(57)【要約】本発明は、第１および第２結合性ドメインを含む二重特異的結合性分子を提供し、その際、第１結合性ドメインはＴ４のエピトープクラスター４に結合でき、第２結合性ドメインはＴ細胞上のＣＤ３受容体複合体に結合できる。さらに本発明は、その二重特異的結合性分子をコードする核酸配列、その核酸配列を含むベクター、およびそのベクターで形質転換またはトランスフェクションした宿主細胞を提供する。さらに本発明は、本発明の二重特異的結合性分子を調製する方法、医療におけるその二重特異的結合性分子の使用、およびその二重特異的結合性分子を含むキットを提供する。【選択図】図２
2014533929.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１および第２結合性ドメインを含む二重特異的結合性分子：
（ａ）第１結合性ドメインは５Ｔ４のエピトープクラスター４に結合できる；
（ｂ）第２結合性ドメインはＴ細胞上のＣＤ３受容体複合体に結合できる；
その際、エピトープクラスター４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すヒト配列のアミノ酸残基１７０−２２２により形成される、５Ｔ４の細胞外タンパク質ドメインに相当する。
【請求項２】
第１結合性ドメインは５Ｔ４のエピトープクラスター２およびエピトープクラスター４に結合でき、その際、エピトープクラスター２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すヒト配列のアミノ酸残基７８−１３８により形成される、５Ｔ４の細胞外タンパク質ドメインに相当する、請求項１に記載の二重特異的結合性分子。
【請求項３】
第１結合性ドメインはヒトおよびコモンマーモセット(Callithrix jacchus)、ワタボウシタマリン(Saguinus oedipus)またはリスザル(Saimiri sciureus)の５Ｔ４に結合でき、ならびに／あるいは第２結合性ドメインはヒトおよびコモンマーモセット、ワタボウシタマリンまたはリスザルのＣＤ３イプシロンに結合できる、請求項１および２に記載の二重特異的結合性分子。
【請求項４】
ヒト５Ｔ４に対する第１結合性ドメインの親和性は≦１５ｎＭ（好ましくは≦１０ｎＭ）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の二重特異的結合性分子。
【請求項５】
第１および第２結合性ドメインは抗体に由来する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の二重特異的結合性分子。
【請求項６】
（ｓｃＦｖ）２、（単一ドメインｍＡｂ）２、ｓｃＦｖ−単一ドメインｍＡｂ、ディアボディー、またはそのオリゴマーの群から選択される、請求項６に記載の二重特異的結合性分子。
【請求項７】
第１結合性ドメインが、下記のものから選択されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域、ならびにＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の二重特異的結合性分子：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７に示すＣＤＲ−Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８に示すＣＤＲ−Ｌ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４に示すＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２６に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７に示すＣＤＲ−Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２８に示すＣＤＲ−Ｌ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２３に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２４に示すＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２５に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３６に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３７に示すＣＤＲ−Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３８に示すＣＤＲ−Ｌ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３３に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３４に示すＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３５に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５０に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５１に示すＣＤＲ−Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５２に示すＣＤＲ−Ｌ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４７に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４８に示すＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４９に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９０に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９１に示すＣＤＲ−Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９２に示すＣＤＲ−Ｌ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８７に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８８に示すＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８９に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１００に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０１に示すＣＤＲ−Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０２に示すＣＤＲ−Ｌ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９７に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９８に示すＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９９に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｇ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１０に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１１に示すＣＤＲ−Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１２に示すＣＤＲ−Ｌ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０７に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０８に示すＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０９に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｈ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２０に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２１に示すＣＤＲ−Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２２に示すＣＤＲ−Ｌ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１７に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１８に示すＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１９に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３０に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３１に示すＣＤＲ−Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３２に示すＣＤＲ−Ｌ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２７に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２８に示すＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２９に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｊ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４４に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４５に示すＣＤＲ−Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４６に示すＣＤＲ−Ｌ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４１に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４２に示すＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４３に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｋ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５８に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５９に示すＣＤＲ−Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６０に示すＣＤＲ−Ｌ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５５に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５６に示すＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５７に示すＣＤＲ−Ｈ３；ならびに
（ｌ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６８に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６９に示すＣＤＲ−Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７０に示すＣＤＲ−Ｌ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６５に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６６に示すＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６７に示すＣＤＲ−Ｈ３。
【請求項８】
第１結合性ドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４に示すＶＬ領域からなる群から選択されるＶＬ領域を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の二重特異的結合性分子。
【請求項９】
第１結合性ドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３に示すＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異的結合性分子。
【請求項１０】
第１結合性ドメインが、下記のものからなる群から選択されるＶＬ領域およびＶＨ領域を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の二重特異的結合性分子：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示すＶＬ領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示すＶＨ領域；
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に示すＶＬ領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示すＶＨ領域；
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２に示すＶＬ領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１に示すＶＨ領域；
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６に示すＶＬ領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に示すＶＨ領域；
（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６に示すＶＬ領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５に示すＶＨ領域；
（ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６に示すＶＬ領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５に示すＶＨ領域；
（ｇ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６に示すＶＬ領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５に示すＶＨ領域；
（ｈ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６に示すＶＬ領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５に示すＶＨ領域；
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６に示すＶＬ領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５に示すＶＨ領域；
（ｊ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０に示すＶＬ領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９に示すＶＨ領域；
（ｋ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４に示すＶＬ領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３に示すＶＨ領域；ならびに
（ｌ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４に示すＶＬ領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３に示すＶＨ領域。
【請求項１１】
第１結合性ドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の二重特異的結合性分子。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の二重特異的結合性分子をコードする核酸配列。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載の核酸配列または請求項１３に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクションした宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の二重特異的結合性分子を調製する方法であって、請求項１４に記載の宿主細胞を、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の二重特異的結合性分子が発現しうる条件下で培養し、そして産生された二重特異的結合性分子を培養物から回収することを含む方法。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載した、または請求項１５に記載の方法により調製した、二重特異的結合性分子を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
増殖性疾患、腫瘍性疾患または免疫障害から選択される疾患の予防、治療または改善に使用するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載した、または請求項１５に記載の方法により調製した、二重特異的結合性分子。
【請求項１８】
増殖性疾患、腫瘍性疾患または免疫障害から選択される疾患を処置または改善するための方法であって、その必要がある対象に請求項１〜１１のいずれか１項に記載した、または請求項１５に記載の方法により調製した、二重特異的結合性分子を投与する段階を含む方法。
【請求項１９】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の二重特異的結合性分子、請求項１２に記載の核酸分子、請求項１３のいずれか１項に記載のベクター、または請求項１４に記載の宿主細胞を含む、キット。
【請求項２０】
抗体を作成するための、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すヒト５Ｔ４配列のアミノ酸残基１７０−２２２（エピトープクラスター４）および／または７８−１３８（エピトープクラスター２）の使用。
【請求項２１】
抗体、好ましくは二重特異的結合性分子を作成するための、下記を含む方法：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すヒト５Ｔ４配列のアミノ酸残基１７０−２２２（エピトープクラスター４）および／または７８−１３８（エピトープクラスター２）を含むタンパク質で動物を免疫化し、
（ｂ）その抗体を採取し、そして
（ｃ）場合によりその抗体を、好ましくは明細書に記載する５Ｔ４およびＣＤ３に結合する能力を有する二重特異的結合性分子に変換する。
【請求項２２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すヒト５Ｔ４配列のアミノ酸残基１７０−２２２（エピトープクラスター４）または７８−１３８（エピトープクラスター２）からなる、ヒト５Ｔ４フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]  本発明は、第１および第２結合性ドメインを含む二重特異的結合性分子に関するものであり、その際、第１結合性ドメインは５Ｔ４のエピトープクラスター４に結合でき、第２結合性ドメインはＴ細胞上のＣＤ３受容体複合体に結合できる。さらに本発明は、その二重特異的結合性分子をコードする核酸配列、その核酸配列を含むベクター、およびそのベクターで形質転換またはトランスフェクションした宿主細胞に関する。さらに本発明は、本発明の二重特異的結合性分子を調製する方法、医療におけるその二重特異的結合性分子の使用、およびその二重特異的結合性分子を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]  米国で２０１０年には１，５２９，５６０人の男女が癌と診断され、５６９，４９０人の男女が癌のため死亡すると推定されている(Howlader N, Noone AM, Krapcho M, Neyman N, Aminou R, Waldron W, Altekruse SF, Kosary CL, Ruhl J, Tatalovich Z, Cho H, Mariotto A, Eisner MP, Lewis DR, Chen HS, Feuer EJ, Cronin KA, Edwards BK (eds). SEER Cancer Statistics Review, 1975-2008, 国立癌研究所(National Cancer Institute). メリーランド州ベセスダ，http://seer.cancer.gov/csr/1975_2008/，2010年11月のSEERデータ提示に基づく，SEERウェブサイトに2011年に投稿)。これらの数が示唆するように、癌は先進諸国における罹患および死亡の主因の１つである。癌の症例の主要部分を占める大部分の上皮癌については、ほとんど例外なく、早期の外科的完全摘除以外に治療処置はない。外科処置、放射線療法および化学療法を含む反復した集中的な標準処置にもかかわらず、疾患進行は上記のようなかなりの死亡をもたらす。したがって、これらの患者集団の転帰を改善するための革新的治療法に対する高い医療ニーズがある。
【０００３】
[0003]  モノクローナル抗体により決定された細胞表面抗原５Ｔ４は、９週という早い発生時期のすべてのタイプの栄養芽層が発現する７２−ｋＤの糖タンパク質である。成体組織では５Ｔ４発現はわずかな特殊化した上皮細胞タイプに限定されるが、成体の肝臓、肺、気管支、心臓、精巣、卵巣、脳または筋肉には検出されない。この抗原は、発生起源のものを含めた多様な腫瘍細胞系によって選択的に発現する。分子特性、比較的限られた正常組織分布、および特定の腫瘍細胞タイプによる発現は、この抗原を悪性疾患の診断マーカーとして使用するために価値あるものにする(Hole & Stern, Br J Cancer. (1988) 57(3), 239-46)。
【０００４】
