(57)【要約】  アンドロゲン性脱毛症の治療において、ミノキシジル応答を比色分析に基づいて予測する方法、プロセス、システム及び装置が開示されている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンドロゲン性脱毛症に罹患している被験者のための治療を選択する方法であって、
前記被験者から、１つ又は複数の毛包又は頭皮の生検サンプルを取得するステップ；
前記サンプル中のミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性を測定するための分析を行い、それにより、前記サンプル中のミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性レベルを示す活性値を生成するステップ；
前記活性値を１つ又は複数の標準活性値と比較するステップであって、各標準活性値は、前記被験者を含む患者群について毛髪の再成長又は維持に関して予期されるミノキシジル応答が高いか低いかを表しており、それにより、特定のミノキシジル投与量での前記被験者の毛髪の再成長又は維持に関して予期されるミノキシジル応答が高いか低いかについて指示を作成するステップ；及び
前記被験者に前記指示を伝達するステップ
を備える方法。
【請求項２】
前記指示が、毛髪の再成長又は維持に関して高いミノキシジル応答が予測されるというものであり、前記特定のミノキシジル投与量が、約2％の局所用溶液、約5％の局所用溶液、約2％の局所用フォーム、約5％の局所用フォーム、約2.5mgの錠剤及び約5mgの錠剤から成る群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分析が、
前記１つ又は複数の毛包又は頭皮の生検を、pHが約6.5から約8.0の間の約50mMのリン酸カリウム緩衝剤、約5mMの塩化マグネシウム、約20μMのアデノシン3’,5’‐二リン酸（PAP）又はアデノシン3’-リン酸5’-ホスホ硫酸（PAPS）、約5mMの硫酸p-ニトロフェニル及び約0.1mMのミノキシジルを含む反応混合物中に配置するステップ；
前記反応混合物を混合するステップ；
前記反応混合物を所定の長さにわたりインキュベートするステップ；及び
前記反応を停止させるステップ
を備える請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記リン酸カリウム緩衝剤が約8.0のpHを有する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
pH約8.7の約0.25Mトリス塩酸の塩基性緩衝剤を前記反応混合物に加え、比色分析を停止して前記分析の感度を改善する請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記反応混合物を約37℃で約4時間から約16時間にわたりインキュベートする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記反応混合物を室温でインキュベートする請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記反応混合物を室温を超える温度でインキュベートし、染料のターンオーバー及び前記比色分析のシグナル強度を増大する請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記比較のステップを、コンピュータ又はニューラルネットワークにより実行する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ又は複数の標準値は、１つ又は複数のミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性レベルであり、他の被験者の統計サンプルが、特定のミノキシジル投与量での毛髪の再成長又は維持に関するミノキシジル応答が高いか低いかを示す請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記伝達のステップが電子信号の送信を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記分析が指示染料を用いる比色分析である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記比色分析が代替的な指示染料を用い、前記ミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性レベルを決定する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記比色分析が基質として2-ナフトールを用い、前記分析の感度又は特異性を改善する請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
１つの毛包が前記分析において用いられる請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
１つ又は複数の毛包を用いており、前記分析のための反応時間が前記反応における毛包の数に逆相関する請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
高いミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性を有する患者が低用量のミノキシジル及び／又はミノキシジルの適用頻度の減少を処方される請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
低いミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性を有する患者が高用量のミノキシジル及び／又はミノキシジルの適用頻度の増大を処方される請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
低いミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性を有する患者がクリーム、溶液及び／又はゲルの形態で安定化した形態の硫酸ミノキシジルを処方される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
硫酸ミノキシジルが、リポソーム内又はマイクロカプセル化で安定化されている請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記分析のための試薬をカプセル内に封入し、前記毛包又は頭皮の生検サンプルと共に溶液に溶解する請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記分析がポジティブコントロール（リファレンス）とネガティブコントロール（ブランク）とを含み、前記毛包又は頭皮の生検サンプルと比較する請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記分析がコントラスト剤の存在下で行われ、前記反応からのシグナルを増大する請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記分析が、薬物の活性化のための硫酸化を必要とする薬物(a)、又は硫酸化により不活性化した薬物(b)のいずれかに対する被験者の応答を予測するために用いられる請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
約30mMから約70mMのリン酸カリウム緩衝剤（pH6.5）；
約3mMから約7mMの塩化マグネシウム；
約15μMから約25μMのアデノシン3’,5’‐二リン酸（PAP）又はアデノシン3’-リン酸5’-ホスホ硫酸（PAPS）；
約3mMから約7mMの硫酸p-ニトロフェニル；及び
約0.07mMから約0.13mMのミノキシジル
を含む組成物。
【請求項２６】
pHが約6.5から約8.0の間のリン酸カリウム緩衝剤の濃度が約50mMであり、塩化マグネシウムの濃度が約5mMであり、アデノシン3’,5’‐二リン酸（PAP）又はアデノシン3’-リン酸5’-ホスホ硫酸（PAPS）の濃度が約20μMであり、硫酸p-ニトロフェニルの濃度が約5mMであり、ミノキシジルの濃度が約0.1mMである請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
請求項２５に記載の組成物を含む、蓋を有する透明容器；
pH約8.7の約0.20Mから約0.30Mのトリス塩酸を含む緩衝剤容器；及び
前記緩衝剤容器の内容物を装置の内容物と混合するための手段
を備えるキット。
【請求項２８】
pHが約8.7のトリス塩酸の濃度が約0.25Mである請求項２７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンドロゲン性脱毛症の治療において、ミノキシジル応答を予測するシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
毛髪の損失は、様々な心理的影響及び社会的影響に関連している。何らかの治療を開始する前に、疾病の過程、重篤度及び治療の選択肢を予測することには利点がある。毛髪の損失の分野では、現在利用できる科学的な診断検査は極めて少なく、治療応答を予測する方法も少ない。
【０００３】
さらに、毛髪の損失の関連産業には、育毛、養毛及び植毛をうたった製品が多数存在している。残念ながら、有効であると科学的に証明された治療法は少なく、臨床試験を受けた数少ない治療法も、全ての患者に等しく効果を与えるとは限らない。
【０００４】
アンドロゲン性脱毛症は、米国食品医薬品局（FDA）が認可したミノキシジル薬剤（Rogaine（登録商標）又はRegaine（登録商標）として市販されている）によって、男性において治療が成功している。ミノキシジルは、女性の脱毛症治療に対しても、FDAによって認可されているが、大部分の女性にとって、ミノキシジルは、存在する毛髪を維持することに辛うじて成功しているに過ぎない。ミノキシジルの効果が薄い男性をフィナステリドで治療することには成功したが、ミノキシジルが無効である女性に同じことは言えない。これまでのところ、研究は、女性のアンドロゲン性脱毛症の治療におけるフィナステリドの有効性を示すことに失敗している。
【０００５】
男性のアンドロゲン性脱毛症と女性のアンドロゲン性脱毛症との間には、重大な相違点がある。異なる脱毛のパターンとは別に、男性の脱毛症及び女性の脱毛症は、異なるメカニズムに従っている。男性において、脱毛症は、正常なアンドロゲンレベルが高いことに関連しており、毛根のアンドロゲンに対する規定となる感度と結びつけられる。しかしながら女性は、男性よりもアンドロゲンレベルがおよそ10倍は低く、アンドロゲンの絶対量は、毛根のアンドロゲンに対する増大した感度という因子よりも重要ではない。
【０００６】
