(57)【要約】ヒト対象において、体重減少または体脂肪の減少を誘発する方法、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）レベルを増加させる方法、および成長ホルモンの投薬頻度を減少させる方法における、成長ホルモンに結合される絨毛性ゴナドトロピンのアミノ末端カルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）および２つのカルボキシ末端絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰを含む、成長ホルモンタンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチドの使用が開示される。本発明の成長ホルモンおよび成長ホルモンをコードするポリヌクレオチドを含む薬学的組成物ならびにその使用方法も開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象において体重減少を誘発するか、または体脂肪を減少させる方法であって、
前記対象に、
成長ホルモンと、
前記成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、
前記成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰとを含む、治療有効量のポリペプチドを投与し、それによって前記対象において体重減少を誘発するか、または体脂肪を減少させることを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
少なくとも１つのＣＴＰの配列が、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列によってコードされることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、シグナルペプチドをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記シグナルペプチドの配列が、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つのＣＴＰが、グリコシル化されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのＣＴＰが、切り詰められていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つのＣＴＰが、リンカーを介して前記成長ホルモンに結合されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記リンカーが、ペプチド結合であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記成長ホルモンが、１週間に１回、または２週間に１回投与されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記成長ホルモンが、０．０５〜７．２ｍｇ／投与の用量で投与されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記成長ホルモンが、約２ｍｇ／投与の用量で投与されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記成長ホルモンが、約４ｍｇ／投与の用量で投与されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記成長ホルモンが、約１．２ｍｇ／投与の用量で投与されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記成長ホルモンが、前記対象に皮下投与されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト対象においてインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）レベルを増加させる方法であって、
前記対象に、
成長ホルモンと、
前記成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、
前記成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰとを含む、治療有効量のポリペプチドを投与し、それによって前記対象においてＩＧＦ−１レベルを増加させることを含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
少なくとも１つのＣＴＰの配列が、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列によってコードされることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、シグナルペプチドをさらに含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記シグナルペプチドが、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記成長ホルモンが、１週間に１回、または２週間に１回投与されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記成長ホルモンが、０．０５〜７．２ｍｇ／投与の用量で投与されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記成長ホルモンが、約２ｍｇ／投与の用量で投与されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記成長ホルモンが、約４ｍｇ／投与の用量で投与されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記成長ホルモンが、約１．２ｍｇ／投与の用量で投与されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記成長ホルモンが、前記対象に皮下投与されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
ヒト対象において成長ホルモンの投薬頻度を減少させる方法であって、
１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を前記成長ホルモンのアミノ末端に結合させ、かつ、２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰを前記成長ホルモンのカルボキシ末端に結合させるステップを含み、
それによって前記成長ホルモンの投薬頻度を減少させるようにしたことを特徴とする方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１つのＣＴＰの配列が、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列によってコードされることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
シグナルペプチドをＣＴＰの前記アミノ末端に結合するステップをさらに含むことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記シグナルペプチドが、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記成長ホルモンが、１週間に１回、または２週間に１回投与されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記成長ホルモンが、０．０５〜７．２ｍｇ／投与の用量で投与されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記成長ホルモンが、約２ｍｇ／投与の用量で投与されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記成長ホルモンが、約４ｍｇ／投与の用量で投与されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記成長ホルモンが、約１．２ｍｇ／投与の用量で投与されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記成長ホルモンが、前記対象に皮下投与されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
小児または青年であるヒト対象において、成長または体重増加を誘発する方法であって、
前記対象に、
成長ホルモンと、
前記成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、
前記成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰとを含む、治療有効量のポリペプチドを投与し、それによって前記対象において成長または体重増加を誘発することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
少なくとも１つのＣＴＰの配列が、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列によってコードされることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリペプチドが、シグナルペプチドをさらに含むことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記シグナルペプチドの配列が、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも１つのＣＴＰが、グリコシル化されていることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
少なくとも１つのＣＴＰが、切り詰められていることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも１つのＣＴＰが、リンカーを介して前記成長ホルモンに結合されていることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記リンカーが、ペプチド結合であることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記成長ホルモンが、１週間に１回、または２週間に１回投与されることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
前記成長ホルモンが、０．０５〜７．２ｍｇ／投与の用量で投与されることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
前記成長ホルモンが、約２ｍｇ／投与の用量で投与されることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
前記成長ホルモンが、約４ｍｇ／投与の用量で投与されることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４７】
前記成長ホルモンが、約１．２ｍｇ／投与の用量で投与されることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４８】
前記成長ホルモンが、前記対象に皮下投与されることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４９】
対象においてインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）レベルを正常な治療範囲内に維持する方法であって、
前記対象に、
成長ホルモンと、
前記成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、
前記成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰとを含む治療有効量のポリペプチドを投与し、それによって前記対象においてＩＧＦ−Ｉを正常な治療範囲内に維持することを含むことを特徴とする方法。
【請求項５０】
少なくとも１つのＣＴＰの配列が、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列によってコードされることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ポリペプチドが、シグナルペプチドをさらに含むことを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記シグナルペプチドが、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記成長ホルモンが、１週間に１回、または２週間に１回投与されることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記成長ホルモンが、０．０５〜７．２ｍｇ／投与の用量で投与されることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記成長ホルモンが、約２ｍｇ／投与の用量で投与されることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記成長ホルモンが、約４ｍｇ／投与の用量で投与されることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
前記成長ホルモンが、約１．２ｍｇ／投与の用量で投与されることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５８】
前記成長ホルモンが、前記対象に皮下投与されることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００６年２月３日に出願された米国仮出願第６０／７６４，７６１号の利益を主張する、２００７年２月１日に出願された米国特許出願第１１／７００，９１１号の継続である、２００９年３月１１日に出願された米国特許出願第１２／４０１，７４６号の一部継続出願である、２００９年６月２日に出願された米国特許出願第１２／４７６，９１６号の一部継続出願である、２００９年７月２４日に出願された米国特許出願第１２／５０９，１８８号の一部継続出願である、２０１１年８月２日に出願された米国出願第１３／１９５，９３１号に対して優先権を主張する。これらの出願の全ては、本明細書においてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
ヒト対象において、体重減少または体脂肪の減少を誘発する方法、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）レベルを増加させる方法、および成長ホルモンの投薬頻度を減少させる方法における、成長ホルモンに結合される絨毛性ゴナドトロピンのアミノ末端カルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）および２つのカルボキシ末端絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰを含む、成長ホルモンタンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチドの使用が開示される。本発明の成長ホルモンおよび成長ホルモンをコードするポリヌクレオチドを含む薬学的組成物ならびにその使用方法も開示される。
【背景技術】
【０００３】
ポリペプチドは、血液、肝臓、または腎臓における変性または酵素分解の影響を受けやすい。したがって、ポリペプチドは、典型的に、数時間の短い循環半減期を有する。ペプチド薬物は、その低い安定性のため、通常、活性ペプチドの有効な血漿濃度を維持するために、持続的頻度で送達される。さらに、ペプチド薬物は、通常、注入により投与されるため、ペプチド薬物の頻繁な注射は、対象にかなりの不快感をもたらす。よって、治療用ポリペプチドの半減期を延長し、一方でその高い薬理的有効性を維持する技術の必要性が存在する。そのような所望されるペプチド薬物は、向上された血清安定性、高い活性、および対象に注射されたときの望ましくない免疫応答を誘発する低い確率の要件も満たすべきである。
【０００４】
短い血清半減期等の好ましくない薬物動態は、さもなければ有望な多くの薬物候補の薬学的開発を阻止する可能性がある。血清半減期は分子の実験的特徴であり、それぞれの新しい薬物の可能性について実験的に決定されなければならない。例えば、低分子量のポリペプチド薬物では、腎臓濾過等の生理学的クリアランス機構が、必要とされる投薬レジメンの費用または頻度のため、薬物の治療レベルの維持を実行不可能にする可能性がある。逆に、薬物またはその代謝物が毒性の副作用を有する長い血清半減期は、望ましくない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一実施形態では、本発明は、ヒト対象において体重減少を誘発するか、または体脂肪を減少させる方法を提供し、対象に、成長ホルモンと、成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰとを含む、治療有効量のポリペプチドを投与し、それによって前記対象において体重減少を誘発するか、または体脂肪を減少させることを含む。
【０００６】
別の実施形態では、本発明は、ヒト対象においてインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）レベルを増加させる方法を提供し、対象に、成長ホルモンと、成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰとを含む、治療有効量のポリペプチドを投与し、それによって前記対象においてＩＧＦ−１レベルを増加させることを含む。
【０００７】
一実施形態では、本発明は、対象においてインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）レベルを正常な治療範囲内に維持する方法を提供し、本方法は、対象に、成長ホルモンと、前記成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰとを含む治療有効量のポリペプチドを投与し、それによって対象においてＩＧＦ−Ｉを正常な治療範囲内に維持することを含む。
【０００８】
別の実施形態では、本発明は、ヒト対象において成長ホルモンの投薬頻度を減少させる方法を提供し、１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を前記成長ホルモンのアミノ末端に、そして２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰを成長ホルモンのカルボキシ末端に結合し、それによって成長ホルモンの投薬頻度を減少させるステップを含む。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、ヒト対象において成長または体重増加を誘発する方法を提供し、小児または青年である前記対象に、成長ホルモンと、前記成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、前記成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰとを含む、治療有効量のポリペプチドを投与し、それによって前記対象において成長または体重増加を誘発することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ｈＧＨ（配列番号５）、ｈＧＨ−ＣＴＰ（配列番号９）、ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ（配列番号１０）、ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ（配列番号１１）、およびｔＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ（配列番号１２）の分子量および同一性を図示するウエスタンブロットである。ＰＡＧＥ  ＳＤＳゲルがブロットされ、モノクローナル抗ｈＧＨ抗体を用いて染色された。写真は、市販および野生型のｈＧＨと同様、ＣＴＰ修飾ｈＧＨ変異体が抗ｈＧＨ抗体によって認識されることを示す。
【図２】本発明のＧＨ−ＣＴＰポリペプチド（異なるＭＯＤ）の投与後の下垂体切除されたラットの体重増加を図示する棒グラフである。
【図３】（１）ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ  ｐＣＩ−ｄｈｆｒプラスミドのマップ、（２）ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰの構造タンパク質式の２つのスキームを含む。
【図４Ａ】ラット（用量／経路当たりｎ＝３〜６）におけるＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰまたはＧＨの単回静脈内または皮下用量後の平均血漿ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰまたはＧＨ濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示すグラフである。
【図４Ｂ】ラット（用量／経路当たりｎ＝３〜６）におけるＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰまたはＧＨの単回静脈内または皮下用量後の平均血漿ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰまたはＧＨ濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示すグラフである。
【図５】毎日のＧＨ注射（０．１ｍｇ／Ｋｇ／日）（用量当たりｎ＝１０）と比較した、下垂体切除されたラットにおけるＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ（０．４、０．８、および４ｍｇ／Ｋｇ）の単回皮下用量後の平均増分体重増加を示すグラフである。
【図６】ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰの単回注射後の曲線下面積がラットにおける体重増加と相関することを示すグラフである。
【図７】毎日のＧＨ注射（０．１ｍｇ／Ｋｇ／日）（用量当たりｎ＝１０）と比較した、下垂体切除されたラットにおける４日間毎のＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ（０．４、０．８、および４ｍｇ／Ｋｇ）の単回皮下用量後の増分体重増加を示すグラフである。
【図８】ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰおよび市販のｈＧＨの皮下注射後の下垂体切除されたラットにおけるｈＧＨ血清濃度を示すグラフである。ＰＫ／ＰＤプロファイルを決定するために、ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ０．６もしくは１．８ｍｇ／Ｋｇおよびバイオトロピン０．３５もしくは１．０５ｍｇ／Ｋｇの単回用量が下垂体切除されたラットに皮下注射された。注射後の血清ｈＧＨは、特定のＥＬＩＳＡキットを用いて測定された。
【図９】ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰおよび市販のｈＧＨの皮下注射後の下垂体切除されたラットにおけるＩＧＦ−１血清レベルを示すグラフである。ＰＫ／ＰＤプロファイルを決定するために、ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ０．６もしくは１．８ｍｇ／Ｋｇおよびバイオトロピン０．３５もしくは１．０５ｍｇ／Ｋｇの単回用量が下垂体切除されたラットに皮下注射された。注射後の血清ＩＧＦ−Ｉは、特定のＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて測定された。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一実施形態では、本発明は、持続型成長ホルモンおよびそれを生成し、使用する方法を提供する。別の実施形態では、持続型成長ホルモンは、カルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ、ＣＴＰ単位とも称される）を含む。別の実施形態では、持続型ポリペプチドは、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を含む。別の実施形態では、ＣＴＰは、関心の成長ホルモンまたはポリペプチドの分解に対する保護剤として作用する。別の実施形態では、ＣＴＰは、関心の成長ホルモンまたはポリペプチドのＣｍａｘを延長する。別の実施形態では、ＣＴＰは、関心の成長ホルモンまたはポリペプチドのＴｍａｘを延長する。別の実施形態では、ＣＴＰは、関心の成長ホルモンまたはポリペプチドの循環半減期を延長する。いくつかの実施形態では、ＣＴＰは、関心の成長ホルモンまたはポリペプチドの効力を向上する。
【００１２】
他の実施形態では、アミノ末端に結合される単一ＣＴＰと、タンデムでカルボキシ末端に結合される２つのＣＴＰペプチドとを含む本発明の関心の操作された成長ホルモンまたはポリペプチドは、生物学的活性に関して、関心の非ＣＴＰ修飾成長ホルモンまたはポリペプチドと少なくとも等しい。他の実施形態では、アミノ末端に結合される単一ＣＴＰと、タンデムでカルボキシ末端に結合される２つのＣＴＰペプチドとを含む本発明の関心の操作された成長ホルモンまたはポリペプチドは、薬物動態および薬力学等の薬理学的基準に関して、関心の非ＣＴＰ修飾成長ホルモンまたはポリペプチドと少なくとも等しい。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、成長ホルモンと、成長ホルモンのアミノ末端に結合される少なくとも１つのＣＴＰペプチドと、成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される少なくとも２つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとを含むポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドと、成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとを含むポリペプチドを提供する。
【００１４】
別の実施形態では、用語「ＣＴＰペプチド」、「カルボキシ末端ペプチド」、および「ＣＴＰ配列」は、本明細書において互換的に使用される。別の実施形態では、カルボキシ末端ペプチドは、完全長ＣＴＰである。別の実施形態では、カルボキシ末端ペプチドは、切り詰められたＣＴＰである。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００１５】
別の実施形態では、「シグナル配列」および「シグナルペプチド」は、本明細書において互換的に使用される。別の実施形態では、「配列」は、ポリヌクレオチドに関するとき、コードタンパク質を指し得る。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、成長ホルモン、成長ホルモンのアミノ末端に結合される単一の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド、および成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドからなるポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、成長ホルモン、成長ホルモンのアミノ末端に結合される単一の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド、成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド、および１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドのアミノ末端に結合されるシグナルペプチドからなるポリペプチドを提供する。
【００１７】
別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰを含む成長ホルモンは、ＣＴＰなしの同じ成長ホルモンと比較して、向上された生体内生物学的活性を有する。別の実施形態では、そのアミノ末端に結合される少なくとも１つのＣＴＰと、そのカルボキシ末端に結合される少なくとも２つのＣＴＰとを含む成長ホルモンは、ＣＴＰなしの同じ成長ホルモンと比較して、向上された生体内生物学的活性を有する。別の実施形態では、そのアミノ末端に結合される１つのＣＴＰと、そのカルボキシ末端に結合される２つのＣＴＰとを含む成長ホルモンは、ＣＴＰなしの同じ成長ホルモンと比較して、向上された生体内生物学的活性を有する。
