(57)【要約】本発明の態様は、単離された酵素の存在下またはそれらの酵素を発現する組換え宿主細胞の存在下での二官能性または三官能性C7アルカンの生合成のための方法に関する。二官能性または三官能性C7アルカンは、ナイロン-7、ナイロン-7,x、ナイロン-x,7およびポリエステルの生産における中間体として有用である。2014525741.tif 000030
2014525741.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
2,6ジアミノピメレート（2,6 DAP）およびα-アミノピメレート（AAP）から選択される化合物を、2,6 DAPの6-アミノ-2-ヘプテン二酸（6A2HA）への還元的脱アミノ化またはAAPの2-ヘプテン二酸（2 HDA）への還元的脱アミノ化を触媒する酵素と接触させる段階を含む、化合物を変換する方法であって、ここで6A2HAまたは2 HDAが生成される、方法。
【請求項２】
化合物が2,6 DAPである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
6A2HAを、6A2HAのAAPへのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAAPが生成される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
AAPを、AAPの2 HDAへの還元的脱アミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで2 HDAが生成される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
2 HDAを、2 HDAのピメリン酸（PA）へのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPAが生成される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
PAを、PAのピメリン酸セミアルデヒド（PAS）へのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
PASを、PASの7-アミノヘプタン酸（7 AHA）へのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
7 AHAを、7 AHAのエナントラクタム（ENTL）へのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、請求項7記載の方法。
【請求項９】
7 AHAを、7 AHAの7-アミノヘプタナール（7 AHT）へのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAHTが生成される、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
7 AHTを、1,7-ジアミノヘプタン（1,7 DAH）を生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
2 HDAを、2-ヘプテン二酸-補酵素A（2 HDA-CoA）を生成するための2 HDAへの補酵素A（CoA）の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで2 HDA-CoAが生成される、請求項4記載の方法。
【請求項１２】
2 HDA-CoAを、2 HDA-CoAのピメロイルCoA（PCoA）へのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPCoAが生成される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
PCoAを、PCoAのPAへのチオエステル加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPAが生成される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
PAを、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
AAPを、α-ケトピメレート（AKP）を生成するためのAAPへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAKPが生成される、請求項4記載の方法。
【請求項２０】
AKPを、AKPのα-ヒドロキシピメレート（AHP）へのケトン還元を触媒する1つまたは複数の酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAHPが生成される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
AHPを、α-ヒドロキシピメレート（AHP-CoA）を生成するためのAHPへのCoAの転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAHP-CoAが生成される、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
AHP-CoAを、AHP-CoAの2 HDA-CoAへの脱水を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで2 HDA-CoAが生成される、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
2 HDA-CoAを、2 HDA-CoAのPCoAへのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPCoAが生成される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
PCoAを、PCoAのPAへのチオエステル加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPAが生成される、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
PAを、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、請求項26記載の方法。  
【請求項２９】
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
AHPを、AHPの2 HDAへの脱水を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで2 HDAが生成される、請求項20記載の方法。
【請求項３１】
2 HDAを、2 HDAのピメリン酸（PA）へのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPAが生成される、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
PAを、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
2 HDAを、2 HDA-CoAを生成するための2 HDAへのCoAの転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで2 HDA-CoAが生成される、請求項30記載の方法。
【請求項３８】
2 HDA-CoAを、2 HDA-CoAのPCoAへのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPCoAが生成される、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
PCoAを、PCoAのPAへのチオエステル加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPAが生成される、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
PAを、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、請求項41記載の方法。
【請求項４４】
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
AKPを、AKPのα-ケトスベレート（AKS）へのα-ケト酸鎖伸長を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAKSが生成される、請求項19記載の方法。
【請求項４６】
AKSを、α-アミノスベレート（AAS）を生成するためのAKSへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAASが生成される、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
AASを、AASの7 AHAへのα-ケト酸脱カルボキシル化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、請求項47記載の方法。
【請求項５０】
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
AKSを、AKSのPASへのα-ケト酸脱カルボキシル化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、請求項45記載の方法。
【請求項５２】
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、請求項52記載の方法。
【請求項５５】
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
PCoAを、PCoAのPASへの還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、請求項23記載の方法。
【請求項５７】
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、請求項57記載の方法。
【請求項６０】
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、請求項59記載の方法。
【請求項６１】
PCoAを、PCoAのPASへの還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、請求項38記載の方法。
【請求項６２】
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、請求項62記載の方法。
【請求項６５】
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、請求項64記載の方法。
【請求項６６】
6A2HAおよび2 HDAから選択される化合物を、6A2HAのAAPへのエノエート還元または2 HDAのPAへのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここでAAPまたはPAが生成される、化合物を変換する方法。
【請求項６７】
PCoAおよびピメロイル-［acp］（PACP）から選択される化合物を、PCoAまたはPACPのPAへのチオエステラ-ゼ加水分解を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここでPAが生成される、化合物を変換する方法。
【請求項６８】
PAを、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、請求項67記載の方法。
【請求項６９】
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、請求項68記載の方法。
【請求項７０】
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、請求項69記載の方法。
【請求項７１】
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、請求項69記載の方法。
【請求項７２】
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、請求項71記載の方法。
【請求項７３】
AKPを、AKPのAHPへのケトン還元を触媒する1つまたは複数の酵素と接触させる段階を含み、ここでAHPが生成される、化合物を変換する方法。
【請求項７４】
AKPがα-ケトアジペートまたはα-ケトグルタレートの鎖伸長によって生成される、請求項73記載の方法。
【請求項７５】
AHPをPAまたはPCoAに変換する段階をさらに含む、請求項73記載の方法。
【請求項７６】
α-ケト酸鎖の伸長によってAKPをAKSに変換する段階を含む、化合物を変換する方法。
【請求項７７】
AKPがα-ケトアジペートまたはα-ケトグルタレートの鎖伸長によって生成される、請求項76記載の方法。
【請求項７８】
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここで7 AHAが生成される、化合物を変換する方法。
【請求項７９】
PASが、2,6 DAP、AKG、PCoAまたはPACPからの変換によって得られる、請求項78記載の方法。
【請求項８０】
PCoAおよびPACPから選択される化合物を、該化合物のPASへの還元を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここでPASが生成される、化合物を変換する方法。
【請求項８１】
PASを、PASの7-ヒドロキシヘプタン酸（7 HHA）へのアルコール脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここで7 HHAが生成される、化合物を変換する方法。
【請求項８２】
前記酵素、または前記1つまたは複数の酵素が、精製された酵素である、請求項1〜81のいずれか一項記載の方法。
【請求項８３】
前記酵素、または前記1つまたは複数の酵素が、細胞溶解物または部分精製された細胞溶解物中に存在する、請求項1〜81のいずれか一項記載の方法。
【請求項８４】
前記酵素、または前記1つまたは複数の酵素が、該酵素を組換え発現する細胞中に存在する、請求項1〜81のいずれか一項記載の方法。
【請求項８５】
酵素がアンモニアリアーゼを含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項８６】
アンモニアリアーゼが、EC 4.3.1におけるアンモニアリアーゼである、請求項85記載の方法。
【請求項８７】
EC 4.3.1におけるアンモニアリアーゼが、EC 4.3.1.1、EC 4.3.1.2、EC 4.3.1.3、EC 4.3.1.12、EC 4.3.1.13、またはEC 4.3.1.24を含む、請求項86記載の方法。
【請求項８８】
酵素がエン酸レダクターゼを含む、請求項3、5、12、23、31、38、および66のいずれか一項記載の方法。
【請求項８９】
エン酸レダクターゼがEC 1.3.1におけるエン酸レダクターゼを含む、請求項88記載の方法。
【請求項９０】
EC 1.3.1におけるエン酸レダクターゼがEC 1.3.1.31を含む、請求項89記載の方法。
【請求項９１】
酵素がカルボン酸レダクターゼを含む、請求項6、14、25、32、40、および68のいずれか一項記載の方法。
【請求項９２】
カルボン酸レダクターゼがEC 1.2.99におけるカルボン酸レダクターゼを含む、請求項91記載の方法。
【請求項９３】
EC 1.2.99におけるカルボン酸レダクターゼがEC 1.2.99.6を含む、請求項92記載の方法。
【請求項９４】
酵素がωトランスアミナーゼを含む、請求項7、15、26、33、52、57、62、69、および78のいずれか一項記載の方法。
【請求項９５】
ωトランスアミナーゼがEC 2.6.1におけるトランスアミナーゼを含む、請求項94記載の方法。
【請求項９６】
EC 2.6.1におけるωトランスアミナーゼが、EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.2、EC 2.6.1.7、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.36、EC 2.6.1.39、EC 2.6.1.42、またはEC 2.6.1.68を含む、請求項95記載の方法。
【請求項９７】
酵素が、チオエステラーゼ、酸-チオールリガーゼ、またはCoAトランスフェラーゼを含む、請求項13、24、39、56、61、および67のいずれか一項記載の方法。
【請求項９８】
チオエステラーゼが、EC 3.1.2におけるチオエステラーゼを含む、請求項97記載の方法。
【請求項９９】
EC 3.1.2におけるチオエステラーゼが、EC 3.1.2.18、EC 3.1.2.19、またはEC 3.1.2.20を含む、請求項98記載の方法。
【請求項１００】
酸-チオールリガーゼがEC 6.2.1における酸-チオールリガーゼを含む、請求項97記載の方法。
【請求項１０１】
EC 6.2.1における酸-チオールリガーゼが、EC 6.2.1.3、EC 6.2.1.14、またはEC 6.2.1.23を含む、請求項100記載の方法。
【請求項１０２】
CoAトランスフェラーゼが、EC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼを含む、請求項97記載の方法。
【請求項１０３】
EC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼがEC 2.8.3.12またはEC 2.8.3.13を含む、請求項102記載の方法。
【請求項１０４】
酵素がアミノトランスフェラーゼを含む、請求項10、18、19、29、36、44、46、50、60、65、および72のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０５】
アミノトランスフェラーゼがEC 2.6.1におけるアミノトランスフェラーゼを含む、請求項104記載の方法。
【請求項１０６】
EC 2.6.1におけるアミノトランスフェラーゼがEC 2.6.1.67を含む、請求項105記載の方法。
【請求項１０７】
1つまたは複数の酵素がカルボニルレダクターゼを含む、請求項20または73記載の方法。
【請求項１０８】
カルボニルレダクターゼがEC.1.1.1.184を含む、請求項107記載の方法。
【請求項１０９】
酵素がα-ケト酸デカルボキシラーゼを含む、請求項47または51記載の方法。
【請求項１１０】
酵素が脂肪アシルCoAレダクターゼを含む、請求項56、61、または80記載の方法。
【請求項１１１】
脂肪アシルCoAレダクターゼがEC 1.2.1におけるレダクターゼを含む、請求項110記載の方法。
【請求項１１２】
EC 1.2.1における脂肪アシルCoAがEC 1.2.1.50を含む、請求項111記載の方法。
【請求項１１３】
酵素がアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む、請求項9、15、28、35、43、49、55、59、64、および71のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１４】
アルデヒドデヒドロゲナーゼが、EC 1.2.1におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む、請求項113記載の方法。
【請求項１１５】
EC 1.2.1におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼがEC 1.2.1.4またはEC 1.2.1.63を含む、請求項114記載の方法。
【請求項１１６】
酵素がCoAトランスフェラーゼを含む、請求項11、21、および37のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１７】
CoAトランスフェラーゼが、EC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼを含む、請求項116記載の方法。
【請求項１１８】
EC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼがEC 2.8.3.12またはEC 2.8.3.13を含む、請求項117記載の方法。
【請求項１１９】
酵素がアミドヒドロラーゼである、請求項8、16、27、34、42、48、53、58、63、および70のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２０】
酵素がヒドロリアーゼを含む、請求項22または30記載の方法。
【請求項１２１】
ヒドロリアーゼがEC 4.2.1におけるヒドロリアーゼを含む、請求項120記載の方法。
【請求項１２２】
EC 4.2.1におけるヒドロリアーゼが、EC 4.2.1.2、EC 4.2.1.59、4.2.1.61、4.1.2.17、または4.1.2.18を含む、請求項121記載の方法。
【請求項１２３】
α-ケト酸鎖の伸長が、AksA、AksD、AksE、および AksFを含む酵素の1つまたは複数のセットによって触媒される、請求項45、74、76、および77のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２４】
AksAがEC 2.3.3におけるAksA酵素を含む、請求項123記載の方法。
【請求項１２５】
EC 2.3.3におけるAksA酵素がEC 2.3.3.13または2.3.3.14を含む、請求項124記載の方法。
【請求項１２６】
AksDがEC 4.2.1におけるAksD酵素を含む、請求項123記載の方法。
【請求項１２７】
EC 4.2.1におけるAksD酵素がEC 4.2.1.33を含む、請求項126記載の方法。
【請求項１２８】
AksFがEC 1.1.1におけるAksF酵素を含む、請求項123記載の方法。
【請求項１２９】
EC 1.1.1におけるAksF酵素がEC 1.1.1.85を含む、請求項128記載の方法。
【請求項１３０】
1つまたは複数のα-ケト酸鎖伸長酵素がメタン生成細菌に由来する、請求項45、74、76、および77のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３１】
酵素がアルコールデヒドロゲナーゼを含む、請求項81記載の方法。
【請求項１３２】
アルコールデヒドロゲナーゼがEC.1.1.1.1またはEC 1.1.1.2を含む、請求項131記載の方法。
【請求項１３３】
アルコールデヒドロゲナーゼが、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）由来のadhA、ザイモモナス・モビリス由来のadhB、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）由来のブタノールデヒドロゲナーゼ、サッカロミセス（Saccharomyces）ADHIV、およびS.セレビシエ（S.cerevisiae）由来のADH6から選択される、請求項131記載の方法。
【請求項１３４】
PCoAまたはPACPがアセチルCoAまたはベンゾイルCoAから誘導される、請求項67または80記載の方法。
【請求項１３５】
アセチルCoAが、セルロース系原材料、糖類、グリセロール、または脂肪酸を含む再生可能な原材料から誘導される、請求項134記載の方法。
【請求項１３６】
アセチルCoAが、SynGas、メタン、またはメタノールから誘導される、請求項134記載の方法。
【請求項１３７】
ベンゾイルCoAが多環式芳香族炭化水素から誘導される、請求項134記載の方法。
【請求項１３８】
2,6 DAPが、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼを欠くリジン産生生物によって生産される、請求項1、2、および79のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３９】
2,6 DAPが再生可能な原材料から誘導される、請求項1、2、79、および138のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４０】
再生可能な原材料が糖類を含む、請求項139記載の方法。
【請求項１４１】
生物由来のナイロン-7、ナイロン-7,x、またはナイロン-x,7。
【請求項１４２】
PASまたはAASから誘導される7 AHAを重合させる段階を含む工程によって生産されるナイロン-7。
【請求項１４３】
PCoA、PACP、または2 HDAから誘導されるPA、および7 AHAから誘導される1,7 DHAを重合させる段階を含む工程によって生産されるナイロン-7,7。
【請求項１４４】
（i）請求項2〜7;
（ii）請求項2〜4および11〜15;
（iii）請求項2〜4および19〜26;
（iv）請求項2〜4、19〜20、および30〜33;
（v）請求項2〜4、19〜20、30、および37〜41;
（vi）請求項2〜4、19、および45〜47;
（vii）請求項2〜4、19、45、および51〜52;
（viii）請求項2〜4、19〜23、および56〜57;
（ix）請求項2〜4、19〜20、30、37〜38、および61〜62;
（x）請求項67〜69;
（xi）請求項73〜75;
（xii）請求項76〜77;
（xiii）請求項78〜79;または 
（xiv）請求項80
の方法段階を含む方法によって作製される7 AHAを重合させる段階を含む工程によって生産されるナイロン-7。
【請求項１４５】
（a）請求項2〜7および9〜10;
（b）請求項2〜4、11〜15、および17〜18;
（c）請求項2〜4、19〜26、および28〜29;
（d）請求項2〜4、19〜20、30〜33、および35〜36;
（e）請求項2〜4、19〜20、37〜41、および43〜44;
（f）請求項2〜4、19、45〜47、および49〜50;
（g）請求項2〜4、19、45、51〜52、および54〜55;
（h）請求項2〜4、19〜23、および56〜60;
（i）請求項2〜4、19〜20、37〜38、および61〜65;
（j）請求項67〜69および71〜72;
（k）請求項73〜75;
（1）請求項76〜77;
（m）請求項78〜79;または
（n）請求項80
の方法段階を含む方法によって作製される1,7 DHA、ならびに
（o）請求項2〜5;
（p）請求項2〜4および11〜13;
（q）請求項2〜4および19〜24;
（r）請求項2〜4、19〜20、および30〜31;
（s）請求項2〜4、19〜20、30、および37〜39;
（t）請求項67;または
（u）請求項73〜75
の方法段階を含む方法によって作製されるPAを重合させる段階を含む工程によって生産される、ナイロン7,7。
【請求項１４６】
宿主細胞の実質的に純粋な培養物であって、そのうちの実質的な数が、7 AHA、PA、1,7 DAH、ENTL、および7 HHAから選択される１つまたは複数のポリマー単量体の生合成に関与する１つまたは複数の酵素をコードする1つまたは複数の外因性核酸を含み、該酵素が、アシルCoAレダクターゼ、アシル-［acp］レダクターゼ、チオエステルヒドロラーゼ、アンモニアリアーゼ、エン酸レダクターゼ、アミノトランスフェラーゼ、CoAトランスフェラーゼ、チオエステラーゼ、酸-チオールリガーゼ、ヒドロリアーゼ、カルボニルレダクターゼ、チオエステラーゼ、カルボン酸レダクターゼ、脂肪アシルCoAレダクターゼ、ω-トランスアミナーゼ、α-ケト酸デカルボキシラーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、およびα-ケト酸鎖の伸長を触媒する酵素からなる群より選択される、宿主細胞の実質的に純粋な培養物。
【請求項１４７】
前記細胞が原核細胞である、請求項146記載の培養物。
【請求項１４８】
原核細胞が、大腸菌（Escherichia coli）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、スフィンゴモナス属（sphingomonads）、シュードモナス属（pseudomonads）、メタン生成細菌（例えばメタノバクテリウム・オートトロフィカム（Methanobacterium autotrophicum））、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、サルモネラ属（Salmonella）、バークホルデリア属（Burkholderia）、モラクセラ属（Moraxella）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、サイクロバクター属（Psychrobacter）、サーモトガ属（Thermotoga）、アシネトバクテリア（Acinetobacteria）、ロドバクター属（Rhodobacter）、アゾアルカス属（Azoarcus）、ロドスピリルム属（Rhodospirillum）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、連鎖球菌（streptococci）、乳酸杆菌（lactobacilli）、ノカルジア属（Nocardia）、バチルス属（Bacillus）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、クロストリジウム属（Clostridium）、ストレプトミセス属（Streptomyces）、およびアルスロバクター属（Arthobacter）からなる群より選択される、請求項147記載の培養物。
【請求項１４９】
前記細胞が真核細胞である、請求項146記載の培養物。
【請求項１５０】
真核細胞が真菌細胞である、請求項149記載の培養物。
【請求項１５１】
真菌細胞が酵母細胞である、請求項150記載の培養物。
【請求項１５２】
酵母細胞が、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、カンジダ属（Candida）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、リゾプス属（Rhizopus）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、ピキア属（Pichia）、トリコスポロン属（Trichosporon）、イサタケンキア属（Issatchenka）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）、デバリオミセス属（Debaryomyces）、ハンセヌラ属（Hansenula）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、シュワニオミセス属（Schwanniomyces）、およびリポミセス属（Lipomyces）からなる群より選択される酵母の細胞である、請求項151記載の培養物。
【請求項１５３】
カンジダ細胞が、C.トロピカリス（C.tropicalis）、C.アルビカンス（C.albicans）、C.クロアカエ（C.cloacae）、C.グイリエルモンディイ（C.guillermondii）、C.インターメディア（C.intermedia）、C.マルトサ（C.maltosa）、C.パラプシロシス（C.parapsilosis）、およびC.ゼイレノイデス（C.zeylenoides）からなる群より選択される酵母の細胞である、請求項152記載の培養物。
【請求項１５４】
真菌細胞が、アスペルギルス属（Aspergillus）、エクソフィアラ属（Exophiala）、ケカビ属（Mucor）、トリコデルマ属（Trichoderma）、クラドスポリウム属（Cladosporium）、ファネロケーテ属（Phanerochaete）、クラドフィアロフォラ属（Cladophialophora）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、スケドスポリウム属（Scedosporium）、およびオフィオストマ属（Ophiostoma）からなる群より選択される真菌の細胞である、請求項150記載の培養物。
【請求項１５５】
アンモニアリアーゼがEC 4.3.1におけるアンモニアリアーゼを含む、請求項146記載の培養物。
【請求項１５６】
EC 4.3.1におけるアンモニアリアーゼが、EC 4.3.1.1、EC 4.3.1.2、EC 4.3.1.3、EC 4.3.1.12、EC 4.3.1.13、またはEC 4.3.1.24を含む、請求項155記載の培養物。
【請求項１５７】
エン酸レダクターゼがEC 1.3.1におけるエン酸レダクターゼを含む、請求項146記載の培養物。
【請求項１５８】
EC 1.3.1におけるエン酸レダクターゼがEC 1.3.1.31を含む、請求項157記載の培養物。
【請求項１５９】
カルボン酸レダクターゼがEC 1.2.99におけるカルボン酸レダクターゼを含む、請求項146記載の培養物。
【請求項１６０】
EC 1.2.99におけるカルボン酸レダクターゼがEC 1.2.99.6を含む、請求項159記載の培養物。
【請求項１６１】
ω-トランスアミナーゼがEC 2.6.1におけるトランスアミナーゼを含む、請求項160記載の培養物。
【請求項１６２】
EC 2.6.1におけるω-トランスアミナーゼが、EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.2、EC 2.6.1.7、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.36、EC 2.6.1.39、EC 2.6.1.42、またはEC 2.6.1.68を含む、請求項161記載の培養物。
【請求項１６３】
チオエステラーゼがEC 3.1.2におけるチオエステラーゼを含む、請求項146記載の培養物。
【請求項１６４】
EC 3.1.2におけるチオエステラーゼが、EC 3.1.2.18、EC 3.1.2.19、またはEC 3.1.2.20を含む、請求項163記載の培養物。
【請求項１６５】
酸-チオールリガーゼがEC 6.2.1における酸-チオールリガーゼを含む、請求項146記載の培養物。
【請求項１６６】
EC 6.2.1における酸-チオールリガーゼが、EC 6.2.1.3、EC 6.2.1.14、またはEC 6.2.1.23を含む、請求項165記載の培養物。
【請求項１６７】
CoAトランスフェラーゼがEC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼを含む、請求項146記載の培養物。
【請求項１６８】
EC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼがEC 2.8.3.12またはEC 2.8.3.13を含む、請求項167記載の培養物。
【請求項１６９】
アミノトランスフェラーゼがEC 2.6.1におけるアミノトランスフェラーゼを含む、請求項146記載の培養物。
【請求項１７０】
EC 2.6.1におけるアミノトランスフェラーゼがEC 2.6.1.67を含む、請求項169記載の培養物。
【請求項１７１】
カルボニルレダクターゼがEC.1.1.1.184を含む、請求項146記載の培養物。
【請求項１７２】
脂肪アシルCoAレダクターゼがEC 1.2.1におけるレダクターゼを含む、請求項146記載の培養物。
【請求項１７３】
EC 1.2.1における脂肪アシルCoAがEC 1.2.1.50を含む、請求項172記載の培養物。
【請求項１７４】
アルデヒドデヒドロゲナーゼがEC 1.2.1におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む、請求項146記載の培養物。
【請求項１７５】
EC 1.2.1におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼがEC 1.2.1.4またはEC 1.2.1.63を含む、請求項174記載の培養物。
【請求項１７６】
ヒドロリアーゼがEC 4.2.1におけるヒドロリアーゼを含む、請求項146記載の培養物。
【請求項１７７】
EC 4.2.1におけるヒドロリアーゼが、EC 4.2.1.2、EC 4.2.1.59、4.2.1.61、4.1.2.17、または4.1.2.18を含む、請求項176記載の培養物。
【請求項１７８】
α-ケト酸鎖の伸長を触媒する酵素が、AksA、AksD、AksE、およびAksF酵素を含む酵素のセットから選択される1つまたは複数の酵素を含む、請求項146記載の培養物。
【請求項１７９】
AksAがEC 2.3.3におけるAksA酵素を含む、請求項178記載の培養物。
【請求項１８０】
EC 2.3.3におけるAksA酵素がEC 2.3.3.13または 2.3.3.14を含む、請求項179記載の培養物。
【請求項１８１】
AksDがEC 4.2.1におけるAksD酵素を含む、請求項178記載の培養物。
【請求項１８２】
EC 4.2.1におけるAksD酵素がEC 4.2.1.33を含む、請求項181記載の培養物。
【請求項１８３】
AksFがEC 1.1.1におけるAksF酵素を含む、請求項178記載の培養物。
【請求項１８４】
EC 1.1.1におけるAksF酵素がEC 1.1.1.85を含む、請求項183記載の培養物。
【請求項１８５】
アルコールデヒドロゲナーゼがEC.1.1.1.1またはEC 1.1.1.2を含む、請求項146記載の培養物。
【請求項１８６】
アルコールデヒドロゲナーゼが、ザイモモナス・モビリス由来のadhA、ザイモモナス・モビリス由来のadhB、クロストリジウム・アセトブチリカム由来のブタノールデヒドロゲナーゼ、サッカロミセスADHIV、およびS.セレビシエ由来のADH6から選択される、請求項146記載の培養物。
【請求項１８７】
7 AHA、PA、1,7 DAH、ENTL、および7 HHAから選択される1つまたは複数のポリマー単量体の生合成に関与する１つまたは複数の外因性核酸をコードする１つまたは複数の外因性核酸を含む単離された細胞であって、該酵素が、アシルCoAレダクターゼ、アシル-［acp］レダクターゼ、チオエステルヒドロラーゼ、アンモニアリアーゼ、エン酸レダクターゼ、アミノトランスフェラーゼ、CoAトランスフェラーゼ、チオエステラーゼ、酸-チオールリガーゼ、ヒドロリアーゼ、カルボニルレダクターゼ、カルボン酸レダクターゼ、脂肪アシルCoAレダクターゼ、ω-トランスアミナーゼ、α-ケト酸デカルボキシラーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、およびα-ケト酸鎖の伸長を触媒する酵素からなる群より選択される、単離された細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2011年6月30日出願の米国特許仮出願第61/503,043号、ならびにすべて2011年12月21日出願の米国特許仮出願第61/578,265号;同第61/578,272号および同第61/578,289号の恩典を主張するものであり、これらはすべてその全体が、本明細書中に完全に明記されているかのごとくに参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明の態様は、1つまたは複数の単離された酵素の存在下または1つまたは複数の酵素を発現する組換え宿主細胞の存在下で二官能性または三官能性C7アルカンを生合成生産するための方法に関する。二官能性または三官能性C7アルカンは、例えばナイロン-7、ナイロン-7,xおよび/またはナイロン-x,7の生産における中間体として有用である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
化学工業による持続可能な活動の推進は、エネルギー使用量を減少させること、原料を再利用すること、および物品の生産の間に生成される副産物を低減することに焦点が置かれている。しかし、化学工業は基本的な原材料として石油と天然ガスに強く依存する。主要な石油化学工程に関連した最適化の状態を考慮すると、エネルギー、排出物、およびコストを現在のレベルより低く抑えるためには原材料の使用および製造設計における大幅な変更が必要である。バイオテクノロジーは、植物由来の糖類のような再生可能な炭水化物、または脂肪酸のような他の再生可能な原材料からの工業化学中間体および最終産物の生産のための新たなアプローチを提供する。加えて、バイオテクノロジーはまた、バイオディーゼル生産からのグリセロールのような廃棄物もしくは価値の低い一連の物質を利用する方法、またはベンゼン、トルエンおよび多環式芳香族炭化水素（PAH）などの石油化学由来の原材料を、既存の化学工程よりも環境に対して有害でないバイオプロセスにおける有用な生成物に変換する方法も提供する。
【０００４】
米国特許第2010/0203600号（特許文献1）および国際公開公報第2011/031147号（特許文献2）は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。特に様々な再生可能および非再生可能な原材料からナイロン-7、ナイロン-7,x、ナイロン-x,7およびポリエステルの化学中間体ならびに最終産物としてのナイロン-7、ナイロン-7,x、ナイロン-x,7およびポリエステルを導くコスト効率のよい生合成経路が当技術分野において必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第2010/0203600号
【特許文献２】国際公開公報第2011/031147号
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、少なくとも一部には、ナイロン-7、ナイロン-x,7、ナイロン-7,xおよびポリエステルを生産するのに有用な中間体（単量体）である二官能性または三官能性C7アルカンを生合成するための酵素系および組換え宿主の開発に基づく。特に、本明細書で述べるように、ナイロン-7、ナイロン-7,x、ナイロン-x,7およびポリエステルの生産において有用な中間体は、植物由来の糖類およびグリセロールなどの再生可能な原材料から、またはベンゼンもしくはシクロヘキサンカルボキシレートなどの石油化学由来の原材料から生合成によって生成することができる。一部の態様では、二官能性または三官能性C7アルカンの生成は、最終的には共通の中間体であるピメリン酸セミアルデヒド（7-オキソヘプタノエートとしても知られる）を介して進行するが、ピメリン酸セミアルデヒドを生成するために使用できる多数の異なる原材料および多数の方法が存在する。図1は、様々な二官能性C7アルカンへのピメリン酸セミアルデヒドの生物転換を示す概略図である。
【０００７】
例えば、ピメリン酸セミアルデヒドは、ピメロイル-補酵素A（CoA）、ピメロイル-［アシルキャリアータンパク質（acp）］、ピメリン酸（ヘプタン1,7-ジオエートとしても知られる）またはα-ケトスベレートから誘導することができる。本明細書で述べるように、ピメロイルCoAおよびピメロイル-［acp］は、天然の代謝経路における中間体としてピメロイルCoAまたはピメロイル-［acp］を形成する多数の様々な天然の代謝経路を含む、多数の供給源から誘導することができる。
【０００８】
加えて、ピメロイルCoAおよびピメリン酸はまた、対応するエノエート、2-ヘプテン二酸またはその対応するCoAエステルから誘導することもできる。一部の態様では、これらのC7  2-エノエートはD,L-ジアミノピメレートから誘導される。一部の態様では、二官能性C7アルカン（例えば7アミノヘプタン酸）の生成はα-ケトスベレートまたはα-アミノスベレートを介して進行し、これらはD,L-ジアミノピメレートから誘導することができる。他の態様では、α-ケトスベレートまたはα-アミノスベレートはα-ケトピメレートから誘導される。
【０００９】
より具体的には、本明細書は、ナイロン-7、ナイロン-7,7およびポリエステルの製造に有用な中間体を生成するために化合物を変換する様々な方法を提供する。任意の1つの方法のすべての可能な段階を実施する必要はなく、所望化合物が得られたときに方法のいずれかを終了することができる。したがって、例えばピメリン酸、7-アミノヘプタン酸、エナントラクタム、1,7-ジアミノヘプタンまたは7-ヒドロキシヘプタン酸の生成後に任意の方法を終了することができる。
【００１０】
化合物を変換する第1の方法は、2,6ジアミノピメレート（2,6 DAP）およびα-アミノピメレート（AAP）から選択される化合物を、6-アミノ-2-ヘプテン二酸（6A2HA）または2-ヘプテン二酸（2 HDA）が生成されるように、2,6 DAPの6A2HAへの還元的脱アミノ化またはAAPの2 HDAへの還元的脱アミノ化を触媒する酵素と接触させる段階を含み得る。
【００１１】
化合物は2,6 DAPであってよく、第1の方法は、6A2HAを、AAPが生成されるように、6A2HAのAAPへのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み得る。
【００１２】
AAPを、2 HDAが生成されるように、AAPの2 HDAへの還元的脱アミノ化を触媒する酵素と接触させることができる。
【００１３】
2 HDAを、ピメリン酸（PA）が生成されるように、2 HDAのPAへのエノエート還元を触媒する酵素と接触させることができる。
【００１４】
PAを、ピメリン酸セミアルデヒド（PAS）が生成されるように、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させることができる。
【００１５】
PASを、7-アミノヘプタン酸（7 AHA）が生成されるように、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させることができる。
【００１６】
7 AHAを、エナントラクタム（ENTL）が生成されるように、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させることができる。
【００１７】
化合物を変換する第2の方法は、7 AHAの生成までの第1の方法のすべての段階を実施した後、7 AHAを、7-アミノヘプタナール（7 AHT）が生成されるように、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階を含み得る。
【００１８】
7 AHTを、1,7-ジアミノヘプタン（1,7 DAH）が生成されるように、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させることができる。
【００１９】
化合物を変換する第3の方法は、2 HDAの生成までの第1の方法のすべての段階を実施した後、2 HDAを、2-ヘプテン二酸-補酵素A（2 HDA-CoA）が生成されるように、2 HDA-CoAを生成するための2 HDAへの補酵素A（CoA）の転移を触媒する酵素と接触させる段階を含み得る。
【００２０】
2 HDA-CoAを、ピメロイルCoA（PCoA）が生成されるように、2 HDA-CoAのPCoAへのエノエート還元を触媒する酵素と接触させることができる。
【００２１】
PCoAを、PAが生成されるように、PCoAのPAへのチオエステル加水分解を触媒する酵素と接触させることができる。
【００２２】
PAを、PASが生成されるように、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させることができる。
【００２３】
PASを、7 AHAが生成されるように、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させることができる。
【００２４】
7 AHAを、ENTLが生成されるように、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させることができる。
【００２５】
化合物を変換する第4の方法は、7 AHAの生成までの第3の方法のすべての段階を実施した後、7 AHAを、7 AHTが生成されるように、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階を含み得る。
【００２６】
7 AHTを、1,7 DAHが生成されるように、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させることができる。
【００２７】
化合物を変換する第5の方法は、AAPの生成までの第1の方法のすべての段階を実施した後、AAPを、α-ケトピメレート（AKP）が生成されるように、AKPを生成するためのAAPへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階を含み得る。
【００２８】
AKPを、α-ヒドロキシピメレート（AHP）が生成されるように、AKPのAHPへのケトン還元を触媒する1つまたは複数の酵素と接触させることができる。
【００２９】
AHPを、α-ヒドロキシピメレート（AHP-CoA）が生成されるように、AHP-CoAを生成するためのAHPへのCoAの転移を触媒する酵素と接触させることができる。
【００３０】
AHP-CoAを、2 HDA-CoAが生成されるように、AHP-CoAの2 HDA-CoAへの脱水を触媒する酵素と接触させることができる。
【００３１】
2 HDA-CoAを、PCoAが生成されるように、2 HDA-CoAのPCoAへのエノエート還元を触媒する酵素と接触させることができる。
【００３２】
PCoAを、PAが生成されるように、PCoAのPAへのチオエステル加水分解を触媒する酵素と接触させることができる。
【００３３】
PAを、PASが生成されるように、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させることができる。
