(57)【要約】少なくとも１種の抗原および１種のアジュバントを含むワクチン組成物であって、アジュバントが、擬ベーマイトおよびポリアクリレートを含む濾過滅菌可能なナノ粒子を含むことを特徴とするワクチン組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の抗原およびアジュバントを含むワクチン組成物であって、アジュバントが、擬ベーマイトおよびポリアクリレートを含む濾過滅菌可能なナノ粒子を含むことを特徴とするワクチン組成物。
【請求項２】
ナノ粒子の核が本質的に擬ベーマイトからなっており、ポリアクリレートが本質的にナノ粒子の表面にあることを特徴とする、請求項１記載のワクチン組成物
【請求項３】
擬ベーマイトがナノ粒子の質量の少なくとも９０％であることを特徴とする、請求項１または２記載のワクチン組成物。
【請求項４】
ナノ粒子のサイズが３００ｎｍ未満であり、有利には２２０ｎｍ未満であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項５】
少なくとも１種のインフルエンザ抗原を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項６】
少なくとも１種の破傷風タンパク質を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項７】
少なくとも１種の抗原を含むワクチン組成物の製造のための、擬ベーマイトおよびポリアクリレートを含む濾過滅菌可能なナノ粒子の使用。
【請求項８】
ワクチン組成物が皮内投与用であることを特徴とする、請求項７記載の使用。
【請求項９】
ワクチン組成物が少なくとも１種のインフルエンザ抗原を含むことを特徴とする、請求項７または８記載の使用。
【請求項１０】
ナノ粒子が、ワクチン組成物の投与の間に誘発される免疫応答を増大させることを可能にすることを特徴とする、請求項７〜９のいずれか１項記載の使用。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項記載のワクチン組成物を製造する方法であって、
擬ベーマイトおよびポリアクリレートを含む濾過滅菌可能なナノ粒子を調製すること、
該ナノ粒子を滅菌濾過器によって濾過すること、
該ナノ粒子に少なくとも１種のワクチン抗原を加えること、および
さらなる濾過を行ってもよいこと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチンの分野に関し、さらに詳しくは、少なくとも１種のアジュバントを含むワクチン組成物に関する。特に、本発明は、擬ベーマイト（pseudo-boehmite）およびポリアクリレート（ＰＡＡ）を含む濾過滅菌可能なナノ粒子を含むワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルミニウムがワクチンのアジュバントとして有利であることは、従来技術として長い間知られてきた。多くの市販のワクチンは、アルミニウムを水酸化物の形態またはリン酸塩の形態のいずれかで含有している；また、これらの名称は、対応する製品の化学組成を正確には反映していない：水酸化アルミニウムは、正しくはオキシ水酸化物であり、リン酸アルミニウムは、あまり純粋ではないリン酸塩であるが、他のイオン、特に硫酸イオンをよく含有しており、水酸化物イオンもまた含有している。これらのアルミニウム系アジュバントは、アルミニウムゲルとしても知られており、抗原によって誘発される免疫反応を増強させるというそれらの全体的な利点を示しているが、それらは、ある種の欠点を有している。工業的な観点から、慣用の水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムの懸濁液は、粒径が非常に大きいために、製造の終わりに濾過滅菌できず、無菌条件下で進行する製造方法に頼らなければならない。さらにまた、ある種の投与様式の場合、特に皮内投与の場合、アルミニウムは、投与部位で刺青作用をもたらすことが非難されてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
かくして、その欠点を回避するとともにそのアジュバント力の利益を得るために、アルミニウムを含有するワクチン組成物を利用可能にすることが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