【００１８】
別の実施形態では、対象はヒト対象である。別の実施形態では、対象はペットである。別の実施形態では、対象は哺乳類である。別の実施形態では、対象は農場動物である。別の実施形態では、対象はサルである。別の実施形態では、対象はウマである。別の実施形態では、対象はウシである。別の実施形態では、対象はマウスである。別の実施形態では、対象はラットである。一実施形態では、対象は男性である。別の実施形態では、対象は女性である。
【００１９】
別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰ−成長ホルモン−ＣＴＰ−ＣＴＰの構成は、ペプチド結合を介して少なくとも１つのＣＴＰ単位に接続される、成長ホルモンまたはその活性断片を含む。別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰ−成長ホルモン−ＣＴＰ−ＣＴＰは、ペプチド結合を介して追加のＣＴＰ単位に接続される少なくとも１つのＣＴＰ単位にペプチド結合を介して接続される、成長ホルモンまたはその活性断片を含む。別の実施形態では、成長ホルモン、その断片、ならびにＣＴＰ単位および／またはその断片を含む、本明細書に記載されるポリペプチドは、ペプチド結合を介して相互接続される。別の実施形態では、１つの核酸分子は、成長ホルモンおよび／またはその断片ならびにＣＴＰ単位および／またはその断片を含む、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする。
【００２０】
別の実施形態では、カルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）は、リンカーを介して成長ホルモンに結合する。別の実施形態では、ＣＴＰ配列を成長ホルモンに接続するリンカーは、共有結合である。別の実施形態では、ＣＴＰ配列を成長ホルモンに接続するリンカーは、ペプチド結合である。別の実施形態では、ＣＴＰ配列を成長ホルモンに接続するリンカーは、置換ペプチド結合である。別の実施形態では、カルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）配列は、配列番号１および配列番号２に示される配列から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２１】
別の実施形態では、配列番号１は、次のアミノ酸（ＡＡ）配列：ＤＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＱ（配列番号１）を含む。別の実施形態では、配列番号２は、次のアミノ酸（ＡＡ）配列：ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号２）を含む。
【００２２】
別の実施形態では、カルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）配列は切り詰められている。別の実施形態では、切り詰められたＣＴＰは、次のアミノ酸配列：ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰ（配列番号４）を含む。
【００２３】
別の実施形態では、本発明のカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）ペプチドは、未変性ヒト絨毛性ゴナドトロピンペプチドのアミノ酸１１２から位置１４５までのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本発明のＣＴＰ配列は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンペプチドのアミノ酸１１８から位置１４５までのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＴＰ配列はまた、位置１１２〜１１８の間のいずれの位置から始まり、ヒト絨毛性ゴナドトロピンペプチドの位置１４５で終結する。いくつかの実施形態では、ＣＴＰ配列ペプチドは、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、または３４個のアミノ酸の長さであり、遺伝子バンク寄託ＣＴＰアミノ酸配列の位置１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、または１１８で始まる。
【００２４】
別の実施形態では、ＣＴＰペプチドは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第  号に記載される、ＣＴＰペプチドである。別の実施形態では、ＣＴＰペプチドは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，７１２，１２２号に記載される１〜５の保存アミノ酸置換だけ未変性ＣＴＰとは異なる絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰの変異体である。別の実施形態では、ＣＴＰペプチドは、１つの保存アミノ酸置換だけ未変性ＣＴＰとは異なる絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰの変異体である。別の実施形態では、ＣＴＰペプチドは、２つの保存アミノ酸置換だけ未変性ＣＴＰとは異なる絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰの変異体である。別の実施形態では、ＣＴＰペプチドは、３つの保存アミノ酸置換だけ未変性ＣＴＰとは異なる絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰの変異体である。別の実施形態では、ＣＴＰペプチドは、４つの保存アミノ酸置換だけ未変性ＣＴＰとは異なる絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰの変異体である。別の実施形態では、ＣＴＰペプチドは、５つの保存アミノ酸置換だけ未変性ＣＴＰとは異なる絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰの変異体である。別の実施形態では、本発明のＣＴＰペプチドアミノ酸配列は、未変性ＣＴＰアミノ酸配列またはそのペプチドと少なくとも７０％相同である。別の実施形態では、本発明のＣＴＰペプチドアミノ酸配列は、未変性ＣＴＰアミノ酸配列またはそのペプチドと少なくとも８０％相同である。別の実施形態では、本発明のＣＴＰペプチドアミノ酸配列は、未変性ＣＴＰアミノ酸配列またはそのペプチドと少なくとも９０％相同である。別の実施形態では、本発明のＣＴＰペプチドアミノ酸配列は、未変性ＣＴＰアミノ酸配列またはそのペプチドと少なくとも９５％相同である。
【００２５】
別の実施形態では、本発明のＣＴＰペプチドＤＮＡ配列は、未変性ヒトＣＴＰ  ＤＮＡ配列またはそのペプチドと少なくとも７０％相同である。別の実施形態では、本発明のＣＴＰペプチドＤＮＡ配列は、未変性ヒトＣＴＰ  ＤＮＡ配列またはそのペプチドと少なくとも８０％相同である。別の実施形態では、本発明のＣＴＰペプチドＤＮＡ配列は、未変性ＣＴＰ  ＤＮＡ配列またはそのペプチドと少なくとも９０％相同である。別の実施形態では、本発明のＣＴＰペプチドＤＮＡ配列は、未変性ＣＴＰ  ＤＮＡ配列またはそのペプチドと少なくとも９５％相同である。
【００２６】
一実施形態では、切り詰められたＣＴＰは、配列番号４の最初の１１個のアミノ酸を含む。一実施形態では、切り詰められたＣＴＰは、配列番号４の最初の８個のアミノ酸を含む。一実施形態では、切り詰められたＣＴＰは、配列番号４の最初の１３個のアミノ酸を含む。一実施形態では、切り詰められたＣＴＰは、配列番号４の最初の６個のアミノ酸を含む。一実施形態では、切り詰められたＣＴＰは、配列番号４の最初の５個のアミノ酸を含む。
【００２７】
一実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列のうちの少なくとも１つがグリコシル化される。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列の両方がグリコシル化される。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列のうちの２つがグリコシル化される。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列のうちの２つ以上がグリコシル化される。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列の全てがグリコシル化される。一実施形態では、本発明のＣＴＰ配列は、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む。一実施形態では、本発明のＣＴＰ配列は、２つのグリコシル化部位を含む。一実施形態では、本発明のＣＴＰ配列は、３つのグリコシル化部位を含む。一実施形態では、本発明のＣＴＰ配列は、４つのグリコシル化部位を含む。
【００２８】
別の実施形態では、少なくとも１つのカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）配列は、配列番号１および配列番号２に示される配列から選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、少なくとも１つのカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）は切り詰められている。
【００２９】
一実施形態では、本明細書において提供されるタンパク質もしくはペプチドまたはそれらの断片のカルボキシまたはアミノ端部に関するとき、用語「終端（ｔｅｒｍｉｎｉ）」、「末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ）」、「末端端部（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ）」、および「末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」は、本明細書において互換的に使用される。別の実施形態では、用語「Ｃ末端」、「カルボキシ末端」、または「カルボキシル末端」は、本明細書において互換的に使用される。別の実施形態では、用語「Ｎ末端」および「アミノ末端」は、本明細書において互換的に使用される。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００３０】
別の実施形態では、成長ホルモンのアミノ末端端部および成長ホルモンのカルボキシ末端端部の両方のＣＴＰ配列は、成長ホルモンの分解に対して向上された保護を提供する。別の実施形態では、成長ホルモンのアミノ末端端部の少なくとも１つのＣＴＰ配列および成長ホルモンのカルボキシ末端端部の２つのＣＴＰ単位は、クリアランスに対して向上された保護を提供する。別の実施形態では、成長ホルモンのアミノ末端端部の少なくとも１つのＣＴＰ配列および成長ホルモンのカルボキシ末端端部の２つのＣＴＰ単位は、延長されたクリアランス時間を提供する。別の実施形態では、成長ホルモンのアミノ末端端部の少なくとも１つのＣＴＰ配列および成長ホルモンのカルボキシ末端端部の２つのＣＴＰ単位は、成長ホルモンのＣｍａｘを向上する。別の実施形態では、成長ホルモンのアミノ末端端部の少なくとも１つのＣＴＰ配列および成長ホルモンのカルボキシ末端端部の２つのＣＴＰ単位は、成長ホルモンのＴｍａｘを向上する。別の実施形態では、成長ホルモンのアミノ末端端部の少なくとも１つのＣＴＰ配列および成長ホルモンのカルボキシ末端端部の２つのＣＴＰ単位は、成長ホルモンのＴ１／２（半減期）を向上した。
【００３１】
別の実施形態では、成長ホルモンのアミノ末端端部および成長ホルモンのカルボキシ末端端部の両方のＣＴＰ配列は、修飾された成長ホルモンの半減期を延長する。別の実施形態では、成長ホルモンのアミノ末端端部の少なくとも単一のＣＴＰ配列および成長ホルモンのカルボキシ末端端部の少なくとも２つのＣＴＰ配列は、修飾された成長ホルモンに延長された半減期を提供する。別の実施形態では、成長ホルモンのアミノ末端端部の単一のＣＴＰ配列および成長ホルモンのカルボキシ末端端部の２つのＣＴＰ配列は、結合された成長ホルモンに延長された半減期を提供する。別の実施形態では、成長ホルモンのアミノ末端端部の単一のＣＴＰ配列および成長ホルモンのカルボキシ末端端部のタンデムの２つのＣＴＰ配列は、修飾された成長ホルモンに延長された半減期を提供する。
【００３２】
別の実施形態では、ポリペプチドのアミノ末端端部のＣＴＰ配列、成長ホルモンのカルボキシ末端端部のＣＴＰ配列、およびカルボキシ末端でＣＴＰ配列にタンデムで結合される少なくとも１つの追加のＣＴＰ配列は、分解に対して成長ホルモンに向上された保護を提供する。いくつかの実施形態では、成長ホルモンのアミノ末端端部のＣＴＰ配列、成長ホルモンのカルボキシ末端端部のＣＴＰ配列、およびカルボキシ末端でＣＴＰ配列にタンデムで結合される少なくとも１つの追加のＣＴＰ配列は、成長ホルモンの半減期を延長する。いくつかの実施形態では、成長ホルモンのアミノ末端端部のＣＴＰ配列、成長ホルモンのカルボキシ末端端部のＣＴＰ配列、およびカルボキシ末端でＣＴＰ配列にタンデムで結合される少なくとも１つの追加のＣＴＰ配列は、成長ホルモンの生物学的活性を向上する。
【００３３】
別の実施形態では、成長ホルモンは、シグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、内因性シグナル配列を含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、いずれの既知の成長ホルモンまたは複数の成長ホルモンの内因性シグナル配列を含むが、これに限定されない。別の実施形態では、本発明のポリペプチドおよび方法は、次のアミノ酸配列：ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡ（配列番号３）を含むシグナルペプチドをさらに有する成長ホルモンを提供する。
【００３４】
別の実施形態では、本発明の抱合成長ホルモンは、未修飾成長ホルモンと同じ様式で使用される。別の実施形態では、本発明の抱合成長ホルモンは、増加した循環半減期および血漿滞留時間、減少したクリアランス、ならびに増加した臨床生体内活性を有する。別の実施形態では、本明細書に記載される抱合成長ホルモンの改善された性質により、これらの抱合体は、未修飾成長ホルモンより少ない頻度で投与される。別の実施形態では、本明細書に記載される抱合成長ホルモンは、１週間に１回〜２週間に１回投与される。別の実施形態では、本明細書に記載される抱合成長ホルモンは、２週間に１回〜３週間に１回投与される。別の実施形態では、本明細書に記載される抱合成長ホルモンは、１日１回〜１週間に３回投与される。別の実施形態では、投与頻度の減少は、改善された治療効果ならびに改善された患者の生活の質をもたらす改善された患者のコンプライアンスをもたらす。別の実施形態では、ポリ（エチレングリコール）に連結された成長ホルモンの従来の抱合体と比較して、本発明の抱合体の分子量およびリンカー構造を有する成長ホルモンＣＴＰ抱合体は、改善された効力、改善された安定性、上昇したＡＵＣレベル、向上された循環半減期を有することが分かった。別の実施形態では、ポリ（エチレングリコール）に連結された成長ホルモンの従来の抱合体と比較して、本発明の抱合体の分子量およびリンカー構造を有する成長ホルモンは、改善された効力、改善された安定性、上昇したＡＵＣレベル、向上された循環半減期を有することが分かった。別の実施形態では、治療有効量の抱合成長ホルモンは、生体内で測定可能な予想される生物学的活性に必要な抱合体の量である。別の実施形態では、本発明の教示により利用される成長ホルモンは、増加した効力を示す。別の実施形態では、ＣＴＰ配列の、成長ホルモンのアミノおよびカルボキシの両方の末端への結合は、生体内活性の延長をもたらす。
【００３５】
別の実施形態では、抱合成長ホルモンの治療有効量は、治療される状態の正確な種類、治療される患者の状態、ならびに組成物中の他の成分のような因子により決定される。別の実施形態では、抱合成長ホルモンの治療有効量は、１週間に１回、投与される体重１ｋｇ当たり０．０１〜１０μｇである。別の実施形態では、抱合成長ホルモンの治療有効量は、１週間に１回、投与される体重１ｋｇ当たり０．１〜１μｇである。別の実施形態では、抱合成長ホルモンを含む薬学的組成物は、様々な手段でヒト患者に投与するのに有効な強度で製剤化される。
【００３６】
別の実施形態では、成長ホルモンは、当業者に既知の任意の成長ホルモンである。別の実施形態では、成長ホルモンはヒト成長ホルモンである。別の実施形態では、成長ホルモンのヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列は、遺伝子バンクデータベースにおいて入手可能である。別の実施形態では、成長ホルモンはホモログである。別の実施形態では、ホモログは、そのアミノ酸置換およびその生物学的に活性なポリペプチド断片を含む、欠失、挿入、または置換変異体も指す。
【００３７】
別の実施形態では、成長ホルモンは、ｈＧＨ欠損エクソン２、３、４の変異体、またはそのいずれの組み合わせである。別の実施形態では、成長ホルモンは、シグナルペプチドを含む。別の実施形態では、成長ホルモンは、シグナル切断部位を含む。別の実施形態では、本発明のＣＴＰによって修飾されたＧＨを含むポリペプチドは、組換えＧＨを含む。
【００３８】
別の実施形態では、本明細書に記載される成長ホルモンは、成長ホルモン（ＧＨ）様サイトカインのスーパーファミリーのメンバーである。別の実施形態では、本明細書に記載される成長ホルモンは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）である。別の実施形態では、ヒト成長ホルモンは、次のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ０１２４１）：ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣＧＦ（配列番号５）を含む。別の実施形態では、ヒト成長ホルモンは、次のアミノ酸配列：ＭＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣＧＦ（配列番号６）を含む。別の実施形態では、ヒト成長ホルモンは、次のアミノ酸配列：ＭＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡ（配列番号７）を含む。別の実施形態では、ｈＧＨは、次のアミノ酸配列：ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＶＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣＧＦ（配列番号８）を含む。別の実施形態では、ｈＧＨは、ｈＧＨの位置６５のグルタミンがバリンで置換される置換変異体である。
【００３９】
別の実施形態では、本発明の成長ホルモンは、受託番号ＡＡＡ７２２６０の遺伝子バンクアミノ酸寄託配列を含む。別の実施形態では、本発明の成長ホルモンは、受託番号ＡＡＫ６９７０８の遺伝子バンクアミノ酸寄託配列を含む。別の実施形態では、本発明の成長ホルモンは、受託番号ＣＡＡ０１４３５の遺伝子バンクアミノ酸寄託配列を含む。別の実施形態では、本発明の成長ホルモンは、受託番号ＣＡＡ０１３２９の遺伝子バンクアミノ酸寄託配列を含む。別の実施形態では、本発明の成長ホルモンは、受託番号ＣＡＡ００３８０の遺伝子バンクアミノ酸寄託配列を含む。別の実施形態では、本発明の成長ホルモンは、受託番号ＡＡＡ７２５５５の遺伝子バンクアミノ酸寄託配列を含む。別の実施形態では、本発明の成長ホルモンは、受託番号ＮＰ＿０００５０６．２の遺伝子バンクアミノ酸寄託配列を含む。別の実施形態では、本発明の成長ホルモンは、受託番号ＮＰ＿０７２０５３．１の遺伝子バンクアミノ酸寄託配列を含む。別の実施形態では、本発明の成長ホルモンは、受託番号ＮＰ＿０７２０５４．１の遺伝子バンクアミノ酸寄託配列を含む。別の実施形態では、本発明の成長ホルモンは、受託番号ＮＰ＿０７２０５５．１の遺伝子バンクアミノ酸寄託配列を含む。別の実施形態では、本発明の成長ホルモンは、受託番号ＮＰ＿０７２０５６．１の遺伝子バンクアミノ酸寄託配列を含む。
【００４０】
別の実施形態では、本明細書に記載される成長ホルモンをコードする核酸分子は、当業者に既知の成長ホルモンの任意のアミノ酸配列をコードする。別の実施形態では、本明細書に記載される成長ホルモンをコードする核酸分子は、ｈＧＨをコードする。別の実施形態では、成長ホルモンをコードする核酸分子は、受託番号ＮＭ＿０００５１５．３の遺伝子バンク核酸寄託配列を含む。別の実施形態では、成長ホルモンをコードする核酸分子は、受託番号ＮＭ＿０２２５５９．２の遺伝子バンク核酸寄託配列を含む。別の実施形態では、成長ホルモンをコードする核酸分子は、受託番号ＮＭ＿０２２５６０．２の遺伝子バンク核酸寄託配列を含む。別の実施形態では、成長ホルモンをコードする核酸分子は、受託番号ＮＭ＿０２２５６１．２の遺伝子バンク核酸寄託配列を含む。別の実施形態では、成長ホルモンをコードする核酸分子は、受託番号ＮＭ＿０２２５６２．２の遺伝子バンク核酸寄託配列を含む。
【００４１】
別の実施形態では、本発明の成長ホルモンを含むポリペプチドは、成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される１つのＣＴＰ（ｈＧＨ−ＣＴＰ）を含み、次のアミノ酸配列：ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣＧＦＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号９）を有する。
【００４２】
別の実施形態では、本発明の成長ホルモンを含むポリペプチドは、成長ホルモンのカルボキシ末端に結合されるタンデムの２つのＣＴＰ（ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ）を含み、次のアミノ酸配列：ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣＧＦＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１０）を有する。
【００４３】
別の実施形態では、本発明の成長ホルモンを含むポリペプチドは、成長ホルモンのカルボキシ末端にタンデムに結合される２つのＣＴＰと、成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つのＣＴＰ（ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ）とを含み、次のアミノ酸配列：ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣＧＦＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１１）を有する。
【００４４】
別の実施形態では、本発明の成長ホルモンを含むポリペプチドは、成長ホルモンのカルボキシ末端に結合されるタンデムの２つのＣＴＰを含み、２つのＣＴＰのうちの１つのＣＴＰが切り詰められ、１つの追加のＣＴＰは成長ホルモンのアミノ末端に結合され（ｔＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ）、次のアミノ酸配列：ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣＧＦＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１２）を有する。
【００４５】
別の実施形態では、本発明の成長ホルモンを含むポリペプチドは、成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される１つのＣＴＰと、成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つのＣＴＰ（ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ）とを含み、次のアミノ酸配列：ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣＧＦＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１３）を有する。
【００４６】
別の実施形態では、成長ホルモンと、１つのＣＴＰとを含むポリペプチドは、次のアミノ酸配列：ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣＧＦ（配列番号１４）を含む。
【００４７】
別の実施形態では、ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、次の核酸配列：ｔｃｔａｇａｇｇａｃａｔｇｇｃｃａｃｃｇｇｃａｇｃａｇｇａｃｃａｇｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇｇｃｃｔｔｃｇｇｃｃｔｇｃｔｇｔｇｃｃｔｇｃｃａｔｇｇｃｔｇｃａｇｇａｇｇｇｃａｇｃｇｃｃａｇｃｔｃｔｔｃｔｔｃｔａａｇｇｃｔｃｃａｃｃｃｃｃａｔｃｔｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃｃａｇｃａｇａｃｔｇｃｃｇｇｇｃｃｃｃａｇｃｇａｃａｃａｃｃｃａｔｔｃｔｇｃｃｃｃａｇｔｔｃｃｃｃａｃｃａｔｃｃｃｃｃｔｇａｇｃａｇｇｃｔｇｔｔｃｇａｃａａｃｇｃｃａｔｇｃｔｇａｇｇｇｃｔｃａｃａｇｇｃｔｇｃａｃｃａｇｃｔｇｇｃｃｔｔｔｇａｃａｃｃｔａｃｃａｇｇａｇｔｔｃｇａｇｇａａｇｃｃｔａｃａｔｃｃｃｃａａｇｇａｇｃａｇａａｇｔａｃａｇｃｔｔｃｃｔｇｃａｇａａｃｃｃｃｃａｇａｃｃｔｃｃｃｔｇｔｇｃｔｔｃａｇｃｇａｇａｇｃａｔｃｃｃｃａｃｃｃｃｃａｇｃａａｃａｇａｇａｇｇａｇａｃｃｃａｇｃａｇａａｇａｇｃａａｃｃｔｇｇａｇｃｔｇｃｔｇａｇｇａｔｃｔｃｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇａｔｃｃａｇａｇｃｔｇｇｃｔｇｇａｇｃｃｃｇｔｇｃａｇｔｔｃｃｔｇａｇａａｇｃｇｔｇｔｔｃｇｃｃａａｃａｇｃｃｔｇｇｔｇｔａｃｇｇｃｇｃｃａｇｃｇａｃａｇｃａａｃｇｔｇｔａｃｇａｃｃｔｇｃｔｇａａｇｇａｃｃｔｇｇａｇｇａｇｇｇｃａｔｃｃａｇａｃｃｃｔｇａｔｇｇｇｃｃｇｇｃｔｇｇａｇｇａｃｇｇｃａｇｃｃｃｃａｇｇａｃｃｇｇｃｃａｇａｔｃｔｔｃａａｇｃａｇａｃｃｔａｃａｇｃａａｇｔｔｃｇａｃａｃｃａａｃａｇｃｃａｃａａｃｇａｃｇａｃｇｃｃｃｔｇｃｔｇａａｇａａｃｔａｃｇｇｇｃｔｇｃｔｇｔａｃｔｇｃｔｔｃａｇａａａｇｇａｃａｔｇｇａｃａａｇｇｔｇｇａｇａｃｃｔｔｃｃｔｇａｇｇａｔｃｇｔｇｃａｇｔｇｃａｇａａｇｃｇｔｇｇａｇｇｇｃａｇｃｔｇｃｇｇｃｔｔｃａｇｃｔｃｃａｇｃａｇｃａａｇｇｃｃｃｃｔｃｃｃｃｃｇａｇｃｃｔｇｃｃｃｔｃｃｃｃａａｇｃａｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｇｃｃｃｔｃｃｇａｃａｃａｃｃａａｔｃｃｔｇｃｃｔｃａｇｔｇａｔｇａａｇｇｔｃｔｇｇａｔｇｃｇｇｃｃｇｃ（配列番号１５）を含む。
【００４８】
別の実施形態では、ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、次の核酸配列：ｔｃｔａｇａｇｇａｃａｔｇｇｃｃａｃｃｇｇｃａｇｃａｇｇａｃｃａｇｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇｇｃｃｔｔｃｇｇｃｃｔｇｃｔｇｔｇｃｃｔｇｃｃａｔｇｇｃｔｇｃａｇｇａｇｇｇｃａｇｃｇｃｃａｇｃｔｃｔｔｃｔｔｃｔａａｇｇｃｔｃｃａｃｃｃｃｃａｔｃｔｃｔｇｃｃｃａｇｃｃｃｃａｇｃａｇａｃｔｇｃｃｇｇｇｃｃｃｃａｇｃｇａｃａｃａｃｃｃａｔｔｃｔｇｃｃｃｃａｇｔｔｃｃｃｃａｃｃａｔｃｃｃｃｃｔｇａｇｃａｇｇｃｔｇｔｔｃｇａｃａａｃｇｃｃａｔｇｃｔｇａｇｇｇｃｔｃａｃａｇｇｃｔｇｃａｃｃａｇｃｔｇｇｃｃｔｔｔｇａｃａｃｃｔａｃｃａｇｇａｇｔｔｃｇａｇｇａａｇｃｃｔａｃａｔｃｃｃｃａａｇｇａｇｃａｇａａｇｔａｃａｇｃｔｔｃｃｔｇｃａｇａａｃｃｃｃｃａｇａｃｃｔｃｃｃｔｇｔｇｃｔｔｃａｇｃｇａｇａｇｃａｔｃｃｃｃａｃｃｃｃｃａｇｃａａｃａｇａｇａｇｇａｇａｃｃｃａｇｃａｇａａｇａｇｃａａｃｃｔｇｇａｇｃｔｇｃｔｇａｇｇａｔｃｔｃｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇａｔｃｃａｇａｇｃｔｇｇｃｔｇｇａｇｃｃｃｇｔｇｃａｇｔｔｃｃｔｇａｇａａｇｃｇｔｇｔｔｃｇｃｃａａｃａｇｃｃｔｇｇｔｇｔａｃｇｇｃｇｃｃａｇｃｇａｃａｇｃａａｃｇｔｇｔａｃｇａｃｃｔｇｃｔｇａａｇｇａｃｃｔｇｇａｇｇａｇｇｇｃａｔｃｃａｇａｃｃｃｔｇａｔｇｇｇｃｃｇｇｃｔｇｇａｇｇａｃｇｇｃａｇｃｃｃｃａｇｇａｃｃｇｇｃｃａｇａｔｃｔｔｃａａｇｃａｇａｃｃｔａｃａｇｃａａｇｔｔｃｇａｃａｃｃａａｃａｇｃｃａｃａａｃｇａｃｇａｃｇｃｃｃｔｇｃｔｇａａｇａａｃｔａｃｇｇｇｃｔｇｃｔｇｔａｃｔｇｃｔｔｃａｇａａａｇｇａｃａｔｇｇａｃａａｇｇｔｇｇａｇａｃｃｔｔｃｃｔｇａｇｇａｔｃｇｔｇｃａｇｔｇｃａｇａａｇｃｇｔｇｇａｇｇｇｃａｇｃｔｇｃｇｇｃｔｔｃａｇｃｔｃｃａｇｃａｇｃａａｇｇｃｃｃｃｔｃｃｃｃｃｇａｇｃｃｔｇｃｃｃｔｃｃｃｃａａｇｃａｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｇｃｃｃｔｃｃｇａｃａｃａｃｃａａｔｃｃｔｇｃｃａｃａｇａｇｃａｇｃｔｃｃｔｃｔａａｇｇｃｃｃｃｔｃｃｔｃｃａｔｃｃｃｔｇｃｃａｔｃｃｃｃｃｔｃｃｃｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｃｃｃｃｔｃｔｇａｃａｃｃｃｃｔａｔｃｃｔｇｃｃｔｃａｇｔｇａｔｇａａｇｇｔｃｔｇｇａｔｇｃｇｇｃｃｇｃ（配列番号１６）を含む。
