(57)【要約】  ｐＨセンサーまたはｐＨ指示薬に対して、等温の試薬のキットを用いて、核酸と増幅混合物を提供する工程、等温の増幅を用いて核酸を増幅する工程、および、ｐＨセンサーまたはｐＨ指示薬を用いて、増幅によるｐＨの変化を検知する工程による、核酸の増幅をモニタリングする方法。試薬のキットは、マグネシウム塩、第４級アンモニウム塩、アルカリ塩基を含む。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を等温で増幅する際に使用される混合物を形成するために組み合わせ可能な試薬のキットであって、
試薬のキットは、マグネシウム塩、第４級アンモニウム塩、アルカリ塩基を含む、ことを特徴とするキット。
【請求項２】
混合物の緩衝能は、混合物に当てられたセンサーによって検知される閾値のｐＨ変化により分割された増幅中に放出されたプロトンの予想される濃度未満に設定される、ことを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項３】
混合物の緩衝能は、混合物に当てられたセンサーによって検知される閾値のｐＨ変化により分割された増幅中に放出されたプロトンの予想される濃度の２分の１未満に設定される、ことを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項４】
検知される閾値のｐＨ変化は前記センサーの検出限界である、ことを特徴とする請求項２または３に記載のキット。
【請求項５】
増幅の動作条件での混合物の緩衝能は、１０ｍＭ未満、好ましくは５ｍＭ未満、より好ましくは１ｍＭ未満である、ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のキット。
【請求項６】
混合物中の緩衝剤の濃度は、５ｍＭ未満、より好ましくは３ｍＭ未満、２ｍＭ未満、または１ｍＭ未満である、ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載のキット。
【請求項７】
硫酸化合物の濃度は、もしそれが存在する場合、１５ｍＭ未満、好ましくは１０ｍＭ未満、８ｍＭ未満、５ｍＭ未満、または、１ｍＭ未満である、ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載のキット。
【請求項８】
第４級アンモニウム塩、好ましくは塩化アンモニウムの濃度は、２ｍＭから１５ｍＭの間にある、ことを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載のキット。
【請求項９】
アルカリ塩基の濃度は、混合物のｐＨを、６から９、好ましくは７から８．８、より好ましくは８から８．６の間で設定する、ことを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載のキット。
【請求項１０】
アルカリ塩基はＮａＯＨ、ＫＯＨ、またはＬｉＯＨのうちの１つである、ことを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載のキット。
【請求項１１】
核酸の増幅で使用される１つ以上のプライマーをさらに含み、プライマーは、増幅が標的核酸の存在を示すように、対立遺伝子に特異的である、ことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載のキット。
【請求項１２】
等温の増幅は、鎖置換増幅、好ましくは、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）である、ことを特徴とする請求項１乃至１１のいずれかに記載のキット。
【請求項１３】
混合物の緩衝能は、増幅がない状態で放出される予想される量のプロトンをほぼ遮蔽する、ことを特徴とする請求項１乃至１２のいずれかに記載のキット。
【請求項１４】
鎖置換酵素、ヌクレオチド、およびプライマーをさらに含み、これらの少なくとも１つは残りの試薬とは別々に保管される、ことを特徴とする請求項１乃至１３のいずれかに記載のキット。
【請求項１５】
核酸の増幅をモニタリングする方法であって、
該方法は、
ｐＨセンサーまたはｐＨ指示薬に対して、請求項１乃至１４のいずれかの試薬のキットを用いて、核酸と増幅混合物を提供する工程、
等温の増幅を用いて核酸を増幅する工程、および、
ｐＨセンサーまたはｐＨ指示薬を用いて、増幅によるｐＨの変化を検知する工程を含む、方法。
【請求項１６】
ｐＨ指示薬は比色用色素または蛍光色素である、ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ｐＨセンサーはイオン感受性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）である、ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
あらかじめ決められた量の変化以上に混合物のｐＨを変化させるために必要な反応時間を決定する工程と、
前記反応時間に基づいて核酸の出発濃度を定量化する工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項１５乃至１７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