この目的を達成するために、本発明は、少なくとも１種の抗原およびアジュバントを含有するワクチン組成物であって、アジュバントが、擬ベーマイトおよびポリアクリレートを含む濾過滅菌可能なナノ粒子を含むことを特徴とする、ワクチン組成物を提供する。
【０００５】
本発明の対象は、少なくとも１種の抗原を含有するワクチン組成物の製造のための、擬ベーマイトおよびポリアクリレートを含む濾過滅菌可能なナノ粒子の使用である。
【０００６】
特に、本発明は、該ワクチン組成物の投与の間に誘発される免疫反応を増強させることができるこのようなナノ粒子の使用である。
【０００７】
本発明の対象は、また、
擬ベーマイトおよびポリアクリレートを含む濾過滅菌可能なナノ粒子を調製し、
該ナノ粒子を滅菌濾過器によって濾過し、
該ナノ粒子に少なくとも１種の抗原を加え、
必要に応じてさらに濾過を行うことができる、
少なくとも１種の抗原およびアジュバントを含むワクチン組成物の製造方法である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の対象によって、特に皮内（ＩＤ）投与後に、慣用的に使用されているアルミニウム懸濁液よりも反応源性反応の誘発が低く、製造工程の最後に濾過によって滅菌を行うことができる、ワクチンアジュバントを提供することができる。
【０００９】
本発明の他の利点は、以下の記載により明らかになる。
【００１０】
本発明の条件の範囲内で、ナノ粒子とは、直径２２０ｎｍの孔を有する滅菌濾過器を通過することができるサイズの粒子である。かくして、該粒子は、変形して小さい孔を通過することができるので、該粒子のサイズは３００ｎｍ未満である。しかしながら、該粒子のサイズは、好ましくは２２０ｎｍ未満、より好ましくは２００ｎｍ未満である。かかる粒子は、透明なコロイド懸濁液を形成する。有利には、粒子の大半が直径３０〜２００ｎｍであり、カットオフ閾値が２２０ｎｍである滅菌濾過器を用いて物質を過剰に損失させずに濾過されるようになる、懸濁液が使用される。該粒子の直径は、種々の技術によって測定され得る流体力学的径である：例えば、準弾性光散乱法が使用され得る。この技術によって、コロイド懸濁液中の、半径が１ナノメーターから数マイクロメーターまでの範囲の粒子サイズを測定することができる。懸濁液中の粒子は、ブラウン運動（熱運動および液体分子と固体粒子の衝突）を受ける。光散乱測定の原理は、コロイド懸濁液中の粒子にレーザータイプの可干渉性単色光を照射すること、次いで、アバランシェフォトダイオード（光子の数を計数する装置）によって、これらの粒子によって散乱させられた光の強度の変動を記録することからなる。
【００１１】
これらの実験は、通常、見た目には透明な、非常に薄い媒体中にて行われる。本発明の場合には、ナノ粒子の直径は、脱塩水で希釈した（一般的に、１／１０）後に測定した。使用した機械のモデルは、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＺｅｔａＳｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳであった。
【００１２】
本発明によると、ナノ粒子は、基本的に、透析によるナノ粒子の洗浄後のナノ粒子の凝集を防止するために表面にポリアクリレートを有する擬ベーマイトからなる。本発明の特定の態様によると、ポリアクリレートは、静電相互作用によって擬ベーマイトに結合している。本発明の一の態様によると、ポリアクリレートの量は、ナノ粒子の質量の１０％未満の質量、さらに詳しくは、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の質量である。本発明の一の態様によると、ポリアクリレートの量は、ナノ粒子の質量の少なくとも１％の質量、さらに詳しくは、２％を超える質量、３％を超える質量、４％を超える質量、５％を超える質量、６％を超える質量、７％を超える質量、８％を超える質量、９％を超える質量である。
【００１３】
擬ベーマイトとしての本発明のナノ粒子の基本成分の定性分析は、Ｘ線回折分析によって行うことができ、１４、２８.１、３２.４、４９.３、５５.５および６５°２θ（λ＝０.１５４０６ｎｍ）で観察された主要なライン（０２０）、（０２１）、（１３０）、（１５０）、（１５１）および（１３２）を有する擬ベーマイトに特徴的なＸ線回折図が得られた。
【００１４】