【００４９】
別の実施形態では、ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、次の核酸配列：ｔｃｔａｇａｇｇａｃａｔｇｇｃｃａｃｃｇｇｃａｇｃａｇｇａｃｃａｇｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇｇｃｃｔｔｃｇｇｃｃｔｇｃｔｇｔｇｃｃｔｇｃｃａｔｇｇｃｔｇｃａｇｇａｇｇｇｃａｇｃｇｃｃａｇｃｔｃｔｔｃｔｔｃｔａａｇｇｃｔｃｃａｃｃｃｃｃｇａｇｃｃｔｇｃｃｃｔｔｃｃｃｃａｃｃａｔｃｃｃｃｃｔｇａｇｃａｇｇｃｔｇｔｔｃｇａｃａａｃｇｃｃａｔｇｃｔｇａｇｇｇｃｔｃａｃａｇｇｃｔｇｃａｃｃａｇｃｔｇｇｃｃｔｔｔｇａｃａｃｃｔａｃｃａｇｇａｇｔｔｃｇａｇｇａａｇｃｃｔａｃａｔｃｃｃｃａａｇｇａｇｃａｇａａｇｔａｃａｇｃｔｔｃｃｔｇｃａｇａａｃｃｃｃｃａｇａｃｃｔｃｃｃｔｇｔｇｃｔｔｃａｇｃｇａｇａｇｃａｔｃｃｃｃａｃｃｃｃｃａｇｃａａｃａｇａｇａｇｇａｇａｃｃｃａｇｃａｇａａｇａｇｃａａｃｃｔｇｇａｇｃｔｇｃｔｇａｇｇａｔｃｔｃｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇａｔｃｃａｇａｇｃｔｇｇｃｔｇｇａｇｃｃｃｇｔｇｃａｇｔｔｃｃｔｇａｇａａｇｃｇｔｇｔｔｃｇｃｃａａｃａｇｃｃｔｇｇｔｇｔａｃｇｇｃｇｃｃａｇｃｇａｃａｇｃａａｃｇｔｇｔａｃｇａｃｃｔｇｃｔｇａａｇｇａｃｃｔｇｇａｇｇａｇｇｇｃａｔｃｃａｇａｃｃｃｔｇａｔｇｇｇｃｃｇｇｃｔｇｇａｇｇａｃｇｇｃａｇｃｃｃｃａｇｇａｃｃｇｇｃｃａｇａｔｃｔｔｃａａｇｃａｇａｃｃｔａｃａｇｃａａｇｔｔｃｇａｃａｃｃａａｃａｇｃｃａｃａａｃｇａｃｇａｃｇｃｃｃｔｇｃｔｇａａｇａａｃｔａｃｇｇｇｃｔｇｃｔｇｔａｃｔｇｃｔｔｃａｇａａａｇｇａｃａｔｇｇａｃａａｇｇｔｇｇａｇａｃｃｔｔｃｃｔｇａｇｇａｔｃｇｔｇｃａｇｔｇｃａｇａａｇｃｇｔｇｇａｇｇｇｃａｇｃｔｇｃｇｇｃｔｔｃａｇｃｔｃｃａｇｃａｇｃａａｇｇｃｃｃｃｔｃｃｃｃｃｇａｇｃｃｔｇｃｃｃｔｃｃｃｃａａｇｃａｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｇｃｃｃｔｃｃｇａｃａｃａｃｃａａｔｃｃｔｇｃｃａｃａｇａｇｃａｇｃｔｃｃｔｃｔａａｇｇｃｃｃｃｔｃｃｔｃｃａｔｃｃｃｔｇｃｃａｔｃｃｃｃｃｔｃｃｃｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｃｃｃｃｔｃｔｇａｃａｃｃｃｃｔａｔｃｃｔｇｃｃｔｃａｇｔｇａｔｇａａｇｇｔｃｔｇｇａｔｇｃｇｇｃｃｇｃ（配列番号１７）を含む。
【００５０】
別の実施形態では、本発明の成長ホルモンは、成長ホルモンの既知の配列と相同である。別の実施形態では、本発明の成長ホルモンは、本明細書に開示される成長ホルモン配列と相同である。いくつかの実施形態では、本発明による相同性は、そのアミノ酸置換およびその生物学的に活性なポリペプチド断片を含む、欠失、挿入、または置換変異体も包含する。一実施形態では、置換変異体は１つであり、ｈＧＨの位置６５のグルタミンがバリンで置換される［Ｇｅｌｌｅｒｆｏｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｎａｌ  １９８９，７：１７３−８３］。
【００５１】
一実施形態では、「ヒト成長ホルモン」（ｈＧＨ）とは、ｈＧＨ活性（すなわち、成長の刺激）を示す、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ０１２４１に示されるようなポリペプチドを指す。
【００５２】
一実施形態では、「ヒト成長ホルモン」（ｈＧＨ）とは、ｈＧＨ活性（すなわち、成長の刺激）を示す、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ０１２４１に示されるようなポリペプチドを指す。一実施形態では、本発明のｈＧＨは、ホモログも指す。一実施形態では、本発明のｈＧＨアミノ酸配列は、デフォルトパラメータを用いる、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを使用して決定される、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１２４１に示されるｈＧＨ配列に少なくとも５０％相同である。一実施形態では、本発明のｈＧＨアミノ酸配列は、デフォルトパラメータを用いる、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを使用して決定される、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１２４１に示されるｈＧＨ配列に少なくとも６０％相同である。一実施形態では、本発明のｈＧＨアミノ酸配列は、デフォルトパラメータを用いる、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを使用して決定される、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１２４１に示されるｈＧＨ配列に少なくとも７０％相同である。一実施形態では、本発明のｈＧＨアミノ酸配列は、デフォルトパラメータを用いる、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを使用して決定される、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１２４１に示されるｈＧＨ配列に少なくとも８０％相同である。一実施形態では、本発明のｈＧＨアミノ酸配列は、デフォルトパラメータを用いる、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを使用して決定される、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１２４１に示されるｈＧＨ配列に少なくとも９０％相同である。一実施形態では、本発明のｈＧＨアミノ酸配列は、デフォルトパラメータを用いる、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを使用して決定される、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１２４１に示されるｈＧＨ配列に少なくとも９５％相同である。
【００５３】
別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、脂肪細胞に結合し、それらを刺激して、トリグリセリドを分解し、循環脂質を取り込み、蓄積するその能力を抑制する。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、主にインスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）により媒介される間接的な作用を及ぼす（実施例のセクションに示される）。
【００５４】
別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、肝臓および他の組織を刺激して、ＩＧＦ−Ｉを分泌させることにより身体成長を刺激する。別の実施形態では、ＩＧＦ−Ｉは、軟骨細胞の増殖を刺激し、骨成長をもたらす。別の実施形態では、ＩＧＦ−Ｉは、骨格筋細胞の増殖を刺激し、筋成長をもたらす。
【００５５】
別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、タンパク質、脂質、および炭水化物代謝に対して代謝作用を誘発する。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、直接的な作用を有する。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、ＩＧＦ−Ｉの誘発を通した間接的な作用を有する。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、リーダーペプチドをさらに含む。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、ＣＴＰを切り詰められた構築物を含む。
【００５６】
別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、組織においてタンパク質同化を刺激する。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、アミノ酸取り込み、増加したタンパク質合成、および減少したタンパク質酸化を刺激する。
【００５７】
別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、脂肪代謝を刺激する。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、脂肪細胞におけるトリグリセリド分解および酸化を刺激することにより脂肪の利用を刺激する。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、体脂肪を減少させる。
【００５８】
別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、炭水化物代謝を刺激する。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、血中グルコースを正常範囲内に維持する。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、抗インスリン活性を含む。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、末梢組織におけるグルコースの取り込みを刺激し、肝臓におけるグルコース合成を向上するインスリンの能力を抑制する。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、インスリン分泌を刺激し、高インスリン血症をもたらす。
【００５９】
別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、対象において、生成が制限される、または生成されない成長ホルモンを補うために使用される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、生成が制限される、または生成されない成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）を補う。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、ソマトスタチンの増加された活性を相殺する。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、生成が制限された、または生成されないグレリンを補う。
【００６０】
別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、視床下部、下垂体、または標的細胞のいずれかにおける病変に関連する疾患を治療するために使用される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、ホルモンに対する減少した標的細胞の応答に関連する疾患を治療するために使用される。
【００６１】
別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、重度の成長遅延の小児を治療するために使用される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、病理学的に低身長の小児を治療するために使用される。別の実施形態では、本発明のＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、運動能力を向上させるために使用される。別の実施形態では、本発明のＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、老化の症状を治療するために使用される。別の実施形態では、本発明のＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、老化の美容的症状を治療するために使用される。
【００６２】
別の実施形態では、ＧＨを欠乏する小児をＧＨで治療することによって、成長の向上をもたらし、一方で、ＧＨを欠乏する成人において、ＧＨを用いた治療は、除脂肪体重の増加、および体脂肪の減少または低下をもたらす。別の実施形態では、ＧＨのＣＴＰ修飾形態を用いた治療は、小児および成人において、これらの作用の向上をもたらす。別の実施形態では、ＧＨを欠乏する小児におけるＣＴＰ修飾ｈＧＨを用いた治療は、毎日、同じ用量の市販の未修飾ＧＨを受けたＧＨを欠乏する小児と比較したとき、成長の向上をもたらす。別の実施形態では、小児におけるＣＴＰ修飾ｈＧＨを用いた治療は、毎日、同じ用量の市販の未修飾ＧＨを受けた小児と比較したとき、成長の向上をもたらす。別の実施形態では、ＧＨを欠乏する成人におけるＣＴＰ修飾ｈＧＨを用いた治療は、毎日、同じ用量の市販の未修飾ＧＨを受けたＧＨを欠乏する成人と比較したとき、除脂肪体重の増加、および体脂肪の減少をもたらす。別の実施形態では、成人におけるＣＴＰ修飾ｈＧＨを用いた治療は、毎日、同じ用量の市販の未修飾ＧＨを受けたを成人と比較したとき、除脂肪体重の増加、および体脂肪の減少をもたらす。
【００６３】
別の実施形態では、本発明のＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、女性対象において母乳生成を向上させるために使用される。別の実施形態では、本発明のＣＴＰ／ウシＧＨ抱合体は、乳牛における乳生成を向上させるために使用される。別の実施形態では、本発明のＣＴＰ／動物−ＧＨ構築物は、畜産農業技術に使用される。別の実施形態では、本発明のＣＴＰ／農場動物−ＧＨ構築物は、限定されないが、ブタ等の農場動物の成長を向上させるために使用される。
【００６４】
別の実施形態では、本発明の方法は、筋成長を刺激する、心機能を増加させる、骨成長を刺激する、筋肉の完全性を維持する、筋代謝の平衡を保つ、筋発達を誘発する、新規筋発達を誘発する、骨負荷を向上させる、骨粗鬆症に関連する症状を治療する、消耗性疾患を治療する、脂肪分解を増加させる、体液平衡を改善する、骨粗鬆症を治療する、肺機能を改善する、免疫を改善する、重要臓器を再成長させる、幸福感を増加させる、ＲＥＭ睡眠を回復させる、またはそれらのいずれかの組み合わせのために、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本発明の方法は、筋成長を刺激する、心機能を増加させる、骨成長を刺激する、筋肉の完全性を維持する、筋代謝の平衡を保つ、筋発達を誘発する、新規筋発達を誘発する、骨負荷を強化する、骨粗鬆症に関連する症状を治療する、消耗性疾患を治療する、脂肪分解を増加させる、体液平衡を改善する、骨粗鬆症を治療する、肺機能を改善する、免疫を改善する、重要臓器を再成長させる、幸福感を増加させる、ＲＥＭ睡眠を回復させる、またはそれらのいずれかの組み合わせのために、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドを提供する。
【００６５】
別の実施形態では、本発明の方法は、消耗性疾患、ＡＩＤＳ、悪液質、またはｈＧＨ欠乏を治療するための、Ｎ末端上に追加で少なくとも１つのＣＴＰアミノ酸ペプチドと、Ｃ末端上に少なくとも１つのＣＴＰアミノ酸ペプチドとを有するｈＧＨを提供する。別の実施形態では、本発明の方法は、消耗性疾患、ＡＩＤＳ、悪液質、またはｈＧＨ欠乏を治療するための、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドを提供する。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本発明のヒト成長ホルモンポリペプチドは、成長不全障害等の成長および体重に関する状態、ＡＩＤＳ消耗、老化、ＨＩＶ感染対象の免疫機能障害、異化疾病、手術回復、うっ血性心筋症、肝移植、肝切除後の肝再生、慢性腎不全、腎性骨ジストロフィー、骨粗鬆症、軟骨無形成症／軟骨低形成症、骨格異形成症、クローン病等の慢性炎症もしくは栄養障害、短小腸症候群、若年性慢性関節炎、嚢胞性線維症、男性不妊症、Ｘ連鎖低リン血症性くる病、ダウン症候群、二分脊椎症、ヌーナン症候群、肥満、筋力障害、および線維筋痛症に悩む対象を治療するために使用され得る。
【００６７】
別の実施形態では、本発明のヒト成長ホルモンポリペプチドは、多発性硬化症の対象を治療するために使用され得る。別の実施形態では、本発明のヒト成長ホルモポリペプチドは、肥満対象の体重減少を向上させるために使用され得る。別の実施形態では、本発明のヒト成長ホルモポリペプチドは、肥満対象の体脂肪を減少させるために使用され得る。別の実施形態では、本発明のヒト成長ホルモンポリペプチドは、対象の除脂肪体重を増加させるために使用され得る。別の実施形態では、本発明のヒト成長ホルモンポリペプチドは、心不全、潰瘍性大腸炎、および火傷に罹患する対象を治療するために使用され得る。別の実施形態では、本発明のヒト成長ホルモンポリペプチドは、筋量を増やすために使用され得る。
【００６８】
別の実施形態では、本発明の方法は、本明細書に記載されるＧＨタンパク質をコードする核酸配列を提供する。別の実施形態では、本発明の方法は、筋成長を刺激する、心機能を増加させる、骨成長を刺激する、筋肉の完全性を維持する、筋代謝の平衡を保つ、筋発達を誘発する、新規筋発達を誘発する、骨負荷を強化する、骨粗鬆症に関連する症状を治療する、消耗性疾患を治療する、脂肪分解を増加させる、体液平衡を改善する、骨粗鬆症を治療する、肺機能を改善する、免疫を改善する、重要臓器を再成長させる、幸福感を増加させる、ＲＥＭ睡眠を回復させる、またはそれらのいずれかの組み合わせのために、ＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、本発明の教示により利用される。いくつかの実施形態では、ＣＴＰ配列の、ｈＧＨタンパク質のアミノ末端およびカルボキシ末端への結合は、効力の増加をもたらす（図２）。いくつかの実施形態では、ＣＴＰ配列の、ｈＧＨタンパク質のアミノ末端およびカルボキシ末端への結合は、生体内活性の延長をもたらす。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本明細書で使用される、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、未変性ポリペプチド（分解生成物、合成的に合成されたポリペプチド、または組換えポリペプチドのいずれか）、およびペプチド模倣薬（典型的に、合成的に合成されたポリペプチド）、ならびにいくつかの実施形態では、体内ではポリペプチドにさらに安定性を付与する、または細胞内に浸透することがさらに可能な修飾を有する、ポリペプチド類似体であるペプトイドおよびセミペプトイドを包含する。
【００７１】
いくつかの実施形態では、修飾は、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ポリペプチド結合修飾（ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＦ＝ＣＨを含むがこれらに限定されない）、主鎖修飾、および残基修飾を含むが、これらに限定されない。ペプチド模倣化合物を調製するための方法は、当該技術分野において周知であり、例えばＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ１７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に明記されており、本明細書に完全に示されるかのように参照により組み込まれる。これに関係するさらなる詳細は以下に提供される。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ポリペプチド内のポリペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は置換される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド結合は、Ｎメチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）によって置換される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド結合は、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）によって置換される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド結合は、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）によって置換される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド結合は、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）によって置換され、式中、Ｒは、任意のアルキル、例えば，メチル、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド結合は、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）によって置換される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド結合は、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）によって置換される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド結合は、オレフィン２重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）によって置換される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド結合は、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）によって置換される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド結合は、ポリペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）によって置換され、式中、Ｒは、炭素原子上に天然に存在する「正規」側鎖である。いくつかの実施形態では、これらの修飾は、ポリペプチド鎖を伴う結合のうちのいずれかで、および同時にいくつか（２〜３つの結合）でも生じる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＰｈｅ等のポリペプチドの天然の芳香族アミノ酸は、フェニルグリシン、ＴＩＣ、ナフチルラニン（ｎａｐｈｔｈｙｌｅｌａｎｉｎｅ）（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅまたｏ−メチル−Ｔｙｒのハロゲン化誘導体等の合成非天然酸に置換される。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、１つ以上の修飾されたアミノ酸または１つ以上の非アミノ酸モノマー（例えば脂肪酸、複合糖質等）を含む。
【００７４】
一実施形態では、「アミノ酸」または「アミノ酸」は、２０個の天然に存在するアミノ酸を含むように理解され、これらのアミノ酸は、例えばヒドロキシプロリン、ホスホセリン、およびホスホスレオニンを含む、生体内で翻訳後修飾されることが多く、他の珍しいアミノ酸は、２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ｎｏｒ−バリン、ｎｏｒ−ロイシン、およびオルニチンを含むが、これらに限定されない。一実施形態では、「アミノ酸」は、Ｄ−およびＬ−アミノ酸の両方を含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、可溶性形態であるポリペプチドを必要とする治療薬に利用される。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、そのヒドロキシル含有側鎖によりポリペプチドの可溶性を増加させることができるセリンおよびスレオニンを含むがこれらに限定されない、１つ以上の非天然および天然の極性アミノ酸を含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを含むポリペプチドは、直鎖状形態で利用されるが、環化（ｃｙｃｌｉｃｉｚａｔｉｏｎ）がＣＴＰにより修飾されたｈＧＨ特徴にひどく干渉しない場合、成長ホルモンの環式形態も利用され得ることを当業者は理解する。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＴＰにより修飾されたｈＧＨは、標準的な固相法等を用いて、生化学的に合成される。いくつかの実施形態では、これらの生化学的方法は、排他的固相合成、部分的固相合成、フラグメント縮合、または古典的溶液合成を含む。いくつかの実施形態では、これらの方法は、成長ホルモンが比較的短い（約５〜１５ｋＤａ）とき、および／または組換え技法によって生成することができず（すなわち、核酸配列によってコードされない）、したがって異なる化学を伴うときに使用される。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ＣＴＰにより修飾された固相ｈＧＨ合成手順は、当業者に周知であり、Ｊｏｈｎ  Ｍｏｒｒｏｗ  Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｊａｎｉｓ  Ｄｉｌｌａｈａ  Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ（２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８４）によってさらに説明されている。いくつかの実施形態では、合成ポリペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィーによって精製され［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ  Ｔ．（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ．ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．Ｎ．Ｙ．］、その組成は、当業者に既知の方法によって、アミノ酸配列決定を介して確認することができる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、組換えタンパク質技法は、本発明のＣＴＰによって修飾されたｈＧＨを生成するために使用される。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質技法は、比較的長いポリペプチド（例えば１８〜２５個のアミノ酸より長い）を生成するために使用される。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質技法は、本発明のＣＴＰにより修飾された大量のｈＧＨを生成するために使用される。いくつかの実施形態では、組換え技法は、Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４、Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９、Ｂｒｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：５１１−５１４、Ｔａｋａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３０７−３１１、Ｃｏｒｕｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６７１−１６８０、およびＢｒｏｇｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８−８４３、Ｇｕｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９−５６５、ならびにＷｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，１９８８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩ，ｐｐ４２１−４６３によって説明される。