[0004]  癌および癌進行における５Ｔ４の関与については明らかな証拠がある。癌細胞の表面における高レベルの５Ｔ４発現が下記のものについて示された：卵巣癌(Wrigley E, McGown AT, Rennison J, et al. 5T4 oncofetal antigen expression in ovarian carcinoma. Int J Gynecol Cancer. 1995;5:269-274)、大腸癌(Starzynska T, Marsh PJ, Schofield PF, Roberts SA, Myers KA, Stern PL. Prognostic significance of 5T4 oncofetal antigen expression in colorectal carcinoma. Br J Cancer. 1994;69:899-902)、子宮頚癌(Jones H, Roberts G, Hole N, McDicken IW, Stern P. Investigation of expression of 5T4 antigen in cervical cancer. Br J Cancer. 1990;6:69-100)、胃癌(Starzynska T, Rahi V, Stern PL. The expression of 5T4 antigen in colorectal and gastric carcinoma. Br J Cancer. 1992;66:867-869、および前記)、および肺癌(Forsberg G, Ohlsson L, Brodin T, et al. Therapy of human non-small-cell lung carcinoma using antibody targeting of modified superantigen. Br J Cancer. 2001;85:129-136.)。疾患進行、すなわち転移との関連も立証された(Mulder WM, Stern PL, Stukart MJ, et al. Low intercellular adhesion molecule 1 and high 5T4 expression on tumor cells correlate with reduced disease-free survival in colorectal carcinoma patients. Clin Cancer. 1997;3:1923-1930、およびStarzynska T, Wiechowska-Kozlowska A, Marlicz K, et al. 5T4 oncofetal antigen in gastric carcinoma and its clinical significance. Eur J Gastroenterol Hepatol. 1998;10:479-484、およびNaganuma H, Kono K, Mori Y, et al. Oncofetal antigen 5T4 expression as a prognostic factor in patients with gastric cancer. Anticancer Res. 2002;22:1033-1038)。癌病変部と対照的に正常組織における５Ｔ４の発現は限られている(Ali A, Langdon J, Stern PL, Partidge M. The pattern of expression of 5T4 oncofoetal antigen on normal, dysplastic and malignant oral mucosa. Oral Oncol. 2001;37:57-64)ので、５Ｔ４は標的化癌療法に適した標的抗原として示唆されている(Woods AM, Wang WW, Shaw DM, et al. Characterization of the murine 5T4 oncofoetal antigen: a target for immunotherapy in cancer. Biochem J. 2002;366:353-365、およびHole N, Stern PL. Isolation and characterization of 5T4, A tumor-associated antigen. Int J Cancer. 1990;45:179-184)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Howlader N, Noone AM, Krapcho M, Neyman N, Aminou R, Waldron W, Altekruse SF, Kosary CL, Ruhl J, Tatalovich Z, Cho H, Mariotto A, Eisner MP, Lewis DR, Chen HS, Feuer EJ, Cronin KA, Edwards BK (eds). SEER Cancer Statistics Review, 1975-2008
【非特許文献２】Hole & Stern, Br J Cancer. (1988) 57(3), 239-46
【非特許文献３】Wrigley E, McGown AT, Rennison J, et al. 5T4 oncofetal antigen expression in ovarian carcinoma. Int J Gynecol Cancer. 1995;5:269-274
【非特許文献４】Starzynska T, Marsh PJ, Schofield PF, Roberts SA, Myers KA, Stern PL. Prognostic significance of 5T4 oncofetal antigen expression in colorectal carcinoma. Br J Cancer. 1994;69:899-902
【非特許文献５】Jones H, Roberts G, Hole N, McDicken IW, Stern P. Investigation of expression of 5T4 antigen in cervical cancer. Br J Cancer. 1990;6:69-100
【非特許文献６】Starzynska T, Rahi V, Stern PL. The expression of 5T4 antigen in colorectal and gastric carcinoma. Br J Cancer. 1992;66:867-869
【非特許文献７】Forsberg G, Ohlsson L, Brodin T, et al. Therapy of human non-small-cell lung carcinoma using antibody targeting of modified superantigen. Br J Cancer. 2001;85:129-136
【非特許文献８】Mulder WM, Stern PL, Stukart MJ, et al. Low intercellular adhesion molecule 1 and high 5T4 expression on tumor cells correlate with reduced disease-free survival in colorectal carcinoma patients. Clin Cancer. 1997;3:1923-1930
【非特許文献９】Starzynska T, Wiechowska-Kozlowska A, Marlicz K, et al. 5T4 oncofetal antigen in gastric carcinoma and its clinical significance. Eur J Gastroenterol Hepatol. 1998;10:479-484
【非特許文献１０】Naganuma H, Kono K, Mori Y, et al. Oncofetal antigen 5T4 expression as a prognostic factor in patients with gastric cancer. Anticancer Res. 2002;22:1033-1038
【非特許文献１１】Ali A, Langdon J, Stern PL, Partidge M. The pattern of expression of 5T4 oncofoetal antigen on normal, dysplastic and malignant oral mucosa. Oral Oncol. 2001;37:57-64
【非特許文献１２】Woods AM, Wang WW, Shaw DM, et al. Characterization of the murine 5T4 oncofoetal antigen: a target for immunotherapy in cancer. Biochem J. 2002;366:353-365
【非特許文献１３】Hole N, Stern PL. Isolation and characterization of 5T4, A tumor-associated antigen. Int J Cancer. 1990;45:179-184
【発明の概要】
【０００６】
[0005]  抗体に基づく癌療法には、有効であるために癌細胞の表面に強固に結合している標的抗原が要求される。抗体は、表面標的に結合することによって直接または間接的に致死信号を癌細胞へ送達できる。理想的な処置シナリオに要求されるように、標的抗原５Ｔ４は特定の癌細胞に多量に存在し、到達可能であり、正常細胞には存在しないか、遮閉されているか、または量がはるかに少ない。
【０００７】
[0006]  ５Ｔ４抗原は２０年以上前に癌の標的として同定されたが、まだ抗５Ｔ４免疫療法は癌の処置として承認されていない。したがって、この抗原を標的とする有効な療法に対する明らかなニーズがある。
【０００８】
[0007]  したがって、この課題を解決するための手段および方法を、１つのドメインで細胞傷害性細胞、すなわち細胞傷害性Ｔ細胞に結合し、かつ第２結合性ドメインで腫瘍細胞の表面の５Ｔ４に結合する、二重特異性分子の形で本発明において提供する。
【０００９】
[0008]  １観点において、本発明は、第１態様では第１および第２結合性ドメインを含む下記の二重特異的結合性分子を提供する：
（ａ）第１結合性ドメインは５Ｔ４のエピトープクラスター４に結合できる；
（ｂ）第２結合性ドメインはＴ細胞上のＣＤ３受容体複合体に結合できる；
その際、エピトープクラスター４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すヒト配列のアミノ酸残基１７０−２２２により形成される、５Ｔ４の細胞外タンパク質ドメインに相当する。
【００１０】
[0009]  ５Ｔ４癌胎児抗原は、１型膜貫通タンパク質のグループに属する７２ｋＤａのロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）糖タンパク質である。さらに、５Ｔ４抗原は、細胞外ドメインに７つの推定コンセンサスＮ−連結グリコシル化部位をもつ高度にＮ−グリコシル化されたタンパク質である(Shaw et al. Biochem. J. 363 (2002) 137-145)。
【００１１】
[0010]  成熟型の細胞外５Ｔ４抗原は、それのアミノ酸に基づくエレメントにより構築できる：Ｎ末端セリンリッチリピート（ＳＲＲ；２２ａａ）、続いて４個のシステインを含む３６アミノ酸長さの未決定領域、それぞれ２４、２４および２３アミノ酸長さの３つの隣接するロイシンリッチリピート（ＬＬＲ  １〜３）、４５ａａ（アミノ酸）の親水性セグメント、続いてそれぞれ２４、２４および１＋２３アミノ酸長さのさらに３つのロイシンリッチリピート（ＬＲＲ  ４〜５）、さらに４個のシステインを含む５３ａａの第２の未決定セグメント、それに続いて最後に２２＋４アミノ酸長さの最終ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ  ７）（５Ｔ４の構造の説明については図１を参照）。５Ｔ４抗原については結晶構造が得られないので、各ロイシンリッチリピートが１つの２３ａａ長さの３６０度屈曲らせんを形成したメクラウナギ(hagfish)タンパク質に由来するロイシンリッチリピートの結晶構造との構造比較に基づいて、仮説構造を図１に示す(Kim et al. J. Biol. Chem. 282 (2007) 6726-6732);したがって、並んだ３つのＬＬＲが小さなチューブまたはバレル(barrel)を形成している可能性がある。２つの構造未決定セグメント内に局在するシステイン類の相互作用による、より複雑な構造の可能性もある；これによって細胞外領域全体の屈曲が引き起こされてＮ末端が細胞膜に近づく可能性がある。本発明者らは、ヒト５Ｔ４のＮ末端配列決定法を用いて、未熟タンパク質中のアミノ酸Ｔ３５がＮ末端リーダーペプチド開裂後の成熟タンパク質の最もＮ末端にあるアミノ酸であると同定した。実施例に示す実験を設計するために用いた５Ｔ４の仮説構造を図１に示す。
【００１２】
[0011]  二重特異性抗体によるＴ細胞動員を介した標的細胞の再指向溶解(redirected lysis)は、細胞溶解性シナプス形成ならびにパーフォリンおよびグランザイム類の送達を伴なう。嵌合した(engaged)Ｔ細胞は連続的に標的細胞を溶解することができ、ペプチド抗原のプロセシングおよび提示を妨げる免疫回避機序、またはクローンＴ細胞分化により影響されない。腫瘍抗原ＭＣＳＰ(Melanoma associated Chondroitin Sulfate Proteoglycan、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン)について、それぞれの二重特異性抗体分子は、ＭＣＳＰに対する結合親和性が類似するにもかかわらず全長ヒトＭＣＳＰで安定にトランスフェクションしたＣＨＯ標的細胞の再指向溶解の効力が大幅に異なると記載されている。二重特異性抗体分子の効力にとって細胞表面抗原中のエピトープの位置が重要な要因であることを示唆するエピトープ距離効果が確証された；すなわち、より遠位のＭＣＳＰドメインを除くと、膜近位結合性の二重特異性抗体分子による標的細胞溶解が改善された(Bluemel et al. Cancer Immunol Immunother. 2010; 59(8), 1197)。そのように報じられると、有効な二重特異性抗体を作成しようとする当業者は膜の近くにある５Ｔ４エピトープに対して高い親和性を備えた結合剤を探索する方向に偏るであろう。
【００１３】
[0012]  さらに、専門者は、標的細胞をエフェクター細胞により（エフェクター細胞と標的細胞の嵌合により）排除するための二重特異的結合性分子の作成について、標的構造体に対する化合物の親和性を増大させると化合物の効力が増大するはずであると予想するであろう。
【００１４】
[0013]  この分野でのこの予想に反して、意外にも、二重特異性という面で膜近位（エピトープクラスター７）および膜遠位（エピトープクラスター４および２／４）に対して同等の高い親和性（ｎＭ範囲）を備えた５Ｔ４結合分子について、膜遠位エピトープクラスターに対する結合剤は、５Ｔ４を発現する標的細胞の溶解に際し、膜に対してより近位にあるエピトープにおいて５Ｔ４に結合するものより有意に高い効力を示すことが見出された。５Ｔ４に対する結合剤の親和性は、組換え抗原発現を用いた人工的な系（たとえば、チップの固定化）を用いて決定されたのではなく、５Ｔ４抗原を自然状態で発現する生存細胞を用いるスカッチャードにより決定されていたので、これは特に意外である。
【００１５】
[0014]  本明細書中で用いる単数形“a”、“an”、および“the”は、状況からみてそうではないことが明らかに指示されない限り複数表記を含むことを留意しなければならない。したがって、たとえば“試薬”という表記は１種類以上の異なるそのような試薬を含み、“方法”という表記は当業者に既知の同等な段階および方法であって本明細書に記載する方法を改変または置換できるものを含む。別途指示しない限り、一連の要素の前にある用語“少なくとも”は、その一連の各々の要素を表わすと理解すべきである。当業者は本明細書に記載する特定の態様に対する多数の均等物を認識しており、あるいはルーティン実験程度を用いて確認できるであろう。そのような均等物は本発明に包含されるものとする。
【００１６】
[0015]  本明細書中で用いる用語“および／または”はいずれも、“および”、“または”、および“その用語により連結される要素の全部または他のいずれかの組合わせ”の意味を含む。
【００１７】
[0016]  本明細書中で用いる用語“約”は、その数値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。
【００１８】
[0017]  本明細書および後続の特許請求の範囲の全体において、状況からみてそうではないことが要求されない限り、用語“含む（comprise、ならびに変形、たとえばcomprisesおよびcomprising）”は、記載した整数もしくは段階または一群の整数もしくは段階の包含を示すが、他のいずれかの整数もしくは段階または一群の整数もしくは段階の除外を示すものではないと理解されるであろう。本明細書中で用いる場合に用語“comprising”は、用語“containing”もしくは“including”で、または時には本明細書中で用いる場合に“having”で置換できる。
【００１９】
[0018]  本明細書中で用いる場合、用語“からなる(consisting of)”は、その主張要素に明記されていないいずれかの要素、段階または成分を除外する。本明細書中で用いる場合、用語“本質的に・・・からなる(consisting essentially of)”は、その主張の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない物質または段階を除外しない。本明細書中でそれぞれの場合、“含む(comprising)”、“本質的に・・・からなる(consisting essentially of)”、および“からなる(consisting of)”はいずれも、他の２つの用語のいずれかと置き換えることができる。
【００２０】
[0019]  用語“結合性ドメイン”は、本発明に関して特定の標的エピトープと特異的に結合／相互作用する（特定の標的エピトープに結合／と相互作用することができる）、ポリペプチドのドメインを特徴づける。“エピトープ”は抗原性であり、したがって用語エピトープは本明細書中で時には“抗原構造体”または“抗原決定基”とも呼ばれる。したがって、結合性ドメインは“抗原−相互作用−部位”である。用語“抗原−相互作用−部位”は、本発明によれば、特異的抗原または特異的抗原グループ、たとえば異なる種における同一抗原と特異的に相互作用しうる、ポリペプチドのモチーフを規定する。そのような結合／相互作用が“特異的認識”を規定することも理解される。一例において、特定の標的エピトープと特異的に結合／相互作用するポリペプチドは抗体であり、そのドメインは抗体のＶＨおよび／またはＶＬ領域である。
【００２１】
[0020]  用語“エピトープ”は、抗原上の部位であってそれに結合性ドメイン、たとえば抗体もしくは免疫グロブリンまたは抗体もしくは免疫グロブリンの誘導体が特異的に結合する部位を表わす。エピトープは、タンパク質の三次フォールディングにより並置される連続アミノ酸または非連続アミノ酸の両方から形成される可能性がある。“線状エピトープ”は、認識されるエピトープをアミノ酸の一次配列が構成するエピトープである。線状エピトープは、一般に少なくとも３、より一般的には少なくとも５、たとえば約８〜約１０個のアミノ酸をユニーク配列中に含む。
【００２２】
[0021]  “コンホメーショナルエピトープ”は、線状エピトープと異なり、エピトープを構成するアミノ酸の一次配列が認識されるエピトープの唯一の決定要素ではないエピトープである（たとえば、エピトープを規定する抗体によってそのアミノ酸の一次配列が必ずしも認識されないエピトープ）。一般に、コンホメーショナルエピトープは線状エピトープと対比して多い数のアミノ酸を含む。コンホメーショナルエピトープの認識に関して、結合性ドメインは、抗原、好ましくはペプチドもしくはタンパク質またはそのフラグメント（本発明に関して、結合性ドメインのうちの１つに対する抗原は５Ｔ４タンパク質である）の三次元構造を認識する。たとえば、タンパク質分子がフォールディングして三次元構造を形成した場合、コンホメーショナルエピトープを形成する特定のアミノ酸および／またはポリペプチド主鎖が並置されて、抗体がそのエピトープを認識できる状態になる。エピトープのコンホメーションを決定する方法には、たとえばｘ線結晶学、二次元核磁気共鳴分光法および部位特異的スピン標識法および電子常磁性共鳴分光法が含まれるが、これらに限定されない。さらに、提示する実施例に、特定の結合性ドメインが特定のタンパク質の１以上のエピトープクラスターに結合するかどうかを試験するためのさらに他の方法を記載する。
【００２３】
[0022]  本明細書中で用いる用語“エピトープクラスター”は、抗原の特定の連続範囲内にあるエピトープの全体を表わす。
【００２４】
[0023]  １観点において、ヒト５Ｔ４タンパク質中の各エピトープクラスターを非霊長類（たとえば、ネズミ）５Ｔ４抗原の各エピトープクラスターと交換した場合、ヒト５Ｔ４抗原結合性リガンド（たとえば、ｓｃＦｖ）は、１つの特異的エピトープクラスターに結合してその抗原への結合能を有意に喪失する。非霊長類（たとえば、ネズミ）５Ｔ４抗原の各エピトープクラスターとの交換によるこの結合喪失を試験する方法は、付随する実施例１〜３に記載されている。
【００２５】
[0024]  用語“特異的に認識する”、“を指向する”および“と反応する”は、本発明によれば、結合性ドメインがエピトープの少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、より好ましくは少なくとも４個のアミノ酸と特異的に相互作用および／または結合しうることを意味する。そのような結合は、“鍵と鍵穴の原理”の特異性により例示できる。
【００２６】
[0025]  本明細書中で用いる用語“特異的相互作用”、“特異的結合性”または“特異的に結合する”は、結合性ドメインが特定のタンパク質または抗原に対して明らかな親和性を示し、かつ一般に他のタンパク質または抗原との有意の交差反応性を示さないことを意味する。“明らかな”または優先的な結合には、１０−６Ｍ（ＫＤ）以上の親和性での結合が含まれる。好ましくは、結合親和性が約１０−１１〜１０−８Ｍ、好ましくは約１０−１１〜１０−９Ｍである場合、結合は特異的であるとみなされる。必要であれば、結合条件を変更することにより、特異的結合に実質的に影響を及ぼすことなく非特異的的結合を減らすことができる。結合性ドメインが標的と特異的に反応または結合するかどうかは、特に、それらの結合性ドメインのうちの１つと標的タンパク質または抗原との反応を、それらの結合性ドメインと他のタンパク質または抗原との反応と比較することによって、容易に試験できる。
【００２７】
[0026]  特異的結合は、結合性ドメインおよび抗原のアミノ酸配列中の特定のモチーフにより行なわれると考えられる。したがって、結合は、それらの一次、二次または三次構造の結果として、またそれらの構造の二次修飾の結果として達成される。抗原−相互作用−部位とそれの特異的抗原との特異的な相互作用は、その部位を抗原に結合させるだけの場合もある。あるいはさらに、抗原−相互作用−部位とそれの特異的抗原との特異的な相互作用は、たとえば抗原のコンホメーションの変化の誘導、抗原のオリゴマー化などによって信号の開始をもたらす場合がある。一例では、結合性ドメインは抗体である。
【００２８】
[0027]  用語“本質的に結合しない”は、本発明の二重特異的結合性分子の結合性ドメインが他のタンパク質を結合しないこと、すなわち他のタンパク質と３０％未満、好ましくは２０％未満、好ましくは１０％未満、好ましくは９、８、７、６または５％未満の交差反応性を示すことを意味する。
【００２９】
[0028]  本明細書中で用いる用語“交差−種特異性”、“交差−種認識”および“種間特異性”は、結合性ドメインがヒトおよびヒト以外の種、好ましくは霊長類の種の同じ標的分子に結合する能力を表わす。したがって、“交差−種特異性”および“種間特異性”は、異なる種に発現する同じ分子Ｘ（たとえば、５Ｔ４またはＣＤ３ε）に対する種間反応性を記述し、Ｘ（たとえば、５Ｔ４またはＣＤ３ε）以外の分子に対する反応性を記述するものではない。
【００３０】
[0029]  １観点において、本発明の結合性ドメインの交差−種特異性は、ヒトタンパク質、および霊長類におけるそれらに対応するアナログに限定される。たとえば、５Ｔ４アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）はカニクイザル(cynomolgus)５Ｔ４アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）またはアカゲザル(rhesus)５Ｔ４アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）にかなり類似すると思われる。したがって、カニクイザルまたはアカゲザルの５Ｔ４に対する結合性ドメインはヒト５Ｔ４を結合する可能性がある。
【００３１】
[0030]  したがって、１態様において、ヒト５Ｔ４、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示すヒト配列のアミノ酸残基１７０−２２２により形成される、５Ｔ４の細胞外タンパク質ドメインのエピトープクラスター４に結合する結合性ドメインは、カニクイザル５Ｔ４、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示すカニクイザル配列のアミノ酸残基１７０−２２２により形成される、５Ｔ４の細胞外タンパク質ドメインのエピトープクラスター４にも結合する。
【００３２】
[0031]  タンパク質（そのフラグメント、好ましくは生物活性フラグメントおよびペプチド、通常は３０個未満のアミノ酸をもつものを含む）は、共有ペプチド結合により互いに結合した１個以上のアミノ酸を含む（アミノ酸の鎖を生じる）。本明細書中で用いる用語“ポリペプチド”は、３０個を超えるアミノ酸からなる一群の分子を記述する。ポリペプチドはさらに、マルチマー、たとえばダイマー、トリマー、およびより高次のオリゴマー、すなわち１より多いポリペプチド分子からなるものを形成することができる。そのようなダイマー、トリマーなどを形成するポリペプチド分子は、同一であってもよく、同一でなくてもよい。そのようなマルチマーの対応する高次構造体は、したがってホモ−またはヘテロダイマー、ホモ−またはヘテロトリマーなどと呼ばれる。ヘテロマルチマーの例は抗体分子であり、それらは天然形態では２つの同一ポリペプチド軽鎖および２つの同一ポリペプチド重鎖からなる。用語“ポリペプチド”および“タンパク質”は、自然に修飾されたポリペプチド／タンパク質をも表わし、その際、修飾はたとえば翻訳後修飾、たとえばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などにより行なわれる。そのような修飾は当技術分野で周知である。
【００３３】
[0032]  １態様において、二重特異的結合性分子の第１結合性ドメインは５Ｔ４のエピトープクラスター２およびエピトープクラスター４に結合でき、その際、エピトープクラスター２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すヒト配列のアミノ酸残基７８−１３８により形成される、５Ｔ４の細胞外タンパク質ドメインに相当する。
【００３４】
[0033]  前記に述べたように、１観点において、二重特異的結合性分子の第１結合性ドメインはヒトおよびコモンマーモセット(Callithrix jacchus)、ワタボウシタマリン(Saguinus oedipus)またはリスザル(Saimiri sciureus)の５Ｔ４に結合でき、ならびに／あるいは第２結合性ドメインはヒトおよびコモンマーモセット、ワタボウシタマリンまたはリスザルのＣＤ３イプシロンに結合できる。この態様によれば、本発明の二重特異的結合性分子の一方または両方の結合性ドメインが哺乳動物目の霊長類のメンバーに対して交差−種特異性である。
【００３５】
