(57)【要約】  本発明は、多発性骨髄腫(MM)患者の層別化方法であって、前記患者のB細胞、好ましくは悪性B細胞がその表面にBCMAタンパク質を発現するかどうかを測定することを含む前記方法に関する。抗体ベースの多発性骨髄腫(MM)治療薬の選択方法もまた、BCMAが、患者のB細胞、好ましくは悪性B細胞の細胞表面に発現されるかどうかに基づく。さらにまた、BCMA陽性悪性B細胞を有する患者の抗体ベースの治療薬もまた提供される。【選択図】図１Ａ
2014520248.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗BCMA抗体治療薬に順調に反応する性質を有する多発性骨髄腫(MM)患者の層別化方法であって、多発性骨髄腫(患者のB細胞、好ましくは悪性B細胞が前記B細胞の表面にBCMAタンパク質を発現するかどうかを測定することを含み、前記B細胞がその表面にBCMAタンパク質を発現する場合に、前記患者が前記抗BCMA抗体治療薬に順調に反応する性質を有する前記方法。
【請求項２】
BCMA陰性多発性骨髄腫(MM)患者を診断する方法であって、患者のB細胞、好ましくは悪性B細胞がその表面にBCMAタンパク質を発現するかどうかを測定することを含み、BCMAタンパク質が前記B細胞の表面に何も検出されない場合に、前記患者がBCMA陰性MMを患っている前記方法。
【請求項３】
抗体ベースの多発性骨髄腫(MM)治療薬を選択する方法であって、患者のB細胞、好ましくは悪性B細胞が前記B細胞の表面にBCMAタンパク質を発現するかどうかを測定することを含み、前記B細胞がBCMA陽性の場合には、その患者は抗CD20抗体治療薬および/または抗CD38抗体治療薬および/または抗BCMA抗体治療薬および/または抗CS1抗体治療薬の対象であることができ、前記B細胞がBCMA陰性の場合には、その患者は抗CD20抗体治療薬および/または抗CD38抗体治療薬および/または抗CS1抗体治療薬の対象である前記方法。
【請求項４】
B細胞が患者から得られる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
B細胞が、CD38陽性、CD56陽性または陰性、CD45陽性およびCD19陽性であると特徴付けられる、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
患者が抗BCMA抗体治療薬で治療される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
抗BCMA抗体が、
モノクローナル抗体、
キメラ抗体、
ヒト化抗体または
二重特異性抗体
である、請求項１〜６いずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
抗BCMA抗体が毒素に結合される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
B細胞、好ましくは悪性B細胞がBCMA陽性である性質を有する多発性骨髄腫(MM)患者の治療または改善に使用するための抗BCMA抗体治療薬。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法によって診断される多発性骨髄腫(MM)患者の治療または改善に使用するための抗BCMA抗体。
【請求項１１】
B細胞、好ましくは悪性B細胞がBCMA陰性である多発性骨髄腫(MM)患者の治療または改善に使用するための抗CD20抗体および/または抗CD38抗体および/または抗CS1抗体。
【請求項１２】
BCMAタンパク質がVicky-1またはMAB 193で検出可能である、請求項１〜１１のいずれか１項。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を実施するための、抗BCMA抗体および使用説明書を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多発性骨髄腫(MM)患者の層別化方法であって、前記患者のB細胞、好ましくは悪性B細胞がその表面にBCMAタンパク質を発現するかどうかを測定することを含む前記方法に関する。抗体ベースの多発性骨髄腫(MM)治療薬の選択方法もまた、BCMAが、患者のB細胞、好ましくは悪性B細胞の細胞表面に発現されるかどうかに基づく。さらにまた、BCMA陽性悪性B細胞を有する患者の抗体ベースの治療法もまた提供される。
【背景技術】
【０００２】
血漿B細胞の不治の悪性腫瘍である多発性骨髄腫(MM)は、新規に診断されたすべての血液悪性腫瘍の14%を占めると推定されている (Colson et al., (2004) Clin J Oncol Nurs 8 (5): 473-480)。MMは異種疾患であり、主として染色体転座、特にt(11;14)、t(4;14)、t(8;14)、del(13)、del(17)によって引き起こされる(Drach et al., (1998) Blood 92(3):802-809; Gertz et al., (2005) Blood 106(8):2837-2840; Facon et al., (2001) Blood 97(6):1566-1571)。MM罹患患者は、骨破壊、骨髄浸潤、腎不全、免疫不全および癌診断の心理社会的負担による種々の疾患関連症状を経験する可能性がある。化学療法および幹細胞移植アプローチなどの興味をそそられる新規治療が利用可能になりつつあり、生存率が改善されているが、多くの場合、好ましくない副作用が生じるため、MMはなお不治のままである(Lee et al., (2004) J Natl Compr Canc Netw 8 (4): 379-383)。
【０００３】
MMは血漿B細胞の悪性腫瘍によって引き起こされる。前記悪性血漿B細胞を最終的に同定するために、血漿B細胞の表面に存在するいくつかのタンパク質が見出された(Harada et al., (1993) Blood 81(10): 2658-2663; Robillard N et al., Blood (2003) 102(3): 1070-1071)。例えば、CD38は骨髄腫細胞(悪性血漿B細胞)の表面に強く発現され(すなわちCD38++)、従って骨髄中の他の造血器細胞から血漿B細胞が区別されることが見出された。さらに、Haradaらはまた、7名の健常ドナーからの骨髄における正常血漿B細胞はVLA-4+VLAS-5+MPC-1+CD44+CD19+CD56-であり、他方では成熟骨髄腫細胞(20例中12例)はVLA-4+VLAS-5+MPC-1+CD19-CD56+であり、CD19+Cd56-である骨髄腫細胞はなかったことを見出した。さらに、CD20の発現が、成熟小型血漿B細胞の形態とt(11;14)を有するMM患者とに関連することが報告された。
【０００４】
BLyS(Bリンパ球刺激因子;B Lymphocyte stimulator)は、BAFF、TALL-1またはTHANKとも呼ばれ、腫瘍壊死因子(TNF)スーパーファミリーメンバーである。これはII型膜貫通タンパク質であり、正常B細胞の発達およびホメオスタシスの維持に重要な役割を果たし、悪性B細胞の生存を促進する。BLySの3つの受容体、すなわちBCMA(B細胞成熟抗原;B cell maturation antigen)、BAFF受容体(BAFF-R)およびTACI(膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターシクロフィリンリガンドインタラクター;transmembrane activator and calcium modulator cyclophilin ligand interactor)が同定された。これら3つの受容体は、I型1回膜貫通型受容体であり、TNF受容体ファミリーに属する。BCMAおよびBAFF-Rは、主にBリンパ球上に発現されるが、TACIはB細胞上に見出すことができ、T細胞を活性化する。さらに、BCMAおよびTACIは、BLySの最も近い構造ホモログであるAPRIL(増殖誘導リガンド; a proliferation-inducing ligand)に結合することができる。Novakらは、BLyS(BAFF)の3つの受容体がMM患者のB細胞の細胞表面に発現されることを見出した(Novak et al., (2004) Blood 103(2):689-694)。
【０００５】
BLySの受容体の1つであるBCMAは、成熟B細胞に優先的に発現されることが知られている(Gras et al., (1995) Int Immunol 7:1093-1106; Thompson et al., (2000) J Exp Med 192:129-135)。さらにまた、BCMA mRNAとしてのBCMAの発現が正常B細胞分化の後期においてアップレギュレートされており、かつMM細胞において強く発現されていることが見出された(Tarte et al., (2002) Blood 100:1113-1122; Tarte et al., (2003) Blood 102:592-600; Claudio et al., (2002) Blood 100:2175-2186)。さらに、Bellucciらは、BCMAの発現、すなわちBCMA mRNAがB細胞成熟後期に選択的に発現されることを確認した(Belluci et al., (2005) Blood 105:3945-3950)。しかしながら、Liらは、BCMAの発現、すなわちBCMA mRNAが、患者からのMM細胞においていつも検出可能であるとは限らないことを見出した(Li et al., (2010) Med Oncol 27:439-445)。このために、BCMAの発現が形質細胞および胚中心B細胞のみに限定されていることが報告されてはいたが、BCMA+集団は、末梢血からのナイーブおよびメモリーB細胞においてもまた観察された(US2009/0325196)。BCMA+B細胞の平均は、ナイーブB細胞においては24%であり、メモリーB細胞においては20.8%であるが、これは形質芽細胞の平均(37.9%)よりも低い。しかしながら、BCMAは主に形質芽細胞において発現されると考えられる。
【０００６】
T細胞リンパ腫患者からの腫瘍細胞において、BCMA遺伝子およびインターロイキン2遺伝子の融合をもたらすt(4;16)(q26;p13.1)染色体転座が見出され、男性の濾胞性リンパ腫患者において、BCMA遺伝子、HLA-D遺伝子およびいくつかの造血新生物関連遺伝子、例えばMHC2TAおよびBCL2遺伝子などの融合をもたらすt(16;18)(p13;q21.3)染色体転座が見出されたことが報告されている(Laabi et al., (1992) J EMBO 11(11):3897-3904;Mahmoodi et al., (2004) Can Genet Cytogenet 154(2):160-162)。これらの染色体転座がMMを引き起こすことは報告されていないが、転座の1つは、濾胞中心B細胞のリンパ腫と定義される濾胞性リンパ腫に関連する。
