(57)【要約】  本発明により、血漿分離デバイスから得られる血漿試料を用い、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて血漿試料を分析して血漿試料中の少なくとも２つの分析物質のレベルを検出して１又は２以上の障害を診断し、複数の障害を診断してそれらを区別する方法が提供される。
2014520265.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一の乾燥した血液試料から１又は２以上の障害を診断及び識別する方法であって、
血漿分離デバイスから血漿試料を得るステップであって、前記血漿分離デバイスが、半透性血液分離部材を覆う取り外し可能な保持部材と、前記保持部材の一部に形成され前記半透性血液分離部材と連通する血液導入部と、前記半透性血液分離部材と連通する取り外し可能な血漿試料収集貯槽と、前記取り外し可能な血漿試料収集貯槽と連通する基板とを備え、全血試料が前記血液導入部に添加されて前記半透性血液分離部材によって分離され、前記血漿試料が前記取り外し可能な血漿試料収集貯槽に収集されるステップと、
液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて前記血漿試料を分析し、前記血漿試料中の少なくとも２つの分析物質のレベルを検出して１又は２以上の障害を診断するステップであって、前記少なくとも２つの分析物質のレベルが総ホモシステイン、メチルマロン酸、Ｓ−アデノシルホモシステイン、ベタイン、コリン、非対称性ジメチルアルギニン、対称性ジメチルアルギニン、クレアチニン、アミノ酸、グルタチオン、フェニルアラニン、チロシン、ビタミンＤ、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ４（アデニン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ１２、葉酸、又は鉄から選択されるステップと
を含む方法。
【請求項２】
取り外し可能な血漿試料収集貯槽が基板から取り外される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
取り外し可能な血漿試料収集貯槽から血漿試料が単離される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
取り外し可能な保持部材から白血球試料を得るステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
総ホモシステイン、メチルマロン酸、Ｓ−アデノシルホモシステイン、ベタイン、コリン、非対称性ジメチルアルギニン、対称性ジメチルアルギニン、クレアチニン、アミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、ビタミンＤ、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ４（アデニン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、及びビタミンＢ７（ビオチン）から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４の追加的な分析物質のレベルを検出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
血漿分離デバイスを受け取るステップが郵便で受け取られるものとしてさらに定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
１又は２以上の障害が栄養障害、血液疾患、精神疾患、神経疾患、血管系疾患、末梢疾患、心臓血管系疾患、脳血管系疾患、遺伝性代謝障害、腎不全、アルギニン血症、アルギニノコハク酸尿症、カルバモイルリン酸シンテターゼ欠乏症１、シトルリン血症、ホモシスチン尿症、高メチオニン血症、高アンモニア血症、高オルニチン血症、ホモシトルリン尿症、メープルシロップ尿症、フェニルケトン尿症、チロシン血症、シスタチオニン  β−シンテアーゼ欠乏症、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素欠乏症、又はメチルマロン酸血症の少なくとも１つから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
血漿分離デバイスから血漿試料を得るステップであって、前記血漿分離デバイスが、半透性血液分離部材を覆う取り外し可能な保持部材と、前記保持部材の一部に形成され前記半透性血液分離部材と連通する血液導入部と、前記半透性血液分離部材と連通する取り外し可能な血漿試料収集貯槽と、前記取り外し可能な血漿試料収集貯槽と連通する基板とを備え、全血試料が前記血液導入部に添加されて前記半透性血液分離部材によって分離され、血漿試料が前記取り外し可能な血漿試料収集貯槽に収集されるステップと、
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて前記血漿試料を分析し、前記血漿試料中の少なくとも２つの分析物質のレベルを検出して１又は２以上の疾患を診断するステップであって、前記少なくとも２つの分析物質のレベルが総ホモシステイン、メチルマロン酸、Ｓ−アデノシルホモシステイン、ベタイン、コリン、非対称性ジメチルアルギニン、対称性ジメチルアルギニン、クレアチニン、アミノ酸、グルタチオン、フェニルアラニン、チロシン、ビタミンＤ、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ４（アデニン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ１２、葉酸、又は鉄から選択されるステップと
を含む、疾患を診断する方法。
【請求項９】
総ホモシステイン、メチルマロン酸、Ｓ−アデノシルホモシステイン、ベタイン、コリン、非対称性ジメチルアルギニン、対称性ジメチルアルギニン、クレアチニン、アミノ酸、グルタチオン、ビタミンＤ、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ４（アデニン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ１２、葉酸、又は鉄から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４の追加的な分析物質のレベルを検出するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
分析物質が総ホモシステイン、Ｓ−アデノシルホモシステイン、非対称性ジメチルアルギニン、フェニルアラニン、及び対称性ジメチルアルギニンを包含し、かつ１又は２以上の血管系リスクファクターを診断するために用いられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
総ホモシステイン、Ｓ−アデノシルホモシステイン、非対称性ジメチルアルギニン、及び対称性ジメチルアルギニンから選択される１つ又は２つの追加的な分析物質のレベルを検出するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
分析物質が総ホモシステイン、メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン、Ｓ−アデノシルホモシステイン、フェニルアラニン、及びアミノ酸を包含し、かつ１又は２以上の遺伝性代謝障害を診断するために用いられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
血漿分離デバイスを郵便で受け取るステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも２つの分析物質のレベルを包含する分析物質がＳ−アデノシルホモシステイン、非対称性ジメチルアルギニン、対称性ジメチルアルギニン、及びクレアチニンから選択され、かつ腎不全を診断するために用いられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
Ｓ−アデノシルホモシステイン、非対称性ジメチルアルギニン、対称性ジメチルアルギニン、及びクレアチニンから選択される１つ、２つ、又は３つの追加的な分析物質のレベルを検出するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
検出される分析物質が総ホモシステイン及びメチルマロン酸のレベルを包含し、総ホモシステイン及びメチルマロン酸のレベルの上昇がコバラミン欠乏症を示し、総ホモシステインのレベルの上昇とメチルマロン酸の正常レベルとの組み合わせが葉酸欠乏症を示し、コバラミン、葉酸、又はその両方の欠乏症が診断される、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
疾患が栄養障害、血液疾患、精神疾患、神経疾患、血管系疾患、末梢疾患、心臓血管系疾患、脳血管系疾患、遺伝性代謝障害、腎不全、アルギニン血症、アルギニノコハク酸尿症、カルバモイルリン酸シンテターゼ欠乏症１、シトルリン血症、ホモシスチン尿症、高メチオニン血症、高アンモニア血症、高オルニチン血症、ホモシトルリン尿症、メープルシロップ尿症、フェニルケトン尿症、チロシン血症、シスタチオニン  β−シンテアーゼ欠乏症、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素欠乏症、又はメチルマロン酸血症の少なくとも１つから選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
以下のステップ（ａ）〜（ｇ）を含む、臨床試験中の対象における薬物レベルをモニターする方法。
（ａ）試験に関与している対象を準備するステップ；
（ｂ）前記対象から血漿分離デバイスを得るステップ；
（ｃ）前記血漿分離デバイスから血漿試料を得るステップであって、前記血漿分離デバイスが、半透性血液分離部材を覆う取り外し可能な保持部材と、前記保持部材の一部に形成され前記半透性血液分離部材と連通する血液導入部と、前記半透性血液分離部材と連通する取り外し可能な血漿試料収集貯槽と、前記取り外し可能な血漿試料収集貯槽と連通する基板とを備え、全血試料が前記血液導入部に添加されて前記半透性血液分離部材によって分離され、前記血漿試料が前記取り外し可能な血漿試料収集貯槽に収集されるステップ；
（ｄ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて前記血漿試料を分析し、前記血漿試料中の少なくとも２つの分析物質のレベルを検出するステップであって、前記少なくとも２つの分析物質のレベルが総ホモシステイン（ｔＨｃｙ）、メチルマロン酸（ＭＭＡ）、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）、ベタイン、コリン、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、クレアチニン、アミノ酸、グルタチオン、フェニルアラニン、ビタミンＤ、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ４（アデニン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ１２、葉酸、又は鉄から選択されるステップ；
（ｅ）前記対象に薬剤を提供するステップ；
（ｆ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて前記血漿試料を分析して薬剤レベルを検出するステップ；
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のステップを繰り返すステップ
【請求項１９】
臨床試験が栄養障害、血液疾患、精神疾患、神経疾患、血管系疾患、末梢疾患、心臓血管系疾患、脳血管系疾患、遺伝性代謝障害、又は腎不全のためのものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
臨床試験が前臨床試験であり、対象がネコ、イヌ、ヤギ、非ヒト霊長類、マウス、ブタ、又はラットである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
臨床試験が臨床薬物試験であり、対象がヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
