(57)【要約】患者においてヒト多形グリオブラストーマ（ＧＢＭ）脳腫瘍を診断および治療するための方法を開示する。この方法は、患者に有効量の組成物を投与する工程を含み。前記組成物は１２−２０アミノ酸長であり、脳腫瘍原始細胞（ＢＴＩＣ）または高浸潤グリオーマ細胞（ＨＩＧＣ）のサブタイプに優先的に結合する能力について選択されたペプチドを含む。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）細胞が注入された１つの脳半球から反対側の脳半球に転移することにより特徴付けられるヒト多形グリオブラストーマ（ＧＢＭ）細胞の高浸潤グリオーマ細胞（ＨＩＧＣ）サブタイプ、および
（ｉｉ）自己複製し、外来の有糸分裂促進因子または成長因子の添加なしでの神経半球を形成し、および免疫不全マウスの脳に移植したときにｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍を誘発する能力により特徴付けられるヒトＧＢＭ細胞の脳腫瘍原始細胞（ＢＴＩＣ）サブタイプ、の１つを標的とするペプチド組成物であって、ペプチドが１２−２０アミノ酸の単離ペプチドであり、ＨＩＧＣのターゲティングについての配列番号１―１０、１３および１７から選択される配列を含み、およびＢＴＩＣのターゲティングについての配列番号１１−１６からなる群より選択される配列を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記ペプチドが、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−およびＤ−アミノ酸の混合物、または逆に配列されたＤ−アミノ酸のレトロインベルソペプチドからなる、請求項１のペプチド組成物。
【請求項３】
ヒトＧＢＭ腫瘍を有する患者においてＨＩＧＣまたはＢＴＩＣの局在化のために用いるときに、前記ペプチドに結合している放射性造影剤を更に含む、請求項１に記載のペプチド組成物。
【請求項４】
ヒトＧＢＭ腫瘍を有する患者においてＨＩＧＣまたはＢＴＩＣを抑制または死滅させるために用いるときに、前記ペプチドに結合した抗がん剤を更に含む、請求項１のペプチド組成物。
【請求項５】
ＨＩＧＣのターゲティングに用いる場合に、前記ペプチドが配列番号７（Ｈ１０）、１３（Ｅ１０）、および１７（修飾Ｈ１０）からなる群より選択される配列を含む、請求項１に記載のペプチド組成物。
【請求項６】
ＨＩＧＣのターゲティングに用いる場合に、前記ペプチドが配列番号１７（修飾Ｈ１０）の配列を含む、請求項１に記載のペプチド組成物。
【請求項７】
ＢＴＩＣのターゲティングに用いる場合、前記ペプチドが配列番号１１（７Ａ）、１３（Ｅ１０）、１４（３Ｆ）、および１６（３Ｂ）からなる群より選択される配列を含む、請求項１のペプチド組成物。
【請求項８】
前記ペプチドが配列番号１１（７Ａ）の配列を含む、請求項７のペプチド組成物。
【請求項９】
脳血液関門を通過してヒトＧＢＭ細胞を患者に届けるための使用において、前記ペプチドが配列番号１８または１９で定義されるキャリアペプチドに結合されている、請求項１のペプチド組成物。
【請求項１０】
前記ペプチドがポリ（ラクチドｃｏ−グリセリド）コポリマー、シクロデキストリン、またはセチルアルコール／ポリソルベートからなるナノ粒子内に封入されている、請求項１のペプチド組成物。
【請求項１１】
ＨＩＧＣに優先的に結合する少なくとも１つのペプチドおよびＢＴＩＣに優先的に結合する少なくとも１つのペプチドを含む、請求項１のペプチド組成物の使用。
【請求項１２】
ＧＢＭ腫瘍を有する患者においてＨＧＩＣまたはＢＴＩＣサブタイプ細胞の存在を検出するために、前記組成物がペプチドに結合している検出可能な造影剤を含む、請求項１の組成物の使用。
【請求項１３】
ＧＢＭ腫瘍を有する患者におけるＨＩＧＣまたはＢＴＩＣサブタイプ細胞の抑制または死滅させるために、前記組成物が前記ペプチドに結合している抗がん剤を含む、請求項１のペプチド組成物の使用。
【請求項１４】
患者において、多形グリオブラストーマ（ＧＢＭ）腫瘍を特徴づけるための方法であって、
（ａ）（ｉ）１２−２０アミノ酸の間の長さを有し、細胞が反対側に注入された脳半球から反対側の脳半球に移転をする能力、第一ペプチドに結合する能力、および患者の腫瘍領域において細胞に結合したときに第一ペプチドを造影させることができる第一造影剤へ結合する能力により特徴づけられる、ヒトＧＢＭ細胞の高浸潤グリオーマ細胞（ＨＩＧＣ）サブタイプへ優先的に結合する能力について選択された、第一ペプチドを含むペプチド組成物を患者に投与した後にｉｎ  ｖｉｖｏで患者の脳腫瘍の像を形成する工程、
（ｂ）（ｉ）（ｂ）自己再生能力、外来有糸分裂促進因子および成長因子の投与なしで球体を形成する能力、および免疫不全状態のマウスの脳にあったときにｉｎ  ｖｕｉｖｏで腫瘍を誘発する能力の幹細胞様性質により特徴づけられ、および患者の腫瘍領域における細胞に結合したときに生体内において第二ペプチドを造影することができる第二造影剤に結合する、ヒトＧＢＭ細胞の脳腫瘍開始細胞（ＢＴＩＣ）サブタイプに優先的に結合する能力について選択された１２−２０アミノ酸の間の長さを有する第二ペプチドを含むペプチド組成物を投与した後に患者のｉｎｖｉｖｏでの脳腫瘍の像を形成する工程、、
（ｃ）第一および第二ペプチドの分布および工程（ａ）および（ｂ）で形成されたイメージで観察されたそれらの関連するコントラストの分布から、
（ｃｉ）腫瘍の外科的切除のための、腫瘍の境界、
（ｃｉｉ）腫瘍の放射線治療の目的のための、腫瘍の境界、
（ｃｉｉｉ）腫瘍を処理するための化学的治療方法の計画する目的のための、腫瘍内の別の腫瘍細胞表現型の発現プロファイル、および
（ｃｉｖ）工程（ａ）および工程（ｂ）が繰り返して行われるときの所与のタイムコースに対する、第一および第二ペプチドとそれらに関与する造影剤の分布の変化、
の少なくとも１つを決定する工程を含む。
【請求項１５】
工程（ａ）および（ｂ）は、
（ｉ）造影剤がガドリニウムベース造影剤、酸化鉄造影剤、およびマンガン造影剤からなる群より選択されるＭＲＩ、
（ｉｉ）造影剤が６４Ｃｕジアセチル−ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン）、１８Ｆ−フルオロデオキシグルコース、１８Ｆ−フルオライド、３’−デオキシ−３’−［１８Ｆ］−フルオロチミジン、１８Ｆ−フルオロミソニダゾール、ガリウム、テクネチウム−９９ｍ、およびタリウムからなる群より選択される陽電子放射断層撮影またはシンチグラフィー、ならびに
（ｉｉｉ）造影剤がバリウム、ガストログラフィン、およびヨウ素造影剤からなる群より選択されるＸ線撮像、の１つにより行うことができる、請求項１４の方法。
【請求項１６】
工程（ａ）および（ｂ）が同時に行われ、第一および第二造影剤が結合している第一および第二ペプチドが独立して検出することができる、請求項１４の方法。
【請求項１７】
工程（ａ）および（ｂ）を連続的に行う、請求項１４の方法。
【請求項１８】
第一ペプチドが配列番号７（Ｈ１０）、１３（Ｅ１０）、および１７（修飾Ｈ１０）からなる群より選択される配列を含む、請求項１４の方法。
【請求項１９】
第二ペプチドが配列番号１１（７Ａ）、１３（Ｅ１０）、１４（３Ｆ）、および１６（３Ｂ）からなる群より選択される配列を含む、請求項１４の方法。
【請求項２０】
ペプチド組成物が静脈内に投与される請求項１４の方法。
【請求項２１】
患者におけるヒト多形グリオブラストーマ（ＧＢＭ）腫瘍における細胞表現型の遺伝子発現プロファイルを特徴づける方法において、
（ａ）（ｉ）分化したＧＢＭ腫瘍細胞、
（ｉｉ）細胞が注入された１つの脳半球から反対側の脳半球へ移転する能力により特徴付けられるヒト多形グリオブラストーマ（ＧＢＭ）の高浸潤性グリオーマ細胞（ＨＩＧＣ）サブタイプ、および
（ｉｉｉ）自己再生でき、外来有糸分裂促進因子および成長因子の添加なしで、半球を形成することができ、免疫不全マウスの脳にあったときに生体内で腫瘍を形成することができる、それらの幹細胞様性質により特徴付けられるヒトＧＢＭの脳腫瘍開始細胞（ＢＴＩＣ）サブタイプの１つに対応する腫瘍において、細胞を同定する工程、および
（ｂ）この細胞タイプの知られている遺伝子発現パターンと同定された細胞タイプとの相関を決定する工程からなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は２００９年１１月２４日に提出された米国仮出願Ｎｏ．６１／２６４，０６４に対して優先権を主張する２０１０年１１月１９日に提出された米国一部継続出願Ｎｏ．１２／９５０，８５５である、２０１１年６月２日に提出された米国一部継続出願Ｎｏ．１３／１５２，２１４である。これらの文献を参照により本発明に援用する。
【０００２】
本発明は悪性グリア細胞、特にヒト多形グリオブラストーマ（ＧＢＭ）細胞の脳腫瘍原始細胞（ＢＴＩＣ）サブタイプおよびヒトＧＢＭ細胞の高浸潤性グリオーマ細胞（ＨＩＧＣ）サブタイプを標的とすることができるペプチド、ならびにこのペプチドを用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
引用文献
１．  Ｖａｎ  Ｍｅｉｒ，  Ｅ．Ｇ．，  Ｈａｄｊｉｐａｎａｙｉｓ，  Ｃ．Ｇ．，  Ｎｏｒｄｅｎ，  Ａ．Ｄ．，  Ｓｈｕ，  Ｈ．Ｋ．，  Ｗｅｎ，  Ｐ．Ｙ．，  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，  Ｊ．Ｊ．  Ｅｘｃｉｔｉｎｇ  ｎｅｗ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏ−ｏｎｃｏｌｏｇｙ：  ｔｈｅ  ａｖｅｎｕｅ  ｔｏ  ａ  ｃｕｒｅ  ｆｏｒ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ．  ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ６０，  １６６−１９３．
２．  Ｔｒａｎ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，  Ｍ．Ａ．  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｉｎｃｕｒａｂｌｅ  ｃａｎｃｅｒｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １７，  ４１７−４２１．
３．  Ｌａｃｒｏｉｘ，  Ｍ．，  Ａｂｉ−Ｓａｉｄ，  Ｄ．，  Ｆｏｕｒｎｅｙ，  Ｄ．Ｒ．，  Ｇｏｋａｓｌａｎ，  Ｚ．Ｌ．，  Ｓｈｉ，  Ｗ．，  ＤｅＭｏｎｔｅ，  Ｆ．，  Ｌａｎｇ，  Ｆ．Ｆ．，  ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ，  Ｉ．Ｅ．，  Ｈａｓｓｅｎｂｕｓｃｈ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｈｏｌｌａｎｄ，  Ｅ．，  Ｈｅｓｓ，  Ｋ．，  Ｍｉｃｈａｅｌ，  Ｃ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｓａｗａｙａ，  Ｒ．  （２００１）．  Ａ  ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ４１６  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ：  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ，  ｅｘｔｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ９５，  １９０−１９８．
４．  Ｍａｎｇｉｏｌａ，  Ａ．，  ｄｅ  Ｂｏｎｉｓ，  Ｐ．，  Ｍａｉｒａ，  Ｇ．，  Ｂａｌｄｕｃｃｉ，  Ｍ．，  Ｓｉｃａ，  Ｇ．，  Ｌａｍａ，  Ｇ．，  Ｌａｕｒｉｏｌａ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ａｎｉｌｅ，  Ｃ．  （２００８）．  Ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  １１３，  ８４１−８４６．
５．  Ｗａｎｇ，  Ｌ．，  Ｒａｈｎ，  Ｊ．Ｊ．，  Ｌｕｎ，  Ｘ．，  Ｓｕｎ，  Ｂ．，  Ｋｅｌｌｙ，  Ｊ．Ｊ．，  Ｗｅｉｓｓ，  Ｓ．，  Ｒｏｂｂｉｎｓ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｆｏｒｓｙｔｈ，  Ｐ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｓｅｎｇｅｒ，  Ｄ．Ｌ．  （２００８）．  Ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｇｌｉｏｍａ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐ７５  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ６，  ｅ２８９．
６．  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，  Ａ．Ｌ．，  Ｌｕｎ，  Ｘ．，  Ｒａｈｎ，  Ｊ．Ｊ．，  Ｌｉａｃｉｎｉ，  Ａ．，  Ｗａｎｇ，  Ｌ．，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｍ．Ｇ．，  Ｐａｒｎｅｙ，  Ｉ．Ｆ．，  Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，  Ｂ．Ｌ．，  Ｒｏｂｂｉｎｓ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｆｏｒｓｙｔｈ，  Ｐ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｓｅｎｇｅｒ，  Ｄ．Ｌ．  （２００７）．  Ｔｈｅ  ｐ７５  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓ  ａ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｇｌｉｏｍａ  ｉｎｖａｓｉｏｎ．  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ５，  ｅ２１２．
７．  Ｋｏｕｋｏｕｒａｋｉｓ，  Ｇ．Ｖ．，  Ｋｏｕｌｏｕｌｉａｓ，  Ｖ．，  Ｚａｃｈａｒｉａｓ，  Ｇ．，  Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ，  Ｃ．，  Ｐａｎｔｅｌａｋｏｓ，  Ｐ．，  Ｍａｒａｖｅｌｉｓ，  Ｇ．，  Ｆｏｔｉｎｅａｓ，  Ａ．，  Ｂｅｌｉ，  Ｉ．，  Ｃｈａｌｄｅｏｐｏｕｌｏｓ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｋｏｕｖａｒｉｓ，  Ｊ．  （２００９）．  Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｈｉｇｈ  ｇｒａｄｅ  ｂｒａｉｎ  ｇｌｉｏｍａｓ：  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ；  ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｒｔｉｃｌｅ．  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １４，  １５６１−１５７７．
８．  Ｋｉｔａｎｇｅ，  Ｇ．Ｊ．，  Ｃａｒｌｓｏｎ，  Ｂ．Ｌ．，  Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，  Ｍ．Ａ．，  Ｇｒｏｇａｎ，  Ｐ．Ｔ．，  Ｌａｍｏｎｔ，  Ｊ．Ｄ．，  Ｄｅｃｋｅｒ，  Ｐ．Ａ．，  Ｗｕ，  Ｗ．，  Ｊａｍｅｓ，  Ｃ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｓａｒｋａｒｉａ，  Ｊ．Ｎ．  （２００９）．  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＧＭＴ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ．  Ｎｅｕｒｏ  Ｏｎｃｏｌ  １１，  ２８１−２９１．
９．  Ｈａｌａｔｓｃｈ，  Ｍ．Ｅ．，  Ｌｏｗ，  Ｓ．，  Ｍｕｒｓｃｈ，  Ｋ．，  Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ，  Ｔ．，  Ｓｃｈｍｉｄｔ，  Ｕ．，  Ｕｎｔｅｒｂｅｒｇ，  Ａ．，  Ｖｏｕｇｉｏｕｋａｓ，  Ｖ．Ｉ．，  ａｎｄ  Ｆｅｕｅｒｈａｋｅ，  Ｆ．  （２００９）．  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｔｏ  ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ．  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  １１１，  ２１１−２１８．
１０．  Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，  Ｂ．，  ＭｃＥｌｌｉｎ，  Ｂ．，  Ｃａｍａｃｈｏ，  Ｃ．Ｖ．，  Ｔｏｍｉｍａｔｓｕ，  Ｎ．，  Ｓｉｒａｓａｎａｇａｎｄａｌａ，  Ｓ．，  Ｎａｎｎｅｐａｇａ，  Ｓ．，  Ｈａｔａｎｐａａ，  Ｋ．Ｊ．，  Ｍｉｃｋｅｙ，  Ｂ．，  Ｍａｄｄｅｎ，  Ｃ．，  Ｍａｈｅｒ，  Ｅ．，  Ｂｏｏｔｈｍａｎ，  Ｄ．Ａ．，  Ｆｕｒｎａｒｉ，  Ｆ．，  Ｃａｖｅｎｅｅ，  Ｗ．Ｋ．，  Ｂａｃｈｏｏ，  Ｒ．Ｍ．，  ａｎｄ  Ｂｕｒｍａ，  Ｓ．  （２００９）．  ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ：  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６９，  ４２５２−４２５９．