さらにまた、Novakらは、MM細胞株および新鮮分離MM細胞は、それらの細胞表面にBCMAタンパク質およびTACIタンパク質を発現し、それらの細胞表面にBAFF-Rタンパク質の一過性発現(variable expression)をもたらすことが見出された(Novak et al., (2004) Blood 103(2):689-694)。
【０００７】
BCMAタンパク質は、初めはヒト成熟Bリンパ球のゴルジ装置における内在性膜タンパク質、すなわち細胞内タンパク質として報告されたが、BCMAタンパク質が、MM細胞/細胞株の細胞表面に発現されることもまた報告された(Gras et al., (1995) International Immunol 7(7):1093-1105)。このことは、BCMAがB細胞の分化およびホメオスタシスにおいて重要な役割を有していると考えられることを示している。Grasらの発見は、Grasらによって記載されたBCMAタンパク質が、染色体転座のために、BCMAとIL-2との間の融合タンパク質であるという事実と関連するかもしれない。しかしながら、BCMAは、一方では、推定上そのBAFFおよびAPRILとの本質的相互作用によって、B細胞の分化およびホメオスタシスに必須なB細胞マーカーであることが確立されている(Schliemann et al., (2001) Science 293 (5537):2111-2114)。
【０００８】
これまでは、多発性骨髄腫患者の2つの最も有望な治療オプションは、大量化学療法後のタンデム自己幹細胞注入かまたは、骨髄破壊的治療もしくは骨髄非破壊的前処置後の同種造血幹細胞移植である。しかしながら、微小残存疾患の残存によって、治癒はまれである。従って、残存腫瘍細胞を安定化またはさらには根絶するための革新的な治療法の必要に迫られている。
癌標的抗原の発見および分子構造解析によって、従来の破壊的治療後の残存癌細胞を認識し除去するように患者の免疫系を刺激するためのより焦点を合わせたアプローチを用いることが可能となる。従って、抗体ベースの治療薬は、MMの治療のための魅力的な選択肢である。MM細胞は、それが”変換”される前はB細胞であったため、CD20などの一般に知られている特定のB細胞表面タンパク質が抗体の標的として用いられる。正常B細胞もまた抗CD20抗体によって標的とされるが、正常B細胞が回復するのに対し、悪性B細胞は回復しないと想定される(かつ、それが観察されている)ことが観察されたため、抗CD20抗体治療薬は患者に適用される。これまでは、当業者は、ひとたび悪性B細胞がBCMA、PIM2、MUM1/IRF4またはXBP1などのmRNAレベルでの目的とする標的(Claudio et al. (2002)Blood 100:2175-2186)を発現すれば、このような細胞は抗体ベースの治療薬の対象であることができるという仮定から出発する。
【０００９】
しかしながら、これまで、MMの可能な治療薬を評価するために、特に抗BCMA抗体を用いて、MM患者ならびにMM細胞株においてBCMA mRNAとBCMAタンパク質との相関が存在するかどうかに関していまだに報告されていない。むしろ、DNAがRNAを作り、RNAがタンパク質を作るという一般に認められた概念に従って、ひとたびBCMA mRNAがMM細胞において検出可能であれば、BCMAタンパク質は、受容体として機能するために前記細胞の細胞表面に存在すると当然のことながら仮定された。このことは、BCMAに、B細胞免疫およびB細胞ホメオスタシス(Mackay and Browning (2002) Nat Rev Immunol. (2):465-475)の発達ならびにMM 細胞の増殖(Novak et al., (上記で引用); Bellucci et al., (2005) Blood 105:3945-3950)における重要な役割を割り当てる種々の報告と一致するであろう。
【００１０】
いくつかの最近の研究もまた、悪性および正常形質細胞におけるBCMAの発現を実証づけており、BCMAを介したBAFFシグナル伝達が骨髄腫細胞増殖をもたらすことを示した(Shu et al., (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:9156-9161; O’Connor et al., (2004) J Exp Med. 199:91-98; Novak et al.,(上記で引用); Avery et al., (2003) J Clin Invest. 112:286-297)。総合すれば、これらの研究は、BCMAが一般に骨髄腫において発現され、BCMAを介したシグナル伝達がin vivoでの骨髄腫細胞の増殖に寄与することもできることを示唆した(Bellucciら、上記で引用)。
従って、DNAがRNAを作り、RNAがタンパク質を作るという一般に認められた概念に基づき、BCMAがMM増殖における重要な役割を割り当てられており、従ってMM B細胞の細胞表面にその存在が暗示されるということが事実であるとすれば、多発性骨髄腫治療は自動的に開始されていたであろう(Ryan et al., (2007) Mol Cancer Ther 6: 3009-3018)。その結果として、BCMAが、そのmRNAが検出可能な場合に、細胞表面に実際に存在するかどうかについてこれまでだれも疑うことをせず、従って、BCMAが細胞表面に存在しない場合に多発性骨髄腫を患っている患者に必ずしも有益ではないにもかかわらず、抗体ベースの治療薬が開始されていたであろう。
【発明の概要】
【００１１】
BCMAは、正常B細胞分化および悪性B細胞増殖(多発性骨髄腫における)の両方に重要であると考えられるという知識にもかかわらず、本発明者らは、BCMAがMMにおいても重要な役割を果たしているにも関わらず、DNAがRNAを作り、RNAがタンパク質を作る(次いでこれは恐らく細胞表面に存在する)というドグマがBCMA mRNAデータのみに基づく場合にもあてはまるかどうかという疑問を自問自答した。言い換えれば、検出可能なmRNAにもかかわらず、BCMAはMM細胞の細胞表面に存在しないかもしれず、従って抗体ベースの治療薬の標的として利用できないかもしれないことは、当該技術分野では認識されていなかった(Ryanら、上記で引用)。従って、MMの治療または改善のために、抗BCMA抗体ベースの治療薬を個別化することを、当該技術分野で誰も考えなかった。なぜなら、悪性B細胞分化および増殖におけるBCMAの重要な役割を考慮に入れて、DNAがRNAを作り、RNAがMMの表面に存在するタンパク質を作ると考えられたからである。従って、抗BCMA抗体治療薬を個別化することが求められている。
【００１２】
故に、本発明の基礎をなす技術的課題は、前述の要求に従うことである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】OPM-2細胞におけるFACSによるOPM-2細胞に対する抗BCMA抗体の結合を示す図である。
【図２】異なる10のMM細胞株のBCMAタンパク質(A)発現レベルおよびBCMA mRNA(B)発現レベルを示す図である。
【図３】原発性MM細胞の発現解析-BCMA発現陽性および陰性患者試料の典型的な結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、好ましくは、MMの治療または改善に用いられる他の抗体または化合物との併用で抗BCMA抗体を用いる治療であって、BCMA mRNAが検出される場合に、BCMAタンパクが、いわば自動的にMM細胞の表面に存在するという仮定がありとあらゆる患者に必ずしも正しくないという本発明者らの認識に基づく前記治療を提供することによってこれらの要求に取り組む。実際、本発明者らは、MM患者を、それぞれ、タンパク質レベルでのBCMAの発現の有無に関して、すなわち、MM細胞の細胞表面上でのその有無に関してスクリーニングすることがきわめて重要であることを見出した。
【００１５】
従って、本発明は、抗BCMA抗体治療薬に順調に反応する性質を有する多発性骨髄腫(MM)患者の層別化方法であって、患者のB細胞、好ましくは悪性B細胞(MM細胞またはMM B細胞)が前記B細胞の表面にBCMAタンパク質を発現するかどうかを測定することを含む前記方法において、前記B細胞がその表面にBCMAタンパク質を発現する場合に、前記患者が前記抗BCMA抗体治療薬に順調に反応する性質を有する前記方法を提供する。
【００１６】
さらにまた、本発明は、BCMA陰性多発性骨髄腫(MM)患者を診断する方法であって、患者のB細胞、好ましくは悪性B細胞がその表面にBCMAタンパク質を発現するかどうかを測定することを含む前記方法において、前記B細胞の表面にBCMAタンパク質が何も検出されない場合に、前記患者がBCMA陰性MMを患っている前記方法を提供する。
本発明はまた、抗体ベースの多発性骨髄腫(MM)治療薬を選択する方法であって、患者のB細胞、好ましくは悪性B細胞が前記B細胞の表面にBCMAタンパク質を発現するかどうかを測定することを含む前記方法において、前記B細胞がBCMA陽性の場合には、その患者は抗CD20抗体治療薬および/または抗CD38抗体治療薬および/または抗BCMA抗体治療薬および/または抗CS1抗体治療薬の対象であることができ、前記B細胞がBCMA陰性の場合には、その患者は抗CD20抗体治療薬および/または抗CD38抗体治療薬および/または抗CS1抗体治療薬の対象である前記方法を提供する。
【００１７】
本発明のさらなる側面は、B細胞がBCMA陽性である性質を有する多発性骨髄腫(MM)患者の治療または改善に使用するための抗BCMA抗体治療薬、本発明の方法(単数または複数)に従って診断される多発性骨髄腫(MM)患者の治療または改善に使用するための抗BCMA抗体および、B細胞がBCMA陰性である多発性骨髄腫(MM)患者の治療または改善に使用するための抗CD20抗体および/または抗CD38抗体および/または抗CS1抗体治療薬に関する。
【００１８】
本明細書において、単数形”ある(a)””ある(an)”および”その(the)”は、文脈によって明確に否定されない限り複数指示を含む事に注意しなければならない。従って、例えば、”ある発現カセット(an expression casette)”とは、本明細書に記載の発現カセットの1以上を含み、”その方法(the method)”とは、本明細書に記載の方法のために改変または置き換えることができる当業者に公知の等価なステップおよび方法を含む。
