(57)【要約】宿主細胞ゲノムの１つ以上の選択される標的部位の中に１つ以上の外因性の核酸を組み込むための方法が、本明細書において提供される。ある実施形態において、方法が、宿主細胞ゲノムを、ゲノムの標的部位の中に組み込まれることとなる外因性の核酸およびゲノム標的部位の近くでまたはゲノム標的部位内で二本鎖切断を引き起こすことができるヌクレアーゼを含む、１つ以上の組み込みポリヌクレオチドと接触させるステップを含む。いくつかの実施形態において、複数の外因性の核酸が、１回の形質転換反応により同時に組み込まれる。いくつかの実施形態において、方法が、ゲノムにおける特定の位置でのドナーＤＮＡの組み込みを促進するための、細胞の中への１つ以上のヌクレアーゼおよび１つ以上のドナーＤＮＡアセンブリの導入を含む。
2014513535.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞ゲノムの中に複数の外因性の核酸を組み込むための方法であって、
（ａ）宿主細胞を、
（ｉ）複数の外因性の核酸であって、外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘを含み、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、前記宿主細胞ゲノムの標的部位（ＴＳ）ｘで（ＥＳ）ｘの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数の外因性の核酸；ならびに
（ｉｉ）それぞれの前記標的部位（ＴＳ）ｘについて、（ＴＳ）ｘで切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘであって、前記切断が、（ＴＳ）ｘでの（ＥＳ）ｘの相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼと接触させるステップ
ならびに
（ｂ）宿主細胞を回収するステップであって、選択された外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、それぞれの選択された標的配列（ＴＳ）ｘで組み込まれている、ステップを含み、
ｘが、１〜ｎの任意の整数であり、ｎが、少なくとも２である、方法。
【請求項２】
（ＨＲ１）ｘが、（ＴＳ）ｘの５’領域に対して相同であり、（ＨＲ２）ｘが、（ＴＳ）ｘの３’領域に対して相同である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（Ｎ）ｘが、（ＴＳ）ｘの前記５’領域と前記３’領域との間に位置づけられる領域で切断することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
単一のヌクレアーゼが、それぞれの（ＴＳ）ｘを切断することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、または１０である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記回収するステップが、選択マーカーの組み込みを必要としない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記回収するステップが、前記標的部位で切断することができるヌクレアーゼと前記宿主細胞を接触させないことと比較して、より高い頻度で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記回収するステップが、スクリーニングされた１０、９、８、７、６、５、４、３、または２つの接触宿主細胞またはそのクローン集団毎に約１の頻度で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記回収するステップが、ＰＣＲ、サザンブロット、制限マッピング、およびＤＮＡ配列決定からなる群から選択される少なくとも１つの方法によって前記組み込みを同定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
（Ｎ）ｘが、（ＴＳ）ｘ内の内因性のゲノム配列を切断することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
（Ｎ）ｘが、（ＴＳ）ｘ内の外因性の配列を切断することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記外因性の配列が、ホーミングエンドヌクレアーゼについての認識配列である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ホーミングエンドヌクレアーゼが、Ｆ−ｃｐｈＩである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ＥＳ）ｘが、（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
（Ｄ）ｘが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ＥＳ）ｘが、線状である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記宿主細胞が、生合成経路の１つ以上の酵素をコードする１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
生合成経路の１つ以上の酵素をコードする前記１つ以上の異種ヌクレオチド配列が、ゲノムで組み込まれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、生合成経路の酵素をコードする、（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
（Ｄ）ｘが、生合成経路の酵素の変異体をコードする、複数の核酸分子を含むライブラリ（Ｌ）ｘのメンバーである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記宿主細胞が、イソペンテニルピロリン酸を作製するためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１つ以上の酵素をコードする１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記メバロン酸経路の前記１つ以上の酵素が、アセチル−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記宿主細胞が、ＭＥＶ経路の酵素をそれぞれコードする複数の異種核酸を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、テルペンシンターゼをコードする、（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記テルペンシンターゼが、モノテルペンシンターゼ、ジテルペンシンターゼ、セスキテルペンシンターゼ、セスタテルペンシンターゼ、トリテルペンシンターゼ、テトラテルペンシンターゼ、およびポリテルペンシンターゼからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
（Ｎ）ｘが、（Ｎ）ｘをコードする核酸配列を含む発現ベクターとして提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
（Ｎ）ｘが、精製タンパク質として前記宿主細胞の中に形質転換される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
（Ｎ）ｘが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）、トランスポザーゼ、および部位特異的レコンビナーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたＴｙｐｅＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＴｙｐｅＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼが、ＨＯエンドヌクレアーゼおよびＦｏｋ
Ｉエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ジンクフィンガー結合ドメインが、３、５、または６つのジンクフィンガーを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記エンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記エンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、またはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記エンドヌクレアーゼが、内因性のゲノム配列に特異的に結合するように修飾され、修飾された前記エンドヌクレアーゼが、もはや、その野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合しない、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
修飾された前記エンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼから誘導される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
修飾された前記エンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、またはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼから誘導される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、および動物細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記宿主細胞が、酵母細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞が、パン酵母、Ｍａｕｒｉ、Ｓａｎｔａ  Ｆｅ、ＩＺ−１９０４、ＴＡ、ＢＧ−１、ＣＲ−１、ＳＡ−１、Ｍ−２６、Ｙ−９０４、ＰＥ−２、ＰＥ−５、ＶＲ−１、ＢＲ−１、ＢＲ−２、ＭＥ−２、ＶＲ−２、ＭＡ−３、ＭＡ−４、ＣＡＴ−１、ＣＢ−１、ＮＲ−１、ＢＴ−１、またはＡＬ−１株のものである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１に記載の方法によって生成される宿主細胞。
【請求項４２】
宿主細胞であって、前記宿主細胞は：
（ａ）複数の外因性の核酸であって、外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘを含み、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、前記宿主細胞ゲノムの標的部位（ＴＳ）ｘで（ＥＳ）ｘの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数の外因性の核酸；ならびに
（ｂ）それぞれの前記標的部位（ＴＳ）ｘについて、（ＴＳ）ｘで切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘであって、前記切断が、（ＴＳ）ｘでの（ＥＳ）ｘの相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼを含み、
ｘが、１〜ｎの任意の整数であり、ｎが、少なくとも２である、宿主細胞。
【請求項４３】
（ＨＲ１）ｘが、（ＴＳ）ｘの５’領域に対して相同であり、（ＨＲ２）ｘが、（ＴＳ）ｘの３’領域に対して相同である、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
（Ｎ）ｘが、（ＴＳ）ｘの前記５’領域と前記３’領域との間に位置づけられる領域で切断することができる、請求項３３に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
単一のヌクレアーゼが、それぞれの（ＴＳ）ｘを切断することができる、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４６】
ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、または１０である、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４７】
（Ｎ）ｘが、（ＴＳ）ｘ内の内因性のゲノム配列を切断することができる、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４８】
（Ｎ）ｘが、（ＴＳ）ｘ内の外因性の配列を切断することができ、ｘが、１または１〜ｎの任意の整数である、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４９】
前記外因性の配列が、ホーミングエンドヌクレアーゼについての認識配列である、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項５０】
前記ホーミングエンドヌクレアーゼが、Ｆ−ｃｐｈＩである、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項５１】
（ＥＳ）ｘが、（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘをさらに含む、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項５２】
（Ｄ）ｘが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群から選択される、請求項５１に記載の宿主細胞。
【請求項５３】
（ＥＳ）ｘが、線状である、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項５４】
前記宿主細胞が、生合成経路の１つ以上の酵素をコードする１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項５５】
生合成経路の１つ以上の酵素をコードする前記１つ以上の異種ヌクレオチド配列が、ゲノムで組み込まれる、請求項５４に記載の宿主細胞。
【請求項５６】
前記外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、生合成経路の酵素をコードする、（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘを含む、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項５７】
（Ｄ）ｘが、生合成経路の酵素の変異体をコードする、複数の核酸分子を含むライブラリ（Ｌ）ｘのメンバーである、請求項５６に記載の宿主細胞。
【請求項５８】
前記宿主細胞が、イソペンテニルピロリン酸を作製するためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１つ以上の酵素をコードする１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項５９】
前記メバロン酸経路の前記１つ以上の酵素が、アセチル−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼから選択される、請求項５８に記載の宿主細胞。
【請求項６０】
前記宿主細胞が、ＭＥＶ経路の酵素のそれぞれをコードする複数の異種核酸を含む、請求項５８に記載の宿主細胞。
【請求項６１】
前記外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、テルペンシンターゼをコードする、（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘを含む、請求項５８に記載の宿主細胞。
【請求項６２】
前記テルペンシンターゼが、モノテルペンシンターゼ、ジテルペンシンターゼ、セスキテルペンシンターゼ、セスタテルペンシンターゼ、トリテルペンシンターゼ、テトラテルペンシンターゼ、およびポリテルペンシンターゼからなる群から選択される、請求項６１に記載の宿主細胞。
【請求項６３】
（Ｎ）ｘが、（Ｎ）ｘをコードする核酸配列を含む発現ベクターとして提供される、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項６４】
（Ｎ）ｘが、精製タンパク質として前記宿主細胞の中に形質転換される、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項６５】
（Ｎ）ｘが、精製ＲＮＡとして宿主細胞の中に形質転換される、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項６６】
（Ｎ）ｘが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）、トランスポザーゼ、および部位特異的レコンビナーゼからなる群から選択される、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項６７】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたＴｙｐｅＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である、請求項６６に記載の宿主細胞。
【請求項６８】
前記ＴｙｐｅＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼが、ＨＯエンドヌクレアーゼおよびＦｏｋ
Ｉエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項６７に記載の宿主細胞。
【請求項６９】
前記ジンクフィンガー結合ドメインが、３、５、または６つのジンクフィンガーを含む、請求項６７に記載の宿主細胞。
【請求項７０】
前記エンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項６６に記載の宿主細胞。
【請求項７１】
前記エンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、またはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群から選択される、請求項６６に記載の宿主細胞。
【請求項７２】
前記エンドヌクレアーゼが、内因性の宿主細胞ゲノム配列に特異的に結合するように修飾され、修飾された前記エンドヌクレアーゼが、もはや、その野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合しない、請求項６６に記載の宿主細胞。
【請求項７３】
修飾された前記エンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼから誘導される、請求項７２に記載の宿主細胞。
【請求項７４】
修飾された前記エンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、またはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼから誘導される、請求項７２に記載の宿主細胞。
【請求項７５】
前記宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、および動物細胞からなる群から選択される、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項７６】
前記宿主細胞が、酵母細胞である、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項７７】
前記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、請求項７６に記載の酵母細胞。
【請求項７８】
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞が、パン酵母、Ｍａｕｒｉ、Ｓａｎｔａ  Ｆｅ、ＩＺ−１９０４、ＴＡ、ＢＧ−１、ＣＲ−１、ＳＡ−１、Ｍ−２６、Ｙ−９０４、ＰＥ−２、ＰＥ−５、ＶＲ−１、ＢＲ−１、ＢＲ−２、ＭＥ−２、ＶＲ−２、ＭＡ−３、ＭＡ−４、ＣＡＴ−１、ＣＢ−１、ＮＲ−１、ＢＴ−１、またはＡＬ−１株のものである、請求項７７に記載の酵母細胞。
【請求項７９】
キットであって、前記キットは：
（ａ）複数の外因性の核酸であって、外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、
（ｉ）第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘであって、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、酵母細胞ゲノムの選択される標的部位（ＴＳ）ｘで（ＥＳ）ｘの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘならびに
（ｉｉ）（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘを含む、複数の外因性の核酸、
（ｂ）複数のヌクレアーゼであって、ヌクレアーゼ（Ｎ）ｘが、それぞれ、（ＴＳ）ｘで切断することができ、前記切断が、（ＴＳ）ｘでの（ＥＳ）ｘの相同組換えをもたらす、複数のヌクレアーゼを含み、
ｘが、１〜ｎの任意の整数であり、ｎが、少なくとも２である、キット。
【請求項８０】
複数のプライマー対（Ｐ）ｘをさらに含み、プライマー対が、それぞれ、ＰＣＲによって、（ＴＳ）ｘでの（ＥＳ）ｘの組み込みを同定することができる、請求項７９に記載のキット。
【請求項８１】
（ＨＲ１）ｘが、（ＴＳ）ｘの５’領域に対して相同であり、（ＨＲ２）ｘが、（ＴＳ）ｘの３’領域に対して相同である、請求項７９に記載のキット。
【請求項８２】
（Ｎ）ｘが、（ＴＳ）ｘの前記５’領域と前記３’領域との間に位置づけられる領域で切断することができる、請求項７９に記載のキット。
【請求項８３】
ｎ＝≧６０００であり、（ＴＳ）ｘが、それぞれ、前記酵母細胞ゲノムの特有の領域である、請求項７９に記載のキット。
【請求項８４】
（Ｎ）ｘが、（ＴＳ）ｘ内の内因性の酵母ゲノム配列を切断することができる、請求項７９に記載のキット。
【請求項８５】
（Ｎ）ｘが、（ＴＳ）ｘ内の外因性の配列を切断することができる、請求項７９に記載のキット。
【請求項８６】
（ＥＳ）ｘが、（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘをさらに含む、請求項７９に記載のキット。
【請求項８７】
（Ｄ）ｘが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群から選択される、請求項８６に記載のキット。
【請求項８８】
（ＥＳ）ｘが、線状である、請求項７９に記載のキット。
【請求項８９】
（ＥＳ）ｘが、環状である、請求項７９に記載のキット。
【請求項９０】
（Ｎ）ｘが、（Ｎ）ｘをコードする核酸配列を含む発現ベクターとして提供される、請求項７９に記載のキット。
【請求項９１】
（Ｎ）ｘが、精製タンパク質として提供される、請求項７９に記載のキット。
【請求項９２】
（Ｎ）ｘが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）、トランスポザーゼ、および部位特異的レコンビナーゼからなる群から選択される、請求項７９に記載のキット。
【請求項９３】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたＴｙｐｅＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である、請求項９２に記載のキット。
【請求項９４】
前記ＴｙｐｅＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼが、ＨＯエンドヌクレアーゼおよびＦｏｋ  Ｉエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項９３に記載のキット。
【請求項９５】
前記ジンクフィンガー結合ドメインが、３、５、または６つのジンクフィンガーを含む、請求項９３に記載のキット。
【請求項９６】
前記エンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項９２に記載のキット。
【請求項９７】
前記エンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、またはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群から選択される、請求項９２に記載のキット。
【請求項９８】
前記エンドヌクレアーゼが、内因性の酵母ゲノム配列に特異的に結合するように修飾され、修飾された前記エンドヌクレアーゼが、もはや、その野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合しない、請求項９２に記載のキット。
【請求項９９】
修飾された前記エンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼから誘導される、請求項９８に記載のキット。
【請求項１００】
修飾された前記エンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、またはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼから誘導される、請求項９９に記載のキット。
【請求項１０１】
酵母細胞ゲノムの標的部位の中への外因性の核酸のマーカーレス組み込みのための方法であって、前記方法は：
（ａ）酵母細胞を、
（ｉ）第１の相同性領域（ＨＲ１）１および第２の相同性領域（ＨＲ２）１を含む外因性の核酸（ＥＳ）１であって、（ＨＲ１）１および（ＨＲ２）１が、標的部位（ＴＳ）１で宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、外因性の核酸（ＥＳ）１ならびに
（ｉｉ）（ＴＳ）１で切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）１であって、前記切断が、（ＴＳ）１での（ＥＳ）１の相同組換えをもたらす、（ＴＳ）１で切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）１と接触させるステップ
ならびに
（ｂ）（ＴＳ）１で組み込まれた（ＥＳ１）を有する酵母細胞を回収するステップであって、前記回収するステップが、選択マーカーの組み込みを必要としない、ステップ、を含む、方法。
【請求項１０２】
酵母細胞であって、
（ａ）第１の相同性領域（ＨＲ１）１および第２の相同性領域（ＨＲ２）１を含む外因性の核酸（ＥＳ）１であって、（ＨＲ１）１および（ＨＲ２）１が、前記酵母細胞のゲノムの標的部位（ＴＳ）１で宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、外因性の核酸（ＥＳ）１ならびに
（ｂ）（ＴＳ）１で切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）１であって、前記切断が、（ＴＳ）１での（ＥＳ）１の相同組換えをもたらす、（ＴＳ）１で切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）１を含み、
（ＥＳ）１が、選択マーカーを含まない、酵母細胞。
【請求項１０３】
宿主細胞ゲノムの中に複数の外因性の核酸を組み込むための方法であって、
（ａ）宿主細胞を、
（ｉ）複数のライブラリであって、ライブラリ（Ｌ）ｘが、それぞれ、複数の外因性の核酸を含み、選択された外因性の核酸が、５’から３’方向に、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘ、群（Ｄ）ｘから選択される目的の任意の核酸、および第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘを含み、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、前記宿主細胞ゲノムの標的部位（ＴＳ）ｘで前記選択された外因性の核酸の宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数のライブラリならびに
（ｉｉ）それぞれの前記標的部位（ＴＳ）ｘについて、（ＴＳ）ｘで切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘであって、前記切断が、（ＴＳ）ｘでの前記選択された外因性の核酸の相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼと接触させるステップ
ならびに
（ｂ）宿主細胞を回収するステップであって、それぞれのライブラリ（Ｌ）ｘ由来の外因性の核酸が、それぞれの選択された標的配列（ＴＳ）ｘで組み込まれているステップを含み、
ｘが、１〜ｎの任意の整数であり、ｎが、少なくとも２である、方法。
【請求項１０４】
宿主細胞であって、前記宿主細胞は：
（ａ）複数のライブラリであって、ライブラリ（Ｌ）ｘが、それぞれ、複数の外因性の核酸を含み、選択された外因性の核酸が、５’から３’方向に、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘ、群（Ｄ）ｘから選択される目的の任意の核酸、および第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘを含み、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、前記宿主細胞のゲノムの標的部位（ＴＳ）ｘで前記選択された外因性の核酸の宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数のライブラリ；ならびに
（ｂ）それぞれの前記標的部位（ＴＳ）ｘについて、（ＴＳ）ｘで切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘであって、前記切断が、（ＴＳ）ｘでの前記選択された外因性の核酸の相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼ（Ｎ）ｘを含み、
ｘが、１〜ｎの任意の整数であり、ｎが、少なくとも２である、宿主細胞。
【請求項１０５】
組成物であって、前記組成物は：
（ａ）酵母細胞、
（ｂ）複数の外因性の核酸であって、外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、
（ｉ）第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘであって、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、酵母細胞ゲノムの選択される標的部位（ＴＳ）ｘで（ＥＳ）ｘの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘならびに
（ｉｉ）（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘを含む、複数の外因性の核酸、
（ｃ）複数のヌクレアーゼであって、ヌクレアーゼ（Ｎ）ｘが、それぞれ、（ＴＳ）ｘで切断することができ、前記切断が、（ＴＳ）ｘでの（ＥＳ）ｘの相同組換えをもたらす複数のヌクレアーゼを含み、
ｘが、１〜ｎの任意の整数であり、ｎが、少なくとも２である、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願の相互参照
この出願は、２０１１年４月２７日に出願された米国仮出願第６１／４７９，８２１号；２０１１年６月２４日に出願された米国仮出願第６１／５００，７４１号；および２０１１年９月２６日に出願された米国仮出願第６１／５３９，３８９号（これらの内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
２．技術分野
本明細書において提供される方法および組成物は、一般に、分子生物学および遺伝子工学の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
３．背景技術
宿主細胞ゲノムの中に外因性の核酸を導入し、かつ組み込むための遺伝子工学技術は、様々な分野において必要とされる。たとえば、合成生物学の分野において、遺伝子修飾株の生成は、宿主細胞の染色体の中への、注文生産のＤＮＡ配列の挿入を必要とし、一般に、工業規模の産生は、宿主生物の中への数十の遺伝子の導入を必要とする。工業用株についての設計の最適化は、経験的に到達し、多くのＤＮＡアセンブリの構築ならびに単独でおよび／または他の生合成経路構成成分と共にインビボにおいて試験することを必要とする。
【０００４】
遺伝子工学は、遺伝子ターゲティングに非常に依存しており、これは、ドナー鋳型ＤＮＡの染色体外断片を利用し、細胞の相同組換え（ＨＲ）機構を引き起こし、外因性のドナー配列と染色体配列を交換する。たとえば非特許文献１を参照されたい。遺伝子ターゲティングは、その効率が制限されており、また、植物および哺乳動物細胞において、過剰量の鋳型配列が提供された１０６細胞のうちのわずか約１つが、所望の遺伝子修飾を受ける。酵母は、相同組換えについての能力の増加を実証する。しかしながら、酵母ゲノムの中への外因性のＤＮＡの取り込みの成功は、なお比較的まれな事象であり（１０５に約１つ）、通常、単一のゲノム修飾のみを含む組換え細胞をスクリーニングするために選択マーカーの使用を必要とする。さらに、酵母において使用するに入手可能である選択マーカーの貯蔵所がわずかに限られているので、選択マーカー（複数可）は、同じマーカーを使用してさらなるゲノム修飾を可能にするために、いくつかの場合においては、製造環境または自然環境に宿主細胞を放出する前に、組換え株から取り出されなければならない。したがって、任意の単一の遺伝子座で組み込みを達成することができる効率とは別個に、ゲノム工学の１度に１つずつという一連の性質は、複数の遺伝子座で変化をなすのに、修飾しなければならない遺伝子座と同数の操作サイクルが必要とされることを必要とする。
【０００５】
