(57)【要約】本発明は、式(I)の2-メチレン-ビタミンD類似体(式中、RおよびXが請求項1で定義される通りである)、具体的には(20S)-25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3および(20R)-25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3、ならびにそれらの薬学的使用を開示する。これらの化合物は、比較的高い結合活性、および、未分化細胞の増殖を停止させかつ単球へのそれらの分化を誘導する際の顕著な活性を示すことから、特に、骨肉腫、白血病、大腸がん、乳がん、皮膚がん、または前立腺がんの処置または予防のための抗がん剤としての使用を明示している。これらの化合物はまた、比較的高い血漿カルシウム上昇活性を有することから、骨疾患の処置における使用も明示している。式（I）2014532621.tif 000061
2014532621.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式を有する化合物:
2014532621.tif 000043
式中、Xは、水素およびヒドロキシ保護基からなる群より選択され、かつ、Rは、アルキル基、水素、ヒドロキシアルキル基、もしくはフルオロアルキル基であってもよいか、またはRは下記式の側鎖を表してもよく、
2014532621.tif 000044
式中、炭素20における立体化学的中心はR配置もしくはS配置を有してもよく、かつ、上記側鎖構造中のZは、Y、-OY、-CH2OY、-C≡CY、および-CH=CHYより選択され、該側鎖中の二重結合はシス幾何学的配置もしくはトランス幾何学的配置を有してもよく、かつ、Yは水素、メチル、-COR5、および下記構造の基より選択され、
2014532621.tif 000045
式中、mおよびnは独立して0〜5の整数を表し、R1は、水素、重水素、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、フルオロ、トリフルオロメチル、およびC1〜5-アルキルより選択され、該C1〜5-アルキルは、直鎖もしくは分岐状であってもよくかつヒドロキシ置換基もしくは保護ヒドロキシ置換基を有してもよく、かつ、R2、R3、およびR4のそれぞれは独立して重水素、重水素化アルキル(deuteroalkyl)、水素、フルオロ、トリフルオロメチル、およびC1〜5アルキルより選択され、該C1〜5アルキルは、直鎖もしくは分岐状であってもよくかつヒドロキシ置換基もしくは保護ヒドロキシ置換基を有してもよく、かつ、R1およびR2は一緒になって、オキソ基、もしくはkが整数である一般式CkH2k-を有するアルキリデン基、=CR2R3基、もしくはpが2〜5の整数である-(CH2)p-基を表し、かつ、R3およびR4は一緒になって、オキソ基、もしくはqが2〜5の整数である-(CH2)q-基を表し、かつ、R5は水素、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、もしくはC1〜5アルキルを表し、かつ、該側鎖中の20位、22位、もしくは23位におけるCH基のいずれかは窒素原子で置き換えられてもよいか、または、20位、22位、および23位における-CH(CH3)-基、-(CH2)m-基、-CR1R2-基、もしくは-(CH2)n-基のいずれかはそれぞれ酸素原子もしくは硫黄原子で置き換えられてもよい。
【請求項２】
Xが水素である、請求項1記載の化合物。
【請求項３】
Rが、
2014532621.tif 000046
より選択される、請求項1記載の化合物。
【請求項４】
Xが水素である、請求項3記載の化合物。
【請求項５】
有効量の請求項1記載の化合物の少なくとも1つを薬学的に許容される賦形剤とともに含有する、薬学的組成物。
【請求項６】
前記有効量が、組成物1グラム当たり約0.01μg〜約1000μgを構成する、請求項5記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記有効量が、組成物1グラム当たり約0.1μg〜約500μgを構成する、請求項5記載の薬学的組成物。
【請求項８】
下記式を有する化合物:
2014532621.tif 000047
式中、X1およびX2は、同一でもあってもよいかまたは異なっていてもよく、それぞれ水素またはヒドロキシ保護基より選択される。
【請求項９】
X2が水素である、請求項8記載の化合物。
【請求項１０】
X1が水素である、請求項8記載の化合物。
【請求項１１】
X1およびX2が両方ともt-ブチルジメチルシリルである、請求項8記載の化合物。
【請求項１２】
有効量の請求項8記載の化合物の少なくとも1つを薬学的に許容される賦形剤とともに含有する、薬学的組成物。
【請求項１３】
前記有効量が、組成物1グラム当たり約0.01μg〜約1000μgを構成する、請求項12記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記有効量が、組成物1グラム当たり約0.1μg〜約500μgを構成する、請求項12記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
下記式を有し、かつ、(20S)-25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3と命名されている、化合物：
2014532621.tif 000048
。
【請求項１６】
有効量の(20S)-25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3を薬学的に許容される賦形剤とともに含有する、薬学的組成物。
【請求項１７】
前記有効量が、組成物1グラム当たり約0.01μg〜約1000μgを構成する、請求項16記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記有効量が、組成物1グラム当たり約0.1μg〜約500μgを構成する、請求項16記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
下記式を有し、かつ、(20R)-25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3と命名されている化合物：
2014532621.tif 000049
。
【請求項２０】
有効量の(20R)-25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3を薬学的に許容される賦形剤とともに含有する、薬学的組成物。
【請求項２１】
前記有効量が、組成物1グラム当たり約0.01μg〜約1000μgを構成する、請求項20記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記有効量が、組成物1グラム当たり約0.1μg〜約500μgを構成する、請求項20記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
骨肉腫、白血病、大腸がん、乳がん、皮膚がん、または前立腺がんからなる群より選択される疾患を処置する方法であって、該疾患を有する対象に、下記式を有する1-デスオキシ-2-メチレン-ビタミンD類似体の有効量を投与する段階を含む、方法:
2014532621.tif 000050
式中、Xは、水素およびヒドロキシ保護基からなる群より選択され、かつ、Rはアルキル基、水素、ヒドロキシアルキル基、もしくはフルオロアルキル基であってもよいか、またはRは下記式の側鎖を表してもよく、
2014532621.tif 000051
式中、炭素20における立体化学的中心はR配置もしくはS配置を有してもよく、かつ、上記側鎖構造中のZはY、-OY、-CH2OY、-C≡CY、および-CH=CHYより選択され、該側鎖中の二重結合はシス幾何学的配置もしくはトランス幾何学的配置を有してもよく、かつ、Yは水素、メチル、-COR5、および下記構造の基より選択され、
2014532621.tif 000052
式中、mおよびnは独立して0〜5の整数を表し、R1は、水素、重水素、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、フルオロ、トリフルオロメチル、およびC1〜5-アルキルより選択され、該C1〜5-アルキルは、直鎖もしくは分岐状であってもよくかつヒドロキシ置換基もしくは保護ヒドロキシ置換基を有してもよく、かつ、R2、R3、およびR4のそれぞれは独立して重水素、重水素化アルキル、水素、フルオロ、トリフルオロメチル、およびC1〜5アルキルより選択され、該C1〜5アルキルは、直鎖もしくは分岐状であってもよくかつヒドロキシ置換基もしくは保護ヒドロキシ置換基を有してもよく、かつ、R1およびR2は一緒になって、オキソ基、もしくはkが整数である一般式CkH2k-を有するアルキリデン基、=CR2R3基、もしくはpが2〜5の整数である-(CH2)p-基を表し、かつ、R3およびR4は一緒になって、オキソ基、もしくはqが2〜5の整数である-(CH2)q-基を表し、かつ、R5は、水素、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、もしくはC1〜5アルキルを表し、かつ、該側鎖中の20位、22位、もしくは23位におけるCH基のいずれかは窒素原子で置き換えられてもよいか、または、20位、22位、および23位における-CH(CH3)-基、-(CH2)m-基、-CR1R2-基、もしくは-(CH2)n-基のいずれかはそれぞれ酸素原子もしくは硫黄原子で置き換えられてもよい。
【請求項２４】
前記ビタミンD類似体を経口投与する、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
前記ビタミンD類似体を非経口投与する、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
前記ビタミンD類似体を経皮投与する、請求項23記載の方法。
【請求項２７】
前記ビタミンD類似体を直腸投与する、請求項23記載の方法。
【請求項２８】
前記ビタミンD類似体を経鼻投与する、請求項23記載の方法。
【請求項２９】
前記ビタミンD類似体を舌下投与する、請求項23記載の方法。
【請求項３０】
約0.01μg/日〜約1000μg/日の投与量で前記ビタミンD類似体を投与する、請求項23記載の方法。
【請求項３１】
前記ビタミンD類似体が、下記式を有し、かつ、(20S)-25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3と命名されている、請求項23記載の方法：
2014532621.tif 000053
。
【請求項３２】
前記ビタミンD類似体が、下記式を有し、かつ、(20R)-25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3と命名されている、請求項23記載の方法：
2014532621.tif 000054
。
【請求項３３】
骨量を維持するかまたは増加させることが望まれる代謝性骨疾患を処置する方法であって、該疾患を有する患者に、下記式を有する化合物の有効量を投与する段階を含む、方法:
2014532621.tif 000055
式中、Xは、水素およびヒドロキシ保護基からなる群より選択され、かつ、Rは、アルキル基、水素、ヒドロキシアルキル基、もしくはフルオロアルキル基であってもよいか、またはRは下記式の側鎖を表してもよく、
2014532621.tif 000056
式中、炭素20における立体的化学中心はR配置もしくはS配置を有してもよく、かつ、上記側鎖構造中のZは、Y、-OY、-CH2OY、-C=CY、および-CH=CHYより選択され、該側鎖中の二重結合はシス幾何学的配置もしくはトランス幾何学的配置を有してもよく、かつ、Yは水素、メチル、-COR5、および下記構造の基より選択され、
2014532621.tif 000057
