(57)【要約】  本発明は、とりわけ、生体分子を含む試料を分析するための方法であって、Ａ）ａ）前記試料を溶解して、溶解された試料を用意し、場合により、前記溶解された試料を清澄化するステップと、ｂ）前記溶解された試料の少なくとも一部を、前記分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物と接触させ、これにより再構成された組成物を用意するステップと、ｃ）前記再構成された組成物を用いて分析方法を行うステップとを含む、またはＢ）ａ）前記試料を溶解溶液と接触させ、これにより溶解混合物を用意するステップと、ｂ）前記溶解混合物を用いて、前記分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物を再構成し、これにより再構成された組成物を用意するステップと、ｃ）前記再構成された組成物を用いて分析方法を行うステップとを含み、前記再構成された組成物が、場合により清澄化され、ステップｂ）に続き、前記試料の溶解を支持する少なくとも１ステップが行われる、方法に関する。さらに、特に適合したプロセシングカートリッジおよびシステムが提供される。【選択図】図１２
2014533934.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子を含む試料を分析するための方法であって、
Ａ
ａ）前記試料を溶解して、溶解された試料を用意し、場合により、前記溶解された試料を清澄化するステップと、
ｂ）前記溶解された試料の少なくとも一部を、前記分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物と接触させ、これにより再構成された組成物を用意するステップと、
ｃ）前記再構成された組成物を用いて分析方法を行うステップと、
を含む、または
Ｂ
ａ）前記試料を溶解溶液と接触させ、これにより溶解混合物を用意するステップと、
ｂ）前記溶解混合物を用いて、前記分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物を再構成し、これにより再構成された組成物を用意するステップと、
ｃ）前記再構成された組成物を用いて分析方法を行うステップと、
を含み、前記再構成された組成物が、場合により清澄化され、ステップｂ）に続き、前記試料の溶解を支持する少なくとも１ステップが行われる、方法。
【請求項２】
前記溶解された試料および／または前記再構成された組成物の清澄化が、
ａ）溶解の前、間または後に、前記試料を、前記溶解された試料から生じる夾雑物、特に沈殿物と結合するための手段と接触させるステップ、
ｂ）前記溶解された試料または前記再構成された組成物の少なくとも一部をフィルターまたは膜に通過させるステップ、
ｃ）請求項２ａ）に記載の夾雑物、特に沈殿物と結合するための前記手段が、前記溶解された試料から生じる夾雑物、特に沈殿物と結合するステップ、
ｄ）前記夾雑物の結合が、前記溶解された試料から生じる夾雑物、特に沈殿物が、請求項２ａに記載の夾雑物と結合するための前記手段と結合するが、前記分析方法において分析される対象とする生体分子の実質的な結合が生じない条件下で生じるステップ、
ｅ）溶解の前、間または後に、前記試料が、前記溶解された試料から生じる夾雑物（contaminate）、特に沈殿物と結合する少なくとも１つの固体支持体と接触し、これにより前記沈殿物と複合体を形成し、前記複合体が、好ましくは分離されるステップ、
ｆ）溶解の前、間または後に、前記試料を、夾雑物、特に沈殿物と結合するための手段と接触させ、前記溶解混合物を用いて前記乾燥組成物の再構成が起こり、試料溶解が、前記再構成された組成物を加熱することにより促進され、これにより、前記溶解された試料から生じ、前記再構成された組成物に含まれる夾雑物、特に沈殿物が結合し、これにより清澄化された再構成された組成物を用意するステップ、および／または
ｇ）前記分析方法の１種または複数種の阻害剤と結合するおよび／またはこれを中和する少なくとも１種の化合物または組成物を添加するステップ、
のうち１つまたは複数を伴う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
溶解の前、間または後に、前記試料を、前記溶解された試料から生じる夾雑物と結合する少なくとも１つの固体支持体と接触させ、前記固体支持体が、次の特徴、
ａ）前記固体支持体が、粒子、プレートおよび他の粒子状物質からなる群から選択される、
ｂ）前記固体支持体が、前記溶解された試料から生じる夾雑物、特に沈殿物を前記固体支持体に結合させる表面を有する、
ｃ）前記固体支持体が、金属酸化物を含む、
ｄ）前記固体支持体が、シリカ表面を有する、
ｅ）前記固体支持体が、その表面に、夾雑物の前記固体支持体への結合を促進するための１種または複数種のリガンドを含み、好ましくは、前記リガンドは、イオン交換基、カルボキシル基、スルホン酸基およびシランリガンドからなる群から選択される、
ｆ）前記固体支持体が、その表面にカルボキシル基を含む、
ｇ）前記固体支持体が、分子篩、好ましくはゼオライトを含むまたはそれである、
ｈ）前記溶解された試料および／または前記再構成された組成物への前記固体支持体の取り込みが、前記溶解された試料および／または前記再構成された組成物のｐＨ値の上昇をもたらす、
ｉ）前記固体支持体が、磁性である、および／または
ｊ）前記固体支持体が、溶解溶液に含まれる、
のうち１つまたは複数を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記再構成プロセスが、次の特徴、
ａ）前記乾燥組成物を再構成するために、前記清澄化された溶解された試料の少なくともアリコートを、前記乾燥組成物と接触させる、
ｂ）前記乾燥組成物を再構成するために、前記溶解混合物の少なくともアリコートを、前記乾燥組成物と接触させる、
ｃ）所定の量の前記溶解された試料、前記清澄化された溶解された試料または前記溶解混合物が、再構成のために前記乾燥組成物に添加される、
ｄ）前記乾燥組成物と、前記溶解された試料、前記清澄化された溶解された試料または前記溶解混合物とを含む前記混合物を、かき混ぜて、前記再構成プロセスを補助する、および／または
ｅ）前記乾燥組成物と、（ｉ）前記溶解された試料、（ｉｉ）前記清澄化された溶解された試料または（ｉｉｉ）前記溶解混合物とを含む前記混合物を、磁石を用いて撹拌し、磁性材料が、前記乾燥組成物に含まれて、前記再構成プロセスを補助する、
のうち１つまたは複数を有する、請求項１から３のうち１項または複数項に記載の方法。
【請求項５】
前記試料の前記溶解が、次の特徴、
ａ）溶解が、前記試料の加熱、１種または複数種の酵素による処理、１種または複数種の化学物質の添加および／または機械的処理のうち１つまたは複数により達成または補助される、
ｂ）溶解が、前記試料を溶解溶液と接触させることにより達成され、好ましくは、溶解は、加熱により補助される、
ｃ）前記試料の溶解のため、好ましくは潜在的な阻害剤の非特異的な複合体形成により、前記続く分析方法の阻害を防止または低下させる少なくとも１種のポリマーが添加される、
ｄ）前記溶解溶液が、磁気撹拌子を含む、
ｅ）前記溶解溶液が、前記溶解物（lysate）を清澄化するための固体支持体を含む、
ｆ）前記溶解された試料を清澄化して、清澄化された溶解された試料を用意し、前記試料の前記再構成が、前記乾燥組成物と前記清澄化された試料の少なくとも一部との接触を伴う、および／または
ｇ）溶解が、前記乾燥組成物の前記再構成に続き行われる加熱ステップにより達成および／または補助される、
のうち１つまたは複数を有する、請求項１から４のうち１項または複数項に記載の方法。
【請求項６】
前記試料の前記溶解が、
（ａ）少なくとも１種の非イオン性界面活性剤または非イオン性洗剤の混合物と、
（ｂ）好ましくは潜在的な阻害剤の非特異的な複合体形成により、前記続く分析方法の阻害を防止または低下させる、少なくとも１種のポリマーと、
（ｃ）場合によりタンパク質分解酵素と、
（ｄ）場合により二価カチオンのキレート剤と、
（ｅ）場合により緩衝物質と、
を含む溶解溶液の添加を含む、請求項１から５のうち１項または複数項に記載の方法。
【請求項７】
前記試料の溶解および再構成が、
ａ）
（ｉ）前記試料を溶解溶液および夾雑物、好ましくは沈殿物を除去するための固体支持体と接触させて、これにより溶解混合物を生成するステップと、
（ｉｉ）少なくとも９０℃、好ましくは少なくとも９５℃の温度まで前記混合物を加熱するステップと、
（ｉｉｉ）５０℃を下回る温度まで前記溶解された試料を場合により冷却するステップと、
（ｉｖ）前記固体支持体および沈殿物を含む前記形成された複合体を分離することにより、前記溶解された試料を清澄化し、これにより清澄化された溶解物（lysate）を用意するステップと、
（ｖ）前記乾燥組成物を再構成するために前記清澄化された溶解物（lysate）を用いるステップと、
を含む、または
ｂ）
（ｉ）前記試料を溶解溶液および夾雑物、好ましくは沈殿物を除去するための固体支持体と接触させて、これにより溶解混合物を生成するステップと、
（ｉｉ）前記乾燥組成物を再構成するために前記溶解混合物を用いるステップと、
（ｉｉｉ）少なくとも９０℃、好ましくは少なくとも９５℃の温度まで前記再構成された組成物を加熱するステップと、
（ｉｖ）５０℃を下回る温度まで前記再構成された組成物を場合により冷却するステップと、
（ｖ）前記固体支持体および沈殿物を含む前記形成された複合体を分離することにより、前記再構成された組成物を清澄化し、これにより清澄化された再構成された組成物を用意するステップと、
を含む、または
ｃ）
（ｉ）前記試料を溶解溶液および夾雑物、好ましくは沈殿物を除去するための固体支持体と接触させて、これにより溶解混合物を生成するステップと、
（ｉｉ）前記乾燥組成物を再構成するために前記溶解混合物を用いるステップと、
（ｉｉｉ）前記再構成された組成物を、少なくとも９０℃、好ましくは少なくとも９５℃の温度を伴う少なくとも１回の加熱ステップを含む増幅反応に供するステップと、
を含む、請求項１から６のうち１項または複数項に記載の方法。
【請求項８】
−  前記分析方法が、次の特徴、
ａ）前記試料に含まれる生体分子、好ましくは核酸の分析を伴う、
ｂ）前記分析方法が、検出反応を含む、
ｃ）前記分析方法が、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃または少なくとも９５℃の温度を伴う少なくとも１回の加熱ステップを含む、
ｄ）前記分析方法が、増幅反応を含む、
ｅ）前記分析方法が、ＰＣＲまたは等温増幅反応を含む、
ｆ）前記分析方法が、少なくとも１回の加熱ステップを伴い、前記再構成された組成物に含まれる前記試料の溶解が、前記加熱ステップにより補助される、および／または
ｇ）前記分析方法が、清澄化のために添加される前記固体支持体の存在下で行われる
のうち１つまたは複数を有する、
および／または
−  前記乾燥組成物が、次の特徴、
ａ）凍結乾燥組成物である、
ｂ）前記企図される分析方法の実施に必要な試薬の少なくとも一部、好ましくは全てを含む、
ｃ）増幅反応の実施に必要な試薬の少なくとも一部、好ましくは全てを含む、
ｄ）ポリメラーゼ、増幅反応の実施に適した反応緩衝液（buffer）、ｄＮＴＰ、プライマーおよび／またはプローブからなる群から選択される試薬のうち１種または複数種、好ましくは全てを含む、および／または
ｅ）磁石を用いた再構成における前記組成物の混合を可能にすることにより、前記再構成プロセスの補助を可能にする磁性材料を含む、
のうち１つまたは複数を有する、
請求項１から７のうち１項または複数項に記載の方法。
【請求項９】
前記生体分子が、核酸であり、前記乾燥組成物が、凍結乾燥組成物であり、前記溶解された試料または前記再構成された組成物が清澄化される、請求項１から８のうち１項または複数項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１または請求項１から９のうち１項もしくは複数項に記載の生体分子を含む試料を分析するための方法における使用に適したプロセシングカートリッジであって、カートリッジ本体（３３）と、分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物を含む少なくとも１個の反応チャンバー（３８）とを含み、前記カートリッジ本体（３３）が、試料取入れ開口部（４）、少なくとも１個の試料排出口（５）ならびに前記試料取入れ開口部（４）および前記試料排出口（５）を接続する流体通路（６）を含み、前記試料排出口（５）が、前記反応チャンバー（３８）に開口し、前記カートリッジが、前記反応チャンバー（３８）に含まれる前記乾燥組成物の再構成が、前記試料取入れ開口部（４）を通って前記カートリッジに進入する試料により達成されるように設計されている、プロセシングカートリッジ。
【請求項１１】
次の特徴、
ａ）前記流体通路（６）が、チャネルおよび／または空洞のうち少なくとも１つを含み、前記カートリッジ本体（３３）の表面に少なくとも部分的に形成される、
ｂ）前記カートリッジ本体（３３）が、前記試料が前記試料取入れ開口部（４）を通って進入した後の既定の試料通路のためのチャネルおよび／または空洞のシステムを含む、
ｃ）前記カートリッジが、少なくとも２個の反応チャンバー（３８）を含み、前記試料のための前記流体通路（６）が、分岐し、少なくとも２個の試料排出口（５）において終わり、各試料排出口（５）が、異なる反応チャンバー（３８）中に開口する、
ｄ）前記１個または複数個の反応チャンバー（３８）が、前記カートリッジ本体（３３）に一体的に含まれる、
ｅ）前記１個または複数個の反応チャンバー（３８）が、前記カートリッジ本体（３３）に組み立てられる別個のデバイス（複数可）として提供される、
ｆ）前記カートリッジ本体（３３）が、少なくとも１個の反応チャンバー（３８）を前記カートリッジ本体（３３）に接続するための手段、好ましくは接続突出部（２０）を含む、
ｇ）前記カートリッジ本体（３３）が、複数の反応チャンバー（３８）および／または前記反応チャンバーを接続するための複数の手段、好ましくは接続突出部（２０）を含む、
ｈ）前記カートリッジ本体（３３）が、試料容器（３９）を前記カートリッジ本体（３３）に接続するための手段、好ましくは接続突出部（１０）を含む、
ｉ）前記容器（３９）が前記カートリッジ本体（３３）に組み立てられた場合、前記カートリッジ本体（３３）が、流体通路Ｂ（３）を通して前記試料容器（３９）と流体連絡した流体取入れ開口部Ｂ（１）を含み、空気が、前記流体排出口Ｂ（２）を経て前記試料容器（３９）に導入される、および／または
ｊ）前記容器（３９）が、前記カートリッジ本体（３３）に組み立てられた場合、前記カートリッジ本体（３３）が、前記試料容器（３９）内に位置するチューブ（３０）を含み、前記試料が、前記チューブ（３０）を経て前記試料取入れ開口部（４）に到達する、
のうち１つまたは複数を有する、請求項１０に記載のプロセシングカートリッジ。
【請求項１２】
前記乾燥組成物の再構成のために前記反応チャンバー（３８）に進入することができる液体の量を制御するための手段が設置された、請求項１０または１１に記載のプロセシングカートリッジ。
【請求項１３】
前記反応チャンバー（３８）および／または前記反応チャンバーを前記カートリッジ本体に接続するための前記手段（２０）が、空気等の流体が前記反応チャンバー（３８）を出ることができる少なくとも１個の流体開口部Ａ（７）を含む、請求項１０から１２のうち１項または複数項に記載のプロセシングカートリッジ。
【請求項１４】
流体が前記反応チャンバー（３）を出ることができる前記流体開口部Ａ（７）が、障壁（４０）を含み、前記障壁（４０）が、液体の通過を実質的に防止し、好ましくは、前記障壁（４０）が、次の特徴、
ａ）前記障壁が、少なくとも前記障壁が液体と接触する前に空気を通過させるが、前記障壁が、液体の通過を実質的に防止する、
ｂ）前記障壁が、膜またはフィルターである、
ｃ）前記障壁が、疎水性である、および／または
ｄ）前記障壁が、多孔性である
のうち１つまたは複数を有する、請求項１３に記載のプロセシングカートリッジ。
【請求項１５】
−  前記試料排出口（５）および／または前記流体開口部Ａ（７）が、反応チャンバー（３８）の側壁および／または前記反応チャンバーを前記カートリッジに接続するための前記手段（２０）の側壁に少なくとも部分的に含まれるチューブとして設計されている、
および／または
−  前記カートリッジ本体（３３）が、流体通路Ａ（９）により前記流体開口部Ａ（７）に接続されている流体排出口Ａ（８）を含む、
請求項１０から１４のうち１項または複数項に記載のプロセシングカートリッジ。
【請求項１６】
前記試料通路（６）および／または前記流体通路Ａ（９）の閉鎖を可能にする手段により特徴づけられる、請求項１０から１５のうち１項または複数項に記載のプロセシングカートリッジ。
【請求項１７】
前記試料通路（６）および／または前記流体通路Ａ（９）を覆う蓋（１５２）に圧力が加えられると、前記蓋（１５２）と併せて前記流体通路（６、９）の閉鎖を可能にする少なくとも１個の障壁（５４、１５４）が、前記試料通路（６）および／または前記流体通路Ａ（９）内に設置された、請求項１６に記載のプロセシングカートリッジ。
【請求項１８】
前記カートリッジ本体（３３）が、前記試料取入れ開口部（４）と流体接続するように配置された試料容器開口部を含む試料容器（３９）に組み立てられた、請求項１０から１７のうち１項または複数項に記載のプロセシングカートリッジ。
【請求項１９】
前記試料容器（３９）が、溶解組成物と混合された分析される試料を含有し、好ましくは、前記溶解組成物が、次の特徴、
ａ）
（ａ）少なくとも１種の非イオン性界面活性剤または非イオン性洗剤の混合物、
（ｂ）好ましくは潜在的な阻害剤の非特異的な複合体形成により、前記続く分析方法の阻害を防止または低下させる、少なくとも１種のポリマー、
（ｃ）場合によりタンパク質分解酵素、
（ｄ）場合により二価カチオンのキレート剤、および
（ｅ）場合により緩衝物質、
を含む溶解溶液である、
ｂ）磁気撹拌子を含む、および／または
ｃ）請求項３に記載の溶解物（lysate）を清澄化するための固体支持体を含む、
のうち１つまたは複数を有することを特徴とする、請求項１８に記載のプロセシングカートリッジ。
【請求項２０】
流体を含有し前記カートリッジ本体（３３）に組み立てることのできる試料容器（３９）から、前記カートリッジ本体（３３）に組み立てることのできるまたは前記カートリッジ本体（３３）の一体的な部分として設置されている少なくとも１個の反応チャンバー（３８）への流体接続の設置に適したカートリッジ本体であって、
−  試料取入れ開口部（４）および試料排出口（５）、
−  前記試料取入れ開口部（４）および前記試料排出口（５）を接続する試料通路（６）、
−  前記試料容器（３９）を接続するための試料容器接続突出部（１０）であり、前記試料容器（３９）を前記接続突出部（１０）に組み立てると、前記試料取入れ開口部（４）が前記試料容器（３９）と流体連絡する試料容器接続突出部（１０）、
−  反応チャンバー（３８）を接続するための少なくとも１個の反応チャンバー接続突出部（２０）であって、前記反応チャンバー（３８）を前記接続突出部（２０）に組み立てると、前記試料排出口（５）が、前記反応チャンバー（３８）と流体連絡する、および／または前記カートリッジ本体（３３）の一体的な部分として設置される少なくとも１個の反応チャンバー（３８）を含む反応チャンバー接続突出部（２０）、
を含み、少なくとも１個の流体開口部Ａ（７）が、前記反応チャンバー接続突出部（２０）および／または前記反応チャンバー（３８）に設置され、前記流体開口部（７）が、障壁（４０）を含み、前記障壁が、少なくとも前記障壁が液体と接触する前に空気を通過させるが、前記障壁が、液体の通過を実質的に防止する、カートリッジ本体。
【請求項２１】
前記障壁（４０）が、次の特徴、
ａ）前記障壁が、膜またはフィルターである、
ｂ）前記障壁が、疎水性である、および／または
ｃ）前記障壁が、多孔性である、
のうち１つまたは複数を有する、請求項２０に記載のカートリッジ本体。
【請求項２２】
次の特徴、
ａ）前記試料排出口（５）および／または前記流体開口部Ａ（７）が、チューブとして設計され、前記チューブが、反応チャンバー（３８）の側壁および／または前記反応チャンバー接続突出部（２０）の側壁に少なくとも部分的に含まれる、
ｂ）前記カートリッジ本体（３３）が、流体排出口Ａ（８）と、前記流体開口部Ａ（７）および前記流体排出口Ａ（８）を接続する流体通路Ａ（９）とを含む、および／または
ｃ）前記カートリッジ本体が、前記試料通路（６）および／または前記流体通路Ａ（９）の閉鎖を可能にする手段により特徴づけられる、
のうち１つまたは複数を有する、請求項２０または２１に記載のカートリッジ本体。
【請求項２３】
−  流体取入れ開口部Ｂ（１、１０１）および流体排出口Ｂ（２、１０２）、
−  前記流体取入れ開口部Ｂ（１、１０１）および前記流体排出口Ｂ（２、１０２）を接続する流体通路Ｂ（３、１０３）、
を含み、前記試料容器（３９）を前記試料容器接続突出部（１０）に組み立てると、前記流体排出口Ｂ（２）および前記試料取入れ開口部（４）が、前記試料容器（３９）と流体連絡する、請求項２０から２２のうち１項または複数項に記載のカートリッジ。
【請求項２４】
次の特徴、
ａ）前記流体通路を覆う蓋（１５２）に圧力が加えられると、前記蓋（１５２）と併せて、前記試料通路（６）および／または前記流体通路Ａ（９）の閉鎖を可能にする少なくとも１個の障壁（５４、１５４）が、前記試料通路（６）および／または前記流体通路Ａ（９）内に設置されている、
ｂ）前記試料排出口（４）および／または前記流体開口部Ａ（７）、好ましくは両方が、チューブとして設計され、前記チューブが、反応チャンバー（３８）の側壁の凸部および／または前記反応チャンバー接続突出部（２０）の側壁の凸部に少なくとも部分的に含まれる、
ｃ）側壁（１１）および底壁（１３）を含み、前記底壁（１３）の反対に開口部（１４）を場合により含む前記試料容器接続突出部（１０）であって、前記流体排出口Ｂ（２）および前記試料取入れ開口部（４）が、前記底壁（１３）または前記側壁（１１）の少なくとも１つに配置されている、
ｄ）側壁（２１）および底壁（２３）を含む前記反応チャンバー接続突出部（２０）であって、前記試料排出口（５）および場合により前記流体開口部Ａ（７）が、前記底壁（２３）または前記側壁（２１）の少なくとも１つに配置されている、
ｅ）前記カートリッジ本体（３３）が、第１の末端開口部（３１）および第２の末端開口部（３２）を備えるチューブ（３０）を含み、これにより、前記第１の末端開口部（３１）が、前記試料取入れ開口部（４）と整列し、好ましくは、前記チューブ（３０）が、硬質の長手方向に延在するチューブである、
ｆ）前記試料容器接続突出部（１０）の前記側壁（１１）および／または前記反応チャンバー接続突出部（２０）の前記側壁（２１）が、管状体を形成する、
ｇ）前記試料容器接続突出部（１０）の前記側壁（１１）が、前記試料容器の開口部に嵌まるように適合され、好ましくは、前記試料容器接続突出部（１０）の前記側壁（１１）が、管状体を形成し、前記管状体が、外部ねじ山（１５）を有する、および／または前記反応チャンバー接続突出部（２０）の前記側壁（２１）が、前記突出部（２０）に組み立てることのできる反応チャンバー（３８）の開口部に嵌まるように適合され、好ましくは、前記反応チャンバー接続突出部の前記側壁が、管状体を形成し、前記管状体が、外部ねじ山を有する、
ｈ）前記試料通路（６、１０６）が、前記カートリッジ本体（３３、１３３）の表面に形成されたチャネルまたは空洞により少なくとも部分的に設置される、および／または前記流体通路Ａ（９、１０９）が、前記カートリッジ本体（３３、１３３）の表面に形成されたチャネルまたは空洞により少なくとも部分的に形成される、および／または前記流体通路Ｂ（３、１０３）が、前記カートリッジ本体（３３、１３３）の表面に形成されたチャネルまたは空洞により少なくとも部分的に設置される、
ｉ）蓋（１５２）が、前記カートリッジ本体（３３、１３３）に取り付けられ、前記蓋が、前記試料通路（６、１０６）、前記流体通路Ａ（９、１０９）および／または前記流体通路Ｂ（３、１０３）の少なくとも一部を形成する前記チャネルまたは空洞を閉鎖し、前記蓋が、好ましくはホイルである、
ｊ）前記試料通路（６、１０６）が、前記カートリッジ本体（３３、１３３）の表面に形成されたチャネルまたは空洞により少なくとも部分的に形成され、前記流体通路Ａ（９）が、前記カートリッジ本体（３３、１３３）の表面に形成されたチャネルまたは空洞により少なくとも部分的に形成され、前記流体通路Ｂ（３、１０３）が、前記カートリッジ本体の表面に形成されたチャネルまたは空洞により少なくとも部分的に形成され、これにより、前記チャネルまたは空洞を閉鎖する蓋（１５２）が、前記カートリッジ本体（３３、１３３）に取り付けられる、
ｋ）前記流体取入れ開口部Ｂ（１、１０１）、前記流体排出口Ｂ（２、１０２）、前記試料取入れ開口部（４、１０４）、前記試料排出口（５、１０５）、前記流体開口部Ａ（７、１０７）および前記任意選択の流体排出口Ａ（８、１０８）が、前記カートリッジ本体（３３、１３３）の同一表面に配置されている、
ｌ）前記流体開口部Ａ（７）、前記流体取入れ開口部Ｂ（１）および／または前記任意選択の流体排出口Ａ（８）が、膜またはフィルター（４０）により閉鎖されている、
ｍ）前記カートリッジ本体（３３）が、さらに別の反応チャンバー（３８）を前記カートリッジ本体（３３）に接続するための少なくとも１個の追加的な反応チャンバー接続突出部（２０）を含み、前記さらに別の反応チャンバー接続突出部（２０）が、先行する請求項に記載の反応チャンバー接続突出部（２０）と同一の要素を含み、前記さらに別の反応チャンバー接続突出部（２０）の前記試料排出口（５）が、前記試料通路（６、１０６）と流体連絡する、および／または
ｎ）前記カートリッジ本体が、前記試料通路（６、１０６）と流体連絡した少なくとも１個の追加的な反応チャンバーを含む、
のうち１つまたは複数を有する、請求項２０から２３のうち１項または複数項に記載のカートリッジ本体。
【請求項２５】
請求項２０から２４のいずれか１項に定義されている特徴を有するカートリッジ本体（３３）により特徴づけられる、請求項１０から１９のいずれか１項に記載のプロセシングカートリッジ。
【請求項２６】
生体分子を含む試料の分析方法を行うためのシステムを用いて分析方法を行うための操作方法であって、前記システムが、
ａ）前記分析方法のための試薬を含む乾燥組成物を含む少なくとも１個の反応チャンバー（３８）を含む、請求項１０から１９および２５のうち１項または複数項に記載のプロセシングカートリッジ、
ｂ）前記プロセシングカートリッジに組み立てることのできる、生体分子を含む試料を受け入れるための試料容器（３９）、
ｃ）それに組み立てられた前記容器を含む前記プロセシングカートリッジを受け入れるための、かつ前記プロセシングカートリッジと併せて前記分析方法を行うためのプロセシングデバイス、
を含み、前記方法が、
ａ）試料を含む試料容器を、請求項１０から１９および２５のうち１項または複数項に記載のプロセシングカートリッジに接続するステップと、
ｂ）前記プロセシングカートリッジをプロセシングデバイスに挿入するステップと、
ｃ）完全に（fully）自動化されたアッセイを開始するステップと、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、溶解物（lysate）を清澄化させて、分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物を再構成するための方法、再構成された乾燥組成物を用いて生体分子を検出するための分析方法および試料のプロセシングに有用な特定のカートリッジを提供する。
【背景技術】
【０００２】