【００１９】
本開示に引用したすべての公報および特許は、参照によりその全体が組み込まれる。組み込まれた材料が、本明細書に矛盾するかまたは一致しない範囲内において、本明細書はこのような任意の材料に優先する。特記しない限り、一連の要素に先立つ用語”少なくとも”は、そのシリーズにおけるあらゆる要素を指すものと解される。当業者は、単にルーチン試験を用いて、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するかまたは確認することができるであろう。このような等価物は、本発明に含まれるものとする。
【００２０】
本明細書および以下の請求項を通じて、特記しない限り、語”含む(comprise)”ならびに”含む(comprises)”および”含んでいる(comprising)”などの語尾変化形は、規定された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループの組み込みを意味するが、任意の他の整数もしくはステップまたは正数もしくはステップのグループを排除するものではないと理解される。本明細書で用いられる場合、用語”含んでいる(comprising)”は、用語”含有している(containing)”で置き換えられることができ、本明細書で用いられる場合、場合により用語”有している(having)”で置き換えられることができる。本明細書で用いられる場合、”からなっている(consisting of)”は、請求項の要素に記載されていない任意の要素、ステップまたは成分を排除する。本明細書で用いられる場合、”本質的に〜からなっている(consisting essentially of)”は、請求項の基本的および新規特性に著しく影響しない材料またはステップを排除しない。本明細書における各例において、用語”含んでいる(comprising)”、”本質的に〜からなっている(consisting essentially of)”および”からなっている(consisting of)”のいずれかは、他の2つの用語に置き換えることができる。
【００２１】
本明細書において、複数の列挙された要素間の接続語”および/または(and/or)”は、個々のおよび組み合わされた選択肢の両方を含むとして理解される。例えば、2つの要素が”および/または”で結合されている場合、第1選択肢は、第2要素なしの第1要素の利用可能性を指して言う。第2選択肢は、第1要素なしの第2要素の利用可能性を指して言う。第3選択肢は、第1要素と第2要素を合わせた利用可能性を指して言う。これらの選択肢のいずれか1つが意味の範囲内に入ると理解され、従って、本明細書で使用する用語”および/または”の必要条件を満足する。選択肢の2以上の同時利用可能性もまた意味の範囲内に入ると理解され、従って、本明細書で使用する用語”および/または”の必要条件を満足する。
【００２２】
本明細書のテキストを通じていくつかの文書が引用されている。本明細書に引用された文書のそれぞれ(特許、特許出願、科学出版物、製造業者の使用説明書などを含む)は、上記下記にかかわらず、その全体が参照により本願に組み込まれる。これらのいずれも、先行発明によってこのような開示に本発明が先行しないと認めるものとして解釈してはならない。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明の目的は、患者のB細胞、好ましくは悪性B細胞の表面におけるBMCA発現に基づくMM患者の層別化方法ならびに、BCMA遺伝子の発現、すなわちBCMA mRNAと、MM患者のB細胞、好ましくは悪性B細胞の表面におけるBCMAタンパク質との相関に基づく、抗BCMA抗体、好ましくは抗CD38抗CD20および/または抗CS1抗体などの他の抗体との併用で抗BCMA抗体を用いるMM患者の新規治療を提供することである。患者が本発明に記載の方法によってBCMA陽性と診断される場合、BCMAが、その患者のありとあらゆる健常B細胞上に発現されず、あるいは本質的に発現されず、患者の悪性B細胞上には発現されることが事実であるとすれば、抗BCMA抗体治療薬は、例えば抗CD20抗体治療薬と比較して優れていることができる。なぜなら、CD20はありとあらゆるB細胞上で発現されると考えられるからである。従って、すべてのB細胞が枯渇されると考えられるが、一方で、理論にとらわれるわけではないが、抗BCMA抗体治療薬は、必ずしも患者のすべての健常B細胞を枯渇させないと考えられる。なぜなら、BCMAは、発生および/またはホメオスタシスにおいて、ありとあらゆる健常B細胞上に発現されないか、あるいは本質的に発現されないからである。
【００２４】
従って、第1の側面において、本発明は、抗BCMA抗体治療薬に順調に反応する性質を有する多発性骨髄腫(MM)患者の層別化方法であって、前記患者のB細胞、好ましくは悪性B細胞が前記B細胞の表面にBCMAタンパク質を発現するかどうかを測定することを含む前記方法において、前記B細胞がその表面にBCMAタンパク質を発現する場合に、前記患者が前記抗BCMA抗体治療薬に順調に反応する性質を有する前記方法を提供する。
上記の側面に加えて、またはこれに代えて、本発明は、BCMA陰性多発性骨髄腫(MM)患者を診断する方法であって、前記患者のB細胞、好ましくは悪性B細胞がその表面にBCMAタンパク質を発現するかどうかを測定することを含む前記方法において、前記B細胞の表面にBCMAタンパク質が何も検出されない場合に、前記患者がBCMA陰性MMを患っている前記方法を提供する。
【００２５】
本明細書において、用語”層別化”は、抗BCMA抗体を用いるMM患者の治療が有益であるかどうかを考察するための、BCMA遺伝子の転写物、すなわちmRNAの発現ばかりでなく、その翻訳遺伝子産物、すなわち細胞表面に位置するBCMAタンパク質の例えば抗BCMA抗体による検出に基づく、BCMAを有するMM患者サブ母集団へのMM患者集団の統計区分を含む。B細胞、好ましくは悪性B細胞の細胞表面におけるBCMAの検出が好ましい。しかしながら、それにもかかわらず、mRNAレベルでのBCMA発現をさらに試験/測定することができる。前記用語はまた、多発性骨髄腫の治療または改善のために、抗BCMA抗体ベースの治療薬によって利益を得ることができる患者と利益を得ることができない患者とに患者を選別することも言う。特に、患者を層別化するとは、MMを患っている患者のB細胞、好ましくは悪性B細胞の表面にBCMAが発現されるかどうかに関して測定することを含む。B細胞がB細胞の細胞表面にBCMAを発現する患者は、前記治療によって利益を得ることができ、B細胞が細胞表面にBCMAを発現しない患者は、前記抗BCMA抗体治療薬によって利益を得ることができない。しかしながら、このようなBCMA陰性患者は、次には、例えば、本明細書に記載されるように、MMの治療または改善に適用される抗CD20、抗CD38および/もしくは抗CS1抗体治療薬または任意の他の抗体治療薬によって利益を得ることができる。
【００２６】
本明細書においては、用語”B細胞”は、(T細胞によって支配される細胞性免疫応答とは対照的に)体液性免疫応答において重要な役割を果たすリンパ球を意味する。B細胞の主な機能は、抗原に対する抗体を作り、抗原提示細胞(APC)の役割を果たし、抗原相互作用による活性化後に結局メモリーB細胞へと分化することである。この段階(抗体産生)において、B細胞は”形質細胞”を含むが、本明細書においては、これを場合により”血漿B細胞”とも呼ぶ。本明細書で用いられる場合、これらの形質細胞または血漿B細胞もまた用語”B細胞”に含まれる。しかしながら、前駆B細胞ならびにその発達および/または分化系列決定のすべての段階におけるB細胞もまた用語”B細胞”に含まれる。B細胞は、適応免疫系の必須成分である。用語”B細胞”は正常(すなわち健常)B細胞も含むが、この用語は、好ましくは、悪性B細胞、特にMMと関連する悪性B細胞(すなわちMM B細胞)を含む。
【００２７】
従って、MM患者との関連で、用語”B細胞”は、正常および悪性B細胞を共に含むが、悪性B細胞(すなわちMM B細胞)が好ましい。”悪性”は、進行性疾患、特に本明細書に記載のMMに寄与するリンパ球(特にB細胞)を説明する。この用語は、癌(本明細書においてはMM)の説明で最もよく知られている。悪性BCMA陽性B細胞は、その増殖が自己限定性ではなく、隣接組織に侵入することができ、遠隔組織に広がる(転移する)ことができる。本明細書で用いられる場合、悪性は癌性と同義である。本発明との関連で、これらの悪性B細胞が主な関心事である。なぜなら、それらが抗体、特に抗BCMA抗体によって標的とされるべきであり、その目的のために、本明細書に記載されるように、これらのB細胞がその細胞表面におけるBCMAの発現に関して分析される。本発明の方法および/または抗体ベースの治療薬の対象であるMM患者は、好ましくは悪性B細胞を有し、前記悪性B細胞は、好ましくは多発性骨髄腫細胞である。もちろん前記患者はまた、正常B細胞を有する(あるいはなお有する)。悪性B細胞は、好ましくは、以下の本明細書に記載の手段および方法によって測定、検出および/または単離されることができる。簡潔に言えば、患者の悪性B細胞は、本明細書に記載の、特に請求項に記載の特異的(すなわち特徴的)B細胞表面マーカー(単数または複数)(CD38陽性、CD56陽性または陰性、CD45陽性および/またはCD19陽性)の1以上によって測定、検出および/または単離されることができる。
【００２８】
用語”多発性骨髄腫(MM)”は、形質細胞骨髄腫またはカーラー病(Otto Kahlerにちなんで)とも呼ばれ、ストローマ細胞と密接に接触する骨髄内の悪性血漿B細胞の集積を特徴とする不治のクローン性B細胞である。MMは、特に、例えば、前駆血漿B細胞への複数の遺伝的傷害、すなわち主にt(11;14)、t(4;14)、t(8;14)などの転座またはdel(13)およびdel(17)などの欠失によって引き起こされる染色体転座によって引き起こされる進行性疾患であり、その腫瘍細胞は著しく増殖し、アポトーシス抵抗性になる。
【００２９】
Bリンパ球は骨髄に由来し、リンパ節に移動する。Bリンパ球が発達するに従って、それは成熟し、それの細胞表面に種々のタンパク質を提示する。それが活性化されて抗体を分泌する場合、それは形質細胞として知られる。Bリンパ球が、胚中心として知られるリンパ節の一部を離れた後に、Bリンパ球において多発性骨髄腫が発生する。
免疫系は、B細胞の増殖および抗体の分泌を厳密な制御下に置く。染色体および遺伝子が、多くの場合再編成によって傷害を受ける場合、この制御は失われる。多くの場合、プロモーター遺伝子が染色体に移動(転座)し、そこでプロモーター遺伝子が遺伝子を刺激して過剰産生させる。