様々な個体の間で、男性であろうと女性であろうと、様々な毛髪の損失の治療に対する異なる人々の応答には広範な多様性が存在する。この多様性は、毛包内における可変の酵素活性の一因となる遺伝的因子の結果であると推測され、包括的なアプローチを困難にしている。したがって、効果的な診断方法及び治療方法を得られると有利であり、そこでは、患者を、酵素活性等の基準に基づいて選択及び治療することができる。当該基準によって、ミノキシジル及びその他の薬物による治療から効果を得る可能性を有する人々を特定し、治療が効果的でなさそうな個体を特定する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第2011/0212167号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、アンドロゲン性脱毛症の治療において、ミノキシジル応答を予測するシステム及び方法に関するものであり、一実施態様においては、比色分析に基づいて良い。様々な態様が考えられるが、本出願では、その内のいくつかを実証する。特に、毛包におけるミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性の変化を、アンドロゲン性脱毛症の治療におけるミノキシジルの有効性を予測するために用いて良い。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示の一実施態様においては、アンドロゲン性脱毛症に罹患している被験者のための治療を選択する方法が提供されており、当該方法は、当該被験者から１つ又は複数の毛包又は頭皮の生検サンプルを取得するステップ；当該サンプル中のミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性を測定するための分析を行い、それにより、当該サンプル中のミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性レベルを示す活性値を生成するステップ；当該活性値を１つ又は複数の標準活性値と比較するステップであって、各標準活性値は、被験者を含む患者群について毛髪の再成長又は維持に関して予期されるミノキシジル応答が高いか低いかを表しており、それにより、特定のミノキシジル投与量での被験者の毛髪の再成長又は維持に関して予期されるミノキシジル応答が高いか低いかについて指示を作成するステップ；及び、被験者に当該指示を伝達するステップを備える。
【００１０】
他の実施態様では、約30mMから約70mMのリン酸カリウム緩衝剤（pH6.5）；約3mMから約7mMの塩化マグネシウム；約15μMから約25μMのアデノシン3’,5’‐二リン酸（PAP）又はアデノシン3’-リン酸5’-ホスホ硫酸（PAPS）；約3mMから約7mMの硫酸p-ニトロフェニル；及び、約0.07mMから約0.13mMのミノキシジルを含む、分析を行うための組成物が準備されている。
【００１１】
他の実施態様では、分析を行うための前記組成物を含む、蓋を有する透明容器；約0.20Mから約0.30MのpH8.7のトリス塩酸を含む緩衝剤容器；及び、緩衝剤容器の内容物を装置の内容物と混合するための手段を含むキットが準備されている。
【００１２】
本明細書に組み込まれた添付の図面は、本出願に開示された発明の１つ又は複数の例示的実施態様を説明しており、詳細な説明と共に、これらの発明の原則及び実施例を説明するために用いられる。当業者は、当該図面が例示的なものにすぎないこと、及び、図面中に描写されたものは、明細書の文章又は当該分野の常識に基づいて適応させられても良いことを理解するであろう。
【００１３】
図面において、類似する参照番号は、明細書中の類似する構成要素に付されている。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】１つ又は複数の毛包を分析し、結果を提供する方法を示すフローチャートの図である。
【図２】分析を行うか、又は、分析試料を分析して毛包を検査し、結果を提供するためのコンピュータ化されたシステムの一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の様々な例示的実施態様は、アンドロゲン性脱毛症治療の文脈でここに記載される。
【００１６】
ここでの記載は、アンドロゲン性脱毛症治療の文脈において提供される。当業者は、以下の詳細な説明が例示的なものに過ぎず、何ら限定を意図するものではないことを理解するであろう。その他の実施態様は、本開示を利用している当業者に容易に示唆されるであろう。以下に、添付の図面に説明された実施態様について詳細に記載されるであろう。同様の参照の指示は、全ての図面及び以下の詳細な説明を通して、同じ又は類似の部分に言及するために用いられるであろう。
【００１７】
明瞭にするために、本出願に記載された実施態様の所定の特徴を全ては図示及び説明しない。当然のことながら、このような実際の実施態様を開発する際に、実施態様固有の多数の決定を行って、適用及び事業に関連する制約の順守といった開発者の具体的な目標を達成する必要があり、これらの具体的な目標は、実施態様によって、及び、開発者によって変化するものであろう。さらに、当然のことながら、このような開発努力は複雑で時間を要するかも知れないが、本開示を利用する当業者にとっては、型通りの作業であると思われる。
【００１８】
アンドロゲン性脱毛症は極めて一般的であり、60歳までに、男性の約60％及び女性の50％超が発症する。現在のところ、アンドロゲン性脱毛症の治療に関して、２つの薬物がFDAによって認可されている。フィナステリド及びミノキシジルである。しかしながら、フィナステリドを用いた治療は、男性においては毛髪の再成長及び維持に成功しているが、女性においては、大幅な改善を示すことに失敗している。したがって、ミノキシジルは、現在のところFDAによって認可された唯一の女性型脱毛症に対する薬物である。さらに、ミノキシジルを用いた治療を有効にするためには、当該治療が有効であると認識できないまま長期間にわたってミノキシジルを使用しなければならない場合が多い。本発明の目標の１つは、ミノキシジルを用いた治療に最も良好に応答するであろう患者を選別し、それにより効果的な脱毛症治療を個別に提供することにある。
【００１９】
