(57)【要約】本発明は、エンドスタチンの変異体を含む新規な抗腫瘍医薬を開示する。変異体は、エンドスタチンのＡＴＰ結合部位に変異を含み、ＡＴＰアーゼ活性が低下し、抗血管新生活性が増大している。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドスタチン又はその多様体、変異体若しくはＰＥＧ修飾産物の生物活性を検出する方法であって、前記エンドスタチン、多様体、変異体又はＰＥＧ修飾産物のＡＴＰアーゼ活性を検出するステップを含む方法。
【請求項２】
前記エンドスタチンが、配列番号１又は配列番号２で示される配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エンドスタチン多様体が、配列番号３又は配列番号４で示される配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記エンドスタチン変異体が、配列番号６〜１１、１５〜２７及び３０〜３１からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記エンドスタチン多様体変異体が、配列番号１３又は配列番号１４で示される配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
エンドスタチン、多様体又は変異体の前記ＰＥＧ修飾産物が、エンドスタチン、多様体又は変異体のＮ末端でのモノメトキシポリ（エチレングリコール）による単一の及び部位特異的な修飾によって得られる産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記モノメトキシポリ（エチレングリコール）が、モノメトキシポリ（エチレングリコール）−アルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
マラカイトグリーンリン酸塩アッセイ又はＡＴＰ  ＢｉｏＬｕｍｉｎｉｚｅｒアッセイによってエンドスタチンのＡＴＰアーゼ活性を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
エンドスタチン又はその多様体のＡＴＰアーゼ活性を低下させることを含む、エンドスタチンの生物活性を向上させる方法。
【請求項１０】
遺伝子工学によって前記エンドスタチン又はその多様体のＡＴＰ結合モチーフＧＸＸＧＸＸＫに変異を導入し、それによってＡＴＰアーゼ活性が低下したエンドスタチン変異体を得ることを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記エンドスタチン変異体の内皮細胞移動阻害活性が増強されている、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記エンドスタチン変異体の腫瘍阻害活性が増強されている、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記エンドスタチン変異体が、配列番号６〜１１、１３、１４、１５〜２７及び３０〜３１からなる群から選択される配列を含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
抗血管新生活性が増加し、ＡＴＰ結合モチーフに変異を含み、対応する野生型エンドスタチン又はその多様体と比較してＡＴＰアーゼ活性が低下した、エンドスタチン又はその多様体の変異体。
【請求項１５】
対応する前記野生型エンドスタチン又はその多様体と比較して、ＡＴＰアーゼ活性が少なくとも３０％減少している、請求項１４に記載の変異体。
【請求項１６】
対応する前記野生型エンドスタチン又はその多様体と比較して、ＡＴＰアーゼ活性が少なくとも５０％減少している、請求項１５に記載の変異体。
【請求項１７】
対応する前記野生型エンドスタチン又はその多様体と比較して、ＡＴＰアーゼ活性が少なくとも７０％減少している、請求項１６に記載の変異体。
【請求項１８】
対応する前記野生型エンドスタチン又はその多様体と比較して、ＡＴＰアーゼ活性が少なくとも９０％減少している、請求項１７に記載の変異体。
【請求項１９】
ＡＴＰアーゼ活性を持たない、請求項１８に記載の変異体。
【請求項２０】
対応する前記野生型エンドスタチン又はその多様体と比較して、前記ＡＴＰ結合モチーフに変異を含む、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項２１】
配列番号１のアミノ酸残基８９〜９５からなるＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓモチーフに対応する配列中に変異を含み、前記変異が１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失又は付加であり、前記変異が、前記変異体のＡＴＰアーゼ活性の減少又は消失をもたらす、請求項２０に記載の変異体。
【請求項２２】
配列番号１のアミノ酸残基８９〜９５からなる前記Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓモチーフに対応する前記配列の部分的又は完全な欠失を含む、請求項２１に記載の変異体。
【請求項２３】
配列番号１のアミノ酸残基８９、９２及び９５に対応する前記配列中に１つ又はいくつかのアミノ酸残基の置換又は欠失を含む、請求項２１に記載の変異体。
【請求項２４】
（ａ）配列番号１のアミノ酸残基８９に対応するＧｌｙ残基が、非荷電若しくは芳香族アミノ酸で置換された又は欠失した、又は
（ｂ）配列番号１のアミノ酸残基９２に対応するＧｌｙ残基が、非荷電アミノ酸で置換された又は欠失した、又は
（ｃ）配列番号１のアミノ酸残基９５に対応するＬｙｓ残基が、正荷電若しくは非荷電アミノ酸で置換された又は欠失した、又は
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の任意の組合せである、請求項２３に記載の変異体。
【請求項２５】
（ａ）配列番号１のアミノ酸残基８９に対応するＧｌｙ残基が、Ａｌａ若しくはＰｒｏのいずれかで置換された又は欠失した、又は
（ｂ）配列番号１のアミノ酸残基９２に対応するＧｌｙ残基が、Ａｌａで置換された又は欠失した、又は
（ｃ）配列番号１のアミノ酸残基９５に対応するＬｙｓ残基が、Ａｒｇ若しくはＧｌｎのいずれかで置換された又は欠失した、又は
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の任意の組合せである、請求項２４に記載の変異体。
【請求項２６】
配列番号６〜１１、１３、１４、１５〜２７及び３０〜３１からなる群から選択される配列を含む、請求項２５に記載の変異体。
【請求項２７】
配列番号６、配列番号１０、配列番号２７及び配列番号３０からなる群から選択される配列を含む、請求項２６に記載の変異体。
【請求項２８】
ヒトエンドスタチン又はその多様体の変異体である、請求項１４〜２７のいずれか一項に記載のエンドスタチン又はその多様体の変異体。
【請求項２９】
請求項１４〜２８のいずれか一項に記載の変異体を含む医薬組成物。
【請求項３０】
前記変異体が、ＰＥＧ分子に共有結合されている、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記ＰＥＧの分子量が、５〜４０ｋＤである、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記ＰＥＧが、前記変異体のＮ末端でαアミノ基に共有結合されている、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記ＰＥＧが、モノメトキシポリ（エチレングリコール）である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記モノメトキシポリ（エチレングリコール）が、モノメトキシポリ（エチレングリコール）−アルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）である、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
腫瘍を有する対象に請求項１４〜２８のいずれか一項に記載の変異体又は請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、腫瘍治療法。
【請求項３６】
血管新生関連疾患を治療するための医薬の調製における、請求項１４〜２８のいずれか一項に記載の変異体の使用。
【請求項３７】
前記血管新生関連疾患が腫瘍である、請求項３６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な抗腫瘍治療薬に関する。特に、本発明は、エンドスタチンの変異体を提供し、その変異体はＡＴＰアーゼ活性が低下し、血管新生阻害活性が増強されている。本発明は、腫瘍を含む血管新生関連疾患の治療におけるその変異体の使用も提供する。
【背景技術】
【０００２】
１９９７年に、ハーバード大学のＦｏｌｋｍａｎ教授は、内在性血管新生阻害剤−エンドスタチン（ＥＳ）を発見した。エンドスタチンは、コラーゲンＸＶＩＩＩのＣ末端の２０ｋＤａ切断フラグメントであり、血管内皮細胞の増殖、移動及びｉｎ  ｖｉｖｏでの血管形成に対する阻害活性を有していた。組換えエンドスタチンは、マウスにおいて様々な種類の腫瘍の成長及び転移を阻害することができ、薬剤耐性を誘導することなく腫瘍を治療することもできる（Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｊ．ら  Ｃｅｌｌ  １９９７；８８：２７７〜２８５頁；Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｊ．ら  Ｎａｔｕｒｅ  １９９７；３９０：４０４〜４０７頁）。
【０００３】
