(57)【要約】  多重反射飛行時間型（ＭＲＴＯＦ）質量分光計（１２）および試料を同定する方法を開示する。イオン源（１５）において試料イオンを生成する。このＭＲＴＯＦは、反射軸（ＸＸ’）上に第１および第２イオン対向ミラー（２０，２０’）を有するクローズド・ミラー機構である。このＭＲＴＯＦ（１２）は、前記軸（ＸＸ’）上に双方向イオン・デフレクタ（５０）も含んでいる。デフレクタ（５０）により、時刻ｔ０＜ゼロ＞においてイオンを反射軸上に短パルスとして偏向させる。それによりイオンは、複数回振動し、飛行時間中にｍ／ｚに従って分離する。ｔ時間経過した時点において、軸（ＸＸ’）に沿って双方向に移動したイオンを双方向デフレクタ（５０）によりＭＲＴＯＦ（１２）からイオン検知器機構（５５）に放出する。飛行時間後のイオンの分離は、質量を各ピークに割り当てる必要なしに検出機構（５５）による生物学的試料の「指紋」の作成を可能にする。指紋のライブラリーとの比較は、同定を可能にする。
2014521055.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を同定する方法であって、
（ａ）同定される前記試料から試料イオンを生成するステップと、
（ｂ）時刻ｔ０において前記試料イオンを多重パス飛行時間型（ＴＯＦ）質量分光計に導入し、かつ前記試料イオンの少なくとも一部を前記多重パスＴＯＦ質量分光計中の経路に沿って繰り返し移動させるステップであって、相異なるｍ／ｚを有するイオンが飛行時間中に分離し、さらに、少なくとも第１のｍ／ｚを有するイオンが少なくとも第２の異なるｍ／ｚを有するイオンを追い越すステップと、
（ｃ）時刻ｔ１（＞ｔ０）を始点として前記試料イオンを前記多重パスＴＯＦ質量分光計から放出するステップと、
（ｄ）放出された前記試料イオンを検知するステップと、
（ｅ）複数のピークを含む第１試料指紋を作成するステップであって、各ピークは、特定の質量対電荷比を有するイオンから生じ、かつ、ｔ１以降の前記多重パスＴＯＦ質量分光計からのそれらの放出の順序と逐次的関係に配置され、これらのピークの少なくとも一部は、ｍ／ｚの逐次順序に配置されず、前記第１試料指紋は、前記試料の同定のために既知の身元の試料からの基準指紋のライブラリーと比較可能であるステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記試料が微生物であり、かつ、前記ライブラリーが既知微生物の基準指紋のライブラリーである、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
得られた前記第１試料指紋を基準指紋のライブラリーと比較するステップをさらに含む、
請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記第１試料指紋と前記ライブラリー中の前記既知試料の１つからの基準指紋との合致または最良適合が得られたときに前記試料を同定するステップをさらに含む、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ピークが前記多重パスＴＯＦ質量分光計からの放出の時間との関係において分離される、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
既知の身元の試料からの基準指紋の前記ライブラリーが、前記試料を同定するために使用される前記多重パスＴＯＦ質量分光計と実質的に同一の分光計パラメータを有する１つ以上の基準ＴＯＦを使用して作成され、
前記多重パスＴＯＦ質量分光計における試料イオンの滞留時間が、試料イオンの前記多重パスＴＯＦ質量分光計への注入とそこからの放出の開始の間の期間が（ｔ１−ｔ０）として定義され、かつ、前記基準ＴＯＦにおいて基準指紋の前記ライブラリーを作成するために使用された前記既知の試料からのイオンの滞留時間とほぼ同じとする、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
既知の身元の試料からの基準指紋の前記ライブラリーが、前記試料を同定するために使用された前記多重パスＴＯＦ質量分光計と相異なる分光計パラメータを有する１つ以上の基準多重パスＴＯＦを使用して作成され、
さらに、修正アルゴリズムを前記試料指紋および／または前記基準指紋に適用することにより、試料イオンの前記多重パスＴＯＦ質量分光計への注入とそこからの放出の開始の間の期間が時間（ｔ１−ｔ０）として定義され、かつ、種々の多重パスＴＯＦのスペクトル・パラメータの差異および前記基準多重パスＴＯＦ中の基準イオン種に関して調整される前記多重パスＴＯＦ質量分光計における試料イオン種の実効滞留時間が同一になるようにするステップを含む、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
（ｆ）時刻ｔ２（≠ｔ０；ｔ１）において、前記試料から生成された別の試料イオンを前記多重パスＴＯＦ質量分光計に導入するステップと、
（ｇ）時刻ｔ３（＞ｔ２）を始点として追加試料イオンを前記多重パスＴＯＦ質量分光計から放出するステップであって、前記多重パスＴＯＦ質量分光計における前記追加試料イオンの第２滞留時間は、前記追加試料イオンの前記多重パスＴＯＦ質量分光計への注入とそれらの追加試料イオンのそこからの放出の開始の間の期間（ｔ３−ｔ２）として定義され、前記第１試料指紋を作成するために使用された試料イオンの滞留時間（ｔ１−ｔ０）と異なるものとするステップと、
（ｈ）放出された前記追加試料イオンを検知するステップと、
（ｉ）既知の身元の試料からの基準指紋の前記ライブラリーと比較できる第２試料指紋を作成するステップと、
をさらに含む請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記多重パスＴＯＦ質量分光計が反射ミラー軸を有するイオン移動のためのクローズド・パスを形成するように互いに向き合うように配置される第１および第２イオン・ミラーを含み、前記多重パスＴＯＦ質量分光計が、前記反射ミラー軸に沿って配置される双方向デフレクタ機構をさらに含み、
前記反射ミラー軸に沿って前記第１イオン・ミラーから前記第２イオン・ミラーへの第１方向に移動する試料イオンを、検知のために前記双方向デフレクタ機構を使用して、前記時刻ｔ１を始点として前記反射ミラー軸から検知機構の方へ偏向させるステップと、
前記反射ミラー軸に沿って前記第２イオン・ミラーから第１イオン・ミラーへの第２方向に移動する試料イオンを、検知のために前記双方向デフレクタ機構を使用して、前記時刻ｔ１を始点として前記反射ミラー軸から前記検知機構の方へ偏向させるステップと、
をさらに含む請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記多重パスＴＯＦ質量分光計が反射ミラー軸を有するクローズド・パスを形成するように互いに向き合うように配置される第１および第２イオン・ミラーを含み、前記多重パスＴＯＦ質量分光計が、前記反射ミラー軸に沿って配置される双方向デフレクタ機構をさらに含む方法であって、
前記反射ミラー軸に沿って前記第１イオン・ミラーから前記第２イオン・ミラーへの第１方向に移動する試料イオンを、検知のために前記双方向デフレクタ機構を使用して、前記時刻ｔ１およびｔ３を始点として前記反射ミラー軸から検知機構の方へ偏向させるステップと、
前記反射ミラー軸に沿って前記第２イオン・ミラーから第１イオン・ミラーへの第２方向に移動する試料イオンを、検知のために前記双方向デフレクタ機構を使用して、前記時刻ｔ１およびｔ３を始点として前記反射ミラー軸から前記検知機構の方へ偏向させるステップと、
をさらに含む請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記検知機構が第１および第２検知器を含む方法であって、前記第１方向に移動する前記試料イオンを前記第１検知器の方へ偏向させる一方、前記第２の方向に移動する前記試料イオンを前記第２検知器の方へ偏向させるステップをさらに含む、
請求項９または１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１および第２検知器において前記試料イオンを後段加速するステップをさらに含む、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記多重パスＴＯＦ質量分光計が、イオン移動のためのクローズド・トラックまたは８の字状パスを形成するように配置される複数の電気および／または磁気セクタを含み、
