(57)【要約】【課題】  本発明は、イヌインフルエンザ組み換えウイルスに関する。当該組み換えウイルスは、ＺＪＣＩＶイヌインフルエンザウイルスのＨＡ及びＮＡ遺伝子並びにＰＲ８ウイルスのＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、Ｍ、ＮＰ及びＮＳからなる六つの内部遺伝子を含む。本発明は、またイヌインフルエンザ組み換えウイルスの製造方法と応用に関する。本発明のイヌインフルエンザ組み換えウイルスは、ニワトリ胚とＭＤＣＫ細胞において高いウイルス力価と赤血球凝集価を示し、イヌインフルエンザワクチンを開発する為に優れた接種ウイルスとして使用することができる。【選択図】図２
2014516530.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＺＪＣＩＶイヌインフルエンザウイルスのＨＡ及びＮＡ遺伝子並びにＰＲ８ウイルスのＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、Ｍ、ＮＰ及びＮＳ遺伝子からなる六つの内部遺伝子を含むイヌインフルエンザ組み換えウイルスであって、
前記イヌインフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子のヌクレオチド配列が、
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列と９８％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択され；
前記イヌインフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列が、
（１）配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（２）配列番号２に示すアミノ酸配列と９８％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択されるイヌインフルエンザ組み換えウイルス。
【請求項２】
前記イヌインフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子が、配列番号３に示すヌクレオチド配列を有し、または、前記イヌインフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子が、配列番号３に示すヌクレオチド配列と９８％以上のホモロジーを有する配列を有する、請求項１に記載のイヌインフルエンザ組み換えウイルス。
【請求項３】
前記イヌインフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子が、配列番号４に示すヌクレオチド配列を有し、または、前記イヌインフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子が、配列番号４に示すヌクレオチド配列と９８％以上のホモロジーを有する配列を有する、請求項１に記載のイヌインフルエンザ組み換えウイルス。
【請求項４】
ＺＪＣＩＶイヌインフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子及びＮＡ遺伝子をそれぞれ別々に含む組み換えプラスミドを構築すること；
前記ＨＡ遺伝子の組み換えプラスミド及びＮＡ遺伝子の組み換えプラスミドと、ＰＲ８ウイルスのＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、Ｍ、ＮＰ、及びＮＳ内部遺伝子をそれぞれ別々に含む６つのプラスミドとを、２９３Ｔ細胞にトランスフェクションさせて、トランスフェクション後の細胞を培養すること；
培養細胞上清をニワトリ胚に接踵し、ニワトリ胚尿膜腔液を得るために該ニワトリ胚をインキュベーター内で適切な時間培養すること、当該尿膜腔液の赤血球凝集性を測定すること、赤血球凝集活性がある場合、配列解析により意図しない変異が含まれないことを確認して、イヌインフルエンザ組み換えウイルスを得ることを含む、請求項１に記載のイヌインフルエンザ組み換えウイルスの製造方法。
【請求項５】
前記組み換えプラスミドが、空ベクターとして使用したＰＢＤベクターを含有する、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
培養細胞上清が、９〜１１日齢のニワトリ胚に接踵され、ニワトリ胚尿膜腔液を得るために該ニワトリ胚が３７℃のインキュベーターで４８〜７２時間培養される、請求項４に記載の製造方法。