現在、生体試料をプロセシングし、そこに含まれている生体分子を検出および分析する迅速な分析方法に対する大きな需要がある。係る分析方法の必要条件は、対象とする生体分子が、分析可能な量かつ企図される分析方法に十分な純度で提供されるように、分析される生体分子、例えば、核酸が分析方法に利用されることである。分析のため、例えば、核酸を検出するため、例えば、広く用いられる方法は、対象とする核酸を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。ＰＣＲは、特異的プライマーを選択することにより、試料に含まれる核酸集団における対応する配列の存在を同定することができるため、当該分析方法である。その上、ＰＣＲ増幅産物（amplificate）それ自体が、さらなる分析の対象となり得る、例えば、これは、それ以外にも検出、配列決定、同定または分析することができる。等温核酸増幅および検出反応は、ＰＣＲの周知の代替法である。分析方法のこのカテゴリーの例は、ＬＡＭＰ（ループ媒介性等温増幅（loop mediated isothermal amplication））、ＲＰＡ（リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（recombinase polymerase amplification））、ｔＨＤＡ（ヘリックス依存性増幅（helix dependend amplification））、ＮＥＡＲ（ニッキング酵素増幅反応（nicking enzyme amplification reaction））、ＴＭＡ（転写増幅（transcription mediated amplification））およびＮＡＳＢＡ（核酸配列ベース増幅（nucleic acid sequence based amplification））である。
【０００３】
より大量の異なる試料を同時にプロセシングする必要がある事例が多いため、係る分析のために安価で時間節約的な方法を用いることが望ましい。従って、標的生体分子を最初に精製することなく分析することができ、従って、対象とする生体分子を含む粗溶解物（lysate）を用いて分析方法を行うことができることが望ましい（desireous）。最初に生体分子を単離する必要を克服することにより、時間および費用を節約することができる。不適切な条件または緩衝液（buffer）系が選ばれた場合、分析方法を十分な精度で行うことができないため、増幅反応等、分析方法において粗溶解物（lysate）を用いることができるようになるために、溶解条件は、慎重に選ばなければならない。特に、企図される分析方法を阻害し得る夾雑物を低下または中和させることが重要である。増幅反応における直接的な粗溶解物（lysate）の使用を可能にする適切な溶解緩衝液（buffer）は、例えば、特許文献１に記載されている。そこに開示されている溶解緩衝液（buffer）は、溶解物（lysate）に含まれるＰＣＲ阻害剤と結合するまたはそれを中和させるＰＶＰ等、結合剤または増粘剤を含む。しかし、依然として、増幅方法等、分析方法において直接的に用いることのできる溶解物（lysate）を用意するための改善された方法を提供する必要がある。特に、企図される分析方法に潜在的に干渉し得る夾雑物をより効率的に除去することができる溶解方法を提供する必要がある。
【０００４】
費用効果的に、また、特殊化されていない設備において分析方法を行うことができるようになるために、安価で単純に管理しやすい完全な生体分子分析プロセスを提供する必要がある。今日、感染性疾患の診断または癌検出およびモニタリングの遺伝子検査のための核酸の増幅を伴う分析方法は、診断検査室内における一般的な方法である。数多くの特殊化されたデバイスは、多くのプロトコールステップの自動化により検査の実施を容易にする。検査の大部分は現在、非携帯式で操作が複雑な器具を用いて中央集中型の検査室において行われている。現在、検査は一般に、アッセイを行うための高度な技能を有する人物を必要とする。その結果、特異的な核酸断片の含有が疑われる試料を得てから、その有無を決定するまでにかかる時間は、多くの場合数時間、場合によっては数日間である。しかし、他の種類の分析検査と同様に、医師らは、多くの場合、より速く、簡便で使い勝手のよい形式で得ることができる結果を必要とする。結果的に、速く簡便に核酸検査を行うことのできる携帯式分析システムの必要がある。その一方、いわゆる「一体型（integrated）」デバイスが設計され、また、構築において小型化の傾向が生じた。このような進化は、「ラボオンチップ（Lab-on-a-Chip）」（ＬｏＣ）システムをもたらし、そのうち最も精巧なものは、試料から結果へと診断検査をプロセシングすることができる。よって、小型化（minaturized）システム、例えば、カートリッジにおいて分析方法が行われるシステムを利用することができる。個々のカートリッジは、例えば、特許文献２、特許文献３、特許文献４および特許文献５に記載されている。
【０００５】
個々のカートリッジは、多くの場合、対象とする分析方法の実施に必要な試薬を乾燥形態、好ましくは凍結乾燥形態で含む。試薬の乾燥組成物は、分析方法、特に、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応等の増幅反応において、あるいはタンパク質等、他の分析物を検出するために広く用いられる。個々の乾燥組成物は通常、例えば、酵素、検出化合物、例えば、標識された抗体またはプローブ、緩衝液（buffer）、塩、オリゴヌクレオチドその他等、分析方法に必要な１種または複数種の試薬、あるいはさらには全試薬を含む。個々の乾燥組成物、特に、凍結乾燥組成物の使用は、貯蔵の際に乾燥組成物が安定的であるという利点を有し、従って、個々の凍結乾燥組成物は多くの場合、カートリッジにおいて行われる分析方法に必要なあらゆる試薬を提供するよう、カートリッジにおいて用いられる。個々の乾燥形態における試薬の提供は、顧客自身が、必要な試薬を組み合わせる必要がないという利点を有する。その代わりに、単に水または適した緩衝液（buffer）等、所定の量の液体が添加されて乾燥試薬を再構成し、これにより、例えば、核酸を含む試料が取り込まれると直ちに企図される分析方法を行うのに適した反応ミックスが提供される。そこで、試薬が適した濃度で提供されることを確実にするため、再構成プロセスのために既定の量の液体が添加されることが重要である。この目的のため、多くの場合、カートリッジと併せてポンプまたは分注デバイスが用いられる。その上、個々のカートリッジはまた、適した試薬および磁性粒子等の構成要素を設計および備えて、特にＰＣＲ方法等、企図される分析方法の実施に先立ち、試料から対象とする生体分子、特に、核酸を精製することができる。精製がこれらのシステムにおいて行われ、核酸が十分に純粋な形態で提供されて、特に、増幅方法等、分析方法が可能になることを確実にする。よって、公知のＬｏＣシステムは、カートリッジが幾分複雑な設計を有し、その上、カートリッジにおいて行われるプロセスも通常、分析方法の実施を可能にするために幾分複雑であるという問題点を有する。本システムは、チップ内において試料のプロセシングを行うために数種の試料プロセシング緩衝液（buffer）および他の溶液を必要とする。その上、試料プロセシングのために特定の容量の前記緩衝液（buffer）をプロセシングするために、込み入ったバルブ、ポンプおよび他の手段が必要とされる。これは、個々のカートリッジの費用を増加させる。よって、個々のカートリッジシステムを用いて企図される分析方法を行うためのより単純な方法の必要がある。その上、特に、より少ない費用で作製することができるより単純に設計されたカートリッジを提供する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１１／０１７７５１６号明細書
【特許文献２】国際公開第２００６／０７１７７０号パンフレット
【特許文献３】米国特許出願公開第２００９／０１３０６５８号明細書
【特許文献４】国際公開第２００６／０４２７３４号パンフレット
【特許文献５】ＤＥ１０２００８００４６４６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、上述の先行技術の方法およびシステムの少なくとも一問題点を克服すること、および／または上述の先行技術の方法およびシステムを向上させることである。その上、本発明の目的は、上述の必要のうち少なくとも１つに取り組むことである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の態様において、分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物の再構成を含む、生体分子を含む試料を分析するための分析方法が提供される。本明細書において、本発明者らは、先ず生体分子を精製する必要がない、あるいは乾燥組成物を再構成するために再構成緩衝液（buffer）または水等、再構成溶液を用いる必要がない、個々の乾燥組成物の再構成を可能にする迅速な方法を見出した。
【０００９】
第１の下位態様（sub-aspect）Ａにおいて、前記方法は、
ａ）試料を溶解して、溶解された試料を用意し、場合により、前記溶解された試料を清澄化するステップと、
ｂ）前記溶解された試料の少なくとも一部を、分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物と接触させ、これにより再構成された組成物を用意するステップと、
ｃ）前記再構成された組成物を用いて分析方法を行うステップと
を含む。
【００１０】
本発明者らは、驚くべきことに、溶解された試料を直接用いることにより、分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物を再構成することが可能であることを見出した。よって、先行技術の方法とは対照的に、溶解された試料を添加する前に、例えば、水または適した緩衝液（buffer）を添加することにより乾燥組成物を再構成する必要はない。逆に、好ましくは、特に沈殿物等の夾雑物を除いて清澄化された、溶解された試料を再構成のために直接的に用いることができる。よって、先ず生体分子を精製する必要および／または別個の液体を添加して乾燥組成物を再構成する必要はない。それどころか、溶解後に、溶解された試料は、再構成のために乾燥組成物と直接的に接触する。これは、相当に時間を節約し、個々のプロセスを、ＬｏＣシステムにおいて用いられるようなカートリッジのプロセシングにおける使用に特に適したものとする。生体分子を精製するための、および／または試料を再構成するための別個の試薬は必要ない。方法全体（個々にプロセシングするカートリッジ）は、溶解された試料により操作することができる。従って、溶解溶液により試料の溶解を行う場合、要求するプロセシングステップの全てを行うために１種の溶液のみが必要とされる。試料は、適切な溶解溶液において有利に直接的に収集し、これによりさらなるプロセシングステップを省くことができる。よって、驚くべきことに、対象とする分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物の使用を伴う分析方法を行うための、単純かつ迅速な方法が提供される。
【００１１】
第２の下位態様Ｂにおいて、前記方法は、
ａ）試料を溶解溶液と接触させ、これにより溶解混合物を用意するステップと、
ｂ）前記溶解混合物を用いて、分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物を再構成し、これにより再構成された組成物を用意するステップと、
ｃ）前記再構成された組成物を用いて分析方法を行うステップと
を含み、前記再構成された組成物が、場合により清澄化され、ステップｂ）に続き、前記試料の溶解を支持する少なくとも１ステップが行われる。
【００１２】
本発明者らは、試料が溶解される前に乾燥組成物を効率的に再構成することが可能であることも見出した。この変種において、溶解溶液と混合された試料を含む溶解混合物が、乾燥組成物を再構成するために用いられ、これはその結果、分析方法を行うための試薬に加えて試料および溶解溶液を含む、再構成された混合物として提供される。再構成後に、再構成された混合物に含まれる試料を（完全に）溶解するために、少なくとも１ステップ、好ましくは、加熱ステップが行われる。前記ステップは、ステップｃ）に先立ち、例えば、別個の中間ステップとして行うことができる。しかし、溶解は、分析方法の実施中に達成することもでき、あるいは完了することができる。これは、分析方法が加熱ステップを含む場合、特に実行可能である。これにより、方法は、プロセシングステップを省くことができる。
【００１３】
第２の態様において、本発明は、溶解された試料または溶解溶液と混合された試料を乾燥組成物に添加し、混合することにより、溶解された試料、好ましくは、清澄化された溶解された試料、あるいは分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物を再構成するための溶解溶液と混合された試料の使用に関する。
【００１４】
上に記す通り、本発明者らは、溶解された試料、好ましくは、清澄化された溶解された試料または溶解溶液と混合された試料を含む溶解混合物の少なくともアリコート（aliquot）を添加することにより、例えば、ＰＣＲ方法等、分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物を再構成することが可能であることを見出した。これにより、分析方法の実施に適した、再構成された組成物が提供される。好ましくは、使用前に清澄化された溶解された試料の直接的な使用は、時間および再構成試薬を省くことができるという利点を有する。その上、本発明者らは、試料および溶解溶液を含む溶解混合物を添加することにより、乾燥組成物の効率的な再構成を達成することが可能であることを見出した。これにより、再構成プロセスを相当に単純化することができる。
【００１５】
第３の態様において、本発明は、試料から沈殿物を除いて清澄化するための方法であって、試料が、溶解の前、間または後に、溶解された試料から生じる沈殿物と結合する少なくとも１つの固体支持体と接触し、これにより沈殿物と複合体を形成し、前記複合体が、場合により残りの試料から分離される方法に関する。
【００１６】
本方法は、清澄化された溶解された試料の提供において特に効率的である。本発明者らは、分析方法を阻害し得る沈殿物等の夾雑物を溶解された試料から除く清澄化に特に適した方法を開発した。例として示す通り、特に、増幅反応の実施を企図する場合、個々の方法は、溶解された試料から分析反応に持ち越される沈殿物により阻害され得るため、沈殿物の効率的な結合は、続く分析方法の性能を改善する。その上、例として示す通り、前記方法の使用は、再構成された組成物から個々の阻害性夾雑物を除く清澄化にも適している。
【００１７】
第４の態様において、試料に分子篩、好ましくはゼオライトを添加して、酸性試料のｐＨ値を上昇させるステップを含む、酸性試料のｐＨ値を上昇させるための方法が提供される。本方法は、例えば、酸性から中性、中性からアルカリ性のｐＨ範囲へと溶解された試料のｐＨ値を調整するために、有利に用いることができる。
【００１８】
第５の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に係る生体分子を含む試料を分析するための方法における使用に適したプロセシングカートリッジであって、カートリッジ本体と、分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物を含む少なくとも１個の反応チャンバーとを含み、前記カートリッジ本体が、試料取入れ開口部、少なくとも１個の試料排出口、ならびに試料取入れ開口部および試料排出口を接続する流体通路を含み、試料排出口が、反応チャンバーへと開口し、反応チャンバーに含まれる乾燥組成物の再構成が試料取入れ開口部を通ってカートリッジに進入する試料により達成されるように設計されている、プロセシングカートリッジに関する。
【００１９】
本発明者らは、先行技術のカートリッジと比較して著しく単純なカートリッジ設計を開発した。カートリッジ内で起こるプロセス全体は、試料投入開口部を通ってカートリッジに進入する試料により操作される。企図される分析方法を適切な感度および／または特異性で行うことができるように、乾燥組成物の再構成に適した形態で試料が提供される。この目的のため、試料は、一実施形態において、前処理された試料、例えば、上述の溶解された試料である。前処理は、試料の収集に用いられる容器において有利に行うことができ、この容器は、試料容器開口部が試料取入れ開口部と流体接続し、これにより前処理された試料がカートリッジ本体中に進入できるように、プロセシングカートリッジに組み立てることができる。試料取入れ開口部を通ってカートリッジに進入する試料は、好ましくは、溶解された試料、より好ましくは、清澄化された溶解された試料である。その上、試料は、試料および溶解溶液を含む溶解混合物となり得る。個々の溶解混合物において、試料の溶解はまだ完了していない。本明細書に示す通り、溶解は、例えば、分析中、例えばＰＣＲ反応において行われる単純な加熱ステップにより、前記溶解混合物を用いて乾燥組成物を再構成した後に完了することができる。よって、有利には、試料に含まれる生体分子を精製するための別個の手段、あるいは乾燥組成物の再構成を達成するためにリザーバから反応チャンバーへと水または緩衝液（buffer）等、液体を分注するための手段は、プロセシングカートリッジに提供されない。逆に、反応チャンバー内における乾燥組成物の再構成は、試料投入開口部を通してカートリッジに進入する試料により達成される。その単純な設計により、非常に少ない費用でのカートリッジの作製が可能である。その上、個々の単純なカートリッジ設計は、より複雑な設計よりも間違いを起こしにくい。
【００２０】
第６の態様において、流体を含有し、カートリッジ本体に組み立てることのできる試料容器から、カートリッジ本体に組み立てることのできるまたはカートリッジ本体に一体的な部分として接地されている少なくとも１個の反応チャンバーへの流体接続の提供に適したカートリッジ本体であって、
−  試料取入れ開口部および試料排出口、
−  試料取入れ開口部および試料排出口を接続する試料通路、
−  試料容器を接続するための試料容器接続突出部であり、試料容器を前記接続突出部に組み立てると、試料取入れ開口部が試料容器と流体連絡する試料容器接続突出部、
−  反応チャンバーを接続するための少なくとも１個の反応チャンバー接続突出部であって、反応チャンバーを前記接続突出部に組み立てると、試料排出口が反応チャンバーと流体連絡する、および／またはカートリッジ本体の一体的な部分として設置される少なくとも１個の反応チャンバーを含む反応チャンバー接続突出部
を含み、少なくとも１個の流体開口部Ａが、反応チャンバー接続突出部および／または反応チャンバーに設置され、前記流体開口部Ａが、障壁を含み、前記障壁が、少なくとも前記障壁が液体と接触する前に空気を通過させるが、前記障壁が、液体の通過を実質的に防止する、カートリッジ本体が提供される。
【００２１】
本発明の第６の態様に係るカートリッジ本体は、費用効率的な洗練された設計を含むという利点を有し、この設計は、本発明の詳細な説明においてさらに説明する通り、反応チャンバーに含まれる乾燥組成物の簡単な再構成を可能にする。試料取入れ開口部を通してカートリッジ本体に進入し、設置された流体通路を通って少なくとも１個の反応チャンバーに到達する試料による少なくとも１個の反応チャンバーの充填は、流体開口部Ａに含まれる液体に対する障壁により制御される。前記障壁は、好ましくは、空気（少なくとも加湿前の）を通過させるが、試料を実質的に通過させない多孔性疎水性膜である。試料は、疎水性膜に達すると前記膜を通り過ぎることができず、反応チャンバーの充填は自動的に停止し、これにより、好ましくは上述の清澄化された溶解された試料である所定の適切な量の試料により、乾燥組成物が再構成されることを確実にする。前記カートリッジ本体は、本発明の第５の態様に係るプロセシングカートリッジにおけるカートリッジ本体として有利に用いることができる。
【００２２】
第７の態様において、分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物を含む反応チャンバーを含む、本発明の第５の態様に係るプロセシングカートリッジの作製のための方法であって、
（ａ）ポリマーから少なくとも１個のチャネルおよび／または空洞を有するカートリッジ本体を作製して、カートリッジ本体の試料取入れ開口部とカートリッジ本体の少なくとも１個の試料排出口との間に流体通路を設置するステップと、
（ｂ）少なくとも１個の反応チャンバー中に試薬を置き、その中で試薬を乾燥させ、これにより分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物を含む反応チャンバーを用意するステップと、
（ｃ）カートリッジ本体の少なくとも１個のチャネルおよび／または空洞を蓋で閉鎖するステップと
を含む方法が提供される。
【００２３】
カートリッジの単純で効果的な設計により、その作製は、非常に費用効率的である。
【００２４】
第８の態様において、生体分子を含む試料の分析方法を行うためのシステムであって、
ａ）分析方法のための試薬を含む乾燥組成物を含む少なくとも１個の反応チャンバーを含む、本発明の第５の態様に係るプロセシングカートリッジ、
ｂ）プロセシングカートリッジに組み立てることのできる、生体分子を含む試料を受け入れるための容器、
ｃ）それに組み立てられた容器を含むプロセシングカートリッジを受け入れるための、かつプロセシングカートリッジと併せて分析方法を行うためのプロセシングデバイス
を含む、システムが提供される。
【００２５】
カートリッジの独自の設計のため、また試料容器内で試料をプロセシングして、乾燥組成物の再構成に適した前処理された試料、例えば清澄化された溶解された試料を用意する可能性のため、個々のシステムは、少ない費用で試料を自動的にプロセシングすることができるという利点を有する。その上、プロセシングデバイスは、幾分単純でサイズが小さいため、いかなる検査室または施設で用いることもでき、そこで試料が、例えば医療診断のポイントと併せて（in conjunction with point of care diagnostics）収集および分析される。
【００２６】
第９の態様において、本発明の第７の態様に係るシステムを用いて分析方法を行うための操作方法であって、
ａ）試料を含む容器を、本発明の第４の態様に係るプロセシングカートリッジに接続するステップであり、前記プロセシングカートリッジが、分析方法のための試薬を含む乾燥組成物を含む少なくとも１個の反応チャンバーを含む、ステップと、
ｂ）それに組み立てた試料容器を備えるプロセシングカートリッジをプロセシングデバイスに挿入するステップと、
ｃ）完全に（fully）自動化されたアッセイを開始するステップと
を含む方法が提供される。
【００２７】
プロセシングカートリッジの単純な設計と共に、乾燥組成物の再構成を包含するカートリッジ内のプロセス全体が、容器からカートリッジに進入する前処理された試料、好ましくは、清澄化された溶解物（lysate）または溶解混合物により操作されるという特色は、非常に費用効率的かつ信頼のおける方法の提供を可能にする。カートリッジへの収集された試料を含む容器の接続およびプロセシングデバイスへのカートリッジの挿入を別として、分析方法のための試料の調製に、手作業のステップは必要とされない。全物質および試薬（好ましくは、前処理組成物、好ましくは溶解溶液において収集された試料を除く）が、閉鎖された使い捨てカートリッジ中に用意される。その上、全プロセスが、閉鎖されたカートリッジシステム内で行われる。健康に対し潜在的に有害な物質（閉鎖されたカートリッジに残存する試料および試薬廃棄物）と使用者との直接的な接触はない。プロセシングカートリッジは、小型で単純に構造化されており、安価に作製できる。
【００２８】
当業者であれば、本願の他の目的、特色、利点および態様は、次の説明および添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。しかし、次の説明、添付の特許請求の範囲および特定の実施例が、本願の好ましい実施形態を示しつつ、単なる例証目的で記されていることを理解されたい。当業者であれば、次の記載を読むことにより、開示されている発明の精神および範囲内における様々な変更および修正が容易に明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
第１の態様において、試料の溶解と、分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物の再構成とを含む、生体分子を含む試料を分析するための分析方法が提供される。
【００３０】
第１の下位態様Ａにおいて、前記方法は、
ａ）試料を溶解して、溶解された試料を用意し、場合により、前記溶解された試料を清澄化するステップと、
ｂ）前記溶解された試料の少なくとも一部を、分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物と接触させ、これにより再構成された組成物を用意するステップと、
ｃ）前記再構成された組成物を用いて分析方法を行うステップと、
を含む。
【００３１】
驚くべきことに、本発明者らは、例えば、水または再構成緩衝液（buffer）等、このような目的のために通常用いられる液体の代わりに溶解された試料を用いることにより、分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物を再構成することが可能であることを見出した。再構成のために溶解された試料を用いることにより、企図される分析方法の実施に適した再構成された組成物が得られる。従って、先行技術の方法とは対照的に、生体分子の事前の精製および／または乾燥組成物の別個の再構成プロセスを時代遅れなものとすることにより、相当な時間およびプロセシングステップを省くことが有利に可能である。例として示す通り、溶解された試料を直接的に用いて、例えば、増幅反応等、分析方法を行うのに必要な試薬を含む乾燥組成物を再構成する場合、前記方法を効率的に行うことができる。再構成は通常、企図される分析方法に干渉し得る相当量の夾雑物を含まない水または他の液体により実質的に達成されるため、溶解物（lysate）を再構成に直接的に用いることができるということは、非常に驚くべきことであった。専ら溶解された試料を用いて再構成が成功し、企図される分析方法に適した再構成された組成物が得られることは、実に驚くべきことであった。
【００３２】
本明細書における用語「溶解」は、試料の破壊、分解および／または消化を指す。個々の溶解ステップにおいて、特に核酸等、生体分子は、細胞から放出させることができる、あるいは例えばタンパク質等、他の試料構成要素を除くことができる。本明細書において、特に核酸等、生体分子が細胞から放出されるにしろ、あるいは例えば、試料に含まれるタンパク質または他の物質から核酸等、生体分子を放出させるために溶解が行われるにしろ、これらにかかわりなく、本出願人らは、試料を破壊、分解および／または消化する個々のステップを一般に溶解ステップと言う。異なる試料材料の効率的な溶解の達成を可能にする数通りの方法が先行技術において知られている。適した溶解方法として、試料における機械的、化学的、物理的または酵素による作用が挙げられるがこれらに限定されない。個々の溶解ステップの例として、ビーズミルにおける試料の粉砕、超音波処理、表面音響波（ＳＡＷ）、凍結融解サイクルの反復、加熱、洗剤の添加、および／または例えばタンパク質分解酵素、例えばヒドロラーゼもしくはプロテアーゼ等、タンパク質分解化合物または塩の添加が挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態において、タンパク質分解化合物が、溶解において用いられる。好ましい実施形態において、タンパク質分解化合物は、タンパク質分解酵素である。タンパク質分解酵素は、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドにおけるペプチド結合の開裂を触媒する酵素を指す。例示的なタンパク質分解酵素として、プロテイナーゼおよびプロテアーゼ、特にズブチリシン、ズブチラーゼ（subtilase）、アルカリセリンプロテアーゼその他が挙げられるがこれらに限定されない。ズブチラーゼは、セリンプロテアーゼ、即ち、活性側にセリン残基を有する酵素のファミリーである。ズブチリシンは、広範な基質特異性を有する細菌セリンプロテアーゼである。例示的なズブチリシンとして、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＲ、プロテイナーゼＴ、ズブチリシン、ズブチリシンＡ、キアゲン（QIAGEN）プロテアーゼその他が挙げられるがこれらに限定されない。ズブチラーゼ、ズブチリシン、プロテイナーゼＫおよび他のプロテアーゼの記述は、とりわけ、ジェノフ（Genov）ら、Int. J. Peptide Protein Res. 45: 391-400, 1995に見出すことができる。好ましくは、タンパク質分解酵素は、プロテイナーゼＫである。好ましくは、タンパク質分解酵素は、加熱および／またはかき混ぜ下で用いられる。その上、例えば、リゾチーム、ザイモラーゼ（zymolase）および／またはペクチナーゼ（pektinase）等、１種または複数種の細胞壁消化酵素を溶解に用いることができる。適した溶解方法は、企図される分析方法にも依存する。分析方法のための試薬を含む乾燥組成物の再構成は、溶解された試料の添加により達成されるため、実施される溶解が、続く分析方法の実施を、分析方法を適切に行うことができない程度まで阻害し得る濃度で、続く分析方法の１種または複数種の阻害剤を導入しないことを確実にすることが重要である。耐容できる濃度は、行われる分析方法、例えば、用いられる酵素および阻害剤に対するその感受性ならびに分析方法の適切な実施に必要とされる感度に依存する。これらのパラ���ータは、試料毎にも変動し得る。本明細書において、溶解された試料の添加により再構成が達成されるという事実により、予め再構成された乾燥試薬の組成物に、溶解された試料のより少量のアリコートしか添加されない方法と比較して、通常より多量の生体分子が分析方法に導入されることを考慮しなければならない。このようなより多量の生体分子は、溶解された試料に含まれる夾雑物による分析反応の潜在的な阻害も代償し得る。