【００３０】
上記のように、免疫グロブリンH鎖遺伝子(14番染色体遺伝子座14q32)と癌遺伝子(多くの場合11q13、4p16.3、6p21、16q23および20q11[10])の間の染色体転座が、多発性骨髄腫患者においてしばしば観察される。この変異によって、骨髄腫の病因における重要な初期事象であると考えられる癌遺伝子の調節障害が生じる。その結果は、形質細胞クローンの増殖および、さらなる変異および転座をもたらすゲノム不安定性である。14番染色体異常は、全骨髄腫患者の約50%において観察される。13番染色体の(部分)欠失もまた、患者の約50%において観察される。
【００３１】
従って、本発明の方法および/または抗体ベースの治療薬の対象であるMM患者は、好ましくは、本明細書に記載の染色体転座(単数または複数)および/または欠失(単数または複数)のいずれかを有する。形質細胞によるサイトカイン(特にIL-6)の産生は、骨粗鬆症などの局部損傷の多くを引き起こし、悪性細胞が成長する微小環境を作る。血管新生(新生血管の誘引)が増加する。産生される抗体は種々の器官に蓄積し、腎不全、ポリニューロパチーおよび種々の他の骨髄腫関連症状を引き起こす。本発明との関連で、MMは、好ましくは、国際病期分類システム(International Staging System)(Greipp et al. (2005)J. Clin. Oncol. 23 (15):3412-3420 および/またはデューリー-サーモン(Durie-Salmon)病期分類システム(Durie et al. (1975)Cancer 36 (3): 842-854に従って病期分類される。
【００３２】
国際病期分類システム:
・病期I期:β2-ミクログロブリン(β2M)<3.5mg/L、アルブミン>=3.5g/dL
・病期II期:β2M<3.5mg/Lおよびアルブミン<3.5g/dL;またはβ2M 3.5mg/L〜5.5mg/L(血清アルブミンによらず)
・病期III期:β2M>=5.5mg/L
デューリー-サーモン病期分類システム:
・病期I期:以下のすべてを満たす
Hb>10g/dL
正常カルシウム
骨格検査:正常または孤立性形質細胞腫または骨粗鬆症
血清パラプロテインレベル<5g/dL(IgGの場合)、<3g/dL(IgAの場合)
尿中L鎖排泄<4g/24h
・病期II期:I期の基準もIII期の基準も満たさない
・病期III期:以下の1以上を満たす
Hb<8.5g/dL
高カルシウム>12mg/dL
骨格検査:3以上の溶解性骨病変
血清パラプロテイン>7g/dL(IgGの場合)、>5g/dL(IgAの場合)
尿中L鎖排泄>12g/24h
デューリー-サーモン病期分類システムの病期I期、II期およびIII期は、血清クレアチニンに応じてAまたはBに分けることができる:
A:血清クレアチニン<2mg/dL(<177umol/L)
B:血清クレアチニン>2mg/dL(>177umol/L)
【００３３】
従って、本発明の方法および/または抗体ベースの治療薬の対象であるMM患者は、好ましくは、国際病期分類システムおよび/またはデューリー-サーモン病期分類システムに従って病期分類される。
また、本発明の方法および/または抗体ベースの治療薬の対象であるMM患者は、国際病期分類システムおよび/またはデューリー-サーモン病期分類システムに従って、病期I期、II期およびIII期を有することができる。
【００３４】
MM罹患患者は、骨破壊、骨髄浸潤、腎不全、免疫不全および癌診断の心理社会的負担による種々の疾患関連症状を経験する可能性がある。興味をそそられる新規治療薬および治療アプローチが利用可能になりつつあるが、多くの場合、好ましくない副作用が生じる。大部分の骨髄腫患者はまた、腎障害を引き起こし、正常抗体の産生を妨げ、免疫不全を引き起こす恐れのある異常抗体であるパラプロテインの産生を特徴とする。多くの場合、高カルシウム血症(高カルシウムレベル)を伴う。骨髄腫は、血液検査(タンパク質電気泳動、末梢血スメアなど)、骨髄の顕微鏡検査(骨髄生検)および一般に病変骨のX線によって診断される。
【００３５】
多くの器官が骨髄腫に影響される場合があるので、その症状および徴候は大変多様である。多発性骨髄腫の一般の四つ組を思い出すために時々用いられるニーモニックは、CRAB(C=カルシウム(上昇)、R=腎不全、A=貧血、B=骨病変)である。骨髄腫は、多くの起こり得る症状を有するが、すべての症状は他の原因による可能性がある。それらを、罹患率の高いものから順にここで示せば、骨痛、感染、腎不全、貧血、神経系症状である。
【００３６】
本明細書で用いられる場合、用語”BCMA”は、天然配列BCMAおよびBCMAバリアントを含む(これらは本明細書でさらに定義される)。BCMAは、マウス組織型もしくはヒト組織型または他の供給源などの種々の供給源から単離されることもできるし、組換え法または合成法によって製造されることもできる。”BCMA”は、B細胞成熟抗原(B Cell maturation antigen)の略語である。BCMAは、BLyS((Bリンパ球刺激因子(B Lymphocyte stimulator);Human Genome Science社の商標、ロックヴィル、メリーランド州)の受容体として単離されたが、BAFF、THANK、TALL-1、TNFSF13、zTNF4とも呼ばれる。
【００３７】
BCMAはI型1回膜貫通型受容体であり、TNFファミリー受容体に属し、主にBリンパ球上で発現される。本明細書で用いられるBCMAはまた、天然配列BCMAおよびBCMAバリアント(これらは本明細書でさらに定義される)を含み、マウス組織型もしくはヒト組織型または他の供給源などの種々の供給源から単離されることもできるし、組換え法または合成法によって製造されることもできる。
【００３８】
”天然配列BCMAは、天然由来のBCMAと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このような天然配列BCMAは、天然から単離することもできるし、組換えまたは合成手段によって製造されることもできる。天然に存在するBCMAの短縮型または分泌型(例えば、細胞外ドメイン配列を含む可溶型)、天然に存在するバリアント型(例えば、選択的スプライシングされた型)および天然に存在するBCMAの対立遺伝子バリアント。本発明の一実施形態において、天然配列BCMAは、配列番号1のアミノ酸1〜184またはその断片を含む成熟または完全長天然配列BCMAポリペプチドである。このような断片は、好ましくは生物学的に活性である。
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser 
1               5                   10                  15      
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr 
20                  25                  30          
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser 
35                  40                  45              
Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu 
50                  55                  60                  
Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile 
65                  70                  75                  80  
Ser Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu 
85                  90                  95      
Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu 
100                 105                 110         
Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys 
115                 120                 125             
Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe 
130                 135                 140                 
Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys 
145                 150                 155                 160 
Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu 
165                 170                 175     
Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg (配列番号1)
180                 
【００３９】
本明細書において、”生物学的に活性”とは、直接または間接に行うことができるin vivoまたはin vitro活性を有することを意味する。BCMAの生物学的に活性な断片は、例えば受容体の活性部位に対して70%のアミノ酸相同性を有することができ、より好ましくは少なくとも80%の相同性を有することができ、最も好ましくは少なくとも90%の相同性を有することができる。受容体に対する同一性または相同性は、本明細書においては、配列番号1におけるBCMA残基と同一であるか、あるいは配列番号1におけるアミノ酸残基の規定部分と同一である候補配列におけるアミノ酸残基の百分率と定義される。生物活性は、APRILおよび/またはBAFFとの相互作用として試験することができる。
【００４０】