１１．  Ｒｅｙａ，  Ｔ．，  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｃｌａｒｋｅ，  Ｍ．Ｆ．，  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｍａｎ，  Ｉ．Ｌ．  （２００１）．  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，  ｃａｎｃｅｒ，  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１４，  １０５−１１１．
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１３．  Ｌａｇａｓｓｅ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｍａｎ，  Ｉ．Ｌ．  （１９９７）．  Ｅｎｆｏｒｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｃｌ−２  ｉｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｒｅｓｃｕｅｓ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｒｅｖｅｒｓｅｓ  ｏｓｔｅｏｐｅｔｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｏｐ／ｏｐ  ｍｉｃｅ．  Ｃｅｌｌ  ８９，  １０２１−１０３１．
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１８．  Ｃｌａｒｋｅ，  Ｍ．Ｆ．，  Ｄｉｃｋ，  Ｊ．Ｅ．，  Ｄｉｒｋｓ，  Ｐ．Ｂ．，  Ｅａｖｅｓ，  Ｃ．Ｊ．，  Ｊａｍｉｅｓｏｎ，  Ｃ．Ｈ．，  Ｊｏｎｅｓ，  Ｄ．Ｌ．，  Ｖｉｓｖａｄｅｒ，  Ｊ．，  Ｗｅｉｓｓｍａｎ，  Ｉ．Ｌ．，  ａｎｄ  Ｗａｈｌ，  Ｇ．Ｍ．  （２００６）．  Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ−−ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｎ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ：  ＡＡＣＲ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６，  ９３３９−９３４４．
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２０．  Ｓｉｎｇｈ，  Ｓ．Ｋ．，  Ｃｌａｒｋｅ，  Ｉ．Ｄ．，  Ｔｅｒａｓａｋｉ，  Ｍ．，  Ｂｏｎｎ，  Ｖ．Ｅ．，  Ｈａｗｋｉｎｓ，  Ｃ．，  Ｓｑｕｉｒｅ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｄｉｒｋｓ，  Ｐ．Ｂ．  （２００３）．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３，  ５８２１−５８２８．
２１．  Ｓｉｎｇｈ，  Ｓ．Ｋ．，  Ｃｌａｒｋｅ，  Ｉ．Ｄ．，  Ｈｉｄｅ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｄｉｒｋｓ，  Ｐ．Ｂ．  （２００４）．  Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３，  ７２６７−７２７３．
２２．  Ｂａｏ，  Ｓ．，  Ｗｕ，  Ｑ．，  ＭｃＬｅｎｄｏｎ，  Ｒ．Ｅ．，  Ｈａｏ，  Ｙ．，  Ｓｈｉ，  Ｑ．，  Ｈｊｅｌｍｅｌａｎｄ，  Ａ．Ｂ．，  Ｄｅｗｈｉｒｓｔ，  Ｍ．Ｗ．，  Ｂｉｇｎｅｒ，  Ｄ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｒｉｃｈ，  Ｊ．Ｎ．  （２００６）．  Ｇｌｉｏｍａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｂｙ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４４４，  ７５６−７６０．
２３．  Ｌｅｅ，  Ｊ．，  Ｋｏｔｌｉａｒｏｖａ，  Ｓ．，  Ｋｏｔｌｉａｒｏｖ，  Ｙ．，  Ｌｉ，  Ａ．，  Ｓｕ，  Ｑ．，  Ｄｏｎｉｎ，  Ｎ．Ｍ．，  Ｐａｓｔｏｒｉｎｏ，  Ｓ．，  Ｐｕｒｏｗ，  Ｂ．Ｗ．，  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ，  Ｎ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｗ．，  Ｐａｒｋ，  Ｊ．Ｋ．，  ａｎｄ  Ｆｉｎｅ，  Ｈ．Ａ．  （２００６）．  Ｔｕｍｏｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｉｎ  ｂＦＧＦ  ａｎｄ  ＥＧＦ  ｍｏｒｅ  ｃｌｏｓｅｌｙ  ｍｉｒｒｏｒ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒｓ  ｔｈａｎ  ｄｏ  ｓｅｒｕｍ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ９，  ３９１−４０３．
２４．  Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｏ，  Ｓ．Ｇ．，  Ｃｏｍｂｉ，  Ｒ．，  Ｃａｊｏｌａ，  Ｌ．，  Ｐａｔｒｉｚｉ，  Ａ．，  Ｒｅｄａｅｌｌｉ，  Ｓ．，  Ｂｅｎｔｉｖｅｇｎａ，  Ａ．，  Ｂａｒｏｎｃｈｅｌｌｉ，  Ｓ．，  Ｍａｉｒａ，  Ｇ．，  Ｐｏｌｌｏ，  Ｂ．，  Ｍａｎｇｉｏｌａ，  Ａ．，  ＤｉＭｅｃｏ，  Ｆ．，  Ｄａｌｐｒａ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｖｅｓｃｏｖｉ，  Ａ．Ｌ．  （２００９）．  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｐｏｏｌｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｅｘｉｓｔ  ｗｉｔｈｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２８，  １８０７−１８１１．
２５．  Ｖｅｓｃｏｖｉ，  Ａ．Ｌ．，  Ｇａｌｌｉ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，  Ｂ．Ａ．  （２００６）．  Ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ６，  ４２５−４３６．
２６．  Ｗｕ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｗｕ，  Ｐ．Ｙ．  （２００９）．  ＣＤ１３３  ａｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｃｅｒｎｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ  １８，  １１２７−１１３４．
２７．  Ｃｈｅｎｇ，  Ｊ．Ｘ．，  Ｌｉｕ，  Ｂ．Ｌ．，  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，  Ｘ．  （２００９）．  Ｈｏｗ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｉｓ  ＣＤ１３３  ａｓ  ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ？  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｖ  ３５，  ４０３−４０８．
２８．  Ｋｅｌｌｙ，  Ｊ．Ｊ．，  Ｓｔｅｃｈｉｓｈｉｎ，  Ｏ．，  Ｃｈｏｊｎａｃｋｉ，  Ａ．，  Ｌｕｎ，  Ｘ．，  Ｓｕｎ，  Ｂ．，  Ｓｅｎｇｅｒ，  Ｄ．Ｌ．，  Ｆｏｒｓｙｔｈ，  Ｐ．，  Ａｕｅｒ，  Ｒ．Ｎ．，  Ｄｕｎｎ，  Ｊ．Ｆ．，  Ｃａｉｒｎｃｒｏｓｓ，  Ｊ．Ｇ．，  Ｐａｒｎｅｙ，  Ｉ．Ｆ．，  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，  Ｓ．  （２００９）．  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｏｃｃｕｒｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｏｆ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｍｉｔｏｇｅｎｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２７，  １７２２−１７３３．
２９．  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，  Ｂ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，  Ｓ．  （１９９２）．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５，  １７０７−１７１０．
３０．  Ｏｈ，  Ｙ．，  Ｍｏｈｉｕｄｄｉｎ，  Ｉ．，  Ｓｕｎ，  Ｙ．，  Ｐｕｔｎａｍ，  Ｊ．Ｂ．，  Ｊｒ．，  Ｈｏｎｇ，  Ｗ．Ｋ．，  Ａｒａｐ，  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，  Ｒ．  （２００５）．  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．  Ｃｈｅｓｔ  １２８，  ５９６Ｓ−６００Ｓ．
【０００４】
３１．  Ｒａｆｉｉ，  Ｓ．，  Ａｖｅｃｉｌｌａ，  Ｓ．Ｔ．，  ａｎｄ  Ｊｉｎ，  Ｄ．Ｋ．  （２００３）．  Ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ａｄｄｒｅｓｓ  ｂｏｏｋ：  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｖｅｓｓｅｌ  ｚｉｐ  ｃｏｄｅｓ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４，  ３３１−３３３．
３２．  Ｈａｒｔ，  Ｓ．Ｌ．，  Ｋｎｉｇｈｔ，  Ａ．Ｍ．，  Ｈａｒｂｏｔｔｌｅ，  Ｒ．Ｐ．，  Ｍｉｓｔｒｙ，  Ａ．，  Ｈｕｎｇｅｒ，  Ｈ．Ｄ．，  Ｃｕｔｌｅｒ，  Ｄ．Ｆ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｃｏｕｔｅｌｌｅ，  Ｃ．  （１９９４）．  Ｃｅｌｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ａ  ｃｙｃｌｉｃ  Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９，  １２４６８−１２４７４．
３３．  Ｋｏｉｖｕｎｅｎ，  Ｅ．，  Ｗａｎｇ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，  Ｅ．  （１９９４）．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ  ５  ｂｅｔａ  １  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２４，  ３７３−３８０．
３４．  Ｋｏｉｖｕｎｅｎ，  Ｅ．，  Ｇａｙ，  Ｄ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，  Ｅ．  （１９９３）．  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ  ５  ｂｅｔａ  １  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８，  ２０２０５−２０２１０．
３５．  Ａｒａｐ，  Ｗ．，  Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，  Ｅ．  （１９９８）．  Ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９，  ３７７−３８０．
３６．  Ｎｏｒｒｉｓ，  Ｊ．Ｄ．，  Ｐａｉｇｅ，  Ｌ．Ａ．，  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，  Ｄ．Ｊ．，  Ｃｈａｎｇ，  Ｃ．Ｙ．，  Ｈｕａｃａｎｉ，  Ｍ．Ｒ．，  Ｆａｎ，  Ｄ．，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｐ．Ｔ．，  Ｆｏｗｌｋｅｓ，  Ｄ．Ｍ．，  ａｎｄ  ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ，  Ｄ．Ｐ．  （１９９９）．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５，  ７４４−７４６．
３７．  Ｚｈａｎｇ，  Ｊ．，  Ｓｐｒｉｎｇ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｂ，  Ｍ．  （２００１）．  Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｒａｎｄｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  １７１，  １５３−１６４．
３８．  Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，  Ｕ．Ｂ．，  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，  Ｖ．，  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｈ．，  Ｍｉｓｃｈｌｅｒ，  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｇｈａｒｔ，  Ｋ．  （２００２）．  Ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９，  ６０６−６１２．
３９．  Ａｕｒｉａｃ，  Ａ．，  Ｗｉｌｌｅｍｅｔｚ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｃａｎｏｎｎｅ−Ｈｅｒｇａｕｘ，  Ｆ．  Ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ：  ａ  ｎｅｗ  ｒｏｕｔｅ  ｆｏｒ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．
４０．  Ｌｉｎｄｎｅｒ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｋｎｏｒｒ，  Ｒ．  （２００９）．  Ｒａｆｔｉｎｇ  ｔｒｉｐｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ．  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｂｉｏｌ  ２，  ４２０−４２１．
４１．  Ｐａｔｒａ，  Ｓ．Ｋ．  （２００８）．  Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ  ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７８５，  １８２−２０６．
４２．  Ｒｏｌｌａｓｏｎ，  Ｒ．，  Ｋｏｒｏｌｃｈｕｋ，  Ｖ．，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｃ．，  Ｓｃｈｕ，  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｂａｎｔｉｎｇ，  Ｇ．  （２００７）．  Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｌｉｐｉｄ−ｒａｆｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｄｕａｌ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｍｏｔｉｆ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １２０，  ３８５０−３８５８．
４３．  Ｏｓｔｒｏｍ，  Ｒ．Ｓ．，  ａｎｄ  Ｌｉｕ，  Ｘ．  （２００７）．  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−ｆｒｅｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｔｏ  ｄｅｆｉｎｅ  ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓ  ａｎｄ  ｃａｖｅｏｌａｅ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４００，  ４５９−４６８．