本発明は、ミノキシジルがミノキシジルスルホトランスフェラーゼによる生化学的活性化を必要とし、活性ミノキシジル硫酸塩代謝物を生成するという発見に一部基づいている。ミノキシジルに関する作用に基づくアンドロゲン性脱毛症治療の正確なメカニズムは、完全には理解されていない。しかしながら、インビトロ研究では、硫酸ミノキシジルがミノキシジルの活性代謝物であることが証明されている。アンドロゲン性脱毛症の治療に関するミノキシジル応答は、頭皮におけるスルホトランスフェラーゼ活性の違いに関連付けられている。したがって、ミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性を高いレベルで有する被験者は、より多くの硫酸ミノキシジルを生成するので、アンドロゲン性脱毛症の治療に関して良好なミノキシジル応答を示す可能性がある。他方、ミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性のレベルが低い被験者は、それほど多くの硫酸ミノキシジルを生成しないので、アンドロゲン性脱毛症の治療に関して乏しいミノキシジル応答を示す可能性がある。
【００２０】
アンドロゲン性脱毛症の治療にミノキシジルを用いた臨床試験は、毛髪の維持及び成長に関して、統計的に有意な結果を示した。いくつかの研究は、ミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性のレベルが、アンドロゲン性脱毛症治療でミノキシジルに応答している患者において著しく大きいことを証明した。本出願で説明するように、毛髪の再成長の評価は、以下のパラメータの内、１つ又は複数に基づいている：患者の自己評価、標準的尺度を用いた医師による評価、全体写真を用いた評価（global photography assessment）、毛髪の直径の測定、毛髪の平均長の測定、毛髪の平均直径の測定、及び毛髪の重量の測定である。本発明は、ミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性の生化学的変化を、薬物応答マーカーとして、アンドロゲン性脱毛症のミノキシジルによる治療のために用いる方法を提供する。ミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性レベルに基づいて、本出願で開示された方法は、医師又は患者が、適切な治療及びそのアンドロゲン性脱毛症治療のための用量を選択することを可能にする。
【００２１】
本出願に記載された１つのアプローチに従って、患者の毛包のサンプルを取得して良い。可能であれば、少なくとも２つの毛包を採取して良い。それにより、１つの毛包のみを分析した場合、少なくとも１つの毛包が、必要な場合の予備となるであろう。
【００２２】
患者の毛包サンプルについて比色分析を行い、ミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性のレベルを決定して良い。患者の毛包サンプル（１個からｎ個の毛包）を、約50mMのリン酸カリウム緩衝剤（pH約6.5）、約5mMの塩化マグネシウム、約20μMのアデノシン3’,5’‐二リン酸（PAP）又はアデノシン3’-リン酸5’-ホスホ硫酸（PAPS）、約5mMの硫酸p-ニトロフェニル、及び約0.1mMのミノキシジルを含む反応混合物中に配置して良い。
【００２３】
一実施態様において、当該反応は、蓋又は毛包サンプルを挿入して良いその他の開口部を有する透明容器内で行われ得る。１つの限定的でない例において、分析試料容器内の液体の全体量は約0.2mlであり得る。
【００２４】
前記反応の一部として、ミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性の存在下で、硫酸p-ニトロフェニルは、発色性p-ニトロフェノラート（colorimetric p-nitrophenolate）に変換されることが理解されている。
【００２５】
当該反応物を混合した後、分析に用いられた毛包の数に応じて、約4時間から約16時間にわたり、37℃でインキュベートして良い。混合を、容器を振動させることを含む先行技術で知られたあらゆる混合手段によって行って良い。毛包の数が多くなると、必要とされるインキュベーション時間は短くなる。一実施態様では、１つの毛包を用いた分析試料を約16時間にわたりインキュベートして良い。別の実施態様では、2つの毛包を用いた分析試料を約4時間にわたりインキュベートして良い。
【００２６】
サンプルのインキュベーションの後、当該反応を約10分の1の体積のpH8.7の約0.25Mトリス塩酸緩衝剤を添加することによって停止させ、混合を行って良い。pHは、一実施態様において8.5から9.0の間で変化し得る。特に、分析が行われるか、又はキットの一部として販売されている場合は、塩基性緩衝剤を別個の容器に準備し、分析試料反応容器に注入して良い。別の実施態様では、塩基性緩衝剤を最初から組み込まれているシリンジ内に準備し、プランジャーを手動で押すか、又は、何らかの自動制御若しくはコンピュータ制御によって、適切な時に主要反応容器に注入して良い。
【００２７】
約405nmでの吸光度を、分光光度計で読み取るか、又は、ミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性に対応する様々な強度を示す標準カラーカードと比較して良い。比較的高いレベルのスルホトランスフェラーゼ活性を有する患者については、比較的強い発色が読み取られ、比較的大きな色の変化がもたらされることになるであろう。それとは対照的に、比較的低いレベルのスルホトランスフェラーゼ活性を有する患者については、比較的弱い発色が読み取られ、それに応じて比較的小さな色の変化がもたらされることになるであろう。比色分析の応答が強い患者は、毛髪の再成長又は維持に関して、ミノキシジルに応答することが期待される。それに対して、比色分析の応答が弱い患者は、ミノキシジルにあまり応答しないであろうと予想される。
