末端分解、例えばアミノ酸１つずつの切断を防止することによって、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質の安定性を増進する。また、末端でのさらなるアミノ酸は、マルチマー構築を容易にし、マルチマー性非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質ポリペプチドは、反復アミノ酸配列の一部ではないＮ末端およびＣ末端アミノ酸を含んでもよい。１つの態様において、本発明記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、グリシン−プロリン−プロリン（ＧＰＰ）トリプレットに先行され、そしてカルボキシ末端で２つのグリシン残基（ＧＧ）によって伸長される。
【００５１】
本発明記載の上記非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、酵素および／または化学的タンパク質分解に対して優れた安定性を有する。
好ましくは、本発明記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を用いると、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でまたはＬＣ−ＭＳなどの他の方法によって、安定性アッセイにおいて／該アッセイ後、分解または切断産物、すなわちコードされる（全長）非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質のものより小さいサイズのポリペプチドは、見られないかまたは減少して見られる。安定性は、例えば、ポリペプチドが酵母宿主の培地内に分泌された後に試験可能であり、そのため実質的にすべて（少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、９９％または最も好ましくは１００％）の組換えポリペプチドが完全サイズである場合、ポリペプチドは安定である。酵素的または化学的加水分解に対する安定性はまた、ポリペプチドを、１またはそれより多いタンパク質分解酵素または加水分解化学物質とインキュベーションすることによって、そして処理の明記した期間後、生じる分子量を分析することによっても、試験可能である。
【００５２】
例えば、組換え天然ゼラチンおよび同じ酵母宿主において産生される本発明記載のゼラチンの分子量を発酵後に比較する際、本発明記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、同じ条件下で、そして同じ方法で産生された天然ゼラチンよりもより分解されない。分解はまた、例えば、同じ量の試料を装填したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のバンド強度を分析することによっても定量化可能である。例えば、Ｗｅｒｔｅｎら  １９９９（上記）を参照されたい。
【００５３】
本発明の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質の遺伝子は、本明細書の別の箇所に記載するアミノ酸配列基準を満たすさらなる修飾を伴う、天然コラーゲン性配列をコードする遺伝子由来であってもよい。あるいは、本発明の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質の遺伝子は、デノボで合成可能である。遺伝子合成は、多様な企業によって提供される。
【００５４】
Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質マルチマー
さらなる態様において、上記のモノマーのマルチマーを提供する。したがって、本発明は、上記のような非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質の少なくとも２つの反復を含むかまたは該反復からなる非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を含む。こうしたマルチマーは、したがって、モノマー配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０反復を含むかまたは該反復からなる。したがって、上記モノマー配列のマルチマーを含むかまたは該マルチマーからなる非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質ポリペプチドを提供する。好ましくは、モノマー反復は、同じモノマー単位配列の反復である（反復はアミノ酸配列中で同一である）が、場合によってまた、異なるモノマー単位の組み合わせ（各々が上記基準に属する異なるアミノ酸配列を有するもの）を用いてもよい。
【００５５】
好ましくは、モノマー単位は、スペーシングアミノ酸によって分離されないが、短い連結アミノ酸、例えば１、２、３、４または５アミノ酸が、１またはそれより多いモノマーの間に挿入されてもよい。好ましくは、モノマー反復単位間には７未満の介在アミノ酸、より好ましくは３未満のアミノ酸がある。
【００５６】
