(57)【要約】  本発明は、生体触媒として酵素トランスアミナーゼを用いるα−ヒドロキシケトンからの光学活性キラルアミンの生成方法に関する。特に、本発明は、生体触媒としてＳ−トランスアミナーゼ及びアミン供与体としてイソプロピルアミンを使用することによるＲ−フェニルアセチルカルビノール（Ｒ−ＰＡＣ）からの（１Ｒ，２Ｓ）−ノルエフェドリン及びその塩の生成に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．一連のα−ヒドロキシケトンから選択されるアミノ受容体、すなわちケト基質及びアミノ供与体を用意し；
ｂ．前記したケト基質及びアミノ供与体を（Ｒ）または（Ｓ）−選択的トランスアミナーゼと反応させ；および
ｃ．最後に、所望の光学活性キラルアミン及びケトン副生成物を得る；
ことを含む光学活性キラルアミンの生成方法であって、前記方法は約６〜８のｐＨを有する反応混合物中、２５〜３５℃の温度範囲で１２〜４８時間の反応時間実施する前記方法。
【請求項２】
前記α−ヒドロキシケトンがＲ−フェニルアセチルカルビノールである、請求項１（ａ）に記載の方法。
【請求項３】
前記アミノ供与体がアミンまたはアミノ酸を含む群、特にイソプロピルアミン（２−アミノプロパンとも称する）、α−フェニルエチルアミン（１−フェニルエタンアミンとも称する）及びそのエナンチオマーの（Ｓ）−１−フェニルエタンアミン及び（Ｒ）−１−フェニルエタンアミン、２−アミノ−４−フェニルブタン、グリシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタメート、グルタミン酸ナトリウム、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｄ，Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、β−アラニン、タウリン、ｎ−オクチルアミン、シクロヘキシルアミン、１，４−ブタンジアミン、１，６−ヘキサンジアミン、６−アミノヘキサン酸、４−アミノ酪酸、チラミン及びベンジルアミン、２−アミノブタン、２−アミノ−１−ブタノール、１−アミノ−１−（２−メトキシ−５−フルオロフェニル）エタン、１−アミノ−１−フェニルプロパン、１−アミノ−１−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン、１−アミノ−１−（４−ブロモフェニル）プロパン、１−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）プロパン、１−フェニル−２−アミノプロパン、１−（３−トリフルオロメチルフェニル）−２−アミノプロパン、２−アミノプロパノール、１−アミノ−１−フェニルブタン、１−フェニル−２−アミノブタン、１−（２，５−ジメトキシ−４−メチルフェニル）−２−アミノブタン、１−フェニル−３−アミノブタン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−アミノブタン、１−アミノ−２−メチルシクロペンタン、１−アミノ−３−メチルシクロペンタン、１−アミノ−２−メチルシクロヘキサン、１−アミノ−１−（２−ナフチル）エタン、３−メチルシクロペンチルアミン、２−メチルシクロペンチルアミン、２−エチルシクロペンチルアミン、２−メチルシクロヘキシルアミン、３−メチルシクロヘキシルアミン、１−アミノテトラリン、２−アミノテトラリン、２−アミノ−５−メトキシテトラリン及び１−アミノインダン
から選択される請求項１（ａ）に記載の方法。
【請求項４】
前記アミノ供与体がイソプロピルアミンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記トランスアミナーゼが大腸菌由来である、請求項１（ｂ）に記載の方法。
【請求項６】
前記光学活性キラルアミンが、（１Ｓ，２Ｓ）または（１Ｒ，２Ｒ）ノルエフェドリンである、請求項１（ｃ）に記載の方法。
【請求項７】
