(57)【要約】  本開示は、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む、炎症性神経疾患を治療する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性神経疾患を治療するまたは予防する方法であって、対象に、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
炎症性神経疾患が、炎症性刺激に対するＴ細胞応答を伴うまたは原因とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＳＴＲＯ−１ｂｒｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
炎症性神経疾患が、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、ギラン・バレー症候群、ランバート・イートン症候群、重症筋無力症、横断性脊髄炎、ロイコジストロフィー、および進行性多巣性白質脳症からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
疾患が、全身性エリテマトーデスである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
疾患が、多発性硬化症である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
疾患が、多発性硬化症の慢性進行型、または多発性硬化症の再発寛解型である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を全身投与する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
疾患が再発寛解疾患であって、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を疾患再発期の間に投与して、疾患の再発を予防するまたは遅延させる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
対象に、および／または疾患の病因部位に、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の数を増加させるのに有効な量の、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ｋｇあたり、２×１０６から８×１０６個の間のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ｋｇあたり、３×１０６から６×１０６個の間のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
低用量の、ＳＴＲＯ−１＊細胞および／またはその子孫を投与することを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
低用量の、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫が、ｋｇあたり、０．１×１０６と３×１０６個の間のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
低用量の、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫が、ｋｇあたり、約３×１０６個のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を、１週間毎に１回以下の頻度で投与することを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を、４週間毎に１回以下の頻度で投与することを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫が富化された集団を遺伝子組み換えして、Ｔ細胞の刺激を遮断する分子を発現すること、および／または可溶性因子がそのような遺伝子改変細胞に由来することを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された集団ならびに／またはそれに由来する因子を、Ｔ細胞の刺激を遮断する化合物と共に投与することを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞が富化された集団が、オートジェネイック（autogeneic）または同種異系であること、および／または可溶性因子が、オートジェネイックまたは同種異系細胞に由来することを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞が富化された集団が、投与に先だって、および／または可溶性因子を得るのに先立って培養増殖されていることを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
抗原に対する免疫応答を予防する方法であって、対象に、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む、前記方法。
【請求項２３】
免疫応答が、Ｔ細胞介在性免疫応答である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
Ｔ細胞介在性免疫応答が、Ｔ細胞増殖を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
Ｔ細胞介在性免疫応答を、特異抗原に対して抑制する、およびＴ細胞介在性免疫応答を、他の抗原に対して抑制しない、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
対象が、前もって抗原に対する免疫応答を生じており、集団、子孫および／または可溶性因子が、該抗原に対するさらなる免疫応答を抑制する、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
集団、子孫および／または可溶性因子を、対象が抗原に対する免疫応答を生じた後に投与して、それにより、該抗原に対するさらなる免疫応答を予防することを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子の投与後、少なくとも約２４日の間、免疫応答を抑制する、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
対象において、抗原に対する寛容性を誘導する方法であって、対象に、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む、前記方法。
【請求項３０】
抗原または特異抗原は、それに対して炎症性応答が生じるものである、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
炎症性応答が、炎症性神経疾患の原因である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を、炎症性神経疾患を治療するまたは予防する化合物とともに投与する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
化合物が、酢酸グラチラマーおよび／またはβ−インターフェロンである、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
炎症性神経疾患の治療または予防において使用する、および／または抗原に対する免疫応答を抑制する、および／または抗原に対する寛容性を誘導する、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子。
【請求項３５】
炎症性神経疾患を治療するまたは予防する、および／または抗原に対する免疫応答を抑制する、および／または抗原に対する寛容性を誘導する薬剤の製造における、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１１年６月３に出願された、「神経疾患を治療するまたは予防する方法」と題された米国特許出願第６１／４９３，０７３号からの優先権を主張する。その出願の内容全体は、ここに参照により組み込まれる。
【０００２】
配列表
配列表は、本出願とともに電子出願される。配列表の内容全体は、ここに参照により組み込まれる
【０００３】
本開示は、神経疾患を治療するまたは予防する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
炎症性神経疾患は、対象の免疫系が神経系の構成要素を標的とするまたは攻撃する状態の種類である。これらの疾患は、例えば、神経細胞、シュワン細胞、もしくは神経系髄鞘の他の細胞、または神経伝達物質を攻撃する免疫系から生じる可能性がある。いくつかの場合では、炎症性神経疾患は、既存の疾患の合併症または構成要素であることもあり、例示的な炎症性神経疾患には、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ギラン・バレー症候群、ランバート・イートン症候群、重症筋無力症、横断性脊髄炎、ロイコジストロフィーまたは進行性多巣性白質脳症が挙げられる。
【０００５】
ＭＳは、良くみられる炎症性神経疾患の一つである。これは、ヒト中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性で脱髄性の変性疾患である。これは、全世界に見られる疾患であり、米国だけでおよそ３００，０００人が患っている。ＭＳを患う大多数の者（約７０％〜８０％の場合）は、２０歳と４０歳の年齢の間で、発病を示し始める。ＭＳは、臨床経過、核磁気共鳴画像化法（ＭＲＩ）によるスキャン評価、および生検および剖検材料の病理分析にもとづく、不均一な障害である。この疾患はそれ自体、欠陥の非常の多数の可能な組合せを示し、それらには、脊髄、脳幹、脳神経、小脳、大脳、および認識にかかわる症候群が挙げられる。進行性の能力障害が、ＭＳを患う大部分の患者の運命である。約半数のＭＳ患者が、疾患発症から１５年以内で歩行のための杖を必要とする。
【０００６】
ＭＳは、大部分の場合（約８０％）、完全にまたは部分的に可逆的な限局性の神経障害を特徴とする臨床的再発を示す。この型のＭＳは、再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）として知られ、炎症と浮腫が支配的である。ＣＮＳの活動性炎症は、ガドリ二ウム増強した白色物質の病変として、ＭＲＩ上で可視化される。平均約３９年で、ＲＲＭＳの症例の約半数が、臨床的再発またはＭＲＩで検出される白色物質の病変の非存在のもとで、不可逆的な神経障害を漸進的に蓄積する。疾患のこの段階は、二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）または、慢性疾患として知られている。ＲＲＭＳを示さない患者の２０％が、疾患発症から進行性の臨床的悪化を示し、これは一次性進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）として知られており、慢性疾患のもう一つの形態である。
【０００７】
現在、急性MSの再発は、高用量、短期間の静脈内コルチコステロイドを用いて治療するのが通常である。この治療は、再発の持続期間を短縮するが、回復の度合いまたは長期間の疾患経過を改善することはない。現在、米国で承認された、いくつかの認証済の疾患修飾性治療があり、これらは、臨床的再発率を低下させる、次の再発までの時間を延ばす、および／またはＭＲＩ上での新たな病変の蓄積を減少させることが意図されている。しかしながら、これらの治療は、特に再発寛解期でのMSの治療に、中程度に効果的であるというだけである。これらの治療はまた、疾患の進行を遅らせるだけであり、髄鞘再生という結果にはならない。
【０００８】
ＳＬＥは、身体の多様な臓器系に影響を及ぼす炎症性疾患である。ＳＬＥを患う対象は、頭痛、人格変化、器質脳症候群、末梢性ニューロパシー、感覚ニューロパシーや、例えば偏執症、躁病、および統合失調症を含む精神面での問題、発作、横断性脊髄炎、ならびに麻痺および脳梗塞といった、多様な神経障害を発症する可能性がある。これらの変化の一部は、抗リン脂質抗体(例えば、抗カルジオリピン抗体)によって引き起こされる可能性があり、この抗体は、中枢神経系の細胞に結合して機能および／または血栓症を妨害する可能性がある。
【０００９】
狼瘡を治療する一般的な薬剤治療は、コルチコステロイドまたは免疫抑制剤の使用が挙げられる、両方ともに望ましくない副作用を有し、症状が出るさいにそれらの症状を治療するのみである。
【００１０】
他の炎症性神経疾患は、例えば、免疫抑制剤、コルチコステロイド、血漿交換または静脈内免疫グロブリンを使用して治療されるが、これらはそれぞれ、感染の、または他の有害な副作用の危険性を有している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願第６１／４９３，０７３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、当技術分野には、炎症性神経疾患を治療するのに有用な新たな治療法の必要性があることは、当業者には明らかであるだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明人は、炎症性神経疾患、すなわち慢性麻痺性実験的炎症性脊髄炎（ＥＡＥ）に関して認められている動物モデルにおいて、ＳＴＲＯ−１＋多能性細胞調製物の効果を研究した。本発明人は、ＥＡＥ誘導後に投与したＳＴＲＯ−１＋細胞が疾患の重症度を減少させたことを見出した。
【００１４】
本発明人はまた、ＳＴＲＯ−１＋細胞が、抗体に対して前もって免疫付与し動物からのＴ細胞により、抗原に対する免疫応答を予防することを見出した。
【００１５】
本開示は、炎症性神経病患対象において代謝症候群もしくはその症状を治療するまたは予防する方法であって、対象に、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む方法を提供する。
【００１６】
一例では、炎症性神経疾患は、炎症性刺激へのＴ細胞応答を伴うまたは原因とする。
【００１７】
一例では、方法は、ＳＴＲＯ−１ｂｒｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む。
【００１８】
一例では、炎症性神経疾患は、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、ギラン・バレー症候群、ランバート・イートン症候群、重症筋無力症、横断性脊髄炎、ロイコジストロフィーおよび進行性多巣性白質脳症からなる群から選択される。
【００１９】
一例では、疾患は、全身性エリテマトーデスである。
【００２０】
他の例では、疾患は、多発性硬化症である。一例では、疾患は、多発性硬化症の慢性進行型である。他の例では、疾患は、多発性硬化症の再発寛解型である。
【００２１】
一例では、方法は、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む。一例では、子孫はさらに、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞がさらに富化されている。
【００２２】
例示的な細胞および／または子孫はさらに、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＰ）および／または熱ショックタンパク質９０β（ＨＳＰ９０ｐ）および／またはＣＤ１４６を発現する。
【００２３】
一例では、細胞の集団は、骨髄または歯髄に由来する。
【００２４】
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子が、全身投与される。例えば、Ｓｔｒｏ−１＋細胞および／またはその子孫細胞が富加された細胞の集団および／またはそれに由来する可溶性因子は、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、大動脈中、心臓の心房もしくは心室中、または炎症性神経疾患に冒された臓器に連結した血管中に投与されてもよい。例えば、集団および／または子孫および／またはそれに由来する可溶性因子を静脈内に投与する。
【００２５】
他の例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫が富化された集団および／またはそれに由来する可溶性因子を、脳脊髄液にまたは中枢神経系に投与する。
【００２６】
さらなる例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫が富化された集団またはそれに由来する可溶性因子を、疾患の部位に、例えば、髄鞘変性部位に投与する。
【００２７】
再発寛解疾患（例えば、再発寛解ＭＳ）の場合には、細胞を疾患再発期に投与して、疾患の再発を予防するまたは遅延させてもよい。
【００２８】
一例では、方法は、有効量の、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む。一例では、有効量は、対象における、および／または病因部位における制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の数を増加させるのに充分な量である。
【００２９】
本明細書に記載のあらゆる例による例示的な方法は、炎症性神経疾患の臨床的尺度を改善する、および／または炎症性神経疾患に付随する抗原に対する免疫応答を減少させるもしくは予防するのに充分な用量の、集団および／または子孫および／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む。
【００３０】
一例では、方法は、有効量の、または治療有効量の、集団および／または子孫および／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む。
【００３１】