[0034]  他の態様において、ヒト５Ｔ４に対する第１結合性ドメインの親和性は≦１５ｎＭ（好ましくは≦１０ｎＭ）である。
【００３６】
５Ｔ４に対してこの高い親和性を示す、エピトープクラスター４およびエピトープクラスター２と４内のエピトープに結合する本発明の二重特異的結合性分子は、エピトープクラスター７内のエピトープに同じ範囲の親和性でエピトープに結合する二重特異的結合性分子より卓越した細胞傷害活性を示した。
【００３７】
[0035]  １態様において、第１または第２結合性ドメインは抗体に由来する。他の態様において、両方の結合性ドメインが抗体に由来する。
【００３８】
[0036]  用語“抗体”の定義には、モノクローナル、キメラ、一本鎖、ヒト化およびヒト抗体など、ならびに抗体フラグメントなどの態様、特にＦａｂフラグメントが含まれる。抗体のフラグメントまたは誘導体にはさらに下記のものが含まれる：Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖフラグメント、または単一ドメイン抗体、たとえばドメイン抗体もしくはナノボディー、単一可変ドメイン抗体、もしくは１つの可変ドメインのみを含む免疫グロブリン単一可変ドメイン：それはＶＨＨ、ＶＨまたはＶＬであってもよく、それらは他のＶ領域またはドメインとは無関係に抗原またはエピトープを特異的に結合する；たとえば、Harlow and Lane (1988)および(1999), 前掲; Kontermann and Duebel, Antibody Engineering, Springer, 2nd ed. 2010、ならびにLittle, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009。そのような免疫グロブリン単一可変ドメインには、単離された抗体単一可変ドメインポリペプチドだけでなく、抗体単一可変ドメインポリペプチド配列の１以上のモノマーを含む、より大きなポリペプチドも含まれる。
【００３９】
[0037]  そのような抗体および／またはフラグメントの調製のために種々の方法が当技術分野で知られており、それらを使用できる。たとえば、（抗体）誘導体はペプチドミメティックにより調製できる。さらに、一本鎖抗体の調製のために記載された方法(特に下記を参照：US Patent 4,946,778、Kontermann and Duebel (2010), 前掲、およびLittle(2009), 前掲)を、選択したポリペプチド（単数または複数）に対して特異的な一本鎖抗体の調製に適合させることができる。また、トランスジェニック動物を用いて、本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質に対して特異的なヒト化抗体を発現させることもできる。モノクローナル抗体の調製のために、連続的な細胞系培養により産生される抗体を提供するいずれかの手法を使用できる。そのような手法の例には、ハイブリドーマ法(Koehler and Milstein Nature 256 (1975), 495-497)、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法(Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72)、およびヒトモノクローナル抗体を調製するためのＥＢＶハイブリドーマ法(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96)が含まれる。ＢＩＡｃｏｒｅシステムに採用されている表面プラズモン共鳴は、標的ポリペプチド、たとえばＣＤ３イプシロンのエピトープに結合するファージ抗体の有効性を高めるために使用できる(Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13)。本発明に関して、用語“抗体”が、後記に述べるように宿主において発現させることができる抗体構築体、たとえば特にウイルスまたはプラスミドベクターによりトランスフェクションおよび／またはトランスダクションすることができる抗体構築体を含むことも想定される。
【００４０】
[0038]  さらに、本明細書中で用いる用語“抗体”はまた、本明細書に記載する抗体の誘導体またはバリアントであってその記載する抗体と同じ特異性を示すものに関する。“抗体バリアント”の例には、非ヒト抗体のヒト化バリアント、“アフィニティー成熟”抗体(たとえば下記を参照：Hawkins et al. J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992)、およびLowman et al., Biochemistry 30, 10832-10837 (1991))、および変異したエフェクター機能（単数または複数）を備えた抗体変異体(たとえば下記を参照：US Patent 5,648,260、Kontermann and Duebel (2010), 前掲、およびLittle(2009), 前掲)が含まれる。
【００４１】
用語“抗原結合性ドメイン”、“抗原結合性フラグメント”および“抗体の結合性領域”は、本明細書中で用いる場合、抗体と抗原の特異的結合に関与するアミノ酸を含む抗体分子部分を表わす。抗体が特異的に認識して結合する抗原部分は、前記のように“エピトープ”と呼ばれる。前記のように、抗原結合性ドメインは、一般に抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含むことができる；しかし、それは両方を含まなければならないわけではない。たとえば、Ｆｄフラグメントは２つのＶＨ領域をもち、無傷の抗原結合性ドメインがもつ抗原結合機能の一部をしばしば保持する。抗体の抗原結合性フラグメントには下記のものが含まれる：（１）Ｆａｂフラグメント、すなわちＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインをもつ一価フラグメント；（２）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、すなわち２つのＦａｂフラグメントがヒンジ領域でジスルフィド橋により連結した二価フラグメント；（３）２つのＶＨおよびＣＨ１ドメインをもつＦｄフラグメント；（４）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインをもつＦｖフラグメント；（５）１つのＶＨドメインをもつｄＡｂフラグメント(Ward et al., (1989) Nature 341 :544-546)；（６）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（７）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）。Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨは別個の遺伝子によりコードされるが、それらは組換え法を用いて合成リンカーにより連結させることができ、これによりそれらをＶＬ領域とＶＨ領域が対になって一価分子を形成したタンパク質の一本鎖にすることができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；たとえば、Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA85:5879-5883を参照)。これらの抗体フラグメントは当業者に既知の一般的な手法を用いて得られ、それらのフラグメントは無傷の抗体と同じ方法で機能について評価される。
【００４２】
[0039]  本明細書中で用いる用語“モノクローナル抗体”は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を表わす；すなわち、この集団を構成する抗体は、少量存在する場合がある自然に起きる可能性のある変異および／または翻訳後修飾（たとえば、異性化、アミド化）を除いて、同一である。モノクローナル抗体は高特異性であり、単一の抗原部位を指向する。さらに、一般に異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体を含む一般的な（ポリクローナル）抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基を指向する。モノクローナル抗体は、それらの特異性のほかに、他の免疫グロブリンが混入していないハイブリドーマ培養により合成されるという点で有利である。修飾語“モノクローナル”は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特性を示しており、いずれか特定の方法による抗体調製が要求されると解釈すべきではない。たとえば、本発明により使用されるモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)が最初に記載したハイブリドーマ法により作成でき、あるいは組換えＤＮＡ法(たとえば、U. S. Patent No. 4,816,567を参照)により作成できる。“モノクローナル抗体”は、たとえばClackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)に記載される手法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。本発明におけるモノクローナル抗体には、具体的には“キメラ型の”抗体（免疫グロブリン）、すなわち重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であり、一方、その鎖の残部（単数または複数）は他の種に由来する抗体または他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であるもの、ならびに目的とする生物活性を示す限り、そのような抗体のフラグメントが含まれる(U. S. Patent No. 4,816, 567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984))。本発明において目的とする抗体には、ヒト以外の霊長類（たとえば、旧世界猿、類人猿など）に由来する可変ドメイン抗原結合性配列およびヒト定常領域配列を含む“プリミタイズド（霊長類化）(primitized)”抗体が含まれる。
【００４３】
[0040]  “ヒト化”形態の非ヒト（たとえば、ネズミ）抗体は、大部分がヒト配列であって最小限の非ヒト免疫グロブリン由来配列を含む、キメラ型の免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそのフラグメント（たとえば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合性サブ配列）である。ヒト化抗体は大部分がヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの超可変領域（ＣＤＲとも言う）からの残基が、目的とする特異性、親和性および能力をもつヒト以外の種（ドナー抗体）、たとえばマウス、ラットまたはウサギの超可変領域からの残基により置換されている。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基により置換されている。さらに、本明細書中で用いる“ヒト化抗体”は、レシピエント抗体にもドナー抗体にもみられない残基を含むこともできる。これらの修飾は、抗体性能をさらに改良および最適化するために行なわれる。ヒト化抗体は、適切には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、一般にヒト免疫グロブリンのものをも含むであろう。これ以上の詳細については、Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)を参照。
【００４４】
[0041]  用語“ヒト抗体”には、当技術分野で既知であるヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に実質的に対応する可変領域および定常領域をもつ抗体が含まれる；これには、たとえば、Kabatら(See Kabat, et al. (1991) 前掲)により記載されるものが含まれる。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（たとえば、インビトロでのランダムまたは部位特異的な変異形成により、またはインビボでの体細胞変異により導入された変異）を、たとえばＣＤＲ中、特にＣＤＲ３中に含むことができる。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基で置換された少なくとも１、２、３、４、５、またはそれ以上の位置をもつことができる。
【００４５】
[0042]  本明細書中で用いる“インビトロで作成した抗体”は、可変領域の全部または一部（たとえば、少なくとも１つのＣＤＲ）が非免疫細胞選択（たとえば、インビトロファージディスプレー、プロテインチップ、または候補配列をそれらが抗原に結合する能力について試験しうる他のいずれかの方法）で作成した抗体を表わす。したがってこの用語は、好ましくは免疫細胞におけるゲノム再配列により生成した配列を除外する。
【００４６】
[0043]  “二重特異性(bispecific)”または“二価抗体(bifunctional antibody)”は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位をもつ人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含めたさまざまな方法で作成できる。たとえば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990)を参照。抗体またはその抗原結合性フラグメントを得るための当業者に既知である多数の方法を利用できる。たとえば、抗体は組換えＤＮＡ法(U.S. Patent 4,816,567)を用いて調製できる。モノクローナル抗体は、既知の方法に従ってハイブリドーマの作成により調製することもできる(たとえば、Kohler and Milstein (1975) Nature, 256: 495-499を参照)。この方法で形成されたハイブリドーマを次いで標準法、たとえば酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）および表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））分析によりスクリーニングして、特定抗原と特異的に結合する抗体を産生する１以上のハイブリドーマを同定する。いずれかの形態の特定抗原、たとえば組換え抗原、天然形態、そのいずれかのバリアントまたはフラグメント、ならびにその抗原性ペプチドを、免疫原として使用できる。
【００４７】
抗体を作成するための代表的な１方法には、タンパク質発現ライブラリー、たとえばファージまたはリボソームディスプレーライブラリーのスクリーニングが含まれる。ファージディスプレーは、たとえばLadner et al., U.S. Patent No. 5,223,409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624-628に記載されている。
【００４８】
[0044]  ディスプレーライブラリーの使用のほかに、特定抗原を用いてヒト以外の動物、たとえばげっ歯類、たとえばマウス、ハムスターまたはラットを免疫化することができる。１態様において、このヒト以外の動物はヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。たとえば、マウス抗体産生を欠如したマウス系統をヒトＩｇ遺伝子座の大型フラグメントで工学的に操作することができる。ハイブリドーマ技術を用いて、目的とする特異性を備えた遺伝子に由来する抗原特異的モノクローナル抗体を作成し、そして選択することができる。たとえば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21、US 2003-0070185、WO 96/34096、およびWO96/33735を参照。
【００４９】
[0045]  モノクローナル抗体をヒト以外の動物から得ることができ、次いで修飾されたもの、たとえばヒト化、脱免疫、キメラ型のものを、当技術分野で既知の組換えＤＮＡ法を用いて調製することができる。キメラ抗体を作成するためのさまざまな方法が記載されている。たとえば下記を参照：Morrison et al., Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 81:6851, 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985; Cabilly et al., U.S. Patent No. 4,816,567; Boss et al., U.S. Patent No. 4,816,397; Tanaguchi et al., EP 171496; EP 173494, GB 2177096。ヒト化抗体は、たとえばヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現するけれども内因性マウス免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現できないトランスジェニックマウスを用いて調製することもできる。Winterは、本明細書に記載するヒト化抗体を作成するために使用できる代表的なＣＤＲグラフティング法を記載している(U.S. Patent No. 5,225,539)。特定のヒト抗体の全部のＣＤＲを非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置換することができ、あるいはＣＤＲの一部のみを非ヒトＣＤＲで置換することができる。ヒト化抗体が予定抗原に結合するのに必要な数のＣＤＲを置換しさえすればよい。
【００５０】
ヒト化抗体またはそのフラグメントは、抗原結合に直接的には関係しないＦｖ可変ドメインの配列を、ヒトＦｖ可変ドメインからの同等な配列で置換することにより作成できる。ヒト化抗体またはそのフラグメントを作成するための代表的な方法は、Morrison (1985) Science 229:1202-1207により; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214により;ならびにUS 5,585,089; US 5,693,761; US 5,693,762; US 5,859,205;およびUS 6,407,213により提供される。それらの方法には、重鎖または軽鎖のうち少なくとも１つからの免疫グロブリンＦｖ可変ドメインの全部または一部をコードする核酸配列の単離、操作および発現が含まれる。そのような核酸は、前記のように予定標的に対する抗体を産生するハイブリドーマから、また他の供給源から得ることができる。ヒト化抗体分子をコードするこの組換えＤＮＡを、次いで適切な発現ベクター内へクローニングすることができる。
【００５１】
[0046]  ヒト化抗体は、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖細胞系列置換および／または復帰変異の導入によって最適化することができる。そのような変化した免疫グロブリン分子は、当技術分野で既知の幾つかの手法のいずれかにより作成できる(たとえば、Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al, Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982；またEP 239 400の教示に従って作成できる)。
【００５２】
[0047]  抗体またはそのフラグメントは、ヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失または“脱免疫”により修飾することもできる；WO 98/52976およびWO 00/34317に開示された方法による。要約すると、抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインを、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて分析することができる；これらのペプチドは潜在Ｔ細胞エピトープである(WO 98/52976およびWO 00/34317に定義)。潜在Ｔ細胞エピトープの欠失のために、“ペプチドスレッディング(peptide threading)”と呼ばれるコンピューターモデリング法を適用でき、さらにヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースをＶＨおよびＶＬ配列中に存在するモチーフについて検索することができる；WO 98/52976およびWO 00/34317に記載。これらのモチーフは１８種類のＭＨＣクラスＩｌ  ＤＲアロタイプのいずれかに結合し、したがって潜在Ｔ細胞エピトープを構成する。検出された潜在Ｔ細胞エピトープを、可変ドメイン中の少数のアミノ酸残基の置換により、または好ましくは単一アミノ酸置換により、排除することができる。一般に、保存的置換が行なわれる。しばしば、ただし専らではなく、ヒト生殖細胞系列の抗体配列中の位置に共通のアミノ酸を使用できる。ヒト生殖細胞系列の配列は、たとえばTomlinson, et al. (1992) J. MoI. Biol. 227:776-798; J. MoI. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. et al. (1995) Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242;およびTomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 14:4628-4638に示されている。Ｖ  ＢＡＳＥディレクトリーは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的ディレクトリーを提供する(Tomlinson, LA. et al.により編集, MRC Centre for Protein Engineering, 英国ケンブリッジ)。これらの配列をヒト配列の供給源として、たとえばフレームワーク領域およびＣＤＲに使用できる。コンセンサスヒトフレームワーク領域も使用できる；たとえば、U.S. Patent No. 6,300,064に記載。
【００５３】
[0048]  ＶＨとＶＬの対合により、一緒に１つの抗原結合部位が形成される。ＶＨに対して最も近位にあるＣＨドメインをＣＨ１と表記する。各Ｌ鎖はＨ鎖に１つの共有ジスルフィド結合により連結し、一方、２つのＨ鎖はそのＨ鎖のイソ型に応じて１以上のジスルフィド結合により互いに連結している。ＶＨおよびＶＬドメインはフレームワーク領域と呼ばれる比較的保存された配列の４領域からなり（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）、これらが３つの超可変配列領域（相補性決定領域、ＣＤＲ）の骨格を形成する。ＣＤＲは、抗体と抗原の特異的相互作用に関与する大部分の残基を含む。ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる。したがって、重鎖上のＣＤＲ構成要素はＨ１、Ｈ２、およびＨ３と呼ばれ、一方、軽鎖上のＣＤＲ構成要素はＬ１、Ｌ２、およびＬ３と呼ばれる。
【００５４】
[0049]  用語“可変”は、免疫グロブリンドメインの、可変性を示しかつその抗体の特異性および結合親和性の決定に関係する部分を表わす（すなわち、“可変ドメイン（単数または複数）”）。可変性は抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているわけではない；それは重鎖および軽鎖の可変領域それぞれのサブドメインに集中している。これらのサブドメインは“超可変”領域または“相補性決定領域”（ＣＤＲ（単数または複数））と呼ばれる。可変ドメインのより保存された（すなわち、超可変性ではない）部分は、“フレームワーク”領域（ＦＲＭ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ４つのＦＲＭ領域を含み、これらは大部分がβシートコンフィギュレーションをとり、３つの超可変領域により連結されて、βシート構造を連結する（場合によりその一部を形成する）ループを形成する。それぞれの鎖中の超可変領域はＦＲＭによって互いに近接して保持され、他方の鎖からの超可変領域と共に抗原結合部位の形成に寄与する(参照：Kabat et al., 前掲)。定常ドメインは抗原結合に直接的には関係しないが、種々のエフェクター機能、たとえば抗体依存性の細胞仲介細胞傷害性および補体活性化を示す。
【００５５】
[0050]  本発明の二重特異的結合性分子については、第１および第２ドメインが（ｓｃＦｖ）２、（単一ドメインｍＡｂ）２、ｓｃＦｖ−単一ドメインｍＡｂ、ディアボディー、またはそのオリゴマーの群から選択される分子を形成していることも好ましい。
【００５６】