混合物は、参照電極、好ましくは銀−塩化銀電極と流体連通する、ことを特徴とする請求項１５乃至１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
混合物は、核酸の標的の一塩基多型（ＳＮＰ）に相補的な少なくとも１つの塩基を有する１つ以上の対立遺伝子に特異的なプライマーを含み、前記方法は、ｐＨセンサーまたはｐＨ指示薬によって検知されるように、増幅が進行するかどうかに依存して、核酸の前記少なくとも１つの塩基を特定する工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項１５乃至１９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１】
増幅は、混合物の緩衝能の１０％以上、混合物のプロトン濃度を変化させる、ことを特徴とする請求項１５乃至２０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２２】
請求項１乃至１４のいずれか１つのキットを使用して核酸を等温で増幅する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大量の核酸を増幅する方法およびキットに関する。本発明は、等温の増幅技術に特に関係する。増幅された核酸はセンサーによって検知されてもよい。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子分析を行うとき、サンプル中に存在するコピーの数は通常少なすぎて検知できないため、サンプル中のコピー数を増幅するニーズが一般にある。
【０００３】
これは、例えば、サーモサイクリング（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）による増幅または等温の増幅を用いて行うことができる。等温の技術はＳＤＡ、ＬＡＭＰ、ＳＭＡＰ、ＩＣＡＮ、ＳＭＡＲＴを含む。その反応は鎖置換反応を用いて一定の温度で進行する。増幅は、サンプル、プライマー、鎖置換活性を備えたＤＮＡポリメラーゼ、および、基質の混合物を一定温度でインキュベートすることにより、単一ステップで完了することができる。
【０００４】
ループ媒介等温増幅（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＬＡＭＰ）と呼ばれるある技術では、標的に特異的な増幅は、標的遺伝子上の６〜８の異なる領域をそれぞれ認識するために特別に設計された４〜６の異なるプライマーを用いることで、達成される。ＬＡＭＰは、参照によって本明細書に組み込まれる、Ｅｉｋｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌの特許文献１「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ」でさらに記載されている。
【０００５】
そのような方法は、一般的に、１５−６０分で、１０９−１０１０倍、核酸のコピーを増幅する。プライマーに加えて、鎖置換技術は、酵素の機能性を維持するために、トリスおよび硫酸の化合物（ＭｇＳＯ４、ＮＨ４ＳＯ４など）を使用する。
【０００６】
トリスは、有機化合物（化学式（ＨＯＣＨ２）３ＣＮＨ２で、公式にはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとして知られている）である。ＬＡＭＰのような鎖置換技術は、最適なｐＨで反応を維持する緩衝液としてトリスを使用する。トリスおよび硫酸の推奨濃度は、２０ｍＭ以上であり、それぞれ１２−２０ｍＭである。
【０００７】
ひとたび核酸が増幅されると、核酸アッセイは、分光光度法、濁度、ＬＦＤ（側方流動ディップスティック）（ｌａｔｅｒａｌ  ｆｌｏｗ  ｄｉｐｓｔｉｃｋｓ）またはルシフェラーゼなどの第２の検出技術を必要とする。しかしながら、そのような既知の技術には欠点がある。蛍光試薬は標識がＵＶ蛍光を可能にすること必要としているため高価である。ＳＹＢＲグリーンなどの蛍光試薬はＤＮＡと結合して、本質的に発がん性にしてしまい、エームス試験は、ＤＮＡを変異原性かつ細胞毒性であると示す。同様に、ＳＹＢＲグリーンは、特異的ではなく、どんな二本鎖ＤＮＡにも結合して、バックグラウンドシグナルを増やしてしまう。濁度測定は、定量化をもたらすためには高価な器具の使用を必要とする。最後に、ＬＦＤで使用される試薬は、非特異的な検出をしやすい第２の共役を必要とする。
【０００８】
既存の等温技術はｐＨ検出を使用する系には適していない。したがって、当該技術分野では、等温で核酸を増幅し、安全で廉価なデバイスで効率的に核酸を検知するためのキットおよび方法に対するニーズがある。驚いたことに、発明者たちは、使用される試薬が増幅収量を増加させることもあることに気付いた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＥＰ２０４５３３７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の態様によれば、核酸を等温で増幅する際に使用される混合物を形成するために組み合わせ可能な試薬のキットが提供され、試薬のキットは、マグネシウム塩、第４級アンモニウム塩、アルカリ塩基を含む。混合物の緩衝能は、混合物に当てられたセンサーによって検知される閾値のｐＨ変化により分割された増幅中に放出されたプロトンの予想される濃度未満に設定されてもよい。
