(57)【要約】  セロデキストリンおよびβ‐Ｄ‐グルコースの発酵増進。本開示は、セロデキストリンおよびβ‐Ｄ‐グルコースの発酵用の組成物および方法を提供する。また、宿主細胞、およびグルコースムタロターゼ活性を有する組み換えポリペプチドを提供する。さらに、セロデキストリンおよびβ‐Ｄ‐グルコースを含む混合物の発酵時に細胞増殖、化学物質の生産、およびセロデキストリンおよびβ‐Ｄ‐グルコースの消費する向上させる方法を提供する。
2014504877.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組み換えＤＮＡ、および
グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡを含み、
セロビオース含有培地で増殖される場合では、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする前記組み換えＤＮＡを欠いている対応する宿主細胞によって消費されるよりも多くのセロビオースの分子を消費する、宿主細胞。
【請求項２】
１つ以上のβ‐グルコシダーゼをコードする組み換えＤＮＡをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
グルコースムタロターゼ活性を有する上記ポリペプチドは、配列番号１７、１９、２１および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項１または２に記載の宿主細胞。
【請求項４】
グルコースムタロターゼ活性を有する上記ポリペプチドは、配列番号２８〜３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項１または２に記載の宿主細胞。
【請求項５】
セロビオース含有混合物を発酵させる方法であって、
前記セロビオース含有混合物を請求項１〜４の何れか一項に記載の宿主細胞と接触させる工程、および
発酵を促す条件下で前記宿主細胞をインキュベートする工程を含む、方法。
【請求項６】
セロビオース含有混合物を発酵させる方法であって、
１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組み換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および
１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする前記組み換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする前記組み換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を含み、
グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする前記組み換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする前記組み換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって消費されるよりも多くのセロビオースが消費される、方法。
【請求項７】
化学物質の生産量を増加させる方法であって、
１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組み換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および
１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする前記組み換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする前記組み換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を含み、
グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする前記組み換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする前記組み換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって生成されるよりも多くの前記化学物質が生成される、方法。
【請求項８】
上記化学物質はアルコールであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記アルコールは、エタノール、ｎ‐プロパノール、ｎ‐ブタノール、イソブタノール、３‐メチル‐１‐ブタノール、２‐メチル‐１‐ブタノール、３‐メチル‐１‐ペンタノール、およびオクタノールからなる群から選択されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記化学物質は、テルペノイド、ポリケチド、脂肪酸、脂肪酸誘導体、または有機酸であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
細胞の増殖速度を増加させる方法であって、
１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組み換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および
１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする前記組み換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする前記組み換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を含み、
グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする前記組み換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞において、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする前記組み換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって得られるよりも高い細胞の増殖速度が得られる、方法。
【請求項１２】
上記宿主細胞は、１つ以上のβ‐グルコシダーゼをコードする組み換えＤＮＡをさらに含むことを特徴とする請求項６〜１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ムタロターゼ活性を有する上記ポリペプチドは、配列番号１７、１９、２１および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項６〜１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ムタロターゼ活性を有する上記ポリペプチドは、配列番号２８〜３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項６〜１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を発酵させる方法であり、
前記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上の組み換えポリペプチドと接触させる工程、
前記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物をグルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上の組み換えポリペプチドと接触させると共に、または接触させた後に、前記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を細胞と接触させる工程、および
発酵を促す条件下で、前記細胞および前記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物をインキュベートする工程を備え、
前記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物をグルコースムタロターゼ活性を有する前記１つ以上の組み換えポリペプチドと接触させることで、グルコースムタロターゼ活性を有する前記１つ以上の組み換えポリペプチドと接触させていないβ‐Ｄ‐グルコース含有混合物が前記細胞に消費されるよりも多く、β‐Ｄ‐グルコース含有混合物が前記細胞によって発酵中に消費されることを特徴とする、方法。
【請求項１６】
β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を発酵させる方法であり、
グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡを含む宿主細胞を提供する工程、および
グルコースムタロターゼ活性を有する前記１つ以上のポリペプチドをコードする前記組み換えＤＮＡが発現するように前記宿主細胞を培養する工程を備え、
グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする前記組み換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする前記組み換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞が消費するよりも多くのβ‐Ｄ‐グルコース含有混合物が消費されることを特徴とする、方法。
【請求項１７】
前記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物は、セルロースの加水分解によって得られることを特徴とする請求項１５または１６の何れかに記載の方法。
【請求項１８】
ムタロターゼ活性を有する前記ポリペプチドは、配列番号１７、１９、２１および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項１５〜１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ムタロターゼ活性を有する前記ポリペプチドは、配列番号２８〜３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項１５〜１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組み換えＤＮＡ、および
グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡを含み、
セロビオース含有培地で培養される場合に、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする前記組み換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞が消費するよりも多くのセロビオースの分子を消費し、グルコースムタロターゼ活性を有する前記ポリペプチドは配列番号２８および２９のアミノ酸配列の一方または両方を含む、宿主細胞。
【請求項２１】
グルコースムタロターゼ活性を有する前記ポリペプチドは、配列番号２８および２９のアミノ配列を含むことを特徴とする請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記宿主細胞は、１つ以上のβ‐グルコシダーゼをコードする組み換えＤＮＡをさらに含むことを特徴とする請求項２０または２１に記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、参照により全開示内容を援用するＵ．Ｓ．Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．６１／４３５，２１６（出願日：２０１１年１月２１日）に優先権を主張する。
【０００２】
（分野）
本願開示は、セロデキストリンおよびβ‐Ｄ‐グルコースの発酵に関する。本願開示は特に、組み換えポリペプチドを含む、セロデキストリンおよびβ‐Ｄ‐グルコースの発酵用の組成物、組み換えヌクレオチドおよび組み換えポリペプチドを含む宿主細胞、およびそれらの使用方法に関する。本発明はさらに、セロデキストリンおよびβ‐Ｄ‐グルコースの発酵方法に関する。
【０００３】
（ＡＳＣＩＩテキストファイル上の配列表の提示）
ＡＳＣＩＩテキストファイルを参照することにより、その全提示内容（下掲）を本願に援用する：コンピュータ読み取り可能形式（ＣＲＦ）の記配列表（ファイル名：６５８０１２００１０４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録日：２０１２年１月１１日、サイズ：６１ＫＢ）。
【０００４】
（背景）
エネルギー安全保障、エネルギー持続性、および地球規模の気候変動への関心の高まりから、バイオ燃料が徹底的に調査されている。植物系材料をバイオ燃料に変換する生物変換法は、化石燃料の化学製造法に取って代わる魅力的な代替法とみなされている。
【０００５】
植物の主要な要素であり、地球上の最も豊富な有機化合物の１つであるセルロースは、β（１‐４）結合Ｄグルコース分子の長鎖上に構成された多糖類である。セルロースは、糖類系の組成を有することから、バイオ燃料の製造用の豊富な潜在的原材料である。例えば、糖類をエタノールのようなバイオ燃料に発酵してもよい。セルロースに含まれる糖類をバイオ燃料の製造のために使用するためには、セルロースをより小さい分子に分解する必要がある。
【０００６】
セルロースは、セルラーゼの作用によって酵素的に加水分解されてもよい。セルラーゼは、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、およびβ‐グルコシダーゼを含む。セルラーゼの作用は、セルロースの１‐４β‐Ｄ‐グリコシド結合を切断し、β‐Ｄ‐グルコース分子の最終的な放出を引き起こす。セルロースを個々の糖分子へ分解している最中に、中間分解生成物として様々な長さのグルコース重合体が形成されてもよい。セルロースの加水分解によって得られる、約２〜６分子の長さを有するグルコース重合体は、「セロデキストリン」と称される。
【０００７】
パン酵母としても知られるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、何千年もの間、六炭糖類からエタノールへの生物変換のために使用されてきた。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはまた、Ｄ‐グルコースを大規模に工業発酵させてエタノールとするために最も広く使用されている微生物である。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、植物系のバイオマスを生物変換してバイオ燃料とするうえで非常に適した候補である。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、その遺伝学的および生理学的な背景がよく研究されており、豊富な遺伝的手段を有するとともに、高エタノール濃度に対する高い耐性を示す。また、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの低発酵ｐＨにより、発酵中の細菌汚染を防ぐことができる。
【０００８】
近年、セルロース加水分解物中に存在する混合糖類をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いて共発酵させる新たな手法が示された（Ｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０８：５０４−５０９，２０１１；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．６（１１）：２１２９−２１３２，２０１０）。このアプローチによって、セロビオースおよびキシロースの同時共発酵が促進されただけではなく、セロビオースおよびキシロースの共発酵の相乗効果によるエタノール収量および生産性の増加がもたらされた。改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにより細胞内の加水分解反応を介して引き起こされるセロビオースの発酵は、グルコースの発酵と比較した場合、幾つかの利点を有する。第一に、セルビオースは、グルコース抑制を発生させることなく、キシロースまたはガラクトースなどの他の糖類と共消費することが可能である。第二に、セロビオースを他の糖類と共利用することで、全体的な生産性を向上させることが可能である。第三に、セルロースを完全に分解させてグルコースとするための手段として、費用の高いβ‐グルコシダーゼは必須ではない。
【０００９】
上述の利点にも関わらず、セロビオースの消費速度はグルコースの消費速度と比較して非常に遅い。さらに、セロビオースの発酵中に少量のグルコース、セロデキストリンセロトリオース、およびセロデキストリンセロテトラオースが培地内に蓄積されてしまっていた。セロトリオースおよびセロテトラオースは、細胞内のセロビオースおよびグルコースが高濃度なときに、β‐グルコシダーゼのトランスグリコシル化活性によって生成される。これらを観察することにより、改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによるセロビオースの効率的な発酵のための未知の制約工程が存在している可能性が示唆された。
【００１０】
セロデキストリンおよびβ‐Ｄ‐グルコース分子を微生物により発酵させるための改良組成物および方法を本願に開示する。
【００１１】
（発明の概要）
本開示の特定の実施形態では、グルコースムタロターゼ活性を有する組換えポリペプチド、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを含む宿主細胞、およびそれらの生成方法および使用方法を提供することによって上記の課題に応じている。また、本開示の特定の実施形態では、セロデキストリンおよびβ‐Ｄ‐グルコース分子を発酵させる方法、化学物質の生産量を増加させる方法、および細胞の増殖速度を高める方法を提供することによって上記の課題に応じている。
【００１２】
一実施形態では、本開示は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組み換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡとを含み、セロビオース含有培地で増殖される場合では、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって消費されるよりも多くのセロビオースの分子を消費する宿主細胞を提供する。
【００１３】
別の実施形態では、本開示は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組み換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡとを含み、セロビオース含有培地で増殖される場合では、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって消費されるよりも多くのセロビオースの分子を消費する宿主細胞であって、１つ以上のβ‐グルコシダーゼをコードする組換えＤＮＡをさらに含むことを特徴とする宿主細胞を提供する。
【００１４】
他の実施形態では、本開示は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組み換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡとを含み、セロビオース含有培地で増殖される場合では、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって消費されるよりも多くのセロビオースの分子を消費する宿主細胞であって、ムタロターゼ活性を有する前記ポリペプチドは配列番号１７、１９、２１および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする宿主細胞を提供する。
【００１５】
他の実施形態では、本開示は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組み換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡとを含み、セロビオース含有培地で増殖される場合では、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって消費されるよりも多くのセロビオースの分子を消費する宿主細胞であって、ムタロターゼ活性を有する前記ポリペプチドは配列番号２８〜３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする宿主細胞を提供する。
【００１６】
他の実施形態では、本開示は、セロビオース含有混合物を発酵させる方法を提供し、前記方法は、前記セロビオース含有混合物を、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡおよびグルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを含む宿主細胞と接触させ、前記宿主細胞は、セロビオース含有培地で増殖される場合に、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって消費されるよりも多くのセロビオースの分子を消費する工程、および発酵を促す条件下で宿主細胞をインキュベートする工程を備える。
【００１７】
他の実施形態では、本開示は、セロビオース含有混合物を発酵させる方法を提供し、前記方法は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって消費されるよりも多くのセロビオースが消費される。
【００１８】
他の実施形態では、本開示は、セロビオース含有混合物の発酵方法を提供し、前記方法は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって消費されるよりも多くのセロビオースが消費され、前記宿主細胞は１つ以上のβ‐グルコシダーゼをコードする組換えＤＮＡをさらに含む。
【００１９】
他の実施形態では、本開示は、セロビオース含有混合物の発酵方法を提供し、前記方法は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって消費されるよりも多くのセロビオースが消費され、ムタロターゼ活性を有する前記ポリペプチドは配列番号１７、１９、２１および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００２０】
他の実施形態では、本開示は、セロビオース含有混合物の発酵方法を提供し、前記方法は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって消費されるよりも多くのセロビオースが消費され、ムタロターゼ活性を有する前記ポリペプチドは配列番号２８〜３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００２１】
他の実施形態では、本開示は、化学物質の生成量を増加させる方法を提供し、前記方法は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって生成されるよりも多くの前記化学物質が生成される。
【００２２】
他の実施形態では、本開示は、化学物質の生成量を増加させる方法を提供し、前記方法は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって生成されるよりも多くの化学物質が生成され、前記宿主細胞は１つ以上のβ‐グルコシダーゼをコードする組換えＤＮＡをさらに含む。
【００２３】
他の実施形態では、本開示は、化学物質の生成量を増加させる方法を提供し、前記方法は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって生成されるよりも多くの化学物質が生成され、ムタロターゼ活性を有する前記ポリペプチドは配列番号１７、１９、２１および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００２４】
他の実施形態では、本開示は、化学物質の生成量を増加させる方法を提供し、前記方法は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって生成されるよりも多くの化学物質が生成され、ムタロターゼ活性を有する前記ポリペプチドは配列番号２８〜３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００２５】
他の実施形態では、本開示は、化学物質の生成量を増加させる方法を提供し、前記方法は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって生成されるよりも多くの前記化学物質が生成され、前記化学物質はアルコールである。
【００２６】
他の実施形態では、本開示は、化学物質の生成量を増加させる方法を提供し、前記方法は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって生成されるよりも多くの前記化学物質が生成され、前記化学物質はアルコールであり、前記宿主細胞は１つ以上のβ‐グルコシダーゼをコードする組換えＤＮＡをさらに含む。
【００２７】
他の実施形態では、本開示は、化学物質の生成量を増加させる方法を提供し、前記方法は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって生成されるよりも多くの前記化学物質が生成され、前記化学物質はアルコールであり、ムタロターゼ活性を有する前記ポリペプチドは配列番号１７、１９、２１および２３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００２８】
他の実施形態では、本開示は、化学物質の生成量を増加させる方法を提供し、前記方法は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって生成されるよりも多くの前記化学物質が生成され、前記化学物質はアルコールであり、ムタロターゼ活性を有する前記ポリペプチドは配列番号２８〜３２からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００２９】
他の実施形態では、本開示は、化学物質の生成量を増加させる方法を提供し、前記方法は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって生成されるよりも多くの前記化学物質が生成され、前記化学物質はアルコールであり、前記アルコールは、エタノール、ｎ‐プロパノール、ｎ‐ブタノール、イソブタノール、３‐メチル‐１‐ブタノール、２‐メチル‐１‐ブタノール、３‐メチル‐１‐ペンタノールおよびオクタノールからなる群から選択される。
【００３０】
他の実施形態では、本開示は、化学物質の生成量を増加させる方法を提供し、前記方法は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって生成されるよりも多くの前記化学物質が生成され、前記化学物質はアルコールであり、前記アルコールは、エタノール、ｎ‐プロパノール、ｎ‐ブタノール、イソブタノール、３‐メチル‐１‐ブタノール、２‐メチル‐１‐ブタノール、３‐メチル‐１‐ペンタノールおよびオクタノールからなる群から選択され、前記宿主細胞は、１つ以上のβ‐グルコシダーゼをコードする組換えＤＮＡをさらに含む。
【００３１】
他の実施形態では、本開示は、化学物質の生成量を増加させる方法を提供し、前記方法は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって生成されるよりも多くの前記化学物質が生成され、前記化学物質はアルコールであり、前記アルコールは、エタノール、ｎ‐プロパノール、ｎ‐ブタノール、イソブタノール、３‐メチル‐１‐ブタノール、２‐メチル‐１‐ブタノール、３‐メチル‐１‐ペンタノール、およびオクタノールからなる群から選択され、ムタロターゼ活性を有する前記ポリペプチドは配列番号１７、１９、２１および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００３２】
他の実施形態では、本開示は、化学物質の生成量を増加させる方法を提供し、前記方法は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって生成されるよりも多くの前記化学物質が生成され、前記化学物質はアルコールであり、前記アルコールは、エタノール、ｎ‐プロパノール、ｎ‐ブタノール、イソブタノール、３‐メチル‐１‐ブタノール、２‐メチル‐１‐ブタノール、３‐メチル‐１‐ペンタノール、およびオクタノールからなる群から選択され、ムタロターゼ活性を有する前記ポリペプチドは配列番号２８〜３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００３３】
他の実施形態では、本開示は、化学物質の生成量を増加させる方法を提供し、前記方法は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって生成されるよりも多くの前記化学物質が生成され、前記化学物質は、テルペノイド、ポリケチド、脂肪酸、脂肪酸誘導体、又は有機酸である。
【００３４】
他の実施形態では、本開示は、化学物質の生成量を増加させる方法を提供し、前記方法は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって生成されるよりも多くの前記化学物質が生成され、前記化学物質は、テルペノイド、ポリケチド、脂肪酸、脂肪酸誘導体、又は有機酸であり、前記宿主細胞は、１つ以上のβ‐グルコシダーゼをコードする組換えＤＮＡをさらに含む。
【００３５】
他の実施形態では、本開示は、化学物質の生成量を増加させる方法を提供し、前記方法は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって生成されるよりも多くの前記化学物質が生成され、前記化学物質はテルペノイド、ポリケチド、脂肪酸、脂肪酸誘導体、又は有機酸であり、ムタロターゼ活性を有する前記ポリペプチドは配列番号１７、１９、２１および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００３６】
他の実施形態では、本開示は、化学物質の生成量を増加させる方法を提供し、前記方法は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって生成されるよりも多くの前記化学物質が生成され、前記化学物質はテルペノイド、ポリケチド、脂肪酸、脂肪酸誘導体、又は有機酸であり、ムタロターゼ活性を有する前記ポリペプチドは配列番号２８〜３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００３７】
他の実施形態では、本開示は、細胞の増殖速度を増加させる方法を提供し、前記方法は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を、培地で培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞の増殖速度が、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞の増殖速度よりも増加する。
【００３８】
他の実施形態では、本開示は、細胞の増殖速度を増加させる方法を提供し、前記方法は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を、培地で培養する工程を備え、前記宿主細胞は、１つ以上のβ‐グルコシダーゼをコードする組換えＤＮＡをさらに含み、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞の増殖速度が、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞の増殖速度よりも増加する。
【００３９】
他の実施形態では、本開示は、細胞の増殖速度を増加させる方法を提供し、前記方法は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を、培地で培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞の増殖速度が、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞の増殖速度よりも増加し、ムタロターゼ活性を有する前記ポリペプチドは配列番号１７、１９、２１、および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００４０】