一例では、方法は、ｋｇあたり、１×１０４から５×１０６個の間のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む。例えば、方法は、ｋｇあたり、１×１０５から１×１０６個の間のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む。例えば、方法は、ｋｇあたり、２×１０５から８×１０５個の間のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む。例えば、方法は、ｋｇあたり、約２×１０５個のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫、またはｋｇあたり、約４×１０５個のＳＴＲＯ−ｆ細胞および／またはその子孫、またはｋｇあたり、約８×１０５個のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む。
【００３２】
一例では、本明細書に記載のあらゆる例による方法は、低用量の、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を投与することを含む。例えば、低用量の、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫は、ｋｇあたり、１×１０３と３×１０５個の間のＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫を含む。
【００３３】
一例では、集団および／または子孫および／またはそれに由来する可溶性因子を、複数回、投与する。例えば、集団および／または子孫および／またはそれに由来する可溶性因子を、１週間に複数回、または４以上の週毎に１回、投与する。
【００３４】
一例では、集団および／または子孫および／またはそれに由来する可溶性因子を、炎症性の神経学的状態の寛解期に投与する。
【００３５】
他の例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された集団は遺伝子組み換えされて、Ｔ細胞の刺激を遮断する分子を発現する、ならびに／または可溶性因子は、そのような遺伝子改変細胞に由来する。
【００３６】
他の例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された集団および／またはそれに由来する因子を、Ｔ細胞の刺激を遮断する化合物とともに投与する。
【００３７】
ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞が富化された集団は、オートジェネイックまたは同種異系であってもよく、および／または可溶性因子は、オートジェネイック（autogeneic）なまたは同種異系の細胞に由来してもよい。一例では、細胞の集団および／または子孫細胞は、同種異系である、および／または可溶性因子は、オートジェネイックな細胞に由来する。
【００３８】
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞が富化された集団は、投与に先立って、および／または可溶性因子を得るのに先立って、培養増殖されている。
【００３９】
他の例では、本明細書に記載の方法は、免疫抑制剤を投与することを含む。免疫抑制剤は、前記移植細胞が機能的であるのに充分な時間の間、投与してもよい。
【００４０】
本開示はまた、抗原に対する免疫応答を予防する方法であって、対象に、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む方法を提供する。
【００４１】
一例では、免疫応答は、Ｔ細胞介在性応答である。例示的なＴ細胞介在性応答は、Ｔ細胞増殖を含む。
【００４２】
一例では、Ｔ細胞介在性応答は、特異抗原に対して抑制され、および他の抗原に対するＴ細胞介在性応答は抑制されない。
【００４３】
一例では、対象は前もって、抗原に対する免疫応答を引き起こしており、かつ集団、子孫および／または可溶性因子は、該抗原に対するさらなる免疫応答を抑制する。
【００４４】
一例では、集団、子孫および／または可溶性因子は、対象が抗原に対する免疫応答を引き起こした後に投与され、それにより、該抗原に対するさらなる免疫応答を予防する。
【００４５】
一例では、免疫応答は、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を投与した後、少なくとも約２４日間、抑制される。
【００４６】
本開示はまた、対象において、抗原に対する寛容性を誘導する方法であって、対象に、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を投与することを含む方法を提供する。
【００４７】
本明細書記載の方法の一例では、抗原または特異抗原は、それに対して免疫応答が生じるものである。例えば、免疫応答は、炎症性神経疾患の原因となる。
【００４８】
本明細書に記載のあらゆる例による方法の一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を、炎症性神経疾患を治療するまたは予防する化合物とともに投与する。例示的な化合物は、酢酸グラチラマー（glatiramer acetate）および／またはβインターフェロンである。
【００４９】
化合物は、集団および／もしくは子孫ならびに／またはそれに由来する可溶性因子と混合してもよい、または（例えば、化合物ならびに集団および／もしくは子孫ならびに／またはそれに由来する可溶性因子が同時に効能を提供するように）集団および／もしくは子孫ならびに／またはそれに由来する可溶性因子と同時に投与する、および／またはその前もしくは後に投与してもよい。
【００５０】
本開示はまた、炎症性神経疾患の治療または予防に使用する、および／または抗原に対するＴ細胞媒介性免疫応を抑制する、および／または抗原に対する寛容性を誘導する、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を提供する。
【００５１】
本開示はまた、炎症性神経疾患を治療するもしくは予防する、および／または抗原に対するＴ細胞媒介性免疫応答を抑制する、および／または抗原に対する寛容性を誘導する薬剤の製造における、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫が富化された細胞の集団ならびに／またはそれに由来する可溶性因子の使用を提供する。
【００５２】
本開示のそれぞれの例は、髄鞘崩壊および／または髄鞘もしくはその構成要素に対する免疫応答を減少させる、遅延させる、または予防する方法に準用すると解されるものとする。
【００５３】
本開示のそれぞれの例は、神経系またはその構成要素における炎症に準用すると解されるものとする。
【００５４】
本開示のそれぞれの例は、髄鞘再生または神経突起伸長を誘導する、または促進する方法に準用すると解されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】成人ヒト骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）によるＴＮＡＰ（ＳＴＲＯ−３）および間葉系前駆細胞マーカー、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔの共発現を示す。ＳＴＲＯ−１  ＭＡＣＳで選別したＢＭＭＮＣのインキュベーション、およびＦＩＴＣに結合したヤギ抗マウスＩｇＭ抗体での間接標識（ｘ軸）、およびＰＥに結合したヤギ抗マウスＩｇＧで間接標識されたＳＴＲＯ−３ｍＡｂ（マウスＩｇＧ１）（ｙ軸）によって、二色免疫蛍光法およびフローサイトメトリーを行った。ドットプロットヒストグラムはリストモードデータとして収集した５×１０４個の事象を表わしている。垂直線および水平線は、同条件下で処置したアイソタイプ一致の対照抗体、１Ｂ５（ＩｇＧ）および１Ａ６．１２（ＩｇＭ）で得られた平均蛍光の１．０％未満の活性レベルに設定した。結果は、少数のＳＴＲＯ−ｊｂｒｉｇｈｔCejlsの集団がＴＮＡＰを共発現（C0eＸPresse(l)）したが（右上の象限）、一方残りのＳＴＲＯ−１＋細胞はＳＴＲＯ−３ｍＡｂと反応しなかったことを示している。
【図２−１】培養され増殖したＳＴＲＯ−１ｂｒｉＭＰＣのＳＴＲＯ−１ｂｒｉまたはＳＴＲＯ−１ｄｉｍ子孫の遺伝子発現プロファイルである。ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖した骨髄ＭＰＣの単個細胞懸濁液は、トリプシン／ＥＤＴＡ処理により調製した。細胞は、ＳＴＲＯ−１抗体で染色し、続いてその抗体を、ヤギ抗マウスＩｇＭ−フルオレセインイソチオシアネートと一緒にインキュベートすることによって明らかにした。全細胞ＲＮＡは、蛍光標識細胞分取の後に、ＳＴＲＯ−１ｄｉｍまたはＳＴＲＯ−１ｂｒｉ発現細胞の集団から精製した（Ａ）。ＲＮＡｚｏｌＢ抽出法と標準的な手順を用いて、全ＲＮＡを、各亜集団から単離し、ｃＤＮＡ合成の鋳型として使用した。多様な転写産物の発現を、従来の記述(Gronthos et al.  J Cell Sci. 775:1827-1835, 2003)の標準プロトコルを用いて、ＰＣＲ増幅により評価した。本研究で使用したプライマーセットを、表２に示す。増幅の後、各反応混合物を、１．５％アガロースゲル電気泳動で分析し、臭化エチジウム染色により可視化した（Ｂ）。各細胞マーカーについての相対遺伝子発現を、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現を基準にして、ＩｍｍａｇｅＱａｎｔソフトウェアを用いて評価した（Ｃ）。
【図２−２】培養され増殖したＳＴＲＯ−１ｂｒｉＭＰＣのＳＴＲＯ−１ｂｒｉまたはＳＴＲＯ−１ｄｉｍ子孫の遺伝子発現プロファイルである。ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖した骨髄ＭＰＣの単個細胞懸濁液は、トリプシン／ＥＤＴＡ処理により調製した。細胞は、ＳＴＲＯ−１抗体で染色し、続いてその抗体を、ヤギ抗マウスＩｇＭ−フルオレセインイソチオシアネートと一緒にインキュベートすることによって明らかにした。全細胞ＲＮＡは、蛍光標識細胞分取の後に、ＳＴＲＯ−１ｄｉｍまたはＳＴＲＯ−１ｂｒｉ発現細胞の集団から精製した（Ａ）。ＲＮＡｚｏｌＢ抽出法と標準的な手順を用いて、全ＲＮＡを、各亜集団から単離し、ｃＤＮＡ合成の鋳型として使用した。多様な転写産物の発現を、従来の記述(Gronthos et al.  J Cell Sci. 775:1827-1835, 2003)の標準プロトコルを用いて、ＰＣＲ増幅により評価した。本研究で使用したプライマーセットを、表２に示す。増幅の後、各反応混合物を、１．５％アガロースゲル電気泳動で分析し、臭化エチジウム染色により可視化した（Ｂ）。各細胞マーカーについての相対遺伝子発現を、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現を基準にして、ＩｍｍａｇｅＱａｎｔソフトウェアを用いて評価した（Ｃ）。
【図３】培養され増殖したＳＴＲＯ−１＋ＭＰＣのＳＴＲＯ−１ｂｒｉ子孫は、高レベルのＳＤＦ−１を発現するが、ＳＴＲＯ−１ｄｉｍの子孫はそうではない。（Ａ）ＳＴＲＯ−１＋ＢＭＭＮＣの、ＭＡＣＳで単離した調製物を、ＦＡＣＳを用い、領域に従って異なるＳＴＲＯ−１サブセット、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔおよびＳＴＲＯ−１ｄｉｍ／ｄｕｌｌに分割した。全ＲＮＡを、各ＳＴＲＯ−１亜集団から調製し、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔサブトラクションハイブリダイゼーションライブラリを構築するのに使用した（Ｂ−Ｃ）。複製ニトロセルロースフィルター、これは、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔサブトラクテッドｃＤＮＡを用いて形質転換した細菌クローンから増幅した代表的なＰＣＲ生成物を用いてブロットした。このフィルターはその後、［３２Ｐ］デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ＞で標識されたＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ（Ｂ）またはＳＴＲＯ−１ｄｉｍ／ｄｕｌｌ（Ｃ）サブトラクテッドｃＤＮＡのどちらかを用いて精査した。矢印は、ヒトＳＤＦ−１に対応するｃＤＮＡ断片を含む１クローンの差次的発現を示す。（Ｄ）培養に先立って新にＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ単離したＢＭＭＮＣ  ＳＴＲＯ−１集団から調製した全ＲＮＡ中のＳＤＦ−１およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）転写物の相対発現を示す逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ分析である。ｂｐは、塩基対を示す。
【図４】慢性進行性ＥＡＥのモデルにおける平均の臨床疾患スコアに関して、ＭＰＣ治療の効果を示すグラフ表示である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＭＯＧ３５−５５で０日目に免疫付与し、そしてその後、疾患誘導後の８日目、１０日目および１２日目に、ＭＰＣの静脈内注入を用いて治療した。ＭＰＣの投与量を表示する。
【図５】MPC治療が、慢性進行性EAEにおいて、累積疾患指数の、用量依存する減少を誘導することを示すグラフ表示である(平均の臨床疾患スコアの曲線下全面積分析)。
【図６】ＭＯＧ３５−５５で免疫付与したマウスから単離した脾臓細胞の増殖の倍数変化を、ＭＯＧ３５−５５を用いた刺激の後に、非刺激脾臓細胞と比較して示すグラフ表示である。
【図７】ＭＯＧ３５−５５で免疫付与したマウスから単離した脾臓細胞の増殖の倍数変化を、ＰＭＡ／イオノマイシンを用いた非特異的再刺激の後に、非刺激脾臓細胞と比較して示すグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
配列リストの手がかり
配列番号１  ＧＡＰＤＨをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号２  ＧＡＰＤＨをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号３  ＳＤＦ−１をコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号４  ＳＤＦ−１をコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号５  ＩＬ−１βをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号６  ＩＬ−１βをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号７  ＦＬＴ−１をコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号８  ＦＬＴ−１をコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号９  ＴＮＦ−αをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号１０  ＴＮＦ−αをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号１１  ＫＤＲをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号１２  ＫＤＲをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号１３  ＲＡＮＫＬをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号１４  ＲＡＮＫＬをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号１５  レプチンをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号１６  レプチンをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号１７  ＣＢＦＡ−１をコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号１８  ＣＢＦＡ−１をコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号１９  ＰＰＡＲγ２をコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号２０  ＰＰＡＲγ２をコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号２１  ＯＣＮをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号２２  ＯＣＮをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号２３  ＭｙｏＤをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号２４  ＭｙｏＤをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号２５  ＳＭＭＨＣをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号２６  ＳＭＭＨＣをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号２７  ＧＦＡＰをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号２８  ＧＦＡＰをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号２９  ネスチンをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号３０  ネスチンをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号３１  ＳＯＸ９をコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号３２  ＳＯＸ９をコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号３３  Ｘ型コラーゲンをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号３４  Ｘ型コラーゲンをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号３５  アグリカンをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