単一の乾燥した血液試料から複数の障害を診断及び識別するためのシステムであって、
半透性血液分離部材を覆う取り外し可能な保持部材と、前記保持部材の一部に形成され前記半透性血液分離部材と連通する血液導入部と、前記半透性血液分離部材と連通する取り外し可能な血漿試料収集貯槽と、前記取り外し可能な血漿試料収集貯槽と連通する基板とを備える血漿分離器であって、前記血液導入部に添加した全血試料が前記半透性血液分離部材によって分離され、血漿試料が前記取り外し可能な血漿試料収集貯槽に収集される血漿分離器と、
前記血漿試料中の少なくとも２つの分析物質のレベルを検出し、複数の障害を診断してそれらを識別するためのＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムであって、前記少なくとも２つの分析物質のレベルが総ホモシステイン（ｔＨｃｙ）、メチルマロン酸（ＭＭＡ）、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）、ベタイン、コリン、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、クレアチニン、アミノ酸、グルタチオン、フェニルアラニン、ビタミンＤ、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ４（アデニン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ１２、葉酸、又は鉄から選択されるＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムと
を含むシステム。
【請求項２３】
単一の乾燥した血液試料からの多重試料分析の方法であって、
血漿分離デバイスから血漿試料を得るステップであって、前記血漿分離デバイスが、半透性血液分離部材を覆う取り外し可能な保持部材と、前記保持部材の一部に形成され前記半透性血液分離部材と連通する血液導入部と、前記半透性血液分離部材と連通する取り外し可能な血漿試料収集貯槽と、前記取り外し可能な血漿試料収集貯槽と連通する基板とを備え、全血試料が前記血液導入部に添加されて前記半透性血液分離部材によって分離され、前記血漿試料が前記取り外し可能な血漿試料収集貯槽に収集されるステップと、
前記血漿試料の１又は２以上の成分に標識するステップと、
液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて前記血漿試料を分析し、前記血漿試料中の前記１又は２以上の成分を検出するステップと
を含む方法。
【請求項２４】
半透性血液分離部材を覆う取り外し可能な保持部材と、
前記保持部材の一部に形成され前記半透性血液分離部材と連通する血液導入部と、
前記半透性血液分離部材と連通する取り外し可能な血漿試料収集貯槽と、
前記取り外し可能な血漿試料収集貯槽と連通する基板とを備える血漿分離器であって、
前記血液導入部に添加した全血試料が前記半透性血液分離部材によって分離され、前記血漿試料が前記取り外し可能な血漿試料収集貯槽に収集される、血漿分離器。
【請求項２５】
以下のステップ（ａ）〜（ｆ）を含む、対象における薬物レベルをモニターする方法。
（ａ）対象から血漿分離デバイスを得るステップ；
（ｂ）前記血漿分離デバイスから血漿試料を得るステップであって、前記血漿分離デバイスが、半透性血液分離部材を覆う取り外し可能な保持部材と、前記保持部材の一部に形成され前記半透性血液分離部材と連通する血液導入部と、前記半透性血液分離部材と連通する取り外し可能な血漿試料収集貯槽と、前記取り外し可能な血漿試料収集貯槽と連通する基板とを備え、全血試料が前記血液導入部に添加されて前記半透性血液分離部材によって分離され、前記血漿試料が前記取り外し可能な血漿試料収集貯槽に収集されるステップ；
（ｃ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて前記血漿試料を分析し、前記血漿試料中の少なくとも２つの分析物質のレベルを検出するステップであって、前記少なくとも２つの分析物質のレベルが総ホモシステイン（ｔＨｃｙ）、メチルマロン酸（ＭＭＡ）、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）、ベタイン、コリン、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、クレアチニン、アミノ酸、グルタチオン、フェニルアラニン、ビタミンＤ、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ４（アデニン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ１２、葉酸、又は鉄から選択されるステップ；
（ｄ）前記対象に薬剤を提供するステップ；、
（ｅ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて前記血漿試料を分析して前記薬剤のレベルを検出するステップ；
（ｆ）必要であれば任意に（ａ）〜（ｅ）のステップを繰り返すステップ 
【請求項２６】
疾患が栄養障害、血液疾患、精神疾患、神経疾患、血管系疾患、末梢疾患、心臓血管系疾患、脳血管系疾患、遺伝性代謝障害、腎不全、アルギニン血症、アルギニノコハク酸尿症、カルバモイルリン酸シンテターゼ欠乏症１、シトルリン血症、ホモシスチン尿症、高メチオニン血症、高アンモニア血症、高オルニチン血症、ホモシトルリン尿症、メープルシロップ尿症、フェニルケトン尿症、チロシン血症、シスタチオニン  β−シンテアーゼ欠乏症、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素欠乏症、又はメチルマロン酸血症の少なくとも１つから選択される、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、少量の全血中の１又は２以上の分析物質の存在の決定に特に関係する分析アッセイに有用な基盤技術、デバイス及び方法に関するが、それだけに限定されない。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲を限定するものではないが、少量の血液試料中の１又は２以上の分析物質の存在の決定に関して本発明の背景を述べる。
【０００３】
現在、個別の検出又は定量手法を用いて個別の分析物質を検出又は定量することが一般に行われている。例えば、酵素アッセイ、免疫アッセイ、化学的比色アッセイ、蛍光標識及び測定、化学発光標識及び測定、並びに電気化学発光標識及び測定は、種々の分析物質の存在を検出するために用いられ得る周知の分析手法の数例である。これらの手法の多くはテストストリップ又はカートリッジ上で実施される。
【０００４】
例えば、「Assay for Sulfhydryl Amino Acids and Methods for Detecting and Distinguishing Cobalamin and Folic Acid Deficiency」と題された米国特許第４９４０６５８号明細書には、スルフヒドリルアミノ酸のレベル、特に温血動物の体組織試料中の総ホモシステインレベルを決定する方法、総ホモシステインレベルのアッセイを用いてコバラミン及び葉酸の欠乏症を検出する方法、並びにメチルマロン酸のアッセイと関連した総ホモシステインレベルのアッセイを用いてコバラミンと葉酸の欠乏症を区別する方法が開示されている。
【０００５】
「Device for Analysis for Constituents in Biological Fluids」と題された米国特許第５４３５９７０号明細書には、生物学的流体から血液細胞を、好ましくは全血から血漿を分離するためのデバイスが開示されている。
【０００６】
「Plasma or Serum Separator, Plasma or Serum Sampling Method, Plasma or Serum Separating Method, Test Carrier and Glass Fiber」と題された米国特許第７４０７７４２号明細書には、遠心分離機を用いず、かつ血液細胞成分の漏洩又は溶血を起こさずに少量の血液から良好な効率で血漿又は血清を単離することができ、また緊急検査、在宅検査等の随時、即時治療を必要とする医療現場の血液検査において簡単に短時間で全血被検試料から血漿又は血清を単離収集することができる血漿又は血清の分離器及び血漿又は血清の採取法が開示されている。
【０００７】
「Apparatus for the Separation of Plasma」と題された米国特許出願第１２／８６７３３５号明細書には、血液分離装置、より詳しくは血液を吸収し、試料液として血液成分、例えば血漿を分離するための装置が開示されている。前記装置は、血液を吸収するための供給デバイス、試料液として血液成分を分離するためのデバイス、好ましくはもっぱら毛管力によって試料液を吸収する導管、及び導管の入口又は供給ゾーンにおいて導管に試料液を充填するためのデバイスを含む。分離デバイスは特に膜であり、カーブしていて、特に凸状の形状をしており、前記カーブした、特に凸状の形状の先端は充填デバイス中に突出している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４９４０６５８号明細書
【特許文献２】米国特許第５４３５９７０号明細書
【特許文献３】米国特許第７４０７７４２号明細書
【特許文献４】米国特許出願第１２／８６７３３５号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、血漿分離デバイスから血漿試料を得て、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ, liquid-chromatography-tandem-mass spectrometer）を用いて血漿試料を分析し、血漿試料中の少なくとも２つの分析物質のレベルを検出して１又は２以上の障害を診断することによって、単一の乾燥した血液試料を用いて１又は２以上の障害を診断し、それらを区別する方法を提供するものであり、少なくとも２つの分析物質のレベルは総ホモシステイン、メチルマロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、Ｓ−アデノシルホモシステイン、ベタイン、コリン、非対称性ジメチルアルギニン、対称性ジメチルアルギニン、クレアチニン、アミノ酸、グルタチオン、ビタミンＤ、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ４（アデニン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ１２、葉酸、又は鉄から選択される。血漿分離デバイスには、半透性血液分離部材を覆う取り外し可能な保持部材と、保持部材の一部に形成され半透性血液分離部材と連通する血液導入部と、半透性血液分離部材と連通する取り外し可能な血漿試料収集貯槽と、取り外し可能な血漿試料収集貯槽と連通する基板とを備え、全血試料は血液導入部に添加されて半透性血液分離部材によって分離され、血漿試料は取り外し可能な血漿試料収集貯槽に収集される。取り外し可能な血漿試料収集貯槽は基板から取り外すことができ、取り外し可能な血漿試料収集貯槽から血漿試料を単離することができる。さらに、取り外し可能な保持部材から白血球試料を単離することができる。本発明によって２種以上の分析物質を分析することができ、また本発明には総ホモシステイン、メチルマロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、Ｓ−アデノシルホモシステイン、ベタイン、コリン、非対称性ジメチルアルギニン、対称性ジメチルアルギニン、クレアチニン、アミノ酸、グルタチオン、ビタミンＤ、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ４（アデニン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ１２、葉酸、及び／又は鉄から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又はそれを超える追加的な分析物質のレベルが含まれ得る。血漿分離デバイスは郵便又はその他の任意の送達方法で受け取られる。１つの態様においては、１又は２以上の障害は、栄養疾患若しくは障害、血液疾患、精神疾患、神経疾患、血管系疾患、末梢疾患、心臓血管系疾患、脳血管系疾患、遺伝性代謝障害、腎不全、アルギニン血症、アルギニノコハク酸尿症、カルバモイルリン酸シンテターゼ欠乏症１、シトルリン血症、ホモシスチン尿症、高メチオニン血症、高アンモニア血症、高オルニチン血症、ホモシトルリン尿症、メープルシロップ尿症（ＭＳＵＤ, Maple Syrup Urine Disease）、フェニルケトン尿症（古典的高フェニルアラニン血症／ビオプテリンコファクター欠乏症）、チロシン血症、シスタチオニン  β−シンテアーゼ欠乏症（ホモシステイン及びメチオニンの上昇）、メチレンテトラヒド��葉酸還元酵素欠乏症（ＭＴＨＦＲ, Methylenetetrahydrofolate reductase、ホモシステインの上昇、低メチオニン）、又はメチルマロン酸血症の少なくとも１つから選択される疾患から選択される。
