(57)【要約】遺伝子組換えファージ及びその利用本発明は、遺伝子組換えファージ、及び目的の生体分子の産生法におけるその利用に関する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子組換え  発現系が挿入され、
Ｓ遺伝子、Ｒ遺伝子及び／又はＱ遺伝子が不活性化されており、
Ｉｎｔ遺伝子及び／又はＸｉｓ遺伝子が不活性化されている、
遺伝子組換えファージ。
【請求項２】
Ｒｚ遺伝子が不活性化されている、請求項１に記載の遺伝子組換えファージ。
【請求項３】
遺伝子組換え  発現系が挿入され、
Ｉｎｔ遺伝子、Ｘｉｓ遺伝子、及びＲ遺伝子、Ｓ遺伝子及びＲｚ遺伝子が不活性化されている、
請求項１〜２のいずれか１項に記載の遺伝子組換えファージ。
【請求項４】
遺伝子組換え  発現系が挿入され、
Ｉｎｔ遺伝子、Ｘｉｓ遺伝子、及びＱ遺伝子、Ｒ遺伝子、Ｓ遺伝子及びＲｚ遺伝子が不活性化されている、
請求項１〜２のいずれか１項に記載の遺伝子組換えファージ。
【請求項５】
発現系がＴ７発現系である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子組換えファージ。
【請求項６】
遺伝子組換え前記ファージがラムダファージ、４３４ファージ、ｐｈｉ８０ファージ、ｐｈｉ８１ファージ、ＨＫ９７ファージ、Ｐ２１ファージである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子組換えファージ。
【請求項７】
遺伝子組換え前記ファージがＰ１１ファージからＰ５３ファージのうちの１つである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子組換えファージ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子組換えファージとヘルパーファージとを含むキット。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子組換えファージを含む宿主細胞。
【請求項１０】
前記宿主細胞が腸内細菌、好ましくは大腸菌、より好ましくはＢＬ２１である、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
ｔｏｎＡ、ｇａｌＫ、ａｒａＢ、ａｒａＡ、ｌｏｎ、ｏｍｐＴ、ｒｃｓＡ，ｈｓｄＲ，ｍｒｒ、ｅｎｄＡ及びｒｅｃＡの遺伝子のうち、少なくとも１つの遺伝子の不活性化をさらに含む、請求項９〜１０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
ｃｃｄｂ遺伝子の挿入を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の宿主細胞とｃｃｄＡ遺伝子を含むプラスミドとを含むキット。
【請求項１４】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載の宿主細胞を準備するためのプロセスであって、宿主細胞を請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子組換えファージに感染させることを含むプロセス。
【請求項１５】
目的の生体分子を産生するためのプロセスであって、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子組換えファージ及び前記目的の生体分子の核酸配列を含む宿主細胞を培養することと、
前記目的の生体分子を回収することと、
を含むプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体系における目的の生体分子の産生の分野に関する。詳細には、本発明は、遺伝子組換えファージと、培養液のファージ感染及び／又は細菌の溶菌を回避するためのその利用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌細胞は、生体分子、特に標的タンパク質の産生のために選択される系である。細菌系の最大の利点は、利用が容易であること、及び多量のタンパク質を限られた培養量の中で迅速に産生できることである。
【０００３】
最も広く日常的に使用される細菌系の１つは、バクテリオファージＴ７発現系である。この細菌系は米国特許第４，９５２，４９６号に記載されている。この系では、標的タンパク質をコードする遺伝子がＴ７プロモーターの制御下に置かれ、宿主細菌、通常の場合、組み込まれたラムダＤＥ３溶原ファージを含む大腸菌（Ｅ．coli）に形質転換される。ラムダＤＥ３溶原ファージは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を持つ。ＩＰＴＧを含む培地で培養されると、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの発現が誘導され、標的タンパク質を発現させる。
【０００４】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子（Ｔ７遺伝子１）がＩｎｔ遺伝子の配列内に組み込まれているため、ラムダＤＥ３ファージには溶菌段階に入る能力が欠損しているはずである。しかしながら、一部のタンパク質が産生される間、他のファージが存在しない状態で細菌の溶菌が見られ、このことはＤＥ３ファージがその溶菌特性を回復しうることを示唆している。細菌の溶菌が存在することと、それ以上に培養液中に感染性のファージが存在することとが極めて問題なのは、（i）産生した標的タンパク質を何らかの用途、例えば製薬上の用途に使用することを損なうため、（ii）ファージの一切の痕跡を除去するための除染プロセスを行うには、製造ラインを停止し、一回分の培養を完全に取り替えることが必要となるため、及び（iii）組換えタンパク質の収率を著しく減少させるため、である。
【０００５】
ファージを使用する代替的な方法として、国際公開第０３／０５０２４０号には、相同組換えを用いて組み込まれたＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を含む宿主細胞で標的タンパク質を産生する発現系が記載されている。しかしながら、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のサイズと、相同組換えをすべての大腸菌株で行うことが容易ではない（Ｐｈｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１０１，８３１−８３６，２００８に記載のとおり）という事実のため、国際公開第０３／０５０２４０号の系を実施するのは困難である。その結果、組み込まれたＴ７ＲＮＡポリメラーゼを保有する形質転換された細胞の数は、極めて少数であるか、又はこれらの細胞は得られない。さらに、相同組換えを用いると、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の組み込みを含んだ細菌を選択する選択マーカーの使用が必要になる。このマーカーは、他の選択ステップのために使用することができなくなり、株の最終的な使用にとって望ましくないかもしれない。例えば、使用頻度の高い選択マーカーは抗生物質抵抗性遺伝子であるが、バイオ医薬品の製造ではこれらの遺伝子を避けることが推奨される。したがって、抗生物質抵抗性遺伝子を株から除去する追加的なステップが必要であり、これを行うことが常に可能というわけではない。
【０００６】
国際公開第２００８／１３９１５３号には、宿主細胞が、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの発現カセットを含むプラスミドで形質転換される他の発現系の記載がある。しかしながら、プラスミドを使用することから、宿主細胞がプラスミドを含み続けることを確実にするため、宿主細胞を選択条件下に維持する必要がある。加えて、プラスミドは、発現系を損なう組換えを受けることが多い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このため、目的の生体分子を産生するための全く新たな方法、つまり、ファージを使用するとき、培養液が感染性のファージで汚染されたり、成長やタンパク質産生の間に意図せず溶解されたりしない方法が必要である。
【０００８】
このように、本発明は、培養の間にその溶菌特性を回復しない遺伝子組換えファージを提供し、これにより、ファージの汚染なしに目的の生体分子の産生を可能にする。
【課題を解決する手段】
【０００９】
本発明の目的の一つは、
発現系が挿入され、
Ｓ遺伝子及び／又はＲ遺伝子が不活性化されている、
遺伝子組換えファージである。
【００１０】
本発明の一実施形態では、Ｉｎｔ遺伝子及び／又はＸｉｓ遺伝子は不活性化されている。
【００１１】
本発明の他の目的は、
発現系が挿入され、
Ｓ遺伝子、Ｒ遺伝子及び／又はＱ遺伝子が不活性化され、
Ｉｎｔ遺伝子及び／又はＸｉｓ遺伝子が不活性化されている、
遺伝子組換えファージである。
【００１２】
本発明の他の実施形態では、Ｒｚ遺伝子は不活性化されている。
【００１３】
本発明の他の実施形態では、発現系が挿入され、Ｉｎｔ遺伝子、Ｘｉｓ遺伝子及びＲ遺伝子、Ｓ遺伝子及びＲｚ遺伝子が不活性化されている。
【００１４】
本発明の他の実施形態では、発現系が挿入され、Ｉｎｔ遺伝子、Ｘｉｓ遺伝子及びＱ遺伝子、Ｒ遺伝子、Ｓ遺伝子及びＲｚ遺伝子が不活性化されている。
【００１５】
本発明の他の実施形態では、発現系はＴ７発現系である。
【００１６】
本発明の他の実施形態では、ファージはラムダファージ、４３４ファージ、ｐｈｉ８０ファージ、ｐｈｉ８１ファージ、ＨＫ９７ファージ、Ｐ２１ファージである。
【００１７】
本発明の他の実施形態では、上述の遺伝子組換えファージは、配列番号１０の配列を有している。本発明の他の実施形態では、上述の遺伝子組換えファージは、Ｐ１１ファージからＰ５３ファージのうちの１つである。
【００１８】
本発明の他の目的は、上述の遺伝子組換えファージとヘルパーファージとを含むキットである。
【００１９】