ポリアクリレートを使用するのは、使用されるポリマーは生体適合性がなければならないから、すなわち、それらは、投与される生物に対して毒性を示してはならないからである。さらに、使用されるポリマーは、ナノ粒子の合成に用いられる温度で安定でなければならない。使用されるポリアクリレートは、種々の分子量からなるものであってよい；特に、ポリアクリル酸ナトリウムまたは医薬用途に適しているポリアクリル酸の他の塩であり得る。Fluka社から入手したポリアクリル酸ナトリウムＰＡＡ２１００、およびPolysciencesから入手したＰＡＡ−６００００を用いた場合に優れた結果が得られた。
【００１５】
該粒子は、S. Musicらによって「Chemical and microstructural properties of Al-oxide phases obtained from AlCl3 solutions in alkaline medium」という標題でMaterials Chemistry and Physics, 1999, 59, 12-19に記載された方法に端を発する方法に従って製造される。S. Musicらの方法によると、５分間にわたって、塩基（ＮａＯＨ）を添加して、アルミニウム塩の水溶液のｐＨを１１よりもわずかに高い値まで上昇させる（ｐＨメーターを使用して管理する）。次いで、該混合物を１０分間激しく撹拌し、次いで、オートクレーブに移し、１６０℃で２４時間加熱した。ブフナー濾過によって該生成物（均一な白色溶液）を回収し、洗浄し、次いで、オーブン中にて６５℃で一夜乾燥させた。Y. Mathieuらによって「Control of the morphology and particle size of boehmite nanoparticles synthesized under hydrothermal conditions」という標題でLangmuir 2007, 23, 9435-9442に記載されたような本発明による合成の場合、該合成は、開始時にアルミニウム塩の水溶液に添加されるポリアクリル酸ナトリウムの存在下で行われる。このポリマーの存在は、形成された粒子の凝集を防止する。ポリアクリレートとアルミニウム塩の相対量は、該ポリアクリレートを該アルミニウム塩溶液に溶解することができて、ワクチンアジュバントとしての使用に適している濾過可能なナノ粒子を得ることができるように選択される。かくして、ＰＡＡ２１００を用いた場合、ポリアクリル酸ナトリウムのアルミニウムに対するモル比が０.４３〜０.５７であるのが有利であったことに注目した。
【００１６】
塩基を添加する前に、ポリアクリル酸ナトリウムとアルミニウム塩の混合物を成熟工程に置き、この間、撹拌する。この成熟工程は、有利には、室温で約２４時間施される。工業的な観点から、室温で短時間作動できるのが非常に有利であるが、必要に応じて、例えば週末の間にわたって、延長することができる。
【００１７】
ナノ粒子製造のためのアルミニウム塩は、種々の性質を有するものであり得る；それらは、特に、塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ3）、硝酸アルミニウム（Ａｌ(ＮＯ3)3）または硫酸アルミニウム（Ａｌ2(ＳＯ4)3）である；好ましくは、塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ3）が選ばれる。
【００１８】
該混合物のｐＨを上昇させるのに使用され得る塩基は、種々あるが、特にＮａＯＨ、ＫＯＨおよびＮＨ4ＯＨから選ぶことができる。有利には、当該ナノ粒子の合成は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を使用して行われる。
【００１９】
本発明によると、５〜１０分間持続する動作中にｐＨを約１０〜１１まで上昇させるために、水酸化ナトリウムが使用される。このｐＨ上昇期間に、存在する種々のアルミニウム種が分解および転位のような変化を受けて、多かれ少なかれ結晶相を形成する。
【００２０】
本発明によると、次いで、該混合物を、一定時間、例えば１〜１７時間、熱水処理し；有利には、得られた粒子のサイズおよびそれらの濾過性に関して、３時間が選ばれる。この処理は、静止モードで行われるか、または９０℃〜２００℃の温度で、特に１６０℃で、撹拌しながら行われる。
【００２１】
