(57)【要約】  Ｈｉｆ１α転写体（ｍＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）塩基配列に相補的に結合して細胞内でＨｉｆ１αの発現を抑制すると同時に免疫反応を誘発しない低分子干渉リボ核酸（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）および前記ｓｉＲＮＡの癌の予防および／または治療における用途が提供される。前記Ｈｉｆ１αを暗号化するｍＲＮＡと相補結合できるｓｉＲＮＡはリボ核酸媒介干渉現象（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）によってほとんど全ての癌細胞に共通的に過発現されるＨｉｆ１αの発現を抑制して癌細胞の増殖および転移を阻害することができるので、抗ガン剤として有用に用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈｉｆ１α  ｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）中の下記の表１６に記載されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、および５乃至１４の中で選択されたいずれか一つに該当するｍＲＮＡを標的とする１５乃至３０ｂｐの二重鎖ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）。
＜表１＞
2014504501.tif 000020
【請求項２】
前記ｓｉＲＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、１０、および１２からなる群より選択される一つ以上の塩基配列に該当するｍＲＮＡを標的とする、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
前記ｓｉＲＮＡは、３’末端または５’末端または両末端に１乃至５ヌクレオチド（ｎｔ）からなる突出部を含む、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡは、下記の表１７に記載されたｓｉＲＮＡ１乃至１３および１８乃至２０からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ：
＜表２＞
2014504501.tif 000021
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７のセンス配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ５、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５のセンス配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６のアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ９、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９のセンス配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０のアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ１１、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３のセンス配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ１８、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４のセンス配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６のアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ１９、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５のセンス配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０のアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ２０
からなる群より選択される、請求項４に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項６】
前記ｓｉＲＮＡは、一つ以上のリボ核酸の糖構造、または塩基構造、または前記リボ核酸間の結合部位が化学的に変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）される、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項７】
前記化学的変形は、
バックボーンのホスホジエステル結合をボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）で置換すること、および
リボース環（ｒｉｂｏｓｅ  ｒｉｎｇ）の２’−ＯＨ位置にメチル基（２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ）またはフルオロ基（２’−ｆｌｕｏｒｏ）を導入すること
からなる群より選択された１種以上である、請求項６に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項８】
前記ボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）は、３’末端または５’末端または両末端に導入される、請求項７に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項９】
前記ｓｉＲＮＡは、下記の表１０に記載されたｓｉＲＮＡ２１乃至５０からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載のｓｉＲＮＡ：
＜表３＞
2014504501.tif 000022
2014504501.tif 000023
上記表１０で、
化学的変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の表記法は次の通りであり：
＜表４＞ 
2014504501.tif 000024
変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の内容は次の通りであり、但し、ｍｏｄ１からｍｏｄ７まではアンチセンス鎖の１０番および１１番位置の塩基には変形を加えず、ｍｏｄ１からｍｏｄ１０までの全てのｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖の３’末端にあるｄＴｄＴ（ホスホジエステル結合）がホスホロチオエート結合（３’−ｄＴ＊ｄＴ、＊：Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｂｏｎｄ）で置換される：
＜表５＞
2014504501.tif 000025
【請求項１０】
請求項１乃至９のうちのいずれか一項によるｓｉＲＮＡを含む発現ベクター。
【請求項１１】
前記発現ベクターは、プラスミド、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）ベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、および癌細胞溶解性ウイルス（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）ベクターからなる群より選択される、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１乃至９のうちのいずれか一項によるｓｉＲＮＡを有効性分として含有する抗癌組成物。
【請求項１３】
前記ｓｉＲＮＡを核酸伝達体（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）との複合体形態に含む、請求項１２に記載の抗癌組成物。
【請求項１４】
前記核酸伝達体は、ウイルス性ベクター、非ウイルス性ベクター、リポソーム、陽イオン性高分子、ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）、エマルジョン、および脂質ナノ粒子（ｓｏｌｉｄ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）からなる群より選択される、請求項１３に記載の抗癌組成物。
【請求項１５】
抗癌化学療法剤、または
成長因子、成長因子受容体、下位信号伝達タンパク質、ウイルス性腫瘍誘発因子、および抗ガン剤耐性遺伝子からなる群より選択されるものの発現を阻害するｓｉＲＮＡ
を追加的に含む、請求項１２に記載の抗癌組成物。
【請求項１６】
動物の生体から分離されたＨｉｆ１αを発現する細胞を準備する段階と、
請求項１乃至９のうちのいずれか一項によるｓｉＲＮＡを前記生体から分離されたＨｉｆ１αを発現する細胞と接触させる段階と、
を含む、Ｈｉｆ１αの合成または発現を抑制する方法。
【請求項１７】
動物の生体から分離されたＨｉｆ１αを発現する癌細胞を準備する段階と、
請求項１乃至９のうちのいずれか一項によるｓｉＲＮＡを前記生体から分離されたＨｉｆ１αを発現する癌細胞と接触させる段階と、
を含む、癌細胞の成長を抑制する方法。
【請求項１８】
請求項１乃至９のうちのいずれか一項によるｓｉＲＮＡまたは請求項１０の発現ベクターを有効性分として含有する薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｈｉｆ１α転写体（ｍＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）塩基配列に相補的に結合して細胞内でＨｉｆ１αの発現を抑制する同時に免疫反応を誘発しない低分子干渉リボ核酸（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）および前記ｓｉＲＮＡの癌の予防および／または治療における用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｈｉｆ１（Ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  １）はヘテロダイマー転写因子であって、Ｈｉｆ１の実質的活性を調節するＨｉｆ１αと、核輸送（ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）役割を果たすＨｉｆ−１βからなる。Ｈｉｆ１αはベーシック−ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂａｓｉｃ−ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ）−ＰＡＳ（ＰＥＲ−ＡＲＮＴ−ＳＩＭ）スーパーファミリー（ｓｕｐｅｒ  ｆａｍｉｌｙ）に属する転写因子で、酸素正常状態（ｎｏｒｍｏｘｉａ）ではＯＤＤ（ｏｘｙｇｅｎ−ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）のＰｒｏ５９４とＰｒｏ４０２残基にヒドロキシル化が起こりＶＨＬ（ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ  Ｌｉｎｄａｕ）−ユビキチンＥ３リガーゼ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  Ｅ３  ｌｉｇａｓｅ）複合体によって分解されるが、多様な固形癌で主に発生する低酸素状態（ｈｙｐｏｘｉａ：酸素比率５％以下の状態）ではヒドロキシル化が抑制されて分解されずダイマー状態で細胞質から核に移動し、ＨＲＥ（ｈｙｐｏｘｉａ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）に結合して血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）および解糖過程（ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）、細胞成長と分化に関与する遺伝子発現を誘導する（Ｖｅｒｏｎｉｃａ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６６（１２），  ６２６４−７０，  ２００６；Ｓｅｍｅｎｚａ  ＧＬ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃａｎｃｅｒ  ３，  ７２１−３２，  ２００３）。