”BCMA細胞外ドメイン”または”BCMA ECD”とは、BCMAの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを本質的に含まないBCMA型のことを言う。通常は、BCMA細胞外ドメインはこのような膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの1%未満を有し、好ましくは、このようなドメインの0.5%未満を有する。場合により、BCMA ECDは配列番号1のアミノ酸残基8〜41または配列番号1のアミノ酸残基4〜51または配列番号1のアミノ酸残基1〜53を含む。本発明の好ましい実施形態において、BCMA ECDは、配列番号1のアミノ酸残基1〜51を含む。本発明のBCMAポリペプチドに関して同定された膜貫通ドメインは、そのタイプの疎水性ドメインを同定するために当該技術分野でルーチンに用いられる基準に従って同定されることは、当業者には明らかであろう。膜貫通ドメインの正確な境界は変わり得るが、本明細書に具体的に記載されているドメインのいずれかの末端において恐らくはせいぜい約5アミノ酸以下であろう。従って、BCMA ECDは、場合によりアミノ酸8〜41(配列番号1)を含むことができる。
【００４１】
”BCMAバリアント”は、下記の、完全長天然配列BCMAに対して導きだした配列番号1に示すアミノ酸配列またはBCMA配列に対して少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性を有する活性BCMAを意味する。このようなBCMAバリアントは、例えば、配列番号1の配列の末端またはC末端において1以上のアミノ酸残基が付加または欠失されたBCMAポリペプチドを含む。通常は、BCMAバリアントは、配列番号1のアミノ酸配列に対して、少なくとも約80%または85%のアミノ酸配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性を有し、よりさらに好ましくは少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性を有する。
【００４２】
本明細書に記載のBCMA配列に関する”パーセント(%)アミノ酸配列同一性”は、配列をアラインメントし、最大配列同一性パーセントを得るために必要に応じてギャップを導入した後、配列同一性の一部として保存的置換を考慮に入れない場合の、BCMA配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基の百分率と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを測定するためのアラインメントは、当該技術分野の範囲内の種々の方法で、例えばBLAST、ALIGNまたはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアなどの公表されているコンピュータソフトウェアを用いて達成することができる。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【００４３】
本発明との関連で用いられる場合、用語”順調に反応する性質を有する”は、抗体ベースの治療薬、特に抗BCMA抗体治療薬を投与される患者からのMM B細胞が、前記抗体に感受性を有する可能性が高いことを意味する。(好ましくは患者から得られた)MM B細胞が順調に反応する可能性は、本明細書に記載されるように、MM B細胞の細胞表面におけるBCMAの発現に依存する。より具体的には、本明細書に記載されるように、MM B細胞は、MM B細胞の細胞表面におけるBCMAの発現レベルが対照細胞(単数または複数)よりも高い場合に前記抗体に順調に反応することができる。MM B細胞の細胞表面におけるBCMAの発現レベルは、本明細書に記載されるように測定される。
BCMAの表面発現は、例えば、適切な抗BCMA抗体を用いて、細胞ソーティング(FACS)によって行うことができる。抗BCMA抗体は、当該技術分野で公知の手段および方法によって製造されることもできるし、商取引により入手することもできる。
【００４４】
特に、本発明はまた、BCMAに特異的に反応する抗体を含む。抗タンパク質/抗ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体は、標準プロトコルによって製造することができる(例えば、Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)を参照のこと)。マウス、ハムスターまたはウサギなどの哺乳動物は、ペプチドの免疫原性型で免疫することができる。タンパク質またはペプチドに対する免疫原性を付与する技術は、担体への結合または当該分野で公知の他の技術を含む。BCMAの免疫原性部分は、アジュバントの存在下で投与することができる。免疫の進行は、血漿または血清における抗体価の検出によってモニターすることができる。抗体レベルを評価するために、抗原として免疫原を用いる、標準ELISAまたは他のイムノアッセイを用いることができる。
【００４５】
好ましい実施形態において、抗体は、BCMAの抗原決定基もしくはそのコレセプター、例えば配列番号1のポリペプチドの抗原決定基または密接に関連したヒトまたは非ヒト哺乳動物ホモログ(例えば70、80または90パーセント相同な、より好ましくは少なくとも95パーセント相同な)に免疫特異性である。本発明のよりさらに好ましい実施形態において、抗BCMA抗体は、例えば配列番号1に80パーセント未満の相同性を示す;好ましくは配列番号1に90パーセント未満の相同性を示す;最も好ましくは配列番号1に95パーセント未満の相同性を示すタンパク質と実質的に交差反応しない(すなわち特異的に反応しない)。”実質的に交差反応しない”とは、その抗体が、非相同タンパク質に対して、配列番号1のタンパク質に対する結合親和性の10パーセント未満である、より好ましくは5パーセント未満である、よりさらに好ましくは1パーセント未満である結合親和性を有することを意味する。
【００４６】
上記のように、BCMAは細胞外ドメインを含む。前記細胞外ドメインは、好ましくは、本発明の方法および抗体ベースの治療薬に用いられる抗体の標的である。好ましい抗BCMA抗体は、ラット抗ヒトBCMA抗体、マウス抗ヒトBCMA抗体、ラクダ科動物抗ヒトBCMA抗体、ヒツジ抗ヒトBCMA抗体などの抗ヒトBCMA抗体である。もちろん、患者の表面においてヒト以外の哺乳動物、例えばネコまたはイヌからのBCMAを検出しようとする場合、診断される種以外の種からの抗体が用いられる。例えば、患者がイヌまたはネコの場合、マウス、ラット、ヒツジ、ラクダ科動物の抗イヌまたは抗ネコBCMA抗体が用いられる。
抗BCMA抗体に変えて、BCMA、好ましくはヒトBCMAに指向性を有するアンチカリン、すなわちリポカリン突然変異タンパク質、例えば涙液リポカリン突然変異タンパク質、細菌リポカリン突然変異タンパク質またはhNGALリポカリン突然変異タンパク質を用いることもできる。
【００４７】
本発明に記載の方法に用いられる特に好ましい抗体は、抗ヒト抗体Vicky-1および/またはMAB 193(クローン335004)である。Vicky-1は、ラットIgG1アイソタイプであり、GeneTexカタログ番号#GTX17323から入手できる。MAB193はラットIgG2aアイソタイプであり、R&D Systems社カタログ番号#MAB193から入手できる。従って、本発明に記載の方法において、BCMA、好ましくはMM B細胞の表面に発現されるBCMAがVicky-1またはMAB 193によって検出できることが好ましい。同様に、本明細書に記載されるように、MMを患う可能性のある患者またはそれを患っていることが疑われる患者が、Vicky-1またはMAB 193で検出可能なMM B細胞を有することが好ましい。言い換えれば、前記患者(より具体的には、前記患者のB細胞、特にMM B細胞)が、いわばVicky-1および/またはMAB193陽性であることが好ましい。
BCMAの表面発現は、Biacoreなどの表面プラズモン共鳴(SPR)技術によって試験することができる。
【００４８】
本発明に記載の方法との関連で、対照細胞、好ましくはBCMA陰性細胞、より好ましくはBCMA陰性B細胞、よりさらに好ましくはBCMA陰性MM B細胞より高い(すなわちそれを超える)検出可能シグナルを示す場合、MM B細胞はその表面にBCMAを発現すると考えられる(すなわち、それはBCMA陽性である、あるいは特定のBCMA発現レベルを有する)。好ましいBCMA陰性MM B細胞は、U266B1、JJN-3またはLP-1であり、U266B1およびJJN-3が好ましい。特に、このようなBCMA陰性細胞株は、それにもかかわらず検出可能なBCMA mRNAを有することができる。当業者は、対象とするB細胞上のBCMAの発現による検出可能シグナルが対照細胞の検出可能シグナルよりも高いかどうかを容易に測定することができる。検出可能シグナルとの関連で”高い”とは、対象とするB細胞、例えば患者からの1以上のB細胞の表面におけるBCMAの発現による検出可能シグナルが、BCMA陰性対照細胞からのシグナルよりも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100%以上高いことを意味する。上記のように、MAB193またはVicky-1抗体は、好ましくは、患者、好ましくはMM患者のB細胞、好ましくは悪性B細胞の表面におけるBCMAの発現を検出/単離/測定するために用いられる。
【００４９】
”シグナル”または”検出可能シグナル”は、抗体-抗原反応の結果を反映する。本発明との関連で、抗体-抗原反応は、好ましくは抗BCMA抗体とBCMAとの反応である。
シグナルは、抗体、特に本明細書に記載のBCMAに対する抗体のシグナル生成基によって提供されるシグナルとして測定されることができる。シグナルは、以下に記載されるように、例えば分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段によって検出可能な任意のシグナルであることができる。シグナルはまた、以下に記載の抗原の特異的受容体シグナル生成基によって提供されるシグナルとして測定されることもできる。
【００５０】
シグナル生成基とは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段によって検出可能な成分のことを言う。例えば有用な標識は、32P、35Sまたは125Iなどの放射性標識;蛍光色素(例えばCy-3Cy-5);発色団、高電子密度試薬;検出可能シグナルを生成する酵素(例えばELISAで一般的に用いられる酵素);またはスピンラベルを含む。標識または検出可能部分は、試料中での結合した検出可能部分の量を定量するために用いることができる放射性、発色または蛍光シグナルなどの測定可能な信号を示すかまたは生成する。
【００５１】