【００１１】
混合物の緩衝能は、混合物に当てられたセンサーによって検知される閾値のｐＨ変化により分割された増幅中に放出されたプロトンの予想される濃度の２分の１未満に設定されてもよい。
【００１２】
検知される閾値のｐＨ変化は前記センサーの検出限界であってもよい。増幅の動作条件での混合物の緩衝能は、１０ｍＭ未満、好ましくは５ｍＭ未満、より好ましくは１ｍＭ未満であってもよい。
【００１３】
混合物中の緩衝剤の濃度は、５ｍＭ未満、より好ましくは３ｍＭ未満、２ｍＭ未満、または１ｍＭ未満であってもよい。
【００１４】
硫酸化合物の濃度は、もしそれが存在する場合、１５ｍＭ未満、好ましくは１０ｍＭ未満、８ｍＭ未満、５ｍＭ未満、または、１ｍＭ未満であってもよい。
【００１５】
第４級アンモニウム塩、好ましくは塩化アンモニウムの濃度は、２ｍＭから１５ｍＭの間にある。
【００１６】
アルカリ塩基の濃度は、混合物のｐＨを、６から９、好ましくは７から８．８、より好ましくは８．３から８．６の間で設定する。
【００１７】
アルカリ塩基はＮａＯＨ、ＫＯＨ、またはＬｉＯＨのうちの１つである。
【００１８】
核酸の増幅で使用される１つ以上のプライマーも存在し、そのようなプライマーは、増幅が標的核酸の存在を示すように、対立遺伝子に特異的である。
【００１９】
等温の増幅は、鎖置換増幅、好ましくは、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）であってもよい。
【００２０】
混合物の緩衝能は、増幅がない状態で放出される予想される量のプロトンをほぼ遮蔽してもよい。
【００２１】
そこで、キットは、鎖置換酵素、ヌクレオチド、およびプライマーを有していてもよく、好ましくは、これらの少なくとも１つは残りの試薬とは別々に保管される。
【００２２】
本発明の第２の態様によれば、等温の増幅のための試薬のキット、ｐＨセンサー、またはｐＨ指示薬を使用し、等温の増幅を利用して核酸を増幅し、および、ｐＨセンサーまたはｐＨ指示薬を用いて、増幅によるｐＨの変化を検知するための方法が提供される。
【００２３】
ｐＨ指示薬は比色用色素または蛍光色素であってもよく、ｐＨセンサーはイオン感受性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）であってもよい。
【００２４】
該方法は、あらかじめ決められた量の変化以上に混合物のｐＨを変化させるために必要な反応時間を決定し、その反応時間に基づいて核酸の出発濃度を定量化してもよい。
【００２５】
混合物は、参照電極、好ましくは銀−塩化銀電極と流体連通してもよい。
【００２６】
混合物は、核酸の標的の一塩基多型（ＳＮＰ）に相補的な少なくとも１つの塩基を有する１つ以上の対立遺伝子に特異的なプライマーを含んでもよく、該方法は、ｐＨセンサーまたはｐＨ指示薬によって検知されるように、増幅が進行するかどうかに依存して、核酸の前記少なくとも１つの塩基を特定する工程をさらに含む。
【００２７】
増幅は、混合物の緩衝能の１０％以上、混合物のプロトン濃度を変化させてもよい。
【００２８】
本発明の第３の態様によれば、試薬の新しいキットを使用して核酸を等温で増幅する工程を含む方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
本発明の特定の実施形態は、添付の図面を参照して、ほんの一例としてここに記載される。
【００３０】
【図１】一連の化学反応は、ＬＡＭＰなどの鎖置換増幅技術である。
【図２】サンプルに当てたＩＳＦＥＴの外形図である。
【図３】ｐＨ検出システムの外形図である。
【図４】（選択肢Ａ）ＤＮＡを特定する、または、（選択肢Ｂ）ＤＮＡの量を計算するために、ＤＮＡサンプルの増幅をモニターする方法のフローチャートである。
【図５】通常のＬＡＭＰ手法での試薬の緩衝能のグラフである。
【図６】ＮＨ４Ｃｌの異なる濃度の緩衝能を示すグラフである。
【図７】サンプル中のＤＮＡの定量化のための標準曲線グラフである。
【００３１】
従来のＬＡＭＰ増幅方法は、２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．８）、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ）４ＳＯ４、２．５ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のトリトンＸ−１００、０．８Ｍのベタイン、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ｄＮＴＰ、およびＢｓｔポリメラーゼなどの標準的なアッセイ条件下で置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用する。
【００３２】
発明者たちは、これらの従来の試薬が、主として増幅中にプロトンの生成を遮蔽する能力を有しているため、ｐＨセンサーでは検知できないことに気付いた。
【００３３】
確かに、これらの成分はすべて異なるｐＫａを有しており、そのことは、これらが混合物の緩衝能に異なる影響を及ぼすことを意味している。