【０００３】
したがって、Ｈｉｆ１αが活性化される経路は多様であるため、これら経路をターゲットとするものよりＨｉｆ１α  ｍＲＮＡをターゲットとするｓｉＲＮＡを用いてＨｉｆ１αの発現量を根本的に抑制することが最も良い方法であると考えられる。
【０００４】
最近、リボ核酸媒介干渉現象が既存の方法では医薬的に不可能（ｎｏｎ−ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）であったターゲットに対しても精密な遺伝子選択性を示す先導物質を迅速に導出することにより、合成医薬開発時に発生する制限されたターゲットおよび非選択性に対する解決策を提示し化学合成医薬品の限界が克服できる技術と考えられて、既存の方式では治療が難しい各種疾病、特に腫瘍治療剤開発に利用しようとする研究が活発に行われている。
【０００５】
リボ核酸媒介干渉現象（ＲＮＡｉ）は、二重螺旋構造を有する２１〜２５個の塩基からなるリボ核酸が標的遺伝子の転写体（ｍＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）に相補的に結合し該当転写体を分解して特定遺伝子の発現を抑制する現象である（Ｎｏｖｉｎａ  ＆  Ｓｈａｒｐ、Ｎａｔｕｒｅ、４３０：１６１−１６４、２００４）。
【０００６】
しかし、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）が初期免疫反応を誘導し、予想したより非特異的なＲＮＡｉ効果を頻繁に誘導するということを発見した。
【０００７】
哺乳動物細胞で長さが長い二重鎖のｓｉＲＮＡは有害なインターフェロン反応を誘導することができ、長さが短い二重鎖ｓｉＲＮＡも人体や細胞に有害な初期インターフェロン免疫反応を起こすと報告されており、予想したより高い非特異的なＲＮＡｉ効果を誘導すると知られている（Ｋｌｅｉｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４５２：５９１−７，２００８）。
【０００８】
癌の進行に重要な役割を果たすＨｉｆ１αをターゲットとしたｓｉＲＮＡ抗ガン剤開発が試みられているが、現在までその成果は微々たる水準である。ｓｉＲＮＡの個別シーケンスの遺伝子抑制効能について提示されたことがなく、特に免疫活性に対する考慮が全くされていないのが実情である。
【０００９】
ｓｉＲＮＡは高い活性と優れたターゲット特異性などの長所で新たな治療剤として無限の可能性を示しているが、血液内核酸分解酵素によって分解されて血中安定性が低く、負電荷を帯びるため細胞膜通過が不可能であり、迅速に排泄され血液中半減期が短くて組織内分布が制限的であり、免疫体系活性化度は他の遺伝子調節機構に影響を与えるオフターゲット効果（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔ）を誘発するなどの問題があって、薬物としての開発に障害になっているのが実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
よって、本発明者らは本発明の配列特異性が高くて標的遺伝子の転写体に特異的に結合してＲＮＡｉ効率性を増加させ、免疫毒性を誘発しないｓｉＲＮＡを開発して本発明を完成した。
【００１１】
本発明の一例は、Ｈｉｆ１α転写体塩基配列に相補的に結合してＨｉｆ１αの合成および／または発現を特異的に阻害するｓｉＲＮＡを提供する。
【００１２】
また他の例は、前記ｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターを提供する。
【００１３】
また他の例は、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターを有効性分として含むＨｉｆ１αの合成および／または発現阻害用薬学的組成物を提供する。
【００１４】
また他の例は、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターを有効性分として含む抗癌組成物を提供する。
【００１５】
また他の例は、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターをＨｉｆ１αを発現する細胞と接触させて、Ｈｉｆ１αの合成および／または発現を抑制する方法および前記ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターのＨｉｆ１αを発現する細胞でのＨｉｆ１αの合成および／または発現抑制のための用途を提供する。
【００１６】
また他の例は、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターをＨｉｆ１αを発現する癌細胞に接触させて癌細胞の成長を抑制する方法および前記ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターのＨｉｆ１αを発現する癌細胞での癌細胞の成長抑制のための用途を提供する。
【００１７】
また他の例は、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターを治療的有効量で投与して癌を予防および／または治療する方法および前記ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターの癌の予防および／または治療のための用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、Ｈｉｆ１α転写体塩基配列に相補的に結合して細胞内でＨｉｆ１αの合成および／または発現を抑制するｓｉＲＮＡ、これを含む医薬組成物、およびその用途を提供する。
【００１９】
一実施例で、本発明はＨｉｆ１αの合成および／または発現を特異的に阻害するｓｉＲＮＡを提供する。また他の例で、本発明は前記Ｈｉｆ１αの合成および／または発現を特異的に阻害するｓｉＲＮＡを有効性分として含むＨｉｆ１α合成および／または発現抑制用薬学的組成物を提供する。また他の例で、本発明は前記Ｈｉｆ１αの合成および／または発現を特異的に阻害するｓｉＲＮＡを有効性分として含む癌細胞成長阻害剤または癌の予防および／または治療用薬学的組成物（抗癌組成物）を提供する。
【００２０】
本発明は、人を含む哺乳動物のＨｉｆ１α  ｍＲＮＡ、その選択的スプライシング形態（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｅ  ｆｏｒｍ）、および／または同一系統のＨｉｆ１α遺伝子の発現を阻害する技術に関し、これは本発明で提供されるｓｉＲＮＡの特定容量を患者に投与した時にターゲットｍＲＮＡが減少することによって成就され得る。
【００２１】
以下、これをより詳しく説明する。
【００２２】
前記Ｈｉｆ１αは、哺乳動物由来、好ましくは人または人と同一な系統のＨｉｆ１αおよびそのスプライシング構造体であり得る。人と同一な系統とは、遺伝子またはｍＲＮＡが人のＨｉｆ１α遺伝子またはこれから由来するｍＲＮＡと８０％以上の配列類似性を有する他の哺乳動物を意味し、具体的に、人、霊長類、げっ歯類などを含むことができる。
【００２３】
本発明の一実施例で、Ｈｉｆ１αをコーディングするｍＲＮＡに該当するセンス鎖のｃＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１であり得る。
【００２４】
本発明によるｓｉＲＮＡは、Ｈｉｆ１αのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）内部の連続する１５乃至２５ｂｐ、好ましくは１８乃至２２ｂｐからなる領域、具体的に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、および５乃至１４からなる群より選択された１種以上の塩基配列（ｃＤＮＡ上の塩基配列）に該当するｍＲＮＡ領域を標的とするものであり得る。前記好ましいｃＤＮＡ上の標的領域を下記の表１に整理した。したがって、本発明の一実施例で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＨｉｆ１α  ｃＤＮＡ領域の中のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ: ２、３、および５乃至１４からなる群より選択された１種以上の塩基配列に該当するｍＲＮＡ領域を標的とするｓｉＲＮＡを提供する。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、１０、および１２からなる群より選択された塩基配列に該当するｍＲＮＡ領域を標的とするｓｉＲＮＡを提供する。
【００２５】
【表１】
2014504501.tif 000002
【００２６】
本明細書で使用された‘標的ｍＲＮＡ’とは、人のＨｉｆ１α  ｍＲＮＡ、人と同一な系統のＨｉｆ１α  ｍＲＮＡ、その選択的スプライシング構造体を称す。具体的に、Ｈｕｍａｎ：ＮＭ_００１５３０、ＮＭ_１８１０５４（ＮＭ_００１５３０で塩基配列２２０３〜２２４８が削除されたスプライシング形態）、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ：ＮＭ_００１０４３１、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ：ＡＢ１６９３３２などが含まれる。したがって、本発明のｓｉＲＮＡは、人または人と同一な系統のＨｉｆ１α  ｍＲＮＡまたはその選択的スプライシング形態を標的とするものであり得る。
【００２７】
本明細書で、‘ｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）領域を標的とする’というのは、ｓｉＲＮＡが前記ｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）領域塩基配列の中の全部または一部、例えば塩基配列の８５〜１００％と相補的な塩基配列を有して、前記ｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）領域に特異的に結合できることを意味する。