１つの態様において、マルチマーは、上記のようなモノマーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０反復を含むかまたは該反復からなる。１つの態様において、マルチマーは、配列番号１またはその断片に対して少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより多いアミノ酸配列同一性を有するか、あるいは実質的に同一である配列の、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０反復を含むかまたは該反復からなる（配列類似性は、上に概略するように決定される）。したがって、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質には、（配列番号１）ｎが含まれ、式中、ｎは１およびそれより大きいものより選択される整数であり、好ましくはｎは１〜１０またはそれより大きい。ＩＣＰモノマーの２つの反復は、二量体（配列番号２）を生じ；ＩＣＰモノマーの４つの反復は四量体（配列番号３）を生じる。
【００５７】
１つの態様において、本発明記載のマルチマー非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、グリシン−プロリン−プロリン（ＧＰＰ）トリプレットに先行され、そしてカルボキシ末端で２つのグリシン残基（ＧＧ）によって伸長される。したがって、本発明記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質には、ＧＰＰ（（配列番号１））ｎＧＧ、式中、ｎは１およびそれより大きいものより選択される整数であり、好ましくはｎは１〜１０またはそれより大きい、が含まれる。ｎ＝１の場合、ＩＣＰ（配列番号４）と称される本発明記載のゼラチンが得られる。上記式において、ｎ＝２の場合、配列ＩＣＰ２（配列番号５）が得られ；上記式において、ｎ＝３は、配列ＩＣＰ３（配列番号６）を生じ；上記式において、ｎ＝４の場合、配列ＩＣＰ４（配列番号７）が得られる。
【００５８】
こうしたマルチマーは、既知の標準分子生物学法を用いて生成可能である。
モノマーおよび／またはマルチマーを含む材料および組成物
本発明は、細胞接着に適しており、そして医学的またはバイオテクノロジー的適用に使用可能である、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に、特に、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質に関する。
【００５９】
本発明記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、バイオテクノロジープロセスまたは医学的適用において使用可能な細胞培養支持体をコーティングするのに非常に適していることが見出された。
【００６０】
ゼラチン中のＲＧＤ配列は、インテグリンと称される細胞壁上の特異的受容体に接着可能である。これらのインテグリンは、細胞結合アミノ酸配列を認識する際に特異性が異なる。天然ゼラチン、および例えばフィブロネクチンはどちらも、ＲＧＤ配列を含有しうるが、ゼラチンはフィブロネクチンに結合しない細胞に結合可能であるし、そして逆もまた当てはまる。したがって、ＲＧＤ配列を含むフィブロネクチンは、細胞接着目的のため、ゼラチンに常に代用できるわけではない。
【００６１】
組換え的に産生されたゼラチンは、動物由来ゼラチンの不都合な点、例えばゼラチンが由来する動物から生じる病原体の潜在的な混入を伴わない。
細胞培養支持体として、または細胞培養支持体と組み合わせて用いた場合、本発明記載のゼラチン様ポリペプチドは、細胞結合ポリペプチドとして機能する。これらは、これらの上に増殖する細胞によってもまた代謝されうる点で、他のポリペプチドよりも優れている。
【００６２】
組換え産生ゼラチンのさらなる利点は、その分子量（ＭＷ）が均一に維持されうることである。天然ゼラチン、特に天然供給源より単離されるゼラチンは、不可避的に、５ｋＤａより小さく、４００ｋＤａを超える分子量の巨大ポリマーまでのペプチドの、広い分子量分布を有する。特に、細胞培養支持体としてマイクロキャリアーコアビーズと組み合わせた場合、より小さいペプチドの不都合な点は、細胞が到達不能である、マイクロキャリアーのより細かい孔の内部に該ペプチドが接着し、したがって、添加されるゼラチンの一部が用いられないことである。組換え産生法を用いると、ゼラチンは望ましい分子量を持つように設計可能であり、この望ましくない効果が防止される。
【００６３】
本発明記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を含む細胞支持体を提供する。こうした細胞支持体は、
１）１またはそれより多い本発明記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を含むコーティングでコーティングされた、コアビーズ（例えばマイクロキャリアービーズ）またはペトリ皿等の細胞培養支持体；
