(57)【要約】  本発明は、hmgb2遺伝子の機能の不活化によって遺伝的に弱毒化されたプラスモディウム寄生虫を使用する、宿主をマラリアに対して免疫するための新規組成物および方法に関する。
2014520563.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物におけるマラリアまたは脳性マラリアの予防に使用するための、hmgb2遺伝子の機能が不活化されているプラスモディウム（Plasmodium）属に属する生寄生虫。
【請求項２】
寄生虫の株が、プラスモディウム・ベルゲイ（Plasmodium berghei）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）、および二日熱マラリア原虫（Plasmodium knowlesi）からなる群より選択される、請求項1に記載の寄生虫。
【請求項３】
寄生虫の株が、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫および四日熱マラリア原虫からなる群より選択される、請求項1または2に記載の寄生虫。
【請求項４】
寄生虫の株が熱帯熱マラリア原虫である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の寄生虫。
【請求項５】
寄生虫が、その野生型の形態において、脳性マラリアを引き起こさない、請求項1〜4のいずれか一項に記載の寄生虫。
【請求項６】
寄生虫の株がプラスモディウム・ベルゲイNK65である、請求項1、2および5のいずれか一項に記載の寄生虫。
【請求項７】
寄生虫の株が、非細胞接着性であるかまたは低下した細胞接着能を有する熱帯熱マラリア原虫株である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の寄生虫。
【請求項８】
寄生虫の株が、低下した細胞接着能を有する熱帯熱マラリア原虫株である、請求項7に記載の寄生虫。
【請求項９】
寄生虫が非赤血球内メロゾイトの形態にある、請求項1〜8のいずれか一項に記載の寄生虫。
【請求項１０】
寄生虫が赤血球内形である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の寄生虫。
【請求項１１】
寄生虫が、赤血球内トロフォゾイト、メロゾイトまたはシゾントの形態にある、請求項10に記載の寄生虫。
【請求項１２】
寄生虫が、赤血球内メロゾイトまたはシゾントの形態にある、請求項11に記載の寄生虫。
【請求項１３】
寄生虫がスポロゾイトの形態にある、請求項1〜8のいずれか一項に記載の寄生虫。
【請求項１４】
hmgb2遺伝子の機能が、該遺伝子の完全な欠失または部分的欠失によって不活化されている、請求項1〜13のいずれか一項に記載の寄生虫。
【請求項１５】
hmgb2遺伝子の機能が、該遺伝子の完全な欠失によって不活化されている、請求項14に記載の寄生虫。
【請求項１６】
hmgb2遺伝子のコード領域が選択可能マーカーで置き換えられている、請求項14または15に記載の寄生虫。
【請求項１７】
選択可能マーカーが、ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードするヒト遺伝子である、請求項16に記載の寄生虫。
【請求項１８】
hmgb2遺伝子の機能が、HMGB2タンパク質の翻訳を阻止するか減少させる干渉RNAを使って不活化されている、請求項1〜13のいずれか一項に記載の寄生虫。
【請求項１９】
1つ以上の他の遺伝子の機能が不活化されている、請求項1〜18のいずれか一項に記載の寄生虫。
【請求項２０】
機能が不活化されている他の遺伝子が、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ヌクレオシドトランスポーター1、UIS3、UIS4、p52およびp36をコードする遺伝子ならびにその組み合わせからなる群より選ばれる、請求項19に記載の寄生虫。
【請求項２１】
免疫原としての、免疫学的有効量の請求項1〜20のいずれか一項に記載の寄生虫と、1つ以上の医薬上許容される賦形剤または担体とを含む、免疫原性組成物。
【請求項２２】
免疫原としての、請求項1〜20のいずれか一項に記載の寄生虫と、1つ以上の医薬上許容される賦形剤または担体とを含む、マラリアワクチン。
【請求項２３】
1つ以上の免疫アジュバントも含む、請求項21に記載の免疫原性組成物または請求項22に記載のワクチン。
【請求項２４】
免疫アジュバントが、ムラミルペプチドタイプのアジュバント；トレハロースジミコレート（TDM）；リポ多糖（LPS）；モノホスホリルリピドA（MPL）；カルボキシメチルセルロース；完全フロイントアジュバント；不完全フロイントアジュバント；場合によってはスクアレンまたはスクアランが補足されている「水中油型」エマルションタイプのアジュバント；無機質アジュバント；細菌毒素；CpGオリゴデオキシヌクレオチド；サポニン；合成コポリマー；サイトカインおよびイミダゾキノロンからなる群より選択される、請求項23に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２５】
非経口投与するために製剤化された、請求項21、23および24のいずれか一項に記載の免疫原性組成物または請求項22〜24のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２６】
請求項1〜20のいずれか一項に記載の寄生虫をいくつか含む、請求項21および23〜25のいずれか一項に記載の免疫原性組成物または請求項22〜25のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２７】
1用量単位あたり10〜106個、好ましくは102〜106個の該寄生虫を赤血球内形で含む、請求項21および23〜26のいずれか一項に記載の免疫原性組成物または請求項22〜26のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２８】
1用量単位あたり103〜107個の寄生虫をスポロゾイトの形態で含む、請求項21および23〜26のいずれか一項に記載の免疫原性組成物または請求項22〜26のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２９】
1用量単位あたり102〜107個の寄生虫を非赤血球内メロゾイトの形態で含む、請求項21および23〜26のいずれか一項に記載の免疫原性組成物または請求項22〜26のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項３０】
マラリアまたは脳性マラリアに対するワクチン組成物を調製するための、請求項1〜20のいずれか一項に記載の寄生虫の使用。
【請求項３１】
対象をマラリアに対して免疫するための方法であって、該対象に、請求項21および23〜29のいずれか一項に記載の免疫原性組成物または請求項22〜29のいずれか一項に記載のワクチンを投与することを含む方法。
【請求項３２】
組成物またはワクチンが非経口投与される、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
組成物またはワクチンが皮下投与、筋肉内投与、皮内投与または静脈内投与される、請求項32に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学分野、特にマラリア対策の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
［発明の技術的背景］