他の実施形態では、本開示は、細胞の増殖速度を増加させる方法を提供し、前記方法は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を、培地で培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞の増殖速度が、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞の増殖速度よりも増加し、ムタロターゼ活性を有する前記ポリペプチドは配列番号２８〜３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００４１】
β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を発酵させる方法であり、前記方法は、β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上の組換えポリペプチドと接触させる工程、前記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物をグルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上の組換えポリペプチドと接触させると共に、または接触させた後に、前記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を細胞に接触させる工程、および、発酵を促す条件下で、前記細胞と前記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物とをインキュベートする工程を備え、前記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物をグルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上の組換えポリペプチドと接触させることで、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上の組換えポリペプチドと接触させていないβ‐Ｄ‐グルコース含有混合物が前記細胞に消費されるよりも多く、β‐Ｄ‐グルコース含有混合物が前記細胞によって発酵中に消費される。
【００４２】
β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を発酵させる方法であり、前記方法は、β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上の組換えポリペプチドと接触させる工程、前記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上の組換えポリペプチドと接触させると共に、または接触させた後に、前記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を細胞に接触させる工程、および、発酵を促す条件下で、前記細胞と前記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物とをインキュベートする工程を備え、前記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物をグルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上の組換えポリペプチドと接触させることで、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上の組換えポリペプチドと接触させていないβ‐Ｄ‐グルコース含有混合物が前記細胞に消費されるよりも多く、β‐Ｄ‐グルコース含有混合物が前記細胞によって発酵中に消費され、前記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物はセルロースの加水分解によって得られる。
【００４３】
β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を発酵させる方法であり、前記方法は、β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上の組換えポリペプチドと接触させる工程、前記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上の組換えポリペプチドと接触させると共に、または接触させた後に、前記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を細胞に接触させる工程、および、発酵を促す条件下で、前記細胞と前記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物とをインキュベートする工程を備え、前記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物をグルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上の組換えポリペプチドと接触させることで、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上の組換えポリペプチドと接触させていないβ‐Ｄ‐グルコース含有混合物が前記細胞に消費されるよりも多く、β‐Ｄ‐グルコース含有混合物が前記細胞によって発酵中に消費され、ムタロターゼ活性を有する前記ポリペプチドは配列番号１７、１９、２１および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００４４】
β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を発酵させる方法であり、前記方法は、β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上の組換えポリペプチドと接触させる工程、前記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上の組換えポリペプチドと接触させると共に、または接触させた後に、前記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を細胞に接触させる工程、および、発酵を促す条件下で、前記細胞と前記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物とをインキュベートする工程を備え、前記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物をグルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上の組換えポリペプチドと接触させることで、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上の組換えポリペプチドと接触させていないβ‐Ｄ‐グルコース含有混合物が前記細胞に消費されるよりも多く、β‐Ｄ‐グルコース含有混合物が前記細胞によって発酵中に消費され、ムタロターゼ活性を有する前記ポリペプチドは配列番号２８〜３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００４５】
β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を発酵させる方法であり、前記方法は、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現するように前記宿主細胞を培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞が消費するよりも多くのβ‐Ｄ‐グルコース含有混合物が消費される。
【００４６】
β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を発酵させる方法であり、前記方法は、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現するように前記宿主細胞を培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞が消費するよりも多くのβ‐Ｄ‐グルコース含有混合物が消費され、前記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物はセルロースの加水分解によって得られる。
【００４７】
β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を発酵させる方法であり、前記方法は、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現するように前記宿主細胞を培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞が消費するよりも多くのβ‐Ｄ‐グルコース含有混合物が消費され、ムタロターゼ活性を有する前記ポリペプチドは配列番号１７、１９、２１および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００４８】
β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を発酵させる方法であり、前記方法は、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを含む宿主細胞を提供する工程、および、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現するように前記宿主細胞を培養する工程を備え、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞が消費するよりも多くのβ‐Ｄ‐グルコース含有混合物が消費され、ムタロターゼ活性を有する前記ポリペプチドは配列番号２８〜３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００４９】
他の実施形態では、本開示は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、セロビオース含有培地で増殖される場合では、前記グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞が消費するよりも多くのセロビオースの分子を消費し、前記グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドは配列番号２８および２９のアミノ酸配列の一方または両方を含む。幾つかの態様では、上記グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２８および２９のアミノ配列を含む。態様の幾つかでは、上記宿主細胞は、１つ以上のβ‐グルコシダーゼをコードする組換えＤＮＡをさらに含む。
【００５０】
（図面の簡単な説明）
図１は、５つの異なるアルドース  １‐エピメラーゼを過剰発現させた場合に発生する、改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの親株Ｄ４５２‐ＢＴのセロビオース利用への影響を示す。上記改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、図中の説明に示すように、多コピープラスミドｐＲＳ４２３内の組み換えセロデキストリントランスポーター、β‐グルコシダーゼ、およびアルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子を発現する。アルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子およびその生物源とは、ｇａｌＭ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＧＡＬ１０‐Ｓｃ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、系統名：ＹＢＲ０１９Ｃ）、ＧＡＬ１０‐Ｐｓ（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ＹＨＲ２１０Ｃ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、系統名：ＹＨＲ２１０Ｃ）、ＹＮＲ０７１Ｃ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、系統名：ＹＮＲ０７１Ｃ）である。コントロール用の生物は、組み換えセロデキストリントランスポーターおよびβ‐グルコシダーゼを発現し、空のｐＲＳ４２３プラスミドを含むものを用いた。セロビオースを含む培地は、異なるアルドース  １‐エピメラーゼを過剰発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発酵させた。各株について、セロビオース消費（左パネル；１リットル当たりのセロビオースのグラム量で測定）、細胞増殖（中パネル；６００ｎｍの吸光度で測定）、およびエタノール生産（右パネル；１リットル当たりのエタノールのグラム量で測定）を測定した。
【００５１】
図２は、図中の説明に示すように、多コピープラスミドｐＲＳ４２３内の組み換えセロデキストリントランスポーター、β‐グルコシダーゼ、およびアルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いた、セロビオースを含む培地の発酵反応中のエタノール収量、エタノール生産性、およびエタノール濃度の比較を示す。アルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子およびその生物源は、ＧＡＬ１０−Ｓｃ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、系統名：ＹＢＲ０１９Ｃ）、ＹＨＲ２１０Ｃ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、系統名：ＹＨＲ２１０Ｃ）、およびＹＮＲ０７１Ｃ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、系統名：ＹＮＲ０７１Ｃ）である。
【００５２】
図３は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃを過剰発現させた場合に発生する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いたセロビオースの発酵反応への影響を示す。セロビオースを含む培地は、組み換えセロデキストリントランスポーターおよびβ‐グルコシダーゼを発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、またはＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃ、組み換えセロデキストリントランスポーター、およびβ‐グルコシダーゼを過剰発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発酵させた。各株について、細胞増殖（左パネル；６００ｎｍの吸光度で測定）、セロビオース消費（中パネル；１リットル当たりのセロビオースのグラム量で測定）、エタノール生成量（右パネル；１リットル当たりのエタノールのグラム量で測定）を測定した。
【００５３】
図４は、２つの異なるアルドース  １‐エピメラーゼを過剰発現させた場合に発生する、改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの親株ＳＬ０１のセロビオース利用への影響を示す。改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、図中の説明に示すように、多コピープラスミドｐＲＳ４２４内の組み換えセロデキストリントランスポーター、β‐グルコシダーゼ、およびアルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子を発現する。アルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子およびその生物源は、ｓｃＡＥＰ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、系統名：ＹＨＲ２１０Ｃ）およびｎｃＡＥＰ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、系統名：ＮＣＵ０９７０５）である。コントロール用の生物は、組み換えセロデキストリントランスポーターおよびβ‐グルコシダーゼを発現し、空のｐＲＳ４２４プラスミドを含むものを使用した。セロビオースを含む培地は、異なるアルドース  １‐エピメラーゼを過剰発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発酵させた。各株について、細胞増殖（左上パネル；６００ｎｍの吸光度で測定）、セロビオース消費量（右上パネル；１リットル当たりのセロビオースのグラム量で測定）、グルコース濃度（左下パネル；１リットル当たりのグルコースのグラム量で測定）、およびエタノール生産量（右下パネル；１リットル当たりのエタノールのグラム量で測定）を測定した。
【００５４】
図５は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２つのアルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子をノックアウトした場合に発生する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのセロビオース利用への影響を示す。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、ＹＢＲ０１９Ｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、およびＹＮＲ０７１Ｃの３つの推定アルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子を含む。ＹＨＲ２１０ＣおよびＹＮＲ０７１Ｃの両方の遺伝子をノックアウトしたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株ＳＬ０１、およびＹＢＲ０１９ＣおよびＹＨＲ２１０Ｃの両方の遺伝子をノックアウトしたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株ＳＬ０１を調製した。図中の説明によって示す異なる株は、「△（ＹＨＲ＋ＹＮＲ）」（ＹＨＲ２１０ＣおよびＹＮＲ０７１Ｃをノックアウト）、「△（ＹＨＲ＋ＧＡＬ１０）」（ＹＨＲ２１０ＣおよびＹＢＲ０１９Ｃをノックアウト）、および「コントロール」（何れのアルドース  １‐エピメラーゼもノックアウトせず）である。セロビオースを含む培地は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアルドース  １‐エピメラーゼノックアウト株で発酵させた。各株について、細胞増殖（上パネル；６００ｎｍの吸光度で測定）、セロビオース消費量（中パネル；１リットル当たりのセロビオースのグラム量で測定）、およびエタノール生産量（下パネル；１リットル当たりのエタノールのグラム量で測定）を測定した。
【００５５】
図６は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの１つのアルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子をノックアウトした場合に発生する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのセロビオース利用への影響を示す。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、ＹＢＲ０１９Ｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、およびＹＮＲ０７１Ｃの３つの推定アルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子を含む。各推定アルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子をノックアウトしたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株ＳＬ０１を調製した。図中の説明によって示す異なる株は、△ＹＨＲ（ＹＨＲ２１０Ｃをノックアウト）、△ＧＡＬ１０（ＹＢＲ０１９Ｃをノックアウト）、△ＹＮＲ（ＹＮＲ０７１Ｃをノックアウト）、および「コントロール」（何れのアルドース  １‐エピメラーゼもノックアウトせず）である。セロビオースを含む培地は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアルドース  １‐エピメラーゼノックアウト株で発酵させた。各株について、細胞増殖（上パネル；６００ｎｍの吸光度で測定）、セロビオース消費量（中パネル；１リットル当たりのセロビオースのグラム量で測定）、およびエタノール生産量（下パネル；１リットル当たりのエタノールのグラム量で測定）を測定した。
【００５６】
図７は、セロビオーストランスポーター（ｃｄｔ−１）遺伝子および細胞内β‐グルコシダーゼ（ｇｈ１−１）遺伝子の両方を含む改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ４５２‐ＢＴ株を用いたグルコース発酵反応（Ａ）およびセロビオース発酵反応（Ｂ）の比較を示す。図中の符号は、以下のものである：ＯＤ（白抜き丸）、グルコース（黒塗り下向き三角）、セロビオース（黒塗り上向き三角）、およびエタノール（黒塗り菱形）。
【００５７】
図８は、スクロース加水分解物を含む培地内のＮ．ｃｒａｓｓａを用いたＡＥＰの転写解析と、ススキ属植物（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）加水分解物を含む培地内のＮ．ｃｒａｓｓａを用いたＡＥＰの転写解析の転写解析との比較を示す。図中の「１」は、スクロース加水分解物を含む培地内で１６時間経過後の結果を示す。図中の「２」は、ススキ属植物加水分解物を含む培地内で１６時間経過後の結果を示す。図中の「３」は、ススキ属植物加水分解物を含む培地内で４０時間経過後の結果を示す。図中の「４」は、ススキ属植物加水分解物を含む培地内で１１２時間経過後の結果を示す。図中の「５」は、ススキ属植物加水分解物を含む培地内で２３２時間経過後の結果を示す。
【００５８】
図９は、Ｎ．ｃｒａｓｓａ由来の２つのＡＥＰのアミノ酸配列のアライメント、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の２つの推定ＡＥＰのアミノ酸配列のアライメントを示す。
【００５９】
図１０は、セロビオース発酵経路を含むＢＹ４７４１の△ＹＨＲ株、△ＹＮＲ株、および△ＧＡＬ株を用いたセロビオースの発酵反応の比較を示す。誤差は１５％以内である。図中の符号は、以下のものである；コントロール（黒塗り丸）、△ＹＨＲ（黒塗り上向き三角）、△ＹＮＲ（黒塗り四角）、および△ＧＡＬ（黒塗り菱形）とである。
【００６０】
図１１は、セロビオース（Ａ）またはグルコース（Ｂ）内で増殖させたＢＹ４７４１のＡＥＰノックアウト株の特異的なＡＥＰ活性を示す。ＡＥＰ活性の一単位は、非酵素速度に加えて、２２℃で１分間の内に１μｍｏｌのα‐グルコースをβ‐グルコースへ変換させる酵素の量として定義される。誤差は、１５％以内である。
【００６１】
図１２は、セロビオース発酵経路を含む改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ４５２‐ＢＴ株のＡＥＰ遺伝子（ＧＡＬ１０−Ｓｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、またはＹＮＲ０７１Ｃ）を過剰発現する３つのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ４５２‐ＢＴ株を用いたセロビオースの発酵反応の比較を示す。図中の符号は、以下のものである；コントロール（黒塗り丸）、ＹＨＲ２１０Ｃ（黒塗り上向き三角）、ＹＮＲ０７１Ｃ（黒塗り四角）、およびＧＡＬ１０−Ｓｃ（黒塗り菱形）。全ての発酵結果の数値は、２つの独立した発酵反応の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示す。
【００６２】
（発明を実施するための最良の形態）
本願開示は、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドおよびその使用方法と、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチドと、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドを含む組成物およびその使用方法と、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む組成物およびその使用方法とに関する。本願開示はさらに、セロデキストリン含有物質の発酵方法と、セロデキストリン含有物質の発酵時のセロデキストリンの消費を増大させる方法と、セロデキストリン含有物質の発酵時の化学物質の生成を増大させる方法と、セロデキストリン含有物質の発酵時の細胞増殖を増大させる方法と、上記方法を行うための組成物とに関する。本願開示はさらに、β‐Ｄ‐グルコース含有物質の発酵方法と、β‐Ｄ‐グルコース含有物質の発酵時のβ‐Ｄ‐グルコースの消費を増大させる方法と、β‐Ｄ‐グルコース含有物質の発酵時の化学物質の生成を増大させる方法と、β‐Ｄ‐グルコース含有物質の発酵時の細胞増殖を増大させる方法と、上記方法を行うための組成物とに関する。
【００６３】
セルロースとセロデキストリンは、β（１‐４）結合Ｄ‐グルコース分子によって構成される。セロデキストリンまたはセルロースを加水分解して個々のグルコース分子とすることにより、β‐Ｄ‐グルコース分子の放出が引き起こされる。グルコース分子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの生物によって多様な代謝経路に利用されるために 、一般的には先ずヘキソキナーゼによってリン酸化される。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、ヘキソキナーゼは好ましくはα‐Ｄ‐グルコース分子をリン酸化する。または、ヘキソキナーゼはα‐Ｄ‐グルコース分子のリン酸化のみを行う。α‐Ｄ‐グルコース分子は、Ｄ‐グルコースのアルファ型およびベータ型を相互転換させるムタロターゼ作用により、β‐Ｄ‐グルコース分子から生成されてもよい。
【００６４】
β‐Ｄ‐グルコースに優先してα‐Ｄ‐グルコースを利用するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの特性は、セルロース、セロデキストリン、およびβ‐Ｄ‐グルコース分子を変換してアルコールなどの有用な発酵化学生成物とする変換反応において潜在的な律速段階となる。したがって、本願に提供するのは、β‐Ｄ‐グルコース分子をα‐Ｄ‐グルコース分子に変換するための組成物および方法である。理論に縛られることなく、β‐Ｄ‐グルコース分子からα‐Ｄ‐グルコース分子への変換を促進することで、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによるβ‐Ｄ‐グルコース分子の利用、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによるセロデキストリンおよびセルロースなどのβ‐Ｄ‐グルコース分子を含む物質の利用を増大させてもよい。本願にさらに提供するは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによるβ‐Ｄ‐グルコースおよびセロデキストリンのより良い利用を実現するための組成物および方法である。また、本願に開示の組成物および方法は、糖類のアルファ型およびベータ型の何れかを優先的に利用する生物によるβ‐Ｄ‐グルコース分子または他の糖分子の活用についても応用することが可能である。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、「アルドース  １‐エピメラーゼ」は、以下に定義するようなグルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドを示す。本明細書中で使用される場合、「アルドース  １‐エピメラーゼ」はまた、アルドース  １‐エピメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを示す。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、セロデキストリンは、異なる長さのグルコースポリマーを示す。また、セロデキストリンは、セロビオース（２グルコースモノマー）、セロトリオース（３グルコースモノマー）、セロテトラオース（４グルコースモノマー）、セロペンタオース（５グルコースモノマー）、セロヘキサオース（６グルコースモノマー）を含むが、これに限定されない。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、糖類は、単糖類（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース）、二糖類（例えば、セロビオース、スクロース、ラクトーゼ、マルトース）、およびオリゴ糖類（一般的に３〜１０個の構成単糖を含む）を示す。
【００６８】
（開示のポリペプチド）
本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」は、連続する複数の重合アミノ酸残基（例えば、連続する少なくとも約１５個の重合アミノ酸残基）を含むアミノ酸配列である。ポリペプチドは、修飾アミノ酸残基、コドンにコードされない天然のアミノ酸残基、および非天然のアミノ酸残基を任意に含む。
【００６９】
本明細書中で使用される場合、「タンパク質」は、天然または合成の区別なく、アミノ酸配列、オリゴペプチド、ペプチド、またはポリペプチド、またはその部分を示す。
【００７０】
（グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチド）
本願に開示するのは、グルコースムタロターゼ活性を有する組み換えポリペプチドである。本明細書中で使用される場合、「ムタロターゼ活性」は、β‐Ｄ‐グルコースからα‐Ｄ‐グルコースへの変換および／またはα‐Ｄ‐グルコースからβ‐Ｄ‐グルコースへの変換をすることが可能な酵素の能力を示す。「ムタロターゼ活性」はまた、Ｌ‐アラビノース、Ｄ‐キシロース、Ｄ‐ガラクトース、マルトース、およびラクトーゼを含む他の糖類のアルファ型およびベータ型を相互に変換することが可能な酵素の能力を示す。
【００７１】
本願に開示のグルコースムタロターゼ活性を有する組み換えポリペプチドは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのポリペプチドＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃ（配列番号：１７）、ＹＨＲ２１０Ｃ（配列番号：１９）、ＹＮＲ０７１Ｃ（配列番号：２１）、Ｎ．ｃｒａｓｓａのポリペプチドＮＣＵ０９７０５（配列番号：２３）を含むが、これに限定されない。
【００７２】
一実施形態では、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのポリペプチドＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１０ポリペプチドは、文献において、アルドース  １‐エピメラーゼ、ＵＤＰ‐グルコース４‐エピメラーゼ、ＵＤＰ‐ガラクトース４‐エピメラーゼおよびムタロターゼを含む様々な名称で称される。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１０は二機能性の酵素であり、タンパク質のＮ‐末端部分はＵＤＰ‐グルコースエピメラーゼ活性（ＵＤＰ−グルコースおよびＵＤＰガラクトースの間の変換）を有し、タンパク質のＣ‐末端部分はムタロターゼ活性を有している。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１０酵素の結晶構造は、近年の学術論文に開示されている（Ｔｈｏｄｅｎ  ａｎｄ  Ｈｏｌｄｅｎ，（２００５）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０（２３）：２１９００−２１９０７参照）。
【００７３】