【００２８】
本明細書で‘相補的’というのは、ポリヌクレオチドの両鎖が塩基対を形成することができるのを意味する。相補的ポリヌクレオチドの両鎖はワトソン−クリック方式で塩基対を形成して二重鎖を形成する。本発明で塩基Ｕが言及される場合、特別な言及がない限り塩基Ｔで置換可能である。
【００２９】
本発明の薬学的組成物のＨｉｆ１α合成および／または発現抑制効果と癌治療効果はＨｉｆ１αの効果的な合成および／または発現抑制によって成就されるので、前記薬学組成物に有効性分として含有されるｓｉＲＮＡは前記特定ｍＲＮＡ領域のうちの一つ以上を標的とする１５〜３０ｂｐの二重鎖ｓｉＲＮＡであり得る。前記ｓｉＲＮＡは突出部がない平滑（ｂｌｕｎｔ）末端を有する対称構造であるか、または３’末端または５’末端または両末端に１〜５個のヌクレオチド（ｎｔ）の突出部を有する構造であり得る。前記突出部ヌクレオチドはいかなる配列でも関係がないが、ｄＴ（デオキシチミジン）２乃至４個、例えば２つを付けることができる。
【００３０】
好ましい具体的な例で、前記ｓｉＲＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９乃至１１６、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９乃至２２、２５乃至４４、および５３乃至１１５のヌクレオチド配列からなる群より選択された１種以上のヌクレオチド配列を含むものであり得る。より具体的に、前記ｓｉＲＮＡは下記の表２に示すｓｉＲＮＡ１乃至ｓｉＲＮＡ５０、好ましくはｓｉＲＮＡ１、ｓｉＲＮＡ２、ｓｉＲＮＡ４、およびｓｉＲＮＡ１３およびｓｉＲＮＡ１８乃至ｓｉＲＮＡ５０からなる群より選択された１種以上であり得る。
【００３１】
【表２】
2014504501.tif 000003
2014504501.tif 000004
2014504501.tif 000005
【００３２】
【表３】
2014504501.tif 000006
【００３３】
【表４】
2014504501.tif 000007
【００３４】
上記表４において、ｍｏｄ１からｍｏｄ７まではアンチセンス鎖の１０番および１１番位置の塩基には変形を加えず、ｍｏｄ１からｍｏｄ１０までの全てのｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖の３’末端にあるｄＴｄＴ（ホスホジエステル結合）をホスホロチオエート結合（３’−ｄＴ*ｄＴ、*：Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｂｏｎｄ）で置換する。
【００３５】
前記ｓｉＲＮＡはＨｉｆ１α転写体（ｍＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）塩基配列の特定標的領域に対する配列特異性が高くて、標的遺伝子の転写体に特異的に相補的結合してＲＮＡ干渉効率性が増加し細胞内でＨｉｆ１αの発現および／または合成抑制効率に優れている。また、免疫誘発活性が最小化なされたことを特徴とする。
【００３６】
前記のように、本発明で提供するｓｉＲＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＨｉｆ１α  ｃＤＮＡ領域の中のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、および５乃至１４からなる群より選択された１種以上の領域に対するｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９乃至２２、２５乃至４４、および５３乃至１１５のヌクレオチド配列からなる群より選択された１種以上のヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡ、さらに好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９乃至２２、２５乃至４４、および５３乃至１１５からなる４６種のｓｉＲＮＡからなる群より選択された１種以上であり得る。前記ｓｉＲＮＡはリボ核酸配列自体、またはこれを発現する組み換えベクター（発現ベクター）形態を全て含む概念である。前記発現ベクターはプラスミドまたはアデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、癌細胞溶解性ウイルス（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）などからなる群より選択されるウイルスベクターであり得る。
【００３７】
また、本発明による薬学的組成物は有効成分としてｓｉＲＮＡと薬学的に許容される担体を含む場合を含む。前記薬学的に許容される担体はこの分野に通常使用される全ての担体を含み、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストリン、グリセロール、エタノールなどからなる群より選択された１種以上であり得るが、これに制限されるのではない。
【００３８】
本発明のｓｉＲＮＡまたは薬学的組成物の投与対象患者は哺乳動物、好ましくは人、猿、げっ歯類（マウス、ラット）であり得、特にＨｉｆ１αの発現と関連する疾病や症状を有するか、Ｈｉｆ１α発現抑制を必要とする全ての哺乳動物、例えば、人であり得る。
【００３９】
Ｈｉｆ１α抑制に有効な効果を得ながら免疫反応などの好ましくない副反応を最少化するために、組成物内のｓｉＲＮＡの濃度または使用または処理濃度は、０．００１乃至１０００ｎＭ、好ましくは０．０１乃至１００ｎＭ、さらに好ましくは０．１乃至１０ｎＭとすることができるが、これに制限されるのではない。
【００４０】
本発明によるｓｉＲＮＡまたはこれを含む薬学的組成物によって治療可能な癌は、肺ガン、肝癌、大腸癌、すい臓癌、胃ガン、乳癌、卵巣ガン、腎臓ガン、甲状腺癌、食道癌、前立腺癌、および脳ガンなどの各種固形癌、皮膚癌、骨肉腫、軟部組織肉腫、神経膠腫、リンパ腫などからなる群より選択された１種以上であり得る。
【００４１】
以下、ｓｉＲＮＡの構造、設計過程およびこれを含む薬学的組成物をより詳しく説明する。
【００４２】
本発明のｓｉＲＮＡはＲＮＡｉ機構によってＨｉｆ１α  ｍＲＮＡの分解を起こしてＨｉｆ１αタンパク質の発現を誘発しないか減少させる機能を果たす。
【００４３】
一実施例で、ｓｉＲＮＡはＲＮＡ干渉（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）（ＲＮＡｉ）経路を誘発する低分子阻害ＲＮＡ二重鎖（ｓｍａｌｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘｅｓ）を意味する。具体的に、ｓｉＲＮＡはセンスＲＮＡ鎖とそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、両鎖が１５〜３０ｂｐ、具体的には１５〜２５ｂｐ、さらに具体的には１５〜２２ｂｐを含むＲＮＡ二重鎖である。ｓｉＲＮＡは二重鎖領域を含み単一鎖がヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）またはステムループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造を形成する構造であるか、２つの分離された鎖の二重鎖であり得る。センスＲＮＡ鎖は標的遺伝子のｍＲＮＡ配列のヌクレオチド配列と同一な配列を有し、センス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖が互いにワトソンとクリックの相補的な塩基配列結合によって二重鎖をなしている。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖はＲＩＳＣ（ＲＮＡ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）に捕集されて、ＲＩＳＣがアンチセンス鎖と相補的な目標ｍＲＮＡを確認した後、切断または翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）阻害を誘導するようにする。
【００４４】
一実施例で、二重鎖ｓｉＲＮＡは３’末端、５’末端または両側末端に１乃至５ヌクレオチドの突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を有することができる。または、両末端が切断された形態の平滑末端（ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄ）を有するものであり得る。具体的には、ＵＳ２００２００８６３５６、およびＵＳ７０５６７０４に開示されたｓｉＲＮＡであり得る（前記文献は本明細書に参照として含まれる）。
【００４５】
本発明の一実施例で、ｓｉＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖とアンチセンス鎖が１５〜３０ｂｐの二重鎖であり、突出部がない平滑末端を有する対称構造、または少なくとも一つ、例えば１〜５個のヌクレオチドの突出部を有する非対称構造であり得る。突出部ヌクレオチドはいかなる配列でも関係がないが、ｄＴ（デオキシチミジン）２乃至４個、例えば２つを付けることができる。
【００４６】
前記アンチセンス鎖は生理学的条件でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のｍＲＮＡの標的領域に混成化する。‘生理学的条件での混成化’とは、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でｍＲＮＡの特定標的領域と混成化することを意味する。具体的に、前記アンチセンス鎖はｍＲＮＡの標的領域、好ましくは前記表１のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、および５乃至１４の塩基配列のうちの一つ以上と８５％以上の配列相補性を有するものであり得、さらに具体的に前記アンチセンス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の塩基配列内の連続する１５乃至３０ｂｐ塩基配列、好ましくは連続する１５乃至２５ｂｐ塩基配列、より好ましくは連続する１５乃至２２ｂｐの塩基配列、さらに好ましくは前記表１のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、および５乃至１４の塩基配列から選択された一つ以上に完全相補的な配列を含むものであり得る。
【００４７】
また、一実施例で、ｓｉＲＮＡは一鎖が他の鎖より短い非対称的な二重鎖構造であり得る。具体的に、１９乃至２１ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ｎｔ）のアンチセンス鎖；および前記アンチセンスに相補的な配列を有する１５乃至１９ｎｔのセンス鎖（但し、アンチセンス鎖が１９ｎｔである場合、センス鎖は１９ｎｔではない）から構成される二重鎖（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ）のｓｉＲＮＡ分子（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であって、前記ｓｉＲＮＡはアンチセンスの５’方向の末端が平滑末端（ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄ）であり、アンチセンスの３’末端に１〜５ヌクレオチド突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇ）（例えば、（ｄＴ）ｎ、ｎ＝１〜５、好ましくは２〜４の整数）を有する非対称ｓｉＲＮＡであり得る。具体的に、ＷＯ０９／０７８６８５に開示されたｓｉＲＮＡであり得る。