【００３４】
上に言及した試薬のなかで、トリス塩酸は、ポリメラーゼが作用するのに最適な範囲内で溶液を安定したｐＨ値に維持しやすくするために、対イオン（Ｈ＋およびＯＨ−）を吸収する能力を有している。
【００３５】
発明者たちは、ポリメラーゼ（Ｂｓｔなど）が作用可能となるようにｐＨを設定しつつ、トリス塩酸をＮａＯＨに交換することで緩衝能が減少することに気付いた。さらに、ＮａＯＨは、二本鎖ＤＮＡの二本鎖をさほど厳重には結合せず、置換ポリメラーゼが二本鎖を容易に分解することを可能にし、それによって反応を促進して鎖置換酵素の効率を上げる。
【００３６】
さらに、ＩＳＦＥＴなどの電子センサーは、白金、Ａｇ／ＡｇＣｌ、カロメルなどの参照電極を使用する。このような材料のいくつかは、とりわけＡｇ／ＡｇＣｌ電極は、これらの標準的な試薬で反応する。例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極で、トリスは、Ａｇ／ＡｇＣｌ性能の質を低下させるトリス−Ａｇ複合体を電極上に形成し、硫酸を含有する試薬は、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を汚染しかねない。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本方法を使用する好ましいシステムは、ｐＨセンサーまたはｐＨ指示薬、マイクロ流体構造、核酸サンプル、試薬、および、サンプルの電圧電位を設定するのに必要な場合は参照電極を含む。試薬とサンプルを組み合わせて、増幅を可能にするための１つの流体にする。プロトンは増幅の間に放出され、ｐＨの変化はｐＨセンサーまたはｐＨ指示薬で測定される。
【００３８】
好ましくは、ｐＨセンサーまたはｐＨ指示薬は、ＩＳＦＥＴ（イオン感受性電界効果トランジスタ）である。これは図３に示され、ｐＨセンサー（３）は、ＣＭＯＳマイクロチップ（７）上の１つ以上のイオン感受性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）であってもよく、その上に、基質（２）の空間によって定義されるマイクロ流体チャンバー（８）を有する。試薬と核酸サンプルは、ＩＳＦＥＴに暴露された１つ以上のチャンバーに加えられる前後に、組み合わされてもよい。ＩＳＦＥＴはそれぞれ、シグナルプロセッサによってモニターされる電気シグナルを出力する。ＩＳＦＥＴのパッシベーション層は、プロトン（水素イオン）に高感度になるように機能化させることできる。核酸が増幅されると、プロトンが放出され、ＩＳＦＥＴの電気出力の変化としてシグナルプロセッサによって検知される。
【００３９】
代替的な実施形態では、ｐＨ指示薬は、増幅中に放出されたプロトンを検知するために使用されてもよい。例えば、ｐＨ指示薬は、比色用色素または蛍光色素であってもよく、これは、接触する流体のｐＨが変化する際に色素から放出される波長などの光学的性質を変化させる。ｐＨ指示薬の例としては、フルオレセイン、ピラニン、および、ｐＨｒｏｄｏ（商標）色素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能）を含んでいる。
【００４０】
マイクロ流体構造は、近接のサンプルを受け取るウェル、チャンバー、またはチャネルであってもよく、センサーまたは指示薬は、センサーまたは指示薬にサンプルを送達するための手段を含んでもよい。マイクロ流体構造は、センサーまたは指示薬から離れたプロトンの拡散を減少させるのにも役立つ。以下の実施形態では、ＩＳＦＥＴは、ｐＨ検出スキームを例証するために使用されるが、他のｐＨセンサーを使用することもできる。チャンバーは、ＳＵ−８などの材料の中の空洞によって定義されてもよく、これはマイクロチップの上に配され、離れて選択的にエッチング処理されることで、前記空洞が残される。
【００４１】
図２は、フローティングゲートと流体の電解質に晒された窒化ケイ素で作られる検知層を含むＩＳＦＥＴを示している。ＩＳＦＥＴは、引用によって本明細書に組み込まれる特許ＵＳ２００４１３４７９８（Ａ１）にさらに記載されている。
【００４２】
好ましくは、ＩＳＦＥＴはそれぞれ、ＩＳＦＥＴと参照シグナルの間の差から標準化された出力シグナルを生成する。参考シグナルは、陰性対照反応に晒された別のＩＳＦＥＴ、または、チップに置かれたがｐＨの変動には晒されていないＦＥＴに由来してもよい。したがって、チップ上の任意の共通するドリフトまたはノイズは、これらのシグナル間の差をとることで除去される。
【００４３】
好ましい増幅反応は等温の増幅反応であり、好ましくは、鎖置換反応である。本明細書で使用されているように、鎖置換反応は、鎖置換反応が可能な鎖置換活性と反応条件を備えたポリメラーゼによって提供される。鎖置換反応の例としては、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、または、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）が挙げられる。
【００４４】