一態様では、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドは、全長ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃタンパク質（配列番号：１７）である。他の態様では、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドは、ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃタンパク質のＣ‐末端側の約半分を含むポリペプチドである。他の態様では、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドは、ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃタンパク質（配列番号３０）のアミノ酸残基Ｉｌｅ‐３７８からＳｅｒ‐６９９までである（配列番号１７のアミノ酸番号３７８〜６９９）。他の態様では、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドは、ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃタンパク質（配列番号３１）のアミノ酸残基Ｇｌｕ‐３６１からＳｅｒ‐６９９までである（配列番号１７のアミノ酸番号３６１〜６９９）。他の態様では、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドは、ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃタンパク質（配列番号３２）のアミノ酸残基Ｐｈｅ‐３６４からＳｅｒ‐６９９までである（配列番号１７のアミノ酸番号３６４〜６９９）。当業者に理解されるように、ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃのエピメラーゼ活性に第一義的にまたは全体的に関与するＮ‐末端アミノ酸は除去する一方で、ムタロターゼ活性に必要とされるＣ‐末端アミノ酸は保存されているＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃのさらなる短縮型を調製することが可能である。ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃのそのような短縮型は、例えば、ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃタンパク質の様々な短縮型を調製し、グルコースムタロターゼ酵素活性について試験することによって、同定されてもよい。タンパク質の短縮型の調製方法は当該技術分野において周知であり、例えば、ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃのタンパク質をコードする遺伝子の短縮型をＰＣＲによって作製し、タンパク質の短縮型をコードする遺伝子を発現ベクター内にクローン化し、この発現ベクターを用いて宿主細胞の形質転換を行い、このように形質転換を行った宿主細胞のタンパク質を発現することを含んでよい。
【００７４】
他の実施形態では、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのポリペプチドＹＨＲ２１０Ｃ（配列番号１９）である。一態様では、ＹＨＲ２１０Ｃポリペプチド配列は、ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃタンパク質のアミノ酸残基Ｐｈｅ‐３６４からＳｅｒ‐６９９までとの配列相同性に基づいてアライメントが行われてもよい。
【００７５】
他の実施形態では、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのポリペプチドＹＮＲ０７１Ｃ（配列番号２１）である。一態様では、ＹＮＲ０７１Ｃポリペプチド配列は、ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃタンパク質のアミノ酸残基Ｐｈｅ‐３６４からＳｅｒ‐６９９までとの配列相同性に基づいてアライメントが行われてもよい。
【００７６】
他の実施形態では、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドは、Ｎ．ｃｒａｓｓａのポリペプチドＮＣＵ０９７０５（配列番号２３）である。一態様では、ＮＣＵ０９７０５ポリペプチド配列は、ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃタンパク質のアミノ酸残基Ａｌａ‐３８６からＡｒｇ‐６９７までとの配列相同性に基づいてアライメントが行われてもよい。
【００７７】
他の実施形態では、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドは、下掲のアミノ酸モチーフの一方または両方を含むポリペプチドである。
【００７８】
モチーフ１：Ｇ−Ｘ−［ＶＴＩ］−［ＶＰＩ］−Ｇ−Ｒ−［ＶＴＹ］−［ＡＴ］−Ｎ−Ｒ−［ＶＩＬＴ］（配列番号２８）（ＧＡＬ／ＹＢＲ０１９Ｃの４２４位〜４３４位の残基に対応）。式中、Ｘは任意のアミノ酸を示す。括弧で示すアミノ酸の位置では、アミノ酸は括弧内に示す任意のアミノ酸である。例えば、[ＶＴＩ］は、Ｖ、Ｔ、またはＩである。
【００７９】
モチーフ２：Ｔ−［ＶＰＩ］−［ＶＩ］−［ＭＧＮ］−Ｘ−［ＳＴＡ］−［ＮＳＱＨＰ］−Ｈ−［ＩＳＴ］−Ｙ−［ＦＷ］−Ｎ−Ｌ（配列番号２９）（ＧＡＬ／ＹＢＲ０１９Ｃの５３０位〜５４２位の残基に対応）。式中、Ｘは任意のアミノ酸を示す。括弧で示すアミノ酸の位置では、アミノ酸は括弧内に示す任意のアミノ酸である。例えば、[ＶＰＩ］は、Ｖ、Ｐ、またはＩである。
【００８０】
一態様では、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２８のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む。一態様では、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２９のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む。一態様では、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドは、上述の配列番号２８および２９のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む。
【００８１】
特定の実施形態では、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドは、ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、ＹＮＲ０７１Ｃ、およびＮＣＵ０９７０５の何れかのポリペプチドに対して少なくとも約２０％、少なくとも約２９％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸残基配列同一性を有する。特定の実施形態では、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドは、ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、ＹＮＲ０７１Ｃ、およびＮＣＵ０９７０５の何れかのポリペプチドの少なくとも７個、８個，９個、１０個，１１個，１２個、１３個，１４個，１５個、２０個，２５個、３０個，３５個，４０個、４５個、または５０個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドである。
【００８２】
グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドはさらに、ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、ＹＮＲ０７１Ｃ、およびＮＣＵ０９７０５の何れかのポリペプチドの保存的に修飾した変異体である組み換えポリペプチドを含む。本願で使用するような「保存的に修飾した変異体」は、アミノ酸を化学的に同様なアミノ酸で置換する結果となる、ポリペプチド配列の個々の置換、欠損、または付加を含む。機能的に類似しているアミノ酸を提供する保存的置換表は当該技術分野において周知である。そのような保存的に修飾した変異体は、開示の多型変異体、種間ホモログ、および対立遺伝子に追加して加えられものであり、これらを除外するものではない。下掲の８個のグループは、互いの保存的置換となるアミノ酸の例を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）参照）。
【００８３】
グルコースムタロターゼ活性を有する組み換えポリペプチドはさらに、ポリペプチドＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、ＹＮＲ０７１Ｃ、およびＮＣＵ０９７０５のホモログまたはオルソログであるポリペプチドを含む。本願で使用するような「ホモロジー」は、参照配列と第二の配列の少なくとも断片との配列同一性を示す。ホモログは当該技術分野に公知の任意の方法で同定されてもよく、好ましくは、ＢＬＡＳＴ法を用いて同定されてもよい。ＢＬＡＳＴ法では、参照配列を単一の第二の配列または配列断片、または配列のデータベースと比較する。以下に説明するように、ＢＬＡＳＴ法は、配列間の比較をパーセント同一性およびパーセント類似性に基づいて行う。本願で使用するような「オルソロジー」は、共通の祖先遺伝子に由来する異なる種類の遺伝子を示す。
【００８４】
（開示のポリヌクレオチド）
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、および「核酸の配列」およびそれらの変種は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２デオシキＤ‐リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ‐リボースを含む）、プリン塩基またはピリミジン塩基のＮ‐グリコシドであるポリヌクレオチドの他の種類、および、非ヌクレオチド骨格を含む他の重合体（但し、ＤＮＡ中およびＲＮＡ中で確認されるように当該重合体は、塩基の対合および積み重ねを可能にする構造で核酸塩基を含んでいるとする）に対する上位概念を表している。したがって、上記用語は、周知の種類の核酸配列修飾（例えば、１つ以上の天然ヌクレオチドを類似体で置換）、ヌクレオチド間修飾（例えば、非電荷結合含むヌクレオチド間修飾（例えば、メチルホスホン酸塩、リン酸トリエステル、アミド亜リン酸エステル、カルバミン酸塩など）、負荷電結合を含むヌクレオチド間修飾（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、および正電荷結合を含むヌクレオチド間修飾（例えば、アミノアルキルホスホルアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル）など）、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ‐リジンなどを含む）などのペンダント部分を含むもの、インターカレータを含むもの（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、およびキレート剤を含むもの（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含む。本明細書中で使用される場合、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの記号は、ＩＵＰＡＣ‐ＩＵＢ生化学用語委員会が推奨する記号である。
【００８５】
（ムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）
本発明は、ムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドを含む。本発明はさらに、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞、およびそのような宿主細胞の使用方法に関する。
【００８６】
本願開示の組み換えポリヌクレオチドは、本願に開示するようなグルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。幾つかの態様では、開示のポリヌクレオチドは、配列番号１７のポリペプチド（ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド、配列番号１９のポリペプチド（ＹＨＲ２１０Ｃポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド、配列番号２１のポリペプチド（ＹＮＲ０７１Ｃポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド、配列番号２３のポリペプチド（ＮＣＵ０９７０５ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含む。幾つかの態様では、開示のポリヌクレオチドは、配列番号１６のポリヌクレオチド（ＧＡＬ１０/ＹＢＲ０１９Ｃポリペプチドをコード）、配列番号１８のポリヌクレオチド（ＹＨＲ２１０Ｃポリペプチドをコード）、配列番号２０のポリヌクレオチド（ＹＮＲ０７１Ｃポリペプチドをコード）、および配列番号２２のポリヌクレオチド（ＮＣＵ０９７０５ポリペプチドをコードする）を含む。
【００８７】
特定の態様では、開示の組み換えポリヌクレオチドは、配列番号１６、１８、２０、および２２のポリヌクレオチドに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のヌクレオチド残基配列同一性を有する。
【００８８】
開示のポリヌクレオチドはまた、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号２９のアミノ酸配列の一方または両方を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【００８９】
開示のポリヌクレオチドはさらに、ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、ＹＮＲ０７１Ｃ、およびＮＣＵ０９７０５のポリペプチドの保存的に修飾した変異体をコードするポリヌクレオチドを含む。開示のポリヌクレオチドはさらに、ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、ＹＮＲ０７１Ｃ、およびＮＣＵ０９７０５のポリペプチドのホモログまたはオルソログをコードするポリヌクレオチドを含む。
【００９０】
開示のポリヌクレオチドの配列は、例えば、直接化学合成法またはクローニング法を含む当業者に公知の適切な方法によって調製される。直接化学合成法に関しては、核酸の重合体の形成は一般的に、３’末端側をブロッキングしたヌクレオチド単量体および５’末端側をブロッキングしたヌクレオチド単量体を成長ヌクレオチド鎖の５’末端のヒドロキシル基に順次付加することを備え、各単量体の付加は、付加される単量体（一般的には、リン酸トリエステルまたはリン酸アミデートなどのリン誘導体）の３’末端側の位置に対して前記成長ヌクレオチド鎖の５’末端のヒドロキシル基が求核攻撃を行うことで実現される。このような方法論は当業者に公知であり、関連の文書および文献［例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２１：７１９−７２２；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．４，５００，７０７；５，４３６，３２７；および５，７００，６３７］に記載されている。さらに、適当な制限酵素を用いてＤＮＡを開裂して、その断片をゲル電気泳動法を用いて分離した後に、当業者に公知の技法（ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法； 例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６８３，１９５））を用いてゲルから所望の核酸配列を回収することで、所望の配列を天然材料から単離してもよい。
【００９１】
開示の各ポリヌクレオチドは、発現ベクターに組み込むことが可能である。「発現ベクター」または「ベクター」は、宿主細胞への形質導入、宿主細胞の形質変換、または宿主細胞の感染を引き起こすことで、宿主細胞本来の核酸および／またはタンパク質と異なる核酸および／またはタンパク質を宿主細胞内に発現させるか、または、宿主細胞本来の発現方法とは異なる方法で宿主細胞内に発現させる化合物および／または組成物を示す。「発現ベクター」は、宿主細胞によって発現される核酸（通常はＲＮＡまたはＤＮＡ）の配列を含む。発現ベクターはまた、適宜、ウイルス、リポソーム、またはタンパク質被膜などの宿主細胞内への核酸の進入を促進する物質を含む。本願の開示で使用を意図する発現ベクターは、好適または必須の操作要素と共に核酸配列を挿入することが可能な発現ベクターを含む。さらに、発現ベクターは、宿主細胞の内部へ移送されて、宿主細胞内で複製されることが可能な発現ベクターであることが必要である。好適な発現ベクターはプラスミドであり、特に、核酸配列の転写に好適または必須の操作要素を含む、十分な文献が存在するプラスミドである。そのようなプラスミドは、他の発現ベクターと同様に、当業者に周知である。
【００９２】
個々のポリヌクレオチドの取り込みは、例えば、発現ベクター（例えばプラスミド）の特定部位を開裂させる制限酵素（例えば、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｈａＩ、ＸｈｏＩ、ＸｍａＩなど）の使用を含む公知の方法によって達成されてもよい。制限酵素は、アニーリングされて、開裂した発現ベクターの端部に相補的な配列の末端を含む（または，含むように合成した）ポリヌクレオチドになることが可能な一本鎖の端部を提供する。アニーリングは、適切な酵素（例えば、ＤＮＡリガーゼ）を用いて行われる。当業者に理解されるように、上述の発現ベクターおよび好適なポリヌクレオチドは、多くの場合では同一の制限酵素を用いて開裂され、これにより双方の端部同士が互いに相補的になるよう確実にしている。さらに、ＤＮＡリンカーを用いて、核酸配列を発現ベクターの内部へ連結することを容易にしてもよい。
【００９３】
一連の個々のポリヌクレオチドはまた、当業者に周知の方法（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６８３，１９５）を用いて結合することが可能である。例えば、好適なポリヌクレオチドの各々は、最初に個別のＰＣＲ法で生成することが可能である。その後、特定のプライマを設計して、上記ＰＣＲ法の生成物の端部が相補配列を含むようにする。上記ＰＣＲ法の生成物を混合し、変性させて、リアニーリングを行った場合では、３'末端側の端部にマッチング配列を含む鎖は重複して、互いにプライマとして作用することが可能である。上記重複をＤＮＡポリメラーゼにより延伸させることで、元の配列を互いに「接合した（ｓｐｌｉｃｅｄ）」分子を生成する。このように、一連の個々のポリヌクレオチドは、互いに「接合（ｓｐｌｉｃｅ）」されて、その後に宿主細胞に同時に形質導入されてもよい。したがって、複数のポリヌクレオチドの各々の発現が影響される。
【００９４】
個々のポリヌクレオチドまたは「接合（ｓｐｌｉｃｅ）」したポリヌクレオチドはその後、発現ベクター内に取り込まれる。発現ベクター内へのポリヌクレオチドの取り込み過程に関して、本願の開示は限定されない。当業者であれば、発現ベクター内へのポリヌクレオチドの取り込みに必要な工程に精通している。典型的な発現ベクターは、１つ以上の調節領域が先行する所望のポリヌクレオチドを、リボソーム結合部位（例えば、ヌクレオチド３個分〜９個分の配列長を有し、E  coliの開始コドンからヌクレオチド３個分〜１１個分上流に配置されているヌクレオチド配列）と一緒に含む。ＳｈｉｎｅおよびＤａｌｇａｒｎｏ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５４（５４９５）：３４−３８ならびにＳｔｅｉｔｚ（１９７９）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ｅｄ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ，Ｒ．Ｆ．），１：３４９−３９９（Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照。
【００９５】
本願で使用する用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、制御配列によってポリペプチドの発現が導かれるように、制御配列をＤＮＡ配列またはヌクレオチドに対して適切な位置に配置した構成を示す
調節領域は、例えば、プロモータおよびオペレータを含む領域を含む。プロモータは、所望のポリヌクレオチドと作動可能に連結されることで、ＲＮＡポリメラーゼ酵素を介したポリヌクレオチドの転写を開始する。オペレータは、リプレッサータンパク質が結合可能なタンパク質結合ドメインを含む、プロモータに隣接する核酸の配列である。リプレッサータンパク質の非存在下では、プロモータを介して転写が開始する。リプレッサータンパク質の存在下では、オペレータのタンパク質結合ドメインに特異的なリプレッサータンパク質がオペレータと結合することで、転写を抑制する。この方法により、使用する特定の調節領域とこれに対応するリプレッサータンパク質の存在または不在とに基づいて、転写制御が成し遂げられる。例は、ラクトースプロモータ（Ｌａｄリプレッサータンパク質は、ラクトースと接触した場合に配座が変更されることで、オペレータとの結合が防止される）、およびトリプトファンプロモータ（トリプトファンと複合化された場合では、ＴｒｐＲリプレッサータンパク質は、オペレータを結合する配座を有する；トリプトファンの不在下では、ＴｒｐＲリプレッサータンパク質は、オペレータと結合しない配座を有する）を含む。他の例は、ｔａｃプロモータ（ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０（１）：２１−２５参照）である。当業者によって理解されるように、上述および他の発現ベクターを本発明に使用してもよく、この点において本発明は限定されるものではない。
【００９６】
任意の好適な発現ベクターを使用して所望の配列の取り込みを行ってもよいが、容易に利用可能な発現ベクターは、プラスミド（ｐＳＣｌＯｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＢＲｌＭＣＳ−３、ｐＵＲ、ｐＥＸ、ｐＭＲｌＯＯ、ｐＣＲ４、ｐＢＡＤ２４、ｐＵＣ１９など）およびバクテリオファージ（Ｍｌ３ファージおよびλファージなど）を含む。但し、発現ベクターはこれに限定されない。当然ながら、そのような発現ベクターは特定の宿主細胞にのみ適することがある。しかし、当業者であれば、特定の発現ベクターが所定の宿主細胞に適しているか否かを通常の実験を通して容易に決定することが可能である。例えば、発現ベクターは、宿主細胞に導入されることが可能であり、導入後、発現ベクターに含まれる配列の生存能力および発現について観察される。さらに、発現ベクターおよびそれらの特定の宿主細胞に対する適応性を記載する、関連する文書および文献を参照してもよい。
【００９７】
（配列のアライメントおよび配列同一性）
比較のために配列のアライメントを行う方法は、前記技術分野で周知である。例えば、任意の２つの配列間のパーセント配列同一性は、数学的アルゴリズムを用いて決定することが可能である。そのような数学的アルゴリズムの非限定的な例は、マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）のアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１  １７（１９８８））、スミスら（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．）の局所相同性アルゴリズム（ｌｏｃａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．  ２：４８２（１９８１））、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびウンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）の相同性アライメントアルゴリズム（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３  ４５３（１９７０））、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）の類似性検索法（ｓｅａｒｃｈ−ｆｏｒ−ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ−ｍｅｔｈｏｄ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４  ２４４８（１９８８））、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）のアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７２２６４（１９９０））を修正したアルゴリズム（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３  ５８７７）である。
【００９８】
コンピュータによるこれら数学的アルゴリズムの実行は、配列を比較して配列同一性を決定するために利用することが可能である。そのような実行は、ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ社、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）と、ＡＬＩＧＮプログラム（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）およびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、  ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．，ＵＳＡ）とを含むが、これらに限定されない。こうしたプログラムを用いたアライメントは、初期設定パラメータを用いて実行することが可能である。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、ヒギンスら（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｇｅｎｅ  ７３：２３７  ２４４  （１９８８））、ヒギンスら（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．）（ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１  １５３  （１９８９））、コーペットら（Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：１０８８１  ９０  （１９８８））、ファンら（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）（ＣＡＢＩＯＳ  ８：１５５  ６５  （１９９２））、およびピアソンら（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４：３０７  ３３１  （１９９４））に十分に記載されている。ＡＬＩＧＮプログラムは、上述のマイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）（１９８８）のアルゴリズムに基づいている。アミノ酸配列を比較する場合では、ＡＬＩＧＮプログラムと一緒にＰＡＭ１２０重量残基表（ＰＡＭ１２０  ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティー（ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ）、および４のギャップペナルティー（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）を使用することができる。アルトシュルら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．）のＢＬＡＳＴプログラム（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３（１９９０））は、上述のカーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）（１９９０）のアルゴリズムに基づいている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に相同のヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて、スコア＝１００、ワード長＝１２として実行することが可能である。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質またはポリペプチドに相同のアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴＸプログラムを用いて、スコア＝５０、ワード長＝３として実行することが可能である。比較用のギャップアライメントを得るために、アルトシュルら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．）に記載の方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９（１９９７））でＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０内）を使用することが可能である。代わりに、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０内）を使用して、分子間の遠い関係性を検出する繰り返し検索を実行することが可能である。上掲のアルトシュルら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅ���  ａｌ．）（１９９７）を参照。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、またはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用する場合では、各プログラム（例えば、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ、タンパク質用のＢＬＡＳＴＸ）の初期設定パラメータを使用することが可能である。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照。また、アライメントは、検測により手動で実行してもよい。
【００９９】
本明細書中で使用される場合、核酸配列（またはポリペプチド配列）の配列同一性または同一性は、配列間の一致性が特定の比較ウィンドウ全域に渡って最大化するようにアライメントを行った２つの配列間で同一な残基について言及している。配列同一性の百分率をタンパク質に関して使用する場合では、アミノ酸残基を類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換するアミノ酸の保存的置換によって相違することの多い、配列間で互いに異なる残基の位置は、分子の機能的特性の変化を生じさせないことが認められる。配列同士が保存的置換において異なる場合では、置換の保存的性質を補正するためにパーセント配列同一性を上方に調節してもよい。そのような保存的置換によって異なる配列は、配列類似性または類似性を有していると言われている。こうした調節を行う手段は、当業者に周知である。一般的に、このことは、完全な不釣り合いよりも部分的なように、保存的置換を得ることを含み、それによって上記パーセンテージ配列同一性を高める。一般的に、こうした手法は、保存的置換を完全な不一致というよりも部分的な不一致としてスコアリングして、パーセンテージ配列同一性を増大させることを含んでいる。したがって、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアを与え、非保存的置換に０のスコアを与える場合では、保存的置換に０と１の間のスコアを与える。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、  Ｃａｌｉｆ．）で実行されるように計算される。
【０１００】