４４．  Ｅｃｈａｒｒｉ，  Ａ．，  Ｍｕｒｉｅｌ，  Ｏ．，  ａｎｄ  Ｄｅｌ  Ｐｏｚｏ，  Ｍ．Ａ．  （２００７）．  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ｒａｆｔ／ｃａｖｅｏｌａｅ  ｄｏｍａｉｎｓ：  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １８，  ６２７−６３７．
４５．  Ｇｉｍｐｌ，  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｇｅｈｒｉｇ−Ｂｕｒｇｅｒ，  Ｋ．  （２００７）．  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｒｅｐ  ２７，  ３３５−３５８．
４６．  Ｒｏｕｑｕｅｔｔｅ−Ｊａｚｄａｎｉａｎ，  Ａ．Ｋ．，  Ｐｅｌａｓｓｙ，  Ｃ．，  Ｂｒｅｉｔｔｍａｙｅｒ，  Ｊ．Ｐ．，  ａｎｄ  Ａｕｓｓｅｌ，  Ｃ．  （２００６）．  Ｒｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｒａｆｔｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  １８，  １０５−１２２．
４７．  Ｐａｎｇ，  Ｈ．，  Ｌｅ，  Ｐ．Ｕ．，  ａｎｄ  Ｎａｂｉ，  Ｉ．Ｒ．  （２００４）．  Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ＧＭ１  ｌｅｖｅｌｓ  ａｒｅ  ａ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｖｅｏｌａｅ／ｒａｆｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｏｌｇｉ  ａｐｐａｒａｔｕｓ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１７，  １４２１−１４３０．
４８．  Ｓｉｎｇｈ，  Ｒ．Ｄ．，  Ｐｕｒｉ，  Ｖ．，  Ｖａｌｉｙａｖｅｅｔｔｉｌ，  Ｊ．Ｔ．，  Ｍａｒｋｓ，  Ｄ．Ｌ．，  Ｂｉｔｔｍａｎ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｐａｇａｎｏ，  Ｒ．Ｅ．  （２００３）．  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃａｖｅｏｌｉｎ−１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １４，  ３２５４−３２６５．
４９．  Ｇｉｌ，  Ｃ．，  Ｃｕｂｉ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ａｇｕｉｌｅｒａ，  Ｊ．  （２００７）．  Ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ７５ＮＴＲ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５８１，  １８５１−１８５８．
５０．  Ｅｚｒａｔｔｙ，  Ｅ．Ｊ．，  Ｂｅｒｔａｕｘ，  Ｃ．，  Ｍａｒｃａｎｔｏｎｉｏ，  Ｅ．Ｅ．，  ａｎｄ  Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎ，  Ｇ．Ｇ．  （２００９）．  Ｃｌａｔｈｒｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｆｏｒ  ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ  ｉｎ  ｍｉｇｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８７，  ７３３−７４７．
５１．  ｄｉ  Ｂｌａｓｉｏ，  Ｌ．，  Ｄｒｏｅｔｔｏ，  Ｓ．，  Ｎｏｒｍａｎ，  Ｊ．，  Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏ，  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｐｒｉｍｏ，  Ｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｄ１  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＶＥＧＦ−Ａ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｌｐｈａｖｂｅｔａ３  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．  Ｔｒａｆｆｉｃ．
５２．  Ｍｉａｃｚｙｎｓｋａ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｂａｒ−Ｓａｇｉ，  Ｄ．  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ：  ｓｅｅｉｎｇ  ｉｓ  ｂｅｌｉｅｖｉｎｇ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．
５３．  Ｕｒｒａ，  Ｓ．，  Ｅｓｃｕｄｅｒｏ，  Ｃ．Ａ．，  Ｒａｍｏｓ，  Ｐ．，  Ｌｉｓｂｏｎａ，  Ｆ．，  Ａｌｌｅｎｄｅ，  Ｅ．，  Ｃｏｖａｒｒｕｂｉａｓ，  Ｐ．，  Ｐａｒｒａｇｕｅｚ，  Ｊ．Ｉ．，  Ｚａｍｐｉｅｒｉ，  Ｎ．，  Ｃｈａｏ，  Ｍ．Ｖ．，  Ａｎｎａｅｒｔ，  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｂｒｏｎｆｍａｎ，  Ｆ．Ｃ．  （２００７）．  ＴｒｋＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ７５  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ７５  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２，  ７６０６−７６１５．
５４．  Ｊａｂｂｏｕｒ，  Ｍ．Ｎ．，  ａｎｄ  Ｍａｔｉｏｌｉ，  Ｇ．Ｔ．  （２００６）．  Ａｇｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｏｒｉｇｉｎ  （ｓｔｅｍ  ｖｅｒｓｕｓ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）  ｏｆ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．  Ｍｅｄ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ  ６７，  １４３７−１４４２．
５５．  Ｔｒｏｇ，  Ｄ．，  Ｙｅｇｈｉａｚａｒｙａｎ，  Ｋ．，  Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓ，  Ｍ．，  Ｆｒｉｅｄｌｅｉｎ，  Ａ．，  Ｍｏｅｎｋｅｍａｎｎ，  Ｈ．，  Ｈａｅｒｔｅｌ，  Ｎ．，  Ｓｃｈｕｅｌｌｅｒ，  Ｈ．，  Ｂｒｅｉｐｏｈｌ，  Ｗ．，  Ｓｃｈｉｌｄ，  Ｈ．，  Ｌｅｐｐｅｒｔ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｇｏｌｕｂｎｉｔｓｃｈａｊａ，  Ｏ．  （２００６）．  Ｐｒｏ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ−ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｎ  ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５４２，  ８−１５．
５６．  Ｔｒｏｇ，  Ｄ．，  Ｙｅｇｈｉａｚａｒｙａｎ，  Ｋ．，  Ｓｃｈｉｌｄ，  Ｈ．Ｈ．，  ａｎｄ  Ｇｏｌｕｂｎｉｔｓｃｈａｊａ，  Ｏ．  （２００８）．  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｌｉｏｍａ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｇｌｉｏｍａｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｉｎｓｔ  Ｍｅｃｈ  Ｅｎｇ  Ｈ  ２２２，  １１４９−１１６０．
５７．  Ｂｒｏｎｆｍａｎ，  Ｆ．Ｃ．，  Ｔｃｈｅｒｐａｋｏｖ，  Ｍ．，  Ｊｏｖｉｎ，  Ｔ．Ｍ．，  ａｎｄ  Ｆａｉｎｚｉｌｂｅｒ，  Ｍ．  （２００３）．  Ｌｉｇａｎｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ７５  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：  ａ  ｓｌｏｗ  ｒｏｕｔｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｅｎｄｏｓｏｍｅ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２３，  ３２０９−３２２０．
５８．  Ｄｅｉｎｈａｒｄｔ，  Ｋ．，  Ｒｅｖｅｒｓｉ，  Ａ．，  Ｂｅｒｎｉｎｇｈａｕｓｅｎ，  Ｏ．，  Ｈｏｐｋｉｎｓ，  Ｃ．Ｒ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｉａｖｏ，  Ｇ．  （２００７）．  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ  Ｒｅｄｉｒｅｃｔ  ｐ７５ＮＴＲ  ｆｒｏｍ  ａ  ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｏ  ａ  ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ  ａｘｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．  Ｔｒａｆｆｉｃ  ８，  １７３６−１７４９．
５９．  Ｂｉｌｄｅｒｂａｃｋ，  Ｔ．Ｒ．，  Ｇａｚｕｌａ，  Ｖ．Ｒ．，  Ｌｉｓａｎｔｉ，  Ｍ．Ｐ．，  ａｎｄ  Ｄｏｂｒｏｗｓｋｙ，  Ｒ．Ｔ．  （１９９９）．  Ｃａｖｅｏｌｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｔｒｋ  Ａ  ａｎｄ  ｐ７５（ＮＴＲ）  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４，  ２５７−２６３．
６０．  Ｂｉｌｄｅｒｂａｃｋ，  Ｔ．Ｒ．，  Ｇｒｉｇｓｂｙ，  Ｒ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｄｏｂｒｏｗｓｋｙ，  Ｒ．Ｔ．  （１９９７）．  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ７５（ＮＴＲ）  ｗｉｔｈ  ｃａｖｅｏｌｉｎ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｔｏ  ｃａｖｅｏｌａｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２，  １０９２２−１０９２７．
６１．  Ｂａｒｂａｓｓ，  Ｃ．Ｂ．，  ＤＲ．  Ｓｃｏｔｔ，  ＪＫ．    Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，  ＧＪ．  （２００４）．  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  １ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ  Ｐｒｅｓｓ）．
６２．  ｒａｐｐａｔｚ  Ｊ，  Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＡＪ，  Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  ＡＮＧ１００５：  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．２８（１５  Ｓｕｐｐｌ．）  （２０１０）  （Ａｂｓｔｒａｃｔ  ２００９）．
６３．  Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，  Ｗ．Ｍ．，    Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｂｒｉａｎ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  （１９９７）  １７，  ７１３？７３１．
６４．  Ｇａｂａｔｈｕｌｅｒ，  Ｒ．，  ＣＮＳ  Ｎｅｕｒ０ｌ  Ｄｉｓｏｒｄ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，  ８（３）：１９５−２０４  （２００９）．  
６５．  Ｍｅｎｅｉ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  ２００５  Ｍａｒ；２（２）：３６３−７６．  
６６．  Ｓｔｕｋｅｌ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ，  Ｊｕｎｅ，  （２００９）．  
６７．  Ｇｅｌｐｅｒｉｎａ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａ．  Ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ，  ７４（２）：  １５７−１６３  （Ｆｅｂ．  ２０１０）．
６８．  Ｇｉｌ，  ＥＳ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  １０（３）：５０５−５１６，  Ｍａｒｃｈ，  ２００９）．  
６９．  Ｋｏｚｉａｒａ，  Ｊ．  Ｍ．，  ａｔ  ｅｌ．，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ９９（２）：  ２５９−２６９  （Ｓｅｐｔ，  ２００４）．
７０．  Ｙａｎｇ，  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｒｏｙ  Ｓｏｃ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，  ７（Ｓｕｐｐ４）：Ｓ４１１−Ｓ４２２  （Ｊｕｎｅ，  ２０１０）．
７１．  Ａｇａｒｗａｌ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ，  １５（８）：９１７−９２５  （２００９）．
【０００５】
多形グリオブラストーマ（ＧＢＭ）は、手術、放射線、およびテモゾロミドで治療した際に、短期の再発および約１年の生存期間の中央値を示す、複雑で異質な疾患である［１−３］。前神経（よりよい患者生存プロフィール）、内決定因子（「神経」）、間充織（ＮＦ−１ロスに関係する）、増殖（古典的には；ＥＧＦＲ突然変異あるいは増幅に関係する）サブタイプ（［１］で参照されている）への転写クラスタリングによる分類は、ターゲットとされた治療方法の合理的な選択だけでなく予後を決定する際に、個々の患者のプロファイルに有用性であることが強調されている。しかしながら、これらのサブタイプを臨床的にターゲットとすることへの実際的なアプローチを開発する必要がある。
【０００６】
徹底的な放射線および化学的治療にもかかわらず、腫瘍再増殖は事実上避けられず、通常、切除マージンの数センチメートル内に生じる［４］。治療の失敗に寄与する２つの潜在的な疾患病原巣がある。第一は、主な腫瘍部位から、遺伝的および表現型として個別の細胞が主な腫瘍容積から、数センチメートルの距離まで伸びる長いつる状のものを形成することができるまたは離れて位置するという利点により、科学的治療または放射線治療に耐性のある主な浸潤腫瘍のサブ集団を形成することができることを示した（４−６）、ならびに薬物耐性遺伝子および高められたＤＮＡ複製能力をしめした（７−１０）近年の臨床およびｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究により、浸潤性グリオーマが特徴付けられてきたことである。これらの細胞は、本発明において高浸潤グリオーマ細胞またはＨＩＧＣと言う。
【０００７】
第二の推定上の病原巣は癌幹細胞（ＣＳＣ）のコンセプトに基づいている。ＣＳＣは自己複製のメカニズムにより生じ、幹細胞と癌細胞との間の性質を有する（１１）。この癌幹細胞の仮説は、形質転換された一部の極わずかな幹細胞の集団または自己複製性質を必要とされている原始細胞が癌細胞複製のソースであると提案している。癌幹細胞の存在の証拠は、いくつかの血液学的悪性腫瘍について示唆されてきた（１２−１４）。より近年では、固形腫瘍について示唆されている（１４−１８）。
【０００８】
