(57)【要約】本開示は、ドメインの付加及び進化を通じて既存のタンパク質−タンパク質相互作用を操作する包括的方法を提示する。本開示は、ノッチンペプチドの一部が特定の標的への結合用に創出された配列で置換されたノッチンペプチドを含む新規な融合タンパク質の創出を教示する。かかる融合タンパク質は、２個又は３個以上の受容体又は受容体リガンドに結合できる及び／又はそれらを阻害できるため、二重特異性又は多重特異性でもあり得る。ノッチンは、リガンド−受容体相互作用を増加させるため又は多重特異性タンパク質を創出するための一般的なプラットフォームとして既存のリガンド（又は受容体）と融合することができる。加えて、前記融合タンパク質は、ノッチンの適切な発現及び折り畳みを促す別のタンパク質に融合させたノッチンペプチドを含み得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第一の標的に結合するための結合ループを中に有するノッチンポリペプチドと、
（ｂ）第二の標的に結合するための配列を中に有する第二ポリペプチドであって、（i）該第二の標的に結合する細胞表面受容体か又は（ii）該第二の標的に結合する細胞表面受容体リガンドである第二ポリペプチドと、
を含む、融合タンパク質。
【請求項２】
前記ノッチンポリペプチドが、ＥＥＴＩ−ＩＩ、ＡｇＲＰ又はアガトキシンのいずれか１つである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ノッチンポリペプチドがω−コノトキシンである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ノッチンポリペプチドが、その結合ループ中に非天然配列を含有する、請求項１、２又は３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記非天然配列が、細胞とそれを取り囲む組織との間の接着を媒介する、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ノッチンポリペプチドが、（ａ）αｖβ３インテグリン、（ｂ）αｖβ５インテグリン、及び（ｃ）α５β１インテグリンのうちの１又は２以上との結合を媒介する配列を含有する、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記第二ポリペプチドが、受容体型チロシンキナーゼの細胞外ドメインである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記第二ポリペプチドが、受容体型チロシンキナーゼのＩｇ１ドメインである、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記Ｉｇ１ドメインが、Ａｘｌ受容体、ＭｕＳＫ受容体、又はＦＧＦ受容体に由来する、請求項７に記載の融合タンパク質。  
【請求項１０】
前記受容体型チロシンキナーゼがＡｘｌ受容体である、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記ノッチンポリペプチドが、ＥＥＴＩ−ＩＩ、ＡｇＲＰ及びアガトキシンからなる群より選択される、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記結合ループが、（ａ）αｖβ３インテグリン、（ｂ）αｖβ５インテグリン、及び（ｃ）α５β１インテグリンのうちの１又は２以上と結合するように操作されている、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
（ａ）インテグリンに対して高い親和性を有する結合ループを含む、ＥＥＴＩ−ＩＩ又はＡｇＲＰノッチンポリペプチドと、
（ｂ）（i）Ａｘｌ細胞外ドメイン、及び（ii）肝細胞増殖因子のＮＫ１断片からなる群より選択されるポリペプチドと、
を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
（ａ）ＤＮＡ構築物内に前記融合タンパク質と多数のランダム化ＤＮＡ配列とをコードする多数のＤＮＡ構築物を有するライブラリーを調製する工程と、
（ｂ）該ライブラリーの該ＤＮＡ構築物を酵母で発現させ、発現したＤＮＡ構築物が該酵母表面上にランダム化配列を有するポリペプチドとして提示される工程と、
（ｃ）クローンを標的と接触させることによって、該発現したＤＮＡ構築物と第一の標的又は第二の標的との結合について該クローンをスクリーニングする工程と、
（ｄ）該標的と高い親和性で結合する翻訳ＤＮＡ構築物を発現するクローンを選択する工程と、
（ｅ）該選択されたクローンのコード配列を得ることによって、前記融合タンパク質を調製することができる工程と、
を具える、請求項１に記載の融合タンパク質を調製する方法。
【請求項１５】
前記ノッチンが、ＥＥＴＩ−ＩＩ、ＡｇＲＰ、アガトキシン又はコノトキシンのうちの１つである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第二ポリペプチドが、リガンド結合部位を含む受容体断片と、リガンドの受容体に結合する部位を含むリガンド断片とからなる群より選択される、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第二ポリペプチドが、チロシンキナーゼ受容体断片である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記第二ポリペプチドが、増殖因子断片である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記第二ポリペプチドが、Ａｘｌ、ｃ−Ｍｅｔ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、及びＧａｓ６からなる群より選択されるポリペプチドを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記ノッチンポリペプチドがＥＥＴＩ−ＩＩである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記ノッチンが、インテグリンに結合するように操作されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記インテグリンが、（ａ）αｖβ３インテグリン、（ｂ）αｖβ５インテグリン、及び（ｃ）α５β１インテグリンのうちの少なくとも１つである、請求項２１に記載の方法、
【請求項２３】
前記ノッチンが、ループ１及びループ３が操作されたＥＥＴＩ−ＩＩである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
(ａ)（i）阻害される受容体の細胞外ドメインをコードするポリペプチドと、（ii）阻害される受容体でない細胞表面受容体に結合するように操作されたループドメインを有するノッチンポリペプチドと、を含む一定量の可溶性融合タンパク質を投与する工程を具える、受容体に対するリガンドの結合を阻害する方法。
【請求項２５】
前記細胞表面受容体がインテグリンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記阻害される受容体が受容体型チロシンキナーゼである、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記チロシンキナーゼがＴＡＭ受容体型チロシンキナーゼである、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１０年１１月８日に出願された米国仮特許出願第６１／４１１,３５０号に基づく優先権を主張し、参照することにより前記仮特許出願の全体が本明細書に含まれるものとする。
【０００２】
［政府支援の陳述］
本発明は、国立衛生研究所により授与された契約ＣＡ１５１７０６の下で政府支援によってなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
［配列表への言及］
本国際出願は、ＥＦＳ−ＷｅｂによりＡＳＣＩＩ形式で提出している配列を含み、参照することによりその全体が本明細書に含まれるものとする。この配列表は、２０１１年１１月７日に作成され、６１,４４０バイトの大きさを有し、“381593pct.txt”と名付けられている。
【０００４】
本発明は、タンパク質工学の分野に関し、ノッチンペプチド、すなわち、特に詳細に明らかにされた骨格及び高い安定性を有し、本技術分野でシスチンノット・ミニタンパク質とも呼ばれるペプチドの分野に関する。
【背景技術】
【０００５】
［関連技術］
発明の詳細な説明において言及される技術的特徴に関し得るため、本発明の特定態様に関する背景情報を下に示すが、詳細に説明する必要はない。つまり、本発明で使用される個別の部分又は方法は、下記で論じる材料において更に詳細に説明でき、これら材料は、当業者に対し、特許請求の範囲に記載された本発明の特定態様を創出する又は使用するための更なる案内を提供し得る。下記の論述は、本願のあらゆる請求項又は記載される材料の先行技術的効果に対する情報の関係性についての同意として解釈されるべきでない。
【０００６】
タンパク質−タンパク質相互作用は、生体のほぼ全ての過程及び遺伝子の複製を媒介し、組み換えは、タンパク質機能の進化にとって重要であると考えられる。指向進化はタンパク質の最適化にとって計り知れないほど貴重なツールであるが、試験管内での進化ストラテジーは、一般に、対象のタンパク質の活性部位又は結合部位を直接的に操作することに焦点を合わせる。タンパク質機能の指向進化における遺伝子の複製及び組み合わせの力を利用する例は限られている。
【０００７】
特異的な分子認識事象は、生体においてリガンドと受容体との間の相互作用を規定する。これら相互作用は、多くの生物学的過程を媒介し、多数の生理学的過程における分子認識の重要性を強調する。分子認識の操作は、タンパク質に基づくバイオセンサー、イメージング剤、及び治療薬候補を開発するためにバイオテクノロジー分野で幅広く用いられている。認識の増強を図るための従来方法は、特異的相互作用を最適化すること、例えば、天然のタンパク質−タンパク質相互作用の抗体認識又は親和性成熟を増強すること、に焦点を合わせる。しかしながら、事実上、分子認識は、しばしば複数のドメインの境界面で起こり、遺伝子組み換えによるタンパク質ドメインの結合は、タンパク質機能の進化に強力な役割を果たすと考えられる。この方法を生体外でのタンパク質機能の操作に用いた文献は数例である。既存の例は、完全に人工的な相互作用を進化させることか、又はタンパク質−ペプチド相互作用を最適化することに限られている。従来の指向進化研究がタンパク質の自然進化を理解する手掛かりを与えてきたのと同様に、ドメインの付加及び進化の自然のやり方を利用することは、自然進化経路を調査するための新たな手段を提供するであろう。更に、既存の高親和性タンパク質−タンパク質相互作用を増強することに焦点を合わせるドメインの付加及び進化の詳細解析は、分子認識の研究及びタンパク質操作ツールとしての使用に対する本方法の有用性の厳密な検査を提供するであろう。
【０００８】
［具体的な特許及び出版物］
ノッチンは、様々なノッチンペプチドの配列及び構造を提供するノッチンデータベースｈｔｔｐ：／／ｋｎｏｔｔｉｎ．ｃｂｓ．ｃｎｒｓ．ｆｒ／Ｋｎｏｔｔｉｎｓ．ｐｈｐに記載されている。
【０００９】
２０１０年３月９日に特許された、“速度論的に制御されたライゲーションによるタンパク質の収束合成”と題されたＫｅｎｔらの米国特許第７,６７４,８８１号明細書は、ＥＥＴＩ−ＩＩの合成を開示する。
【００１０】
“Ａｘｌ癌遺伝子”と題されたＬｉｕの米国特許第５,４６８,６３４号明細書は、ａｘｌ癌遺伝子活性を示す哺乳動物ａｘｌ受容体をコードする単離ＤＮＡ配列を開示する。
【００１１】
２００９年１０月１５日に公開された、「インテグリン結合性改変ペプチド」と題されたＣｏｃｈｒａｎらの米国特許出願公開第２００９／０２５７９５２号明細書は、フィブロネクチンの細胞表面受容体（α５β１インテグリン）又はビトロネクチンの細胞表面受容体（αｖβ３インテグリン及びαｖβ５インテグリン）に対して高い親和性（低い平衡解離常数(ＫＤ)）で結合するように操作したペプチドを開示する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
下記概要は、本発明の特徴及び態様を全て包含することを意図するものでなく、本発明が本概要で論じる特徴及び態様を全て包含しなければならないことを暗示するものでもない。簡潔にするため、選択的な組み合わせ又は部分組み合わせが明確に列挙されていなくとも、様々な実施形態の特定の特徴を組み合わせ得ることを理解できる。
【００１３】
従って、特定の態様において、本発明は、（ａ）第一の標的に結合するための結合ループを中に有するノッチンポリペプチドと、（ｂ）第二の標的に結合するための配列を中に有する第二ポリペプチドであって、（i）該第二の標的に結合する細胞表面受容体か又は（ii）該第二の標的に結合する細胞表面受容体リガンドである第二ポリペプチドと、を含む。ノッチンについて知られるように、結合ループは、典型的に、束縛されたシステイン残基間に存在する。これらループは、ランダム化配列のライブラリーを調製することによって改変することができる。本態様において、ノッチンポリペプチドは、その結合ループ内に非天然配列を含有する。つまり、前記配列は、ノッチンに天然に存在しない；好ましくは、前記配列は、高度な結合に対するスクリーニング手法によって選択される。本発明の特定の態様では、融合タンパク質が、細胞とそれを取り囲む組織との間の接着を媒介する非天然配列を含有するであろう。本発明の特定の態様では、ノッチンポリペプチドが、（ａ）αｖβ３インテグリン、（ｂ）αｖβ５インテグリン、及び（ｃ）α５β１インテグリンのうちの１又は２以上との結合を媒介する配列を含有する。本発明の特定の態様では、融合タンパク質が、受容体型チロシンキナーゼの細胞外ドメインである第二ポリペプチドを含む。本発明の特定の態様では、前記第二ポリペプチドが、受容体型チロシンキナーゼのＩｇ１ドメインである。本発明の特定の態様では、前記Ｉｇ１ドメインが、Ａｘｌ受容体、ＭｕＳＫ受容体、又はＦＧＦ受容体に由来する。本発明の特定の態様では、前記受容体型チロシンキナーゼがＡｘｌ受容体である。本発明の特定の態様では、前記ノッチンポリペプチドが、ＥＥＴＩ−ＩＩ、ＡｇＲＰ及びアガトキシンからなる群より選択される。本発明の特定の態様では、融合タンパク質が、（ａ）αｖβ３インテグリン、（ｂ）αｖβ５インテグリン、及び（ｃ）α５β１インテグリンのうちの１又は２以上と結合するように操作されている結合ループドメインを有する。
【００１４】
本発明の特定の態様では、融合タンパク質が、（ａ）インテグリンに対して高い親和性を有する結合ループを含む、ＥＥＴＩ−ＩＩ又はＡｇＲＰノッチンポリペプチドと、（ｂ）（i）Ａｘｌ細胞外ドメイン、及び（ii）肝細胞増殖因子のＮＫ１断片からなる群より選択されるポリペプチドと、を含む。
【００１５】
本発明の特定の態様は、（ａ）ＤＮＡ構築物内に前記融合タンパク質及び多数のランダム化ＤＮＡ配列をコードする多数のＤＮＡ構築物を有するライブラリーを調製する工程と、（ｂ）該ライブラリーの該ＤＮＡ構築物を酵母で発現させ、発現したＤＮＡ構築物が該酵母表面上にランダム化配列を有するポリペプチドとして提示される工程と、（ｃ）クローンを標的と接触させることによって、該発現したＤＮＡ構築物と第一の標的又は第二の標的との結合について該クローンをスクリーニングする工程と、（ｄ）該標的と高い親和性で結合する翻訳されたＤＮＡ構築物を発現するクローンを選択する工程と、（ｅ）該選択されたクローンのコード配列を得ることによって、前記融合タンパク質を調製することができる工程と、を具える、融合タンパク質を調製する方法を含む。
【００１６】
本発明の特定の態様は、(ａ)（i）阻害される受容体の細胞外ドメインをコードするポリペプチドと、（ii）阻害される受容体でない細胞表面受容体に結合するように操作されたループドメインを有するノッチンポリペプチドと、を含む一定量の可溶性融合タンパク質を投与する工程を具える、受容体に対するリガンドの結合を阻害する方法を含む。
【００１７】
様々な前記方法の特定の態様では、前記チロシンキナーゼがＴＡＭ受容体型チロシンキナーゼである。
【００１８】
特定の態様において、本発明は、改変ノッチン部分と、好ましくは受容体、受容体リガンド又は該天然分子の結合特性を有するそれらの断片である別の結合部分とを含有する、二重特異性又は多重特異性の融合タンパク質を調製する方法を含む。このように調製される融合タンパク質は、２個の異なる結合部分と２個の異なるリガンドとを有する。ノッチン部分は、そのＣ末端で、結合部分のＮ末端と融合する。あるいは、ノッチン部分は、そのＮ末端で結合部分のＣ末端と融合してもよい。
【００１９】
特定の態様において、本発明は、（ａ）前記融合タンパク質及び多数のランダム化ループドメインをコードする多数のＤＮＡ構築物を有し、一定の結合多様性とライブラリーから選択される多数の強力な結合体とを提供するライブラリーを調製する工程、（ｂ）ライブラリー中のＤＮＡ構築物をタンパク質変異型として発現させる工程と、（ｃ）第二結合パートナーに対するタンパク質変異型の結合についてライブラリーをスクリーニングする工程と、（ｄ）第二結合パートナーに高い親和性で結合するＤＮＡ構築物を発現するクローンを選択する工程と、（ｅ）選択したクローンのコード配列を得る工程とを具え、これによって融合タンパク質を調製することができる、第二結合パートナーに対して高い親和性で結合するように操作されたループドメインを有する第二ポリペプチド（例えば、ノッチン）に融合する第一結合パートナー（例えば、受容体又は受容体リガンド）に結合する第一ポリペプチドを含む融合タンパク質を調製する方法を含む。選択される第二結合パートナーは、完全に異なる分子（タンパク質、糖タンパク質、多糖、脂質、細胞構造体、ウイルスエピトープ等）であっても、又は第一結合パートナー（受容体若しくは受容体リガンド）に対する結合部位上の異なるエピトープであってもよい。特定の態様において、本発明は、受容体断片である第一ポリペプチドを利用する。例えば、様々なドメインを有する細胞表面受容体を、細胞外リガンド結合ドメインをコードする断片の形態で用いる。細胞表面受容体は、受容体型チロシンキナーゼでもよい。本発明の特定の態様では、第一ポリペプチドが、受容体リガンドであっても、又は受容体に結合する該リガンドの断片であってもよい。リガンドは、アゴニストであってもアンタゴニストであってもよい。第一ポリペプチドは、Ａｘｌ、ｃ−Ｍｅｔ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体及びＧａｓ６からなる群より選択される配列の少なくとも一部分である配列を有し得る。
【００２０】