【００３３】
第２の下位態様Ｂにおいて、前記方法は、
ａ）試料を溶解溶液と接触させ、これにより溶解混合物を用意するステップと、
ｂ）前記溶解混合物を用いて、分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物を再構成し、これにより再構成された組成物を用意するステップと、
ｃ）前記再構成された組成物を用いて分析方法を行うステップと
を含み、前記再構成された組成物は、場合により清澄化され、ステップｂ）に続き、前記試料の溶解を支持する少なくとも１ステップが行われる。
【００３４】
上述の通り、本発明者らは、試料が完全に溶解される前に乾燥組成物を効率的に再構成することも可能であることを見出した。この変種において、溶解溶液と混合された試料を含む溶解混合物は、乾燥組成物の再構成に用いられ、従って、分析方法を行うための試薬に加えて試料および溶解溶液を含む再構成された混合物として提供される。溶解混合物において、試料の溶解は、少なくとも不完全である。再構成後に、再構成された混合物に含まれる試料を（完全に）溶解するために、少なくとも１ステップ、好ましくは加熱ステップが行われる。前記ステップは、ステップｃ）の前に、例えば、別個の中間ステップとして行うことができる。しかし、溶解は、分析方法の実施の間に達成または完了することもできる。分析方法が、例えばＰＣＲと同様に加熱ステップを含む場合、これは、特に実行可能である。これにより、本発明に係る方法のこのような変種は、プロセシングステップを省くことができる。
【００３５】
本発明の第１の態様に係る方法の両方の下位態様は、多くの共通の特色を共有するため、続いて両方の方法の共通のステップをまとめて記す。
【００３６】
一実施形態において、試料は、生体試料の溶解を達成および／または促進する化学物質および／または試薬を含む溶解組成物、好ましくは溶解溶液と接触する。溶解溶液の組成に応じて、溶解は、直接的に開始することができる。一部の実施形態において、溶解は、追加的な手段、例えば、加熱ステップの実施により促進、従って補助される。好ましい実施形態において、試料の溶解は、試料を適切な溶解緩衝液（buffer）と接触させ、加熱することにより達成される。上に示す通り、また、例において示す通り、試料の溶解は、溶解された試料を再構成のために乾燥組成物と接触させる前に達成することができる。しかし、溶解は、試料および溶解溶液を好ましくは混合物として乾燥組成物に添加した後に、個々に完了して達成することもできる。例えば、再構成された混合物は、再構成された混合物内で試料の溶解を達成および／または完了するために加熱することができる。本実施形態は、ＰＣＲ反応等、加熱ステップを伴う分析方法を行う場合、特に適している。
【００３７】
核酸が対象とする生体分子である場合に特に適した一実施形態において、溶解溶液は、構成要素として（ａ）非イオン性界面活性剤または非イオン性洗剤の混合物を含む試料に添加される。非イオン性洗剤は、好ましくは、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ポリソルベートおよびアルキルフェノールエトキシレート、好ましくはノニルフェノールエトキシレート、アルキルグルコシドおよび／またはポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群から選択される。用語「脂肪アルコール」は、本発明の目的のため、６〜２２個の炭素原子、好ましくは８〜２０個の炭素原子、優先的には１０〜１８個の炭素原子、特に好ましくは１２〜１８個の炭素原子の鎖長を有するアルコールを特に意味する。優先度は、１２、１４、１６または１８個の炭素原子を有するアルコールに特に与えられる。脂肪アルコールは、モノまたはポリ不飽和となり得るが、好ましくは、飽和脂肪アルコールである。用語「ポリオキシエチレン」は、本発明の目的のため、ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ単位（式中、ｎは、好ましくは、２〜１５０の整数であり、さらに好ましくは４〜１２０であり、さらになお好ましくは８〜８０であり、最も好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０から選択される整数である）を特に意味する。適したポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルの好ましい例は、単独でまたは混合物として用いることのできるポリエトキシル化ラウリル、セチル、オレイルまたはステアリルアルコールである。本発明の好ましい実施形態において、少なくとも１種のポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルは、６〜２２個の炭素原子を有する脂肪アルコール構成要素と、２〜１５０個の（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）単位を有するポリオキシエチレン構成要素とを含む。好ましくは、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルは、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテルおよび／またはポリオキシエチレンオレイルエーテルからなる群から選択される。アルキルグルコシドとして、好ましくは、ポリソルベート、好ましくはポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリソルベート４０またはポリソルベート８０、より好ましくはポリソルベート２０の群に由来する非イオン性洗剤が用いられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルの好ましい例として、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０が挙げられる。好ましくは、少なくとも２種の個々の非イオン性洗剤が、溶解溶液に含まれる。一実施形態において、溶解溶液における構成要素（ａ）は、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０（ノニルフェニルポリエチレングリコール）およびＢｒｉｊ５８からなる群から選択される。好まし���は、少なくとも２種の個々の非イオン性洗剤は、溶解溶液において構成要素（ａ）として含まれる。用いられる溶解溶液における非イオン性界面活性剤または非イオン性洗剤の混合物の濃度は、０．０５〜５％の間、好ましくは０．１％〜２％の間、より好ましくは０．２％〜１．５％の間、最も好ましくは０．４％〜１％の間である。好ましくは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および／またはＴｗｅｅｎ  ２０が、溶解溶液における構成要素（ａ）として含まれる。
【００３８】
構成要素（ｂ）として、溶解溶液は、続く分析方法の阻害を防止または低下させる少なくとも１種のポリマーを含む。よって、溶解溶液へのポリマーの取り込みは、例えば増幅反応等、続く分析方法が、前記ポリマーが溶解溶液に取り込まれない場合と比較して、前記ポリマーが溶解溶液に取り込まれる場合に性能の改善を示すという効果を有する。ポリマーは、潜在的な阻害剤を非特異的に複合体形成させることにより阻害を防止または低下させると仮定される。いかなる化合物が阻害剤として作用するかは、続いて行われる分析方法にも依存する。例えば、核酸を含む試料から通常生じる核酸増幅反応の通常の阻害剤として、プロテオグリカン、タンパク質および糖が挙げられるがこれらに限定されない。ポリマーは、好ましくは、０．０５〜０．５％、好ましくは０．０８５％〜０．２％の範囲内の濃度で溶解溶液に含まれる。また、ポリマーの混合物を用いてもよい。一実施形態において、ポリマーは、結合剤および／または増粘剤として作用し、好ましくは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリオキサゾリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールおよびＬｕｖｉｔｅｃから選択される。好ましくは、ポリビニルピロリドンが溶解溶液に取り込まれる。この目的に用いることのできる適した結合剤および／または増粘剤は、国際公開第２０１０／００３４９３号パンフレットにおいても記載されている。例において示す通り、ＰＶＰ等、係る結合剤および／または増粘剤は、増幅反応の阻害の防止において非常に効率的である。溶解された試料または清澄化された溶解された試料に含まれる夾雑物の阻害性効果を防止または低下させるための追加的な化合物が、溶解溶液に取り込まれてもよい。
【００３９】
構成要素（ｃ）として、溶解溶液は、少なくとも１種の酵素、好ましくはタンパク質分解酵素を含み得る。適したタンパク質分解酵素は、上に記載されている。好熱性プロテイナーゼ、特に好ましくは、プロテイナーゼＫまたはズブチリシンの中から選択される好熱性プロテイナーゼを用いることが好ましい。溶解溶液において好熱性プロテイナーゼＫを用いることが非常に特に好ましい。プロテイナーゼは、好ましくは、溶解溶液１ミリリットル当たり０．５〜１０μユニット、好ましくは１．５〜４μユニット（国際単位）をもたらすような量で用いられる。しかし、タンパク質分解酵素は、別個に添加してもよい。
【００４０】
一実施形態において、溶解溶液は、構成要素（ｄ）として、二価カチオンの少なくとも１種のキレート剤を含む。適したキレート剤として、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジニトリロ四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸およびＮ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン（ＮＴＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施形態において、ＥＤＴＡが用いられる。本明細書において、用語「ＥＤＴＡ」は、例えば、Ｋ2ＥＤＴＡ、Ｋ3ＥＤＴＡまたはＮａ2ＥＤＴＡ等、とりわけＥＤＴＡ化合物のＥＤＴＡ部分を示す。ＥＤＴＡ等、キレート剤の使用は、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ等、ヌクレアーゼが阻害されるという有利な効果を有する。キレート剤は、好ましくは、溶解溶液において０．５ｍＭ〜５ｍＭ、好ましくは０．７５ｍＭ〜２ｍＭ、最も好ましくは１ｍＭ〜１．５ｍＭの濃度で用いられる。好ましくは、ＥＤＴＡが用いられる。
【００４１】
一実施形態において、溶解溶液は、構成要素（ｅ）として、少なくとも１種の緩衝物質を含む。緩衝物質は、続く分析方法の実施に必要とされるｐＨ範囲と適合するｐＨ範囲に溶解溶液を緩衝することができる筈である。これは、溶解された試料のｐＨが、溶解に用いられる溶液により強く影響され、溶解された試料が、分析方法のための試薬を含む乾燥組成物の再構成に用いられるためである。好ましくは、緩衝液（buffer）は、溶液のｐＨが、７．５〜１１の間、より好ましくは７．５〜９となるように、溶解溶液において用いられる。個々に緩衝された溶解溶液は、核酸増幅反応の実施に適した試薬を含む乾燥組成物の再構成に特に適している。ｐＨ緩衝物質は、５ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜８０ｍＭ、より好ましくは３０〜５０ｍＭの濃度で溶解溶液に含まれ得る。好ましくは、緩衝物質は、Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳまたはホスフェートからなる群から選択される。
【００４２】
特に好ましい溶解溶液は、
−  構成要素（ａ）として、各非イオン性洗剤が０．２％〜０．６％、好ましくは０．４％〜０．５％の濃度で含まれている、２種の非イオン性洗剤、好ましくはポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）およびノニルフェニルポリエチレングリコール（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０）の混合物、
−  構成要素（ｂ）として、０．０５％〜０．１５％、好ましくは０．１％の濃度の、好ましくはＰＶＰであるポリマー、
−  場合により、構成要素（ｃ）としてプロテイナーゼＫ等、タンパク質分解酵素、
−  構成要素（ｄ）として、１．５ｍＭを下回る濃度のＥＤＴＡ、
−  構成要素（ｅ）として、７．５ｍＭ〜２０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭの濃度の緩衝物質、好ましくはＴＲＩＳ
を含む。
【００４３】
個々の溶解溶液のｐＨ値は、好ましくは、およそ８．０〜９．０の間、優先的にはｐＨ８．５である。
【００４４】
上述の溶解溶液は、加熱ステップと組み合わせた場合、試料の溶解において特に効果的である。この目的のため、試料および溶解溶液を含む溶解混合物は、少なくとも３分間、好ましくは少なくとも５分間、少なくとも９０℃、好ましくは少なくとも９５℃の温度まで加熱される。好ましくは、次に、加熱された試料は、５０℃を下回る温度まで冷却され、より好ましくは、少なくとも室温まで冷却される。本明細書において、個々の冷却ステップが、それ自体を個々に構成する夾雑物で構成される沈殿物の生成を促進することが判明した。効率的な沈殿物生成および後述する清澄化ステップの実施による沈殿物の除去／結合は、夾雑物を効率的に枯渇させて、残る溶解された試料をもたらす。溶解溶液が、タンパク質分解酵素を含むおよび／または組み合わせて用いられる場合、タンパク質分解酵素が働くのに適した温度、例えば、７０℃を下回る、好ましくは６５℃を下回る、より好ましくは６０℃を下回る温度で、好ましくは、かき混ぜ処理と組み合わせて、溶解混合物をインキュベートすることが好ましい。前記インキュベーション後に、より高温の加熱ステップが行われる。係る加熱ステップは、本明細書において煮沸溶解とも称される。試料の効率的な溶解を達成するためのこの一連のプロセシングステップは、試料が効率的に溶解され、タンパク質分解酵素が変性されるという利点を有する。記載されている溶解溶液は、個々の増幅反応を実質的に阻害し得る濃度で構成要素を含まないため、ＰＣＲ等、増幅反応の実施に特に適合する。
【００４５】
試料を溶解組成物と接触させた後、その結果得られた混合物は、好ましくは、完全な混合物を確実にするためにかき混ぜられる。混合は、さらに詳細に後述する通り、ボルテックスすることにより、空気等の気体を混合物中に導入することにより、あるいは磁気撹拌することにより補助することができる。一実施形態において、溶解溶液は、撹拌子を動かすための磁石を用いる場合、試料の混合の補助に用いることのできる少なくとも１個の磁気撹拌子を含む。
【００４６】
続く分析方法の性能を改善するため、特にＰＣＲ反応等の増幅反応を実施する場合、再構成のために乾燥組成物と溶解物（lysate）を接触させる前に溶解物（lysate）を清澄化することが好ましい。従って、本実施形態において、乾燥組成物の再構成は、清澄化された溶解された試料の少なくとも一部（アリコート）と乾燥組成物との接触および混合を伴う。溶解された試料を清澄化するための数種類の選択肢が存在する。非限定的な例を後述する。その上、個々の清澄化ステップは、再構成された組成物に含まれる夾雑物の除去および／または不活性化にも有利である。上述の通り、本発明の第１の態様に係る方法の下位態様Ｂに係る方法において、試料の溶解は、溶解混合物により乾燥組成物が再構成された後に達成および／または完了される。従って、特に、上述の通り熱処理が行われる場合、生じる夾雑物は個々に、試料の溶解の際に放出され、例えば、プロテオグリカン、タンパク質および糖は、再構成された組成物中に放出され、個々の夾雑物は、そこで沈殿物を生成することができる。一実施形態において、個々に再構成された組成物は、分析方法を行う前に清澄化される。再構成された組成物を清澄化するための数種の選択肢が存在する。非限定的な例を後述する。
【００４７】
一実施形態において、試料を、溶解の前、間または後に、溶解された試料から生じる夾雑物を除去するための手段と接触させる。これにより、清澄化された溶解された試料または清澄化された再構成された組成物を提供することができる。夾雑物が全て除去される必要はない。そうではなく、夾雑物の量は単に、企図される分析方法を適切に行うことができ、特に必要な感度および／または特異性をもたらすことができるレベルまで除去される必要がある。一実施形態において、続く分析方法の阻害剤を除去または不活性化するために、化学的試薬が用いられる。ポリマー、特にＰＶＰ等、適した化合物は、既に上に記載されている。溶解の間に直接的な夾雑物の効率的な除去を達成するために、溶解の前または間にこれらの試薬を添加することが好ましい。試薬は、好ましくは溶解溶液に取り込まれる。
【００４８】
混入の主要な起源は、特に、細胞含有試料をプロセシングする場合、溶解における沈殿物の生成である。個々の沈殿物は、特に、溶解において試料が加熱される際に生成される。溶解された試料から例えば増幅反応または検出反応等の分析方法への沈殿物の持越しは、前記分析方法および／または得られた結果の解釈を激しく妨害することができる。従って、個々の沈殿物を複合体形成させ、好ましくは、残りの溶解された試料から複合体を分離する、例えば、清澄化された溶解された試料を用意することが有利である。分離は、例えば、沈降または遠心分離により補助され得る。前記ステップがこの目的のために行われる場合、沈殿物は、例えば、清澄化された溶解物（lysate）または清澄化された再構成された組成物に対応する上清を残してチューブの底に沈降させることができる。沈降は、例えば、遠心分離により加速および改善され得る。しかし、沈殿物の分離を補助することが好ましい。夾雑物が残りの試料から除去されるため、沈殿物の複合体形成は、その時点で清澄化効果を有する。しかし、残りの試料から夾雑物の少なくとも一部を分離することが好ましい。
【００４９】
一実施形態において、溶解の前、間または後に、沈殿物を除去し、これにより清澄化された溶解物（lysate）または清澄化された再構成された組成物を用意するための手段が提供される。この関連において用いられる用語、除去は、続く分析方法を適切に行うことのできる程度まで沈殿物の量が少なくとも低下することを意味する。一実施形態において、試料の溶解を支持するための、あるいはさらには達成するためのステップが行われた溶解物（lysate）の少なくとも一部および／または再構成された組成物の少なくとも一部は、溶解された試料の通過または再構成された組成物の通過の際に沈殿物を食い止めるまたは除去することのできる手段を通過する。適した手段は、フィルター材料、膜もしくは層または沈殿物と結合する粒子の充填を含む群から選択され得る。溶解された試料または再構成された組成物は、前記手段を通過し、沈殿物は、捕捉され、前記手段により個々に食い止められ、これにより、試料がフィルターを通過した後に清澄化された試料を提供する。例えば、フィルターまたは膜等、前記手段は、多孔性となり得る。孔は、溶解された試料または再構成された組成物中に存在する沈殿物を効率的に食い止め、従って除去するために十分に小さくなる必要がある。
【００５０】
好ましい実施形態において、試料を、溶解の前、間または後に、沈殿物と結合する少なくとも１つの固体支持体と接触させ、これにより沈殿物と複合体を形成する。当然ながら、また、例えば、固体支持体としてビーズ等の粒子を用いる場合、２個以上の複合体を形成してもよい。よって、本明細書における用語「複合体」は、複数の複合体も指す。固体支持体への結合は、好ましくは、非特異的であり、吸着により達成される。複合体は、好ましくは、残りの溶解物（lysate）、個々に残りの再構成された組成物から分離され、これにより、清澄化された溶解物（lysate）を提供する。複合体の分離は、沈降、遠心分離により、あるいは磁性固体支持体が用いられる場合は磁性分離により補助され得る。例えば、複合体は、容器の底に濃縮することができ、清澄化された溶解された試料に対応する上清を得ることができる。固体支持体への沈殿物の結合は、複合体の沈降を補助し、従って、残りの試料から沈殿物の除去を楽にする（alleviate）。しかし、例において示す通り、固体支持体の添加はまた、複合体が除去されず、従って分析方法の間に存在する場合も、沈殿物等、含まれている夾雑物の阻害性効果が低下するという点において有益であり清澄化効果をもたらす。明らかなことに、結合している沈殿物は利用できず、従って不活性化されているため、固体支持体に結合させることによる沈殿物の複合体形成は、有益な効果を既にもたらしている。
【００５１】
一実施形態において、固体支持体は、粒子、プレートおよび他の粒子状物質からなる群から選択される。一実施形態において、固体支持体は、溶解物（lysate）または再構成された組成物中に存在する夾雑物、特に沈殿物と結合する表面を有する。用語「結合」は、広義で用いられており、前記夾雑物の少なくとも一部を固体支持体と共に除去することができる、固体支持体と夾雑物、特に沈殿物とのいずれかの相互作用を指す。結合は、好ましくは、吸着により達成される。
【００５２】
一実施形態において、金属酸化物を含むまたはこれからなる鉱物粒子は、溶解された試料を清澄化するためのまたは再構成された組成物を清澄化するための固体支持体として用いられる。適した固体支持体の例として、例えば、シリカ粒子またはガラス粒子等、シリカ表面を有する固体支持体や、ポリマー支持体が挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態において、固体支持体は、含水ケイ酸含有酸化物吸着性表面を有する。しかし、固体支持体は、沈殿物を結合するための適した表面を生じる、あるいは沈殿物の結合を改善する１種または複数種のリガンドを含んでいてもよい。一実施形態において、リガンドは、イオン交換基からなる群から、好ましくは、カルボキシル基、スルホン酸基およびシランリガンド等、陽イオン交換基の群から選択される。また、個々のリガンドの組合せを用いることもできる。固体支持体は、下流の分析方法の阻害剤、例えば、増幅反応の阻害剤と結合するリガンドまたは化合物をその表面にさらにまたはその代わりに含むことができる。適した例は上に記載されている。好ましくは、固体支持体は、カルボキシル基を含む表面を有する。
【００５３】
溶解された試料から沈殿物を除去するために適した表面をもたらす例示的な固体支持体は、例えば、ガラス、シリカ、ポリマーまたはコーティングされた材料から作製されたビーズまたは粒子としても知られる小球を包含する。特に好ましい実施形態において、粒子等、固体支持体は磁性である。しかし、例えば容器等、例えば試料の収容に用いられる消耗品の内部表面を改変することも本発明の範囲内に収まる。試料と接触する容器の内部壁の少なくとも一部が、個々のリガンドを含む場合、沈殿物は、前記表面と結合、好ましくは吸着し、これにより試料壁に固定化され得る。これは、沈殿物の量が低下した、清澄化された溶解された試料の、例えば上清としての回収を可能にする。
【００５４】
固体支持体、それぞれ夾雑物と結合するために提供された表面への特に沈殿物等、前記夾雑物の結合は、夾雑物は固体支持体と結合するが、対象とする生体分子は結合しないまたはより低い程度で結合する条件下で起こる。従って、用いられる溶解条件は、主に、特に沈殿物等の夾雑物は固体支持体、それぞれ表面と結合、好ましくは吸着するが、対象とする生体分子は実質的に結合せず、溶解された試料または再構成された組成物中に十分な量で残り、企図される分析方法の実施を可能にするという点において選択的である。
【００５５】
好ましくは、沈殿物と結合するための固体支持体は、溶解溶液に含まれる。これにより、試料の溶解により生成されるあらゆる沈殿物が、その生成後に固体支持体に直接的に結合し、これにより複合体を形成することが確実になる。これにより、沈殿物は、残りの試料から枯渇される。沈殿物等、夾雑物の除去に用いられる固体支持体の存在下における溶解の実施は、達成される清澄化の結果を改善する。この結果は恐らく、沈殿物が、生成されつつ直接的に結合することができるためである。これは、乾燥組成物の再構成前に溶解が達成されるか、あるいはその後に溶解が達成されるかにかかわらない。
【００５６】
一実施形態において、固体支持体は、分子篩を含むまたは分子篩である。分子篩は、吸着剤として用いることのできる正確かつ均一なサイズの小孔を含有する材料である。好ましくは、分子篩は、アルミノケイ酸塩鉱物、粘土、多孔性ガラス、微小孔性チャコール（charcoals）、ゼオライト、活性炭素またはそこを通して水等の小分子が拡散することのできる開放構造を有する合成化合物を含む。例として示す通り、ゼオライト等、分子篩は、溶解された試料からの沈殿物等、夾雑物の除去において特に効果的である。分子篩は、好ましくは溶解溶液である溶解組成物に添加することができる。分子篩は、上述の固体支持体に加えて用いることもできる。
【００５７】
腟スワブ試料等の酸性試料をプロセシングする場合、固体支持体としてのゼオライト等の分子篩の使用は、ゼオライトが、溶解された試料および／または溶解混合物のｐＨ値を上昇させることができるという特定の利点を有する。例えば増幅反応等の多くの分析方法は、酸性ｐＨ値で適切に機能しないため、この利点は有益である。増幅反応の実施に必要な試薬を含む乾燥組成物に多くの場合含まれる緩衝物質は、再構成のために添加された酸性の溶解された試料、個々に酸性の溶解混合物の量により、多くの場合、再構成された組成物のｐＨ値を所望の個々に必要とされるｐＨ範囲に維持することができない。溶解混合物の調製、特に清澄化された溶解物（lysate）の調製の際にゼオライトを取り込む場合、この問題を克服することができる。例えば、ゼオライトの添加は、酸性ｐＨ値から７〜９．５、好ましくは７．５〜９の間のｐＨ値へのｐＨ値上昇を可能にし、これにより例えば増幅反応、特にＰＣＲ等、個々の範囲内のｐＨ値を必要とする分析方法の性能をさらに改善することができる。従って、一実施形態において、溶解の前、間または後に少なくとも１種の固体支持体が添加され、この操作は、溶解された試料のｐＨ値が上昇するという効果を有する。本実施形態は、７を下回る、６．５を下回る、６を下回る、５．５を下回る、５を下回るまたは４．５を下回るｐＨを有する酸性試料をプロセシングする場合に特に適している。好ましくは、分子篩、より好ましくはゼオライトがこの目的のために用いられる。分子篩は、カルボキシル化粒子等の沈殿物と結合する他の固体支持体に加えて添加することもできる。
【００５８】