マラリアはプラスモディウム（Plasmodium）属の真核単細胞寄生虫が引き起こす感染性疾患である。この寄生虫症は世界中に存在し、開発途上国では深刻な経済問題および健康問題を引き起こす。熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）は、ヒトに感染する5タイプのプラスモディウムのなかで最も有害な種である。世界保健機関（WHO）によれば、熱帯熱マラリア原虫は、年間2億5千万〜5億例の急性疾患と年間約100万例の死亡（とりわけ5歳未満の小児および妊婦）の原因である。脳性マラリアは、マラリアの重症な神経学的合併症であり、この疾患の致死例の大多数は脳性マラリアが原因である。たとえ生き残ったとしても、脳性マラリアは重篤な神経学的後遺症につながりうる。免疫系が形成途上にある幼児の場合は特にそうである。脳性マラリアの病理発生過程は複雑であり、完全に解明されたというにはほど遠い。現時点では、この脳病変はおそらく、主要器官（脾臓、肺、心臓、腸、腎臓、肝臓および脳）の微小血管における寄生赤血球の滞留と、その器官における炎症誘発性サイトカインの産生との結果であり、それが、その個体の死につながりうる全身性の症候群および状態をもたらすと、一般に考えられている。
【０００３】
マラリア対策はWHOにとって大きな課題の一つであるが、今までのところ、この疾患の抑制を目指す努力は全て失敗に終わっている。WHOのデータは期待が持てるように見えても、過去30年の間、殺虫剤に対するハマダラカの耐性が発生し、抗マラリア薬に対する熱帯熱マラリア原虫の化学療法抵抗性が（抗マラリア薬を併用してもなお）拡大していることから、状況は悪化している。
【０００４】
マラリアに対して本当に有効なワクチンが存在しないことが、この疾患の対策を困難にしている。ワクチンを開発する最初の試みは1970年代に遡る。それ以降、ワクチン治験の数は増え続けてきたが、それらは、その2つの逐次的宿主であるヒトおよび蚊における本寄生虫の発生の複雑さや、本寄生虫の少なからぬ抗原変異が関与する、免疫系を回避するための極めて複雑な機序に直面している。
【０００５】
本寄生虫の赤血球期におけるこの変異は、プラスモディウムタンパク質-ペプチド複合体を使った従来の予防的ワクチン接種を、極めて困難にする。本寄生虫のタンパク質から生産されたマラリアワクチンは現在、臨床治験の第III相にある（GlaxoSmithKline BiologicalsのRTS,S）。しかし第II相において得られた結果は、このワクチンが臨床的マラリアの発生を35％しか低減せず、重症マラリアの発生を49％しか低減しないことを示している。
【０００６】
それでもなお、赤血球形の本寄生虫に対して有効なワクチンを得ることは、そのようなワクチンによって、症状を軽減することも、寄生虫負荷量および血中のガメトサイト量を低減すること、そしてそれゆえに、本寄生虫の伝播を低減することも、可能になるであろうと考えると、この疾患の根絶においては大きな努力目標である。
【０００７】
熱帯熱マラリア原虫3D7が寄生した赤血球の極低用量での反復投与を抗マラリア薬の同時服用と併用すると、患者を赤血球期の相同株から防御する能力を有する免疫が誘導されることが、最近の研究によって示されている（Pombo et al., 2002）。
【０００８】
そこで、遺伝的に弱毒化された生寄生虫（すなわちGAP、「Genetically Attenuated Parasite（遺伝的弱毒化寄生虫）」）を使って、長期間持続する無感染防御を誘導することが考えられた。したがっていくつかのGAPが記述されている。しかし、これらのGAPの大半は、弱毒化寄生虫のスポロゾイトによって、肝細胞段階を標的とする。赤血球段階を標的とする2つのGAP、すなわちプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（PNP）（Ting et al., 2008）またはヌクレオシドトランスポーター1（NT1）（Aly et al., 2010）が不活化されたプラスモディウム・ヨエリ（P. yoelii）齧歯類寄生虫も記述されている。これらのGAPは相同株に関する免疫を付与すると共に、程度は低いものの、非相同株に関する免疫も付与することが示されている。しかし、これらの遺伝的に弱毒化された生寄生虫を使ったワクチンの効力および無毒性は、まだ決定されていない。
【０００９】
したがって現時点では、特に、脳性マラリアなどの重篤な発作の発生を抑えると共に、寄生虫負荷量および末梢血におけるガメトサイトの量も低減し、それによって本疾患の伝播のリスクを低減することを可能にするであろう新規な戦略を開発することが、今なお不可欠である。
【発明の概要】
【００１０】
［発明の概要］
本発明の目的は、マラリアを予防するために、特に脳性マラリアなどといったマラリアの重篤な発作の発生を防止するために、マラリアの新規ワクチン組成物を提供することである。
【００１１】
本発明者らは、プラスモディウム属に属し、かつhmgb2遺伝子の機能が不活化されている生寄生虫を、マラリアワクチンにおける免疫原として使用できることを実証した。実際、本発明者らは、そのような寄生虫の投与が、寄生虫の排除（末梢血中の寄生虫負荷量が顕微鏡による検出閾値未満であること）を可能にすると共に、プラスモディウムによる感染、特に高病原性株による感染に対する、より具体的には本疾患の総体症状およびその伝播の原因である赤血球期の寄生虫に対する、効果的かつ長期間持続する防御をも可能にする、宿主における免疫反応を誘導することを観察した。
【００１２】
したがって本発明は、まず第一に、マラリアの予防に使用するための、特に本疾患の重症な神経学的合併症である脳性マラリアの予防に使用するための、hmgb2遺伝子の機能が不活化されているプラスモディウム属に属する生寄生虫に関する。
【００１３】
好ましくは、本発明の寄生虫は、哺乳動物、特にヒトにおける、マラリアまたは脳性マラリアの予防に使用される。
【００１４】
寄生虫の株は、プラスモディウム・ベルゲイ（Plasmodium berghei）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）、および二日熱マラリア原虫（Plasmodium knowlesi）からなる群より選択することができる。好ましくは、寄生虫の株は、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫および二日熱マラリア原虫からなる群より選択され、特に好ましくは、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫および四日熱マラリア原虫からなる群より選択される。
【００１５】
ある特定実施形態では、寄生虫の株が熱帯熱マラリア原虫である。
【００１６】
もう一つの特定実施形態では、寄生虫の株がプラスモディウム・ベルゲイ、特にプラスモディウム・ベルゲイNK65である。
【００１７】
好ましくは、寄生虫は、その野生型の形態において、脳性マラリアを引き起こさない。
【００１８】
ある特定実施形態では、寄生虫の株が、非細胞接着性であるか、または低下した細胞接着能を有する熱帯熱マラリア原虫株であり、好ましくは低下した細胞接着能を有する熱帯熱マラリア原虫株である。
【００１９】
本発明の寄生虫は、赤血球内形、特に赤血球内トロフォゾイト、メロゾイトまたはシゾントの形態、好ましくは赤血球内メロゾイトまたはシゾントの形態をとりうる。
【００２０】
本発明の寄生虫は、非赤血球内メロゾイト、すなわち寄生赤血球から完全な精製または部分精製によって得られるメロゾイトの形態をとりうる。
【００２１】
本発明の寄生虫は、スポロゾイトの形態もとりうる。
【００２２】
hmgb2遺伝子の機能は、該遺伝子の完全な欠失または部分的な欠失によって、好ましくは該遺伝子の完全な欠失によって、不活化することができる。特に、hmgb2遺伝子のコード領域を、ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードするヒト遺伝子などの選択可能マーカーで置き換えることができる。
【００２３】
hmgb2遺伝子の機能は、HMGB2タンパク質の翻訳を阻止するか減少させる干渉RNAを使って不活化することもできる。
【００２４】
本発明の寄生虫では、1つ以上の他の遺伝子の機能を不活化することができる。特に、機能が不活化される他の遺伝子は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ヌクレオシドトランスポーター1、UIS3、UIS4、p52およびp36をコードする遺伝子、ならびにその組み合わせからなる群より選ぶことができる。
