(57)【要約】  本発明は、改善された特性を有するＦｃ含有ポリペプチドの産生のための方法および組成物を対象とする。【選択図】図１
2014532661.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする患者における免疫応答を増強し、シアル酸化Ｎ‐グリカンを含むＦｃ含有ポリペプチドの治療的有効量を該患者に投与することを含む方法であって、ここで該シアル酸化Ｎ‐グリカン中の該シアル酸残基がα‐２，３結合を含有し、ならびに該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％がＳＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む、前記の方法。
【請求項２】
該患者が感染性疾患または新生物疾患に罹患しているかまたは発症する危険にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％がＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該Ｆｃポリペプチドが抗体または抗体フラグメントである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
該Ｆｃポリペプチドが配列番号６または配列番号７から本質的に構成される抗体フラグメントである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
該Ｆｃ含有ポリペプチドが配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列、さらに親ポリペプチドにおけるシアル酸含量と比較した場合に、増加したシアル酸含量をもたらす一または複数の突然変異を含むかまたはから本質的に構成される抗体または抗体フラグメントである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
該Ｆｃ含有ポリペプチドが、該Ｆｃ領域の位置２４３および２６４に突然変異を含む（ここで番号付はＫａｂａｔと同様にＥＵインデックスに準拠している）抗体または抗体フラグメントである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該Ｆｃ含有ポリペプチドが、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較した場合に、以下の特性、ａ）増加したエフェクター機能ｂ）増加した免疫細胞リクルート能、およびｃ）増加した炎症性の一または複数を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Ｆｃ含有ポリペプチドを含む医薬製剤であって、ここで該Ｆｃ含有ポリペプチドがシアル酸化Ｎ‐グリカンを含み、該シアル酸化Ｎ‐グリカン中の該シアル酸化残基がα‐２，３結合を含み、ならびに該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％がＳＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む、前記の医薬製剤。
【請求項１０】
該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％がＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む、請求項９に記載の医薬製剤。
【請求項１１】
該Ｆｃ含有ポリペプチドが、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較した場合に、以下の特性、（ａ）増加したエフェクター機能；（ｂ）増加した免疫細胞リクルート能；および（ｃ）増加した炎症性の一または複数を有する、請求項９〜１０のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１２】
該Ｆｃ含有ポリペプチドが、配列番号６または配列番号７から本質的に構成される抗体フラグメントである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１３】
該Ｆｃ含有ポリペプチドが、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列、さらに親ポリペプチドにおけるシアル酸含量と比較した場合に、増加したシアル酸含量をもたらす一又は複数の突然変異を含むかまたはから構成される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１４】
該Ｆｃ含有ポリペプチドが、該Ｆｃ領域の位置２４３および２６４に突然変異を含む（ここで番号付はＫａｂａｔと同様にＥＵインデックスに準拠している）抗体または抗体フラグメントである、請求項１３に記載の医薬製剤。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトまたは動物の治療剤として有用であるＦｃ含有ポリペプチドの産生のための方法および組成物を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
治療タンパク質はしばしば、所期の応答を生じさせるために、内在性タンパク質または生理的成分との会合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）または結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）によってその治療効果を達成する。例えば、モノクローナル抗体はしばしば、二の結合事象によってその治療効果を達成する。第一に、抗体の可変ドメインが標的細胞上の特異的タンパク質、例えば癌細胞の表面上のＣＤ２０に結合する。この後に、該抗体の定常領域（Ｆｃ）に結合して、該抗体が結合した細胞を破壊するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等のエフェクター細胞のリクルートメントが続く。この過程は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）として知られており、ＩｇＧ１ｓの重鎖のＦｃ領域内のＡｓｎ２９７における特異的なＮ‐グリコシル化事象に依存する（Ｒｏｔｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：１１１３‐１１２３（１９８９））。このＮ‐グリコシル化構造を欠く抗体は、なお抗原に結合するがＡＤＣＣを媒介することができず、これは明らかにＮＫ細胞の表面上のＦｃ受容体であるＦｃγＲＩＩＩａに対する該抗体のＦｃドメインの低下した親和性の結果である。
【０００３】
Ｎ‐グリコシル化の存在が抗体のエフェクター機能において役割を果たすばかりでなく、Ｎ‐結合型オリゴ糖の特定の構成物がまたその最終機能にとって重要である。フコースの欠如または二分岐Ｎ‐アセチルグルコサミンの存在は、ＡＤＣＣ活性の効力と相互に正に関連づけられている（Ｒｏｔｈｍａｎ（１９８９），Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６‐１８０（１９９９）、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３‐２６７４０（２００２），ａｎｄ  Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６‐３４７３（２９９３））。Ｆｃ領域におけるシアル酸化が静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の抗炎症特性に正に相互に関連づけられるという証拠も存在する。例えば、Ｋａｎｅｋｏ  Ｅｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３：６７０‐６７３，２００６；Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，：１１‐１５，２００７を参照されたい。
【０００４】
抗体の機能および効力における特定のＮ‐グルコシル化の有用性を考えると、抗体の機能を修飾するためには、抗体内のＮ‐結合型オリゴ糖の構成物を修飾する方法が望ましいであろう。特に、抗体等のＦｃ含有ペプチドに増加または増強した免疫細胞活性化能を与えるためには、Ｎ‐結合型オリゴ糖の構成物を修飾することが望ましいであろう。当該抗体は、感染性疾患または新生物疾患を治療するために、ならびにワクチン用のアジュバントとして役立つために使用され得る。
【０００５】
酵母および他の真菌の宿主は、組換えタンパク質の産生のための重要な産生構築基盤（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）である。酵母は真核生物であり、従って、分泌経路において生じる翻訳後修飾の多くを含む、高等真核細胞と共通の進化的過程を共有する。糖鎖工学における最近の進歩は、ヒトにおけるグリコシル化の過程を模倣する一連の酵素過程を実行可能とする、遺伝的に修飾されたグリコシル化過程を有する酵母菌株ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の細胞株をもたらした。例えば、ヒトのカウンターパーツと実質的に同一である組換え糖タンパク質を下等真核生物宿主細胞において産生するための方法が記載されている、米国特許第７，０２９，８７２号、７，３２６，６８１号および７，４４９，３０８号を参照されたい。前記の方法により酵母において産生されたと同様のヒト様シアル酸化二分岐複合Ｎ‐結合型グリカンは、治療的糖タンパク質の産生のための有用性が証明されている。従って、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等の酵母における抗体産生をさらに修飾または改善する方法が望ましいであろう。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、それを必要とする患者における免疫応答を増強する方法を含み、親ポリペプチドにおけるα‐２，３結合含量と比較して増加したα‐２，３結合型シアル酸含量を含むＦｃ含有ポリペプチドの治療的有効量を該患者に投与することを含む。一実施形態において、該患者は感染性疾患または新生物疾患に罹患しているかまたは発症する危険にある。
【０００７】
一実施形態において該α‐２，３結合型シアル酸含量は、該Ｆｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域に一または複数の突然変異を導入することによって（親ポリペプチドにおけるα‐２，３結合含量と比較して）増加される。
【０００８】
一実施形態において、該α‐２，３結合型シアル酸の含量は、α‐２，３‐シアル酸転移酵素を有する宿主細胞内で該Ｆｃ含有ポリペプチドを発現することによって（親ポリペプチドにおけるα‐２，３結合含量と比較して）増加される。他の実施形態において、該α‐２，３結合型シアル酸の含量は、α‐２，３‐シアル酸転移酵素をコードする核酸により形質転換された宿主細胞内で該Ｆｃ含有ポリペプチドを発現することによって（親ポリペプチドにおけるα‐２，３結合含量と比較して）増加される。一実施形態において、該宿主細胞は哺乳動物細胞である。一実施形態において、該宿主細胞は下等真核宿主細胞である。一実施形態において、該宿主細胞は真菌宿主細胞である。一実施形態において、該宿主細胞はピキア属菌種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）である。一実施形態において、該宿主細胞はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
【０００９】
一実施形態において、該α‐２，３結合型シアル酸含量は、該Ｆｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域内に一または複数の突然変異を導入することによって、ならびにα‐２，３‐シアル酸転移酵素をコードする核酸により形質転換された宿主細胞において該Ｆｃ含有ポリペプチドを発現することによって（親ポリペプチドにおけるα‐２，３結合含量と比較して）増加される。
【００１０】
一実施形態において、本発明は、それを必要とする患者における免疫応答を増強する方法を含み、シアル酸化Ｎ‐グリカンを含むＦｃ含有ポリペプチドの治療的有効量を該患者に投与することを含むが、ここで該シアル酸化Ｎ‐グリカン内の該シアル酸残基はα‐２，３結合を含有し、ならびに該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該シアル酸化Ｎ‐グリカン内の該シアル酸残基は、もっぱらα‐２，３結合により付加されている。一実施形態において、該患者は感染性疾患または新生物疾患に罹患しているか、または発症する危険にある。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ２Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも８０％は、ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。上記の実施形態のいずれにおいてもＳＡは、ＮＡＮＡもしくはＮＧＮＡ、またはＮＡＮＡもしくはＮＧＮＡの類似体もしくは誘導体であり得る。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｎ‐グリカンはフコースを欠く。他の実施形態において、該Ｎ‐グリカンはコアフコースをさらに含む。
【００１１】
一実施形態において、本発明は、それを必要とする患者における免疫応答を増強する方法を含み、シアル酸化Ｎ‐グリカンを含むＦｃ含有ポリペプチドの治療的有効量を該患者に投与することを含むが、ここで該シアル酸化Ｎ‐グリカン内の該シアル酸残基はα‐２，３結合を含有し、ならびに該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（１‐４）Ｍａｎ（＞＝３）ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ（１‐３）Ｇａｌ（１‐３）ＧｌｃＮＡｃ（１‐３）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるオリゴ糖構造を含む。上記の実施形態のいずれにおいてもＳＡは、ＮＡＮＡもしくはＮＧＮＡ、またはＮＡＮＡもしくはＮＧＮＡの類似体もしくは誘導体であり得る。一実施形態において、該シアル酸化Ｎ‐グリカン内の該シアル酸残基は、もっぱらα‐２，３結合により付加されている。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、患者における新生物疾患（腫瘍）を治療する方法を含み、シアル酸化Ｎ‐グリカンを含むＦｃ含有ポリペプチドの治療的有効量を該患者に投与することを含むが、ここで該シアル酸化Ｎ‐グリカン内の該シアル酸残基はα‐２，３結合を含有し、ならびに該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該シアル酸化Ｎ‐グリカン内の該シアル酸残基は、もっぱらα‐２，３結合により付加されている。一実施形態において、該患者は感染性疾患または新生物疾患に罹患しているか、または発症する危険にある。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ２Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３
ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも８０％は、ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。上記の実施形態の何れにおいてもＳＡは、ＮＡＮＡもしくはＮＧＮＡ、またはＮＡＮＡもしくはＮＧＮＡの類似体もしくは誘導体であり得る。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｎ‐グリカンは、フコースを欠く。他の実施形態において、該Ｎ‐グリカンは、コアフコースをさらに含む。
【００１３】
上記の実施形態のいずれにおいても該Ｆｃポリペプチドは、シアル酸化Ｎ‐グリカンを含む抗体または抗体フラグメントであり得る。一実施形態において、該Ｆｃポリペプチドは、完全長抗体の重鎖のＡｓｎ２９７部位に相当する位置にＮ‐グリカンを含む（ここで番号付はＫａｂａｔにおけると同様のＥＵインデックスに準拠している）。一実施形態において、該Ｆｃポリペプチドは、配列番号６または配列番号７を含むかまたはから本質的に構成される抗体または抗体フラグメントである。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列、さらに該親ポリペプチドにおける該シアル酸含量と比較した場合に、増加したシアル酸含量をもたらす一または複数の突然変異を含むかまたはから本質的に構成される。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列、さらに該親ポリペプチドの該シアル酸含量と比較した場合に、増加したシアル酸含量をもたらす一、二、三または四の突然変異を含むかまたはから本質的に構成される。一実施形態において、該親ポリペプチドは、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、該Ｆｃ領域の２４３位に突然変異を含む抗体または抗体フラグメントである（ここで番号付はＫａｂａｔにおけると同様のＥＵインデックスに準拠している）。一実施形態において、該突然変異はＦ２４３Ａである。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、該Ｆｃ領域の２６４位に突然変異を含む抗体または抗体フラグメントである（ここで番号付はＫａｂａｔにおけると同様のＥＵインデックスに準拠している）。一実施形態において、該突然変異はＶ２６４Ａである。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、該Ｆｃ領域の位置２４３および２６４に突然変異を含む抗体または抗体フラグメントである（ここで番号付はＫａｂａｔにおけると同様のＥＵインデックスに準拠している）。一実施形態において、該突然変異は、Ｆ２４３ＡおよびＶ２６４Ａである。
【００１４】
一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較した場合に以下の特性、増加したエフェクター機能、増加した免疫細胞リクルート能および増加した炎症性の一または複数の特性を有する。
【００１５】
本発明はまた、それを必要とする患者における免疫応答を増強する方法であって、Ｎ‐グリカンを含むＦｃ含有ポリペプチドの治療的有効量を該患者に投与することを含む前記の方法も含むが、ここで該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるオリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該シアル酸残基は、もっぱらα‐２，３結合により付加されている。一実施形態において、該患者は、感染性疾患または新生物疾患に罹患しているか、または発症する危険にある。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ２Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、Ｆｃ含有ポリペプチド上のＮ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から構成されるＮ-結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも８０％は、ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。上記の実施形態のいずにおいてもＳＡは、ＮＡＮＡもしくはＮＧＮＡ、またはＮＡＮＡもしくはＮＧＮＡの類似体もしくは誘導体であり得る。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から構成されるＮ-結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｎ‐グリカンはフコースを欠く。他の実施形態において、該Ｎ‐グリカンはコアフコースをさらに含む。
【００１６】
本発明はまた、それを必要とする患者における免疫応答を増強する方法であって、シアル酸化Ｎ‐グリカンを含むＦｃ含有ポリペプチドの治療的有効量を該患者に投与することを含む前記の方法も含み、ここで該Ｆｃ含有ポリペプチド内の該シアル酸残基はα‐２，３結合を含有し、ならびに該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列、さらに該親ポリペプチドにおけるシアル酸含量と比較した場合に、増加したシアル酸含量をもたらす一または複数の突然変異を含むかまたはから構成される。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列、さらに該親ポリペプチドのシアル酸含量と比較した場合に、増加したシアル酸含量をもたらす一、二、三または四の突然変異を含む。一実施形態において、該親ポリペプチドは、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるオリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上のＮ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも８０％は、ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該シアル酸化Ｎ‐グリカン内の該シアル酸残基は、もっぱらα‐２，３結合により付加されている。
【００１７】
本発明はまた、Ｆｃ含有ポリペプチドを含む医薬組成物も含み、ここで該Ｆｃ含有ポリペプチドはシアル酸化Ｎ‐グリカンを含むが、ここで該シアル酸化Ｎ‐グリカン内の該シアル酸残基は、もっぱらα‐２，３結合により付加されている。
【００１８】