遺伝子ターゲティングの効率は、組み込みの意図される部位の近くに導入された標的ゲノム二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｂｒｅａｋ）（ＤＳＢ）と組み合わせられた場合、改善することができる。たとえば非特許文献２および非特許文献３を参照されたい。いわゆる「デザイナーヌクレアーゼ（ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）」は、インビボにおいてＤＮＡの特異的な「標的」配列に結合するように適合させ、二本鎖切断をそれに導入することができる酵素である。そのような標的二本鎖切断は、たとえば、デザイナーヌクレアーゼをコードする遺伝子を含有するプラスミドにより宿主細胞を形質転換することによって達成することができる。宿主細胞は、相同性依存性ＤＮＡ修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ）または非相同的末端結合（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ）のいずれかによってこれらの二本鎖切断を修復する。修復の過程において、いずれのメカニズムも、標的部位に外因性のドナーＤＮＡを組み込むために利用され得る。ドナーＤＮＡが導入されるのと同時にヌクレアーゼが細胞の中に導入される場合、細胞は、標的遺伝子座にドナーＤＮＡを組み込むことができる。
【０００６】
デザイナーヌクレアーゼの到来は、作物における特定の標的遺伝子座の中への導入遺伝子の導入を可能にし（Ｗｒｉｇｈｔら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ４：６９３−７０５（２００５））、治療用抗体を発現する哺乳動物細胞培養系を改善し（Ｍａｌｐｈｅｔｔｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １０６（５）：７７４−７８３（２０１０））、さらに、ヒトゲノムを編集して、ＨＩＶに対する抵抗性を誘起した（Ｕｒｎｏｖら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １１（９）：６３６−６４６（２０１０））。顕著な効果があるが、ＤＳＢ媒介性のＨＲは、たとえば、工業用微生物における機能的な代謝経路の構築に向けて、複数のＤＮＡアセンブリを組み込むのに必要とされる複数回の操作を減らすためにはまだ活用されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：１２８８〜１２９２
【非特許文献２】Ｊａｓｉｎ，  Ｍ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ（１９９６）１２（６）：２２４〜２２８
【非特許文献３】Ｕｒｎｏｖら、Ｎａｔｕｒｅ（２００５）４３５（７０４２）：６４６〜６５１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、宿主細胞ゲノムの特異的な領域の中への、複数の外因性の核酸の同時の組み込みを可能にする方法および組成物についての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
４．発明の概要
宿主細胞の特定のゲノム遺伝子座の中に１つ以上の外因性の核酸を組み込むための方法および組成物が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、複数の外因性の核酸が、１回の形質転換反応により同時に組み込まれる。いくつかの実施形態において、方法が、ゲノムにおける特定の位置でのドナーＤＮＡの組み込みを促進するための、細胞の中への１つ以上のヌクレアーゼおよび１つ以上のドナーＤＮＡアセンブリの導入を含む。方法および組成物は、宿主細胞の本来の相同組換え機構を利用し、この組換えは、組み込みの意図される部位での宿主細胞のゲノムにおける標的二本鎖切断を誘発することによってさらに増強される。
【００１０】
したがって、一態様において、宿主細胞ゲノムの中に複数の外因性の核酸を組み込むための方法であって、
（ａ）宿主細胞を、
（ｉ）複数の外因性の核酸であって、外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘを含み、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、前記宿主細胞ゲノムの標的部位（ＴＳ）ｘで（ＥＳ）ｘの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数の外因性の核酸；ならびに
（ｉｉ）それぞれの前記標的部位（ＴＳ）ｘについて、（ＴＳ）ｘで切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘであって、前記切断が、（ＴＳ）ｘでの（ＥＳ）ｘの相同組換えをもたらすヌクレアーゼ（Ｎ）ｘと接触させるステップ
ならびに
（ｂ）宿主細胞を回収するステップであって、選択された外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、それぞれの選択された標的配列（ＴＳ）ｘで組み込まれるステップを含み、
ｘが、１〜ｎの任意の整数であり、ｎが、少なくとも２である、方法が本明細書において提供される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、（ＨＲ１）ｘが、（ＴＳ）ｘの５’領域に対して相同であり、（ＨＲ２）ｘが、（ＴＳ）ｘの３’領域に対して相同である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘが、（ＴＳ）ｘの前記５’領域と前記３’領域との間に位置づけられる領域で切断することができる。
【００１３】
いくつかの実施形態において、単一のヌクレアーゼが、それぞれの（ＴＳ）ｘを切断することができる。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、または１０である。いくつかの実施形態において、ｎ＞１０である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、前記回収するステップが、選択マーカーの組み込みを必要としない。いくつかの実施形態において、前記標的部位で切断することができるヌクレアーゼと宿主細胞を接触させないことと比較して、前記回収するステップが、より高い頻度で起こる。いくつかの実施形態において、前記回収するステップが、スクリーニングされた１０、９、８、７、６、５、４、３、または２つの接触宿主細胞またはそのクローン集団毎に約１の頻度で起こる。いくつかの実施形態において、前記回収するステップが、ＰＣＲ、サザンブロット、制限マッピング、およびＤＮＡ配列決定からなる群から選択される少なくとも１つの方法によって前記組み込みを同定することを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘが、内因性の宿主ゲノム配列、たとえば（ＴＳ）ｘ内の本来の遺伝子座を切断することができる。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘが、外因性の配列、たとえば（ＴＳ）ｘ内の導入された遺伝子座を切断することができる。
【００１７】
いくつかの実施形態において、（ＥＳ）ｘが、（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘをさらに含む。いくつかの実施形態において、（Ｄ）ｘが、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群から選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、（ＥＳ）ｘが、線状である。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘが、（Ｎ）ｘをコードする核酸配列を含む発現ベクターとして提供される。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘが、精製タンパク質として宿主細胞の中に形質転換される。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘが、精製ＲＮＡとして宿主細胞の中に形質転換される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、宿主細胞が、生合成経路の１つ以上の酵素をコードする１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、生合成経路の１つ以上の酵素をコードする１つ以上の異種ヌクレオチド配列が、ゲノムで組み込まれる。いくつかの実施形態において、外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、生合成経路の酵素をコードする、（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘを含む。いくつかの実施形態において、（Ｄ）ｘが、生合成経路の酵素の変異体をコードする、複数の核酸分子を含むライブラリ（Ｌ）ｘのメンバーである。
【００２０】
いくつかの実施形態において、宿主細胞が、イソペンテニルピロリン酸を作製するためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１つ以上の酵素をコードする１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、メバロン酸（ｍｅｖａｌｏａｎｔｅ）経路の１つ以上の酵素が、アセチル−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼから選択される。いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＭＥＶ経路の酵素をすべてコードする複数の異種核酸を含む。言いかえれば、複数の異種核酸は、総合的に考えると、上記に列挙される、ＭＥＶ経路のそれぞれのクラスの酵素の少なくとも１つの酵素をコードする。いくつかの実施形態において、外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、テルペンシンターゼをコードする、（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘを含む。いくつかの実施形態において、テルペンシンターゼが、モノテルペンシンターゼ、ジテルペンシンターゼ、セスキテルペンシンターゼ、セスタテルペンシンターゼ、トリテルペンシンターゼ、テトラテルペンシンターゼ、およびポリテルペンシンターゼからなる群から選択される。
【００２１】
いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘが、エンドヌクレアーゼ、たとえばメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）、トランスポザーゼ、および部位特異的レコンビナーゼからなる群から選択され、ｘが、１または１〜ｎの任意の整数である。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたＴｙｐｅＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、ＴｙｐｅＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼが、ＨＯエンドヌクレアーゼおよびＦｏｋ  Ｉエンドヌクレアーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガー結合ドメインが、３、５、または６つのジンクフィンガーを含む。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−Ｔ��ｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、またはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群から選択される。特定の実施形態において、エンドヌクレアーゼが、Ｆｃｐｈ−Ｉである。
【００２２】
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼが、内因性の宿主細胞ゲノム配列に特異的に結合するように修飾され、修飾エンドヌクレアーゼが、もはや、その野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合しない。いくつかの実施形態において、修飾エンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼから誘導される。いくつかの実施形態において、修飾エンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、またはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼから誘導される。
【００２３】
いくつかの実施形態において、宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、動物細胞、またはヒト細胞である。特定の実施形態において、宿主細胞が、酵母細胞である。いくつかの実施形態において、酵母細胞が、一倍体酵母細胞である。いくつかの実施形態において、酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞が、パン酵母、Ｍａｕｒｉ、Ｓａｎｔａ  Ｆｅ、ＩＺ−１９０４、ＴＡ、ＢＧ−１、ＣＲ−１、ＳＡ−１、Ｍ−２６、Ｙ−９０４、ＰＥ−２、ＰＥ−５、ＶＲ−１、ＢＲ−１、ＢＲ−２、ＭＥ−２、ＶＲ−２、ＭＡ−３、ＭＡ−４、ＣＡＴ−１、ＣＢ−１、ＮＲ−１、ＢＴ−１、またはＡＬ−１株のものである。
【００２４】
他の態様において、酵母細胞ゲノムの標的部位の中への外因性の核酸のマーカーレス組み込みのための方法であって、
（ａ）宿主酵母細胞を、
（ｉ）第１の相同性領域（ＨＲ１）および第２の相同性領域（ＨＲ２）を含む外因性の核酸（ＥＳ）であって、（ＨＲ１）および（ＨＲ２）が、前記標的部位（ＴＳ）で宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、外因性の核酸（ＥＳ）ならびに
（ｉｉ）（ＴＳ）で切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）であって、前記切断が、（ＴＳ）での（ＥＳ）の相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼ（Ｎ）
と接触させるステップ
ならびに
（ｂ）（ＴＳ）で組み込まれた（ＥＳ）を有する宿主細胞を回収するステップであって、前記回収するステップが、選択マーカーの組み込みを必要としない、ステップ、を含む方法が本明細書において提供される。
【００２５】
他の態様において、本明細書において記載される１つ以上の外因性の核酸をゲノムで組み込むための方法のいずれかによって生成される修飾宿主細胞が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、修飾宿主細胞が、
（ａ）複数の外因性の核酸であって、外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘを含み、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、前記宿主細胞ゲノムの標的部位（ＴＳ）ｘで（ＥＳ）ｘの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数の外因性の核酸；ならびに
（ｂ）それぞれの前記標的部位（ＴＳ）ｘについて、（ＴＳ）ｘで切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘであって、前記切断が、（ＴＳ）ｘでの（ＥＳ）ｘの相同組換えをもたらすヌクレアーゼ（Ｎ）ｘを含み、
ｘが、１〜ｎの任意の整数であり、ｎが、少なくとも２である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、修飾宿主細胞が、酵母細胞であり、
（ａ）第１の相同性領域（ＨＲ１）および第２の相同性領域（ＨＲ２）を含む外因性の核酸（ＥＳ）であって、（ＨＲ１）および（ＨＲ２）が、宿主細胞ゲノムの標的部位（ＴＳ）で宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、外因性の核酸（ＥＳ）ならびに
（ｂ）（ＴＳ）で切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）であって、前記切断が、（ＴＳ）での（ＥＳ）の相同組換えをもたらすヌクレアーゼ（Ｎ）を含み、
（ＥＳ）が、選択マーカーを含まない。
【００２７】
他の態様において、
（ａ）酵母細胞、
（ｂ）複数の外因性の核酸であって、外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、
（ｉ）第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘであって、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、酵母細胞ゲノムの選択される標的部位（ＴＳ）ｘで（ＥＳ）ｘの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘならびに
（ｉｉ）（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘを含む、複数の外因性の核酸、
（ｃ）複数のヌクレアーゼであって、ヌクレアーゼ（Ｎ）ｘが、それぞれ、（ＴＳ）ｘで切断することができ、前記切断が、（ＴＳ）ｘでの（ＥＳ）ｘの相同組換えをもたらす複数のヌクレアーゼを含み、
ｘが、１〜ｎの任意の整数であり、ｎが、少なくとも２である、組成物が、本明細書において提供される。
【００２８】
他の態様において、本明細書において記載される１つ以上の外因性の核酸をゲノムで組み込むための方法を実行するのに有用なキットが、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、キットが、
（ａ）複数の外因性の核酸であって、外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、
（ｉ）第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘであって、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、酵母細胞ゲノムの選択される標的部位（ＴＳ）ｘで（ＥＳ）ｘの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘならびに
（ｉｉ）（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘを含む、複数の外因性の核酸、
（ｂ）複数のヌクレアーゼであって、ヌクレアーゼ（Ｎ）ｘが、それぞれ、（ＴＳ）ｘで切断することができ、前記切断が、（ＴＳ）ｘでの（ＥＳ）ｘの相同組換えをもたらす複数のヌクレアーゼを含み、
ｘが、１〜ｎの任意の整数であり、ｎが、少なくとも２である。
【００２９】
いくつかの実施形態において、（Ｄ）ｘが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、キットが、複数のプライマー対（Ｐ）ｘをさらに含み、プライマー対が、それぞれ、ＰＣＲによって、（ＴＳ）ｘでの（ＥＳ）ｘの組み込みを同定することができる。いくつかの実施形態において、（ＥＳ）ｘが、線状である。いくつかの実施形態において、（ＥＳ）ｘが、環状である。
【００３０】
特定の実施形態において、キットが、酵母ゲノムのおよそ６０００の遺伝子の遺伝子座のいずれかの内の特有の標的部位での外因性の核酸の部位特異的組み込みを可能にする。これらの実施形態において、ｎ≧６０００であり、（ＴＳ）ｘが、それぞれ、酵母細胞ゲノムの特異的な遺伝子座に対して特有である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、部位特異的ヌクレアーゼを使用する、外因性の核酸のマーカーレスゲノム組み込みの例示的な実施形態を提供する。
【図２】図２は、複数の部位特異的ヌクレアーゼを使用する、複数の外因性の核酸の同時のゲノム組み込みの例示的な実施形態を提供する。ＨＲ１−上流相同性領域；ＨＲ２−下流相同性領域；ＴＳ−標的部位；Ｎ−部位特異的ヌクレアーゼ；Ｄ−目的の核酸。
【図３】図３は、イソプレノイド産生についてのＭＥＶ経路の略図を提供する。
【図４】図４は、本明細書において提供されるコンビナトリアル組み込みライブラリを生成するための方法の例示的な実施形態を提供する。陰影線マークは、それぞれのライブラリ（Ｌ）ｘの個々の外因性の核酸メンバーを示す。
【図５】図５は、空ベクターＤＮＡおよび機能的なＥｍＧＦＰをコードする線状「ドナー」ＤＮＡにより形質転換された酵母細胞の９６コロニーのコロニーＰＣＲの結果を提供する。酵母細胞は、ＨＯ、ＹＧＲ２５０ｃ、およびＮＤＴ８０遺伝子座のそれぞれでゲノムで組み込まれた切断型非機能的ＥｍＧＦＰをコードする「標的」核酸のコピーを含んだ。機能的ＥｍＧＦＰをコードする核酸に対して特異的なプライマーにより、ＨＯ、ＹＧＲ２５０ｃ、およびＮＤＴ８０遺伝子座をプローブするために、別々のＰＣＲ反応を実行した。ＰＣＲ産物は、観察されず、機能的ＥｍＧＦＰをコードするドナー核酸との、非機能的ＥｍＧＦＰをコードする標的核酸の交換が起こらなかったことを示した。
【図６】図６は、ｐＺＦＮ．ｇｆｐ  ＤＮＡおよび機能的ＥｍＧＦＰをコードする線状「ドナー」ＤＮＡにより形質転換された酵母細胞の９６コロニーのコロニーＰＣＲの結果を提供する。酵母細胞は、ＨＯ、ＹＧＲ２５０ｃ、およびＮＤＴ８０遺伝子座のそれぞれでゲノムで組み込まれた切断型非機能的ＥｍＧＦＰをコードする「標的」核酸のコピーを含んだ。ｐＺＦＮ．ｇｆｐは、非機能的ＥｍＧＦＰコード配列に特異的な核酸配列を認識し、かつ切断するジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする。機能的ＥｍＧＦＰをコードする核酸に対して特異的なプライマーにより、ＨＯ、ＹＧＲ２５０ｃ、およびＮＤＴ８０遺伝子座をプローブするために、別々のＰＣＲ反応を実行した。多数のＰＣＲ産物が、観察され、機能的ＥｍＧＦＰを発現するＤＮＡとの、非機能的ＥｍＧＦＰ組み込みの交換が成功したことを示す。２３コロニーは、交換された３つすべての遺伝子座を有する。
【図７】図７は、メバロン酸経路の酵素およびファルネセンシンターゼ（ＦＳ）をコードするプラスミドを含む親ファルネセン産生酵母株である株Ｂ；アモルファジエンシンターゼ（ＡＤＳ）の４つのコピーがゲノムで組み込まれた株Ｂの誘導株である株Ｄ；ならびにＦＳをコードするプラスミドが失われた株Ｄの誘導株である株Ｅのセスキテルペン（ｓｅｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅ）力価を提供する。親株Ｂのセスキテルペン能力のほぼ１００％が、ＡＤＳの複数のコピーしか追加されていない株ＤおよびＥにおいて維持される。
【図８】図８は、ＳＦＣ１（ＧＦＰドナーＤＮＡ）およびＹＪＲ０３０ｃ（ＡＤＥ２ドナーＤＮＡ）遺伝子座についての線状ドナーＤＮＡ、ＹＪＲ０３０ｃエンドヌクレアーゼプラスミド（ｐＣＵＴ００６）、ならびにＳＦＣ１エンドヌクレアーゼプラスミド（ｐＣＵＴ０５８）により同時形質転換された細胞についての結果を提供する。ＵＲＡ  ｄｒｏｐｏｕｔ＋Ｋａｎ寒天プレート上で選択されたコロニーの８０％が、ＧＦＰポジティブであった。これらのコロニーのうち、９１％が、ＡＤＥ２組み込みについてポジティブであった。全体で、コロニーの７２．８％が、両方の遺伝子座でのマーカーレスドナーＤＮＡの組み込みに成功した。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
６．実施形態の詳細な説明
６．１  定義
本明細書において使用されるように、ヌクレアーゼ、たとえばホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼに関しての用語「切断する」、「切断」、および／または「切断すること」は、特定の核酸において二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出す作用を指す。ＤＳＢは、当業者らによって理解されるように、平滑末端または付着末端（すなわち５’または３’オーバーハング）を残すことができる。
【００３３】
本明細書において使用されるように、用語「遺伝子操作された宿主細胞」は、遺伝子工学技術（すなわち組換え技術）を使用して親細胞を遺伝子修飾することによって生成される宿主細胞を指す。遺伝子操作された宿主細胞は、親細胞のゲノムに対するヌクレオチド配列の追加、欠失、および／または修飾を含んでいてもよい。
【００３４】
本明細書において使用されるように、用語「異種」は、自然界において通常見つけられないものを指す。用語「異種ヌクレオチド配列」は、自然界において所定の細胞において通常見つけられないヌクレオチド配列を指す。そのため、異種ヌクレオチド配列は、（ａ）その宿主細胞に対して外来の（すなわち細胞にとって「外因性である」）ものであってもよい；（ｂ）宿主細胞において自然に見つけられる（すなわち「内因性である」）が、細胞において不自然な量で存在してもよい（すなわち宿主細胞において自然に見つけられるよりも多いもしくは少ない量）；または（ｃ）宿主細胞において自然に見つけられるが、その自然の遺伝子座の外側に位置づけられてもよい。
【００３５】
本明細書において使用されるように、用語「相同性」は、２つ以上の核酸配列または２つ以上のアミノ酸配列の間の同一性を指す。配列同一性は、パーセンテージ同一性（または類似性もしくは相同性）の面から測定することができ、また、パーセンテージが高いほど、配列は互いにより近いまたは同一である。標準的な方法を使用してアライメントした場合、核酸またはアミノ酸配列の相同体またはオルソログは、相対的に高度の配列同一性を有する。比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野においてよく知られている。様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムが、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２、１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３、１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４、１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ，  ７３：２３７−４４、１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３、１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：１０８８１−９０、１９８８；Ｈｕａｎｇら  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｓ．  Ｂｉｏｓｃ．  ８、１５５−６５、１９９２；およびＰｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．  ２４：３０７−３１、１９９４において記載される。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０、１９９０は、配列アライメント方法および相同性計算についての詳細な考察を提供する。ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０、１９９０）は、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘに関連する使用のために、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ３８  Ａ、Ｒｏｏｍ  ８Ｎ８０５、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．  ２０８９４）を含むいくつかの供給源から、またインターネットで入手可能である。さらなる情報は、ＮＣＢＩウェブサイトで見つけることができる。
【００３６】
本明細書において使用されるように、用語「マーカーレス」は、選択マーカーの組み込みを伴わない、宿主細胞ゲノム内の標的部位の中へのドナーＤＮＡの組み込みを指す。いくつかの実施形態において、用語はまた、宿主細胞ゲノムの中への選択マーカーの組み込みに依存する選択手法の利用を伴わない、そのような宿主細胞の回収をも指す。たとえば、ある実施形態において、エピソームまたは染色体外の選択マーカーが、ゲノム標的部位を切断することができるヌクレアーゼをコードするプラスミドを含む細胞を選択するために利用されてもよい。選択マーカーが宿主細胞ゲノムの中に組み込まれない限り、そのような使用は、「マーカーレス」と見なされるであろう。
【００３７】
本明細書において使用されるように、用語「ポリヌクレオチド」は、当業者によって理解されるように、ヌクレオチド単位から構成されるポリマーを指す。好ましいヌクレオチド単位は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）を含むが、これらに限定されない。有用な修飾ヌクレオチド単位は、４−アセチルシチジン、（５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン）、２−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノ−メチルウリジン、ジヒドロウリジン、２−Ｏ−メチルプソイドウリジン、２−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンチルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルプソイドウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、５−メトキシウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデノシン、ウリジン−５−オキシ酢酸−メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、ワイブトシン、プソイドウリジン、キューオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、２−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２−Ｏ−メチルウリジン、およびその他同種のものを含むものを含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）およびリボ核酸（「ＲＮＡ」）などのような天然に存在する核酸；ならびに核酸アナログを含む。核酸アナログは、天然に存在しない塩基、天然に存在するホスホジエステル結合以外の他のヌクレオチドとの連結で結合するヌクレオチドまたはホスホジエステル結合以外の連結を通して付加された塩基を含むヌクレオチドを含むものを含む。したがって、ヌクレオチドアナログは、たとえば、また、限定を伴うことなく、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｒｉｅｓｔｅｒ）、ホスホロアミデート、ボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、メチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびその他同種のものを含む。
【００３８】
従来の表示法は、ポリヌクレオチド配列を記載するために本明細書において使用され、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は、５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は、５’方向と呼ばれる。
【００３９】
本明細書において使用されるように、用語「同時の」は、複数の組み込みに関して使用される場合、宿主細胞が、ヌクレアーゼ、たとえばヌクレアーゼをコードするプラスミドおよび宿主細胞ゲノムの中に組み込まれることとなる１つを超えるドナーＤＮＡにより同時形質転換される時点から始まる時間ならびに形質転換された宿主細胞またはそのクローン集団が、それぞれの標的遺伝子座でのドナーＤＮＡの組み込みの成功についてスクリーニングされる時点で終わる時間を包含する。いくつかの実施形態において、「同時の」によって包含される時間が、少なくとも、ヌクレアーゼが宿主細胞の染色体（複数可）内のその標的配列に結合し、かつ切断するのに必要とされる、時間の長さである。いくつかの実施形態において、「同時の」によって包含される時間が、少なくとも、６、１２、２４、３６、４８、６０、７２、９６、または９６時間を超える時間であり、宿主細胞が、ヌクレアーゼ、たとえばヌクレアーゼをコードするプラスミドおよび１つを超えるドナーＤＮＡにより同時形質転換される時点から始まる。
【００４０】
６．２  外因性の核酸を組み込むための方法
宿主細胞ゲノムの１つ以上の選択される標的部位の中に１つ以上の外因性の核酸を組み込むための方法が、本明細書において提供される。ある実施形態において、方法が、ゲノム標的部位の中に組み込まれることとなる外因性の核酸を含む、１つ以上の組み込みポリヌクレオチド、すなわちドナーＤＮＡおよびゲノム標的部位の近くでまたは標的部位内で二本鎖切断を引き起こすことができる１つ以上のヌクレアーゼと宿主細胞を接触させるステップを含む。ゲノム標的部位の近くでのまたは標的部位内での切断は、切断部位でのまたは切断部位の近くでの相同組換えの頻度を大幅に増加させる。
【００４１】
特定の態様において、宿主細胞ゲノムの標的部位の中への外因性の核酸のマーカーレス組み込みのための方法であって、
（ａ）宿主細胞を、
（ｉ）第１の相同性領域（ＨＲ１）および第２の相同性領域（ＨＲ２）を含む外因性の核酸（ＥＳ）であって、（ＨＲ１）および（ＨＲ２）が、前記標的部位（ＴＳ）で宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、外因性の核酸（ＥＳ）ならびに
（ｉｉ）（ＴＳ）で切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）であって、前記切断が、（ＴＳ）での（ＥＳ）の相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼ（Ｎ）と接触させるステップならびに
（ｂ）（ＴＳ）で組み込まれた（ＥＳ）を有する宿主細胞を回収するステップであって、前記回収するステップが、選択マーカーの組み込みを必要としない、ステップ、を含む方法が本明細書において提供される。
【００４２】
