(57)【要約】本発明は、ＥＧＦＲ抗体免疫複合体が、ＥＧＦＲおよび／またはＡＬＫ耐性機序を獲得した腫瘍細胞の増殖の阻害において有効であるということの確認に関する。耐性腫瘍細胞を有する患者にＥＧＦＲ抗体免疫複合体を投与する方法もまた開示する。本発明は、ＥＧＦＲ抗体免疫複合体が、抗ＥＧＦＲ療法に対して耐性である腫瘍細胞の増殖の阻害において有効であるということの確認に関する。特定の実施形態において、ＥＧＦＲ抗体免疫複合体は、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤に対しても耐性である腫瘍細胞の増殖の阻害において有効である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＧＦＲ療法に対して耐性または不応性である上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）発現腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、前記方法が、前記腫瘍細胞を、有効量のＥＧＦＲ抗体免疫複合体と接触させることを含む、方法。
【請求項２】
前記療法が、ＥＧＦＲ抗体またはＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の投与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が耐性である前記ＥＧＦＲ療法が、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、ＢＩＢ２９９２、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ネシツムマブ、およびニモツズマブから成る群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記腫瘍細胞のうちの少なくとも１つが：（１）ＥＧＦＲをコードする遺伝子における１つもしくは複数の変異を含むか；（２）ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＡＳ、もしくはＰＴＥＮをコードする遺伝子における１つまたは複数の変異を含むか；（３）活性化されたＭＥＴもしくはＩＧＦ１Ｒ経路を有するか；（４）間葉系組織像を有するかもしくは上皮間葉転換を経ているか；または（５）ＥＲＢＢ２遺伝子の増幅もしくはＨＥＲ２タンパク質産生の増加を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記変異したＥＧＦＲ遺伝子が、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＴ７９０Ｍ変異を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの腫瘍細胞が、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＡＳ、またはＰＴＥＮをコードする遺伝子における１つまたは複数の変異を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＭＥＴまたはＩＧＦ１Ｒ経路が活性化されている、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
患者においてがんを治療する方法であって、前記方法が、前記患者における腫瘍細胞の増殖を阻害するために、有効量のＥＧＦＲ抗体免疫複合体を投与することを含み、前記腫瘍細胞のうちの少なくとも１つが：（１）ＥＧＦＲをコードする遺伝子における１つもしくは複数の変異を含むか；（２）ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＡＳ、もしくはＰＴＥＮをコードする遺伝子における１つまたは複数の変異を含むか；（３）活性化されたＭＥＴもしくはＩＧＦ１Ｒ経路を有するか；（４）間葉系組織像を有するかもしくは上皮間葉転換を経ているか；または（５）ＥＲＢＢ２遺伝子の増幅もしくはＨＥＲ２タンパク質産生の増加を有する、方法。
【請求項９】
患者においてがんを治療する方法であって、前記方法が、
（ａ）（１）ＥＧＦＲをコードする遺伝子における１つもしくは複数の変異を含むか；（２）ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＡＳ、もしくはＰＴＥＮをコードする遺伝子における１つまたは複数の変異を含むか；（３）活性化されたＭＥＴもしくはＩＧＦ１Ｒ経路を有するか；または（４）間葉系組織像を有するかもしくは上皮間葉転換を経ている；前記患者由来の腫瘍細胞を同定すること；および
（ｂ）前記患者に、有効量のＥＧＦＲ抗体免疫複合体を投与することを含む、方法。
【請求項１０】
前記がんが扁平上皮がん、肺がん、頭頸部がん、またはＥＧＦＲ陽性がんである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＭＥＴの活性化がＭＥＴ遺伝子の増幅に起因する、請求項１〜４、または７〜９に記載の方法。
【請求項１２】
ＥＧＦＲ療法が、前記患者に対して、以前に奏功しなかったかまたは現在奏功していない、請求項８〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記療法がＥＧＦＲ抗体またはＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の投与を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＥＧＦＲ抗体がセツキシマブまたはパニツムマブである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤がエルロチニブまたはゲフィチニブである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
患者においてがんを治療する方法であって、前記方法が、前記患者において腫瘍細胞の増殖を阻害するために、有効量のＥＧＦＲ抗体免疫複合体を投与することを含み、前記腫瘍細胞のうちの少なくとも１つが、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤を含む治療に耐性である、方法。
【請求項１７】
患者においてがんを治療する方法であって、前記方法が、
（ａ）少なくとも１つのＡＬＫ阻害剤に耐性である、前記患者由来の腫瘍細胞を同定すること；および
（ｂ）有効量のＥＧＦＲ抗体免疫複合体を前記患者に投与すること；
を含む方法。
【請求項１８】
前記腫瘍細胞のうちの少なくとも１つがＥＭＬ４−ＡＬＫ転座を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記がんが非小細胞肺がんである、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＡＬＫ阻害剤がクリゾチニブである、請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記免疫複合体が式（Ａ）−（Ｌ）−（Ｃ）の構造を有し、式中：
（Ａ）はＥＧＦＲと特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり；
（Ｌ）はリンカーであり；および
（Ｃ）は細胞傷害性薬物であり；ならびに
前記リンカー（Ｌ）は（Ａ）と（Ｃ）を連結する；
請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記ＥＧＦＲ抗体が配列番号１の重鎖可変領域および配列番号２または３の軽鎖可変領域を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記リンカーが、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、親水性リンカー、およびジカルボン酸系リンカーから成る群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記リンカーが切断不可能なリンカーである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記リンカーが：Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエ−ト（ＳＰＰ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエ−ト（ＳＰＤＢ）またはＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエ−ト（スルホ−ＳＰＤＢ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）；Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホＳＭＣＣ）；Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨ−ドアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）；Ｎ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）；Ｎ−（β−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）；およびγ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）；から成る群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞傷害性薬物が、メイタンシノイド、メイタンシノイド類似体、ドキソルビシン、修飾ドキソルビシン、ベンゾジアゼピン、タキソイド、ＣＣ−１０６５、ＣＣ−１０６５類似体、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン類似体、カリチアマイシン、ドラスタチン、ドラスタチン類似体、アウリスタチン、トメイマイシン誘導体、およびレプトマイシン誘導体、または前記薬物のプロドラッグから成る群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞傷害性薬物がメイタンシノイドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞傷害性薬物が、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）またはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＥＧＦＲ抗体免疫複合体が、配列番号１の重鎖可変領域および配列番号２または３の軽鎖可変領域を含む抗体；前記リンカーＳＭＣＣ；および前記メイタンシノイドＤＭ１を含む、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記ＥＧＦＲ抗体免疫複合体を抗悪性腫瘍薬とともに投与する、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記ＥＧＦＲ抗体免疫複合体を、前記抗悪性腫瘍薬と同時に投与する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＥＧＦＲ抗体免疫複合体および抗悪性腫瘍薬を、任意の時間的順序において投与する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記患者がヒトである、請求項８〜３２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＧＦＲ抗体免疫複合体が、ＥＧＦＲ耐性機序を獲得した腫瘍細胞の増殖の阻害において有効であるということの確認に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；ＥｒｂＢ−１；ＨＥＲ１）は、細胞外タンパク質リガンドの上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーの細胞表面受容体である（非特許文献１）。ＥＧＦＲは、サブファミリーが４つの密接に関連する受容体チロシンキナーゼ：ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ−３）およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ−４）からなる、ＥｒｂＢファミリー受容体のメンバーである。ＥＧＦＲの活性化は、その特異的なリガンド、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）およびトランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦα）などの結合により誘引される。リガンドが結合すると、ＥＧＦＲは、不活性な単量体の形態から、活性なホモ二量体へと変化する。さらに、ＥＧＦＲは、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３などのＥｒｂＢ受容体ファミリーの別のメンバーと対になり、活性なヘテロ二量体となることもある。ＥＧＦＲの二量体化は、その内在性の細胞内タンパク質チロシンキナーゼ活性を刺激し、その結果カルボキシ末端のいくつかのチロシン残基の自己リン酸化をもたらす（非特許文献２）。次いで自己リン酸化は、下流のシグナル伝達カスケード、主にＭＡＰＫ、ＡｋｔおよびＪＮＫ経路を誘発し、ＤＮＡ合成および細胞増殖をもたらす。
【０００３】
ＥＧＦＲは、重要な癌遺伝子である。恒常的な活性化をもたらすＥＧＦＲの過剰発現および変異は、肺がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、および多形神経膠芽腫を含む、いくつかのがんと関連づけられている（非特許文献３）。この発見は、ＥＧＦＲに対する抗がん治療薬の開発をもたらした。２つの小分子チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、エルロチニブ（タルセバ）およびゲフィチニブ（イレッサ）が、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および膵がんに対して、承認されている。さらに、ＥＧＦＲに対する２つの拮抗性モノクローナル抗体、セツキシマブ（アービタックス）およびパニツムマブ（ベクチビックス）が、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）および結腸直腸がん（ＣＲＣ）に対して、承認されている。
【０００４】
２つのＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、エルロチニブおよびゲフィチニブは、Ｌ８５８Ｒおよび／またはエクソン１９欠失型ＥＧＦＲ変異を有する、腺癌組織像を有するＮＳＣＬＣにおける単剤療法として、極めて有効である（非特許文献４，非特許文献５）。これらの感作ＥＧＦＲ変異を有する患者は、これらのＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による約７０％の奏効率を示しており、これは従来の化学療法に対する奏効率を超えるものである。しかしながら、かなりの初期応答があるにもかかわらず、これらのがんは最終的に、キナーゼ阻害剤に対する耐性を獲得する。一般に、ＥＧＦＲ療法に対する耐性機序は、以下の３つの主要なカテゴリーに分類することができる：（１）ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＴ７９０Ｍ変異などのＥＧＦＲ変異、（２）ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＡＳおよびＰＴＥＮの変異などの、ＥＧＦＲ下流経路の活性化をもたらす変異、ならびに（３）ＭＥＴおよびＩＧＦ１Ｒ経路などの代償性経路の活性化。ＥＧＦＲ標的療法に対する多様な耐性機序の発見は、次世代のＥＧＦＲ療法に対する、新たな課題を呈している。
【０００５】
２つのＥＧＦＲ拮抗性抗体、セツキシマブおよびパニツムマブは、リガンド結合の遮断により、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する（非特許文献６，  非特許文献７，  非特許文献８）。セツキシマブ治療は、化学療法に応答しなかった結腸直腸がんを有する患者において、全生存および無憎悪生存期間を改善し、生活の質を維持する。しかしながら、セツキシマブ治療は、コドン１２および１３に頻繁に見出されるＫＲＡＳ変異を有する結腸直腸がん患者に対しては、臨床的利益をもたらさない（非特許文献９）。同様に、ＳＣＣＨＮでは、エクソン２〜７欠失型ＥＧＦＲ変異（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）を有するがんにおいて、ＥＧＦＲ抗体は有効性が低い（非特許文献１０）。従って、ＥＧＦＲ標的療法に対する共通の耐性機序を克服し得る、新たながん治療が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈｅｒｂｓｔ  ＲＳ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏ  Ｐｈｙｓ  ５９：  ２１  （２００４）
【非特許文献２】Ｄｏｗｎｗａｒｄ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１１：  ４８３  （１９８４）