本発明の他の目的は、上述の遺伝子組換えファージを含む宿主細胞である。
【００２０】
本発明の一実施形態では、宿主細胞は腸内細菌、好ましくは大腸菌、より好ましくはＢＬ２１である。
【００２１】
本発明の他の実施形態では、上述の宿主細胞は、ｔｏｎＡ、ｇａｌＫ、ａｒａＢ、ａｒａＡ、ｌｏｎ、ｏｍｐＴ、ｒｃｓＡ、ｈｓｄＲ、ｍｒｒ、ｅｎｄＡ及びｒｅｃＡの遺伝子のうち少なくとも１つの遺伝子の不活性化をさらに含む。
【００２２】
本発明の他の実施形態では、上述の宿主細胞は、ｃｃｄｂ遺伝子の挿入を含む。
【００２３】
本発明の他の目的は、上述の宿主細胞とｃｃｄＡ遺伝子を含むプラスミドとを含むキットである。
【００２４】
本発明の他の目的は、上述の宿主細胞を準備するためのプロセスであり、このプロセスは、上述の遺伝子組換えファージで宿主細胞を感染させることを含む。
【００２５】
本発明の他の目的は、目的の生体分子を産生するプロセスであり、このプロセスは、
請求項１から７のいずれか１項に記載の遺伝子組換えファージ及び目的の生体分子の核酸配列を含む宿主細胞を培養することと、
目的の生体分子を回収することと、
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】クマシーブルー染色で色付けされたＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルを示す図であり、目的のタンパク質の産生を表している。１及び６：サイズ、２：ペレット［ｐＳｃｈｅｒｒｙ１］Ｍ１１ＤＥ３誘導前、３：ペレット［ｐＳｃｈｅｒｒｙ１］Ｍ１１ＤＥ３誘導後；４：ペレット［ｐＳｃｈｅｒｒｙ１］ＨＭＳ１７４ＤＥ３誘導前、５：ペレット［ｐＳｃｈｅｒｒｙ１］ＨＭＳ１７４ＤＥ３誘導後。配列は、目的のタンパク質を同定するためのものである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、溶菌特性を再獲得する能力が限定されている遺伝子組換えファージに関する。
【００２８】
本発明者らは、ファージの遺伝子組換えを重点的に扱った。驚くべきことに、本発明者らは、組み込まれたファージのウィルス性配列すべてを欠失させる場合、感染された細菌の生存力が極めて損なわれることになるため、すべてを欠失させることは不可能であることを示した。詳細には、本発明者らは、ｒａｌ遺伝子及びＮ遺伝子のコード配列を含むＤＮＡ断片を欠失させれば、宿主細胞の死滅につながることを示した（実施例参照）。ｒａｌ遺伝子及びＮ遺伝子が溶原状態に関係していることは知られておらず、Ｎ遺伝子は溶菌成長に不可欠なものとして記述されているのみであるため、この結果は驚くべきものであった。逆に溶原状態では、ＣI又はＣ２と名付けられたファージのリプレッサーが、Ｎ及びｒａｌの発現を抑制する。
【００２９】
このように本発明は、
発現系が挿入され、
Ｉｎｔ遺伝子、Ｘｉｓ遺伝子、Ｒ遺伝子、Ｓ遺伝子、Ｑ遺伝子及びＲｚ遺伝子のうち少なくとも１つの遺伝子が不活性化されている、
遺伝子組換えファージに関する。
【００３０】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子は不活性化されている。
【００３１】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｒ遺伝子は不活性化されている。
【００３２】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｑ遺伝子は不活性化されている。
【００３３】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｉｎｔ遺伝子は不活性化されている。
【００３４】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｘｉｓ遺伝子は不活性化されている。
【００３５】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子及びＩｎｔ遺伝子は不活性化されている。
【００３６】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子及びＸｉｓ遺伝子は不活性化されている。
【００３７】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子及びＲ遺伝子は不活性化されている。
【００３８】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子及びＲｚ遺伝子は不活性化されている。
【００３９】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子及びＱ遺伝子は不活性化されている。
【００４０】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｒ遺伝子及びＲｚ遺伝子は不活性化されている。
【００４１】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｒ遺伝子及びＩｎｔ遺伝子は不活性化されている。
【００４２】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｒ遺伝子及びＸｉｓ遺伝子は不活性化されている。
【００４３】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｒ遺伝子及びＱ遺伝子は不活性化されている。
【００４４】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｑ遺伝子及びＲｚ遺伝子は不活性化されている。
【００４５】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｑ遺伝子及びＩｎｔ遺伝子は不活性化されている。
【００４６】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｑ遺伝子及びＸｉｓ遺伝子は不活性化されている。
【００４７】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子、Ｉｎｔ遺伝子及びＸｉｓ遺伝子は不活性化されている。
【００４８】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子、Ｉｎｔ遺伝子及びＲｚ遺伝子は不活性化されている。
【００４９】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子、Ｉｎｔ遺伝子及びＲ遺伝子は不活性化されている。
【００５０】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子、Ｘｉｓ遺伝子及びＲｚ遺伝子は不活性化されている。
【００５１】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子、Ｘｉｓ遺伝子及びＲ遺伝子は不活性化されている。
【００５２】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子、Ｒ遺伝子及びＲｚ遺伝子は不活性化されている。
【００５３】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子、Ｒ遺伝子及びＱ遺伝子は不活性化されている。
【００５４】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子、Ｑ遺伝子及びＲｚ遺伝子は不活性化されている。
【００５５】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子、Ｑ遺伝子及びＩｎｔ遺伝子は不活性化されている。
【００５６】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子、Ｑ遺伝子及びＸｉｓ遺伝子は不活性化されている。
【００５７】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｒ遺伝子、Ｉｎｔ遺伝子及びＸｉｓ遺伝子は不活性化されている。
【００５８】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｒ遺伝子、Ｉｎｔ遺伝子及びＲｚ遺伝子は不活性化されている。
【００５９】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｒ遺伝子、Ｘｉｓ遺伝子及びＲｚ遺伝子は不活性化されている。
【００６０】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｒ遺伝子、Ｑ遺伝子及びＲｚ遺伝子は不活性化されている。
【００６１】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｒ遺伝子、Ｘｉｓ遺伝子及びＱ遺伝子は不活性化されている。
【００６２】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｒ遺伝子、Ｉｎｔ遺伝子及びＱ遺伝子は不活性化されている。
【００６３】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｑ遺伝子、Ｉｎｔ遺伝子及びＲｚ遺伝子は不活性化されている。
【００６４】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｑ遺伝子、Ｉｎｔ遺伝子及びＸｉｓ遺伝子は不活性化されている。
【００６５】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｑ遺伝子、Ｘｉｓ遺伝子及びＲｚ遺伝子は不活性化されている。
【００６６】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子、Ｉｎｔ遺伝子、Ｘｉｓ遺伝子及びＲｚ遺伝子は不活性化されている。