一例として、ＬＡＭＰ方法の化学反応の工程が図１に例証される。工程１では、高温での二本鎖ＤＮＡ鋳型は動的平衡にある。プライマーＦ２は相補的な位置で一本鎖にアニーリング可能である。工程２では、鎖置換活性を備えたポリメラーゼは、ヌクレオチドをＦ２の３’末端から鋳型に沿って伸長させることができる。ヌクレオチドの取り込みは、副産物の１つとして水素イオン（プロトン）を有する反応である。工程３では、Ｆ３プライマーは、鋳型上のＦ３ｃ領域にアニーリングされ、鎖の置換を始める。上鎖は工程４で合成され、さらにプロトンを放出する。下鎖は一本鎖になり（工程５）、これは、Ｆ１ｃが工程６で５’末端でＦ１にアニーリングされると、ステムループを形成する。同時に、ＢＩＰプライマーは鎖の他方の末端にアニーリングされ、ヌクレオチドはＢ２から伸長し、さらに多くのプロトンが放出される。プライマーＢ３は鎖を置換し、工程７で示される二本鎖を形成するために伸長を促進する。工程８の構造は両端が同形のステムループ（ｄｏｕｂｌｅ  ｅｎｄｅｄ  ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）を有し、該ステムループから鋳型を増幅するための連続的な置換および伸長がなされる。前述と同様に、プロトンの放出には伸長が関係している。
【００４５】
本明細書に記載される等温の増幅反応で使用される鎖置換ポリメラーゼは、次のグループ：ｐｈｉ２９−ＤＮＡポリメラーゼ、クレノーＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、９ｏＮｍ（ＴＭ）ＤＮＡポリメラーゼ、および、突然変異体、ならびに、その変異体から選択されてもよい。
【００４６】
当業者は、最適な試薬濃度がポリメラーゼの選択次第であること、および、以下の好ましい試薬に対する修飾が、ポリメラーゼの知識またはポリメラーゼを用いる実験からの通常の実施であるということを認識するであろう。適切な条件についての手引きは、酵素メーカーから入手可能である。
【００４７】
（好ましい試薬濃度）
本方法はいかなる緩衝剤も必要せず、最小限の緩衝剤だけが存在することが望ましい。緩衝剤は、少量の強酸または塩基が加えられるとき、あるいは、本件の場合、少量のプロトンがヌクレオチドの取り込み中に放出されるときにｐＨがわずかに変化するように、選択された作用点付近の溶液の酸度（ｐＨ）を維持するために用いられる弱酸とその共役塩基である。緩衝剤は、ｐＨの変化に対して緩衝を与えるという主たる目的を有する混合物に加えられた化合物である。本明細書で使用されているように、その主目的が干渉以外であるか、あるいは、その緩衝効果が、混合物中の別の化合物よりもはるかに少ない化合物は、緩衝剤ではない。核酸増幅反応のための緩衝剤は、一般に、６と８．５の間のｐＫａ値を有しており、６と９の間の緩衝範囲を有している。例えば、アンモニウム（ＮＨ４＋）は一定の緩衝能力を有しているが、その主な目的は、ｐＨ８の混合物で作用する９．２４のｐＫａで混合物を緩衝することではなく、それはトリスと比較してさほど強い緩衝液ではない。
【００４８】
緩衝剤、酵素、系の最初のｐＨの選択は相互に依存している。例えば、緩衝剤が以下の一般的な緩衝剤：ＴＡＰＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、トリス、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸、ＳＳＣ、およびＭＥＳのうちの１つであってもよいが、１つの実施形態では、トリスは８．５のｐＨでＢＳＴ酵素と共に使用される。好ましくは、緩衝剤の濃度は、１０ｍＭ未満、より好ましくは８ｍＭ未満、５ｍＭ未満、または１ｍＭ未満であってもよい。好ましくは、緩衝剤はトリスまたはＨＥＰＥＳである。
【００４９】
参照電極に対する毒の影響を弱めるために、組み合わせた流体中の硫酸化合物の濃度は、１５ｍＭ未満、好ましくは１０ｍＭ未満、８ｍＭ未満、５ｍＭ未満、または、１ｍＭ未満である。
【００５０】
塩化アンモニウムを硫酸アンモニウムの代わりに使用することができ、高収量の増幅も可能である。一般に、他の第４級塩を塩化アンモニウムの代わりに用いることができる。第４級アンモニウム塩は、構造ＮＲ４＋の正に帯電した多原子イオンであり、Ｒがアルキル基またはアリール基である。塩酸グアニジンと塩化アンモニウムは、第４級アンモニウム塩の例である。
【００５１】
好ましくは、組み合わせた流体中の第４級アンモニウム塩の濃度の範囲は、２ｍＭ、５ｍＭ、または８ｍＭよりも大きい。しかしながら、アンモニウム（ＮＨ４＋）は緩衝能力を有しており、したがって、最適な増幅収量を維持しつつ、組み合わせた流体中の塩化アンモニウムなどのアンモニウム化合物の最終濃度を最小限にする必要がある。緩衝能を減らすために、組み合わせた流体中のアンモニウム化合物の濃度は、１５ｍＭ未満、好ましくは１０ｍＭ未満である。
【００５２】
マグネシウムは鋳型へのヌクレオチドの取り込みを促進するのに役立つ。組み合わせた流体中のマグネシウム化合物、例えば、硫酸マグネシウムの濃度は、好ましくは０．５Ｍより大きく、１ｍＭより大きく、２ｍＭより大きく、または、４ｍＭよりも大きい。組み合わせた流体中のマグネシウムイオンの濃度は、ｄＮＴＰ、鋳型、およびプライマーの濃度に依存する。一般に、組み合わせた流体中の硫酸マグネシウムに対するｄＮＴＰの好ましい比率は、１：２未満、１：３未満、１：４未満、または、１：５未満である。
【００５３】
