(57)【要約】  本発明は、結合するが損失エフェクター機能を有する抗原を保持するＩｇＧ破壊に対して治療的免疫特異的産物の調製及び使用のための方法及び試薬に関する。本発明の試薬は、ヒト対象の予防的又は治療的ワクチンの目的のために免疫原として使用されてもよい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの対象をプロテアーゼの放出を特徴とする病理学的状態から保護する方法であって、ペプチド免疫原を投与することを含み、前記ペプチドが、ＩｇＧ上のタンパク質分解開裂部位と反応する抗体を生成することが可能である、方法。
【請求項２】
前記病理学的状態が、関節炎疾患、悪性疾患、病原菌又は寄生生物の存在、及び血管疾患から選択される疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記疾患が関節リウマチである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記疾患がブドウ球菌属感染である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記疾患が乳癌である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記対象が、心筋梗塞を有すると診断される若しくは疑われるか、又はうっ血性心不全に罹患している、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドが、黄色ブドウ球菌由来のＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−１２、ＨＮＥ、プラスミン、カテプシンＧ、ペプシン、ＩｄｅＳ、又はグルタミルエンドペプチダーゼＩからなる群から選択されるプロテアーゼによって産生されるヒトＩｇＧ内のプロテアーゼ特異的開裂部位に相当する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ヒトＩｇＧ内の前記プロテアーゼ特異的開裂部位が、前記プロテアーゼ特異的開裂部位に対する特異性を有する抗体を使用して、患者からのサンプル中で検出されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
患者を治療するための方法であって、前記患者が特異的抗体を含有する組成物で治療され、抗体が治療される前記特定の疾患に関連する１つ以上のプロテアーゼによる開裂を受けやすく、ペプチド免疫原を前記患者に投与する工程を含み、前記ペプチドが、抗体療法によって治療される前記特定の疾患に関連する前記１つ以上のプロテアーゼによって産生されるＩｇＧ上のタンパク質分解開裂部位に相当するペプチドフラグメント又は類似体である、方法。
【請求項１０】
前記病理学的状態が、関節炎疾患、悪性疾患、病原菌又は寄生生物の存在、及び血管疾患から選択される疾患である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記疾患が関節リウマチである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記疾患がブドウ球菌属感染である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記疾患が乳癌である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象が、心筋梗塞を有すると診断される若しくは疑われるか、又はうっ血性心不全に罹患している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドが、ブドウ球菌由来のＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−１２、ＨＮＥ、プラスミン、カテプシンＧ、ペプシン、ＩｄｅＳ、又はグルタミルエンドペプチダーゼＩからなる群から選択されるプロテアーゼによって産生されるヒトＩｇＧ１内にプロテアーゼ特異的開裂部位に相当する、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
ヒトＩｇＧ内の前記プロテアーゼ特異的開裂部位が、前記プロテアーゼ特異的開裂部位に対する特異性を有する抗体を使用して、患者からのサンプル中で検出されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペプチド免疫原を投与することは、前記抗体のエフェクター機能を含有する組成物を回復、強化、又は維持することを可能にする、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
前記開裂産物類似体ペプチド免疫原が、
ａ．重鎖のＮ末端に最も近位のプロテアーゼによって開裂された抗体の重鎖の一対の残基のうちの前記残基を特定することと、
ｂ．前記ポリペプチドのＮ末端に最も近位である前記プロテアーゼ開裂部位の前記残基が、前記定義された配列のＣ末端になる、前記プロテアーゼ開裂部位の上流にある少なくとも５つの連続アミノ酸残基を含む、ペプチド配列を特定することと、
ｃ．免疫付与に十分な量の前記ペプチド又はペプチド相同体若しくは化学的相同体の溶液を作製することによって調製される、請求項１又は９に記載の方法。
【請求項１９】
前記ペプチド免疫原が、プロテアーゼ開裂部位のアミノ末端側の上流にある配列番号１、２、３、又は４のヒトＩｇＧヒンジ領域配列から選択される少なくとも５つの連続アミノ酸、又は相同種若しくは化学類似体を含む、請求項１又は９に記載の方法。
【請求項２０】
前記ペプチド免疫原が、残基−Ｔ−Ｃ−Ｐ−Ｐ−Ｃ−（配列番号１の残基７〜１１）として定義される、ＩｇＧ１の少なくともヒンジコア、又は相同種若しくは化学的類似体を含む、請求項１又は９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ペプチド免疫原が、配列ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１の残基７〜１８）を有するヒトＩｇＧ１下部ヒンジ及び隣接ＣＨドメインの１２−ｍｅｒペプチド類似体を含む、請求項１又は９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペプチド免疫原が、配列番号５〜１１及びそのＮ末端切断から選択されるアミノ酸配列を有し、少なくとも５つのアミノ酸を含み、ＩｇＧプロテアーゼ開裂部位のＮ末端側の上流にあるアミノ酸配列を含有するペプチドを含む、請求項１又は９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ペプチド免疫原が、（ａ）ＩｇＧ１  ＭＭＰ−３開裂部位（ＴＣＰＰＣＰＡＰ、配列番号１の残基７〜１４）のアミノ末端側のアミノ酸配列、（ｂ）グルタミルエンドペプチダーゼＩｇＧ１開裂部位（ＴＣＰＰＣＰＡＰＥ、配列番号１の残基７〜１５）、及び（ｃ）ＩｄｅＳ  ＩｇＧ１開裂部位（ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ、配列番号１の残基７〜１８）を含むペプチドから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は９に記載の方法。
【請求項２４】
前記ペプチドが化学的類似体であり、前記システイン残基がセリン残基で置換される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記ペプチドが、前記ペプチドの前記Ｃ末端が別の部分に化学的に結合する方法でキャリアタンパク質に抱合する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記キャリアタンパク質が、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）又は血清アルブミンからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ペプチドが配列番号５〜１６のペプチドから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
特異的な投与経路による患者への投与に適合性の薬学的に許容されるキャリア中に、プロテアーゼ開裂部位の前記アミノ末端側の上流にある配列番号１、２、３、又は４の前記ヒトＩｇＧヒンジ領域配列から選択される少なくとも５つの連続アミノ酸を含むペプチド、又は相同種若しくは化学的類似体を含む、ワクチン組成物。
【請求項２９】
前記ペプチドが、前記ペプチドに対する液性反応を強化する目的のためにアジュバントと併せて投与される、請求項２８に記載のワクチン調製物。
【請求項３０】
前記アジュバントが、ＣＤ４０作動薬、ミョウバン、高分子微粒子、水中油型エマルション、ＭＦ５９、ＣｐＧ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、及びＩＬ−２からなる群から選択される、請求項２９に記載のワクチン調製物。
【請求項３１】
前記ペプチドが、配列番号５〜１６のペプチドから選択される、請求項２８、２９、又は３０に記載のワクチン組成物。
【請求項３２】
病理学的状態の治療のために患者に投与される抗体のエフェクター機能を強化又は維持するための方法であって、前記抗体は前記患者において１つ以上のプロテアーゼによる開裂を受けるものであって、治療抗体に結合し、かつ前記治療抗体のエフェクター機能を回復させることができる抗体を生成することが可能なヒトＩｇＧプロテアーゼ開裂部位ペプチドを用いる、前記抗体治療前、その後、又はそれと同時に前記患者にワクチン接種することを含む、方法。
【請求項３３】
前記患者にワクチン接種するために使用される前記ヒトＩｇＧプロテアーゼ開裂部位ペプチドが、配列番号５〜１６のペプチドから選択されるペプチドである、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的特異的特性又は治療的免疫グロブリンと反応する免疫グロブリンの方法、組成物、及び使用に関し、そこで結合は、標的特性又は治療的免疫グロブリンの開裂かつ結合フラグメントに特有の生物活性を回復し、それによって、生物活性を提供又は再構成する。本発明は更に、かかるエクスビボ又はインビボ免疫グロブリンの産生のためにワクチンに使用するための免疫原性免疫グロブリンフラグメントを提供する。
【背景技術】
【０００２】
循環免疫グロブリン、及び特にＩｇＧクラスのそれらの抗体は、主要血清タンパク質である。ヒトプロテアーゼは、炎症性、増殖性、転位性、及び感染性疾患に関連することは周知である。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、及び好中球エラスターゼ等のヒトプロテアーゼは、グルタミルエンドペプチダーゼ（黄色ブドウ球菌）又は連鎖球菌（化膿連鎖球菌）の免疫グロブリン分解酵素等の細菌プロテアーゼと同様に、ＩｇＧ重鎖ポリペプチドを各プロテアーゼに特有の残基で開裂する。重鎖における開裂部位は、２つの重鎖の鎖間ジスルフィド結合が発生するヒンジドメインと呼ばれる領域の周りに集約される。ヒンジの下の領域は、Ｆｃ領域を構成し、ＩｇＧのエフェクター機能に関与する結合部位を含む。微生物の場合、プロテアーゼ発現は潜在的な補助毒性経路であり、ヒンジの下の開裂によるＦｃドメインのタンパク質分解放出が、そうでなければその病的細胞の標的及び致死に至らしめる作用を効果的に中和する限りにおいて、有機体がオプソニン化を回避するのを可能にする（Ｒｏｏｉｊａｋｋｅｒｓら、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ７：４７６〜４８４，２００５）。したがって、特定プロテアーゼの綿密さは、癌、炎症、及び感染性疾患を含む、無数の疾患状態の代表であり得る。
【０００３】
ＩｇＧ分解は、開裂ヒンジドメインに結合する、天然ＩｇＧ自己抗体の存在によって証明されるように、病理学的インビボ環境において強化される（Ｋｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５、Ｎａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０、Ｐｅｒｓｓｅｌｉｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｖｅｎｓ，１９８５、Ｔｅｒｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｊ  Ｉｍｕｎｏｌ．１５４：６４４６〜６４５２）。これらの自己抗体もまた、Ｆ（ａｂ’）２分子内のＣ末端残基として残留する下部ヒンジドメインへの特に強い反応性を有し、幾つかのプロテイナーゼ（パパイン及びペプシンを含む）によって生成されたＦａｂフラグメント、及びＦ（ａｂ’）2フラグメントを結合する（Ｔｅｒｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。実際の開裂産物の検出が報告されているが（Ｆｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，１９７０、Ｗａｌｌｅｒ，１９７４）、これらのフラグメントがバイオメーカーとして機能することを可能にするロバストアッセイは、恐らく様々なフラグメントの迅速なクリアランスからもたらさせる血清の低濃度、又は血液及び組織内の多量の無傷免疫グロブリンの中にフラグメントを検出する際の技術的問題が原因で、開発されていない。特異的抗体が実験中央値ヒト好中球エラスターゼ開裂Ｆｃドメインの検出のために調製され（Ｅｃｋｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９８８．Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２４０：５３１〜５３４）、直接、関節リウマチ患者の滑液中で０．６２μｇ／ｍｌの中央値濃度でＦｃを検出したが、他の種類の関節疾患を有する患者の滑液中では検出されなかった。
【０００４】