前記ケトン副生成物がアセトンである、請求項１（ｃ）に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、包括的には生体触媒として酵素トランスアミナーゼを用いるα−ヒドロキシケトンからの光学活性キラルアミンの生成に関する。より具体的には、本発明は、生体触媒としてＳ−トランスアミナーゼ及びアミン供与体としてイソプロピルアミンを用いることによるＲ−フェニルアセチルカルビノール（Ｒ−ＰＡＣ）からの（１Ｒ，２Ｓ）−ノルエフェドリン及びその塩の生成に関する。
【背景技術】
【０００２】
キラルアミンは医薬及び化学工業界において重要な役割を発揮している。一般的に、キラルアミンは各種の生理学的に（例えば、医薬的に）活性な物質を製造するための分割剤、中間体またはシントンとしてしばしば使用されている。キラルアミンの多数の各種分野において、（Ｒ）または（Ｓ）エナンチオマーのいずれかの１つの特定の光学活性形態のみが所望の生理学的活性を有している。よって、キラルアミンを光学活性形態で製造するための方法が明らかに要望されている。
【０００３】
ノルエフェドリン、すなわち２−アミノ−１−フェニル−１−プロパノールは漢方薬草「麻黄」、すなわちエフェドラ中に天然に存在しているアルカロイドであり、光学活性アミンでもある。ノルエフェドリンは薬草から１−エフェドリン及び他のアルカロイドと一緒に単離される。天然ソースとは別に、ノルエフェドリンは化学的方法により合成され得る。ノルエフェドリンは、接触還元アミノ化、接触水素化等により化学的に合成され得る。化学合成に関連する重大な欠点の１つはジアステレオ選択性を与えず、よって等量のジアステレオマーが得られることである。
【０００４】
従来技術には、以下に示すような１−ノルエフェドリンを生成するための各種合成方法が挙げられる：
１．ｄｌ−フェニルプロパノールアミンの分割による
関連する特許の幾つかは、独国特許２，２５８，４１０（１９７３）、２，３０４，０５５（１９７４）及び２，２５８，４１０（１９７４）、並びに英国特許１，３８５，４９０（１９７５）であり、これらはチアゾリジンカルボン酸を用いるｄｌ−フェニルプロパノールアミンの分割を開示している。独国特許２，２５８，５０７（１９７６）は、パントイン酸を用いるｄｌ−フェニルプロパノールアミンの分割を開示している。独国特許２，８５４，０６９（１９７９）及び２，８５４，０７０（１９７９）は、ｄｌ−フェニルプロパノールアミンの分割におけるｄ−及び１−ノルシュードエフェドリンのマレアミドの使用を明示している。日本特許４５３０（１９５５）は、（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ジメトキシコハク酸を用いるｄｌ−フェニルプロパノールアミンの分割を開示している。ＪＰ−Ａ  ５１／９８２３１も分割方法を開示している。
【０００５】
この従来技術に関連する欠点は、低い収率（乏しいジアステレオ選択性）、コスト及びこれらの分割剤の回収の困難さである。
【０００６】
２．１−１−ヒドロキシ−１−フェニル−２−プロパノンの還元アミノ化
関連する特許の幾つかは、独国特許５８８，８８０（１９３３）、５８７，５８６（１９３３）、５９９，４３３（１９３４）、１，０１４，５５３（１９５７）；英国特許３６５，５３５（１９３０）、３６５，５４１（１９３０）；インド特許ＩＮ１７２９７０（１９９４）；ＥＰ  １１４２８６４である。
【０００７】
３．１−１−フェニル−１−ヒドロキシ−２−プロパノンの誘導体の還元
オキシム、ヒドラゾン、Ｎ−ベンジルイミンのような１−１−フェニル−１−ヒドロキシ−２−プロパノン誘導体の還元は、英国特許３６５，５３５（１９３０）；独国特許１，０１４，５５３（１９５７）；Ｏ．Ｃ．Ｋｒｅｕｔｚ；Ｐ．Ｊ．Ｓ．Ｍｏｒａｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｒ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，８，２６４９−２６５３（１９９７）に報告されている。気体及び液体流出物の発生及び触媒のリサイクル可能性が重大な問題であるのに対して、ＥＰ  ２０５５３７９はこれらの問題の一部を解消し、９７％超のジアステレオマー純度を報告している。
【０００８】
しかしながら、出発物質の１−１−ヒドロキシ−１−フェニル−２−プロパノンはα−ケトールであり、過度の温度及びｐＨ条件に対して感受性であり、よってラセミ化及び異性化が生ずる。