本発明によると、得られたナノ粒子は、濾過滅菌され得、このことは、それらが孔径２２０ｎｍの滅菌濾過器を通過することができるサイズであることを意味する；このような濾過の間に見られる損失は工業的な制約に適合する。詳しくは、０.２２μｍ  ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）フィルターで行われた試験では、ポリマーとアルミニウムの５％未満の損失が生じたことが示される。この５％という値は、おそらく、該アッセイ技術の許容誤差である。
【００２２】
本発明によると、該ナノ粒子は、生理食塩水または生物学的バッファーに懸濁され得る。試験は、特に、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）バッファー、ＴＲＩＳ（トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン）バッファー、または９０ｇ／ＬのＮａＣｌ、０.１２ｇ／ＬのＮａ2ＨＰＯ4および０.６ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4を含む生理食塩水中にて行われる。
【００２３】
本発明の特定の特徴によると、擬ベーマイトとポリアクリレートとのナノ粒子を含む懸濁液は、また、界面活性剤、特に中性界面活性剤、例えばＢｒｉｊTM５８、ＰｌｕｒｏｎｉｃTM１２３もしくはＴｗｅｅｎTM６０、または陰イオン界面活性剤、例えば、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、または、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）のようなポリマーを含む。かくして、形成されたナノ粒子の安定化は、立体効果または静電反発力によって増大し得る。
【００２４】
本発明によると、当該ワクチン組成物は、少なくとも１種の抗原を含む。
【００２５】
本発明を発展させるために、モデル抗原として、精製した破傷風タンパク質を使用した。次いで、他の抗原、特にインフルエンザ抗原、マラリア抗原ＬＳＡ３、または、ＥＴＥＣ（毒素原性大腸菌）組換え抗原を用いて試験を行うことができる。しかしながら、本発明のワクチン組成物は、全微生物であろうとサブユニット抗原であろうと、天然、組換え、ハイブリッドなどである、ワクチンに使用できる抗原をその性質に関係なく含むことができる；該抗原は、実際に、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖、糖脂質、リポペプチド、ＶＬＰ（ウイルス様粒子）などであり得る。
【００２６】
これらの抗原は、動物界および特にヒトに影響を及ぼし易い種々の疾患、特に、ジフテリア、破傷風、ポリオ、狂犬病、百日咳、Ａ型、Ｂ型もしくはＣ型肝炎、黄熱、腸チフス、水疱、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、日本脳炎、インフルエンザ、髄膜炎、コレラ；ロタウイルス、ノロウイルス、ライノウイルス、ＲＳウイルス、単純ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、ウエストナイルウイルス、デングウイルス、チクングニアウイルス、ＨＩＶ（ＡＩＤＳ）によって媒介される感染症；連鎖球菌、クラミジア・トラコマチスおよびクラミジア・ニューモニエ、ナイセリア・ゴノレアおよびナイセリア・メニンギティディス、モラクセラ・カタラーリス、黄色ブドウ球菌またはヘモフィルスインフルエンザｂ菌によってもたらされる細菌性疾患；リステリア症、細菌性赤痢、サルモネラ症、結核、ライム病、癌；マラリア、リーシュマニア症のような寄生虫病などを治療または予防するために使用されるかまたは使用され得る抗原である。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、単一の病原または癌に対する免疫化のための組成物であってよく、すなわち、単一の病原または癌の１種以上の抗原を含むか、または、いくつかの病原または癌に対する免疫化のための組成物（この場合、混合ワクチンと称される）であってよい。本発明の組成物は、また、単一の疾患に特異的であるがこの疾患の媒介物の異なるカテゴリー（該媒介物の性質に依存する、数種類の株もしくは血清型、またはクレイド）に属する数種類の抗原を含むことができる。それは、また、特にアレルギー治療の分野における減感作を意図する、アレルゲンを含むワクチン組成物であってもよい。
【００２８】
