(57)【要約】ヒト型結核菌ポリンＡ（ＭｔｐＡ）のアミノ末端ドメインを含む単離されたポリペプチドであって、ポリンモノマーであるポリペプチドが本明細書に提供される。ヒト型結核菌ポリンＡのカルボキシ末端ドメインを含む単離されたポリペプチドであって、毒素であるポリペプチドも提供される。ヒト型結核菌（Ｍｔｂ）感染を有するか、またはＭｔｂ感染を発症する危険性のある対象におけるＭｔｂ感染を治療または予防する方法も提供される。ヒト型結核菌ポリンのアミノ末端ドメインを含む第１のポリペプチドおよび抗原を含む第２のポリペプチドを含むキメラポリンポリペプチド、ならびに対象において免疫応答を誘発する方法におけるキメラポリンポリペプチドの使用がさらに提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト型結核菌ポリンＡ（ＭｔｐＡ）のアミノ末端ドメインを含む単離されたポリペプチドであって、ポリンモノマーである、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
前記アミノ末端ドメインが、配列番号１のアミノ酸１〜４４３を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが配列番号１を含む、請求項１または２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
ヒト型結核菌ポリンＡ（ＭｔｐＡ）のカルボキシ末端ドメインを含む単離されたポリペプチドであって、毒素である、単離されたポリペプチド。
【請求項５】
ＭｔｐＡのカルボキシ末端ドメインが配列番号１のアミノ酸６５０〜８４６を含む、請求項４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
ＭｔｐＡのアミノ末端ドメインが変異を含むか、ＭｔｐＡのカルボキシ末端ドメインが変異を含むか、またはこれら両方である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドをコードする核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項９】
ヒト型結核菌（Ｍｔｂ）感染を有するか、またはＭｔｂ感染を発症する危険性のある対象におけるＭｔｂ感染を治療または予防する方法であって、前記対象に、ヒト型結核菌ポリン（Ｍｔｐ）の活性を調節する第１の作用物質と、前記Ｍｔｂ感染を治療または予防する第２の作用物質と、を投与することを含む、方法。
【請求項１０】
前記Ｍｔｐがヒト型結核菌ポリンＡ（ＭｔｐＡ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の作用物質がＭｔｐＡのアミノ末端ドメインを標的とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の作用物質が、前記第１の作用物質の不在下での取り込みと比較して前記Ｍｔｐによる前記第２の作用物質の取り込みを増加させることによって前記Ｍｔｐの活性を調節する、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の作用物質が、前記作用物質の不在下での取り込みと比較して前記Ｍｔｐによる１つ以上の栄養素または炭素源の取り込みを減少させることによって前記Ｍｔｐの活性を調節する、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記炭素源がグリセロールである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の作用物質が、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、エタンブトール、イソニアジド、ｐ−アミノサリチル酸、サイクロセリン、バンコマイシン、ストレプトマイシン、クラリソマイシン、エリスロマイシンＡ、リファンピシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、およびノルフロキサシンからなる群から選択される、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ヒト型結核菌（Ｍｔｂ）感染を有するか、またはＭｔｂ感染を発症する危険性のある対象におけるＭｔｂ感染を治療または予防する方法であって、前記対象に、ヒト型結核菌によって生成された毒素を中和する第１の作用物質と、前記Ｍｔｂ感染を治療または予防する第２の作用物質と、を投与することを含む、方法。
【請求項１７】
前記毒素がヒト型結核菌ポリンＡ（ＭｔｐＡ）のカルボキシ末端ドメインを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の作用物質がＭｔｐＡの切断配列を標的とし、前記切断配列がＭｔｐＡのアミノ末端ドメインとＭｔｐＡのカルボキシ末端ドメインとの間に位置する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の作用物質がＭｔｐＡのアミノ末端ドメインからのＭｔｐＡのカルボキシ末端ドメインの切断を阻止する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の作用物質が、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、エタンブトール、イソニアジド、ｐ−アミノサリチル酸、サイクロセリン、バンコマイシン、ストレプトマイシン、クラリソマイシン、エリスロマイシンＡ、リファンピシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、およびノルフロキサシンからなる群から選択される、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ヒト型結核菌ポリンのアミノ末端ドメインを含む第１のポリペプチドと、抗原を含む第２のポリペプチドと、を含む、キメラポリンポリペプチド。
【請求項２２】
前記ヒト型結核菌ポリンのアミノ末端ドメインが配列番号１のアミノ酸１〜４４３を含む、請求２１に記載のキメラポリンポリペプチド。
【請求項２３】
前記抗原が、ウイルス抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、プリオン抗原、および寄生虫抗原からなる群から選択される、請求２１に記載のキメラポリンポリペプチド。
【請求項２４】
前記抗原が癌抗原である、請求項２１に記載のキメラポリンポリペプチド。
【請求項２５】
アミノ酸リンカーを含む第３のポリペプチドをさらに含む、請求項２１に記載のキメラポリンポリペプチド。
【請求項２６】
前記アミノ酸リンカーが切断配列を含む、請求項２５に記載のキメラポリンポリペプチド。
【請求項２７】
請求項２２〜２６のいずれか１項に記載のキメラポリンポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項２８】
請求項２７に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項２９】
対象において抗原に対する免疫応答を誘発する方法であって、前記対象に修飾されたマイコバクテリウムを投与することを含み、前記修飾されたマイコバクテリウムが、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載のキメラポリンポリペプチドを含む、方法。
【請求項３０】
前記修飾されたマイコバクテリウムが、弱毒化したヒト型結核菌である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記修飾されたマイコバクテリウムがウシ型結核菌ＢＣＧである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の２〜１２個の単離されたポリペプチドを含むヒト型結核菌ポリン（Ｍｔｐ）オリゴマー。
【請求項３３】
一本鎖ヒト型結核菌ポリン（Ｍｔｐ）オリゴマーをコードする核酸配列であって、
（ａ）少なくとも第１および第２のポリンコードヌクレオチド配列であって、前記第１のヌクレオチド配列が第１のヒト型結核菌ポリン（Ｍｔｐ）モノマーをコードし、前記第２のヌクレオチド配列が第２のポリンモノマーをコードし、前記第２のコードされたポリンモノマーがマイコバクテリウムポリンモノマーである、ポリンコードヌクレオチド配列と、
（ｂ）アミノ酸リンカーをコードするリンカー核酸配列と、
を含む、核酸配列。
【請求項３４】
前記核酸配列が、第３、第４、第５、第６、第７、および第８のヌクレオチド配列をさらに含み、前記第３、第４、第５、第６、第７、および第８のヌクレオチド配列が、第３、第４、第５、第６、第７、および第８のポリンモノマーをコードし、前記第３、第４、第５、第６、第７、および第８のポリンモノマーが、マイコバクテリウムポリンモノマーである、請求項３３に記載の核酸配列。
【請求項３５】
前記コードされたポリンモノマーのうちの少なくとも１つが野生型ヒト型結核菌ポリンＡ（ＭｔｐＡ）モノマーを含む、請求項３３または３４に記載の核酸配列。
【請求項３６】
前記コードされたポリンモノマーのすべてが野生型ヒト型結核菌ポリンＡ（ＭｔｐＡ）モノマーを含む、請求項３３または３４に記載の核酸配列。
【請求項３７】
前記コードされた野生型ＭｔｐＡモノマーが配列番号１を含む、請求項３５または３６に記載の核酸配列。
【請求項３８】
前記コードされたアミノ酸リンカーが１０〜２０個のアミノ酸を含む、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の核酸配列。
【請求項３９】
前記コードされたアミノ酸リンカーが１５個のアミノ酸を含む、請求項３８に記載の核酸配列。
【請求項４０】
前記コードされたアミノ酸リンカーが（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号４）ペプチド配列を含む、請求項３９に記載の核酸配列。
【請求項４１】
請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項４２】
前記ベクターが構成的プロモーターを含む、請求項４１に記載のベクター。
【請求項４３】
前記構成的プロモーターがｐｓｍｙｃプロモーターを含む、請求項４２に記載のベクター。
【請求項４４】
前記ベクターが誘導性プロモーターを含む、請求項４３に記載のベクター。
【請求項４５】
前記誘導性プロモーターがアセトアミド誘導性プロモーターを含む、請求項４４に記載のベクター。
【請求項４６】
導電性液体培地中の分析物を検出する方法であって、請求項３３に記載のヒト型結核菌ポリン（Ｍｔｐ）オリゴマーに電界を印加することを含み、前記Ｍｔｐオリゴマーがトンネルを画定する出入口および収縮ゾーンを有し、前記Ｍｔｐオリゴマーが第１の導電性液体培地と第２の導電性液体培地との間に位置付けられ、前記第１または第２の導電性液体培地が前記分析物を含む、方法。
【請求項４７】
前記分析物が前記トンネルと相互作用して電流パターンを提供するときにイオン電流を測定することを含み、前記電流パターンにおける遮断の出現が分析物の存在を示す、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記分析物を特定することをさらに含み、前記分析物の特定が、前記電流パターンを同一の条件下で既知の分析物を用いて得られる既知の電流パターンと比較することを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記分析物が、ヌクレオチド、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ポリマー、薬物、イオン、夾雑物、ナノスケール物体、または生物兵器剤である、請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
対象における壊死性細胞死を誘導する方法であって、前記対象に、請求項４または５に記載のポリペプチドを投与することを含む、方法。
【請求項５１】
対象における過度のまばたき、筋肉痛障害、多汗症、または頸部ジストニアを治療または予防する方法であって、前記対象に、請求項４または５に記載のポリペプチドを投与することを含む、方法。
【請求項５２】
対象におけるしわを軽減する方法であって、前記対象における１つ以上の筋肉に、請求項４または５に記載のポリペプチドを投与することを含み、前記筋肉の収縮が前記しわに関連する、方法。
【請求項５３】
ヒト型結核菌ポリン（Ｍｔｐ）の活性を調節する作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記Ｍｔｐを含む細胞を、試験される前記作用物質と接触させることと、
（ｂ）前記Ｍｔｐの活性を決定することであって、対照と比較した前記Ｍｔｐの活性の増加または減少が、前記作用物質が前記Ｍｔｐの活性を調節することを示す、決定することと、
を含む、方法。
【請求項５４】
前記Ｍｔｐが、ヒト型結核菌ポリンＡ（ＭｔｐＡ）である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＭｔｐＡが、配列番号１のアミノ酸１〜４４３を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記Ｍｔｐの活性が、抗生物質の取り込み、抗生物質の排出、または１つ以上の栄養素もしくは炭素源の取り込みからなる群から選択される、請求項５３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗生物質が、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、エタンブトール、イソニアジド、ｐ−アミノサリチル酸、サイクロセリン、バンコマイシン、ストレプトマイシン、クラリソマイシン、エリスロマイシンＡ、リファンピシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、およびノルフロキサシンからなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記炭素源がグリセロールである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
ヒト型結核菌によって生成された毒素を中和する作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）細胞を試験される前記作用物質と接触させることと、
（ｂ）前記細胞を前記毒素と接触させることと、
（ｃ）前記作用物質の存在下で細胞死のレベルを検出することであって、対照と比較した細胞死の減少が、前記作用物質が前記毒素を中和することを示す、検出することと、
を含む、方法。
【請求項６０】
前記毒素がヒト型結核菌ポリンＡ（ＭｔｐＡ）のカルボキシ末端ドメインを含む、請求項５９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年８月３０日出願の米国仮特許出願第６１／５２９，０１０号の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府資金による研究に関する記述
本発明は、米国国立衛生研究所の助成金第ＲＯ１  ＡＩ６３４３２号の下、米国政府による資金供与を受けて行われた。米国政府は、本発明においてある権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
約２０億人がヒト型結核菌（Ｍｔｂ）に感染しており、１人の感染者の肺は、１０億個以上のバチルスを含んでいる。治療に従わない場合、多剤耐性株および超多剤耐性株の選択およびその蔓延の増加につながる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ヒト型結核菌ポリンＡ（ＭｔｐＡ）のアミノ末端ドメインを含む単離されたポリペプチドであって、ポリンモノマーであるポリペプチドが提供される。ＭｔｐＡのカルボキシ末端ドメインを含む単離されたポリペプチドであって、毒素であるポリペプチドも提供される。
【０００５】
ヒト型結核菌（Ｍｔｂ）感染を有するか、またはＭｔｂ感染を発症する危険性のある対象におけるＭｔｂ感染を治療または予防する方法も提供される。この方法は、その対象に、ヒト型結核菌ポリン（Ｍｔｐ）の活性を調節する第１の作用物質およびＭｔｂ感染を治療または予防する第２の作用物質を投与することを含む。
【０００６】
キメラポリンポリペプチドが本明細書に提供される。このキメラポリンポリペプチドは、ヒト型結核菌ポリンのアミノ末端ドメインを含む第１のポリペプチドおよび抗原を含む第２のポリペプチドを含む。
【０００７】
対象において抗原に対する免疫応答を誘発する方法も提供される。この方法は、その対象に、本明細書に記載のキメラポリンポリペプチドを含む修飾されたマイコバクテリウムを投与することを含む。
【０００８】
ヒト型結核菌ポリン（Ｍｔｐ）オリゴマーが本明細書に提供される。Ｍｔｐオリゴマーは、ＭｔｐＡのアミノ末端ドメインを含む２〜１２個の単離されたポリペプチドを含み得る。
【０００９】
一本鎖ヒト型結核菌ポリン（Ｍｔｐ）オリゴマーをコードする核酸配列も提供される。この核酸配列は、少なくとも第１および第２のポリンコードヌクレオチド配列、ならびにアミノ酸リンカーをコードするリンカー核酸配列を含み得る。第１のヌクレオチド配列は、第１のＭｔｐモノマーをコードし得、第２のヌクレオチド配列は、第２のポリンモノマーをコードし得る。
【００１０】
導電性液体培地中の分析物を検出する方法が提供される。この方法は、本明細書に記載のＭｔｐオリゴマーに電界を印加することを含み、Ｍｔｐオリゴマーは、トンネルを画定する出入口および収縮ゾーンを有する。Ｍｔｐオリゴマーは、第１の導電性液体培地と第２の導電性液体培地との間に位置付けられ得、第１または第２の導電性液体培地は、分析物を含み得る。
【００１１】
対象における壊死性細胞死を誘導する方法も提供される。この方法は、その対象に、ＭｔｐＡのカルボキシ末端ドメインを含む単離されたポリペプチドを投与することを含む。ＭｔｐＡのカルボキシ末端ドメインは、対象における過度のまばたき、筋肉痛障害、多汗症、または頸部ジストニアを治療または予防する方法においても使用され得る。
【００１２】
Ｍｔｐポリンの活性を調節する作用物質をスクリーニングする方法がさらに提供される。この方法は、Ｍｔｐを含む細胞を試験される作用物質と接触させることと、Ｍｔｐの活性を決定することとを含む。対照と比較したＭｔｐの活性の増加または減少は、作用物質がＭｔｐの活性を調節していることを示す。
【００１３】