上に記す通り、固体支持体は、好ましくは磁性である。好ましくは、固体支持体は、溶解組成物、好ましくは溶解溶液に取り込まれる。磁気撹拌子と併せて固体支持体として磁性粒子を用いる場合、溶解の際のかき混ぜを非常に効果的に達成することができる。次に、前記方法は、本明細書においてこれを参照することにより援用されているＤＥ１０２００７０４５４７４に記載されている方法に相当し得る。一実施形態において、溶解溶液は、固体支持体として多数の磁性粒子、ならびに撹拌子として用いられる、好ましくはロッド、ダンベルおよび／または楕円体の形状で構成された、少なくとも１個の磁性および／または磁化可能な中心要素を含む。磁性および／または磁化可能な中心要素は、多数の磁性粒子よりも大きい。磁性粒子は、試料と混合される溶解溶液中に分布する。磁性粒子は、続いて少なくとも１個の中心要素上に蓄積する。磁性材料を用いた撹拌および／または混合は、磁性材料と相互作用するよう構成された少なくとも１個の外部磁石、例えば永久磁石または電磁石の使用により補助される。個々の磁性粒子は、有益な清澄化効果をさらにもたらすため、磁性粒子として、好ましくは、上述の通り磁性固体支持体が用いられる。
【００５９】
一実施形態において、清澄化ステップは、続く分析方法の１種または複数種の阻害剤、特に増幅反応の阻害剤と結合および／またはこれを中和する少なくとも１種の化合物または組成物の使用を追加的にまたはその代わりに伴う。好ましくは、前記化合物または組成物は、溶解のために試料に添加される溶解溶液に含まれる。
【００６０】
好ましい実施形態において、試料の溶解および再構成は、
（ｉ）試料を、上述の通り溶解溶液および沈殿物を除去するための固体支持体と接触させて、これにより溶解混合物を形成するステップであって、好ましくは、混合物を、かき混ぜ、好ましくはボルテックスして、均質な混合物を用意するステップと、
（ｉｉ）少なくとも５０℃、少なくとも６０Ｃ、少なくとも７０℃、少なくとも８０℃、好ましくは少なくとも９０℃、より好ましくは少なくとも９５℃の温度まで前記混合物を加熱するステップであって、試料の溶解を促進または完了する加熱ステップと、
（ｉｉｉ）５０℃を下回る温度まで、好ましくは室温になるまで前記溶解された試料を場合により冷却するステップと、
（ｉｖ）固体支持体および生成された沈殿物を含む複合体を分離することにより、前記溶解された試料を清澄化するステップと、
（ｖ）乾燥組成物を再構成するために前記清澄化された溶解物（lysate）を用いるステップと
により達成される。
【００６１】
沈殿物は、特に、個々に加熱プロセスにおいて生成される。例えば、溶解溶液に添加することにより固体支持体を直接的に溶解混合物中に取り込むことは、沈殿物が、生成および／または放出後に固体支持体に直接的に結合、例えば吸着し得るという利点を有する。任意選択の冷却ステップ（ｉｉｉ）は、沈殿物の生成を促進し、従って溶解物（lysate）清澄化を改善する。沈殿物を固体支持体に結合させることにより沈殿物が効率的に除去されることを確実にするため、溶解混合物は、好ましくは、例えば磁気撹拌によりかき混ぜる。この操作は、沈殿物等の夾雑物が、固体支持体と接触し、従って容易に分離することができる複合体をそれと形成する機会を増加させる。かき混ぜを補助するため、磁気撹拌子は、溶解混合物に取り込まれ得る。個々の磁気撹拌子は、好ましくは、溶解溶液に既に取り込まれている。試料収集容器は、上述の溶解組成物等の溶解組成物および磁気撹拌子を予め備えることができるため、本実施形態は、単純かつ消費者が手軽に使える。
【００６２】
さらに別の実施形態において、試料の溶解および再構成は、
（ｉ）試料を溶解溶液および夾雑物、好ましくは沈殿物を除去するための固体支持体と接触させて、これにより溶解混合物を生成するステップと、
（ｉｉ）乾燥組成物を再構成するために前記溶解混合物を用いるステップと、
（ｉｉｉ）試料の溶解を達成または完了するために、少なくとも９０℃、好ましくは少なくとも９５℃の温度まで前記再構成された組成物を加熱するステップと、
（ｉｖ）５０℃を下回る温度まで、溶解された試料を含む前記再構成された組成物を場合により冷却するステップであって、上に記す通り、沈殿物生成、従って清澄化を補助する任意選択の冷却ステップと、
（ｖ）前記固体支持体および沈殿物を含む形成された複合体を分離することにより、前記再構成された組成物を清澄化し、これにより清澄化された再構成された組成物を用意するステップと
により達成される。
【００６３】
本明細書において、乾燥組成物が既に再構成された後に、個々に完了されて溶解が達成される。特にホットスタートＰＣＲ反応の実施を企図する場合、これは時間を節約することができる。（ｉｉｉ）において行われる加熱ステップは、既にホットスタートポリメラーゼを活性化しており、これにより、実際のＰＣＲにおける活性化のためのさらなる加熱ステップを時代遅れなものとする。
【００６４】
さらに別の実施形態において、試料の溶解および再構成は、
（ｉ）試料を溶解溶液および夾雑物、好ましくは沈殿物を除去するための固体支持体と接触させて、これにより溶解混合物を生成するステップと、
（ｉｉ）乾燥組成物を再構成するために前記溶解混合物を用いるステップと、
（ｉｉｉ）再構成された組成物を、好ましくは少なくとも３分間、より好ましくは少なくとも５分間、少なくとも９０℃、好ましくは少なくとも９５℃の温度を伴う少なくとも１回の加熱ステップを含む増幅反応に供するステップと
により達成される。
【００６５】
本方法は、非常に迅速であり、また、プロセシングされる試料に応じて許容できる結果をもたらす。本明細書において、溶解混合物は、乾燥組成物の再構成にも用いられる。しかし、試料の溶解は、増幅反応において、例えば、試料の最初の加熱、例えば、ホットスタートを行うために、例えば、酵素を活性化させるために行われる加熱ステップにおいて達成または完了される。本実施形態において、固体支持体および特に沈殿物等、夾雑物を含む複合体は、再構成された組成物において残ることができ、分離されない。例として示す通り、本実施形態は、特定の試料によっても機能し、さらなるプロセシングステップが時代遅れとなるという利点を有する。よって、たとえ複合体が再構成された組成物から除去されないとしても、個々の固体支持体の存在は、既に有意な改善をもたらしている。しかし、一実施形態において、固体支持体は、残りの試料、この場合はかつて沈殿物が結合していた再構成された組成物から分離される。
【００６６】
乾燥組成物は、企図される分析方法の実施に必要な１種または複数種の試薬を含む。好ましくは、乾燥組成物は、少なくとも１種のタンパク質、好ましくは酵素を含む。いかなる試薬が乾燥組成物中に含まれるかは、分析される、例えば検出される生体分子および企図される分析方法に依存する。適した例を後述する。
【００６７】
一実施形態において、乾燥組成物は、凍結乾燥組成物である。凍結乾燥組成物は、分析方法に必要な試薬を貯蔵できる形態で提供するために広く用いられる。企図される分析方法に必要な試薬を調製された形態、よって使いやすい形態で提供するために、個々の凍結乾燥組成物は、バイオテクノロジー分野において特に用いられる。個々の凍結乾燥組成物は多くの場合、例えば、オリゴヌクレオチド等の核酸、タンパク質、抗体、酵素その他を含む群から選択される少なくとも１種の生物由来物質を含む。個々の凍結乾燥組成物と、含まれている反応組成物、特に、タンパク質等の生化学的構成要素を安定化する適した添加物を調製するための方法は、先行技術において周知のものであり（例えば、医薬品および生物学的製剤のフリーズドライ／凍結乾燥（Freeze-Drying/Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Product）、第２版、国際公開第０１／９２５６９号パンフレット、国際公開第２０１０／００１１６２号パンフレット、米国特許出願公開第２０１０／００６８７１６号明細書および米国特許出願公開第２０１０／０１５９５２９号明細書を参照）、従って、本明細書において詳細に説明する必要はない。本発明に係る方法において用いられる乾燥組成物は、貯蔵できる組成物である。好ましくは、これは長期貯蔵に適している。一実施形態において、乾燥組成物は、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間または少なくとも１２ヶ月間の期間の貯蔵において安定的である。好ましくは、乾燥組成物は、３〜１８ヶ月間または６〜１２ヶ月間の期間安定的である。一実施形態において、乾燥組成物は、企図される分析方法を行うのに必要な化学的および／または生化学的試薬の少なくとも一部を含む。好ましくは、乾燥組成物は、必要な試薬の全てを含むが、その理由として、溶解された試料、好ましくは清澄化された溶解された試料の添加により、組成物は、分析方法を行う準備が整うからである。これは、例えば、後述するＬｏＣシステムにおける方法を用いる場合、特に有利である。好ましい実施形態において、乾燥組成物は、増幅反応、好ましくはＰＣＲ反応を行うのに必要な試薬の少なくとも一部、好ましくは全てを含む。上に記す通り、個々の乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物は、増幅反応に必要な試薬を、貯蔵できる形態のいわゆるマスターミックスの形態で提供するために広く用いられる。増幅反応の実施を企図する場合、増幅反応混合物を生成するために、溶解された試料を用いて乾燥組成物が再構成されることのみが必要とされるが、しかし乾燥組成物中に全試薬が既に含まれているとは限らない場合、場合によりさらに別の試薬を添加することができ、これが好ましい。例えば、ＰＣＲ反応等、増幅反応の実施を企図（indenting）する場合、乾燥組成物は、ポリメラーゼ、増幅反応の実施に適した反応緩衝液（buffer）およびｄＮＴＰからなる群から選択される１種または複数種、好ましくは全試薬を含む。好ましくは、乾燥組成物は、例えば、特定の疾患または感染を示す、例えば、１種または複数種の標的核酸の有無の検出を可能にするプライマーおよび／または標識プローブも含む。酵素および塩等、さらに別の添加物が含まれてもよい。その上、乾燥組成物は、磁石の助けによる再構成における組成物の混合を可能にすることにより、再構成プロセスを補助するための磁性材料を含むことができる。溶解された試料、好ましくは清澄化された溶解された試料を用いた再構成後、また、さらに別の添加物の任意選択の添加後に、その結果得られた再構成された組成物は、企図される分析方法を行う準備が整い、例えば、増幅、例えばＰＣＲ反応における使用に適した乾燥組成物が提供される場合、標的核酸の増幅が生じる。一実施形態において、乾燥組成物は、分析方法における使用に適した試薬を含み、前記分析方法は、対象とする生体分子を含む試料の分析に用いることのできる任意の化学的および／またはバイオテクノロジー方法となり得る。例示的な分析方法を後述する。
【００６８】
一実施形態において、再構成に用いられる液体の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％は、好ましくは清澄化された溶解された試料である溶解された試料または溶解混合物によりもたらされる。再構成は、好ましくは清澄化された溶解された試料である溶解された試料または溶解混合物の添加により専ら有利に達成することができる。一実施形態において、上述の通り得られた清澄化された溶解物（lysate）の少なくともアリコートは、乾燥組成物を再構成するために乾燥組成物と接触する。再構成された組成物は、企図される分析方法に適切な濃度で試薬を含むことを確実にするため、所定の量の溶解された試料または溶解混合物が乾燥組成物に添加される。前記所定の量は、再構成された組成物において、企図される分析方法、例えば増幅反応を行うのに適した濃度で試薬が含まれるように選ばれる。再構成プロセスは、かき混ぜにより、例えば、得られた混合物を出し入れしてピペッティングすることにより、撹拌、振盪またはボルテックスすることにより補助され得る。一実施形態において、混合は、磁石を用いることにより達成される。よって、一実施形態において、磁性材料が乾燥組成物中に含まれる。前記磁性材料は、磁石の助けにより再構成の間および／またはその後に組成物の撹拌および／または混合を可能にする。好ましくは、磁性材料は、組成物が乾燥、好ましくは凍結乾燥される前に組成物中に取り込まれて、乾燥組成物を用意する。これにより、磁性材料は、乾燥組成物中に取り込まれるようになり、再構成プロセスの補助に用いることができる。好ましい実施形態において、磁性材料は、一片または複数片のマグネットホイルである。用いることのできるさらに別の方法は、例えば、本明細書においてこれを参照することにより援用されているＤＥ１０２００７０４５４７４に記載されている。一実施形態において、乾燥組成物は、多数の磁性粒子と共に、好ましくは、ロッド、ダンベルおよび／または楕円体の形状で構成された少なくとも１個の磁性および／または磁化可能な中心要素を含む。磁性および／または磁化可能な中心要素は、多数の磁性粒子よりも大きい。好ましくは、これらの要素は、組成物が乾燥、好ましくは凍結乾燥される前に組成物中に取り込まれる。再構成のために液体と接触した組成物は、多数の第１の磁性粒子と共に、好ましくは、ロッド、ダンベルおよび／または楕円体の形状で構成された少なくとも１個の中心要素を含む。磁性粒子は、液体中に分布し、続いて少なくとも１個の中心要素上に蓄積する。磁性材料を用いた撹拌および／または混合は、磁性材料と相互作用するよう構成された少なくとも１個の外部磁石、例えば、永久磁石または電磁石の使用により補助される。再構成された組成物の撹拌は、反応チャンバーにおいて行われる反応（複数可）の実施においても有利となり得る。例えば、ＰＣＲ増幅における等、加熱ステップを含む反応が行われる場合、好ましくは時折の撹拌は、熱がより迅速かつより均一に分布するという支持的効果を有する。磁性材料は、常磁性材料、超常磁性材料、強磁性材料、フェリ磁性材料およびこれらの混合物の群から選択される材料を含むまたはそれからなることができる。
【００６９】
一実施形態において、乾燥組成物は、上述の通り試料を清澄化するための固体支持体を含む。好ましくは、カルボキシル化粒子が乾燥組成物中に含まれる。一実施形態において、個々の乾燥組成物を、上述の通り試料および溶解溶液を含む溶解混合物と接触させる。本実施形態は、乾燥組成物が、沈殿物等の夾雑物と結合し、これにより固体支持体および夾雑物を含む複合体を形成することにより、再構成された組成物の清澄化に適した固体支持体をもたらすという利点を有する。上述の通り、前記複合体は、場合により、但し好ましくは、例えば増幅反応等、分析方法を行う前に除去される。
【００７０】
本明細書における用語「生体分子（単数または複数）」は、特に、核酸およびポリペプチドを指し、好ましくは、核酸を指す。他の生体分子は、代謝産物を包含する。
【００７１】
本明細書における用語「核酸（単数または複数）」は、特に、通常、サブユニット間のリン酸ジエステル結合により、但し場合によっては、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸その他により共有結合したリボヌクレオシドおよび／またはデオキシリボヌクレオシドを含むポリマーを指す。核酸として、あらゆる種類のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、例えば、ｇＤＮＡ、環状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、循環ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、シクロヘキセン核酸、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｐｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、反復関連ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）、ａｓＲＮＡおよびｓｔＲＮＡ（小さな一時的（small temporal）ＲＮＡ）等が挙げられるがこれらに限定されない非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、断片化核酸、ミトコンドリアまたは葉緑体等、細胞内小器官から得られる核酸、ならびに生体試料中に存在し得る病原体、微生物、寄生生物またはＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスから得られる核酸、例えば、細菌、ウイルスまたは真菌核酸、合成核酸、細胞外核酸が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書における用語「細胞外核酸（単数または複数）」は、特に、細胞に含有されない核酸を指す。個々の細胞外核酸は、多くの場合、無細胞核酸とも称される。これらの用語は、本明細書において同義語として用いられる。用語「細胞外核酸」は、例えば、細胞外ＲＮＡおよび細胞外ＤＮＡを指す。例えば血漿等の体液等、生体試料の無細胞画分（個々に一部）において見出される典型的な細胞外核酸の例として、例えば、細胞外腫瘍関連または腫瘍由来ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、他の細胞外疾患関係のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、エピジェネティックに修飾されたＤＮＡ、胎児ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ等の低分子干渉ＲＮＡ等、哺乳類細胞外核酸ならびに例えば、ウイルス核酸、例えば、原核生物（例えば、細菌）、ウイルスまたは真菌から細胞外核酸集団に放出された病原体核酸等、非哺乳類細胞外核酸が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７２】
本明細書における用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合（複数可）により一体に接続したアミノ酸のポリマーを含む分子を指す。ポリペプチドは、タンパク質（例えば、５０を超えるアミノ酸を有する）およびペプチド（例えば、２〜４９アミノ酸）を包含するいかなる長さのポリペプチドも包含する。ポリペプチドは、例えば、酵素タンパク質またはペプチド、受容体タンパク質またはペプチド、トランスポータータンパク質またはペプチド、殺菌性および／またはエンドトキシン結合タンパク質、構造タンパク質またはペプチド、免疫ポリペプチド、毒素、抗生物質、ホルモン、増殖因子、ワクチンその他等の生物活性ポリペプチドを包含する、いかなる活性または生物活性のタンパク質および／またはペプチドも包含する。前記ポリペプチドは、ペプチドホルモン、インターロイキン、組織プラスミノーゲンアクチベータ、サイトカイン、免疫グロブリン、特に抗体もしくは抗体断片またはこれらの変種からなる群から選択され得る。例えば、グリコシル化ポリペプチド等、修飾ポリペプチドも包含される。
【００７３】
分析方法は、対象とする生体分子を含む試料の分析に用いることのできる、特に、試料に含まれる１種または複数種の対象とする生体分子の分析に用いることのできる、例えば、対象とする生体分子を増幅、同定、検出および／または定量化するためのいかなる化学的および／またはバイオテクノロジー方法であってもよい。好ましくは、分析方法は、溶解された試料に含まれる少なくとも１種の生体分子の存在、非存在および／または含量の検出を可能にする検出反応を含む。好ましくは、前記方法は、少なくとも１種の標的核酸の増幅と、続く、例えば標識プローブを用いた生成されたアンプリコンの検出を含む。個々の分析方法は、先行技術において周知のものであり、試料に含まれる核酸または特異的な核酸等、生体分子を分析するために医学、診断および／または予後分野においても一般に適用されている。従って、分析方法は、疾患の状態の存在、非存在および／または重症度を同定するための、溶解された試料に含まれる生体分子の分析を含むことができ、疾患の例として、数多くの腫瘍性疾患、特に異なる形態の癌等、前悪性病変および悪性病変等が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、溶解された試料は、多くの応用分野における診断および／または予後マーカー（例えば、胎児または腫瘍由来核酸）を検出するために分析することができ、応用分野の例として、非観血的出生前遺伝子検査、個々のスクリーニング、疾患スクリーニング、腫瘍学、癌スクリーニング、早期癌スクリーニング、癌療法モニタリング、遺伝子検査（遺伝子型判定）、感染性疾患検査、病原体の検査、傷害診断、外傷診断、移植医学または他の多くの疾患等が挙げられるがこれらに限定されず、従って、診断および／または予後関連のものである。
【００７４】
対象とする生体分子が、核酸である場合、分析は、いずれかの核酸分析方法を用いて行うことができ、核酸分析方法の例として、同定技術、増幅技術、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温増幅、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、蛍光検出、ハイブリダイゼーションアッセイ、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列決定、制限解析、逆転写、ＮＡＳＢＡ、ＬＡＭＰ（ループ媒介性等温増幅）、ＲＰＡ（リコンビナーゼポリメラーゼ増幅）、ｔＨＤＡ（ヘリックス依存性増幅）、ＮＥＡＲ（ニッキング酵素増幅反応）、ＴＭＡ（転写媒介増幅）およびＮＡＳＢＡ（核酸配列ベース増幅）、アレル特異的ポリメラーゼ連鎖反応、ポリメラーゼサイクリングアセンブリ（polymerase cycling assembly）（ＰＣＡ）、非対称ポリメラーゼ連鎖反応、指数後の線形（linear after the exponential）ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＡＴＥ−ＰＣＲ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ホットスタートポリメラーゼ連鎖反応、配列間特異的（intersequence-specific）ポリメラーゼ連鎖反応（ＩＳＳＲ）、インバースポリメラーゼ連鎖反応、ライゲーションを介した（ligation mediated）ポリメラーゼ連鎖反応、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳＰ）、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、固相ポリメラーゼ連鎖反応、標識された、好ましくは蛍光標識されたプライマーおよび／またはプローブを用いた検出技術または前述のいずれかの組合せ等が挙げられるがこれらに限定されない。個々の技術は、当業者に周知のものであり、よって、本明細書においてさらに記載する必要はない。好ましくは、分析方法は、核酸増幅方法である。
【００７５】
他の分析方法は、例えば標識された抗体または対象とする生体分子に結合する他の適した標識された結合分子を用いた、例えばポリペプチドの存在、非存在および／または含量の検出を包含する。個々の試薬は、凍結乾燥組成物等、乾燥組成物の形態で用意してもよい。
【００７６】
用語「試料」は、本明細書において広義で用いられ、生体分子、特に核酸およびタンパク質を含有する供給源を包含するよう企図される。例示的な試料として、体液、一般に、全血、血清、血漿、赤血球細胞、白血球細胞、バフィーコートや、頬側スワブ、咽頭スワブ、腟スワブ、尿道スワブ、子宮頸部スワブ、咽頭スワブ、直腸スワブ、病変スワブ、膿瘍（abcess）スワブ、鼻咽頭スワブ、肛門スワブ等が挙げられるがこれらに限定されないスワブや、尿、痰、唾液、精液、リンパ液、リコール（liquor）、羊水、脳脊髄液、腹水、糞便、胸水、嚢胞の液、滑液、硝子体液、眼房水、滑液包液、洗眼液、眼吸引液、肺洗浄、肺吸引液、肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、脳、心臓、筋肉、膵臓等が挙げられるがこれらに限定されない組織、および細胞培養物、細菌、微生物、ウイルス、植物、真菌等、生体試料が挙げられるがこれらに限定されず、前述に由来するまたは前述を含む試料を包含する。核酸を含有するまたは含有すると疑われる臨床もしくは法医学的背景から得られる材料または土壌等の環境試料もまた、用語「試料」の企図される意義の範囲内である。その上、当業者であれば、上述の例示的な試料のいずれかから得られる抽出物もしくは材料またはこれらの一部もまた、用語「試料」の範囲内であることを認めるであろう。好ましくは、試料は、ヒト、動物、植物、細菌または真菌に由来する。好ましくは、試料は、細胞、組織、細菌、ウイルス、および例えば血液等の体液、バフィーコート、血漿および血清等の血液製剤、尿、リコール、痰、糞便、ＣＳＦ、および精子、上皮スワブ、腟スワブ、子宮頸部試料、生検、骨髄試料ならびに組織試料、好ましくは肺および肝臓等の器官組織試料からなる群から選択される。試料は、安定化され得る。血液試料等、特定の試料は通常、収集後に、例えば、血液および血液に由来する試料の場合は抗凝血薬等の安定剤と接触させることにより安定化される。
【００７７】
本発明に係る方法は、対象とする生体分子を乾燥組成物と接触させる前に精製するために、例えば、対象とする生体分子を固相に結合させるおよび／または沈殿させることによる、対象とする生体分子を溶解された試料から単離するステップを必要としない。そうではなく、溶解された試料および／または溶解混合物により再構成され、上述の通り、含まれる試料の溶解を誘導または完了するよう処理された再構成された組成物を清澄化することにより、例えば沈殿物等、企図される分析方法と干渉し得る夾雑物は、除去され、個々に不活性化される。この清澄化ステップは、大量の溶解された試料、好ましくは清澄化された溶解された試料、または溶解混合物が、分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物の再構成に直接的に用いられる場合であっても、分析方法が効率的に行われ得ることを確実にする。従って、例えば、分析方法は、溶解と再構成との間に生体分子の精製を行う必要がなく、溶解された試料を再構成に直接的に用いるため、溶解された試料を添加する前に乾燥組成物を再構成する必要もなく、溶解された試料を用いた乾燥組成物の溶解（および任意選択の清澄化）および再構成の直ぐ後に行うことができる。先ず溶解混合物により乾燥組成物を再構成し、次に、例えば加熱ステップを行うことにより、再構成された組成物における溶解を達成または完了する場合、同様の考察が適用される。従って、この方法は、プロセシングカートリッジ、例えば、プロセシングカートリッジの反応チャンバー中に含まれる乾燥組成物を再構成するためのＬｏＣシステムにおける使用に特に適している。
【００７８】
本明細書における用語「溶液」は、例えば溶解溶液としての、特に液体組成物、好ましくは水性組成物を指す。これは、単一相の均質な混合物となり得るが、本発明において用いられる溶液が、例えば沈殿物等の固体構成要素を含むことも本発明の範囲内である。
【００７９】
第２の態様において、本発明は、溶解された試料または溶解溶液と混合された試料を乾燥組成物に添加し、混合することによる、溶解された試料、好ましくは清澄化された溶解された試料または溶解溶液と混合された試料の、分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物を再構成するための使用に関する。
【００８０】
再構成、乾燥組成物に含まれる試薬、分析方法、溶解された試料の調製、再構成された試料の調製および清澄化ステップに関する詳細は、本発明の第１の態様と併せて上に記載されている。反復を避けるため、これは、本発明の第２の態様にも適用される個々の開示に参照されている。上に記す通り、本発明者らは、溶解された試料、好ましくは、清澄化された溶解された試料または溶解混合物の少なくともアリコートを乾燥組成物に添加し、混合することにより、例えば、増幅方法等、分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物を再構成することが可能であることを見出した。上述の通り、再構成溶液等、さらなる溶液を添加する必要はない。その上、例えば核酸等、生体分子は、再構成の前に精製されない。その代わりに、好ましくは、再構成は、溶解された試料、清澄化された溶解された試料または溶解混合物の添加により専ら達成される。これにより、分析方法の実施に適した再構成された組成物が提供される。再構成のための別個の液体の添加が省略されるため、再構成プロセスは相当に単純化される。本方法は、次に記載するさらにより単純なカートリッジ設計の使用を可能にするため、この構成は、この方法をＬｏＣシステムにおける使用に特に有用なものとする。一実施形態において、使用は、再構成された組成物を用いた分析方法の実施を伴う。行うことのできる分析方法および好ましい実施形態に関する詳細は、本発明の第１の態様と併せて上に記載されている。反復を避けるため、これは本発明の第２の態様にも適用される個々の開示に参照されている。