上述の配列同一性のパーセンテージ以外では、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることを示すのは、下記に示すように、ある核酸にコードされるポリペプチドは、他の核酸にコードされるポリペプチドの抗体に対して免疫学的に交差反応性を有しているということである。したがって、一般的に、あるポリペプチドは他のポリペプチドと実質的に同一であり、例えば、これら２つのポリペプチドは保存的置換によってのみ異なっている。２つの核酸配列が実質的に同一であることを示す他の指標は、２つの分子またはその相補体は、以下に示すように、ストリンジェントな条件下で互いとハイブリダイズしていることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることを示すさらに他の指標は、配列の増幅させるために同一のプライマを使用することが可能であることである。
【０１０１】
（グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドを含む組成物）
本願の開示はさらに、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドを含む組成物を提供する。一態様では、グルコースムタロターゼ活性を有する組み換えポリペプチドを提供する。一態様では、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドを含む宿主細胞を提供する。
【０１０２】
（グルコースムタロターゼ活性を有する組み換えポリペプチド）
幾つかの態様では、グルコースムタロターゼ活性を有する組み換えポリペプチドを提供する。幾つかの態様では、グルコースムタロターゼ活性を有する組み換えポリペプチドは、上記に示されるように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのポリペプチドＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、およびＹＮＲ０７１Ｃ、Ｎ．ｃｒａｓｓａのポリペプチドＮＣＵ０９７０５、およびこれらの変異体を含む。幾つかの態様では、グルコースムタロターゼ活性を有する組み換えポリペプチドは、配列番号２８および２９の一方または両方のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１０３】
グルコースムタロターゼ活性を有する組み換えポリペプチドは、サムブルックＪ．ら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．）に記載の標準的な分子生物学技術（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ））によって調製してもよい。組み換えポリペプチドは、トランスジェニック発現系内で発現させ、その後にトランスジェニック発現系から精製してもよい。トランスジェニック発現系として原核生物または真核生物の発現系を使用することが可能である。トランスジェニック宿主細胞は、酵母菌およびＥ．ｃｏｌｉを含んでもよい。幾つかの態様では、トランスジェニック宿主細胞は、細胞外にポリペプチドを分泌してもよい。幾つかの態様では、トランスジェニック宿主細胞は、細胞内に発現後のポリペプチドを保持してもよい。
【０１０４】
特定の態様では、グルコースムタロターゼ活性を有する組み換えポリペプチドは、宿主細胞から単離される。特定の態様では、グルコースムタロターゼ活性を有する組み換えポリペプチドは、タンパク質精製を容易にするために、ＧＳＴ‐タグまたは重合ヒスチジンタグなどのタンパク質「タグ」と一緒に調整してもよい。幾つかの態様では、グルコースムタロターゼ活性を有する組み換えポリペプチドは、高純度（例えば、＞９９％純度、＞９８％純度、＞９５％純度、＞９０％純度など）に精製さてもよい。組み換えポリペプチドは、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィーを含む当業者に公知の様々な技術によって精製されてもよい。
【０１０５】
（開示の宿主細胞）
本願の開示は、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。
【０１０６】
「宿主細胞」および「宿主微生物」は本願において交換可能に使用され、組み換えＤＮＡまたは組み換えＲＮＡを挿入して形質転換させることが可能な、生存している生体細胞を示す。そのような組み換えＤＮＡまたは組み換えＲＮＡは、発現ベクター内に存在することが可能である。したがって、本願に記載するような宿主生物または宿主細胞は、原核生物（例えば、真正細菌界に属する生物）または真核性細胞であってもよい。当業者に理解されるように、原核細胞は膜結合核を欠いている一方で、真核細胞は膜結合核を含んでいる。
【０１０７】
核酸配列を用いた形質転換後にも生存することが可能であれば、任意の原核宿主細胞または真核宿主細胞を本願の開示に使用することが可能である。好ましくは、宿主細胞は、必要な核酸配列の形質導入、その後のタンパク質（例えば、トランスポーター）の発現、および生成される中間体の何れによっても悪影響を受けることがない。好適な真核細胞は、菌、植物、昆虫、または哺乳類の細胞を含むが、これに限定されない。
【０１０８】
特定の実施形態では、宿主は菌株である。本願に使用するような「菌類」は、子嚢菌門、担子菌門、ツボカビ門、および接合菌門（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎ，  Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，  ８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９５，  ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫに定義）、並びに卵菌門（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  ｐａｇｅ  １７１に引用）、および全ての栄養胞子形成菌（上述のＨａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）を含む。
【０１０９】
特定の実施形態では、菌宿主は酵母菌株である。本願に使用するような「酵母菌」は、有子嚢胞子酵母（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）、担子菌酵母、および不完全菌類（不完全酵母菌）に属する酵母（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））を含む。酵母の分類は将来的に変更することも考えられる。本開示の目的上、酵母菌は、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ  （Ｓｋｉｎｎｅｒ，  Ｆ．  Ａ．，  Ｐａｓｓｍｏｒｅ，  Ｓ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，  Ｒ．  Ｒ．，  ｅｄｓ，  Ｓｏｃ．  Ａｐｐ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．  ９，  １９８０）に記載のように定義される。
【０１１０】
特定の実施形態では、酵母菌宿主は、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、またはＹａｒｒｏｗｉａの株である。
【０１１１】
本発明の幾つかの実施形態では、宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｎａｃｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｍｕｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｈｅｈａｔａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓである。他の実施形態では、酵母菌宿主は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  ｃｕｓｔｅｒｓｉｉ、またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘであってもよい。
【０１１２】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの産業用株を含んでよい。アルグエソら（Ａｒｇｕｅｓｏ  ｅｔ  ａｌ．）は、バイオエタノール製造で一般に使用されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの産業用株のゲノム構造、並びにバイオエタノール製造にとって重要な特定の遺伝子多型について論じている（Ａｒｇｕｅｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９：  ２２５８−２２７０，  ２００９）。
【０１１３】
他の実施形態では、菌宿主は、糸状菌株である。「糸状菌」は、下位の菌門および卵菌門（上掲のＨａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５により定義）の全ての糸状形態を含む。糸状菌は、一般的に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合多糖類から構成される菌糸体壁によって特徴付けられる。栄養増殖は菌糸伸張によるものであり、炭素異化作用は偏性好気性である。反対に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母菌の栄養増殖は単細胞性葉状体の出芽によるものであり、炭素異化作用は発酵性であってもよい。
【０１１４】
特定の実施形態では、糸状菌宿主は、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａの株であるが、これらに限定されない。
【０１１５】
特定の実施形態では、糸状菌宿主は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅの株である。他の実施形態では、糸状菌宿主は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ、またはＦｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍの株である。さらに他の実施形態では、糸状菌宿主は、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ、Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ、またはＴｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓの株である。さらに他の実施形態では、糸状菌宿主は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅの株である。
【０１１６】
他の実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。また、特定の実施形態では、原核生物は、Ｅ．  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａである。他の実施形態では、原核宿主細胞は、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｃｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃａｐｓｕｌａｔａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｕｒｎｉｓｓｉｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｕｒｎｉｓｓｉｉ  Ｍ１、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、またはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓである。他の実施形態では、宿主細胞はシアノバクテリアである。細菌宿主細胞のさらなる例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉａ、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、およびＰａｒａｃｏｃｃｕｓに分類されるバクテリア種を含むが、これに限定されない。
【０１１７】
本願に開示の宿主細胞は、組み換え遺伝子を導入して遺伝的に改変されてよい。したがって、係る遺伝的な改変を行った宿主細胞は自然に発生することがない。好適な宿主細胞は、異なる機能のために１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の核酸コンストラクトを発現することが可能な宿主細胞である。
【０１１８】
本願に使用する用語「組み換え核酸」または「異種核酸」、または、「組み換えポリヌクレオチド」、「組み換えヌクレオチド」、または「組み換えＤＮＡ」は、次に挙げる（ａ）〜（ｃ）の条件のうち少なくとも１つに該当する核酸の重合体を示す：（ａ）核酸配列が特定の宿主細胞にとって外来の（すなわち、宿主細胞内に自然に存在することのない）核酸配列であること、（ｂ）核酸配列が特定の宿主細胞内に自然に存在する一方で、その量が自然界において見られないような量（例えば、予測されるよりも多くの量）であること、または、（ｃ）核酸の配列は、自然界においては同一の関係性を有して存在することのないような関係性を有して存在する２つ以上のサブ配列を含んでいること。例えば、（ｃ）の条件を例にとる場合では、組み換え核酸の配列は、新たな機能性核酸を生成するよう構成された無関係の遺伝子由来の２つ以上の配列を含み得る。特に、本発明では、宿主細胞内へ発現ベクターを挿入することが記載されており、発現ベクターは、宿主細胞内に通常では存在しないタンパク質をコードする核酸配列を含むか、または宿主細胞内に通常存在するものの、異なる制御配列に制御されるタンパク質を含む。上記宿主細胞のゲノムを参照すると、上記タンパク質をコードする核酸配列は組み換え核酸配列である。本願に使用するように、用語「組み換えポリペプチド」は、上述の「組み換え核酸」または「異種核酸」、または、「組み換えポリヌクレオチド」、「組み換えヌクレオチド」、または「組み換えＤＮＡ」から生成されるポリペプチドを示す。
【０１１９】
幾つかの実施形態では、上記宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質の何れかを自然に生成する。所望のタンパク質をコードする遺伝子は、宿主細胞に対して異種の遺伝子であってもよい。または、所望のタンパク質をコードする遺伝子は、宿主細胞に内因性の遺伝子である一方で、異種プロモータおよび／または調節領域に作動可能に結合されてもよく、これにより宿主細胞内において高度に発現されてよい。他の実施形態では、上記宿主細部は所望のタンパク質を自然には産生せず、これら分子の産生に必要な１つ以上の遺伝子を発現することが可能な異種核酸コンストラクトを含む。
【０１２０】
（宿主細胞成分）
一態様では、本願開示の宿主細胞は、本願開示のグルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡを含む。一態様では、開示の宿主細胞は、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドを過剰に発現する（すなわち、開示の宿主細胞は、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を含まない対応宿主細胞と比較して、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをより多く発現する）。一態様では、本願開示の宿主細胞は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡを含む。他の態様では、本願開示の宿主細胞は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＹＨＲ２１０Ｃポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡを含む。他の態様では、本願開示の宿主細胞は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＹＮＲ０７１Ｃポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡを含む。他の態様では、本願開示の宿主細胞は、Ｎ．ｃｒａｓｓａのＮＣＵ０９７０５ポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡを含む。他の様態では、本願開示の宿主細胞は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、またはＹＮＲ０７１Ｃポリペプチド、またはＮ．ｃｒａｓｓａのＮＣＵ０９７０５ポリペプチドの変異体または短縮型を含む。他の態様では、本願開示の宿主細胞は、配列番号２８のアミノ酸配列および配列番号２９のアミノ酸配列の一方または両方を含むポリペプチドコードする組み換えＤＮＡを含む。
【０１２１】
特定の態様では、上記ポリペプチドは、ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、ＹＮＲ０７１Ｃ、またはＮＣＵ０９７０５ポリペプチドに対して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１２２】
（セロデキストリントランスポーター）
特定の実施形態では、宿主細胞は、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組み換えＤＮＡをさらに含む。セロデキストリントランスポーターは、細胞の外部から内部へのセロデキストリン分子の輸送、および／または細胞の内部から外部へのセロデキストリン分子の輸送を行う任意の膜貫通タンパク質である。特定の実施形態では、セロデキストリントランスポーターは、細胞の外部から内部へのセロデキストリン分子の輸送、および／または細胞の内部から外部へのセロデキストリン分子の輸送を行う能力を保持する機能性断片である。
【０１２３】
本願に開示の組み換えセロデキストリントランスポーターは、Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １０６  （５２）：２２１５７−２２１６２，  ２００９；Ｔａｂｌｅ  １０，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ  Ｄａｔａ，  Ｄａｔａｓｅｔ  Ｓ１，  ｐａｇｅ  ３）および下記の表１および２に記載の遺伝子の何れかにコードされる組み換えセロデキストリントランスポーターであってもよい。
【０１２４】
表１：セロデキストリントランスポーターをコードする配列の一覧表
【０１２５】
【表１】
2014504877.tif 000003
表２：セロデキストリントランスポーターのオルソログの一覧表
【０１２６】
【表２】
2014504877.tif 000004
￥アクセッション番号が利用可能でない場合では、ＪＧＩ番号が使用される。上記ＪＧＩ番号により、この生物のＪＧＩゲノムポータルを介して上記遺伝子にアクセスすることが可能になる（以下のページよりアクセス可能：ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／ｐｒｏｇｒａｍｓ／ｆｕｎｇｉ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｆ）。Ａ．  ｆｌａｖｕｓ識別子およびＡ．  ｎｉｄｕｌａｎｓ識別子により、ウェブページｇｅｎｏｍｅｓ．ｏｒｇ．ｕｋ／およびウェブページｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ｇｅｎｏｍｅ／ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ＿ｇｒｏｕｐ／ＭｕｌｔｉＨｏｍｅ．ｈｔｍｌのゲノムポータルを介して上記遺伝子にアクセスすることが可能になる。
【０１２７】
他の実施形態では、本願開示の組み換えセロデキストリントランスポーターは、Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １０６  （５２）：２２１５７−２２１６２，  ２００９；Ｔａｂｌｅ  １０，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ  Ｄａｔａ，  Ｄａｔａｓｅｔ  Ｓ１，  ｐａｇｅ  ３）および上記の表１および２に記載の遺伝子の何れかに対して約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸残基配列同一性を有する。
【０１２８】
さらに、本願開示のセロデキストリントランスポーターは、ＮＣＵ００８０１、ＮＣＵ００８０９、ＮＣＵ０８１１４、ＸＰ００１２６８５４１．１、ＬＡＣ２、ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ００８２１、ＮＣＵ０４９６３、ＮＣＵ０７７０５、ＮＣＵ０５１３７、ＮＣＵ０１５１７、ＮＣＵ０９１３３、およびＮＣＵ１００４０を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、組み換えセルデキストリントランスポーターは、ＮＣＵ００８０１、ＮＣＵ００８０９、ＮＣＵ０８１１４、ＸＰ００１２６８５４１．１、ＬＡＣ２、ＮＣＵ００１３０、ＮＣＵ００８２１、ＮＣＵ０４９６３、ＮＣＵ０７７０５、ＮＣＵ０５１３７、ＮＣＵ０１５１７、ＮＣＵ０９１３３、またはＮＣＵ１００４０の何れかの配列にコードされるポリペプチドに対して少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸残基配列同一性を有する。
【０１２９】
特定の実施形態では、上記宿主細胞は、ｃｄｔ‐１またはＣＢＴ１としても知られる、ＮＣＵ００８０１によってコードされるセロデキストリントランスポーターを含む。他の実施形態では、上記宿主細胞は、Ｃｄｔ‐２またはＣＢＴ２としても知られる、ＮＣＵ０８１１４によってコードされるセロデキストリントランスポーターを含む。特定の実施形態では、上記組み換えセロデキストリントランスポーターは、Ｃｄｔ‐１（配列番号３３）またはＣｄｔ‐２（配列番号３４）に対して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１３０】
本願開示の好適なセロデキストリントランスポーターはまた、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＵＳ２０１１／０２６２９８３に記載のセロデキストリントランスポーターおよびＰＣＴ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＷＯ２０１１／１２３７１５に記載のセロデキストリントランスポーターを含むが、これらに限定されない。例えば、好適なセロデキストリントランスポーターは、ＨＸＴ２．１、ＨＸＴ２．２、ＨＸＴ２．３、ＨＸＴ２．４、ＨＸＴ２．５、ＨＸＴ２．６、およびＨＸＴ４も含んでよいが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本願開示の組み換えセロデキストリントランスポーターは、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＵＳ２０１１／０２６２９８３およびＰＣＴ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＷＯ２０１１／１２３７１５に一覧の遺伝子（例えば、ＨＸＴ２．１、ＨＸＴ２．２、ＨＸＴ２．３、ＨＸＴ２．４、ＨＸＴ２．５、ＨＸＴ２．６、またはＨＸＴ４）の何れかにコードされるポリペプチドに対して約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸残基配列同一性のアミノ酸残基配列の配列同一性を有する。
【０１３１】
本願に開示の組み換えセロデキストリントランスポーターはまた、上述に一覧の遺伝子にコードされるポリペプチドの保存的置換を行った変異体をコードするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含んでよいが、これに限定されない。本願開示の組み換えセロデキストリントランスポーターは、上掲のＴｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９年）（Ｔａｂｌｅ  １０，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ  Ｄａｔａ，  Ｄａｔａｓｅｔ  Ｓ１，  ｐａｇｅ  ３）、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＵＳ２０１１／０２６２９８３、およびＰＣＴ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＷＯ２０１１／１２３７１５に記載の一覧の遺伝子の何れかにコードされるポリペプチドのホモログまたはオルソログをコードするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドをさらに含む。
【０１３２】
特定の態様では、本願開示のセロデキストリントランスポーターは、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＣＡＺ８１９６２．１（Ｔｕｂｅｒ  ｍｅｌａｎｏｓｐｏｒｕｍ）のポリペプチド、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＡＢＮ６５６４８．２（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）のポリペプチド、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＥＤＲ０７９６２（Ｌａｃｃａｒｉａ  ｂｉｃｏｌｏｒ）のポリペプチド、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＢＡＥ５８３４１．１（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）のポリペプチド、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＤＡＡ０６７８９．１（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＸＴ１）のポリペプチド、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＣＡＡ３００５３．１（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＬＡＣＰ）のポリペプチド、Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  （ＪＧＩ）  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ  （ＰＩＤ）  ｎｕｍｂｅｒ  ＰＩＤ  １３６６２０  （Ｓ１）（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）のポリペプチド、Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  （ＪＧＩ）  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ  （ＰＩＤ）  ｎｕｍｂｅｒ  ＰＩＤ  １１５６０４  （ＪＧＩ）  （Ｓ２）（Ｐｏｓｔｉａ  ｐｌａｃｅｎｔａ）のポリペプチド、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＸＰ＿００１２６８５４１．１（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ）のポリペプチド、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＸＰ＿００１３８７２３１（ＬＡＣ２，  Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）のポリペプチドを含む。Ｐ．  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍおよびＰ．  ｐｌａｃｅｎｔａのゲノムは、それぞれｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉｐｓｆ．ｏｒｇ／Ｐｈｃｈｒ１／Ｐｈｃｈｒ１．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌおよびｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉｐｓｆ．ｏｒｇ／Ｐｏｓｐｌ１／Ｐｏｓｐｌ１．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌよりアクセス可能である。
【０１３３】
特定の態様では、開示の宿主細胞のセロデキストリントランスポーターは、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＣＡＺ８１９６２．１（Ｔｕｂｅｒ  ｍｅｌａｎｏｓｐｏｒｕｍ）、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＡＢＮ６５６４８．２（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＥＤＲ０７９６２（Ｌａｃｃａｒｉａ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＢＡＥ５８３４１．１（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＤＡＡ０６７８９．１（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＸＴ１）、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＣＡＡ３００５３．１（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＬＡＣＰ）、Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  （ＪＧＩ）  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ  （ＰＩＤ）  ｎｕｍｂｅｒ  ＰＩＤ  １３６６２０  （Ｓ１）（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  （ＪＧＩ）  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ  （ＰＩＤ）  ｎｕｍｂｅｒ  ＰＩＤ  １１５６０４  （ＪＧＩ）  （Ｓ２）（Ｐｏｓｔｉａ  ｐｌａｃｅｎｔａ）、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＸＰ＿００１２６８５４１．１（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ），またはＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＸＰ＿００１３８７２３１（ＬＡＣ２，  Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）に対応するポリペプチドに対して少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸残基配列同一性を有する。
【０１３４】
（セロデキストリントランスポーターモチーフ）