本発明はまた、Ｆｃ含有ポリペプチドを含む医薬組成物も含み、ここで該Ｆｃ含有ポリペプチドはシアル酸化Ｎ‐グリカンを含み、該シアル酸化Ｎ‐グリカン内の該シアル酸残基はα２，３結合を含有し、ならびに該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、少なくともここで、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ２Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、少なくともここで、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から構成されるＮ-結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも８０％は、ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、少なくともここで、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から構成されるＮ-結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該シアル酸化Ｎ‐グリカン内の該シアル酸残基は、もっぱらα‐２，３結合により付加されている。一実施形態において、該Ｎ‐グリカンはフコースを欠く。他の実施形態において、該Ｎ‐グリカンはコアフコースをさらに含む。
【００１９】
医薬製剤を対象とする実施形態のいずれにおいても、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、シアル酸化Ｎ‐グリカンを含む抗体または抗体フラグメントであり得る。一実施形態において、該Ｆｃポリペプチドは、完全長抗体の重鎖のＡｓｎ２９７位に相当する位置にＮ‐グリカンを含む（ここで番号付はＫａｂａｔにおけると同様のＥＵインデックスに準拠している）。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列、さらに該親ポリペプチドにおけるシアル酸含量と比較した場合に、増加したシアル酸含量をもたらす一または複数の突然変異を含む抗体または抗体フラグメントである。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列、さらに該親ポリペプチドにおけるシアル酸含量と比較した場合に、増加したシアル酸含量をもたらす一、二、三または四の突然変異を含む抗体または抗体フラグメントである。一実施形態において、該親ポリペプチドは、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、該Ｆｃ領域の位置２４３位および２６４位に突然変異を含む抗体または抗体フラグメントである（ここで番号付はＫａｂａｔと同様にＥＵインデックスに準拠している）。一実施形態において、該突然変異はＦ２４３ＡおよびＶ２６４Ａである。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較した場合に以下の特性；増加したエフェクター機能、増加した免疫細胞リクルート能および増加した炎症性の一または複数の特性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、４Ｔ１‐Ｌｕｃ２モデルにおける種々の抗体の（腫瘍体積減少に基づく）抗腫瘍活性を示す。
【図２】図２は、４Ｔ１‐Ｌｕｃ２モデルにおける種々の抗体の（腫瘍容積減少に基づく）抗腫瘍活性を示す。
【図３】図３は、４Ｔ１‐Ｌｕｃ２モデルにおける種々の抗体の腫瘍増殖抑制（ＴＧＩ）を示す。
【図４】図４は、種々の抗体により処理された腫瘍移植マウス由来の胚組織への癌転移の画像を示す。
【図５】図５は、実施例４に記載のＡＩＡモデルにおけるα２，３シアル酸化Ｆｃの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
定義  用語「Ｇ０」は、本明細書で用いる場合、ガラクトースもフコースも含まない複合二分岐オリゴ糖ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を表す。
【００２２】
用語「Ｇ１」は、本明細書で用いる場合、フコースを含まず一のガラクトシル残基を含有する複合二分岐オリゴ糖ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を表す。
【００２３】
用語「Ｇ２」は、本明細書で用いる場合、フコースを含まず二のガラクトシル残基を含有する複合二分岐オリゴ糖Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を表す。
【００２４】
用語「Ｇ０Ｆ」は、本明細書で用いる場合、一のコアフコースを含みガラクトースを含まない複合二分岐オリゴ糖ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｆを表す。
【００２５】
用語「Ｇ１Ｆ」は、本明細書で用いる場合、一のコアフコースおよび一のガラクトシル残基を含有する複合二分岐オリゴ糖ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｆを表す。
【００２６】
用語「Ｇ２Ｆ」は、本明細書で用いる場合、一のコアフコースおよび二のガラクトシル残基を含有する複合二分岐オリゴ糖Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｆを表す。
【００２７】
用語「Ｍａｎ５」は、本明細書で用いる場合、下記に示すオリゴ糖構造を表す。
【化１】
2014532661.tif 000003
【００２８】
用語「ＧＦＩ５．０」は、本明細書で用いる場合、主としてＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ‐グリカンを有する糖タンパク質を産生する糖鎖工学的に操作されたキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を表す。
【００２９】
用語「ＧＦＩ６．０」は、本明細書で用いる場合、主としてＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ‐グリカンを有する糖タンパク質を産生する糖鎖工学的に操作されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を表す。
【００３０】
用語「ＧＳ５．０」は、本明細書で用いる場合、Ｎ‐グリコシル化構造Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を表す。
【００３１】
用語「ＧＳ５．５」は、本明細書で用いる場合、Ｎ‐グリコシル化構造ＳＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を表し、α‐２，６シアル酸転移酵素が糖鎖工学的に操作されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株においてそれが産生された場合には、α‐２，６結合型シアル酸をもたらし、ならびにα‐２，３‐シアル酸転移酵素が糖鎖工学的に操作されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｔｏｒｉｓ）株においてそれが産生された場合には、α‐２，３結合型シアル酸をもたらし、ならびにα２，６シアル酸転移酵素およびα‐２，３‐シアル酸転移酵素が糖鎖工学的に操作されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｔｏｒｉｓ）株においてそれが産生された場合には、α‐２，６およびα‐２，３結合型シアル酸の分子種をもたらす。ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において産生されるシアル酸は、シアル酸がＮ‐グリコシルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）とＮＡＮＡの混合物となるＣＭＰ‐ＮＡＮＡヒドロラーゼを発現するように菌株が糖鎖工学的に操作されていなければ、Ｎ‐アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）型である。
【００３２】
用語「ＧＳ６．０」は、本明細書で用いる場合、Ｎ‐グリコシル化構造ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を表し、α‐２，６シアル酸転移酵素が糖鎖工学的に操作されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株においてそれが産生された場合には、α‐２，６結合型シアル酸をもたらし、ならびにα‐２，３‐シアル酸転移酵素が糖鎖工学的に操作されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｔｏｒｉｓ）株においてそれが産生された場合にはα‐２，３結合型シアル酸をもたらし、ならびにα２，６シアル酸転移酵素およびα‐２，３‐シアル酸転移酵素が糖鎖工学的に操作されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｔｏｒｉｓ）株においてそれが産生された場合には、α‐２，６およびα‐２，３結合型シアル酸の分子種をもたらす。ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において産生されたシアル酸は、シアル酸がＮ‐グリコシルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）とＮＡＮＡの混合物となるＣＭＰ‐ＮＡＮＡヒドロラーゼを発現するように菌株が糖鎖工学的に操作されていなければ、Ｎ‐アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）型である。
【００３３】
用語「野生株」または「ｗｔ」は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株に関連して本明細書で用いる場合、グリコシル化を制御するようには遺伝子操作を受けていない自然のピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を表す。
【００３４】
用語「抗体」は、本明細書で用いる場合、免疫グロブリン分子の可変領域内に位置する少なくとも一の抗原認識部位により特異抗原へ結合する能力のある免疫グロブリン分子を表す。本明細書で用いる場合、用語は、４のポリペプチド鎖、即ち各々の対が一の「軽」鎖（ＬＣ）（約２５ｋＤａ）および一の「重」鎖（ＨＣ）（約５０〜７０ｋＤａ）を有する、二の同一のポリペプチド鎖対から構成されるインタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体ばかりでなく、またそのフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ‘）２、Ｆｖ、一本鎖（ＳｃＦｖ）、その変異体、二重特異的形態、抗体部分を含む融合タンパク質、ならびに抗原認識部位およびＣＨ２ドメインのＮ‐結合型グリコシル化部位を含む重鎖免疫グロブリン定常領域の少なくともＣＨ２ドメインの一部を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾立体配置、等の該抗体のフラグメントをも表す。本明細書で用いる場合、用語には、それぞれＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ等のいかなるクラスの抗体も含まれる。
【００３５】
用語「コンセンサス配列ＣＨ２」は、本明細書で用いる場合、種々の抗体由来のＣＨ２ドメインにおいて見出される最も共通のアミノ酸配列に由来した、Ｎ‐結合型グリコシル化部位を含有する重鎖定常領域のＣＨ２ドメインのアミノ酸配列を表す。
【００３６】
用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域またはいわゆるエフェクター領域を規定するために用いられる。該「Ｆｃ領域」は、天然配列型Ｆｃ領域または変異型Ｆｃ領域であってよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、位置Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０のアミノ酸残基からそのカルボキシル末端までの一続きであると定義される。免疫グロブリンは二の定常領域、ＣＨ２およびＣＨ３を含み、ならびに任意にヒンジ領域を含み得る。一実施形態において、該Ｆｃ領域は配列番号６のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、該Ｆｃ領域は配列番号７のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、該Ｆｃ領域は、３‘末端にリジン（Ｋ）残基の付加を伴う配列番号６のアミノ酸配列を含む。該Ｆｃ領域は、完全長抗体の重鎖のＡｓｎ２９７位に相当するＣＨ２ドメインにおける単一のＮ‐結合型グリコシル化部位を含有する（ここで番号付はＫａｂａｔにおけると同様のＥＵインデックスに準拠している）。
【００３７】
用語「Ｆｃ含有ポリペプチド」は、ＣＨ２ドメイン内にＮ‐結合型グリコシル化部位を保持しかつ免疫細胞リクルート能を保持するＦｃ領域またはＦｃ領域のフラグメントを含む、抗体またはイムノアドヘシン等のポリペプチドを表す。この用語は、単量体か二量体かいずれかの化学種としてＦｃ領域を含むかまたはから構成される（またはから本質的に構成される）ポリペプチドを包含する。Ｆｃ領域を含むポリペプチドは、抗体のパパイン消化によってまたは組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。
【００３８】
用語「親抗体」、「親免疫グロブリン」または「親Ｆｃ含有ポリペプチド」は、本明細書で用いる場合、本明細書に開示されるＦｃ領域の突然変異を欠く抗体またはＦｃ含有ポリペプチドを表す。親Ｆｃ含有ポリペプチドは、天然配列型Ｆｃ領域または既存のアミノ酸配列修飾を有するＦｃ領域を含んでよい。天然配列型Ｆｃ領域は、自然界に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列型Ｆｃ領域には、天然配列型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域、天然配列型ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域、天然配列型ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域および天然配列型ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域、ならびに自然発生のその変異型が含まれる。比較手段として用いられる場合、親抗体または親Ｆｃ含有ポリペプチドはいかなる細胞においても発現され得る。一実施形態において、親抗体または親Ｆｃ含有ポリペプチドは、本発明のＦｃ含有ポリペプチドと同じ細胞において発現される。
【００３９】
本明細書で用いる場合、用語「イムノアドヘシン」は、異種の「アドヘシン」タンパク質（例えば、受容体、リガンドまたは酵素）の「結合ドメイン」と免疫グロブリン定常ドメインとを兼ね備えた抗体様分子を示す。構造的には、該イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を有し、抗体の抗原認識および結合部位（抗原結合部位）の配列以外（即ち、「異種」」）のアドヘシンアミノ酸配列と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合体を含む。用語「リガンド結合ドメイン」は、本明細書で用いる場合、いかなる天然細胞表面受容体または少なくとも相当する天然受容体の定性的なリガンド結合能を保持するいかなる領域またはその誘導体をも表す。特定の実施形態において、該受容体は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーと相同である細胞外ドメインを有する細胞表面ポリペプチド由来である。免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーではないがそれでもこの定義に特に含まれる他の受容体には、サイトカインに対する受容体、特にチロシンキナーゼ活性を有する受容体（受容体チロキシナーゼ）、問題となっている疾患に動物が罹病し易くするヘマトポエチンおよび神経成長因子のメンバーがある。一実施形態において、該疾患は癌である。イムノアドヘシンの作製法は当該技術分野において周知である。例えば、ＷＯ００／４２０７２を参照されたい。
【００４０】
用語「Ｆｃ突然変異タンパク質抗体」は、本明細書で用いる場合、Ｆｃ領域において一または複数の突然変異を含む抗体を表す。
【００４１】
用語「Ｆｃ突然変異タンパク質」は、本明細書で用いる場合、Ｆｃ領域に対して一または複数の点突然変異が作成されたＦｃ含有ポリペプチドを表す。
【００４２】
用語「Ｆｃ突然変異」は、本明細書で用いる場合、Ｆｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域に施された突然変異を表す。このような突然変異の例には、Ｆ２４３ＡまたはＶ２６４Ａ突然変異が含まれる（番号付はＫａｂａｔにおけると同様のＥＵインデックスに準拠している）。例えば、用語「Ｆ２４３Ａ」は、Ｆｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域の２４３位におけるＦ（野生型）からＡへの突然変異を表す。用語「Ｖ２６４Ａ」は、Ｆｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域の２６４位におけるＶ（野生型）からＡへの突然変異を表す。位置２４３位および２６４位は、Ｆｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域のＣＨ２ドメインにおけるアミノ酸位置を表す。用語「二重Ｆｃ突然変異タンパク質」は、本明細書で用いる場合、突然変異Ｆ２４３ＡおよびＶ２６４Ａを含むＦｃ含有ポリペプチドを表す。
【００４３】
本明細書および請求項の全体を通して、免疫グロブリン重鎖またはＦｃ含有ポリペプチドにおける残基の番号付は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（免疫学的に重要なタンパク質配列），５ｔｈ  Ｅｄ．（第５版）Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）におけると同様のＥＵインデックスの番号付であり、明示的に本明細書で援用する。「Ｋａｂａｔにおけると同様のＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基番号付を表す。
【００４４】
用語「エフェクター機能」は、本明細書で用いる場合、ＦＣ受容体またはリガンドとの抗体Ｆｃ領域の相互作用から生じる生化学的事象を表す。典型的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞介在細胞傷害（ＡＤＣＣ）；抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーション、等が含まれる。このようなエフェクター機能は、当該技術分野で既知の種々のアッセイ法を使用して評価され得る。
【００４５】
用語「糖鎖工学的に操作されたピキア・パストリス（ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）」は、本明細書で用いる場合、ヒト様Ｎ‐グリカンを発現するように遺伝子改変されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の菌株を表す。例えば、上記のＧＧＩ５．０、ＧＦＩ５．５およびＧＦＩ６．０である。
【００４６】
用語「Ｎ‐グリカン」、「糖タンパク質」および「グリコフォーム」は、本明細書で用いる場合、Ｎ‐結合型オリゴ糖、例えば、アスパラギン‐Ｎ‐アセチルグルコサミン結合によってポリペプチドのアスパラギン残基に付加されているＮ‐結合型オリゴ糖を表す。糖タンパク質に見出される主要な糖は、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ‐アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ‐アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸（ＮＡＮＡ，ＮＧＮＡを含むＳｉａまたはＳＡ、ならびにアセチル化ＮＡＮＡまたはアセチル化ＮＧＮＡを含むその誘導体および類似体）である。糖鎖工学的に操作されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）においてシアル酸は、菌株がＮＡＮＡをＮＧＮＡに転換するためにＣＭＰ‐ＮＡＮＡヒドロキシラーゼを発現するようにさらに糖鎖工学的に操作されない限り、もっぱらＮ‐アセチル‐ノイラミン酸（ＮＡＮＡ）である（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３（５７９２）：１４４１‐１４４３（２００６））。Ｎ‐グリカンは共通の五糖コアＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有し、ここで「Ｍａｎ」はマンノースを表し、「Ｇｌｃ」はグルコースを表し、「ＮＡｃ」はＮ‐アセチルを表しならびにＧｌｃＮＡｃはＮ‐アセチルグルコサミンを表す。Ｎ‐グリカンは、「トリマンノースコア」、「五糖コア」または「小マンノースコア」とも称される、コア構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）に付加される周辺糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコースおよびシアル酸）を含む分岐（アンテナ）の本数に関して異なる。Ｎ‐グリカンはその分岐構成成分に従って分類される（例えば、高マンノース型、複合型またはハイブリッド型）。
【００４７】