【００８１】
第３の独立的態様において、本発明は、試料から沈殿物を除いて清澄化するための方法であって、溶解の前、間または後に、試料を、溶解された試料から生じる沈殿物と結合する少なくとも１つの固体支持体と接触させ、これにより沈殿物と複合体を形成し、前記複合体が、場合により、但し好ましくは、残りの試料から分離される方法に関する。本方法は、上述の通り溶解された試料の清澄化に特に適している。
【００８２】
本発明者らは、清澄化プロセスのために、低下した量の沈殿物を含む清澄化された溶解された試料の用意に特に適した方法を開発した。個々の方法は、溶解された試料から分析反応へと持ち越される沈殿物により阻害され得るため、特に、増幅反応の実施を企図する場合、沈殿物の効率的な除去は、続く分析方法の性能を改善する。従って、個々に清澄化された溶解物（lysate）は、例えば、増幅反応等、分析方法において直接的に用いることができる。その上、開発された溶解物（lysate）清澄化方法は、阻害性の特に沈殿物等、夾雑物の量が低下するため、分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物の再構成に適した清澄化された溶解物（lysate）の用意に特に適している。その上、上に記す通り、個々の方法は、再構成のために溶解混合物が添加された、清澄化された再構成された組成物の用意にも適している。個々の溶解混合物において、溶解は、まだ完了していない。上述の通り、溶解は、再構成された組成物を少なくとも９０℃、好ましくは少なくとも９５℃の温度へと加熱することにより達成および／または完了することができる。詳細は、上に記載されている。清澄化方法、沈殿物と結合するための適した好ましい固体支持体および表面、複合体（複数可）に関する詳細ならびに溶解された試料および適した好ましい溶解溶液を用意するための溶解手順に関する詳細は、本発明の第１の態様と併せて上に記載されている。反復を避けるため、これは本発明の第３の態様にも適用される個々の開示に参照されている。
【００８３】
第４の独立的態様において、分子篩を試料に添加して、酸性試料のｐＨ値を上昇させるステップを含む、酸性試料のｐＨ値を上昇させるための方法が提供される。好ましくは、前記方法は、次の特徴のうち１つまたは複数を有する。
ａ）酸性試料のｐＨ値が、６．５以下、６．０以下、５．５以下、５以下、４．５以下である、あるいは３〜６．５および３．５〜６から選択される範囲内に収まる、
ｂ）分子篩の添加により、ｐＨが、７．５〜９、８〜９および８〜８．５から選択されるｐＨ範囲まで上昇する、
ｃ）添加される分子篩がゼオライトである、
ｄ）分子篩が、試料の溶解の前、間または後に添加される、
ｅ）分子篩と接触させた溶解された試料が、続いて増幅反応において用いられる、および／または
ｆ）分子篩との接触後に核酸精製または単離が行われない。
【００８４】
方法の詳細を次に記載する。適宜、本出願人らは、上述の開示を参照する。
【００８５】
分子篩の例は、上に記載されている。ｐＨ値を上昇させるため、ｐＨ値の上昇をもたらす分子篩を用いる必要がある。好ましくは、分子篩は、酸性試料のｐＨ値を少なくとも１ｐＨ単位、より好ましくは少なくとも２ｐＨ単位高めることができる。酸性試料は、６．５以下、６．０以下、５．５以下、５以下、４．５以下のｐＨ値を有することができる。好ましくは、これは、３〜６．５、好ましくは３．５〜６の間の範囲内に収まるｐＨ値を有する。典型的な酸性試料は、腟試料、例えば、腟または子宮頸部スワブである。一実施形態において、分子篩の添加は、ｐＨが、７．５〜９、好ましくは８〜９、より好ましくは８〜８．５の間に収まるｐＨ範囲まで上昇するという結果を生じる。例として示す通り、ｐＨ上昇分子篩の添加は、試料の初期ｐＨ値が変動する場合であっても、酸性試料のｐＨ値が既定のｐＨ範囲へと調整され得るという驚くべき効果を有する。本発明の本態様において用いられるｐＨ上昇分子篩は、化学的緩衝液（buffer）を添加するよりも相当に良好に機能した。好ましくは、分子篩としてゼオライトが用いられる。例として示す通り、ゼオライトは、酸性試料のｐＨ値の上昇において非常に効率的である。好ましくは、ゼオライトは、２〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５〜３０ｍｇ／ｍｌまたは５〜２０ｍｇ／ｍｌの量で溶解溶液等の溶解組成物と混合された試料へと添加される。好ましくは、ｐＨ上昇分子篩は、試料の溶解の前、間または後に添加される。好ましくは、ｐＨ上昇分子篩は、溶解の間に存在する。これにより、酸性試料は、続く増幅反応におけるこのように用意された溶解物（lysate）の使用に特に有利に好ましくなり得る。これにより、個々にＰＣＲ等の増幅反応と同様にｐＨ値により影響される下流の方法である増幅反応を行う前に溶解物（lysate）のｐＨ値を個別に調整することは、時代遅れなものとなる。その上、溶解の前、間または後における分子篩の添加は、特に沈殿物等、夾雑物が効率的に除去され得るという効果を有する。好ましくはゼオライトである分子篩は、核酸の単離に用いられないが、続く分析方法、特にＰＣＲ等の増幅方法のための試料を調製するために用いられる。従って、分子篩は、好ましくは、核酸と分子篩との実質的な結合が起こらない条件下で酸性試料と接触する。従って、好ましくは、含まれる核酸の少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または標的核酸の少なくとも９８％は、用いられる条件下で分子篩と結合しない。標的核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはその両方を指してもよい。上に記す通り、好ましくは、分子篩は、溶解の間に添加される。
【００８６】
第５の態様において、本発明の第１の態様に係る生体分子を含む試料を分析するための方法における使用に適したプロセシングカートリッジが提供される。前記プロセシングカートリッジは、カートリッジ本体と、分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物を含む少なくとも１個の反応チャンバーとを含み、前記カートリッジ本体は、試料取入れ開口部、少なくとも１個の試料排出口ならびに試料取入れ開口部および試料排出口を接続する流体通路を含み、試料排出口は、反応チャンバーに開口し、カートリッジは、反応チャンバーに含まれる乾燥組成物の再構成が、試料取入れ開口部を通ってカートリッジに進入する試料により達成されるように設計されている。
【００８７】
本明細書における用語「流体」は、気体および液体を網羅する総称として用いられる。
【００８８】
試料流体通路は、チャネルおよび／または空洞の少なくとも１個を含むことができ、好ましくは、カートリッジ本体の表面に少なくとも部分的に形成される。流体通路は、試料が試料取入れ開口部を通して進入した後の試料の既定の流路を確実にし、これにより試料が少なくとも１個の反応チャンバーに到達することを確実にする。反応チャンバーは、カートリッジ本体中に一体化され得る、あるいはカートリッジ本体に組み立てることができる別個の要素として設置され得る。好ましくは、１個または複数個の反応チャンバーは、カートリッジ本体に組み立てられる別個のデバイス（複数可）として設置される。反応チャンバーが別個のデバイスにより設置される本実施形態において、カートリッジ本体は、少なくとも１個の反応チャンバーをカートリッジ本体に接続するための手段、好ましくは接続突出部を含む。接続により、試料排出口と反応チャンバーとの間の流体連絡が確立され、試料は、反応チャンバーに進入することができるようになる。カートリッジ本体は、複数の反応チャンバーを含むこともできる。プロセシングカートリッジに２個以上の反応チャンバーを配置することは、同一試料により２種以上の反応、従って２種以上の分析を行うことができるという利点を有する。これは、例えば、並行して同一カートリッジを用いながら、異なる標的（例えば、疾患マーカーまたは病原体）の有無を検出することを可能にする。よって、係る設計は、マルチプレックスアッセイの実施に特に適している。しかし、先行技術においてよく知られている通り、１個の反応チャンバーにおいて、例えば、異なるプライマーおよび／またはプローブを用いた１種の増幅反応において数種のアッセイを行うこともできる。
【００８９】
別個のデバイス（複数可）として設置される複数の反応チャンバーが用いられる場合、カートリッジ本体は、反応チャンバーをカートリッジ本体に接続するための複数の手段、好ましくは接続突出部を含む。数個の反応チャンバーは、カートリッジ本体に流体密封的に組み立てることのできる１個のデバイスとして提供することができる。これは、例えば、異なる病原体または疾患マーカーを並行して検出するための、個々のチャンバーにおける異なる反応の実施を可能にする。異なる反応チャンバーに、異なる試薬を含む、例えば、増幅反応を行う場合は異なるプライマーおよび／またはプローブを含む乾燥組成物を配置することができる。数個の反応チャンバーを１個のデバイスに取り込むことは、プロセシングカートリッジの取り扱い、従って組み立てを容易にし、費用を節約する。
【００９０】
その上、カートリッジ本体は、試料容器をカートリッジ本体に接続するための手段、好ましくは接続突出部を含む。反応チャンバー（複数可）および試料容器をカートリッジに接続するための適した接続は、先行技術において周知のものであり、よって、いかなる詳細な説明も必要ない。接続は、形態的閉鎖（form closure）、力的閉鎖（force closure）および／または摩擦ロックの原理に基づき確立され得る。好ましい実施形態は、実施例において示されている。
【００９１】
プロセシングカートリッジが用いられる場合、試料は、試料取入れ開口部を通してカートリッジに進入しなければならない。進入は、注入またはその他の適した手段により補助され得る。例えば、試料容器は、試料容器から試料通路への試料の移行を可能にするピストンを含むことができる。
【００９２】
好ましい実施形態において、カートリッジ本体は、流体取入れ開口部Ｂを含み、流体取入れ開口部Ｂは、試料容器がカートリッジ本体に組み立てられる場合、流体通路Ｂを通して前記容器と流体連絡し、試料容器への空気の導入を可能にする。この目的のため、カートリッジ本体は、容器がカートリッジ本体に組み立てられる場合、それを通して空気が前記容器に進入することのできる流体排出口Ｂを含み得る。ポンプ等、圧力発生装置が、流体取入れ開口部Ｂに接続され、これにより試料容器へ空気をポンプ送りさせることができる。ポンプが用いられる場合、圧力は、好ましくは、１００〜１０００mbar（ミリバール）、好ましくは１５０〜５００mbar（ミリバール）、より好ましくは２００〜２５０mbar（ミリバール）の範囲内に収まる。ポンプにより発生された圧力は、試料が、試料取入れ開口部を通ってカートリッジに押し込まれ、従って、試料流体通路により導かれて反応チャンバーに到達するという効果を有する。試料は、試料排出口を通って反応チャンバーに進入する。
【００９３】
一実施形態において、乾燥組成物の再構成のために反応チャンバーに進入することができる液体の量を制御するための手段が提供される。一実施形態において、少なくとも１個の反応チャンバーおよび／または反応チャンバーをカートリッジ本体に接続するための手段は、流体、特に空気または同様の流体が、反応チャンバーを出ることができる少なくとも１個の流体開口部Ａを含む。よって、一実施形態において、反応チャンバーおよび／または反応チャンバーをカートリッジに接続するための接続突出部は、個々の流体開口部Ａを含む。これにより、試料がカートリッジ本体に導入され、反応チャンバーに進入するときに、空気は、反応チャンバーから脱出することができる。空気は、基本的に試料に置き換えられる。一実施形態において、流体が反応チャンバーを出ることができる流体開口部Ａは、障壁を含み、前記障壁は、液体の通過を実質的に防止する。障壁は、少なくとも前記障壁が液体と接触する前に空気を通過させる。しかし、これは、液体の通過を実質的に防止する。これにより、反応チャンバーに進入することができる試料の量は、反応チャンバーが、反応チャンバーに含まれる乾燥組成物の適切な再構成に必要な所望の量の試料で充填されるように制御される。よって、試料の通過を防止する膜により発生される逆圧により、所望の量の試料のみが反応チャンバーに進入することができるため、前記障壁は、計量に有利に用いることができる。その上、これは、反応チャンバーに含まれる試薬を包含する試料が、反応チャンバーから偶発的に流れ出ることを防止する。前記障壁は、好ましくは、所定の量の試料のみが反応チャンバーに進入することができるように配置された膜である。乾燥組成物の再構成に必要とされる所定の量の試料が反応チャンバーに進入すると、好ましくは膜である前記障壁の少なくとも一部は試料と接触し、続いて好ましくは試料のさらなる進入を遮断する。膜は、好ましくは、疎水性膜である。好ましくは、膜は多孔性である。好ましくは、０．０５μｍ〜０．５μｍ、好ましくは０．１μｍ〜３μｍ、より好ましくは１．５μｍ〜２．５μｍ、最も好ましくはおよそ２μｍの範囲内に収まる孔径を有する膜が用いられる。膜は、ポリマーを含むことができる。一実施形態において、膜は、不織ナイロン支持体等、支持体を含む。一実施形態において、膜は、不織ナイロン支持体上に配置されたアクリルコポリマー膜である、あるいは空気および液体の通過に関して同一の特性を有する膜である。試料の障壁として機能する前記膜は、例えば、所定の量の液体を反応チャンバーに導入するための分注デバイス等、より込み入ったデバイスを時代遅れなものとする。十分に正確な計量は、反応チャンバーが試料で充填されるとさらなる試料の進入を防止する前記障壁により達成することができる。よって、例えば、プロセシングデバイスに含まれるポンプは、膜が、容器からカートリッジへとさらなる試料が進入し得るのを防止する逆圧を生じるまで、空気を反応容器に持続的にポンプ送りすることができる。一実施形態において、反応チャンバーの通気およびカートリッジへの試料の投入の制御に用いることのできる前記流体開口部Ａは、空気がカートリッジから直接出るように位置す���。これは、一実施形態において、反応チャンバーに含まれていてよい。
【００９４】
しかし、前記流体開口部Ａは、カートリッジ内部に含まれてもよい。例えば、例として示す通り、これは、反応チャンバーをカートリッジに接続するための手段の内に位置することができる、あるいはこの手段により提供することができる。好ましくは、反応チャンバーの通気に用いられる前記流体開口部Ａは、さらに別の流体排出口Ａに接続するさらに別の流体通路Ａへと開口する。１個または複数個の反応チャンバーから空気を受け入れる、係るさらに別の流体通路Ａの配置は、さらに別の流体通路Ａが遮断されて、これにより加熱ステップの間に液体が蒸発するリスクを防止または少なくとも低下させることができるため、特に、分析方法が、例えば多くの増幅方法と同様に、反応チャンバー内の１回または複数回の加熱ステップを伴う場合、特定の利点を有する。これは、加熱ステップを伴う実施される分析方法の精度を改善し得る。一実施形態において、試料取入れ開口部および試料排出口を接続する流体通路の閉鎖および／または流体開口部Ａを接続し、それを通して流体、特に空気が流体排出口Ａにより反応チャンバーを出ることができる流体通路Ａの閉鎖を可能にする手段が提供される。前記手段は、前記流体通路（複数可）を閉鎖する蓋と併せて、前記流体通路（複数可）の閉鎖または開口を可能にし、これにより単純なバルブとして機能する障壁を前記流体通路（複数可）内に形成し得る。蓋に圧力が加えられると、バルブは閉鎖し、圧力が除かれると、バルブは開口する。本実施形態のさらなる詳細を、カートリッジ本体と併せて後述する。
【００９５】
その上、試料通路における個々の障壁の配置は、試料容器からカートリッジへの試料の移行を著しく単純な様式で行うことができるという利点を有する。本明細書において、試料容器は、溶解溶液と混合された試料を含む。上述の通り、前記混合物が加熱されて、試料の溶解を誘導する。蓋に圧力が加えられ、これによりバルブを閉鎖する。加熱ステップは、試料容器に過圧が生じるという結果を生じる。蓋から圧力を除くことによりバルブが開口する場合、試料は、試料容器において発生される過圧によりカートリッジを流れる。これにより、試料は、配置された試料通路を通して反応チャンバーに進入する。反応チャンバーの制御された充填は、上述の通り試料のための障壁を含む流体開口部Ａの配置により確実となる。接続された試料容器からカートリッジへの試料の移行を達成するために別個のポンプその他が必要とされないため、本実施形態は有利である。好ましくは、移行された試料は、上述の通り溶解された試料、より好ましくは清澄化された溶解された試料または上述の通り溶解混合物である。
【００９６】
本発明に係るカートリッジは、試料プロセシングまたは反応チャンバーに含まれる乾燥組成物の再構成のための液体または溶液のためにいかなるリザーバも必要としないため、著しく単純な設計を有する。その上、カートリッジは、使用した試料材料および／または試薬を貯蔵するための１個または複数個の別個の廃棄物リザーバを必要としない。プロセシングカートリッジ全体は、上述の通り好ましくは溶解された試料または溶解混合物である、カートリッジに進入する試料によって（のみ）操作することができるため、取り扱われるまたは処分される必要のある過剰な液体または溶液は存在しない。その上、例えば、試料をプロセシングまたは乾燥組成物を再構成するための液体がカートリッジ上に配置されないため、前記液体が浸出するリスクが低下する。乾燥組成物の部分的再構成は、そこに含まれる試薬を不可逆的に損ない得るため、係る浸出は相当な問題である。試料に加えて液体を配置する必要がないことは、先行技術カートリッジに優る顕著な利点であり、生産も改善し、費用も低下させる。
【００９７】
好ましい実施形態において、カートリッジ本体は、第１の末端開口部および第２の末端開口部を備えるチューブを含み、チューブの第１の末端開口部は、試料取入れ開口部と整列する。よって、チューブは、試料通路へと延在する。試料容器から来た流体は、先ずチューブの第２の末端開口部へと進入し、チューブを通って流れ、第１の末端開口部においてチューブを去り、チューブの第１の末端開口部と整列した試料取入れ開口部を通って試料通路に進入する。前記チューブは、例えば、カートリッジ本体に組み立てられる場合、試料容器へと到達するよう、また、例えば、流体排出口Ｂを通って試料容器に進入する流体により、あるいは溶解混合物が加熱されて上述する通り試料通路に含まれるバルブが閉鎖される際に発生される過圧により試料容器に過圧が生じる場合、容器に含まれる試料等の流体を試料通路へと流すよう用いることができる。
【００９８】
好ましくは、特に、反応チャンバーが一体化要素として提供される場合は反応チャンバーの側壁、あるいは反応チャンバー接続突出部の側壁のいずれかに配置されるチューブにより、試料排出口および流体開口部Ａが提供される。チューブにおける試料排出口の構築は、試料が、反応容器の側壁にピペット操作（pipettete）されたのと同様の制御された様式で反応チャンバーに進入するという利点を有する。好ましくは、チューブは、側壁の凸部に含まれる。これにより、反応チャンバーの制御されない流れを防止することができる。好ましくは、反応チャンバーと流体連絡した流体開口部Ｂも、好ましくは試料排出口の反対に配置された側壁の凸部に含まれる。前記配置のさらなる詳細および利点を後述および図面に示す。
【００９９】
一実施形態において、カートリッジ本体は、試料等の流体が容器から試料取入れ開口部へと進入できるように、試料容器開口部が試料取入れ開口部と流体接続するような様式で配置された試料容器開口部を含む試料容器に組み立てられる。前記試料容器は、溶解組成物と混合された、分析される試料を含有する。溶解組成物は、本発明の第１の態様と併せて上に記載されている特徴のうち１つまたは複数を有することができる。好ましくは、次の構成要素を含むまたはこれらからなる溶解溶液が用いられる。
（ａ）少なくとも１種の非イオン性界面活性剤または非イオン性洗剤の混合物、
（ｂ）好ましくは潜在的な阻害剤の非特異的な複合体形成により、続く分析方法の阻害を防止または低下させる、少なくとも１種のポリマー、
（ｃ）場合により、タンパク質分解酵素、
（ｄ）場合により、二価カチオンのキレート剤および
（ｅ）場合により、緩衝物質。
【０１００】
適した詳細は、上にも記載されており、これは個々の開示に参照されている。これは、溶解溶液における試料の混合を補助するための磁気撹拌子も含むことができる。好ましくは、これは、溶解物（lysate）を清澄化するための固体支持体を含み、より好ましくは、カルボキシル化磁性粒子を含む。これにより、沈殿物を効率的に除去することができ、「試料」として試料取入れ開口部を通過することができる清澄化された溶解物（lysate）が提供される。溶解された可能性があるおよび／または夾雑物または他の試料構成要素が除去された、個々に前処理された試料もまた、単純さを容易にするためにカートリッジと併せて「試料」と称される。溶解溶液および溶解物（lysate）の清澄化に用いることのできる固体支持体（複数可）のさらなる詳細は、上に記載されており、これは個々の開示に参照されている。
【０１０１】
好ましくは、プロセシングカートリッジは、本発明に係る第６の態様と併せて下に記載するカートリッジ本体を有する。
【０１０２】
第６の態様において、特定のカートリッジ本体が提供される。本発明に係るカートリッジ本体は、試料等の流体を含有する試料容器から少なくとも１個の反応チャンバーへの流体接続を設置するよう用いることができる。試料容器および１個または複数個の反応チャンバー（別個の要素として提供される場合は）は、カートリッジ本体に組み立てることができる。係るカートリッジ本体は、本発明の第１の態様に係る方法の実施に有利に用いることができる。続いて、本出願人らは、前記カートリッジ本体、要素およびその機能の設計ならびにそれと前記カートリッジ本体に組み立てることのできる試料容器および反応チャンバーとの相互作用および／または個々のカートリッジ本体を用いることにより行うことのできる分析方法を説明する。記載されている通り、カートリッジ本体は、流体を含有しカートリッジ本体に組み立てることのできる試料容器から、カートリッジ本体に組み立てることのできるまたはカートリッジ本体の一体的な部分として設置される少なくとも１個の反応チャンバーへと流体接続を提供するのに適している。前記カートリッジ本体は、
−  試料取入れ開口部および試料排出口、
−  試料取入れ開口部および試料排出口を接続する試料通路、
−  試料容器を接続するための試料容器接続突出部であって、試料容器を前記接続突出部に組み立てることにより、試料取入れ開口部が試料容器と流体連絡する試料容器接続突出部、
−  反応チャンバーを接続するための少なくとも１個の反応チャンバー接続突出部であって、反応チャンバーを前記接続突出部に組み立てることにより、試料排出口が反応チャンバーと流体連絡するおよび／またはカートリッジ本体の一体的な部分として設置される少なくとも１個の反応チャンバーを含む反応チャンバー接続突出部
を含み、少なくとも１個の流体開口部Ａは、反応チャンバー接続突出部および／または反応チャンバーに配置され、前記流体開口部Ａは、障壁を含み、前記障壁は、少なくとも前記障壁が液体と接触する前に空気を通過させるが、前記障壁は、液体の通過を実質的に防止する。
【０１０３】
上述および下述の通り、試料取入れ開口部を通してカートリッジ本体に進入し、配置された流体通路を通って少なくとも１個の反応チャンバーに到達する試料による、少なくとも１個の反応チャンバーの充填は、流体開口部Ａに含まれる液体の障壁により制御される。前記障壁は、好ましくは、空気を通過させる（少なくとも加湿前に）が、試料を実質的に通過させない多孔性疎水性膜である。試料が疎水性膜に到達すると直ぐに、試料は前記膜を通過できず、反応チャンバーの充填は自動的に停止し、これにより上述の通り、好ましくは清澄化された溶解された試料である所定の適切な量の試料により乾燥組成物が再構成されることを確実にする。前記カートリッジ本体は、本発明の第５の態様に係るプロセシングカートリッジにおけるカートリッジ本体として有利に用いることができる。試料排出口と流体開口部Ａは、カートリッジ本体の一体的な部分として提供され得る少なくとも１個の反応チャンバー、あるいは好ましくは、別個の要素として提供される少なくとも１個の反応チャンバーと流体連絡している。
【０１０４】
続いて、本出願人らは、特に好ましい実施形態の詳細を特に説明する。さらなる詳細および他の実施形態は、図面、特許請求の範囲および後述にも説明されている。
【０１０５】
カートリッジ本体は、流体取入れ開口部Ｂおよび流体排出口Ｂを有することができ、それにより、流体通路Ｂは、流体取入れ開口部Ｂおよび流体排出口Ｂを接続する。流体取入れ開口部Ｂは、例えば、流体通路Ｂを通って流れ、流体排出口Ｂにおいてカートリッジ本体から去り、例えば試料容器に進入する流体、好ましくは空気を受け入れるように用いることができる。例えば、上述の通り、流体取入れ開口部Ｂは、第１の取入れ開口部を通して空気をポンプ送りする圧力発生装置に接続することができる。カートリッジ本体は、試料取入れ開口部および試料排出口をさらに含み、これにより、試料通路は、試料取入れ開口部および試料排出口を接続する。試料取入れ開口部は、例えば、試料通路を通して流れ、試料排出口においてこれを去り、例えば、反応チャンバーに進入する、試料容器から試料等の液体化産物の吸い上げに用いることができる。
【０１０６】
反応チャンバーおよび／または反応チャンバーをカートリッジ本体に接続するための反応チャンバー接続突出部は、流体、即ち空気が反応チャンバーを出ることができる少なくとも１個の流体開口部を含む。よって、一実施形態において、反応チャンバーおよび／または反応チャンバー接続突出部は、流体開口部Ａを含む。これにより、試料が、カートリッジ本体に導入され、反応チャンバーに進入する場合、空気は、試料通路および反応チャンバーから脱出することができる。空気は、試料に置き換わる。好ましい実施形態において、前記流体開口部Ａは、空気を通過させるが、試料を通過させない障壁、好ましくは膜を含む。詳細は、上に記載されている。これにより、反応チャンバーに進入することができる試料の量は、反応チャンバーに含まれる乾燥組成物の再構成に必要な所望の量の試料が反応チャンバーに充填されるように制御される。よって、試料の通過を防止する膜により生じる逆圧により、所望の量の試料のみが反応チャンバーにポンプ送りされるため、前記障壁は、計量に用いることができる。十分に正確な計量は、反応チャンバーおよび／または流体開口部Ａを含む第２の突出部に含まれる流体開口部Ａに含まれる前記障壁により達成することができる。詳細は、上に記載されている。
【０１０７】
好ましい実施形態において、カートリッジ本体は、流体開口部Ａと、流体排出口Ａと、流体開口部Ａおよび流体排出口Ａを接続する流体通路Ａとを含む。流体開口部Ａは、流体、即ち空気等の気体を吸い上げることができ、流体は、反応チャンバーを去り、流体通路Ａを通して流れて、流体排出口Ａにおいてカートリッジ本体を去る。例えば多くの増幅方法による場合と同様に、分析方法が、反応チャンバーにおける加熱ステップを伴う場合、係る流体排出口Ａおよび流体通路Ａの設置は、特定の利点を有する。上述の通り、また、さらに詳細に後述する通り、流体通路Ａは、蓋と共にバルブとして機能する小型の棒状物を用いて遮断することができる。前記流体通路Ａの遮断は、加熱ステップにおける液体の蒸発を防止する。これは、加熱ステップを伴う、行われる分析方法の精度を改善し得る。
【０１０８】