【００４８】
ｓｉＲＮＡを用いた治療で最も優先して考慮されなければならない点は、標的化された遺伝子の塩基配列で最も大きい活性を有する最適の塩基配列を選定することが必要である。具体的に、一実施例で、前臨床試験と臨床試験間の関連性を高めるために種間保存された配列を含むＨｉｆ１α  ｓｉＲＮＡをデザインするのが好ましい。また、一実施例で、ＲＩＳＣに結合するアンチセンス鎖がＲＩＳＣとの結合力が高いようにデザインするのが好ましい。したがって、センス鎖とアンチセンス鎖の熱力学的安定性に差が出るようにデザインされて、センス鎖はＲＩＳＣと結合せず、ガイド配列であるアンチセンス鎖がＲＩＳＣと結合力を高めるようにする。具体的に、センス鎖のＧＣ配列が６０％を超えず、センス鎖の５’末端から１５番目および１９番目の間にはアデニン／グアニン塩基が３つ以上あり、１乃至７番目の間にはＧ／Ｃ塩基が多いものであり得る。
【００４９】
また、反復塩基配列によってｓｉＲＮＡ自体内部の塩基配列同士が結合してｍＲＮＡに相補的に結合する能力を下げることがあるので、４つ以上の反復塩基配列があるようにデザインすることは避けるのが好ましい。また、１９個の塩基からなるセンス配列の場合、標的遺伝子のｍＲＮＡに結合して転写体分解をよく起こすためにはセンス鎖の５’末端から３番目、１０番目、および１９番目塩基配列がアデニンであり得る。
【００５０】
また、本発明の一実施例で、ｓｉＲＮＡは非特異的結合および免疫誘発活性が最小化されたことを特徴とする。ｓｉＲＮＡによるインターフェロンなどの免疫反応誘導は主に抗原を提示する免疫細胞のエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）に存在するＴＬＲ７（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−７）を通じて起こり、ｓｉＲＮＡのＴＬＲ７との結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）はＧＵが豊富な配列のように配列特異的に起こるので、ＴＬＲ７によって認知されない配列を含むものであり得る。具体的に、５’−ＧＵＣＣＵＵＣＡＡ−３’と５’−ＵＧＵＧＵ−３’のような免疫誘発配列を有せず、Ｈｉｆ１α以外の他の遺伝子との相補性が最小７０％以下であり得る。
【００５１】
本発明の一実施例のＨｉｆ１α  ｃＤＮＡ標的配列の例は前記表１に記載した配列のヌクレオチドを含む。表１の標的配列に基づいてｓｉＲＮＡの長さを標的配列の長さよりさらに長いか短くデザインするか、前記ＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチドを加えるか除いてｓｉＲＮＡ配列をデザインすることができる。
【００５２】
本発明の一実施例で、ｓｉＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖とアンチセンス鎖が１５〜３０ｂｐの二重鎖であり、突出部がないか、少なくとも一つの末端が１〜５ヌクレオチドの突出部を有し、前記アンチセンス鎖は生理学的条件でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、および５乃至１４、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、１０、１２に対応するｍＲＮＡ領域に混成化する。つまり、前記アンチセンス鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、および５乃至１４、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、１０、１２の相補的な配列を含む。つまり、本発明のＨｉｆ１α  ｓｉＲＮＡおよびこれを含む薬学的組成物は有害なインターフェロン反応を誘導しないながらＨｉｆ１α遺伝子の発現を阻害させる特徴を有する。
【００５３】
本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（５’−ＣＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＡＴＧＡＡＣＡ−３’）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０（５’−ＧＣＴＧＡＴＴＴＧＴＧＡＡＣＣＣＡＴＴ−３’）、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２（５’−ＧＣＡＴＴＧＴＡＴＧＴＧＴＧＡＡＴＴＡ−３’）からなる群より選択された１種以上の配列に対応するｍＲＮＡ領域に相補的に結合して細胞内でＨｉｆ１αの発現を抑制する。
【００５４】
本発明の具体例によるＨｉｆ１α  ｓｉＲＮＡは前記表２に記載した通りである。
【００５５】
一実施例で、前記Ｈｉｆ１α  ｓｉＲＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７のセンス配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５のセンス配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６のアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９のセンス配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０のアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３のセンス配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４のセンス配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６のアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５のセンス配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０のアンチセンス配列を含むｓｉＲＮＡ２０からなる群より選択される１種以上であり得る。
【００５６】
ノックダウン（Ｈｉｆ１α発現抑制）は、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）増幅、ｂＤＮＡ（ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ）アッセイ（ａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡなどの方法でｍＲＮＡまたはタンパク質水準の変化を測定して確認できる。本発明の一実施例で、リポソーム複合体を製造して腫瘍細胞株に処理した後、リボ核酸媒介による発現干渉現象をｍＲＮＡ段階でｂＤＮＡ測定法を用いて確認できる。
【００５７】
本発明のｓｉＲＮＡ配列は、Ｈｉｆ１αの合成または発現を効果的に阻害するだけでなく、免疫誘発活性が低いという特徴を有する。
【００５８】
本発明の一実施例で、免疫毒性は、人の末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ：ＰＢＭＣ）にｓｉＲＮＡ−ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−Ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｍｅｔｙｌｓｕｌｆａｔｅ）複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を処理した後、培養液中に遊離されたサイトカインであるインターフェロンアルファおよびガンマ（ＩＮＦ−αおよびＩＮＦ−γ）、腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α：ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２、ＩＬ−１２）などの増加有無を測定して確認できる。
【００５９】
ｓｉＲＮＡは自然に存在する（変形されない）リボ核酸単位構造を有することができ、一つ以上のリボ核酸の糖構造や塩基構造、リボ核酸間の結合部位が一つ以上の化学的変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を有するように合成されるなどの化学的に変形されたものであり得る。前記のようなｓｉＲＮＡの化学的変形を通じて、ｓｉＲＮＡの本来のＲＮＡｉ能力に影響を与えず、ヌクレアーゼ（ｎｕｃｌｅａｓｅ）に対する抵抗性増進、細胞内吸収（ｕｐｔａｋｅ）増加、細胞標的化（ターゲット特異性）向上、安定性増加、またはインターフェロン活性減少、免疫反応およびセンス（ｓｅｎｓｅ）効果のようなオフターゲット効果（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔ）減少などの効果を得ることができる。
【００６０】
ｓｉＲＮＡの化学的変形方法は特に制限されず、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する当業者であれば当該技術分野に公知された方法を用いて所望の方式のとおりに前記ｓｉＲＮＡを合成し変形させることができる（Ａｎｄｒｅａｓ  Ｈｅｎｓｃｈｅｌ、Ｆｒａｎｋ  Ｂｕｃｈｈｏｌｚ１  ａｎｄ  Ｂｉａｎｃａ  Ｈａｂｅｒｍａｎｎ（２００４）  ＤＥＱＯＲ：ａ  ｗｅｂ  ｂａｓｅｄ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  Ｉｓｓｕｅ）：Ｗ１１３−Ｗ１２０）。
【００６１】
ｓｉＲＮＡの化学的変形の一例として、ｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス鎖のホスホジエステル結合をボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）で置換して核酸分解に対する抵抗性を高めることができる。一例として、ｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンス鎖の３’末端または５’末端または両末端、好ましくはＲＮＡの終結位置、例えば、３’末端突出部（例えば（ｄＴ）ｎ、ｎ＝１〜５、好ましくは２〜４の整数）にのみ導入することができる。
【００６２】