プロテアーゼ特異的疾患活性に罹患する対象の体内でインビボＩｇＧ機能の欠乏を是正し、ＩｇＧ開裂のプロセスを補う能力は、これまで治療的戦略として想定されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、標的の結合又は非結合ＩｇＧを分解することが可能なタンパク質分解酵素の放出から生じるＩｇＧ開裂産物に対して特異的である抗体を産生するための抗体及びワクチンに関する。抗体及びワクチンは、プロテアーゼ分解を受けている治療的ＩｇＧ抗体組成物にエフェクター機能を回復するために有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の別の実施形態において、ＩｇＧ開裂産物の新規に作製されたＣ末端配列に相当する疾患特異的開裂部位ペプチドが提供される。これらのペプチドはまた、本発明の抗ＩｇＧ開裂産物抗体での免疫付与、パンニング、及び選択にも有用である。一態様において、ペプチドは、プロテアーゼ開裂部位のアミノ末端側上にある配列番号１、２、３、又は４のヒトＩｇＧヒンジ領域配列から選択された少なくとも５つの連続アミノ酸からなる群から選択される。一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号５〜１１及びそのＮ末端切断のポリペプチドから選択される。別の態様において、ヒトＩｇＧ分子のタンパク質分解開裂部位に基づいたペプチド免疫原を設計する方法が提供される。
【０００７】
本発明の一実施形態において、抗ＩｇＧ開裂産物抗体の組み換え産生のための核酸配列、ベクター、及び宿主細胞を含む、本発明の抗ＩｇＧ開裂産物抗体の調製方法が提供される。抗ＩｇＧ開裂産物抗体を製造する方法の別の態様において、免疫付与された宿主動物が提供され、その動物が本発明の抗体を提供する。特定の実施形態において、動物は、ヒトであり、抗ＩｇＧ開裂産物は、配列番号５〜１１の配列及びそのＮ末端切断等のプロテアーゼ開裂部位のアミノ末端側上にある配列番号１、２、３、又は４のヒトＩｇＧヒンジ領域配列から選択された少なくとも５つの連続アミノ酸からなる群から選択される開裂部位ペプチド免疫原の投与によって生成される。
【０００８】
本発明の別の実施形態において、ＩｇＧ開裂プロテアーゼ産物を特徴とする疾患の診断又は監視に使用するための本発明の抗ＩｇＧ開裂産物抗体を含む、抗ＩｇＧ開裂産物の検出のためのキットが提供される。
【０００９】
本発明の更なる実施形態は、治療方法として、抗ＩｇＧ開裂特異的抗体を患者に投与し、それによって、プロテアーゼ分解を受けている治療的抗体組成物にエフェクター機能を回復する方法である。該方法に従い、エフェクター機能は、ＩｇＧ開裂産物に特異的に結合する本発明の抗体を投与することによって、ＩｇＧ開裂産物に回復される。
【００１０】
本発明の別の態様において、疾患特異的プロテアーゼの生産を特徴とする疾患に罹患するヒトは、かかる患者内のＩｇＧ開裂産物のエフェクター機能を回復するために、配列番号１、２、３、又は４から選択され、かつ配列番号５〜１１及びＮ末端切断の配列等のプロテアーゼ開裂部位のアミノ（Ｎ）末端側上の位置にあるヒトＩｇＧヒンジ領域配列の少なくとも５つの連続アミノ酸、相同種及び化学的類似体からなる群から選択される開裂部位特異的ペプチド免疫原を投与することによって治療することができる。特定の実施形態において、開裂部位特異的ペプチド免疫原は、アミノ酸Ｇｌｕ２３３（ＥＵ番号付け）で終端する開裂ヒトＩｇＧ１へのＮ末端であるペプチドフラグメントに相当し、疾患は、グルタミルエンドペプチダーゼＩ（ＧｌｕＶ８）の放出又はカテプシンＧの好中球放出を特徴とする黄色ブドウ球菌感染から選択される。別の実施形態において、開裂部位特異的ペプチド免疫原は、アミノ酸Ｐｒｏ２３２（ＥＵ番号付け）で終端するペプチドフラグメントＮ末端開裂ヒトＩｇＧ１に相当し、疾患は、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１２の放出を特徴とするヒトの癌の形態を特徴とする。別の実施形態において、開裂部位特異的ペプチド免疫原は、ＧＬｙ２３６（ＥＵ番号付け）で終端する化膿連鎖球菌開裂ヒトＩｇＧ１のＩｄｅＳに対してペプチドフラグメントＮ末端に相当し、疾患は、ブドウ球菌属感染である。
【００１１】
本発明の別の実施形態において、本発明の抗ＩｇＧ開裂産物抗体、及び使用説明書を含むキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒンジ、並びにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、及びＦｃと定義されるペプシン及びパパイン開裂産物との関係を示す、典型的な哺乳類のＩｇＧクラス抗体の様々なドメインを図示する。
【図２】ヒンジ領域周辺のヒトＩｇＧ重鎖の配列を示し、主要タンパク質分解開裂の位置は、矢印で示される。
【図３】３つの異なるプロテアーゼ：ＭＭＰ−３、Ｖ８、及びＩｄｅＳから酵素的に生成されたヒトＩｇＧのフラグメントで免疫付与されたウサギで生成された抗血清の相対的特異性を示すグラフであり、ウサギは、配列ＴＣＰＰＣＰＡＰ、ＭＭＰ−３開裂部位に対応する配列番号１の残基７〜１４；配列ＴＣＰＰＣＰＡＰＥ、グルタミルエンドペプチダーゼ部位に対応する配列番号１の残基７〜１５；配列ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ、ＩｄｅＳ部位に対応する配列番号１の残基７〜１８を有する抱合ペプチドで免疫付与された。３つの個別のウサギ多クローン性抗開裂部位特異的ペプチド抗体調製物のＥＬＩＳＡ反応性を、Ｍａｂ３  ＩｇＧ１κ、並びにＳｃＩｇＧ及び無傷ＩｇＧのＦ（ａｂ’）2フラグメントとのそれらの結合能力に対して試験した。Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、化膿連鎖球菌由来のヒト組み換えＭＭＰ−３、ブドウ球菌グルタミルエンドペプチダーゼＩ、及び組み換えＩｄｅＳで生成された。抗体調製物は、ｓｃＩｇＧ及びＦ（ａｂ1）2への結合を示したが、無傷ＩｇＧへの結合は示さなかった。棒グラフは、３つの複製ウェルの平均±標準偏差に一致する。
【図４】抗体消化物でのウサギポリクローナル抗体調製物の反応性を示すウエスタンブロットである：無傷又はＭＭＰ−３、グルタミルエンドペプチダーゼ（Ｖ８）、又はＩｄｅＳで部分的に消化されているＭａｂ３ヒトＩｇＧ１を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、免疫ブロットによって分離し、（Ａ）を、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）［列１〜４］又は抗ＬＬＧウサギポリクローナル［列６〜１０］でブロットした。（Ｂ）を、抗ＰＡＰ［列２〜５］又は抗ＡＰＥ［列７〜１０］でブロットした。個々の抗血清での検出を可能にするために、ブロットをパネルＡの列５及びパネルＢの列６を介して抗体でのインキュベーション前に切断した。
【図５】５人のＲＡ患者の滑液中のＩｇＧ分解の分析からのサンプル上にＲＡＨ−１試薬を使用して展開され、ＭＭＰ−３、グルタミルエンドペプチダーゼ（Ｖ８）、及びＩｄｅＳでのモノクローナルＩｇＧ１のインビトロタンパク質分解消化物からのサンプルと比較したウエスタンブロット。
【図６】正常なヒト血清サンプルの群のｓｃＩｇＧと比較した、表示される疾患と診断された患者からのヒト血清サンプル中の試薬ＲＡＨ−１によって検出されたｓｃｌｇＧの個々の値のドットプロット。
【図７】ペプチド類似体としてヒトＩｇＧ１ヒンジからの開裂フラグメントを標的とするウサギのモノクローナル抗体、及び特定の残基（図３を参照）で終端する抗体フラグメントの相対的反応性を示す。
【図８】ペプチド類似体（ｒｂポリ）を開裂するために調製されたウサギポリクローナルと比較した、ＩｄｅＳでＩｇＧ１を消化することによって作製されたＦ（ａｂ’）2への補体依存性細胞溶解（ＣＤＣ）を回復する際に、ヒトＩｇＧ１ヒンジの開裂フラグメントを標的とする３つの異なるウサギモノクローナル抗体の濃度依存性を示す。
【図９】対照ウサギ（黒線）対免疫付与されたウサギ（点線）の黄色ブドウ球菌でのインキュベーション後のウィッフルボール内の平均ログのコロニー細菌数及びＳＥＭを示す。
【図１０】黄色ブドウ球菌が接種されたウサギのカプランマイヤー生存プロットであり、対照ウサギ（黒線）及び免疫付与されたウサギ（点線）を示す。
【図１１】ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）が移植され、腫瘍標的Ｍａｂ（８６０）単独（黒三角）；８６０、８６０  ｓｃＩｇＧのプロテアーゼ処置調製物（黒丸）；抗ヒンジ抗体調製物２０９５−２；８６０  ｓｃＩｇＧプラス抗ヒンジ抗体調製物２０９５−２；又はＰＢＳ（白丸）のいずれかで治療されたマウスの５つのグループの経時的な腫瘍体積の変化を示す。
【図１２】単独で、及び抗開裂部位ｍＡｂ、２０９５−２と組み合わせて投与された、抗血小板インテグリンＭａｂ（ｃ７Ｅ３）又はＭａｂのタンパク質分解開裂産物の循環血小板数への、イヌの血小板数への効果を示し、各点は、３つの動物の決定値の平均±ＳＤを表す。
【００１３】
【表１】
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【発明を実施するための形態】
【００１４】
略語
Ａｂｓ＝抗体類、ＡＤＣＣ＝抗体依存性細胞媒介性細胞傷害；ＣＤＣ＝補体依存性細胞傷害；ＨＮＥ＝ヒト好球中エラスターゼ；ＩｄｅＳ＝化膿連鎖球菌の免疫グロブリン分解酵素；Ｉｇ＝免疫グロブリン；Ｍａｂ＝モノクローナル抗体；ＭＭＰ＝マトリックスメタロプロテアーゼ又はメタロプロテイナーゼ；Ｎ末端＝アミノ末端；ｓｃＩｇＧ＝単一開裂ＩｇＧ；ＳＡ＝ストレプトアビジン；ＧｌｕＶ８＝黄色ブドウ球菌由来のグルタミルエンドペプチダーゼＩ。
【００１５】
定義
抗体フラグメント；Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、及びＦｃは、重鎖間のジルフィド結合の還元（コアヒンジ領域）によって更に分離され得る、ＩｇＧ抗体のタンパク質分解開裂産物を説明する用語である。典型的なタンパク質分解で生成された抗体フラグメントには、Ｆａｂ（例えば、パパイン消化による）、Ｆａｂ’（例えば、ペプシン消化及び部分的還元による）、及びＦ（ａｂ’）2（例えば、ペプシン消化による）、ｆａｃｂ（例えば、プラスミン消化による）、ｐＦｃ’（例えば、ペプシン又はプラスミン消化による）、Ｆｄ（例えば、ペプシン消化、部分的還元、及び再集合による）が挙げられ、そこで還元は、鎖間結合を形成するシステイン残基間のジスルフィド結合を除去する（図１を参照）。Ｆｃフラグメントが、ヒンジに対してＮ末端である、残基２２４（ＥＵ番号付け）においてヒトＩｇＧ１を開裂するパパイン開裂フラグメントとして説明されるため、Ｆｃフラグメントは、ヒンジ及び重鎖間ジスルフィド結合を保持すると想定されが、抗体内の重鎖ＣＨ２−ＣＨ３二量体間の高い会合のため、二量体構造は、ジスルフィド（ヒンジ）結合が欠乏している場合でも保持される。したがって、本明細書に使用されるとき、「Ｆｃ」は、共有結合か否かにかかわらず重鎖ＣＨ２−ＣＨ３セグメントの会合によって形成された二量体構造を指す。非共有結合的会合Ｆｃは、洗剤等の変性剤の存在下でＣＨ２−ＣＨ３単量体への解離を起こす能力により、ジスルフィド結合のＦｃと異なり得ることを理解するであろう。
【００１６】
ヒト抗体は、基本構造が２つのヘテロ二量体の二量体である免疫グロブリンであり、ヘテロ二量体はそれぞれ、重鎖及び軽鎖ポリペプチドからなる。
【００１７】
「タンパク質分解」、「プロテアーゼ」、「プロテイナーゼ」、及び「タンパク質分解酵素」という用語用語は、互換的に使用され、２つ以上のフラグメントを産生するポリペプチド鎖を開裂することが可能な薬剤、例えば、酵素を意味し、酵素は、通常温度で、かつ生理学的条件又は生理学的に適合条件下で作用する。生理学的条件には、任意の温度、緩衝剤、カチオン、アニオン、基質、触媒、ｐＨ、共同因子、又は健康又は病気であれ生存している哺乳類の身体内に天然に見られる同等物が挙げられる。しかしながら、プロテアーゼは、任意の種類の生命体であり得る病原体等の非哺乳類源に由来し得る。プロテアーゼは、ペプチド結合に作用するヒドロラーゼである。
【００１８】
「ｓｃＩｇＧ」又は「単一開裂ＩｇＧ」は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含むヘテロ二量体構造を有する、任意の免疫グロブリンクラスＧ分子を意味し、重鎖のうちの１つは、単一重鎖上でタンパク質分解開裂を受け、二番目の重鎖は無傷のままである。
【００１９】
Ｎ末端からＣ末端残基まで記述されたアミノ酸配列に対する「上流」は、所与の残基からＮ末端に向かう配列の残基を意味する。反対に、アミノ酸配列に対して「下流」は、所与の残基からＣ末端に向かう配列の残基を意味する。
【００２０】
基礎構造による抗体機能
一般に、免疫グロブリン、抗体は、それぞれ約１０〜１１ｋＤａの約１００のアミノ酸を含む連続ポリペプチド鎖の領域からなり、特徴的に折り畳まれた球状ドメインを示し、構造の異なる要素を表す。免疫ガンマグロブリンは、約１５０ｋＤａのタンパク質である抗体（ＩｇＧ）であり、これらのドメインは、セグメントにグループ化され、Ｆａｂセグメントは、重鎖可変領域と連続する重鎖第１定常領域（ＣＨ１）へのジスルフィド結合を介して結合された単鎖内の軽鎖定常領域に可変接合した軽鎖からなり、Ｆｃは、ヒンジ領域内の２つ又は３つのジスルフィド結合を介して結合された２つの連続重鎖定常領域（ＣＨ２及びＣＨ３）からなる。研究は、パパイン及びヘプシン等のプロテアーゼが、セグメント間にある部位で優先的に抗体を開裂することを示した。２つの同一のＦａｂセグメントは、ヒンジ領域を介して１つのＦｃセグメントに接続され、したがって、ｌ５０ｋＤａ構造（図１を参照）のＹ型構造を形成する。パパインを使用して生成されたＦａｂセグメントは、典型的には、４６ｋＤａの分子量を有し、非還元性Ｆ（ａｂ’）2は、典型的には、９０〜１００ｋＤａの分子量を有し、非グリコシル化、非還元性Ｆｃは、約５０〜６０ｋＤａの見掛けの分子量を有する。しかしながら、それぞれの抗体種、及び抗体種内の抗体のそれぞれのサブクラスは、わずかに異なり、開裂及び開裂産物の厳密な性質及び位置は異なる。
【００２１】