【非特許文献３】Ｚｈａｎｇ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１７：  ２０５１  （２００７）
【非特許文献４】Ｌｙｎｃｈ  ＴＪ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５０：  ２１２９  （２００４）
【非特許文献５】Ｐａｅｚ  ＪＧ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：  １４９７  （２００４）
【非特許文献６】Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２５９：７７５５−７７６０  （１９８４）
【非特許文献７】Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  １：１３１１−１３１８  （１９９５）
【非特許文献８】Ｐｒｅｗｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ４：２９５７−２９６６  （１９９８）
【非特許文献９】Ｋａｒａｐｅｔｉｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５９：  １７５７  （２００８）
【非特許文献１０】Ｓｏｋ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２：  ５０６４  （２００６）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＥＧＦＲ抗体免疫複合体が、抗ＥＧＦＲ療法に対して耐性である腫瘍細胞の増殖の阻害において有効であるということの確認に関する。特定の実施形態において、ＥＧＦＲ抗体免疫複合体は、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤に対しても耐性である腫瘍細胞の増殖の阻害において有効である。
【０００８】
このように、一実施形態において、本発明は、ＥＧＦＲ療法に対して耐性または不応性であるＥＧＦＲ発現腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、当該方法が、当該腫瘍細胞を有効量のＥＧＦＲ抗体免疫複合体と接触させることを含む、方法を提供する。一実施形態において、当該細胞が耐性である当該ＥＧＦＲ療法は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、ＢＩＢ２９９２、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ネシツムマブ、およびニモツズマブから成る群から選択される。別の実施形態において、当該腫瘍細胞のうちの少なくとも１つは：（１）ＥＧＦＲをコードする遺伝子における１つもしくは複数の変異を含むか；（２）ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＡＳ、もしくはＰＴＥＮをコードする遺伝子における１つまたは複数の変異を含むか；（３）活性化されたＭＥＴもしくはＩＧＦ１Ｒ経路を有するか；（４）間葉系組織像を有するかもしくは上皮間葉転換を経るか；または（５）ＥＲＢＢ２遺伝子の増幅もしくはＨＥＲ２タンパク質産生の増加を有する。別の実施形態において、当該ＥＧＦＲの変異は、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたＴ７９０Ｍ変異を含む。別の実施形態において、少なくとも１つの腫瘍細胞は、例えばＰＩＫ３ＣＡ、ＲＡＳまたはＰＴＥＮをコードする遺伝子の変異による、活性化されたＥＧＦＲ下流経路を有する。別の実施形態において、少なくとも１つの腫瘍細胞は、ＭＥＴまたはＩＧＦ１Ｒ経路などの活性化された代替経路（または複数の代替経路）を有する。一実施形態において、ＭＥＴの活性化は、ＭＥＴ遺伝子の増幅および／またはＭＥＴリガンドの発現に起因する。
【０００９】
ある実施形態において、ＥＧＦＲ抗体免疫複合体は、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤に対しても耐性である、ＥＧＦＲ耐性／不応性腫瘍細胞の増殖の阻害において有効である。一実施形態において、当該腫瘍細胞のうちの少なくとも１つは、ＥＭＬ４−ＡＬＫ転座を含む。別の実施形態において、当該腫瘍細胞は、非小細胞肺腫瘍である。
【００１０】
本発明はまた、患者においてがんを治療する方法であって、当該方法が、当該患者における腫瘍細胞の増殖を阻害するために、有効量のＥＧＦＲ抗体免疫複合体を投与することを含み、当該腫瘍細胞のうちの少なくとも１つが：（１）ＥＧＦＲをコードする遺伝子における１つもしくは複数の変異を含むか；（２）ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＡＳ、もしくはＰＴＥＮをコードする遺伝子における１つまたは複数の変異を含むか；（３）活性化されたＭＥＴもしくはＩＧＦ１Ｒ経路を有するか；（４）間葉系組織像を有するかもしくは上皮間葉転換を経るか；または（５）ＥＲＢＢ２遺伝子の増幅もしくはＨＥＲ２タンパク質産生の増加を有する、方法を提供する。一実施形態において、ＭＥＴの活性化はＭＥＴ遺伝子の増幅に起因する。
【００１１】
本発明はまた、患者においてがんを治療する方法であって、当該方法が、（ａ）（１）ＥＧＦＲをコードする遺伝子における１つもしくは複数の変異を含むか；（２）ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＡＳ、もしくはＰＴＥＮをコードする遺伝子における１つまたは複数の変異を含むか；（３）活性化されたＭＥＴもしくはＩＧＦ１Ｒ経路を有するか；（４）間葉系組織像を有するかもしくは上皮間葉転換を経るか；または（５）ＥＲＢＢ２遺伝子の増幅もしくはＨＥＲ２タンパク質産生の増加を有する、当該患者由来の腫瘍細胞を同定すること；および（ｂ）当該患者に、有効量のＥＧＦＲ抗体免疫複合体を投与すること、を含む、方法を提供する。一実施形態において、ＭＥＴの活性化はＭＥＴ遺伝子の増幅に起因する。一実施形態において、当該がんは扁平上皮癌、肺がん、頭頸部がん、またはＥＧＦＲ陽性がんである。
【００１２】
一実施形態においては、ＥＧＦＲ療法は、当該患者に対して、以前に奏功しなかったかまたは現在奏功していない。別の実施形態において、当該療法は、ＥＧＦＲ抗体またはＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の投与を含む。別の実施形態において、当該ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブまたはパニツムマブである。別の実施形態において、当該ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、エルロチニブまたはゲフィチニブである。
【００１３】
ある実施形態において、当該ＥＧＦＲ抗体免疫複合体は、１つまたは複数のＡＬＫ阻害剤耐性腫瘍細胞を含む、患者のがんの治療において有効である。一実施形態において、当該腫瘍細胞のうちの少なくとも１つは、ＥＭＬ４−ＡＬＫ転座を含む。別の実施形態において、当該腫瘍細胞は非小細胞肺腫瘍である。
【００１４】
一実施形態において、当該免疫複合体は、式（Ａ）−（Ｌ）−（Ｃ）の構造を有し、式中：（Ａ）はＥＧＦＲと特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり；（Ｌ）はリンカーであり；および（Ｃ）は細胞傷害性薬物であり；ならびに、当該リンカー（Ｌ）は（Ａ）と（Ｃ）を連結する。別の実施形態において、当該ＥＧＦＲ抗体は、配列番号１の重鎖可変領域および配列番号２または３の軽鎖可変領域を含む。別の実施形態において、当該リンカーは、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、親水性リンカー、およびジカルボン酸系リンカーから成る群から選択される。別の実施形態において、リンカーは切断不可能なリンカーである。別の実施形態において、当該リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエ−ト（ＳＰＰ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエ−ト（ＳＰＤＢ）またはＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエ−ト（スルホ−ＳＰＤＢ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）；Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホＳＭＣＣ）；Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨ−ドアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）；Ｎ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）；Ｎ−（β−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）；およびγ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）；から成る群から選択される。別の実施形態において、当該細胞傷害性薬物は、メイタンシノイド、メイタンシノイド類似体、ドキソルビシン、修飾ドキソルビシン、ベンゾジアゼピン、タキソイド、ＣＣ−１０６５、ＣＣ−１０６５類似体、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン類似体、カリチアマイシン、ドラスタチン、ドラスタチン類似体、アウリスタチン（ａｒｉｓｔａｔｉｎ）、トメイマイシン誘導体、およびレプトマイシン誘導体、または当該薬物のプロドラッグから成る群から選択される。別の実施形態において、当該細胞傷害性薬物はメイタンシノイドである。別の実施形態において、当該細胞傷害性薬物は、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）またはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である。別の実施形態において、当該ＥＧＦＲ抗体免疫複合体は、配列番号１の重鎖可変領域および配列番号２または３の軽鎖可変領域を含む抗体；当該リンカーＳＭＣＣ；および当該メイタンシノイドＤＭ１を含む。
【００１５】
一実施形態においては、当該抗体免疫複合体を、少なくとも１つの、追加の抗悪性腫瘍薬とともに投与する。別の実施形態においては、当該ＥＧＦＲ抗体免疫複合体を、当該抗悪性腫瘍薬と同時に投与する。別の実施形態においては、当該ＥＧＦＲ抗体免疫複合体および抗悪性腫瘍薬を、任意の時間的順序において投与する。別の実施形態において、当該患者はヒトである。
【００１６】
ある実施形態において、治療には、本発明のＥＧＦＲ免疫複合体および少なくとも１つの追加の標的療法の併用投与が含まれる。有用な標的療法の種類としては、限定されないが、例えば、（１）ＨＥＲ２阻害剤、（２）ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤または標的抗ＥＧＦＲ抗体）、（３）ＢＲＡＦ阻害剤、（４）ＡＬＫ阻害剤、（５）ホルモン受容体阻害剤、（６）ｍＴＯＲ阻害剤、（７）ＶＥＧＦ阻害剤、または（８）がんワクチンが挙げられる。チロシンキナーゼ阻害剤は、ＥＧＦＲに対して特異的であるかまたは多選択性であり得、ＥＧＦＲ以外の、またはＥＧＦＲに加えて、１つまたは複数のキナーゼの活性を阻害することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Ｌ８５８ＲおよびＴ７９０Ｍ  ＥＧＦＲ変異を有するＮＣＩ−Ｈ１９７５  ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞株に対する、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ裸抗体およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体の細胞傷害活性を表す折れ線グラフである。
【図２】５０ｎｇ／ｍＬの肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の存在または不存在下での、ＨＣＣ８２７  ＮＳＣＬＣ細胞株に対する、エルロチニブの細胞傷害活性を表す折れ線グラフである。
【図３】５０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦの不存在下（Ａ）または存在下（Ｂ）での、ＨＣＣ８２７  ＮＳＣＬＣ細胞株に対する、セツキシマブ、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ裸抗体およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体の細胞傷害活性を表す折れ線グラフである。
【図４】間葉系ＮＳＣＬＣ細胞株である、ＮＣＩ−Ｈ２２６に対する、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ裸抗体およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体の細胞傷害活性を表す折れ線グラフである。
【図５】エルロチニブ耐性ＨＣＣ８２７  ＮＳＣＬＣ細胞株の特徴付けを表す図である。（Ａ）親ＨＣＣ８２７細胞株およびエルロチニブ耐性ＨＣＣ８２７−ＥＲ細胞株に対する、エルロチニブの細胞傷害活性を表す折れ線グラフである。（Ｂ）親ＨＣＣ８２７細胞株およびエルロチニブ耐性ＨＣＣ８２７−ＥＲ細胞株の組織学的写真である。（Ｃ）親ＨＣＣ８２７細胞株およびエルロチニブ耐性ＨＣＣ８２７−ＥＲ細胞株のウェスタンブロット解析を示す図である。
【図６】親ＨＣＣ８２７細胞株およびエルロチニブ耐性ＨＣＣ８２７−ＥＲ細胞株におけるＥＧＦＲ、ＨＥＲ３およびＭＥＴの発現を表す、フローサイトメトリーのヒストグラムである。
【図７】親ＨＣＣ８２７細胞株、エルロチニブ耐性ＨＣＣ８２７−ＥＲおよびＨＣＣ８２７−ＥＲ−Ｅ４細胞株に対する、エルロチニブの細胞傷害活性を表す折れ線グラフである。
【図８】指示された用量での、エルロチニブによる１６時間の治療後の、親ＨＣＣ８２７細胞株およびエルロチニブ耐性ＨＣＣ８２７−ＥＲ−Ｅ４細胞株のウェスタンブロット解析を示す図である。
【図９】親ＨＣＣ８２７細胞株およびエルロチニブ耐性ＨＣＣ８２７−ＥＲ−Ｅ４細胞株に対する、セツキシマブ、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ裸抗体およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体の細胞傷害活性を表す折れ線グラフである。
【図１０】Ｇ１２Ｖ  ＫＲＡＳ変異を有するＳＷ６２０結腸直腸腺癌細胞株に対する、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体の細胞傷害活性を表す折れ線グラフである。
【図１１】Ｈ１０４７Ｒ  ＰＩＫ３ＣＡ変異を有するＤｅｔｒｏｉｔ５６２頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）細胞株に対する、セツキシマブ、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ裸抗体およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体の細胞傷害活性を表す折れ線グラフである。
【図１２】親ＨＣＣ８２７細胞（Ａ）、エルロチニブ耐性ＨＣＣ８２７  ＥＲ細胞（Ｂ）およびＨＣＣ８２７  ＥＰＲ細胞（Ｃ）に対する、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体、ｃｈＫＴＩ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体、セツキシマブ、およびエルロチニブの細胞傷害活性を表す図である。
【図１３】ＥＭＬ４−ＡＬＫ遺伝子転座を有するＨ２２２８  ＮＳＣＬＣ腺癌細胞株に対する、クリゾチニブおよびエルロチニブの細胞傷害活性（Ａ）；ならびにｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体、ｃｈＫＴＩ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体、およびセツキシマブの細胞傷害活性（Ｂ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、ＥＧＦＲ抗体複合体が、非結合ＥＧＦＲ抗体および／またはＡＬＫ阻害剤を含むＥＧＦＲ療法に対して耐性である腫瘍細胞の治療において有用であるという発見に関する。より詳細には、ＥＧＦＲ経路に駆動される腫瘍細胞の増殖を阻害する能力を有するが、皮膚ケラチノサイトなどの、ＥＧＦＲを発現している正常細胞には限定された作用しか有さない、ＥＧＦＲ抗体を含む抗体薬物複合体が、ＥＧＦＲ療法耐性腫瘍に対して有効であることが示された。重要なことに、ＥＧＦＲ抗体成分単独では、他のＥＧＦＲ阻害剤と同様、ＥＧＦＲ標的療法耐性腫瘍細胞に対して有効ではない。しかしながら、メイタンシノイドの負荷量（ｐａｙｌｏａｄ）と結合すると、複合体は驚くべきことに、ＥＧＦＲ阻害剤に対する多様な耐性機序を有する腫瘍細胞に対して、強固な活性を示す。