式中、mおよびnは独立して0〜5の整数を表し、R1は、水素、重水素、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、フルオロ、トリフルオロメチル、およびC1〜5-アルキルより選択され、該C1〜5-アルキルは、直鎖もしくは分岐状であってもよくかつヒドロキシ置換基もしくは保護ヒドロキシ置換基を有してもよく、かつ、R2、R3、およびR4のそれぞれは独立して重水素、重水素化アルキル、水素、フルオロ、トリフルオロメチル、およびC1〜5アルキルより選択され、該C1〜5アルキルは、直鎖もしくは分岐状であってもよくかつヒドロキシ置換基または保護ヒドロキシ置換基を有してもよく、かつ、R1およびR2は一緒になって、オキソ基、もしくはkが整数である一般式CkH2k-を有するアルキリデン基、=CR2R3基、もしくはpが2〜5の整数である-(CH2)p-基を表し、かつ、R3およびR4は一緒になって、オキソ基、もしくはqが2〜5の整数である-(CH2)q-基を表し、かつ、R5は水素、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、もしくはC1〜5アルキルを表し、かつ、該側鎖中の20位、22位、もしくは23位におけるCH基のいずれかは窒素原子で置き換えられてもよいか、または、20位、22位、および23位における-CH(CH3)-基、-(CH2)m-基、-CR1R2-基、もしくは-(CH2)n-基のいずれかはそれぞれ酸素原子もしくは硫黄原子で置き換えられてもよい。
【請求項３４】
前記化合物を経口投与する、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
前記化合物を非経口投与する、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
前記化合物を経皮投与する、請求項33記載の方法。
【請求項３７】
前記化合物を直腸投与する、請求項33記載の方法。
【請求項３８】
前記化合物を経鼻投与する、請求項33記載の方法。
【請求項３９】
前記化合物を舌下投与する、請求項33記載の方法。
【請求項４０】
約0.01μg/日〜約1000μg/日の投与量で前記化合物を投与する、請求項33記載の方法。
【請求項４１】
前記疾患が老人性骨粗鬆症である、請求項33記載の方法。
【請求項４２】
前記疾患が閉経後骨粗鬆症である、請求項33記載の方法。
【請求項４３】
前記疾患がステロイド誘発性骨粗鬆症である、請求項33記載の方法。
【請求項４４】
前記疾患が低回転型骨粗鬆症である、請求項33記載の方法。
【請求項４５】
前記疾患が骨軟化症である、請求項33記載の方法。
【請求項４６】
前記疾患が腎性骨異栄養症である、請求項33記載の方法。
【請求項４７】
前記化合物が、下記式を有し、かつ、(20S)-25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3と命名されている、請求項33記載の方法： 
2014532621.tif 000058
。
【請求項４８】
前記化合物が、下記式を有し、かつ、(20R)-25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3と命名されている、請求項33記載の方法： 
2014532621.tif 000059
。
【請求項４９】
Yが、水素およびヒドロキシ保護基からなる群より選択される、下記式を有する化合物:
2014532621.tif 000060
。
【請求項５０】
Yが水素である、請求項49記載の化合物。
【請求項５１】
Yがt-ブチルジメチルシリルである、請求項49記載の化合物。
【請求項５２】
Yがt-ブチルジフェニルシリルである、請求項49記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビタミンD化合物、より詳細には2-メチレン-ビタミンD類似体およびそれらの薬学的使用、特に(20S)-25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3、その生物活性、およびその薬学的使用、ならびに(20R)-25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3、その生物活性、およびその薬学的使用に関する。この後者の化合物は、20-メチル置換基が天然の配向または「R」配向にあることから、2-メチレン-25-ヒドロキシ-ビタミンD3と単に呼ばれることもある。
【背景技術】
【０００２】
天然ホルモンである1α,25-ジヒドロキシビタミンD3、およびエルゴステロール系列のその類似体、すなわち1α,25-ジヒドロキシビタミンD2は、動物およびヒトにおける非常に強力なカルシウム恒常性制御因子であることが知られており、細胞分化におけるそれらの作用も立証されている:Ostrem et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2610 (1987)(非特許文献1)。1α-ヒドロキシビタミンD3、1α-ヒドロキシビタミンD2、様々な側鎖同族体化ビタミンおよびフッ素化類似体を含むこれらの代謝産物の多くの構造類似体が調製および試験された。これらの化合物の一部は、細胞分化における作用とカルシウム制御における作用の興味深い隔たりを示す。作用におけるこの差異は、腎性骨異栄養症、ビタミンD抵抗性くる病、骨粗鬆症、乾癬、および特定の悪性腫瘍などの種々の疾患の処置に有用でありうる。
【０００３】
ビタミンD類似体の別のクラス、すなわちいわゆる19-ノル-ビタミンD化合物は、2個の水素原子による、ビタミンD系に典型的なA環外メチレン基(炭素19)の置き換えを特徴とする。そのような19-ノル-類似体(例えば1α,25-ジヒドロキシ-19-ノル-ビタミンD3)の生物学的試験は、細胞分化を誘導する際の高い有効性および非常に低いカルシウム動員活性を伴う、選択的活性プロファイルを明らかにした。したがって、これらの化合物は悪性腫瘍の処置または様々な皮膚障害の処置のための治療剤として潜在的に有用である。そのような19-ノル-ビタミンD類似体の2つの異なる合成方法が記載されている(Perlman et al., Tetrahedron Lett. 31, 1823 (1990) (非特許文献2); Perlman et al., Tetrahedron Lett. 32, 7663 (1991) (非特許文献3)およびDeLuca et al., 米国特許第5,086,191号(特許文献1))。
【０００４】
米国特許第4,666,634号(特許文献2)では、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3の2β-ヒドロキシ類似体およびアルコキシ(例えばED-71)類似体が潜在的な骨粗鬆症薬および抗腫瘍薬としてChugaiグループによって記載および検討されている。Okano et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 163, 1444 (1989) (非特許文献4)も参照。1α,25-ジヒドロキシビタミンD3の他の2-置換(ヒドロキシアルキル基による、例えばED-120、およびフルオロアルキル基による)A環類似体も調製および試験されている(Miyamoto et al., Chem. Pharm. Bull. 41, 1111 (1993) (非特許文献5); Nishii et al., Osteoporosis Int. Suppl. 1, 190 (1993) (非特許文献6); Posner et al., J. Org. Chem. 59, 7855 (1994) (非特許文献7)およびJ. Org. Chem. 60, 4617 (1995) (非特許文献8))。
【０００５】
興味深く選択的な活性プロファイルを示す1α,25-ジヒドロキシ-19-ノル-ビタミンD3の2-置換類似体、すなわち2位においてヒドロキシ基またはアルコキシ基で置換された化合物(DeLuca et al., 米国特許第5,536,713号(特許文献3))、2位において2-アルキル基で置換された化合物(DeLuca et al 米国特許第5,945,410号(特許文献4))および2位において2-アルキリデン基で置換された化合物(DeLuca et al 米国特許第5,843,928号(特許文献5))も合成された。すべてのこれらの研究は、ビタミンD受容体中の結合部位が合成ビタミンD類似体中のC-2における異なる置換基を収容することができることを示す。
【０００６】
薬理学的に重要なビタミンD化合物の19-ノルクラスを調査する継続的な試みにおいて、炭素2(C-2)におけるメチレン置換基の存在、炭素1(C-1)におけるヒドロキシル基の存在、および炭素20(C-20)に結合した短縮側鎖の存在を特徴とする類似体も合成および試験された。1α-ヒドロキシ-2-メチレン-19-ノル-プレグナカルシフェロールが米国特許第6,566,352号(特許文献6)に記載され、一方、1α-ヒドロキシ-2-メチレン-19-ノル-ホモプレグナカルシフェロールが米国特許第6,579,861号(特許文献7)に記載され、1α-ヒドロキシ-2-メチレン-19-ノル-ビスホモプレグナカルシフェロールが米国特許第6,627,622号(特許文献8)に記載されている。これら3つの化合物はすべて、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3に比べて比較的高いビタミンD受容体に対する結合活性および比較的高い細胞分化活性を有するが、血漿カルシウム上昇活性はあったとしてもほとんど有さない。'352、'861および'622特許に記載のとおり、これらの化合物は、それらの生物活性により、種々の薬学的使用のための優れた候補となる。
【０００７】
炭素10(C-10)から炭素2(C-2)へのA環外メチレン基の転位を特徴とする天然ホルモン1α,25-ジヒドロキシビタミンD3の類似体(例えば1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-19-ノル-ビタミンD類似体)が合成および試験された[Sicinski et al., J. Med. Chem., 41, 4662 (1998) (非特許文献9); Sicinski et al., Steroids 67, 247 (2002) (非特許文献10); ならびにDeLuca et al., 米国特許第5,843,928号(特許文献5); 同第5,936,133号(特許文献9)および同第6,382,071号(特許文献10))を参照]。これらの類似体について行った分子力学研究は、A環立体配座の変化がシクロヘキサンジオール環の平坦化を引き起こしうると予測している。また、分子力学計算およびNMR研究は、A環立体配座平衡が約6:4であり、エクアトリアル1α-OHを有する配座異性体に有利であると予測している。さらに、19-ノル-ビタミンD炭素骨格への2-メチレン基の導入がその1α-A環ヒドロキシルおよび3β-A環ヒドロキシルの特性を変化させると予測された。それらは両方とも、天然ホルモン[すなわち1α,25-(OH)2D3]の分子中の1α-ヒドロキシル基と同様のアリル位置に存在する。1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-19-ノル-ビタミンD類似体は著しい生物学的有効性を特徴とすることがわかった。さらに、そのような類似体の生物学的有効性は、「非天然の」(20S)-配置が存在する場合に劇的に強化されうる。これらの発見を考慮して、本発明は、炭素2(C-2)におけるA環外メチレン基の存在を特徴とするビタミンD化合物(例えば2-メチレン-ビタミンD類似体)に指向するものである。これらの類似体は、生物活性に重要な1α-OHを欠くが、そのようなヒドロキシル基は潜在的には酵素的に生物に導入することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第5,086,191号
【特許文献２】米国特許第4,666,634号
【特許文献３】米国特許第5,536,713号
【特許文献４】米国特許第5,945,410号
【特許文献５】米国特許第5,843,928号
【特許文献６】米国特許第6,566,352号
【特許文献７】米国特許第6,579,861号
【特許文献８】米国特許第6,627,622号
【特許文献９】米国特許第5,936,133号
【特許文献１０】米国特許第6,382,071号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ostrem et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2610 (1987)
【非特許文献２】Perlman et al., Tetrahedron Lett. 31, 1823 (1990)
【非特許文献３】Perlman et al., Tetrahedron Lett. 32, 7663 (1991)
【非特許文献４】Okano et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 163, 1444 (1989)
【非特許文献５】Miyamoto et al., Chem. Pharm. Bull. 41, 1111 (1993)