【請求項７】
イヌインフルエンザを予防又は治療するための、請求項１に記載のイヌインフルエンザ組み換えウイルスの使用。
【請求項８】
請求項１に記載のイヌインフルエンザ組み換えウイルスを含有するインフルエンザワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物工学技術分野に関するものであり、特に、イヌインフルエンザ組み換えウイルス並びにその製造方法及び応用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ａ型インフルエンザウイルスは人間の健康を脅威する重要な感染症の一種である。インフルエンザウイルスは厳格な宿主特異性を持っており、同類のウイルスが異なる宿主に感染した場合であっても、やはり宿主によって制限を受ける。２００４年に、米国で初めてＨ３Ｎ８サブタイプイヌインフルエンザウイルスによるイヌインフルエンザのパンデミックが引き起こされたことが報告され、配列分析の結果、ウマインフルエンザウイルスが進化してこのサブタイプのインフルエンザウイルスがもたらされたことが発見された。その後、オーストラリアにおいてもウマインフルエンザの発生後にイヌインフルエンザウイルスが発生した。２００８年韓国において、Ｈ３Ｎ２サブタイプイヌインフルエンザウイルスによってイヌインフルエンが発生したが、配列分析の結果、Ｈ３Ｎ２サブタイプのイヌインフルエンザウイルスは家禽によって引き起こされたものであり、欧州及び米国におけるウマインフルエンザウイルス由来のイヌインフルエンザウイルスとは異なることが発見された。
【０００３】
２００６−２００７年の間、中国華南地区において、罹患イヌの生体内からいくつかのＨ３Ｎ２サブタイプイヌインフルエンザウイルスが分離され、配列分析の結果、これらのウイルスは韓国で分離されたウイルスと高いホモロジーを有していることが発見された。中国華南地区のペット用イヌの血清に対する調査により、６．７％の該イヌ血清がインフルエンザ陽性であることが発見された。２０１０年、本発明者らの研究室は中国華京地区においてイヌインフルエンザウイルスを分離し、これらをＡ／ｃａｎｉｎｅ／Ｚｈｅｊｉａｎｇ／０１／２０１０（Ｈ３Ｎ２サブタイプ、略語ＺＪＣＩＶ）と命名した。ＺＪＣＩＶウイルスの全ゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）配列分析から、このウイルスは華南のイヌインフルエンザウイルス及び韓国のＨ３Ｎ２イヌインフルエンザウイルスと高いホモロジーを有することを発見した。動物感染実験により、ＺＪＣＩＶウイルスがイヌに感染することができることを発見し、イヌに病気を引き起こし、食欲不振、発熱、咳、鼻汁や膿性分泌物などの症状を示すこと、並びに、解剖後には、肺うっ血、出血、肺胞が炎症性滲出液で満たされる症状が現れることが見出された。
【０００４】
２００９年６月に、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ社はイヌインフルエンザウイルス不活化ワクチンの開発に成功し、米国ではすでに発売されている。しかし、中国でパンデミック（ｐａｎｄｅｍｉｃ）を引き起こしたイヌインフルエンザウイルスと先に米国でパンデミックを惹起したイヌインフルエンザウイルスとは抗原性の差異が有り、二者は異なるＨ３インフルエンザウイルスに由来する。従って、Ｈ３Ｎ２サブタイプイヌインフルエンザウイルス流行株に対するワクチンを開発することは、イヌインフルエンザの予防及び制御のために多大な実用的意義がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、イヌインフルエンザ（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）組み換えウイルス（ｖｉｒｕｓ）を提供することにある。このウイルスは、イヌインフルエンザウイルスＺＪＣＩＶのＨＡ及びＮＡ遺伝子並びにＰＲ８ウイルスの六つ内部遺伝子を含み、この組み換えウイルスにより、アジア地区に於けるイヌインフルエンザウイルスに対する不活化ワクチンを製造し、その応用を図ることができる。
【０００６】
更に、本発明は上記イヌインフルエンザ組み換えウイルスの製造方法及び応用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、以下の技術的解決手段により本発明を完成した。
【０００８】