図１は、部位特異的ヌクレアーゼを使用する、外因性の核酸のマーカーレスゲノム組み込みの例示的な実施形態を提供する。ドナーポリヌクレオチドは、宿主細胞に導入され、ポリヌクレオチドが、第１の相同性領域（ＨＲ１）および第２の相同性領域（ＨＲ２）が側面に位置する目的の核酸（Ｄ）を含む。ＨＲ１およびＨＲ２は、ゲノム標的部位（ＴＳ）の、それぞれ５’および３’領域と相同性を共有する。部位特異的ヌクレアーゼ（Ｎ）もまた、宿主細胞に導入され、ヌクレアーゼが、標的部位内の特有の配列を認識し、かつ切断することができる。部位特異的ヌクレアーゼによる標的部位内での二本鎖切断の誘発に際して、内因性の相同組換え機構は、二本鎖切断を含まない標的部位と比較して、より高い頻度で、切断された標的部位で目的の核酸を組み込む。こういった組み込みの頻度の増加は、組換え事象を受けた形質転換体を選択するために選択マーカーを同時組み込む必要性を不要にする。選択マーカーの必要性を排除することによって、たとえば、遺伝子操作された微生物の構築の間に、完全で機能的な生合成経路を含む株を構築するために必要とされる時間は、大幅に減る。さらに、遺伝子操作戦略は、所定の宿主生物について入手可能なマーカーの貯蔵所が限られていることにより、選択マーカーを再利用する必要性によってもはや制限されない。
【００４３】
いくつかの実施形態において、組み込みに成功した外因性の核酸を含む形質転換細胞のマーカーレス回収が、スクリーニングされた１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、または１００の接触宿主細胞またはそのクローン集団毎に約１の頻度の範囲内で起こる。特定の実施形態において、組み込みに成功した外因性の核酸を含む形質転換細胞のマーカーレス回収が、スクリーニングされた９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０の接触宿主細胞またはそのクローン集団毎に約１の頻度の範囲内で起こる。特定の実施形態において、組み込みに成功した外因性の核酸を含む形質転換細胞のマーカーレス回収が、スクリーニングされた９、８、７、６、５、４、３、または２つの接触宿主細胞またはそのクローン集団毎に約１の頻度の範囲内で起こる。特定の実施形態において、宿主細胞が、酵母細胞であり、組み込みの頻度の増加が、他の宿主細胞型と比べた、相同組換えについての酵母の能力の増加に由来する。
【００４４】
様々な方法は、選択マーカーの使用を伴うことなく標的部位にまたは標的部位の近くに改変されたゲノムを有するそれらの細胞を同定するのに利用可能である。いくつかの実施形態において、そのような方法が、標的部位における任意の変化を検出しようと試み、ＰＣＲ法、配列決定法、ヌクレアーゼ消化、たとえば制限マッピング、サザンブロット、およびその任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００４５】
他の態様において、宿主細胞ゲノムの中に複数の外因性の核酸を組み込むための方法であって、
（ａ）宿主細胞を、
（ｉ）複数の外因性の核酸であって、外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘを含み、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、前記宿主細胞ゲノムの標的部位（ＴＳ）ｘで（ＥＳ）ｘの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数の外因性の核酸；ならびに
（ｉｉ）それぞれの前記標的部位（ＴＳ）ｘについて、（ＴＳ）ｘで切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘであって、前記切断が、（ＴＳ）ｘでの（ＥＳ）ｘの相同組換えをもたらす複数のヌクレアーゼと接触させるステップ
ならびに
（ｂ）宿主細胞を回収するステップであって、選択された外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、それぞれの選択された標的配列（ＴＳ）ｘで組み込まれる、ステップを含み、
ｘが、１〜ｎの任意の整数であり、ｎが、少なくとも２である、方法が、本明細書において提供される。
【００４６】
図２は、複数の部位特異的ヌクレアーゼを使用する、複数の外因性の核酸の同時のゲノム組み込みの例示的な実施形態を提供する。本実施例において、３つのポリヌクレオチドが、宿主細胞に導入され、ポリヌクレオチドが、それぞれ、目的の核酸（Ｄ）ｘを含む外因性の核酸（ＥＳ）ｘを含み、ｘ＝１、２、または３である。（Ｄ）ｘは、それぞれ、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘが側面に位置する。（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘは、ゲノムにおける合計３つの特有の標的部位の、選択される標的部位（ＴＳ）ｘの、それぞれ５’および３’領域と相同性を共有する。複数の部位特異的ヌクレアーゼ（Ｎ）ｘもまた、宿主細胞に導入され、（Ｎ）ｘが、それぞれ、その対応する標的部位（ＴＳ）ｘ内の特有の配列を認識し、かつ切断することができる。その対応する部位特異的ヌクレアーゼ（Ｎ）ｘによる標的部位（ＴＳ）ｘの切断に際して、内因性の相同組換え機構は、（ＴＳ）ｘでの、対応する目的の核酸（Ｄ）ｘの組み込みを促進する。
【００４７】
特定の実施形態において、目的の核酸（Ｄ）ｘを任意選択で含む外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、そのそれぞれのゲノム標的部位（ＴＳ）ｘの中に同時に、すなわち、複数の組み込みポリヌクレオチドおよび複数のヌクレアーゼによる宿主細胞の１回の形質転換により、組み込まれる。いくつかの実施形態において、方法が、任意の複数の外因性の核酸（ＥＳ）ｘを同時に組み込むのに有用である、すなわち、上記に記載される方法について記載される変数に従って、ｘが、１〜ｎの任意の整数であり、ｎが、少なくとも２である。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される同時の組み込みの方法が、１０の選択される標的部位（ＴＳ）ｘの中に１０までの外因性の核酸（ＥＳ）ｘを同時に組み込むのに有用である、すなわち、ｘが、１〜ｎの任意の整数であり、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される同時の組み込みの方法が、２０の選択される標的部位（ＴＳ）ｘの中に２０までの外因性の核酸（ＥＳ）ｘを同時に組み込むのに有用である、すなわち、ｘが、１〜ｎの任意の整数であり、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である。いくつかの実施形態において、ｎ＝２である。いくつかの実施形態において、ｎ＝３である。いくつかの実施形態において、ｎ＝４である。いくつかの実施形態において、ｎ＝５である。いくつかの実施形態において、ｎ＝６である。いくつかの実施形態において、ｎ＝７である。いくつかの実施形態において、ｎ＝８である。いくつかの実施形態において、ｎ＝９である。いくつかの実施形態において、ｎ＝１０である。いくつかの実施形態において、ｎ＝１１である。いくつかの実施形態において、ｎ＝１２である。いくつかの実施形態において、ｎ＝１３である。いくつかの実施形態において、ｎ＝１４である。いくつかの実施形態において、ｎ＝１５である。いくつかの実施形態において、ｎ＝１６である。いくつかの実施形態において、ｎ＝１７である。いくつかの実施形態において、ｎ＝１８である。いくつかの実施形態において、ｎ＝１９である。いくつかの実施形態において、ｎ＝２０である。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される同時の組み込みの方法は、２０を超える外因性の核酸を同時に組み込むのに有用である。
【００４８】
単一の標的部位での単一の外因性の核酸の組み込みと同様に、複数の外因性の核酸の同時の複数の組み込みは、二本鎖切断を誘発することができるヌクレアーゼと標的部位を接触させないことと比較して、実質的により高い頻度で起こる。いくつかの実施形態において、複数の遺伝子座での複数の外因性の核酸の同時の組み込みの間に、すなわち複数のヌクレアーゼの存在下において、任意の単一の遺伝子座の組み込みの頻度が、１回の組み込み事象の間の、すなわち、単一のヌクレアーゼの存在下における、同じ遺伝子座での組み込みの頻度と比較して、実質的により高い。そのような利点は、実施例６（セクション７．５．２）において下記に実証される。理論によって拘束されないが、複数の標的部位で二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす、複数のヌクレアーゼの存在および活性が、カット部位でドナーＤＮＡ（複数可）を組み込むことによってＤＳＢを修復することに成功する形質転換体を富ませるおよび／またはＤＳＢを修復することができない形質転換体に対して選択すると考えられる。ＤＳＢが細胞に対して毒性であるので、ヌクレアーゼの数の増加が、ＤＳＢを多くし、相応して、ドナーＤＮＡ（複数可）のＨＲ媒介性の組み込みを通してＤＳＢを修復することができる細胞が富むと考えられる。
【００４９】
いくつかの実施形態において、組み込みのこの頻度の増加が、複数の組換え事象の同定のための１つ以上の選択マーカーの同時組み込みの必要性を不要にする。いくつかの実施形態において、組み込みに成功した複数の外因性の核酸を含む形質転換細胞のマーカーレス回収が、スクリーニングされた１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、または１００の接触宿主細胞またはそのクローン集団毎に約１の頻度の範囲内で起こる。特定の実施形態において、マーカーレス回収が、スクリーニングされた９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０の接触宿主細胞またはそのクローン集団毎に約１の頻度の範囲内で起こる。より特定の実施形態において、マーカーレス回収が、スクリーニングされた９、８、７、６、５、４、３、または２つの接触宿主細胞またはそのクローン集団毎に約１の頻度の範囲内で起こる。特定の実施形態において、宿主細胞が、酵母細胞であり、組み込みの頻度の増加が、他の宿主細胞型に比べて、相同組換えについての酵母の能力の増加に由来する。
【００５０】
６．２．１．  代謝経路工学のための方法
本明細書において記載される方法および組成物は、たとえば、バイオ燃料、医薬品、またはバイオマテリアルへのバイオマスの変換に向けて、最適化された生合成経路を含む組換え生物を構築するための特定の利点を提供する。機能的な、本来のものではない生物学的経路は、抗マラリア薬アルテミシニンに対する前駆体（たとえばＭａｒｔｉｎら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１：７９６−８０２（２００３）；脂肪酸誘導体燃料および化学物質（たとえば脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、およびワックス；たとえばＳｔｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４６３：５５９−５６２（２０１０）を参照されたい；ハロゲン化メチル誘導燃料および化学物質（たとえばＢａｙｅｒら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３１：６５０８−６５１５（２００９）を参照されたい；コレステロール降下薬を生成するポリケチドシンターゼ（たとえばＭａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：５８９−５９２（２００９）を参照されたい；ならびにポリケチド（たとえばＫｏｄｕｍａｌ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１５５７３−１５５７８（２００４）を参照されたい、の産生のための微生物宿主における構築に成功した。
【００５１】
従来より、代謝工学、特に、生合成経路の構築は、１度に１つずつという一連の様式で進行し、それによって、経路構成成分は、導入されてきた、すなわち、一度に単一の遺伝子座で、宿主細胞ゲノムの中に組み込まれてきた。本明細書において提供される組み込みの方法は、新しい代謝経路、すなわち、宿主細胞によって内因的に産生されない代謝物質を産生する代謝経路の酵素をコードする１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含むように、宿主細胞、たとえば微生物細胞を遺伝子操作するのに典型的に必要とされる時間を減らすために利用することができる。他の特定の実施形態において、本明細書において提供される組み込みの方法は、宿主細胞にとって内因性である代謝経路、すなわち、宿主細胞によって内因的に産生される代謝物質を産生する代謝経路の酵素をコードする１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含むように、宿主細胞を効率的に遺伝子操作するために使用することができる。一実施例において、設計戦略は、宿主細胞の３つの本来の遺伝子を補足的な外因性の経路と交換することを試みるものであってもよい。現状の技術を使用すると、これらの内因性の３つの遺伝子座を修飾するのに、３つの別々の形質転換を必要とする。対照的に、本明細書において提供される同時の複数の組み込みの方法は、３つの組み込みがすべて、１回の形質転換において実行されるのを可能にし、したがって、必要とされる遺伝子操作の回数を３分の１に減らす。さらに、方法は、ある宿主細胞シャーシ（ｃｈａｓｓｉｓ）における複数の部位に組み込まれた、最適化された経路構成成分を含むＤＮＡアセンブリの、第２の宿主細胞シャーシにおける類似の部位への運搬を可能にする。所望の遺伝子型を遺伝子操作するのに必要とされる回数の数を低下させることによって、代謝経路の構築のペースは、実質的に増加する。
【００５２】
６．２．１．１  イソプレノイド経路工学
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法は、遺伝子操作された宿主細胞の産物プロファイルを修飾するために、生合成経路の１つ以上の構成成分を同時に導入するまたは交換するために利用することができる。いくつかの実施形態において、生合成経路が、イソプレノイド経路である。
【００５３】
テルペンは、多くの生物において産生される大きなクラスの炭化水素である。テルペンが化学的に修飾された（たとえば炭素骨格の酸化または転位を介して）場合、結果として生じる化合物は、一般に、テルペノイドと呼ばれ、これはまた、イソプレノイドとしても知られている。イソプレノイドは、たとえば、電子伝達系におけるキノンとして、タンパク質プレニル化を介しての細胞内ターゲティングおよび調節における膜の構成成分として、カロテノイドおよびクロロフィルを含む光合成色素として、ホルモンおよび補助因子として、ならびに様々なモノテルペン、セスキテルペン、およびジテルペンと共に植物防御化合物として、多くの重要な生物学的役割を果たす。それらは、抗生物質、ホルモン、抗癌薬、殺虫剤、および化学物質として工業的に有用である。
【００５４】
テルペンは、イソプレン（Ｃ５Ｈ８）の単位を連結することによって誘導され、存在するイソプレン単位の数によって分類される。ヘミテルペンは、単一のイソプレン単位からなる。イソプレンは、それ自体、単にヘミテルペンと考えられる。モノテルペンは、２つのイソプレン単位からできており、分子式Ｃ１０Ｈ１６を有する。モノテルペンの例は、ゲラニオール、リモネン、およびテルピネオールである。セスキテルペンは、３つのイソプレン単位から構成され、分子式Ｃ１５Ｈ２４を有する。セスキテルペンの例は、ファルネセンおよびファルネソールである。ジテルペンは、４つのイソプレン単位からできており、分子式Ｃ２０Ｈ３２を有する。ジテルペンの例は、カフェストール、カーウェオール、センブレン、およびタキサジエンである。セスタテルペンは、５つのイソプレン単位からできており、分子式Ｃ２５Ｈ４０を有する。セスタテルペンの例は、ゲラニルファルネソールである。トリテルペンは、６つのイソプレン単位からなり、分子式Ｃ３０Ｈ４８を有する。テトラテルペンは、８つのイソプレン単位を含有し、分子式Ｃ４０Ｈ６４を有する。生物学的に重要なテトラテルペンは、非環式リコピン、単環式ガンマ−カロテン、ならびに二環式アルファ−およびベータ−カロテンを含む。ポリテルペンは、多くのイソプレン単位の長い鎖からなる。天然ゴムは、二重結合がシスであるポリイソプレンからなる。
【００５５】
テルペンは、イソペンテニルピロリン酸（イソペンテニル二リン酸またはＩＰＰ）およびその異性体ジメチルアリルピロリン酸（ジメチルアリル二リン酸またはＤＭＡＰＰ）の縮合を通して生合成される。２つの経路、すなわち、真核生物のメバロン酸依存性（ＭＥＶ）経路（図３）および原核生物のメバロン酸非依存性またはデオキシキシルロース５リン酸（ＤＸＰ）経路が、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰを生成することで知られている。植物は、ＭＥＶ経路およびＤＸＰ経路の両方を使用する。ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰは、プレニル二リン酸シンターゼ（たとえば、それぞれ、ＧＰＰシンターゼ、ＦＰＰシンターゼ、およびＧＧＰＰシンターゼ）の作用を通して、ポリプレニル二リン酸（たとえばゲラニル二リン酸またはＧＰＰ、ファルネシル二リン酸またはＦＰＰ、およびゲラニルゲラニル二リン酸またはＧＧＰＰ）に順番に縮合される。ポリプレニル二リン酸中間体は、テルペンシンターゼによって、より複雑なイソプレノイド構造に変換される。
【００５６】
テルペンシンターゼは、複数の産物を形成する大きな遺伝子ファミリーにまとめられる。テルペンシンターゼの例は、ＧＰＰをモノテルペンに変換するモノテルペンシンターゼ；ＧＧＰＰをジテルペンに変換するジテルペンシンターゼ；およびＦＰＰをセスキテルペンに変換するセスキテルペンシンターゼを含む。セスキテルペンシンターゼの例は、ＦＰＰをファルネセンに変換するファルネセンシンターゼである。テルペンシンターゼは、それらが代謝分岐点で働き、細胞によって産生されるイソプレノイドのタイプを決定するので、イソプレノイドへの経路のフラックス（ｆｌｕｘ）の調節において重要である。さらに、テルペンシンターゼは、そのようなテルペンの高収率産生の鍵を握る。そのため、異種イソプレノイド産生のために遺伝子操作された宿主における経路のフラックスを改善するための１つの戦略は、テルペンシンターゼをコードする核酸の複数のコピーを導入することである。たとえば、ファルネセンなどのようなセスキテルペンの産生が所望されるＭＥＶ経路を含む、遺伝子操作された微生物において、セスキテルペンシンターゼ、たとえばファルネセンシンターゼは、経路の末端酵素として利用され、ファルネセンシンターゼ遺伝子の複数のコピーは、ファルネセン産生のために最適化された株の生成に向けて宿主細胞の中に導入されてもよい。
【００５７】
あらゆるイソプレノイドの生合成が、プレニル二リン酸シンターゼおよびテルペンシンターゼの上流の同じ経路構成成分に依存するので、これらの経路構成成分は、宿主「プラットフォーム（ｐｌａｔｆｏｒｍ）」株の中に一度遺伝子操作されたら、任意のセスキテルペンの産生に向けて利用することができ、セスキテルペンの特徴は、宿主細胞の中に導入される特定のセスキテルペンシンターゼによって決定することができる。さらに、異なるイソプレン単位を有するテルペン、たとえばセスキテルペンの代わりにモノテルペンの産生が所望される場合、プレニル二リン酸シンターゼおよびテルペンシンターゼの両方は、経路の上流の構成成分をなお利用しながら、異なるテルペンを産生するために交換することができる。
【００５８】
したがって、本明細書において提供される方法および組成物は、所望のイソプレノイドを産生するために、イソプレノイド産生経路、たとえばＭＥＶ経路を含む宿主細胞を効率的に修飾するために利用することができる。いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＭＥＶ経路を含み、本明細書において提供される同時の複数の組み込みのための方法は、プレニル二リン酸シンターゼおよび／またはテルペンシンターゼの複数のコピーを同時に導入するために利用して、宿主細胞のテルペン産物プロファイルを決定することができる。いくつかの実施形態において、プレニル二リン酸シンターゼが、ＧＰＰシンターゼであり、テルペンシンターゼが、モノテルペンシンターゼである。いくつかの実施形態において、プレニル二リン酸シンターゼが、ＦＰＰシンターゼであり、テルペンシンターゼが、セスキテルペンシンターゼである。いくつかの実施形態において、プレニル二リン酸シンターゼが、ＧＧＰＰシンターゼであり、テルペンシンターゼが、ジテルペンシンターゼである。他の実施形態において、宿主細胞が、ＭＥＶ経路ならびに第１のタイプのテルペン、たとえばファルネセンの産生のためのプレニル二リン酸シンターゼおよび／またはテルペンシンターゼを含み、本明細書において提供される同時の複数の組み込みのための方法は、第２のタイプのテルペン、たとえばアモルファジエンを産生するためのプレニル二リン酸シンターゼおよび／またはテルペンシンターゼの１つ以上のコピーを同時に交換するために利用することができる。これらの実施形態は、実施例３および４において下記に例証される。本明細書において提供される方法は、経路構成成分の複数のコピーを利用する、任意の生合成経路の構築および／または修飾に向けて同様に利用することができ、また、単一の経路構成成分の複数のコピーの追加または交換によりその産物プロファイルを容易に修飾することができる宿主細胞を遺伝子操作するのに特に有用である。
【００５９】
６．２．１．２  コンビナトリアル組み込みライブラリを生成するための方法
一度生合成経路が構築されたら、代謝フラックスを最適化し、かつ高産物力価を達成するために、すべての構成成分の発現レベルを調整する必要がある。フラックスを最適化するための共通のアプローチは、経路構成成分遺伝子の特徴、遺伝子のコドン最適化、溶解性タグの使用、切断または既知の突然変異の使用、ならびに遺伝子の発現状況（すなわちプロモーターおよびターミネーターの選択）を多様化することを含む。株を構築する過程においてこの多様性をサンプリングするために、従来の方法の使用は、非実用的に多くの株を生成し、かつアーカイブすることを必要とする。たとえば、株のエンジニアが３つの遺伝子座の構築物を組み込むことを計画し、それぞれの遺伝子座について１０の変異体を考案した場合、コンビナトリアルな多様性を完全にサンプリングするために１，０００株が生成される必要があるであろう。経路遺伝子が協力して作用し、すべての代謝物質中間体を容易にスクリーニングすることができるとは限らないので、それぞれの組み込みサイクルの後に経路遺伝子の個々の寄与を評価することができないことが多い。したがって、株のエンジニアらは、新規な代謝経路を構築する場合に彼らがサンプリングするデザインスペース（ｄｅｓｉｇｎ  ｓｐａｃｅ）を厳重に制限する選択をルーチン的になす。
【００６０】
最適な経路設計をよりよく同定するために、本明細書において提供されるゲノム修飾のための方法は、合理的に設計された組み込み構築物のコンビナトリアルライブラリーを含む株を生成するために利用することができる。方法は、ゲノムにおける特定の位置でのドナーＤＮＡの複数の同時の組み込みを促進するための、細胞の中への１つ以上のヌクレアーゼおよび１つ以上のドナーＤＮＡアセンブリの導入に依存する。しかしながら、遺伝子操作された株の多様性を生成するために、方法は、ドナーＤＮＡのライブラリ、すなわち、それぞれの標的遺伝子座についての組み込み構築物の混合物を同時形質転換するステップを含み、その結果、宿主株のコンビナトリアル組み込みライブラリを生成することができる（図４）。達成される複数の組み込みの高い頻度は、結果として生じた株が、広範囲なゲノム品質管理を伴うことなく産物を直接、適切にスクリーニングすることができ、最上位の株の特徴は、たとえば配列決定によって、スクリーニングの後に決定することができることを意味する。この方法は、個々の株生成、品質管理、およびアーカイブの負荷を除き、エンジニアが単一のチューブにおいて多様な組み込みの組み合わせを生成し、たとえば、経路の末端産物をスクリーニングすることによって、最善に機能する株を分類することを可能にする。
【００６１】
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書において提供される宿主細胞ゲノムの中に複数の外因性の核酸を組み込むための方法は、
（ｄ）宿主細胞を、
（ｉ）複数のライブラリであって、ライブラリ（Ｌ）ｘが、それぞれ、複数の外因性の核酸を含み、選択された外因性の核酸が、５’から３’方向に、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘ、群（Ｄ）ｘから選択される目的の任意の核酸、および第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘを含み、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、前記宿主細胞ゲノムの標的部位（ＴＳ）ｘで前記選択された外因性の核酸の宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数のライブラリならびに
（ｉｉ）それぞれの前記標的部位（ＴＳ）ｘについて、（ＴＳ）ｘで切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘであって、前記切断が、（ＴＳ）ｘでの前記選択された外因性の核酸の相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼと接触させるステップ
ならびに
（ｅ）宿主細胞を回収するステップであって、それぞれのライブラリ（Ｌ）ｘ由来の外因性の核酸が、それぞれの選択された標的配列（ＴＳ）ｘで組み込まれているステップを含み、
ｘが、１〜ｎの任意の整数であり、ｎが、少なくとも２である。
【００６２】
この方法の略図は、図４において提供される。
【００６３】
（ａ）複数のライブラリであって、ライブラリ（Ｌ）ｘが、それぞれ、複数の外因性の核酸を含み、選択された外因性の核酸が、５’から３’方向に、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘ、群（Ｄ）ｘから選択される目的の任意の核酸、および第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘを含み、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、前記宿主細胞ゲノムの標的部位（ＴＳ）ｘで前記選択された外因性の核酸の宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数のライブラリならびに
（ｂ）それぞれの前記標的部位（ＴＳ）ｘについて、（ＴＳ）ｘで切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘであって、前記切断が、（ＴＳ）ｘでの前記選択された外因性の核酸の相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼ（Ｎ）ｘを含み、
ｘが、１〜ｎの任意の整数であり、ｎが、少なくとも２である、宿主細胞もまた、本明細書において提供される。
【００６４】
いくつかの実施形態において、ライブラリ（Ｌ）ｘが、それぞれ、共通の生合成経路の酵素をコードする外因性の核酸を含む。いくつかの実施形態において、群（Ｄ）ｘが、少なくとも１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、または１０６を超える、目的の特有の核酸を含む。いくつかの実施形態において、ライブラリ（Ｌ）ｘが、それぞれ、生合成経路の酵素の変異体をコードする複数の外因性の核酸を含む。本明細書において使用されるように、用語「変異体」は、選択された酵素と比較して、異なるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有する、生合成経路の酵素を指す。たとえば、いくつかの実施形態において、ライブラリ（Ｌ）ｘが、セスキテルペンシンターゼ変異体を含み、選択されたセスキテルペンシンターゼの野生型バージョンと比較して、セスキテルペンシンターゼ変異体が、対応するアミノ酸配列に対する変化をもたらしてもよいまたはもたらさなくてもよいヌクレオチドの追加、欠失、および／または置換を含んでいてもよい。他の実施形態において、酵素変異体が、参照酵素、たとえば野生型バージョンに比べて、アミノ酸の追加、欠失、および／または置換を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態において、宿主細胞が、前記接触の前に、生合成経路の１つ以上の酵素をコードする１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、生合成経路の１つ以上の酵素をコードする１つ以上の異種ヌクレオチド配列が、ゲノムで組み込まれる。
【００６６】
６．３  組み込みポリヌクレオチド
好都合にも、組み込みポリヌクレオチド、すなわちドナーＤＮＡは、宿主細胞ゲノムの選択された標的部位の中への１つ以上の外因性の核酸構築物の組み込みを促進する。好ましい実施形態において、組み込みポリヌクレオチドが、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘを含む外因性の核酸（ＥＳ）ｘならびに任意選択で、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘの間に位置づけられる目的の核酸を含む。いくつかの実施形態において、組み込みポリヌクレオチドが、線状ＤＮＡ分子である。他の実施形態において、組み込みポリヌクレオチドが、環状ＤＮＡ分子である。
【００６７】
組み込みポリヌクレオチドは、当業者に明らかな任意の技術によって生成することができる。ある実施形態において、組み込みポリヌクレオチドが、当技術分野においてよく知られているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および分子クローニング技術を使用して生成される。たとえばＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＨＡ  Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＨＡ  Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；米国特許第８，１１０，３６０号明細書を参照されたい。
【００６８】
６．３．１．  ゲノム組み込み配列
好ましい実施形態において、組み込みポリヌクレオチドが、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘを含む外因性の核酸（ＥＳ）ｘを含み、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、宿主細胞ゲノム内の選択された標的部位（ＴＳ）ｘで宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる。相同組換えによってゲノムの中に外因性の核酸を組み込むために、組み込みポリヌクレオチドは、好ましくは、一方の末端に（ＨＲ１）ｘおよび他方の末端に（ＨＲ２）ｘを含む。いくつかの実施形態において、（ＨＲ１）ｘが、選択されたゲノムの標的部位（ＴＳ）ｘの５’領域に対して相同であり、（ＨＲ２）ｘが、選択された標的部位（ＴＳ）ｘの３’領域に対して相同である。いくつかの実施形態において、（ＨＲ１）ｘが、選択されたゲノムの標的部位（ＴＳ）ｘの５’領域に対して約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％相同である。いくつかの実施形態において、（ＨＲ２）ｘが、選択された標的部位（ＴＳ）ｘの３’領域に対して約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％相同である。
【００６９】
ある実施形態において、（ＨＲ１）ｘが、目的の核酸（Ｄ）ｘに対して５’に位置づけられる。いくつかの実施形態において、（ＨＲ１）ｘが、（Ｄ）ｘの５’末端に対して直接隣接して位置づけられる。いくつかの実施形態において、（ＨＲ１）ｘが、（Ｄ）ｘの５’の上流に位置づけられる。ある実施形態において、（ＨＲ２）ｘが、目的の核酸（Ｄ）ｘに対して３’に位置づけられる。いくつかの実施形態において、（ＨＲ２）ｘが、（Ｄ）ｘの３’末端に対して直接隣接して位置づけられる。いくつかの実施形態において、（ＨＲ２）ｘが、（Ｄ）ｘの３’の下流に位置づけられる。
【００７０】
特定のゲノム遺伝子座での組み込みポリヌクレオチドの組み込みに影響を及ぼし得る特性は、ゲノム組み込み配列の長さ、切り取ることができる核酸構築物の全長、およびゲノム組み込み遺伝子座のヌクレオチド配列または位置を含むが、これらに限定されない。たとえば、ゲノム組み込み配列の１つの鎖および宿主細胞ゲノムにおける特定の遺伝子座の１つの鎖の間の有効なヘテロデュプレックス形成は、ゲノム組み込み配列の長さに依存してもよい。ゲノム組み込み配列の長さについての有効範囲は、５０〜５，０００ヌクレオチドである。ゲノム組み込み配列およびゲノム遺伝子座の間の相同性についての有効長の議論については、Ｈａｓｔｙら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１：５５８６−９１（１９９１）を参照されたい。
【００７１】
いくつかの実施形態において、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、任意の酵母ゲノム遺伝子座での外因性の核酸（ＥＳ）ｘのゲノム組み込みを可能にする、十分な長さおよび配列同一性の任意のヌクレオチド配列を含むことができる。ある実施形態において、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘのそれぞれが、独立して、約５０〜５，０００ヌクレオチドからなる。ある実施形態において、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘのそれぞれが、独立して、約１００〜２，５００ヌクレオチドからなる。ある実施形態において、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘのそれぞれが、独立して、約１００〜１，０００ヌクレオチドからなる。ある実施形態において、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘのそれぞれが、独立して、約２５０〜７５０ヌクレオチドからなる。ある実施形態において、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘのそれぞれが、独立して、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、または５，０００ヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態において、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘのそれぞれが、独立して、約５００ヌクレオチドからなる。