ＥＳの阻害能力の基礎をなす機序は、腫瘍組織において血管新生を抑制し、栄養分及び酸素の供給を遮断することである。中国において、大腸菌に発現させた組換えヒトエンドスタチン（Ｅｎｄｕ）は抗腫瘍治療薬になり、その抗腫瘍効果は、主に非小細胞性肺癌に重点を置いて臨床試験において広く試験されてきた。ＥＳの多様体（ｖａｒｉａｎｔ）であるＥｎｄｕは、ＥＳのＮ末端に追加のアミノ酸配列（ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ）を有し、酵母に発現させた野生型ヒトＥＳと比較して熱力学的安定性及び生物活性が優れている（Ｆｕ  Ｙ．ら  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１０；４９：６４２０〜６４２９頁）。他の報告では、ＥＳのＮ末端の２７アミノ酸は、完全なＥＳと比較して、血管新生に対して類似の阻害活性を有することが示された（Ｒｏｂｅｒｔ  ＴｊｉｎＴｈａｍＳｊｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５；６５（９）：３６５６〜６３頁）。それ故、多くの研究者が、Ｎ末端２７アミノ酸の活性に基づいて医薬を設計している。
【０００４】
更に、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＥＳの半減期を延長するために、単一部位又は複数部位のＰＥＧ修飾及び抗体Ｆｃフラグメントの結合を含む多くの分子修飾並びに薬剤設計が、ＥＳに対して作製された（Ｔｏｎｇ−Ｙｏｕｎｇ  Ｌｅｅら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８；１４（５）：１４８７〜１４９３頁）。ＥＳの複数部位のＰＥＧ修飾は、通常リシン側鎖のεアミノに施される。この修飾は、ＥＳの半減期を延長できるが、その生物活性は明らかに低下する（Ｇｕｏｙｉｎｇ  Ｍｏｕ，山東大学の学位論文、ＣＮＫＩ、２００５）。この修飾技術と比較して、Ｎ末端における単一部位のＰＥＧ修飾は、ＥＳの安定性だけでなく生物活性も増強できる（ＣＮ１００４７５２７０Ｃ）。関連産物は、臨床試験に入っている。
【０００５】
ＥＳの発見以来、その腫瘍阻害活性に重点を置いた異なる研究室の研究計画から、異なる結果が得られた。Ｆｏｌｋｍａｎ教授の研究室は、ＥＳを使用してマウスの腫瘍を完全に治療した（Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｊ．ら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ、３９０：４０４〜４０７頁）、しかし、他の多くの研究室はこの結果を再現できなかった（Ｎｅｗｓ  Ｆｏｃｕｓ、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５：２１９８〜２１９９頁）。一方、原核生物発現系で生産されるＥＳは、再折り畳みが非常に困難な極性部を含有するので、多くの研究者は、溶解可能なＥＳを生産するために酵母の使用に方向転換したが、これは理想的な結果をもたらさなかった。その後の研究により、酵母発現ＥＳは、Ｎ末端が切断されていることが観察され、切断型は、Ｎ−１、Ｎ−３、及びＮ−４と同定された。Ｎ末端の完全性は、ＥＳの安定性及び生物活性に非常に重要であり、このことが、酵母発現ＥＳから得られた混乱させるような結果を説明している（Ｆｕ  Ｙ．ら  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１０；４９：６４２０〜６４２９頁）。
【０００６】
ＥＳの一次生物学的機能は、内皮細胞の増殖、移動及び管形成を阻害することを含む内皮細胞の活性を阻害すること並びに内皮細胞のアポトーシスを誘導することなどである。分子機能機序の研究により、原形質膜の表面に位置しているヌクレオリンがＥＳの機能的受容体であり、ＥＳのエンドサイトーシス及びその下流のシグナル経路を媒介していることが示される（Ｓｈｉ  ＨＢら、Ｂｌｏｏｄ、２００７、１１０：２８９９〜２９０６頁）。他の報告は、ヌクレオリンが、増殖性の高い乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５の原形質膜上でも発現し、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５においてそのリガンドタンパク質のエンドサイトーシスを媒介できることを示している（Ｓｖｅｎ  Ｃｈｒｉｄｔｉａｎら、ＪＢＣ、２００３、１６３（４）：８７１〜８７８頁）。他の研究では、インテグリン、トロポミオシン、グリピカン、ラミニン及びマトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ２）が全てＥＳの潜在的受容体であると観察されている（Ｓｕｄｈａｋａｒ，Ａ．ら、２００３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：４７６６〜４７７１頁；Ｊａｖａｈｅｒｉａｎ，Ｋ．ら、２００２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４５２１１〜４５２１８頁；Ｋａｒｕｍａｎｃｈｉ，Ｓ．ら、２００１、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、７：８１１〜８２２頁；Ｌｅｅ，Ｓ．Ｊ．ら、２００２、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、５１９：１４７〜１５２頁；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｎ．Ｊ．ら、２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：２５１９０〜２５１９６頁；Ｋｉｍ，Ｙ．Ｍ．ら、２００２、Ｊ. Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２７８７２〜２７８７９頁）。更に、ナイスタチン処理は、内皮細胞におけるＥＳのエンドサイトーシス及び吸収を劇的に増加させ、その結果、内皮細胞移動及び動物の腫瘍成長を阻害するＥＳの生物活性を増強した（Ｃｈｅｎ  Ｙら、２０１１、Ｂｌｏｏｄ、１１７：６３９２〜６４０３頁）。
【０００７】
ＥＳの生物活性を検出する典型的な方法は、内皮細胞の移動、増殖及び管形成の阻害を含む内皮細胞を阻害する活性並びに他の実験に基づいている。一般的に使用される内皮細胞は、主にヒト血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）及びヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を含む。しかし、これらの方法は、高品質な細胞培養及び複雑な技術を必要とし、非常に主観的であり、正確性及び再現性が低い（Ｌｉ  ＹＨら、２０１１、Ｃｈｉｎ  Ｊ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｒｃｈ、第２４巻  ３号：３２０〜３２３頁）。従って、ＥＳ及びその変異体（ｍｕｔａｎｔ）の生物活性を評価する新規な方法を探究し、開発することは、ＥＳ薬の発見及び品質管理において非常に重要なものである。
【０００８】
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）は、多くの生理的及び生物学的反応に関与している、生物にとって重要なエネルギー供給であり、正常な生体活動の維持に重要な役割を果たす。ＡＴＰは、多くの細胞代謝経路で生産され得る：最も典型的な経路において、ＡＴＰは、通常条件下でミトコンドリアにおける酸化的リン酸化によりアデノシン三リン酸合成酵素によって生産される、又は植物における光合成により葉緑体で生産される。ＡＴＰ合成の供給源は、主にグルコース及び脂肪酸である。正常な生理的条件下で、細胞及び血液中のＡＴＰのモル濃度は、それぞれ１〜１０ｍＭ及び１００μＭである。
【０００９】
ＡＴＰアーゼ（アデノシン三リン酸分解酵素とも呼ばれる）は、ＡＴＰを触媒してＡＤＰとＰｉを生産し、エネルギーを放出する酵素である。殆どの条件下で、この反応において生産されるエネルギーは、エネルギーを必要とする別の反応に移すことができ、このプロセスは、生命体の全ての公知の形態に広く利用されている。加えて、ＧＴＰに含有される高エネルギー結合も、タンパク質合成のためのエネルギーを生成することができる。Ｈｓｐ９０、ミオシン及び他のタンパク質は全て、生物活性の実現をＡＴＰに依存しており、従って、これら全てのタンパク質はＡＴＰアーゼ活性を有する。様々な種類のＡＴＰアーゼは、配列及び三次構造の点で異なるが、通常、これらのタンパク質の全てがＡＴＰ結合モチーフとしてＰ−ループ構造を有する（Ａｎｄｒｅａ  Ｔ．Ｄｅｙｒｕｐら、１９９８、ＪＢＣ、２７３（１６）：９４５０〜９４５６）。このＰ−ループ構造は、以下の標準的な配列を示す：ＧＸＸＨＸＸＫ（Ｄｒｉｓｃｏｌｌ，Ｗ．Ｊ．ら、１９９５  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９２：１２３２８〜１２３３２頁）、（Ｇ／Ａ）ＸＸＸＸＧＫ（Ｔ／Ｓ）（Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．ら、１９８２、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１：９４５〜９５１頁）、ＧＸＸＸＸＧＫＳ（Ｓａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ，Ｃ．ら、１９９２、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１：１１６８４〜１１６８８頁）及びＧＸＸＧＸＧＫＳ（Ｔｈｏｍａｓ，Ｐ．Ｍ．ら、１９９５、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、５９：５１０〜５１８頁）。Ｘを除く残りのアミノ酸残基は、比較的保存されている。一般に、ＧＴＰも、これらＡＴＰアーゼのＡＴＰ結合モチーフに結合することができ、従って多くの場合、ＡＴＰとＧＴＰは代替物になり得る。
【００１０】
癌細胞及び内皮細胞を含む高増殖性細胞は異常に強い代謝を有しており、その代謝経路は正常な成熟細胞とは大きく異なる。一方で、癌細胞及び増殖性細胞は大量のＡＴＰを要求し；他方で、これら細胞においてＡＴＰ生産にグルコースを使用する有効性は非常に低い。これは、大部分の癌細胞及び高増殖性細胞が好気性解糖（Ｗａｒｂｕｒｇ効果）によってＡＴＰを生産するからである。この様式は、ＡＴＰを生産するには有効性が低いが、このプロセスで合成される数多くの媒介物は、細胞増殖にとって優れた構成単位として使用され得る（Ｍａｔｔｈｅｗ  Ｇ．ら、２００９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２４：１０２９〜１０３３頁）。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、ＥＳの新規な活性、すなわちＡＴＰアーゼ活性について開示し、ＥＳの新規な使用及びこの新規な活性に基づくＥＳ薬の設計について開示する。