検出可能部分は、共有結合またはイオン、ファンデルワールスもしくは水素結合のいずれかによって、例えば放射性ヌクレオチドまたは、ストレプトアビジンによって認識されるビオチン化ヌクレオチドの組み込みによって、シグナル生成基に組み込まれるかまたは結合されることができる。標識または検出可能部分は直接または間接に検出可能であることができる。間接検出は、検出可能部分への第2の直接または間接検出可能部分の結合を含む。例えば、検出可能部分は、ストレプトアビジンの結合パートナーであるビオチンまたは、相補配列の結合パートナーであって、それに特異的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列などの結合パートナーのリガンドであることができる。結合パートナーは、それ自身が直接に検出可能であることができる。例えば、抗体は、それ自身が蛍光分子で標識されたものであることができる。結合パートナーは、間接的に検出可能であることもできる。
【００５２】
抗体特異的受容体が”シグナル生成基に結合することができる”場合、このことは、それがシグナル生成基に結合することができることを意味する。例えば、抗体特異的受容体は、シグナル生成基に結合することができる官能基を有することができる。官能基は、ビオチンに結合するストレプトアビジン/アビジン、タグ例えばGSTなどの抗原、抗体に結合するヒスチジン残基、レクチンに結合する糖または既知のDig/抗Dig抗体系であることができる。官能基に結合する部分はシグナル生成基を有する。
【００５３】
抗原に対する抗体の結合または抗体に対する抗原の結合を免疫学的に検出するために、当該技術分野で公知の任意のイムノアッセイを用いることができる。イムノアッセイは当業者に公知である。このようなアッセイを実施する方法ならびに実際的適用および手順は、関連している教科書に要約されている。関連している教科書の例は、Tijssen, P., In: Practice and theory of enzyme immunoassays, Burdon, R.H. and v. Knippenberg, P. H. (eds.), Elsevier, Amsterdam (1990), pp. 221-278 および免疫学的検出法を扱ったColowick, S. P. and Caplan, N.O. (eds.), Methods in Enzymology, Academic Press の種々の巻、特に第70、73、74、84、92および121巻である。
イムノアッセイは、例えば、沈降(特に免疫沈降)、電気化学ルミネッセンス(電気化学発光)、RIA(ラジオイムノアッセイ)、ELISA(酵素免疫測定法)、サンドイッチ式免疫測定法、電気化学ルミネッセンスサンドイッチイムノアッセイ(ECLIA)、解離促進ランタニド蛍光イムノアッセイ(DELFIA)、シンチレーション近接アッセイ(SPA)、比濁法、比濁測定法、ラテックス免疫比濁法もしくは比濁測定法、固相免疫検査ならびにSELDI-TOF、MALDI-TOFもしくはキャピラリー電気泳動-質量分析法(CE-MS)などの質量分析法を含む。さらにまた、適切なイムノアッセイは、マイクロプレートELISAベース法、完全自動化されたもしくはロボット化免疫アッセイおよびラテックス凝集反応を含む。
【００５４】
典型的には、本発明において、イムノアッセイは、抗体が抗原に特異的に結合して抗体の検出および/または定量を提供するアッセイまたは抗原が抗体に結合して前記抗原の検出および/または定量を提供するアッセイである。本発明との関連で、抗原は、好ましくはBCMAまたはその断片であり、前記断片は、好ましくは免疫学的に検出可能であり、抗体は好ましくは抗BCMA抗体である。本明細書で用いられる場合、”免疫学的に検出可能な”とは、好ましくは、本明細書に記載されるように、抗原に対する抗体の結合または抗体に対する抗原の結合によって生成されるシグナルが、公知であり、当該技術分野で用いられている手段および方法によって検出可能であることを含む。本発明との関連で、”免疫学的に検出可能な”とは、好ましくは、抗BCMA抗体とBCMAまたはその断片との反応によって生成されるシグナルが、本明細書に記載の対照細胞よりも高い(またはそれを超える)こと、すなわち対象とするMM B細胞がBCMA陽性であることを意味する。
【００５５】
本明細書で用いられる場合、”免疫学的に検出可能ではない”とは、好ましくは、本明細書に記載されるように、抗原に対する抗体の結合または抗体に対する抗原の結合によって生成されるシグナルが、当該技術分野で用いられている公知の手段および方法によって検出可能ではないことを含む。本発明との関連で、”免疫学的に検出可能ではない”とは、好ましくは、抗BCMA抗体とBCMAまたはその断片との反応によって生成されるシグナルが、本明細書に記載されるように、対照細胞のそれと等しいかまたはそれより低いこと、すなわち対象とするMM B細胞がBCMA陰性であることを意味する。
【００５６】
”対象とするMM B細胞”とは、MMを患っている患者またはMMを患っていることが疑われる患者から得られたB細胞、好ましくは悪性B細胞を意味する。本発明に記載の方法に従って前記対象とするMM B細胞を分析する前に、前記B細胞が、それぞれBCMA陽性であるかまたは陰性であるかに関して言うことはできない。
MM B細胞とBCMA陰性細胞の細胞表面におけるBCMAの発現レベルの比較に加えて、あるいはこれに変えて、BCMA陽性細胞株もまた対照細胞として役立つことができる。本発明の意味における(すなわち本明細書に記載の)
適切なBCMA陽性細胞株は、NCI-H929、MOLP-2、OPM-2、MOLP-8、RPMI8226、KMS-12-BMまたはL-363である。特に、対象とするMM B細胞は、それが対照細胞株と少なくとも同等なBCMA発現レベルを有する場合にBCMA陽性であると考えられる。その発現は、好ましくは本明細書に記載されるようにして(すなわち細胞によって生成されるシグナルとして)測定される。
【００５７】
同様に、本発明に記載の方法との関連で、MM B細胞は、それが、本質的に、対照細胞、好ましくはBCMA陰性細胞、より好ましくはBCMA陰性B細胞、よりさらに好ましくはBCMA陰性MM B細胞より高い検出可能シグナルを示さない場合に、その表面にBCMAを発現しない(すなわち、それがBCMA陰性である)と考えられる。好ましいBCMA陰性MM B細胞はU266B1、JJN-3またはLP-1であり、U266B1およびJJN-3が好ましい。特に、このようなBCMA陰性細胞株は、それにもかかわらず検出可能なBCMA mRNAを有することができる。当業者は、対象とするB細胞上のBCMAの発現による検出可能シグナルが対照細胞の検出可能シグナルよりも高くない(すなわちそれ以下である)かどうかを容易に測定することができる。検出可能シグナルとの関連で”等しい”とは、対象とするB細胞、例えば患者からの1以上のB細胞の表面におけるBCMAの発現による検出可能シグナルがBCMA陰性対照細胞のシグナルと同じであることを意味する。検出可能シグナルとの関連で”低い”とは、対象とするB細胞、例えば患者からの1以上のB細胞が、BCMA陰性対照細胞からのシグナルよりも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95またはさらには100%低いシグナルを示すことを意味する。
【００５８】
本発明者らの発見はまた、抗体ベースの多発性骨髄腫(MM)治療薬を選択する方法であって、患者のB細胞が前記血漿B細胞の表面にBCMAタンパク質を発現するかどうかを測定することを含む前記方法において、前記血漿B細胞がBCMA陽性の場合には、その患者は抗CD20抗体治療薬および/または抗CD38抗体治療薬および/または抗BCMA抗体治療薬の対象であることができ、前記B細胞がBCMA陰性の場合には、その患者は抗CD20抗体治療薬および/または抗CD38抗体治療薬の対象である前記方法を当業者に提供する。
実際、本明細書に記載されるように、患者のB細胞がBCMAタンパク質を発現する場合に、前記患者は、潜在的に抗BCMA抗体治療薬に順調に反応する。しかしながら、たとえ患者のB細胞がBCMAに対して陰性(BCMA陰性)だとしても、前記患者は、抗体ベースの治療薬、例えば抗CD20抗体ベースの治療薬および/または抗CD38抗体ベースの治療薬の対象であることができる。従って、本発明は、MMの治療または予防のための1以上の適切な抗体ベースの治療薬を選択する方法および手段を提供する。
【００５９】
治療効果との関連で用いられる場合、用語”潜在的に”とは、抗BCMA抗体が、本発明に記載の方法のアウトカムに基づく治療効果を有すると考えられるにもかかわらず、このような抗体が必ずしも治療上有効であるとは限らないことを意味する。なぜなら、自明ではあるが、MM B細胞の表面におけるBCMAの発現は別として、体重、一般健康状態、性別、食事、薬剤相互作用の個々の要因が、患者がこのような抗体に感受性を有するかどうかに関して影響を有しうるため、本発明に記載の方法は、患者がこのような抗体に感受性を有するかどうかに関して100%安全な予測を提供することはできないからである。しかしながら、本明細書に記載されるように、患者からのMM B細胞がBCMA陽性である場合、抗BCMA抗体が治療効果を有する可能性は、MM B細胞がBCMAの細胞表面発現を示さない患者と比較して50%を超える。好ましくは、可能性は60%、70%、80%または90%を超え、より好ましくは95%を超える。
【００６０】
もちろん、男性/女性を抗CD20および/または抗CD38および/またはCS1抗体ベースの治療薬の対象とする前に、BCMA陰性MM患者がCD20および/またはCD38陽性および/またはCS1陽性であるかどうかに関して測定することが推奨される。抗BCMA抗体ベースの治療薬に加えての(すなわち併用での)さらなる抗体ベースの治療薬(すなわち1以上の抗体ベースの治療薬)(患者がBCMA陽性の場合)は、あるいは本発明に含まれる抗BCMA抗体ベースの治療薬の代わり(患者がBCMA陰性の場合)は、以下の表の最左段に示された標的に基づくことができる。最左段に示された標的に対する抗体が毒素に結合されている場合、このようなコンジュゲートもまた、前記のさらなる抗体ベースの治療薬に含まれる。
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【００６１】