抗原は、軽鎖及び重鎖の各対の可変領域で抗原結合部位を介して抗体に結合する（図１）。エフェクター分子又は細胞として知られる他の分子は、残りの分子内の他の部位、すなわち、抗原結合部位以外に結合し、この抗体部分は、より不変の免疫グロブリン配列を含み、抗体の「定常部分」、かかる部位は、特に軽鎖の末端：上部ヒンジ、下部ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを超えて延在する重鎖の部分によって構成されたＦｃ領域に部分的に位置する。
【００２２】
抗体は、エフェクター分子の結合により仲介される数種のエフェクター機能を有する。例えば、抗体に対する補体のＣ１成分の結合は、補体系を活性化させる。補体の活性化は、オプソニン化及び病原体細胞の溶解（補体媒介性細胞傷害又はＣＤＣと呼ばれるプロセス）において重要である。補体の活性化は、炎症性応答を刺激し、また自己免疫過敏症にも関与し得る。更に、抗体は、Ｆｃ領域を介して細胞に結合し、抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体部位が細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）と結合する。ＩｇＧ（γ受容体）、ＩｇＥ（η受容体）、ＩｇＡ（α受容体）及びＩｇＭ（μ受容体）を含む、抗体の異なるクラスに特異的な多数のＦｃ受容体が存在する。細胞表面上のＦｃ受容体に対する抗体の結合は、多数の重要かつ多様な生物学的応答を誘発し、生物学的応答には、抗体被覆粒子の貪食及び破壊、免疫複合体の排除、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解（抗体依存性細胞媒介細胞傷害、補対指向細胞傷害、又はＡＤＣＣと称される）、炎症性メディエーターの放出、胎盤通過及び内皮細胞再接種（新生児型Ｆｃ受容体又はＦｃＲｎを介する）、並びに免疫グロブリン産生の制御が含まれる。
【００２３】
ヒンジドメインの配列は、通常、ＩｇＧアイソタイプ（配列番号１〜４）及び哺乳類種間で保存される。ＩｇＧ１（配列番号１）及びＩｇＧ３（配列番号１）アイソタイプは、Ｆｃγ受容体への結合及びＦｃエフェクター機能の構造モチーフであるロイシン−ロイシンの対を含む。典型的には、２つの非システイン残基によって分離された少なくとも１つのシステインを含む、「ヒンジコア」の下流の他の残基もまた保存される。
【００２４】
ヒトＩｇＧ１の開裂産物、単一開裂又はｓｃＩｇＧは、ＩｇＧを含む２つの重鎖ポリペプチドのうちの１つにタンパク質分解が生じるとき、ヒト及び細菌プロテアーゼによって形成されるが、前述のように、ヘテロ二量体分子の全体の組成物は、破壊されない（Ｇｅａｒｉｎｇ  ＡＪＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．８１：４１〜４８、２００２、Ｖｉｎｃｅｎｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１５５４０〜１５５４９，２００４）。ｓｃＩｇＧは、恐らく、他のフラグメントよりも血清中に見られる、より豊富なインビボタンパク質分解産物である。
【００２５】
生理学的条件下でのタンパク質分解開裂の動力学は、Ｆ（ａｂ’）2（図１）等の複数回の開裂事象の産物である種よりも、高い割合のｓｃＩｇＧ構造にあるタンパク質分解的開裂ＩｇＧにつながる（２００８年８月４日に出願された米国特許第１２／１８５，３３３号）。数多くのプロテアーゼを試験するプロセスにおいて、無傷ＩｇＧ内の重鎖定常領域の第１の開裂は、第２の開裂より急速に進行することが決定され、この順序は、単一開裂種の一時的な蓄積をもたらす。このＩｇＧ分子の単一開裂型は、その無傷の親と多くの点で区別ができない（例えば、分子サイズ、抗原結合、タンパク質Ａ／Ｇによって認識される能力）。
【００２６】
Ｆ（ａｂ’）2及びｓｃＩｇＧを含むタンパク質分解開裂産物の特異的結合が可能な抗体は、ヒトＩｇＧ１開裂産物を認識するが、無傷ＩｇＧを認識しない本発明の開裂部位類似体ペプチドを使用して生成される。同時係属特許出願は更に、抗原結合特異性を保持するＩｇＧ開裂産物を特異的に認識し、開裂ＩｇＧにＣＤＣ及びＡＤＣＣ等のエフェクター機能を回復することができる抗体調製物を選択することができることを開示する。
【００２７】
タンパク質分解酵素及び疾患関連性
本出願は、インビトロ酵素パネルで作製されたものと同等のサイズのｓｃＩｇＧを含む抗体開裂産物は、関節リウマチを有する患者の滑液等の炎症性滲出液において検出可能であることを証明した。更に、ｓｃＩｇＧは、局所的タンパク質分解活動が既知の病理特性である、多くの疾患を有する患者の血清中で検出することができる。これらの疾患状態のｓｃＩｇＧは、健常ボランティアよりも高濃度であり、比較的経度の炎症疾患を有する患者の血清よりも高い。
【００２８】
表１は、ヒトプロテアーゼ及び２つの細菌プロテアーゼのヒトＩｇＧ１への作用に関する所見の概要である。「凝固プロテイナーゼ」という用語は、ＦＸＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、トロンビン、及び活性タンパク質Ｃを含む、血清凝固カスケードタンパク質を指し、プラスミンは、プラスミノゲン活性剤であるｔＰＡ、ストレプトキナーゼ、及びスタフィロキナーゼと共インキュベートされたプラスミノゲンであり、「プラスミノゲン活性剤単独」とは、プラスミノゲンを含まず、ＭＭＰは、材料において詳細に示されるように活性形態又はプロ酵素のいずれかとして得られる組み換えプロテイナーゼであり、「無し」は、２４時間以内に検出可能な開裂がないことを示す。指示される場合を除き、すべての酵素はヒトであった。残基指定は、ＩｇＧ１抗体重鎖用のＥＵ番号付けシステムで、配列番号１の２５の残基は、完全成熟重鎖の残基２１９〜２４３と一致する。
【００２９】
【表２】
2014504277.tif 000004
（１）Ｂａｒｒｅｔｔ  Ａ．Ｊ．，Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．ａｎｄ  Ｗｏｅｓｓｎｅｒ  Ｊ．Ｆ．（Ｅｄｓ．），Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  Ｖｏｌ．１，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，２００４。
（２）Ｂａｒｒｅｔｔ  Ａ．Ｊ．，Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．ａｎｄ  Ｗｏｅｓｓｎｅｒ  Ｊ．Ｆ．（Ｅｄｓ．），Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  Ｖｏｌ．２，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，２００４。
（３）Ｐｏｗｅｒｓ，ＪＣ．「Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」１９８２。Ｉｎ：Ｆｅｅｎｅｙ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔａｋｅｒ（ｅｄｓ）。Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｏｄ，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ，ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ。Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  １９８。ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９８２  ｐｐ  ３４７〜３６７。
（４）Ｔｃｈｅｔｖｅｒｉｋｏｖ  Ｉ．，Ｒｏｎｄａｙ  Ｈ．Ｋ．，ｖａｎ  Ｅｌ  Ｂ．，Ｋｉｅｒｓ  Ｇ．Ｈ．，Ｖｅｒｚｉｊｌ  Ｎ．，ＴｅＫｏｐｐｅｌｅ  Ｊ．Ｍ．，Ｈｕｉｚｉｎｇａ  Ｔ．Ｗ．Ｊ．，ＤｅＧｒｏｏｔ  Ｊ．ａｎｄ  Ｈａｎｎｅｍａａｉｊｅｒ  Ｒ．，２００４。ＭＭＰ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  ｉｎ  ｐａｉｒｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ。Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ。６３，８８１〜８８３。
（５）Ｖｉｎｃｅｎｔｓ  Ｂ．，ｖｏｎ  Ｐａｗｅｌ−Ｒａｍｍｉｎｇｅｎ  Ｕ．，Ｂｊｏｒｃｋ  Ｌ．ａｎｄ  Ａｂｒａｈａｍｓｏｎ  Ｍ．，２００４。Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，ＩｄｅＳ，ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈａｔ  ｉｔ  ｉｓ  ａ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｓｔｒｉｃｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ＩｇＧ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｅｘｏｓｉｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３，１５５４０〜１５５４９。
（６）Ｓｕｎ  Ｈ．，Ｒｉｎｇｄａｈｌ  Ｕ．，Ｈｏｍｅｉｓｔｅｒ  Ｊ．Ｗ．，Ｆａｙ  Ｗ．Ｐ．，Ｅｎｇｌｅｂｅｒｇ  Ｎ．Ｃ．，Ｙａｎｇ  Ａ．Ｙ．，Ｒｏｚｅｋ  Ｌ．Ｓ．，Ｗａｎｇ  Ｘ．，Ｓｊｏｂｒｉｎｇ  Ｕ．，Ｇｉｎｓｂｕｒｇ  Ｄ．，２００４。Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ｉｓ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｈｏｓｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｇｒｏｕｐ  Ａ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ。Ｓｃｉｅｎｃｅ。３０５，１２８３〜１２８６。
【００３０】
ｓｃＩｇＧを含む開裂ＩｇＧの検出は、ヒンジジスルフィドの、又はその周辺の開裂重鎖の新たに露出したエピトープに特異的に結合するが、無傷の非開裂ＩｇＧ分子と反応しない、親和性精製ポリクロナール抗体（ウサギ）の生成によって達成された。血清中のｓｃＩｇＧの検出の確証は、無傷ＩｇＧと同様の持続性循環寿命である。ｓｃＩｇＧに罹患した個人の体液又は血液中で検出する能力は、新規バイオメーカー戦略となる可能性がある。
【００３１】
抗体調製物
本発明の方法に使用する診断的、予防的、又は治療的薬剤として使用するために、開裂部位特異的ペプチドに対する特異性を有する抗体は、本明細書に例示された評価基準、方法、及び免疫原を使用して、本発明の実施に有用な抗体を作製又は選択するために当該技術分野において周知の様々な方法で調製することができる。
【００３２】
一態様において、抗体は、観察した開裂フラグメント又はそれに由来する開裂部位特異的類似体ペプチドで動物に免疫付与することによって作製されたハイブリドーマから容易に取得される。したがって、抗体は、Ｆ（ａｂ’）2及びｓｃＩｇＧを含む、抗体開裂フラグメント、又はそのＮ末端切断若しくは構造類体によって動物に免疫付与するか、又は抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって取得することができる。一実施形態において、抗体を生成するために使用されるペプチドは、配列番号５〜１１に示されるＩｇＧ１の１４−ｍｅｒペプチドから選択され、ここでポリペプチド又はペプチドのＣ末端残基が、残基開裂の対の表１に示される開裂部位の残基上流（Ｎ末端側）に相当する。ヒンジモチーフ、例えば、ＩｇＧ１の−Ｔ−Ｃ−Ｐ−Ｐ−Ｃ−（配列番号１の残基７〜１１）を含むフラグメントは、システイン残基（Ｃ）が、例えば。アラニン（Ａ）又はセリン（Ｓ）残基と交換され、それによって、開裂ペプチドの化学的相同体の形態を形成しないかぎり、ジスルフィド結合形成によって多重結合となる。
【００３３】
特定の実施形態において、抗体は、ＭＭＰ−３開裂部位のアミノ末端側のアミノ酸の配列に一致する（ＴＣＰＰＣＰＡＰ、配列番号１の残基７〜１４）８−ｍｅｒペプチド、又はグルタミルエンドペプチターゼ部位（ＴＣＰＰＣＰＡＰＥ、配列番号１の残基７〜１５）若しくはＩｄｅＳ部位（ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ、配列番号１の残基７〜１８）に一致する伸張ペプチドを使用して生成される。免疫原として使用されるとき、ペプチドは、容易に共有結合によってキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にＮ末端を介して、又は追加したリンカー残基若しくはペプチドを通して付着させることができる。
【００３４】
したがって、抗体は、当該技術分野において周知のハイブリドーマ技術のいずれかを使用して取得することができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ（１９８７〜２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２nd  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４〜２００１）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ，（１９９７〜２００１）を参照。それぞれは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明の抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、げっ歯類、霊長類、又はこれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、任意の哺乳類も含む、又はそれらに由来することができ、単離ヒト、霊長類、げっ歯類、哺乳類、キメラ、ヒト化及び／又はＣＤＲグラフト抗インテグリン抗体、免疫グロブリン、開裂産物、及びその他の特定部分及び変異を含む。