ヒト型結核菌によって生成された毒素を中和する作用物質をスクリーニングする方法が本明細書に提供される。この方法は、細胞を試験される作用物質と接触させることと、細胞を毒素と接触させることと、作用物質の存在下で細胞死のレベルを検出することとを含む。対照と比較した細胞死のレベルの減少は、作用物質が毒素を中和していることを示す。
【００１４】
１つ以上の実施形態の詳細が、以下の添付の図面および発明を実施するための形態に記載される。他の特徴、物体、および利点が、発明を実施するための形態および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】ウシ型結核菌ＢＣＧの△ｂｃｇ３９６０ｃ（△ＭｔｐＡ）変異体をコードする構築物の略図を示す。図１Ａは、ＭＬ１０１２変異体のゲノム領域を示す。ｂｃｇ３９６０ｃ遺伝子およびその隣接遺伝子が示される。黒色の矢印は、オープンリーディングフレームを表す。垂直の矢印は、トランスポゾンＩＳ１０９６：：Ｋｍの挿入を示す。Ｂｃｇ３９６０ｃタンパク質の配列は、ヒト型結核菌のＲｖ３９０３ｃの配列と同一であり、さらに、隣接遺伝子は、ウシ型結核菌ＢＣＧおよびＭｔｂにおいても同一である。図１Ｂは、様々な細菌種のＲｖ３９０３ｃドメインのＢＬＡＳＴ分析に基づく略図を示す。ＶＩＰ２、ＡＤＰリボシル化毒素ファミリー；ＴＭ：膜貫通ヘリックス；ＤＵＦ６３８、可能性のある赤血球凝集素。
【図１Ｂ】ウシ型結核菌ＢＣＧの△ｂｃｇ３９６０ｃ（△ＭｔｐＡ）変異体をコードする構築物の略図を示す。図１Ａは、ＭＬ１０１２変異体のゲノム領域を示す。ｂｃｇ３９６０ｃ遺伝子およびその隣接遺伝子が示される。黒色の矢印は、オープンリーディングフレームを表す。垂直の矢印は、トランスポゾンＩＳ１０９６：：Ｋｍの挿入を示す。Ｂｃｇ３９６０ｃタンパク質の配列は、ヒト型結核菌のＲｖ３９０３ｃの配列と同一であり、さらに、隣接遺伝子は、ウシ型結核菌ＢＣＧおよびＭｔｂにおいても同一である。図１Ｂは、様々な細菌種のＲｖ３９０３ｃドメインのＢＬＡＳＴ分析に基づく略図を示す。ＶＩＰ２、ＡＤＰリボシル化毒素ファミリー；ＴＭ：膜貫通ヘリックス；ＤＵＦ６３８、可能性のある赤血球凝集素。
【図２Ａ】ＭｔｐＡ（Ｒｖ３９０３ｃ）の細胞内局在性および外膜局在性の結果を示す。図２Ａは、細胞壁分画アッセイを示す。ニトリル誘導性全長ＭｔｐＡＨＡ−Ｈｉｓ（ｐＭＬ２０２４）またはＮ末端ドメイン（１〜４４４ａａ）ＨＡ−Ｈｉｓ（ｐＭＬ２０４０）（ドメイン１）のいずれかをコードするスメグマ菌ｍｃ２１５５の細胞内分画を分析した。細胞を超音波処理によって溶解し（溶解物）、膜画分Ｐ１００を超遠心分離によって可溶性サイトゾルおよびペリプラズムタンパク質を含有する画分ＳＮ１００から分離した。マウス抗ＨＡ−ＨＲＰ共役体を用いてタンパク質を検出した。ＥＺ−Ｒｕｎ（商標）で予め染色したＲｅｃタンパク質ラダーを用いて、タンパク質の大きさを推定した。図２Ｂは、プロテイナーゼＫを用いた表面到達性実験の結果を示す。プラスミドｐＭＬ９７０（ｐｓｍｙｃ−ｐｈｏＡＨＡ）またはｐＭＶ６０１５．１（ｐｈｓｐ６０−ＰＥ＿ＰＧＲＳ３３ＨＡ）を担持するスメグマ菌ｍｃ２１５５をアッセイ対照として用いた。いくつかの株をプロテイナーゼＫとともに（＋）、またはプロテイナーゼＫを伴わずに（−）、４℃で３０分間インキュベートした。プロテイナーゼＫを全細胞または溶解した細胞溶解物に添加した。全細胞および細胞溶解物の抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）ゲル上で分離した。実験を少なくとも２回別々に実行した。
【図２Ｂ】ＭｔｐＡ（Ｒｖ３９０３ｃ）の細胞内局在性および外膜局在性の結果を示す。図２Ａは、細胞壁分画アッセイを示す。ニトリル誘導性全長ＭｔｐＡＨＡ−Ｈｉｓ（ｐＭＬ２０２４）またはＮ末端ドメイン（１〜４４４ａａ）ＨＡ−Ｈｉｓ（ｐＭＬ２０４０）（ドメイン１）のいずれかをコードするスメグマ菌ｍｃ２１５５の細胞内分画を分析した。細胞を超音波処理によって溶解し（溶解物）、膜画分Ｐ１００を超遠心分離によって可溶性サイトゾルおよびペリプラズムタンパク質を含有する画分ＳＮ１００から分離した。マウス抗ＨＡ−ＨＲＰ共役体を用いてタンパク質を検出した。ＥＺ−Ｒｕｎ（商標）で予め染色したＲｅｃタンパク質ラダーを用いて、タンパク質の大きさを推定した。図２Ｂは、プロテイナーゼＫを用いた表面到達性実験の結果を示す。プラスミドｐＭＬ９７０（ｐｓｍｙｃ−ｐｈｏＡＨＡ）またはｐＭＶ６０１５．１（ｐｈｓｐ６０−ＰＥ＿ＰＧＲＳ３３ＨＡ）を担持するスメグマ菌ｍｃ２１５５をアッセイ対照として用いた。いくつかの株をプロテイナーゼＫとともに（＋）、またはプロテイナーゼＫを伴わずに（−）、４℃で３０分間インキュベートした。プロテイナーゼＫを全細胞または溶解した細胞溶解物に添加した。全細胞および細胞溶解物の抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）ゲル上で分離した。実験を少なくとも２回別々に実行した。
【図３Ａ】ＭｔｐＡおよびそのＮ末端ドメインがグリセロールの取り込みおよびグリセロール上での増殖に必要であることを示す。図３Ａは、ウシ型結核菌ＢＣＧのｍｔｐＡ変異体の唯一の炭素源として０．１％グリセロールを含有する最小ＨｄＢ培地上での増殖を示すグラフを示す。図３Ｂは、ウシ型結核菌ＢＣＧの△ｍｔｐＡ変異体および相補株による１４Ｃ標識化グリセロールの蓄積を示すグラフを示す。
【図３Ｂ】ＭｔｐＡおよびそのＮ末端ドメインがグリセロールの取り込みおよびグリセロール上での増殖に必要であることを示す。図３Ａは、ウシ型結核菌ＢＣＧのｍｔｐＡ変異体の唯一の炭素源として０．１％グリセロールを含有する最小ＨｄＢ培地上での増殖を示すグラフを示す。図３Ｂは、ウシ型結核菌ＢＣＧの△ｍｔｐＡ変異体および相補株による１４Ｃ標識化グリセロールの蓄積を示すグラフを示す。
【図４Ａ】スメグマ菌から精製されたＲｖ３９０３ｃ（ＭｔｐＡ）のＮ末端ドメインの精製および単一チャネルレコーディングを示す。スメグマ菌におけるｒｖ３９０３ｃＨＡ−ＨｉｓのＮ末端ドメインの発現およびクロマトグラフィーによる精製。Ｒｖ３９０３ｃ（ａａ１〜４４４）のＮ末端ドメインを、ニトリル誘導性プラスミドｐＭＬ２０４０を用いてスメグマ菌ｍｃ２１５５で発現させた。試料を１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、クマシーブルーで染色するか（図４Ａ）、または抗ＨＡ抗体を用いてウエスタンブロット法で検出した（図４Ｂ）。レーンＭ、分子量マーカー；超音波処理後のペレット１（レーン１）および可溶性画分１（レーン２）；３７℃の０．８％ＳＤＳで一晩抽出した後のペレット２（レーン３）および可溶性画分２（レーン４）；レーン５、Ｎｉ２＋親和性精製；レーン６、アニオン交換精製；レーン７、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル精製。図４Ｃは、脂質二重層実験における精製されたＲｖ３９０３ｃ（ａａ１〜４４４）の単一チャネルレコーディングのトラッキングを示す。１Ｍ  ＫＣｌ中に浸したジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）膜の電流（Ｉ）を、その膜の両面に１００ｎｇ未満の精製タンパク質を添加した後に記録した（最終濃度、１０ｎｇ／ｍＬ未満）。開口（図４Ｄ）および閉鎖（図４Ｅ）現象の周波数を１４個の膜の単一チャネルコンダクタンスから得た。主な単一チャネルコンダクタンスは、４．０±０．２ｎＳである。
【図４Ｂ】スメグマ菌から精製されたＲｖ３９０３ｃ（ＭｔｐＡ）のＮ末端ドメインの精製および単一チャネルレコーディングを示す。スメグマ菌におけるｒｖ３９０３ｃＨＡ−ＨｉｓのＮ末端ドメインの発現およびクロマトグラフィーによる精製。Ｒｖ３９０３ｃ（ａａ１〜４４４）のＮ末端ドメインを、ニトリル誘導性プラスミドｐＭＬ２０４０を用いてスメグマ菌ｍｃ２１５５で発現させた。試料を１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、クマシーブルーで染色するか（図４Ａ）、または抗ＨＡ抗体を用いてウエスタンブロット法で検出した（図４Ｂ）。レーンＭ、分子量マーカー；超音波処理後のペレット１（レーン１）および可溶性画分１（レーン２）；３７℃の０．８％ＳＤＳで一晩抽出した後のペレット２（レーン３）および可溶性画分２（レーン４）；レーン５、Ｎｉ２＋親和性精製；レーン６、アニオン交換精製；レーン７、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル精製。図４Ｃは、脂質二重層実験における精製されたＲｖ３９０３ｃ（ａａ１〜４４４）の単一チャネルレコーディングのトラッキングを示す。１Ｍ  ＫＣｌ中に浸したジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）膜の電流（Ｉ）を、その膜の両面に１００ｎｇ未満の精製タンパク質を添加した後に記録した（最終濃度、１０ｎｇ／ｍＬ未満）。開口（図４Ｄ）および閉鎖（図４Ｅ）現象の周波数を１４個の膜の単一チャネルコンダクタンスから得た。主な単一チャネルコンダクタンスは、４．０±０．２ｎＳである。
【図４Ｃ】スメグマ菌から精製されたＲｖ３９０３ｃ（ＭｔｐＡ）のＮ末端ドメインの精製および単一チャネルレコーディングを示す。スメグマ菌におけるｒｖ３９０３ｃＨＡ−ＨｉｓのＮ末端ドメインの発現およびクロマトグラフィーによる精製。Ｒｖ３９０３ｃ（ａａ１〜４４４）のＮ末端ドメインを、ニトリル誘導性プラスミドｐＭＬ２０４０を用いてスメグマ菌ｍｃ２１５５で発現させた。試料を１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、クマシーブルーで染色するか（図４Ａ）、または抗ＨＡ抗体を用いてウエスタンブロット法で検出した（図４Ｂ）。レーンＭ、分子量マーカー；超音波処理後のペレット１（レーン１）および可溶性画分１（レーン２）；３７℃の０．８％ＳＤＳで一晩抽出した後のペレット２（レーン３）および可溶性画分２（レーン４）；レーン５、Ｎｉ２＋親和性精製；レーン６、アニオン交換精製；レーン７、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル精製。図４Ｃは、脂質二重層実験における精製されたＲｖ３９０３ｃ（ａａ１〜４４４）の単一チャネルレコーディングのトラッキングを示す。１Ｍ  ＫＣｌ中に浸したジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）膜の電流（Ｉ）を、その膜の両面に１００ｎｇ未満の精製タンパク質を添加した後に記録した（最終濃度、１０ｎｇ／ｍＬ未満）。開口（図４Ｄ）および閉鎖（図４Ｅ）現象の周波数を１４個の膜の単一チャネルコンダクタンスから得た。主な単一チャネルコンダクタンスは、４．０±０．２ｎＳである。
【図４Ｄ】スメグマ菌から精製されたＲｖ３９０３ｃ（ＭｔｐＡ）のＮ末端ドメインの精製および単一チャネルレコーディングを示す。スメグマ菌におけるｒｖ３９０３ｃＨＡ−ＨｉｓのＮ末端ドメインの発現およびクロマトグラフィーによる精製。Ｒｖ３９０３ｃ（ａａ１〜４４４）のＮ末端ドメインを、ニトリル誘導性プラスミドｐＭＬ２０４０を用いてスメグマ菌ｍｃ２１５５で発現させた。試料を１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、クマシーブルーで染色するか（図４Ａ）、または抗ＨＡ抗体を用いてウエスタンブロット法で検出した（図４Ｂ）。レーンＭ、分子量マーカー；超音波処理後のペレット１（レーン１）および可溶性画分１（レーン２）；３７℃の０．８％ＳＤＳで一晩抽出した後のペレット２（レーン３）および可溶性画分２（レーン４）；レーン５、Ｎｉ２＋親和性精製；レーン６、アニオン交換精製；レーン７、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル精製。図４Ｃは、脂質二重層実験における精製されたＲｖ３９０３ｃ（ａａ１〜４４４）の単一チャネルレコーディングのトラッキングを示す。１Ｍ  ＫＣｌ中に浸したジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）膜の電流（Ｉ）を、その膜の両面に１００ｎｇ未満の精製タンパク質を添加した後に記録した（最終濃度、１０ｎｇ／ｍＬ未満）。開口（図４Ｄ）および閉鎖（図４Ｅ）現象の周波数を１４個の膜の単一チャネルコンダクタンスから得た。主な単一チャネルコンダクタンスは、４．０±０．２ｎＳである。
【図４Ｅ】スメグマ菌から精製されたＲｖ３９０３ｃ（ＭｔｐＡ）のＮ末端ドメインの精製および単一チャネルレコーディングを示す。スメグマ菌におけるｒｖ３９０３ｃＨＡ−ＨｉｓのＮ末端ドメインの発現およびクロマトグラフィーによる精製。Ｒｖ３９０３ｃ（ａａ１〜４４４）のＮ末端ドメインを、ニトリル誘導性プラスミドｐＭＬ２０４０を用いてスメグマ菌ｍｃ２１５５で発現させた。試料を１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、クマシーブルーで染色するか（図４Ａ）、または抗ＨＡ抗体を用いてウエスタンブロット法で検出した（図４Ｂ）。レーンＭ、分子量マーカー；超音波処理後のペレット１（レーン１）および可溶性画分１（レーン２）；３７℃の０．８％ＳＤＳで一晩抽出した後のペレット２（レーン３）および可溶性画分２（レーン４）；レーン５、Ｎｉ２＋親和性精製；レーン６、アニオン交換精製；レーン７、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル精製。図４Ｃは、脂質二重層実験における精製されたＲｖ３９０３ｃ（ａａ１〜４４４）の単一チャネルレコーディングのトラッキングを示す。１Ｍ  ＫＣｌ中に浸したジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）膜の電流（Ｉ）を、その膜の両面に１００ｎｇ未満の精製タンパク質を添加した後に記録した（最終濃度、１０ｎｇ／ｍＬ未満）。開口（図４Ｄ）および閉鎖（図４Ｅ）現象の周波数を１４個の膜の単一チャネルコンダクタンスから得た。主な単一チャネルコンダクタンスは、４．０±０．２ｎＳである。
【図５Ａ】大腸菌から精製されたＲｖ３９０３ｃ（ＭｔｐＡ）のＮ末端ドメインの精製および単一チャネルレコーディングを示す。Ｒｖ３９０３ｃ（ａａ４９〜４４４）のＮ末端ドメインを、プラスミドｐＭＬ２０６９を用いて大腸菌ＢＬ２１で発現させた。この試料をクマシーブルーで染色した１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した（図５Ａ）。レーンＭ、分子量マーカー；イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドでの誘導前（レーン１）および誘導後（レーン２）のＢＬ２１／ｐＭＬ２０６９の可溶性画分；レーン３、超音波処理後の全細胞溶解物；レーン４、Ｎｉ２＋親和性精製；レーン５、ｓｔｒｅｐタグ精製；レーン７、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル精製。図５Ｂは、脂質二重層実験における精製されたＲｖ３９０３ｃ（ａａ４９〜４４４）の単一チャネルレコーディングのトラッキングを示す。１Ｍ  ＫＣｌ中に浸したＤＰｈＰＣ膜の電流（Ｉ）を、その膜の両面に１００ｎｇ未満の精製タンパク質を添加した後に記録した。
【図５Ｂ】大腸菌から精製されたＲｖ３９０３ｃ（ＭｔｐＡ）のＮ末端ドメインの精製および単一チャネルレコーディングを示す。Ｒｖ３９０３ｃ（ａａ４９〜４４４）のＮ末端ドメインを、プラスミドｐＭＬ２０６９を用いて大腸菌ＢＬ２１で発現させた。この試料をクマシーブルーで染色した１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した（図５Ａ）。レーンＭ、分子量マーカー；イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドでの誘導前（レーン１）および誘導後（レーン２）のＢＬ２１／ｐＭＬ２０６９の可溶性画分；レーン３、超音波処理後の全細胞溶解物；レーン４、Ｎｉ２＋親和性精製；レーン５、ｓｔｒｅｐタグ精製；レーン７、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル精製。図５Ｂは、脂質二重層実験における精製されたＲｖ３９０３ｃ（ａａ４９〜４４４）の単一チャネルレコーディングのトラッキングを示す。１Ｍ  ＫＣｌ中に浸したＤＰｈＰＣ膜の電流（Ｉ）を、その膜の両面に１００ｎｇ未満の精製タンパク質を添加した後に記録した。
【図６】対照スメグマ菌ＭＬ１６株（△ｍｓｐＡ、△ｍｓｐＢ、△ｍｓｐＣ、円形）、ＭＬ１６＋ｐＭＮ０１６株（Ｐｓｍｙｃ−ＭｓｐＡ、逆三角形）、またはＭＬ１６＋ｐＭＬ２０６１株（ｐｉｍｙｃ−Ｒｖ３９０３ｃ（ａａ１〜４４４）、四角形）によるグリセロール取り込みを示す。３７℃で最終濃度３μＭの［１４Ｃ］グリセロールを用いてアッセイを行った。取り込み率を細胞１ミリグラム当たりのグリセロール（ｎｍｏｌ単位）で表す。この取り込み実験を三重に行い、標準偏差で示される。
【図７Ａ】△ｒｖ３９０３ｃ（△ｍｔｐＡ）変異体の生体内での生存率を示す。図７Ａは、ＴＨＰ−１細胞系におけるウシ型結核菌ＢＣＧの生存率を示すグラフを示す。ＴＨＰ−１細胞を、野生型ウシ型結核菌ＢＣＧ（ＭＬ３８３、円形）、△ｒｖ３９０３ｃ変異体（ＭＬ３８６、三角形）、およびＭｓｐＡ（ＭＬ３８７、四角形）またはＲｖ３９０３ｃ（ＭＬ３８８、ひし形）のいずれかで補完された△ｒｖ３９０３ｃ変異体に２０のＭＯＩで感染させた。感染から３時間後、マクロファージをＰＢＳで洗浄して非内部化細菌を除去した。感染後に溶解マクロファージの連続希釈物を指示された時点でプレーティングし、２週間のインキュベーション後にコロニー形成単位（ＣＦＵ）を数えた。ＣＦＵをそれぞれの株の最初の接種材料に従って正規化した。図７Ｂは、ウシ型結核菌ＢＣＧの野生型および△ｒｖ３９０３ｃ変異体の生存率における一酸化窒素の役割を示すグラフを示す。ヒト単球由来マクロファージ（ＨＭＤＭ）を、野生型ウシ型結核菌ＢＣＧ（灰色）または△ｒｖ３９０３ｃ変異体（白色）に１〜３のＭＯＩで感染させた。必要に応じて、感染前にＨＭＤＭをヒトＩＦＮ−γ（２００ＩＵ）で一晩処理した（縞模様の棒）。
【図７Ｂ】△ｒｖ３９０３ｃ（△ｍｔｐＡ）変異体の生体内での生存率を示す。図７Ａは、ＴＨＰ−１細胞系におけるウシ型結核菌ＢＣＧの生存率を示すグラフを示す。ＴＨＰ−１細胞を、野生型ウシ型結核菌ＢＣＧ（ＭＬ３８３、円形）、△ｒｖ３９０３ｃ変異体（ＭＬ３８６、三角形）、およびＭｓｐＡ（ＭＬ３８７、四角形）またはＲｖ３９０３ｃ（ＭＬ３８８、ひし形）のいずれかで補完された△ｒｖ３９０３ｃ変異体に２０のＭＯＩで感染させた。感染から３時間後、マクロファージをＰＢＳで洗浄して非内部化細菌を除去した。感染後に溶解マクロファージの連続希釈物を指示された時点でプレーティングし、２週間のインキュベーション後にコロニー形成単位（ＣＦＵ）を数えた。ＣＦＵをそれぞれの株の最初の接種材料に従って正規化した。図７Ｂは、ウシ型結核菌ＢＣＧの野生型および△ｒｖ３９０３ｃ変異体の生存率における一酸化窒素の役割を示すグラフを示す。ヒト単球由来マクロファージ（ＨＭＤＭ）を、野生型ウシ型結核菌ＢＣＧ（灰色）または△ｒｖ３９０３ｃ変異体（白色）に１〜３のＭＯＩで感染させた。必要に応じて、感染前にＨＭＤＭをヒトＩＦＮ−γ（２００ＩＵ）で一晩処理した（縞模様の棒）。