【０００９】
４．２−アミノ−１−フェニル−１−プロパノンの分割後、還元
所与の技術に関する従来技術の幾つかは、独国特許６３９，１２９（１９３６）；日本特許ＪＰ  ６３０９１３５２（１９８８）；及び文献、例えばＨ．Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ，７６，１２１９−１２２２（１９５６）及びＢ．Ｄ．Ｂｅｒｒａｎｇ，Ａ．Ｈ．Ｌｅｗｉｎ，Ｆ．Ｉ．Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４７，２６４３−２６４７（１９８２）；Ｆ．Ｓｋｉｔａ，Ｆ．Ｋｅｉｌ，Ｅ．Ｂａｅｓｌｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，６６，８５８（１９３２）である。
【００１０】
挙げられている従来技術に関する重大な欠点は、出発物質が塩基として不安定であり、分割効率が悪く、光学的に純粋な鏡像体の全収率が非常に低いことである。更に、記載されている２−アミノ−１−フェニル−１−プロパノンの接触水素化は、方法の全有効性にとって非常に必須のエリスロ生成物のみを与えない。
【００１１】
５．不斉還元
日本特許公開公報ＪＰ  ０５０４９４８［９３，０４９４８］（１９９３）は、α−イソニトロソプロピオフェノンをキラル置換フェロセン触媒の存在下で不斉水素化する方法を記載している。しかしながら、この方法はフェニルプロパノールアミンの１つのエナンチオマーが他のものに比して高いジアステレオマー及びエナンチオマー過剰率を与えず、よって満足できなかった。
【００１２】
６．キラル前駆体
更に別のアプローチは、キラル前駆体（Ｔ．Ｆ．Ｂｕｃｋｌｅｙ；Ｈ．Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３，６１５７−６１６３（１９８１）；Ｋ．Ｋｏｇａ；Ｈ．Ｍａｔｓｏｕ  ａｎｄ  Ｓ．Ｙａｍａｄａ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１４，２４３−２４６（１９６６）；Ｗ．Ｒ．Ｊａｃｋｓｏｎ；Ｈ．Ａ．Ｊａｃｏｂｓ；Ｇ．Ｓ．Ｊａｙａｔｉｌａｋｅ；Ｂ．Ｍ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ａｎｄ  Ｋ．Ｃ．Ｗａｔｓｏｎ，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，４３，２０４５（１９９０））、キラル助剤の使用による（Ｗ．Ｏｐｐｏｌｚｅｒ；Ｏ．Ｔａｍｕｒａ；Ｇ．Ｓｕｒｅｎｄｒａｂａｂｕ  ａｎｄ  Ｍ．Ｓｉｇｎｅｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４，５９００（１９９２））からの１−エリスロ−２−アミノ−１−フェニル−１−プロパノールの立体特異的合成である。
【００１３】
上記した方法に加えて、各種の他の方法がＤ．Ｅｎｄｅｒｓ；Ｈ．Ｌｏｔｔｅｒ；Ｎ．Ｍａｉｇｒｏｔ；Ｊ．Ｐ．Ｍａｚａｌｅｙｒａｔ  ａｎｄ  Ｚ．Ｗｅｌｖａｒｔ，Ｎｏｕｖ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，８，７４７−７５０（１９８４）及び日本特許公開公報ＪＰ  １０  ４５６８８（１９９８）に記載されており、ここではα−イソニトロソプロピオフェノンを、キラルリガンドを有する水素化の存在下で水素化したか、または１，２−アミノアルコールキラル助剤のホウ素水素化物複合体を用いて還元した。
【００１４】
従って、合成化学に基づく従来技術方法の検討から、上に挙げた方法のすべてが以下の欠点、例えば水素化触媒のコスト及びリサイクル可能性、分割剤のコスト及びリサイクル可能性、還元における低いジアステレオ−及びエナンチオ選択性、キラル前駆体またはキラル助剤のコスト及び入手可能性、キラル触媒のコスト及び入手可能性、並びに危険であるおそれがある気体、液体及び固体流出物の発生の少なくとも１つを有していることが分かる。
【００１５】