本明細書で用いる場合、用語「シアル酸」または「ＳＡ」または「Ｓｉａ」は、これに限られるものではないが、Ｎ‐アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＡｃまたはＮＡＮＡ）、Ｎ‐グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）およびそのいずれかの類似体または誘導体を含む（シアル酸分子のいずれかの位置でのアセチル化から生じるものを含む）、シアル酸ファミリーのいずれかのメンバーを表す。シアル酸は、多数の複合糖質の必須構成成分である約３０の天然に生じる酸性炭水化物の一群に対する総称である。Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１１，２７０‐２７１（１９８３）。シアル酸は典型的には、オリゴ糖の非還元末端または最終末端に存在する。ヒトにおいてシアル酸は通常、オリゴ糖の末端残基である。Ｎ‐アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）は最も一般的なシアル酸の形態であり、Ｎ‐グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）は二番目に一般的な形態である。Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１，４４９‐４５２（１９９１）。ＮＧＮＡは動物界の広い範囲に分布しており、種および組織によって、しばしば複合糖質結合シアル酸のかなりの割合を占める。ニワトリおよびヒト等の一定の種は例外であり、なぜならば、それらは正常組織においてＮＧＮＡを欠くからである。Ｃｏｒｆｉｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ，１０，５‐５０（１９８２）。ヒト血清試料においてＮＧＮＡ形態のシアル酸のパーセンテージは、総シアル酸の０．０１％であると報告されている。Ｓｃｈａｕｅｒ，“Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ”，ｆｏｕｎｄ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ（「複合糖質の分子免疫学において見出される「複合糖質の抗原決定基としてのシアル酸」」），（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８）。
【００４８】
用語「ヒト様Ｎ‐グリカン」は、本明細書で用いる場合、操作されていない野生型ヒト細胞によって産生されたオリゴ糖に酷似するＮ‐結合型オリゴ糖を表す。例えば、野生型ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）および他の下等真核細胞は、典型的にはＮ‐グリコシル化部位において高マンノース型タンパク質を産生する。本明細書記載の宿主細胞は、高マンノース化されていないヒト様Ｎ‐グリカンを含む糖タンパク質（例えば、抗体）を産生する。いくつかの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ハイブリッド型および／または複合型Ｎ‐グリカンを有するヒト様Ｎ‐グリカンを産生し得る。本発明の宿主細胞から産生される特定の糖タンパク質上に存在する「ヒト様」グリカンの特定のタイプは、宿主細胞において実施される特定の糖鎖工学的操作のステップに依存するであろう。
【００４９】
用語「高マンノース」型Ｎ‐グリカンは、本明細書で用いる場合、５以上のマンノース残基を有するＮ‐グリカンを表す。
【００５０】
用語「複合」型Ｎ‐グリカンは、本明細書で用いる場合、１，３マンノースアームに結合した少なくとも一のＧｌｃＮＡｃおよび「トリマンノース」コアの１，６マンノースアームに結合した少なくとも一のＧｌｃＮＡｃを有するＮ‐グリカンを表す。複合型Ｎ‐グリカンはまた、シアル酸または誘導体（例えば、「ＮＡＮＡ」または「ＮｅｕＡｃ」、ここで「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を「Ａｃ」はアセチルを表す）により任意に修飾されるガラクトース（「Ｇａｌ」）またはＮ‐アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基を有してもよい。複合型Ｎ‐グリカンはまた、「二分岐」ＧｌｃＮＡｃおよびコアフコース（「Ｆｕｃ」）を含む鎖内置換を有してもよい。一例をあげると、Ｎ‐グリカンがトリマンノースコア上に二分岐ＧｌｃＮＡｃを含む場合に、構造はＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（ＧｌｃＮＡｃ）またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ３と示され得る。Ｎ‐グリカンがトリマンノースコアに結合したコアフコースを含む場合に、構造はＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）と示され得る。複合型Ｎ‐グリカンはまた、「トリマンノースコア」上に複数のアンテナを有することができ、しばしば「多アンテナグリカン」と表される。
【００５１】
用語「ハイブリッド型」（“ｈｙｂｒｉｄ”）Ｎ‐グリカンは、本明細書で用いる場合、トリマンノースコアの１，３マンノースアームの非還元末端上に少なくとも一のＧｌｃＮＡｃを有し、ならびにトリマンノースコアの１，６マンノースアームの非還元末端上にゼロまたは２以上の付加マンノースを有するＮ‐グリカンを表す。
【００５２】
糖タンパク質の調製品中に含まれるグリカンの「モルパーセント（モル百分率）」を表す場合に、該用語は、該タンパク質調製品がＰＮＧアーゼにより処理される場合に遊離され、その後にグリコフォーム組成物によって影響を受けない（例えば、２‐アミノベンズアミド等の蛍光標識によりＰＮＧアーゼで遊離したグリカンプールを標識し、その後に高速液体クロマトグラフィーまたはキャピラリ―電気泳動によって分離し、その後に蛍光強度によってグリカンを定量する）方法により定量された、Ｎ‐結合型オリゴ糖のプールに含まれる個々のグリカンのモルパーセントを意味する。例えば、５０モルパーセントのＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２は、遊離したグリカンの５０パーセントがＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２であり、残りの５０パーセントが他のＮ‐結合型オリゴ糖から構成されることを意味する。
【００５３】
「保存的に修飾された変異型」または「保存的置換」は、該変化がしばしばタンパク質の生物学的活性を変えることなく成され得るような、類似の特性（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、バックボーンコンホメーションおよび合成、等）を有する他のアミノ酸とタンパク質中のアミノ酸との置換を表す。当業者は、一般的にポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が実質的に生物学的な活性を変えないことを認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ（遺伝子の分子生物学），Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（４ｔｈ  Ｅｄ．（第４版））を参照されたい）。さらに、構造的または機能的に類似した複数のアミノ酸の置換は生物学的活性を破壊する可能性が低い。代表的な保存的置換を以下の表に掲載する。
【表１】
2014532661.tif 000004
【００５４】
Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７（ＥＵ番号付与系に準拠）における免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のグリコシル化は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を含むエフェクター経路の最適な認識および活性化のための必要条件であることが明らかにされた。Ｗｒｉｇｈｔ  ＆  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｏｇｙ，１５：２６‐３１（１９９７），Ｔａｏ  ＆  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３（８）：２５９５‐２６０１（１９８９）。それ自体、ＩｇＧの定常領域内のグリコシル化の糖鎖工学的操作は、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）開発にと
って活発な研究分野となった。Ａｓｎ２９７におけるＮ‐結合型グリコシル化の存在が、ＡＤＣＣ（Ｒｏｔｈｍａｎ（１９８９），Ｌｉｆｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，５：８１３‐８２２（１９９５），Ｕｍａｎａ（１９９９），Ｓｈｉｅｌｄｓ（２００２），ａｎｄ  Ｓｈｉｎｋａｗａ（２００３））および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）（Ｈｏｄｏｎｉｃｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，２１（６）：１６４４‐１６５２（２００５），ａｎｄ  Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６５：１１１‐１２８（１９９７））を含む免疫エフェクター機能アッセイにおけるｍＡｂ活性にとって重大な意味を持つことが証明された。機能に関するこの効果は、該グリコシル化Ｆｃドメインによって採用された特異的なコンホメーションに起因していたが、グリコシル化がない場合には該効果は欠如しているらしい。より具体的には、Ｆｃ  ＣＨ２ドメインにおけるグリコシル化を欠くＩｇＧは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを含むＦｃγＲに結合しない（Ｒｏｔｈｍａｎ（１９８９））。
【００５５】
グリコシル化の存在は、抗体のエフェクター機能において役割を果たすように思えるが、それだけではなく、Ｎ‐結合型オリゴ糖の個々の構成成分もまた重要である。例えば、フコースの存在は、インビトロでのＦｃγＲＩＩＩａ結合およびインビトロでのＡＤＣＣに関する顕著な効果を示す（Ｒｏｔｈｍａｎ（１９８９），ａｎｄ  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４（２）：２１００‐２１５（２００６））。ＣＨＯまたはＮＳ０等の哺乳動物の細胞培養によって産生された組換え抗体は、主としてフコシル化されたＮ‐結合型オリゴ糖を含有する（Ｈｏｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９５（５）：９４６‐９６０（２００６），Ｕｍａｎａ（１９９９），ａｎｄ  Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２１：１１‐１６（２００５））。さらに、Ｆｃ領域におけるシアル酸化が抗体に抗炎症性を付与し得るという証拠が存在する。シアル酸化形態を濃縮するためにレクチンカラムで精製された静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）は、シアル酸化Ｆｃフラグメントに限って明確な抗炎症効果を示し、抑制受容体ＦｃγＲＩＩｂの発現における増加と関連していた（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０４：１１‐１５（２００７））。
【００５６】
哺乳動物細胞株由来の抗体のＦｃ領域におけるグリコシル化は、典型的には複合フコシル化グリコフォームからなる優勢な形態を有する、グリコフォームの異種混合物：Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆおよび低い割合であるがＧ２Ｆ、から典型的には構成されている。Ｇ０Ｆ構造への不完全なガラクトース転移をもたらす可能性のある条件には、限定されるものではないが、β‐１，４ガラクトース転移酵素等の非適化ガラクトース転移装置、ならびにゴルジ装置中への不十分なＵＤＰ‐ガラクトース輸送、準最適な細胞培養およびタンパク質発現条件、ならびにオリゴ糖に隣接するアミノ酸残基による立体障害が含まれる。これらの条件の各々が端末ガラクトースの最終の度合いを調節し得る一方で、該Ｆｃオリゴ糖への引き続くシアル酸の転移はＣＨ２ドメインの閉じたポケット立体配置によって阻害されると考えられている。例えば、図１を参照されたい（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２４（１０）：１２３０‐１２３１，２００６）。妥当な末端単糖、特にガラクトースがなければ、または不適な端末ガラクトシル化形態では、シアル酸転移酵素の存在下で産生された場合でさえも、治療タンパク質として作用可能なシアル酸化形態を産生する可能性はほとんどない。ヒトＩｇＧ‐Ｆｃグリコフォームのタンパク質工学および構造解析は、グリコシル化のプロファイルが、Ｆｃのコンホメーションによって影響されることを示したが、例えば、Ｆ２４１、Ｆ２４３，Ｖ２６４、Ｄ２６５およびＲ３０１を含むＦｃポケット中の特定の単一アミノ酸がアラニンに突然変異した場合に、ＣＨＯ産生ＩｇＧ３に由来するオリゴ糖上のガラクトースおよびシアル酸の増加した濃度が達成され得ることが見出された（Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７（１１）：４９６３‐４９６９（１９９６））。一定の突然変異は、それぞれＦｃγＲＩおよびＣ１ｑ結合に対する代替マーカーとして使用される、細胞媒介性スーパーオキシド生成および補体媒介性赤血球溶解に関し多少の効果を有することがさらに明らかにされた。
【００５７】
高度に均一なグリコシル化を有する糖タンパク質を分泌可能な宿主株を作成するために、酵母が遺伝子操作された。Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ  １００（９）：５０２２‐５０２７（２００３）は、触媒ドメインを分泌経路に局在化させるために、真菌ＩＩ型膜タンパク質リーダー配列のライブラリーならびにα１，２マンノシダーゼ触媒ドメインおよびＮ‐アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ触媒ドメインのライブラリーを組み合わせた使用を記載している。このような方法で、インビボで均一なＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ‐グリカン構造を有する糖タンパク質を産生する菌株が単離された。Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３（５７９２）：１４４１‐１４４３（２００６）は、主としてビシアル酸化グリカン構造、ＧＳ６．０、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（９０．５％）およびモノシアル酸化グリカン構造、ＧＳ５．５、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（７．９％）から成るグリカン組成を有するものとして、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において生産された糖タンパク質、エリスロポエチンの生産を記載した。しかしながら、同様の菌株において産生される抗体は、抗体中の端末ガラクトース基質が相対的に低濃度であるために、著しく低含量のシアル酸化Ｎ‐グリカンしか有さないであろう。Ｆｃオリゴ糖のシアル酸化が治療静脈注射用ガンマグロブリンおよびそのＦｃフラグメントに抗炎症性を付与すること（Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３（５７８７）：６７０‐６７３（２００６）、ならびに抗炎症活性がα２，３結合ではなくα２，６結合のシアル酸形態に依存すること（Ａｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２０：３７３‐３７６（２００８））もまた最近明らかにされた。
【００５８】
本明細書で用いる場合、用語「新生物疾患（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）」には、異常で制御不能な細胞増殖からもたらさられるいかなる疾患も含まれる。新生物は、良性、前悪性（上皮内癌）または悪性（癌）であってよく、転移性または転移能があってもなくてもよい。
【００５９】
本明細書で用いる場合、用語「感染性疾患」には、生物の体内に侵入する細菌、真菌またはウイルス等の微生物または他の病原体によって引き起こされるいかなる容態も含まれる。宿主生物および細胞株
【００６０】
本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、いかなる宿主生物、細胞株またはコンピュータ内においても作成され得る。一実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、シアル酸化Ｎ‐グリカンを産生可能な宿主細胞において作成される。
【００６１】
一実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、該細胞が内因的にかまたは遺伝的もしくは工程的操作かのいずれかにより末端α‐２，３‐シアル酸だけを含有する糖タンパク質を産生する、哺乳動物細胞において作成される。培地中での哺乳動物細胞の増殖（組織培養）は常法となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例には、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎ＣＶ１株（ＣＯＳ‐７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎株（２９３細胞または懸濁培養増殖のためにサブクローンされた２９３細胞）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／‐ＤＨＦＲ（ＣＨＯ）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ‐７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ＿１５８７）；ヒト子宮頚部癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ５１）；ＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；ハイブリドーマ細胞株；ＮＳ０；ＳＰ２／０；およびヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）がある。
【００６２】
一実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、α‐２，３シアル酸化Ｎ‐グリカンを産生するように操作されている植物細胞において作成され得る。例えば、Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６）２４，１５９１‐１５９７（２００６）およびＣａｓｔｉｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２８５（２１）：１５９２３‐１５９３０（２０１０）を参照されたい。
【００６３】
一実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、α‐２，３シアル酸化Ｎ‐グリカンを産生するように操作されている昆虫細胞において作成し得る。例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊａｒｖｉｓ，Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．６８：１５９‐９１（２００６）を参照されたい。
【００６４】
一実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、α‐２，３シアル酸化Ｎ‐グリカンを産生するように操作されている細菌細胞において作成し得る。Ｌｉｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２２：４８８‐４９６（２０１１）を参照されたい。
【００６５】
一実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、下等真核宿主細胞または下等真核生物において作成し得る。最近の進歩は、下等真核宿主生物、酵母および糸状菌、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における完全ヒト化治療用物質の生産を可能とするが（米国特許第７，０２９，８７２号および米国特許第７，４４９，３０８号）、その開示内容は本明細書で援用する。またＪａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ４（１）：５８‐７０（２００９）も参照されたい。本出願人はここに、重鎖のＦｃ領域内の位置２４３および２６４におけるアミノ酸に二の突然変異を含む抗体を発現させることが可能な、修飾されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の宿主生物および細胞株をさらに開発した。これらの突然変異を有する抗体は、親抗体と比較した場合に、濃度の増加したおよびより均一な構成成分のα‐２，３結合型シアル酸型Ｎ‐グリカンを有した。
【００６６】
一実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、宿主細胞、より好ましくは端末α‐２，３‐シアル酸を含む主要なＮ‐グリカンを有する糖タンパク質を産生するように操作された酵母または糸状菌の宿主細胞において作成される。本発明の一実施形態において、主要なＮ‐グリカンは、いかなるα‐２，６結合型シリアル酸も産生しないα‐２，３シリアル酸転移酵素により糖鎖工学的に操作された菌株において産生される、α‐２，３結合形態のＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である。
【００６７】
本発明のＦｃ含有ポリペプチドを作成するために使用される細胞株は、いかなる細胞株でも、特に一または複数のα‐２，３