前記多重パスＴＯＦ質量分光計が、イオン移動パスに沿って配置されるデフレクタ機構をさらに含み、
前記イオン移動パスに沿って移動する前記試料イオンを、検知のために前記デフレクタ機構を使用して、前記時刻ｔ１以降に検知機構の方へ偏向させるステップ、
をさらに含む請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料イオンとともに、既知の身元および前記多重パスＴＯＦ質量分光計内の滞留時間を有するロック質量イオンを導入するステップをさらに含み、
放出された前記試料イオンを検知する前記ステップ（ｄ）が前記試料イオンと前記ロック質量イオンの両方を検知することを含み、
前記ステップ（ｅ）が前記試料イオンと前記ロック質量イオンの両方から導かれたピークを含む試料指紋を作成することを含む、
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料指紋中の前記ピークの位置および／または高さを修正するために前記ロック質量イオンの前記既知の身元および滞留時間を使用するステップをさらに含む、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
試料を同定するための多重反射飛行時間型（ＭＲ  ＴＯＦ）質量分光計であって、
試料イオンを生成するためのイオン源と、
反射軸に沿って互いに向き合うように配置される第１および第２イオン・ミラーを有するクローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構と、
前記反射軸に沿って配置される双方向イオン・デフレクタ機構であって、
（ｉ）前記イオン源から前記クローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構中に導入され、前記反射軸に沿って前記第１イオン・ミラーから前記第２イオン・ミラーへの第１方向に移動する試料イオンを、前記クローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構への導入から時間ｔ１が経過したときを始点として、イオン検知機構の方へ偏向させ、かつ、
（ｉｉ）前記イオン源から前記クローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構中に導入され、前記反射軸に沿って前記第２イオン・ミラーから前記第１イオン・ミラーへの第２方向に移動する試料イオンを、時間ｔ１を始点として、前記イオン検知機構の方へ偏向させる、
双方向イオン・デフレクタ機構と、
を備える質量分光計。
【請求項１７】
前記イオン検知機構が複数のデータ・ピークから構成される試料指紋を入手するように構成されるデータ収集手段を含み、
これらの各ピークが特定の質量対電荷比のイオンから生じ、かつ、ｔ１以降の前記クローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構からのそれらの放出の順序と逐次的関係に配置されるが、これらのピークの少なくとも一部はｍ／ｚの逐次順序に配置されない、
請求項１６に記載のＭＲ  ＴＯＦ質量分光計。
【請求項１８】
前記双方向イオン・デフレクタ機構が前記第１イオン・ミラーと前記第２イオン・ミラーのほぼ中間に前記反射軸に沿って配置される、
請求項１６または１７のいずれか一項に記載のＭＲ  ＴＯＦ質量分光計。
【請求項１９】
前記イオン検知機構が第１および第２イオン検知器を含み、
前記第１イオン検知器が前記双方向イオン・デフレクタにより偏向された試料イオンを検知するように構成され、
試料イオンは偏向直前に前記クローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構において前記第１方向に移動しており、
前記第２イオン検知器が前記双方向イオン・デフレクタにより偏向された試料イオンを検知するように構成され、
試料イオンは偏向直前に前記クローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構において前記第２方向に移動している、
請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のＭＲ  ＴＯＦ質量分光計。
【請求項２０】
前記第１イオン検知器が第１電子増倍器の上流に第１変換ダイノードまたは後段加速ダイノードを含み、
前記第２イオン検知器が第２電子増倍器の上流に第２変換ダイノードまたは後段加速ダイノードを含み、
前記イオン検知機構が前記第１および第２電子増倍器の出力をデジタル化するデジタイザーをさらに含み、
前記データ収集手段が前記試料指紋を取得するために前記デジタイザーと交信する、
請求項１９（請求項１７または１８に従属する場合）または１８（請求項１７に従属する場合）のいずれか一項に記載のＭＲ  ＴＯＦ質量分光計。
【請求項２１】
前記第１イオン検知器が第１変換ダイノードまたは後段加速ダイノードを含み、
前記第２イオン検知器が第２変換ダイノードまたは後段加速ダイノードを含み、
前記イオン検知機構が前記第１および第２ダイノードの下流の電子増倍器および前記電子増倍器の出力をデジタル化するデジタイザーをさらに含み、
前記データ収集手段が前記試料指紋を取得するために前記デジタイザーと交信する、
請求項１９（請求項１７または１８に従属する場合）または１８（請求項１７に従属する場合）のいずれか一項に記載のＭＲ  ＴＯＦ質量分光計。
【請求項２２】
前記第１イオン検知器が第１電子増倍器を含み、
前記第２イオン検知器が第２電子増倍器を含み、
前記イオン検知機構がさらに前記第１および第２電子増倍器の出力をデジタル化するデジタイザーを含み、
前記データ収集手段が前記試料指紋を取得するために前記デジタイザーと交信する、
請求項１９（請求項１７または１８に従属する場合）または１８（請求項１７に従属する場合）のいずれか一項に記載のＭＲ  ＴＯＦ質量分光計。
【請求項２３】
前記双方向イオン・デフレクタが双方向電気セクタ・イオン・デフレクタである、
請求項１６〜２２のいずれか一項に記載のＭＲ  ＴＯＦ質量分光計。
【請求項２４】
前記イオン源がマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）イオン源である、
請求項１６〜２３のいずれか一項に記載のＭＲ  ＴＯＦ質量分光計。
【請求項２５】
前記イオン検知機構が後段加速手段を含む、
請求項１６〜２４のいずれか一項に記載のＭＲ  ＴＯＦ質量分光計。
【請求項２６】
前記イオン検知機構がマイクロチャネル・プレート、シンチレーター、および／または光子増倍器などの複数の増幅器の組み合わせから構成されるかまたはそれを含む、
請求項１６〜２５のいずれかに一項に記載のＭＲ  ＴＯＦ質量分光計。
【請求項２７】
複数の異なる基準試料を表す基準指紋のデータベースのために基準指紋を作成する方法であって、
（ａ）前記基準試料から基準イオンを生成するステップと、
（ｂ）時刻ｔ０において前記基準イオンを多重パスＴＯＦ質量分光計に導入し、かつ前記イオンの少なくとも一部を前記多重パスＴＯＦ質量分光計中のパスに沿って繰り返し移動させるステップであって、これにより、相異なるｍ／ｚを有するイオンが飛行時間中に分離し、さらに、少なくとも第１のｍ／ｚのイオンが少なくとも第２の異なるｍ／ｚを有するイオンを追い越すステップと、
（ｃ）時刻ｔ１（＞ｔ０）を始点として前記多重パスＴＯＦ質量分光計から前記基準イオンを放出するステップと、
（ｄ）放出された前記イオンを検知するステップと、
（ｅ）前記基準試料の前記基準指紋を作成するステップであって、前記基準指紋の各ピークは、特定の質量対電荷比のイオンから生じ、かつ、ｔ１以降の前記多重パスＴＯＦ質量分光計からのそれらの放出の順序と逐次的関係に配置され、これらのピークの少なくとも一部は、ｍ／ｚの逐次順序に配置されず、前記基準指紋は、作成された前記基準指紋が前記試料指紋と一致するか否か決定するために、同定対象の試料からの試料指紋と比較することができるステップと、
を含む方法。
【請求項２８】
前記基準試料および前記同定対象試料が、それぞれ微生物である、
請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
作成された前記基準指紋を複数の異なる試料を表す基準指紋のデータベースまたはライブラリーに保存するステップをさらに含む、