【００１９】
Ｉ．定義
本発明の理解を助けるために、いくつかの用語および表現を以下に定義する。
【００２０】
「上皮成長因子受容体」または「ＥＧＦＲ」は、チロシンキナーゼ細胞表面受容体である。「可溶性ＥＧＦＲ」または「ｓＥＧＦＲ」という用語は、ＥＧＦＲの細胞外リガンド結合ドメインを含む、ＥＧＦＲの一部を指す。より詳細には、ｓＥＧＦＲは、成熟型ＥＧＦＲのアミノ酸１〜６１９を含む（Ｕｌｌｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ａｂｅｒｒａｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ａ−４３１  Ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｎａｔｕｒｅ，  Ｖｏｌ．  ３０９，  ４１８−２５  （１９８６））。本明細書において使用される場合「上皮成長因子受容体」または「ＥＧＦＲ」は、野生型または完全長ＥＧＦＲだけでなく、ＥＧＦＲのすべての変異型をも包含することが意図され、それらのうちのいくつかの形態を、以下、本明細書において記載する。
【００２１】
「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」とは、エクソン２〜７が欠失し、その結果ＥＧＦＲの細胞外ドメインにおいてアミノ酸２６７のインフレーム欠失が生じているＥＧＦＲの変異体を意味する。ＥＧＦＲｖＩＩＩはまた、ＩＩＩ型変異体、デルタ−ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｄｅ２−７、およびΔＥＧＦＲとしても知られ、米国特許第６，４５５，４９８号、同第６，１２７，１２６号、同第５，９８１，７２５号、同第５，８１４，３１７号、同第５，７１０，０１０号、同第５，４０１，８２８号、および同第５，２１２，２９０号に記載されている。
【００２２】
「欠失ＥＧＦＲ変異体」とは、細胞外ドメインの一部が欠失しており、ＥＧＦＲシグナル伝達が少なくとも部分的にリガンド非依存性になっている、ＥＧＦＲの欠失変異体を意味する。
【００２３】
「ＡＬＫ阻害剤」とは、例えばＥＭＬ４−ＡＬＫ転座などの、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）の変異を有する腫瘍に作用する、抗癌剤を意味する。ＥＭＬ４−ＡＬＫ転座は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ陽性がんをもたらす。ＥＭＬ４−ＡＬＫ陽性がんは、棘皮動物微小管結合タンパク質様４（ＥＭＬ４）遺伝子がＡＬＫ遺伝子と融合している特徴的な異常なＤＮＡ配置を、細胞が含む、原発性悪性腫瘍を指す。この異常な遺伝子融合体は、多くの場合、がん細胞の悪性挙動を促進および維持すると考えられる、タンパク質（ＥＭＬ４−ＡＬＫ）の産生をもたらす。
【００２４】
「Ｋ−ｒａｓ変異体」という用語は、野生型Ｋ−ｒａｓ（またはそのようなＫ−ｒａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列）と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を含むＫ−ｒａｓタンパク質を指す。Ｋ−ｒａｓ変異体は、限定されないが、対立遺伝子変異型、スプライス変異型、置換変異型、欠失変異型、および挿入変異型を含み得る。「Ｋ−ｒａｓ変異」という用語は、野生型配列（またはそのようなＫ−ｒａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列）と比較した、Ｋ−ｒａｓタンパク質の配列における少なくとも１つのアミノ酸変異を指す。「Ｋ−ｒａｓ変異型腫瘍」または「Ｋ−ｒａｓ変異を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）（または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ））腫瘍」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、タンパク質またはヌクレオチドレベルのいずれかにおいてＫ−ｒａｓ変異を検出し得る、腫瘍細胞集団を指す。本明細書で使用される「Ｋ−ｒａｓ変異を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）（または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ））がん」という用語は、タンパク質またはヌクレオチドレベルのいずれかにおいてＫ−ｒａｓ変異を検出し得る、がん細胞集団を指す。Ｋ−ｒａｓは、ＥＧＦＲ変異と同様に、限定されないが以下を含む、当業者に公知の技術および方法により検出することができる：ＰＣＲベースのアッセイ（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応−制限断片長多型（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）解析、ポリメラーゼ連鎖反応−一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ）解析、リアルタイムＰＣＲ解析、ＰＣＲ塩基配列決定法、変異アレル特異的ＰＣＲ増幅（ＭＡＳＡ）法など）、直接塩基配列決定法、プライマー伸長反応、電気泳動、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、ＴａｑＭａｎアッセイ、ＳＮＰ遺伝子型解析、高解像度メルティング分析（ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ａｓｓａｙ）およびマイクロアレイ解析。
【００２５】
「活性化変異」という用語は、例えば、Ｋ−ｒａｓなどのタンパク質の恒常的活性化、およびシグナル伝達経路の恒常的活性化をもたらす変異を指す。いくつかの実施形態において、活性化変異を含むＫ−ｒａｓタンパク質は、限定されないが、ＭＡＰキナーゼカスケードおよびＰＩ３キナーゼカスケードを含む、いくつかの経路の恒常的な活性を惹起する。いくつかの実施形態において、Ｋ−ｒａｓ変異体およびシグナル伝達経路による恒常的な活性は、細胞増殖の調節解除、分化障害、アポトーシスの減少および細胞生存の延長を含む、悪性の表現型のいくつかの態様に顕著に寄与する。
【００２６】
「ＥＧＦＲに媒介されるがん」という表現は、ＥＧＦＲが、正常な、対応する上皮組織より高いレベルにまで異常に活性化している上皮腫瘍を特徴とするがんを指す。これらのより高いＥＧＦＲ活性は、多くの種類のがんにおいて腫瘍の増殖を促進する。このようながんには、限定されないが、非小細胞肺がん、乳がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、前立腺がんおよび多形神経膠芽腫が含まれる。ＥＧＦＲの異常な活性化は、受容体の過剰発現、遺伝子増幅、活性化変異、受容体リガンドの過剰発現、および／またはＥＧＦＲ活性の制御因子の喪失に起因し得る。
【００２７】
「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介して、標的、例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または前述のものの組み合わせ等を認識し、かつそれに特異的に結合する、免疫グロブリン分子を指す。本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、抗体が所望の生物活性を示す限り、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、抗体断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）変異体、例えば少なくとも２つのインタクトな抗体から生成された二重特異性抗体などの多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、ならびに抗原認識部位を含むいかなる他の修飾された免疫グロブリン分子をも包含する。抗体は、それらの重鎖定常ドメイン（それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる）の識別に基づいて、５つの主要なクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、またはそのサブクラス（アイソタイプ）（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のうちのいずれかであり得る。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる、かつ公知のサブユニット構造および３次元構造を有する。抗体は裸抗体であり得、または、毒素、放射性同位体などの他の分子との複合体であり得る。
【００２８】
「遮断」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原、例えばＥＧＦＲなどの生物活性を阻害するかまたは減少させる抗体である。いくつかの実施形態において、遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、実質的にまたは完全に抗原の生物活性を阻害する。生物活性は、１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％低下させることができ、または１００％低下させることさえできる。
【００２９】
本明細書において抗体に関して使用される「ＥＧＦＲ活性化を阻害する能力」という表現は、ＥＧＦＲとの結合により、ヒトＥＧＦＲ活性化の阻害および受容体の活性化の際に生じるヒトＥＧＦＲの生物活性の阻害をもたらす、抗体を指すことを意図する。細胞増殖アッセイ、アポトーシスアッセイ、受容体結合アッセイ、受容体リン酸化アッセイ、またはマウス腫瘍モデルのいずれかを使用して測定される、１つまたは複数のＥＧＦＲ生物活性の指標を測定することにより、ＥＧＦＲ活性化を阻害する抗体の能力を評価することができる。
【００３０】
「抗ＥＧＦＲ抗体」または「ＥＧＦＲと結合する抗体」という用語は、ＥＧＦＲを標的とする上で、診断薬および／または治療薬として抗体が有用であるような、十分な親和性でＥＧＦＲと結合することができる抗体を指す。いくつかの抗ＥＧＦＲ抗体が当技術分野で公知である。例えば、セツキシマブ（抗体２２５）および抗体５２８Ａｂは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９４３，５３３号に記載されている。
【００３１】
抗ＥＧＦＲ抗体が無関連な非ＥＧＦＲタンパク質と結合する程度は、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）等による測定で、抗体とＥＧＦＲとの結合の約１０％未満であり得る。ある実施形態において、ＥＧＦＲと結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。他の実施形態において、この抗体は、約１００ｎＭ〜約０．１ｎＭ、約１０ｎＭ〜約０．１ｎＭ、または約１ｎＭ〜約０．１ｎＭの解離定数で、ＥＧＦＲと結合する。
【００３２】
「抗体断片」という用語はインタクトな抗体の一部を指し、およびインタクトな抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、線状抗体、単鎖抗体、ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【００３３】
「モノクローナル抗体」は、単一の抗原決定基またはエピトープの、特異性の高い認識および結合に関わる、均一な抗体集団を指す。これは、一般的に、異なる抗原決定基に対する異なる抗体を含む、ポリクローナル抗体と対照的である。「モノクローナル抗体」という用語は、インタクトなおよび完全長のモノクローナル抗体の双方、ならびに抗体断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２，Ｆｖ）、単鎖（ｓｃＦｖ）変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含むいかなる他の修飾された免疫グロブリン分子をも包含する。さらに、「モノクローナル抗体」は、限定されないが、ハイブリドーマ、ファージの選択、組換え発現、およびトランスジェニック動物によるものを含む、いくつもの方法によって作成された、そのような抗体を指す。
【００３４】
「ヒト化抗体」という用語は、最小限の非ヒト（例えば、ネズミの）配列を含む、特異的な免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、またはそれらの断片である、非ヒト（例えばネズミの）抗体の形態を指す。一般的に、ヒト化抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種（例えばマウス、ラット、ウサギ、ハムスターなど）のＣＤＲ由来の残基により置換されている、ヒト免疫グロブリンである（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１：５２２−５２５；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３２：３２３−３２７；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３９：１５３４−１５３６）。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種由来の抗体の対応する残基で置換されている。抗体の特異性、親和性、および／または能力を改良および最適化するために、Ｆｖフレームワーク領域および／または置換された非ヒト残基内のどちらかにおける追加の残基の置換により、ヒト化抗体をさらに修飾することができる。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するすべてまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域を含む、少なくとも１つ、典型的には２つまたは３つの可変領域の、実質的にすべてを含み、一方、すべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、一般的にはヒト免疫グロブリンのものである、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部を含み得る。ヒト化抗体を生成するために使用される方法の例は、米国特許第５，２２５，５３９号に記載されている。
【００３５】
抗体の「可変領域」は、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を、単独または組み合わせのいずれかで指す。重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ、超可変領域としても知られる、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結された、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）から成る。各鎖のＣＤＲは、ＦＲにより近接して連結されており、他の鎖由来のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定するための、以下の少なくとも２つの技術：（１）異種間の配列多様性に基づく手法（すなわち、  Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  （５ｔｈ  ｅｄ．，  １９９１，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．））；および（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づく手法（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ  （１９９７）  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２７３：９２７−９４８））が存在する。さらに、ＣＤＲを決定するために、時にはこれらの２つの手法の組み合わせが、当技術分野において使用される。
【００３６】
可変領域の残基（およそ、軽鎖の残基１〜１０７および重鎖の残基１〜１１３）を指す場合、Ｋａｂａｔ付番方式が一般的に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  （１９９１））。
【００３７】
「ヒト抗体」という用語は、ヒトにより産生された抗体、または当技術分野で公知のいずれかの技術を使用して作成された、ヒトにより産生された抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体のこの定義には、インタクトなもしくは完全長の抗体、その断片、ならびに／または少なくとも１つのヒト重鎖および／もしくは軽鎖ポリペプチドを含む抗体、例えば、ネズミ軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体が含まれる。
【００３８】