カートリッジ本体は、試料容器を接続するための試料容器接続突出部を有する。試料容器を試料容器接続突出部に組み立てると、流体排出口Ｂおよび試料取入れ開口部は、容器と流体連絡する。よって、空気等の流体は、流体排出口Ｂを通して試料容器に進入することができ、試料等の流体は、試料取入れ開口部を通して試料通路に進入することができる。好ましくは、上述の通り、また、さらに詳細に後述する通り、試料の移動を誘導するために、過圧が流体排出口Ｂを介して容器に導入される。しかし、上述の通り、容器からカートリッジへと試料を移行するために、他の方法も実行可能である。
【０１０９】
前記第１の突出部は、１つまたは複数の側壁で構成され得る。チャンバーは、前記１つまたは複数の側壁および底壁により形成され得る。前記チャンバーは、底壁の反対に開口部を有することができる。試料容器を前記接続突出部に接続することにより、流体排出口Ｂおよび試料取入れ開口部は、前記第１の突出部の底壁または側壁の１個に配置される。流体排出口Ｂおよび試料取入れ開口部のこのような配置は、第１の流体、好ましくは空気が試料容器接続突出部に接続されたチャンバーおよび試料容器に吹き込むことを可能にする。第１のチャンバーに吹き込まれたこの空気を用いて、流体排出口Ｂを去り、チャンバーおよび試料容器に進入する流体により生じた過圧により、試料容器に含まれる試料等、さらなる液体を、試料容器接続突出部に接続された試料容器から去らせることができる。試料取入れ開口部の配置は、試料を試料容器から去らせ、試料通路に沿って試料排出口へと流すことができる。
【０１１０】
カートリッジ本体への試料容器の接続は、試料容器とカートリッジ本体との間の緊密な接続を可能にするいずれかの適した手段により達成することができる。例として、ねじ接続、クリッピング機構またはバヨネット（bayonet）クリッピングが挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態において、試料容器接続突出部の１つまたは複数の側壁は、試料容器の開口部に嵌まるように適合されて、接続を達成する。あるいは、１つまたは複数の側壁は、側壁および底壁により形成され得る第１のチャンバーに嵌まるよう接続突出部に適合されてよい。
【０１１１】
本発明に係るカートリッジ本体は、好ましい実施形態において、反応チャンバーを接続するための少なくとも１個の反応チャンバー接続突出部をさらに有する。反応チャンバーを反応チャンバー接続突出部に組み立てることにより、試料排出口は、反応チャンバーと流体連絡する。これにより、試料は、試料排出口を通して反応チャンバーへと進入することができる。反応チャンバー接続突出部は、１つまたは複数の側壁と、底壁とで構成され得る。反応チャンバーと反応チャンバー接続突出部との間の接続は、カートリッジ本体と反応チャンバーとの間に緊密な接続を確実にする任意の適した手段により再度達成することができる。例えば、第２の突出接続部の１つまたは複数の側壁は、反応チャンバーの開口部に嵌まるように適合され得る、あるいは側壁は、例えば、１つまたは複数の側壁と底壁とにより形成され得、底壁の反対に開口部を有する第２の突出接続部の第１のチャンバーに嵌まるよう反応チャンバーの接続突出部に適合され得る。反応チャンバーは、反応チャンバー接続突出部の側壁または底壁に接続することができる。
【０１１２】
試料排出口および場合により流体開口部Ａは、反応チャンバー接続突出部の底壁または側壁の少なくとも１つに配置することができる。上に記す通り、反応チャンバーに流体開口部Ａを配置することも考えられる。しかし、本明細書に記載されている通り、これらをカートリッジ本体、特に反応チャンバー接続突出部に設置することが好ましい。試料排出口および流体開口部Ａのこのような配置は、試料を、試料排出口を通して反応チャンバーに進入させることができる。好ましくは、試料排出口および流体開口部Ａは、反応チャンバー接続突出部の側壁に配置されたチューブにより提供される。チューブは、いかなる形状を有していてもよく、例えば折曲（turning）も含み得る。チューブにおける試料排出口の構築は、試料が、反応容器の側壁にピペット操作されるのと同様の制御された様式で反応チャンバーに進入するという利点を有する。これにより、反応チャンバーの制御されない流れを防止することができる。反応チャンバーと流体連絡した流体開口部Ａは、試料容器から来て、試料通路を通過し、試料排出口を経て反応チャンバーに進入する試料により反応チャンバー内で生じる圧力により、反応チャンバーにおける空気を反応チャンバーから去らせることができる。好ましくは、流体開口部Ａは、反応チャンバー接続突出部の底壁に設置されたチューブにより提供される。上述および下述の通り、反応チャンバーが、再構成に必要な所定の、従って所望の量の試料で充填されると、カートリッジ、個々に反応チャンバーへのさらなる試料の進入を制御するために、前記流体開口部Ａは、好ましくは、膜、好ましくは疎水性膜により閉鎖される。流体開口部Ａを密封している膜は、試料が膜を湿らすまで、空気を少なくとも脱出させることができる。通常、空気の通過はまた、膜が湿ると妨害またはさらには防止される、あるいは空気は、高圧が発生される場合にのみ通過することができ、その理由として、高圧は反応チャンバー内で加熱反応を行うときに生じ得るからである。好ましくは、前記膜は、第２の突出接続の側壁に含まれるチューブの上端に位置する。チューブの形態で流体開口部Ａを提供し、前記チューブ内に、あるいは好ましくは前記チューブの上端に膜を置くことは、反応チャンバーの早すぎる閉鎖を防止することができるという利点を有する。試料が、加えられた圧力により反応チャンバーを速く流れる場合であっても、試料がチューブを上昇する前に先ず反応チャンバーが充填される必要がある。これにより、試料が膜に接触し、従ってこれを湿らす前に反応チャンバーに所望の量の試料が充填され、これにより反応チャンバーをロックすることが確実になる。これにより、反応チャンバーに乾燥組成物の正確な再構成に必要な所定の量の液体が充填されない事態を生じ得る、試料排出口および流体開口部Ａの不要な迂回が防止される。
【０１１３】
本発明に係るカートリッジ本体は、流体取入れ開口部および流体排出口を有すると記載されている。好ましくは、流体取入れ開口部（または一般に開口部）および流体排出口は、本体における穴であるまたはそれを含むことが理解されている。流体取入れ開口部は、流体が流体通路へと流れる穴を形成することができ、流体排出口は、流体通路から流体が流れ出る穴を形成することができる。これは、チューブの形態で提供することができる。２本の流体通路の間の接合部において、同一の穴が、両方の機能を提供することができる。流体取入れ開口部（一般に開口部）と流体排出口のどちらも、形状は限定されない。好ましくは、穴は、円形または楕円形である。しかし、穴は、正方形、三角形または他のいかなる幾何学的形状であってもよい。穴は、開いた穴となり得る。穴は、膜またはフィルターを含むまたはこれで覆われていてもよい。また、この場合、穴は、対象とする流体が、膜またはフィルターを通して流れることができる限り、別の種類の流体が、前記膜またはフィルターを通過することができない場合であっても、穴、従って開口部または排出口であると依然として理解される。
【０１１４】
カートリッジ本体は、流体通路を有することが主張されている。流体通路として、これは、液体（特に、試料）または気体、特に空気等、流体を流すことができる。これは、いかなる形態またはサイズを有してもよい。通路は、１個または複数個のチャネルおよび／または空洞を含むことができる。例えば、通路は、その上部において開口していてよく、例えば、プラスチックフィルム等、蓋を用いて閉鎖することができる。通路は、上述の通り蓋と併せて単純なバルブを設置するための棒状物を含むことができる。通路は、本体を通して導かれる流体のための導管も包含する。通路は、横断面が対称的な形状である必要はない。本発明に係る通路は、流体の流れを既定の方向に導くことができる。例えば、試料が、圧力を加えると試料通路に導入される場合、試料通路は、試料の流れを１個または複数個の反応チャンバーへと導く。試料が導入される場合、流体通路Ａは、空気を流体排出口Ａへと導き、これにより通路システムおよび反応チャンバーから空気を出すことができる。
【０１１５】
カートリッジ本体の試料容器接続突出部は、好ましい実施形態において、第１のチャンバーを取り囲み得る１つまたは複数の側壁で構成され、第１のチャンバーは、底壁によりさらに形成され、底壁の反対に開口部を有する。好ましい実施形態において、試料容器接続突出部の側壁は、管状体を形成し、管状体とは、単に、側壁が、その向かい合う端部同士が閉じられた１つの側壁で構成され得ることを意味する。従って、本明細書における用語「側壁」は、１個の個々の側壁のみが用いられる実施形態も指し、これを網羅する。しかし、試料容器接続突出部は、管状形である必要はない。試料容器接続突出部は、例えば、個々の端部が互いに接続された２個以上、例えば４つの側壁で構成された長方形または四角形（quadratic）の横断面を有することができる。試料容器接続突出部は、また、三角形の横断面または他のいずれかの適した横断面のものとなり得る。１つまたは複数の側壁により形成された第１のチャンバーは、底壁によりさらに形成される。好ましくは、試料容器接続突出部は、カップ形のものである。試料容器接続突出部の底壁は、平らな表面となり得る。しかし、カップのものと同様に、底壁は、丸い形のものであってもよい。一実施形態において、チャンバーは、底壁の反対に開口部を有する。この開口部は、側壁に使用されない領域と同じ大きさとなり得る。しかし、開口部は、第１のチャンバーとさらに接し（boarder）、底壁の反対に配置される上壁に形成されてもよい。
【０１１６】
一実施形態において、試料容器接続突出部は、試料容器の開口部に嵌まるように適合される、あるいは試料容器の接続突出部が試料容器接続突出部の第１のチャンバーに嵌まるように適合される。接続突出部は、好ましくは、試料容器が接続突出部の側壁に接続され、これにより試料容器がカートリッジ本体に緊密に接続されるように適合される。
【０１１７】
好ましくは、流体排出口Ｂおよび試料取入れ開口部は、試料容器接続突出部の底壁にまたは側壁の１個に配置される。流体排出口Ｂおよび試料取入れ開口部は、同一要素に配置される必要はない。例えば、流体排出口Ｂが、底壁に配置され、試料取入れ開口部が、第１の突出部の側壁の１個に配置されてよい。流体排出口Ｂおよび試料取入れ開口部は、好ましくは、第１のチャンバー中に開口するよう配置される。しかし、流体排出口Ｂおよび試料取入れ開口部が側壁に配置され、側壁の上表面において開口することも実行可能である。
【０１１８】
カートリッジ本体の反応チャンバー接続突出部も、好ましい実施形態において、第２のチャンバーを取り囲むことのできる１つまたは複数の側壁で構成され、第２のチャンバーは、底壁によりさらに形成され得る。これは、底壁の反対に開口部を含むことができる。好ましい実施形態において、反応チャンバー接続突出部の側壁は、管状体を形成し、管状体とは、側壁が、その向かい合う端部同士が閉じられた１つの側壁で構成され得ることを意味する。しかし、反応チャンバー接続突出部は、管状形である必要はない。反応チャンバー接続突出部は、例えば、個々の端部が互いに接続された４つの側壁で構成された長方形または四角形の横断面を有することができる。反応チャンバー接続突出部は、三角形の横断面または他のいずれかの適した横断面のものとなることもできる。側壁により形成される第２のチャンバーは、底壁によりさらに形成される。好ましくは、反応チャンバー接続突出部は、カップ形のものである。反応チャンバー接続突出部の底壁は、平らな表面となり得る。しかし、カップのものと同様に、底壁は、丸い形のものであってもよい。チャンバーは、底壁の反対に開口部を有する。この開口部は、側壁に使用されない領域と同じ大きさとなり得る。しかし、開口部は、第１のチャンバーとさらに接し、底壁の反対に配置された上壁に形成されてもよい。
【０１１９】
反応チャンバー接続突出部は、一実施形態において、反応チャンバーの開口部に嵌まるように適合される、あるいは反応チャンバーの接続突出部が、反応チャンバー接続突出部のチャンバーに嵌まるように適合される。接続突出部は、反応チャンバーが接続突出部の側壁に接続され、これにより試料容器がカートリッジ本体に接続され得るように適合される。
【０１２０】
一実施形態において、試料排出口および流体開口部Ａは、反応チャンバー接続突出部の底壁にまたは側壁の１個に配置される。試料排出口および流体開口部Ａは、同一要素に配置される必要はない。例えば、試料排出口が、底壁に配置され、流体開口部Ａが、側壁の１個に配置されてよい。試料排出口および流体開口部Ａは、好ましくは、反応チャンバー接続突出部のチャンバー中に開口するよう配置される。しかし、試料排出口および流体開口部Ａが、側壁に配置され、側壁の上表面において開口することも実行可能である。その上、上述の通り、流体開口部Ａは、これをカートリッジ本体に配置することが好ましいとしても、好ましくは上部において反応チャンバーに含まれてもよい。好ましくは、本明細書においても、上述の理由により、試料排出口および流体開口部Ａは、側壁の凸部にチューブとして配置される。
【０１２１】
好ましい実施形態において、カートリッジ本体は、第１の末端開口部および第２の末端開口部を備えるチューブを含み、チューブの第１の末端開口部は、試料取入れ開口部と整列する。よって、チューブは、試料通路へと延在する。試料容器から来た流体は、先ずチューブの第２の末端開口部へと進入し、チューブを流れて、第１の末端開口部においてチューブを去り、チューブの第１の末端開口部と整列した試料取入れ開口部を通して試料通路に進入する。前記チューブは、例えば、カートリッジ本体に組み立てられると、試料容器へと到達するよう用いることができ、流体排出口Ｂを通して試料容器に進入する流体によって試料容器に過圧が生じる場合、容器に含まれる試料等の流体を試料通路に流すことができる。過圧は、流体取入れ開口部Ｂに接続することのできるポンプ等、圧力発生デバイス（devise）により発生させることができる。
【０１２２】
チューブは、いかなる形状および材料のものであってもよく、例えば、可撓性であってよい。しかし、好ましい実施形態において、チューブは、硬質の長手方向に延在するチューブである。試料容器がカートリッジ本体に取り付けられる場合、これは、試料容器のカートリッジ本体へのより容易な取り付けを可能にし、チューブをより容易に試料容器の開口部中に進入させることができる。好ましくは、チューブは、カートリッジ本体と同一の材料から作製される。好ましくは、これは、前記カートリッジ本体の一体的な部分を形成する。
【０１２３】
好ましい実施形態において、試料容器接続突出部の１つもしくは複数の側壁および／または反応チャンバー接続突出部の１つもしくは複数の側壁は、管状体を形成する。管状体の形態の試料容器接続突出部および／または反応チャンバー接続突出部の形成は、試料容器接続突出部への試料容器の緊密な接続を容易にし、反応チャンバー接続突出部への反応チャンバーの緊密な接続を容易にする。
【０１２４】
接続突出部への試料容器と反応チャンバーとの間の組み立ては、いずれかの適した手段により達成することができる。接続は、形態的閉鎖、力的閉鎖および／または摩擦ロックの原理に基づくことができる。接続のための選ばれた手段に依存して、第１のおよび反応チャンバー接続突出部は、係る接続の達成に適した要素を含む。好ましい実施形態において、試料容器接続突出部の１つまたは複数の側壁は、管状体を形成し、管状体は、外部ねじ山（thread）を有し、これにより、ねじ留めによる適合する試料容器とカートリッジ本体との間の接続を達成することができる。好ましくは、反応チャンバー接続突出部の１つまたは複数の側壁も、反応チャンバーを組み立てるための手段を含む管状体を形成する。１個のカートリッジ本体に２個以上の反応チャンバーを組み立てることが好ましいため、複数の反応チャンバーを含むセットを一度で組み立てることを可能にする機構を用いることが好ましい。
【０１２５】
流体通路は、カートリッジ本体のベースプレートの表面に形成された少なくとも１個のチャネルおよび／または空洞により少なくとも部分的に形成され得る。カートリッジ本体にベースプレートを設置することにより、カートリッジ本体をより容易に取り扱うことができる。チャネルおよび／または空洞は、例えば、ベースプレートを射出成形することにより、あるいはベースプレートにチャネルまたは空洞を刻むことにより、予め用意されたベースプレートの表面に容易に形成することができるため、ベースプレートの表面に形成された少なくとも１個のチャネルおよび／または空洞の形態で少なくとも部分的に流体通路を設置することにより、流体通路を作製するための容易な製造方法が可能となる。
【０１２６】
通路とは、その中を個々の流体が流れることができる、流体の流れを導く空間を特に指す。よって、個々の通路は通常、個々の取入れ開口部から始まり、個々の流体排出口に終わる。好ましくは、通路は、少なくとも１個のチャネルおよび／または空洞により設置される。これは、システム、従って複数のチャネルおよび／または空洞により流体連絡が達成される通路も包含する。カートリッジ本体の異なる側面に配置され得る個々の流体取入れ開口部または個々の流体排出口に到達するため、個々の通路が、基礎本体の表面におけるチャネルにより完全には形成され得ない設計も実行可能である。例えば、個々の流体取入れ開口部または個々の流体排出口に到達するために、通路が、本体を通る導管の形態で少なくとも部分的に導く必要のある設計が実行可能である。
【０１２７】
好ましい実施形態において、カートリッジ本体に、ベースプレートに取り付けられた蓋が設置され、これにより、蓋は、カートリッジ本体に含まれる通路を少なくとも部分的に閉鎖する。これは、単純な仕方でのカートリッジ本体の製造を可能にする。上に記す通り、流体通路は、例えば本体にドリルで穿孔されてよい導管として設計され得る。本体にドリルで穿孔された導管と比較すると、カートリッジ本体の表面に含まれるチャネルまたは空洞は、より容易に製造することができる。発明のこの特定の実施形態において記載されている通り、１個または複数個のチャネルまたは空洞により形成される流体通路（複数可）を流体密封的に作製するために、これは、少なくとも１個の蓋により閉鎖される。蓋は、好ましくは、カートリッジ本体に接着または融合することのできるプラスチックフィルムまたはホイルにより用意される。蓋は、２０μｍ〜５００μｍの厚さを有することができ、好ましくは、５０μｍ〜３００μｍ、より好ましくは７５μｍ〜２５０μｍ、最も好ましくは１００μｍ〜１５０μｍの範囲内に収まる。一実施形態において、カートリッジ本体は、マルチパートの蓋を含み、例えば、異なる蓋区分を用いて、異なる流体通路の１個または複数個のチャネルおよび／または空洞を閉鎖することができる。好ましい実施形態において、カートリッジ本体は、少なくとも２個、好ましくは全流体通路のチャネルおよび／または空洞を閉鎖する蓋を含む。この設計は、カートリッジ本体の製造プロセスをさらに単純化する。
【０１２８】
好ましい実施形態において、カートリッジ本体にベースプレートが設置され、これにより、流体取入れ開口部Ｂ、流体排出口Ｂ、試料取入れ開口部、試料排出口、流体開口部Ａおよび流体排出口Ａは、ベースプレートの同一表面に配置される。ベースプレートの同一表面上における流体取入れ開口部および流体排出口の配置は、単純な仕方でのプロセシングデバイスへのカートリッジの挿入を可能にする。
【０１２９】
好ましい実施形態において、流体取入れ開口部Ｂ、流体開口部Ａおよび／または流体排出口Ａは、膜およびフィルターにより閉鎖される。その上また、図面に示す通り、流体通路のうち１個または複数個は、個々に密封されて、少なくとも部分的にその全長にわたり膜で覆われていてよい。この方策は、蓋に加えて、液体、特に試料が、カートリッジ本体を出ることができないことを確実にする。設置された膜またはフィルターは、例えば、流体により輸送される粒子を締め出すことにより、進入または流出する流体の流れを清浄化する基本的な機能を有することができる。その上、反応チャンバーと流体連絡した流体開口部Ａに含まれる膜またはフィルターに関して、フィルターまたは膜は、流体、この場合は試料の流れを制御するバルブの一種として用いることができる。好ましい実施形態において、流体開口部Ａは、空気または同様の流体のみを通過させるが、他の種類の流体、特に、より高密度の流体および／または特に、水もしくは試料等の水ベースの流体の通過を防止する膜を設置される。好ましい実施形態において、膜は疎水性である。係る膜の使用は、反応チャンバーから流れ出ることのできる種類の流体の制御を可能にする。試料は、試料排出口を通して反応チャンバーに進入し得る。反応チャンバーに進入する流体は、反応チャンバーにおいて過圧をもたらすであろう。しかし、空気は、流体開口部Ａに含まれる膜を通して脱出することができ、これにより、さらなる試料が反応チャンバーに進入することを可能にする。しかし、液体試料は、前記膜を通過することができない。これにより、反応チャンバーに含まれる試料の量が制御される。反応チャンバーは基本的に、膜が試料と接触すると即座にロックされる。従って、個々の疎水性膜またはフィルターを含む流体開口部Ａの配置は、反応チャンバーにおける圧力を制御し、試料排出口を通して反応チャンバーに進入する試料の量を制御する可能性をもたらす。反応チャンバーのサイズは、実質的に全空気が、流体開口部Ａに含まれる膜を通して反応チャンバーから去ると、従って、反応チャンバーに完全にまたはほぼ完全に試料が充填されると、必要な濃度で試薬を含む再構成された組成物の提供に必要な乾燥組成物を再構成するために、所定の量の試料が反応チャンバーに配置されるようなものとなり得る。
【０１３０】
好ましい実施形態において、カートリッジ本体は、一体型の要素である。特に好ましい実施形態において、一体型の要素は、ダイカスト（di-casting）または射出成形により作製される。代替的な実施形態において、カートリッジ本体は、一体型のカートリッジ本体と、一体型の基礎本体に取り付けられた蓋とを有する。これは、カートリッジ本体のより容易な製造を可能にする。蓋は、好ましくは、接着剤を備えた特定のホイル領域を有するホイルとして作製することができ、従って、基礎本体に蓋を永続的に取り付けることができる。
【０１３１】
一実施形態において、試料通路および／または流体通路Ａは、バルブを配置することができる。バルブは、好ましくは、個々の流体通路を通った流体の流れを防止するよう設計される。利点は、上に記載されており、試料容器および／または反応チャンバーにおいて加熱反応が行われる場合、特に適用される。上に記す通り、個々の流路が、チャネルを遮断する壁等の棒状物を有し、これによりチャネルを中断するよう設計される場合、バルブの容易な実施形態を実現することができる。バルブを形成するため、係るチャネルは、壁の領域に可動性、例えば可撓性のプレートを含む蓋により閉鎖され得る。可動性領域は、機械的手段、例えばピンまたはプロセシングデバイスに含まれる力により押し下げることができる。ピンが格納されている場合、通路における流体の圧力は、蓋の可動性部分を押し戻し、流体は、チャネルに配置された壁を越えて流れるであろう。一実施形態において、蓋の可動性部分は、一方では可動性部分の移動を可能にし、他方では通路における流体が、壁に続く流体通路のさらに別の部分のどこかへと流れるのを防止する必要な流体密封性をもたらす可撓性手段により蓋の残りの部分に接続されるであろう。代替的な実施形態において、蓋自体は、流体通路へと移動されてこれを遮断し得る壁等、棒状物を含み得る。例えば、上述の可動性部分は、壁を含み得る。可動性部分が下方に移動されると、壁は下方に移動され、流体通路を遮断し、これにより、そのように設計されたバルブを閉鎖する。
【０１３２】
カートリッジ本体は、さらに別の反応チャンバーを接続するための少なくとも１個のさらに別の接続突出部を含むことができ、前記さらに別の接続突出部は、上述の反応チャンバー接続突出部と同一の要素を含むことができる。２個以上の反応チャンバーの使用は、同一カートリッジを用いて２種以上の分析反応を行うことができるという利点を有する。これは、例えば、異なる病原体または疾患の存在に関する同一試料の検査を可能にする。
【０１３３】
第８の態様において、本発明の第５の態様に係るプロセシングカートリッジを作製するための方法であって、前記プロセシングカートリッジが、分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物を含む、少なくとも１個の反応チャンバーを含む方法が提供される。前記方法は、
（ａ）カートリッジ本体の試料取入れ開口部とカートリッジ本体の少なくとも１個の試料排出口との間に流体通路を設置するための少なくとも１個のチャネルおよび／または空洞を備えるカートリッジ本体を、ポリマーから作製するステップと、
（ｂ）少なくとも１個の反応チャンバー中に試薬を置き、その中で試薬を乾燥させ、これにより分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物を含む反応チャンバーを用意するステップと、
（ｃ）カートリッジ本体の少なくとも１個のチャネルおよび／または空洞を蓋で閉鎖するステップと
を含む。
【０１３４】
１個または複数個の反応チャンバーは、好ましくは、別個のデバイス（複数可）として提供される。これは、試薬を置き、乾燥させるプロセス、好ましくは凍結乾燥プロセスを単純化する。乾燥組成物およびそれに含まれる構成要素に関する詳細は、本発明の第１の態様と併せて上に記載されている。これは、個々の開示に参照されている。１個または複数個の反応チャンバーに乾燥組成物を得た後に、前記方法は、少なくとも１個の反応チャンバーをカートリッジ本体に組み立てるステップを含む。好ましくは、前記組み立てステップは、ステップｃ）の後に行われる。
【０１３５】
カートリッジ本体は、好ましくは、射出成形技術により作製される。上述の通り、カートリッジ本体は、好ましくは、少なくとも１枚の膜を含む。これは、少なくとも１枚の膜が、射出成形金型に組み立てられ、第１のステップにおいて、カートリッジの上部または下部側面が注入され、第２のステップにおいて、他の側面が注入され、これにより膜を含むカートリッジ本体を用意する多段階プロセスで作製される。
【０１３６】
本発明の第９の態様において、
ａ）分析方法のための試薬を含む乾燥組成物を含む少なくとも１個の反応チャンバーを含む、本発明の第５の態様に係るプロセシングカートリッジ、
ｂ）プロセシングカートリッジに組み立てることのできる、生体分子を含む試料を受け入れるための容器、
ｃ）それに組み立てられた容器を含むプロセシングカートリッジを受け入れるための、かつプロセシングカートリッジと併せて分析方法を行うためのプロセシングデバイス
を含む、生体分子を含む試料の分析方法を行うためのシステムが提供される。
【０１３７】
前記システムは、上述のプロセシングカートリッジを含む。その上、システムは、生体分子を含む試料を収集するための容器を含み、容器は、プロセシングカートリッジに接続することができる。第３の要素として、システムは、カートリッジを受け入れ、プロセシングカートリッジ内で分析方法を行うためのプロセシングデバイスを含む。プロセシングデバイスの設計は、行われる分析方法に依存する。続いて、個々のシステムを用いて分析方法を行うための操作方法と併せて、いくつかの詳細を記載する。
【０１３８】
第１０の態様において、第９の態様に係るシステムを用いて分析方法を行うための操作方法であって、
ａ）試料を含む容器を、本発明における第５の態様に係るプロセシングカートリッジに接続するステップと、
ｂ）プロセシングカートリッジをプロセシングデバイスに挿入するステップと、
ｃ）完全に（fully）自動化されたアッセイを開始するステップと
を含む方法が提供される。
【０１３９】
続いて、本出願人らは、個々の操作方法の個別のステップについて説明する。第１のステップにおいて、試料が得られ、容器に挿入される。容器は、好ましくは、収集された試料の溶解に適し、プロセシングカートリッジの反応チャンバーに含まれる乾燥組成物の再構成に適した溶解組成物を含む。溶解組成物は、好ましくは、上述の溶解溶液である。試料を含む容器は、例えば、含まれる試料を溢流させるリスクなしで容器を取り扱うことができるように閉鎖することができる。操作方法を開始するため、試料および溶解組成物を含む容器が、プロセシングカートリッジに接続される。この目的のため、プロセシングカートリッジは、容器とカートリッジとの間の緊密な接続を可能にする適した手段を含む。詳細は、上に記載されている。容器がカートリッジに接続されると即座に、それに組み立てられた容器を含むカートリッジをプロセシングデバイスに挿入することができる。従って、顧客は、収集された試料を含む容器をプロセシングカートリッジに接続し、プロセシングデバイスに挿入することだけが必要とされる。続く全ステップは、自動的に行われる。