従来技術の挙げられている欠点にてらして、上記した制限を回避し、収率及び分割の点でより有効であり、同時に費用効果的である１−エリスロ−２−アミノ−１−フェニル−１−プロパノール（１−ノルエフェドリン）を生成するための方法を開発することがなお必要であり、それに対して酵素的アプローチが上に挙げた問題に対する回答であろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】独国特許出願公開第２，２５８，４１０号明細書
【特許文献２】独国特許出願公開第２，３０４，０５５号明細書
【特許文献３】英国特許出願公開第１，３８５，４９０号明細書
【特許文献４】独国特許出願公開第２，２５８，５０７号明細書
【特許文献５】独国特許出願公開第２，８５４，０６９号明細書
【特許文献６】独国特許出願公開第２，８５４，０７０号明細書
【特許文献７】特開昭３０−４５３０号公報
【特許文献８】特開昭５１−９８２３１号公報
【特許文献９】独国特許発明第５８８，８８０号明細書
【特許文献１０】独国特許発明第５８７，５８６号明細書
【特許文献１１】独国特許発明第５９９，４３３号明細書
【特許文献１２】独国特許発明第１，０１４，５５３号明細書
【特許文献１３】英国特許出願公開第３６５，５３５号明細書
【特許文献１４】英国特許出願公開第３６５，５４１号明細書
【特許文献１５】インド特許第ＩＮ１７２９７０号明細書
【特許文献１６】欧州特許出願公開第１１４２８６４号明細書
【特許文献１７】欧州特許出願公開第２０５５３７９号明細書
【特許文献１８】独国特許発明第６３９，１２９号明細書
【特許文献１９】特開昭６３−０９１３５２号公報
【特許文献２０】特開平０５−０４９４８号公報
【特許文献２１】特開平１０−４５６８８号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｏ．Ｃ．Ｋｒｅｕｔｚ；Ｐ．Ｊ．Ｓ．Ｍｏｒａｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｒ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，８，２６４９−２６５３（１９９７）
【非特許文献２】Ｈ．Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ，７６，１２１９−１２２２（１９５６）
【非特許文献３】Ｂ．Ｄ．Ｂｅｒｒａｎｇ，Ａ．Ｈ．Ｌｅｗｉｎ，Ｆ．Ｉ．Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４７，２６４３−２６４７（１９８２）
【非特許文献４】Ｆ．Ｓｋｉｔａ，Ｆ．Ｋｅｉｌ，Ｅ．Ｂａｅｓｌｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，６６，８５８（１９３２）
【非特許文献５】Ｔ．Ｆ．Ｂｕｃｋｌｅｙ；Ｈ．Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３，６１５７−６１６３（１９８１）
【非特許文献６】Ｋ．Ｋｏｇａ；Ｈ．Ｍａｔｓｏｕ  ａｎｄ  Ｓ．Ｙａｍａｄａ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１４，２４３−２４６（１９６６）
【非特許文献７】Ｗ．Ｒ．Ｊａｃｋｓｏｎ；Ｈ．Ａ．Ｊａｃｏｂｓ；Ｇ．Ｓ．Ｊａｙａｔｉｌａｋｅ；Ｂ．Ｍ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ａｎｄ  Ｋ．Ｃ．Ｗａｔｓｏｎ，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，４３，２０４５（１９９０）
【非特許文献８】Ｗ．Ｏｐｐｏｌｚｅｒ；Ｏ．Ｔａｍｕｒａ；Ｇ．Ｓｕｒｅｎｄｒａｂａｂｕ  ａｎｄ  Ｍ．Ｓｉｇｎｅｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４，５９００（１９９２）
【非特許文献９】Ｄ．Ｅｎｄｅｒｓ；Ｈ．Ｌｏｔｔｅｒ；Ｎ．Ｍａｉｇｒｏｔ；Ｊ．Ｐ．Ｍａｚａｌｅｙｒａｔ  ａｎｄ  Ｚ．Ｗｅｌｖａｒｔ，Ｎｏｕｖ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，８，７４７−７５０（１９８４）
【発明の概要】
【００１８】