[0051]  用語“ＣＤＲ”、およびそれの複数“ＣＤＲ類”は、相補性決定領域（ＣＤＲ）を表わし、それらのうち３つが軽鎖可変領域（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）の結合性を形成し、３つが重鎖可変領域（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）の結合性を形成する。ＣＤＲ類は抗体分子の機能活性に寄与し、骨格領域またはフレームワーク領域を構成するアミノ酸残基により分離されている。厳密な確定的ＣＤＲ境界および長さは、異なる分類およびナンバリング方式の対象となっている。したがって、ＣＤＲ類はKabat、Chothia、コンタクト(contact)、または本明細書に記載するナンバリング方式を含む他のいずれかの定義により表わすことができる。境界の相異にもかかわらず、これらの方式はそれぞれ、可変配列内のいわゆる“超可変領域”を構成するものにおいて、ある程度のオーバーラップをもつ。したがって、これらの方式に従ったＣＤＲ定義は、長さおよび隣接フレームワーク領域との境界領域が異なる可能性がある。たとえば、Kabat、Chothia、および／またはMacCallumら(Kabat et al., 前掲; Chothia et al., J. MoI. Biol, 1987, 196: 901;およびMacCallum et al, J. MoI. Biol, 1996, 262: 732)を参照。しかし、いわゆるKabat方式に従ったナンバリングが好ましい。
【００５７】
[0052]  用語“アミノ酸”または“アミノ酸残基”は、一般に当技術分野で認識されている定義をもつアミノ酸、たとえば下記のものからなる群から選択されるアミノ酸を表わす：アラニン（ＡｌａまたはＡ）；アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）；アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）；アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）；システイン（ＣｙｓまたはＣ）；グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）；グリシン（ＧｌｙまたはＧ）；ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；イソロイシン（ＨｅまたはＩ）：ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）；リジン（ＬｙｓまたはＫ）；メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）；フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）；プロリン（ＰｒｏまたはＰ）；セリン（ＳｅｒまたはＳ）；トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）；チロシン（ＴｙｒまたはＹ）；およびバリン（ＶａｌまたはＶ）；ただし、修飾アミノ酸、合成アミノ酸、または稀アミノ酸も所望により使用できる。一般に、アミノ酸は非極性側鎖をもつもの（たとえば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）；負に荷電した側鎖をもつもの（たとえば、Ａｓｐ、ＧＩｕ）；正に荷電した側鎖をもつもの（たとえば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）；または非荷電極性側鎖をもつもの（たとえば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒ）として分類できる。
【００５８】
[0053]  用語“超可変領域”（“相補性決定領域”またはＣＤＲとしても知られる）は、本明細書中で用いる場合、免疫グロブリンのＶ領域ドメイン内にある抗体アミノ酸残基（通常は、極度の配列可変性をもつ３または４つの短い領域）であって、抗原結合部位を形成し、抗原特異性の主要な決定基であるものを表わす。ＣＤＲ残基を同定するためには少なくとも２つの方法がある：（１）交差−種配列可変性に基づく方法(すなわち、Kabat et al., 前掲);および（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づく方法(Chothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987))。ただし、２つの残基同定法がオーバーラップするけれども同一ではない領域を定義しているという点で、それらを組み合わせてハイブリッドＣＤＲを定義することができる。しかし、一般にＣＤＲ残基は、好ましくはいわゆるKabat（ナンバリング）方式に従って同定される。
【００５９】
[0054]  用語“フレームワーク領域”は、抗体可変領域の当技術分野で認識されている部分であって、より変動性（すなわち、超可変性）のＣＤＲ間にある部分を表わす。そのようなフレームワーク領域は、一般にフレームワーク１〜４（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）と呼ばれ、三次元空間内に６つのＣＤＲ（重鎖から３つ、および軽鎖から３つ）を提示して抗原結合性表面を形成するための骨格を提供する。
【００６０】
[0055]  一般に、ＣＤＲはカノニカル構造(canonical structure)として分類できるループ構造を形成する。用語“カノニカル構造”は、抗原結合性（ＣＤＲ）ループが形成する主要な鎖コンホメーションを表わす。比較構造研究から、６つのうち５つの抗原結合性ループがごく限られたレパートリーの可能なコンホメーションをもつことが見出された。各カノニカル構造は、ポリペプチド主鎖のねじれ角により特徴づけることができる。したがって、抗体間の対応するループは、ループの大部分における高いアミノ酸変動性にもかかわらず、きわめて類似する三次元構造をもつ可能性がある(Chothia and Lesk, J. MoI. Biol., 1987, 196: 901; Chothia et al, Nature, 1989, 342: 877; Martin and Thornton, J. MoI. Biol, 1996, 263: 800；これらのそれぞれを全体として援用する)。さらに、形成されたループ構造とそれを囲むアミノ酸配列の間に関係がある。特定のカノニカルクラスのコンホメーションは、ループの長さ、ならびにそのループの鍵となる位置および保存されたフレームワーク内（すなわち、ループの外側）に存在するアミノ酸によって決まる。したがって、特定のカノニカルクラスへの割当ては、鍵となるこれらのアミノ酸残基の存在に基づいて行なうことができる。用語“カノニカル構造”は、たとえばKabat (Kabat et al, 前掲)が分類したように、抗体の直線配列についての考慮も含むことができる。Kabatナンバリングスキーム（方式）は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を一貫した様式でナンバリングするために広く受け入れられている基準であり、本明細書の他の箇所にも述べるように本発明に適用する好ましいスキームである。抗体のカノニカル構造を決定するために、さらに他の構造検討も採用できる。たとえば、Kabatナンバリングによって完全には反映されない相異を、Chothiaらのナンバリング方式により記述し、ならびに／あるいは他の手法、たとえば結晶学および二次元または三次元コンピューターモデリングによって解明することができる。したがって、ある抗体配列は、特に、適宜なシャシー(chassis)配列を同定しうるカノニカルクラスに入れることができる｛たとえば、多様なカノニカル構造をライブラリーに含めるという希望に基づいて）。抗体アミノ酸配列のKabatナンバリング、およびChothia et al.(前掲)により記載された構造検討、ならびに抗体構造のカノニカル面を解釈するためのそれらの意味合いは、文献に記載されている。
【００６１】
[0056]  ＣＤＲ３は、一般に抗体の結合部位内の分子多様性の最大の根源である。たとえばＨ３は、アミノ酸残基２個程度の短いものか、またはアミノ酸残基２６個を超える可能性がある。種々のクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元コンフィギュレーションが当技術分野で周知である。抗体構造の総説については、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988を参照。各サブユニット構造、たとえばＣＨ、ＶＨ、ＣＬ、ＶＬ、ＣＤＲ、ＦＲ構造には活性フラグメントが含まれることは当業者に認識されるであろう；たとえば、ＶＨ、ＶＬまたはＣＤＲサブユニットの、抗原に結合する部分、すなわち抗原結合性フラグメント、あるいは、たとえばＣＨサブユニットの、たとえばＦｃ受容体および／または補体に結合および／または活性化する部分。ＣＤＲは一般にKabat  ＣＤＲと呼ばれる；Sequences of Proteins of immunological Interest, US Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et alに記載。抗原結合部位を特徴づける他の基準は、Chothiaが記載した超可変ループと呼ばれるものである。たとえば、Chothia, et al. (1987; J. MoI. Biol. 227:799-817;およびTomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 4628-4638を参照。さらに他の基準は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアが採用しているＡｂＭ定義である。全般的に、たとえばProtein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains., Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg)を参照。Kabaｔ  ＣＤＲに関して記載された態様の代わりに、Chothia超可変ループまたはＡｂＭ定義ループに関する類似の記述関係を用いて実装できる。
【００６２】
[0057]  組立ておよび体細胞変異後の抗体遺伝子の配列は著しく多様であり、これらの多様化した遺伝子は１０１０の異なる抗体分子をコードすると推定される(Immunoglobulin Genes, 2nd ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995)。したがって、免疫系は免疫グロブリンのレパトア(repertoire)を備えている。用語“レパトア”は、全体的または部分的に、少なくとも１つの免疫グロブリンをコードする少なくとも１つの配列に由来する、少なくとも１つのヌクレオチド配列を表わす。その配列（単数または複数）は、インビボでの重鎖のＶ、ＤおよびＪセグメントならびに軽鎖のＶおよびＪセグメントの再配列により生成する可能性がある。あるいは、その配列（単数または複数）は、それに対して再配列が起きるもの（たとえばインビトロ刺激）に応答した細胞から生成する可能性がある。あるいは、その配列（単数または複数）の全部または一部をＤＮＡスプライシング、ヌクレオチド合成、変異形成、および他の方法により得ることができる；たとえば、U.S. Patent 5,565,332を参照。レパトアは１つの配列のみを含む場合があり、あるいは遺伝的に多様な集合体中のものを含めた複数の配列を含む場合がある。
【００６３】
[0058]  １態様において、二重特異的結合性分子の第１結合性ドメインはＶＬ領域およびＶＨ領域を含み、その際、ＶＨ領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、２５、３５、４９、８９、９９、１０９、１１９、１２９、１４３、１５７および１６７からなる群から選択されるＣＤＲ−Ｈ３を含む。他の場合、本発明の二重特異的結合性分子は、下記のものから選択されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域、ならびにＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域を含む：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７に示すＣＤＲ−Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８に示すＣＤＲ−Ｌ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４に示すＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２６に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７に示すＣＤＲ−Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２８に示すＣＤＲ−Ｌ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２３に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２４に示すＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２５に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３６に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３７に示すＣＤＲ−Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３８に示すＣＤＲ−Ｌ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３３に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３４に示すＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３５に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５０に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５１に示すＣＤＲ−Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５２に示すＣＤＲ−Ｌ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４７に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４８に示すＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４９に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９０に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９１に示すＣＤＲ−Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９２に示すＣＤＲ−Ｌ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８７に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８８に示すＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８９に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１００に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０１に示すＣＤＲ−Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０２に示すＣＤＲ−Ｌ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９７に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９８に示すＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９９に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｇ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１０に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１１に示すＣＤＲ−Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１２に示すＣＤＲ−Ｌ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０７に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０８に示すＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０９に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｈ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２０に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２１に示すＣＤＲ−Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２２に示すＣＤＲ−Ｌ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１７に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１８に示すＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１９に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３０に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３１に示すＣＤＲ−Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３２に示すＣＤＲ−Ｌ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２７に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２８に示すＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２９に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｊ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４４に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４５に示すＣＤＲ−Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４６に示すＣＤＲ−Ｌ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４１に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４２に示すＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４３に示すＣＤＲ−Ｈ３；
（ｋ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５８に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５９に示すＣＤＲ−Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６０に示すＣＤＲ−Ｌ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５５に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５６に示すＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５７に示すＣＤＲ−Ｈ３；ならびに
（ｌ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６８に示すＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６９に示すＣＤＲ−Ｌ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７０に示すＣＤＲ−Ｌ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６５に示すＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６６に示すＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６７に示すＣＤＲ−Ｈ３。
【００６４】
[0059]  他の態様において、二重特異的結合性分子の第１結合性ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４に示すＶＬ領域からなる群から選択されるＶＬ領域を含む。
【００６５】
[0060]  あるいは、第１結合性ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３に示すＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域を含む。
【００６６】
[0061]  １態様において、二重特異的結合性分子の第１結合性ドメインは、下記のものからなる群から選択されるＶＬ領域およびＶＨ領域を含む：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示すＶＬ領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示すＶＨ領域；
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に示すＶＬ領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示すＶＨ領域；
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２に示すＶＬ領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１に示すＶＨ領域；
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６に示すＶＬ領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に示すＶＨ領域；
（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６に示すＶＬ領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５に示すＶＨ領域；
（ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６に示すＶＬ領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５に示すＶＨ領域；
（ｇ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６に示すＶＬ領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５に示すＶＨ領域；
（ｈ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６に示すＶＬ領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５に示すＶＨ領域；
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６に示すＶＬ領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５に示すＶＨ領域；
（ｊ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０に示すＶＬ領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９に示すＶＨ領域；
（ｋ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４に示すＶＬ領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３に示すＶＨ領域；ならびに
（ｌ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４に示すＶＬ領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３に示すＶＨ領域。
【００６７】
[0062]  一例において、第１結合性ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６８】