本発明の特定の態様では、第二ポリペプチドが、ノッチン足場であり、ＥＥＴＩ−ＩＩ、ＡｇＲＰ及びアガトキシンからなる群より選択され得る。ノッチン足場がω−コノトキシンであり得ることも考えられる。本発明の特定の態様では、ノッチンループドメインがインテグリンに結合するように操作されている。本発明の特定の態様では、前記方法が、対象の標的との結合について選択されたループ部分を有するランダム酵母ディスプレイライブラリーをクローン化する工程を具える。
【００２１】
特定の態様において、本発明は、受容体リガンドポリペプチドを含む融合タンパク質を含み、前記受容体リガンドは、特異的受容体結合部位で受容体と結合し、受容体リガンドに対する特異的受容体結合部位でない結合パートナーに高い親和性で結合するように操作されたループドメインを有するノッチンポリペプチドに融合されている。本発明の特定の態様では、前記受容体リガンドポリペプチドが天然リガンドの断片である。本発明の特定の態様では、前記融合タンパク質が、第一クリングルドメインでＨＧＦアミノ末端を構成する、肝細胞増殖因子のＮＫ１断片のような増殖因子断片である断片を含む。
【００２２】
本発明の特定の態様は、受容体ポリペプチドを含む融合タンパク質を含み、前記受容体は、特異的リガンド結合部位でリガンドに結合し、特異的リガンド結合部位でない結合パートナーに高い親和性で結合するように操作されたループドメインを有するノッチンポリペプチドに融合されている。受容体型チロシンキナーゼは、固形腫瘍進行に関与する受容体型チロシンキナーゼであるＡｘｌ及び肝細胞増殖因子受容体であるＭＥＴからなる群より選択され得る。受容体型チロシンキナーゼは、Ｔｙｒｏ−３及びＭｅｒのような、Ａｘｌの近縁種である近縁な受容体型チロシンキナーゼを含み得る。
【００２３】
本発明の特定の態様では、前記融合タンパク質が、ＥＥＴＩ−ＩＩ、ＡｇＲＰ及びアガトキシンからなる群より選択されるノッチンポリペプチドを含む。本発明の特定の態様では、前記融合タンパク質が、α５β１インテグリン、αｖβ３インテグリン又はαｖβ５インテグリンのうちの少なくとも１つに結合するように操作されたループドメインを含む。本発明の特定の態様では、前記ループドメインがβ３インテグリンに結合するように操作されている。本発明の特定の態様では、前記ループドメインがαｖインテグリンサブユニット又はβ３インテグリンサブユニットに結合するように操作されている。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】Ａｘｌ細胞外ドメインの模式図である。
【図１Ｂ】ＥＥＴＩ−ＩＩ結晶構造のリボンレンダリングである。
【図１Ｃ】Ｇａｓ６リガンドに結合したＡｘｌ−ＥＥＴＩ−ＩＩ融合体の模式図である。
【図１Ｄ】ＥＥＴＩ−ＩＩ−ａｘｌ融合体ライブラリー作成並びに融合体ＥＡ  ７．０１、７．０３、７．０５、８．０４及び８．０５を得るためのスクリーニングの説明である。ループ１及びループ２両方ともランダム化されているのが分かる；Ａｘｌ１のＩｇ１配列の一部分のみが表示されている。これら配列は、ＡｘｌのＩｇ１部分の長さのため、短縮されている。
【図２Ａ】酵母提示構築物の模式図である。
【図２Ｂ】野生型Ａｘｌ  Ｉｇ１による結合と出発Ｅ−Ａｘｌライブラリーによる結合との比較を示す一組の散布図である。
【図３】ＥＡ−Ａｘｌライブラリーのスクリーニングの結果及び分取進行過程の一組の散布図である。
【図４】野生型Ａｘｌ  Ｉｇ１、野生型ＥＥＴＩ−Ａｘｌ及びＥＡ（“ＥＥＴＩ−ＩＩ−Ａｘｌ”）変異体のＧａｓ６に対する平衡結合を示すグラフである。実験の代表データは、別々の日に３連で実施した。
【図５】野生型Ａｘｌ  Ｉｇ１又はＥＡ変異体の可溶性Ｇａｓ６からの解離速度を示すグラフである。野生型Ａｘｌ  Ｉｇ１は単一指数デコイモデルに充分にあてはまり、一方ＥＡ変異体は二重指数デコイモデルにあてはまった。実験の代表データは、別々の比に３連で実施した。
【図６】ＥＡ変異体中の個々のループの貢献を示す一連のグラフである。（図６Ａ）ＥＡ７．０１、（図６Ｂ）ＥＡ７．０６、（図６Ｃ）ＥＡ８．０４の野生型への復帰である。ｗｔＬ１又はｗｔＬ３は、それぞれロープ１又はループ３の野生型ＥＥＴＩ−ＩＩループ配列を指す。参考のために各プロットに野生型(ｗｔ)ＥＥＴＩ−Ａｘｌに対する持続的結合が示されており、ループ１とループ３の双方の野生型ＥＥＴＩ−ＩＩ配列への“復帰”を表す。データは別々の３日で実施した実験の平均値であり、エラーバーは±標準偏差である。
【図７】表面提示されたＡｇＲＰ−Ａｒａｓ４融合タンパク質の可溶性αｖβ３インテグリン及びＭｅｔ受容体に対する結合を、ＡｇＲＰ７Ａ及びＮＫ１変異体Ａｒａｓ４と比較して示す一対の棒グラフである。
【図８】αｖβ３インテグリン及びＭｅｔ受容体を発現する細胞に対する融合タンパク質ＡｇＲＰ７Ａ−Ａｒａｓ４の結合滴定を示す線グラフである。
【図９】Ａｘｌ−ＥＥＴＩ直接融合タンパク質のＧａｓ６に対する結合（図９Ａ）及びαｖβ３インテグリンに対する結合（図９Ｂ）を示す一対のグラフである。
【図１０】ビトロネクチンでコーティングしたマイクロタイタープレートに対するＰＣ３腫瘍細胞接着の阻害を示すグラフである。ノッチン２．５Ｆ−Ｆｃ及び２．５Ｄ−Ｆｃ（Ｆｃ部分に融合したノッチン−インテグリン）は、低ナノモル範囲の濃度でＰＣ３細胞接着を阻害する。陰性コントロールは、無関係のタンパク質である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
［要約］
本発明は、異なる結合機能を提供する第二の異なるペプチド又はタンパク質と融合した操作したノッチンペプチドを含む新規な融合タンパク質の創出を含む。第二ポリペプチドは、受容体又は受容体リガンドである。好ましくは、ノッチンペプチドの一部分が、インテグリンに結合するように作成された配列で置き換えられている。加えて、融合タンパク質は、ノッチンの適切な発現及び折り畳みを促す別のタンパク質に融合したノッチンペプチドを含み得る。
【００２６】
本発明は、受容体リガンド結合を増強するのに用い得る。リガンド−受容体相互作用に関与する天然タンパク質は、治療薬候補の操作の有望な出発点である。タンパク質−タンパク質相互作用の操作に関する従来のアプローチは、既存の相互作用を最適化することに焦点を合わせてきた。しかしながら、本来、タンパク質−タンパク質相互作用は、しばしば、複数のドメインの接合部で起こり、遺伝子組み換えは、タンパク質機能の進化に強力な役割を果たす。これらの知見を用いて、我々は、我々が“ドメインの付加及び進化”と呼び、合成結合ドメインの付加及びそれに続く試験管内進化を通じて結合境界面を拡張することによって増強を達成する、既存のタンパク質−タンパク質相互作用の操作に関する遺伝的アプローチを開発した。  
【００２７】
図１は、本発明の融合が、受容体−リガンド結合に対し別のエピトープを実際に付加することを示す。図１Ａは、Ａｘｌ細胞外ドメインが、２個の免疫グロブリン様ドメイン（Ｉｇ１及びＩｇ２）、そして２個のフィブロネクチンＩＩＩ型様（Ｆｎ）ドメインを含むことを示す。図１Ｂは、ＥＥＴＩ−ＩＩ結晶構造（ＰＤＢ番号２ＥＴＩ）を示す。ドメインの付加及び進化ライブラリー用にランダム化したループ１及び３は、黒色で示す。システインＩ〜ＶＩを記す。図１Ｃは、ドメイン付加ストラテジーを示す概略図である。ＥＥＴＩ−ＩＩ変異体ライブラリーは、Ａｘｌ  Ｉｇ１のＮ末端（構造の左下へ向かう黒色リボン）に結合され、Ｇａｓ６リガンド上の隣接エピトープに結合するＥＥＴＩ−ＩＩ変異体をスクリーニングする。Ａｘｌ−Ｇａｓ６構造は、ＰＤＢ番号２Ｃ５Ｄから出典されている。図１Ｄは、ランダム化したＥＥＴＩ−ＩＩのループＩ領域及びループ３領域並びにＡｘｌ  Ｉｇ１ドメインへの融合を示すアミノ酸配列のリストを示す。図は、ＰｙＭｏｌを用いて作成した。
【００２８】
図２Ａ及び２Ｂは、酵母提示構築物及びＡｘｌに連結した出発Ｅ−ＡｘｌライブラリーＥＥＴＩ−ＩＩ変異体（ランダム化ループ）の評価を示す。（２Ａ）酵母提示Ｅ−Ａｘｌ構築物。対象のタンパク質は、酵母Ａｇａ１タンパク質にジスルフィド結合した酵母Ａｇａ２タンパク質に対する遺伝的融合体として発現される。Ａｇａ１タンパク質が酵母細胞壁に共有結合することによって、提示構築物全体を酵母細胞表面に連結する。酵母ディスプレイにおけるＡｇａ１タンパク質及びＡｇａ２タンパク質の使用は、抗体の表面提示と関連して既に報告されている。例えば、Ｋ．Ｄａｎｅ  Ｗｉｔｔｒｕｐらによる“タンパク質の酵母細胞表面ディスプレイ及びその使用”と題された米国特許第６４２３５３８号明細書を参照されたい。
【００２９】
対照のタンパク質に隣接するＨＡエピトープタグ及びｃ−ｍｙｃエピトープタグは、市販の抗体を用いて相対的酵母表面発現レベルについて染色することができる（参考のために示すｃ−ｍｙｃ染色）。可溶性Ｇａｓ６は、酵母提示タンパク質に対する結合を検査するのに用いることができる；Ｇａｓ６結合は、Ｇａｓ６上のヘキサヒスチジンタグ（配列番号７７）に対する蛍光標識抗体で装飾される。図２Ｂは、野生型Ａｘｌ  Ｉｇ１による結合と出発Ｅ−Ａｘｌライブラリーによる結合との比較を示す散布図を表す。
【００３０】
［I. 二重特異性又は多重特異性結合を有するノッチン融合体］
特定の態様において、本発明は、治療効果の増加のために２個以上の受容体若しくは受容体リガンドに結合する及び／又はそれらを阻害することができるという点で二重特異的又は多重特異的である融合タンパク質を含む。これら融合体は、一例として、インテグリン結合部分を含有するように操作されたＮ末端又はＣ末端ノッチンを含み得る。インテグリン結合ノッチンは、Ｃｏｃｈｒａｎらによる“改変インテグリン結合ペプチド”と題された米国出願公開第２００９／０２５７９５２号明細書に記載されている。フィブロネクチン（α５β１インテグリン）又はビトロネクチン（αｖβ３インテグリン及びαｖβ５インテグリン）に高い親和性（低い平衡解離常数(ＫＤ)）で結合する改変ペプチドが開示される。新規な結合特性を有するノッチンは、融合して、ヘテロオリゴマー二重特異性タンパク質を生成することができる。この手法は、最終段落に記載されている通り、参照により本明細書に含まれるものとし、インテグリン結合ノッチンの説明のため更に閲覧され得る。ここで用いる具体的なインテグリン結合パートナーは、αインテグリン鎖とβインテグリン鎖の両方に特異的であっても、又はβ鎖のみに特異的であってもよい。後者の場合、様々なα−βインテグリンの組み合わせが存在するであろうことから、インテグリン結合は多重特異的であろう。
【００３１】
例えば、インテグリン結合ノッチン−リガンド融合体は、増殖因子ＮＫ１の断片を用いて創出されている。インテグリン結合ノッチンは、α５β１、αｖβ３及びαｖβ５、特にαｖβ３インテグリンのような選択したインテグリンに特異的に結合するように操作されているループを含有する。ＮＫ１は、ＭＥＴ受容体のアゴニストとして働くポリペプチド増殖因子ＨＧＦ／ＳＦの断片である。これは、Ｇｈｅｒａｒｄｉによる“肝細胞増殖因子／散乱係数（ｈｇｆ／ｓｆ）のＮＫ１断片及びその変異型、並びにそれらの使用”と題された米国出願公開第２００４号／０２３６０７３号により詳細に記載されている。簡単に述べると、ＨＧＦ／ＳＦは、血液プロテイナーゼ前駆体プラスミノーゲンのものに似て、６個のドメイン：プラスミノーゲン活性化ペプチドと相同なＮ末端（Ｎ）ドメインと、クリングル（Ｋ）ドメインの４個のコピーと、触媒的に不活性なセリンプロテイナーゼドメインとからなるユニークなドメイン構造を有する。一次ＨＧＦ／ＳＦ転写物の選択的スプライシングの２種の生成物は、Ｎドメインと第一ＫドメインであるＫ１とを含有する断片であるＮＫ１と、ＮとＫ１と第二クリングルドメインであるＫ２とを含有する断片であるＮＫ２とをコードする。その配列は、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ, Ｍａｒｃｈ １９９８, ｐ. １２７５−１２８３, Ｖｏｌ. １８, Ｎｏ. ３に見ることができる。
【００３２】
別の例として、Ａｘｌを用いて、インテグリン結合ノッチン−受容体融合体を調製した。Ａｘｌ受容体は、Ｌｉｕの米国特許第５４６８６３４号明細書に記載されている。簡単に述べると、Ａｘｌは、ＩｇＬ及びＦＮＩＩＩリピートを並べた細胞外領域の構造を有する受容体型チロシンキナーゼである。これは、細胞増殖の刺激に関与する。これは、ビタミンＫ依存性タンパク質Ｇａｓ６に結合することができ、よって細胞質へ信号を伝達する。Ａｘｌの細胞外ドメインは切断することができ、６５ｋＤａの可溶性細胞外ドメインを遊離することができる。切断は、受容体のターンオーバーを増強し、部分的に活性化されたキナーゼを生成する（Ｏ’Ｂｒｙａｎ Ｊ Ｐ, Ｆｒｉｄｅｌｌ Ｙ Ｗ, Ｋｏｓｋｉ Ｒ, Ｖａｒｎｕｍ Ｂ, Ｌｉｕ Ｅ T. (１９９５) Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ. ２７０(２)：５５１−５５７）。しかしながら、切断されたドメインの機能は未知である。
【００３３】
Ａｘｌ受容体は、２個のＧａｓ６結合部位：Ｉｇ１ドメインに位置する主要な高親和性部位と、Ｉｇ２ドメインに位置する弱い副次的な部位とを有する（図１Ａ）。Ｇａｓ６が、その高親和性部位を介してＡｘｌと結び付くと、その後の弱い結合部位を介した結合が受容体の二量体化及び活性化をもたらし、活性な２：２シグナル伝達複合体が形成される。Ａｘｌ過剰発現が様々な範囲の癌細胞株において浸潤及び転移をもたらし、Ａｚｌシグナル伝達の阻害が腫瘍細胞の移動及び転移を阻害するため、これは、治療上関連するリガンド−受容体システムである。生成した二重特異性タンパク質は、高い親和性でインテグリン及びＡｘｌリガンドＧａｓ６と結合する。図１は、配列がドメインの付加及び進化ライブラリー生成及びスクリーニングの概要を表すことを示し；第一行は、システイン結合及びシステイン間のループを有する野生型ＥＥＴＩ−ＩＩ配列を示し；第二行は、ｘ残基が加えられたループ１及び３を示し；ＥＥＴＩ−ＩＩのループ１及び３は、ランダム化されてループライブラリーを生成し、Ａｘ１  Ｉｇ１のＮ末端に融合される；第三行は、ＥＥＴＩ−ＩＩ−ａｘｌ融合変異体であるＥＡ  ７．０１、ＥＡ  ７．０６及びＥＡ  ８．０４の配列を示す；最下行は、ＰＧＭモチーフ又はＰ−Ｇ／Ｔ−Ｍ／Ｋモチーフの同定に由来する配列を列挙する。
【００３４】
Ａｘｌアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ  ＵｎｉＧｅｎｅ２６３６２及びＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ３０５３０で見ることができる。
【００３５】
本発明の別の態様において、ノッチンに融合した受容体又は他の融合タンパク質は、結合目的で変異させられたノッチンに融合することに加えて、結合目的で修飾及び変異もさせられる。これは、実施例６に示される。この実施例において、デコイとして用いられるべき受容体は、最初に細胞外ドメインへ短縮される。Ａｘｌの場合、シグナルペプチドの部分及び細胞ガイドメインの小部分（約４２６アミノ酸の細胞外ドメインから約１１０アミノ酸）を用いた。変異性ＤＮＡ増幅を用いて、受容体断片をコードするＤＮＡ配列に変異を導入する。得られたクローンを天然リガンド（Ａｘｌの場合はＧａｓ６）に対する結合性に対してスクリーニングして、より強力な結合体を、例えばセルソーティングによって選択する。様々な受容体構築物を用いることができた。
【００３６】
このノッチン−Ａｘｌ融合体は、インテグリン結合と天然Ｇａｓ６／Ａｘｌ相互作用の両方に同時に拮抗できる二重特異性又は多重特異性分子として機能することができる。Ｇａｓ６は可溶性リガンドである一方、インテグリンは細胞表面受容体であり、両方の標的は同時に結合することができる。Ｇａｓ６の結合は該可溶性リガンドを捕捉し、その結合を妨げ、続いて内在性Ａｘｌ受容体の活性化を妨げる。インテグリン受容体に対する結合は、インテグリン受容体が細胞外基質タンパク質に結合するのを妨げるであろう。
【００３７】
受容体型チロシンキナーゼのような増殖因子受容体又はシグナル伝達受容体に対するインテグリン結合ペプチドの融合は、インテグリンと増殖因子受容体経路との間に有意なクロストークが存在するため、有利である。例えば、インテグリンとＭｅｔ受容体との間に強いクロストークが存在する。両方の受容体を標的とする薬物は、血管新生及び転移の阻害に一層優れるであろう。治療的タンパク質とインテグリン結合性ノッチンとの融合によるインテグリン標的化は、第二の治療薬を腫瘍細胞に局在化させて、結合活性効果により効力を増加させることもできる。更に、２個の腫瘍受容体を標的とすることができるイメージング剤は、増加したシグナルを発生させ、早期発見のため、より小さな腫瘍を検出することができる。
【００３８】
［ノッチン−Ｆｃ融合体］
本明細書に記載する融合タンパク質の別の例（実施例１２を参照）は、インテグリン結合性ノッチンとマウス抗体のＦｃ部分との間の融合体である。抗体のＦｃ部分は、免疫グロブリン分子を作り上げている２個の重鎖の２個のカルボキシ末端ドメインによって形成される。ＩｇＧ分子は、２個の重鎖（それぞれ約５０ｋＤａ）及び２個の軽鎖（それぞれ約２５ｋＤａ）を含有する。全ての抗体の全体構造は非常に類似しており、タンパク質の先端の小さな領域が極めて可変性であり、僅かに異なる先端構造を有する何百万の抗体が存在することを可能にする。この領域は超可変領域（Ｆａｂ）として知られている。他の断片は、抗原結合活性を持たないが、元々は容易に結晶化することが観察され、この理由のため、結晶可能な断片にちなんで、Ｆｃ断片と名付けられた。この断片は、対になったＣＨ２及びＣＨ３ドメインに相当し、エフェクター分子及び細胞と相互作用する抗体分子の一部である。重鎖アイソタイプ間の機能的相違は、主にＦｃ断片にある。抗体分子のＦｃ部分とＦａｂ部分とを結合するヒンジ領域は、堅固な蝶番ではなく、実際には、２個のＦａｂアームの独立な動きを可能にする柔軟なつなぎなわである。このことは、ハプテンに結合した抗体の電子顕微鏡検査によって実証されている。従って、本発明の融合タンパク質は、抗体断片の各アーム上に１個が存在する２個のノッチンペプチドを含有するように作成することができる。
【００３９】
Ｆｃ部分は、抗体のクラス（及びサブクラス）間で変動するが、そのクラスの範囲内では同一である。重鎖のＣ末端端部がＦｃ領域を形成する。Ｆｃ領域は、受容体結合部分として重要な役割を果たす。抗体のＦｃ部分は、２つの異なる方法でＦｃ受容体に結合する。例えば、ＩｇＧ及びＩｇＭがそれらのＦａｂ部分によって病原体に結合した後に、それらのＦｃ部分が（マクロファージのような）食細胞上の受容体に結合して食作用を誘導することができる。
【００４０】
本発明のノッチン−Ｆｃ融合体は、Ｆｃ部分を用いて二重の結合能力、及び／又は半減期の延長、発現レベルの向上等を提供するように実施することができる。
【００４１】
［II. リガンド受容体結合の改善に用いるノッチン融合体］