【００１０】
本発明はまた、血漿分離デバイスから血漿試料を得て、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて血漿試料を分析し、血漿試料中の少なくとも２つの分析物質のレベルを検出して１又は２以上の障害を診断することによって疾患を診断する方法を提供するものであり、血漿分離デバイスには半透性血液分離部材を覆う取り外し可能な保持部材と、保持部材の一部に形成され半透性血液分離部材と連通する血液導入部と、半透性血液分離部材と連通する取り外し可能な血漿試料収集貯槽と、取り外し可能な血漿試料収集貯槽と連通する基板とを備え、全血試料は血液導入部に添加されて半透性血液分離部材によって分離され、血漿試料は取り外し可能な血漿試料収集貯槽に収集され、少なくとも２つの分析物質のレベルは総ホモシステイン、メチルマロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、Ｓ−アデノシルホモシステイン、ベタイン、コリン、非対称性ジメチルアルギニン、対称性ジメチルアルギニン、クレアチニン、アミノ酸、グルタチオン、ビタミンＤ、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ４（アデニン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ１２、葉酸、又は鉄から選択される。本発明によって総ホモシステイン、メチルマロン酸、Ｓ−アデノシルホモシステイン、ベタイン、コリン、非対称性ジメチルアルギニン、対称性ジメチルアルギニン、クレアチニン、アミノ酸、グルタチオン、ビタミンＤ、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ４（アデニン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ１２、葉酸、又は鉄から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又はそれを超える追加的な分析物質のレベルを分析することができ、これらは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又はそれを超える疾患を決定するために用いられる。１つの態様においては、疾患は、栄養疾患若しくは障害、血液疾患、精神疾患、神経疾患、血管系疾患、末梢疾患、心臓血管系疾患、脳血管系疾患、遺伝性代謝障害、腎不全、アルギニン血症、アルギニノコハク酸尿症、カルバモイルリン酸シンテターゼ欠乏症１、シトルリン血症、ホモシスチン尿症、高メチオニン血症、高アンモニア血症、高オルニチン血症、ホモシトルリン尿症、メープルシロップ尿症、フェニルケトン尿症（古典的高フェニルアラニン血症／ビオプテリンコファクター欠乏症）、チロシン血症、シスタチオニン  β−シンテターゼ欠乏症（ホモシステイン及びメチオニンの上昇）、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素欠乏症（ＭＴＨＦＲ、ホモシステインの上昇、低メチオニン）、又はメチルマロン酸血症の少なくとも１つから選択される。
【００１１】
血漿分離デバイスから血漿試料を得て、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて血漿試料を分析し、血漿試料中の少なくとも２つの分析物質のレベルを検出して血管系リスクファクターを診断することによって血管系リスクファクターを診断する方法も開示され、血漿分離デバイスには半透性血液分離部材を覆う取り外し可能な保持部材と、保持部材の一部に形成され半透性血液分離部材と連通する血液導入部と、半透性血液分離部材と連通する取り外し可能な血漿試料収集貯槽と、取り外し可能な血漿試料収集貯槽と連通する基板とを備え、全血試料は血液導入部に添加されて半透性血液分離部材によって分離され、血漿試料は取り外し可能な血漿試料収集貯槽に収集され、少なくとも２つの分析物質のレベルは総ホモシステイン、Ｓ−アデノシルメチオニン、Ｓ−アデノシルホモシステイン、非対称性ジメチルアルギニン、及び対称性ジメチルアルギニンから選択される。本発明によって総ホモシステイン、Ｓ−アデノシルメチオニン、Ｓ−アデノシルホモシステイン、非対称性ジメチルアルギニン、及び対称性ジメチルアルギニン、又はさらに多くの分析物質から選択される１つ又は２つの追加的な分析物質のレベル並びに血管系疾患若しくは血管系の病気（condition）を分析することができる。
【００１２】
本発明は血漿分離デバイスから血漿試料を得て、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて血漿試料を分析し、血漿試料中の少なくとも２つの分析物質のレベルを検出して遺伝性代謝障害を診断することによって遺伝性代謝障害を診断する方法を開示するものであり、血漿分離デバイスには半透性血液分離部材を覆う取り外し可能な保持部材と、保持部材の一部に形成され半透性血液分離部材と連通する血液導入部と、半透性血液分離部材と連通する取り外し可能な血漿試料収集貯槽と、取り外し可能な血漿試料収集貯槽と連通する基板とを備え、全血試料は血液導入部に添加されて半透性血液分離部材によって分離され、血漿試料は取り外し可能な血漿試料収集貯槽に収集され、少なくとも２つの分析物質のレベルは総ホモシステイン、メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン、Ｓ−アデノシルホモシステイン、及びアミノ酸から選択される。本発明によって総ホモシステイン、メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン、Ｓ−アデノシルホモシステイン、及びアミノ酸から選択される１つ、２つ、又は３つの追加的な分析物質のレベルを分析することができる。
【００１３】
本発明は血漿分離デバイスから血漿試料を得て、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて血漿試料を分析し、血漿試料中の少なくとも２つの分析物質のレベルを検出して腎不全を診断することによって腎不全を診断する方法を提供するものであり、血漿分離デバイスには半透性血液分離部材を覆う取り外し可能な保持部材と、保持部材の一部に形成され半透性血液分離部材と連通する血液導入部と、半透性血液分離部材と連通する取り外し可能な血漿試料収集貯槽と、取り外し可能な血漿試料収集貯槽と連通する基板とを備え、全血試料は血液導入部に添加されて半透性血液分離部材によって分離され、血漿試料は取り外し可能な血漿試料収集貯槽に収集され、少なくとも２つの分析物質のレベルはＳ−アデノシルホモシステイン、非対称性ジメチルアルギニン、対称性ジメチルアルギニン、及びクレアチニンから選択される。本発明によってＳ−アデノシルホモシステイン、非対称性ジメチルアルギニン、対称性ジメチルアルギニン、及びクレアチニンから選択される１つ、２つ、又は３つの追加的な分析物質のレベルを分析することができる。
【００１４】
本発明は血漿分離デバイスから血漿試料を得て、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて血漿試料を分析し、総ホモシステイン及びメチルマロン酸のレベルの上昇の存在を検出することによってコバラミン、葉酸、又はその両方の欠乏症を検出し、それらを区別するための方法を提供するものであり、総ホモシステイン及びメチルマロン酸のレベルの上昇はコバラミン欠乏症を示すことができ、総ホモシステインのレベルの上昇とメチルマロン酸の正常レベルとの組み合わせは葉酸欠乏症を示すことができ、コバラミン、葉酸、又はその両方の欠乏症が診断される。血漿分離デバイスには、半透性血液分離部材を覆う取り外し可能な保持部材と、保持部材の一部に形成され半透性血液分離部材と連通する血液導入部と、半透性血液分離部材と連通する取り外し可能な血漿試料収集貯槽と、取り外し可能な血漿試料収集貯槽と連通する基板とを備え、全血試料は血液導入部に添加されて半透性血液分離部材によって分離され、血漿試料は取り外し可能な血漿試料収集貯槽に収集される。
【００１５】
本発明はまた、（ａ）臨床試験に関与している対象を準備するステップと、（ｂ）前記対象から血漿分離デバイスを得るステップと、（ｃ）前記血漿分離デバイスから血漿試料を得るステップと、（ｄ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて前記血漿試料を分析し、前記血漿試料中の少なくとも２つの分析物質のレベルを検出するステップと、（ｅ）前記対象に薬剤を提供するステップと、（ｆ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて前記血漿試料を分析して薬剤レベルを検出するステップと、（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のステップを繰り返すステップとによって臨床試験中の対象における薬物レベルをモニターする方法を提供するものであり、少なくとも２つの分析物質のレベルは総ホモシステイン（ｔＨｃｙ, total Homocysteine）、メチルマロン酸（ＭＭＡ, Methylmalonic acid）、Ｓ−アデノシルメチオニン、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ, S-adenosylhomocysteine）、ベタイン、コリン、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ, Asymmetric dimethylarginine）、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ, Symmetric dimethylarginine）、クレアチニン、アミノ酸（フルスクリーン４２化合物まで）、グルタチオン、ビタミンＤ、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ４（アデニン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ１２、葉酸、又は鉄から選択される。血漿分離デバイスには、半透性血液分離部材を覆う取り外し可能な保持部材と、保持部材の一部に形成され半透性血液分離部材と連通する血液導入部と、半透性血液分離部材と連通する取り外し可能な血漿試料収集貯槽と、取り外し可能な血漿試料収集貯槽と連通する基板とを備え、全血試料は血液導入部に添加されて半透性血液分離部材によって分離され、血漿試料は取り外し可能な血漿試料収集貯槽に収集される。１つの態様においては、臨床試験は栄養障害、血液疾患、精神疾患、神経疾患、血管系疾患、末梢疾患、心臓血管系疾患、脳血管系疾患、遺伝性代謝障害、又は腎不全のためのものである。別の態様においては、臨床試験は前臨床試験であり、対象はネコ、イヌ、ヤギ、非ヒト霊長類、マウス、ブタ、又はラットである。別の態様においては、臨床試験は臨床薬物試験であり、対象はヒトである。
【００１６】
本発明は血漿分離器及び血漿試料中の少なくとも２つの分析物質のレベルを検出し、複数の障害を診断してそれらを区別するためのＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムを含む、単一の乾燥した血液試料から複数の障害を診断してそれらを区別するためのシステムを提供するものであり、少なくとも２つの分析物質のレベルは総ホモシステイン、メチルマロン酸（ＭＭＡ）、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）、ベタイン、コリン、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、クレアチニン、アミノ酸（フルスクリーン４２化合物）、ビタミンＤ、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ４（アデニン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ１２、葉酸、又は鉄から選択される。血漿分離器には、半透性血液分離部材を覆う取り外し可能な保持部材と、保持部材の一部に形成され半透性血液分離部材と連通する血液導入部と、半透性血液分離部材と連通する取り外し可能な血漿試料収集貯槽と、取り外し可能な血漿試料収集貯槽と連通する基板とを備え、血液導入部に添加された全血試料は半透性血液分離部材によって分離され、血漿試料は取り外し可能な血漿試料収集貯槽に収集される。