【００３５】
ファージディスプレイされた抗体又はペプチドライブラリーも使用して、ｓｃＩｇＧ及び他の抗体フラグメントへの所望の特異性を有する新規結合ドメインを特定し得る。
【００３６】
本発明に有用な抗体又はその結合剤を作製又は選択する上で、この目的に使用された特定の試薬が本発明の更なる態様である。この目的のために開発された特定の免疫原又は試験試料は、図３に示される残基ＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰ  ＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰ  ＳＶＦＬＦＰ（配列番号１）を含むが、これに限定されないＩｇＧ１のヒンジコア周囲の残基を含むことを特徴とする。タンパク質分解酵素と接触すると抗体フラグメントを産生する他のヒトアイソタイプ抗体のヒンジ領域もまた、抗体又は酵素開裂産物への他の結合分子を作製、選択、又は試験する目的で類似体の源として機能し得る。ヒトＩｇＧ４重鎖の類似領域は、それぞれ、残基ＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮ  ＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫ  ＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡ  ＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦ  ＬＦ（配列番号２）並びに配列番号３及び４に示されるＩｇＧ２及びＩｇＧ３用を含む。それぞれの場合において、ペプチドは、プロテアーゼ開裂部位のアミノ末端側上にある配列番号１、２、３、又は４のヒトＩｇＧヒンジ領域配列から選択された少なくとも５つの連続アミノ酸からなる。一態様において、抗体を生成するために使用された特定の免疫原又はペプチドは、残基−Ｃ−Ｐ−Ｐ−Ｃ−として定義されるＩｇＧ１の少なくともヒンジコアを含む。特定の実施形態において、ペプチドは、ヒトＩｇＧ１下部ヒンジの１２−ｍｅｒペプチド類似体、及び配列ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１の残基７〜１８）を有する隣接ＣＨ２ドメインである。
【００３７】
抗体又は他のタンパク質分解開裂産物への結合分子の生成、選択、又は試験する上で有用なペプチドフラグメントを生成する一般的な方法は、ａ）表１に示される特異的プロテアーゼによって例示されたもの等のプロテーゼ開裂抗体重鎖の一対の残基のＮ末端残基を特定する、ｂ）該Ｎ末端残基が定義された配列のＣ末端になる開裂部位から５〜１４以上上流の残基を定義する、ｃ）所望の目的に十分な量のペプチドを産生することである。任意に、任意のシステイン残基は、反応性側基が存在しないか、又は反応性側基が不可逆的又は可逆的に阻害されている、セリン又は他のアミノ酸で置換することができる。記述されるペプチド等のペプチドは、配列番号５〜１１、又はそのＮ末端切断から選択される。ペプチドは、標識される、抱合される、又は架橋される、又は別のものと混合して、又は結合を試験する目的のためのアジュバント、免疫原として、又は例えば、ファージディスプレイライブラリーから結合剤を選択する際の使用のための免疫原若しくはパンニング標的として使用される。
【００３８】
本発明は、一態様において、少なくとも１つの特定の配列、ドメイン、部分又はその変異体を含む、そこに先述の特異的ペプチド又は抗体をコードするポリヌクレオチドを含むか、これに対し相補的か、又はこれとハイブリダイズする単離核酸分子を提供する。本発明は、本明細書において説明されるように、ｓｃＩｇＧに対する特異性を有する少なくとも１つの単離モノクローナル抗体をコードする単離核酸、及び単離核酸を含む核酸ベクトル、及び／又は単離核酸を含む原核又は真核宿主細胞を包含する。宿主細胞は所望により、大腸菌ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ  Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、又はそれらの任意の誘導体、不死化細胞若しくは形質編幹細胞から選択される少なくとも１つであり得る。同様に提供されているのは、ペプチド又は抗体が検出可能な、又は回収可能な量で発現されるようにインビトロ、インビボ又はインサイチュ条件下で核酸をコードする抗体を翻訳することを含む、本発明の少なくとも１つの抗体の産生方法である。
【００３９】
使用方法
診断
ＩｇＧ開裂ペプチドを使用して調製された抗体は、疾患病理学を特定又は確定する上で、又はタンパク質分解活性及びタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）から生じる、それを引き起こす、又はさもなければ、それに関連する経過において、有用な検出試薬として使用することができる。かかる疾患及び経過は、感染、脳卒中、血管疾患、心筋梗塞、及び種々の他の急性及び慢性炎症疾患の増悪及び悪化、それらによって生じる、又はそれらに起因するものを含む。出願者らは、タンパク質分解酵素の１つの特に有用なバイオマーカーが、先述の疾患のうちの幾つかにおいて増加レベルで検出されるｓｃＩｇＧであることを示した。ｓｃＩｇＧが病理部位又は病理過程若しくは感染において胸部的に生成されるため、ｓｃＩｇＧは、疾患部位における特定の組織又は細胞型の関与の測定基準としてのかかる過程の独自で特定のマーカーを提供する。
【００４０】
本発明の一実施形態において、サンプルは、プロテアーゼの上昇レベルを特徴とする疾患を有する、それを有していた、又はその治療を受けた対象から取得する。サンプルを、疾患刺激プロテアーゼと血清ＩｇＧ群との接触に起因することが既知のＩｇＧ開裂フラグメントに対して特異性を有する、抗体調製物等の結合剤と接触させる。
【００４１】
本発明の方法を使用して、過去に疾患又は病状の診断を受けた患者が、進行した疾患（例えば、癌転移、侵襲性腫瘍増殖、持続感染等）のリスクがあるか否かを評価することができる。
【００４２】
幾つかの場合において、例えば、ｓｃＩｇＧの検出は、癌患者において、タンパク質分解酵素、特にＭＭＰの生産に関与することが既知の転移拡散を含む進行した疾患経過の指摘に役立ち得る。幾つかの態様において、腫瘍性疾患は、通常、炎症過程、組織修復、及び治癒（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ，Ｌ．Ｍ．ａｎｄ  Ｗｅｒｂ，Ｚ．２００２．Ｎａｔｕｒｅ  ４２０（１９）：８６０〜８６７）と、これらの機構を共有する。他の研究は、例えば、皮質低下が、心臓及び血管事象、例えば、血栓症のリスク低下、並びにＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９等のＭＭＰの低下の両方と相互作用し、これらの酵素が動脈硬化プラークによって産生されることが示された（Ｄｅｇｕｃｈｉ，Ｊ，Ｍａａｎｏｒｉ，Ａ．，Ｃｈｉｎｇ−Ｈｓｕａｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１４：５５５〜６２）。したがって、本発明の方法は、重度の関節性症候群（ＲＡ、強直性脊椎炎）、ある特定の癌（特に、炎症性乳癌）、重度の冠状動脈異常状態（心筋梗塞及びうっ血性心不全）、並びに喘息等の他の疾患を含むが、これらに限定されない疾患を有する患者に特に適用可能である。本発明の方法を使用して、病態生理学がＩｇＧに作用することが可能なプロテアーゼを伴う、又はそれを誘発するこれらの疾患及び病状を、分泌プロテアーゼ上昇の増進を特徴としない又はプロテアーゼがＩｇＧを開裂しない他の病理学から区別し得る。
【００４３】
したがって、本明細書において説明される試薬を使用する方法が、開裂フラグメントの検出に対して特異的である一方、開裂フラグメントのより具体的な分析は、開裂抗体の様々な領域の結合特異性の分析を含むことができる。例えば、抗原結合選択度及びフラグメント化抗体検出を組み合わせる固相アッセイを使用して、対象におけるある特定の抗原及びプロテアーゼが共局在化され、したがって、タンパク質分解活性の部位での組織、疾患、又は病理学の性質についての情報を提供するか否かを決定することができる。
【００４４】
採血は、健康又は病気の対象、ヒト、又は動物からの組織サンプリングの最も頻繁に実施される形態である。ｓｃＩｇＧは、全身において見られ、形成部位、すなわちプロテアーゼ活性部位に制限されず、特定の区画で局在化され得る疾患活性のレポーターマーカーである。かかる区画の１つは滑液である。したがって、血液又は血清採取は、本発明によって提供される試薬及び方法を使用して、初期の疾患の検出に容易で実行可能な供給源を提供する。あるいは、ＲＡ滑液、肺滲出液、生検、及び同等物等の局所設定のサンプリングも、診断を含む任意の段階の患者に、又は進行疾患を有する患者にも適用することができる。開裂抗体フラグメントは、直接染色法（免疫組織化学法）によってかかる組織サンプル中に、又はサンプルから得られる断片サンプル中に検出され得る。
【００４５】
血液を含む組織サンプルは、任意の残留活性プロテアーゼを抑制するように処理されなければならない。金属のキレート化（例えば、ＥＤＴＡ）は、効果的にＭＭＰを抑制する。ヨードアセトアミドは、システインプロテアーゼ（例えば、ＩｄｅＳ）を阻害し、セリンプロテアーゼは、ＤＦＰ及び同様の化合物で阻害することができる。活性プロテアーゼは、滑液中に存在し、それに応じて処理されなければならない。サンプルもまた、分析時まで冷凍で維持され得る。サンプルが適切に処理されると、本発明のｓｃＩｇＧ特異的試薬は、当業者に既知の、又はまだ開発されていないＥＬＩＳＡ、ビーズに基づく形式、ＲＩＡに使用し得る。
【００４６】
本発明の抗ＩｇＧタンパク質開裂フラグメント試薬は、研究又は診断用途のための、及び緩衝液等の他の試薬と共に無傷ヒトＩｇＧ及び既知重量のＩｇＧ開裂等の標準物質、及び必要に応じて、対象から得た組織サンプルのＩｇＧタンパク質分解酵素フラグメントの定量化と共に、販売用途としてのキットにパッケージ化され得る。
【００４７】
抗体療法
ヒンジペプチド開裂フラグメントに対して免疫特異的な本発明の抗体は、抗原結合ドメイン、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、ｓｃＩｇＧを保持する、タンパク質分解活性開裂ＩｇＧの残留を結合することが可能であり、したがって、無傷Ｆｃ領域を提供することによってＦｃに関連する結合特性及び付随のエフェクター機能を回復する。したがって、本明細書に教示される方法により作製される抗体、又はインビボにタンパク質分解的に作製された抗体フラグメントへの結合特性を有する抗体は、治療的分子として有用であり得る。本発明の抗ＩｇＧ開裂フラグメント抗体を使用して、疾患により誘発されたＩｇＧのタンパク質分解開裂を特徴とする疾患を有する患者を治療することができる。一態様において、抗ＩｇＧ開裂フラグメント抗体を使用して、標的特異的結合能力を保持する抗体フラグメントにエフェクター機能を回復し得る。
【００４８】
ヒト疾患又は病理の治療的又は予防的処理を目的とした抗ＩｇＧ開裂部位抗体は、免疫減又は選択試薬として本発明のペプチドを使用して、本明細書に説明される方法によって調製され得る。開裂ヒンジフラグメントに対して特異的な他の結合ドメインもまた、結合ドメインが、免疫特異的ＩｇＧ開裂産物にＣＤＣ又はＡＤＣＣ等のエフェクター機能を回復することが可能なＦｃドメインに関連する限り使用され得る。勿論、修飾された、又は変異Ｆｃ配列も、幾つかのＦｃＲ駆動相互作用を強化し、その他を減衰させる目的のために本発明によって包含される。修飾Ｆｃ領域は、例えば、米国特許第６７３７０５６号、同第７０８３７８４号、同第７３１７０９１号、同第７３５５００８号、同第７３６４７３１号、同第７３７１８２６号、同第７６３２４９７号、同第７６７０６００号、同第２００４０００２５８７Ａ１号、国際公開第ＷＯ０６１０５３３８Ａ２号、同第ＷＯ２００９０５８４９及び同第ＷＯ２００９０８６３２０号に教示される。
【００４９】
したがって、本発明は、プロテアーゼ開裂ＩｇＧを結合し、エフェクター機能を回復することが可能な抗ＩｇＧ開裂産物抗体又はＦｃ融合タンパク質の組み換え産生のための核酸配列、ベクター、宿主細胞を含んで提供される。
【００５０】
ワクチン接種
抗原結合ドメイン、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、ｓｃＩｇＧを保持し、したがって、機能的Ｆｃ領域を提供することによって抗体のＦｃ関連結合特性及び付随のエフェクター機能を回復する、酵素的に開裂したＩｇＧの残留を結合することが可能な、開裂特異的フラグメントに対して免疫特異的な本発明の抗体は、本明細書に開示される開裂フラグメントペプチドでの免疫付与によって対象に誘発され得る。抗ＩｇＧ開裂産物抗体は、宿主動物をプロテアーゼ開裂部位特異的ペプチド又はタンパク質分解開裂ＩｇＧフラグメントで免疫付与し、動物の血清から抗体を回復させることによって調製することができる。かかる方法において、免疫付与された動物は、本発明の抗体の源であり、診断試験のための試薬として使用されるか、あるいは、治療的に使用される抗体が、説明される方法、又は当該技術分野において既知の方法によって調製される。特定の実施形態において、ヒト対象は、プロテアーゼ開裂部位特異的ペプチド又はタンパク質分解開裂ＩｇＧフラグメントで免疫付与され、抗ＩｇＧ開裂産物は、インビボで生成される。一実施形態において、プロテアーゼ開裂部位特異的免疫原は、配列番号５〜１１の配列等のプロテアーゼ開裂部位のアミノ末端側上にある配列番号１、２、３、又は４のヒトＩｇＧヒンジ領域配列から選択された少なくとも５つの連続アミノ酸、そのＮ末端切断及び化学的相同体からなる群から選択される。
【００５１】