【非特許文献６】Nishii et al., Osteoporosis Int. Suppl. 1, 190 (1993)
【非特許文献７】Posner et al., J. Org. Chem. 59, 7855 (1994)
【非特許文献８】J. Org. Chem. 60, 4617 (1995)
【非特許文献９】Sicinski et al., J. Med. Chem., 41, 4662 (1998)
【非特許文献１０】Sicinski et al., Steroids 67, 247 (2002)
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、炭素10(C-10)においてA環外メチレン基を有することを特徴とするだけでなく、炭素2(C-2)におけるさらなるエキソメチレン置換基の存在も特徴とする、ビタミンD化合物(すなわち2-メチレン-ビタミンD類似体)を目的とする。これらの類似体も1α-OH基を欠き、したがって本発明は、2-メチレン-ビタミンD類似体およびそれらの薬学的使用、より具体的には(20S)-25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3、その生物活性、およびこの化合物の様々な薬学的使用、ならびに(20R)-25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3、その生物活性およびその薬学的使用に関する。
【００１１】
構造的には、これらの1-デスオキシ-2-メチレン-ビタミンD類似体は、以下に示す一般式Iを特徴とする。
2014532621.tif 000003
式中、Xは、水素およびヒドロキシ保護基からなる群より選択され、かつ、R基は、ビタミンD型化合物について公知の典型的な側鎖のいずれかを表す。したがって、Rは、アルキル基、水素、ヒドロキシアルキル基、もしくはフルオロアルキル基であってもよいか、またはRは、下記式の側鎖を表してもよく、
2014532621.tif 000004
式中、炭素20における立体化学的中心はR配置もしくはS配置を有してもよく、かつ、上記側鎖構造中のZは、Y、-OY、-CH2OY、-C≡CY、および-CH=CHYより選択され、該側鎖中の二重結合はシス幾何学的配置もしくはトランス幾何学的配置を有してもよく、かつ、Yは水素、メチル、-COR5、および下記構造の基より選択され、
2014532621.tif 000005
式中、mおよびnは独立して0〜5の整数を表し、R1は、水素、重水素、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、フルオロ、トリフルオロメチル、およびC1〜5アルキルより選択され、該C1〜5アルキルは、直鎖もしくは分岐状であってもよくかつヒドロキシ置換基もしくは保護ヒドロキシ置換基を有してもよく、かつ、R2、R3、およびR4のそれぞれは独立して重水素、重水素化アルキル(deuteroalkyl)、水素、フルオロ、トリフルオロメチル、およびC1〜5アルキルより選択され、該C1〜5アルキルは、直鎖もしくは分岐状であってもよくかつヒドロキシ置換基もしくは保護ヒドロキシ置換基を有してもよく、かつ、R1およびR2は一緒になって、オキソ基、もしくはkが整数である一般式CkH2k-を有するアルキリデン基、=CR2R3基、もしくはpが2〜5の整数である-(CH2)p-基を表し、かつ、R3およびR4は一緒になって、オキソ基、もしくはqが2〜5の整数である-(CH2)q-基を表し、かつ、R5は、水素、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、もしくはC1〜5アルキルを表し、かつ該側鎖中の20位、22位、もしくは23位におけるCH基のいずれかは窒素原子で置き換えられてもよいか、または20位、22位、および23位における-CH(CH3)-基、-(CH2)m-基、-CR1R2-基、もしくは-(CH2)n-基のいずれかはそれぞれ酸素原子もしくは硫黄原子で置き換えられてもよい。
【００１２】
側鎖の特定の重要な例は、天然の20R-配置を有する下記式(a)、(b)、(c)、(d)、および(e)で表される構造、すなわち25-ヒドロキシビタミンD3において見出される側鎖(a); ビタミンD3において見出される側鎖(b); 25-ヒドロキシビタミンD2において見出される側鎖(c); ビタミンD2において見出される側鎖(d); および25-ヒドロキシビタミンD2のC-24エピマーにおいて見出される側鎖(e)である。
【００１３】
側鎖のさらなる重要な例は、20-エピ配置または20S-配置を有する下記式(a)、(b)、(c)、(d)、および(e)で表される構造、すなわち(20S)-25-ヒドロキシビタミンD3において見出される側鎖(a); (20S)-ビタミンD3において見出される側鎖(b); (20S)-25-ヒドロキシビタミンD2において見出される側鎖(c); (20S)-ビタミンD2において見出される側鎖(d); および(20S)-25-ヒドロキシビタミンD2のC-24エピマーにおいて見出される側鎖(e)である。
2014532621.tif 000006
【００１４】
炭素20に対する波線は、炭素20がR配置またはS配置のいずれかを有しうることを示す。
【００１５】
好ましい類似体は、下記式Ia:
2014532621.tif 000007
を有する(20S)-25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3(本明細書では「1D-QMS」と呼ぶ)、および下記式Ib:
2014532621.tif 000008
を有する(20R)-25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3(本明細書では「1D-QM」と呼ぶ)である。本明細書において、化合物Iaはまた「(20S)-2-メチレン-25-ヒドロキシ-ビタミンD3」と命名され得、かつ化合物Ibもまた「2-メチレン-25-ヒドロキシ-ビタミンD3」と命名され得る。
【００１６】
式I、特に式Iaおよび式Ibの上記化合物は、生物活性の望ましい非常に有利なパターンを示す。これらの化合物は、ビタミンD受容体に対する比較的高い結合性を特徴とし、すなわち、それらは、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3とほぼ同等の親和性で結合する。それらは、HL-60細胞の分化を引き起こす能力が1,25(OH)2D3よりもほんのわずかだけ劣る。それらはまた、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3に比べて、骨からカルシウムを動員するそれらの能力においておよび腸管カルシウム輸送を促進するそれらの能力において比較的高い活性を示す。
【００１７】
インビボにおける特徴的な活性プロファイルは、1-ヒドロキシル化が規則的に生じうることから、おそらくプロドラッグとして作用するこれらの化合物の能力のために明らかになり、該化合物の半減期は延長されると予測される。これらの類似体は、少ない頻度の用量投与が望ましい疾患、例えば、老人性骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症、ステロイド誘発性骨粗鬆症、低骨回転型骨粗鬆症、骨軟化症、および腎性骨異栄養症などの骨疾患の重要な療法として役立ちうる。
【００１８】
上記化合物I、特にIaおよびIbは、比較的高い結合親和性を有し、比較的高い細胞分化活性を特徴とし、かつ、比較的高い血漿カルシウム上昇活性を有する。したがって、これらの化合物は、抗がん剤としての可能性を有し、骨肉腫、白血病、大腸がん、乳がん、皮膚がん、および前立腺がんの予防または処置のための治療剤を提供する。
【００１９】
1つまたは複数の前記化合物は、上述の疾患を処置または予防するための組成物中に、該組成物1グラム当たり約0.01μg〜約1000μg、好ましくは該組成物1グラム当たり約0.1μg〜約500μgの量で存在することができ、約0.01μg/日〜約1000μg/日、好ましくは約0.1μg/日〜約500μg/日の投与量で局所投与、経皮投与、経口投与、直腸投与、経鼻投与、舌下投与、または非経口投与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
図1〜図4は、以下「1,25(OH)2D3」と呼ぶ天然ホルモン1α,25-ジヒドロキシビタミンD3と比較した、以下「1D-QMS」と呼ぶ(20S)-25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3の様々な生物活性を示す。
【図１】全長組換えラットビタミンD受容体に対する結合に関して[3H]-1,25-(OH)2-D3と競合する1D-QMSおよび1,25(OH)2D3の相対活性を示すグラフである。
【図２】1D-QMSおよび1,25(OH)2D3の濃度の関数としてのHL-60細胞分化パーセントを示すグラフである。
【図３】1D-QMSと比較した、1,25(OH)2D3の骨カルシウム動員活性を示す棒グラフである。
【図４】1D-QMSと比較した、1,25(OH)2D3の腸管カルシウム輸送活性を示す棒グラフである。
【００２１】
図5〜図8は、以下「1,25(OH)2D3」と呼ぶ天然ホルモン1α,25-ジヒドロキシビタミンD3と比較した、以下「1D-QM」と呼ぶ(20R)-25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3の様々な生物活性を示す。
【図５】全長組換えラットビタミンD受容体に対する結合に関して[3H]-1,25-(OH)2-D3と競合する1D-QMおよび1,25(OH)2D3の相対活性を示すグラフである。
【図６】1D-QMおよび1,25(OH)2D3の濃度の関数としてのHL-60細胞分化パーセントを示すグラフである。
【図７】1D-QMと比較した、1,25(OH)2D3の骨カルシウム動員活性を示す棒グラフである。
【図８】1D-QMと比較した、1,25(OH)2D3の腸管カルシウム輸送活性を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
本明細書および特許請求の範囲において使用される「ヒドロキシ保護基」という用語は、ヒドロキシ官能基の一時的保護に一般に使用される任意の基、例えばアルコキシカルボニル基、アシル基、アルキルシリル基またはアルキルアリールシリル基(以下単に「シリル」基と呼ぶ)、およびアルコキシアルキル基を意味する。アルコキシカルボニル保護基とは、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、イソブトキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルまたはアリルオキシカルボニルなどのアルキル-O-CO-基のことである。「アシル」という用語は、すべての異性体形態の炭素数1〜6のアルカノイル基、またはオキサリル基、マロニル基、スクシニル基、グルタリル基などの炭素数1〜6のカルボキシアルカノイル基、またはベンゾイルなどの芳香族アシル基、またはハロ置換、ニトロ置換もしくはアルキル置換ベンゾイル基を意味する。本明細書または特許請求の範囲において使用される「アルキル」という用語は、すべての異性体形態の炭素数1〜10の直鎖または分岐状のアルキル基を示す。「アルコキシ」とは、酸素によって結合する任意のアルキル基、すなわち「アルキル-O-」で表される基を意味する。アルコキシアルキル保護基とは、メトキシメチル、エトキシメチル、メトキシエトキシメチル、またはテトラヒドロフラニルおよびテトラヒドロピラニルなどの基のことである。好ましいシリル保護基としてはトリメチルシリル基、トリエチルシリル基、t-ブチルジメチルシリル基、ジブチルメチルシリル基、ジフェニルメチルシリル基、フェニルジメチルシリル基、ジフェニル-t-ブチルシリル基および類似のアルキル化シリル基がある。「アリール」という用語はフェニル基、または、アルキル置換、ニトロ置換もしくはハロ置換フェニル基を指す。
【００２３】
「保護ヒドロキシ」基とは、ヒドロキシ官能基の一時的または恒久的保護に一般に使用される上記の基のいずれか、例えば既に定義のシリル基、アルコキシアルキル基、アシル基またはアルコキシカルボニル基で誘導体化または保護されたヒドロキシ基のことである。「ヒドロキシアルキル」、「重水素化アルキル」および「フルオロアルキル」という用語は、それぞれ1個または複数のヒドロキシ基、重水素基またはフルオロ基で置換されたアルキル基を意味する。「アルキリデン」とは、kが整数である一般式CkH2k-を有する基を意味する。
【００２４】