【図８Ａ】ウシ型結核菌ＢＣＧの一酸化窒素への耐性を示す。ウシ型結核菌ＢＣＧを、液体Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９培地中の１００ｍＭの無水ニトロフェリシアン化ナトリウム（ＩＩＩ）（ＳＮＰ）で処理した。連続希釈物を１０％のＯＡＤＣを補充したＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０寒天上にスポットした。プレートを３７℃で３週間インキュベートした。図８Ａは、野生型ウシ型結核菌ＢＣＧ（円形）、△ｍｔｐＡ変異体（逆三角形）、およびＭｓｐＡ（四角形）またはＭｔｐＡ（ひし形）で補完された△ｍｔｐＡ変異体の生存率を示すグラフを示す。ＣＦＵを最初の接種材料に正規化した。実験を三重に行い、３回別々に繰り返した。＊ｐ０．０５未満の野生型株対△ｍｔｐＡ変異体または野生型株対△ｍｔｐＡ＋ＭｓｐＡ株を、スチューデントｔ検定を用いて決定した。図８Ｂは、１００ｍＭのＳＮＰでの処理の７日後の野生型ウシ型結核菌ＢＣＧおよびΔｍｔｐＡ変異体の生存率を示す増殖アッセイを示す。
【図８Ｂ】ウシ型結核菌ＢＣＧの一酸化窒素への耐性を示す。ウシ型結核菌ＢＣＧを、液体Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９培地中の１００ｍＭの無水ニトロフェリシアン化ナトリウム（ＩＩＩ）（ＳＮＰ）で処理した。連続希釈物を１０％のＯＡＤＣを補充したＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０寒天上にスポットした。プレートを３７℃で３週間インキュベートした。図８Ａは、野生型ウシ型結核菌ＢＣＧ（円形）、△ｍｔｐＡ変異体（逆三角形）、およびＭｓｐＡ（四角形）またはＭｔｐＡ（ひし形）で補完された△ｍｔｐＡ変異体の生存率を示すグラフを示す。ＣＦＵを最初の接種材料に正規化した。実験を三重に行い、３回別々に繰り返した。＊ｐ０．０５未満の野生型株対△ｍｔｐＡ変異体または野生型株対△ｍｔｐＡ＋ＭｓｐＡ株を、スチューデントｔ検定を用いて決定した。図８Ｂは、１００ｍＭのＳＮＰでの処理の７日後の野生型ウシ型結核菌ＢＣＧおよびΔｍｔｐＡ変異体の生存率を示す増殖アッセイを示す。
【図９Ａ】Ａ〜Ｃは、空ベクター（図９Ａ）、ＭｔｐＡの野生型カルボキシ末端ドメイン（図９Ｂ）、およびＭｔｐＡの変異体カルボキシ末端ドメイン（ＣＴＤＭ１）（図９Ｃ）の発現時のヒト２９３Ｔ細胞の生存率を示す顕微鏡写真を示す。図９Ｄは、ウエスタンブロット法を示し、ＭｔｐＡのカルボキシ末端ドメインがＭｔｐＡの発現時に切断されることを示す。抗ＨＡ抗体を用いてＭｔｐＡが培養濾液（ＣＦ）および全細胞（ＷＣ）において検出された。ＣＦおよびＷＣ画分の効率的な分離を示すために、抗ＲＮＡポリメラーゼ抗体（ＲＮＡＰ）および分泌タンパク質Ａｇ８５に対する抗体を用いた。
【図９Ｂ】Ａ〜Ｃは、空ベクター（図９Ａ）、ＭｔｐＡの野生型カルボキシ末端ドメイン（図９Ｂ）、およびＭｔｐＡの変異体カルボキシ末端ドメイン（ＣＴＤＭ１）（図９Ｃ）の発現時のヒト２９３Ｔ細胞の生存率を示す顕微鏡写真を示す。図９Ｄは、ウエスタンブロット法を示し、ＭｔｐＡのカルボキシ末端ドメインがＭｔｐＡの発現時に切断されることを示す。抗ＨＡ抗体を用いてＭｔｐＡが培養濾液（ＣＦ）および全細胞（ＷＣ）において検出された。ＣＦおよびＷＣ画分の効率的な分離を示すために、抗ＲＮＡポリメラーゼ抗体（ＲＮＡＰ）および分泌タンパク質Ａｇ８５に対する抗体を用いた。
【図９Ｃ】Ａ〜Ｃは、空ベクター（図９Ａ）、ＭｔｐＡの野生型カルボキシ末端ドメイン（図９Ｂ）、およびＭｔｐＡの変異体カルボキシ末端ドメイン（ＣＴＤＭ１）（図９Ｃ）の発現時のヒト２９３Ｔ細胞の生存率を示す顕微鏡写真を示す。図９Ｄは、ウエスタンブロット法を示し、ＭｔｐＡのカルボキシ末端ドメインがＭｔｐＡの発現時に切断されることを示す。抗ＨＡ抗体を用いてＭｔｐＡが培養濾液（ＣＦ）および全細胞（ＷＣ）において検出された。ＣＦおよびＷＣ画分の効率的な分離を示すために、抗ＲＮＡポリメラーゼ抗体（ＲＮＡＰ）および分泌タンパク質Ａｇ８５に対する抗体を用いた。
【図９Ｄ】Ａ〜Ｃは、空ベクター（図９Ａ）、ＭｔｐＡの野生型カルボキシ末端ドメイン（図９Ｂ）、およびＭｔｐＡの変異体カルボキシ末端ドメイン（ＣＴＤＭ１）（図９Ｃ）の発現時のヒト２９３Ｔ細胞の生存率を示す顕微鏡写真を示す。図９Ｄは、ウエスタンブロット法を示し、ＭｔｐＡのカルボキシ末端ドメインがＭｔｐＡの発現時に切断されることを示す。抗ＨＡ抗体を用いてＭｔｐＡが培養濾液（ＣＦ）および全細胞（ＷＣ）において検出された。ＣＦおよびＷＣ画分の効率的な分離を示すために、抗ＲＮＡポリメラーゼ抗体（ＲＮＡＰ）および分泌タンパク質Ａｇ８５に対する抗体を用いた。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
ヒト型結核菌ポリンＡ（ＭｔｐＡ）のアミノ末端ドメインを含む単離されたポリペプチドが本明細書に提供される。ＭｔｐＡのアミノ末端ドメインを含むこのポリペプチドは、ポリンモノマーであり得る。任意に、ＭｔｐＡのアミノ末端ドメインは、配列番号１のアミノ酸１〜４４３を含む。任意に、単離されたポリペプチドは、配列番号１を含む。
【００１７】
ＭｔｐＡのカルボキシ末端ドメインを含む単離されたポリペプチドも提供される。ＭｔｐＡのカルボキシ末端ドメインは、毒素であり得る。任意に、ＭｔｐＡのアミノ末端ドメインは、配列番号１のアミノ酸６５０〜８４６を含む。
【００１８】
任意に、本明細書に開示されるポリペプチドにおいて、ＭｔｐＡのアミノ末端ドメイン、カルボキシ末端ドメイン、またはアミノ末端ドメインおよびカルボキシ末端ドメインの両方は、１つ以上の変異を含む。
【００１９】
キメラポリンポリペプチドも提供される。このキメラポリンポリペプチドは、ヒト型結核菌ポリン（Ｍｔｐ）のアミノ末端ドメインを含む第１のポリペプチドおよび選択された抗原を含む第２のポリペプチドを含む。このキメラポリンポリペプチドは、Ｍｔｐのアミノ末端ドメインと天然に会合しない抗原を含む。任意に、Ｍｔｐは、ＭｔｐＡである。ＭｔｐＡのアミノ末端ドメインは、例えば、配列番号１のアミノ酸１〜４４３を含み得る。
【００２０】
任意に、キメラポリンポリペプチドは、アミノ酸リンカーを含む第３のポリペプチドをさらに含み得る。このアミノ酸リンカーは、切断配列を含み得る。
【００２１】
抗原は、例えば、ウイルス抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、プリオン抗原、および寄生虫抗原からなる群から選択される得る。抗原は、免疫系によって認識される分子である。ウイルス抗原は、例えば、任意のウイルス抗原分子または不活性化もしくは弱毒化されたウイルス（例えば、エンベロープタンパク質、構造タンパク質、および／またはカプシドタンパク質）を含み得る。任意に、ウイルス抗原は、ＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質ＧＰ１２０である。細菌性抗原は、例えば、任意の細菌性抗原分子または不活性化もしくは弱毒化された細菌を含み得る。任意に、細菌性抗原は、例えば、ヒト型結核菌のＣＦＰ−１０またはＥＳＡＴ−６であり得る。真菌性抗原は、例えば、任意の真菌性抗原分子または不活性化もしくは弱毒化された真菌を含み得る。任意に、真菌性抗原は、アスペルギルスフミガーツスのグルカナーゼＣｒｆ１である。プリオン抗原は、例えば、任意のプリオン抗原分子または不活性化もしくは弱毒化されたプリオンを含み得る。寄生虫抗原は、例えば、任意の寄生虫抗原分子または不活性化もしくは弱毒化された寄生虫を含み得る。任意に、寄生虫抗原は、熱帯熱マラリア原虫の１９ｋＤａのメロゾイト表面タンパク質−１（ＭＳＰ−１（１９）である。原則として、表面抗原は、免疫応答の誘発に最も有用であり、細胞脂質タンパク質、プロテオグリカン、またはそれらの一部分を含み得る。
【００２２】
任意に、目的とする抗原は、癌抗原を含む。癌抗原は、例えば、癌に関連する任意の抗原分子を含み得る。癌に関連する抗原分子は、例えば、癌において過剰発現されるポリペプチドの抗原部分、癌細胞の細胞表面上で発現されるポリペプチドの抗原部分、または癌細胞の細胞表面上のプロテオグリカンまたは脂質の抗原部分を含み得る。任意に、癌抗原は、ヒト前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）である。癌抗原は、当技術分野で知られており、例えば、Ｓｏｎｐａｖｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｒｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．２５：４５１−９（２００７）、Ｓｕｒｉ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．６：３７９−８９（２００６）、Ｓａｌｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１１：３４６１−７３（２００５）、Ｂｅｎｓａｌａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｄｉｓ．１１：１１２−２０（２００８）、Ｄｉｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ  Ｄｉｓ．２０：３−１１（２００４）、ＭｃＮｅｅｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄｉｆ．２２：２４７−６１（２００５）、Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：１７８−８２（２００２）、Ｏｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ６：３０５−１１（１９９９）を参照されたく、これらは、癌抗原ならびにそれらの使用および作製方法について本明細書に組み込まれる。
【００２３】
ヒト型結核菌ポリン（Ｍｔｐ）オリゴマーも提供される。このＭｔｐオリゴマーは、例えば、ＭｔｐＡのアミノ末端ドメイン、ＭｔｐＡのカルボキシ末端ドメイン、またはこれら両方を含む本開示の単離されたポリペプチドを２〜１２個含み得る。例えば、単離されたポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜４４３を含む。
【００２４】
キメラポリペプチドまたは一本鎖ヒト型結核菌ポリン（Ｍｔｐ）オリゴマーをコードする核酸配列も提供される。一本鎖Ｍｔｐオリゴマーをコードする核酸配列は、少なくとも第１および第２のポリンコードヌクレオチド配列、ならびにアミノ酸リンカーをコードするリンカー核酸配列を含む。第１のヌクレオチド配列は、例えば、第１のＭｔｐモノマーをコードし得る。第２のヌクレオチド配列は、例えば、第２のポリンモノマーをコードし得、この第２のコードされたポリンモノマーは、マイコバクテリウムポリンモノマーである。任意に、核酸は、第３、第４、第５、第６、第７、および第８のヌクレオチド配列をさらに含み得る。これらの第３、第４、第５、第６、第７、および第８のヌクレオチド配列は、例えば、第３、第４、第５、第６、第７、および第８のポリンモノマーをコードし得、このポリンモノマーは、マイコバクテリウムポリンモノマーである。
【００２５】
任意に、コードされたポリンモノマーのうちの少なくとも１つは、野生型ヒト型結核菌ポリンＡ（ＭｔｐＡ）モノマーを含む。任意に、一本鎖オリゴマーのコードされたポリンモノマーのすべてが、野生型ＭｔｐＡモノマーを含む。コードされた野生型ＭｔｐＡモノマーは、配列番号１を含み得る。任意に、コードされたポリンモノマーのうちの１つ以上は、配列番号１のアミノ酸１〜４４３を含み得る。
【００２６】
コードされたアミノ酸リンカーは、例えば、１０〜２０個のアミノ酸を含み得る。任意に、コードされたアミノ酸リンカーは、１５個のアミノ酸を含む。任意に、コードされたアミノ酸リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号４）ペプチド配列を含む。
【００２７】
本明細書で使用される際、「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」という用語は、広範に使用され、ペプチド結合によって連結される２個以上のアミノ酸を意味する。タンパク質、ペプチド、およびポリペプチドはまた、本明細書で同義に使用され、アミノ酸配列を指す。「ポリペプチド」という用語が、分子を含むアミノ酸の特定の大きさまたは数を示唆するために本明細書で使用されるものではなく、本発明のペプチドが、最大数個のアミノ酸残基またはそれ以上のアミノ酸残基を含有し得ることを認識されたい。
【００２８】
上述のように、本明細書に提供されるポリペプチドは、所望の機能を有する。ＭｔｐＡのアミノ末端ドメインを含むポリペプチドは、ポリンモノマーとして機能する。ＭｔｐＡのカルボキシ末端ドメインを含むポリペプチドは、毒素として機能する。キメラポリンポリペプチドは、対象に抗原ポリペプチドを提供することによってその対象において免疫応答を誘発する機能を果たす。
【００２９】
すべてのペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質（それらの断片を含む）と同様に、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の機能を変化させないＭｔｐＡのアミノ末端ドメインもしくはカルボキシ末端ドメインのアミノ酸配列、またはキメラポリンポリペプチドのアミノ酸配列のさらなる修飾が生じ得ることが理解される。そのような修飾は、保存的アミノ酸置換を含み、以下でより詳細に論じられる。したがって、本明細書に記載のポリペプチドは、所望の機能が維持される限り修飾され得る。本明細書に開示の遺伝子およびタンパク質の任意の既知の修飾および誘導体または生じ得る修飾および誘導体を定義する１つの方法が、特定の既知の配列に対する同一性の観点での修飾および誘導体の定義であることが理解される。アミノ末端ドメイン、カルボキシ末端ドメイン、配列番号１、または本明細書に提供されるキメラポリンポリペプチドに対して、少なくとも、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセントの同一性を有するポリペプチドが具体的に開示される。例えば、配列番号１に対して少なくとも、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセントの同一性を有するポリペプチドが提供される。当業者であれば、２つのポリペプチドの同一性を決定する方法を容易に理解する。例えば、同一性は、その同一性が最高レベルになるようにそれら２つの配列を整列させた後に計算され得る。
【００３０】
同一性を計算する別の方法は、公開されたアルゴリズムによって行われ得る。比較に最適な配列のアライメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の同一性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性方法の検索、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＧｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、または検査によって行われ得る。
【００３１】
同一の種類の核酸同一性を、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２（１９８９）、Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−１０（１９８９）、Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６（１９８９）に開示のアルゴリズムによって得ることができ、これらは、少なくとも核酸アライメントに関連する物質について参照により本明細書に組み込まれる。これらの方法のうちのいずれかが典型的に使用されてもよく、ある例において、これらの様々な方法の結果が異なり得ることが理解されるが、当業者であれば、これらの方法のうちの少なくとも１つを用いて同一性が見出される場合、配列が提示される同一性を有すると考えられ、かつ本明細書に開示されることを理解する。
【００３２】
タンパク質修飾は、アミノ酸配列修飾を含む。アミノ酸配列の修飾は、対立遺伝子変異（例えば、遺伝子多型による）として自然に生じ得るか、人の介入（例えば、クローン化ＤＮＡ配列の変異原性による）によって生成され得るか、または環境の影響（例えば、紫外線光への暴露）、例えば、誘発性の点、欠失、挿入、および置換変異体等によって生じ得る。これらの修飾は、アミノ酸配列の変化をもたらすか、サイレント変異をもたらすか、制限部位を修飾するか、または他の特異的変異をもたらし得る。アミノ酸配列修飾は、典型的には、３つのクラス：置換修飾、挿入修飾、または欠失修飾のうちの１つ以上に分類される。挿入は、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。挿入は、通常、アミノまたはカルボキシル末端融合の挿入よりも小さい挿入、例えば、およそ１〜４個の残基である。欠失は、タンパク質配列からの１つ以上のアミノ酸残基の除去を特徴とする。典型的には、約２〜６個以下の残基がタンパク質分子内の任意の１つの部位で欠失される。アミノ酸置換は、典型的には、単一の残基の置換であるが、いくつかの異なる位置で同時に起こり得、挿入は、通常、およそ約１〜１０個のアミノ酸残基であり、欠失は、約１〜３０個の残基の範囲である。欠失または挿入は、好ましくは、隣接対で行われ、すなわち、２個の残基の欠失または２個の残基の挿入である。置換、欠失、挿入、またはこれらの任意の組み合わせは、最終構築物に到達するように組み合わせられ得る。変異は、配列をリーディングフレームの外に配置してはならず、好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造をもたらし得る相補領域を作成しない。置換修飾は、少なくとも１個の残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入される修飾である。そのような置換は、概して、以下の表１に従って行われ、保存的置換と称される。