一態様において、本発明はイヌインフルエンザ組み換えウイルスを提供するものであり、ここで、該組み換えウイルスは、ＺＪＣＩＶイヌインフルエンザウイルスのＨＡ及びＮＡ遺伝子並びにＰＲ８ウイルスのＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、Ｍ、ＮＰ及びＮＳからなる六つの内部遺伝子を含む。
【０００９】
前記イヌインフルエンザウイルスＨＡ遺伝子のヌクレオチド配列は、
【００１０】
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列をコード（ｃｏｄｉｎｇ）のヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）配列；
【００１１】
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列と９８％以上のホモロジー（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択され；
【００１２】
前記イヌインフルエンザウイルスＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列は、
【００１３】
（１）  配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
【００１４】
（２）配列番号２に示すアミノ酸配列と９８％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択される。
【００１５】
好ましくは、前記イヌインフルエンザウイルスＨＡ遺伝子は、配列番号３に示すヌクレオチド配列を有し、あるいは上記イヌインフルエンザウイルスＨＡ遺伝子は配列番号３に示すヌクレオチド配列と９８％以上のホモロジーを有する配列を有する。
【００１６】
好ましくは、上記イヌインフルエンザウイルスＮＡ遺伝子は、配列番号４に示すヌクレオチド配列を有し、あるいは上記イヌインフルエンザウイルスＮＡ遺伝子は配列番号４に示すヌクレオチド配列と９８％以上のホモロジーを有する配列を有する。
【００１７】
本発明において、配列番号１に示すアミノ酸配列と９８％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換され、ＺＪＣＩＶイヌインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ、ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）活性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１８】
本発明において、配列番号２に示すアミノ酸配列と９８％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列は、配列番号に示すアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸を欠失、付加、挿入または置換され、ＺＪＣＩＶイヌインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ、Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）活性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１９】
ＨＡとＮＡは、インフルエンザウイルスの二つの主要な表面抗原であり、インフルエンザウイルスの抗原変異は主にＨＡとＮＡの変異を指し、特にＨＡより迅速に変異する。従って、本発明のイヌインフルエンザ組換えウイルスの中に含まれるＺＪＣＩＶイヌインフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子は、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であり、又は配列番号１に示すアミノ酸配列と９８％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であり；本発明のイヌインフルエンザ組換えウイルスの中に含まれるＺＪＣＩＶイヌインフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子は、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であり、又は配列番号２に示すアミノ酸配列と９８％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
【００２０】