基本構造Iの2-メチレン-ビタミンD類似体の調製は、通常の一般的方法によって、すなわち、二環式ビニル化合物IIとジエニンIIIとの薗頭カップリングによって達成することができる。
2014532621.tif 000009
【００２５】
構造IIおよびIIIでは、X基は、ハロゲン(ヨウ素、臭素、または塩素)、およびアルキル-もしくはアリール-スルホニルオキシ、例えばメシルオキシ、トシルオキシ、または最も好ましくはトリフルオキシより選択される脱離基を表す。Y基およびR基は上記定義の基を表し、Yはヒドロキシ保護基であることが好ましく、また、感受性を有しうるかまたはカップリング反応に干渉するR中の任意の官能基が、当技術分野において周知の通り好適に保護されることが理解される。上記に示すプロセスは収束的合成の概念の適用を表すものであり、この概念はビタミンD化合物の調製に有効に適用された[Mascarenas et al., Tetrahedron 47, 3485 (1991), Barrack et al., J. Org. Chem., 53, 1790 (1988); Sanchez-Abella et al., Bioorg. Med. Chem. 16, 10244 (2008)]。
【００２６】
一般構造IIの二環式化合物は、公知であるか、または対応するWindaus-Grundmann型ケトンから公知の方法で容易に調製可能である。そのような公知の二環式ケトンの特定の重要な例としては、下記の側鎖(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)および(n)を有する構造、すなわち25-ヒドロキシGrundmannケトン(h)[Baggiolini et al., J. Org. Chem, 51, 3098 (1986)]; Grundmannケトン(i)[Inhoffen et al., Chem. Ber., 90, 664 (1957)]; 25-ヒドロキシWindausケトン(j)[Baggiolini et al., J. Org. Chem., 51, 3098 (1986)]; Windausケトン(k)[Windaus et al., Ann., 524, 297 (1936)]; (20S)-25-ヒドロキシGrundmannケトン(l)[Sicinski et al., J. Med. Chem., 41, 4662 (1998)]; (20S)-Grundmannケトン(m)[Grzywacz et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 89-90, 13 (2004)]; および(20S)-25-メチルGrundmannケトン(n)[Grzywacz et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 89-90, 13 (2004)]がある。
2014532621.tif 000010
【００２７】
構造IIIのジエニンの調製に関して代替的合成経路が確立された。スキームIに記載の通りに、Reetzら[Tetr. Lett., 34, 7395 (1993)]の方法を使用してアキラルな市販のアセタール-ケトン1をα-メチル化した。次に、形成された2中のケト基を還元し、続いて得られたアルコール3(ジアステレオマー混合物)を塩化ピバロイルでエステル化した。優勢なトランス異性体のみがこの反応を経たことから、得られたエステル4は(S,S)および(R,R)-鏡像異性体の混合物であった。4中のカルボニル基をルイス酸(FeCl3)との反応において脱保護し、形成されたシクロヘキサノン5を、Hayashiら[J. Org. Chem., 69, 5966 (2004)]によって精巧に作製された、触媒量のL-プロリンの存在下でのケトンとニトロソベンゼンとの反応を包含する方法を使用して、エナンチオ選択的にα-ヒドロキシル化した。3つの主生成物6a、b、cを同等の量で単離した。生成物6a中の導入された第二級ヒドロキシルをシリル化し、保護化合物7を、メチルトリフェニルホスホニウムブロミドおよびn-ブチルリチウムから発生するイリドとのWittig反応に供した。形成されたオレフィン8中のピバロイル保護基をDIBALでの処理によって除去し、得られたシクロヘキサノール誘導体9をケトン10に酸化した。そのリチウムアセチリドとの反応によって第三級アルコール11を得て、これを2段階プロセス(メシル化およびメシレートの還元)で脱水した。得られた生成物12中のエチニル置換基からのTMS基の除去後、所望のA環断片13を調製した。
【００２８】
スキームIIは、得られたA環ジエニン13と、保護25-ヒドロキシGrundmannケトンから誘導されたC,D-断片を表すエノールトリフレート14[Sanchez-Abella et al., Bioorg. Med. Chem. 16, 10244 (2008)]との引き続く薗頭カップリングを示す。この反応は、酢酸ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)-ヨウ化銅(I)触媒およびジエチルアミンの存在下で優先的に行われるはずである。カップリングによってトリエニン15を形成し、これをリンドラー触媒およびキノリンの存在下でさらに水素化した。そのような接触水素化の予想生成物であるプレビタミンD化合物16を分取TLCで精製し、ヘキサン中での熱反応に供した。保護ビタミンD化合物17をHPLCで単離し、フッ化テトラブチルアンモニウムによるヒドロキシル脱保護後に所望の25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3(18)を得た。この合成経路は本明細書の実施例Iに記載されている。
【００２９】
スキームIIIおよびスキームIVは、構成単位26および最終ビタミン32をもたらす異なる合成順序を示す。スキームIIIに記載の通りに、Sibilskaら[J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 121, 51 (2010)]によって精巧に作製された方法により市販の(-)-キナ酸(19)から容易に調製されるヒドロキシエステル20を出発化合物として使用し、合成戦略はDesmaeleおよびTanierの研究[Tetrahedron Lett., 26, 4941 (1985)]に基づいた。したがって、第三級アルコールを脱水し、形成されたα,β-不飽和エステル21をジアゾメタンとの反応に供した。そのような立体特異的1,3-双極子環付加によって予想の二環式生成物22を得た。続いて付加体22を熱分解することで窒素を効率的に放出し、不飽和エステル23を形成した。それをDIBALHで還元することでアリルアルコール24を得て、これをPDCでα,β-不飽和アルデヒド25に酸化した。この生成物を(トリメチルシリル)ジアゾメタンで処理して所望のA環断片26を調製した。
【００３０】
スキームIVは、保護(20S)-25-ヒドロキシGrundmannケトン27からの、C,D-断片を表すエノールトリフレート28の調製を示す[Sicinski et al., J. Med. Chem., 41, 4662 (1998)]。LDAを-78℃で加えることで発生した27のエノール型をN-フェニルトリフルイミドで処理して28を得た。続いて、得られたA環ジエニン26とエノールトリフレート28との薗頭カップリングによってトリエニン29を形成し、これをリンドラー触媒およびキノリンの存在下でさらに水素化した。そのような接触水素化の予想生成物であるプレビタミンD化合物30を分取TLCで精製し、ヘキサン中での熱反応に供した。保護ビタミンD化合物31をHPLCで単離し、フッ化テトラブチルアンモニウムによるヒドロキシル脱保護後に所望の(20S)-25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3(32)を得た。この合成経路は本明細書の実施例IIに記載されている。
【００３１】
実施例Iおよび実施例IIから明らかである通り、異なる側鎖を有する他のビタミンD類似体を、本明細書に記載の方法で合成することができる。
【００３２】
本発明を以下の例示的な実施例により説明する。これらの実施例において、アラビア数字(例えば1、2、3など)により同定される特定の生成物は、前述の明細書およびスキームI、スキームII、スキームIII、およびスキームIVにおいてそのように同定された特定の構造を指す。
【実施例】
【００３３】
化学的性質。融点(未補正)をThomas-Hoover毛細管融点装置において決定した。旋光度をクロロホルム中22℃でPerkin-Elmer 241自動旋光計を使用して測定した。紫外線(UV)吸収スペクトルをエタノール中でPerkin-Elmer Lambda 3B紫外可視分光光度計によって記録した。1H核磁気共鳴(NMR)スペクトルをジュウテリオクロロホルム中にて200、400および500MHzでそれぞれVarian Unity、Bruker DMX-400およびBruker DMX-500分光計によって記録した。13C核磁気共鳴(NMR)スペクトルをジュウテリオクロロホルム中にて50、100および125MHzでそれぞれVarian Unity、Bruker DMX-400およびBruker DMX-500分光計によって記録した。化学シフト(δ)を内部Me4Si(δ 0.00)から低磁場で報告した。電子衝撃(EI)質量スペクトルをMicromass AutoSpec(マサチューセッツ州Beverly)機器によって得た。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を、モデル6000A溶媒送達システム、モデルU6Kユニバーサルインジェクターおよびモデル486波長可変吸光度検出器を備えたWaters Associates液体クロマトグラフにおいて行った。THFを使用前にアルゴン下でナトリウムベンゾフェノンケチルから新たに蒸留した。
【００３４】
化合物6a〜6cのプロトンMMR信号の記述では、プロリンを触媒とするプロセスにおいて導入されるヒドロキシル基の配向を任意で「α」と設定し、同じ割り当てをそれらの誘導体7〜13に使用した。化合物20〜26のプロトンMMR信号の記述では、OTBS基の配向を任意で「α」と設定した。
【００３５】
実施例I
25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3(18)の調製
(a) ケトン1のα-メチル化(スキームI)。7-メチル-1,4-ジオキサ-スピロ[4.5]デカン-8-オン(2)。LiHMDS溶液(THF中1.0M、33.0mL、33.0mmol)にアルゴン下、-78℃で1,4-シクロヘキサンジオンモノエチレンケタール(1、5.12g、32.96mmol)の乾燥THF(20mL)溶液を加え、混合物を40分間攪拌した。室温に昇温後、DMPU(13.3mL)を加えた。攪拌をさらに10分間続け、無水MnBr2(7.83g、36.46mmol)を含有するフラスコにエノラート溶液をカニューレ注入し、透明な赤褐色溶液が得られるまで混合物を攪拌した(約30分)。次にヨウ化メチル(2.5mL、40.0mmol)を加え、4時間後、反応液を飽和NH4ClおよびEDTAの添加により反応停止させた。材料をジエチルエーテルで抽出し、MgSO4で乾燥させ、濃縮した。シリカ上でのカラムクロマトグラフィー(3%→5%酢酸エチル/ヘキサン勾配)による精製によって油状α-メチルケトン2(3.72g、67%)を得た。
2:
2014532621.tif 000011
; HRMS(ESI) C9H14O3Na(M++Na)の計算精密質量193.0841、測定精密質量193.0836。
【００３６】
(b) ケトン2の還元。cis-およびtrans-7-メチル-1,4-ジオキサ-スピロ[4.5]デカン-8-オール(3)。ケトン(2、2.99g、17.57mmol)の無水MeOH(83mL)溶液に0℃でNaBH4(1.039g、27.45mmol)をゆっくりと加えた。10分後、冷却浴を取り外し、攪拌を室温で1時間続けた。ブラインを加え、混合物を酢酸エチルで抽出し、2N NaOH溶液で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濃縮した。得られたアルコール3の粗混合物(2.87g、95%; シス:トランス異性体比1:13.3)は、第2の合成工程において使用するために十分に純粋であった。異性体の分離は、ヘキサン/酢酸エチル(9:1)溶媒系を使用するシリカ上でのカラムクロマトグラフィーにより実現することができた。
3(シス異性体):
2014532621.tif 000012