一態様では、セロデキストリントランスポーターは、Ｍａｊｏｒ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  （ＭＦＳ）糖トランスポーターの一員である。トランスポーターのＭＦＳ（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＃  ２．Ａ．１）のメンバーは、大抵の場合では、細胞内Ｎ末端およびＣ末端を有する１２個の膜貫通α‐ヘリックスから構成される（Ｓ．  Ｓ．  Ｐａｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ６２，  １  （Ｍａｒ，  １９９８））。ＭＦＳトランスポーターの一次配列は大きく異なる一方で、全ＭＦＳトランスポーターは共通のＥ．  ｃｏｌｉラクトースパーミアーゼ（ＬａｃＹ）の三次構造（Ｊ．  Ａｂｒａｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１，  ６１０  （Ａｕｇ  １，  ２００３））およびＥ．  ｃｏｌｉ  Ｐｉ  ／グリセロール‐３‐リン酸塩（ＧｌｐＴ）（Ｙ．  Ｈｕａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１，  ６１６  （Ａｕｇ  １，  ２００３））を有すると考えられている。これらの例では、６個のＮ末端およびＣ末端ヘリックスは、ヘリックス６および７の間に配置される長い細胞質ループによって接続される２つの異なるドメインを形成する。この対称性は、ＭＦＳを発生させたと考えられる重複イベントに対応している。基質は、上記Ｎ末端ドメインのヘリックス１、２、４、および５と上記Ｃ末端ドメインのヘリックス７、８、１０、および１１とから形成される親水性の空洞部の内部で結合している。上記空洞部は、ヘリックス３、６、９、および１２によって安定化されている。
【０１３５】
ＭＦＳ（トランスポーター分類＃２．Ａ．１．１）の糖トランスポーターファミリーは、膜貫通ヘリックス６および１２（ＰＥＳＰＲ（配列番号９）／ＰＥＴＫ（配列番号１０）とループ２および８（ＧＲＲ／ＧＲＫ）とに存在するモチーフにより定義されている（Ｍ．  Ｃ．  Ｍａｉｄｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２５，  ６４１  （Ｆｅｂ  １２−１８，  １９８７））。上記糖トランスポーターファミリーの全隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）は、ｐｆａｍ．ｊａｎｅｌｉａ．ｏｒｇ／ｆａｍｉｌｙ／ＰＦ０００８３＃ｔａｂｖｉｅｗ＝ｔａｂ３上で確認することができる。ＰＲＯＳＩＴＥ（（Ｎ．  Ｈｕｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４，  Ｄ２２７  （Ｊａｎ  １，  ２００６））では、上記糖トランスポーターファミリーに属する各トランスポーターを同定するために２つのモチーフを使用している。上記２つのモチーフのうち第１のモチーフは、［ＬＩＶＭＳＴＡＧ］−［ＬＩＶＭＦＳＡＧ］−｛ＳＨ｝−｛ＲＤＥ｝−［ＬＩＶＭＳＡ］−［ＤＥ］−｛ＴＤ｝−［ＬＩＶＭＦＹＷＡ］−Ｇ−Ｒ−［ＲＫ］−ｘ（４，６）−［ＧＳＴＡ］（配列番号１１）であり、第２のモチーフは、［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−Ｇ−［ＬＩＶＭＦＡ］−｛Ｖ｝−ｘ−Ｇ−｛ＫＰ｝−ｘ（７）−［ＬＩＦＹ］−ｘ（２）−［ＥＱ］−ｘ（６）−［ＲＫ］（配列番号１２）である。ＰＲＯＳＩＴＥモチーフの読み方の例として、モチーフ［ＡＣ］−ｘ−Ｖ−ｘ（４）−｛ＥＤ｝は、［ＡｌａまたはＣｙｓ］−任意−Ｖａｌ−任意−任意−任意−任意−｛任意、但し、Ｇｌｕ、Ａｓｐ以外｝（配列番号１３）として翻訳される。
【０１３６】
推定セロデキストリントランスポーターのオルソログおよび確認済みのセロデキストリントランスポーターの間に配置されるＴ−ＣＯＦＦＥＥ内で生成される多配列の配列アライメントにより、保存モチーフが同定される。上記保存モチーフは、ＰＲＯＳＩＴＥ表記法を用いて定義されてきた。膜貫通ヘリックス１は、モチーフ［ＬＩＶＭ］−Ｙ−［ＦＬ］−ｘ（１３）−［ＹＦ］−Ｄ（配列番号１）を含む。膜貫通ヘリックス２は、モチーフ［ＹＦ］−ｘ（２）−Ｇ−ｘ（５）−［ＰＶＦ］−ｘ（６）−［ＤＱ］（配列番号２）を含む。膜貫通ヘリックス２および３を連結するループは、モチーフＧ−Ｒ−［ＲＫ］（配列番号３）を含む。膜貫通ヘリックス５は、モチーフＲ−ｘ（６）−［ＹＦ］−Ｎ（配列番号４）を含む。膜貫通ヘリックス６は、モチーフＷＲ−［ＩＶＬＡ］−Ｐ−ｘ（３）−Ｑ（配列番号５）を含む。膜貫通ヘリックス６および７の間に配置される配列は、モチーフＰ−Ｅ−Ｓ−Ｐ−Ｒ−ｘ−Ｌ−ｘ（８）−Ａ−ｘ（３）−Ｌ−ｘ（２）−Ｙ−Ｈ（配列番号６）を含む。膜貫通ヘリックス７は、モチーフＦ−［ＧＳＴ］−Ｑ−ｘ−Ｓ−Ｇ−Ｎ−ｘ−［ＬＩＶ］（配列番号７）を含む。膜貫通ヘリックス１０および１１およびこれらの間に配置される配列は、モチーフＬ−ｘ（３）−［ＹＩＶ］−ｘ（２）−Ｅ−ｘ−Ｌ−ｘ（４）−Ｒ−［ＧＡ］−Ｋ−Ｇ（配列番号８）を含む。
【０１３７】
したがって、本願に開示の特定の態様は、本願に開示の保存モチーフの１つ以上を含む組み換えセロデキストリントランスポーター、またはその機能性断片に関する。特定の実施形態では、組み換えセロデキストリントランスポーターまたはその機能性断片は、膜貫通α‐ヘリックス１、α‐ヘリックス２、α‐ヘリックス３、α‐ヘリックス４、α‐ヘリックス５、α‐ヘリックス６、α‐リックス７、α‐ヘリックス８、α‐ヘリックス９、α‐ヘリックス１０、α‐ヘリックス１１、α‐ヘリックス１２を含むポリペプチドを含み、前記膜貫通α‐ヘリックス１は配列番号１の配列を含む。他の実施形態では、組み換えセロデキストリントランスポーターは、膜貫通α‐ヘリックス１、α‐ヘリックス２、α‐ヘリックス３、α‐ヘリックス４、α‐ヘリックス５、α‐ヘリックス６、α‐ヘリックス７、α‐ヘリックス８、α‐ヘリックス９、α‐ヘリックス１０、α‐ヘリックス１１、α‐ヘリックス１２を含むポリペプチドを含み、前記膜貫通α‐ヘリックス２は配列番号２の配列を含む。さらに他の実施形態では、組み換えセロデキストリントランスポーターは、膜貫通α‐ヘリックス１、α‐ヘリックス２、α‐ヘリックス３、α‐ヘリックス４、α‐ヘリックス５、α‐ヘリックス６、α‐ヘリックス７、α‐ヘリックス８、α‐ヘリックス９、α‐ヘリックス１０、α‐ヘリックス１１、α‐ヘリックス１２を含むポリペプチドを含み、前記膜貫通α‐ヘリックス２およびα‐ヘリックス３を連結するループは配列番号３の配列を含む。さらに他の実施形態では、組み換えセロデキストリントランスポーターは、膜貫通α‐ヘリックス１、α‐ヘリックス２、α‐ヘリックス３、α‐ヘリックス４、α‐ヘリックス５、α‐ヘリックス６、α‐ヘリックス７、α‐ヘリックス８、α‐ヘリックス９、α‐ヘリックス１０、α‐ヘリックス１１、α‐ヘリックス１２を含むポリペプチドを含み、前記膜貫通α‐ヘリックス５は配列番号４の配列を含む。他の実施形態では、組み換えセロデキストリントランスポーターは、膜貫通α‐ヘリックス１、α‐ヘリックス２、α‐ヘリックス３、α‐ヘリックス４、α‐ヘリックス５、α‐ヘリックス６、α‐ヘリックス７、α‐ヘリックス８、α‐ヘリックス９、α‐ヘリックス１０、α‐ヘリックス１１、α‐ヘリックス１２を含むポリペプチドを含み、前記膜貫通ヘリックスα‐６は配列番号５の配列を含む。さらに他の実施形態では、膜貫通α‐ヘリックス１、α‐ヘリックス２、α‐ヘリックス３、α‐ヘリックス４、α‐ヘリックス５、α‐ヘリックス６、α‐ヘリックス７、α‐ヘリックス８、α‐ヘリックス９、α‐ヘリックス１０、α‐ヘリックス１１、α‐ヘリックス１２を含むポリペプチドを含み、前記膜貫通α‐ヘリックス６および７の間の配列は配列番号６の配列を含む。さらに他の実施形態では、組み換えセロデキストリントランスポーターは、膜貫通α‐ヘリックス１、α‐ヘリックス２、α‐ヘリックス３、α‐ヘリックス４、α‐ヘリックス５、α‐ヘリックス６、α‐ヘリックス７、α‐ヘリックス８、α‐ヘリックス９、α‐ヘリックス１０、α‐ヘリックス１１、α‐ヘリックス１２を含むポリペプチドを含み、前記膜貫通α‐ヘリックス７は配列番号７の配列を含む。他の実施形態では、組み��えセロデキストリントランスポーターは、膜貫通α‐ヘリックス１、α‐ヘリックス２、α‐ヘリックス３、α‐ヘリックス４、α‐ヘリックス５、α‐ヘリックス６、α‐ヘリックス７、α‐ヘリックス８、α‐ヘリックス９、α‐ヘリックス１０、α‐ヘリックス１１、α‐ヘリックス１２を含むポリペプチドを含み、前記膜貫通α‐ヘリックス１０およびα‐ヘリックス１１およびこれらの間の配列は、配列番号８の配列を含む。
【０１３８】
さらに、上述の各実施形態は、任意の数で互いに組み合わされてよい。上述の実施形態の何れかに係る組み換えセロデキストリントランスポーターは、配列番号１〜８の何れか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つを含むポリペプチドを含んでもよい。または、上記ポリペプチドは、配列番号１〜８の全てを含むものであってもよい。例えば、組み換えセロデキストリントランスポーターは、膜貫通α‐ヘリックス１、α‐ヘリックス２、α‐ヘリックス３、α‐ヘリックス４、α‐ヘリックス５、α‐ヘリックス６、α‐ヘリックス７、α‐ヘリックス８、α‐ヘリックス９、α‐ヘリックス１０、α‐ヘリックス１１、α‐ヘリックス１２を含むポリペプチドを含んでよく、前記膜貫通α‐ヘリックス１は配列番号１を含んでよく、前記膜貫通α‐ヘリックス２およびα‐ヘリックス３を結び付けるループは配列番号３を含んでよく、前記膜貫通α‐ヘリックス７は配列番号７を含んでよい。または、他の例では、組み換えセロデキストリントランスポーターは、膜貫通α‐ヘリックス１、α‐ヘリックス２、αヘリックス３、αヘリックス４、α‐ヘリックス５、α‐ヘリックス６、α‐ヘリックス７、α‐ヘリックス８、α‐ヘリックス９、αヘリックス１０、α‐ヘリックス１１、α‐ヘリックス１２を含むポリペプチドを含んでよく、前記膜貫通α‐ヘリックス２は配列番号２を含み、前記膜貫通α‐ヘリックス３は配列番号３を含み、前記膜貫通α‐ヘリックス６は配列番号５を含み、前記膜貫通α‐ヘリックス１０、α‐ヘリックス１１、およびこれらの間の配列は配列番号８を含む。
【０１３９】
（変異セロデキストリントランスポーター）
本願に開示の他の態様は、本願に開示のセロデキストリントランスポーターの機能および／または活性を向上させるために使用する変異セロデキストリントランスポーターに関する。変異セロデキストリントランスポーターは、本願開示のセロデキストリントランスポーターをコードするポリヌクレオチドを突然変異させて作製してもよい。幾つかの実施形態では、本願に開示の変異セロデキストリントランスポーターは、少なくとも１つの突然変異を含んでよく、前記少なくとも１つの突然変異は、機能および／または活性を向上させたセロデキストリントランスポーターの作製させる点突然変異、ミスセンス突然変異、置換突然変異、フレームシフト突然変異、挿入突然変異、重複突然変異、増幅突然変異、転座突然変異、または逆位突然変異を含むが、これに限定されない。
【０１４０】
対象のセロデキストリントランスポーター内に少なくとも１つの突然変異を発生させる方法は当該技術分野に周知であり、ランダム突然変異導入分析法、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ突然変異導入法、挿入的突然変異導入法、化学的突然変異誘発法、および放射法を含むが、これに限定されない。
【０１４１】
幾つかの実施形態では、変異セロデキストリントランスポーターは、１つ以上のアミノ酸置換を含む。例えば、本願開示のセロデキストリントランスポーターは、Ｃｄｔ‐1（配列番号３３）のアミノ酸配列の位置に対応する１つ以上の位置においてアミノ酸置換を含む。好適な１つ以上の位置は、配列番号３３のアミノ酸９１に対応する位置、配列番号３３のアミノ酸１０４に対応する位置、配列番号３３のアミノ酸１７０に対応する位置、配列番号３３のアミノ酸１７４に対応する位置、配列番号３３のアミノ酸１９４に対応する位置、配列番号３３のアミノ酸２１３に対応する位置、および配列番号３３のアミノ酸３３５に対応する位置、およびこれらの組み合わせを含むが、これに限定されない。
【０１４２】
非限定的な一例では、上記１つ以上の位置において発生するアミノ酸置換は、配列番号３３のアミノ酸９１に対応する位置のグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換、配列番号３３のアミノ酸１０４に対応する位置のグルタミン（Ｑ）のアラニン（Ａ）による置換、配列番号３３のアミノ酸１７０に対応する位置のフェニルアラニン（Ｆ）のアラニン（Ａ）による置換、配列番号３３のアミノ酸１７４に対応する位置のアルギニン（Ｒ）のアラニン（Ａ）による置換、配列番号３３のアミノ酸１９４に対応する位置のグルタミン酸塩（Ｅ）のアラニン（Ａ）による置換、配列番号３３のアミノ酸２１３に対応する位置のフェニルアラニン（Ｆ）のリジン（Ｌ）による置換、または配列番号３３のアミノ酸３３５に対応する位置のフェニルアラニン（Ｆ）のアラニン（Ａ）による置換、またはこれらの組み合わせである。特定の好ましい実施形態では、上記１つ以上の位置で発生するアミノ酸置換は、配列番号３３のアミノ酸９１に対応する位置のグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）による置換、および／または配列番号３３のアミノ酸２１３に対応する位置のフェニルアラニン（Ｆ）のリジン（Ｌ）による置換である。
【０１４３】
幾つかの実施形態では、変異セロデキストリントランスポーターの向上させた機能および／または活性の結果、変異セロデキストリントランスポーターを含まない細胞と比較してセロデキストリンの消費速度がより高速の宿主細胞が得られる。例えば、変異セロデキストリントランスポーターを含む宿主細胞のセロデキストリンの消費速度は、対応する野生型のセロデキストリントランスポーターを含む宿主細胞のセロデキストリンの摂取速度と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、少なくとも１７５％、少なくとも２００％、少なくとも２２５％、少なくとも２５０％、少なくとも２７５％、少なくとも３００％、または少なくともこれより高いパーセンテージ分だけ速い。
【０１４４】
（β‐グルコシダーゼ）
特定の実施形態では、宿主細胞は、β‐グルコシダーゼの少なくとも触媒ドメインを含むポリペプチドがヌクレオチドにコードされている組み換えヌクレオチドをさらに含む。本明細書中で使用される場合、β‐グルコシダーゼは、末端に配置される非還元性のβ‐Ｄ‐グルコース残基の加水分解反応をβ‐Ｄ‐グルコースの放出を伴って触媒するβ‐Ｄ‐グルコシドグルコヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．  ３．２．１．２１）を指す。β‐グルコシダーゼの触媒ドメインは、例えば、Ｖｅｎｔｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂ．  ４２  （１）  ５５−６６，  ２００２に記載の基本的な手続きに従って決定されるようなβ‐グルコシダーゼ活性を有する。β‐グルコシダーゼの触媒ドメインは、末端に配置されるβ‐Ｄ‐グルコシダーゼの非還元性の残基の加水分解反応を、グルコースの放出を伴って触媒する任意のドメインである。幾つかの態様では、上記β‐Ｄ‐グルコシダーゼは、グリコシルヒドロラーゼファミリー１に属する。グリコシルヒドロラーゼファミリー１に属するものは、モチーフ［ＬＩＶＭＦＳＴＣ］  −  ［ＬＩＶＦＹＳ］  −  ［ＬＩＶ］  −  ［ＬＩＶＭＳＴ］  −  Ｅ  −  Ｎ  −  Ｇ  −  ［ＬＩＶＭＦＡＲ］  −  ［ＣＳＡＧＮ］（配列番号１４）により同定することが可能である。ここで、「Ｅ」は触媒グルタミン酸塩を示す（ウェブページｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｓｉｔｅ−ｓｅａｒｃｈ−ａｃ？ＰＤＯＣ００４９５）。幾つかの態様では、β‐グルコシダーゼの触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞に対して異種のポリヌクレオチドである。幾つかの態様では、β‐グルコシダーゼの触媒ドメインは、上記宿主細胞の細胞に内在されている。幾つかの態様では、上記β‐グルコシダーゼはＮ．ｃｒａｓｓａに由来する。幾つかの態様では、上記β‐グルコシダーゼはＮＣＵ００１３０（ＧＨ１‐１）である。特定の実施形態では、上記β‐グルコシダーゼはＮＣＵ００１３０のオルソログであってもよい。ＮＣＵ００１３０のオルソログの例は、Ｔ．  ｍｅｌａｎｏｓｐｏｒｕｍ、ＣＡＺ８２９８５．１；Ａ．  ｏｒｙｚａｅ、ＢＡＥ５７６７１．１；Ｐ．  ｐｌａｃｅｎｔａ、ＥＥＤ８１３５９．１；Ｐ．  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、ＢＡＥ８７００９．１；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、ＣＡＧ９９６９６．１；Ｌａｃｃａｒｉａ  ｂｉｃｏｌｏｒ、ＥＤＲ０９３３０；Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、ＥＥＱ３７９９７．１；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ、Ｄ６４０８８；およびＰｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、ＡＢＮ６７１３０．１を含むが、これに限定されない。また、他のβ‐グルコシダーゼを使用することも可能であり、これらは、グリコシルヒドロラーゼファミリー３に属するβ‐グルコシダーゼを含む。こうしたβ‐グルコシダーゼは、ＰＲＯＳＩＴＥ：［ＬＩＶＭ］（２）  −  ［ＫＲ］  −  ｘ  −  ［ＥＱＫＲＤ］  −  ｘ（４）  −  Ｇ  −  ［ＬＩＶＭＦＴＣ］  −  ［ＬＩＶＴ］  −  ［ＬＩＶＭＦ］  −  ［ＳＴ］  −  Ｄ  −  ｘ（２）  −  ［ＳＧＡＤＮＩＴ］（配列番号：１５）のモチーフによって同定することが可能である。なお、上記化学式中の「Ｄ」は触媒アスパラギン酸塩��示す。通常は、ＮＣＢＩ配列ＣＯＧ２７２３中に存在するβ‐グルコシダーゼ／６‐ホスホ‐β‐グルコシダーゼ／β‐グルコシダーゼの保存ドメインを含む任意のβ‐グルコシダーゼを使用してもよい。宿主細胞に含まれるセロデキストリントランスポーターに応じて、特定のβ‐グルコシダーゼの触媒ドメインが好適であり得る。
【０１４５】
（開示の宿主細胞の作製方法および培養方法）
開示の宿主細胞の作製方法および培養方法は、開示の組み換えポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞の内部へ導入または転移することを備える。発現ベクターを宿主細胞の内部へ移動させるこのような方法は当業者に周知である。例えば、発現ベクターを用いてＥ．  ｃｏｌｉの形質転換を行う１つの方法は、塩化カルシウム処理を含み、前記発現ベクターの導入はカルシウムの沈殿物を介して行われる。同様の手順に従って他の塩類（例えば、リン酸カルシウム）を使用してもよい。さらに、電気穿孔法（すなわち、電流を印加して、核酸配列への細胞の透過性を増大させる手法）を用いて宿主細胞の内部に核酸を導入してもよい。また、核酸配列の微量注入法により、宿主細胞の内部に核酸を導入することが可能になる。脂質複合体、リポソーム、およびデンドリマーなどの他の手段を採用してもよい。当業者であれば、上述の方法または他の方法を用いて宿主細胞の内部に所望の配列を導入することが可能である。
【０１４６】
上記ベクターは自己複製ベクター（すなわち、染色体外の実体として存在するベクターであって、染色体複製と無関係に複製するベクター（例えば、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、または人工染色体））であってもよい。上記ベクターは、自己認識が確実に行われるようにする任意の手段を含んでもよい。または、上記ベクターは、宿主に導入された場合にゲノムに取り込まれ、上記ベクターを内部に取り込んだ染色体と一緒に複製されるようなベクターであってもよい。さらに、単一のベクターまたはプラスミド、宿主のゲノムに取り込まれる総ＤＮＡを一緒に含んでいる２つ以上のベクターまたはプラスミド、またはトランスポゾンを使用してもよい。
【０１４７】
上記ベクターは、好ましくは、形質転換宿主を簡単に選択することを可能にする１つ以上の選択可能なマーカーを含む。選択可能なマーカーは遺伝子であり、その遺伝子産物によって、例えば、バイオサイド耐性またはウイルス耐性、重金属類に対する耐性、および栄養要求株への原栄養などが提供される。細菌性細胞の選択は、ａｍｐ遺伝子、ｇｐｔ遺伝子、ｎｅｏ遺伝子、およびｈｙｇ遺伝子などの遺伝子によって与えられる抗菌薬耐性に基づいて行われる。
【０１４８】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主の好適なマーカーは、例えば、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３である。糸状菌宿主用の選択可能なマーカーは、ａｍｄＳ（ａｃｅｔａｍｉｄａｓｅ）、ａｒｇＢ（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｃａｒｂａｍｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｂａｒ（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｈｐｈ（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｎｉａＤ（ｎｉｔｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ｐｙｒＧ（ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、ｓＣ（ｓｕｌｆａｔｅ  ａｄｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、およびｔｒｐＣ（ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、並びにこれらの同等物を含むが、これに限定されない。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属への使用に好ましいマーカーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのａｍｄＳ遺伝子およびｐｙｒＧ遺伝子、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ属のｂａｒ遺伝子である。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属への使用に好ましいマーカーは、ｂａｒおよびａｍｄＳである。
【０１４９】
上記ベクターは、好ましくは、上記ベクターが宿主のゲノムに取り込まれることを可能にするか、または宿主のゲノムと無関係に上記ベクターが細胞内で自己複製することを可能にする要素を含む。
【０１５０】
宿主ゲノム内への取り込みに関して、ベクターは、ベクターの遺伝子配列または他の要素に依存して相同的組換えまたは非相同的組換えによりゲノム内へ取り込まれる。または、上記ベクターは、相同的組み換えによる宿主ゲノム内への取り込みを導くためのさらなるヌクレオチド配列を含んでよい。上記さらなるヌクレオチド配列により、上記ベクターが染色体内の正確な位置で上記宿主ゲノムに取り込まれることが可能になる。的確な位置での取り込みの可能性を増大するために、取り込み要素は、好ましくは、対応する標的配列と高度に相同しているために相同的組み換えの確率を高める十分な数（１００個〜１０，０００個の塩基対、好ましくは４００個〜１０，０００個の塩基対、最も好ましくは８００個〜１０，０００個の塩基対）の核酸を含むべきである。上記取り込み要素は、上記宿主ゲノム内の標的配列と相同の任意の配列でよい。さらには、上記取り込み要素は、何らかをコードしているヌクレオチド配列、または何もコードしていないヌクレオチド配列であってもよい。他方では、上記ベクターは、非相同的組み換えにより上記宿主ゲノム内へ取り込まれてよい。
【０１５１】
自己複製を行うために、ベクターは、導入された宿主細胞内で自己複製することを可能にする複製起点をさらに含んでもよい。上記複製起点は、細胞内で機能する自己複製を仲介する任意のプラスミド複製子である。本願では、用語「複製起点」または「プラスミド複製子」は、ｉｎ ｖｉｖｏでのプラスミドまたはベクターの複製を可能にする配列として定義される。酵母宿主用の複製起点の例は、２ミクロンの複製起点、ＡＲＳ1、ＡＲＳ4、ＡＲＳ１およびＣＥＮ３の組み合わせ、および、ＡＲＳ４およびＣＥＮ６の組み合わせである。糸状菌宿主内で有益な複製起点の例は、ＡＭＡ１およびＡＮＳ１（ＷＯ００／２４８８３）である。ＡＭＡ１遺伝子の単離、およびＡＭＡ１遺伝子を含むプラスミドまたはベクターの構築は、ＷＯ００/２４８８３に開示の方法にしたがって行うことが可能である。
【０１５２】
他の宿主に関しては、形質転換の手順が従来の刊行物に記載されており、例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓに関してはＪ．Ｄ．Ｒｅａｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｇ．２００７，ｐ．５０８８−５０９６に記載されており、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓに関してはＯ．Ｄｅｌｇａｄｏ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １３２，１９９５，２３−２６に記載されており、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓに関してはＵＳ７，５０１，２７５に記載されており、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍに関しては国際出願番号第ＷＯ２００８／０４０３８７号に記載されている。
【０１５３】
宿主細胞内に遺伝子のコピーを１つ以上挿入して、遺伝子産物の生産を向上させてもよい。遺伝子のコピー数の増加は、少なくとも１つの追加の遺伝子コピーを宿主ゲノムに取り込ませるか、またはヌクレオチド配列を有する増幅および選択可能な標識遺伝子を含めることで達成できる。こうした標識遺伝子を含めた細胞は、選択可能なマーカー遺伝子の増幅コピーを含み、したがって遺伝子の追加コピーを含むことになるので、適切な選択可能剤の存在下で細胞培養を行うことにより選び出すことが可能である。
【０１５４】
上述の要素をライゲートして本発明の組み換え発現ベクターを構築するために用いる手順は、当業者に周知である（例えば、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照）。
【０１５５】
宿主細胞は、少なくとも１つの発現ベクターを使用して形質転換される。１つの発現ベクターのみを使用する（中間体を添加しない）場合、発現ベクターは必要な全核酸配列を含むことになる。
【０１５６】
発現ベクターを使用して宿主細胞を形質転換させた後、前記宿主細胞は増殖させられる。培地内での宿主細胞の増殖は、発酵過程を含むことがある。開示の方法は、宿主細胞内の組み換え核酸が発現されるように宿主細胞の培養を行う工程を備えていてもよい。微生物宿主に関しては、発酵過程は、好適な培地内で細胞を培養することを伴う。幾つかの態様では、細胞は、適当な培地を用いて３０℃で増殖される。本願開示の増殖培地は、例えば、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  （ＳＤ）培地、または酵母媒体（ＹＭ）培地などの通常の市販の培地を含むが、これに限定されない。他の合成培地または合成増殖培地を使用してもよく、特定の宿主細胞の増殖にとって適当な培地は、細菌学分野または発酵化学分野の当業者に明らかになるであろう。培養にとって適切な温度範囲および他の条件は上記分野において公知である。
【０１５７】
開示の幾つかの態様によれば、培養培地は宿主細胞の炭素源を含む。このような「炭素源」は、通常、原核細胞または単純な真核細胞の増殖の炭素源として使用するのに好適な基質または化合物を指す。炭素源は多様な形態を採ることが可能であり、そのような多様な形態は、重合体、炭水化物、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチドなどを含むが、これに限定されない。これらは、例えば、グルコースなどの多様な単糖類、オリゴ糖類、多糖類、セルロースまたはヘミセルロースなどのバイオマス重合体、キシロース、アラビノース、スクロースなどの二糖類、飽和または不飽和脂肪酸、コハク酸エステル塩、乳酸塩、酢酸塩、またはエタノールなど、またはこれらの組み合わせを含む。上記炭素源は、さらに、光合成の結果得られる生成物であることが可能であり、グルコースを含むが、これに限定されない。
【０１５８】
幾つかの実施形態では、上記炭素源は、セルロースまたはヘミセルロースなどのバイオマス重合体である。本願に記載の「バイオマス重合体」は、生物材料内に含まれる任意の重合体である。上記生体材料は、生存している生体材料または死滅した生体材料であってもよい。バイオマス重合体は、例えば、セルロース、キシラン、キシロース、ヘミセルロース、リグニン、マンナン、およびバイオマス中に一般的に存在する他の材料を含む。バイオマス重合体源の非限定な例は、草（例えば、スイッチグラス、ススキ属植物）、もみ殻、バガス（ｂａｇａｓｓｅ）、綿、ジュート（ｊｕｔｅ）、麻、亜麻、竹、サイザル麻、アバカ（ａｂａｃａ）、藁、葉、刈り取られた草、トウモロコシ茎葉、トウモロコシの穂軸、醸造用穀物、マメ科植物、ソルガム（ｓｏｒｇｈｕｍ）、サトウキビ、甜菜パルプ、木材チップ、おがくず、およびバイオマス作物（例えば、ハマナ（Ｃｒａｍｂｅ））を含む。
【０１５９】
適当な炭素源に加えて、培地は、培養物の増殖、および多様な糖類の発酵並びに炭化水素および炭化水素の誘導体の作製に必要な酵素経路の促進に好適な当業者に公知の好適なミネラル、塩、共同因子、緩衝、および他の要素をさらに含む必要がある。反応は、好気状態または嫌気状態の下で行ってよい。なお、微生物の条件に基づけば、好気状態、酸素欠乏状態、または嫌気状態が好ましい。宿主細胞が増殖および／または増加するにつれて、多様な糖類またはバイオマス重合体上の増殖、糖発酵、または、炭化水素または炭化水素誘導体の合成に必要な酵素、トランスポーター、または他のタンパク質の発現が影響を受ける。
【０１６０】
（β‐Ｄ‐グルコース含有混合物の発酵方法）
一実施形態では、β‐Ｄ‐グルコース含有混合物の発酵方法が提供される。一態様では、β‐Ｄ‐グルコースは、セルロースまたはセロデキストリンを化学的または酵素的に加水分解してβ‐Ｄ‐グルコースを作製することで得られる。
【０１６１】
一態様では、β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を発酵させる方法は、β‐Ｄ‐グルコース含有混合物にグルコースムタロターゼ活性を有する本願開示の１つ以上の組み換えポリペプチドを接触させる第１の工程を備える。特定の態様では、Ｄ‐グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドは、ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、ＹＮＲ０７１Ｃ、またはＮＣＵ０９７０５ポリペプチドに対して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を有する。上記方法は、上記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物をＤ‐グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドと接触させた後、または上記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物をＤ‐グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドと接触させると共に、上記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物に宿主細胞を接触させる第２の工程を備える。一態様では、宿主細胞はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。上記宿主細胞は、発酵を支持する条件下で上記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を用いて培養され、上記宿主細胞は、グルコースムタロターゼ活性を有する組み換えポリペプチドと接触させなかったβ‐Ｄ‐グルコース含有混合物と接触させた細胞と比較して、β‐Ｄ‐グルコース含有混合物のβ‐Ｄ‐グルコース細胞をより多く消費する。当業者に理解されるように、上記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物をグルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドと接触させることにより、上記混合物に含まれるβ‐Ｄ‐グルコースがα‐Ｄ‐グルコースに変換されて、上記混合物のβ‐Ｄ‐グルコース含有量が減少する。
【０１６２】