「キメラ抗体」という用語は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が、２つ以上の種に由来する抗体を指す。一般的に、その種において免疫応答を誘発することを避けるために、軽鎖および重鎖双方の可変領域は、所望の特異性、親和性、および能力を有する哺乳類（例えばマウス、ラット、ウサギなど）のうちの１種由来の抗体の可変領域に対応し、一方、定常領域は、別の種（通常はヒト）由来の抗体の配列と相同である。
【００３９】
「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、特定の抗体により認識されかつ特異的に結合され得る抗原の部分を指す。抗原がポリペプチドの場合、エピトープは、隣接アミノ酸、およびタンパク質の３次折り畳みにより並置された非隣接アミノ酸の双方から形成され得る。隣接アミノ酸から形成されたエピトープは、一般的にタンパク質が変性しても保持されるが、３次折り畳みにより形成されたエピトープは、一般的にタンパク質が変性すると失われる。エピトープは、独自の空間構造中に、一般的には少なくとも３個、より一般的には、少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を含む。
【００４０】
「結合親和性」は、一般的に、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）間の、非共有結合的な相互作用の総計の強度を指す。別途指示がない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体および抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する、固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当技術分野で公知の通常の方法により測定することができる。低親和性抗体は通常、抗原とゆっくり結合し、すぐに解離する傾向があるが、高親和性抗体は通常、抗原とより速く結合し、より長く結合を維持する傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法が当技術分野で公知であり、それらのうちのいずれをも、本発明の目的のために使用することができる。具体的な例となる実施形態を、以下に記載する。
【００４１】
結合親和性を指すために本明細書で使用される場合、「またはそれより良好な」とは、分子およびその結合パートナー間のより強力な結合を指す。本明細書で使用される場合、「またはそれより良好な」は、より小さいＫｄの数値により表される、より強力な結合を指す。例えば、抗原に対して「０．６ｎＭまたはそれより良好な」親和性を有する抗体について、該抗体の該抗原に対する親和性は、０．６ｎＭ未満、すなわち０．５９ｎＭ、０．５８ｎＭ、０．５７ｎＭ等、または０．６ｎＭ未満のあらゆる値である。
【００４２】
「特異的に結合する」とは、一般に、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープと結合すること、および該結合が抗原結合ドメインおよびエピトープ間のいくらかの相補性を必要とすることを指す。この定義によれば、抗体が、無作為の非関連エピトープと結合するであろうよりもより容易に、その抗原結合ドメインを介してエピトープと結合する場合、抗体はそのエピトープと「特異的に結合する」と言う。「特異性」という用語は、ある抗体があるエピトープに結合する相対的な親和性を説明するために、本明細書において使用される。例えば、抗体「Ａ」は、所与のエピトープに対して、抗体「Ｂ」よりもより高い特異性を有するとみなすことができ、または抗体「Ａ」は、関連するエピトープ「Ｄ」に対してよりもより高い特異性で、エピトープ「Ｃ」と結合する、と言うことができる。
【００４３】
「優先的に結合する」とは、抗体が、関連する、同様の、相同の、または類似するエピトープと結合するであろうよりもより容易に、あるエピトープと特異的に結合することを意味する。このように、所与のエピトープと「優先的に結合する」抗体は、そのような抗体が関連エピトープと交差反応し得るにもかかわらず、関連エピトープよりもそのエピトープと結合する可能性が高い。
【００４４】
抗体が、エピトープに対する参照抗体の結合をある程度遮断する程度まで、そのエピトープと優先的に結合する場合、抗体は、参照抗体の所与のエピトープとの結合を「競合的に阻害する」と言う。競合阻害は、例えば競合ＥＬＩＳＡアッセイなどの、当技術分野で公知のいかなる方法によっても測定することができる。抗体は、所与のエピトープとの参照抗体の結合を、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、競合的に阻害すると言うことができる。
【００４５】
本明細書で使用される「実質的に同様」または「実質的に同一」という表現は、当業者が、当該値（例えば、Ｋｄ値）により測定される生物学的特徴の脈絡において、２つの値間の差異に、生物学的および／または統計的有意性がほとんどまたは全くないと考えるような、２つの数値（一般的に１つは本発明の抗体に関連し、および他方は参照／対照抗体と関連する）間の十分に高い程度の類似性を表す。当該２つの値間の差異は、参照／対照抗体に対する値の関数として、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、または約１０％未満であり得る。２つの「実質的に同様な結合親和性」間の差異は、参照／対照抗体に対する値の関数として、一般的に約１０％未満である。
【００４６】
本明細書で使用される「リガンド非依存性結合」は、ＥＧＦＲとのリガンドの相互作用の不存在下で、ヒトＥＧＦＲ上のエピトープと結合する、ＥＧＦＲ結合剤の能力を表す。
【００４７】
「単離された」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、自然界には存在しない形態である、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、もはやそれらが自然界に存在する形態ではない程度まで精製されたものを含む。いくつかの実施形態において、単離された抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、実質的に純粋である。
【００４８】
本明細書において使用される場合、「実質的に純粋」とは、少なくとも５０％純粋（すなわち、混入物を含まない）、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％純粋、または少なくとも９９％純粋である材料を指す。
【００４９】
本明細書で使用される「免疫複合体」または「複合体」という用語は、細胞結合剤（すなわち、抗ＥＧＦＲ抗体またはその断片）に連結された化合物またはその誘導体を指し、および一般式：Ｃ−Ｌ−Ａにより定義され、式中、Ｃ＝細胞毒素、Ｌ＝リンカー、およびＡ＝細胞結合剤または抗ＥＧＦＲ抗体または抗体断片である。免疫複合体は、逆の順番の一般式：Ａ−Ｌ−Ｃによっても、定義され得る。
【００５０】
「リンカー」は、化合物、通常はメイタンシノイドなどの薬物を、抗ＥＧＦＲ抗体またはその断片などの細胞結合剤と、安定な共有結合の様式で連結することができる、あらゆる化学的部分である。リンカーは、化合物または抗体が活性を維持する条件下で、酸誘発性の切断、光誘発性の切断、ペプチダーゼ誘発性の切断、エステラーゼ誘発性の切断、およびジスルフィド結合切断に対して、感受性であるかまたは実質的に耐性であり得る。好適なリンカーは当技術分野で公知であり、例えば、ジスルフィド基、チオエ−テル基、酸不安定基、感光性基、ペプチダーゼ不安定基およびエステラーゼ不安定基を含む。リンカーはまた、本明細書に記載され、かつ当技術分野で公知の、荷電したリンカー、およびその親水性形態をも含む。
【００５１】
「がん」および「がん性の」という用語は、細胞の集団が未制御の細胞増殖により特徴付けられる、哺乳類における生理的な状態を指すかまたは説明する。がんの例としては、限定されないが、癌種、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられる。「腫瘍」および「新生物」は、良性（非がん性の）または前がん性の病変を含む悪性（がん性の）いずれかの、過剰な細胞の成長または増殖により生じる１つまたは複数の細胞を指す。治療および／または予防し得る「がん」または「腫瘍形成性」疾患の例としては、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部領域、および泌尿生殖器系の新生物が挙げられる。
【００５２】
「がん細胞」、「腫瘍細胞」という用語および文法的等価物は、腫瘍細胞集団の大部分を含む非腫瘍形成性細胞、および腫瘍形成性幹細胞（がん幹細胞）の双方を含む、腫瘍または前がん性病変由来の細胞の全集団を指す。本明細書において使用される「腫瘍細胞」という用語は、それらの腫瘍細胞をがん幹細胞と区別するために、再生および分化する能力を欠く腫瘍細胞のみを指す場合、「非腫瘍形成性の」という用語により修飾される。
【００５３】
「対象」という用語は、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類等を含む、特定の治療の受容者となるあらゆる動物（例えば、哺乳動物）を指す。一般的に、「対象」および「患者」という用語は、ヒト対象に関して、本明細書において互換可能に使用される。
【００５４】
１つまたは複数の追加の治療薬「との組み合わせで」の投与には、同時（併用）投与およびあらゆる順序での連続的投与が含まれる。
【００５５】
「医薬製剤」という用語は、有効成分の生物活性を有効にし得るような形態であり、かつ製剤を投与する対象に対して許容できない毒性を有する付加的な成分を含まない、製剤を指す。製剤は無菌であり得る。
【００５６】
本明細書に開示される抗体の「有効量」は、具体的に定められた目的を達成するために十分な量である。「有効量」は、定められた目的に関して、経験的に、かつ通例の方法で決定することができる。
【００５７】
「治療的有効量」という用語は、対象または哺乳動物において疾患または障害を「治療する」ために有効な、抗体または他の薬物の量を指す。がんの場合には、治療的有効量の薬物は、がん細胞の数を減少させ；腫瘍サイズを減少させ；がん細胞の周辺器官への浸潤を阻害し（すなわち、ある程度遅延または停止させ）；腫瘍転移を阻害し（すなわち、ある程度遅延または停止させ）；腫瘍増殖をある程度阻害し；および／またはがんに付随する症状のうちの１つまたは複数をある程度軽減することができる。本明細書の、「治療すること」の定義を参照のこと。薬物が、現存するがん細胞の増殖を予防および／または現存するがん細胞を殺傷し得る範囲において、薬物は細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性であり得る。「予防的有効量」は、必要とされる用量および期間において、所望の予防的結果を達成するために有効な量を指す。必ずしもというわけではないが、一般的に、予防的用量は、疾患前または疾患早期に、対象において使用されるため、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。
【００５８】
「標識」という用語は、本明細書で使用される場合、「標識された」抗体を生成するように、直接または間接的に抗体と結合した、検出可能な化合物または組成物を指す。標識はそれ自体が検出可能であり（例えば放射性同位元素標識もしくは蛍光標識）、または酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物または組成物の化学的改変を触媒することができる。
【００５９】
「化学療法薬」は、作用機序にかかわらず、がんの治療において有用な化学的化合物である。
【００６０】
「治療すること」もしくは「治療」もしくは「治療する」または「緩和すること」もしくは「緩和する」等の用語は、診断された病的状態または障害の症状を治癒、遅延、減少させ、および／または進行を停止させる、治療的手段を指す。従って、治療を必要とするものには、すでに障害を有するもの；障害を有する可能性があるもの；およびその障害を予防しようするものが含まれる。ある実施形態において、患者が以下のうちの１つまたは複数を示している場合、対象のがんは、本発明の方法により首尾よく「治療される」：がん細胞の数の減少またはがん細胞の完全な不存在；腫瘍サイズの減少；例えば、軟組織および骨へのがんの拡散を含む、周辺器官へのがん細胞浸潤の阻害もしくは不存在；腫瘍転移の阻害もしくは不存在；腫瘍増殖の阻害もしくは不存在；特定のがんに付随する１つまたは複数の症状の軽減；罹患率および死亡率の減少；生活の質の改善；腫瘍の腫瘍原性、腫瘍形成頻度、もしくは腫瘍形成能の減少；腫瘍におけるがん幹細胞の数もしくは発生頻度の減少；腫瘍形成性細胞の非腫瘍形成性状態への分化；または作用のいくつかの組み合わせ。
【００６１】
本明細書で使用される「実質的に非応答性の」という表現は、治療薬の投与後に、安定した増殖または増殖の増加を示す腫瘍またはがんを指す。該表現は、治療薬の投与後に、安定な疾患または進行性疾患を示す患者を指し得る。該表現は、治療薬による治療に耐性である腫瘍またはがんを指す場合に使用し得る。本明細書で使用される「ＥＧＦＲ阻害剤に対して実質的に非応答性の」という表現は、ＥＧＦＲ阻害剤の投与後に、安定した増殖または増加した増殖を示す腫瘍またはがんを指す。いくつかの実施形態においては、ＥＧＦＲ阻害剤を、治療を必要とする患者に投与し、およびＥＧＦＲ阻害剤に対して「実質的に非応答性」であることには、以下が含まれる：がん細胞の数またはがん細胞の継続した増殖に減少が無いこと；腫瘍サイズの減少がないこと；腫瘍サイズの増加；例えば、軟組織および骨へのがんの拡散を含む、周辺器官へのがん細胞浸潤の阻害が見られないこともしくはがん細胞浸潤の継続；腫瘍転移の阻害がみられないこともしくは腫瘍転移の継続；腫瘍増殖の阻害が見られないこともしくは増殖の継続；特定のがんに付随する１つまたは複数の症状の軽減が全くないかもしくはわずかしかないこと；腫瘍の腫瘍原性、腫瘍形成頻度、もしくは腫瘍形成能に全く減少がないかまたはわずかしかないこと；腫瘍におけるがん幹細胞の数もしくは発生頻度に減少が全くないかもしくはわずかしかないこと；または作用のいくつかの組み合わせ。
【００６２】
本明細書において使用される場合、治療に対して「難治性の」疾患は、最初から非応答性であるか、時間とともに非応答性となるか（例えば、３か月以内に（すなわち、疾患の進行が治療開始後３か月もしくはそれ以内に観察される））、または治療の停止後まもなく再発するものである。いくつかの実施形態において、治療に対して「難治性」のがんは、治療に応答しないがんである。
【００６３】
本明細書において使用される場合、治療に対して「耐性の」疾患は、治療に対して非応答性の疾患である。一実施形態において、がんは、治療開始時に耐性であるか、または治療の間に耐性となり得る。ある実施形態において、「難治性の」がんはまた、「耐性の」がんとも呼ばれる。
【００６４】
本開示および特許請求の範囲において使用される、単数形態「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈により別途明確に指示されない限り、複数の形態も含まれる。
【００６５】
本明細書において、「を含む」をいう表現を伴って実施形態が記載される場合はいつも、「からなる」および／または「本質的に、から成る」という表現で説明される、別の類似した実施形態もまた提供されるということが理解される。
【００６６】
本明細書における「Ａおよび／またはＢ」などの表現において使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」、ならびに「Ｂ」の両方を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」等の表現において使用される「および／または」という用語は、以下の実施形態の各々を包含することが意図される：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
【００６７】
ＩＩ．ＥＧＦＲ抗体
ＥＧＦＲと特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片（すなわち「ＥＧＦＲ抗体」）を使用して、本発明において有用なＥＧＦＲ免疫複合体を生成することができる。本発明には、ＥＧＦＲ抗体、またはそのＥＧＦＲ結合断片、部分、もしくは他の抗原結合形態のうちのあらゆる種類の使用が含まれる。これらには、例えば、限定されないが、種々の形態の抗体およびその断片、例えばポリクローナルもしくはモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片；キメラ抗体、霊長類化抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体もしくはその抗原結合性断片；または抗体のエピトープ結合性断片、例えば単鎖、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２が含まれる（Ｐａｒｈａｍ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３１：２８９５−２９０２  （１９８３）；  Ｓｐｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１３：４７０−４７８  （１９７４）；  Ｎｉｓｏｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ８９：２３０−２４４  （１９６０））。
【００６８】