【００１７】
血漿分離デバイスから血漿試料を得るステップと、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて血漿試料を分析し、血漿試料中の少なくとも２つの分析物質のレベルを検出して代謝障害を診断するステップとを含む、代謝障害を診断する方法も開示され、血漿分離デバイスには半透性血液分離部材を覆う取り外し可能な保持部材と、保持部材の一部に形成され半透性血液分離部材と連通する血液導入部と、半透性血液分離部材と連通する取り外し可能な血漿試料収集貯槽と、取り外し可能な血漿試料収集貯槽と連通する基板とを備え、全血試料は血液導入部に添加されて半透性血液分離部材によって分離され、血漿試料は取り外し可能な血漿試料収集貯槽に収集され、少なくとも２つの分析物質のレベルは総ホモシステイン（ｔＨｃｙ）、メチルマロン酸（ＭＭＡ）、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）、ベタイン、コリン、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、クレアチニン、アミノ酸（フルスクリーン４２化合物まで）、グルタチオン、ビタミンＤ、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ４（アデニン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、及びビタミンＢ７（ビオチン）から選択される。さらに、総ホモシステイン、メチルマロン酸、Ｓ−アデノシルホモシステイン、ベタイン、コリン、非対称性ジメチルアルギニン、対称性ジメチルアルギニン、クレアチニン、アミノ酸、ビタミンＤ、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ４（アデニン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ１２、葉酸、又は鉄から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４の追加的な分析物質のレベルを分析することができる。
【００１８】
本発明は、血漿分離デバイスから血漿試料を得て、血漿試料の１又は２以上の成分に標識し、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて血漿試料を分析し、血漿試料中の１又は２以上の成分を検出することによって、単一の乾燥した血液試料からの多重試料分析の方法を含むものであり、血漿分離デバイスには半透性血液分離部材を覆う取り外し可能な保持部材と、保持部材の一部に形成され半透性血液分離部材と連通する血液導入部と、半透性血液分離部材と連通する取り外し可能な血漿試料収集貯槽と、取り外し可能な血漿試料収集貯槽と連通する基板とを備え、全血試料は血液導入部に添加されて半透性血液分離部材によって分離され、血漿試料は取り外し可能な血漿試料収集貯槽に収集される。本発明の多重分析によって、同一のＭＳ／ＭＳ（例えばｉＴＲＡＱ）スキャンにおいて共フラグメント化された非標識及び標識前駆体（例えばＩＣＡＴ）から誘導されるＭＳ／ＭＳイオンの比に基づく定量化を組み合わせることができる。さらに、本発明は代謝障害、鎌状赤血球障害、ＨＩＶ、マラリア感染、並びにその他の障害及び感染を検出するために用いることができる。それゆえ、本発明によって単一の乾燥した血液試料からの「標的」及び「非標的」プロテオーム分析のための多重分析物質血漿分離デバイス及び方法が提供される。
【００１９】
本発明のさらに別の実施形態には、半透性血液分離部材を覆う取り外し可能な保持部材と、保持部材の一部に形成され半透性血液分離部材と連通する血液導入部と、半透性血液分離部材と連通する取り外し可能な血漿試料収集貯槽と、取り外し可能な血漿試料収集貯槽と連通する基板とを備える血漿分離器が含まれ、血液導入部に添加された全血試料は半透性血液分離部材によって分離され、血漿試料は取り外し可能な血漿試料収集貯槽に収集される。
【００２０】
本発明のさらに別の実施形態には、（ａ）対象から血漿分離デバイスを得るステップと、（ｂ）前記血漿分離デバイスから血漿試料を得るステップであって、前記血漿分離デバイスが、半透性血液分離部材を覆う取り外し可能な保持部材と、前記保持部材の一部に形成され前記半透性血液分離部材と連通する血液導入部と、前記半透性血液分離部材と連通する取り外し可能な血漿試料収集貯槽と、前記取り外し可能な血漿試料収集貯槽と連通する基板とを備え、全血試料が前記血液導入部に添加されて前記半透性血液分離部材によって分離され、前記血漿試料が前記取り外し可能な血漿試料収集貯槽に収集されるステップと、（ｃ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて前記血漿試料を分析し、前記血漿試料中の少なくとも２つの分析物質のレベルを検出するステップであって、前記少なくとも２つの分析物質のレベルが総ホモシステイン（ｔＨｃｙ）、メチルマロン酸（ＭＭＡ）、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）、ベタイン、コリン、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、クレアチニン、アミノ酸（フルスクリーン４２化合物まで）、グルタチオン、フェニルアラニン、ビタミンＤ、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ４（アデニン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ１２、葉酸、又は鉄から選択されるステップと、（ｄ）前記対象に薬剤を提供するステップと、（ｅ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて前記血漿試料を分析して前記薬剤のレベルを検出するステップと、（ｆ）必要であれば任意に（ａ）〜（ｅ）のステップを繰り返すステップとを含む、対象における薬物レベルをモニターする方法が含まれる。１つの態様においては、疾患は栄養障害、血液疾患、精神疾患、神経疾患、血管系疾患、末梢疾患、心臓血管系疾患、脳血管系疾患、遺伝性代謝障害、腎不全、アルギニン血症、アルギニノコハク酸尿症、カルバモイルリン酸シンテターゼ欠乏症１、シトルリン血症、ホモシスチン尿症、高メチオニン血症、高アンモニア血症、高オルニチン血症、ホモシトルリン尿症、メープルシロップ尿症、フェニルケトン尿症、チロシン血症、シスタチオニン  β−シンテアーゼ欠乏症、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素欠乏症、又はメチルマロン酸血症の少なくとも１つから選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
本発明の特徴及び利点をより完全に理解するため、添付した図面とともに本発明の詳細な説明についてここで参照する。
【図１】ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムのイメージである。
【図２Ａ−２Ｂ】採血から及び指穿刺血漿分離デバイス（ＰＳＤ, plasma separator device）からの血漿におけるｔＨｃｙ試験の相関を示すデータ及びプロットである。
【図３】血漿分離デバイスのイメージである。
【図４Ａ−４Ｂ】標準（図４Ａ）及び試料（図４Ｂ）についての血漿ｔＨｃｙの液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）決定の多重反応モニタリング（ＭＲＭ, Multiple reaction monitoring）プロットのイメージである。
【図５Ａ−５Ｄ】対象１及び２についての血漿試料及びＰＳＤ試料からの回収を示す表であり、ｔＨｃｙの予想濃度及び実測濃度並びに回収された添加標準の量を含む。
【図６Ａ−６Ｂ】血漿から及びＰＳＤにスポットした血漿からの血漿中ＭＭＡ試験の相関を示すデータ及びプロットである。
【図７】本発明の試料抽出及び分析の手順の１つを示す図である。
【図８】室温におけるＰＳＤ上のｔＨｃｙの安定性を示すグラフである。
【図９】ＰＳＤ  ｔＨｃｙの容量依存性を示すグラフである。
【図１０】ＥＳＲＤを有する対象において静脈穿刺とＰＳＤ収集を同時に行った場合の結果を示すグラフである。
【図１１】血漿及びＰＳＤにおけるチロシンについての相関を示すグラフである。
【図１２】血漿及びＰＳＤにおけるフェニルアラニンについての相関を示すグラフである。
【図１３】血漿及びＰＳＤにおけるＡＤＭＡについての相関を示すグラフである。
【図１４】血漿及びＰＳＤにおけるＳＤＭＡについての相関を示すグラフである。
【図１５】血漿及びＰＳＤにおけるアルギニンについての相関を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の種々の実施形態の作成及び使用について以下に詳細に検討するが、多岐にわたる特定の状況において具現化され得る多くの適用可能な発明概念が本発明によって提供されることを理解されたい。本明細書において検討する特定の実施形態は、本発明を作成し使用するための特定の様式を示すのみであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００２３】
本発明の理解を容易にするため、いくつかの用語を以下に定義する。本明細書において定義する用語は、本発明に関連する分野における当業者によって一般的に理解される意味を有している。「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」等の用語は単数の構成要素のみを指すことを意図しておらず、説明のためにその中の特定の例を使用することができる一般的な種類を含んでいる。本明細書における用語は本発明の特定の実施形態を記述するために使用されるが、特許請求の範囲にまとめたもの以外は、その使用によって本発明を限定するものではない。
【００２４】
本明細書において用いられる場合、「無機分子」は炭化水素基（単数又は複数）を含まない分子を指す。
【００２５】
本明細書において用いられる場合、「有機分子」は炭化水素基（単数又は複数）を含む分子を指す。
【００２６】
本明細書において用いられる場合、「ビタミン」はある種の生物学的種に必要な微量の有機物質を指す。
【００２７】
本明細書において用いられる場合、「生物分子」は生体の基本的成分として通常存在する有機化合物を指す。
【００２８】
本明細書において用いられる場合、「脂質」は、クロロホルム又はエーテル等の非極性溶媒によって細胞及び組織から抽出することができる水不溶性の油状又はグリース状の有機物質を指す。
【００２９】
本明細書において用いられる場合、「ホモシステイン」（Ｈｃｙ）は、以下の分子式：ＨＳＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨを有する化合物を指す。生物学的には、Ｈｃｙはメチオニンの脱メチル化によって産生され、メチオニンからのシステインの生合成における中間体である。用語「Ｈｃｙ」は遊離Ｈｃｙ（還元形における）及び共役Ｈｃｙ（酸化形における）を包含する。Ｈｃｙはジスルフィド結合を通してタンパク質、ペプチド、それ自身又はその他のチオールと共役し得る。
【００３０】
本明細書において用いられる場合、「血清」はフィブリン塊及び血液細胞を除去した後に得られる血液の流体部分を指し、循環血液中の血漿とは区別される。
【００３１】
本明細書において用いられる場合、「血漿」は流体で、血液の非細胞部分を指し、凝血の後に得られる血清とは区別される。
【００３２】