【００１２】
本発明は、ＥＳはＡＴＰアーゼ活性が強力であるという発見に基づいている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験は、ＥＳのＡＴＰアーゼ活性が、内皮細胞溶解物に由来するＡＴＰの変性において大きな差無しに、ＡＴＰアーゼ活性が天然に高いことが公知であるミオシン（ブタ心臓抽出物）よりわずかに低いにすぎないことを示した。
【００１３】
本発明は、ＥＳのＡＴＰアーゼ活性に基づいてＥＳの生物活性を検出し、評価する新規な方法を提供する。本方法は、生化学的アッセイによってＥＳの細胞外ＡＴＰアーゼ活性を検出することにより、組換え的に生産されたＥＳの立体構造及び生物活性を決定することを可能にする。現在の細胞学的検出法と比較して、酵素活性に基づくこの新規な手法は、より高感度で正確であり、操作が容易であり、再現性が信頼でき、従って、ＥＳ及びその多様体の生物活性を検出し、品質を評価するために広く使用され得る。
【００１４】
従って、本発明は、エンドスタチン又はその多様体、変異体若しくはＰＥＧ修飾産物のＡＴＰアーゼ活性を検出すること含む、エンドスタチン又はその多様体、変異体若しくはＰＥＧ修飾産物の生物活性を検出する方法を提供する。例えば、マラカイトグリーンリン酸塩アッセイ及びＡＴＰ生物発光アッセイを使用して、エンドスタチン又はその多様体、変異体若しくはＰＥＧ修飾産物のＡＴＰアーゼ活性を検出し、それによって組換え的に生産されたＥＳ産物の立体構造及び生物活性を決定できる。
【００１５】
ＥＳは、ヌクレオリン媒介エンドサイトーシスよって内皮細胞に入ることができることが示された。本発明の１例において、ＥＳがＡＴＰアーゼ活性を細胞内で実行できるか検出するために、ＥＳのＡＴＰアーゼ活性を内皮細胞溶解物において検出した。その結果は、ＥＳが内皮細胞溶解物においてＡＴＰアーゼ活性を実行できることを示す。
【００１６】
本発明者らは、野生型ＥＳ配列（配列番号１）の８９〜９５番目のアミノ酸残基Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓが、典型的なＡＴＰ結合モチーフの保存されたＧＸＸＧＸＸＫ配列を含有することを見出した（Ｄｒｉｓｃｏｌｌ、Ｗ．Ｊ．ら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９２：１２３２８〜１２３３２頁）。３個のアミノ酸（２個のＧ及び１個のＫ）は、様々な種において高度に保存されている。ＥＳのＡＴＰアーゼ活性は、ＡＴＰ結合モチーフにおける点突然変異によって変化させることができる。ＥＳの結晶構造が公知になっているにもかかわらず、ＥＳとＡＴＰ又はＧＴＰとの複合体の結晶構造に関する報告は全くない。共結晶化技術を使用して、典型的な結合モチーフ配列の他にＡＴＰ又はＧＴＰと相互作用可能なＥＳタンパク質中の他のアミノ酸残基を同定し、そのようなアミノ酸残基の欠失又は置換及び他の修飾によって、ＥＳのＡＴＰアーゼ活性及び内皮活性に対する阻害効果を変化させることが将来的に可能になる。
【００１７】
本発明者らは、公知のＥＳ結晶構造に基づいて、三次構造においてＡＴＰ結合モチーフがＥＳのＣ末端近くにあり、三次構造においてＮ末端もＣ末端の非常に近くにあるということを発見した。その結果、１例において、本発明者らは異なるＮ末端配列を有するＥＳ多様体を比較し、Ｎ末端から４アミノ酸を欠失している（Ｎ−４）ＥＳ多様体は、完全長ＥＳよりＡＴＰアーゼ活性が著しく高いことを発見した。しかし、Ｎ−４はＥＳより細胞学的活性及び腫瘍阻害活性が著しく低いことは、以前に報告された（Ｆｕ  Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１０；４９：６４２０〜６４２９頁）。
【００１８】
マウスＥＳ（ＭＭ）が、マウス腫瘍を完全に治療できたことも報告された（Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９７；３９０：４０４〜４０７頁）。しかし、アミノ酸配列整列分析によって、マウスＥＳがヒトＥＳの典型的なＡＴＰ結合モチーフを含有しないことが判明した（図１）。その結果、ＭＭのＡＴＰアーゼ活性を検出し、その活性がヒトＥＳより著しく低く、ヒトＥＳのわずか約１／５であることを発見した。しかし、ＭＭの腫瘍阻害効果は、ヒトＥＳより高かった。
【００１９】
従って、ＥＳのＡＴＰアーゼ活性と細胞学的活性との関係を更に同定するために、ＡＴＰ結合モチーフのいくつかのアミノ酸に点突然変異を導入した。これらの変異がＡＴＰアーゼ活性だけでなく、内皮細胞移動に対するＥＳの阻害効果も変化させることを観察した。更に、いくつかのＥＳの変異体はＡＴＰアーゼ活性が低下したが、内皮細胞移動に対する阻害効果は著しく増強された。いくつかの場合を除いて、ＡＴＰアーゼ活性は、細胞学的活性と負の相関がある。
【００２０】
本発明のいくつかの例において、配列番号６〜１１、１３、１４、１５〜２７及び、３０〜３１に示される配列を含むＥＳ変異体は全てＡＴＰアーゼ活性が低下したが、内皮細胞移動については同等又は著しく高い阻害効果を示した。ＥＳが脈管阻害タンパク質であり、その重要な機能は内皮細胞活性を阻害することによって血管新生を阻害することであり、従って、血管新生関連疾患（例えば、腫瘍、黄斑変性、肥満及び糖尿病）を治療するために使用できるということを考慮すると、ＥＳのこれら変異体は、より強力な活性を作用させて血管新生関連疾患（例えば、腫瘍）を阻害できると考えられる。
【００２１】
加えて、ＥＳの抗血管新生活性とＡＴＰアーゼ活性との相関に基づいて、分子クローニング技術よってＡＴＰアーゼ活性を更に変化させる（低下させる）ことによりＥＳ変異体を設計して、腫瘍及び血管新生関連疾患を阻害するのにより有効なＥＳ医薬を得られる可能性がある。
【００２２】
従って、本発明は、エンドスタチン及びその多様体のＡＴＰアーゼ活性を低下させることを含む、エンドスタチンの生物活性を増加させる方法も提供する。特に、遺伝子工学手法を採用して、エンドスタチン又はその多様体のＡＴＰ結合モチーフＧＸＸＧＸＸＫに変異を導入し、それによってＡＴＰアーゼ活性は低下するが、生物活性は増加する（例えば、内皮細胞移動及び腫瘍成長に対する阻害効果は増加する）エンドスタチン変異体を得ることができる。
【００２３】
本発明は、ＡＴＰ結合モチーフにおいて変異され、野生型エンドスタチン又はその多様体と比較して、抗血管新生活性が増強され、ＡＴＰアーゼ活性が減少したエンドスタチン変異体も提供する。
【００２４】
変異体のＡＴＰアーゼ活性は、野生型エンドスタチン又はその多様体と比較して、少なくとも約３０％、例えば少なくとも約５０％、少なくとも約７０％又は少なくとも約９０％低下することが好ましい。例えば、変異体のＡＴＰアーゼ活性は、野生型エンドスタチン又はその多様体と比較して、わずかに約６０〜７０％、例えば約５０〜６０％、４０〜５０％、３０〜４０％、２０〜３０％、１０〜２０％若しくは１０％以下又は更に低い。一実施形態において、変異体は、ＡＴＰアーゼ活性を有さない。
【００２５】
いくつかの実施形態において、対応する野生型エンドスタチン又はその多様体と比較して、変異体はＡＴＰ結合モチーフに変異を含む。例えば、変異体は、配列番号１の８９〜９５番目のアミノ酸残基からなるＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓモチーフに対応する配列中に変異を含み、変異は、１つ又はいくつかのアミノ酸の交換、欠失若しくは付加又はその組合せからなる群から選択され、その変異は、変異体においてＡＴＰアーゼ活性の減少又は消失をもたらす。
【００２６】
いくつかの実施形態において、変異体は、配列番号１の８９〜９５番目のアミノ酸残基からなるＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓモチーフに対応する配列の部分的又は完全な欠失を含む。
【００２７】
本発明のエンドスタチン変異体は、以下の変異を含むことが好ましい：（ａ）配列番号１のアミノ酸残基８９に対応するＧｌｙ残基が、非荷電若しくは芳香族アミノ酸で置換される又は欠失する；又は（ｂ）配列番号１のアミノ酸残基９２に対応するＧｌｙ残基が、非荷電アミノ酸で置換される又は欠失する；又は（ｃ）配列番号１のアミノ酸残基９５に対応するＬｙｓ残基が、正荷電若しくは非荷電アミノ酸で置換される又は欠失する；又は（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の任意の組合せである。
【００２８】
本発明のエンドスタチン変異体は、以下の変異を含むことがより好ましい：（ａ）配列番号１のアミノ酸残基８９に対応するＧｌｙ残基が、Ａｌａ若しくはＰｒｏのいずれかで置換される又は欠失する；又は（ｂ）配列番号１のアミノ酸残基９２に対応するＧｌｙ残基が、Ａｌａで置換される又は欠失する；又は（ｃ）配列番号１のアミノ酸残基９５に対応するＬｙｓ残基が、Ａｒｇ若しくはＧｌｎのいずれかで置換される又は欠失する；又は（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の任意の組合せである。
【００２９】
当然ながら、変異体タンパク質の荷電分布及び立体構造に影響を及ぼさないという条件のもとに、上記の交換は、荷電アミノ酸を用いて行うこともできる。
【００３０】
特定の実施形態において、本発明のエンドスタチン変異体は、配列番号６〜１１、１３、１４、１５〜２７及び３０〜３１からなる群から選択される配列を含む。本発明のエンドスタチン変異体は、配列番号６、配列番号１０、配列番号２７及び配列番号３０からなる群から選択される配列を含むことが好ましい。
【００３１】
本発明のエンドスタチン変異体は、ヒトエンドスタチンの変異体であることが好ましい。
【００３２】