本発明の目的は、生体触媒として酵素トランスアミナーゼを用いてα−ヒドロキシケトンから光学活性キラルアミンを生成する方法を提供することである。特に、本発明は、生体触媒としてＳ−トランスアミナーゼ及びアミン供与体としてイソプロピルアミンを使用することによるＲ−フェニルアセチルカルビノール（Ｒ−ＰＡＣ）からの（１Ｒ，２Ｓ）−ノルエフェドリン及びその塩の生成に関する。
【００１９】
従って、本発明は、
ａ．一連のα−ヒドロキシケトンから選択されるアミノ受容体、すなわちケト基質及びアミノ供与体を用意するステップ；
ｂ．前記したケト基質及びアミノ供与体をトランスアミナーゼ、特に（Ｒ）または（Ｓ）−選択的トランスアミナーゼと反応させるステップ；
ｃ．最後に、所望の光学活性キラルアミン及びケトン副生成物を得るステップ；
を含む光学活性キラルアミンの生成方法を提供する。
【００２０】
よって、本発明は、アミノ供与体由来のアミノ基をアミノ受容体として作用するケト基質にアミノ基転移して、所望生成物を形成するために少なくとも１つのトランスアミナーゼを使用することによる光学活性キラルアミンの合成方法を提供する。従って、本発明は、規定されているアミノ供与体の存在下でトランスアミナーゼ、すなわちアミノトランスアミナーゼ酵素を使用することによる光学活性キラルアミンを生成する酵素的方法を特徴とする。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、基質としてα−ヒドロキシケトンを用い、酵素及びアミノ供与体の存在下で光学活性アミン生成物を生成する改良方法に関する。特に、本発明は、
ａ）一連のα−ヒドロキシケトンから選択されるアミノ受容体、すなわちケト基質及びアミノ供与体を用意し；
ｂ）前記したケト基質及びアミノ供与体をトランスアミナーゼ、特に（Ｒ）または（Ｓ）−選択的トランスアミナーゼと反応させ；
ｃ）最後に、所望の光学活性キラルアミン及びケトン副生成物を得る；
ことを含む光学活性アミンの生成方法を提供する。
【００２２】
特許請求されている発明の主題をより明確に且つ簡明に説明し、指摘するために、以下の本明細書中で使用されている特定の用語に対して次の定義を与える。
【００２３】
「トランスアミナーゼ」及び「アミノトランスフェラーゼ」は、受容体分子のカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）に対してアミノ基（ＮＨ２）、一対の電子及び第１級アミン由来のプロトンを移動させる酵素能力を有するポリペプチドを指すべく本明細書中で互換可能に使用されている。本明細書中で使用されているトランスアミナーゼには、天然（野生型）トランスアミナーゼ、及びヒトの操作により生ずる非天然の工学処理されているポリペプチドが挙げられる。
【００２４】
「ケト基質」、「ケト」、「ケトン」及び「アミノ受容体」は、供与体アミン由来のアミノ基を受容するカルボニル（ケトまたはケトン）化合物を指すべく本明細書中で互換可能に使用されている。
【００２５】
「アミノ供与体」、「アミン供与体」及び「供与体アミン」は、トランスアミナーゼ及びケトンと反応して、所望のアミン生成物及びケトン副生成物を生成するアミノ酸またはアミンを指すべく本明細書中で互換可能に使用されている。
【００２６】
「ピリドキサール−リン酸」、「ＰＬＰ」、「ピリドキサール−５’−リン酸」、「ＰＹＰ」及び「Ｐ５Ｐ」は、トランスアミナーゼ反応において補酵素として作用する化合物を指すべく本明細書中で互換可能に使用されている。トランスアミナーゼ酵素を用いるアミノ基転移反応において、アミノ供与体のアミン基は補酵素に転移してケト副生成物を生成するが、ピリドキサール−５’−リン酸はピリドキサミンリン酸に変換される。ピリドキサール−５’−リン酸は別のケト化合物（アミノ受容体）と反応させることにより再生される。ピリドキサミンリン酸由来のアミン基がアミノ受容体に転移すると、キラルアミンが生じ、補酵素が再生される。幾つかの実施形態では、ピリドキサール−５’−リン酸はピリドキシン（ＰＮ）、ピリドキサール（ＰＬ）、ピリドキサミン（ＰＭ）及びそのリン酸化同等物；ピリドキシンリン酸（ＰＮＰ）及びピリドキサミンリン酸（ＰＭＰ）を含めたビタミンＢ６ファミリーの他のメンバーにより置換され得る。
【００２７】