B細胞は、B細胞表面マーカーによって選択および/または同定されることができる。本明細書においては、”B細胞表面マーカー”または”B細胞表面抗原”は、それに結合するアンタゴニストによって標的にされることができる、B細胞の表面に発現される抗原である。例示的なB細胞表面マーカーは、限定するものではないが、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD40、CD52、D53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86、CDl80(RP105)、FcRH2(IRTA4)、CD79A、C79B、CR2、CCR6、CD72、P2X5、HLA-DOB、CXCR5(BLRl)、FCER2、BR3(aka BAFF-R)、TACI、BTLA、NAG14(aka LRRC4)、SLGC16270(aka LOC283663)、FcRHl(IRTA5)、FcRH5(IRTA2)、ATWD578(aka MGC15619)、FcRH3(IRTA3)、FcRH4(IRTAl)、FcRH6(aka LOC343413)を含み、特にBCMAを含む。
【００６２】
MM B細胞は、前述のように、B細胞表面マーカーによって検出、選択および/または同定されることができる。しかしながら、好ましくはMM B細胞は、以下のマーカー:CD19、CD56、CD117、CD20、CD28、CD27、CD81および/またはCD200(Rawston et al. (2008)Haematologica 93(3):431-438 の表2もまた参照のこと)によって選択および/または同定される。本発明のMM B細胞は、好ましくは、少なくともCD38陽性、CD56陽性または陰性、CD45陽性およびCD19陽性であると特徴付けられる。
【００６３】
本発明に記載の方法の対象であるB細胞、好ましくは悪性B細胞は、好ましくは患者から得られる。本発明に記載の患者は哺乳動物であり、好ましくは前記患者または哺乳動物はMMを患っているか、あるいはMMを患っていることが疑われる。治療の目的上、”哺乳動物”とは、ヒト、家畜、農園動物、非ヒト霊長類動物および乳房組織を有する任意の他の動物を含む、哺乳動物として分類される任意の動物のことを言う。哺乳動物は、ヒト、マウス、ラットなどのげっ歯動物、ウサギ、イヌ、ネコ、チンパンジー、ウマ、ブタなどを含むが、ヒトが好ましい。患者はまた、ヒト患者および獣医患者を含むが、ヒト患者が好ましい。上記方法のそれぞれにおいて、哺乳動物は多発性骨髄腫を患っている哺乳動物であることができる。治療を”必要とする”哺乳動物は、限定するものではないが、多発性骨髄腫を有する哺乳動物、または多発性骨髄腫を有することが疑われる哺乳動物を含むことができる。
【００６４】
本明細書で用いられる場合、”被験者”は、哺乳動物および非哺乳動物被験者を含む。
患者から得られるB細胞は、好ましくは、試料に含まれる。本発明によれば、用語”試料”とは、被験者、細胞株、組織培養物または少なくともB細胞を含む他の供給源から得られる任意の生体試料を意味する。生体試料は、体液(血液、血清、血漿、尿、唾液、滑液および髄液など)ならびにB細胞を含むことが認められる組織源を含む。被験者から組織生検物および体液を得る方法は当該分野で公知である。一般に、末梢血単核細胞(PBMC)、特にB細胞およびT細胞を含む生体試料が供給源として好ましい。末梢血単核細胞(PBMC)、特にB細胞およびT細胞を含む試料は、好ましくは、ヒト患者の末梢血から採取される。他の好ましい試料は全血、血清、血漿または滑液であるが、血漿または血清が最も好ましい。しかしながら、ヒト患者の末梢血からの試料が特に好ましい。
患者が抗BCMA抗体で治療されることが、本発明に記載の方法の好ましい実施形態である。患者の治療に用いられる抗体ならびに、層別化方法、診断または抗体ベースのMM治療薬の選択に用いられる抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、ドメイン抗体(dAb)またはナノボディである。
【００６５】
用語”抗体”はまた、限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異性、多特異性(例えば二重特異性)、非特異的、ヒト化、ヒト、一本鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、変異、移植、ドメイン(VHH)およびin vitro生成抗体ならびに、ラクダ抗体およびヒト化ラクダ抗体を含む。従って、用語”抗体”はまた、精製血清、すなわち精製ポリクローナル血清にも関する。従って、前記用語は、好ましくは、血清、より好ましくはポリクローナル血清、最も好ましくは精製(ポリクローナル)血清に関する。さらに、本発明に用いられる用語”抗体”はまた、記載された抗体と同じ特異性を示す本明細書に記載の抗体の誘導体またはバリアントにも関する。”抗体バリアント”の例は、非ヒト抗体のヒト化バリアント、”親和性成熟”抗体(例えば Hawkins et al. J. Mol. Biol. 254889-896 (1992)およびLowman et al., Biochemistry 3010832- 10837 (1991)を参照のこと)ならびに改変されたエフェクター機能(単数または複数)を有する抗体変異体(例えば米国特許第5648260号参照)を含む。本明細書で用いられる場合、用語”抗原結合性ドメイン”、”抗原結合断片”および”抗体結合領域”は、抗体と抗原との間の特異的結合に関与するアミノ酸を含む抗体分子の一部を指す。抗体によって特異的に認識され結合される抗原の一部は、上記のように”エピトープ”と呼ばれる。上記のように、抗原結合性ドメインは、一般的には、抗体L鎖可変領域(VL)および抗体H鎖可変領域(VH)を含むことができる。しかしながら、それは両方を含まなければならないわけではない。例えば、Fd断片は2つのVH領域を有し、多くの場合、無傷の抗原結合性ドメインの抗原結合機能の一部を保持する。抗体の抗原結合断片の例は、(1)VL、VH、CLおよびCH1ドメインを有する一価断片であるFab断片;(2)ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合される2つのFab断片を有する二価の断片であるF(ab')2断片;(3)2つのVHおよびCH1ドメインを有するFd断片;(4)抗体の1つのアームのVLおよびVHドメインを有するFv断片;(5)VHまたはVLドメインを有するdAb断片(Ward et al.(1989) Nature 341 :544-546); (6)単離された相補性決定領域(CDR)ならびに(7)一本鎖Fv(scFv)を含む。Fv断片の2つのドメインであるVLおよびVH>は、異なる遺伝子によってコードされるが、VLおよびVH領域対で一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖として製造されることを可能にする合成リンカーによって、組換え法を用いて結合させることができる(一本鎖Fv(scFv)として知られる;例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883 を参照のこと)。これらの抗体断片は当業者に公知の慣用法を用いて得られ、それらの断片は、無傷の抗体と同様に機能に関して評価される。本明細書においては、用語”免疫グロブリン”(Ig)は”抗体”と同義で使用される。
【００６６】
本発明のさらなる側面は、血漿B細胞がBCMA陽性である性質を有する多発性骨髄腫(MM)患者の治療に使用するための抗BCMA抗体治療薬である。
本発明のよりさらなる側面は、本発明に記載の方法によって診断される多発性骨髄腫(MM)患者の治療に使用するための抗BCMA抗体である。
本発明の他の側面はまた、B細胞がBCMA陰性である多発性骨髄腫(MM)患者の治療に使用するための抗CD20抗体および/または抗CD38抗体である。
本発明の一実施形態において、抗BCMA抗体は、MM患者における悪性血漿B細胞に対して毒性を示す化学療法剤を含む毒素に結合される。適切な化学療法剤はWO2010/121093に開示されており、例えばボルテゾミブ(ベルケイド)、サリドマイド(タロミド)、レナリドミド(レブラミド)である。
【００６７】
用語”治療する”または”治療”は、治療処置および防止もしくは予防処置の両方を指し、ここで、目的は、癌、特にMMの発達または広がりなどの望ましくない生理学的変化または障害を予防または遅らせる(減らす)ことである。本発明の目的上、有益なまたは所望の臨床結果は、限定するものではないが、検出可能であるか検出不能であるかにかかわらず、症状の軽減、疾患の範囲の縮小、疾患の安定化状態(すなわち悪化しない)、疾患進行の遅延もしくは減速、疾病状態の改善もしくは一時的緩和および寛解(部分的または全体的にかかわらず)を含む。”治療”はまた、治療を受けない場合に予想される生存と比較して生存を長くすることを意味することができる。治療を必要とする人々は、すでに状態または障害を有する人々ばかりでなく、状態または障害を有する傾向のある人々または状態または障害を予防すべき人々もまた含む。
【００６８】
抗BCMA抗体、抗CD20抗体、抗CD38抗体および/または抗CS1抗体は、好ましくは”有効量”で投与される。”有効量”は、具体的に述べられた目的を実施するのに十分な量である。”有効量”は、経験的に決定することもできるし、述べられた目的に関連する公知の方法で決定することもできる。用語”治療的有効量”とは、哺乳動物(aka患者)におけるMMを”治療”または”改善”するのに有効な本発明の治療剤の量のことを言う。1例において、治療的有効量は、増殖阻害量または細胞傷害性量であることができる。MMの場合は、以下のいずれか1つに活性な薬物の治療的有効量である:癌細胞数の減少;悪性MM B細胞数、腫瘍サイズの減少;末梢器官への癌細胞浸潤の抑制(すなわちある程度の遅延および好ましくは停止);腫瘍転移の抑制(すなわちある程度の遅延および好ましくは停止);腫瘍増殖のある程度の抑制;および/または癌と関連する症状の1以上のある程度の抑制。薬物が既存の癌細胞の増殖を抑制し、かつ/または殺すことができる範囲に限り、薬物は細胞増殖抑制性および/または細胞傷害性であることができる。”治療”または”治療的有効量”とは、治療剤の投与コースであって、所望の効果を得るためのある期間にわたるいくつかの投与間隔を含むことができるコースのことを言う。
【００６９】
B細胞枯渇剤(すなわち、抗BCMA抗体、抗CD20抗体、抗CD38抗体または、B細胞の表面に発現されるCS1などの標的に対する任意の他の抗体)は、種々の方法、例えばボーラスなどでの静注または皮下、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、関節内、滑膜内、鞘内もしくは吸入経路による一定時間の持続注入によって患者に投与することができる。