【００８０】
別の実施形態では、本発明のＣＴＰにより修飾されたｈＧＨは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用して合成される。別の実施形態では、本発明のＣＴＰにより修飾されたｈＧＨをコードするポリヌクレオチドは、シス−調節配列（例えばプロモーター配列）の転写制御を含む発現ベクターの中に連結される。別の実施形態では、シス−調節配列は、本発明の成長ホルモンの構成的発現を指示するのに好適である。別の実施形態では、シス−調節配列は、本発明のＣＴＰにより修飾されたｈＧＨの組織特異的発現を指示するのに好適である。別の実施形態では、シス−調節配列は、本発明のＣＴＰにより修飾されたｈＧＨの誘発性発現を指示するのに好適である。
【００８１】
別の実施形態では、本発明と共に使用するのに好適な組織特異的プロモーターは、特定の細胞集団において機能的である配列を含み、例としては、肝臓特異的であるアルブミン等のプロモーター［Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７］、リンパ球系特異的プロモーター［Ｃａｌａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５］、特にＴ細胞受容体のプロモーター［Ｗｉｎｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３］、および免疫グロブリン［Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３７２９−７４０］、神経フィラメントプロモーター等の神経特異的プロモーター［Ｂｙｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７］、膵臓特異的プロモーター［Ｅｄｌｕｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６］、または乳漿プロモーター等の乳腺特異的プロモーター（米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられるが、これに限定されない。本発明と共に使用するのに好適な誘発性プロモーターは、例えばテトラサイクリン誘発性プロモーターを含む（Ｓｒｏｕｒ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２００３．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９０：３９８−４０５）。
【００８２】
一実施形態では、「ポリヌクレオチド」とは、単離され、ＲＮＡ配列、相補的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列、および／または複合ポリヌクレオチド配列（例えば上記の組み合わせ）の形態で提供される１本鎖または２本鎖核酸配列を指す。
【００８３】
一実施形態では、「相補的ポリヌクレオチド配列」とは、逆転写酵素を用いたメッセンジャーＲＮＡ、または任意の他のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの逆転写に由来する配列を指す。一実施形態では、配列は、その後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて生体内または生体外で増幅され得る。
【００８４】
一実施形態では、「ゲノムポリヌクレオチド配列」とは、染色体に由来する（単離された）配列を指し、よって、染色体の隣接部分を表す。
【００８５】
一実施形態では、「複合ポリヌクレオチド配列」とは、少なくとも部分的に相補的であり、少なくとも部分的にゲノムである配列を指す。一実施形態では、複合配列は、本発明のポリペプチドをコードするために必要とされるいくつかの外部（ｅｘｏｎａｌ）配列、ならびにその間に挿置される介在配列を含むことができる。一実施形態では、介在配列は、他の遺伝子を含む任意の供給源のものであり得、典型的に、保存スプライシングシグナル配列を含む。一実施形態では、介在配列は、シス作用性発現調節要素を含む。
【００８６】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、実施例１に記載されるＰＣＲ技法、または当業者に既知の任意の他の方法もしくは手順を用いて調製される。いくつかの実施形態では、手順は、２つの異なるＤＮＡ配列の連結を伴う（例えば、"Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ"，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２を参照）。
【００８７】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、組換えポリペプチドの発現を可能にするために、発現ベクター（すなわち核酸構築物）の中に挿入される。一実施形態では、本発明の発現ベクターは、このベクターを原核生物における複製および統合に好適な状態にするさらなる配列を含む。一実施形態では、本発明の発現ベクターは、このベクターを真核生物における複製および統合に好適な状態にするさらなる配列を含む。一実施形態では、本発明の発現ベクターは、このベクターを原核生物および真核生物の両方における複製および統合に好適な状態にするシャトルベクターを含む。別の実施形態では、クローン化ベクターは、転写および翻訳開始配列（例えばプロモーター、エンハンサー）ならびに転写および翻訳ターミネーター（例えばポリアデニル化シグナル）を含む。
【００８８】
一実施形態では、様々な原核生物または真核生物細胞は、本発明のＣＴＰにより修飾されたｈＧＨを発現させるために、宿主発現系として使用され得る。いくつかの実施形態では、これらは、ポリペプチドコード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌、ポリペプチドコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母、組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウイルスＴＭＶ）で感染された、またはポリペプチドコード配列を含む、Ｔｉプラスミド等の組換えプラスミド発現ベクターで形質転換された植物細胞系等の微生物を含むが、これらに限定されない。
【００８９】
別の実施形態では、細菌ではない発現系は、本発明の成長ホルモンを発現させるために使用される（例えばＣＨＯ細胞等の哺乳類発現系）。一実施形態では、哺乳類細胞において本発明のポリヌクレオチドを発現させるために使用される発現ベクターは、ＣＭＶプロモーターおよびネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＣＩ−ＤＨＦＲベクターである。実施例１において、一実施形態によるｐＣＩ−ｄｈｆｒベクターの構築が説明される。
【００９０】
別の実施形態では、本発明の細菌系において、いくつかの発現ベクターは、発現されるポリペプチドを対象とする使用により有利に選択され得る。一実施形態では、大量のポリペプチドが所望される。一実施形態では、可能であれば、細菌の周辺質、またはタンパク質生成物が容易に精製される培養培地の中に発現された生成物を指示する疎水性シグナル配列との融合として、高レベルのタンパク質生成物の発現を指示するベクターが所望される。一実施形態では、ある融合タンパク質は、ポリペプチドの回収を補助するために、特定の切断部位を用いて操作される。一実施形態では、そのような操作に適応するベクターは、大腸菌発現ベクターのｐＥＴ系列を含むが、これに限定されない［Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９（１９９０）］。
【００９１】
一実施形態では、酵母発現系が使用される。一実施形態では、米国特許出願第５，９３２，４４７号に開示される、構成的または誘発性プロモーターを含むいくつかのベクターが酵母に使用され得る。別の実施形態では、外来性ＤＮＡ配列の酵母染色体への統合を促進するベクターが使用される。
【００９２】
一実施形態では、本発明の発現ベクターは、例えば、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）等の単一ｍＲＮＡからのいくつかのタンパク質の翻訳を可能にするさらなるポリヌクレオチド配列、およびプロモーター−キメラポリペプチドのゲノム統合のための配列をさらに含むことができる。
【００９３】
別の実施形態では、哺乳類発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）、ｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、およびｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能）、ｐＴＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能）、ならびにそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない。
【００９４】
別の実施形態では、レトロウイルス等の真核生物ウイルスからの調節要素を含む発現ベクターは、本発明によって使用される。ＳＶ４０ベクターはｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２を含む。いくつかの実施形態では、ウシパピローマウイルスに由来するベクターはｐＢＶ−１ＭＴＨＡを含み、Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒウイルスに由来するベクターはｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５を含む。他の例示的なベクターは、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌腫瘍ウイルスプロモーター、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核生物細胞における発現に有効性を示す他のプロモーターの指示によりタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターを含む。
【００９５】
別の実施形態では、組換えウイルスベクターは、横感染および標的特異性等の利点をもたらすため、本発明のＣＴＰにより修飾されたＧＨの生体内発現に有用である。一実施形態では、横感染は、例えばレトロウイルスの生活環に固有であり、単一の感染細胞が出芽分離し、隣接する細胞に感染する、多くの子孫ウイルス粒子を生成するプロセスである。別の実施形態では、結果は、広範囲が迅速に感染することであり、その大半は、元のウイルス粒子によって最初に感染しなかった。一実施形態では、横方向に広がることができないウイルスベクターが生成される。別の実施形態では、この特徴は、所望される目的が特定の遺伝子を局所数の標的細胞の中に導入することである場合、有用であり得る。
【００９６】
別の実施形態では、本発明の発現ベクターを細胞の中に導入するために、様々な方法が使用され得る。そのような方法は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９，１９９２）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９）、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  Ｍｉｃｈ．（１９９５），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．（１９８８）、およびＧｉｌｂｏａ  ｅｔ  ａｔ．［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４（６）：５０４−５１２，１９８６］に記載されており、例えば安定した、または一過性のトランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔、および組換えウイルスベクターによる感染を含む。加えて、陽陰選択方法については、米国特許第５，４６４，７６４号および第５，４８７，９９２号を参照。
【００９７】
別の実施形態では、高トランスフェクション効率はウイルスの感染性質により得ることができるため、ウイルス感染による核酸の導入は、リポフェクションおよび電気穿孔等の他の方法に対していくつかの利点をもたらす。
【００９８】
一実施形態では、本発明のＣＴＰにより修飾されたＧＨは、以上に説明されるいずれの好適な投与モードを利用して、個人に投与される（すなわち生体内遺伝子療法）核酸構築物からも発現され得ることを理解する。一実施形態では、核酸構築物は、適切な遺伝子送達ビヒクル／方法（トランスフェクション、形質導入、相同組換え等）、および必要であれば発現系を介して好適な細胞の中に導入され、その後、修飾された細胞は、培養で増やされ、個人に戻される（すなわち、生体外遺伝子療法）。
【００９９】
一実施形態では、成長ホルモンを使用する生体内遺伝子療法は、動物モデルにおいて実施された。
【０１００】
一実施形態では、植物発現ベクターが使用される。一実施形態では、ポリペプチドコード配列の発現は、いくつかのプロモーターによって操作される。いくつかの実施形態では、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡおよび１９Ｓ  ＲＮＡプロモーター［Ｂｒｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：５１１−５１４（１９８４）］、またはＴＭＶに対するコートタンパク質プロモーター［Ｔａｋａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３０７−３１１（１９８７）］等のウイルス性プロモーターが使用される。別の実施形態では、例えばＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット等の植物プロモーター［Ｃｏｒｕｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６７１−１６８０（１９８４）、およびＢｒｏｇｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８−８４３（１９８４）］、または熱ショックプロモーター、例えば大豆ｈｓｐ１７．５−Ｅもしくはｈｓｐ１７．３−Ｂ［Ｇｕｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９−５６５（１９８６）］が使用される。一実施形態では、構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルス性ベクター、直接ＤＮＡ形質転換、微量注入、電気穿孔、および当業者に周知の他の技法を用いて、植物細胞の中に導入される。例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩ，ｐｐ  ４２１−４６３（１９８８）］を参照。当該技術分野において周知の昆虫および哺乳類宿主細胞系等の他の発現系も本発明によって使用され得る。
【０１０１】
挿入されたコード配列（ポリペプチドをコードする）の転写および翻訳に必要な要素を含む以外に、本発明の発現構築物は、発現されたポリペプチドの安定性、生成、精製、収率、または活性を最適化するように操作された配列を含むこともできることを理解する。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本発明の発現ベクターを宿主細胞系の中に導入するために、様々な方法が使用され得る。いくつかの実施形態では、そのような方法は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９，１９９２）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９）、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  Ｍｉｃｈ．（１９９５），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．（１９８８）、およびＧｉｌｂｏａ  ｅｔ  ａｔ．［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４（６）：５０４−５１２，１９８６］に記載されており、例えば安定した、または一過性のトランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔、および組換えウイルスベクターによる感染を含む。加えて、陽陰選択方法については、米国特許第５，４６４，７６４号および第５，４８７，９９２号を参照。
【０１０３】
一実施形態では、形質転換された細胞は、多量の組換えポリペプチドの発現を可能にする有効な条件下で培養される。別の実施形態では、有効な培養条件は、タンパク質生成を可能にする有効な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨ、および酸素条件を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、有効な培地とは、本発明の組換えポリペプチドを生成するために細胞が培養される任意の培地を指す。別の実施形態では、培地は、典型的に、同化可能な炭素、窒素、およびリン酸源、ならびに適切な塩、鉱物、金属、およびビタミン等の他の栄養素を有する水溶液を含む。別の実施形態では、本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振盪フラスコ、試験チューブ、マイクロタイター皿、およびペトリ皿において培養され得る。別の実施形態では、培養は、組換え細胞に適切な温度、ｐＨ、および酸素含量で行われる。別の実施形態では、培養条件は、当業者の専門知識内である。
【０１０４】
別の実施形態では、生成に使用されるベクターおよび宿主系により、本発明の得られる成長ホルモンは、発酵培地内に分泌される、大腸菌の周辺質空間等の２つの細胞膜間の空間内に分泌される組換え細胞内に留まるか、または細胞もしくはウイルス性膜の外表面上に保持されるかのいずれかである。
【０１０５】
一実施形態では、所定の培養時間後、組換えポリペプチドの回収が達成される。
【０１０６】
一実施形態では、本明細書で使用される、「組換えポリペプチドを回収する」とは、ポリペプチドを含む全発酵培地を回収することを指し、分離または精製のさらなるステップを示唆する必要はない。
【０１０７】
一実施形態では、本発明の成長ホルモンは、これらに限定されないが、親和クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、等電点電気泳動、および差次的可溶化等の様々な標準的なタンパク質精製技法を用いて精製される。
【０１０８】
一実施形態では、回収を容易にするために、発現されたコード配列は、本発明のポリペプチド、および縮合された切断可能な部分をコードするように操作され得る。一実施形態では、融合タンパク質は、例えば切断可能な部分に特異的なカラム上に固定することにより、ポリペプチドが親和クロマトグラフィーによって容易に単離され得るように設計され得る。一実施形態では、切断可能な部位は、ポリペプチドと切断可能な部位との間で操作され、ポリペプチドは、この部位で融合タンパク質を特異的に切断する適切な酵素または薬剤で処理することにより、クロマトグラフカラムから解放され得る［例えばＢｏｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：６５−７０（１９８８）およびＧａｒｄｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５８５４−１５８５９（１９９０）を参照］。
【０１０９】
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、「実質的に純粋な」形態で回収される。
【０１１０】
一実施形態では、「実質的に純粋」とは、本明細書に記載される用途におけるタンパク質の有効な使用を可能にする純度を指す。
【０１１１】
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、生体外発現系を使用して合成することもできる。一実施形態では、生体外合成方法は、当該技術分野において周知であり、系の構成成分は、商業的に入手可能である。
【０１１２】
一実施形態では、組換えＤＮＡ技術を用いたＣＴＰにより修飾されたＧＨの生成が実施される。
【０１１３】
別の実施形態では、組換えポリペプチドが合成され、精製され、その治療有効性は生体内または生体外のいずれかでアッセイされ得る。一実施形態では、本発明のＣＴＰにより修飾された組換えＧＨの結合活性は、様々なアッセイを用いて確認することができる。
【０１１４】
一実施形態では、本発明は、ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰポリペプチドを含む。一実施形態では、組換えＤＮＡ技術方法は、実施例１に図示されるＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰポリペプチドの生成に使用される。一実施形態では、本発明のＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰポリペプチドの治療有効性は、いずれの生体内でアッセイされる。一実施形態では、本発明のＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰポリペプチドの治療有効性は、いずれの生体外でアッセイされる。一実施形態では、本発明の組換えｈＧＨポリペプチドの結合活性は、前にヒト成長ホルモン受容体でトランスフェクトされたＮｂ２（プロラクチン依存性ラットリンパ腫細胞系（ＥＣＡＣＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ））またはＦＣＤ−Ｐ１マウス細胞系を用いて測定される。一実施形態では、ｈＧＨのこれらの受容体への結合は、一実施形態では、ｈＧＨ活性の機能としてＭＴＴ細胞染色のレベルによって測定される細胞増殖を誘発する。一実施形態では、生体内活性は、治療された成長ホルモン欠乏動物において、経時的に体重増加を測定することにより推定される。
【０１１５】
一実施形態では、本発明は、対象において成長または体重増加を誘発する方法を提供し、対象に、成長ホルモンと、前記成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰとを含む、治療有効量のポリペプチドを投与し、それによって対象において成長または体重増加を誘発することを含む。
【０１１６】
別の実施形態では、本発明は、ヒト対象において成長を誘発する方法を提供し、前記対象に、成長ホルモンと、前記成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、前記成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰとを含む、治療有効量のポリペプチドを投与し、それによって前記対象において成長を誘発することを含む。一実施形態では、前記ヒト対象は青年である。別の実施形態では、ヒト対象は小児である。別の実施形態では、ヒト対象はＧＨ欠乏小児である。
【０１１７】
別の実施形態では、本発明は、ヒト対象において体重増加を誘発する方法を提供し、前記対象に、成長ホルモンと、前記成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、前記成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰとを含む、治療有効量のポリペプチドを投与し、それによって前記対象において体重増加を誘発することを含む。一実施形態では、前記ヒト対象は青年である。別の実施形態では、ヒト対象は小児である。別の実施形態では、ヒト対象はＧＨ欠乏小児である。
【０１１８】
別の実施形態では、本発明は、ヒト対象において体重減少を誘発するか、または体脂肪を減少させる方法を提供し、前記対象に、成長ホルモンと、前記成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、前記成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰとを含む、治療有効量のポリペプチドを投与し、それによって前記対象において体重減少を誘発するか、または体脂肪を減少させることを含む。一実施形態では、前記対象は肥満である。別の実施形態では、対象は体重過多である。別の実施形態では、ヒト対象は成人である。別の実施形態では、ヒト対象はＧＨ欠乏成人である。
【０１１９】
別の実施形態では、本発明は、対象における脂肪沈着を減少させる方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、対象における筋量を増加させる方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、対象における筋成長を促進する方法を提供する。別の実施形態では、ヒト対象は成人である。別の実施形態では、ヒト対象はＧＨ欠乏成人である。別の実施形態では、本発明は、脂肪に対する筋肉の割合を増加させる方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、肥満度指数（ＢＭＩ）またはケトレー指数を減少させる方法を提供する。
【０１２０】
別の実施形態では、本明細書において、対象に、本明細書に記載されるＣＴＰにより修飾された成長ホルモンを投与することを含む、対象の成長を誘発する方法が提供される。一実施形態では、ＣＴＰ修飾成長ホルモンが対象に直接投与され、一方、別の実施形態では、前記ＣＴＰ修飾成長ホルモンをコードするポリヌクレオチドが対象に投与される。別の実施形態では、本明細書において、既知の賦形剤、既知のビヒクル、ならびに成長ホルモンと、成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰとを含むポリペプチドからなる組成物を対象に投与することを含む、対象の成長を誘発する方法が提供される。別の実施形態では、本明細書において、既知の賦形剤、既知のビヒクル、ならびに成長ホルモンと、成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰとを含むポリペプチドからなる組成物を対象に投与することを含む、対象の成長を誘発する方法が提供される。
【０１２１】
別の実施形態では、成長は体重増加により測定される。別の実施形態では、成長は身長増加により測定される。別の実施形態では、成長は体重増加により測定される。別の実施形態では、成長は筋量増加により測定される。別の実施形態では、成長は体重増加により測定される。別の実施形態では、成長は骨量増加により測定される。別の実施形態では、成長は体重増加により測定される。別の実施形態では、成長は脂肪増加により測定される。別の実施形態では、成長は、当業者に既知の任意の既知の手段により測定される。別の実施形態では、成長が測定される対象は小児である。別の実施形態では、成長が測定される対象はＧＨ欠乏小児である。
【０１２２】
別の実施形態では、本発明のＣＴＰにより修飾されたＧＨを含むポリペプチドは、０．１〜５ｍｌの溶液中１〜９０マイクログラムの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨを含むポリペプチドは、０．１〜５ｍｌの溶液中１〜５０マイクログラムの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨを含むポリペプチドは、０．１〜５ｍｌの溶液中１〜２５マイクログラムの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨを含むポリペプチドは、０．１〜５ｍｌの溶液中５０〜９０マイクログラムの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨを含むポリペプチドは、０．１〜５ｍｌの溶液中１０〜５０マイクログラムの用量で投与される。