「天然」または「野生型」は天然に存在している形態を指す。例えば、天然または野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然のソースから単離され得るが、ヒトの操作により故意に修飾されていない生物中に存在している配列である。
【００２８】
例えば細胞、核酸またはポリペプチドに関連して使用されている「組換え」、「工学処理されている」または「非天然」は、別の方法で天然に存在しないように修飾されているか、或いは同一であるが、合成材料から及び／または組換え技術により操作することにより生成または誘導される材料、または天然または天然型の該材料に相当する材料を指す。非限定例には、特に天然（非組換え）形態の細胞内に存在していない遺伝子を発現しているか、また他の方法で異なるレベルで発現する天然遺伝子を発現している組換え細胞が挙げられる。
【００２９】
原則、本発明の反応は以下のスキームに従う：
【００３０】
【化１】
2014521362.tif 000002
【００３１】
よって、本発明は、所望の生成物を形成するようにアミノ供与体由来のアミノ基のアミノ受容体として作用するケト基質へのアミノ基転移のために少なくとも１つのトランスアミナーゼを用いることによる光学活性キラルアミンの合成方法を提供する。使用する具体的トランスアミナーゼのエナンチオ優位性に応じて、光学活性キラルアミンが得られる。例えば、本発明のＳ−特異的トランスアミナーゼ酵素は、Ｓ−特異的キラルアミンを形成するようにアミノ供与体由来のアミノ基のケト基質への転移を触媒することができる。最後には、Ｒ−特異的トランスアミナーゼ酵素は、Ｒ−特異的キラルアミンを形成するようにアミノ供与体由来のアミノ基のケト基質への転移を触媒する。
【００３２】
本発明の文脈において、使用されるトランスアミナーゼ酵素は、天然（野生型）トランスアミナーゼ、及びヒトの操作により生ずる非天然の工学処理されているポリペプチドの両方からなる。一般的に、本明細書中に記載されているトランスアミナーゼ酵素は、アミノ供与体由来のアミノ基のアミノ受容体（ケトン基質）への転移によるアミノ基転移反応を触媒する。この反応の生成物はアミン生成物及びアミノ受容体（ケトン）副生成物である。
【００３３】
本発明の文脈において、アミノ受容体はトランスアミナーゼによりアミノ供与体から転移されたアミノ基を受容することができる分子である。本発明の特に好ましい実施形態では、アミノ受容体はケトン官能基を含有している。本明細書中に記載されているアミノ受容体、すなわちケト基質は一連のα−ヒドロキシケトン化合物からなり、例えば式１、式２及び式３に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
【化２】
2014521362.tif 000003
【００３５】
本発明の文脈において、アミノ供与体は酵素トランスアミナーゼを用いてアミノ基をアミノ受容体、すなわちケト基質に与えることができる分子である。特に好ましい実施形態では、アミノ供与体はアミンまたはアミノ酸である。本発明で使用され得る典型的なアミノ供与体には、キラル及びアキラルアミノ酸、並びにキラル及びアキラルアミンが挙げられる。本発明で使用され得るアミノ供与体には、非限定例としてイソプロピルアミン（２−アミノプロパンとも称する）、α−フェニルエチルアミン（１−フェニルエタンアミンとも称する）、及びそのエナンチオマーの（Ｓ）−１−フェニルエタンアミン及び（Ｒ）−１−フェニルエタンアミン、２−アミノ−４−フェニルブタン、グリシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタメート、グルタミン酸ナトリウム、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｄ，Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−リシン、Ｌ−オルニチン、β−アラニン、タウリン、ｎ−オクチルアミン、シクロヘキシルアミン、１，４−ブタンジアミン、１，６−ヘキサンジアミン、６−アミノヘキサン酸、４−アミノ酪酸、チラミン及びベンジルアミン、２−アミノブタン、２−アミノ−１−ブタノール、１−アミノ−１−（２−メトキシ−５−フルオロフェニル）エタン、１−アミノ−１−フェニルプロパン、１−アミノ−１−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン、１−アミノ−１−（４−ブロモフェニル）プロパン、１−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）プロパン、１−フェニル−２−アミノプロパン、１−（３−トリフルオロメチルフェニル）−２−アミノプロパン、２−アミノプロパノール、１−アミノ−１−フェニルブタン、１−フェニル−２−アミノブタン、１−（２，５−ジメトキシ−４−メチルフェニル）−２−アミノブタン、１−フェニル−３−アミノブタン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−アミノブタン、１−アミノ−２−メチルシクロペンタン、１−アミノ−３−メチルシクロペンタン、１−アミノ−２−メチルシクロヘキサン、１−アミノ−１−（２−ナフチル）エタン、３−メチルシクロペンチルアミン、２−メチルシクロペンチルアミン、２−エチルシクロペンチルアミン、２−メチルシクロヘキシルアミン、３−メチルシクロヘキシルアミン、１−アミノテトラリン、２−アミノテトラリン、２−アミノ−５−メトキシテトラリン及び１−アミノインダンが挙げられ、これらには可能ならば（Ｒ）及び（Ｓ）の単一異性体の両方及び前記アミンのすべての考えられる塩が含まれる。
【００３６】
従って、特に好ましい実施形態では、本発明は、Ｒ−ＰＡＣ（Ｒ−フェニルアセチルカルビノール）を（Ｓ）または（Ｒ）−選択的トランスアミナーゼ及びアミノ供与体のイソプロピルアミンと反応させて、光学活性な（１Ｒ，２Ｓ）または（１Ｒ，２Ｒ）ノルエフェドリンを得ることを予測する。ノルエフェドリンのＲ−ＰＡＣへの脱アミノ化もアミン受容体としてピルベートを用いて調べた。ミカエリス−メンテン酵素速度論に従って基質濃度を高めると反応速度が高くなる。
【００３７】
基質のアミノ基転移は、酵素のアリコートを典型的には規定濃度の基質と一緒に用いてバイオリアクター中で実施される。ｐＨ、温度及び混合のような反応パラメーターは最適の生物触媒活性及び安定性に有利であるレベルで維持される。同様の反応は、逆反応を防止するために形成時に生成物を回収するような連続モードで行われる。
【００３８】
反応は宿主中での所望のトランスアミナーゼの発現によりインビボでも実施され得、生体内変換によりα−ヒドロキシケトンが産生される。本発明の文脈において、所望の宿主は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐ．）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、大腸菌属（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｐ．）の群から選択される。α−ヒドロキシケトンを産生するための記載されている生体内変換方法は、カーボリゲーションのために所望酵素を発現する宿主細胞中で起こる。生体内変換反応のプロセス中、α−ヒドロキシケトンはアルデヒドの外部添加により宿主細胞中で生成される。
【００３９】
次いで、こうして生成されたα−ヒドロキシケトンを発現トランスアミナーゼ酵素の存在下で対応するアミンに変換させる。これは、１ポットインビボ方法、或いは当該酵素を発現する単一または複数の微生物が関与する２つ以上の段階でのインビボ／インビトロ、またはインビボ及びインビトロ変換の組合せを含む段階的方法であり得る。
【００４０】
本発明をより完全に理解するために、以下の生成及び試験例を提示する。これらの例は例示の目的のみであり、本発明の範囲を多少なりとも限定すると解釈されるべきでない。
【００４１】
ＨＰＬＣを用いるジアステレオマー純度の測定は以下に示す条件を用いて実施した：
カラム：Ｃ１８Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  Ｍａｃｈｅｒｙ  Ｎａｇｅｌ，（２５０×４．６ｍｍ）５μｍ、
波長：２１０ｎｍ、
流速：１．０ｍｌ／分、
ラン時間：２０分間、
注入容量：２０μｌ、
システム圧力：１２．００〜１４．００ＭＰａ、
標準濃度：移動相中０．１ｍｇ／ｍｌ、