配列番号３６  アグリカンをコードする核酸を増幅するオリゴヌクレオチド
【００５７】
一般的技術および選択された定義
本明細書を通じて、それ以外に具体的に述べられている場合または文脈がそれ以外に要求する場合を除いて、単一ステップへの参照、物質の組成物、ステップの群または物質の組成物の群は、１つおよび複数（すなわち一つまたは複数）のそれらのステップ、物質の組成物、ステップの群または物質の組成物の群を包含すると解されるものとする。
【００５８】
本明細書に記載される各実施例は、それ以外に具体的に述べられて場合を除き、本開示のそれぞれおよびすべての他の例に準用されるものとする。
【００５９】
当業者は、本開示が、具体的に記載されたもの以外の変形および修正を許容することができることを理解するであろう。本開示がそのような変形および修正すべてを含むことを理解すべきである。本開示はまた、本明細書で参照または表示されているステップ、機能、組成物および化合物のすべてを個々にまたは集合的に、ならびに、前記ステップもしくは機能のいずれかのおよびすべての組み合わせまたはいずれか２つ以上の組み合わせを含む。
【００６０】
本開示は、本明細書に記載される具体的な実施例によって範囲を制限されるものではなく、例示を目的とすることだけを意図している。機能的に等価な生成物、組成物、および方法は、本明細書に記載される場合、明確に、本開示の範囲内にある。
【００６１】
本開示は、それ以外に表示されている場合を除き、分子生物学、微生物学、ウイルス学、ＤＮＡ組み換え技術、溶液中でのペプチド合成、固相ペプチド合成、および免疫学の従来技術を用いて過度の実験なしに実行される。そのような手順は、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Second Edition (1989),Vol I,II，およびIIIの全部； DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford,のテキスト全体； Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed, 1984) IRL Press, Oxford，のテキスト全体、および特にその中でのＧａｉｔによる，ｐｐｌ−２２の論文； Atkinson et al, pp35-81; Sproat et al, pp 83-115; および Wu et al, pp 135-151; 4. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1985) IRL Press, Oxford，のテキスト全体； Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford,のテキスト全体; Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.),のシリーズ全体; J.F. Ramalho Ortigao, “The Chemistry of Peptide Synthesis" In: Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (Interactiva, Germany); Sakakibara, D., Teichman, J., Lien, E. Land Fenichel, R.L. (1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 73 336-342; Merrifield, R.B. (1963). J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154; Barany, G. and Merrifield, R.B. (1979) in The Peptides (Gross, E. and Meienhofer, J. eds.), vol. 2, pp. 1-284, Academic Press, New York. 12. Wunsch, E., ed. (1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Miiler, E., ed.), vol. 15, 4th edn., Parts 1 and 2, Thieme, Stuttgart; Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474; Handbook of Experimental Immunology, VoIs. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); および Animal Cell Culture: Practical Approach, Third Edition (John R. W. Masters, ed., 2000), ISBN 0199637970,のテキスト全体、に記載されている。
【００６２】
本明細書をとおして、文脈がそれ以外を要求する場合を除き、「comprise（含む）」という語、または「comprises」もしくは「comprising」といった変化形は、述べられたステップまたは要素または完全体またはステップ（複数）もしくは要素（複数）もしくは完全体（複数）の群の包含を意味するが、あらゆる他のステップまたは要素または完全体または要素もしくは完全体の群の排除を意味するものではないことが理解されるであろう。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「由来する（derived from）」の用語は、特定の完全体が、具体的な源から、その源から必ずしも直接的ではないにしても、得られうることを表示すると解されるものとする。ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞に由来する可溶性因子という文脈では、この用語は、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはそれらの子孫細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の間に産生される一つまたは複数の因子、例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物等などを意味すると解されるものとする。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「炎症性神経疾患」という用語は、免疫応答、そして一部の例では、自己免疫応答の結果生じる、神経シグナル伝達の欠陥、および／または神経機能不全、および／または神経細胞死により特徴づけられるあらゆる障害を含むと解されるものとする。一例では、炎症性神経障害は、髄鞘変性、および／または、例えば髄鞘の構成要素すなわちリン脂質またはガングリオシドといった神経系の構成要素に対する自己抗体を伴うまたは原因とする障害である。炎症性神経疾患は、一次疾患であることもあり、または既存の疾患の合併症、例えば、いくつかの場合ではＳＬＥであることもある。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、神経疾患を生じるまたは伴う対象における免疫応答を減少させるのに充分な量の、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫細胞ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を含むと解されるものとする。例えば、有効量の、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫細胞ならびに／またはそれに由来する可溶性因子は、例えば、核磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）および／または髄鞘に対する自己抗体および／またはＣＳＦにおけるオリゴクローナルバンドを用いて検出可能な、脳または脊髄における病変を減少させることもある。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、臨床的炎症性神経疾患の一つ以上の症状を減少させるまたは阻害するのに充分な量の、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫細胞ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を意味すると解されるものとする。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「予防有効量」という用語は、臨床的炎症性神経疾患の検出可能な一つ以上の症状の開始を予防するまたは阻害するまたは遅延させるのに充分な量の、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫細胞ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を意味すると解されるものとする。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「低用量」という用語は、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫の、０．７×１０６個より少ないがそれでも、炎症性神経疾患を生じるまたは伴う対象における脂質および／またリポタンパク質レベルに、および／または炎症性神経疾患を治療するもしくは予防するのに充分な量を意味すると理解されるものとする。例えば、低用量は、０．５×１０６個以下の細胞、または０．４×１０６個以下の細胞、または０．３×１０６個以下の細胞または０．２×１０６個以下の細胞を含む。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「治療する(treat)」、「治療(treatment)」、「治療すること(treating)」という用語は、ある治療有効量の、可溶性因子および／または細胞を投与すること、ならびに炎症性の神経学的状態を伴うまたはそれから生じる臨床状態の一つ以上の症状を減少させるまたは阻害することを意味すると解されるものとする。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「予防する（prevent）」、「予防すること（preventing）」、「予防（prevention）」という用語は、予防有効量の可溶性因子および／または細胞を投与すること、ならびに臨床的炎症性神経学的状態の一つ以上の症状の発症または進行を停止するまたは抑制するまたは遅延させることを意味すると解されるものとする。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「可溶性因子」という用語は、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫によって産生される、水溶性のあらゆる分子、例えば、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、炭水化物を意味すると解されるものとする。そのような可溶性因子は、細胞内にありうる、および／または細胞によって分泌されうる。そのような可溶性因子は、複雑な混合物（例えば上清）および／もしくはその画分であり得る、並びに／または精製された因子であり得る。本開示の一例では、可溶性因子は、上清中に含有される。従って、一つまたは複数の可溶性因子の投与を目的とする本明細書のいかなる例も、上清の投与に準用されると解されるものとする。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「上清」という用語は、液状培地といった適切な培地において間葉前駆細胞および／またはその子孫細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの培養をおこなった後に生成される非細胞性物質をさす。典型的には、上清は、適切な条件と時間のもと培地中で細胞を培養し、その後に遠心分離といった過程により細胞性物質を除去することによって生成される。上清は、投与前にさらなる精製ステップを経ても経なくてもよい。一例では、上清は、１０４個より少ないといった、１０５個より少ない、例えば、生細胞は含まないといった、１０３個より少ない細胞を含む。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「抗原に対する免疫応答を予防する」という用語は、本明細書に記載のいずれかの例に従う、集団および／または子孫および／またはそれに由来する可溶性因子は、既存の免疫応答を抑制するのに反して、免疫応答の発症を遅延させるおよび／または減少させるおよび／または停止することを意味すると解されるものとする。本明細書の一部の例では、抗原に対する免疫応答を予防することを目的とする、本開示の例は、抗原に対する既存の免疫応答を減少させるまたは阻害するのに準用すると解されるものとする。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「正常または健康な個体」という用語は、当技術分野で既知のおよび／または本明細書記載の方法により評価した炎症性の神経学的状態を患っていない対象を意味すると解されるものとする。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「酢酸グラチラマー（glatiramer acetate）」という用語は、髄鞘構成タンパク質に見られる、４つのアミノ酸、すなわちグルタミン酸、リジン、アラニン、チロシンのランダムな高分子を含む免疫調節剤である、現在、コパキソン（Copaxone）という商品名で販売されているものを意味すると解されるものとする。
【００７６】
ＳＴＲＯ−１＋細胞または子孫細胞、およびそれに由来する上清もしくは一つ以上の可溶性因子
ＳＴＲＯ−１＋細胞は、骨髄、血液、歯髄細胞、脂肪組織、皮膚、脾臓、膵臓、脳、腎臓、肝臓、心臓、網膜、脳、毛包、腸、肺、リンパ節、胸腺、骨、靱帯、腱、骨格筋、真皮、および骨膜に見出される細胞であり、中胚葉および／または内胚葉および／または外胚葉等の生殖細胞系に分化することができる。
【００７７】
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞は、多数の細胞型、例えば、限定はされないが、脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織、筋肉組織、および線維性結合組織に分化可能な多能性細胞である。これらの細胞が迎える具体的な細胞系譜の決定および分化経路は、機械的影響、および／または増殖因子、サイトカイン、および／または宿主組織によって構築される局所的な微小環境の条件等といった内在性生物活性因子からくる種々の影響に依存する。従って、ＳＴＲＯ−１＋多能性細胞は、分裂して、どちらも幹細胞である娘細胞を生じる非造血系前駆細胞であるか、または適切な時期に不可逆的に分化して表現型を持つ細胞（phenotypic cell）を生じる前駆細胞である。
【００７８】
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞は、対象、例えば、治療を受ける対象または近縁の（related）対象もしくは非近縁の（unrelated）対象（同一種か異種かに関わらない）から得られた試料から富化される。「富化された」、「富化」という用語またはその変化形は、無処置の細胞集団（例えば、天然環境にある細胞）と比較したときに、ある特定の細胞型の割合またはいくつかの特定の細胞型の割合が増加している細胞集団を記述するために本明細書では使用される。一例では、ＳＴＲＯ−１＊細胞が富化された集団の割合は、少なくとも約０．１％または０．５％または１％または２％または５％または１０％または１５％または２０％または２５％または３０％または５０％または７５％のＳＴＲＯ−１＋＿細胞を含む。この点において、「ＳＴＲＯ−１＋細胞が富化された細胞集団」という用語は、「Ｘ％のＳＴＲＯ１＊細胞を含む細胞集団」という用語について明示的な支持を与えると解されるであろう。ここでＸ％は、本明細で列挙されているようにパーセンテージである。ＳＴＲＯ−１＋細胞は、一部の例では、クローン原生コロニー、例えばＣＦＵ−Ｆ（線維芽細胞）を形成する可能性があり、またはそのサブセット（例えば５０％または６０％または７０％または７０％または９０％または９５％）がこの活性を有する可能性がある。
【００７９】
一例では、細胞集団は、選択可能な形態でＳＴＲＯ−１＋細胞を含む細胞の調製物から富化される。この点において、「選択可能な形態」という用語は、ＳＴＲＯ−１＋細胞の選択を可能にするマーカー（例えば細胞表面マーカー）を発現することを意味すると理解されるであろう。マーカーは、ＳＴＲＯ−１であってもよいが、しかしそうである必要はない。例えば、本明細書に記載されているおよび／または例示されているように、ＳＴＲＯ−２および／またはＳＴＲＯ−３（ＴＮＡＰ）および／またはＳＴＲＯ−４および／またはＶＣＡＭ−１および／またはＣＤ１４６および／または３Ｇ５を発現する細胞（例えばＭＰＣ）はまた、ＳＴＲＯ−１（そしてＳＴＲＯ−１ｂｒｇｈｔであってもよい）を発現する。従って、細胞がＳＴＲＯ−１＋であるという表示は、細胞がＳＴＲＯ−１発現によって選択されるということを意味するものではない。一例では、細胞は、少なくともＳＴＲＯ−３発現に基づいて選択され、例えばそれらはＳＴＲＯ−３＋（ＴＮＡＰ＊）である。