２）１またはそれより多い本発明記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を含むコーティングでコーティングされた、インプラントまたは移植片デバイス（例えば股関節、歯科、または他のインプラント、ステント等）、
３）１またはそれより多い本発明記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を含むコーティングでコーティングされた、組織操作用の足場またはマトリックス、例えば人工皮膚マトリックス材料；
４）１またはそれより多い本発明記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を含むコーティングでコーティングされた、創傷治癒製品；
５）１またはそれより多い本発明記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を含むかまたは該タンパク質からなる、組織接着剤
からなる群より選択されうる。
【００６４】
好ましくは、細胞支持体は、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質でコーティングされたインプラントまたは移植片材料、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質でコーティングされた組織操作用足場、歯科製品（の一部）、創傷治癒製品（の一部）、人工皮膚マトリックス材料（の一部）および組織接着剤（の一部）からなる群より選択される。
【００６５】
１つの態様において、本明細書に提供する細胞支持体は、好ましくは、本発明記載のただ１つの非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を含む。産物は、したがって、アミノ酸配列、分子量等が均一である。場合によって、ペプチドは、例えば、化学的架橋によって架橋されてもよい。
【００６６】
異なる態様において、本発明記載のポリペプチドの混合物は、例えば、２、３、４、５、またはそれより多い本発明記載の異なるアミノ酸配列を使用可能である。混合物の比は多様であってもよく、例えば１：１、または１０：１、５０：１、１００：１、１：１００、１：５０、１：１０、およびその間の比であってもよい。場合によって、タンパク質のこれらの混合物、またはその一部がまた、架橋されていてもよい。
【００６７】
多孔マイクロキャリアービーズをコーティングするために非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質モノマー（単数または複数）および／またはマルチマーを用いる場合、好ましくは少なくとも約３０ｋＤａの分子量のポリペプチド、より好ましくは少なくとも約４０ｋＤａ、特に少なくとも約５０ｋＤａ、さらに特に少なくとも約６０ｋＤａ、そして特に少なくとも約７０ｋＤａまたはそれより多い分子量のポリペプチドを用いる。これは、より小さいポリペプチドは、ビーズ上の孔に進入し、それによって、コーティングされるビーズの細胞付着特性に寄与しない可能性があるためである。したがって、特に、ビーズをコーティングするために低濃度のタンパク質を用いる場合には、コーティングプロセスが不十分になる可能性もある。
【００６８】
好ましくは、用いる非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａまたはゼラチン様タンパク質の分子量は均一であり、７５％を超える、好ましくは８５％を超える、より好ましくは９５％を超える、そして特に少なくとも９８％のタンパク質が、選択した分子量から２０％以内の均一なＭＷを有する。
【００６９】
上に明記した範囲内に分子量を選択することによって、コーティングプロセスにおいて、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａまたはゼラチン様タンパク質コーティング溶液の粘度が、実際に制御可能となる。こうしたゼラチン溶液のゼラチン濃度を可能な限り高く選択することが可能である一方、完全な、またはより重要なことに、部分的ゲル化が、防止されうる。均一なゼラチンによって、マイクロキャリアーを同一にコーティングするプロセスが確実になる。均一なコーティングプロセスによって、ゼラチンを最小量で使用し、そしてゼラチンコーティング溶液を最小体積で使用することが可能になる。これは、当該技術分野に知られるよりも、より効率的なコーティングプロセスを生じる。
【００７０】
本発明の１つの態様において、非多孔コアビーズを本発明のゼラチンでコーティングする。適切な非多孔コアビーズは、ポリスチレンまたはガラスで作製される。他の適切な非多孔材料が当業者に知られる。
【００７１】
本発明の特定の好適な態様は、多孔コアビーズ、例えば修飾デキストランまたは架橋セルロース、または（多孔）ポリスチレン、特にＤＥＡＥ−デキストラン由来のビーズを、本発明の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質でコーティングするプロセスである。他の適切な多孔材料が当業者に知られ、そしてこれには、例えば他の化学的に修飾されるかまたは修飾されない多糖が含まれる。