【００２５】
第2の態様において、本発明は、免疫原としての免疫学的有効量の本発明の寄生虫と、1つ以上の医薬上許容される賦形剤または担体とを含む、免疫原性組成物に関する。また本発明は、免疫原としての本発明の寄生虫と、1つ以上の医薬上許容される賦形剤または担体とを含むマラリアワクチンに関する。
【００２６】
本免疫原性組成物またはワクチンは1つ以上の免疫アジュバントも含みうる。特に免疫アジュバントは、ムラミルペプチドタイプのアジュバント；トレハロースジミコレート（TDM）；リポ多糖（LPS）；モノホスホリルリピドA（MPL）；カルボキシメチルセルロース；完全フロイントアジュバント；不完全フロイントアジュバント；場合によってはスクアレンまたはスクアランが補足された、「水中油型」エマルションタイプのアジュバント；無機質アジュバント；細菌毒素；CpGオリゴデオキシヌクレオチド；サポニン；合成コポリマー；サイトカインおよびイミダゾキノロンからなる群より選択しうる。
【００２７】
本免疫原性組成物またはワクチンは非経口投与するために製剤化しうる。
【００２８】
本免疫原性組成物またはワクチンは、本発明の寄生虫をいくつか含みうる。
【００２９】
好ましくは、本組成物またはワクチンは、1注射用量あたり10〜107個、好ましくは10〜105個、より好ましくは102〜105個の寄生虫を含む。
【００３０】
ある特定実施形態では、本免疫原性組成物またはワクチンが、1用量単位あたり10〜106個、好ましくは102〜106個の本発明の寄生虫を赤血球内形で含む。
【００３１】
もう一つの特定実施形態では、本免疫原性組成物またはワクチンが、1用量単位あたり102〜107個の本発明の寄生虫を、非赤血球内メロゾイトの形態で含む。
【００３２】
さらにもう一つの特定実施形態では、本免疫原性組成物またはワクチンが、1用量単位あたり103〜107個の本発明の寄生虫をスポロゾイトの形態で含む。
【００３３】
もう一つの態様において、本発明は、マラリアまたは脳性マラリアに対するワクチン組成物を調製するための本発明の寄生虫の使用に関する。
【００３４】
もう一つの態様において、本発明は、対象をマラリアに対して免疫するための方法であって、本発明の免疫原性組成物またはワクチンを、該対象に、好ましくは非経口投与、特に皮下、筋肉内、皮内または静脈内投与することを含む方法にも関係する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】野生型寄生虫PbNK65または変異型寄生虫PbNK65Δhmgb2が寄生している赤血球（pRBC）（それぞれ静脈内注射1回あたり105個および106個のpRBC）に感染させたC57BL/6マウスの寄生虫血。寄生虫血は、顕微鏡下で染色塗抹標本中のpRBCを計数することによって解析し、pRBCの百分率（平均±標準偏差）として表す。実験は5匹のマウスで行い、数回繰り返した。p値は0.008である。
【図２】変異型寄生虫PbNK65Δhmgb2による初感染とそれに続く2つの病原性野生型寄生虫PbNK65およびPbANKAによる3回の感染とに付したマウスの生存率の研究。1回目のチャレンジはD19（初感染の19日後）に行い、2回目をD71に行い、最後に3回目をD162に行った。各チャレンジ時に、初感染に付していない同齢のマウスを感染させ、それらがどうなるかおよび高寄生虫血または脳性マラリアによるそれらの死を監視することによって、PbNK65およびPbANKAに感染させたpRBCの2つの調製物の病原性を確認した。各実験につき5匹のマウスを解析した。
【図３】さまざまな量の変異型寄生虫PbNK65Δhmgb2感染pRBCによるC57BL/6マウスの免疫。10匹のマウスを、時刻0において、103個（□）、104個（○）または105個（△）のPbNK65Δhmgb2感染pRBCに感染させた。次に、これらのマウスを、D24に、105個の野生型病原性寄生虫PbNK65感染pRBC（n＝5）または野生型病原性寄生虫PbANKA感染pRBC（n＝5）による感染チャレンジに付した。ナイーブマウスも、D24に、105個の野生型病原性寄生虫PbNK65感染pRBC（▲）または野生型病原性寄生虫PbANKA感染pRBC（●）による感染チャレンジに付した。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
［発明の詳細な説明］
熱帯熱マラリア原虫ゲノムの配列決定は2002年に完了した。このゲノムはおよそ5500個の遺伝子を含み、そのうちの50％以上は、機能が全くわかっていない。熱帯熱マラリア原虫における転写調節に関与する因子を研究する際に、本発明者らは、4つのHMGB（PfHMGB1〜4；高移動度群ボックス（High Mobility Group Box）タンパク質）をアノテートした。これらは、核内因子であり細胞外メディエーターでもあるという特色を有する極めて豊富な非ヒストン核タンパク質である。
【００３７】
これらのタンパク質が詳しく研究されているヒトでは、これらが細胞核内に存在し、クロマチンリモデリングによる転写の調節に関与する構造因子として作用する。細胞にとって危険な状況（異物、炎症）では、これらのタンパク質が細胞培地に能動的に分泌されかつ/または細胞壊死の場合であれば受動的に分泌され、マクロファージおよび免疫系の他の担当細胞を活性化することによって現実の危険信号（アラーミン）として作用する（Lotze and Tracey, 2005）。ヒトHMGB1タンパク質の関与は、全身性炎症を引き起こす疾患、例えばエリテマトーデス、敗血症性ショックまたは関節リウマチ、および一定のがんにおいて実証されている。さらに、患者の血清におけるヒトHMGB1タンパク質の増加は、これらの疾患の重症度との相関関係が証明されている。
【００３８】
熱帯熱マラリア原虫において、本発明者らは、100アミノ酸未満の小さなタンパク質であるPfHMGB1およびPfHMGB2を、より詳しく研究した。これら2つのタンパク質は、それらのヒト相同体と同様に、DNAを折り曲げ、特定のDNA構造と相互作用する能力を有する(Briquet et al., 2006）。これらも分泌され、熱帯熱マラリア原虫培養上清中に見いだされる。熱帯熱マラリア原虫のHMGB1および2タンパク質は、マウス単球株においてTNFα発現を活性化し誘導する能力を有する（Kumar et al., 2008）。
【００３９】
本願において、本発明者らは、プラスモディウム・ベルゲイ（P. berghei）ANKA寄生虫（PbANKA）に感染させたC57BL/6マウスを、脳性マラリアの動物モデルとして使用した。この動物モデルでは、ヒト病理の主特徴、例えば運動失調、空間失見当識、痙攣および昏睡が再現される。これらの臨床症状は動物の死をもたらしうる。ヒトの場合と同様に、このモデルでも、寄生赤血球の滞留、脳出血および脳病変、炎症誘発性サイトカインの産生および血液脳関門の破壊が観察される。このモデルでは、PbANKA分離株に感染させたC57BL/6マウスの全てが、脳性マラリアにより、およそ7日で死亡する。これに対し、本発明者らは、寄生虫PbANKAΔhmgb2に感染させたマウスの60％が、脳性マラリアを発症しないことを観察した。
【００４０】
本発明者らは、感染後20〜25日で高寄生虫血によるC57BL/6マウスの死亡を誘発するが脳性マラリアは引き起こさない、もう一つのプラスモディウム・ベルゲイ分離株、NK65分離株のhmgb2遺伝子を不活化した。本発明者らは、まず第一に、この遺伝子の不活化が、マウスにおけるPbNK65Δhmgb2の発生を妨げ、感染の10〜15日後に得られる末梢血から寄生虫を排除することを観察した。次に、本発明者らは、寄生虫の排除をもたらす宿主の応答が、相同野生型株PbNK65についてだけでなく、脳性マラリアを誘発する能力を有する高病原性非相同株PbANKAについても、6ヶ月以上持続する無感染免疫を誘導するのに十分であることを実証した。
【００４１】
したがって、第一の態様において、本発明は、好ましくは哺乳動物における、特に好ましくはヒトにおける、マラリアまたは脳性マラリアの予防に使用するための、hmgb2遺伝子の機能が不活化されているプラスモディウム属に属する生寄生虫に関する。