ＥＧＦＲ免疫複合体を生成するために特に有用なＥＧＦＲ抗体は、同時係属中の米国特許出願公開第２０１２／０１５６２１７号に記載されている。１つのそのような抗体、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒは、配列番号１の重鎖可変領域および配列番号２または３の軽鎖可変領域を含むヒト化抗体である。
【００６９】
【数１】
2014533954.tif 000002
【００７０】
他のＥＧＦＲ抗体は、当技術分野において公知である。これらの抗体には、ネシツムマブ、セツキシマブ（ｃｅｔｉｘｕｍａｂ）、パニツムマブ、ニモツズマブ、ザルツムマブ、モノクローナル抗体８０６が含まれる（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２００７；１１７（２）：３４６−３５２）。
【００７１】
ＩＩＩ．ＥＧＦＲ免疫複合体
本発明はまた、薬物またはプロドラッグと連結されるかまたは結合した、本明細書に開示される抗ＥＧＦＲ抗体、抗体断片、およびそれらの機能的等価物を含む、複合体（本明細書において免疫複合体とも呼ばれる）に関する。好適な薬物またはプロドラッグは、当技術分野で公知である。薬物またはプロドラッグは、細胞傷害性薬物であり得る。本発明の細胞毒複合体において使用される細胞傷害性薬物は、細胞の死をもたらすか、または細胞死を誘発するか、または何らかの様式で細胞生存能を減少させる、あらゆる化合物であり得、例えば、メイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体などを含む。他の好適な細胞傷害性薬物は、例えばベンゾジアゼピン、タキソイド、ＣＣ−１０６５およびＣＣ−１０６５類似体、デュオカルマイシンおよびデュオカルマイシン類似体、例えばカリチアマイシンなどのエンジイン、アウリスタチンを含むドラスタチンおよびドラスタチン類似体、トメイマイシン誘導体、レプトマイシン誘導体、メトトレキサート、シスプラチン、カルボプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシルおよびモルフォリノドキソルビシンである。
【００７２】
薬物またはプロドラッグを抗体または機能的等価物と連結するために、連結基を使用することにより、免疫複合体を作製することができる。好適な連結基は当技術分野で公知であり、例えば、ジスルフィド基、チオエ−テル基、酸不安定基、感光性基、ペプチダーゼ不安定基およびエステラーゼ不安定基を含む。
【００７３】
薬物またはプロドラッグを、例えば、抗ＥＧＦＲ抗体またはその断片に、ジスルフィド結合を介して連結することができる。リンカー分子または架橋剤は、抗ＥＧＦＲ抗体またはその断片と反応し得る反応性化学基を含む。細胞結合剤との反応のための反応性化学基は、Ｎ−スクシンイミジルエステルおよびＮ−スルホスクシンイミジルエステルであり得る。さらにリンカー分子は、薬物と反応してジスルフィド結合を形成し得るジチオピリジル基であり得る、反応性化学基を含む。リンカー分子には、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（例えば、Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  １７３：  ７２３−７３７  （１９７８）を参照のこと）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエ−ト（ＳＰＤＢ）（例えば、米国特許第４，５６３，３０４号を参照のこと）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホブタノエ−ト（スルホ−ＳＰＤＢ）（米国特許出願公開第２００９／０２７４７１３号を参照のこと）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエ−ト（ＳＰＰ）（例えば、ＣＡＳ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ番号３４１４９８−０８−６を参照のこと）、２−イミノチオラン、またはアセチルコハク酸無水物が含まれる。例えば、抗体または細胞結合剤を架橋試薬により修飾することができ、こうして誘導された、遊離または保護チオール基を含む抗体または細胞結合剤を、次いでジスルフィドまたはチオール含有メイタンシノイドと反応させて複合体を得る。複合体は、限定されないが、ＨＰＬＣ、サイズ排除、吸着、イオン交換および親和性捕捉、透析またはタンジェント流ろ過を含むクロマトグラフィーにより、精製することができる。
【００７４】
本発明の別の態様において、抗ＥＧＦＲ抗体は、免疫複合体の作用強度、溶解度または有効性を強化する上で、ジスルフィド結合およびポリエチレングリコールスペーサーを介して、細胞傷害性薬物に連結されている。そのような切断可能な親水性リンカーは、国際公開第２００９／１３４９７６号および同第２００３／０６８１４４号に記載されている。このリンカー設計の付加的な利益は、抗体−薬物複合体の、所望の高い単量体比率および最小の凝集である。この態様において具体的に意図されるのは、ポリエチレングリコールスペーサー（（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ＝１−１４）を有し、薬物負荷が２〜８の狭い範囲である、ジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）により連結された細胞結合剤および薬物の複合体である。これらの複合体は、がん細胞に対する比較的高い強力な生物活性を示し、最小のタンパク質凝集で、高い結合収率（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｙｉｅｌｄ）および高い単量体比率という、所望の生化学的性質を有する。
【００７５】
本態様において具体的に考慮されるのは、式（Ｉ）：
ＣＢ−［Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ−）ｎ−Ｙ−Ｄ］ｍ  （Ｉ）
で表される抗ＥＧＦＲ抗体薬物複合体、または式（Ｉ’）：
［Ｄ−Ｙ−（−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ−）ｎ−Ｘｌ］ｍ−ＣＢ  （Ｉ’）
で表される複合体であり、
式中：
ＣＢは抗ＥＧＦＲ抗体または断片を表し；
Ｄは薬物を表し；
Ｘは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤と結合した、脂肪族、芳香族、または複素環単位を表し；
Ｙはジスルフィド結合を介して薬物と結合した、脂肪族、芳香族または複素環単位を表し；
ｌは０または１であり；
ｍは２〜８の整数であり；および
ｎは１〜２４の整数である。いくつかの実施形態において、ｍは２〜６の整数である。いくつかの実施形態において、ｍは３〜５の整数である。いくつかの実施形態において、ｎは２〜８の整数である。
【００７６】
あるいは、例えば、米国特許第６，４４１，１６３号および同第７，３６８，５６５号に開示される通り、薬物をまず修飾して、細胞結合剤と反応させるのに好適な反応性エステルを導入することもできる。活性化されたリンカー部分を含むこれらの薬物と細胞結合剤の反応は、細胞結合剤薬物複合体を生成するための別の方法を提供する。メイタンシノイドを、例えば米国特許第６，７１６，８２１号に記載される通り、ＰＥＧ連結基を使用して、抗ＥＧＦＲ抗体または断片と連結することもできる。これらの切断不可能なＰＥＧ連結基は、水および非水性溶媒の双方に可溶性であり、１つまたは複数の細胞傷害性薬物を細胞結合剤に連結するために使用することができる。例示的なＰＥＧ連結基には、一端では官能性スルフヒドリルまたはジスルフィド基、別の一端では活性エステルを介して、リンカーの両端で細胞傷害性薬物および細胞結合剤と反応する、ヘテロ二官能性ＰＥＧリンカーが含まれる。ＰＥＧ連結基を使用する細胞毒複合体合成の一般的な例としては、参照により本明細書にその全体が組み込まれる、米国特許第６，７１６，８２１号を再度参照する。合成は、反応性ＰＥＧ部分を有する１つまたは複数の細胞傷害性薬物と細胞結合剤との反応により始まり、結果として、各反応性ＰＥＧ部分の末端活性エステルの、細胞結合剤のアミノ酸残基による置換が生じ、ＰＥＧ連結基を介して細胞結合剤と共有結合した１つまたは複数の細胞傷害性薬物を含む、細胞毒複合体が得られる。あるいは、細胞結合を、二官能性ＰＥＧ架橋剤により修飾して、反応性ジスルフィド部分（例えばピリジルジスルフィド）を導入し、それを次いでチオール含有メイタンシノイドで処理して複合体を得ることができる。別の方法においては、細胞結合を二官能性ＰＥＧ架橋剤により修飾してチオール部分を導入し、それを次いで反応性ジスルフィド含有メイタンシノイド（例えばピリジルジスルフィド）で処理して、複合体を得ることができる。
【００７７】
切断不可能なリンカーを有する抗体−メイタンシノイド複合体を作製することもできる。このような架橋剤は、当技術分野で説明されており（米国特許出願公開第２００５／０１６９９３３号を参照のこと）、限定されないが、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−（β−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）；およびγ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）を含む。いくつかの実施形態においては、文献に記載される通り、架橋試薬、例えばスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホ−ＳＭＣＣ、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スルホ−ＭＢＳまたはスクシンイミジル−ヨードアセテートで、抗体を修飾して、１〜１０個の反応性基を導入する（Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １０１：３９５−３９９  （１９７９）；  Ｈａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ５６−６３  （１９８４）；  および  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １８：６９０−６９７  （１９７９））。次いで修飾された抗体をチオール含有メイタンシノイド誘導体と反応させて、複合体を得る。複合体を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムによるゲルろ過により、または透析もしくはタンジェント流ろ過により、精製することができる。修飾された抗体を、チオール含有メイタンシノイド（１〜２モル当量／マレイミド基）で処理し、抗体−メイタンシノイド複合体を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムによるゲルろ過、セラミックハイドロキシアパタイトカラム上のクロマトグラフィー、透析もしくはタンジェント流ろ過、またはそれらの方法の組み合わせにより精製する。一般的に、抗体あたり平均１〜１０個のメイタンシノイドが連結される。１つの方法は、抗体をスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）で修飾して、マレイミド基を導入し、その後修飾された抗体とチオール含有メイタンシノイドを反応させて、チオエ−テル連結複合体を得る。再度、抗体分子あたり１〜１０個の薬物分子を有する複合体が生じる。抗体、抗体断片、および他のタンパク質のメイタンシノイド複合体を、同様にして作製する。
【００７８】
本発明の別の態様においては、ＰＥＧスペーサーの中介による切断不可能な結合を介して、ＥＧＦＲ抗体を薬物に連結する。薬物と抗ＥＧＦＲ抗体または断片との間にリンカーを形成する親水性ＰＥＧ鎖を含む、好適な架橋試薬もまた、当技術分野で公知であるか、または商業的に入手可能である（例えば、オハイオ州パウエルの、カンタバイオデザイン社（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）より）。好適なＰＥＧ含有架橋剤はまた、当業者に公知の標準的な合成化学技術を使用して、市販のＰＥＧ自体から合成することもできる。米国特許出願公開第２００９／０２７４７１３号および国際公開第２００９／１３４９７６号に詳細に記載される方法により、薬物を二官能性のＰＥＧ含有架橋剤と反応させて、以下の式：Ｚ−Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｙｐ−Ｄで表される化合物を得、次いでそれを細胞結合剤と反応させて、複合体を得ることができる。あるいは、細胞結合剤を二官能性ＰＥＧ架橋剤で修飾して、チオール反応性基（例えば、マレイミドまたはハロアセトアミド）を導入し、次いでそれをチオール含有メイタンシノイドで処理して、複合体を得ることができる。別の方法においては、細胞結合剤を二官能性ＰＥＧ架橋剤で修飾して、チオール部分を導入し、次いでそれを、チオール反応性メイタンシノイド（例えばマレイミドまたはハロアセトアミドを有するメイタンシノイド）で処理して、複合体を得ることもできる。
【００７９】
従って、本発明の別の態様は、式（ＩＩ）または式（ＩＩ’）：
ＣＢ−［Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｙｐ−Ｄ］ｍ  （ＩＩ）
［Ｄ−Ｙｐ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｘｌ］ｍ−ＣＢ  （ＩＩ’）
で表される抗ＥＧＦＲ抗体薬物複合体であり、
式中、ＣＢは、抗ＥＧＦＲ抗体または断片を表し；
Ｄは薬物を表し；
Ｘはチオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤と結合した、脂肪族、芳香族または複素環単位を表し；
Ｙは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、エーテル結合、アミン結合、炭素−炭素結合およびヒドラゾン結合から成る群から選択される共有結合を介して、薬物と結合した、脂肪族、芳香族、または複素環単位を表し；
ｌは０または１であり；
ｐは０または１であり；
ｍは２〜１５の整数であり；および
ｎは１〜２０００の整数である。
【００８０】
いくつかの実施形態において、ｍは２〜８の整数であり；および
いくつかの実施形態において、ｎは１〜２４の整数である。
【００８１】
いくつかの実施形態において、ｍは２〜６の整数である。
【００８２】
いくつかの実施形態において、ｍは３〜５の整数である。
【００８３】
いくつかの実施形態において、ｎは２〜８の整数である。好適なＰＥＧ含有リンカーの例としては、抗ＥＧＦＲ抗体またはその断片との反応のためのＮ−スクシンイミジルエステルまたはＮ−スルホスクシンイミジルエステル部分、および化合物との反応のためのマレイミドまたはハロアセチルをベースとする部分を有するリンカーが挙げられる。本明細書に記載の方法により、当技術分野で公知のあらゆる架橋剤中に、ＰＥＧスペーサーを組み込むことができる。
【００８４】
本明細書に開示されるリンカーの多くは、米国特許出願公開第２００５／０１６９９３３号および同第２００９／０２７４７１３号、国際公開第２００９／１３４９７６号に詳細に記載されており、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８５】
本発明には、例えばメイタンシノイドなどの約２〜約８個の薬物分子（「薬物負荷」）が、抗ＥＧＦＲ抗体またはその断片に連結されており、同一の細胞結合剤に連結された、より少ないかまたはより多い数の薬物の薬物負荷と比較して、複合体の抗腫瘍作用がより一層有効である態様が含まれる。本明細書で使用される「薬物負荷」は、細胞結合剤（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体またはその断片）と結合し得る薬物分子（例えば、メイタンシノイド）の数を指す。１つの態様において、細胞結合剤と結合し得る薬物分子の数は、平均約２〜約８（例えば、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１）である。Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）およびＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）メイタンシン（ＤＭ４）を使用することができる。
【００８６】
二官能性架橋試薬と抗ＥＧＦＲ抗体またはその断片を反応させることにより、抗ＥＧＦＲ抗体またはその断片を修飾し、それにより、リンカー分子と抗ＥＧＦＲ抗体またはその断片との共有結合を生じさせることができる。本明細書において使用される場合、「二官能性架橋試薬」は、本明細書に記載される薬物などの薬物と、細胞結合剤を、共有結合により連結するあらゆる化学的部分である。別の方法において、連結部分の一部は、薬物により提供される。この点において、薬物は、細胞結合剤を薬物と連結するために使用されるより大きなリンカー分子の部分である連結部分を含む。例えば、メイタンシノイドＤＭ１を形成するために、メイタンシンのＣ−３ヒドロキシル基の側鎖を、遊離スルフヒドリル基（ＳＨ）を有するように修飾する。メイタンシンのこのチオール化形態は、修飾された細胞結合剤と反応して、複合体を形成することができる。従って、最終的なリンカーは２つの成分から組み立てられ、そのうちの１つは架橋試薬により提供され、もう一方はＤＭ１からの側鎖により提供される。
【００８７】
薬物分子を、血清アルブミンなどの中間担体分子を介して、抗体分子に連結することもできる。
【００８８】