【００６７】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子、Ｉｎｔ遺伝子、Ｘｉｓ遺伝子及びＲ遺伝子は不活性化されている。
【００６８】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子、Ｉｎｔ遺伝子、Ｒ遺伝子及びＲｚ遺伝子は不活性化されている。
【００６９】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子、Ｒ遺伝子、Ｘｉｓ遺伝子及びＲｚ遺伝子は不活性化されている。
【００７０】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｒ遺伝子、Ｒｚ遺伝子、Ｘｉｓ遺伝子及びＩｎｔ遺伝子は不活性化されている。
【００７１】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｑ遺伝子、Ｒ遺伝子、Ｒｚ遺伝子及びＳ遺伝子は不活性化されている。
【００７２】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｑ遺伝子、Ｒ遺伝子、Ｒｚ遺伝子及びＩｎｔ遺伝子は不活性化されている。
【００７３】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｑ遺伝子、Ｒ遺伝子、Ｓ遺伝子及びＩｎｔ遺伝子は不活性化されている。
【００７４】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｑ遺伝子、Ｒｚ遺伝子、Ｓ遺伝子及びＩｎｔ遺伝子は不活性化されている。
【００７５】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｑ遺伝子、Ｒ遺伝子、Ｒｚ遺伝子及びＸｉｓ遺伝子は不活性化されている。
【００７６】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｑ遺伝子、Ｒ遺伝子、Ｓ遺伝子及びＸｉｓ遺伝子は不活性化されている。
【００７７】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｑ遺伝子、Ｒｚ遺伝子、Ｓ遺伝子及びＸｉｓ遺伝子は不活性化されている。
【００７８】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｑ遺伝子、Ｒ遺伝子、Ｉｎｔ遺伝子及びＸｉｓ遺伝子は不活性化されている。
【００７９】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｑ遺伝子、Ｒｚ遺伝子、Ｉｎｔ遺伝子及びＸｉｓ遺伝子は不活性化されている。
【００８０】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｑ遺伝子、Ｓ遺伝子、Ｉｎｔ遺伝子及びＸｉｓ遺伝子は不活性化されている。
【００８１】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子、Ｒ遺伝子、Ｒｚ遺伝子、Ｘｉｓ遺伝子及びＩｎｔ遺伝子は不活性化されている。
【００８２】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子、Ｒ遺伝子、Ｑ遺伝子、Ｒｚ遺伝子及びＸｉｓ遺伝子は不活性化されている。
【００８３】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子、Ｒ遺伝子、Ｑ遺伝子、Ｒｚ遺伝子及びＩｎｔ遺伝子は不活性化されている。
【００８４】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子、Ｒ遺伝子、Ｑ遺伝子、Ｘｉｓ遺伝子及びＩｎｔ遺伝子は不活性化されている。
【００８５】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子、Ｑ遺伝子、Ｒｚ遺伝子、Ｘｉｓ遺伝子及びＩｎｔ遺伝子は不活性化されている。
【００８６】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｒ遺伝子、Ｑ遺伝子、Ｒｚ遺伝子、Ｘｉｓ遺伝子及びＩｎｔ遺伝子は不活性化されている。
【００８７】
一実施形態では、遺伝子組換えファージは発現系を含み、Ｓ遺伝子、Ｒ遺伝子、Ｑ遺伝子、Ｒｚ遺伝子、Ｘｉｓ遺伝子及びＩｎｔ遺伝子は不活性化されている。
【００８８】
本発明に使用されうるファージの例は、ラムダ（λ）ファージ、ラムダ様ファージ及びラムダ状ファージを含むが、これらに限定されるものではない。大腸菌ファージラムダとしても知られるラムダファージは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に感染するウィルスである。ラムダは、テンペレートバクテリオファージである。ラムダ様ファージは、非収縮性の長い尾を特徴とするバクテリオファージと古細菌ウィルスの系統群を成す。ラムダ状ファージは、ラムダファージの近縁生物である。これらのファージのほとんどは大腸菌で成長するが、例えばネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のような他の宿主細胞を由来とするものもわずかにある。これらのファージは、ラムダと同じ遺伝子配列を有しうる。
【００８９】
本発明において用いられうるラムダ様ファージ及びラムダ状ファージの例は、大腸菌ファージ４３４、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、ＨＫ９７、Ｐ２１及びＰ２２を含むが、これらに限定されるものではない。
【００９０】
一実施形態では、ファージはラムダ（腸内細菌ファージラムダ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｈａｇｅ  ｌａｍｂｄａ）、受託番号ＮＣ＿００１４１６）である。このラムダファージのゲノム構成は以下の表１で示される。
【表１】
2014520519.tif 000002
2014520519.tif 000003
【００９１】
本発明では、ラムダファージの配列内における残基の位置は、ＮＣ＿００１４１６に関する。
【００９２】
他の実施形態では、ファージはラムダＤＥ３（受託番号ＥＵ０７８５９２）である。ラムダＤＥ３ファージは修飾されたラムダファージＤ６９であり、ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を有する。ラムダＤＥ３の配列によって保有される遺伝子とその位置のリストは、以下の表２で示される。
【表２】
2014520519.tif 000004
2014520519.tif 000005
【００９３】
本発明では、ラムダＤＥ３ファージの配列内における残基の位置は、ＥＵ０７８５９２に関する。
【００９４】
「発現系」とは、本明細書で使用するとき、系を転写するための追加的な断片に作動可能に結合された核酸配列をコードする断片からなる直鎖ＤＮＡ分子又は環状ＤＮＡ分子を指す。
【００９５】
この追加的な断片には、プロモーター及び終止コドン配列が含まれる。発現系は、１つ又は複数の複製開始点、１つ又は複数の選択マーカー及びリボソーム結合位置をコードする配列をさらに含みうる。
【００９６】
「作動可能に結合された」とは、例えば一旦プロモーターで転写が始まると、コードされた断片を通って終止コドンまで転写が続くといったように、断片が本来期待される形で機能するように配置されていることを意味する。
【００９７】
本発明で意味する「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼを結合させ、転写を開始させる発現制御要素である。
【００９８】
本発明の一実施形態では、核酸配列は「強力な」プロモーターの制御下にある。強力なプロモーターとは、そのプロモーターの配列が一方ではＲＮＡポリメラーゼ、通常は天然型の対応するＲＮＡポリメラーゼと結合する親和性が高いこと、他方ではそのＲＮＡポリメラーゼによるｍＲＮＡ形成の割合によって特徴づけられる。
【００９９】
好ましい実施形態では、核酸配列は「誘導性プロモーター」の制御下にある。「誘導性プロモーター」とは、外因によって調節されうるプロモーターであり、外因とは、例えば誘導質（「誘導因子）」ともいう）分子の存在やリプレッサー分子の不存在、又は温度、モル浸透圧濃度あるいはｐＨ値の上下のような物理的要素である。Ｍａｋｒｉｄｅｓらによって、様々なプロモーターとそれぞれのプロモーターに対応する誘導原理が検討された（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９６，（６０）３：５１２−５３８）。本発明において使用されうる誘導性プロモーターの例には、ｔａｃプロモーター又はｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター又はｌａｃＵＶ５プロモーター（すべてラクトース又はそのアナログＩＰＴＧ（イソプロピルチオ-β-D-ガラクトシド）によって誘導可能）、厳密に調節可能なａｒａＢＡＤプロモーター（ＰＢＡＤ，Ｇｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，アラビノースにより誘導可能）、ｔｒｐプロモーター（β−インドールアクリル酸の追加又はトリプトファンの欠乏により誘導可能、トリプトファンの追加によって抑制可能）、ラムダプロモーターｐＬ（λ）（温度上昇により誘導）、ｐｈｏＡプロモーター（リン酸塩の欠乏により誘導可能）、ＰｐｒｐＢ（プロピオン酸を用いて誘導）や組換えタンパク質の発現に好適なその他のプロモーターが含まれ、これらはすべて大腸菌ＲＮＡポリメラーゼを使用するが、これらに限定されるものではない。
【０１００】