【００４２】
寄生虫は、好ましくは、脊椎動物において、特に哺乳動物において、発生する能力を有し、プラスモディウム・ビンケイア（Plasmodium vinckeia）、プラスモディウム・プラスモディウム（Plasmodium plasmodium）およびプラスモディウム・ラベラニア（Plasmodium laverania）からなる群より選択される亜属に属する。
【００４３】
ある実施形態では、寄生虫が、ヒト宿主において発生する能力を有し、亜属プラスモディウム・プラスモディウムまたはプラスモディウム・ラベラニアに属する。好ましくは、寄生虫は、ヒトにおいてマラリアの原因になる種、特に熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫および二日熱マラリア原虫からなる群より選択される種に属する。二日熱マラリア原虫は基本的には霊長類に感染する寄生虫であるが、この寄生虫によるヒト感染例が報告される数は増えつつある。特に好ましくは、寄生虫は、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫および四日熱マラリア原虫からなる群より選択される種に属する。ある特定実施形態では、寄生虫が、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫および四日熱マラリア原虫からなる群より選択される種に属する。好ましい一実施形態では、寄生虫が種・熱帯熱マラリア原虫に属する。
【００４４】
もう一つの実施形態では、寄生虫が、ヒトにおいて、免疫反応を誘導する能力を有するが、マラリアの症状を引き起こす能力は有さない種に属する。好ましくは、この寄生虫は、亜属プラスモディウム・ビンケイアに属するげっ歯類寄生虫である。ヒトでのワクチン接種におけるげっ歯類寄生虫の使用により、対象への生寄生虫の投与に関連するリスクをかなり低減することが可能になる。げっ歯類寄生虫は、ヒトに感染するプラスモディウム（例えば熱帯熱マラリア原虫）の、ヒト赤血球への侵入に必要なタンパク質を、1つ以上発現するように改変することができる。そのようなタンパク質は、例えばTriglia et al. （2000）の論文に記載されている。好ましくは、寄生虫は、種プラスモディウム・ベルゲイまたはプラスモディウム・ヨエリに属する。特に好ましくは、寄生虫は、種プラスモディウム・ベルゲイに属する。好ましい一実施形態では、寄生虫が種プラスモディウム・ベルゲイのNK65分離株である。
【００４５】
ある特定実施形態では、寄生虫が、プラスモディウム・ベルゲイ、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫および二日熱マラリア原虫からなる群より選択される種に属する。寄生虫は、プラスモディウム・ベルゲイ、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫および四日熱マラリア原虫からなる群、またはプラスモディウム・ベルゲイ、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫および四日熱マラリア原虫からなる群、あるいはプラスモディウム・ベルゲイおよび熱帯熱マラリア原虫からなる群より選択される種にも属しうる。
【００４６】
好ましい一実施形態では、寄生虫の野生型株、すなわちhmgb2遺伝子が活性な寄生虫が、脳性マラリアを引き起こさない。この株は、例えば、プラスモディウム・ベルゲイNK65、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫および二日熱マラリア原虫からなる群より選ぶことができる。この株は、その細胞接着能を失っているかまたは低下した細胞接着能を有する熱帯熱マラリア原虫株であってもよい。ある実施形態では、寄生虫の野生型株が非細胞接着性熱帯熱マラリア原虫株である。もう一つの実施形態では、寄生虫の野生型株が、低下した細胞接着能を有する熱帯熱マラリア原虫株である。細胞接着性は、脳性マラリアの発生に直結する熱帯熱マラリア原虫の性質である。事実、細胞接着性熱帯熱マラリア原虫に感染した赤血球は、内皮細胞の表面分子、例えばCD36、ICAM1、VCAM1またはPECAM1/CD31に結合することで、血管閉塞、炎症およびさまざまな器官（特に脳）の損傷を引き起こす能力を有する。ある株の細胞接着能は、当業者に知られている任意の技法によって、例えばBuffet et al. （1999）の論文またはTraore et al.（2000）の論文に記載されているものによって、評価することができる。「低下した細胞接着能」という用語は、参照細胞接着性プラスモディウム株、例えば熱帯熱マラリア原虫3D7株で観察されるものより低い細胞接着能を指す。細胞接着性は、参照細胞接着性プラスモディウム株、例えば熱帯熱マラリア原虫3D7株との比較で、少なくとも40％、50％、60％、70％、80％、90％または95％、好ましくは少なくとも80％、特に好ましくは少なくとも90％低下させることができる。例えばエクスビボ培養での継代を繰り返すことによって低下した細胞接着能を有する熱帯熱マラリア原虫株を得ることができる（Udeinya et al., 1983）。低下した細胞接着能を有するさまざまな熱帯熱マラリア原虫株が、例えばTrenholme et al.（2000）の論文（clag9遺伝子が不活化されている熱帯熱マラリア原虫）およびNacer et al.（2011）の論文（熱帯熱マラリア原虫D10およびT9-96）などに記載されている。したがって、ある特定実施形態では、寄生虫の野生型株が、細胞接着性が弱いまたは非細胞接着性の熱帯熱マラリア原虫株である。特に、寄生虫の野生型株は、clag9遺伝子 が不活化されている熱帯熱マラリア原虫株、熱帯熱マラリア原虫D10株、および熱帯熱マラリア原虫T9-96株からなる群より選択される、低下した細胞接着能を有する熱帯熱マラリア原虫株でありうる。
【００４７】
本発明に従って使用される寄生虫では、hmgb2遺伝子の機能が不活化されている。これは、この遺伝子によってコードされているHMGB2タンパク質の活性が完全にまたは部分的に阻害されており、好ましくは完全に阻害されていることを意味する。この阻害は当業者に周知の数多くの方法によって達成することができる。例えば遺伝子の機能は、hmgb2遺伝子の転写または翻訳を阻止するか減少させることによって、またはタンパク質の正しいフォールディングもしくはその活性を破壊することなどによって、転写レベルまたは翻訳レベルで阻止するか、タンパク質レベルで阻止することが可能である。
【００４８】
特に、hmgb2遺伝子の機能は、この遺伝子の完全なまたは部分的な欠失によって、あるいはこの遺伝子を不活性にするために、1つ以上のヌクレオチドを挿入または置換することによって、不活化することができる。
【００４９】
ある特定実施形態では、hmgb2遺伝子の機能が、この遺伝子の完全なまたは部分的な欠失によって、好ましくは完全な欠失によって、不活化されている。
【００５０】
好ましくは、hmgb2遺伝子の欠失は相同組換えによって達成される。この方法は、当業者にはよく知られており、プラスモディウム属の寄生虫には何度も応用されてきた（例えばThathy and Menard, 2002参照）。ある特定実施形態では、hmgb2遺伝子のコード領域を、相同組換えにより、組換えが起こった寄生虫の選択を可能にするマーカーで置き換える。選択可能マーカーは、例えば、寄生虫にピリメタミン耐性を付与するヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhfr）遺伝子であることができる。hmgb2遺伝子が欠失している寄生虫の取得を実験項に例示する。本発明のある特定実施形態において、使用される寄生虫は、hmgb2遺伝子が選択可能マーカー（好ましくはヒトdhfr遺伝子）で置き換えられた寄生虫である。本発明の具体的一実施形態において、使用される寄生虫は、hmgb2遺伝子が選択可能マーカー（好ましくはヒトdhfr遺伝子）で置き換えられたプラスモディウム・ベルゲイ（好ましくはNK65分離株）である。本発明のもう一つの特定実施形態において、使用される寄生虫は、hmgb2遺伝子が選択可能マーカー（好ましくはヒトdhfr遺伝子）で置き換えられた、好ましくは非細胞接着性であるかまたは細胞接着性が弱い、熱帯熱マラリア原虫である。