【００８０】
細胞またはその集団の選択への言及が、特定の組織源からの選択である必要はない。本名明細書に記載されるように、ＳＴＲＯ−１＊細胞は、非常に多様な源から選択または分離または富化されうる。とはいうものの、一部の例では、これらの用語は、ＳＴＲＯ−１＊細胞（例えばＭＰＣ）を含むあらゆる組織、または血管組織、または周皮細胞（例えばＳＴＲＯ−１＊周皮細胞）を含む組織、または本明細書に列挙される組織のいずれかまたはそれ以上のものに支持を与える。
【００８１】
一例では、本開示で用いられる細胞は、ＴＮＡＰ＊、ＶＣＡＭ−１＊、ＴＨＹ−１＊、ＳＴＲＯ−４＊（ＨＳＰ−９０ｐ）、ＳＴＲＯ−２＊、ＣＤ４５＊、ＣＤ１４６＊、３Ｇ５＊またはそれらのあらゆる組合せからなる群から、個々に、または集合的に選択される一つまたは複数のマーカーを発現する。
【００８２】
「個々に（individually）」とは、本開示が、列挙されたマーカーまたはマーカー群を個別に包含すること、および、個々のマーカーまたはマーカー群が本明細書に個別には列挙されているわけではないにもかかわらず、添付の特許請求の範囲が、かかるマーカーまたはマーカー群を互いから個別に、且つ可分的に定義してもよいことを意味している。
【００８３】
「集合的に（collectively）」とは、本開示が、あらゆる数の、またはあらゆる組合せの列挙されたマーカーまたはペプチド群を含むこと、および、かかるあらゆる数の、またはあらゆる組合せの列挙されたマーカーまたはマーカー群が本明細書では具体的に一覧にされているわけではないにもかかわらず、添付の特許請求の範囲が、かかる組合せまたは部分的な組合せを、マーカーまたはマーカー群の他のあらゆる組合せから個別に、且つ可分的に定義してもよいことを意味している。
【００８４】
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞はＳＴＲＯ−１ｂｒｇｈｔ（ＳＴＲＯ−１ｂｒiと同義）である。一例では、Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞は、ＳＴＲＯ−１ｄｉｍまたはＳＴＲＯ−１ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ細胞と比較して優先的に富化される。
【００８５】
一例では、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞は、さらに、ＴＮＡＰ＋、ＶＣＡＭ−１＋、ＴＨＹ−１＋、ＳＴＲＯ−４＋（ＨＳＰ−９０ｐ）、ＳＴＲＯ−２＋および／またはＣＤ１４６＋のうちの一つまたは複数である。例えば、細胞は、１つ以上の前述のマーカーに選択されるおよび／または１つ以上の前記マーカーを発現することが示される。この点において、マーカーを発現することが示された細胞が、具体的に試験される必要はなく、むしろ、前もって富化されたまたは単離された細胞が試験されてもよく、引き続いて使用、単離または富化された細胞もまた、同一のマーカーを発現するものと、妥当に仮定されてもよい。
【００８６】
一例では、前記間葉系前駆細胞は、国際公開第ＷＯ２００４／８５６３０号で定義されたように、血管周囲の間葉系前駆細胞である。例えば、間葉系前駆細胞は、血管周囲細胞のマーカーを発現する、例えば、細胞は、ＳＴＲＯ−１＋またはＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔおよび／または３Ｇ５＋である。一例では、細胞は、血管新生した組織、または臓器もしくはその部分から単離した細胞であるまたは前もってそうであった、またはその細胞の子孫である。
【００８７】
所与のマーカーに関して「陽性（positive）」であると見なされる細胞は、用語が蛍光の強度に関連する場合、マーカーが細胞表面上に存在している程度に応じた、低（低（lo）または弱陽性（dim））レベルもしくは高（強陽性（bright、bri））レベルのマーカーどちらかを発現している場合がある。ここで、この用語は、細胞の分取過程で使用される他のマーカーの蛍光強度に関係している。低（または弱陽性もしくは微陽性（dull））および強陽性の差異は、分取されている特定の細胞集団上の使用されるマーカーとの関連で理解されるだろう。所与のマーカーに関して「陰性（negative）」であるとみなされる細胞は、必ずしもその細胞に全く存在していないわけではない。この用語は、マーカーが、前記細胞によって相対的に非常に低いレベルで発現されていること、および、検出可能な程度に標識された場合に、マーカーが非常に小さなシグナルを発すること、またはバックグラウンドレベル、例えば、アイソタイプ対照抗体を用いて（suing）検出されたレベル以上には検出不能であること、を意味する。
【００８８】
「強陽性（bright）」という用語は、本明細書で使用される場合、検出可能な程度に標識された場合に、相対的に高いシグナルを発する細胞表面上マーカーを指している。理論に制限されることを望むものではないが、「強陽性」細胞は、試料中の他の細胞よりもいっそう多くの標的マーカータンパク質（例えばＳＴＲＯ−１から識別される抗原）を発現すると提唱されている。例えば、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ細胞は、ＦＩＴＣ結合ＳＴＲＯ−１抗体で標識された場合、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析によって測定される、非強陽性細胞（ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌ／ｄｉｍ）よりも大きな蛍光シグナルを発する。一例では、「強陽性」細胞は、出発試料中に含まれる最も明るく標識された骨髄単核細胞のうちの少なくとも約０．１％を構成している。他の例では、「強陽性」細胞は、出発試料中に含まれる最も明るく標識された骨髄単核細胞のうちの少なくとも約０．１％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約１．５％、または少なくとも約２％を構成している。ある例では、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞は、「バックグラウンド」、すなわちＳＴＲＯ−１である細胞と比較して、ＳＴＲＯ−１の細胞表面発現が２対数分（２  ｌｏｇ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）高い。比較した場合、ＳＴＲＯ−１ｄｉｍおよび／またはｓＴＲＯ−１ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ細胞は、「バックグラウンド」よりも、ＳＴＲＯ−１の細胞表面発現が２対数未満分高く、典型的には、約１対数以下分高い。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「ＴＮＡＰ」という用語は、組織非特異的アルカリホスファターゼの全てのアイソフォームを包含することが意図されている。例えば、その用語には、肝アイソフォーム（ＬＡＰ）、骨アイソフォーム（ＢＡＰ）および腎アイソフォーム（ＫＡＰ）が包含される。ある例では、ＴＮＡＰはＢＡＰである。一例では、ＴＮＡＰは、本明細書で使用される場合、ブダペスト条約の規定に基づきＰＴＡ−７２８２の寄託受託番号で２００５年１２月１９日にＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるＳＴＲＯ−３抗体と結合することができる分子を指す。
【００９０】
さらに、ある例では、ＳＴＲＯ−１＊細胞はクローン原性のＣＦＵ−Ｆを生じさせることができる。
【００９１】
一例では、かなりの割合のＳＴＲＯ−１＋多能性細胞が、少なくとも２種類の異なる生殖細胞系に分化することができる。多能性細胞が分化決定され得る系譜の例としては、限定はされないが、骨前駆細胞；胆管上皮細胞および肝細胞への多分化能を有する肝細胞前駆細胞；乏突起膠細胞および星状膠細胞へと進行するグリア細胞前駆細胞を生じることができる神経限定細胞（neural restricted cell）；ニューロンへと進行する神経前駆細胞；心筋および心筋細胞の前駆細胞、グルコース応答性インスリン分泌膵β細胞株が挙げられる。他の系譜としては、限定はされないが、象牙芽細胞、象牙質産生細胞および軟骨細胞、並びに以下の前駆細胞：網膜色素上皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト等の皮膚細胞、樹状細胞、毛包細胞、尿細管上皮細胞、平滑筋細胞および骨格筋細胞、精巣前駆細胞、血管内皮細胞、腱、靱帯、軟骨、脂肪細胞、線維芽細胞、骨髄基質、心筋、平滑筋、骨格筋、周皮細胞、血管細胞、上皮細胞、グリア細胞、神経細胞、星状膠細胞および乏突起膠細胞が挙げられる。
【００９２】
別の例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞は、培養後、造血細胞を生じさせることができない。  
【００９３】
一例では、本細胞は治療を受ける対象から採取され、標準的な技術を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され、自己成分または同種異系成分としてその対象に投与するための上清または可溶性因子または増殖した細胞を得るために用いられる。別の例では、樹立されたヒト細胞株のうちの一つまたは複数の細胞が用いられる。本開示の別の有用な例では、非ヒト動物の（または、患者がヒトでない場合は別の種に由来の）細胞が用いられる。
【００９４】
本開示は、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞（後者は増殖後細胞（expanded cell）とも称される）から得られる、または由来する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養から生成される上清または可溶性因子の使用も企図している。本開示の増殖後細胞は、培養条件（培地中の刺激因子の数および／または種類を含む）、継代数等に応じて、種々様々な表現型を有し得る。ある例では、子孫細胞は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０回の継代後に、親集団から得られる。もっとも、子孫細胞は、任意の回数の継代後に親集団から得ることができる。
【００９５】
子孫細胞は任意の適切な培地中で培養することによって得ることができる。「培地」という用語は、細胞培養に関して使用される場合、細胞周辺の環境の成分を含む。培地は固体、液体、気体または相および物質の混合物であってもよい。培地には、液体の増殖培地、および細胞増殖を維持しない液体培地が含まれる。また、培地には、寒天、アガロース、ゼラチンおよびコラーゲン基質等のゼラチン質の培地も含まれる。気体培地の例としては、ペトリ皿または他の固体もしくは半固体の担体上で増殖している細胞が曝される気相が挙げられる。また、「培地」という用語は、それが未だ細胞と接触していない場合であっても、細胞培養での使用を目的としている物質を指す。すなわち、細菌培養用に調製された栄養分に富んだ液体が培地である。水または他の液体と混合されたときに細胞培養に適したものとなる粉末状混合物は、「粉末状培地」と称することができる。
【００９６】
一例では、本開示の方法に有用な子孫細胞は、ＳＴＲＯ−３抗体で標識した磁気ビーズを用いて、ＴＮＡＰ＋ＳＴＲＯ−１＋細胞を骨髄から単離し、その後、その単離細胞を培養増殖することによって得られる（適切な培養条件の例は、Gronthos et al. Blood 85: 929-940, 1995を参照）。
【００９７】
一例では、そのような増殖後細胞（子孫）（例えば、少なくとも５回継代後）は、ＴＮＡＰ”、ＣＣ９＋、ＨＬＡクラスＩ＋、ＨＬＡクラスＩＩ”、ＣＤ１４＼、ＣＤ１９”、ＣＤ３”、ＣＤ１１ａｃ、ＣＤ３１”、ＣＤ８６”、ＣＤ３４”および／またはＣＤ８０’であり得る。しかし、可能性としては、本明細書に記載の条件とは異なる培養条件下では、種々のマーカーの発現は異なる場合がある。また、これらの表現型の細胞は増殖後の細胞集団において優勢であり得るが、一方で、そのことはこの表現型を有さない細胞の割合が小さいことを意味するものではない（例えば、わずかな比率の増殖後細胞はＣＣ９’であり得る）。一例では、増殖後細胞は異なる細胞型への分化能をまだなお有している。
【００９８】
一例では、上清もしくは可溶性因子、または細胞それ自体を得るために用いられる消費後（expended）細胞集団が含む細胞は、そのうち、少なくとも５０％といった、少なくとも２５％がＣＣ９＋である。
【００９９】
別の例では、上清もしくは可溶性因子、または細胞それ自体を得るために用いられる増殖後細胞集団が含む細胞は、そのうち、少なくとも４５％といった、少なくとも４０％がＳＴＲＯ−１＋である。
【０１００】
さらなる例では、増殖後細胞は、ＬＦＡ−３、ＴＨＹ−１、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、３Ｇ５、ＣＤ４９ａ／ＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、インテグリンβ６−１９、トロンボモジュリン、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＥＧＦ−Ｒ、ＩＧＦ１−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ、レプチン−Ｒ（ＳＴＲＯ−２はレプチン−Ｒである）、ＲＡＮＫＬ、ＳＴＲＯ−１ｂｒｇｈｔおよびＣＤ１４６からなる群から集合的に、もしくは個々に選択される一つもしくは複数のマーカー、またはこれらのマーカーのあらゆる組合せを発現し得る。
【０１０１】
一例では、子孫細胞は、国際公開第ＷＯ２００６／０３２０９２号に定義および／または記載される、多能性増殖後ＳＴＲＯ−１＋多能性細胞子孫（Multipotential Expanded STRO-1+ Multipotential cells Progeny）（ＭＥＭＰ）である。子孫が由来し得るＳＴＲＯ−１＋多能性細胞が富化された集団を調製する方法は、国際公開第ＷＯ０１／０４２６８号および同第ＷＯ２００４／０８５６３０号に記載されている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏという文脈では、ＳＴＲＯ−１＋多能性細胞は完全に純粋な調製物として存在することはまれであり、通常は組織特異的分化決定済み（committed）細胞（ＴＳＣＣ）である他の細胞と一緒に存在している。国際公開第ＷＯ０１／０４２６８号は、そのような細胞を骨髄から約０．１％〜９０％の純度レベルで回収することに言及している。子孫が由来するＭＰＣを含む集団は、組織源から直接回収してもよいし、あるいは、ｅｘ  ｖｉｖｏで既に増殖させてある集団であってもよい。
【０１０２】
例えば、子孫は、それらが存在する集団の全細胞の少なくとも約０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９５％を含む、収集され、増殖していない、実質的に精製されたＳＴＲＯ−１＋多能性細胞の集団から得てもよい。このレベルは、例えば、ＴＮＡＰ、ＳＴＲＯ−１＾’、３Ｇ５＋、ＶＣＡＭ−１、ＴＨＹ−１、ＣＤ１４６およびＳＴＲＯ−２からなる群から個々に、または集合的に選択される少なくとも１つのマーカーが陽性である細胞を選別することによって達成することができる。
【０１０３】
ＭＥＭＰＳは、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉマーカーに対し陽性であり、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）マーカーに対し陰性であるという点で、新たに収集されたＳＴＲＯ−１＋多能性細胞と区別することができる。対照的に、新たに単離されたＳＴＲＯ−１＋多能性細胞は、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉおよびＡＬＰの両方に対し陽性である。本開示のある例では、投与される細胞のうち少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％が、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ、ＡＬＰ’の表現型を有する。一例では、ＭＥＭＰＳはＫｉ６７、ＣＤ４４および／またはＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＶＬＡ−３、α３β１マーカーのうちの一つまたは複数に対し陽性である。さらなる例では、ＭＥＭＰはＴＥＲＴ活性を示さず、および／または、ＣＤ１８マーカーに対し陰性である。
【０１０４】
ＳＴＲＯ−１＋細胞出発集団は、国際公開第ＷＯ０１／０４２６８号または同第ＷＯ２００４／０８５６３０号に記載される、あらゆる一つまたは複数の組織型、すなわち、骨髄、歯髄細胞、脂肪組織および皮膚由来、あるいは、より広範に、脂肪組織、歯、歯髄、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、網膜、脳、毛包、腸、肺、脾臓、リンパ節、胸腺、膵臓、骨、靱帯、骨髄、腱および骨格筋由来であってもよい。
【０１０５】
本開示を実施する際、任意の所与の細胞表面マーカーを保有している細胞の分別は、いくつかの異なる方法によって達成できるが、一部の方法は、結合物質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を関係するマーカーに結合し、高レベル結合、または低レベル結合または結合なしのいずれかである、結合を示す細胞を分別することに依存することは理解されるだろう。最も都合のよい結合物質は、モノクローナル抗体といった、抗体または抗体ベースの分子であるか、またはこれらの後者の作用物質の特異性という理由からモノクローナル抗体に基づいている。抗体は両方のステップに用いることができるが、他の作用物質を用いてもよく、従って、マーカーを保有している細胞、またはマーカーがない細胞を富化するために、これらのマーカーに対するリガンドを使用してもよい。
【０１０６】
抗体またはリガンドを固体の担体に付着させることで、粗分別が可能となる。いくつかの例では、分別技術は、収集される画分の生存能の保持率を最大とする。異なる効率の種々の技術が、比較的粗い分別を行うために使用可能である。使用される具体的な技術は、分別効率、随伴する細胞毒性、実施の容易さおよび速さ、並びに高性能機器および／または技巧の必要性に応じたものとなるだろう。分別の手順には、限定はされないが、抗体被膜磁気ビーズを用いた磁気分別、アフィニティークロマトグラフィーおよび固体の基盤に付着した抗体での「パニング」が含まれ得る。正確な分別を提供する技術としては、限定はされないが、ＦＡＣＳが挙げられる。ＦＡＣＳを実施するための方法は、当業者には明らかであるだろう。
【０１０７】
本明細書に記載のマーカーの各々に対する抗体は市販されており（例えば、ＳＴＲＯ−１に対するモノクローナル抗体はＲ＆Ｄシステム社、米国から購入できる）、ＡＴＣＣまたは他の預託機関から入手可能であり、および／または、当該分野で認知されている技術を用いて作製することができる。
【０１０８】
ＳＴＲＯ−１＋細胞を単離するための方法は、例えば、ＳＴＲＯ−１の高レベル発現を認識する磁気細胞分取（ＭＡＣＳ）を利用する固相分取ステップである第一ステップを含む。所望であれば、より高レベルの前駆細胞発現をもたらすために、国際公開第ＷＯ０１／１４２６８号の特許明細書に記載される第二の分取ステップを続けることができる。この第二の分取ステップには、２つ以上のマーカーの使用が含まれ得る。
【０１０９】
ＳＴＲＯ−１＋細胞を得るための方法には、既知の技術を用いた第一富化ステップの前に、細胞の源を収集することが含まれてもよい。従って、組織が外科的に摘出される。源組織を構成する細胞は、その後分別されて、いわゆる単個細胞懸濁液にされる。この分別は、物理的手段および／または酵素的手段によって達成することができる。
【０１１０】
適切なＳＴＲＯ−１＋細胞集団を得た後、細胞を任意の適切な手段で培養または増殖させてＭＥＭＰを得ることができる。
【０１１１】
一例では、前記細胞は治療を受ける対象から採取され、標準的な技術を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され、その対象に自己または同種異系間の組成物として投与することを目的とした上清または可溶性因子または増殖後細胞を得るために用いられる。別の例では、樹立されたヒト細胞株のうちの一つまたは複数の細胞が、上清または可溶性因子を得るために使用される。本開示の別の有用な例では、非ヒト動物（または、患者がヒトでない場合は別の種に由来）の細胞が、上清または可溶性因子を得るために使用される。
【０１１２】
本開示は、あらゆる非ヒト動物種由来の細胞、例えば、限定はされないが、非ヒト霊長類細胞、有蹄動物、イヌ、ネコ、ウサギ、げっ歯類、トリ、および魚の細胞を用いて実施できる。本開示を実施することができる霊長類細胞としては、限定はされないが、チンパンジー、ヒヒ、カニクイザル、および他のあらゆる新世界ザルまたは旧世界ザルの細胞が挙げられる。本開示を実施することができる有蹄動物細胞としては、限定はされないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、水牛およびバイソンの細胞が挙げられる。本開示を実施することができるげっ歯類細胞としては、限定はされないが、マウス、ラット、モルモット、ハムスターおよびスナネズミの細胞が挙げられる。本開示を実施することができるウサギ種の例としては、家畜化されたウサギ、ノウサギ（jack rabbit、hare）、ワタオウサギ、カンジキウサギ、およびナキウサギが挙げられる。ニワトリ（Gallus gallus）は、本開示を実施することができるトリ種の一例である。
【０１１３】
本開示の方法に有用な細胞は、使用前、または上清もしくは可溶性因子を得る前に、保存することができる。真核細胞、具体的には哺乳類細胞を保存および保管するための方法およびプロトコルは、当該技術分野において周知である（例えば、Pollard, J. W. and Walker, J. M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, Second Edition, Humana Press, Totowa, N.J.; Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, Fourth Edition, Wiley-Liss, Hoboken, N.J.を参照）。間葉系幹／前駆細胞、またはその子孫等の単離された幹細胞の生物活性を維持するための方法は、本開示と一緒に利用することができる。一例では、前記細胞は凍結保存を用いて維持および保管される。
【０１１４】
遺伝子改変細胞
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞は、遺伝子改変されて、例えば、関心のタンパク質、例えば、治療および／または予防効能を提供するタンパク質、例えば、Ｔ細胞の活性化を予防する、または神経細胞の増殖および／もしくは分化ならびに／または髄鞘産生を誘導するポリペプチド、を発現および／または分泌する。例示的なＴ細胞拮抗剤には、例えば、Toda et al., Eur. J. Immunol., 30: 403-414, 2000.に記載されるペプチドが挙げられる。
【０１１５】
他の例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞は、遺伝子改変されて、炎症性の神経学的状態を治療するタンパク質、例えば、β―インターフェロンを発現する。
【０１１６】
細胞を遺伝子改変する方法は、当業者には明らかであるだろう。例えば、細胞で発現されるべき核酸は、細胞での発現を誘導するためのプロモーターと機能的に連結される。例えば、核酸は、例えば、ウイルスプロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター）またはＳＶ−４０プロモーター等の、対象の種々の細胞中で機能できるプロモーターに連結される。さらなる適切なプロモーターは当該技術分野において周知であり、本開示の本例に準用すると解されるものとする。
【０１１７】
例えば、核酸は発現コンストラクトの形態で提供される。本明細書で使用される場合、「発現コンストラクト」という用語は、細胞中で機能的に連結された核酸（例えば、レポーター遺伝子および／または対抗選択可能な（counter-selectable）レポーター遺伝子）を発現させる能力を有する核酸を指す。本開示の文脈においては、発現コンストラクトは、プラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスのサブゲノム断片もしくはゲノム断片、または異種ＤＮＡを発現可能な形態で維持および／または複製できる他の核酸を含むか、またはそれら自身であってもよいことは理解されるべきである。
【０１１８】
本開示の方法を実施するための適切な発現コンストラクトを構築するための方法は、当業者には明らかであり、例えば、Ausubel et al (In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987)または Sambrook et al (In: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001）に記載されている。例えば、発現コンストラクトの各成分は、例えばＰＣＲを用いて適切な鋳型核酸から増幅され、その後、例えばプラスミドまたはファージミド等の適切な発現コンストラクト中にクローニングされる。
【０１１９】
そのような発現コンストラクトに適切なベクターは、当該技術分野において周知であり、および／または、本明細書に記載されている。例えば、哺乳類細胞における、本発明の方法に適切な発現ベクターは、例えば、ライフテクノロジーズ社より提供されるｐｃＤＮＡベクター一式のベクター、ｐＣＩベクター一式（プロメガ社）のベクター、ｐＣＭＶベクター一式（クロンテック社）のベクター、ｐＭベクター（クロンテック社）、ｐＳＩベクター（プロメガ社）、ＶＰ１６ベクター（クロンテック社）またはｐｃＤＮＡベクター一式（インビトロジェン社）のベクターである。
【０１２０】
当業者は、さらなるベクター、および例えば、ライフテクノロジー社、クロンテック社またはプロメガ社等の、そのようなベクターの供給源を承知しているだろう。
【０１２１】
単離された核酸分子またはそれを含む遺伝子コンストラクトを発現のために細胞に導入する手段は、当業者に周知である。所与の生物体に用いられる技術は、既知の優れた技術に依存する。組換えＤＮＡを細胞に導入するための手段としては、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによって媒介されるトランスフェクション、例えばリポフェクタミン（ギブコ社、米国メリーランド州）および／またはセルフェクチン（ギブコ社、米国メリーランド州）による、リポソームによって媒介されるトランスフェクション、ＰＥＧによって媒介されるＤＮＡの取り込み、エレクトロポレーション、並びに、例えばＤＮＡを被膜したタングステンまたは金粒子（アグラセタス社（Agracetus Inc.）、米国ウィスコンシン州）による微小粒子照射（microparticle bombardment）が特に挙げられる。
【０１２２】
あるいは、本開示の発現コンストラクトはウイルスベクターである。適切なウイルスベクターは当該技術分野において周知であり、市販されている。核酸の送達および宿主細胞ゲノムへの核酸の組込みを目的とした従来のウイルスベースの系としては、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。あるいは、アデノウイルスベクターが、エピソームのままの核酸を宿主細胞に導入するのに有用である。ウイルスベクターは、標的細胞および標的組織における遺伝子導入の、効率的で且つ用途の広い方法である。さらに、高い導入効率が、多くの異なる細胞型および標的組織で確認されている。
【０１２３】
例えば、レトロウイルスベクターは、通常、最大６〜１０ｋｂの外来配列パッケージング容量を有する、シス作動性長末端反復配列（ＬＴＲ）を含む。最小のシス作動性ＬＴＲであってもベクターの複製およびパッケージングには充分であり、その後、発現コンストラクトを標的細胞に組み込むのに使用され、長期発現を提供する。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳｒＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびその組合せをベースとするものが含まれる（例えば、Buchscher et al., J Virol. 5(5:2731-2739 (1992); Johann et al, J. Virol. 65:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al, Virol. 76:58-59 (1990); Wilson et al, J. Virol. 63:274-2318 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700; Miller and Rosman BioTechniques 7:980-990, 1989; Miller, A. D. Human Gene Therapy 7:5-14, 1990; Scarpa et al Virology 75:849-852, 1991; Burns et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:8033-8037, 1993を参照）。
【０１２４】
また、様々なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系が核酸送達用に開発されている。ＡＡＶベクターは、当該技術分野において周知の技術を用いて容易に構築することができる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開第ＷＯ９２／０１０７０号および同第ＷＯ９３／０３７６９号；Lebkowski et al. Molec. Cell. Biol. 5:3988-3996, 1988; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press);Carter Current Opinion in Biotechnology 5:533-539, 1992; Muzyczka. Current Topics in Microbiol, and Immunol. 158:97-129, 1992; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801, 1994; Shelling and Smith Gene Therapy 7:165-169, 1994;並びにZhou et al. J Exp. Med. 779:1867-1875, 1994を参照されたい。
【０１２５】
本開示の発現コンストラクトを到達するのに有用なさらなるウイルスベクターとしては、例えば、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルス等の痘ファミリー（pox family）のウイルス由来のもの、またはアルファウイルス属または複合（conjugate）ウイルスベクター（例えば、Fisher-Hoch et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 56:317-321, 1989に記載のもの）が挙げられる。
【０１２６】
細胞および可溶性因子の治療／予防有用性を試験する
細胞または可溶性因子の、炎症性神経学的状態の開始または進行を治療するまたは予防するまたは遅延させる能力を決定する方法は、当業者には明らかであろう。
【０１２７】
例えば、細胞または可溶性因子(例えば、因子の混合物、または単一因子、または因子の画分（例えば、親和性精製またはクロマトグラフィーに由来する））をスクリーニングして、炎症性神経疾患（例えば、ＭＳ）病理の構成要素のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおける治療剤を同定する。例示的モデルには、髄の構成要素、例えば、髄鞘構成タンパク質、髄鞘稀突起膠細胞糖タンパク質または髄鞘プロテオリピドタンパク質と反応するトランスジェニックＴ細胞レセプターを含むＭＳのトランスジェニックマウスモデルから単離した、Ｔ細胞または混合リンパ球集団を用いるものが挙げられる。細胞を、髄鞘タンパク質と、細胞および／または可溶性因子の存在および非存在下で接触させ、免疫応答のレベルを、例えば、インターロイキン（ＩＬ）−２またはインターフェロンγといった炎症誘発性サイトカインの分泌を検出することにより、評価する。代わりに、またはさらに、細胞の増殖応答を、例えば、（３Ｈ）チミジン取り込みを用いて、評価する。免疫応答を減少させる、細胞および／または可溶性因子を、治療薬として選択する。例示的な試験は、Illes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101: 11749-11754, 2004 or Rossi et al., J. Biomolecular Screening, 12: 481-489, 2007に記載されている。
【０１２８】
細胞および／または可溶性因子を、炎症性神経疾患のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいても試験する。例示的モデルには、ＥＡＥモデルが挙げられ、これは、マウスまたはラットに髄鞘髄タンパク質またはそれに由来するペプチド（例えば、ＭＯＧ、ＭＢＰまたはＰＬＰ）で免疫付与し、免疫応答をタンパク質に対して発生させ、それによりＭＳのモデルを誘導するというものである。代わりに、髄鞘髄タンパク質に免疫活性をもつＴ細胞をマウスまたはラットに導入してＥＡＥを誘導する。例示的なＥＡＥモデルは、例えば、Tsunoda and Fujinami, J Neuropathol Exp Neurol.55:673-686, 1996に概説されている。
【０１２９】
ＭＳの他のモデルには、髄鞘タンパク質に特異的なＴ細胞レセプター、例えば、ＭＯＧ、ＭＢＰまたはＰＬＰを発現するトランスジェニック動物が挙げられる。例示的モデルは、例えば、Bettelli et al., JEM 797:1073-1081, 2003; Illes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101: 11749-11754, 2004; or Rossi et al., J. Biomolecular Screening, 12: 481-489, 2007;に記載されている、または例えば、ジャクソンラボラトリーズ(Jackson Laboratories)、米国から市販されている（例えば、ＭＯＧに反応するトランスジェニックＴ細胞レセプターを有するマウス２Ｄ２）。
【０１３０】
炎症性神経症状を発症する、ＳＬＥの例示的モデルには、モデル、または抗リン脂質抗体症候群（例えば、Ziporen et al., J. Clin, Invest., 100: :613-613, 1997に記載されている)、またはBrey et al., Annals NY Acad Sci., 823: 97-106, 1996に概説されているモデルが挙げられる。
【０１３１】
ギラン・バレー症候群のモデルには、動物の感作によって生じるもの、例えば、ガングリオシドＧＭ１を有するウサギ(例えば、Yuki et al., Ann Neurol. 49: 712-720, 2001に記載されている)が挙げられる。
【０１３２】
上記のことから、本開示はまた、炎症性の神経学的状態の治療、予防または遅延のための細胞または可溶性因子を同定または単離する方法を提供し、前記方法は：
（ｉ）炎症性の神経学的状態を患う試験対象に細胞または可溶性因子を投与すること、および対象の免疫応答または神経機能／機能不全を評価すること；