本発明の本態様において、ランダム化ループを有し受容体に融合したノッチンのライブラリーをスクリーニングして、改善されたリガンド結合を創出するプラットフォームとして用いる。一例として、ＥＥＴＩライブラリーをＡｘｌに融合させて、このライブラリーをスクリーニングして、Ｇａｓ６リガンドに対する増加した親和性を有するＥＥＴＩ−Ａｘｌ結合体を単離した。このように、ノッチンは、リガンド−受容体相互作用の親和性を増加させるための一般的なプラットフォームとして既存のリガンド（又は受容体）と融合させることができる。
【００４２】
ここで、我々は、合成ノッチン結合ドメインの付加及びそれに続く最適化によってタンパク質を操作する可能性を示す。このアプローチの能力を実証するため、我々は、１ラウンドのみの指向進化を用いて天然の高親和性（１桁台のナノモル）タンパク質−タンパク質相互作用をナノモル以下のレベルまで増強する。この研究を通じて、我々は、エクバリウム・エラテリウム（Ｅｃｂａｌｌｉｕｍ  ｅｌａｔｅｒｉｕｍ）のトリプシン阻害剤ＩＩ（ＥＥＴＩ−ＩＩ）ノッチンの表面上の２個の構造的に隣接したループを同時に操作して、外因性標的に向けた結合面を形成することができることも実証する。つまり、受容体及びリガンドは、融合したノッチン上のループを操作することによって、及び又は、受容体若しくはリガンド自体のループを操作することによって、付加的な表面で結合するか又は結合させることができる。この研究は、実験室進化研究に遺伝子の複製及び組み合わせの自然進化の過程を利用する可能性を実証し、タンパク質機能の調査及び最適化に広く応用できるはずである。
【００４３】
ドメインの付加及び進化のストラテジーは、既存のタンパク質−タンパク質相互作用の親和性を増大するための広範なストラテジーである。合成結合ドメインを、結合タンパク質のＮ末端又はＣ末端に融合させて、続いて、隣接エピトープに結合することによって結合パートナーに対する親和性を増大させるように進化させることができる。我々は、“ナイーブ”ライブラリーからの結合タンパク質の同定における応用も想定する。我々は、“ナイーブ”という用語により、標的に対して天然の結合を有さないタンパク質に基づくライブラリーを意味し、例えば、ＥＥＴＩ−ＩＩノッチンがＧａｓ６に対して天然の結合親和性を示さないことである。このアプローチの更なる応用は、ナイーブライブラリーからの結合タンパク質の同定を含む。腫瘍標的に結合するように操作したＥＥＴＩ−ＩＩペプチドは、生体内分子イメージング手法にとってかなり有望である。しかしながら、ナイーブライブラリーからの結合タンパク質の同定は、一つには、同定したタンパク質の親和性が検出に充分な程度に高くなければならないという要求のため、難しい。例えば、酵母表面提示結合において一桁台のμＭの範囲の親和性は検出限界を下回り、そのようなタンパク質は一般にライブラリーソーティングの間に濃縮されないであろう。ドメインの付加及び進化は、既存の相互作用を増強するが、それ自体は分離した状態で検出限界を下回る親和性を有する合成結合ドメインの同定を可能にする“アンカーリング”ストラテジーとして用いることができる。下記の実施例では、ノッチン変異体をＡｘｌの不存在下で発現させた場合、本発明で開発したＥＥＴＩ−ＩＩ変異体が、Ｇａｓ６に対し検出限界を下回る弱い結合親和性を示す。それに続く従来のストラテジー又は更なるドメインの付加及び進化による親和性成熟を用いて、高い親和性を有する合成結合薬物を充分に生成することができる。
【００４４】
［III. 折り畳まれた機能性ノッチンタンパク質の発現を増強するノッチン融合体］
ノッチンペプチドは、適切に折り畳まれた形態で得ることが困難な場合がある。ペプチドの化学合成及び再折り畳みを行うことはできるが、広範囲にわたる最適化を必要とする、この問題は、ノッチンをタンパク質に融合することによって軽減され得る。例えば、ＥＥＴＩ−ＩＩ２．５Ｄ（下記で説明する）は酵母で可溶型として発現できなかった。しかしながら、Ａｘｌに融合した場合、高収率の折り畳まれた機能性ノッチン−Ａｘｌ融合体が得られた。融合パートナーを切り離すためにプロテアーゼ切断部位をＥＥＴＩ−ＩＩ２．５ＤとＡｘｌとの間に導入した。これは、いずれかの融合パートナーを発現のために用いる場合の一般的なストラテジーであり得るか、又は、上述のような二重特異性タンパク質の作成の一環とし得る。
【００４５】
これは、Ｆｃ、ヒト血清アルブミン等のような修飾ドメインの融合にも影響を与え、治療的用途のために半減期を増加させるであろう。
【００４６】
発現が困難なノッチンを適切に発現したタンパク質に融合することによって、収率を向上させることができる。プロテアーゼ認識配列をノッチンと融合パートナーとの間に挿入する。これは、下記実施例７で例示されている。
【００４７】
［定義］
特に定義のない限り、本明細書中で用いる技術的及び科学的用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で記載されたものと類似する又は同等な方法及び材料は、本発明の実施又は試験において用いることができるが、好ましい方法及び材料を記載する。一般に、細胞及び分子生物学及び化学に関連して用いられる学術用語並びに細胞及び分子生物学及び化学の技術は、本技術分野で周知であり、通常用いられるものである。具体的に規定しないが、ある種の実験手法は、一般に、本技術分野で周知の通常の方法に従って、また本明細書の全体を通して引用され論じられる様々な一般的及びより詳細な参考文献に記載されたように、行われる。明確さの目的で、次の用語を下記で定義する。
【００４８】
“有効量”という用語は、改変ペプチドの同族結合パートナーとの結合を調節することができる本発明の融合タンパク質の量を意味する。有効量は、投与経路及び患者の病状に左右されるであろう。
【００４９】
“医薬として許容される”は、有効成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、投与された宿主にとって毒性でない、あらゆる担体を包含することを意味する。例えば、非経口投与のため、上記有効成分は、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリンガー溶液のようなビヒクルで注射用の単位剤形に調剤することができる。
【００５０】
「ノッチンタンパク質」という用語は、タンパク質類、糖類及び脂質類のような様々な分子標的に結合する、典型的には２４〜４０アミノ酸の小型タンパク質の構造ファミリーを意味する。これらの三次元構造は、３〜５個のジスルフィド結合の特有の配置によって本質的に規定される。２個の他の鎖内ジスルフィド結合によって制限される大環状分子を横断する１個のジスルフィド架橋を有する特徴的な結び目構造を持つトポロジーが、このクラスの生体分子に名前を貸した、同じシステインネットワークを有する幾つかの異なる微小タンパク質において見出された。その二次構造含量は低いが、ノッチンは、ジスルフィド結合骨格によって安定化した小型の三重鎖逆平行βシートを共有する。システインノットタンパク質とも呼ばれるノッチンファミリーの生化学的によく定義されたメンバーとしては、エクバリウム・エラテリウム種子由来のトリプシン阻害剤ＥＥＴＩ−ＩＩ、捕食性イモガイであるアンボイナイガイ（Ｃｏｎｕｓ  ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓ）由来の神経細胞Ｎ型Ｃａ２＋チャネル遮断剤であるω−コノトキシン、アグーチ関連タンパク質（ＡｇＲＰ、Ｍｉｌｌｈａｕｓｅｒら、“Ａｎｎ. Ｎ.Ｙ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ., Ｊｕｎｅ １, ２００３；９９４（１）：２７−３５を参照のこと）、オメガアガトキシンファミリー等が挙げられる。適切なアガトキシン配列は、米国特許出願公開第２００９／０２５７９５２号で与えられており、通常の発明者は本願と共に利用できる。別のアガトキシン配列は、ＧｅｎＢａｎｋ(登録商標)アクセッション番号Ｐ３７０４５のオメガ−アガトキシン−Ａａ４ｂ；Ｐ８１７４４のオメガ−アガトキシン−Ａａ３ｂ等で与えられる。その他のノッチン配列は、ＧｅｎＢａｎｋ(登録商標)アクセッション番号ＦＪ６０１２１８．１，ｋｎｏｔｔｉｎ［ベミシア・タバシ(Ｂｅｍｉｓｉａ  ｔａｂａｃｉ)］；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ８５０７９，オメガ−リコトキシン；及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ３４９１７，ミュー−ＯコノトキシンＭｒＶＩＡ＝電位作動型ナトリウムチャネル遮断剤で見出すことができる。
【００５１】
コノトキシン類は、一般に、長さが１０〜３０残基のペプチドからなる。具体的な例は、食魚性のイモガイであるヤキイモ（Ｃｏｎｕｓ  ｍａｇｕｓ）で見出された天然に存在するコノペプチドの合成等価体ジコノチドであるＰＲＩＡＬＴ(登録商標)である。ジコノチドは、２６３９ダルトンの分子量及びＣ１０２Ｈ１７２Ｎ３６Ｏ３２Ｓ７の分子式を有し３個のジスルフィド架橋を含有する２５アミノ酸の多塩基性ペプチドである。
【００５２】
ノッチンタンパク質は、特徴的なジスルフィド結合構造を有する。この構造は、Ｇｅｌｌｙら、“Ｔｈｅ ＫＮＯＴＴＩＮ ｗｅｂｓｉｔｅ ａｎｄ ｄａｔａｂａｓｅ： ａ ｎｅｗ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｄｅｄｉｃａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｋｎｏｔｔｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄ,” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, ２００４, Ｖｏｌ. ３２, Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ Ｄ１５６−Ｄ１５９にも説明されている。多数のノッチンに三重鎖βシートが存在する。この結び目構造に関与するシステインは、Ｃｙｓ残基が互いに結合していることを指し示す図１Ｄの線で結ばれて、示される。Ｃｙｓ残基間の空間は、本発明で重要であり、それは改変ループの分子トポロジー及び高次構造のためである。改変ループは、ＲＧＤを含み、インテグリン結合ループを提供することができる。これらの属性は、高親和性インテグリン結合にとって重要である。ＲＧＤ擬似ループをノッチンＣｙｓ残基間に挿入するが、このループの長さは、それらＣｙｓ残基間の三次元空間に依存する最適なインテグリン結合に応じて調節されなければならない。例えば、フランキングＣｙｓ残基が互いに結合している場合、最適なループは、フランキングＣｙｓ残基が一次配列において離れたＣｙｓ残基と結合している場合よりも短くなり得る。そうでなければ、高親和性インテグリン結合のために、より長いＲＧＤ含有ループを抑制する特定のアミノ酸置換を最適な高次構造へ導入することができる。
【００５３】
本発明のノッチンタンパク質は、作られたある種の修飾を含み、ノッチンを短縮しても又はループ若しくは不要なシステイン残基若しくはジスルフィド結合を除去してもよい。
【００５４】
“アミノ酸”という用語は、天然に存在するアミノ酸と合成アミノ酸の両方を包含し、アミノ酸のＤ体とＬ体の両方及びラセミ体を包含する。より具体的には、アミノ酸は、最大１０個の炭素原子を含む。それらは、付加的なカルボキシル基並びに窒素及び硫黄のようなヘテロ原子を含み得る。好ましくは、アミノ酸がαアミノ酸及びβアミノ酸である。αアミノ酸という用語は、カルボキシル基に直接結合した炭素であるα炭素にアミノ基が結合したアミノ酸を指す。βアミノ酸という用語は、カルボキシル基から１個離れた炭素であるβ炭素にアミノ基が結合したアミノ酸を指す。本明細書中で記載するアミノ酸は、“Ｘ”がいずれかのアミノ酸を意味する標準ＩＵＰＡＣ１文字命名法で呼ぶ。
【００５５】
“ＥＥＴＩ”という用語は、プロテインデータバンクエントリー（ＰＤＢ）２ＥＴＩを意味する。ノッチンデータベースにおけるこのエントリーはＥＥＴＩ−ＩＩである。これは、下記配列
2014504270.tif 000002
を有する。全長ＥＥＴＩ−ＩＩは、最終プロリンが位置３０に位置する３０アミノ酸配列を有する：
2014504270.tif 000003
【００５６】
ループ１及びループ３は太字で下線を引いた。これらループは、下記で実証されるように、変化させることができ、結合効率にも影響を与え得る。他のループは結合効率に影響せずに変化させ得る。
【００５７】
“ＡｇＲＰ”という用語は、ＰＤＢエントリー１ＨＹＫを意味する。ノッチンデータベースにおけるこのエントリーは、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＡＧＲＰ＿ＨＵＭＡＮであり、１２９アミノ酸の全長配列を見出すことができる。これは、８７番目のアミノ酸で開始する配列を含む。追加のＧをこの構築物に加える。これは、Ｊａｃｋｓｏｎらの論文（２００２年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１巻、７５６５頁）に記載されているＣ１０５Ａ変異も含む。
2014504270.tif 000004
【００５８】
破線を引いた部分は、下記の“小型の”異形において除外した断片を示す。ループ４由来の太字で下線を引いた部分は、下に記載するＲＧＤ配列によって置き換えられる。ループ１及びループ３は、下の括弧の間に示す。
2014504270.tif 000005
【００５９】
ＡｇＲＰに関する“小型の”という用語は、ＰＤＢエントリー１ＭＲＯを意味する。これはＳｗｉｓｓＰｒｏｔＡＧＲＰ＿ＨＵＭＡＮでもある。これは、上で与えられたものと類似する下記配列を有する。
2014504270.tif 000006
配列中、下線を引いた“Ａ”は、予想される二量体形成シスチンを排除するアミノ酸置換を表す。（本明細書で、シスチンは１個のアミノ酸を指し；システインは二量体を指す。）ループ４由来の太字で下線を引いた部分は、下に記載するＲＧＤ配列によって置き換えられる。
【００６０】
“アガトキシン”という用語は、オメガアガトキシンＰＤＢ：１ＯＭＢ及びノッチンデータベースにおけるＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリーＴＯＧ４Ｂ＿ＡＧＥＡＰを意味する。これは、下記配列を有する。
2014504270.tif 000007
【００６１】
破線は、“小型の”アガトキシンについて除外されたペプチド部分を示す。追加のグリシンが小型構築物のＮ末端に加えられる。太字で下線を引いた部分は、下記で記載するＲＧＤ配列によって置き換えられる。
【００６２】
“ループドメイン”という用語は、規則正しい二次構造を有さないペプチド鎖内にあり、一般にそのペプチドの表面上に存在するアミノ酸配列を指す。“ループ”という用語は、αヘリックス、βシート等の形態にあるような規則正しい形態でない二次構造を指すものと本技術分野で理解される。
【００６３】
ペプチドに関連して、“実質的に同一”という用語は、ペプチドが、特定の比較ウインドウによって参照配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、最も好ましくは少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを示し、この場合、ペプチドは、ペプチド全体、分子足場部分、又は結合ループ部分（約９〜１１残基）のいずれかである。好ましくは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（(１９７０) Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ., ４８：４４３ ４５３）を用いて最適なアラインメントが行われる。２個のペプチド配列が実質的に同一であることのしるしは、一方のペプチドが、第二のペプチドに対して産生される抗体と免疫学的に反応性であることである。本発明の目的について、配列が明確に例示した特定配列と実質的に同一であることの別のしるしは、問題の配列が少なくとも参照配列と同じように高いインテグリン結合親和性を有することである。従って、例えば、２個のぺプチドが保存的置換によってのみ相違する場合、ペプチドは、第二のぺプチドと実質的に同一である。“保存的置換”は周知であり、例えば、ＰＡＭ２５０スコアリング行列によって例示される。“実質的に類似”するペプチドは、同一でない残基位置が保存的アミノ酸変化によって相違し得ることを除き、上述した配列を共有する。本明細書中で使用するように、２個の核酸又はポリペプチド配列に関連して、“配列同一性”又は“同一性”は、２個の配列の残基が特定の比較ウインドウによって最大一致を目指して整列させた場合に同一であることを指す。タンパク質に関して配列同一性の比率を用いる場合、同一でない残基位置は、しばしば、保存的アミノ酸置換によって相違し、この場合、アミノ酸残基は類似の化学特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換され、よって分子の機能的特性を変えないことが認められる。配列が保存的置換で相違する場合、配列同一性率は、置換の保存的性質を修正するように上方修正され得る。そのような保存的置換により相違する配列は、“配列類似性”又は“類似性”を有するといえる。この修正を行う手法は、当業者に周知である。これは、典型的には、保存的置換を全体的でなく部分的なミスマッチとしてスコアリングすることを含み、これにより配列同一性の比率が増加する。従って、例えば、同一アミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存的置換が０のスコアを与えられる場合、保存的置換は０と１の間のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、ＮＩＨ多重アラインメントワークショップ（http://helixweb.nih.gov/multi-align/）で実行されるように計算される。三次元ツールを配列比較に用いてもよい。
【００６４】
本明細書中で用いるように、“配列同一性の比率”は、比較ウインドウによって最適に整列させた２個の配列を比較することによって決定される値を意味し、２個の配列の最適アラインメントについて、比較ウインドウにおけるポリペプチド配列の部分は、（付加又は欠失を含まない）参照配列と比較して付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。その比率は、両方の配列に同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が存在する位置の数を測定して、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウインドウ中の位置の総数で割り、結果に１００をかけて配列同一性の比率を得ることによって計算される。
【００６５】