現在、グリオブラストーマにおいて、ＣＳＣの関与があることを至適する  ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏのデータが蓄積されている（１９−２５）。増殖、予後、および治療に対する反応を含む腫瘍の挙動を決定するであろうことから、脳腫瘍幹細胞のコンセプト、または本明細書で用いられるように、脳腫瘍原始細胞またはＢＴＩＣは、潜在的に重要である。ＢＴＩＣの１つの重要な特徴は、それらはヒトの病気に非常に類似しており、それゆえ、脳腫瘍の生物学的理解および治療の開発について、最良のシステムとなるかもしれないということである（２３）。更に、ＢＴＩＣはより小さい細胞遺伝学的および分子的異常性を有している（２１、２３）。この異常性は脳腫瘍形成において、偶然生じるイベント（即ち、形質転換の連続として生じる変化だけでなく）を同定することにより簡単に検出できる。ＢＴＩＣの存在と、正確な操作定義と、用語の使用が議論の話題となるべきである。ＣＤ１３３は、「幹細胞性」のインジケーターとして議論の的になっている（２６−２８）ので、本明細書では、ＢＴＩＣを、自己複製することができ、別の系統に分化して、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍を形成することができる患者由来細胞であると定義する（２８）。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、１つの側面において、（ｉ）ヒトの脳半球から細胞が注入された反対側へ転移する能力により特徴付けられる、ヒト多形グリオーマ（ＧＢＭ）の高浸潤グリオーマ細胞（ＴＩＣＢ）サブタイプ、および（ｉｉ）自己複製し、外来の有糸分裂促進因子および成長因子の添加をしないで球をつくり、および免疫不全マウスの脳に移植した場合、生体内で、腫瘍形成を誘発することができる幹細胞様性質により特徴づけられる、ヒトＧＢＭ細胞の脳腫瘍原始細胞（ＢＴＩＣ）サブタイプ、の１つを標的とするペプチド組成物である。この組成物は１２−２０の間のアミノ酸で、ＨＩＧＣのターゲティングのための配列番号１−１０、１３および１７からなる群より選択される配列、およびＢＴＩＣをターゲティングする配列番号１１−１６からなる群より選択される配列を含む。
【００１０】
この組成物は複数のＧＢＭ結合ペプチド、例えば、ＨＩＣＧ’ｓに優先的に結合する少なくとも１つのペプチドおよびＢＴＩＣ’ｓに優先的に結合する少なくとも１つのペプチドを含んでも良い。
【００１１】
この組成物のペプチドはＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、Ｌアミノ酸およびＤアミノ酸の混合物、または逆の順に配列されたＤアミノ酸のレトロインベルソペプチドからなる。
ヒトＧＢＭ腫瘍を有する患者において、ＨＩＧＣまたはＢＴＩＣの局在化させるための使用において、この組成物はペプチドに結合した造影剤を含む。
【００１２】
ヒトＧＢＭ腫瘍を有する患者においてＨＩＧＣまたはＢＴＩＣを抑制または死滅させるための使用において、この組成物はペプチドに結合した抗腫瘍剤を更に含む。
【００１３】
ＨＩＧＣのターゲティングのためには、このペプチドは配列番号７（Ｈ１０）、配列番号１３（Ｅ１０）、および配列番号１７（修飾Ｈ１０）からなる群より選択される配列、ならびに好ましくは配列番号１７（修飾Ｈ１０）を含んでいてもよい。
【００１４】
ＢＴＩＣのターゲティングのための使用では、このペプチドは配列番号１１（７Ａ）、配列番号１４（３Ｆ）、配列番号１６（３Ｂ）、および配列番号１３（Ｅ１０）からなる群より選択される配列を含み、好ましくは配列番号１１（７Ａ）を含んでいてもよい。
【００１５】
血液脳関門を横断して、ヒトＧＢＭ腫瘍を患者に届けるための使用では、この単離されたペプチドは配列番号１８または１９で定義される配列を有するキャリアペプチドに結合している。他の態様では、この単離されたポリペプチドはポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマー、シクロデキストリン、またはセチルアルコール／ポリソルベートで作られた、ナノ粒子の中に包含されている。
【００１６】
本明細書では、ヒトＧＢＭ腫瘍を有する患者においてＨＩＧＣまたはＢＴＩＣサブタイプの細胞の存在を検出するための前述のペプチドの使用を開示する。この組成物は、このペプチドに結合した検出可能な造影剤を含む。ＨＩＧＣサプタイプの細胞の存在を検出するための例示的な組成物中のペプチドは配列番号７または１７を含み、追加的に配列番号１８または１９で定義されるペプチドを含んでいてもよい。ＢＴＩＣサブタイプの細胞の存在を検出するための例示的な組成物におけるペプチドは配列番号１１を含み、追加的に配列番号１８または１９で定義されるペプチドを含んでいてもよい。
【００１７】
更に、ヒト多形グリオーマ（ＧＢＭ）腫瘍を有する患者においてＨＩＧＣまたはＢＴＩＣサブタイプ細胞を抑制または死滅させるための、前述のペプチド組成物の使用も開示される。ここにおいて、この組成物はこのペプチドに結合した抗がん剤を含む。ＨＩＧＣサブタイプの細胞を抑制または死滅させるための１つの例示的な組成物は配列番号７または１７の配列を含む。ＢＩＴＣサブタイプの細胞を抑制または死滅させるための例示的な組成物におけるペプチドは配列番号１１の配列を含む。
【００１８】
他の側面において、本発明は患者の多形グリオブラストーマ（ＧＭＢ）主要を特徴づける方法を含む。該方法は、
（ａ）（ｉ）１２−２０アミノ酸の間の長さを有し、細胞が反対側に注入された脳半球から反対側の脳半球に移転をする能力、第一ペプチドに結合する能力、および患者の腫瘍領域において細胞に結合したときに第一ペプチドを造影することができる第一造影剤へ結合する能力により特徴づけられる、ヒトＧＢＭ細胞の高浸潤グリオーマ細胞（ＨＩＧＣ）サブタイプへ優先的に結合する能力について選択された、第一ペプチドを含むペプチド組成物を患者に投与した後に患者の脳腫瘍の像を形成する工程、
（ｂ）自己再生能力、外来有糸分裂促進因子および成長因子の投与なしで球体を形成する能力、および免疫不全状態のマウスの脳にあったときにｉｎ  ｖｕｉｖｏで腫瘍を誘発する能力の幹細胞様性質により特徴づけられ、および患者の腫瘍領域における細胞に結合したときに生体内において第二ペプチドを造影することができる第二造影剤に結合する、ヒトＧＢＭ細胞の脳腫瘍開始細胞（ＢＴＩＣ）サブタイプに優先的に結合する能力について選択された１２−２０アミノ酸の間の長さを有する第二ペプチドを含むペプチド組成物を投与した後に患者のｉｎｖｉｖｏでの脳腫瘍の像を形成する工程、ならびに
（ｃ）第一および第二ペプチドの分布ならびに工程（ａ）および（ｂ）で形成された像で観察されたそれらの関連するコントラストの分布から、
（ｃｉ）腫瘍の外科的切除のための、腫瘍の境界、
（ｃｉｉ）腫瘍の放射線治療の目的のための、腫瘍の境界、
（ｃｉｉｉ）腫瘍を処理するための化学的治療方法を計画する目的のための、腫瘍内の別の腫瘍細胞表現型の発現プロファイル、および
（ｃｉｖ）工程（ａ）および工程（ｂ）が繰り返して行われるときの所与のタイムコースに対する、第一および第二ペプチドとそれらに関与する造影剤の分布の変化、
の少なくとも１つを決定する工程を含む。工程（ａ）および（ｂ）は、
（ｉ）造影剤がガドリニウムベース造影剤、酸化鉄造影剤、およびマンガン造影剤からなる群より選択されるＭＲＩ、
（ｉｉ）造影剤が６４Ｃｕジアセチル−ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン）、１８Ｆ−フルオロデオキシグルコース、１８Ｆ−フルオライド、３’−デオキシ−３’−［１８Ｆ］−フルオロチミジン、１８Ｆ−フルオロミソニダゾール、ガリウム、テクネチウム−９９ｍ、およびタリウムからなる群より選択される陽電子放射断層撮影またはシンチグラフィー、ならびに
（ｉｉｉ）造影剤がバリウム、ガストログラフィン、およびヨウ素造影剤からなる群より選択されるＸ線撮像、の１つにより行うことができる。
【００１９】
このペプチド組成物は静脈内に投与してもよい。１つの態様において、工程（ａ）および工程（ｂ）は一緒に行われ、および第一および第二造影剤は結合した第一および第二ペプチドの分布を独立して決定することができる。他の態様において、工程（ａ）および（ｂ）は別々に行われる。
【００２０】
投与される第一ペプチドは配列番号７（Ｈ１０）、１３（Ｅ１０）、および１７（修飾Ｈ１０）からなる群より選択される配列を含んでいて良い。投与される第二ペプチドは配列番号１１（７Ａ）、１３（Ｅ１０）、１４（３Ｆ）、および１６（３Ｂ）からなる群より選択される配列を含んでいて良い。
【００２１】
更なる他の側面において、本発明は、患者におけるヒト多形グリオブラストーマ（ＧＢＭ）腫瘍における細胞の表現型の遺伝子発現プロファイルを特徴づける方法を含み、該方法は、
（ａ）（ｉ）分化したＧＢＭ腫瘍細胞、
（ｉｉ）細胞が注入された１つの脳半球から反対側の脳半球へ移転する能力により特徴付けられるヒト多形グリオブラストーマ（ＧＢＭ）の高浸潤性グリオーマ細胞（ＨＩＧＣ）サブタイプ、および
（ｉｉｉ）自己再生でき、外来有糸分裂促進因子および成長因子の添加なしで、半球を形成することができ、免疫不全マウスの脳にあったときに生体内で腫瘍を形成することができる、それらの幹細胞様性質により特徴付けられるヒトＧＢＭの脳腫瘍開始細胞（ＢＴＩＣ）サブタイプ、の１つに対応する腫瘍において、細胞を同定する工程、および
（ｂ）この細胞タイプの知られている遺伝子発現パターンと同定された細胞タイプとの相関を決定する工程とによる。
【００２２】
これらのおよび本発明の他の目的および特徴は、本明細書の発明の詳細な説明を添付の図を一緒に読んだときにより完全に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
図１Ａはｉｎ  ｖｉｖｏの連続継代により開発された高浸潤グリオーマ細胞集団に優先的に結合し、Ｕ８７Ｒといわれるファージの選択についての概略的図である。ペプチド選択は細胞間の任意の共通のファージを除去するために、連続的バイオパニングを用いる２段階プロセスにおいて行われた。第一に、ＰｈＤ−１２Ｍ１３組み合わせファージ提示ライブラリーが、非標的細胞、非浸潤Ｕ８７Ｔ細胞に結合するファージについて差し引かれる。次に、標的細胞Ｕ８７Ｒに優先的に結合するファージについて陽性選択を行った。任意の非結合ファージを捨て、残ったファージを１２Ｒライブラリーを呼ばれる標的特異結合ファージを高める連続工程において、増殖させた。
【００２４】
図１Ｂは、細胞の表面に結合しているファージを検出する全細胞ＥＬＩＳＡアッセイを示す。この１２Ｒファージライブラリーを浸潤性Ｕ８７Ｒまたは非浸潤性Ｕ８７Ｔ細胞をインキュベーションして、任意の非結合ファージを除去して、ＨＰＲ−抗−Ｍ１３抗体およびＭＴＢ基質（青）を用いて、結合ファージを検出した。１２Ｒライブラリーは高浸潤Ｕ８７Ｒ細胞に優先的に結合した。
【００２５】
図２Ａは、グリオーマ浸潤を選択的に抑制する１２ＲライブラリーサブクローンＨ１０の抑制能力を示す。アガロースプレート上の宿主細胞をファージを連続希釈したものを平板培養を用いて、ファージサブクローンを単離した。個々のクローンが単離され、増幅され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイにおいてそれらの抑制能力を試験した。Ｈ１０とされたファージは、トランスウェルメンブラン（３ｘ１０１０ｐｆｕ：４時間、３７℃）でコートされた脳様マトリクスを通過するＵ８７Ｒ細胞浸潤の転移を特異的にそして、有意にブロックした。ＬＳＰまたはランダムファージの影響をアッセイして宿主細胞により可能性のあるコンタミネーションを抑制した。
【００２６】
図２ＢはＨ１０ファージに加えて、Ｈ１０合成ペプチド（５０μＭ）がグリオーマ浸潤を示すタンパク質である、ｐ７５ＮＴＲで形質転換してＵ８７ＭＧ細胞だけでなく、高浸潤Ｕ８７Ｒの転移を効果的および選択的に抑制することを示す。
【００２７】
図２Ｃはグリオブラストーマ患者から隔離された５／７脳腫瘍原始細胞（ＢＴＩＣ）が、Ｈ１０ペプチドに抑制されたことによる、Ｈ１０ペプチドの臨床関連性を示す。アスタリスクは未処置対照とは有意差があることを示している（Ｄｅｎｎｅｔｔ’ｓ  （ｐ≦０．０５）。
【００２８】
図３Ａはコレステロースオキシダーゼが細胞転移を抑制することを示すグラフである。浸潤性Ｕ８７Ｒ細胞はトランスウェルメンブランでコートされた基質上で平板培養され、コレステロールオキシダーゼで４時間処理された（１．８Ｕ／ｍｌ）。トランスウェル面ブランの下方に転移した細胞はクリスタルバイオレットで染色され、光学顕微鏡でカウントされた。
【００２９】
図３Ｂはコレステロールオキシダーゼが脂質ラフトマーカーＧＭ１の内部局在化を阻害することを示している。Ｕ８７Ｒ細胞は、トランスウェル面ブランでコートされた基質上で平板培養され、コレステロールオキシダーゼとＡｌｅｘａ５５５−コレラトキシンＢサブユニットで１２０分間処理されて、そのレセプターであるＧＭ１の取り込みおよび／または代謝回転における違いについて評価された。白矢印はＧＭ１の膜蓄積を示す。
【００３０】
図４ＡはＨ１０の存在におけるＧＭ１の蓄積を示す。浸潤性Ｕ８７Ｒ細胞は、トランスウェルメンブランでコートされたマトリックス上で平板培養され、Ａｌｅｘａ５５５−コレラトキシンサブユニットの存在下で３０分間インキュベーションして、脂質ラフトマーカーＧＭ１の取り込みおよび／または代謝回転における違いを評価した。Ｈ１０で処理された細胞は、ＧＭ１染色の全体的な蓄積がみられ、球状の内部構造および膜上に配置されたことを特徴とする（白矢印）。
【００３１】
図４ＢはＨ１０μコレステロールオキシダーゼで処理された浸潤性グリオーマ細胞が、脂質ラフトに見られる膜タンパク質であって、細胞転移を促進すると知られている、ｐ７５ＮＴＲ高分子量複合体を蓄積させることを示すウエスタンブロットである。濃度勾配分画がコラーゲン上で平板培養されたＵ８７Ｒ細胞から調製され、ＰＢＳ（対照）、Ｈ１０ファージ、Ｆ２ファージ、またはコレステロールオキシダーゼ、で２時間処理し、ｐ７５ＮＴＲについてウエスタンブロットにより解析した。白矢印は、複合体を含む高分子量ｐ７５ＮＴＲを示す。図下方の線で示すのは、一般的な器官において見られた分画である。
【００３２】
図４ＣはＨ１０でのグリオーマ細胞の処理がプラズマメンブランにおいて、ｐ７５ＮＴＲを蓄積させることを示す。ＢＴＩＣ２５細胞（非ＧＦＰ）をトランスウェルメンブランでコートしたマトリックス上で平板培養し、ファージで２時間処理した。ｐ７５ＮＴＲシグナリングの間に、通常切断される、ｐ７５ＮＴＲレセプターがＨ１０処理の後に細胞膜において、大きく高められる。ｐ７５ＮＴＲはＨ１０で処理されたＧＭ１コンパートメントに蓄積するわけではないようだ。この事は、Ｈ１０が膜構造の１つ以上のクラスに影響するということを示している。
【００３３】
図５はビオチン化７Ａペプチドで染色されたＢＴＩＣ単離体の共焦点顕微鏡写真からのシングルｚスタック投影である。非標的（Ｕ８７ＭＧＨ；ＮＳＣ）および標的（ＢＴＩＣ）細胞で、ビオチン化７Ａペプチド（赤）を用いて、７Ａペプチドの結合特異性を共焦点顕微鏡写真を用いて評価した。
【００３４】
図６はＨ１０のｉｎｖｉｖｏ帰着能力を示す。浸潤性Ｕ８７Ｒまたは非浸潤性Ｕ８７Ｔ細胞をＳＣＩＤマウスの右脳半球で成長させた。一旦腫瘍が確立されると、マウスを麻酔所処理して。Ｈ１０ファージを１０分間灌流させた。未結合ファージをＰＢＳで系から洗浄した。脳の凍結切片を作成し、Ｍ１３ファージまたはヒト核抗原（ｈＮＡ）について、免疫組織学的染色を行った。Ｕ８７Ｔ細胞を用いて確立させた腫瘍との比較について、Ｈ１０ファージはより効率的にＵ８７Ｒ腫瘍細胞へ帰着した。このことは、Ｕ８７Ｒ細胞体の染色および異種移植片の縁にそって、染色が濃くなっていたことにより証明される。
【００３５】
図６Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏで７ＡがＢＴＩＣ１２およびＢＴＩＣ２５異種移植片に帰着することを示す。細胞をＳＣＩＤマウスの右脳半球に移植し、３ヶ月間腫瘍を確立させた。ファージ結合の分布は２つのＢＴＩＣ異種移植で独特であり、サンプル間で違いを示した。７Ａ帰着はＵ２５Ｎ細胞株から生成した腫瘍を有するマウスでは観察されなかった。ランダムに選択されたファージＡ１でＢＴＩＣ２５外来職片を染色すると、最小染色を示した。
【００３６】
図７Ａ−Ｄは、７ＡペプチドがＢＴＩＣ単離体内で所定の細胞挙動を有するサブポピュレーションを区別することができることを示している。図７Ａにおいて、ＢＴＩＣは限界希釈法によりサブクローニングされ、ビオチン化７Ａペプチドへの結合について、スクリーニングされた。７Ａに結合するサブポピュレーションは培地中で神経球を形成する能力が高く、ＳＣＩＤマウスに見られる異種移植のように高度な増殖性を示さず、脳側室近くに優先的に観察された。ヒト核抗原を視覚化するためにトルイジンブルーで切片を対比染色した。図７Ｂはマウス脳の７Ａペプチドに高い確率で結合することが証明されたＢＴＩＣ２５ダブクローンの薄片における成長パターンを示す。図７ＣはＢＴＩＣ２５サブクローンに結合している非７Ａペプチドの成長パターンを示す。ヒト腫瘍細胞は、ＤＡＢでヒトヌクレオニンの免疫化学的染色によりマウス脳内で検出された。組織構造のイメージのための対比染色は、トルイジンブルーで行った。図７Ｄにおけるプロットは、７Ａ結合変異体の２２コの半球移植および７Ａ非結合変異体の２１個の半球移植のマウス脳における観察された成長パターンの概要である。まとめると、このデータでは７Ａへの結合能により定義された２つのサブ集団が脳環境下に再導入された時の成長パターンおよび挙動において異なることが確認される。
【００３７】
図８はＢＴＩＣ単離体の代表的選択におけるＢＴＩＣ選択性ペプチドの結合特異性を示す。
【００３８】
図９ＡはＦＩＴＣトランスフェリンの取り込みについて、視覚化されたｐ７５ＮＴＲ形質転換グリオーマ細胞（Ｕ８７ｐ７５）の共焦点像である。Ｈ１０およびコレステロールオキシダーゼ存在下での、Ｕ８７ｐ７５ＮＴＲ成長について、細胞をコラーゲンでコートしたトランスウェルメンブラン上で平板培養した後に、ＦＩＴＣトランスフェリンの取り込みを２時間評価した。Ｈ１０とコレステロールオキシダーゼはクラスリンコート小胞のマーカーであるトランスフェリンまたはトランスフェリンレセプターの分散に影響しなかった。