本発明のワクチン組成物は、ワクチンの投与に通常使用されるいずれかの経路によって投与され得る；しかしながら、皮内投与が特に興味深い。詳しくは、それは優れた免疫反応を誘発するのに非常に十分であると思われるが、皮内経路には、局所的反応源性反応を導く場合があるという欠点があり、その使用を妨げ得る。本発明のナノ粒子によって、反応源性反応が非常に少ないか全くなく、特に従来技術のアルミニウム懸濁液を用いた場合に生じていたような刺青作用がない内皮免疫化を行うことが可能となった。
【００２９】
本発明によると、当該ワクチン組成物は、擬ベーマイトとポリアクリレートとのナノ粒子を含む懸濁液を抗原懸濁液と単純に混合物することによって製造される。この操作は、ナノ粒子を含むコロイド懸濁液に抗原を添加するか、または抗原をすでに含んでいる懸濁液にナノ粒子を添加することによって、行われ得る。さらにまた、数種類の抗原を含むワクチン組成物の提供が望まれる場合には、ある種の抗原の吸着が他の抗原に優先して行われるのが好ましい場合がある。特に、ワクチン組成物が、安定性または免疫原性を理由に吸着されるべきではないものも含む抗原の混合物を含有する場合には、以下のように処理するのが好ましい場合がある：吸着されるべきではない抗原を導入する前に、まず、アルミニウム系粒子を、吸着を要する抗原、またはバッファー中に存在するイオンもしくは賦形剤で飽和させる。
【００３０】
本発明のナノ粒子の製造中にポリマー過剰になる可能性がある。この起こり得る過剰のポリマーを除去するために、ナノ粒子の製造工程の後または抗原との混合工程の後に直接、さらなる工程を行うことができる。この除去工程は、適度な多孔性（ナノ粒子のサイズに応じて３０〜１００ｋＤａ）を有する膜を介して、脱塩水（Ｍｉｌｌｉ  Ｑ、Millipore）、生理食塩水または生物学的バッファーに対する透析またはダイアフィルトレーションによって行われ得る。
【実施例】
【００３１】
下記の実施例によって、本発明の具体例を例示する。
【００３２】
実施例１：擬ベーマイトナノ粒子のコロイド懸濁液の合成
Flukaから入手した分子量２１００のポリアクリル酸ナトリウム（ＮａＰａ）およびAvocadoから入手した塩化アルミニウム・六水和物（ＡｌＣｌ3６Ｈ2Ｏ）を使用した。
ＮａＰａ  ９ｇをＡｌＣｌ3の０.１Ｍ水溶液７５ｍｌに溶解した。生じた混合物を室温で２４時間激しく撹拌した。その時、該混合物のｐＨは５.５〜５.９であった。次いで５Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を滴下してｐＨを１０.５にし、次いで、該混合物をさらに１０分間撹拌した。ｐＨが上昇して９.０〜９.５に達した時に、該溶液は、わずかに濁った。これは、擬ベーマイトナノ粒子の沈殿に相当する。最終ナノ粒子を得るために、ｐＨ１０.５で得られた懸濁液をオートクレーブに移し、撹拌しながら（１５ｒｐｍ）、１６０℃で３時間加熱した。次いで、該コロイド懸濁液を、３０ｋＤａポリエーテルポリスルホン膜を装着したＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｌｉｃｅ  ２００卓上装置を用いて蒸留水５Ｌに対して透析することによって洗浄した。得られたコロイド懸濁液をポリプロピレンボトル中にて貯蔵した。サイズ測定を行った結果、サイズが多分散性指数０.１９（強度解析）で１５〜４０ｎｍ（数値分布）の範囲である、単一のナノ粒子集団が存在することが分かった。２５０００ｒｐｍで１時間遠心分離することによって固体物質の試料を得、物理化学的分析を行うために８０℃で一夜乾燥させた。
該試料を、銅のＫα１ライン（λ＝１.５４０６Å）を使用してＳｔｏｅ−Ｓｔａｄｉ−Ｐ回折計によりＸ線回折によって分析した。照射光は、ゲルマニウム結晶からなるフロント・モノクロメーターの存在によって完全に単色光である。この分析のために、予め粉砕しておいた当該試料をリンデマン管（直径０.３ｍｍ）に入れる。ゴニオメーターヘッドに取り付けたキャピラリー管を回転させ、１１°（２θ）の角度範囲をカバーすることができるＰＳＤ型（位置敏感型検出器）の短い線形検出器を使用してデバイ−シェラー法で回折図を記録する。
乾燥した試料のＸ線回折分析により、擬ベーマイトに特徴的な結果が得られた。
得られたナノ粒子は、０.２μｍ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＰＶＤＦ膜で、原子吸光分析法によって測定された最少量（３.１％）の物質損失をもって濾過滅菌することができた。
【００３３】