【００７２】
６．３．２．  目的の核酸
いくつかの実施形態において、組み込みポリヌクレオチドが、目的の核酸（Ｄ）ｘをさらに含む。目的の核酸は、当業者によって有用であると見なされる任意のＤＮＡセグメントとすることができる。たとえば、ＤＮＡセグメントは、宿主ゲノムに対して「ノックイン」することができる目的の遺伝子を含んでいてもよい。他の実施形態において、ＤＮＡセグメントが、宿主細胞ゲノムの標的部位の中への構築物の組み込みに際して標的遺伝子を特異的に破壊し、それによって、破壊された遺伝子を非機能的にすることができる「ノックアウト」構築物として機能する。目的の核酸（Ｄ）ｘの有用な例は、タンパク質コード配列、レポーター遺伝子、蛍光マーカーコード配列、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、転写活性化因子、転写リプレッサー、転写活性化因子結合部位、転写リプレッサー結合部位、イントロン、エクソン、ポリＡテイル、マルチクローニングサイト、核移行シグナル、ｍＲＮＡ安定化シグナル、組み込み遺伝子座、エピトープタグコード配列、分解シグナル、または任意の他の天然に存在する分子もしくは合成ＤＮＡ分子を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、（Ｄ）ｘが、天然起源のものとすることができる。その代わりに、（Ｄ）ｘは、インビトロにおいて産生された、完全に合成起源のものとすることができる。さらに、（Ｄ）ｘは、単離された天然に存在するＤＮＡ分子の任意の組み合わせまたは単離された天然に存在するＤＮＡ分子および合成ＤＮＡ分子の任意の組み合わせを含むことができる。たとえば、（Ｄ）ｘは、タンパク質コード配列に作動可能に連結された異種プロモーター、ポリＡテイルに連結されたタンパク質コード配列、エピトープタグコード配列とインフレームで連結されたタンパク質コード配列、およびその他同種のものを含んでいてもよい。目的の核酸（Ｄ）ｘは、クローニングされたＤＮＡ（たとえばＤＮＡ「ライブラリ」）から当技術分野において知られている標準的な手順によって、化学合成によって、ｃＤＮＡクローニングによって、または所望の細胞から精製されたゲノムＤＮＡもしくはその断片のクローニングによって、またはＰＣＲ増幅およびクローニングによって得られてもよい。たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｄ．  ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；Ｇｌｏｖｅｒ，  Ｄ．Ｍ．（ｅｄ．）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ２ｄ．  ｅｄ．、ＭＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｔｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．（１９９５）を参照されたい。
【００７３】
特定の実施形態において、目的の核酸（Ｄ）ｘは、選択マーカーをコードする核酸を含まない。これらの実施形態において、本明細書において記載される方法によって提供される組み込みの高い効率は、選択培地上での形質転換細胞の成長の必要性を伴うことなく、組み込み事象のスクリーニングおよび同定を可能にする。しかしながら、選択培地上での成長がそれにもかかわらず所望される他の実施形態において、目的の核酸（Ｄ）ｘが、宿主ゲノムの中への外因性の核酸の組み込みを選択するために使用されてもよい選択マーカーを含むことができる。
【００７４】
多種多様の選択マーカーが、当技術分野において知られている（たとえばＫａｕｆｉｎａｎ、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １８５：４８７（１９９０）；  Ｋａｕｆｍａｎ、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １８５：５３７（１９９０）；  Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、Ｇｅｎｅ，  １０３：５３（１９９１）；  Ｒｏｍａｎｏｓら、ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐａｇｅｓ  １２３−１６７（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；  Ｍａｒｋｉｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５４：３５９（１９９６）；  Ｐｆｅｉｆｅｒら、Ｇｅｎｅ，  １８８：１８３（１９９７）；  Ｔｕｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｅ、Ｇｅｎｅ，  １９９：２５（１９９７）；  Ｈａｓｈｉｄａ−Ｏｋａｄｏら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ４２５：１１７（１９９８）を参照されたい）。いくつかの実施形態において、選択マーカーが、薬剤抵抗性マーカーである。薬剤抵抗性マーカーは、そうでなければ細胞を死滅させるであろう外因性の薬剤を細胞が解毒するのを可能にする。薬剤抵抗性マーカーの例証となる例は、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、ブレオマイシン、ストレプトマイシン、ヒグロマイシン、ネオマイシン、Ｚｅｏｃｉｎ（商標）、およびその他同種のものなどのような抗生物質に対する抵抗性を付与するものを含むが、これらに限定されない。他の実施形態において、選択マーカーが、栄養要求性マーカーである。栄養要求性マーカーは、細胞が本質的な構成成分（通常アミノ酸）を合成するのを可能にし、同時に、その本質的な構成成分を欠く培地において成長する。選択栄養要求性遺伝子配列は、たとえばｈｉｓＤを含み、これは、ヒスチジノールの存在下において、ヒスチジンなしの培地における成長を可能にする。他の選択マーカーは、ブレオマイシン抵抗性遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、ヒグロマイシンＢ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ＡＵＲＩ遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、およびその他同種のものを含む。他の実施形態において、選択マーカーが、栄養要求性突然変異を救出するもの以外のマーカーである。たとえば、宿主細胞株は、突然変異が、知られている選択方法によって同定することができる限り、栄養要求性突然変異以外の突然変異、たとえば、宿主に対して致命的ではなく、また、株の意図される使用、たとえば工業用の発酵に対して副作用をも引き起こさない突然変異を含むことができる。
【００７５】
染色体で組み込まれたポリヌクレオチドを含む宿主細胞形質転換体はまた、個々のＤＮＡセグメントによってもしくはＤＮＡセグメントの組み合わせによってコードされる他の形質、たとえば、光を放射するペプチドの発現を示す宿主細胞形質転換体を選択することによってまたは個々の宿主細胞コロニーの分子的分析によって、たとえば、制限酵素マッピング、ＰＣＲ増幅、または単離され、アセンブルされたポリヌクレオチドもしくは染色体組み込み部位の配列分析によって同定することもできる。
【００７６】
６．４  ヌクレアーゼ
本明細書において記載される方法のいくつかの実施形態において、宿主細胞ゲノムが、切断する、すなわち、選択された標的部位内の指定された領域で二本鎖切断を引き起こすことができる１つ以上のヌクレアーゼと接触させられる。いくつかの実施形態において、二本鎖切断誘発剤が、認識配列でまたはその近くでブレークをもたらすように、特異的なポリヌクレオチド認識配列を認識するおよび／またはそれに結合する任意の作用物質である。二本鎖切断誘発剤の例は、エンドヌクレアーゼ、部位特異的レコンビナーゼ、トランスポザーゼ、トポイソメラーゼ、およびジンクフィンガーヌクレアーゼを含むが、これらに限定されず、修飾誘導体、変異体、およびその断片を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼのそれぞれが、選択された標的部位（ＴＳ）ｘ内の指定される領域で二本鎖切断を引き起こすことができる。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼが、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘがそれぞれ相同性を共有する、（ＴＳ）ｘの５’および３’領域の間に位置づけられる領域で二本鎖切断を引き起こすことができる。他の実施形態において、ヌクレアーゼが、（ＴＳ）ｘの５’および３’領域の上流または下流に位置づけられる領域で二本鎖切断を引き起こすことができる。
【００７８】
認識配列は、二本鎖切断誘発剤が特異的に認識するおよび／または結合する、任意のポリヌクレオチド配列である。認識部位配列の長さは、多様化することができ、たとえば、長さが、少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、またはそれより多いヌクレオチドである配列を含む。
【００７９】
いくつかの実施形態において、認識配列が、パリンドロームである、すなわち、ある鎖上の配列が、相補鎖上で反対方向で同様に読まれる。いくつかの実施形態において、ニック／切断部位が、認識配列内にある。他の実施形態において、ニック／切断部位が、認識配列の外側にある。いくつかの実施形態において、切断が、平滑末端をもたらす。他の実施形態において、切断が、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングのいずれかとすることができる一本鎖オーバーハング、すなわち「付着末端」をもたらす。
【００８０】
いくつかの実施形態において、選択された標的部位内の認識配列が、宿主細胞ゲノムに対して内因性かであってもよいまたは外因性であってもよい。認識部位が内因性の配列である場合、それは、天然に存在するまたは天然の二本鎖切断誘発剤によって認識される認識配列であってもよい。その代わりに、内因性の認識部位は、二本鎖切断をもたらすように内因性の認識配列を特異的に認識するように設計されたまたは選択された、修飾されたまたは遺伝子操作された二本鎖切断誘発剤が認識するおよび／または結合することができる。いくつかの実施形態において、修飾された二本鎖切断誘発剤が、天然の、天然に存在する二本鎖切断誘発剤から誘導される。他の実施形態において、修飾された二本鎖切断誘発剤が、人工的に作り出されるまたは合成される。そのような修飾されたまたは遺伝子操作された二本鎖切断誘発剤を選択するための方法は、当技術分野において知られている。たとえば、タンパク質（複数可）のアミノ酸配列変異体は、ＤＮＡにおける突然変異によって調製することができる。突然変異誘発およびヌクレオチド配列改変のための方法は、たとえば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：４８８−９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５４：３６７−８２；米国特許第４，８７３，１９２号明細書；Ｗａｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇａａｓｔｒａ編（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびその中に引用される参考文献を含む。タンパク質の生物学的活性に影響を及ぼす可能性が低いアミノ酸置換に関する手引きは、たとえば、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｆｏｕｎｄ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．）のモデルにおいて見つけられる。同様の特性を有する他のアミノ酸とのあるアミノ酸の交換などのような保存的置換は、好ましい場合がある。保存的欠失、挿入、およびアミノ酸置換は、タンパク質の特徴における根本的な変化をもたらすとは予想されず、任意の置換、欠失、挿入、またはその組み合わせの効果は、ルーチン的なスクリーニングアッセイによって評価することができる。ダブルストランドブレーク誘発活性についてのアッセイは、知られており、一般に、認識部位を含有するＤＮＡ基質に対する作用物質の全体的な活性および特異性を測定する。
【００８１】
本明細書において提供される方法のいくつかの実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する酵素であり、塩基を損傷することなく、特異的な部位としてＤＮＡを切断する制限エンドヌクレアーゼを含む。制限エンドヌクレアーゼは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、およびＩＶ型エンドヌクレアーゼを含み、これらは、サブタイプをさらに含む。制限エンドヌクレアーゼは、さらに記載され、たとえばＲＥＢＡＳＥデータベースにおいて分類されている（ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍのウェブページ；Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：４１８−２０）、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：１８０５−１２、およびＢｅｌｆｏｒｔら（２００２）ｉｎ  Ｍｏｂｉｌｅ  ＤＮＡ  ＩＩ、ｐｐ．  ７６１−７８３、Ｃｒａｉｇｉｅら編、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．。
【００８２】
本明細書において使用されるように、エンドヌクレアーゼはまた、ホーミングエンドヌクレアーゼをも含み、これは、制限エンドヌクレアーゼのように、特異的な認識配列に結合し、カットする。しかしながら、ホーミングエンドヌクレアーゼについての認識部位は、典型的により長い、たとえば約１８ｂｐ以上である。メガヌクレアーゼとして知られているホーミングエンドヌクレアーゼは、保存配列モチーフに基づいて以下のファミリーに分類されている：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号：５０）ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧ（配列番号：５１）ホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼ。たとえばＳｔｏｄｄａｒｄ、Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３８（１）：４９−９５（２００６）を参照されたい。これらのファミリーは、保存ヌクレアーゼ活性部位コアモチーフおよび触媒メカニズム、生物学的およびゲノム分布、ならびに非ホーミングヌクレアーゼ系に対するより広い関係において非常に異なる。たとえばＧｕｈａｎ  ａｎｄ  Ｍｕｎｉｙａｐｐａ（２００３）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３８：１９９−２４８；Ｌｕｃａｓら（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９：９６０−９；Ｊｕｒｉｃａ  ａｎｄ  Ｓｔｏｄｄａｒｄ（１９９９）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ５５：１３０４−２６；Ｓｔｏｄｄａｒｄ（２００６）Ｑ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３８：４９−９５；およびＭｏｕｒｅら（２００２）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９：７６４を参照されたい。これらのファミリー由来の有用な特異的ホーミングエンドヌクレアーゼの例は、Ｉ−ＣｒｅＩ（Ｒｏｃｈａｉｘら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：９７５−９８４（１９８５）を参照されたい、Ｉ−ＭｓｏＩ（Ｌｕｃａｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２９：９６０−９６９（２００１）を参照されたい、Ｉ−ＳｃｅＩ（Ｆｏｕｒｙら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４４０：３２５−３３１（１９９８）を参照されたい、Ｉ−ＳｃｅＩＶ（Ｍｏｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０：４０６９−４０７６（１９９２）を参照されたい、Ｈ−ＤｒｅＩ（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５（２００２）を参照されたい、Ｉ−ＨｍｕＩ（Ｇｏｏｄｒｉｃｈ−Ｂｌａｉｒら、Ｃｅｌｌ  ６３：４１７−４２４（１９９０）；  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ−Ｂｌａｉｒら、Ｃｅｌｌ  ８４：２１１−２２１（１９９６）を参照されたい、Ｉ  ＰｐｏＩ（Ｍｕｓｃａｒｅｌｌａら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １０：３３８６−３３９６（１９９０）を参照されたい、Ｉ−ＤｉｒＩ（Ｊｏｈａｎｓｅｎら、Ｃｅｌｌ  ７６：７２５−７３４（１９９４）；  Ｊｏｈａｎｓｅｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１：４４０５（１９９３）を参照されたい、Ｉ−ＮｊａＩ（Ｅｌｄｅら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２５９：２８１−２８８（１９９９）；  Ｄｅ  Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅら、Ｊ．  Ｅｕｋａｒｙｏｔ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４１：４５７−４６３（１９９４）を参照されたい、Ｉ−ＮａｎＩ（Ｅｌｄｅら、Ｓ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２５９：２８１−２８８（１９９９）；  Ｄｅ  Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅら、Ｊ．  Ｅｕｋａｒｙｏｔ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４１：４５７−４６３（１９９４）を参照されたい）、Ｉ−ＮｉｔＩ（Ｄｅ  Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅら、Ｊ．  Ｅｕｋａｒｙｏｔ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４１：４５７−４６３（１９９４）；  Ｅｌｄｅら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２５９：２８１−２８８（１９９９）を参照されたい、Ｉ−ＴｅｖＩ（Ｃｈｕら、Ｃｅｌｌ  ４５：１５７−１６６（１９８６）を参照されたい、Ｉ−ＴｅｖＩＩ（Ｔｏｍａｓｃｈｅｗｓｋｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５：３６３２−３６３３（１９８７）を参照されたい、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ（Ｅｄｄｙら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ５：１０３２−１０４１（１９９１）を参照されたい、Ｆ−ＴｅｖＩ（Ｆｕｊｉｓａｗａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：７４７３−７４８１（１９８５）を参照されたい、Ｆ−ＴｅｖＩＩ（Ｋａｄｙｒｏｖら、Ｄｏｋｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３３９：１４５−１４７（１９９４）；  Ｋａｌｉｍａｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８：４２７７（１９９０）を参照されたい、Ｆ−ＣｐｈＩ（Ｚｅｎｇら、Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  １９：２１８−２２２（２００９）を参照されたい、ＰＩ−ＭｇａＩ（Ｓａｖｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２９：４３１０−４３１８（２００１）を参照されたい、Ｉ−ＣｓｍＩ（Ｃｏｌｌｅａｕｘら、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２２３：２８８−２９６（１９９０）を参照されたい、Ｉ−ＣｅｕＩ（Ｔｕｒｍｅｌら、Ｊ  ．Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１８：２９３−３１１（１９９１）を参照されたい、およびＰＩ−ＳｃｅＩ（Ｈｉｒａｔａら  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５：６７２６−６７３３（１９９０）を参照されたい、を含むが、これらに限定されない。
【００８３】
本明細書において記載される方法のいくつかの実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼの天然に存在する変異体および／または遺伝子操作された誘導体が、使用される。反応速度、補助因子相互作用、発現、最適条件、および／または認識部位特異性を修飾するならびに活性をスクリーニングするための方法が、知られている。たとえばＥｐｉｎａｔら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：２９５２−６２；Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５；Ｇｉｍｂｌｅら（２００３）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３３４：９９３−１００８；Ｓｅｌｉｇｍａｎら（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：３８７０−９；Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４２：３１−４１；Ｒｏｓｅｎら（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４：４７９１−８００；Ｃｈａｍｅｓら（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：ｅ１７８；Ｓｍｉｔｈら（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４：ｅ１４９；Ｇｒｕｅｎら（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：ｅ２９；Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｚｈａｏ（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：ｅ１５４；国際公開第２００５１０５９８９号パンフレット；国際公開第２００３０７８６１９号パンフレット；国際公開第２００６０９７８５４号パンフレット；国際公開第２００６０９７８５３号パンフレット；国際公開第２００６０９７７８４号パンフレット；および国際公開第２００４０３１３４６号パンフレットを参照されたい。有用なホーミングエンドヌクレアーゼはまた、国際公開第０４／０６７７３６号パンフレット；国際公開第０４／０６７７５３号パンフレット；国際公開第０６／０９７７８４号パンフレット；国際公開第０６／０９７８５３号パンフレット；国際公開第０６／０９７８５４号パンフレット；国際公開第０７／０３４２６２号パンフレット；国際公開第０７／０４９０９５号パンフレット；国際公開第０７／０４９１５６号パンフレット；国際公開第０７／０５７７８１号パンフレット；国際公開第０７／０６０４９５号パンフレット；国際公開第０８／１５２５２４号パンフレット；国際公開第０９／００１１５９号パンフレット；国際公開第０９／０９５７４２号パンフレット；国際公開第０９／０９５７９３号パンフレット；国際公開第１０／００１１８９号パンフレット；国際公開第１０／０１５８９９号パンフレット；および国際公開第１０／０４６７８６号パンフレットにおいて記載されるものをも含む。
【００８４】
任意のホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、もしくはＰＩ−ＴｌｉＩＩまたはその任意の変異体もしくは誘導体を含むが、これらに限定されない二本鎖切断誘発剤として使用することができる。
【００８５】
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼが、本来のまたは内因性の認識配列に結合する。他の実施形態において、エンドヌクレアーゼが、本来のものではないまたは外因性の認識配列に結合し、本来のまたは内因性の認識配列に結合しない修飾エンドヌクレアーゼである。
【００８６】
本明細書において提供される方法のいくつかの実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼが、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）である。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属における植物病原細菌のＴＡＬエフェクターは、疾患において重要な役割を果たすまたは宿主ＤＮＡに結合し、エフェクターに特異的な宿主遺伝子を活性化することによって防御を引き起こす。たとえばＧｕら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：１１２２−５；Ｙａｎｇら（２００６）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０３：１０５０３−８；Ｋａｙら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４８−５１；Ｓｕｇｉｏら（２００７）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０４：１０７２０−５；Ｒｏｍｅｒら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４５−８；Ｂｏｃｈら（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６（５９５９）：１５０９−１２；およびＭｏｓｃｏｕ  ａｎｄ  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ（２００９）３２６（５９５９）：１５０１を参照されたい。ＴＡＬエフェクターは、１つ以上のタンデムリピートドメインを通して配列特異的な様式でＤＮＡと相互作用するＤＮＡ結合ドメインを含む。反復配列は、典型的に、３４アミノ酸を含み、リピートは、典型的に、互いに９１〜１００％相同である。リピートの多型は、通常、１２および１３位に位置し、ＴＡＬ−エフェクターの標的配列における近接ヌクレオチドの特徴との、１２および１３位のリピート可変二残基（ｒｅｐｅａｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ−ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）の特徴の間に一対一の対応があるように思われる。
【００８７】
ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメインは、所望の標的配列に結合するように遺伝子操作され、たとえばＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼドメイン、典型的に、ＦｏｋＩなどのようなＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ由来の非特異的切断ドメインに融合されてもよい（たとえばＫｉｍら（１９９６）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：１１５６−１１６０を参照されたい）。他の有用なエンドヌクレアーゼは、たとえばＨｈａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎｏｄ、ＢｂｖＣＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩ、およびＡｌｗＩを含んでいてもよい。したがって、好ましい実施形態において、ＴＡＬＥＮは、共同して、標的ＤＮＡ配列における特異的なヌクレオチド配列に結合し、その結果、ＴＡＬＥＮが、特異的なヌクレオチド配列内のまたはそれに隣接する標的ＤＮＡを切断する、複数のＴＡＬエフェクターリピート配列を含むＴＡＬエフェクタードメインを含む。本明細書において提供される方法に有用なＴＡＬＥＮは、国際公開第１０／０７９４３０号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１１／０１４５９４０号明細書において記載されるものを含む。
【００８８】
いくつかの実施形態において、標的ＤＮＡ内の特異的なヌクレオチド配列に結合するＴＡＬエフェクタードメインが、１０以上のＤＮＡ結合リピート、好ましくは、１５以上のＤＮＡ結合リピートを含むことができる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合リピートが、それぞれ、標的ＤＮＡ配列における塩基対の認識を決定するリピート可変二残基（ＲＶＤ）を含み、ＤＮＡ結合リピートが、それぞれ、標的ＤＮＡ配列における１つの塩基対の認識を担い、ＲＶＤが、１つ以上の、Ｃを認識するためのＨＤ；Ｔを認識するためのＮＧ；Ａを認識するためのＮＩ；ＧまたはＡを認識するためのＮＮ；ＡまたはＣまたはＧまたはＴを認識するためのＮＳ；ＣまたはＴを認識するためのＮ＊、ここで、＊は、ＲＶＤの第２の位置におけるギャップを示す；Ｔを認識するためのＨＧ；Ｔを認識するためのＨ＊、ここで、＊は、ＲＶＤの第２の位置におけるギャップを示す；Ｔを認識するためのＩＧ；Ｇを認識するためのＮＫ；Ｃを認識するためのＨＡ；Ｃを認識するためのＮＤ；Ｃを認識するためのＨＩ；Ｇを認識するためのＨＮ；Ｇを認識するためのＮＡ；ＧまたはＡを認識するためのＳＮ；およびＴを認識するためのＹＧを含む。
【００８９】