請求項２７または２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２９の方法に従って作成された基準指紋のデータベースまたはライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、未知の合成物または類型、特に、しかし、排他的ではなく、細菌または菌類のコロニーなどの微生物の試料の同定方法に関する。それは、微生物有機体などの試料の同定のための装置にも関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌または菌類のコロニーなどの微生物有機体の分析および同定のための種々様々な技法が開発されてきた。たとえば、菌株保存の技法が長年にわたり開発されてきた。この技法では、同定／分析される物質の試料が収集され、次にこの試料が培養されて、たとえば顕微鏡的に分析され得る培養物に成長する。この技法は時間がかかるものであり（それは少なくとも数時間を要し、ときには数日かかることもある）、多数の細菌類型を見逃すことがある。
【０００３】
細菌学的分析の第２の技法は、いわゆるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この手順は、ＤＮＡ鎖の特定の領域を増殖する。微生物学におけるＰＣＲ記相は、病原性因子の検知および特異遺伝子の同定による病原菌株からの非病原菌株の区別に基づいている。
【０００４】
細菌学的分析および同定のための別の技法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）源を有する飛行時間形（ＴＯＦ）質量分光計を使用する。ＭＡＬＤＩ技法は１９８０年代後半に開発されたが、島津製作所の田中による生物学的高分子の分析に対するその応用に対し２００２年にノーベル化学賞が与えられた。これらの原理の早期の記述は、田中らによるＲａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，  １９８８，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２，  ｐａｇｅ  １５１に見られる。この技法を使用して、再現可能な種特異のスペクトル・パターンを作成し、それを用いて種レベルにおいて微生物を同定することができる。
【０００５】
有機体の広域スペクトルは、グラム陽性およびグラム陰性細菌、ノカルジア菌、ミコバクテリウム、酵母菌および糸状菌を含めてＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ技法を使用して同定されてきた。この技法は比較的迅速であり（菌株保存の技法に比べて確かに）、材料費はごくわずかであり、ゲノム配列決定に匹敵する正確度を与える。ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ技法のさらに詳細な検討は、以下に掲載されている：Ｓｅｎｇ，  Ｐ．，  Ｍ．  Ｄｒａｎｃｏｕｒｔ，  Ｆ．  Ｇｏｕｒｉｅｔ，  Ｂ．  Ｌａ  Ｓｃｏｌａ，  Ｐ．Ｅ．  Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，  Ｊ．Ｍ．  Ｒｏｌａｉｎ，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｒａｏｕｌｔ，  “Ｏｎｇｏｉｎｇ  Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ：  Ｒｏｕｔｉｎｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ｂｙ  Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ２００９，  Ａｕｇｕｓｔ  １５；  ４９（４）：  ｐａｇｅｓ  ５５２−３。また、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／１９５８３５１９も参照。
【０００６】
３つの異なる研究所により同一のバクテリア（この場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ａｔｃｃ  ３３６９４））についてＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分光分析技法を使用して得られた質量スペクトルが次の論文に示されている：Ｗｕｎｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １６，  Ｉｓｓｕｅ  ４，  Ａｐｒｉｌ  ２００５，  Ｐａｇｅｓ  ４５６−４６２  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄｉｒｅｃｔ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ａｒｔｉｃｌｅ／ｐｉｉ／Ｓ１０４４０３０５０４００８２２０）。Ｗｕｎｓｃｈｅｌらの論文に示された質量スペクトルのそれぞれは、５０回の平均スペクトルを表している。Ｗｕｎｓｃｈｅｌらによるこの論文は、３つの異なる研究所により得られた３つの質量スペクトルの質量スペクトルから作成された生物学的指紋も示している。これらの指紋は、たとえばベースライン雑音を除去することにより質量スペクトルを単純化する。Ｗｕｎｓｃｈｅｌの論文の指紋では、横（ｘ）軸が質量対電荷比（ｍ／ｚ）を表すのに対し、縦（ｙ）軸はピークの相対的強度を表す。
【０００７】
３つの指紋間に共通のピークが明らかに存在することがＷｕｎｓｃｈｅｌらの論文において示されているようであるが（特にｍ／ｚ＝７０００付近の大きなピークおよびｍ／ｚ＝９，５００付近に対応するように見えるやや小さいピーク）、同様に、３つの指紋のいずれか１つのみに現れる多数のピークが存在する。これらの指紋自体は名目的に同一の微生物学的物質から作成されたのであるから、同定（指紋とかかる指紋のライブラリーとの比較による）の正確度は、測定された指紋が分析対象の微生物のデータベース中の指紋に一致する程度に直接関連する。
【０００８】
Ｗｕｎｓｃｈｅｌらの論文における３つの指紋間の食い違いの理由の一部は、現在使用されているＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析技法が良好な感度および比較的低いコストにも関わらず、解像度が低いかまたは非常に低い指紋を作成することである。細菌の同定では、細菌起源の２００以上のピークが検知されているが、しかし恐らくこれらの１／４のみが、特定の種に関係し（すなわち、それに特有であり）、したがって種の同定または種間の区別に役立ち得る。
【０００９】
比較的低い解像度（解像度は、隣接ピーク間を区別する能力の尺度である）に加えて、現在のデータベースは、約１０，０００以下のみのｍ／ｚを有する指紋も含んでいる。しかし、Ｗｕｎｓｃｈｅｌらの論文に記載されたＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ作成の指紋から分かるように、２０，０００まで質量範囲を拡張することが望ましい。さらに、解像度が高いほど、また、感度が高いほど、より特異的な同定を可能にするであろう。
【００１０】
細菌同定のための現在のＭＡＬＤＩ  ＴＯＦは、主として線形ＴＯＦ質量分光計を使用する。高い解像度の装置は、確かに存在する。たとえば、イオン・ミラー使用多重反射ＴＯＦなどの装置は、そのようなものとして知られている。しかし、これらは、高価であり、大型であり、生物学的同定のために使用される既存線形ＴＯＦ質量分光計より本質的に感度が低い。Ｏｒｂｉｔｒａｐ（商標）およびＦＴ−ＩＣＲ  ＭＳ装置などのＦＴＭＳ装置は、非常に高い感度を与え得るが、しかし、それらの質量範囲には限界があり、一般的にＭＡＬＤＩイオン源により生成されるより大きい一価の種には適さない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】田中耕一他，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，  １９８８，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２，  ｐａｇｅ  １５１
【非特許文献２】Ｓｅｎｇ，  Ｐ．，  Ｍ．  Ｄｒａｎｃｏｕｒｔ，  Ｆ．  Ｇｏｕｒｉｅｔ，  Ｂ．  Ｌａ  Ｓｃｏｌａ，  Ｐ．Ｅ．  Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，  Ｊ．Ｍ．  Ｒｏｌａｉｎ，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｒａｏｕｌｔ，  “Ｏｎｇｏｉｎｇ  Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ：  Ｒｏｕｔｉｎｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ｂｙ  Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ２００９，  Ａｕｇｕｓｔ  １５；  ４９（４）：  ｐａｇｅｓ  ５５２−３
【非特許文献３】Ｗｕｎｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １６，  Ｉｓｓｕｅ  ４，  Ａｐｒｉｌ  ２００５，  Ｐａｇｅｓ  ４５６−４６２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
この背景において、先行技術におけるこれらの問題に取り組むことが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の第１の態様に従って、以下のステップを含む試料を同定する方法を提供する：
（ａ）同定対象の試料から試料イオンを生成するステップ、
（ｂ）試料イオンを試料多重パス飛行時間型（ＴＯＦ）質量分光計に一度に導入し、かつ少なくとも一部のイオンをＴＯＦ質量分光計のパスに沿って繰り返し移動させるステップであって、これにより、相異なるｍ／ｚを有するイオンが飛行時間中に分離し、さらに、少なくとも第１のｍ／ｚを有するイオンが少なくとも第２の異なるｍ／ｚを有するイオンを追い越すステップ、
（ｃ）時刻ｔ１（＞ｔ０）を始点として試料イオンをＴＯＦから放出するステップ、
（ｄ）放出されたイオンを検知するステップ、および
（ｅ）複数のピークを含む試料の第１の指紋を作成するステップであって、各ピークは、特定の質量対電荷比を有するイオンから生じ、ｔ１以降の多重パスＴＯＦからのそれらの放出の順序と逐次的関係に配置されるが、この場合、これらのピークの少なくとも一部は、ｍ／ｚの逐次順序に配置されず、第１の指紋は、同定対象試料の同定のために既知試料の指紋のライブラリーと比較可能であるステップ。
【００１４】
本発明は、同定される試料が微生物である場合に特に有用である。それらの微生物の例は、細菌または菌類を含む。したがって、このような場合、指紋は生物学的指紋であり、ライブラリーまたはデータベースは既知微生物の指紋の１つである。しかし、本発明は、微生物以外の他の生物学的試料および非生物学的試料の同定にも応用することができる。以下の記述では、微生物の場合に特に言及するが、当然のことながら、それは説明のためであり、一般的試料の一例にすぎない。
【００１５】
本発明は、微生物を同定するために使用できる指紋の作成のために質量スペクトルが必須でないことを認識した。特に、構成分子が昇順または降順ｍ／ｚに従って配列される正式質量スペクトルを得ることが不要であることが明確にされた。必要なことすべては、特徴の作成であり、この場合、構成ピークが十分に分離され、かつ、基準スペクトル中のピークの順番に対応する順序に配置されるか、または少なくともそれに従ってマップされ得ることが必要である。最も単純な実施形態では、これは、試料微生物について作成された第１生物学的指紋中のピークが、たとえば同一の微生物学的物質から作成された試料ライブラリー中の基準生物学的指紋におけるピークと同一の順序であることを意味する。しかし、別の方法として、試料指紋と基準指紋のどちらか一方中のピークは、サンプル指紋と基準指紋のいずれかにおけるピーク位置を試料指紋と基準指紋の残りの一方における同一ピークと同じ位置にマップするどちらか一方または両方のソフトウェア操作により、異なる順序で作成することができる。
【００１６】
基準指紋および試料指紋を得るために使用される装置の分光パラメータが同一であることを条件として、試料および基準の微生物学的物質が一致する場合、イオンが同じ時刻ｔ１を起点として多重パスＴＯＦから放出されたとき、そのピーク順序が増加または減少質量対電荷比と直接の関係をもたないとしても、同一イオンによるピークは、各指紋において同じ相対的位置に現れるはずである。しかし、分光パラメータが異なる場合には、変換係数またはコンボリューションを試料指紋と基準指紋の一方または両方に適用して、同一イオンによるピークが各指紋において同一の相対的位置に現れるようにしなければならない。たとえば、多重パスＴＯＦとして多重反射（ＭＲ）ＴＯＦを使用する場合、基準生物学的指紋を得るために使用されたＭＲ  ＴＯＦ中のミラー相互間の距離が、試料を分析し、試料の生物学的指紋を得るために使用されたＭＲ  ＴＯＦにおけるイオン・ミラー相互間の距離と異なるならば、２つのＭＲ  ＴＯＦのどちらか一方の滞留時間を調整する必要がある。これは、イオン・ミラー相互間の相異なる離隔のために、一定の質量対電荷比のイオンが各ＭＲ  ＴＯＦにおいてそれぞれに対する放出後の同一時間後に完全に異なる場所に存在し、かつ、異なる方向に移動している可能性があるためである。試料指紋および基準指紋のそれぞれは、ほぼ同一のピーク解像度で得られることが望ましい。
【００１７】
本明細書において示される方法の広い質量範囲および高い感度は、ライブラリーまたはデータベース中の基準指紋に対する試料指紋の照合において高い信頼性を与えるが、ＴＯＦ中のイオン滞留時間を種々変更してこの方法を繰り返すことにより、さらに高い信頼性を実現することができる。これを行うことにより、イオンは異なる順序で放出され、そして第１イオン滞留時間から得られたときに重なり合う可能性を有するピークの曖昧さが除去され得る。もちろん、第２基準指紋データベース（この第２滞留時間のための）が望ましいか、または必要であり得る。特定の実施形態では、作成された指紋は、各ピークのイオン存在量の数量的示度およびピーク分離の数量示度（すなわち、ピークは、たとえば、トラップからのイオン放出時間に対応して指紋の“ｘ”軸に沿って分離される）も示す。かかる情報は、試料指紋と既知（基準）指紋のライブラリーとの照合を試みる比較アルゴリズムが利用できる情報を最適化する。それにも関わらず、当然のことながら、最も広い意味における本発明は、そのように制限されない。たとえば、時間分離のみを使用すること（たとえば、すべてのピークが同じ高さになるようにすべての存在情報を除去すること）、そしてそれでも基準データベースとの照合を得るために十分な指紋を得ることが実現可能である。
【００１８】
別の好ましい選択肢として、１つ以上のロック質量イオン（既知ｍ／ｚのイオン、したがって多重パスＴＯＦからの放出時間が予測できる）を多重パスＴＯＦ中に試料イオンとともに（またはそれに続いて）導入することができる。ロック質量イオンの検知を利用して、試料イオンの指紋中の位置を調整すること、または実際に、直接測定することなく試料イオンの位置を推測することができる。
【００１９】
本明細書において使用している用語「多重パスＴＯＦ」は、少なくとも一部のイオン、好ましくはすべてのイオンが繰り返し（すなわち複数回）クローズド・パスをたどるように配置された導入イオンのためのクローズド・パスを有するＴＯＦ質量分光計を指している。軽いイオンは、重いイオンより速く移動し、したがって重いイオンより頻繁にクローズド・パスに沿って移動する。導入された後のある時点で、軽いイオンの一部は重いイオンより少なくとも１回多くクローズド・パスを移動し、したがってかかる重いイオンを追い越す。クローズド・パスを有するかかる多重パスＴＯＦの例は、イオン・ミラー間でイオンが繰り返し反射されるように互いに向かい合う１対のイオン・ミラーを有する多重反射（ＭＲ）ＴＯＦ、または多くの周期または軌道にわたるクローズド・パス上のイオンの移動を維持する多数の静電セクタを有するマルチターンＴＯＦ質量分光計（ＭＵＬＴＵＭ）を含む。
【００２０】
本発明の方法では、イオンの少なくとも一部が多重パスＴＯＦ質量分光計中のパスに沿って複数回移動するが、この場合、相異なるｍ／ｚを有するイオンが飛行時間中に分離し、かつ、いくつかのイオンは他のイオンを追い越す。すなわち、他のイオンを追い越すことにおいて、これらのイオンの一部は、他のイオンより少なくとも１回多くパスに沿って移動する。一般的に、一部のイオンは、数回の反射または通過の後に他のイオンを追い越す。これは、オープン・パスまたは線形ＴＯＦに比し高い解像度のピーク分離を与える。多重パスＴＯＦの場合の実効分離長は、より長くなり得るからである。たとえば高速線源加速および後段加速を使用した場合、１００，０００までの質量解像度が得られるであろう。本発明のＴＯＦ構成は、大型ＴＯＦイオン・ミラーを使用するオープンＭＲ−ＴＯＦシステムに比し高い感度も与える。