【０１２３】
別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨを含むポリペプチドは、１週間に１回、筋肉内（ＩＭ）注射、皮下（ＳＣ）注射、または静脈内（ＩＶ）注射により、０．１〜５ｍｌの溶液中１〜９０マイクログラムの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨを含むポリペプチドは、１週間に２回、筋肉内（ＩＭ）注射、皮下（ＳＣ）注射、または静脈内（ＩＶ）注射により、０．１〜５ｍｌの溶液中１〜９０マイクログラムの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨを含むポリペプチドは、１週間に３回、筋肉内（ＩＭ）注射、皮下（ＳＣ）注射、または静脈内（ＩＶ）注射により、０．１〜５ｍｌの溶液中１〜９０マイクログラムの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨを含むポリペプチドは、２週間に１回、筋肉内（ＩＭ）注射、皮下（ＳＣ）注射、または静脈内（ＩＶ）注射により、０．１〜５ｍｌの溶液中１〜９０マイクログラムの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨを含むポリペプチドは、１７日に１回、筋肉内（ＩＭ）注射、皮下（ＳＣ）注射、または静脈内（ＩＶ）注射により、０．１〜５ｍｌの溶液中１〜９０マイクログラムの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨを含むポリペプチドは、１９日週に１回、筋肉内（ＩＭ）注射、皮下（ＳＣ）注射、または静脈内（ＩＶ）注射により、０．１〜５ｍｌの溶液中１〜９０マイクログラムの用量で投与される。
【０１２４】
別の実施形態では、本発明のＣＴＰにより修飾されたＧＨ等の５０，０００ダルトンより低い分子量のタンパク質薬物は、一般に、数時間の循環半減期を有する生体内短寿命種である。別の実施形態では、皮下投与経路は、一般に、循環内への持続放出を提供する。別の実施形態では、本発明のＣＴＰ修飾ポリペプチドは、ＧＨ等の５０，０００ダルトンより低い分子量のタンパク質薬物の半減期を延長する。別の実施形態では、本発明のＣＴＰ修飾ポリペプチドは、ＧＨが長期間その有益な作用を発揮することを可能にする。
【０１２５】
別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨを含むＣＴＰ修飾ポリペプチドの免疫原性は、単離されたＧＨと等しい。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨを含むＣＴＰ修飾ポリペプチドの免疫原性は、単離されたＧＨと同等である。別の実施形態では、本明細書に記載されるＧＨをＣＴＰペプチドで修飾することにより、ＧＨの免疫原性は減少する。別の実施形態では、ＧＨを含むＣＴＰ修飾ポリペプチドは、単離されたＧＨタンパク質と同じくらい活性である。別の実施形態では、ＧＨを含むＣＴＰ修飾ポリペプチドは、単離されたＧＨより活性である。別の実施形態では、ＧＨを含むＣＴＰ修飾ポリペプチドは、生物活性における減少を最小にする一方で、分解に対する成長ホルモンの保護能力を最大にする。
【０１２６】
別の実施形態では、本発明のＣＴＰにより修飾されたＧＨは、それ自体が個人に提供される。一実施形態では、本発明のＣＴＰにより修飾されたＧＨは、薬学的に許容される担体と混合される薬学的組成物の一部として個人に提供される。
【０１２７】
別の実施形態では、「薬学的組成物」とは、生理学的に好適な担体および賦形剤等の他の化学構成成分を含む、本明細書に記載される活性成分のうちの１つ以上の調製物を指す。薬学的組成物の目的は、化合物の生物への投与を容易にするためである。
【０１２８】
別の実施形態では、「活性成分」とは、生物学的作用を説明する関心のポリペプチド配列を指す。
【０１２９】
一実施形態では、本発明は、組み合わされた調製物を提供する。一実施形態では、「組み合わされた調製物」は、特に、上に定義される組み合わせパートナーが単独で、または組み合わせパートナーの区別された量の異なる固定された組み合わせの使用により、すなわち、同時に、並行して、別個に、または逐次的に投薬され得るという意味で、「キットの構成要素」を定義する。別の実施形態では、キットの構成要素の構成要素は、その結果、キットの構成要素のいずれの構成要素に関して、例えば同時に、または経時的にずれて、すなわち、異なる時間点および等しいまたは異なる時間間隔で投与され得る。組み合わせ調製物において、組み合わせパートナーの総量の割合が投与される。組み合わせ調製物は、例えば、治療される患者の亜集団、または異なる必要性が、当業者によって容易になされ得る、特定の疾患、疾患の重篤度、年連、性別、もしくは体重による可能性がある１人の患者の必要性に対処するために、変動し得る。
【０１３０】
別の実施形態では、互換的に使用される、「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」とは、生物に著しい刺激をもたらさず、かつ投与される化合物の生物学的活性および性質を抑制しない担体または希釈剤を指す。アジュバントは、これらの句に含まれる。一実施形態では、薬学的に許容される担体に含まれる成分のうちの１つは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、有機および水性の両方の培地において広範囲の溶解性を有する生体適合性ポリマーであり得る（Ｍｕｔｔｅｒら（１９７９））。
【０１３１】
別の実施形態では、「賦形剤」とは、活性成分の投与をさらに容易にするために、薬学的組成物に添加される不活性物質を指す。一実施形態では、賦形剤は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類、およびデンプンの種類、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ならびにポリエチレングリコールを含む。
【０１３２】
製剤および薬物の投与に関する技法は、"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，"Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ、最新版に見出され、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
別の実施形態では、好適な投与経路は、例えば、経口、直腸、経粘膜、経鼻、腸、または非経口送達（筋肉内、皮下、および髄内注射）、ならびにくも膜下腔内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻孔内、または眼内注射を含む。
【０１３４】
別の実施形態では、調製物は、例えば調製物の患者の身体の特定の領域内への直接注射を介して、全身様式ではなく、局所様式で投与される。
【０１３５】
様々な投薬量範囲の実施形態が、本明細書によって想定される。本発明のＣＴＰにより修飾されたＧＨの投薬量は、一実施形態では、０．００５〜１００ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．００５〜５ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．０１〜５０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．１〜２０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．１〜１０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．０１〜５ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．００１〜０．０１ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．００１〜０．１ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．１〜５ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．５〜５０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．２〜１５ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．８〜６５ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、１〜５０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、５〜１０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、８〜１５ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、１０〜２０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、２０〜４０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、６０〜１２０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、１２〜４０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、４０〜６０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、５０〜１００ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、１〜６０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、１５〜２５ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、５〜１０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、５５〜６５ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、１〜５ｍｇ／日の範囲である。
【０１３６】
本発明のＣＴＰにより修飾されたＧＨの投薬量は、一実施形態では、０．００５〜１００ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．００５〜５ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．０１〜５０ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．０５〜７．２ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．０５〜７．２ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．０５〜７．２ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．１〜２０ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．１〜１０ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．０１〜５ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．００１〜０．０１ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．００１〜０．１ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．１〜５ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．５〜５０ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．２〜１５ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．２６〜１０．７ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、０．８〜６５ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、１〜５０ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、５〜１０ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、８〜１５ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、１０〜２０ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、２０〜４０ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、６０〜１２０ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、１２〜４０ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、４０〜６０ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、５０〜１００ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、１〜６０ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、１５〜２５ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、５〜１０ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、５５〜６５ｍｇ／週の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、１〜５ｍｇ／週の範囲である。
【０１３７】
別の実施形態では、対象に与えられるＧＨ投薬量は、対象の同じ集団（例えば、小児、高齢者、男性、女性、ＧＨ欠乏、特定の国民等）からの参照対象に与えられる標準的な投与量の５０％である。別の実施形態では、投薬量は、特定の対象集団からの対象に与えられる投薬量の３０％である。別の実施形態では、投薬量は、特定の対象集団からの対象に与えられる投薬量の４５％である。別の実施形態では、投薬量は、特定の対象集団からの対象に与えられる投薬量の１００％である。
【０１３８】
別の実施形態では、投薬量は、１〜５ｍｇ／週である。別の実施形態では、投薬量は、２ｍｇ／週である。別の実施形態では、投薬量は、４ｍｇ／週である。別の実施形態では、投薬量は、１．２ｍｇ／週である。別の実施形態では、投薬量は、１．８ｍｇ／週である。別の実施形態では、投薬量は、ほぼ本明細書に記載される投薬量である。
【０１３９】
別の実施形態では、投薬量は、１〜５ｍｇ／投与である。別の実施形態では、投薬量は、２ｍｇ／投与である。別の実施形態では、投薬量は、４ｍｇ／投与である。別の実施形態では、投薬量は、１．２ｍｇ／投与である。別の実施形態では、投薬量は、１．８ｍｇ／投与である。一実施形態では、組成物は１週間に１回投与される。別の実施形態では、組成物は、２週間に１回投与される。別の実施形態では、組成物は毎月投与される。別の実施形態では、組成物は毎日投与される。
【０１４０】
別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、鼻孔内投薬形態に製剤化される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、注射可能投薬形態に製剤化される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、０．０００１ｍｇ〜０．６ｍｇの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、０．００１ｍｇ〜０．００５ｍｇの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、０．００５ｍｇ〜０．０１ｍｇの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、０．０１ｍｇ〜０．３ｍｇの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、０．２ｍｇ〜０．６ｍｇの範囲の用量の用量で対象に投与される。
【０１４１】
別の実施形態は、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、１〜１００マイクログラムの範囲の用量で対象に投与でされる。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、１０〜８０マイクログラムの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、２０〜６０マイクログラムの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、１０〜５０マイクログラムの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、４０〜８０マイクログラムの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、１０〜３０マイクログラムの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、３０〜６０マイクログラムの範囲の用量で対象に投与される。
【０１４２】
別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、０．２ｍｇ〜２ｍｇの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、２ｍｇ〜６ｍｇの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、４ｍｇ〜１０ｍｇの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、５ｍｇ〜１５ｍｇの範囲の用量で対象に投与される。
【０１４３】
別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、筋肉内に注射される（筋肉内注射）。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、皮膚の下に注射される（皮下注射）。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、筋肉内に注射される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、皮膚の下に注射される。
【０１４４】
別の実施形態では、本発明の方法は、ＧＨ療法の使用におけるコンプライアンスを増加させることを含み、ＧＨ療法を必要とする対象に、ＣＴＰにより修飾されたＧＨを提供し、それによって、成長ホルモン療法の使用におけるコンプライアンスを増加させることを含む。
【０１４５】
別の実施形態では、本発明の方法は、ＧＨ療法を必要とする慢性疾病に悩む患者のコンプライアンスを増加させることを含む。別の実施形態では、本発明の方法は、上述のＣＴＰでＧＨを修飾することにより、ＧＨの投薬頻度の減少を可能にする。別の実施形態では、用語「コンプライアンス」は、アドヒアランスを含む。別の実施形態では、本発明の方法は、ＧＨの投与頻度を減少させることにより、ＧＨ療法を必要とする患者のコンプライアンスを増加させることを含む。別の実施形態では、ＧＨの投与頻度の減少は、ＣＴＰ修飾ＧＨにさらなる安定性を付与するＣＴＰ修飾により達成される。別の実施形態では、ＧＨの投与頻度の減少は、成長ホルモンのＴ１／２の増加の結果として達成される。別の実施形態では、ＧＨの投与頻度の減少は、ＧＨのクリアランス時間の増加の結果として達成される。別の実施形態では、成長ホルモンの投与頻度の減少は、成長ホルモンのＡＵＣ測定の増加の結果として達成される。
【０１４６】
よって、別の実施形態では、本発明は、成長ホルモンの曲線下面積（ＡＵＣ）を改善する方法をさらに提供し、１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドを成長ホルモンのアミノ末端に結合し、２つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドを成長ホルモンのカルボキシ末端に結合し、それによって成長ホルモンの曲線下面積（ＡＵＣ）を改善するステップを含む。
【０１４７】
よって、別の実施形態では、本発明は、成長ホルモンの投薬頻度を減少させる方法をさらに提供し、１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドを成長ホルモンのアミノ末端に結合し、２つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドを成長ホルモンのカルボキシ末端に結合し、それによって成長ホルモンの投薬頻度を減少させるステップを含む。
【０１４８】
よって、別の実施形態では、本発明は、成長ホルモン療法の使用において、それを必要とする対象におけるコンプライアンスを増加させる方法を提供し、前記対象に、成長ホルモンと、前記成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、前記成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとを含むポリペプチドを提供し、それによって成長ホルモン療法の使用におけるコンプライアンスを増加させることを含む。一実施形態では、前記対象はヒトである。
【０１４９】
別の実施形態では、本発明は、ヒト対象においてインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）レベルを増加させる方法を提供し、前記対象に、成長ホルモンと、前記成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、前記成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰとを含む、治療有効量のポリペプチドを投与し、それによって前記対象においてＩＧＦ−１レベルを増加させることを含む。別の実施形態では、ＩＧＦ−１レベルを増加させる方法は、以下の実施例６に提供される。
【０１５０】
別の実施形態では、本発明は、ヒト対象においてインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）レベルを所望される治療範囲に増加させる方法を提供し、対象に、成長ホルモンと、成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、前記成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰとを含む治療有効量のポリペプチドを投与し、それによって対象においてＩＧＦ−１レベルを所望される治療範囲に増加させることを含む。別の実施形態では、ヒト対象は成人である。別の実施形態では、ヒト対象はＧＨ欠乏成人である。別の実施形態では、ヒト対象は正常な成人である。別の実施形態では、ＩＧＦ−１レベルを所望される治療レベルに増加させる方法は、以下の実施例９に提供される。
【０１５１】
一実施形態では、本発明は、対象においてインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）レベルを正常な治療範囲内に維持する方法を提供し、本方法は、対象に、成長ホルモンと、成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰとを含む治療有効量のポリペプチドを投与し、それによって対象においてＩＧＦ−Ｉレベルを正常な治療範囲内に維持することを含む。別の実施形態では、ＩＧＦ−１レベルを正常な治療レベルに維持する方法は、以下の実施例９に提供される。
【０１５２】
一実施形態では、ヒト対象においてＩＧＦ−１レベルを増加させることは、１型糖尿病、２型糖尿病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳは「ルー・ゲーリック病」としても知られる）、重度の火傷、および筋緊張性筋ジストロフィー（ＭＭＤ）を治療する、予防する、または抑制するのに有効であり得る。別の実施形態では、ヒト対象においてＩＧＦ−１レベルを正常な治療範囲に維持することは、１型糖尿病、２型糖尿病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳは「ルー・ゲーリック病」としても知られる）、重度の火傷、および筋緊張性筋ジストロフィー（ＭＭＤ）を治療する、予防する、または抑制するのに有効であり得る。
【０１５３】
一実施形態では、所望される治療範囲は、以下にさらに提供されるように、年齢群および性別によって層別化される、正常な集団において予想される平均ＩＧＦ−１レベルから＋／−２標準偏差〜−２標準偏差として定義される（実施例９を参照）。加えて、試験は、正常範囲内の患者の分散を観察する目的のため、＋／−１．５標準偏差の狭い範囲内のＩＧＦ−１レベルを測定した（以下の実施例９を参照）。
【０１５４】
別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、１日１回対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨを含むポリペプチドは、２日に１回対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、３日に１回対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、４日に１回対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、５日に１回対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、６日に１回対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、１週間に１回対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、７〜１４日に１回対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、１０〜２０日に１回対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、５〜１５日に１回対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、１５〜３０日に１回対象に投与される。
【０１５５】
別の実施形態では、投薬量は、５０〜５００ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、５０〜１５０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、１００〜２００ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、１５０〜２５０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、２００〜３００ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、２５０〜４００ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、３００〜５００ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、３５０〜５００ｍｇ／日の範囲である。
【０１５６】
一実施形態では、投薬量は２０ｍｇ／日である。一実施形態では、投薬量は３０ｍｇ／日である。一実施形態では、投薬量は４０ｍｇ／日である。一実施形態では、投薬量は５０ｍｇ／日である。一実施形態では、投薬量は０．０１ｍｇ／日である。別の実施形態では、投薬量は０．１ｍｇ／日である。別の実施形態では、投薬量は１ｍｇ／日である。別の実施形態では、投薬量は０．５３０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投薬量は０．０５ｍｇ／日である。別の実施形態では、投薬量は５０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投薬量は１０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投薬量は２０〜７０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投薬量は５ｍｇ／日である。