‐シアル酸化糖タンパク質を産生する能力を有する細胞株であり得る。当業者は、本明細書記載の材料および方法が、本明細書で例として提供されているピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の特定の菌株に限定されるものではなく、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３等の一または複数の末端ガラクトースを有するＮ‐グリカンが産生される、いかなるピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株または他の酵母または糸状菌株をも包含し得ることを認識し理解するであろう。末端ガラクトースは、α‐２，３結合型シアル酸の産生のための基質として働き、Ｎ‐グリカン構造ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２をもたらす。適切な菌株の例は、米国特許第７，０２９，８７２号、米国公開特許第２００６‐０２８６６３７号およびＨａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３（５７９２）：１４４１‐１４４３（２００６）に記載されており、それらの記載は、該記載が詳細に記載される通りに本明細書で援用する。
【００６８】
一般的に、酵母等の下等真核生物はタンパク質、特に糖タンパク質の発現に使用されるが、なぜならば、それらは経済的に培養可能であり、高収率をもたらし得、適切に修飾された場合に適切なグリコシル化が可能だからである。酵母は特に、迅速な形質転換、試験タンパク質局在化方法および簡便な遺伝子ノックアウト技術を可能とする確立された遺伝的特質を提供する。適切なベクターは、発現制御配列、例えば３‐ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素を含むプロモーター、および複製起点、終結配列および所望の同類のものを有する。
【００６９】
本発明は、本明細書ではメタノール資化性酵母ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を使用して示されているが、他の有用な下等真核宿主細胞には、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピキア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピキア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａａｅ）、ピキア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・ミヌータ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌータ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）、ピキア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピキア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピキア・テルモトルレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピキア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピキア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピキア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピキア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｃａ）、ピキア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クリベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ）、クリベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）が含まれる。種々の酵母、例えばＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）は、特に組織培養に適しているが、なぜならば、それらは高細胞密度まで増殖し得て、大量の組換えタンパク質を分泌し得るからである。同様に糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）および���の他も、本発明の糖タンパク質を工業的規模で生産するために使用し得る。
【００７０】
下等真核生物、特に酵母および糸状菌は、グルコシル化パターンがヒト様であるまたはヒト化されている糖タンパク質を、それらが発現するように遺伝的に修飾し得る。上記の通り、用語「ヒト様Ｎ‐グリカン」は、本明細書で用いる場合、操作されていない野生型ヒト細胞により産生されるオリゴ糖に酷似するＮ‐結合型オリゴ糖を表す。本発明の好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞は、ハイブリッド型Ｎ‐グリカンおよび／または複合型Ｎ‐グリカン；即ち「ヒト様Ｎ‐グリコシル化」を有するヒト様糖タンパク質を産生し得る。本発明の宿主細胞から産生される糖タンパク質上に主として存在する個々の「ヒト様」グリカンは、実施される個々の操作ステップに左右されるであろう。このようにして、特定の所望のグリコフォームが組成物中で優勢である糖タンパク質組成物が産生され得る。米国特許第７，４４９，３０８号に記載されるように、哺乳動物のグリコシル化経路の全部または一部を模倣するために、選択された内在性のグリコシル化酵素を除去し、および／または宿主細胞を遺伝子操作し、および／または外来性の酵素を供給することによってこれは達成され得る。必要に応じて、糖タンパク質がコアフコシル化を有しまたは有さずに産生され得るように、追加のグリコシル化の遺伝子操作が実施され得る。下等真核宿主細胞の使用は、糖タンパク質の主要なグリコフォームが組成物中の糖タンパク質の３０モル％以上存在し得るように、これらの細胞が高度に均一な糖タンパク質の組成物を産生し得る点でさらに有利である。特定の態様において、主要なグリコフォームは、組成物中に存在する糖タンパク質の４０モル％、５０モル％、６０モル％、７０モル％以上、ならびに最も好ましくは８０モル％以上で存在し得る。
【００７１】
下等真核生物、特に酵母は、その中でグリコシル化パターンがヒト様であるまたはヒト化されている糖タンパク質をそれらが発現するように、遺伝的に修飾され得る。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓらにより米国特許第７，４４９，３０８号に記載されるように、選択された内在性のグリコシル化酵素を除去しおよび／または外来性の酵素を供給することよってそれは達成され得る。例えば、宿主細胞は、（枯渇していなければ糖タンパク質上のＮ‐グリカンにマンノース残基を付加するであろう）１，６‐マンノース転移酵素活性が枯渇するように選択または操作され得る。
【００７２】
一実施形態において、該宿主細胞は、通常は該触媒ドメインと結合しておらず、該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に対するα１，２‐マンノシダーゼ活性を標的化するために選択された、細胞標的化シグナルペプチドに融合したα１，２‐マンノシダーゼ触媒ドメインをさらに含んでいる。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、主としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。例えば、米国特許第７，０２９，８７２号および第７，４４９，３０８号および米国公開特許出願第２００５／０１７０４５２号は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生することが可能な下等真核宿主細胞を開示する。
【００７３】
他の実施形態において、前記の宿主細胞は、通常は該触媒ドメインに結合せず、該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に対するＧｌｃＮＡｃ転移酵素Ｉ活性を標的化するために選択された、細胞標的化シグナルペプチドに融合したＧｌｃＮＡｃ転移酵素（ＧｎＴ  Ｉ）触媒ドメインをさらに含んでいる。該宿主のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、主としてＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号および第７，４４９，３０８号および米国公開特許出願第２００５／０１７０４５２号は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生することが可能な下等真核宿主細胞を開示する。上記の細胞において産生された糖タンパク質は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生するためにインビトロでヘキソサミニダーゼにより処理され得る。
【００７４】
他の実施形態において、前記の宿主細胞は、通常は該触媒ドメインに結合せず、該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に対するマンノシダーゼＩＩ活性を標的化するために選択された、細胞標的化シグナルペプチドに融合したマンノシダーゼＩＩ触媒ドメインをさらに含んでいる。該宿主のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、主としてＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号および米国公開特許出願第２００４／０２３００４２号は、マンノシダーゼＩＩ酵素を発現し、主としてＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを有する糖タンパク質を産生することが可能な下等真核宿主細胞を開示する。上記の細胞において産生された糖タンパク質は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生するために、インビトロでヘキソサミニダーゼにより処理され得る。
【００７５】
他の実施形態において、前記の宿主細胞は、通常は該触媒ドメインに結合せず、該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に対するＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＩ活性を標的化するために選択された、細胞標的化シグナルペプチドに融合したＧｌｃＮＡｃ転移酵素ＩＩ（ＧｎＴ  ＩＩ）触媒ドメインをさらに含んでいる。該宿主のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、主としてＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号および第７，４４９，３０８および米国公開特許出願第２００５／０１７０４５２号は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生することが可能な下等真核宿主細胞を開示する。上記の細胞において産生された糖タンパク質は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生するために、インビトロでヘキソサミニダーゼにより処理され得る。
【００７６】
他の実施形
態において、前記の宿主細胞は、通常は該触媒ドメインに結合せず、該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に対するガラクトース転移酵素活性を標的化するために選択された、細胞標的化シグナルペプチドに融合したガラクトース転移酵素触媒ドメインをさらに含んでいる。該宿主のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはその混合物を含む組換え糖タンパク質、例えば、主としてＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはその混合物を含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号および米国公開特許出願第２００６／００４０３５３号は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生することが可能な下等真核宿主細胞を開示する。上記の細胞において産生された糖タンパク質は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば主としてＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質組成物を産生するために、インビトロでガラクトシダーゼにより処理され得る。
【００７７】
他の実施形態において、前記の宿主細胞は、通常は該触媒ドメインに結合せず、該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に対するシアル酸転移酵素活性を標的化するために選択された、細胞標的化シグナルペプチドに融合したシアル酸転移酵素触媒ドメインをさらに含んでいる。好ましい実施形態において、シアル酸転移酵素は、α‐２，３‐シアル酸転移酵素である。該宿主のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、主としてＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはその混合物を含む組換え糖タンパク質を産生する。酵母および糸状菌等の下等真核宿主細胞にとって、該宿主細胞がＮ‐グリカンへの転移のためにＣＭＰ‐シアル酸を提供するための手段をさらに含むことは有用である。米国公開特許出願第２００５／０２６０７２９号は、ＣＭＰ‐シアル酸合成経路を有する下等真核生物を遺伝子操作するための方法を開示し、米国公開特許出願第２００６／０２８６６３７号は、シアル酸化糖タンパク質を産生する下等真核生物を遺伝子操作するための方法を開示する。シアル酸化含量を増強するためには、ＣＭＰ‐シアル酸合成経路の２以上のコピーまたはシアル酸転移酵素の２以上のコピーを含むように該宿主細胞を構築することが有用であり得る。上記の細胞において産生された糖タンパク質は、主としてＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはその混合物を含む組換え糖タンパク質を産生するために、インビトロでノイラミニダーゼにより処理され得る。
【００７８】
前記の宿主細胞のいずれも、米国公開特許出願第２００５／０２０８６１７号および第２００７／００３７２４８号に開示されている通り、二分岐（ＧｎＴ  ＩＩＩ）および／または多分岐（ＧｎＴ  ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＩＸ）Ｎ‐グリカン構造を有する糖タンパク質を産生するために、ＧｎＴ  ＩＩＩ、ＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  Ｖ、ＧｎＴ  ＶＩおよびＧｎＴ  ＩＸから成る群より選択される一または複数のＧｌｃＮＡｃ転移酵素をさらに含み得る。さらに前記の宿主細胞は、ＮＡＮＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＧＮＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＮＡＮＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＧＮＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の組み合せを含む抗体を含めて、ＳＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含む組換え糖タンパク質（例えば、抗体）を産生し得る。一実施形態において、組換え糖タンパク質は、ＳＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されかつα‐２，６結合ＳＡを欠いた構造を含むＮ‐グリカンを含むであろう。
【００７９】
他の実施形態において、主としてＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ‐グリカンを有する糖タンパク質を産生する宿主細胞は、通常は該触媒ドメインに結合せず、宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に対するガラクトース転移酵素活性を標的化するために選択された、細胞標的化シグナルペプチドに融合したガラクトース転移酵素触媒ドメインをさらに含んでいる。該宿主のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、主にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生する。
【００８０】
他の実施形態において、主としてＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ‐グリカンを有する糖タンパク質を産生した前記の宿主細胞は、通常は該触媒ドメインに結合せず、該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に対するシアル酸転移酵素活性を標的化するために選択された、細胞標的化シグナルペプチドに融合したシアル酸転移酵素触媒ドメインをさらに含んでいる。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＳＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム（例えば、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはＮＧＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２またはその混合物）を含む組換え糖タンパク質を産生する。
【００８１】
前記の宿主細胞のいずれも、一または複数の糖輸送体、例えばＵＤＰ‐ＧｌｃＮＡｃ輸送体（例えば、クリベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＵＤＰ‐ＧｌｃＮＡｃ輸送体）、ＵＤＰ‐ガラクトース輸送体（例えば、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）  ＵＤＰ‐ガラクトース輸送体）、およびＣＭＰ‐シアル酸輸送体（例えば、ヒトシアル酸輸送体）をさらに含み得る。酵母および糸状菌等の下等真核宿主細胞は上記の輸送体を欠くために、酵母および糸状菌等の下等真核宿主細胞が上記の輸送体を含むように遺伝子操作されることが好ましい。
【００８２】
さらに、前記の宿主細胞のいずれもＮ‐グリカン占有率を増加するためにさらに操作され得る。例えば、Ｇａｕｌｉｔｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．１０３：１１６４‐１１７５（２００９）；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｓｐｙｈｓ．Ａｃｔａ  １７２６：１２１‐１３７（２００５）；ＷＯ２００６／１０７９９０を参照されたい。一実施形態において前記の宿主細胞のいずれの細胞も、異種単一サブユニットオリゴ糖転移酵素（例えば、リーシュマニア属種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．）ＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはその混合物）をコードする一の核酸分子および異種糖タンパク質をコードする一の核酸分子を少なくとも含むようにさらに操作され得て、ここで該宿主細胞は内在性ＯＴアーゼ複合体を含むタンパク質をコードする内在性の宿主細胞遺伝子を発現する。一実施形態において、前記の宿主細胞のいずれも、リーシュマニア属種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．）のＳＴＴ３Ｄタンパク質をコードする少なくとも一の核酸分子および異種糖タンパク質をコードする核酸分子を含むようにさらに操作されることが可能であり、ここで宿主細胞は内在性ＯＴアーゼ複合体を含むタンパク質をコードする内在性の宿主細胞遺伝子を発現する。
【００８３】
宿主細胞には、α‐マンノシダーゼ抵抗性Ｎ‐グリカンを有さない糖タンパク質を産生するように遺伝子操作される下等真核細胞（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等の酵母）がさらに含まれる。これは、一または複数のβ‐マンノース転移酵素遺伝子（例えば、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４）（米国公開特許出願第２００６／０２１１０８５を参照されたい）を欠失または破壊し、ならびにリン酸マンノース転移酵素遺伝子ＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｂ（例えば、米国特許第７，１９８．９２１号および第７，２５９，００７号を参照されたい）の一または両方を欠失または破壊することによって、リン酸マンノース残基を有する糖タンパク質を欠失または破壊することによって達成され得るが、他の態様においてはまたＭＮＮ４Ａ遺伝子の欠失または破壊をも含み得る。破壊には、特定の酵素をコードするオープンリーディングフレームの破壊、またはオープンリーディングフレームの発現の破壊、または緩衝ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、その他を使用しての一または複数のβ‐マンノース転移酵素および／またはリン酸マンノース転移酵素をコードするＲＮＡの翻訳の阻害が含まれる。さらに細胞は、化学阻害剤の添加によりまたは組織培養条件の変更により、α‐マンノシダーゼ抵抗性Ｎ‐グリカンを有する糖タンパク質を産生し得る。これらの宿主細胞は、上記の通り特定のＮ‐グリカン構造を産生するようにさらに修飾され得る。
【００８４】