誘導性プロモーターの中には、「漏出性の」発現行動を示すものがある。こうしたプロモーター（いわゆる「漏出性プロモーター」）は、原則として誘導性であるが、そうであるにもかかわらず外部から誘導されることなく基礎発現をも示す。非誘導条件下で漏出性発現を示す誘導性プロモーターは、構成的プロモーターと類似に行動しうる（すなわち、これらは安定的かつ継続的に活性である、あるいは特定の培養条件の結果として活性化又は促進されうる）。漏出性プロモーターは、継続して行われる培養プロセスに特に有用でありうる。漏出性プロモーターの例は、Ｔ７プロモーター及びｔｒｐプロモーターである。
【０１０１】
本発明の一実施形態では、プロモーターは構成的、すなわち、一方では誘導を必要とすることなく、また他方では抑制される可能性もなく、発現を制御するプロモーターでありうる。したがって、ある程度のレベルで継続的かつ安定的な発現が起こる。一例として、強力な構成的ＨＣＤプロモーター（Ｐｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００２，２４：１１８５−１１８９，Ｊｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２００４，３６：１５０−１５６）が構成的な発現に適用されうる。
【０１０２】
一実施形態では、発現系は、目的の生体分子の発現を誘導するタンパク質をコードする核酸配列を含む。有利には、目的の生体分子の発現は、例えば選択下にあるような特別な条件下で誘導される。
【０１０３】
こうした核酸配列の例には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子であるＴ７遺伝子１が含まれるが、これに限定されるものではない。この場合においては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの発現が、Ｔ７プロモーターの制御下に置かれた目的の生体分子の発現を誘導する。
【０１０４】
発現系は、Ｔ７発現系であることが好ましい。Ｔ７発現系は、本明細書に援用する米国特許第４，９５２，４９６号に記載された。Ｔ７発現系はＴ７ファージに由来するＤＮＡ断片を含み、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの全コード配列（すなわちＴ７遺伝子１）を含有している。Ｔ７遺伝子１の本来の活性プロモーターはいずれも除去され、コード配列の前に誘導性のｌａｃＵＶ５プロモーターが挿入された。ｌａｃＵＶ５プロモーターは、ＩＰＴＧを培地に追加することにより誘導される。
【０１０５】
他の実施形態によると、発現系は目的の生体分子の核酸配列を含む。
【０１０６】
目的の生体分子に関しては、制限はない。これは原則として、いかなるアミノ酸配列であっても、例えばＤＮＡやＲＮＡのような核酸配列であってもよい。
【０１０７】
アミノ酸配列の例には、例えば工業で使用される生体分子又は治療で使用される生体分子など、工業規模で産生されるポリペプチド、タンパク質又はペプチドが含まれる。
【０１０８】
本発明の方法により産生することができる生体分子の例は、酵素、調節タンパク質、受容体、ペプチド、例えばペプチドホルモン、サイトカイン、膜タンパク質又は輸送タンパク質があるが、これらに限定されるものではない。
【０１０９】
目的の生体分子は、ワクチン接種に用いられる抗原、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激タンパク質、アレルゲン、全長の抗体又は抗体断片あるいは抗体の誘導体であってもよい。抗体の誘導体は、単一鎖の抗体、（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、シングルドメイン抗体（ＶＨ断片又はＶＬ断片）、ラクダシングルドメイン抗体のようなドメイン抗体（ＶＨＨ、ナノボディ）といった群から、又は、例えばＡｎｄｅｒｓｅｎ及びＲｅｉｌｌｙ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，１５：４５６−４６２）あるいはＨｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２００５（２３）９：１１２６−１１３６）に記載のあるようなその他の抗体型から選択されうる。
【０１１０】
本発明における目的の生体分子は、例えば被膜タンパク質、コアタンパク質、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼなどのタンパク質（ウィルス性の抗原）によって例示することもでき、例えばＢ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、Ｉ−ＨＶ、インフルエンザなどの病原ウィルスのゲノム、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）などの増殖因子のゲノム、腫瘍壊死因子、インターフェロン、インターロイキンなどのサイトカインのゲノム、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、トロンボポエチンなどの造血因子のゲノム、黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＢ−ＲＨ）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、インスリン、ソマトスタチン、成長ホルモン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体化ホルモン（ＬＵ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、バソプレシン、オキシトシン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、グルカゴン、ガストリン、セクレチン、パンクレオザイミン、コレシストキニン、アンジオテンシン、ヒト胎盤性ラクトーゲン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、セルレイン、モチリンなどのペプチドホルモンのゲノム、エンケファリン、エンドルフィン、ダイノルフィン、キョートルフィンなどの鎮痛ペプチド、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、アスパラギナーゼ、カリクレインなどの酵素のゲノム、ボンベシン、ニューロテンシン、ブラジキニン、サブスタンスＰ、アルツハイマーのアミロイドペプチド（ＡＤ）、ＳＯＤ１、プレセニリン１及び２、レニン、シヌクレイン、アミロイドＡ、アミロイドＰ、アクチビン、抗ＨＥＲ−２、ボンベシン、エンケファリナーゼ、プロテアーゼインヒビター、治療用酵素、Ｄ１−アンチトリプシン、哺乳動物トリプシンインヒビター、哺乳動物膵臓トリプシンインヒビター、カルシトニン、心臓肥大因子、カルジオトロフィン（カルジオトロフィン−１など）、ＣＤタンパク質（ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８及びＣＤ−１９など）、ＣＦＴＲ、ＣＴＮＦ、デオキシリボヌクレアーゼ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、サイトカイン、トランスサイレチン、アミリン、リポタンパク、リンホカイン、リゾチーム、成長ホルモン（ヒト成長ホルモンを含む）、ウシ成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、増殖因子、脳由来神経栄養因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（Ｄ  ＦＧＦ及びＤ  ＦＧＦなど）、インスリン様成長因子I及びII、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−I（脳ＩＧＦ−I）、インスリン様増殖因子結合タンパク質、神経成長因子（ＮＧＦ−Ｄなど）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、成長ホルモン又は成長因子受容体、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）（ＴＧＦ−Ｄ、ＴＧＦ−Ｄ１、ＴＧＦ−Ｄ２、ＴＧＦ−Ｄ３、ＴＧＦ−Ｄ４、ＴＧＦ−Ｄ５など）、神経栄養因子（ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン４、ニューロトロフィン５又はニューロトロフィン６）、ゲルゾリン、グルカゴン、カリクレイン、ミュラー管抑制因子、神経栄養因子、ｐ５３、プロテインＡ又はＤ、プロレラキシン、レラキシンＡ鎖、レラキシンＢ鎖、リウマトイド因子、ロドプシン、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）、インヒビン、インスリン、インスリン鎖、インスリンＡ鎖、インスリンＤ鎖、インスリン受容体、プロインスリン、黄体化ホルモン、インテグリン、インターロイキン（ＩＬｓ）（ＩＬ−１〜ＩＬ１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３など）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、フィブリリン、卵胞刺激ホルモン、凝固因子（第VIII因子、第IX因子、組織因子及びフォンヴィレブランド因子など）、抗凝固因子（プロテインＣ、心房性ナトリウム利尿因子、肺表面活性物質など）、プラスミノーゲン活性化因子（ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子又はウロキナーゼ）、トロンビン、腫瘍壊死因子Ｄ又はＤ、Ｄ−ケト酸デヒドロゲナーゼ、アドレシン、骨形成タンパク質（ＢＭＰｓ）、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）（Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦ）、崩壊促進因子、ホーミング受容体、インターフェロン（インターフェロンα、インターフェロンγ及びインターフェロンβなど）、ケラチン、骨誘導因子、ＰＲＮＰ、調節タンパク質