本明細書において使用される場合、「細胞結合剤に連結された」または「抗ＥＧＦＲ抗体または断片に連結された」という表現は、好適な連結基またはその前駆体を介して、細胞結合剤または抗ＥＧＦＲ抗体もしくは断片と結合した少なくとも１つの薬物誘導体を含む、複合体分子を指す。１つの連結基はＳＭＣＣである。
【００８９】
ある実施形態において、本発明において有用な細胞傷害性薬物は、メイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体である。好適なメイタンシノイドの例としては、メイタンシノールのエステルおよびメイタンシノール類似体が挙げられる。メイタンシノールおよびメイタンシノール類似体と同様に、微小管形成を阻害し、かつ哺乳類細胞に非常に有毒な、あらゆる薬物が含まれる。
【００９０】
好適なメイタンシノールエステルの例としては、修飾された芳香環を有するものおよび他の位置における修飾を有するものが含まれる。そのような好適なメイタンシノイドは、米国特許第４，４２４，２１９号；同第４，２５６，７４６号；同第４，２９４，７５７号；同第４，３０７，０１６号；同第４，３１３，９４６号；同第４，３１５，９２９号；同第４，３３１，５９８号；同第４，３６１，６５０号；同第４，３６２，６６３号；同第４，３６４，８６６号；同第４，４５０，２５４号；同第４，３２２，３４８号；同第４，３７１，５３３号；同第５，２０８，０２０号；同第５，４１６，０６４号；同第５，４７５，０９２号；同第５，５８５，４９９号；同第５，８４６，５４５号；同第６，３３３，４１０号；同第７，２７６，４９７号、および同第７，４７３，７９６号に開示されている。
【００９１】
ある実施形態において、本発明の免疫複合体は、公式にはＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシンと呼ばれる、チオール含有メイタンシノイド（ＤＭ１）を、細胞傷害性薬物として使用する。ＤＭ１は、以下の構造式（ＩＩＩ）：
【化１】
2014533954.tif 000003
により表される。
【００９２】
別の実施形態において、本発明の複合体は、チオール含有メイタンシノイドＮ２’−デアセチル−Ｎ２’（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（例えば、ＤＭ４）を、細胞傷害性薬物として使用する。ＤＭ４は、以下の構造式（ＩＶ）：
【化２】
2014533954.tif 000004
により表される。
【００９３】
立体障害のあるチオール結合を含む側鎖を含む、別のメイタンシノイドは、以下の構造式（Ｖ）：
【化３】
2014533954.tif 000005
により表される、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ−２’（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ３と呼ばれる）である。
【００９４】
米国特許第５，２０８，０２０号および同第７，２７６，４９７号に教示される、それぞれのメイタンシノイドを、本発明の複合体においても使用することができる。この点に関して、米国特許第５，２０８，０２０号および同第７，２７６，６９７号の全開示は、参照により本明細書に組み込まれている。
【００９５】
メイタンシノイドにおける多くの位置は、連結部分を化学的に連結する位置として機能し得る。例えば、ヒドロキシル基を有するＣ−３位置、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位置、ヒドロキシで修飾されたＣ−１５位置、およびヒドロキシ基を有するＣ−２０位置は、全て有用であることが期待される。いくつかの実施形態において、Ｃ−３位置は、連結部分を化学的に連結する位置として機能し、およびいくつかの特定の実施形態において、メイタンシノールのＣ−３位置は、連結部分を化学的に連結する位置として機能する。
【００９６】
いくつかの複合体を構造的に表したものを、以下に示す：
【化４】
2014533954.tif 000006
【００９７】
【化５】
2014533954.tif 000007
【００９８】
【化６】
2014533954.tif 000008
【００９９】
【化７】
2014533954.tif 000009
【０１００】
【化８】
2014533954.tif 000010
【０１０１】
【化９】
2014533954.tif 000011
【０１０２】
【化１０】
2014533954.tif 000012
【０１０３】
【化１１】
2014533954.tif 000013
【０１０４】
本発明にはまた、種々の異性体、ならびに本明細書に記載されるメイタンシノイドおよび複合体（例えば、式（ＩＩＩ）〜（Ｖ）のメイタンシノイドおよび式（ＶＩ）〜（ＸＩＩＩ）の複合体）の混合物も含まれる。ある化合物および本発明の複合体は、種々の立体異性体型で存在し得る。立体異性体は、それらの空間配置においてのみ異なる化合物である。エナンチオマーは、最も一般的には、それらがキラル中心として作用する１つの不斉に置換された炭素原子を含むことに因り、その鏡像を重ね合わすことができない立体異性体の対である。「エナンチオマー」は、互いの鏡像であり、かつ重ね合わすことができない分子の対のいずれかを意味する。ジアステレオマーは、最も一般的には、それらが２つ以上の不斉に置換された炭素原子を含むことに因り、鏡像として関連していない立体異性体である。「Ｒ」および「Ｓ」は、１つまたは複数のキラル炭素原子周囲の、置換基の立体配置を表す。キラル中心がＲまたはＳとして定義されていない場合、純粋なエナンチオマーまたは両立体配置の混合物のいずれかが存在する。
【０１０５】
「ラセミ化合物」または「ラセミ混合物」は、等モル量の２つのエナンチオマーから成る化合物を意味し、ここでそのような混合物は、光学活性を示さない；すなわちそれらは偏光面を回転させない。
【０１０６】
このような抗体−メイタンシノイド複合体を生成するためのいくつかの記載が、米国特許第６，３３３，４１０号、同第６，４４１，１６３号、同第６，７１６，８２１号、および同第７，３６８，５６５号において提供され、そのそれぞれの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０７】
一般に、水性緩衝液中の抗体の溶液を、反応性基を有するジスルフィド部分を有するモル過剰のメイタンシノイドとともに、インキュベートすることができる。反応混合物を、過剰なアミン（例えばエタノールアミン、タウリンなど）の添加によりクエンチすることができる。次いでゲルろ過により、メイタンシノイド−抗体複合体を精製することができる。
【０１０８】
抗体分子あたりに結合したメイタンシノイド分子の数は、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度の比率を分光光度的に測定することにより、判定することができる。メイタンシノイド分子／抗体の平均数は、例えば、１〜１０個または２〜５個であり得る。
【０１０９】
アントラサイクリン化合物、ならびにそれらの誘導体、中間体および修飾型を使用して、抗ＥＧＦＲ免疫複合体を作製することもできる。例えば、ドキソルビシン、ドキソルビシン誘導体、ドキソルビシン中間体、および修飾ドキソルビシンを、抗ＥＧＦＲ複合体において使用することができる。例示的な化合物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１０／００９１２４号に記載される。そのような化合物には、例えば、以下の式：
【化１２】
2014533954.tif 000014
で表される化合物が含まれ、式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシまたはメトキシ基であり、およびＲ２はＣ１−Ｃｓアルコキシ基、またはその薬剤的に許容される塩である。
【０１１０】
抗体とメイタンシノイドまたは他の薬物との複合体の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで種々の望まれない細胞株の増殖を抑制する能力を、評価することができる。例えば、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ２９２、およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍなどの細胞株を、これらの化合物の細胞傷害性の評価のために、容易に使用することができる。評価される細胞を、４〜５日間、化合物に暴露し、細胞の生存率を公知の方法による直接アッセイにおいて測定することができる。次いでＩＣ５０値を、アッセイの結果から算出することができる。
【０１１１】
本明細書に記載されるいくつかの実施形態によれば、免疫複合体は、細胞中に内部移行することができる。従って、免疫複合体は、ＥＧＦＲ発現細胞により取り込まれるかまたは内部移行した際に、治療効果を発揮することができる。いくつかの特定の実施形態において、免疫複合体は、切断可能なリンカーにより細胞傷害性薬物に連結された、抗体、抗体断片、またはポリペプチドを含み、細胞傷害性薬物は、それがＥＧＦＲ発現細胞に内部移行した際に、抗体、抗体断片、またはポリペプチドから切断される。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、免疫複合体は腫瘍体積を減少させることができる。例えば、いくつかの実施形態において、免疫複合体による治療は、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満のＴ／Ｃ値（％）をもたらす。
【０１１３】
本発明の別の態様においては、薬物の代りに、ｓｉＲＮＡ分子を、本発明の抗体と連結することができる。オリゴヌクレオチドの修飾のために一般に使用される方法により、ｓｉＲＮＡを、本発明の抗体と連結することができる（例えば、米国特許出願公開第２００５０１０７３２５号および同第２００７０２１３２９２号を参照のこと）。従って、３’または５’−ホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｍｉｄｉｔｅ）形態のｓｉＲＮＡを、ヒドロキシル官能性を有する架橋剤の一端と反応させて、ｓｉＲＮＡおよび架橋剤間にエステル結合をもたらすことができる。同様にｓｉＲＮＡホスホラミダイトと末端アミノ基を有する架橋剤の反応により、アミンを介した、架橋剤とｓｉＲＮＡとの結合が生じる。あるいは、ｓｉＲＮＡを、標準的な化学的方法により誘導体化して、チオール基を導入することができる。このチオール含有ｓｉＲＮＡを、活性ジスルフィドまたはマレイミド部分を導入するために修飾された抗体と反応させて、切断可能または切断不可能な複合体を得ることができる。この方法により、１〜２０個のｓｉＲＮＡ分子を、抗体に連結することができる。
【０１１４】
ＩＶ．治療方法
上述の通り、本発明のＥＧＦＲ免疫複合体は、ＥＧＦＲ療法および／またはＡＬＫ阻害剤に実質的に非応答性の腫瘍細胞の増殖の阻害において有用である。ある実施形態において、免疫複合体は、腫瘍増殖の阻害、腫瘍体積の低減、および／または腫瘍の腫瘍形成能の低減において有用である。使用する方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏの方法であり得る。
【０１１５】
ある実施形態において、ＥＧＦＲ免疫複合体により治療される疾患は、ＥＧＦＲを標的とする非結合抗体および／または小分子ＡＬＫ阻害剤に対する、内因性の耐性を有するか、または耐性を獲得するがんである。一実施形態において、疾患は、ＥＧＦＲ療法に対して細胞を耐性にする特徴（例えば体細胞の変異）を内因的に含む、１つまたは複数の腫瘍細胞を含むことを特徴とする。ある実施形態において、がんは、（１）細胞が、ＥＧＦＲをコードする遺伝子における１つもしくは複数の変異を含むか、（２）細胞が、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＡＳもしくはＰＴＥＮをコードする遺伝子における１つもしくは複数の変異を含むか、（３）細胞が、活性化された、ＭＥＴおよびＩＧＦ１Ｒ経路などの代償性経路を含むか、または（４）上皮間葉転換などの他の分子的変化が存在する、１つもしくは複数のＥＧＦＲ発現細胞を特徴とする。上皮間葉転換または形質転換は、極性上皮細胞が、間葉系細胞の表現型を呈することを可能にする複数の生化学的変化を経ることを可能にする生物学的過程であり、これには遊走能、侵襲性の増加、アポトーシスに対する耐性の上昇、および細胞外膜成分産生の多大な増加が含まれる。
【０１１６】
ある実施形態において、がんは、（１）ＥＧＦＲ遺伝子の増幅、（２）例えばＨ１０４７ＲなどのＰＩＫ３ＣＡの変異、（３）例えばＫＲＡＳコドン１２および１３におけるＲＡＳ変異、（４）ＰＴＥＮの下方制御もしくは喪失、（５）ＭＥＴ遺伝子の増幅、ＭＥＴの過剰発現および／もしくはＨＧＦの過剰発現によるＭＥＴの活性化、（６）ＩＧＦ１Ｒの活性化、（７）ＡＫＴの活性化、または（８）ＥＲＫ１／２の活性化、が存在するＥＧＦＲ発現細胞を特徴とする。
【０１１７】
ある実施形態において、ＥＧＦＲ免疫複合体により治療される疾患は、腫瘍細胞がＥＧＦＲ療法に対する耐性を獲得したがんである。そのような実施形態において、腫瘍細胞は、標準治療として使用される薬物に対する耐性を獲得し、これらの薬物は腫瘍細胞の治療において、既に有効ではなくなっている。一実施形態において、ＥＧＦＲ標準治療療法には、限定されないが、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、およびＢＩＢ２９９２などのＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ならびにセツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ネシツムマブ、およびニモツズマブなどの抗ＥＧＦＲ抗体が含まれる。
【０１１８】
ある実施形態において、ＥＧＦＲ免疫複合体により治療される疾患は、腫瘍細胞がＡＬＫ阻害剤療法に耐性であるがんである。そのような実施形態において、腫瘍細胞は、標準治療として使用される薬物に対する耐性を獲得し、これらの薬物は腫瘍細胞の治療において、既に有効ではなくなっている。一実施形態において、ＡＬＫ阻害剤標準治療療法には、限定されないが、クリゾチニブが含まれる。
【０１１９】
ある実施形態においては、腫瘍細胞は、最初は標準のＥＧＦＲ療法に感受性であり、時間とともに当該療法に対する耐性を獲得する。ある実施形態において、腫瘍細胞は、体細胞の変異により耐性を獲得する。一実施形態において、ＥＧＦＲ標準治療薬物による治療中または治療開始後６ヶ月以内の疾患の進行は、ＥＧＦＲ標準治療薬物が既に有効ではないことを示す。別の実施形態において、ＥＧＦＲ標準治療薬物による治療中または治療開始後１２ヶ月以内の疾患の進行は、ＥＧＦＲ標準治療薬物が既に有効ではないことを示す。ある実施形態において、当業者は、ＥＧＦＲ標準治療療法に対する耐性を獲得した腫瘍細胞を示す分子マーカーの存在について、腫瘍試料を試験することにより、疾患の進行を判断し得る。ある実施形態において、当業者は、標準的撮像手段、腫瘍バイオマーカーの評価、または臨床的悪化の兆候により、疾患の進行を判断し得る。
【０１２０】
さらなる態様において、本発明は、膀胱、脳、頭頸部、膵臓、肺、乳房、卵巣、結腸、前立腺、皮膚、および腎臓のがんを含む、ＥＧＦＲが異常に発現している細胞増殖障害を治療するための改善された方法であって、当該方法が、治療的有効量の本発明の抗ＥＧＦＲ結合剤を、それを必要とするヒト対象に投与することを含む、方法に関する。別の実施形態において、抗体はヒト化抗体である。本発明の抗ＥＧＦＲ結合剤により治療することができる細胞増殖障害の例としては、限定されないが：腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部領域、および泌尿生殖器系に位置する新生物が挙げられる。
【０１２１】
同様に、他の細胞増殖障害もまた、本発明のＥＧＦＲ免疫複合体により治療することができる。そのような細胞増殖障害の例としては、限定されないが：副腎皮質過形成（クッシング病）、先天性副腎過形成、子宮内膜過形成、良性前立腺肥大症、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮過形成（ヘック病）、皮脂腺過形成、代償性肝臓過形成、および上述される器官系に位置する、新生物以外の、あらゆる他の細胞増殖疾患が挙げられる。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、腫瘍細胞を阻害する方法には、腫瘍または腫瘍細胞を、ＥＧＦＲ免疫複合体とｉｎ  ｖｉｖｏで接触させることが含まれる。ある実施形態において、腫瘍または腫瘍細胞をＥＧＦＲ免疫複合体と接触させることは、動物モデルにおいて行われる。例えば、免疫無防備状態のマウス（例えばＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）において増殖させた１つまたは複数の変異ＥＧＦＲを発現している異種移植片に、ＥＧＦＲ免疫複合体を投与して、腫瘍増殖を阻害することができる。いくつかの実施形態においては、がん幹細胞を、例えば、組織生検、胸水、または血液試料などの患者試料から単離し、免疫無防備状態のマウスに注射し、次いでそのマウスに、ＥＧＦＲ免疫複合体を投与して、腫瘍細胞の増殖を阻害する。いくつかの実施形態においては、動物に腫瘍形成性細胞を導入するのと同時か、またはそのすぐ後に、ＥＧＦＲ免疫複合体を投与して、腫瘍の増殖を予防する。いくつかの実施形態においては、腫瘍形成性細胞が指定されたサイズに増殖した後に、ＥＧＦＲ免疫複合体を、治療薬として投与する。