【００３９】
図９Ｂは、イオジキサノール勾配分離法をもちいた浸潤性Ｕ８７細胞の分画を示す。Ｕ８７Ｒ細胞はＨ１０、Ｆ１２、コレステロールオキシダーゼまたは対象ＰＢＳで２時間処理した。細胞を溶解し、イオジキサノール勾配を用いて分画した後、トランスイフェリンレセプターについてウエスタンブロット解析を行った。
【００４０】
図１０Ａは、抗−ｐ７５ＮＴＲウエスタンブロットと完全長ｐ７５ＮＴＲを示す。Ｃ末端フラグメント（αセクレターゼ）および細胞内ドメイン（γセクレターゼ）切断生成物をＨ１０、ＭｂＣＤ、またはＨ１０＋ＭｂＣＤで処理した後視覚化した。
【００４１】
図１０ＢはＨ１０に４時間および１週間曝した後の完全長ｐ７５ＮＴＲのウエスタンブロットを示す。
【００４２】
図１０Ｃはコレステロールオキシダーゼおよびメチル−β−シクロデキストリンの存在下で行われたｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイである。コレステロールオキシダーゼとメチル−βシクロデキストリンはＵ８７ｐ７５グリオーマ細胞の細胞浸潤を有意に抑制した。
【００４３】
図１１はいくつかのビオチン化合成ペプチド（縦列）への特異結合についてスクリーニングされた患者由来ＢＴＩＣ単離体（横列）のパネルの共焦点像である。ファージ提示法により単利された派プチド候補はビオチンでタグ付けされた合成ペプチドとして作られた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで標的細胞とインキュベーションした後、余分なペプチドを冷たいＰＢＳで洗浄して除去し、残った細胞表面に結合したものを、Ａｌｅｘａ５６８（蛍光赤）ストレプトアビジン会合体（ビオチンに固く結合する）で検出した。像を蛍光顕微鏡で捕らえた。
【００４４】
図１２Ａと図１２Ｂは異なる細胞外マトリクスの存在下でのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのトランスウェル転移アッセイを示す。脳基質の存在は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ｈ１０が仲介する細胞転移の抑制に必要であり（図１２Ａ）、その効果の大部分においてコラーゲンＩがこの影響を仲介する（図１２Ｂ）。
図１２Ｃは外来コラーゲンの有無における、Ｈ１０ペプチドの存在下での、７Ａ＋ＢＴＩＣ細胞（＃２、＃４、および＃５）ならびにＢＴＩＣ  ７Ａ−細胞（＃３、＃６、および＃７）の転移を図示する。見てわかるように、Ｈ１０はコラーゲン不存在下でＢＴＩＣ７Ａ細胞の転移の抑制に効果的であったが、７Ａ−ＢＴＩＣ細胞については転移を抑制するためにＨ１０は異種コラーゲンを必要とした。これは図１２Ｂで見られるＵ８７Ｒ細胞で見られたパターンと類似していた。
【００４５】
図１３Ａと１３Ｂは腫瘍移植部位の近くで二分化され、ビオチン化Ａ７ペプチドで染色された５つのマウスの脳の薄切片（１３Ａ）および非７Ａ結合サブクローンを投与した５つのマウスの脳の薄切片（１３Ｂ）の高倍率像である。
【００４６】
図１４Ａは生きているマウスにおいてＢＴ０２５細胞からの大きな移植腫瘍に帰着する蛍光標識した７Ａペプチドの能力を示す（１４Ａ）。図１４Ｂと１４Ｃは腫瘍移植部位の近くで二分化して、ヒト核高原（緑）およびトータルＲＮＡ（青）について染色して、細胞の位置の外部を示した後の、図１４Ａの像の低倍率増および高倍率像をそれぞれ示す。赤いペプチドシグナルは主な腫瘍塊に隣接する細胞だけでなく、周辺組織においても別途拡散して観察された。
【００４７】
図１５Ａは蛍光標識された３Ｂペプチドを頚動脈を介して注入した後の、ＢＴ０２５移植腫瘍を運ぶインタクトマウスの脳を示す。図１５Ｂは１５Ａにおける脳の蛍光染色した薄切片である。図１５Ｂは赤いペプチドシグナルが主な腫瘍塊の内部と外部の両方にあることを示す。
【００４８】
図１６Ａは腫瘍注入部位で二分化したインタクトマウスの脳と上向きに回転させた切断面を示す。図１６Ｂおよび１６Ｃはそれぞれ３Ｆペプチドを頚動脈注射した動物からの脳切片の低倍率顕微鏡写真および高倍率顕微鏡写真である。これらの図は３Ｆは主な腫瘍集団の外部に拡散的に広がっている細胞へと優先的に結合することを示している。
【００４９】
図１７Ａと１７Ｂは１６Ｂおよび１６Ｃで観察されたものと同じ結果が頚動脈注射よりもむしろ尾静脈注射により投与されたペプチドで観察されたことを示す。
【００５０】
図１８Ａはマウスの脳全体と腫瘍注入部位を示す。図１８Ｂおよび図１８ＣはＨ１０ペプチドを頚動脈注射した動物からの脳切片の顕微鏡写真であり、これらはＨ１０は主な腫瘍塊の外側に拡散するようにして広がる細胞に優先的に結合することを示す。図１８Ｄはペプチドが尾静脈から投与されたときの類似する結果を示す。
【００５１】
図１９Ａは全マウス脳および腫瘍注入部位を示す。図１９Ｂおよび１９ＣはＥ１０ペプチドを頚動脈注射した動物由来の脳切片の顕微鏡写真である。これらは、Ｅ１０が腫瘍塊の内部の細胞の一部に結合し（１９Ｂ）、かつ主な腫瘍塊の外側の細胞に結合することを示している（１９Ｃ）。同様の結果はＥ１０ペプチドを尾静脈を介して注入したときにも観察された（図１９Ｄ）。
【００５２】
図２０は３つの独立して単離された結合細胞サブクローンと、３つの独立して単離された７Ａ非結合サブクローン（図１２Ｃで同定されたサブクローン）とから単離されたｍＲＮＡから生成されたマイクロアレイデータの遺伝子群を示す。
図２１Ａ−２１Ｃはマウスの脳に移植されたＢＴＩＣ２５腫瘍を示すＭＲＩ像である。Ｅ１０ペプチドで覆われた鉄ナノ粒子を注入し、この実験の２４時間のタイムコースで見られた腫瘍像の累進的増強を示す。
図２２Ａ−２２ＢはＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）標識Ｅ１０ペプチドで修飾された鉄ナノ粒子の注入後で、この研究の１時間のタイムコースに観察された腫瘍増の累進的増強を示す、大型のＢＴＩＣ移植腫瘍およびＭＲＩ像である。
図２３はＦＬＡＧ−Ｅ１０ペプチドの存在についてＭＲＩ像を取り、染色した後のＢＴＩＣ２５移植マウスの脳からの薄切片である。ここにおいて、濃い染色部分は主な腫瘍塊において存在するＦＬＡＧ標識（すなわち、鉄ナノ粒子で修飾されたＦＬＡＧ−Ｅ１０ペプチド）の存在を示す。
図２４Ａ−２４ＤはＢＴＩＣ１３４を移植して、緑、赤、および遠赤蛍光標識ペプチドのカクテルを注射したマウスの実験からの像である（Ｅ１０：図２４Ａおよび２４Ｂで見られる緑色；Ｈ１０＋１０Ｃ：図２４Ｃで見られる赤；および７Ａ＋３Ｆ：図２４Ｄに見られる遠赤）。図２４Ｅはヒトヌクレオリン（ＤＡＢによる像、濃い染色部分）について線欲された免疫組織学的像である。この図はマウス脳内のヒト細胞の存在と位置とを示す。
【発明の詳細な説明】
【００５３】
「ヒト多形グリオブラストーマ（ＧＭＢ）」はヒトにおける最も一般的でアグレッシブなタイプの原始脳腫瘍細胞を意味する。ＧＢＭ腫瘍は未分化細胞（偽柵構造壊死）に囲まれた、壊死組織の小さい領域に存在により特徴付けられる。血管の過形成のほかにこの特徴がこれらの特徴を有していないグレード３の星状細胞腫とは異なる。
【００５４】
「高浸潤グリオブラストーマ細胞」または「ＨＩＧＣ」は細胞が注入された脳半球から反対側の半球へ細胞が転移する能力により特徴付けられるヒトＧＢＭ細胞のサブタイプ（サブポピュレーション）である。ＨＩＧＣの例としては、Ｕ８７ＭＧヒトグリオーマ細胞のＵ８７Ｒサブタイプがある。
【００５５】
「脳腫瘍原始細胞」または「ＢＴＩＣ」は自己複製し、外来の有糸分裂促進因子および成長因子なしに神経球を生成し、および免疫不全マウスの脳に移植したときにｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍形成を誘発するもとができる、幹細胞様性質により特徴付けられるヒトＧＢＭ細胞のサブタイプ（サブポピョレーション）である。
【００５６】
「ペプチド提示ファージ」の語はそれらの表面に外来パプチドのライブラリー、通常組み合わせライブラリー、を発現するように遺伝子工学的に修飾されたバクテリオファージを意味する。このバクテリオファージは、外来ライブラリーペプチドのファージ表面の存在に基づいてファージ選択を可能にする。
【００５７】
「ＨＩＧＣ特異ペプチド」の語は、以下のセクションＶＩＩＩＣで説明するファージディスプレイパニングの条件下でＨＩＧＣに優先的に結合する、通常ペプチドディスプレイファージに関連するペプチド、を意味する。
【００５８】
「ＢＴＩＣ特異ペプチド」の語は、通常、ペプチドディスプレイファージに関連するペプチドで、以下のセクションＶＩＩＩＤで説明するファージディスプレイパニングの条件下でＢＴＩＣに優先的に結合するペプチドを意味する。
【００５９】
以下のセクションＶＩＩＩＣおよびＶＩＩＩＤで説明するファージ提示洗浄条件下で固定されたＨＩＧＣまたはＴＩＧＣ標的細胞に結合したままであれば、「優先的にＨＩＧＣまたはＢＴＩＣに結合する」ペプチド提示ファージである。
【００６０】
アミノ酸残渣はそれらの標準的な１文字コードにより本明細書では記載される（例えば、ｗｗｗ．ｍｕｎ．ｃａ／ｂｉｏｃｈｅｍ／ｃｏｕｒｓｅｓ／３１０７／ａａｓｙｍｂｏｌｓ．ｈｔｍｌ参照。）
【００６１】
「造影剤」は磁気共鳴像（ＭＲＩ）、陽子放射断層像（ＰＥＴ）、シンチグラフィー、コンピューター断層像（ＣＴ）、およびＸ線像の撮像技術に関して用いるもので、特に標的とする解剖学的構造または細胞へ撮像剤が結合することに関して、像から利用可能な情報を多くするために用いる。例示的な造影剤は（ｉ）ＭＲＩに用いるものとしては、ガドリニウムベース造影剤、酸化鉄造影剤、およびマンガン造影剤があり、ＰＥＴまたはシンチグラフィーに用いるものとしては、６４Ｃｕジアセチル−ビス（４Ｎ−メチルチオセミカルバゾーン）、１８Ｆ−フルオロデオキシグルコース、１８Ｆ−フルオライド、３’−デオキシー３’−［１８Ｆ］フルオロチミジン（ＦＬＴ）、１８Ｆ−フルオロミソニダゾール、ガリウム、テクネチウム−９９ｍ、およびタリウムがあり、Ｘ線造影剤としては、バリウム、ガストログラフィン、およびヨウ素造影剤がある。
【００６２】
例えば、血流中に安定な２つの成分の組成物として、ペプチドと共に試薬が運搬されるように試薬とペプチドが直接的または間接的に付着している場合、試薬がペプチドに「結合する」という。この試薬は共有結合的にペプチドに結合させても良いし、それら自体がペプチドに共有結合するキレート、キャビタンド、ナノ粒子、または脂質粒子等の構造で運搬されてもよい。また、試薬はナノ収支または脂質構造等の安定構造内でペプチドと共に運搬されてもよい。
ＩＩ．Ｕ８７Ｒ細胞特異ペプチド
【００６３】
本発明において、浸潤性グリオーマおよびＢＴＩＣコンパートメントが新たに形作られ、可能性のある標的可能成分も詳細な試験を可能にする。本明細書で説明する浸潤グリオーマモデルは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるマウスの脳を通過して、ＧＦＰネオ形質転換されたＵ８７ＭＧヒトグリオブラストーマ細胞が通過して、注入された部位に対して反対側の脳半球から浸潤したサブポピュレーションを単離するために開発された（５および６）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されたときと、非浸潤の反対部分（Ｕ８７Ｒ、腫瘍形成）を比較すると、これらの細胞は高度に浸潤する性質をｉｎ  ｖｉｔｒｏとマウスの脳に再注入したときの両方で示した。マイクロアレイ解析は、多くの遺伝子が、Ｕ８７Ｔ細胞と比較して、Ｕ８７Ｒ細胞において、ｐ７５ＮＴＲの高められた発現を示すと共に、下方調整または上方調整のいずれかを行うことを示した。機能的、生物学的、および臨床の研究の組み合わせを用いて、ｐ７５ＮＴＲは劇的に高められた浸潤と遺伝的には別のグリオーマ細胞の浸潤と侵入を劇的に高め、しばしば高浸潤グリオブラストーマ患者の検体において強く発現していることが発見された（６）。これらの観察はＵ８７Ｒサブポピュレーションが、後のペプチドスクリーニングにおいて好適なモデルであることを示している。このＵ８７Ｒサブタイプは高浸潤グリオーマ細胞（ＨＩＧＣ）の一例である。
【００６４】
ＢＴＩＣモデルは新たに再分泌されたヒト脳腫瘍検体由来の一連の一次細胞培養物からなる。腫瘍の起源は一般的な抗体のパネルに対して試験を行いＧＢＭの診断を確認する。サブポピュレーションは培養中で神経球を自己再生する能力、ならびにグリオーマの大きな星状細胞、オリゴデンドロサイト、または神経系統への分化能力により選択される。１０細胞ほどをマウスの脳に注入すると、これらの脳腫瘍原始細胞（ＢＴＩＣ）は臨床的にはＧＢＭ検体に見られるのと類似して、原始腫瘍を再発生し、ならびに強固に浸潤する（２８）。もしＢＴＩＣが脳腫瘍幹細胞を最も良く表しているかどうかが不明確であっても、それらは依然としてヒトの疾患の挙動を示すことについての優秀なモデルである。
【００６５】
本発明にしたがって、ＧＢＭの治療後に再発した患者の病巣からの細胞のターゲティング、特徴付け、および操作に有用なペプチドが確立された。このペプチド選択は他の研究において既に証明されているファージ提示技術を用いて達成される。例えば、標的細胞または精製された分子におけるファージ提示ライブラリーは、機能的有用性を有するペプチド試薬の単離［３５−３８」だけでなく、確立された細胞集団のサブポピュレーション特有の細胞表面タンパク質の特徴付け（例えば、血管調査システム［３０、３１］）および特定のタンパク質機能のモチーフ重要性の同定（例えば、インテグリン会合のために必要なＲＧＤモチーフ「３２――３４」）を導く。特定の用語において、グリオブラストーマ患者の診断または治療に有用な独特のファージ提示ペプチドの選択はｅｘ  ｖｉｖｏで、治療的困難性を引き起こすＧＢＭの特定の性質を再補足する、我々の独特の臨床的に信頼の置けるモデルシステムの必要性を満たし、単離体において研究されるべき原因となる細胞を特定することができる。
【００６６】
本明細書で説明する選択されたペプチドの最終パネルは細胞集団間の違い、所与の細胞集団内で分子的不均一性を示すのに有用であると証明され、患者の治療効果と腫瘍遺伝的表現型のマッチング、または特定の治療領域、癌治療における個人用医薬品の必須成分のマッチングを可能にする、グリオブラストーマサブタイプの特徴付けにおいて、更に改善されるであろう。あるいは、ｉｎ  ｖｉｖｏ使用調査の理由から、これらのペプチドは臨床的なイメージングツールとして、または特定の腫瘍サブタイプの化学治療の標的試薬として用いることができる。浸潤性を示す患者からの検体だけでなく、Ｕ８７Ｒ細胞の有糸分裂および浸潤能力をこれらの１つが劇的に抑制するので未修飾ペプチドの固有の治療可能性もある。
Ａ．グリオーマ細胞有糸分裂を抑制するＵ８７Ｒ特異ペプチドの単離となる、ファージ提示ライブラリーの選択バイオパニング
【００６７】
本発明は、高浸潤性である（Ｕ８７Ｒ）ヒトグリオーマ細胞のポピュレーションのｉｎ  ｖｉｖｏでの選択を既に説明した（６）。これらの高浸潤性グリオーマ細胞に結合することができるペプチドを単離するために、組み合わせファージ提示ライブラリーを用いたバイオパニング実験を用いた。はじめに、非浸潤（Ｕ８７Ｔ）性Ｕ８７細胞を用いてサブトラクティブバイオパニングを行い、次いで、Ｕ８７Ｒ細胞を用いてセレクティブバイオパニングを行い、全細胞ＥＬＩＳＡアッセイ（図１Ｂ）により、Ｕ８７Ｒと優先的に相互作用することが確認されたファージ（図１Ａ）のライブラリーを単離する。これらのファージをアガロースプレート上で宿主細胞を用いてファージを連続希釈して平板培養してサブクローニングし、ペプチド挿入の配列を決定し、表１に列挙した。この表は左から右に向かって（ｉ）同定されたペプチド（ｉｉ）ペプチド配列、（ｉｉｉ）配列番号、および（ｉｖ）これらの配列を含む細胞結合ファージの数を示す。
【００６８】
更なる生化学的およびｉｎ  ｖｉｖｏでの評価のためにファージを選択するために、Ｕ８７Ｒ細胞の挙動に機能的に影響を与える能力について試験を行った。Ｈ１０ファージ提示配列（配列番号７）は脳様細胞外マトリクスでコートされた膜を通過するＵ８７Ｒ細胞の転移を抑制することが発見された（図２Ａ）。他のファージペプチド、例えば、Ｍ３２およびＭ３４、もＨ１０で処理した場合同様の抑制効果を示したが、同じ程度ではなかった。宿主細胞からのバクテリアの成分が抑制を引き起こすという可能性は、ランダムに選択されたファージのＬＳＰおよび２０倍要領の効果を試験からは達成できなかった。Ｕ８７Ｒ細胞の転移、ならびに脳腫瘍異種移植において、悪性表現型を付与するのに有効であるとされている分子であるｐ７５ＮＴＲで形質転換されたＵ８７ＭＧ細胞［６］もＨ１０ペプチドの合成バージョンは抑制することができる。これらの結果は、ファージペプチドの不存在下で、このペプチドの抑制性質を証明している。
【表１】
2014516975.tif 000003
【００６９】
個々の患者の生検から確立されたＢＴＩＣを用いたトランスウェルアッセイにおいてＨ１０ペプチドの幅広い有用性を評価した。これらは、細胞の動きが測定可能である間、８．０μｍのミクロ細孔を有する膜から構成されている。ＢＴＩＣ株は切除された腫瘍から直接単離されたので、Ｈ１０の真の臨床的ポテンシャルについての示唆を与えると思われた。７つすべてが抑制傾向を示した（図２Ｃ）が、試験されたＢＴＩＣ株の７０％（５／７）の転移は有意に抑制された。Ｈ１０が有意な効果を示さないケースでは、この細胞は高度に浸潤しなかった。Ｆ２対照ペプチドはこれらの１２マーペプチドの抑制可能であることを示すためのコンパレーターとして用いた。アスタリスクは０．０５のｐ値を示すＤｕｎｎｅｔｔ‘ｓマルチプルレンジ比較テストで“未処置”対照からの統計的差を示す。このデータはＨ１０のヒトグリオブラストーマ由来細胞の転移を抑制する能力を示している。
Ｂ．Ｈ１０はＧＭ１含有構造および他の脂質ラフト成分のターンオーバーに影響する
【００７０】
Ｈ１０ペプチドがグリオーマの浸潤を抑制することによる分子メカニズムを決定するために、このペプチドのビオチン化バージョンをパートナーに結合する能力を引き下げ、マススペクトロメトリーで解析した。検出されたタンパク質の多くが、エンドソームのまたは血管輸送の役割を担うかまたはこれらに関係を有していた（表２）。