【００５１】
hmgb2遺伝子の機能は、この遺伝子のmRNAの翻訳を阻止するか減少させることによって不活化することもできる。ターゲット遺伝子の発現を特異的に阻害することを可能にするRNA干渉は当業者には周知の現象であり、プラスモディウム遺伝子の発現を阻害するために既に使用されている（例えばMcRobert and McConkey, 2002；Mohmmed et al., 2003；Gissot et al. 2004参照）。ある実施形態では、干渉RNAまたはその前駆体をコードする配列が寄生虫のゲノムに導入され、その発現が、強力なプロモーター、好ましくは構成的プロモーター、例えば寄生虫の全発生段階において活性なeEF1α伸長因子、またはスポロゾイトおよび赤血球サイクルにおいて活性なHSP70遺伝子のプロモーターなどによって制御される。干渉RNAの配列と構造は当業者であれば容易に選ぶことができる。特に、使用される干渉RNAは低分子干渉RNA（siRNA）でありうる。
【００５２】
配列決定されたさまざまなプラスモディウム種のhmgb2遺伝子の配列および対応するタンパク質配列のGenBankリファレンスを、下記表1に掲載する。
［表1］現在までに配列決定されたさまざまなプラスモディウム種のHMGB2のヌクレオチドおよびタンパク質配列のGenBankリファレンス
【表１】
2014520563.tif 000003
【００５３】
まだ配列決定されていないプラスモディウム種のhmgb2遺伝子は、当業者に周知の方法を使って、特にハイブリダイゼーションまたはPCRによって、容易に同定することができる。
【００５４】
本発明の寄生虫では、hmgb2以外の1つ以上の遺伝子の機能も不活化することができる。機能が不活化されるさらなる遺伝子は、哺乳動物宿主、特にヒトにおける寄生虫の生存に関与する遺伝子であることができる。好ましくは、このさらなる遺伝子の不活化は、寄生虫のビルレンスを減弱すると同時に、その免疫原性を保つことを可能にする。このさらなる遺伝子は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（PNP；PFE0660c）、ヌクレオシドトランスポーター1（NT1；PF13_0252）、UIS3（PF13_0012）、UIS4（PF10_0164初期転写産物）、p52（PFD0215c、6システインモチーフを有するタンパク質）およびp36（PFD0210c）、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選ぶことができる（カッコ内のリファレンスは、例として本明細書に掲載する熱帯熱マラリア原虫3D7配列のPlasmoDBバンクアクセッション番号である）。
【００５５】
本発明の寄生虫を成長させるための方法、および寄生虫の保存方法、特に冷凍保存の方法は、既に記述されており、当業者にはよく知られている（例えばLeef et al., 1979；Orjih et al., 1980参照）。これらの寄生虫は、細胞培養を使ってエクスビボで成長させるか、動物、例えばマウスにおいて、インビボで成長させることができる。
【００５６】
ある実施形態では、本発明の寄生虫が、赤血球形で、特に非赤血球内メロゾイトの形態または赤血球内メロゾイト、トロフォゾイトもしくはシゾントの形態で使用される。
【００５７】
ある特定実施形態では、本発明の寄生虫が、赤血球内メロゾイト、トロフォゾイトまたはシゾントの形態で、すなわち赤血球内にある形態で使用される。
【００５８】
もう一つの特定実施形態では、寄生虫が、非赤血球内メロゾイトの形態で、すなわち寄生赤血球の破裂後に部分的にまたは完全に精製されたメロゾイトの形態で使用される。メロゾイトは、Boyle et al.（2010）の論文に記載されている方法など、当業者に知られている任意の方法に従って得ることができる。
【００５９】
寄生赤血球は、宿主（好ましくはヒト）に寄生虫を導入し、寄生虫血が最低1％、好ましくは5％〜10％に達した時に、感染した宿主の赤血球を回収することによって得ることができる。好ましい一実施形態では、寄生赤血球が、血液型がOでありリーサス因子陰性であるヒト宿主から回収される。
【００６０】
もう一つの好ましい実施形態において、寄生赤血球は、ヒト赤血球の、好ましくは血液型Oおよびリーサス因子陰性である赤血球の、エクスビボ感染によって得られる。場合によっては、主として赤血球内メロゾイト、トロフォゾイトまたはシゾントが得られるように、寄生赤血球培養物を同期することができる。プラスモディウム寄生虫のエクスビボ培養法は当業者にはよく知られている（例えばTrager and Jensen, 1976参照）。
【００６１】
こうして得られた寄生赤血球には抗凝固剤、例えばヘパリンを加えることができる。寄生赤血球は、インビボ使用に適合する1つ以上の凍結保護剤、例えばグリセロールまたはジメチルスルホキシド（DMSO）などの存在下で冷凍することによって保存することができる。寄生赤血球は、およそ45日を超えない期間であれば、適当な保存培地、例えばSAGM（「Saline Adenine Glucose Mannitol（食塩水・アデニン・グルコース・マンニトール）」）培地またはCPD（Citrate Phosphate Dextrose（クエン酸・リン酸・デキストロース））溶液に入れて4℃の冷蔵庫で保存することもできる。
【００６２】
もう一つの実施形態では、本発明の寄生虫が、スポロゾイトの形態で使用される。スポロゾイトは、寄生虫が増幅する蚊宿主に寄生虫を導入することによって得ることができる。次に、感染した蚊の唾液腺からスポロゾイトを回収する。こうして得られたスポロゾイトは、例えば液体窒素中で凍結することによって保存しておいて、生きた状態で宿主に注入するために、それを融解することができる。あるいは、蚊の唾液腺から回収した後に、凍結乾燥または冷蔵によって、スポロゾイトを投与まで保存しておくことができる。
【００６３】
対象への本発明の寄生虫の投与は、迅速な寄生虫排除にもかかわらず、プラスモディウムによる感染に関して、特に熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫および二日熱マラリア原虫からなる群より選ばれるプラスモディウム、好ましくは熱帯熱マラリア原虫による感染に関して、数ヶ月間持続する免疫を、対象において誘導することを可能にする。この免疫は、特に、使用した寄生虫の株以外のプラスモディウム株に関して交差免疫であることができる。特に、脳性マラリアを引き起こさない株に属する本発明の寄生虫の投与は、この重症な神経学的合併症を引き起こす能力を有するプラスモディウム株による感染に関して交差免疫をもたらすことができる。それゆえに、本発明の寄生虫は、マラリアおよび/または脳性マラリアの予防に使用することができる。特に、対象への本発明の寄生虫の投与は、脳性マラリアを誘発する能力を有する熱帯熱マラリア原虫に関して、数ヶ月間持続する免疫を誘導することを可能にし、よってこの寄生虫によって誘発されるマラリアおよび/または脳性マラリアを予防することを可能にする。
【００６４】
本明細書において使用する用語「予防」は、寄生虫との接触後に、疾患の症状が存在しないこと、または存在する症状が低減していることを指す。特に、「マラリアの予防」という用語は、マラリアの原因となるプラスモディウムとの接触後に、処置された対象において、症状が存在しないこと、または存在する症状が低減していることを指す。「脳性マラリアの予防」という用語は、マラリアの原因であり脳性マラリアを誘発する能力を有するプラスモディウムとの接触後に、処置された対象において、症状が存在しないこと、または存在する症状が低減していることを指す。この用語は、マラリアの原因であり脳性マラリアを誘発する能力を有するプラスモディウムに感染した対象における、脳性マラリアの発生の不在、またはあまり重症でない脳性マラリアもしくは低減した脳性マラリアの発生を指すこともできる。