（ｉｉ）（ｉ）での対象の免疫応答または神経機能／機能不全を、細胞または可溶性因子を投与されなかった、炎症性の神経学的状態を患う対照である対象の、免疫応答または神経機能／機能不全と比較すること、
を含み、この場合に、対照である対象と比較して、試験対象における免疫応答または神経機能／機能不全の改善が、細胞または可溶性因子が炎症性の神経学的状態を治療するということを示していることは、当業者には明らかであろう。
【０１３３】
細胞は、本明細書に記載のいずれかの例であってもよい。
【０１３４】
細胞性組成物
本開示の一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞は、組成物の形態で投与される。例えば、かかる組成物は薬剤的に許容できる担体および／または賦形剤を含む。
【０１３５】
「担体」および「賦形剤」という用語は、貯蔵、投与、および／または活性化合物の生物活性を促進するために当該技術分野において従来用いられる組成物を指す（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mac Publishing Company (1980)を参照）。担体は活性化合物のあらゆる望ましくない副作用を減らすこともできる。適切な担体は、例えば、安定であり、例えば、担体中の他の成分と反応できない。一例では、担体は、治療に使用された投与量および濃度において、重大な局所的または全身的な有害作用をレシピエントにもたらさない。
【０１３６】
本開示のための適切な担体には、従来的に使用されるものが含まれ、例えば、水、食塩水、水性デキストロース、ラクトース、リンゲル液、緩衝液、ヒアルロナンおよびグリコールは、特に（等張である場合）水剤用に、例示的な液体担体である。適切な医薬担体および賦形剤としては、デンプン、セルロース、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等が挙げられる。
【０１３７】
別の例では、担体は、例えば、その中で細胞が生育または懸濁される、培地組成物である。例えば、かかる培地組成物は、それを投与された対象においていかなる有害作用も誘導しない。
【０１３８】
例示的な担体および賦形剤は、細胞の生存能、ならびに／または炎症性神経病患を減少、防止もしくは遅延させる細胞の能力に悪影響を及ぼさない。
【０１３９】
一例では、担体または賦形剤によって緩衝作用（buffering activity）がもたらされ、それにより細胞および／または可溶性因子が適切なｐＨに維持されることで生物活性が発現される。例えば、その担体または賦形剤はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。ＰＢＳは、魅力的な担体または賦形剤であるが、その理由は、血流中または組織もしくは組織の周辺もしくは隣接領域中への、例えば、注射による直接的な適用を目的として、本開示の組成物が液体として製造されるような場合に、ＰＢＳが細胞および因子と最小限にしか相互作用せず、細胞および因子の迅速な放出を可能とするためである。
【０１４０】
ＳＴＰＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞は、レシピエント適合性であり、レシピエントに対し有害ではない産物に分解される足場に組み込む、または埋め込むこともできる。これらの足場によって、レシピエントである対象に移植されるべき細胞に、支持および保護がもたらされる。天然および／または合成の生分解性足場は、そのような足場の例である。
【０１４１】
種々の異なる足場が、本開示の実施において成功裏に使用され得る。好ましい足場としては、限定はされないが、生物的で、分解可能な足場が挙げられる。天然の生分解性足場としては、コラーゲン、フィブロネクチン、およびラミニン足場が挙げられる。細胞移植の足場のための適切な合成材料は、広範な細胞成長および細胞機能を支持可能なものであるべきである。そのような足場は再吸収可能なものであってもよい。適切な足場としては、例えば、Vacanti, et al. J. Ped. Surg. 23:3-9 1988; Cima, et al. Biotechnol. Bioeng. 55:145 1991; Vacanti, et al. Plast. Reconstr. Surg. 55:753-9 1991に記載されるような、ポリグリコール酸の足場；またはポリ酸無水物、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の合成高分子が挙げられる。
【０１４２】
別の例では、本細胞はゲル状足場（アップジョン社のゼルフォーム等）に投与され得る。
【０１４３】
本明細書に記載の方法に有用な本細胞性組成物は、単独で、または他の細胞との混合物として投与されてもよい。本開示の組成物と併せて投与され得る細胞としては、限定はされないが、他の多分化能もしくは多能性を有する細胞もしくは幹細胞、または骨髄細胞が挙げられる。異なる型の細胞は、本開示の組成物と、投与の直前または少し前に混合することができ、あるいは、それらを投与前にある一定期間、一緒に共培養してもよい。
【０１４４】
一例では、本組成物は、有効量または治療的もしくは予防的に有効量の細胞を含む。例えば、本組成物は、約I×１０５個のＳＴＲＯ−１＋細胞／ｋｇ〜約１×１０７個のＳＴＲＯ−１＋細胞／ｋｇまたは約１×１０６個のＳＴＲＯ−１＋細胞／ｋｇ〜約５×１０６個のＳＴＲＯ−１＋細胞／ｋｇを含む。投与されるべき細胞の正確な量は、種々の因子、例えば、患者の年齢、体重、および性別、並びに炎症性神経病患の範囲および重症度に応じて決定される。
【０１４５】
一部の例では、細胞は、細胞が対象の血行路に出て行くことを拒むが、細胞から分泌された因子が血行路に進入することは許すチャンバー内に含まれる。このように、本細胞が対象の血行路に因子を分泌することを可能とさせることにより、可溶性因子は対象に投与され得る。そのようなチャンバーは、対象におけるある部位に均等に埋め込むことで可溶性因子の局所レベルを増加させることができる。
【０１４６】
本開示の一部の例では、細胞性組成物を用いた治療の開始前に患者を免疫抑制することは、必ずしも必要であったり、望まれたりするわけではない。従って、ＳＴＲＯ−１＋細胞またはその子孫の、同種異系間、さらには異種間での移植であっても、場合によっては許容されることがある。
【０１４７】
しかし、他の場合においては、細胞治療開始前に、患者を薬理学的に免疫抑制することおよび／または細胞組成物に対する対象の免疫応答を減少させることが望ましいか、または適切であり得る。これは、全身的または局所的な免疫抑制剤の使用によって達成することができ、あるいは封入デバイスにて本細胞を送達することによって達成することもできる。本細胞は、細胞および治療因子に必要とされる栄養分および酸素を透過させるが、免疫液性因子および細胞は透過させないカプセルに封入してもよい。一例では、カプセルの材料は、アレルギーを起こしにくいもので、標的組織内に容易に且つ安定して位置し、移植された構造体にさらなる保護を与える。移植細胞に対する免疫応答を低減または除去するこれらのおよび他の手段は、当該技術分野において周知である。代わりに、本細胞を、それらの免疫原性を低減させるために、遺伝的に改変してもよい。
【０１４８】
可溶性因子
本開示の一例では、ＳＴＲＯ−１＊細胞由来の、および／もしくは子孫細胞由来の上清または可溶性因子は、例えば、適切な担体および／または賦形剤を含む組成物の形態で、投与される。例えば、担体または賦形剤は可溶性因子または上清の生物学的効果に悪影響を及ぼさない。
【０１４９】
一例では、本組成物は、可溶性因子または上清の成分、例えば、プロテアーゼ阻害剤を安定化させるための物質の組成物を含む。例えば、プロテアーゼ阻害剤は、対象に対し有害作用を有するのに充分な量では含まれない。
【０１５０】
ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の、および／もしくは子孫細胞由来の上清または可溶性因子を含む組成物は、例えば、培地中で、または安定な担体もしくは緩衝溶液、例えば、リン酸緩衝食塩水中で、適切な液体懸濁液として調製してもよい。適切な担体は本明細書の上記の通りである。別の例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の、および／または子孫細胞由来の上清または可溶性因子を含む懸濁液は、注射用の油状懸濁液である。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油等の脂肪油；またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル；またはリポソームが挙げられる。注射用に使用されるべき懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン等の、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。所望により懸濁液は、化合物の溶解性を増加させ、高濃度での溶液の調製を可能とする、適切な安定剤または作用物質を含んでもよい。
【０１５１】
無菌の注射剤は、必要とされる量の上清または可溶性因子を、上記成分のうちの一つまたは組合せと一緒に、適切な溶媒に組み入れ、必要に応じて、その後フィルター滅菌を行うことによって、調製できる。
【０１５２】
通常、分散液は、上清または可溶性因子を、基本（basic）分散媒および上に列挙されたものから必要な他の成分を含有する無菌のビヒクルに組み入れることによって調製される。無菌注射剤調製用の無菌散剤の場合、例示的な調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、それによって、活性成分およびその予め細菌濾過した溶液由来の任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる。本開示の別の態様によれば、上清または可溶性因子は、その溶解性を増強する一つまたは複数のさらなる化合物と共に製剤化され得る。
【０１５３】
担体または賦形剤の他の例は、例えば、Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N. Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N. Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y.に記載されている。
【０１５４】
治療組成物は、通常、製造および貯蔵の条件下では無菌且つ安定であるべきである。本組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または他の規則構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、および適切なその混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチン等の被膜の使用によって、分散の場合に必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、本組成物中に等張剤、例えば、糖類、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール等、または塩化ナトリウムを含む。注射用組成物の持続的吸収は、本組成物中に、吸収を遅延させる作用物質、例えば、一ステアリン酸塩およびゼラチンを含むことによってもたらされ得る。さらに、可溶性因子を、徐放性製剤、例えば徐放性ポリマーを含む組成物中に、投与してもよい。例えば、移植片およびマイクロカプセル化した送達系を含む徐放性製剤等、活性化合物は化合物を急速な放出から保護する担体と一緒に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸およびポリ乳酸ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧ）等の、生分解性、生体適合性の高分子を使用することができる。そのような製剤を調製するための多くの方法が、特許されているか、または当業者に一般的に知られている。
【０１５５】
上清または可溶性因子は、例えば、可溶性因子を除放させるために、適切な基質と併せて投与してもよい。
【０１５６】
組成物のさらなる構成要素
ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の上清または可溶性因子、ＳＴＲＯ−１＋細胞またはその子孫は、他の有益な薬物または生化学的分子（増殖因子、栄養因子）とともに投与されてもよい。他の薬剤とともに投与されるとき、それらは、単一の薬剤的組成物で、または独立した薬剤的組成物で、同時にまたは連続して、他の薬剤とともに（他の薬剤の投与の前後に）投与されてもよい。同時投与されてもよい生理活性因子には、反アポトーシス剤（例えばＥＰＯ、ＥＰＯミメチボディ、ＴＰＯ、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ、ＨＧＦ、カスパーゼ阻害剤）；抗炎症薬（例えばｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、ＴＧＦベータ阻害剤、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１阻害剤、ぺミロラスト、トラニラスト、レミケード、シロリムスおよびＮＳＡＩＤ（非ステロイド性の抗炎症薬物；例えば、テポキサリン、トルメン、スプロフェン）；免疫抑制／免疫修飾剤（例えば、シクロスポリン、タクロニムスのようなカルシニューリン阻害剤；ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムス、エベロリムス）；抗増殖剤（例えばアザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；コルチコステロイド（例えばプレドニゾン、ヒドロコルチゾン）；コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン）；モノクローナル抗ＩＬ−２Ｒアルファ受容体抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ）といった抗体、（例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）；抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）；モノクローナル抗Ｔ細胞抗体ＯＫＴ３）といったポリクローナル抗Ｔ細胞抗体；反血栓形成剤（例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、ＰＰａｃｋ（デキストロフェニルアラニン  プロリン  アルギニン  クロロメチルケトン）、抗トロンビン化合物、血小板受容体拮抗薬、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害剤および血小板阻害薬）；および抗酸化剤（例えば、プロブコール、ビタミＡ、アスコルビン酸、トコフェノール、コエンザイムＱ１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、Ｎ−アセチルシステイン）とともに局所麻酔薬、などが挙げられる。
【０１５７】
一例では、本明細書に記載のいずれかの例に従う組成物は、炎症性神経病患の治療または予防のためのさらなる因子を含む。
【０１５８】
代わりに、またはさらに、本明細に記載のいずれかの例に従う、細胞、分泌因子および／または組成は、炎症性の神経学的状態の既知の治療と組み合わされる。
【０１５９】
一例では、本明細に記載のいずれかの例に従う薬剤的組成物は、炎症性の神経学的状態またはその症状を治療するのに使用する化合物を含む。代わりに、本明細に記載のいずれかの開示例に従う治療／予防の方法はさらに、炎症性の神経学的状態またはその症状を治療するのに使用する化合物を投与することを含む。例示的な化合物には、細胞毒性薬、化学療法薬、免疫抑制剤、サイトカイン、サイトカイン拮抗薬または抗体、増殖因子、ホルモン、インテグリン、インテグリン拮抗薬または抗体（例えば、ジェンテック社（Genentech）から市販されているエファリズマブ（efalizumab）（ＲＡＰＴＩＶＡ（商標））といった抗ＬＦＡ−１抗体、またはバイオジェンアイデック／エランファーマスーティカル社（Biogen Idec/Elan Pharmaceuticals, Inc）から入手可能なナタリズマブ（natalizumab）（ＴＹＳＡＢＲＩ（商標））といった抗α−４インテグリン抗体）等、またはＢ細胞表面マーカーと結合する抗体（例えば、リツキシマブ（rituximab）といった抗ＣＤ２０抗体（Ｒｉｔｕｘａｎ（商標）またはＭａｂｔｈｅｒａ（商標）またはオクレリズマブ（ocrelizumab）（両方ともジェンテック社から入手可能）またはジェンマブ／グラクソグループ（Genmab/Glaxo Group）から入手可能なオファツマブ（ofatumumab）（Ａｒｚｅｒｒａ（商標）））が挙げられる。
【０１６０】
組合せ治療の一部の例では、細胞、因子および／または組成物は、インターフェロンクラスの薬剤、例えばＩＦＮ−β−１ａ（ＲＥＢＩＦ（商標）およびＡＶＯＮＥＸ（商標））またはＩＦＮ−β−ｌｂ（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（商標））；オリゴペプチド、例えば酢酸グラチラマー（ＣＯＰＡＸＯＮＥ（商標））；細胞毒性薬、例えばミトキサントロン（ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（商標））、メトトレキサート、シクロフォスファミド、クロランブシル、アザチオプリン；静脈内イミノグロブリン（ガンマグロブリン）；リンパ球枯渇治療（例えば、ミトキサントロン、シクロフォスファミド、キャンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）、抗ＣＤ４抗体、クラドリビン、全身放射線照射、骨髄移植）；全身コルチコステロイド治療を含むコルチコステロイド（例えば、メチルプレドニゾン、プレドニゾン、デキサメタゾン、またはグルコルチコイド）；非リンパ球枯渇免疫抑制治療（例えば、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）またはシクロスポリン）；セリバスタチン（ＢＡＹＣＯＬ（商標））、フルバスタチン（ＬＥＳＣＯＬ（商標））、アトルバスタチン（登録商標ＬＩＰＩＴＯＲ）、ロバスタチン（ＭＥＶＡＣＯＲ（商標））、プラバスタチン（ＰＲＡＶＡＣＨＯＬ（商標））、シルバスタチン（ＺＯＣＯＲ（商標））を含む、「ステイン」クラスのコレステロール低下薬；エストラジオール；テストステロン（高投与量であってもよい； Stuve et al. Neurology 8:290-301, 2002）；ホルモン補充療法；ＭＳの二次的または関連する症状（例えば、痙縮、失禁、疼痛、疲労）の治療；疾患修飾性抗リュウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）；非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；血漿交換；レボチロキシン；シクロスポリンＡ；ソマタスタチン類似体；サイトカインまたはサイトカインレセプター拮抗薬；代謝抵抗物質；免疫抑制剤；リハビリテーション手術；放射性ヨウ素；または甲状腺切除、と組み合わせられる。