本発明は、本発明の上述のエンドスタチン変異体を含む医薬組成物も提供する。本発明の医薬組成物において、エンドスタチン変異体をＰＥＧ分子に共有結合させることもできる。ＰＥＧの分子量は、５〜４０ＫＤなど、例えば、５〜２０ＫＤ又は２０〜４０ＫＤである。ＰＥＧの分子量は、２０ＫＤ、例えば２０ｋＤモノメトキシポリ（エチレングリコール）又はモノメトキシポリ（エチレングリコール）−アルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）であることが好ましい。ＰＥＧ分子は、エンドスタチンのＮ末端αアミノ基に共有結合されることが好ましい。
【００３３】
本発明は、腫瘍患者に上述のエンドスタチン変異体又は本発明の医薬組成物を投与することを含む、腫瘍を治療する方法も提供する。
【００３４】
本発明は、血管新生関連疾患の治療のための医薬の調製における、上述のエンドスタチン変異体の使用にも関する。上述の血管新生関連疾患は、腫瘍であることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ヒト及びマウスＥＳの配列整列を示す図である。
【図２】ＥＳ、ＥＳ変異体、ＥＳ多様体及びそれらのｍＰＥＧ修飾産物の調製を示す図である。    （Ａ）遺伝子操作細菌の発現。    （Ｂ）封入体タンパク質の精製。    （Ｃ）再折り畳みタンパク質の精製。    （Ｄ）修飾タンパク質の精製。
【図３】ＥＳ、ＥＳ多様体及びそれらのｍＰＥＧ修飾産物のＡＴＰアーゼ活性を示す図である。
【図４】内皮細胞溶解物中のＥＳ、ＥＳ多様体及びそれらのｍＰＥＧ修飾産物のＡＴＰアーゼ活性を示す図である。    （Ａ）内皮細胞溶解物中のＥＳ及びｍＰＥＧ−ＥＳは、ＡＴＰを生物分解することができることを示す図である。    （Ｂ）内皮細胞溶解物中のＥＳ、Ｅｎｄｕ及びそれらのｍＰＥＧ修飾産物は、ＡＴＰを生物分解することができることを示す図である。
【図５】ＡＴＰ酵素活性アッセイにより、ＥＳ、ＥＳ多様体及びそれらのｍＰＥＧ修飾産物の生物活性の迅速で正確な検出が可能になることを示す図である。    （Ａ）ＡＴＰ酵素活性アッセイに基づいてＥＳ及びＥｎｄｕの生物活性を検出するための標準曲線である。    （Ｂ）ＡＴＰ酵素活性アッセイに基づいてｍＰＥＧ−ＥＳ及びｍＰＥＧ−Ｅｎｄｕの生物活性を検出するための標準曲線である。
【図６】ＥＳ変異体のＡＴＰアーゼ活性の比較を示す図である。
【図７】内皮細胞溶解物におけるＡＴＰの生物分解に対するＥＳ変異体の活性の比較を示す図である。
【図８】内皮細胞移動阻害に対するＥＳ変異体の活性の比較を示す図である。
【図９】Ｅｎｄｕ変異体のＡＴＰアーゼ活性及び内皮細胞移動阻害活性の比較を示す図である。    （Ａ）Ｅｎｄｕ変異体のＡＴＰアーゼ活性を示す図である。    （Ｂ）内皮細胞移動阻害に対するＥｎｄｕ変異体の活性を示す図である。
【図１０】天然ヒトＥＳの配列である。
【図１１】大腸菌において発現される組換えヒトＥＳの配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失され得る。
【図１２】大腸菌において発現される組換えヒトＮ−４の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍ及び最後のアミノ酸Ｋは、組換え発現の間にランダムに欠失され得る。
【図１３】大腸菌において発現される組換えヒトＥｎｄｕの配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失される。
【図１４】大腸菌において発現される組換えヒトＥＳ００１の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失され得る。
【図１５】大腸菌において発現される組換えヒトＥＳ００３の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失され得る。
【図１６】大腸菌において発現される組換えヒトＥＳ００４の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失され得る。
【図１７】大腸菌において発現される組換えヒトＥＳ００５の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失され得る。
【図１８】大腸菌において発現される組換えヒトＥＳ００６の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失され得る。
【図１９】大腸菌において発現される組換えヒトＥＳ００７の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失され得る。
【図２０】大腸菌において発現される組換えヒトＥＳ００８の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失され得る。
【図２１】大腸菌において発現される組換えヒトＥｎｄｕ００１の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失され得る。
【図２２】大腸菌において発現される組換えヒトＥｎｄｕ００３の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失され得る。
【図２３】大腸菌において発現される組換えヒトＥｎｄｕ００８の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失され得る。
【図２４】大腸菌において発現される組換えヒトＥＳ０１０の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失され得る。
【図２５】大腸菌において発現される組換えヒトＥＳ０１１の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失され得る。
【図２６】大腸菌において発現される組換えヒトＥＳ０１２の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失され得る。
【図２７】大腸菌において発現される組換えヒトＳ０１の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失され得る。
【図２８】大腸菌において発現される組換えヒトＳ０２の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失され得る。
【図２９】大腸菌において発現される組換えヒトＳ０９の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失され得る。
【図３０】大腸菌において発現される組換えヒトＳ１０の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失される。
【図３１】大腸菌において発現される組換えヒトＳ１２の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失される。
【図３２】大腸菌において発現される組換えヒトＺ００５の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失される。
【図３３】大腸菌において発現される組換えヒトＺ００６の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失される。
【図３４】大腸菌において発現される組換えヒトＺ００８の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失される。
【図３５】大腸菌において発現される組換えヒトＺ００９の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失される。
【図３６】大腸菌において発現される組換えヒトＺ１０１の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失される。
【図３７】大腸菌において発現される組換えヒトＺ１０３の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失される。
【図３８】大腸菌において発現される組換えヒトＺ１０４の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失され得る。
【図３９】大腸菌において発現される組換えヒトＺＮ１の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失される。
【図４０】大腸菌において発現される組換えヒトＺＮ２の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失される。
【図４１】大腸菌において発現される組換えヒトＺＮ３の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失される。
【図４２】大腸菌において発現される組換えヒトＺＮ４の配列である。Ｎ末端における第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失される。
【図４３】ＥＳ変異体ＥＳ０１０、ＥＳ０１１、ＥＳ０１２の内皮細胞移動阻害効果の比較を示す図である。
【図４４】ＥＳ変異体Ｓ０１、Ｓ０２、Ｓ０９、Ｓ１０の内皮細胞移動阻害効果の比較を示す図である。
【図４５】ＥＳ変異体Ｓ１２の内皮細胞移動阻害効果の比較を示す図である。
【図４６】ＥＳ変異体Ｚ００５、Ｚ００６、Ｚ００８、Ｚ００９の内皮細胞移動阻害効果の比較を示す図である。
【図４７】ＥＳ変異体Ｚ１０１、Ｚ１０３、Ｚ１０４、ＺＮ１、ＺＮ２、ＺＮ３、ＺＮ４の内皮細胞移動阻害効果の比較を示す図である。
【図４８】動物レベルでの、非小細胞性肺癌Ａ５４９腫瘍成長に対するＥＳ変異体の阻害効果を示す図である。（Ａ）腫瘍体積、及び（Ｂ）腫瘍重量。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
特に明記しない限り、この説明において使用される科学的及び技術的用語は、本分野において当業者が一般に理解する意味を有するべきである。通常、細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、細菌学、遺伝学並びにタンパク質及び核酸化学に関してこの説明中で使用される専門語及び技術は、本分野において公知であり、一般的に使用されている。