、スーパーオキシドディスムターゼ、表面膜タンパク質、輸送タンパク質、Ｔ細胞受容体などのペプチド性神経伝達物質のゲノム、ｇｐｌ２０（ＨＩｂ）イムノトキシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、精嚢外分泌腺タンパク質、Ｄ２−ミクログロブリン、ＰｒＰ、プロカルシトニン、アタキシン１、アタキシン２、アタキシン３、アタキシン６、アタキシン７、ハンチグチン、アンドロゲン受容体、ＣＲＥＢ結合タンパク質、ｇｐｌ２０、ｐ３００、ＣＲＥＢ、ＡＰＩ、ｒａｓ、ＮＦＡＴ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症関連タンパク質、微生物タンパク質（例えばマルトース結合タンパク質、ＡＢＣトランスポーター、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、チオレドキシン、Ｄ−ラクタマーゼ）、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、スーパーオキシドディスムターゼ、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、リボヌクレアーゼ、カタラーゼ、ウリカーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、トリプシン、パパイン、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ又はバトロキソビンなどの酵素、オピオイド、例えば、エンドルフィン、エンケファリン又は非天然オピオイド、ホルモン又はニューロペプチド、例えば、カルシトニン、グルカゴン、ガストリン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、コレシストキニン、黄体化ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、コルチコトロピン放出因子、バソプレッシン、オキシトシン、抗利尿ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、リラキシン、プロラクチン、ペプチドＹＹ、ニューロ���プチドＹ、膵臓ポリペプチド（ｐａｎｃｒｅａｓｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、レプチン、ＣＡＲＴ（コカイン・アンフェタミン調節転写産物）、ＣＡＲＴ関連ペプチド、ペリリピン、ＭＣ−４などのメラノコルチン（メラニン細胞刺激ホルモン）、メラニン凝集ホルモン、ナトリウム利尿ペプチド、アドレノメデュリン、エンドセリン、セクレチン、アミリン、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、ボンベシン、ボンベシン様ペプチド、チモシン、ヘパリン結合タンパク質、可溶性ＣＤ４、視床下部放出因子及びメラノトニン又はこれらの機能を持つ類縁体のゲノムにコードされうる。本発明の他の実施形態では、標的タンパク質は、プロセシング酵素、例えば、プロテアーゼ（例えばエンテロキナーゼ、 カスパーゼトリプシン様セリンプロテアーゼ)、リパーゼ、ホスファターゼ、 グリコシルヒドロラーゼ（例えばマンノシダーゼ、キシロシダーゼ、フコシダーゼ）、キナーゼ、モノ又はジオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、トランスグルタミナーゼ、カルボキシペプチダーゼ、アミダーゼ、エステラーゼ、及びホスファターゼであってもよい。
【０１１１】
このような哺乳動物ポリペプチドに好ましい由来には、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、オオカミ及び齧歯動物が含まれ、ヒトタンパク質を有するものが特に好ましい。
【０１１２】
本発明の目的の生体分子は、上述のタンパク質のバリアントをも包含する。これらのバリアントは、例えば上述のタンパク質と同様の活性を有し、上述のタンパク質のアミノ酸配列において、１つ又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質を包含する。このようなタンパク質は、上述のタンパク質と同様の活性を有し、上述のタンパク質のアミノ酸配列において、１つ又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質によって例示することができる。欠失、置換、挿入及び付加から選択される２つ又はそれ以上の異なる修飾が同時に行われうる。
【０１１３】
また、本発明の目的の生体分子は、上述のタンパク質の「部分ペプチド」を包含する。タンパク質の部分ペプチドは、上述のタンパク質のアミノ酸配列の一部が途切れなく続いているアミノ酸配列を有する部分ペプチドによって例示することができ、この部分ペプチドは、好ましくは該タンパク質と同じ活性を有する。このような部分ペプチドは、上述のタンパク質のアミノ酸配列の中の少なくとも２０、好ましくは少なくとも５０のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドによって例示することができる。このポリペプチドは、上述のタンパク質の活性と関連する領域に対応するアミノ酸配列を含んでいることが好ましい。さらに、本発明で用いられる部分ペプチドは、このポリペプチドを修飾することによって得られる部分ペプチドであってもよく、このポリペプチドでは、１つ又は複数のアミノ酸残基（例えば約１〜２０、より好ましくは約１〜１０、さらに好ましくは約１〜５）がアミノ酸配列から欠失している、アミノ酸配列に置換されている、挿入されている及び／又は付加されている。また、本発明で用いられる部分ペプチドは、抗体産生のための抗原として用いることもできる。
【０１１４】
本発明の一実施形態では、目的の生体分子は、ヒト成長ホルモン、ヒトインスリン、卵胞刺激ホルモン、第VIII因子、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、αガラクトシダーゼＡ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、ドルナーゼアルファ、組織プラスミノーゲン活性化因子、グルコセレブロシダーゼ、インターフェロン、インスリン様増殖因子１、ウシソマトトロピン、ブタソマトトロピン、ウシキモシン及びＢ型肝炎ウィルスの外被タンパク質を有する群から選択される。
【０１１５】
また、目的の生体分子は、周辺質において環化、糖鎖付加、リン酸化、メチル化、酸化、脱水、タンパク質切断などの翻訳後修飾及び輸送後修飾が行われたポリペプチド又はタンパク質を包含する。
【０１１６】
一実施形態において、目的の生体分子は、細胞外媒質中の生体分子（本明細書では「細胞外生体分子」とよぶ）を代謝するための酵素である。一実施形態では、細胞外生体分子は多糖又は脂質を含む。本発明の一実施形態では、多糖は、アルギン酸、ペクチン、セルロース、セロビオース、ラミナリン又はこれらの混合物を含む。本発明の一実施形態では、脂質は、脂肪酸、糖脂質、ベタイン脂質、グリセロ脂質、リン脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、サッカロ脂質、ポリケチド又はこれらの混合物を含む。本発明の一実施形態では、目的の生体分子は、多糖を単糖、オリゴ糖又はその両方に転換する酵素である。
【０１１７】
本発明の一実施形態では、目的の生体分子は、脂質を脂肪酸、単糖又はその両方に転換する酵素である。本発明の一実施形態では、単糖又はオリゴ糖は、オリゴアルギン酸、マンヌロネート、グルロネート、マンニトール、ａ−ケト酸、４−デオキシ−Ｌ−エリスロ−ヘキソースウロースウロナート（ＤＥＨＵ）、２−ケト−３−デオキシＤ−グルコン酸（ＫＤＧ）、グルコース、グルクロン酸、ガラクツロン酸、ガラクトース、キシロース、アラビノース又はマンノースである。本発明の一実施形態では、脂肪酸は、１４：０、ｔｒａｎｓ−１４、１６：０、１６：１ｎ−７、ｔｒａｎｓ−１６、１６：２ｎ−６、１８：０、１８：１ｎ−９、１８：２ｎ−６、１８：３ｎ−６、１８：３ｎ−３、１８：４ｎ−３、２０：０、２０：２ｎ−６、２０：３ｎ−６、２０：４ｎ−３、２０：４ｎ−６又は２０：５ｎ−３である。
【０１１８】
本発明の一実施形態では、目的の生体分子は、細胞外生体分子を化学製品に転換する酵素である。本発明の一実施形態では、この化学製品は、エタノール、ブタノール又はバイオディーゼルである。本発明の一実施形態では、このバイオディーゼルは、脂肪酸、脂肪酸エステル又はテルペノイドである。
【０１１９】
「不活性化」という用語は、本明細書で使用するとき、転写段階又は翻訳段階での遺伝子発現の阻害又は抑制を指す。好ましくは、「不活性化」という用語は、転写が抑制されている遺伝子を指す。
【０１２０】
本発明によれば、遺伝子の変異又は遺伝子のコード配列内での発現系の挿入を原因として、遺伝子の不活性化が起こりうる。
本発明においては、「変異」という用語は、遺伝子配列における安定的な変化を指す。本発明において遺伝子の不活性化につながりうる変異の例には、点変異、挿入、欠失及び増幅又は遺伝子重複が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２１】
変異は、欠失であることが好ましい。本明細書で使用するときの「欠失」という用語は、遺伝子の喪失又は欠如、好ましくは遺伝子の完全な喪失又は欠如を意味する。より好ましくは、欠失は、欠失した遺伝子の開始コドンの位置で、又はそれより前の位置で始まり、欠失した遺伝子の終止コドンの位置で、又はそれより後の位置で終わる。
【０１２２】