[0063]  本発明の二重特異的結合性分子は、好ましくは“単離された”二重特異的結合性分子である。“単離された”は、本明細書に開示する二重特異的結合性分子を記述するために用いる場合、それの調製環境の成分から同定、分離および／または回収された二重特異的結合性分子を意味する。好ましくは、単離された二重特異的結合性分子は、それの調製環境からの他のすべての成分を付随しない。それの調製環境の混在成分、たとえば組換えトランスフェクションした細胞から生じるものは、一般に診断または療法における使用を妨げると思われる物質であり、これには酵素、ホルモン、および他のタンパク質または非タンパク質系の溶質を含めることができる。好ましい態様において、二重特異的結合性分子は（１）スピニングカップ配列決定装置(spinning cup sequenator)を用いて少なくとも１５残基のＮ末端または内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度にまで、あるいは（２）非還元または還元条件下でクーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質度にまで、精製されるであろう。しかし、通常は単離された抗体は少なくとも１回の精製段階によって調製されるであろう。
【００６９】
[0064]  本明細書に記載する二重特異的結合性分子のアミノ酸配列修飾が考慮される。たとえば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが好ましい場合がある。二重特異的結合性分子のアミノ酸配列バリアントは、二重特異的結合性分子の核酸に適宜なヌクレオチド変化を導入することにより、またはペプチド合成により調製される。
【００７０】
[0065]  そのような修飾には、たとえば二重特異的結合性分子のアミノ酸配列からの残基の欠失、配列中への残基の挿入、および／または配列内の残基の置換が含まれる。欠失、挿入および置換のいずれかの組合わせを行なって、最終構築体に到達する；ただし、その最終構築体は目的特性を保有する。アミノ酸の変化が二重特異的結合性分子の翻訳後プロセスを変更する場合もある；たとえば、グリコシル化部位の数または位置の変化。好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸をＣＤＲにおいて置換でき、一方、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２５個のアミノ酸をＦＲにおいて置換できる。それらの置換は、好ましくは本明細書に記載するように保存的置換である。さらに、または代わりに、１、２、３、４、５または６個のアミノ酸を各ＣＤＲにおいて挿入または欠失させることができ（もちろん、それらの長さに応じて）、一方、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２５個のアミノ酸をＦＲにおいて挿入または欠失させることができる。
【００７１】
[0066]  変異形成のために好ましい二重特異的結合性分子の特定の残基または領域を同定するのに有用な方法は、“アラニンスキャンニング変異形成”と呼ばれる；Cunningham and Wells in Science, 244: 1081-1085 (1989)に記載。この方法では、二重特異的結合性分子内の残基または一群の標的残基を同定し（たとえば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕなどの荷電残基）、中性または負電荷のアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）により置換して、それらのアミノ酸とエピトープの相互作用を行なわせる。
【００７２】
[0067]  次いで、置換に対して機能感受性を示すアミノ酸位置を、その置換部位にさらなるバリアントを導入するか、またはその代わりに他のバリアントを導入することによって、改良する。したがって、アミノ酸配列バリエーションを導入するための部位を前決定するが、その変異自体の性質を前決定する必要はない。たとえば、特定部位における変異の性能を分析するためには、アラニンスキャンニングまたはランダム変異形成を標的コドンまたは領域において実施し、発現した二重特異的結合性分子バリアントを目的活性についてスクリーニングする。
【００７３】
[0068]  好ましくは、アミノ酸配列挿入には、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合体、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列間挿入が含まれる。二重特異的結合性分子の挿入バリアントには、抗体のＮ末端もしくはＣ末端を酵素に融合させたもの、または抗体の血清中半減期を延長するポリペプチドに融合させたものが含まれる。
【００７４】
[0069]  他のタイプのバリアントは、アミノ酸置換バリアントである。これらのバリアントは、二重特異的結合性分子中に、異なる残基で置換されたアミノ酸残基を好ましくは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個含む。置換変異形成のための最も重要な部位には、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ、特に超可変領域が含まれるが、重鎖および／または軽鎖中のＦＲの変更も考慮される。
【００７５】
[0070]  たとえば、ＣＤＲ配列が６個のアミノ酸を含む場合、これらのアミノ酸のうち１、２または３個を置換することが想定される。同様に、ＣＤＲ配列が１５個のアミノ酸を含む場合、これらのアミノ酸のうち１、２、３、４、５または６個を置換することが想定される。
【００７６】
[0071]  一般に、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲのうち１以上または全部においてアミノ酸を置換する場合、こうして得られた“置換された”配列は、“元の”ＣＤＲ配列と少なくとも、６０％、より好ましくは６５％、よりさらに好ましくは７０％、特に好ましくは７５％、より特に好ましくは８０％同一であることが好ましい。これは、“置換された”配列との同一度がＣＤＲの長さに依存することを意味する。たとえば、５個のアミノ酸をもつＣＤＲは、少なくとも１個の置換されたアミノ酸をもつためには、それの置換された配列と好ましくは８０％同一である。したがって、二重特異的結合性分子のＣＤＲ類はそれらの置換された配列との同一度が異なる可能性がある；たとえば、ＣＤＲＬ１は８０％の同一度をもち、一方、ＣＤＲＬ３は９０％の同一度をもつ可能性がある。
【００７７】
[0072]  好ましい置換（substitutionまたはreplacement）は、保存的置換である。しかし、二重特異的結合性分子が第１結合性ドメインを介して５Ｔ４に結合しかつ第２結合性ドメインを介してＣＤ３εに結合する能力を保持し、および／またはそれのＣＤＲ類がこうして置換された配列との同一度をもつ（“元の”ＣＤＲ配列と少なくとも、６０％、より好ましくは６５％、よりさらに好ましくは７０％、特に好ましくは７５％、より特に好ましくは８０％同一である）限り、いかなる置換も想定される（非保存的置換、または下記の表１中に挙げる“代表的置換のうち１以上を含む）。
【００７８】
[0073]  保存的置換を表１の“好ましい置換”の項目の下に示す。そのような置換の結果、生物活性が変化すれば、次いで表１中の“代表的置換”と称する、または後記にアミノ酸クラスに関してさらに記載する、より実質的な変化を導入し、そして生成物を目的特性についてスクリーニングすることができる。
【００７９】
表１．アミノ酸置換
【００８０】
【表１】
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【００８１】
[0074]  本発明の結合性分子の生物学的特性の実質的修飾は、下記を維持することに対するそれらの影響が有意に異なる置換を選択することにより達成される：（ａ）置換領域におけるポリペプチド主鎖の、たとえばシートもしくはらせんコンホメーションとしての構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩。天然残基は、共通の側鎖特性に基づいてグループ分けされる：（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｉｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【００８２】
[0075]  非保存的置換は、これらのクラスのうち１つのメンバーを他のクラスのものに交換することを伴なうであろう。二重特異的結合性分子の適正なコンホメーションの保持に関係のないいずれかのシステイン残基を、一般にセリンで置換して、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を阻止することができる。逆に、システイン結合（単数または複数）を抗体に付加して、それの安定性を改善することができる（特に、抗体が抗体フラグメント、たとえばＦｖフラグメントである場合）。
【００８３】
[0076]  特に好ましいタイプの置換バリアントは、親抗体（たとえば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１個以上の超可変領域残基の置換を伴なう。一般に、さらに進化させるために選択した生成バリアント（単数または複数）は、それらが由来する親抗体と比較して改善された生物学的特性をもつであろう。そのような置換バリアントを作成するための好都合な方法は、ファージディスプレーを用いる親和性成熟(affinity maturation)を伴なう。要約すると、幾つかの超可変領域部位（たとえば、６〜７つの部位）を変異させて、各部位における可能なあらゆるアミノ酸置換体を作成する。こうして作成した抗体バリアントを、線維状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ生成物への融合体として一価様式でディスプレーする。ファージディスプレーされたこれらのバリアントを、次いで本明細書に開示するようにそれらの生物活性（たとえば、結合親和性）についてスクリーニングする。修飾のための候補となる超可変領域を同定するために、アラニンスキャンニング変異形成を実施して、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定することができる。あるいは、またはさらに、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、結合性ドメインとたとえばヒト５Ｔ４とのコンタクト点を同定することが有益な可能性がある。そのようなコンタクト残基および隣接残基は、本明細書に詳述した手法に従った置換のための候補である。そのようなバリアントが作成されると、そのバリアントのパネルに本明細書に記載するスクリーニングを施し、１以上の関連アッセイにおいて卓越した特性を備えた抗体をさらなる進化のために選択することができる。
【００８４】
[0077]  二重特異的結合性分子の他の修飾が本発明において考慮される。たとえば、二重特異的結合性分子を、多様な非タンパク質ポリマーの１つ、たとえばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーに連結させることができる。二重特異的結合性分子を、たとえばコアセルベーション法または界面重合により調製されたマイクロカプセル（たとえば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセル、およびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）内に、コロイド薬物送達システム（たとえば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）内に、またはマクロエマルジョン中に、捕獲することもできる。そのような手法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)に示されている。
【００８５】
[0078]  本明細書に開示する二重特異的結合性分子は、イムノリポソームとして配合することもできる。“リポソーム”は、多様なタイプの脂質、リン脂質および／または界面活性剤から構成される小さなベシクルであり、薬物を哺乳動物に送達するのに有用である。リポソームの成分は一般に、生体膜の脂質配置と同様に２層形成で配置される。抗体を収容したリポソームは、当技術分野で既知の方法により調製される；たとえば下記に記載：Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al. , Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); U. S. Pat. No. 4,485,045および4,544,545;ならびにW097/38731, 1997年10月23日公開。延長された循環時間をもつリポソームが、U. S. Patent No. 5,013, 556に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法により調製できる。規定ポアサイズのフィルターを通してリポソームを押し出して、希望する直径をもつリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントを、Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)の記載に従ってジスルフィド交換反応によりリポソームにコンジュゲートさせることができる。化学療法剤を場合によりリポソーム内に収容する。参照：Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989)。
【００８６】
[0079]  組換え法を用いる場合、二重特異的結合性分子は、細胞内、ペリプラズム（細胞周辺腔）において産生され、あるいは培地中へ直接分泌される可能性がある。二重特異的結合性分子が細胞内で産生される場合、第１段階として、粒状の細胞屑（宿主細胞または細胞溶解断片のいずれか）を、たとえば遠心または限外濾過により除去する。Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)には、大腸菌(E coli)のペリプラズムに分泌された抗体を単離する方法が記載されている。
【００８７】
[0080]  細胞から調製した二重特異的結合性分子の組成物は、たとえばヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製法である。
【００８８】
[0081]  さらに他の観点において、本発明は、本発明の二重特異的結合性分子をコードする核酸配列に関する。
【００８９】
その核酸分子は好ましくはベクター中に含まれ、ベクターは好ましくは宿主細胞内に含まれる。その宿主細胞は、たとえば本発明の核酸配列で形質転換またはトランスフェクションした後、二重特異的結合性分子を発現できる。その目的のために、核酸分子は作動可能な状態で制御配列と連結している。
【００９０】
[0082]  本明細書中で用いる用語“宿主細胞”は、本発明の二重特異的結合性分子をコードする核酸を形質転換、トランスフェクションなどにより導入した細胞を表わすものとする。そのような用語はその特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在子孫をも表わすことを理解すべきである。後続世代において変異または環境影響のためある修飾が起きる可能性があるので、そのような子孫は事実、親細胞と同一ではない可能性があるが、それでもなお本明細書中で用いるこの用語の範囲に含まれる。
【００９１】
[0083]  本明細書中で用いる用語“発現”は、本発明の二重特異的結合性分子の産生に関係するいずれかの段階を含み、これには転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌が含まれるが、これらに限定されない。用語“制御配列”は、作動可能な状態で連結したコード配列が特定の宿主生物において発現するのに必要なＤＮＡ配列を表わす。原核細胞に適した制御配列には、たとえばプロモーター、場合によりオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
【００９２】
[0084]  核酸は、それが他の核酸配列と機能的関係に置かれている場合は“作動可能な状態で連結している”。たとえば、プレ配列または分泌リーダーに対するＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現すれば、そのポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能な状態で連結している；プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を与えれば、そのコード配列に作動可能な状態で連結している；リボソーム結合部位は、それが転写を促進するような位置にあれば、コード配列に作動可能な状態で連結している。一般に、“作動可能な状態で連結している”は、連結されているＤＮＡが連続していること、また分泌リーダーの場合には連続しかつリーディングフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続している必要はない。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合、常法に従って合成オリゴヌクレオチドであるアダプターまたはリンカーを用いる。
【００９３】
[0085]  適切な宿主細胞には原核細胞および真核宿主細胞が含まれ、これには酵母、真菌、昆虫細胞、ならびに哺乳動物細胞が含まれる。
【００９４】
[0086]  本発明の二重特異的結合性分子は、細菌において産生させることができる。本発明の二重特異的結合性分子の発現後、好ましくはその二重特異的結合性分子を可溶性画分中の大腸菌細胞ペーストから単離し、たとえばアフィニティークロマトグラフィーおよび／またはサイズ排除により精製することができる。最終精製は、たとえばＣＨＯ細胞において発現した抗体を精製するための方法と同様に実施できる。原核細胞のほかに、真核細胞微生物、たとえば繊維状真菌または酵母が、本発明の二重特異的結合性分子に適したクローニングまたは発現の宿主である。下等真核細胞宿主微生物のうちでは、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、すなわち一般的なパン酵母が最も一般的に用いられる。しかし、他の多数の属、種、および株を一般的に利用でき、本発明に有用である；たとえば、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe);クルイベロミセス属(Kluyveromyces)宿主、たとえばクルイベロミセス・ラクティス(K. lactis)、クルイベロミセス・フラギリス(K. fragilis) (ATCC 12424)、クルイベロミセス・ブルガリカス(K. bulgaricus) (ATCC 16045)、クルイベロミセス・ウィッケラミイ(K. wickeramii) (ATCC 24178)、クルイベロミセス・ワルティイ(K. waltii) (ATCC 56500)、クルイベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum) (ATCC 36906)、クルイベロミセス・サーモトレランス(K. thermotolerans)、およびクルイベロミセス・マルキシアヌス(K. marxianus);ヤロウィア属(yarrowia) (EP 402 226);ピチア・パストリス(Pichia pastoris) (EP 183 070);カンジダ属(Candida);トリコデルマ・リーシア(Trichoderma reesia) (EP 244 234);ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa);シュワニオミセス属(Schwanniomyces)、たとえばシュワニオミセス・オッシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis);ならびに繊維状真菌、たとえばアカパンカビ属(Neurospora)、アオカビ属(Penicillium)、トリポクラジウム属(Tolypocladium)、ならびにコウジカビ属(Aspergillus)宿主、たとえば為巣性こうじ菌(A. nidulans)および黒色こうじ菌(A. niger)。
【００９５】
[0087]  本発明のグリコシル化された二重特異的結合性分子、好ましくは抗体由来の二重特異的結合性分子を発現させるのに適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫の細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株および変種、ならびに対応するヨトウガ(Spodoptera frugiperda)（毛虫）、ネッタイシマカ(Aedes aegypti)（蚊）、セスジヤブカ(Aedes albopictus)（蚊）、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)（ミバエ）、およびカイコガ(Bombyx mori)などの宿主からの許容昆虫宿主細胞が同定された。トランスフェクションのための多様なウイルス株、たとえばキンウワバ(Autographa californica)ＮＰＶ（核多角体病ウイルス）のＬ−１変種、およびカイコガＮＰＶのＢｍ−５株を公に入手でき、そのようなウイルスを本発明に従って、特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのためのウイルスとして使用できる。
【００９６】
[0088]  ワタ、トウモロコシ、バレイショ、ダイズ、ペチュニア、トマト、シロイヌナズナ属(Arabidopsis)およびタバコの植物細胞培養物も宿主として利用できる。タンパク質を植物細胞培養物において産生させるのに有用なクローニングベクターおよび発現ベクターは、当業者に既知である。たとえば下記を参照：Hiatt et al., Nature (1989) 342: 76-78、Owen et al. (1992) Bio/Technology 10: 790-794、Artsaenko et al. (1995) The Plant J 8: 745-750、およびFecker et al. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986。
【００９７】
[0089]  しかし、脊椎動物細胞が最も重要であり、培養における脊椎動物細胞の増殖（組織培養）がルーティンな方法になっている。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は下記のものである：ＳＶ４０により形質転換したサル腎ＣＶ１系列（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎系列（２９３細胞、または懸濁培養における増殖のためにサブクローニングした２９３細胞；Graham et al. , J. Gen Virol. 36: 59 (1977));ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ, Urlaub et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980));マウスセルトリ細胞（ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980));サル腎細胞（ＣＶＩ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット(buffalo rat)肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，１４１３  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５  １）；ＴＲＩ細胞(Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. 383 : 44-68 (1982))；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞癌系列（Ｈｅｐ  Ｇ２）。
【００９８】
[0090]  組換え法を用いる場合、二重特異的結合性分子は、細胞内、ペリプラズムにおいて産生され、あるいは培地中へ直接分泌される可能性がある。二重特異的結合性分子が細胞内で産生される場合、第１段階として、粒状の細胞屑（宿主細胞または細胞溶解断片のいずれか）を、たとえば遠心または限外濾過により除去する。Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)には、大腸菌のペリプラズムに分泌された抗体を単離する方法が記載されている。要約すると、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間かけて融解する。細胞屑を遠心により除去することができる。抗体が培地中へ分泌される場合、一般にまずそのような発現系からの上清を、市販のタンパク質濃縮用フィルター、たとえばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットで濃縮する。プロテアーゼ阻害剤、たとえばＰＭＳＦを上記段階のいずれかで装入してタンパク質分解を阻害し、かつ抗生物質を装入して外来性汚染生物の増殖を阻害することができる。
【００９９】
[0091]  宿主細胞から産生された本発明の二重特異的結合性分子は、たとえばヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製法である。
【０１００】