【表１】
2014531896.tif 000002
【００３３】
特定のアミノ酸置換を含む修飾は、以下の実施例に記載の方法を含む既知の方法によって行われる。一例として、修飾は、タンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的変異原性によって行われ、それによってその修飾をコードするＤＮＡを生成し、その後に組換え細胞培養物においてＤＮＡを発現する。既知の配列を有するＤＮＡの所定の部位で置換変異を行うための技法が周知であり、例えば、Ｍ１３プライマー変異原性およびＰＣＲ変異原性がある。
【００３４】
ポリペプチド配列、その変異形、およびその断片をコードする核酸が開示される。これらの配列は、特定のタンパク質配列に関連するすべての縮重配列、すなわち、１つの特定のタンパク質配列をコードする配列を有するすべての核酸、ならびに縮重核酸を含む、そのタンパク質配列の本開示の変異形および誘導体をコードするすべての核酸を含む。したがって、それぞれの特定の核酸配列が本明細書に記載されていない場合もあるが、ありとあらゆる配列が実際に本開示のタンパク質配列について本明細書に開示および記載されることが理解される。
【００３５】
ヒト型結核菌（Ｍｔｂ）感染を有するか、またはＭｔｂ感染を発症する危険性のある対象におけるＭｔｂ感染を治療または予防する方法も提供される。Ｍｔｂを有する対象には、Ｍｔｂ感染と診断された対象が含まれる。危険性のある対象には、例えば、刑務所または医療施設を含むＭｔｂ源への既知の暴露または潜在的暴露のある対象が含まれる。この方法は、その対象に、ヒト型結核菌ポリン（Ｍｔｐ）の活性を調節する第１の作用物質およびＭｔｂ感染を治療または予防する第２の作用物質を投与することを含む。このＭｔｐには、例えば、ヒト型結核菌ポリン（ＭｔｐＡ）が含まれ得る。
【００３６】
第１の作用物質は、例えば、ＭｔｐＡのアミノ末端ドメインを標的とし得る。ＭｔｐＡのアミノ末端ドメインを標的とするとは、第１の作用物質が直接的または間接的に結合して、アミノ末端ドメインの機能を妨害し得ることを意味する。任意に、第１の作用物質は、配列番号１のアミノ酸１〜４４３を標的とする。任意に、第１の作用物質は、第１の作用物質の不在下での取り込みと比較してＭｔｐによる第２の作用物質の取り込みを増加させることによってＭｔｐの活性を調節する。任意に、第１の作用物質は、その作用物質の不在下での取り込みと比較してＭｔｐによる１つ以上の栄養素または炭素源の取り込みを減少させることによってＭｔｐの活性を調節する。
【００３７】
任意に、１つ以上の栄養素は、炭素、酸素、水素、窒素、亜リン酸、硫黄、カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、および微量元素からなる群から選択され得る。任意に、炭素源は、糖類、アミノ酸、グリセロール、脂肪酸、脂質、および洗剤からなる群から選択され得る。細菌の栄養素および炭素源は、当技術分野で知られており、例えば、Ｌｉｍ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｋｅｎｄａｌｌ／Ｈｕｎｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２００３）を参照されたい。
【００３８】
Ｍｔｂ感染を有するか、またはＭｔｂ感染を発症する危険性のある対象におけるＭｔｂ感染を治療または予防する方法は、例えば、その対象に、ヒト型結核菌によって生成された毒素を中和する第１の作用物質およびＭｔｂ感染を治療または予防する第２の作用物質を投与することを含み得る。毒素を中和するとは、第１の作用物質が毒素の機能を排除または軽減することを意味する。任意に、毒素は、ヒト型結核菌ポリンＡ（ＭｔｐＡ）のカルボキシ末端ドメインを含む。第１の作用物質は、例えば、ＭｔｐＡの切断配列を標的とし得る。ＭｔｐＡの切断配列は、ＭｔｐＡのアミノ末端ドメインとカルボキシ末端ドメインとの間に位置し得る。任意に、第１の作用物質は、ＭｔｐＡのアミノ末端ドメインからのＭｔｐＡのカルボキシ末端ドメインの切断を阻止する。切断を阻止するとは、その作用物質がカルボキシ末端ドメインとアミノ末端ドメインとの間のＭｔｐＡポリペプチドの切断を阻止することを意味する。理論によって限定されるものではないが、第１の作用物質は、例えば、切断配列を結合し、ポリペプチドの切断に関与するプロテアーゼによる切断配列へのアクセスを阻止し得る。あるいは、第１の作用物質は、切断に関与するプロテアーゼを標的とし、そのプロテアーゼがＭｔｐＡポリペプチドを切断するのを阻止し得る。
【００３９】
第１の作用物質は、例えば、核酸分子、ポリペプチド、小分子、またはペプチド模倣薬からなる群から選択され得る。核酸分子は、例えば、アンチセンス配列、短い阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）配列からなる群から選択され得る。ポリペプチドは、例えば、抗体またはその断片であり得る。
【００４０】
第２の作用物質は、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、エタンブトール、イソニアジド、ｐ−アミノサリチル酸、サイクロセリン、バンコマイシン、ストレプトマイシン、クラリソマイシン、エリスロマイシンＡ、リファンピシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、およびノルフロキサシンからなる群から選択され得る。
【００４１】
本明細書で使用される際、核酸分子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）配列であり得る。２１〜２５ヌクレオチドｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ配列は、例えば、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列、６０〜８０ヌクレオチド前駆体配列の転写によって発現ベクターから生成され得、これは、その後、細胞ＲＮＡｉ機構によって処理されて、ｓｉＲＮＡ配列またはｍｉＲＮＡ配列のいずれかを生成する。あるいは、２１〜２５ヌクレオチドｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ配列は、例えば、化学的に合成され得る。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ配列の化学合成は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、およびＡｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）等の企業から市販されている。ｓｉＲＮＡ配列は、好ましくは、正確な相補性を有する標的ｍＲＮＡ内の特異的配列を結合し、標的ｍＲＮＡ分子の分解をもたらす。ｓｉＲＮＡ配列は、標的ｍＲＮＡ分子内の任意の位置で結合し得る。ｍｉＲＮＡ配列は、好ましくは、正確な相補性または正確ではない相補性を有する標的ｍＲＮＡ内の特異的配列を結合し、標的ｍＲＮＡ分子の翻訳抑制をもたらす。ｍｉＲＮＡ配列は、標的ｍＲＮＡ配列内の任意の位置で結合し得るが、好ましくは、標的ｍＲＮＡ分子の３’非翻訳領域内で結合する。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ分子を送達する方法は、当技術分野で知られている。例えば、Ｏｈ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６１（１０）：８５０−６２（２００９）、Ｇｏｎｄｉ  ａｎｄ  Ｒａｏ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２０（２）：２８５−９１（２００９）、およびＷｈｉｔｅｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．８（２）：１２９−３８（２００９）を参照されたい。
【００４２】
本明細書で使用される際、核酸分子は、アンチセンス核酸配列であり得る。アンチセンス核酸配列は、例えば、発現ベクターから転写されて、標的ｍＲＮＡの少なくとも特異的部分および／またはその標的をコードする内在性遺伝子に相補的であるＲＮＡを生成し得る。特定の細胞条件下でのアンチセンス核酸のハイブリダイゼーションは、転写および／または翻訳を阻害することによって標的タンパク質発現の阻害をもたらす。
【００４３】
「抗体」という用語は、本明細書において広義に使用され、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を含む。この用語は、ヒト抗体および／またはヒト化抗体も指し得る。ヒトモノクローナル抗体を生成するための技法の例として、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７，１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）：８６−９５（１９９１））によって説明される技法が挙げられる。ヒト抗体（およびその断片）は、ファージ提示ライブラリを用いて生成され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１））。本開示のヒト抗体は、トランスジェニック動物からも得られ得る。例えば、免疫化に応答してヒト抗体の全レパートリーを生成することができるトランスジェニック変異体マウスが説明されている（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１−５（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）を参照のこと）。
【００４４】
対象において抗原に対する免疫応答を誘発する方法も提供される。この方法は、その対象に、修飾されたマイコバクテリウムを投与することを含み、この修飾されたマイコバクテリウムは、本明細書に開示のキメラポリンポリペプチドのうちのいずれかを含む。任意に、修飾されたマイコバクテリウムは、本明細書に開示のキメラポリンポリペプチドのうちのいずれかを含む。任意に、修飾されたマイコバクテリウムは、弱毒化したヒト型結核菌またはウシ型結核菌ＢＣＧから選択される。弱毒化したとは、その株の毒性が修飾されていない株よりも低くなるように修飾されることを意味する。修飾されたマイコバクテリウムを用いるための戦略が当技術分野で知られており、例えば、Ｓａｍｂａｎｄａｍｕｒｔｈｙ  ａｎｄ  Ｊａｃｏｂｓ，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．７：９５５−６１（２００５）およびＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７２：３４９−５７（２０１０）を参照されたい。
【００４５】
導電性液体培地中の分析物を検出する方法も提供される。この方法は、電界を本明細書に開示のヒト型結核菌ポリン（Ｍｔｐ）オリゴマーに印加することを含む。Ｍｔｐオリゴマーは、例えば、トンネルを画定する出入口および収縮ゾーンを有し得、Ｍｔｐオリゴマーは、第１の導電性液体培地と第２の導電性液体培地との間に位置付けられる。任意に、第１または第２の導電性液体培地は、分析物を含む。
【００４６】
分析物を検出する方法は、例えば、分析物がトンネルと相互作用して電流パターンを提供するときにイオン電流を測定することを含み得る。電流パターンにおける遮断の出現は、分析物の存在を示す。任意に、この方法は、分析物を特定することを含み、分析物の特定は、電流パターンを同一の条件下で既知の分析物を用いて得られる既知の電流パターンと比較することを含む。
【００４７】
分析物は、例えば、ヌクレオチド、核酸、アミノ酸、ポリペプチド、タンパク質、ポリマー、薬物、イオン、夾雑物、ナノスケール物体、または生物兵器剤からなる群から選択され得る。任意に、分析物は、２個以上のサブユニットを含むポリマーである。ポリマーは、例えば、ポリペプチド、タンパク質、または核酸を含み得る。
【００４８】
Ｍｔｐオリゴマーは、例えば、ポリマーの第１のサブユニットとポリマーの少なくとも第２のサブユニットを区別するために使用され得る。区別は、第１および第２のサブユニットがトンネルを介して別々に移動して第１および第２の電流パターンを生成するときに生成されたイオン電流を測定することを含み得る。第１の電流パターンおよび第２の電流パターンは、例えば、互いに異なり得る。任意に、Ｍｔｐオリゴマーは、ポリマーを配列決定し得る。ポリマーの配列決定は、ポリマーのそれぞれのユニットがトンネルを介して別々に移動してポリマーのそれぞれのサブユニットに関連する電流パターンを提供するときにイオン電流または光信号を測定することを含み得る。それぞれの電流パターンは、ポリマーが配列決定されるように、同一の条件下で既知のサブユニットの既知の電流パターンと比較される。
【００４９】
Ｍｔｐオリゴマーは、例えば、分析物の濃度、大きさ、分子量、形状、もしくは配向、またはこれらの任意の組み合わせを決定するためにも使用され得る。
【００５０】
対象における壊死性細胞死を誘導する方法も提供される。対象における過度のまばたき、筋肉痛障害、多汗症、または頸部ジストニアを治療または予防する方法も提供される。この方法は、その対象に、ＭｔｐＡのカルボキシ末端ドメインを含む単離されたポリペプチドを投与することを含む。任意に、ＭｔｐＡのカルボキシ末端ドメインは、配列番号１のアミノ酸６５０〜８３４を含む。
【００５１】
対象におけるしわを軽減する方法も提供される。この方法は、対象の１つ以上の筋肉に、ＭｔｐＡのカルボキシ末端ドメインを含む単離されたポリペプチドを投与することを含み、筋肉の収縮は、しわ（例えば、顔面のしわを軽減するために顔面の筋肉）に関連する。任意に、ＭｔｐＡのカルボキシ末端ドメインは、配列番号１のアミノ酸６５０〜８３４を含む。
【００５２】
Ｍｔｐの活性を調節する作用物質をスクリーニングする方法がさらに提供される。この方法は、Ｍｔｐを含む細胞を試験される作用物質と接触させることと、Ｍｔｐの活性を決定することとを含む。対照と比較したＭｔｐの活性の増加または減少は、作用物質がＭｔｐの活性を調節することを示す。本明細書で使用される際、対照は、試験される作用物質と接触されていない細胞であり得る。任意に、Ｍｔｐは、ＭｔｐＡである。任意に、Ｍｔｐは、ＭｔｐＡのアミノ末端ドメインを含む。ＭｔｐＡのアミノ末端ドメインは、例えば、配列番号１のアミノ酸１〜４４３を含み得る。
【００５３】
Ｍｔｐの活性は、抗生物質の取り込み、抗生物質の排出、および１つ以上の栄養素または炭素源の取り込みからなる群から選択され得る。抗生物質は、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、エタンブトール、イソニアジド、ｐ−アミノサリチル酸、サイクロセリン、バンコマイシン、ストレプトマイシン、クラリソマイシン、エリスロマイシンＡ、リファンピシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、およびノルフロキサシンからなる群から選択され得る。炭素源は、例えば、グリセロールであり得る。
【００５４】
ヒト型結核菌によって生成された毒素を中和する作用物質をスクリーニングする方法がさらに提供される。この方法は、細胞を試験される作用物質と接触させることと、細胞を毒素と接触させることと、作用物質の存在下で細胞死のレベルを検出することを含む。対照と比較した細胞死の減少は、作用物質が毒素を中和することを示す。本明細書で使用される際、対照は、試験される作用物質と接触されていない細胞であり得る。任意に、毒素は、ＭｔｐＡのカルボキシ末端ドメインを含む。ＭｔｐＡのカルボキシ末端ドメインは、例えば、配列番号１のアミノ酸６５０〜８３４を含み得る。
【００５５】
提供されるポリペプチド、核酸分子、小分子、および／またはペプチド模倣薬、ならびに本明細書に記載の薬学的に許容される担体を含有する組成物が本明細書に提供される。本明細書に提供される組成物は、生体外または生体内投与に好適である。薬学的に許容される担体とは、生物学的にまたは他の点で望ましくない物質ではない物質を意味し、すなわち、この物質は、望ましくない生物学的影響を引き起こすか、またはそれが含有される薬学的組成物の他の成分と有害な様式で相互作用することなく対象に投与される。担体は、活性成分の分解を最小限に抑え、かつ対象における有害な副作用を最小限に抑えるために選択される。
【００５６】
好適な担体およびそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｖｉｄ  Ｂ．Ｔｒｏｙ，ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）において説明されている。典型的には、製剤を等張性にするために、適切な量の薬学的に許容される塩が製剤中で使用される。薬学的に許容される担体の例として、滅菌水、生理食塩水、リンガー溶液等の緩衝液、およびデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、概して、約５〜約８または約７〜７．５である。他の担体は、免疫原性ポリペプチドを含有する固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックス等の徐放性調製物を含む。マトリックスは、成形物品の形態、例えば、薄膜、リポソーム、または微粒子である。ある担体が、例えば、投与経路および投与される組成物の濃度に応じてより好ましくあり得る。担体は、ヒトまたは他の対象への作用物質、例えば、ポリペプチド、核酸分子、小分子、および／またはペプチド模倣薬の投与に好適なものである。
【００５７】
組成物は、局所治療または全身治療が所望されるかに応じて、かつ治療される領域に応じて、いくつかの方法で投与される。組成物は、いくつかの投与経路のうちのいずれかを介して投与され、局所、経口、非経口、静脈内、関節内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、経皮、肝内、頭蓋内、噴霧／吸入、または気管支鏡検査による導入を含む。任意に、組成物は、経口吸入、鼻腔吸入、または鼻腔内粘膜投与によって投与される。吸入による組成物の投与は、鼻または口を通り得、噴霧または液滴機構、例えば、エアロゾルの形態で送達され得る。
【００５８】