他の態様では、β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を発酵させる方法は、β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を宿主細胞と接触させる第一の工程を含み、前記宿主細胞は、本願開示のグルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドを含む。一態様では、上記宿主細胞はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。特定の態様では、上記組み換えポリヌクレオチドは、ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、ＹＮＲ０７１Ｃ、またはＮＣＵ０９７０５ポリペプチドに対して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードする。上記方法は、発酵を促す条件下で、上記組み換えポリヌクレオチドを発現するように、上記細胞を上記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物で培養する第二の工程を含み、上記宿主細胞は、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする上記組み換えポリヌクレオチドを含まない細胞によって消費されるよりも多くのβ‐Ｄ‐グルコースを上記β‐Ｄ‐グルコース含有混合物から消費する。好ましくは、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする上記組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞と、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする上記組み換えポリヌクレオチドを含まない宿主細胞とは、その他の点では遺伝的背景が同じである。
【０１６３】
（セロデキストリン含有混合物の発酵方法）
一実施形態では、本願開示は、セロデキストリン含有混合物の発酵方法を提供する。一態様では、セロデキストリンは、セルロースを化学的加水分解または酵素加水分解することで得られる。一態様では、セロデキストリンはセロビオースである。
【０１６４】
一態様では、セロデキストリン含有混合物を発酵する方法は、宿主細胞を提供する第一の工程を含み、前記宿主細胞は、本願開示のグルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドを含む。一態様では、宿主細胞はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。特定の態様では、組み換えポリヌクレオチドは、ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、ＹＮＲ０７１Ｃ、またはＮＣＵ０９７０５ポリペプチドに対して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードする。上記方法は、発酵を促す条件下で、上記組み換えポリヌクレオチドを発現するように、上記細胞をセロデキストリン含有混合物とともに培養する第二の工程を含む。
【０１６５】
他の態様では、セロデキストリン含有混合物を発酵させる方法は、宿主細胞を提供する第一の工程を含み、前記宿主細胞は、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドおよび１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組み換えポリヌクレオチドを含む。一態様では、上記宿主細胞はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。特定の態様では、組み換えポリヌクレオチドは、ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、ＹＮＲ０７１Ｃ、またはＮＣＵ０９７０５ポリペプチドに対して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を有する、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。特定の態様では、組み換えポリヌクレオチドは、ＮＣＵ００８０１またはＮＣＵ０８１１４ポリペプチドに対して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を有するセロデキストリントランスポーターをコードする。一態様では、上記宿主細胞はさらに、β‐グルコシダーゼの少なくとも触媒ドメインを含むポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドを含む。そのような組み換えポリヌクレオチドは、セロデキストリンを利用する内在的能力を持たない宿主細胞にとって有用である。一態様では、β‐グルコシダーゼの触媒ドメインは細胞内ドメインである。一態様では、β‐グルコシダーゼはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａに由来する。一態様では、β‐グルコシダーゼはＮＣＵ００１３０にコードされる。
【０１６６】
上記方法は、発酵を促す条件下で、上記組み換えポリヌクレオチドを発現させるように、上記細胞をセロデキストリン含有混合物とともに培養する第二の工程を含む。
【０１６７】
（セロデキストリン含有混合物の発酵中にセロデキストリンの消費を増加させる方法）
本願開示はさらに、セロデキストリン含有混合物の発酵中にセロデキストリンの消費を増加させる方法を提供する。一態様では、セロデキストリンは、セルロースを化学的加水分解または酵素加水分解することで得られる。一態様では、セロデキストリンは、セロビオースである。
【０１６８】
一態様では、セロデキストリン含有混合物の発酵中にセロデキストリンの消費を増加させる方法は、宿主細胞を提供する第一の工程を含み、前記宿主細胞は、本願開示のグルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドと、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組み換えポリヌクレオチドとを含む。一態様では、上記宿主細胞はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。特定の態様では、組み換えポリヌクレオチドは、ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、ＹＮＲ０７１Ｃ、またはＮＣＵ０９７０５ポリペプチドに対して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸同一性を有する、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。特定の態様では、組み換えポリヌクレオチドは、ＮＣＵ００８０１またはＮＣＵ０８１１４ポリペプチドに対して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸同一性を有するセロデキストリントランスポーターをコードする。一態様では、上記宿主細胞はさらに、β‐グルコシダーゼの少なくとも触媒ドメインを含むポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドを含む。そのような組み換えポリヌクレオチドは、セロデキストリンを利用する内在的能力を持たない宿主細胞にとって有用である。一態様では、β‐グルコシダーゼの触媒ドメインは細胞内ドメインである。一態様では、β‐グルコシダーゼはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａに由来する。一態様では、β‐グルコシダーゼはＮＣＵ００１３０にコードされる。
【０１６９】
上記方法は、発酵を促す条件下で、上記組み換えポリヌクレオチドを発現させるように、上記細胞をセロデキストリン含有混合物とともに培養する第二の工程を含み、前記第二の工程では、上記宿主細胞が、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする上記組み換えポリヌクレオチドを含まない細胞によって消費されるよりも多くのセロデキストリンをセロデキストリン含有混合物から消費する。好ましくは、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする上記組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞と、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする上記組み換えポリヌクレオチドを含まない宿主細胞とは、その他の点では同一の遺伝的背景を有する。
【０１７０】
宿主細胞によるセロデキストリンの消費は、当業者に公知の任意の方法で測定してもよい。一般的に、細胞によるセロデキストリンの消費は、前記細胞が増殖している培地中のセロデキストリンの濃度を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測ることで測定される。好ましくは、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする上記組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞と、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする上記組み換えポリヌクレオチドを含まない宿主細胞とは、その他の点では同一の遺伝的背景を有する。セロデキストリンを含む培地は、セルロースなどのバイオマス重合体に酵素的処理を施すことで得られる。
【０１７１】
（セロデキストリン含有混合物の発酵中に化学物質の生産を増加させる方法）
本願開示はさらに、セロデキストリン含有混合物の発酵中に化学物質の生産を増加させる方法を提供する。一態様では、セロデキストリンは、セルロースを化学的加水分解または酵素加水分解することで得られる。一態様では、セロデキストリンは、セロビオースである。
【０１７２】
一態様では、セロデキストリン含有混合物の発酵中に化学物質の生産を増加させる方法は、宿主細胞を提供する第一の工程を含み、前記宿主細胞は、本願開示のグルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドと、１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組み換えポリヌクレオチドとを含む。一態様では、上記宿主細胞はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。特定の態様では、組み換えポリヌクレオチドは、ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、ＹＮＲ０７１Ｃ、またはＮＣＵ０９７０５ポリペプチドに対して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％のアミノ酸同一性を有する、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。特定の態様では、組み換えポリヌクレオチドは、ＮＣＵ００８０１またはＮＣＵ０８１１４ポリペプチドに対して少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸同一性を有するセロデキストリントランスポーターをコードする。一態様では、上記宿主細胞はさらに、β‐グルコシダーゼの少なくとも触媒ドメインを含むポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドを含む。そのような組み換えポリヌクレオチドは、セロデキストリンを利用する内在的能力を持たない宿主細胞にとって有用である。一態様では、β‐グルコシダーゼの触媒ドメインは細胞内ドメインである。一態様では、β‐グルコシダーゼはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａに由来する。一態様では、β‐グルコシダーゼはＮＣＵ００１３０にコードされる。
【０１７３】
上記方法は、発酵を促す条件下で、上記組み換えポリヌクレオチドを発現させるように、上記細胞をセロデキストリン含有混合物とともに培養する第二の工程を含み、前記第二の工程では、上記宿主細胞が、セロデキストリン含有混合物の発酵中に、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする上記組み換えポリヌクレオチドを含まない細胞によって生成されるよりも多くの化学物質を生成する。好ましくは、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする上記組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞と、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする上記組み換えポリヌクレオチドを含まない宿主細胞とは、その他の点では同一の遺伝的背景を有する。
【０１７４】
一態様では、セロデキストリン含有混合物の発酵中に生成される化学物質は、糖類の発酵中に微生物宿主によって生成されるものであれば如何なる生成物をも含む。一態様では、セロデキストリン含有混合物の発酵中に生成される化学物質はアルコールである。一態様では、セロデキストリン含有混合物の発酵中に生成される化学物質は、エタノール、プロパノール、またはブタノールである。
【０１７５】
宿主細胞による化学物質の生成は、当業者に公知の任意の方法によって測定してもよい。一般的には、細胞によるアルコールなどの化学物質の生成は、前記細胞が増殖している培地中の前記化学物質の濃度を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測ることで測定される。
【０１７６】
（セロデキストリン含有混合物の発酵中に細胞増殖率を高める方法）
本願開示はさらに、セロデキストリン含有混合物の発酵中に細胞増殖率を高める方法を提供する。一態様では、セロデキストリンは、セルロースを化学的にまたは酵素を利用して加水分解することで得られる。一態様では、セロデキストリンはセロビオースである。
【０１７７】
一態様では、セロデキストリン含有混合物の発酵中に細胞増殖率を高める方法は、宿主細胞を提供する第一の工程を含み、前記宿主細胞は、本願開示のグルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドと、1つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組み換えポリヌクレオチドとを含む。一態様では、上記宿主細胞はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。特定の態様では、組み換えポリヌクレオチドは、ＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、ＹＮＲ０７１Ｃ、またはＮＣＵ０９７０５ポリペプチドに対するアミノ酸同一性が少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。特定の態様では、組み換えポリヌクレオチドは、ＮＣＵ００８０１またはＮＣＵ０８１１４ポリペプチドに対して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸同一性を有するセロデキストリントランスポーターをコードする。一態様では、上記宿主細胞はさらに、β‐グルコシダーゼの少なくとも触媒ドメインを含むポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドを含む。そのような組み換えポリヌクレオチドは、セロデキストリンを利用する内在能力を持たない宿主細胞にとって有用である。一態様では、β‐グルコシダーゼの触媒ドメインは細胞内ドメインである。一態様では、β‐グルコシダーゼはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａに由来する。一態様では、β‐グルコシダーゼはＮＣＵ００１３０にコードされる。
【０１７８】
上記方法は、発酵を促す条件下で、上記組み換えポリヌクレオチドを発現させるように、上記細胞を上記セロデキストリン含有混合物とともに培養する第二の工程を含み、前記第二の工程では、上記宿主細胞が、セロデキストリン含有混合物の発酵中に、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする上記組み換えポリヌクレオチドを含まない細胞の増殖率よりも高い増殖率を示す。好ましくは、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする上記組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞と、グルコースムタロターゼ活性を有するポリペプチドをコードする上記組み換えポリヌクレオチドを含まない宿主細胞とは、その他の点では同一の遺伝的背景を有する。
【０１７９】
宿主細胞の増殖率は、当業者に公知の任意の方法で測定してもよい。一般的には、細胞の増殖率は、懸濁液における細胞濃度を吸光度法で測ることで測定される。
【０１８０】
（連結バイオ処理の方法）
本願では、連結バイオ処理によってセルロース含有物質を発酵生成物に転換する方法がさらに提供される。連結バイオ処理は、酵素生成、バイオマス加水分解、およびバイオ燃料生成を１つのステージにまとめたものである。一態様では、連結バイオ処理によってセルロース含有物質を発酵生成物に変換する方法は、Ａ）セルロース含有物質を、1つ以上のセルラーゼ、1つ以上のセロデキストリントランスポーター、1つ以上のβ‐グルコシダーゼ、および本願開示のグルコースムタロターゼ活性を有する1つ以上のポリペプチドをコードする組み換え核酸を含む細胞と接触させる工程と、Ｂ）セルロース分解および発酵を促す条件下、前記セルロース含有物質を、前記組み換え核酸を発現している細胞とともにインキュベートし、発酵生成物を生成する工程とを含む。
【０１８１】
セルロース含有物質の分解で得られる糖類から生成される発酵生成物は、エタノール、ｎ‐プロパノール、ｎ‐ブタノール、イソ‐ブタノール、３‐メチル‐１‐ブタノール、２‐メチル‐１‐ブタノール、３‐メチル‐１‐ペンタノール、およびオクタノールを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１８２】
（セロデキストリンおよびβ‐Ｄ‐グルコースを生成する方法）
一態様では、本願開示のセロデキストリンおよびβ‐Ｄ‐グルコースはセルロースから生成される。セルロースは、β（１‐４）が連結したＤ‐グルコース分子の長鎖からなる。セルロースをより小さな分子に加水分解すると、およそ２個から６個のβ‐Ｄ‐グルコース分子が連結した分子（「セロデキストリン」）が生成されるか、またはβ‐Ｄ‐グルコース分子が個々に生成される。一態様では、セルロースの加水分解によって生成されるセロデキストリンはセロビオースである。
【０１８３】
一態様では、セルロースは植物バイオマスから得られる。一態様では、セルロースは藻類から得られる。一態様では、セルロースは菌類から得られる。他の態様では、セルロースは細菌性バイオフィルムから得られる。
【０１８４】
一態様では、セルロースはリグノセルロースから得られる。リグノセルロースの主要な構成要素は、セルロース、ヘミセルロース、およびリグニンである。リグノセルロースからセルロースを作製する方法は当業者に公知であり、物理的および化学的な工程を含む。一態様では、セルロースは、リグノセルロースから酸加水分解によって得られる。一態様では、セルロースは、リグノセルロースから蒸気爆発によって得られる。一態様では、セルロースは、リグノセルロースからアンモニア繊維拡張（ＡＦＥＸ）によって得られる。
【０１８５】
セルロースを、酵素によってあるいは化学的に加水分解してセロデキストリンおよびβ‐Ｄ‐グルコース分子にしてもよい。
【０１８６】
セルロースを酸で処理することで化学的に加水分解して、セロデキストリンおよびβ‐Ｄ‐グルコース分子にしてもよい。一態様では、セルロースは大気圧下且つ室温下で酸で処理される。一態様では、セルロースは大気圧を超える気圧下且つ４０℃を超える温度下で酸で処理される。
【０１８７】
セルロースをセルラーゼで処理することで酵素的に加水分解して、セロデキストリンおよびβ‐Ｄ‐グルコース分子にしてもよい。セルラーゼは、例えば、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、ベータ-グルコシダーゼを含んでよい。一態様では、セルラーゼは組み換えセルラーゼである。一態様では、セルラーゼは耐熱性のセルラーゼである。一態様では、セルラーゼは、タンパク質のＣ末端に炭水化物結合ドメイン（ＣＢＤ）を有する。
【０１８８】
幾つかの態様では、セルラーゼは、セルラーゼを天然に発現する生物から直接単離してもよい。幾つかの態様では、セルラーゼは、セルラーゼを天然に発現する生物に由来のセルラーゼ遺伝子を発現ベクター内に入れて宿主細胞内で使用することで、遺伝子を組み換えて生成してもよい。セルラーゼを発現する生物の種類は、例えば、菌類とバクテリアを含む。
【０１８９】
セルラーゼを発現する菌類は、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｃｕｌｅａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｎｉａ  （Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｍｉｃｕｌｏｓｕｍ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１９０】
セルラーゼを発現するバクテリアは、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈａｍｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｕｓｕｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ、Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｃｕｒｖａｔａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍｅ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１９１】
本願開示をその具体的な実施形態とともに記載してきたが、上記記載はあくまでも例示目的であり、発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。本願開示の範囲内において他にどのような態様、利点、変形があるかは、本願開示の属する技術分野の当業者には明らかであろう。
【０１９２】
（実施例）
下記の実施例はあくまでも例示であり、本願開示の如何なる態様を如何なるかたちでも限定するものではない。
【０１９３】
（実施例１：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ４５２‐ＢＴ株のセロビオース発酵におけるアルドース  １‐エピメラーゼ（ＡＥＰ）をコードする遺伝子の過剰発現）
ＡＥＰの過剰発現がセロビオースの消費に与える影響を調べるため、ＡＥＰをコードする様々な遺伝子をクローニングし、セロデキストリントランスポーター（ｃｄｔ‐１）と細胞内β‐グルコシダーゼ（ｇｈ１‐１）とを発現する改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて過剰発現させた。ＡＥＰをコードする５つの遺伝子を異なる微生物からクローニングして、多コピープラスミド（ｐＲＳ４２３）へ、強力なプロモータ（ＰＧＫプロモータかＴＥＦプロモータ）の制御下に導入した（表１）。
＜表１  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．由来の様々なＡＥＰ遺伝子＞
【０１９４】
【表３】
2014504877.tif 000005
各コンストラクトを、セロビオースを利用する改変されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであるＤ４５２‐ＢＴ株に導入した。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ４５２‐ＢＴ株では、セロデキストリントランスポーター（ｃｄｔ‐１）およびβ‐グルコシダーゼ（ｇｈ１‐１）をそれぞれ多コピープラスミドｐＲＳ４２６およびｐＲＳ４２５を用いて過剰発現させた。
【０１９５】
セロビオースの利用率をエタノールの生成率と比較するために、最小培地でセロビオースを用いて前培養した後、これらの形質転換体を２５０ｍＬのフラスコ中の５０ｍＬのＹＰセロビオース（８０ｇ／Ｌ）培地に、初期の吸光度を約１．０として接種した。発酵実験を１００ｒｐｍ、３０℃で行った。ＵＶ可視分光光度計（Ｂｉｏｍａｔｅ  ５，Ｔｈｅｒｍｏ，ＮＹ）を用いて６００ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定して、細胞増殖を観察した。セロビオース、グルコース、グリセロール、酢酸塩およびエタノールの濃度を、屈折率検出器を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １２００  Ｓｅｒｉｅｓ）で測定した。Ｒｅｚｅｘ  ＲＯＡ‐有機酸  Ｈ＋  （８％）カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を用い、当該カラムを、０．００５ＮのＨ２ＳＯ４を移動相として、流速０．６ｍｌ／分、５０℃で溶出させた。
【０１９６】
（セロビオースの利用における様々なアルドース  １‐エピメラーゼの比較）
新しく構築した６つの株および親株を用いた発酵実験から、ＧＡＬ１０（ＹＢＲ０１９Ｃ）の過剰発現と、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＹＨＲ２１０ＣおよびＹＮＲ０７１Ｃにコードされる二つの推定アルドース  １‐エピメラーゼの過剰発現とは、より高いセロビオース消費率およびより高いエタノール生成率を示すことを見出した（図１）。Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ由来のＧＡＬ１０およびＥ．ｃｏｌｉ由来のｇａｌＭは、セロビオースの利用に何ら影響を及ぼさなかった（図１）。２２時間目の時点で、ＧＡＬ１０（ＹＢＲ０１９Ｃ）、ＹＨＲ２１０Ｃ、およびＹＮＲ０７１Ｃによる形質転換体によって消費されたセロビオースの量（６５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ）は、空のプラスミド（ｐＲＳ４２３）を含むコントロール用の株のセロビオース消費量（４８ｇ／Ｌ）と比べて非常に多かった（表２）。その結果、エタノール生成量も、ＧＡＬ１０（ＹＢＲ０１９Ｃ）、ＹＨＲ２１０Ｃ、およびＹＮＲ０７１Ｃの過剰発現によって、それぞれ１４ｇ／Ｌから２２、２０、１８ｇ／Ｌへと増えた。アルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子の過剰発現によるセロビオース消費率とエタノール生成率の上昇は、エタノールの生産性の大幅な上昇につながった（０．６２ｇ／Ｌ‐ｈｒから１．００ｇ／Ｌ‐ｈｒ、０．９２ｇ／Ｌ‐ｈｒ、０．８３ｇ／Ｌ‐ｈｒ）。
＜表２  発酵開始から２２時間経過した時点でのＡＥＰ過剰発現株によるセロビオース消費およびエタノール生成の比較＞
【０１９７】
【表４】
2014504877.tif 000006
（ＧＡＬ１０（ＹＢＲ０１９Ｃ）過剰発現がセロビオース発酵にもたらす影響）
ＧＡＬ１０（ＹＢＲ０１９Ｃ）過剰発現がセロビオース発酵にもたらす影響を確かめるため、ＧＡＬ１０（ＹＢＲ０１９Ｃ）過剰発現株（Ｄ４５２‐ＢＴ‐４２３ＧＡＬ１０）および親株（Ｄ４５２ＢＴ）の発酵実験を個別に繰り返した。発酵は、ＹＰ‐セロビオース（８０ｇ／Ｌ）培地で酸素を制限した状況下において３０℃で行った。予想通り、Ｄ４５２‐ＢＴ‐４２３ＧＡＬ１０は、より高い細胞増殖、セロビオース消費率、エタノール生成率を示した。３０時間経過した時点では、Ｄ４５２‐ＢＴ‐４２３ＧＡＬ１０は、コントロール用の株と比較して、より増殖し（ＯＤ１９対ＯＤ１６）、より多くのセロビオースを消費し（８０ｇ／Ｌ対７０ｇ／Ｌ）、より多くのエタノールを生成した（３７ｇ／Ｌ対２５ｇ／Ｌ）（図３）。その結果、エタノールの生産性は、ＧＡＬ１０（ＹＢＲ０１９Ｃ）の過剰発現により５０％増加した（１．２３ｇ／Ｌ‐ｈ対０．８３ｇ／Ｌ‐ｈ）。
【０１９８】
（実施例２：セロビオーを発酵するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬ０１株におけるアルドース  １‐エピメラーゼ（ＡＥＰ）をコードする遺伝子の過剰発現）
２つのＡＥＰ遺伝子を多コピープラスミドｐＲＳ４２４内でもクローニングし、多コピープラスミドｐＲＳ４２５内にセロデキストリントランスポーター（ｃｄｔ‐１）およびβ‐グルコシダーゼ（ｇｈｌ‐１）を含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬ０１株にて発現させた（表３）。各ＡＥＰ遺伝子は、ＨＸＴ７プロモータおよびＨＸＴ７ターミネータとともにクローニングした。空のプラスミドｐＲＳ４２４をネガティブコントロールとして、ＳＬ０１株を形質転換した。
＜表３  ＳＬ０１株で過剰発現させたＡＥＰ遺伝子の源＞
【０１９９】
【表５】
2014504877.tif 000007
酵母株を合成ドロップアウト培地で培養してプラスミドを維持した（アミノ酸および硫酸アンモニウムを含まない０．１７％Ｄｉｆｃｏ酵母窒素原礎培地、０．５％硫酸アンモニウム、０．０５％アミノ酸ドロップアウト混合物）。２％Ｄ‐グルコースを加えたＹＰＡ培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン、０．０１％アデニンヘミサルフェート）を用いて酵母株を増殖させた。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株を、バッフル無しの振盪フラスコ内で３０℃、１００ｒｐｍで増殖させ、発酵させた。酵母株ごとに、単一のコロニーを最初は２０ｇ／Ｌのグルコースを加えたＳＣ‐Ｕｒａ‐Ｌｅｕ培地２ｍＬ中で増殖させ、次いで２５０ｍＬの振盪フラスコ中の同一のＳＣ‐Ｕｒａ‐Ｌｅｕ培地５０ｍＬ中に接種し、混合糖発酵の研究に十分な細胞を得た。一日増殖させたあと、細胞を遠沈させ、セロビオース８０ｇ／Ｌを添加したＹＰＡ培地５０ｍＬ中に接種した。糖類およびエタノールの濃度は、Ｂｉｏ‐ｒａｄ  ＨＰＸ‐８７Ｈカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）および島津製作所ＲＩＤ−１０ａ屈折率検出器を備えた島津製作所ＨＰＬＣを用い、製造者の定めた手順に従って測定した。ＨＰＸ‐８７Ｈカラムは、島津製作所ＣＴＯ−２０ＡＣカラムオーブンを用いて６５℃に保った。０．５ｍＭ硫酸溶液を、０．６ｍＬ／分の定常流速の移動相として用いた。濾過した試料１０μＬを、島津製作所ＳＩＬ‐２０ＡＣ  ＨＴ自動試料採取器を設置したＨＰＬＣシステム内に注入し、注入後２５分で各作業を停止した。糖類およびエタノールの濃度は、一連の外部基準を用いて作成した基準カーブを用いて測定した。各データポイントは、複製試料の平均値を表した。
【０２００】
図４に示すように、過剰発現したＡＥＰ遺伝子は、バイオマス成長、セロビオース消費率、およびエタノール生産が僅かに上昇している一方で、グルコース蓄積が低下したことを示した。セロビオース消費率は、ｓｃＡＥＰ過剰発現株およびｎｃＡＥＰ過剰発現株でそれぞれ９％および８％上昇した。エタノール生産率は、ｓｃＡＥＰ過剰発現株およびｎｃＡＥＰ過剰発現株でそれぞれ８％および２５％上昇した。グルコース蓄積率は、ｓｃＡＥＰ過剰発現株およびｎｃＡＥＰ過剰発現株の何れにおいても低下した。４８時間経過した時点では、ｓｃＡＥＰ過剰発現株はコントロール株と比較して３２％少ないグルコース蓄積を示したのに対し、ｎｃＡＥＰ過剰発現株はコントロール株と比較して９．５％少ないグルコース蓄積を示した（５．８ｇ／Ｌ、７．８ｇ／Ｌ、８．６ｇ／Ｌ）。
【０２０１】
（実施例３：１つまたは２つのＡＥＰ遺伝子をノックアウトしたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるアルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子の機能をさらに調べるため、遺伝子ノックアウト手法を用いた。バイオインフォマティクス研究に基づき、ＹＨＲ２１０ｃ、ＹＮＲ０７１ｃ、およびＹＢＲ０１９ｃの３つの推定アルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて同定した。異なるノックアウトの組み合わせを調べるため、△ＹＨＲ２１０ｃ、△ＹＮＲ０７１ｃ、および△ＧＡＬ１０（ＹＢＲ０１９ｃ）を含む３つの単一ＡＥＰノックアウト株と、△（ＹＨＲ２１０ｃ＋ＹＮＲ０７１ｃおよび△（ＹＨＲ２１０ｃ＋ＧＡＬ１０を含む２つの二重ＡＥＰノックアウト株とを構築した。上記ＡＥＰノックアウト株はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＬ０１株において構築し、全てのノックアウト株は、セロデキストリントランスポーター（ｃｄｔ‐１）およびβ‐グルコシダーゼ（ｇｈｌ‐１）をコードするプラスミドｐＲＳ４２５‐（ｇｈｌ‐１）‐ｃｄｔ１を含む。