[0092]  アフィニティーリガンドを付着させるマトリックスは、最も多くの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用できる。機械的に安定なマトリックス、たとえば制御ポアガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースを用いて達成できるものより速い流速およびより短い処理時間を可能にする。本発明の二重特異的結合性分子がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸＭｒｅｓｉｎ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ニュージャージー州フィリプスバーグ）が精製のために有用である。タンパク質精製のための他の手法、たとえばイオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿法、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（たとえば、ポリアスパラギン酸カラム）上でのクロマトグラフィー、クロマト−フォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿法も、回収すべき抗体に応じて利用できる。
【０１０１】
[0093]  他の観点において、本発明の二重特異的結合性分子を調製するための方法が提供され、その方法は、本発明において定める宿主細胞をその二重特異的結合性分子が発現しうる条件下で培養し、そして産生された二重特異的結合性分子を培養物から回収することを含む。
【０１０２】
[0094]  別態様において、本発明の二重特異的結合性分子または本発明方法に従って調製された二重特異的結合性分子を含む組成物が提供される。好ましくは、この組成物は医薬組成物である。
【０１０３】
[0095]  本明細書中で用いる用語“医薬組成物”は、患者、好ましくはヒト患者に投与するための組成物に関する。特に好ましい本発明の医薬組成物は、本発明の二重特異的結合性分子を含む。好ましくは、医薬組成物は、キャリヤー、安定剤および／または賦形剤の適切な配合物を含む。好ましい態様において、医薬組成物は非経口、経皮、腔内、動脈内、クモ膜下および／または鼻内投与のための組成物、あるいは組織内への直接注射によるものを含む。特にその組成物を注入または注射により患者に投与することが想定される。適切な組成物の投与は、種々の方法により、たとえば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与により行なうことができる。特に、本発明は適切な組成物の連続投与(uninterrupted administration)を提供する。限定ではない例として、連続投与、すなわち持続投与(continuous administration)は、患者が着用した患者体内への療法薬の流入を計量するための小型ポンプシステムにより実現できる。本発明の二重特異的結合性分子を含む医薬組成物は、そのポンプシステムの使用により投与できる。そのようなポンプシステムは一般に当技術分野で知られており、普通は注入すべき療法薬を収容したカートリッジの定期的交換に依存する。そのようなポンプシステムのカートリッジを交換する際、それ以外では中断されない患者体内への療法薬流入が一時的に中断される可能性がある。そのような場合、カートリッジ交換前の投与期とカートリッジ交換後の投与期はなお、合わせてそのような療法薬の１回の“連続投与”を構成する本発明の投薬手段および方法の意味の範囲内にあるとみなされる。
【０１０４】
[0096]  これらの本発明の二重特異的結合性分子の持続的または連続的な投与は、流体送達用具または小型ポンプシステムにより静脈内または皮下に行なうことができ、これには流体をレザバーから駆出するための流体駆動メカニズムおよびこの駆動メカニズムを作動させるための作動メカニズムが含まれる。皮下投与用のポンプシステムは、患者の皮膚を穿通して適切な組成物を患者の体内へ送達するための針またはカニューレを含むことができる。そのようなポンプシステムは、静脈、動脈または血管とは関係なく患者の皮膚に直接に固定または設置して、それによりポンプシステムと患者の皮膚を直接接触させることができる。ポンプシステムは、２４時間ないし数日間まで患者の皮膚に設置しておくことができる。ポンプシステムは、小容量用のレザバーを備えた小型のものであってもよい。限定ではない例として、投与すべき適切な組成物用のレザバーの容量は０．１〜５０ｍｌであってもよい。
【０１０５】
[0097]  持続投与は、皮膚に貼付して時々交換するパッチによる経皮投与であってもよい。この目的に適した薬物送達用パッチシステムは当業者に既知である。有利には、使用済み第１パッチを取り除く直前に、たとえば使用済み第１パッチのすぐ隣の皮膚の表面に新たな第２パッチを配置すると同時に使用済み第１パッチの交換を達成できるので、経皮投与は連続投与特に好適であることに注目すべきである。流れの中断または電池不良の問題は生じない。
【０１０６】
[0098]  本発明組成物は、医薬的に許容できるキャリヤーをさらに含むことができる。適切な医薬用キャリヤーの例は当技術分野で周知であり、これには溶液、たとえばリン酸緩衝化生理食塩水、水、エマルジョン、たとえば油／水エマルジョン、各種の湿潤剤、無菌溶液、リポソームなどが含まれる。そのようなキャリヤーを含む組成物は、周知の常法により配合できる。配合物は、炭水化物、緩衝液、アミノ酸および／または界面活性剤を含むことができる。炭水化物は、非還元糖、好ましくはトレハロース、ショ糖、オクタスルフェート、ソルビトールまたはキシリトールであってもよい。一般に、本明細書中で用いる“医薬的に許容できるキャリヤー”は、医薬投与に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤、ならびに吸収遅延剤を意味する。医薬活性物質のためのそのような媒体および作用剤の使用は当技術分野で周知である。許容できるキャリヤー、賦形剤または安定剤は、用いる投与量および濃度でレシピエントに対して無毒性であり、下記のものを含む：追加の緩衝剤；保存剤；補助溶媒；抗酸化剤：アスコルビン酸およびメチオニンを含む；キレート化剤、たとえばＥＤＴＡ；金属錯体（たとえば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；生分解性ポリマー、たとえばポリエステル；塩を形成する対イオン、たとえばナトリウム、多価糖アルコール；アミノ酸、たとえばアラニン、グリシン、アスパラギン、２−フェニルアラニン、およびトレオニン；糖類または糖アルコール、たとえばトレハロース、ショ糖、オクタスルフェート、ソルビトールまたはキシリトール  スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、ミオイニシトース(myoinisitose)、ガラクトース、ラクチトール、リビトール、ミオイニシトール(myoinisitol)、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール類（環状糖アルコール）（たとえば、イノシトール）、ポリエチレングリコール；硫黄含有還元剤、たとえばグルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、［アルファ］−モノチオグリセロール、およびチオ硫酸ナトリウム；低分子量タンパク質、たとえばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、または他の免疫グロブリン；ならびに親水性ポリマー、たとえばポリビニルピロリドン。そのような配合物を持続投与のために使用でき、投与はポンプシステムを用いる、および／または用いない、静脈内または皮下投与であってもよい。アミノ酸は荷電アミノ酸、好ましくはリジン、酢酸リジン、アルギニン、グルタミン酸および／またはヒスチジンであってもよい。界面活性剤は、ディタージェント、好ましくは＞１．２ＫＤの分子量をもつもの、および／またはポリエーテル、好ましくは＞３ＫＤの分子量をもつものであってもよい。限定ではない好ましいディタージェントの例は、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ４０、Ｔｗｅｅｎ  ６０、Ｔｗｅｅｎ  ８０またはＴｗｅｅｎ  ８５である。限定ではない好ましいポリエーテルの例は、ＰＥＧ  ３０００、ＰＥＧ  ３３５０、ＰＥＧ  ４０００またはＰＥＧ  ５０００である。本発明に用いる緩衝系は、好ましいｐＨ５〜９をもつことができ、クエン酸塩、コハク酸塩、リン酸塩、ヒスチジンお��び酢酸塩を含むことができる。
【０１０７】
[0099]  本発明の組成物は適切な用量で対象に投与することができ、それは、本明細書に記載する交差−種特異性を示す本発明のポリペプチドの用量を増加させながらチンパンジー以外の霊長類、たとえばマカクに投与することによる用量漸増試験により決定できる。前記のように、本明細書に記載する交差−種特異性を示す本発明のポリペプチドは、チンパンジー以外の霊長類の前臨床試験にヒトの薬物と同一の形態で有利に使用できる。これらの組成物は、他のタンパク質薬物および非タンパク質薬物と組み合わせて投与することもできる。これらの薬物は、本明細書に記載する本発明のポリペプチドを含む組成物と同時に、またはそのポリペプチドの投与前もしくは投与後に別個に既定の時間間隔および用量で投与できる。投与計画は担当医および臨床要因により決定されるであろう。医療分野で周知のように、いずれの患者についての投与量も多数の要因に依存し、これには患者の体格、体表面積、年齢、投与する個々の化合物、性別、投与の時間および経路、全般的健康状態、ならびに併用投与する他の薬物が含まれる。
【０１０８】
[0100]  非経口投与用の製剤には、無菌の水性または非水性の液剤、懸濁液剤および乳剤が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、たとえばオリーブ油、および注射用の有機エステル、たとえばオレイン酸エチルである。水性キャリヤーには、水、アルコール性／水性の溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれ、これには塩類溶液および緩衝液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、または固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養素の補充液、電解質補充液（たとえば、リンガーのデキストロースを基礎とするもの）などが含まれる。保存剤および他の添加剤、たとえば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活性ガスなどが存在する場合もある。さらに、本発明の組成物は、タンパク質系のキャリヤー、たとえば血清アルブミンまたは免疫グロブリン、好ましくはヒトに由来するものを含むことができる。本発明の組成物は、組成物の目的用途に応じて、本明細書に定める本発明のポリペプチドのほかに、さらに他の生物活性薬剤を含む可能性のあることが想定される。そのような薬剤は、当技術分野で既知の、消化器系に作用する薬物、細胞分裂抑制剤として作用する薬物、高尿酸血症を予防する薬物、免疫反応を阻害する薬物（たとえば、コルチコステロイド類）、炎症反応を調節する薬物、循環系に作用する薬物、および／またはサイトカインなどの薬剤であってもよい。本発明の二重特異的結合性分子を併用療法において、すなわち他の抗癌薬と組み合わせて適用することも想定される。
【０１０９】
[0101]  本明細書に定める医薬組成物の生物活性は、たとえば後記の例、WO 99/54440、またはSchlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12)に記載されるように、細胞傷害性アッセイにより決定できる。本明細書中で用いる“有効性”または“インビボ有効性”は、たとえば標準化ＮＣＩ応答基準を用いた、本発明の医薬組成物による療法に対する応答を表わす。本発明の医薬組成物を用いた療法の成功またはインビボ有効性は、その所期の目的に対する組成物の有効性、すなわち組成物がそれの目的効果、すなわち病的細胞、たとえば腫瘍細胞の枯渇をもたらす能力を表わす。インビボ有効性は、それぞれの病態について確立された標準法によりモニターでき、それには白血球数、鑑別、蛍光活性化セルソーティング、骨髄吸引が含まれるが、これらに限定されない。さらに、各種の疾患特異的な臨床化学パラメーターおよび他の確立された標準法を使用できる。さらに、コンピューター支援断層撮影、Ｘ線、核磁気共鳴断層撮影(たとえば、国立癌研究所(National Cancer Institute)基準に基づく応答評価[Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol. 1999 Apr;17(4):1244])、陽電子放射断層撮影スキャンニング、白血球数、鑑別、蛍光活性化セルソーティング、骨髄吸引、リンパ節生検／組織検査、および各種のリンパ腫特異的臨床化学パラメーター（たとえば、乳酸デヒドロゲナーゼ）、ならびに他の確立された標準法を使用できる。
【０１１０】
[0102]  本発明の医薬組成物のような薬物を開発する際の他の主な取組みは、薬物動態特性の予測可能な調節である。この目的のために、特定の薬物がその状態を処置する能力に影響を及ぼす、薬物候補の薬物動態プロフィール、すなわち薬物動態パラメーターのプロフィールを確立することができる。ある薬物が特定の病態を処置する能力に影響を及ぼす薬物動態パラメーターには、半減期、分布体積、肝初回通過代謝および血清結合度が含まれるが、これらに限定されない。その薬物の有効性は前記の各パラメーターにより影響される可能性がある。
【０１１１】
[0103]  “半減期”は、投与した薬物の５０％が生物学的プロセス、たとえば代謝、排泄などにより排除される時間を意味する。
【０１１２】
[0104]  “肝初回通過代謝”とは、薬物が最初に肝臓と接触した際に、すなわちそれが肝臓を最初に通過する間に代謝される性向を意味する。
【０１１３】
[0105]  “分布体積”は、身体の種々の区画、たとえば細胞内空間および細胞外空間、組織ならびに臓器などの全体に薬物が保持される程度、ならびにこれらの区画内における薬物分布を意味する。
【０１１４】
[0106]  “血清結合度”は、薬物が血清タンパク質、たとえばアルブミンと相互作用および結合して、その薬物の生物活性を低下または喪失させる性向を意味する。
【０１１５】
[0107]  薬物動態パラメーターには、特定の薬物投与量に対する生物学的利用能、遅延時間（Ｔｌａｇ）、Ｔｍａｘ、吸収速度、即効性(more onset)および／またはＣｍａｘも含まれる。“生物学的利用能”は、血液区画中の薬物量を意味する。“遅延時間”は、薬物投与とそれが血液または血漿中に検出および測定可能になるまでの間の時間の遅れを意味する。
【０１１６】
[0108]  “Ｔｍａｘ”は、薬物の最大血中濃度に達した時間であり、“Ｃｍａｘ”はその薬物について得られた最大血中濃度である。薬物がそれの生物学的効果のために要求される血中濃度または組織濃度に達するまでの時間は、あらゆるパラメーターにより影響される。前記に概説したようにチンパンジー以外の霊長類における前臨床動物試験で決定できる交差−種特異性を示す二重特異性一本鎖抗体の薬物動態パラメーターは、たとえばSchlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1 - 12)による刊行物中にも述べられている。
【０１１７】
[0109]  本明細書中で用いる用語“毒性”は、投与した薬物の有害事象または重篤な有害事象として現われる毒作用を表わす。これらの副作用は、投与後の全身的な薬物耐容性の欠如および／または局所的な薬物耐容性の欠如と言うことができる。毒性には、薬物により引き起こされる催奇形作用または発がん作用も含めることができる。
【０１１８】
[0110]  本明細書中で用いる用語“安全性”、“インビボ安全性”または“耐容性”は、薬物の投与直後（局所耐容性）およびより長い適用期間中に重篤な有害事象を誘発しない薬物投与を定義する。“安全性”、“インビボ安全性”または“耐容性”は、たとえば規則的間隔で処置中および追跡期間中に評価することができる。測定には、臨床評価、たとえば臓器所見、および検査室での異常スクリーニングが含まれる。臨床評価を実施して、ＮＣＩ−ＣＴＣおよび／またはＭｅｄＤＲＡ標準に従って正常所見に対する偏差を記録／コード化することができる。臓器所見は、アレルギー／免疫、血液／骨髄、心不整脈、凝血などの基準を含むことができる；たとえば、Common Terminology Criteria for adverse events v3.0（ＣＴＣＡＥ）に記載。検査できる検査室パラメーターには、たとえば血液検査、臨床化学、凝血プロフィールおよび尿分析、ならびに他の体液、たとえば血清、血漿、リンパ液、脳脊髄液または髄液などの検査が含まれる。したがって、安全性は、たとえば理学的検査、イメージング法（すなわち、超音波、ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、テクニカルデバイスを用いる他の措置（すなわち、心電図）、バイタルサインにより、検査室パラメーターの測定および有害事象の記録により評価できる。たとえば、本発明による使用および方法に際してのチンパンジー以外の霊長類における有害事象を、組織病理学的および／または組織化学的方法により検査することができる。
【０１１９】
[0111]  用語“有効量”または“有効投与量”は、目的とする効果を達成または部分的に達成するのに十分な量と定義される。用語“療法有効量”は、既に疾患に罹患している患者においてその疾患およびそれの合併症を治癒または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量と定義される。この用途に有効な量は、感染症の重症度および対象自身の免疫系の全般的状態に依存するであろう。用語“患者”には、予防処置または療法処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物対象が含まれる。
【０１２０】
[0112]  本明細書中で用いる用語“有効かつ無毒性の用量”は、本発明の二重特異的結合性分子の耐容量であって、重大な毒作用なしに病的細胞の枯渇、腫瘍排除、腫瘍収縮、または疾患の安定化をもたらすのに十分なほど高い量を表わす。そのような有効かつ無毒性の用量は、たとえば当技術分野で記載されている用量漸増試験により決定でき、重篤な有害副作用を誘発する量（用量制限毒性、ＤＬＴ）より低くなければならない。
【０１２１】
[0113]  前記の用語は、たとえば、Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting on July 16, 1997にも述べられている。
【０１２２】
[0114]  本発明の二重特異的結合性分子の適切な投与量または療法有効量は、処置すべき状態、その状態の重症度、それ以前の療法、ならびに患者の病歴およびその療法薬に対する応答に依存するであろう。適量は、それをその患者に１回または一連の投与にわたって投与できるという担当医の判断に従って調整できる。この医薬組成物を唯一の療法剤として、または必要に応じて追加の療法、たとえば抗癌療法と組み合わせて投与できる。
【０１２３】
[0115]  本発明の医薬組成物は、特に非経口投与、すなわち皮下、筋肉内、静脈内、関節内および／または滑膜内投与に有用である。非経口投与は、ボーラス注射または持続注入により実施できる。
【０１２４】
[0116]  医薬組成物が凍結乾燥されていた場合、その凍結乾燥材料を投与前にまず適宜な液体中に再構成する。凍結乾燥材料を、たとえば注射用殺菌水(bacteriostatic water for injection)（ＢＷＦＩ）、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、またはそのタンパク質が凍結乾燥前にあったものと同じ配合物中に再構成することができる。
【０１２５】
[0117]  好ましくは、本発明の二重特異的結合性分子または本発明方法により調製された二重特異的結合性分子を、増殖性疾患、腫瘍性疾患、または免疫障害から選択される疾患の予防、治療または改善に使用する。
【０１２６】
[0118]  本発明の別態様は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、または免疫障害から選択される疾患の処置または改善のための方法であって、その必要がある患者に本発明の二重特異的結合性分子または本発明方法により調製された二重特異的結合性分子を投与する段階を含む方法を提供する。
【０１２７】
[0119]  本明細書に記載する配合物は、その必要がある患者において本明細書に記載する病的状態を治療および／または予防する際の医薬組成物として有用である。用語“処置”は、療法処置および予防(prophylacticまたはpreventative)措置の両方を表わす。処置には、疾患／障害、疾患／障害の症状、または疾患／障害の素因を伴なう患者の身体に、その患者に由来する摘出された組織または細胞に、治癒、修復、軽減、緩和、変化、矯正、改善、改良の目的で、またはその疾患、疾患の症状もしくは疾患の素因に影響を及ぼす目的で、配合物を適用または投与することが含まれる。
【０１２８】
[0120]  “処置の必要がある”者には、既にその障害を伴なう者、またはその障害を予防すべき者が含まれる。用語“疾患”は、本明細書に記載するタンパク質配合物による処置が有益であると思われるいずれかの状態である。これには慢性および急性の障害または疾患が含まれ、これはその哺乳動物に問題の疾患に対する素因をもたらす病的状態を含む。本発明において処置すべき疾患／障害の限定ではない例には、増殖性疾患、腫瘍性疾患、または免疫障害が含まれる。
【０１２９】
[0121]  他の観点において、本発明の二重特異的結合性分子、本発明の核酸分子、本発明のベクター、または本発明の宿主細胞を含む、キットが提供される。このキットは、二重特異的結合性分子を収容した１以上のバイアルおよび使用のための指示を含むことができる。このキットは、本発明の二重特異的結合性分子を投与するための手段、たとえば注射器、ポンプ、注入器なども収容することができる。
【０１３０】
[0122]  さらに他の観点において、本発明は、好ましくは本明細書に記載する５Ｔ４およびＣＤ３に結合する能力を有する抗体、好ましくは二重特異的結合性分子の作成のための、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すヒト５Ｔ４配列のアミノ酸残基１７０−２２２（エピトープクラスター４）および／または７８−１３８（エピトープクラスター２）の使用に関する。
【０１３１】
[0123]  また本発明は、抗体、好ましくは二重特異的結合性分子を作成するための、下記を含む方法に関する：（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すヒト５Ｔ４配列のアミノ酸残基１７０−２２２（エピトープクラスター４）および／または７８−１３８（エピトープクラスター２）を含むタンパク質で動物を免疫化し、（ｂ）その抗体を採取し、そして場合により（ｃ）その抗体を、好ましくは本明細書に記載する５Ｔ４およびＣＤ３に結合する能力を有する二重特異的結合性分子に変換する。
【０１３２】
[0124]  本発明はさらに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すヒト５Ｔ４配列のアミノ酸残基１７０−２２２（エピトープクラスター４）またはアミノ酸７８−１３８（エピトープクラスター２）からなる５Ｔ４フラグメントを考慮する。
【０１３３】
[0125]  本発明は特定の方法、プロトコルまたは試薬に限定されないことを理解すべきである；それらは変更できるからである。本明細書に提示する考察および例は特定の態様を記述するために提示されるにすぎず、本発明の範囲を限定するためのものではない；本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【０１３４】
[0126]  本明細書の本文全体において引用する刊行物および特許（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の明細、指示などを含む）は、前記および後記のいずれにおいても、それらの全体が援用される。本明細書中のいずれも、本発明が先発明によりそのような開示内容に先立つ資格がないことを認めるものと解釈すべきではない。援用したものが本明細書と矛盾するかまたは不一致であるならば、本明細書がそのようなものの代わりとなる。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】[0127]  図１：５Ｔ４の仮説構造。ＳＲＲ：セリンリッチリピート（褐色）；ＬＲＲ：ロイシンリッチリピート（青色）；システインを黄色丸により示す；潜在的グリコシル化部位を星印でマークする。
【図２】[0128]  図２：５Ｔ４の構造モデル：エピトープクラスタリングのために設計したキメラ構築体中の交換されたセグメントを強調している。ＬＬＲ：ロイシンリッチリピート。ＳＲＲ：セリンリッチリピート。星印：炭水化物の位置。
【図３】[0129]  図３：キメラ５Ｔ４構築体についてのエピトープクラスタリング−ヒト５Ｔ４とネズミ(murine)５Ｔ４の配列アラインメント。ヒト５Ｔ４とネズミ５Ｔ４のアミノ酸配列のアラインメント。細胞内ドメインおよび膜貫通ドメインを点線四角によりマークしてある。キメラ構築体においてヒト配列を相同ネズミ配列で置換したセグメントも四角で囲み、ヒト配列を表わすアミノ酸位置を示す。