【０１６１】
他の例では、本明細書に記載のいずれかの例による組成物は、前駆体細胞の血管細胞への分化を誘導するまたは促進する因子を、さらに含む。例示的な因子には、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ；例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ）、およびＦＧＦが挙げられる。
【０１６２】
他の例では、本明細書に記載のいずれかの例に従う組成物は、組織特異的分化決定済み細胞（ＴＳＣＣ）、をさらに含む。この点においては、国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＡＵ２００５／００１４４５号が、ＴＳＣＣおよびＳＴＲＯ−１＋細胞の投与がＴＳＣＣの増殖の促進を導くことができることを示している。一例では、ＴＳＣＣは、神経細胞性細胞、例えば、神経細胞、神経細胞性前駆体細胞またはシュワン細胞である。そのような組成物を対象に投与することは、例えば、神経細胞または髄鞘の産生を増加させるという結果となり得る。他の例では、ＴＳＣＣは、血管系細胞である。そのような組成物を対象に投与することは、血管系の産生の増加という結果、例えば、罹患組織に送達される栄養物の増加という結果となり得る。
【０１６３】
医療デバイス
本開示はまた、本明細書に記載のいずれかの例による方法において使用される医療デバイスを提供する。例えば、本開示は、本明細書に記載のいずれかの例による、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはそれらの子孫細胞および／もしくはそれからの可溶性因子ならびに／または組成物を含む、注射器もしくはカテーテルまたは他の適切な送達デバイスを提供する。注射器またはカテーテルは、本明細書に記載のいずれかの例による方法における使用説明書と同梱されていてもよい。
【０１６４】
他の例では、本開示は、本明細書に記載のあらゆる例にように、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫細胞および／もしくはその可溶性因子ならびに／または組成物を含む移植片を提供する。移植片は、本明細書に記載のいずれかの例による方法における使用説明書と同梱されてもよい。適切な移植片は、例えば、本明細書で上述の足場、ならびにＳＴＲＯ−１＋細胞および／またはその子孫細胞および／またはその可溶性因子とともに形成されてもよい。
【０１６５】
投与様式
ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の上清もしくは可溶性因子、ＳＴＲＯ−１＋細胞またはその子孫は、外科的に移植、注射、送達（例えば、カテーテルまたは注射器を手段として）されてもよいし、あるいは、修復または増強を必要としている部位に直接的または間接的に投与されてもよい。
【０１６６】
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の上清または可溶性因子、ＳＴＲＯ−１＋細胞またはその子孫は、対象の血流に送達される。例えば、ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の上清または可溶性因子、ＳＴＲＯ−１＋細胞またはその子孫は非経口的に送達される。非経口投与の経路の例としては、限定はされないが、腹腔内、脳室内（intraventricular, intracerebroventricular）、くも膜下腔内が挙げられる。一例では、ＳＴＲＯ−１＊細胞由来の上清または可溶性因子、ＳＴＲＯ−１＋細胞またはその子孫は、動脈内、大動脈中、心臓の心房もしくは心室中、または血管中に送達される。
【０１６７】
心臓の心房または心室への細胞送達の場合、肺への急速な細胞送達によって生じ得る合併症を避けるため、細胞は左心房または左心室に投与されることがある。
【０１６８】
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の上清または可溶性因子、ＳＴＲＯ−１＋細胞またはその子孫は、例えば、注射器を用いて、またはカテーテルもしくは中心静脈カテーテル（central line）を通じて、送達部位に注入される。
【０１６９】
治療製剤の投与計画の選択は、いくつかの因子、例えば、血清または組織での実体（entity）の代謝回転速度、症状レベル、および実体（entity）の免疫原性に依存する。例えば、投与計画は、許容できる副作用レベルを一貫させて、患者に送達される治療化合物の量を最大とする。従って、送達される製剤の量は、特定の実体（entity）および治療されている状態の重症度に部分的に依存する。
【０１７０】
一例では、ＳＴＲＯ−１＊細胞由来の上清または可溶性因子、ＳＴＲＯ−１＋細胞またはその子孫は、単回急速投与量として送達される。あるいは、ＳＴＲＯ−１＋細胞由来の上清または可溶性因子、ＳＴＲＯ−１＋細胞またはその子孫は、持続点滴によって、または、例えば、１日、１週間の間隔の、もしくは週に１〜７回の投与によって、投与される。例示的な投与プロトコルは、重大な望ましくない副作用を回避する、最大の投与量または投与頻度を含むものである。週当たりの合計投与量は、使用される化合物のタイプおよび活性に応じて決定される。適切な投与量の決定は、臨床医によって、例えば、当該技術分野において、治療に影響を与えると知られている、もしくは疑われている、または治療に影響を与えると予想されるパラメーターまたは因子を用いて、行われる。通常、投与はやや適量未満の量から開始され、その後、あらゆる負の副作用と比較して所望の、または最適の効果が達成されるまで、小さな増加量で増加される。
【０１７１】
炎症性の神経学的状態の進行を治療するまたは遅延させることを目的とした本開示の例に従って、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫細胞ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を、例えば、当技術分野で既知のおよび／または本明細書記載の標準的な方法を用いて、障害の診断後に投与することができる。
【０１７２】
炎症性の神経学的状態の開始を予防するまたは遅延させることを目的としたそれらの例のために、ＳＴＲＯ−１＋細胞および／もしくはその子孫細胞ならびに／またはそれに由来する可溶性因子を、障害の臨床診断に先立って、例えば、対象が髄鞘に病変を患っていていながら、未だＭＳと診断されていない時、および／または抗リン脂質抗体を産生した時に投与することができる。
【０１７３】
本開示はさらに、以下の非制限的な例に記載される。
【実施例】
【０１７４】
実施例１：ＳＴＲＯ−３＊細胞の選択によるＭＰＣの免疫選択
骨髄（ＢＭ）を、健康な正常成人の志願者（２０〜３５歳）から採取する。簡潔には、４０ｍｌのＢＭを、後腸骨稜から、リチウム−ヘパリン抗凝固剤含有チューブに吸引する。
【０１７５】
ＢＭＭＮＣを、前述（Zannettino, A.C. et al. (1998) Blood 92: 2613-2628）の通りに、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（ニコメッドファーマ（Nycomed Pharma）、ノルウェイ、オスロ）を用いて、密度勾配分別によって調製する。４００×ｇ、４℃、３０分間の遠心分離後、淡黄色の層をホールピペットで除去し、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、ＣＳＬリミテッド社（CSL Limited）、オーストラリア、ヴィクトリア）を含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；ライフテクノロジー社（Life Technologies）、メリーランド州ゲイサーズバーグ）から成る「ＨＨＦ」中で３回洗浄する。
【０１７６】
続いて、ＳＴＲＯ−３＋（またはＴＮＡＰ＋）細胞を、前述（Gronthos et al. (2003) Journal of Cell Science 116: 1827-1835; Gronthos, S. and Simmons, P.J. (1995) Blood 85: 929-940）の通りに、磁気活性化細胞分取で単離した。簡潔には、およそ１〜３×１０８個のＢＭＭＮＣを、ＨＨＦ中１０％（ｖ／ｖ）正常ウサギ血清から成るブロッキング緩衝液中で、２０分間、氷上でインキュベートする。細胞を、ブロッキング緩衝液中＾ｇ／ｍｌのＳＴＲＯ−３ｍＡｂ溶液２００μｌと一緒に、氷上で１時間インキュベートする。続いて、細胞を４００×ｇでの遠心分離によってＨＨＦ中で２回洗浄する。ＨＨＦ緩衝液中１／５０希釈のヤギ抗マウスγ−ビオチン（サザンバイオテクノロジー社（Southern Biotechnology Associates）、英国バーミンガム）を加え、細胞を氷上で１時間インキュベートする。細胞を、上記と同様に、ＭＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡ、５ｍＭのＥＤＴＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを補充したＣａ２＋およびＭｎ２＋を含まないＰＢＳ）中で２回洗浄し、最終体積０．９ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液中に再懸濁する。
【０１７７】
１００μｌのストレプトアビジンミクロビーズ（ミルテニーバイオテック社（Miltenyi Biotec）；ドイツ、ベルギッシュグラートバハ）を細胞懸濁液に添加し、氷上で１５分間インキュベートする。細胞懸濁液を２回洗浄し、０．５ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁した後、ミニＭＡＣＳカラム（MS Columns、ミルテニーバイオテック社（Miltenyi Biotec））上に充填し、０．５ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液で３回洗浄して、ＳＴＲＯ−３ｍＡｂ（２００５年１２月１９日にアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）にＰＴＡ−７２８２の受託番号で寄託；国際公開第ＷＯ２００６／１０８２２９号を参照）と結合しなかった細胞を回収する。さらに１ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液を加えた後、カラムを磁石から取り除き、ＴＮＡＰ＋細胞を陽圧で単離した。各画分からの細胞の一定分量をストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色し、純度をフローサイトメトリーで評価することができる。
【０１７８】
実施例２：ＳＴＲＯ−３ｍＡｂによって選択された細胞はＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞である。
ＳＴＲＯ−３ｍＡｂを、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞を単離する単一試薬として用いることの可能性を確認する目的の実験を設計した。
【０１７９】
ＳＴＲＯ−３（ＩｇＧ１）はＳＴＲＯ−１（ＩｇＭ）とは異なるアイソタイプであることを考慮し、ＳＴＲＯ−３のクローン原性ＣＦＵ−Ｆを同定する能力を、ＭＡＣＳ方法を用いて単離されたＳＴＲＯ−１＋細胞のその共発現に基づく２色ＦＡＣＳ分析によって評価した（図１）。ドットプロットヒストグラムは、リストモードデータとして収集された５×１０４個の事象を表わしている。垂直線および水平線は、同条件下で処理したアイソタイプ対応対照抗体、１Ｂ５（ＩｇＧ）および１Ａ６．１２（ＩｇＭ）で得られた平均蛍光の１．０％未満の反応性レベルに設定された。結果は、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞のうち微量の集団がＴＮＡＰを共発現したが（右上象限）、残りのＳＴＲＯ−１＋細胞はＳＴＲＯ−３ｍＡｂと反応しなかったことを示している。その後、４つの象限全てからＦＡＣＳで単離された細胞をＣＦＵ−Ｆの発生率に対して評価した（表１）。
【０１８０】
表１：細胞表面マーカーであるＳＴＲＯ−１およびＴＮＡＰの共発現に基づく２重染色ＦＡＣＳ分析によるヒト骨髄細胞の富化（図１参照）。ＦＡＣＳで分取した細胞を、２０％ＦＣＳを補充したαＭＥＭ中で、標準的なクローン原性条件下で培養した。データは、播種された１０５個細胞当たりの１４日目のコロニー形成細胞（ＣＦＵ−Ｆ）の平均数±ＳＥ（ｎは３つの異なる骨髄穿刺液）を表わしている。これらのデータは、ヒトＭＰＣがＳＴＲＯ−１抗原を明るく共発現するＢＭのＴＮＡＰ陽性画分だけに限定されていることを示している。
【表１】
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【０１８１】
実施例３：ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌおよびＳＴＲＯ−１ｂｒｉ細胞の、相対遺伝子および表面タンパク質の発現
第１の組の実験では、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を適用して、蛍光標識細胞分取により単離したＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌまたはＳＴＲＯ−１ｂｒｉ集団により発現した、多様な系列関連遺伝子の遺伝子発現プロファイルを調べた（図２Ａ）。第２の組の実験では、フローサイトメトリーおよび平均チャネル蛍光分析（mean channel fluorescence analysis）を適用して、蛍光標識細胞分取により単離したＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌまたはＳＴＲＯ−１ｂｒｉ集団により発現した、多様な系統関連タンパク質の表面タンパク質発現プロファイルを調べた。
【０１８２】
全細胞ＲＮＡは、２×１０６個のＳＴＲＯ−１ｂｒまたはＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌのいずれかの分取された一次細胞、軟骨細胞ペレットおよび他の誘導培養から調製し、製造元（バイオテックスラボラトリーズ社（Biotecx Lab. Inc.）、テキサス州、ヒューストン）の奨励にもとづき、ＲＮＡｚｏｌＢ抽出法を用いて溶解させた。各亜集団から単離したＲＮＡはその後、ファーストストランドｃＤＮＡ（First-strand cDNA）合成キット(ファルマシアバイオテック社（Pharmacia Biotech）、スウェーデン、ウプサラ)を用いて調製した、ｃＤＮＡ合成の鋳型として使用した。多様な転写産物の発現は、従来記述の標準プロトコル(Gronthos et al., J. Bone and Min. Res. 14:48-57, 1999)を用いて、ＰＣＲ増幅により評価した。本研究で使用されたプライマーのセットを、表２に示す。増幅の後、各反応混合物を、１．５％アガロースゲル電気泳動で分析し、臭化エチジウム染色により可視化した。ＲＮＡの完全性は、ＧＡＰＤＨの発現により評価した。
【０１８３】
各細胞マーカーの相対遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨの発現を基準にして、ＩｍａｇｅＱａｎｔソフトウェアを用いて評価した（図２Ｂ、Ｃ）。加えて、２色フローサイトメトリー分析を用いて、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖したＭＰＣのタンパク質発現プロファイルを、ＳＴＲＯ−１抗体と組み合わせて、さらに広範囲の細胞系統関連マーカーに対するそれらの発現に基づき調べた。ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌおよびＳＴＲＯ−１ｂｒｉ培養細胞の遺伝子およびタンパク質発現に基づく遺伝子の発現型のまとめを表３に示す。データは、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖したＳＴＲＯ−１ｂｒｉＭＰＣが、血管周囲細胞、例えばアンジオポエチン−１、ＶＣＡＭ−１、ＳＤＦ−１、ＩＬ−１p、ＴＮＦα、およびＲＡＮＫＬに関連するマーカーの差次的にさらに高い発現を示すことを表している。ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌおよびＳＴＲＯ−１ｂｒｉ培養した細胞のタンパク質および遺伝子発現プロファイルの間の比較を、表３と４にまとめる。
【０１８４】