実施例２：分子量６００００のポリアクリル酸ナトリウムの溶液を使用する擬ベーマイトとポリアクリレートとのナノ粒子の合成
Polysciencesから入手した分子量６００００のポリアクリル酸ナトリウム（ＮａＰａ）の３５％（ｗ／ｗ）水溶液およびFlukaから入手した塩化アルミニウム・六水和物（ＡｌＣｌ3・６Ｈ2Ｏ）を使用した。
ポリマー３６ｇを得るために、水６６.８６ｇを含有するポリマー溶液１０２.８６ｇを使用した。
ビーカーにＡｌＣｌ3  ７.２４２９ｇを入れ、水２２５.８９ｇを加えた。
このアルミニウム溶液を上記ポリマー溶液に加えて、０.１ＭのＡｌＣｌ3溶液３００ｍｌを得た。
得られた混合物は白色であった。
この混合物を２４時間激しく撹拌した。
２４時間後、混合物のｐＨは６.１であった。次いで、５Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を、ｐＨが１０.２になるまで滴下した。
該混合物を１時間撹拌しながらホモジナイズし、次いで、オートクレーブ中に置き、撹拌しながら（１４００ｒｐｍ）、１６０℃で３時間加熱した。
得られた溶液は乳白色がかっており、これを分析して、擬ベーマイトに特徴的なＸ線回折ピークを有する、濾過滅菌に適合する平均サイズ約１００ｎｍのナノ粒子からなることが判明した。
この溶液は、再凝集せずにナノ粒子の完全性を維持しながら１年以上貯蔵可能であった。
【００３４】
実施例３：水酸化アルミニウムのナノ粒子および精製破傷風タンパク質を含むワクチン組成物の調製および濾過試験
実施例１に従って調製した擬ベーマイトナノ粒子懸濁液４.５ｍｌに生理食塩水１ｍｌあたり１２００フロキュレーション単位の濃度でアッセイした精製破傷風タンパク質の調製物１０μｌを加えることによってワクチン組成物を調製した。
該混合物を適度に撹拌し、次いで、５ｍｌのプラスチック製シリンジに取り付けたＰＶＤＦ膜（Milliporeから入手）を通過させた。
ナノ粒子のサイズの測定は、ナノ粒子への破傷風タンパク質の添加の前および後に行った；タンパク質の存在または不在にかかわらず、同じサイズプロファイルが得られた。これは、破傷風タンパク質がナノ粒子の凝集をもたらさないことを示している。
同様に、濾過によりアルミニウムが３％失われたことが判明したが、これは、工業的な観点から十分に受け入れられるものである。
かくして、本発明のワクチン組成物は、０.２２μｍ滅菌濾過器で、物質を過剰に損失することなく濾過することができるということが結論づけられる。
【００３５】
実施例４：皮内投与された、ナノ粒子およびインフルエンザ抗原を含む本発明の組成物のマウスに対する反応源性試験
この試験のための動物モデルとして雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用して、本発明の組成物の局所反応源性を標準的なアルミニウム懸濁液と比較して評価した。
この試験において、当該抗原は、不活化フラグメント株Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）およびＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４を株１種につき１ｍｌあたりＨＡ  １５０μｇの割合で含むＦｌｕ  ＩＤ貯蔵液として知られている三価インフルエンザワクチンからなるものであった。
マウス１０匹ずつの４つのグループに、アジュバントの存在下または不在下のワクチンの最適以下の用量３０μｌ（すなわち、ＨＡ  ０.３μｇ／株）を耳の内面に３週間の間隔で皮内投与した。
投与した組成物は、下記のようにして調製した：
【００３６】
グループＡ：Ｆｌｕ  ＩＤ単独；Ｆｌｕ  ＩＤ貯蔵液５４μｌをＰＢＳバッファー７５６μｌで希釈した。
グループＢ：Ｆｌｕ  ＩＤ＋ＡｌＯＯＨ；下記の成分を連続して添加した：
Ｆｌｕ  ＩＤ貯蔵液５４μｌ
ＰＢＳバッファー６０４μｌ
１ｍｌあたりアルミニウム８.０１ｍｇを含有する市販のＡｌＯＯＨ懸濁液（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標））１５２μｌ
該混合物を２時間適度に撹拌した。
グループＣ：Ｆｌｕ  ＩＤ＋ＡｌＰＯ4；下記の成分を連続して添加した：
Ｆｌｕ  ＩＤ貯蔵液５４μｌ
ＰＢＳバッファー４６３μｌ
１ｍｌあたりアルミニウム４.１５ｍｇを含有する市販のＡｌＰＯ4懸濁液（ＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標））２９３μｌ