【図４】[0130]  図４：ＣＨＯ細胞の表面に発現したネズミおよびヒトの５Ｔ４ならびに７種類のキメラ型ヒト−ネズミ５Ｔ４構築体をフローサイトメトリーにより示したもの。ＣＨＯ上のヒト５Ｔ４、ならびにキメラ５Ｔ４分子であるｈｕ  ５Ｔ４  Ｅ１  ｍｕ、ｈｕ  ５Ｔ４  Ｅ２  ｍｕ、ｈｕ  ５Ｔ４  Ｅ３  ｍｕおよびｈｕ  ５Ｔ４  Ｅ６  ｍｕの発現は、モノクローナル抗ヒト５Ｔ４抗体で検出された。ｈｕ  ５Ｔ４  Ｅ４  ｍｕ、ｈｕ  ５Ｔ４  Ｅ５  ｍｕおよびｈｕ  ５Ｔ４  Ｅ７  ｍｕの発現は、ポリクローナル抗ヒト５Ｔ４抗体で検出された。ネズミ５Ｔ４の発現は、ポリクローナル抗マウス５Ｔ４抗体で検出された。結合したモノクローナル抗体は、フィコエリトリンにコンジュゲートした抗マウスＦｃ−ガンマ特異的抗体で検出された。結合したポリクローナル抗体は、ＰＥ標識した抗ヒツジ抗体で検出された。
【図５−１】[0131]  図５：Ｂｉａｃｏｒｅシステムを用いた、ヒトおよびマカク(macaque)５Ｔ４ならびにヒトおよびマカクＣＤ３上における二重特異性抗体の結合定数の決定。抗原を低密度ないし中間密度（１００ＲＵ）でＣＭ５チップに固定化した。二重特異性抗体の希釈液をチップ表面に浮遊させ、ＢｉａＥｖａｌソフトウェアを用いて結合を決定した。それぞれの二重特異性抗体の結合速度(on-rate)および解離速度(off-rate)ならびに得られた結合定数（ＫＤ）を各グラフの下に示す。括弧内の数字は、それぞれの５Ｔ４二重特異性抗体の二相性解離速度のため不正確である解離速度およびＫＤ計算値を示す。
【図５−２】同上。
【図５−３】同上。
【図５−４】同上。
【図５−５】同上。
【図６−１】[0132]  図６：５Ｔ４抗原陽性細胞上のエピトープ４を指向する二重特異性抗体の結合定数の決定。細胞を二重特異性抗体それぞれの３組の系列希釈液と共にインキュベートした。検出は、抗Ｈｉｓ  Ｆａｂ／Ａｌｅｘａ４８８を検出抗体として用いて、厳密な一価(monovalent)方式で実施された。５Ｔ４抗原陽性細胞を用いた：天然のヒト５Ｔ４発現細胞系としてのＮＣＩ−Ｎ８７（左欄）、組換え５Ｔ４を発現するトランスフェクションしたＣＨＯ細胞（中欄）、および組換え５Ｔ４を発現するトランスフェクションしたＣＨＯ細胞（右欄）。各グラフにスカッチャード(Scatchard)解析を含む双曲線グラフを示す。各ＫＤ値が各図に含まれる。
【図６−２】同上。
【図７−１】[0133]  図７：５Ｔ４抗原陽性細胞上のエピトープ７を指向する二重特異性抗体の結合定数の決定。細胞を二重特異性抗体それぞれの３組の系列希釈液と共にインキュベートした。検出は、抗Ｈｉｓ  Ｆａｂ／Ａｌｅｘａ４８８を検出抗体として用いて、厳密な一価方式で実施された。５Ｔ４抗原陽性細胞を用いた：天然のヒト５Ｔ４発現細胞系としてのＮＣＩ−Ｎ８７（左欄）、組換え５Ｔ４を発現するトランスフェクションしたＣＨＯ細胞（中欄）、および組換え５Ｔ４を発現するトランスフェクションしたＣＨＯ細胞（右欄）。各グラフにスカッチャード解析を含む双曲線グラフを示す。各ＫＤ値が各図に含まれる。
【図７−２】同上。
【図８−１】[0134]  図８：５Ｔ４抗原陽性細胞上のエピトープＥ２／４を指向する二重特異性抗体の結合定数の決定。細胞を二重特異性抗体それぞれの３組の系列希釈液と共にインキュベートした。検出は、抗Ｈｉｓ  Ｆａｂ／Ａｌｅｘａ４８８を検出抗体として用いて、厳密な一価方式で実施された。５Ｔ４抗原陽性細胞を用いた：天然のヒト５Ｔ４発現細胞系としてのＮＣＩ−Ｎ８７（左欄）、組換え５Ｔ４を発現するトランスフェクションしたＣＨＯ細胞（中欄）、および組換え５Ｔ４を発現するトランスフェクションしたＣＨＯ細胞（右欄）。各グラフにスカッチャード解析を含む双曲線グラフを示す。各ＫＤ値が各図に含まれる。
【図８−２】同上。
【図８−３】同上。
【図８−４】同上。
【図９−１】[0135]  図９：５Ｔ４二重特異性抗体の細胞傷害性を１８時間の５１クロム放出アッセイで測定したもの。エフェクター細胞：刺激された濃縮ヒトＣＤ８  Ｔ細胞。標的細胞：５Ｔ４陽性ヒト腫瘍細胞系ＨＣＴ１１６。エフェクター：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比：１０：１。刺激された濃縮ヒトＣＤ８  Ｔ細胞を用いた細胞傷害活性についての現在の二重特異性抗体経験に基づくランキング区間（ＥＣ５０）＜１０ｐｇ／ｍｌ（１）、［１０−１００ｐｇ／ｍｌ］（２）、［１００−１０００ｐｇ／ｍｌ］（３）、［１０００−５０００ｐｇ／ｍｌ］（４）、≧５０００ｐｇ／ｍｌｐｇ／ｍｌ（５）。
【図９−２】同上。
【図１０−１】[0136]  図１０：５Ｔ４二重特異性抗体の細胞傷害性を４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイで測定したもの。エフェクター細胞：刺激されていないヒトＰＢＭＣ。標的細胞：ヒト５Ｔ４でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞。エフェクター：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比：１０：１。刺激されていないヒトＰＢＭＣを用いた細胞傷害活性についての現在の二重特異性抗体経験に基づくランキング区間（ＥＣ５０）：＜２５０ｐｇ／ｍｌ（１）、［２５０−１０００ｐｇ／ｍｌ］（２）、［１０００−５０００ｐｇ／ｍｌ］（３）、［５０００−２００００ｐｇ／ｍｌ］（４）、≧２００００ｐｇ／ｍｌｐｇ／ｍｌ（５）。
【図１０−２】同上。
【図１１−１】[0137]  図１１：５Ｔ４二重特異性抗体の細胞傷害性を４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイで測定したもの。エフェクター細胞：刺激されていないヒトＰＢＭＣ。標的細胞：５Ｔ４陽性ヒト腫瘍細胞系ＮＣＩ−Ｎ８７。エフェクター：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比：１０：１。刺激されていないヒトＰＢＭＣを用いた細胞傷害活性についての現在の二重特異性抗体経験に基づくランキング区間（ＥＣ５０）：＜２５０ｐｇ／ｍｌ（１）、［２５０−１０００ｐｇ／ｍｌ］（２）、［１０００−５０００ｐｇ／ｍｌ］（３）、［５０００−２００００ｐｇ／ｍｌ］（４）、≧２００００ｐｇ／ｍｌｐｇ／ｍｌ（５）。
【図１１−２】同上。
【図１２−１】[0138]  図１２：５Ｔ４二重特異性抗体の細胞傷害性を４８時間のＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイで測定したもの。エフェクター細胞：マカクＴ細胞系４１１９ＬｎＰｘ。標的細胞：マカク５Ｔ４でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞。エフェクター：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比：１０：１。マカクＴ細胞系４１１９ＬｎＰｘを用いた細胞傷害活性についての現在の二重特異性抗体経験に基づくランキング区間（ＥＣ５０）：＜２５０ｐｇ／ｍｌ（１）、［２５０−１０００ｐｇ／ｍｌ］（２）、［１０００−５０００ｐｇ／ｍｌ］（３）、［５０００−２００００ｐｇ／ｍｌ］（４）、≧２００００ｐｇ／ｍｌｐｇ／ｍｌ（５）。
【図１２−２】同上。
【図１３】[0139]  図１３：ＨＣＴ−１１６進行期腫瘍モデルにおける二重特異性抗体の抗腫瘍活性。ＨＣＴ−１１６ヒト大腸癌細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右背側腹部に皮下注射した（グループ当たりｎ＝１０）。腫瘍が約１８０〜２００ｍｍ３の体積に達した後、ヒトＴ細胞を腹腔内に移植した。５Ｔ４−ＣＤ３二重特異性抗体（５Ｔ４−１２  ＨＬ×ＣＤ３  ＨＬ）（０．１、０．５および２．５ｍｇ／ｋｇ／日）を静脈内ボーラス注射により尾側部静脈に１４日間投与した。対照動物（グループ２）およびＴ細胞注射を行なわない動物（グループ１）には、ビヒクルを静脈内ボーラス注射により尾側部静脈に１４日間投与した。腫瘍の増殖を外部カリパス測定により決定し、腫瘍体積を標準的な半楕円式により計算した：（長さ［ｍｍ］×幅［ｍｍ］２）／２。
【図１４】[0140]  図１４：ＮＣＩ−Ｎ８７進行期腫瘍モデルにおける二重特異性抗体の抗腫瘍活性。ＮＣＩ−Ｎ８７ヒト胃癌細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右背側腹部に皮下注射した（グループ当たりｎ＝１０）。腫瘍が約１８０〜２００ｍｍ３の体積に達した後、ヒトＴ細胞を腹腔内に移植した。５Ｔ４−ＣＤ３二重特異性抗体（５Ｔ４−１２  ＨＬ×ＣＤ３  ＨＬ）（０．１、０．５および２．５ｍｇ／ｋｇ／日）を静脈内ボーラス注射により尾側部静脈に２１日間投与した。対照動物（グループ２）およびＴ細胞注射を行なわない動物（グループ１）には、ビヒクルを静脈内ボーラス注射により尾側部静脈に２１日間投与した。腫瘍の増殖を外部カリパス測定により決定し、腫瘍体積を標準的な半楕円式により計算した：（長さ［ｍｍ］×幅［ｍｍ］２）／２。
【発明を実施するための形態】
【０１３６】
[0141]  実施例
以下の実施例により本発明を説明する。これらの実施例が本発明を限定すると解釈すべきではない。実施例は説明のために含まれ、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例１】
【０１３７】
[0142]  実施例１
キメラ型の膜貫通５Ｔ４を発現するＣＨＯ細胞の作成
キメラ型エピトープマッピング分子を構築するために、ヒト５Ｔ４の各エピトープドメインのアミノ酸配列をネズミ配列に変化させた。
下記の分子が構築された：
・ｈｕ  ５Ｔ４  Ｅ１  ｍｕ（アミノ酸３４−７７：ネズミ）
・ｈｕ  ５Ｔ４  Ｅ２  ｍｕ（アミノ酸７８−１３８：ネズミ）
・ｈｕ  ５Ｔ４  Ｅ３  ｍｕ（アミノ酸１３９−１６９：ネズミ）
・ｈｕ  ５Ｔ４  Ｅ４  ｍｕ（アミノ酸１７０−２２２：ネズミ）
・ｈｕ  ５Ｔ４  Ｅ５  ｍｕ（アミノ酸２２３−２７０：ネズミ）
・ｈｕ  ５Ｔ４  Ｅ６  ｍｕ（アミノ酸２７１−２９９：ネズミ）
・ｈｕ  ５Ｔ４  Ｅ７  ｍｕ（アミノ酸３００−３６０：ネズミ）
これらのｃＤＮＡ構築体を哺乳動物発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲ中へクローニングし、ＣＨＯ細胞中へ安定にトランスフェクションした。ＣＨＯにおけるヒト５Ｔ４、ならびにキメラ５Ｔ４分子ｈｕ  ５Ｔ４  Ｅ１  ｍｕ、ｈｕ  ５Ｔ４  Ｅ２  ｍｕ、ｈｕ  ５Ｔ４  Ｅ３  ｍｕおよびｈｕ  ５Ｔ４  Ｅ６  ｍｕの発現を、ＦＡＣＳアッセイにおいてモノクローナル抗ヒト５Ｔ４抗体を用いて確認した（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃ＭＡＢ４９７５１）。ｈｕ  ５Ｔ４  Ｅ４  ｍｕ、ｈｕ  ５Ｔ４  Ｅ５  ｍｕおよびｈｕ  ５Ｔ４  Ｅ７  ｍｕの発現は、ポリクローナル抗ヒト５Ｔ４抗体を用いて検出された（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃ＡＦ４９７５）。Ｍｕ  ５Ｔ４発現は、ポリクローナル抗マウス５Ｔ４抗体を用いて立証された（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃ＡＦ５０４９）。用いた５Ｔ４抗体濃度は５μｇ／ｍｌであった。結合したモノクローナル抗体は、Ｒ−フィコエリトリンにコンジュゲートした抗マウスＦｃガンマ特異的抗体（１：１００；Ｄｉａｎｏｖａ  ＃１１５−１１６−０７１）で検出された。結合したポリクローナル抗体を、５μｇ／ｍｌのＰＥ標識した抗ヒツジ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＃ｓｃ−３７４６）で検出した。すべての抗体を２％  ＦＣＳ含有ＰＢＳ中に希釈した。陰性対照として、第１抗体の代わりにＰＢＳ／２％  ＦＣＳと共に細胞をインキュベートした。試料をＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ計測器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメトリーにより測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．６）により解析した。ヒト−ネズミ５Ｔ４キメラの表面発現について、トランスフェクションしたＣＨＯ細胞を種々の抗５Ｔ４抗体によるフローサイトメトリーで分析および確認した（図４）。
【実施例２】
【０１３８】
[0143]  実施例２
２．１  ＨＥＫ  ２９３における一過性発現
配列確認済みヌクレオチド配列を含む発現プラスミドのクローンを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｍｂＨ，  ドイツ、カールスルーエ）におけるトランスフェクションおよびタンパク質発現のために、製造業者のプロトコルに従って用いた。発現したタンパク質を含有する上清を採取し、細胞を遠心により分離し、上清を−２０℃で保存した。
【０１３９】
２．２  ＣＨＯ細胞における安定発現
配列確認済みヌクレオチド配列を含む発現プラスミドのクローンを、これらの構築体の真核細胞発現のためにＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内へトランスフェクションした。ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞における真核細胞タンパク質発現は、Kaufman R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566の記載に従って実施された。メトトレキセート（ＭＴＸ）濃度を最終濃度２０ｎＭ  ＭＴＸにまで増大させることにより、構築体の遺伝子増幅を誘発した。静止期培養物を２回継代した後、細胞をローラーボトル内において、ヌクレオチドを含まないＨｙＱ  ＰＦ  ＣＨＯ液体ダイズ培地（０．１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を含む４．０ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有；ＨｙＣｌｏｎｅ）で７日間増殖させた後に収穫した。細胞を遠心により分離し、発現したタンパク質を含有する上清を−２０℃で保存した。
【実施例３】
【０１４０】
[0144]  実施例３
ネズミｓｃＦｖフラグメントのエピトープ クラスタリング
ヒトもしくはネズミ５Ｔ４で、またはキメラ５Ｔ４分子でトランスフェクションした細胞を、ヒト／マカク５Ｔ４に結合するｓｃＦｖを含有する粗製の未希釈ペリプラズム抽出物で染色した。結合したｓｃＦｖを１μｇ／ｍｌの抗−ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｆ１８０４）およびＲ−ＰＥ標識した抗マウスＦｃガンマ特異的抗体（１：１００；Ｄｉａｎｏｖａ  ＃１１５−１１６−０７１）で検出した。すべての抗体を２％  ＦＣＳ含有ＰＢＳ中に希釈した。陰性対照として、ペリプラズム抽出物の代わりにＰＢＳ／２％  ＦＣＳと共に細胞をインキュベートした。試料をＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ計測器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメトリーにより測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．６）により解析した。
【実施例４】
【０１４１】
[0145]  実施例４
種々の組換え形態の可溶性ヒトおよびマカク５Ｔ４の入手
ヒトおよびマカク５Ｔ４のコード配列（ＧｅｎＢａｎｋ，寄託番号ＮＭ＿００６６７０［ｈｕｍａｎ］；ＮＭ＿０１１６２７［ｍｏｕｓｅ］で公開されたヒトおよびマウス５Ｔ４配列）、ヒトアルブミン、ネズミＦｃγ１およびネズミアルブミンのコード配列を、それぞれヒトおよびマカク５Ｔ４の可溶性融合タンパク質、ならびにそれぞれヒトアルブミン、ネズミＩｇＧ１  Ｆｃおよびネズミアルブミン、ならびに５Ｔ４の細胞外ドメインのみを含む可溶性タンパク質をコードする、人工ｃＤＮＡ配列の構築に用いた。可溶性ヒトおよびマカク５Ｔ４タンパク質の発現のための構築体を作成するために、前記の全長５Ｔ４  ｃＤＮＡのＰＣＲ変異形成および標準プロトコルによる分子クローニングにより、ｃＤＮＡフラグメントを得た。
【０１４２】
ヒトアルブミンとの融合体について、下記のものを含むように修飾ｃＤＮＡフラグメントを設計した：最初に構築体の真核細胞発現のためのコザック(Kozak)部位、続いてそれぞれヒトおよびマカク５Ｔ４タンパク質（それぞれヒトおよびマカク５Ｔ４のシグナルペプチドおよび細胞外ドメインに対応するアミノ酸１−３５５を含む）のコード配列、続いてインフレームで人工Ｓｅｒ１−Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ１リンカーのコード配列、続いてインフレームでヒト血清アルブミンのコード配列、続いてインフレームでＦｌａｇタグのコード配列、続いてインフレームで修飾ヒスチジンタグ（ＳＧＨＨＧＧＨＨＧＧＨＨ）のコード配列、ならびに終止コドン。
【０１４３】
ネズミＩｇＧ１との融合体について、下記のものを含むように修飾ｃＤＮＡフラグメントを設計した：最初に構築体の真核細胞発現のためのコザック部位、続いてそれぞれヒトおよびマカク５Ｔ４タンパク質（それぞれヒトおよびマカク５Ｔ４のシグナルペプチドおよび細胞外ドメインに対応するアミノ酸１−３５５を含む）のコード配列、続いてインフレームで人工Ｓｅｒ１−Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ１リンカーのコード配列、続いてインフレームでネズミＩｇＧ１のヒンジ部およびＦｃガンマ部分のコード配列、続いてインフレームでヘキサヒスチジンタグのコード配列、ならびに終止コドン。
【０１４４】
ネズミアルブミンとの融合体について、下記のものを含むように修飾ｃＤＮＡフラグメントを設計した：最初に構築体の真核細胞発現のためのコザック部位、続いてそれぞれヒトおよびマカク５Ｔ４タンパク質（それぞれヒトおよびマカク５Ｔ４のシグナルペプチドおよび細胞外ドメインに対応するアミノ酸１−３５５を含む）のコード配列、続いてインフレームで人工Ｓｅｒ１−Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ１リンカーのコード配列、続いてインフレームでネズミ血清アルブミンのコード配列、続いてインフレームでＦｌａｇタグのコード配列、続いてインフレームで修飾ヒスチジンタグ（ＳＧＨＨＧＧＨＨＧＧＨＨ）のコード配列、ならびに終止コドン。
【０１４５】
可溶性細胞外ドメイン構築体について、下記のものを含むように修飾ｃＤＮＡフラグメントを設計した：最初に構築体の真核細胞発現のためのコザック部位、続いてそれぞれヒトおよびマカク５Ｔ４タンパク質（それぞれヒトおよびマカク５Ｔ４のシグナルペプチドおよび細胞外ドメインに対応するアミノ酸１−３５５を含む）のコード配列、続いてインフレームで人工Ｓｅｒ１−Ｇｌｙ１リンカーのコード配列、続いてインフレームでＦｌａｇタグのコード配列、続いてインフレームで修飾ヒスチジンタグ（ＳＧＨＨＧＧＨＨＧＧＨＨ）のコード配列、ならびに終止コドン。
【０１４６】
これらのフラグメントの最初と最後に制限部位を導入するｃＤＮＡフラグメントも設計した。導入した制限部位、すなわち５’末端のＥｃｏＲＩおよび３’末端のＳａｌＩを、以下のクローニング操作に利用した。これらのｃＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩにより、ｐＥＦ−ＤＨＦＲと表示されるプラスミド内へクローニングした（ｐＥＦ−ＤＨＦＲは、Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150に記載されている)。以上の操作はすべて標準プロトコルに従って実施された(Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001))。
【実施例５】
【０１４７】
[0146]  実施例５
Ｂｉａｃｏｒｅに基づくヒトおよびマカクの５Ｔ４およびＣＤ３に対する二重特異性抗体親和性の決定
ヒト血清アルブミン（ＡＬＢ）との組換え５Ｔ４融合タンパク質を用いてＢｉａｃｏｒｅ分析実験を実施して、５Ｔ４標的結合を決定した。ＣＤ３親和性測定のために、ヒト抗体Ｆｃ部に融合したＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ｅ）のＮ末端２７アミノ酸をもつ組換え融合タンパク質を用いた。この組換えタンパク質は、ヒトＣＤ３ｅ１−２７バージョンおよびカニクイザルＣＤ３ｅバージョン中に存在する；両方ともＣＤ３バインダーのエピトープを二重特異性抗体中に保有する。
【０１４８】
詳細には、ＣＭ５  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に約１００〜１５０ＲＵのそれぞれの組換え抗原を、酢酸緩衝液ｐＨ４．５を用いて、製造業者のマニュアルに従って固定化した。二重特異性抗体試料を５種類の濃度で装入した：ＨＢＳ−ＥＰ流動用緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中に希釈して５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭおよび３．１３ｎＭ。流速は３０〜３５ｕｌ／分で３分間であり、次いでＨＢＳ−ＥＰ流動用緩衝液を８分間、再び３０〜３５ｕｌ／ｍｌの流速で適用した。１０ｍＭグリシン−０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ２．４５を用いてチップの再生を行なった。ＢｉａＥｖａｌソフトウェアを用いてデータセットを解析した（図５）。一般に２つの独立した実験を行なった。
【実施例６】
【０１４９】
[0147]  実施例６
二重特異性結合および種間交差反応性
フローサイトメトリーのために、２００，０００個の各細胞系を氷上で３０分間、濃度５μｇ／ｍｌの精製した二重特異性分子５０μｌと共にインキュベートした。２％  ＦＣＳ含有ＰＢＳ中で細胞を２回洗浄し、ネズミＰｅｎｔａＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ；２％  ＦＣＳ含有ＰＢＳ  ５０μｌ中に１：２０希釈）で構築体の結合を検出した。洗浄後、結合したＰｅｎｔａＨｉｓ抗体を、フィコエリトリンにコンジュゲートしたＦｃガンマ特異的抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）（２％  ＦＣＳ含有ＰＢＳ中に１：１００希釈）で検出した。
【実施例７】
【０１５０】
[0148]  実施例７
スカッチャード(Scatchard)に基づくヒトおよびマカク５Ｔ４に対する二重特異性抗体の親和性の決定
スカッチャード分析のために、Ｍｉｃｒｏｍｅｔで開発された一価検出系（抗Ｈｉｓ  Ｆａｂ／Ａｌｅｘａ  ４８８）を用いて飽和結合実験を実施して、各細胞系に対する二重特異性抗体の一価結合を正確に決定した。
【０１５１】
２×１０４個の各細胞系（自然に５Ｔ４を発現するヒト癌細胞系ＮＣＩ−Ｎ８７、組換えヒト５Ｔ４を発現するＣＨＯ細胞系、組換えマカク５Ｔ４を発現するＣＨＯ細胞系）を、それぞれ５０ｕｌの３組の希釈系列（１：２で８回希釈）の各５Ｔ４二重特異性抗体（１００ｎＭから開始）と共にインキュベートし、続いて４℃で撹拌下に１６時間のインキュベーションおよび残り１回の洗浄段階を行なった。次いで細胞をさらに３０分間、３０μｌの抗Ｈｉｓ  Ｆａｂ／Ａｌｅｘａ４８８溶液（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ；３０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。１回の洗浄段階後、細胞を３．５％のホルムアルデヒドを含有するＦＡＣＳ緩衝液１５０μｌに再懸濁し、さらに１５分間インキュベートし、遠心し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩマシーンおよびＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを用いて解析した。データは２つの独立した実験セットから作成された。数値を双曲線としてプロットした。各スカッチャード分析を計算して、最大結合（Ｂｍａｘ）を外挿した。各ＫＤを反映する最大半量結合における二重特異性抗体の濃度を決定した。三重測定の数値を双曲線としてプロットした。スカッチャード評価を用いて最大結合を決定し、各ＫＤを計算した。表２に示す数値は、５Ｔ４二重特異性抗体当たり２つの独立した実験から得られた。５Ｔ４二重特異性抗体当たり１つの代表的実験を図６〜８に示す。
【０１５２】
【表２】
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【０１５３】
表２．細胞に基づくスカッチャード分析（それぞれ２つの独立した実験）からの５Ｔ４二重特異性抗体の親和性（ＫＤ）
Ｂｉａｃｏｒｅにより測定した組換え可溶性ヒトおよびマカク５Ｔ４抗原に対する１５種類の５Ｔ４二重特異性抗体の高い親和性を、ヒトまたはマカク５Ｔ４でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞におけるスカッチャード分析により確認できた。最も重要なことに、ヒト腫瘍細胞系ＮＣＩ−Ｎ８７の表面に発現した天然５Ｔ４に対する親和性は、組換え５Ｔ４をそれらの表面に発現するＣＨＯ細胞において測定したものに近似する。Ｅ２／４エピトープクラスターのすべての５Ｔ４二重特異性抗体およびＥ７エピトープクラスターのすべての５Ｔ４二重特異性抗体が、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞上の天然ヒト５Ｔ４にサブｎＭの親和性で結合し、一方、Ｅ４エピトープクラスターの５Ｔ４二重特異性抗体４種類のうち４種類が天然ヒト５Ｔ４に１桁ｎＭの親和性で結合する。
【実施例８】
【０１５４】
[0149]  実施例８
細胞傷害活性