非経口投与用の調製物は、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含む。非水溶媒の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、およびオレイン酸エチル等の注入可能な有機エステルがある。水性担体は、水、アルコール／水溶液、エマルジョン、または懸濁液を含み、生理食塩水および緩衝培地を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、塩化デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、または固定油を含む。静脈内ビヒクルは、流体および栄養素補液、電解質補液（リンガーデキストロース系のもの等）等を含む。例えば、抗菌剤、抗酸化物質、キレート剤、および不活性ガス等の防腐剤および他の添加物が任意に存在する。
【００５９】
局所投与用の製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、液滴、坐薬、スプレー、液体、および粉末を含む。従来の薬学的担体、水性、粉末、または油性基剤、増粘剤等が任意に必要であるか、または望ましい。
【００６０】
経口投与用の組成物は、粉末もしくは顆粒、水溶媒もしくは非水溶媒中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、サシェ、または錠剤を含む。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、または結合剤が任意に望ましい。
【００６１】
任意に、核酸分子またはポリペプチドは、核酸分子またはポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターによって投与される。生体外または生体内のいずれかで、例えば、発現ベクターによって核酸分子および／またはポリペプチドを細胞に送達するために使用され得るいくつかの組成物および方法が存在する。これらの方法および組成物は、大きく２つのクラス：ウイルスベースの送達系および非ウイルスベースの送達系に分類され得る。そのような方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載の組成物および方法との使用に容易に適応できる。
【００６２】
本明細書で使用される際、プラスミドまたはウイルスベクターは、本開示の核酸を分解することなく細胞に輸送する作用物質であり、それが送達される細胞内での核酸分子および／またはポリペプチドの発現を引き起こすプロモーターを含む。ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンドビス、およびＨＩＶ骨格を有するウイルスを含む他のＲＮＡウイルスである。ウイルスファミリーをベクターとしての使用に好適にするこれらのウイルスの特性を共有する任意のウイルスファミリーも好ましい。レトロウイルスベクターは、概して、Ｃｏｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｔｏｒｖｉｒｕｓｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）によって説明されており、ベクターおよびベクターを作成する方法について参照により本明細書に組み込まれる。複製欠損アデノウイルスの構築が説明されている（Ｂｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：１２１３−２０（１９８７）、Ｍａｓｓｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２−８３（１９８６）、Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７−７４（１９８６）、Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：１２２６−３９（１９８７）、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：８６８−７２（１９９３））。ベクターとしてこれらのウイルスを使用する利点は、それらが最初の感染細胞内で複製し得るため、どの程度それらが他の細胞型に転移することができるかが限定されるが、新たな感染ウイルス粒子を形成することができないことである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質、およびいくつかの他の組織部位への直接の生体内送達後に高効率を達成することが示されている。他の有用な系には、例えば、複製および宿主制限非複製ワクシニアウイルスベクターが含まれる。
【００６３】
提供されるポリペプチドおよび／または核酸分子は、ウイルス様の粒子を介して送達され得る。ウイルス様の粒子（ＶＬＰ）は、ウイルスの構造タンパク質に由来するウイルスタンパク質（複数を含む）からなる。ウイルス様の粒子を作製および使用するための方法は、例えば、Ｇａｒｃｅａ  ａｎｄ  Ｇｉｓｓｍａｎｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：５１３−７（２００４）に記載されている。
【００６４】
提供されるポリペプチドは、サブウイルス濃密体（ＤＢ）によって送達され得る。ＤＢは、膜融合によってタンパク質を標的細胞に輸送する。ＤＢを作製および使用するための方法は、例えば、Ｐｅｐｐｅｒｌ−Ｋｌｉｎｄｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：２７８−８４（２００３）に記載されている。
【００６５】
提供されるポリペプチドは、テグメント凝集体によって送達され得る。テグメント凝集体を作製および使用するための方法は、国際公開第ＷＯ２００６／１１０７２８号に記載されている。
【００６６】
非ウイルス系送達方法は、核酸分子およびポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを含み得、この核酸は、発現制御配列に動作可能に連結される。好適なベクター骨格は、例えば、プラスミド、人工染色体、ＢＡＣ、ＹＡＣ、またはＰＡＣ等の当技術分野で日常的に使用されるものを含む。多くのベクターおよび発現系は、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）等の企業から市販されている。ベクターは、典型的には、１つ以上の調節領域を含む。調節領域は、制限なく、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答要素、タンパク質認識部位、誘導要素、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終止配列、ポリアデニル化配列、ならびにイントロンを含む。
【００６７】
哺乳類宿主細胞内のベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、様々な供給源、例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、肝炎Ｂウイルス、最も好ましくは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）等のウイルスのゲノムから、または異種哺乳類プロモーター、例えば、β−アクチンプロモーターもしくはＥＦ１αプロモーターから、またはハイブリッドもしくはキメラプロモーター（例えば、β−アクチンプロモーターに融合したＣＭＶプロモーター）から得られ得る。言うまでもなく、宿主細胞または関連種由来のプロモーターも本明細書において有用である。
【００６８】
エンハンサーは、概して、転写開始部位から一定ではない距離で機能するＤＮＡの配列を指し、転写ユニットに対して５’または３’のいずれかであり得る。さらに、エンハンサーは、イントロン内、ならびにコード配列自体内に存在し得る。それらは、通常、１０〜３００塩基対（ｂｐ）長であり、それらは、シスで機能する。エンハンサーは、通常、近くのプロモーターからの転写を増加させる機能を果たす。エンハンサーは、転写調節を媒介する応答要素も含み得る。哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテイン、およびインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が知られているが、典型的には、一般的な発現のために真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを用いる。好ましい例には、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーがある。
【００６９】
プロモーターは、誘導性プロモーター（例えば、化学的または物理的に調節されたプロモーター）であり得る。化学的に調節されたプロモーターは、例えば、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、または金属の存在によって調節され得る。任意に、誘導性プロモーターは、アセトアミド誘導性プロモーターである。物理的に調節されたプロモーターは、例えば、温度および光等の環境因子によって調節され得る。このプロモーターは、細胞型特異的プロモーター（例えば、神経細胞特異的、腎臓特異的、心臓特異的、肝臓特異的、または筋肉特異的）であり得る。細胞型特異的プロモーターは、それが発現するよう意図される細胞型においてのみ発現する。このプロモーターは、細胞型から独立して発現するプロモーターであり得る。細胞型から独立して発現し得るプロモーターの例として、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、アデノウイルスＥ１Ａプロモーター、およびＥＦ−１αプロモーターが挙げられる。任意に、このプロモーターは、ｐｓｍｙｃプロモーターである。
【００７０】
エンハンサーは、概して、転写開始部位から一定ではない距離で機能するＤＮＡの配列を指し、転写ユニットに対して５’または３’のいずれかであり得る。さらに、エンハンサーは、イントロン内、ならびにコード配列自体内に存在し得る。それらは、通常、１０〜３００塩基対長であり、それらは、シスで機能する。エンハンサーは、通常、近くのプロモーターからの転写を増加させる機能を果たす。エンハンサーは、転写調節を媒介する応答要素も含み得る。哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテイン、およびインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が知られているが、典型的には、一般的な発現のために真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを用いる。好ましい例には、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーがある。
【００７１】
このベクターは、例えば、複製起点、足場付着領域（ＳＡＲ）、および／またはマーカーも含み得る。マーカー遺伝子は、細胞に選択可能な表現型、例えば、抗生物質耐性を与え得る。このマーカー産物は、遺伝子が細胞に送達されたか、かつ送達された時点で発現しているかを決定するために使用される。マーカー遺伝子の例として、βガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、およびルシフェラーゼをコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子が挙げられる。哺乳類細胞の好適な選択可能なマーカーの例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブラストサイジン、およびピューロマイシンがある。そのような選択可能なマーカーが哺乳類宿主細胞への移動に成功したとき、形質転換した哺乳類宿主細胞は、選択圧下に置かれても生き残ることができる。さらに、発現ベクターは、発現したポリペプチドの操作または検出（例えば、精製または局在化）を促進するように設計されたタグ配列を含み得る。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素、またはＦＬＡＧ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）配列等のタグ配列は、典型的には、コードされたポリペプチドとの融合として発現される。そのようなタグは、カルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかを含むポリペプチド内の任意の位置に挿入され得る。
【００７２】
本明細書を通して使用される際、対象は、脊椎動物、より具体的には、哺乳動物（例えば、ヒト）であり得る。この用語は、特定の年齢または性別を意味しない。したがって、男性（雄）または女性（雌）にかかわらず、成人および新生対象が包含されるよう意図される。本明細書で使用される際、患者または対象は、同義に使用されてもよく、疾患または障害（例えば、ヒト型結核菌（Ｍｔｂ）感染またはその危険性）を有する対象を指し得る。「患者」または「対象」という用語は、ヒトおよび獣医学的対象を含む。
【００７３】
疾患または障害（例えば、Ｍｔｂ感染）を発症する危険性のある対象には、例えば、ヒト型結核菌への既知の暴露または潜在的暴露のある対象（例えば、刑務所もしくは医療施設での雇用のため、または特定の場所（例えば、刑務所または病院）でのヒト型結核菌の蔓延のため）、あるいはその疾患または障害の初期兆候または症状を示す対象が含まれる。現在疾患または障害を有する対象は、その疾患または障害の１つまたは２つ以上の症状を有し、その疾患または障害と診断されているかもしれない。
【００７４】
本明細書に記載の方法および作用物質は、予防的治療および治療的治療の両方に有用である。予防的に使用する場合、治療的に有効な量の本明細書に記載の作用物質が、発症前（例えば、Ｍｔｂ感染の明らかな兆候の前）または早期発症中（例えば、Ｍｔｂ感染の初期兆候および症状時）に対象に投与される。予防的投与は、Ｍｔｂ感染の症状が現れる前に数日間〜数年間生じ得る。予防的投与は、例えば、Ｍｔｂ感染に罹りやすい対象（例えば、病院従事者）の予防的治療において使用され得る。治療的治療は、Ｍｔｂ感染の診断後に対象に治療的に有効な量の本明細書に記載の作用物質を投与することを含む。
【００７５】
本明細書で教示される方法に従って、対象に有効な量の作用物質が投与される。「有効な量」および「有効な用量」という用語は、同義に使用される。「有効な量」という用語は、所望の生理学的応答を引き起こすのに必要な任意の量と定義される。有効な量および作用物質を投与するスケジュールを経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは、当業者の技術の範囲内である。投与の用量は、疾患または障害の１つ以上の症状に影響を及ぼす（例えば、軽減または遅延させる）といった所望の効果をもたらすのに十分な用量の範囲である。用量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応等のかなりの有害な副作用を引き起こすほど高い用量であってはならない。概して、用量は、年齢、状態、性別、疾患の種類、疾患もしくは障害の程度、投与経路、または他の薬物がレジメンに含まれているかによって異なり、当業者によって決定され得る。用量は、任意の禁忌の場合に個々の医師によって調整され得る。用量は異なり得、１日１回以上の用量投与で１日間または数日間投与され得る。手引きは、薬学的生成物の所与のクラスに適切な用量についての文献において見つけることができる。
【００７６】
本明細書で使用される際、「治療」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、疾患もしくは状態またはその疾患もしくは状態の症状の影響を軽減する方法を指す。したがって、本開示の方法において、治療とは、すでに罹患している疾患もしくは状態またはその疾患もしくは状態の症状の重症度において、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の軽減を指し得る。例えば、疾患を治療するための方法は、対照と比較して対象における疾患の１つ以上の症状において１０％の軽減が存在する場合に治療であると見なされる。したがって、軽減は、天然または対照レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１０％〜１００％の間の任意の割合の軽減であり得る。治療が必ずしも疾患、状態、またはその疾患もしくは状態の症状の治癒または完全な除去を指すわけではないことが理解される。
【００７７】
本明細書で使用される際、疾患または障害を「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、および「予防」という用語は、対象が疾患または障害の１つ以上の症状を呈し始める前または呈し始めたときに生じる行為、例えば、治療薬の投与を指し、この行為は、疾患または障害の１つ以上の症状の発症または悪化を阻害または遅延させる。本明細書で使用される際、「減少」、「軽減」、または「阻害」への言及は、対照レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはこれ以上の変化を含む。そのような用語は、完全な排除を含み得るが、必ずしも含むわけではない。
【００７８】
本開示の方法および組成物のために使用され得るか、それらとともに使用され得るか、それらの調製において使用され得るか、またはそれらの生成物である物質、組成物、および成分が開示される。これらおよび他の物質が本明細書に開示されており、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群等が開示されるとき、これらの化合物のそれぞれの様々な個々および集合的な組み合わせおよび順列の特定の参照が明確に開示されない場合があるが、それぞれ本明細書に具体的に企図および記載されることが理解される。例えば、この方法を含むある方法が開示されて論じられ、かついくつかの分子に加えられるいくつかの修飾が論じられる場合、この方法のありとあらゆる組み合わせおよび順列、ならびに可能な修飾は、それとは反対に具体的に指示されない限り、具体的に企図される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも具体的に企図および開示される。この概念は、本開示の組成物を用いる方法におけるステップを含むが、これらに限定されない本開示のすべての態様に適用される。したがって、実行され得る様々なさらなるステップが存在する場合、これらのさらなるステップのそれぞれを本開示の方法の任意の特定の方法ステップまたは方法ステップの組み合わせとともに実行することができ、かつそれぞれのそのような組み合わせまたは組み合わせのサブセットが具体的に企図され、開示されたと見なされるべきであることが理解される。