【００３４】
PASを、7 AHAが生成されるように、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させることができる。
【００３５】
7 AHAを、ENTLが生成されるように、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させることができる。
【００３６】
化合物を変換する第6の方法は、7 AHAの生成までの第5の方法のすべての段階を実施した後、7 AHAを、7 AHTが生成されるように、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階を含み得る。
【００３７】
7 AHTを、1,7 DAHが生成されるように、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させることができる。
【００３８】
化合物を変換する第7の方法は、AHPの生成までの第5の方法のすべての段階を実施した後、AHPを、2 HDAが生成されるように、AHPの2 HDAへの脱水を触媒する酵素と接触させる段階を含み得る。
【００３９】
2 HDAを、ピメリン酸（PA）が生成されるように、2 HDAのPAへのエノエート還元を触媒する酵素と接触させることができる。
【００４０】
PAを、PASが生成されるように、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させることができる。
【００４１】
PASを、7 AHAが生成されるように、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させることができる。
【００４２】
7 AHAを、ENTLが生成されるように、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させることができる。
【００４３】
化合物を変換する第8の方法は、7 AHAの生成までの第5の方法のすべての段階を実施した後、7 AHAを、7 AHTが生成されるように、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階を含み得る。
【００４４】
7 AHTを、1,7 DAHが生成されるように、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させることができる。
【００４５】
化合物を変換する第9の方法は、2 HDAの生成までの第7の方法のすべての段階を実施した後、2 HDAを、2 HDA-CoAが生成されるように、2 HDA-CoAを生成するための2 HDAへのCoAの転移を触媒する酵素と接触させる段階を含み得る。
【００４６】
2 HDA-CoAを、PCoAが生成されるように、2 HDA-CoAのPCoAへのエノエート還元を触媒する酵素と接触させることができる。
【００４７】
PCoAを、PAが生成されるように、PCoAのPAへのチオエステル加水分解を触媒する酵素と接触させることができる。
【００４８】
PAを、PASが生成されるように、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させることができる。
【００４９】
PASを、7 AHAが生成されるように、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させることができる。
【００５０】
7 AHAを、ENTLが生成されるように、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させることができる。
【００５１】
化合物を変換する第10の方法は、7 AHAの生成までの第9の方法のすべての段階を実施した後、7 AHAを、7 AHTが生成されるように、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階を含み得る。
【００５２】
7 AHTを、1,7 DAHが生成されるように、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させることができる。
【００５３】
化合物を変換する第11の方法は、AKPの生成までの第5の方法のすべての段階を実施した後、AKPを、α-ケトスベレート（AKS）が生成されるように、AKPのAKSへのα-ケト酸鎖伸長を触媒する酵素と接触させる段階を含み得る。
【００５４】
AKSを、α-アミノスベレート（AAS）が生成されるように、AASを生成するためのAKSへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させることができる。AASを、7 AHAが生成されるように、AASの7 AHAへのα-ケト酸脱カルボキシル化を触媒する酵素と接触させることができる。
【００５５】
7 AHAを、ENTLが生成されるように、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させることができる。
【００５６】
化合物を変換する第12の方法は、7 AHAの生成までの第11の方法のすべての段階を実施した後、7 AHAを、7 AHTが生成されるように、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階を含み得る。
【００５７】
7 AHTを、1,7 DAHが生成されるように、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させることができる。
【００５８】
化合物を変換する第13の方法は、AKSの生成までの第11の方法のすべての段階を実施した後、AKSを、PASが生成されるように、AKSのPASへのα-ケト酸脱カルボキシル化を触媒する酵素と接触させる段階を含み得る。
【００５９】
PASを、7 AHAが生成されるように、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させることができる。
【００６０】
7 AHAを、ENTLが生成されるように、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させることができる。
【００６１】
化合物を変換する第14の方法は、7 AHAの生成までの第13の方法のすべての段階を実施した後、7 AHAを、7 AHTが生成されるように、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階を含み得る。
【００６２】
7 AHTを、1,7 DAHが生成されるように、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させることができる。
【００６３】
化合物を変換する第15の方法は、PCoAの生成までの第5の方法のすべての段階を実施した後、PCoAを、PASが生成されるように、PCoAのPASへの還元を触媒する酵素と接触させる段階を含み得る。
【００６４】
PASを、7 AHAが生成されるように、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させることができる。
【００６５】
7 AHAを、ENTLが生成されるように、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させることができる。
【００６６】
化合物を変換する第16の方法は、7 AHAの生成までの第15の方法のすべての段階を実施した後、7 AHAを、7 AHTが生成されるように、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階を含み得る。
【００６７】
7 AHTを、1,7 DAHが生成されるように、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させることができる。
【００６８】
化合物を変換する第17の方法は、PCoAの生成までの第9の方法のすべての段階を実施した後、PCoAを、PASが生成されるように、PCoAのPASへの還元を触媒する酵素と接触させる段階を含み得る。
【００６９】
PASを、7 AHAが生成されるように、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させることができる。
【００７０】
7 AHAを、ENTLが生成されるように、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させることができる。
【００７１】
化合物を変換する第18の方法は、7 AHAの生成までの第17の方法のすべての段階を実施した後、7 AHAを、7 AHTが生成されるように、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階を含み得る。
【００７２】
7 AHTを、1,7 DAHが生成されるように、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させることができる。
【００７３】
化合物を変換する第19の方法は、6A2HAおよび2 HDAから選択される化合物を、AAPまたはPAが生成されるように、6A2HAのAAPへのエノエート還元または2 HDAのPAへのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階を含み得る。AAPまたはPAの生成後に、第1から第18の方法において上述したAAPまたはPAの生成後の段階のいずれかを実施できることが理解される。
【００７４】
化合物を変換する第20の方法は、PCoAおよびピメロイル-［acp］（PACP）から選択される化合物を、PAが生成される、PCoAまたはPACPのPAへのチオエステラ-ゼ加水分解を触媒する酵素と接触させる段階を含み得る。
【００７５】
PAを、PASが生成されるように、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させることができる。
【００７６】
PASを、7 AHAが生成されるように、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させることができる。
【００７７】
7 AHAを、ENTLが生成されるように、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させることができる。
【００７８】
化合物を変換する第21の方法は、7 AHAの生成までの第20の方法のすべての段階を実施した後、7 AHAを、7 AHTが生成されるように、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階を含み得る。
【００７９】
7 AHTを、1,7 DAHが生成されるように、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させることができる。
【００８０】
化合物を変換する第22の方法は、AKPを、AHPが生成されるように、AKPのAHPへのケトン還元を触媒する1つまたは複数の酵素と接触させる段階を含み得る。AKPは、α-ケトアジペートまたはα-ケトグルタレートの鎖伸長によって生成することができた。AHPを、次にPAまたはPCoAに変換することができる。PAまたはPCoAの生成後に、第1から第18の方法において上述したPAまたはPCoAの生成後の段階のいずれかを実施できることが理解される。
【００８１】
化合物を変換する第23の方法は、α-ケト酸鎖の伸長によってAKPをAKSに変換する段階を含み得る。AKPは、α-ケトアジペートまたはα-ケトグルタレートの鎖伸長によって生成することができた。AKSの生成後に、第1から第18の方法において上述したAKSの生成後の段階のいずれかを実施できることが理解される。
【００８２】
化合物を変換する第24の方法は、PASを、7 AHAが生成されるように、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階を含み得る。PASは、2,6 DAP、AKG、PCoAまたはPACPからの変換によって得ることができた。AHAの生成後に、第1から第18の方法において上述したAHAの生成後の段階のいずれかを実施できることが理解される。
【００８３】
化合物を変換する第25の方法は、PCoAおよびPACPから選択される化合物を、PASが生成されるように、化合物のPASへの還元を触媒する酵素と接触させる段階を含み得る。PASの生成後に、第1から第18の方法において上述したPASの生成後の段階のいずれかを実施できることが理解される。さらに、PCoAの生成を導く第1から第18までおよび第22の方法において述べた段階のいずれかを、第25の方法の前に実施することができる。
【００８４】
化合物を変換する第26の方法は、PASを、7-ヒドロキシヘプタン酸（7 HHA）が生成されるように、PASの7 HHAへのアルコール脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階を含み得る。PASの生成を導く第1から第18までならびに第20、第22、第23および第25の方法において述べた段階のいずれかを、第26の方法の前に実施できることが理解される。
【００８５】
前述した方法のいずれにおいても、酵素は精製形態で使用することができる。あるいは、酵素は細胞溶解物または部分精製された細胞溶解物の形態で使用できる。加えて、酵素は、該酵素を組換え発現する細胞中に存在し得る。
【００８６】
前述した方法において、還元的脱アミノ化を触媒する酵素はアンモニアリアーゼを含み得る。アンモニアリアーゼは、EC 4.3.1、例えばEC 4.3.1.1、EC 4.3.1.2、EC 4.3.1.3、EC 4.3.1.12、EC 4.3.1.13またはEC 4.3.1.24に認められる。
【００８７】
前述した方法において、エノエート還元を触媒する酵素はエン酸レダクターゼを含み得る。エン酸レダクターゼは、EC 1.3.1、例えばEC 1.3.1.31に認められる。
【００８８】
前述した方法において、カルボン酸還元を触媒する酵素はカルボン酸レダクターゼを含み得る。カルボン酸レダクターゼは、EC 1.2.99、例えばEC 1.2.99.6に認められる。
【００８９】
前述した方法において、セミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素はω-トランスアミナーゼを含み得る。ω-トランスアミナーゼは、EC 2.6.1、例えばEC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.2、EC 2.6.1.7、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.36、EC 2.6.1.39、EC 2.6.1.42またはEC 2.6.1.68に認められる。
【００９０】
前述した方法において、チオエステル加水分解を触媒する酵素は、チオエステラーゼ、酸-チオールリガーゼまたはCoAトランスフェラーゼを含み得る。チオエステラーゼは、
EC 3.1.2、例えばEC 3.1.2.18、EC 3.1.2.19またはEC 3.1.2.20に認められる。酸-チオールリガーゼは、EC 6.2.1、例えばEC 6.2.1.3、EC 6.2.1.14またはEC 6.2.1.23に認められる。CoAトランスフェラーゼは、 EC 2.8.3、例えばEC 2.8.3.12またはEC 2.8.3.13に認められる。
【００９１】
前述した方法において、アミノ基の転移を触媒する酵素はアミノトランスフェラーゼを含み得る。アミノトランスフェラーゼは、EC 2.6.1、例えばEC 2.6.1.67に認められる。
【００９２】
前述した方法において、ケトン還元を触媒する酵素はカルボニルレダクターゼであり得る。カルボニルレダクターゼはEC.1.1.1.184を含み得る。
【００９３】
前述した方法において、α-ケト酸脱カルボキシル化を触媒する酵素はα-ケト酸デカルボキシラーゼであり得る。
【００９４】
前述した方法において、還元（例えばPCoAのPASへの還元）を触媒する酵素は脂肪アシルCoAレダクターゼであり得る。脂肪アシルCoAレダクターゼは、EC 1.2.1、例えばEC 1.2.1.50に認められる。
【００９５】
前述した方法において、アルデヒド脱水素化を触媒する酵素はアルデヒドデヒドロゲナーゼであり得る。アルデヒドデヒドロゲナーゼは、EC 1.2.1、例えばEC 1.2.1.4またはEC 1.2.1.63に認められる。
【００９６】
前述した方法において、CoAの転移を触媒する酵素はCoAトランスフェラーゼを含み得る。CoA トランスフェラーゼは、EC 2.8.3、例えばEC 2.8.3.12またはEC 2.8.3.13に認められる。
【００９７】
前述した方法において、アミド加水分解を触媒する酵素はアミノヒドロラーゼであり得る。
【００９８】
前述した方法において、脱水（例えばAHPまたはAHP-CoAの脱水）を触媒する酵素はヒドロリアーゼであり得る。ヒドロリアーゼは、EC 4.2.1、例えばEC 4.2.1.2、EC 4.2.1.59、4.2.1.61、4.1.2.17または4.1.2.18に認められる。
【００９９】
前述した方法において、α-ケト酸鎖の伸長を触媒 する酵素は、AksA、AksD、AksEおよびAksFを含む酵素の１つまたは複数のセットを含み得る。AksAは、EC 2.3.3、例えばEC 2.3.3.13または 2.3.3.14に認められる。AksDは、EC 4.2.1、例えばEC 4.2.1.33に認められる。AksFは、EC 1.1.1、例えばEC 1.1.1.85に認められる。α-ケト酸鎖伸長酵素の１つまたは複数（例えば2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、12以上、14以上、18以上、または20以上）は、メタン生成細菌に由来し得る。
【０１００】
前述した方法において、アルコール脱水素化を触媒する酵素はアルコールデヒドロゲナーゼを含み得る。アルコールデヒドロゲナーゼは、EC.1.1.1.1またはEC 1.1.1.2を含み得る。アルコールデヒドロゲナーゼはまた、例えばザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）由来のadhA、ザイモモナス・モビリス由来のadhB、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）由来のブタノールデヒドロゲナーゼ、サッカロミセス（Saccharomyces）ADHIV、およびS.セレビシエ（S. cerevisiae）由来のADH6であり得る。
【０１０１】
本明細書の方法において使用されるPCoAまたはPACPは、アセチルCoAまたはベンゾイルCoAから誘導することができる。アセチルCoAは、セルロース系原材料、糖類、グリセロールまたは脂肪酸を含む再生可能な原材料から誘導することができる。さらに、アセチルCoAはSynGas、メタンまたはメタノールから誘導することができる。ベンゾイルCoAは多環式芳香族炭化水素から誘導することができる。
【０１０２】
本明細書の方法において使用される2,6 DAPは、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼを欠くリジン産生生物によって生産され得る。2,6 DAPは再生可能な原材料から誘導され、再生可能な原材料は糖類を含み得る。
【０１０３】
本明細書は、生物由来のナイロン-7、ナイロン-7,x、ナイロン-x,7およびポリエステルを特徴とする。本明細書はまた、7 AHAを重合させる段階を含む工程によって生成されるナイロン-7も含み、ここで7 AHAはPASまたはAASから誘導される。また、PAと1,7 DHAを重合させる段階を含む工程によって生成されるナイロン-7,7も本明細書によって提供され、ここでPAはPCoA、PACPまたは2 HDAから誘導され、および1,7 DHAは 7 AHAから誘導される。本明細書はまた、7 AHAの生成を導く方法のいずれかによって作製された7 AHAを重合させる段階を含む工程によって生成されるナイロン-7を具現化する。本発明の別の局面は、1,7 DHAとPAを重合させる段階を含む工程によって生成されるナイロン-7,7であり、ここで1,7 DHAは、1,7 DHAの生成を導く上述した方法のいずれかによって作製され、およびPAは、PAの生成を導く上述した方法のいずれかによって作製される。
【０１０４】
本明細書はまた、宿主細胞の実質的に純粋な培養物を提供し、そのうちの実質的な数が、7 AHA、PA、1,7 DAH、ENTLおよび7 HHAから選択される１つまたは複数のポリマー単量体の生合成に関与する１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の外因性核酸を含み、これを発現する。これらの酵素は、アシルCoAレダクターゼ、アシル-［acp］レダクターゼ、チオエステルヒドロラーゼ、アンモニアリアーゼ、エン酸レダクターゼ、アミノトランスフェラーゼ、CoAトランスフェラーゼ、チオエステラーゼ、酸-チオールリガーゼ、ヒドロリアーゼ、カルボニルレダクターゼ、カルボン酸レダクターゼ、脂肪アシルCoAレダクターゼ、ω-トランスアミナーゼ、α-ケト酸デカルボキシラーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、およびα-ケト酸鎖の伸長を触媒する酵素を含む。本明細書で使用される場合、「実質的な数」は、培養物中の細胞の少なくとも10％（例えば少なくとも:20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％またはさらには100％）である。
【０１０５】
培養物の細胞は、限定されることなく、大腸菌（Escherichia coli）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、スフィンゴモナス属（sphingomonads）、シュードモナス属（pseudomonads）、メタン生成細菌（例えばメタノバクテリウム・オートトロフィカム（Methanobacterium autotrophicum））、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、サルモネラ属（Salmonella）、バークホルデリア属（Burkholderia）、モラクセラ属（Moraxella）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、サイクロバクター属（Psychrobacter）、サーモトガ属（Thermotoga）、アシネトバクテリア（Acinetobacteria）、ロドバクター属（Rhodobacter）、アゾアルカス属（Azoarcus）、ロドスピリルム属（Rhodospirillum）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、連鎖球菌（streptococci）、乳酸杆菌（lactobacilli）、ノカルジア属（Nocardia）、バチルス属（Bacillus）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、クロストリジウム属（Clostridium）、ストレプトミセス属（Streptomyces）、およびアルスロバクター属（Arthobacter）などの原核細胞であり得る。
【０１０６】
あるいは、培養物の細胞は、真核細胞、例えば酵母細胞などの真菌細胞であり得る。酵母細胞は、限定されることなく、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、カンジダ属（Candida）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、リゾプス属（Rhizopus）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、ピキア属（Pichia）、トリコスポロン属（Trichosporon）、イサタケンキア属（Issatchenka）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）、デバリオミセス属（Debaryomyces）、ハンセヌラ属（Hansenula）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、シュワニオミセス属（Schwanniomyces）、およびリポミセス属（Lipomyces）などの酵母の細胞であり得る。カンジダ属細胞は、限定されることなく、カンジダ・トロピカリス（C.tropicalis）、カンジダ・アルビカンス（C.albicans）、カンジダ・クロアカエ（C.cloacae）、カンジダ・グイリエルモンディイ（C.guillermondii）、カンジダ・インターメディア（C.intermedia）、カンジダ・マルトサ（C.maltosa）、カンジダ・パラプシロシス（C.parapsilosis）、およびカンジダ・ゼイレノイデス（C.zeylenoides）などの酵母の細胞であり得る。他の真菌細胞は、限定されることなく、アスペルギルス属（Aspergillus）、エクソフィアラ属（Exophiala）、ケカビ属（Mucor）、トリコデルマ属（Trichoderma）、クラドスポリウム属（Cladosporium）、ファネロケーテ属（Phanerochaete）、クラドフィアロフォラ属（Cladophialophora）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、スケドスポリウム属（Scedosporium）、およびオフィオストマ属（Ophiostoma）などの真菌の細胞であり得る。
【０１０７】
細胞によって発現され得る外因性酵素は以下のとおりである。アンモニアリアーゼは、EC 4.3.1、例えばEC 4.3.1.1、EC 4.3.1.2、EC 4.3.1.3、EC 4.3.1.12、EC 4.3.1.13またはEC 4.3.1.24のアンモニアリアーゼを含み得る。エン酸レダクターゼは、EC 1.3.1、例えばEC 1.3.1.31のエン酸レダクターゼを含み得る。カルボン酸レダクターゼは、EC 1.2.99、例えばEC 1.2.99.6のカルボン酸レダクターゼを含む。ω-トランスアミナーゼは、EC 2.6.1、例えばEC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.2、EC 2.6.1.7、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.36、EC 2.6.1.39、EC 2.6.1.42またはEC 2.6.1.68のトランスアミナーゼを含み得る。チオエステラーゼは、EC 3.1.2、例えばEC 3.1.2.18、EC 3.1.2.19またはEC 3.1.2.20のチオエステラーゼを含み得る。酸-チオールリガーゼは、EC 6.2.1、例えばEC 6.2.1.3、EC 6.2.1.14またはEC 6.2.1.23の酸-チオールリガーゼを含み得る。CoAトランスフェラーゼは、EC 2.8.3、例えばEC 2.8.3.12またはEC 2.8.3.13のCoAトランスフェラーゼを含み得る。アミノトランスフェラーゼは、EC 2.6.1、例えばEC 2.6.1.67のアミノトランスフェラーゼを含み得る。カルボニルレダクターゼはEC.1.1.1.184を含み得る。脂肪アシルCoAレダクターゼは、EC 1.2.1、例えばEC 1.2.1.50の脂肪アシルCoAレダクターゼを含み得る。アルデヒドデヒドロゲナーゼは、EC 1.2.1、例えばEC 1.2.1.4またはEC 1.2.1.63のアルデヒドデヒドロゲナーゼを含み得る。ヒドロリアーゼは、EC 4.2.1、例えばEC 4.2.1.2、EC 4.2.1.59、4.2.1.61、4.1.2.17または4.1.2.18のヒドロリアーゼを含む。α-ケト酸鎖の伸長を触媒する酵素は、AksA、AksD、AksEおよびAksF酵素を含む１つまたは複数のセットの酵素を含み得る。AksAは、EC 2.3.3、例えばEC 2.3.3.13または 2.3.3.14のAksA酵素を含み得る。AksDは、EC 4.2.1、例えばEC 4.2.1.33のAksD酵素を含み得る。AksFは、EC 1.1.1、例えばEC 1.1.1.85のAksF酵素を含み得る。アルコールデヒドロゲナーゼは、例えばEC.1.1.1.1またはEC 1.1.1.2を含み得る。加えてアルコールデヒドロゲナーゼは、例えばザイモモナス・モビリス由来のadhA、ザイモモナス・モビリス由来のadhB、クロストリジウム・アセトブチリカム由来のブタノールデヒドロゲナーゼ、サッカロミセスADHIV、およびS.セレビシエ由来のADH6を含み得る。
【０１０８】
本明細書の別の局面は、7 AHA、PA、1,7 DAH、ENTLおよび7 HHAから選択される１つまたは複数のポリマー単量体の生合成に関与する１つまたは複数の外因性核酸をコードする１つまたは複数の外因性核酸を含み、これを発現する、単離された宿主細胞である。酵素は、アシルCoAレダクターゼ、アシル-［acp］レダクターゼ、チオエステルヒドロラーゼ、アンモニアリアーゼ、エン酸レダクターゼ、アミノトランスフェラーゼ、CoAトランスフェラーゼ、チオエステラーゼ、酸-チオールリガーゼ、ヒドロリアーゼ、カルボニルレダクターゼ、カルボン酸レダクターゼ、脂肪アシルCoAレダクターゼ、ω-トランスアミナーゼ、α-ケト酸デカルボキシラーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、およびα-ケト酸鎖の伸長を触媒する酵素を含む。細胞および酵素は、宿主細胞の実質的に純粋な培養物に関して上述したもののいずれかであり得る。
【０１０９】
他の目的および利点は、本明細書に記載する以下の詳細な説明の検討から当業者に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図1は、ピメリン酸セミアルデヒドの、ナイロン-7、ナイロン-7,7およびナイロン-7,xの生成、ならびにポリエステルの生成のために有用な種々の二官能性C7アルカンへの生物転換を示す概略図である。
【図２】図2は、ピメロイルCoA、ピメロイル-［acp］またはα-ケトスベレートからのピメリン酸セミアルデヒドの形成の概略図であり、これらはすべて、示されているような天然に存在する経路の中間体である。
【図３】図3は、α-ケト酸鎖の伸長における一連の反応の概略図である。3つの基本的な反応が関与する:クエン酸同族体を形成するα-ケト二酸とアセチルCoAとの間の縮合、クエン酸同族体のイソクエン酸同族体への異性化、およびイソクエン酸同族体の、付加的なメチレン基を含むα-ケト二酸への酸化的脱カルボキシル化[Howell98:Howell DM,Harich K,Xu H,White RH（1998）.Alpha-keto acid chain elongation reactions involved in the biosynthesis of coenzyme B（7-mercaptoheptanoyl threonine phosphate）in methanogenic Archaea." Biochemistry 1998;37（28）;10108-17.]。  これらの反応は、TCAサイクルI（原核生物）におけるクエン酸シンターゼ、アコニターゼおよびイソクエン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される反応、ならびにリジン生合成Vにおける（R）-ホモクエン酸シンターゼ、ホモアコニターゼおよび（-）-スレオ-イソホモクエン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される反応に類似する[Howell,1998,前記]。
【図４】図4は、3つのマロニルCoAの縮合を介したピメロイルCoAの形成の概略図である。
【図５】図5は、ビオチン生合成経路II中の7-ケト-8-アミノペラルゴネート生合成におけるピメリン酸または他の前駆体からのピメロイルCoAの形成の概略図である。7-ケト-8-アミノペラルゴネートはビオチン生合成の鍵となる中間体である。宿主生物におけるピメロイルCoAの分解は、7-ケト-8-アミノペラルゴン酸シンテターゼ（E.C.2.3.1.47）をコードする遺伝子、BioFの欠失または不活性化によって阻止することができる。
【図６】図6は、ビオチン生合成経路I中の7-ケト-8-アミノペラルゴネート生合成におけるピメロイル-[acp]またはそのメチルエステルの形成の概略図である。ビオチン生合成における鍵となる中間体。ピメリン酸またはピメリン酸セミアルデヒドは、太字で示すaaaS（アシル-ACPシンテターゼ）、FatA（脂肪アシル-ACPチオエステラーゼA）、FatB（脂肪アシル-ACPチオエステラーゼB）、またはアシル-[acp]レダクターゼの作用によってこれらの前駆体から調製することができる。
【図７】図7は、ベンゾエートまたはシクロヘキサンカルボキシレートの分解からのピメロイルCoAの形成を示すスキームである。
【図８】図8は、スフィンゴモナス属およびコリネバクテリウム属種のテトラリン分解経路におけるピメリン酸セミアルデヒドの形成を示すスキームである。
【図９】図9は、メタン生成細菌によるクロトネートからのシクロヘキサンカルボキシレート経路におけるピメロイルCoAの形成を示すスキームである。Mouttaki et al.,Applied and Environmental Microbiology,pages 930-938（2001）参照。
【図１０】図10は、D,L-ジアミノピメレートを出発点とする、2-アミノヘプタン二酸を介したピメリン酸セミアルデヒドおよび7-アミノヘプタン酸への構築した経路の例を示す概略図である。2-アミノヘプタン二酸からピメリン酸セミアルデヒドへは、アンモニアリアーゼによる2-ヘプテン二酸への還元的脱アミノ化を介した経路、または後ほどピメリン酸もしくはそのCoAエステルに変換することができるα-ケト酸の形成を介した経路の2つがある。あるいは、2-アミノヘプタン二酸から誘導されるα-ケトピメレートは、1回の鎖伸長によってα-ケトスベレートを形成し、これを脱カルボキシル化してピメリン酸セミアルデヒドを形成することができるか、または脱カルボキシル化によって直接7-アミノヘプタン酸を導く、α-アミノスベレートに変換することができる。α-ケトピメレートはα-ケトアジペートから誘導することもでき、α-ケトアジペートは、α-ケトグルタレートから2回の連続的なα-ケト酸鎖の伸長を介して誘導することができる。
【図１１Ａ】図11Aは、シトロバクター・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）のアンモニアリアーゼタンパク質の発現物からの可溶性および不溶性画分に関するSDS-PAGE分析を示す。
【図１１Ｂ】図11Bは、クロストリジウム・テタノモーファム（Clostridium tetanomorphum）（I5）およびアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）（I6）のアンモニアリアーゼタンパク質の発現物からの可溶性および不溶性画分に関するSDS-PAGE分析を示す。
【図１２】図12は、ノカルジア属種のカルボン酸レダクターゼ遺伝子の発現物からの可溶性および不溶性画分に関するSDS-PAGE分析を示す。
【図１３】図13は、ノカルジアCARレダクターゼ活性によるピメリン酸のピメリン酸セミアルデヒドへの還元に起因する経時的な吸光度の変化を示す。
【図１４】図14は、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）の YciAチオエステラーゼタンパク質（I8）の発現物からの可溶性画分および不溶性画分に関するSDS-PAGE分析を示す。
【図１５】図15は、アミノトランスフェラーゼIlvE-ω Vf融合物（pING2022）およびIlvE-Ad最適化ω融合物（pING2030）タンパク質のSDS-PAGE分析を示す。
【図１６】図16は、ピルビン酸ナトリウムおよび7-アミノヘプタン酸の生物転換の結果を、7-アミノヘプタン酸基質およびL-アラニン生成物の測定濃度で示す。
【図１７】図17は、48時間後および96時間後の6種の生物転換体におけるL-およびD-2-アミノスベリン酸エナンチオマー濃度からのHPLC結果の概要を示す。
【図１８】図18は、大腸菌GadA（I29）、大腸菌LysA（I30）、大腸菌 GadA ilvE（I31）および大腸菌LysA ilvE（I32）タンパク質の発現物のビーズ溶解からの可溶性および不溶性画分に関するSDS-PAGE分析を示す。
【図１９】図19は、2-アミノスベレートの脱カルボキシル化からの7-アミノヘプタン酸の形成を示す。
【図２０】図20は、MJ0277タンパク質とcomD（SEQ ID 41）/comE（SEQ ID 42）タンパク質との間で有意の相同性を示す、ClustalWアルゴリズムを使用したタンパク質アラインメントを示す。
【図２１】図21は、MJ0277の、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）由来のLACLAアセト乳酸シンターゼ（SEQ ID 43）に対する相同性を示す。
【図２２】図22は、LACLAアセト乳酸シンテターゼ、メタノセラ・パラディコラ（Methanocella paludicola）由来のcomD/comEおよび仮説上のアセト乳酸シンターゼMJ0277における機能性ドメインの分析が、これらすべてがリン酸チアミン結合部位を含む類似の構造を有することを明らかにしたことを示す。
【図２３】図23は、IlvE-ω Vf融合遺伝子を含む、pING2022ベクターのマップを表示する。
【図２４】図24は、IlvE-Ad最適化ω融合遺伝子を含むpING2030ベクターのマップを表示する。
【図２５】図25は、SEQ.ID 1〜40を記載する。
【発明を実施するための形態】
【０１１１】
発明の詳細な説明
一般に、本開示は、ナイロン-7、ナイロン-7,xおよびナイロン-x,7の生産、ならびにポリエステルの生産における中間体として有用な二官能性または三官能性C7アルカンを生合成的に生産するための方法および材料に関する。
【０１１２】
一部の態様では、1つまたは複数（例えば2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上、16以上、17以上、18以上、19以上、20以上、またはさらにそれ以上）の単離された酵素（例えばアンモニアリアーゼ、エン酸レダクターゼ、アミノトランスフェラーゼ、CoAトランスフェラーゼ、チオエステラーゼ、酸-チオールリガーゼ、ヒドロリアーゼ、カルボニルレダクターゼ、チオエステラーゼ、カルボン酸レダクターゼ、脂肪アシルCoAレダクターゼ、ω-トランスアミナーゼ、α-ケト酸デカルボキシラーゼ、α-ケト酸鎖の伸長を触媒する酵素、アシル-ACPシンテターゼ、FatA（脂肪アシル-ACPチオエステラーゼA）、FatB（脂肪アシル-ACPチオエステラーゼB）、またはアシル-[acp]レダクターゼ）は、二官能性または三官能性C7アルカンを生合成的に生産するために使用できる。そのような酵素は、該酵素をコードする外因性核酸を発現する組換え細胞または該酵素を天然に発現する非組換え細胞から単離することができる。
【０１１３】
一部の態様では、1つまたは複数（例えば2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上、16以上、17以上、18以上、19以上、20以上、またはさらにそれ以上）の酵素（例えばアンモニアリアーゼ、エン酸レダクターゼ、アミノトランスフェラーゼ、CoAトランスフェラーゼ、チオエステラーゼ、酸-チオールリガーゼ、ヒドロリアーゼ、カルボニルレダクターゼ、チオエステラーゼ、カルボン酸レダクターゼ、脂肪アシルCoAレダクターゼ、ω-トランスアミナーゼ、α-ケト酸デカルボキシラーゼ、α-ケト酸鎖の伸長を触媒する酵素、アシル-ACPシンテターゼ、FatA、FatB、またはアシル-[acp]レダクターゼの１つまたは複数（上記のような））をコードする1つまたは複数（例えば2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上、16以上、17以上、18以上、19以上、20以上、またはさらにそれ以上）の外因性核酸を含む組換え宿主、またはそのような組換え宿主もしくは前記酵素を天然に発現する非組換え細胞から調製された溶解物を、二官能性または三官能性C7アルカンを生合成的に生産するために使用できる。組換え宿主はまた、代謝中間体を二官能性または三官能性C7アルカンの生産へと迂回させるために１つまたは複数の内因性酵素の欠失を有していてもよい。
【０１１４】
本明細書で述べるように、生合成的に生産された二官能性または三官能性C7アルカンは、ナイロン-7、ナイロン-7,xまたはナイロン-x,7、ならびにポリエステルを生産するために使用できる。「ナイロン-7」という用語は、単量体7-アミノヘプタン酸の重合によってまたはエナントラクタムの開環縮合によって生成されるポリアミドである。ナイロン-7は、「ポリエナントアミド」または「ポリヘプタンアミド」としても知られる。
【０１１５】
「ナイロン-x,7」という用語は、ヘプタン-1,7-二酸（ピメリン酸またはピメレートとしても知られる）とジアミンの重合によって生成されるポリアミドのファミリーを指す。整数xは、ヘプタン1,7-二酸が反応するジアミン中の炭素原子の数を示す。一部の態様では、整数xは3より大きい整数、例えば5より大きい、7より大きい、または9より大きい整数である。例えば、ナイロン-5,7は、ヘプタン1,7-二酸と1,5-ペンタンジアミンを反応させることによって生成される。ナイロン7,7は、ヘプタン1,7-二酸と1,7-ジアミノヘプタンを反応させることによって生成される。
【０１１６】
「ナイロン-7,x」という用語は、ヘプタメチレンジアミンとジカルボン酸の重合反応によって生成されるポリアミドのファミリーを指す。整数xは、ヘプタメチレンジアミンが反応するジカルボン酸中の炭素原子の数を示す。例えば、ナイロン-7,5は、ヘプタメチレンジアミン（1,7-ジアミノヘプタンまたは1,7-ヘプタンジアミンとしても知られる）とペンタン-1,5-二酸との反応によって生成される。一部の態様では、整数xは3より大きい整数、例えば5より大きい、7より大きいまたは9より大きい整数である。
【０１１７】
「ポリエステル」という用語は、主鎖にエステル官能基を含むポリマーのカテゴリーを指す。ポリエステルは、ホモポリマー、例えばカプロラクトンの開環縮合によって生成されるポリカプロラクトンであり得る。コポリマーポリエステルは、多官能性アルコールと酸のエステル化縮合によって形成される。例えば、アジピン酸とエチレングリコールを使用してポリエチレンアジペートを生成する。そのようなコポリマーにおいてアジピン酸の代わりにピメリン酸を使用することができる。あるいは、７-ヒドロキシヘプタン酸を使用してポリエナントラクトンを生成することができる。
【０１１８】
本発明の前記および他の局面を、本明細書で述べる態様に関してここでより詳細に説明する。本発明は種々の形態で具体化することができ、本明細書で記述する態様に限定されると解釈されるべきでないことが認識されるべきである。むしろ、これらの態様は、本開示が詳細かつ完全であるように、および本発明の範囲を当業者に伝えるために提供されるものである。
【０１１９】
1.1  定義
本明細書で本発明の説明において使用される用語は、特定の態様を説明することだけを目的とし、本発明の限定を意図しない。本発明の態様の説明および付属の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「1つ」および「その」は、文脈上明らかに指示されない限り、複数形態も含むことが意図されている。また、本明細書で使用される場合、「および/または」は、関連する列挙項目の1つまたは複数のありとあらゆる組合せを指し、それらを包含する。特に定義されない限り、説明において使用される技術および学術用語を含むすべての用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、1つの「酵素」または複数の「酵素」という用語は、反応を触媒することができるタンパク質触媒を指す。本明細書において、この用語は単離された酵素だけを意味するのではなく、その酵素を発現する宿主細胞も含む。したがって、酵素CによるAのBへの変換は、酵素Cを発現する宿主細胞によるAのBへの変換も包含すると解釈されるべきである。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「二官能性C７アルカン」という用語は、7個の炭素原子と2個の官能基を有する直鎖または分枝鎖の飽和または不飽和炭化水素を指す。官能基は、炭化水素鎖上の任意の場所に位置してよい。一部の態様では、官能基は炭化水素鎖の末端に位置する（例えば各々の末端に1個の官能基）。この用語はまた、エナントラクタムなどの環式化合物も包含することが意図されている。例示的な二官能性C７アルカンは、ピメロイルCoA、ピメロイル-［acp］、ヘプタン-1,7-二酸（ピメリン酸またはピメレート）、7-アミノヘプタン酸、7-ヒドロキシヘプタン酸、ヘプタメチレンジアミン、1,7-ヘプタンジオール、7-アミノヘプタノール、7-アミノヘプタナール、エナントラクタム、ピメリン酸セミアルデヒド（7-オキソヘプタノエートとしても知られる）、2-ヘプテン二酸、および2-ヘプテン二酸CoAを含むが、それらに限定されるわけではない。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、「〜オエート（-oate）」および「〜オイン酸（-oic acid）」という用語、例えばヘプタノエートおよびヘプタン酸は、交換可能に使用される。さらに、「〜エート」、「〜オエート」および「〜オイン酸」は、その中性またはイオン化形態およびいわゆる「両性イオン性」形態のいずれかの化合物を指すために全体を通じて交換可能に使用することができる。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「三官能性C７アルカン」という用語は、7個の炭素原子と3個の官能基を有する直鎖または分枝鎖の飽和または不飽和炭化水素を指す。官能基は、炭化水素鎖上の任意の場所に位置してよい。一部の態様では、3個の官能基のうちの2個は炭化水素鎖の末端に位置する（例えば各々の末端に1個の官能基）。例示的な三官能性C７アルカンは、2-オキソピメレート（α-ケトピメレート）、2-アミノピメレート（α-アミノピメレート）、2-ヒドロキシピメレート（α-ヒドロキシピメレート）、および2-ヒドロキシピメレートCoA（α-ヒドロキシピメレートCoA）を含むが、それらに限定されるわけではない。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「官能基」という用語は、アミン基、カルボン酸基、アルデヒド基、アルコール基、補酵素A基またはケト基を指す。「アミン基」という用語は、-NH2ラジカルを指す。「カルボン酸基」という用語は、-COOHラジカルを指す。「アルデヒド基」という用語は、-C（O）Hラジカルを指す。「アルコール基」という用語は、-OHラジカルを指す。「ケト基」という用語は、C（O）ラジカルを指す。
【０１２５】
「補酵素A基」という用語は、活性な酵素系を形成する多くの酵素（アポ酵素）の活性のために存在する必要がある、有機補因子または補欠分子族（酵素の非タンパク質部分）を指す。補酵素Aはある種の縮合酵素において機能し、アセチルまたは他のアシル基の転移および脂肪酸の合成と酸化、ピルビン酸の酸化および他のアセチル化において作用する。
【０１２６】
「acp」または「アシルキャリアータンパク質」という用語は、アセチル補酵素Aおよびマロニル補酵素Aからアセチル基およびマロニル基を取り、それらを縮合によって連結してβ-ケト酸アシルキャリアータンパク質を形成し、二酸化炭素およびスルフヒドリル形態のアシルキャリアータンパク質を放出するタンパク質（典型的には脂肪酸合成において活性である）を指す。
【０１２７】
二官能性または三官能性C7アルカン上の官能基は、同じであるかまたは異なっていてもよい。例えば、二官能性C7アルカンに関する一部の態様では、両方の官能基がアミン基であってよく、両方の官能基がカルボン酸基であってよく、または両方の官能基がアルコール基であってよい。
【０１２８】
一部の態様では、二官能性C7アルカン上の官能基の一方はアミン基であり、他方はカルボン酸基である。一部の態様では、二官能性C7アルカン上の官能基の一方はアルコール基であり、他方はカルボン酸基である。一部の態様では、二官能性C7アルカン上の官能基の一方はアルコール基であり、他方はアミン基である。
【０１２９】
三官能性C7アルカンに関する一部の態様では、官能基の2個はカルボン酸基であり、1個の官能基はケト基またはヒドロキシル基またはアミノ基である。
【０１３０】
「異種の」という用語は、宿主細胞と同じ種の細胞に由来しない任意の核酸またはポリペプチドを指すために本明細書で使用される。したがって、本明細書で使用される場合、「同種の」核酸またはタンパク質は、宿主細胞と同じ種の細胞において生じるまたは宿主細胞と同じ種の細胞によって産生されるものである。
【０１３１】