これらの抗体は、好ましくは、医薬組成物の形態で投与される。用法・用量は、担当医および臨床的因子によって決定されるであろう。医療分野で公知のように、任意の患者の用量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与期間、投与経路、一般健康状態および、同時に投与される他の薬物を含む多くの因子によって決まる。非経口投与用製剤は、滅菌水性または非水性懸濁液およびエマルションを含む。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油および注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は、生理食塩水および緩衝媒体を含む水、アルコール溶液、水溶液、エマルションまたは懸濁液を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、デキストロースリンゲル、デキストロース、塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液または固定油を含む。静脈内ビヒクルは、流体および栄養素補充液、電解質補充液(デキストロースリンゲルに基づくものなど)を含む。防腐薬および他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなどもまた存在することができる。さらにまた、本発明の医薬組成物は、本明細書の他の部分で例示されるように、追加の抗腫瘍剤などのさらなる薬剤を含むことができる。
【００７０】
本発明の他の実施形態は、抗BCMA抗体および使用説明書、特に本発明に記載の方法の実施方法に関する使用説明書を含むキットである。該キットは、少なくとも1つの容器と、その容器に添付してまたはその容器に付随してラベルまたは添付文書とを含む。適切な容器は、例えばボトル、バイアル、シリンジなどを含む。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から製造することができる。該容器は、治療剤を取り出すための滅菌アクセスポートを有することができる(例えば、該容器は、皮下注射針によって穿孔可能な栓を有する静注液バッグまたはバイアルであることができる)。該ラベルまたは添付文書は、その組成物がMMを治療するために用いられることを示すことができる。
加えて、該キットは、さらに、静菌性注射用水(BWFI)、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第2容器を含むことができる。該キットはさらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針およびシリンジを含む、商業上および利用者の観点から望ましい他の材料を含むことができる。
【実施例】
【００７１】
抗体のALEXA Fluor(登録商標)488による標識化
ALEXA Fluor(登録商標)モノクローナル抗体標識化キット(Invitrogen社#A20181)を用いて抗BCMA IgGおよび適切なアイソタイプ対照IgGをALEXA Fluor(登録商標)488で標識した。標識化および標識度の計算は、製造業者の使用説明書に従って行った。
【００７２】
表1:ALEXA Fluor(登録商標)488による標識化に用いる抗BCMAモノクローナル抗体
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【００７３】
骨髄吸引物からの原発性悪性血漿B細胞の染色
70μmセルストレーナー(BD社、352350)を介してMM患者からの骨髄吸引物を濾過した。血漿細胞数を前もって測定しておき、それに基づいて、染色のための吸引物容量を算出した:
CD45陰性集団中1〜10%の形質細胞180μl;
CD45陰性集団中11〜20%の形質細胞120μl;
CD45陰性集団60μl中21〜31%の形質細胞;
適切な吸引物の容量を、以下の抗体のそれぞれの1.5μlと共にインキュベートした:CD38-APC(BD社、クローン:HIT2、#555462)、CD56-PE-Cy-7(BD社、クローン:NCAM16.2、#335791)、CD45-APC-Cy7(BD社、クローン:2D1;#557833)および6μlのCD19-PerCP-Cy5.5(BD社、クローン:HIB19、#561295)。診断用染色のために、固定および透過処理キット(Invitrogen社、#GAS-003)を用いて細胞を固定および透過処理し、次いで抗Igκ-FITC(BD社、クローン:G20-193、#555791)および抗Igλ-PE(BD社、クローン:JDC-12、#555797)のそれぞれ6μlで処理した。BCMAの検出のために、Vicky-1-Alexa488またはMAB193-Alexa48810μg/mlならびにアイソタイプ対照ラットIgG1-Alexa488およびラットIgG2a-Alexa48810μg/mlを用い、試料を4℃で15分間インキュベートした。細胞を洗浄し、FACS Lyse/Wash Assistant、LWA(BD社)を用いて赤血球を溶解した。FACSCantoフローサイトメーター(BD社)を用いてシグナルを分析した。CD45低、CD38高、CD19低集団でゲーティングすることによって形質細胞を同定し、患者がその形質細胞上にCD56を発現する場合は、CD56高でゲーティングした。対照として、非形質細胞をCD45高、CD38低、CD56低でゲーティングした。両方の集団、例えばVicky-1およびラットIgG1に対してAlexa488の蛍光強度を測定した。特異的抗体およびアイソタイプ対照蛍光シグナル由来のヒストグラムをオーバーレイさせ、差に注目した。非形質細胞がVicky-1およびMab193およびアイソタイプ対照に対して蛍光強度における差を示さず、ラットIgG1またはIgG2aに対してそれぞれ測定した蛍光と比較して、Vicky-1およびMAB193に対して形質細胞上の蛍光が明確に増加する場合、患者をBCMA陽性とみなす。Flow Joを用いて生のデータを解析した。データ収集日に割り当てた患者の試料番号に加えて、識別のために患者に連続番号をつけた。
【００７４】
種々の抗BCMA抗体を用いるOPM-2細胞のFACS染色
ヒト末梢血であり、多発性骨髄腫細胞由来のOPM-2細胞株の細胞表面にBCMAタンパク質が発現されるかどうかを試験するために、Vicky-1およびMAB193をFACS分析に用いた(図1)。その結果、OPM-2細胞の表面に発現しているBCMAタンパク質に対して十分な染色効果を示した。しかしながら、Vicky-1はMAB193と比較してより強いFACSシフトを示すことが見出された(図1)。Vicky-1およびMAB193の平均蛍光シグナルもまた判明した(表2)。従って、ここで行ったさらなる実験には、抗BCMA抗体としてVicky-1を用いた。
【００７５】
表2．平均蛍光シグナル
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【００７６】
MM細胞株におけるタンパク質発現レベルとmRNA発現レベルの相関
次のステップとして、本発明者らは、異なる10のMM細胞株において、FACSおよびヒトエクソン遺伝子チップ(Affymetrix社)をそれぞれ用いてBCMAタンパク質レベルとBCMA mRNAレベルを試験した(図2)。
Liら(Med Oncol (2010) 27:439-445)によって記載されたプライマーを用いて、RT-PCRでmRNA発現レベルを解析した。詳しくは、当該技術分野で一般に行われているのと同様にしてMM細胞から全細胞RNAを単離した。単離されたRNAを逆転写(RT)による第一鎖cDNA合成の鋳型として用い、cDNAをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の鋳型として用いた。以下のプライマーを用いた:BCMA5´-TTACTTGTCCTTCCAGGCTGTTCT-3´(センス)(配列番号2)および5´-CATAGAAACCAAGGAAGTTTCTACC-3´(アンチセンス)(配列番号3)。
【００７７】
図2(A)は、10のMM細胞株における、Vicky-1を用いたFACSによるBCMAタンパク質レベルの結果を示す。興味深いことに、細胞表面のBCMAタンパク質レベルは、各細胞株において異なっていた。特に、NCI-H929(大変強い、表3において+++で示されている)、MOLP-2、OPM-2およびKMS-12-BM(強い、表3において++で示されている)は、前記細胞株の細胞表面において大変強いかまたは強い発現を示した。他方では、U226B1、JJN-3およびLP-1は、前記細胞株の細胞表面においてBCMAタンパク質の発現を示さなかった。
【００７８】
図2(B)は、異なる10のMM細胞株のBCMA mRNAレベルを示す。GAPDH mRNAレベルでの正規化によって相対的発現レベルを得た。例えばNCI-H929細胞株においては、BCMA mRNAレベルは大変高かったが、それは同様に高いタンパク質レベルを示した。U266B1、JJN-3およびLP-1の細胞表面においてBCMAタンパク質の発現は検出されなかったが、前記細胞株においてBCMA mRNAは検出された。JJN-3およびLP-1細胞株のBCMA mRNAレベルはむしろ高かったことに注意されたい。従って、本発明者らは、細胞表面におけるBCMAタンパク質とMM細胞株におけるBCMA mRNAとの間に強い相関はないと結論した。
【００７９】
表3:異なる10のMM細胞株におけるタンパク質発現レベルとmRNA発現レベルの概要
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【００８０】
MM患者の骨髄形質細胞におけるBCMAタンパク質の発現
さらにまた、本発明者らは、23名のMM患者からのMM細胞(悪性血漿B細胞)の細胞表面においてBCMAタンパク質が発現されるかどうか、Vicky−1またはMAB193によって検出されるかどうかに関して試験した。23名の患者の骨髄吸引物を、FACSでBCMA発現に関して解析した。その結果、MM患者の52%(12/23)がMM細胞の細胞表面においてBCMA陽性を示したが、MM患者の48%(11/23)がBCMA陰性を示したことが認められた(表4)。図3では、原発性形質細胞において、FACSシグナルシフトが検出された。他方では、非形質細胞において、シグナルシフトは認められなかった(図3)。
【００８１】
表4
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n.a.該当なし
+陽性染色
-陰性染色
【図１】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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