【００３７】
特に明記しない限り、この説明において使用される方法及び技術は、本分野で一般的に公知である従前通りの方法並びにこの説明に記載の又は引用文献に記載の方法に従って通常実行される。例えば、Ｓａｍｂｏｏｋ  Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第三版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９８）；及びＣｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３）を参照のこと。
【００３８】
この説明において参照される全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体を参照により組み込む。
【００３９】
ＥＳ、ＥＳ多様体、ＥＳ変異体及びそれらのｍＰＥＧ修飾産物
ＥＳ（エンドスタチン）とは、天然のエンドスタチン、例えば、配列番号１の配列を持つヒトエンドスタチンのことを指す（図１０）。ＥＳ多様体とは、天然のＥＳ分子のＮ末端又はＣ末端のいずれかに１〜１５アミノ酸の付加又は欠失を含む分子のことを指す。ＥＳ多様体は、天然に存在する多様体であってもよく、例えば、ヒトＥＳが大腸菌において組換え的に発現される場合、第１アミノ酸Ｍは、ランダムに欠失され得、配列番号２の配列を持つＥＳ多様体が生産される（図１１）。別の例の場合、ＥＳが酵母において組換え的に発現される場合、Ｎ末端のランダムな切断により、Ｎ末端から４アミノ酸の欠失を持つＥＳ多様体が生産され得、その多様体は、配列番号３の配列を有する（図１２）。更に、Ｃ末端Ｋもランダムに欠失され得る。ＥＳ多様体は、人工的な多様体でもあり得る。例えば、発現及び安定性を向上させるために、配列番号４の配列を有するＥＳ多様体であるＥｎｄｕは、野生型ＥＳのＮ末端にＭＧＧＳＨＨＨＨＨ配列を持つ９アミノ酸の付加を有し（図１３）、その第１アミノ酸Ｍは、組換え発現の間にランダムに欠失され得る。本出願において、ＥＳ多様体とは、ＥＳの天然に存在する又は人工的な多様体のことを指し、その多様体は、対応する野生型ＥＳと同じ又は類似の血管新生阻害活性を有し、同じ又は類似のＡＴＰ結合モチーフ及びＡＴＰアーゼ活性を有する。
【００４０】
本出願において、ＥＳ変異体とは、天然のＥＳ又はＥＳ多様体のＡＴＰ結合部位を修飾することによって、例えば、アミノ酸点突然変異によりＡＴＰ結合モチーフを修飾することによって得られる変異されたタンパク質のことを指す。
【００４１】
Ｍｅｄｇｅｎｎから購入したＥｎｄｕ、及びＥＳ、ＥＳ多様体を除いて、本発明で使用したＥＳ変異体は、ＰＲＯＴＧＥＮによって提供された。
【００４２】
ＰＥＧ修飾ＥＳ、Ｅｎｄｕ及びＮ−４は、それぞれｍＰＥＧ−ＥＳ、ｍＰＥＧ−Ｅｎｄｕ及びｍＰＥＧ−Ｎ−４と命名される。これらの産物はそれぞれ、２０ｋＤモノメトキシポリ（エチレングリコール）−アルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）によって修飾されたＥＳ、Ｅｎｄｕ及びＮ−４であり、活性化ｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基に対する結合部位は、ＥＳ、Ｅｎｄｕ及びＮ−４のＮ末端αアミノ基である。
【００４３】
ＡＴＰ生物発光アッセイキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
このＡＴＰアッセイは、十分に承認され広く使用されている方法であり、感度が非常に高く、その原理は以下の通りである。ホタルルシフェラーゼは、ルシフェリンの酸化を触媒して、ＡＴＰのエネルギーを用いて光子を放射させる。従って、ホタルルシフェラーゼによって触媒される発光反応において、検出系における発光強度は、ＡＴＰ濃度と良い比例関係を有する。生物発光分析装置（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｅｎｔｒｏ  ＬＢ  ９６０）を使用して、反応系中の発光強度を検出することにより、反応系中のＡＴＰ濃度を正確に算出できる。
【００４４】
マラカイトグリーンリン酸塩アッセイキット（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）
これは、ＡＴＰアーゼ活性を試験するために十分に承認され広く使用されている方法である。その原理は、以下の通りである。酸性条件において、マラカイトグリーン、モリブデン酸塩とリン酸との反応は、緑色の物質を生成することができ、その物質は、６００〜６６０ｎｍの波長範囲で検出できる。吸光度は、特定の範囲に渡ってリン酸塩濃度と良い比例関係を有する。ＡＴＰアーゼによって触媒されるＡＴＰ加水分解の間に、ＡＤＰ及びＰｉが放出される。従ってこのキットによって検出されるリン酸塩濃度によって、ＡＴＰアーゼ活性を算出することができる。この方法は、簡便で迅速であり、ホスファターゼ、リパーゼ及びヌクレオシドトリホスファターゼの活性並びにリン酸塩濃度の分析ばかりでなく高スループット薬剤スクリーニングに広く使用されている。
【００４５】
ＡＴＰ結合モチーフ
これらのモチーフとは、ＡＴＰアーゼ活性を持つタンパク質中にある、ＡＴＰと結合できる典型的な一次配列のことを指す。通常ＡＴＰ結合モチーフはＰ−ループ構造を有し、その構造は、ＧＸＸＧＸＸＫ、（Ｇ／Ａ）ＸＸＸＸＧＫ（Ｔ／Ｓ）、ＧＸＸＸＸＧＫＳ及びＧＸＸＧＸＧＫＳを含むいくつかの典型的な配列を有する。これらのうち、Ｘによって置換されていないアミノ酸残基は、比較的保存的である。一般に、これらのＡＴＰ結合モチーフは、ＧＴＰにも結合できる。
【００４６】
ＡＴＰ結合部位
これらの部位とは、典型的なＡＴＰ結合モチーフ及びＡＴＰ結合に関与する他のアミノ酸部位を含む、ＡＴＰアーゼ活性を持つタンパク質中にある、ＡＴＰと結合できる部位のことを指す。これらのアミノ酸残基は、一次配列上でＡＴＰ結合モチーフから遠い場合があるが、三次構造においてはＥＳとＡＴＰ／ＧＴＰとの相互作用に関与する。別法として、これら部位の欠落又は交換は、タンパク質立体構造に干渉することによって、ＥＳとＡＴＰ／ＧＴＰとの相互作用を間接的に妨げることができる。
【００４７】
新規なＥＳ活性、すなわちＡＴＰアーゼ活性の発見に基づいて、本発明は、ＥＳの生物活性を評価するための新規な方法を提供する。内皮細胞移動に基づく現在のアッセイと比較して、本方法はより簡便で正確であり、再現性が良いことを証明する。本発明は、ＥＳ、ＥＳ多様体及びＥＳ変異体の作用機序を研究するための、並びに薬剤開発及び品質管理のための重要な研究手法を提供する。
【００４８】
従って、本発明は、ＥＳ、ＥＳ多様体、ＥＳ変異体及びＰＥＧ修飾ＥＳ産物の生物活性を検出する方法を提供する。本方法は、上で述べた通り、ＥＳ、ＥＳ多様体、ＥＳ変異体及びＰＥＧ修飾ＥＳのＡＴＰアーゼ活性を検出することを含む。例えば、マラカイトグリーンリン酸塩アッセイキット又はＡＴＰ生物発光アッセイキットを使用してＥＳ、ＥＳ多様体、ＥＳ変異体及びＰＥＧ修飾ＥＳのＡＴＰアーゼ活性を検出し、それによって組換え生産されたＥＳの立体構造及び生物活性を決定することが可能である。
【００４９】
一方、ＡＴＰ結合モチーフ中にあるいくつかの公知のＰ−ループ構造配列と比較することにより、ＥＳの一次配列においてＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ配列を有するアミノ酸残基８９〜９５は、ＧＸＸＧＸＸＫからなる典型的なＡＴＰ結合モチーフ（ＥＳ  ＡＴＰアーゼ活性の構造基準である）と一致することが判明した（図１０）。
【００５０】
ＥＳの結晶構造に基づいて、三次構造においてＥＳ  ＡＴＰ結合モチーフがＮ末端の近傍にあり、そのため、Ｎ末端配列の変更によって誘導される立体特異的障害の変化が、ＥＳのＡＴＰアーゼ能に影響し得ることが判明した。そこで、本発明の１例において、ＥＳ多様体Ｅｎｄｕ（Ｎ末端に９個の追加のアミノ酸残基がある）及びＮ−４（Ｎ末端に４アミノ酸の欠失がある）のＡＴＰアーゼ活性を検出した。その結果は、ＥＳ多様体であるＥｎｄｕ及びＮ−４が、ＡＴＰアーゼ活性を有することを示した。ＥＳと比較して、ＥｎｄｕのＡＴＰアーゼ活性は著しく低下しており、一方でＮ−４のＡＴＰアーゼ活性は著しく増加していた（図３）。これらの結果は、異なるＮ末端完全性によって誘導される立体特異的障害の変化が、ＥＳのＡＴＰアーゼ活性に実際に影響することを示した。従って、典型的なＡＴＰ結合モチーフＧＸＸＧＸＸＫとは別に、共結晶化分析によって確認された他のＡＴＰ相互作用部位は、ＡＴＰアーゼ活性を修飾するための潜在的な標的部位になり得る。
【００５１】
Ｎ末端αアミノでのｍＰＥＧによる単一点修飾の後に、内皮細胞移動を阻害するＥＳ及びＥｎｄｕの活性が著しく向上したことが報告された（ＣＮ  １００４７５２７０Ｃ）。そして、本発明の１例において、ｍＰＥＧ−ＥＳ、ｍＰＥＧ−Ｅｎｄｕ及びｍＰＥＧ−Ｎ−４のＡＴＰアーゼ活性が検出され、ＡＴＰアーゼ活性が著しく低下していることが判明した（図３）。つまり、ＥＳ、ＥＳ多様体及びそれらのｍＰＥＧ修飾産物のこの群において、ＡＴＰアーゼ活性は、内皮細胞移動阻害の活性と負の相関があり、従って、ＡＴＰアーゼ活性が高くなれば、内皮細胞移動阻害活性は低くなる。この結果を、ＥＳ多様体Ｎ−４によって確認した：Ｎ−４のＡＴＰアーゼ活性はＥＳ及びＥｎｄｕより高く（図３）、一方で他の細胞活性は著しく低下していた（Ｆｕ  Ｙ．ら  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１０；４９：６４２０〜６４２９頁）。
【００５２】
上記のデータから、ＥＳ、ＥＳ多様体及びそれらのｍＰＥＧ修飾産物において、ＡＴＰアーゼ活性が、内皮細胞移動阻害の活性と負に相関することが判明した。この発見に基づいて、より高い内皮細胞移動阻害の活性を持つＥＳを得るために、ＥＳのＡＴＰ結合部位に点突然変異を導入してＡＴＰアーゼ活性を減少させた。
【００５３】
従って、本発明は、ＥＳ及びＥＳ多様体のＡＴＰアーゼ活性を低下させることを含むＥＳの生物活性を向上させる方法を提供する。特に、遺伝子工学によってＥＳ及びＥＳ多様体のＡＴＰ結合モチーフＧＸＸＧＸＸＫを変異させ、それによってＡＴＰアーゼ活性は低下するが、内皮細胞移動及び腫瘍阻害活性などの生物活性が向上したＥＳ変異体を得ることができる。
【００５４】
本発明の１例において、以下の変異が、ＥＳ  ＡＴＰ結合部位に導入された：