【００２１】
イオン源は、ＴＯＦ質量分光計に導入するためのイオンを生成する一般的な源である。微生物の場合にはＭＡＬＤＩ源が好ましい。しかし、試料の種類によって、エレクトロスプレー（ＥＳＩ）またはその他のイオン源も使用できる。
【００２２】
本発明の第２の態様に従って、以下を備える試料同定用多重反射飛行時間型（ＭＲ  ＴＯＦ）質量分光計を提供する：
試料イオンを生成するイオン源、
反射軸に沿って互いに向き合うように配置されている第１および第２イオン・ミラーを有するクローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構、
反射軸に沿って配置され、次のように構成される双方向イオン・デフレクタ機構：
（ｉ）イオン源からクローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構に導入され、反射軸に沿って第１・イオン・ミラーから第２・イオン・ミラーへの第１方向に移動する試料イオンを、クローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構への導入から時間ｔ１が経過した時刻を始点として、イオン検知機構に偏向させ、かつ、
（ｉｉ）イオン源からクローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構に導入され、反射軸に沿って第２・イオン・ミラーから第１・イオン・ミラーへの第２方向に移動する試料イオンを、やはり時刻ｔ１を始点として、イオン検知機構に偏向させる。
【００２３】
双方向イオン・デフレクタを使用することにより、クローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦの全内容を反射軸から逸らしてミラー機構の外へ偏向させることができる。これは、高い解像度のデータの生成を可能とするが（これは、クローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦの固有の特徴である）、しかし同時にこれまでよりはるかに広い質量範囲の取得も可能とし、それにより指紋中のデータ点の個数が増加するので、試料微生物が基準データベース中の微生物に一致するか否か決定するために役立つより多くのデータがもたらされる。
【００２４】
好ましくは、このイオン検知機構は、変換ダイノードまたは後段加速ダイノード、電子増倍記管および／またはデジタイザー、および取得したデータを格納するコンピュータ含んでなるか、またはそれらを含む。特に好ましい実施形態では、第１と第２イオン・ミラー間で第１方向に移動するイオンは、前記第１方向から第１イオン検知器へ偏向され、通常第１検知器へ移動する。一方、第２と第１・イオン・ミラー間で反対方向に移動するイオンは偏向され、やはり、通常第２イオン検知器への同じ方向に移動する。
【００２５】
したがって、好ましい構成は、ナノセカンド未満で応答する検知システムを必要としない。イオン・パケットは、３〜５ｎｓより小さくする必要がないからである。
【００２６】
本発明のさらに別の態様に従って、以下のステップを含む複数の異なる基準試料を表す基準指紋のデータベースのための基準指紋を作成する方法を提供する：
（ａ）基準試料から基準イオンを生成するステップ、
（ｂ）時刻ｔ０において、基準イオンを基準多重パスＴＯＦ質量分光計に一度に導入し、かつ、少なくとも一部のイオンをＴＯＦ質量分光計中のパスに沿って繰り返し移動させるステップであって、そのとき、相異なるｍ／ｚを有するイオンが飛行時間中に分離し、そのときさらに、少なくとも第１のｍ／ｚを有するイオンが少なくとも第２の異なるｍ／ｚを有するイオンを追い越すステップ、
（ｃ）時刻ｔ１（＞ｔ０）を始点として基準イオンを基準多重パスＴＯＦから放出するステップ、
（ｄ）放出されたイオンを検知するステップ、
（ｅ）基準試料の基準指紋を作成するステップであって、基準指紋の各ピークは、特定の質量対電荷比を有するイオンから生じ、かつ、ｔ１以降の多重パスＴＯＦからのそれらの放出の順序と逐次的関係に配置されるが、この場合、これらのピークの少なくとも一部は、ｍ／ｚの逐次順序に配置されない。基準指紋は、試料からの指紋が作成された基準指紋と一致するか否か決定するために、同定対象試料からの指紋と比較することができるステップ。
【００２７】
このライブラリーは、もちろん、現状と同じ種類のＴＯＦを使用して構成する（移植する）ことができるし、またはその後の試料分析のために使用されるであろう。他方、基準指紋のこのデータベースまたはライブラリーは、恐らく別の国において種々のＴＯＦ（恐らく上で説明したような種々のスペクトル・パラメータを有する）を使用して作成できるであろう。
【００２８】
また、当然のことながら、得られた試料指紋の比較（または、実際に、試料ＴＯＦから得られた生データのデータ処理でさえ）は、当該試料ＴＯＦで局部的に、または別のコンピュータにおいて遠隔的に、または実際に別の国のライブラリーにアクセスすることにより実行することができる。
【００２９】
このように、安価で小型の質量分光計を使用する高解像度細菌ＭＡＬＤＩ同定方法−装置が提供される。この解像度は、ＦＴＭＳのそれに近づくが、しかし数ミリセカンドのみの装置内滞留時間を要求する。設けられる非常に長い飛行パスの故に、高解像度ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ナノセカンドのパルス幅またはナノセカンド未満のパルス幅さえ有する）の初期ビーム・パラメータは、通常の高解像度ＴＯＦに比較して、非常に寛容である。したがって、狭いパルス幅の検知システムは、要求されない。
【００３０】
また、ＦＴＭＳの場合のようなＣトラップおよびｒｆスイッチングも要求されない。本発明は、安定高電圧電源（ＨＶ  ＰＳＵ）（２つのプラス電源および２つのマイナス電源）およびミラー・システムおよびイオンの放出のための電圧を供給する低電圧（数百ボルト）高速パルサーを使用して簡単な方法により実現できる。このＨＶ  ＰＳＵは、原理上、単一のＨＶ  ＰＳＵとすることができるが、実際には、中性ＭＡＴＲＩＸ分子との衝突を低減するとともにポスト・ソース分解（ＰＳＤ）を最小化する上で有益な遅延抽出を実現するために１つまたは２つの高圧電源およびパルサーが望ましい。本発明の種々のその他の重要かつ／または好ましい態様は、以下の具体的記述および添付の請求項の考察から明らかとなるであろう。
【００３１】
本発明は、多数の方法で実施され得るが、ここでそのいくつかについて例示のみを目的として添付図面を参照しつつ説明する。図面の内容は次のとおりである。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明を表す第１実施形態に従って微生物有機体を同定するための装置を示す。
【図２】本発明を表す第２実施形態に従って微生物有機体を同定するための装置を示す。
【図３】本発明を表す第３実施形態に従って微生物有機体を同定するための装置を示す。
【図４】本発明を表す第４実施形態に従って微生物有機体を同定するための装置を示す。
【図５】図１〜４の装置における複数の異なる反射回数に対応するｍ／ｚとの対比における飛行時間のおおまかなプロットを示す。
【図６】シミュレートされた指紋およびその部分拡大図を示す。
【図７】２つの相異なるイオン滞留時間でシミュレートされた指紋を示す。
【図８】本発明の１つの実施形態による指紋の一部のおおまかな説明図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
最初に、図１を参照する。多重反射飛行時間型（ＭＲ  ＴＯＦ）質量分光計１０が示されている。装置１０は、全体として参照番号１２により指示されるクローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構および全体として参照番号５５により示されるイオン検知機構を含んでいる。
【００３４】