他の態様において、本発明は前記イヌインフルエンザ組み換えウイルスの製造方法を提供するものであり、該製造方法は、
【００２１】
ＺＪＣＩＶイヌインフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子及びＮＡ遺伝子をそれぞれ別々に含む組み換えプラスミドを構築すること；
【００２２】
前記ＨＡ遺伝子の組み換えプラスミド及びＮＡ遺伝子の組み換えプラスミドと、ＰＲ８ウイルスのＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、Ｍ、ＮＰ、及びＮＳ内部遺伝子をそれぞれ別々に含む六つのプラスミドとを一緒に、２９３Ｔ細胞にトランスフェクションさせて、トランスフェクション後の細胞を培養すること；
【００２３】
培養細胞上清をニワトリ胚に接踵し、ニワトリ胚尿膜腔液を得るためにインキュベーターの中で適切な時間培養すること、当該尿膜腔液の赤血球凝集性を測定すること、赤血球凝集活性がある場合、配列解析により意図しない変異が含まれないことを確認して、イヌインフルエンザ組み換えウイルスを得ることを含む。
【００２４】
好ましくは、培養細胞上清を９−１１日齢のニワトリ胚に接踵し、該ニワトリ胚を３７℃のインキュベーターで４８−７２時間培養後、雛胚尿膜腔液を得る。
【００２５】
前記組み換えプラスミドは、ＰＢＤベクターを空ベクターとして使用する。
【００２６】
更に別の態様において、本発明は、イヌインフルエンザの予防・治療用ウイルス不活化ワクチンの製造における前記イヌインフルエンザ組み換えウイルスの応用を提供するものである。
【００２７】
更に他の態様において、本発明は、イヌインフルエンザ組み換えウイルスを含有するインフルエンザワクチンを提供するものである。
【発明の効果】
【００２８】
本発明のイヌインフルエンザ組み換えウイルスは、ニワトリ胚とＭＤＣＫ細胞の両方において高いウイルス力価と赤血球凝集を生成することででき、イヌインフルエンザワクチンを開発するための優れた接種ウイルスとして使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
以下に添付の図面及び発明を実施するための形態を併せてさらに詳細に記載する。
【図１】本願の実施例１における、イヌインフルエンザウイルスＺＪＣＩＶのＨＡとＮＡのＲＴ−ＰＣＲ電気泳動図である。
【図２】本願の実施例３における、組み換えウイルスとＺＪＣＩＶをニワトリ胚に接踵させた後の異なる時間における赤血球凝集価を示したグラフである。
【図３】本願の実施例３における、組み換えウイルスとＺＪＣＩＶのニワトリ胚での成長曲線の比較を示すグラフである。
【図４】本願の実施例３における、組み換えウイルスとＺＪＣＩＶをＭＤＣＫ細胞に接踵させた後の異なる時間における赤血球凝集価を示すグラフである。
【図５】本願の実施例３における、組み換えウイルスとＺＪＣＩＶのＭＤＣＫ細胞での成長曲線の比較を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
次の実施例において、実験方法の具体的な条件が示されていない場合は、通常、一般的な方法に従って、例えば「精編分子生物学ラボマニュアル」（Ｆ．  Ｍ．  アオスポ（奥斯伯）、Ｒ．  Ｅ．  キングストン（金斯頓），  Ｊ．  Ｇ．  サイドマン編集者、馬学軍、舒躍龍翻訳。北京：科学プレス、２００４）等の方法に従って実施する。
【００３１】
イヌインフルエンザウイルスワクチンの開発のための重要な前提は良い接種ウイルスであるが、本発明者らの研究室で、以前分離されたＡ／ｃａｎｉｎｅ／Ｚｈｅｊｉａｎｇ／０１／２０１０ウイルス（Ｈ３Ｎ２サブタイプ、略語ＺＪＣＩＶ）はニワトリ胚または細胞中での増幅の両方で、血球凝集力価は非常に低かった。そのため、本発明はＺＪＣＩＶイヌインフルエンザウイルスの主要抗原蛋白、即ち、ＨＡ及びＮＡ遺伝子をＰＲ８ウイルス残りの６つの内部遺伝子と一緒に組み換え、インフルエンザウイルスの逆遺伝学システムにより、ニワトリ胚と細胞の中で高いウイルス価及び赤血球凝集価を生成することができるイヌインフルエンザ組み換えウイルスを得た。本組み換えウイルスはイヌインフルエンザワクチンを開発する為の優れた接種ウイルスとして使用することができる。
【００３２】
実施例１  組み換えプラスミドの構築と同定
１．ＰＣＲ増幅
トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、イヌインフルエンザウイルスＺＪＣＩＶの全ＲＮＡを抽出した。Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｋｉｔ逆転写キット（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、そのマニュアルによって、１２ｂｐのプライマー５’−ＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧ−３’を特異的プライマーとして、ｃＤＮＡ第一鎖を合成した。得られたｃＤＮＡの第一鎖をテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として、ｓａｐＩ−ＨＡ−ｕｐ、ｓａｐＩ−ＨＡ−ｄｏｗｎとｓａｐＩ−ＮＡ−ｕｐ、ｓａｐＩ−ＮＡ−ｄｏｗｎを上下流プライマー（ＢｓｐＱＩ制限酵素切断部位を含む、表１に示すように）として用いて、ＺＪＣＩＶ断片（Ｆｒａｇｍｅｎｔ）のＨＡとＮＡを別々に増幅した。ＰＣＲ増幅プログラムは、９４℃初期変性５  分間、次のサイクル、９４℃変性４５ｓ、５３℃アニーリング４５秒、７２℃の延長１分間４５ｓを３０サイクルを実行し、最後に７２℃で再び延長を１０  分間行った。同時にテンプレートを含まない陰性対照も置いた。反応後、ＰＣＲ産物に対して１．０％アガロースゲル電気泳動（ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）実験を行った。結果は図１に示すように、二つのＰＣＲストリップ（ｓｔｒｉｐ）が現れた。サイズは、別々に約１７００  ｂｐのＨＡと１４００  ｂｐのＮＡであり、目的断片のサイズと一致した。図１において、Ｍ：  ＤＮＡ分子量標準；１：  ＺＪＣＩＶ  ＨＡ  ＰＣＲ産物；２：  ＺＪＣＩＶ  ＮＡ  ＰＣＲ産物を示す。
【００３３】
【表１】
2014516530.tif 000003
【００３４】
２、ＰＣＲ産物のゲル抽出（Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）
電気泳動後、ＵＶ光の下で、ゲルから目的ＤＮＡ断片のアガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ）を切り出し、ＤＮＡ迅速抽出キットを使用してＤＮＡを抽出した。具体的な方法は以下の通りである。ＵＶランプ下で、目的ＤＮＡを含むアガロースゲルを切り出し、紙を使用してゲル表面の液体を吸収し、ゲルを小片に切断し、１．５ｍｌの無菌ＥＰ管に入れて、ゲル容積の３倍の（１００ｍｇの＝１００μｌの容積）バッファ（Ｂｕｆｆｅｒ）ＤＥ−  Ａ（ゲル液）を加えて、混合した後、７５℃加熱し、完全に溶融した（約６−８分間）ゲル片になるまで断続的に混合（２−３分間）した。バッファＤＥ−Ａの容積の半分のバッファＤＥ−Ｂ（結合液）を加え、均一に混合し；抽出するＤＮＡ断片が４００ｂｐ未満であると場合には、ゲルの容積と同量のイソプロパノール（Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）を添加した。混合液をＤＮＡ調製管に移して、１２０００×ｇで遠心分離を１分間行い、回収管の廃液を捨てた。調製管を回収管に挿入して、５００μｌバッファ（Ｂｕｆｆｅｒ）  Ｗ１（洗液）を加え、１２０００×ｇで遠心分離を３０秒間行い、回収管の廃液を捨てた。調製管を回収管に挿入し、７００μｌバッファ（Ｂｕｆｆｅｒ）Ｗ２（脱塩液）を加えて、１２０００×ｇ  で遠心分離を１分間行い、回収管の廃液を捨てた。同様の方法で更に１回洗浄した。調製管を回収管に挿入し、１２０００×ｇで遠心分離を１分間行った。最後に、調製管をきれいな１．５ｍｌ  ＥＰ管に入れて、製造膜の中央に３０μｌの脱イオン水を加えて、室温で１分間放置し、１２０００×ｇで遠心分離を１分間行い、溶出したＤＮＡを−２０℃で保管した。
【００３５】
３．酵素切断、連結及び形質転換
精製ＰＣＲ産物とＰＢＤベクター（本研究室に保管されている）は、ＢｓｐＱＩ制限エンドヌクレアーゼ（ＮＥＢ）作用下、説明書に従って、５０℃で１時間インキュベートした。ゲル抽出キットを用いて、目的断片とＰＢＤプラスミドの酵素切断産物を抽出し、１μｌのＴ４リガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）緩衝液と１μｌの  Ｔ４リガーゼ（ＴａｋａＲａ）を加えた。連結反応は１０μｌで、均一に混合することにより行った。１６℃で一晩静置して連結させた。連結産物はコンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）ＪＭ１０９（本研究室にて製造）に形質転換し、無菌条件下、クリーンベンチ（ｃｌｅａｎ  ｂｅｎｃｈ）内でＡｍｐを含むＬＢ固体培地上にコーティングして、３７℃で８−２０時間培養した。