【００２８】
さらに別の実施態様では、患者の毛包の比色分析の結果が、最適な治療計画を決定するために用いられる。ミノキシジルを用いた治療の濃度及び／又は頻度を修正して、患者のミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性に適合させることも含まれる。さらに、患者がミノキシジルに応答しそうにない場合には、フィナステリドをミノキシジルの代わりに推奨して良い。
【００２９】
図１によると、本願に係る方法100は、被験者から毛包のサンプルを取得するステップ102を有している。104のステップでは、毛包サンプルを一意識別子でコード付けして、例えばプライバシーを保護し、処理を容易にして良い。106のステップでは、毛包サンプルをすでに説明したように分析して良い。当該分析は、本出願に記載された比色分析を用いて行われ得る。108のステップにおいて、当該分析の結果を、被験者又は被験者の介護者に伝えて良い。分析の結果は、それぞれその一意識別子と関連付けられてコンピュータシステムに伝送可能であり、当該コンピュータシステムはウェブベースのサーバーを含んでいても良く、当該サーバーには、一意識別子を即時使用するための正式認証があれば、被験者又は介護者によってアクセス可能である。当該結果は、患者がアンドロゲン性脱毛症の治療において、2％、5％又はそれより多いミノキシジルに応答するであろう可能性を示すことに加えて、患者のミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性レベルを参考データベースと比較することによって、必要な容量及び１日当たりの治療頻度に関する予測を含んでいても良い。
【００３０】
図２は、前記方法を実施するためのシステム200を概略的に示している。被験者の毛包サンプル202が、実験室204に送られる。次に、すでに述べた手順の内１つ又は複数に従って、サンプルの分析が行われる。当該分析の結果は例えばデータベースと比較され、患者がアンドロゲン性脱毛症の治療に関してミノキシジルに応答するであろう可能性について指示を作成する。当該データベースは、実際には動的なものであっても良く、過去のミノキシジルによる治療及び当該治療に対する応答に基づく統計的な適応のために継続的にアップデートされるので、当該データベースは、適応すること、又は、患者群及び長期にわたる治療から学習することが可能であり、このようにして、薬物療法に対する応答者の可能性を予測するより良い判断材料となり得る。当該データベース、又は、本出願に記載されたスキームに適応可能なその他の全体若しくは回路若しくはモジュールは、コンピュータシステム206内に存在しているか、又は、当該コンピュータシステムからは離れて存在しても良い。比較及び分析の結果は、例えばインターネット210等のネットワークを使って電子的に、被験者又は介護者のコンピュータシステム208に転送され得る。代替的又は付加的に、比較及び分析の結果をサーバー212に蓄積することが可能であり、被験者又は介護者は、プライバシーを保護するための一意識別子の参照を要求する正式な認証に従って、当該サーバーにリモートからアクセスできる。
【００３１】
前記システム及び方法を実行するためにニューラルネットワークを用いて、患者がアンドロゲン性脱毛症の治療に関してミノキシジルに応答するであろう可能性を、当該患者のミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性プロファイルに基づいて予測することも可能であろう。このようなアプローチによると、薬物療法に対する応答の可能性の予測には、(a)N層ニューラルネットワークを構築するステップ；(b)患者のミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性プロファイルに加えて、患者のアンドロゲン性脱毛症のミノキシジルを用いた治療に関する結果のデータセットで、ニューラルネットワークをトレーニングするステップ；(c)被験者から毛包サンプルを取得するステップ；(d)当該サンプルから、ミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性プロファイルを作成するステップであって、当該プロファイルは、一組の所定のミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性レベルに関連付けられた値の関数であるステップ；(e)被験者のミノキシジルスルホトランスフェラーゼ活性プロファイルをニューラルネットワークに入力するステップ；(f)ニューラルネットワークから、一回投与又は複数回投与の薬物療法に対する患者の予想される結果（レスポンデント）を示す値又は一組の値を得るステップ；及び、(g)推奨された投与量での薬物療法を患者に提供するステップが含まれ得る。
【００３２】
上記は、本発明を実施する例示的なモードであり、限定を意図するものではない。以下の請求項に記載の本発明の精神及び範囲から離れることなく、変更を加えることが可能であることは、当業者には明らかであろう。
【符号の説明】
【００３３】
１００  本願に係る方法
１０２  毛包の取得
１０４  一意識別子との関連付け
１０６  分析
１０８  結果の提供
２００  方法を実施するためのシステム
２０２  被験者の毛包サンプル
２０４  実験室
２０６  コンピュータシステム
２０８  被験者又は介護者のコンピュータシステム
２１０  インターネット
２１２  サーバー
【図１】
2014528727.tif 000003
【図２】
2014528727.tif 000004
【国際調査報告】
2014528727.tif 000005
2014528727.tif 000006
2014528727.tif 000007