; HRMS(ESI) C9H16O3Na(M++Na)の計算精密質量195.0997、測定精密質量195.1002。
3(トランス異性体):
2014532621.tif 000013
; HRMS(ESI) C9H16O3Na(M++Na)の計算精密質量195.0997、測定精密質量195.0999。
【００３７】
(c) 3中のヒドロキシ基の保護。trans-7-メチル-8-ピバロイルオキシ-1,4-ジオキサ-スピロ[4.5]デカン(4)。異性体アルコール3(2.86g、16.65mmol; シス:トランス1:13.3)の無水ピリジン(30mL)溶液に塩化ピバロイル(2.06mL、16.74mmol)をゆっくりと加え、混合物を60℃で3時間攪拌した。加熱浴を除去し、混合物を室温に冷却した。次にHCl溶液(5%)を加え、混合物を酢酸エチルで抽出し、飽和NaHCO3で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濃縮した。ヘキサン/酢酸エチル(97:3)を使用するシリカ上でのカラムクロマトグラフィーによってエステル4(3.95g、97%)を得て、ヘキサン/酢酸エチル(8:2)でさらに溶離して未反応アルコール3(シス異性体、128mg)を得た。
4:
2014532621.tif 000014
; HRMS(ESI) C14H24O4Na(M++Na)の計算精密質量279.1572、測定精密質量279.1564。
【００３８】
(d) ケタール4中のカルボニル基の脱保護。trans-3-メチル-4-ピバロイルオキシ-シクロヘキサノン(5)。アセタール4(120mg、467.8μmol)の塩化メチレン(13.7mL)溶液に室温でFeCl3×6H2O(653mg、2.42mmol)を加えた。得られた帯黄色懸濁液を1.5時間攪拌し、水の添加により反応停止させた。水層を塩化メチレンで抽出し、一緒にした有機層をMgSO4で乾燥させ、濃縮した。残渣をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサン/酢酸エチル(98:2)で溶離してケトン5(84mg、96%)を無色油状物として得た。
5:
2014532621.tif 000015
; HRMS(ESI) C12H20O3Na(M++Na)の計算精密質量235.1310、測定精密質量235.1313。
【００３９】
(e) ケトン5のα-ヒドロキシル化。ケトン5(551mg、2.59mmol)およびL-プロリン(143.6mg、1.25mmol)のクロロホルム(5mL)中攪拌溶液にニトロソベンゼン(485mg、4.53mmol)のクロロホルム(10mL)溶液をシリンジポンプにより4℃で24時間かけてゆっくりと加えた。次に混合物を室温でさらに2時間攪拌した。反応液をブラインの添加により反応停止させ、酢酸エチルで抽出し、MgSO4で乾燥させ、濃縮した。ヘキサン/酢酸エチル(9:1)を使用するシリカ上でのカラムクロマトグラフィーにより異性体α-ヒドロキシケトン(溶離順序で)6c、6bおよび6a(34.5:30.1:35.4; 380mg、64%)を得た。これらの化合物は純度約90%(NMRにより判定)であり、さらに精製せずに次の合成工程に使用した。
(2R,4R,5R)-2-ヒドロキシ-5-メチル-4-ピバロイルオキシ-シクロヘキサノン(6a):
2014532621.tif 000016
; HRMS(ESI) C12H20O4Na(M++Na)の計算精密質量251.1260、測定精密質量251.1264。
(2R,4S,5S)-2-ヒドロキシ-5-メチル-4-ピバロイルオキシ-シクロヘキサノン(6b): 
2014532621.tif 000017
; HRMS(ESI) C12H20O4Na(M++Na)の計算精密質量251.1260、測定精密質量251.1261。
(2R,3R,4S)-2-ヒドロキシ-3-メチル-4-ピバロイルオキシ-シクロヘキサノン(6c): 
2014532621.tif 000018
; HRMS(ESI) C12H20O4Na(M++Na)の計算精密質量251.1260、測定精密質量251.1263。
【００４０】
(f) 6a中のヒドロキシ基の保護。(2R,4R,5R)-2-[(tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ]-5-メチル-4-ピバロイルオキシ-シクロヘキサノン(7)。α-ヒドロキシケトン6a(765mg、3.6mmol)および硝酸銀(1.72g、10.14mmol)の無水DMF(16mL)溶液にアルゴン下、室温でt-BDPSCl(1.16mL、4.53mmol)を加えたところ、白色析出物が直ちに形成された。反応液を17時間攪拌した後、水の添加により反応停止させた。混合物をヘキサンで抽出し、MgSO4で乾燥させ、濃縮した。シリカ上でのカラムクロマトグラフィー(1%→4%ジエチルエーテル/ヘキサン)による精製によって保護α-ヒドロキシケトン7(1.2g、97%)を得た。
7: [α]20D -61°(c 1.7、CHCl3);
2014532621.tif 000019
; HRMS(ESI) C28H38O4SiNa(M++Na)の計算精密質量489.2437、測定精密質量489.2435。
【００４１】
(g) ケトン7のWittigメチレン化。(2R,4R,5R)-2-[(tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ]-5-メチル-1-メチレン-4-ピバロイルオキシ-シクロヘキサン(8)。無水THF(1.4mL)中メチルトリフェニルホスホニウムブロミド(122mg、342μmol)に0℃でn-BuLi(ヘキサン中1.6M; 431μL、689.5μmol)を滴下した。15分後、ホスホニウム塩(122mg、342μmol)をさらに加え、溶液を0℃で10分間、室温で20分間攪拌した。次に橙赤色混合物を-78℃に冷却し、予め冷却した(-78℃)ケトン7(160mg、344μmol)の無水THF(350μL)溶液に移した。反応混合物を-78℃で4時間、次に室温で1時間攪拌した。混合物をブラインに注ぎ、ヘキサンで抽出した。有機層をMgSO4で乾燥させ、蒸発させて橙色油状残渣を得て、これをシリカSep-Pakカートリッジ上に適用した。ヘキサン/ジエチルエーテル(97:3)での溶離によって純粋なオレフィン化合物8(153mg、97%)を無色油状物として得た。
8: [α]20D -47°(c 2.83、CHCl3);
2014532621.tif 000020
; HRMS(ESI) C29H40O3SiNa(M++Na)の計算精密質量487.2645、測定精密質量487.2664。
【００４２】
(h) エステル8の還元。(1R,2R,5R)-5-[(tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ]-2-メチル-4-メチレン-シクロヘキサノール(9)。エステル8(710mg、1.53mmol)のトルエン:塩化メチレン(2:1、45mL)中攪拌溶液にアルゴン下、-78℃で水素化ジイソブチルアルミニウム(トルエン中1.0M; 6.12mL、6.12mmol)をゆっくりと加えた。攪拌を-78℃で1時間、-40℃で30分間続けた。酒石酸カリウム-ナトリウム(2N、4mL)、HCl水溶液(2N、4mL)およびH2O(14mL)を加えることで混合物を反応停止させ、酢酸エチルで抽出した。有機相をブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥させ、蒸発させた。残渣を、ヘキサン/酢酸エチル(9:1)を使用するシリカ上でのカラムクロマトグラフィーにより精製してアルコール9(558mg、96%)を得た。
9: [α]20D -42°(c 4.0、CHCl3); 
2014532621.tif 000021
; 13C NMR (50MHz、CDCl3) 主信号: δ18.45、19.49、27.16、36.88、40.97、43.27、72.27、73.82、109.52、127.58、127.78、129.77、129.85、134.01、134.48、135.99、136.16、148.23; HRMS(ESI) C24H32O2SiNa(M++Na)の計算精密質量403.2070、測定精密質量403.2064。
【００４３】
(i) シクロヘキサノール9の酸化。(2R,5R)-5-[(tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ]-2-メチル-4-メチレン-シクロヘキサノン(10)。アルコール9(396mg、1.04mmol)の無水塩化メチレン(20mL)中攪拌溶液にアルゴン下、室温でデス-マーチンペルヨージナン(529mg、1.25mmol)を加えた。攪拌を1時間続け、飽和NaHCO3をゆっくりと加えた。混合物を塩化メチレンで抽出し、MgSO4で乾燥させ、濃縮した。残渣をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサン/ジエチルエーテル(98:2)で溶離してケトン10(389mg、95%)を無色油状物として得た。
10: [α]20D -49°(c 3.0、CHCl3); 
2014532621.tif 000022
; HRMS(ESI) C24H30O2SiNa(M++Na)の計算精密質量401.1913、測定精密質量401.1899。
【００４４】
(j) ケトン10からヒドロキシアルキン11への変換。(1S,2R,5R)-5-[(tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ]-2-メチル-4-メチレン-1-[(トリメチルシラニル)エチニル]-シクロヘキサノール(11)。トリメチルシリルアセチレン(76μL、537μmol)の無水THF(2mL)溶液にアルゴン下、0℃でn-BuLi溶液(ヘキサン中1.6M、326μL、522μmol)を滴下した。溶液を30分間攪拌し、-78℃に冷却した後、予め冷却した(-78℃)ケトン10(158mg、417.3μmol)の乾燥THF(2mL)溶液をゆっくりと加えた。15分後、混合物を0℃に昇温させ、さらに30分間攪拌した。反応液を水の添加により反応停止させ、エーテルで抽出し、MgSO4で乾燥させ、濃縮した。得られた生成物をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサン/酢酸エチル(98:2)で溶離してアルコール11(190mg、96%)を無色油状物として得た。
11: [α]20D -42°(c 1.6、CHCl3); 
2014532621.tif 000023
; HRMS(ESI) C29H40O2Si2Na(M++Na)の計算精密質量499.2465、測定精密質量499.2473。
【００４５】
(k) アルコール11の脱水。(5R)-5-[(tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ]-2-メチル-4-メチレン-1-[(トリメチルシラニル)エチニル]-シクロヘキセン(12)。アルコール11(174mg、364μmol)およびTEA(309μL、2.21mmol)の乾燥塩化メチレン(6mL)中攪拌溶液にアルゴン下、室温で塩化メシル(170μL、2.19mmol)をゆっくりと加えた。1時間後、反応液を5% HClの添加により反応停止させ、塩化メチレンで抽出した。有機相を飽和NaHCO3で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濃縮した。得られた生成物をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサン/ジエチルエーテル(99:1)で溶離してエニン12(64mg、38%)を無色油状物として得た。
12:
2014532621.tif 000024
; HRMS(ESI) C29H38OSi2Na(M++Na)の計算精密質量481.2359、測定精密質量481.2361。
【００４６】
(l) 12からのTMS基の除去。(5R)-5-[(tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ]-1-エチニル-2-メチル-4-メチレン-シクロヘキサン(13)。保護アセチレン(58mg、126μmol)の無水THF/MeOH(1:1、6mL)中攪拌溶液にアルゴン下、室温で無水炭酸カリウム(34.5mg、250μmol)を加えた。攪拌を19時間続けた後、水および飽和NH4Clを加え、混合物をヘキサンで抽出し、MgSO4で乾燥させ、濃縮した。残渣をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサンで溶離して化合物13(47mg、96%)を得た。