イオンはイオン源において生成され、次にイオン光学機器を使用してクローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構１２の方に導かれる。イオン源および光学機器は、ブロックの形態で全体として参照番号１５により示されている。イオン源およびイオン光学機器の具体的構成は、本発明の一部を形成せず、かつ、それは、いずれにせよ、当業者によく知られている。このイオン源は、エレクトロスプレー源などの他のイオン源も使用できるが、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）源とすることが好ましい。しかし、２０１１年現在、細菌エレクトロスプレー・イオン化は、確立された技術ではない。
【００３５】
イオン源により生成され、イオン光学機器１５により導かれたイオンは、クローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構１２の反射軸ＸＸ’の方に向けられる。この軸は、それぞれ、第１イオン・ミラー２０と第２イオン・ミラー２０’の間に設定される。源からのイオンは、小さなデフレクタを使用するかまたは軸的に一方のミラーをオフにすることによりＸＸ’軸に入ることができる。軸上注入は、より大きな質量範囲を受け容れることができるが、オン・オフされるミラー関連電圧の安定性の問題が生ずることがある。
【００３６】
クローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構１２中に注入された後、イオンは、第１および第２ミラー２０、２０’間で軸ＸＸ’に沿って往復するが、これは、図１におけるイオン・ビーム３０により示されている。
【００３７】
クローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構１２は、イオン・ビーム３０のシールド４０も含んでいる。
【００３８】
第１および第２イオン・ミラー２０、２０’の間に、イオン・デフレクタ器５０が設けられているが、その目的および好ましい構成についてこれからより詳しく説明する。イオン・デフレクタ器５０は、双方向である。すなわち、それは、第１イオン・ミラー２０から第２イオン・ミラー２０’の方へ、したがって図１において左から右へ移動するイオンを軸ＸＸ’からクローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構１２の外へ偏向させ、また、第２イオン・ミラー２０’と第１イオン・ミラー２０間で反対方向、図１において右から左に移動するイオンをクローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構１２の外へ偏向させるように構成される。
【００３９】
図１において双方向イオン・デフレクタ器５０によりミラー軸ＸＸ’から偏向されたイオンは、イオン検出機構５５に入り、ここで検知され得る。図１の特定の機構では、図１においてそれぞれ示されている第１および第２イオン・ミラー２０、２０’の間で左から右へ移動するイオンは、イオン・デフレクタ器５０により第１変換ダイノードまたは後段加速ダイノード６０の方へ偏向される。当業者が容易に理解できることであるが、二次放出が第１ノード６０の表面で発生する。第１ダイノード６０からの二次電子は、次に第１電子増倍器７０に衝突し、それが電子シャワーを生成する。この電子シャワーは、電子増倍器７０の陽極（図示せず）で終わる。次にこの陽極は、デジタイザー８０に直接に（それが地電位にあるときに）、またはたとえば容量性または誘導性の結合の使用により（それが浮動状態にあるときに、すなわち地電位より高い）接続される。電子増倍器７０は、電子増幅器と光子増幅器の組み合わせとして形成することもできる（たとえば、マイクロチャネル・プレートまたは電子増幅器、その後位に置かれて電子を光子に変換するシンチレーター、およびその後位に置かれて光子出力を組み合わせる１つまたは２つの光子増倍器の使用により）。
【００４０】
一方、クローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構１２の軸ＸＸ’に沿って右から左へ、すなわち第２および第１イオン・ミラー２０’、２０の間で移動するイオンは、イオン・デフレクタ器５０により第１ダイノード６０から離れた位置を占めている第２変換ダイノードまたは後段加速ダイノード６０’の方へ偏向される。次にこの第２ダイノード６０’は、二次電子を生成し、それが第２電子増倍器７０’に衝突する。これらの二次電子は、第２電子増倍器７０’により増倍されて平行電子シャワーを形成する。これは、（前述したように）第２電子増倍器７０’の陽極により捕捉される。それは、次に、直接または間接にデジタイザー８０に結合される。したがって、デジタイザー８０は、クローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構１２中を双方向に移動していたイオンがイオン・デフレクタ器５０によりクローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構１２から放出されたとき、それらのイオンを表す入射電流を受ける。
【００４１】
放出されたイオンの存在を表す信号は、コンピュータ９０によりデジタル化され、集約される。このコンピュータは、多重反射飛行時間型装置１０の専用部分でよいが、その代わりに、装置１０のデータ・ポート（図示せず）と、たとえば配線通信または無線通信する別の独立パソコンとすることもできる。コンピュータ９０は、たとえばインターネット経由で別のライブラリーまたは情報データベースと直接または間接に通信する。本発明の好ましい実施形態のこの特徴について、再度、以下においてさらに詳しく説明する。
【００４２】
図１の構成の使用中、イオンは、クローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構１２の中に短パルスとして注入され、その中の第１と第２イオン・ミラー２０、２０’間で軸ＸＸ’に沿って複数回往復する。イオンは、任意の時刻ｔ０において注入され、かつ、複数回の往復を許容されるので、イオンの実効経路長が拡張される。種々の質量対電荷比を有するイオンがクローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構１２内を相異なる速度で移動し、したがって飛行時間中に分離して一連のイオン・パケットを形成する。
【００４３】
イオンがクローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構１２を複数回横切った後、第２の時刻ｔ１（＞ｔ０）において、上述したように、軸ＸＸ’に沿って移動中のイオンをその軸から逸らせてイオン検知機構５５に向かわせるためにイオン・デフレクタ器５０が励起される。もちろん、時刻ｔ１におけるイオンは、非常に細い束状ではなく、むしろ軸ＸＸ’に沿って離ればなれになっている。したがって、別々のイオン・パケットが次々にイオン・デフレクタ器５０に到着するので、トラップのイオンが空になるまで時刻ｔ１から一定の時間がかかる。したがって、第１イオン・パケットが時刻ｔ１に到着したとすると、後続パケットは、ｔ’１、ｔ’’１、ｔ’’’１、（ここでｔ’１、ｔ’’１、ｔ’’’１＞ｔ１）に到着し得る。しかし説明を簡単にするために、以下の説明では、単一の放出時刻（たとえば、ｔ１）に言及するが、この時刻は、単に、ＭＲ  ＴＯＦからのイオンの放出が継続する時間ウィンドウの始まり（または中間）を表すものと理解するべきである。
【００４４】
イオン・デフレクタ器５０は双方向であるので、クローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構１２内のほぼすべてのイオンが上記時刻ｔ１から始まって放出され得る。ＭＲ  ＴＯＦへのイオン注入とトラップからの放出の開始の時間差（ｔ１−ｔ０）は、以下、クローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構１２内のイオン滞留時間と称する。
【００４５】
上述したクローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構１２内におけるイオン分離のために、一連のイオン・パケットがミラー軸ＸＸ’から放出される。各パケット内のイオンの相対的数量は、イオン検知機構５５により検知される信号に正比例する。換言すると、検知器機構５５は、種々の強度を有する一連のピークを形成するであるが、その各強度は、各イオン・パケット中のイオンの相対的存在量に比例する。
【００４６】