【００７２】
ビーズサイズは、５０μｍ〜５００μｍで多様でありうる。典型的な平均マイクロキャリアービーズサイズは、生理食塩水中、約１００μｍ、約１５０μｍまたは約２００μｍである。ビーズの少なくとも９０％が範囲内にあるサイズ範囲は、８０〜１２０μｍ、１００〜１５０μｍ、１２５〜１７５μｍまたは１５０〜２００μｍで多様でありうる。
【００７３】
広範囲の細胞がマイクロキャリアー上で培養可能である。例えば、無脊椎動物、魚類、鳥類由来の細胞、および哺乳動物起源の細胞がすべて培養可能である。形質転換および正常細胞株、線維芽細胞および上皮細胞、そしてさらに遺伝子操作細胞もまた、多様な生物学的適用のため、例えばインターフェロン、インターロイキン、増殖因子等の免疫学的剤の産生のため、マイクロキャリアー上で培養可能である。マイクロキャリアー上で培養する細胞はまた、口蹄疫または狂犬病のようなワクチンとして用いられる多様なウイルスの宿主としても働く。
【００７４】
マイクロキャリアー培養は、大量培養以外の非常に多数の適用を有する。マイクロキャリアー上で増殖している細胞は、細胞間または細胞・基層相互作用などの細胞生物学の異なる側面を研究するための優れたツールとして働く。細胞分化および成熟、代謝研究もまた、マイクロキャリアーを用いて実行可能である。こうした細胞はまた、電子顕微鏡研究のため、または細胞膜などの細胞内小器官の単離のためにも使用可能である。また、この系は、本質的に三次元の系であり、そして優れた３Ｄモデルとして働く。同様に、この系を用いて、細胞の共培養を行ってもよい。したがって、適用には、多量の細胞、ウイルスおよび細胞産物（例えばインターフェロン、酵素、核酸、ホルモン）の産生、細胞接着、分化および細胞機能に関する研究、灌流カラム培養系、顕微鏡研究、有糸分裂細胞の採取、細胞の単離、膜研究、細胞の保存および輸送、細胞トランスファーに関するアッセイ、ならびに標識化合物の取り込みに関する研究が含まれる。
【００７５】
マイクロキャリアーはまた、脾臓細胞集団からのマクロファージの枯渇にも使用可能である。本発明の組換え非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質でコーティングされたＤＥＡＥ−デキストランマイクロキャリアーは、コンカナバリンＡ（ｃｏｎＡ）によるリンパ球の刺激を増強可能である。同種腫瘍細胞で集密となったマイクロキャリアービーズをマウスに注入して、体液性および細胞仲介免疫を増加させることも可能である。植物プロトプラストを、本発明の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質でコーティングされたＤＥＡＥ−デキストランマイクロキャリアー上に固定することも可能である。
【００７６】
マイクロキャリアーが提供する、高い表面積対体積比の結果として、これらは、多様な生物学的産物を、実験室規模、ならびに例えばさらに４０００リットルまたはそれより多い産業規模で成功裡に使用可能である。
【００７７】
ゼラチンコーティングマイクロキャリアーを用いて、発現される産物の大規模産生を達成することも可能である。産生規模バイオリアクターにおけるマイクロキャリアーの装填は、一般的には２０ｇ／ｌであるが、最大４０ｇ／ｌまで増加させうる。マイクロキャリアーは、バッチおよび灌流系において、攪拌培養において、そしてウェーブバイオリアクターで使用可能であり、それとともに、伝統的な静置単層およびローラー培養の表面積を増加させうる。
【００７８】
さらなる好ましい態様において、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、本質的に、ヒドロキシプロリン残基を含まない。プロリンのヒドロキシル化は、コラーゲンにおける三重らせんの形成に関する必要条件であり、そしてゼラチンのゲル化において役割を果たす。非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質のアミノ酸残基の、特に１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは３％未満、そして特に１％未満が、ヒドロキシプロリンである。最も好ましくは、タンパク質はヒドロキシプロリンを含まない。非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質のゲル化能が好ましくない適用においては、より高い濃度のヒドロキシプロリン不含タンパク質を用いてもよく、そして溶液は、より粘度が低く、より激しい攪拌を必要とせず、培養細胞に対して、より少ない剪断力しか生じないであろう。ＷＯ  ０２／０７００００  Ａ１に記載されるように、ヒドロキシプロリンを本質的に含まない非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、天然ゼラチンとは対照的に、ＩｇＥを伴う免疫反応を示さない。ヒドロキシプロリンの非存在は、例えば、形質転換されておらず、または機能するプロリル−４−ヒドロキシラーゼ酵素を含まない、ピキア属宿主、例えばピキア・パストリスにおいて発現することによって達成可能である。