該混合物を２時間適度に撹拌した。
グループＤ：Ｆｌｕ  ＩＤ＋ナノＡｌＯＯＨ；下記の成分を連続して添加した：
Ｆｌｕ  ＩＤ貯蔵液５４μｌ
Ｈ2Ｏ  ５μｌ
１０倍濃縮ＰＢＳバッファー７６μｌ
実施例１に記載の方法で調製した、１ｍｌあたり１.８ｍｇのＡｌを含む擬ベーマイトナノ粒子６７５μｌ
該混合物を室温で２時間適度に撹拌した。
【００３７】
該マウスを毎日モニターし、各注射後２週間、耳に現れる浮腫、紅斑および病変を非公認スケールで採点した。
被験製剤に関わらず、有意な紅斑は見られなかった。同様に、浮腫は報告されなかった。
しかしながら、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムのいずれであっても標準的なアルミニウムを含む組成物を投与したマウスの場合に注射部位に白色／赤色の結節の出現が見られた。しかしながら、意外にも、非常に興味深いことに、本発明の組成物を投与したマウスには結節が見られなかった。
【００３８】
従来のアルミニウムを含むアジュバントの投与後に結節が出現したマウスの数に関する結果を下記の表１に例示する：
【表１】
2014520836.tif 000002
【００３９】
特に興味深いことに、アルミニウムの量が全てのグループで同一（４５μｇ）であったにも関わらず、本発明のナノ粒子中のアルミニウムの製剤化によって、耐容性が非常に高くなることが分かった。
【００４０】
実施例５：皮内投与された、ナノ粒子およびインフルエンザ抗原を含む本発明の組成物のマウスに対する免疫原性試験
この試験で、本発明の組成物の免疫原性をＡｌＯＯＨまたはＡｌＰＯ4のいずれかの標準的なアルミニウムを含む組成物およびアルミニウムを含有しないがポリマーだけを含有する組成物と比較して評価した。
上記実施例と同様に、この試験において、当該抗原は、不活化フラグメント株Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）およびＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４を株１種につき１ｍｌあたりＨＡ  １５０μｇの割合で含むＦｌｕ  ＩＤ貯蔵液として知られている三価インフルエンザワクチンからなるものであった。この試験で使用したＦｌｕ  ＩＤ貯蔵液ワクチンのバッチは、上記実施例で使用したものと同じものであった。
この試験は、９匹ずつの９つのグループに分けた雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して行った。
各マウスに、その属するグループに応じて、下記の組成物の最適以下の用量３０μｌ（すなわち、ＨＡ  ０.３μｇ／株）を耳の内面に３週間の間隔で皮内投与した。
投与した組成物は、下記のようにして調製した：
【００４１】
グループＡ：Ｆｌｕ  ＩＤ単独；Ｆｌｕ  ＩＤ貯蔵液５４μｌをＰＢＳバッファー７５６μｌで希釈した。
グループＢ：Ｆｌｕ  ＩＤ＋ＡｌＰＯ4；下記の成分を連続して添加した：
Ｆｌｕ  ＩＤ貯蔵液５４μｌ
ＰＢＳバッファー４６３μｌ
１ｍｌあたり４.１５ｍｇのアルミニウムを含有する市販のＡｌＰＯ4懸濁液（ＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標））２９３μｌ
この混合物を１０秒間ボルテックスした。
グループＣ：Ｆｌｕ  ＩＤ＋ＡｌＯＯＨ；下記の成分を連続して添加した：
Ｆｌｕ  ＩＤ貯蔵液５４μｌ
ＰＢＳバッファー５９５μｌ
１ｍｌあたり７.５３ｍｇのアルミニウムを含有する市販のＡｌＯＯＨ懸濁液（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標））１６１μｌ
この混合物を１０秒間ボルテックスした。
グループＤ：Ｆｌｕ  ＩＤ＋擬ベーマイトナノ粒子；下記の成分を連続して添加した：
Ｆｌｕ  ＩＤ貯蔵液５４μｌ
Ｈ2Ｏ  ５μｌ
１０倍濃縮ＰＢＳバッファー７６μｌ
実施例１に記載の方法で調製した、１ｍｌあたり１.８ｍｇのＡｌを含む擬ベーマイトナノ粒子６７５μｌ
この混合物を１０秒間ボルテックスした。
グループＥ：Ｆｌｕ  ＩＤ＋ポリマー；下記の成分を連続して添加した：
Ｆｌｕ  ＩＤ貯蔵液５４μｌ
Ｈ2Ｏ  ５μｌ
１０倍濃縮ＰＢＳバッファー７６μｌ
Flukaから入手した分子量２１００のＮａＰａ（ポリアクリル酸ナトリウム）を１ｍｌあたり１７ｍｇ含有する溶液６７５μｌ