本発明の一実施形態では、Ｓ遺伝子は不活性化されている。Ｓ遺伝子は、ホリンタンパク質（Ｓ１０５）及びアンチホリンタンパク質（Ｓ１０７）の両方をコードする。ホリンタンパク質が引き金となり、膜に孔が形成される。ホリンは、Ｒ遺伝子によってコードされるエンドリシンの放出に必要である。それとは反対に、アンチホリンタンパク質はＳ１０５の孔形成を抑制する。一実施形態によれば、Ｓ遺伝子は配列番号１の配列を有する。他の実施形態では、Ｓ遺伝子の配列は、配列番号１と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及びより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示している。
【０１２３】
Ｓ遺伝子は、Ｓタンパク質の機能に重大な影響を及ぼさない又はその機能を変更させないアミノ酸の修飾に関連する保存的な配列修飾を含みうる。このような保存的修飾には、アミノ酸の置換、付加及び欠失が含まれる。修飾は、部位特異的変異誘発やＰＣＲを介した変異誘発などの当技術分野では既知の標準的な技術によって、Ｓ遺伝子配列に導入可能である。
【０１２４】
アミノ酸の保存的置換は、典型的には、アミノ酸残基を類似の理化学的性質を持つ側鎖を有するアミノ酸残基と置換するものである。Ｓタンパク質の修飾された配列には、１個、２個、３個、４個又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失又は置換が含まれうる。置換が行われる場合、好ましい置換は保存的修飾である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分岐側鎖を持つアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。このように、Ｓタンパク質配列内の１個又は複数個のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基と置換することができ、修飾されたＳタンパク質は、配列番号１の配列でコードされたＳタンパク質と比較することで、保存された機能（すなわち本明細書で述べる性質）について検査することができる。
【０１２５】
「同一性」又は「同一の」という用語は、２つ又はそれ以上のポリペプチドの配列間での関係において用いる場合、ポリペプチド間の配列関連度を指し、２個又はそれ以上のアミノ酸残基の鎖のマッチする数により決定される。「同一性」は、ギャップアラインメント（もしあれば）を伴う２つ又はそれ以上の配列のうちより小さいものの間の完全なマッチの百分率を、特別な数理モデル又はコンピュータープログラム（すなわち「アルゴリズム」）で処理して測るものである。互いに関連するポリペプチドの同一性は、既知の方法により容易に計算可能である。このような方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ５  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；ａｎｄ  Ｃａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載の方法が含まれるが、これらに限定されるものではない。同一性を決定するための好ましい方法は、検査される配列の間で最大のマッチを突き止めるように設計されている。同一性を決定する方法は、一般に入手可能なコンピュータープログラムに記されている。２つの配列の間の同一性を決定するための好ましいコンピュータープログラムの方法には、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．＼２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏI．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））を含むＧＣＧプログラムパッケージが含まれる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）及びその他の情報源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ）から一般に入手可能である。また、周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも、同一性の決定に用いられうる。
【０１２６】
他の実施形態では、Ｒ遺伝子は不活性化されている。Ｒタンパク質はエンドリシンであり、このトランスグリコシラーゼは、宿主細胞の細胞壁のムレインを分解する。一実施形態によれば、Ｒ遺伝子は、配列番号２の配列を有している。他の実施形態では、Ｒ遺伝子の配列は、配列番号２と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及びより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示している。
【０１２７】
Ｒ遺伝子は、Ｒタンパク質の機能に重大な影響を及ぼさない又はその機能を変更させないアミノ酸の修飾に関連する上述の保存的な配列修飾を含みうる。Ｒタンパク質の修飾された配列には、１個、２個、３個、４個又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失又は置換が含まれうる。このように、Ｒタンパク質配列内の１個又は複数個のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基と置換することができ、修飾されたＲタンパク質は、配列番号２の配列でコードされたＲタンパク質と比較することで、保存された機能（すなわち本明細書で述べる性質）について検査することができる。
【０１２８】
他の実施形態では、Ｒｚ遺伝子は不活性化されている。Ｒｚタンパク質はスパニン（ｓｐａｎｉｎ）ファミリーに属する。このタンパク質は、溶菌段階中に宿主細胞の外膜を破壊する作用に関連しうる。一実施形態によれば、Ｒｚ遺伝子は、配列番号３の配列を有している。他の実施形態では、Ｒｚ遺伝子の配列は、配列番号３と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及びより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示している。
【０１２９】
Ｒｚ遺伝子は、Ｒｚタンパク質の機能に重大な影響を及ぼさない又はその機能を変更させないアミノ酸の修飾に関連する上述の保存的な配列修飾を含みうる。Ｒｚタンパク質の修飾された配列には、１個、２個、３個、４個又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失又は置換が含まれうる。このように、Ｒｚタンパク質配列内の１個又は複数個のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基と置換することができ、修飾されたＲｚタンパク質は、配列番号３の配列でコードされたＲｚタンパク質と比較することで、保存された機能（すなわち本明細書で述べる性質）について検査することができる。
【０１３０】
他の実施形態では、Ｑ遺伝子は不活性化されている。Ｑタンパク質は、後期遺伝子制御因子（ｌａｔｅ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）であり、Ｑタンパク質は、ラムダＤＮＡの全ての「後期」領域の転写に用いられるプロモーターからのＲＮＡ合成のアンチターミネーターである。一実施形態によれば、Ｑ遺伝子は、配列番号３５の配列を有している。他の実施形態では、Ｑ遺伝子の配列は、配列番号３５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及びより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示している。
【０１３１】
Ｑ遺伝子は、Ｑタンパク質の機能に重大な影響を及ぼさない又はその機能を変更させないアミノ酸の修飾に関連する上述の保存的な配列修飾を含みうる。Ｑタンパク質の修飾された配列には、１個、２個、３個、４個又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失又は置換が含まれうる。このように、Ｑタンパク質配列内の１個又は複数個のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基と置換することができ、修飾されたＱタンパク質は、配列番号３５の配列でコードされたＱタンパク質と比較することで、保存された機能（すなわち本明細書で述べる性質）について検査することができる。
【０１３２】
他の実施形態では、Ｓ遺伝子のコード配列を含む核酸断片は欠失している。本発明によれば、この核酸断片はｒａｌ遺伝子のコード配列（配列番号４）及び／又はＮ遺伝子のコード配列（配列番号５）を含まない。したがって、一実施形態によれば、ファージがラムダであるとき、残基３３９３０と３５５８２との間の領域は欠失していない。
【０１３３】
他の実施形態によれば、ファージがラムダ（ＤＥ３）であるとき、残基１０８１３と残基１１３９１との間の領域は欠失していない。
【０１３４】
好ましくは、この核酸断片はＮ遺伝子及びＣ２遺伝子のコード配列（配列番号６）、並びにＣ２遺伝子のプロモーターの調節配列を含まない。Ｃ２遺伝子の調節配列が欠失されないことを確実にするためには、欠失すべき断片は、後に続く遺伝子、すなわちＣｒｏ遺伝子の開始コドンＡＴＧの位置で始まり得る。
【０１３５】
より好ましくは、この核酸断片はｒａｌ遺伝子、Ｎ遺伝子及びＣ２遺伝子のコード配列（配列番号６）、並びにＣ２遺伝子のプロモーターの調節配列を含まない。
【０１３６】
Ｃ２遺伝子はリプレッサータンパク質をコードするが、このことは、溶原状態を維持するのに重要である。この遺伝子は、他の幾つかのラムダ状のファージの配列内ではｃIともよばれる。ラムダファージでは、ｒａｌ遺伝子、Ｎ遺伝子及びｃI遺伝子のコード配列は、残基３３９３０〜３８０４０又は残基３３９３０〜３８０２２である。ラムダＤＥ３ファージでは、ｒａｌ遺伝子、Ｎ遺伝子、Ｃ２遺伝子のコード配列は、残基１０８１３〜１２４３６である。
【０１３７】