【００７９】
本明細書で引用される出版物およびそれらが引用される資料は、参照によりそれらの全体が本明細書に具体的に組み込まれる。
【００８０】
実施例
方法
化学物質および酵素。ハイグロマイシンＢをＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。すべての他の化学物質を入手可能な最高純度でＭｅｒｃｋ（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ）またはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ＤＮＡ制限および修飾用の酵素をＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手した。オリゴヌクレオチドをＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）から入手した。
【００８１】
細菌株、培地、および増殖条件。大腸菌ＤＨ５αをクローニング実験に使用し、３７℃のルリア−ベルターニ培養液中で日常的に増殖させた。スメグマ菌株を０．２％グリセロールおよび０．０１％チロキサポールを補充した３７℃のＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９培地（Ｄｉｆｃｏ）中で、または０．５％グリセロールを補充したＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０プレート上で増殖させた。ウシ型結核菌ＢＣＧ（Ｓｔｒａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｐａｓｔｅｕｒ）を０．２％グリセロール、０．０１％チロキサポール、および１０％ＯＡＤＣ（Ｒｅｍｅｌ、Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）を補充したＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９培地（Ｄｉｆｃｏ）中で、または０．５％グリセロールおよび１０％ＯＡＤＣ（Ｒｅｍｅｌ）を補充したＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０プレート上で増殖させた。抗生物質を必要に応じて以下の濃度で使用した：ハイグロマイシン（大腸菌の場合２００μｇ／ｍＬ、マイコバクテリアの場合５０μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）。０．０１％チロキサポールおよび適切な炭素源（１％Ｔｗｅｅｎ−８０または０．１％グリセロール）を補充したＨａｒｔｍａｎｓ−ｄｅ  Ｂｏｎｔ（ＨｄＢ）培地（Ｓｍｅｕｌｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：２７０−８３（１９９９））を増殖実験の最少培地として使用した。
【００８２】
プラスミドの構築。使用したプラスミドが表２に列記されており、使用したオリゴヌクレオチドが表３に列記されている。ｂｌａ耐性カセットを用いず、かつ大腸菌での低コピー数で新たな統合的ベクターを構築するために、プラスミドｐＭＬ１１３（Ｗｏｌｓｃｈｅｎｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９：２４３５−４２（２００７））をＳｓｐＩおよびＣｌａＩで消化し、その後、Ｔ４ポリメラーゼ処理を行って付着末端を除去した。ｐＢＲ３２２複製起点をＦｓｐＩおよびＤｒａＩで消化したｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からクローニングした。さらなる適用のためにＰａｃＩ制限部位を使用することを可能にするために、得られたプラスミドをＰａｃＩで消化し、その後、Ｔ４ポリメラーゼと平滑末端反応させ、再連結して、ｐＭＬ２００８の構築をもたらした。ｐｉｍｙｃの制御下のＭｓｐＡ発現カセットを、ＣｌａＩで消化し、その後、Ｔ４ポリメラーゼで補充反応させ、ＳｐｅＩで消化して、ｐＭＮ０１３（Ｓｔｅｐｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（２００４））からクローニングした。得られた断片をＳｐｅＩおよびＰｍｅＩで消化したｐＭＬ２００８にクローニングして、ｐＭＬ２００９を得た。Ｈ３７ＲｖのゲノムＤＮＡ（アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＡＩＤ）契約書ＨＨＳＮ２６６２００４０００９１Ｃ、表題「Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ」の一環としてＣｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手）由来のｒｖ３９０３ｃ（ヒト型結核菌ポリン（ＭｔｐＡ）とも称される）のＰＣＲ増幅をオリゴヌクレオチドＣＮ１５３７およびＣＮ１３９７を用いて行い、ＰａｃＩ制限部位を５’末端に、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を３’末端に導入した。得られたＰＣＲ断片およびｐＭＬ２００９をＰａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、連結して、ｐＭＬ２０１０を得た。ＭｔｐＡのＮ末端ドメイン（アミノ酸（ａａ）１〜４４４）の相補ベクターｐＭＬ２０４６を得るために、ＣＮ１５３７およびＣＮ１７２９を用いてＰＣＲ増幅し、その後、ＰａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同一の酵素で消化したｐＭＬ２００９に連結した。ｐＭＬ２０４６およびｐＭＮ０１６（Ｓｔｅｐｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：７１４−３０（２００５））をＰｍｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化して、スメグマ菌発現ベクターｐＭＬ２０６１を得た。ＭｔｐＡのタグ付けバージョンを得るために、２段階ＰＣＲ増幅を用いた：（１）ＨｉｓタグをＣＮ１３９３（ＮｄｅＩ部位を５’末端に導入）およびＣＮ１８２４を用いて付加し、（２）ＨＡタグをＣＮ１３９３およびＣＮ１８２５（ＨｉｎｄＩＩＩ部位を３’末端に導入し、かつＥｃｏＲＶ部位をＭｔｐＡとタグとの間に導入）を用いて付加した。得られたＰＣＲ断片をＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同一の酵素で消化したｐＮＩＴ−１：：ｇｆｐ（Ｐａｎｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ８９：１２−６（２００９））に連結して、ｐＭＬ２０２４を得た。耐性カセットを交換するために、ｐＭＬ��０２４をＨｐａＩおよびＸｂａＩで消化し、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩで消化したｐＭＳ２（Ｋａｐｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２７８：１１５−２４（２００１））に連結して、ｐＭＬ２０３１を得た。ＭｔｐＡのＮ末端ドメイン（ａａ１〜４４４）のニトリル誘導性ベクターｐＭＬ２０４０を、ＣＮ１３９３およびＣＮ１７２０を用いてＭｔｐＡをＰＣＲ増幅し、その後、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、同一の酵素で消化したｐＭＬ２０３１に連結することによって得た。ＭｔｐＡのＮ末端ドメイン（ａａ４９〜４４４）の大腸菌発現ベクターを構築するために、遺伝子を大腸菌での効率的な発現のためにコドン最適化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で合成した。ドメイン１（シグナル配列を含まない）を２段階プロトコルを用いてＰＣＲで増幅した：（ｉ）５’末端ＳｔｒｅｐタグをＣＮ１８０６に導入し、３’末端ＨＡタグをＣＮ１８０９に導入し、（ｉｉ）５’末端ＮｄｅＩ部位をＣＮ１７５３に導入し、３’末端ＨｉｓタグおよびＨｉｎｄＩＩＩをＣＮ１７８１に導入した。得られたＰＣＲ断片をＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同一の酵素で消化したｐＥＴ−２８ｂ（＋）にクローニングした。
【表２】
2014531896.tif 000003
【表３】
2014531896.tif 000004
【００８３】
スメグマ菌の細胞内分画。実験を、いくつかの修飾を伴って、以前に説明されたように（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ８８：５２６−４４（２００８））行った。手短に、ニトリル誘導性全長ＭｔｐＡ（ｐＭＬ２０２４）またはＮ末端ドメイン（ｐＭＬ２０４０）を含有するスメグマ菌ｍｃ２１５５を、ＯＤ６００が０．２に達するまで増殖させた。５μＭイソバレロニトリルを添加してタンパク質発現を誘導した。増殖の４８時間後、培養物を遠心分離によって収集し、１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）で２回洗浄した。この細胞を再懸濁し、超音波処理（１０分間、１２ワットの出力電力）によって溶解した。破壊されていない細胞を低速遠心分離（４，０００×ｇで１５分間）によって除去した。結果として得られた上清を１００，０００×ｇで１時間超遠心分離して、サイトゾルタンパク質（ＳＮ−１００．１）を膜画分（Ｐ−１００．１）から分離した。Ｐ−１００．１を広範囲にわたって洗浄して、すべてのサイトゾルタンパク質および膜に付着したタンパク質を除去した。すべての試料をタンパク質装填緩衝液（１６０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．０、１２％ＳＤＳ、３２％グリセロール、０．４％ブロモフェノールブルー）と混合し、１０分間煮沸し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に装填した。このタンパク質ゲルを５０ｍＡで一晩ブロットし、トランスファー緩衝液（２５ｍＭトリス塩基、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ、２０％メタノール）をポリ二フッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上に移した。全長Ｒｖ３９０３ｃおよびＮ末端ドメインのタグ付けバージョンを抗ＨＡ−ＨＲＰ抗体（Ｓｉｇｍａ）で検出し、ＭｓｐＡをＥＣＬプラスキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いてＭｓｐＡに対するウサギ抗血清（ｐＡＫ＃８１３）（Ｋａｒｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：６５４３−６（１９９９））で検出した。ＬａｂＷｏｒｋｓ（ＵＶＰ、Ｕｐｌａｎｄ，ＣＡ）化学発光イメージングシステムおよびソフトウェアを用いて、発光を可視化および定量化した。
【００８４】
プロテイナーゼ到達性アッセイ。このアッセイを、以前に説明されたように（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ８８：５２６−４４（２００８））行った。ＰＥ−ＰＧＲＳ−３３ＨＡ（ｐＭＶ６１０１５．１）（Ｃａｓｃｉｏｆｅｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：１５３６−４７（２００７））およびＰｈｏＡＨＡ（ｐＭＬ９７０）（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ８８：５２６−４４（２００８））をプロテイナーゼ到達性アッセイで対照として用いた。株を上述のように増殖させた。プロテイナーゼＫ処理を４℃で３０分間行った。
【００８５】
ＭｔｐＡのＮ末端ドメインの精製。上述のスメグマ菌ｍｃ２１５５を担持するプラスミドｐＭＬ２０４０でＭｔｐＡのＮ末端ドメイン（ａａ１〜４４４）のニトリル誘導を行った。細胞を収集し、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ３０００超音波液体処理装置（Ｍｉｓｏｎｉｘ，Ｉｎｃ．、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）（１５分間、１２ワットの出力電力）を用いて４℃で破壊した。ペレットを低速遠心分離（４，０００×ｇ）によって得て、１ｍｇ／ｍＬのリゾチームおよび０．０１ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩで、３７℃で２時間処理した。超音波処理ステップを上述のように再度実行した。低速遠心分離（４，０００×ｇ）によって得たペレットがＭｔｐＡのＮ末端ドメインの大部分を含んでいるため、さらなる精製ステップに使用した。タンパク質を０．８％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と３７℃で一晩インキュベートして可溶化した。非可溶性物質を室温で１０分間遠心分離（１６，０００×ｇ）して除去した。その後、抽出されたタンパク質を、１．７ｍＬのＰＯＲＯＳ  ２０ＭＣ  Ｎｉ−ＮＴＡカラム（ＢｉｏＬｏｇｉｃ  ｄｕｏｆｌｏｗ、ＢｉｏＲａｄ  ＨＰＬＣシステム）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上に充填し、０Ｍ〜０．５Ｍのイミダゾール勾配を用いて溶出した。製造業者のプロトコルに従って精製を行った。次に、他の箇所（Ｓｉｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：１７８２７−３７（２００８））に記載されるように、１．７ｍＬのＰＯＲＯＳ  ２０ＨＺアニオン交換カラムを用いてアニオン交換精製を行った。１０ｍＭ〜２ＭのＮａＣｌの範囲の塩濃度勾配を用いて溶出を行った。ゲル精製を実行するために、タンパク質試料を３７℃で１時間インキュベートし、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に充填した。タンパク質を可視化するために、イミダゾール亜鉛塩による逆染色を実行し（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐａｔｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２；５６４−７３（１９９２））、その後、ウエスタンブロット分析を用いて確定した。目的とするタンパク質バンドをゲルから切除し、Ｄ−Ｔｕｂｅｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて溶出した。陰極緩衝液（０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．２５、０．１Ｍトリシン、０．１％ＳＤＳ）を用いて５０ｍＡで一晩（４℃）電気溶出を行った。得られたタンパク質を、Ｄチューブ透析キット（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）（製造業者のプロトコルに従う）を用いて、０．５％ｎ−オクチルポリエチレンオキシド（ＯＰＯＥ，Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）を含有するＰＢＳに対して４℃で一晩透析した。精製されたタンパク質のチャネル形成活性を脂質二重層法を用いて分析した。タンパク質濃度をＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて決定した。さらに、既知の量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の較正曲線を、画像分析ソフトウェア（ＬａｂＷｏｒｋｓ  ４．６、ＵＶＰ）を用いてクマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中のタンパク質濃度を推定するために用いた。大腸菌からのＭｔｐＡのＮ末端ドメイン（ａａ４９〜４４４）のタンパク質発現および精製のために、ＢＬ２１を担持���るプラスミドｐＭＬ２０６９を用いた。以前に公開されたプロトコル（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ８８：５２６−４４（２００８））を用いて、Ｎ末端ドメインが可溶性画分および封入体の両方で局在化されることが見出された。可溶性画分を一緒にプールし、Ｎｉ親和性精製を上述のように行った。Ｓｔｒｅｐタグバッチ精製を、製造業者の指示に従ってストレプタクチンセファロース（ＩＢＡ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。０．５％のＯＰＯＥを溶出緩衝液に添加した。ゲル溶出、透析、およびタンパク質濃度決定を上述のように行った。
【００８６】
チャネル活性分析。ＭｔｐＡのＮ末端ドメインの単一チャネルコンダクタンスを以前に説明されたように（Ｓｉｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：１７８２７−３７（２００８））分析した。夾雑物の陰性対照またはチャネルを二重層で形成する緩衝液の固有の能力として、任意の検出可能なタンパク質を含有しない略同一の大きさのゲル切片をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り取り、ＭｔｐＡのＮ末端ドメインについて上に記載される方法と同一の方法で処理した。少なくとも３つの異なる膜を、タンパク質を添加する前にこの試料を用いて記録した（１０ｍＶおよび１００ｍＶで）。
【００８７】
グリセロール取り込み実験。グリセロール取り込み実験を、いくつかの修飾を伴って、以前に説明されたように（Ｄａｎｉｌｃｈａｎｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５２：３１２７−３４（２００８ｂ））実行した。細胞を遠心分離によって０．５〜１．０のＯＤ６００で収集し、取り込み緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ６．９、１５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．０２％チロキサポール）中で２回洗浄し、同一の緩衝液中に再懸濁した（平均乾燥重量は、０．５〜１ｍｇ／ｍＬである）。細胞を３７℃で５分間（スメグマ菌）または１５分間（ウシ型結核菌ＢＣＧ）予めインキュベートした後、［１４Ｃ］グリセロールを添加した（比放射能：１４６ｍＣｉ／ｍｍｏＬ）。放射活性的に標識されたグリセロールの最終濃度は、スメグマ菌では１．５μＭであり、ウシ型結核菌ＢＣＧでは３μＭであった。実験を三重に行い、少なくとも２回別々に繰り返した。