【００３６】
４．組み換えプラスミドの鑑定
ＬＢ固体培地上の単コロニー（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｌｏｎｙ）を採取し、Ａｍｐを含む約３ｍｌのＬＢ液体培地を加えた試験管に入れ、その後、震盪器に固定し、３７℃で１０時間又は一晩振盪培養した。アルカリ抽出法を用いて菌液から抽出したプラスミドを、ＰＣＲ法により同定した。陽性として同定されプラスミドを配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）し、ＤＮＡｓｔａｒ配列分析ソフトウェアを用いて比較した。結果が示すように、組み換えプラスミドＰＢＤ−ＺＪＣＩＶＨＡ及びＰＢＤ−ＺＪＣＩＶＮＡの構築に成功した。ＨＡ遺伝子配列は配列番号  ３に示し、ＮＡ遺伝子配列は配列番号４に示した。
【００３７】
実施例２  組み換えＰＲ８ウイルスの作製
１．トランスフェクションプラスミド準備
ウルトラピュアプラスミド抽出キット（ＯＭＥＧＡ）を用いてプラスミドを抽出した。操作手順は次のようにした：１）接種ループをグリセロール中に保存した細菌（プラスミドＰＢＤ−ＺＪＣＩＶＨＡ、ＰＢＤ−ＺＪＣＩＶＮＡ、ＰＢＤ−ＰＲ８Ｍ、ＰＢＤ−ＰＲ８ＰＢ１、ＰＢＤ−ＰＲ８ＰＢ２、ＰＢＤ−ＰＲ８ＰＡ、ＰＢＤ−ＰＲ８ＮＳ、ＰＢＤ−ＰＲ８ＮＰを含む。後者の六つのプラスミドは本研究室において保管されている。）に浸し、Ａｍｐを含むＬＢフラットプレートの表面上で線を描き、３７℃で一晩放置した；２）単コロニーを採取して、５ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地に接種し、ＯＤ６００値が１．０−１．５になるまで、３７℃で振盪培養した；３）一晩培養した培養液の３ｍｌを收集し、遠心分離により培地を完全に除去した；４）菌体の懸濁：ＲＮａｓｅ  Ａを含む０．２５ｍｌのＳｏｌｕｔｉｏｎＩ溶液を用いて均質の状態になるまで菌体を懸濁させた、；５）細菌の溶解：０．２５ｍｌＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩ溶液を添加し、穏やかに混合するために５回反転させた；６）中和：０．１２５ｍｌのＢｕｆｆｅｒ  Ｎ３溶液を加え、穏やかに混合するためにすぐに５回反転させて白色の綿状沈殿物が形成させ、室温、１２，０００×ｇで１０分間遠心分離した；７）慎重に上澄み液を清浄な１．５ｍｌ遠心分離管に移し、遠心分離管の容積の０．１倍の量のＥＴＲ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（青色）を上澄み液に加え、７−１０回転倒させ、その後、１０分間氷浴させた；８）  ４２℃の温水浴に加え５分間置き、再び混濁し、室温、１２，０００×ｇで、３分間遠心分離し、ＥＴＲ溶液中、遠心分離管の底部に青色分層を形成させた；９）上澄み液を新しい１．５ｍｌ遠心分離管に移し、遠心分離管の容積の０．５倍の量の無水アルコール（ａｂｓｏｌｕｔｅ  ａｌｃｏｈｏｌ）を加え、６−７回反転し、室温で１−２分間放置した；１０）予め２ｍｌのＥ４溶液を用いて平衡化させたＨｉＢａｎｄ  ＤＮＡＭｉｎｉカラム（ｃｏｌｕｍｎ）に上記混合液を加え、２ｍｌの回収管の中に挿入して、室温、１０，０００×ｇで、１分間遠心分離し、溶解液がカラムを通過するようにした；１１）回収管中の液体を捨て、残りの混合液をカラムに加え、室温、１０，０００×ｇで、１分間遠心分離し、溶解液が完全にカラムを通過するようにし；５００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＨＢをカラムに加え、室温、１０，０００×ｇで、１分間遠心分離し、残留タンパク質の除去を確実にするためカラムを洗浄し、高品質のＤＮＡを得た；１２）液体を捨て、７００μｌのＤＮＡウォッシュバッファー（Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いて、洗浄し、室温、１０，０００×ｇで、１分間遠心分離し、液体を捨てた；１３）操作を繰り返し、ＤＮＡ  Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒを添加した；１４）液体を捨て、空転させ、室温、１２，０００×ｇで２分間遠心分離し、液体を捨てた；１５）カラムを清浄な１．５ｍｌの遠心分離管に挿入して、３０−５０μｌの無エンドトキシン（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｆｒｅｅ）溶出液をカラムに加え、室温で２分間放置し、室温、１２，０００×ｇで、１分間遠心分離してＤＮＡを溶出させた、溶出は二回行うことができる；１６）電気泳動により検出し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００ｃ紫外可視分光光���計を用いて、ＯＤ２６０、ＯＤ２８０を測定し、ＤＮＡ含量と純度を推測した。結果：トランスフェクト時に必要な十分な量のプラスミドを得た。