本明細書において用いられる場合、「実質的に純粋」は、純度を評価するために当業者によって使用される薄層クロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び高性能液体クロマトグラフィー等の標準的分析方法によって決定される容易に検出可能な不純物を含まない充分に均一な組成物、又はさらなる精製によっても物質の酵素的及び生物学的な活性等の物理的及び化学的性質が検出可能な程には変化しない程度に充分に純粋であることを指す。
【００３３】
本明細書において用いられる場合、「試料」は分析物質アッセイが望まれる分析物質を含み得る全てのものを指す。試料は生物学的流体の上清等の生物学的試料、例えば尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞便、痰、脳脊髄液、涙液、粘液、羊水、その他であり得る。
【００３４】
本明細書において用いられる場合、「多重アッセイ」は単一のアッセイにおいて複数（１２種以上）の分析物質を同時に測定する１種の手順を指し、一度に１つ又はいくつかの分析物質を測定する手順とは区別される。多重アッセイは生物学的試料中の所与の分子の種類を検出又はアッセイして治療効果を決定するために広く用いられている。
【００３５】
本明細書において用いられる場合、「分析物質」は、生物学的高分子及び低分子、元素又はイオン、有機又は無機分子、リガンド、アンチリガンド並びに本発明を用いて検出することができるその他の化学種を含む任意の分子（単数又は複数）を指す。本発明の方法、システム及び分離器は分析物質をアッセイするために用いることができる。例えば、無機分子はナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、塩素、鉄、銅、亜鉛、マンガン、コバルト、ヨウ素、モリブデン、バナジウム、ニッケル、クロム、フッ素、ケイ素、スズ、ホウ素又はヒ素イオン等の無機イオンであってよい。アッセイすべき有機分子はアミノ酸、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ビタミン、単糖、オリゴ糖、脂質又はタンパク質であってよい。種々の分析物質について以下の略語が用いられる：ホモシステイン（ｔＨｃｙ）、メチルマロン酸（ＭＭＡ）、メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ４（アデニン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ１２、葉酸、又は鉄。
【００３６】
試験される分析物質（単数又は複数）に応じて、本発明は栄養欠乏症、臨床症状を含む障害若しくは疾患、並びに／又は血液学的、精神的及び／若しくは神経的疾患を含むが、これらに限定されない、いくつかの障害を決定、同定、及び／又は診断するために用いることができる。その他の疾患としては、血管系リスクファクター若しくは疾患、又は血管系疾患、末梢疾患、心臓血管系疾患、及び／若しくは脳血管系疾患等の障害が挙げられる。本発明によって遺伝性代謝障害、及び／又は腎不全も同定することができる。本発明を用いてまた検出することができる特定の病気の非限定的な例としては、アルギニン血症、アルギニノコハク酸尿症、カルバモイルリン酸シンテターゼ欠乏症１、シトルリン血症、ホモシスチン尿症、高メチオニン血症、高アンモニア血症、高オルニチン血症、ホモシトルリン尿症、メープルシロップ尿症、フェニルケトン尿症（古典的高フェニルアラニン血症／ビオプテリンコファクター欠乏症）、チロシン血症、メチルマロン酸血症、シスタチオニン  β−シンテターゼ欠乏症（ホモシステイン及びメチオニンの上昇）、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素欠乏症（ＭＴＨＦＲ、ホモシステインの上昇、低メチオニン）が挙げられる。
【００３７】
追加的な代謝物及びこれに関連する病気は、例えばwww.ommbid.comに見出すことができ、これは分析物質及び充分に解説された状態との相関を提供する注釈付きの情報源である。以下の参考文献の関連する部分は、ある種の分析物質の代謝レベル及びそれらが関係する疾患又は病気の決定を教示するものであり、参照により本明細書に組み込まれる：C. D.M. van Karnebeek and S. Stockler, Treatable inborn errors of metabolism causing intellectual disability: A systematic literature review, Mol. Genetics and Metabolism, 105 (2012) 368-381; Editorial, Asymmetric dimethylarginine (ADMA): Is really a biomarker for cardiovascular prognosis? Intl. Journal of Cardiology 153 (2011) 123-125; A. Meinitzer, et al., Symmetrical and Asymmetrical Dimethylarginine as Predictors for Mortality in Patients Referred for Coronary Angiography: The Ludwigshafen Risk and Cardiovascular Health Study Clinical Chemistry 57:1 (2011) 112-121; C. Wagner and M. Koury A-S-Adenosylhomocysteine-a better indicator of vascular disease than homocysteine? Am J Clin Nutr 2007;86:1581-1585; S. Stabler, et al., Elevation of Serum Cystathionine Levels in Patients with Cobalamin and Folate Deficiency Blood Vol 81, No 12 (1993) 3404-3413; Physicians's Guide to the Laboratory Diagnosis of Metabolic Diseases, Blau, Duran and Blaskovics (Eds) (1996) Chapman and Hall, Alden Press Oxford, Chapter B, Amino Acid Analysis 24-28; and S. Stabler and R. Allen, Vitamin B12 Deficiency as a Worldwide Health Problem, Annu. Rev. Nutr. (2004) 24:299-326。
【００３８】
本発明には液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）又はその等価物（例えばイオン駆動技術を有する多成分検出器）を用いることができ、これは臨床化学に導入されていて当業者には既知であり（例えばVogeser M., Clin. Chem. Lab. Med. 41 (2003) 117-126を参照）、より感度が高い同じもののより新規なバリアントを含んでもよい。この技術の利点は分析的特異性及び正確性が高いこと、並びに信頼できる分析法の開発における適応性である。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは強固な技術であることが示されており、大規模な常用検査室の設定にも適用可能である。試料材料の調製に関する要求事項はＧＣ−ＭＳに比べると限られている；しかし最新技術によって提示される単なるタンパク質の沈殿はいくつかのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法には充分であろうが、極めて高感度の方法におけるイオン抑制効果を避けるためには、より効率的な抽出法が通常必要となる（Annesley, T. M., Clin. Chem. 49 (2003) 1041-1044）。「オフライン」若しくは「オンライン」固相抽出又は溶媒抽出はこの問題を解決するために現在用いられている手法であるが、本発明においては他のバリアントも用いることができる。
【００３９】
本発明によって、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ手法を用いる診断検査に用いるための方法及び血漿分離デバイスが提供される。本発明によって、従来の採血法に比べて、瀉血医の必要がない、血漿を分離するために遠心分離機を用いることが避けられる、血液収集チューブを開けることによって病原体に曝されることが避けられる、冷凍庫における血漿の保存や標本の輸送におけるドライアイスの使用が避けられる、本発明を用いて収集した血液をマルチバリアパウチに入れてシールし、容易かつ安全に保存し、郵便で発送することができること等のいくつかの利点が提供される。さらに、本発明によって遠隔地における対象のスクリーニングを可能にするための収集及び輸送に関わるコストがより少なく、使用が容易な血漿分離デバイスが提供され、これは臨床研究又は調査研究におけるさらなる利点である。この血漿分離デバイスとともにＬＣ−ＭＳ／ＭＳ手法を用いることによって、指穿刺による血液の小滴から得られた血漿においてその他の代謝物及び薬物を試験することが可能になる。
【００４０】
本発明の血漿分離デバイスによって、蛍光検出に連結されたＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ−Ｆｌｕ）、電気化学的検出に連結されたＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ−ＥＣ）及びＬＣ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）等の血漿ｔＨｃｙの決定方法が提供される。
【００４１】
高ホモシステイン血症をもたらすいくつかの先天性代謝異常は、血管系及び神経学的合併症と関連している。これらの症例の管理においては、療法中の血漿総ホモシステイン（ｔＨｃｙ）のモニタリングがしばしば必要となる。Chematics, Inc.社（North Webster, IN, US）から入手される血漿分離デバイス（ＰＳＤ）を用いるｔＨｃｙの分析のための簡単、高感度、かつ費用効果の良い方法が認証されてきた。指穿刺から得た血液は、２層を含むＰＳＤカードの血液導入部に添加される。上層には血液細胞が保持される一方、血漿は第２層に拡散し、小さなディスクに吸収される。血漿ｔＨｃｙはディスクから溶出し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（4000QTRAP, ABSciex社）によって決定される。注入あたりの全分析時間は１．５分で、Ｈｃｙは０．９分で溶出した。較正曲線は２．５〜８０μｍｏｌ／Ｌで直線であることが示され、定量限界は０．５μｍｏｌ／Ｌであった。３つの異なった濃度における血漿ｔＨｃｙのアッセイ内及びアッセイ間ＣＶはそれぞれ８．２〜８．９％及び７．７〜１０．７％であった。この収集法を認証するため、指穿刺からの血液をＰＳＤ上に収集するのと同時に従来の静脈穿刺採血により血液を収集した。ｔＨｃｙ濃度の範囲を得るため、対照の対象及び腎不全患者から試料を得た。血漿ｔＨｃｙ値の比較（ＰＳＤ対静脈穿刺）は優れた相関を示した（ｒ＝０．９６、勾配＝１．０８、ｎ＝２９、ｔＨｃｙ濃度範囲７〜３６．６μｍｏｌ／Ｌ）。ＰＳＤ上に収集した血漿のｔＨｃｙは、４℃で保存した場合に２年間安定である。
【００４２】
図１はＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムのイメージである。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム１０はオリフィス１４及びスキマー１６と連通したソース１２を含む。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム１０は高圧セル１８、これに接続されたＱ１セル２０、これに続く衝突セル２２、例えばＬＩＮＡＣ衝突セル、及びＱ３セル２４、並びに最終的にレンズ２６及び検出器２８までを含む。Ｑ１セル２０は試料３０を分離する一方、衝突セル２０は分離された試料３０を多数のフラグメント３２にフラグメント化し、またＱ３セル２４において多数のフラグメント３２を分離されたフラグメント３４に再分離し、検出器２８に送る方法を提供する。分離されたフラグメント３４は次いで検出器２８によって検出され、３６にプロットされる。
【００４３】