開裂部位特異的免疫付与又は「ワクチン戦略」の使用は、ＩｇＧ内の残基特異的開裂によって形成されたエピトープのための開裂部位特異的抗体の特異性のみに制限された、プロテアーゼ由来（すなわち、タンパク質分解で強化された腫瘍の場合において細菌由来又は宿主由来）を含まないＩｇＧの生来のＦｃドメイン機能の一般的回復を提供する。個人は、望ましい場合に、幅広い抗体回復能力のために、１つ以上の開裂部位ペプチド又は類似ペプチドでワクチン接種され得る。あるいは、患者は、開裂部位特異的抗体反応を生成するために、ワクチン接種前、その最中、又はその後に開裂部位特異的抗体で治療され得る。特定の実施形態において、個人は、標的抗体活性が、エフェクター機能に関与し、抗体は１つ以上のＩｇＧ開裂プロテアーゼによる開裂を受けるものであって、所与の疾患状態を治療するために設計された標的抗体調製物の投与前、それと同時に、又はその後に疾患特異的開裂部位特異的ペプチド又は類似ペプチドでワクチン接種される。このようにして、標的抗体のエフェクター機能は、回復することができ、抗体処理の効果は、抗体の標的機能が変更されずに強化されるか、又は回復される。一実施形態において、対象において治療される疾患は、１つ以上のＩｇＧ開裂プロテアーゼの生産を特徴とする（表１参照）。
【００５２】
ワクチン接種方法は、当該技術分野において周知であり、特に、低分子抗原、すなわちハプテン、及び直鎖ペプチドは、その複数がキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等の免疫原でもあり得るキャリア分子に抱合するとき、より免疫原性であることは既知である。多くの抱合方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎによる「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６に説明されている。簡潔に述べると、キャリアへのハプテンの抱合は、一般に、両端において反応性官能基を有する様々な長さの直鎖分子からなるリンカー又はより適切には架橋リンカーによって達成される。ホモ二官能性リンカー（すなわち、グルタルアルデヒド）において、２つの官能基は、同一であり、ヘテロ二官能性リンカーでは、それらは異なる。詳細な抱合化学は周知である。標的ＩｇＧ開裂フラグメントが、免疫グロブリンのＮ末端部分（可変領域、ＣＨ１、及び幾つかの場合において、コアヒンジドメインの一部）に関連する抗原特異的結合ドメインを保持するため、抗体反応は、開裂部位における新規のＣ末端に相当する類似ペプチドの部分に指向されなければならない。したがって、類似ペプチドのＮ末端を抱合し、免疫原として遊離Ｃ末端残基を提示することが望ましい。
【００５３】
ワクチン接種方法において、アジュバント（例えば、アルミニウム含有アジュバント（Ａｌｕｍ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ））を、非抱合型又は抱合型ヒンジ領域類似ペプチドと使用して、抗体（液性又はＴｈ２駆動）を生成するための免疫反応を指向し、開裂部位特異的フラグメントに対して結合ドメインを指向することができる。天然リガンドｇｐ３９等のＣＤ４０作動薬を使用して、免疫反応を刺激することができる。好ましくは、抗原提示細胞、好ましくは樹枝状細胞上のＣＤ４０受容体を活性化するＣＤ４０作動薬が一例である。
【００５４】
ヒトワクチン
安全かつ有効なヒトワクチン調製物が開発されている。組み換えタンパク質ベースのワクチンの免疫原性を強化するために、アジュバントが必要である。最も広く使用されるアジュバントは、ベーマイト及びヒドロキシリン酸アルミニウム等の一般にミョウバンと呼ばれる不溶性アルミニウム塩である。ミョウバンアジュバントは、主にＴｈ２型サイトカイン反応を誘発する（Ｌｉｎｄｂｌａｄ，２００４、Ｒａｚ  ＆  Ｓｐｉｅｇｅｌｂｅｒｇ，１９９９、Ｖａｌｅｎｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。したがって、代替的アジュバントは、ペプチドワクチン開発の成功に必要であり得る。
【００５５】
抗原のポリマー微小粒子封入は、ワクチンアジュバントとして評価されている（Ｅｙｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ  １１，５０９〜５１４、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００４  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ４，４８３〜４９１）。ポリ（ＤＬ−ラクチドコグリコリド）（ＰＬＧ）で形成された微小粒子は、当該技術分野において周知である。
【００５６】
様々な水中油型エマルションもまた、ミョウバンに対する代替的アジュバントとして開発されている。これらの最も進化したものは、許容される安全プロファイルを有する潜在的なアジュバントである、スクアレン水中油型エマルション（ＭＦ５９）である。フラウドと呼ばれるインフルエンザワクチン産物は、ＭＦ５９を含む。ミョウバンのように、ＭＦ５９は、インビボ樹枝状細胞による抗原摂取を促進することができる。その上、筋肉内注射後に、ＭＦ５９がリンパ節に移動するＡＰＣによって内在化されることが示されている。抗原送達を促進する以外に、ＭＦ５９もまた、それが筋肉内注射後に血単核細胞の流入を促進することが認められたため、局所炎症誘発性アジュバントとして機能する。
【００５７】
ミョウバン、ＭＦ５９、又は微小粒子と組み合わせて使用することができる他の分子には、ワクチンに対するＴｈ１型反応を強化するためのＣｐＧ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＩＬ−２が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
混合されたアジュバント又は「ワクチン」を有する、又は有さない調製免疫原は、皮内、皮下、鼻腔内、及び筋肉内等に制限されない任意の好適な経路によって対象に投与され得る。
【００５９】
ワクチン接種のために様々なプロトコルを使用し得る。本発明の一態様として意図される１つのプロトコルは、所望の免疫原を含む第１のワクチン組成物、プライムワクチン組成物が、プライムワクチン組成物の免疫原と形態が異なる対応する免疫原を含むブーストワクチン組成物と併せて投与される、プライムブーストプロトコルである。ブーストワクチン組成物は、プライムワクチン組成物と同時に投与され得るか、又はプライムワクチン組成物の初期投与の後のある時点において投与され得る。プライム及びブーストワクチン組成物は、同一経路を介して投与され得るか、異なる経路を介して投与され得る。プライム及びブースト組成物が同時に投与される場合、それらは、同一の製剤の一部として、又は異なる製剤として投与され得る。プライムワクチン組成物及びブーストワクチン組成物の両方は、１回又は数回投与され得る。したがって、プライムワクチンの投与量は、ブーストワクチンの投与量の投与後に投与され得る。これら及び他の既知の、又はまだ発見されていない、様々なワクチン投与経路及びワクチン投与のタイミングを使用してワクチンプロトコルを最適化することは、当業者の技術範囲内である。
【００６０】
本発明は一般的な用語で説明したが、本発明の実施形態は、以下の実施例において更に開示される。
【実施例】
【００６１】
実施例１：免疫グロブリン開裂部位特異的抗体調製物を引き起こすためのペプチド免疫原の使用。
内因性プロテアーゼによって産生された宿主（患者）抗体フラグメントの存在の確認は、開裂ＩｇＧに選択的に結合するが、無傷ＩｇＧには結合しない試薬を必要とする。開裂構成要素の特定、及び正常集団と比較した疾患を有する患者からのサンプル内のフラグメント含有量の定量的差異の両方は、試薬を使用して評価することができなければならない。
【００６２】
比較的高濃度の無傷ＩｇＧ濃度を含有する未知であるが恐らく少量のＩｇＧフラグメントの溶液中の検出は、困難である。ｓｃＩｇＧが、可能性のあるＩｇＧ開裂フラグメントとして記載されているが（Ｇｅａｒｉｎｇ  ２００２  ｓｕｐｒａ）、ヒトサンプルの定量化は、過去に実施されていなかった。この目的のため、必要な特異性を有する試薬を、開裂ＩｇＧに対して高い特異性を有するが、無傷ＩｇＧには有さないウサギで生成した。
【００６３】
ヒトＩｇＧ１ヒンジの３つの抱合された、及び徐々に長くなる単鎖ペプチド類似体を、免疫付与に使用した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにおいて）。ＭＭＰ−３開裂部位のアミノ末端側上のアミノ酸配列に一致する８−ｍｅｒペプチドを、Ｎ末端（ＴＣＰＰＣＰＡＰ、配列番号１の残基７〜１４）を介してキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に共有的に付着させた。グルタミルエンドペプチダーゼ部位（ＴＣＰＰＣＰＡＰＥ、配列番号１の残基７〜１５）及びＩｄｅＳ部位（ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ、配列番号１の残基７〜１８）に一致する延長ペプチドを、免疫原として別個に調製した。ニュージーランドウサギ（１つの免疫原当たり２匹）を、完全フロインドアジュバントの０．２ｍｇの抱合ペプチドの皮下注射により免疫付与し、不完全フロイントアジュバントの０．１ｍｇの抗原で更に３回、１４日目、４２日目、及び５６日目に再ブースした。４週目、８週目、及び１０週目に血清を収集し、抗体精製のために免疫原毎にプールした。免疫タイターを、固相抗原ペプチドに基づくＥＬＩＳＡによって監視した。
【００６４】
抗体の親和性精製は、活性化支持体上で固定化されたそれぞれのペプチド抗原を採用した。同一の抗原で免疫付与された２匹のウサギからの抗血清をプールし、抗原カラムを完全に洗浄した後に、抗原カラムを通過させた。特定の抗体を、それぞれ３Ｍ  ＫＳＣＮ及び０．１Ｍグリシン、ｐＨ  ２．５を使用して低親和性及び高親和性プールとして溶出した。２つのプールは、区別できない結合特性を生じ、交互に使用された、及び／又はプールされた。結合抗体の３つの別個に溶出したプールを、次に、今回は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（Ｍａｂ３）を含む無傷抗体を含有するカラム上で、第２の親和性吸収工程の対象とした。２番目の親和性クロマトグラフィー工程の目的は、無傷ＩｇＧを認識し得る望ましくない抗体を除去することであった。しかしながら、ＩｇＧカラムに吸収されたウサギ抗体は、ほとんど、又は全くなく、抗体群は、その暴露されたカルボキシ末端を有する「開裂」配列のみと反応性であったことを示唆した。
【００６５】
個々の親和性精製ウサギの抗ペプチド抗体を、ＥＬＩＳＡによってヒトＩｇＧの酵素的生成フラグメント並びに無傷ＩｇＧへのそれらの結合能力に対して試験した（図３）。配列番号１の残基７〜１４（ＭＭＰ−３部位類似体）に抱合するＫＬＨで免疫付与されたウサギの精製抗体は、無傷ＩｇＧに結合せず、ＭＭＰ−３でのＩｇＧｎｏ消化によって産生されたｓｃＩｇＧ及びＦ（ａｂ’）2に対して特異性が高かった。この抗体調製物は、Ｖ８プロテアーゼ及びＩｄｅＳで産生されたｓｃＩｇＧ及びＦ（ａｂ’）2に対して最小限の反応性を示した。対照的に、Ｖ８開裂部位ヒンジペプチド類似体（配列番号１の残基７〜１５）及びＩｄｅＳ開裂部位ヒンジペプチド類似体（配列番号１の残基７〜１８）で免疫付与されたウサギから取得した抗体は、これらの２つの酵素のいずれかによって産生されたｓｃＩｇＧｓ及びＦ（ａｂ’）2に対して交差反応性結合プロファイルを示した。しかしながら、これらの調製物は、ＭＭＰ−３消化産物に対して最小限の反応性を示した。抗体調製物のいずれも無傷ＩｇＧと結合せず、抗体調製物のいずれも、図４に示されるように、３つの異なる酵素によって産生されたＦ（ａｂ’）2及びｓｃＩｇＧを含むフラグメントと同等に反応性ではなかった。
【００６６】
抗ヒンジ試薬の目的とした使用は、複雑なインビボ設定で疾患特異的組織に存在する酵素によって産生されたか、又は疾患特異的細胞若しくは細胞集団、例えば、湿潤性マクロファージ若しくは好中球によって産生された、ｓｃＩｇＧ及びＦ（ａｂ’）2（及び他の潜在的なフラグメント）の検出である。潜在的ＩｇＧフラグメントの最適な適用範囲では、できる限り広域な開裂部位認識プロファイルを有することが望ましいと考えられた。この理由により、３つのウサギ抗体プールのそれぞれの混合物を、後に続くウエスタンブロット法及び血清ベースのＥＬＩＳＡ試験での使用のために、０．３３ｍｇ／ｍＬの各構成要素（合計＝１ｍｇ／ｍＬ）で調製した。このプールされた試薬は、ＲＡＨ−１と称される。
【００６７】
ＲＡＨ−１試薬を、別の炎症性流体、関節リウマチ（ＲＡ）を有する患者の滑液内にＩｇＧフラグメントを検出するその能力に対して試験した。ＲＡ患者からの滑液サンプルを市販で購入した。図５に示されるように、ＲＡＨ−１調製物は、無傷ＩｇＧと反応しなかったが、すべての３つのプロテーゼ消化から、ｓｃＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）2、恐らくＦａｂ’を検出した。ＲＡ患者からのすべての５つの滑液サンプルでは、バンドを、ほぼｓｃＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）2、及びＦａｂ’のサイズで検出し、これらのタンパク質分解フラグメントがＲＡを有する個人からの滑液内に存在することを示唆する。
【００６８】
関節リウマチ（ＲＡ）を有する１０人の対象、及び１０人の年齢と性別が一致した健康な個人からの血清サンプルをＧｅｎｏｍｉｃ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅから入手した。ＥＬＩＳＡ結果は、ＲＡを有する１０人の対象中の４人が、＞６０μｇ／ｍＬの血清ｓｃＩｇＧ濃度を表したことを示した。健康な対照グループにおいて、ｓｃＩｇＧ濃度は、＜８．２μｇ／ｍＬ〜５２．７μｇ／ｍＬの範囲であった。この比較のためのサンプルは、疾患の段階、治療レジメン等のために厳密に選択されなかったが、これらの市販のサンプルへのこのアッセイは、上昇したｓｃＩｇＧ濃度が疾患を有する患者において検出することができることを示唆する。