【００３８】
２．２９３Ｔ細胞のトランスフェクション
前記抽出された超高純度プラスミドは、ＰＢＤ−ＺＪＣＩＶＨＡ、ＰＢＤ−ＺＪＣＩＶＮＡ、ＰＢＤ−ＰＲ８Ｍ、ＰＢＤ−ＰＲ８ＰＢ１、ＰＢＤ−ＰＲ８ＰＢ２、ＰＢＤ−ＰＲ８ＰＡ、ＰＢＤ−ＰＲ８ＮＳとＰＢＤ−ＰＲ８ＮＰを含み、適切なリポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）２０００によって、３．５ｃｍ直径の２９３Ｔ細胞にコトランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。トランスフェクションの６時間後、細胞上清を捨て、２ｍｌの  ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培養液を加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターに入れて７２時間培養した。
【００３９】
３．組み換えＰＲ８ウイルスの作製
トランスフェクションの４８時間後の細胞上清を、９−１１日齢のＳＰＦニワトリ胚（北京メリアヴィニョントン実験動物テクノロジー株式会社）に接踵して、該ニワトリ胚をパラフィン（ｐａｒａｆｆｉｎ）で密封した後、３７℃のインキュベーターの中で培養した。４８−７２時間後、該ニワトリ胚を４℃で一晩静置し、ニワトリ胚尿膜腔液を得るために取り出した。尿膜腔液が凝集活性を有するか否かは、赤血球凝集試験によって測定した。結果：尿膜腔液は、赤血球を凝集させることができ、ＺＪＣＩＶのＨＡとＮＡ遺伝子を含むＰＲ８組み換えウイルスの作製に成功したことが明らかとなった。
【００４０】
４．組み換えウイルスの同定
Ｔｒｉｚｏｌを用いて、組み換えウイルスの尿膜腔液の全ＲＮＡを抽出し、１２ｂｐプライマーを用いて逆転写して、第一のｃＤＮＡを得た。第一のｃＤＮＡをテンプレートとして、ｓａｐＩ−ＨＡ−ｕｐ、ｓａｐＩ−ＨＡ−ｄｏｗｎとｓａｐＩ−ＮＡ−ｕｐ、ｓａｐＩ−ＮＡ−ｄｏｗｎを上下流プライマーとして使って、ＺＪＣＩＶのＨＡとＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、１％アガロースゲル電気泳動により同定した。更に、ＺＪＣＩＶのＨＡとＺＪＣＩＶのＮＡのＰＣＲ産物を会社により配列決定した。結果：アガロース電気泳動ゲルで二つのストリップが現れた。サイズは、それぞれ約１７００ｂｐと１４００ｂｐであり、標的とするサイズと完全に一致した。更に、配列決定による結果から、ＰＣＲ産物がＺＪＣＩＶのＨＡとＮＡ断片であることが確認された。
【００４１】
実施例３  得られた組み換えウイルスの成長特性の同定
１．得られた組み換えウイルスとＺＪＣＩＶのＥＩＤ５０測定
ウイルスを含むニワトリ胚尿膜腔液は１０倍希釈倍率で希釈し、１０−６〜１０−１０の各希釈度のニワトリ胚尿膜腔液をそれぞれ５個の９−１１日齢のＳＰＦニワトリ胚に接踵し、３７℃で４８時間連続培養した。感染胚胎尿膜腔液の赤血球凝集活性を測定して、感染したかどうかを決定し、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法を使用してＥＩＤ５０（ニワトリ胚の半分が感染する量）を計算した。結果：得られた組み換えウイルスとＺＪＣＩＶのＥＩＤ５０は、それぞれ１０７．５／１００μｌと１０６．５／１００μｌであった。
【００４２】
２．得られた組み換えウイルスとＺＪＣＩＶのＴＣＩＤ５０測定
１：１０−３から始まる１０倍希釈、異なる希釈倍率の組み換えウイルスとＺＪＣＩＶを単層のＭＤＣＫ細胞が成長した４８ウェルプレート（ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に接踵した。接踵の過程は以下の通りとした：ＰＢＳを用いてＭＤＣＫ細胞を２回洗浄し、その後、各ウェルに１００μｌのウイルスを加え、各希釈倍率についてこの操作を３回繰り返した。４８ウェルプレートを３７℃のＣＯ２インキュベーターに入れ、ウイルスが細胞に吸収されるようにし、２０分間隔で細胞を左右に一度振り、１．５−２時間後、細胞培養液中のウイルスを捨て、ＰＢＳを用いて細胞を２回洗浄して、その後、無血清培地３００μｌを添加した。ウイルスを吸収させた細胞は、ＣＯ２インキュベーターで７２時間連続培養し、その後、各ウェルの赤血球凝集活性を測定し、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法を使用してＴＣＩＤ５０（組織細胞の半分が感染する量）を計算した。結果：得られた組み換えウイルスとＺＪＣＩＶのＴＣＩＤ５０は、それぞれ１０６．５／１００μｌと１０５．５／１００μｌであった。