宿主細胞には、タンパク質Ｏ‐マンノース転移酵素（Ｄｏｌ‐Ｐ‐Ｍａｎ：タンパク質（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）マンノース転移酵素遺伝子  ）（ＰＢＴ）（米国特許第５，７１４，３７７号を参照されたい）の一または複数を欠失または破壊することによって糖タンパク質のＯ‐グリコシル化を制御するように遺伝子改変された、または国際公開第ＷＯ２００７／０６１６３１号に開示の通りに、Ｐｍｔｐ阻害剤および／またはα‐マンノシダーゼの存在下で増殖された、またはその両方に該当する、下等真核細胞（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等の酵母）が含まれる。破壊には、Ｐｍｔｐをコードするオープンリーディングフレームの破壊、またはオープンリーディングフレームの発現の破壊、または緩衝ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、等を使用しての一または複数のＰｍｔｐをコードするＲＮＡの翻訳の阻害が含まれる。該宿主細胞には、特定のＮ‐グリカン構造を産生するように改変された前記の宿主細胞のいずれも含まれ得る。
【００８５】
Ｐｍｔｐ阻害剤には、限定されるものではないがベンジリデンチアゾリジンジオンが含まれる。使用され得るベンジリデンチアゾリジンジオンの例は、５‐［［３，４‐ビス（フェニルメトキシ）フェニル］メチレン］‐４‐オキソ‐２‐チオキソ‐３‐チアゾリジン酢酸；５‐［［３‐（１‐フェニルエトキシ）‐４‐（２‐フェニルエトキシ）フェニル］メチレン］‐４‐オキソ‐２‐チオキソ‐３‐チアゾリジン酢酸；および５‐［［３‐（１‐フェニル‐２‐ヒドロキシ）エトキシ）‐４‐（２‐フェニルエトキシ）フ
ェニル］メチレン］‐４‐オキソ‐２‐チオキソ‐３‐チアゾリジン酢酸である。
【００８６】
特定の実施形態において、少なくとも一の内在性ＰＭＴ遺伝子の機能または発現が低減され、破壊されまたは欠失される。例えば、特定の実施形態において、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３およびＰＭＴ４遺伝子から成る群より選択された少なくとも一の内在性のＰＭＴ遺伝子が低減され、破壊されまたは欠失されるか、さもなければ該宿主細胞が一または複数のＰＭＴ阻害剤の存在下で培養される。他の実施形態において該宿主細胞は、一または複数のＰＭＴ遺伝子の欠失または破壊を含み、そして該宿主細胞は一または複数のＰｍｔｐ阻害剤の存在下で培養される。これらの実施形態の特定の態様において、該宿主細胞はまた分泌型α‐１，２‐マンノシダーゼも発現する。
【００８７】
ＰＭＴ欠失または破壊および／またはＰｍｔｐ阻害剤は、Ｏ‐グリコシル化の占有率を減少することによって、即ちグリコシル化している糖タンパク質上のＯ‐グリコシル化部位の総数を減少することによってＯ‐グリコシル化を制御する。該細胞によって分泌されるα‐１，２‐マンノシダーゼのさらなる添加は、糖タンパク質上のＯ‐グリカンのマンノース鎖長を減少することによってＯ‐グリコシル化を制御する。従って、ＰＭＴ欠失または破壊および／またはＰｍｔｐ阻害剤と分泌型α‐１，２‐マンノシダーゼの発現とを組み合わせることが、占有率および鎖長の減少によってＯ‐グリコシル化を制御する。個々の状況において、ＰＭＴ欠失または破壊、Ｐｍｔｐ阻害剤とα‐１，２‐マンノシダーゼとの個々の組合せは、経験的に決定される。なぜならば、個々の異種の糖タンパク質（例えば、Ｆａｂｓおよび抗体）は、異なる効率で、発現されおよびゴルジ装置を通って輸送され得るので、ＰＭＴ欠失または破壊、Ｐｍｔｐ阻害剤およびα‐１，２‐マンノシダーゼの個々の組合せを要求し得るからである。他の態様において、一または複数の内在性マンノース転移酵素をコードする遺伝子が欠失される。この欠失は、分泌型α‐１，２‐マンノシダーゼおよび／またはＰＭＴ阻害剤を供給することと組み合わせることが可能であり、または分泌型α‐１，２‐マンノシダーゼおよび／またはＰＭＴ阻害剤を供給する代わりに可能である。
【００８８】
このようにＯ‐グリコシル化の制御は、本明細書で開示の宿主細胞における特定の糖タンパク質を、より良好な全収率でまたは適切にアセンブルされた糖タンパク質の収率で産生するために有用であり得る。Ｏ‐グリコシル化の減少または除去は、全抗体およびＦａｂフラグメントのアセンブリーおよび輸送に有利な影響を有するように思われる。なぜならば、それらは分泌経路を横切り、細胞表面に輸送されるからである。従って、Ｏ‐グリコシル化が制御される細胞においては、適切にアセンブルされた抗体またはＦａｂフラグメントの収率は、Ｏ‐グリコシル化が制御されない宿主細胞において得られる収率を上回って増加する。
【００８９】
αマンノシダーゼに抵抗性である、β結合型マンノース残基を有するＮ‐グリカンおよびＯ‐グリカンの可能性を減少または除去するために、糖鎖工学的に操作された組換えピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞が、一または複数のβ‐マンノース転移酵素遺伝子（例えば、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＭＢＴ４）を除去または破壊することによって、α‐マンノシダーゼ抵抗性Ｎ‐グリカンを有する糖タンパク質を除去するように遺伝子操作される（米国特許第７，４６５，５７７号および米国特許第７，７１３，７１９号）。ＢＭＴ２、ならびにＢＭＴ１、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の一または複数の欠失または破壊は、宿主細胞タンパク質に対する検出可能な抗体との交差反応性を減少または除去する。
【００９０】
糖タンパク質の収率は、場合によっては哺乳動物もしくはヒトシャペロンタンパク質をコードする核酸分子を過剰発現させることによって、または一または複数の内在性シャペロンタンパク質をコードする遺伝子を、一もしくは複数の哺乳動物もしくはヒトシャペロンタンパク質をコードする核酸分子と置換することによって改善され得る。さらに、該宿主細胞における哺乳動物またはヒトシャペロンタンパク質の発現はまた、細胞におけるＯ‐グリコシル化を制御するようにも思われる。従って本明細書には、シャペロンタンパク質をコードする少なくとも一の内在性遺伝子の機能が減少または除去された宿主細胞がさらに含まれ、ならびに該シャペロンタンパク質の哺乳動物類似体またはヒト類似体の少なくとも一つをコードするベクターが該宿主細胞において発現される。また、該内在性宿主細胞シャペロンおよび該哺乳動物またはヒトシャペロンタンパク質が発現される宿主細胞も包含される。他の態様において、該下等真核宿主細胞は酵母または糸状菌宿主細胞である。ヒトシャペロンタンパク質が、組換えタンパク質の収率を改善しおよびＯ‐グリコシル化を減少または制御するために導入される宿主細胞のシャペロンの使用例は、国際公開第ＷＯ２００９１０５３５７号および第ＷＯ２０１００１９４８７号に開示されている（その開示内容は本明細書で援用する）。上と同様に、一もしくは複数の内在性シャペロンタンパク質をコードする遺伝子を、一もしくは複数の哺乳動物もしくはヒトシャペロンタンパク質をコードする核酸分子と置換すること、または上記の通り一もしくは複数の哺乳動物もしくはヒトシャペロンタンパク質を過剰発現することに加えて、タンパク質Ｏ‐マンノース転移酵素（ＰＭＴ）タンパク質をコードする少なくとも一の内在性遺伝子の機能または発現が減少、破壊または欠失されている下等真核宿主細胞がさらに含まれる。特定の実施形態において、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３およびＰＭＴ４遺伝子から成る群より選択される少なくとも一の内在性ＰＭＴ遺伝の機能が減少、破壊または欠失される。
【００９１】
さらに、Ｏ‐グリコシル化は、抗原に対する抗体またはＦａｂフラグメントのアフィニティおよび／またはアビティティに影響を与え得る。これは、抗体またはＦａｂの産生のための最終的な宿主細胞が、抗体を選択するために使用された宿主細胞と同一でない場合に特に重要であり得る。例えば、Ｏ‐グリコシル化は抗原に対する抗体またはＦａｂフラグメントのアフィニティを阻害するかもしれず、従ってそうでなければ抗原に対する高いアフィニティを有し得る抗体またはＦａｂフラグメントが、Ｏ‐グリコシル化が抗原に結合する抗体またはＦａｂフラグメントの能力を阻害し得るために、同定されないかもしれない。他の事例では、抗原に対する高いアビディティを有する抗体またはＦａｂフラグメントが、Ｏ‐グリコシル化が抗原に対する抗体またはＦａｂフラグメントのアビディティを阻害するために、同定されないかもしれない。前二例において、哺乳動物細胞株において産生された場合に特に有効であり得る抗体またはＦａｂフラグメントは、抗体またはＦａｂフラグメントを同定および選択するための宿主細胞が他の細胞型、例えば酵母または真菌細胞（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞）であったために、同定されないかもしれない。酵母におけるＯ‐グリコシル化が哺乳動物細胞におけるＯ‐グリコシル化と著しく異なり得ることは周知である。これは、野生型酵母のＯ‐グリコシル化を哺乳動物におけるムチン型またはジストログリカン型Ｏ‐グリコシル化と比較する場合に特に関連している。特定の場合、Ｏ‐グリコシル化は、抗原結合を阻害する代わりに、抗体またはＦａｂフラグメントの抗原に対するアフィニティまたはアビディティを増強し得る。この効果は、該産生宿主細胞が抗体またはＦａｂフラグメントを同定および選択するために使用された宿主細胞と異なる場合には好ましくない（例えば、同定および選択が酵母において実施され、該産生宿主が哺乳動物細胞である場合）。なぜならば、該産生宿主において該Ｏ‐グリコシル化はもはや抗原に対する増強されたアフィニティまたはアビディティを引き起こした種類のものではないからである。従って、Ｏ‐グリコシル化の制御は、抗体またはＦａｂフラグメントの同定および選択が該宿主細胞のＯ‐グリコシル化系によって影響されることなしに、抗原に対する抗体またはＦａｂフラグメントのアフィニティまたはアビディティに基づいて、特定の抗原に対する特異性を有する抗体またはＦａｂフラグメントを同定し選択するために、本明細書の材料および方法の使用を可能にし得る。従って、Ｏ‐グリコシル化の制御は、最終的に哺乳動物細胞株において産生される抗体またはＦａｂフラグメントを同定および選択するための酵母または真菌宿主細胞の有用性をさらに高める。
【００９２】
当業者は、特定のＮ‐グリカンまたはシアル酸化糖タンパク質を産生するために遺伝子操作された他のピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）および酵母細胞株、例えば、限定されるものではないが、特定のガラクトシル化またはシアル酸化形態を産生するように遺伝子操作された上記の宿主生物および細胞株と組み合わせて、本明細書記載の材料および方法をどのように利用するかをさらに認識し理解するであろう。例えば、米国公開特許第２００６‐０２８６６３７号、「下等真核生物におけるシアル酸化Ｎ‐グリカンの産生」を参照されたいが、そこでは、炭素源としてのガラクトースの取り込みおよび利用のための経路が遺伝子操作されており、その説明は該記載が詳細に記載されるかのように本明細書で援用する。
【００９３】
さらに本明細書の方法は、          α‐２，３‐シアル酸転移酵素活性を有さないが、しかしα‐２，３シアル酸転移酵素活性を含むヒト様およびヒト糖タンパク質を産生するように操作された他の下等真核細胞株において、上記の組換えＦｃ含有ポリペプチドを産生するために使用され得る。該方法はまた、シアル酸化Ｎ‐グリカンの産生が生得的な形質である真核細胞株において上記の組換えＦｃ含有ポリペプチドを産生するためにも使用し得る。
【００９４】
該Ｆｃ含有ポリペプチド上のα‐２，３およびα‐２，６結合型シアル酸の濃度は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、順相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびパルスドアンペロメトリック検出器を有する高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ‐ＰＡＤ）を含む、周知の技術を使用して測定され得る。Ｆｃ含有ポリペプチドの産生
【００９５】
本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、シアル酸化Ｎ‐グリカンを有するＦｃ領域を含むポリペプチドを産生するために適した、当該技術分野において既知のいずれかの方法に従って作成され得る。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは抗体または抗体フラグメントである（限定されるものではないが、抗体のＦｃ領域から構成されるかまたはから本質的に構成されるポリペプチドを含む）。他の実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドはイムノアドヘシンである。抗体、抗体フラグメントおよびイムノアドヘシンの調製方法は、当該技術分野で周知である。ポリペプチドに点突然変異を導入する方法、例えば部位特異的突然変異誘発も当該分技術野で周知である。
【００９６】
一実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、α‐２，３シアル酸転移酵素を生来的に発現した宿主細胞において発現される。一実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、α‐２，３シアル酸転移酵素をコードする核酸により形質転換された宿主細胞において発現される。一実施形態において、該宿主細胞は哺乳動物細胞である。一実施形態において、該宿主細胞は下等真核宿主細胞である。一実施形態において、該宿主細胞は真菌宿主細胞である。一実施形態において、該宿主細胞はピキア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）である。一実施形態において、該宿主細胞はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。一実施形態において、前記の宿主細胞は、シアル酸化Ｎ‐グリカンを含むＦｃポリペプチドを産生することが可能であり、ここで該シアル酸化Ｎ‐グリカン中の該シアル酸残基はアルファ‐２，３結合を含有する。一実施形態において、前記の宿主細胞は、Ｆｃ含有ポリ
ペプチドを産生することが可能であり、ここで該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ２Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも８０％は、ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。上記実施形態のいずれにおいても、該ＳＡはＮＡＮＡもしくはＮＧＮＡ、またはＮＡＮＡもしくはＮＧＮＡの類似体もしくは誘導体であり得る。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃから成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該シアル酸化Ｎ‐グリカン中の該シアル酸残基はもっぱらα‐２，３結合により付加されている。Ｆｃ含有ポリペプチドのＮ‐グリカン分析
【００９７】
本明細書で糖鎖工学的に操作されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＦＩ５．０およびＧＦＩ６．０において産生された抗体のＮ‐グリカン組成は、ペプチド‐Ｎ‐グリコシダーゼＦによる抗体からの遊離後に、マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型（ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ）質量分析によって分析し得る。遊離炭水化物組成はＡｌｌｅｎｔｅｃｈ  Ｐｒｅｖａｉｌ  ｃａｒｂｏ（Ａｌｌｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ  ＩＬ）カラム上のＨＰＬＣによって定量し得る。免疫細胞の活性化方法
【００９８】
本発明はまた、免疫細胞をα‐２，３‐結合型シアル酸を含むＦｃ含有ポリペプチドと接触させることによって、免疫細胞を活性化するまたは免疫細胞のエフェクター機能を増強する方法も含む。
【００９９】
本発明はまた、免疫細胞を親ポリペプチドにおけるα‐２，３‐結合の含量と比較して増加した含量のα‐２，３‐結合型シアル酸を含むＦｃ含有ポリペプチドと接触させることによって、免疫細胞を活性化するまたは免疫細胞のエフェクター機能を増強する方法も含む。一実施形態において該Ｆｃ含有ポリペプチドは、該親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較した場合に次の特性：（ａ）増加したエフェクター機能；（ｂ）増加した免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、および／またはエフェクター細胞／マクロファージ）リクルート能；および（ｃ）増加した炎症性、の一または複数を有する。一実施形態において、増加した炎症性を有するＦｃ含有ポリペプチドは、炎症を引き起こす因子／サイトカイン、例えばＩＬ‐１、ＩＬ‐６、ＲＡＮＫＬおよびＴＮＦの分泌を刺激する増加した／増強した能力を有するＦｃ含有ポリペプチドである。
【０１００】
本発明のいくつかの実施形態において、α‐２，３‐結合型シアル酸の含量は、α‐２，３シアル酸転移酵素をコードする核酸により形質転換された宿主細胞において、該Ｆｃ含有ポリペプチドを発現することによって増加される。一実施形態において、該宿主細胞は酵母細胞である。いくつかの実施形態において、α‐２，３‐結合型シアル酸の含量は、増加したシアル酸含量をもたらす細胞培養条件下で該Ｆｃ含有ポリペプチドを産生することによってさらに増加される。他の実施形態において、α‐２，３‐結合型シアル酸の含量は、該Ｆｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域において一または複数の突然変異を導入することによって増加される。一実施形態において、該突然変異は、２４１、２４３、２６４、２６５、２６７、２９６、３０１および３２８から成る群より選択される一または複数の位置に導入さる（ここで番号付はＫａｂａｔと同様にＥＵインデックスに準拠している）。一実施形態において、該突然変異は、２４１、２４３、２６４、２６５、２６７、２９６、３０１および３２８から成る群より選択される二以上の位置に導入される。一実施形態において、該突然変異は、該Ｆｃ領域の位置２４３および２６４に導入される。一実施形態において、位置２４３および２６４における該突然変異は：Ｆ２４３ＡおよびＶ２６４Ａ；Ｆ２４３ＹおよびＶ２６４Ｇ；Ｆ２４３ＴおよびＶ２６４Ｇ；Ｆ２４３ＬおよびＶ２６４Ａ；Ｆ２４３ＬおよびＶ２６４Ｎ；ならびにＦ２４３ＶおよびＶ１６４Ｇ、から成る群より選択される。一実施形態において、導入される該突然変異はＦ２４３ＡおよびＶ２６４Ａである。他の実施形態において、導入される該突然変異は：Ｆ２４３Ａ、Ｖ２６４Ａ、Ｓ２６７Ｅ、およびＬ３２８Ｆである。
【０１０１】
上記の免疫細胞を活性化する方法は、癌または感染性疾患（慢性ウイルス感染症等）を治療するために使用され得、または予防または治療ワクチンに対するアジュバントとして使用され得る。
【０１０２】
上記の方法のいくつかの実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドにおける該シアル酸残基のすべては、もっぱらα‐２，３結合により付加されている。他の実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドにおける該シアル酸残基のほとんどは、α‐２，３結合により付加されている。他の実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドにおける該シアル酸残基のいくつかはα‐２，３結合により付加されており、一方、その他はα‐２，６結合により付加されている。
【０１０３】
上記の方法のいくつかの実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるオリゴ糖構造を含む。
【０１０４】
上記の方法のいくつかの実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ２Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるオリゴ糖構造を含む。
【０１０５】
上記の方法のいくつかの実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から構成されるオリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも８０％は、ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ-結合型オリゴ糖構造を含む。
【０１０６】
上記の方法のいくつかの実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるオリゴ糖構造を含む。
【０１０７】
上記の方法のいくつかの実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から構成されるオリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも８０％は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列、さらに増加したシアル酸含量をもたらす一または複数の突然変異を含む。他の実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列、さらに増加したシアル酸含量をもたらす一、二、三または四の突然変異（例えば：２４１、２４３、２６４、２６５、２６７、２９６、３０１および３２８、から成る群より選択される一または複数の位置における突然変異（ここで番号付はＫａｂａｔと同様にＥＵインデックスに準拠している））を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号８または９のアミノ酸配列を含む。
【０１０９】
他の実施形態において、α‐２，３‐結合型シアル酸含量は、α‐２，３シアル酸転移酵素をコードする核酸により形質転換された宿主細胞において該Ｆｃ含有ポリペプチドを発現することによって、および該Ｆｃ含有ポリペプチドの該Ｆｃ領域において一または複数の突然変異を導入することによって増加される。一実施形態において、該宿主細胞は酵母細胞である。該突然変異は上記の該Ｆｃ突然変異のいずれでもあり得る。
【０１１０】