【００７１】
脂質ラフトはエンドサイトーシスプロセスに含まれることから［３９−４４］、脂質ラフト阻害物質として知られているコレステロールオキシダーゼ［４５、４６］で処理したＵ８７Ｒ細胞の反応を試験した。細胞転移はトランスウェルアッセイで抑制され（図３Ａ）、非カベオラ脂質ラフトおよびカベオラの成分である［４７、４８］ＧＭ１が細胞内、特に原形質膜に蓄積することが観察された（図３Ｂ）。同様の影響は、対照との比較において、３つの独立した細胞株において、Ｈ１０で細胞を処理した場合に観察された（図４Ａ）。
【表２】
2014516975.tif 000004
【００７２】
ｐ７５ニューロトロフンレセプター（ＮＴＲ）は所定の試薬で単離された脂質ラフトにおいて、差別的に検出することができる［４９］。あるいは、細胞内小胞は細胞のポーラエクストリームに対する特定の機能に必要な分子、例えば、有糸分裂の間のリーディングエッジに対するインテグリン等の消化酵素または構造分離の輸送、を届けることができる［５０−５２］。
【００７３】
ｐ７５ＮＴＲは特定の試薬で単離された脂質ラフトにおいて差別的に検出することができ［４９］、グリオーマ細胞において、タンパク分解プロセスを経て細胞有糸分裂を引き起こす［５］。従って、ｐ７５ＮＴＲが細胞内取り込み現象の後に脂質ラフト内で切断もされていることが考えられる［５３］。Ｈ１０がエンドソームに位置するｐ７５ＮＴＲに影響を及ぼすかどうかを決定するために、細胞を超持続的に溶解し（小胞および小胞内器官を少なくとも部分的に維持して）１０−４０％のスクロース／イオジキサノール勾配を用いて分離して、このフラクションを別々に収集した。Ｈ１０とコレステロールオキシダーゼの両方はｐ７５ＮＴＲのより高い分子量にシフトしてより濃厚な勾配分画に収集された（図４Ｂ）。ｐ７５ＮＴＲの大部分はＧＭ１含有脂質ラフトと関係がなかったようであるが、Ｈ１０で細胞をインキュベーションすると、ｐ７５ＮＴＲが細胞内及細胞外ドメインに共存することになる（図４Ｃ）。データを考慮すると、（ｉ）Ｈ１０はＧＭ１およびｐ７５ＮＴＲ含有脂質ラフトの代謝回転を抑制することができる、および（ｉｉ）Ｈ１０は細胞内生成されたｐ７５ＮＴＲ細胞外ドメインの少なくとも１部分の放出を阻害するようである。対照的に、Ｈ１０とコレステロールオキシダーゼは、クラスリンコート小胞のマーカーである、トランスフェリンまたはそのレセプターの細胞内局在化または分画勾配の影響を与えない（図９Ａおよび９Ｂ）。一方Ｈ１０は過剰に発現されたｐ７５ＮＴＲに明確な影響を与えないけれども、内生的に発現された完全長タンパク質のわずかな蓄積を引き起こした。（図１０Ａ−１０Ｃ）。
ＩＩＩ．ＢＴＩＣ細胞特異ペプチド
【００７４】
ＢＴＩＣ特異ファージライブラリーは１２Ｒライブラリーとして、Ｕ８７ＧＭ細胞、Ｕ２５１Ｎ細胞、バックグラウンドファージのライブラリーを補正するためのサブトラクション細胞としてのヒト正常胎児星状細胞、および選択のための異なる患者由来のＴＩＣ単離体の混合物（ＢＴＩＣ１２、２５、４２、５０）を用いて生成された。
Ａ．バイオパニングされたＢＴＩＣ単離体からのペプチドは培養された神経球内で異質性を示す
【００７５】
単離された最も豊富なファージは７Ａ（２５／５０）とされ、１２マーの配列、Ｎ−ＰＳＰＨＲＱＲＱＨＩＬＲ−Ｃ（配列番号１１）をコードしていた。更に、５つの別のファージ（１０Ｃ、Ｅ１０、３Ｆ、Ｃ１、および３Ｂ）が１つ以上から単離され、スクリーニングされたサブクローニングの５０％（２５／５０）を含んでいた。結果を表３に示す。
【００７６】
サブトラクションのために用いた細胞よりもＢＴＩＣに優先的に結合する７Ａを確認するために、神経半球およびＵ８７ＭＧ細胞をビオチン標識合成ペプチドを含む懸濁液中で染色した。ＢＴＩＣ株の２つが神経球内において陽性細胞の高いパーセンテージを示したが、図５Ｂに示すように、正常幹細胞（非癌性であり、抑制または選択に使用されていない）およびＵ８７ＭＧ細胞は主に陰性であった。ＢＴＩＣラインのパネルを通過したすべての選択されたペプチドの相互作用の検査は、各細胞集団内の異質性を強調し、特別のペプチド配列に、細胞挙動あるいは患者への影響のいずれかを結び付ける能力を関連させるためのプラットフォームを確立した。図８はＢＴＩＣの代表的な選択において、発見されたＢＴＩＣに特異的なペプチドの結合特異性を示す。
【表３】
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【００７７】
図８で見られるように、Ｅ１０はＵ８７ＭＧとＢＴＩＣの両方に結合し、Ｕ８７Ｒ（ＨＩＧＣ）およびＵ８７Ｔ（主な腫瘍）の両方にも結合することが観察されている。従って、Ｅ１０はＧＢＭ腫瘍においてこれら３つの細胞表現型に共通するマーカーとして提供可能である。
ＩＶ．Ｕ８７ＲおよびＢＴＩＣ結合ペプチドの帰着性質
【００７８】
選択されたファージまたはそれらに対応するペプチドの能力を、同所異種移植モデルにおいてグリオーマ細胞を検出するそれらの能力に従って、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて個々のＵ８７ＲまたはＢＴＩＣグリオーマ細胞標的に対して「帰着」する能力について、試験した。Ｈ１０の場合、Ｕ８７ＲまたはＵ８７Ｔ異種移植片を有するＳＣＩＤマウスに、ＰＢＳに予め曝して未結合粒子を除去した、試験ファージを１０分間注入した。脳の連続切片をＭ１３ファージについて免疫組織学的に染色すると、Ｈ１０がＵ８７Ｒにおいて特異的に帰着しており、Ｕ８７Ｔ細胞では帰着していないことが検出された（図６Ａ）。
【００７９】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、７Ａが神経球内のサブセット細胞に特的結合を示すかどうかを確認するために、ＢＴＩＣ異種移植片を有するＳＣＩＤマウスに７Ａファージを注射して、抗ファージ免疫組織学的脳凍結切片を作成した。神経球のｅｘ  ｖｉｖｏ染色で見られるように、ＢＴＩＣ１２および２５のメイン腫瘍容積内の細胞のサブセットのみが陽性染色を示した（図６Ｂ）。更に、周辺の組織ならびに非標的細胞から作成された異種移植片、特にＵ２５Ｎヒトグイオブラストーマ株において染色は検出されなかった。ＢＴＩＣ異種移植を対照ファージで予備灌流すると（Ａ１、ランダムに選択されたサブクローン）最小の染色を示した。このことは、再度７Ａ提示ペプチドの選択性および結合特異性が確認された。
【００８０】
上に報告された研究は、７Ａファージ／ペプチドが個々のＢＴＩＣ系統（図５、図６Ｂ）内の細胞の部分集合だけを認識することを示す。したがって、７Ａ結合が指標かもしれないこれらの細胞のユニークな特性があったかどうかを判断することは興味のあることであった。ＢＴＩＣ  ２５細胞は限界希釈法によってサブクローン化され、ペプチド結合のためにスクリーニングされた。７Ａ結合が豊富な細胞集団は接着性コロニーとは対照的に、培地において神経球を形成する非結合性カウンターパートとは明らかに異なっていた（図７）。更に、７Ａ結合しているサブポピュレーションは同所異種移植（３ヶ月育成期間）においてあまり増殖をせず、神経幹細胞ニッチを宿すと知られている脳の領域である、脳室下領域内でわずかに検出されたのみであった。７Ａ非結合サブポピュレーションは非常に腫瘍形成能力があり、周辺組織においてわずかに浸潤しただけで非常に大きな腫瘍容積を形成する。それゆえ、７Ａペプチドは、神経球形成、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける低増殖活性、および脳室領域の優先的局在に関係する細胞の集団とは異なる。両方の集団がＢＴＩＣ培養に由来したという事実は、隠れた前駆体から再発された腫瘍まで７Ａがこの病巣内の細胞の進行を追跡することができることを示す。
Ｖ．ペプチド組成物およびペプチド会合体
【００８１】
１つの側面において、本発明は（ｉ）ヒトＧＢＭ細胞の高浸潤前グリオーマ細胞（ＨＩＧＣ）サブタイプ、例えば、Ｕ８７ＧＭ細胞のＵ８７Ｒサブタイプ、または（ｉｉ）上で特徴付けをした、ヒトＧＢＭ細胞の脳腫瘍原始細胞（ＢＴＩＣ）サブタイプのいずれかを標的とするペプチド組成物を含む。組成物中のペプチドは１２−２０アミノ酸残基の長さであり、配列番号１−１７で定義される配列または所与の配列に９０％の同一性を有する配列の１つを含む。即ち、このペプチドは配列番号１−１７のいずれか１つと同じか、またはこれらの配列のなかで最大でも１つのアミノ酸が異なる配列のみを含む。このペプチドはアミノ酸の所与の配列のみを含むか、または２０残基の中にＮ末端および／またはＣ末端残基を含む。従って、例えば、配列番号７、ＴＮＳＩＷＹＴＡＰＹＭＦ（Ｈ１０）は、これと正確に同一な配列、同じ配列において１２残基のいずれかに１つのアミノ酸が置換、付加、または欠失された配列、またはＮ末端またはＣ末端の両方またはいずれかにおいて８つまでの追加的な残基を有するペプチドである。例えば、配列番号１７（ＫＫＧＴＮＳＩＷＹＴＡＰＹＭＦ）は配列番号７（Ｈ１０）の１２残基を含み、３つのＮ末端残基（ＫＫＧ）も含む。これらの残基はＨ１０ペプチドに２つのリジン残基を追加的して、水溶性を高めたものである。
Ａ．ペプチド
【００８２】
本発明のペプチドは天然のＬ−異性体、Ｄ−アミノ酸形態、またはこれら２つの混合物を有するアミノ酸を用いて、従来の固層または組み換えＤＮＡ合成技術により形成される。全部がＤ形態または部分的にＤ形態を有するペプチド組成物は生物学的条件下で、例えば、患者に投与された場合、タンパク質分解により耐性となることが予測される。全てがＬ型アミノ酸、全てがＤ型アミノ酸、または活性化されたＤ−またはＬ−アミノ酸を用いたＤとＬのアミノ酸の混合物からなるペプチドの調製に用いる固層ペプチド合成方法は、例えば、Ｇｕｉｃｈａｒｄ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  Ｖｏｌ．  ９１，  ｐｐ．  ９７６５−９７６９，  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９９４に記載されている。代替的に、このペプチドは逆配列方向に合成されたＤアミノ酸からなっていてもよい。即ち、カルボキシ末端からアミノ末端に向かって、レトロインベルソ（ＲＩ）ポリペプチドと呼ばれているものを生成する。ＲＩ形態ペプチドの合成方法は、例えば、Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，  Ｍ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ｍ．Ｍ．，  Ｐａｒｔｉａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｒｅｔｒｏ−Ｉｎｖｅｒｓｏ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ａｎｄ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ，  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ，  １９９８，  ９８：７６３−７９５に記載されている。本明細書を参照により本明細書に援用する。
【００８３】
ＨＩＧＣのターゲティングでの使用のために、このペプチドは、配列番号２（Ｍ３２）、７（Ｈ１０）、および９（Ｍ２４）を含み、配列番号７（Ｈ１０）を代表とする、配列番号１−１０、１３、および１７からなる群より選択される配列を含む。配列番号１３はＢＴＩＣとＨＩＧＣとの両方、および分化したＧＢＭ腫瘍細胞集団に結合し、１７は修飾されて溶解性を高めたものである。ＢＴＩＣターゲティングにおける使用について、このペプチドは配列番号１１−１６、好ましくは配列番号１１（７Ａ）、１４（３Ｆ）、および１６（３Ｂ）を含み、配列番号１１を代表とする。
Ｂ．ペプチド会合体および組成物
【００８４】
ヒトＧＢＭ腫瘍を有する患者におけるＨＩＧＣまたはＢＴＩＣサブタイプを検出するための診断薬として用いるために、このペプチドは放射性造影剤または他の検出可能部分、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＧＢＭ細胞タイプの撮像のための、またはｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＢＭ細胞タイプの撮像のための、蛍光剤等の造影剤と結合される。現在造影剤を用いるｉｎ  ｖｉｖｏのための主要な造影技術はｘ線／コンピュータ断層映像法（ＣＴ）、磁気共鳴造影法（ＭＲＩ）、陽電子放射型断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射形コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、および超音波技術がある。幅広く用いられている放射性造影剤は、ＭＲＩについては（ｉ）ガンマグロブリンベース造影剤、酸化鉄造影剤、マンガン造影剤があり、ＰＥＴまたはシンチグラフィーについては、６４Ｃｕジアセチル−ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン）、１８Ｆ−フルオロデオキシグルコース、１８Ｆ−フルオライド、３’−デオキシ−３’−［１８Ｆ］−フルオロチミジン、１８Ｆ−フルオロミソニダゾール、ガリウム、テクネチウム−９９ｍ、およびタリウムがあり、Ｘ線撮像については、バリウム、ガストログラフィン、およびヨウ素造影剤がある。造影剤または造影剤を運ぶ配位複合体、例えば、ラジオアイソトープ金属は、既知の技術、例えば、配位複合体への共有結合により、ペプチドに結合される。
【００８５】
ＨＩＧＣまたはＢＴＩＣ細胞を抑制または崩壊させるための治療薬としての使用について、このペプチドは、例えば、アルキル化剤、抗代謝剤、植物アルカロイドおよびテルペノイド、例えば、タキソール、トポイソメラーゼ、プロエオソームインヒビター、およびモノクローナル抗体を含む各種抗がん剤の１つに結合されている。この抗がん剤は周知の方法でペプチドに共有結合している。他の態様において、このペプチドは抗がん剤をカプセル化した形で運ぶ粒子、例えば、リポソーム、の表面に結合される。
【００８６】
更なる態様において、本発明のペプチドはアンギオペップ（ＡｎｇｉｏＰｅｐ）２またはアンギオペップ７（それぞれ配位１８および１９）のようなペプチド担体と融合ペプチドを形成している。この融合ペプチドは脳血液関門（ＢＢＢ）（６２）を横断するペプチドの通過を促進することができる。
【００８７】
本発明の組成物は（ｉ）ペプチド単独、（ｉｉ）液体または乾燥状態の好適な担体、例えば、生理食塩水中のペプチド、（ｉｉｉ）前述の結合した形態のペプチド、または（ｉｖ）ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマー、シクロデキストリンナノ粒子、またはセチルアルコール／ポリソルベートのナノ粒子内に封入されたペプチドを含む。ＢＢＢを通過して薬を提供するのに有用なナノ粒子は当業者に知られている（例えば、６８−７１）。このナノ粒子は好ましくは３０−１００ｎｍの範囲のサイズで、血液流れ中の循環時間を高めるためにポリエチレングリコールでコートされていてもよい。この粒子は、例えば、生理食塩水等の注射可能な媒体に懸濁されていてもよく、疎水性形態で提供されてもよい。
【００８８】
このペプチド組成物は複数のＧＢＭ結合ペプチドおよび／またはペプチド会合体、例えば、ＢＩＴＣに優先的に結合する少なくとも１つのペプチドまたはペプチド会合体、およびＨＩＧＣに優先的に結合する少なくとも１つのペプチドまたはペプチド会合体、を含んでいてもよい。
Ｃ．担持ペプチド
【００８９】
Ｈ１０ファージを予備灌流させたＵ８７腫瘍を有するマウスの脳の免疫組織学的染色は、腫瘍部分または腫瘍の周辺部分のいずれかの位置で陽性シグナルを示した。このことは、Ｈ１０が脳血液関門（ＢＢＢ）を通過する能力を有することを示している。この特徴は、本発明の他の側面では、担体ペプチドとしてＨ１０ペプチドの会合体を含む新規な組成物において、および脳に届けられるべき神経薬物または抗がん剤においてにも利用される。このような薬剤は、用いられる任意の薬物を含み、うつ病、不安、統合失調症、運動亢進、アルツハイマー病あるいはパーキンソン病のような神経学的な条件あるいは上に指定されたクラス等のあらゆる抗腫瘍化合物も、脳血液関門を破ることができたならば、それは治療する際に有用である。この薬剤は、ペプチド上のヒドロキシ、スルフィド、アミン、またはカルボキシル基への化合物の直接結合または化合物上の対応する活性化された基へのペプチドの直接結合、または二官能性のカップリング剤等の、既知の方法に従ってペプチドに結合される。
ＶＩ．診断および治療方法
【００９０】
ＧＢＭの研究は、腫瘍の発達の生物学から、これらの腫瘍についての原始因子および疾患病巣であると近年信じられている細胞のサブセットに拡大された。近年の見解は所与の脳腫瘍は再発に寄与している固有のポテンシャルを保持している各サブポピュレーションとともに、幹細胞性または分化の各種ステージを有する細胞の混合物からなるということである［１、５４］。患者への影響を予測し、再発性疾患［１］の性質のためのプロファイルをよりよく描写し始めた。これらのサブポピュレーションのすべてが再発された疾患に結局帰着して、現在の治療によって、治療可能であるとは限られないことは明白になっている。さらに、シナリオを複雑にして、これらの細胞集団も化学的および放射性治療により刺激されたよりアグレッシブな表現型なるかもしれない［５５、５６］。本発明の１つのゴールは、ＧＢＭおよび関連疾患の確立されたサブタイプの排除についての現実的な解決に寄与することである。
【００９１】
そのためにも、本発明はヒトＧＢＭ腫瘍を有する患者を診断および／または治療するための方法、特に、腫瘍の再発の原因と見られている腫瘍細胞のサブポピュレーションを特徴付けおよび／または処理することによるヒト患者におけるＧＢＭ腫瘍の治療についての改善を提供する。患者は化学療法、ｘ線放射治療、および／または外科的除去等の１つ以上の既知の手段で治療されていてもよい。この初期の治療は、腫瘍サイズまたは成長を有意に減少させたが治療領域のその側にあるＨＩＧＣサブポピュレーションの存在により、またはかつ度的にＧＢＭ細胞を分割して腫瘍を再分配することができる細胞のＢＴＩＣサブポピュレーションを通じて、腫瘍は再発する。