核酸および特定の宿主細胞に関して本明細書で使用される「外因性」という用語は、自然界で認められるその特定の細胞においては生じない（およびその特定の細胞からは得ることができない）任意の核酸を指す。それゆえ、非天然の核酸は、ひとたび宿主細胞に導入された場合、宿主細胞にとって外因性とみなされる。非天然の核酸は、全体としての核酸が自然界には存在しないことを条件として、自然界で認められる核酸サブ配列または核酸配列のフラグメントを含み得ることに留意することが重要である。例えば、発現ベクター内にゲノムDNA配列を含む核酸分子は、全体としてのその核酸分子（ゲノムDNAプラスベクターDNA）は自然界には存在しないので、非天然の核酸であり、それゆえひとたび宿主細胞に導入された場合、宿主細胞にとって外因性である。それゆえ、全体として自然界には存在しない任意のベクター、自律複製プラスミドまたはウイルス（例えばレトロウイルス、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）は、非天然の核酸であるとみなされる。したがってPCRまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されるゲノムDNAフラグメントならびにcDNAは、それらが自然界では認められない別個の分子として存在するので、非天然の核酸であるとみなされる。また、プロモーター配列およびポリペプチドをコードする配列（例えばcDNAまたはゲノムDNA）を自然界では認められない配置で含む任意の核酸は非天然の核酸であることになる。天然に存在する核酸は特定の細胞にとって外因性であり得る。例えば、酵母xの細胞から単離された染色体全体は、ひとたびその染色体が酵母yの細胞に導入された場合、酵母yの細胞に関しては外因性核酸である。
【０１３２】
「外因性」核酸が「同種の」または「異種の」核酸であり得ることは上記から明らかである。これに対し、核酸または遺伝子（または核酸もしくは遺伝子によってコードされるタンパク質）および特定の細胞に関して本明細書で使用される「内因性」という用語は、自然界で認められるようにその特定の細胞中に存在する（およびその特定の細胞から得ることができる）任意の核酸または遺伝子を指す。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「組換え宿主」という用語は、そのゲノムが少なくとも外因性核酸配列によって増大している宿主を指す。そのような核酸配列は、天然では宿主中に存在しない核酸（すなわち異種核酸）、通常はRNAに転写されないまたはタンパク質に翻訳されない（「発現されない」）DNA配列、および非組換え宿主に導入することを所望する他の核酸配列（例えば特定の核酸配列の発現を変化させる調節領域）を含むが、それらに限定されるわけではない。典型的には本明細書で述べる組換え宿主のゲノムは、1つまたは複数の外因性核酸の安定な導入を介して増大されることが認識される。一般に、外因性核酸は、もともとはDNAの受容者である宿主中には存在しない（すなわち異種核酸である）が、例えばコードされる生成物の生産を増強するためまたは核酸の発現パターンを変化させるために、所与の宿主から核酸を単離することおよびその後、その核酸の1つまたは複数の付加的なコピーを同じ宿主に導入することは本発明の範囲内である。一部の場合、外因性核酸は、例えば相同組換えまたは部位指定突然変異によって、内因性遺伝子またはDNA配列を修飾するまたはさらには置換する。内因性遺伝子の修飾または置換は、特定のコードされる生成物、例えば酵素の欠失を生じさせ得る。適切な組換え宿主を以下で述べる。組換え宿主はまた、宿主細胞のゲノムには組み込まれないが、細胞中にエピソームとして存在する（および好ましくは複製する）核酸を含み得る。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、遺伝子が転写されることを可能にするDNA配列を指す。プロモーターはRNAポリメラーゼによって認識され、次にそれが転写を開始させる。それゆえ、プロモーターは、RNAポリメラーゼによって直接結合されるかまたはRNAポリメラーゼの動員に関与するDNA配列を含む。プロモーター配列はまた、遺伝子クラスター中の遺伝子の転写レベルを増強する（ゆえに「エンハンサー」の名称）タンパク質（すなわち転写因子のセットに酷似する、トランス作用因子）と結合することができるDNAの1つまたは複数の領域である、「エンハンサー領域」も含み得る。エンハンサーは、典型的にはコード領域の5'末端に位置するが、プロモーター配列から離れていてもよく、例えば遺伝子のイントロン領域内または遺伝子のコード領域の3'側であってもよい。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」は、発現制御配列が関心対象のコード配列の発現を有効に制御するように遺伝子構築物に組み込まれることを意味する。
【０１３６】
1.2  原材料
様々な異なる原材料が二官能性または三官能性アルカンを生成するために使用できる。一部の態様では、組換え宿主細胞または細胞（例えば組換え宿主細胞）から調製された溶解物を、７-アミノヘプタン酸などの二官能性または三官能性C７アルカンを生成するために再生可能な原材料と接触させる。炭素源として使用し得る再生可能な原材料の例は、セルロース系原材料、植物由来の炭水化物および脂肪酸を含むが、それらに限定されるわけではない。一部の態様では、組換え宿主細胞を接触させる原材料は、グルコース、スクロース、キシロース、脂肪酸またはグリセロールである。
【０１３７】
上記で列挙したような再生可能な原材料に加えて、組換え宿主細胞を、炭素源として、SynGasとしても知られる合成ガスでの増殖のために改変することができる。この特定の態様では、本発明の組換え宿主細胞を、二官能性または三官能性C７アルカンを生成するためにSynGasまたは他の気体状炭素の利用のための効率的な代謝経路を提供するように遺伝子操作する。
【０１３８】
加えて、本明細書で述べる組換え宿主または組換え宿主細胞から調製された溶解物を芳香族炭化水素原材料と接触させることができる。再生可能な原材料ではなく芳香族炭化水素原材料を使用することは、そのような石油由来の材料をより環境に無害な化合物に変換し、環境への影響を低減する方法を提供する。適切な芳香族炭化水素原材料の例は、トルエン、ベンゼン、安息香酸およびシキメートを含むが、それらに限定されるわけではない。
【０１３９】
1.3.酵素が触媒する段階を含む二官能性C7アルカンへの経路
上述したように、本発明の態様は、1つまたは複数の単離された酵素の存在下、該酵素を発現する組換え宿主細胞の存在下、または該酵素を発現する細胞（例えば組換え細胞）の細胞溶解物（または部分精製された溶解物）の存在下で二官能性または三官能性C7アルカンを生成するための方法に関する。一部の態様では、二官能性または三官能性C7アルカンの生成はピメレートまたはピメロイルCoAから始まり、共通の中間体、すなわちピメリン酸セミアルデヒドを介して進行する。具体的には、一部の態様では、本発明は、ピメリン酸セミアルデヒドの7-アミノヘプタン酸へのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素を使用することによって二官能性C7アルカン、7-アミノヘプタン酸を生成する方法に関する。図1参照。ω-トランスアミナーゼなどのセミアルデヒドアミノトランスフェラーゼを使用することができる。例示的なトランスアミナーゼは、EC 2.6.1、例えばEC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.2、EC 2.6.1.7、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.36、EC 2.6.1.39、EC 2.6.1.42およびEC 2.6.1.68に分類されるトランスアミナーゼを含むが、それらに限定されるわけではない。一部の態様では、アミノトランスフェラーゼは、ビブリオ・フルビアリス（V.fluvialis）、バチルス・ウェイヘンステファネンシス（B.weihenstephanensis）、緑膿菌（P.aeruginosa）、枯草菌（B.subtilis）、またはシュードモナス・シリンゲ（P.syringae）由来のEC 2.6.1.18に分類されるβ-アラニンアミノトランスフェラーゼである。その全体が参照により本明細書に組み入れられる、国際公開公報第2011/031147号参照。
【０１４０】
一部の態様では、7-アミノヘプタナールは、7-アミノヘプタン酸の7-アミノヘプタナールへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素を用いて生成できる。図1参照。EC 1.2.1、例えばEC 1.2.1.4またはEC 1.2.1.63に分類されるアルデヒドデヒドロゲナーゼを使用して、7-アミノヘプタン酸から7-アミノヘプタナールを生成することができる。
【０１４１】
一部の態様では、ヘプタメチレンジアミン（1、7-ジアミノヘプタンとしても知られる）は、アミノ基の転移を触媒する酵素を用いて7-アミノヘプタナールから生成できる。図1参照。適切なアミノトランスフェラーゼは、EC 2.6.1、例えば EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.2、EC 2.6.1.7、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.36、EC 2.6.1.39、EC 2.6.1.42およびEC 2.6.1.68のアミノトランスフェラーゼを含むが、それらに限定されるわけではない。一部の態様では、アミノトランスフェラーゼは、ビブリオ・フルビアリス、バチルス・ウェイヘンステファネンシス、緑膿菌、枯草菌、またはシュードモナス・シリンゲ由来のEC 2.6.1.18に分類されるβ-アラニンアミノトランスフェラーゼである。その全体が参照により本明細書に組み入れられる、国際公開公報第2011/031147号参照。
【０１４２】
一部の態様では、エナントラクタムは、7-アミノヘプタン酸のアミド加水分解を触媒する酵素を用いて7-アミノヘプタン酸から生成できる。図1参照。適切なアミドヒドロラーゼは、EC 3.5.2、例えばEC 3.5.2.12またはEC 3.5.2.11に分類されるアミドトランスフェラーゼを含む。
【０１４３】
一部の態様では、アルデヒドの還元を触媒する酵素を用いて、７-ヒドロキシヘプタノエートをピメリン酸セミアルデヒドから生成するか、または７-アミノヘプタノールを７-アミノヘプタナールから生成する。図1参照。例えば、EC 1.1.1、例えばEC 1.1.1.21に分類されるアルコールデヒドロゲナーゼが使用できる。
【０１４４】
一部の態様では、1,7-ヘプタンジオールは、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼを用いて7-ヒドロキシヘプタノエートから生成できる。適切なアルデヒドデヒドロゲナーゼは、EC 1.2.1（例えばEC 1.2.1.4）に分類され得る。図1参照。適切なアルコールデヒドロゲナーゼはE.C.1.1.1、例えばEC 1.1.1.1に分類され得る。
【０１４５】
C７二官能性または三官能性アルカンが宿主に毒性であり得る態様（例えば７-オキソヘプタノエートまたは７-アミノヘプタナールなどのセミアルデヒド）において、毒性化合物への変換は、単離された酵素または組換え宿主からの溶解物を用いてインビトロで実施できる。一部の態様では、毒性化合物は宿主によって生成され、その後エナントラクタムに変換される（単離された酵素、酵素を発現する宿主細胞を用いて、または化学変換によって）。
【０１４６】
1.5  ピメレートおよび/またはピメロイルCoAへの生合成経路
ピメレートおよび/またはピメロイルCoAは、以下を含む多数の異なる方法によって得ることができる:（i）α-ケト酸鎖伸長経路から生成されるα-ケトスベレート、（ii）ビオチン生合成経路I、（iii）ビオチン生合成経路II、（iv）3個のマロニルCoA分子の1個のピメロイルCoA分子への縮合、（v）ベンゾエート分解経路、（vi）シクロヘキサンカルボキシレート経路、（vi）D,L-ジアミノピメレート経路、および（vii）出発炭素源がクロトネートである生合成経路。図2参照。ピメレートおよび/またはピメロイルCoAへのこれらの経路は以下でさらに詳細に説明する。
【０１４７】
これらの経路のいずれかにおいて、ピメレートは、チオエステルの加水分解を触媒する酵素を用いてピメロイルCoAから生成できる。例えば、チオエステルを加水分解することができる酵素は、チオエステラーゼ、酸-チオールリガーゼおよびCoAトランスフェラーゼを含むが、それらに限定されるわけではない。適切なチオエステラーゼは、EC 3.1.2、例えばEC 3.1.2.18、EC 3.1.2.19またはEC 3.1.2.20に分類されるチオエステラーゼを含む。例えば、以下の酵素の1つが使用できる:EC 3.1.2に分類されるチオエステルヒドロラーゼ/アシルCoAチオエステラーゼ、例えばEC 3.1.2.19および3.1.2.18のADP依存性中鎖アシルCoAヒドロラーゼ、EC 3.1.2.20のアシルCoAヒドロラーゼ、またはEC 3.1.2.3のヒドロラーゼ。適切な酸-チオールリガーゼは、EC 6.2.1、例えば EC 6.2.1.3、EC 6.2.1.14および EC 6.2.1.23に分類される酸-チオールリガーゼを含む。適切なCoAトランスフェラーゼは、EC 2.8.3、例えばEC 2.8.3.6、EC 2.8.3.8、EC 2.8.3.12またはEC 2.8.3.13に分類されるCoAトランスフェラーゼを含む。
【０１４８】
ヘプタン-1,7-二酸は、EC 2.3.1.38（[アシルキャリアータンパク質]S-アセチルトランスフェラーゼ）などの [acp]-チオエステルに作用する酵素またはfatAおよびfatBなどのEC 3.1.2.14のヒドロラーゼの使用によってピメロイル-[acp]から得ることができる。あるいは、ピメリン酸は、AaasaS（アシル-ACPシンテターゼ）によるエステル結合の加水分解、次いでリパーゼ/エステラーゼによるメチル基の除去によってピメロイル-[acp]メチルエステルから得ることができる。
【０１４９】
ピメレートは、カルボン酸の還元を触媒する酵素を用いてピメリン酸セミアルデヒドに変換することができる。適切なレダクターゼは、EC 1.2.99に分類されるカルボン酸レダクターゼまたはEC 1.2.1、例えばEC 1.2.1.50に分類される脂肪アシルCoAレダクターゼを含むが、それらに限定されるわけではない。一部の態様では、脂肪アシルCoAレダクターゼは、ピメロイルCoAまたはピメロイル-[acp]をピメリン酸セミアルデヒドに直接変換することができる。EC 1.2.99の例示的なカルボニルレダクターゼは、ノカルジア種（参照により本明細書に組み入れられる、Aimin.et al.,Appl.Environ.Microbiol.70:1874-1881（2004））またはストレプトミセス・グリセウス（S.griseus）（参照により本明細書に組み入れられる、Suzuki et al.,J.Antibiot.（Tokyo）60:380-387（2007））由来のEC 1.2.99.6を含むが、それに限定されるわけではない。EC 1.2.1の例示的なカルボニルレダクターゼは、例えばクロロフレクサス・オーランティアカス（C.aurantiacus）（参照により本明細書に組み入れられる、Hugler,M,et al.,J.Bacteriology 184:2404-2410（2002））、メタッロスパエラ・セドゥラ（M.sedula）（参照により本明細書に組み入れられる、Kockelkorn,D.and Fuchs,G.,J.Bacteriology 191:6352-6362（2009））、またはスルフォロバス・トコダイ（S.tokodai）（参照により本明細書に組み入れられる、Alber,B.et al.,J.Bacteriology 188:8551-8559（2006））由来のEC 1.2.1.75;および、例えばアシネトバクター属種（Acinetobacter sp.）、マガモ（A.platyrhynchos）（参照により本明細書に組み入れられる、Ishige,T.,et al.,Appl.Envtl Microbiology 68:1192-1195（2002））、シロイヌナズナ（A.thaliana）（どちらも参照により本明細書に組み入れられる、Doan,T.T.,et al.,Journal Plant Physiology 166:787-796（2009）およびHooks,M.A.,et al.,Plant J.20:1-13（1999））;ヒト（Homo sapiens）（参照により本明細書に組み入れられる、McAndrew,R.P.et al.,J.Biol.Chem.283:9435-9443（2008））、マウス（M.Musculis）、P.レイオグナチ（P.leiognathi）、P.ホスホレウム（P.phosphoreum）、エンドウ（P.sativum）、またはシナウスイロイルカ（S.chinesis）由来の1.2.1.50を含むが、それらに限定されるわけではない。
【０１５０】
1.5.1  α-ケト酸鎖の伸長
二官能性アルカンは、α-ケトグルタレートから当技術分野にて公知のα-ケトアジペート、α-ケトピメレートまたはα-ケトスベレートへの連続的な鎖伸長反応によって生成できる。例えば図3および国際公開公報第2010/068944号参照。次に、α-ケト二酸（Cn、n=5〜8）または対応する 2-アミノ二酸の脱カルボキシル化により、Cn-1、例えばC4〜7のα,ω-二官能性アルカンの前駆体が提供される。これらの連続的なα-ケト酸鎖伸長反応は、メタノカルドコッカス・ジャナスキイ（Methanocaldococcus jannaschii）、メタノコッカス・ボルタエ（Methanococcus voltae）およびメタノサルシナ・サーモフィラ（Methanosarcina thermophila）などのメタン生成細菌において明らかにされたように補酵素Bの生合成経路において起こる。
【０１５１】
α-ケトグルタレート（C5）からα-ケトスベレートへの3回の連続的な鎖伸長は、基質に対して3回（およびEC 4.2.1.114（AksD（3-イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼラージサブユニット）/AksE（3-イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼスモールサブユニット））の場合は6回）作用する同じ3つの酵素によって触媒され、各回に鎖の長さを増大させる。図3参照。これらの酵素は以下を含むが、それらに限定されるわけではない:EC 2.3.3.14:α-ケトグルタレート、α-ケトアジペートおよびα-ケトピメレートに作用する、ホモクエン酸シンターゼ/AksA（α-イソプロピルリンゴ酸シンターゼ）;EC 4.2.1.114:（R）-ホモシトレー、ジホモシトレートまたはトリホモシトレートの脱水反応、ならびにシス-ホモアコニテート、シス-（ホモ）2アコニテートおよびシス-（ホモ）3アコニテートの水和反応を触媒する、ホモアコニターゼまたはAksD/AksE;ならびにEC 1.1.1.87:ホモイソシトレート、スレオ-イソ（ホモ）2シトレートおよびスレオ-イソ（ホモ）3シトレートのNAD（P）+依存性酸化的脱カルボキシル化を触媒する、ホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼまたはAksF（多官能性3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ/D-リンゴ酸デヒドロゲナーゼ）。
【０１５２】
例示的なAksA酵素は、EC 2.3.3、例えばEC 2.3.13または2.3.3.14におけるものを含むが、それらに限定されるわけではない。例示的なAksD酵素は、EC 4.2.1、例えばEC 4.2.1.33におけるものを含む。例示的なAksF酵素は、EC 1.1.1、例えばEC 1.1.1.85の酵素を含むが、それらに限定されるわけではない。
【０１５３】
一部の態様では、鎖伸長酵素は、AksA MTH1630、AksD MTH1631、AksE MTH0829またはAksF MTH1388である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第2010/104391号参照。
【０１５４】
この経路の利点は、宿主における3つの異種タンパク質の組換え発現しか必要としないことである。α-ケトグルタレートからα-ケトアジペートへの鎖伸長は、アエロピュルム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）、ピロコッカス・アビッシ（Pyrococcus abyssi）、ピロコッカス・ホリコシイ（Pyrococcus horikoshii）、スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）、スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）およびサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）を含む古細菌のリジン生合成V経路、ならびにユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）、アスペルギルス属、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）およびサッカロミセス・セレビシエを含む酵母および真菌のリジン生合成IV経路においても起こる。
【０１５５】
リジン生合成IVおよびV経路において、α-ケトグルタレートからα-ケトアジペートへの反応は、4つの酵素、すなわちEC 2.3.3.14:ホモクエン酸シンターゼ（hcs/LYS20/LYS21/nifV）、EC 4.2.1.114:メタン細菌HACN、EC 4.2.1.36:ホモアコニターゼヒドラターゼ、およびEC 1.1.1.87:ホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（hicDHまたはLYS12）の連続的な作用によって触媒される。
【０１５６】
1.5.3  マロニルCoA縮合経路
一部の態様では、ある種の生物は3個のマロニルCoA分子を1個のピメロイルCoA分子に縮合することができるので、マロニルCoAをピメロイルCoAの供給源として使用することができる。図4参照。また、参照により本明細書に組み入れられる、Lin,S.and Cronan,J.E.,Molecular Biosystems 7:1811-21（2011）も参照のこと。したがって、ピメロイルCoAがマロニルCoAから生成される組換え宿主を生産することができる。一部の態様では、宿主細胞はアクロモバクター属（Achromobacter）以外の生物である。一部の態様では、ピメロイルCoAは、その後、ピメリン酸または他の二官能性C7アルカンに変換し得る。
【０１５７】
1.5.4 ビオチン生合成経路I（グラム陰性菌）およびII（グラム陽性菌）
一態様では、組換え宿主細胞は、グリセロールおよび/または脂肪酸から誘導されるアセチルCoAからピメリン酸および/またはピメロイル-[acp] を生産する。例えば、どちらも参照により本明細書に組み入れられる、Lin,S.,Nature Chem.Biol.6:682-688（2010）;およびCronan,J.E.and Lin,S.,Current Opinion in Chem.Biology 15:1-7（2011）参照。図5は、ビオチン生合成II（グラム陽性菌）におけるピメリン酸または他の前駆体からのピメロイルCoAの形成を示す。図6は、ビオチン生合成I（グラム陰性菌）におけるピメロイル-[acp]またはそのメチルエステルの形成を示す。図6はまた、ピメロイル-[acp]メチルエステルのピメリン酸モノメチルエステルへの変換のための経路も示す。ピメリン酸モノメチルエステルは、その後、例えばEC 3.1.1のリパーゼの存在下でピメリン酸（ヘプタン-1,7-二酸）に変換される。図6はまた、エステラーゼ（EC 3.1.1、例えば EC 3.1.1.85の酵素、BioH）の存在下でのピメロイル-[acp]メチルエステルのピメロイル-[acp]への変換も示す。ピメロイル-[acp]は、その後、チオエステラーゼ、例えばEC 3.1.2.14の酵素、例えばFatAまたはFatBの存在下でピメリン酸（ヘプタン-1,7-二酸）に変換される。一部の態様では、本発明は、図6に示す酵素の1つまたは全部を含むピメリン酸（ヘプタン-1,7-二酸）を生産することができる組換え宿主細胞を企図する。一部の態様では、組換え宿主細胞は、ピメロイルCoAがビオチン生合成にシャトルすることができないように、6-カルボキシヘキサノイルCoA（ピメロイルCoA）を7-ケト-8-アミノペラルゴン酸（KAPA）に変換することができる酵素であり、天然のビオチン生合成経路を有する宿主生物においてBioF遺伝子によってコードされる、7-ケト-8-アミノペラルゴン酸シンテターゼの欠失を有する。
【０１５８】
ピメロイル-[acp]メチルエステルはまた、BioI（例えば枯草菌由来のBioI）による長鎖アシル-[acp]および/または遊離脂肪酸の代謝の結果としても生成され得る。
【０１５９】
1.5.5  真核生物の生合成経路
ピメリン酸および/またはピメロイルCoAは真核生物のビオチン生合成経路からも得ることができる。例えば、どちらも参照により本明細書に組み入れられる、Roje,S.,Phytochemistry 68:1904-1921（2007）;およびCharles R.Hall,The Contribution of Horizontal Gene Transfer to the Evolution of Fungi（May 10,2007）（未公表博士論文、Duke University）（Duke University Librariesのファイル）参照。真核生物経路において、アセチルCoAは、EC 2.3.1.9に分類される酵素を使用してアセトアセチルCoAに生物変換され;アセトアセチルCoAは、E.C.1.1.1.157に分類される酵素を使用して（S）-3-ヒドロキシブタノイルCoAに生物変換され;（S）-3-ヒドロキシブタノイルCoAは、EC 4.2.1.17に分類される酵素を使用してクロトニルCoAに生物変換され;クロトニルCoA は、EC 4.1.1.70に分類される酵素を使用してグルタコニル-1-CoAに生物変換され;グルタコニル-1-CoAは、EC 1.3.99.7に分類される酵素を使用してグルタリルCoAに生物変換され;グルタリルCoAは、EC 2.3.1.43に分類される酵素を使用して3-ケトピメリル CoAに生物変換され;3-ケトピメリル CoAは、EC 1.1.1.4259に分類される酵素を使用して3-ヒドロキシピメリルCoAに生物変換され;3-ヒドロキシピメリルCoAは、EC 4.2.1.-に分類される酵素を使用して2,3-ジデヒドロピメロイルCoAに生物変換され;そして 2,3-ジデヒドロピメロイルCoAは、EC 1.3.1.62に分類される酵素を使用してピメロイルCoAに生物変換される。ピメロイルCoAは、その後ピメリン酸に変換される。
【０１６０】
一部の態様では、アセチルCoAをトリカルボン酸（TCA）サイクルに供給することができ、該サイクルにおいてアセチルCoAはコハク酸（ブタン-l,4-二酸）に変換される。次にコハク酸は、TCAサイクルから、2-オキソグルタレートの2-ヒドロキシ-1,2,4-ブタントリカルボン酸（ホモシトレート）への生物転換（例えばEC 2.3.3.14の酵素による）から出発して;EC 4.2.1.36に分類される酵素を使用したホモシトレートのホモシスアコニターゼへのおよびホモシスアコニターゼのホモイソシトレートへの生物転換;EC 1.1.1.87に分類される酵素を使用したホモイソシトレートのオキサログルタレートへの生物転換;EC 1.1.1.87に分類される酵素を使用したオキサログルタレートの2-オキソアジペートへの生物変換、ならびにEC 1.2.4.2に分類される酵素を使用した2-オキソアジペートのグルタリルCoAへの生物転換を行い、ピメリン酸合成経路へと迂回する。グルタリルCoAは、上記で論じたようにピメロイルCoAに変換することができる。ホモシトレートは最終的にピメロイルCoAに変換され、その後、上記で述べたようにピメリン酸に変換される。
【０１６１】
それゆえ、一部の態様では、本発明は、アセチルCoAをヘプタン- 1,7-二酸に変換するための酵素を含む組換え宿主細胞を提供する。一部の態様では、組換え宿主細胞は、宿主生物が天然のビオチン生合成経路を有する場合、ピメロイルCoAがビオチン生合成にシャトルすることができないように、6-カルボキシヘキサノイルCoA（ピメロイルCoA）を7-ケト-8-アミノペラルゴン酸（KAPA）に変換することができる酵素であり、宿主においてBioF遺伝子によってコードされる、7-ケト-8-アミノペラルゴン酸シンテターゼの欠失を有する。本発明の態様はまた、そのような組換え宿主細胞の使用を含む、ヘプタン- 1,7-二酸を生産する方法も提供する。
【０１６２】
1.5.6  ベンゾイルCoA分解経路
本明細書において企図されるピメロイルCoAおよび/またはピメリン酸の1つの付加的な供給源は、図7に示すベンゾエート分解経路である。例えば、すべてが参照により本明細書に組み入れられる、Bernsteinb,J.R.,et al.,Metabolic Eng'g 10:131-140（2008）;Harwood,C.S.,et al.,FEMS Microbiology Reviews 22:439-458（1999）;およびHarrison,F.H.and Harwood,C.S.,Microbiology 151:727-736（2005）参照。多数の変換が図7に例示されており、その中でベンゾエートはEC 6.2.1.25に分類される酵素を使用してベンゾイルCoAに変換され、最終的にピメロイルCoAに変換される。ベンゾイルCoAは、EC 1.3.99.15に分類される酵素を使用してシクロヘキサ-1,5-ジエンカルボニルCoAに変換される。一部の態様では、シクロヘキサ-1,5-ジエンカルボニルCoAは、EC 4.2.1.100 に分類される酵素を使用して6-ヒドロキシシクロへキス-1-エン-1-カルボキシルCoAに生物変換され;6-ヒドロキシシクロへキス-1-エン-1-カルボキシルCoAは、EC 1.1.1-に分類される酵素を使用して6-ケトオキシシクロへキス-1-エン-1-カルボキシルCoAに生物変換され;6-ケトオキシシクロへキス-1-エン-1-カルボキシルCoAは、EC 3.7.1.-に分類される酵素を使用して3-ヒドロキシピメリルCoAに生物変換され;3-ヒドロキシピメリルCoAは、EC 4.2.1.-に分類される酵素を使用して6-カルボキシルへキス-2-エノイルCoAに生物変換され;3-ヒドロキシピメリルCoAは、EC 1.3.1.62に分類される酵素を使用してピメロイルCoAに生物変換される。ピメロイルCoAは、次に、ピメリン酸（ヘプタン-1,7-二酸）に変換される。一部の態様では、EC 4.2.1.-に分類される酵素を使用してシクロヘキサ-1,5-ジエンカルボニルCoAはシクロヘキス-1-エン-1-カルボキシルCoAに生物変換され、シクロヘキス-1-エン-1-カルボキシルCoAは2-ヒドロキシシクロヘキサン-1-カルボキシルCoAに生物変換され;2-ヒドロキシシクロヘキサン-1-カルボキシルCoA は、E.C.1.1.1.-に分類される酵素を使用して2-ケトシクロヘキサン-1-カルボキシルCoAに生物変換され、そして2-ケトシクロヘキサンカルボキシルCoAは、EC 3.1.2.-_に分類される酵素（例えば、EC 3.1.2.-に分類される酵素、α-ケトシクロヘキサンカルボキシルCoAヒドロラーゼRp-badI）を使用してピメロイルCoAに生物変換される。
【０１６３】
一部の態様では、ヘプタン-1,7-二酸を生産することができる組換え宿主細胞は、図7または本章で列挙される酵素の1つまたは複数を含む。
【０１６４】
1.5.7  2,6-ジアミノピメレート経路
ピメレートのさらに別の供給源は、2,6-ジアミノピメレートとしても知られるD,L-ジアミノピメレートである。D,L-ジアミノピメレートはリジンの生成における中間体である。一部の態様では、内因性リジン経路は、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの欠失を有する組換え宿主細胞を作製することにより、ピメレートを優先的に生産するように改変できる。例えば図10参照。D,L-ジアミノピメレートは、D,L-ジアミノピメレートの6-アミノ-2-ヘプテン二酸への還元的脱アミノ化を触媒する酵素によって不飽和モノアミノピメリン酸に生物変換することができる。D,L-ジアミノピメレートの還元的脱アミノ化を触媒する酵素の例は、EC 4.3.1、例えばEC 4.3.1.1、EC 4.3.1.2、EC 4.3.1.3、EC 4.3.1.12、EC 4.3.1.13およびEC 4.3.1.24に分類されるアンモニアリアーゼを含む。一部の態様では、アンモニアリアーゼは、シトロバクター・アマロナティカス（C.amalonaticus）、クロストリジウム・テタノモルフム（C.tetanomorphum）またはA.オリゼ由来のEC 4.3.1.2に分類されるメチルアスパラギン酸アンモニアリアーゼである。例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Botting,Biochemistry 27:2953-2955（1988）;およびKato,Appl.Microbiol.Biotechnol.50:468-474（1998）参照。
【０１６５】
6-アミノ-2-ヘプテン二酸は、6-アミノ-2-ヘプテン二酸の2-アミノ-2-ヘプタン二酸（2-アミノピメリン酸またはα-アミノピメレートとしても知られる）へのエノエート還元を触媒する酵素を使用して2-アミノ-2-ヘプテン二酸に生物変換することができる。6-アミノ-2-ヘプテン二酸のエノエート還元を触媒する酵素の例は、EC 1.3.1、例えばEC 1.3.1.31に分類されるエン酸レダクターゼを含む。一部の態様では、エン酸レダクターゼは、それぞれ枯草菌またはリコペルシコン・エスクレンタム（L.esculentum）由来のEC 1.3.1.31のYqjMまたはOPR1/3である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Stueckler,Org.Lett.9:5409-541 1（2007）;Kitzing,J.Biol.Chem.280:27904-27913（2005）;Hall,Angew.Chem.Int.Ed.46:3934-3937（2007）;およびBreithaupt,Proc.Natl.Acad.Sci USA 103 :14337-14342（2006）参照。
【０１６６】
2-アミノピメリン酸は、2-アミノピメリン酸の還元的脱アミノ化を触媒する酵素によって対応する2-ヘプテン二酸（2,3-ジデヒドロピメリン酸としても知られる）に変換することができる。2-アミノピメリン酸の還元的脱アミノ化を触媒する酵素の例は、上述したようなEC 4.3.1、例えばEC 4.3.1.1、EC 4.3.1.2、EC 4.3.1.3、EC 4.3.1.12、EC 4.3.1.13またはEC 4.3.1.24に分類されるアンモニアリアーゼを含む。2-ヘプテン二酸は、CoAトランスフェラーゼ（例えば、EC2.8.3、例えば EC 2.8.3.12または EC 2.8.3.13に分類されるCoAトランスフェラーゼ）および酸-チオールリガーゼ（例えば、EC 6.2.1、例えばEC 6.2.1.3、EC 6.2.1.14またはEC 6.2.1.23に分類される酸-チオールリガーゼ）を使用して2-ヘプテン二酸CoAに変換することができる。
【０１６７】
2-ヘプテン二酸CoAは、次に、EC 1.3.1に分類されるエン酸レダクターゼ酵素などの2-ヘプテン二酸のエノエート還元を触媒する酵素によってピメレートCoAに変換される。
【０１６８】
図10および図3に示すように、α-ケトピメレートも1回の鎖伸長を受けてα-ケトスベレートを形成することができ、それが、脱カルボキシル化されてピメリン酸セミアルデヒドを形成するか、または脱カルボキシル化によって直接7-アミノヘプタン酸を導く、α-アミノスベレートに変換され得る。例示的なデカルボキシラーゼは、EC 4.1.1、例えばEC 4.1.1.11、EC 4.1.1.15、EC 4.1.1.17、EC 4.1.1.18、EC 4.1.1.19、EC 4.1.1.20およびEC 4.1.1.86のデカルボキシラーゼを含む。一部の態様では、デカルボキシラーゼは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、国際公開公報第2011/031147号に記載されているように、L.ラクティス由来のEC 4.1.1.1のケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼkivD;シュードモナス・プチダ（P.putida）由来のEC4.1.1.7のベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼmdIC A460IもしくはBFD;S.セレビシエ由来のEC 4.1.1.1のピルビン酸デカルボキシラーゼイソ酵素1および2 Pdc1;Z.モビリス由来のピルビン酸デカルボキシラーゼPdc（I472A）;またはL.ラクティス由来のEC 4.1.1.72の分枝鎖α-ケト酸デカルボキシラーゼkdcAを含む。
【０１６９】
α-アミノスベレートは、メタン生成細菌（例えばメタノバクテリウム・オートトロフィカム）中に存在するもののような鎖伸長酵素を使用して7-アミノヘプタン酸に変換することができる。そのような鎖伸長酵素は、上記で論じたようにAksA、AksDおよびAksEまたはFを含むが、それらに限定されるわけではない。例示的なAksA酵素は、EC 2.3.3におけるものを含むが、それらに限定されるわけではない。EC 2.3.3の例示的な酵素は、EC 2.3.13または2.3.3.14を含むが、それらに限定されるわけではない。例示的なAksD酵素は、EC 4.2.1におけるものを含む。EC 4.2.1の例示的な酵素は、EC 4.2.1.33を含むが、それらに限定されるわけではない。例示的なAksF酵素は、EC 1.1.1の酵素を含むが、それらに限定されるわけではない。EC 1.1.1の例示的な酵素は、EC 1.1.1.85を含むが、それらに限定されるわけではない。および、この場合、第4のセットの酵素はデカルボキシラーゼを含む。例示的なデカルボキシラーゼは、EC 4.1.1.におけるものを含む。例示的なEC 4.1.1のデカルボキシラーゼは、EC 4.1.1.11、EC 4.1.1.15、EC 4.1.1.17、EC 4.1.1.18、EC 4.1.1.19、EC 4.1.1.20および EC 4.1.1.86を含むが、それらに限定されるわけではない。
【０１７０】
一態様では、α-ケトピメレートを、α-ヒドロキシピメレートへのケトン還元を触媒する1つまたは複数の酵素（例えばEC 1.1.1.184などのカルボニルレダクターゼ）と接触させることができ、今度はこれを、CoAの転移を触媒する酵素（例えば上述したCoAトランスフェラーゼ）を使用してα-ヒドロキシピメレートCoAに変換することができる。α-ヒドロキシピメレートCoAは、α-ヒドロキシピメレートCoAの脱水を触媒する酵素（例えば、EC 4.2.1.例えばEC 4.2.1.2、EC 4.2.1.59、EC 4.2.1.61に分類されるヒドロリアーゼ）で2-ヘプテン二酸CoAに変換することができる。2-ヘプテン二酸CoAは、2-ヘプテン二酸CoAのエノエート還元を触媒する酵素を使用してピメリン酸CoAに変換することができる。適切なエン酸レダクターゼは上述されている。
【０１７１】
一部の態様では、本発明は、D,L-ジアミノピメレートを優先的にピメレートに変換するのに必要な1つまたは複数の酵素を含む組換え宿主細胞を提供する。
【０１７２】
1.5.8  クロトネート経路
ピメロイルCoAの供給源、および最終的にピメレートの供給源は、出発炭素源がクロトネートである生合成経路である。その生合成経路を図9に例示する。例えば、Mouttaki,H.,et al.,Applied Envtl.Microbiology 73:930-938（2001）参照。クロトネートはアセチルCoAに分解される。図9に示す生合成経路において生成されるアセチルCoAの3分の2がアセテートに変換されることが報告されている。一部の態様では、本発明は、図9に示すように多数の代謝段階においてアセチルCoAがアセテートではなくアセトアセチルCoAに変換され、その後グルタコニルCo Aに変換されるように、アセチルCoAをアセテートに変換する酵素（例えばリン酸アセチルトランスフェラーゼおよびアセテートキナーゼ）が欠失している組換え宿主細胞を提供する。グルタコニルCoAはその後グルタリルCoAに変換される。グルタリルCoAは、鎖伸長されて3-オキソピメリルCoAを形成する。還元、脱水および2度目の還元後、ピメリルCoAが得られる。
【０１７３】
図9に示す生合成経路において、ピメリルCoAは最終的にシクロヘキサンカルボキシレートに変換される。そのような生合成経路はシントロファス・アシディトロフィカス（S.aciditrophicus）において認められている。それゆえ、一部の態様では、本発明は、代謝経路がピメロイルCoAで終了するように、ピメロイルCoAをシクロへキス-1-エン-1-カルボキシルCoAに変換し、最終的にシクロヘキサンカルボキシレートに変換する酵素をコードする遺伝子が「ノックアウト」されている組換え宿主細胞を提供する。
【０１７４】
1.5.9  テトラリン分解経路
一部の態様では、ピメリン酸セミアルデヒドは、スフィンゴモナスおよびコリネバクテリウム属種からのテトラリン（ベンゾシクロヘキサン）分解経路を使用して生産される。7-オキソヘプタン酸は、スフィンゴモナス・マクロゴリタビド（Sphingomonas macrogolitabid）におけるテトラリン分解経路の中間体として生成される.Lopez-Sanchez,A.,et al.,Appl.Environ.Microbiol.76:110-118（2010）。テトラリンは、ピルビン酸およびピメリン酸セミアルデヒドを生じる両方の芳香環の開裂によって代謝される。有機溶媒であるテトラリンは、ナフタレンから誘導される複雑な出発物質である。ナフタレンは現在コールタールから生産されるが、ナフタレン合成のための生合成経路がシロアリ、真菌および一部の種類の植物において生じることは公知である。Chen,J.et al.,Nature 392:558-559（1998）;Daisy,B.H.,et al.,Microbiology 148:3737-3741（2002）;およびAzuma,H.,et al.,Phytochemistry 42:999-1004（1996）。ピメリン酸セミアルデヒドは、上記で論じたように7-アミノヘプタン酸または 7-ヒドロキシヘプタン酸に変換することができる。
【０１７５】
1.11  2-オキソピメレートからのヘキサメチレンジアミン
本発明の一部の態様はまた、組換え宿主細胞を使用することを含む、2-オキソピメレートからヘキサメチレンジアミンを生成する方法も提供する。2-オキソピメレートは、メタン生成古細菌における補酵素B生合成経路の公知の中間体である。
【０１７６】
それゆえ本発明は、以下を含む組換え宿主細胞を提供する:2-オキソピメレートを2-アミノピメレートに変換することができる酵素（例えばEC 2.6.1.67のアミノトランスフェラーゼ酵素）、2-アミノピメレートを2-アミノ-7-オキソヘプタノエートに変換することができる酵素（例えばEC 1.4.1のレダクターゼ酵素）、2-アミノ-7-オキソヘプタノエートを2,7-ジアミノヘプタノエートに変換することができる酵素（例えばEC 2.6.1の1-アミノトランスフェラーゼ酵素）、および2,7-ジアミノヘプタノエートをヘキサメチレンジアミンに変換することができる酵素（例えばEC 4.1.1のデカルボキシラーゼ酵素）。一部の態様では、ヘキサメチレンジアミンを生産することができる組換え宿主細胞は、これらの酵素のいずれかまたは全部を含む。本発明の態様はまた、これらの組換え宿主細胞の使用を含む、ヘキサメチレンジアミンを生産する方法も提供する。
【０１７７】
一部の態様では、本発明は、糖類、脂肪酸、グリセロールおよびSynGasなどの再生可能な原材料からヘキサメチレンジアミンを生産するための方法を提供する。一部の態様では、ヘキサメチレンジアミンを生産することができる非天然の宿主細胞は、再生可能な原材料をヘキサメチレンジアミンに変換するのに必要な酵素のいずれかまたは全部を含む。
【０１７８】
2.2  組換え宿主細胞
本開示は、本明細書で述べる経路の1つにおいて化合物を生成するために使用される酵素の1つまたは複数（例えば2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上、16以上、17以上、18以上、19以上、20以上、またはさらにそれ以上）を組換え発現する組換え宿主細胞、および二官能性および三官能性C7アルカンを生成するためにそのような宿主細胞を使用する方法を特徴とする。例えば、宿主細胞は以下の1つまたは複数（上記のような）をコードする1つまたは複数（上記のような）の外因性核酸を含み得る:D,L-ジアミノピメレートまたはα-アミノピメレートの還元的脱アミノ化を触媒する酵素、2-ヘプテン二酸のピメリン酸へのエノエート還元を触媒する酵素、ピメリン酸のピメリン酸セミアルデヒドへのカルボン酸還元を触媒する酵素、ピメリン酸セミアルデヒドの7-アミノヘプタン酸へのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素、7-アミノヘプタン酸のエナントラクタムへのアミド加水分解を触媒する酵素、7-アミノヘプタン酸の7-アミノヘプタナールへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素、1,7-ジアミノヘプタンを生成するための7-アミノヘプタナールへのアミノ基の転移を触媒する酵素、2-ヘプテン二酸CoAを生成するための2-ヘプテン二酸へのCoAの転移を触媒する酵素、2-ヘプテン二酸CoAのピメロイルCoAへのエノエート還元を触媒する酵素、ピメリン酸を生成するためのピメロイルCoAのチオエステル加水分解を触媒する酵素、ピメリン酸のピメリン酸セミアルデヒドへのカルボン酸還元を触媒する酵素、α-ケトピメレートを生成するためのα-アミノピメレートからのアミノ基の転移を触媒する酵素、α-ケトピメレートのα-ヒドロキシピメレートへのカルボニル還元を触媒する酵素、α-ヒドロキシピメレートCoAを生成するためのα-ヒドロキシピメレートへのCoAの転移を触媒する酵素、α-ヒドロキシピメレートの2-ヘプテン二酸への還元を触媒する酵素、α-ケトピメレートのα-ケトスベレートへのα-ケト酸鎖伸長を触媒する酵素、α-アミノスベレートを生成するためのα-ケトスベレートへのアミノ基の転移を触媒する酵素、α-アミノスベレートの7-アミノヘプタン酸へのα-ケト酸脱カルボキシル化を触媒する酵素、ピメリン酸セミアルデヒドを生成するためのα-ケトスベレートのα-ケト酸脱カルボキシル化を触媒する酵素、ピメリン酸を生成するための6-アミノ-2-ヘプテン二酸のエノエート還元を触媒する酵素、またはピメロイル-［acp］のピメリン酸へのチオエステル加水分解を触媒する酵素。組換え宿主細胞は、上記に列挙した酵素の1つまたは複数をコードする1つまたは複数（上記のような）の核酸からなる任意のサブグループを含み得る。
【０１７９】
典型的に使用される宿主細胞は多数の特性を有する:それらは、容易に遺伝的に修飾することができ、本発明の方法において使用される条件に耐性であり、工業的に有用な細胞密度に増殖する。
【０１８０】
任意で、宿主細胞は単細胞微生物であってよく、または細胞株の細胞であってよい。宿主細胞は野生型の遺伝子型であってよい。この場合、本発明の方法の１つまたは複数の段階を触媒するために使用される酵素は宿主細胞において天然に存在し、本発明の方法において工業的に使用できるレベルで発現される。代替法では、宿主細胞は、本発明の態様の方法において工業的に使用できるレベルで酵素を発現するように遺伝的に修飾されている。酵素は、それが発現される細胞から調達され得る。代替法では、酵素は異なる株または種の細胞から調達される。
【０１８１】
１つの代替法では、宿主細胞は原核生物である。別の代替法では、宿主細胞は真核生物である。典型的には単細胞微生物が使用される。
【０１８２】
原核細胞という用語は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌を含む。適切なグラム陰性菌の例は、大腸菌、ロドシュードモナス・パルストリス、スフィンゴモナス属、シュードモナス属、ならびにコリネバクテリウム属、サルモネラ属、バークホルデリア属、モラクセラ属、アルカリゲネス属、サイクロバクター属、サーモトガ属、アシネトバクテリア、ロドバクター属、アゾアルカス属、およびロドスピリルム属に属する他の細菌を含む。適切なグラム陽性菌の例は、連鎖球菌、乳酸杆菌、ならびにノカルジア属、バチルス属、ロドコッカス属、クロストリジウム属、ストレプトミセス属、およびアルスロバクター属に属する他の細菌を含む。
【０１８３】
真核生物宿主細胞は、酵母および他の真菌に由来するもの、ならびに、例えば昆虫、マウス、ラット、霊長動物またはヒト細胞に由来するものを含む。適切な真核生物宿主細胞の例は、酵母ヤロウィア・リポリティカ;カンジダ属、例えばカンジダ・トロピカリス、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・クロアカエ、カンジダ・グイリエルモンディイ、カンジダ・インターメディア、カンジダ・マルトサ、カンジダ・パラプシロシス、およびカンジダ・ゼイレノイデス;ロドトルラ属、リゾプス属、トリコスポロン属、およびリポミセス属に属する酵母;ならびにアスペルギルス属、エクソフィアラ属、ケカビ属、トリコデルマ属、クラドスポリウム属、ファネロケーテ属、クラドフィアロフォラ属、ペシロミセス属、スケドスポリウム属、およびオフィオストマ属に属する他の真菌を含む。