サンプル濃度：移動相中１．０ｍｇ／ｍｌ、
移動相：２５％  水酸化テトラメチルアンモニウム溶液（ＭＥＲＣＫ製）（１６ｍｌ）に、ＨＰＬＣグレード水（５００ｍｌ）を添加し、十分に撹拌する。オルトリン酸（５ｍｌ）を撹拌しながらゆっくり添加する。ＨＰＬＣグレード水を用いて容量を１０００ｍｌとし、十分に混合する。上記緩衝液（９５６ｍｌ）にメタノール（４０ｍｌ）及びテトラヒドロフラン（４ｍｌ）を添加し、撹拌する。溶液を０．４５ミクロン濾紙を用いて濾過し、音波処理し、溶媒リザーバー中に移す。
【実施例】
【００４２】
本発明をより完全に理解するために、以下の生成及び試験例を提示する。これらの例は例示の目的のみであり、本発明の範囲を多少なりとも限定すると解釈されるべきでない。
【００４３】
［実施例１］
トランスアミナーゼのスクリーニング
５ｍＭ  Ｒ−ＰＡＣ、すなわち１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−オン（９９．５％  ｗ／ｖ）、５００ｍＭ  イソプロピルアミン、５０ｍＭ  リン酸カリウムｐＨ７．４、１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、及び（発現酵素ＳまたはＲトランスアミナーゼを含有している）カテゴリー１細菌のバイオマス  １８ｇｍ／Ｌを含む反応混合物を３０℃で振とうさせながら一晩インキュベートした。
【００４４】
ａ）発現Ｓ−トランスアミナーゼ（１Ｒ，２Ｓ生成物を与える）
ｂ）発現Ｒ−トランスアミナーゼ（１Ｒ，２Ｒ生成物を与える）
各カテゴリーの２つのトランスアミナーゼの場合、いずれにしても９８％超の選択率で９５％超の変換率が得られた。
【００４５】
［実施例２］
光学活性２−アミノ−１−フェニル−１−プロパノール、すなわちＲ，Ｓノルエフェドリンの生成
２５ｍＭ  Ｒ−ＰＡＣ市販品、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、５００ｍＭ  イソプロピルアミン及び（発現Ｓ−トランスアミナーゼを含有しているカテゴリー１細菌の）バイオマス  ９ｇｍ／Ｌを含む反応混合物を３０℃で振とうさせながら約５時間インキュベートした後、別の２５ｍＭ  Ｒ−ＰＡＣ市販品を添加した。全部で２６時間インキュベートした後、５０ｍＭ  １Ｒ，２Ｓノルエフェドリン塩基を得た。選択率は９８％であった。
【００４６】
注：Ｒ−ＰＡＣの市販サンプルは、約２５〜３５％  Ｒ−ＰＡＣ  ｗ／ｖに加えてトルエン、ベンジルアルコール及びベンズアルデヒドを含有している。この酵素の残留活性は、最高５５〜６０℃の温度に１５分間さらしても無傷であることが分かっており、よってアミノ基転移はより高温で、不純物に対する耐性変化を伴い及び高い反応速度で実施され得る。
【００４７】
実施例に記載した反応は以下のスキームに従う：
【００４８】
【化３】
2014521362.tif 000004
【００４９】
［実施例３］
光学活性２−アミノ−１−フェニル−１−プロパノール、すなわちＲ，Ｓノルエフェドリンの生成
【００５０】
１．バイオマス産生
大腸菌培養物を２段階の前培養により１Ｌ規模までスケールアップした。約６Ｌの培地を収容している１０発酵槽を接種するためにこうして得た種菌を使用した。
【００５１】
２．反応
０．５ｇｍの（１％）Ｒ−ＰＡＣ、すなわち１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−オン、９ｍｌの（０．９６Ｍ）イソプロピルアミン、３０．５ｍｌの（１００ｍＭ）リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．４、２５ｍｇのピリドキサールリン酸、及び（酵素トランスアミナーゼを含有している）バイオマス  ３．７５ｇｍ湿潤重量を含む反応混合物をインキュベートし、３０℃で４８時間振とうさせるために保持した。９１％変換率が９８％ジアステレオマー過剰率で得られた。
【００５２】
従って、本発明は、規定されているアミノ供与体の存在下でトランスアミナーゼ、すなわちアミノトランスアミナーゼ酵素を用いることにより光学活性キラルアミンを生成する酵素的方法を特徴とする。
【国際調査報告】
2014521362.tif 000005