しかし、先行技術と対照的に、また、発明の概要の項において説明したように、本願発明者は、各ピークはもちろん固有の質量対電荷比を有するイオンの結果であるが、しかし細菌種の正確な同定は各ピークに質量を割り当てること必要としないこと（すなわち、質量スペクトルの作成を必要としないこと）を認識した。実際、必要なことは、単に、クローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構１２内のイオンの最短滞留時間（ｔ１−ｔ０）が、種々のイオン種が適切に分離され、分離されたピークが十分に区別され得るほどに、十分に長いことである。他の要求条件は、イオン種が特定の順序で放出されることのみである。この理由は、次のとおりである。相異なる質量対電荷比を有するイオンがクローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構１２内で相異なる周波数で振動するので、イオンの種々のパケット（それらの質量対電荷比に応じて分離された）の相対的位置は、ｔ０後の相異なる時刻ｔ１、ｔ２、ｔ３、・・・において異なる。注意すべきは、これが、必ずしも、時間ｔ１が常に同一でなければならないことを意味しないことである。実際、本発明の特に好ましい態様では、複数の滞留時間を用いることができ、そして同様に異なる滞留時間を使用してスペクトルを作成することができる。しかし、滞留時間またはそれに関連するかまたはそれから導かれるパラメータの情報により、１つのかかるスペクトルを他のスペクトルにマップすることが可能でなければならない。一貫性の要求条件の理由は、作成された生物学的指紋が、既知の微生物を利用して作成された生物学的指紋のライブラリーまたはデータベース中の等価スペクトルと同種類間比較できるようにすることである。
【００４７】
本発明を具体化する原理は、図５を参照することにより、より良く理解できるであろう。これは、異なる反射回数に関わる合計飛行時間対ｍ／ｚのおおまかなプロットである。図５から分かるように、たとえば、合計３ｍｓの合計飛行時間（すなわち、ｔ１−ｔ０＝３ｍｓ）のとき、多数のイオンが同一の空間を占め得る：たとえば、１００回の反射を経験した２００よりやや高いｍ／ｚのイオンは、８０回の反射を経験した３５０をやや超えるｍ／ｚのイオンおよび６０回の反射を経験したｍ／ｚ＝６００を有するイオンとイオン・デフレクタにおいて同一空間を占める。相異なる反射回数を有する多数の他のｍ／ｚのイオンも同一の空間を占める。明確にするために、図５には、１、２０、４０、６０・・・回の反射のみ示したが、２、３、４、５、６・・・２１、２２、２３・・・回の反射を経験したその他のｍ／ｚを有するイオンの共存も存在する。しかし、ここで留意すべきは、必ずしもすべてのイオンが、特に高い解像度において、同一空間を占めるわけではないことである。その理由は、ｍ／ｚが連続体ではなく、また、イオンのすべての組み合わせがスペクトル内に存在するわけではないからである。
【００４８】
したがって、形成されるスペクトルは、質量数を与えないが、その代わりに「スペクトル指紋」または「生物識別子」を与える。この場合、スペクトルの垂直軸は依然としてピーク強度であるが、しかしＸ軸はもはや質量ではなく、質量対電荷比または飛行時間（それは、もちろん、ｍ／ｚに関連している）である。それは、一種の任意のスペクトルまたは指紋の座標であり、唯一の要求条件は、それが少なくとも一貫していることまたは一貫して知られることである。
【００４９】
図６ａおよび６ｂは、それぞれ、シミュレートされた指紋およびその部分拡大図を示している。各図において、垂直（ｙ）軸は、試料から導かれた所与のイオンの存在量を任意の単位で表す。水平（ｘ）軸は、時間の長さである。この例では、時間は、ＭＲ  ＴＯＦへの試料の注入からそれからの放出およびその後の検知までの時間である（それは、原点がゼロではなく、４ミリセカンドである理由である）。図６ａおよび６ｂの指紋は、実際の生物学的試料からのものではなく、本発明の原理を示すためにプロテオミクス実験からの擬似乱数データを使用してシミュレートにより作成された。図６ａには、約５００のピークが示されているが、しかし、通常、これよりはるかに少ないピークを得る。データベース中の基準指紋と対比する場合、はるかに少ない個数でも試料の正確な同定のために一般的に十分であるからである。
【００５０】
図６ａのピークは、４００〜２４，０００Ｄａの質量範囲に対応するが、しかし、一見して分かるように、これらのピークは、ｍ／ｚの昇順または降順ではなく、時刻ｔ１後のＭＲ  ＴＯＦからの放出の順序に並べられている。
【００５１】
注目するべきは、非常に広いシミュレートされたピーク（図６ｂに示されている）が実際の測定器で見出されるものよりはるかに広いことである。この場合、ピークのＦＷＨＭは、一般的に１ｎｓから１０ｎｓの桁になると予想される（在来のＴＯＦ機器における一般的なナノメーター未満のピーク幅に対比して）。
【００５２】
図２〜４は、基準または試料のスペクトル指紋を作成する測定装置１０の代案構成を示している。図２〜４の構成要素の多くは、図１の構成要素と対応しており、したがって同様な参照番号を付した。
【００５３】
図２におけるクローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構１２は、図１に示し、それに関連して説明した機構と同じである。しかし、図２のイオン検知機構５５’は、図１の機構と異なっている。図２の構成では、イオン検知機構は、やはり、それぞれ、イオン軸ＸＸ’から各方向に逸らされたイオンを受け取る第１および第２変換ダイノードまたは後段加速ダイノード６０、６０’を含んでいる。しかし、図１の構成と対照的に、図２では、各ダイノード６０、６０’は補助電極を生成し、それが単一の電子増倍器７０に衝突し、それにより二次電子が発生されてデジタイザー８０により検知される。このデジタイザーは、次にコンピュータ９０と交信する。
【００５４】
やはり本発明を具体化する代案装置１０を表す図３の構成でも、クローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構１２は、図１および２で示した装置と同じである。しかし、この場合、イオン検知機構５５’’は、変換ダイノードを含まない。後段加速ダイノードも図２の特定の構成には示されていないが、実際には後段加速の使用は、依然として望ましいであろう。それは、比較的高いｍ／ｚのイオンの検知にとって有益であるからである。
【００５５】
図２の実施形態では、イオンは、ミラー軸ＸＸ’からそれぞれ第１および第２電子増倍器７０、７０’に向かって偏向される。これらは、次に、それぞれ、二次電子のシャワーを形成し、それが単一のデジタイザー８０により検知される。コンピュータは、デジタイザー８０によりデジタル化されたデータを収集する。
【００５６】
最後に、図４では、イオン・デフレクタ器５０は、第１および第２対向電気セクタ装置から構成されているが、これらは、励起されたとき、両反対方向に移動するイオンをミラー軸ＸＸ’から逸らし、それぞれを単一電子増倍器７０に向かわせる。次にこの単一電子増倍器は、デジタイザー８０によるデジタル化およびそれに続くコンピュータ９０による収集のために二次電子の単一シャワーを形成する。
【００５７】
データベースの編集方法および試料微生物の同定においてそれを使用する方法について、これから説明する。既知の微生物の指紋を作成するために、好ましくは図１〜４において示したような装置１０において、しかし任意選択的にその代わりに在来の構成のＴＯＦ分光計において上述の技術を使用して、当該微生物の試料を分析する。在来のＴＯＦを使用する場合には、解像度が図１〜４の装置の解像度にほぼ匹敵する装置を使用する。既知微生物のスペクトル指紋を得るために使用することが好ましいクローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構１２のパラメータは固定してもよいが（すなわち、たとえば、第１と第２イオン・ミラー２０、２０’間の離隔を常に一定とし得る）、これは不要である。必要なことは、少なくともスペクトル・パラメータが既知であり、したがって既知微生物を使用して作成される基準スペクトル指紋を、必要な場合に、相異なるパラメータを有する装置を使用して作成された試料指紋にマップできることである。これを達成する１つの方法は、試料微生物とともに内部検量体を使用して検量体ピーク（またはロック質量）がスペクトル指紋内に現れるようにすることである。好ましくは、２つ以上のロック質量化合物を使用する。これを行うことにより、相異なるスペクトル／指紋を標準化された形態または比較可能な形態にデコンボリューションすることが常に可能となる。マッピングは、通常、ソフトウェアで行われる。ピーク・マッピングを支援するロック質量の使用は、図８に関連して以下においてさらに詳しく説明する。