【００７９】
ヒドロキシプロリンの量を、任意の標準的アミノ酸分析法、例えばＨＰ  ＡｍｉｎｏＱｕａｎｔシリーズＩＩ、操作者ハンドブック、１９９０、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ＧｍｂＨ、ドイツ連邦共和国、ヴァルドブロン分析部門、ＨＰ部品番号０１０９０−９００２５に記載されるような方法によって決定してもよい。
【００８０】
１つの態様において、本発明の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、三重らせん構造を含まない。
さらなる態様において、本発明は、細胞上の表面受容体をブロッキングするための、そしてこうした受容体をブロッキングするための組成物を作製するための、本発明記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質の使用に関する。例えば、血管新生の阻害において、または心臓線維芽細胞上のインテグリンのブロッキングにおいて、細胞受容体のブロッキングを適用する。
【００８１】
細胞が増殖している、本発明記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質でコーティングされた細胞支持体は、例えば、皮膚移植または創傷治療中に、あるいは骨または軟骨（再）増殖を増進するために、適用可能である。本発明の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質でインプラント材料をコーティングして、細胞を接着させ、そしてしたがって移植を促進することもまた可能である。
【００８２】
１つの態様において、本発明は、本発明記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を含む組成物に関する。該組成物は、薬学的組成物あるいは栄養または栄養補助組成物であってもよい。例えば、本発明の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質、特にマルチマーは、代用血液中の血漿増補液として使用可能である。
【００８３】
本発明のさらに別の態様において、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を含む徐放組成物を提供する。組成物は、したがって、１またはそれより多い薬剤をさらに含んでもよい。徐放配合物は、当該技術分野において作製可能であり、例えば、１またはそれより多い薬剤を取り巻くコーティング層として、あるいは薬剤を封入するかまたは取り込むマトリックスを作製するために、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質またはこれらを含む組成物を用いることによって作製可能である。注射によって（皮下、静脈内または筋内）または経口的にまたは吸入によって、徐放組成物を投与してもよい。手術によって、徐放組成物を移植してもよい。さらに別の適切な投与経路は、外部創傷ドレッシング材を通じるか、または経皮的であってもよい。
【００８４】
徐放組成物は、好ましくは、架橋型、例えば化学的に架橋された非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を含む。本発明はさらに、疼痛、癌療法、心臓血管疾患、心筋修復、血管新生、骨修復および再生、創傷治療、神経刺激／療法および糖尿病の治療において使用するための、本明細書に記載するような徐放組成物の使用を提供する。
【００８５】
本発明の別の態様は、上述のような非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を含む止血組成物を提供する。止血剤として用いるため、本発明の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、好ましくは、当該技術分野に知られる技術を用いて、スポンジ様材料にトランスファーされる。スポンジに、適切な抗出血化合物を含浸させてもよい。さらに、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質スポンジを他のスポンジ様材料と組み合わせてもよいし、または本発明の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質の水溶液の蒸発によってスポンジを作製してもよく、ここで溶液は、創傷への接着、血液吸収能等のようなスポンジ特性を改善する他の構成要素を含んでもよい。本発明の組換え非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質と組み合わせるのに適した化合物は、例えば、キトサンまたは酸化再生セルロース（ＯＲＣ）である。場合によって、本発明の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、スポンジ形成中または形成後に、ある程度、架橋される。
【００８６】