【００８８】
抗生物質耐性の決定。最小阻害濃度（ＭＩＣ）の決定を、一部修正（Ｄａｎｉｌｃｈａｎｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５２：２５０３−１１（２００８）、Ｄａｎｉｌｃｈａｎｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５２：３１２７−３４（２００８ｂ））が加えられたマイクロプレートアラマーブルーアッセイ（ＭＡＢＡ）（Ｆｒａｎｚｂｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：３６２−６（１９９８））を用いてを行った。最終薬物濃度は、以下の通りであった：イソニアジドおよびエタンブトールでは０．０３１２５〜１μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシンおよびリファンピシンでは０．０４〜１．２８μｇ／ｍＬ、レボフロキサシン、オフロキサシンおよびクラリスロマイシンでは０．０６２５〜２μｇ／ｍＬ、ｐ−アミノサリチル酸およびモキシフロキサシンでは０．２５〜８μｇ／ｍＬ、シプロフロキサシンおよびノルフロキサシンでは０．５〜１６μｇ／ｍＬ、クロラムフェニコールおよびサイクロセリンでは１〜３２μｇ／ｍＬ、バンコマイシンでは２．５〜８０μｇ／ｍＬ、エリスロマイシンＡおよびテトラサイクリンでは８〜２５６μｇ／ｍＬ、アンピシリンでは３０〜９６０μｇ／ｍＬ。ＭＡＢＡを三重に、少なくとも２回別々に行った。
【００８９】
一酸化窒素に対する感受性。ウシ型結核菌ＢＣＧ株を、ＯＤ６００が２に達するまで７Ｈ９／ＯＡＤＣ／０．０１％チロキサポール中で増殖させた。この培養物をペレット化し、洗浄し、最初の量の１／１０の量中に再懸濁した。この懸濁液の０．１ｍＬの一定分量を、０ｍＭ、５ｍＭ、２５ｍＭ、および１００ｍＭの無水ニトロフェリシアン化ナトリウム（ＩＩＩ）（ＳＮＰ，Ｓｉｇｍａ）を含有する０．９ｍＬの新鮮な培地に添加した。それぞれの懸濁液を３７℃（２００ｒｐｍ）で０、１、３、または７日間インキュベートした。この培養物の連続希釈物を７Ｈ１０／ＯＡＤＣ／Ｈｙｇプレート上にプレーティングし、３７℃で３週間インキュベートし、その後、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を計数した。このデータをパーセント生存率（［第Ｘ日目に暴露されたＣＦＵの数／Ｘ日目に暴露されなかったＣＦＵの数］×１００％）として再計算した。それぞれの株を三重に試験し、アッセイを３回別々に繰り返した。
【００９０】
マクロファージ実験。ヒト急性単球性白血病細胞（ＴＨＰ−１）を、以前に説明されたように（Ｊｏｒｄａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：５２９−４８（２００８））維持した。５０ｍＭのホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）を用いてＴＨＰ−１単球のマクロファージへの分化を一晩行った。ヒト単球由来マクロファージ（ＨＭＤＭ）を、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  Ｐｏｒｔｕｇｕeｓ  ｄｏ  Ｓａｎｇｕｅが快く提供してくれたバフィーコート調製物から得て、以前に説明されたように（Ｊｏｒｄａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：５２９−４８（２００８））調製した。ＴＨＰ−１細胞を２０の感染多重度（ＭＯＩ）に感染させ、ＨＭＤＭを１〜３のＭＯＩに感染させた。それぞれの実験において、感染から３時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄して、非内部化細菌を除去した。感染後異なる時点（３時間、１、３、５、および７日間）で、細胞をＰＢＳで洗浄し、水中１％Ｉｇｅｐａｌ（Ｓｉｇｍａ）溶液で溶解した。連続希釈を水中で実行し、１０％ＯＡＤＣを補充したＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０培地上にプレーティングした。コロニー形成単位（ＣＦＵ）を３７℃で２週間インキュベートした後に計数した。必要に応じて、ＨＭＤＭを感染前にヒトＩＦＮ−γ（２００ＩＵ）で一晩処理した。
【００９１】
Ｒｖ３９０３ｃの二次構造の分析。分析を以前に説明されたように（Ｓｉｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：１７８２７−３７（２００８））行った。
【００９２】
統計分析。データは、平均±標準偏差で示されており、ｐ値をスチューデントｔ検定を用いて計算し、０．０５未満のＰ値を有意であると見なした。
【実施例１】
【００９３】
Δｒｖ３９０３ｃ（ΔＭｔｐＡ）変異体の特徴付け。
低分子量の親水性化合物の取り込みに関与するＭｔｂの外膜タンパク質を特定する以前の試みにおいて、ウシ型結核菌ＢＣＧのトランスポゾンライブラリを構築し、アンピシリンに耐性を示す変異体についてスクリーニングした（Ｄａｎｉｌｃｈａｎｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５２：２５０３−１１（２００８））。マイコバクテリウム外膜タンパク質の予測のために以前に制定された基準（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ８８：５２６−４４（２００８））に基づいて特定されたこのライブラリ中に可能性のある外膜タンパク質が存在しなかった。しかしながら、ＯｍｐＡＴｂは、グラム陰性細菌のポリン（ｄｅ  Ｋｅｙｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６０：２０３４−５２（２００３））において観察されるように、古典的なＳｅｃシグナル配列（Ａｌａｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９：６３５１−８（２００７））を有しないＭｔｂの外膜タンパク質である。したがって、ライブラリ中のアンピシリン耐性変異体を、シグナル配列を除いて既知のポリンの特性（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ８８：５２６−４４（２００８））を有する仮説上のタンパク質について再度分析した。スクリーニングした変異体のうちの１つ、ＭＬ１０１２は、仮説上のアラニン−プロリン豊富なタンパク質をコードするｂｃｇ３９６０ｃにおける挿入（図１Ａ）を含む。ウシ型結核菌ＢＣＧのＢｃｇ３９６０ｃは、ＭｔｂのＲｖ３９０３ｃと同一であり、したがって、簡潔化のために、ｂｃｇ３９６０ｃウシ型結核菌ＢＣＧトランスポゾン変異体は、Δｒｖ３９０３ｃ変異体またはΔＭｔｐＡ変異体と称される。ＭｔｐＡの不活性化は、アンピシリンに対するウシ型結核菌ＢＣＧの３２倍に増加した耐性をもたらす（表４）、（Ｄａｎｉｌｃｈａｎｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５２：２５０３−１１（２００８））。このタンパク質は古典的なＳｅｃシグナル配列（シグナルＰ可能性＝０．１未満）（Ｂｅｎｄｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０：７８３−９５（２００４））を有しないが、さらなる分析は、ＭｔｐＡが、Ｖ型分泌系（Ｊａｃｏｂ−Ｄｕｂｕｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｉｏｂｉｏｌ．４０：３０６−１３（２００１），Ｓｚａｂａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：２２１−６（２００５））のいくつかのタンパク質で見つけられた「伸長した」シグナル配列を有することを示した。ＭｔｐＡの予測されたシグナル配列は、Ｎ末端伸長（アミノ酸（ａａ）１〜２０）、続いて、Ｓｅｃシグナル配列に関連する正準のドメイン：帯電ドメイン（ａａ２１〜２４）、疎水性ドメイン（ａａ２５〜３６）、および切断ドメイン（ａａ３７〜４５）からなる。
【表４】
2014531896.tif 000005
【００９４】
注目すべきことに、著しく保存されたＮ末端伸長シグナルペプチド領域を有する伸長したシグナル配列は、クラスβ−およびγ−プロテオバクテリア由来のグラム陰性細菌タンパク質においてのみ見つけられており、Ｖ型分泌経路、例えば、自己輸送体、２パートナー分泌系、および三量体自己輸送体を介して分泌されたタンパク質においてのみ見つけられている（Ｄｅｓｖａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２６４：２２−３０（２００６））。しかしながら、マイコバクテリウム中のＶ型分泌系のタンパク質はまだ特徴付けられていない。利用可能な配列情報に基づいて、Ｍｔｂ、ウシ型結核菌、およびウシ型結核菌ＢＣＧ等の増殖の遅いマイコバクテリウムのゲノムのみが、ＭｔｐＡタンパク質の全長相同体を有する。生物情報的予測（表５）と組み合わせたＢＬＡＳＴ分析（図１Ｂ）は、ＭｔｐＡが組織化されて３つのドメインになることを示唆する：細菌を含有するミコール酸に特異的なＮ末端ドメイン（ａａ１〜４４３）、非構造化ドメイン２（ａａ４４４〜７３４）、およびβ−シート含量の高いＣ末端ドメイン（７３５〜８４６）（図１Ｂ）。このＮ末端ドメインは、いくつかの保存された領域を含み、領域Ａ（ａａ１〜１０５）は、いくつかのアクチノバクテリア中の全タンパク質であり、領域Ｂ（ａａ１４０〜２３０）は、ノカルジア菌およびマイコバクテリウムに保存され、領域Ｃ（ａａ２３０〜４４４）は、マイコバクテリウムにおいてのみ見つけられる。Ｃ末端ドメインの機能は未知であるが、いくつかの細菌および子嚢菌類で見つけられる相同体は、赤血球凝集素様の分泌タンパク質または付着因子／溶血様のタンパク質であると予測される。
【表５】
2014531896.tif 000006
【実施例２】
【００９５】
ＭｔｐＡは外膜タンパク質である。
ＭｔｐＡが表面会合タンパク質であるかを試験するために、ニトリル誘導性プロモーターの制御下でＣ末端にＨＡおよびＨｉｓをタグ付けした全長タンパク質およびそのＮ末端ドメイン（ａａ１〜４４４）（ドメイン１）をクローニングし、それらをスメグマ菌ｍｃ２１５５で発現させた。細胞内分画を用いてそれらが膜で局在化されたかを決定するためにこれら両方のタンパク質を試験した。細胞エンベロープ画分（Ｐ１００）およびその画分を含有する水溶性細胞質タンパク質およびペリプラズムタンパク質（ＳＮ１００）を全細胞溶解物の超遠心分離（１００，０００×ｇ）（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ８８：５２６−４４（２００８））によって分離した。Ｎ末端ドメインも全長ＭｔｐＡもいずれも膜画分Ｐ１００に会合し、可溶性画分ＳＮ１００には会合しなかった（図２Ａ）。同様の分画プロファイルが、ＭｓｐＡ、ＯｍｐＡＴｂ、およびＲｖ１６９８等の他の既知のマイコバクテリウム外膜タンパク質において以前に見出されている（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ８８：５２６−４４（２００８））。Ｐ１００画分が内膜および外膜タンパク質ならびに膜会合タンパク質を含有するため、ＭｔｐＡの表面到達性が決定された。この目的を達成するために、ＭｔｐＡのプロテイナーゼＫへの到達性を試験し（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ８８：５２６−４４（２００８））、これは、プロテイナーゼＫがマイコバクテリウム細胞エンベロープに浸透することができないことに基づいている。したがって、細胞外ループを有するタンパク質のみが全細胞に消化される。アッセイの対照として、表面タンパク質ＰＥ＿ＰＧＲＳ３３ＨＡ（Ｃａｓｃｉｏｆｅｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：１５３６−４７（２００７））を過剰発現させ、これはプロテイナーゼＫの存在下で著しく消化し、ペリプラズムタンパク質ＰｈｏＡＨＡ（Ｓｉｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：１７８２７−３７（２００８））を過剰発現させ、これはプロテイナーゼＫ処理の影響を受けなかった（図２Ｂ）。ＰＥ＿ＰＧＲＳ３３ＨＡと同様に、全長ＭｔｐＡは、プロテイナーゼＫで処理したときに大部分が分解し、ＭｔｐＡが表面到達可能であることを示した。膜会合実験および表面到達性実験の組み合わせは、ＭｔｐＡが外膜タンパク質であることを示す。対照的に、ＭｔｐＡのＮ末端ドメイン（ドメイン１）は、全細胞においてプロテイナーゼＫによって分解されなかったが、細胞溶解物をプロテイナーゼＫで処理したときに完全に分解された（図２Ｂ）。ＭｔｐＡのＮ末端ドメインの膜会合に基づいて、タンパク質が外膜に対して標的化されるが、全細胞におけるプロテイナーゼＫ分解に到達可能な細胞外ループを欠くことを示唆する。
【実施例３】
【００９６】
ＭｔｐＡはウシ型結核菌ＢＣＧにおけるグリセロールの取り込みに必要である。
グラム陰性細菌およびスメグマ菌のポリンにおける変異は、唯一の炭素源として使用される際のグルコースおよびグリセロール等の低分子または親水性の溶質の取り込みの減少により、増殖速度の低下をもたらし得る（Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｆｅｒｅｎｃｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：３９１７−２２（１９９８）、Ｓｔｅｐｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：７１４−３０（２００５））。増殖の遅いマイコバクテリウムにおける栄養素の取り込みがＭｔｐＡに依存的であるかを決定するために、野生型ウシ型結核菌ＢＣＧの増殖をΔＭｔｐＡ変異体と比較して分析した。オレイン酸を唯一の炭素源として使用したときに増殖に差異は観察されず、ΔＭｔｐＡ変異体における栄養素としての疎水性溶質の利用がウシ型結核菌ＢＣＧの野生型株と同一であり、ΔＭｔｐＡ変異体が固有の増殖欠陥を有しないことを示唆した。炭素源としてグリセロール、グルコース、およびオレイン酸を含有するＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９富栄養培地を用いて、わずかの増殖欠陥がΔＭｔｐＡ変異体において観察された。この培地において損なわれた化合物のΔＭｔｐＡ変異体における利用を特定するために、様々な炭素源を有する最小Ｈａｒｔｍａｎｓ−ｄｅ  Ｂｏｎｄ（ＨｄＢ）培地を用いた。ΔＭｔｐＡ変異体の増殖は、０．１％グリセロールを唯一の炭素源として添加したときに最小限にとどまった（図３Ａ）。次に、ΔＭｔｐＡ変異体の観察された増殖遅延がグリセロール輸送の欠如に起因するかを試験した。取り込み実験は、ΔＭｔｐＡ変異体における［１４Ｃ］グリセロール蓄積が野生型株と比較して大幅に減少したことを明らかにし、ＭｔｐＡがウシ型結核菌ＢＣＧにおけるグリセロールの取り込みに大きな役割を果たすことを示唆した（図３Ｂ）。
【００９７】
生物情報的分析（図１Ｂ）は、ＭｔｐＡがいくつかのドメインから成ることを示す。この仮説を試験するために、全長タンパク質またはＮ末端ドメインを同一の統合的ベクターにクローニングし、結果として生じた株の増殖を液体培地で試験した。ΔＭｔｐＡ変異体の増殖欠陥の部分的な補完が、７Ｈ９  Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ培地においてＮ末端ドメイン（ａａ１〜４４４）および全長ＭｔｐＡの両方で観察された。全長ＭｔｐＡが唯一の炭素源としてグリセロールを有する液体最少培地において変異体の増殖欠陥を部分的にのみ補完した一方で、ＭｔｐＡのＮ末端ドメイン（ドメイン１）は、ＭｔｐＡ変異体の増殖欠陥を完全に補完した（図３Ａ）。さらに、富栄養培地および液体最少培地の両方におけるΔＭｔｐＡ変異体の増殖速度の増加も、スメグマ菌の一般的なポリンをコードする遺伝子であるｍｓｐＡの発現時に観察された（図３Ａ）。これらの結果は、ＭｔｐＡ変異体がウシ型結核菌ＢＣＧの外膜を通る輸送の欠如によりグリセロールの取り込みを欠いていることを示す。さらに、ＭｔｐＡのＮ末端ドメイン（ａａ１〜４４４）の発現は、ウシ型結核菌ＢＣＧのＭｔｐＡ変異体の増殖および取り込み補完に十分な発現である。
【実施例４】
【００９８】
ＭｔｐＡのＮ末端ドメインはチャネル活性を有する。
ＭｔｐＡのＮ末端ドメインもＭｓｐＡもいずれもΔＭｔｐＡ変異体の増殖欠陥を補完するという観察に基づいて、このドメインがポリン活性を有すると推測した。ポリンは、小分子の拡散を可能にする水を充填したチャネルタンパク質、および直接脂質膜を通って拡散することができないイオンである（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：４８５−９０（１９９６））。ポリンを通るイオンの通過を平面脂質二重層アッセイを用いて電気生理学的に測定することができる。この方法は、チャネルタンパク質の平面脂質膜への取り込みを検出し、継時的に測定される膜電流の離散的増加に相当する（Ｂｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ５１１：３０５−１９（１９７８））。この目的を達成するために、ＭｔｐＡのＮ末端ドメイン（ａａ１〜４４４）をニトリル誘導性プロモーターの制御下でスメグマ菌で発現させた。ＭｔｐＡのＮ末端ドメインを３７℃の０．８％のＳＤＳを有するペレット画分から抽出し、Ｎｉ＋−ＮＴＡ親和性カラム上で精製し、その後、アニオン交換精製した。測定されたチャネル活性がクマシー染色を用いて検出されなかった他のタンパク質夾雑物によって生じるという可能性を排除するために、ＭｔｐＡのＮ末端ドメインに対応するタンパク質バンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切除し、電気溶出を用いて精製した（図４Ａおよび４Ｂ）。洗剤を含有する貯蔵緩衝液を脂質二重層に添加したときに挿入事象は検出されず、緩衝液／洗剤は単独でチャネルを形成する固有の能力を有さず、かつチャネル活性を有するいずれの夾雑タンパク質も含有しないことを示した。１００ｎｇ未満の精製されたＭｔｐＡのＮ末端ドメインの同一の膜への添加は、電流の段階的増加をもたらした（図４Ｃ）。記録されたいくつかの異なるタンパク質調製物の孔は１００個を超えた。最も高い周波数の単一チャネルコンダクタンスは、４．０±０．２ｎＳであった（図４Ｄおよび４Ｅ）。