【０１５７】
別の実施形態では、投薬量は１〜９０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投薬量は１〜９０ｍｇ／２日である。別の実施形態では、投薬量は１〜９０ｍｇ／３日である。別の実施形態では、投薬量は１〜９０ｍｇ／４日である。別の実施形態では、投薬量は１〜９０ｍｇ／５日である。別の実施形態では、投薬量は１〜９０ｍｇ／６日である。別の実施形態では、投薬量は、１〜９０ｍｇ／週である。別の実施形態では、投薬量は１〜９０ｍｇ／９日である。別の実施形態では、投薬量は１〜９０ｍｇ／１１日である。別の実施形態では、投薬量は１〜９０ｍｇ／１４日である。
【０１５８】
別の実施形態では、成長ホルモンの投薬量は、１０〜５０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投薬量は１０〜５０ｍｇ／２日である。別の実施形態では、投薬量は１０〜５０ｍｇ／３日である。別の実施形態では、投薬量は１０〜５０ｍｇ／４日である。別の実施形態では、投薬量は１０〜５０マイクログラム／５日である。別の実施形態では、投薬量は１０〜５０ｍｇ／６日である。別の実施形態では、投薬量は、１０〜５０ｍｇ／週である。別の実施形態では、投薬量は１０〜５０ｍｇ／９日である。別の実施形態では、投薬量は１０〜５０ｍｇ／１１日である。別の実施形態では、投薬量は１０〜５０ｍｇ／１４日である。
【０１５９】
経口投与は、一実施形態では、錠剤、カプセル、ロゼンジ、咀しゃく錠、懸濁剤、エマルジョン等を含む、単位投薬形態を含む。そのような単位投薬形態は、安全かつ有効量の本発明の所望される成長ホルモンを含み、そのそれぞれは、一実施形態では、約０．７もしくは３．５ｍｇ〜約２８０ｍｇ／７０ｋｇ、または別の実施形態では、約０．５もしくは１０ｍｇ〜約２１０ｍｇ／７０ｋｇである。経口投与の単位投薬形態の調製物に好適な薬学的に許容される担体は、当該技術分野において周知である。いくつかの実施形態では、錠剤は、典型的に、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、マンニトール、ラクトース、およびセルロース等の不活性希釈剤、デンプン、ゼラチン、およびスクロース等の結合剤、デンプン、アルギン酸、およびクロスカルメロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、およびタルク等の潤滑剤として従来の薬学的に適合性のアジュバントを含む。一実施形態では、二酸化ケイ素等の滑剤は、粉末混合物の流動特徴を改善するために使用され得る。一実施形態では、ＦＤ＆Ｃ染料等の着色剤は、外観のために添加され得る。アスパルテーム、サッカリン、メントール、ペパーミント、および果実風味等の甘味剤および風味剤は、咀しゃく錠に関して有用なアジュバントである。カプセルは、典型的に、上記に開示される１つ以上の固形希釈剤を含む。いくつかの実施形態では、担体構成成分の選択は、本発明の目的に重要ではない味覚、費用、および貯蔵安定性のような２次的な問題により、当業者により容易に行われ得る。
【０１６０】
一実施形態では、経口投薬形態は、既定の放出プロファイルを含む。一実施形態では、本発明の経口投薬形態は、延長放出性錠剤、カプセル、ロゼンジ、または咀しゃく錠を含む。一実施形態では、本発明の経口投薬形態は、持続放出性錠剤、カプセル、ロゼンジ、または咀しゃく錠を含む。一実施形態では、本発明の経口投薬形態は、即時放出性錠剤、カプセル、ロゼンジ、または咀しゃく錠を含む。一実施形態では、経口投薬形態は、当業者に既知の薬学的活性成分の所望される放出プロファイルにより製剤化される。
【０１６１】
経口組成物は、いくつかの実施形態では、液体溶液、エマルジョン、懸濁液等を含む。いくつかの実施形態では、そのような組成物の調製に好適な薬学的に許容される担体は、当該技術分野において周知である。いくつかの実施形態では、液体経口組成物は、約０．００１％〜約０．９３３％、別の実施形態では、約０．０１％〜約１０％の所望される化合物または複数の化合物を含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法に使用するための組成物は、いくつかの実施形態では、本発明の化合物の安全かつ有効量の化合物、および任意に、局所経鼻投与を目的とする他の化合物を含む水溶液またはエマルジョンである、溶液またはエマルジョンを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約０．００１％〜約１０．０％ｗ／ｖのＣＴＰにより修飾されたＧＨ、より好ましくは約００．１％〜約２．０を含み、これは経鼻経路による化合物の全身送達のために使用される。
【０１６３】
別の実施形態では、薬学的組成物は、液体調製物の静脈内、動脈内、または筋肉内注射により投与される。いくつかの実施形態では、液体製剤は、溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、油等を含む。一実施形態では、薬学的組成物は静脈内投与され、よって静脈内投与に好適な形態に製剤化される。別の実施形態では、薬学的組成物は動脈内投与され、よって動脈内投与に好適な形態に製剤化される。別の実施形態では、薬学的組成物は、筋肉内投与され、よって筋肉内投与に好適な形態に製剤化される。
【０１６４】
さらに、別の実施形態では、薬学的組成物は、身体表面に局所的に投与され、よって局所投与に好適な形態に製剤化される。好適な局所製剤は、ゲル、軟膏、クリーム、ローション、液滴等を含む。局所投与に関して、本発明の化合物は、さらなる適切な治療薬または複数の治療薬と混合され、薬学的担体と共に、または薬学的担体を伴わずに生理学的に許容される希釈剤の溶液、懸濁液、またはエマルジョンとして調製され、適用される。
【０１６５】
一実施形態では、本発明の薬学的組成物は、当該技術分野において周知のプロセス、例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣形成、研和、乳化、カプセル封入、封入、または凍結乾燥プロセスにより製造される。
【０１６６】
一実施形態では、本発明による使用のための薬学的組成物は、活性成分の薬学的に使用され得る調製物中への処理を容易にする賦形剤および助剤を含む１つ以上の生理学的に許容される担体を用いる従来の様式で製剤化される。一実施形態では、製剤化は、投与経路による。
【０１６７】
一実施形態では、本発明の注射物は、水溶液に製剤化される。一実施形態では、本発明の注射物は、ハンクス液、リンゲル液、または生理学的塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液に製剤化される。いくつかの実施形態では、経粘膜投与に関して、透過されるバリアに適切な浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は、一般に当該技術分野において既知である。
【０１６８】
一実施形態では、本明細書に記載される調製物は、例えばボーラス注射または連続点滴による、非経口投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、注射用製剤は、単位投薬形態で、例えばアンプルまたは任意に添加された防腐剤を含む多用量容器で提示される。いくつかの実施形態では、組成物は、油中の懸濁液、溶液、もしくはエマルジョン、または水性ビヒクルであり、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤等の製剤用薬剤を含む。
【０１６９】
組成物は、いくつかの実施形態では、塩化ベンザルコニウムおよびチメロサール等の防腐剤、エデト酸ナトリウムなどのキレート化剤、リン酸塩、クエン酸塩、および酢酸塩等の緩衝剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトールなどの浸透剤、アスコルビン酸、アセチルシスチン、２亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、芳香族薬剤、セルロースおよびその誘導体を含むポリマー等の粘度調整剤、ならびにポリビニルアルコールおよび必要に応じてこれらの水性組成物のｐＨを調節するための酸および塩基も含む。組成物は、いくつかの実施形態では、局所麻酔剤または他の活性物も含む。組成物は、スプレー、ミスト、滴液等として使用され得る。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、非経口投与用の薬学的組成物は、水可溶性形態の活性調製物の水溶液を含む。加えて、活性成分の懸濁液は、いくつかの実施形態では、適切な油系または水系注射懸濁液として調製される。好適な親油性溶剤またはビヒクルは、いくつかの実施形態では、ゴマ油等の脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリド、もしくはリポソーム等の合成脂肪酸エステルを含む。水性注射懸濁液は、いくつかの実施形態では、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン等の懸濁液の粘度を増加させる物質を含む。別の実施形態では、懸濁液は、高濃度溶液の調製を可能にするために活性成分の溶解度を増加させる好適な安定剤または薬剤も含む。
【０１７１】
別の実施形態では、活性化合物は、小胞、特にリポソームで送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）、Ｔｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）、Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，ｉｂｉｄ．，ｐｐ．３１７−３２７を参照、一般的に同書を参照）。
【０１７２】
別の実施形態では、制御放出系で送達される薬学的組成物は、静脈内注射、移植可能な浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、または他の投与モード用に製剤化される。一実施形態では、ポンプが使用される（Ｌａｎｇｅｒ、上記、Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）、Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）、Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．  Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照）。別の実施形態では、ポリマー材料が使用され得る。さらに別の実施形態では、制御放出系は、治療標的、すなわち、脳に近接して設置され得、よって全身用量の画分のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、上記、ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）による概評に論じられている。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、活性成分は、使用前に好適なビヒクル、例えば減菌の発熱性物質除去蒸留水系溶液で構成するための粉末形態である。組成物は、いくつかの実施形態では、噴霧および吸入投与用に製剤化される。別の実施形態では、組成物は、噴霧手段が取り付けられた容器に含まれる。
【０１７４】
一実施形態では、本発明の調製物は、例えばココアバターまたは他のグリセリド等の従来の坐剤基材を用いて、座剤または滞留浣腸等の直腸組成物に製剤化される。
【０１７５】
別の実施形態では、本発明の内容で使用するのに適した薬学的組成物は、活性成分が意図される目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物を含む。別の実施形態では、治療有効量とは、治療される対象の疾患の症状を予防する、軽減する、もしくは寛解させる、または治療される対象の生存を延長するのに有効な活性成分の量を意味する。
【０１７６】
一実施形態では、治療有効量の決定は、十分に当業者の能力内である。
【０１７７】
薬学的に許容される担体またはその構成成分として機能することが可能である物質のいくつかの例としては、糖類（ラクトース、グルコース、およびスクロース等）、デンプン類（コーンスターチおよびジャガイモデンプン）、セルロースおよびその誘導体（カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、およびメチルセルロース）、粉末トラガント、麦芽、ゼラチン、タルク、固形潤滑剤（ステアリン酸およびステアリン酸マグネシウム等）、硫酸カルシウム、植物油（ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、およびカカオの油等）、ポリオール類（プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、および，ポリエチレングリコール等）、アルギン酸、乳化剤（Ｔｗｅｅｎ（商標）商品乳化剤等）、湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム等）、着色剤、風味剤、錠剤化剤、安定剤、抗酸化剤、防腐剤、発熱性物質除去蒸留水、等張生理食塩水、ならびにリン酸緩衝溶液である。化合物と共に使用される薬学的に許容される担体の選択は、基本的に、化合物が投与される方式によって決定される。一実施形態では、対象化合物が注射される場合、薬学的に許容される担体は、血液適合性懸濁剤を含む減菌の生理学的生理食塩水であり、そのｐＨは、約７．４に調整されている。
【０１７８】
加えて、組成物は、結合剤（例えば、アカシア、コーンスターチ、ゼラチン、カルボマー、エチルセルロース、グアーガム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン）、崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、二酸化ケイ素、クロスカメロースナトリウム、クロスポビドン、グアーガム、グリコール酸ナトリウムデンプン）、様々なｐＨおよびイオン強度の緩衝剤（例えば、トリス−ＨＣＩ、酢酸塩、リン酸塩）、表面への吸収を防止するための添加剤（アルブミンもしくはゼラチン）、洗剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、胆汁酸塩）、プロテアーゼ阻害剤、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、浸透増強剤、可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、２亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシアニソール）、安定剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒロキシプロピルメチル（ｈｙｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｙｌ）セルロース）、粘度増加剤（例えば、カルボマー、コロイド状二酸化ケイ素、エチルセルロース、グアーガム）、甘味剤（例えば、アスパルテーム、クエン酸）、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、流動補助剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）、可塑剤（例えば、ジエチルフタレート、クエン酸トリエチル）、乳化剤（例えば、カルボマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム）、ポリマーコーティング剤（例えば、ポロキサマーもしくはポロキサミ）、コーティングおよびフィルム形成剤（例えば、エチルセルロース、アクリル酸塩、ポリメタクリル酸塩）、および／またはアジュバントをさらに含む。
【０１７９】
シロップ、エリキシル剤、エマルジョン、および懸濁液用の担体の典型的な構成成分は、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、液体スクロース、ソルビトール、および水を含む。懸濁液に関して、典型的な懸濁剤は、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ（商標）、ＲＣ−５９１）、トラガントおよびアルギン酸ナトリウムを含み、典型的な湿潤剤は、レシチンおよびポリエチレンオキシドソルビタン（例えば、ポリソルベート８０）を含む。典型的な防腐剤は、メチルパラベンおよび安息香酸ナトリウムを含む。別の実施形態では、経口液体組成物は、上記に開示される甘味剤、風味剤、および着色剤等の１つ以上の構成成分も含む。
【０１８０】
組成物は、活性材料のポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル等のポリマー化合物の粒子状調製物中もしくは調製物の上、あるいはリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層、もしくは多層小胞、赤血球影、またはスフェロプラスト上への組み込みも含む。そのような組成物は、物理的状態、溶解度、安定性、生体内放出の速度、および生体内クリアランスの速度に影響を及ぼす。
【０１８１】
ポリマーによってコーティングされる粒子状組成物（例えばポロキサマーまたはポロキアミン）および組織特異的受容体、リガンド、もしくは抗原に対して向けられる抗体に結合するか、または組織特異的受容体のリガンドに結合する化合物も、本発明によって包含される。
【０１８２】
別の実施形態では、化合物は、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、またはポリプロリン等の水溶性ポリマーの共有結合により修飾される。別の実施形態では、修飾された化合物は、静脈内注射後、対応する未修飾の化合物より血液中で実質的に長い半減期を示す。一実施形態では、修飾はまた、水溶液における化合物の溶解度を増加する、凝集を排除する、化合物の物理的および化学的安定性を向上させる、ならびに化合物の免疫原性および反応性を大幅に減少させる。別の実施形態では、所望される生体内生物学的活性は、未修飾の化合物より頻度が少ない、または低用量のそのようなポリマー化合物外転（ａｂｄｕｃｔｓ）の投与により達成される。
【０１８３】
別の実施形態では、有効量または有効用量の調製物は、最初は生体外アッセイから推定され得る。一実施形態では、用量は、動物モデルにおいて製剤化され得、そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。
【０１８４】
一実施形態では、本明細書に記載される活性成分の毒性および治療有効性は、細胞培養物または実験動物における生体外の標準的な薬学的手順により決定され得る。一実施形態では、これらの生体外ならびに細胞培養物アッセイおよび動物研究から得たデータは、ヒトに使用するための投薬量の範囲を製剤化するのに使用され得る。一実施形態では、投薬量は、採用される投薬形態および利用される投与経路により変動する。一実施形態では、正確な製剤、投与経路、および投薬量は、患者の状態を考慮して、個々の医師によって選択され得る［例えば、Ｆｉｎｇｌ，ｅｔ  ａｌ．，（１９７５）"Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ"，Ｃｈ．１  ｐ．１を参照］。
【０１８５】
一実施形態では、治療される状態の重篤度および応答性により、投薬は、単回または複数投与のものであり得、治療過程は数日から数週間に及ぶか、あるいは治癒がもたらされるまで、または疾患状態の減少が達成されるまでである。
【０１８６】
一実施形態では、投与される組成物の量は、勿論、治療される対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方医師の判断等による。
【０１８７】
一実施形態では、適合性のある薬学的担体に製剤化される本発明の調製物を含む組成物が調製され、適切な容器に配置され、かつ示される状態の治療用に標識され得る。
【０１８８】
別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、全身投与を介して投与される。別の実施形態では、本明細書に記載される成長ホルモンは、静脈内、筋肉内、または皮下注射により投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾されたＧＨは、非イオン性表面活性剤（すなわち界面活性剤）、様々な糖類、有機ポリオール、および／またはヒト血清アルブミン等の複合有機賦形剤および安定剤と組み合わされた、凍結乾燥された（すなわち凍結−乾燥）調製物である。別の実施形態では、薬学的組成物は、注射用の減菌水中に、記載されるＣＴＰにより修飾された凍結乾燥されたＧＨを含む。別の実施形態では、薬学的組成物は、注射用の減菌ＰＢＳ中に、記載される凍結乾燥された成長ホルモンを含む。別の実施形態では、薬学的組成物は、注射用の減菌ｏ．９％ＮａＣｌ中に、記載される凍結乾燥された成長ホルモンを含む。
【０１８９】
別の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に記載されるＣＴＰにより修飾されたＧＨと、ヒト血清アルブミン、ポリオール、糖類、およびアニオン性表面活性安定化剤等の複合担体とを含む。例えば、ＷＯ  ８９／１０７５６（Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｏｌｙｏｌ  ａｎｄ  ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ）を参照。別の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に記載される成長ホルモンと、ラクトビオン酸と、酢酸塩／グリシン緩衝液とを含む。別の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に記載されるＣＴＰにより修飾されたＧＨと、インターフェロン組成物の水への溶解度を増加させるアルギニンまたはグルタミン酸塩等のアミノ酸とを含む。別の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に記載されるＣＴＰにより修飾された凍結乾燥されたＧＨと、グリシンもしくはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と、緩衝液（例えば酢酸塩）と、等張剤（例えばＮａＣｌ）とを含む。別の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に記載されるＣＴＰにより修飾された凍結乾燥されたＧＨと、リン酸緩衝液と、グリシンと、ＨＳＡとを含む。
【０１９０】
別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰにより修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、約４〜７．２のｐＨを有する緩衝溶液に配置されるとき、安定する。別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰにより修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、安定化剤としてアミノ酸、いくつかの場合では、塩（アミノ酸が荷電側鎖を含まない場合）により安定する。
【０１９１】
別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰにより修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、約０．３重量％〜５重量％のアミノ酸である安定剤を含む液体組成物である。
【０１９２】
別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰにより修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、投薬の正確性および製品の安全性を提供する。別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰにより修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、注射可能な用途に使用するための、生物学的に活性で安定した液体製剤を提供する。別の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に記載されるＣＴＰにより修飾された非凍結乾燥されたＧＨを含む。
【０１９３】
別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰにより修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、投与前の貯蔵および輸送を容易にする液体状態で長期間の貯蔵を可能にする液体製剤を提供する。
【０１９４】
別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰにより修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、マトリックス材料として固形脂質を含む。別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰにより修飾されたＧＨを含む注射可能な薬学的組成物は、マトリックス材料として固形脂質を含む。別の実施形態では、噴霧凝固による脂質微小粒子の生成（Ｓｐｅｉｓｅｒ  ａｎｄ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．８（１９９１）４７−５４）、続いて経口投与用の脂質ナノペレット（Ｓｐｅｉｓｅｒ、第ＥＰ０１６７８２５号（１９９０））が、Ｓｐｅｉｓｅｒにより説明された。別の実施形態では、使用される脂質は、身体に良好に忍容される（例えば、非経口栄養用のエマルジョンに存在する脂肪酸からなるグリセリド）。
【０１９５】
別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰにより修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、リポソームの形態である（Ｊ．Ｅ．Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓ  ａｎｄ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．／ｎｄ．５６（１９９４）２６７−２７５）。
【０１９６】
別の実施形態では、本明細書に記載される、ＣＴＰにより修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、ポリマー微小粒子を含む。別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰにより修飾されたＧＨを含む注射可能な薬学的組成物は、ポリマー微小粒子を含む。別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰにより修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、ナノ粒子を含む。別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰにより修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、リポソームを含む。別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰにより修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は脂質エマルジョンを含み、別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰにより修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、微小球を含む。別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰにより修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、脂質ナノ粒子を含む。別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰにより修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、両親媒性脂質を含む脂質ナノ粒子を含む。別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰにより修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、薬物、脂質マトリックス、および界面活性剤を含む脂質ナノ粒子を含む。別の実施形態では、脂質マトリックスは、少なくとも５０％ｗ／ｗであるモノグリセリド含量を有する。