本発明はまた、抗原に対する免疫応答が増加されまたは増強されるように：免疫細胞を：（ｉ）抗原および（ｉｉ）α‐２，３‐結合型シアル酸を含むＦｃ含有ポリペプチド、と接触させることを含む抗原に対する免疫応答を増加する方法も含む。この方法は、インビボ（患者内）でまたはエクスビボで実施され得る。一実施形態において、本発明は：（ｉ）患者から免疫細胞を取得し、（ｉｉ）該免疫細胞とα‐２，３結合型シアル酸を含むＦｃ含有ポリペプチドとを接触させ、および（ｉｉｉ）次に該免疫細胞を患者に投与することを含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、親ポリペプチドにおけるα‐２，３‐結合含量と比較して増加したα‐２，３‐結合型シアル酸含量を含む。治療方法
【０１１１】
本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、組織または外来性微生物の破壊または排除が望まれる疾病または疾患の治療において使用され得る。例えば、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、新生物疾患または感染性（例えば、細菌性、ウイルス性、真菌性または酵母性）疾患を治療するために使用され得る。さらに、本発明のＦｃ含有ポリペプチドはワクチンアジュバントとして使用され得る。
【０１１２】
本発明は、それを必要とする患者における免疫応答を増強する方法を含み：α‐２，３‐結合型シアル酸を含むＦｃ含有ポリペプチドの治療的有効量を該患者に投与することを含む。一実施形態において、該患者は感染性疾患に罹患している。他の実施形態において、患者は新生物疾患に罹患している。
【０１１３】
本発明は、それを必要とする患者における免疫応答を増強する方法を含み：親ポリペプチドにおけるα‐２，３‐結合含量と比較して増加したα‐２，３‐結合型シアル酸含量を含むＦｃ含有ポリペプチドの治療的有効量を該患者に投与することを含む。一実施形態において、患者は感染性疾患に罹患している。他の実施形態において、患者は新生物疾患に罹患している。いくつかの実施形態において、α‐２，３‐結合型シアル酸含量は、α‐２，３シアル酸転移酵素をコードする核酸により形質転換された宿主細胞において該Ｆｃ含有ポリペプチドを発現することによって増加される。一実施形態において、該宿主細胞は酵母細胞である。いくつかの実施形態において、α‐２，３‐結合型シアル酸含量は、増加したシアル酸含量をもたらす細胞培養条件下で該Ｆｃ含有ポリペプチドを産生することによってさらに増加される。他の実施形態において、α‐２
，３‐結合型シアル酸含量は、該Ｆｃ含有ポリペプチドの該Ｆｃ領域において一または複数の突然変異を導入することによって増加される。一実施形態において、該突然変異は：２４１、２４３、２６４、２６５、２６７、２９６、３０１および３２８から成る群より選択される一または複数の位置に導入される（ここで番号付はＫａｂａｔと同様にＥＵインデックスに準拠している）。一実施形態において、該突然変異は、２４１、２４３、２６４、２６５、２６７、２９６、３０１および３２８から成る群より選択される二以上の位置に導入される。一実施形態において、該突然変異は、該Ｆｃ領域の位置２４３および２６４に導入される。一実施形態において、位置２４３および２６４の該突然変異は：Ｆ２４３ＡおよびＶ２６４Ａ；Ｆ２４３ＹおよびＶ２６４Ｇ；Ｆ２４３ＴおよびＶ２６４Ｇ；Ｆ２４３ＬおよびＶ２６４Ａ；Ｆ２４３ＬおよびＶ２６４Ｎ；ならびにＦ２４３ＶおよびＶ２６４Ｇから成る群より選択される。一実施形態において、導入される該突然変異はＦ２４３ＡおよびＶ２６４Ａである。他の実施形態において、導入される該突然変異は：Ｆ２４３Ａ、Ｖ２６４Ａ、Ｓ２６７Ｅ、およびＬ３２８Ｆである。他の実施形態において、該α‐２，３‐結合型シアル酸含量は、α‐２，３シアル酸転移酵素をコードする核酸により形質転換された宿主細胞において該Ｆｃ含有ポリペプチドを発現することによって、および該Ｆｃ含有ポリペプチドの該Ｆｃ領域に一または複数の突然変異を導入することによって増加される。該突然変異は本明細書記載の該Ｆｃ突然変異のいずれでもあり得る。
【０１１４】
上記の治療方法のいくつかの実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドにおける該シアル酸残基のすべては、もっぱらα‐２，３結合により付加されている。他の実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドにおける該シアル酸残基のほとんどは、α‐２，３結合により付加されている。他の実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドにおける該シアル酸残基のいくつかは、α‐２，３結合により付加されており、一方、その他はα‐２，６結合により付加されている。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％は、ＳＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるオリゴ糖構造を含む。いくつかの実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％は、ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から構成されるオリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも８０％は、ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。いくつかの実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から構成されるオリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも８０％は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。
【０１１６】
一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列、さらに増加したシアル酸含量をもたらす一または複数の突然変異を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列、さらに増加したシアル酸含量をもたらす一、二、三または四の突然変異を含む（例えば：２４１、２４３、２６４、２６５、２６７、２９６、３０１および３２８から成る群より選択される一または複数の位置における突然変異、ここで番号付はＫａｂａｔと同様にＥＵインデックスに準拠している）。いくつかの実施形態において、該突然変異は：Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ；Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６４Ｇ；Ｆ２４３Ｔ／Ｖ２６４Ｇ；Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６４Ａ；Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６４Ｎ；Ｆ２４３Ｖ／Ｖ２６４Ｇ；Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ／Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆである。
【０１１７】
一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号８または配列番号９のアミノ酸配列を含む。
【０１１８】
上記の方法のいくつかの実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較した場合に次の特性：（ａ）増加したエフェクター機能；（ｂ）増加した免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞および、またはエフェクター細胞／マクロファージ）リクルート能；および（ｃ）増加した炎症性、の一または複数を有する。
【０１１９】
一実施形態において、本発明は、それを必要とする患者における免疫応答を増強する方法を含み、シアル酸化Ｎ‐グリカンを含むＦｃ含有ポリペプチドの治療的有効量を該患者に投与することを含むが、ここで該シアル酸化Ｎ‐グリカン内の該シアル酸残基はα‐２，３結合を含み、ならびに該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、患者は、感染性疾患または新生物疾患を罹患しているかまたは発病する危険にある。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ２Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から構成されるＮ-結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも８０％は、ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から構成されるＮ-結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも８０％は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃポリペプチドは、完全長抗体の重鎖のＡｓｎ２９７位に相当する位置にＮ‐グリカンを含む（ここで番号付はＫａｂａｔと同様にＥＵインデックスに準拠している）。一実施形態において、該Ｎ‐グリカンはフコースを欠く。他の実施形態において、該Ｎ‐グリカンはコアフコースをさらに含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドにおけるシアル酸残基のすべては、もっぱらα‐２，３結合により付加されている。
【０１２０】
一実施形態において、本発明は、それを必要とする患者における免疫応答を増強する方法を含み、シアル酸化Ｎ‐グリカンを含むＦｃ含有ポリペプチドの治療的有効量を該患者に投与することを含むが、ここで該シアル酸化Ｎ‐グリカン内の該シアル酸残基はα‐２，３結合を含有し、ならびに該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（１‐４）Ｍａｎ（＞＝３）ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ（１‐３）Ｇａｌ（１‐３）ＧｌｃＮＡｃ（１‐３）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるオリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該シアル酸化Ｎ‐グリカン内の該シアル酸残基は、もっぱらα‐２，３結合により付加されている。一実施形態において、該Ｆｃポリペプチドは、完全長抗体の重鎖のＡｓｎ２９７位に相当する位置にＮ‐グリカンを含む（ここで番号付はＫａｂａｔと同様にＥＵインデックスに準拠している）。一実施形態において、該Ｎ‐グリカンはフコースを欠く。他の実施形態において、該Ｎ‐グリカンはコアフコースをさらに含む。
【０１２１】
一実施形態において、本発明は、それを必要とする患者における免疫応答を増強する方法を含み、シアル酸化Ｎ‐グリカンを含むＦｃ含有ポリペプチドの治療的有効量を該患者に投与することを含むが、ここで、該シアル酸化Ｎ‐グリカン内の該シアル酸残基はα‐２，３結合を含有し、ならびに該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドにおける該シアル酸残基のすべては、もっぱらα‐２，３結合により付加されている。一実施形態において、該Ｎ‐グリカンはフコースを欠く。他の実施形態において、該Ｎ‐グリカンはコアフコースをさらに含む。一実施形態において、該Ｆｃポリペプチドは、シアル酸化Ｎ‐グリカンを含む抗体または抗体フラグメントである。一実施形態において、該Ｆｃポリペプチドは、完全長抗体の重鎖のＡｓｎ２９７位に相当する位置にＮ‐グリカンを含む（ここで、番号付はＫａｂａｔと同様にＥＵインデックスに準拠している）。一実施形態において、該Ｆｃポリペプチドは、配列番号６または配列番号７を含むかまたはから本質的に構成される抗体または抗体フラグメントである。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列、さらに親ポリペプチドにおけるシアル酸含量と比較した場合に増加したシアル酸含量をもたらす一または複数の突然変異を含むかまたはから構成される。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列、さらに親ポリペプチドにおけるシアル酸含量と比較した場合に増加したシアル酸含量をもたらす一、二、三または四の突然変異を含むかまたはから構成される。一実施形態において、該親ポリペプチドは、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、該Ｆｃ領域の位置２４３および２６４に突然変異を含む抗体または抗体フラグメントである（ここで、番号付はＫａｂａｔと同様にＥＵインデックスに準拠している）。一実施形態において、該突然変異はＦ２４３ＡおよびＶ２６４Ａである。
【０１２２】
一実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチ
ドは、体重キログラム当たり１ないし１００ミリグラムの間の用量で投与され得る。一実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、体重キログラム当たり０．００１ないし１０ミリグラムの間の用量で投与され得る。一実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、体重キログラム当たり０．００１ないし０．１ミリグラムの間の用量で投与され得る。一実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、体重キログラム当たり０．００１ないし０．０１ミリグラムの間の用量で投与され得る。
【０１２３】
本発明は、ワクチン接種（予防的か治療的のいずれでも）の間に免疫原性を追加免疫する方法を含み：α‐２，３‐結合シアル酸を含むＦｃ含有ポリペプチドの治療的有効量を該患者に投与することを含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、ウイルスまたは細菌抗原を認識する抗体またはイムノアドヘシンである。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、親ポリペプチドにおけるα‐２，３‐結合含量と比較して増加したα‐２，３‐結合型シアル酸含量を含む。Ｆｃ含有ポリペプチドにおける該シアル酸含量は、上に開示した方法を含めた任意の方法を使用して増加され得る。
【０１２４】
本発明は、ワクチン接種（予防的か治療的かのいずれでも）の間に免疫原性を追加免疫する方法を含み、シアル酸化Ｎ‐グリカンを含むＦｃ含有ポリペプチドの治療的有効量を該患者に投与することを含むが、ここで該シアル酸化Ｎ‐グリカン内の該シアル酸残基はα‐２，３結合を含有し、ならびに該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（１‐４）Ｍａｎ（＞＝３）ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ（１‐３）Ｇａｌ（１‐３）ＧｌｃＮＡｃ（１‐３）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるオリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドにおけるシアル酸残基のすべては、もっぱらα‐２，３結合により付加されている。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、完全長抗体の重鎖のＡｓｎ２９７位に相当する位置にＮ‐グリカンを含む（ここで番号付はＫａｂａｔと同様にＥＵインデックスに準拠している）。一実施形態において、該Ｎ‐グリカンはフコースを欠く。他の実施形態において、該Ｎ‐グリカンはコアフコースをさらに含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、ウイルスまたは細菌抗原に結合する。
【０１２５】
本発明はまた、α‐２，３‐結合型シアル酸を含むＦｃ含有ポリペプチドのワクチンアジュバントとして使用を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％は、ＳＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるオリゴ糖構造を含む。
【０１２６】
本発明はまた、ワクチンアジュバントとしてのＦｃ含有ポリペプチドの使用を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、シアル酸化Ｎ‐グリカンを含み、ここで該シアル酸化Ｎ‐グリカン内の該シアル酸残基はα‐２，３結合を含有し、ならびに該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（１‐４）Ｍａｎ（＞＝３）ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ（１‐３）Ｇａｌ（１‐３）ＧｌｃＮＡｃ（１‐３）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるオリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド内の該シアル酸残基のすべては、もっぱらα‐２，３結合により付加されている。一実施形態において、該Ｎ‐グリカンはフコースを欠く。他の実施形態において、該Ｎ‐グリカンはコアフコースをさらに含む。一実施形態において、該Ｆｃポリペプチドは、完全長抗体の重鎖のＡｓｎ２９７位に相当する位置にＮ‐グリカンを含む（ここで番号付はＫａｂａｔと同様にＥＵインデックスに準拠している）。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドはウイルスまたは細菌抗原に結合する。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、第二の治療薬または治療法と併用され得る。いくつかの実施態様において本発明のＦｃ含有ポリペプチド（α‐２，３‐結合型シアル酸を含む）は、癌または感染性疾患の治療に有用な他の治療抗体と併用され得る。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチド（α‐２，３‐結合型シアル酸を含む）は、癌または感染性疾患を予防または治療するためのワクチンと併用される。非限定的な例として本発明のＦｃ含有ポリペプチド（α‐２，３‐結合型シアル酸を含む）は、治療すべき癌または感染と関連のある一もしくは複数の抗原を含有するタンパク質、ペプチドもしくはＤＮＡワクチン、または当該抗原によりパルスした樹枝状細胞を含むワクチンと併用される。他の実施形態には、（弱毒化）癌細胞またはホールウイルスワクチンと一体になっての本発明のＦｃ含有ポリペプチド（α‐２，３‐結合型シアル酸を含む）の使用が含まれる。Ｆｃ含有ポリペプチドのエフェクター機能を増加する方法
【０１２９】
本発明はまた：（ｉ）親Ｆｃ含有ポリペプチドを選択し、および（ｉｉ）該親Ｆｃ含有ポリペプチドにおけるα‐２，３‐結合型シアル酸（例えば、ＳＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ここで該シアル酸残基はもっぱらα‐２，３結合によりガラクトースに付加されている）含量を添加または増加することを含む、Ｆｃ含有ポリペプチドのエフェクター機能または炎症性を増加する方法を含む。一実施形態において、該親Ｆｃ含有ポリペプチドは、感染性疾患もしくは新生物疾患の治療に有用であるか、またはワクチンアジュバントとして使用され得るポリペプチドである。
【０１３０】
本発明はまた：（ｉ）親Ｆｃ含有ポリペプチドを選択し、および（ｉｉ）α‐２，３‐結合型シアル酸（例えば、ＳＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）含量を追加または増加することを含む、Ｆｃ含有ポリペプチドの抗腫瘍能を増加する方法を含んでおり、ここで該シアル酸残基はもっぱら該親Ｆｃ含有ポリペプチドにおいてα‐２，３結合によりガラクトースに付加されている。
【０１３１】
本発明はまた：（ｉ）親Ｆｃ含有ポリペプチドを選択し、および（ｉｉ）前記のＦｃ含有ポリペプチドを、α‐２，３‐シアル酸転移酵素をコードする核酸により形質転換された宿主細胞において発現することを含む、Ｆｃ含有ポリペプチドの抗腫瘍能を増加する方法を含んでいる。一実施形態において、該宿主細胞は哺乳動物細胞である。一実施形態において、該宿主細胞は下等真核宿主細胞である。一実施形態において、該宿主細胞は真菌宿主細胞である。一実施形態において、該宿主細胞はピキア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）である。一実施形態において、該宿主細胞はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。一実施形態において、前記の宿主細胞は、シアル酸化Ｎ‐グリカンを含むＦｃポリペプチドを産生することが可能であり、ここで該シアル酸化Ｎ‐グリカン内の該シアル酸残基はα‐２，３結合を含有する。一実施形態において、前記の宿主細胞は、Ｆｃ含有ポリペプチドを産生することが可能であり、ここで該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％はＳＡ２Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から構成されるＮ-結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも８０％は、ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。上記の実施形態のいずれにおいても該ＳＡは、ＮＡＮＡもしくはＮＧＮＡ、またはＮＡＮＡもしくはＮＧＮＡの類似体もしくは誘導体であり得る。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から構成されるＮ-結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドにおける該シアル酸残基のすべては、もっぱらα‐２，３結合により付加されている。一実施形態において、該Ｎ‐グリカンはフコースを欠く。他の実施形態において、該Ｎ‐グリカンはコアフコースをさらに含む。生物学的標的