他の一例として、ｓｉＲＮＡセンス（ｓｅｎｓｅ）またはアンチセンス鎖の５’末端、３’末端、または両末端にＥＮＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｒｉｄｇｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）或いはＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を導入する方法があり、好ましくはｓｉＲＮＡセンス（ｓｅｎｓｅ）鎖の５’末端に導入することができる。これによってＲＮＡｉ能力に影響を与えずｓｉＲＮＡ安定性を増加させ免疫反応および非特異的抑制効果を減らすことができる。
【００６３】
また他の一例として、リボース環（ｒｉｂｏｓｅ  ｒｉｎｇ）の２’−位置にある−ＯＨ（ヒドロキシ基）を−ＮＨ２（アミノ基）、−Ｃ−アリル（アリル基）、−Ｆ（フルオロ基）、または−Ｏ−Ｍｅ（またはＣＨ３、メチル基）で置換する化学的変形を加えることができる。例えば、センス鎖の１番および２番核酸のリボース環において２’−ＯＨを２’−Ｏ−Ｍｅで置換するか、アンチセンス鎖の２番核酸のリボース環において２’−ＯＨを２’−Ｏ−Ｍｅで置換、またはグアニン（Ｇ）またはウリジン（Ｕ）を含む一部ヌクレオチドでリボース環の２’−ＯＨを２’−Ｏ−Ｍｅ（メチル基）または２’−Ｆ（フルオロ基）で置換することができる。
【００６４】
上述の化学的変形以外にも多様な化学的変形を加えることができ、このような化学的変形はある一つの形態の変形のみが行われることもでき、様々な化学的変形が共に行われることもできる。
【００６５】
本発明の一例で、化学的変形は前記表４の化学的変形のうちの一つであり得、表４において、ｍｏｄ１からｍｏｄ７まではアンチセンス鎖の１０番および１１番位置の塩基には変形を加えず、ｍｏｄ１からｍｏｄ１０までの全てのｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖の３’末端にあるｄＴｄＴ（ホスホジエステル結合）をホスホロチオエート結合（３’−ｄＴ*ｄＴ、*：Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｂｏｎｄ）で置換することができる。
【００６６】
前記化学的変形において、ｓｉＲＮＡ二重鎖構造を安定化させると同時に、遺伝子発現阻害活性を減少させないのが好ましいので、最小限の変形が好ましい。
【００６７】
また、ｓｉＲＮＡにコレステロール、ビオチン、細胞浸透性質を有するペプチド（ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）のようなリガンド（ｌｉｇａｎｄ）をセンス鎖の５’−または３’−末端に付けるのも可能である。
【００６８】
本発明のｓｉＲＮＡは、化学的合成、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）転写またはダイサー（Ｄｉｃｅｒ）やその他類似の活性を有するヌクレアーゼで長い二重鎖ＲＮＡを切断して製造することができる。または、前記のように、ｓｉＲＮＡをプラスミドやウイルス性発現ベクターなどを通じて発現させて使用することができる。
【００６９】
ｓｉＲＮＡ特定配列がインターフェロンを誘導するかどうかを樹枝状細胞を含む人の末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ：ＰＢＭＣ）で実験的に確認した後、免疫反応を誘発しない配列を選別して候補ｓｉＲＮＡ配列に選定することができる。
【００７０】
以下、前記ｓｉＲＮＡの伝達のための薬物伝達システム（ＤＤＳ）を説明する。
【００７１】
ｓｉＲＮＡの細胞内伝達効率を高めるためには、核酸伝達体（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）が活用できる。
【００７２】
細胞内に核酸物質を伝達するための核酸伝達体にはウイルス性ベクター、非ウイルス性ベクター、リポソーム、陽イオン性高分子、ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）、エマルジョン、脂質ナノ粒子（ｓｏｌｉｄ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）などがある。ウイルスベクター（ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）は伝達効率が高くて持続時間が長い利点がある。前記ウイルスベクターにはレトロウイルスベクター（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）、アデノウイルスベクター（ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）、癌細胞溶解性ウイルスベクターなどが含まれる。非ウイルスベクター（ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）はプラスミドを含むことができる。その以外にもリポソーム、陽イオン性高分子、ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）、エマルジョン、脂質ナノ粒子（ｓｏｌｉｄ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）などの多様な剤形が使用される。核酸伝達のための陽イオン性高分子にはキトサン、アテロコラーゲン（ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ）、陽イオン性ポリペプチド（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）などのような天然高分子とポリ（Ｌ−リシン）（ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎ））、線形または分枝型ＰＥＩ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｉｍｉｎｅ）、シクロデキストリン系列多価陽イオン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎ）、デンドリマー（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）などのような合成高分子が含まれる。
【００７３】
本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡと核酸伝達体との複合体（薬学的組成物）は、癌の治療のためにインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）またはエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）上で細胞内に導入できる。下記の実施例で確認できるように、本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡと核酸伝達体との複合体を細胞内に導入すると、標的タンパク質であるＨｉｆ１αの発現を選択的に減少させて癌の生成に関与するＨｉｆ１αの発現が抑制され癌細胞が死滅して癌の治療が可能になる。
【００７４】
本発明のｓｉＲＮＡまたはこれを含む薬学的組成物は、局所、経口または非経口的などに投与するために製剤化することができる。具体的に、ｓｉＲＮＡの投与は、目の粘膜、膣、または肛門内投与を含む局所投与、または肺、気管支、鼻腔、外皮、内皮投与、静脈、動脈、皮下、腹腔、筋肉、頭蓋（脳硬膜または脳室）などの非経口投与、または経口投与などの経路を通じて行われ得る。局所投与のために、ｓｉＲＮＡまたはこれを含む薬学的組成物は、パッチと軟膏、ローション、クリーム、ジェル、滴剤、座薬、スプレー、溶液、パウダーなどの形態に製剤化できる。非経口的投与、脳硬膜或いは脳室内投与のために、ｓｉＲＮＡまたはこれを含む薬学的組成物は、バッファー、希釈剤、透過促進剤、その他通常薬剤学的に使用可能な伝達体或いは賦形剤のような適切な添加剤を含有する滅菌水溶液を含むことができる。
【００７５】
また、本発明のｓｉＲＮＡまたはこれを含む薬学的組成物は、ｓｉＲＮＡを注射用組成物と混合して腫瘍が発生した部位に注射形態で投与するか、ゲル組成物または経皮吸収用粘着組成物と混合して、直接患部に塗ったり付けて経皮経路で投与することができるように実現するのが好ましい。前記注射用組成物は特別な制限はないが、等張性水溶液または懸濁液形態であるのが好ましく、滅菌処理、および／または補助剤（例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤溶液促進剤、浸透圧調節のための塩、緩衝剤および／またはリポソーム製剤）を含有することができる。前記ゲル組成物はカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、アクリル酸重合体、カルボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）などの通常のゲル製剤と薬学的に許容される担体および／またはリポソーム製剤を含有し、前記経皮吸収用粘着組成物は有効成分層が粘着剤層、皮脂吸収のための吸着層および治療薬物層を含み、治療薬物層は薬学的に許容される担体および／またはリポソーム製剤を含有するものであり得るが、これに制限されるのではない。
【００７６】
また、本発明の癌治療用薬学的組成物は、Ｈｉｆ１αの発現を抑制するｓｉＲＮＡ以外に従来に公知された抗癌化学療法剤を追加的に含むことによって、併用効果が期待できる。本発明のＨｉｆ１αの発現を抑制するｓｉＲＮＡと併用投与が可能な抗癌化学療法剤は例えば、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、バルビシン（ｖａｌｕｂｉｃｉｎ）、クルクミン（ｃｕｒｃｕｍｉｎ）、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、テムシロリムス（ｔｅｍｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）、エベロリムス（ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）、ボリノスタット（ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）などからなる群より選択された１種以上であり得る。
【００７７】
また、このような化学療法剤との併用と共にまたは別個に、Ｈｉｆ１α  ｓｉＲＮＡと共に各種成長因子（ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦなど）、成長因子受容体および下位信号伝達タンパク質、ウイルス性腫瘍誘発因子、抗ガン剤耐性遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡと併用して癌の様々な経路を同時に遮断することによって、抗癌効果を極大化させることができる。
【００７８】
本発明のまた他の例は、Ｈｉｆ１αの合成および／または発現抑制のための有効量の前記Ｈｉｆ１α  ｓｉＲＮＡをＨｉｆ１αを発現する細胞に接触させる段階を含むＨｉｆ１α発現および／または合成を抑制する方法を提供する。前記細胞はＨｉｆ１αを発現する全ての細胞であって、例えば癌細胞であり得、動物、好ましくは哺乳動物、例えば、人、猿、げっ歯類（マウス、ラットなど）などの生体内細胞であるか、生体から分離された細胞であり得る。例えば、前記Ｈｉｆ１α発現および／または合成を抑制する方法は、動物の生体から分離されたＨｉｆ１αを発現する細胞を準備する段階；および請求項１乃至９のうちのいずれか一項によるｓｉＲＮＡを前記生体から分離されたＨｉｆ１αを発現する細胞と接触させる段階を含むことができる。前記Ｈｉｆ１αを発現する細胞は生体から分離されたＨｉｆ１αを発現する細胞を人工的に培養したものであり得る。