【００６９】
別の試験において、罹患した個人からの市販の血清源をＧｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ（現ＳｅｒａＣａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）として特定した。それぞれ８つの疾患の１０人の異なる個人からの少量の容積（３００マイクロＬ）の血清を購入した。疾患カテゴリーは、関節リウマチ、変形性関節症、喘息、１型糖尿病、乳癌、肺癌、心筋梗塞、及びうっ血性心不全であった。加えて、２８人の年齢一致及び性別一致の健常なボランティアからの血清を対照としてこの販売者から入手した。
【００７０】
ＥＬＩＳＡフォーマットアッセイを使用して、サンプルを分析し、結果を図６に示す。アッセイは、ＲＡＨ−１試薬の選択性に基づき、既知の特異的プロテアーゼにより生成されたものと比較して、ＩｇＧ開裂産物が明らかに検出可能であり、炎症性自己免疫疾患、関節リウマチでは、健康又は正常なドナーで維持されたレベルを上回ることを証明した。対照的に、変形性関節炎を有する患者は、正常な個人のサンプルのレベル範囲と同様であり、その範囲内を示した。
【００７１】
実施例２：抗ヒンジＩｇＧモノクローナル抗体の調製物
製造及びヒト患者における潜在的使用のために、開裂ＩｇＧを結合し、無傷ＩｇＧを結合しないモノクローナル抗体等の定義された分子を産生することが望ましい。以下の手順は、かかる分子の生成方法を示す。
【００７２】
ヒトＩｇＧ1下部ヒンジ領域の１２−ｍｅｒペプチド類似体及び隣接ＣＨ２ドメインは、ヒトＩｇＧ１のＩｄｅＳ開裂部位のペプチド類似体である免疫原：ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１の残基７〜１８）である。天然に存在するシステインを、変異型ＴＡＰＰＡＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１２）を与えるためにアラニンによって置換した。標準的化学手法によってＮ末端システインを追加し、キーホールリンペットヘモシアン（ＫＬＨ）への抱合を可能した。
【００７３】
ニュージーランドシロウサギ（３）を、複数回の皮下部位（５）を使用して完全フロインドアジュバントの０．５ｍｇのＫＬＨペプチドで免疫付与した。動物を、３週間の間隔で合計４回の免疫付与のために不完全フロイントアジュバントの０．２５ｍｇの免疫原でブーストした。
【００７４】
同一のペプチドのＢＳＡ抱合型の血清抗体タイターを、標準ＥＬＩＳＡ方法によって免疫付与の過程中に監視した。動物（２）をタイターデータに基づき脾臓摘出に選択した。ウサギハイブリドーマを、ウサギ縮合パートナー細胞と縮合した脾臓誘導のリンパ球から生成した（Ｓｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔ，１９９５  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９２（２０）：９３４８〜９３５２）。細胞増殖を複数のプレートでの縮合２〜３週間後に観察した。
【００７５】
陽性ハイブリドーマをＢＳＡ免疫原ペプチド抱合でコーティングされたプレート上のＥＬＩＳＡを介してスクリーニングした。各縮合から複数の陽性クローンが特定された。更なるスクリーニングには、無傷ＩｇＧ１及びＩｇＧ１の様々な酵素生成Ｆ（ａｂ’）２フラグメントへの結合が伴った。これらのスクリーニング又はカウンタースクリーニング策には、３つのクローン（指定３３−２、９１−２、及び６８−６）を、免疫原ペプチドへの、及び免疫原ペプチドのＣ末端又はその近傍のＣ末端を有する、及び無傷ＩｇＧ１との最小結合を有するＦ（ａｂ’）２フラグメントへの結合の強い選択性に基づき選択した。陽性ハイブリドーマをサブクローンし、拡大した。
【００７６】
ウサギＩｇＧを、固定化タンパク質Ａのクロマトグラフィーを含む標準方法によって個別の細胞上澄みから精製した。精製されたウサギＩｇＧのヒトＩｇＧヒンジ領域のペプチド類似体への結合の特異性、並びにＩｄｅＳ及びＭＭＰ−３酵素を用いてＡｂ内で開裂された単一又は二重開裂（Ｆ（ａｂ’）２）から作製された無傷ＩｇＧ及び精製ＩｇＧフラグメントを、標準ＥＬＩＳＡプロトコルで試験した。簡潔に述べると、標準ペプチド化学によって合成され、Ｎ末端ビオチン化したペプチドを、ストレプトアビジンでコーティングされたウェル上で捕捉した。ＩｇＧ及びフラグメントを、直接、１０μｇ／ｍＬでコーティングした。ウサギｍＡｂの結合を、よく特徴付けられたヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃ−西洋ワサビペルオキシダーゼ及びＯＰＤ基質システムによって検出した。
【００７７】
ウサギｍＡｂ  ９１−２のＥＬＩＳＡ結果を図７に示す。配列番号１の残基１６〜２３（Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｖ−Ｆ）のいずれかで終端する下部ヒンジペプチドへの明らかな結合選択性があった。配列番号１の３〜１５（Ｄ−Ｋ−Ｔ−Ｈ−Ｔ−Ｃ−Ｐ−Ｐ−Ｃ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｅ）に包括される上部ヒンジ、コアヒンジ、又は初期下部ヒンジのこれらのセグメントに一致する上流残基のいずれかで終端するペプチドへの結合がほとんどない、又は全くない。ＭＭＰ−３生成のＦ（ａｂ’）２フラグメント及びｓｃＩｇＧフラグメントへのごくわずかな結合があった（配列番号１の残基１４及び１５（Ｐ−Ａ−Ｐで終わる）との間のＭＭＰ−３開裂部位のペプチド類似体への結合不足に一致する）。対照的に、Ｃ末端配列（−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｌ−Ｌ−Ｇ）を有するべきである、Ｉｄｅｓ生成のＦ（ａｂ’）２フラグメント及びｓｃＩｇＧへの実質的結合があった。したがって、ウサギｍＡｂ結合特異性は、それを引き起こした免疫原によく適合した。直接コーティングされたｒｂ（ウサギ）ＩｇＧは、陽性対照であった。
【００７８】
補体アッセイ
ＷＩＬ２−Ｓ細胞、ＣＤ２０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８８８５）を発現するリンパ芽球様Ｂ細胞株を、ＣＤＣアッセイに標的細胞として使用した。５０μｌの細胞を、９６ウェルプレートのウェルに追加し、ＲＰＭＩ、５％の加熱不活性化ＦＢＳ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのプルビン酸ナトリウム、ペニシリン（５００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５００Ｕ／ｍｌ）、２ｍＭのＬ−グルタミンのウェル当たり最終濃度８×１０4細胞を得た。様々な濃度の抗体とともに、又はそれ無しで、付加的な５０μｌをウェルに追加し、プレートを室温で２時間インキュベートとした。５０μｌの１０％のウサギ補体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をウェルに追加し、プレートを３７℃で２０分間インキュベートした。全ての試料は３組で実行された。プレートを２００ｇで３分間遠心分離し、プレートを分離するために５０μｌの上澄みを除去し、ＣＤＣをラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞毒性検出キット（Ｒｏｃｈｅ）で測定した。吸収度を、Ｓｐｅｃｔｒａ  ｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して測定した。データを、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）並びに細胞及び補体のみを含む最小コントロールで最高細胞毒性に正規化した。
【００７９】
図８は、３つのウサギ開裂部位特異的ｍＡｂが、ＣＤ２０を結合する抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントの固定濃度の存在下で滴定されるとき、補体依存性細胞溶解を標的細胞に回復させることができたことを示す。ウサギｍＡｂは、ポリクローナルウサギ開裂部位特異的ｍＡｂ調製物（上記で説明される同一の血清ｓｃＩｇＧ検出システムの構成要素）よりも低い濃度で有効であった。ＣＤ２０の無傷抗体は、予想されるように活性であったが、そのＦ（ａｂ’）２フラグメント及びｓｃＩｇＧ型のみは活性ではなかった。ウサギ開裂部位特異的ｍＡｂは、細胞結合Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの不在下で細胞溶解を誘導することができなかった。これらの結果は、モノクローナル部位特異的抗体が、補体媒介エフェクター機能を、さもなければＩｇＧ１の不活性タンパク質分解開裂産物を再構成することができることを確立する。
【００８０】
ヒトシステムにおけるエフェクター機能の回復を試験するために、Ｍａｂ  ９１−２のウサギ抗体変異ドメインをクローンし、ヒト定常ドメインに縮合し、ＨＥＫ２９３細胞内で発現させた。得られたウサギキメラＭａｂは、２０９５−２と指定した。抗体特異性を再度、ＥＬＩＳＡ形式で開裂部位ペプチドへ結合させることによって試験し、最高の親和性が−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｌ−Ｌ−Ｇで終端するペプチドであったことを確定した。
【００８１】
結合特異性を更に、表面プラズモン共鳴プラットフォーム（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して、２０９５−２抗体のＦａｂフラグメントを使用して検査した。簡潔に述べると、Ｆａｂを、標準ＮＨＳ／ＥＤＣカップリングを使用して、３つの異なる表面密度（８５００、１６５０、及び３５０  ＲＵ）でＢｉａｃｏｒｅ  ２０００内のＣＭ５センサーチップに対して固定化した。泳動緩衝液は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．４、１５０ｍＭのＮａｃｌ、及び０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有した。データを２５℃で収集した。
【００８２】
３つのＮ末端のビオチン化ペプチドを、固定化Ｆａｂへの結合に対して試験する：ＷＴは、化膿連鎖球菌ＩｄｅＳプロテアーゼによる開裂後のヒトＩｇＧ１開裂部位からのペプチドフラグメントの予測された配列に相当し、Ｅ２３３Ａは、Ｃ末端の４位上流のアミノ酸残基で単一アラニン置換を有する変異体に相当し、Ｌ２３４Ａは、Ｃ末端から３位上流のアミノ酸残基に単一アラニン置換を有する変異体である。ペプチドを、カップリング化学と適合するペプチドを作製し、モノマー構造を保存するためにセリンを置換することによって修飾した。
【００８３】
ペプチド野生型及びＥ２３３Ａを、それぞれ、最高濃度としての５８８ｎＭ及び２．９μＭを使用して３倍の希釈系列において試験した。ペプチドＬ２３４Ａを、２倍の希釈系列において最高濃度としての１４．７μＭで試験した。各ペプチド濃度系列を、３つの異なる濃度のＦａｂ表面の上で三部試験した。会合及び解離を１分間監視した。表面を、１／５００希釈のリン酸の１２秒の注射で再生成した。各表面からの反応データを全体的に適合させて、下記の表に要約される結合定常を決定した。各ペプチド相互作用は、サンプル１：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）モデルに非常によく適合する。
【００８４】
会合速度（Ｍ−１ｓ−１のｋa））は、１０の倍数未満ほど異なったが、解離速度（ｓ−１のｋd）は、２００倍以上異なった。３つのペプチドの算出されたｎＭのＫDを下記に示す（表２）。
【００８５】
【表３】
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【００８６】
これらの結果は、モノクローナル抗体２０９５−２が、ヒトＩｇＧ１のＮ末端（上流）配列のＩｄｅＳ開裂部位ペプチドの類似体であり、システイン残基が原因のモノマー構成にある、使用される免疫原への結合に対して特異性が高いことを示す。
【００８７】
実施例３：開裂部位特異的抗体のインビボモデル
開裂部位特異的抗体のインビボ開裂ＩｇＧを救う能力を試験するために、「組織ケージ」（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ＪＡ，ｅｔ．ａｌ．（１９９７）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４３（３）：６６７〜６７１）を採用する細菌感染のモデルを適用した。このシステムにおいて、ウィッフルボールは、外科的に背側頚部領域に皮下に移植される。モデルは、感染体が容易にアクセス可能な流体区画、組織パウチ内に局所化されることを可能にし、細菌に対する抗生物質の有効性を評価するために使用されている。
【００８８】
本システムにおいて、ウサギウィッフル流体ボールは、ウサギ血清において報告されている５〜１０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧとは対照的に、約１．５ｍｇ／ｍｌのＩｇＧを含有することが発見された。ＧｌｕＶ８発現細菌黄色ブドウ球菌でのウサギの感染が、ウィッフルボール内のウサギＩｇＧの開裂を生じるであろうということが我々の仮定である。更に、ＧｌｕＶ８開裂ＩｇＧ開裂部位特異的ペプチド類似体でのウサギのワクチン接種は、ブドウ球菌に対する一定の保護を提供するロバストな開裂部位特異的タイターを生じるであろう。
【００８９】
モデルが、ウサギ開裂部位特異的抗体が黄色ブドウ球菌感染に対するあるレベルの保護を提供することができることを示す陽性結果を提供するために、４つの要素が実行されなければならない。第１に、ＧｌｕＶ８は、ウサギＩｇＧを開裂することが可能でなければならない。第２に、ウサギは、既存の黄色ブドウ球菌抗原に対するある免疫活性を有さなければならないか、又は黄色ブドウ球菌が対象ＩｇＧになるため、感染直後に黄色ブドウ球菌に対する抗体媒体性免疫反応を生成することが可能でなければならない。第３に、ワクチン接種アプローチは、開裂ウサギＩｇＧを結合するために十分な親和性及び特異性の開裂可能部位特異的抗体をもたらさなければならない。最終的に、開裂抗体類似体で免疫付与された動物は、免疫付与されていない動物とは測定可能に異なる反応を呈さなければならない。