【０１３２】
以下の実施例において出願人は、本発明の材料および方法を市販の抗ＴＮＦ抗体の配列と類似する配列を有するＩｇＧ１抗体を使用して例示するが、一方、本発明が開示の抗体に限定されるものでないことに留意されたい。当業者は、本明細書の材料および方法が、増強したエフェクター機能細胞の特性が望まれるであろう、任意のＦｃ含有ポリペプチドまたはその生物活性のある形態を産生するためにも使用され得ることを認識し理解するであろう。本発明によりこのように産生されるＦｃ含有ポリペプチドまたは抗体の種類に関しては、制限がないことにさらに留意されたい。該Ｆｃ含有ポリペプチドの該Ｆｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ由来であり得る。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドの該Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含むＩｇＧ由来である。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドの該Ｆｃ領域はＩｇＧ１由来である。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドの該Ｆｃ領域はＩｇＧ１由来である。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドの該Ｆｃ領域はＩｇＧ１由来である。特定の実施形態において、本明細書の材料および方法によって産生される抗体または抗体フラグメントはヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗体であり得る。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、新生物疾患（即ち癌）に関与する生物学的標的に結合し得る。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦ、ＥＦＧＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＰＤ‐１、ＰＤ‐１Ｌ、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ‐４、ＧＩＴＲ、ｍＴＯＲ、ＣＳ１、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ１３７、ＣＡ１２５、ＭＵＣ１、ＰＥＭ抗原、Ｅｐ‐ＣＡＭ、１７‐１ａ、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＨＬＡ‐ＤＲ、ＧＤ２‐ガングリオシド、ＳＫ‐１抗原、Ｌａｇ３、Ｔｉｍ３、ＣＴＬＡ４
、ＴＩＧＩＴ、ＳＩＲＰａ、ＩＣＯＳ、Ｔｒｅｍｌ２、ＮＣＲ３、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０および４‐１ＢＢから選択される抗原に結合し得る。
【０１３５】
他の実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、いかなる病原性抗原にも結合し得る（例えば、ウイルスまたは細菌抗原）。いくつかの実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、Ｆｌｕ  ＨＡ、ＨＢＶ抗原またはＨＣＶ抗原に結合し得る。医薬製剤
【０１３６】
本発明はまた、シアル酸化Ｎ‐グリカンを含むＦｃ含有ポリペプチドを含む医薬製剤も含み、ここで該シアル酸化Ｎ‐グリカン内の該シアル酸残基はα‐２，３結合、および薬学的に許容可能な担体を含有する。一実施形態において、該シアル酸化Ｎ‐グリカン内の該シアル酸残基のすべては、α‐２，３結合により付加されている。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、抗体または抗体フラグメントまたはイムノアドヘシンである。
【０１３７】
一実施形態において、本発明は、Ｆｃ含有ポリペプチドを含む医薬組成物に関し、ここで該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるオリゴ糖構造を含み、ここで該シアル酸残基はもっぱらα‐２，３結合により付加されている。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から構成されるオリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも８０％は、ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から構成されるオリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも８０％は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｎ‐グリカンはフコースを欠く。他の実施形態において、該Ｎ‐グリカンはコアフコースをさらに含む。
【０１３８】
一実施形態において、本発明は、Ｆｃ含有ポリペプチドを含む医薬製剤を含み、ここで、該Ｆｃ含有ポリペプチドはシアル酸化Ｎ‐グリカンを含み、ここで該シアル酸化Ｎ‐グリカン内の該シアル酸残基はα‐２，３結合を含有し、ならびに該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ２Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡ（２‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から構成されるＮ-結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも８０％０％は、ＳＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から構成されるＮ-結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの少なくとも８０％は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるＮ‐結合型オリゴ糖構造を含む。一実施形態において、該シアル酸化Ｎ‐グリカン内の該シアル酸残基のすべては、もっぱらα‐２，３結合により付加されている。一実施形態において、該Ｎ‐グリカンはフコースを欠く。他の実施形態において、該Ｎ‐グリカンはコアフコースをさらに含む。一実施形態において該Ｎ‐グリカンは、完全長抗体の重鎖のＡｓｎ２９７位に相当する位置に付加されている（ここで番号付はＫａｂａｔと同様にＥＵインデックスに準拠している）。
【０１３９】
一実施形態において、該Ｆｃ含有ポリペプチドは、親Ｆｃ含有ポリペプチドと比較した場合に次の特性：増加したエフェクター機能；増加した免疫細胞リクルート能；および増加した炎症性、の一または複数を有する。
【０１４０】
一実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含むかまたはから構成される。他の実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列、さらに親Ｆｃ含有ポリペプチドにおけるシアル酸含量と比較した場合に増加したシアル酸含量をもたらす一または複数の突然変異を含むかまたはから構成される。他の実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列、さらに親Ｆｃ含有ポリペプチドにおけるシアル酸含量と比較した場合に増加したシアル酸含量をもたらす一、二、三または四の突然変異を含むかまたはから構成される。一実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、配列番号８または配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたはから構成される。
【０１４１】
本明細書で利用する場合、用語「薬学的に許容可能」は、連邦または州政府の監督官庁によって認可された、または動物、より具体的には人間における使用に関する米国薬局方または他の一般に認められた薬局方に収載された、活性成分の生物学的活性の有効性を阻害しない無毒物質を意味する。用語「担体」は、それと共に治療薬が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを表し、限定されるものではないが、水及び油等の滅菌液体を含む。担体の特性は投与経路に依存する。
【０１４２】
治療薬および診断薬の医薬製剤は、許容可能な担体、賦形剤または安定剤と共に、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水性溶液または懸濁液の形態で混合することによって調製され得る（例えば、Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ‘ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（「グッドマンとギルマンの治療学の薬理学的基礎」），ＭｃＧｒａｗ‐Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（「レミントン：薬学の科学と実際」），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ（「医薬剤形：非経口薬」），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ（「医薬剤形：錠剤」），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（「医薬剤形：分散系」），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ（「賦形剤の毒性と安全性」），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい）。
【０１４３】
投与方法は種々に変わり得る。適切な投与経路には、経口、直腸、経粘膜、腸内、非経口；筋肉内、皮下、皮内、脊髄内、髄腔内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、眼球内、吸入、吸送、局所、皮膚、経皮または動脈内が含まれる。
【０１４４】
ある一定の実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、注射等の侵襲的経路（上記を参照されたい）によって投与され得る。本発明のいくつかの実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドまたはその医薬組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、関節腔内（例えば、関節炎の関節内）、腫瘍内に、または吸入、エアロゾル送達によって投与される。非侵襲的経路（例えば、経口的；例えば丸剤、カプセル剤または錠剤）による投与もまた本発明の範囲内である。
【０１４５】
ある一定の実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、注射等の侵襲的経路（上記を参照されたい）によって投与され得る。本発明のいくつかの実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドまたはその医薬組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、関節腔内（例えば、関節炎の関節内）、腫瘍内に、または吸入、エアロゾル送達によって投与される。非侵襲的経路（例えば、経口的；例えば丸剤、カプセル剤または錠剤）による投与もまた本発明の範囲内である。
【０１４６】
組成物は、当該技術分野で既知の医療機器により投与され得る。例えば、本発明の医薬組成物は、例えばプレフィルドシリンジまたは自動注入装置を含む皮下針による注射によって投与され得る。
【０１４７】
本発明の医薬組成物は、ニードルレス皮下注射装置、例えば、米国特許第６，６２０，１３５号；６，０９６，００２号；５，３９９，１６３号；５，３８３，８５１号；５，３１２，３３５号；５，０６４，４１３号；４，９４１，８８０号；４，７９０，８２４号または４，５９６，５５６号に開示された装置によっても投与され得る。
【０１４８】
本発明の医薬組成物はまた、注入によっても投与され得る。医薬組成物を投与する周知の埋没物およびモジュール形態の例には：制御された速度で薬物を分配する埋込型マイクロインフュージョンポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号；精確な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号；連続薬物送達のための可変流量埋込型装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号；複室コンパートメントを有する浸透圧薬送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号が含まれる。多くの他のこのような埋没物、送達システムおよびモジュールは当業者にとって周知である。
【０１４９】
代わりに、抗体は全身的な方法よりはむしろ局所的な方法、例えば、関節炎の関節への直接の抗体注射により、しばしばデポ製剤または持続放出製剤中で投与され得る。さらに、抗体は標的化薬物送達系、例えば、組織特異的抗体により被覆したリポソームにおいて、例えば、関節炎の関節または免疫病理によって特徴づけられる病
原体媒介性障害を標的として投与され得る。該リポソームは障害組織によって標的化され、選択的に吸収され得る。
【０１５０】
投与計画は、治療用抗体の血清または組織代謝回転速度、症状のレベル、治療用抗体の免疫原性および生物学的マトリックスにおける標的細胞の到達性を含むいくつかの要因に依存する。投与計画は好ましくは、一方で望ましくない副作用を最小にしながら、同時に標的病態において改善を果たすのに十分な治療用抗体を送達する。従って、送達される生物学的な量は、一部は個々の治療用抗体および治療すべき症状の重症度に依存する。治療用抗体の適切な用量の選択に関するガイダンスが利用可能である（例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ（１９９６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ（「抗体療法」），Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（ｅｄ．）（編）（１９９１）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ（「モノクローナル抗体、サイトカインおよび関節炎」），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｃｈ（ｅｄ．）（編）（１９９３）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（「自己免疫疾患におけるモノクローナル抗体およびペプチド療法」），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１‐６０８；Ｍｉｌｇｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６‐１９７３；Ｓｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３‐７９２；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３−６１９；Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４‐３２；Ｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４‐１６０２を参照されたい）。
【０１５１】
適切な用量の決定は、臨床医によって、例えば、当該技術分野で知られたまたは考えられている治療に影響を与えるパラメータまたは因子を使用してなされる。一般的に用量は、適量より幾分か少ない量で始め、その後いかなる負の副作用に比較しても所期または最適の効果が達成されるまで、わずかな増加量ずつ増加される。重要な診断測定値には、例えば炎症等の症状の測定値または産生される炎症性サイトカインの濃度が含まれる。好ましくは、使用され得る生物学的製剤は、治療対象の動物と同じ種由来であり、それによって試薬に対するいかなる免疫応答も最小化し得る。ヒト患者の場合、例えば、キメラ、ヒト化および完全ヒトＦｃ含有ポリペプチドが好ましい。
【０１５２】
Ｆｃ含有ポリペプチドは、連続注入によって、または投与された複数用量、例えば、毎日、週に１〜７回、毎週、隔週、毎月、隔月、年４回、年２回、毎年、等によって供給され得る。用量は、静脈内、皮下、局所、経口、経鼻、直腸、筋肉内、脳内、精髄内に、または吸入によって供給され得る。総週用量は、一般的に少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重、より一般的には０．２μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、１０  ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ以上である（例えば、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：４２７‐４３４（２００３）；Ｈｅｒｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６９２‐１６９８（２００２）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．６７：４５１‐４５６（１９９９）；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：１３３‐１４４（２００３）を参照されたい）。他の実施形態において、本発明のＦｃ含有ポリペプチドは、皮下または静脈内に、毎週、隔週、「４週間毎」、毎月、隔月または年４回、１０、２０、５０、８０、１００、２００、５００、１０００または２５００ｍｇ／患者に基づいて投与される。
【０１５３】
本明細書で用いる場合、用語「治療的有効量」、「治療的有効用量」および「有効量」は、単独でまたは追加の治療薬と併用されて細胞、組織または患者に投与された場合に、疾患または容態、または該疾患もしくは容態の進行の一または複数の症状において、測定可能な改善を引き起こすのに有効である本発明のＦｃ含有ポリペプチドの量を表す。治療的有効用量はさらに、少なくとも部分的な症状改善、例えば、関連する病状の治療、治癒、予防または改善、または当該症状の治療、治癒、予防または改善の速度の増加をもたらすのに十分であるＦｃ含有ポリペプチドの量を表す。単独で投与される個々の活性成分に適用される場合、治療的有効用量は単独の成分の当該用量を表す。併用に対し適用される場合、治療的有効用量は、併用投与が連続か同時かどうかにかかわらず、治療効果をもたらす活性成分の総量を表す。治療の有効量は、診断測定値または診断パラメータの少なくとも１０％；通常は少なくとも２０％；好ましくは少なくとも約３０％；より好ましくは少なくとも４０％および最も好ましくは少なくとも５０％だけの改善をもたらす。有効量はまた、主観的測度が疾患重篤度を評価するために使用される場合においては、主観的測度における改善ももたらす。
【実施例１】
【０１５４】
抗ＴＮＦα  Ｆｃ突然変異タンパク質の構築
【０１５５】
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における抗ＴＮＦモノクローナル抗体内の二の突然変異（Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ）を有するＦｃの調製を、以下に収載する配列およびプロトコルを使用して実施した。親（野生型）抗ＴＮＦα抗体の重鎖および軽鎖配列を配列番号１および２に示す。二重突然変異タンパク質抗ＴＮＦα抗体の重鎖の配列を配列番号３に示す。野生型および二重突然変異タンパク質抗ＴＮＦα抗体の軽鎖配列は同一である。
【０１５６】
α‐接合因子プレドメインのシグナル配列（配列番号４および５）をＰＣＲ融合によって軽鎖または重鎖の末端にインフレームで融合した。該配列は、コドン最適化し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．，８６０  Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ  Ａｖｅ．Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ  ０８８５４，ＵＳＡ）によって合成した。重鎖および軽鎖の双方とも、抗‐ＨＥＲ２ＩｇＧ１およびそのＦｃ突然変異タンパク質を構築するのと同様の方法によって抗体発現ベクターにクローン化した。
【０１５７】
ＩｇＧ１とその突然変異タンパク質の融合シグナル配列を有する重鎖および軽鎖を、それぞれピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーターの下流およびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｃｙｃターミネーターの前にクローン化した。完全重鎖および完全軽鎖の発現カセットを一緒に最終発現ベクターに組み込んだ。ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）へのゲノム挿入は、Ｓｐｅ１によるベクターの直線化およびＴｒｐ２部位への標的を狙った組み込みによって行った。プラスミドｐＧＬＹ６９６４は、野生型の抗ＴＮＦα  ＩｇＧ１抗体をコードする。プラスミドｐＧＬＹ７７１５は、抗ＴＮＦα  ＩｇＧ１  Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａ二重突然変異タンパク質をコードする。糖鎖工学的に操作されたピキア（Ｐｉｃｈｉａ）ＧＦＩ６．０  ＹＧＬＹ２２８３４が、抗ＴＮＦα  Ｆｃ突然変異タンパク質を産生するための親宿主であった。その遺伝子型は以下の通りである：ｕｒａ５Δ：：ＳｃＳＵＣ２  ｏｃｈ１Δ：：ｌａｃＺ  ｂｍｔ２Δ：：ｌａｃＺ／ＫｌＭＮＮ２‐２  ｍｎｎ４Ｌ１Δ：：ｌａｃＺ／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３  ｐｎｏｌΔｍｎｎ４Δ：：ｌａｃＺ  ＡＤＥ１：ｌａｃＺ／ＮＡ１０／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３／ＦＢ８ｈｉｓ１Δ：：ｌａｃＺ／ＳｃＧＡＬ１０／ＸＢ３３／ＤｍＵＧＴ  ａｒｇｌΔ：：ＨＩＳ１／ＫＤ５３／ＴＣ５４ｂｍｔ４Δ：：ｌａｃＺ  ｂｍｔ１Δ：：ｌａｃＺ  ｂｍｔ３Δ：：ｌａｃＺ  ＴＲＰ２：ＡＲＧ１／ＭｍＣＳＴ／ＨｓＧＮＥ／ＨｓＣＳＳ／ＨｓＳＰＳ／ＭｍＳＴ６‐３３ｓｔｅ１３Δ：：ｌａｃＺ／ＴｒＭＤＳ１  ｄａｐ２Δ：：ＮａｔＲ  ＴＲＰ５：ＨｙｇＲＭｍＣＳＴ／ＨｓＧＮＥ／ＨｓＣＳＳ／ＨｓＳＰＳ／ＭｍＳＴ６‐３３  Ｖｐｓ１０‐１Δ：：ＡＯＸ１ｐ＿ＬｍＳＴＴ３ｄ。抗ＴＮＦα  Ｆｃ突然変異タンパク質発現プラスミドをＹＧＬＹ２２８３４に形質転換し、ＹＧＬＹ２３４２３を作成した。ＹＧＬＹ２３４２３は、α２，６シアル酸化抗ＴＮＦαＦｃ突然変異タンパク質を作成するための産生菌株として使用した。