高い塩素濃度はＡｇ／ＡｇＣｌ電極を助けるため、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムなどの一価の塩が加えられ、塩化物イオン濃度は好ましくは、１０ｍＭよりも大きく、２０ｍＭよりも大きく、３０ｍＭよりも大きく、４０ｍＭよりも大きく、または５０ｍＭよりも大きい。１つの実施形態では、流体中の塩化物イオン濃度は４０ｍＭと６０ｍＭの間にある。
【００５４】
流体の出発ｐＨを設定するために、ＮａＯＨ、ＬｉＯＨ、またはＫＯＨなどのアルカリ塩基が流体に加えられる。アルカリ塩基の濃度は、６と９の間、好ましくは７と８．８の間、もっとも好ましくは８と８．６の間に設定されるように設計され、これらのｐＨ領域は、特定の酵素を作動させるのに望ましい。Ｂｓｔポリメラーゼについては、好ましい出発ｐＨは、７よりも大きく、さらに好ましくは８．２よりも大きく８．８未満で、さらに好ましくは８．６未満である。
【００５５】
他の試薬の濃度は通常の量で維持されてもよい。Ｎｏｔｏｍｉ  Ｔ  ｅｔ．  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０００  Ｊｕｎ  １５；  ２８（１２）：  Ｅ６３を参照。例えば、１つの実施形態では、Ｂｓｔポリメラーゼの量は、組み合わせた流体の１マイクロリットル当たり少なくとも０．３ユニットであり、ベタインの濃度は０−１．５Ｍ、好ましくは０．８Ｍ−１Ｍであり、プライマーの総濃度は２ｍから６．２ｕＭの間である。
【００５６】
上記の試薬濃度は、高収量の増幅を与えると同時に、核酸の増幅中に放出されたプロトンを検知するためにｐＨセンサーを使用することができるように低緩衝能を与えることが分かった。
【００５７】
そのプロセスは一定の温度で行うことができ、サーモサイクリングに関連するセンサーシグナルのドリフトを減少させ、センサーシグナルをより安定したものにする。さらに、そのプロセスは、半導体プラットホームと適合性が高い。例えば、最適な酵素の温度は、オンチップの加熱素子と温度センサーで達成および監視可能である。サーモサイクリングに関連する熱膨張と熱疲労に対する懸念はほとんどない。試薬はマイクロチップ上の電極に影響を与えないように選ばれる。
【００５８】
典型的には、等温の方法は、指定された温度を必要とし、これは使用される試薬によって決定される。例えば、ＬＡＭＰでは、酵素は６０から６５°Ｃの間でもっとも良く機能する。有利なことに、本明細書に記載の好ましい実施形態の試薬／緩衝液は、広範な作動温度を可能にする。
【００５９】
等温の増幅は、サーモサイクリングとは異なり、それぞれがＤＮＡを二倍にする別々の工程を含んでいないため、所定の時間にどれだけの増幅が起こったかを推測することは難しい。その結果、そのような等温の増幅方法は一般に、バックグラウンド（すなわち、非特異的な）増幅または蛍光バックグラウンドレベルが非常に高い副作用を備えた過度な増幅を促す。本方法は、十分な収量が得られたときに、増幅プロセスを止めることができるように、増幅プロセスのリアルタイム検出を可能にする。本方法がマイクロチップ上で行われる場合、流体はｐＨセンサーによってモニターされ、チップ表面の素子によって加熱され、温度は、増幅が一時中断する点まで上昇／低下させることができる。このことは、十分な増幅が行われたことを確認するために不必要に待つことなく、バックグラウンドＤＮＡを越える十分な所望のＤＮＡがあることを保証する。
【００６０】
試薬は、組み合わせる際に上記の濃度で提供される。試薬のなかには、それ自体の安定性の必要とされる要件を有する混合の前に、別々に保管されてもよいものもある。例えば、酵素は、酵素の安定性を確保するために、他の試薬とは別の中程度の緩衝溶液中に長時間保管されてもよい。残りの試薬と混合すると、緩衝剤は十分に希釈されて、ｐＨの変化をあまり遮蔽しないようになる。加えて、対象となる特異的な遺伝子のプライマーは、別の溶液で、または、凍結乾燥した形態で、提供されてもよい。条件および事前の混合濃度は、当業者に知られているか、あるいは、用いられる試薬を考慮して当業者により導き出される。
【００６１】
（応用）
図４のフローチャートに例証されるように、ＤＮＡサンプルが調製されて、１つ以上のチャンバーまたはウェルに分けられてもよい。チャンバーまたはウェルはそれぞれ、マイクロチップ上のＩＳＦＥＴに晒される。ＤＮＡはループ媒介等温増幅用試薬と結合する。以下は個々に好ましい試薬および濃度であり、組み合わせは試薬の最も好ましいキットである：
・１マイクロリットル当たり少なくとも０．３ユニットのＢｓｔポリメラーゼ
・１Ｍのベタインの濃度
・５ｕＭのプライマーの総濃度
・５ｍＭの硫酸マグネシウムの濃度
・１ｍＭのトリスの濃度
・ゼロの硫酸アンモニウムの濃度
・組み合わせた流体のｐＨを８．５ｐＨに設定する、１．２ｍＭのＮａＯＨの濃度
・５ｍＭの塩化アンモニウムの濃度、および
・５０ｍＭの塩化カリウムの濃度。
【００６２】
ＩＳＦＥＴシグナルは、参照ＦＥＴに関して差動的に得られ、シグナルプロセッサによってモニターされる。チャンバーと流体は、マイクロチップに一体化されたヒーターによって６０°Ｃに加熱される。あらかじめ定義された反応時間の後に、十分な鋳型の増幅が生じて、可能であれば、ＩＳＦＥＴシグナルの変化として検知されたに違いない。シグナルは、増幅とシグナルの変化がいつ閾値量を超えたかを決定するために、連続的にモニターすることも可能である。
【００６３】