【０１２３】
ある実施形態において、ＥＧＦＲ療法耐性腫瘍の増殖を阻害する方法には、対象に、治療的有効量のＥＧＦＲ免疫複合体を投与することが含まれる。ある実施形態において、当該対象はヒトである。ある実施形態において、当該対象は、腫瘍を有するか、腫瘍を摘出している。
【０１２４】
さらに、本発明は、対象において、腫瘍の腫瘍形成能を減少させる方法であって、治療的有効量のＥＧＦＲ免疫複合体を、当該対象に投与することを含む、方法を提供する。ある実施形態において、当該腫瘍にはがん幹細胞が含まれる。ある実施形態において、当該腫瘍におけるがん幹細胞の発生頻度は、免疫複合体の投与により減少する。
【０１２５】
本発明のＥＧＦＲ免疫複合体を含む医薬組成物を、局所または全身治療のいずれかのために、いくつもの方法により投与することができる。投与は、局所投与（例えば、膣および直腸送達を含む粘膜への投与）、例えば経皮パッチ剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤および散剤；経肺投与（例えば、噴霧器によるものを含む、散剤もしくはエアロゾルの吸入もしくは吹送；気管内、鼻腔内、表皮および経皮投与）；経口投与；または静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内への注射もしくは注入を含む、非経口投与；または頭蓋内（例えば、くも膜下腔内もしくは脳室内）投与であり得る。
【０１２６】
ある実施形態において、ＥＧＦＲ免疫複合体の投与に加え、方法または治療は、第２の抗癌剤を投与すること（ＥＧＦＲ免疫複合体の投与前、投与と同時、および／または投与後に）をさらに含む。
【０１２７】
ＥＧＦＲ免疫複合体および第２の抗癌剤の組み合わせを、あらゆる順番で、または同時に投与し得るということが理解される。選択された実施形態においては、ＥＧＦＲ免疫複合体を、第２の抗癌剤による治療を以前に受けたことがある患者に投与する。ある特定の他の実施形態においては、ＥＧＦＲ免疫複合体および第２の抗癌剤を、実質的に同時に、または同時に投与する。例えば、第２の抗癌剤による治療（例えば、化学療法）の過程を経ている間に、対象にＥＧＦＲ免疫複合体を投与し得る。ある実施形態においては、ＥＧＦＲ免疫複合体を、第２の抗癌剤による治療開始後、１年以内に投与する。ある代替的な実施形態においては、ＥＧＦＲ免疫複合体を、第２の抗癌剤によるあらゆる治療の開始後、１０か月、８か月、６か月、４か月、または２か月以内に投与する。ある特定の他の実施形態においては、ＥＧＦＲ免疫複合体を、第２の抗癌剤によるあらゆる治療の開始後、４週間、３週間、２週間、または１週間以内に投与する。いくつかの実施形態においては、ＥＧＦＲ免疫複合体を、第２の抗癌剤によるあらゆる治療の開始後、５日、４日、３日、２日、または１日以内に投与する。２つの薬物または治療を、数時間または数分間以内に（すなわち、実質的に同時に）、対象に投与し得るということが、さらに理解される。
【０１２８】
有用な抗癌剤の種類としては、例えば、抗チューブリン剤、アウリスタチン、ＤＮＡ小溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、モノ（白金）、ビス（白金）および三核白金錯体およびカルボプラチンなどの白金錯体）、アントラサイクリン、抗生物質、抗フォレート剤、代謝拮抗剤、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、実行化合物（ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、プリン代謝拮抗剤、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどが挙げられる。ある実施形態において、第２の抗癌剤は、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害薬、トポイソメラーゼ阻害剤、または血管新生阻害剤である。
【０１２９】
ＥＧＦＲ免疫複合体との組み合わせで投与し得る抗癌剤には、化学療法薬が含まれる。従って、いくつかの実施形態において、方法または治療には、本発明の免疫複合体および１つの化学療法薬または複数の異なる化学療法薬の混合物の、併用投与が含まれる。そのような化学療法薬のための製剤および投薬スケジュールを、製造者の指示に従って、または熟練の医師により経験的に判断される通りに、使用することができる。そのような化学療法のための製剤および投薬スケジュールは、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｅｄ．，  Ｍ．  Ｃ．  Ｐｅｒｒｙ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍｄ．  （１９９２）にも記載されている。
【０１３０】
ある実施形態において、治療には、本発明のＥＧＦＲ免疫複合体および放射線療法の併用投与が含まれる。ＥＧＦＲ免疫複合体による治療は、放射線療法の実施の前、同時、または後に実施し得る。そのような放射線療法のためのあらゆる投薬スケジュールを、熟練の医師により判断される通りに、使用することができる。  
【０１３１】
ある実施形態において、治療には、本発明のＥＧＦＲ免疫複合体と他の標的療法の併用投与が含まれる。有用な標的療法の種類としては、限定されないが、例えば、（１）ＨＥＲ２阻害剤、（２）ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤または標的抗ＥＧＦＲ抗体）、（３）ＢＲＡＦ阻害剤、（４）ＡＬＫ阻害剤、（５）ホルモン受容体阻害剤、（６）ｍＴＯＲ阻害剤、（７）ＶＥＧＦ阻害剤、または（８）がんワクチンが挙げられる。チロシンキナーゼ阻害剤は、ＥＧＦＲに対して特異的であるかまたは多選択性であり得、ＥＧＦＲ以外の、またはＥＧＦＲに加えて、１つまたは複数のキナーゼの活性を阻害することができる。ＥＧＦＲ免疫複合体による治療は、標的療法の実施の前、同時、または後に実施し得る。
【０１３２】
本開示のある抗体の作製および本開示の抗体の使用方法を詳細に説明する、以下の非限定的な実施例を参照することにより、本開示の実施形態をさらに定義することができる。材料および方法の両方に対する多くの改変を、本開示の範囲から逸脱することなく実践し得ることが、当業者には明らかとなるであろう。
【実施例】
【０１３３】
実施例
本明細書に記載される実施例および実施形態は、例示目的のみのためのものであり、それらに照らした種々の改変または変更が当業者に示唆され、かつ本出願の精神および権限の範囲に含まれるということが理解される。
（実施例１）
【０１３４】
ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体は、Ｔ７９０Ｍ  ＥＧＦＲ変異を有するＮＳＣＬＣ細胞株に対して有効である
ＥＧＦＲ変異Ｔ７９０Ｍは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤、エルロチニブおよびゲフィチニブに対する、最も一般的な耐性機序のうちの１つである（Ｓｕｄａ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １６：  ５４８９  （２０１０）；  Ｓｅｑｕｉｓｔ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ３：  ７５ｒａ２６  （２０１１）；  および  Ｕｒａｍｏｔｏ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ７３：  ３６１  （２０１１））。ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体の、Ｔ７９０Ｍに媒介される耐性を克服する能力を試験するために、ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイを実施した。ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株は、感作（Ｌ８５８Ｒ）および耐性（Ｔ７９０Ｍ）の両方のＥＧＦＲ変異を有するＮＳＣＬＣ腺癌細胞株であり（Ｃｏｓｍｉｃデータベース、ウェルカムトラストサンガー研究所（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））、そのためそれは、臨床環境で見出されるＥＧＦＲキナーゼ阻害剤耐性腫瘍を、精密に模倣する。
【０１３５】
細胞傷害性アッセイを、以下の通りに実施した。標的細胞を、１，５００〜３，０００細胞／ウェルで、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む１００μＬの完全ＲＰＭＩ培地中に播種した。試験物を、完全ＲＰＭＩ培地中に、５倍希釈系列を使用して希釈し、ウェルあたり１００μＬを添加した。最終濃度は一般的に、３ｘ１０−８Ｍ〜８ｘ１０−１４Ｍの範囲であった。細胞を、加湿された５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃にて、４〜５日間インキュベートした。残存細胞の生存能を、比色ＷＳＴ−８アッセイにより判定し、４５０ｎｍ（Ａ４５０）での吸光度を、マルチウェル・プレートリーダーで測定した。処理された各試料の値を、未処理の対照の平均値で割ることにより、生存率を算出した。試験物の濃度に対する生存率の値を、各処理について、片対数でプロットした。
【０１３６】
図１に示す通り、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体は、ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞の殺傷において有効であり、ＥＣ５０は３ｎＭであった。これに対して、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ裸抗体は、いかなる作用も有さず、非結合対照複合体であるｃｈＫＴＩ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、１０ｎＭのＥＣ５０にて、またはｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体よりも３倍高い濃度でのみ、腫瘍細胞を殺傷した。これらのデータは、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体が、Ｔ７９０Ｍに媒介されるＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の耐性機序を克服し得ることを示唆する。
（実施例２）
【０１３７】
ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体は、ＭＥＴ／ＨＧＦに媒介されるＥＧＦＲキナーゼ阻害剤耐性機序を克服し得る
ＭＥＴ遺伝子の増幅、ＭＥＴタンパク質の過剰発現および／またはＭＥＴリガンドであるＨＧＦの過剰発現によるＭＥＴシグナル伝達の活性化は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤であるゲフィチニブまたはエルロチニブに対する、二番目に最も一般的な耐性機序である（Ｕｒａｍｏｔｏ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ７３：  ３６１  （２０１１））。Ｙａｎｏら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：  ９４７９  （２００８））は、ＨＧＦが、ＥＧＦＲ感作変異を有する肺腺癌細胞株においてゲフィチニブ耐性を誘導し得るが、ＥＧＦＲリガンド（ＥＧＦおよびＴＧＦ−α）またはＩＧＦ１Ｒリガンド（ＩＧＦ−１）はそうではないことを示した。図２に示す実験により、この発見が確認された。この実験においては、エクソン１９欠失型ＥＧＦＲ感作変異を有するＨＣＣ８２７細胞株（Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：  ９４７９  （２００８））を、５０ｎｇ／ｍＬの肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の存在または不存在下で、次第に増加する用量のエルロチニブとともにインキュベートした。ＨＧＦが存在しない場合、エルロチニブは、腫瘍細胞の増殖を有効に阻害することができる（ＥＣ５０＝０．９ｎＭ）。しかしながら、５０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦを添加すると、ＨＣＣ８２７細胞は、エルロチニブに媒介される細胞増殖の阻害に対して、強固に耐性となる。
【０１３８】
次いでこのｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体の細胞傷害活性を試験するために使用した。図３に示す通り、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体は、ＨＧＦの不存在下（図３Ａ）または存在下（図３Ｂ）でのＨＣＣ８２７細胞の阻害において、非常に有効であった（表１）。セツキシマブおよびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ裸抗体は、ＨＣＣ８２７細胞に対してわずかな活性を示し、この活性はＨＧＦの存在下でさらに減少した。これらのデータは、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体が、ＭＥＴ／ＨＧＦ経路の活性化により媒介されるＥＧＦＲキナーゼ阻害剤耐性を克服し得ることを示唆する。
【０１３９】
【表１】
2014533954.tif 000015
（実施例３）
【０１４０】
ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体は、間葉系組織像を有する腫瘍細胞株に対して有効である
間葉系組織像を有するＮＳＣＬＣ細胞株は、一般的に、上皮組織像を有するものよりもゲフィチニブに対してより耐性である（Ｙａｕｃｈ  ＲＬ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：  ８６８６  （２００５））。ゲフィチニブ耐性間葉系肺がん株に対する、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体の細胞傷害活性を試験するために、Ｈ２２６細胞株を用いる細胞傷害性アッセイを、実施例１に記載される通りに実施した。Ｈ２２６細胞株は、間葉系組織像を有する扁平上皮癌である。ＥＧＦＲの高発現にもかかわらず、Ｈ２２６細胞株は、ゲフィチニブに耐性である（Ｙａｕｃｈ  ＲＬ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：  ８６８６  （２００５））。図４に示す通り、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体は、Ｈ２２６細胞株に対して非常に有効であり、ＥＣ５０＝０．１４ｎＭであった。これに対して、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体またはセツキシマブのいずれも、Ｈ２２６腫瘍細胞増殖に作用を及ぼさなかった。非結合対照複合体であるｃｈＫＴＩ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体よりも、約１６０倍より高い濃度にてのみ、細胞傷害性であった。これらのデータは、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体が、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤およびセツキシマブに耐性である、間葉系組織像を有する肺がん細胞株において、非常に有効であることを示唆する。
（実施例４）
【０１４１】
エルロチニブ耐性ＮＳＣＬＣ腺癌細胞株の作製および特徴付け
ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤耐性環境における、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体の細胞傷害活性をさらに評価するために、エルロチニブ耐性ＨＣＣ８２７細胞株を作製した。ＨＣＣ８２７細胞株は、エクソン１９欠失型ＥＧＦＲ変異を有し、それにより、エルロチニブを含むＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して非常に感受性が高くなっている（Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：  ９４７９  （２００８））（図２および５Ａ）。簡単に説明すると、ＨＣＣ８２７細胞株を、２ｎＭから開始して２ｕＭまでの、次第に増加する濃度のエルロチニブの存在下で、４か月を超える期間連続して培養した。得られたＨＣＣ８２７−ＥＲ細胞株は、親細胞株と比較して、エルロチニブに対して高度に耐性であった（図５Ａ）。興味深いことに、ＨＣＣ８２７細胞の組織像は、エルロチニブに対する耐性を獲得した際に、上皮から間葉系へと変化した（図５Ｂ）。この組織学的変化は、分子マーカーにおける変化を伴った。親細胞株はＥ−カドヘリン（上皮マーカー）陽性であり、ビメンチン（間葉系マーカー）陰性であったが、エルロチニブ耐性ＨＣＣ８２７−ＥＲ細胞株はＥ−カドヘリン陰性およびビメンチン陽性であった（図５Ｃ）。図６に示す通り、ＨＣＣ８２７−ＥＲ細胞株は、まだＥＧＦＲを発現していたが、親系統と比較すると、有意により低いレベルであった。細胞表面のＨＥＲ３およびＭＥＴの発現もまた、エルロチニブ耐性ＨＣＣ８２７−ＥＲ細胞株において、減少していた。図６に示す細胞あたりの抗体結合（ＡＢＣ）は、細胞表面の抗原密度を表し；それをＰＥ−Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズ（ＢＤバイオサイエンス社）、および１：１の比率でＰＥにより標識された対応抗原に対する指示抗体を使用して測定した。