【０１８４】
宿主細胞は様々な異なる形態で提供され得る。細胞は休止細胞であってよい。すなわち細胞は培養で増殖され、培地から取り出された後、生物触媒として使用される。細胞は増殖後すぐに使用されてもよく、または使用時まで保存されてもよい。典型的な保存方法は凍結である。代替法では、細胞は使用時まで凍結乾燥される。さらなる代替法では、細胞は増殖中の細胞である。すなわち細胞は、培養されつつそれらの生物触媒作用を果たす。特定の生物触媒反応のための基質が、宿主細胞によって変換される細胞の膜を横断することができない場合、１つの代替法では、粗溶解物を使用してもよい。粗溶解物は、細胞の溶解後に生成される細胞成分の初期懸濁液である。細胞の溶解は、化学的または機械的手段を含む任意の手段によって実施し得る。溶解のさらなる方法は、当業者の一般的知識および本明細書の教示に照らして当業者に明らかである。別の代替法では、清澄化溶解物を使用し得る。清澄化溶解物は、粗溶解物を遠心分離して非溶解細胞および他の細胞デブリをペレット化することによって調製し得る。
【０１８５】
一部の態様では、組換え宿主細胞の実質的に純粋な培養物が提供される。本明細書で使用される場合、組換え宿主細胞の「実質的に純粋な培養物」は、培養物中の生細胞の総数の約40％未満（すなわち約35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、2％、1％、0.5％、0.25％、0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％未満、またはさらにそれ未満）が組換え細胞以外の生細胞、例えば細菌、真菌（酵母を含む）、マイコプラズマ、または原生動物細胞である、その細胞の培養物である。これに関連して「約」という用語は、該当するパーセンテージが指定されるパーセンテージよりも15％前後であり得ることを意味する。それゆえ、例えば約20％は17％から23％であり得る。組換え細胞のそのような培養物は、細胞および増殖、保存または輸送培地を含む。培地は、液体、半固体（例えばゼラチン状培地）または凍結であり得る。培養物は、液体培地中もしくは半固体培地中/上で増殖している細胞、または凍結保存もしくは輸送培地を含む保存もしくは輸送培地中で保存もしくは輸送されている細胞を含む。培養物は、培養容器または保存容器または基質（例えば培養皿、フラスコもしくはチューブまたは保存バイアルもしくはチューブ）中に存在する。
【０１８６】
一態様では、本開示の組換え細胞は、ろ過または遠心分離などの従来の方法によって発酵工程から採取し、高い活性を維持しつつドライペレットまたは乾燥粉末製剤に製剤化することができる。本明細書で開示される活性の1つまたは複数を示す乾燥粉末全組換え細胞組成物の生産のための工程は、噴霧乾燥、凍結乾燥、流動床乾燥、真空ドラム乾燥、または凝集等を含み得る。組成物は、本明細書で述べる生合成方法に適した貯蔵安定な乾燥生物触媒組成物であり得る。凍結乾燥、流動床乾燥または押出/球形ペレット化、次いで流動床乾燥を用いる方法などの乾燥方法は特に有用であり得る。これらの工程のための温度は、高い残留活性および立体選択性を維持するために100℃未満であり得るが、典型的には70℃未満であり得る。乾燥粉末製剤は、0〜10％w/w、典型的には2〜5％w/wの含水率を有するべきである。乾燥工程の間の組換え細胞の熱耐性を改善するためまたは乾燥特性を改善するために塩（例えばKCl）、糖類、タンパク質等のような安定化添加剤を含んでもよい。一部の態様では、部分精製または完全精製された酵素を、組換え宿主または組換えもしくは非組換え細胞の溶解物の代わりにまたはそれらと組み合わせて使用し得る。完全または部分精製された酵素は、本明細書で述べる組換え細胞または非組換え細胞のいずれかの完全または部分精製された溶解物であり得る。精製の方法は当技術分野において周知である。部分精製または完全精製は、関心対象の酵素が、その酵素によって触媒される反応に干渉し得る（例えば基質とも反応することによってまたは中間体もしくは所望生成物を望ましくない化合物に変換することによって）他の細胞成分から分離されるという利点を有する。しかし精製は任意の生物触媒調製にさらなる段階を追加し、そのためすべての場合に適切であるとは限らない。部分または完全精製された酵素の使用の適切性の決定は、本明細書の教示に従って十分に当業者の理解の範囲内である。
【０１８７】
一部の態様では、本発明の方法における変換の１つまたは複数は、好気的条件下で生物触媒によって実施される。代替法では、本発明の方法における変換の１つまたは複数は嫌気的条件下で実施される。さらなる代替法では、本発明の方法の一部の段階は好気的条件下で実施され、別の一部の段階は嫌気的条件下で実施される。
【０１８８】
2.3  全細胞生物触媒の修飾
本発明の方法において使用される生物触媒は、酵素が天然に存在する種の非修飾宿主細胞であり得る。典型的には、しかし、非天然の（すなわち組換えまたは遺伝子操作された）宿主細胞を生成するように宿主細胞を遺伝的に修飾する必要がある。
【０１８９】
2.4  宿主細胞ゲノムの染色体修飾
一部の態様では、全細胞生物触媒（すなわち宿主細胞）の染色体は修飾されている。この修飾は、染色体中の核酸の挿入、欠失または置換であり得る。細胞の染色体に修飾を行う方法は周知であり、例えばトランスポゾン突然変異誘発、Cre-Lox媒介性組換え、λRedおよびRecET媒介性組換えである。
【０１９０】
核酸の染色体への安定な組込みは、選択マーカーを必要とせずに核酸の維持を可能にするので好都合である。
【０１９１】
反復挿入を実施することにより、多数の異なる核酸を宿主細胞生物触媒の染色体に安定に組み込むことが可能である。安定な組込みとは、宿主細胞が改変を喪失せずに5世代を超えて培養され得ることを意味する。一般に、安定な遺伝的改変は、10世代を超えて存続する修飾を含み、特に安定な修飾は約25世代を超えて存続し、より特定すると、安定な遺伝的修飾は、無期限を含む、50世代を超える。
【０１９２】
2.5  宿主細胞生物触媒のゲノムのエピソーム修飾
一部の態様では、宿主細胞ゲノムのエピソーム組成物を修飾する。エピソームにより、任意の自律複製するエレメント、例えばプラスミド（線状または環状であり得る）、コスミド、酵母人工染色体（YAC）等が意味される。エピソームエレメントはしばしばそれらの宿主細胞に代謝負荷をかけ、したがって、エピソームの少なくとも1つのコピーが細胞分裂後に各々の娘細胞中に存在することを確実にする何らかの能動的分配機構が存在しない場合は、選択マーカーを含む必要がある。
【０１９３】
2.6  導入核酸配列
細胞に導入される核酸は、多数のエレメントの1つまたは複数（例えば2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上、16以上、17以上、18以上、19以上、20以上、またはさらにそれ以上）を含み得る。典型的には、エレメントの1つは、二官能性または三官能性C7アルカンまたはそのような分子の前駆体を生産するために使用される酵素をコードする。一部の代替法では、核酸は、本発明の方法において機能する酵素ではないタンパク質をコードする。
【０１９４】
典型的には、プロモーターは核酸に作動可能に連結される。プロモーターの選択は意図される適用に依存し、当業者によって容易に決定され得る。例えば、酵素が触媒する反応が特定の宿主細胞に有害であり得る場合は、遺伝子発現が必要に応じて作動または停止され得るように、調節または誘導的プロモーターを使用することが望ましいと考えられる。あるいは、酵素が増殖のすべての段階で発現されることを確実にするために弱いまたは強力な構成的プロモーターのいずれかによって駆動される発現を有することが好ましいと考えられる。真核細胞系に適する例示的なプロモーターは、SV40初期プロモーター 、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（MMTV）ステロイド誘導性プロモーター、およびモロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）プロモーターを含む。例示的な酵母プロモーターは、3-ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）プロモーター、ガラクトキナーゼ（GAL1）プロモーター、ガラクトエピメラーゼプロモーター、およびアルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）プロモーターを含む。酵母における他の適切なプロモーターは当業者に公知である。細菌細胞系に適する例示的なプロモーターは、T7、T3、SP6、lacおよびtrpプロモーターを含むが、それらに限定されるわけではない。
【０１９５】
発現を確実にすることが必要な場合、導入される核酸はまた、必要に応じて5'非翻訳領域（UTR）、3 'UTR、エンハンサーおよび/またはターミネーター領域を含むように作動可能に連結され得る。そのようなエレメントは当業者に公知である。
【０１９６】
2.7  宿主細胞における複数の酵素の発現
一部の態様では、宿主細胞の単一株を使用して、本発明の方法において使用される複数（例えば2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上、16以上、17以上、18以上、19以上、20以上、またはさらにそれ以上）の酵素を発現させる。この場合、複数の酵素は同じ導入核酸によってコードされ得る。代替法では、酵素は別々の導入核酸フラグメント上にコードされ得る。酵素は、すべてが単一プロモーターから（例えば酵素をオペロンの形態で配置することによって）発現され得る。代替法では、酵素は複数の別々のプロモーターから発現され得る。一部の場合、複数の別々のプロモーターが同じ化学物質によって誘導され得る（例えば、複数の酵素の各々が酵素GALプロモーターから発現され得、したがって各遺伝子をガラクトースで誘導できることを意味する）。他の適切なプロモーターは当技術分野において公知である。代替法では、本発明の方法において使用される酵素をコードする遺伝子の各々は異なるプロモーターの制御下にある。したがって、異なる酵素を異なる誘導化合物の使用を通して個別に導入することができる。別の代替法では、いくつかの酵素は同じプロモーターの制御下にあり、およびまたいくつかの酵素は異なるプロモーターの制御下にある、中間的なアプローチが使用される。この代替法は、多数の酵素経路が宿主細胞において生成されており、経路の各成員をその他の経路成員と協調して制御するが、各々の経路を別々に制御することが望ましい場合に特に好都合であり得る。
【０１９７】
さらに、複数の酵素が染色体から発現されるかまたはプラスミドから発現されるかに関して考慮することができる。酵素がプラスミドから発現される場合、好都合には各プラスミドが異なる起点および/または異なる選択マーカーを含む。
【０１９８】
単一細胞における複数の酵素の発現は、共発現される酵素が反応経路において互いの直後に作用する場合、上流の酵素反応の生成物が直ちに下流の酵素による作用に利用可能となることを保証するので好都合である。これは、（i）中間体の精製および第2の反応を実施する第2の反応容器の設置の必要性、または（ii）生成物を、上流の酵素を含む細胞から下流の酵素を含む細胞によって作用され得る培地へと輸送する必要性を回避する。
【０１９９】
2.8  シャペロン系
細胞が非天然の条件下でタンパク質を発現するように遺伝子操作されている場合（例えば、ある種にネイティブであるタンパク質が天然のレベルより高いレベルで発現される場合、または代替法では、異なる種からのタンパク質が宿主細胞において発現される場合）、一部の場合には、そのタンパク質は活性形態では発現されない。その代わりに、誤って折りたたまれ、非機能性の「封入体」凝集物として蓄積され得る。この場合、タンパク質を発現するのに使用される細胞を、タンパク質の誤った折りたたみを防ぐことができるまたは凝集状態からタンパク質を再度折りたたむことができるシャペロンタンパク質をさらに発現するための遺伝子修飾に供し得る。そのようなシャペロンタンパク質を含むことは、細胞当たりの活性タンパク質の量を増大させ、それゆえ本発明の方法の全体的な効率を上昇させるので、好都合である。発現されるシャペロンは宿主細胞のシャペロンタンパク質であり得る。代替法では、シャペロンはタンパク質と同じ種/株に由来し得る。発現のための典型的なシャペロンタンパク質は、GroEL/GroESファミリーの成員、およびDnaJ/DnaK/GrpEファミリーの成員を含む。原型大腸菌のGroEL/GroESおよびDnaJ/DnaK/GrpEタンパク質のホモログが他の原核生物種において同定されており（例えば、参照）、真核生物ホモログも公知である（GroELおよびGroESは真核生物タンパク質Hsp60およびHsp10に対応し、DnaJ、DnaKおよびGrpEはそれぞれ真核生物タンパク質Hsp70、Hsp40およびHsp24に対応する）。これらのタンパク質は多数の種の酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ）において同定されている。本発明の方法において使用される酵素との共発現のための適切なシャペロンタンパク質の選択は、本明細書の教示に従って当業者に明らかである。
【０２００】
2.9  宿主細胞の代謝遺伝子操作
代謝遺伝子操作は、化合物を生産する細胞の能力を高めるために宿主細胞におけるパラメータを最適化する工程である。本発明の方法において使用される宿主細胞は、任意で、上記で論じた二官能性C7アルカンの生産量を最適化するように遺伝子操作されている。
【０２０１】
化合物を生産する細胞の能力を高める代謝遺伝子操作は、主として2つの手段によって実施される。第一には、出発物質から所望生成物を生産する経路における酵素を最適化することである。二官能性C7アルカンの生産をもたらす多酵素経路において（図面に示し、前の章で述べたように）、当業者に公知の技術（例えば二次元電気泳動、同位体標識した前駆体の使用、および核磁気共鳴（NMR）分光法）を用いて経路の各中間体の濃度を測定すること、それゆえいずれの酵素変換が律速段階であるか、すなわち反応スキーム中のどの段階が最も遅いかを決定することが可能である。これは、この中間体に作用する酵素が変換の全体的な速度を制限していることを示す、中間体の蓄積を観察することによって決定できる。この場合、この中間体が反応する速度が、それゆえ、増大されるべきである。これは多くの手段によって実施できる。第一に、制限している酵素の発現レベルを増大させ得る。任意で、これは、酵素をコードする遺伝子を強力なプロモーター、例えば酵素が大腸菌で発現されている場合はT7プロモーターまたは酵素が酵母で発現されている場合はTEFプロモーターの制御下に置くことによって達成され得る。第二の選択肢は、例えば遺伝子をマルチコピープラスミド上に置くことによって、または遺伝子の複数のコピーを宿主細胞の染色体に組み込むことによって（これらのコピーは染色体内の同じ位置にまたは染色体内の異なる位置に組み込み得る）、細胞中に存在する、酵素をコードする遺伝子のコピー数を増加させることである。
【０２０２】
二官能性C7アルカンの生産（図面に示し、前の章で述べたように）はまた、基質、中間体のいずれか、または生成物を、本発明の方法の目的である以外の代謝経路へと迂回させることができるいずれかの酵素を不活性化するまたは酵素の活性を低減することによっても増大させることができる。それゆえ、二官能性C７アルカンの収率を高めるために酵素の活性を低下させ得る。したがって一部の態様では、本明細書で開示される組換え宿主細胞は、本発明の方法の出発物質、または二官能性C７アルカンを生産する反応経路において生成されるいずれかの中間体を、異なる望ましくない最終生成物へと迂回させることができる1つまたは複数の酵素の欠失を有し得る（例えば関心対象の酵素をコードする核酸を欠失させることによってまたは核酸の発現を低減することによって）。代替法では、酵素を欠失させず、その代わりに野生型酵素の速度より低い速度で基質、中間体または生成物に対して作用し得るように改変する。酵素が可逆的反応を触媒する場合は、酵素が所望の方向の反応においてのみ作用するように改変すべきである。
【０２０３】
例えば、一部の態様では、組換え宿主細胞は、ピメロイル-［acp］を7-ケト-8-アミノペラルゴン酸（KAPA）に変換するまたは6-カルボキシヘキサノイルCoA（ピメロイルCoA）をKAPAに変換することができる酵素の欠失（例えば7-ケト-8-アミノペラルゴン酸シンテターゼ（E.C.2.3.1.47）をコードする遺伝子、BioFの欠失または不活性化）を有し得る。
【０２０４】
一部の態様では、組換え宿主細胞は、リジン栄養要求株を作り出す、ジアミノピメレートデカルボキシラーゼの欠失を有し得る。リジン栄養要求株は、リジンの直前前駆体であるD,L-ジアミノピメレートへの炭素フラックスを調節解除するために特に有用であり得る。リジン栄養要求株は流加発酵を必要とする。
【０２０５】
2.10  増殖中の全細胞生物触媒
本発明の一部の態様では、本発明の方法において細胞が変換を実施する時点で増殖中（すなわち分裂中）である宿主細胞を使用する。これらの態様では、所望の二官能性C7アルカンの生産を最適化する条件下で細胞を培養する。本明細書で述べる組換え宿主細胞のいずれかを、本発明の生合成生成物を生産するおよび/または分泌するように培養することができる。本明細書で使用される場合、培養という用語は発酵槽およびバイオリアクターと等価である。
【０２０６】
2.10.1  培地
一部の場合、増殖に使用される炭素源は、栄養ブロス、例えばルリア培地または酵母抽出物培地の形態で提供される。また別の場合には、宿主細胞の増殖に適した規定培地（すなわち各成分の濃度が既知である培地）を使用し得る。１つの代替法では、増殖培地はグルコースを炭素源として含む。別の代替法では、培地中で宿主細胞によって使用される炭素源は、グルコース、スクロース、キシロース、脂肪酸およびグリセロールである。
【０２０７】
2.10.2  同じ培養物中での複数の株の増殖
一部の態様では、本発明の方法において変換を触媒する酵素は2つ以上の株/種の細胞において存在し、それらの2つ以上の株/種の細胞は同時に使用される。本発明の方法における変換が実施されるときに複数の株/種が増殖している（すなわち細胞が共培養下にある）場合、選択される株/種は、ある株がその他の株を打ち負かしてしまわないように選択されねばならない。そのような関係は、共培養物に人工的共生を導入することによって得ることができる。すなわち使用される2つの株/種は、各々必須栄養素に栄養要求性であるが、異なる栄養素について栄養要求性である。さらに、その他の株は、培養物の増殖培地が2つの必須栄養素を含まない場合に両方の株が培養物中で共に生存できるように、その栄養素を過剰に生産するように遺伝子操作されるべきである。適切な栄養要求株の選択は、本明細書の教示に従って十分に当業者の理解の範囲内である。
【０２０８】
2.10.3  発酵
本明細書で述べる培養条件は、ヘプタン-1,7-二酸、7-オキソヘプタン酸、7-ヒドロキシヘプタン酸、7-ヒドロキシヘプタナール、7-アミノヘプタン酸、ヘプタメチレンジアミン、1,7-ヘプタンジオール、7-アミノヘプタナール、7-アミノヘプタノールまたはエナントラクタムの製造のためにスケールアップすることができ、連続的に増殖させることができる。例示的な増殖手順は、例えば流加発酵およびバッチ分離、流加発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離を含む。これらの工程のすべてが当技術分野において周知である。発酵手順は、商業的な量の二官能性および三官能性C7アルカンの生合成生産のために特に有用である。一般に、および非連続的な培養手順に関して、先に述べたヘプタン-1,7-二酸、7-オキソヘプタン酸、7-ヒドロキシヘプタン酸、7-ヒドロキシヘプタナール、7-アミノヘプタン酸、ヘプタメチレンジアミン、1,7-ヘプタンジオール、7-アミノヘプタナール、7-アミノヘプタノールまたはエナントラクタムの連続的および/またはほぼ連続的な生産は、対数期の増殖を維持するおよび/またはほぼ維持するのに十分な養分および培地の存在下で、本明細書で述べるヘプタン-1,7-二酸、7-オキソヘプタン酸、7-ヒドロキシヘプタン酸、7-ヒドロキシヘプタナール、7-アミノヘプタン酸、ヘプタメチレンジアミン、1,7-ヘプタンジオール、7-アミノヘプタナール、7-アミノヘプタノールまたはエナントラクタムを生産する組換え宿主細胞を培養する段階を含む。そのような条件下での連続培養は、例えば1日、2、3、4、5、6または7日またはそれ以上を含み得る。加えて、連続培養は、 1週間、2、3、4または5週間またはそれ以上および数か月までを含み得る。あるいは、組換え細胞は、特定の適用に適する場合は、数時間培養することができる。連続的および/またはほぼ連続的な培養条件は、これらの例示的な期間の間のすべての時間間隔を含み得ることが理解されるべきである。本発明の宿主細胞を培養する時間は、所望の目的のために十分な量の生成物を生産するのに十分な期間である。
【０２０９】
発酵手順は当技術分野において周知である。簡単に述べると、先に述べたヘプタン-1,7-二酸、7-オキソヘプタン酸、7-ヒドロキシヘプタン酸、7-ヒドロキシヘプタナール、7-アミノヘプタン酸、ヘプタメチレンジアミン、1,7-ヘプタンジオール、7-アミノヘプタナール、7-アミノヘプタノールまたはエナントラクタムの生合成生産のための発酵は、例えば
流加発酵およびバッチ分離、流加発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離において利用できる。バッチ発酵および連続発酵手順の例は当技術分野において周知である。
【０２１０】
本明細書で述べるヘプタン-1,7-二酸、7-オキソヘプタン酸、7-ヒドロキシヘプタン酸、7-ヒドロキシヘプタナール、7-アミノヘプタン酸、ヘプタメチレンジアミン、1,7-ヘプタンジオール、7-アミノヘプタナール、7-アミノヘプタノールまたはエナントラクタムの生産体を、これらの実質的な量の連続生産のために使用する上記発酵手順に加えて、ヘプタン-1,7-二酸、7-オキソヘプタン酸、7-ヒドロキシヘプタン酸、7-ヒドロキシヘプタナール、7-アミノヘプタン酸、ヘプタメチレンジアミン、1,7-ヘプタンジオール、7-アミノヘプタナール、7-アミノヘプタノールまたはエナントラクタム生産体はまた、例えば生成物を他の化合物に変換するさらなる手順に同時に供することができるか、または生成物を発酵培養物から分離し、所望する場合は生成物を他の化合物に変換する化学的または生物触媒変換に連続的に供することができる。
【０２１１】
2.11  本発明の組成物
本発明はまた、本発明による組換え宿主細胞ならびにヘプタン-1,7-二酸、7-オキソヘプタン酸、7-ヒドロキシヘプタン酸、7-ヒドロキシヘプタナール、7-アミノヘプタン酸、ヘプタメチレンジアミン、1,7-ヘプタンジオール、7-アミノヘプタナール、7-アミノヘプタノールおよびエナントラクタムを含む組成物も提供する。本発明はまた、本発明による組換え宿主細胞および原材料を含む組成物も提供する。一部の態様では、原材料は再生可能な原材料であり、例えば原材料は、グルコース、スクロース、キシロース、脂肪酸およびグリセロールからなる群より選択される。一部の態様では、原材料は多環芳香族炭化水素、例えばベンゼン、トルエンまたはシキメートである。
【実施例】
【０２１２】
3.1  実施例
ここまで本発明を一般的に説明してきたが、本発明は以下の実施例を参照することによってより容易に理解され、これらの実施例は説明として提供されるものであり、限定を意図されない。本明細書で開示される例示的な態様に、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な修正および変更を加え得ることが理解される。
【０２１３】
3.1.1  アンモニアリアーゼ（EC 4.3.1.-）による2,6-ジアミノピメレートの2-アミノ-5,6-デヒドロピメリン酸（6-アミノ-2-ヘプテン二酸）への変換および2-アミノヘプタン二酸の2-ヘプテン二酸への変換（図10参照）
3.1.1.1  MAL酵素遺伝子標的の選択
2,6-ジアミノピメリン酸の、ナイロン-7,7の生産において使用されるピメリン酸への変換、およびピメリン酸の7-アミノヘプタン酸への変換に関与する経路を同定した後、これらの経路からの遺伝子標的を選択した。特に、酵素標的を、その広い基質特異性、広範囲の宿主における存在、クローン化され、外因性に発現され得ること、および合理的設計によるタンパク質遺伝子操作のために利用可能な結晶構造に基づき、メチルアスパラギン酸アンモニアリアーゼ（MAL;EC 4.3.1.2）を含むアンモニアリアーゼファミリー（EC 4.3.1）から選択した。シトロバクター・アマロナティカス、クロストリジウム・テタノモルフムおよびアスペルギルス・オリゼ由来のMAL遺伝子を選択した。C.アマロナティカスによってコードされるMAL酵素（GeneBank AB005294;フラグメント1641-2882878596..879060NM_NM）とC.テタノモルフム（GeneBank S48141;フラグメント756-1997）によってコードされるMAL酵素は有意の相違を有する（57％の同一性）。アスペルギルス・オリゼのMAL遺伝子（GeneBank XM_001827609）は進化的に分岐しており（シトロバクター・アマロナティカスMAL と44％の同一性、クロストリジウム・テタノモルフムMALと39％の同一性）、異なる触媒特性および/または選択性を示し得る。2,6-ジアミノピメレートおよび2-アミノヘプタン二酸の還元的脱アミノ化のための潜在的な酵素である別の異例のアンモニアリアーゼは、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）（受託番号BAD69624）由来のD-グルコサミン酸アンモニアリアーゼ（EC 4.3.1.9）である。これは、α,β- 脱離反応を触媒する異例のアンモニアリアーゼである:
D-グルコサミネート→ 2-デヒドロ-3-デオキシ-D-グルコネート＋NH3
2014525741.tif 000003
【０２１４】
3.1.1.2  遺伝子標的を含む発現ベクターのクローニング
シトロバクター・アマロナティカス、クロストリジウム・テタノモルフムおよびアスペルギルス・オリゼ由来の選択したMAL遺伝子標的を、inABLE技術を使用してIPTG誘導性pET21-aバックボーンにクローニングし、I4（シトロバクター・アマロナティカスMAL遺伝子を有するpET21-a）、I5（クロストリジウム・テタノモルフムMAL遺伝子を有するpET21-a）、およびI6（アスペルギルス・オリゼMAL遺伝子を有するpET21-a）を生成した。最初に、ソフトウェア解析を用いて遺伝子およびベクターDNAをトランケートされたパートに分割する。選択したMAL遺伝子およびpET21ベクター内の潜在的な制限酵素、例えばEarIの部位を同定し、突然変異を導入することによって分断した。コード配列内に位置するEarI制限部位を、コードされるタンパク質配列を改変するのを避けるために、例えばサイレント突然変異の組込みによって、分断した。生じたDNAはEarI部位を含まず、EarI（DNA 2.0を通して入手した）、長および短リンカーオリゴヌクレオチド（Sigma-Aldrichを通して入手した）ならびに長および短パートオリゴヌクレオチド（Sigma-Aldrichを通して入手した）によって隣接された対応するトランケートパートを設計するソフトウェア解析のための入力配列を使用した。パートおよびリンカーオリゴヌクレオチドの5'末端を、適切な反応条件（6μMオリゴ、1 PNK緩衝液、1mM ATP、10U T4キナーゼ、5mM DTT、5％（w/v）PEG8000）下に37℃で30分間、T4キナーゼの存在下でプライマーをインキュベートすることによってリン酸化し、次いで65℃で20分間酵素を不活性化した。
【０２１５】
次に、リン酸化したリンカーオリゴおよびリン酸化したパートオリゴを、等モル量の各オリゴ（6μMで50μL）を混合し、次にサーモサイクラーで混合物を65℃に加熱した後、温度を20℃まで徐々に低下させることによってアニーリングし、特異的な16bpの突出部を有する部分的二本鎖のパートオリゴおよび部分的二本鎖のリンカーオリゴ（融解温度75℃以上）を形成した。生じたアニーリングしたパートオリゴ（POA）およびアニーリングしたリンカーオリゴ（LOA）を、次に、TE緩衝液（トリス-EDTA）で1μMの最終濃度に希釈した。
【０２１６】
次に、選択した遺伝子（シトロバクター・アマロナティカス、クロストリジウム・テタノモルフムおよびアスペルギルス・オリゼMAL）に対応するパート/リンカーフラグメントを、クローニングしたトランケートパートのEarI消化、次いでそれらのそれぞれのアニーリングしたパートオリゴ（POA28、POA29またはPOA30）、それらのトランケートパート（TP28、TP29またはTP30）、およびベクターバックボーンからのアニーリングしたリンカーオリゴ（LOA31）の連結という連続的なサイクルによって作製した。ベクターバックボーンに対応するパートリンカー融合物を、そのアニーリングしたパートオリゴ（POA31）、そのトランケートパート（TP31）およびいずれかの遺伝子からのアニーリングしたリンカーオリゴ（LOA28、LOA29またはLOA30）の連結によって調製した。トランケートパートと比較して10倍および20倍モル過剰のLOAおよび POAを、各々のEarI消化/連結サイクルの間のトランケートパートとオリゴヌクレオチドの連結を促進するためにそれぞれ遺伝子およびベクター反応において使用した。反応は50μLの総容量で実施し、サーモサイクラー（Eppendorf Mastercycler Gradient）でインキュベートした。EarI消化/連結のサイクルは、それぞれT4 DNAリガーゼを使用してEarI消化および連結のための最適温度に対応する、37℃と16℃の間で温度を交互に変化させることによって達成した。試料を0.7％アガロースゲルに負荷し、アガロースゲル分離およびゲル抽出（QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit）を介してパートリンカーを残留バックボーンから精製した。パートリンカーフラグメントの調製のためのアガロースゲル電気泳動後、予想されたサイズのフラグメントが認められた。適合する3bp突出部を示すアニーリングしたオリゴヌクレオチドと消化したフラグメントの連結は、切断不能のパート/リンカーフラグメントの形成を生じさせた。
【０２１７】
遺伝子パート/リンカー融合物を、次に、2パート集合を用いてそれらのそれぞれのベクターパート/リンカー融合物と組み合わせ、先に作製したパートリンカーを用いて大腸菌発現ベクターを構築した。遺伝子およびベクターパートリンカー融合物を等モル量（各々0.1pmol）で一緒に混合し、これは、各々のパートからのアニーリングしたパートオリゴヌクレオチドおよびアニーリングしたリンカーオリゴヌクレオチドにおいて形成された特異的な相補的突出部による予想されたDNAフラグメント集合体を生じさせた。反応物を室温で30分間インキュベートした後、2μlの集合体反応物および10μlのコンピテント細胞を使用して高効率の化学的にコンピテントなNEB10β大腸菌細胞の形質転換を実施した。形質転換した細胞をLB-Amp-寒天に塗布し、37℃で一晩インキュベートした。各集合体について500クローンを得た。次に2つのランダムなクローンを各集合体から採取し、QIAGEN QIAprep Miniprep Kitを使用して対応するベクターを単離した。
【０２１８】
正しい集合体、例えばpET21-aバックボーンへのシトロバクター・アマロナティカス遺伝子集合体の構築を確認するため、先に単離したベクターに関して制限分析を実施した。大腸菌発現ベクターへのシトロバクター・アマロナティカス遺伝子の集合体から得たクローンをPvuIおよびBmgBIを用いて分析し、挿入に関して陽性のクローンを同定した。大腸菌発現ベクターへのクロストリジウム・テタノモルフム遺伝子の集合から得たクローンをPstIおよびAlwNI（図30、表10）を用いて分析し、挿入に関して陽性のクローンを同定した。大腸菌発現ベクターへのアスペルギルス・オリゼ遺伝子の集合から得たクローンをSphIおよびEcoRVを用いて分析し、挿入に関して陽性のクローンを同定した。各試料からの制限産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。各集合体からの両方のクローンに関して予想されたバンドパターンを認め、シトロバクター・アマロナティカス、クロストリジウム・テタノモルフムおよびアスペルギルス・オリゼMAL遺伝子を保有する大腸菌発現ベクターの構築を確認した。陰性対照としてパート/リンカー融合物pET21-aパート/pET21-aリンカーを用いてI7陰性対照ベクター（pET21-a対照）の構築を実施し、陰性対照遺伝子不含構築物の作製からのクローンを、XmnIおよびAlwNIを用いて分析した。発現ベクターの適切な構築をさらに確認するため、ベクターバックボーンの3'末端と遺伝子の5'末端の間ならびに遺伝子の3'末端とベクターバックボーンの5'末端の間のパート接合部を各集合体からの2つのクローンの一方から配列決定した。
【０２１９】
3.1.1.3  大腸菌における外因性MAL遺伝子の発現
先に得られた大腸菌構築物を使用して、大腸菌におけるシトロバクター・アマロナティカス、クロストリジウム・テタノモルフムおよびアスペルギルス・オリゼMAL遺伝子の発現を検討した。ベクター（各集合体から10ngのDNA）を使用してエレクトロコンピテントBL21（DE3）大腸菌細胞を形質転換し、形質転換試料をLB-Amp-寒天に塗布した。37℃で一晩インキュベートした後、形質転換体を得た。
【０２２０】
単一クローンを各集合体プレートから採取し、出発培養物として5mlのLB-Amp培地に接種するために使用した。37℃および250rpmで一晩インキュベートした後、OD600を測定した。2mLの各出発培養物（約4.5×107〜6.2×107細胞）を使用して100mLのLB-Ampに接種し、0.6〜0.8のOD600に達するまで培養物を500mLのバッフル付き振とうフラスコにおいて37℃および250rpmでインキュベートした。pET21-aではT7プロモーターによって制御されるタンパク質発現を1mM IPTG（最終濃度）の添加によって誘導し、培養物を37℃および250rpmでさらにインキュベートした。1mLの各試料を誘導の前、誘導後4時間、および誘導後24時間に採取した。OD600を測定することによって細胞増殖を調べた。誘導後24時間のインキュベーション後に残った残存培養物を50mLファルコンチューブに移し、5000rpmで10分間の遠心分離によって採取して、細胞ペレットを-20℃で保存した。
【０２２１】
次に、各集合体からの各時点の試料をSDS-PAGE分析用に処理した。試料を13000rpmで2分間遠心分離した後、上清を取り、リゾチーム（15 mg/mL）およびベンゾナーゼ（3.4U/μL）を添加したBugbusterタンパク質抽出試薬を用いて細胞を溶解した。次に溶解反応物を13000rpmで2分間遠心分離し、可溶性画分を新しいチューブに移して、不溶性画分を水に再懸濁した。20μlの各画分を80μlのSDS試料緩衝液（SDS負荷緩衝液、9％DTTおよび水）と混合し、混合物をヒートブロックにおいて95℃で5分間加熱した。次に10μlの各試料をSDS-PAGE 4〜20％トリシンゲルに負荷し、可溶性および不溶性画分のタンパク質含量を分析した。IPTG誘導後、予想されたサイズ（45 kDa）のタンパク質バンドが可溶性画分において明瞭に見えた。陰性対照実験では対応するタンパク質を認めず、予想された45kDaのシトロバクター・アマロナティカスMALタンパク質および45kDaのクロストリジウム・テタノモルフMALタンパク質が、組み立てた発現ベクター構築物から大腸菌において可溶性タンパク質として成功裏に発現されたことを示唆した。誘導後、いずれの試料の不溶性画分においても有意のタンパク質を認めなかった。45kDaのアスペルギルス・オリゼMALタンパク質も、組み立てた発現ベクター構築物から大腸菌において発現されたが、これは不溶性タンパク質として発現された（誘導後、45kDaのバンドが不溶性画分において可視であった）（図11Aおよび11B参照）。
【０２２２】
アスペルギルス・オリゼMALタンパク質の溶解度を改善するため、誘導の温度および/または誘導物質の濃度を低下させた。これらは、一部の場合にはタンパク質合成の速度の低下およびそれゆえタンパク質折りたたみの効率上昇に起因してタンパク質溶解度の上昇をもたらすことが示されている。これらのパラメータを、上述したのと同じ発現および誘導手順を用いて低下させたが、SDS-PAGE分析は、アスペルギルス・オリゼMALタンパク質がまだ不溶性であったことを示す（誘導後に45kDaのバンドが不溶性画分において可視であった）。アスペルギルス・オリゼMALタンパク質を含む酵母発現ベクターは、タンパク質を可溶性形態で発現させるために使用し得る。
【０２２３】
シトロバクター・アマロナティカスまたはクロストリジウム・テタノモルフMAL遺伝子を発現する大腸菌の培養物を、酵素アッセイでの使用のための可溶性タンパク質の生産を増大させるようにスケールアップした。培養物を先に述べたように増殖させ、誘導して、採取した。簡単に述べると、先に調製した各々の形質転換プレートから単一クローンを採取し、20mlのLB-Amp培地に出発培養物として接種した。37℃および250rpmで一晩インキュベートした後、OD600を測定した。16mLの各出発培養物（約4.4×108細胞）を使用して800mLのLB-Ampに接種し、0.6〜0.8のOD600に達するまで培養物を2Lのバッフル付き振とうフラスコにおいて37℃および250rpmでインキュベートした。タンパク質発現を1mM IPTG（最終濃度）の添加によって誘導し、培養物を37℃および250rpmでさらにインキュベートした。誘導後24時間のインキュベーション後に、残存培養物を4本の50mLファルコンチューブに移し、5000rpmで10分間の反復遠心分離（各チューブにつき4回の遠心分離;各回当たり50mLの培地）によって採取して、細胞ペレットを-20℃で保存した。
【０２２４】
シトロバクター・アマロナティカス、クロストリジウム・テタノモルフおよびアスペルギルス・オリゼMALタンパク質を収集するためにガラスビーズ溶解を用いて細胞を分断した。誘導後24時間の試料からの細胞ペレットを、0.1mMトリス、1mg/mlペプスタチンAおよび200mM PMSFプロテアーゼ阻害剤からなるビーズ溶解緩衝液に再懸濁した。酸で洗った212〜300μmのガラスビーズ（溶解緩衝液1mL当たり0.4g）を各チューブに添加し、並行して超音波処理水浴中で溶解した。4本のチューブの各々から250μlの試料を超音波処理の前、細胞溶解の5分後および10分後に採取した。各時点からの250μl試料をプールして、1mLの総試料を得た。5000rpmで10分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移して無細胞抽出物を調製した。等容量の水で10分間超音波処理した後に単離した細胞ペレットを再懸濁した後、不溶性試料を調製した。残存ペレットおよび上清を-20℃で保存した。20μlの各プール画分を80μlのSDS試料緩衝液（SDS負荷緩衝液、9％DTTおよび水）と混合し、混合物をヒートブロックにおいて95℃で5分間加熱した。次に10μlの各SDS試料調製物をSDS-PAGE 4〜20％トリシンゲルに負荷し、可溶性および不溶性画分のタンパク質含量を分析した。シトロバクター・アマロナティカスMALおよびクロストリジウム・テタノモルフMALの発現物からの試料においてタンパク質バンドが明瞭に検出された。
【０２２５】
3.1.1.4  外因性に発現されたMALの機能性
シトロバクター・アマロナティカス、クロストリジウム・テタノモルフおよびアスペルギルス・オリゼに由来するメチルアスパラギン酸アンモニアリアーゼの活性を、最初に、I4、I5およびI6株を用いてβ-メチルアスパルテートに対して検定した。本明細書で述べるその後の試験では、これらの株の活性を異なる基質、すなわち2-アミノピメレート、D,L-リジン、および最後に2,6-ジアミノピメリン酸に関して検定した。I17による2-アミノピメレートの陰性対照生物転換も実施した。
【０２２６】
3.1.1.4.1  β-メチルアスパルテートに対するI4、I5およびI6株の生物転換スクリーニング
2014525741.tif 000004
I4、I5およびI6リアーゼ株の5g/Lまたは20g/L全細胞当量で6種の生物転換体を調製した。酵素濃度は全細胞当量に基づいて計算し、これは、遠心分離後のペレット化した細胞質量（湿細胞重量）を、溶解の間に細胞を再懸濁するのに使用した緩衝液の容量で除したものである。生物転換を、10mM DL-スレオ-βメチルアスパルテートを用いて3ml容量で実施した。
【０２２７】
反応物を軌道インキュベータにおいて30℃でインキュベートし、1、5および18時間後にHPLCによる分析のために試料を取り出した。1mlのアリコートを、熱に不安定なタンパク質を除去するための熱処理によって分析用に調製した。その後試料を10,000rpmで2分間遠心分離し、0.2ミクロンのフィルターを通してろ過した。試料の分析は、RIDおよびUV検出を用いて5mMの硫酸移動相でPhenomenex Rezexカラムを使用するHPLCによって実施した。試料中のメサコン酸の検出によってリアーゼ活性の確認を行った。各生物転換において形成されたメサコン酸の濃度を、Aldrichからの外部標準メサコン酸の測定によって決定した。
【０２２８】
すべてのI4およびI5株生物転換においてメサコン酸が検出され、リアーゼ酵素の機能的発現がこれらの細胞抽出物中に存在することを確認した。I6株では活性を認めず、これは、タンパク質が不溶性形態で発現されることを示した、発現タンパク質のSDS PAGE分析によって認められた結果と一致する。I4およびI5株から分析したすべての試料中のメサコン酸の収量は約5mMであり、これは、野生型酵素がL-エナンチオ選択的であるので、10mM DL-スレオ-βメチルアスパルテートに関して予想された活性と一致する。I4およびI5株では、ちょうど1時間のインキュベーション後に完全な変換が認められた。
【０２２９】
3.1.1.4.2   2-アミノピメレートに対するI4およびI5株の生物転換スクリーニング
2014525741.tif 000005
2-アミノピメレートに対するI4およびI5酵素活性を調べるために、様々なレベルの酵素および基質濃度で（2変数、2レベル状況デザイン）8種の生物転換体を調製した。以下に示す様々な負荷を用いて3ml容量で生物転換を実施した。
【０２３０】
I4株5g/L;2-アミノピメレート濃度5mM
【０２３１】
I4株5g/L;2-アミノピメレート濃度10mM
【０２３２】
I4株20g/L;2-アミノピメレート濃度5mM
【０２３３】
I4株20g/L;2-アミノピメレート濃度10mM
【０２３４】
I5株5g/L;2-アミノピメレート濃度5mM
【０２３５】
I5株5g/L;2-アミノピメレート濃度10mM
【０２３６】
I5株20g/L;2-アミノピメレート濃度5mM
【０２３７】
I5株20g/L;2-アミノピメレート濃度10mM
【０２３８】
生物転換体を軌道インキュベータにおいて30℃でファルコンチューブに入れた。7、14および21日後にアリコート（1ml）を生物転換体から取り出した。リアーゼ活性を観察する最大の可能性を提供するために長期間のインキュベーションを行った。1mlアリコートを、熱に不安定なタンパク質を除去するための熱処理によって分析用に調製した。その後試料を10,000rpmで2分間遠心分離し、0.2ミクロンのフィルターを通してろ過した。プレカラム誘導体化法を用いてHPLCによって試料の分析を実施した。この方法は、L-およびD-2-アミノピメレート誘導体のジアステレオマー対を形成するBoc-システインおよびオルトフタルアルデヒド試薬を用いてキラル付加物を形成する段階を含む。次にジアステレオマー（2-アミノピメレートのエナンチオマーである）を、338nmでC18カラムおよび5mMリン酸カリウム緩衝液pH 7.0およびアセトニトリル勾配を用いてHPLCによって分離することができる。各試料中のL-およびD-2-アミノピメレートシグナルのピーク面積を記録し、L-2-アミノピメレート標準品において認められた低下をD-2-アミノピメレートに対する％として表す。
【０２３９】
データは、L-2-アミノピメレートがすべての生物転換体において分解されていることを示す。鏡像体過剰率の増大は、L-βメチルアスパルテートに優先的に作用するこれらのリアーゼ酵素について予想された天然のL-エナンチオ選択性と一致する。より低い基質負荷（5mM）は、より高い基質負荷と比較してより大きなエナンチオ濃縮（すなわち利用可能な基質のより高い変換）も示し、これは予想されたリアーゼ活性と一致する。
【０２４０】
未反応の2-アミノピメレートの存在を質量分析によって確認した。M＋H=176.09を試料において認め、C7H13NO4についてシミュレートしたマススペクトルと合致した。フルスイープ（full sweep）マススペクトルで、エン酸生成物（M＋H＝159.06）を認めなかった。しかし、MSが20m/z幅の質量分離にわたって20秒間イオンを蓄積した場合、正しい生成物シグナルを認め、これはC7H10O4についてシミュレートしたマススペクトルと合致した。
【０２４１】
rac-2-アミノピメリン酸出発物質の試料も分析した。この標準品に関して実施した同じ MS方法を使用すると、2-アミノピメレートについての予想分子イオンを明瞭に示した。しかし、20m/z幅の質量分離にわたって20秒間MSイオン蓄積を反復すると（先の生物転換体試料に関して実施したように）、マスフラグメントとしてのエノ酸生成物の存在を明らかにした。
【０２４２】
3.1.1.4.3  I17株による2-アミノピメレートの陰性対照生物転換
3.1.1.4.1で述べた実験で使用したレベルに合致するように様々なレベルの細胞抽出物および基質を用いて4種の生物転換体を調製した。3mlの反応容量で以下に示すように生物転換を実施した。
【０２４３】
I7株5g/L;2-アミノピメレート濃度5mM
【０２４４】
I7株5g/L;2-アミノピメレート濃度10mM
【０２４５】
I7株20g/L;2-アミノピメレート濃度5mM
【０２４６】
I7株20g/L;2-アミノピメレート濃度10mM
【０２４７】
生物転換体を軌道インキュベータにおいて30℃でインキュベートし、8、13および21日後に試料を採取した。反応物の分析を、3.1.1.4.1で上述した実験において述べた方法に従ってHPLCによって実施した。
【０２４８】
データは、I17株においてL-エナンチオマーの多少の喪失が存在することを示す。しかし、L-エナンチオマーの相対的な減少は、特に２週間インキュベートした２番目の時点を比較した場合、I4およびI5株による等価の生物転換より少ない。以下に示す傾向は、生物転換におけるI4およびI5株が、細胞抽出物および基質負荷を検討する2×2の統計デザイン実験にわたってI17陰性対照株と比較すると、一貫してより高いレベルのL-2-アミノピメレート分解を有することを明らかに示す。
【０２４９】
3.1.1.4.4  DL-リジンを用いたI4およびI5 CFEの生物転換スクリーニング
2014525741.tif 000006
2-アミノピメレートに対するリアーゼ活性を試験するために使用したのと同様の方法で8種の生物転換体を調製した。I4およびI5リアーゼ株を、様々な濃度の細胞出物およびDL-リジン基質を用いて以下のように試験した。
【０２５０】
I4株5g/L;DL-リジン濃度5mM
【０２５１】
I4株5g/L;DL-リジン濃度10mM
【０２５２】
I4株20g/L;DL-リジン濃度5mM
【０２５３】
I4株20g/L;DL-リジン濃度10mM
【０２５４】
I5株5g/L;DL-リジン濃度5mM
【０２５５】
I5株5g/L;DL-リジン濃度10mM
【０２５６】
I5株20g/L;DL-リジン濃度5mM
【０２５７】
I5株20g/L;DL-リジン濃度10mM
【０２５８】
生物転換体を軌道インキュベータにおいて30℃でファルコンチューブに入れた。7、14および21日後にアリコート（1ml）を生物転換体から取り出した。リアーゼ活性を観察する最大の可能性を提供するために長期間のインキュベーションを行った。1mlアリコートを、熱に不安定なタンパク質を除去するための熱処理によって分析用に調製した。その後試料を10,000rpmで2分間遠心分離し、0.2ミクロンのフィルターを通してろ過した。DL-リジン試料を、エナンチオマー比を観測するためにキラルHPLCカラム（Chirobiotic T2 Astec）を用いて分析し、リアーゼ活性を決定した。試料を7、14および21日後に生物転換体から取り出した。
【０２５９】
結果は、5mMリジンを用いたすべての生物転換体においてL-リジンの喪失を示す。DL-リジンへのエナンチオ選択的作用には多少の変動が認められ、L-リジンの濃度はD-リジンの濃度を上回った。HPLCクロマトグラムにおける低いUV吸光度（210nmに設定した検出器）およびリジンの低いシグナル対ノイズ比のために、偽陽性L-リジン検出の可能性をこれらの結果から排除することはできない。しかし、概してDL-リジンからのL-リジンの分解は8種の生物転換体にわたって認められ、I4およびI5株において機能するリアーゼから生じる潜在的な溶解活性の予想される立体選択性と一致する。
【０２６０】
これらの生物転換体におけるリアーゼ活性の機能性を裏付けるさらなる証拠を集めるために、試料をMSによって分析し、試料中の所望のエン酸生成物を検出することを試みた。未反応リジンに対応するMSシグナル（M＋H＝176.09）を試料中で認め、C6H14N2O2についてシミュレートしたマススペクトルと合致した。
【０２６１】
フルスイープマススペクトルで、エン酸生成物（M＋H＝130.09）を認めなかった。しかし、アミノピメリン酸反応に関して、MSが20m/z幅の質量分離にわたって20秒間イオンを蓄積した場合、正しい生成物シグナルを認め、C6H11NO2についてシミュレートしたマススペクトルと合致した。