【００７９】
また他の例は、Ｈｉｆ１αの合成および／または発現抑制のための有効量の前記Ｈｉｆ１α  ｓｉＲＮＡをＨｉｆ１αを発現する癌細胞に接触させて癌細胞の成長を抑制する方法を提供する。前記癌細胞は動物、好ましくは哺乳動物、例えば、人、猿、げっ歯類（マウス、ラットなど）などの生体内に存在する細胞であるか、生体から分離された細胞であり得る。例えば、前記癌細胞の成長を抑制する方法は、動物の生体から分離されたＨｉｆ１αを発現する癌細胞を準備する段階；および請求項１乃至９のうちのいずれか一項によるｓｉＲＮＡを前記生体から分離されたＨｉｆ１αを発現する癌細胞と接触させる段階を含むことができる。
【００８０】
また他の例は、前記治療学的有効量のＨｉｆ１α  ｓｉＲＮＡを患者に投与する段階を含む癌の予防および／または治療方法を提供する。前記癌の予防および／または治療方法は、前記投与段階前に癌の予防および／または治療が必要な患者を確認する段階を追加的に含むことができる。
【００８１】
本発明によって治療可能な癌は、大部分の固形癌（肺ガン、肝癌、大腸癌、すい臓癌、胃ガン、乳癌、卵巣ガン、腎臓ガン、甲状腺癌、食道癌、前立腺癌、脳ガン）、皮膚癌、骨肉腫、軟部組織肉腫、神経膠腫、リンパ腫などからなる群より選択された１種以上であり得る。
【００８２】
前記患者は哺乳動物、好ましくは人、猿、げっ歯類（マウス、ラットなど）などであり得、特にＨｉｆ１αの発現と関連する疾病や症状（例えば、癌）を有するか、Ｈｉｆ１α発現抑制を必要とする全て哺乳動物、例えば、人であり得る。
【００８３】
本発明によるｓｉＲＮＡの有効量は、Ｈｉｆ１α発現または合成抑制またはこれによる癌細胞成長阻害および癌治療効果を得るために投与に要求される量を意味する。したがって、疾患の種類、症状の程度、投与されるｓｉＲＮＡの種類、剤形の種類、患者の年令、体重、一般健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路および治療期間、同時使用される化学抗ガン剤などの薬物をはじめとする多様な因子によって適切に調節できる。例えば、１日投与容量は０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇであることが良く、前記容量は一度に全て投与されるか、数回にわたって分量して投与できる。
【発明の効果】
【００８４】
本発明のＨｉｆ１α転写体（ｍＲＮＡ）の塩基配列に相補的なｓｉＲＮＡはリボ核酸媒介干渉現象（ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）によって癌細胞に共通的に発現されるＨｉｆ１αの発現を抑制して癌細胞を死滅させるので、優れた抗癌効果を発揮することができる。また、免疫反応を最小限に誘発することができる長所がある。
【００８５】
本発明で採択したリボ核酸媒介干渉現象を用いたＲＮＡｉ技術が高い活性と精密な遺伝子選択性によってＨｉｆ１αの発現を選択的に阻害する最も効果的な方法として提示されており、既存の大部分の薬物が既に発現されたタンパク質の機能を抑制するのに反して、人体に存在する遺伝子調節（ｎａｔｕｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ）機構であるＲＮＡｉ技術は特定疾病誘発タンパク質の発現を選択的に阻害することができるだけでなく、タンパク質が合成される前段階であるｍＲＮＡを分解するので、副作用を誘発せず癌の成長と転移を抑制してより根源的な癌治療技術になることと期待する。
【００８６】
また、ｓｉＲＮＡと共に化学療法を併用して化学療法剤に対する敏感度を高めることによって治療効果を極大化し、副作用を減少させることができるだけでなく、Ｈｉｆ１α  ｓｉＲＮＡと共に各種成長因子（ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦなど）、成長因子受容体および下位信号伝達タンパク質、ウイルス性腫瘍誘発因子、抗ガン剤耐性遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡと併用して癌の様々な経路を同時に遮断することによって抗癌効果を極大化することができる付加的な利点がある。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
但し、下記の実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例に限定されるのではない。
【実施例】
【００８８】
実施例１．Ｈｉｆ１α発現抑制用ｓｉＲＮＡが結合できるターゲット塩基配列のデザイン
ｓｉＤｅｓｉｇｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＢＬＯＣＫ−ｉＴＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＡｓｉＤｅｓｉｇｎｅｒ（ＫＲＩＢＢ）、ｓｉＤｉｒｅｃｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｋｙｏ）およびｓｉＲＮＡ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）のｓｉＲＮＡデザインプログラムを用いてＨｉｆ１α  ｍＲＮＡ配列（ＮＭ_００１５３０）の中でｓｉＲＮＡが結合できる標的塩基配列を導出した。下記の表５に標的塩基配列としてｃＤＮＡ配列で表現された配列を示した。
【表５】
2014504501.tif 000008
【００８９】
実施例２．Ｈｉｆ１α発現抑制用ｓｉＲＮＡの製造
実施例１でデザインした標的塩基配列に結合できるｓｉＲＮＡ２０種を三千里製薬（韓国）に合成依頼して使用した。２０種のｓｉＲＮＡの配列は表６のようにし、両鎖の３’末端にｄＴｄＴを含むようにした。
【００９０】
【表６】
2014504501.tif 000009
【００９１】
実施例３．ｓｉＲＮＡを用いた腫瘍細胞株でのＨｉｆ１αの発現抑制試験
前記実施例２で製造したそれぞれのｓｉＲＮＡを用いて、腫瘍細胞株である人間肺ガン細胞株（Ａ５４９、ＡＴＣＣ）を形質転換させ、形質転換された腫瘍細胞株でＨｉｆ１αの発現様相を測定した。
【００９２】
実施例３−１．腫瘍細胞株の培養
米国種菌協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）から入手した人間肺ガン細胞株（Ａ５４９）を１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清、ペニシリン（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ培養培地（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）で３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下に培養した。
【００９３】
実施例３−２．Ｈｉｆ１α発現抑制用ｓｉＲＮＡとリポソームの複合体製造
実施例１でデザインして合成製造したｓｉＲＮＡ１乃至２０の２０個のｓｉＲＮＡに対してＨｉｆ１α発現抑制用ｓｉＲＮＡとこれを伝達するリポソームリポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）との複合体を製造した。
【００９４】
ｓｉＲＮＡ  １０ｎＭを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）２５ｕｌとウェル（ｗｅｌｌ）当り０．４ｕｌのリポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を同一体積で混合し常温で２０分間反応させてｓｉＲＮＡとリポソームとの複合体を製造した。
【００９５】
実施例３−３．Ｈｉｆ１αターゲットｓｉＲＮＡを用いた腫瘍細胞株でのＨｉｆ１α  ｍＲＮＡ発現抑制
前記実施例３−１で培養した肺ガン細胞株を９６ウェル−プレートにそれぞれウェル当り細胞を１０４細胞数ずつ分注（ｓｅｅｄｉｎｇ）した。２４時間後に培地を除去し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地をウェル（ｗｅｌｌ）当り５０μｌずつ添加した。前記実施例３−２で製造したｓｉＲＮＡとリポソームの複合体組成物５０μｌを添加して２４時間３７℃、５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素が維持される細胞培養器に培養した。
【００９６】
Ｈｉｆ１α  ｍＲＮＡ発現が５０％阻害される薬物濃度であるＩＣ５０数値の計算のためにＡ５４９細胞株にそれぞれのｓｉＲＮＡを０．００１ｎＭ乃至１０ｎＭの間の７個の濃度範囲で処理した。
【００９７】
実施例３−４．Ｈｉｆ１α  ｍＲＮＡの定量分析_肺ガン細胞
ｓｉＲＮＡリポソーム複合体によって発現抑制されたＨｉｆ１α  ｍＲＮＡの発現程度はＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ社）を用いたｂＤＮＡ測定法で測定した。
【００９８】
ｓｉＲＮＡリポソーム複合体を細胞に２４時間処理した後、ｍＲＮＡを定量した。製造社のプロトコルの通り９６−ウェルプレート１ウェル（ｗｅｌｌ）当り１００μｌのＬｙｓｉｓ  ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０  ｂＤＮＡ  ｋｉｔ）を処理して５０℃で１時間細胞を溶解させた。Ｐａｎｏｍｉｃｓ社でＨｉｆ１αのｍＲＮＡに特異的に結合するプローブ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ、Ｃａｔ．＃  ＳＡ−１１５９８）を購買して、得られた細胞サンプル中の８０μｌと共に９６ウェルプレートに混合した。ｍＲＮＡがウェルに固定されプローブと結合できるように５５℃で１６時間乃至２０時間反応させた。その次に、各ウェルにキットの増幅作用試薬１００μｌを入れて５５℃で反応させ洗浄（ｗａｓｈ）する過程を２段階行った。３番目増幅作用試薬１００μｌを入れ５０℃で反応させた後、発光を誘導する試薬を１００μｌ入れ５分後に蛍光および発光測定器（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ、Ｓｙｎｅｒｇｙ−ＨＴ）に入れて発光値を測定してリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）のみ処理した対照群の発光値（１００％）に対する百分率値を算出した。この百分率は対照群と各ｓｉＲＮＡを処理した試験群でのＨｉｆ１α  ｍＲＮＡの発現率を示す。
【００９９】
人間肺ガン細胞株であるＡ５４９でリポソームのみ処理した対照群の発光（ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）測定値に対比して１０ｎＭのＨｉｆ１α  ｓｉＲＮＡリポソーム複合体を処理した実験群の発光（ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）測定値の相対的な値を計算して、ｓｉＲＮＡに形質転換させたＡ５４９細胞株で発現されるＨｉｆ１α  ｍＲＮＡの水準を測定し、その結果を下記の表７に示した。