“受容体型チロシンキナーゼ”という用語は、その通常の意味で用いられる；具体例は下記で与えられる。“ＴＡＭ受容体型チロシンキナーゼ”という用語は、ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ及びＭｅｒＴＫを含む受容体キナーゼのＴＡＭファミリーを指す。これらは、キナーゼドメイン内の保存配列及び接着分子様細胞外ドメインによって特徴付けられ、Ｌｉｎｇｅｒらの論文（“ＴＡＭ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ： ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ, ｓｉｇｎａｌｉｎｇ, ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ,” Ａｄｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ２００８；１００：３５−８３）によって更に説明される。
【００６６】
全体説明
［ノッチンペプチドの操作］
本発明の融合タンパク質の重要な特徴は、所定のリガンドへの特異的結合にノッチン部分を用いることである。ノッチン結合は、好ましくは、天然の溶媒露出ループを所定のリガンドへの結合用に選択した短い（例えば、５〜１２アミノ酸）配列で置き換えることによって操作される。溶媒露出（すなわち、表面上の）ループは、一般に、ジスルフィド結合したシステイン残基によって固定されている。新しい、すなわち置換アミノ酸配列は、好ましくは、ループ部分のコドンをランダム化し、改変ペプチドを発現させ、所定のリガンドに対して最大の結合を有する変異体を選択することによって得られる。先の工程から最も強力な結合性タンパク質を採用し、ループを再ランダム化して、この選択工程を複数回繰り返してもよい。
【００６７】
ＥＥＴＩ−ＩＩノッチンペプチドは、ジスルフィド結び目構造トポロジーを含み、突然変異誘発を行うことができる複数の溶媒露出ループを有する。Ｇａｓ６との境界面を進化させるため、我々は構造的に隣接するループ１及びループ３をランダム化した。このＥＥＴＩ−ＩＩループライブラリーの直接的なＡＣ１  Ｉｇ１のＮ末端への融合（図１Ｄに図示）は、天然のＧａｓ６−Ａｘｌ相互作用を乱さず、これにより、数千万の一桁台のナノモル結合体のバックグラウンドをもたらした。このようなバックグラウンドから増強されたクローンを単離する能力は、タンパク質工学の酵素表面ディスプレイ及び定量蛍光活性化セルソーティングの力を語る。更に、機能喪失をこうむっていない出発ライブラリーは、結合パートナーの一方に対する無作為変異がしばしば初期ライブラリーの大部分について機能の低下をもたらす従来の指向進化ストラテジーのものと異なる。ドメイン付加ナイーブライブラリーにおける野生型特性の保持は自然進化の展望に光を当て、これによって、ドメインの付加及び進化は事実上、活性低下の代償なく、配列空間を探索しながら、タンパク質機能の進化を可能にすることができる。
【００６８】
多種多様なノッチンペプチドを本発明の融合タンパク質に用いることができる。例えば、酵母細胞表面上に提示される場合、下記変異体は、フィブロネクチン由来のＲＧＤ配列を有する変異体よりも約２〜３倍良好にαｖβ３インテグリンと結合する。
【００６９】
【表１】
2014504270.tif 000008
【００７０】
２００９年４月３日に出願された同時継続出願第１２／４１８,３７６号に記載されるように、上記改変ノッチンは、ＲＧＤ結合ループを含み、インテグリンと特異的に結合する。そこに記載する通り、これらループは、非ＲＧＤ残基において、結合特異性及び力価に影響することなく、ある程度まで変化させることができる。例えば、１１残基のうちの３個を変化させた場合、２.５Ｄに対して約７０％の同一性を有するであろう。上記改変ノッチンは、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン及びα５β１インテグリンに特異的に結合することが示されている。
【００７１】
インテグリンに結合するように操作したノッチンペプチドの別の例は、ＡｇＲＰである。下の表２は、フローサイトメトリーによって単離し、太字の残基によって表示されるように、ループ４中にＲＧＤ配列及びフランキング残基を有するＡｇＲＰ変異体の配列を示す。
【００７２】
【表２】
2014504270.tif 000009
【００７３】
付加的ＡｇＲＰ改変ノッチンは、上で参照したＣｏｃｈｒａｎらの米国出願公開第２００９／０２５７９５２号明細書に記載されているように創出することができる。ＡｇＲＰノッチン融合体は、ＡｇＲＰのループ１、２及び３に加えて上で例示するループ４を用いて調製することができる。
【００７４】
［改変ノッチン結合パートナー］
改変ノッチンを別のタンパク質に融合させる。このタンパク質は、本明細書の記載に従って改変ノッチンの設計にある程度入るであろう。つまり、融合パートナー及びノッチン結合パートナーは、それらが同じ生物学的経路に存在する点で論理的関係を有し、これらは、結合されて治療結果等を改善する標的を対象とする。
【００７５】
改変ノッチン−チロシンキナーゼ受容体融合体によって下記で例示されるように、融合体は、チロシンキナーゼに対するリガンドと結合するように操作してもよい。融合体は投与されてリガンドと結合され、それにより、デコイとして働き、天然リガンドがチロシンキナーゼ受容体と結合するのを妨げる。下記で更に例示するように、チロシンキナーゼ受容体全体を使用しない；天然リガンド、好ましくはアゴニストと結合する部分のみを使用する。Ａｘｌの場合、Ｇａｓ６リガンドと結合するＡｘｌ受容体のＩｇ１部分及びＩｇ２部分を使用する。増殖停止特異的６であるＧａｓ６は、血漿ビタミンＫ依存性タンパク質ファミリーに属する。Ｇａｓ６は、抗凝固タンパク質と高い構造相同性を共有し合うが、ＴＡＭファミリーの受容体型チロシンキナーゼであるｔｙｒｏ３、Ａｘｌ及びＭｅｒＴＫとの相互作用を通じて増殖因子様特性を有する。
【００７６】
改変ノッチン−タンパク質融合体の別の例は、融合パートナーが増殖因子又は増殖因子の活性断片である融合体であり、ノッチンは、血管系中又は腫瘍に存在し得るような内皮細胞と結合するように操作される。これは、αｖβ３インテグリンと、Ｍｅｔ受容体に結合する増殖因子又は増殖因子断片とを結びつけるように操作したノッチン（ＡｇＲＰ）によって例示される。αｖβ３インテグリンと細胞外基質との相互作用は、毛細血管から出芽する内皮細胞及び血管新生にとって極めて重要である。更に、インテグリン媒介性アウトサイドインシグナルは、増殖因子受容体と協同して、細胞の増殖及び運動性を促進する。別の例として、Ｓｏｌｄｉらの論文（“Ｒｏｌｅ ｏｆ ａｌｐｈａｖ ｂｅｔａ３ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏf ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２,” Ｔｈe ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ （１９９９） １８, ８８２−８９２）は、インテグリン系によって血管新生誘導因子受容体の調節の可能性を見極めることを報告しており、ヒト内皮細胞においてαｖβ３インテグリンとチロシンキナーゼ血管内皮増殖因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ−２）との間の相互作用を調べた。ＶＥＧＦ受容体とＭｅｔ受容体（肝細胞増殖因子受容体としても知られる）の両方とも受容体型チロシンキナーゼである。
【００７７】
結合パートナー選択の別の例は、αｖβ３インテグリンに結合する改変ノッチンと、ＭＥＴ受容体のアゴニストとして働くポリペプチド増殖因子ＨＧＦ／ＳＦの断片であるＮＫ１との融合である。下に記載するように、ＮＫ１を修飾して、高度に安定でより効果的なアゴニスト性リガンドを創出するか、又は高度に安定でより効果的なアンタゴニストを創出した。
【００７８】
［（ドメイン付加により）合成結合ドメインを有するＥＥＴＩ−Ａｘｌ融合体］
下記の実施例で、エクバリウム・エラテリウムのトリプシン阻害剤ＩＩ（ＥＥＴＩ−ＩＩ）は合成結合ドメインとして働き、その融合パートナーの結合を増大させる。ＥＥＴＩ−ＩＩは、優れた安定性特性を提供する特徴的な織り合わされたジスルフィド結合骨格を含むノッチンペプチドファミリーのメンバーである（図１Ｂ）。ＥＥＴＩ−ＩＩの溶媒露出ループは、突然変異誘発に対して寛容性であり、新規な認識特性について既に個別に操作されてきた。しかしながら、本研究では、ＥＥＴＩ−ＩＩ中の構造的に隣接する２個のループを同時にランダム化して、生じたＥＥＴＩ−ＩＩ変異体のライブラリーを野生型Ａｘｌ  Ｉｇ１に融合させた。Ａｘｌ配列は、Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅのＧｅｎｅＩＤ５５８で与えられる。次に、このライブラリーをスクリーニングして、増大したＧａｓ６結合親和性を有する新規なＥＥＴＩ−Ａｘｌ融合体を同定した。つまり、結合は、Ａｘｌ受容体を介して、また改変ループを介して起こるであろう。１ラウンドのみの指向進化に続いてナノモル以下の親和性を有する変異体を同定し、その変異体では、ＥＥＴＩ−ＩＩ変異体の改変ループの両方とも、新規な結合面の創出によってＧａｓ６に対する親和性の増大に貢献した。この研究は、ドメインの付加及び進化がタンパク質機能を増強することを裏付け、足場としてのＥＥＴＩ−ＩＩノッチンが新規な認識特性を操作することも裏付ける。
【００７９】
［ドメイン付加ライブラリーの設計及び合成］
ＡｘｌのＩｇ１ドメインはＧａｓ６に対する優位な結合部位を含むことから、Ｇａｓ６／Ａｘｌ相互作用の親和性を増大させるために、ＥＥＴＩ−ＩＩノッチンペプチドのループライブラリーをＡｘｌ  Ｉｇ１に融合させた。Ｇａｓ６／Ａｘｌ複合体ではＡｘｌ  Ｉｇ１のＮ末端がそのＣ末端よりもＧａｓ６の近くにあり、従って、ＥＥＴＩ−ＩＩ変異体のＧａｓ６との相互作用をより可能にしやすそうであるため（図１Ｃ）、ＡｘｌのＮ末端への融合を選択した。ＥＥＴＩ−ＩＩ及びＡｘｌの構造の解析は、ＡｘｌのＮ末端へのＥＥＴＩ−ＩＩの融合が２個のタンパク質の三次構造の間におよそ１１アミノ酸の間隔を与えるであろうことを示す。従って、更なるリンカー残基を含めることなく、ＥＥＴＩ−ＩＩループライブラリーをＡｘｌのＮ末端に直接融合させることを選択した。  ＥＥＴＩ−ＩＩ中の最終Ｐｒｏ３０残基及びＡｘｌ  Ｉｇ１のＰｒｏ２０を排除して、結合の柔軟性を向上させ、ＥＥＴＩ−ＩＩのＳｅｒ２９をＡｘｌのＡｒｇ２１に直接融合させた。構造的に隣接しており（図１Ｂ）、ＥＥＴＩ−ＩＩノッチン状に連続的な結合面の形成を可能にするであろうことから、ランダム化についてＲＲＴＩ−ＩＩループ１及びループ３を選択した。野生型のループ１及びループ３を、ＮＮＳコドンを用いて、それぞれ７〜１０アミノ酸及び６〜８アミノ酸のランダム化配列で同時に置き換えた（図１Ｄ）。ＮＮＳコドンストラテジーは、１個の停止コドンのみをコードすることによって停止コドンの頻度を制限しながら、２０個のアミノ酸全てを改変ループに含めることを可能にする。他の縮重ライブライリーストラテジーを用いてもよい。他の例示的ストラテジーについては、Ｋｌｅｅｂらの論文（“Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ｔｕｎａｂｌｅ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ,” Ｐｒｏｃ. Ｎａｔ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. １０４： １３９０７-１３９１２ (２００７)）を参照されたい。
【００８０】
直接融合は、酵母提示ｐＣＴプラスミドにおいてＡｘｌ  Ｉｇ１アミノ酸Ｇｌｙ２２の前にプロリン−アルギニンジペプチドをコードするＡｖｒＩＩ（Ｃ‘ＣＴＡＧ，Ｇ）部位を含めることによって達成した。ＥＥＴＩ−ＩＩループライブラリーは、制限消化したＡｘｒＩＩ部位の最初の塩基対を‘Ｔ’で置き換えて、ＥＥＴＩ−ＩＩのＳｅｒ２９とＡｘｌ  Ｉｇ１のＡｒｇ２１との所望のＳｅｒ−Ａｒｇ結合をコードするＴＣＴＡＧＧ（配列番号４０）を与えるように設計した。
【００８１】
ＥＥＴＩ−ＩＩループライブラリー用ｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲアセンブリ技術を用いて合成し、酵母提示Ｅ−Ａｘｌライブラリーは、ｐＣＴ−Ａｖｒ−Ａｘｌアクセプタープラスミドに対する相同組み換えによって生成させた（実施例を参照）。このライブラリーは、本明細書でＥ−Ａｘｌライブラリーと呼ぶ；これは、希釈物プレーティング及びコロニー計数によって測定したように、１．２×１０８個の形質転換体を含んでいた。無作為に選択した個々のクローンの配列解析は、意図した融合ストラテジー、ループ長分布、及びＡｘｌ配列への変異の欠如を確認した。先の複数のランダム化ループを含むライブラリーの報告と一致して、およそ３０％のクローンは、停止コドン又は変異を含まない全ループ配列を含んでいた。
【００８２】
ナイーブライブラリーからの結合タンパク質の同定は、一つには、同定したタンパク質の親和性が検出に充分なほど高くなければならないという要求のため、努力を必要とする。例えば、酵母表面ディスプレイにおいて、一桁台のμＭ範囲の結合親和性は検出限界を下回り、このようなタンパク質は一般にライブラリーソーティングの間に濃縮されないであろう。ドメインの付加及び進化は、既存の相互作用を増強するが、それ自体は単離において検出限界を下回る親和性を有し得る合成結合ドメインの同定を可能にする“アンカーリング”ストラテジーとして用いることができる。この裏付けとして、本発明で開発したＥＥＴＩ−ＩＩ変異体は、ノッチン変異体がＡｘｌの不存在下で発現される場合にはＧａｓ６に対して検出限界を下回る弱い結合親和性を示す。それに続く従来のストラテジー又は更なるドメインの付加及び進化による親和性成熟を用いて、高い親和性を有する完全合成結合薬を生成させることができる。
【００８３】
［ライブラリースクリーニング及び配列解析］
Ｅ−Ａｘｌライブラリーの発現及びそのＧａｓ６に対する結合を、それぞれ、酵母提示構築物上のｃｍｙｃエピトープタグ及び可溶性Ｇａｓ６上のヘキサヒスチジンタグ（配列番号７７）（図２Ａ）の免疫蛍光標識によって評価した。図２Ａは、酵母表面ディスプレイにおいて知られているように、アガトキシン構成要素Ａｇａ  １ｐ及びＡｇａ  ２ｐがこの順番で酵母細胞壁から伸びていることを示す。Ｈｙｌｉｔｅ４４８  ２２でタグを付けた抗ｈｉｓ抗体をＧａｓ６上のｈｉｓタグ３２に結合させる；ｍｙｃタグ２６をチキン抗ｍｙｃ抗体２８に結合させ、今度はＡｌｅｘａ５５５，３０で標識した抗チキン抗体により結合される。融合体にヘマグルチニンタグも含める。これにＡｘｌ−Ｉｇ１を融合させて、Ｇａｓ６リガンドのＡｘｌに対する結合が実行される。酵母細胞表面上に発現した出発ライブラリーの全メンバーは、野生型Ａｘｌ  Ｉｇ１と同じレベルでＧａｓ６に結合した（図２Ｂ）。これは、ＡｘｌのＮ末端へのＥＥＴＩ−ＩＩループライブラリーの直接結合が天然のＧａｓ６−Ａｘｌ相互作用を乱さないことを実証する。結果的に、これは、稀な改良クローンを分離しなければならない数千万の野生型の一桁台のナノモルの結合体のバックグラウンドも生じる。
【００８４】
酵母表面ディスプレイを用いたライブラリースクリーニングのために、しばしば結合クローンの上位１％を収集する；しかしながら、この極めて高いバックグラウンドレベルの結合のため、結合クローンの上位６％を収集して増強された特性を有する稀なクローンを失う可能性を低減する保存的分取ストラテジーを最初に用いた（図３）。
【００８５】
図３は、ライブラリーを分取するときに、可溶性Ｇａｓ６への結合についてスクリーニングすることによって最初の分取を行ったことを示す。その後の分取は、Ｇａｓ６への結合の後に解離速度の増大に対して選択圧を付与する過剰な競合相手の存在下でのインキュベーションが続く‘解離速度(ｏｆｆ−ｒａｔｅ)’分取を用いた。第６ラウンド目の分取で、ネガティブソーティングを行って、二次抗Ｈｉｓ抗体に結合している変異体を取り除いた。第６分取の産物（下記）は、１ラウンドのみの分取でこれらが完全に排除されたことを示す。最終分取の産物は、４６時間の非結合（‘解離(ｏｆｆ)’）工程の後に結合を保持した。
【００８６】
後期の分取ラウンドにおけるストリンジェンシーを増加させるため、２ｎＭのＧａｓ６と共にインキュベーションした後に、競合相手として働く１Ｍの過剰のＧａｓ６の存在下で非結合工程を続ける‘解離’分取を行った。過剰な競合相手は、可溶性Ａｘｌ受容体と複合した遊離Ｇａｓ６を隔離することによって酵母提示Ｅ−ＡｘｌからのＧａｓ６の解離を付加逆性のものとし、これによって、より遅い解離速度を有するクローンに対する選択圧を増加させる。
【００８７】
［インテグリン及び増殖因子受容体を標的とする二重特異性タンパク質］
実施例８に、αｖβ３インテグリンに結合するように操作したノッチン（ＡｇＲＰ）と、ＨＧＦのＮ末端及び第１クリングルドメインを含む断片（ＮＫ１と呼ばれる）との間の融合体の調製を記載する。ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）のこの部分は、Ｍｅｔ受容体に結合する。ｃ−Ｍｅｔ（ＭＥＴ又はＭＮＮＧ  ＨＯＳ形質転換遺伝子）は、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）として知られるタンパク質をコードするがん原遺伝子である。この肝細胞増殖因子受容体タンパク質は、チロシンキナーゼ活性を持つ。一次一本鎖前駆体タンパク質は、翻訳後切断されて、ジスルフィド結合されて成熟受容体を形成するαサブユニット及びβサブユニットを生成する。
【００８８】
αｖβ３インテグリン受容体は、数多くの固形腫瘍細胞上で過剰発現され、癌の重要な標的とされる。シスチン−ノットペプチドであるアグーチ関連タンパク質（ＡｇＲＰ）は、４個のジスルフィド結合及び４個の溶媒露出ループを含む。これを、ｐＭ結合親和性でαｖβ３インテグリン受容体を標的とするように操作した。ＡｇＲＰ変異体である７Ａは、強力な結合親和性を有することが示された。７Ａ変異体のＵ８７ＭＧ細胞及びＫ５６２−αｖβ３細胞に対するＫＤ値は、それぞれ０．７８ｎＭ及び０．８９ｎＭである。
【００８９】
Ｍｅｔ受容体型チロシンキナーゼ及びそのリガンドである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、腫瘍進行と組織再生の両方を媒介することに重要な役割を果たす。ＨＧＦのＮ末端及び第一クリングルドメイン（ＮＫ１）は、Ｍｅｔ受容体を活性化する能力を保持する天然に存在するスプライスバリアントである。しかしながら、ＮＫ１は、弱いアゴニストであり、比較的不安定で、その治療上の可能性は限られている。Ｍｅｔ受容体アゴニスト及びアンタゴニストとして機能して増強された生化学的及び生物物理学的特性を持つＮＫ１変異体を設計した。下に記載するように、最初に、酵母表面ディスプレイを用いて、安定性及び組み換え発現収率の増大のためにＮＫ１を進化させた。我々のライブラリー選別から単離したＮＫ１変異体は、ＮＫ１ホモ二量体化を媒介する残基の変異のため、弱いＭｅｔ受容体アンタゴニストとして機能した。このＮＫ１ホモ二量体化境界面を復元してアゴニスト性リガンドを創出するか、又は更にこれらの相互作用を破壊してより効果的なアンタゴニストを創出する点変異を導入した。最も良いアンタゴニストは、野生型由来のアンタゴニストに対して１５℃の改良である最高約６４℃の融点を示し、発現収量に最大４０倍の改良を示した。