サブトラクティブハイブリダイゼーション研究もまた、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ細胞により一意的に発現する遺伝子を同定するために実行した。簡潔には、ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌおよびＳＴＲＯ−１ｂｒiを、上に示すように単離した（図３Ａを見られたい）。全ＲＮＡを、５つの異なる骨髄試料からプールされたＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌおよびＳＴＲＯ−１ｂｒｉ細胞から、ＲＮＡ  ＳＴＡＴ−６０システム（テルテスト社（TEL-TEST）)を用いて調製した。ファーストストランド合成は、ＳＭＡＲＴ  ｃＤＮＡ合成キット（クロンテックラボラトリーズ社（Clontech Laboratories)を用いて実行した。得られたｍＲＮＡ／一本鎖ｃＤＮＡハイブリッドは、最初の室温プロセスにおいて形成された３'および５'末端の特異的プライマー部位を用いる長距離ＰＣＲ（Advantage 2PCRキット;クロンテック社)により、製造元の仕様にもとづき、増幅した。ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ  ｃＤＮＡのＲｓａＩ消化の後、２アリコート(aliquot)を使用して、異なる特異的アダプターオリゴヌクレオチドを、クロンテックＰＣＲ選択ｃＤＮＡサブトラクションキット（Clontech PCR-Select cDNA Subtraction Kit）を用いて、結合した。２回のサブトラクティブハイブリダイゼーションを、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ（テスター）およびＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌ（ドライバー）ｃＤＮＡ、およびその逆を用いて、製造元のプロトコルに従って実行した。この手順はまた、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉドライバーｃＤＮＡに対してハイブリダイズしたＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌテスターｃＤＮＡを用いて、逆に実行した。
【０１８５】
ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ集団により一意的に発現する遺伝子を同定するために、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉサブトラクテッドｃＤＮＡを用いて、Ｔ／Ａクローニングベクターに結合したＳＴＲＯ―１ｂｒｉサブトラクテッドｃＤＮＡｓにより形質転換した、２００の無作為に選択された細菌クローンを含む複製低密度マイクロアレイフィルターを構築した。マイクロアレイは引き続いて、［３２Ｐ］ｄＣＴＰ標識したＳＴＲＯ−１ｂｒｉまたはＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌいずれかのサブトラクテッドｃＤＮＡを用いて精査した（図３Ｂ−Ｃ）。差次的スクリーニングにより、合計４４のクローンを同定し、これらは、ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌとＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ亜集団の間で高度に差次的に発現した。差次的に発現したクローンすべてのＤＮＡ塩基配列決定は、ただ１つのクローンが、既知の間質細胞マイトジェンの代表、すなわち、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）(Gronthos and Simmons, Blood. 85: 929-940, 1995)であることを明らかにした。興味深いことに、４４のクローンのうち６つが、ケモカインである間質由来因子−１（ＳＤＦ−１）に対応するＤＮＡ挿入断片を含むことがわかった。ヒトＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈt細胞における多量のＳＤＦ−１転写物は、新たに分取されたＳＴＲＯ−１ｂｒｉ８ｈl、ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌ、およびＳＴＲＯ−１ｎｅｇiｔｉｖｅ骨髄亜集団から調製した全ＲＮＡの半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより確認した（図３Ｄおよび表３）。
【０１８６】
表２：ＲＴ−ＰＣＲプライマーおよびヒトｍＲＮＡの特異的増幅の条件
【表２−１】
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【表２−２】
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【０１８７】
表３：ＳＴＲＯ−１ＢｒｉおよびＳＴＲＯ−１^”集団における相対遺伝子発現のまとめ。逆転写ＰＣＲにより決定した、ＳＴＲＯ−１ＢｒｉとＳＴＲＯ−１Ｄｕｌｌ集団の間で測定可能で差次的な発現を示した遺伝子のリストを示す。値は、ハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨを基準にした相対遺伝子発現量を表す。
【表３】
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【０１８８】
タンパク質表面発現をＳＴＲＯ−１発現の密度と関連付けるために、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖した細胞に由来する骨髄ＭＰＣの単個細胞懸濁液を、トリプシン／ＥＤＴＡ剥離により調製し、引き続いてＳＴＲＯ−１抗体とともに、広範囲の細胞系統関連マーカーを同定する抗体と組み合わせてインキュベートした。ＳＴＲＯ−１は、ヤギ抗マウスＩｇＭ−フルオレセインイソチオシアネートを用いて同定する一方、他のすべてのマーカーは、ヤギ抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ−フィコエリスリンのどちらかを用いて同定した。細胞内抗原を同定するこれらの抗体については、細胞調製物はまず、ＳＴＲＯ−１抗体をもちいて標識し、冷７０％エタノールを用いて固定して細胞膜を透過性にし、その後、細胞内抗原特異抗体とともにインキュベートした。アイソタイプ一致した対照抗体は、同一条件下で使用した。ＣＯＵＬＴＥＲ  ＥＰＩＣＳフローサイトメーターを用いて２色フローサイトメトリー分析を実行し、リストモードデータを収集した。ドットプロットは、各系統細胞マーカー（ｙ軸）およびＳＴＲＯ−１（ｘ軸）について蛍光強度のレベルを表示する５，０００個のリストモード事象を表す。垂直および水平の象限は、アイソタイプ一致した陰性の対照抗体を基準にして確立した。
【０１８９】
表４：ＳＴＲＯ−１ＢｒｉおよびＳＴＲＯ−１Ｄｌ，ｌｌ集団における相対タンパク質発現のまとめである。フローサイトメトリーにより決定したＳＴＲＯ−１ＢｒｉとＳＴＲＯ−１Ｄ,,,,の集団の間で差次的発現を示したタンパク質のリストを示す。値は、染色の相対的な平均蛍光強度を表す。
【表４】
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【０１９０】
これらの結果は、ＳＤＦ−１αおよびＲＡＮＫＬを、ＳＴＲＯ−１ｂｎ細胞が高度に発現していることを示している。これは、重要である。なぜなら、これら両タンパク質が、ＥＡＥといった免疫障害に対する防御をもたらすＣＤ４＋およびＣＤ２５＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の上方調節に関与していることが知られている(Loser et al., Nature Medicine 12:1372-1379, 2006; Hess, Biol. Blood Marrow Transplant, 12 (1 Suppl 2):13-21, 2006; and Meiron et al., J. Exp. Medicine 205:2643-2655, 2008)からである。
【０１９１】
実施例４：ＥＡＥにおけるＳＴＲＯ−１＋細胞の効果
以下の実験のために、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスにおける、髄鞘稀突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）誘導された実験的炎症性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を用いた。Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスは、ＭＳ患者のものと同様な表現型症状（進行する性麻痺）だけでなく示すだけでなく、ＣＮＳに広範な炎症、脱髄および軸索の喪失／損傷を示す。使用された、ＥＡＥ誘導の免疫化手順、臨床症状の評価およびＭＰＣ移植は以下のとおりである。
【０１９２】
ＥＡＥの能動的誘導
２００μｇの組み換えＭＯＧをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解し、４００μｇの殺菌された結核菌Ｈ３７Ｒａを含む等容積の完全フロイントアジュバントと混合して、このＭＯＧでマウスに免疫付与した。０．１ｍｌのこの混合物を、２５ゲージ（Ｇ）針を用いて、左右脇腹に皮下注入した（合計０．２ｍｌ／マウス）。また、０．３０ｍｌのＰＢＳ中３５０ｎｇの不活性化した百日咳菌毒を、０日目と２日目に２９Ｇ針を用いて尾静脈を通じ静注（ｉ．ｖ．）し、これによりマウスに免疫付与した。注入後に、穏やかな圧力をＩ．Ｖ．部位に３０秒間かけて、ｉ．ｖ．部位からの出血の危険性を減少させた。
【０１９３】
マウスを２〜５分毎に１０〜１５分間、監視し、活動性の出血がないことを確かめた。
【０１９４】
ＭＰＣを用いた治療
ＭＰＣを、本質的に実施例１に記載のとおりに単離した。疾患誘導の８、１０、１２日目に、容積２００μｌのＰＢＳ中、２×１０５または４ｘ１０５個のＭＰＣを、単回の静脈内（ｉ．ｖ．）注入として投与した（表５参照）。対照には、等容積のＰＢＳのみをｉ．ｖ．注入した。マウスを毎日監視し、以下に記載の尺度に従って、臨床的兆候を採点した。実験は、およそ３６日間継続し、疾患の経過を監視した。実験の終了時に、脳、脊髄および視神経を切開し、ホルマリン中で固定した。
【０１９５】
表５：治療計画のまとめ
【表５】
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【０１９６】
マウスの監視
すべてのマウスを、実験全体について、神経機能障害の兆候について、毎日調査した。
神経機能障害の等級:
０−正常
１−尾の緊張喪失のみ
２−後肢１本または２本の軽度の脱力および異常な足取り
３−後肢の運動不能
４−後肢の運動不能および軽度の前肢脱力
５−死亡
【０１９７】
結果
対照Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスは、ＭＳ患者のものと同様な表現型症状（進行性麻痺）を示すだけでなく、ＣＮＳに、広範な炎症、脱髄および軸索の喪失／損傷を示す。
【０１９８】
図４に示すように、ＥＡＥ疾患誘導の開始時に投与した静脈内投与ＭＰＣは、ＰＢＳで治療したＥＡＥ動物と比較して、３６日間にわたり、平均臨床疾患スコアの重症度を抑制することができる。
【０１９９】
図５は、ＭＰＣ治療が、慢性進行性ＥＡＥにおける累積疾患指数の用量依存的減少を誘導することを示す（平均病患スコアの全曲線下面積分析）。
【０２００】
ＭＰＣ投与の効果を表６にまとめる：
表６：ＭＰＣを用いた治療後のマウスＥＡＥモデルの臨床結果のまとめ
【表６】
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【０２０１】
表６に示すデータは、すべての動物が、ＭＯＧペプチド３５−５５を用いたＥＡＥの誘導の１０〜１８日後に神経疾患を示すことを表している。ＰＢＳで治療した対照動物の２５％（３／１２）が、ＭＰＣで治療した動物０／１５と比較して、死亡した。最高臨床スコアは、対照群で最高であり、すべてのＭＰＣ治療群は、さらに低い最高臨床スコアを示した。
【０２０２】
３６日の継続期間の平均臨床スコアについての曲線下面積（ＡＵＣ）である累積疾患指数はすべて、対照群に認められるものと比較して、ＭＰＣ治療群に関してさらに低かったことから、ＭＰＣによる、ＥＡＥ疾患の着実で持続した抑制が示される。
【０２０３】
これらのデータは、ヒト炎症性神経学的状態のこのモデルにおいて、ヒトMPCが、EAEの臨床的重症度を減少させるのに効果的であることを示している。
【０２０４】
実施例４：Ｔ細胞増殖に与えるＭＰＣの効果
実施例３に記載の、ＭＰＣ治療したマウスおよび対照を、病患誘導（ＭＯＧ３５−５５免疫化）の３６日後に選別した。脾臓細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培地のみで培養するか、またはＭＯＧ３５−５５を用いて再刺激し、そしてその後、［３Ｈ］チミジン取り込みを通じてＴ細胞増殖応答を測定した。ＭＯＧに特異的な増殖応答を、培地のみ（刺激せず）で培養した適合脾臓細胞と比較した。ＰＭＡ／イオノマイシン中で培養した脾臓細胞は、Ｔ細胞増殖の非特異的（抗原依存性のない）刺激を決定する目的を果たした。
【０２０５】
図６に示すデータは、二次的なｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＭＯＧによる抗原攻撃に対するＴ細胞免疫応答が、対照動物から培養したＴ細胞と比較して阻害されることを示している。図７のデータは、前もってｉｎ  ｖｉｖｏでＭＰＣ治療した動物におけるＴ細胞免疫応答が、ＰＢＳ治療した対照動物から培養したＴ細胞と比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＭＡ／イオノマイシンを用いた非特異的刺激に対して強力な応答を維持していることを示している。非特異的刺激に対するこの過剰な応答は、マウスＴ細胞による、ヒト抗原に対する異種応答を反映している可能性がある。
【０２０６】
これらのデータは、ヒトＭＰＣが、ＭＰＣの最終投与の２４日後でさえも、特異的抗原（例えば、ＭＯＧによる抗原刺激）に対するＴ細胞免疫応答を減少させるまたは予防することを示している。データは、ＳＴＲＯ−１富化ＭＰＣが、発性硬化症抗原に対する寛容性を誘導することを示している。
【０２０７】
実施例６：ＭＰＣのＩｎ  Ｖｉｔｒｏ効果
MPC免疫調節する性質を、増殖試験、混合リンパ球反応およびサイトカイン産生により、以下に記載のとおり試験する。
【０２０８】
増殖試験および混合リンパ球反応
単核細胞を、健康なＣ５７ＢＬ／６マウス、２Ｄ２トランスジェニックマウス、または本質的に実施例４に記載のとおりにＭＰＣまたはビヒクルのみを用いて治療したＭＯＧ免疫付与マウスの脾臓から収集する。単個細胞懸濁液を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（すべてインビトロジェン社から）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（シグマ社）および５０μＭのβ−メルカプトエタノール（シグマ社）を含む完全ＲＰＭＩ培地において調製する。赤血球細胞溶解の後、細胞を２回洗浄し、そしてその後、３とおりの９６ウェル平底マイクロタイタープレート(Nunc社)中、ウェルあたり２．５×１０５個の細胞の濃度で、２０μｇ／ｍｌのＭＯＧ３５−５５（ＧＬバイオケム社（GL Biochem））、８００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシンおよび２０ｐｇ／ｍｌのホルボールミリステート酢酸（ＰＭＡ）（ともにシグマ社）の存在下で播種するか、または＼０μｇ／ｍ＼の抗ＣＤ３および＾ｇ／ｍｌの抗ＣＤ８（ともＢＤから）を用いてプレコートしたウェル中へ播種する。細胞はその後、３７°Ｃで５％ＣＯ２とともに７２時間インキュベートし、＾Ci/ウェル［３Ｈ］チミジンを、培養の最後１８時間の間、加える。細胞をフィルターマット上に収集し、取り込まれた放射性核酸を、トップカウントハーベスター（Top Count Harvester）(パッカードバイオサイエンス（Packard Biosciences）)上で計数する。MPCによるT細胞増殖の阻害に関連する実験のために、ウェルあたりの濃度が２．５〜０．００２×１０４個の細胞の範囲にあるＭＰＣを、脾臓細胞を加えるのに先立って播種する。
【０２０９】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）において、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（応答体（responder））からの２×１０５個の脾臓細胞を、同数の放射線照射（２０Ｇｙ）Ｂａｌｂ／ｃ刺激体（stimulator）すなわち放射線照射ＭＰＣとともにインキュベートし、５日間培養して、培養の最後２４時間の間、１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジンを加える。
【０２１０】
Ｔ細胞の阻害に関連するＭＬＲにおいて、２×１０４個の放射線照射ＭＰＣを、脾臓細胞を加えるのに先立って、ウェルに播種する。
【０２１１】
サイトカイン産生
サイトカイン産生の分析に使用する上清は、２０μｇ／ｍｌのＭＯＧ３５−５５のみを用いて、または２×１０４個のＭＰＣ（ＭＰＣ：脾臓細胞の比１：１０）の存在のもとで刺激した、２Ｄ２トランスジェニックマウスからの２．５×１０６個の脾臓細胞との二日間の共培養から得られる。サイトカインの定量的分析をマウスＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）キット（ＢＤ）を用い、基本的に製造元の説明書に従って実行し、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター上で分析（ｕｓ）する。以下のサイトカイン：インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子−ａ（ＴＮＦ−ａ）を測定する。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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