【０１００】
【表７】
2014504501.tif 000010
【０１０１】
表７でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３および５乃至１４（ｓｉＲＮＡ番号１、２、および４乃至１３）は本発明の実施例に該当し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、および１５乃至１８（ｓｉＲＮＡ番号３、および１４乃至１７）は比較例として提示されたものである。表７に示されているように、総１７種のｓｉＲＮＡによって形質転換された細胞株でＨｉｆ１α  ｍＲＮＡの発現程度を見てみた結果、本発明の１３種のｓｉＲＮＡが比較例の４種のｓｉＲＮＡより優れた抑制効果を示した。具体的に、本発明の１３種のｓｉＲＮＡの中でＨｉｆ１α発現の抑制率が４０％以下（発現率が６０％以上）であるｓｉＲＮＡが１種であり、抑制率が４０％超過７０％以下（発現率が３０％以上６０％未満）であるｓｉＲＮＡが９種、抑制率が７０％以上（発現率が３０％未満）であるｓｉＲＮＡが３種であるのを確認した。
【０１０２】
前記表７で優れた遺伝子発現抑制効果を有する３種のｓｉＲＮＡであるｓｉＲＮＡ５、９、および１１番に対してＡ５４９細胞株を用いて１０ｎＭから０．００１ｎＭの範囲でＨｉｆ１α  ｍＲＮＡ発現減少効果を調査してＩＣ５０を求めて下記の表８に示した。ＩＣ５０数値はＳｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  １９０（ＥＬＩＳＡ機器）モデルで支援されるＳｏｆｒＭａｘ  ｐｒｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｂｉｏｔｅｋ（Ｓｙｎｅｒｇｙ−ＨＴ社ＥＬＩＳＡ機器）モデルで支援されるＫＣ４ソフトウェア（ＫＣ４  ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて計算した。ｓｉＲＮＡ５、９および１１のＩＣ５０数値をｓｉＲＮＡ３および１６と比較した時、４乃至５００倍程度優れていることが分かる。
【０１０３】
【表８】
2014504501.tif 000011
【０１０４】
実施例３−５．非対称構造ｓｉＲＮＡのＨｉｆ１α  ｍＲＮＡ抑制効果_肺ガン細胞
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、１０、または１２を標的とする、対称構造のｓｉＲＮＡ５、９、および１１とセンス鎖がアンチセンス鎖より短い非対称構造のｓｉＲＮＡであるｓｉＲＮＡ１８、１９、および２０をそれぞれ１０ｎＭの濃度で肺ガン細胞株であるＡ５４９にそれぞれ処理し、Ｈｉｆ１α  ｍＲＮＡ抑制効能を調査して下記の表９に示した。実験方法は実施例３−４と同様な方式とした。
【０１０５】
【表９】
2014504501.tif 000012
【０１０６】
表９に示されているように、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、１０、および１２を標的とする場合、非対称構造ｓｉＲＮＡでも対称構造ｓｉＲＮＡと類似の程度にＨｉｆ１α発現を効果的に抑制することが分かった。
【０１０７】
実施例４．ｓｉＲＮＡの化学的構造変形
ｓｉＲＮＡ番号５、９、および１２の化学的構造変形体を製作した。
表１０に示されているように、ｓｉＲＮＡの化学的構造変形は１０個の形態に製作し、２’−Ｏ−Ｍｅ、ホスホロチオエート結合、２’−Ｆを用いた化学的構造変形、或いは末端にＥＮＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｒｉｄｇｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を導入した化学的構造変形をした。デザインした化学的構造変形ｓｉＲＮＡは三千里製薬（韓国）に合成依頼して使用した。
【０１０８】
【表１０】
2014504501.tif 000013
2014504501.tif 000014
【０１０９】
【表１１】
2014504501.tif 000015
【０１１０】
【表１２】
2014504501.tif 000016
【０１１１】
但し、ｍｏｄ１からｍｏｄ７まではアンチセンス鎖の１０番および１１番位置の塩基には変形を加えず、ｍｏｄ１からｍｏｄ１０までの全てのｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖の３’末端にあるｄＴｄＴ（ホスホジエステル結合）をホスホロチオエート結合（３’−ｄＴ*ｄＴ、*：Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｂｏｎｄ）で置換する。
【０１１２】
実施例５．化学的構造変形ｓｉＲＮＡの腫瘍細胞株でのｍＲＮＡ抑制効果
実施例４の化学的構造変形されたｓｉＲＮＡの腫瘍細胞株でｍＲＮＡ抑制効能が維持されるかを確認しようと、化学的構造変形しないｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ５、９、および１１）と構造変形したｓｉＲＮＡ２１乃至５０の３０個のｓｉＲＮＡを実施例３−２のようにリポソーム複合体を製造して、人間肺ガン細胞株（Ａ５４９、ＡＴＣＣ）を形質転換させ（１０ｎＭ  ｓｉＲＮＡ）、形質転換された腫瘍細胞株でＨｉｆ１αの発現様相を実施例３−４と同一に定量分析し、その結果を下記の表１３に示した。
【０１１３】
【表１３】
2014504501.tif 000017
（化学的構造変形をしない元のｓｉＲＮＡはｍｏｄ０と表示した。）
【０１１４】
表１３に示されているように、ｓｉＲＮＡ５、９、１１を化学的構造変形させた時にも腫瘍細胞株でｍＲＮＡ抑制効能が維持されることが分かった。特に、ｍｏｄ５、ｍｏｄ６、ｍｏｄ７、ｍｏｄ８、ｍｏｄ９、およびｍｏｄ１０の場合、化学的構造変形しないｓｉＲＮＡと比較する時、同等以上の効能を示した。
【０１１５】
実施例６．ｓｉＲＮＡによる免疫活性サイトカイン遊離抑制効果
本発明のｓｉＲＮＡが免疫毒性があるかを評価するために下記のような過程で実験を行った。
【０１１６】
実施例６−１．末梢血単核細胞準備
人の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、試験当日に健康な支援者から供給を受けた血液からＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７試薬（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を使用して密度勾配遠心法（ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）を用いて分離した（Ｂｏｙｕｍ  Ａ．  Ｓｅｐｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ．  Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２１（Ｓｕｐｐｌ９７）：７７、１９６８）。血液は１：１比率（重量基準）で互いに混ざらないように１５ｍｌチューブに分注されたＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７試薬の上に慎重に入れた。４００ｘｇ、常温で３０分間遠心分離した後、滅菌ピペットでＰＢＭＣが含まれている層のみを分離した。分離されたＰＢＭＣが入っているチューブに１０ｍｌのリン酸塩緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）を入れた後、２５０ｘｇで１０分間遠心分離し、５ｍｌのＰＢＳで２回さらにＰＢＭＣを洗浄した。分離されたＰＢＭＣは血清が含まれない培地であるｘ−ｖｉｖｏ１５培地（Ｌｏｎｚａ、  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）で４ｘ１０６細胞／ｍｌになるように浮遊させた後、９６−ウェルプレートにウェル（ｗｅｌｌ）当り１００ｕｌずつ分注した。
【０１１７】
実施例６−２．ｓｉＲＮＡ−ＤＯＴＰＡ複合体製造
前記実施例６−１で準備されたＰＢＭＣ細胞に分注するためのｓｉＲＮＡ−ＤＯＴＰＡ複合体を次のような方法で製造した。ＤＯＴＡＰトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）試薬（ＲＯＣＨＥ、Ｇｅｒｍａｎｙ）５ｕｌとｘ−ｖｉｖｏ１５培地４５ｕｌおよびｓｉＲＮＡ番号５、９、１１のｍｏｄ１乃至ｍｏｄ１０の化学的変形体１ｕｌ（５０ｕＭ）とｘ−ｖｉｖｏ１５培地４９ｕｌをそれぞれ混合して製造した後、１０分間室温で反応させた。１０分後にＤＯＴＡＰが含まれている溶液とｓｉＲＮＡが含まれている溶液を混合した後、２０分間２０乃至２５℃温度で反応させてｓｉＲＮＡ−ＤＯＴＡＰ複合体を製造した。
【０１１８】
実施例６−３．細胞の培養
実施例６−１の分注されたＰＢＭＣ培養液１００ｕｌに実施例６−２の方法によって製造されたｓｉＲＮＡ−ＤＯＴＡＰ複合体をウェル当り１００ｕｌずつ添加した後（ｓｉＲＮＡ最終濃度２５０ｎＭ）、３７℃のＣＯ２細胞培養器で１８時間培養後培養した。対照群としてｓｉＲＮＡ−ＤＯＴＡＰ複合体を処理しない細胞培養群およびｓｉＲＮＡを含まないままＤＯＴＡＰのみが処理された細胞培養群を使用し、陽性対照群としてはｓｉＲＮＡの代わりに免疫反応を誘発すると知られた物質であるＰｏｌｙ  Ｉ：Ｃ（Ｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｉｃ−ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｏｓｔａｓｓｉｕｍ  ｓａｌｔ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）およびｓｉＡｐｏＢ−１  ｓｉＲＮＡ（ｓｅｎｓｅ  ＧＵＣ  ＡＵＣ  ＡＣＡ  ＣＵＧ  ＡＡＵ  ＡＣＣ  ＡＡＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７）、アンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）：*ＡＵＵ  ＧＧＵ  ＡＵＵ  ＣＡＧ  ＵＧＵ  ＧＡＵ  ＧＡＣ  ＡＣ、*：５’ホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８、三千里製薬）を前記実施例６−２と同様な方法でＤＯＴＡＰと複合体を製造して処理した細胞培養群を使用した。培養後に細胞上層液のみを分離した。
【０１１９】
実施例６−４．免疫活性の測定