Ａ．ＧＢＭ腫瘍を特徴付ける方法
【００９２】
１つの側面において、本発明は近年の処置方法を受けられないかもしれない腫瘍リザーバー（患者）に関して、ＨＩＧＣおよびＢＴＩＣ表現型を含む、腫瘍内で別の細胞表現型の密度および分布に従い、患者の中の多形グリオブラストーマ（ＧＢＭ）腫瘍を特徴づける方法を提供する。
【００９３】
この方法は、腫瘍領域内でＨＩＧＣとＢＴＩＣサブタイプの両方および任意で腫瘍の大部分を占める主な分化した腫瘍細胞の密度と分布を示す、患者の脳腫瘍の１つ以上のイメージを作成する工程を含む。１つのイメージが作成された場合、１つがＨＩＧＣ細胞を優先的に標的とし、第一造影剤に結合するペプチドを含み、もう１つはＢＴＩＣ細胞を優先的に標的とし、第二造影剤に結合するペプチドを含む、２つ以上のペプチド組成物のカクテルを患者に投与して、２つの造影剤によりそれぞれペプチドの標的細胞タイプへの結合を視覚化できるようにする。
２つ以上の別々のイメージが作成される場合、２つ以上の細胞タイプを別々に視覚化するために、それぞれのイメージは既知のイメージ処理技術により１つのイメージに統合することができる。
【００９４】
用いられるであろう技術は、磁気共鳴造影法（ＭＲＩ）、陽子放射型断層撮影法（ＰＥＴ）、シンチグラフィー、コンッピューター断層撮影法（ＣＴ）、およびＸ線である。それぞれの技術について、各好適な造影剤が利用可能であり、ＭＲＩについては（ｉ）ガンマグロブリンベース造影剤、酸化鉄造影剤、マンガン造影剤があり、ＰＥＴまたはシンチグラフィーについては、６４Ｃｕジアセチル−ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン）、１８Ｆ−フルオロデオキシグルコース、１８Ｆ−フルオライド、３’−デオキシ−３’−［１８Ｆ］−フルオロチミジン、１８Ｆ−フルオロミソニダゾール、ガリウム、テクネチウム−９９ｍ、およびタリウムがあり、Ｘ線撮像については、バリウム、ガストログラフィン、およびヨウ素造影剤がある。造影剤は直接共有結合または放射性画像化金属についてペプチドへの金属器レートの共有結合等の標準的な方法により関連するペプチドに結合される。
【００９５】
１つ以上のイメージが生成されると、医師は容易に密度および分布、例えば、腫瘍内のおよび腫瘍の縁における第一および第二ペプチドおよびそれらの関連する造影剤の局在化を評価することができる。
【００９６】
図１３−１９はマウス脳や移植されたヒトＧＢＭ腫瘍の特定の細胞を標的とする。ＢＴＩＣおよびＨＩＧＣ特異ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏターゲティングを示す。図１３Ａおよび１３Ｂの研究で示されるように、脳腫瘍は７Ａペプチドへの結合により同定される患者由来ＢＴＩＣ細胞株ＢＴ０２５とマウスに移植された。この腫瘍を除去し、切片を作成し、顕微鏡での視覚化のために染色をした。図１４−１９に示す研究において、ＢＴ０２５細胞株（図１４−１７）またはＵ８７ＭＧ細胞株(図１８および図１９）由来の移植されたＢＧＭ腫瘍を有するマウスへ蛍光化ペプチドを静脈内に投与した。ペプチド局在化のあと、動物を殺し、それらの脳腫瘍を除去して、切片を作成して、蛍光顕微鏡で視覚化した。これらの研究の結果は試験されたそれぞれのペプチドについて静脈内に投与した時にペプチド蛍光会合体が特定の脳腫瘍細胞を標的とすることができることを示している。
【００９７】
図１３ＡはＢＴ０２５細胞株をあらかじめ注射して、ヒト核酸にだけ存在する高原に特異な抗体および黒茶色の検出試薬で染色した５つのマウスの脳からの薄切片の高倍率像を示す。この図は脳腫瘍組織中に拡散する７Ａ結合細胞があることを示す。
【００９８】
図１３ＢはＢＴ０２５サブクローンを注入した５つのマウスの脳からの薄切片を示す。トルイジンブルー染色は大規模な腫瘍成長を正常組織の崩壊を明確に示している。したがって、マウスの脳へ細胞を注入する前のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの７Ａ結合は分化したＢＴ０２５細胞集団のｉｎ  ｖｉｖｏでの挙動を予測することができる。
【００９９】
図１４Ａは生きているマウスにおいてＢＴ２５細胞から成長した大きな移植腫瘍へ、蛍光ラベルした７Ａペプチド（配列番号１１、ＢＴＩＣ結合について優先的）が帰着する能力をしめしている。このペプチドは、頚動脈注射によりマウスに投与され、３０分間血流循環させてバックグラウンドシグナルを取り除き、マウスを殺した。脳を除去し、オリンパスＯＶ１００全マウスイメージシステムを用いて撮影した。倍率のない検察においては、腫瘍の大きな増殖が観察された（図１４）。蛍光シグナルは腫瘍の一部で強かったが、存在するすべての主要細胞を検出できなかった。
【０１００】
図１４Ｂと図１４Ｃは、図１４Ａの脳を腫瘍移植部位の近くで二等分し、ヒト核抗原（緑）およびトータルＤＮＡ（青）について染色して、細胞の位置の概観を表した後に、この脳から作成した薄切片の低倍率顕微鏡写真および高倍率顕微鏡写真を示す。赤いペプチドシグナルは組織の周辺に拡散的に広がっている組織だけでなく、主な腫瘍塊に隣接する細胞でも観察された。図１４Ｃは特に７Ａペプチドが主な腫瘍塊の外側に拡散して広がっている細胞に主に結合していることを示している。
【０１０１】
図１５Ａと図１５Ｂは蛍光標識された３Ｂペプチド（配列番号１６、ＢＴＩＣ細胞に優先的に結合する）を注射した動物の類似する切片を示す。図１５Ｂは３Ｂが主な腫瘍塊の中と外の両方にある細胞に結合することを示す。このことは、３Ｂが腫瘍細胞の増殖と拡散的転移の両方を検出することができることを示す。
【０１０２】
図１６Ａと１６Ｂは蛍光標識３Ｆペプチド（配列番号１４、ＢＴＩＣ細胞に主に結合する）を注射した動物の、同様の観察を示す。図１６Ｂは薄切片を作った時に、赤いシグナルの大部分が主な腫瘍塊の周辺組織において拡散的に転移した細胞のヒト核抗原については緑色シグナルに近いことを示している。図１７Ａと図１７Ｂは同様の結果が、頚動脈注射よりも尾静脈注射によりペプチドを投与したときに、同様の結果が観察できることを示している。
【０１０３】
図１８Ａおよび１８Ｂ−１８Ｄは蛍光ラベル修飾Ｈ１０ペプチド（配列番号１０、ＨＩＧＣに優先的に結合する）を注射したＵ８７ＭＧＣヒトグリオーマ細胞株で誘発して腫瘍を有する動物の類似の観察を示す。これらの研究において、腫瘍は大きく成長せず、切片作成なしでは遠赤蛍光シグナルは明確に観察されなかった。図１８Ｂ−１８Ｃ（同じ切片の異なる倍率）は、修飾Ｈ１０ペプチドＨＩＧＣから予想されたように、主な腫瘍塊の外側に拡散的に広がる細胞に優先的に結合することを示す。同様の結果は、このペプチドを尾静脈を介して注射したときにも観察された（図１８Ｄ）。
【０１０４】
図１９Ａと１９Ｂと、Ｕ８７ＭＧヒトグリオーマブラスト細胞株で誘発して腫瘍を有する動物において、蛍光ラベル修飾Ｅ１０ペプチド（配列番号１３、ＢＴＩＣとＨＩＧＣの両方に結合する）を注射した動物の図１９Ｄは同様の結果を示す。これらの研究において腫瘍は大きく成長せず、切片を作成しないと遠赤蛍光シグナルは明確に観察されなかった（図１９Ａ）。図１９ＢはＥ１０が主な腫瘍塊の中の細胞の一部に結合することを示す。図１９ＣはＥ１０が主な腫瘍ｓ相棒塊の外側の細胞に結合することも示す。同様の結果は、尾静脈を介してペプチドを投与したときにも得られた。
【０１０５】
前述の研究は、ＢＴＩＣに特異的な（７Ａ、３Ｂ、および３Ｆ）、ＨＩＧＣに特異的な（修飾Ｈ１０）、および両方の細胞タイプに特異的な（Ｅ１０）ペプチド会合体がヒトＧＢＭｉｎｖｉｖｏ組織に局在できて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、各種細胞タイプの密度および局在化における情報を提供できること、および標的をペプチド会合体の静脈内投与によりターゲティングを行うことができることを示している。
【０１０６】
得られたイメージから、特にＨＩＧＣおよびＢＴＩＣにおいて、主な腫瘍およびリザーバー細胞を含むであろう腫瘍の縁の両方で、腫瘍の直径および位置を決定するためのこの方法の用い方が理解される。この情報は、同様に再発のリスクを外科医によりよく決定させることができ、放射線腫瘍医においては放射線治療に必須な脳の容積と位置をより実際的に決定することができる。
【０１０７】
処置計画を進めるにはリザーバー腫瘍細胞の存在および分布を考慮する必要があるが、この方法は、リザーバー細胞を排除または減らすことにおける処置の効果をモニターすることもできる。この態様において、この方法に従って、脳を開始時に撮影し、処置のタイムコースの１つ以上の時点で撮影し、リザーバー細胞上の腫瘍の影響を記録する。
【０１０８】
最終的に、この処置方法は、腫瘍内の別の表現型の腫瘍細胞の異なる発現プロファイルを利用する、ＧＢＭ腫瘍治療についての化学療法の計画に用いてもよい。図２０は３つの独立して単離された７Ａ結合細胞サブクローンと３つの独立して単離されたｍＲＮＡから生成されたマイクロアレイーデータの遺伝子集団を示す。全７Ａ結合サブクローンの遺伝子プロファイルは７Ａ非結合サブクローンと同様に一緒に塊となった（類似の遺伝子発現を証明している）。このことは、７Ａが転写性が独特であるＢＴＩＣサブタイプ間を区別して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその挙動が予測可能であるという見解を強調する。この遺伝子発現データにより、腫瘍医は特別な（特定の）遺伝子発現プロファイルにして最も効果的な化学的治療試薬の同定において、細胞の別の遺伝子発現プロファイルを試すことができる。この図は前述のものに加えて、医療用の造影剤または化学治療薬を届けるためのターゲティング試薬としてのＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）−Ｅ１０ペプチド会合体の開発の先例となりえる。これらのデータは所与の１つのペプチドの結合において特異性を示す拡散した腫瘍のターゲティングを最大化するために、１つ以上のペプチドを用いる可能性も示している。
Ｂ．遺伝子発現プロファイル
【０１０９】
本発明の他の側面に従って、次に（同様に）異なる遺伝子発現プロファイルを有するＢＧＭ細胞サブタイプの特定のペプチドに優先的に結合するペプチドの発見はその成分細胞の点から腫瘍を特徴づけるための新規な方法を提供する。この方法に従い、腫瘍医は細胞タイプの基地の発現パターンで同定された細胞タイプと関連付け、本発明のペプチドで各特定のタイプの細胞の存在および／または分布および／または分布および／または数を基地の同定された遺伝子発現プロファイルの治療計画の根拠として決定する。
例としては、表４は７Ａ−ＢＴＩＣ細胞に関係する７Ａ＋ＢＴＩＣ細胞で発現が増加した遺伝子を列挙する。組織サンプルが１つ以上の発現増加した酵素、例えばＳＮＲＰＮ、ＰＴＧＤＳ、またはＨ１９の増加したレベルを示した場合、腫瘍医はサンプル内の細胞が主に７Ａ＋結合ＢＴＩＣであると認識にて、治療剤または毒と会合した、表３に記載の７Ａ、１０Ｃ、Ｃ１、３ＢまたはＥ１０等の７Ａ＋細胞に結合する治療用ペプチドで患者を処置する。同様に、生検組織が表５に記載のタンパク質の１つの高められたレベルを示した場合、腫瘍医はＨＩＧＣ細胞株に結合するペプチドであると予測でき、患者を治療薬または毒に会合したＵ８７Ｒ細胞に結合した治療用ペプチド、例えば、Ｈ１０、Ａ２、Ｍ３２、Ｃ１２、Ｍ５、Ｍ４３、Ｍ１９、Ｆ２、Ｍ２４、およびＭ２３等の表１に記載のペプチドの１つで治療する。
【表４】
2014516975.tif 000006
【表５】
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Ｃ．治療
【０１１０】
更なる側面において、本発明のペプチド組成物は腫瘍治療において、特定の腫瘍細胞タイプへの治療剤のターゲティングに有用である。１つの一般的なやり方として、腫瘍医は１つの知られている治療、例えば手術、放射線治療、または化学療法、あるいはこれらの組合せを腫瘍の治療に適用し、次にこの腫瘍リザーバー細胞への治療剤をターゲティングさせるために本発明の組成物を用いて初期治療のあとの再発におけるリザーバー効果を最小化する。
【０１１１】
デリバリーシステムの多くは、ペプチド組成物を脳へ届けることができる（６２−７１）。前述のように、Ｈ１０ペプチドはそれ自身で脳血液関門を通過して抑制されるべき腫瘍部位へ移動することができ、従って、ペプチド単独でまたは造影剤または抗がん剤に結合したペプチドとしてのいずれかで、動脈内、ＩＶ、ＩＭ、ｓｕｂＱ、鼻の粘膜、または肺を含む全身的な経路に投与される。マウスの腫瘍についてのこの研究は、更に研究されたペプチドの全てが静脈内投与後に脳組織を標的とすることが可能となったことを示す。
【０１１２】
ＣＮＳデリバリーについての他の有用な手段は、灌流高圧デリバリー（６６）、薬理学的ベース、または物理学的ベース（６３）等のいずれかの浸透（浸潤）（神経外科的な）に幅広く分類される。神経外科的ベース手段は脳室内注入、脳内移植、およびＢＢＢ分裂を含む。薬理学的ベース手段は（例えば、６８−７１に記載のような）ナノ粒子担体を含む。物理学的基本手段は、ペプチドの栄養素の担体仲介輸送またはペプチドの受容体仲介輸送のいずれかの、通常の内生経路の利点を用いるものである。
【０１１３】
後者のカテゴリーにおいて、Ｄｒａｐｐａｔｚらは、再発したグリオブラストーマを有する患者にＡＮＧ１００５のフェーズＩスタディーを行った。ＡＮＧ１００５は低密度のリポタンパク質受容体関連タンパク質１受容体（６２）を介して、脳血液関門を横断して通過させる新規なペプチド、Ａｎｇｉｏ−Ｐｅｐ−２、に結合した３つのパクリタキセル分子からなる。Ａｎｇｉｏ−Ｐｅｐ−２は、ＢＢＢにおいて低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）受容体に結合する１９アミノ酸ペプチド（配列番号１７）であって、受容体仲介輸送により脳に薬物を続ける能力がある。ここにおいて、ＢＴＩＣ−またはＨＩＧＣ−特異ペプチドは、造影剤または抗がん剤を含んでいてもいなくてもよいが、Ａｎｇｉｏ−ｐｅｐペプチドに結合しており、全身に届けられる。
【０１１４】
代替的に、手術で初期腫瘍を除去した後に、本発明の組成物は、オブラートに包んで直接、または、このペプチドを定期的に届けるための灌流圧力デリバリーポンプを装着することにより、投与することができる。高灌流デリバリー（ＣＥＤ）はチップが標的部位に近いところに設置されている注入カテーテルを用いる。この技術において、カニューレが処置されるべき棒の領域に直接挿入されており、治療薬をＢＢＢを循環しているカニューレのバルク流れを通じて届ける。
【０１１５】
このペプチド組成物はマンニトールまたは他のＢＢＢ分断薬を用いるＢＢＢの短時間の分断の後、代替的に投与することができる。このアプローチは患者の脳腫瘍にアバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）を届けるために用いられている（６７）。
【０１１６】
更なる他の輸送方法は、嗅覚神経経路（軸策輸送）および嗅覚上皮経路を介する鼻の輸送ルートを用いる。
【０１１７】
前述のように、診断方法は、通常、例えば、手術、放射線治療、または化学的治療による、ＧＢＭ腫瘍の初期治療の後、ＢＴＩＣおよび／またはＨＩＧＣの病巣をイメージ化して行われる。標的細胞の視覚化における解像度、患者に投与された診断薬の投与量、または投与経路により、意義のある診断結果が得られるまで、これらを変化させる。
【０１１８】
いずれの細胞タイプの病巣かを同定した後に、患者が治療形態でこのペプチドを用いて治療を行い、再発性細胞の集団をノックアウトまたは減らす。この治療の間、減らされたＨＩＧＣまたはＢＴＩＣ集団の進行を本発明の診断方法で定期的にチェックして、必要ならば組成物の治療投与量を変更して、標的であるＨＩＧＣまたはＢＴＩＣの抑制または崩壊の程度を高める。治療は、例えば、組成物を２週間に１度、または１週間に１度投与して、所望の最終ポイントが観察されるまで続けることができる。
【０１１９】
以下で説明する実験方法は、定時的なものであり、特許請求範囲で定義される発明の範囲を限定するものではない。
ＶＩＩ．実施例の方法
【０１２０】
動物実験は全て、カルガリー大学の倫理学委員会および動物療養所によって提供された稟議書に従って行われた。貯蔵されている患者サンプルからの脳腫瘍原始細胞の単離を含む、腫瘍および正常組織は、アルバータ、カルガリー、Ｆｏｏｔｈｉｌｌｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの腫瘍組織バンクから得た。
Ａ．細胞培養
【０１２１】
ヒトグリオーマ細胞Ｕ８７はアメリカンタイプカルチャーコレクションから提供され、ＧＦＰ形質転換され、前述のようにＵ８７ＴとＵ８７Ｒサブポピュレーション［６］に分離されていた。ヒトグリオーマ細胞株Ｕ２５Ｎとヒト胎児正常細胞は、Ｖ．  Ｗ．  Ｙｏｎｇ  （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｇａｒｙ，  Ｃａｌｇａｒｙ，  Ａｌｂｅｒｔａ，  Ｃａｎａｄａ）から贈られた。全ての細胞は、１０％  熱失活ウシ血清  ［ＦＢＳ］，  ０．１  ｍＭ  非必須アミノ酸，  ２  ｍＭ  Ｌ−グルタミン，  １  ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、および４００  μｇ／ｍｌのＧ４１８  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３７oＣ  、湿度５％  のＣＯ２インキュベーター内で感染させた細胞で懸濁された、完全培地（ダルベッコ修飾イーグル培地［ＤＭＥＭ］）中で維持した。細胞を８０−９０％コンフルエンスでトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で収穫して。継代培養した。
【０１２２】