ＥＳ００１−−ＥＳ−Ｋ９６Ｒ                        （配列番号５）  （図１４）
ＥＳ００３−−ＥＳ−Ｇ９０Ａ                        （配列番号６）  （図１５）
ＥＳ００４−−ＥＳ−Ｇ９３Ａ＆Ｋ９６Ｒ              （配列番号７）  （図１６）
ＥＳ００５−−ＥＳ−Ｇ９０Ａ＆Ｇ９３Ａ＆Ｋ９６Ｒ    （配列番号８）  （図１７）
ＥＳ００６−−ＥＳ−Ｇ９３Ａ                        （配列番号９）  （図１８）
ＥＳ００７−−ＥＳ−Ｇ９０Ａ＆Ｅ９２Ｋ＆Ｇ９３Ａ＆Ｋ９６Ｒ
（配列番号１０）（図１９）
ＥＳ００８−−ＥＳ−Ｅ９２Ｑ＆Ｐ９４Ｑ＆Ｋ９６Ｑ    （配列番号１１）（図２０）
【００５５】
生化学的方法を使用することによって検出された通り、ＥＳと比較して、変異体のＡＴＰアーゼ活性は著しく増加し、一方で変異体ＥＳ００３、ＥＳ００４、ＥＳ００５、ＥＳ００６及びＥＳ００７のＡＴＰアーゼ活性は著しく低下した（図６）。ＥＳは、内皮細胞に取り込まれ、細胞内ＡＴＰを分解することができるが、生細胞はＡＴＰの消費を迅速に補償することができる。そのため、現在の方法は、生細胞中のＡＴＰ濃度を検出する代わりに全細胞溶解物中のＡＴＰ分解を検出するように通常設計されている。全細胞溶解物中で、変異体ＥＳ００３、ＥＳ００６、ＥＳ００７及びＥＳ００８のＡＴＰアーゼ活性はＥＳよりなお著しく低かったが（図７Ａ）、変異体ＥＳ００１、ＥＳ００４及びＥＳ００５のＡＴＰアーゼ活性はＥＳと同等であった（図７Ｂ）。これは、全タンパク質とＡＴＰとの相互作用に影響し得るこれら変異によって誘導されたＰ−ループ構造の変化に起因する可能性がある。
【００５６】
その後、内皮細胞移動を阻害するこれらＥＳ変異体の活性を続けて確認した。結果は、基本的に予想と一致した。極めて少数の変異体を除いて、大部分のＥＳ変異体のＡＴＰアーゼ活性は、内皮細胞移動阻害の活性と負に相関した（図８）。
【００５７】
加えて、本発明の１例において、以下の変異が、ＥＳ多様体（Ｅｎｄｕ）に導入された：
Ｅｎｄｕ００１−−Ｅｎｄｕ−Ｋ１０４Ｒ              （配列番号１２）（図２１）
Ｅｎｄｕ００３−−Ｅｎｄｕ−Ｇ９８Ａ                （配列番号１３）（図２２）
Ｅｎｄｕ００８−−Ｅｎｄｕ−Ｅ１００Ｑ＆Ｐ１０２Ｑ＆Ｋ１０４Ｑ
（配列番号１４）（図２３）
【００５８】
ＥＳと比較したとき、ＡＴＰ結合部位における変異が、ＡＴＰアーゼ活性及び内皮細胞移動の阻害に関してＥｎｄｕに類似の影響を及ぼすことが判明した。従って、ＡＴＰ結合部位に変異を導入することによってＡＴＰアーゼ活性及び内皮細胞移動の阻害を変化させる戦略は、ＥＳ多様体にも適用されると考えられる。
【００５９】
従って、本発明は、抗血管新生活性が向上したＥＳ変異体も提供する。変異体は、ＡＴＰ結合部位に変異を含む。野生型ＥＳ又はその多様体と比較して、変異体は、ＡＴＰアーゼ活性が低下している。
【００６０】
変異体のＡＴＰアーゼ活性は、野生型エンドスタチン又はその多様体と比較して、少なくとも約３０％、例えば少なくとも約５０％、少なくとも約７０％又は少なくとも約９０％低下することが好ましい。例えば、変異体のＡＴＰアーゼ活性は、野生型エンドスタチン又はその多様体と比較して、わずかに約６０〜７０％、例えば約５０〜６０％、４０〜５０％、３０〜４０％、２０〜３０％、１０〜２０％若しくは１０％以下又は更に低い。１例において、変異体は、ＡＴＰアーゼ活性を全く有さなかった。
【００６１】
いくつかの実施形態において、対応する野生型エンドスタチン又はその多様体と比較して、変異体はＡＴＰ結合モチーフに変異を含む。例えば、変異体は、配列番号１のアミノ酸残基８９〜９５からなるＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓモチーフに対応する配列中に変異を含み、前記変異は、１つ又はいくつかのアミノ酸の交換、欠失又は付加であり、前記変異は、前記変異体のＡＴＰアーゼ活性の減少又は欠失をもたらす。
【００６２】
いくつかの実施形態において、変異体は、配列番号１の８９〜９５番目のアミノ酸残基からなるＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓモチーフに対応する配列の部分的又は完全な欠失を含む。
【００６３】
本発明のＥＳ変異体は、以下の変異を含むことが好ましい：（ａ）配列番号１のアミノ酸残基８９に対応するＧｌｙ残基が、非荷電若しくは芳香族アミノ酸で置換される又は欠失する；又は（ｂ）配列番号１のアミノ酸残基９２に対応するＧｌｙ残基が、非荷電アミノ酸で置換される又は欠失する；又は（ｃ）配列番号１のアミノ酸残基９５に対応するＬｙｓ残基が、正荷電若しくは非荷電アミノ酸で置換される又は欠失する；又は（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の任意の組合せである。
【００６４】
本発明のＥＳ変異体は、以下の変異を含むことがより好ましい：（ａ）配列番号１のアミノ酸残基８９に対応するＧｌｙ残基が、Ａｌａ若しくはＰｒｏのいずれかで置換される又は欠失する；又は（ｂ）配列番号１のアミノ酸残基９２に対応するＧｌｙ残基が、Ａｌａで置換される又は欠失する；又は（ｃ）配列番号１のアミノ酸残基９５に対応するＬｙｓ残基が、Ａｒｇ若しくはＧｌｎのいずれかで置換される又は欠失する；又は（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の任意の組合せである。
【００６５】
特定の実施形態において、本発明のＥＳ変異体は、配列番号６〜１１、１３、１４、１５〜２７及び３０〜３１からなる群から選択される配列を含む。本発明のＥＳ変異体は、配列番号６、配列番号１０、配列番号２７及び配列番号３０からなる群から選択される配列を含むことが好ましい。
【００６６】
本発明のＥＳ変異体は、ヒトＥＳの変異体であることが好ましい。
【００６７】
本発明は、上述のＥＳ変異体を含む医薬組成物も提供する。本発明の医薬組成物において、ＥＳ変異体をＰＥＧ分子に共有結合させることもできる。ＰＥＧの分子量は、５〜４０ｋＤなど、例えば、５〜２０ｋＤ又は２０〜４０ｋＤである。ＰＥＧは、２０ｋＤの分子量、例えば、２０ｋＤ  ｍＰＥＧ又はｍＰＥＧ−ＡＬＤを有することが好ましい。ＰＥＧ分子は、ＥＳのＮ末端αアミノ基に共有結合されることが好ましい。
【００６８】
本発明は、腫瘍がある患者に上述のエンドスタチン変異体又は本発明の医薬組成物を投与することを含む、腫瘍を治療する方法も提供する。
【００６９】
本発明は、血管新生関連疾患の治療のための医薬の調製における、上述のエンドスタチン変異体の使用にも関する。上述の血管新生関連疾患は、腫瘍であることが好ましい。
【００７０】
本発明は以下の非排他的な実施例をもって更に説明されるが、本発明がこれらの実施例に制限されないことを理解されたい。
【実施例】
【００７１】
実施例１：ＥＳ組換え株の構築
エンドスタチンの遺伝子を、肺癌細胞Ａ５４９のｃＤＮＡから増幅し、次いで、ｐＥＴ３０ａプラスミドにクローニングして、組換えプラスミドを得た。遺伝子増幅用の５’プライマーは、ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＧＣＧＡＣＴＴＣであり、３’プライマーは、ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＧＧＡＧＧＣＡＧＴＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧであった。制限エンドヌクレアーゼは、それぞれＮｄｅＩ及びＸｈｏＩであった。当技術分野の通常の技術によって上記の組換えプラスミドを大腸菌に形質転換し、更にタンパク質発現させた。
【００７２】
実施例２：変異させたＡＴＰ結合部位を含有するＥＳ又はＥｎｄｕ変異体を生産する株の構築
野生型ヒトＥＳのＡＴＰ結合部位を変異により修飾した。詳細な変異プロセス、プライマー対及び形質転換プロセスは、実施例１と同じであった。変異体を、以下の通りに列挙する：
ＥＳ００１−ＥＳ−Ｋ９６Ｒ                          （配列番号５）  （図１４）
ＥＳ００３−ＥＳ−Ｇ９０Ａ                          （配列番号６）  （図１５）
ＥＳ００４−ＥＳ−Ｇ９３Ａ＆Ｋ９６Ｒ                （配列番号７）  （図１６）
ＥＳ００５−ＥＳ−Ｇ９０Ａ＆Ｇ９３Ａ＆Ｋ９６Ｒ      （配列番号８）  （図１７）
ＥＳ００６−ＥＳ−Ｇ９３Ａ                          （配列番号９）  （図１８）
ＥＳ００７−ＥＳ−Ｇ９０Ａ＆Ｅ９２Ｋ＆Ｇ９３Ａ＆Ｋ９６Ｒ
（配列番号１０）（図１９）
ＥＳ００８−ＥＳ−Ｅ９２Ｑ＆Ｐ９４Ｑ＆Ｋ９６Ｑ      （配列番号１１）（図２０）
【００７３】
野生型Ｅｎｄｕ配列に基づいて上記と同じ手順を使用することにより、対照として、変異したＡＴＰ結合部位を含有する変異体（すなわちＥｎｄｕ００１、Ｅｎｄｕ００３及びＥｎｄｕ００８）も構築した。
Ｅｎｄｕ００１−Ｅｎｄｕ−Ｋ１０４Ｒ                （配列番号１２）（図２１）
Ｅｎｄｕ００３−Ｅｎｄｕ−Ｇ９８Ａ                  （配列番号１３）（図２２）
Ｅｎｄｕ００８−Ｅｎｄｕ−Ｅ１００Ｑ＆Ｐ１０２Ｑ＆Ｋ１０４Ｑ
（配列番号１４）（図２３）
【００７４】
実施例３：組換えＥＳ、ＥＳ変異体及びＥｎｄｕ変異体の調製