当該技術分野に知られる任意の方法によって、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質の架橋を行ってもよい。１つの例は、水中で、架橋剤を本発明の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質の溶液に添加し、その後、水を蒸発させることである。また、スポンジ材料が形成された後に、架橋材料をスポンジに含浸させ、そしてスポンジが乾燥するまで蒸発させることによって、架橋剤を添加してもよい。適切な架橋剤は、例えば、グルタルアルデヒドまたはカルボジイミドのようなアルデヒドである。
【００８７】
本発明記載のスポンジには、多くの医学的使用がある。スポンジは、高血圧で、非常に広い出血面積の出血を停止するだけでなく、滲出性の出血を停止させるのに用いてもよい。以下の内部または外部手術法は、本発明記載の止血スポンジを用いて成功裡に実行される：全身手術、例えば、実質性臓器（肝臓、腎臓、脾臓等）の手術、心臓血管手術、胸部手術、移植手術、整形外科手術、骨手術、形成手術、耳、鼻および喉の手術、脳外科、泌尿器科および婦人科の手術、ならびに創傷治療におけるような止血。
【００８８】
別の態様は、上記のような非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を含む皮膚充填剤を提供する。本出願において、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質をまず水に溶解し、そして次いで、より親水性でない溶媒、例えばアセトンを添加することによって水溶液から沈殿させる。調製中、例えば２つのリジン残基を架橋するグルタルアルデヒドのような架橋剤が存在してもよい。別の周知の生体適合性架橋剤は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）である。
【００８９】
これらの架橋剤または架橋剤の組み合わせは、ポリペプチド溶液に添加したら自発的に架橋を開始するか、または例えばｐＨを調整した後、または光開始によって、または他の活性化機構によって、架橋を開始する、剤を含んでもよい。
【００９０】
適切な架橋剤は、好ましくは、生物分解中に放出された際、毒性または抗原性効果を誘発しないものである。適切な架橋剤は、例えば、１またはそれより多いグルタルアルデヒド、水溶性カルボジイミド、ビスエポキシ化合物、ホルマリン、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド、グリシジルエーテル、例えばアルキレングリコールジグリシジルエーテルまたはポリグリセロールポリグリシジルエーテルである。非常に小さい粒子が得られうる（１〜５００ミクロンの平均サイズ）。
【００９１】
これらの小さい粒子は、注射可能組織充填剤として、あるいは組織増大または美容手術に適している。こうした適用のため、平均粒子サイズは、好ましくは１００ミクロンより大きいかまたはこれに等しい。１５０〜５００の範囲の平均粒子サイズもまた好ましい。他の適切な平均粒子サイズは、２２０、２５０、３００、３５０、４００および４５０ミクロンである。組織充填剤または増大剤として適した粒子は、粒子注射後に、塊形成が生じないが、自然な印象が得られるように、変形可能でなければならない。
【００９２】
本発明はまた、癌転移阻害において使用するための、そして血小板凝集を防止するための、または組織接着を防止するために手術後に使用するための、上述のような非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質も提供する。
【００９３】
ＥＰ−Ａ−０９２６５４３、ＥＰ−Ａ−１０１４１７６またはＷＯ０１／３４６４６に開示されるような組換え法によって、本発明記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を産生してもよい。また、本発明のタンパク質の産生および精製を可能にするため、本明細書に援用されるＥＰ−Ａ−０９２６５４３およびＥＰ−Ａ−１０１４１７６の実施例も参照されたい。
【００９４】
したがって、適切な微生物によって、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現させることによって、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を産生することも可能である。反復配列の不適切な発現により感受性でないため、細菌よりも真菌および酵母細胞が好ましい。該プロセスは、真菌細胞または酵母細胞で最適に実行可能である。適切には、宿主細胞は、高発現宿主細胞、例えばハンゼヌラ属、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）またはピキア属種である。最も好ましくは、宿主は、発現されたタンパク質を攻撃するプロテアーゼを高レベルには持たない。メチロトローフ酵母細胞、例えばピキア属またはハンゼヌラ属種の使用が好ましい。発現系としてのピキア・パストリスの使用が、ＥＰ−Ａ−０９２６５４３およびＥＰ−Ａ−１０１４１７６に開示される。