本発明によって、診察を必要とせず、家庭で採血できる（例えば自己処理）方法及びデバイスが提供される。本発明によって収集時間を最適化できる（例えば早朝又は絶食）方法及びデバイスが提供される。さらに、本発明によって高ホモシステイン血症、再メチル化欠損及びＣＢＳ欠乏症の患者の頻繁なモニタリングが可能になる。本発明によって新生児、幼児及び小児に特に有用な方法及びデバイスが提供される。実用上、本発明によって遠心分離及び手動の血漿分離が必要ないため、診療所における試料処理が低減される。本発明によってドライアイスの必要がないダイレクトメール等による試料輸送が容易になり、通常の血漿輸送に時として付随する漏洩を避けられる。
【００４４】
図２Ａ及び図２Ｂは、採血から及び指穿刺血漿分離デバイス（ＰＳＤ）からの血漿におけるｔＨｃｙ試験の相関を示すデータ及びプロットである。
【００４５】
図３は血漿分離デバイスのイメージである。血漿分離デバイス５０は上面５６に血液導入部５４を有する血液分離器５２を含む。血液試料５８は血液導入部５４の上に置かれてもよく、保持部材６０が取り外されて血漿分離デバイス５０から上面５６が分離される。半透性膜６２は上面５６と基板６４との間に位置している。半透性膜６２と基板６４との間には血漿収集貯槽６６があり、血漿６８を受容し、血漿収集貯槽６６は例えば約２．０μｌ〜約３．５μｌを含み得るが、１つの実施形態においては、容量は約２．４μｌであった（より少量又はより多量、例えば０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、７．５、１０、１２．５、１５、２０、２５、５０マイクロリットル又はそれ以上も包含される）。
【００４６】
１つの実施形態においては、血漿分離デバイス５０は個体から全血試料を血液導入部５４に受容する。保持部材６０は血漿分離デバイス５０から上面５６を取り外す。上面５６と基板６４との間に位置する半透性膜６２によって血漿６８が分離され、血漿６８は半透性膜６２と基板６４との間の血漿収集貯槽６６に収集される。ホモシステイン等の１又は２以上の代謝物又は分析物質について、２．４μｌの血漿６８の試料を試験した。
【００４７】
別の実施形態においては、血漿分離デバイス５０は個体から全血試料を血液導入部５４に受容する。保持部材６０は血漿分離デバイス５０から上面５６を取り外す。
【００４８】
保持部材６０の血液導入部５４の上の全血試料を、血液細胞からＤＮＡを抽出することによって処理し、遺伝子型分析を行った。上面５６と基板６４との間に位置する半透性膜６２によって血漿６８が分離され、血漿６８は半透性膜６２と基板６４との間の血漿収集貯槽６６に収集される。メチルマロン酸（ＭＭＡ）、定量的アミノ酸、及びビタミンＤ等の１又は２以上の代謝物又は分析物質について、２．４μｌの血漿６８の試料を試験した。
【００４９】
本発明によって、血漿分離デバイス５０を用いてｔＨｃｙレベルを決定するための手順が提供される。血漿分離デバイス５０には２．４μｌが保持される。血漿分離デバイス５０についての１つの試料調製手順には、０．７ｍｇ／ｍｌのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む５μＭのＩＳ（ｄ４−Ｈｃｙ）３０μｌと血漿分離デバイス５０とを組み合わせ、ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートするステップが含まれる。１０μｌ／ｍｌのギ酸を含むアセトニトリル１８０μｌを試料に加える。次いで試料をボルテックスし、４℃、１４８００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、７５μｌをＬＣ−ＭＳバイアルに移し、分析のために１μｌを注入する。アセトニトリル７５％及びギ酸０．１％からなる移動相を用い、３２℃に維持したGemini  １５０×３ｍｍ  ５μカラムで、Ｈｃｙ及びｄ４−Ｈｃｙを定組成溶出させた。試料あたり全分析時間１．５分で、Ｈｃｙとｄ３−Ｈｃｙの両方が０．９分で溶出した。
【００５０】
図４Ａ及び図４Ｂは、標準（図４Ａ）及び試料（図４Ｂ）についての血漿ｔＨｃｙのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（ＭＲＭ）決定のプロットのイメージである。プロットはｄ４−Ｈｃｙ（１）、メチオニン（２）、及びＨｃｙ（３）のピークを明確に示している。
【００５１】
【表１】
2014520265.tif 000003
【００５２】
図５Ａ〜図５Ｄは、対象１及び２についての血漿試料及びＰＳＤ試料からの回収を示す表であり、ｔＨｃｙの予想濃度及び実測濃度並びに回収された添加標準の量を含む。
【００５３】
１つの試料調製法においては、単一の３／１６インチの乾燥した血液スポットパンチを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ｄ３−メチルマロン酸（ｄ３−ＭＭＡ）、ｄ３−メチルクエン酸（ｄ３−ＭＣＡ）、及びｄ８−ホモシステインを含む酸性アセトニトリル−水溶液で抽出する。１時間の撹拌の間に、遊離のホモシステイン、タンパク質結合ホモシステイン、及び加えたｄ８−ホモシステイン内部標準はホモシステインに還元される。抽出物を移して次に加熱窒素下で蒸発させる。乾燥した残留物をｎ−ブタノール中３Ｎ  ＨＣｌで処理してブチルエステルを形成させる。ブタノールを蒸発させた後、残留物を再構成し、遠心分離し、上清をマイクロバイアルに移し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供する。
【００５４】
本発明によって、血漿分離デバイス５０を用いてＭＭＡレベルを決定するための手順が提供される。血漿分離デバイス５０には２．４μｌが保持される。血漿分離デバイス５０についての１つの試料調製手順には、５μＭのＩＳ（ｄ３−ＭＭＡ）８０μｌと血漿分離デバイス５０とを組み合わせ、ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートするステップが含まれる。試料溶液７０μｌをAmicon Ultra ０．５ｍＬ  １０，０００ＭＷカットオフ超遠心分離フィルターに負荷し、室温で１０分間、１４８００ｒｐｍで遠心分離する。濾液を取り出して分析のため、１０μｌの注入としてＭＴＰに負荷する。アセトニトリル１０％及びギ酸０．１％からなる移動相を用い、３２℃に維持したWaters Symmetry  １００×２．１ｍｍ  ３．５μカラムで、ＭＭＡ及びｄ３−ＭＭＡを定組成溶出させた。試料あたり全分析時間２分で、ＭＭＡとｄ３−ＭＭＡの両方が１．２分で溶出した。図６Ａ〜図６Ｂは、血漿から及びＰＳＤにスポットした血漿からの血漿中ＭＭＡ試験の相関を示すデータ及びプロットである。
【００５５】
下表は、疾患との関連について検出される分析物質を比較するものである。例えば、本発明によって、単一のＰＳＤ試料を用いて多数の分析物質を検出し、例えば栄養欠乏症、血管系リスクファクター、先天性代謝異常、アミノ酸代謝異常症、腎不全等の障害を同定し、診断することができる。本発明を用いて他の化合物、例えばグルタチオンを分析することもできよう。
【００５６】
【表２】
2014520265.tif 000004
【００５７】
本発明のＰＳＤを用いて検出することができる多数の分析物質のいくつかとしては、ホモシステイン（ｔＨｃｙ）、メチルマロン酸（ＭＭＡ）、メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）、ベタイン、コリン、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、クレアチニン、アミノ酸（フルスクリーン４２化合物）、グルタチオン、ビタミンＤ、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ４（アデニン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、及びビタミンＢ７（ビオチン）が挙げられる。分析物質の１つ又は全ての検出が、本明細書において意図されている。
【００５８】
血漿分離デバイスにおけるＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるＳ−アデノシルメチオニン、Ｓ−アデノシルホモシステイン、ＡＤＭＡ、及びＳＤＭＡの測定。上表の方法１〜３においては、安定同位体希釈液体クロマトグラフィー−電気噴霧注入タンデム質量分析（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ, liquid chromatography-electrospray injection tandem mass spectrometry）を用いて血漿又は血清中のＳＡＭ、ＳＡＨ、ＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、メチオニン、コリン、ベタイン、及びシスタチオニンを決定する。較正のため、それぞれの分析操作にはキャリブレーター及び内部標準（２Ｈ３−ＳＡＭｅ、Ｌ−（２，３，３，４，４，５，５−２Ｈ７−ＡＤＭＡ、２Ｈ３−メチオニン、２Ｈ３−コリン、２Ｈ３−ベタイン、２Ｈ３−シスタチオニン）を含めた。それぞれの標準の１ｍＭ保存溶液を蒸留水で希釈し、以下の濃度範囲、即ち１２．５〜４００ｎｍｏｌ／Ｌ（ＳＡＭ及びＳＡＨ）、１２５〜２０００ｎｍｏｌ／Ｌ（ＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、及びシスタチオニン）、並びに５〜８０μｍｏｌ／Ｌ（メチオニン、コリン、及びベタイン）にわたって５点較正曲線を作成した。
【００５９】
微小遠心フィルターユニット、Microcon YM-10、１０ｋＤａ  ＮＭＷＬ（Millipore社、USA）を用いた試料調製。試料は、１０〜５０μｍｏｌ／Ｌの標識同位体内部標準を含む移動相Ａ１００μＬを単一のＰＳＤ又は標準２．４μｌに加え、続いてボルテックスし、室温で１０分間インキュベートすることによって調製した。インキュベーション溶液９０μｌを微小遠心フィルターユニットに加え、４℃で２０分間、１４８００×ｇで遠心分離した。試料濾液を取り出し、分析のためにマイクロタイタープレートに移した。4000 QTRAP（登録商標）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Applied Biosystems社）と連結したＬＣ−ＭＳシステム、Shimadzu Prominence  ＬＣシステムに１０μｌを注入した。
【００６０】
二相勾配を用い、全操作時間１２分、流量２５０μＬ／分で、３３℃に維持した２５０×２．０ｍｍ EZ-faast分析カラム（Phenomenex社）によってクロマトグラフ分離を行った。ＨＰＬＣ用溶媒は、（Ａ）４ｍＭ酢酸アンモニウム、０．１％ギ酸、０．１％ヘプタフルオロ酪酸（ｐＨ＝２．５）、（Ｂ）１００％メタノール及び０．１％ギ酸であった。初期勾配条件はＡ７５％：Ｂ２５％で、６分間でＢ１００％まで直線的に増加させ、１分間一定に保った。７．１分で移動相を初期条件に５分間リセットした。３〜８分の間のカラム流出液をＥＳＩ源に送達し、それ以外は流出液を廃液に流した。滞在時間３０ｍｓのポジティブＥＳＩを用いたＭＲＭによって化合物を検出した。カーテンガスを１５Ｌ／分に設定し、ソースガス１及び２を６０Ｌ／分に設定した。イオン噴霧電圧５０００Ｖでヒーターを７００℃に設定し、ＣＡＤガス（窒素）を３．５×１０ｅ−５Ｔｏｒｒに設定した。分析物質特異的ＭＲＭ遷移をモニターし、デクラスタリング電位（ＤＰ, declustering potentials）、入口電位（ＥＰ, entrance potential）、衝突エネルギー（ＣＥ, collision energy）、及び衝突出口電位（ＣＸＰ, collision exit potential）を以前の表に示す。全てのデータはAnalyst software version 1.4.2を用いて収集した。
【００６１】