【０２６２】
DL-リジン出発物質の試料も分析した。この標準品に関して実施した同じMS方法を使用すると、DL-リジンについて予想された分子イオンを明らかに示した。しかし、20m/z幅の質量分離にわたる20秒間のMSイオン蓄積を反復すると（先の生物転換体試料に関して実施したように）、マスフラグメントとしてのエン酸生成物の存在を明らかにした。
【０２６３】
3.1.1.4.5  メソ-2,6-ジアミノピメリン酸を用いたI4およびI5 CFEの生物転換スクリーニング
2014525741.tif 000007
メソ-2,6-ジアミノピメリン酸に対するリアーゼ活性を試験するために6種の生物転換体を調製した。I4、I5および17株を5mM メソ-2,6-ジアミノピメリン酸を用いて試験し、様々な濃度の細胞出物を以下のように検査した。
【０２６４】
I4株5g/L;メソ-2,6-ジアミノピメリン酸濃度5mM
【０２６５】
I4株20g/L;メソ-2,6-ジアミノピメリン酸濃度5mM
【０２６６】
I5株5g/L;メソ-2,6-ジアミノピメリン酸濃度5mM
【０２６７】
I5株20g/L;メソ-2,6-ジアミノピメリン酸濃度5mM
【０２６８】
I17株5g/L;メソ-2,6-ジアミノピメリン酸濃度5mM
【０２６９】
I17株20g/L;メソ-2,6-ジアミノピメリン酸濃度5mM
【０２７０】
生物転換体を軌道インキュベータにおいて30℃でファルコンチューブに入れた。4日後にアリコート（1ml）を生物転換体から取り出し、HPLC分析までさらなる試料の取得を保留する。
【０２７１】
4日後に取得した試料をMSによって分析した。分析はメソ-2,6-ジアミノピメリン酸の存在を確認し、これはC7H14N2O4についてシミュレートしたマスシグナルと合致した。
【０２７２】
生物転換体試料においてこのマススペクトルでは所望のエン酸シグナルを認めなかった。しかし、イオン蓄積を0.5秒間導入した場合、試料の1つにおいて対応するエン酸シグナル（M＋H＝174.08）を認めた。
【０２７３】
3.1.2  エン酸レダクターゼ（EC 1.3.1.31）またはエノイルCoAデヒドロゲナーゼ（EC 1.3.1.62）による2-アミノ-5,6-デヒドロピメリン酸（6-アミノ-2-ヘプテン二酸）の2-アミノヘプタン二酸への変換および2-ヘプテン二酸またはそのCoAエステルのピメリン酸またはそのCoAエステルへの変換（図10参照）
3.1.2.1  エン酸レダクターゼ標的の選択
ピメリン酸の2つの不飽和中間体、すなわち2-アミノ-5,6-デヒドロピメリン酸および2-ヘプテン二酸の、それらの対応する飽和化合物、2-アミノヘプタン二酸およびピメリン酸への変換に関与する経路を同定した後、酵素標的を、α,β-不飽和カルボン酸に対するそれらの異なる基質特異性およびそれらの安定性に基づき、エン酸レダクターゼファミリー（EC 1.3.1）、例えばEC 1.3.1.31から選択した（Stereocomplementary bioreduction of α,β-unsaturated dicarboxylic acids and dimethyl esters using enoate reductases - Enzyme- and substrate-based stereocontrol:Stueckler et al.Org.Lett.2007,9,5409-5411）。
【０２７４】
特に、枯草菌由来のエン酸レダクターゼ遺伝子（YqjM）（GeneBank D84432;フラグメント242791-243807）およびトマト（Solanum lycopersicum）由来のエン酸レダクターゼ遺伝子（OPR1およびOPR3）（それぞれ、GeneBank NM_001247852;フラグメント108-1238およびGeneBank NM_001246944;フラグメント94-1284）は以前にクローン化され、大腸菌において成功裏に発現されており、合理的設計を介したタンパク質遺伝子操作を可能にする、YqjMおよびOPR3酵素の結晶構造が報告されたことから、これらを選択した（The 1.3 A crystal structure of the flavoprotein YqjM reveals a novel classof old yellow enzyme:Kitzing et al.J.Biol.Chem.2005,280,27904-27913;Asymmetric bioreduction of activated alkenes using cloned 12-oxophytodienoate reductase isoenzymes OPR-1 and OPR-3 from Lycopersicon esculentum（Tomato）:A striking switch of stereopreference:Hall et al.Angew.Chem.Int.Ed.2007,46,3934-3937;Crystal structure of 12-oxophytodienoate reductase 3 from tomato - Self inhibition by dimerization:Breithaupt et al.PNAS 2006,103,14337-14342）。
【０２７５】
クロストリジウム種由来のエン酸レダクターゼも、それらの広い基質特異性にゆえに考慮される（Chiral compounds synthesized by biocatalytic reductions:Simon et al.Angew.Chem.Ed.Engl.1985,24,539-553;Properties and mechanistic aspects of newly found redox enzymes from anaerobes suitable for bioconversions on preparatory scales:Simon et al.Pure & Appl.Chem.1992,64,1181-1186）。しかし、これらの酵素は、酸素に対するそれらの高い感受性に起因して概念の初期実証のためにクローン化されず、発現されなかった（Enoate reductases of Clostridia - Cloning,sequencing and expression:Rohdich et al.J.Biol.Chem.2001,276,5779-5787）が、嫌気性宿主における最終経路構築のための有用な触媒であり得る。特に、以下のエン酸レダクターゼは、標的である2-エノイルC7化合物における二重結合の還元のために有用であるはずである:
【０２７６】
クロストリジウム・クルイベリ（Clostridium kluyveri）由来のenr 2-エン酸レダクターゼ（Y16137）EC 1.3.1.31:全細胞のクロストリジウム・クルイベリは、分子水素の存在下で広範囲の2-エノエートを還元することが認められた。基質は、チグリン酸、アクリル酸、メタクリル酸、ジメタクリル酸、（E）-ペンテン酸、（E）-ヘキセン酸、ソルビン酸、ケイ皮酸[19]、（E）-2-ブテン酸および（E）-2-メチル-2-ブテン酸、（E）-および（Z）-3-メチル -2-ペンテン酸、p-メトキシ-ケイ皮酸および p-ニトロ-ケイ皮酸であった[Buhler,M.,Giesel,H.,Tischer,W.and Simon,H.（1980）Occurrence and the possible physiological role of 2-enoate reductases.FEBS Lett.109,244-246]。この酵素をコードする遺伝子の部分配列が同定された[Rohdich,F.,Wiese,A.,Feicht,R.,Simon,H.and Bacher,A.（2001）Enoate reductases of Clostridia.Cloning,sequencing,and expression.J.Biol.Chem.276,5779-5787]。C.クルイベリのゲノムは配列決定されているので、我々はこの遺伝子の完全な配列を見出した（YP_001394144.1、GENEBANK）。
【０２７７】
クロストリジウム・チロブチリカム（C.tyrobutyricum）（以前のクロストリジウム種La 1）由来のenr 2-エン酸レダクターゼ（Y09960）EC 1.3.1.31:  2-エン酸レダクターゼは、（E）-ブテノエートで増殖するクロストリジウム種において見出され、均一に精製された。これは、（E）-2-メチルブテノエートおよびシンナメート[Elshahed MS,Bhupathiraju VK,Wofford NQ,Nanny MA,Mclnerney MJ.（2001）Metabolism of benzoate,cycle-hex-1-ene carboxylate,and cyclohexane carboxylate by "Syntrophus aciditrophicus" strain SB in syntrophic association with H（2）-using microorganisms.Appl Environ Microbiol.67:1728-1738]、（E）-α-ホルミルアミノ-シンナメート、ならびに4-メチル-2-ペンテノエート[Buhler,M.,Giesel,H.,Tischer,W.and Simon,H.（1980）Occurrence and the possible physiological role of 2-enoate reductases.FEBS Lett.109,244-246]を受け入れた。enrレダクターゼをコードする遺伝子が同定され、酵素は嫌気的条件下で大腸菌において過剰発現された [Rohdich,F.,Wiese,A.,Feicht,R.,Simon,H.and Bacher,A.（2001）Enoate reductases of Clostridia.Cloning,sequencing,and expression.J.Biol.Chem.276,5779-5787]。
【０２７８】
ムーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）（以前のクロストリジウム・サーモアセチカム（Clostridium thermoaceticum））由来のenr 2-エン酸レダクターゼ（Y16136）EC 1.3.1.31:  C.チロブチリカム由来のエン酸レダクターゼに対する抗血清は、好温性クロストリジウム・サーモアセチカムのタンパク質と交差反応した。このレダクターゼをコードする遺伝子が同定され、酵素は大腸菌において成功裏に過剰発現された [Rohdich,2001]。
【０２７９】
他の潜在的なエン酸レダクターゼ候補物は、サッカロミセス・セレビシエおよびシュードモナス・プチダから同定されたが、遺伝子の特性づけの証拠およびα,β-不飽和カルボン酸に対する活性は、それぞれこれらの２つの酵素に関して報告されなかった。
【０２８０】
エン酸レダクターゼに加えて、ピメロイルCoAデヒドロゲナーゼ（EC 1.3.1.62）は、2-ヘプテン二酸および対応するCoAエステル中の二重結合の還元を触媒するはずである。ピメロイルCoAデヒドロゲナーゼ活性は、ベンゾエートとデスルフォビブリオ属種（Desulfovibrio sp.）のG11株との共培養物中またはクロトネートとの純粋培養中で増殖するシントロファス・アシディトロフィカス（Syntrophus aciditrophicus）の細胞抽出物において見出され、ベンゾエート分解経路に関与する（Elshahed MS,Bhupathiraju VK,Wofford NQ,Nanny MA,McInemey MJ.（2001）Metabolism of benzoate,cyclohex-1-ene carboxylate,and cyclohexane carboxylate by "Syntrophus aciditrophicus" strain SB in syntrophic association with H（2）-using microorganisms.Appl Environ Microbiol.67:1728-1738）。データベース上で見出される他の仮説上のピメロイルCoAデヒドロゲナーゼは、スフィンゴモナス・マクロゴリタビダ（Sphingomonas macrogolitabida）由来の ThnJ（D9PTN0）およびThnK（D9PTM9）（β酸化経路によるテトラリン分解についての遺伝子クラスター中で見出された）、ロドシュードモナス・パルストリス由来のPimC（Q6N3I0）およびPimD（Q6N3I1）ならびにブラディリゾビウム属種（Bradyrhizobium sp.）由来のPimC（A5ES10）およびPimD（A5ES09）を含む。
【０２８１】
本発明に有用な他のデヒドロゲナーゼは、デスルホコッカス・マルチボランス（Desulfococcus multivorans）由来のGDHグルタリル補酵素Aデヒドロゲナーゼを含み、非脱カルボキシル化グルタコニル補酵素Aを形成するグルタリル補酵素Aデヒドロゲナーゼは、絶対嫌気性菌デスルホコッカス・マルチボランスにおいて特性づけられた[Wischgoll S,Demmer U,Warkentin E,Gunther R,Boll M,Ermler U.（2010）Structural basis for promoting and preventing decarboxylation in glutaryl-coenzyme A dehydrogenases.Biochemistry.49:5350-5357]。この酵素を過剰発現させ、その結晶構造を決定した。
【０２８２】
3.1.2.2  遺伝子標的を含む発現ベクターのクローニング
選択した枯草菌およびトマト由来のYqjM、OPR1および OPR3遺伝子標的を、次に、3.1.1.2章で詳述したようにinABLE技術を用いてIPTG誘導性pET21-aバックボーンにクローニングし、I1（pET21-a中の枯草菌YqjM遺伝子）、I2（pET21-a中のトマトOPR1遺伝子）、およびI3（pET21-a中のトマトOPR3遺伝子）を作製した。
【０２８３】
簡単に述べると、選択した遺伝子およびベクターバックボーン内の潜在的EarI部位を、EarI消化/連結サイクルを含むパート/リンカー融合物調製への干渉を防ぐために分断した。枯草菌YqjMエン酸レダクターゼ遺伝子ではEarI部位を認めなかったが、トマトOPR1およびOPR3遺伝子ではそれぞれ1つおよび2つのEarI部位を検出し、制限部位にサイレント突然変異を組み込むことによってこれらを分断した。トマトOPR3遺伝子配列におけるEarI部位1および2の分断は不慮のEarI部位形成をもたらし、これは配列を合成した後で初めて発見された。残留EarI部位を、Strategene からのQuikchange単一部位指定突然変異誘発キットを用いて除去した。残留EarI部位を分断するために順方向および逆方向プライマーを設計し、プライマーを、Quikchange反応の前に3.1.1.2章で述べたようにリン酸化した。Quikchangeおよび陰性対照反応物を以下のように調製した:
2014525741.tif 000008
反応をサーモサイクラーにおいて実施し（95℃、0.5分;95℃、0.5分、55℃、1分、68℃、10分の35サイクル;68℃、1分、4℃保持）、その後DpnI（1μL）で処理して、メチル化親DNAを37℃で2時間消化した。消化反応物（3μL）を使用してTOP10エレクトロコンピテント大腸菌細胞を形質転換し、形質転換試料（100μL）をLB-Kan-寒天に塗布した。37℃で一晩インキュベートした後、Quikchange反応プレートで約100クローンを得たのに比して、陰性対照プレートでは皆無であった。10クローンをプレートから採取し、対応するプラスミドを精製して、EarI消化によって分析した。アガロースゲル上に300bpのバンドが存在しないことは、OPR3遺伝子内に位置するEarI部位が欠失していることを示した。EarI消化は、数個のクローンが残留EarI部位の除去に関して陽性であることを示した。DNA塩基配列決定によりクローンの配列を確認した。
【０２８４】
クローン3（EarIの除去に関して陽性のクローン）からのベクターを使用して、エレクトロコンピテントTOP10大腸菌細胞を形質転換した。QIAGEN Hi-Speed Plasmid Purification Midi Kitを使用して、培養物から大きなDNAストックを調製し、その後QIAGEN PCR精製キットを用いてDNA試料を濃縮した。最終的なDNA濃度および試料の容量は、120μl中470.0 ng/μl（DNA濃度199.8nM）であった。
【０２８５】
3つのEarI部位をベクターバックボーンpET21-aにおいて検出し、これらを、制限部位の最後のグアニジン塩基をチミンに突然変異させる（逆相補配列では最初のシトシンのアデニンへの突然変異に対応する）ことによって分断した。
【０２８６】
次に、EarIを含まない配列をパート設計ソフトウェアにおける入力配列として使用し、3.1.1.2章で論じたように、EarI部位によって隣接された対応するトランケートパートを設計した。合成した枯草菌YqjM（TP25）、トマトOPR1（TP26）、およびトマトOPR3（TP27）トランケートパートをDNA2.0 pJ201ベクターに挿入した。クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むフラグメントの導入によってpET21-aトランケートパートベクターを完全合成し、ベクターTP31を作製した。
【０２８７】
inABLEオリゴヌクレオチドのリン酸化およびその後のアニーリングを、3.1.1.2章で述べたように実施した。
【０２８８】
次に、パート/リンカー融合物を、先に3.1.1.2章で述べたように、トランケートパートの5'末端をその対応するパートオリゴのアニールしたフラグメントと連結し、トランケートパートの3'末端をリンカーオリゴのアニールしたフラグメントと連結することによって調製した。枯草菌YqjM、トマトOPR1およびトマトOPR3遺伝子に対応するパートリンカー融合物を、それらのそれぞれのアニールしたパートオリゴ、それらのトランケートパート、およびベクターバックボーンからのアニールしたリンカーオリゴの連結によって調製した。ベクターバックボーンに対応するパートリンカー融合物を、そのアニールしたパートオリゴ、そのトランケートパート、およびどちらかの遺伝子からのアニールしたリンカーオリゴの連結によって調製した。陰性対照遺伝子を含まない集合体も、ベクターバックボーンのアニールしたパートオリゴ、そのトランケートパート、およびそのアニールしたリンカーオリゴの連結によって調製し、ベクターバックボーンの自己集合体を生じさせた。
【０２８９】
トランケートパートに対して10倍および20倍モル過剰のリンカーおよびパートオリゴを、各々のEarI消化/連結サイクルの間のトランケートパートとオリゴヌクレオチドの間の連結を促進するために遺伝子およびベクター反応において使用した。50μLのEarI消化/連結反応物をサーモサイクラー（Eppendorf Mastercycler Gradient）でインキュベートし、温度を37℃と16℃の間で交互に変化させた。サイクルの完了後、試料を0.7％アガロースゲルに負荷し、パート/リンカー融合物の調製に関して予想されたサイズのフラグメント、例えば枯草菌YqjMパート/pET21-aリンカーおよびトマトOPR1パート/pET21-aリンカーならびに3kbベクターバックボーン;またはpET21-aパート/トマト OPR3リンカー-5.3kbおよびトマトOPR3パート/pET21-aリンカー-1.2 kbならびにベクターバックボーンに対応する1.8kbバンドを認めた。次に正しいサイズのバンドをゲルから切り出し、QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kitを使用してDNAをゲル抽出した。DNA濃度は、30μlの総容量で14.4ng/μlから49.6μg/μlの範囲であった（DNA濃度範囲5.4nM〜35.6nM）。
【０２９０】
遺伝子パート/リンカー融合物とそれらのそれぞれのベクターパート/リンカー融合物との組合せを、次に、3.1.1.2章で述べたように2パート集合を介して実施した。簡単に述べると、遺伝子パートリンカーとベクターパートリンカーを室温で30分間インキュベートした後、2μlの集合体反応物および10μlのコンピテント細胞を使用して高効率のOPR3化学的コンピテントNEB10β大腸菌細胞の形質転換を実施した。形質転換した細胞をLB-Amp-寒天に塗布し、37℃で一晩インキュベートした。各集合体について500クローンを得た。1つまたは2つのランダムなクローンを各集合体から選択し、QIAGEN QIAprep Miniprep Kitを使用して対応するベクターを単離した。
【０２９１】
3.1.1.2章で述べたように、ベクターの構築を確認するために制限を実施した。簡単に述べると、集合体I1から得たクローンをPstIおよびHincIIを用いて分析して、枯草菌YqjM遺伝子の大腸菌pET21-1発現ベクターへの挿入に関して陽性のクローンを同定し、集合体I2から得たクローンをPvuIおよびPsiIを用いて分析して、集合体I3から得たクローンをBglIIおよびMluIを用いて分析した。制限産物をアガロースゲルで泳動させて、各集合体から試験したクローンに関して予想されたバンドパターンを認め、枯草菌YqjM、トマトOPR1およびトマトOPR3エン酸レダクターゼ遺伝子を保有する大腸菌pET21-a発現ベクターの構築を確認した。加えて、ベクターバックボーンの3'末端と遺伝子の5'末端の間ならびに遺伝子の3'末端とベクターバックボーンの5'末端の間のパート接合部を配列決定し、構築を確認した。
【０２９２】
3.1.2.3  大腸菌における外因性エン酸レダクターゼ遺伝子の発現
最初に、クローン化したエン酸レダクターゼ遺伝子を、3.1.1.3章で上述したように1mM IPTGおよび37℃の誘導温度を用いて大腸菌で発現させた。簡単に述べると、各々培養物について誘導前および誘導後の様々な時点でOD600を測定した。誘導後24時間のインキュベーション後に残った残存培養物を50mLファルコンチューブに移し、5000rpmで10分間の遠心分離によって採取して、SDS-PAGEを用いて試料のタンパク質含量を分析した。予想されたサイズ（35 kDa）の大きなタンパク質バンドが、IPTG誘導後に枯草菌YqjMエン酸レダクターゼの発現試験からの可溶性画分において明瞭に見えた。IPTG誘導後にトマトOPR1エン酸レダクターゼの発現物からの不溶性画分において大きなバンドが見え、I2から発現された予想上の42kDa OPR1タンパク質が大腸菌において不溶性であることを示唆した。予想されたサイズ（44kDa）のタンパク質バンドが、トマトOPR3 エン酸レダクターゼI3のIPTG誘導後に可溶性部分ならびに不溶性画分で明瞭に検出され、予想された 44kDaのトマトOPR3エン酸レダクターゼタンパク質が大腸菌において部分的可溶性形態として発現されることを示唆した。
【０２９３】
文献における最適化された大腸菌でのトマトOPR1エン酸レダクターゼの機能的発現の報告に基づき、大腸菌でのトマトOPR1エン酸レダクターゼの溶解度を改善する試みとしてIPTG濃度（0.1〜1mM IPTGの範囲）および誘導温度（16〜37℃の範囲）についての条件を最適化した（Strassner et al.JBC 1999,274,p.35067-35073;Hall et al.Angew.Chem.Int.Ed.2007,46,p.3934-3937）。3.1.1.3章で述べたのと同じ発現プロトコルおよび同じSDS-PAGE試料調製物を溶解度最適化実験に使用した。
【０２９４】
各集合体からの各時点の試料を、次に、3.1.1.3章で述べたようにSDS-PAGE分析用に処理し、SDS-PAGEを用いて分析して、これは、誘導温度の16℃への低下および誘導物質濃度の0.1 mMへの低下が大腸菌において発現されるトマトOPR1エン酸レダクターゼを部分的に可溶化するのに有効であることを示した。
【０２９５】
3つのエン酸レダクターゼを発現する大腸菌株を800ml培養物までスケールアップし、活性を検定した。
【０２９６】
3.1.3  脂肪酸アシルCoAレダクターゼ（アルデヒド形成FAR）（EC 1.2.1.50）またはアシル-[acp]レダクターゼ（EC 1.2.1.80）によるピメロイルCoAおよびピメロイル-[acp]のピメリン酸セミアルデヒドへの変換（図2参照）。
3.1.3.1  標的酵素の選択
脂肪アシルCoAレダクターゼは、クチクラワックス形成のために植物および他の高等真核生物におけるワックスエステル合成に関与する。古細菌および細菌では、これらの酵素は長鎖アルカン生合成に関与するが、これらの生物におけるそれらの生理的機能はまだ必ずしも明らかではない。植物におけるワックスエステルの形成は、アシルCoAの伸長から始まって長鎖脂肪酸（LFCA）（または脂肪アシルCoA）を形成し、次にこれが脱カルボニル経路またはアシルCoA還元経路によって還元される（Cheesbrough and Kolattukudy,1984）。
【０２９７】
炭化水素が脱カルボニル化経路によって形成される。この経路は、アルデヒドを生成する脂肪アシルCoAレダクターゼ触媒反応によって開始され、次いでアルデヒドデカルボニラーゼによって触媒される脱カルボニル化により[Cn-1]アルカンを生じる（Cheesbrough and Kolattukudy,1984）。
【０２９８】
脂肪アシルCoA還元経路もLCFAのアルデヒドへの還元によって開始され、次いでアルデヒドレダクターゼによるアルデヒドのさらなる還元によって均一な長さの第一級アルコールが生成される（Millar et al.,1999）（Kolattukudy,1971）。同様の経路が原核生物において存在すると考えられる（Schirmer et al.,2010）。
【０２９９】
両方の経路が、可逆的反応において脂肪アシルCoAレダクターゼ（FAR;EC 1.2.1.50）によって触媒される長鎖アシルCoAのアルデヒドへの還元によって開始される。アシルCoA還元経路において、アルデヒドはアルコールへとさらに還元される。これは、生物によって１段階または2段階のいずれかで達成され得る。2段階還元はアシルCoAレダクターゼ触媒反応を使用して開始され、これが、脂肪アルデヒドレダクターゼによって触媒される2番目の還元のための脂肪アルデヒドを放出する。1段階還元は、アルデヒド中間体を放出せずにアシルCoAをアルコールに直接還元する、二官能性アシルCoAレダクターゼによって触媒される。したがって、脂肪アシルCoAレダクターゼは大きく2つの種類に分けられる:（1）アルコール形成アシルCoAレダクターゼおよび（2）アルデヒド生成アシルCoAレダクターゼ。原核生物および真核生物において両方の種類の例が存在する。標的はピメリン酸セミアルデヒドであるので、アルデヒド生成脂肪アシルCoAレダクターゼはピメロイルCoAの還元のための最も有望な候補である。
【０３００】
予備的な文献およびデータベース検索は、配列相同性によって検討または同定されたアシルCoAレダクターゼの圧倒的多数が、真核生物および原核生物の両方においてアルコール形成FARであることを明らかにした。しかし、アルデヒド生成レダクターゼの初期の例の1つはアシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）-Acr1に由来した。それゆえ、この酵素の一次配列を他のアルデヒド生成酵素についてのデータベース検索で使用した。
【０３０１】
アシルCoAレダクターゼに関する一般的な規則として、より短いタンパク質（295〜350アミノ酸）はアルデヒド生成酵素である傾向があり、一方より長いポリペプチド（500＋アミノ酸）はアルコール生成酵素であると考えられる。しかし、データベースに寄託された短い酵素の大部分は、配列データ以上のさらなる情報がない推定上または仮説上の注釈しかなく、この理由から、これらは考慮しなかった。
【０３０２】
以下の基準を用いて候補を選択した:（1）酵素はアルデヒドだけを生成しなければならないまたはタンパク質遺伝子操作によってアルコール形成を排除する余地がなければならない;（2）タンパク質の存在の証拠が存在しなければならない、すなわちタンパク質が細胞画分において同定および精製されているまたは単離されている;（3）アシルCoAまたはアシル-ACP基質を使用して酵素を試験した;（4）酵素は、活性が多酵素複合体とは無関係に実証されていない限り、多酵素複合体の一部であってはならない。ひとたび候補が同定されれば、選択を順位づける付加的なデータを提供するためにさらなるバイオインフォマティクスおよび文献検索を実施した。
【０３０３】
表1は、公知のアルデヒド形成酵素（Acr1）に対して実施したデータベース検索の結果を示す。各々の候補物を精製し、インビトロで検定した。候補物を順位づけ、それらの適切性に従って分類した。最上位の酵素（1〜3）はさらなる検討のための最良の候補物とみなされ、中間順位の酵素（4および5）は良好な候補物とみなされるが、さらなる調査を必要とし、そして下位に分類された酵素（6）は、タンパク質配列がないことおよび配列決定されたゲノムが欠如していることから、酵素活性データを得るためにさらなる努力を必要とする。
【０３０４】
（表１）様々な生物からの候補アシルCoAレダクターゼ
2014525741.tif 000009
＊証拠のレベル-酵素活性は、酵素が異種もしくは同種のいずれかで精製されたこと、または活性が粗抽出物または他の細胞画分において測定されたことを意味する。
【０３０５】
アシネトバクター・カルコアセティカスAcr1（P94129）（Reiser,S.,and Somerville,C.（1997）:Isolation of mutants of Acinetobacter calcoaceticus deficient in wax ester synthesis and complementation of one mutation with a gene encoding a fatty acyl coenzyme A reductase.J Bacteriol 179,2969-2975）:アルデヒド生成アシルCoAレダクターゼは精製されており、295アミノ酸を含み、分子量は32.5kDaである。この酵素は大腸菌で発現されており、無細胞抽出物はアシルCoAレダクターゼ活性を含むことが示された。C12からC24の範囲の長さのアシルCoA基質を検定した（奇数のCの基質は検定しなかった）。対応するアルデヒドが、C12基質を除くすべての場合に生成された。この酵素の基質範囲をさらに検討することおよびより短い長さのアシルCoAに関するその活性を試験することは価値があるであろう。ピメロイルCoAが基質ではない場合も、基質範囲を広げる指向性進化の余地がある。この酵素は、脂肪酸誘導体の生産増強についての特許（米国特許第20110256599号）において直接命名された。
【０３０６】
シネココッカス・エロンガタス（Synechococcus elongatus）PCC 7942（YP_400611）由来のAAR（Schirmer,A.,Rude,M.A.,Li,X.,Popova,E.,and Del Cardayre,S.B.（2010）.Microbial Biosynthesis of Alkanes.Science 329,559-562）:このアシル-ACPレダクターゼは藍色細菌S.エロンガタス中に存在し、AARと称される。この酵素はアルカン生合成に関与すると考えられる。大腸菌MG1655において発現され、精製されている。CoAおよびACPの両誘導体が基質である。したがって、オクタデカナールが、脂肪アルコールの形成を伴わずにオレオイルCoAおよびオレオイル-ACPから形成される。しかし、オレオイル-ACPは、オレオイルCoAについての130μMのKMと比較して8μMのKMを有する、好ましい基質であった。この酵素はNADPH依存性であり、活性にはマグネシウムを必要とする。他の基質は試験してない。アルデヒド形成についての選択性およびCoA誘導体に関する活性は、この酵素をピメロイルCoA還元に関して試験するための良好な候補物にしている。さらに、密接に関連する生物においてこの遺伝子の多数のオルソログが存在する（Schirmer et al.,2010）が、AARが最もよく検討されている。以下の特許は、（Schirmer et al.,2010）からの研究に関連する:国際公開公報第2009/140695号および国際公開公報第2009/140696号。
【０３０７】
フォトバクテリウム・ホスホレウム（Photobacterium phosphoreum）由来のLuxC（BAF92773）（Boylan,M.,Miyamoto,C,Wall,L.,Graham,A.,and Meighen,E.（1989）.Lux C,D and E genes of the Vibrio fischeri luminescence operon code for the reductase,transferase,and synthetase enzymes involved in aldehyde biosynthesis.Photochemistry and photobiology 49,681-688;Lee,C.Y.,and Meighen,E.A.（1997）.Cysteine-286 as the site of acylation of the Lux-specific fatty acyl-CoA reductase.Biochim Biophys Acta 1338,215-222;Wang,X.,and Kolattukudy,P.E.（1995）.Solubilization and purification of aldehyde-generating fatty acyl-CoA reductase from green alga Botryococcus braunii,FEBS Lett 370,15-18）:LuxCは、脂肪アシルCoAレダクターゼ、脂肪アシルシンテターゼおよび脂肪アシルチオエステラーゼからなる多酵素複合体（LuxCDE）の一部であり、生物発光に関与する。LuxCは広く検討された酵素であり、 大腸菌においてクローン化され、発現され、精製されている。この酵素は、C14基質、テトラデカノイルCoA（ミリストイルCoA）に対してアシルCoAレダクターゼ活性を示し、テトラデカノイルCoAは対応するアルデヒド、テトラデカナールに還元される。他の基質は試験していない。LuxCはインビボでマルチサブユニット複合体の一部であるが、この酵素は野生型生物から成功裏に精製されており、大腸菌から発現され、部分精製されている。どちらの場合も、LuxCは他のサブユニットとは独立して活性であった。このことはLuxCを、ピメロイルCoAをピメリン酸セミアルデヒドに変換するための良好な候補物にする。
【０３０８】
マリノバクター・アクアエオレイ（Marinobacter aquaeolei）VT8由来の FAcoAR（YP_959769.1）（Willis,R.M.,Wahlen,B.D.,Seefeldt,L.C.,and Barney,B.M.（2011）.Characterization of a fatty acyl-CoA reductase from Marinobacter aquaeolei VT8:a bacterial enzyme catalyzing the reduction of fatty acyl-CoA to fatty alcohol.Biochemistry 50,10550-10558）:この脂肪アシルCoAレダクターゼ（FAcoARと称される）は、γプロテオバクテリア、マリノバクター・アクアエオレイVT8において最近発見された。この酵素は、アシルCoA誘導体のアルコールへの還元を触媒する、二官能性アシルCoAレダクターゼの初めての原核生物の例である。重要な点として、これはC12未満の基質で試験された唯一の酵素でありインビトロでオクタノイルCoAに活性を示す（Willis et al.,2011）。この酵素はアシルCoAからアルコールを生成するが、これを含めるための論理的根拠は、オクタノイルCoA（C8）からアラキドノイルCoA（C20）までの広い基質範囲を有する明らかな証拠が存在することである。さらに、C末端はAcr1酵素に高い配列相同性を示し、そのためN末端領域はアルコール形成ドメインであり得る。それゆえ、機能性のアルデヒド生成酵素を作製することを目的として、ポリペプチドのN末端領域をコードする遺伝子の部分を除去することの影響を試験することは価値があるであろう。このアプローチに関する潜在的な問題は、酵素が不活性であり得るまたはアルデヒドがトランケートされた酵素複合体から放出されない場合があり得ることである。この酵素はアシルACP誘導体に対する活性に関しては試験しなかった。
【０３０９】
マリノバクター・アクアエオレイVT8由来のFAR（YP_959486）（Hofvander,P.,Doan,T.T.P.,and Hamberg,M.（2011）.A prokaryotic acyl-CoA reductase performing reduction of fatty acyl-CoA to fatty alcohol.FEBS Letters 585,3538-3543）:この脂肪アシルCoAレダクターゼ（FARと称される）はもともと脂肪アルデヒドレダクターゼとして同定された（Wahlen,B.D.,Oswald,W.S.,Seefeldt,L.C.,and Barney,B.M.（2009）.Purification,characterization,and potential bacterial wax production role of an NADPH-dependent fatty aldehyde reductase from Marinobacter aquaeolei VT8.Appl Environ Microbiol 75,2758-2764）が、その後アシルCoAレダクターゼ活性を有することが示された（Hofvander,P.,Doan,T.T.P.,and Hamberg,M.（2011）.A prokaryotic acyl-CoA reductase performing reduction of fatty acyl-CoA to fatty alcohol.FEBS Letters 585,3538-3543）。これは上述した脂肪アシルCoAレダクターゼに非常に類似するが、アシルACP誘導体にも作用することが公知である。C16-CoAから C20-CoAまでで活性を認めたが、より短い基質に関しては試験しなかった。この酵素は513アミノ酸長であり、Acr1と同じアルデヒド生成に関連するC末端ドメインを有する。この酵素もトランケートし得る可能性があり、これは、先に述べたようにN末端領域を切断除去することを意味する。2つの別々の（および競合する）研究グループがFARとFAcoRを検討したので、FARとFAcoRが完全に異なる酵素であるかどうかは明らかでない。
【０３１０】
ボトリオコッカス・ブラウニイ（Botryococcus braunii）由来のアルデヒド生成アシルCoAレダクターゼ（AAB35106）（Wang,X.,and Kolattukudy,P.E.（1995）.Solubilization and purification of aldehyde-generating fatty acyl-CoA reductase from green alga Botryococcus braunii.FEBS Lett 370,15-18）:この酵素は、微細藻類、ボトリオコッカス・ブラウニイ由来のアルデヒド生成アシルCoAレダクターゼである。この酵素は野生型生物から精製されており、標識活性化脂肪酸、[1-14C]-パルミトイルCoAを用いて検定した。酵素は対応するアルデヒドを生成することが示され、NADH依存性であった。基質範囲は検討されておらず、これは対処する必要があろう。さらに、タンパク質をクローン化し、大腸菌において発現させ、精製する必要がある。受託番号AAB35106は、精製酵素からの部分的な26アミノ酸のN末端配列に言及する。完全なタンパク質配列はUNIPROT、BRENDAまたはNCBIデータベースには寄託されていない。ゲノムの配列決定は進行中である（http://www.jgi.doe.gov/）。N末端配列についてのプライマーを使用して遺伝子を単離する余地はあり得るが、この酵素についての全般的な情報の欠如は、代謝遺伝子操作のためのその利用を複雑にし得る。
【０３１１】
したがって、ピメロイルCoAのピメリン酸セミアルデヒドへの還元に関して試験すべき適切な候補物である多くのアシルCoAレダクターゼが同定されている。アシネトバクター・カルコアセティカス由来の酵素、Acr1は、短鎖の奇数のCの基質に対する活性に関しては情報がないが、同定された酵素のうちで最もよく特性づけられているので、最良の候補物であると考えられる。初期試験が陰性であった場合も、この酵素はまだピメロイルCoA還元を得る指向性進化のための良好な標的であろう。
【０３１２】
S.エロンガタス由来のAARおよびそのオルソログならびにLuxCも有望な候補物である。これらの酵素は比較的長鎖の脂肪アシルCoA基質に作用するが、短鎖基質に関しては試験されていない。やはり、初期試験が陰性である場合は、指向性進化が所望の基質選択性を得るための有望な経路を提供し得る。
【０３１３】
M.アクアエオレイVT8由来の2つの酵素も有望であり得るが、アルデヒドの酸化を防ぐために多少のタンパク質遺伝子操作を必要とする可能性がある。これらの酵素は、同定されたすべての脂肪アシルCoAレダクターゼの中で最短鎖の脂肪アシルCoAに作用することが公知であるので、適切な候補物である。B.ブラウニイ由来の酵素をコードする遺伝子はまだ同定されていない。これがこの酵素を取り上げるうえで最も難しい点であるが、他の選択肢が成功しない場合は検討し得る。類似の酵素も高等植物（例えばエンドウ（Pisum sativum））において公知であり、試験するためのさらなる選択肢を提供するが、やはりまだ十分に特性づけられていない。
【０３１４】
したがって、上記の6つの酵素は、細胞画分中で組換えまたは天然のいずれかで調製され、（部分的または完全に）精製されて、インビトロで検定されたという文献報告があることから、これらを選択した。それらのヌクレオチド配列および一次アミノ酸配列は、ボトリオコッカス・ブラウニイ由来の酵素を除き、主要なタンパク質データベースBRENDAおよびUNIPROTに寄託されている。試験からの結果は、査読のある専門誌に公表されている。試験した基質はオクタノイルCoA（C8）からアラキドノイルCoA（C20）までにわたり、シネココッカス・エロンガタス由来のAARの場合はアシルACPも基質として含んだ。対応するアルデヒドが生成物として形成される。しかし、これまで、いずれの酵素もピメロイルCoAまたはいかなる他の奇数のCの基質に関しても試験されておらず、おそらくそれは、これらの基質の代謝が常に偶数のCの基質と同じパターンに従うと考えられており、現在まで、これらの基質に対して試験するに足る根拠が存在しなかったためである。それゆえ、これらの酵素がピメロイルCoAの還元を触媒する可能性は高い。ピメロイルCoAが基質ではない場合も、これらの酵素は指向性進化または標的タンパク質遺伝子操作のための良好な出発点を提供するであろう。
【０３１５】
ピメロイルCoAのピメリン酸セミアルデヒドへの変換のための長鎖脂肪アシルCoAレダクターゼの中の他の候補物は、以下の生物からのレダクターゼを含むが、それらに限定されるわけではない:エンドウ（Vioque et al.,1997.Resolution and purification of an aldehyde-generating and an alcohol-generating fatty acyl-CoA reductase from Pea leaves（Pisum sativum L.）,Archives of Biochemistry and Biophysics,340（1）,64-72）;ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）（P12748）（Boylan et al.,1985.Functional identification of the fatty acid reductase components encoded in the luminescence operon of Vibrio fischeri,Journal of Bacteriology,163（3）,1186-1190）;ブラシカ・オレラセア（Brassica oleracea）およびセイヨウナタネ（B.napus）（Q39342）（Kolattukudy,1971.Enzymatic synthesis of fatty alcohols in Brassica oleracea.Archives of Biochemistry and Biophysics,142（2）,701-709）;クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）（Day et al.,1978.Partial purification and properties of acyl-CoA reductase from Clostridium butyricum,Archives of Biochemistry and Biophysics,190（1）,322-331）;マガモ（Ishige,T.;Tani,A.;Takabe,K.;Kawasaki,K.;Sakai,Y.;Kato,N.Wax Ester Production from n-Alkanes by Acinetobacter sp.Strain M-1 :Ultrastructure of Cellular Inclusions and Role of Acyl Coenzyme A Reductase.Appl Environ Microbiol 2002,68,1192-1195）;シロイヌナズナ（Doan,T.T.P.;Carlsson,A.S.;Hamberg,M.;Bulow,L.;Stymne,S.;Olsson,P.Functional expression of five Arabidopsis fatty acyl-CoA reductase genes in Escherichia coli.Journal of plant physiology 2009,166,787-796;Hooks,M.A.;Kellas,F.;Graham,I.A.Long-chain acyl-CoA oxidases of Arabidopsis.Plant J.1999,20,1-13）;ヒトR.P.;Wang,Y.;Mohsen,A.-W.;He,M.;Vockley,J.;Kim,J.-J.P.Structural basis for substrate fatty acyl chain specificity:crystal structure of human very-long-chain acyl-CoA dehydrogenase.J Biol Chem 2008,283,9435-9443）;ホホバ（Simmondsia chinensis）（Q9XGY7）、およびマウス（Q7TNT2、Q922J9）。
【０３１６】
3.1.4  カルボン酸レダクターゼ（EC 1.2.99.-）によるピメリン酸のピメリン酸セミアルデヒドへの変換 
3.1.4.1  カルボン酸レダクターゼ標的の選択、クローニングおよび発現
ピメリン酸のピメリン酸セミアルデヒドへの還元のための酵素標的をカルボン酸レダクターゼファミリー（EC 1.2.99.-、例えばEC 1.2.99.6）から選択した。特に、ノカルジア属のカルボン酸レダクターゼは、芳香族基質に対して大きな基質特異性を示す単量体酵素であり、大腸菌において成功裏にクローン化され、発現された（Nocardia sp.Carboxylic acid reductase:Cloning,expression,and characterization of a new aldehyde oxidoreductase family:He et al.Appl.Environ.Microbiol.2004,70,1874-1881）。この酵素は、それゆえ、ピメリン酸のピメリン酸セミアルデヒドへの変換を観測する初期スクリーニングのための良好な候補物であった。
【０３１７】
ノカルジア属種のカルボン酸レダクターゼ（CAR）遺伝子（GeneBank AY495697）をあらかじめpHAT-10ベクター（Clontech）にクローニングした。ノカルジア属種由来のカルボン酸レダクターゼを保有する大腸菌株BL-21（DE3）RPlpPV2-85を使用した（He et al.（2004））。次に標準的な条件（1mM IPTG、37℃の誘導前および誘導後温度）を使用して発現試験を開始し、先に報告したプロトコルに従ってIPTG誘導下に大腸菌において発現させ、活性アッセイのために十分なタンパク質を生産するようにスケールアップした。
【０３１８】
3.1.4.2  細胞溶解およびSDS-PAGE分析
活性アッセイ用の材料を提供するために細胞ペレットを溶解した。大規模であるため、リゾチーム処理と併せてガラスビーズ溶解を使用して細胞を破壊した。誘導後4時間の試料からの細胞ペレットを、1.5 mg/mL のリゾチームを添加した、0.1mMトリス、1mg/mlペプスタチンAおよび200mM PMSFプロテアーゼ阻害剤からなるビーズ溶解緩衝液に再懸濁した（5のOD600で1mL の培養物からの細胞ペレットの溶解のために161μLの混合物を使用すべきである）。酸で洗った212〜300μmのガラスビーズ（溶解緩衝液1mL当たり0.4g）を各試料に添加し、ボルテックスすることによって溶解した（ボルテックス30秒および氷上で30秒のサイクルを10サイクル）。次に溶解反応物を13000rpmで20分間遠心分離した。可溶性画分を新しいチューブに移し、不溶性画分を、先に使用した溶解緩衝液の容量と同じ容量の水に再懸濁した。20μlの各画分を80μlのSDS試料緩衝液（SDS負荷緩衝液、9％DTTおよび水）と混合し、混合物をヒートブロックにおいて95℃で5分間加熱した。次に20μlの各SDS試料調製物をSDS-PAGE 4〜20％トリシンゲルに負荷し、可溶性および不溶性画分のタンパク質含量を分析した（図12）。