（診断法）
本方法は、図４の選択肢Ａによる好ましい実施形態において、例証されるように、核酸鎖中の１つ以上の塩基を特定するために使用されてもよい。特定は単一塩基または特徴的な配列であってもよい。独自の配列が特定される場合、病状に関連するある塩基を特定することは可能であり、塩基についてのこの知識は、診断のための方法を提供することができる。対象となる塩基の例としては、特徴的な配列、一塩基多型（ＳＮＰ）、欠失、挿入、短いタンデム反復（ＳＴＰ）、および、受け継がれるまたは体細胞的に由来する突然変異体が挙げられる。病原体の検出も可能であり、それによって、該方法は生物の存在、または、生物の菌株の存在を検知することもある。
【００６４】
ＦＩＰ（フォワードインナープライマー（ｆｏｒｗａｒｄ  ｉｎｎｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ））およびＢＩＰ（バックインナープライマー（ｂａｃｋ  ｉｎｎｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ））オリゴなどの増幅で使用されるプライマーは、配列、ＳＮＰ、またはＳＴＰ領域を包含するまたは除外するように設計可能である。このように、増幅または増幅の欠如は、特定される塩基／配列の存在または不在を示す。
【００６５】
図１で示される系において、ＤＮＡの同時増幅を行うために、２以上のチャンバーまたはウェルが用いられてもよい。各々のウェルは、異なるプライマーセットを加え、各プライマーセットは、サンプルＤＮＡの異なる塩基を検出するのに適している。したがって、ＤＮＡは、相補的なプライマーセットがある状態下でのみ増幅して、プロトンを生成し、一方で、それ以外では増幅しない。１つのチャンバーだけが増幅を経験する場合、ＤＮＡはホモ接合型、すなわち、両方の遺伝子に同一の対立遺伝子（突然変異型または野性型）を有していると考えられる。２つのチャンバーが増幅を経験する場合、ＤＮＡは、ヘテロ接合型、すなわち、遺伝子に異なる対立遺伝子（突然変異型と野性型）を有していると考えられる。当業者は、対応するウェル中のプライマーセットの知識と組み合わせて変動を検知するために、ＩＳＦＥＴシグナルをモニタリングすることによって、サンプルＤＮＡの塩基を決定することができる。シグナル処理の条件を少なくするために、ＩＳＦＥＴからのシグナルをリアルタイムで比較することで、各々のウェルの増幅副産物間の違いを表わすシグナルを出力することができる。
【００６６】
（定量化）
該方法は、図４の選択肢Ｂで例証されるように、サンプル中のＤＮＡの量を定量化するために使用されてもよい。任意の時間のプロトン濃度は、流体中のＤＮＡの量と、以前の生成されたプロトンの蓄積量に比例し、それは検知領域から離れて拡散してはいない。任意の時間に反応開始からシグナルが変化したことを知り、これを標準と比較することで、当業者は、増幅の開始時のサンプル中のＤＮＡの量を決定することができる。したがって、当業者は、サンプル中の出発ＤＮＡの量を決定するために、現在の量と時間から過去に遡って作業する。
【００６７】
標準は、モデル、実験データ、またはアッセイと平行に増幅反応を受ける１つ以上の別個の内部制御反応に由来してもよい。標準は、記憶媒体のルックアップ表として、または、コンピュータ・プログラムの定量化の方程式として表わされてもよい。図７は、ＤＮＡの量対そのＤＮＡの量を検出する時間の典型的なグラフを示す。グラフは内挿または外挿することができ、あるいは、反応時間が測定された後、ＤＮＡ量を推定すべくデータを介して最適な方程式を抽出するために使用することができる。
【００６８】
反応時間は、増幅が開始してから（すなわち、増幅のためのすべての試薬と条件が揃っているとき）、ｐＨの変化が閾値よりも大きくなるまでの期間である。ｐＨの変化は、ｐＨセンサーのシグナルまたはｐＨ指示薬をモニタリングすることによって検知されてもよい。
【００６９】
（ＲＮＡ）
本方法は、ＤＮＡポリメラーゼとともにトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ  ＲＴａｓｅ）などの逆転写酵素（ＲＴａｓｅ）を用いてＲＮＡ鋳型を検知するために使用されてもよい。ｃＤＮＡは鋳型ＲＮＡから合成され、現在の技術で増幅され、その後、ｐＨセンサーまたはｐＨ指示薬を用いて検知可能である。
【００７０】
（緩衝能の最適化）
ほとんどの化合物が混合物に一定の緩衝能を供している一方で、完全な貢献は理想的に最小化される。しかしながら、酵素を安定させるために最小の緩衝液が必要とされることもある。緩衝剤（仮に存在する場合）、総試薬緩衝能、および濃度の選択は、増幅反応によって生じる予想されるプロトンを考慮してなされなければならない。生成されたプロトンの量は、出発鋳型の量、増幅条件、および増幅時間（過剰なヌクレオチド、酵素、およびプライマーを想定して）に依存する。出発鋳型はドナーに依存し、得られた生体サンプルのタイプと増幅時間は、検査のオペレーターまたは製造業者によって選ばれてもよい。しかしながら、増幅時間、生体サンプルのタイプ、およびドナーのタイプについての知識から、当業者は、生成されるプロトンの予想量（または量の範囲）を計算することができる。
【００７１】