ＳＡＭ、ＳＡＨ、ＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、メチオニン、シスタチオニン、コリン及びベタインは、１００％メタノールまでの勾配により、それぞれ７、６．６、６．５、６．５、４．３、６．１、及び３．８分の保持時間で分解された。ＨＰＬＣクロマトグラフ条件によってはＡＤＭＡとＳＤＭＡは完全に分離されなかったが、ＭＳ−ＭＳモードで作動させたスペクトロメーターマスにおいてそれらが異なったフラグメント化パターンを有することから完全に識別された。フラグメントイオンの実測されたｍ／ｚ値はＳＡＭに対しｍ／ｚ  ３９９→２５０、ＳＡＨに対しｍ／ｚ  ３８５→１３６、２Ｈ３−ＳＡＭに対しｍ／ｚ  ４０２→２５０、ＡＤＭＡに対しｍ／ｚ  ２０３→４６、ＳＤＭＡに対しｍ／ｚ  ２０３→１７２、２Ｈ７−ＡＤＭＡに対しｍ／ｚ  ２１０→４６、メチオニンに対しｍ／ｚ  １５０→１０４、２Ｈ３−メチオニンに対しｍ／ｚ  １５３→１０７、シスタチオニンに対しｍ／ｚ  ２２３→１３４、２Ｈ４−シスタチオニンに対しｍ／ｚ  ２２７→１３８、コリンに対しｍ／ｚ  １０４→４５、２Ｈ４−コリンに対しｍ／ｚ  １０８→４９、ベタインに対しｍ／ｚ  １１８→５９、２Ｈ３−ベタインに対しｍ／ｚ  １２１→６１であった。
【００６２】
血漿分離デバイスにおけるＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるビタミンＢ種及びビタミンＤの測定。ＰＳＤに付随する少量サイズに対応させるため、方法５を改変した。簡単に言えば、Ｂビタミン類の安定同位体を含む溶液３０μｌをＰＳＤ又は標準２．４μｌに加え、暗所で光を遮断して１０分間、氷上でインキュベートした。次に、Ｂビタミン類の安定同位体を含む６％ＴＣＡ溶液３０μｌを加えて試料を脱タンパクする。試料をボルテックスし、光を遮断して１時間、氷上でインキュベートする。インキュベーション後に、試料を４℃で１０分間、１４８００ｒｐｍで遠心分離する。上清をマイクロタイタープレートに負荷し、５μｌをＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに注入する。Ｂビタミン類の分離は、Agilent Eclipse Plus Ｃ１８  １５０×３ｍｍ  ３．５μ上で、勾配によって行われる。
【００６３】
血漿分離デバイスにおけるＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる定量的血漿アミノ酸スクリーン。AB Sciex社によって提供されたａＴＲＡＱ法の試料調製を改変してＰＳＤに付随する少量サイズに対応させることによって、ＰＳＤからの定量的アミノ酸スクリーンを含む方法４を実施する。使用時に対象は血液試料を採取してＰＳＤに載せることができる。次いでＰＳＤ試料を分析してホモシステイン（ｔＨｃｙ）、メチルマロン酸（ＭＭＡ）、メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）、ベタイン、コリン、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、クレアチニン、アミノ酸（フルスクリーン４２化合物）、ビタミンＤ、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ４（アデニン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、及びビタミンＢ７（ビオチン）を決定する。次いで結果は栄養欠乏症、血管系リスクファクター、及び先天性代謝異常の診断を補助するために使用することができる。
【００６４】
血漿分離デバイス（ＰＳＤ）は血液分離部材を有しており、血液分離部材は保持部材によって覆われ、保持されている。保持部材は下側に基板フィルム、上側にカバーフィルムを含んでおり、血液分離部材は基板フィルムとカバーフィルムとの間に固く挟まれている。血液分離部材と保持部材との間に全く空隙を残すことなく両者を接着することによって血液分離部材を保持部材によって固く覆い、保持すれば、全血から高純度の血漿又は血清を単離することが可能である。血液導入部がカバーフィルムの近位端部の上面に形成されており、血液導入部の反対側の保持部材の遠位端部に血漿又は血清採取用の開口が開けられている。
【００６５】
血液分離部材は血液導入部においてその外側が露出しており、損傷等からの保護のための保護部材で覆われている。保護部材としては、それが血液の浸透の結果としての表面張力の作用によって丸くならない限り、任意の材料を用いることができ、ナイロン等のプラスチック材料が用いられ得る。
【００６６】
血液導入部の形状は特に限定されず、円形又は多角形等の任意の他の形状でよい。血液導入部の形状は、カバーフィルムの近位端部が全て剥ぎ取られて大きな開口部を形成するように形成されていてもよい。血液導入部は好ましくは保護部材によって覆われているが、保護部材を設けず、血液分離部材が外気に曝されるような実施形態であっても、本発明の機能及び結果が達成され得ることは言うまでもない。
【００６７】
採取用開口は保持部材の上面、その底面、又は遠位端部の側面の任意の部分に開けることができ、特に限定はない。血漿又は血清採取用の開口のサイズは、０．０２ｍｍ〜１ｍｍの円形又は四角形であってよい。
【００６８】
血液分離部材として用いられる繊維状材料及び／又は多孔質材料としては、無機繊維、例えばガラス繊維及びアスベスト、天然有機繊維、例えば木綿、パルプ、絹等、半合成繊維又は合成繊維、例えばセルロース、セルロースアセテート、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリウレタン、ポリアミド、ポリビニルホルマール、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ビスコースレーヨン等を挙げることができる。
【００６９】
血液分離部材はコーティング材料、例えばヘキシレングリコール、ブトキシ基を有するプロパノール及びブトキシ基を有するアクリルアミドによってコートされた繊維状材料及び／又は多孔質材料であってよい。コーティング材料は単独で用いてもよく、又は例えばガラス繊維フィルター、ヘキシレングリコール、ブトキシ基を有するプロパノール及びブトキシ基を有するアクリルアミドからなる群から選択される１又は２種以上でコートされたガラス繊維の２種以上から併せてなっていてもよい。
【００７０】
血液分離部材のサイズは少なくとも血液試料の量に対応する容量である必要がある。その形状は特に限定されず、四角形、三角形、その他の多角形、円形、楕円形、遠位端が狭くなったテーパーを有する羽子板形状及びその他からなる群から選択される任意の形状であってよい。
【００７１】
血液分離部材の厚みは、全血中の血漿又は血清部分から血液細胞部分が分離され、血液導入部から供給される全血中の血液細胞部分が血液分離部材の中に留まり、血漿又は血清部分が横断方向に、即ち血漿又は血清採取用開口の方向に移動させられることを可能にするものであり、したがって血液分離部材の厚みは、血液分離部材がその上面から底面まで血液細胞部分によって充填され、血漿又は血清が血液細胞分離部材中で横断方向に流れるように設定される。血液分離部材のサイズは試験に必要な血漿又は血清の量に基づいて適正に決定するだけでよく、それに関して特に限定はない。
【００７２】
本発明の血漿又は血清分離法は血漿分離デバイスを利用するものであり、したがって血液細胞成分の漏洩や溶血を起こすことなく、少量の血液からでも効率的に血漿又は血清を単離することができる。
【００７３】
第１の態様において本発明の血漿採取法には、採血部分に刺され、その部分に出血を起こさせる穿刺デバイスが含まれる。採血部分には特に限定はなく、例えば手、足等である。出血の後、血漿分離デバイスの血液導入部又は保護部材は出血部位に接触させられ、血液が採取されて、血液導入部を通して血液が供給される。
【００７４】
吸収された血液は血液分離部材中を血液導入部から遠位端部の採取用開口に移動し、血漿又は血清と赤血球との移動速度の差を用いて赤血球は血液導入部側に単離される一方、血漿又は血清は血漿又は血清採取用開口側に単離される；したがって、血漿又は血清は血液分離部材中で単離される。保持部材、特にカバーフィルムは透明又は半透明であるので、分離プロセスはカバーフィルムを通して目視で確認できる。血漿又は血清の採取量は、血液のヘマトクリット値及び血液分離部材の血漿又は血清分離能力によって決定される。単離された試料円は、分析のため血漿分離デバイスから取り出すことができる。
【００７５】
本発明の血漿分離デバイス及び方法によれば、遠心分離機を用いることなく、少量の血液から高純度の血漿又は血清を容易に得ることができる。本発明によって定量分析に直接供することができる血漿又は血清試料が提供される。
【００７６】
血液分離積層体は血液分離部材から作られた第１層、溶血ブロック部材から作られた第２層、及び血漿又は血清吸収部材から作られた第３層からなる。第１層は血液分離作用を発揮し、血液分離部材から作られている。第２層は溶血が第３層に広がらないようブロック作用を発揮し、ニトロセルロース及びシクロポア等の多孔質フィルム材料から作られている。第３層は単離された血漿又は血清の吸収作用を発揮し、ガラス繊維、セルロース、不織布、濾紙等の吸水性材料から作られている。
【００７７】
本発明によって前臨床研究における血液収集量の低減がもたらされ、これは動物試験及びデータの品質に顕著な効果がある。例えば、研究に必要な齧歯類の数を最大７５％低減することができ、試験に必要な化合物の分量も大幅に低減することができる。これは組成物がまだ最適化されておらず、獲得して精製するためのコストが高く、時間がかかり、困難な場合に特に適している。本発明により、齧歯類の追加を必要とせずに追加できる時点の数を増加すること、及び逐次的薬物動態（ＰＫ）プロファイリングを可能にすることによって、前臨床研究において高品質のデータを生成するための方法が提供される。逐次的ＰＫプロファイリングにより、複合プロファイリングを用いた際に見られる動物間の変動が除去され、データの品質が大幅に改善される。
【００７８】
本発明により、より低侵襲性の採血を用いる方法を提供することによる薬物開発プログラムが提供され、これは小児科学研究及び重症の患者に特に有益である。さらに、ＨＩＶ及びＢ型肝炎等の病原体が不活性化されるので、特別のバイオハザードの予防策を必要とせず、室温及び通常の条件下における試料の発送、取扱い及び保存が、本発明によって可能になる。本発明によって臨床現場における特別の設備（例えば冷却遠心分離機、モニター付き冷凍庫等）の必要性が低減され、発展途上国における臨床研究が可能になる。
【００７９】
指穿刺からの血漿中の総ホモシステイン及びメチルマロン酸のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析
【００８０】
いくつかの先天性代謝異常が、血管系及び神経学的合併症と関連する中度及び重度の高ホモシステイン血症をもたらし得ることを決定するため、本発明を用いた。療法中に血漿総ホモシステイン（ｔＨｃｙ）をモニターすることは、これらの症例の管理においてしばしば必要となる。血漿分離デバイス（ＰＳＤ）を用いて得られるｔＨｃｙの分析のために、本発明の簡単、高感度、かつ費用効果の良いＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を開発した。このデバイスを、Ｂ１２欠乏症のマーカーであるメチルマロン酸（ＭＭＡ）の決定のためにも用いて認証した。
【００８１】
Ｈｃｙ及びＭＭＡの標準をSigma社から、また同位体標識標準の２Ｈ４−Ｈｃｙ（Cambridge Isotopes社）及び２Ｈ３−ＭＭＡ（CDN Isotopes社）を入手した。ＭＭＡのキャリブレーター及び品質管理材料はRecipe Chemicals社（ドイツ）から入手した。
【００８２】
指穿刺からの血液滴をＣＨＥＭＣＡＲＤ（商標）（Chematics社、North Webster, USA）の試験領域に添加する（図１）。３分以内に濾過及び吸収を行って血液試料の残りから血漿を分離し、血漿２．４μｌを含む単一のディスクを残す。血漿ディスクが付着したカードを発送及び保存のため、分析時までマルチバリアパウチに入れる。ジチオスレイトール及び内部標準（２Ｈ４−Ｈｃｙ及び２Ｈ３−ＭＭＡ）を加えて血漿ディスクを室温で１０分間インキュベートすることにより、血漿ｔＨｃｙ及びＭＭＡの抽出を行う（図３に示す）。ｔＨｃｙ及びＭＭＡの血漿及びＰＳＤレベルを、既に述べた安定同位体希釈液体クロマトグラフィー−電気噴霧注入タンデム質量分析（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）の変法によって測定した（Ducros V, Belva-Besnet H, Casetta B, Favier A. A robust liquid chromatography tandem mass spectrometry method for total plasma homocysteine determination in clinical practice. Clin Chem Lab Med 2006;44(8):987-990）。