【００６５】
第2の態様において、本発明は、免疫学的有効量の本発明の寄生虫と、1つ以上の医薬上許容される賦形剤または担体とを含む免疫原性組成物に関する。本組成物に含まれる寄生虫は上述のとおりである。
【００６６】
ある実施形態では、本組成物が、本発明の寄生虫を、赤血球形で、特に赤血球内メロゾイト、トロフォゾイトもしくはシゾントの形態で、または非赤血球内メロゾイトの形態で、好ましくは赤血球内メロゾイト、トロフォゾイトまたはシゾントの形態で含む。
【００６７】
ある特定実施形態において、本組成物は、本発明の寄生虫が寄生した赤血球であって、実験項でも説明する上述の方法に従って得ることができるものを含む。
【００６８】
もう一つの実施形態では、本組成物に含まれる寄生虫が、上述のように、スポロゾイトの形態にある。
【００６９】
免疫原性組成物は、それを投与された対象において、それが含有する寄生虫に対する免疫系の応答を誘導する能力を有する。本明細書において使用する用語「免疫学的有効量」は、対象における免疫応答の引き金を引くのに十分な寄生虫の量を指す。
【００７０】
好ましくは、免疫原性組成物がマラリアワクチンである。
【００７１】
ある実施形態では、本発明の組成物が、上に定義した寄生赤血球、メロゾイトまたはスポロゾイト、好ましくは寄生赤血球またはスポロゾイトを、1つ以上の医薬上許容される賦形剤に懸濁することによって得られる。当業者は、寄生虫の形態（赤血球内、メロゾイトまたはスポロゾイト）に応じて、また想定している投与経路に応じて、賦形剤を容易に選ぶことができる。これらの賦形剤は、特に、滅菌水、滅菌生理食塩水およびリン酸緩衝液からなる群より選ぶことができる。当業者に周知の他の賦形剤も使用することができる。好ましくは、組成物が寄生赤血球を含む場合、使用される賦形剤は、組成物が対象に投与されるまで赤血球の完全性を保証する等張液である。好ましくは、組成物は、少なくとも１つの抗凝固剤、例えばヘパリンも含む。
【００７２】
本組成物は、上に定義した寄生虫スポロゾイトを医薬上許容される担体、例えばリポソームなどと混合することによって得ることもできる。
【００７３】
使用する賦形剤または担体は、寄生赤血球の完全性および/またはスポロゾイトもしくはメロゾイトの生存が保証されるように選ばれる。使用する賦形剤または担体は、使用される形態（メロゾイト、スポロゾイトまたは赤血球内形）が何であれ、免疫される対象に組成物が投与されるまでは、本発明の寄生虫の生存が保証されるように選ばれる。
【００７４】
好ましい一実施形態では、免疫される対象が哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００７５】
本発明の組成物は、例えば非経口投与、皮下投与、粘膜投与、経粘膜投与、または表皮投与することができる。好ましくは、組成物は、非経口投与、特に皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与または皮内投与するために製剤化される。
【００７６】
ある特定実施形態では、寄生虫が赤血球形であって、好ましくは赤血球に含まれており、組成物は、非経口投与、好ましくは皮下投与、静脈内投与、または皮内投与、特に好ましくは静脈内投与するために製剤化される。
【００７７】
もう一つの特定実施形態では、寄生虫がスポロゾイトの形態にあり、組成物は、非経口投与、好ましくは皮下投与、筋肉内投与または皮内投与、好ましくは筋肉内投与または皮下投与するために製剤化される。生スポロゾイトを含む組成物を投与する方法は、当業者にはよく知られている（例えば国際特許出願WO2004/045559およびHoffman et al.（2010）の論文を参照されたい）。
【００７８】
ある実施形態では、寄生虫が赤血球形であって、赤血球に含まれており、本発明の組成物は、1用量単位あたり10〜106個の寄生赤血球（pRBC）、好ましくは1用量単位あたり100〜106個のpRBC、特に好ましくは100〜105個のpRBC、特に好ましくは100〜104個のpRBCを含む。ある特定実施形態では、寄生虫が赤血球形であって、赤血球に含まれており、本発明の組成物が、1用量単位あたり10〜100個の寄生赤血球（pRBC）を含む。
【００７９】
もう一つの実施形態では、寄生虫が非赤血球内メロゾイトの形態にあり、本発明の組成物が、1用量単位あたり102〜107個のメロゾイト、好ましくは1用量単位あたり103〜105個のメロゾイトを含む。
【００８０】
さらにもう一つの実施形態では、寄生虫がスポロゾイトの形態にあり、本発明の組成物が、1用量単位あたり103〜107個のスポロゾイト、好ましくは1用量単位あたり104〜105個のスポロゾイトを含む。
【００８１】
当業者は、免疫される対象の生理学的データ、例えばその年齢または免疫状態、所望する免疫の程度、投与回数、および使用する投与経路を考慮することにより、投与すべき用量を容易に決定することができる。投与される用量は、寄生虫の保存様式によっても変動しうる。
【００８２】
本発明の組成物は、本発明の寄生虫の1つ以上の株を含みうる。ある実施形態では、組成物が、hmgb2遺伝子の機能が不活化されている少なくとも1つの熱帯熱マラリア原虫株と1つの三日熱マラリア原虫株とを含む。
【００８３】
本発明の組成物は、他の1つ以上のプラスモディウム属の遺伝的弱毒化寄生虫も含みうる。これらの寄生虫は、例えば、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子、ヌクレオシドトランスポーター1、UIS3、UIS4、p52もしくはp36遺伝子の機能の修飾もしく不活化を呈するか、または照射によって得られる弱毒化寄生虫でありうる。これらの寄生虫は、好ましくは、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫および二日熱マラリア原虫からなる群より選択される株に属する。
【００８４】
本発明の組成物は、1つ以上の免疫アジュバントも含みうる。これらのアジュバントは免疫系を刺激し、よって、本発明の寄生虫に関して得られる免疫応答を補強する。これらの免疫アジュバントには、例えばムラミルペプチドタイプのアジュバント、例えばN-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン（MDP）およびその誘導体；トレハロースジミコレート（TDM）；リポ多糖（LPS）；モノホスホリルリピドA（MPL）；カルボキシメチルセルロース；完全フロイントアジュバント；不完全フロイントアジュバント；場合によってはスクアレンまたはスクアランが補足された、「水中油型」エマルションタイプのアジュバント；無機質アジュバント、例えばミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カリウムまたはリン酸カルシウム；細菌毒素、例えばコレラ毒素サブユニットB、不活化型の百日咳毒素または大腸菌由来の熱不安定性リンフォトキシン；CpGオリゴデオキシヌクレオチド；サポニン；合成コポリマー、例えばポリオキシエチレン（POE）とポリオキシプロピレン（POP）のコポリマー；サイトカイン；またはイミダゾキノロンなどがあるが、これらに限るわけではない。アジュバントの組み合わせを使用することができる。これらさまざまなタイプのアジュバントは当業者にはよく知られている。特に、本発明の組成物は、CpGオリゴデオキシヌクレオチドおよび無機質アジュバント、特にミョウバン、ならびにそれらの混合物からなる群より選択される1つ以上の免疫アジュバントを含みうる。
【００８５】
もう一つの態様では、本発明は、マラリアまたは脳性マラリアに対するワクチン組成物を調製するための、hmgb2遺伝子の機能が不活化されているプラスモディウム属に属する生寄生虫の使用に関する。
【００８６】
本発明は、本発明のマラリアまたは脳性マラリアに対するワクチン組成物を生産するための方法にも関係する。
【００８７】
ある実施形態では、本方法が、本発明の生寄生虫に感染させた赤血球を1つ以上の医薬上許容される賦形剤または担体と混合することからなるステップを含む。好ましくは、赤血球は、血液型がOでありリーサス因子陰性である宿主から得られるヒト赤血球である。