13: 
2014532621.tif 000025
; HRMS(ESI) C26H30OSiNa(M++Na)の計算精密質量409.1964、測定精密質量409.1954。
【００４７】
(m) ジエニン13とトリフレート14とのカップリング(スキームII)。3β-[(tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ]-2-メチレン-25-[(トリエチルシリル)オキシ]-9,10-セココレスタ-5(10),8-ジエン-6-イン(15)。アセチレン13(47mg、121.6μmol)およびトリフレート14(50mg、95μmol)の無水DMF(0.95mL)溶液にアルゴン下、室温でCuI(2.7mg、14.2μmol)、(PPh3)2Pd(OAc)2(2.0mg、2.7μmol)およびEt2NH(945μL)を加えた。20分後、混合物は濃赤褐色になった。水を加え、混合物をヘキサンで抽出し、MgSO4で乾燥させ、濃縮した。得られた生成物をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサンで溶離して化合物15(63mg、87%)を得た。
15:
2014532621.tif 000026
; HRMS(ESI) C50H74O2Si2Na(M++Na)の計算精密質量785.5125、測定精密質量785.5150。
【００４８】
(n) トリエニン15の水素化およびプレビタミンD化合物16の熱反応。2-メチレン-25-[(トリエチルシリル)オキシ]-ビタミンD3 tert-ブチルジフェニルシリルエーテル(17)。トリエニン15(63mg、82.5μmol)のヘキサン(7.6mL)およびキノリン(13.5μL)溶液にリンドラー触媒(189mg)を加え、混合物を水素正圧下、室温で攪拌した。リンドラー触媒を8時間中に4回(30mgずつ)加えた後、混合物をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサン/エーテル(99.7:0.3)で溶離してプレビタミンD生成物と未反応基質との混合物を得た。ヘキサン/エーテル(98:2)を用いる分取TLC(シリカゲル60F254、20×20cm、250μm層)によるさらなる精製によってプレビタミン化合物16(12.7mg、20%; 回収基質に対して25%)および未変化ジエニン12.1mgを得た。次にシリル化プレビタミンを無水ヘキサン(6mL)に溶解させ、アルゴン下、65℃で5時間および40℃で終夜攪拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を、ヘキサン/酢酸エチル(99:1)溶媒系を使用するHPLC(9.4mm×25cm Zorbax-Silカラム、4mL/分)で精製した。純粋な保護ビタミン17(9.7mg、76%)をRV 15.5mLで溶離した。
17:
2014532621.tif 000027
; HRMS(ESI) C50H76O2Si2Na(M++Na)の計算精密質量787.5281、測定精密質量787.5272。
【００４９】
(o) ビタミンD化合物17中のヒドロキシルの脱保護。25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3(18)。保護ビタミン17(8.7mg)のTHF(0.7mL)溶液にアルゴン下、室温でフッ化テトラブチルアンモニウム(THF中1.0M; 546μL、546μmol)を加えた。攪拌を18時間続け、ブラインを加え、混合物を酢酸エチルで抽出した。有機抽出物をMgSO4で乾燥させ、蒸発させた。残渣を、ヘキサン/2-プロパノール(97:3)溶媒系を使用するHPLC(9.4mm×25cm Zorbax-Silカラム、4mL/分)で精製し、ビタミン18(1.357mg、29%)をRV 35mLで収集した。メタノール/水(93:7)溶媒系を使用するHPLC(9.4mm×25cm Zorbax Eclipse XDB-C18カラム、4mL/分)後にビタミンの分析試料を得た(RV 28mL)。
18: UV(EtOH)λmax 268.5nm;
2014532621.tif 000028
; HRMS(ESI) C28H44O2Na(M++Na)の計算精密質量435.3239、測定精密質量435.3231。
【００５０】
実施例II
(20S)-25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3(32)の調製
(a) ヒドロキシエステル20の脱水(スキームIII)。(5R)-5-[(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ]-4-メチレン-シクロヘキサ-1-エンカルボン酸メチルエステル(21)。アルコール20(162.5mg、540.8μmol)の無水四塩化炭素(5.1mL)溶液にアルゴン下、室温で[α,α-ビス(トリフルオロメチル)ベンゼンメタノラト]ジフェニル硫黄(545.6mg、811.2μmol)の無水四塩化炭素(1.8mL)溶液を加えた。反応液を2時間攪拌し、水を加えた。混合物を塩化メチレンで抽出し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。得られた生成物をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサン/ジエチルエーテル(97:3)で溶離して、脱水試薬が混入した所望の生成物を得た。ヘキサン/ジエチルエーテル(92:8)を使用する分取TLCプレート(シリカゲル60F254、20×20cm、層厚250nm)におけるさらなる精製によって不飽和エステル21(139mg、91%)を無色油状物として得た。
21: [α]D -48°(c 1.0、CHCl3);
2014532621.tif 000029
; HRMS(ESI) C15H26O3SiNa(M++Na)の計算精密質量305.1549、測定精密質量305.1558。
【００５１】
(b) ジアゾメタンのエステル21への付加。(3aR,6R,7aR)-6-[(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ]-5-メチレン-3,3a,4,5,6,7-ヘキサヒドロ-インダゾール-7a-カルボン酸メチルエステル(22)。不飽和エステル21(375mg、1.327mmol)の無水ジエチルエーテル(2mL)溶液に室温でジアゾメタンのジエチルエーテル溶液[5.5mL; Arndt, Org. Synth., 15, 3 and 48 (1935)の手順に従って調製]を加えた。反応混合物を光から保護し、終夜攪拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をヘキサンに溶解させ、シリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサン/酢酸エチル(96:4)で溶離して二環式化合物22(423mg、99%)を無色油状物として得た。
22: [α]D +2.1°(c 1.0、CHCl3);
2014532621.tif 000030
; HRMS(ESI) C16H28N2O3SiNa(M++Na)の計算精密質量347.1767、測定精密質量347.1758。
【００５２】
(c) 付加体22の熱分解。(5R)-5-[(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ]-2-メチル-4-メチレン-シクロヘキサ-1-エンカルボン酸メチルエステル(23)。新たに蒸留した無水DMSO(16mL)中の化合物22(310mg、955μmol)の溶液をアルゴン下、125℃で5時間攪拌した。加熱浴を除去し、水を加え、混合物をヘキサンで抽出し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。ヘキサン/ジエチルエーテル(97:3)を使用するシリカ上でのカラムクロマトグラフィーによって不飽和エステル23(239mg、98%)および回収基質(43mg)を得た。
23: [α]D -41°(c 1.0、CHCl3);
2014532621.tif 000031
; HRMS(ESI) C16H28O3SiNa(M++Na)の計算精密質量319.1706、測定精密質量319.1705。
【００５３】
(d) エステル23の還元。(5'R)-5'-[(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ]-2'-メチル-4'-メチレン-シクロヘキサ-1'-エニル)-メタノール(24)。エステル23(89mg、300μmol)のトルエン/塩化メチレン(2:1; 8mL)中攪拌溶液にアルゴン下、-78℃で水素化ジイソブチルアルミニウム(トルエン中1.0M; 1.33mL、1.33mmol)をゆっくりと加えた。攪拌を-78℃で1時間続けた。酒石酸カリウム-ナトリウム(2N、4mL)、HCl水溶液(2N、4mL)、H2Oをゆっくりと加えることで混合物を反応停止させ、酢酸エチルで抽出した。一緒にした有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、濃縮した。残渣をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサン/酢酸エチル(95:5)で溶離してアルコール24(78mg、96%)を得た。
24: [α]D -49°(c 1.0、CHCl3);
2014532621.tif 000032
; HRMS(ESI) C15H28O2SiNa(M++Na)の計算精密質量291.1757、測定精密質量291.1749。
【００５４】
(e) アルコール24の酸化。(5'R)-5'-[(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ]-2-メチル-4-メチレン-シクロヘキサ-1-エンカルボアルデヒド(25)。アルコール24(77mg、286.8μmol)および二クロム酸ピリジニウム(347mg、1.61mmol)の無水塩化メチレン(4.6mL)中混合物をアルゴン下、室温で16時間激しく攪拌した。次に反応混合物をセライトパッド(塩化メチレンで洗浄)を通して濾過し、溶媒を減圧除去した。残渣をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサン/酢酸エチル(98:2)で溶離してアルデヒド25(33.5mg、44%)を無色油状物として得た。
25: [α]D -49°(c 1.0、CHCl3);
2014532621.tif 000033
; HRMS(ESI) C15H26O2SiNa(M++Na)の計算精密質量289.1600、測定精密質量289.1608。
【００５５】
(f) アルデヒド25からジエニン26への変換。(5'R)-5'-[(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ]-1-エチニル-2-メチル-4-メチレン-シクロヘキセン(26)。(トリメチルシリル)ジアゾメタン(ヘキサン中2.0M、76μL、151.52μmol)の無水THF(150μL)溶液にアルゴン下、-78℃でn-BuLi(ヘキサン中1.6M; 101μL、161.71μmol)を加え、アルデヒド25(33.5mg、125.73μmol)の乾燥THF(100μL+100μL)溶液をカニューレ経由で加えた。1時間後、冷却浴を取り外し、攪拌を室温で終夜続けた。水を加え、混合物をヘキサンで抽出し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。残渣をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサンで溶離してジエニン26(16mg、52%)および回収基質(1.5mg)を得た。
26: [α]D -44.5°(c 1.0、CHCl3);
2014532621.tif 000034
; HRMS(ESI) C16H26OSiNa(M++Na)の計算精密質量285.1651、測定精密質量285.1648。
【００５６】