【０１４０】
好ましい実施形態において、試料は、容器内で溶解される。好ましくは、容器に含まれる溶解組成物は、溶解された試料を清澄化するための上述の固体支持体を含む。好ましくは、溶解は、加熱により補助される。この目的のため、プロセシングデバイスは、加熱ユニットを含むことができる。その上、磁性固体支持体が、溶解物（lysate）の清澄化に用いられる場合、プロセシングデバイスは、好ましくは、容器の底または側壁に結合している沈殿物／夾雑物と共に磁性固体支持体の収集を可能にするための磁石を含む。これにより、溶解された試料は、高度に効率的に清澄化することができる。好ましくは、清澄化された溶解された試料である溶解された試料は、試料取入れ開口部を通してプロセシングカートリッジに進入する。好ましくは、プロセシングカートリッジは、流体取入れ開口部Ｂ、第１の流体通路および流体排出口Ｂならびに試料取入れ開口部を備える、本発明の第５のおよび／または第６の態様と併せて上に記載されているカートリッジ本体設計を有する。上述の通り、個々の流体システムは、プロセシングカートリッジへの試料、好ましくは清澄化された溶解物（lysate）の移行を達成するために、非常に単純な設計を提供する。プロセシングデバイスは、流体取入れ開口部Ｂを通した空気のポンプ送りを可能にする圧力発生装置を含み得る。空気は、第１の流体通路および流体排出口Ｂを通して反応容器に進入する。その結果得られた圧力は、容器に含まれる好ましくは清澄化された溶解物（lysate）である試料が押し上げられ、従って好ましくは上述の試料取入れ開口部として設計された試料取入れ開口部を通ってプロセシングカートリッジに進入するという効果を有する。試料の進入を達成するためのさらに別の仕方は、上に記載されている。
【０１４１】
試料の進入を補助するため、プロセシングカートリッジは、好ましくは容器へと延在し、好ましくは清澄化された溶解された試料である試料へと延在するチューブを好ましくは含む。試料取入れ開口部を通してプロセシングカートリッジへと進入すると、試料は、試料排出口に到達するまで試料通路を通過する。試料排出口から、好ましくは上述の通り得られる清澄化された溶解物（lysate）である試料が、乾燥組成物を含む反応チャンバーに進入する。これにより、好ましくは溶解された試料である試料は、乾燥組成物と接触するようになり、従ってこれを再構成する。再構成プロセスは、例えば、上述の通り混合、ボルテックスまたは磁気撹拌（steering）することにより補助することができる。乾燥組成物が、例えば、マグネットホイル等、磁気撹拌を可能にする磁性材料を含む場合、プロセシングデバイスは、反応チャンバー内の乾燥組成物に含まれる磁性材料の運動を可能にする磁石を含む。一実施形態において、プロセシングデバイスは、交流電圧下の電磁石を含む。さらに別の実施形態において、永久磁石の回転が提供される。
【０１４２】
反応チャンバーの充填は、乾燥組成物の再構成に所定の量の液体のみが用いられることを確実にするために制御される。好ましい実施形態において、試料による反応チャンバーの充填は、液体試料のための障壁を形成する疎水性膜に試料が到達すると即座に停止する。図に示す通り、前記疎水性膜は、好ましくは第３の流体取入れ開口部の末端に位置する。
【０１４３】
乾燥組成物の再構成の後に、分析方法を行うことができる。プロセシングデバイスは、分析方法を行うのに必要な機械を含む。例えば、核酸増幅が行われる場合、プロセシングデバイスは、反応チャンバーが位置する領域において、特に加熱および冷却要素等、ＰＣＲ反応の実施に必要なあらゆる要素を含む。その上、プロセシングデバイスは、好ましくは、リアルタイムＰＣＲを行うことができるおよび／または蛍光シグナルを検出することができるように蛍光検出器を含む。しかし、プロセシングデバイスは、例えば分光光度的測定、濁度測定、ナノ粒子凝集の決定その他等、検出を行うための他の手段を含むこともできる。続いて、アッセイの結果は、好ましくは同様に、例えば、読み取りユニットにおけるプロセシングデバイスによって提示される。
【０１４４】
本発明に係るシステム全体は、その非常に単純な設計および非常に単純な流体のため、独自のものである。プロセシングカートリッジは、試料停止および計量構造（複数可）として疎水性膜を用い、いかなる込み入ったバルブも含まないが、その代わりに、棒状物／壁等、障壁により流体通路を一時的に閉鎖することができる。その上、これは、単純に空気を容器にポンプ送りすることにより、あるいはプロセシングカートリッジに接続された容器において試料が加熱される際に発生される過圧を利用することにより、システム内の試料を移動させることができる。従って、他のプロセシングカートリッジおよびシステムとは対照的に、設計全体が最小限まで低減され、これにより全要素の費用効率的な作製を可能にする。アッセイの完了後に、プロセシングカートリッジ全体は、それに接続された容器と共に廃棄することができる。容器をプロセシングカートリッジに組み立てた後、システム全体が閉鎖され、これによりカートリッジに含まれる試料または例えば増幅産物が、カートリッジから脱出し得ることを防止する。この目的のため、適した膜が用いられる。分析方法の実施に用いる必要がある液体のみが、試料を含む容器から来る。容器は、プロセシングカートリッジ内の分析のための試料の調製、例えば、試料溶解がその中で行われるため、同時に試料プロセシング容器として機能する収集容器である。その上、容器は、唯一の液体、即ち、必要であれば、反応チャンバーに含まれる乾燥組成物の再構成に適したものとなるよう前処理された試料を含む液体コンテナとしても機能する。核酸が、対象とする生体分子である場合、試料は、好ましくは、本発明の第１の態様と併せて上に記載されている容器内で溶解され、清澄化される。試料取入れ開口部を通してカートリッジ本体に進入する試料は、再構成された組成物が、例えば、必要とされる感度および／または特異性による、増幅および検出反応を含む企図される分析方法の実施に適するような、反応チャンバーに含まれる乾燥組成物の再構成に適している。一実施形態において、試料は、容器においてこの目的のため調製される、例えば、上述の通り溶解および清澄化される。容器は、好ましくは、５００μｌ〜３ｍｌの溶解および／または安定化溶液を含む。核酸分析のために試料を調製するための好ましい溶解溶液は、上に記載されている。前記溶解溶液は、好ましくは、上述の通り溶解物（lysate）を清澄化するための固体支持体を含む。機能検査ユニットは、容器をプロセシングカートリッジに接続することにより得られる。
【０１４５】
本発明のプロセシングカートリッジを用いてアッセイプロトコールを操作するためのプロセシングデバイスは、精巧な機械的システムを含む。設計は、行われる分析方法に依存する。プロセシングデバイス内部の主な機械的電子工学的特色は、試料の溶解を支持するための加熱要素、プロセシングカートリッジに容器が組み立てられる場合、容器への空気のポンプ送りに適したポンプ、磁気撹拌のための少なくとも１個の磁石である。その上、ＰＣＲ反応が行われるべき場合はＰＣＲユニットが提供される。プロセシングデバイス内で行われるＰＣＲ反応の熱サイクリングは一般に、ペルチェ（Pelletier）素子により容易となる。プロセシングカートリッジとプロセシングデバイスとの間のあらゆる接続は、好ましくは、膜で密封される。システム全体は、複雑性が低い。
【０１４６】
本明細書において参照されている数値範囲は、範囲を規定する数を包括する。本明細書に提供されている標題は、本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではなく、これは、本明細書を総体的に参照しつつ解釈することができる。一実施形態において、方法の場合は特定のステップを含むものとして、あるいは組成物、溶液および／または緩衝液（buffer）の場合は特定の成分を含むものとして本明細書に記載されている主題は、個々のステップまたは成分からなる主題を指す。本明細書に記載されている好ましい実施形態を選択および組み合わせることが好ましく、好ましい実施形態の個々の組合せから生じる特定の主題も、本開示に属する。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】実施例１に従って得られた清澄化された溶解物（lysate）および清澄化されていない溶解物（lysate）（参照）を用いた、定量的ＰＣＲの結果を示す図である。ＭａｓＧ：マグアトラクト（MagAttract）懸濁液Ｇ（キアゲン（QIAGEN））；ＭａｓＢ：マグアトラクト（MagAttract）懸濁液Ｂ（キアゲン（QIAGEN））、Ｓｅｒａｄｙｎ（カルボキシル化磁性粒子）；ｒｅｆ：磁性粒子処理（清澄化）なし溶解物（lysate）。
【図２】溶解物（lysate）清澄化のために異なるビーズを検査した、実施例２の結果を示す図である。一方の参照は、ビーズなしだが血液ありでプロセシングし（溶解物（lysate）清澄化なし）、第２の参照は、ビーズなし血液なしだが添加（spike）細菌ありで検査した。従って、第２の参照は、基本的にＰＣＲ阻害化合物／夾雑物が存在しないＰＣＲの結果を示す。
【図３】本発明に係る溶解物（lysate）清澄化プロセスの効率を実証する図である。左側に、清澄化されていない血液溶解物（lysate）を示し、右側に、本発明に係る溶解物（lysate）清澄化を行った同一試料を示す。
【図４】７種の異なる腟スワブ試料を用いて清澄化された溶解物（lysate）を作製した、実施例３の結果を示す図である。定量的ＰＣＲにおいて１０μｌの清澄化されたまたは粗（未清澄化）溶解物（lysate）を直接的に用いた。
【図５】異なる種類の磁性粒子を用いて溶解物（lysate）を清澄化した、溶解した４種の異なる腟スワブ試料の結果を示す図である。定量的ＰＣＲにおいて１０μｌの溶解物（lysate）を用いた。Ｓｅｒａｄｙｎ（カルボキシル化ビーズ）；ＭａｓＧ（マグアトラクト（MagAttract）懸濁液Ｇ（キアゲン（QIAGEN）））；ＭａｓＢ（マグアトラクト（MagAttract）懸濁液Ｂ（キアゲン（QIAGEN）））。
【図６】定量的ＰＣＲにおいて異なる容量の清澄化された溶解物（lysate）を直接的に用いてヒトゲノムＤＮＡを検出した、異なる磁性粒子を用いてプロセシングされプールされた腟スワブ試料を示す図である。２５μｌの溶解物（lysate）または清澄化された溶解物（lysate）を添加することにより、乾燥ＰＣＲ組成物を再構成した。
【図７】腟スワブ試料等、酸性試料をプロセシングする場合における、溶解におけるゼオライトの取り込みの有益な効果を示す図である。実施例６に従ってゼオライトありおよびなしで試料をプロセシングした。
【図８】ゼオライトありおよびなしで血液試料をプロセシングし、大腸菌（E.coli）のゲノムＤＮＡを検出するための定量的ＰＣＲにおいて異なる容量の溶解物（lysate）を直接的に用いた、実施例７の結果を示す図である。２５μｌの清澄化された溶解物（lysate）を用いて、プライマーおよびプローブを含む乾燥ＰＣＲミックスを再構成した。
【図９】実施例８の結果を示す図である。８名の異なるドナーから得られた頬側スワブ試料を、ゼオライトありおよびなしでプロセシングし、異なる容量の溶解物（lysate）を用いて、これを定量的ＰＣＲにおいて直接的に用いた。
【図１０】１６種の独立的な調製物から得られた糞便スワブ試料をＳｅｒａｄｙｎビーズによりプロセシングし、大腸菌ゲノムＤＮＡおよびヒト遺伝子を検出する定量的ＰＣＲにおいて、得られた清澄化された溶解物（lysate）を異なる容量で直接的に用いた、実施例９の結果を示す図である。
【図１１】カルボキシル化磁性ビーズを用いて沈殿物を除去する場合における、ＰＣＲにおける効果を示す図である（実施例１１を参照）。試料１、２、５および７は、溶解物（lysate）を清澄化するために磁性ビーズを添加しなかった腟スワブ試料である。試料３、４、６および８は、腟スワブ試料の溶解物（lysate）にカルボキシル化磁性粒子を添加することにより得られた、清澄化された溶解物（lysate）である。
【図１２】図１２ａ）は、本発明に係るカートリッジ本体の上面図であり、図１２ｂ）は、図１２ａ）における線Ａ−Ａに沿って切断した図１２ａ）のカートリッジ本体の側面図である。
【図１３】試料容器および反応チャンバーを組み立てた、図１２におけるカートリッジ本体の側面図である。
【図１４】本発明に係るカートリッジの下方からの透視図である。
【図１５】本発明に係るカートリッジのさらに別の実施形態の組立分解透視図である。
【図１６】図１５に示す試料カートリッジの上面図である。
【図１７】反応チャンバーを含むプロセシングカートリッジを提供するための、カートリッジに組み立てることのできる複数の反応チャンバーを含むデバイスを示す図である。
【図１８】バルブとして機能する流体通路６および９内の壁の機能を図解する図である。
【図１９】本発明に係るシステムを図解する図である。
【図２０】試料の収集を図解する図である。
【図２１】実施例１２に記載されている試料の溶解および凍結乾燥ＰＣＲミックスの再構成を行うための、本発明の異なる実施形態の実施を図解する図である。
【０１４８】
図１２ａ）に示すカートリッジ本体３３は、流体取入れ開口部Ｂ（１）および流体排出口Ｂ（２）を有する。流体通路Ｂ（３）は、カートリッジ本体の上表面に配置された壁に接することにより設置される。これにより、流体の通過が可能な空洞が形成される。従って、図１２ａ）に示す実施形態において、ほぼ正方形の横断面を有する流体通路Ｂ（３）が設置され、これにより正方形の流体通路Ｂ（３）の一隅に流体取入れ開口部Ｂ（１）が配置され、流体通路Ｂ（３）の第２の隅に流体排出口Ｂ（２）が配置される。流体取入れ開口部Ｂ（１）を経て流体通路Ｂ（３）に進入することができる流体、好ましくは、空気は、流体取入れ開口部Ｂ（１）から正方形の形状の流体通路Ｂ（３）をわたって流体排出口Ｂ（２）へと流れ、カートリッジ本体に試料容器が接続されている場合、試料容器に進入する。本明細書に記載されている通り、圧力により空気をカートリッジ、従って試料容器中に導入するために、ポンプを流体取入れ開口部Ｂ（１）に接続し、これによりカートリッジへの試料の進入を楽にすることができる。図１２ａ）に示すカートリッジ本体３３は、試料取入れ開口部４および試料排出口５がさらに設置される。試料取入れ開口部４および試料排出口５は、試料通路６により接続される。試料通路６は、カートリッジ本体の上表面におけるチャネルにより作製される。容器から試料取入れ開口部４を通してカートリッジ本体に進入する試料は、試料排出口５に到達するまで試料通路６に沿って進み、反応チャンバーがカートリッジ本体３３に組み立てられる場合、試料排出口５を通して反応チャンバーに進入する。図１２に示す実施形態は、カートリッジ本体３３の４個の反応チャンバー接続突出部を経てカートリッジ本体と接続された、４個の反応チャンバーを受け入れるよう設定される。反応チャンバー接続突出部（複数可）は、図１２ｂ）に見出すことができる。反応チャンバーを組み立てると、これは、分岐する試料通路６と流体連絡し、各分岐は、異なる反応チャンバーへと開口する異なる試料排出口で終わる。しかし、本明細書に記載されている通り、反応チャンバーをカートリッジ本体の一体的な部分として提供することも範囲内である。
【０１４９】
その上、カートリッジ本体は、流体開口部Ａ（７）および流体排出口Ａ（８）が設置される。試料通路６と同様に設計された流体通路Ａ（９）は、流体開口部Ａ（７）および流体排出口Ａ（８）を接続する、カートリッジ本体の上表面におけるチャネルである。流体開口部Ａ（７）および試料排出口５はそれぞれ、反応チャンバー接続突出部の側壁の凸部に部分的に含まれるチューブとして設計されている。前記チューブは、反応チャンバーと流体連絡している。流体開口部Ａ（７）および試料排出口５は、互いの反対に配置される。流体開口部Ａ（７）および試料排出口５を反応チャンバー側壁において少なくとも部分的にチューブとして設計することは、反応チャンバーへの流体の流れが十分に調節されるという利点を有する。管状試料排出口５を経た反応チャンバーへの試料の進入は、試料が反応チャンバーの側壁へと手動によりピペット操作されたのと同様である。これにより、反応チャンバーの不規則な充填をもたらし得る、試料による反応チャンバーの制御されない流れが防止され得る。流体開口部Ａ（７）は、液体障壁として疎水性膜を含む。膜は、反応チャンバーに進入する特に試料等の液体が前記障壁を通過するのを防止する。従って、流体開口部Ａにおける膜のため、液体は流体通路Ａ（９）に進入することができない。しかし、疎水性膜は、少なくとも液体で湿る前は、空気を通過させることができる。これにより、試料に置き換えられた空気は、流体開口部Ａ（７）を通って試料通路６および反応チャンバーを出ることができる。よって、空気に関して、流体開口部Ａ（７）は、空気を流体通路９へと導く流体取入れ開口部として考慮することができ、流体通路９から流体排出口Ａ（８）を通して空気はカートリッジから脱出する。流体排出口Ａ（８）および流体取入れ口Ｂ（１）は両者共に、反応チャンバーに含まれる液体、特に試料および／または反応産物（例えば、アンプリコン）の意図的でない漏出からカートリッジを密封するための疎水性膜を含む。プロセシングカートリッジのこの流体密封性は、試料容器が組み立てられると、接続された試料容器を包含するプロセシングカートリッジ全体を使用後に容易に廃棄することができるという利点を有する。
【０１５０】
試料通路６および流体通路９は、流体通路を生じるチャネルを中断することにより流体通路６および７を遮断する小型の棒状物５４を含む。カートリッジ本体を閉鎖する好ましくはホイルであるプロセシングカートリッジの蓋（図示せず）と共に、棒状物は、試料通路６および流体通路Ａの可逆的な閉鎖、従って密封を可能にするバルブとして機能する。これは、例えば、接続された試料容器または組み立てられた反応チャンバーのいずれかにおいて行われる加熱反応から生じる蒸発した水等の液体が、試料通路６および流体通路Ａを通って進むことを防止するため、有利である。試料通路６に関して、試料を溶解するために行われた加熱ステップにおいて試料容器から蒸発した水等の液体が、試料通路６を通って思いがけず進み、乾燥組成物を含む反応チャンバーに到達することが有利に防止される。蒸発した液体の係る漏出は、反応チャンバーに含まれる乾燥組成物の部分的な水分補給を生じ得、これは、前記乾燥組成物を損ない、これにより続く分析方法の実施を危うく（jeapordize）し得る。試料溶解のために行われる熱処理の際に蓋に圧力を加えることにより、バルブが閉鎖され、これにより蒸発した液体が反応チャンバーに到達することを防止する。溶解後に、圧力は蓋から除かれ、これによりバルブを開放し、小型の棒状物５４を超えて試料を流し、従って試料排出口５を通して反応チャンバーに進入することができる。流体通路Ａ（９）の遮断に関して、反応チャンバーに含まれる液体の蒸発を防止することができる。流体開口部Ａ（７）が、疎水性膜を含んでいても、反応チャンバーにおいて加熱ステップが行われる場合、発生される圧力のため膜により完全には防止されず蒸発が起こることがある。よって、反応チャンバーにおいて加熱ステップが行われる場合、流体通路Ａ（９）における棒状物５４の設置が特に有利である。
【０１５１】
図１２ｂ）から分かる通り、カートリッジ本体は、試料容器接続突出部１０を設置される。試料容器接続突出部１０は、底壁１３によりさらに形成され、底壁１３の反対に開口部１４を有する第１のチャンバー１２を取り囲む側壁１１で構成される。接続突出部の側壁は、試料容器の開口部に嵌まるように適合され、接続突出部１０の側壁１１に接続することになる試料容器に適合される。図１２ｂ）から分かる通り、試料取入れ開口部４は、底壁１３に配置される。図１２ａ）から分かる通り、流体排出口Ｂ（２）も底壁１３に配置される。試料容器は、側壁１１の外側に設置された外部ねじ山１５によって試料容器接続突出部１０の側壁１１に接続することができる。
【０１５２】
カートリッジ本体は、反応チャンバー接続突出部２０をさらに設置され、これは、第２のチャンバー２２を取り囲む側壁２１で構成され、底壁２３によりさらに形成され、底壁２３の反対に開口部２４を有する。接続保護の側壁２１は、反応チャンバーを形成するレセプタクルの開口部に嵌まるように適合される。反応チャンバーを形成する前記レセプタクルは、反応チャンバー接続突出部２０の側壁と接続することができる。図１２ｂ）から分かる通り、試料排出口５は、側壁２１の１個においてチューブまたはチャネルとして配置され、側壁２１の下端において開口する。同様に、第３の流体開口部Ａ（７）は、側壁２１の１個において配置され、該側壁２１の下端において開口する。上端に疎水性膜が設置される。
【０１５３】
図１２ｂ）から分かる通り、チューブ３０が設置される。チューブ３０は、第１の末端開口部３１および第２の末端開口部３２を有する。第１の末端開口部３１は、試料取入れ開口部４と整列する。図１２ｂ）から分かる通り、チューブ３０は、カートリッジ本体３３と一体的に配置される。
【０１５４】
図１３ａ）は、図１２に示すものと同じカートリッジ本体３３の側面図を示し、試料容器３９は、カートリッジ本体に組み立てられている。組み立てると、チューブ３０は、試料容器３９へと突出し、従って、試料チューブ３９に溶解溶液および分析される試料が充填されると溶解溶液内に位置し、これにより試料の進入を楽にする。その上、試料プロセシングカートリッジは、対象とする分析方法を行うための試薬を含む乾燥組成物を含む反応チャンバー３８を含む。図１３ｂ）から分かる通り、４個の反応チャンバー３８（ａ）〜３８（ｄ）が提供される。反応チャンバー３８は、カートリッジに組み立てるため、反応チャンバー接続突出部２０上に設置される１個の別のデバイスとして提供される。
【０１５５】
図１３ｂ）は、図１３ａ）に係る反応チャンバー３８（ａ）〜３８（ｄ）を含むデバイスを、図１３ａ）の線Ａ−Ａに沿って切断した側面図を示す。分析方法を行うための乾燥試薬を含む反応チャンバー３８（ａ）〜３８（ｄ）は、反応チャンバー接続突出部２０を介してカートリッジ本体３３に組み立てられる。流体開口部Ａ（７）は、疎水性かつ多孔性であり空気を通過させるが液体を通過させない膜４０により密封される。空気の通過は、疎水性膜４０が液体により湿らされると妨げられる。従って、試料が疎水性膜４０を湿らすと即座に、反応チャンバー３８は密封される。
【０１５６】
図１２および１３に示すカートリッジ本体３３は、図１４に示す通り試料容器３９と共に組み立てられるプロセシングカートリッジの一部を形成することができる。図１２、１３および１４に示す実施形態において、カートリッジは、４個の反応チャンバー３８を有するよう設計されている。この理由のため、図１２に示すカートリッジ本体の試料通路６は分岐し、各分岐は、各反応チャンバーの試料排出口において終わる。その上、各反応チャンバーは、個々に流体開口部Ａ（７）に接続され、これにより試料を対応する反応チャンバーへと流し、空気の脱出を可能にする。反応チャンバー３８は、反応チャンバーから対応する流体開口部Ａを通して流体排出口Ａへと脱出する空気を導くために、流体通路Ａ（９）に接続され、空気は流体排出口Ａからカートリッジを出る。図１３ｂ）に示す通り、全反応チャンバーの流体開口部Ａ（７）は、反応チャンバーから空気を脱出させ、反応チャンバーの充填を制御できるようにするために膜４０を含む。本明細書において、全流体開口部Ａ（７）を進む１枚の膜４０が用いられる。反応チャンバー３８は、プライマー、プローブ、酵素、ｄＮＴＰおよび緩衝液（buffer）等、増幅反応を行うための試薬を含む乾燥組成物を含有する。
【０１５７】
図１４に示す通り、試料容器３９は、カートリッジ本体３３に組み立てることができる。試料容器３９は、試料容器開口部が、本明細書においてチューブ３０を含む試料取入れ開口部４と流体接続するように配置された試料容器開口部を有する。試料容器３９は、内部ねじ山を有し、試料容器接続突出部１０の外部ねじ山１５にねじ留めされる。試料容器３９は、分析される試料を含有する。上に記す通り、好ましい実施形態において、試料は、上述の通り溶解溶液と混合される。溶解溶液は、好ましくは、溶解物（lysate）を清澄化するための固体支持体を含む。好ましくは、カルボキシル化ビーズが用いられる。これにより、試料は、分析のために前処理および調製される。続いて、清澄化された試料は、試料取入れ開口部４を通して試料通路６に進入することができる。しかし、溶解溶液と混合された試料が、試料取入れ開口部４を通して試料通路６に進入し、個々に起こる溶解が、乾燥試薬の再構成後に、例えば、ＰＣＲ反応において行われる加熱ステップの間に、カートリッジにおいて、例えば、反応チャンバー３８内で完了することも本発明の範囲内である。
【０１５８】
図１５は、カートリッジのさらに別の実施形態を示す。同様の要素は、図１２〜１４に示す実施形態における相当する要素と比較して数が１００増加した同参照番号を割り当てた。図１５に示す実施形態は、流体通路Ｂ（１０３）の全長にわたり膜１５０を設置できることを示す。図１５はまた、流体通路Ａ（１０９）の全長にわたり膜１５１を設置できることを示す。図１５はまた、蓋１５２をカートリッジ本体１３３に取り付けて、全流体通路を緊密に密封できることを示す。蓋１５２が、流体通路Ｂ（１０３）を少なくとも部分的に形成する第１のチャネル、試料通路１０６を少なくとも部分的に形成する第２のチャネルおよび流体通路Ａ（１０９）を少なくとも部分的に形成する空洞を閉鎖するように、蓋１５２は、カートリッジ本体１３３に取り付けられる。蓋は、好ましくは、プラスチックホイルである。本実施形態において、２個の反応チャンバーのみが設置される。
【０１５９】
図１６は、図１５に示すカートリッジの上面図である。同一の要素は、同一の番号付けにより示す。その上、カートリッジの下に、検出領域におけるプロセシングカートリッジとプロセシングデバイスとの間の接続を、カートリッジの図に示す線に沿って切断した側面図で示す。検出器は、反応チャンバーの下部に位置し、従って、例えば蛍光シグナルを捕捉することができる。
【０１６０】
図１７ａ）は、別個の要素として提供され、カートリッジ本体の対応する接続突出部に設置されて、これによりプロセシングカートリッジを提供することのできる反応チャンバー３８（ａ）〜３８（ｄ）を示す。理解される通り、４個の反応チャンバー３８（ａ）〜３８（ｄ）は、１個のデバイスとして提供され、これにより、取り扱い、特にカートリッジへの組み立てを単純化する。この目的のため、反応チャンバー３８（ａ）〜３８（ｄ）は、結合ブリッジ１５３を介して接続される。線Ａ−Ａに沿った側面図を図１７ｂ）に示す。さらに別の反応チャンバーの提供も本発明の範囲内である。
【０１６１】
図１８は、試料通路６および流体通路Ａ（９）に取り込まれる流体障壁１５４の詳細な図である。障壁は、示されている実施形態においてプラスチックホイルである蓋１５２に関連してバルブとして機能する小型の壁として設計されている。蓋１５２は、チャネルを覆い、個々の壁に接着する。蓋１５２に圧力が加えられる場合、チャネルは閉鎖され、水または試料等の液体は、前記障壁１５４を通過することができない。蓋から圧力が除去されると即座に、通路６および９のチャネルは開口し、本明細書においては溶解緩衝液（buffer）と混合された試料を含む試料、例えば溶解された試料または溶解混合物である液体は、前記障壁１５４を越えて流れることができる。代替的な設計において、個々の障壁１５４は、蓋１５２に取り付けられ、蓋に圧力を加えることによりチャネルに挿入される。下に、組み立てた試料容器および反応チャンバーを備えるカートリッジ本体の側面図が示されており、図中、詳細な図が強調されている。
【０１６２】
図１９は、本発明に係るシステムを図解する。試料は、スワブ４１を用いて収集され、試料は、溶解溶液を含む試料容器３９に挿入される。試料収集は、図２０においても図解されており、ねじ山を有し磁気撹拌子１５５を含む、異なる設計の試料チューブを用いている。試料容器３９は、分析方法を行うための乾燥試薬を含む組み立てられた反応チャンバーを含むカートリッジ本体３３に組み立てられる。次に、個々に組み立てられたカートリッジは、プロセシングデバイス１６０中に進入する。
【実施例】
【０１６３】
実施例１：血漿における大腸菌の溶解
材料
−  血漿（ＥＤＴＡ安定化）
−  大腸菌グリセロールストック（タイター：３．０４×１０8細胞／ｍｌ；１０μｌ＝３×１０6細胞）