【０１５８】
遺伝子型を記載するために用いられる略語は、当業者により周知され理解されており、以下の略語を含む：ＳｃＳＵＣ２        Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）転化酵素ＯＣＨ１            α‐１，６‐マンノース転移酵素Ｋ１ＭＮＮ２‐２    Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＤＰ‐ＧｌｃＮＡｃ輸送体ＢＭＴ１            β‐マンノース輸送（β‐マンノース除去）ＢＭＴ２            β‐マンノース輸送（β‐マンノース除去）ＢＭＴ３            β‐マンノース輸送（β‐マンノース除去）ＢＭＴ４            β‐マンノース輸送（β‐マンノース除去）ＭＮＮ４Ｌ１        ＭＮＮ４‐様１（電荷除去）ＭｍＳＬＣ３５Ａ３  ＵＤＰ‐ＧｌｃＮＡｃ輸送体のマウス類似体ＰＮＯ１            Ｎ‐グリカンのリン酸マンノース化（電荷除去）ＭＮＮ４            マンノース転移酵素（電荷除去）ＳｃＧＡＬ１０      ＵＤＰ‐グルコース４‐エピメラーゼＸＢ３３            ＳｃＫＲＥ２リーダーに融合したトランケート化ＨｓＧａｌＴ１ＤｍＵＧＴ          ＵＤＰ‐ガラクトース輸送体ＫＤ５３            ＳｃＭＮＮ２リーダーに融合したトランケート化ＤｍＭＮＳＩＩＴＣ５４            ＳｃＭＮＮ２リーダーに融合したトランケート化ＲｎＧＮＴＩＩＮＡ１０            ＰｐＳＥＣ１２リーダーに融合したトランケート化ＨｓＧＮＴＩＦＢ８              ＳｃＳＥＣ１２リーダーに融合したトランケート化ＭｍＭＮＳ１ＡＴｒＭＤＳ１        分泌型Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｓｅｅｉ）ＭＮＳ１ＡＤＥ１            Ｎ‐サクシニル‐５‐アミノイミダゾール‐４‐カルボキサミドリボチド（ＳＡＩＣＡＲ）シンテターゼＭｍＣＳＴ          マウスＣＭＰ‐シアル酸輸送体ＨｓＧＮＥ          ヒトＵＤＰ‐ＧｌｃＮＡｃ２‐エピメラーゼ／Ｎ‐アセチルマンノサミンキナーゼＨｓＣＳＳ          ヒトＣＭＰ‐シアル酸シンテターゼＨｓＳＰＳ          ヒトＮ‐アセチルノイラミン酸‐９‐リン酸シンテターゼＭｍＳＴ６‐３３    ＳｃＫＲＥ２リーダーに融合したトランケート化したマウスα‐２，６‐シアル酸転移酵素ＬｍＳＴＴ３ｄ      大形リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）由来のオリゴ糖転移酵素の触媒サブユニット酵母の形質転換およびスクリーニング
【０１５９】
糖鎖工学的に操作されたＧＳ６．０株をＹＰＤ富栄養培地（酵母エキス１％、ペプトン２％およびブドウ糖２％）で増殖し、対数増殖期に遠心分離によって収穫し、氷冷した１Ｍ  ソルビトールにより３回洗浄した。Ｓｐｅ１で消化したプラスミドの１ないし５μｇをコンピテント酵母細胞と混合し、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）電気穿孔プログラムをプリセットしたＢｉｏ‐Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（登録商標）（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ，２０００  Ａｌｆｒｅｄ  Ｎｏｂｅｌ  Ｄｒｉｖｅ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ  ９４５４７）を使用して電気穿孔処理した。回復用の富栄養培地中２４℃で一時間後に、該細胞をゼオシン３００μｇ／ｍｌを含有する最少
グルコース（ＹＮＢ１．３４％、ビオチン０．０００４％、ブドウ糖２％、寒天１．５％）寒天平板培地に播き、形質転換体が現れるまで２４℃でインキュベートした。抗体の精製
【０１６０】
分泌された抗体の精製は、当業者によって利用可能な公表された方法、例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４（２）：２１０‐２１５（２００６）を使用して実施可能であり、その方法において抗体は発酵上清からプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによって捕獲され、フェニルセファロース高速流動樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用してさらに精製される。α‐２，３シアル酸化抗ＴＮＦ二重突然変異タンパク質抗体の作成
【０１６１】
「α２，３  ＳＡ  ＩｇＧ」と特定される試薬は、上記のＧＦＩ６．０株において産生される配列番号２および配列番号３のアミノ酸配列を有する抗ＴＮＦ抗体に相当し、それはインビトロでα２，６結合型シアル酸を除去するためにノイラミニダーゼにより処理し、さらにインビトロでα‐２，３シアル酸転移酵素により処理した。即ち、精製した抗体（４〜５ｍｇ／ｍｌ）を、１ｍｌ当たり塩化ナトリウム６．１６ｍｇ、一塩基性リン酸ナトリウム脱水物０．９６ｍｇ、二塩基性リン酸ナトリウム二水和物１．５３ｍｇ、クエン酸ナトリウム０．３０ｍｇ、クエン酸一水和物１．３０ｍｇ、マンニトール１２ｍｇ、ポリソルベート８０  １．０ｍｇを含むｐＨ５．２に調整した製剤バッファー中に放置した。抗体混合液にノイラミニダーゼ（１０ｍＵ／ｍｌ）を添加し、少なくとも５時間または脱アシル酸化が完了するまで３７℃でインキュベートした。脱シアル酸化した物質は、ノイラミニダーゼを除去するためにＣａｐｔｏＭＭＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム精製に適用し、４ｍｇ／ｍｌの濃度でシアル酸転移酵素バッファー（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２）に再配合した。α‐２，３シアル酸伸長のために、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）において発現され、ｈｉｓタグにより精製された組換え酵素、マウスα‐２，３シアル酸転移酵素を使用した。該酵素混合物は、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ（登録商標）、カタログ番号１１８７３５８０００１）の存在下に１．２ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ中に配合した。シアル酸化反応に先立って、ペプスタチン（５０μｇ／ｍｌ）、キモスタチン（２ｍｇ／ｍｌ）および１０ｍＭ  ＣＭＰ‐シアル酸を酵素混合物に添加し、引き続いて０．２μｍのフィルターを通して滅菌した。酵素混合物の１ｍｌを脱シアル酸化した物質１０ｍｌに添加した。反応は３７℃で８時間行った。シアル酸化の収率はＥＳＩ‐Ｑ‐ＴＯＦによる質量測定によって確認した。最終物質はＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製し、上記のバッファー中に配合し濾過滅菌（０．２μｍ膜）した。最終物質のグリコシル化物は２‐ＡＢラベリング法に基づくＨＰＣＬによって分析した。該ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの約８９％がＮＡＮＡ（１‐２）Ｇａｌ（１‐２）ＧｌｃＮＡｃ（２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるオリゴ糖構造を含んでいた。
【実施例２】
【０１６２】
α‐２，３シアル酸化Ｆｃ含有ポリペプチドの抗腫瘍活性
【０１６３】
Ｆｃ含有ポリペプチドのα‐２，３結合型シアル酸化が免疫細胞のエフェクター機能を増強し得るかどうかを特定するために、４Ｔ１腫瘍細胞株を使用してα‐２，３結合型ＳＡ  ＩｇＧの効力を測定した。
【０１６４】
ホタルルシフェラーゼ［Ｌｕｃ２］により安定して形質転換されたマウス乳房腫瘍細胞株４Ｔ１［ＡＴＣＣ  ＣＲＬ＿２５３９］をＦＢＳ１０％添加ＲＰＭＩ‐１６４０培地で培養した。３ｘ１０５の４Ｔ１‐Ｌｕｃ２細胞を、８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹側に皮下経路により移植した。移植後一週間目に腫瘍をＢｉｏｐｔｉｃｏｎ  ＴｕｍｏｒＩｍａｇｅｒを使用して３次元測定によって評価し、処理群にランダム化した。各々５匹のマウスから成る群を、週ごとの処理計画において明示した抗体の用量により３週間の間続けて処理した。腫瘍体積は毎週モニターし、結果はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析した。
【０１６５】
このモデルにおいて、正の対照として抗マウスＰＤ１アンタゴニスト抗体（自家製）を使用した。負の対照としてアイソタイプ抗体および抗ＣＤ９０（自家製）抗体を使用した。
【０１６６】
本実験は、抗ＰＤ１処理がＣＤ８の細胞障害性応答を活性化し、腫瘍増殖を抑制する一方で、同時に抗ＣＤ９０がすべてのＴリンパ球サブセットを欠失させ制御されない腫瘍増殖を可能とすることを示す（図１〜２）。α‐２，３  ＳＡ  ＩｇＧは腫瘍体積を劇的に減少させる。
【０１６７】
α‐２，３シアル酸化ＩｇＧによる皮下４Ｔ１‐Ｌｕｃ２乳房腫瘍を有するマウスの処理は、アイソタイプ処理したマウスと比較した場合に４９％という中位の腫瘍増殖阻害（「ＴＧＩ」）をもたらした（図３）。抗ＰＤ１は強いＴＧＩ（６９％）を示したが、一方、抗ＣＤ９０は弱いＴＧＩを示した。インビボでのアイソタイプ処理群の腫瘍倍加時間［ＴＤＴ］は、α‐２，３シアル酸化ＩｇＧ処理群の４．７日と比較して３．９日であった。この測定値からすると、α‐２，３シアル酸化ＩｇＧ処理された動物における腫瘍が〜１６００立方ｍｍに達するまでには、アイソタイプ処理した動物のわずか約２９日と比較して、平均約３４日を要するであろう。
【０１６８】
研究の最後に、マウスをＤ‐ルシフェリン１５０ｍｇ／ｋｇ体重で処理し、そしてマウスは１０分後に安楽死させた。肺を収穫し、ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ［Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ］を使用して撮像した。肺コロニー形成に対する相対生物発光はＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを使用して評価した。アイソタイプ処理した動物における腫瘍は、肺へ転移する強い傾向を示すが［転移率１００％］、一方、α‐２，３シアル酸化ＩｇＧにより処理した場合はマウスのわずか２０％だけが肺コロニー形成を示しており、転移抑制効果を示唆している（図４）。抗ＰＤ１処理も強い転移抑制効果を示すが、一方、抗ＣＤ９０処理マウスは、すべてのマウスにおいて驚くべき腫瘍転移を示した（データ未掲載）。
【実施例３】
【０１６９】
増加したα２，３シアル酸含量を有する抗ＣＤ４０アゴニスト抗体のアジュバントおよび抗腫瘍活性
【０１７０】
ＣＤ４０は、抗原提示細胞上で発現される腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーの一メンバーである。ＣＤ４０アゴニストは、種々の腫瘍に対する免疫応答を引き起こすこと、および種々の新生細胞の増殖をインビトロおよびインビボの双方で阻害することが明らかにされている。抗原提示細胞上のＦｃγ受容体ＩＩＢに対す増強された結合能を有するＣＤ４０に対するアゴニストｍＡｂは、抗原提示細胞の活性を増加し、それによって獲得免疫応答を促進することが明らかにされている（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３（６０４５）：１０３０（２０１１））。ＣＤ４０アゴニスト抗体は、膨張を促進するＤＣ（樹状細胞）の熟成および細胞障害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化をもたらす阻害的なＦｃｇＲＩＩＢとの共会合を要求するということが提案された。
【０１７１】
増加したＦｃγ受容体ＩＩＢ結合能を有する抗ＣＤ４０アゴニストｍＡｂがそのＦｃ領域における増加したα‐２，３シアル酸含量から利益を得ることが可能かどうかを研究するために、そのＦｃ領域上に突然変異Ｆ２４３Ａ／Ｖ２６４Ａを導入することによって、およびＧＦＩ６．０株において該抗体を発現することによって該抗体を修飾した。この抗体は、次に腫瘍退縮および全体の長期生存に関して、４Ｔ１転移性乳癌モデルおよび／またはマウスＢ細胞リンパ腫Ａ２０モデルにおいて研究した。
【０１７２】
４Ｔ１モデルは実施例２に記載している。即ち、ホタルルシフェラーゼ［Ｌｕｃ２］により安定して形質転換したマウス乳房腫瘍細胞株４Ｔ１［ＡＴＣＣ  ＣＲＬ＿２５３９］を、ＦＢＳ１０％添加ＲＰＭＩ‐１６４０培地で培養する。３ｘ１０５の４Ｔ１‐Ｌｕｃ２細胞を、８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹側に皮下経路により移植する。移植後一週間目に、腫瘍をＢｉｏｐｔｉｃｏｎ  ＴｕｍｏｒＩｍａｇｅｒを使用して３次元測定によって評価し、処理群にランダム化する。各々５匹のマウスから成る群を、毎週の処理計画において明示した改変型抗ＣＤ４０抗体の用量により３週間の間続けて処理する。腫瘍体積は毎週モニターし、結果はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析した。
【０１７３】
もう一つのモデルにおいて動物は、マウスＢ細胞リンパ腫細胞Ａ２０に感染させ、次に改変型抗ＣＤ４０抗体により処理する。Ａ２０細胞は、ＦＢＳ１０％、Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ１％、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび５０μＭ  ２−メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩで維持する。ＢＡＬＢ／ｃマウスの静脈内に、マウス対照ＩｇＧか改変型抗ＣＤ４０抗体のいずれかの２００μｇを注射する。一時間後に、２ｘ１０７のＡ２０細胞を皮下に接種する。Ａ２０感染マウスに対する腫瘍増殖および長期生存をモニターする。
【実施例４】
【０１７４】
コラーゲン抗体誘導関節炎（ＡＩＡ）モデルにおけるα２，３シアル酸化ＦＣフラグメントの効果
【０１７５】
モデルの誘導：ＡＩＡ（抗体誘導関節炎）は、５のモノクローナル抗体、即ちクローンＡ２‐１０（ＩｇＧ２ａ）、Ｆ１０‐２１（ＩｇＧ２ａ）、Ｄ８‐６（ＩｇＧ２ａ）、Ｄ１‐２Ｇ（ＩｇＧ２ｂ）およびＤ２‐１１２（ＩｇＧ２ｂ）のカクテルからなり、ＩＩ型コラーゲンの種々の種の保存エピトープを認識する市販のＡｒｔｈｒｏｇｅｎ‐ＣＩＡ（登録商標）関節炎誘発性モノクローナル抗体（Ｃｈｏｎｄｒｅｘから購入）により誘導する。
【０１７６】
動物：追加の同時刺激因子なしで関節炎誘導しやすい１０週齢のＢ１０．ＲＩＩＩマウスを使用した。これらの動物はＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒｔｏｒｙ  から購入した。
【０１７７】
臨床スコアリング：関節炎誘導後、毎日脚の腫脹を測定した。各々の脚を個別に評価し、脚のスコアは全体の疾患スコアを得るために加えた：無腫脹＝０；指の腫脹＝１、指と脚の腫脹＝２；アキレス関節合併症を有する指と脚＝３；マウス当たりの最小スコア＝０、最大スコア＝１２。
【０１７８】
研究計画：関節炎は、抗‐ＣＩＩｍＡｂ病原体カクテルＩＶの３ｍｇの０日目の受身移入によって誘導した。マウス群は以下の試薬により皮下処理した：
【表２】
2014532661.tif 000005
【０１７９】
「α２，３シアル酸化Ｆｃ」と特定される試薬は、配列番号９のアミノ酸配列（ただし、５‘位置に追加のアラニン残基を含む）を含み、以下の遺伝子系図：［ｕｒａ５Δ：：ＳｃＳＵＣ２  ｏｃｈ１Δ：：ｌａｃＺ  ｂｍｔ２Δ：：ｌａｃＺ／ＫｌＭＮＮ２‐２，ｍｎｎ４Ｌ１Δ：：ｌａｃＺ／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３  ｐｎｏ１Δｍｎｎ４Δ：：ｌａｃＺ，ＡＤＥ１：：ｌａｃＺ／ＮＡ１０／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３／ＦＢ８，ｈｉｓ１Δ：：ｌａｃＺ／ＳｃＧＡＬ１０／ＸＢ３３／ＤｍＵＧＴ，ａｒｇ１Δ：：ＨＩＳ１／ＫＤ５３／ＴＣ５４，ｂｍｔ４Δ：：ｌａｃＺ  ｂｍｔ１Δ：：ｌａｃＺ  ｂｍｔ３Δ：：ｌａｃＺ，ＴＲＰ２：：ＡＲＧ１／ＭｍＣＳＴ／ＨｓＧＮＥ／ＨｓＣＳＳ／ＨｓＳＰＳ／ｒＳｉａＴ６‐３３，ＴＲＰ５：：ｌａｃＺ／ＭｍＣＳＴ／ＨｓＧＮＥ／ＨｓＣＳＳ／ＨｓＳＰＳ／ｒＳｉａＴ６‐３３，ＡＤＥ８：：ｌａｃＺ‐ＵＲＡ５‐ｌａｃＺ／ＴｒＭＤＳ１／ＬｍＳＴＴ３ｄ，ＴＲＰ２：：Ｓｈ  ｂｌｅ／ｈＦｃ  ｄｏｕｂｌｅ  ｍｕｔｅｉｎ（ＳＥＱ２）（二重突然変異タンパク質（配列２）），ａｔｔ１  Δ：：ＳｃＡＲＲ３］を有するピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ３１４２５において産生されたＦｃフラグメントに相当する。試薬は、抗体を発酵上清からプロテインＡアフィニテ
ィクロマトグラフィーによって捕獲し、フェニルセファロース高速流動樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用してさらに精製する標準法を使用して精製した。該最終物質のグリコシル化物はＮＰ（順相）‐ＨＰＬＣによって分析した。該ポリペプチド上の該Ｎ‐グリカンの８４％は、末端から２番目のガラクトース残基にα‐２，３結合したシアル酸を有する二重シアル酸化グリカン（ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を含んでいた。
【０１８０】
「脱グリコシル化Ｆｃ」と特定される試薬は、配列番号９のアミノ酸配列（ただし、５‘位置に追加のアラニン残基を含む）を含み、以下の遺伝子系図：［ｕｒａ５Δ：：ＳｃＳＵＣ２  ｏｃｈ１Δ：：ｌａｃＺ  ｂｍｔ２Δ：：ｌａｃＺ／ＫｌＭＮＮ２‐２  ｍｎｎ４Ｌ１Δ：：ｌａｃＺ／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３  ｐｎｏ１Δｍｎｎ４Δ：：ｌａｃＺ  ＡＤＥ１：ｌａｃＺ／ＮＡ１０／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３／ＦＢ８ｈｉｓ１Δ：：ｌａｃＺ／ＳｃＧＡＬ１０／ＸＢ３３／ＤｍＵＧＴ    ａｒｇ１Δ：：ＨＩＳ１／ＫＤ５３／ＴＣ５４ｂｍｔ４Δ：：ｌａｃＺ  ｂｍｔ１Δ：：ｌａｃＺ  ｂｍｔ３Δ：：ｌａｃＺ  ＴＲＰ２：ＡＲＧ１／ＭｍＣＳＴ／ＨｓＧＮＥ／ＨｓＣＳＳ／ＨｓＳＰＳ／ＭｍＳＴ６‐３３ｓｔｅ１３Δ：：ｌａｃＺ／ＴｒＭＤＳ１  ｄａｐ２Δ：：ＮａｔＲ  ＴＲＰ５：ＨｙｇＲＭｍＣＳＴ／ＨｓＧＮＥ／ＨｓＣＳＳ／ＨｓＳＰＳ／ＭｍＳＴ６‐３３  Ｖｐｓ１０‐１Δ：：ＡＯＸ１ｐ＿ＬｍＳＴＴ３ｄ  ＴＲＰ２：：Ｓｈ  ｂｌｅ／ｈＦｃ  ｄｏｕｂｌｅ  ｍｕｔｅｉｎ（ＳＥＱ２）（二重突然変異タンパク質（配列２））］を有するピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ２７８９３において産生されたＦｃフラグメントに相当する。試薬は、抗体を発酵上清からプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによって捕獲し、フェニルセファロース高速流動樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用してさらに精製する標準法を使用して精製した。得られたタンパク質は、Ｎ‐結合型グリカンを除去するためにインビトロでペプチド：Ｎ‐グリカナーゼによって処理した。
【０１８１】
「ＡＩＡ対照」と特定される群は、（ＡＩＡを誘導するための抗ＣＩＩｍＡｂ病原体カクテルの投与以外の）いかなる処理も受けなかったマウスを表す。
【０１８２】
「無感作」と特定される群は、ＡＩＡを誘導するための抗ＣＩＩｍＡｂ病原体カクテルを受けなかったマウスに相当する。
【０１８３】
マウスの全ての群には０日目に投与した。臨床スコアは１０日間モニターした。
【０１８４】
これらの実験結果は図５に示す。α２，３シアル酸化‐Ｆｃは、本炎症モデルにおける脚の腫脹と浮腫を劇的に増強した。配列表
【化２】
2014532661.tif 000006
2014532661.tif 000007
2014532661.tif 000008
【０１８５】
本発明は、本明細書において例証的な実施形態に関連して記載されているが、本発明がこれに限定されるものでないことを理解されたい。当業者であって本明細書の教示を利用する者であれば、本発明の範囲以内においてさらなる改変および実施形態を認知し得るであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2014532661.tif 000012
【図５】
2014532661.tif 000013
【配列表】
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【国際調査報告】
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