【０２０２】
セロビオースの利用において、上記２つの二重ノックアウト株は発酵能が明らかに低下した（表４および図５）。４８時間経過した時点では、バイオマス生産は、ＯＤ３３からＯＤ１９．７（△（ＹＨＲ２１０ｃ＋ＹＮＲ０７１ｃ））またはＯＤ１７．５（△（ＹＨＲ２１０ｃ＋ＧＡＬ１０）へと大幅に低下した。セロビオース消費率は、△（ＹＨＲ２１０ｃ＋ＹＮＲ０７１ｃ）株において１．６５ｇ／Ｌ／ｈから１．４８ｇ／Ｌ／ｈへと１０％低下し、△（ＹＨＲ２１０ｃ＋ＧＡＬ１０）株において１．６５ｇ／Ｌ／ｈから１．３５ｇ／Ｌ／ｈへと１８％低下した。エタノール生産率は、△（ＹＨＲ２１０ｃ＋ＹＮＲ０７１ｃ）株において０．４８３ｇ／Ｌ／ｈから０．３１８ｇ／Ｌ／ｈへと３４％低下し、△（ＹＨＲ２１０ｃ＋ＧＡＬ１０）株において０．４８３ｇ／Ｌ／ｈから０．２３４ｇ／Ｌ／ｈへと５２％低下した。
【０２０３】
上記３つの単一ノックアウト株も、発酵能にいくつかの欠点を示した（図６）。４８時間経過した時点では、バイオマス生成は、ＯＤ３３からＯＤ１７（△ＹＨＲ２１０ｃ）、ＯＤ３３からＯＤ１９（△ＧＡＬ１０）、またはＯＤ３３からＯＤ１８（△ＹＮＲ０７１ｃ）へと大幅に下落した。セロビオース消費率は、１．６５ｇ／Ｌ／ｈから１．４８ｇ／Ｌ／ｈ（△ＹＨＲ２１０ｃ）、１．６５ｇ／Ｌ／ｈから１．４３ｇ／Ｌ／ｈ（△ＧＡＬ１０）、または１．６５ｇ／Ｌ／ｈから１．４６ｇ／Ｌ／ｈ（△ＹＮＲ０７１ｃ）へと下落した。エタノール生産率は、０．４８３ｇ／Ｌ／ｈから０．３６０ｇ／Ｌ／ｈ（△ＹＨＲ２１０ｃ）または０．１８５ｇ／Ｌ／ｈ（△ＧＡＬ１０）へと下落した。△ＹＮＲ０７１ｃ株では、すべてのエタノールが炭素源として消費された。
＜表４  ＡＥＰノックアウト株における発酵の比較＞
【０２０４】
【表６】
2014504877.tif 000008
上記ＡＥＰノックアウト株では、特にセロビオース消費において、２４時間の遅延時間が存在した。この期間には、上記二重ノックアウト株の何れによってもほとんどセロビオースは消費されなかった。これは、生体内では、アルドース  １‐エピメラーゼの発現レベルが低いためにグルコース生産が抑制され、その結果、セロビオース消費およびバイオマス生産が低下したことを意味している。アルドース  １‐エピメラーゼの欠乏による影響は、培養プロセス全体に渡って続き、その結果、培養終了時においてバイオマス生産量、エタノール生産量、およびセロビオース消費量が低下した。二重ノックアウト株△（ＹＨＲ２１０ｃ＋ＹＮＲ０７１ｃ）において唯一機能するアルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子はＧＡＬ１０であり、二重ノックアウト株△（ＹＨＲ２１０ｃ＋ＧＡＬ１０）において唯一機能するアルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子はＹＮＲ０７１ｃである。そして、△（ＹＨＲ２１０ｃ＋ＧＡＬ１０）は△（ＹＨＲ２１０ｃ＋ＹＮＲ０７１ｃ）よりも増殖率およびセロビオース消費率が低いため、ＹＮＲ０７１ｃの発現レベルおよび触媒能はＧＡＬ１０のものよりも低いと結論付けることができる。
【０２０５】
（実施例４：ｃｄｔ‐１遺伝子およびｇｈ１‐１遺伝子を含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ４５２‐ＢＴ株におけるグルコース発酵率とセロビオース発酵率の比較）
セロビオーストランスポーター（ｃｄｔ‐１）および細胞内β‐グルコシダーゼ（ｇｈ１‐１）の両方をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅへ導入することで、炭素源としてセロビオースの発酵を行うことが可能になった（上述のＨａ  ｅｔ  ａｌ．２０１１；上述のＬｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。導入したセロビオースは細胞内で２つのグルコースの分子に加水分解できるので、改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによるセロビオース発酵率は、セロビオース輸送が律速的でない限り、グルコース発酵率と同様であると考えることができる。しかしながら、ｃｄｔ‐１およびｇｈ１‐１を含む改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによるセロビオース発酵率は、グルコース発酵率より極めて低かった。改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ４５２‐ＢＴ株は４３時間内に８０ｇ／Ｌのセロビオースを消費して３２．７ｇ／Ｌのエタノールを生産し、その結果、エタノールの収率は０．４１ｇ／ｇであり、セロビオースの消費率は１．９ｇ／Ｌ‐ｈであった（図７）。しかしながら、改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ４５２‐ＢＴ株は１３時間内に８０ｇ／Ｌのグルコースを消費して３４．７ｇ／Ｌのエタノールを生産し、その結果、エタノールの収率は０．４４ｇ／ｇであり、グルコースの消費率は６．１ｇ／Ｌ‐ｈであった。最終的なエタノール濃度とエタノール収率は、糖類の種類（モノグルコースかジグルコースか）に関わらず類似していたが、セロビオースの消費率はグルコースの消費率より３倍低かった。この結果は、効率的なセロビオース発酵を制限する未知の工程が存在する可能性を示唆している。
【０２０６】
（実施例５：異なる培地で増殖させたＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａのアルドース  １‐エピメラーゼ発現レベルの転写学的分析）
セロビオーストランスポーター（ｃｄｔ‐１）および細胞内β‐グルコシダーゼ（ｇｈ１‐１）はセルロース分解性の菌類であるＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａからクローニングされたため、改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによるセロビオース発酵を改善する遺伝子ターゲットを、Ｎ．ｃｒａｓｓａによるセルロースバイオマス利用中に得られる遺伝子発現データを検討することで発見することができる。セルロース基質および単糖の双方を用いたＮ．ｃｒａｓｓａに関する従来の転写プロファイリング研究によれば、Ｎ．ｃｒａｓｓａがスクロース含有培地上で増殖するときに比べ、Ｎ．ｃｒａｓｓａがススキ属植物加水分解物上で増殖するときの方が、アルドース  １‐エピメラーゼ（ＮＣＵ０８３９８、ＡＥＰ‐Ｎｃ）の発現レベルは高くなった（Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９）（図８）。この結果は、セロビオーストランスポーター（ｃｄｔ‐１）と細胞内β‐グルコシダーゼ（ｇｈ１‐１）を通した効率的な細胞内セロビオース利用には、ＡＥＰ‐Ｎｃの高い発現が必要であることを示唆した。そこで、ＡＥＰの発現が高ければ、改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによるセロビオースの発酵が改善されるという仮説を立てた。
【０２０７】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１０遺伝子は、ＡＥＰ活性およびＵＤＰガラクトース  ４‐エピメラーゼ活性を有する二機能性の酵素をコードする。三次元構造分析の結果、ＧＡＬ１０はガラクトース  ４‐エピメラーゼドメイン（Ｎ端末ドメイン）およびアルドース  １‐エピメラーゼドメイン（Ｃ端末ドメイン）の両方を有していることが明らかになった（Ｓｈａｒｍａ  ａｎｄ  Ｍａｌａｋａｒ  ２０１０）。ＡＥＰ‐Ｎｃとアライメントを行った場合では、ＧＡＬ１０は、ＡＥＰ‐Ｎｃのアミノ酸配列に対して２４．７％の配列同一性を示した（図９）。さらに、ＧＡＬ１０に対して高いアミノ酸同一性を有する２つの推定ＡＥＰ遺伝子（ＹＨＲ２１０ＣおよびＹＮＲ０７１Ｃ）（それぞれ５０．６％および５１．０％）を発見した。ＹＨＲ２１０ＣおよびＹＮＲ０７１Ｃのアミノ酸配列はまた、ＡＥＰ‐Ｎｃのアミノ酸配列に対してそれぞれ２４．２％および２６．６％の配列同一性を有する。
【０２０８】
（実施例６：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＢＹ４７４１株のＡＥＰ遺伝子の欠失）
セロビオース利用プロセスにおける推定ＡＥＰの機能をさらに調べるため、セロビオース利用経路が組み込まれたプラスミドを、ＹＨＲ２１０Ｃ、ＹＮＲ０７１Ｃ、またはＧＡＬ１０遺伝子を欠失させた３つのＢＹ４７４１ノックアウト株に導入した。得られた△ＹＨＲ、△ＹＮＲ、および△ＧＡＬとセロビオース利用経路を含むコントロール株とが増殖すると、△ＹＨＲおよび△ＹＮＲ株は野生株よりもすぐれたセロビオース消費を示した。興味深いことに、△ＧＡＬ株はセロビオースによって増殖が完全に止まった（図１０）。セロビオース消費率は、△ＹＨＲ株および△ＹＮＲ株ではそれぞれ、０．７８ｇ／Ｌ‐ｈから１．２６ｇ／Ｌ‐ｈおよび０．７８ｇ／Ｌ‐ｈから１．２５ｇ／Ｌ‐ｈへと上昇した。これは、野生株に比べてそれぞれ６０．３％および５９．９％の改善であった。グルコース蓄積に関しては、△ＹＨＲおよび△ＹＮＲ株は野生株よりも高いグルコース蓄積を示し、これは△ＹＨＲおよび△ＹＮＲ株によるセロビオース消費率と比例していた。したがって、グルコースの蓄積は、ＹＨＲ２１０ＣまたはＹＮＲ０７１Ｃ遺伝子の欠失に起因するというよりも、むしろセロビオース消費に起因する。△ＹＨＲ株および△ＹＮＲ株によるセロビオース消費率がより高いことを考慮すると、エタノール生産はセロビオース消費と関連していた。したがって、すべての株の中で、△ＹＨＲ株が最も高いエタノール生産性を示した。しかし、△ＧＡＬ株では、セロビオースはほとんど消費されなかった。発酵が終わった時点で、１２．０ｇ／Ｌのセロビオース消費しか観察されなかった。その結果、△ＧＡＬ株によるグルコース蓄積またはエタノール生産はまったく観察されなかった。
【０２０９】
ＡＥＰの機能をさらに探るため、ＡＥＰ欠失株のＡＥＰ酵素活性を測定した（図１１）。これらのＡＥＰ欠失株をセロビオースを唯一の炭素源として増殖させると、△ＹＨＲ株の特定ムタロターゼ活性はコントロール株のそれの４５．７％だったのに対し、△ＹＮＲ株の特定ムタロターゼ活性はコントロール株のそれの８９．５％だった。△ＧＡＬ株では、ＡＥＰ活性は認められなかった（図１１Ａ）。試験されたＡＥＰ活性は、グルコースを唯一の炭素源として用いた場合とは全く異なっていた。△ＹＨＲ株および△ＹＮＲ株の特定ムタロターゼ活性はほぼ同一のレベルにあり、これは△ＧＡＬ株およびコントロール株の活性の約３倍であった（図１１Ｂ）．
（実施例７：ＡＥＰ遺伝子の過剰発現を伴うＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株）
ＡＥＰ過剰発現の影響を測定するため、ＡＥＰ遺伝子（ＧＡＬ１０、ＹＨＲ２１０Ｃ、ＹＮＲ０７１Ｃ）の強い発現レベルを容易にする過剰発現カセットを、株としてのバックグランドが異なる２つの改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株に導入した。ＡＥＰの過剰発現のために、ＡＥＰをＴＥＦ１プロモータおよびＣＹＣ１ターミネータの制御下に置いたｐＲＳ４２３ベクターを用いた。セロビオース利用経路のために、遺伝子をＰＧＫプロモータおよびＣＹＣ１ターミネータの制御下に置くコンストラクトｐＲＳ４２６‐ｃｄｔ‐１およびｐＲＳ４２５‐ｇｈ１‐１を用いた（上掲のＧａｌａｚｋａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０；上掲のＨａ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＢＹ４７４１株を親株として用いた場合ではセロビオース発酵に改善は見られなかったが（データは不図示）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ４５２‐ＢＴ株を親株として用いた場合ではセロビオース消費率およびエタノール生産率の改善が見られた（図１２）。ＧＡＬ１０、ＹＨＲ２１０Ｃ、およびＹＮＲ０７１の過剰発現は全て、セロビオース発酵の改善につながったが、ＧＡＬ１０過剰発現株が、ＹＨＲ２１０ＣおよびＹＮＲ０７１過剰発現株に比べて最も高いセロビオース発酵率およびエタノール生産率を示した。さらに、セロデキストリン蓄積は、ＡＥＰ遺伝子の導入後、低下した。その結果、３６時間経過した時点では、ＧＡＬ１０過剰発現株は、コントロール株に比べて７２％高いセロビオース消費率および１１９％のエタノール生産率を示した。
【０２１０】
（実施例の検討）
セルロース系バイオ燃料生産には、セルロース系バイオマスにおいて最も豊富な糖類であるグルコースとキシロースを効率的に用いるのが望ましい。過去二十年間、効率的なグルコースおよびキシロースの利用のために改変ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを、遺伝工学および代謝工学を通して作製しようとする様々な試みがなされてきた（Ｔａｎｔｉｒｕｎｇｋｉｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．７５（２）：８３−８８，１９９３；ＫｏｔｔｅｒおよびＣｉｒｉａｃｙ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８（６）：７７６−７８３，１９９３；Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４（５）：１８５２−１８５９，１９９８；Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９（１）：４９５−５０３，２００３；Ｈａｈｎ−Ｈａｇｅｒｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０８：１４７−１７７，２００７）。しかしながら、グルコースおよびキシロースの連続的な利用には、キシロースからのエタノールの生産性およびエタノール収率の低さなどの幾つかの制約がある（上掲のＪｅｆｆｒｉｅｓおよびＪｉｎ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６３（５）：４９５−５０９，２００４；Ｈａｈｎ−Ｈａｇｅｒｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。これらの問題に対応するために、セロビオースおよびキシロースの共発酵のための新たな手法を作り出した。この手法により、エタノールの生産収率および生産性は急激に改善された（上掲のＨａ  ｅｔ  ａｌ．２０１１；上掲のＬｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。しかしながら、セロビオースおよびグルコースはエタノールの収率が類似しているにも関わらず、セロビオースの発酵率はグルコースのそれの３倍の遅さである。この結果は、効率的なセロビオースの利用を妨げる未知の工程が存在する可能性を示している。グルコース誘導は、細胞膜からの信号伝達メカニズムによって開始されることが知られている（Ｒｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．２（２）：１８３−２０１，２００２，；Ｓａｎｔａｎｇｅｌｏ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒ．７０（１）：２５３−２８２，２００６；Ｇａｎｃｅｄｏ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒ．６２（２）：３３４−３６１，１９９８）。しかしながら、セロビオース発酵の場合、グルコースはセロビオースから細胞内β‐グルコシダーゼによって細胞内で生産されるので、通常のグルコース信号伝達メカニズムでは効率的ではなく、セロビオースの利用は緩やかなものになった。
【０２１１】
Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａはセロビオースを利用することが知られており、Ｎ．ｃｒａｓｓａ由来のセロビオーストランスポーター（ＣＤＴ‐１）および細胞内β‐グルコシダーゼ（ＧＨ１‐１）がクローニングされて特徴付けられてきた（Ｇａｌａｚｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３０（６０００）：８４−８６，２０１０）。したがって、Ｎ．ｃｒａｓｓａ由来の転写分析データを調べ、改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによるセロビオース利用を制限する工程を探し出した。興味深いことに、ＡＥＰの発現レベルは、ススキ属植物加水分解物を含む最小培地におけるほうが、スクロース含有培地におけるよりも１６０倍高いことが判明した。この結果は、ＡＥＰの高い発現レベルが、Ｎ．ｃｒａｓｓａによるセロビオース利用を容易にしている可能性を示唆している。制御されたセロビオースの利用では、β型グルコースはβ‐グルコシダーゼによって生成されるが、糖類のアノマーの相互交換は、生体外では自発的に起きるにもかかわらず、β型糖からα型糖への相互転換は生体内では十分には高くない（Ｆｅｋｅｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５（２０）：７１４１−７１４６，２００８；Ｂｏｕｆｆａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４４（３）：２６９−２７８，１９９４）。酵母はα‐グルコースを好むことが知られているので、ＡＥＰの活性は効率的なセロビオース発酵に対して律速的であり得る。
【０２１２】
Ｎ．ｃｒａｓｓａ由来のＡＥＰ遺伝子（ＡＥＰ‐Ｎｃ）をＢＬＡＳＴ検索法のプローブ配列として用いて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＧＡＬ１０遺伝子を同定した。この遺伝子はＡＥＰ活性およびＵＤＰガラクトース４‐エピメラーゼ活性を有する二機能酵素をコードするものである。それに加えて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるさらに２つの推定ＡＥＰ遺伝子（ＹＨＲ２１０ＣおよびＹＮＲ０７１Ｃ）を同定した。ＧＡＬ１０、ＹＨＲ２１０Ｃ、およびＹＮＲ０７１Ｃは、ＡＥＰ‐Ｎｃに対するアミノ酸配列の同一性が、それぞれ２４．７％、２４．２％、および２６．６％である。ＹＨＲ２１０Ｃ遺伝子は、未知の機能を持つ推定タンパク質として注釈された。しかしながら、その配列のＧＡＬ１０に対する類似性が報告されている（Ｍａｊｕｍｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１（４）：７５３−７５９，２００４）。ＹＮＲ０７１Ｃ遺伝子は、その機能が不明である。ＹＨＲ２１０ＣおよびＹＮＲ０７１Ｃは、ＧＡＬ１０に対するアミノ酸配列の同一性が、それぞれ５０．６％および５１．０％である。
【０２１３】
ＡＥＰノックアウト株に関する我々の研究に基づき、ＧＡＬ１０エピメラーゼはセロビオース利用に支配的な役割を果たすと結論付けられた。ＢＹ４７４１株では、ＧＡＬ１０遺伝子をノックアウトすると、セロビオースによる増殖がほとんどなく、ＡＥＰ活性は全く観察されなかった。しかしながら、酵素アッセイの結果の示唆するところによれば、ＧＡＬ１０は支配的なＡＥＰであるが、その発現は他の２つのＡＥＰの発現によって抑制されている。高レベルのＡＥＰが要求されるセロビオース発酵条件では、ＧＡＬ１０は効率的に発現し、ＧＡＬ１０の欠失は限定的なＡＥＰ酵素活性および細胞の無増殖につながる。グルコース発酵条件下では、ＧＡＬ１０の発現はグルコースによって抑制されるので、△ＧＡＬ株およびコントロール株はほぼ同一の酵素活性を示す。欠失させたＹＨＲ２１０ＣおよびＹＮＲ０７１ＣはＧＡＬ１０の発現を抑制することはできず、このことが、△ＹＨＲ株および△ＹＮＲ株で高いＡＥＰ活性が見られることを説明する。この分析に基づいて、複合ＡＥＰ調節システムがＢＹ４７４１株に存在すると考えられる。グルコースの相互転換が必要な場合には、支配的なＧＡＬ１０の発現が活性化される。グルコースが充足している場合では、ＹＨＲ２１０ＣおよびＹＮＲ０７１Ｃなどの低活性ＡＥＰが発現し、ＧＡＬ１０の発現は抑制される。
【０２１４】
ＡＥＰ過剰発現のさらなる研究は、ＢＹ４７４１株の発酵能が悪いために制約があった。そのため、増殖がより速いＤ４５２‐ＢＴ株を用いた。ＡＥＰ遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ４５２‐ＢＴ株に導入することで、セロビオース発酵率は大幅に改善された。空のｐＲＳ４２３ベクターを有するコントロール株が３６時間の間に４７ｇ／Ｌのセロビオースしか消費しなかったのに対し、上記３つのＡＥＰ遺伝子のうち１つを過剰発現した株は、３６時間の間に７２〜８０ｇ／Ｌを消費した。コントロール株と、上記３つのＡＥＰ遺伝子のうち１つを過剰発現した株とのエタノール生産の違いは、さらに大きい。ＧＡＬ１０、ＹＨＲ２１０Ｃ、およびＹＮＲ０７１Ｃを過剰発現する株による３６時間のエタノール生産は、コントロール株のエタノール生産よりも、それぞれ１２３％、１１０％、および６９％多い。さらに、セロデキストリンの最大蓄積量は、ＡＥＰ遺伝子の過剰発現により、１３ｇ／Ｌから７〜１１ｇ／Ｌへと低下した。以上を合わせると、ＡＥＰ遺伝子をセロビオース発酵経路を含む改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ４５２‐ＢＴ株に導入することにより、細胞増殖率、セロビオース消費率、およびエタノール生産率が改善されたのみならず、セロデキストリン蓄積が低下した。
【０２１５】
（実施例の材料と方法）
上記実施例の材料と方法には、以下のものが含まれる。
【０２１６】
（株およびプラスミドコンストラクト）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ４５２‐ＢＴ株（ＭＡＴα、ｌｅｕ２、ｈｉｓ３、ｕｒａ３、ｃａｎ１）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＢＹ４７４１株（ＭＡＴａ、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｍｅｔ１５、ｕｒａ３）をセロビオース代謝の制御に用いた。３つのＡＥＰノックアウト株をＯｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）から購入した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５（Ｆ−  ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ｈｓｄＲ１７  ［ｒＫ−  ｍＫ＋］  ｓｕｐＥ４４  ｔｈｉ−１  ｇｙｒＡ  ｒｅｌＡ１）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を遺伝子クローニングおよび遺伝子操作に用いた。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ由来のβ‐グルコシダーゼ（ｇｈ１‐１）およびセロデキストリントランスポーター（ｃｄｔ‐１）の発現のため、ＰＧＫプロモータおよびＣＹＣ１ターミネータの間に２つの読み取り枠（ｃｄｔ‐１およびｇｈ１‐１）を配置し、それぞれｐＲＳ４２６‐ＣＤＴ‐１およびｐＲＳ４２５‐ＢＧＬを作製した（上掲のＧａｌａｚｋａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０；上掲のＨａ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。１つのＡＥＰ遺伝子（ＧＡＬ１０）および２つの推定ＡＥＰ遺伝子（ＹＨＲ２１０ＣおよびＹＮＲ０７１Ｃ）をＴＥＦ１プロモータおよびＣＹＣ１ターミネータの間に配置し、ｐＲＳ４２３‐ＡＥＰを作製した。
【０２１７】
ｐＲＳ４２５プラスミド（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて、ＡＥＰノックアウト株で用いたｇｈ１‐１およびｃｄｔ‐１を含むプラスミドを構築した。ＰＹＫ１プロモータおよびＡＤＨ１ターミネータをそれぞれセロビオーストランスポーターのＮ端末およびＣ端末に加える一方で、ＴＥＦ１プロモータおよびＰＧＫ１ターミネータをそれぞれβ‐グルコシダーゼのＮ端末およびＣ端末に加えた。
【０２１８】
（培地および培養条件）
Ｅ．ｃｏｌｉをルリア‐ベルターニ培地で増殖させた。必要に応じて、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを上記培地に添加した。酵母を、２０ｇ／Ｌのグルコースを添加したＹＰ培地（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、バクトペプトン２０ｇ／Ｌ）で３０℃で規定通りに培養した。アミノ酸栄養要求性マーカーを用いて形質転換体を選ぶために、酵母完全合成（ＹＳＣ）培地を用いた。この培地は、酵母窒素原礎培地６．７ｇ／Ｌに対して、グルコース２０ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、および適切なヌクレオチドとアミノ酸を供給するＣＳＭ‐Ｌｅｕ‐Ｔｒｐ‐Ｕｒａ（Ｂｉｏ  １０１，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）を含むものである。
【０２１９】
（発酵実験）
酵母細胞を、グルコース２０ｇ／Ｌを含むＹＳＣ培地で増殖させて、セロビオース発酵のための接種材料を調製した。指数増殖期中期の細胞を収穫し、滅菌水で二度洗浄してから接種した。フラスコ発酵実験はすべて、セロビオース８０ｇ／Ｌを含むＹＰ培地５０ｍＬを用いて、２５０ｍＬフラスコ中で、３０℃で、初期ＯＤ６００を１．０以下にし、酸素を制限した条件下で行った。
【０２２０】
（酵母の形質転換）
キシロースおよびセロビオース代謝経路を構築するための発現カセットの形質転換は、酵母ＥＺ形質転換キット（ＢＩＯ  １０１，Ｖｉｓｔａ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて行った。形質転換体はすべて、グルコース２０ｇ／Ｌを含むＹＳＣ寒天培地上で選択した。必要に応じてアミノ酸およびヌクレオチドを添加した。
【０２２１】
（ＡＥＰ酵素アッセイ）
セロビオース８０ｇ／Ｌを添加したＹＰ培地５ｍＬで充填した培養チューブで細胞培養を行った。細胞は３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間増殖させ、その後Ｙ−ＰＥＲ抽出試薬（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して製造者の指示に従い再懸濁した。その後、タンパク質濃度およびＡＥＰ活性を測定するために、上澄みを回収した。総タンパク質濃度を測定するために、ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を製造者の指示に従い使用した。Ｓｙｎｅｒｇｙ２マルチモードマイクロプレートリーダーを用いて、ＯＤ５８０における吸光度の変化を測定した。総タンパク質濃度は、製造者の指示に従って計算した。ＡＥＰ活性を測定するために、α‐グルコースおよびβ‐グルコースの間の転換が、β‐Ｄ‐グルコースデヒドロゲナーゼに触媒されたβ‐グルコースの酸化およびＮＡＤ＋の還元に結びつけられた。０．３４ｍＭのＮＡＤ＋、０．５Ｕのβ‐Ｄ‐グルコースデヒドロゲナーゼ、および５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌバッファを含むアッセイ混合物を調製した。上記混合物８２０μＬをＵＶキュベットにピペットで移し、その後ＡＥＰ含有溶液１３０μＬを添加した。新たに調製した１６６μＭのα‐グルコース５０μＬを添加して反応を開始させ、３４０ｎｍにおける吸光度の上昇を３分間記録した。
【０２２２】
（分析方法）
細胞の増殖は、ＵＶ可視分光光度計（Ｂｉｏｍａｔｅ  ５，Ｔｈｅｒｍｏ，ＮＹ）を用いて、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）によって観察した。グルコース、キシロース、キシリトール、グリセロール、酢酸塩、およびエタノールの濃度を、屈折率検出器を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １２００  Ｓｅｒｉｅｓ）によって、Ｒｅｚｅｘ  ＲＯＡ‐有機酸Ｈ＋（８％）カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を用いて測定した。上記カラムは、５０℃で流速０．６ｍｌ／ｍｉｎの０．００５ＮのＨ２ＳＯ４で溶出した。
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
【図１】図１は、５つの異なるアルドース  １‐エピメラーゼを過剰発現させた場合に発生する、改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの親株Ｄ４５２‐ＢＴのセロビオース利用への影響を示す。上記改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、図中の説明に示すように、多コピープラスミドｐＲＳ４２３内の組み換えセロデキストリントランスポーター、β‐グルコシダーゼ、およびアルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子を発現する。アルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子およびその生物源とは、ｇａｌＭ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＧＡＬ１０‐Ｓｃ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、系統名：ＹＢＲ０１９Ｃ）、ＧＡＬ１０‐Ｐｓ（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ＹＨＲ２１０Ｃ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、系統名：ＹＨＲ２１０Ｃ）、ＹＮＲ０７１Ｃ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、系統名：ＹＮＲ０７１Ｃ）である。コントロール用の生物は、組み換えセロデキストリントランスポーターおよびβ‐グルコシダーゼを発現し、空のｐＲＳ４２３プラスミドを含むものを用いた。セロビオースを含む培地は、異なるアルドース  １‐エピメラーゼを過剰発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発酵させた。各株について、セロビオース消費（左パネル；１リットル当たりのセロビオースのグラム量で測定）、細胞増殖（中パネル；６００ｎｍの吸光度で測定）、およびエタノール生産（右パネル；１リットル当たりのエタノールのグラム量で測定）を測定した。
【図２】図２は、図中の説明に示すように、多コピープラスミドｐＲＳ４２３内の組み換えセロデキストリントランスポーター、β‐グルコシダーゼ、およびアルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いた、セロビオースを含む培地の発酵反応中のエタノール収量、エタノール生産性、およびエタノール濃度の比較を示す。アルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子およびその生物源は、ＧＡＬ１０−Ｓｃ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、系統名：ＹＢＲ０１９Ｃ）、ＹＨＲ２１０Ｃ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、系統名：ＹＨＲ２１０Ｃ）、およびＹＮＲ０７１Ｃ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、系統名：ＹＮＲ０７１Ｃ）である。