【００８８】
もう一つの実施形態では、本方法が、本発明の寄生虫の生非赤血球内メロゾイトを1つ以上の医薬上許容される賦形剤または担体と混合することからなるステップを含む。
【００８９】
さらにもう一つの実施形態では、本方法が、本発明の寄生虫の生スポロゾイトを1つ以上の医薬上許容される賦形剤または担体と混合することからなるステップを含む。
【００９０】
好ましい一実施形態では、寄生赤血球の形態またはメロゾイトの形態またはスポロゾイトの形態にある寄生虫を1つ以上の免疫アジュバントとも混合する。これらのアジュバントは上に定義したとおりでありうる。
【００９１】
本方法は、該寄生赤血球、該メロゾイトまたは該スポロゾイトを、例えば上述の方法を使って取得する先行ステップも含みうる。
【００９２】
得られた組成物またはワクチンは、投与するまで、例えば、それが寄生赤血球を含有する場合には、冷凍保存または冷蔵保存するか、またはそれがスポロゾイトまたはメロゾイトを含有する場合には、冷凍保存、冷蔵保存または凍結乾燥保存することができる。好ましくは、得られた組成物またはワクチンを、投与するまで、冷凍保存する。凍結乾燥の場合は、投与前に、適当な希釈剤を、例えば滅菌水または滅菌生理食塩水、好ましくは滅菌生理食塩水を、凍結乾燥物に加える。
【００９３】
この態様では、本発明の寄生虫および組成物に関するさまざまな実施形態も、想定される。
【００９４】
もう一つの実施形態において、本発明は、マラリアに対して対象を免疫するための方法であって、該対象への本発明の免疫原性組成物またはワクチンの投与を含む方法に関する。
【００９５】
好ましくは、対象は哺乳動物、特にヒトである。
【００９６】
好ましい一実施形態では、本方法が、該対象への本発明のワクチンの投与を含む。
【００９７】
ある実施形態では、本方法が、本発明の免疫原性組成物またはワクチンの1回量の投与を含む。
【００９８】
もう一つの実施形態では、本方法が、本発明の免疫原性組成物またはワクチンの複数回量の投与を含む。対象の免疫は2〜6回の投与後に獲得することができる。好ましくは、投与間に、およそ4〜8週間の間隔、好ましくはおよそ6〜8週間の間隔をあける。
【００９９】
本発明者らは、本発明の寄生虫を寄生させた105個の赤血球を含む1回量の投与により、哺乳動物において少なくとも6ヶ月は持続する無感染免疫を獲得することが可能になることを実証した。好ましい一実施形態では、本発明が、初回量の本発明の免疫原性組成物またはワクチンの投与と、そのおよそ6ヶ月〜1年後の第2用量の投与とを含む。好ましくは、用量が、10〜106個、好ましくは100〜106個の寄生赤血球、102〜107個のメロゾイト、または103〜107個のスポロゾイトを含む。好ましい一実施形態では、用量が約103個の寄生赤血球を含む。もう一つの好ましい実施形態では、用量が10〜100個の寄生赤血球を含む。
【０１００】
マラリアまたは脳性マラリアに関する対象の免疫は、完全である場合も、不完全である場合もありうる。不完全免疫の場合は、免疫対象では、樹立した疾患の症状の重篤度が、非免疫対象に見られるものと比較して低減するであろう。完全免疫の場合は、免疫対象が、寄生虫との接触後に、疾患の症状を示さないであろう。
【０１０１】
好ましい一実施形態では、本発明の組成物を投与することによって得られる免疫が、無感染免疫である。これは、投与された寄生虫の発生が著しく改変されることと、投与の約2〜4週間後に対象の末梢血には寄生虫がもはや検出されないこととを意味する。
【０１０２】
本発明は、マラリアに対して対象を免疫する方法であって、該寄生虫に感染させた蚊による咬刺を利用して、該対象に、スポロゾイトの形態にある本発明の寄生虫を投与することを含む方法にも関係する。
【０１０３】
限定するわけではないが、例示のために、以下に実施例を掲載する。
【実施例】
【０１０４】
［実施例］
HMGBタンパク質の機能を研究するにあたって、本発明者らは、最近、プラスモディウム・ベルゲイANKA寄生虫（PbANKA）に感染させたC57BL/6マウスのモデルにおいて、プラスモディウム・ベルゲイのHMGB2タンパク質が、実験的脳性マラリア（ECM）の樹立に関与することを明らかにした。PbANKA中のhmgb2遺伝子の不活化は、C57BL/6マウスにおける寄生虫の発生を妨げず、それでもなお、ECMの樹立の遅延を誘導し、さらには65％の症例において、その完全な消滅を誘導した。さらにまた、前もってPbANKAΔhmgb2に感染させたマウスに組換えHMGB2タンパク質を投与することにより、脳性マラリアの発生を復活させることが可能になることも、明らかになった。
【０１０５】
材料と方法
マウス
使用するマウスはC57BL/6マウス（Charles River Laboratories）である。これらのマウスは実験的脳性マラリアに対して感受性である（CM-S）。
【０１０６】
野生型寄生虫
プラスモディウム・ベルゲイANKA寄生虫（PbANKA）（MRA-867）は、7±1日で脳性マラリアによるC57BL/6マウスの死を誘発する。この寄生虫はeef1プロモーターの制御下にGFPタグを有する（Thaty and Menard, 2002）。
【０１０７】
プラスモディウム・ベルゲイNK65寄生虫（PbNK65）（MRA-268）（de Sa et al., 2009）は、感染後20〜25日で、高寄生虫血によるC57BL/6マウスの死を誘発する。他方、この寄生虫は脳性マラリアを引き起こさない。
【０１０８】
PbNK65Δhmgb2寄生虫の取得
クローニングベクターの構築：hmgb2遺伝子のそれぞれ5'UTRおよび3'UTR位置にある、オープンリーディングフレームに隣接する領域（以下、HR1およびHR2という）（約500bpの長さを有する）を、特異的プライマー（表2）を使ってPbNK65寄生虫のゲノムDNAから、PCRによって増幅し、pCR（登録商標）II-TOPOベクター（Invitrogen）にクローニングした。次に、大腸菌One Shot（登録商標）TOP10エレクトロコンピテント細菌を、これらのコンストラクトで形質転換し、アンピシリンおよびカナマイシンを含有するLB培地上で選択した。
［表2］HR1およびHR2ホモロジー領域を増幅するためのプライマー
【表２】
2014520563.tif 000004
【０１０９】
増幅に使用したプライマーは、
・HR1については、配列の5'UTR位置にApaI制限部位を、また3'UTR位置にSmaI制限部位を、
そして
・HR2については、配列の5'UTR位置にNotI制限部位を、また3'UTR位置にAscI制限部位を
付加するように設計した。これらの制限部位は、PCRフラグメントをベクター中に挿入することを可能にする。
【０１１０】
次に、5'および3'非翻訳領域HR1およびHR2を、5'UTR位置にあるプロモーターef1αおよび3'UTR位置にあるdhfr/ts（dhfr/チミジル酸シンターゼ）の制御下に置かれたヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ（hudhfr）の遺伝子を含有するpBC SK-Hudhfrベクター（Stratagene）に挿入した。Hudhfrカセットに対して、HR1を5'UTR位置に挿入し、HR2を3'UTR位置に挿入した。相同組換え中は、これら2つのHR1およびHR2領域がプラスモディウム・ベルゲイゲノム中のhmgb2遺伝子の相補配列と対になって、この遺伝子のレベルでの二重相同組換えを可能にし、結果として、その欠失を可能にする。Hudhfrはピリメタミン耐性を付与し、この薬物を使って変異型寄生虫を選択した。
【０１１１】
寄生虫のトランスフェクションおよび変異型寄生虫の選択：Koning-Ward et al.（2000）に記載のプロトコールに従って、プラスモディウム・ベルゲイのメロゾイトのトランスフェクションを行った。感染は全て静脈内注射によって行った。
【０１１２】