【００９９】
ＭｔｐＡのＮ末端ドメインの観察されたチャネル活性がスメグマ菌の共精製された夾雑タンパク質に起因するという可能性を排除するために、タンパク質の発現を大腸菌において実行した。切断されたＭｔｐＡのＮ末端ドメイン（ａａ４９〜４４４）をコドン最適化し、Ｎ末端でＳｔｒｅｐタグ、およびＣ末端でＨＡ−およびＨｉｓタグを含むＴ７−発現ベクターにクローニングした。ＭｔｐＡのＮ末端ドメインをＮｉ２＋およびＳｔｒｅｐタグ親和性クロマトグラフィーならびにゲル溶出によって精製した（図５Ａ）。精製されたＭｔｐＡのＮ末端ドメインの平面脂質二重層への再構成は、コンダクタンスの段階的増加をもたらした（図５Ｂ）。これらのステップが対照実験において観察されなかったため、洗剤を含有する緩衝液のみを二重層に添加したとき、観察されたチャネル活性がＭｔｐＡのＮ末端ドメイン（ａａ４９〜４４４）の存在によって引き起こされるという結論を下すことができる。さらに、スメグマ菌（図４Ｄおよび４Ｅ）および大腸菌（図５Ｂ）から精製されたＭｔｐＡのＮ末端ドメインの単一チャネルコンダクタンスがほぼ同一であり、ＭｔｐＡのＮ末端ドメインがポリン活性を有することを示した。
【０１００】
以前に、スメグマ菌における親水性小分子の取り込みがＭｓｐ様のポリンによって媒介されることが示されている（Ｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０：４５１−６４（２００１）、Ｓｔｅｐｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：７１４−３０（２００５））。さらに、ポリンの数の減少は、低下した増殖速度をもたらす（Ｓｔｅｐｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：７１４−３０（２００５））。したがって、ＭｔｐＡのＮ末端ドメインがポリン機能を有する場合、増殖および栄養素取り込みの速度の増加がＭｔｐＡのＮ末端ドメインの発現時にスメグマ菌ポリン変異体において観察されるであろう。タグ付けされていないＭｔｐＡのＮ末端ドメイン（ａａ１〜４４４）をＭＬ１６、スメグマ菌の３重ポリン変異体（ΔｍｓｐＡ  ΔｍｓｐＢ  ΔｍｓｐＤ）（Ｓｔｅｐｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：７１４−３０（２００５））で発現させたとき、ＭＬ１６と比較して、［１４Ｃ］グリセロールの蓄積の統計的に有意な増加がこの株において観察された（図６）。しかしながら、ＭｔｐＡのＮ末端ドメインの発現時の［１４Ｃ］グリセロール蓄積のレベルは、ｍｓｐＡを発現した対照ΔｍｓｐＡ  ΔｍｓｐＢ  ΔｍｓｐＤ株と比較してはるかに低かった。これらのデータは、ＭｔｐＡのＮ末端ドメインが、ＭｓｐＡの外膜輸送活性未満ではあるが、外膜輸送活性を有することを示唆する。これは、（ヒト型結核菌ポリンＡに対する）ＭｔｐＡの名前が提案されるＲｖ３９０３ｃのポリン活性に基づいている。
【実施例５】
【０１０１】
ＭｔｐＡは生体内での栄養素の取り込みに必要である。
スメグマ菌中のポリンの欠失は、ファゴソームに存在する殺菌成分の取り込みの減少によるマクロファージの生存率の改善をもたらす（Ｆａｂｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．１１：８６８−７５（２００９）、Ｐｕｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７３：８４４−５７（２００９））。マクロファージのＭｔｂの生存にＭｔｐＡが果たす役割を定義するために、ヒト急性単球性白血病細胞（ＴＨＰ−１）を野生型ウシ型結核菌ＢＣＧ、ΔＭｔｐＡ変異体、または全長ＭｔｐＡもしくはｍｓｐＡのいずれかで補完された変異体に感染させた。以前に報告されたように、ＴＨＰ−１細胞は、生きた野生型ウシ型結核菌ＢＣＧ細菌を感染後７日間にわたって低いレベルで一定に保った（図７Ａ）（Ｊｏｒｄａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：５２９−４８（２００８））。対照的に、ΔＭｔｐＡ変異体は、感染後最初の３日間に急速に死滅した。ＭｔｐＡで補完したときに、観察された表現型は完全に逆になり、ＭｔｐＡが栄養素の取り込みおよびマクロファージにおけるウシ型結核菌ＢＣＧの生存に必要であることを示した。ΔＭｔｐＡ変異体におけるＭｓｐＡの発現は、特に感染の最初の段階中に株の生存率を大幅に低下させ（図７Ａ）、マクロファージにおけるＭｓｐＡおよびＭｔｐＡの機能が大きく異なることを示唆した。
【実施例６】
【０１０２】
ＭｔｐＡは生体外および生体内における一酸化窒素への耐性を媒介する。
反応性窒素および酸素中間体の生成は、結核感染の制御の役割を果たす（ＭａｃＭｉｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：３２３−５０（１９９７））。以前に、ｍｓｐポリン遺伝子の不在が一酸化窒素へのスメグマ菌の耐性を与えることが示されている（Ｆａｂｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．１１：８６８−７５（２００９））。ＭｔｐＡが一酸化窒素への増殖の遅いマイコバクテリウムの耐性に重要であるかを調べるために、野生型ウシ型結核菌ＢＣＧ、ΔＭｔｐＡ変異体、または全長ＭｔｐＡもしくはｍｓｐＡのいずれかで補完された変異体を、一酸化窒素ドナー無水ニトロフェリシアン化ナトリウム（ＩＩＩ）（ＳＮＰ）で処理した。液体Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９培地中ですべての株をＳＮＰで処理することによって、用量および時間依存的様式で回収されたコロニーの数を減少させた（図８Ａおよび８Ｂ）。回収された野生型株の細菌の数は、ΔＭｔｐＡ株と比較して少なくとも１００倍減少した（図８Ｂ）。ΔＭｔｐＡ株におけるＭｔｐＡの発現は、ウシ型結核菌ＢＣＧの一酸化窒素感受性を完全に回復させ、ウシ型結核菌ＢＣＧがＭｔｐＡの不在下で一酸化窒素に高度に耐性を示すことを示唆した（図８Ａ）。ΔＭｔｐＡ変異体におけるｍｓｐＡの過剰発現は、処理の２４時間後に株をほぼ完全に除去し（図８Ａ）、したがって、毒性化合物のＭｓｐＡ媒介取り込みが一酸化窒素応力下で生存率の低下につがなるという以前の観察を裏付けた。
【０１０３】
一酸化窒素へのΔＭｔｐＡ株の耐性の増加が生体内において任意の利点を有するかを決定するために、γ−インターフェロンで処理した／処理していないヒト単球由来マクロファージ（ＨＭＤＭ）を野生型ウシ型結核菌ＢＣＧに感染させた。γ−インターフェロンは、ウシ型結核菌ＢＣＧでの感染後２日以降に一酸化窒素レベルを著しく増加させながらマクロファージにおける一酸化窒素シンターゼ活性を誘導することで知られている（Ｊｏｒｄａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：５２９−４８（２００８））。これに一致して、野生型株とΔＭｔｐＡ株はいずれも未処理のＨＭＤＭにおける感染にわたって着実に増殖したが、野生型株よりもこの変異体で少ない細菌が回収された。これは、特に感染の７日目に顕著であった（図７Ｂ）。回収された細菌数の大幅な減少がγ−インターフェロンで刺激したＨＭＤＭの感染後最初の２日間に野生型株において観察された。興味深いことに、未処理の細胞と比較してマクロファージをγ−インターフェロンで処理したときにΔＭｔｐＡ変異体の生存率に有意差は観察されず、ＭｔｐＡの不在が生体内で細胞を一酸化窒素の有害な影響から守ることを示唆した。
【実施例７】
【０１０４】
ＭｔｐＡの不在がウシ型結核菌ＢＣＧに多剤耐性表現型を与える。
グラム陰性細菌におけるポリンの欠如が低レベルの耐性のみを低分子量の親水性薬物に与える（Ｎｉｋａｉｄｏ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６７：５９３−６５６（２００３））一方で、スメグマ菌中のポリンの喪失は、より高い耐性レベルをもたらす（Ｄａｎｉｌｃｈａｎｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５２：３１２７−３４（２００８））。増殖の遅いマイコバクテリウムにおける薬物の取り込み経路はこれまで特定されていない。しかしながら、ポリンがβ−ラクタム系抗生物質、エタンブトール、イソニアジド、およびストレプトマイシンの取り込みを媒介することが示唆されている（Ｓｔｅｐｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４８：４１６３−７０（２００４））。Ｍｔｂの薬物耐性がＭｔｐＡによって媒介されるかを決定するために、マイクロプレートアラマーブルーアッセイ（ＭＡＢＡ）を用いた。ウシ型結核菌ＢＣＧのいくつかの低分子量の親水性抗生物質への耐性（表４、Ａ群）は、ＭｔｐＡの不在下で大幅に増加した。例えば、３２倍および１６倍増加した最小阻害濃度（ＭＩＣ）が、それぞれ、ΔＭｔｐＡ株中のアンピシリンおよびクロラムフェニコールにおいて観察された一方で、抗結核薬エタンブトール、イソニアジド、およびｐ−アミノサリチル酸（ＰＡＳ）への耐性は８倍超増加した。驚いたことに、エリスロマイシンおよびリファンピシン等の高分子量で疎水性の抗生物質のＭＩＣもΔＭｔｐＡ変異体において著しく増加した（表４、Ｃ群）。低分子量および／または親水性抗生物質へのＭｓｐＡまたはＭｔｐＡを発現するΔＭｔｐＡ株の耐性は、野生型ウシ型結核菌ＢＣＧの耐性と同一であり（表４、Ａ群、Ｄ群）、ＭｔｐＡがウシ型結核菌ＢＣＧをこれらの薬物に対してより感受性の高いものにし、かつＭｓｐＡおよびＭｔｐＡが同様の機構によって機能することを示唆する。
【実施例８】
【０１０５】
ＭｔｐＡのＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）は毒素活性を有する。
スメグマ菌、大腸菌、および出芽酵母においてＭｔｐＡのＣＴＤを生体内で発現させる試みは失敗したが、生体外（細胞を含まない）発現は、微量のタンパク質の回収を可能にした。ＭｔｐＡのＣＴＤが哺乳類細胞において毒性であるかを試験するために、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下でＨＡタグと融合したＭｔｐＡのＣＴＤを含有するｐＲＫ７系ベクター（Ｇｒａｙｃａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．３：１９７７−８６（１９８９））をヒト２９３Ｔ細胞系に一時的にトランスフェクトした。トランスフェクトしてから２４時間後の細胞の顕微鏡検査は、ｇｆｐ含有ベクターでトランスフェクトした細胞と比較して（図９Ａ）、細胞の大半が死んだ（図９Ｂ）ことを明らかにした。細胞死がＣＴＤの活性に関連するものであり、過剰発現のせいではないことを示すために、ＣＴＤの非毒性変異体のスクリーニングを実行した。大腸菌におけるＣＴＤの発現が有害であるとして、ＣＴＤ−Ｇｆｐ翻訳融合がＣＴＤの点変異またはインフレーム欠失を含むクローンにおいてのみ蛍光性であると仮定した。予想通り、ＣＴＤの野生型配列を有する蛍光クローンは得られなかった。しかしながら、点変異を含む４つの異なる変異体（ＣＴＤＭ１〜４）がＧｆｐ−蛍光に基づいて特定された：ＣＴＤＭ１（Ｇ８１８Ｅ）、ＣＴＤＭ２（Ａ８１１Ｅ）、ＣＴＤＭ３（Ｇ７５２Ｖ）、およびＣＴＤＭ４（Ｇ６６２Ｄ／Ｒ７８８Ｌ）。変異体ＣＴＤＭ１は、ヒト２９３Ｔ細胞において完全に非毒性であった（図９Ｃ）。これらの結果は、ＭｔｐＡが以前に特徴付けられていない細菌性毒素ドメインを含むことを示し、マイコバクテリウムＯＭタンパク質が新規の機構によって機能するという仮定を強調する。多くの細菌性毒素の活性は、細胞表面での分泌（Ｉ型およびＩＩＩ型）または切断（Ｖ型）を必要とする。これらの機構のどちらがＭｔｐＡに適用されるかを試験するために、ウシ型結核菌ＢＣＧの全細胞および培養濾液ならびにＣ末端でＨＡおよびＨｉｓタグ付けしたＭｔｐＡを含有するＭｔｂ  ΔｍｔｐＡ株を分析した。抗ＨＡ抗体を用いて、全長ＭｔｐＡが全細胞において検出され、約２４ｋＤａの切断されたタンパク質が濃縮培養濾液において検出され（図９Ｄ）、ＣＴＤが全長タンパク質としてＯＭに移動し、その後、切断され、ＣＦに解放されることを示した。さらに、ＣＴＤの切断部位を質量分析によって特定した。ＯＭチャネルドメインおよび毒素ドメインでのＭｔｐＡの組織化は、ピロリ菌のＶａｃＡ等の自己輸送体（Ｖａ型分泌）の組織化に類似している（Ｃｏｖｅｒ＆Ｂｌａｎｋｅ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：３２０−３２（２００５））が、これらのドメインは、グラム陰性細菌とは異なって組織化される。自己輸送体の類似性がそれらのＯＭチャネルドメインに限定されるとして、マイコバクテリウムＯＭの構造がグラム陰性細菌の構造とは大きく異なるため、マイコバクテリウム自己輸送体が今まで見出されていないことは驚くべきことではない。
配列番号１  ＭｔｐＡ（Ｒｖ３９０３ｃ）
ＭＡＰＬＡＶＤＰＡＡＬＤＳＡＧＧＡＶＶＡＡＧＡＧＬＧＡＶＩＳＳＬＴＡＡＬＡＧＣＡＧＭＡＧＤＤＰＡＧＡＶＦＧＲＳＹＤＧＳＡＡＡＬＶＱＡＭＳＶＡＲＮＧＬＣＮＬＧＤＧＶＲＭＳＡＨＮＹＳＬＡＥＡＭＳＤＶＡＧＲＡＡＰＬＰＡＰＰＰＳＧＣＶＧＶＧＡＰＰＳＡＶＧＧＧＧＧＡＰＫＧＷＧＷＶＡＰＹＩＧＭＩＷＰＮＧＤＳＴＫＬＲＡＡＡＶＡＷＲＳＡＧＴＱＦＡＬＴＥＩＱＳＴＡＧＰＭＧＶＩＲＡＱＱＬＰＥＡＧＬＩＥＳＡＦＡＤＡＹＡＳＴＴＡＶＶＧＱＣＨＱＬＡＡＱＬＤＡＹＡＡＲＩＤＡＶＨＡＡＶＬＤＬＬＡＲＩＣＤＰＬＴＧＩＫＥＶＷＥＦＬＴＤＱＤＥＤＥＩＱＲＩＡＨＤＩＡＶＶＶＤＱＦＳＧＥＶＤＡＬＡＡＥＩＴＡＶＶＳＨＡＥＡＶＩＴＡＭＡＤＨＡＧＫＱＷＤＲＦＬＨＳＮＰＶＧＶＶＩＤＧＴＧＱＱＬＫＧＦＧＥＥＡＦＧＭＡＫＤＳＷＤＬＧＰＬＲＡＳＩＤＰＦＧＷＹＲＳＷＥＥＭＬＴＧＭＡＰＬＡＧＬＧＧＥＮＡＰＧＶＶＥＳＷＫＱＦＧＫＳＬＩＨＷＤＥＷＴＴＮＰＮＥＡＬＧＫＴＶＦＤＡＡＴＬＡＬＰＧＧＰＬＳＫＬＧＳＫＧＲＤＩＬＡＧＶＲＧＬＫＥＲＬＥＰＴＴＰＨＬＥＰＰＡＴＰＰＲＰＧＰＱＰＰＲＩＥＰＰＥＳＧＨＰＡＰＡＰＡＡＫＰＡＰＶＰＡＮＧＰＬＰＨＳＰＴＥＳＫＰＰＰＶＤＲＰＡＥＰＶＡＰＳＳＡＳＡＧＱＰＲＶＳＡＡＴＴＰＧＴＨＶＰＨＧＬＰＱＰＧＥＨＶＰＡＱＡＰＰＡＴＴＬＬＧＧＰＰＶＥＳＡＰＡＴＡＨＱＰＱＷＡＴＴＰＡＡＰＡＡＡＰＨＳＴＰＧＧＶＨＳＴＥＳＧＰＨＧＲＳＬＳＡＨＧＳＥＰＴＨＤＧＡＳＨＧＳＧＨＧＳＧＳＥＰＰＧＬＨＡＰＨＲＥＱＱＬＡＭＨＳＮＥＰＡＧＥＧＷＨＲＬＳＤＥＡＶＤＰＱＹＧＥＰＬＳＲＨＷＤＦＴＤＮＰＡＤＲＳＲＩＮＰＶＶＡＱＬＭＥＤＰＮＡＰＦＧＲＤＰＱＧＱＰＹＴＱＥＲＹＱＥＲＦＮＳＶＧＰＷＧＱＱＹＳＮＦＰＰＮＮＧＡＶＰＧＴＲＩＡＹＴＮＬＥＫＦＬＳＤＹＧＰＱＬＤＲＩＧＧＤＱＧＫＹＬＡＩＭＥＨＧＲＰＡＳＷＥＱＲＡＬＨＶＴＳＬＲＤＰＹＨＡＹＴＩＤＷＬＰＥＧＷＦＩＥＶＳＥＶＡＰＧＣＧＱＰＧＧＳＩＱＶＲＩＦＤＨＱＮＥＭＲＫＶＥＥＬＩＲＲＧＶＬＲＱ
配列番号２  ＭｔｐＡのアミノ末端ドメイン（Ｒｖ３９０３ｃ）
ＭＡＰＬＡＶＤＰＡＡＬＤＳＡＧＧＡＶＶＡＡＧＡＧＬＧＡＶＩＳＳＬＴＡＡＬＡＧＣＡＧＭＡＧＤＤＰＡＧＡＶＦＧＲＳＹＤＧＳＡＡＡＬＶＱＡＭＳＶＡＲＮＧＬＣＮＬＧＤＧＶＲＭＳＡＨＮＹＳＬＡＥＡＭＳＤＶＡＧＲＡＡＰＬＰＡＰＰＰＳＧＣＶＧＶＧＡＰＰＳＡＶＧＧＧＧＧＡＰＫＧＷＧＷＶＡＰＹＩＧＭＩＷＰＮＧＤＳＴＫＬＲＡＡＡＶＡＷＲＳＡＧＴＱＦＡＬＴＥＩＱＳＴＡＧＰＭＧＶＩＲＡＱＱＬＰＥＡＧＬＩＥＳＡＦＡＤＡＹＡＳＴＴＡＶＶＧＱＣＨＱＬＡＡＱＬＤＡＹＡＡＲＩＤＡＶＨＡＡＶＬＤＬＬＡＲＩＣＤＰＬＴＧＩＫＥＶＷＥＦＬＴＤＱＤＥＤＥＩＱＲＩＡＨＤＩＡＶＶＶＤＱＦＳＧＥＶＤＡＬＡＡＥＩＴＡＶＶＳＨＡＥＡＶＩＴＡＭＡＤＨＡＧＫＱＷＤＲＦＬＨＳＮＰＶＧＶＶＩＤＧＴＧＱＱＬＫＧＦＧＥＥＡＦＧＭＡＫＤＳＷＤＬＧＰＬＲＡＳＩＤＰＦＧＷＹＲＳＷＥＥＭＬＴＧＭＡＰＬＡＧＬＧＧＥＮＡＰＧＶＶＥＳＷＫＱＦＧＫＳＬＩＨＷＤＥＷＴＴＮＰＮＥＡＬＧＫＴＶＦＤＡＡＴＬＡＬＰＧＧＰＬＳＫＬＧＳＫＧＲＤＩＬＡＧＶＲＧＬＫＥＲＬ
配列番号３  ＭｔｐＡのカルボキシ末端ドメイン（Ｒｖ３９０３ｃ）
ＲＬＳＤＥＡＶＤＰＱＹＧＥＰＬＳＲＨＷＤＦＴＤＮＰＡＤＲＳＲＩＮＰＶＶＡＱＬＭＥＤＰＮＡＰＦＧＲＤＰＱＧＱＰＹＴＱＥＲＹＱＥＲＦＮＳＶＧＰＷＧＱＱＹＳＮＦＰＰＮＮＧＡＶＰＧＴＲＩＡＹＴＮＬＥＫＦＬＳＤＹＧＰＱＬＤＲＩＧＧＤＱＧＫＹＬＡＩＭＥＨＧＲＰＡＳＷＥＱＲＡＬＨＶＴＳＬＲＤＰＹＨＡＹＴＩＤＷＬＰＥＧＷＦＩＥＶＳＥＶＡＰＧＣＧＱＰＧＧＳＩＱＶＲＩＦＤＨＱＮＥＭＲＫＶＥＥＬＩＲＲＧＶＬＲＱ
【図１Ａ】
2014531896.tif 000007
【図１Ｂ】
2014531896.tif 000008
【図２Ａ】
2014531896.tif 000009
【図２Ｂ】
2014531896.tif 000010
【図３Ａ】
2014531896.tif 000011
【図３Ｂ】
2014531896.tif 000012
【図４Ａ】
2014531896.tif 000013
【図４Ｂ】
2014531896.tif 000014
【図４Ｃ】
2014531896.tif 000015
【図４Ｄ】
2014531896.tif 000016
【図４Ｅ】
2014531896.tif 000017
【図５Ａ】
2014531896.tif 000018
【図５Ｂ】
2014531896.tif 000019
【図６】
2014531896.tif 000020
【図７Ａ】
2014531896.tif 000021
【図７Ｂ】
2014531896.tif 000022
【図８Ａ】
2014531896.tif 000023
【図８Ｂ】
2014531896.tif 000024
【図９Ａ】
2014531896.tif 000025
【図９Ｂ】
2014531896.tif 000026
【図９Ｃ】
2014531896.tif 000027
【図９Ｄ】
2014531896.tif 000028
【配列表】
2014531896000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年4月30日(2014.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014531896000001.app
【国際調査報告】
2014531896.tif 000029
2014531896.tif 000030
2014531896.tif 000031