一実施形態では、この欠失した核酸断片の長さは３０ｋｂ〜３００ｂ、好ましくは５ｋｂ〜５００ｂである。他の実施形態では、この欠失した核酸断片の長さは３０ｋｂ、２５ｋｂ、２０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、９ｋｂ、８ｋｂ、７ｋｂ、６ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、７５０ｂ、５００ｂである。
【０１３８】
ファージがラムダである一実施形態によれば、欠失した核酸断片は、３５５８２位〜４５１８６位の範囲、好ましくは３８０４１位〜４５１８６位又は３８０２３位〜４５１８６位の範囲の位置で始まり、４５５１０位〜４８５０２位の範囲の位置で終わる。
【０１３９】
ファージがラムダＤＥ３である他の実施形態によれば、欠失した核酸断片は、１１３９２位〜１６７６４位の範囲、好ましくは１２４３７〜１６７６４位の範囲の位置で始まり、１７０８８位〜４２９２５位の範囲の位置で終わる。
【０１４０】
他の実施形態では、欠失すべき核酸断片は、少なくともＳ遺伝子及びＲ遺伝子のコード配列を含む。一実施形態によれば、ファージがラムダであるとき、核酸断片は、３５５８２位〜４５１８６位の範囲、好ましくは３８０４１位〜４５１８６位又は３８０２３位〜４５１８６位の範囲の位置で始まり、４５９７０位〜４８５０２位の範囲の位置で終わる。他の実施形態では、ファージがラムダＤＥ３であるとき、核酸断片は１１３９２位〜１６７６４位の範囲、好ましくは１２４３７位〜１６７６４位の範囲の位置で始まり、１７５４８位〜４２９２５位の範囲の位置で終わる。
【０１４１】
他の実施形態では、欠失すべき核酸断片は、少なくともＳ遺伝子、Ｒ遺伝子及びＲｚ遺伝子のコード配列を含む。一実施形態によれば、ファージがラムダであるとき、核酸断片は、３５５８２位〜４５１８６位の範囲、好ましくは３８０４１位〜４５１８６位又は３８０２３位から４５１８６位の範囲の位置で始まる。この実施形態によれば、断片は、４６４２８位〜４６４５８位の範囲の位置で終わってもよい。やはりこの実施形態によれば、核酸断片は、４６４２８位〜４８５０２位の範囲の位置で終わってもよい。
【０１４２】
他の実施形態によれば、ファージがラムダＤＥ３であるとき、核酸断片は、１１３９２位〜１６７６４位の範囲、好ましくは１２４３７位〜１６７６４位の範囲の位置で始まる。この実施形態によれば、断片は、１８００６位〜１８０３６位の範囲の位置で終わってもよい。やはりこの実施形態によれば、核酸断片は、１８００６位〜２４４９６位の範囲の位置で終わってもよい。やはりこの実施形態によれば、核酸断片は、１８００６位〜４２９２５位の範囲の位置で終わってもよい。
【０１４３】
他の実施形態によれば、欠失すべき核酸断片は、少なくともＲ遺伝子のコード配列を含む。  
【０１４４】
一実施形態によれば、ファージがラムダであるとき、核酸断片は、３５５８２位〜４５４９３位の範囲、好ましくは３８０４１位又は３８０２２位〜４５４９３位の範囲の位置で始まる。この実施形態によれば、欠失すべき核酸断片は、４５９７０位〜４８５０２位の範囲の位置で終わってもよい。
【０１４５】
他の実施形態によれば、ファージがラムダＤＥ３であるとき、核酸断片は、１１３９２位〜１７０７１位の範囲、好ましくは１２４３７位〜１７０７１の範囲の位置で始まる。この実施形態によれば、欠失すべき核酸断片は、１７５４８位〜２４４９６位の範囲の位置で終わってもよい。やはりこの実施形態によれば、欠失すべき核酸断片は、１７５４８位〜４２９２５位の範囲の位置で終わってもよい。
【０１４６】
他の実施形態によれば、欠失すべき核酸断片は、少なくともＲ遺伝子及びＲｚ遺伝子のコード配列を含む。
【０１４７】
一実施形態によれば、ファージがラムダであるとき、核酸断片は、３５５８２位〜４５４９３位の範囲、好ましくは３８０４１位又は３８０２２位〜４５４９３位の範囲の位置で始まる。この実施形態によれば、欠失すべき核酸断片は、４６４２８位〜４６４５８位の範囲の位置で終わってもよい。やはりこの実施形態によれば、欠失すべき核酸断片は、４６４２８位〜４８５０２位の範囲の位置で終わってもよい。
【０１４８】
他の実施形態によれば、ファージがラムダＤＥ３であるとき、核酸断片は、１１３９２位〜１７０７１位の範囲、好ましくは１２４３７位〜１７０７１位の範囲の位置で始まる。この実施形態によれば、欠失すべき核酸断片は、１８００６位〜１８３３０位の範囲の位置で終わってもよい。やはりこの実施形態によれば、欠失すべき核酸断片は、１８００６位〜２４４９６位の範囲の位置で終わってもよい。やはりこの実施形態によれば、欠失すべき核酸断片は、１８００６位〜４２９２５位の範囲の位置で終わってもよい。
【０１４９】
他の実施形態によれば、欠失すべき核酸断片は、少なくともＱ遺伝子のコード配列を含む。
【０１５０】
一実施形態によれば、ファージがラムダであるとき、欠失した核酸断片は、３５５８２位〜４３８８６位の範囲、好ましくは３８０４１位〜４３８８６位又は３８０２３位〜４３８８６位の範囲の位置で始まり、４４５１０位〜４８５０２位の範囲の位置で終わる。
【０１５１】
他の実施形態によれば、ファージがラムダＤＥ３であるとき、欠失した核酸断片は、１１３９２位〜１５４６４位の範囲、好ましくは１２４３７位〜１５４６４位の範囲の位置で始まり、１６０８８位〜４２９２５位の範囲の位置で終わる。
【０１５２】
他の実施形態によれば、欠失すべき核酸断片は、少なくともＱ遺伝子及びＳ遺伝子のコード配列を含む。
【０１５３】
一実施形態によれば、ファージがラムダであるとき、欠失した核酸断片は、３５５８２位〜４３８８６位の範囲、好ましくは３８０４１位〜４３８８６位又は３８０２３位〜４３８８６位の範囲の位置で始まり、４５５１０位〜４８５０２位の範囲の位置で終わる。
【０１５４】
他の実施形態によれば、ファージがラムダＤＥ３であるとき、欠失した核酸断片は、１１３９２位〜１５４６４位の範囲、好ましくは１２４３７位〜１５４６４位の範囲の位置で始まり、１７０８８位〜４２９２５位の範囲の位置で終わる。
【０１５５】
他の実施形態によれば、欠失すべき核酸断片は、少なくともＱ遺伝子、Ｓ遺伝子及びＲ遺伝子のコード配列を含む。
【０１５６】
一実施形態によれば、ファージがラムダであるとき、欠失した核酸断片は、３５５８２位〜４３８８６位の範囲、好ましくは３８０４１位〜４３８８６位又は３８０２３位〜４３８８６位の範囲の位置で始まり、４５９７０位〜４８５０２位の範囲の位置で終わる。
【０１５７】
他の実施形態によれば、ファージがラムダＤＥ３であるとき、欠失した核酸断片は、１１３９２位〜１５４６４位の範囲、好ましくは１２４３７〜１５４６４位の範囲で開始し、１７５４８〜４２９２５位の範囲の位置で終了する。
【０１５８】
他の実施形態によれば、欠失すべき核酸断片は、少なくともＱ遺伝子、Ｓ遺伝子、Ｒ遺伝子及びＲｚ遺伝子のコード配列を含む。
【０１５９】
一実施形態によれば、ファージがラムダであるとき、欠失した核酸断片は、３５５８２位〜４３８８６位の範囲、好ましくは３８０４１位〜４３８８６位又は３８０２３位〜４３８８６位の範囲の位置で始まり、４６４２８位〜４８５０２位の範囲の位置で終わる。
【０１６０】
他の実施形態によれば、ファージがラムダＤＥ３であるとき、欠失した核酸断片は、１１３９２位〜１５４６４位の範囲、好ましくは１２４３７位〜１５４６４位の範囲で始まり、１８００６位〜４２９２５位の範囲の位置で終わる。
【０１６１】
一実施形態では、Ｉｎｔ遺伝子は不活性化されている。Ｉｎｔタンパク質は、ファージゲノムの宿主ゲノムへの挿入及び切除を司る。一実施形態によれば、Ｉｎｔ遺伝子は、配列番号７の配列を有している。他の実施形態では、Ｉｎｔ遺伝子の配列は、配列番号７と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及びより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示している。
【０１６２】
Ｉｎｔ遺伝子は、Ｉｎｔタンパク質の機能に重大な影響を及ぼさない又はその機能を変更させないアミノ酸の修飾に関連する上述の保存的な配列修飾を含みうる。Ｉｎｔタンパク質の修飾された配列には、１個、２個、３個、４個又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失又は置換が含まれうる。このように、Ｉｎｔタンパク質配列内の１個又は複数個のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基と置換することができ、修飾されたＩｎｔタンパク質は、配列番号７の配列でコードされたＩｎｔタンパク質と比較することで、保存された機能（すなわち本明細書で述べる性質）について検査することができる。
【０１６３】
一実施形態では、Ｘｉｓ遺伝子は不活性化されている。Ｘｉｓタンパク質はエキシシオナーゼであり、宿主細菌の染色体からラムダファージＤＮＡを切除するプロセスに関与している。一実施形態によれば、Ｘｉｓ遺伝子は、配列番号８の配列を有している。他の実施形態では、Ｘｉｓ遺伝子の配列は、配列番号８と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及びより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示している。
【０１６４】
Ｘｉｓ遺伝子は、Ｘｉｓタンパク質の機能に重大な影響を及ぼさない又はその機能を変更させないアミノ酸の修飾に関連する上述の保存的な配列修飾を含みうる。Ｘｉｓタンパク質の修飾された配列には、１個、２個、３個、４個又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失又は置換が含まれうる。このように、Ｘｉｓタンパク質配列内の１個又は複数個のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基と置換することができ、修飾されたＸｉｓタンパク質は、配列番号８の配列でコードされたＸｉｓタンパク質と比較することで、保存された機能（すなわち本明細書で述べる性質）について検査することができる。
【０１６５】