１つの態様において、微生物は、活性翻訳後プロセシング機構、例えば特にプロリンのヒドロキシル化およびまたリジンのヒドロキシル化は含まない。別の態様において、宿主系は、非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質が非常に有効な方式でヒドロキシル化される、内因性プロリンヒドロキシル化活性を有する。宿主細胞および発現しようとする配列に関する知識と組み合わせて、宿主細胞を本発明記載の組成物において適切な非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質の発現に適したものにする、本明細書記載の必要なパラメータに基づく、既知の産業酵素産生真菌宿主細胞、特に酵母細胞からの適切な宿主細胞の選択は、当業者には可能であろう。
【００９５】
したがって、本発明の１つの側面において、本発明記載の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を産生するための方法であって、
ａ）適切なプロモーターに機能可能であるように連結された、上述のようなタンパク質をコードする核酸配列を含む、発現ベクターを調製し、
ｂ）前記発現ベクターで酵母種を形質転換し、
ｃ）前記酵母種を、適切な発酵条件下で培養して、前記核酸配列の発現を可能にし；
ｄ）場合によって、培地および／または宿主細胞から前記タンパク質を単離する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００９６】
非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質を培地から単離することが好ましい。
好ましくは、前記非天然組換えゼラチンは、少なくとも５ｇ／ｌ上清、好ましくは少なくとも７ｇ／ｌのレベルで、そしてより好ましくは９ｇ／ｌ上清より多い量で産生される。１２、１３、１５または１７あるいは１９ｇ／ｌまたはそれより高い分泌レベルであってさえ、達成されている。好ましくは、本発明の非天然Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａタンパク質は、単離され、そして精製される。
【００９７】
突然変異体宿主株、例えば１またはそれより多いタンパク質分解酵素が欠損している株もまた用いてもよいが、本発明にしたがって、その必要はなく、これは組換えポリペプチドが非常に安定であり、そしてタンパク質分解に耐性であるためである。
【００９８】
本発明は、以下の限定されない実施例において、より詳細に説明されるであろう。
配列
配列番号１：  ＩＣＰモノマーの配列。
【００９９】
配列番号２：  ＩＣＰ二量体の配列。
配列番号３：  ＩＣＰ四量体の配列。
配列番号４：  ＩＣＰの配列。
【０１００】
配列番号５：  ＩＣＰ２の配列。
配列番号６：  ＩＣＰ３の配列。
配列番号７：  ＩＣＰ４の配列。
【０１０１】
配列番号８：  プラスミドｐＦＦＺαＡの配列。
配列番号９：  ＩＣＰ３変異体１の配列。
配列番号１０：  ＩＣＰ３変異体２の配列。
【０１０２】
配列番号１１：  ＩＣＰ３変異体３の配列。
配列番号１２：  ＩＣＰ３変異体４の配列。
配列番号１３：  ＩＣＰ３変異体６の配列。
【０１０３】
配列番号１４：  ＩＣＰ３変異体７の配列。
配列番号１５：  ＩＣＰ３変異体８の配列。
【実施例】
【０１０４】
用いた株および遺伝子ベクター
本実施例において、ピキア・パストリス株ＣＢＳ７４３５を宿主株として用いた。プラスミドｐＦＦＺα  Ａを、合成ゼラチンをコードする遺伝子のベクターとして用いた。該ベクターは、以下の要素を含有する：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプラスミド維持のための複製起点、大腸菌またはピキア・パストリスいずれかにおいて使用可能なゼオシン耐性マーカー、およびＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ１ターミネーター、ならびに関心対象の遺伝子のメタノール誘導性発現および分泌を制御するための、サッカロミセス・セレビシエ由来の酵母フェロモン接合因子アルファのプレプロ配列。プラスミドのＤＮＡ配列を配列番号８として開示する。
【０１０５】
ゼラチン様タンパク質産生のための遺伝子構築物の調製
細胞結合増進のため、ＩＣＰ３と称される合成ゼラチンを設計した。ＩＣＰ３の配列を配列番号６として開示する。該配列には、細胞結合配列ＲＧＤがリッチである。
【０１０６】
合成ゼラチンＩＣＰ３のためのコドン最適化遺伝子を合成した。この遺伝子を、ＸｈｏＩ−ＸｂａＩ断片として、同じ酵素で消化したｐＦＦＺα  Ａ中にサブクローニングした。これによって、プラスミドｐＦＦＺ−ＩＣＰ３が生じた。このプラスミドは、ＭＦα−ＩＣＰ３をコードし、この中で、ＩＣＰ３ゼラチン配列は、接合因子アルファのプレプロ配列に融合している。このプラスミドを含有する宿主細胞を用いて、ＭＦα−ＩＣＰ３を産生し、そして分泌させた。ピキア・パストリスにおける異種タンパク質の産生および分泌、ならびにその成熟（分泌シグナルの除去）の原理は、当該技術分野に周知である。
【０１０７】
宿主細胞の形質転換