混合物の緩衝能は、閾値量よりも大きなｐＨの変化が、緩衝された混合物の存在下でさえ増幅によって予想された（あるいは最も少なく予想された）プロトンの生成に起因するように、選ぶことができる。ｐＨの変化閾値は、センサーと関連する回路の検出限界であってもよい。あるいは、ｐＨの変化閾値は、０．１ｐＨ、より好ましくは０．２ｐＨ、最も好ましくは０．５ｐＨであってもよい。
【００７２】
緩衝能は以下の方程式（Ｉ）によって定義される：
β＝ｄｎ／ｄ（ｐ［Ｈ＋］）
ここで、ｎは追加されたＯＨ−またはＨ＋の量であり、ｄ（ｐ［Ｈ＋］）は、水素イオン濃度の余対数における結果として生じる無限小の変化である。
【００７３】
０．５ｐＨの下限検出限界を有し、３５ｕｌの増幅反応物に晒されたＩＳＦＥＴを使用する典型的な実施形態では、３０分後、実験の収量は５０ｕｇの増幅産物である。増幅産物の収量から放出されたプロトンの合計は、およそ２．１７ｍＭ（塩基対の分子量が６５０ｇ／ｍｏｌｅと仮定して）になる。
β＝２．１７ｍΜ／＞０．５
β＜４．３４ｍΜ
したがって、混合物の緩衝能は、所望の０．５よりも大きなｐＨの変化を達成するためには、４．３４ｍＭ未満に設定されなければならない。
【００７４】
以下の表１は、６．１５と８．４３の間で２５ＣでｐＫａを含む一般的な緩衝剤の特性を提供する。これらの緩衝剤の濃度は、短い増幅反応時間で大きなｐＨ変化を達成するために、反応で最小化されなければならない。しかしながら、緩衝剤は、バックグラウンドノイズを減少させ、酵素を安定させ、および／または、初期の反応を安定させるために、随意に提供されてもよい。表２は、緩衝剤の濃度を変えることによって、Ｂｓｔ酵素に適した増幅反応の緩衝能の効果を計算している。見て分かるように、多くの緩衝液の選択肢が上記の要件を満たしており、４．３４ｍＭ未満（４３４０ｕＭ）の緩衝能を有している。この条件を満たす表２に列挙された各々の緩衝剤と濃度は、個々に好ましく、本発明の範囲内であるとみなされる。
【００７５】
【表１】
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【００７６】
【表２】
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【００７７】
幾つかの実施形態では、緩衝能は、十分なｐＨシグナルが検知されることを保証するために、約数によって計算された最大から減らされる。緩衝能は、増幅反応から予想されるプロトン放出によるｐＨの変化を検知可能な最大の緩衝能の、２分の１未満、好ましくは５分の１未満、または、１０分の１未満であってもよい。したがって、上記の実施例において、緩衝能は、４．３４ｍＭの１／１０、すなわち、０．４３４ｍＭに設定されてもよい。
【００７８】
１つの実施形態では、流体中の試薬の緩衝能は、さもなければ標的核酸の増幅の失敗をもたらすことすらあるｐＨの変化を遮蔽するように準備される。この変化はイオンのバックグラウンドノイズと考えることができ、このノイズは、ヌクレオチド、プライマー、または鋳型の非特異的な増幅または自発的な分解および加水分解によることもある。非特異的な増幅は、鋳型核酸の標的領域に由来しない核酸増幅産物を指す。一般に、これは、プライマーダイマーの形成、および／または、鋳型ＤＮＡの標的ではない領域へアニーリングされるプライマーに起因する。
【００７９】
１つの実施形態では、混合物の総緩衝能は、バックグラウンドノイズを無視することができるように設定される。例えば、該方法の間に生成されることもあるバックグラウンドノイズの量は、実験から推測または理解でき、ｐＨの変化として表すことができる。試薬の緩衝能は、検出下限を与えるために上に示唆された最小量を越えて、バックグラウンドによって放出または消費されたプロトンを吸収することでバックグラウンドを遮蔽する量まで、増やすことができる。したがって、標的鋳型核酸のための特異的なヌクレオチドの挿入に対応しなければならない十分なプロトンの放出がなければ、かつ、その放出があるまでは、いかなるシグナルもｐＨセンサーまたは指示薬によって検知されない。
【００８０】
１つの実施形態では、ＤＮＡサンプルおよび試薬は、多数のマイクロ流体チャンバーに加えられる。典型的な実施形態では、緩衝液がない状態でのバックグラウンドによるｐＨの低下が０．１ｐＨで見込まれる。この推定された効果を遮蔽するために、少量の緩衝液が各チャンバーに与えられる。センサーシグナルは、化学反応が起こる前後およびその最中にモニタリングされる。有意なプロトンを放出する核酸増幅反応があるチャンバーでのみ、センサーシグナルに検知可能な変化がある。したがって、１つの実施形態では、緩衝能は０．５ｍＭよりも大きい。
【００８１】
対立遺伝子に特異的なプライマーのような様々な試薬は、サンプル上の遺伝バイオマーカーの存在または不在を検知するために使用されてもよい。反応はＤＮＡの増幅であってもよく、試薬は、サーモサイクリングまたは等温の増幅に適したプライマーおよびヌクレオチドを含んでもよい。標的ＤＮＡの増幅が１つ以上のチャンバーで進むにつれ、プロトンは、緩衝液によって遮蔽された推定されたバックグラウンド効果以上に放出される。ｐＨの変化はセンサーシグナルの変化として検知される。
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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