【００９０】
インテグリンとｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路との間のクロストークを研究して、有意な関係性を示した。Ｍｅｔ受容体の天然リガンドであるＨＧＦ／ＳＦのシグナル伝達は、上皮細胞及び内皮細胞における機能的に不活性なαｖβ３インテグリンにおいてリガンド結合活性を導入することができる。従って、αｖβ３インテグリンとＭｅｔ受容体の両方を標的として阻害する二重特異性タンパク質は、特に単受容体標的薬と比較して、効果的な癌治療薬として有望である。
【００９１】
［融合体で有用な受容体型チロシンキナーゼ（“ＲＴＫ”）断片］
本発明の融合タンパク質は、様々な受容体型チロシンキナーゼを含み得る。これらタンパク質は、それらの細胞外及びリガンド結合モチーフに関して良く特徴付けられている。これらは、ＲＴＫクラスＩ（ＥＧＦ受容体ファミリー）（ＦｒｂＢファミリー）；ＲＴＫクラスＩＩ（インスリン受容体ファミリー）；ＲＴＫクラスＩＩＩ（ＲＤＧＦ受容体ファミリー）；ＲＴＫクラスＩＶ（ＦＧＦ受容体ファミリー）；ＲＴＫクラスＶ（ＶＥＧＥ受容体ファミリー）；ＲＴＫクラスＶＩ（ＨＧＦ受容体ファミリー）；ＲＴＫクラスＶＩＩ（Ｔｒｋ受容体ファミリー）；ＲＴＫクラスＶＩＩＩ（Ｅｐｈ受容体ファミリー）；ＲＴＫクラスＩＸ（ＡＸＬ受容体ファミリー）；ＲＴＫクラスＸ（ＬＴＫ受容体ファミリー）；ＲＴＫクラスＸＩ（ＴＩＥ受容体ファミリー）；ＲＴＫクラスＸＩＩ（ＲＯＲ受容体ファミリー）；ＲＴＫクラスＸＩＩＩ（ＤＤＲ受容体ファミリー）；ＲＴＫクラスＸＩＶ（ＲＥＴ受容体ファミリー）；ＲＴＫクラスＸＶ（ＫＬＧ受容体ファミリー）；ＲＴＫクラスＸＶＩ（ＲＹＫ受容体ファミリー）；及びＲＴＫクラスＸＶＩＩ（ＭｕＳＫ受容体ファミリー）を含む。好ましくは、これら受容体を有する融合タンパク質の調製において、受容体の一部のみを含む、すなわち、細胞外Ｎ末端領域を含み、免疫グロブリン（Ｉｇ）様又は上皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメイン、フィブロネクチンＩＩ型リピート、又はＲＴＫの各サブファミリーに特徴的な高システイン領域を含む様々な保存要素を示すポリペプチドを調製する；これらドメインは、主として、細胞外リガンド、例えば特定の増殖因子又はホルモンに結合するリガンド結合部位を含む。細胞内Ｃ末端領域は、最も高い保存レベルを示し、これら受容体のキナーゼ活性を担当する触媒ドメインを含み、ＲＴＫ基質の受容体自己リン酸化及びチロシンリン酸化を触媒する。
【００９２】
受容体型チロシンキナーゼ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋを含む様々な情報源から入手可能である。本発明に従って断片及び融合タンパク質を創出するのに用いることができる例示的配列は、例えばＲａｎｄらの論文（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｓ.” Ｐｒｏｃ. Ｎａｔ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. Ｏｃｔｏｂｅｒ ４, ２００５ ｖｏｌ. １０２ ｎｏ. ４０ １４３４４−１４３４９）で与えられる。下記のリストは、その刊行物から抜粋される。
【００９３】
2014504270.tif 000010
【００９４】
Ｌｅｅらの論文（“Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ： ａ ｌｉｇａｎｄ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆｌｔ４,” ＰＮＡＳ    Ｍａｒｃｈ ５, １９９６ ｖｏｌ. ９３ ｎｏ. ５ １９８８−１９９２）も参照されたい。
【００９５】
本発明で使用する受容体の正確な断片は、本教示及び既存の受容体構造の知識を考慮して決定することができる。リガンド結合ポケットのみをコードする正確な配列を用いることが必要ではない。追加のアミノ酸を含むある程度の柔軟性が認容される。例えば、米国出願公開第２００４／１３２６３４号で開示されるように、全てのＥｐｈファミリーメンバーのＮ末端細胞外領域がリガンド結合に必要なドメインを含み、具体的には、高システインドメイン及び２個のフィブロネクチンＩＩ型リピートが後に続く。一般に、Ｎ末端部分の約４００、５００又は６００アミノ酸を、受容体型チロシンキナーゼのリガンド結合断片として用い得る。
【００９６】
上記リストは、アミノ酸及びヌクレオチド配列を提供する。他のヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋからペプチド又はタンパク質の名称について検索することによって得ることができる。ノッチンＤＮＡ配列は、与えられたアミノ酸配列から、いずれかのコドンアサインメントを用いて得ることができる；コドンアサインメントは、酵母のような、用いる発現ベクターに基づき選択することができる。ＥＥＴＩヌクレオチド配列は、国際公開第０２／３４９０６号、ＧｅｎＢａｎｋのＡＸ４９７０５５で与えられており；ＡＧＲＰヌクレオチド配列はＮＧ＿０１１５０１で見ることができ；アガトキシンのヌクレオチド配列はＧｅｎｂａｎｋのＭ９５５４０．１で見ることができる。別のノッチンのアミノ酸及びヌクレオチド配列は、ノッチンであるプサコテアシン（Ｐｓａｃｏｔｈｅａｓｉｎ）に関する論文（Ｊ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. （２０１０）, ２０（４）, ７０８-７１１）で見ることができる。
【００９７】
［融合体に有用な受容体リガンド断片］
ここで、特定の受容体リガンドである肝細胞増殖因子及び抗体Ｆｃ断片を例示する。肝細胞増殖因子（ｃ−ｍｅｔとも呼ばれる）を断片化して、ｍｅｔ受容体に結合することが知られている部分を得た。このＨＧＦ断片はＮＫ１断片としても知られている。例示配列を配列番号６６で与える。この配列は、ＰＡＮ＿Ａｐｐｌｅスーパーファミリーの配列の一部及びＫＲスーパーファミリーの配列の一部を含む。従って、本教示で与えられる本明細書で例示する組成は、肝細胞増殖因子様タンパク質；プラスミノーゲンドメイン含有タンパク質；マクロファージ刺激因子１；及び、ＲＯＮ（“recepteur d’origine Nantais”）のような他のプラスミノーゲン関連増殖因子を含むように拡張することができる。Ｍａｅｓｔｒｉｎｉらの論文（“Ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ ｔｈｅ ＭＥＴ−ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ,“ ＰＮＡＳ Ｊａｎｕａｒｙ ２３, １９９６ ｖｏｌ. ９３ ｎｏ. ２ ６７４−６７８）を参照されたい。哺乳動物においても、肝細胞増殖因子はセリンプロテアーゼの相同体であるが、そのタンパク質分解活性を失っていた。
【００９８】
［二重特異性タンパク質の投与］
本発明の融合タンパク質は、細胞培養研究におけるような試験管内で、すなわち、移植用の細胞に投与してもよいが、生体内に投与してもよい。治療用タンパク質について使用される様々な処方及び投与計画を用いることができる。医薬組成物は、ＣＦＰに加えて、動物への投与に適し（例えば、生理食塩水）ひいては活性な融合タンパク質の医薬上使用することが出来る調剤薬への加工を促す助剤（賦形剤、安定剤又は希釈剤のような）を含む、適切な、医薬として許容される担体、生物学的に適合性のビヒクル及び添加剤を含むことができる。このような組成物は、最終的に、本発明のキメラタンパク質と相乗的に又は協調的に作用する別の治療用組成物と併用することができる。あるいは、他の医薬組成物は、特定の疾患に対して治療効果があることが知られている融合タンパク質（例えば、乳癌に対するハーセプチン）を用いて基礎とすることができる。あるいは、可溶性のものを含む医薬組成物を組み合わせて、様々な治療計画で使用するための“カクテル”とすることができる。
【００９９】
医薬組成物は、投与方法の要求を満たすいずれか許容されるやり方で調剤することができる。例えば、生体材料及び他の薬物送達用ポリマーの使用、更に、特定の投与方法を有効にする様々な技術及びモデルは、文献に開示されている（Ｌｕｏ Ｂ ａｎｄ Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ Ｇ Ｄ, ２００１； Ｃｌｅｌａｎｄ Ｊ Ｌ ｅｔ ａｌ., ２００１）。
【０１００】
当業者は、一般に受け入れられたあらゆる投与方法を用いて測定して、そのときの融合タンパク質の所望の血中レベルを定めることができる。例えば、投与は、皮下、静脈内、硬膜外、局所、皮内、髄腔内、直接脳室内、腹腔内、経皮（例えば、徐放製剤で）、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、肺内（吸入）、眼内のような様々な非経口経路、経口経路、又は口腔経路によることができる。
【０１０１】
他の特に好ましい投与経路は、エアゾール製剤及びデボー製剤である。発明した薬剤の持続放出製剤、特にデボー製剤が明確に意図される。
【０１０２】
非経口投与は、ボーラス注射によるもの又は時間をかけた段階的な灌流によるものとすることができる。非経口投与用製剤は、本技術分野で既知の助剤若しくは賦形剤を含み得る滅菌水又は非水性溶液、懸濁液及びエマルションを包含し、常法に従って調製することができる。更に、活性な融合タンパク質の懸濁液を適切な油性注射懸濁液として投与してもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、脂肪油、例えば、ゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチル若しくはトリグリセリドが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでもよく、その物質としては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランが挙げられる。任意により、懸濁液は、安定剤を含んでもよい。医薬組成物は、注射による投与に適する溶液を含み、約０．０１〜９９％、好ましくは約２０〜７５％の活性な融合タンパク質を賦形剤と一緒に含む。直腸投与することができる組成物としては、坐剤が挙げられる。
【０１０３】
非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）投与用に、活性なタンパク質を、医薬として許容される非経口用ビヒクル（例えば、水、生理食塩水、デキストロース溶液）及び浸透圧を維持する（例えば、マンニトール）又は化学的安定性を維持する（例えば、保存剤及び緩衝剤）添加剤と併せて、液剤、懸濁剤、エマルション又は凍結乾燥粉末として調剤することができる。製剤は、通常用いられる技術によって滅菌される。経粘膜投与用に、透過すべき障壁に適した浸透剤を製剤に用いる。このような浸透剤は、本技術分野で一般に知られている。
【０１０４】
経口的に服用することができる医薬として又は生理学上許容される製剤としては、ゼラチンで  作られた押し込み式カプセル、及びゼラチンとグリセロール又はソルビトールのような可塑剤とから作られた封止ソフトカプセルが挙げられる。押し込み式カプセルは、活性成分を、乳糖のような充填剤、デンプンのような結合剤、及び／又はタルク若しくはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤と、また任意により安定剤との混合物として含むことができる。ソフトカプセルでは、活性な融合タンパク質を、脂肪油、流動パラフィン、又は液状ポリエチレングリコールのような適切な液体中に溶解又は懸濁させてもよい。更に、安定剤を加えてもよい。全ての経口投与用製剤は、かかる投与に適する用量とすべきである。
【０１０５】
融合タンパク質を注射、例えば、ボーラス注射又は連続的灌流による非経口投与用に調剤することができる。注射用製剤は、添加された保存剤と共に、単位用量形態で、例えば、アンプルで又は多回投与容器で存在することができる。医薬組成物は、水性ビヒクル中に懸濁剤、液剤又はエマルションのような形態とすることができ、懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤のような製剤化剤を含むことができる。あるいは、活性成分を、使用前にパイロジェンフリーの滅菌水のような適切なビヒクルでの構成用の粉末形態又は凍結乾燥形態とすることができる。
【０１０６】
先に説明した製剤に加えて、融合タンパク質は、デポー製剤として調剤することもできる。そのような長期作用性剤は、埋め込み（例えば、皮下若しくは筋肉内に）よって又は筋肉内注射によって投与することができる。よって、例えば、融合タンパク質を、適切な高分子若しくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）若しくはイオン交換樹脂を用いて製剤化してもよく、又は難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として調剤してもよい。更に、融合タンパク質は、治療薬を含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックスのような持続放出システムを用いて送達してもよい。様々な持続放出材料が本技術分野で確立されており、周知である。持続放出カプセルは、その化学的性質に依存して、融合タンパク質を数週間から最長１００日又は１年を超えて放出することができる。
【０１０７】
投与される用量は、レシピエントの年齢、性別、健康状態及び体重、もしあれば、併用療法、処置の頻度、並びに所望される効果の性質によって左右されるであろうことが理解される。用量は、当業者によって理解され、また決定することができるように、個々の患者に合わせて調整されるであろう。各治療に必要な総用量は、多段階投与によって又は単回投与で投与することができる。本発明の医薬組成物は、単独で、又はその病状若しくはその病状の他の症状を対象とする他の治療薬と併用して投与することができる。大抵、活性なタンパク質の１日用量は、体重１キログラム当たり０．０１〜１００ミリグラムからなる。望む結果を得るためには、通常、分割投与で又は持続放出形態で１日当たり１キログラム当たり１〜４０ミリグラム与えられることが有効である。二回目の又は後続の投与は、個体に最初に若しくは前回投与された用量と同じ、それより少な又はそれより多い用量で行うことができる。本発明によると、本発明の物質は、治療上有効量で、他の治療計画又は薬物の前に、同時に又はその後に（例えば、多剤併用療法）、予防的に又は治療的に個体に投与することができる。他の治療薬と同時に投与される活性薬剤は、同一組成物で又は異なる組成物で投与することができる。
【０１０８】
本発明の方法で用いるあらゆるタンパク質について、治療上有効量を最初に細胞培養試験から見積もることができる。例えば、試験管内の系でサイトカイン発現を低減することが示された濃度点又は濃度範囲を含む又は包含する循環濃度範囲を達成する用量を動物モデルで処方することができる。このような情報を用いて、ヒトで有用な用量をより正確に決定することができる。治療上有効量は、患者の症状の改善をもたらす融合タンパク質量を指す。このような融合タンパク質の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物において標準製薬手順により、例えば、ＬＤ５０（被験集団のうちの５０％の致死量）及びＥＤ５０（被験集団のうちの５０％に治療効果のある用量）を測定することによって、決定することができる。毒性と治療効果の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０とＥＤ５０の比として表現することができる。高い治療指数を示す融合タンパク質が好ましい。これら細胞培養試験及び動物研究から得られたデータを、ヒトで使用するための用量範囲の調剤に用いることができる。このような融合タンパク質の用量は、好ましくは、毒性が殆ど又は全くなくＥＤ５０を含む循環濃度範囲内である。その用量は、この範囲内で、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じて変動し得る。的確な製剤、投与経路及び用量は、個別の医師が患者の健康状態を考慮して選択することができる。
【実施例】
【０１０９】
実施例１〜５で説明するように、我々が“ドメインの付加及び進化”と呼ぶ、既存のタンパク質−タンパク質相互作用を操作する包括的な方法を開発し、その方法では、増強が、合成結合ドメインの付加及びそれに続く試験管内進化を通じて結合境界面を拡張することによって達成される。合成ノッチン結合ドメインの付加及び進化を通じてＧａｓ６とＡｘｌ受容体との間の天然の高親和性リガンド−受容体相互作用を増強する能力を示すことによって、この方法を検証した。
【０１１０】
我々は、ＥＥＴＩ−ＩＩ−ａｘｌ融合変異体が、最大４倍に増大したＧａｓに対する親和性を有することを特定した。重要なことは、Ａｘｌ  Ｉｇ１が突然変異誘導及びスクリーニング過程の間に変異を累積しなかったことであり、これは、親和性の増大が改変ＥＥＴＩ−ＩＩ変異体によるものであり得ることを示している。改変ループの野生型ＥＥＴＩ−ＩＩ配列への個々の復帰は、幾つかのＥＡ変異体が親和性増大のために両方の改変ループを必要とすることを確かめた。我々の知る限り、これは、ノッチンの２個のループを外因性の標的に向けた結合面へと操作した最初の例である。また、３個のＥＡ変異体の各々は、およそ４５％の非天然ＥＥＴＩ−ＩＩアミノ酸配列を含む。合わせて、これは更に、新規な結合試薬の生成に対するノッチンの折り畳みの頑強性を立証する。また、この研究は、癌の転移におけるＡｘｌの役割を伝えることにも関連する。ドミナントネガティブなＡｘｌ受容体は、腫瘍細胞の移動及び転移を抑制し（Ｖａｊｋｏｃｚｙ ｅｔ ａｌ., ２００６；Ｒａｎｋｉｎ ｅｔ ａｌ., ２０１０）、親和性が増大したＥＡ変異体は、有用な治療薬候補であり得る。
【０１１１】