【００９０】
我々は、ＧｌｕＶ８が、インビトロ下部ヒンジ領域に位置するアミノ酸Ｅ２３３とＬ２３４との間でヒトＩｇＧ１を開裂すること（国際公開第ＷＯ２００９／０２３４５７Ａ１号、Ｒｙａｎ  ＭＨ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４５（７）：１８３７〜１８４６）を以前に示した。この領域内のウサギＩｇＧ下部ヒンジ領域の配列は、単一アミノ酸変化Ａ２３１Ｐを除き、ヒトＩｇＧ１配列と同等である。ＧｌｕＶ８開裂部位として、酵素は、ウサギＩｇＧに作用することが予測される。
【００９１】
【表４】
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【００９２】
接種３日後に、血清、及び黄色ブドウ球菌含有のウサギのウィッフルボール流体からのウサギＩｇＧを、タンパク質Ａ試薬を使用して別個に精製した。ウサギＩｇＧの得られた調製物を、ＭＡＬＤＩによって分析し、ＩｇＧ開裂の量を決定した。ウサギ血清ＩｇＧのＭＡＬＤＩ分析は、ＩｇＧの一価分子イオン（１４３，６００Ｄａ）、無傷ＩｇＧの二価分子イオン（７１，７００Ｄａ）、及びウサギアルブミン（６５，８００Ｄａ）に一致する、３つの主要ピークを明らかにした。対照的に、ウィッフルボールウサギＩｇＧのＭＡＬＤＩ分析は、Ｆｃフラグメントの一価分子イオン（５２，８００Ｄａ）、Ｆｃフラグメントの二価分子イオン（２５，５００Ｄａ）、及び無傷ＩｇＧの一価分子イオン（１４３，７００Ｄａ）に一致する小さいピークを含んだ。これらの結果は、黄色ブドウ球菌を含有するウィッフルボール流体から精製されたウサギＩｇＧが、開裂ＩｇＧを含有し、血清から精製されたウサギＩｇＧが検出できないＩｇＧ開裂産物を有する無傷ＩｇＧを含有しなかったことを示した。したがって、インビボウサギＩｇＧが、ヒトＩｇＧ１のように、黄色ブドウ球菌を含有する微小環境内で開裂を受けやすいと結論付けた。
【００９３】
黄色ブドウ球菌に対する研究動物の免疫状態に関して、血清中の既存の免疫反応性の存在を、２つの黄色ブドウ球菌由来抗原を使用して、ＥＬＩＳＡによって試験した。これらは、ブドウ球菌α毒素（α溶血素、Ｈ１ａ）及びブドウ球菌外毒素Ｂ（共通して食中毒に関連する毒素）であった。その後ヒンジ類似ペプチドで免疫付与された６匹のウサギからの研究前血清、及び６匹の免疫付与されていない対照ウサギからの接種前血清を、１：５０、１：２００、及び１：８００の希釈で、２つの毒素への結合に対して試験した。陽性タイターを、最高の希釈として定量化し、光学密度（４９０ｎｍ）は、一致する対照ウェル（抗原でコーティングされていない）で得られた信号の２倍又はそれ以上であった。加えて、ウサギがかかるタンパク質に暴露される可能性が低いため、ヒトインテグリン及びトリタマゴアルブミンを、潜在的な陰性対照として試験した。結果を下記に表集計した（表３）。
【００９４】
【表５】
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【００９５】
結果
結果は、１２匹の研究動物において、その後の抗ブドウ球菌毒素反応性の発生が存在することを示した。数匹のウサギでは、タイターは、試験された最大希釈（１：８００）を明らかに超えた。対照的に、ヒト及びトリ抗原への免疫反応性の発生は、著しく低く、１：５０の希釈でのみ検出可能であった。これらの結果は、ウサギが、生涯、黄色ブドウ球菌に自然に暴露され、接種時のブドウ球菌抗原の即座に標的にすることが可能でなければならない、又は迅速にリコール反応を開始する能力を保持するという仮定を支持した。これらの所見は、黄色ブドウ球菌抗原への抗体のスペクトルが、細胞表面構成要素に抗原を含んで存在し得ることを示唆する。
【００９６】
実施例４：免疫付与
実施例３に説明される手段は、試験対象ウサギが、天然の細胞標的抗原に対して提供し得る、黄色ブドウ球菌抗原に対する免疫タイターを以前に展開させたことを実証した。ウサギが、細菌チャレンジに対して保護するために開裂部位ペプチドでのワクチン接種後に十分に特異的でロバストな開裂部位特異的抗原反応を生成したか否かを決定するために、以下の実験を実施し、そこで、ウサギを、免疫原ＫＬＨに抱合されたＧｌｕＶ８開裂部位ペプチド類似体（配列番号１の残基７〜１５、ＴＣＰＰＣＰＡＰＥ）で免疫付与した。
【００９７】
ヒトＩｇＧ１ヒンジの残基２２５〜２３３のペプチド類似体を、化学的に合成した。免疫原ペプチド、Ｃ−Ｔ−Ｓ−Ｐ−Ｐ−Ｓ−Ｐ−Ｓ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｅ（Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ、配列番号１６）を、結合のためのＮ末端Ｃｙｒ、及びＩｇＧ内の２２６及び２２９位で生じるＣｙｓのためのＳｅｒの内部置換を含み、これらの位置におけるペプチドの酸化及び二量体化を回避するように設計した。
【００９８】
ペプチドを、０．２５ｍｍｏｌスケールのＦａｓｔＭｏｃ化学及びＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ワング樹脂を使用して、ＡＢＩ  ４３３Ａペプチドシンセサイザー上で調製した。約１９０ｍｇの粗ペプチドを、樹脂から放出し、２つのＶｙｄａｃ  Ｃ−１８カラム上で、複数回の注射を介して精製した。留分を収集し、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析した。プールされた留分は、Ｅｌｌｍａｎ試験によって、３８ｍｇの遊離システインを有する凍結乾燥産物をもたらした。
【００９９】
ペプチドのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）への抱合を、Ｉｍｊｅｃｔ免疫原ＥＤＣキット（Ｐｉｅｒｃｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｎｏ．７７６２２）を使用してＥＤＣカップリング化学（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド）で達成した。ＥＤＣ抱合緩衝液中の４ｍｇ／ｍＬの２２ｍｇの精製ペプチドを、水中で１０ｍｇ／ｍＬのＫＬＨの等価質量と組み合わせた。ペプチドのＫＬＨへの結合は、室温で２時間ゆっくり混合しながら、混合物へのＥＤＣ溶液を添加した後に生じた。上記の工程のすべてを、製造者の指示に従い実行した。抱合混合物を、ＰＢＳに対して透析して、過剰な結合試薬を除去した。ＫＬＨペプチド抱合を、実施例１に説明されるポリクローナルウサギ開裂部位特異的特異的抗体調製物ＲＡＨ（配列Ｃ−Ｐ−Ｐ−Ｃ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｅで終わる開裂部位特異的類事ペプチドへの反応性）、及び補足及び検出抗体としてのビオチン化抗ＫＬＨ抗体をそれぞれ使用してサンドイッチ免疫アッセイによって確定した。
【０１００】
免疫付与後、ウサギ血清のペプチド類似体への反応性をＥＬＩＳＡによって試験した。表４は、タイター（信号が検出可能である希釈の逆数として）を示し、すべてのウサギが、血清内に検出可能な開裂部位特異的類似体ペプチドに反応性がある抗体を有したことを示す。１匹の動物（６５７）は、６４０と同等の１／タイターを有する免疫原への非常に低いレベルの検出可能な抗体を有した。開裂部位特異的抗体もまた、６匹すべてのウサギのウィッフルボール流体内に検出し、同一の動物（６５７）は、非常に低いレベルの検出可能な抗体を有した。したがって、６匹中５匹のウサギが、血清及びウィッフルボール流体の両方において検出可能なロバスト開裂部位特異的抗体タイターを表した。
【０１０１】
【表６】
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【０１０２】
研究の最終相において、免疫付与されたウサギ及び免疫付与されていないウサギを、黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ２９２１３）の６．２ｌｏｇの１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）で、直接、ウィッフルボール区画内に接種した。
【０１０３】
細菌数及び試験対象の生存能力を、２週間の経過にわたり細菌数及び生存に対して監視した。図９に示されるデータは、研究の一週目中に、対照動物の平均細菌数が、開裂部位特異的ワクチン接種動物よりも数ｌｏｇ高かった。例えば、２日目に、対照は、７．２ｌｏｇ10  ＣＦＵ／ｍｌのウィッフルボール流体を有したが、免疫付与されたグループは、５．２ｌｏｇ10  ＣＦＵ／ｍｌのウィッフルボール流体を有した。
【０１０４】
細菌数の差異は、ウサギ生存能力の著しい差異に変換された。２週間の研究の最後まで、対照動物のうちの４０％パーセントのみが生存したが、開裂部位特異的ワクチン接種された動物のうちの１００％が生存能力を有した（図１０）。
【０１０５】
したがって、これらの結果は、病原への固有の免疫力が存在するとき、プロテアーゼによって産生された抗原の副産物、恐らく開裂したが、依然として免疫反応性である抗黄色ブドウ球菌ＩｇＧに対するこの免疫方法によって有効レベルまで回復することができるという仮定を支持した。このプロセスは、高いタンパク質分解細菌で接種された動物の細菌数を低減することによるだけでなく、動物が死亡から救われたという事実によって証明された。
【０１０６】
実施例４：癌を治療するための受動免疫付与。
開裂部位特異的抗体による、腫瘍標的Ｍａｂへのエフェクター機能の回復の原理を証明するために、マウスヒト腫瘍異種移植モデル、ＳＣＩＤベージュマウスのＭＤＡ  ＭＢ  ２３１同所異種移植モデルを、ＣＮＴＯ８６０（ＵＳ  ７６０５２３５）と呼ばれる抗体と共に使用し、以前に、モデルにおいて腫瘍成長を低減させる能力を示すことを証明したヒト組織因子（ＣＤ１４２）に指向させた。
【０１０７】
研究は、ＣＮＴＯ８６０のＩｇＧ１の下部ヒンジドメインのタンパク質分解開裂が、抗体を無効にさせ、開裂部位特異的開裂部位ｍＡｂが、ＳＣＩＤベージュマウスにおいてＭＤＡ−ＭＢ−２３１同所異種移植モデルで開裂ＣＮＴＯ８６０の抗腫瘍有効性を回復するかどうかを評価することを示すように設計した。
【０１０８】
無傷抗腫瘍抗原抗体、ＣＮＴＯ  ８６０は、ヒトＩｇＧ１定常領域を含む。プロテアーゼ開裂抗体、ＣＮＴＯ８６０を、上述のように細菌プロテアーゼＩｄｅＳを使用して調製した。
【０１０９】
抗体調製物を、毎週新たに希釈し、０．１ｍｇ／ｋｇの動物投薬で、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬで供給した。ｍＡｂ  ２０９５−２（キメラ開裂部位特異的開裂IdeS）を単独で、１．０ｍｇ／ｋｇで８６０の変異体と同一のスケジュールで投与した。
【０１１０】
免疫不全マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した約１８〜２０ｇの体重のＳＣＩＤベージュマウス（Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＣｒｌ−ｓｃｉｄ−ｂｇＢＲ）に全身麻酔し、ＩＡＣＵＣに認可されたプロトコルによって特定されるように、無血清ＤＭＥＭ中５×１０7細胞／ｍＬで懸濁されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト乳癌株（ＡＴＣＣ  ＃ＨＴＢ−２６）細胞を、５０μＬの容積の（右腋窩番号２又は３）哺乳類脂肪体内に移植した。
【０１１１】
グループ当たり８匹のマウスは、表５（下記）に示されるように試験物質又はＰＢＳ（対照グループ）を受けた。グループ４は、単一療法に対して上記に特定される用量でＣＮＴＯ  ８６０単一開裂ＩｇＧを受け、ｍＡｂ  ２０９５−２が２時間遅れで１．０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与される。投薬を研究の３日目に開始し、一週間に一度繰り返した。
【０１１２】
【表７】
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【０１１３】
研究を、対照グループの腫瘍が８００ｍｍ３の体積に到達したときに終了した。終了時、すべての動物から全血を、調製されたＥＤＴＡでコーティングされた管内に心穿刺を介して収集した。研究の終了時、体重及び腫瘍測定値を記録し、一次腫瘍を外科的に除去し、計量した。
【０１１４】
結果
実験中の特定の時間における各マウスグループの平均腫瘍体積を図１１に示す。統計的に、ＣＮＴＯ８６０での治療グループにおける腫瘍体積は、研究１１日目に開始した他のグループのそれぞれと比較して低かった。ＣＮＴＯ８６０及びｍＡｂ２０９５−２の組み合わせグループにおける腫瘍体積は、研究１８〜４０日目からのＰＢＳグループの腫瘍体積よりも低く、研究２６〜４０日目からのＣＮＴＯ８６０  ｓｃＩｇＧ単独グループの腫瘍体積よりも低く、研究１８〜４０日目からのｍＡｂ２０９５−２単独グループの腫瘍体積よりも低かった。治療グループ間の腫瘍体積における他の差異は存在しなかった。
【０１１５】
ＣＮＴＯ８６０単独グループは、すべての他のグループよりも、より少ない最終腫瘍重量を有した。加えて、ＣＮＴＯ８６０及びｍＡｂ２０９５−２の組み合わせグループは、ＰＢＳ単独グループ及びｍＡｂ２０９５−２単独グループの両方よりも小さい腫瘍を有した。治療グループ間の腫瘍重量における他の差異は存在しなかった。
【０１１６】
これらの結果は、開裂部位特異的抗体調製物での受動免疫付与が、開裂標的特異的抗体が存在する抗腫瘍活性を回復させることを証明する。
【０１１７】
実施例５：開裂部位特異的抗体及び開裂標的抗体を使用する標的細胞減少