【０３１９】
予想されたサイズ（128kDa）のタンパク質バンドが、誘導の4時間後に可溶性および不溶性画分において明瞭に見えた（図1:それぞれレーン3および4）。より多量の発現タンパク質が可溶性画分において認められ（図12:レーン3）、大きな割合のタンパク質が可溶性形態で発現されることを示した。
【０３２０】
3.1.4.3  活性アッセイ
活性アッセイは、陽性対照としての安息香酸ナトリウムおよびピメリン酸ナトリウムに対するCAR活性の分光光度検出に基づいた。アッセイの条件はApplied and Environmental Microbiology 2004,70,pl874-1881から採用した。
【０３２１】
以下の保存溶液を調製した:50mM安息香酸ナトリウム、50mMピメリン酸ナトリウム、 100mM MgCl2、lmM DTTを含む50mMトリスHCl pH7.5、10v/v％グリセロール緩衝液中の1mM EDTA、10mM ATP、1.5mM NADPH（還元形態）。
【０３２２】
石英キュベットに以下の試薬を添加した:100μL MgCl2、100μL ATP、100μL NADPH、200μLトリスHCl緩衝液。340nmでの吸光度を測定し、記録して、100μLのCAR無細胞抽出物を添加した。吸光度を観測し、記録した。2分後に100μLの100mM安息香酸ナトリウムまたはピメリン酸ナトリウムを添加し、再び吸光度を観測して、記録した。経時的に観測した吸光度を初期測定から差し引いた。データへの最良直線適合をプロットし、340nmでの吸光度の変化率の勾配を作成して、安息香酸と比較した吸光度の変化の相対率を決定するために以下の図13および表2に提示する。
【０３２３】
（表２）
2014525741.tif 000010
【０３２４】
したがって、ノカルジア属由来のCARは、安息香酸に対する活性の50％超でピメリン酸のピメリン酸セミアルデヒドへの還元を触媒した。EC 1.2.99.6からのピメリン酸の還元のための他の適切な酵素は、例えばストレプトミセス・グリセウス（Streptomyces griseus）の酵素（Suzuki et al.,2007.GriC and GriD constitute a carboxylic acid reductase involved in grixazone biosynthesis in Streptomyces griseus.J Antibiot（Tokyo）.Jun;60（6）:380-7）を含む。
【０３２５】
3.1.5  チオエステルヒドロラーゼ（EC 3.2.1.-）、ピメロイルCoAリガーゼ（EC 6.2.1.-）、例えばEC 6.2.1.14および6.2.1.23、またはCoAトランスフェラーゼ（EC 2.8.3.-）によるピメロイルCoAのピメリン酸への変換、およびオレオイル-[acp]ヒドロラーゼ（EC 3.1.2.14）によるピメロイル-[acp]のピメリン酸への変換 
CoASHの加水分解または転移を触媒することができる酵素は、EC 3.2.1.-、例えばEC 3.1.2.2、EC 3.1.2.3、EC 3.1.2.18、3.1.2.19、3.1.2.20、EC 3.1.2.21、EC 3.1.2.27からのチオエステルヒドロラーゼ、EC 6.2.1.-、例えばEC 6.2.1.3、EC 6.2.1.14、EC 6.2.1.23からの酸-チオールリガーゼ、ならびにEC 2.8.3.-、例えばEC 2.8.3.12および EC 2.8.3.13からのCoAトランスフェラーゼを含む。これら3つのファミリーの中で、チオエステラーゼは、多数の特性づけられた酵素ならびに鎖の長さ（C-3からC-26）の観点および官能基（ジカルボキシリルCoA基質）の観点から見たそれらの広い基質特異性のゆえに、ピメロイルCoAの加水分解のための最良候補物を提示する。
【０３２６】
3.1.5.1  酸-チオールリガーゼ
酸-チオールリガーゼは、付随するアデノシン三リン酸（ATP）の加水分解を伴って炭素-硫黄結合の形成を触媒する。アシルCoAの加水分解は、それゆえ、逆反応と比較して熱力学的に不利である酸-チオールリガーゼ触媒反応の間、ATPの生成を必要とする。
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【０３２７】
しかし、これらの酵素はなおも有用であり、いくつかのCoAリガーゼはピメロイルCoAに作用することが公知である:
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【０３２８】
リシニバチルス・スファエリカス（Lysinibacillus sphaericus）（バチルス・スファエリカス）（Bacillus sphaericus）由来のBioW（Uniprot:P22822）
ピメリン酸CoAシンターゼ（6-カルボキシヘキサン酸CoAリガーゼ）は、無細胞抽出物を用いてバチルス・スファエリカスにおいて発見された。これはビオチン生合成経路に関与する。酵素活性は、7-ケト-8-アミノペラルゴン酸シンテターゼと合わせた反応およびサッカロミセス・セレビシエを使用した微生物学的アッセイによって間接的に決定された［1］。ピメリン酸CoAシンターゼ（bioW）をコードする遺伝子は、B.スファエリカスゲノムからのライブラリ担持配列を有する大腸菌突然変異体の相補性試験によって7-ケト-8-アミノペラルゴン酸シンテターゼ（bioF）と共に同定された[Gloeckler R,Ohsawa I,Speck D,Ledoux C,Bernard S,Zinsius M,Villeval D,Kisou T,Kamogawa K,Lemoine Y.（1990）Cloning and characterization of the Bacillus sphaericus genes controlling the bioconversion of pimelate into dethiobiotin.Gene.87:63-70]。BioWは大腸菌において過剰発現され、均一に精製された[Ploux O,Soularue P,Marquet A,Gloeckler R,Lemoine Y.（1992）Investigation of the first step of biotin biosynthesis in Bacillus sphaericus.Purification and characterization of the pimeloyl-CoA synthase,and uptake of pimelate.Biochem J.287:685-690]。この酵素は、ピメリン酸二ナトリウム、ATP、CoASHおよびMgCl2の存在下で活性であった。反応の生成物はピメロイルCoAおよびAMPであり、ADPは検出されなかった。この酵素はATP およびピメリン酸に対してのみ特異的であった。他のヌクレオチド（例えばGTP、AMP）および代替的な基質（コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、スベリン酸）は受け入れられなかった。
【０３２９】
シュードモナス・メンドシナ35（Pseudomonas mendocina 35）由来のPauA（GenBank:AJ012480.1）
異化ピメロイルCoAリガーゼ、pauAは、シュードモナス・メンドシナ35におけるジカルボン酸（C6〜C10）の分解に関与する[Binieda A,Fuhrmann M,Lehner B,Rey-Berthod C,Frutiger-Hughes S,Hughes G,Shaw NM.（1999）Purification,characterization,DNA sequence and cloning of a pimeloyl-CoA synthetase from Pseudomonas mendocina 35.Biochem J.340:793-801]。この酵素はジカルボン酸を活性化し、ジカルボン酸はその後β酸化経路によって代謝される。酵素は均一に精製され、部分的アミノ酸配列が決定された。pauAはbioWより広い基質範囲を示し、ピメリン酸（100％相対活性）、アジピン酸（72％）およびアゼライン酸（18％）を受け入れた。この酵素は、ビオチン生合成経路に関与するbioWよりも1桁から2桁分活性であった。遺伝子pauAが同定され、リガーゼは大腸菌において成功裏に過剰発現された。
【０３３０】
巨大菌（Bacillus megaterium）由来のピメロイルCoAシンテターゼ 
酵素を79％の回収率で約34倍に精製した[Izumi Y,Morita H,Tani Y,Ogata K.（1974）The pimeloyl-CoA synthetase responsible for the first step in biotin biosynthesis by microorganisms.Agr.Biol.Chem.38,2257-2262]。反応は、ピメリン酸、ATP、CoASHおよびMgCl2を必要とした。この酵素はピメリン酸に対してのみ特異的であり、他のジカルボン酸は受け入れられなかった。興味深いことに、ATPをADPで置き換えることができ、ピロリン酸開裂が必須ではないことを示唆した。アミノ酸配列およびヌクレオチド配列は不明である。しかし、巨大菌の3つの完全なゲノムが1974年から公表されている。それゆえ、bioWホモログに関するBLAST検索を実施した。残念ながら、これはいかなる適合も示さなかった。
【０３３１】
ラベンダー（Lavandula vera L.）由来の植物ピメロイルCoAシンターゼ
ラベンダー細胞培養物におけるピメロイルCoAシンターゼ活性が記述されている［6］。［3H］-ピメリン酸はビオチン生合成における前駆体であることが認められたが、この酵素または遺伝子について入手可能なデータはない。
【０３３２】
エンドウ由来の植物可溶性アシルCoAシンテターゼ
エンドウタンパク質抽出物の可溶性画分において活性が認められた[7]。酵素はATP/Mg2+およびCoASHを必要とした。リガーゼの分子量を、リシニバチルス・スファエリカス由来のリガーゼに対するポリクローナル抗体を使用してウェスタンブロット法によって決定した。酵素は、ピメリン酸ならびにアゼライン酸を受け入れたが、ノナン酸は受け入れなかった。GTPをATPの代わりに使用することができたが、ADPについては反応を認めなかった。可溶性ピメロイルCoAシンテターゼをコードする遺伝子は同定されなかった。
【０３３３】
エンドウ由来の植物ペルオキシソームアシルCoAシンテターゼ
この酵素はペルオキシソームタンパク質画分に位置した[GerblingH,Axiotis S,Douce R.（1994）A new acyl-CoA synthetase,located in higher plant cytosol.J Plant Physiol.143:561-564.]。ピメリン酸はピメロイルCoAへと活性化され、その後β酸化経路によってアセチルCoAおよびマロニルCoAに分解された。この酵素の基質範囲は試験しなかった。この酵素は、同じ生物由来の可溶性アシルCoAシンテターゼよりも高いｐH最適値を示した。
【０３３４】
ラット（Rattus norvegicus）由来のジカルボン酸CoAリガーゼ
ジカルボン酸（C5〜C16）は、ラット肝臓からのミクロソームタンパク質画分由来のジカルボキシリルCoAシンテターゼによってそれらのCoAエステルに変換された[Vamecq J,de Hoffmann E,Van Hoof F.（1985）The microsomal dicarboxylyl-CoA synthetase.Biochem J.230:683-693.]。この酵素はATPを利用するが、GTPは利用しない。反応はその生成物によって阻害され、AMPはピロリン酸よりも阻害性である。酵素はC12基質に対して最も高い活性を示した。ジカルボキシリルCoAシンテターゼの一部のアッセイでは、CoA消費のプラトーの後にCoAが放出された。これは、反応が可逆的であり得ることを示唆するので、重要な所見である。しかし、タンパク質試料がCoAチオエステラーゼで汚染されていた可能性があるため、この示唆はいくぶん慎重に取り扱うべきである。この酵素は有望であり得るが、ラットゲノム配列のBLAST検索はいかなるbioWまたはpauAホモログも明らかにしなかった。遺伝子を同定するには代替的なアプローチ、例えば酵素の精製、N末端配列決定、プライマー設計およびPCR増幅が必要であろう。
【０３３５】
未同定細菌、LP-1株由来のピメロイルCoAシンテターゼ
硝酸ナトリウムおよびピメリン酸ナトリウムで増殖するように濃縮した活性汚泥由来の脱窒素菌の環境培養物において活性が認められた[Gallus C,Schinlc B.（1994）Anaerobic degradation of pimelate by newly isolated denitrifying bacteria.Microbiology.140:409-416.]。この酵素はATPおよび Mg2+の存在下で活性であった。反応の生成物はADPではなくAMPであった。この酵素は安息香酸を受け入れなかった。
【０３３６】
CoAリガーゼは、可逆性に関して厳密にまたは体系的に試験されていない。結晶構造が得られておらず、そのため活性部位の構造は不明である。それゆえ、AMP、ピロリン酸またはマグネシウムイオンが可逆的反応のために必要であるかどうかは明らかでなく、これらの補因子の組合せの存在下および不在下でインビトロアッセイを実施すべきである。言うまでもなく、最終的な目標は全細胞において可逆的反応を得ることであり、これはより困難であり得る。経路における後の反応は、当然ながら、平衡をチオ開裂の方向に引き寄せる。それにもかかわらず、ATPの加水分解およびその後のピロリン酸の加水分解は正反応をエネルギー発生性にするので、これは逆転させるのが難しい反応であり得る。それゆえ、細胞を遺伝子操作することを試みる前に、インビトロで反応の可逆性に対する種々のATP:AMP比の影響を測定することが重要である。ATP:AMP比が決定的に重要である場合は、可逆的反応を進行させるのに十分なだけ細胞内ATP濃度を低下させるように細胞エネルギー充足率を操作することが必要であり得る。これは、次に、十分に低いATP濃度を達成するためにATPシンターゼ阻害剤または脱共役剤を使用する必要があり得るので、良好な生産性を得ることに関してさらなる困難を引き起こし得る。原則として、これらの問題はいずれも克服できないわけではないが、遺伝子操作された生物触媒の開発は複雑になり得る。それゆえ、チオエステラーゼなどのより単純な酵素系をより高い優先度として検討した。
【０３３７】
3.1.5.2  CoAトランスフェラーゼ（EC 2.8.3.-）
CoAトランスフェラーゼは、ピメロイルCoA、アジピルCoA（EC 2.8.3.13-Substrate specificity of a dicarboxyl-CoA:dicarboxylic  acid coenzyme A transferase from rat liver mitochondria:Deana et al. Biochem Int.1992,26,767-773）のC-6誘導体に対して活性を示すにもかかわらず、狭い基質特異性または、例えばコハク酸-ヒドロキシメチルグルタル酸CoAトランスフェラーゼの場合のような遺伝子/タンパク質特性づけの欠如のために、チオエステラーゼほど魅力的ではない候補物である。このファミリーからの一部の酵素は、アシダミノコッカス・フェルメンタンス（Acidaminococcus fermentans）（EC 2.8.3.12 -Glutaconate CoA-transferase from Acidaminococcus fermentans:Buckel et al.Eur.J.Biochem.1981,118,315-321）由来の酵素、グルタコン酸CoAトランスフェラーゼの活性を、部位指定突然変異誘発によってCoAトランスフェラーゼからCoAエステラーゼに変更することが可能であったので（Mack M,Buckel W.（1997）Conversion of glutaconate CoA-transferase from Acidaminococcus fermentans into an acyl-CoA hydrolase by site-directed mutagenesis.FEBS Lett.405;209-212）、なおも有用であり得る。この酵素は大腸菌において成功裏に発現され、グルタコニルCoA、3-メチルグルタコニルCoA、ブチンジオイルCoA、2-ヒドロキシアジポイルCoA、オキサロクロトニルCoAおよびムコニルCoAの酵素生合成のために使用された（Parthasarthy A,Pierik A,Kahnt J,Zelder O,Buckel W.（2011）Substrate specificity of 2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase from Clostiridium symbiosum:Toward a bio-based production of adipic acid.Biochemistry.50:3540-35500）。GctABの結晶構造も公表された（Jacob U,Mack M,Clausen T,Huber R,Buckel W,Messerschmidt A.（1997）Glutaconate CoA-transferase from Acidaminococcus fermentans:the crystal structure reveals homology with other CoA-transferases.Structure.5:415-426）。このトランスフェラーゼは、いくつかの水素結合を介して末端カルボン酸陰イオンをセリン残基に結合し、これにより種々の鎖の長さに調整し得る。ラット由来のCoAトランスフェラーゼ（コハク酸-ヒドロキシメチルグルタル酸CoAトランスフェラーゼEC 2.8.3.13）は、スクシニルCoA、マロニルCoA、グルタリルCoAに関して認められるよりも高い親和性でアジピルCoAを基質として受け入れるので、この酵素も良好な候補物である（Substrate specificity of a dicarboxyl-CoA:dicarboxylic acid coenzyme A transferase from rat liver mitochondria（Deana Biochem Int.1992,26,767-773））。
【０３３８】
3.1.5.3  チオエステルヒドロラーゼ（EC 2.3.1.-）
3.1.5.3.1  適切な酵素の選択
チオエステラーゼはチオエステルの加水分解を触媒する加水分解酵素である:
2014525741.tif 000013
【０３３９】
データベースには非常に多くのチオエステラーゼが列挙されているが、2つのチオエステラーゼ（ACOT8およびACOT4）だけがジカルボキシリル-モノCoAエステルに対する活性に関して試験されていると思われる。
2014525741.tif 000014
【０３４０】
マウス由来のACOT8ペルオキシソームアシルCoAチオエステラーゼ8（以前のPTE-2）
ACOT8はヒトPET1チオエステラーゼのホモログである。この酵素は大腸菌において Hisタグ融合タンパク質として過剰発現され、HisTrapカラムクロマトグラフィを用いて均一に精製された[Westin MA,Hunt MC,Alexson SE.（2005）The identification of a succinyl-CoA thioesterase suggests a novel pathway for succinate production in peroxisomes.J Biol Chem.280:38125-38132]。活性は、長鎖アシルCoAに関して5〜10μM超の基質濃度で阻害されたが、BSAの添加は阻害を防止された。チオエステラーゼの基質範囲を、飽和および不飽和直鎖アシルCoA（C2〜C20）を用いて試験した。最も高い活性はC10〜C18の胆汁酸（トリヒドロキシコプロスタノイルCoA、コロイルCoAおよびケノデオキシコロイルCoAならびに分枝鎖アシルCoA）に対してであった。試験した基質の大部分についてのKm値はかなり低く、ACOT8が非常に広い基質特異性を有し、それらの大部分を受け入れ得ることを強く示唆した。ACOT8はCoASHにより10〜15μMのIC50で強力に阻害された。ACOT8はジカルボキシリル-モノCoA誘導体に対する活性に関しても試験され、長鎖基質を優先的に加水分解した（C鎖の長さがC3からC12に増大すると共に活性が上昇した）[Hunt MC,Solaas K,Kase BF,Alexson SE.（2002）Characterization of an acyl-coA thioesterase that functions as a major regulator of peroxisomal lipid metabolism.J Biol Chem.277:1128-1138]。
【０３４１】
マウス由来のACOT3（以前のPTE-1a）
ACOT3は大腸菌において発現され、均一に精製された[19]。この酵素はC8からC26までのモノカルボン酸エステルに対して活性を示し、より長鎖の基質（C16）に対して最も高い活性を示した。酵素は胆汁酸エステルを受け入れなかった。遊離CoASHによる阻害は存在しなかった。ジカルボン酸エステルは試験しなかった。
【０３４２】
マウス由来のACOT5（以前のPTE-1c）
ACOT5は大腸菌において発現され、均一に精製された[Westin MA,Alexson SE,Hunt MC.（2004）Molecular cloning and characterization of two mouse peroxisome proliferator-activated receptor alpha（PPARalpha）-regulated peroxisomal acyl-CoA thioesterases.J Biol Chem.279:21841-21848]。この酵素はC6からC20までのモノカルボン酸エステルに対して活性を示し、中鎖基質（C10）に対して最も高い活性を示した。酵素は胆汁酸エステルを受け入れなかった。遊離CoASHによる阻害は存在しなかった。ジカルボン酸エステルは試験しなかった。
【０３４３】
マウス由来のACOT4ペルオキシソームアシルCoAチオエステラーゼ4（以前のPTE-1b）
ACOT4は大腸菌において発現され、均一に精製された[18]。この酵素は狭い基質範囲を示し、スクシニルCoAおよびグルタリルCoAを受け入れた。反応は、500μMまでの濃度ではCoASHによって阻害されなかった。
【０３４４】
ACOT8、ACOT5およびACOT3は、したがって、ピメリン酸生合成経路に関与するジカルボキシリルCoAおよび他のアシルCoAの加水分解のための優れた候補物である。
【０３４５】
3.1.5.3.2  選択したチオエステラーゼに関するクローニング、発現および生物転換
マウスAcot8（野生型mRNA配列 GeneBank NM_133240;mRNAフラグメント65-1027）およびインフルエンザ菌YciA（野生型遺伝子配列GeneBank L42023フラグメント 878596-879060）由来のチオエステラーゼを、それらのジカルボキシリルCoA基質に対する特異性のゆえに、ピメロイルCoAのピメリン酸への変換についての例として選択した（The identification of a succinyl-CoA thioesterase suggests a novel pathway for succinate production in peroxisomes:Westin J.et al.Biol.Chem 2005,280,38125-38132;Divergence of function in the hot dog fold enzyme superfamily - the bacterial thioesterase YciA:Zhuang et al.Biochemistry 2008,47,2789-2796）。どちらの遺伝子もそれらのそれぞれの宿主ゲノムから同定され、大腸菌において成功裏にクローニングされ、発現された（Characterization of an acyl-CoA thioesterase that functions as a major regulator of peroxisomal lipid metabolism:Hunt et al.J.Biol.Chem.277,1128-1138;Divergence of function in the hot dog fold enzyme superfamily - the bacterial thioesterase YciA:Zhuang et al.Biochemistry 2008,47,2789-2796）。
【０３４６】
両遺伝子を、対応する大腸菌発現ベクターの構築のための野生型配列として選択し、大腸菌BL21（DE3）を形質転換するために使用した。インフルエンザ菌YciAチオエステラーゼの発現は大腸菌において達成された（図14h）が、マウスAcot8チオエステラーゼの発現は達成されなかった。予想されたサイズ（17kDa）のタンパク質バンドが、IPTG誘導後に可溶性画分（レーン2から3）および不溶性画分（レーン6および7）において明瞭に検出された。陰性対照実験（レーン4および8）では対応するタンパク質を認めず、予想された17kDaのインフルエンザ菌YciAチオエステラーゼタンパク質が集合体構築物I8から大腸菌において成功裏に発現されたことを示唆した。YciAタンパク質の可溶性発現は誘導後4時間から24時間のインキュベーションの間経時的に増大すると思われ（レーン2および3）、一方不溶性発現は同じ期間に減少すると思われた（レーン6および7）。それゆえ、24時間後の可溶性試料はインフルエンザ菌YciAチオエステラーゼの活性を観測するために最良の候補物であると思われた。
【０３４７】
マウスAcot8タンパク質の発現は、pET21-a/IPTG発現系を使用して大腸菌で検出されなかったので、サッカロミセス・セレビシエを、チオエステラーゼ酵素を生産し、試験するための代替的な系として選択した。S.セレビシエ発現ベクターでの形質転換を実施し、構成的プロモーターADH1pからの発現を、細胞溶解後にSDS-PAGEで観測した。
【０３４８】
3.1.6  アミノトランスフェラーゼ（EC 2.6.1.19;EC 2.6.1.39）によるピメリン酸セミアルデヒドの7-アミノヘプタン酸への変換およびα-ケトスベレートのα-アミノスベレートへの変換
トランスアミナーゼまたはアミノトランスフェラーゼは、アミノ酸とケト酸の間の反応を触媒する酵素である。この反応は、アミノ供与体からアミノ基を除去する段階、α-ケト酸を残す段階、およびそれを受容体α-ケト酸に転移してアミノ酸に変換する段階を含む。これらはアミノ酸の合成において重要な酵素であり、自然界全体に遍在する。これらの酵素の多くはピリドキサルリン酸（PLP）を補因子として含む。これらの酵素は、広範囲の基質を利用する、広範囲の細胞機能をカバーする大きくて多様性のあるファミリーに属する。
【０３４９】
3.1.6.1  ピメリン酸セミアルデヒドの7-アミノヘプタン酸への変換
文献検索、BLAST検索およびタンパク質データベース検索によって同定された多数の候補物は、ピメリン酸セミアルデヒドの7-アミノヘプタン酸への変換のための適切な酵素である。
2014525741.tif 000015
EC 2.6.1.19
ストレプトミセス・グリセウス由来の4-アミノ酪酸トランスアミナーゼ
この酵素は1985年に初めて検討され、以下の反応を触媒することが認められた。
4-アミノブタノエート＋2-オキソグルタレート→4-オキソブタノエート＋グルタメート
この酵素は、6-アミノヘキサノエートおよび7-アミノヘプタノエートを含む比較的広い基質範囲を有し、2-オキソグルタレートをアミノ受容体として使用して、対応するセミアルデヒドを形成する（Yonaha,K.,K.Suzuki,and S.Toyama,4-Aminobutyrate:2-oxoglutarate aminotransferase of Streptomyces griseus:purification and properties.Eur J Biochem,1985.146（1）:p.101-6）。これは非常に有望であるが、これらの反応の可逆性は試験されていない。それゆえ、グルタメートは7-オキヘプタノエートから7-アミノヘプタン酸を提供するので、これをアミノ供与体として使用して逆反応をインビトロで試験する。酵素をS.グリセウスIFO 3102（S.グリセウス亜種グリセウス）において精製し、各々約50kDaの2つの同一サブユニットからなる100 kDaであることを認めた。補因子はピリドキサル5'-リン酸である。タンパク質はPubmedデータベースに寄託される（表1）。推定上の4-アミノトランスフェラーゼと注釈されている、これをコードする遺伝子（SGR_1829）は、IFO 3102に密接に関連する、S.グリセウスIFO 13350のゲノム配列中に存在する。明らかではないが、このタンパク質が、記述され、検討された酵素の近接ホモログである可能性は極めて高い（Yonaha,K.,K.Suzuki,and S.Toyama,4-Aminobutyrate:2-oxoglutarate aminotransferase of Streptomyces griseus:purification and properties.Eur J Biochem,1985.146（1）:p.101-6）。入手可能な基質範囲データを考慮すると、このタンパク質は適切なアミノトランスフェラーゼ酵素として試験するための非常に良好な候補物である。
【０３５０】
EC 2.6.1.39 
サーマス・サーモフィルス由来のアミノアジピン酸トランスアミナーゼ（Q72LL6）
これは、哺乳動物由来のα-アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ（AAAAT）に相同性を有する酵素であり、細菌サーマス・サーモフィルスHB27におけるリジン合成に関与すると考えられる[2,3]。動力学データが、2-オキソアジペート、2-オキソイソカプロエート、α-アミノアジペートおよびさらには芳香族アミノ酸などに基質に関して入手可能である[3]。タンパク質は大腸菌において発現され、精製されており、インビトロでは主として、各々約44kDaのサイズのサブユニットのホモ二量体として存在することが認められた（Miyazaki,T.,et al.,alpha-Aminoadipate aminotransferase from an extremely thermophilic bacterium,Thermus thermophilus.Microbiology,2004.150（Pt 7）:p.2327-34）。広い基質特異性、その原核生物起源およびコード遺伝子が入手可能であることは、これが1に関して試験するための良好な候補物であり得ることを示唆する。これは非常によく検討された酵素であり、その結晶構造が入手可能であって（PDB ID:2ZP7）、基質特異性への機構的洞察を提供する（Ouchi,T.,et al.,Dual roles of a conserved pair,Arg23 and Ser20,in recognition of multiple substrates in alpha-aminoadipate aminotransferase from Thermus thermophilus.Biochem Biophys Res Commun,2009.388（1）:p.21-7;Tomita,T.,et al.,Mechanism for multiple-substrates recognition of alpha-aminoadipate aminotransferase from Thermus thermophilus.Proteins,2009.75（2）:p.348-59）。
【０３５１】
ラット由来のアミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ（Q64602）
この酵素は先に述べたサーマス・サーモフィルス由来の酵素に類似する。キヌレニン/アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼと注釈されているが、2つの異なるタンパク質がこれらの反応を実施することを示唆するいくつかの証拠がある（Mawal,M.R.and D.R.Deshmukh,Alpha-aminoadipate and kynurenine aminotransferase activities from rat kidney.Evidence for separate identity.J Biol Chem,1991.266（4）:p.2573-5）。タンパク質はラットの腎臓から精製され、ヒト胚性腎線維芽細胞において発現されており、約100kDaのサイズであることが認められた。この酵素は2-オキソアジペートを基質として受け入れることができる。初期試験は（おそらく同じ酵素に関して）、見かけ上可逆性である反応においてDL-2-アミノピメリン酸をアミノ供与体とし、2-オキソグルタレートを受容体として使用できることを示している（Deshmukh,D.R.and S.M.Mungre,Purification and properties of 2-aminoadipate:2-oxoglutarate aminotransferase from bovine kidney.Biochem J,1989.261（3）:p.761-8）。同じ論文は、ピメリン酸が活性の阻害剤であり得、ピメリン酸の存在下で活性が30％低下し得ることを示した。
【０３５２】
上記の3つの酵素は、7-アミノヘプタン酸を生成する最終的なアミノ基転移に適するはずである。S.グリセウス由来の酵素は良好な候補物であり、クローニング、発現および精製の工程は特に難しくはないであろう。同じことが、広い基質範囲を有すると思われる、T.サーモフィルス由来のLysNにも当てはまる。ラット由来の酵素はより困難であろうが、活性データは、この酵素が必要な特定の基質を使用し得ることを示唆する。
【０３５３】
3.1.6.2  選択したアミノトランスフェラーゼの発現
2つの遺伝子を、どちらもピメリン酸セミアルデヒドの7-アミノヘプタン酸への変換およびα-ケトスベレートのα-アミノスベレートへの変換のために選択した:（1）IlvE-ωVf融合物（SEQ ID 1および 2）ならびに（2）IlvE-Ad最適化ω融合物（SEQ ID 3および4）。これらの遺伝子を、以前に大腸菌において高い発現レベルを示した、分枝鎖アミノトランスフェラーゼIlvEの5'末端と共にωアミノトランスフェラーゼの融合物を組み込んだプラスミドにおいて調製した（図23および図24参照）。IlvEフラグメントの導入はアミノトランスフェラーゼ遺伝子の発現を有意に増大させることが実証された。IlvEフラグメントと分枝鎖アミノトランスフェラーゼ遺伝子を含む別の熱誘導性プラスミドも活性アッセイにおいて試験した（ING66）。
【０３５４】
さらなる5つの遺伝子（バチルス・ウェイヘンステファネンシス（Bacillus weihenstephanensis）KBAB4、緑膿菌（gi9951072）、枯草菌（gi16078032）、シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）クラスIII、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）クラスIII）を選択した（DSM特許（Preparation of 6-aminocaproic acid from 5-formyl valeric acid:DSM - US2011-0171699 A1特許）。これらの酵素はα-ケトピメリン酸のα-アミノピメリン酸への変換においてある程度の活性を示し、ピメリン酸セミアルデヒドの7-アミノヘプタン酸への変換においても活性であり得る（SEQ ID 5〜14参照）。
【０３５５】
前述同様に大腸菌BL21において発現されたIlvE-ωVf融合物（pING2022）（図23）およびIlvE-Ad最適化ω融合物（pING2030）（図 24）タンパク質のSDS-PAGE分析。予想されたサイズの明らかなバンドがIlvE-ωVf融合物（pING2022）（図15、レーン5および6）ならびにIlvE-Ad最適化ω融合物（pING2030）（図15、レーン8および9）タンパク質の両方で認められる。陰性対照では対応するバンドは存在せず、IlvE-ωVf融合物およびIlvE-Ad最適化ω融合物タンパク質の発現を確認した。
【０３５６】
IlvE-ωVf融合物（pING2022）およびIlvE-Ad最適化ω融合物（pING2030）アミノトランスフェラーゼタンパク質の活性アッセイ
組換えVfアミノトランスフェラーゼを使用して7-アミノヘプタン酸への活性を検定した。3種の生物転換体を調製し、7-アミノヘプタン酸およびピルビン酸ナトリウムのL-アラニンへの変換に対する酵素負荷の影響を検討した。生物転換体におけるL-アラニンの検出は、7-アミノヘプタン酸に関する所望のアミノトランスフェラーゼ特異性の明確な証拠を提供する。7-アミノヘプタン酸のピメリン酸セミアルデヒドへのアミノトランスフェラーゼ変換を示す反応スキームを以下に提示する:
2014525741.tif 000016
【０３５７】
3種の生物転換体（3ml容量）は、50mMピルビン酸ナトリウムおよび10mM 7-アミノヘプタン酸を含んだ。反応物を30℃の軌道インキュベータに保持し、アリコートを分析のために生物転換体から定期的に採取した。
2014525741.tif 000017
【０３５８】
アリコート（1ml）を生物転換体から取り、95℃に5分間加熱して、可溶性タンパク質を沈殿させた。その後試料を遠心分離し、上清をHPLC分析の前に0.2ミクロンのフィルターを通してろ過した。HPLC分析は、β-メルカプトエタノールおよびオルトフタルアルデヒドとの化学付加物形成に基づくプレカラム誘導体化法を用いた。L-アラニンおよび7-アミノヘプタン酸の外部標準品を使用して、生物転換体中の7-アミノヘプタン酸およびL-アラニンの濃度を測定した。
【０３５９】
結果（図16）は、生物転換体におけるL-アラニンの形成を明らかに示し、Vfアミノトランスフェラーゼに関するアミノトランスフェラーゼ活性および特異性についての説得力のある証拠を提供する。7-アミノヘプタン酸濃度は、予想されたアミノトランスフェラーゼ活性と一致して経時的に低下する。7-アミノヘプタン酸の割合は、やはり予想されたトランスアミナーゼ活性と一致して、酵素の濃度上昇と共に増大する。形成されるL-アラニンの量は消費された7-アミノヘプタン酸とは合致しないが、これは、大腸菌抽出物中に存在する他の非アミノトランスフェラーゼ酵素によって形成されるL-アラニンの選択的な生化学的分解によって引き起こされ得る。
【０３６０】
2-アミノスベレートに対する活性を評価するためにアミノトランスフェラーゼのさらなる検討を実施した。
2014525741.tif 000018
【０３６１】
L-2-アミノスベリン酸の2-ケトスベリン酸へのアミノトランスフェラーゼ変換は、生物転換を調節する可能性を提供する。
【０３６２】
6種の生物転換を実施し、pING 2022、pING2030およびING66（Ilve分枝鎖アミノトランスフェラーゼ、E.C.2.6.1.42、既に菌株コレクションに存在する構築物）を検討した。各々の生物転換は、以下に示されているように10mMのDL-2-アミノスベリン酸、50mMピルビン酸ナトリウムおよび高負荷または低負荷の無細胞抽出物（CFE）を含んだ:注記:ING 66は全細胞として使用した:
2014525741.tif 000019
【０３６３】
6種の形質転換体（3ml容量）を30℃の軌道インキュベータに保持し、アリコートを分析のために生物転換体から定期的に採取した。アリコート（1ml）を生物転換体から取り、95℃に5分間加熱して、可溶性タンパク質を沈殿させた。その後試料を遠心分離し、上清をHPLC分析の前に0.2ミクロンのフィルターを通してろ過した。HPLC分析は、Boc-システインおよびオルトフタルアルデヒドとの化学付加物形成に基づくプレカラム誘導体化法を用いた。DL-2-アミノスベリン酸およびL-アラニンの外部標準品を使用して、2-アミノスベリン酸エナンチオマーの保持時間を測定した。
【０３６４】
結果は、6種の生物転換体すべてにわたってL-2-アミノスベリン酸濃度の低下およびD-2-アミノスベリン酸のエナンチオ濃縮を示す。ここで試験したアミノトランスフェラーゼはL-立体選択性を示すことが公知であるので、この結果はL-エナンチオマーへのアミノトランスフェラーゼの作用と一致する。ピルビン酸塩のアミノ基転移から生じるはずである測定可能なL-アラニンはHPLCによって認められなかったが、7-アミノヘプタン酸の反応において先に認められたように、形成されたL-アラニンが生物転換体中に存在するその他の宿主タンパク質によってさらに分解された可能性がある。
【０３６５】
ING66生物転換体（rc0212-46-1および-2）は、pING2022およびpING2030アミノトランスフェラーゼと比較して有意に高いレベルのL-2-アミノスベリン酸分解を示した。ING 66分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼは、L-2-アミノスベリン酸のより短い（C5）ホモログであるL-2-アミノグルタレート（L-グルタミン酸）に対して卓越した選択性を示すことが既に公知であり、そのためING 66に対する活性のこの優先性は予想外ではない。
【０３６６】
3.1.7  α-アミノデカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.-）によるα-アミノスベリン酸の7-アミノヘプタン酸への変換（図10参照）
適切な触媒を、α-アミノスベリン酸の脱カルボキシル化のための候補物としてα-アミノ酸デカルボキシラーゼから、特にアスパラギン酸4-デカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.11）、 グルタミン酸デカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.15）、リジンデカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.18）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.20）およびジアミノ酪酸デカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.86）から選択した。
【０３６７】
大腸菌GadAグルタミン酸デカルボキシラーゼおよび大腸菌LysAジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼを最初にこれらの群のタンパク質から選択した。他の適切な酵素は、メタノカルドコッカス・ジャナスキイ由来のLysA（AAB99100）（EC 4.1.1.20）（Ray,S.S.,et al.,Cocrystal structures of diaminopimelate decarboxylase:mechanism,evolution,and inhibition of an antibiotic resistance accessory factor.Structure,2002.10（11）:p.1499-508）、ならびに大腸菌に存在するリジンデカルボキシラーゼ:嫌気的条件下でリジンによって誘導性であり、非常に高い活性を有するCadA（AAA23536）および構成的に発現されるがリジンに対してより低い活性を有するLdc（受託番号D87518）（Kikuchi,Y.,et al.,Characterization of a second lysine decarboxylase isolated from Escherichia coli.J Bacteriol,1997.179（14）:p.4486-9）を含む。
【０３６８】
選択した遺伝子に対応するDNA配列ならびにそれらの関連タンパク質配列をSEQ ID 15〜18に示す。大腸菌LysAジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの配列は、先に述べたように大腸菌コドン最適化遺伝子として選択した（Preparation of 6-aminocaproic acid from 5-formyl valeric acid:DSM - US2011-0171699 A1特許）。大腸菌 GadAグルタミン酸デカルボキシラーゼは野生型配列として選択した。先の例で述べた方法を用いて遺伝子をクローン化し、発現させた。
【０３６９】
先に調製した構築物（I29:pET21-GadAおよびI30:pET21-LysA）に加えて、2つのさらなる構築物を、inABLE技術を用いてilvEフラグメント（以下の集合体I31およびI32）の導入によって調製した。関心対象のタンパク質の上流の大腸菌分枝アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（IlvE）の15アミノ酸のN末端ペプチドの導入は、大腸菌における一部のタンパク質標的の発現上昇をもたらすことが以前に示されている。
【０３７０】
発現結果を以下に要約する:
2014525741.tif 000020
【０３７１】
活性アッセイのためのタンパク質抽出物の調製
誘導後24時間の試料からのあらかじめ凍結した細胞ペレットを、1.5mgのリゾチームを添加した、0.1mMトリス、1mg/mlペプスタチンAおよび200mM PMSFプロテアーゼ阻害剤からなるビーズ溶解緩衝液に再懸濁した（5のOD600で1mL の培養物からの細胞ペレットの溶解のために161μLの混合物を使用すべきである）。酸で洗った212〜300μmのガラスビーズ（溶解緩衝液1mL当たり0.4g）を各試料に添加した。全速力でボルテックスする30秒のバースト、次いで氷上で30秒のインキュベーションを合計10分間反復することによって溶解を実施した。
【０３７２】
1mLの試料を取り、残りの培養物を活性アッセイに使用した。1mL試料を13000rpmで2分間遠心分離し、上清を分離した。上述したようにSDS試料を調製し、SDS-PAGEゲルで分析した（図18）。溶解後、バグバスターによって溶解した、1mL試料中には存在しない大腸菌GadA ilvE（I31）タンパク質についての可溶性画分に大きなバンドが存在する（図18、レーン4）。以前に高い可溶性発現を示した、大腸菌LysA（I32）タンパク質は、ビーズ溶解ではあまり可溶性発現を示さなかった（図18、レーン5）。これは溶解方法の大きな変動性を示し得る。次に粗細胞抽出物を使用して4つの構築物I29〜I32から発現されたタンパク質の活性を観測した。
【０３７３】
2-アミノスベレートに対する活性を検定するために生物転換を実施した。各生物転換は、記述されているように（Biochem.J.（1965）96,75）1mM  2-メルカプトエタノールおよび10□g/mlリン酸ピリドキサルを含んだ。生物転換に含まれたすべての基質は10mM濃度であり、粗細胞抽出物負荷は20g/L全細胞当量であった。生物転換体をファルコンチューブにおいて37℃および250rpmでインキュベートした。
【０３７４】
試料を18時間および24時間のインキュベーション後に採取した。アリコートを95℃に5分間加熱し、可溶性タンパク質を変性させた。12,000rpmでの遠心分離および上清の0.2ミクロンろ過によって沈殿物を除去した。関連する基質の脱カルボキシル化が起こっていたかどうかを確認するため、ろ過した試料をHPLCによって分析した。
2014525741.tif 000021
【０３７５】
DL-２-アミノスベリン酸の変換は、α-アミノ酸デカルボキシラーゼの作用によって７-アミノヘプタン酸を生成するはずである。HPLCトレースは、この実験の期間にわたってDL-２-アミノスベリン酸濃度の変化をほとんど示さなかった。7-アミノヘプタン酸に対応するピークは、しかし、24時間のアリコートにおいて認められた。7-アミノヘプタン酸に対応する認められたピークの濃度を図19に示す。
【０３７６】
3.1.8  α-ケトデカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.-）によるα-ケトスベリン酸のピメリン酸への変換
3,1.8.1  適切な触媒の選択
デカルボキシラーゼのファミリーの中で、α-ケト酸デカルボキシラーゼ、特にピルビン酸デカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.1）、ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.7）および分枝鎖2-オキソ酸デカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.72）は、α-ケトスベリン酸の脱カルボキシル化のための最良の候補物として浮上した。
【０３７７】