本明細書において提供される方法のいくつかの実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼが、部位特異的レコンビナーゼである。レコンビナーゼとも呼ばれる部位特異的レコンビナーゼは、その適合性の組換え部位の間の保存的部位特異的組換えを触媒するポリペプチドであり、天然のポリペプチドならびに活性を保持する誘導体、変異体、および／または断片ならびに天然のポリヌクレオチド、活性を保持するレコンビナーゼをコードする誘導体、変異体、および／または断片を含む。部位特異的レコンビナーゼおよびそれらの認識部位の概説については、Ｓａｕｅｒ（１９９４）Ｃｕｒｒ  Ｏｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５：５２１−７；およびＳａｄｏｗｓｋｉ（１９９３）ＦＡＳＥＢ  ７：７６０−７を参照されたい。いくつかの実施形態において、レコンビナーゼが、セリンレコンビナーゼまたはチロシンレコンビナーゼである。いくつかの実施形態において、レコンビナーゼが、インテグラーゼまたはリゾルバーゼファミリー由来のものである。いくつかの実施形態において、レコンビナーゼが、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ラムダインテグラーゼ、およびＲからなる群から選択されるインテグラーゼである。インテグラーゼファミリーの他のメンバーについては、たとえばＥｓｐｏｓｉｔｏら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：３６０５−１４およびＡｂｒｅｍｓｋｉら（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ５：８７−９１を参照されたい。反応速度、補助因子相互作用および必要性、発現、最適条件、ならびに／または認識部位特異性を修飾するならびにレコンビナーゼおよび変異体の活性をスクリーニングするための方法が、知られており、たとえばＭｉｌｌｅｒら（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２０：７２１−９；Ｌａｎｇｅ−Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ  ａｎｄ  Ｎａｓｈ（１９８４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５９：１２７２４−３２；Ｃｈｒｉｓｔら（１９９８）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２８８：８２５−３６；Ｌｏｒｂａｃｈら（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６：１１７５−８１；Ｖｅｒｇｕｎｓｔら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：９７９−８２；Ｄｏｒｇａｉら（１９９５）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５２：１７８−８８；Ｄｏｒｇａｉら（１９９８）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２７７：１０５９−７０；Ｙａｇｕら（１９９５）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５２：１６３−７；Ｓｃｌｉｍｅｎｔｅら（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９：５０４４−５１；Ｓａｎｔｏｒｏ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚｅ（２００２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：４１８５−９０；Ｂｕｃｈｈｏｌｚ  ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ（２００１）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９：１０４７−５２；Ｖｏｚｉｙａｎｏｖら（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：１６５６−６３；Ｖｏｚｉｙａｎｏｖら（２００３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３２６：６５−７６；Ｋｌｉｐｐｅｌら（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ  ７：３９８３−９；Ａｒｎｏｌｄら（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ  １８：１４０７−１４；国際公開第０３／０８０４５号パンフレット；国際公開第９９／２５８４０号パンフレット；および国際公開第９９／２５８４１号パンフレットを参照されたい。認識部位は���約３０ヌクレオチドの最小限の部位〜数百ヌクレオチドの範囲にある。天然に存在する部位および変異体を含む、レコンビナーゼについての任意の認識部位を使用することができる。変異体認識部位は、知られており、たとえばＨｏｅｓｓら（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １４：２２８７−３００；Ａｌｂｅｒｔら（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ７：６４９−５９；Ｔｈｏｍｓｏｎら（２００３）Ｇｅｎｅｓｉｓ  ３６：１６２−７；Ｈｕａｎｇら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９：４４３−８；Ｓｉｅｂｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：１７４０−７；Ｓｃｈｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１２７４６−５１；Ｔｈｙｇａｒａｊａｎら（２００１）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１：３９２６−３４；Ｕｍｌａｕｆ  ａｎｄ  Ｃｏｘ（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ  ７：１８４５−５２；Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ（１９９８）Ｇｅｎｅ  ２１６：５５−６５；国際公開第０１／２３５４５号パンフレット；国際公開第９９／２５８２１号パンフレット；国際公開第９９／２５８５１号パンフレット；国際公開第０１／１１０５８号パンフレット；国際公開第０１／０７５７２号パンフレット、および米国特許第５，８８８，７３２号明細書を参照されたい。
【００９０】
本明細書において提供される方法のいくつかの実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼが、トランスポザーゼである。トランスポザーゼは、ゲノム中のある位置から他の位置への、トランスポゾンの転移を媒介するポリペプチドである。トランスポザーゼは、典型的に、トランスポゾンを切り取るためにダブルストランドブレークを誘発し、末端近くのリピートを認識し、切り取られたトランスポゾンの末端を引き合わせ、いくつかの系においては、他のタンパク質もまた、転移の間に末端を引き合わせるために必要とされる。トランスポゾンおよびトランスポザーゼの例は、トウモロコシ由来のＡｃ／Ｄｓ、Ｄｔ／ｒｄｔ、Ｍｕ−Ｍ１／Ｍｎ、およびＳｐｍ（Ｅｎ）／ｄＳｐｍエレメント、キンギョソウ由来のＴａｍエレメント、バクテリオファージ由来のＭｕトランスポゾン、細菌トランスポゾン（Ｔｎ）および挿入配列（ＩＳ）、酵母のＴｙエレメント（レトロトランスポゾン）、シロイヌナズナ由来のＴａ１エレメント（レトロトランスポゾン）、ショウジョウバエ由来のＰ因子トランスポゾン（Ｇｌｏｏｒら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１１１０−１１１７）、ショウジョウバエ由来のＣｏｐｉａ、Ｍａｒｉｎｅｒ、およびＭｉｎｏｓエレメント、イエバエ由来のＨｅｒｍｅｓエレメント、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）由来のＰｉｇｇｙＢａｃｋエレメント、線虫由来のＴｃ１エレメント、ならびにマウス由来のＩＡＰエレメント（レトロトランスポゾン）を含むが、これらに限定されない。
【００９１】
本明細書において提供される方法のいくつかの実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびダブルストランドブレーク誘発剤ドメインから構成される、遺伝子操作された二本鎖切断誘発剤である。遺伝子操作されたＺＦＮは、２つのジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）からなり、これらのそれぞれは、二量体化に際して活性になる、ＦｏｋＩ酵素由来のヌクレアーゼドメインなどのような非特異的エンドヌクレアーゼの単一サブユニットに融合される。典型的に、単一のＺＦＡは、３つまたは４つのジンクフィンガードメインからなり、これらのそれぞれが、特異的なヌクレオチドトリプレット（ＧＧＣ、ＧＡＴなど）を認識するように設計される。したがって、２つの「３−フィンガー」ＺＦＡから構成されるＺＦＮは、１８塩基対標的部位を認識することができ、１８塩基対認識配列は、ヒトおよび植物のゲノムなどのような大きなゲノム内でさえ、一般に、特有である。２つのＦｏｋＩヌクレアーゼ単量体の共存および二量体化を導くことによって、ＺＦＮは、標的遺伝子座で、ＤＮＡにおける二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出す機能的部位特異的エンドヌクレアーゼを生成する。
【００９２】
有用なジンクフィンガーヌクレアーゼは、知られているものおよび本明細書において記載される１つ以上の標的部位（ＴＳ）に対して特異性を有するように遺伝子操作されたものを含む。ジンクフィンガードメインは、たとえば宿主細胞ゲノムの標的部位内の選択されたポリヌクレオチド認識配列に特異的に結合するポリペプチドを設計するために適用可能である。ＺＦＮは、非特異的エンドヌクレアーゼドメイン、たとえばＨＯまたはＦｏｋＩなどのようなＩＩｓ型エンドヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼドメインに連結された、遺伝子操作されたＤＮＡ結合ジンクフィンガードメインからなる。その代わりに、操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡニッキング／切断活性を保持する他の二本鎖切断誘発剤またはその誘導体に融合することができる。たとえば、このタイプの融合は、異なる標的部位に二本鎖切断誘発剤を導くために、ニックもしくは切断部位の位置を改変するために、より短い標的部位に誘発剤を導くために、またはより長い標的部位に誘発剤を導くために使用することができる。いくつかの実施例において、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが、部位特異的レコンビナーゼ、トランスポザーゼ、またはＤＮＡニッキングおよび／もしくは切断活性を保持するその誘導体に融合される。転写活性化因子ドメイン、転写リプレッサードメイン、およびメチラーゼを含むさらなる機能性を、ジンクフィンガー結合ドメインに融合することができる。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼドメインの二量体化が、切断活性に必要とされる。
【００９３】
ジンクフィンガーは、それぞれ、標的ＤＮＡにおける３つの連続塩基対を認識する。たとえば、３つのフィンガードメインは、９つの近接ヌクレオチドの配列を認識し、ヌクレアーゼの二量体化の必要性と共に、ジンクフィンガートリプレットの２つのセットは、１８ヌクレオチド認識配列に結合するように使用される。有用なデザイナージンクフィンガーモジュールは、様々なＧＮＮおよびＡＮＮトリプレットを認識するもの（Ｄｒｅｉｅｒら（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：２９４６６−７８；  Ｄｒｅｉｅｒら（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０３：４８９−５０２；  Ｌｉｕら（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：３８５０−６）ならびに様々なＣＮＮまたはＴＮＮトリプレットを認識するもの（Ｄｒｅｉｅｒら（２００５）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０：３５５８８−９７；  Ｊａｍｉｅｓｏｎら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ２：３６１−８）を含む。Ｄｕｒａｉら（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：５９７８−９０；Ｓｅｇａｌ（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６：７６−８３；Ｐｏｒｔｅｕｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｒｏｌｌ（２００５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：９６７−７３；Ｐａｂｏら（２００１）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７０：３１３−４０；Ｗｏｌｆｅら（２０００）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  ２９：１８３−２１２；Ｓｅｇａｌ  ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ（２００１）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １２：６３２−７；Ｓｅｇａｌら（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：２１３７−４８；Ｂｅｅｒｌｉ  ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ（２００２）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：１３５−４１；Ｃａｒｒｏｌｌら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １：１３２９；Ｏｒｄｉｚら（２００２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１３２９０−５；Ｇｕａｎら（２００２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１３２９６−３０１；国際公開第２００２０９９０８４号パンフレット；国際公開第００／４２２１９号パンフレット；国際公開第０２／４２４５９号パンフレット；国際公開第２００３０６２４５５号パンフレット；米国特許出願公開第２００３００５９７６７号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１０８８８０号明細書；米国特許第６，１４０，４６６号明細書、米国特許第６，５１１，８０８号明細書、および米国特許第６，４５３，２４２号明細書もまた、参照されたい。有用なジンクフィンガーヌクレアーゼはまた、国際公開第０３／０８０８０９号パンフレット；国際公開第０５／０１４７９１号パンフレット；国際公開第０５／０８４１９０号パンフレット；国際公開第０８／０２１２０７号パンフレット；国際公開第０９／０４２１８６号パンフレット；国際公開第０９／０５４９８５号パンフレット；および国際公開第１０／０６５１２３号パンフレットにおいて記載されるものをも含む。
【００９４】
６．５  ゲノム標的部位
本明細書において提供される方法において、ヌクレアーゼは、ゲノム標的部位の近くでまたは標的部位内で二本鎖切断を引き起こすことができる宿主細胞に導入され、これは、切断部位でのまたは切断部位の近くでの相同組換えの頻度を大幅に増加させる。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼについての認識配列が、宿主細胞ゲノムにおいて標的部位にのみ存在し、それによって、ヌクレアーゼによるあらゆるオフターゲットゲノム結合および切断を最小限にする。
【００９５】
いくつかの実施形態において、ゲノム標的部位が、天然の遺伝子座などのように、宿主細胞にとって内因性である。いくつかの実施形態において、天然のゲノム標的部位が、本明細書において提供される組み込みの方法において利用されることとなるヌクレアーゼのタイプに従って選択される。利用されることとなるヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼである場合、最適な標的部位は、多くの公的に入手可能なオンラインリソースを使用して選択されてもよい。たとえば、その全体が参照によってこれによって組み込まれるＲｅｙｏｎら、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １２：８３（２０１１）を参照されたい。たとえば、Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚｅｄ  Ｐｏｏｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＯＰＥＮ）は、非常に頑健であり、高い特異性およびインビボにおける機能性を有するジンクフィンガーアレイを遺伝子操作するための公的に入手可能なプロトコールであり、植物、ゼブラフィッシュ、ならびにヒト体細胞および多能性幹細胞において効率的に機能するＺＦＮの生成の使用に成功してきた。ＯＰＥＮは、候補ＺＦＡについての、あらかじめ構築され、無作為化されたプールが、所望の標的配列に対して高い親和性および特異性を有するものを同定するためにスクリーニングされる選択ベースの方法である。ＺＦＮＧｅｎｏｍｅは、ＯＰＥＮにより生成されたＺＦＮについての可能性のある標的部位を同定し、可視化するためのＧＢｒｏｗｓｅベースのツールである。ＺＦＮＧｅｎｏｍｅは、モデル生物の、配列決定され、アノテートされたゲノムにおける、可能性のあるＺＦＮ標的部位の一覧を提供する。ＺＦＮＧｅｎｏｍｅは、現在、７つのモデル生物；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、コナミドリムシ、シロイヌナズナ、キイロショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、線虫、およびヒトの完全に配列決定されたゲノム内にマッピングされた、合計１１．６百万を超える可能性のあるＺＦＮ標的部位を含む。３つの植物種；ダイズ（大豆）、イネ（米）、トウモロコシ（とうもろこし）および３つの動物種コクヌストモドキ（こくぬすともどき）、ハツカネズミ（マウス）、ドブネズミ（どぶねずみ）を含むさらなるモデル生物が、近い将来、追加されるであろう。ＺＦＮＧｅｎｏｍｅは、その染色体位置および転写開始部位（複数可）に関する位置を含む、それぞれの可能性のあるＺＦＮ標的部位についての情報を提供する。ユーザは、いくつかの異なる基準（たとえば遺伝子ＩＤ、転写物ＩＤ、標的部位配列）を使用して、ＺＦＮＧｅｎｏｍｅに照会することができる。
【００９６】
利用されることとなるヌクレアーゼが、ＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼである場合、いくつかの実施形態において、最適な標的部位が、その全体が参照によってこれによって組み込まれるＳａｎｊａｎａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ７：１７１−１９２（２０１２）によって記載される方法に従って選択されてもよい。手短に言えば、ＴＡＬＥＮは、二量体として機能し、左および右のＴＡＬＥＮと呼ばれる１対のＴＡＬＥＮは、ＤＮＡの反対の鎖上の配列を標的にする。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメインおよび単量体ＦｏｋＩ触媒ドメインの融合物として遺伝子操作される。ＦｏｋＩ二量体化を促進するために、左および右のＴＡＬＥＮ標的部位は、およそ１４〜２０塩基の間隔で選ばれる。そのため、それぞれ２０ｂｐ配列を標的にする１対のＴＡＬＥＮについて、最適な標的部位は、形態５’−ＴＮ１９Ｎ１４−２０Ｎ１９Ａ−３’を有するはずであり、左のＴＡＬＥＮは、５’−ＴＮ１９−３’を標的にし、右のＴＡＬＥＮは、５’−Ｎ１９Ａ−３’のアンチセンス鎖を標的にする（Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣ）。
【００９７】
本明細書において提供される方法の他の実施形態において、ゲノム標的部位が、宿主細胞にとって外因性である。たとえば、１つ以上のゲノム標的部位は、本明細書において記載される組み込みの方法を実行する前に、従来の方法、たとえば遺伝子ターゲティングを使用して、宿主細胞ゲノムにおいて遺伝子操作することができる。いくつかの実施形態において、同じ標的配列の複数のコピーが、宿主細胞ゲノムにおいて、異なる遺伝子座で遺伝子操作され、それによって、標的配列を特異的に認識する単一のヌクレアーゼのみの使用により、同時の複数の組み込み事象を促進する。他の実施形態において、複数の異なる標的配列が、宿主細胞ゲノムにおいて、異なる遺伝子座で遺伝子操作される。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された標的部位が、宿主細胞の天然のゲノムにおいてそうでなければ示されない標的配列を含む。たとえば、ホーミングエンドヌクレアーゼは、イントロンまたはインテイン中に通常埋め込まれている、大きな認識部位（１２〜４０ｂｐ）を標的にし、そのため、それらの認識部位は、非常にまれであり、哺乳動物サイズのゲノム中に存在するこれらの部位は、ないかまたはわずかである。したがって、いくつかの実施形態において、外因性のゲノム標的部位が、ホーミングエンドヌクレアーゼについての認識配列である。いくつかの実施形態において、ホーミングヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔ���ＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、もしくはＰＩ−ＴｌｉＩＩまたはその任意の変異体もしくは誘導体からなる群から選択される。特定の実施形態において、外因性のゲノム標的部位は、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＶＤＥ（ＰＩ−ＳｃｅＩ）、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、またはＰＩ−ＭｔｕＩＩについての認識配列であり、これらのそれぞれは、下記に提供される。
【００９８】
【表１】
2014513535.tif 000003
６．６  送達
いくつかの実施形態において、本明細書において記載される方法に有用な１つ以上のヌクレアーゼが、精製タンパク質として宿主細胞に提供される、たとえば送達される。他の実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼがヌクレアーゼをコードする核酸を含むポリヌクレオチド（複数可）を介して提供される。他の実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼが宿主細胞核において直接翻訳することができる、精製ＲＮＡとして宿主細胞の中に導入される。
【００９９】
ある実施形態において、上記に記載される組み込みポリヌクレオチド、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、もしくは精製ヌクレアーゼタンパク質またはその任意の組み合わせが、当技術分野において知られている、細胞の中に外因性のタンパク質および／または核酸を導入するための任意の従来の技術を使用して、宿主細胞の中に導入されてもよい。そのような方法は、溶液からの細胞による分子の直接的な取込みまたはたとえばリポソームもしくは免疫リポソームを使用するリポフェクションを通して促進される取込み；粒子媒介性のトランスフェクションなどを含むが、これらに限定されない。たとえば、米国特許第５，２７２，０６５号明細書；Ｇｏｅｄｄｅｌら編、１９９０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、ＣＡ；Ｋｒｉｅｇｅｒ、１９９０、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを参照されたい。細胞を形質転換するための特定の方法は、当技術分野においてよく知られている。Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７５：１２９２−３（１９７８）；Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５：３３７６−３３８５（１９８５）を参照されたい。例示的な技術は、スフェロプラスティング（ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔｉｎｇ）、エレクトロポレーション、ＰＥＧ  １０００媒介性の形質転換、および酢酸リチウムまたは塩化リチウム媒介性の形質転換を含むが、これらに限定されない。
【０１００】
いくつかの実施形態において、微粒子銃が、宿主細胞、特に、植物などのような、従来の技術を使用して形質転換する／トランスフェクトするのがそうでなければ困難である宿主細胞の中に組み込みポリヌクレオチド、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、精製ヌクレアーゼタンパク質、またはその任意の組み合わせを導入するために利用される。微粒子銃は、形質転換反応を微視的な金粒子に結び付け、その後、標的細胞に圧縮ガスを使用して粒子を押し込むことによって作用する。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼをコードする核酸を含むポリヌクレオチドが、宿主細胞内でのヌクレアーゼの発現を可能にする発現ベクターである。適した発現ベクターは、大腸菌、酵母、または哺乳動物細胞において遺伝子を発現させる際の使用で知られているものを含むが、これらに限定されない。大腸菌発現ベクターの例は、ｐＳＣＭ５２５、ｐＤＩＣ７３、ｐＳＣＭ３５１、およびｐＳＣＭ３５３を含むが、これらに限定されない。酵母発現ベクターの例は、ｐＰＥＸ７およびｐＰＥＸ４０８を含むが、これらに限定されない。適した発現ベクターの他の例は、ＣＥＮ．ＡＲＳ配列および酵母選択マーカーを含むシャトルベクターの酵母−大腸菌ｐＲＳシリーズ；ならびに２μプラスミドを含む。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、宿主細胞においてより高い使用頻度を有するコドンに置換するために修飾することができる。たとえば、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてより高い使用頻度を有するコドンに置換するために修飾することができる。
【０１０２】
ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼについての場合のように、それぞれの単量体の別々の発現を必要とするヘテロ二量体としてヌクレアーゼが機能するいくつかの実施形態において、ヘテロ二量体の単量体は、それぞれ、同じ発現プラスミドまたは異なるプラスミドから発現されてもよい。複数のヌクレアーゼが異なる標的部位での二本鎖切断を達成するために細胞に導入される実施形態において、ヌクレアーゼが、単一のプラスミドまたは別々のプラスミド上にコードされてもよい。
【０１０３】
ある実施形態において、ヌクレアーゼ発現ベクターが、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする選択マーカーをさらに含む。そのような選択は、十分な量のヌクレアーゼの発現が起こるのに必要な時間、たとえば１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６、または９６時間を超える期間、宿主細胞においてベクターを保持するのに有用になり得、その後、宿主細胞は、発現ベクターがもはや保持されない条件下で成長させてもよい。ある実施形態において、選択マーカーが、ＵＲＡ３、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ｚｅｏｃｉｎ抵抗性、およびホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ発現ベクターベクターが、１つ以上のドナー核酸分子の組み込みに続く、発現ベクターを含有しない宿主細胞の選択を可能にする逆選択（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ）マーカーを含んでいてもよい。使用されるヌクレアーゼ発現ベクターはまた、選択マーカーを有していないまたは選択されないベクターである一時的なベクターであってもよい。特定の実施形態において、一時的なヌクレアーゼ発現ベクターを含む宿主細胞の子孫は、次第にベクターを失う。
【０１０４】
ある実施形態において、発現ベクターが、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に、適切に作用するように連結された転写終結配列およびプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、プロモーターが、恒常的プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターが、誘発性プロモーターである。酵母細胞における使用に適したプロモーターの例証となる例は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのＴＥＦ１遺伝子のプロモーター、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＧＫ１遺伝子のプロモーター、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＤＨ３遺伝子のプロモーター、抑制性プロモーター、たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＴＲ３遺伝子のプロモーター、および誘発性プロモーター、たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのガラクトース誘発性プロモーター（たとえばＧＡＬ１、ＧＡＬ７、およびＧＡＬ１０遺伝子のプロモーター）を含むが、これらに限定されない。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、核局在配列（ＮＬＳ）を含むさらなるヌクレオチド配列が、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の５’に連結される。ＮＬＳは、より大きなヌクレアーゼ（＞２５ｋＤ）の核局在を促進することができる。いくつかの実施形態において、核局在配列が、ＳＶ４０核局在配列である。いくつかの実施形態において、核局在配列が、酵母核局在配列である。
【０１０６】
ヌクレアーゼ発現ベクターは、当業者に明らかな任意の技術によって生成することができる。ある実施形態において、ベクターが、当技術分野においてよく知られているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および分子クローニング技術を使用して生成される。たとえばＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＨＡ  Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照されたい。
【０１０７】
６．７  宿主細胞
他の態様において、本明細書において記載される１つ以上の外因性の核酸をゲノムで組み込むための方法のいずれかによって生成される修飾宿主細胞が、本明細書において提供される。適した宿主細胞は、染色体またはエピソーム遺伝子座の中への目的の核酸または「ドナーＤＮＡ」の組み込みが所望される任意の細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞が、相同組換えを実行する能力を有する生物の細胞である。いくつかの例証となる実施形態が、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において実証されるが、本明細書において提供されるゲノム修飾の方法は、組換え系が酵母ほど熟達していない場合でさえ、機能的な組換え系を有するすべての生物有機体で実施することができると考えられる。機能的な相同組換え系を有する他の細胞または細胞型は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよび大腸菌などのような細菌（これはＲｅｃＥ  ＲｅｃＴ組換えに熟達している；Ｍｕｙｒｅｒｓら、ＥＭＢＯ  ｒｅｐ．  １：２３９−２４３、２０００）；原生動物（たとえばプラスモジウム、トキソプラズマ）；他の酵母（たとえばＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）；糸状菌（たとえばＡｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）；植物、たとえばコケであるニセツリガネゴケ（Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ａｎｄ  Ｚｒｙｄ、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １１：１１９５−１２０６、１９９７）；ならびに哺乳動物細胞およびニワトリＤＴ４０細胞などのような動物細胞（Ｄｉｅｋｅｎら、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  １２：１７４−１８２、１９９６）を含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、宿主細胞が、原核細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞が、真核細胞である。いくつかの実施形態において、細胞が、真菌細胞（たとえば酵母細胞）、細菌細胞、植物細胞、または動物細胞（たとえばニワトリ細胞）である。いくつかの実施形態において、宿主細胞が、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃｏｓ−７細胞、マウス線維芽細胞、マウス胚性癌腫細胞、またはマウス胚性幹細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞が、昆虫細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞が、Ｓ２細胞、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ細胞、Ｓ１２細胞、５Ｂ１−４細胞、Ｔｎ５細胞、またはＳｆ９細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞が、単細胞真核生物細胞である。
【０１０９】