(g) Grundmannケトン27からエノールトリフレート28への変換(スキームIV)。(20S)-25-[(トリエチルシリル)オキシ]-8-トリフルオロメタンスルホニルオキシ-デス-A,B-コレスタ-8-エン(28)。LDA(THF/ヘプタン/エチルベンゼン中2.0M; 40μL、80μmol)の乾燥THF(100μL)溶液にアルゴン下、-78℃でケトン27(28.5mg、72.19μmol)の無水THF(350μL)溶液をゆっくりと加えた。次にN-フェニルトリフルイミド(28.3mg、79.27μmol)の乾燥THF(100μL)溶液を加えた。2時間後、冷却浴を除去し、反応混合物を室温に昇温させた。攪拌を30分間続け、水を加えた。混合物をヘキサンで抽出し、MgSO4で乾燥させ、濃縮した。残渣をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサンで溶離してエノールトリフレート28(17.2mg、回収基質を考慮して82%)および未反応ケトン27(12mg)を得た。
28: [α]20D -5.3°(c 0.86 CHCl3);
2014532621.tif 000035
; HRMS(ESI) C25H45F3O4SSiNa(M++Na)の計算精密質量549.2658、測定精密質量549.2637。
【００５７】
(h) ジエニン26とトリフレート28とのカップリング。(20S)-3β-[(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ]-2-メチレン-25-[(トリエチルシリル)オキシ]-9,10-セココレスタ-5(10),8-ジエン-6-イン(29)。ジエニン26(6.1mg、22.9μmol)およびトリフレート28(8.9mg、16.89μmol)の無水DMF(200μL)溶液にアルゴン下、室温でCuI(0.507mg、2.66μmol)、(PPh3)2Pd(OAc)2(0.38mg、0.507μmol)およびEt2NH(185μL)を加えた。30分後、混合物は濃赤褐色になった。水を加え、混合物をヘキサンで抽出し、MgSO4で乾燥させ、濃縮した。得られた生成物をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサンで溶離してトリエニン29(10mg、93%)を得た。
29:
2014532621.tif 000036
; HRMS(ESI) C40H70O2Si0Na(M++Na)の計算精密質量661.4813、測定精密質量661.4823。
【００５８】
(i) トリエニン29の水素化およびプレビタミンD化合物30の熱反応。(20S)-2-メチレン-25-[(トリエチルシリル)オキシ]-ビタミンD3 tert-ブチルジフェニルシリルエーテル(31)。トリエニン29(10mg、15.64μmol)のヘキサン(1.8mL)およびキノリン(2.61μL)溶液にリンドラー触媒(36.46mg)を加え、混合物を水素正圧下、室温で攪拌した。リンドラー触媒を2時間中に2回(20mgずつ)加えた後、混合物をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサン/エーテル(99:1)で溶離してシリル化プレビタミン30(8mg、80%)を得た。次にプレビタミンを無水ヘキサン(5mL)に溶解させ、アルゴン下、60℃で8時間および終夜攪拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサン/ジエチルエーテル(99.8:0.2)で溶離して保護ビタミン31(7mg、87%)を得た。
31:
2014532621.tif 000037
; HRMS(ESI) C40H72O2Si2Na(M++Na)の計算精密質量663.4969、測定精密質量663.4971。
【００５９】
(j) ビタミンD化合物31中のヒドロキシルの脱保護。(20S)-25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3(32)。保護ビタミン31(8.0mg)のTHF(1mL)溶液にアルゴン下、室温でフッ化テトラブチルアンモニウム(THF中1.0M; 595μL、595μmol)を加えた。攪拌を20時間続け、ブラインを加え、混合物を酢酸エチルで抽出した。有機抽出物をMgSO4で乾燥させ、蒸発させた。残渣を、ヘキサン/2-プロパノール(96:4)溶媒系を使用するHPLC(9.4mm×25cm Zorbax-Silカラム、4mL/分)で精製し、ビタミン32(1.18mg、23%)をRV 39mLで収集した。メタノール/水(93:7)溶媒系を使用するHPLC(9.4mm×25cm Zorbax Eclipse XDB-C18カラム、4mL/分)後にビタミンの分析試料を得た(RV 35mL)。
32: UV(EtOH) λmax 268.8nm;
2014532621.tif 000038
; HRMS(ESI) C28H44O2Na(M++Na)の計算精密質量435.3239、測定精密質量435.3231。
【００６０】
スキームI、スキームII、スキームIII、およびスキームIVは以下に記載の通りである。
【００６１】
2014532621.tif 000039
【００６２】
2014532621.tif 000040
【００６３】
2014532621.tif 000041
【００６４】
2014532621.tif 000042
【００６５】
(20S)-25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3(1D-QMS)の生物活性
2位に対するメチレン基の導入、ならびに炭素10においてメチレン置換基を有すること、および炭素20におけるメチル基をエピ配置またはS配置に向けることは、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3に比べて、全長組換えラットビタミンD受容体への結合に対する効果をほとんどまたは全く示さなかった。化合物1D-QMSは標準的1,25-(OH)2D3に比べてほぼ同等の親和性で該受容体に結合する(図1)。これらの結果からは、化合物1D-QMSが同等の生物活性を有すると予想されうる。しかし驚くべきことに、化合物1D-QMSは、独自の生物活性を有する非常に選択的な類似体である。
【００６６】
図4は、腸管カルシウム輸送を刺激する際に、1D-QMSが、天然ホルモンである1,25-ジヒドロキシビタミンD3(1,25(OH)2D3)の活性に比べて比較的に高い活性を有することを示す。1D-QMSは、腸管にわたる活性カルシウム輸送を促進する際には1,25(OH)2D3とほぼ同等である。
【００６７】
図3は、1D-QMSが1,25(OH)2D3に比べて比較的に高い骨カルシウム動員活性を有することを示す。780pmol/ラットを投与する場合に同様の活性が観察されることから、1D-QMSは骨カルシウムストアを放出する際の天然ホルモンとほぼ同等の有効性を有する。
【００６８】
したがって図3および図4は、1D-QMSが比較的に高い血漿カルシウム上昇活性を有することを特徴としうることを示す。
【００６９】
図2は、1D-QMSが、HL-60細胞分化に関して1,25(OH)2D3とほぼ同等に強力であることから、がんの処置、特に骨肉腫、白血病、大腸がん、乳がん、皮膚がん、および前立腺がんの予防または処置のための優れた候補となることを示す。
【００７０】
実験方法
本発明の化合物を以下の方法を使用して調製および試験した。
【００７１】
ビタミンD受容体結合性
試験材料
タンパク質源
全長組換えラット受容体を大腸菌(E. coli)BL21(DE3)コドン＋RIL細胞中で発現させ、2つの異なるカラムクロマトグラフィーシステムを使用して均一になるまで精製した。第1のシステムは、このタンパク質上でC末端ヒスチジンタグを用いるニッケルアフィニティー樹脂とした。この樹脂から溶離したタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィー(S-セファロース高速流)を使用してさらに精製した。精製タンパク質のアリコートを液体窒素中で急速凍結させ、使用まで-80℃で保管した。結合アッセイ法での使用のために、タンパク質を0.1% Chaps界面活性剤を伴うTEDK50(50mM Tris、1.5mM EDTA、pH7.4、5mM DTT、150mM KCI)中で希釈した。受容体タンパク質およびリガンドの濃度を、添加された放射標識リガンドの20%以下が受容体に結合するように最適化した。
【００７２】
試験薬
非標識リガンドをエタノールに溶解させ、濃度を紫外分光光度法(1,25(OH)2D3: モル吸光係数＝18,200、λmax＝265nm)を使用して決定した。放射標識リガンド(3H-1,25(OH)2D3、約159Ci/ミリモル)をエタノール中に最終濃度1nMで加えた。
【００７３】
アッセイ条件
放射標識リガンドおよび非標識リガンドを希釈タンパク質100mclに最終エタノール濃度10%以下で加え、混合し、結合平衡に到達するように氷上で終夜インキュベートした。翌日、ヒドロキシルアパタイトスラリー(50%)100mclを各管に加え、10分間隔で30分間混合した。ヒドロキシルアパタイトを遠心分離で収集した後、0.5% Titron X-100を含有するTris-EDTA緩衝液(50mM Tris、1.5mM EDTA、pH7.4)で3回洗浄した。最終洗浄後、ペレットをBiosafe IIシンチレーションカクテル4mlを収容するシンチレーションバイアルに移し、混合し、シンチレーションカウンターに入れた。全結合量を放射標識リガンドのみを収容する管から決定した。
【００７４】
HL-60分化
試験材料
試験薬
試験薬をエタノールに溶解させ、紫外分光光度法を使用して濃度を決定した。細胞培養液中に存在するエタノールの最終濃度(0.2%以下)を変化させずにある範囲の薬物濃度を試験することができるように、系列希釈液を調製した。
【００７５】
細胞
ヒト前骨髄球性白血病(HL60)細胞を、10%ウシ胎仔血清を含有するRPMI-1640培地中で増殖させた。細胞を5% CO2の存在下、37℃でインキュベートした。
【００７６】
アッセイ条件
HL60細胞を1.2x105細胞/mlでプレーティングした。プレーティングの18時間後、二通りの細胞を薬物で処理した。4日後、細胞を収集し、ニトロブルーテトラゾリウム還元アッセイ法を行った(Collins et al., 1979; J. Exp. Med. 149:969-974)。分化細胞の割合を、合計200個の細胞を計数して細胞内黒青色ホルマザン沈着物を含む数を記録することで決定した。単球細胞への分化の確認を、食細胞活性を測定することで決定した(データは示さず)。
【００７７】
インビトロ転写アッセイ法
ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に24-ヒドロキシラーゼ(24OHアーゼ)遺伝子プロモーターを安定的に形質移入させたROS 17/2.8(骨)細胞中で転写活性を測定した(Arbour et al., 1998)。ある範囲の用量を細胞に与えた。投与の16時間後、細胞を収集し、ルミノメーターを使用してルシフェラーゼ活性を測定した。RLU＝相対ルシフェラーゼ単位。
【００７８】
腸管カルシウム輸送および骨カルシウム動員
雄の離乳Sprague-Dawleyラットに食餌11(Suda et al, J. Nutr. 100:1049, 1970)(0.47% Ca) + ビタミンAEKを1週間、続いて食餌11(0.02% Ca) + ビタミンAEKを3週間与えた。次にラットを1週間の0.47% Caを含有する同一の食餌、続いて2週間の0.02% Caを含有する同一の食餌に切り換えた。用量投与を0.02%カルシウム食餌の最終週の間に始めた。4回の連続した腹腔内用量を約24時間の間隔で与えた。最終投与の24時間後、切断した頸部から血液を採取し、血清カルシウム濃度を骨カルシウム動員の尺度として原子吸光分光法により決定した。腸管の最初の10cmも、反転腸管法を使用する腸管カルシウム輸送分析のために採取した。
【００７９】
データの解釈
VDR結合性およびHL60細胞分化
1D-QMS(Ki=2×10-10M)は、全長組換えラットビタミンD受容体に対する結合に関して[3H]-1,25(OH)2D3と競合する能力において天然ホルモン1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(Ki=2x10-10M)とほぼ同等の活性を有する(図1)。また、1D-QMSは、HL60分化を促進する能力(効果または有効性)において、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(EC50=3x10-9M)に比べてわずかに強力ではない(EC50=1×10-8M)(図2参照)。これらのデータはまた、1D-QMSが、細胞分化を引き起こす際および細胞増殖を抑制する際に直接的な細胞活性を有することから、特に骨肉腫、白血病、大腸がん、乳がん、皮膚がん、および前立腺がんを予防または処置するための、抗がん剤としての有意な活性を有することを示す。