これら4つの群の各々からのタンパク質をコードする遺伝子は広範囲の宿主から同定されており、それらの生成物は生化学的におよび一部の場合は構造的に特性づけられている（The crystal structure of benzoylformate decarboxylase at 1.6A resolution -Diversity of catalytic residues in ThDP-dependent enzymes:Hasson et al.Biochemistry 1998,37,9918-9930;High resolution crystal structure of pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis:Dobritzsch et al.J.Biol.Chem.1998,273,20196-20204;Structure of the branched-chain keto acid decarboxylase（KdcA）from Lactococcus lactis provides insights into the structural basis for the chemoselective and enantioselective carboligation reaction:Berthold et al.Acta Crystallographica Sec.D 2007.D63,1217-1224）。
【０３７８】
次に、これらの群の中から以下の酵素をそれらの基質特異性に従って選択した:ラクトコッカス・ラクティスkivD 2-ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（GeneBank JA114157）;ラクトコッカス・ラクティスkdcA分枝鎖α-ケト酸デカルボキシラーゼ（GeneBank JA114154）、サッカロミセス・セレビシエ pdc1ピルビン酸デカルボキシラーゼ（GeneBank JA114148）、ザイモモナス・モビリスpdc（I472A）ピルビン酸デカルボキシラーゼ突然変異体（GeneBank JA114151）、シュードモナス・プチダmd1C（A460I）ベンゾイルギ酸突然変異体（GeneBank AY143338;フラグメント2860-4446）。
【０３７９】
最初の4つの酵素は、以前に、標的化合物であるα-ケトスベリン酸のC-7誘導体、α-ケトピメリン酸の脱カルボキシル化においてある程度の活性を示した（Preparation of 6-aminocaproic acid from 5-formyl valeric acid:DSM - US2011-0171699 A1特許）。
【０３８０】
シュードモナス・プチダ由来のベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼのA460I突然変異体の特性づけは、2-ケトオクタン酸に対して低い活性を示す野生型酵素と比較して（Comparative characterisation of ThPP-dependent decarboxylases:Gocke et al.J.Mol.Cat.B:Enzymatic 2009,61,30-35）、2-ケトヘキサン酸に対する高い選択性を示した（Exchanging the substrate specificities of pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis and benzoylformate decarboxylase from Pseudomonas putida:Siegert et al.Port.Eng.Des.Sel.2005,18,345-357）。
【０３８１】
3.1.8.1  2-ケトピメリン酸および2-ケトスベリン酸の合成
2-ケトスベレートおよび2-ケトピメレートのα-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を特性づけるために、これらの基質は市販されていないので合成した。使用した経路および方法はJOC 1986 51,p2389-2391から採用し、3.77gの2-ケトスベリン酸および1.72gの2-ケトピメリン酸を調製した。2つのそれぞれの生成物の化学構造を1Hおよび13C-NMRによって決定した。
2014525741.tif 000022
【０３８２】
3.1.9  α-ケトデカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.-）によるα-ケトスベリン酸のピメリン酸セミアルデヒドへの変換
補酵素B [（7-メルカプトヘプタノイル）スレオニンリン酸]の合成のための経路は、古細菌における他の代謝経路の分析ならびに2Hおよび13C標識前駆体の最終生成物への組込みの質量分析に基づき、White [White RH（1989）Biosynthesis of the 7-mercaptoheptanoic acid subunit of component B [（7-mercaptoheptanoyl）threonine phosphate] of methanogenic bacteria,Biochemistry,28:860-865]によって主張された。この経路は、 仮定上の2-ケト酸デカルボキシラーゼによって媒介される2-ケトスベリン酸の7-オキソヘプタン酸（ピメリン酸セミアルデヒド）への非酸化的脱カルボキシル化段階を含む。次の段階では、7-メルカプトヘプタン酸が形成される。この生成物だけが形成される（C5およびC6等価物は形成されない）ので、これは、経路の上流の酵素の少なくとも1つがC8基質だけを受け入れ、C6およびC7基質は受け入れないことを示す。
【０３８３】
経路は、GC-MS を用いた2-ケトグルタレートから2-ケトスベレートへの2-ケトジカルボン酸伸長反応の確認[White RH（1989）A novel biosynthesis of medium chain length alpha-ketodicarboxylic acids in methanogenic archaebacteria.Archivers of Biochemistry and Biophysics,270:691-697]ならびに7-オキソヘプタン酸からの7-メルカプトヘプタン酸および補酵素Bの合成[White RH（1989）Steps in the conversion of a-ketosuberate to 7-mercaptoheptanoic acid in methanogenic bacteria,Biochemistry,28:9417-9423;White RH（1994）Biosynthesis of 7-mercaptoheptanoylthreonine phosphate,Biochemistry,33:7077-7081]によって検証された。経路の段階の一部に関与する酵素をコードする遺伝子（aksA、aksD、aksEおよびaksF）は同定され、大腸菌においてクローン化され、発現されているが、2-ケトスベリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子は同定、クローン化および発現されてされていない[Howell DM,Harich K,Xu H,White RH.（1998）Alpha-keto acid chain elongation reactions involved in the biosynthesis of coenzyme B（7-mercaptoheptanoyl threonine phosphate）in methanogenic Archaea.Biochemistry,37:10108-10117;Howell DM,Graupner M,Xu H,White RH.（2000）Identification of enzymes homologous to isocitrate dehydrogenase that are involved in coenzyme B and leucine biosynthesis in methanoarchaea.J Bacteriol.182:5013-5016;Drevland RM,Jia Y,Palmer DR,Graham DE.（2008）Methanogen homoaconitase catalyzes both hydrolyase reactions in coenzyme B biosynthesis.J Biol Chem.283:28888-28896]。2-ケトスベリン酸の7-オキソヘプタン酸への非酸化的脱カルボキシル化については不明であり、この活性はインビトロでは報告されていない。しかし、2-ケトスベリン酸は全細胞によって補酵素Bに変換された[White RH（1989）]。
【０３８４】
方法
WhiteとGrahamによって行われた研究は、古細菌（Archaebacteria）（メタノカルドコッカス・ジャナスキイのような）が2-ケトスベリン酸の7-オキソヘプタン酸への非酸化的脱カルボキシル化に関与する酵素を有する可能性があることを示した。補酵素B経路に関わる他の酵素は、M.ジャナスキイ[Bult CJ,White O,Olsen GJ,Zhou L,Fleischmann RD,Sutton GG,Blake JA,FitzGerald LM,Clayton RA,Gocayne JD,Kerlavage AR,Dougherty BA,Tomb JF,Adams MD,Reich CI,Overbeek R,Kirkness EF,Weinstock KG,Merrick JM,Glodek A,Scott JL,Geoghagen NS,Venter JC.（1996）Complete genome sequence of the methanogenicarchaeon,Methanococcus jannaschii.Science.273:1058-1073]およびメタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Methanobacterium thermoautotrophicum）ΔH[Smith DR,Doucette-Stamm LA,Deloughery C,Lee H,Dubois J,Aldredge T,Bashirzadeh R,Blakely D,Cook R,Gilbert K,Harrison D,Hoang L,Keagle P,Lumm W,Pothier B,Qiu D,Spadafora R,Vicaire R,Wang Y,Wierzbowski J,Gibson R,Jiwani N,Caruso A,Bush D,Reeve JN,（1997）Complete genome sequence of Methanobacterium thermoautotrophicum deltaH:functional analysis and comparative genomics.J Bacteriol.179:7135-7155] のゲノムの分析によって同定された。ゲノムを標的遺伝子クラスターの存在に関して分析し、既存の酵素に相同性を示すタンパク質についてBLAST検索した。我々は、2-ケトスベリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を同定するために同様のアプローチをとった。
【０３８５】
結果
遺伝子クラスターの分析
細菌ゲノムは、特定の経路において役割を果たす酵素をコードする遺伝子がオペロンおよび/または遺伝子クラスターに局在する、高レベルの組織化を示し得る。補酵素B経路の他の酵素が同定されており、一部の古細菌ゲノムの配列が公表されているので、2-ケトスベリン酸デカルボキシラーゼを同定することを試みた。以下の表はこの経路に関わる遺伝子および酵素を示す。
2014525741.tif 000023
M.ジャナスキイおよびM.サーモオートトロフィカム由来の補酵素B生合成遺伝子は、M.サーモオートトロフィカムにおける（R）-ホモクエン酸シンターゼ（MTH1630）およびホモクエン酸シンターゼ/デヒドラターゼラージサブユニット（MTH1631）をコードする遺伝子を除き、遺伝子クラスターに存在するとは思われなかった。上記に列挙した遺伝子のいずれかを含む仮説上のオペロンの分析は、公知のデカルボキシラーゼに相同性を有するいかなるタンパク質の存在も示さなかった。それゆえ、M.ジャナスキイにおける関連代謝経路中の類似の脱カルボキシル化に関して検索を行った。
【０３８６】
メタノカルドコッカス・ジャナスキイゲノムの分析
M.ジャナスキイにおける他の代謝経路の分析は、類似の脱カルボキシル化が補酵素M経路に存在することを示した[Graupner M,Xu H and White RH.（2000）Identification of the gene encoding sulfopyruvate decarboxylase,an enzyme involved in biosynthesis of coenzyme M.J Bacteriol.182:4862-4867]。
2014525741.tif 000024
3-スルホピルベートのスルホアセトアルデヒドへの非酸化的脱カルボキシル化は、2つのサブユニット、comD（SEQ ID 19）およびcomE（SEQ ID 20）を含むスルホピルビン酸デカルボキシラーゼ（EC.4.1.1.79）によって触媒される。補酵素Bおよび補酵素Mはどちらもメタン生成に関与し、脱カルボキシル化の下流の反応が類似するので、デカルボキシラーゼが共に進化して、互いに高い相同性を示す可能性がある。
【０３８７】
BRENDAデータベースにおいて見出されるcomD、comEおよびそれらのオルソログを、メタノカルドコッカス・ジャナスキイのBLAST検索のクエリとして使用した。メタノセラ属メタン生成古細菌（Methanocella paludicola）由来のcomD/comEデカルボキシラーゼ（SEQ ID 21）を使用して最良の適合を得た。
【０３８８】
M.ジャナスキイゲノムによってコードされる2つのオープンリーディングフレーム（MJ0277および MJ0663）だけが、E値＜0.0001で comD/comEに有意の相同性を示した。これらはどちらもアセト乳酸シンターゼと注釈された（SEQ ID 22およびSEQ ID 23）。
【０３８９】
BRENDAデータベースに寄託されている、類似の基質を受け入れるデカルボキシラーゼ（2-ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ、α-ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ、アミノ基転移アミノ酸デカルボキシラーゼ、ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ、2-ケトアルギニンデカルボキシラーゼ、ホスホノピルビン酸デカルボキシラーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼおよびインドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ）の配列を使用して別の検索を実施した。
2014525741.tif 000025
2014525741.tif 000026
【０３９０】
MJ0277（受託番号NP_247250）およびMJ0663（NP_247647）は、ゲノムを検索するのに使用したクエリのほとんどすべてについて良好なヒットであった。ClustalWアルゴリズムを用いたタンパク質アラインメントは、MJ0277とcomD/comEタンパク質の間で有意の相同性を示した（図20）。しかし、MJ0277はラクトコッカス・ラクティス由来のLACLAアセト乳酸シンターゼに対してさらにいっそう高い相同性を示した（図21）。
【０３９１】
LACLAアセト乳酸シンターゼ、メタノセラ属メタン生成古細菌由来のcomD/comEおよび仮説上のアセト乳酸シンターゼMJ0277 における機能性ドメインの分析は、これらのすべてがリン酸チアミン結合部位を含む類似の構造を有することを示した（図22）。メタノカルドコッカス・ジャナスキイ由来の第2のオープンリーディングフレームMJ0663についてもほとんど同じ結果を得た。
【０３９２】
アセト乳酸シンターゼ（ALS）酵素（アセトヒドロキシ酸シンターゼとしても知られる）は、ピルベートのα-アセトラクテートへの変換を触媒する。
2014525741.tif 000027
【０３９３】
反応の第一段階は、ピルベート（2-ケト酸である）の酵素結合中間体への脱カルボキシル化であり、前記中間体はさらに第2のピルベート分子と縮合してアセトラクテートを生じる。したがって、2-ケト酸デカルボキシラーゼおよびアセト乳酸シンターゼは互いに高い相同性を示す可能性がある。
【０３９４】
結論
M.ジャナスキイゲノムの分析は、アセト乳酸シンターゼと注釈される2つのタンパク質（MJ0277およびMJ0663）の存在を示し、これらは、補酵素B生合成に関与するこれまで同定されていなかった2-ケトスベリン酸非酸化的デカルボキシラーゼである可能性がある。これらの１つが実際のアセト乳酸シンターゼである可能性は非常に高い。この酵素活性は多くの古細菌で示されており、M.ジャナスキイはアセト乳酸シンターゼ調節サブユニット、MJ0161をコードする。しかし、前記酵素の1つは未同定の2-ケト酸デカルボキシラーゼであり得、単に誤って注釈されたのかもしれない。あるいは、2-ケトスベリン酸は、補酵素M経路において3-スルホピルベートの脱カルボキシル化に関与する酵素によって脱カルボキシル化される可能性がある。それゆえ、comD/comEデカルボキシラーゼも標的酵素とみなすべきである。
【０３９５】
アセト乳酸シンターゼと注釈されたタンパク質MJ0277（NP_247250）およびMJ0663（NP_247647）を、2-ケトアジピン酸、2-ケトピメリン酸および2-ケトスベリン酸の非酸化的脱カルボキシル化についての最有力候補物として同定した。加えて、3-スルホピルビン酸デカルボキシラーゼcomD/comE（P58415/P58416）、Kgd（Q9CC97）、citM（Q7X4Z5）、kivd（Q684J7）、ARO10（Q06408）、MdlC（Q97XR3）、aruI（B7V368）、fom2（Q6D9X5）、PDC6（P26263）およびIpdC（F2EPZ5）は、2-ケトスベリン酸のピメリン酸セミアルデヒドへの変換についての優れた候補物である（SEQ ID 24〜40）。
【０３９６】
3.1.10  α-ケト酸の鎖伸長によるα-ケトピメリン酸のα-ケトスベリン酸への変換（図10参照）
3.1.10.1  酵素遺伝子標的の選択
α-ケトピメリン酸のα-ケトスベリン酸への変換は、以前にメタン生成古細菌、例えばメタノカルドコッカス・ジャナスキイ、メタノコッカス・バンニエリ（Methanocaldococcus vannielii）、メタノカルドコッカス・マリパルディス（Methanocaldococcus maripaludis）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム、メタノサルシナ・サーモフィラ等における補酵素Bの生合成の一部であると報告された（White,Arch.Biochem.Biophys.270:691-697（1989））。ロイシンおよびリジン生合成に関与する酵素に相同な、α-ケトグルタル酸からスベリン酸への複数回の鎖伸長に関与する酵素をコードする遺伝子がメタノカルドコッカス・ジャナスキイから同定され、それらの対応するタンパク質が特性づけられた（α-keto acid chain elongation reactions involved in the biosynthesis of coenzyme B（7-mercaptoheptanoyl threonine phosphate）in Howell et al.,Biochemistry 37:10108-10117（1998）;Drevland et al.,J.Bacteriol.189:4391-4400（2007）;Howell et al.,J.Bacteriol.182:5013-5016（2000）;Drevland et al.,J.Biol.Chem.283:28888-28896（2008）;and Jeyakanthan et al.,Biochemistry 49:2687-2696（2010））。
【０３９７】
オルソロガス遺伝子もメタノバクテリウム・サーモオートトロフィカムから同定されたが、それらの生成物はまだ特性づけられていない。少なくとも2つの同質遺伝子が、以前にメタノカルドコッカス・ジャナスキイにおいて報告されたように、必要とされる活性（AskA、AksD/EおよびAksF）の各々についてこの古細菌で報告された（Smith et al.1997,179,7135-7155）。以下の表は、先に言及した文献およびそれらの可能性のある推定上の機能に基づき、十分に特性づけられたメタノカルドコッカス・ジャナスキイタンパク質と共に対応するメタノバクテリウム・サーモオートトロフィカムタンパク質のオルソロジーを提示する。
2014525741.tif 000028
2014525741.tif 000029
【０３９８】
メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカムにおける鎖伸長タンパク質のオルソログの同定は、メタノカルドコッカス・ジャナスキイとメタノバクテリウム・サーモオートトロフィカムゲノムの間の比較ゲノミクスデータ、対応するタンパク質の配列分析および活性アッセイから文献で報告された。選択的なメタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム遺伝子産物およびそれらの対応するメタノカルドコッカス・ジャナスキイオルソログの、α-ケトピメリン酸の合成のための潜在的な適用が報告された（国際公開公報第2010-104391 A2号）。それゆえ、8つのメタノバクテリウム・サーモオートトロフィカムタンパク質、すなわちAksA 2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼ/ホモクエン酸シンターゼMTH1630およびMTH1481、フラグメント1337346-1338863;AksD 3-イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ/ホモアコニターゼ（ラージサブユニット）MTH1386フラグメント1253910-1255169;およびMTH1631フラグメント1495715-1497001;AksE 3-イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼまたはイソメラーゼ/ホモアコニターゼ（スモールサブユニット）MTH 0829フラグメント 752586-753098;およびMTH1387フラグメント1255181-1255669;ならびにAksF 3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ/ホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼMTH0184フラグメント130396-131391;およびMTH 1388フラグメント1255666-1256655を、ピメリン酸とスベリン酸の間の鎖伸長反応の例示のために選択した。
【０３９９】
野生型遺伝子を、開始コドンGTGまたはTTGがATGに変化した遺伝子AksA（1）-MTH1630、AksD（2）-MTH1631およびAksF（2）-MTH1388を除き、対応する大腸菌発現ベクターの構築のために選択した。
【０４００】
3.1.10.2  遺伝子標的を含む発現ベクターのクローニング
次に、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム由来の選択した遺伝子標的を、3.1.1.2章で詳述したように、inABLE技術を用いてIPTG誘導性pET21-aバックボーンにクローニングし、I9（pET21-a 中のM.サーモオートトロフィカムAksA（1）-MTH1630遺伝子）、I10（pET21-a中の M.サーモオートトロフィカム AksA（2）-MTH1481遺伝子）、I11（pET21-a中の M.サーモオートトロフィカムAksD（1）-MTH1386遺伝子）、I12（pET21-a 中のM.サーモオートトロフィカムAksD（2）-MTH1631遺伝子）、I13（pET21-a 中のM.サーモオートトロフィカムAksE（l）-MTH0829遺伝子）、I14（pET21-a中のM.サーモオートトロフィカムAksE（2）-MTH1387遺伝子）、I15（pET21-a中のM.サーモオートトロフィカムAksF（1）-MTH0184遺伝子）、およびI16（pET21-a中のM.サーモオートトロフィカムAksF（2）-MTH1388遺伝子）を作製した。
【０４０１】
簡単に述べると、選択した遺伝子およびベクターバックボーン中の潜在的なEarI部位を、EarI消化/連結サイクルを含むパート/リンカー融合物調製への干渉を防ぐために分断した。AksD（1）-MTH1386、AksD（2）-MTH1631およびAksE（2）-MTH1387ではEarI部位を認めなかった。AksA（1）-MTH1630、AksA（2）-MTH1481、AksE（1）-MTH0829およびAksF（2）-MTH1388遺伝子の各々において1つのEarI部位を認め、AksF（1）-MTH0184遺伝子では2つのEarI部位を認め、ベクターバックボーンpET21-aでは3つのEarI部位を検出した。制限部位にサイレント突然変異を導入することによってEarI部位を分断した。制限部位の最後のグアニジン塩基をチミンに突然変異させることによってベクター中の3つのEarI部位を分断した。
【０４０２】
次に、EarIを含まない配列をパート設計ソフトウェアにおける入力配列として使用し、3.1.1.2章で論じたように、EarI部位によって隣接された対応するトランケートパートを設計した。合成したメタノバクテリウム・サーモオートトロフィカムAksA（1）-MTH1630（TP48）、AksA（2）-MTH1481（TP49）、AksD（1）-MTH1386（TP50）、AksD（2）-MTH1631（TP51）、AksE（1）-MTH0829（TP52）、AksE（2）-MTH1387（TP53）、AksF（1）-MTH0184（TP54）およびAksF（2）-MTH1388（TP55）トランケートパートをDNA2.0 pJ201ベクターに挿入した。クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むフラグメントを導入してpET21-aトランケートパートベクターを完全合成し、ベクターTP31を作製した。
【０４０３】
inABLEオリゴヌクレオチドのリン酸化およびその後のアニーリングを、3.1.1.2章で述べたように実施した。簡単に述べると、オリゴをT4キナーゼと共に37℃で30分間インキュベートし、次いで酵素を65℃で20分間不活性化した。
【０４０４】
次に、パートリンカー融合物を、先に3.1.1.2章で述べたように、トランケートパートの5'末端をその対応するパートオリゴのアニールしたフラグメントと連結し、トランケートパートの3'末端をリンカーオリゴのアニールしたフラグメントと連結することによって調製した。選択した遺伝子（メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカムAksA（1）-MTH1630、AksA（2）-MTH1481、AksD（1）-MTH1386、AksD（2）-MTH1631、AksE（1）-MTH0829、AksE（2）-MTH1387、AksF（1）-MTH0184および AksF（2）-MTH1388）に対応するパートリンカー融合物を、それらのそれぞれのアニールしたパートオリゴ（POA48、POA49、POA50、POA51、POA52、POA53、POA54またはPOA55）、それらのトランケートパート（TP48、TP49、TP50、TP51、TP52、TP53、TP54またはTP55）ならびにベクターバックボーンからのアニールしたリンカーオリゴの連結によって調製した。ベクターバックボーンに対応するパートリンカー融合物を、そのアニールしたパートオリゴ、そのトランケートパート、およびどちらかの遺伝子からのアニールしたリンカーオリゴの連結によって調製した。陰性対照遺伝子を含まない集合体も、ベクターバックボーンのアニールしたパートオリゴ、そのトランケートパート、およびそのアニールしたリンカーオリゴの連結によって調製し、ベクターバックボーンの自己集合体を生じさせた。
【０４０５】
トランケートパートに対して10倍および20倍モル過剰のリンカーおよびパートオリゴを、各々のEarI消化/連結サイクルの間のトランケートパートとオリゴヌクレオチドの間の連結を促進するために遺伝子およびベクター反応において使用した。50μLのEarI消化/連結反応物をサーモサイクラー（Eppendorf Mastercycler Gradient）でインキュベートし、温度を37℃と16℃の間で交互に変化させた。サイクルの完了後、試料を0.7％アガロースゲルに負荷し、パート/リンカー融合物の調製に関して予想されたサイズのフラグメントを認めた。次に正しいサイズのバンドをゲルから切り出し、QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kitを使用してDNAをゲル抽出した。DNA濃度は、30μlの総容量で13.6ng/μlから24.8μg/μlの範囲であった（DNA濃度範囲4.9nM〜53.9nM）。陰性対照遺伝子不含構築物の作製のためにパート/リンカー融合物（pET21-aパート/pET21-aリンカー）の自己集合も実施した。
【０４０６】
遺伝子パート/リンカー融合物とそれらのそれぞれのベクターパート/リンカー融合物との組合せを、次に、3.1.1.2章で述べたように2パート集合体を介して実施した。簡単に述べると、遺伝子パートリンカーとベクターパートリンカーを室温で30分間インキュベートした後、2μlの集合体反応物および10μlのコンピテント細胞を使用して高効率の化学的コンピテントNEB10β大腸菌細胞の形質転換を実施した。形質転換した細胞をLB-Amp-寒天に塗布し、37℃で一晩インキュベートした。各集合体について約1000クローンを得た。2つのランダムなクローンを各集合体から選択し、QIAGEN QIAprep Miniprep Kitを使用して対応するベクターを単離した。
【０４０７】
3.1.1.2章で述べたように、ベクターの構築を確認するために制限を実施した。簡単に述べると、I9から得たクローンをBglIIおよびXmnIを用いて分析して、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカムAksA（1）-MTH1630遺伝子のpET21-aへの挿入に関して陽性のクローンを同定し、I10集合体から得たクローンをPstIおよびXmaI/XbaIを用いて分析して、AksA（2）-MTH1481遺伝子のpET21-aへの挿入を同定し、I11集合体から得たクローンをHincIIおよびAlwNIを用いて分析して、AksD（1）-MTH1386遺伝子の挿入を同定し、I12集合体から得たクローンをNcoIおよびBglII を用いて分析して、AksD（2）-MTH1631の挿入を同定し、I13集合体から得たクローンをMluIおよびXmnI を用いて分析して、AksE（1）-MTH0829のpET21-aへの挿入を同定し、I14集合体から得たクローンをPsiIおよびXmaI/AlwNIを用いて分析して、AksE（2）-MTH1387遺伝子の大腸菌発現ベクターへの挿入を同定し、I15集合体から得たクローンをAlwNIおよびHincIIを用いて分析して、AksF（1）-MTH0184遺伝子の大腸菌発現ベクターへの挿入を同定し、I16集合体から得たクローンをBsaIおよびHindIII/AlwNIを用いて分析して、AksF（2）-MTH1388の挿入を同定した。制限産物をアガロースゲルで泳動させて、各集合体から試験したクローンに関して予想されたバンドパターンを認め、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム鎖伸長遺伝子を保有する大腸菌pET21-a発現ベクターの構築を確認した。加えて、ベクターバックボーンの3'末端と遺伝子の5'末端の間ならびに遺伝子の3'末端とベクターバックボーンの5'末端の間のパート接合部を配列決定し、構築を確認した。
【０４０８】
3.1.10.3  大腸菌における外因性チオエステラーゼ遺伝子の発現
大腸菌における外因性メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカムAksA（1）-MTH1630、AksA（2）-MTH1481、AksD（1）-MTH1386、AksD（2）-MTH1631、AksE（1）-MTH0829、AksE（2）-MTH1387、AksF（1）-MTH0184およびAksF（1）-MTH0184鎖伸長遺伝子の発現を3.1.1.3章で述べたように実施した。簡単に述べると、エレクトロコンピテントBL21（DE3）細胞を10ng DNAで形質転換し、形質転換試料をLB-Amp-寒天に塗布した。37℃で一晩インキュベートした後、形質転換体を得た。単一クローンを各集合体から採取し、5mlのLB-Amp培地に出発培養物として接種した。37℃および250rpmで一晩インキュベートした後、培養物のOD600を測定し、2mLの培養物（約8×107）を使用して100mLのLB-Ampに接種し、これを500mLのバッフル付き振とうフラスコにおいて37℃および250rpmでインキュベートした。
【０４０９】
1mM IPTG（最終濃度）の添加によってタンパク質発現を誘導し、培養物を37℃および250rpmでインキュベートした。1mLの試料を誘導の前、誘導後4時間および24時間のインキュベーション後に採取し、OD600を測定して細胞増殖を判定した。誘導後24時間のインキュベーション後、残存培養物を50mLファルコンチューブに移し、5000rpmで10分間の遠心分離によって採取して、細胞ペレットをさらなる分析のために使用するかまたは-20℃で保存した。
【０４１０】
SDS-PAGE分析のために、試料を13000rpmで2分間遠心分離し、上清を取り出して、リゾチーム（15 mg/mL）およびベンゾナーゼ（3.4U/μL）を添加したBugbusterタンパク質抽出試薬を用いて細胞を溶解した。次に溶解反応物を13000rpmで2分間遠心分離し、可溶性画分を新しいチューブに移して、不溶性画分を水に再懸濁した。20μlの各画分を80μlのSDS試料緩衝液（SDS負荷緩衝液、9％DTTおよび水）と混合し、ヒートブロックにおいて95℃で5分間加熱して、次に10μlの各SDS試料調製物をSDS-PAGE 4〜20％トリシンゲルに負荷し、可溶性および不溶性画分のタンパク質含量を分析した。
【０４１１】
AksE（2）-MTH1387タンパク質だけが可溶性形態で、すなわちIPTG誘導後に可溶性画分において18kDバンドとして成功裏に発現された。AksA（1）-MTH1630、AksD（2）-MTH1631、AksF（1）-MTH0184およびAksF（2）-MTH1388タンパク質は不溶性形態で発現され、すなわち、それぞれ44、36および46kDバンドが不溶性部分で検出された。AksA（2）-MTH1481、AksD（1）-MTH1386およびAksE（2）-MTH1387タンパク質については発現が検出されなかった。それゆえ、文献におけるメタノカルドコッカス・ジャナスキイオルソログの発現成功の報告に基づき、AksA（1）-MTH1630、AksD（2）-MTH1631、AksF（1）-MTH0184、AksF（2）-MTH1388、AksA（2）-MTH1481、AksD（1）-MTH1386およびAksE（2）-MTH1387について発現最適化を実施した。特に、M.ジャナスキイオルソログの発現に関する文献データは、特に誘導物質濃度および誘導温度に関して種々の条件のセットを明らかにした。IPTG 濃度は0.1から1mMの間で異なり（初期条件1mM）、誘導の温度は16 ℃と37℃の間で異なった（初期条件37℃）。3.1.1.3章で述べたのと同じ発現プロトコルおよびSDS-PAGE試料調製物を溶解度最適化実験のために使用した。
【０４１２】
AksA（1）-MTH1630タンパク質発現のレベルは、IPTG濃度を10倍低下させた後改善されたが、タンパク質は不溶性のままであった;温度の最適化は発現または溶解度に影響を及ぼさなかった。AksD（2）-MTH1631およびAksF（2）-MTH1388については、両タンパク質は誘導後に不溶性画分においてのみ可視であったので、IPTG濃度を10倍低下させることによる溶解度の有意の改善は認められなかった。AksD（2）-MTH1631およびAksF（2）-MTH1388については、両タンパク質は誘導後に不溶性画分においてのみ可視であったので、誘導温度を16℃に低下させることによる溶解度の有意の改善は認められなかった。しかし、AksF（1）-MTH0184の溶解度は、誘導温度を30℃に低下させることによって改善された。それゆえ、AksA（1）-MTH1630（I9）、AksD（2）-MTH1631（I12）およびAksF（2）-MTH1388（I16）は種々の宿主において、例えばサッカロミセス・セレビシエのような真核生物系またはバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）のような好熱菌において発現され得る。
【０４１３】
メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカムAksA（1）-MTH1630、AksA（2）-MTH1481、AksD（2）-MTH1631およびAksE（1）-MTH0829遺伝子産物は、pET21-a/IPTG発現系を使用して大腸菌において可溶性形態では発現されなかったので、サッカロミセス・セレビシエ発現系を使用してこれらの遺伝子を発現のためにクローン化した。構成的プロモーターADH1p、転写ターミネーターCYC1t、およびYEplac195プラスミドに由来する高コピー数ベクターバックボーンを含む、酵母ベクターバックボーンのパート/リンカー融合物の調製においてEarIの代わりにSapI制限酵素を使用したことを除き、上述したinABLE技術を用いて発現ベクターを構築した。各々のパート/リンカー集合体を用いてTOP10エレクトロコンピテント大腸菌細胞を形質転換し、QIAGEN Hi-Speed Plasmid Purification Midi Kit（120μl中67.4〜173.0nM）を用いて大きなDNAストックを調製した。アガロースゲル電気泳動後、SapIの使用にもかかわらず、酵母ベクターパート/ADH1プロモーターリンカーの調製物について予想されたサイズのフラグメントを認めた。次に正しいバンドをゲルから切り出し、QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit（30μl中14.1〜138.1nM）を用いてDNAをゲル抽出した。
【０４１４】
次に、4パート集合体反応物、すなわちADH1プロモーター、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム遺伝子AksA（1）-MTH1630、AksA（2）-MTH1481、AksD（2）-MTH1631およびAksE（1）-MTH0829の各々、CYC1ターミネーターおよび酵母ベクターバックボーンを37℃でインキュベートして最終構築物を調製した。次に、10μlの高効率の化学的にコンピテントなNEB10β大腸菌細胞を2μlの集合体反応物で形質転換し、LB-Kan-寒天に塗布して、37℃で一晩インキュベートした。4パート集合体について200〜250クローンを得た。次に5つのランダムなクローンをプレートから採取し、QIAGEN QIAprep Miniprep Kitを用いて対応するベクターを単離した。
【０４１５】
制限分析を用いて単離した構築物を分析した。PmeI/SapIを使用した予備分析を実施し、トランケートベクター夾雑物を同定した。クローンはトランケートベクター夾雑物を含まず、そこで4つのパート/リンカー融合物の挿入を確認するために制限酵素XhoI/NdeI、BsaIおよびMluIを使用してそれらを分析した。両方のクローンについて予想されたバンドパターンを認め、ADH1プロモーター、関心対象の遺伝子、CYC1ターミネーターおよび酵母ベクターバックボーンを保有するS.セレビシエ発現ベクターの構築を確認した。最後に、4パートの間の接合部を配列決定し、正しい構築を確認した。
【０４１６】
S.セレビシエI24〜I27発現ベクターでの形質転換を本明細書で述べたように実施することができ、SDS-PAGEを用いた細胞溶解後に構成的プロモーターADH1pからの発現を観測することができる。I24構築物は、酵母ベクターバックボーンに挿入されたADH1プロモーター、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカムAksA（1）-MTH1630遺伝子およびCYC1ターミネーターを含む。I25構築物は、ADH1プロモーター、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカムAksA（2）-MTH1481遺伝子および CYC1ターミネーターを含む。I26構築物は、ADH1プロモーター、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカムAksD（2）-MTH1631遺伝子およびCYC1ターミネーターを含む。I27構築物は、ADH1プロモーター、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカムAksE（1）-MTH0829遺伝子およびCYC1ターミネーターを含む。
【０４１７】
本出願全体を通して引用される特許、特許出願、公表文献、製品説明およびプロトコルは、すべての目的に関してそれらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
2014525741.tif 000031
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２５−４】
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【図２５−５】
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【図２５−６】
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【図２５−７】
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【図２５−８】
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【図２５−９】
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【図２５−１０】
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【図２５−１１】
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【図２５−１２】
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【図２５−１３】
2014525741.tif 000068
【図２５−１４】
2014525741.tif 000069
【図２５−１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年5月19日(2014.5.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピメロイル-CoA（PCoA）またはピメロイル［acp］（PACP）を、PCoAまたはPACPのピメリン酸（PA）へのチオエステル加水分解を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここでPAが生成される、化合物を変換する方法。
【請求項２】
酵素が、チオエステラーゼ、酸-チオールリガーゼ、またはCoAトランスフェラーゼである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
チオエステラーゼが、
EC 3.1.2におけるチオエステラーゼ、
EC 3.1.2.18、EC 3.1.2.19、またはEC 3.1.2.20におけるチオエステラーゼ、
yciAの遺伝子産物、
EC 3.1.2.14におけるチオエステラーゼ、および
fatAまたはfatBの遺伝子産物
のうちの1つまたは複数であり、
酸-チオールリガーゼが、
EC 6.2.1における酸-チオールリガーゼ、および
EC 6.2.1.3、EC 6.2.1.14、またはEC 6.2.1.23における酸-チオールリガーゼ
のうちの1つまたは複数であり、かつ、
CoAトランスフェラーゼが、
EC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼ、および
EC 2.8.3.12またはEC 2.8.3.13におけるCoAトランスフェラーゼ
のうちの1つまたは複数である、
請求項2記載の方法。
【請求項４】
PCoAまたはPACPが、
（a）図10に示される経路；
（b）ビオチン生合成経路I（図6参照）；
（c）ビオチン生合成経路II（図5参照）；
（d）ベンゾエートもしくはシクロヘキサンカルボキシレート分解経路（図7参照）；
（e）シクロヘキサンカルボキシレート経路（図9参照）；または
（f）3つのマロニル-CoA分子の縮合（図4参照）
の一つまたは複数の工程を含む過程によって生成され、
ここでPCoAまたはPACPが生成される、
請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
PAを、PAのピメリン酸セミアルデヒド（PAS）へのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素が、
カルボン酸レダクターゼ、
EC 1.2.99におけるカルボン酸レダクターゼ、および
EC 1.2.99.6におけるカルボン酸レダクターゼ
のうちの1つまたは複数である、
請求項5記載の方法。
【請求項７】
PCoAまたはPACPを、PCoAまたはPACPのPASへの還元を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここでPASが生成される、化合物を変換する方法。
【請求項８】
PCoAまたはPACPのPASへの還元を触媒する酵素が、
脂肪アシルCoAレダクターゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼ、
EC 1.2.1における脂肪アシルCoAレダクターゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼ、
EC 1.2.1.4、EC 1.2.1.50、EC 1.2.1.63、またはEC 1.2.1.80における脂肪アシルCoAレダクターゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼ
のうちの1つまたは複数である、
請求項7記載の方法。
【請求項９】
PCoAまたはPACPが、
（a）図10に示される経路；
（b）ビオチン生合成経路I（図6参照）；
（c）ビオチン生合成経路II（図5参照）；
（d）ベンゾエートもしくはシクロヘキサンカルボキシレート分解経路（図7参照）；
（e）シクロヘキサンカルボキシレート経路（図9参照）；または
（f）3つのマロニル-CoA分子の縮合（図4参照）、
の一つまたは複数の工程を含む過程によって生成され、
ここでPCoAまたはPACPが生成される、
請求項7または8記載の方法。
【請求項１０】
α-ケトスベレート（AKS）を、AKSのPASへのα-ケト脱カルボキシル化を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここでPASが生成される、化合物を変換する方法。
【請求項１１】
AKSのPASへのα-ケト脱カルボキシル化を触媒する酵素が、
α-ケトデカルボキシラーゼまたはアセト乳酸シンターゼ、および
EC 4.1.1.-における酵素
のうちの1つまたは複数である、
請求項10記載の方法。
【請求項１２】
AKSが、
（a）図10に示される経路；または
（b）メタン生成古細菌の補酵素B経路（図3参照）
の一つまたは複数の工程を含む過程によって生成される、
請求項10または11記載の方法。
【請求項１３】
AKSを、α-アミノスベレート（AAS）を生成するためのAKSへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここでAASが生成される、化合物を変換する方法。
【請求項１４】
α-アミノスベレート（AAS）を生成するためのAKSへのアミノ基の転移を触媒する酵素が、
アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、
EC 2.6.1におけるアミノトランスフェラーゼ、または
EC 2.6.1.39、EC 2.6.1.42、もしくはEC 2.6.1.67におけるアミノ酸アミノトランスフェラーゼ
のうちの1つまたは複数である、
請求項13記載の方法。
【請求項１５】
AKSが、
（a）図10に示される経路；または
（b）メタン生成古細菌の補酵素B経路（図3参照）
の一つまたは複数の工程を含む過程によって生成される、
請求項13または14記載の方法。
【請求項１６】
AASを、AASの7-アミノヘプタン酸（7 AHA）へのα-アミノ酸脱カルボキシル化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、請求項13〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
AASの7-アミノヘプタン酸（7 AHA）へのα-アミノ酸脱カルボキシル化を触媒する酵素が、