特定の実施形態において、宿主細胞が、酵母細胞である。有用な酵母宿主細胞は、微生物保管所（たとえばＩＦＯ、ＡＴＣＣなど）に委託され、中でも、Ａｃｉｃｕｌｏｃｏｎｉｄｉｕｍ、Ａｍｂｒｏｓｉｏｚｙｍａ、Ａｒｔｈｒｏａｓｃｕｓ、Ａｒｘｉｏｚｙｍａ、Ａｓｈｂｙａ、Ｂａｂｊｅｖｉａ、Ｂｅｎｓｉｎｇｔｏｎｉａ、Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ、Ｂｏｔｒｙｏｚｙｍａ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｂｕｌｌｅｒａ、Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｄｅｋｋａｒａ、Ｄｉｐｏｄａｓｃｏｐｓｉｓ、Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ、Ｅｅｎｉｅｌｌａ、Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｅｌｌａ、Ｅｒｅｍａｓｃｕｓ、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｈａｓｅｇａｗａｅａ、Ｈｏｌｔｅｒｍａｎｎｉａ、Ｈｏｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈｉａ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａｓｐｏｒａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｏｎｄｏａ、Ｋｕｒａｉｓｈｉａ、Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ、Ｍｒａｋｉａ、Ｍｙｘｏｚｙｍａ、Ｎａｄｓｏｎｉａ、Ｎａｋａｚａｗａｅａ、Ｎｅｍａｔｏｓｐｏｒａ、Ｏｇａｔａｅａ、Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ、Ｐｈａｃｈｙｔｉｃｈｏｓｐｏｒａ、Ｐｈａｆｆｉａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｓａｉｔｏｅｌｌａ、Ｓａｋａｇｕｃｈｉａ、Ｓａｔｕｒｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｃｈｉｚｏｂｌａｓｔｏｓｐｏｒｉｏｎ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｒｏｐａｃｈｙｄｅｒｍｉａ、Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ、Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ、Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｅｓ、Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｅｌｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ、Ｔｓｕｃｈｉｙａｅａ、Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅｓ、Ｗａｌｔｏｍｙｃｅｓ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ、Ｙａｍａｄａｚｙｍａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｚｙｇｏａｓｃｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｚｙｇｏｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ、およびＺｙｇｏｚｙｍａ属に属する酵母細胞を含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ細胞、Ｄｅｋｋｅｒａ  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ細胞、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ細胞、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ細胞、またはＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（現在Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａとして知られている）細胞である。特定の実施形態において、酵母宿主細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ細胞またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ（以前Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓと呼ばれた）細胞である。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞が、Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、またはＣａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓなどのように、Ｃａｎｄｉｄａ属に属する細胞である。他の特定の実施形態において、酵母宿主細胞が、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ細胞である。
【０１１１】
特定の実施形態において、酵母宿主細胞が、パン酵母細胞、ＣＢＳ  ７９５９細胞、ＣＢＳ  ７９６０細胞、ＣＢＳ  ７９６１細胞、ＣＢＳ  ７９６２細胞、ＣＢＳ  ７９６３細胞、ＣＢＳ  ７９６４細胞、ＩＺ−１９０４細胞、ＴＡ細胞、ＢＧ−１細胞、ＣＲ−１細胞、ＳＡ−１細胞、Ｍ−２６細胞、Ｙ−９０４細胞、ＰＥ−２細胞、ＰＥ−５細胞、ＶＲ−１細胞、ＢＲ−１細胞、ＢＲ−２細胞、ＭＥ−２細胞、ＶＲ−２細胞、ＭＡ−３細胞、ＭＡ−４細胞、ＣＡＴ−１細胞、ＣＢ−１細胞、ＮＲ−１細胞、ＢＴ−１細胞、およびＡＬ−１細胞からなる群から選択されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＰＥ−２細胞、ＣＡＴ−１細胞、ＶＲ−１細胞、ＢＧ−１細胞、ＣＲ−１細胞、およびＳＡ−１細胞からなる群から選択されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である。特定の実施形態において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞が、ＰＥ−２細胞である。他の特定の実施形態において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞が、ＣＡＴ−１細胞である。他の特定の実施形態において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞が、ＢＧ−１細胞である。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞が、工業用の発酵、たとえばバイオエタノール発酵に適した細胞である。特定の実施形態において、細胞が、工業用発酵環境の認識されるストレス条件である高溶媒濃度、高温、基質利用の拡張、栄養素制限、浸透圧ストレス、酸性度、亜硫酸塩、および細菌コンタミネーションまたはその組み合わせ下で存続するように条件付けられる。
【０１１３】
６．８  キット
他の態様において、本明細書において記載される１つ以上の外因性の核酸をゲノムで組み込むための方法を実行するのに有用なキットが、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、キットが、
（ａ）複数の外因性の核酸であって、外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、
（ｉ）第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘであって、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、宿主細胞ゲノムの選択される標的部位（ＴＳ）ｘで（ＥＳ）ｘの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘならびに
（ｉｉ）（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘを含む、複数の外因性の核酸、
（ｂ）複数のヌクレアーゼであって、ヌクレアーゼ（Ｎ）ｘが、それぞれ、（ＴＳ）ｘで切断することができ、前記切断が、（ＴＳ）ｘでの（ＥＳ）ｘの相同組換えをもたらす複数のヌクレアーゼを含み、
ｘが、１〜ｎの任意の整数であり、ｎが、少なくとも２である。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、（Ｄ）ｘが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、キットが、複数のプライマー対（Ｐ）ｘをさらに含み、プライマー対が、それぞれ、ＰＣＲによって、（ＴＳ）ｘでの（ＥＳ）ｘの組み込みを同定することができる。いくつかの実施形態において、（ＥＳ）ｘが、線状である。いくつかの実施形態において、（ＥＳ）ｘが、環状である。
【０１１５】
特定の実施形態において、キットが、酵母ゲノムのおよそ６０００の遺伝子の遺伝子座のいずれかの内の特有の標的部位での外因性の核酸の部位特異的組み込みを可能にする。これらの実施形態において、ｎ＝≧６０００であり、（ＴＳ）ｘが、それぞれ、酵母細胞ゲノムの単一の遺伝子座に対して特有である。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、キットが、宿主酵母細胞の任意の遺伝子座の中に１つ以上の外因性の核酸を組み込むための方法について説明する、使用のための説明書をさらに含む。
【実施例】
【０１１７】
７．実施例
７．１  実施例１：複数の外因性の核酸の同時の複数の組み込み
本明細書において記載される方法および組成物は、１回の形質転換ステップにおいて酵母細胞ゲノムの２つの遺伝子座で組み込まれた２つの外因性の核酸を含む修飾酵母細胞を作り出すために実行され、修飾酵母細胞の回収は、選択マーカー（複数可）の使用を必要としない。
【０１１８】
（ａ）ＮＤＴ８０遺伝子座内に位置づけられるＦ−ＣｐｈＩエンドヌクレアーゼについての、あらかじめ導入された認識部位および（ｂ）：ＨＯ遺伝子座内に位置づけられるＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼについての、あらかじめ導入された認識部位を含む宿主株が、提供される。宿主細胞は、（１）Ｆ−ＣｐｈＩをコードする発現プラスミド；（２）Ｉ−ＳｃｅＩをコードする発現プラスミド；（３）ＮＤＴ８０遺伝子座の５’および３’領域に対応する＞５００ｂｐ配列の２つのストレッチが側面に位置する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする発現カセットを含む線状ＤＮＡ；ならびに（４）ＨＯ遺伝子座の５’および３’領域に対応する＞５００ｂｐ配列の２つのストレッチが側面に位置するｌａｃＺをコードする発現カセットを含む線状ＤＮＡにより同時に形質転換される。それぞれＦ−ＣｐｈＩおよびＩ−ＳｃｅＩをコードする発現プラスミドを包含する代わりとして、精製Ｆ−ＣｐｈＩタンパク質および精製Ｉ−ＳｃｅＩタンパク質が、形質転換反応に含まれる。非ダブルストランドブレーク対照は、Ｆ−ＣｐｈＩおよびＩ−ＳｃｅＩ発現プラスミドまたは精製タンパク質の非存在下において、線状組み込み構築物（３）および（４）のみによる宿主細胞の形質転換によって実行される。
【０１１９】
実験用および対照形質転換体は、選択なしの培地上で平板培養され、それぞれのプレートからのコロニーは、ＧＦＰおよびｌａｃＺの発現についてそれぞれ可視化される。コロニーＰＣＲは、それぞれ組み込まれた組み込み構築物（３）または（４）およびそれらのそれぞれの標的配列の間のジャンクションの上流および下流にアニールするプライマー対により独立して実行され、組み込みの忠実度および頻度を確認する。
【０１２０】
７．２  実施例２：複数の外因性の核酸の同時の複数の組み込み
本実施例は、宿主細胞ゲノムにおける標的二本鎖切断の誘発の後に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主の３つの異なる遺伝子座での３つの外因性の核酸の同時の組み込みを実証する結果を提供する。手短に言えば、エメラルドグリーン蛍光タンパク質の切断型非機能的コピー（ｅｍｇｆｐ△）をコードする外因性の「標的」核酸配列を、宿主酵母細胞の、それぞれ、ＨＯ、ＹＧＲ２５０ｃ、およびＮＤＴ８０遺伝子座の中に組み込んだ。組換え細胞は、エメラルドグリーン蛍光タンパク質（ＥｍＧＦＰ）のインタクトで機能的なコピーをコードする線状「ドナー」ＤＮＡおよび（１）空ベクターまたは（２）ｅｍｇｆｐ△コード配列内の配列を特異的に認識し、かつ切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ．ｇｆｐ）をコードする発現ベクター、ｐＺＦＮ．ｇｆｐのどちらかにより形質転換した。形質転換されたコロニーは、ドナーＥｍＧＦＰコード配列との、標的ｅｍｇｆｐ△コード配列の１つ、２つ、または３つのゲノム組み込みコピーの交換について、コロニーＰＣＲ（ｃＰＣＲ）によってスクリーニングした。
【０１２１】
７．２．１．  標的ＤＮＡの構築および組み込み
ヌクレアーゼ媒介性の二本鎖切断のための外因性のゲノム標的部位を生成するために、内容についてそれらの全体が参照によってこれによって組み込まれる米国特許第８，１１０，３６０号明細書において記載されるように、ｅｍｇｆｐ△をコードする標的ＤＮＡを、ＲＹＳＥ媒介性のアセンブリを使用して構築した。野生型ＥｍＧＦＰコード配列（配列番号：１）のヌクレオチド４５０〜４６２を、以下の配列：５’ＣＧＴＣＴＡＡＡＴＣＡＴＧ３’（配列番号：２）と交換し、（１）ＥｍＧＦＰの１５２位での成熟前終止コドン（ｅｍｇｆｐ△）および（２）ＺＦＮ．ｇｆｐについての認識／切断配列の導入がもたらされた。
【０１２２】
ＨＯ、ＹＧＲ２５０ｃ、およびＮＤＴ８０遺伝子座のそれぞれの中へのｅｍｇｆｐ△コード配列の標的組み込みのために、ｅｍｇｆｐ△コード配列に、それぞれの遺伝子座についての上流および下流の相同配列の約２００〜５００ｂｐ（配列番号：３〜８）が側面に位置した。組み込み事象が成功したコロニーの選択のために、特有の選択マーカーもまた、それぞれの構築物の中に取り込み、ｅｍｇｆｐ△コード配列の５’に位置づけられた。ＨＯ組み込み構築物は、ＫａｎＲを含み、ＹＧＲ２５０ｃ組み込み構築物は、ＵＲＡ３を含み、ＮＤＴ８０組み込み構築物は、ＮａｔＲを含んだ。組み込み構築物は、それぞれ、ナイーブＣＥＮ．ＰＫ２一倍体酵母株（株Ａ）に順次、形質転換し、株は、ｅｍｇｆｐ△コード配列の３つの組み込みコピーを有するかを確認した。
【０１２３】
７．２．２．  ＺＦＮ酵母発現プラスミドの構築
ジンクフィンガーヌクレアーゼは、２つの機能的ドメイン：ジンクフィンガータンパク質の鎖から構成されるＤＮＡ結合ドメインおよびＦｏｋＩのヌクレアーゼドメインから構成されるＤＮＡ切断ドメインからなる。ＦｏｋＩのエンドヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡを切断するために、必須のヘテロ二量体として機能し、したがって、１対のＺＦＮが、その標的配列に結合し、切断するために必要とされる。ＺＦＮ．ｇｆｐ（ＣｏｍｐｏＺｒ（登録商標）ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の標的配列は、５’−ＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣｇｔｃｔａｔＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡ−３’（配列番号：９）であり、認識配列は、大文字で示し、切断配列は、小文字で示す。
【０１２４】
高コピーＺＦＮ．ｇｆｐ酵母発現プラスミド、ｐＺＦＮ．ｇｆｐは、以下のように構築した。遺伝子ＺＦＮ．ｇｆｐ．１およびＺＦＮ．ｇｆｐ．２は、それぞれ、ＺＦＮ．ｇｆｐの必須のヘテロ二量体の一方のメンバーをコードするが、哺乳動物発現プラスミドからＰＣＲ増幅し、それぞれ、異なるＰＧＡＬ１、１０プロモーターならびにＡＤＨ１およびＣＹＣ１ターミネーターに融合した。ＰＧＡＬ１０＞ＺＦＮ．ｇｆｐ．１−ＴＡＤＨ１およびＰＧＡＬ１＞ＺＦＮ．ｇｆｐ．２−ＴＣＹＣ１の個々のＰＣＲ産物を、ＬＥＵ２選択マーカーを含む直線化ベクター骨格と共に、オーバーラップ末端の相同組換えを介してのインビボにおけるアセンブリのためにナイーブ酵母株の中に同時形質転換した。ＰＣＲ産物は、ｐＧＡＬ１、１０プロモーター配列で組換えられ、末端のプライマーが追加された相同配列を介してベクター骨格の中にアセンブルされた。形質転換体は、ロイシンを欠く最少培地上で選択し、単離し、液体培地中で成長させた。複数のクローン由来のプラスミドは、Ｚｙｍｏｐｒｅｐ  Ｙｅａｓｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｉキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、酵母から抽出した。その後、抽出プロトコール由来の溶出液を、大腸菌ＸＬ−１  ｂｌｕｅ化学的コンピテント細胞に形質転換した。プラスミドは、大腸菌において一晩増殖させ、ミニプレップした（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）。正確なクローンを制限酵素マッピングによって同定した。
【０１２５】
７．２．３．  ドナーＤＮＡによる形質転換および二本鎖切断の誘発
標準的な酢酸リチウム／ＳＳＤＮＡ／ＰＥＧプロトコール（Ｇｉｅｔｚ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ３５０：８７−９６（２００２））は、ＥｍＧＦＰおよび（１）空ベクターまたは（２）ｐＺＦＮ．ｇｆｐ発現ベクターのどちらかをコードする線状「ドナー」ＤＮＡにより株Ａを同時形質転換するために使用した。ＥｍＧＦＰコード配列は、ＺＦＮ．ｇｆｐについての認識／切断部位内の位置、すなわち、４５０位（Ｃ→Ｇ）、４５６位（Ａ→Ｔ）、４６１位（Ｔ→Ｃ）、および４６２位（Ｇ→Ｃ）でｅｍｇｆｐ△コード配列と異なる。したがって、ＺＦＮ．ｇｆｐは、ＥｍＧＦＰ配列内ではなく、ｅｍｇｆｐ△配列内で認識し、切断することが予想される。
【０１２６】
１マイクログラムの適切なプラスミドＤＮＡを、７０ｕｌの線状ＥｍＧＦＰ  ＤＮＡ（約３００ｎｇ／ｕｌ）と共に同時形質転換した。形質転換はすべて、ＺＦＮ発現を誘発するためにＹＰ＋２％ガラクトース中で一晩回復させた。様々な希釈液を、ロイシンを欠く最少培地寒天プレート上で平板培養し、プラスミドＤＮＡにより形質転換されたコロニーを選択した。プレートは、３０℃で３日間培養した。
【０１２７】
７．２．４．  複数の同時の組み込みについての確認
コロニーＰＣＲは、それぞれの標的遺伝子座での、ＥｍＧＦＰコード配列との、ｅｍｇｆｐ△コード配列の交換の頻度を決定するために実行した。ＤＮＡは、それぞれの形質転換由来の９６コロニーから準備し、それぞれ、ＥｍＧＦＰおよびＨＯ、ＥｍＧＦＰおよびＮＤＴ８０、ならびにＥｍＧＦＰおよびＹＧＲ２５０ｃに対して特異的なプライマー対によりプローブし、その結果、それぞれの遺伝子座でのＥｍＧＦＰコード配列の組み込みの成功により、予測されるサイズの増幅産物が産生されることが予想され、非組み込みによっては、増幅産物を産生しないことが予想された。
【０１２８】
【表２】
2014513535.tif 000004
図５において示されるように、線状ＥｍＧＦＰドナーＤＮＡ（配列番号：１）および空ベクター対照により形質転換された９６コロニーのうち、ＰＣＲの間に増幅産物は産生されず、二本鎖切断の非存在下において、標的ｅｍｇｆｐ△コード配列を含む３つの遺伝子座のいずれにおいても、組み込み事象、すなわち交換が成功しなかったことを示した。対照的に、線状ＥｍＧＦＰ  ＤＮＡおよびｐＺＦＮ．ｇｆｐにより形質転換された９６コロニーのうち、２つのコロニーが、ＥｍＧＦＰコード配列と交換された１つの遺伝子座を有し、４つのコロニーが、交換された２つの遺伝子座を有し、２３のコロニーが、交換された３つの遺伝子座をすべて有した（図６）。コロニーＰＣＲ結果は、プレート上で、形質転換されたコロニーの蛍光を可視化することによって確証した（データ示さず）。ＥｍＧＦＰ  ＤＮＡおよび空ベクターにより形質転換されたコロニーのいずれも、緑色に見えず、標的ｅｍｇｆｐ△コード配列のいずれも、機能的ＥｍＧＦＰコード配列と交換されなかったことを示した。対照的に、ＥｍＧＦＰ  ＤＮＡおよびｐＺＦＮ．ｇｆｐにより形質転換されたコロニーの約２０％は、緑色に見え、ｃＰＣＲによって観察された組み込み事象の頻度とおよそ関係した。
【０１２９】
これらの結果は、宿主細胞のゲノムにおける複数の標的二本鎖切断の誘発が、外因性のドナー核酸の同時の複数の標的組み込みを促進することができることを実証する。
【０１３０】
７．３  実施例３：アモルファジエン産生株へのファルネセン産生株の変換を促進するためのテルペンシンターゼ遺伝子の同時の複数の組み込み
本実施例は、高メバロン酸経路フラックスのために遺伝子操作されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主の３つの異なる遺伝子操作された遺伝子座での３つのセスキテルペンシンターゼ遺伝子の同時の組み込みを実証する結果を提供する。その結果として、ファルネセンを産生し、ファルネセンシンターゼ遺伝子のプラスミドベースのコピーを含む親株は、アモルファジエンシンターゼの複数のゲノム組み込みコピーを含むアモルファジエン産生株に変換された。手短に言えば、Ｆ−ＣｐｈＩ部位が側面に位置するＵＲＡ３、ＮａｔＲ、およびＫａｎＲマーカーカセットを、宿主株の、それぞれ、Ｇａｌ８０、ＨＸＴ３、およびＭａｔα遺伝子座で組み込ませた。その後、宿主は、Ｆ−ＣｐｈＩエンドヌクレアーゼをコードするプラスミドならびにそれぞれ、それらのそれぞれの標的遺伝子座に対する相同性領域が側面に位置する、Ｇａｌ１プロモーターから発現され、ＣＹＣ１ターミネーターによって終結するアモルファジエンシンターゼ（ＡＤＳ）遺伝子（ＡＤＳカセット）の別個のコドン最適化を含有する３つの線状「ドナー」ＤＮＡ構築物により同時形質転換した。形質転換されたコロニーは、ＡＤＳカセットとの、１つ、２つ、または３つのゲノム組み込み標的マーカー遺伝子座の交換について、コロニーＰＣＲ（ｃＰＣＲ）によってスクリーニングした。三重に組み込まれた株を同定し、第４のＡＤＳカセットを組み込むことによってさらに遺伝子操作し、結果として生じる株は、ファルネセンシンターゼをコードするプラスミドの損失を可能にする条件下で培養し、その結果、その産物プロファイルは、ファルネセンからアモルファジエンに完全に変換された。
【０１３１】
７．３．１．  親ファルネセン産生株の構築
アモルファジエンシンターゼをコードする外因性のドナーＤＮＡの複数の同時の組み込みに有用なファルネセン産生酵母株、Ｙ３６３９を、以下のように調製した。
【０１３２】
株Ｙ９３（ＭＡＴ  Ａ）およびＹ９４（ＭＡＴアルファ）は、それぞれ、酵母菌株Ｙ００２およびＹ００３（それぞれ、ＣＥＮ．ＰＫ２バックグラウンドＭＡＴ  ＡまたはＭＡＴアルファ；ｕｒａ３−５２；ｔｒｐ１−２８９；ｌｅｕ２−３，１１２；ｈｉｓ３△１；ＭＡＬ２−８Ｃ；ＳＵＣ２；ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎら（２０００）Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ２６：７０６−７１４）のＥＲＧ９遺伝子のプロモーターを、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭＥＴ３遺伝子のプロモーターと交換することによって生成した。この目的のために、指数関数的に成長しているＹ００２およびＹ００３細胞は、ＥＲＧ９上流および下流配列が側面に位置する、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓのＴｅｆ１遺伝子のプロモーターおよびターミネーターが側面に位置するカナマイシン抵抗性マーカー（ＫａｎＭＸ）、ＥＲＧ９コード配列、ＥＲＧ９プロモーターの切断型セグメント（ｔｒｕｎｃ．ＰＥＲＧ９）、ならびにＭＥＴ３プロモーター（ＰＭＥＴ３）を含んだ組み込み構築物ｉ８（配列番号：１４）により形質転換した。宿主細胞形質転換体は、０．５μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含む培地上で選択し、選択されたクローンは、診断用ＰＣＲによって確認し、株Ｙ９３およびＹ９４が得られた。
【０１３３】
株Ｙ１７６（ＭＡＴ  Ａ）およびＹ１７７（ＭＡＴアルファ）は、それぞれ、株Ｙ９３およびＹ９４におけるＡＤＥ１遺伝子のコード配列を、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａのＬＥＵ２遺伝子（ＣｇＬＥＵ２）のコード配列と交換することによって生成した。この目的のために、３．５ｋｂ  ＣｇＬＥＵ２ゲノム遺伝子座は、プライマー６１−６７−ＣＰＫ０６６−Ｇ（配列番号：１５）および６１−６７−ＣＰＫ０６７−Ｇ（配列番号：１６）を使用し、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）からＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物を指数関数的に成長しているＹ９３およびＹ９４細胞の中に形質転換した。宿主細胞形質転換体は、ＣＳＭ−Ｌ上で選択し、選択されたクローンは、診断用ＰＣＲによって確認し、株Ｙ１７６およびＹ１７７が得られた。
【０１３４】
株Ｙ１８８は、株Ｙ１７６の中に、それぞれ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子のガラクトース誘発性プロモーターの調節性の制御下にある、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ１３、ＥＲＧ１０、およびＥＲＧ１２遺伝子のコード配列ならびにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨＭＧ１遺伝子の切断型コード配列のさらなるコピーを導入することによって生成した。この目的のために、指数関数的に成長しているＹ１７６細胞を、ＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）により消化した、２μｇの発現プラスミドｐＡＭ４９１およびｐＡＭ４９５により形質転換した。宿主細胞形質転換体は、ウラシルおよびヒスチジンを欠くＣＳＭ（ＣＳＭ−Ｕ−Ｈ）上で選択し、選択されたクローンは、診断用ＰＣＲによって確認し、株Ｙ１８８が得られた。
【０１３５】
株Ｙ１８９は、株Ｙ１７７の中に、それぞれ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子のガラクトース誘発性プロモーターの調節性の制御下にある、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ２０、ＥＲＧ８、およびＥＲＧ１９遺伝子のコード配列ならびにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨＭＧ１遺伝子の切断型コード配列のさらなるコピーを導入することによって生成した。この目的のために、指数関数的に成長しているＹ１８８細胞を、ＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化した、２μｇの発現プラスミドｐＡＭ４８９およびｐＡＭ４９７により形質転換した。宿主細胞形質転換体は、トリプトファンおよびヒスチジンを欠くＣＳＭ（ＣＳＭ−Ｔ−Ｈ）上で選択し、選択されたクローンは、診断用ＰＣＲによって確認し、株Ｙ１８９が得られた。
【０１３６】
株Ｙ２３８は、株Ｙ１８８およびＹ１８９を交配し、それぞれ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子のガラクトース誘発性プロモーターの調節性の制御下にある、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＩＤＩ１遺伝子のコード配列ならびにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨＭＧ１遺伝子の切断型コード配列のさらなるコピーを導入することによって生成した。この目的のために、株Ｙ１８８およびＹ１８９のおよそ１×１０７細胞を、室温で６時間ＹＰＤ培地プレート上で混合し、二倍体細胞をＣＳＭ−Ｈ−Ｕ−Ｔ上で選択し、指数関数的に成長している二倍体を、ＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化した２μｇの発現プラスミドｐＡＭ４９３により形質転換した。宿主細胞形質転換体は、アデニンを欠くＣＳＭ（ＣＳＭ−Ａ）上で選択し、選択されたクローンは、診断用ＰＣＲによって確認し、株Ｙ２３８が得られた。
【０１３７】
株Ｙ２１０（ＭＡＴ  Ａ）およびＹ２１１（ＭＡＴアルファ）は、株Ｙ２３８を胞子にすることによって生成した。二倍体細胞は、２％酢酸カリウムおよび０．０２％ラフィノース液体培地中で胞子になり、Ｓｉｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＭＳＭ３００マイクロマニピュレータ（Ｓｉｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ，  ＬＴＤ．  Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、ＵＫ）を使用して、およそ２００の遺伝的四分子（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｅｔｒａｄ）が単離された。胞子は、ＣＳＭ−Ａ−Ｈ−Ｕ−Ｔ上で選択し、選択されたクローンは、診断用ＰＣＲによって確認し、株Ｙ２１０（ＭＡＴ  Ａ）およびＹ２１１（ＭＡＴアルファ）が得られた。
【０１３８】
株Ｙ２２１は、ベクターｐＡＭ１７８により、指数関数的に成長しているＹ２１１細胞を形質転換することによって生成した。宿主細胞形質転換体は、ＣＳＭ−Ｌ上で選択した。
【０１３９】
株Ｙ２９０は、株Ｙ２２１のＧＡＬ８０遺伝子のコード配列を欠失させることによって生成した。この目的のために、指数関数的に成長しているＹ２２１細胞は、ＧＡＬ８０上流および下流配列が側面に位置する、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓのＴｅｆ１遺伝子のプロモーターおよびターミネーターが側面に位置するヒグロマイシンＢ抵抗性マーカー（ｈｐｈ）を含んだ組み込み構築物ｉ３２（配列番号：１７）により形質転換した。宿主細胞形質転換体は、ヒグロマイシンＢを含む培地上で選択し、選択されたクローンは、診断用ＰＣＲによって確認し、株Ｙ２９０が得られた。
【０１４０】
株Ｙ３１８は、ロイシンリッチ培地における一連の増殖によって、株Ｙ２９０からｐＡＭ１７８ベクターを除去し、ＣＳＭ−Ｌ上でそれらが成長することができない個々のコロニーを試験することによって生成し、株Ｙ３１８が得られた。
【０１４１】
株Ｙ４０９は、β−ファルネセンシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を株Ｙ３１８の中に導入することによって生成した。この目的のために、指数関数的に成長しているＹ３１８細胞を、発現プラスミドｐＡＭ４０４により形質転換した。宿主細胞形質転換体は、ＣＳＭ−Ｌ上で選択し、株Ｙ４０９が得られた。
【０１４２】
株Ｙ４１９は、株Ｙ４０９のＧＡＬプロモーターを恒常的に活性にすることによって生成した。この目的のために、指数関数的に成長しているＹ４０９細胞は、修飾ＥＲＧ９プロモーターおよびコード配列の上流および下流配列が側面に位置する、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓのＴｅｆ１遺伝子のプロモーターおよびターミネーターが側面に位置する、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｕｒｓｅｉのノーセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）抵抗性マーカー（ＮａｔＲ）ならびにその天然のプロモーターの「適切に作用する恒常的」バージョン（ＰＧＡＬ４ｏｃ；  Ｇｒｉｇｇｓ  ＆  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８（１９）：８５９７−８６０１）およびＧＡＬ４ターミネーター（ＴＧＡＬ４）の調節性の制御下のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ４遺伝子のコード配列を含んだ組み込み構築物ｉ３３（配列番号：１８）により形質転換した。宿主細胞形質転換体は、ノーセオトリシンを含む培地上で選択し、選択されたクローンは、診断用ＰＣＲによって確認し、株Ｙ４１９が得られた。
【０１４３】
株Ｙ６７７は、株Ｙ４１９の修飾ＧＡＬ８０遺伝子座に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１遺伝子のプロモーターの調節性の制御下のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ１２遺伝子のコード領域のさらなるコピーを導入することによって生成した。この目的のために、指数関数的に成長しているＹ６７７細胞は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓのＴｅｆ１遺伝子のプロモーターおよびターミネーターが側面に位置する、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｕｒｓｅｉのカナマイシン抵抗性マーカー（ＫａｎＲ）ならびにＧＡＬ１プロモーター（ＰＧＡＬ１）およびＥＲＧ１２ターミネーター（ＴＥＲＧ１２）が側面に位置する、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ１２遺伝子のコード配列およびターミネーター配列を含んだ組み込み構築物ｉ３７（配列番号：１９）により形質転換した。宿主細胞形質転換体は、カナマイシンを含む培地上で選択し、選択されたクローンは、診断用ＰＣＲによって確認し、株Ｙ６７７が得られた。
【０１４４】
株Ｙ１５５１は、化学的突然変異誘発によって株Ｙ６７７から生成した。突然変異した株は、β−ファルネセンの産生の増加についてスクリーニングし、株Ｙ１５５１が得られた。
【０１４５】
株Ｙ１７７８は、化学的突然変異誘発によって株Ｙ１５５１から生成した。突然変異した株は、β−ファルネセンの産生の増加についてスクリーニングし、株Ｙ１７７８が得られた。
【０１４６】
株Ｙ１８１６は、株Ｙ１７７８のＨＸＴ３コード配列を、一方がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来し、他方がＣ．ｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来であるアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼコード配列の２つのコピーならびにＢ．ｊｕｎｃｅａのＨＭＧＳ遺伝子のコード配列の１つのコピーと交換することによって生成した。この目的のために、指数関数的に成長しているＹ１７７８細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨＸＴ３遺伝子の上流および下流配列が側面に位置する、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓのＴｅｆ１遺伝子のプロモーターおよびターミネーターが側面に位置するヒグロマイシンＢ抵抗性マーカー（ｈｙｇ）、切断型ＴＤＨ３プロモーター（ｔＰＴＤＨ３）およびＡＨＰ１ターミネーター（ＴＡＨＰ１）が側面に位置するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ１０遺伝子のコード配列、ＹＰＤ１プロモーター（ＰＹＰＤ１）およびＣＣＷ１２ターミネーター（ＴＣＣＷ１２）が側面に位置する、Ｃ．ｂｕｔｙｌｉｃｕｍのアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子のコード配列（チオラーゼ）、ならびにＴＵＢ２プロモーター（ＰＴＵＢ２）が先行する、Ｂ．ｊｕｎｃｅａのＨＭＧＳ遺伝子のコード配列（ＨＭＧＳ）を含んだ組み込み構築物ｉ３０１（配列番号：２０）により形質転換した。宿主細胞形質転換体は、ヒグロマイシンＢを含む培地上で選択し、選択されたクローンは、診断用ＰＣＲによって確認し、株Ｙ１８１６が得られた。