この方法の更なる応用は、ナイーブライブラリーからの結合タンパク質の同定を含む。腫瘍標的に結合するように操作したＥＥＴＩ−ＩＩペプチドは、生体内分子イメージング法にとってかなり有望である。しかしながら、ナイーブライブラリーからの結合タンパク質の同定は、一つには、同定したタンパク質の親和性が検出に充分な程度に高くなければならないという要求のため、難しい。例えば、酵母表面提示結合において一桁台のμＭの範囲の親和性は検出限界を下回り、そのようなタンパク質は一般にライブラリーソーティングの間に濃縮されないであろう。ドメインの付加及び進化は、既存の相互作用を増強するが、それ自体は分離した状態で検出限界を下回る親和性を有する合成結合ドメインの同定を可能にする“アンカーリング”ストラテジーとして用いることができる。この裏付けとして、ノッチン変異体をＡｘｌの不存在下で発現させた場合、本発明で開発したＥＥＴＩ−ＩＩ変異体は、Ｇａｓ６に対し検出限界を下回る弱い結合親和性を示す。それに続く従来のストラテジー又は更なるドメインの付加及び進化による親和性成熟を用いて、高い親和性を有する合成結合薬物を充分に生成することができる。
【０１１２】
下記で説明するように、αｖβ３／αｖβ５インテグリンに結合する改変ＥＥＴＩノッチン変異型２．５Ｄを、野生型ＡｘｌのＩｇ１のＮ末端に直接融合させた。この多重特異性融合タンパク質の構想を、酵母表面ディスプレイを用いて、ＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌが単一特異性のタンパク質であるＥＥＴＩ２．５及びＡｘｌそれぞれに匹敵するレベルでαｖβ３インテグリン及びＧａｓ６に結合したことを示すことによって、立証した。更に、αｖβ３インテグリン又はＧａｓ６の結合は、飽和濃度の他の標的の存在によって影響を受けなかった。このことは、ＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌがαｖβ３インテグリンとＧａｓ６の両方と同時に相互作用できることを示唆する。ＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌ融合タンパク質は、微生物宿主で３５ｍｇ／Ｌの規模で組み換え的に生産することができた。生成したタンパク質は、細胞表面上に発現したαｖβ３インテグリンに対して高い親和性（約２ｎＭのＫＤ）を提示した。
【０１１３】
［例１：試薬及び培地］
ＳＤ−ＣＡＡ培地は、２０ｇ／Ｌのグルコース、６．７ｇ／Ｌの酵母窒素原基礎培地（アミノ酸を含まない）、５．４ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４、８．６ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、及び５ｇ／Ｌのバクトカザミノ酸を含有した；ＳＧ−ＣＡＡ培地は、グルコースを２０ｇ／Ｌのガラクトースで置き換えたことを除いて、同一であった。ｐＨ４．５のＳＤ−ＣＡＡ培地は、リン酸塩を１３．７ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム二水和物及び８．４ｇ／Ｌのクエン酸無水物で置き換えて、ｐＨ４．５に調整したことを除いて、ＳＤ−ＣＡＡと同一であった。Ｇａｓ６タンパク質及びＡｘｌ−Ｆｃタンパク質は、Ｒ＆Ｄシステムズ社から購入し、チキン抗ｃｍｙｃ抗体及びヤギ抗チキンＡｌｅｘａ５５５抗体はインビトロジェン社から購入し、マウス抗Ｈｉｓ  Ｈｉｌｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ４８８モノクローナル抗体は、Ａｎａｓｐｅｃ社から購入した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、１１．９ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．４、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．７ｍＭの塩化カリウムからなる。ＰＢＳ／ＢＳＡは、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含むＰＢＳからなった。
【０１１４】
［例２；酵母表面提示ライブラリー生成：ＥＥＴＩ／Ａｘｌ融合体］
ＥＥＴＩ−ＩＩループ１を置き換える、７、８、９又は１０個の縮重ＮＮＳコドンを有する４種のフォワードアッセンブリープライマーと、ＥＥＴＩ−ＩＩループ３を置き換える、６、７又は８この縮重ＮＮＳコドンを有する３種のリバースアッセンブリープライマーとを用いて、ＥＥＴＩ−ＩＩループライブラリーを構築した。（ＥＥＴＩ−ＩＩアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ１２０７１であり；ＤＢＮＡ配列は、２００９年４月３日に出願された同時係属米国出願第１２／４１８,３７６号で与えられ、参照により本明細書にも含まれる。ＤＮＡ配列は、与えられたアミノ酸配列の逆翻訳によって所望の通りに設計できる。）プライマー配列は、ループに隣接する領域に相補性であった。ＥＥＴＩ−ＩＩ、ランダム化ループ１及びループ３並びにＡｘｌ中のランダム化ループのアミノ酸配列を、図１Ｄに示す。１×ＫＯＤポリメラーゼバッファー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ，１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１Ｍのベタイン、及び２．５ユニットのＫＯＤポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）と共に、４種のフォワードプライマーをプールしてそれぞれ１μＭで用い、３種のリバースプライマーのそれぞれをプールして、それぞれ１．３３μＭで用いた。熱サイクルパラメーターは次の通りであった。ステップ１：９５℃で２分；ステップ２：９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分（３０サイクル）；ステップ３：７２℃で１０分。構築したＤＮＡ（０．６μＬ）を、２μＭのフォワード及びリバース増幅プライマー、１×Ｐｆｘ５０バッファー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ及び５ユニットのＰＦｘ５０ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社）を用いて増幅させた。フォワード増幅プライマーはｐＣＴ骨格に対して５０ｂｐの相同性を有し、一方、リバース増幅プライマーはＡｘｌ  Ｉｇ１のＮ末端に対して５０ｂｐの相同性を持ち、ＥＥＴＩ−ＩＩのＣ末端（Ｓｅｒ２９）とＡｘｌ  Ｉｇ１のＮ末端（Ａｒｇ２１）との適切なＳｅｒ−Ａｒｇ結合を確実にするように設計した。プラスミド骨格の調製について、ＮｈｅＩ制限部位及びＢａｍＨＩ制限部位を用いて、Ｉｇ１ドメインを含むＡｘｌアミノ酸（２２〜１３２；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ３０５３０）を、酵母提示ｐＣＴプラスミド（Ｂｏｄｅｒ及びＷｉｔｔｒｕｐ，１９９７）にクローン化した。Ａｘｌ配列の５’に直接ＡｖｒＩＩ制限部位を含めた。これを、ＮｈｅＩ部位の下流に、制限消化を促す１４ｂｐの“ジャンクＤＮＡ”のスペーサーとともに配置した。このプラスミドをｐＣＴ  Ａｖｒ−Ａｘｌと名付けた。ライブラリー合成用のプラスミド骨格は、ｐＣＴ  Ａｖｒ−ＡｘｌをＮｈｅＩ制限酵素及びＡｖｒＩＩ制限酵素で消化することによって作成した。合計で約５０μｇのｃＤＮＡ挿入物と約２５μｇの制限消化ｐＣＴ  Ａｖｒ−Ａｘｌ骨格とを電気穿孔法によってＥＢＹ１００に形質転換し、相同組み換えによって生体内で構築を行った。連続希釈プレーティング及びコロニー計数によって見積もったように、１．２×１０８個の形質転換体のライブラリーが得られた。無作為に選択したクローンの配列解析で、ＥＥＴＩ−ＩＩ変異体においてＥＥＴＩ−ＩＩとＡｘｌ  Ｉｇ１との適切な融合及び所望のループ長分布を確かめ��。
【０１１５】
酵母表面ディスプレイは、米国特許第６,４２３,５３８号で更に説明される。一般に、少なくとも１０４個の形質転換体が得られるであろう。
【０１１６】
プライマーは、下記のように設計した。
【０１１７】
［ＥＥＴＩ−Ａｘｌライブラリー合成／アッセンブリー及び増幅用ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマー］
下記配列において、プラスミド骨格に対する相同性のために用いるヌクレオチドを５’末端から最初の斜線までで示す。プライマーの最初の斜線から二重斜線までの部分及びプライマーの三重斜線から３’末端までの部分は、ＥＥＴＩ−ＩＩの残基と一致する。Ｎはいずれかのヌクレオチドを表わし、ＳはＧ及びＣの入り交りである。プライマーの二重斜線から三重斜線までの部分は、ＥＥＴＩ−ＩＩループ１又はループ３のランダム化残基を生成するために用いるヌクレオチドである。
L1_7X_fwd: 
Ggttctgctagc/ggttgt//nnsnnsnnsnnsnnsnnsnns///
tgtaaacaagattctgattgtttggctggttgtgtt (配列番号:６７)
L1_8X_fwd: 
Ggttctgctagc/ggttgt//nnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnns///
tgtaaacaagattctgattgtttggctggttgtgtt (配列番号:６８)
L1_9X_fwd: 
Ggttctgctagc/ggttgt//nnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnns///
tgtaaacaagattctgattgtttggctggttgtgtt (配列番号:６９)
L1_10X_fwd: 
Ggttctgctagc/ggttgt//nnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnns///
tgtaaacaagattctgattgtttggctggttgtgtt (配列番号:７０)
【０１１８】
下記のリバースプライマーの場合は、５’末端から最初の斜線までが、アクセプタープラスミド骨格部分でもあるＡｘｌ受容体構築物のＮ末端をコードするヌクレオチドと相同である。上のように、最初の斜線から二重斜線までの領域及び三重斜線から３’末端までの領域は、ＥＥＴＩ−ＩＩの残基と一致する。Ｎはいずれかのヌクレオチドを表わし、ＳはＧ及びＣの入り交りである。
L3_6X_rev: 
Cgtgcccct/gagaccaca//snnsnnsnnsnnsnnsnn///
acaaacacaaccagccaaacaatcag (配列番号７１)
L3_7X_rev: 
Cgtgcccct/gagaccaca//snnsnnsnnsnnsnnsnnsnn///
acaaacacaaccagccaaacaatcag (配列番号７２)
L3_8X_rev: 
Cgtgcccct/gagaccaca//snnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnn///
acaaacacaaccagccaaacaatcag (配列番号７３)
【０１１９】
ＰＣＲアッセンブリーによるライブラリー合成の後に、そのライブラリーを、プラスミド骨格に対して約５０塩基対の相同性（下線部、リバース増幅プライマーの場合についてはＡｘｌ配列に対する相同性を含む）を含む下記の増幅プライマーを用いて増幅した。約５０塩基対の相同性は、“Ｒａｙｍｏｎｄ ＣＫ, Ｐｏｗｎｄｅｒ ＴＡ, Ｓｅｘｓｏｎ ＳＬ. １９９９.  Ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ.  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２６：１３４−１３８, １４０−１３１.”に記載されるように、ライブラリー挿入物とプラスミド骨格とのアッセンブリーを可能にする。
Library_amplification_reverse:
Ttccctgggttgcccacgaagggactttcttcagcctgcgtgcccct/gctaccaca   (配列番号７４)
Library_amplification_forward: (プラスミド骨格に対する相同性は斜線の５’側)
Ggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttctgctagc/ggttgt   (配列番号７５)
【０１２０】
［例３：Ｇａｓ６を用いたライブラリースクリーニング］
様々な濃度のＧａｓ６を酵母提示ライブラリーとともにＰＢＳ／ＢＳＡ中で室温にて約２〜３時間インキュベートした。最後の１時間は、チキン抗ｃｍｙｃ抗体を１：２５０の最終希釈物に加えた。遠心分離によって細胞をペレット化して、１ｍＬの氷冷ＰＢＳ／ＢＳＡで洗滌し、ヤギ抗チキンＡ５５５の１：１００希釈物及びマウス抗Ｈｉｓ４８８抗体の１：１００希釈物を含有するＰＢＳ／ＢＳＡ中に再懸濁させ、２分間氷冷した。細胞をペレット化し、１ｍＬの氷冷ＰＢＳ／ＢＳＡで洗滌して、Ｖａｎｔａｇｅ  ＳＥフローサイトメーター（スタンフォードＦＡＣＳ）で蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により分取した。収集した細胞をｐＨ４．５のＳＤ−ＣＡＡ培地中で増幅し、ＦＡＣＳの更なるラウンドのためにＳＧ−ＣＡＡ培地中で３０℃にて発現を誘導して、変異体に富むプールを得た。ＦＡＣＳによる分取の最初のラウンドは、合計およそ８×１０７個の分取細胞に対する３つの別個の分取からなり、その後の分取ラウンドは、先のラウンドで収集した酵母の数の少なくとも１０×で解析して、残りのライブラリー変種の充分な試料採取を確実にした。Ｇａｓ６の濃度を低減することにより、分取のストリンジェンシーを増加させた。後の分取ラウンドでは、Ｇａｓ６とのインキュベーションに続いて、細胞をペレット化し、洗滌し、“解離速度”分取のために発現競合者（Ａｘｌ−Ｆｃの約５０倍のモル過剰）の存在下でインキュベートした。非結合段階の最後の１時間では、チキン抗ｃｍｙｃを１：２５０の最終希釈物に加えた。細胞をペレット化し、洗滌し、上述のように二次抗体で染色した。Ｚｙｍｏｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いて酵母培養物からプラスミドＤＮＡを回収し、プラスミドミニプレップのためにＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ストラタジーン社）へ形質転換させた。ＭＣ  Ｌａｂ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ社、カリフォルニア）によってＤＮＡ配列決定を行った。
【０１２１】
５ラウンドの分取の後、ライブラリーは、野生型Ａｘｌ  Ｉｇ１よりも強い結合を持つクローンを濃縮し始めた（図３）。ランダム化配列を含むライブラリーのスクリーニングにおける一般的な問題は、人為的結合体をスクリーニングする可能性である。例えば、抗ヘキサヒスチジン二次抗体（“ヘキサヒスチジン”は配列番号７７として開示される）を用いてＧａｓ６結合を照らすことから、幾つかの“増強された”クローンは実際に二次抗体に結合した。これに対するコントロールのため、０ｎＭのＧａｓ６及び従来通りの二次抗体標識を用いたネガティブソーティングを行って、収集プールから二次結合体を除去した（図３、分取６）。二次結合体をモニターし続けたが、この１回のみのネガティブソーティングはその後の分取産物全体から人為的結合体を排除するのに充分であった。最後に、Ｇａｓ６に対して野生型Ａｘｌ  Ｉｇ１を上回る増強された結合を有する変異体の濃縮プールを得た。比較のため、４６時間の‘解離’段階を用いた最後の分取は、４時間の‘解離’段階のみを用いた第４分取よりも高く持続的な結合を示し、動力学的解離速度の有意な改善を実証した。
【０１２２】
［例４：改変変異体の特徴付け］
リガンド枯渇を回避して結合平衡に達するように実験的に決定した容積、細胞数及びインキュベーション時間を用いて、Ｇａｓ（０．０５〜４００ｎＭ）を、室温でＰＢＳ／ＢＳＡ中で対象のタンパク質を提示している５×１０４個の酵母細胞に加えた。細胞をペレット化して、氷冷ＰＢＳ／ＢＳＡで洗滌し、チキン抗ｃｍｙｃの１：２５０希釈物を含有するＰＢＳ／ＢＳＡ中に再懸濁させ、氷上で４０分間インキュベートした。細胞をペレット化して、洗滌し、ヤギ抗チキン及びマウス抗Ｈｉｓ二次抗体の１：１００希釈物を含有するＰＢＳ／ＢＳＡ中に氷上で２０分間再懸濁させた。細胞を洗滌し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン社）及びＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社）を用いて解析した。結合滴定を、カレイダグラフソフトウエアを用いて４パラメータシグモイド曲線にあてはめて、平衡結合常数（ＫＤ）を決定した。動力学的非結合試験のため、細胞を結合平衡が達成されるまで２ｎＭのＧａｓ６と共にインキュベートし、ついで洗滌し、ペレット化して、解離速度分取のために０、１、４、９．２５、２３又は４６時間、上述のように５０倍モル過剰のＡｘｌ−Ｆｃの存在下でインキュベートした。フローサイトメトリーによって持続結合を解析し、カレイドグラフソフトウエアを用いて、未結合のものを単一又は二重指数関数デコイ曲線に適切にあてはめた。野生型ＥＡループ変異型への復帰のための持続的結合を、非結合段階を０〜９．２５時間行ったことを除いて、動力学的結合試験と同じく行った。
【０１２３】
第７、第８及び第９ラウンドの分取の産物から無作為に選択した合計３１個のクローンの配列決定は、２０個のユニークなクローンを明らかにし、第１０ラウンドの分取では、第９ラウンドの分取段物由来のクローンのうちの２個を濃縮した（下記の表３）。全てのクローンは、最初のライブラリー設計に沿ったループ長を示し、どのクローンもＡｘｌ配列に変異を含まなかった。これは、ＥＡクローンの親和性の増大がＥＥＴＩ−ＩＩ変異体に特異的であることを示す。共通Ｐ−Ｇ／Ｔ−Ｍ／Ｋモチーフについて、２０個のクローンのうち３個がループ３にＰＧＭモチーフを含み、２個の更なるクローンがＰＴＭ又はＰＧＫを含んだ。Ｐ−Ｇ／Ｔ−Ｍ／Ｋモチーフに先行するＬ又はＬ−Ｘ及び後続するＲ−Ｓも発生率がさらに少なかった（図１Ｄ）。興味深いことに、２０個のＥＡ変異体のうちの４個であるＥＡ７．０１、ＥＡ７．０５、ＥＡ７．０６及びＥＡ８．０４のみが改変ループにシステインを含まなかったが、これらのうちの１個であるＥＡ７．０５は、ループ１に先行する保存システイン残基にｃｙｓからａｒｇへの変異を含んだ。ループ３にＰ−Ｇ／Ｔ−Ｍ／Ｋモチーフを含む幾つかの変異体も改変ループにシステインを含み、これは、追加のシステインがＥＥＴＩ−ＩＩループ構造を完全には乱さない場合があることを示唆する（表３）。しかしながら、対になっていないシステインの潜在的影響を最小限にするため、ＥＡ７．０１、ＥＡ７．０６及びＥＡ８．０４を更なる調査のために選択した。簡略化のため、Ａｘｌ融合体の配列全体をここでは示さないが、配列番号４１、４６及び５０について添付した配列表で示す。Ａｘｌ  Ｉｇ１配列は、天然形態と変異形態の両方で下記に示され、下記のＥＡ配列において、注記される場合以外は天然形態で用いられることが理解される。例えば、表３に列挙するＥＡ７．０１は、図１Ｄ及び配列番号４１に示すように、Ａｘｌ  Ｉｇ１のＮ末端に融合してＡｘｌ  Ｉｇ１配列のＮ末端配列を続ける。表３に列挙する他のＥＡ類は、“ＲＧＴ．．．”で始まるＡｘｌ配列と同様に融合する。全長配列を配列番号４１、４６及び５０で与え、図１Ｄで最長“ＱＡＥ．．．”部分まで図示する。繰り返すが、下記表３のポリペプチドにおいて、末端ＧＳは、下記で配列番号８４に示すようにＡｘｌ  Ｉｇ１ドメインに融合する。