α-ケトデカルボキシラーゼもしくはアセト乳酸シンターゼ、または
EC 4.1.1.-における酵素
のうちの1つまたは複数である、
請求項16記載の方法。
【請求項１８】
7 AHAを、7 AHAのエナントラクタム（ENTL）へのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、請求項16または17記載の方法。
【請求項１９】
7 AHAを、7 AHAの7-アミノヘプタナール（7 AHT）へのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、請求項16または17記載の方法。
【請求項２０】
7 AHTを、1,7-ジアミノヘプタン（1,7 DAH）を生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
PASを、PASの7-アミノヘプタン酸（7 AHA）へのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここで7 AHAが生成される、化合物を変換する方法。
【請求項２２】
7 AHAを、7 AHAのエナントラクタム（ENTL）へのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
7 AHAを、7 AHAの7-アミノヘプタナール（7 AHT）へのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階であって、ここで7 AHTが生成される、段階、および
7 AHTを、1,7-ジアミノヘプタン（1,7 DAH）を生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階であって、ここで1,7 DAHが生成される、段階
をさらに含む、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
（1）（a）ピメロイル-CoA（PCoA）もしくはピメロイル［acp］（PACP）を、PCoAもしくはPACPのピメリン酸（PA）へのチオエステル加水分解を触媒する酵素と接触させる工程であって、ここでPAが生成される、工程；および（b）PAを、PAのピメリン酸セミアルデヒド（PAS）へのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる工程；
（2）PCoAもしくはPACPを、PCoAもしくはPACPのPASへの還元を触媒する酵素と接触させる工程；
（3）α-ケトスベレート（AKS）を、AKSのPASへのα-ケト脱カルボキシル化を触媒する酵素と接触させる工程；または
（4）テトラリン分解経路（図8参照）の一つもしくは複数の工程
を含む過程によってPASが生成される、
請求項21〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
7 AHTを、1,7-ジアミノヘプタン（1,7 DAH）を生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここで1,7 DAHが生成される、化合物を変換する方法。
【請求項２６】
1,7-ジアミノヘプタン（1,7 DAH）を生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素が、
アミノ酸アミノトランスフェラーゼまたはω-トランスアミナーゼ、
EC 2.6.1におけるアミノ酸アミノトランスフェラーゼまたはEC 2.6.1におけるω-トランスアミナーゼ、
EC 2.6.1.39、EC 2.6.1.42、またはEC 2.6.1.67におけるアミノ酸アミノトランスフェラーゼ、および
EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、またはEC 2.6.1.39におけるω-トランスアミナーゼ
のうちの1つまたは複数である、
請求項25記載の方法。
【請求項２７】
7 AHTが、図10に示される経路の一つまたは複数の工程によって生成される7 AHAのアルデヒド脱水素化によって生成される、請求項25または26記載の方法。
【請求項２８】
前記酵素、あるいは1つまたは複数の酵素が、（i）単離されている、（ii）細胞溶解物もしくは部分精製された細胞溶解物中に存在する、または（iii）該酵素を組換え発現する宿主細胞中に存在する、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
前記酵素、あるいは1つまたは複数の酵素が、（i）単離されている、（ii）細胞溶解物、部分精製された細胞溶解物、複数の細胞溶解物、もしくは部分精製された複数の細胞溶解物中に存在する、または（iii）該酵素を組換え発現する1つまたは複数の宿主細胞株中に存在する、請求項7〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
前記酵素、あるいは1つまたは複数の酵素が、（i）単離されている、（ii）細胞溶解物もしくは部分精製された細胞溶解物中に存在する、または（iii）該酵素を組換え発現する宿主細胞中に存在する、請求項10〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
前記酵素、あるいは1つまたは複数の酵素が、（i）単離されている、（ii）細胞溶解物もしくは部分精製された細胞溶解物中に存在する、または（iii）該酵素を組換え発現する宿主細胞中に存在する、請求項13〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
前記酵素、あるいは1つまたは複数の酵素が、（i）単離されている、（ii）細胞溶解物もしくは部分精製された細胞溶解物中に存在する、または（iii）該酵素を組換え発現する宿主細胞中に存在する、請求項21〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
前記酵素、あるいは1つまたは複数の酵素が、（i）単離されている、（ii）細胞溶解物もしくは部分精製された細胞溶解物中に存在する、または（iii）該酵素を組換え発現する宿主細胞中に存在する、請求項25〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
（a）（i）チオエステラーゼ、酸チオールリガーゼ、もしくはCoAトランスフェラーゼ；および(ii)カルボン酸レダクターゼ；
(b)(i)脂肪アシルCoAレダクターゼもしくはアルデヒドデヒドロゲナーゼ；および(ii)産物がPCoAもしくはPACPである反応を触媒する酵素；
(c)(i)ケト酸デカルボキシラーゼもしくはアセト乳酸シンターゼ：および(ii)産物がAKSである反応を触媒する酵素；
(d)(i)アミノトランスフェラーゼ；および(ii)デカルボキシラーゼもしくはアセト乳酸シンターゼ；または
(e)(i)アミノトランスフェラーゼもしくはω-トランスアミナーゼ；および(ii)産物が7 AHTである反応を触媒する酵素
をコードする１つまたは複数の外因性核酸を含む、単離された細胞。
【請求項３５】
原核細胞または真核細胞である、請求項34記載の細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
[本発明1001]
2,6ジアミノピメレート（2,6 DAP）およびα-アミノピメレート（AAP）から選択される化合物を、2,6 DAPの6-アミノ-2-ヘプテン二酸（6A2HA）への還元的脱アミノ化またはAAPの2-ヘプテン二酸（2 HDA）への還元的脱アミノ化を触媒する酵素と接触させる段階を含む、化合物を変換する方法であって、ここで6A2HAまたは2 HDAが生成される、方法。
[本発明1002]
化合物が2,6 DAPである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
6A2HAを、6A2HAのAAPへのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAAPが生成される、本発明1002の方法。
[本発明1004]
AAPを、AAPの2 HDAへの還元的脱アミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで2 HDAが生成される、本発明1003の方法。
[本発明1005]
2 HDAを、2 HDAのピメリン酸（PA）へのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPAが生成される、本発明1004の方法。
[本発明1006]
PAを、PAのピメリン酸セミアルデヒド（PAS）へのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、本発明1005の方法。
[本発明1007]
PASを、PASの7-アミノヘプタン酸（7 AHA）へのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、本発明1006の方法。
[本発明1008]
7 AHAを、7 AHAのエナントラクタム（ENTL）へのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、本発明1007の方法。
[本発明1009]
7 AHAを、7 AHAの7-アミノヘプタナール（7 AHT）へのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAHTが生成される、本発明1007の方法。
[本発明1010]
7 AHTを、1,7-ジアミノヘプタン（1,7 DAH）を生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、本発明1009の方法。
[本発明1011]
2 HDAを、2-ヘプテン二酸-補酵素A（2 HDA-CoA）を生成するための2 HDAへの補酵素A（CoA）の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで2 HDA-CoAが生成される、本発明1004の方法。
[本発明1012]
2 HDA-CoAを、2 HDA-CoAのピメロイルCoA（PCoA）へのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPCoAが生成される、本発明1011の方法。
[本発明1013]
PCoAを、PCoAのPAへのチオエステル加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPAが生成される、本発明1012の方法。
[本発明1014]
PAを、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、本発明1013の方法。
[本発明1015]
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、本発明1015の方法。
[本発明1017]
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、本発明1015の方法。
[本発明1018]
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、本発明1017の方法。
[本発明1019]
AAPを、α-ケトピメレート（AKP）を生成するためのAAPへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAKPが生成される、本発明1004の方法。
[本発明1020]
AKPを、AKPのα-ヒドロキシピメレート（AHP）へのケトン還元を触媒する1つまたは複数の酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAHPが生成される、本発明1019の方法。
[本発明1021]
AHPを、α-ヒドロキシピメレート（AHP-CoA）を生成するためのAHPへのCoAの転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAHP-CoAが生成される、本発明1020の方法。
[本発明1022]
AHP-CoAを、AHP-CoAの2 HDA-CoAへの脱水を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで2 HDA-CoAが生成される、本発明1021の方法。
[本発明1023]
2 HDA-CoAを、2 HDA-CoAのPCoAへのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPCoAが生成される、本発明1022の方法。
[本発明1024]
PCoAを、PCoAのPAへのチオエステル加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPAが生成される、本発明1023の方法。
[本発明1025]
PAを、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、本発明1024の方法。
[本発明1026]
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、本発明1025の方法。
[本発明1027]
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、本発明1026の方法。
[本発明1028]
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、本発明1026の方法。  
[本発明1029]
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、本発明1028の方法。
[本発明1030]
AHPを、AHPの2 HDAへの脱水を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで2 HDAが生成される、本発明1020の方法。
[本発明1031]
2 HDAを、2 HDAのピメリン酸（PA）へのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPAが生成される、本発明1030の方法。
[本発明1032]
PAを、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、本発明1031の方法。
[本発明1033]
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、本発明1032の方法。
[本発明1034]
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、本発明1033の方法。
[本発明1035]
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、本発明1033の方法。
[本発明1036]
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、本発明1035の方法。
[本発明1037]
2 HDAを、2 HDA-CoAを生成するための2 HDAへのCoAの転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで2 HDA-CoAが生成される、本発明1030の方法。
[本発明1038]
2 HDA-CoAを、2 HDA-CoAのPCoAへのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPCoAが生成される、本発明1037の方法。
[本発明1039]
PCoAを、PCoAのPAへのチオエステル加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPAが生成される、本発明1038の方法。
[本発明1040]
PAを、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、本発明1039の方法。
[本発明1041]
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、本発明1040の方法。
[本発明1042]
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、本発明1041の方法。
[本発明1043]
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、本発明1041の方法。
[本発明1044]
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、本発明1043の方法。
[本発明1045]
AKPを、AKPのα-ケトスベレート（AKS）へのα-ケト酸鎖伸長を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAKSが生成される、本発明1019の方法。
[本発明1046]
AKSを、α-アミノスベレート（AAS）を生成するためのAKSへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAASが生成される、本発明1045の方法。
[本発明1047]
AASを、AASの7 AHAへのα-ケト酸脱カルボキシル化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、本発明1046の方法。
[本発明1048]
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、本発明1047の方法。
[本発明1049]
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、本発明1047の方法。
[本発明1050]
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、本発明1049の方法。
[本発明1051]
AKSを、AKSのPASへのα-ケト酸脱カルボキシル化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、本発明1045の方法。
[本発明1052]
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、本発明1051の方法。
[本発明1053]
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、本発明1052の方法。
[本発明1054]
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、本発明1052の方法。
[本発明1055]
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、本発明1054の方法。
[本発明1056]
PCoAを、PCoAのPASへの還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、本発明1023の方法。
[本発明1057]
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、本発明1056の方法。
[本発明1058]
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、本発明1057の方法。
[本発明1059]
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、本発明1057の方法。
[本発明1060]
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、本発明1059の方法。
[本発明1061]
PCoAを、PCoAのPASへの還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、本発明1038の方法。
[本発明1062]
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、本発明1061の方法。
[本発明1063]
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、本発明1062の方法。
[本発明1064]
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、本発明1062の方法。
[本発明1065]
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、本発明1064の方法。
[本発明1066]
6A2HAおよび2 HDAから選択される化合物を、6A2HAのAAPへのエノエート還元または2 HDAのPAへのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここでAAPまたはPAが生成される、化合物を変換する方法。
[本発明1067]
PCoAおよびピメロイル-［acp］（PACP）から選択される化合物を、PCoAまたはPACPのPAへのチオエステラ-ゼ加水分解を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここでPAが生成される、化合物を変換する方法。
[本発明1068]
PAを、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、本発明1067の方法。
[本発明1069]
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、本発明1068の方法。
[本発明1070]
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、本発明1069の方法。
[本発明1071]
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、本発明1069の方法。
[本発明1072]
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、本発明1071の方法。
[本発明1073]
AKPを、AKPのAHPへのケトン還元を触媒する1つまたは複数の酵素と接触させる段階を含み、ここでAHPが生成される、化合物を変換する方法。
[本発明1074]
AKPがα-ケトアジペートまたはα-ケトグルタレートの鎖伸長によって生成される、本発明1073の方法。
[本発明1075]
AHPをPAまたはPCoAに変換する段階をさらに含む、本発明1073の方法。
[本発明1076]
α-ケト酸鎖の伸長によってAKPをAKSに変換する段階を含む、化合物を変換する方法。
[本発明1077]
AKPがα-ケトアジペートまたはα-ケトグルタレートの鎖伸長によって生成される、本発明1076の方法。
[本発明1078]
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここで7 AHAが生成される、化合物を変換する方法。
[本発明1079]
PASが、2,6 DAP、AKG、PCoAまたはPACPからの変換によって得られる、本発明1078の方法。
[本発明1080]
PCoAおよびPACPから選択される化合物を、該化合物のPASへの還元を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここでPASが生成される、化合物を変換する方法。
[本発明1081]
PASを、PASの7-ヒドロキシヘプタン酸（7 HHA）へのアルコール脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここで7 HHAが生成される、化合物を変換する方法。
[本発明1082]
前記酵素、または前記1つまたは複数の酵素が、精製された酵素である、本発明1001〜1081のいずれかの方法。
[本発明1083]
前記酵素、または前記1つまたは複数の酵素が、細胞溶解物または部分精製された細胞溶解物中に存在する、本発明1001〜1081のいずれかの方法。
[本発明1084]
前記酵素、または前記1つまたは複数の酵素が、該酵素を組換え発現する細胞中に存在する、本発明1001〜1081のいずれかの方法。
[本発明1085]
酵素がアンモニアリアーゼを含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1086]
アンモニアリアーゼが、EC 4.3.1におけるアンモニアリアーゼである、本発明1085の方法。
[本発明1087]
EC 4.3.1におけるアンモニアリアーゼが、EC 4.3.1.1、EC 4.3.1.2、EC 4.3.1.3、EC 4.3.1.12、EC 4.3.1.13、またはEC 4.3.1.24を含む、本発明1086の方法。
[本発明1088]
酵素がエン酸レダクターゼを含む、本発明1003、1005、1012、1023、1031、1038、および1066のいずれかの方法。
[本発明1089]
エン酸レダクターゼがEC 1.3.1におけるエン酸レダクターゼを含む、本発明1088の方法。
[本発明1090]
EC 1.3.1におけるエン酸レダクターゼがEC 1.3.1.31を含む、本発明1089の方法。
[本発明1091]
酵素がカルボン酸レダクターゼを含む、本発明1006、1014、1025、1032、1040、および1068のいずれかの方法。
[本発明1092]
カルボン酸レダクターゼがEC 1.2.99におけるカルボン酸レダクターゼを含む、本発明1091の方法。
[本発明1093]
EC 1.2.99におけるカルボン酸レダクターゼがEC 1.2.99.6を含む、本発明1092の方法。
[本発明1094]
酵素がωトランスアミナーゼを含む、本発明1007、1015、1026、1033、1052、1057、1062、1069、および1078のいずれかの方法。
[本発明1095]
ωトランスアミナーゼがEC 2.6.1におけるトランスアミナーゼを含む、本発明1094の方法。
[本発明1096]
EC 2.6.1におけるωトランスアミナーゼが、EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.2、EC 2.6.1.7、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.36、EC 2.6.1.39、EC 2.6.1.42、またはEC 2.6.1.68を含む、本発明1095の方法。
[本発明1097]
酵素が、チオエステラーゼ、酸-チオールリガーゼ、またはCoAトランスフェラーゼを含む、本発明1013、1024、1039、1056、1061、および1067のいずれかの方法。
[本発明1098]
チオエステラーゼが、EC 3.1.2におけるチオエステラーゼを含む、本発明1097の方法。
[本発明1099]
EC 3.1.2におけるチオエステラーゼが、EC 3.1.2.18、EC 3.1.2.19、またはEC 3.1.2.20を含む、本発明1098の方法。
[本発明1100]
酸-チオールリガーゼがEC 6.2.1における酸-チオールリガーゼを含む、本発明1097の方法。
[本発明1101]
EC 6.2.1における酸-チオールリガーゼが、EC 6.2.1.3、EC 6.2.1.14、またはEC 6.2.1.23を含む、本発明1100の方法。
[本発明1102]
CoAトランスフェラーゼが、EC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼを含む、本発明1097の方法。
[本発明1103]
EC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼがEC 2.8.3.12またはEC 2.8.3.13を含む、本発明1102の方法。
[本発明1104]
酵素がアミノトランスフェラーゼを含む、本発明1010、1018、1019、1029、1036、1044、1046、1050、1060、1065、および1072のいずれかの方法。
[本発明1105]
アミノトランスフェラーゼがEC 2.6.1におけるアミノトランスフェラーゼを含む、本発明1104の方法。
[本発明1106]
EC 2.6.1におけるアミノトランスフェラーゼがEC 2.6.1.67を含む、本発明1105の方法。
[本発明1107]
1つまたは複数の酵素がカルボニルレダクターゼを含む、本発明1020または1073の方法。
[本発明1108]
カルボニルレダクターゼがEC.1.1.1.184を含む、本発明1107の方法。
[本発明1109]
酵素がα-ケト酸デカルボキシラーゼを含む、本発明1047または1051の方法。
[本発明1110]
酵素が脂肪アシルCoAレダクターゼを含む、本発明1056、1061、または1080の方法。
[本発明1111]
脂肪アシルCoAレダクターゼがEC 1.2.1におけるレダクターゼを含む、本発明1110の方法。
[本発明1112]
EC 1.2.1における脂肪アシルCoAがEC 1.2.1.50を含む、本発明1111の方法。
[本発明1113]
酵素がアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む、本発明1009、1015、1028、1035、1043、1049、1055、1059、1064、および1071のいずれかの方法。
[本発明1114]
アルデヒドデヒドロゲナーゼが、EC 1.2.1におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む、本発明1113の方法。
[本発明1115]
EC 1.2.1におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼがEC 1.2.1.4またはEC 1.2.1.63を含む、本発明1114の方法。
[本発明1116]
酵素がCoAトランスフェラーゼを含む、本発明1011、1021、および1037のいずれかの方法。
[本発明1117]
CoAトランスフェラーゼが、EC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼを含む、本発明1116の方法。
[本発明1118]
EC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼがEC 2.8.3.12またはEC 2.8.3.13を含む、本発明1117の方法。
[本発明1119]
酵素がアミドヒドロラーゼである、本発明1008、1016、1027、1034、1042、1048、1053、1058、1063、および1070のいずれかの方法。
[本発明1120]
酵素がヒドロリアーゼを含む、本発明1022または1030の方法。
[本発明1121]
ヒドロリアーゼがEC 4.2.1におけるヒドロリアーゼを含む、本発明1120の方法。
[本発明1122]
EC 4.2.1におけるヒドロリアーゼが、EC 4.2.1.2、EC 4.2.1.59、4.2.1.61、4.1.2.17、または4.1.2.18を含む、本発明1121の方法。
[本発明1123]
α-ケト酸鎖の伸長が、AksA、AksD、AksE、および AksFを含む酵素の1つまたは複数のセットによって触媒される、本発明1045、1074、1076、および1077のいずれかの方法。
[本発明1124]
AksAがEC 2.3.3におけるAksA酵素を含む、本発明1123の方法。
[本発明1125]
EC 2.3.3におけるAksA酵素がEC 2.3.3.13または2.3.3.14を含む、本発明1124の方法。
[本発明1126]
AksDがEC 4.2.1におけるAksD酵素を含む、本発明1123の方法。
[本発明1127]
EC 4.2.1におけるAksD酵素がEC 4.2.1.33を含む、本発明1126の方法。
[本発明1128]
AksFがEC 1.1.1におけるAksF酵素を含む、本発明1123の方法。
[本発明1129]
EC 1.1.1におけるAksF酵素がEC 1.1.1.85を含む、本発明1128の方法。
[本発明1130]
1つまたは複数のα-ケト酸鎖伸長酵素がメタン生成細菌に由来する、本発明1045、1074、1076、および1077のいずれかの方法。
[本発明1131]
酵素がアルコールデヒドロゲナーゼを含む、本発明1081の方法。
[本発明1132]
アルコールデヒドロゲナーゼがEC.1.1.1.1またはEC 1.1.1.2を含む、本発明1131の方法。
[本発明1133]
アルコールデヒドロゲナーゼが、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）由来のadhA、ザイモモナス・モビリス由来のadhB、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）由来のブタノールデヒドロゲナーゼ、サッカロミセス（Saccharomyces）ADHIV、およびS.セレビシエ（S.cerevisiae）由来のADH6から選択される、本発明1131の方法。
[本発明1134]
PCoAまたはPACPがアセチルCoAまたはベンゾイルCoAから誘導される、本発明1067または1080の方法。
[本発明1135]
アセチルCoAが、セルロース系原材料、糖類、グリセロール、または脂肪酸を含む再生可能な原材料から誘導される、本発明1134の方法。
[本発明1136]
アセチルCoAが、SynGas、メタン、またはメタノールから誘導される、本発明1134の方法。
[本発明1137]
ベンゾイルCoAが多環式芳香族炭化水素から誘導される、本発明1134の方法。
[本発明1138]
2,6 DAPが、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼを欠くリジン産生生物によって生産される、本発明1001、1002、および1079のいずれかの方法。
[本発明1139]
2,6 DAPが再生可能な原材料から誘導される、本発明1001、1002、1079、および1138のいずれかの方法。
[本発明1140]
再生可能な原材料が糖類を含む、本発明1139の方法。
[本発明1141]
生物由来のナイロン-7、ナイロン-7,x、またはナイロン-x,7。
[本発明1142]
PASまたはAASから誘導される7 AHAを重合させる段階を含む工程によって生産されるナイロン-7。
[本発明1143]
PCoA、PACP、または2 HDAから誘導されるPA、および7 AHAから誘導される1,7 DHAを重合させる段階を含む工程によって生産されるナイロン-7,7。
[本発明1144]
（i）本発明1002〜1007;
（ii）本発明1002〜1004および1011〜1015;
（iii）本発明1002〜1004および1019〜1026;
（iv）本発明1002〜1004、1019〜1020、および1030〜1033;
（v）本発明1002〜1004、1019〜1020、1030、および1037〜1041;
（vi）本発明1002〜1004、1019、および1045〜1047;
（vii）本発明1002〜1004、1019、1045、および1051〜1052;
（viii）本発明1002〜1004、1019〜1023、および1056〜1057;
（ix）本発明1002〜1004、1019〜1020、1030、1037〜1038、および1061〜1062;
（x）本発明1067〜1069;
（xi）本発明1073〜1075;
（xii）本発明1076〜1077;
（xiii）本発明1078〜1079;または 
（xiv）本発明1080
の方法段階を含む方法によって作製される7 AHAを重合させる段階を含む工程によって生産されるナイロン-7。
[本発明1145]
（a）本発明1002〜1007および1009〜1010;
（b）本発明1002〜1004、1011〜1015、および1017〜1018;
（c）本発明1002〜1004、1019〜1026、および1028〜1029;
（d）本発明1002〜1004、1019〜1020、1030〜1033、および1035〜1036;
（e）本発明1002〜1004、1019〜1020、1037〜1041、および1043〜1044;
（f）本発明1002〜1004、1019、1045〜1047、および1049〜1050;
（g）本発明1002〜1004、1019、1045、1051〜1052、および1054〜1055;
（h）本発明1002〜1004、1019〜1023、および1056〜1060;
（i）本発明1002〜1004、1019〜1020、1037〜1038、および1061〜1065;
（j）本発明1067〜1069および1071〜1072;
（k）本発明1073〜1075;
（1）本発明1076〜1077;
（m）本発明1078〜1079;または
（n）本発明1080
の方法段階を含む方法によって作製される1,7 DHA、ならびに
（o）本発明1002〜1005;
（p）本発明1002〜1004および1011〜1013;
（q）本発明1002〜1004および1019〜1024;
（r）本発明1002〜1004、1019〜1020、および1030〜1031;
（s）本発明1002〜1004、1019〜1020、1030、および1037〜1039;
（t）本発明1067;または
（u）本発明1073〜1075
の方法段階を含む方法によって作製されるPAを重合させる段階を含む工程によって生産される、ナイロン7,7。
[本発明1146]
宿主細胞の実質的に純粋な培養物であって、そのうちの実質的な数が、7 AHA、PA、1,7 DAH、ENTL、および7 HHAから選択される1つまたは複数のポリマー単量体の生合成に関与する1つまたは複数の酵素をコードする1つまたは複数の外因性核酸を含み、該酵素が、アシルCoAレダクターゼ、アシル-［acp］レダクターゼ、チオエステルヒドロラーゼ、アンモニアリアーゼ、エン酸レダクターゼ、アミノトランスフェラーゼ、CoAトランスフェラーゼ、チオエステラーゼ、酸-チオールリガーゼ、ヒドロリアーゼ、カルボニルレダクターゼ、チオエステラーゼ、カルボン酸レダクターゼ、脂肪アシルCoAレダクターゼ、ω-トランスアミナーゼ、α-ケト酸デカルボキシラーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、およびα-ケト酸鎖の伸長を触媒する酵素からなる群より選択される、宿主細胞の実質的に純粋な培養物。
[本発明1147]
前記細胞が原核細胞である、本発明1146の培養物。
[本発明1148]
原核細胞が、大腸菌（Escherichia coli）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、スフィンゴモナス属（sphingomonads）、シュードモナス属（pseudomonads）、メタン生成細菌（例えばメタノバクテリウム・オートトロフィカム（Methanobacterium autotrophicum））、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、サルモネラ属（Salmonella）、バークホルデリア属（Burkholderia）、モラクセラ属（Moraxella）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、サイクロバクター属（Psychrobacter）、サーモトガ属（Thermotoga）、アシネトバクテリア（Acinetobacteria）、ロドバクター属（Rhodobacter）、アゾアルカス属（Azoarcus）、ロドスピリルム属（Rhodospirillum）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、連鎖球菌（streptococci）、乳酸杆菌（lactobacilli）、ノカルジア属（Nocardia）、バチルス属（Bacillus）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、クロストリジウム属（Clostridium）、ストレプトミセス属（Streptomyces）、およびアルスロバクター属（Arthobacter）からなる群より選択される、本発明1147の培養物。
[本発明1149]
前記細胞が真核細胞である、本発明1146の培養物。
[本発明1150]
真核細胞が真菌細胞である、本発明1149の培養物。
[本発明1151]
真菌細胞が酵母細胞である、本発明1150の培養物。
[本発明1152]
酵母細胞が、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、カンジダ属（Candida）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、リゾプス属（Rhizopus）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、ピキア属（Pichia）、トリコスポロン属（Trichosporon）、イサタケンキア属（Issatchenka）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）、デバリオミセス属（Debaryomyces）、ハンセヌラ属（Hansenula）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、シュワニオミセス属（Schwanniomyces）、およびリポミセス属（Lipomyces）からなる群より選択される酵母の細胞である、本発明1151の培養物。
[本発明1153]
カンジダ細胞が、C.トロピカリス（C.tropicalis）、C.アルビカンス（C.albicans）、C.クロアカエ（C.cloacae）、C.グイリエルモンディイ（C.guillermondii）、C.インターメディア（C.intermedia）、C.マルトサ（C.maltosa）、C.パラプシロシス（C.parapsilosis）、およびC.ゼイレノイデス（C.zeylenoides）からなる群より選択される酵母の細胞である、本発明1152の培養物。
[本発明1154]
真菌細胞が、アスペルギルス属（Aspergillus）、エクソフィアラ属（Exophiala）、ケカビ属（Mucor）、トリコデルマ属（Trichoderma）、クラドスポリウム属（Cladosporium）、ファネロケーテ属（Phanerochaete）、クラドフィアロフォラ属（Cladophialophora）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、スケドスポリウム属（Scedosporium）、およびオフィオストマ属（Ophiostoma）からなる群より選択される真菌の細胞である、本発明1150の培養物。
[本発明1155]
アンモニアリアーゼがEC 4.3.1におけるアンモニアリアーゼを含む、本発明1146の培養物。
[本発明1156]
EC 4.3.1におけるアンモニアリアーゼが、EC 4.3.1.1、EC 4.3.1.2、EC 4.3.1.3、EC 4.3.1.12、EC 4.3.1.13、またはEC 4.3.1.24を含む、本発明1155の培養物。
[本発明1157]
エン酸レダクターゼがEC 1.3.1におけるエン酸レダクターゼを含む、本発明1146の培養物。
[本発明1158]
EC 1.3.1におけるエン酸レダクターゼがEC 1.3.1.31を含む、本発明1157の培養物。
[本発明1159]
カルボン酸レダクターゼがEC 1.2.99におけるカルボン酸レダクターゼを含む、本発明1146の培養物。
[本発明1160]
EC 1.2.99におけるカルボン酸レダクターゼがEC 1.2.99.6を含む、本発明1159の培養物。
[本発明1161]
ω-トランスアミナーゼがEC 2.6.1におけるトランスアミナーゼを含む、本発明1160の培養物。
[本発明1162]
EC 2.6.1におけるω-トランスアミナーゼが、EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.2、EC 2.6.1.7、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.36、EC 2.6.1.39、EC 2.6.1.42、またはEC 2.6.1.68を含む、本発明1161の培養物。
[本発明1163]
チオエステラーゼがEC 3.1.2におけるチオエステラーゼを含む、本発明1146の培養物。
[本発明1164]
EC 3.1.2におけるチオエステラーゼが、EC 3.1.2.18、EC 3.1.2.19、またはEC 3.1.2.20を含む、本発明1163の培養物。
[本発明1165]
酸-チオールリガーゼがEC 6.2.1における酸-チオールリガーゼを含む、本発明1146の培養物。
[本発明1166]
EC 6.2.1における酸-チオールリガーゼが、EC 6.2.1.3、EC 6.2.1.14、またはEC 6.2.1.23を含む、本発明1165の培養物。
[本発明1167]
CoAトランスフェラーゼがEC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼを含む、本発明1146の培養物。
[本発明1168]
EC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼがEC 2.8.3.12またはEC 2.8.3.13を含む、本発明1167の培養物。
[本発明1169]
アミノトランスフェラーゼがEC 2.6.1におけるアミノトランスフェラーゼを含む、本発明1146の培養物。
[本発明1170]
EC 2.6.1におけるアミノトランスフェラーゼがEC 2.6.1.67を含む、本発明1169の培養物。
[本発明1171]
カルボニルレダクターゼがEC.1.1.1.184を含む、本発明1146の培養物。
[本発明1172]
脂肪アシルCoAレダクターゼがEC 1.2.1におけるレダクターゼを含む、本発明1146の培養物。
[本発明1173]
EC 1.2.1における脂肪アシルCoAがEC 1.2.1.50を含む、本発明1172の培養物。
[本発明1174]
アルデヒドデヒドロゲナーゼがEC 1.2.1におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む、本発明1146の培養物。
[本発明1175]
EC 1.2.1におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼがEC 1.2.1.4またはEC 1.2.1.63を含む、本発明1174の培養物。
[本発明1176]
ヒドロリアーゼがEC 4.2.1におけるヒドロリアーゼを含む、本発明1146の培養物。
[本発明1177]
EC 4.2.1におけるヒドロリアーゼが、EC 4.2.1.2、EC 4.2.1.59、4.2.1.61、4.1.2.17、または4.1.2.18を含む、本発明1176の培養物。
[本発明1178]
α-ケト酸鎖の伸長を触媒する酵素が、AksA、AksD、AksE、およびAksF酵素を含む酵素のセットから選択される1つまたは複数の酵素を含む、本発明1146の培養物。
[本発明1179]
AksAがEC 2.3.3におけるAksA酵素を含む、本発明1178の培養物。
[本発明1180]
EC 2.3.3におけるAksA酵素がEC 2.3.3.13または 2.3.3.14を含む、本発明1179の培養物。
[本発明1181]
AksDがEC 4.2.1におけるAksD酵素を含む、本発明1178の培養物。
[本発明1182]
EC 4.2.1におけるAksD酵素がEC 4.2.1.33を含む、本発明1181の培養物。
[本発明1183]
AksFがEC 1.1.1におけるAksF酵素を含む、本発明1178の培養物。
[本発明1184]
EC 1.1.1におけるAksF酵素がEC 1.1.1.85を含む、本発明1183の培養物。
[本発明1185]
アルコールデヒドロゲナーゼがEC.1.1.1.1またはEC 1.1.1.2を含む、本発明1146の培養物。
[本発明1186]
アルコールデヒドロゲナーゼが、ザイモモナス・モビリス由来のadhA、ザイモモナス・モビリス由来のadhB、クロストリジウム・アセトブチリカム由来のブタノールデヒドロゲナーゼ、サッカロミセスADHIV、およびS.セレビシエ由来のADH6から選択される、本発明1146の培養物。
[本発明1187]
7 AHA、PA、1,7 DAH、ENTL、および7 HHAから選択される1つまたは複数のポリマー単量体の生合成に関与する1つまたは複数の外因性核酸をコードする1つまたは複数の外因性核酸を含む単離された細胞であって、該酵素が、アシルCoAレダクターゼ、アシル-［acp］レダクターゼ、チオエステルヒドロラーゼ、アンモニアリアーゼ、エン酸レダクターゼ、アミノトランスフェラーゼ、CoAトランスフェラーゼ、チオエステラーゼ、酸-チオールリガーゼ、ヒドロリアーゼ、カルボニルレダクターゼ、カルボン酸レダクターゼ、脂肪アシルCoAレダクターゼ、ω-トランスアミナーゼ、α-ケト酸デカルボキシラーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、およびα-ケト酸鎖の伸長を触媒する酵素からなる群より選択される、単離された細胞。
他の目的および利点は、本明細書に記載する以下の詳細な説明の検討から当業者に明らかになる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014525741000001.app
【国際調査報告】
2014525741.tif 000071
2014525741.tif 000072
2014525741.tif 000073
2014525741.tif 000074
2014525741.tif 000075
2014525741.tif 000076
2014525741.tif 000077