【００８３】
図７に本発明の試料抽出及び分析の手順の１つを示す。ＰＳＤディスク又は標準２．４マイクロリットル（Ｈｃｙのみ）を、ＩＳ溶液１０マイクロリットルとともにチューブに入れ、オービタル振盪器により室温、１０分間、９００ｒｐｍで混合する。チューブを室温、１４，８００ｒｐｍで５分間遠心分離する。液相を２つの試料に分離する。第１の試料については液相６０マイクロリットルを分離し、１０マイクロリットルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳに負荷してＭＭＡを測定する。残りに対して０．１％ギ酸含有アセトニトリル１８０マイクロリットルを加えてボルテックスする。チューブを遠心分離し、１マイクロリットルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳに注入してｔＨｃｙを測定する。
【００８４】
以下はｔＨｃｙ分析法の概要である。機器：ABSciex 4000 QTRAPに連結されたShimadzu Prominence ＨＰＬＣ；ＨＰＬＣカラム：Gemini １５０×３ｍｍ  ５μ（Phenomenex社）：ＨＰＬＣ溶出液（定組成）：０．１％ギ酸含有７５％アセトニトリル（流量＝０．６ｍｌ／分）。保持時間：Ｈｃｙ及び２Ｈ４−Ｈｃｙ４＝０．９分。較正曲線範囲２．５〜８０μｍｏｌ／Ｌ（水で調製２．４μｌ）。試料調製：図７参照。内部標準（ＩＳ, Internal standard）溶液：２Ｈ４−Ｈｃｙ  １０μＭ及び２Ｈ３−ＭＭＡ  ２μＭ、０．１％ＤＴＴ含有水で調製。ＭＳ／ＭＳの設定を以下の表にまとめる。
【００８５】
【表３】
2014520265.tif 000005
【００８６】
以下はＭＭＡ分析法の概要である。機器：ABSciex 5500 QTRAPに連結されたShimadzu Nexera ＨＰＬＣ；ＨＰＬＣカラム：Synergi Hydro-RP ２５０×３ｍｍ  ４μ（Phenomenex社）。ＨＰＬＣ溶出液Ａ−０．１％ギ酸含有水、Ｂ−０．１％ギ酸含有メタノール。以下の表は勾配プロファイルを含む。
【００８７】
【表４】
2014520265.tif 000006
【００８８】
保持時間：ＭＭＡ及び２Ｈ３−ＭＭＡ＝５．５分。較正曲線範囲２２１〜１４９９ｎｍｏｌ／Ｌ（Recipe社）。試料調製は図７に従った。内部標準（ＩＳ）溶液：２Ｈ４−Ｈｃｙ  １０μＭ及び２Ｈ３−ＭＭＡ  ２μＭ、０．１％ＤＴＴ含有水で調製。以下の表はＭＳ／ＭＳの設定を含む。
【００８９】
【表５】
2014520265.tif 000007
【００９０】
本発明を用いて、アッセイ内及びアッセイ間でｔＨｃｙ及びＭＭＡを矛盾なく測定することが可能であった。例えば、以下の表はアッセイ内及びアッセイ間の両方の方法の精度を示す。
【００９１】
【表６】
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【００９２】
図８は０日、１４日及び４２日を比較した、室温におけるＰＳＤ上のｔＨｃｙの安定性を示すグラフである。図９は種々の量の血漿をＰＳＤに適用した場合のＰＳＤ  ｔＨｃｙの容量依存性を示すグラフである。図１０はＥＳＲＤを有する対象において静脈穿刺とＰＳＤ収集を同時に行った場合の結果を示すグラフである。
【００９３】
本発明のＰＳＤは従来の採血法に対していくつかの利点を提供することが見出された：１．瀉血医の必要がない；２．血漿を分離するために遠心分離機を用いることが避けられる；３．血液収集チューブを開けることによって病原体に曝されることが避けられる；４．標本の輸送におけるドライアイスの使用が避けられる；５．冷凍庫における血漿の保存スペースが低減される；及び６．ＰＳＤを用いて収集した血液をマルチバリアパウチに入れてシールし、容易かつ安全に保存し、郵便で発送することができる。試料の取扱い、発送、及び保存の要求事項は、血漿ｔＨｃｙ及びＭＭＡの試験に付随するコストを総合的に低減する。
【００９４】
さらに、進行中の予備的研究によれば、この手法を用いて他の代謝物（例えばＳ−アデノシルメチオニン、Ｓ−アデノシルホモシステイン、メチオニン、非対称性ジメチルアルギニン、対称性ジメチルアルギニン及びその他のアミノ酸）も決定できるであろうことが示唆される。この方式の収集は高ホモシステイン血症の症例におけるモニタリング療法に有用であるが、臨床研究又は調査研究のために遠隔地において対象をスクリーニングするためにも有用であろう。
【００９５】
血漿分離デバイスを用いた指穿刺からのＰＫＵモニタリング
【００９６】
本発明は、フェニルアラニンの分析のための改善された在宅収集法として用いることができる、指穿刺から血漿を収集する新規な方法においても用いられた。
【００９７】
簡単に言えば、本発明はフェニルアラニンを分析するために用いられた。フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）の管理には、フェニルアラニンの食事制限と個体のフェニルアラニン血中レベルの頻繁なモニタリングの両方が含まれる。本発明者らによって、血漿分離デバイス（ＰＳＤ）を用いるフェニルアラニン及びチロシンの分析のための簡単、正確、かつ費用効果の良い方法が開発され、認証された。
【００９８】
方法：指穿刺血液（１又は２滴）をＰＳＤカードに添加し、ここで上層に細胞が保持される一方、血漿はディスクを通って第２層に濾過される。血漿（２．４μｌ）をディスクから抽出し、液体クロマトグラフィー−電気噴霧タンデム質量分析（4000QTRAP, ABSciex社）によってフェニルアラニン及びチロシンを決定する。
【００９９】
結果：本方法によって広い直線作動範囲（１０〜２０００μｍｏｌ／Ｌ）にわたって全分析不正確度１０％未満で、フェニルアラニン及びチロシンの両方の正確な決定が可能になる。血漿フェニルアラニン及びチロシンの値の比較（ＰＳＤ対血漿）は、優れた相関を示した（それぞれＰｅａｒｓｏｎ  ｒ＝０．９９２、勾配＝１．１；Ｐｅａｒｓｏｎ  ｒ＝０．９６９、勾配＝１．０２；ｎ＝１０）。ＰＳＤ上に収集した血漿フェニルアラニン及びチロシンは４℃で保存した場合、２年間安定である。
【０１００】
本方法により、ＰＳＤからのチロシン及びフェニルアラニンの正確な決定が可能になる。以下の表に本発明のＰＳＤを使用した結果を示す。
【０１０１】
【表７】
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【０１０２】
図１１は血漿及びＰＳＤにおけるチロシンについての相関を示すグラフである。図１２は血漿及びＰＳＤにおけるフェニルアラニンについての相関を示すグラフである。
【０１０３】
本発明はＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ及びアルギニンの回収を測定するためにも用いられた。以下の表に本発明を用いたＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ及びアルギニンの回収の結果を示す。
【０１０４】
【表８】
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【０１０５】
図１３は血漿及びＰＳＤにおけるＡＤＭＡについての相関を示すグラフである。図１４は血漿及びＰＳＤにおけるＳＤＭＡについての相関を示すグラフである。図１５は血漿及びＰＳＤにおけるアルギニンについての相関を示すグラフである。
【０１０６】
ＰＳＤ上に血液試料を収集し、引き続いて濾過して血漿を得ることは単に少量を必要とするのみであり、それにより従来の濾紙上の全血に比べて試験室における標本の廃棄が少なくなることが見出された。ＰＳＤ収集法により、在宅設定又は臨床研究及び／若しくは調査研究のための遠隔地における対象の疾患又は治療の正確なモニタリングが可能になる。
【０１０７】
本明細書において検討したいかなる実施形態も、本発明の任意の方法、キット、試薬、又は組成物に関して実施でき、逆もそうであることが意図されている。さらに、本発明の組成物は本発明の方法を実現するために用いることができる。
【０１０８】
本明細書に記載した特定の実施形態は説明のために示されており、本発明を限定するためではないことが理解されよう。本発明の範囲から逸脱することなく、種々の実施形態において本発明の主要な特徴を利用することができる。当業者は本明細書に記載した特定の手順に対する多数の等価物を日常の実験の範囲内で認識し、又は確認することができよう。そのような等価物は本発明の範囲内にあると考えられ、特許請求の範囲に含められている。
【０１０９】
本明細書に記述した全ての出版物及び特許出願は本発明が関係する技術分野における当業者の技能レベルを示すものである。全ての出版物及び特許出願は、各々の個別の出版物又は特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１０】
特許請求の範囲及び／又は明細書において用語「含む（comprising）」と併せて用いられる場合には、単語「ａ」又は「ａｎ」の使用は「１つの」を意味し得るが、「１又は２以上」、「少なくとも１つ」、及び「１つ又は２つ以上」の意味とも矛盾しない。特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、選択肢のみを指すと明確に示されない限り、又は選択肢が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために用いられるが、本開示は選択肢のみ、及び「及び／又は」を指す定義を支持している。本出願を通して用語「約」は、値がデバイス、その値を決定するために用いられる方法、又は研究対象の間に存在する変動に固有の誤差変動を含むことを示すために用いられる。
【０１１１】
本明細書及び特許請求の範囲において用いられる場合、単語「含む（comprising）」（並びに「comprise」及び「comprises」等のcomprisingの任意の形）、「有する（having）」（並びに「have」及び「has」等のhavingの任意の形）、「含む（including）」（並びに「includes」及び「include」等のincludingの任意の形）又は「含む（containing）」（並びに「contains」及び「contain」等のcontainingの任意の形）は、包括的又はオープンエンドであって、追加的な、言及されていない要素又は方法ステップを排除するものではない。
【０１１２】
本明細書において用いられる場合、用語「又はそれらの組み合わせ」は、その用語に先立つ列挙された項目の全ての順列及び組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はそれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣの、及び特定の文脈において順序が重要である場合には、またＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、又はＣＡＢの少なくとも１つを含むことを意図している。この例を続ければ、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢ等の１又は２以上の項目又は用語の繰り返しを含む組み合わせが明示的に含まれる。文脈から他が明白でない限り、いかなる組み合わせにおいても典型的には項目又は用語の数に限定はないことは、当業者には理解されよう。
【０１１３】
本明細書において開示し特許請求する全ての組成物及び／又は方法は、本開示を考慮することにより、不必要な実験をすることなく、作成及び実行することができる。本発明の組成物及び方法は好ましい実施形態に関して記述されているが、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、組成物及び／又は方法に対し、並びに本明細書に記載した方法のステップ又はステップの順列において変化させることができることは、当業者には明らかであろう。当業者には明らかなそのような同様の置換物及び改変の全ては、添付した特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲及び概念の中にあるとみなされる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図５Ｃ−５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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