【０１９７】
一実施形態では、本発明の組成物は、活性成分を含む１つ以上の単位投薬形態を含むＦＤＡ承認キット等のパックまたはディスペンサー装置において提示される。一実施形態では、パックは、例えばブリスターパック等の金属またはプラスチックホイルを含む。一実施形態では、パックまたはディスペンサー装置には、投与説明書が添付される。一実施形態では、パックまたはディスペンサーには、医薬品の製造、使用、または販売を規制する政府機関により規定された形態の容器に関連する通知書が添付され、この通知書は、組成物の形態またはヒトもしくは獣医投与の機関による承認を反映する。米国食品医薬品局により承認された、そのような通知書は、一実施形態では、処方薬物のまたは承認された製品説明書の標識である。
【０１９８】
一実施形態では、本発明のＣＴＰにより修飾されたＧＨは、各薬剤の単独での治療と比較して、改善された治療効果を達成するために、さらなる活性剤と共に個人に提供され得ることを理解する。別の実施形態では、併用療法に関連する有害な副作用に対する手段（例えば、相補的薬剤の投薬および選択）が講じられる。
【０１９９】
本発明のさらなる目的、利点、および新規特性は、制限することが意図されない次の実施例の検証により、当業者に明らかとなるであろう。加えて、以上に概説され、下の特許請求の範囲のセクションに主張される本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、次の実施例において実験的支持を得る。
【実施例】
【０２００】
一般に、本明細書に使用される命名法および本発明に利用される実験手順は、分子、生化学的、微生物学的、および組換えＤＮＡ技法を含む。そのような技法は文献に十分に説明されている。例えば、"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ"  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）、"Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ"Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ"，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  （１９８９）、Ｐｅｒｂａｌ，"Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ"，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８８）、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ"，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）"Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ"，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）、米国特許第４，６６６，８２８号、第４，６８３，２０２号、第４，８０１，５３１号、第５，１９２，６５９号、および第５，２７２，０５７号に示される方法、"Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ"，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、"Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  −  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ"ｂｙ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．  Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、"Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），"Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）、Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），"Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）、利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に記載されており、例えば米国特許第３，７９１，９３２号、第３，８３９，１５３号、第３，８５０，７５２号、第３，８５０，５７８号、第３，８５３，９８７号、第３，８６７，５１７号、第３，８７９，２６２；号、第３，９０１，６５４号、第３，９３５，０７４号、第３，９８４，５３３号、第３，９９６，３４５号、第４，０３４，０７４号、第４，０９８，８７６号、第４，８７９，２１９号、第５，０１１，７７１号、および第５，２８１，５２１号を参照、"Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）、"Ｎｕｃｌ���ｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ"Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）、"Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ"Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８４）、"Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ"Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）、"Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ"ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）、"Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ"  Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）ａｎｄ"Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ"Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、"ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ"，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）、Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ"ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照し、その全ては、参照により組み込まれる。他の一般的な参考文献は、本文書を通して提供される。
【０２０１】
実施例１    ｈＧＨ構築物の生成
【０２０２】
材料および方法
【０２０３】
４つのｈＧＨクローン（２０ｋＤタンパク質の変異体）を合成した。４つの変異体からのｈＧＨ配列を含むＸｂａＩ−Ｎｏｔ  Ｉ断片は、前にＸｂａＩ−ＮｏｔＩで消化された真核生物発現ベクターｐＣＩ−ｄｈｆｒの中に連結される。４つのクローン（４０１−０、１、２、３、および４）からのＤＮＡを調製した。２２ｋＤタンパク質からの別の部分ｈＧＨクローン（１−２４２ｂｐ）も合成された（０６０６１１４）。Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓからプライマーを注文した。本発明のＣＴＰポリペプチドにより修飾されたｈＧＨを生成するために使用されたプライマー配列は、下の表１に要約される。
【０２０４】
【表１】
2014521684.tif 000003
【０２０５】
４０２−０−ｐ６９−１（ｈＧＨ）（配列番号５）の構築。ｈＧＨは、下に記載される実験の対照として使用するために調製された野生型組換えヒト成長ホルモン（ＣＴＰなし）である。
【０２０６】
３つのＰＣＲ反応を実施した。最初の反応は、プライマー２５およびプライマー３２Ｒならびにテンプレートとして０６０６１１４のプラスミドＤＮＡ（ｈＧＨ１−２４２ｂｐの部分クローン）を用いて行われ、ＰＣＲ増幅の結果として、２４５ｂｐ生成物が形成された。
【０２０７】
第２の反応は、プライマー３３およびプライマー４Ｒならびにテンプレートとして４０１−０−ｐ５７−２のプラスミドＤＮＡを用いて行われ、ＰＣＲ増幅の結果として、５４２ｂｐ生成物が形成された。
【０２０８】
最後の反応は、プライマー２５および４Ｒならびにテンプレートとして前の２つの反応の生成物の混合物を用いて行われ、ＰＣＲ増幅の結果として、７０５ｂｐ生成物が形成され、ＴＡクローン化ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＫ２０００−０１）の中に連結された。ｈＧＨ−０配列を含むＸｂａＩ−ＮｏｔＩ断片は、真核生物発現ベクターｐＣＩ−ｄｈｆｒの中に連結された。ベクターは、ＤＧ−４４ＣＨＯ細胞内にトランスフェクトされた。細胞をタンパク質を含まない培地で成長させた。
【０２０９】
４０２−１−ｐ８３−５（ｈＧＨ−ＣＴＰ）−配列番号９および４０２−２−ｐ７２−３（ｈＧＨ−ＣＴＰｘ２）−配列番号１０の構築。ｈＧＨ−ＣＴＰは、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＣＴＰ）のβ鎖のＣ末端ペプチドの１つのコピーに縮合された組換えヒト成長ホルモンである。ｈＧＨ−ＣＴＰのＣＴＰカセットはＣ末端に結合された（１つのカセット）。ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰは、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＣＴＰ）のβ鎖のＣ末端ペプチドの２つのコピーに縮合された組換えヒト成長ホルモンである。ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰの２つのＣＴＰカセットは、Ｃ末端に結合された（２つのカセット）。
【０２１０】
ｈＧＨ−ＣＴＰおよびｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰの構築は、ｈＧＨ−０の構築と同じ方式で実施された。ｐＣＩ−ｄｈｆｒ−４０１−１−ｐ２０−１（ｈＧＨ＊−ｃｔｐ）およびｐＣＩ−ｄｈｆｒ−４０１−２−ｐ２１−２（ｈＧＨ＊−ｃｔｐ  ｘ２）は、第２のＰＣＲ反応において、テンプレートとして使用された。
【０２１１】
ｈＧＨ−ＣＴＰおよびｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰは、ＤＧ−４４ＣＨＯ細胞において発現された。細胞をタンパク質を含まない培地で成長させた。ｈＧＨは２２ｋＤのＭＷを有し、一方、各「ＣＴＰカセット」は、８．５ｋＤを全体的な分子量に寄与するため、ｈＧＨ−ＣＴＰの分子量は、約３０．５ｋＤである（図１を参照）。ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰの分子量は、約３９ｋＤである（図１を参照）。
【０２１２】
４０２−３−ｐ８１−４（ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ）−配列番号１１および４０２−４−ｐ８２−９（ＣＴＰ＊ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ）−配列番号１２の構築。ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰは、ヒト絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰのβ鎖のＣ末端ペプチドの３つのコピーに縮合された組換えヒト成長ホルモンである。ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰの３つのＣＴＰカセットは、Ｎ末端（１つのカセット）およびＣ末端（２つのカセット）の両方に結合された。ｔＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰは、ヒト絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰのβ鎖のＣ末端ペプチドの１つの切り詰められたコピーおよび２つの完全なコピーに縮合される組換えヒト成長ホルモンである。ｔＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰの切り詰められたＣＴＰカセットはＮ末端に結合され、２つのＣＴＰカセットはＣ末端に結合された（２つのカセット）。
【０２１３】
３つのＰＣＲ反応を実施した。最初の反応は、プライマー２５およびプライマー３５Ｒならびにテンプレートとしてｐ４０１−３−ｐ１２−５または４０１−４−ｐ２２−１のプラスミドＤＮＡを用いて行われ、ＰＣＲ増幅の結果として、２６５または２２０ｂｐ生成物が形成された。第２の反応は、プライマー３４およびプライマー３７ＲならびにテンプレートとしてＴＡ−ｈＧＨ−２−ｑ６５−１のプラスミドＤＮＡを用いて行われ、ＰＣＲ増幅の結果として、６９５ｂｐ生成物が形成された。最後の反応は、プライマー２５および３７Ｒならびにテンプレートとして前の２つの反応の生成物の混合物を用いて行われ、ＰＣＲ増幅の結果として、９３８または８９１ｂｐ生成物が形成され、ＴＡクローン化ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＫ２０００−０１）の中に連結された。ｈＧＨ配列を含むＸｂａＩ−Ｎｏｔ  Ｉ断片は、我々の真核生物発現ベクターｐＣＩ−ｄｈｆｒの中に連結された。
【０２１４】
ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰおよびｔＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰは、ＤＧ−４４  ＣＨＯ細胞において発現された。細胞をタンパク質を含まない培地で成長させた。ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰの分子量は約４７．５ｋＤであり（図１を参照）、ｔＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰの分子量は約４３．２５ｋＤである（図１を参照）。
【０２１５】
４０２−６−ｐ９５ａ−８（ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ）−配列番号１３の構築：ｈＧＨ−６の構築は、ｈＧＨ−３の構築と同じ方式で実施された。ｐＣＩ−ｄｈｆｒ−４０２−１−ｐ８３−５（ｈＧＨ−ｃｔｐ）は、第２のＰＣＲ反応において、テンプレートとして使用された
【０２１６】
４０２−５−ｐ９６−４（ＣＴＰ−ｈＧＨ）−配列番号１４の構築：ＰＣＲ反応は、プライマー２５およびプライマー３９ＲならびにテンプレートとしてｐＣＩ−ｄｈｆｒ−ｃｔｐ−ＥＰＯ−ｃｔｐ（４０２−６−ｐ９５ａ−８）のプラスミドＤＮＡを使用して実施され、ＰＣＲ増幅の結果として、７６３ｂｐ生成物が形成され、ＴＡクローン化ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＫ２０００−０１）の中に連結された。ｃｔｐ−ｈＧＨ配列を含むＸｂａＩ−Ｎｏｔ  Ｉ断片を我々の真核生物発現ベクターｐＣＩ−ｄｈｆｒの中に連結し、４０２−５−ｐ９６−４クローンを得た。
【０２１７】
実施例２    本発明のｈＧＨ−ＣＴＰポリペプチドの生体内生物活性試験
【０２１８】
次の実験は、市販の組換えヒトＧＨおよびｈＧＨと比較して、ｈＧＨ−ＣＴＰポリペプチドの持続型生物学的活性の可能性を試験するために実施された。
【０２１９】
材料および方法
【０２２０】
雌の下垂体切除されたラット（６０〜１００ｇ）は、２１．７μｇのｈＧＨ−ＣＴＰポリペプチドの皮下注射を毎週、または５μｇの対照の市販ｒｈＧＨの皮下注射を１日１回受けた。
【０２２１】
体重は、治療前、第１の注射２４時間後、そして２１日目の研究の最後まで２日に１回、全ての動物において測定された。各点は、群の平均体重増加パーセンテージ（（体重０日目−体重最終日）／体重０日目）を表す。平均体重増加は、市販のｈＧＨの１日１回の注射に対して基準化された。治療スケジュールは表２に要約される。
【０２２２】
【表２】
2014521684.tif 000004
【０２２３】
結果
【０２２４】
結果は図２に要約される。これらの結果は、ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ（配列番号１１）およびｔＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ（配列番号１２）が１００％の体重増加を誘発した市販のｒｈＧＨと比較して、１２０％を超える体重増加を誘発したことを示す。
【０２２５】
結論
【０２２６】
２１．７μｇのＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ（配列番号１１）およびｔＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ（配列番号１２）の３回の１週間に１回の用量（注射日：１、７、および１３）は、５μｇの用量で１３日間１日１回投与された同じ蓄積用量で注射された市販のｒｈＧＨと比較して、下垂体切除されたラットにおいて３０％のより大きな体重増加を誘発した。
【０２２７】
実施例３    ＣＴＰ修飾ＧＨの薬物動態研究
【０２２８】
単回用量の薬物動態研究は、スプラーグドーリーラットで行われた。全ての動物実験は、動物福祉法（Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｃｔ）の動物実験に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）により、およびＭｏｄｉｇｅｎｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｌｔｄ．の施設内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓの）監視および承認のもと、行われた。ラットは、個別に、または１ケージに２匹のいずれかで、１２時間の明／暗周期の部屋のケージに入れられた。水（自治体の給水）およびゲッ齒類固形飼料へのアクセスは自由であった。
【０２２９】
ラットにおけるＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰおよびＧＨの薬物動態を比較するために、１群に雄３〜６匹で、スプラーグドーレイラット（２７０〜２９０ｇ）を４つの群に分けた。ラットは、無作為に４つの治療群に割り当てられた（表３を参照）。ラットは、ＧＨ（５０μｇ／ｋｇ静脈内もしくは皮下）またはＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ（１０８μｇ／ｋｇ静脈内もしくは皮下）の単回の皮下または静脈内注射を投与された。イソフラン麻酔下で採取された投与前サンプルを除き、血液採取は、麻酔なしの動物において実施された。血液サンプル（約０．２５ｍｌ）は、表３に要約される時間で、ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ血漿濃度のＥＬＩＳＡ分析用にＥＤＴＡコーティングされたマイクロタイナーに採取された。各サンプル採取後、血液容量は、等容量の減菌０．９％生理食塩水と交換された。サンプルは、遠心分離および血漿採取１時間前に最大１時間氷上で保管された。血漿サンプルは、分析前に約−２０℃で保管された。
【０２３０】
【表３】
2014521684.tif 000005
【０２３１】
ヒト成長ホルモンの検出専用の市販のサンドウィッチＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）は、ラット血漿サンプルの評価に使用された。このキットは、抗体サンドウィッチＥＬＩＳＡ形式の手段により血漿中のヒト成長ホルモを検出する。このキットは、最初は、ラット血漿中のＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰの濃度を測定するために使用された。これらの血漿サンプルに関して、ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ標準曲線（１．２〜１００ｎｇ／ｍｌ）が使用され、ラット血漿中のＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰの濃度は、この曲線から内挿された。
【０２３２】
クリアランス（ＣＬまたはＣＬ／Ｆ）、分布の容量（ＶｄもしくはＶｄ／Ｆ）、半減期（ｔ１／２）、血漿濃度曲線下面積対時間曲線下面積（ＡＵＣ）、観察された最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）、および観察された最大血漿濃度までの時間（Ｔｍａｘ）を含む標準的な薬物動態パラメータは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎのモデル化プログラム（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、バージョン３．１）を用いて、非コンパートメント分析により、血漿アルブトロピン（ａｌｂｕｔｒｏｐｉｎ）またはＧＨ濃度／時間曲線から得られた。血漿ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰまたはＧＨ濃度データは、この分析に関して、均一に加重された。ＡＵＣは、静脈内データに関しては、対数線形台形分析、そして皮下データに関しては線形アップ／対数ダウン台形法を用いて計算された。各ラットまたはサルの血漿濃度プロファイル（皮下アルブトロピンデータを除く）は、個々に分析され、薬物動態パラメータの平均±標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）値は、表４および図４に報告される。
【０２３３】
ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰは２７５個のアミノ酸、および最大１２のＯ結合炭水化物の１本鎖タンパク質である。構造は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のβ鎖のＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）の３つのコピーに結合される修飾されたヒト成長ホルモン（Ｓｏｍａｔｒｏｐｉｎ）からなり、１つのコピーはＮ末端で結合され、２つのコピー（タンデムで）はＣ末端で結合される。ヒト成長ホルモンは、１９１個のアミノ酸からなる。ＣＴＰは、２８個のアミノ酸および４つのＯ−結合糖鎖からなる。
【０２３４】
実施例４    ＳＤラットにおけるＣＴＰ修飾ＧＨの薬物動態
【０２３５】
ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰの薬物動態が評価され、市販のｈＧＨ（バイオトロピン）と比較された。
【０２３６】
【表４】
2014521684.tif 000006
【０２３７】
データ統計分析
【０２３８】
血清サンプルの分析は、各サンプルの比濃度レベルを決定するために行われた。濃度および時間点データは、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ非コンパートメント分析を用いて処理された。
【０２３９】
決定されたパラメータは、ＡＵＣ、ＭＲＴ、ｔ１／２、Ｃｍａｘ、およびＴｍａｘを含んだ。図４は、ラット（用量／経路当たりｎ＝３〜６）におけるＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰまたはＧＨの単回静脈内もしくは皮下用量後のＧＨ濃度（ｐｇ／ｍｌ）と比較した、ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ血漿濃度の優れた薬物動態プロファイルを示す。
【０２４０】
５０μｇ／ｋｇの単回皮下注射後、ＳＤラットの血液からのＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰのクリアランスは、ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰおよびバイオトロピンよりも非常にゆっくりであった。対応する計算された半減期時間およびＡＵＣは、
バイオトロピン     Ｔ１／２  １．７時間    ＡＵＣ    ４１時間＊ｎｇ／ｍＬ
CTP-hGH-CTP        Ｔ１／２  ８．５時間    ＡＵＣ  ４２４時間＊ｎｇ／ｍＬ
CTP-hGH-CTP-CTP    Ｔ１／２  ９．０時間    ＡＵＣ  ６８０時間＊ｎｇ／ｍＬ
であった。
【０２４１】
結論
【０２４２】
ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰは、他の６つの変異体中最終候補として選択された。ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰは、生物学的活性および薬物動態に関して優れた性能を示した。
【０２４３】
実施例５    単回用量／反復用量のＣＴＰ修飾ＧＨの体重増加アッセイ（ＷＧＡ）
【０２４４】
下垂体切除された（両耳間法）雄の３〜４週齢のラットをＣＲＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。３週間の術後馴化期間中、擬似手術ラットと類似する体重増加により明らかである下垂体切除が不完全であると考えられる動物を除くために、ラットを検査し、１週間に２回体重を量った。下垂体切除が不完全なこれらのラットは、研究から除かれた。下垂体切除されたラットの平均体重は、実験の時点で７０〜９０グラムであった。これは、ｈＧＨの標準的なＵＳＰおよびＥＰバイオアッセイである。下垂体切除されたラット（下垂体が除去されたラット）は、体重を増加させる能力を失う。ｈＧＨ（およびＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ）のこれらのラットへの注射は、体重増加をもたらす。所定の時間期間に沿った測定された体重増加および注射されたｈＧＨの量に基づき、ｈＧＨ（およびＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ）の比活性が決定される。ラットは、４日間隔で３週間、０．４、０．８、および４ｍｇ／Ｋｇの単回皮下用量または０．６および１．８ｍｇ／Ｋｇの反復皮下用量を投与された。全動物の個々の体重は、無作為、最初の投薬前、その後２日毎、または死亡した場合、死亡時、および殺処理前に決定された。
【０２４５】
単回用量および反復用量体重増加アッセイ
【０２４６】
下垂体切除されたラットにおけるＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰの異なる投薬パターン後の全身成長応答を比較した結果は、図５に示される。結果は、０．４および０．８ｍｇ／Ｋｇ／日用量のｈＧＨ−ＣＴＰの単回注射が、０．１ｍｇ／Ｋｇ／日のバイオトロピンの４日間の１日１回の注射と等しかったことを示す。ｈＧＨ−ＣＴＰ作用のピークは、２日後であった。
【０２４７】
図６は、ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰの単回注射後の曲線下面積がラットにおける体重増加と相関することをさらに示す。よって、集合データは、体重増加が累積ＡＵＣと密接に相関することを示す。
【０２４８】