組換えＥＳ、ＥＳ変異体及びＥｎｄｕ変異体の発現及び調製について例示するための一例として、変異体ＥＳ００３の調製を行った。具体的には、ＥＳ及びその変異体を生産するための株を、ＬＢ培地含有振とうフラスコで終夜培養し、次いで５Ｌ発酵用容器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）に植菌した。適切な時間にＩＰＴＧを添加し、次いで約４時間後に細菌を集菌した（図２Ａ）。細菌を緩衝液に再懸濁し、高圧ホモジナイザによって徹底的に破砕し、破砕された細菌を遠心分離してペレットを採取した。このプロセスを３回繰り返した。次いで、ＤＥＡＥカラム又はＱカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、及びＣＭカラム又はＳＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、４．０〜１０．０のｐＨ勾配でタンパク質を溶出した。再生した及び再生していないタンパク質をそれぞれ精製して、９５％より高い純度で、再生したタンパク質を得た（図２Ｂ、Ｃ）。再生したタンパク質を濃縮し、次いでＰＢＳ又はＮａＡｃ−ＨＡｃで透析した。再生したタンパク質のＮ末端の修飾は、モノメトキシポリ（エチレングリコール）−アルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ、２０ｋＤａ、Ｂｅｉｊｉｎｇ  ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を使用することにより実施された。ＣＭカラム又はＳＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用することにより修飾タンパク質を精製し、４．０〜１０．０のｐＨ勾配で溶出して、標的成分を得た（図２Ｄ）。
【００７５】
実施例４：ＥＳ及びその多様体は、高効率なＡＴＰアーゼである
サンプル希釈緩衝液を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．０２％  ＮａＮ３（ｐＨ７．４）から調製した。ＥＳ、その多様体Ｅｎｄｕ及びＮ−４を、サンプル希釈緩衝液を用いて終濃度５００μｇ／ｍｌに希釈した。群１：陰性対照、同体積の無タンパク質緩衝液をサンプル希釈緩衝液に添加；及び群２、ＥＳ、その多様体Ｅｎｄｕ及びＮ−４（終濃度５００μｇ／ｍｌ）。
【００７６】
５００μＭ  ＡＴＰを対照に添加し、水浴で、３７℃で３０分間反応を実施し、その後、反応を停止するために５分間氷上に置いた。同時に、ＥＳ及びその多様体のサンプルにも同じ手順を採用した。
【００７７】
２つの群のサンプルを、それぞれ適切な比に希釈し、次いで連続的に９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに添加した。マラカイトグリーンリン酸塩アッセイキット（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びマイクロプレートリーダ（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ｍｋ３、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用することにより、各群のサンプルの吸光度を決定した。反応系中のリン酸塩濃度を算出し、次いでＥＳのＡＴＰアーゼ活性に変換した。
ＡＴＰアーゼ活性（ｎＭ／ｍｇ／分）＝△リン酸塩濃度（ｎＭ／ｍｌ）／反応時間（３０分間）／ＥＳ又はその多様体濃度（ｍｇ／ｍｌ）。
【００７８】
その結果は、ＥＳ、Ｅｎｄｕ及びＮ−４が高いＡＴＰアーゼ活性を有し、Ｎ−４が最高のＡＴＰアーゼ活性を有することを示した。
【００７９】
同じ方法を使用して、ｍＰＥＧ修飾ＥＳ、Ｅｎｄｕ及びＮ−４のＡＴＰアーゼ活性を検出し、その結果は、ｍＰＥＧ−ＥＳ、ｍＰＥＧ−Ｅｎｄｕ及びｍＰＥＧ−Ｎ−４のＡＴＰアーゼ活性が、ＥＳ、Ｅｎｄｕ及びＮ−４と比較して低下したことを示した。
【００８０】
陽性対照として、上記実験の全てをミオシン（ブタ心臓から抽出、Ｓｉｇｍａ）に採用した。ミオシンは高いＡＴＰアーゼ活性を有することが周知である。その結果は、ＥＳ及びその多様体が高効率なＡＴＰアーゼであることを示した（図３）。
【００８１】
実施例５：ＥＳ、Ｅｎｄｕ及びそのｍＰＥＧ修飾産物は、ＡＴＰアーゼとして作用するので、ヒト血管内皮細胞の全細胞ホモジネート中のＡＴＰの量を著しく低下させ得る。
ヒト血管内皮細胞を最初に採取し、その後、細胞溶解緩衝液で全細胞溶解物を調製する。低温での遠心分離により、沈殿物、不純物及び細胞残屑を除去した（上記の操作を、氷上で、低温で行った）。細胞溶解物を、平均的に４群に分けて、その各々を異なる処理に供した。群１：陰性対照、同体積の無タンパク質緩衝液を添加；群２：ＥＳ（５０μｇ／ｍｌ）による処理；群３：ＥＳ（１００μｇ／ｍｌ）による処理；群４：ＥＳ（２００μｇ／ｍｌ）による処理。各群を室温に置いて、ＥＳを添加後直ちに反応を開始させ、次いで２５分後に氷上に戻して反応を停止させた。各群における細胞ホモジネートのＡＴＰの量を、ＡＴＰ生物発光検出キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用することにより検出した。その結果は、対照群と比較して、ＥＳが著しく分解させ、ヒト血管内皮細胞の溶解物中のＡＴＰレベルを低下させ得ることを示した。その結果は実施例４と一致しており、細胞溶解緩衝液などの関連複雑系においてもＥＳがＡＴＰ分解活性を持ち得ることを更に実証した。同時に、ＰＥＧ修飾ＥＳ（ｍＰＥＧ−ＥＳ）も著しく分解させ、ヒト血管内皮細胞の溶解物中のＡＴＰレベルを低下させ得ることが判明し、ＥＳとｍＰＥＧ−ＥＳの用量（それぞれ５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ）及び処理時間が同じ環境下では、ｍＰＥＧ−ＥＳのＡＴＰ分解活性は、ＥＳよりわずかに低い（図４Ａ）。
【００８２】
ＥＳを、同じ機序を持つ他のタンパク質又はその多様体Ｅｎｄｕと置き換えることもできる。ＥｎｄｕとｍＰＥＧ修飾Ｅｎｄｕ（ｍＰＥＧ−Ｅｎｄｕ）（Ｎ末端に追加のアミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨを持つＥＳに、２０ｋＤａ  ｍＰＥＧ−ＡＬＤ修飾が付加される）との同時比較実験において、類似の結果が得られた。前述と同じ方法によってヒト血管内皮細胞の全細胞溶解成分を得て、異なる処理により以下のように平均的に７群に分けた。群１：無処理陰性対照；群２：ウシ血清アルブミンＢＳＡ（１００μｇ／ｍｌ）を含む陰性対照、ＢＳＡはＡＴＰアーゼ活性を全く持たないことが周知のタンパク質であり、通常この種の実験において陰性対照として使用される；群３：陽性対照、ブタ心臓ミオシン（１００μｇ／ｍｌ）処理、ミオシンは高いＡＴＰアーゼ活性を持つことが周知のタンパク質であり、陽性対照として使用される；群４：ＥＳ（１００μｇ／ｍｌ）処理；群５：ｍＰＥＧ−ＥＳ（１００μｇ／ｍｌ）処理；群６：Ｅｎｄｕ（１００μｇ／ｍｌ）処理；群７：ｍＰＥＧ−Ｅｎｄｕ（１００μｇ／ｍｌ）処理。各群を、ＥＳ、Ｅｎｄｕ又はｍＰＥＧ修飾産物を添加後直ちに室温に置いて２５分間反応させ、氷上に戻して反応を停止させた。同じ用量ミオシン、ＢＳＡ、ＥＳ、ｍＰＥＧ−ＥＳ、Ｅｎｄｕ、ｍＰＥＧ−Ｅｎｄｕを添加し、同じ反応条件の場合、ミオシンが最高のＡＴＰ分解活性（ＡＴＰアーゼ活性も意味する）を示すことを、その結果は示した。ＥＳ、ｍＰＥＧ−ＥＳ、Ｅｎｄｕ及びｍＰＥＧ−Ｅｎｄｕは全てそれぞれのＡＴＰアーゼ活性を示し、中でも、天然配列を持つＥＳは最高のＡＴＰアーゼ活性を有し、ミオシンに近い；ｍＰＥＧ−ＥＳは、２番目に高いＡＴＰアーゼ活性を有し、ＥＳよりわずかに低い；Ｅｎｄｕ及びｍＰＥＧ−Ｅｎｄｕは、それぞれ、より低いＡＴＰアーゼ活性を有する（図４Ｂ）。
【００８３】
実施例６：ＥＳ活性を決定する場合、ＡＴＰアーゼ活性評価は、再現性が高い簡便で正確な方法である。
ＥＳ、多様体及びそのＰＥＧ修飾産物のＡＴＰアーゼ活性を決定する方法は、実施例４に記載の方法に従って確立された。氷浴上で、サンプル希釈緩衝液を用いて連続した濃度勾配にＥＳ、ｍＰＥＧ−ＥＳ、Ｅｎｄｕ及びｍＰＥＧ−Ｅｎｄｕをそれぞれ希釈した（図５に示される）。希釈したサンプルを、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに添加した。マラカイトグリーンリン酸塩アッセイキット（Ｍａｌａｃｈｉｔｅ  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ，ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用することにより、ＯＤ６３０を検出した。希釈したサンプルの濃度を、希釈係数に従って算出した。次いで、以下の式に従って△ＯＤ６３０を算出した：
△ＯＤ６３０＝Ｓ１（ＯＤ６３０）−Ｓ２（ＯＤ６３０）
【００８４】
Ｘ軸にサンプル濃度及びＹ軸に対応する△ＯＤ６３０を用いて曲線を描画した。ｍＰＥＧ−ＥＳ、Ｅｎｄｕ及びｍＰＥＧ−Ｅｎｄｕの検出並びに描画を、同様に同時に実施した。結果は、サンプル濃度とＥＳ、ｍＰＥＧ−ＥＳ、Ｅｎｄｕ及びｍＰＥＧ−Ｅｎｄｕに対応する△ＯＤ６３０との間で、全てが０．９９より大きいＲ２を持つ優れた直線性を示した（図５）。従って、決定した直線の範囲内で、本方法は、ＥＳ、多様体及びそのＰＥＧ修飾産物の活性を検出するために広く使用できる。
【００８５】
実施例７：ＥＳのＡＴＰ結合部位における変異は、ＡＴＰアーゼ活性の変化をもたらす
ＡＴＰ結合部位に変異を有するＥＳのＡＴＰアーゼ活性を、実施例４に記載の方法を使用して検出した。変異体ＥＳ００１は、ＥＳと比較して、より高いＡＴＰアーゼ活性を有し、一方で変異体ＥＳ００３〜ＥＳ００８の活性は劇的に低下した。変異体ＥＳ００３〜ＥＳ００８のＡＴＰアーゼ活性は、マウスエンドスタチン（ＭＭ）と類似していた（図６）。
【００８６】
実施例８：ＥＳのＡＴＰ結合部位における変異は、全細胞溶解物中のＡＴＰアーゼ活性の変化をもたらす
実施例５に記載の方法に従って、ヒト血管内皮細胞を採取し、細胞溶解緩衝液を用いて全細胞溶解物を調製した。低温で遠心分離することにより、細胞ホモジネート中のペレット、不純物及びデブリを除去した。全細胞溶解物を、以下のような異なる処理のためにいくつかの群に等分した：
群１：陰性対照、ＥＳを含まない等体積の緩衝液処理；
群２：ＥＳ（１００μｇ／ｍｌ）処理；
群３：マウスエンドスタチンＭＭ（１００μｇ／ｍｌ）処理；
群４：ＥＳ変異体ＥＳ００３（１００μｇ／ｍｌ）処理；
群５：ＥＳ変異体ＥＳ００６（１００μｇ／ｍｌ）処理；
群６：ＥＳ変異体ＥＳ００７（１００μｇ／ｍｌ）処理；
群７：ＥＳ変異体ＥＳ００８（１００μｇ／ｍｌ）処理。
【００８７】
各群のＡＴＰの量を、ＡＴＰ生物発光検出キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して検出した。その結果は、野生型ヒトＥＳが明らかなＡＴＰ分解活性を有する一方で、マウスＭＭは標準的なＡＴＰ結合ドメインを欠いているのでＡＴＰアーゼ活性が低いことを示した。ＥＳ変異体ＥＳ００３、ＥＳ００６、ＥＳ００７及びＥＳ００８は、ＡＴＰ結合部位における異なる変異により、野生型ＥＳと比較してＡＴＰ分解活性が劇的に減少した。ＥＳ００３及びＥＳ００８は、最も大きく活性が低下した（図７Ａ）。