【０１２４】
【表３−１】
2014504270.tif 000011
【表３−２】
2014504270.tif 000012
【０１２５】
［例５：Ｇａｓ６に対するＡｘｌ変異型の特徴付け］
酵母ディスプレイを用いてＧａｓと改変ＥＡ変異体との間の結合相互作用を特徴付ける目的で、最初に、酵母ディスプレイがＧａｓ６−Ａｘｌ相互作用の正確な親和性測定を可能にすることを確かめることを試みた。酵母提示されたＡｘｌを用いて、既に報告されている表面プラズモン共鳴及び固相結合により測定されたＡｘｌ変異体の結合親和性を再現することができた（表４）。これは、酵母提示されたＡｘｌが受容体の組み換え異形と同様であることを立証する。
【０１２６】
【表４】
2014504270.tif 000013
【０１２７】
ＥＥＴＩ−ＩＩ変異体のみの親和性は弱すぎて検出されなかったが、Ａｘｌ  Ｉｇ１と融合した場合、ＥＡ変異体は、野生型Ａｘｌ  Ｉｇ１より最大で約４倍強いナノモル以下の親和性を示した。ＡｘｌのＮ末端に融合した野生型ＥＥＴＩ−ＩＩは、野生型Ａｘｌと同じ親和性を示した。これは、融合構築体が天然のＡｘｌ−Ｇａｓ６相互作用を妨げず、親和性の向上が単純にＡｘｌのＮ末端へのＥＥＴＩ−ＩＩノッチンの融合に起因するというよりもＥＥＴＩ−ＩＩループ変異体のためであることを更に実証する（図４及び表４）。
【０１２８】
【表５】
2014504270.tif 000014
【０１２９】
増強された結合の性質を調査するため、結合研究を行って、解離速度をモニターした。野生型Ａｘｌ  Ｉｇ１又はＥＡ変異体を発現している酵母を２ｎＭのＧａｓ６と共にインキュベーションした後で、上述した‘解離速度’分取と同様なやり方で盛る過剰の競合者と共にインキュベーションした。野生型Ａｘｌ  Ｉｇ１は単一指数関数デコイモデルによってよく説明される動力学的解離を示し、一方、ＥＡ変異体は、より複雑な動態を示し、二重指数関数デコイモデルを用いてあてはめられなければならない（図５及び表５）。コントロールとしての野生型ＥＥＴＩ−Ａｘｌは、野生型Ａｘｌ  Ｉｇ１と識別不能な解離速度を示し、単一指数関数デコイモデルによってよくあてはめられた（データは図示せず）。
【０１３０】
【表６】
2014504270.tif 000015
【０１３１】
各々の改変ループの親和性増大への寄与を調べるため、ＥＡ変異体のループ１又は３を個別に野生型ＥＥＴＩ−ＩＩ配列に復帰させてＧａｓ６に対する結合を試験した（図６）。これら研究で、野生型ＥＥＴＩ−Ａｘｌを、両ループの野生型への“復帰”に対するコントロールとして用いた。ＥＡ７．０６の持続的結合の評価は、ループ１の野生型ＥＥＴＩ−ＩＩ配列への復帰（ＥＡ７．０６ｗｔＬ１）は親のＥＡ７．０６変異体と同一の持続的結合を示すことから、ループ３のみがＧａｓ６との相互作用に貢献することを明らかにした（図６Ｂ）。ＥＡ７．０１及びＥＡ８．０４について、ループ１の野生型ＥＥＴＩ−ＩＩ配列への復帰（ＥＡ７．０１ｗｔＬ１及びＥＡ８．０４ｗｔＬ１）は、それぞれの親変異体よりも弱いが、野生型ＥＥＴＩ−Ａｘｌよりも強い持続的結合を示す。ループ３の野生型への復帰（ＥＡ７．０１ｗｔＬ３及びＥＡ８．０４ｗｔＬ３）は、野生型ＥＥＴＩ−Ａｘｌを上回る改良を完全に消失させた（図６Ａ及びＣ）。それと共に、これは、ＥＡ７．０１及びＥＡ８．０４について、ループ３が主たる寄与因子であるが、結合の最大の増強には両改変ループが必要であり、ＥＡ７．０６についてはループ３が単独の寄与因子であることを実証する。
【０１３２】
［例６：変異受容体断片（ＥＥＴＩ−ＩＩ−Ａｘｌ  Ｉｇ１）を有するノッチン融合体］
下記の実施例は、インテグリンに結合するように操作した変異ＥＥＴＩ−ＩＩノッチンに融合させたＡｘｌ  Ｉｇ１受容体断片、つまりノッチン２．５Ｄ及び２．５Ｆの調製を開示する。２．５Ｄ及び２．５Ｆは、両方ともエクバリウム・エラテリウムのトリプシン阻害剤ＩＩ（ＥＥＴＩ−ＩＩ）ノッチンの変異型である。これらはノッチンをそれぞれ、αｖβ３インテグリン及びαｖβ５インテグリン、並びにαｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、α５β１インテグリンに特異的に結合するように操作した。これを達成するため、ＥＥＴＩ−ＩＩのループ１を、インテグリン認識トリペプチドモチーフであるＲＧＤを含むランダム化配列と置き換えた。ついで、酵母表面提示及び蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて、所望の結合特性を有するクローンを選択した。これらインテグリンは臨床上重要な癌標的であり、Ａｘｌは同様に癌の治療用の新興の標的である受容体型チロシンキナーゼである。Ａｘｌの過剰発現は様々な癌の侵襲性及び転移性表現型と関連付けられており、Ａｘｌとその天然のリン癌度であるＧａｓ６との間の相互作用に拮抗することは治療上価値があり得ることが示唆される。
【０１３３】
ＡｘｌのＳ６−１及びＳ６−２は、Ａｘｌの天然リガンドであるＧａｓ６に野生型よりも高い親和性で結合する改変型のＡｘｌ  Ｉｇ１である。エラープローンＰＣＲを用いて、変異体を野生型Ａｘｌ  Ｉｇ１遺伝子に導入し、生じた変異体ＤＮＡライブラリー酵母の表面上で発現させた。ＦＡＣＳを用いて、Ｇａｓ６に対する結合が向上したクローンを単離した。クローンＳ６−１及びＳ−２は、野生型をそれぞれ２０倍及び１２倍上回る平衡結合の向上を示し、向上は主として解離速度の改善に由来する。Ｇａｓ６を強力に結合することに加えて、Ｓ６−１は、安定性の有意な増大を表す、野生型を１３℃上回る融解温度の改良を有する。
【０１３４】
下記表７は、用いた様々なペプチド（ＥＥＴＩ−ＩＩ）及びＡｘｌ変異体を示す。
【０１３５】
【表７】
2014504270.tif 000016
【０１３６】
［アミノ酸配列］
野生型ＥＥＴＩ−ＩＩ、２．５Ｄ及び２．５Ｆのアミノ酸配列を下に示す。下に示すように１アミノ酸変異及び欠失をＡｘｌ  Ｉｇ１受容体断片に導入した。角括弧付き[ＡＰ]は、表３で示すＥＡ融合体で除外した。
【０１３７】
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【０１３８】
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【０１３９】
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【０１４０】
融合構築物：
標準的なクローニング技術を用いて、ＥＥＴＩ−ＩＩ変異体をコードする遺伝子とＡｘｌ  Ｉｇ１をコードする遺伝子とを、融合タンパク質をコードする１個の遺伝子構築物へと組み立てた。ＥＥＴＩ−ＩＩドメインをＡｘｌ  Ｉｇ１のＮ末端に融合させ、Ｎ末端ノッチンドメインに続くＡｘｌ  Ｉｇ１ドメインからなる融合タンパク質を得た。融合体の全体の柔軟性を改善するため、ＥＥＴＩ−ＩＩの最後のプロリンとＡｘｌの最初のアラニン及びプロリンとを除去した。次いで融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現プラスミドと選択プラスミドの両方に連結した。この融合タンパク質を酵母の表面上で発現させて、可溶性に産生されることに加えて、結合研究を可能にしている。
【０１４１】
データ：
簡単に言うと、２．５Ｄ−Ａｘｌを提示した酵母を用いて、この融合体が機能的であるかを試験した。融合体の可溶性αｖβ３インテグリン及びＧａｓ６に結合する能力を測定して、２．４単独及びＡｘｌ単独で示される結合レベルと比較した。融合体は、２．５のもとの一致したαｖβ３結合親和性を示し、同時に野生型ＡｘｌのＧａｓ６に対する親和性を維持し、融合構築物を有効であると確認した。加えて、各可溶性標的の結合を飽和量の第二標的の存在下で試験して、融合体のαｖβ３インテグリンとＧａｓ６の両方に同時に結合する能力を試験した。これら結合レベルは、それらを個別に測定した場合と同じであり、融合体が実際にその標的両方に同時に結合できることを示唆した。最後に、融合体が安定であることを確認するため、融合体を酵母ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）中で可溶性に生産させた。精製組み換え体の収量は１リットルあたり５０〜７５ｍｇ程度であった。これらタンパク質を、αｖβ３インテグリンを過剰発現するように形質転換した細胞に対して結合する能力について試験した。それらは、２．５Ｄについて先に測定したのと一致する平衡結合を示し、更に、２個のタンパク質ドメインを融合させることは結合特性に負の影響を及ぼさなかったことを立証した。
【０１４２】
融合体の機能：
このノッチン−Ａｘｌ融合体は、インテグリン結合と天然のＧａｓ６／Ａｘｌ相互作用の両方に同時に拮抗することができる多重特異性分子として機能するであろう。Ｇａｓ６が可溶性リガンドである一方でインテグリン類は細胞表面受容体であり、両方の標的は同時に結合されることを可能にする。Ｇａｓ６の結合は、可溶性リガンドを捕捉し、可溶性リガンドが細胞外Ａｘｌ受容体に結合して活性化するのを妨げるであろう。インテグリン受容体に対する結合は、細胞外基質タンパク質と結合するのを妨げるであろう。
【０１４３】
［例７：改変ノッチンの収量を向上させるノッチン融合体］
上述のように、ノッチン類は、組み換え的に産生することが困難であり得る。それらをよく発現しているタンパク質に融合させることによって、それらを高収率で発現させることができる。ノッチンの切断は、タンパク質ドメイン間にプロテアーゼ部位を挿入することにより達成することができる。
【０１４４】
融合構築物：
標準的なクローニング技術を用いて、ＥＥＴＩ−ＩＩ変異体をコードする遺伝子とＡｘｌ  Ｉｇ１をコードする遺伝子とを、融合タンパク質をコードする１個の遺伝子構築物へと組み立てた。ノッチン融合体のＮ末端とＣ末端の両方を、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）認識部位であるＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号８０）を有し、タンパク質ドメイン間に挿入されるように作成した。次いで、遺伝子を酵母発現プラスミドに連結し、酵母ピキア・パストリスを形質転換した。
【０１４５】
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【０１４６】
Ｎ末端融合体とＣ末端融合体の双方を１リットル当たり約５０ｍｇの精製収量で産生させた。次いで、精製した融合体にＴＥＶによるタンパク質分解切断を行って、ノッチンドメインを遊離させた。次いで、ノッチンを、ＦＰＬＣによって更に精製し、その融合パートナーから分離した。注目すべきは、フォールドした機能性ＥＥＴＩ変異体２．５Ｄが、この融合タンパク質の助けなしに酵母で発現できなかったことである。
【０１４７】
Ｎ末端融合体は、太字で示す連結配列を含むことが分かる。加えて、直接融合は、連結配列なしに行うことができた、すなわち、２．５Ｄ  ＥＥＴＩ／インテグリンペプチドのカルボキシ末端セリンをＡｘｌ  Ｉｇ１ドメインのアルギニンに直接融合させる。ＥＥＴＩ２．５ＤをＡｘｌ  Ｉｇ１に融合させることによってαｖβ３／αｖβ５インテグリン及びＧａｓ６を結合することができる多重特異性分子を形成した。Ａｘｌの結晶構造の解析は、Ｎ末端が二次構造構成要素から充分に遠く離れており、実施例９で記載する直接融合を用いて、ノッチンに対する直接融合が適切に生じたことを示唆した。
【０１４８】
［例８：Ｍｅｔ受容体を結合する改変ＨＧＦ断片（ＮＫ１）に融合したαｖβ３に対するＡｇＲＰノッチン］
Ａｒａｓ４と名付けられた最も強力な結合性ＮＫ１断片の１つでＡｇＲＰ変異体７Ａを連結することによって、二重特異性融合タンパク質を構築した。Ａｒａｓ４はＡｇＲＰ７ＡのＣ末端で連結され、２つのドメイン間にアミノ酸リンカーは存在しない。
【０１４９】
酵母表面ディスプレイを用いて、可溶性αｖβ３インテグリン及びＭｅｔ受容体に対する結合を測定した。０．５ｎＭ及び５ｎＭのαｖβ３インテグリン及びＭｅｔに対する結合を測定してＡｇＲＰ７Ａ及びＡｒａｓ４単独と比較した（図７）。図７は、融合タンパク質が、αｖβ３インテグリン及びＭｅｔ受容体それぞれに対してＡｇＲＰ及びＮＫ１変異体に匹敵する結合親和性を有することを示す。これは、融合タンパク質を発現でき、その個々の構成部分がそれぞれの標的に立体障害なしに結合することを示す。
【０１５０】
融合タンパク質ＡｇＲＰ７Ａ−Ａｒａｓ４のオープンリーディングフレームをｐＰＩＣＫ９Ｋプラスミドに組み込み、ピキア・パストリスを形質転換させた。メーカーの使用説明書（インビトロジェン社）に従って、融合タンパク質を酵母培養物で発現させ、次いで、ヒスチジンタグ（配列番号７７）による金属キレートクロマトグラフィーにより精製した。この融合タンパク質の遺伝子の概略図を下の四角形に示す。油号タンパク質ＡｇＲＰ７Ａ−Ａｒａｓ４のタンパク質配列を表８に列挙し、下に列挙する。
【０１５１】
2014504270.tif 000021
【０１５２】
上記は、ｐＰＣＩ９Ｋプラスミド中の融合タンパク質の遺伝子の模式図である。ＳｎａＢＩ、ＡｖｒＩＩ及びＭｌｕＩは制限酵素部位である。
【０１５３】
【表８−１】
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【表８−２】
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【０１５４】
ＮＫ１断片の変異型配列を用いることができ、これは、例えば、Ｈａｒｔｍａｎら、“Ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ ｓｃａｔｔｅｒ ｆａｃｔｏｒ/ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｓ ｔｈｅ ｃ−Ｍｅｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｅｌｌ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｕｔ ｎｏｔ ｍｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ,” Ｐｒｏｃ. Ｎａｔ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ Ｖｏｌ. ８９, ｐｐ. １１５７４−１１５７８, １９９２年１２月に記載されている。
上記タンパク質（配列番号６６）の詳細を下に示す。
【０１５５】
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【０１５６】
Ｃ末端でＨｉｓタグに下線を引いてある。ＡｇＲＰ７Ａ−Ａｒａｓ４融合タンパク質の結合親和性を、αｖβ３インテグリンとＭｅｔ受容体の双方を発現するＫ５６２−αｖβ３細胞で測定した（図８）。Ｋ５６２白血病細胞は予めαｖβ３インテグリンで形質転換した（Ｂｌｙｓｔｏｎｅ, Ｓ. Ｄ. （１９９４）. Ｊ. Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ. １２７, １１２９-１１３７）。フローサイトメトリーにより、これら細胞株がＭｅｔ受容体も天然に発現することも示した（データは図示せず）。
【０１５７】
ノッチン（ＥＥＴＩ２．５Ｆ及びＡｇＲｐ７Ａ）並びにＮＫ融合タンパク質を作成して、生物学的特徴の試験管内での研究のために精製した。これら様々なＮＫ変異型を、Ｍ２．２、Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）及びＡｒａｓ４を含む２個の別個のノッチンタンパク質のＣ末端に融合させた。従って、次のバリエーションで構成される６個のタンパク質：ＡｇＲｐ７Ａ−Ａｒａｓ４、ＥＥＴＩ２．５Ｆ−Ａｒａｓ４、ＡｇＲｐ７Ａ−Ｍ２．２、ＥＥＴＩ２．５Ｆ−Ｍ２．２、ＡｇＲｐ７Ａ−Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）及びＥＥＴＩ２．５Ｆ−Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）を構築して、試験管内アッセイに用いた。Ｍ２．２は指向進化の第２ラウンドに由来し、Ａｒａｓ４は、我々の先のＮＫ１出願の指向進化の第３ラウンドに由来する。Ｄ１２７Ａは、アンタゴニスト活性を調節することが既に示されている点変異である。
【０１５８】
Ｋ５６２−αｖβ３細胞結合アッセイでは、形質転換されてαｖβ３インテグリンを発現するＫ５６２細胞におけるαｖβ３インテグリンに対するＡｇＲｐ７Ａ−Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）及びＥＥＴＩ２．５Ｆ−Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）の結合親和性（ＫＤ値）が２．１±１．１ｎＭ及び４．６±１．６ｎＭである。ＨＵＶＥＣ細胞結合アッセイでは、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対するＡｇＲｐ７Ａ−Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）及びＥＥＴＩ２．５Ｆ−Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）の結合親和性（ＫＤ値）が９．４±１．０ｎＭ及び４．７±０．６ｎＭである。ＨＵＶＥＣは、中間レベルのαｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン及びＭｅｔ受容体並びに高レベルのαｖβ３インテグリンを発現する。
【０１５９】