【００５８】
同様に当然のことながら、既知微生物およびそれらのスペクトル指紋のデータベースまたはライブラリーは、非常に大きいであろう（データベースに保存されている微生物の件数および上述のように作成されたコンピュータ・データの量の両方において）。したがって、既知微生物のデータベースまたはライブラリーを局部的に、たとえば、コンピュータ９０のハードドライブに保管することは実際的でもなく、望ましくもない。その代わりに、遠隔アクセスのためのセントラル・レポジトリのライブラリーにたとえばインターネット経由で保管することが好ましいであろう。これは、図１〜４に図式的に示されている。データベースは、もちろん、装置１０と異なる国に置くことができる。
【００５９】
データベースまたはライブラリーが確立された後、同定対象の微生物の試料を図１〜４の装置１０を使用して分析する。その分析は、前述した方法によりスペクトル指紋を作成する。コンピュータ９０において作成された試料指紋は、ライブラリー１００における種々の既知の微生物の指紋との比較のためにインターネット経由で送り出される。その結果は、再びインターネットを使用して、ライブラリー１００からコンピュータ９０に送り返され得る。試料指紋を作成するために使用されたパラメータが基準指紋を作成するために使用されたパラメータと異なるために、変換を行う必要がある場合には、変換は、コンピュータ９０において局部的にまたはライブラリー／データベース１００において局部的にまたはいずれかほかの場所において行い得る。比較結果は、試料微生物とライブラリー１００中の既知微生物間の合致の確率の順番に配列された同定可能性を有する一連の（既知の）微生物として既知の方法で提供可能である。
【００６０】
試料スペクトル指紋と、それと対応するかまたはそれにマップされたライブラリー・スペクトル指紋との単一比較は効果的であるが、好ましい実施形態では、クローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構１２内の相異なる滞留時間を使用して試料微生物の２つ以上のスペクトル指紋を取得する。相異なる滞留時間で同一試料から得られた各スペクトル指紋がデータベース１００中の複数の等価の基準スペクトル指紋にマップできるならば、照合（またはその他）におけるさらに高い信頼性を達成することができる。たとえば、複数のイオン種を扱う場合に、任意の滞留時間において、全く異なる質量対電荷比の２つのイオン種が、これらのイオンが放出される時点において、重なり合う可能性がある。これは、これらのイオン種の一方がクローズド・ミラーＭＲ  ＴＯＦ機構１２を他のイオン種と異なる回数だけ移動したためである。複数の滞留時間を使用することにより、両方の場合にこれらの重なり合いの起きる確率は相当に低減されか、または全面的に除去される。
【００６１】
この原理は、それぞれ、２つの相異なるイオン滞留時間でシミュレートされた指紋を示す図７ａおよび７ｂを参照することにより、より良く理解され得る。図７ｂの指紋（滞留時間は４ミリセカンド以上、すなわち、イオンは、デフレクタが励起されてトラップを空にするまでに少なくとも４ミリセカンドにわたりトラップ中をイオン・ミラー間で往復する）では、これらのイオンは、図７ａの場合（最短滞留時間２ミリセカンド）より長くトラップ中に滞留するので、特定のイオン種は、デフレクタが励起されたとき、各場合においてトラップ中の相異なる相対位置に存在する。具体例を提起すると、図７ｂの指紋において（最短滞留時間４ミリセカンド）、ｍ／ｚ＝２７２２．３８７およびｍ／ｚ＝３９６１．８３を有するイオンに対応するピークは、反対方向に向かって双方向デフレクタへ移動するのであるが、それぞれ、ｔ＝４，０４０，５９７．７ｎｓにおいてデフレクタに到着する。これらは同時に到着するので、これらを区別することは困難である。
【００６２】
しかし、実験を繰り返して、わずか２ミリセカンドの最短滞留時間の指紋を作成することにより、ｍ／ｚ＝２７２２．３８７およびｍ／ｚ＝３９６１．８３を有するイオンからのピークは、それぞれ、２，０２０，２９９ｎｓおよび２，０２０，３６７ｎｓにおいて双方向デフレクタに到着する（したがって、十分に区別できる）。同一試料から導かれるがしかし相異なる最短滞留時間を使用する２つの（もちろん、またはそれより多くの）指紋からのデータを使用して、それらの指紋のどちらか一方におけるピークの重なり合いの曖昧性の解消を可能にするアルゴリズムを構築することができる。
【００６３】
図８は、本発明の１つの実施形態による指紋の一部のおおまかな説明図を示している。図８の部分指紋は、擬似乱数データなどからシミュレートされたものではなく、ピーク幅の提示を試みることなく（それは、現在の説明に密接な関係を有していないので）、単にピークのあり得る構成を示している。前述したように、同定される試料とともに１つ以上のロック質量を導入ことが可能であり、かつ、実際に望ましい。ロック質量は、質量スペクトル中の明確な基準点を与えるのに十分な存在量の明確なピークを有する既知ｍ／ｚのイオンである。本発明の実施においては、１つ以上（好ましくは２つ以上）のロック質量を使用する。その目的は、質量スペクトルそのものを改善することではない。なぜならば、当然のことながら、本発明の指紋は質量スペクトルではなく、それよりむしろ、放出時間などの任意の数量に対比してプロットされる各試料イオンおよびロック質量イオンのイオン存在量の表現であり、また、この場合イオンはトラップからの放出の順序またはトラップからの放出順序にマップされる順序に配置されるである。ロック質量は、それよりむしろ、ｘ（たとえば、放出時間）軸およびｙ（存在量）軸のいずれかまたは両方における種々のピークの位置に適用される修正を可能にする。測定されたロック質量ピークのそれらの予期される存在量／時間からのｘおよび／またはｙ方向のずれは、未知起源の他のピークに対し修正を適用するために使用できるからである。
【００６４】
この原理は、図８においてＡおよびＢとして示されているピークから理解することができる。各ピークは、破線で示されている期待位置から（高さと時間の両方において）ずれている。このシフトは、他のピークのすべてのための修正係数を与えるために使用することができる。
【００６５】
一部の実施形態では、ロック質量は、当該指紋におけるピーク（ロック質量イオンと試料イオンの両方からの）のそれぞれが測定された存在量および放出時間に関するものであるということに基づいて単に指紋の修正を可能にするために使用されるが、複数のロック質量を使用することにより、さらに、本発明の別の実施形態に従って試料イオンの放出時間を測定する必要性を全面的に省くことが可能になる。代わりに、かかる放出時間は、ロック質量の決定された位置から推測することができる。
【００６６】
いくつかの特定の実施形態について記述したが、種々の変形が考えられる。たとえば、図１〜４の単一デフレクタ器ではなく、デフレクタの組み合わせ、たとえばドッグレグ構成の使用が考えられる。また、デフレクタをイオン・ミラーの中央に正確に配置する必要がないことも高く評価される。デフレクタは、いずれか一方の側にずらすことができる。さらに、ミラー自体も同じであることを必要としない。
【００６７】
記述した技術は、大阪大学で開発され、たとえば、Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  Ｖｏｌｕｍｅ  ３８，  ２００３，  ｐａｇｅｓ  １１２５−１１４２、豊田らにより記述されているマルチターン飛行時間型分光計（“ＭＵＬＴＵＭ”）でも同様に使用することができる。この装置は、８の字形構成であり、より容易に空にすることができる。それを行うために電気セクタのうちの１つをオフに切り換えることのみ必要であるからである。
【００６８】
さらに、特定の実施形態について細菌および糸状菌のスペクトル指紋の作成に関して説明したが、その他の生物試料にも適用できる技術も構想している。解像度は、細菌の菌株および種の分析を可能とするために確実に十分である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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