以下の実験において、開裂部位特異的抗体（ＩｄｅＳ開裂ヒトＩｇＧ１（キメラ開裂部位特異的開裂IdeS）への特異性を有するウサギ−ヒトキメラｍＡｂ  ｍＡｂ  ２０９５−２）のインビボ投与を、単一開裂ＩｇＧ又は二重開裂ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）2の投与後に調査した。
【０１１８】
抗血小板インテグリン（αIIbβIIIa、ＩＩｂ／ＩＩＩａとも称される）結合抗体、ｃ７Ｅ３を、数々の理由により標的抗体として使用した。抗血小板ｍＡｂは、予備試験において、５日間にわたる回復の２４時間後に著しい血小板クリアランスもたらすことが示されたヒトＩｇＧ１キメラであった（イヌ科動物のＦｃγ受容体及び／又は補体系によるｍＡｂの実質的な即時認識を示す）。加えて、効果は、血小板機能の抑制を引き起こさず、したがって、臨床的に関連する出血性合併症を引き起こす可能性がない無傷ＩｇＧ（０．０５ｍｇ／ｋｇ）投与量で区別可能であった。最後に、循環血小板数は、容易に定量化可能なエンドポイントを提供し、この非終端研究における複数の血液サンプルは、このサイズの動物に対して出血アーチファクト又はリスクを課さなかった。
【０１１９】
材料及び方法
ｃ７Ｅ３の３つの調製物を使用した：無傷マウス−ヒトＩｇＧ１キメラ抗体、細菌酵素ＩｄｅＳを使用して調製された単一開裂及びＦ（ａｂ’）2。
【０１２０】
第１に、ｃ７Ｅ３抗体抗原結合及び血小板減少パラメーターをイヌにおいて確立した。試験注入の結果は、０．０１ｍｇ／ｋｇの投与量（ヒトで血小板クリアランスを駆動するのに十分過ぎると算出された）が２時間、及び２４時間でイヌにおいて無効であり、生理食塩水基グループと区別できなかったことを示した。０．０５ｍｇ／ｋｇの投与量は、２時間でわずかに効果があったが、２４時間で、＞９０％の血小板クリアランスをもたらした。ｃ７Ｅ３  ＩｇＧの０．２ｍｇ／ｋｇの投与量は、２時間で著しい血小板クリアランスをもたらし、次いで、それは２４時間後に維持された。これらの結果は、実質的な即時的血小板クリアランス（２４時間）をもたらす、最低投与量（０．０５ｍｇ／ｋｇ）をイヌに割り当てるための必要な情報を提供した。
【０１２１】
血小板機能への効果
ｃ７Ｅ３は、血小板表面ＩＩｂ／ＩＩＩ３受容体に結合することによって血小板凝集を抑制し、それによって、活性化血小板上の受容体に結合し、それらを共にクランプするフィブリノゲンの能力を阻害する。無傷及び単一開裂ｃ７Ｅ３  ＩｇＧのそれぞれの抑制プロファイルを、血小板凝集アッセイで試験した。血小板凝集を、生理学的作動薬での活性化後に血小板懸濁液を通る光透過率として測定する。抑制を、５μＭのアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）に対する対照凝集と比較する。抑制の割合を、対照凝集−試験凝集×１００％÷対照凝集で算出した。
【０１２２】
結果は、ＩｄｅＳプロテアーゼによる単一下部ヒンジ開裂後に血小板へのｃ７Ｅ３の結合／抑制の喪失がなかったことを示した。
【０１２３】
ＩｄｅＳプロテアーゼによって単一開裂されたｃ７Ｅ３  ＩｇＧ及びｃ７Ｅ３  ＩｇＧもまたインビボで比較した。５匹の動物の３つのグループは、生理食塩水の対照、無傷ｃ７Ｅ３  ＩｇＧ（０．０５ｍｇ／ｋｇ）、又はｃ７Ｅ３単一開裂ＩｇＧ（０．０５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを受けた。血小板数をベースラインで監視し、投与２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、及び９６時間後に監視した。研究を５日間に制限することで、結果の解釈を混乱させ得る、抗ｃ７Ｅ３免疫反応の可能性を最小限化した。結果を、各時点における各動物グループの平均血小板数±ＳＤとして図３に表す。誤差バーの範囲は、異なる動物における血小板数の正常変動性を含む（例えば、単一開裂ＩｇＧ治療グループにおける５匹の動物での投与前の数は、それぞれ、１μＬ当たり１７５，０００、３５５，０００、３０５，０００、２７６，０００、及び３３４，０００であった）。それにもかかわらず、平均結果は、無傷ｃ７Ｅ３  ＩｇＧが２４時間で明らかな最低点を有する血小板数の実質的な減少を誘発したことを明らかに確定した。同一の０．０５ｍｇ／ｋｇ投与量でのｃ７Ｅ３  ＩｇＧの単一開裂型は、本質的に効果がなかった。単一開裂ｃ７Ｅ３グループ及び生理食塩水対照グループは、９６時間の監視期間にわたって同様のプロファイルを示した。血小板数は、生理食塩水対照グループ及び単一開裂ｃ７Ｅ３グループの両方において最終の９６時間の測定で低下し、非免疫媒介原因（例えば、血液量は、繰り返しのサンプリングで失われる）を示唆する。
【０１２４】
無傷ｃ７Ｅ３  ＩｇＧグループにおける血小板数は、９６時間で投与前レベルの約５０％に達する段階的回復を示した。有害な臨床所見（例えば、出血）は、任意のグループにおいて確認されず、これは、低循環血小板数及び／又は血小板の著しい抑制に対する、制限期間における既知のヒト許容度と一致する。
【０１２５】
この研究の所見とは、下部ヒンジ内のＩｇＧの単一タンパク質分解開裂が、著しいエフェクター機能の喪失をもたらすことであった。この血小板への等価結合にかかわらず、ｃ７Ｅ３の単一開裂誘導体は、（この研究において無傷ｃ７Ｅ３でみられるように）通常オプソニン化細胞を除去する免疫系の構成要素を係合することができなかった。これらのインビボ結果は、単一開裂誘導体がＡＤＣＣ及び補体アッセイにおいて本質的にすべてのエフェクター機能を失う数々の細胞標的ｍＡｂでの同様のインビボ所見を確定する。
【０１２６】
実験前と一致させるために、ｃ７Ｅ３の変異体をすべて、０．０５ｍｇ／ｋｇ投与量で投与した。研究プロトコルは、表６に記載される３つの動物の７つの異なるグループを含んだ。実験の独自の態様には（グループ６及び７）、第１の標的ｍＡｂの注入後、１０分間遅れて開裂部位特異的ｍＡｂの注入を伴う。開裂部位特異的ＩｄｅＳ開裂部位ｍＡｂ、２０９５−２を、ｃ７Ｅ３変異体のすべてに使用された投与量よりも１０倍高い０．５ｍｇ／ｋｇで投与した。より高い投与量を、開裂部位特異的ｍＡｂと血小板結合ｃ７Ｅ３変異体との錯化を最大化するために選択した。すべてのｍＡｂを、２０分間の期間にわたる遅い注入によって送達した。血小板数を、９６時間の期間にわたり監視した。血小板数を、明確な提示のために各動物内の投与前の数に正規化し、これらの３つの動物グループにおける数値的血小板数において正常変異性を最小限化するために正規化した。
【０１２７】
【表８】
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【０１２８】
結果を図１２に示す。この研究から多くの所見が生じた。投与量を見つける研究として、無傷ｃ７Ｅ３  ＩｇＧを、０．０５ｍｇ／ｋｇで投与し、２４〜４８時間で明らかな最悪値を有する実質的な血小板クリアランスを誘発した。血小板数の回復は、約７２時間で開始され、９６時間の測定にわたってゆっくりと増大した。付加的な血液サンプルを、完全な回復が生じるかどうかの評価を可能にするように７日目（１６８時間）に研究に組み込んだ。完全な回復は、すべての適用可能な治療グループにおいて７日で生じた。
【０１２９】
無傷ｃ７Ｅ３  ＩｇＧとは対照的に、単一開裂ＩｇＧ及びＦ（ａｂ’）2は、血小板数への効果がなく、これらのグループの血小板数の変化は、生理食塩水対照グループとは異ならなかった。同様に、開裂部位特異的ｍＡｂ、２０９５−２は、単独で注入されたとき（グループ５）、循環血小板への測定可能な影響はなかった。しかしながら、ｃ７Ｅ３  Ｆ（ａｂ’）2及びｍＡｂ  ２０９５−２グループでは、２時間で、効果がほぼ最大であるように、血小板数の迅速な減少が生じた。加えて、血小板低下の範囲は、２時間及び２４時間の測定で、開裂部位特異的抗体が開裂抗体留分後に投与されたグループにおいて、無傷ｃ７Ｅ３  ＩｇＧを受けたグループ（単独；グループ２）よりも大きいように思えた。その後、血小板数は、徐々に回復し、４８時間で、回復速度は、無傷ｃ７Ｅ３  ＩｇＧグループの回復速度に匹敵した。
【０１３０】
Ｆ（ａｂ’）2の組み合わせグループでは、ｍＡｂ  ２０９５−２が、単一開裂ｃ７Ｅ３  ＩｇＧとカップリングしたとき、血小板クリアランスの範囲は、Ｆ（ａｂ’）2グループに見られるように顕著ではなく、ｓｃＩｇＧグループにおける１つの不十分な反応性動物に起因し得る（このグループでは広い誤差棒グラフにも反映される）。それにもかかわらず、血小板クリアランスは、無傷ｃ７Ｅ３  ＩｇＧグループにおいて明らかになったものよりも早く生じた。ｓｃＩｇＧ結果は、インビボｍＡｂを有するこの誘導体の標的が、Ｆ（ａｂ’）2の標的と同様に有効であると考えられるため、重要である−インビトロ所見に基づき予測できなかった結果。
【０１３１】
考察／結論
本明細書に説明される一連の動物研究は、ＩｇＧの単一開裂タンパク質分解誘導体が、この場合において、インビボでそれらが結合する細胞を除去する能力を失うという初期のインビボ所見を確定した。無傷ｃ７Ｅ３  ＩｇＧは、投与量≧０．０５ｍｇ／ｋｇで、イヌにおいて２４時間以内に血小板クリアランスを誘発することが示された。０．０５ｍｇ／ｋｇの投与量を、血小板当たり数千のコピーのＩｇＧ、又は約５％のαIIbβ3受容体遮断を提供するのに十分であるように算出した。受容体遮断の実質的に高いレベルは、血小板機能の抑制に必要であることは既知である（血小板当たり約８０，０００のコピー）。したがって、イヌ科動物の免疫系は、この断片レベルでＩｇＧでオプソニン化される細胞を一掃する能力を有する。
【０１３２】
結果は、ヒトＩｇＧ１下部ヒンジの単一タンパク質分解開裂がｃ７Ｅ３  ＩｇＧの血小板クリアランス特性を破棄したことを示した。ここで、機能的不活性の単一開裂ＩｇＧを、ＩｄｅＳプロテアーゼでの部分的消化により、エクスビボで調製したが、本明細書に証明されるように、他のプロテアーゼは、同様の機能喪失を有するＩｇＧをもたらす。単一のＩｄｅＳ開裂は、インビトロ血小板抑制アッセイに示されるように、ｃ７Ｅ３の抗原結合特性に影響を及ぼさなかった。所見は、適さないタンパク質分解環境（例えば、ある腫瘍、細菌感染、炎症設定）に関連する病理学における宿主免疫系のある特定の欠点を説明するための機構を示唆した。
【０１３３】
研究所見は、ＩｇＧ内のタンパク質分解欠損を是正する手段を指摘した。つまり、特異的ｍＡｂ対タンパク質開裂部位は、不活性細胞結合抗体上に機能的Ｆｃドメインを沈着し、それによってＦｃ媒介エフェクター機能を回復しなければならない。
【０１３４】
ＩｇＧヒンジ内のＩｄｅＳ部位に対するモノクローナル抗体を、ウサギの免疫付与によって生成した。このｍＡｂ、２０９５−２は、ヒト定常領域を組み込むための修飾後、ＡＤＣＣ及び補体アッセイにおいて、不活性Ｆ（ａｂ’）2又は単一開裂ＩｇＧにインビトロ細胞死滅を容易に回復した。
【０１３５】
主要試験は、インビボｃ７Ｅ３  ＩｇＧのＩｄｅＳ生成タンパク質分解誘導体と組み合わせて２０９５−２を採用した。２段階プロトコルを、ｃ７Ｅ３が、第１に血小板に結合し、次いで、過剰な開裂部位特異的ｍＡｂの後に、血小板結合ｃ７Ｅ３との錯体に結合することが可能になるように設計した。カップリング抗開裂ヒンジＭａｂ及び開裂Ｍａｂの存在下で、血小板クリアランスは、無傷ｃ７Ｅ３  ＩｇＧ単独で誘発されたものより早く、即時的血小板クリアランスは、（ｃ７Ｅ３  Ｆ（ａｂ’）2で）著しかった。組み合わせた療法での血小板クリアランスの速さは、免疫細胞死滅／除去様式の強化を示唆する。
【０１３６】
実施例６：癌を治療するための開裂部位特異的ワクチン接種
ヒンジ類似ペプチドワクチン接種の使用は、侵襲性及び転移性癌等の慢性ヒト疾患を治療する可能性を有する。侵襲性癌を治療する手段として、開裂部位特異的指向ワクチン接種の有効性を試験するのに好適な、数々の侵襲性癌動物モデルが、現在存在する。
【０１３７】
ワクチン接種アプローチは、抗腫瘍ｍＡｂ療法単独と比較して著しく異なる薬力的プロファイルをもたらす。後者では、確立された腫瘍は、その表面上の特異的標的へのモノクローナル抗体の突然の投薬を受ける。腫瘍は、これらの細胞上の同一の抗原に対する、又は付加的な抗原に対する宿主抗体によって既に標的とされ得るか、又は標的とされ得ない。ワクチン接種戦略は、初期に開始された場合、生成される腫瘍成長部位又は侵襲部位に存在する任意の腫瘍表面開裂抗体に係合するために、開裂部位特異的宿主抗体の連続的及び比較的不変レベルを提供する。
【０１３８】
先述の感染モデルにおいて、ウサギの固有の体液反応を使用して証明されるように、一次反応の細胞標的は、ほぼ無関係であり、二次抗体波は、存在する任意の損傷した一次抗体にエフェクター機能を回復する。不活性化され、細胞結合結合宿主抗体は、開裂部位特異的Ａｂｓのための様々な抗原標的（及び表面位置）を提供するであろう。
【０１３９】
本明細書において証明されるように、細胞表面抗原に指向され、それを係合する単一又は二重開裂抗体は、開裂部位特異的抗原によって標的になることができ、それによって、無傷開裂部位特異的抗体によって提供されるエフェクター機能を使用して標的細胞を排除する宿主能力を回復する。別の、かつ著しく異なるアプローチは、転移性癌等の特定の疾患に関連するプロテアーゼによって誘発された開裂損傷部位に対して宿主を免疫付与することである。例えば、腫瘍細胞は、ヒンジ内のＩｇＧを開裂するマトリックス金属プロテアーゼを生産する。開裂部位に対するワクチン接種は、分子欠損に対抗し、その局所環境における免疫機能を増大させる宿主抗体を提供することができる。
【０１４０】
損傷したｍＡｂの標的は、詳しい特定に対する必要性なく、複数のタンパク質分解酵素の作用に対して保護するために、開裂部位特異的ペプチドの混合物を使用して、特異的であることができるか、又は多数の標的になることができる。
【０１４１】
したがって、本発明に従い、治療を必要とする対象の癌患者は、治療前、治療後、又は治療と同時に、癌を治療する抗体組成物内に開裂部位特異的抗体反応を生成するために、開裂部位ペプチド免疫原でワクチン接種される。一例では、免疫原は、配列番号１の残基１０〜１４であるアミノ酸配列Ｐ−Ｃ−Ｐ−Ａ−Ｐで終端する配列を有するＭＭＰ−３又はＭＭＰ−１２開裂部位ペプチドである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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