3週齢のスイスマウスを2.6×106個のPbANKAまたはPbNK65 pRBCに感染させた。寄生虫血が2％〜3％（主要幼若段階）に達したら、心臓内穿刺によって血液をヘパリンに採取した（1.5〜2mlの血液）。1体積のウシ胎児血清（InVitrogen）を補足した4体積のRPMI1640（Invitrogen）からなる完全培養培地5mlで、血液を手短に洗浄した。450gで8分間の遠心分離後に、pRBCを50mlの完全培養培地に取り出した。次に、さらに50mlの完全培養培地を加えた細胞懸濁液を、500mlのエルレンマイヤーフラスコに入れ、70rpmで浸透しながら、1.5〜2バールの圧力下、３６．５℃で、終夜培養した。
【０１１３】
翌日、塗抹標本を使って主に成熟シゾントが存在することを確認した後、pRBC培養物を1500rpmで10分間遠心分離し、次にペレットを、50mlコニカルチューブ中の完全培養培地35mlに取り出した。次に、チューブの底に密度勾配が形成されるように、10mlの50％ナイコデンツ（Nycodenz）（Lucron Bioproducts、1×PBS中に1/2希釈）を、pRBC培養物に極めて注意深く加えた。450g、周囲温度で、20分間の遠心分離（ブレーキなし）により、pRBCの精製が起こって、チューブの中央部に茶色い輪を形成した。pRBCの茶色い輪を収集（約20ml）してから、20mlの完全培養培地で洗浄した。450gで8分間の遠心分離後に、成熟シゾントのペレットを最終的に3mlの完全培養培地に取り出し、次にそれを3つの1.5mlエッペンドルフチューブに分配した。シゾントは脆弱であるから、この操作は極めて慎重に行う必要があった。この段階で、得られたシゾントの量は10回の独立したトランスフェクションを行うのに十分であった。次に、16000gで5秒間の最終遠沈後に、各チューブ中のシゾントペレットを、得られたプラスミドコンストラクト（pbhmgb1またはpbhmgb2用のpBC-5'HR1Hudhfr3'HR2）のそれぞれ5μg（前もってApaIおよびAscIで消化したもの）を含む100μlのエレクトロポレーション緩衝液（Nucleofector Solution 88A6、Amaxa）に取り出した。Amaxa NucleofectorエレクトロポレーターのU33プログラムを使って寄生虫をトランスフェクトした。電気ショックは、成熟シゾントの膜を破裂させ、そうして放出されたメロゾイトは、線状化プラスミドを内在化することができる。キュベットの内容物に50μlの完全培養培地を直ちに加え、2匹の3週齢スイスマウスを各トランスフェクトメロゾイト100μlに直ちに感染させた。感染後のD1に、選択薬ピリメタミンを飲料水に入れて投与し、塗抹標本作成を毎日行った。ピリメタミン溶液は次のように調製した：70mgのピリメタミン（Sigma Aldrich）、10ml DMSO、1リットルになる量の水、pH3.5〜5.5。マウスが寄生虫の存在に関して陽性になり（感染後D6ぐらい）、寄生虫血が2％〜10％に達した時に、その血液を心臓内穿刺によって採取した。
【０１１４】
寄生虫の培養条件および接種
C57BL/6マウスを、107個のpRBC/200μlを含有するバイアル各200μlに、腹腔内感染させた。寄生虫血が1％〜5％に達したら（感染後5〜6日）、約100μlの血液を動物の頬からヘパリンを含有するチューブに採取した。この血液を1mlの冷PBSで2回洗浄し、3800rpmで5分間遠心分離した。1/1000に希釈して細胞を計数した後、C57BL/6マウスを105個のpRBCに感染させた。
【０１１５】
寄生虫血測定
寄生虫血は、染色塗抹標本中の寄生赤血球（pRBC）を顕微鏡下で計数することによって解析される。
【０１１６】
寄生赤血球の調製およびpRBCの凍結
C57BL/6マウスを、107個のpRBC/200μlを含有するバイアル各200μlに、腹腔内感染させる。2タイプの寄生虫ストックを調製する。
【０１１７】
スタビレート：寄生虫血が3％〜10％に達した時（107個の寄生赤血球による感染後5〜6日）に、感染マウスから心臓内穿刺（麻酔下）によってヘパリン含有チューブに血液を採取し、以下の冷凍保存混合物に入れて液体窒素中で凍結するまでは、常に氷上に保つ：1体積の純グリセロール（Sigma Aldrich）＋9体積のオルシーバー液（Sigma Aldrich）。スタビレートは採取した血液1体積で調製し、そこに2体積の冷凍保存混合物を加える。等量ずつ小分けしたものを液体窒素で凍結してから（マウス1匹あたり約300μl）、−８０℃で保存した。
【０１１８】
バイアル：既述のように、ただし寄生虫血が1％〜5％に達した時に、血液を心臓内穿刺によって採取する。この血液を冷PBSで数回洗浄し、3800rpmで5分間遠心分離する。次に、寄生赤血球の数を計数してから、107個のpRBC/200μlを含有するバイアルを冷凍保存混合物（前段落参照）中に調製する。
【０１１９】
結果
PbNK65寄生虫の発生におけるHMGB2タンパク質の役割
本発明者らは、hmgb2遺伝子の不活化が、C57BL/6（CM-S）マウスにおけるPbNK65Δhmgb2の発生を妨げ、感染用量の寄生虫による感染の10〜15日後（D10〜D15）に寄生虫の排除を伴うことを実証した。図1は、野生型PbNK65またはPbNK65Δhmgb2を寄生させた赤血球にC57BL/6マウスを感染させた3回の実験の平均を表す（1実験あたりn＝5のマウス）。変異型寄生虫のこの排除は、感染の約15日後に観察された。変異型寄生虫は血液塗抹標本にはもはや検出されなかったが、野生型寄生虫の発生は、感染の約25日後に高寄生虫血によって死亡するまで続いた。これは、野生型寄生虫は発生し続けるものの、PbNK65Δhmgb2による感染は、C57BL/6マウスにおいて、この寄生虫の発生を改変する免疫応答を誘導するからである。C57BL/6マウスにおけるその発生時に同じ排除動態を示すいくつかの独立した変異型クローンが得られた。
【０１２０】
PbNK65Δhmgb2による初感染が誘導する無感染防御
変異型寄生虫PbNK65Δhmgb2（腹腔内または静脈内に105個のpRBC）による初感染に付したC57BL/6マウスにおいて、1〜3回の連続的感染チャレンジによる実験を、何度か行った。C57BL/6マウスの血中に寄生虫がもはや検出されなくなった時に（D19付近）、発明者らは、2つの高病原性野生型寄生虫：
1．高寄生虫血によるマウスの死をもたらす野生型相同寄生虫PbNK65、および
2．脳性マラリアによるマウスの死を誘発する野生型非相同寄生虫PbANKA
を使って、1回目の感染チャレンジを行い（D19）、次にD71に2回目、D162に3回目を行った。
【０１２１】
図2に、3回の連続的感染チャレンジによる実験の結果を示す。PbNK65Δhmgb2による初感染に付したマウスは、全て、3回の感染チャレンジに耐えて生き残り、少なくとも7ヶ月は、無感染防御が維持された。各チャレンジ時に、本発明者らは、ナイーブマウスにおける野生型PbNK65寄生虫の発生が約25日まで続き、その時点でマウスは高寄生虫血によって死に始めること、およびナイーブマウスにおける野生型PbANKA寄生虫の発生が約7日まで続き、その時点で、マウスは脳性マラリアで死ぬことを確認した（寄生虫の病原性およびマウスの週齢に関する対照）。
【０１２２】
無感染防御を促進するのに必要かつ十分なPbNK65Δhmgb2に感染した赤血球の最小用量を決定するために、105〜103個のpRBC（図3）および102個のpRBC（結果の記載なし）による初感染に付したマウスで、感染チャレンジを行った。これらの実験は、102または103個のpRBCの注射により、105個の野生型PbNK65またはPbANKA pRBCの静脈内注射によって行われる感染チャレンジ時に、無感染防御を誘導することが可能になることを、明らかにした。
【０１２３】
結論
これらの結果は、PbNK65Δhmgb2寄生虫による初感染後に無感染免疫（寄生虫がもはや末梢血中に検出されない）が誘導されうることを示している。この防御は、野生型相同寄生虫PbNK65に及ぶだけでなく、脳性マラリアを誘発する能力を有する非相同寄生虫PbANKAにも及ぶ。
【０１２４】
［参考文献］
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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