【０１４７】
株Ｙ２０５５は、化学的突然変異誘発によって株Ｙ１７７８から生成した。突然変異株は、β−ファルネセンの産生の増加についてスクリーニングし、株Ｙ２０５５が得られた。
【０１４８】
株Ｙ２２９５は、化学的突然変異誘発によって株Ｙ２０５５から生成した。突然変異株は、β−ファルネセンの産生の増加についてスクリーニングし、株Ｙ２２９５が得られた。
【０１４９】
株Ｙ３１１１は、株Ｙ２２９５の交配型をＭＡＴ  ＡからＭＡＴアルファに切り替えることによって生成した。この目的のために、指数関数的に成長しているＹ２２９５細胞は、ＭＡＴアルファ交配遺伝子座およびヒグロマイシンＢ抵抗性マーカー（ｈｙｇＡ）を含んだ組み込み構築物ｉ４７６（配列番号：２１）により形質転換した。宿主細胞形質転換体は、ヒグロマイシンＢを含む培地上で選択し、選択されたクローンは、診断用ＰＣＲによって確認し、株Ｙ３１１１が得られた。
【０１５０】
株Ｙ２１６８は、化学的突然変異誘発によって株Ｙ１８１６から生成した。突然変異株は、β−ファルネセンの産生の増加についてスクリーニングし、株Ｙ２１６８が得られた。
【０１５１】
株Ｙ２４４６は、化学的突然変異誘発によって株Ｙ２１６８から生成した。突然変異株は、β−ファルネセンの産生の増加についてスクリーニングし、株Ｙ２４４６が得られた。
【０１５２】
株Ｙ３１１８は、株Ｙ２４４６の天然のＵＲＡ３遺伝子座の中に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ８０遺伝子のコード配列、プロモーター、およびターミネーターを挿入することによって生成した。この目的のために、指数関数的に成長しているＹ２４４６細胞は、オーバーラップＵＲＡ３配列（これは、相同組換えによるＧＡＬ８０遺伝子のループアウトによる切り取りおよびもとのＵＲＡ３配列の復原を可能にする）が側面に位置する、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ８０遺伝子のプロモーター、ターミネーター、およびコード配列（ＧＡＬ８０）を含んだ組み込み構築物ｉ４７７（配列番号：２２）により形質転換した。宿主細胞形質転換体は、５−ＦＯＡを含む培地上で選択し、株Ｙ３１１８が得られた。
【０１５３】
株Ｙ３２１５は、株Ｙ３１１１およびＹ３１１８を交配することによって生成した。株Ｙ３１１１およびＹ３１１８のおよそ１×１０７細胞を、交配を可能にするために、室温で６時間ＹＰＤ培地プレート上で混合し、その後、ＹＰＤ寒天プレート上での平板培養を続け、単一のコロニーを単離した。二倍体は、ｈｐｈＡによりマークされたＭＡＴアルファ遺伝子座および野生型ＭＡＴ  Ａ遺伝子座の両方の存在について、コロニーＰＣＲによってスクリーニングすることによって同定した。
【０１５４】
株Ｙ３０００は、株Ｙ３２１５を胞子にし、ＧＡＬ８０コード配列をループアウトすることによって生成した。二倍体細胞は、２％酢酸カリウムおよび０．０２％ラフィノース液体培地中で胞子になった。無作為の胞子を、単離し、ＹＰＤ寒天上で平板培養し、３日間成長させ、その後、ＧＡＬ８０を欠く（すなわち、機能的ＵＲＡ３遺伝子を有する）細胞のみの成長を可能にするＣＳＭ−Ｕ上でレプリカ平板培養した（ｒｅｐｌｉｃａ−ｐｌａｔｅ）。その後、胞子は、β−ファルネセン産生について試験し、最良の産生株を同定し、組み込み構築物ｉ３０１の存在は、診断用ＰＣＲによって確認し、株Ｙ３０００が得られた。
【０１５５】
株Ｙ３２８４は、株Ｙ３０００からＵＲＡ３マーカーを除去することによって生成した。この目的のために、指数関数的に成長しているＹ３０００細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＵＲＡ３遺伝子の上流および下流配列が側面に位置する、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子のガラクトース誘発性プロモーターの制御下の、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａのｈｉｓＧコード配列ならびにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ１３遺伝子のコード配列およびＨＭＧ１遺伝子の切断型コード配列を含んだ組み込み構築物ｉ９４（配列番号：２３）により形質転換した。宿主細胞形質転換体は、５−ＦＯＡを含む培地上で選択し、選択されたクローンは、診断用ＰＣＲによって確認し、株Ｙ３２８４が得られた。
【０１５６】
株Ｙ３３８５は、株Ｙ３２８４のＮＤＴ８０コード配列を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアセチル−ＣｏＡシンテターゼ遺伝子のコード配列およびＺ．ｍｏｂｉｌｉｓのＰＤＣ遺伝子のコード配列のさらなるコピーと交換することによって生成した。この目的のために、指数関数的に成長しているＹ３３８５細胞は、上流および下流ＮＤＴ８０配列が側面に位置するＵＲＡ３マーカー、ＨＸＴ３プロモーター（ＰＨＸＴ３）およびＰＧＫ１ターミネーター（ＴＰＧＫ１）が側面に位置する、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＣＳ２遺伝子のコード配列（ＡＣＳ２）、ならびにＧＡＬ７プロモーター（ＰＧＡＬ７）およびＴＤＨ３ターミネーター（ＴＴＤＨ３）が側面に位置する、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓのＰＤＣ遺伝子のコード配列（ｚｍＰＤＣ）を含んだ組み込み構築物ｉ４６７（配列番号：２４）により形質転換した。宿主細胞形質転換体は、ＣＳＭ−Ｕ上で選択し、選択されたクローンは、診断用ＰＣＲによって確認し、株Ｙ３３８５が得られた。
【０１５７】
株Ｙ３５４７は、化学的突然変異誘発によって株Ｙ３３８５から生成した。突然変異した株は、β−ファルネセンの産生の増加についてスクリーニングし、株Ｙ３５４７が得られた。
【０１５８】
株Ｙ３６３９は、化学的突然変異誘発によって株Ｙ３５４７から生成した。突然変異した株は、β−ファルネセンの産生の増加についてスクリーニングし、株Ｙ３６３９が得られた。
【０１５９】
７．３．２．  標的ＤＮＡの構築および組み込み
ＦｃｐｈＩエンドヌクレアーゼ媒介性の二本鎖切断のための外因性のゲノム標的部位を、株Ｙ３６３９の３つの異なる遺伝子座の中に組み込んだ。３つの標的部位カセットは、それぞれ、ＦｃｐｈＩエンドヌクレアーゼについての認識配列ならびにそれぞれ、（１）ＵＲＡ３（修飾Ｇａｌ８０遺伝子座に対する相同性領域が側面に位置する）（配列番号：２５）；（２）ＮａｔＲ（修飾ＨＸＴ３遺伝子座に対する相同性領域が側面に位置する）（配列番号：２６）；および（３）ＫａｎＲ（修飾Ｍａｔα遺伝子座に対する相同性領域が側面に位置する）（配列番号：２７）についてのコード配列を含んだオーバーラップ断片のＰＣＲアセンブリを使用して構築した。標的部位カセットは、それぞれ、Ｙ３６３９の中に連続的に形質転換し、株は、正確な遺伝子座に、Ｆ−ＣｐｈＩが側面に位置するマーカーカセットの３つの組み込みコピーを有することを、コロニーＰＣＲによって確認した（「株Ｂ」）。
【０１６０】
７．３．３．  Ｆ−ＣｐｈＩ酵母発現プラスミドの構築
ＨｙｇＲ選択マーカーを含むＦ−ＣｐｈＩ酵母発現プラスミドｐＡＭ１７９９は、その全体が参照によってこれによって組み込まれる米国特許第７，９１９，６０５号明細書において以前に記載される。
【０１６１】
７．３．４．  ドナーＤＮＡによる形質転換および二本鎖切断の誘発
標準的な酢酸リチウム／ＳＳＤＮＡ／ＰＥＧプロトコール（Ｇｉｅｔｚ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２００２；３５０：８７−９６）は、４２度での熱ショックの前に、細胞の３０分間の３０度でのインキュベーションを含むように修飾した。この方法は、ＦｃｐｈＩエンドヌクレアーゼをコードするｐＡＭ１７９９ならびにそれぞれ、株Ｂの、それぞれ、修飾Ｇａｌ８０（配列番号：２８）、ＨＸＴ３（配列番号：２９）、およびＭａｔα遺伝子座（配列番号：３０）に対する相同性領域が側面に位置するクソニンジンのアモルファジエンシンターゼ（ＡＤＳ）についてのコドン最適化コード配列を含む３つの線状「ドナー」ＤＮＡにより株Ｂを同時形質転換するために使用した。
【０１６２】
１マイクログラムのｐＡＭ１７９９を、約１００ｎｇのそれぞれのＡＤＳドナーＤＮＡと共に同時形質転換した。形質転換はすべて、Ｆ−ＣｐｈＩ発現を誘発するためにＹＰ＋２％ガラクトース中で一晩回復させた。様々な希釈液を、ヒグロマイシンを含有するＹＰＤ寒天プレート上で平板培養し、プラスミドＤＮＡにより形質転換されたコロニーを選択した。プレートは、３０℃で３日間培養した。
【０１６３】
７．３．５．  複数の同時の組み込みについての確認
コロニーＰＣＲ（ｃＰＣＲ）は、ＡＤＳカセットコード配列とのＦ−ＣｐｈＩが側面に位置するマーカーカセットコード配列の交換の頻度を決定するために実行した。ＤＮＡは、それぞれＡＤＳおよびＧａｌ８０遺伝子座、ＡＤＳおよびＨＸＴ３遺伝子座、ならびにＡＤＳおよびＭａｔα遺伝子座に対して特異的なプライマー対によりプローブした２０コロニーから準備し、その結果、それぞれの遺伝子座でのＡＤＳカセットコード配列の組み込みの成功により、予測されるサイズの増幅産物が産生されることが予想され、非組み込みによっては、増幅産物を産生しないことが予想された。それぞれの遺伝子座の５’および３’末端から増幅産物を産生するためのＰＣＲ反応は、マルチプレックスで試みた。いくつかの場合において、５’または３’増幅産物のみが検出に成功したが、ＡＤＳカセットの適切な組み込みは、より大きなＰＣＲ断片を配列決定することによってこれらの遺伝子座で確認された。
【０１６４】
【表３】
2014513535.tif 000005
ｃＰＣＲによってスクリーニングした２０コロニーのうち、１４が、Ｇａｌ８０遺伝子座で組み込まれたＡＤＳを有し、１７が、ＨＸＴ３遺伝子座で組み込まれたＡＤＳを有し、４つが、Ｍａｔα遺伝子座で組み込まれたＡＤＳを有した。Ｍａｔα遺伝子座での組み込みの低い率は、Ｆ−ＣｐｈＩ部位の側面に位置する定方向反復塩基配列によって媒介されるこの遺伝子座での自己閉環によって説明することができる。合計で、６つのクローンが、単一の部位で組み込まれたＡＤＳを有し、１０のクローンが、２つの部位で組み込まれたＡＤＳを有し、３つのクローンが、３つの遺伝子座すべてで組み込まれたＡＤＳを有した（「株Ｃ」）。三重に組み込まれた株は、両方の側面を包含する、より長いＰＣＲ産物を配列決定することによってさらに確認した。
【０１６５】
１．１．５  組み込まれたＡＤＳ株の完成およびセスキテルペンアッセイ
三重に組み込まれたＡＤＳ株は、標準的なプロトコールを使用して、Ｈｉｓ３遺伝子座で、ＵＲＡカセット（配列番号：４０）によりマークされたＡＤＳの最終のコピーを組み込むことによってさらに遺伝子操作し、結果として生じる株を、この第４のコピーについて確認した（「株Ｄ」）。最終的に、Ｌｅｕ＋によりマークされた高コピーファルネセンシンターゼプラスミド（ｐＡＭ４０４）を失わせるために、株Ｄ細胞を、非選択的培地中で継代培養した（「株Ｅ」）。
【０１６６】
株Ｅのいくつかの分離株は、株Ｄおよびもとの親株Ｂと一緒にセスキテルペン産生についてアッセイした。手短に言えば、株Ｂ、Ｄ、およびＥの分離株は、ウェル当たり２％スクロースと共に３６０μＬのＢｉｒｄ  Ｓｅｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＢＳＭ）を含有する９６ウェルプレートの別々のウェル中でインキュベートした（前培養）。９９９ｒｐｍの撹拌による３３．５℃での３日間のインキュベーションの後に、１４．４μＬのそれぞれのウェルを、４％スクロースと共に３６０μＬの新鮮なＢＳＭを含有する新しい９６ウェルプレートのウェルの中に接種した（産生培養）。９９９ｒｐｍの撹拌による３３．５℃でのさらに２日間のインキュベーションの後に、試料は、採取し、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析によってセスキテルペン産生について分析した。試料は、メタノール−ヘプタン（１：１  ｖ／ｖ）により抽出し、混合物は、細胞性の物質を除去するために遠心分離した。メタノール−ヘプタン抽出物の一定分量をヘプタン中に希釈し、その後、パルスドスプリット注入を使用して、メチルシリコーン固定相に注入した。ファルネセンおよびアモルファジエンは、水素炎イオン化検出（ＦＩＤ）と共にＧＣを使用して、沸点によって分離した。トランス−β−カリオフィレンは、特定のＧＣオーブンプロファイルの間の注入および溶離の成功についてモニターするために、保持時間マーカーとして使用した。
【０１６７】
図７において示されるように、セスキテルペン産生合計は、すべての株についてほとんど同様のままであった（３〜３．５ｇ／Ｌ）が、産物プロファイルは、ファルネセン（株Ｂ）〜混合産物（株Ｄ）〜アモルファジエン（株Ｅ）の変換に成功した。
【０１６８】
これらの結果は、宿主細胞のゲノムにおける複数の標的二本鎖切断の誘発が、機能的遺伝子カセットの同時の複数の組み込みを促進することができることを実証し、この場合、１回の形質転換におけるアモルファジエン産生株へのファルネセン産生株の変換を促進する。
【０１６９】
７．４  実施例４：ファルネセンシンターゼの複数の組み込みコピーの、アモルファジエンシンターゼとの同時の交換
本実施例は、４つのゲノムで組み込まれたテルペンシンターゼ遺伝子の同時の交換が、シンターゼコード領域内のデザイナーヌクレアーゼ誘発性の二本鎖切断によって促進されたことを実証する結果を提供する。手短に言えば、株Ｙ３６３９（実施例３において記載される）から誘導したが、ファルネセンシンターゼ（ＦＳ）遺伝子の４つの、染色体外コピーではなく組み込みコピーを含む、既存のファルネセン産生株を、デザイナーＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）をコードするプラスミドおよび新しいテルペンシンターゼ遺伝子をコードする４つの線状ドナーＤＮＡにより同時形質転換した。デザイナーＴＡＬＥＮは、組み込まれたファルネセンシンターゼ遺伝子に対して特有の配列に結合し、切断することができる。形質転換されたコロニーは、コロニーＰＣＲ（ｃＰＣＲ）によってスクリーニングし、１、２、３、または４つのゲノムで組み込まれた標的マーカー遺伝子座を有する株を同定した。
【０１７０】
７．４．１．  標的ＤＮＡの構築および組み込み
そのそれぞれの標的遺伝子座に対する相同性領域（約５００ｂｐ）が側面に位置するテルペンシンターゼコード配列をそれぞれが含む４つのドナーカセットを、オーバーラップＰＣＲによってアセンブルした。ドナーＤＮＡのうちの３つは、ＡＤＳコード配列を含み、また選択マーカーを含まなかった（配列番号４１〜４３）が、最終のドナーＤＮＡは、ＵＲＡ３マーカーカセット（配列番号：４４）に融合された、ファルネセンシンターゼ（ＦＳ）の新規なコドン最適化を含むカセットとした。ドナーＤＮＡのどれも、ＦＳ特異的ＴＡＬＥＮによって認識される標的部位を含有しなかった（５’−ＴＡＧＴＧＧＡＧＧＡＡＴＴＡＡＡＡＧＡＧＧＡＡＧＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＴＡＡＣＴＡＴＣＡＡ−３’（配列番号：４５））。
【０１７１】
株（株Ｆ）における４つの組み込みＦＳカセットの交換のために、ｈｙｇ＋によりマークされたＴＡＬＥＮプラスミドは、実施例３において記載されるプロトコールを使用して、約５００ｎｇのそれぞれの線状ドナーＤＮＡと共に宿主株の中に同時形質転換した。様々な希釈液を、ＣＳＭ−ＵＲＡ＋Ｈｙｇプレート上で平板培養し、３日間３０度でインキュベートした。
【０１７２】
７．４．２．  複数の同時の組み込みについての確認
ＴＡＬＥＮプラスミドの選択およびＣＳＭ−ＵＲＡ＋Ｈｙｇプレート上でのＵＲＡ３によりマークされたコドン−ＦＳカセットの組み込みの後に、コロニーＰＣＲは、３つの遺伝子座でのマークなしのＡＤＳカセットとの組み込みＦＳカセットの交換の頻度を決定するために実行した。ＤＮＡは、２０コロニーから準備し、ＮＤＴ８０、ＤＩＴ１、およびＥＲＧ１０遺伝子座でのＡＤＳカセットの組み込みについて特異的なプライマー対によりプローブし、その結果、それぞれの遺伝子座でのＡＤＳカセットコード配列の組み込みの成功により、予測されるサイズの増幅産物が産生されることが予想され、非組み込みによっては、増幅産物を産生しないことが予想された。
【０１７３】
【表４−１】
2014513535.tif 000006
検査した４８のクローンのうちの３つのクローンが、ＵＲＡ３によりマークされたＦＳに加えて単一のＡＤＳカセットを組み込み、１つのクローンが、２つのＡＤＳカセットを組み込み、１つのクローンが、３つのＡＤＳカセットをすべて組み込んだ。複数の組み込み結果は、両方の側面を包含する、より長いＰＣＲ産物を配列決定することによってさらに確認した。
【０１７４】
これらの結果は、生合成経路を含む宿主細胞における部位特異的デザイナーヌクレアーゼの発現が、１回の形質転換ステップにおいて、経路遺伝子の複数の組み込みコピーの、新しい経路遺伝子との同時の交換を促進することができることを実証する。
【０１７５】
７．５  実施例５：別個のデザイナーヌクレアーゼにより切断された２つの遺伝子座の中へのマーカーレスＤＮＡ構築物の同時の複数の組み込み
本実施例は、それぞれの部位が別個のデザイナーヌクレアーゼにより切断される、２つの天然の標的部位での２つのマーカーレスＤＮＡ構築物の同時の組み込みを実証する結果を提供する。手短に言えば、ＡＤＥ−宿主株は、（１）ＧＦＰカセットを含む線状ＤＮＡ断片（ＳＦＣ１遺伝子座に対して相同な上流および下流領域が側面に位置する）；（２）ＡＤＥ２カセットを含む線状ＤＮＡ断片（ＹＪＲ０３０ｃ遺伝子座に対して相同な上流および下流領域が側面に位置する）；ならびに（３）それぞれ天然のＳＦＣ１およびＹＪＲ０３０ｃオープンリーディングフレームにおける配列を標的にするデザイナーヌクレアーゼをコードするプラスミド（複数可）により同時形質転換した。プラスミド（複数可）についての選択の後に、形質転換されたコロニーは、ＧＦＰ蛍光および白色について視覚的にスクリーニングし、ＡＤＥ−表現型が補完されたことを示した。コロニーＰＣＲ（ｃＰＣＲ）もまた、両方の遺伝子座の交換を確認するために実行した。興味深いことには、デザイナーエンドヌクレアーゼを一緒に使用した場合に、単一のデザイナーヌクレアーゼのみを使用した場合の組み込みの率と比較して、両方の標的遺伝子座での組み込みの率における有意な改善が観察された。
【０１７６】
７．５．１．  ドナーＤＮＡカセットの構築
２つのドナーＤＮＡは、オーバーラップ断片：（１）ＳＦＣ１遺伝子座に対して相同な上流および下流領域の約５００ｂｐが側面に位置する、ＧＦＰカセットを含む線状ＤＮＡ断片（配列番号：５８）ならびに（２）ＹＪＲ０３０ｃ遺伝子座に対して相同な上流および下流領域の約５００ｂｐが側面に位置する、ＡＤＥ２カセットを含む線状ＤＮＡ断片（配列番号：５９）のＰＣＲアセンブリを使用して生成した。
【０１７７】
７．５．２．  ヘテロ二量体ＺＦＮ発現プラスミドの構築
ＹＪＲ０３０ｃ特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするプラスミドを、２つの方法で構築した。第１のバージョンにおいて、異なるＧａｌ１−１０プロモーターの発現下の、Ａｄｈ１およびＣＹＣ１ターミネーターによって終結するヘテロ二量体ＺＦＮの２つのＯＲＦを、酵母における３つの部分的なギャップ修復によって、ＫａｎによりマークされたＣＥＮ−ＡＲＳベクターの中にクローニングした（ｐＣＵＴ００６）。第２のバージョンもまた、構築し、ヘテロ二量体ＺＦＮの両方のＯＲＦを、単一のＯＲＦとしてＧａｌ１０プロモーターから発現させ、単量体は、切断可能なペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列によって分離される。この第２のプラスミドは、ＫａｎによりマークされたＣＥＮ−ＡＲＳベクター骨格への、ＰＣＲ断片のＩＩＳ型制限酵素消化物によって産生されるリンカーを使用する、３つの部分のライゲーションによって構築した（ｐＣＵＴ０１６）。ＳＦＣ１特異的ＺＦＮをコードするプラスミドもまた、同じリンカー戦略、マーカー、および骨格を使用して、単一のＯＲＦとして構築した（ｐＣＵＴ０１５）。その後、マーカーは、酵母におけるギャップ修復反応の手段によってＵＲＡに変更した（ｐＣＵＴ０５８）。ＹＪＲ０３０ｃおよびＳＦＣ１特異的ヌクレアーゼの両方の発現のための単一のプラスミドを構築するために、ｐＣＵＴ１６およびｐＣＵＴ１５由来の単一のＯＲＦを、新しいＣＥＮ−ＡＲＳ  Ｋａｎ＋ベクター骨格の中にサブクローニングし、Ｃｙｃ１およびＡｄｈ１ターミネーターと共に、Ｇａｌ１−１０の異なるプロモーターから発現させた（ｐＣＵＴ０３２）。
【０１７８】
７．５．１．  ドナーＤＮＡによる形質転換および二本鎖切断の誘発
１マイクログラムのそれぞれのデザイナーヌクレアーゼプラスミドＤＮＡまたは単一のプラスミド上に両方のデザイナーエンドヌクレアーゼを含有するプラスミドを、約１マイクログラムのそれぞれのドナーＤＮＡと共に同時形質転換した。形質転換はすべて、ヌクレアーゼ発現を誘発するためにＹＰ＋２％ガラクトース中で一晩回復させた。様々な希釈液は、ＵＲＡ  ｄｒｏｐｏｕｔ＋Ｋａｎ寒天プレート（２重のプラスミドについて）またはＹＰＤ＋Ｋａｎ上で平板培養し、プラスミドＤＮＡにより形質転換されたコロニーを選択した。プレートは、３０℃で３〜４日間インキュベートした。
【０１７９】
７．５．２．  複数の同時の組み込みについての確認
ＳＦＣ１遺伝子座でのマーカーレス組み込みは、適切なフィルターを使用して、ＵＶ光下のＧＦＰ蛍光の観察によってスコア化した。ＡＤＥ２のマーカーレス組み込みは、白いコロニー色の観察によってスコア化し、宿主株におけるＡＤＥ２欠失表現型（淡紅色のコロニー）が補完されたことを示した。典型的な実験において、５０〜１５０のコロニーをアッセイした。視覚的スコア化戦略は、プライマー、組み込み構築物の５’および内部リバースプライマーを使用して、コロニーＰＣＲによってコロニーのサブセットにおいて確認した。それぞれの遺伝子座での組み込みは、予測されるサイズの増幅産物を産生するが、非組み込みによっては、増幅産物を産生しないことが予想された。ｃＰＣＲ結果により、視覚的スコア化方法の正確性を確認した。
【０１８０】
【表４−２】
2014513535.tif 000007
図８において示されるように、ＳＦＣ１およびＹＪＲ０３０ｃ遺伝子座についての線状ドナーＤＮＡならびにＹＪＲ０３０ｃエンドヌクレアーゼプラスミド（ｐＣＵＴ００６）およびＳＦＣ１エンドヌクレアーゼプラスミド（ｐＣＵＴ０５８）により同時形質転換された細胞において、ＵＲＡ  ｄｒｏｐｏｕｔ＋Ｋａｎ寒天プレート上で選択されたコロニーの８０％が、ＧＦＰポジティブであった。これらのコロニーのうち、９１％が、ＡＤＥ２組み込みについてポジティブであった。全体で、コロニーの７２．８％が、両方の遺伝子座でドナーＤＮＡを組み込んだ。
【０１８１】
ＳＦＣ１遺伝子座についての線状ドナーＤＮＡおよびＳＦＣ１を標的にするデザイナーヌクレアーゼプラスミド（ｐＣＵＴ０１５）により同時形質転換された細胞において、細胞の５０％が、ＧＦＰについてポジティブであった。細胞がＹＪＲ０３０ｃ遺伝子座についての線状ドナーＤＮＡおよびＹＪＲ０３０ｃ遺伝子座を標的にするデザイナーヌクレアーゼプラスミド（ｐＣＵＴ０１６）により同時形質転換された場合、細胞の５％のみが、ＡＤＥ２組み込みについてポジティブであった。宿主細胞が、ＳＦＣ１およびＹＪＲ０３０ｃ遺伝子座についての線状ＤＮＡならびにＳＦＣ１／ＹＪＲ０３０ｃデザイナーヌクレアーゼプラスミド（ｐＣＵＴ０３２）により同時形質転換された場合、細胞の７６％がＧＦＰポジティブであり、６３％が、ＡＤＥ２ポジティブであった。それが、複数の部位がデザイナーエンドヌクレアーゼによって標的にされる場合に、組み込み効率における予想外に有意な改善を実証するという点においてこの結果は注目すべきである。
【０１８２】
これらの結果は、宿主細胞のゲノムにおける天然の遺伝子座での複数の標的二本鎖切断の誘発が、機能的遺伝子カセットの同時の複数のマーカーレスの組み込みを促進することができることを実証する。
【０１８３】
本明細書において引用される刊行物、特許、および特許出願はすべて、それぞれの個々の刊行物または特許出願が、参照によって組み込まれるように明確にかつ個々に示されるかのように、参照によって本明細書において組み込まれる。前述の発明は、理解の明瞭さのために例証および実施例として詳細に記載されたが、添付の請求項の精神または範囲から逸脱することなく、ある変更および修飾がなされてもよいことは、本発明の教示を考慮して当業者らに容易に明らかになるであろう。
【図１】
2014513535.tif 000008
【図２】
2014513535.tif 000009
【図４】
2014513535.tif 000010
【図３】
2014513535.tif 000011
【図５】
2014513535.tif 000012
【図６】
2014513535.tif 000013
【図７】
2014513535.tif 000014
【図８】
2014513535.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成25年12月25日(2013.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞ゲノムの複数（ｎ個）の標的部位に複数（ｎ個）の外因性の核酸を同時に組み込むためのインビトロでの方法であって、ここで、ｎは少なくとも２であり、前記方法は：
（ａ）宿主細胞を、
（ｉ）前記複数の外因性の核酸であって、ここで、ｘは、１〜ｎで変動する整数であり、そして、それぞれの整数ｘにつき、外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘを含み、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、前記宿主細胞ゲノムの前記複数（ｎ個）の標的部位から選択された標的部位（ＴＳ）ｘで（ＥＳ）ｘの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数の外因性の核酸；ならびに
（ｉｉ）それぞれの前記標的部位（ＴＳ）ｘについて、（ＴＳ）ｘで切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘであって、前記切断が、（ＴＳ）ｘでの（ＥＳ）ｘの相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼと同時に接触させるステップ；ならびに
（ｂ）宿主細胞を回収するステップであって、外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、その選択された標的配列（ＴＳ）ｘで組み込まれている、ステップ
を含む、方法。
【請求項２】
宿主細胞であって、前記宿主細胞は：
（ａ）複数（ｎ個）のゲノムの標的部位であって、ここで、ｎは少なくとも２である、ゲノムの標的部位；
（ｂ）複数（ｎ個）の外因性の核酸であって、ここで、ｘは、１〜ｎで変動する整数であり、そして、それぞれの整数ｘにつき、外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘを含み、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、前記複数（ｎ個）のゲノムの標的部位から選択された標的部位（ＴＳ）ｘで（ＥＳ）ｘの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、外因性の核酸；ならびに
（ｃ）それぞれの前記標的部位（ＴＳ）ｘについて、（ＴＳ）ｘで切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘであって、前記切断が、（ＴＳ）ｘでの（ＥＳ）ｘの相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼ
を含む、宿主細胞。
【請求項３】
宿主細胞であって、前記宿主細胞は：
（ａ）複数（ｎ個）のゲノムの標的部位であって、ここで、ｎは少なくとも２である、ゲノムの標的部位；ならびに
（ｂ）複数（ｎ個）の外因性の核酸であって、ここで、ｘは、１〜ｎで変動する整数であり、そして、それぞれの整数ｘにつき、外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘを含み、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、前記複数（ｎ個）のゲノムの標的部位から選択された標的部位（ＴＳ）ｘで（ＥＳ）ｘの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数の外因性の核酸を含み、
ここで、前記ゲノムの標的部位（ＴＳ）ｘは二本鎖切断を含む、
宿主細胞。
【請求項４】
（ＨＲ１）ｘが、（ＴＳ）ｘの５’領域に対して相同であり、（ＨＲ２）ｘが、（ＴＳ）ｘの３’領域に対して相同である、請求項１に記載の方法または請求項２もしくは３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
（Ｎ）ｘが、（ＴＳ）ｘの前記５’領域と前記３’領域との間に位置づけられる領域で切断することができる、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項６】
単一のヌクレアーゼが、それぞれの（ＴＳ）ｘを切断することができる、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項７】
ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、または１０である、請求項１および４〜６のいずれか一項に記載の方法または請求項２〜６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記回収するステップが、選択マーカーの組み込みを必要としない、請求項１および４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記回収するステップが、前記標的部位で切断することができるヌクレアーゼと前記宿主細胞を接触させないことと比較して、より高い頻度で起こる、請求項１および４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記回収するステップが、スクリーニングされた１０、９、８、７、６、５、４、３、または２つの接触宿主細胞またはそのクローン集団毎に約１の頻度で起こる、請求項１および４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
（Ｎ）ｘが、（ＴＳ）ｘ内の内因性のゲノム配列を切断することができる、請求項１および４〜１０のいずれか一項に記載の方法または請求項２および４〜７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
（Ｎ）ｘが、（ＴＳ）ｘ内の外因性の配列を切断することができる、請求項１および４〜１０のいずれか一項に記載の方法または請求項２および４〜７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記外因性の配列が、ホーミングエンドヌクレアーゼについての認識配列である、請求項１２に記載の方法または宿主細胞。
【請求項１４】
前記ホーミングエンドヌクレアーゼが、Ｆ−ｃｐｈＩである、請求項１３に記載の方法または宿主細胞。
【請求項１５】
（ＥＳ）ｘが、（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘをさらに含む、請求項１および４〜１４のいずれか一項に記載の方法または請求項２〜７および１１〜１４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
（Ｄ）ｘが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法または宿主細胞。
【請求項１７】
（ＥＳ）ｘが、線状である、請求項１および４〜１６のいずれか一項に記載の方法または請求項２〜７および１１〜１６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
（Ｎ）ｘが、（Ｎ）ｘをコードする核酸配列を含む発現ベクターとして提供される、請求項１および４〜１７のいずれか一項に記載の方法または請求項２および４〜７および１１〜１７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
（Ｎ）ｘが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）、トランスポザーゼ、および部位特異的レコンビナーゼからなる群から選択される、請求項１および４〜１８のいずれか一項に記載の方法または請求項２および４〜７および１１〜１８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
前記エンドヌクレアーゼが、内因性のゲノム配列に特異的に結合するように修飾され、修飾された前記エンドヌクレアーゼが、もはや、その野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合しない、請求項１９に記載の方法または宿主細胞。
【請求項２１】
前記エンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項１９または２０に記載の方法または宿主細胞。
【請求項２２】
前記エンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、またはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼに由来する、請求項１９または２０に記載の方法または宿主細胞。
【請求項２３】
前記宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、および動物細胞からなる群から選択される、請求項１および４〜２２のいずれか一項に記載の方法または請求項２〜７および１１〜２２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
前記宿主細胞が、酵母細胞である、請求項１および４〜２３のいずれか一項に記載の方法または請求項２〜７および１１〜２３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
前記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、請求項２４に記載の方法または宿主細胞。
【請求項２６】
宿主細胞ゲノムの複数（ｎ個）の標的部位に複数（ｎ個）の外因性の核酸を同時に組み込むためのインビトロでの方法であって、ここで、ｎは少なくとも２であり、前記方法は：
（ａ）宿主細胞を、