【０１４２】
ＨＣＣ８２７−ＥＲ細胞株を、限界希釈によりさらにサブクローニングした。図７に示す通り、得られたサブクローンＨＣＣ８２７−ＥＲ−Ｅ４細胞株は、ＨＣＣ８２７−ＥＲ細胞株と同様に、エルロチニブ耐性を維持し、ＥＧＦＲ抗原密度は５３，０００までさらに減少した。この細胞株をより詳細に特徴付けするために、ＨＣＣ８２７−ＥＲ−Ｅ４細胞を、エルロチニブの不存在下で１週間培養し、異なる用量のエルロチニブで１６時間処理した。細胞可溶化物を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウェスタンブロットにより解析した。図８に示す通り、ＨＣＣ８２７−ＥＲ−Ｅ４細胞株は、間葉系マーカーを維持していた（Ｅ−カドヘリン陰性およびビメンチン陽性）。ＦＡＣＳデータ（図６）と並行して、ＥＧＦＲレベルは、親ＨＣＣ８２７細胞株と比較して有意に減少した。両細胞株におけるＥＧＦＲリン酸化は、エルロチニブの存在下で完全に阻害された。ＨＣＣ８２７親細胞株と対照的に、ＨＣＣ８２７−ＥＲ−Ｅ４細胞株において、ＨＥＲ３リン酸化は全く存在しなかった。ＰＴＥＮレベルにおける変化はなかった。興味深いことに、ＨＣＣ８２７親系統におけるＡＫＴレベルは、エルロチニブ処理により、用量依存的に減少したが、ＨＣＣ８２７−ＥＲ−Ｅ４細胞株においては、変化しなかった。平行して、ＨＣＣ８２７細胞株において、ＡＫＴリン酸化は、エルロチニブにより阻害されたが、ＨＣＣ８２７−ＥＲ−Ｅ４細胞株においては、ホスホＡＫＴ（ｐＡＫＴ）レベルにおける変化はわずかであった。ｐＡＫＴと同様に、エルロチニブは、ＨＣＣ８２７親系統においてＥＲＫ１／２リン酸化を阻害したが、ＨＣＣ８２７−ＥＲ−Ｅ４細胞株においては、効果はより少なかった。さらに、ＥＧＦＲのエクソン１９、２０および２１のＤＮＡ塩基配列決定により、エクソン１９の欠失以外のいかなる付加的な変異も見つからなかった。全体としてこれらのデータは、エルロチニブの存在下で、ＨＣＣ８２７−ＥＲ−Ｅ４細胞株が、ＥＧＦＲ経路下流の２つの重要なシグナル伝達経路である、ＡＫＴおよびＥＲＫ１／２シグナル伝達経路を維持することができるということを示す。ＨＣＣ８２７−ＥＲ−Ｅ４細胞株において、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３の活性化が存在しないことは、この細胞株が、ＡＫＴおよびＥＲＫ１／２シグナル伝達経路を誘因する代償性経路の機序を獲得したが、これはエルロチニブにより影響を受けないということを示唆する。
【０１４３】
ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体は、エルロチニブ耐性ＨＣＣ８２７−ＥＲ−Ｅ４細胞株に対して有効である
ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体の活性を試験するために、実施例１に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイを、ＨＣＣ８２７−ＥＲおよびＨＣＣ８２７−ＥＲ−Ｅ４細胞株を用いて実施した。図９および表２に示す通り、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、抗原密度の有意な減少にもかかわらず、エルロチニブ耐性細胞の殺傷において非常に有効であった。エルロチニブ耐性細胞株におけるｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体のＥＣ５０値は、親ＨＣＣ８２７細胞株（表１）におけるものに匹敵した。セツキシマブ、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体、および非結合対照複合体ｃｈＫＴＩ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、エルロチニブ耐性細胞株において、わずかな作用しか有さなかった。
【０１４４】
【表２】
2014533954.tif 000016
（実施例５）
【０１４５】
ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体は、セツキシマブ耐性結腸直腸がんおよび頭頸部がん細胞株に対して有効である
セツキシマブ（アービタックス）は、結腸直腸がんおよび頭頸部がんの治療のために承認されている。セツキシマブによる治療は、化学療法に応答しなかった結腸直腸がんを有する患者において、全生存および無憎悪生存期間を改善し、生活の質を維持する。しかしながら、セツキシマブ治療は、コドン１２および１３において頻繁に見出されるＫＲＡＳ変異を有する患者に対しては、利益をもたらさない（Ｋａｒａｐｅｔｉｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５９：  １７５７  （２００８））。ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体が、ＫＲＡＳ変異に媒介されるセツキシマブ耐性を克服し得るかどうかを試験するために、Ｇ１２Ｖ  ＫＲＡＳ変異を有する結腸直腸がん細胞株であるＳＷ６２０（Ｃｏｓｍｉｃデータベース、ウェルカムトラストサンガー研究所（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））を使用して、実施例１に記載されるとおりに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイを行った。図１０に示す通り、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体は、ＳＷ６２０腫瘍細胞の殺傷において有効であり、ＥＣ５０は４．１ｎＭであった。非結合複合体対照であるｃｈＫＴＩ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１もまた、腫瘍細胞を殺傷することができるが、それには１０倍より高い濃度が必要である（ＥＣ５０＝約３９ｎＭ）。
【０１４６】
ＰＩＫ３ＣＡ変異は、ＨＥＲ２＋転移性乳がんにおけるトラスツズマブ（ハーセプチン）耐性（Ｋａｔａｏｋａ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２１：  ２５５  （２０１０）；  Ｌｅｅ  ＪＹ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７：  ２０６  （２００７））、および頭頸部がんにおけるセツキシマブ（アービタックス）耐性（Ｒｅｂｕｃｃｉ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ３８：  １８９  （２０１１））に関連している。ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体が、ＰＩＫ３ＣＡ変異に媒介される耐性を克服できるかどうかを調査するために、最も一般的なＨ１０４７Ｒ  ＰＩＫ３ＣＡ変異のうちの１つを有するＳＣＣＨＮがん細胞株である、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２（Ｃｏｓｍｉｃデータベース、ウェルカムトラストサンガー研究所（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））を使用して、実施例１に記載されるとおりに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイを、実施した。図１１に示す通り、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体は、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２腫瘍細胞の増殖の阻害において非常に有効であり、ＥＣ５０値は０．６２ｎＭであった。非結合複合体対照であるｃｈＫＴＩ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１もまた、腫瘍細胞を殺傷したが、ＥＣ５０は、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体のものより３０倍高い、１９ｎＭであった。これに対して、セツキシマブおよびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体は、腫瘍細胞の増殖に全く影響を及ぼさなかった。全体として、これらのデータは、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体が、セツキシマブに対する種々の耐性機序を克服し得るということを、強く示唆する。
（実施例６）
【０１４７】
ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体は、Ｔ７９０Ｍ  ＥＧＦＲ変異およびＭＥＴ遺伝子増幅を有する、エルロチニブ耐性ＨＣＣ８２７  ＮＳＣＬＣ細胞株に対して有効である
ＥＧＦＲ阻害剤に耐性のＮＳＣＬＣ細胞に対するＩＭＧＮ２８９の活性をさらに実証するために、光冨博士（愛知県がんセンター中央病院、胸部外科、日本、名古屋）の研究所で、エルロチニブ感受性ＨＣＣ８２７細胞（親ＨＣＣ８２７細胞）を、それぞれ、次第に増加する濃度のエルロチニブまたはエルロチニブおよびＰＨＡ６６５，７５２（ＭＥＴ阻害剤）中で増殖させることにより作成された、ＨＣＣ８２７  ＥＲ（Ａｉｃｈｉ）およびＨＣＣ８２７  ＥＰＲ（Ａｉｃｈｉ）細胞株を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイを実施した（Ｓｕｄａ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １６：  ５４８９  （２０１０））。Ｓｕｄａ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １６：  ５４８９  （２０１０）および図１２に示す通り、ＨＣＣ８２７  ＥＲおよびＨＣＣ８２７  ＥＰＲ細胞は、エルロチニブに対して、親ＨＣＣ８２７細胞よりも有意により耐性であった。親ＨＣＣ８２７、ＨＣＣ８２７  ＥＲ（Ａｉｃｈｉ）およびＨＣＣ８２７  ＥＰＲ細胞におけるエルロチニブのＥＣ５０は、それぞれ、２．９４Ｅ〜１０Ｍ、約７．２８Ｅ〜６Ｍ、および約５．８４Ｅ〜６Ｍであった（表３）。ＨＣＣ８２７  ＥＲ細胞株は、高コピー数のＭＥＴ遺伝子を含み、ＨＣＣ８２７  ＥＰＲ細胞株はＴ７９０Ｍ  ＥＧＦＲ変異を有する（Ｓｕｄａ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １６：  ５４８９  （２０１０））。これらの細胞株は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する２つの主要な耐性機序を反映する（Ｓｅｑｕｉｓｔ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ３：  ７５ｒａ２６  （２０１１））。親ＨＣＣ８２７、ＨＣＣ８２７  ＥＲおよびＨＣＣ８２７  ＥＰＲ細胞株におけるＥＧＦＲ抗原密度は、それぞれ、１９２，６００、３２，５００および４２１，６００である。
【０１４８】
細胞傷害性アッセイの結果（図１２）は、親ＨＣＣ８２７（Ａｉｃｈｉ）細胞が、エルロチニブ、セツキシマブおよびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体によるＥＧＦＲシグナル伝達の阻害に対して高度に感受性であることを示し、ＥＣ５０は１Ｅ〜１０Ｍの範囲であった（表３）。これに対して、ＨＣＣ８２７  ＥＲおよびＥＰＲ（Ａｉｃｈｉ）細胞は、エルロチニブ、セツキシマブおよびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体に対して高度に耐性であった。重要なことに、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体は、ＭＥＴ遺伝子の増幅およびＴ７９０Ｍ  ＥＧＦＲ変異を有するエルロチニブ耐性細胞株に対して、非常に有効であった。全体として、これらのデータは、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体が、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する種々の耐性機序を克服し得るということを、強く示唆する。
【０１４９】
【表３】
2014533954.tif 000017
（実施例７）
【０１５０】
ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体は、クリゾチニブ耐性ＥＭＬ４−ＡＬＫ＋Ｈ２２２８  ＮＳＣＬＣ細胞株に対して有効である
ＥＭＬ４−ＡＬＫ遺伝子転座は、ＡＬＫキナーゼの恒常的な活性化をもたらし、ＮＳＣＬＣ腺癌のうちの約５％における駆動変異として特定されている（Ｃａｓｔｒｏ−Ｃａｒｐｅｎｏ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｏｎｃｏｌ．  １３：７７４−７７９  （２０１１）に概説）。ＡＬＫ阻害剤であるクリゾチニブは、ＥＭＬ４−ＡＬＫ遺伝子転座を有する腫瘍に対して非常に有効であり、近年、ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣの治療のためにＦＤＡに承認された。不運なことに、ＥＭＬ４−ＡＬＫ＋腫瘍のうちの約４０％がクリゾチニブに耐性である。さらに、クリゾチニブに感受性である腫瘍は、薬物に対する耐性を急速に獲得し得る（Ｃａｓｔｒｏ−Ｃａｒｐｅｎｏ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｏｎｃｏｌ．  １３：７７４−７７９  （２０１１））。Ｈ２２２８は、ＡＬＫチロシンキナーゼ阻害剤ＴＡＥ６８４に耐性である、ＥＭＬ４−ＡＬＫ遺伝子転座を有するＮＳＣＬＣ腺癌細胞株である（Ｋｏｉｖｕｎｅｎ  ＪＰ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：４２７５−４２８３  （２００８））。我々の実験において、Ｈ２２２８細胞は、クリゾチニブに対しても耐性であった（ＥＣ５０＝３．８２Ｅ〜６Ｍ）（図１３Ａ）。Ｈ２２２８細胞が比較的高レベルのＥＧＦＲ（１１６，０００抗原／細胞）を発現していたため、エルロチニブ、セツキシマブ、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体、およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体の活性を、この細胞株において試験した。図１３Ａおよび１３Ｂに示す通り、エルロチニブは、高用量においてのみ活性であった（ＥＣ５０＝２．６１Ｅ〜５Ｍ）。この細胞株におけるエルロチニブの活性は、ＥＧＦＲ阻害剤耐性のＨＣＣ８２７細胞株におけるものに匹敵し（実施例６を参照のこと）、Ｈ２２２８細胞が、エルロチニブに対して、本来耐性であることを示唆している。セツキシマブおよびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体の両方が、３Ｅ〜８Ｍの濃度で、腫瘍増殖の最大３５％しか阻害することができなかった（図１３Ｂ）。これに対して、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、ほぼ完全に腫瘍細胞を殺傷し、ＥＣ５０は３．２Ｅ〜１１Ｍであった。このデータは、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体が、ＡＬＫ阻害剤耐性ＥＭＬ４−ＡＬＫ＋Ｈ２２２８細胞株である、ＮＳＣＬＣ腺癌に対して、高度に有効である事を示唆する。
【０１５１】
特定の実施形態の前述の説明は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにしているため、当技術分野内の知識を適用することにより、過度な実験をすることなく、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、他者がこのような特定の実施形態を容易に改変し、および／または種々の用途のために適応させ得る。従ってこのような適応および改変は、本明細書に提示される教示および指導に基づき、開示される実施形態の等価物の意味および範囲内であることが意図される。本明細書の語法または用語が、当業者により、教示および指導に照らして解釈されるように、本明細書の語法または用語が説明の目的のためであり、限定する目的のためではないことが理解される。
【０１５２】
本発明の幅および範囲は、上述の、例となる実施形態のいずれかに限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの等価物によってのみ、定義されるべきである。
【図１】
2014533954.tif 000018
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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