【００８０】
ビタミンD欠乏動物における骨からのカルシウム動員および腸管カルシウム吸収
低カルシウム食(0.02%)を摂取するビタミンD欠乏ラットを使用して、腸管および骨中の1D-QMSおよび1,25(OH)2D3の活性を試験した。予想通り、天然ホルモン(1,25(OH)2D3)は試験投与量で血清カルシウムレベルを増加させた(図3)。図3はまた、1D-QMSが、骨からカルシウムを動員する際の1,25(OH)2D3とほぼ同等の活性を有することを示す。1D-QMSの780pmol/日で連続4日間の投与により、有意な骨カルシウム動員が生じた。1D-QMSおよび天然ホルモンを投与する場合にいずれも780pmolで血清カルシウムの有意な増加が観察されることから、1D-QMSは骨カルシウムストアを放出する際に天然ホルモンと同等である。
【００８１】
腸管カルシウム輸送を同一の動物群において反転腸管法を使用して評価した(図4)。これらの結果は、化合物1D-QMSが、推奨されるより低い投与量で投与される場合に、腸管カルシウム輸送活性を促進する1,25(OH)2D3に比べてほぼ同等の能力を有することを示す。したがって、1D-QMSが試験用量において比較的に高い腸管カルシウム輸送活性を有すると結論づけることができる。
【００８２】
インビボにおける特徴的な活性プロファイルは、1-ヒドロキシル化が規則的に生じうることから、おそらくプロドラッグとして作用するこの化合物の能力のために明らかになり、該化合物の半減期は延長されると予測される。したがってこの類似体は、少ない頻度の用量投与が望ましい疾患、例えば、老人性骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症、ステロイド誘発性骨粗鬆症、低回転型骨粗鬆症、骨軟化症、および腎性骨異栄養症などの骨疾患の重要な療法として役立ちうる。
【００８３】
これらの結果は、1D-QMSが本明細書に記載の数多くのヒト療法のための優れた候補であることをさらに示す。1D-QMSは、(1)有意なVDR結合性、転写活性および細胞分化活性を有し、(2)容易に合成されることから、がんを処置するための優れた候補となる。
【００８４】
(20R)-25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3(1D-QM)の生物活性
2位に対するメチレン基の導入、ならびに炭素10においてメチレン置換基を有すること、および炭素20におけるメチル基を天然配置またはR配置に向けることは、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3に比べて、全長組換えラットビタミンD受容体への結合に対する効果をほとんどまたは全く示さなかった。化合物1D-QMは標準的1,25-(OH)2D3に比べてほぼ同等の親和性で該受容体に結合する(図5)。これらの結果からは、化合物1D-QMが同等の生物活性を有すると予想されうる。しかし驚くべきことに、化合物1D-QMは、独自の生物活性を有する非常に選択的な類似体である。
【００８５】
図8は、腸管カルシウム輸送を刺激する際に、1D-QMが、天然ホルモンである1,25-ジヒドロキシビタミンD3(1,25(OH)2D3)の活性に比べて比較的に高い活性を有することを示す。1D-QMは、腸管にわたる活性カルシウム輸送を促進する際に1,25(OH)2D3とほぼ同等である。
【００８６】
図7は、1D-QMが1,25(OH)2D3に比べて比較的に低い骨カルシウム動員活性を有することを示す。780pmol/ラットが投与されるまでほとんどまたは全く活性が観察されない一方で、天然ホルモンを投与する場合に87pmolで血清カルシウムの有意な増加が観察されることから、1D-QMは骨カルシウムストアを放出する際に天然ホルモンよりも強力ではない。
【００８７】
図6は、1D-QMが、HL-60細胞分化に関して1,25(OH)2D3とほぼ同等に強力であることから、がんの処置、特に骨肉腫、白血病、大腸がん、乳がん、皮膚がん、および前立腺がんの予防または処置のための優れた候補となることを示す。
【００８８】
データの解釈
VDR結合性およびHL60細胞分化
1D-QM(Ki=9x10-10M)は、全長組換えラットビタミンD受容体に対する結合に関して[3H]-1,25(OH)2D3と競合する能力において天然ホルモン1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(Ki=3x10-10M)とほぼ同等の活性を有する(図5)。また、1D-QMは、HL60分化を促進する能力(効果または有効性)において、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(EC50=3x10-9M)に比べてわずかに強力ではない(EC50=10-7M超)(図6参照)。これらのデータは、1D-QMが、細胞分化を引き起こす際および細胞増殖を抑制する際に直接的な細胞活性を有することから、特に骨肉腫、白血病、大腸がん、乳がん、皮膚がん、および前立腺がんを予防または処置するための、抗がん剤としての有意な活性を有することを示す。
【００８９】
ビタミンD欠乏動物における骨からのカルシウム動員および腸管カルシウム吸収
低カルシウム食(0.02%)を摂取するビタミンD欠乏ラットを使用して、腸管および骨中の1D-QMおよび1,25(OH)2D3の活性を試験した。予想通り、天然ホルモン(1,25(OH)2D3)は試験投与量で血清カルシウムレベルを増加させた(図7)。図7はまた、1D-QMが、骨からカルシウムを動員する際に1,25(OH)2D3よりも低い活性を有することを示す。1D-QMの87pmol/日で連続4日間の投与により、骨カルシウム動員はほとんどまたは全く生じなかった。780pmol/ラットが投与されるまでほとんどまたは全く活性が観察されない一方で、天然ホルモンを投与する場合に87pmolで血清カルシウムの有意な増加が観察されることから、1D-QMは骨カルシウムストアを放出する際に天然ホルモンよりも強力ではない。
【００９０】
腸管カルシウム輸送を同一の動物群において反転腸管法を使用して評価した(図8)。これらの結果は、化合物1D-QMが、推奨されるより低い投与量で投与される場合、腸管カルシウム輸送活性を促進する際には1,25(OH)2D3に比べて強力ではないことを示す。
【００９１】
インビボでの特徴的な活性プロファイルは、1-ヒドロキシル化が規則的に生じうることから、おそらくプロドラッグとして作用するこの化合物の能力のために明らかになり、該化合物の半減期は延長されると予測される。したがってこの類似体は、少ない頻度の用量投与が望ましい疾患、例えば、老人性骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症、ステロイド誘発性骨粗鬆症、低回転型骨粗鬆症、骨軟化症、および腎性骨異栄養症などの骨疾患の重要な療法として役立ちうる。
【００９２】
これらの結果は、1D-QMが本明細書に記載の数多くのヒト療法のための優れた候補であることをさらに示す。1D-QMは、(1)有意なVDR結合性および細胞分化活性を有し、(2)容易に合成されることから、がんを処置するための優れた候補となる。
【００９３】
予防および/または処置の目的で、式I、Ia、およびIbにより定義される本発明の化合物を、当技術分野において公知である従来の方法に従って、無害の溶媒中の溶液剤として、または好適な溶媒もしくは担体中の乳剤、懸濁液剤もしくは分散液剤として、または固体担体とともに丸剤、錠剤もしくはカプセル剤として、治療的適用のために製剤化することができる。任意のそのような製剤は、安定剤、抗酸化剤、結合剤、着色料、または乳化剤もしくは味覚変革剤などの他の薬学的に許容される無毒の賦形剤を含有してもよい。
【００９４】
式Iの化合物、特に式Iaの1D-QMSおよび式Ibの1D-QMを、経口投与、局所投与、非経口投与、直腸投与、経鼻投与、舌下投与、または経皮投与することができる。本化合物は、好適な滅菌溶液剤の注射もしくは静脈内注入によって、または消化管を経由する液体用量もしくは固体用量の形態で、または経皮適用に好適なクリーム剤、軟膏剤、パッチ剤、もしくは同様のビヒクルの形態で投与することが有利である。1日当たり0.01μg〜1000μg、好ましくは1日当たり約0.1μg〜約500μgの用量の化合物I、特に1D-QMSおよび1D-QMが予防および/または処置の目的に適しており、そのような用量は、当技術分野において十分理解されているとおり、処置すべき疾患、その重症度、および対象の応答に従って調整される。本化合物が作用特異性を示すことから、それぞれ単独で好適に投与することができるか、あるいは、異なる程度の骨塩動員およびカルシウム輸送刺激が有利であるとわかる状況では、段階的用量の別の活性ビタミンD化合物、例えば1α-ヒドロキシビタミンD2もしくはD3、または1α,25-ジヒドロキシビタミンD3とともに好適に投与することができる。
【００９５】
上述の処置において使用するための組成物は、有効成分としての上記式I、Ia、およびIbにより定義される化合物I、特に1D-QMSおよび1D-QMの有効量、ならびに好適な担体を含む。本発明に従って使用されるそのような化合物の有効量は、組成物1グラム当たり約0.01μg〜約1000μg、好ましくは組成物1グラム当たり約0.1μg〜約500μgであり、かつ、約0.01μg/日〜約1000μg/日、好ましくは約0.1μg/日〜約500μg/日の投与量で、局所投与、経皮投与、経口、投与直腸投与、経鼻投与、舌下投与、または非経口投与することができる。
【００９６】
化合物I、特に1D-QMSおよび1D-QMをクリーム剤、ローション剤、軟膏剤、局所パッチ剤、丸剤、カプセル剤もしくは錠剤、坐薬、エアロゾル剤として、または薬学的に無害でかつ許容される溶媒もしくは油中の溶液剤、乳剤、分散液剤もしくは懸濁液剤などの液体形態で製剤化することができ、そのような調製物は安定剤、抗酸化剤、乳化剤、着色料、結合剤、または味覚変革剤などの他の薬学的に無害または有益な成分をさらに含有しうる。
【００９７】
化合物I、特に1D-QMSおよび1D-QMは、前骨髄球の正常マクロファージへの分化を実行するために十分な量で投与することが有利でありうる。上記の投与量が好適であり、当技術分野において十分に理解されるとおり、疾患の重症度、ならびに対象の状態および応答に従って投与量を調整すべきであると理解される。
【００９８】
本発明の製剤は、有効成分と薬学的に許容されるその担体および任意で他の治療用成分との結合を含む。担体は、製剤の他の成分に適合性があってそのレシピエントに有害でないという意味で「許容される」ものでなければならない。
【００９９】
経口投与に好適な本発明の製剤は、それぞれ所定量の有効成分を含有するカプセル剤、サシェ剤、錠剤もしくは舐剤などの分離単位の形態; 散剤もしくは顆粒剤の形態; 水性液体もしくは非水性液体中の溶液剤もしくは懸濁液剤の形態; または水中油型乳剤もしくは油中水型乳剤の形態でありうる。
【０１００】
直腸投与用製剤は、有効成分とカカオバターなどの担体とを包含する坐薬の形態、または浣腸剤の形態でありうる。
【０１０１】
非経口投与に好適な製剤は、レシピエントの血液と等張性であることが好ましい有効成分の滅菌油性または水性調製物を好都合に含む。
【０１０２】
局所投与に好適な製剤としてはリニメント剤、ローション剤、塗布剤; クリーム剤、軟膏剤もしくはペースト剤などの水中油型もしくは油中水型乳剤; または液滴剤などの溶液剤もしくは懸濁液剤; またはスプレー剤などの、液体または半液体調製物が挙げられる。
【０１０３】
経鼻投与では、スプレー缶、ネブライザーまたは噴霧器によって分配される散剤、自己推進式（self-propelling）製剤またはスプレー製剤の吸入を使用することができる。製剤は分配される場合に10〜100μの範囲の粒径を有することが好ましい。
【０１０４】
製剤は用量単位形態で好都合に提示することができ、薬学分野において周知の方法のいずれかによって調製することができる。「用量単位」という用語は、有効成分それ自体を含むかまたは固体もしくは液体の薬学的な希釈剤もしくは担体とのその混合物を含む、物理的および化学的に安定な単位用量として、患者に投与可能な一体の、すなわち単一の用量を意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2014532621.tif 000069
【国際調査報告】
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2014532621.tif 000071
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