８．１  刺激されたヒトＴ細胞を用いたクロム放出アッセイ
ＣＤ８＋  Ｔ細胞を濃縮した刺激されたＴ細胞を下記に従って得た。ペトリ皿（直径１４５ｍｍ，Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ  ＧｍｂＨ，クレムズミュンスター）を、最終濃度１μｇ／ｍｌの市販の抗ＣＤ３特異的抗体（ＯＫＴ３，Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ）で３７℃において１時間コートした。結合しなかったタンパク質をＰＢＳによる１回の洗浄段階で除去した。このプレコートしたペトリ皿に、３〜５×１０７個のヒトＰＢＭＣを、安定化グルタミン／１０％  ＦＣＳ／ＩＬ−２  ２０Ｕ／ｍｌ（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標），Ｃｈｉｒｏｎ）を含む１２０ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０中において添加し、２日間刺激した。３日目に細胞を採集し、ＲＰＭＩ  １６４０で１回洗浄した。ＩＬ−２を最終濃度２０Ｕ／ｍｌになるまで添加し、細胞を上記と同じ細胞培養培地中で再び１日間培養した。
【０１５５】
Ｄｙｎａｌ−Ｂｅａｄｓを製造業者のプロトコルに従って用いて、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ５６＋  ＮＫ細胞の枯渇により、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を濃縮した。
【０１５６】
マカクまたはヒト５Ｔ４でトランスフェクションしたＣＨＯ標的細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０％  ＦＣＳを含有する最終体積１００μｌのＲＰＭＩ中において、１１．１ＭＢｑの５１Ｃｒで３７℃において６０分間標識した。その後、この標識した標的細胞を５ｍｌのＲＰＭＩで３回洗浄し、次いで細胞傷害性アッセイに用いた。アッセイを９６ウェルプレート内で、全体積２００μｌの補充ＲＰＭＩ（前記）中においてＥ：Ｔ比１０：１で実施した。出発濃度０．０１〜１μｇ／ｍｌの精製した二重特異性抗体およびその３倍希釈液を用いた。アッセイのためのインキュベーション時間は１８時間であった。細胞傷害性は、上清中へ放出されたクロムを最大溶解（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘの添加）と自然溶解（エフェクター細胞なし）の差に対比した相対値として決定された。すべての測定を四重に実施した。上清中のクロム活性の測定をＷｉｚａｒｄ  ３”ガンマ計数器（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧｍｂＨ，ドイツ、ケルン）で実施した。結果の解析をＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用Ｐｒｉｓｍ  ５（バージョン５．０，ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，米国カリフォルニア州サンディエゴ）で実施した。Ｓ字形用量応答曲線から解析プログラムにより計算したＥＣ５０値を、細胞傷害活性の比較に用いた。
【０１５７】
８．２  刺激されていないヒトＰＢＭＣによるＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイ
エフェクター細胞の単離
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離により、濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）、すなわち輸血のための血液を採集する血液銀行の副生物から調製した。バフィーコートは地方血液銀行から供給され、採血の同日にＰＢＭＣを調製した。Ｆｉｃｏｌｌ密度遠心分離およびダルベッコのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）による徹底的な洗浄の後、赤血球溶解用緩衝液（１５５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭのＫＨＣＯ３，１００μＭのＥＤＴＡ）と共にインキュベートすることにより、残留赤血球をＰＢＭＣから除去した。血小板はＰＢＭＣを１００×ｇで遠心分離した際に上清により除去された。残りのリンパ球は主にＢおよびＴリンパ球、ＮＫ細胞および単球を含む。ＰＢＭＣは、３７℃／５％  ＣＯ２で、１０％  ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中における培養により維持された。
【０１５８】
ＣＤ１４＋およびＣＤ５６＋細胞の枯渇
ＣＤ１４＋細胞を枯渇させるために、ヒトＣＤ１４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃ，ＭＡＣＳ，＃１３０−０５０−２０１）を用い、ＮＫ細胞を枯渇させるためにヒトＣＤ５６  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（ＭＡＣＳ，＃１３０−０５０−４０１）を用いた。ＰＢＭＣを計数し、室温で１０分間、３００×ｇで遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットをＭＡＣＳ単離用緩衝液［８０μＬ／細胞１０７個；ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃２００１２−０４３），０．５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，＃１０２７０−１０６），２ｍＭのＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，＃Ｅ−６５１１）］に再懸濁した。ＣＤ１４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓおよびＣＤ５６  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（２０μＬ／細胞１０７個）を添加し、４〜８℃で１５分間インキュベートした。細胞をＭＡＣＳ単離用緩衝液（１〜２ｍＬ／細胞１０７個）で洗浄した。遠心分離（上記を参照）の後、上清を廃棄し、細胞をＭＡＣＳ単離用緩衝液（５００μＬ／細胞１０８個）に再懸濁した。次いでＣＤ１４／ＣＤ５６陰性細胞をＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，＃１３０−０４２−４０１）により単離した。ＰＢＭＣ  ｗ／ｏ  ＣＤ１４＋／ＣＤ５６＋細胞（ＣＤ１４＋／ＣＤ５６＋細胞を含まないＰＢＭＣ）を、ＲＰＭＩ完全培地、すなわちＲＰＭＩ  １６４０（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，＃ＦＧ１２１５）に１０％のＦＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，＃Ｓ０１１５）、１×非必須アミノ酸（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，＃Ｋ０２９３）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，＃Ｌ１６１３）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，＃Ｌ０４７３）および１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，＃Ａ２２１３）を補充したもので、インキュベーター内において３７℃で、必要になるまで培養した。
【０１５９】
標的細胞の標識化
フローサイトメトリーにおける細胞溶解の分析のために、蛍光性の膜色素ＤｉＯＣ１８（ＤｉＯ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，＃Ｖ２２８８６）を用いて標的細胞としてのヒトもしくはマカク５Ｔ４でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞または５Ｔ４発現ヒトＮＣＩ−Ｎ８７細胞を標識し、それらをエフェクター細胞から識別した。要約すると、細胞を収穫し、ＰＢＳで１回洗浄し、２％（ｖ／ｖ）のＦＢＳおよび膜色素ＤｉＯ（５μＬ／細胞１０６個）を含有するＰＢＳ中で細胞１０６個／ｍＬに調整した。３７℃で３分間のインキュベーション後、細胞を完全ＲＰＭＩ培地中で２回洗浄し、細胞数を１．２５×１０５個／ｍＬに調整した。０．５％（ｖ／ｖ）等張ＥｏｓｉｎＧ溶液（Ｒｏｔｈ，＃４５３８０）を用いて細胞の生存性を判定した。
【０１６０】
フローサイトメトリーに基づく分析
このアッセイは、５Ｔ４二重特異性抗体の系列希釈液の存在下でのマカクまたはヒト５Ｔ４トランスフェクションしたＣＨＯ細胞の溶解を定量するために設計された。
【０１６１】
等体積のＤｉＯ標識した標的細胞とエフェクター細胞（すなわち、ＰＢＭＣ  ｗ／ｏ  ＣＤ１４＋細胞）を混合して、Ｅ：Ｔの細胞比を１０：１にした。１６０μＬのこの懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルへ移した。４０μＬの、５Ｔ４二重特異性抗体および陰性対照二重特異性抗体（ＣＤ３を基礎とする二重特異性抗体であって、無関係な標的抗原を認識するもの）の系列希釈液、または追加の陰性対照としてのＲＰＭＩ完全培地を添加した。二重特異性抗体が仲介する細胞傷害反応を７％  ＣＯ２加湿インキュベーター内で４８時間、進行させた。次いで細胞を新たな９６ウェルプレートへ移し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を最終濃度１μｇ／ｍＬで添加することにより、標的細胞膜の統合性の喪失をモニターした。ＰＩは普通は生存細胞から排除される膜不透過性色素であり、これに対し死細胞はそれを取り込んで蛍光発光により同定できるようになる。試料をＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ計測器でフローサイトメトリーにより測定し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアで解析した（両方ともＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから）。
【０１６２】
標的細胞はＤｉＯ陽性細胞として同定された。ＰＩ陰性標的細胞を生存標的細胞として分類した。細胞傷害性のパーセントを次式に従って計算した：
【０１６３】
【数１】
2014533929.tif 000005
【０１６４】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェア（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，サンディエゴ）を用いて、細胞傷害性のパーセントを対応する二重特異性抗体濃度に対してプロットした。用量応答曲線を、傾きを固定したＳ字形用量応答曲線の評価のための４パラメーターロジスティック回帰モデルで解析し、ＥＣ５０値を計算した。
【０１６５】
８．３  マカクＴ細胞系によるＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイ
マカクＴ細胞系４１１９ＬｎＰｘ(Knappe et al. Blood 95:3256-61 (2000), Prof Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen-Nuernbergによって好意的に提供された)をエフェクター細胞源として用いた。マカク５Ｔ４トランスフェクションしたＣＨＯ細胞の標的細胞標識化およびフローサイトメトリーに基づく細胞傷害活性の分析を、前記に従って実施した。
【実施例９】
【０１６６】
[0150]  実施例９
細胞傷害活性
ヒト様５Ｔ４二重特異性抗体がエフェクターＴ細胞を５Ｔ４発現標的細胞へ再指向させる効力を、５種類の追加インビトロ細胞傷害性アッセイで分析した：
１．  ５Ｔ４二重特異性抗体が、刺激されたヒトエフェクターＴ細胞を５Ｔ４陽性ヒト腫瘍細胞系ＨＣＴ１１６へ再指向させる効力を、５１−クロム放出アッセイで測定した；
２．  ５Ｔ４二重特異性抗体が、刺激されていないヒトＰＢＭＣ中のＴ細胞をヒト５Ｔ４トランスフェクションしたＣＨＯ細胞へ再指向させる効力を、ＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイで測定した；
３．  ５Ｔ４二重特異性抗体が、刺激されていないヒトＰＢＭＣ中のＴ細胞を５Ｔ４陽性ヒト腫瘍細胞系Ｎ８７へ再指向させる効力を、ＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイで測定した；
４．  交差反応性５Ｔ４二重特異性抗体がマカクＴ細胞をマカク５Ｔ４トランスフェクションしたＣＨＯ細胞へ再指向させる効力を確認するために、マカクＴ細胞系をエフェクター細胞として用いて実施した；
５．  モノマー形とダイマー形の５Ｔ４二重特異性抗体間の効力ギャップを、５１−クロム放出アッセイで、ヒト５Ｔ４トランスフェクションしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用い、刺激されたヒトＴ細胞をエフェクター細胞として用いて決定した。
【０１６７】
９．１  ５Ｔ４陽性ヒト腫瘍細胞系ＨＣＴ１１６に対する刺激されたヒトＴ細胞
５Ｔ４二重特異性抗体の細胞傷害活性を、５１−クロム（５１Ｃｒ）放出による細胞傷害性アッセイで、５Ｔ４陽性ヒト腫瘍細胞系ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ  ＣＣＬ−２４７）を標的細胞源として用い、刺激された濃縮ヒトＣＤ８  Ｔリンパ球をエフェクター細胞として用いて分析した（図９）。
【０１６８】
刺激された濃縮ヒトＣＤ８  Ｔ細胞をエフェクター細胞として用い、ヒト５Ｔ４トランスフェクションしたＣＨＯ細胞を標的として用いた５１クロム放出アッセイの結果に従って、刺激された濃縮ヒトＣＤ８  Ｔ細胞をエフェクター細胞として用い、５Ｔ４陽性ヒト腫瘍細胞系ＨＣＴ１１６を標的として用いた場合、１桁ｐｇ／ｍｌという低いＥＣ５０値をもつ最も高い細胞傷害性の５Ｔ４二重特異性抗体が、Ｅ２／４エピトープクラスター内に見出された。ＨＣＴ１１６アッセイで２桁ｐｇ／ｍｌのＥＣ５０値をもつ、Ｅ４エピトープクラスターに対する５Ｔ４二重特異性抗体の強い活性もみられた。しかし、Ｅ７エピトープクラスターの５Ｔ４二重特異性抗体はＨＣＴ１１６細胞に対して２桁ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０値という乏しい細胞傷害性を示した；ただし、ヒト５Ｔ４トランスフェクションしたＣＨＯ細胞に対する細胞傷害活性についてのそれらのＥＣ５０値はなお、許容できる３桁ｐｇ／ｍｌの範囲内にあった。
【０１６９】
９．２  ヒト５Ｔ４トランスフェクションした標的細胞に対する刺激されていないヒトＰＢＭＣ
５Ｔ４二重特異性抗体の細胞傷害活性を、ＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイにおいて、ヒト５Ｔ４でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用い、刺激されていないヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いて同様に分析した（図１０）。
【０１７０】
刺激されていないヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞とし、５Ｔ４トランスフェクションしたＣＨＯ細胞を標的とする、ＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイの結果により、既に５１クロム放出アッセイでみられたエピトープ−活性関係が確認された。Ｅ２／４エピトープクラスター内では、８種類中６種類の５Ｔ４二重特異性抗体が１桁ｐｇ／ｍｌのＥＣ５０値できわめて有効であると証明され、８種類中２種類はなお２桁ｐｇ／ｍｌのＥＣ５０値を示した。４種類のＥ４クラスター二重特異性抗体すべてが２桁ｐｇ／ｍｌのＥＣ５０範囲にあり、一方、Ｅ７クラスターの５Ｔ４二重特異性抗体は、刺激されていないヒトＰＢＭＣにより、ヒト５Ｔ４でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞の最大半量溶解を誘発するのに３桁ｐｇ／ｍｌの濃度（すなわち、ＥＣ５０）を必要とした。
【０１７１】
９．３  ５Ｔ４陽性ヒト腫瘍細胞系ＮＣＩ−Ｎ８７に対する刺激されていないヒトＰＢＭＣ
５Ｔ４二重特異性抗体の細胞傷害活性を、ＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイにおいて、５Ｔ４陽性ヒト腫瘍細胞系ＮＣＩ−Ｎ８７を標的細胞源として用い、刺激されていないヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いてさらに分析した（図１１）。
【０１７２】
刺激されていないヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用い、５Ｔ４陽性ヒト腫瘍細胞系ＮＣＩ−Ｎ８７を標的として用いる、ＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイの結果により、Ｅ２／４クラスターにマッピングした５Ｔ４二重特異性抗体の卓越した細胞傷害活性が再び確認された。このアッセイでは、Ｅ４エピトープクラスターの４種類の５Ｔ４二重特異性抗体がそれらのＥ２／４カウンパートとほぼ同じ活性であると証明された。しかし、Ｅ７クラスターの二重特異性抗体は、刺激されていないヒトＰＢＭＣによりヒトＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍細胞の最大半量溶解を誘発するのに１桁ｎｇ／ｍｌの濃度（すなわち、ＥＣ５０）を必要とした；これは、刺激された濃縮ヒトＣＤ８エフェクターＴ細胞を用いる５１クロム放出アッセイで試験した他の５Ｔ４陽性ヒト腫瘍細胞系（ＨＣＴ１１６）に対してそれらの活性が乏しいことと一致する。
【０１７３】
９．４  マカク５Ｔ４発現標的細胞に対するマカクＴ細胞
最後に、５Ｔ４二重特異性抗体の細胞傷害活性を、ＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイにおいて、マカク５Ｔ４でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞を標的細胞として用い、マカクＴ細胞をエフェクター細胞源として用いて分析した（図１２）。
【０１７４】
マカクの系におけるＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイの結果は、ヒトの系における所見と近似していた。したがって、細胞系４１１９ＬｎＰｘ由来のマカクＴ細胞は誘発されて、マカク５Ｔ４でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞を効果的に死滅させた：Ｅ２／４クラスターの５Ｔ４二重特異性抗体により１桁ｐｇ／ｍｌのＥＣ５０値で、Ｅ４クラスターの５Ｔ４二重特異性抗体により２桁ｐｇ／ｍｌのＥＣ５０値で、Ｅ７クラスターの５Ｔ４二重特異性抗体により３〜４桁ｐｇ／ｍｌのＥＣ５０値で。
【実施例１０】
【０１７５】
[0151]  実施例１０
ヒト腫瘍異種移植モデルにおける二重特異性抗体の療法効果
ヒト癌細胞系ＨＣＴ−１１６およびＮＣＩ−Ｎ８７をＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊマウスの右背側腹部に皮下注射した。
【０１７６】
腫瘍が体積１８０〜２００ｍｍ３に達した後、マウスをランダムに処置グループに分けた。インビトロ増加させたヒトＴ細胞を動物グループの腹腔に注射することによりマウスに移植した。マウスグループ１（ｎ＝５）にはエフェクター細胞を投与せず、Ｔ細胞単独で腫瘍の増殖に及ぼす影響をモニターするグループ２との比較のための、非移植対照として用いた。
【０１７７】
平均腫瘍体積がそれぞれ２４０（ＨＣＴ−１１６）および２００ｍｍ３（ＮＣＩ−Ｎ８７）になった時点で処置を開始した。処置開始日の処置グループそれぞれの平均腫瘍サイズは、他のグループのいずれとも統計的に差がなかった（分散分析）。マウスを０．１、０．５および２．５ｍｇ／ｋｇ／日の５Ｔ４−１２−ＣＤ３で、それぞれ１４日間（ＨＣＴ−１１６）および２１日間（ＮＣＩ−Ｎ８７）の静脈内ボーラス注射により処置した。
【０１７８】
試験期間中、腫瘍をカリパス（caliper）により測定し、グループ間の腫瘍体積比較により進行を評価した。
【０１７９】
【表３】
2014533929.tif 000006
【０１８０】
表３  ＨＣＴ−１１６進行期腫瘍モデルにおける相対腫瘍体積
ｘ日目の腫瘍体積を相対腫瘍体積(Relative Tumor Volume)（ＲＴＶ）として表わし、次式に従って計算する：ＲＴＶ＝ＴＶｘ／ＴＶ１５；ここで、ＴＶｘはｘ日目の腫瘍体積であり、ＴＶ１５は１５日目（Ｄ１５）の処置開始前腫瘍体積である。
【０１８１】
【表４】
2014533929.tif 000007
【０１８２】
表４  ＨＣＴ−１１６進行期腫瘍モデルにおける二重特異性抗体仲介による腫瘍増殖阻害
Ｔ／Ｃ％は、ＴＶをＴ／Ｃ％＝１００×（処置グループの中央ＴＶ）／（対照グループの中央ＴＶ）として計算することにより決定される。
【０１８３】
【表５】
2014533929.tif 000008
【０１８４】
表５  ＮＣＩ−Ｎ８７進行期腫瘍モデルにおける相対腫瘍体積
ｘ日目の腫瘍体積を相対腫瘍体積（ＲＴＶ）として表わし、次式に従って計算する：ＲＴＶ＝ＴＶｘ／ＴＶ２２；ここで、ＴＶｘはｘ日目の腫瘍体積であり、ＴＶ１５は２２日目（Ｄ２２）の処置開始前腫瘍体積である。
【０１８５】
【表６】
2014533929.tif 000009
【０１８６】
表６  ＮＣＩ−Ｎ８７進行期腫瘍モデルにおける二重特異性抗体仲介による腫瘍増殖阻害
Ｔ／Ｃ％は、ＴＶをＴ／Ｃ％＝１００×（処置グループの中央ＴＶ）／（対照グループの中央ＴＶ）として計算することにより決定される。
【０１８７】
【表７−１】
2014533929.tif 000010
【０１８８】
【表７−２】
2014533929.tif 000011
【０１８９】
【表７−３】
2014533929.tif 000012
【０１９０】
【表７−４】
2014533929.tif 000013
【０１９１】
【表７−５】
2014533929.tif 000014
【０１９２】
【表７−６】
2014533929.tif 000015
【０１９３】
【表７−７】
2014533929.tif 000016
【０１９４】
【表７−８】
2014533929.tif 000017
【０１９５】
【表７−９】
2014533929.tif 000018
【０１９６】
【表７−１０】
2014533929.tif 000019
【０１９７】
【表７−１１】
2014533929.tif 000020
【０１９８】
【表７−１２】
2014533929.tif 000021
【０１９９】
【表７−１３】
2014533929.tif 000022
【０２００】
【表７−１４】
2014533929.tif 000023
【０２０１】
【表７−１５】
2014533929.tif 000024
【０２０２】
【表７−１６】
2014533929.tif 000025
【０２０３】
【表７−１７】
2014533929.tif 000026
【図１】
2014533929.tif 000027
【図３】
2014533929.tif 000028
【図２】
2014533929.tif 000029
【図４】
2014533929.tif 000030
【図５−１】
2014533929.tif 000031
【図５−２】
2014533929.tif 000032
【図５−３】
2014533929.tif 000033
【図５−４】
2014533929.tif 000034
【図５−５】
2014533929.tif 000035
【図６−１】
2014533929.tif 000036
【図６−２】
2014533929.tif 000037
【図７−１】
2014533929.tif 000038
【図７−２】
2014533929.tif 000039
【図８−１】
2014533929.tif 000040
【図８−２】
2014533929.tif 000041
【図８−３】
2014533929.tif 000042
【図８−４】
2014533929.tif 000043
【図９−１】
2014533929.tif 000044
【図９−２】
2014533929.tif 000045
【図１０−１】
2014533929.tif 000046
【図１０−２】
2014533929.tif 000047
【図１１−１】
2014533929.tif 000048
【図１１−２】
2014533929.tif 000049
【図１２−１】
2014533929.tif 000050
【図１２−２】
2014533929.tif 000051
【図１３】
2014533929.tif 000052
【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2014533929.tif 000054
2014533929.tif 000055
2014533929.tif 000056
2014533929.tif 000057
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