【００８８】
別の実験において、類似の方法を用いて全細胞溶解液中でＥＳ変異体ＥＳ００１、ＥＳ００４、ＥＳ００５のＡＴＰアーゼ活性も検出した。ＥＳ００１、ＥＳ００４、ＥＳ００５は、ＥＳと比較して、同等又はより高いＡＴＰアーゼ活性を有する（図７Ｂ）。
【００８９】
実施例９：ＡＴＰ結合部位における変異は、ＥＳの内皮細胞移動阻害活性の変化をもたらす
細胞移動を決定する方法：１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含有するＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）バスケット（孔径８μｍ、Ｃｏｓｔａｒ）の上層に、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ、ＡＴＣＣより）をウェル当たり２×１０４個細胞を播種した。バスケットの上層と底層両方に同濃度（２０μｇ／ｍｌ）のＥＳを添加した。バスケットを５％ＣＯ２中で、３７℃で６時間インキュベートして、細胞を移動させた。次いで、細胞を、グルタルアルデヒドを用いて固定し、クリスタルバイオレットで染色した。膜を通って底層に完全に移動した細胞数を、各穴からランダムに選択した５領域から計数し、次いで平均し、対照群と比較して、移動した細胞の減少（各タンパク質の阻害率）を決定した。各群を３つ複製し、実験を少なくとも２回独立して反復した。
【００９０】
内皮細胞（ＨＭＥＣ）を、異なる処理のために以下の群に分けた：
群１：陰性対照、ＥＳを含まない等体積の緩衝液処理；
群２：ＥＳ（２０μｇ／ｍｌ）処理；
群３：マウスエンドスタチンＭＭ（２０μｇ／ｍｌ）処理；
群４：ＥＳ変異体ＥＳ００３（２０μｇ／ｍｌ）処理；
群５：ＥＳ変異体ＥＳ００６（２０μｇ／ｍｌ）処理；
群６：ＥＳ変異体ＥＳ００７（２０μｇ／ｍｌ）処理；
群７：ＥＳ変異体ＥＳ００８（２０μｇ／ｍｌ）処理。
【００９１】
その結果は、ＭＭ、変異体ＥＳ００３、ＥＳ００６、ＥＳ００７及びＥＳ００８の内皮細胞移動阻害活性が、ＥＳと比較して著しく増加したことを示した（図８Ａ）。
【００９２】
別の実験において、類似の方法を用いてＥＳ００１、ＥＳ００３、ＥＳ００４及びＥＳ００５の内皮細胞移動阻害活性も比較した。ＥＳと比較したとき、ＥＳ００３はより高い阻害活性を示したが、他の全ての変異体はより低い阻害活性を示した（図８Ｂ）。
【００９３】
実施例１０：ＡＴＰ結合部位における変異は、ＥｎｄｕのＡＴＰアーゼ活性及び内皮細胞移動阻害活性の変化をもたらす
本実施例において、実施例４及び９に記載の方法に基づいて、Ｅｎｄｕ変異体のＡＴＰアーゼ活性（図９Ａ）及び内皮細胞移動阻害活性（図９Ｂ）を比較した。その結果から、ＥｎｄｕのＡＴＰ結合部位における変異によって引き起こされたＡＴＰアーゼ活性及び内皮細胞移動阻害活性の変化が、同種の変異によって引き起こされたＥＳの対応する活性の変化と類似していることが明らかになった。
【００９４】
実施例１１：野生型ＥＳのＡＴＰ結合モチーフ及び隣接する配列を変異させることによって、ＡＴＰ活性が様々に低下した変異体が得られた。
本実施例において、ＥＳのＡＴＰ結合モチーフを、実施例１に記載のサイクル及びプライマーを使用して、二段階ＰＣＲで変異させた。変異部位を、以下の通りに要約した：
名称          変異部位                                    配列番号
ＥＳ０１０    ＭＥＳ−Ｒ５Ｍ                              配列番号１５（図２４）
ＥＳ０１１    ＭＥＳ−Ｒ５Ｑ                              配列番号１６（図２５）
ＥＳ０１２    ＭＥＳ−Ｒ５Ｑ＆Ｅ９２Ｑ＆Ｐ９４Ｑ＆Ｋ９６Ｑ                      
配列番号１７（図２６）
Ｓ０１        ＭＥＳ−△Ｎ２−５（ＨＳＨＲ）＆Ｉｎｓｅｒｔ  Ｓ９７
配列番号１８（図２７）
Ｓ０２        ＭＥＳ−△Ｎ２−５（ＨＳＨＲ）＆Ｉｎｓｅｒｔ  Ｔ９７
配列番号１９（図２８）
Ｓ０９        ＭＥＳ−Ｉｎｓｅｒｔ  Ｓ９７                配列番号２０（図２９）
Ｓ１０        ＭＥＳ−Ｉｎｓｅｒｔ  Ｔ９７                配列番号２１（図３０）
Ｓ１２        ＭＥＳ−△Ｃ１−４                          配列番号２２（図３１）
Ｚ００５      ＭＥＳ−△Ｇ９０＆△Ｇ９３＆Ｋ９６Ｑ        配列番号２３（図３２）
Ｚ００６      ＭＥＳ−△Ｇ９０＆Ｒ５Ｑ                    配列番号２４（図３３）
Ｚ００８      ＭＥＳ−△Ｇ９０＆Ｒ５Ｑ  ＆△Ｇ９３        配列番号２５（図３４）
Ｚ００９      ＭＥＳ−△Ｇ９０＆Ｒ５Ｑ＆Ｋ９６Ｑ          配列番号２６（図３５）
Ｚ１０１      ＭＥＳ−△Ｇ９０＆Ｋ１０７Ｒ＆Ｋ１１８Ｒ＆Ｋ１８４Ｒ
配列番号２７（図３６）
Ｚ１０３      ＥＳ００８−Ｋ７６Ｒ＆Ｋ１０７Ｒ  ＆Ｋ１８４Ｒ
配列番号２８（図３７）
Ｚ１０４      ＥＳ００８−Ｋ７６Ｒ＆Ｋ１１８Ｒ  ＆Ｋ１８４Ｒ
配列番号２９（図３８）
ＺＮ１        Ｚ１０１−Ｋ７６                            配列番号３０（図３９）
ＺＮ２        ＭＥＳ−Ｇ９０Ａ＆Ｋ７６Ｒ＆Ｋ１０７Ｒ＆Ｋ１１８Ｒ＆Ｋ１８４Ｒ
配列番号３１（図４０）
ＺＮ３        ＺＮ２−Ｇ９３Ａ                            配列番号３２（図４１）
ＺＮ４        ＺＮ２−Ａ９０Ｐ                            配列番号３３（図４２）
【００９５】
実施例２及び１１におけるＥＳ多様体、変異体及びそのｍＰＥＧ修飾産物のＡＴＰアーゼ活性を実施例４に記載の方法で測定し、その結果を表１に示した。
【表１】
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【００９６】
実施例１２：ＨＭＥＣ移動に対するＥＳ変異体の効果
細胞移動アッセイを、実施例９に記載のＴｒａｎｓｗｅｌｌアッセイで推定した。多くの変異体タンパク質の内皮細胞移動阻害活性が著しく増強されたことを考慮し、本実施例においては少ない用量（５μｇ／ｍＬ）を選択して細胞を処理して様々な変異体タンパク質間の活性の差異をより際立って示したが、図４３〜４７に示す通り、著しい阻害効果も観察された。ＥＳと比較してＡＴＰアーゼ活性と内皮細胞移動阻害活性の両方が低下したＺ１０３、Ｚ１０４、ＺＮ３及びＺＮ４を除いた、他の全ての変異体は、同等又は著しく増大した内皮細胞移動阻害活性を示したが、この活性は、ＡＴＰアーゼ活性と内皮細胞移動阻害活性との負の相関と一致している。４つの変異体Ｚ１０３、Ｚ１０４、ＺＮ３及びＺＮ４の例外は、タンパク質一体構造における過度の変異部位の効果によって引き起こされる可能性がある。
【００９７】
実施例１３：動物レベルでの非小肺癌Ａ５４９細胞の腫瘍成長に対するエンドスタチン変異体の阻害効果。
増殖性Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−１８５）を培養し、６〜８週齢ヌードマウス（Ｖｉｔａｌ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．）に皮下注射した。腫瘍体積が８０〜１００ｍｍ３に達したら、薬物治療を開始した。担腫瘍マウスを５群に分け、それぞれ異なる投与で処理した。変異体の抗血管新生活性の増大を考慮して、より低用量（１２ｍｇ／ｋｇ、共通の用量は２４ｍｇ／ｍＬ）を投与して、担腫瘍マウスを処理した。群１：薬物治療無しの陰性対照群、等用量で食塩水だけを注射；群２：ｍＰＥＧ−ＥＳ投与群；群３：Ｍ００３投与群、Ｍ００３を投与した；群４：Ｍ００７投与群、Ｍ００７を投与した；群５：ＭＺ１０１投与群、ＭＺ１０１を投与した。上記の４つのエンドスタチン変異体、すなわちｍＰＥＧ−ＥＳ、Ｍ００３（ｍＰＥＧ−ＥＳ００３）、Ｍ００７（ｍＰＥＧ−ＥＳ００７）及びＭＺ１０１（ｍＰＥＧ−Ｚ１０１）全てを、週に一度１２ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈に注射した。処理期間は、２１日間（３週間）であった。実験の間、全ての群において腫瘍の長半径Ａと短半径ＢをＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｖｅｒｎｉｅｒ  ｃａｌｉｐｅｒを用いて測定し、腫瘍体積を式Ｖ＝０．５×Ａ×Ｂ２（ｍｍ３）により算出した。
【００９８】
図４８Ａに示される腫瘍成長の結果から、陰性対照（群１）と比較して、ｍＰＥＧ−ＥＳ投与（群２）の腫瘍体積阻害率は４５％であり；Ｍ００３投与（群３）及びＭ００７投与（群４）の腫瘍体積阻害率はｍＰＥＧ−ＥＳ投与にほぼ等しく；ＭＺ１０１投与（群５）の腫瘍体積阻害率は７１．２％であり、群５が最小の腫瘍体積及び最高の薬物阻害率を有することが明らかになった。
【００９９】
実験が終わり次第、腫瘍を坦腫瘍マウスから解剖し、計量した。図４８Ｂに示すように、全ての薬物治療群の腫瘍重量阻害率が、腫瘍体積結果と一致した。陰性対照と比較して、ＭＳ０３投与（群２）の腫瘍重量阻害率は、４２％であり；Ｍ００３投与（群３）及びＭ００７投与（群４）の腫瘍重量阻害率は、ｍＰＥＧ−ＥＳ投与にほぼ等しく；ＭＺ１０１投与（群５）における腫瘍体積阻害率は６４％であり、群５が最小の腫瘍重量及び最高の薬物阻害率であった。
【０１００】
本実施例における結果は、坦腫瘍マウスモデルにおいて、エンドスタチン変異体が、１２ｍｇ／ｋｇ／週の用量で好ましい腫瘍成長阻害効果を有することを実証した。ｍＰＥＧ−ＥＳの阻害率は約４０％であり；Ｍ００３及びＭ００７の阻害率は、ｍＰＥＧ−ＥＳとほぼ等しい及びわずかに低く；ＭＺ１０１の阻害効果は、ｍＰＥＧ−ＥＳより良く、最良の治療効果と最高の腫瘍阻害率（約６０〜７０％）を示した。
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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