４日間隔で投与されたｈＧＨ−ＣＴＰ構築物は、図７に示されるバイオトロピンの毎日の注射と同じ体重増加を促進する。ヒトにおけるｈＧＨの半減期は、ラットより５倍良いと予想される、つまり、１回の単回注射に関して、ヒトにおいて１０日後に潜在的なピーク作用を示す。これらの結果は、ヒトにおける１週間に１回または２週間に１回のｈＧＨ−ＣＴＰ構築物ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰの投与を支持する。
【０２４９】
実施例６    ＣＴＰ修飾ＧＨの約力学／薬物動態研究
【０２５０】
下垂体切除された（両耳間法）雄の３〜４週齢のラットをＣＲＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。３週間の術後馴化期間中、擬似手術ラットと類似する体重増加により明らかである下垂体切除が不完全であると考えられる動物を除くために、ラットを検査し、１週間に２回体重を量った。下垂体切除が不完全なこれらのラットは、研究から除かれた。下垂体切除されたラットおよび偽ラットの平均体重は、実験時、それぞれ、７０および１５０ｇであった。
【０２５１】
ラットは、ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ、ビヒクル、ヒト成長ホルモンＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ、またはヒト成長ホルモンを単回皮下投与され（２０μｇ／ラット）、０．２ｍｌ／ラットの注射容量で皮下投与された。ＧＨの用量は０．３５および１．０５μｇ／Ｋｇであり、対応する０．６および１．８μｇ／Ｋｇ用量のＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ中のＧＨ量と等モルである成長ホルモンの用量であった。治療群は表４に要約される。注射後、ＩＧＦ−１分析用の血漿サンプルを表５に記載される時間に得た。サンプルは、市販のＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステム）を用いてＩＧＦ−１濃度に関して分析された。
【０２５２】
ＣＴＰ修飾ｈＧＨの毎週投与は、標準ＧＨのように正常な範囲内にＩＧＦ−Ｉを維持するのに成功し、加えて標準的なＧＨのように体重も維持する。
【０２５３】
【表５】
2014521684.tif 000007
【０２５４】
非コンパートメント薬物動態分析は、各群の平均血清濃度対時間曲線に対して実施された。ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ  Ｃｍａｘは、バイオトロピンＣｍａｘより非常に高かった。ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰの最終半減期は、バイオトロピンより６倍高かった。
【０２５５】
【表６】
2014521684.tif 000008
【０２５６】
ＡＵＣ０−ｔおよびＡＵＣ０−∞は、非常に類似し、サンプル採取の期間は、薬物動態プロファイルを特徴付けるのに適切であったことを示唆する。ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰのＡＵＣは、バイオトロピンより１０倍高かった。さらに、Ｃｍａｘは、一般に用量に比例し、ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰに関して、バイオトロピンのＣｍａｘより２倍高かった。しかしながら、図８に示されるように、ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰのＴｍａｘは、バイオトロピンの０．５時間と比較して８時間であり、最終半減期は、用量レベルと共に変動するようには思えなかった。ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰのＴ１／２は、バイオトロピンより６．８倍長かった。
【０２５７】
ＧＨの間接的作用は、主に、成長ホルモンに応答して肝臓および他の組織から分泌されるホルモンであるインスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）により媒介される。成長ホルモンの成長促進作用の大半は、実際、その標的細胞に対するＩＧＦ−Ｉ作用による。したがって、下垂体切除されたラットにおけるＩＧＦ−１血清レベルに対するＣＴＰ−ｈＧＨ構築物、ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰの作用が測定された。図９は、ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰおよび市販のｈＧＨの皮下注射後の下垂体切除されたラットにおけるＩＧＦ−１血清レベルの結果を提示する。
【０２５８】
ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ０．６または１．８ｍｇ／Ｋｇおよびバイオトロピン０．３５または１．０５ｍｇ／Ｋｇの単回用量は、ＰＫ／ＰＤプロファイルを決定するために、下垂体切除されたラットに皮下注射された。注射後の血清ＩＧＦ−Ｉが、特定のＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて測定された。
【０２５９】
ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰの注射後のＩＧＦ−Ｉの累積血清レベルは、バイオトロピンの注射後より非常に高かった。Ｃｍａｘは、一般に用量に比例し、ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰに関して、バイオトロピンのＣｍａｘより３〜４倍高かった。ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰのＴｍａｘは、バイオトロピンの２０〜２４時間と比較して、３６〜４８時間であった。結論として、血清における高ｈＧＨレベルおよび長期存在は、ＩＧＦ−１レベルの大幅な増加をもたらす。
【０２６０】
実施例７    ＣＴＰ修飾ＧＨの炭水化物含量およびシアル酸含量
【０２６１】
Ｏ−グリカンの分析は、Ｐｒｏｚｙｍｅキットに基づく。Ｏ−グリカンは、化学的および酵素的にタンパク質から切断され、ペーパークロマトグラフィーを用いてペプチドから単離される。Ｏ−グリカンプールの配列決定は、標準と比較して、連続酵素消化（エキソグリコシダーゼ）、続くＨＰＬＣ分析により行われた。
【０２６２】
配列分析によるグリコプロファイリング
【０２６３】
グリコプロファイリングは、Ｌｕｄｇｅｒ  Ｌｔｄにより行われた。２つのサンプル（ＥＮ６４８およびＲＳ０７０８）は、３つ組放出を通して取得され、各放出は３つ組でＨＰＬＣによっても分析された。ＥＮ６４８およびＲＳ０７０８の３つ組の３００μｇサンプルならびにクエン酸塩／塩化ナトリウム緩衝液＋正の対照フェチュイン（２５０μｇ）および１００μｌの水の負の対照の単一の１００μｌのサンプルは、緩衝液を水と取り換えるために、１０，０００Ｄａの分子量カットオフ膜を用いて遠心分離することにより限界濾過され、Ｏモード条件下（６０oＣで６時間）、ヒドラジン分解を通して取得された。放出されたグリカンは、再Ｎアセチル化され、ＬｕｄｇｅｒＣｌｅａｎ  ＣＥＸカートリッジにより浄化された。放出されたグリカンのアリコートは、次に２−アミノベンズアミド（２ＡＢ）で標識され、Ｌｕｄｇｅｒ  Ｃｌｅａｎ  Ｓカートリッジで浄化され、ＬｕｄｇｅｒＳｅｐ−Ｎ２  ＨＩＬＩＣ−ＨＰＬＣにより分析された。
【０２６４】
単糖類含量
【０２６５】
中性単糖類の分析は、グリカンをその構成要素単糖類構成成分に加水分解することを必要とする。加水分解は、無傷糖タンパク質サンプルで、Ｌｕｄｇｅｒ  Ｌｔｄにより行われた。具体的には、５０μｇの無傷糖タンパク質を、酸加水分解し、２−ＡＢ（２−アミノベンズアミド）標識し、逆相ＨＰＬＣカラムにかけられた。この方法は、ＮおよびＯ連結型を含む糖タンパク質上に存在する全てのグリカンを加水分解する。
【０２６６】
シアル酸プロファイリング
【０２６７】
２つのサンプル（ＥＮ６４８およびＲＳ０７０８）および緩衝対照を分析した。シアル酸分析は、単糖類の適度の酸放出、続いてＤＭＢフルオロフォア標識およびＬｕｄｇｅｒＳｅｐ−Ｒ１カラム上でのＨＰＬＣ分析を必要とする。５０μｇの無傷糖タンパク質を各分析用に酸加水分解した。
【０２６８】
ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰの糖分析
【０２６９】
【表７】
2014521684.tif 000009
【０２７０】
単糖類プロファイルは、ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰ糖タンパク質サンプルがＯリンク型グリカンを主に含むことを示す。主なＯ−グリカンピークは、シアル酸付加されたコア１（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ）である。主なシアル酸はＮｅｕ５Ａｃであり、３〜４％のジアセチル化シアル酸Ｎ−アセチル−９−Ｏ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５，９Ａｃ２）および１％未満のＮ−グリコリルノイラミン酸の存在を示唆するいくつかの少数のピークが存在する。少量のＮｅｕ５Ａｃα２−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃも存在する。
【０２７１】
実施例８    アカゲザルにおけるＣＴＰ修飾ＧＨの薬物動態／毒性動態分析
【０２７２】
各動物に関して血清濃度対時間曲線を生成した。非コンパートメント分析は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎプロフェッショナルバージョン５．２．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｔ  Ｖｉｅｗ  ＣＡ．）で行われた。推定される薬物動態パラメータは下の表８に示される。
【０２７３】
【表８】
2014521684.tif 000010
【０２７４】
ＡＵＣ０−ｔおよびＡＵＣ０−∞は、非常に類似し、サンプル採取の期間は、薬物動態プロファイルを特徴付けるのに適切であったことを示唆する。Ｃｍａｘは用量に比例した。Ｔｍａｘは高用量で遅かった。Ｔｍａｘは、低用量群の全動物に関して４時間であり、高用量群においては８または２４時間であった。最終半減期は２つの用量群に関して類似する。
【０２７５】
ＡＵＣは用量にほぼ比例するが、低用量と比較して、ＣＬ／ＦおよびＶｚ／Ｆに関してわずかに低い推定を生成する高用量で比例ＡＵＣよりわずかに大きい。ＣＬおよびＶｚが高用量で低い、またはＦが低用量で低いかを述べることは不可能である。群間で重なりがあるため、これがＣＬ／ＦおよびＶｚ／Ｆにおいて有意差を表すかは疑問である。
【０２７６】
モデルにより推定された薬物動態パラメータは、非コンパートメント分析のものと非常に類似した。吸収および排出半減期は下の表９に示される。
【０２７７】
【表９】
2014521684.tif 000011
【０２７８】
データは、排出速度は群間で極めて類似するが、Ｔ１／２排出が低用量群においてわずかに長いことを示す。しかしながら、吸収は、１．８ｍｇ／ｋｇの投与後と比較して、９０ｍｇ／ｋｇの皮下投与後、５倍超ゆっくりである。非コンパートメント分析の場合のように、モデル化は、高用量で遅いＴｍａｘを示した。
【０２７９】
ＧＨの補足は、小児および成人のＧＨ欠乏の治療に有効であるが、長期間にわたる毎日の注射の欠点は、ある患者集団における医師によるその使用を制限し、また投薬ミスのリスク、介護者の数、治療の費用、および／ノンコンプライアンスを増加させる。処方されたＧＨ投薬レジメンに従わない影響を理解することができない低身長の小児等のある集団において、ＧＨ療法による最適な利益を達成するために、コンプライアンスの必要性は特に重要である。毎日のＧＨ注射のより好適な代替えの発見およびそれに続くコンプライアンスの問題は、ＧＨ欠乏小児がＧＨ治療を継続して必要とする成人に移行する場合、さらに重要さを増す。毎日の療法の必要性は、組換えＧＨの短い血漿半減期によるところが大きく、ＧＨの持続放出形態の開発を導いた（Ｒｅｉｔｅｒ  ＥＯ．Ａｔｔｉｒｅ  ＫＭ．，Ｍａｓｈｉｎｇ  ＴＪ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ＢＬ．Ｋｅｍｐ  ＳＦ．Ｎｅｏｌｉｔｈ  ＲＢ．Ｆｏｒｄ  ＫＭ．  ａｎｄ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｐ．  Ａ  ｍｕｌｔｉｍｅｍｂｅｒ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ＧＨ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎａｉｖｅ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＧＨ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８６（２００１），ｐｐ．４７００−４７０６．）。
【０２８０】
本明細書に提供される、組換えヒト成長ホルモン−ＣＴＰ融合タンパク質ＧＨ−ＣＴＰは、ラットにおいて、持続期間がＧＨより長い薬物動態プロファイルを有する。この独特の薬物動態プロファイルは、それぞれ、成長および血漿ＩＧＦ−１レベルの上昇により示されるように、成長ホルモン欠乏ラットにおいて、薬力学的作用を達成するために、ＧＨ−ＣＴＰの間欠投与を可能にする。
【０２８１】
ＧＨ−ＣＴＰは、ラットにおいて皮下投与されたとき、ＧＨと比較して、優れた薬物動態プロファイルを提供する。ＧＨと比較して、ＧＨ−ＣＴＰの血漿クリアランスにおいて実質的な差がある。具体的には、血漿は、皮下投薬後、ＧＨより６倍超ゆっくりＧＨ−ＣＴＰ除去される。ＧＨ−ＣＴＰの最終半減期および平均滞留時間は、皮下投与後、ラットにおいて、ＧＨよりほぼ６倍長かった。加えて、皮下投薬後のＣｌ／Ｆは、ＧＨ−ＣＴＰにおいて、ＧＨより１０倍低かった。
【０２８２】
薬物動態が薬力学的効果があるラットにおいて役立つかを検査するために、ＧＨ−ＣＴＰが毎日より少ない頻度の投薬レジメンでＧＨ欠乏の下垂体切除されたラットの成長を刺激するかもしれないという可能性が、等モルＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰおよびＧＨ用量レベルで試験された。ＧＨ−ＣＴＰの単回皮下注射は、ＧＨの４日間の毎日連続注射と等しい漸進的体重増加を促進した。加えて、ＧＨ−ＣＴＰの４日毎の投与は、ＧＨに対して向上された体重増加を示す。
【０２８３】
薬力学的に、下垂体切除されたラットにおけるＧＨに対するＧＨ−ＣＴＰの長い循環時間は、単回皮下注射後の血液血漿において測定されたＩＧＦ−１応答の延長をもたらす。単回用量のＧＨ−ＣＴＰの皮下投与は、下垂体切除ラットにおいて、用量依存様式で、循環ＩＧＦ−１濃度を増加させた。最高アルブトロピン用量で、ＩＧＦ−１濃度は、単回投与後７５時間もの間、基準を上回って上昇した。よって、単回用量のＧＨ−ＣＴＰの向上された循環時間は、単回用量のＧＨに対して実質的な薬力学的改善をもたらし、標準的なＧＨ治療レジメンと比較して、投薬頻度を減少させながら、類似する成長向上および体脂肪の減少を提示し得る可能性を高める。
【０２８４】
アカゲザルにおいては９０ｍｇ／ｋｇ、そしてラットにおいては１８０ｍｇ／ｋｇの単回ＣＴＰ修飾ｈＧＨ用量は、両種において十分に忍容された。これらの動物におけるタンパク質の予測されたクリアランスに基づくラットと霊長類との間の相対成長係数は、約×２である。治療用タンパク質の業界により承認されている外挿モデルと一致して、半減期は種間で増加するＩ（ＦＤＡ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ）。霊長類の９０ｍｇ／ｋｇは、ラットの１８０ｍｇ／ｋｇのＣＴＰ修飾ｈＧＨよりわずかに良好なＰＫプロファイルを有する。よって、ヒトへの相対成長外挿は、１週間に１回または１回／２週の注射を支持する。
【０２８５】
ＣＴＰ−ＧＨ構築物を利用する本概念は、市販のＧＨ組換え生成物と比較して投薬頻度を減少させた。Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  Ｄｅｐｏｔ（登録商標）は、小児集団における使用を承認したＧＨの持続放出性製剤であるが、既存対照との比較は、１年および２年の成長速度が、ＧＨで治療された小児（１年の成長速度１０．１±２．８ｃｍ／年）の小児より、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  Ｄｅｐｏｔ（登録商標）を与えられた小児（１年の成長速度８．２±１．８  ｃｍ／年）において大幅に低い（ｐ＜０．００１）ことを明らにした（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ＢＬ．Ｂｌｅｔｈｅｎ  ＳＬ．Ｒｅｉｔｅｒ  ＥＯ．  Ａｔｔｉｅ  ＫＭ．Ｎｅｕｗｉｒｔｈ  ＲＢ．  ａｎｄ  Ｆｏｒｄ  ＫＭ．Ａ  ｌｏｎｇ−ａｃｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  （Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  Ｄｅｐｏｔ（登録商標））：ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｗｏ  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｊ．  Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．１５（２００２），ｐｐ．７１５−７２２．）。皮下投与されたＮｕｔｒｏｐｉｎ  Ｄｅｐｏｔ（登録商標）の局所作用は、小塊、紅斑、注射部位の痛み、頭痛、および嘔吐を含む。ラットおよびサルの両方における前臨床毒物学研究は、ＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰの皮下投与がビヒクルと比較して局所反応を生成しないことを示した。低頻度のＧＨの投与形態の医学的必要性を考えると、ラットにおける本研究のＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰの薬理学的性質は、この生成物が毒物学および患者コンプライアンスに関しても好ましいことを示唆する。ラットにおけるＣＴＰ−ｈＧＨ−ＣＴＰ−ＣＴＰの維持された活性は、現在毎日の投薬で達成されている治療利益を得るために、間欠投与のみを必要とする薬剤としてのその潜在的な実用性を支持する。
【０２８６】
実施例９    ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ−ＣＴＰ）の持続型ＣＴＰ修飾された型は成長ホルモン欠乏成人において高度に有効であった−第ＩＩ相臨床試験
【０２８７】
無作為化非盲検第ＩＩ相臨床試験は、現在毎日成長ホルモンの注射を受容している患者において、毎週、または１ヶ月に２回のいずれかで注射されるｈＧＨ−ＣＴＰの安全性、忍容性、薬物動態、および薬力学的性質を評価するために行われた。試験は、６カ国の多数の施設で行われた。試験の３つの主なコホートは、成長ホルモン欠乏成人患者が毎日注射の形態で７日間にわたり受容する当量累積市販ｈＧＨ用量の３０％、４５％、または１００％を含む単回毎週用量のｈＧＨ−ＣＴＰを受容した（それぞれ、「３０％」、「４５％」、および「１００％」コホートと称される）。データは、各コホートに１３人の３９人の患者の結果を反映する。各コホートに女性２人を含んだ。
【０２８８】
３つの主なコホートに加え、成長ホルモン欠乏成人は、正式な第ＩＩ相試験の外で行われる実験的な第４のコホートに参加した。実験的な第４コホートの患者は、成長ホルモン欠乏成人患者が毎日注射の形態で２週間の期間にわたって受容する累積市販用量の５０％を含むｈＧＨ−ＣＴＰの単回注射を２週間に１回受容する。
【０２８９】
ｈＧＨ−ＣＴＰの単回毎週注射を受容する３つの主なコホートの有効性は、７日間にわたって（研究の治療の最終週中）、所望される治療範囲内のインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）レベルを毎日測定することにより定義される。所望される治療範囲は、年齢群および性別によって層別化される、正常な集団において予想される平均ＩＧＦ−１レベルから＋２標準偏差〜−２標準偏差として定義される。加えて、試験は、正常範囲内の患者の分散を観察する目的のため、＋／−１．５標準偏差の狭い範囲内のＩＧＦ−１レベルを測定した。
【０２９０】
結果
【０２９１】
表１０は、正常な集団の平均ＩＧＦ−１レベルからの標準偏差で表された、最終治療週中に測定された、男性の正常な治療範囲内（＋／−２ＳＤ）の日数の平均パーセント、狭い正常治療範囲内（＋／−１．５ＳＤ）の日数の平均パーセント、およびＩＧＦ−１の平均Ｃｍａｘ（最高濃度レベル）を含む。
【０２９２】
【表１０】
2014521684.tif 000012
【０２９３】
成人患者が通常初期治療用量として処方されるであろう累積毎週ｈＧＨ用量の５０％を含む１週間当たり２ｍｇのｈＧＨ−ＣＴＰは、成人第ＩＩＩ相において、男性および女性の開始用量として定義される可能性が高い。
【０２９４】
安全性および／または忍容性問題のエビデンスはなく、高用量で使用されたとき、ｈＧＨ−ＣＴＰが患者において過剰なレベルのＩＧＦ−１、または正常範囲をも上回るレベルを誘発する兆候はなかった。
【０２９５】
本発明のある特性が本明細書において図示され、説明されたが、当業者は、今や多くの修正、置換、変更、および等価物に気が付くだろう。したがって、付属の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨内に入る全てのそのような修正および変更を網羅することが意図されることを理解する。
【図１】
2014521684.tif 000013
【図２】
2014521684.tif 000014
【図３】
2014521684.tif 000015
【図４Ａ】
2014521684.tif 000016
【図４Ｂ】
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【図５】
2014521684.tif 000018
【図６】
2014521684.tif 000019
【図７】
2014521684.tif 000020
【図８】
2014521684.tif 000021
【図９】
2014521684.tif 000022
【配列表】
2014521684000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年3月31日(2014.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象において体重減少を誘発するか、または体脂肪を減少させるための薬剤の調製のための治療有効量のポリペプチドの使用であって、
前記ポリペプチドが、
成長ホルモンと、
前記成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、
前記成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰとを含むことを特徴とする使用。
【請求項２】
少なくとも１つのＣＴＰが、グリコシル化されていることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
少なくとも１つのＣＴＰが、切り詰められていることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項４】
少なくとも１つのＣＴＰが、リンカーを介して前記成長ホルモンに結合されていることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記リンカーが、ペプチド結合であることを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項６】
ヒト対象においてインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）レベルを増加させるための薬剤の調製のための治療有効量のポリペプチドの使用であって、
前記ポリペプチドが、
成長ホルモンと、
前記成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、
前記成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰとを含むことを特徴とする使用。
【請求項７】
ヒト対象において成長ホルモンの投薬頻度を減少させるための薬剤の調製のための治療有効量のポリペプチドの使用であって、
前記ポリペプチドが、
成長ホルモンと、
前記成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、
前記成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰとを含むことを特徴とする使用。
【請求項８】
小児または青年であるヒト対象において、成長または体重増加を誘発するための薬剤の調製のための治療有効量のポリペプチドの使用であって、
前記ポリペプチドが、
成長ホルモンと、
前記成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、
前記成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰとを含むことを特徴とする使用。
【請求項９】
少なくとも１つのＣＴＰが、グリコシル化されていることを特徴とする請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
少なくとも１つのＣＴＰが、切り詰められていることを特徴とする請求項８に記載の使用。
【請求項１１】
少なくとも１つのＣＴＰが、リンカーを介して前記成長ホルモンに結合されていることを特徴とする請求項８に記載の使用。
【請求項１２】
前記リンカーが、ペプチド結合であることを特徴とする請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
対象においてインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）レベルを正常な治療範囲内に維持するための薬剤の調製のための治療有効量のポリペプチドの使用であって、
前記ポリペプチドが、
成長ホルモンと、
前記成長ホルモンのアミノ末端に結合される１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、
前記成長ホルモンのカルボキシ末端に結合される２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰとを含むことを特徴とする使用。
【請求項１４】
少なくとも１つのＣＴＰの配列が、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列によってコードされることを特徴とする請求項１、６、７、８、および１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、シグナルペプチドをさらに含むことを特徴とする請求項１、６、７、８、および１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
前記シグナルペプチドが、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記成長ホルモンが、１週間に１回または２週間に１回投与されることを特徴とする請求項１、６、７、８、および１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
前記成長ホルモンが、０．０５〜７．２ｍｇ／投与の用量で投与されることを特徴とする請求項１、６、７、８、および１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
前記成長ホルモンが、約２ｍｇ／投与の用量で投与されることを特徴とする請求項１、６、７、８、および１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
前記成長ホルモンが、約４ｍｇ／投与の用量で投与されることを特徴とする請求項１、６、７、８、および１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
前記成長ホルモンが、約１．２ｍｇ／投与の用量で投与されることを特徴とする請求項１、６、７、８、および１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
前記成長ホルモンが、前記対象に皮下投与されることを特徴とする請求項１、６、７、８、および１３のいずれか１項に記載の使用。
【国際調査報告】
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