この混合物を１０秒間ボルテックスした。
【００４２】
該マウスを試験の間じゅうモニターした。
Ｄ４２に、すなわち２回目の注射から３週間後に、各マウスの頸動脈を切開して血液試料を採取した。該試料を処理して、体液応答試験を行うための血清を単離した。
１グループにつき６匹のマウスから脾臓も採取して、細胞応答試験を行った。
行った試験は、ＥＬＩＳＡアッセイ、赤血球凝集抑制試験、およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイである。
ＥＬＩＳＡアッセイは、慣用の方法で行われ、これによって、Ａ／Ｈ１Ｎ１株に特異的な血清ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの量を測定した。抗体検出閾値は、２０（１.３ｌｏｇ１０）ＥＬＩＳＡ単位である。力価はすべて、ＥＬＩＳＡ単位のｌｏｇ１０で表す。各グループのマウスについて、幾何平均および対応する９５％信頼間隔を算出した。
赤血球凝集抑制試験によって、免疫化動物の血清中に存在する機能的抗体を評価することができる。それは、誘発された抗体の、被験インフルエンザウイルスによるニワトリの赤血球の凝集を阻害する能力を測定する。赤血球凝集抑制（ＨＩ）力価は、赤血球凝集が見られない最終希釈の逆数である。各グループのマウスについて、幾何平均および対応する９５％信頼間隔を算出した。これは、投与した組成物中に存在する３種類の株の各々に関して行った。
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、新しく単離した脾臓細胞を、ワクチン組成物の３種類の株の混合物と一緒にまたはＮＰタンパク質のクラスＩエピトープ（エピトープＣＤ８）に相当する九量体ペプチドと一緒に一夜インキュベートして再刺激し、これを使用して行われる。細胞応答は、脾臓細胞１０6個についての、インフルエンザ特異的ＩＬ−５またはＩＦＮ−γを分泌する細胞の数で表す。
インフルエンザ特異的ペプチドによる再刺激の間、ＩＬ−５またはＩＦＮ−γを分泌する細胞は、検討中のマウスのグループに関係なく、ＥＬＩＳＰＯＴによって検出されなかった。
【００４３】
インフルエンザ抗原によるインビトロでの再刺激に関して、得られた結果を下記表２に示す（角括弧内は９５％信頼間隔である）：
【表２】
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【００４４】
これらの結果は、驚くべきことに、本発明のナノ粒子によって、細胞応答、特にＩＬ−５を分泌する細胞およびＩＦＮ−γを分泌する細胞の刺激を得ることができることを示している。
統計学的観点から、ダネット調整法との混合モデルによると、当該ナノ粒子は、ＩＬ−５およびＩＦＮ−γを分泌する細胞の数を有意にそれぞれ８.２倍（ｐ＜０.００１）および３９.５倍（ｐ＝０.００２）に増加させると考えられるが、従来のアルミニウム系アジュバントには当てはまらない。
ポリアクリレート単独では、ＩＬ−５の分泌が、有意さの限界である３.３倍だけ（ｐ＝０.０２７）増加したことが分かる。
【００４５】
体液性応答試験に関する結果を下記表３に示す（いずれの場合も、角括弧内は、９５％信頼間隔である）。
【表３】
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【００４６】
統計学的観点から、ナノ粒子を用いて得られたＨＩ力価およびＩｇＧ１力価の増加は、ダネット調整法との混合モデルによると、ワクチン単独を用いて得られた力価に関して有意であると考えられた（抗Ｈ１Ｎ１  ＨＩ力価について１１.７倍（ｐ＜０.００１）；抗Ｈ３Ｎ２  ＨＩ力価について１２.７倍（ｐ＜０.００１）；抗Ｂ力価について２９.９倍（ｐ＜０.００１）；抗Ｈ１Ｎ１  ＩｇＧ１力価について２０.０倍（ｐ＜０.００１）および抗Ｈ１Ｎ１  ＩｇＧ２ａ力価について６.３倍（ｐ＝０.００８））。
これらの結果は、２回の皮内免疫化後の本発明のナノ粒子の体液性応答誘発能を示している。ポリマー単独がこのアジュバント力を持っていないことが分かる。
【００４７】
さらにまた、本発明のナノ粒子だけがＩｇＧ２ａ応答を増大させる。これは、当該免疫応答プロファイルが、他のアルミニウム系アジュバントの場合よりも、ＴＨ１型の応答に向けられていることを意味する。
【国際調査報告】
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