−  溶解緩衝液（buffer）：０．１％ＰＶＰ  分子量１００００（ＭＷ１０．０００）；０．４５％Ｔｗｅｅｎ−２０；０．４５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣＬ  ｐＨ８．０；１ｍＭ  ＥＤＴＡ
−  磁性粒子懸濁液：
ａ）ＭａｓＧ（マグアトラクト（MagAttract）懸濁液Ｇ（キアゲン（QIAGEN）  −  シリカビーズ）
ｂ）ＭａｓＢ（マグアトラクト（MagAttract）懸濁液Ｂ（キアゲン（QIAGEN）  −  シリカビーズ）
ｃ）カルボキシル化磁性粒子（Ｓｅｒａｄｙｎ）
【０１６４】
プロトコール
１．５ｍｌマイクロチューブに９２０μｌの溶解緩衝液（buffer）を用意する。５０μｌの血漿を添加し、２０μｌのビーズ懸濁液を添加した。参照方法では、２０μｌの水を添加した。１０μｌの細胞（無希釈）を添加し、エッペンドルフ（Eppendorf）サーモミキサーにおいて５分間９５℃、１４００ｒｐｍで混合物をインキュベートする。これにより、細胞を溶解する。この混合物を室温まで冷やし、磁性分離（参照による沈降）を行う。添加された磁性粒子により、沈殿物を粒子に吸着させ、磁石を用いてチューブの底に収集する。これにより、溶解物（lysate）は清澄化される。大腸菌の定量的ＰＣＲにおいて得られた上清（清澄化された溶解物（lysate））を用いる（１μｌおよび１０μｌ）。
【０１６５】
ｑＰＣＲプロトコール
用いた条件を次表にまとめる。
【０１６６】
【表１】
2014533934.tif 000003
サイクリングパラメータ:5分間95℃;(10秒間95℃)40×
【０１６７】
結果
本実施例の結果を図１に示す。行われたＰＣＲ方法のＣｔ値を示す。特定の閾値を達成するため、Ｃｔ値が高いほど、より多くのＰＣＲサイクルが必要とされる。従って、高いＣｔ値は、試料における少量の核酸および／またはＰＣＲ阻害剤の存在のいずれかを示す。これらの効果を区別するため、１μｌおよび１０μｌの清澄化された溶解物（lysate）を並行して検査した。１０μｌの清澄化された溶解物（lysate）を用いたＰＣＲ反応は、より多くの核酸を含むため、Ｃｔ値は、１μｌの試料材料を用いたＰＣＲ反応と比較して減少する筈である。より多くの核酸がＰＣＲ反応に供されたという事実にもかかわらず相当な減少が見られない場合、これは、ＰＣＲ反応が阻害されることを示す。図１は、溶解物（lysate）を清澄化するための磁性粒子の添加が、全被験粒子によりＣｔ値の相当な減少をもたらすことを実証する。この結果は、溶解物（lysate）を清澄化するための本発明に係る方法が、増幅反応の阻害剤、特に溶解プロセスにおいて形成される沈殿物の除去において非常に効果的であることを実証する。シリカベースの磁性粒子も同様に相当な改善を示したが、カルボキシル化磁性粒子により最良の結果が達成された。カルボキシル化ビーズにより、Ｃｔ値の殆ど理想的な減少が達成される。参照方法（溶解物（lysate）を清澄化するために磁性粒子は添加されなかった）に従ってプロセシングされた試料において、ほぼ１０倍多い核酸が添加されたという事実にもかかわらず、Ｃｔ値はおよそ０．５Ｃｔ単位しか減少しなかった。これは、上清における夾雑物の存在によりＰＣＲが相当に阻害されたことを示す。従って、実施例１の結果は、全被験磁性粒子が、溶解物（lysate）からＰＣＲを阻害する沈殿物の除去に適していたことを実証する。より多くの溶解物（lysate）は、増幅反応により多くの阻害剤を導入するため、これは、定量的ＰＣＲにおいてより多量の溶解物（lysate）の使用を企図する場合、特に重要である。乾燥したＰＣＲ試薬を再構成するために溶解物（lysate）の使用を企図する場合、沈殿物等、阻害する夾雑物を効率的に除去するため、溶解物（lysate）清澄化が特に重要であり、これを続く実験で示す。しかし、複雑さの少ない試料型および／または他の分析方法のため、個々の溶解物（lysate）清澄化ステップは、有利であるとしても必須とは限らない。
【０１６８】
実施例２：血液におけるコリネバクテリウム属（Corynebacterium）の溶解
材料
−  血液（安定化）
−  コリネバクテリウムグルタミクム（Corynebacteria glutamicum）グリセロールストック（タイター：１．３×１０8細胞／ｍｌ；２３μｌ＝３×１０6細胞）
−  溶解緩衝液（buffer）（実施例１を参照）
−  磁性粒子懸濁液：
ａ）Ａｄｅｍｔｅｃｈカルボキシビーズ（Ａｄｅｍｔｅｃｈ）
ｂ）Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ  ＭＫ２３０／カルボキシル（ＪＳＲ  Ｃｏｒｐ）
ｃ）カルボキシル化磁性粒子（Ｓｅｒａｄｙｎ）
【０１６９】
プロトコール
１．５μｌマイクロチューブに９５２μｌの溶解緩衝液（buffer）を用意する。５０μｌの血液を添加し、２０μｌのビーズ懸濁液を添加する。参照方法においては、その代わりに２０μｌの水を添加し、本発明の教示に従った溶解物（lysate）清澄化は行われない。その後、２３μｌの細胞（無希釈）を添加し、混合物をエッペンドルフ（Eppendorf）サーモミキサーにおいて５分間９５℃、１４００ｒｐｍでインキュベートする。この混合物を室温まで冷やす。その後、溶解物（lysate）は、本発明に係る溶解物（lysate）を清澄化するための方法における磁性分離および参照方法による沈降により清澄化される。コリネバクテリウムグルタミクム（Corynebacterium glutamicum）の定量的ＰＣＲにおいて、上清（磁性分離の場合は清澄化された溶解物（lysate））を用いる（１μｌおよび１０μｌ）。
【０１７０】
ｑＰＣＲプロトコール
用いたＰＣＲ条件を次表にまとめる。
【０１７１】
【表２】
2014533934.tif 000004
サイクリングパラメータ:5分間95℃;(10秒間95℃)40×
【０１７２】
結果
結果を図２に示す。図に示す通り、投入材料として１０μｌの清澄化された溶解物（lysate）を用いた場合に観察されたＣｔ値の減少に由来するように、磁性ビーズを添加した場合、Ｃｔ値は相当に改善された。これは、被験ビーズが、溶解物（lysate）から特に沈殿物等、夾雑物の除去を成功でき、これにより相当な溶解物（lysate）清澄化効果を達成したことを示す。従って、より多くの溶解物（lysate）を増幅反応に用いることができる。
【０１７３】
図３は、いかなる種類の磁性粒子が検査されたかにかかわりなく、磁性ビーズにより血液沈殿物を効率的に除去することができることを示す。左側に、溶解物（lysate）を清澄化するために磁性粒子が添加されていない、溶解された試料を示す。図に示す通り、マイクロチューブの底に赤色の沈殿物が形成される。右側に、本発明の第３の態様により教示される通りに磁性粒子を用いて清澄化された、清澄化された血液溶解物（lysate）の上清を示す。図に示す通り、磁性粒子の単純な添加は、血液沈殿物の効率的な除去を可能にし、これにより溶解物（lysate）を清澄化する。
【０１７４】
実施例３：腟スワブの溶解および直接的な増幅
材料
−  腟スワブ
−  溶解緩衝液（buffer）（実施例１を参照）
−  磁性粒子懸濁液：カルボキシル化磁性粒子（Ｓｅｒａｄｙｎ）
【０１７５】
プロトコール
腟スワブ（子宮頸管内スワブ、Ｃｏｐａｎ）を１ｍｌ溶解緩衝液（buffer）中に移した。１．５ｍｌマイクロチューブに２００μｌの腟スワブ試料を用意した。５０μｌのＳｅｒａｄｙｎビーズ懸濁液におけるＳｅｒａｄｙｎビーズ沈降ありおよびなしで、２００μｌの溶解緩衝液（buffer）を添加した。この混合物を２０秒間ボルテックスし、エッペンドルフ（Eppendorf）サーモミキサーにおいて５分間９５℃、１４００ｒｐｍでインキュベートした。この混合物を室温まで冷やした。磁性分離を２分間行い、参照（ビーズなし）を最大スピードで１分間遠心分離した。ヒトＨ１８Ｓ定量的ＰＣＲにおいて１０μｌの上清を用いた。
【０１７６】
ｑＰＣＲプロトコール
ＰＣＲ条件は次の通りである。
【０１７７】
【表３】
2014533934.tif 000005
サイクリングパラメータ:5分間95℃;(10秒間95℃)40×
【０１７８】
結果
結果を図４に示す。磁性粒子の添加ありおよびなしで、７種の異なる腟スワブ試料を溶解し、１０μｌの個々の清澄化および清澄化されていない溶解物（lysate）を定量的ＰＣＲにおいて直接的に用いた。図に示す通り、清澄化された溶解物（lysate）は全て、ＰＣＲ反応を実施することができた。あらゆる事例において、本発明の教示するところに従って清澄化された溶解物（lysate）の性能は、遠心分離による沈殿物の沈降のみ行った参照方法と比較して相当により良好であった。
【０１７９】
実施例４：腟スワブによる溶解および直接的な増幅
材料、プロトコールおよび定量的ＰＣＲプロトコール
実施例３に記載されている通り試料を調製した。但し、Ｓｅｒａｄｙｎビーズに加えて、溶解物（lysate）を清澄化するために、シリカビーズ（マグアトラクト（MagAttract）懸濁液Ｇおよびマグアトラクト（MagAttract）懸濁液Ｂ（キアゲン（QIAGEN））も用いた。
【０１８０】
結果
図５は、結果を示す。図に示す通り、沈殿物は、カルボキシル化された表面またはシリカ表面のいずれかを有する異なる磁性粒子を用いることにより、溶解物（lysate）から効果的に清澄化することができる。
【０１８１】
実施例５：腟スワブによる溶解および直接的な増幅
材料
−  イオン交換粒子（デュオライト（Duolite）  ＥＳ４６８およびアンバーライト（Amberlite）  ＸＡＤ−７）およびガラスビーズ０．１ｍｍ
−  溶解緩衝液（buffer）（実施例１を参照）
【０１８２】
プロトコール
腟スワブ（子宮頸管内スワブ、Ｃｏｐａｎ）を１ｍｌの溶解緩衝液（buffer）中に移した。１．５ｍｌマイクロチューブにおいて１５ｍｇの粒子を秤量した。参照は、溶解物（lysate）清澄化のために粒子を添加せずに調製した。２００μｌの溶解緩衝液（buffer）および２００μｌの腟スワブ試料を添加し、混合物を２０秒間ボルテックスした。ボルテックスした混合物をエッペンドルフ（Eppendorf）サーモミキサーにおいて５分間９５℃、１４００ｒｐｍでインキュベートした。この混合物を室温まで冷やし、最大スピードで１分間遠心分離した。ヒトＨ１８ＳのｑＰＣＲにおいて上清、即ち、清澄化された溶解物（lysate）を用いた。
【０１８３】
ｑＰＣＲプロトコール
実施例３に記載されている通り定量的ＰＣＲを行った。しかし、全溶解物（lysate）はまた、凍結乾燥（lyophylle）において乾燥させた用いたプライマーおよびプローブを包含するＰＣＲマスターミックスと併せて検査した。２５μｌの清澄化されていない溶解物（lysate）（参照）または２５μｌの清澄化された溶解物（lysate）を添加することにより、用いたプライマーおよびプローブを包含する前記凍結乾燥したＰＣＲマスターミックスを再構成した。従って、清澄化された溶解物（lysate）を添加することにより、ＰＣＲマスターミックスの再構成を行った。
【０１８４】
結果
結果は、図６に示されており、１μｌまたは１０μｌの清澄化された溶解物（lysate）をＰＣＲに添加した場合、イオン交換粒子を用いた溶解物（lysate）の清澄化が、増幅の実施を成功させることを実証する。その上、結果は、乾燥したＰＣＲミックスを再構成するために、清澄化された溶解物（lysate）を使用できることも実証する。清澄化された溶解物（lysate）を再構成に直接的に用いて、これにより、例えば水または再構成緩衝液（buffer）を用いた別個の再構成ステップを時代遅れなものとすることができるため、これは、先行技術の方法と比較して相当な単純化である。従って、個々の方法は、本明細書にも記載されているラボオンチップシステムにおいて特に適している。結果に示す通り、参照方法は、１μｌまたは１０μｌを液体ＰＣＲマスターミックスに添加する場合、ＰＣＲ反応の実施を可能にしたが、乾燥したＰＣＲミックスの再構成に失敗した。本明細書において、ＰＣＲの成功は、溶解物（lysate）から沈殿物を除去するために磁性粒子を添加した場合のみに可能である。その後、方法は、ほぼ等しく効果的であった。これは、乾燥したＰＣＲミックスの再構成に適した溶解物（lysate）を効率的に調製および作製するという点において、本発明に係る溶解物（lysate）清澄化方法の利点を実証する。
【０１８５】
実施例６：腟スワブによる溶解および直接的な増幅
材料
−  ゼオライトＣＡＳ：１３１８−０２−１  Ｆｌｕｋａ、９６０９６
−  溶解緩衝液（buffer）（実施例１を参照）
−  カルボキシル化磁性粒子の懸濁液（Ｓｅｒａｄｙｎ）
【０１８６】
プロトコール
１ｍｌの溶解緩衝液（buffer）中に腟スワブ（子宮頸管内スワブ、Ｃｏｐａｎ）を用意する。１．５ｍｌマイクロチューブにおいて３０ｍｇのゼオライトを秤量する。参照において、ゼオライトを添加しなかった。２５０μｌの溶解緩衝液（buffer）を添加し、４０μｌのＳｅｒａｄｙｎビーズ懸濁液を添加した。２５０μｌの腟スワブ試料の添加後に、混合物を２０秒間ボルテックスし、エッペンドルフ（Eppendorf）サーモミキサーにおいて５分間９５℃、１４００ｒｐｍでインキュベートした。この混合物を室温まで冷やした。磁性分離を２分間行い、ヒトＨ１８ＳのｑＰＣＲにおいて清澄化された溶解物（lysate）、即ち、上清を用いた。通常の液体ＰＣＲ反応において１μｌ、１０μｌの溶解物（lysate）を用い、乾燥したＰＣＲ試薬によりＰＣＲ反応を行うために、２５μｌの清澄化された溶解物（lysate）を用いた。本明細書において、清澄化された溶解物（lysate）は、乾燥したＰＣＲ試薬を再構成するために同時に用いられる。
【０１８７】
ｑＰＣＲプロトコール
実施例３に記載されている通りＰＣＲを行ったが、一例において、プライマーおよびプローブを包含するＰＣＲミックスを乾燥させ、続いて２５μｌの清澄化された溶解物（lysate）で再構成した。
【０１８８】
結果
固体粒子としてのゼオライトによる腟スワブ溶解物（lysate）の処理は、ｐＨ値の上昇をもたらした。この効果は、１０を超えるＣｔ値によるＰＣＲ性能の顕著な改善をもたらした。従って、検出は１０００倍を超えて改善された。
【０１８９】
図７は、定量的ＰＣＲ反応において異なる容量の溶解物（lysate）を直接的に用いた、実施例６に従ってゼオライトありおよびなしでプロセシングした腟スワブ試料を示す。２５μｌの清澄化された溶解物（lysate）を用いて乾燥したＰＣＲ試薬を再構成した。右側に、試料のｐＨ値を示す。図に示す通り、溶解におけるゼオライトの添加は、溶解された試料のｐＨ値の上昇をもたらし、従って、最適条件下でＰＣＲ反応を行うことができるという効果を有した。よって、ゼオライトは、例えば、沈殿物等、溶解された試料に含まれる夾雑物が除去されるため、増幅反応において有益な効果を有するのみならず、さらに、ｐＨ値が上昇するため、ゼオライトは、ｐＨ値における有益な影響も有する。
【０１９０】
実施例７：血液における大腸菌の溶解および直接的な増幅
材料
−  ヒト血液
−  大腸菌グリセリンストック（タイター：９．２×１０9細胞／ｍｌ；１０μｌ（ＰＢＳにより１：３０希釈）＝３×１０6細胞）
−  ゼオライトＣＡＳ：１３１８−０２−１  Ｆｌｕｋａ、９６０９６
−  溶解緩衝液（buffer）：（実施例１を参照）
【０１９１】
プロトコール
３０ｍｇのゼオライトを秤量して、１．５ｍｌマイクロチューブに入れた。ゼオライトなしで参照を行った。５μｌの血液および１０μｌの細胞と共に、９８５μｌの溶解緩衝液（buffer）をマイクロチューブに添加した。この混合物をエッペンドルフ（Eppendorf）サーモミキサーにおいて５分間９５℃、１４００ｒｐｍでインキュベートした。この混合物を室温まで冷やした。短時間の遠心分離の後、大腸菌ｑＰＣＲにおいて上清を用いた。本明細書において、続くＰＣＲにおいて１μｌ、１０μｌおよび２５μｌ（乾燥したＰＣＲミックスの再構成のため）を用いた。
【０１９２】
ｑＰＣＲプロトコール
実施例３に記載されている通りＰＣＲを行った。１回の反応のため、プライマーおよびプローブを包含する完全ＰＣＲマスターミックスを凍結乾燥において乾燥させた。
【０１９３】
結果
結果は、沈殿物等の夾雑物を除いて溶解物（lysate）を清澄化するために、ゼオライトを固体粒子として効果的に用いることができ、従って、ＰＣＲ反応の直接的な実施に適した溶解物（lysate）を作製できることを実証する。ＰＣＲにおいて行われる、本発明の教示するところに従って清澄化された溶解物（lysate）も、乾燥したＰＣＲミックスの再構成に適していた。
【０１９４】
実施例８：頬側スワブにおける大腸菌の溶解および直接的な増幅
材料
−  ヒト血液
−  大腸菌グリセロールストック（タイター：９．２×１０9細胞／ｍｌ；１０μｌ（ＰＢＳによる１：３０希釈）＝３×１０6細胞）
−  ゼオライトＣＡＳ：１３１８−０２−１  Ｆｌｕｋａ、９６０９６
−  １．１ｍｌの溶解緩衝液（buffer）中に頬側スワブ（頬１つ当たり１スワブ）を移した
−  溶解緩衝液（buffer）（実施例１を参照）
【０１９５】
プロトコール
１．５ｍｌマイクロチューブにおいて３０ｍｇのゼオライトを秤量した。ゼオライトなしで参照を調製した。５μｌの血液および１０μｌの細胞と共に４９０μｌの頬側スワブ試料を添加した。この混合物をエッペンドルフ（Eppendorf）サーモミキサーにおいて５分間９５℃、１４００ｒｐｍでインキュベートする。この混合物を室温まで冷やし、遠心分離後に、大腸菌ｑＰＣＲにおいて上清（清澄化された溶解物（lysate））を用いた。本明細書において、２５μｌ反応液に１μｌ、１０μｌを添加した。
【０１９６】
ｑＰＣＲプロトコール
実施例３に記載されている通りプロトコールを行った。
【０１９７】
結果
結果を図９に示す。図に示す通り、溶解物（lysate）を清澄化するためのゼオライトによる頬側スワブ溶解物（lysate）の処理は、相当に改善されたＰＣＲ性能をもたらす。平均して、およそ２．６サイクル早くＣｔ値が達成される。これは、６倍の改善に相当する。
【０１９８】
実施例９：糞便スワブに添加した大腸菌の溶解および直接的な増幅
材料
−  ヒト糞便試料
−  次の通りに糞便試料スワブを得た。スワブ（ピューリタン（puritan）ポリエステル）を水で湿らせ、過剰な水を除いた。スワブを糞便試料中に押し付け、スワブをそれ自身の軸の周りで回転させることにより過剰な試料を除いた。次に、５００μｌの溶解緩衝液（buffer）を充填した１．５ｍｌマイクロチューブにスワブを加えた。チューブの縁において液体中でスワブをそれ自身の軸の周りで再度回転させることにより、糞便材料を溶解緩衝液（buffer）中に移した。
−  大腸菌グリセロールストック（タイター：９．２×１０9細胞／ｍｌ；１０μｌ（ＰＢＳによる１：３０希釈）＝３×１０6細胞）
−  ゼオライトＣＡＳ：１３１８−０２−１  Ｆｌｕｋａ、９６０９６
−  溶解緩衝液（buffer）（実施例１を参照）
−  カルボキシル化磁性粒子の懸濁液（Ｓｅｒａｄｙｎ）
【０１９９】
プロトコール
３０ｍｇのゼオライトを秤量して、１．５ｍｌマイクロチューブに入れた。ゼオライトを添加せずに参照を行った。１０μｌの大腸菌細胞と共に２５０μｌの糞便試料および５０μｌのＳｅｒａｄｙｎビーズを添加した。この混合物をエッペンドルフ（Eppendorf）サーモミキサーにおいて５分間９５℃、１４００ｒｐｍでインキュベートし、室温まで冷やした。磁性分離を２分間行い、新しいチューブに上清（清澄化された溶解物（lysate））を移した。ヒトＨ１８Ｓおよび大腸菌ｑＰＣＲにおいて上清を用いた（１μｌおよび１０μｌ）。
【０２００】
ｑＰＣＲプロトコール
実施例３に記載されている通り定量的ＰＣＲを行った。
【０２０１】
結果
結果を図１０に示す。図に示す通り、本発明に教示されている溶解物（lysate）清澄化は、糞便等、非常に困難な材料の溶解物（lysate）の効率的な清澄化をさらに可能にし、これにより最初に試料から核酸を精製する必要のない、直接的な増幅反応に適した清澄化された溶解物（lysate）を作製する。
【０２０２】
実施例１０：ゼオライトの添加による腟スワブ試料のｐＨ値の上昇
ＰＣＲ等、酵素によるプロセスを行う場合、ＰＣＲの場合は用いる酵素、例えばｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのために所定のｐＨ値を維持することが必須である。腟スワブは、非常に酸性であるため、ゼオライトのｐＨ活性効果は、前記試料により特によく実証することができる。腟スワブ試料は、およそ４のｐＨ値を有するが、標準ＰＣＲ反応にはおよそ８〜９のｐＨ値が必要である。実施例１０において、続くパラメータがどのように腟スワブ試料のｐＨ値に影響を与えるか分析された。Ａ）ゼオライトベースの分子篩（３オングストローム孔径）の添加およびＢ）より高いイオン強度を有する溶解緩衝液（buffer）の添加。効果を強調するため、特に酸性の腟試料を用いた。
【０２０３】
変形Ａ）において、６０μｌの溶解緩衝液（buffer）（実施例９を参照、さらに１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．５を添加）を、溶解緩衝液（buffer）（実施例９を参照）における６０μｌの腟スワブ試料に添加した。得られた混合物の１５μｌをｐＨ試験紙片に添加して、溶解物（lysate）のｐＨ値を決定した。
【０２０４】
変形Ｂ）において、６０μｌの溶解緩衝液（buffer）（実施例９を参照、さらに３３ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．５および粒子状の中間サイズの分子篩（３オングストローム孔径）を添加）を、溶解緩衝液（buffer）（実施例９を参照）における６０μｌの腟スワブに添加した。得られた混合物の１５μｌをｐＨ試験紙片に添加して、ｐＨ値を決定した。次の表に結果を示す。
【０２０５】
【表４】
2014533934.tif 000006
【０２０６】
図に示す通り、より低い緩衝液（buffer）強度およびゼオライト（分子篩）の組合せの添加は、より強い緩衝液（buffer）の添加のため、８〜８．５の必要なｐＨ値まで相当に良好にｐＨ値を上昇させる。結果は、さらにより均一であり、よって信頼できる。従って、ゼオライトは、４．５を下回るｐＨ値を有する酸性試料から、増幅反応の実施に適した８〜８．５の範囲のｐＨ値へのｐＨ値の確実な上昇に用いることができる。
【０２０７】
実施例１１：カルボキシル化磁性粒子の添加による溶解物（lysate）清澄化
腟スワブは、遊離細胞層および糖タンパク質含有粘液くず（slime junk）等、大量の肉眼で見える粒子を含む。次の実験により示す通り、前記粒子性夾雑物は、カルボキシル化磁性粒子を用いると非常に良好に分離することができる。溶解緩衝液（buffer）（実施例１を参照）における５０μｌの腟スワブ試料を、２．５ｍｇのカルボキシル化磁性粒子（Ｓｅｒａｄｙｎ）を含有した５０μｌの溶解緩衝液（buffer）で希釈した。試料を混合し、５分間９５℃でインキュベートした。その後、試料を２分間室温で冷却し、沈殿物を除去するために１分間磁気により分離した。得られた上清（清澄化された溶解物（lysate））を、ピペットを用いて新しい反応容器に移した。図１１に示す通り、溶解された試料へのカルボキシル化磁性粒子の添加は、肉眼で見える沈殿物の優れた除去をもたらした。
【０２０８】
実施例１２：本発明に係る異なる方法および溶解手順を用いた乾燥ＰＣＲ試薬の再構成
材料
−  鼻咽頭スワブ
−  Ｃ．グルタミクム細胞の懸濁液
−  溶解緩衝液（buffer）（実施例１を参照）
−  磁性粒子懸濁液：カルボキシル化磁性粒子（Ｓｅｒａｄｙｎ）
【０２０９】
プロトコール
５００μｌの溶解緩衝液（buffer）中に各スワブ試料を移した。３名のドナーから得られた３種のスワブ試料をプールした。試料を含む個々のプールの１０００μｌを、溶解緩衝液（buffer）、６６μｌの前分離（seperate）したＳｅｒａＭａｇビーズおよび１０μｌのＣ．グルタミクム懸濁液と混合した。プロセシングするため、３通りの異なる方法を用いた。
【０２１０】
方法１：プライマーおよびプローブを含む凍結乾燥したｑｕａｎｔｉｆａｓｔ  ＰＣＲマスターミックスを、試料、溶解緩衝液（buffer）および磁性ビーズを含んだ溶解混合物２５μｌにより再構成した。しかし、試料の溶解を促進するための特別な方策は適用しなかった。よって、凍結乾燥したマスターミックスの再構成は、溶解緩衝液（buffer）に含まれる試料を用いて行われた。従って、再構成は、試料を含む溶解混合物により行われたが、これは（完全には）溶解していなかった。再構成されたＰＣＲ組成物は、溶解緩衝液（buffer）と共に試料を含んだ。１０個の個々に再構成された組成物を調製し、プールした。１０個の試料全て一緒に、２５μｌのアリコートを標準ＰＣＲストリップ（strip）に移した。１．２５μｌのＣ．グルタミクム懸濁液を各反応液に添加した。用いた条件下における試料の溶解は、完全でなかったため、再構成されたＰＣＲミックスを既に含んでいる個々の混合物を５分間９５℃でインキュベートして溶解を促進し、その上、ＰＣＲ反応を阻害し得る混入物を構成する沈殿物の生成を増加させるため、室温まで１分間冷やした。磁性ビーズを１分間収集／分離した。これにより、沈殿物をビーズに結合させ、溶解物（lysate）を清澄化した。２０μｌの清澄化反応液を新しいＰＣＲチューブへと移した。続いて、次の条件下でＰＣＲ反応を行った。９５℃１０秒間、６０℃３０秒間を４０サイクル。１０個の試料を並行してプロセシングした。従って、ＰＣＲマスターミックスの再構成後に、試料の変性および従って溶解を促進するための加熱ステップを行った。これにより、もはやＰＣＲにおける初期加熱ステップは必要とされないため、プロセシングステップの省略を可能にした。
【０２１１】
方法２：プライマーおよびプローブを含む１０ポーション（portion）の凍結乾燥したｑｕａｎｔｉｆａｓｔ  ＰＣＲマスターミックスを、試料、溶解緩衝液（buffer）および磁性ビーズを含んだ溶解混合物２５μｌを用いて再構成した。よって、再度、再構成は溶解混合物により行われ、試料は、溶解緩衝液（buffer）と接触しただけだが、溶解は加熱によりまだ促進されなかった。個々に再構成されたＰＣＲミックスをプールし、２０μｌをＰＣＲ反応チューブへと移した（１０試料を並行してプロセシングした）。１μｌのＣ．グルタミクム懸濁液を添加した。その後、次の条件を用いてＰＣＲ反応を直接的に行った。９５℃５分間、９５℃１０秒間、６０℃３０秒間、最後の２ステップを４０サイクル反復した。本明細書において、溶解は実際のＰＣＲにおいて促進および達成されるため、このプロトコールは、非常に速い。
【０２１２】
方法３：ＰＣＲストリップの１０個の反応チューブに２５ｍｌを移した。１．２５ｍｌのＣ．グルタミクム懸濁液を添加し、混合物を９５°でインキュベートして、試料の溶解を促進した。この反応液を室温まで１分間冷やし、ビーズを１分間分離した。２５ｍｌの上清（清澄化された溶解物（lysate））を、再構成のために凍結乾燥したＰＣＲマスターミックスを含むＰＣＲストリップへと移した（１０試料）。２５ｍｌの個々の再構成された組成物をチューブに移し、本実施例の方法２において記載されている通りＰＣＲにおいてプロセシングした。
【０２１３】
図２１は、結果を示す。図に示す通り、３通りの方法は全て、同等の結果をもたらし、分析ステップにおいて、例えば、ＰＣＲ反応において溶解ステップを共に行うことにより、本発明に係る方法のショートカットを用いることも可能であることを実証する。これにより、相当な時間を節約することができる。
【０２１４】
従って、本発明に係る方法のあらゆる代替法を用いることができる。
【図１】
2014533934.tif 000007
【図２】
2014533934.tif 000008
【図４】
2014533934.tif 000009
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図２１】
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【図３】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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