【図３】図３は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃを過剰発現させた場合に発生する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いたセロビオースの発酵反応への影響を示す。セロビオースを含む培地は、組み換えセロデキストリントランスポーターおよびβ‐グルコシダーゼを発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、またはＧＡＬ１０／ＹＢＲ０１９Ｃ、組み換えセロデキストリントランスポーター、およびβ‐グルコシダーゼを過剰発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発酵させた。各株について、細胞増殖（左パネル；６００ｎｍの吸光度で測定）、セロビオース消費（中パネル；１リットル当たりのセロビオースのグラム量で測定）、エタノール生成量（右パネル；１リットル当たりのエタノールのグラム量で測定）を測定した。
【図４Ａ】図４は、２つの異なるアルドース  １‐エピメラーゼを過剰発現させた場合に発生する、改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの親株ＳＬ０１のセロビオース利用への影響を示す。改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、図中の説明に示すように、多コピープラスミドｐＲＳ４２４内の組み換えセロデキストリントランスポーター、β‐グルコシダーゼ、およびアルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子を発現する。アルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子およびその生物源は、ｓｃＡＥＰ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、系統名：ＹＨＲ２１０Ｃ）およびｎｃＡＥＰ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、系統名：ＮＣＵ０９７０５）である。コントロール用の生物は、組み換えセロデキストリントランスポーターおよびβ‐グルコシダーゼを発現し、空のｐＲＳ４２４プラスミドを含むものを使用した。セロビオースを含む培地は、異なるアルドース  １‐エピメラーゼを過剰発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発酵させた。各株について、細胞増殖（左上パネル；６００ｎｍの吸光度で測定）を測定した。
【図４Ｂ】図４は、２つの異なるアルドース  １‐エピメラーゼを過剰発現させた場合に発生する、改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの親株ＳＬ０１のセロビオース利用への影響を示す。改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、図中の説明に示すように、多コピープラスミドｐＲＳ４２４内の組み換えセロデキストリントランスポーター、β‐グルコシダーゼ、およびアルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子を発現する。アルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子およびその生物源は、ｓｃＡＥＰ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、系統名：ＹＨＲ２１０Ｃ）およびｎｃＡＥＰ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、系統名：ＮＣＵ０９７０５）である。コントロール用の生物は、組み換えセロデキストリントランスポーターおよびβ‐グルコシダーゼを発現し、空のｐＲＳ４２４プラスミドを含むものを使用した。セロビオースを含む培地は、異なるアルドース  １‐エピメラーゼを過剰発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発酵させた。各株について、グルコース濃度（左下パネル；１リットル当たりのグルコースのグラム量で測定）を測定した。
【図４Ｃ】図４は、２つの異なるアルドース  １‐エピメラーゼを過剰発現させた場合に発生する、改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの親株ＳＬ０１のセロビオース利用への影響を示す。改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、図中の説明に示すように、多コピープラスミドｐＲＳ４２４内の組み換えセロデキストリントランスポーター、β‐グルコシダーゼ、およびアルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子を発現する。アルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子およびその生物源は、ｓｃＡＥＰ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、系統名：ＹＨＲ２１０Ｃ）およびｎｃＡＥＰ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、系統名：ＮＣＵ０９７０５）である。コントロール用の生物は、組み換えセロデキストリントランスポーターおよびβ‐グルコシダーゼを発現し、空のｐＲＳ４２４プラスミドを含むものを使用した。セロビオースを含む培地は、異なるアルドース  １‐エピメラーゼを過剰発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発酵させた。各株について、セロビオース消費量（右上パネル；１リットル当たりのセロビオースのグラム量で測定）を測定した。
【図４Ｄ】図４は、２つの異なるアルドース  １‐エピメラーゼを過剰発現させた場合に発生する、改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの親株ＳＬ０１のセロビオース利用への影響を示す。改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、図中の説明に示すように、多コピープラスミドｐＲＳ４２４内の組み換えセロデキストリントランスポーター、β‐グルコシダーゼ、およびアルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子を発現する。アルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子およびその生物源は、ｓｃＡＥＰ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、系統名：ＹＨＲ２１０Ｃ）およびｎｃＡＥＰ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、系統名：ＮＣＵ０９７０５）である。コントロール用の生物は、組み換えセロデキストリントランスポーターおよびβ‐グルコシダーゼを発現し、空のｐＲＳ４２４プラスミドを含むものを使用した。セロビオースを含む培地は、異なるアルドース  １‐エピメラーゼを過剰発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発酵させた。各株について、エタノール生産量（右下パネル；１リットル当たりのエタノールのグラム量で測定）を測定した。
【図５Ａ】図５は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２つのアルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子をノックアウトした場合に発生する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのセロビオース利用への影響を示す。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、ＹＢＲ０１９Ｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、およびＹＮＲ０７１Ｃの３つの推定アルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子を含む。ＹＨＲ２１０ＣおよびＹＮＲ０７１Ｃの両方の遺伝子をノックアウトしたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株ＳＬ０１、およびＹＢＲ０１９ＣおよびＹＨＲ２１０Ｃの両方の遺伝子をノックアウトしたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株ＳＬ０１を調製した。図中の説明によって示す異なる株は、「△（ＹＨＲ＋ＹＮＲ）」（ＹＨＲ２１０ＣおよびＹＮＲ０７１Ｃをノックアウト）、「△（ＹＨＲ＋ＧＡＬ１０）」（ＹＨＲ２１０ＣおよびＹＢＲ０１９Ｃをノックアウト）、および「コントロール」（何れのアルドース  １‐エピメラーゼもノックアウトせず）である。セロビオースを含む培地は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアルドース  １‐エピメラーゼノックアウト株で発酵させた。各株について、細胞増殖（上パネル；６００ｎｍの吸光度で測定）を測定した。
【図５Ｂ】図５は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２つのアルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子をノックアウトした場合に発生する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのセロビオース利用への影響を示す。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、ＹＢＲ０１９Ｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、およびＹＮＲ０７１Ｃの３つの推定アルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子を含む。ＹＨＲ２１０ＣおよびＹＮＲ０７１Ｃの両方の遺伝子をノックアウトしたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株ＳＬ０１、およびＹＢＲ０１９ＣおよびＹＨＲ２１０Ｃの両方の遺伝子をノックアウトしたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株ＳＬ０１を調製した。図中の説明によって示す異なる株は、「△（ＹＨＲ＋ＹＮＲ）」（ＹＨＲ２１０ＣおよびＹＮＲ０７１Ｃをノックアウト）、「△（ＹＨＲ＋ＧＡＬ１０）」（ＹＨＲ２１０ＣおよびＹＢＲ０１９Ｃをノックアウト）、および「コントロール」（何れのアルドース  １‐エピメラーゼもノックアウトせず）である。セロビオースを含む培地は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアルドース  １‐エピメラーゼノックアウト株で発酵させた。各株について、セロビオース消費量（中パネル；１リットル当たりのセロビオースのグラム量で測定）を測定した。
【図５Ｃ】図５は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２つのアルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子をノックアウトした場合に発生する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのセロビオース利用への影響を示す。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、ＹＢＲ０１９Ｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、およびＹＮＲ０７１Ｃの３つの推定アルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子を含む。ＹＨＲ２１０ＣおよびＹＮＲ０７１Ｃの両方の遺伝子をノックアウトしたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株ＳＬ０１、およびＹＢＲ０１９ＣおよびＹＨＲ２１０Ｃの両方の遺伝子をノックアウトしたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株ＳＬ０１を調製した。図中の説明によって示す異なる株は、「△（ＹＨＲ＋ＹＮＲ）」（ＹＨＲ２１０ＣおよびＹＮＲ０７１Ｃをノックアウト）、「△（ＹＨＲ＋ＧＡＬ１０）」（ＹＨＲ２１０ＣおよびＹＢＲ０１９Ｃをノックアウト）、および「コントロール」（何れのアルドース  １‐エピメラーゼもノックアウトせず）である。セロビオースを含む培地は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアルドース  １‐エピメラーゼノックアウト株で発酵させた。各株について、エタノール生産量（下パネル；１リットル当たりのエタノールのグラム量で測定）を測定した。
【図６Ａ】図６は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの１つのアルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子をノックアウトした場合に発生する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのセロビオース利用への影響を示す。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、ＹＢＲ０１９Ｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、およびＹＮＲ０７１Ｃの３つの推定アルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子を含む。各推定アルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子をノックアウトしたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株ＳＬ０１を調製した。図中の説明によって示す異なる株は、△ＹＨＲ（ＹＨＲ２１０Ｃをノックアウト）、△ＧＡＬ１０（ＹＢＲ０１９Ｃをノックアウト）、△ＹＮＲ（ＹＮＲ０７１Ｃをノックアウト）、および「コントロール」（何れのアルドース  １‐エピメラーゼもノックアウトせず）である。セロビオースを含む培地は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアルドース  １‐エピメラーゼノックアウト株で発酵させた。各株について、細胞増殖（上パネル；６００ｎｍの吸光度で測定）を測定した。
【図６Ｂ】図６は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの１つのアルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子をノックアウトした場合に発生する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのセロビオース利用への影響を示す。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、ＹＢＲ０１９Ｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、およびＹＮＲ０７１Ｃの３つの推定アルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子を含む。各推定アルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子をノックアウトしたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株ＳＬ０１を調製した。図中の説明によって示す異なる株は、△ＹＨＲ（ＹＨＲ２１０Ｃをノックアウト）、△ＧＡＬ１０（ＹＢＲ０１９Ｃをノックアウト）、△ＹＮＲ（ＹＮＲ０７１Ｃをノックアウト）、および「コントロール」（何れのアルドース  １‐エピメラーゼもノックアウトせず）である。セロビオースを含む培地は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアルドース  １‐エピメラーゼノックアウト株で発酵させた。各株について、セロビオース消費量（中パネル；１リットル当たりのセロビオースのグラム量で測定）を測定した。
【図６Ｃ】図６は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの１つのアルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子をノックアウトした場合に発生する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのセロビオース利用への影響を示す。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、ＹＢＲ０１９Ｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、およびＹＮＲ０７１Ｃの３つの推定アルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子を含む。各推定アルドース  １‐エピメラーゼ遺伝子をノックアウトしたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株ＳＬ０１を調製した。図中の説明によって示す異なる株は、△ＹＨＲ（ＹＨＲ２１０Ｃをノックアウト）、△ＧＡＬ１０（ＹＢＲ０１９Ｃをノックアウト）、△ＹＮＲ（ＹＮＲ０７１Ｃをノックアウト）、および「コントロール」（何れのアルドース  １‐エピメラーゼもノックアウトせず）である。セロビオースを含む培地は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアルドース  １‐エピメラーゼノックアウト株で発酵させた。各株について、エタノール生産量（下パネル；１リットル当たりのエタノールのグラム量で測定）を測定した。
【図７Ａ】図７は、セロビオーストランスポーター（ｃｄｔ−１）遺伝子および細胞内β‐グルコシダーゼ（ｇｈ１−１）遺伝子の両方を含む改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ４５２‐ＢＴ株を用いたグルコース発酵反応の比較を示す。図中の符号は、以下のものである：ＯＤ（白抜き丸）、グルコース（黒塗り下向き三角）、セロビオース（黒塗り上向き三角）、およびエタノール（黒塗り菱形）。
【図７Ｂ】図７は、セロビオーストランスポーター（ｃｄｔ−１）遺伝子および細胞内β‐グルコシダーゼ（ｇｈ１−１）遺伝子の両方を含む改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ４５２‐ＢＴ株を用いたセロビオース発酵反応の比較を示す。図中の符号は、以下のものである：ＯＤ（白抜き丸）、グルコース（黒塗り下向き三角）、セロビオース（黒塗り上向き三角）、およびエタノール（黒塗り菱形）。
【図８】図８は、スクロース加水分解物を含む培地内のＮ．ｃｒａｓｓａを用いたＡＥＰの転写解析と、ススキ属植物（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）加水分解物を含む培地内のＮ．ｃｒａｓｓａを用いたＡＥＰの転写解析の転写解析との比較を示す。図中の「１」は、スクロース加水分解物を含む培地内で１６時間経過後の結果を示す。図中の「２」は、ススキ属植物加水分解物を含む培地内で１６時間経過後の結果を示す。図中の「３」は、ススキ属植物加水分解物を含む培地内で４０時間経過後の結果を示す。図中の「４」は、ススキ属植物加水分解物を含む培地内で１１２時間経過後の結果を示す。図中の「５」は、ススキ属植物加水分解物を含む培地内で２３２時間経過後の結果を示す。
【図９Ａ】図９は、Ｎ．ｃｒａｓｓａ由来の２つのＡＥＰのアミノ酸配列のアライメント、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の２つの推定ＡＥＰのアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図９Ｂ】図９は、Ｎ．ｃｒａｓｓａ由来の２つのＡＥＰのアミノ酸配列のアライメント、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の２つの推定ＡＥＰのアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図１０Ａ】図１０は、セロビオース発酵経路を含むＢＹ４７４１の△ＹＨＲ株、△ＹＮＲ株、および△ＧＡＬ株を用いたセロビオースの発酵反応の比較を示す。誤差は１５％以内である。図中の符号は、以下のものである；コントロール（黒塗り丸）、△ＹＨＲ（黒塗り上向き三角）、△ＹＮＲ（黒塗り四角）、および△ＧＡＬ（黒塗り菱形）とである。
【図１０Ｂ】図１０は、セロビオース発酵経路を含むＢＹ４７４１の△ＹＨＲ株、△ＹＮＲ株、および△ＧＡＬ株を用いたセロビオースの発酵反応の比較を示す。誤差は１５％以内である。図中の符号は、以下のものである；コントロール（黒塗り丸）、△ＹＨＲ（黒塗り上向き三角）、△ＹＮＲ（黒塗り四角）、および△ＧＡＬ（黒塗り菱形）とである。
【図１０Ｃ】図１０は、セロビオース発酵経路を含むＢＹ４７４１の△ＹＨＲ株、△ＹＮＲ株、および△ＧＡＬ株を用いたセロビオースの発酵反応の比較を示す。誤差は１５％以内である。図中の符号は、以下のものである；コントロール（黒塗り丸）、△ＹＨＲ（黒塗り上向き三角）、△ＹＮＲ（黒塗り四角）、および△ＧＡＬ（黒塗り菱形）とである。
【図１０Ｄ】図１０は、セロビオース発酵経路を含むＢＹ４７４１の△ＹＨＲ株、△ＹＮＲ株、および△ＧＡＬ株を用いたセロビオースの発酵反応の比較を示す。誤差は１５％以内である。図中の符号は、以下のものである；コントロール（黒塗り丸）、△ＹＨＲ（黒塗り上向き三角）、△ＹＮＲ（黒塗り四角）、および△ＧＡＬ（黒塗り菱形）とである。
【図１１Ａ】図１１は、セロビオース内で増殖させたＢＹ４７４１のＡＥＰノックアウト株の特異的なＡＥＰ活性を示す。ＡＥＰ活性の一単位は、非酵素速度に加えて、２２℃で１分間の内に１μｍｏｌのα‐グルコースをβ‐グルコースへ変換させる酵素の量として定義される。誤差は、１５％以内である。
【図１１Ｂ】図１１は、グルコース内で増殖させたＢＹ４７４１のＡＥＰノックアウト株の特異的なＡＥＰ活性を示す。ＡＥＰ活性の一単位は、非酵素速度に加えて、２２℃で１分間の内に１μｍｏｌのα‐グルコースをβ‐グルコースへ変換させる酵素の量として定義される。誤差は、１５％以内である。
【図１２Ａ】図１２は、セロビオース発酵経路を含む改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ４５２‐ＢＴ株のＡＥＰ遺伝子（ＧＡＬ１０−Ｓｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、またはＹＮＲ０７１Ｃ）を過剰発現する３つのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ４５２‐ＢＴ株を用いたセロビオースの発酵反応の比較を示す。図中の符号は、以下のものである；コントロール（黒塗り丸）、ＹＨＲ２１０Ｃ（黒塗り上向き三角）、ＹＮＲ０７１Ｃ（黒塗り四角）、およびＧＡＬ１０−Ｓｃ（黒塗り菱形）。全ての発酵結果の数値は、２つの独立した発酵反応の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示す。
【図１２Ｂ】図１２は、セロビオース発酵経路を含む改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ４５２‐ＢＴ株のＡＥＰ遺伝子（ＧＡＬ１０−Ｓｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、またはＹＮＲ０７１Ｃ）を過剰発現する３つのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ４５２‐ＢＴ株を用いたセロビオースの発酵反応の比較を示す。図中の符号は、以下のものである；コントロール（黒塗り丸）、ＹＨＲ２１０Ｃ（黒塗り上向き三角）、ＹＮＲ０７１Ｃ（黒塗り四角）、およびＧＡＬ１０−Ｓｃ（黒塗り菱形）。全ての発酵結果の数値は、２つの独立した発酵反応の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示す。
【図１２Ｃ】図１２は、セロビオース発酵経路を含む改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ４５２‐ＢＴ株のＡＥＰ遺伝子（ＧＡＬ１０−Ｓｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、またはＹＮＲ０７１Ｃ）を過剰発現する３つのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ４５２‐ＢＴ株を用いたセロビオースの発酵反応の比較を示す。図中の符号は、以下のものである；コントロール（黒塗り丸）、ＹＨＲ２１０Ｃ（黒塗り上向き三角）、ＹＮＲ０７１Ｃ（黒塗り四角）、およびＧＡＬ１０−Ｓｃ（黒塗り菱形）。全ての発酵結果の数値は、２つの独立した発酵反応の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示す。
【図１２Ｄ】図１２は、セロビオース発酵経路を含む改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ４５２‐ＢＴ株のＡＥＰ遺伝子（ＧＡＬ１０−Ｓｃ、ＹＨＲ２１０Ｃ、またはＹＮＲ０７１Ｃ）を過剰発現する３つのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ４５２‐ＢＴ株を用いたセロビオースの発酵反応の比較を示す。図中の符号は、以下のものである；コントロール（黒塗り丸）、ＹＨＲ２１０Ｃ（黒塗り上向き三角）、ＹＮＲ０７１Ｃ（黒塗り四角）、およびＧＡＬ１０−Ｓｃ（黒塗り菱形）。全ての発酵結果の数値は、２つの独立した発酵反応の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年10月17日(2013.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組み換えＤＮＡ、および
グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡを含み、
セロビオース含有培地で増殖される場合では、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする前記組み換えＤＮＡを欠いている対応する宿主細胞によって消費されるよりも多くのセロビオースの分子を消費する、宿主細胞。
【請求項２】
１つ以上のβ‐グルコシダーゼをコードする組み換えＤＮＡをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
グルコースムタロターゼ活性を有する上記ポリペプチドは、配列番号１７、１９、２１および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項１または２に記載の宿主細胞。
【請求項４】
グルコースムタロターゼ活性を有する上記ポリペプチドは、配列番号２８〜３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項１または２に記載の宿主細胞。
【請求項５】
セロビオース含有混合物を発酵させる方法であって、
前記セロビオース含有混合物を請求項１〜４の何れか一項に記載の宿主細胞と接触させる工程、および
発酵を促す条件下で前記宿主細胞をインキュベートする工程を含む、方法。
【請求項６】
化学物質の生産量を増加させる方法であって、
１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組み換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および
１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする前記組み換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする前記組み換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を含み、
グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする前記組み換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする前記組み換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって生成されるよりも多くの前記化学物質が生成される、方法。
【請求項７】
上記化学物質はアルコールであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記アルコールは、エタノール、ｎ‐プロパノール、ｎ‐ブタノール、イソブタノール、３‐メチル‐１‐ブタノール、２‐メチル‐１‐ブタノール、３‐メチル‐１‐ペンタノール、およびオクタノールからなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記化学物質は、テルペノイド、ポリケチド、脂肪酸、脂肪酸誘導体、または有機酸であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
細胞の増殖速度を増加させる方法であって、
１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする組み換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡとを含む宿主細胞を提供する工程、および
１つ以上のセロデキストリントランスポーターをコードする前記組み換えＤＮＡと、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする前記組み換えＤＮＡとが発現するように、前記宿主細胞を培地で培養する工程を含み、
グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする前記組み換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞において、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする前記組み換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞によって得られるよりも高い細胞の増殖速度が得られる、方法。
【請求項１１】
上記宿主細胞は、１つ以上のβ‐グルコシダーゼをコードする組み換えＤＮＡをさらに含むことを特徴とする請求項６〜１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ムタロターゼ活性を有する上記ポリペプチドは、配列番号１７、１９、２１および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項６〜１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ムタロターゼ活性を有する上記ポリペプチドは、配列番号２８〜３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項６〜１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
β‐Ｄ‐グルコース含有混合物を発酵させる方法であり、
グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡを含む宿主細胞を提供する工程、および
グルコースムタロターゼ活性を有する前記１つ以上のポリペプチドをコードする前記組み換えＤＮＡが発現するように前記宿主細胞を培養する工程を備え、
グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする前記組み換えＤＮＡが発現することで、前記宿主細胞によって、グルコースムタロターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする前記組み換えＤＮＡを持たない対応する宿主細胞が消費するよりも多くのβ‐Ｄ‐グルコース含有混合物が消費されることを特徴とする、方法。
【請求項１５】
グルコースムタロターゼ活性を有する前記ポリペプチドは配列番号２８および２９のアミノ酸配列の一方または両方を含むことを特徴とする請求項１に記載の宿主細胞。
【国際調査報告】
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