加えて、デュアル受容体直接結合アッセイは、多重特異性タンパク質がＭｅｔ及びインテグリンに同時に結合することを示した。この実験では、可溶性Ａｌｅｘａ−４８８標識ヒトＭｅｔ−Ｆｃ（２２０ｎＭ）と単一特異性タンパク質及び多重特異性タンパク質との混合物をＫ５６２−αｖβ３細胞に加えた。結合はフローサイトメトリーによって検出した。ＡｇＲｐ７Ａ−Ｍ２．２、ＥＥＴＩ２．５Ｆ−Ｍ２．２、ＡｇＲｐ７Ａ−Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）及びＥＥＴＩ２．５Ｆ−Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）は可溶性Ｍｅｔ−Ｆｃに結合でき、またＫ５６２−αｖβ３細胞上のαｖβ３インテグリンと結合した。これらの結果は、ノッチン融合体がαｖβ３インテグリン及びＭｅｔ受容体と同時に結合できることを実証する。
【０１６０】
タンパク質を４０％ヒト血清とともに３７℃で数日間にわたりインキュベートしたときに、ＡｇＲｐ７Ａ−Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）及びＥＥＴＩ２．５Ｆ−Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）の血清安定性が示された。試料をウエスタンブロットにより分析し、ＦＬＡＧエピトープタグに対する抗体を用いて検出した。７日間にわたり無傷の融合タンパク質の量に有意な低減は観察されず、血清プロテアーゼ及び温度上昇に対するノッチン融合タンパク質の安定性が示された。
【０１６１】
細胞を０．５ｎＭのＨＧＦで刺激するＨＵＶＥＣ増殖アッセイを行った。ＡｇＲｐ７Ａ、ＥＥＴＩ２．５Ｆ、ＡｇＲｐ７Ａ−Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）又はＥＥＴＩ２．５Ｆ−Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）タンパク質を加えて、ＨＵＶＥＣ増殖の阻害に対する効果を観察した。ＡｇＲｐ７Ａは、ＨＵＶＥＣ増殖に対してほとんど阻害効果を持たなかった。ＥＥＴＩ２．５Ｆ単独では、良好な阻害を示した（１μＭで７０％阻害、細胞単独の場合＝９０％阻害）。ノッチン融合タンパク質ＡｇＲｐ７Ａ−Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）又はＥＥＴＩ２．５Ｆ−Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）は、陰性コントロールのものと等しい阻害レベルに近づくＡｇＲｐ７Ａ及びＥＥＴＩ２．５Ｆと比較して、細胞増殖に対してより高い阻害効果を示した。
【０１６２】
Ｍｅｔ受容体リン酸化アッセイをＰＣ３（前立腺癌細胞）で行った。Ｍｅｔ受容体リン酸化は、０．３ｎＭのＨＧＦで刺激した後にウエスタンブロットによりアッセイした。ＡｇＲｐ７Ａ、Ａｒａｓ４及びＡｇＲｐ７Ａ−Ａｒａｓ４タンパク質を加えて、Ｍｅｔリン酸化の阻害に対する効果を観察した。ＡｇＲｐ７ＡはＭｅｔリン酸化の阻害を示さなかった。Ａｒａｓ４及びＡｇＲｐ７Ａ−Ａｒａｓ４の添加に対しては、Ｍｅｔ受容体リン酸化の用量依存的な低減が観察され、ＡｇＲｐ７Ａ−Ａｒａｓ４ノッチン融合タンパク質でそれよりわずかに高い阻害効果が観察された。（注：ＰＣ３細胞は中間レベルのαｖβ３インテグリン及びＭｅｔ並びに低レベルのα５β１インテグリンを発現する）
【０１６３】
マイクロタイタープレートのウェル上にヒトビトロネクチンをコーティングし、様々な濃度のＡｒａs４、ＡｇＲｐ７Ａ、ＥＥＴＩ２．５Ｆ、ＡｇＲｐ７Ａ−Ａｒａｓ４又はＥＥＴＩ２．５Ｆ−Ａｒａｓ４の存在下で細胞を播種することによって、ビトロネクチンに対するＰＣ３細胞接着の阻害を行った。予想通り、ＰＣ３細胞接着を阻害しなかったＡｒａｓ４を除き、全ての構築物についての最大半量濃度の値は類似し、低ｎＭ範囲（約２０〜４０ｎＭ）であった。
【０１６４】
［例９：野生型Ａｘｌ受容体断片に直接融合したノッチン融合体］
例６で記載したように、ＥＥＴＩノッチン／インテグリン結合ペプチドのＡｘｌ膜結合型キナーゼ受容体との直接結合体を調製した。Ａｘｌ  Ｉｇ１ドメインのアミノ酸２１〜１３２を用いた。ＥＥＴＩ２．５ＤをＡｘｌ  Ｉｇ１に融合させることによって、αｖβ３／αｖβ５インテグリン及びＧａｓ６を結合できる多重特異性分子を形成した。
【０１６５】
配列を下に示し、ノッチンタンパク質２．５Ｄに下線を引き、Ａｘｌ部分は配列ＲＧＴ．．．で始まる。
【０１６６】
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【０１６７】
融合タンパク質がαｖβ３インテグリンとＧａｓ６の一方に結合する能力を、ＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌ融合タンパク質を酵母提示構築物にクローン化して細胞表面上に提示させる酵母提示プラットフォームを用いて試験した。ＥＥＴＩ２．５Ｄ、Ａｘｌ  Ｉｇ１又はＥＥＴＩ２．５−Ａｘｌ融合タンパク質のいずれかを発現している酵母を様々な濃度の可溶性αｖβ３インテグリン又はＧａｓ６とともにインキュベートした。結合反応は平衡となり、その時点で過剰なリガンドを洗滌によって除去した。適切なリガンド（インテグリン又はＧａｓ６）に対する蛍光標識抗体を含有する溶液中に、酵母を懸濁させた。フローサイトメトリーを用いて、二次抗体の検出によって、結合したインテグリン又はＧａｓ６を定量した。これらの実験は、ＥＥＴＩ２．５Ｄ及びＡｘｌ  Ｉｇ１がそれぞれαｖβ３インテグリン及びＧａｓ６に結合するのみであり、一方でＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌ融合体は両タンパク質にそれら単一特異性構成部分と等しいレベルで結合することを示した。このデータは、ＥＥＴＩ２．５ＤとＡｘｌ  Ｉｇ１との融合がどちらの標的タンパク質に対する結合も破壊しないことを実証する。ＥＥＴＩ２．５Ｄ、野生型Ａｘｌ  Ｉｇ１又はＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌ融合体を発現している酵母を２０ｎＭ、５０ｎＭ又は１００ｎＭのαｖβ３インテグリンとともにインキュベートした。予想されるように、ＥＥＴＩ２．５Ｄ及びＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌのみがインテグリンに結合し、野生型Ａｘｌはこの受容体に対する天然親和性を有さない。同一の組の酵母試料を０．２ｎＭ、２ｎＭ又は２０ｎＭのＧａｓ６とともにインキュベートした。野生型Ａｘｌ及びＥＥＴＩ２．５Ｄ−ＡｘｌはＧａｓ６に対する親和性を示すが、ＥＥＴＩ２．５Ｄのみ結合を検出しない。両方の場合において、ＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌ融合タンパク質は、その単一特異性構成部分と同様の親和性でインテグリン又はＧａｓ６に結合する。
【０１６８】
次に、ＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌを発現している酵母を、飽和濃度のＧａｓ６の存在下でαｖβ３インテグリンとともにインキュベートすることによって、又は飽和濃度のαｖβ３インテグリンの存在下でＧａｓ６とともにインキュベートすることによって、融合体が両標的に同時に結合する能力を調べた。これらの結果の概要を図９で示す。両方の場合において、過剰な可溶性第二リガンドの存在は、第一リガンドに対する結合を実質的に減少させない。これらの結果は、１つの標的のＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌ融合体タンパク質への結合が第二の結合を妨げずＧａｓ６とαｖβ３インテグリンの双方との同時相互作用を容認することを示す。
【０１６９】
図９の酵母表面提示結合データを参照する。図９Ａでは、酵母を、２００ｎＭのαｖβ３インテグリンの存在下で２０ｎＭ又は１００ｎＭのＧａｓ６とともにインキュベートした。二重特異性タンパク質は、過剰なインテグリンが存在する場合もＧａｓ６に対する親和性を維持する。図９Ｂでは、酵母を、１００ｎＭのＧａｓ６の存在下で１００ｎＭ又は２００ｎＭのαｖβ３インテグリンとともにインキュベートした。Ｇａｓ６が存在する場合も、αｖβ３インテグリンに対する親和性は失われない。それとともに、これら実験は、ＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌが両標的に同時に結合できることを示唆する。
【０１７０】
［例１０：組み換え酵母で生産したノッチン融合体］
次いで、ＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌ融合タンパク質をｐＰｉｃ９Ｋ酵母分泌ベクターにクローン化し、メーカーのマニュアル（インビトロジェン社）に従って酵母株Ｐ．パストリスで可溶性タンパク質を組み換え的に生産した。ニッケル親和性クロマトグラフィーを用いて培養上清からタンパク質を精製し、タンパク質をエンドグリコシダーゼ（ｅｎｄｏＨ）で処理することによって、異種酵母糖鎖付加を切断した。単量体のＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて更に精製した。最終産物の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び分析的サイズ排除クロマトグラｆ−を用いて分析した。高度に純粋な単量体ＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌ融合タンパク質を１リットル当たりおよそ３５ミリグラムの収率で得た。
【０１７１】
組み換え的に生産したＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌを、細胞表面αｖβ３インテグリンを結合する能力について試験した、αｖβ３インテグリンを過剰発現するように形質転換されているＫ５６２白血病細胞（Ｋ５６２−αｖβ３細胞）を様々な濃度のＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌとともにインキュベートした。反応が平衡に達した時点で、過剰なＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌを洗滌によって除去し、組み換え多重特異性タンパク質上のＦＬＡＧエピトープタグに対する蛍光標識抗体を含有する溶液に細胞を再懸濁させた。次いで、フローサイトメトリーを用い、蛍光抗ＦＬＡＧ抗体を検出することによって、結合したＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌの量を定量した。ＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌ融合タンパク質のＫ５６２−αｖβ３細胞に対する親和性（Ｋｄ）を１．７２ｎＭであると測定した。加えて、円二色性分光法を用いて、野生型Ａｘｌと比較して、ＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌ融合タンパク質の熱安定性を分析した。野生型Ａｘｌ  Ｉｇ１は４１℃の融解温度（Ｔｍ）を有することが分かった。ＥＥＴＩ２．５ＤをＡｘｌのｎ末端に融合させることによって、１１℃の安定性の改善が観察された（Ｔｍ約５２℃）。これらの結合研究及びＣＤ実験の結果を下記の表にまとめた。
【０１７２】
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【０１７３】
Ｋ５６２−αｖβ３細胞上に発現したαｖβ３インテグリンに対する観察された結合の特異性を、この細胞をＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌ及び環状ＲＧＤ（ｃＲＧＤ）とともにインキュベートすることによって試験した。ＥＥＴＩ２．５Ｄはインテグリン上でｃＲＧＤと同じエピトープに結合するため、タンパク質がインテグリンに特異的に結合している場合、モル過剰のｃＲＧＤはＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌに競合して解離させる。ｃＲＧＤは、Ｋ５６２−αｖβ３細胞へのＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌの結合を阻害し、タンパク質が実際に細胞表面上のαｖβ３インテグリンに特異的に結合していることを示唆する。
【０１７４】
［例１１：自己切断ＴＥＶ−ノッチン融合体］
幾つかのノッチンは、適切に折り畳まれたモノマーよりも高次オリゴマーを生成するため、組み換え的に生産することが困難である。例えば、我々は、固相ペプチド合成を用いたＥＥＴＩ２．５Ｄの化学合成及び試験管内折り畳みの確固たる方法を立証しているが、このノッチンを酵母に基づく発現系で組み換え的に発現させることはできていない。適切に折り畳まれたＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌ融合体を高い組み換え体収率で生産できるという知見は、ノッチンを組み換え的に生産する手法としての自己切断ＴＥＶ−２．５Ｄ構築物の開発につながった。
【０１７５】
この融合体では、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼをＥＥＴＩノッチン変異型２．５Ｄに融合させた。ＴＥＶは、アミノ酸配列中グリシン（Ｇ）がセリン（Ｓ）で置き換えられてもよいＳＥＮＬＹＦＱＳ又はＧＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号８２）のどちらかであり得る８個のアミノ酸配列を認識する。次いで、ＴＥＶは最後のＧ／Ｓの直前で切断する。この切断部位は、ＴＥＶプロテアーゼのＣ末端に位置し、ＥＥＴＩ２．５Ｄが続いた。ＥＥＴＩ２．５Ｄの最初のアミノ酸はグリシン（Ｇ）であり、切断後に残ったものから余分な残基を除外するため、そのグリシンを取り除く。翻訳の際、融合タンパク質のプロテアーゼ部分は、別の融合体の切断部位と相互作用して、それを切断し、そのため遊離のＥＥＴＩ２．５Ｄノッチンが生成することができる。
【０１７６】
この自己切断融合タンパク質をＮ末端及びＣ末端にそれぞれＦＬＡＧ及び６×ＨＩＳタグを伴ってｐＰｉｃ９Ｋ酵母分泌ベクターにクローン化し、メーカーの指示に従って（インビトロジェン社）酵母株Ｐ．パストリスに形質転換させた。発現培養物の上清に対するウエスタンブロットはＦＬＡＧ又はＨＩＳタグのどちらかについて探索した。ウエスタンブロットは、Ｎ末端ＦＬＡＧタグについての探索がＴＥＶプロテアーゼに相当する高分子量種を示すことを明らかにした。Ｃ末端の６×ＨＩＳタグについて染色したブロットは、切断されたノッチンに相当する約８ｋＤａの種を示す。これら発現試験に基づき、この自己切断構築物が、標準的な微生物系での生産が困難であるノッチンを組み換え的に発現させる実行可能な方法である。
【０１７７】
自己切断構築物は、微生物系で生産することができない他のノッチンの組み換え生産を容認する。このストラテジーはノッチン以外のタンパク質を生産することにも使用できる。あるいは、Ａｘｌのような融合パートナーを用いて、ノッチンとＡｘｌタンパク質との間にプロテアーゼ切断部位を導入して、ノッチンの組み換え発現を促すことができる。
【０１７８】
［例１２：ノッチン−Ｆｃ融合体］
この例では、マウス抗体のＦｃ部分をインテグリン結合ノッチンであるＥＥＴＩに上述するように融合させる。ノッチン−Ｆｃ融合体を分子クローニング及び哺乳動物細胞発現によって創出した。これら修飾したノッチンタンパク質は、数分程度の半減期を有する未修飾ノッチンと比較して、長い循環時間（数日）を有するであろう。この系を用いて、ＥＥＴＩをベースとするノッチンペプチド２．５Ｄ及び２．５Ｆ並びに野生型ＥＥＴＩ−ＩＩをマウスＩｇ２ａのＦｃドメイン（配列番号８３）に融合させて哺乳動物ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞でノッチン−Ｆｃ融合タンパク質を発現できることを示した。Ｆｃドメインは既知の配列であり、ｍＲＮＡ配列については例えばアクセッション番号ＮＭ＿０１０１８４．２を参照されたい。ノッチンペプチドを生成してＮｕＰＡＧＥ４〜１２％ビス−トリスゲル上で泳動させた。結果は、予期したサイズの非還元型（ＮＲ）及び還元型（Ｒ）ノッチン２２．５Ｄ−Ｆｃを示した。次いで、これらノッチンタンパク質をゲル濾過クロマトグラフィーによって分析して、純粋なノッチン−Ｆｃ２は凝集の傾向を示さなかった。
【０１７９】
次いで、ノッチン−Ｆｃタンパク質の腫瘍細胞株への結合を測定した。ノッチン２．５Ｆ−Ｆｃペプチドは、野生型ＥＥＴＩＩ−Ｆｃに対して測定した場合のノッチン２．５Ｄ−Ｆｃペプチドと比較して、より高い親和性でｓｋ０ｖ３細胞に結合することを見出した。対照的に、ノッチン２．５−Ｆｃ及び２．５Ｄ−Ｆｃは、αｖβ３インテグリンで形質転換させたＫ５６２白血病細胞に同様な親和性で結合した。
【０１８０】
別の腫瘍モデルでは、ノッチン−Ｆｃタンパク質が細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質であるビトロネクチンに対するＰＣ３細胞接着を阻害する能力を分析した。両ノッチン−Ｆｃタンパク質は腫瘍細胞接着を強く阻害し、一方、陰性コントロールは阻害しなかった。結果を図１０に示す。インテグリン−ＥＣＭ接着の阻害はカスパーゼ媒介性アポトーシスを誘導するため、この生物学的メカニズムは、将来の研究で調査されるであろう。
【０１８１】
本研究は、受容体結合親和性を乱すことなく抗体Ｆｃドメインをノッチンタンパク質に融合させることができることの最初の実証である。このストラテジーは、インテグリン以外の様々な生物医学的標的に対する改変ノッチンタンパク質の半減期を増加させるための一般的なプラットフォームであろう。また、一価のノッチンを上回る増加した結合親和性と増加又は変化した生物学的効力を有し得る二量体タンパク質（Ｆｃ融合体は二価であるため）を作成する潜在的なプラットフォームでもある。更に、Ｆｃ融合体を骨組みとして用いて、抗体に基づく薬物を用いて行われているものと同様な、より高次のオリゴマー又は多価／多重特異性タンパク質を構築することができる。
【０１８２】
［結論］
上記具体的な記載は、発明を例示する及び説明することを意図しており、添付された請求の文字通りの等価な範囲によって定義される発明の範囲を限定するものとみなされるべきでない。本明細書中で言及するあらゆる特許又は刊行物も、明確に提示されていないことがあり得るがこの分野の研究者によって理解されるであろう本発明の特定の態様を実施するのに有用な方法及び材料の詳細を伝えることを意図する。このような特許又は刊行物は、必要に応じ、参照される方法又は材料を説明する及び使用可能にする目的で、各々が具体的及び個別に参照により援用された及び本明細書に含まれた場合と同じ程度まで、参照により本明細書に含まれるものとする。          
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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