（ｉ）複数のライブラリであって、ここで、ｘは、１〜ｎで変動する整数であり、そして、それぞれの整数ｘにつき、ライブラリ（Ｌ）ｘが、それぞれ、複数の外因性の核酸を含み、各々の外因性の核酸が、５’から３’方向に、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘ、群（Ｄ）ｘから選択される目的の任意の核酸、および第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘを含み、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、前記宿主細胞ゲノムの標的部位（ＴＳ）ｘで選択された外因性の核酸の宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数のライブラリ；ならびに
（ｉｉ）それぞれの前記標的部位（ＴＳ）ｘについて、（ＴＳ）ｘで切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘであって、前記切断が、（ＴＳ）ｘでの（Ｌ）ｘ由来の外因性の核酸の相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼと同時に接触させるステップ；
ならびに
（ｂ）宿主細胞を回収するステップであって、それぞれのライブラリ（Ｌ）ｘ由来の外因性の核酸が、それぞれの選択された標的配列（ＴＳ）ｘで組み込まれている、ステップ
を含む、方法。
【請求項２７】
宿主細胞であって、前記宿主細胞は：
（ａ）複数（ｎ個）のゲノムの標的部位であって、ここで、ｎは少なくとも２である、ゲノムの標的部位；
（ｂ）複数のライブラリであって、ここで、ｘは、１〜ｎで変動する整数であり、そして、それぞれの整数ｘにつき、ライブラリ（Ｌ）ｘが、それぞれ、複数の外因性の核酸を含み、各々の外因性の核酸が、５’から３’方向に、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘ、群（Ｄ）ｘから選択される目的の任意の核酸、および第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘを含み、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、前記宿主細胞のゲノムの標的部位（ＴＳ）ｘで選択された外因性の核酸の宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数のライブラリ；ならびに
（ｃ）それぞれの前記標的部位（ＴＳ）ｘについて、（ＴＳ）ｘで切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘであって、前記切断が、（ＴＳ）ｘでの（Ｌ）ｘ由来の外因性の核酸の相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼ
を含む、宿主細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
特定の実施形態において、キットが、酵母ゲノムのおよそ６０００の遺伝子の遺伝子座のいずれかの内の特有の標的部位での外因性の核酸の部位特異的組み込みを可能にする。これらの実施形態において、ｎ≧６０００であり、（ＴＳ）ｘが、それぞれ、酵母細胞ゲノムの特異的な遺伝子座に対して特有である。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
宿主細胞ゲノムの中に複数の外因性の核酸を組み込むための方法であって、
（ａ）宿主細胞を、
（ｉ）複数の外因性の核酸であって、外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘを含み、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、上記宿主細胞ゲノムの標的部位（ＴＳ）ｘで（ＥＳ）ｘの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数の外因性の核酸；ならびに
（ｉｉ）それぞれの上記標的部位（ＴＳ）ｘについて、（ＴＳ）ｘで切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘであって、上記切断が、（ＴＳ）ｘでの（ＥＳ）ｘの相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼと接触させるステップ
ならびに
（ｂ）宿主細胞を回収するステップであって、選択された外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、それぞれの選択された標的配列（ＴＳ）ｘで組み込まれている、ステップを含み、
ｘが、１〜ｎの任意の整数であり、ｎが、少なくとも２である、方法。
（項目２）
（ＨＲ１）ｘが、（ＴＳ）ｘの５’領域に対して相同であり、（ＨＲ２）ｘが、（ＴＳ）ｘの３’領域に対して相同である、項目１に記載の方法。
（項目３）
（Ｎ）ｘが、（ＴＳ）ｘの上記５’領域と上記３’領域との間に位置づけられる領域で切断することができる、項目１に記載の方法。
（項目４）
単一のヌクレアーゼが、それぞれの（ＴＳ）ｘを切断することができる、項目１に記載の方法。
（項目５）
ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、または１０である、項目１に記載の方法。
（項目６）
上記回収するステップが、選択マーカーの組み込みを必要としない、項目１に記載の方法。
（項目７）
上記回収するステップが、上記標的部位で切断することができるヌクレアーゼと上記宿主細胞を接触させないことと比較して、より高い頻度で起こる、項目１に記載の方法。
（項目８）
上記回収するステップが、スクリーニングされた１０、９、８、７、６、５、４、３、または２つの接触宿主細胞またはそのクローン集団毎に約１の頻度で起こる、項目１に記載の方法。
（項目９）
上記回収するステップが、ＰＣＲ、サザンブロット、制限マッピング、およびＤＮＡ配列決定からなる群から選択される少なくとも１つの方法によって上記組み込みを同定することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
（Ｎ）ｘが、（ＴＳ）ｘ内の内因性のゲノム配列を切断することができる、項目１に記載の方法。
（項目１１）
（Ｎ）ｘが、（ＴＳ）ｘ内の外因性の配列を切断することができる、項目１に記載の方法。
（項目１２）
上記外因性の配列が、ホーミングエンドヌクレアーゼについての認識配列である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
上記ホーミングエンドヌクレアーゼが、Ｆ−ｃｐｈＩである、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
（ＥＳ）ｘが、（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
（Ｄ）ｘが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
（ＥＳ）ｘが、線状である、項目１に記載の方法。
（項目１７）
上記宿主細胞が、生合成経路の１つ以上の酵素をコードする１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
生合成経路の１つ以上の酵素をコードする上記１つ以上の異種ヌクレオチド配列が、ゲノムで組み込まれる、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
上記外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、生合成経路の酵素をコードする、（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘを含む、項目１に記載の方法。
（項目２０）
（Ｄ）ｘが、生合成経路の酵素の変異体をコードする、複数の核酸分子を含むライブラリ（Ｌ）ｘのメンバーである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
上記宿主細胞が、イソペンテニルピロリン酸を作製するためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１つ以上の酵素をコードする１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目２２）
上記メバロン酸経路の上記１つ以上の酵素が、アセチル−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼから選択される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
上記宿主細胞が、ＭＥＶ経路の酵素をそれぞれコードする複数の異種核酸を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
上記外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、テルペンシンターゼをコードする、（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘを含む、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
上記テルペンシンターゼが、モノテルペンシンターゼ、ジテルペンシンターゼ、セスキテルペンシンターゼ、セスタテルペンシンターゼ、トリテルペンシンターゼ、テトラテルペンシンターゼ、およびポリテルペンシンターゼからなる群から選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
（Ｎ）ｘが、（Ｎ）ｘをコードする核酸配列を含む発現ベクターとして提供される、項目１に記載の方法。
（項目２７）
（Ｎ）ｘが、精製タンパク質として上記宿主細胞の中に形質転換される、項目１に記載の方法。
（項目２８）
（Ｎ）ｘが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）、トランスポザーゼ、および部位特異的レコンビナーゼからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目２９）
上記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたＴｙｐｅＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
上記ＴｙｐｅＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼが、ＨＯエンドヌクレアーゼおよびＦｏｋ
Ｉエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
上記ジンクフィンガー結合ドメインが、３、５、または６つのジンクフィンガーを含む、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
上記エンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
上記エンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、またはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群から選択される、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
上記エンドヌクレアーゼが、内因性のゲノム配列に特異的に結合するように修飾され、修飾された上記エンドヌクレアーゼが、もはや、その野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合しない、項目２８に記載の方法。
（項目３５）
修飾された上記エンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼから誘導される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
修飾された上記エンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、またはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼから誘導される、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
上記宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、および動物細胞からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３８）
上記宿主細胞が、酵母細胞である、項目１に記載の方法。
（項目３９）
上記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
上記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞が、パン酵母、Ｍａｕｒｉ、Ｓａｎｔａ  Ｆｅ、ＩＺ−１９０４、ＴＡ、ＢＧ−１、ＣＲ−１、ＳＡ−１、Ｍ−２６、Ｙ−９０４、ＰＥ−２、ＰＥ−５、ＶＲ−１、ＢＲ−１、ＢＲ−２、ＭＥ−２、ＶＲ−２、ＭＡ−３、ＭＡ−４、ＣＡＴ−１、ＣＢ−１、ＮＲ−１、ＢＴ−１、またはＡＬ−１株のものである、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
項目１に記載の方法によって生成される宿主細胞。
（項目４２）
宿主細胞であって、上記宿主細胞は：
（ａ）複数の外因性の核酸であって、外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘを含み、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、上記宿主細胞ゲノムの標的部位（ＴＳ）ｘで（ＥＳ）ｘの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数の外因性の核酸；ならびに
（ｂ）それぞれの上記標的部位（ＴＳ）ｘについて、（ＴＳ）ｘで切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘであって、上記切断が、（ＴＳ）ｘでの（ＥＳ）ｘの相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼを含み、
ｘが、１〜ｎの任意の整数であり、ｎが、少なくとも２である、宿主細胞。
（項目４３）
（ＨＲ１）ｘが、（ＴＳ）ｘの５’領域に対して相同であり、（ＨＲ２）ｘが、（ＴＳ）ｘの３’領域に対して相同である、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目４４）
（Ｎ）ｘが、（ＴＳ）ｘの上記５’領域と上記３’領域との間に位置づけられる領域で切断することができる、項目３３に記載の宿主細胞。
（項目４５）
単一のヌクレアーゼが、それぞれの（ＴＳ）ｘを切断することができる、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目４６）
ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、または１０である、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目４７）
（Ｎ）ｘが、（ＴＳ）ｘ内の内因性のゲノム配列を切断することができる、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目４８）
（Ｎ）ｘが、（ＴＳ）ｘ内の外因性の配列を切断することができ、ｘが、１または１〜ｎの任意の整数である、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目４９）
上記外因性の配列が、ホーミングエンドヌクレアーゼについての認識配列である、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目５０）
上記ホーミングエンドヌクレアーゼが、Ｆ−ｃｐｈＩである、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目５１）
（ＥＳ）ｘが、（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘをさらに含む、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目５２）
（Ｄ）ｘが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群から選択される、項目５１に記載の宿主細胞。
（項目５３）
（ＥＳ）ｘが、線状である、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目５４）
上記宿主細胞が、生合成経路の１つ以上の酵素をコードする１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目５５）
生合成経路の１つ以上の酵素をコードする上記１つ以上の異種ヌクレオチド配列が、ゲノムで組み込まれる、項目５４に記載の宿主細胞。
（項目５６）
上記外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、生合成経路の酵素をコードする、（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘを含む、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目５７）
（Ｄ）ｘが、生合成経路の酵素の変異体をコードする、複数の核酸分子を含むライブラリ（Ｌ）ｘのメンバーである、項目５６に記載の宿主細胞。
（項目５８）
上記宿主細胞が、イソペンテニルピロリン酸を作製するためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１つ以上の酵素をコードする１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目５９）
上記メバロン酸経路の上記１つ以上の酵素が、アセチル−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼから選択される、項目５８に記載の宿主細胞。
（項目６０）
上記宿主細胞が、ＭＥＶ経路の酵素のそれぞれをコードする複数の異種核酸を含む、項目５８に記載の宿主細胞。
（項目６１）
上記外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、テルペンシンターゼをコードする、（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘを含む、項目５８に記載の宿主細胞。
（項目６２）
上記テルペンシンターゼが、モノテルペンシンターゼ、ジテルペンシンターゼ、セスキテルペンシンターゼ、セスタテルペンシンターゼ、トリテルペンシンターゼ、テトラテルペンシンターゼ、およびポリテルペンシンターゼからなる群から選択される、項目６１に記載の宿主細胞。
（項目６３）
（Ｎ）ｘが、（Ｎ）ｘをコードする核酸配列を含む発現ベクターとして提供される、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目６４）
（Ｎ）ｘが、精製タンパク質として上記宿主細胞の中に形質転換される、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目６５）
（Ｎ）ｘが、精製ＲＮＡとして宿主細胞の中に形質転換される、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目６６）
（Ｎ）ｘが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）、トランスポザーゼ、および部位特異的レコンビナーゼからなる群から選択される、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目６７）
上記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたＴｙｐｅＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である、項目６６に記載の宿主細胞。
（項目６８）
上記ＴｙｐｅＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼが、ＨＯエンドヌクレアーゼおよびＦｏｋ
Ｉエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、項目６７に記載の宿主細胞。
（項目６９）
上記ジンクフィンガー結合ドメインが、３、５、または６つのジンクフィンガーを含む、項目６７に記載の宿主細胞。
（項目７０）
上記エンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである、項目６６に記載の宿主細胞。
（項目７１）
上記エンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、またはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群から選択される、項目６６に記載の宿主細胞。
（項目７２）
上記エンドヌクレアーゼが、内因性の宿主細胞ゲノム配列に特異的に結合するように修飾され、修飾された上記エンドヌクレアーゼが、もはや、その野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合しない、項目６６に記載の宿主細胞。
（項目７３）
修飾された上記エンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼから誘導される、項目７２に記載の宿主細胞。
（項目７４）
修飾された上記エンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、またはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼから誘導される、項目７２に記載の宿主細胞。
（項目７５）
上記宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、および動物細胞からなる群から選択される、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目７６）
上記宿主細胞が、酵母細胞である、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目７７）
上記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、項目７６に記載の酵母細胞。
（項目７８）
上記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞が、パン酵母、Ｍａｕｒｉ、Ｓａｎｔａ  Ｆｅ、ＩＺ−１９０４、ＴＡ、ＢＧ−１、ＣＲ−１、ＳＡ−１、Ｍ−２６、Ｙ−９０４、ＰＥ−２、ＰＥ−５、ＶＲ−１、ＢＲ−１、ＢＲ−２、ＭＥ−２、ＶＲ−２、ＭＡ−３、ＭＡ−４、ＣＡＴ−１、ＣＢ−１、ＮＲ−１、ＢＴ−１、またはＡＬ−１株のものである、項目７７に記載の酵母細胞。
（項目７９）
キットであって、上記キットは：
（ａ）複数の外因性の核酸であって、外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、
（ｉ）第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘであって、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、酵母細胞ゲノムの選択される標的部位（ＴＳ）ｘで（ＥＳ）ｘの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘならびに
（ｉｉ）（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘを含む、複数の外因性の核酸、
（ｂ）複数のヌクレアーゼであって、ヌクレアーゼ（Ｎ）ｘが、それぞれ、（ＴＳ）ｘで切断することができ、上記切断が、（ＴＳ）ｘでの（ＥＳ）ｘの相同組換えをもたらす、複数のヌクレアーゼを含み、
ｘが、１〜ｎの任意の整数であり、ｎが、少なくとも２である、キット。
（項目８０）
複数のプライマー対（Ｐ）ｘをさらに含み、プライマー対が、それぞれ、ＰＣＲによって、（ＴＳ）ｘでの（ＥＳ）ｘの組み込みを同定することができる、項目７９に記載のキット。
（項目８１）
（ＨＲ１）ｘが、（ＴＳ）ｘの５’領域に対して相同であり、（ＨＲ２）ｘが、（ＴＳ）ｘの３’領域に対して相同である、項目７９に記載のキット。
（項目８２）
（Ｎ）ｘが、（ＴＳ）ｘの上記５’領域と上記３’領域との間に位置づけられる領域で切断することができる、項目７９に記載のキット。
（項目８３）
ｎ＝≧６０００であり、（ＴＳ）ｘが、それぞれ、上記酵母細胞ゲノムの特有の領域である、項目７９に記載のキット。
（項目８４）
（Ｎ）ｘが、（ＴＳ）ｘ内の内因性の酵母ゲノム配列を切断することができる、項目７９に記載のキット。
（項目８５）
（Ｎ）ｘが、（ＴＳ）ｘ内の外因性の配列を切断することができる、項目７９に記載のキット。
（項目８６）
（ＥＳ）ｘが、（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘをさらに含む、項目７９に記載のキット。
（項目８７）
（Ｄ）ｘが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群から選択される、項目８６に記載のキット。
（項目８８）
（ＥＳ）ｘが、線状である、項目７９に記載のキット。
（項目８９）
（ＥＳ）ｘが、環状である、項目７９に記載のキット。
（項目９０）
（Ｎ）ｘが、（Ｎ）ｘをコードする核酸配列を含む発現ベクターとして提供される、項目７９に記載のキット。
（項目９１）
（Ｎ）ｘが、精製タンパク質として提供される、項目７９に記載のキット。
（項目９２）
（Ｎ）ｘが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）、トランスポザーゼ、および部位特異的レコンビナーゼからなる群から選択される、項目７９に記載のキット。
（項目９３）
上記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたＴｙｐｅＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である、項目９２に記載のキット。
（項目９４）
上記ＴｙｐｅＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼが、ＨＯエンドヌクレアーゼおよびＦｏｋ  Ｉエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、項目９３に記載のキット。
（項目９５）
上記ジンクフィンガー結合ドメインが、３、５、または６つのジンクフィンガーを含む、項目９３に記載のキット。
（項目９６）
上記エンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである、項目９２に記載のキット。
（項目９７）
上記エンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、またはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群から選択される、項目９２に記載のキット。
（項目９８）
上記エンドヌクレアーゼが、内因性の酵母ゲノム配列に特異的に結合するように修飾され、修飾された上記エンドヌクレアーゼが、もはや、その野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合しない、項目９２に記載のキット。
（項目９９）
修飾された上記エンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼから誘導される、項目９８に記載のキット。
（項目１００）
修飾された上記エンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、またはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼから誘導される、項目９９に記載のキット。
（項目１０１）
酵母細胞ゲノムの標的部位の中への外因性の核酸のマーカーレス組み込みのための方法であって、上記方法は：
（ａ）酵母細胞を、
（ｉ）第１の相同性領域（ＨＲ１）１および第２の相同性領域（ＨＲ２）１を含む外因性の核酸（ＥＳ）１であって、（ＨＲ１）１および（ＨＲ２）１が、標的部位（ＴＳ）１で宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、外因性の核酸（ＥＳ）１ならびに
（ｉｉ）（ＴＳ）１で切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）１であって、上記切断が、（ＴＳ）１での（ＥＳ）１の相同組換えをもたらす、（ＴＳ）１で切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）１と接触させるステップ
ならびに
（ｂ）（ＴＳ）１で組み込まれた（ＥＳ１）を有する酵母細胞を回収するステップであって、上記回収するステップが、選択マーカーの組み込みを必要としない、ステップ、を含む、方法。
（項目１０２）
酵母細胞であって、
（ａ）第１の相同性領域（ＨＲ１）１および第２の相同性領域（ＨＲ２）１を含む外因性の核酸（ＥＳ）１であって、（ＨＲ１）１および（ＨＲ２）１が、上記酵母細胞のゲノムの標的部位（ＴＳ）１で宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、外因性の核酸（ＥＳ）１ならびに
（ｂ）（ＴＳ）１で切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）１であって、上記切断が、（ＴＳ）１での（ＥＳ）１の相同組換えをもたらす、（ＴＳ）１で切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）１を含み、
（ＥＳ）１が、選択マーカーを含まない、酵母細胞。
（項目１０３）
宿主細胞ゲノムの中に複数の外因性の核酸を組み込むための方法であって、
（ａ）宿主細胞を、
（ｉ）複数のライブラリであって、ライブラリ（Ｌ）ｘが、それぞれ、複数の外因性の核酸を含み、選択された外因性の核酸が、５’から３’方向に、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘ、群（Ｄ）ｘから選択される目的の任意の核酸、および第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘを含み、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、上記宿主細胞ゲノムの標的部位（ＴＳ）ｘで上記選択された外因性の核酸の宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数のライブラリならびに
（ｉｉ）それぞれの上記標的部位（ＴＳ）ｘについて、（ＴＳ）ｘで切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘであって、上記切断が、（ＴＳ）ｘでの上記選択された外因性の核酸の相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼと接触させるステップ
ならびに
（ｂ）宿主細胞を回収するステップであって、それぞれのライブラリ（Ｌ）ｘ由来の外因性の核酸が、それぞれの選択された標的配列（ＴＳ）ｘで組み込まれているステップを含み、
ｘが、１〜ｎの任意の整数であり、ｎが、少なくとも２である、方法。
（項目１０４）
宿主細胞であって、上記宿主細胞は：
（ａ）複数のライブラリであって、ライブラリ（Ｌ）ｘが、それぞれ、複数の外因性の核酸を含み、選択された外因性の核酸が、５’から３’方向に、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘ、群（Ｄ）ｘから選択される目的の任意の核酸、および第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘを含み、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、上記宿主細胞のゲノムの標的部位（ＴＳ）ｘで上記選択された外因性の核酸の宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、複数のライブラリ；ならびに
（ｂ）それぞれの上記標的部位（ＴＳ）ｘについて、（ＴＳ）ｘで切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘであって、上記切断が、（ＴＳ）ｘでの上記選択された外因性の核酸の相同組換えをもたらす、ヌクレアーゼ（Ｎ）ｘを含み、
ｘが、１〜ｎの任意の整数であり、ｎが、少なくとも２である、宿主細胞。
（項目１０５）
組成物であって、上記組成物は：
（ａ）酵母細胞、
（ｂ）複数の外因性の核酸であって、外因性の核酸（ＥＳ）ｘが、それぞれ、
（ｉ）第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘであって、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘが、酵母細胞ゲノムの選択される標的部位（ＴＳ）ｘで（ＥＳ）ｘの宿主細胞媒介性の相同組換えを開始することができる、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘならびに
（ｉｉ）（ＨＲ１）ｘの３’および（ＨＲ２）ｘの５’に位置づけられる目的の核酸（Ｄ）ｘを含む、複数の外因性の核酸、
（ｃ）複数のヌクレアーゼであって、ヌクレアーゼ（Ｎ）ｘが、それぞれ、（ＴＳ）ｘで切断することができ、上記切断が、（ＴＳ）ｘでの（ＥＳ）ｘの相同組換えをもたらす複数のヌクレアーゼを含み、
ｘが、１〜ｎの任意の整数であり、ｎが、少なくとも２である、組成物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014513535000001.app
【国際調査報告】
2014513535.tif 000016
2014513535.tif 000017
2014513535.tif 000018
2014513535.tif 000019