免疫毒性程度を確認するために、前記実施例６−３のようにｓｉＲＮＡ−ＤＯＴＡＰ複合体を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に処理して遊離されるサイトカインを定量した。上層液内に含まれているインターフェロンアルファ（ＩＮＦ−α）およびインターフェロンガンマ（ＩＮＦ−γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、およびインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の含量をＰｒｏｃａｒｔａ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ、ＵＳＡ）を用いて測定した。つまり、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）に対する抗体が付着されたビード（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｅａｄ）５０ｕｌをフィルタープレート（ｆｉｌｔｅｒ  ｐｌａｔｅ）に移して洗浄緩衝液（ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）で１回洗浄した後、５０ｕｌのＰＢＭＣ培養液の上層液およびサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）標準液を分注して常温で６０分間５００ｒｐｍで振りながら培養した。前記サイトカインに対する抗体が付着されたビード、洗浄緩衝液、サイトカイン標準液などの測定器具および試料は全て前記Ｐｒｏｃａｒｔａ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔに含まれたものを使用した。
【０１２０】
以後、洗浄緩衝液で１回洗浄し、キット内に含まれている検出用（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）抗体２５ｕｌを分注して５００ｒｐｍで振りながら３０分間常温で反応させた。再び減圧下に反応液を除去して洗浄した後、キット内に含まれているストレプトアビジン−ＰＥ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）５０ｕｌを分注して５００ｒｐｍで振りながら常温で３０分間反応させた後、減圧下に反応液を除去して３回洗浄をする段階を経た。１２０ｕｌの測定緩衝液（ｒｅａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）を分注して５００ｒｐｍで５分間振った後にルミネックス機器（Ｂｉｏｐｌｅｘ  ｌｕｍｉｎｅｘ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏｒａｄ、ＵＳＡ）を用いて各サイトカインビード（ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｂｅａｄ）別ＰＥ蛍光程度を測定した。ＰＢＭＣにｓｉＲＮＡをそれぞれ２５０ｎＭ処理した時、遊離された細胞培養液中のサイトカイン濃度（ｐｇ／ｍｌ）を下記の表１４に示した。試料中のサイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）濃度は１．２２〜２０，０００ｐｇ／ｍｌ範囲の標準検量曲線から計算した。
【０１２１】
【表１４】
2014504501.tif 000018
【０１２２】
表１４で‘Ｍｅｄｉｕｍ’は何も処理しない対照群、‘ＤＯＴＡＰ’はＤＯＴＡＰ単独処理群、‘ＰＯＬＹ  Ｉ：Ｃ’または‘ｓｉＡｐｏＢ−１'は陽性対照物質処理群、‘ｓｉＲＮＡ５’はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７および２８のｓｉＲＮＡを処理した試験群、‘ｓｉＲＮＡ９’はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５および３６のｓｉＲＮＡおよび‘ｓｉＲＮＡ１２’はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９および４０のｓｉＲＮＡを表示されたように化学変形させた試験群を示す。
【０１２３】
前記で、化学的構造変形されたｍｏｄ１〜１０の場合、インターフェロンアルファの数値が低い増加のみを示し、その他残りのサイトカインは大きい変化がないか非常に低い水準の増加のみを示した。インターフェロンアルファの数値がｍｏｄ１−>ｍｏｄ２−>ｍｏｄ３、４、５、７、８、９の順に顕著に減少してＤＯＴＡＰ単独処理群の水準に落ちるので、本発明のｓｉＲＮＡ番号５、９および１１の化学的構造変形体は免疫活性を減少させることができる。
【０１２４】
実施例７．化学的構造変形ｓｉＲＮＡのセンス鎖によるオフターゲット効果（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔ）の抑制効果
本発明のｓｉＲＮＡの化学的構造変形を通じてセンス鎖によるオフターゲット（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）効果を除去することができるかを下記のような過程で実験を行った。
【０１２５】
センス鎖によるオフターゲット（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）効果が起こる程度は、センス鎖がＲＩＳＣと結合してセンス鎖と相補的な塩基配列を有する配列に作用する場合に、センス鎖の相補的な配列を有するホタルルシフェラーゼプラスミドによって発現されるルシフェラーゼ量がｓｉＲＮＡを処理しない細胞に比べて減少するのを確認することによって分かる。また、アンチセンスの相補的な配列を有するホタルルシフェラーゼプラスミドを処理した細胞に対してはｓｉＲＮＡによって示されるルシフェラーゼの減少程度でアンチセンスによるｓｉＲＮＡの効能が化学的構造変形をした後にどの程度維持されるかが確認できる。
【０１２６】
実施例７−１．ホタルルシフェラーゼベクター（ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｖｅｃｔｏｒ）準備
ホタルルシフェラーゼを発現するｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（Ａｍｂｉｏｎ）ベクターにそれぞれのｓｉＲＮＡに対して、アンチセンス鎖に相補的な配列およびセンス鎖に相補的な配列をそれぞれクローニングして入れて２つの異なるプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）をそれぞれ準備した。前記相補的な配列はコスモジーンテックに依頼して両端にＳｐｅＩとＨｉｎｄＩＩＩのｅｎｚｙｍｅ  ｓｉｔｅ  ｏｖｅｒｈａｎｇを有するようにデザインして合成した後に、ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴベクターのＳｐｅＩとＨｉｎｄＩＩＩ  ｅｎｚｙｍｅ  ｓｉｔｅを用いてクローニングして入れた。
【０１２７】
実施例７−２．ｓｉＲＮＡの化学的構造変形を通じたオフターゲット（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）効果の抑制測定
前記実施例７−１で準備された、ｓｉＲＮＡのセンスとアンチセンス各鎖の相補的な配列が含まれているプラスミドを用いてｓｉＲＮＡのアンチセンスとセンス鎖の効能程度を測定した。
【０１２８】
具体的に、実施例７−１で準備されたホタルルシフェラーゼベクター（ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｖｅｃｔｏｒ）をｓｉＲＮＡと共にＡ５４９細胞（ＡＴＣＣ）内にトランスファクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた後に発現されるホタルルシフェラーゼの量をルシフェラーゼアッセイ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ）で測定した。トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）一日前にＡ５４９細胞株を２４ウェルプレート（ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に６＊１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで準備した。相補的な塩基配列がクローニングされたルシフェラーゼベクター（１００ｎｇ）をｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）と補正ベクターであるレニラルシフェラーゼ（ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を発現するｐＲＬ−ＳＶ４０ベクター（２ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にリポフェクタミン２０００（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）でトランスフェクションさせた。細胞はトランスフェクション２４時間後に、自然型溶解バッファー（Ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて溶解（ｌｙｓｉｓ）させた後、デュアルルシフェラーゼアッセイキット（Ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ）でルシフェラーゼ活性（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定した。
【０１２９】
ホタルルシフェラーゼ測定値はレニラルシフェラーゼ（ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）測定値でトランスフェクション効率を補正した後、ｓｉＲＮＡなしに各鎖の相補的な配列をクローニングして入れたホタルルシフェラーゼベクターとレニラルシフェラーゼベクターのみトランスフェクションさせた対照群の補正されたルシフェラーゼ数値（１００％）に対する百分率値を算出して下記表１５に示した。
【０１３０】
【表１５】
2014504501.tif 000019
（化学的構造変形をしない元のｓｉＲＮＡはｍｏｄ０と示した。）
【０１３１】
前記表１５に示されているように、人の肺ガン細胞株ではｓｉＲＮＡ１１の場合に化学的構造変形をしないｓｉＲＮＡ（ｍｏｄ０）それ自体でもセンス鎖によるオフターゲット（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）効果がなかった。しかし、ｓｉＲＮＡ５、９番のセンス鎖に相補的な配列を有するホタルルシフェラーゼの活性が減少することを通じて若干のセンス鎖によるオフターゲット（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）効果を示したが、化学的構造変形をさせた場合に特に、ｓｉＲＮＡ５番はｍｏｄ３で、ｓｉＲＮＡ９番はｍｏｄ２でオフターゲット（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）効果は減少し、アンチセンスターゲット（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔａｒｇｅｔ）に対する効果は維持された。
【配列表】
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【国際調査報告】
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2014504501.tif 000027
2014504501.tif 000028
2014504501.tif 000029
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