脳腫瘍原始細胞（ＢＴＩＣ）は、ＢＴＩＣ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにより供給され、Ｄｒ．Ｊｏｈｎ  Ｋｅｌｌｙ［２８］により単離された後、Ｄｒｓ．Ｇｒｅｇ  ＣａｉｒｎｃｒｏｓｓとＳａｍｕｅｌ  Ｗｅｉｓｓにより維持され、Ｎｅｕｔｒｏ  Ｃｕｌｔ培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内で神経半球として維持されているものである。ＢＴＩＣ２５を７Ａ陽性および陰性集団へサブクローニングすることは、限界希釈法により行った。
Ｂ．バクテリオファージ培養
【０１２３】
Ｔｈｅ  Ｐｈ．Ｄ．ＴＭ−１２ファージ提示ペプチドライブラリーキット  （Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）  を取り扱い説明書のとおりに用いた。簡単に説明すると、ファージライブラリーを以下のように増幅した：バクテリア宿主株ＥＲ２７３８を一晩培養したものを２０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含むＬＢブロスで１／１００に希釈して、１０μＬのファージ（〜１０８−１０１０ｐｆｕ／μＬ）を接種して、３７ｏＣで一晩振とう培養した。バクテリアをペレット状にして、１／６容量の２０％ｗ／ｖＰＥＧ−８０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌを加えて上清からファージを沈殿させて、４ｏＣで一晩貯蔵し、１００００ｘｇで１５分間延伸分離をした。ペレットはファージを含んでおり、ＰＢＳ中で戻された。精製されたファージをマウスの実験に用いる場合には、０．２２μｍのフィルターでろ過して用いた。
【０１２４】
ファージ力価は１０μＬの連続希釈されたファージと２００μＬのＥＲ２７３８を３ｍＬの５０ｏＣに温められたＬＢ中７％アガロースに添加して、２０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、４０μｇ／ｍＬ  ＸＧａｌ、および５０μｇ／ｍＬＩＰＴＧを含む温められたＬＢアガープレートに注いで決定した。３７℃で一晩培養した後、ブループラークをｐｆｕ／μＬの計算のためにカウントした。パスツールピペットを用いてアガロースプレートから単離されたプラークを除去して、１００μＬの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、６ｍＭ  ＭｇＳＯ４中のファージを４ｏＣで一晩抽出して、プラークをサブクローンした。増幅培地は、前述の２０μＬの抽出緩衝液に接種した。
Ｃ．Ｕ８７Ｒ（浸潤グリオーマ）特異ペプチド配列のバイオパニング
【０１２５】
［６１］に記載のように、バイオパニングを行った。サブトラクション細胞（例えば、Ｕ８７Ｔ）をパックスＥＤＴＡを含む組織培養プラスチックから放出させて、ＰＢＳで洗浄した後、１ｘ１０７細胞を１．５ｘ１０１１ｐｆｕのＰｈ．Ｄ．−１２Ｍ１３ファージライブラリー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含むＰＢＳ中１％ＭＢＳＡに再懸濁させた。この細胞およびファージを緩やかに撹拌しながら、室温で１時間エッペンドルフチューブ内でインキュベーションし、細胞をペレット化して上清を維持する前に、細胞とファージをサブトラクション細胞の他の分割試料を含む新しいチューブに移した。インキュベーションと上清の移動を３回行い、移された上清は最後に空のチューブに移した。選択細胞はパックスＥＤＴＡを含む組織培養プラスチックから放出させて、ＰＢＳで洗浄した。５ｘ１０６細胞を３ｘサブトラクト上清中に再懸濁して、緩やか振とうしながら４ｏＣで４時間インキュベーションした。この細胞ペレットをＰＢＳ中５ｘ冷蔵１％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。各洗浄ごとに新しいチューブに移した。１ｍｇ／ｍＬＢＳＡを含む１ｍＬの０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ  ｐＨ２．２中で４ｏＣで１０分間細胞を揺らして、結合ファージを溶出させ、上清を直ちに１５０μＬの１Ｍトリス−ＨＣｌ  ｐＨ９．１で中和した。最終的なライブラリーを取扱説明書に従って増幅した。
Ｄ．ＢＴＩＣ特異結合配列のバイオパニング
【０１２６】
ＢＴＩＣ特異ファージライブラリーをＵ８７Ｒライブラリーで説明したように生成した。今回は、Ｕ８７ＧＭ細胞、Ｕ２５１Ｎ細胞、およびヒト正常胎児星状細胞をバックグラウンドを補正するために用い、異なる患者からのＢＴＩＣ細胞株の混合物を選択のために用いた。細胞が接着していたら、ＥＤＴＡで放出させ、神経球のように育成した場合（例えば、ＢＴＩＣ）、小さい穴のピペットチップを用いたピペッティングを繰り返して１つ１つの細胞に分離した。特に定義しない限り、サブトラクティブバイオパニングと選択バイオパニングはＵ８７Ｒライブラリーについて説明したように行った。
Ｅ．全細胞ＥＬＩＳＡ
【０１２７】
１ｘ１０４試験細胞を２４ウェルディッシュのウェルの０．５ｍＬの培地中で平板培養し、通常の培養条件で平衡になるまで培養し、この培地をＨＥＰＥＳ緩衝培養培地に置き換えた。５ｘ１０９ｐｆｕファージをこのウェルに添加して、１時間室温で緩やかに振とうし、ＰＢＳで３回洗浄した。結合ファージを抗−Ｍ１３−ＨＲＰ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と、不溶性ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ）で検出した。
Ｆ．トランスウェルアッセイ
【０１２８】
８μｍ穴サイズのトランスウェルインサートの膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）を脳様マトリクス（７２０μＬの３ｍｇ／ｍＬ  コラーゲンＩ  （ＰｕｒｅＣｏｌ）；１８０μＬの１０ｘＤＭＥＭ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；９ｕＬの１ｍｇ／ｍＬヒトプラズマフィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ）；９ｕＬの１ｍｇ／ｍＬ硫酸今度路インデューサーチンプロテオグリカン  （Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）；１６μＬの０．１５ｍｇ／ｍＬ  ラミニン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））で両面をコートし、乾燥させて、容器上部で１００μＬの培地および容器下部で５００μＬの培地中で５ｘ１０４細胞を平板培養した。コラーゲンの包含はＨ１０の抑制効果をみるために必要である（図Ｓ４）。３ｘ１０１０ｐｆｕの試験ファージを通常の培養条件下で４時間インキュベーションした細胞を含む上部チャンバーに添加した。インキュベーションの最後に、この培地を吸引して、細胞を固定して、９５％エタノール中１％クリスタルバイオレットで１分間染色した。トランスウェルをＰＢＳですすいで、その後上部膜表面の細胞を綿棒で除去した。膜の表面下に転移した細胞を香華組み合わせ顕微鏡を用いてカウントして、５つの顕微鏡視野における細胞の合計を各膜について記録した。
Ｇ．共焦点顕微鏡検査
【０１２９】
接着細胞：１３ｍｍカバーガラスを中和された３ｍｇ／ｍＬコラーゲンＩ（ＰｕｒｅＣｏｌ）でコートして、乾燥させて、１ｘ１０４／ｍＬの細胞を０．５ｍＬ容量で平板培養して、正常培養条件下で２０分間平衡化させた。カバーガラスを３％のホルムアルデヒドを含むＰＢＳで１０分間固定して、洗浄して、その後２％ＢＳＡ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで１：１０００に希釈したビオチン化ペプチド（３ｍＭストック）または一次抗体中でインキュベーションした。ＰＢＳで洗浄した後、カバーガラスを洗浄して、ＤＡＫＯマウンティング培地でマウントする前に、二次抗体またはストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ５６８を１：２５０で希釈したものを適用した。
【０１３０】
懸濁神経半球：５０μＬの高密度に懸濁された神経半球をエッペンドルフチューブ中で懸濁した以外は、前述のように染色した。この染色された神経半球をカバーガラスの下にＤＡＫＯマウンティング培地を滴下してマウントした。
Ｈ．Ｉｎ  ｖｉｖｏファージホーミング  
【０１３１】
３ｘ１０４のＵ８７Ｔまたは１ｘ１０５のＵ８７Ｒ細胞をＳＣＩＤマウスの１つの脳半球に３μＬ注入して、４または６週間育成した。特定の分子染色のために、ラベルされていない一次抗体、ＦＩＴＣ−トランスフェリンまたはＡｌｅｘａ５５５−コレラトキシンＢサブユニット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２％ＢＳＡ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで１：１０００に希釈して、ビオチン化ペプチドの代わりに用いた。必要であれば、種特異蛍光ラベルされた二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１：５００に希釈した。用いた一次抗体は抗−ｐ７５  細胞内ドメインｐＡｂ  （Ｐｒｏｍｅｇａ），  抗−ｐ７５  細胞外ドメインｍＡｂクローンＭＥ２０．４  （Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ），  および抗−トランスフェリンレセプター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含んでいた。
Ｉ．スクロース／イオジキサノール勾配
【０１３２】
細胞を１ｍＬの０．２５Ｍスクロース、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０の中にそぎ落とし、細胞が顕微鏡で見えなくなるまでホモジナイズした。細片を８００ｘｇで５分遠心分離してペレット化し、０．２５Ｍスクロース、１４０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、６０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含むＯｐｔｉＰｒｅｐ  （Ｓｉｇｍａ，  ６０％イオジキサノール）の勾配により作られた、１０ｍＬの１０−４０％の連続グラジエントのはじめに負荷した。勾配をスイングバスケットロター内で流し、０．５ｍＬの分画を収集した。総タンパク質を−２０℃の２０ｍＭＤＴＴ、１５％ＴＣＡ、の２容量を加えて沈殿させ、−２０℃で一晩貯蔵し、４℃で２０分間遠心分離した。ペットを２０μＬの１Ｍトリスおよび２０μＬの２Ｘのレアミル緩衝液中に再懸濁した。全体の容量を１つのウェルに負荷させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析とウエスタントランスファーを行った。
Ｊ．Ｉｎ  ｖｉｖｏファージホーミング：
【０１３３】
３ｘ１０４のＵ８７Ｔ細胞、３ｘ１０５のＵ８７Ｒ細胞または５ｘ１０４ＢＴＩＣをＳＣＩＤマウスの１つの脳半球に３μＬ注入して、４、６、または１２週間それぞれ育成した。このマウスを麻酔して、頚動脈から脳へ５ｘ１０９ｐｆｕを注入する前に、１５分間２０％（ｗ／ｖ）の１５０μＬのマンニトールで処理した。１０分間ファージを循環させた後、右心房をクリップで閉じた後、左心室へ１５ｍＬのＰＢＳを注入して、循環システムから未結合ファージを洗浄除去した。脳を回収して、ドライアイス上で直ちに凍結して、ＯＣＴで切片を作るために包埋した。
Ｋ．免疫組織学
【０１３４】
連続切片を冷蔵アセトンで固定して、エタノール勾配を利用して脱水し、切片中の内生ペルオキシダーゼを０．０７５％Ｈ２Ｏ２／メタノールで失活させ、非特異結合をＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清でブロックした。この切片をブロック緩衝液中１：１００希釈したラビットポリクローナル抗−Ｍ１３−抗体（自家製）、または１：５０希釈したマウスモノクローナル抗−ヒト細胞核（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）  でインキュベーションした。ＰＢＳ洗浄に続いて、適当なビオチン化二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ．ｃｏｍ）  を適応した。アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体をＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮＥｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ｋｉｔ  （Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて形成して、ペルオキシダーゼにより茶色反応性生物になるＳＩＧＭＡＦＡＳＴ  ＤＡＢ  （３，３９−ジアミノベンンジジエンテトラヒドロクロリド）  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して検出した。トルイジンブルー（凍結切片のための）を核対比染色として用いた。切片はその後、連続的にエタノールキシレンで脱水して、エンテラン（Ｅｎｔｅｌｌａｎ）  （Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓでマウントした。
配列リスト
ＳＶＳＶＧＭＫＰＳＰＲＰ  （配列番号１）  （Ａ２）  
ＧＩＳＬＳＳＹＬＱＳＴＱ  （配列番号２）  （Ｍ３２）  
ＥＨＭＡＬＴＹＰＦＲＰＰ  （配列番号  ３）  （ＣＩ  ２）  
ＨＷＡＰＳＭＹＤＹＶＳＷ  （配列番号  ４）  （ＭＳ）  
ＲＴＶＰＤＹＴＡＨＶＲＴ  （配列番号  ５）  （Ｍ４３）  
ＳＧＨＱＬＬＬＮ  ＭＰＮ  （配列番号６）  （Ｍｌ  ９）  
ＴＮＳＩＷＹＴＡＰＹＭＦ  （配列番号７）  （Ｈ１０）  
ＧＭＳＬＳＲＱＭＬＷＳＬ  （配列番号８）  （Ｆ２）  
ＨＬＦＰＱＳＮＹＧＧＨＳ  （配列番号９）  （Ｍ２４）  
ＣＩＱＬＡＮＰＰＲＬＸＧ  （配列番号１０）  （Ｍ２３）  
ＰＳＰＨＲＱＲＱＨＩＬＲ  （配列番号１  １）  （７Ａ）  
ＱＴＩＲＩＩＩＲＲＳＲＴ  （配列番号１２）  （Ｉ  ＯＣ）  
ＳＬＨＭＲＨＫＲＫＰＲＲ  （配列番号１３）  （Ｅ１０）  
ＳＳＲＳＭＱＲＴＬＩＩＳ  （配列番号１４）  （３Ｆ）  
ＩＲＳＩＲＭＲＲＩＬＩＬ  （配列番号１５）  （Ｃ  Ｉ  ）  
ＫＴＳＭＲＰＬＩＬＩＨＩ  （配列番号１６）  （３Ｂ）  
ＫＫＧＴＮＳＩＷＹＴＡＰＹＭＦ  （配列番号１７）  （  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｈ１０）
ＴＦＦＹＧＧＳＲＧＫＲＮＮＦＫＴＥＥＹ  （配列番号１８）  （ＡｎｇｉｏＰｅｐ-２）
ＴＦＦＹＧＧＳＲＧＲＲＮＮＦＲＴＥＥＹ  （配列番号１９）  （ＡｎｇｉｏＰｅｐ-７）  
【図１ＡＢ】
2014516975.tif 000012
【図２ＡＢＣ】
2014516975.tif 000013
【図３ＡＢ】
2014516975.tif 000014
【図４ＡＢＣ】
2014516975.tif 000015
【図５】
2014516975.tif 000016
【図６ＡＢ】
2014516975.tif 000017
【図７】
2014516975.tif 000018
【図７Ｂ】
2014516975.tif 000019
【図７Ｃ】
2014516975.tif 000020
【図７Ｄ】
2014516975.tif 000021
【図８】
2014516975.tif 000022
【図９ＡＢ】
2014516975.tif 000023
【図１０ＡＢＣ】
2014516975.tif 000024
【図１１】
2014516975.tif 000025
【図１２Ａ】
2014516975.tif 000026
【図１２Ｂ】
2014516975.tif 000027
【図１２Ｃ】
2014516975.tif 000028
【図１３ＡＢ】
2014516975.tif 000029
【図１４ＡＢＣ】
2014516975.tif 000030
【図１５ＡＢ】
2014516975.tif 000031
【図１６ＡＢＣ】
2014516975.tif 000032
【図１７ＡＢ】
2014516975.tif 000033
【図１８Ａ】
2014516975.tif 000034
【図１８Ｂ】
2014516975.tif 000035
【図１８Ｃ】
2014516975.tif 000036
【図１８Ｄ】
2014516975.tif 000037
【図１９Ａ】
2014516975.tif 000038
【図１９Ｂ】
2014516975.tif 000039
【図１９Ｃ】
2014516975.tif 000040
【図１９Ｄ】
2014516975.tif 000041
【図２０】
2014516975.tif 000042
【図２１ＡＢＣ】
2014516975.tif 000043
【図２２ＡＢＣ】
2014516975.tif 000044
【図２３】
2014516975.tif 000045
【図２４ＡＢＣＤＥ】
2014516975.tif 000046
【配列表】
2014516975000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成26年5月12日(2014.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014516975000001.app
【国際調査報告】
2014516975.tif 000051
2014516975.tif 000052
2014516975.tif 000053