プラスミドｐＦＦＺ−ＩＣＰ３を制限酵素ＰｍｅＩで直線化して、宿主細胞のＡＯＸ１プロモーターにおける組込みを促進した。エレクトロポレーションによって、直線化プラスミドを宿主細胞に導入した。０．５ｍｇ／ｍｌの濃度でゼオシンを補充したＹＰＤ寒天プレート（水中の１０ｇ／ｌ酵母エキス、２０ｇ／ｌペプトン、２０ｇ／ｌデキストロースおよび２０ｇ／ｌ寒天）上に形質転換混合物をプレーティングすることによって、形質転換体を選択した。
【０１０８】
ゼラチン様タンパク質の組換え産生
以下のように、振盪フラスコ培養において、いくつかの形質転換体によるＩＣＰ３産生を分析した。エルレンマイヤー（１００ｍＬ）に１０ｍＬのＹＰＤ培地（水中の１０ｇ／ｌ酵母エキス、２０ｇ／ｌペプトンおよび２０ｇ／ｌデキストロース）を満たした。これらの培養に、形質転換後に見られるコロニー由来の細胞を接種した。培養を一晩、飽和に到達させた。翌日、遠心分離（３０００ｘｇ、１０分間）によって細胞を採取し、そして消費された培地をデカントした。細胞を緩衝最小メタノール培地（１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０、１．３４％酵母窒素基剤、４ｘ１０−５％ビオチン、０．５％メタノール）中に再懸濁し、そしてこの培地上で一晩増殖させた。次の２日間、各培養に最終濃度１％までメタノールを添加した。５日目、遠心分離によって細胞を除去し、そしてＭｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩ電気泳動系（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって、上清を分析した。いくつかの代表的な形質転換体によるＩＣＰ３産生を図１Ａに示す。比較のため、同じ条件下で増殖させる宿主株の２つの培養の上清もまた示す。図１から、ＩＣＰ３産物にはいくつかのより小さいタンパク質分解産物が付随すると推測されうる。
【０１０９】
分解産物の性質決定
切断部位を同定するため、質量分析を行うことを決定した。ＩＣＰ３は、非常に反復性の配列を有するため、質量分析をＩＣＰ３に対してでなく、ＩＣＰに対して行った。ＩＣＰの配列を配列番号４として開示する。ＩＣＰを上述の方法で産生し、そして陰イオン交換クロマトグラフィーによって部分的に精製した。分析液体クロマトグラフィーカップリング質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を用いて、損なわれていないタンパク質ＩＣＰ３およびその分解産物の質量を決定した。ＩＣＰの理論的質量は１７６１７ダルトンである。
【０１１０】
得られた分子質量を表１に列挙する。
【０１１１】
【表１】
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【０１１２】
観察質量を、ＩＣＰから理論的に得られうる質量と比較した。この分析によって、配列ＧＬＡＧおよびＧＡＡＧがタンパク質分解的切断に特に感受性であることが示唆された。さらに、アルギニン残基のＣ末端側のアミノ酸に応じて、タンパク質分解はしばしば、配列ＧＥＲの後で起こる。タンパク質分解はまた、配列ＰＧＫＥＧＶ中のリジン残基の後で起こることも見出された。さらに、ＬＣ−ＭＳデータによって、切断が特定のアスパラギン酸残基の後で起こることが示唆される。
【０１１３】
タンパク質分解に耐性である変異体の開発
このタンパク質分解的分解により耐性である組換えゼラチン様タンパク質を開発し、そしてどの配列がタンパク質分解活性によってターゲットとされるのかを決定するため、一連のＩＣＰ３変異体（配列番号９〜１５）を設計し、そして合成した。これらの変異体を産生し、そして上述のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１１４】
変異体１、２、３および４（配列番号９〜１２）は、ＲＧＤおよびＧＥＲ配列周囲に突然変異を含有する。しかし、これらの変異体は、元来のＩＣＰ３に比較した際、分解バンドの数の有意な減少を示さなかった。
【０１１５】
ＩＣＰ３変異体６（配列番号１３）は、すべてのＧＬＡトリプレットが欠失していることを除き、ＩＣＰ３と同一である。ＩＣＰ３変異体８（配列番号１５）は、すべてのＧＡＡトリプレットがＧＡＰトリプレットで置換されていることを除き、ＩＣＰ３変異体６と同一である。驚くべきことに、ＧＬＡトリプレットの除去およびＧＡＰトリプレットによるＧＡＡトリプレットの置換は、図１Ｂに見られうるように、元来のＩＣＰ３タンパク質に関して観察された分解バンドを消滅させた。ＩＣＰ３変異体７（配列番号１４）は、アスパラギン酸残基の数を限定するために欠失されているＲＧＤトリプレットを除き、ＩＣＰ３と同一である。しかし、この変異体は、分解の望ましくない増加を示し、これはおそらくこの変異体の全体の疎水性が増加したことによって引き起こされた。
【図１】
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【国際調査報告】
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