【００４３】
３．得られた組み換えウイルスとＺＪＣＩＶが雛ニワトリ胚における成長特性比較
得られた組み換えウイルスとＺＪＣＩＶを１００ＥＩＤ５０となるように希釈し、この希釈倍率の液を、それぞれ１８個の９−１１日齢のＳＰＦニワトリ胚に接踵した。接踵から６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、７２時間後に、それぞれ接踵したＳＰＦニワトリ胚を３個取り出し、その尿膜腔液を収集して赤血球凝集価（図２）を測定した。それぞれの時間に收集した尿膜腔液を１０倍希釈倍率で希釈し、各希釈倍率のウイルス液を３個の９−１１日齢のＳＰＦニワトリ胚に接踵した。接踵量は１００μｌ／個となるようにした。接踵から４８時間後、ニワトリ胚尿膜腔液の赤血球凝集活性を測定して、異な時間における尿膜腔液のウイルス含量を計算し、ウイルスの成長曲線（図３）を描いて、得られた組み換えウイルスとＺＪＣＩＶの胚上の成長状況を比較した。結果を図２に示す。接踵後１２時間以内では、ＺＪＣＩＶと組み換えウイルスの尿膜腔液はいずれも赤血球凝集性が認められなかった。接踵後４８時間では、組み換えウイルスの赤血球凝集価は２１１に達しており、これはＺＪＣＩＶの赤血球凝集価よりも有意に高かった。結果を図３に示した。ＺＪＣＩＶと得られた組み換えウイルスはいずれも接踵から６時間後には、ウイルスを検出することができなかった。接踵から１２時間後、得られた組み換えウイルスのウイルス力価はＺＪＣＩＶよりも有意に高く、接踵から４８時間後に最高に達した。
【００４４】
４．得られた組み換えウイルスとＺＪＣＩＶのＭＤＣＫ細胞上での成長特性の比較
得られた組み換えウイルスとＺＪＣＩＶを１００ＴＣＩＤ５０となるように希釈し、この希釈倍率の液を、それぞれ、８０％のＭＤＣＫ成長細胞を含むＴ２５細胞瓶に接踵した。接踵から６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、７２時間後に、それぞれ細胞上清を回収してその赤血球凝集価（図４）を測定した。各時間に收集された細胞上清中のウイルス含量を次のように算出した。收集した細胞上清を１０倍希釈倍率で希釈し、各希釈倍率のウイルス液を、２４ウェルの細胞培養プレート上で８０％まで成長したＭＤＣＫ細胞の３ウェルに接踵し、接踵後４８時間において赤血球凝集活性を測定し、各時間に收集された細胞上清中のウイルス含量（ＴＣＩＤ５０）を算出し、このＴＣＩＤ５０に従って、ウイルスの成長曲線（図５）を描いて、得られた組み換えウイルスとＺＪＣＩＶのＭＤＣＫ細胞上での成長を比較した。赤血球凝集価の結果を図４に示した。接踵後１２時間以内では、ＺＪＣＩＶの細胞上清には赤血球凝集活性が無かったが、組み換えウイルスの細胞上清には赤血球凝集活性が認められ、それは接踵後３６時間で最高に達し、その後比較的安定な状態となる傾向が認められた。全感染過程で、組み換えウイルスの赤血球凝集活性はＺＪＣＩＶの赤血球凝集活性よりも有意に高かった。ウイルス力価の結果を図５に示す。ＺＪＣＩＶと得られた組み換えウイルスは、接踵から６時間後ではウイルスを検出することができなかった。接踵後１２時間に、得られた組み換えウイルスを検出することができたが、ＺＪＣＩＶは接踵後２４時間までは検出されなかった。接踵から３６時間後に、組み換えウイルスとＺＪＣＩＶのウイルス力価は最高に達し、その後減少した。全感染過程で、組み換えウイルスのウイルス力価はＺＪＣＩＶのウイルス力価よりも有意に高かった。
【００４５】
以上、上記実施例は本発明の実施の形態を示しているにすぎず、その説明がより具体的かつ詳細であったとしても、本発明の請求の範囲を制限するものではない。本発明の属する当業者にとって、本発明の思想を逸脱しない限り、本発明に対する様々な変更及び改善は許容されるものとし、すべて本発明の保護範囲内に属するものとする。故に、本発明特許の保護範囲は特許請求の範囲を基準とされるべきものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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