一実施形態では、Ｉｎｔ遺伝子のコード配列を含む核酸断片は欠失している。一実施形態によれば、ファージはラムダであり、欠失すべき核酸断片は、２７８１２位〜２８８８２位の残基を含む。他の実施形態によれば、ファージはラムダであり、欠失すべき核酸断片は、１位〜２７８１２位の範囲の位置で始まり、２８８８２位〜３３９２９位の範囲の位置で終わる。
【０１６６】
一実施形態では、Ｘｉｓ遺伝子のコード配列を含む核酸断片は欠失している。
【０１６７】
一実施形態によれば、ファージはラムダであり、欠失すべき欠失した核酸断片は、２８８６０位〜２９０７８位の残基を含む。他の実施形態によれば、ファージはラムダであり、断片は、１位〜２８８６０位の範囲の位置で開始し、２９０７８〜３３９２９位の範囲の位置で終了する。
【０１６８】
他の実施形態によれば、ファージはラムダＤＥ３であり、欠失した核酸断片は、５５８６〜５８０４位の残基を含む。他の実施形態によれば、欠失すべき断片は、１位〜５５８６位の範囲の位置で始まり、５８０４位〜１０８１２位の範囲の位置で終わる。
【０１６９】
一実施形態では、Ｘｉｓ遺伝子及びＩｎｔ遺伝子のコード配列を含む核酸断片は欠失している。一実施形態によれば、ファージはラムダであり、欠失すべき核酸断片は、２７８１２位〜２９０７８位の残基を含む。他の実施形態によれば、ファージはラムダであり、欠失すべき核酸断片は、１位〜２７８１２位の範囲の位置で始まり、２９０７８位〜３３９２９位の範囲の位置で終わる。
【０１７０】
本発明の一実施形態では、本発明の遺伝子組換えファージはさらにｋｉｌ遺伝子に対して不活性化されている。一実施形態によれば、ｋｉｌ遺伝子は、配列番号３６の配列を有している。他の実施形態では、ｋｉｌ遺伝子は、配列番号３６と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示している。好ましくは、ｋｉｌ遺伝子のコード配列は欠失している。
【０１７１】
一実施形態によれば、ファージはラムダであり、欠失した核酸断片は、３３１８７位〜３３３３１位の残基を含む。
【０１７２】
他の実施形態によれば、ファージはラムダであり、欠失した核酸断片は、９９１３位〜１００５７位の残基を含む。
【０１７３】
一実施形態によれば、ａｔｔＰ配列は、本発明のファージの配列から欠失していない。ａｔｔＰ配列は配列番号９である。ａｔｔＰ配列は、ラムダファージの配列では２７５８６位〜２７８１７位にあり、ラムダＤＥ３ファージのゲノム（ファージのゲノムは環状であり、したがってａｔｔＰ配列は継続する）では、４２７８８位〜４２９２５位及び１位〜９４位にある。
【０１７４】
本発明の一実施形態では、遺伝子組換えファージはａｔｔＰ配列及びＣ２遺伝子の配列を含む。他の実施形態では、遺伝子組換えファージは、ａｔｔＰ配列及びＣ２遺伝子の配列からなる。
【０１７５】
好ましい一実施形態では、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ１１は、配列番号１０の配列を有し、（ＤＥ３）ΔＳ−Ｃ、Δｘｉｓ−ｅａ１０である（ＤＥ３は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子がｉｎｔ遺伝子の配列内に組み込まれたラムダファージＤＥ３を指す）。この組換えファージＰ１１は、遺伝子Ｓ、Ｒ、Ｒｚ、Ｘｉｓ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する。
【０１７６】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ１２は、遺伝子Ｉｎｔ及びＳのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ１２の一例は、配列ＤＥ３  ΔＳ、Δｘｉｓ−ｅａ１０である）。
【０１７７】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ１３は、遺伝子Ｓ、Ｒ、Ｒｚ、Ｑ、Ｘｉｓ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ１３の一例は、配列ＤＥ３  ΔＳ−Ｃ、Δｘｉｓ−ｅａ１０、ΔＱである）。
【０１７８】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ１４は、遺伝子Ｒ及びＩｎｔが欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ１４の一例は、ＤＥ３  ΔＲである）。
【０１７９】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ１５は、遺伝子Ｑ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ１５の一例は、配列ＤＥ３  ΔＱである）。
【０１８０】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ１６は、遺伝子Ｓ及びＸｉｓのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ１６の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６ΔＳ、Δｘｉｓ−ｅａ１０である）。
【０１８１】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ１７は、遺伝子Ｒ及びＸｉｓのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ１７の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６ΔＲ、Δｘｉｓ−ｅａ１０である）。
【０１８２】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ１８は、遺伝子Ｑ及びＸｉｓのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ１８の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６Δｘｉｓ−ｅａ１０、ΔＱである）。
【０１８３】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ１９は、遺伝子Ｒ、Ｒｚ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ１９の一例は、配列ＤＥ３  ΔＲ、ΔＲｚである）。
【０１８４】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ２０は、遺伝子Ｓ、Ｒｚ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ２０の一例は、配列ＤＥ３  ΔＳ、ΔＲｚである）。
【０１８５】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ２１は、遺伝子Ｒｚ、Ｑ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ２１の一例は、配列ＤＥ３  ΔＲｚ、ΔＱである）。
【０１８６】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ２２は、遺伝子Ｓ、Ｑ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ２２の一例は、配列ＤＥ３  ΔＳ、ΔＱである）。
【０１８７】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ２３は、遺伝子Ｒ、Ｑ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ２３の一例は、配列ＤＥ３  ΔＲ、ΔＱである）。
【０１８８】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ２４は、遺伝子Ｓ、Ｒ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ２４の一例は、配列ＤＥ３  ΔＳ、ΔＲである）。
【０１８９】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ２５は、遺伝子Ｒ、Ｒｚ及びＸｉｓのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ２５の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６  ΔＲ、Δｘｉｓ−ｅａ１０、ΔＲｚである）。
【０１９０】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ２６は、遺伝子Ｓ、Ｒｚ及びＸｉｓのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ２６の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６  ΔＳ、Δｘｉｓ−ｅａ１０、ΔＲｚである）。
【０１９１】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ２７は、遺伝子Ｑ、Ｒｚ及びＸｉｓのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ２７の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６  ΔＲｚ、Δｘｉｓ−ｅａ１０、ΔＱである）。
【０１９２】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ２８は、遺伝子Ｓ、Ｑ及びＸｉｓのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ２８の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６  ΔＳ、Δｘｉｓ−ｅａ１０、ΔＱである）。
【０１９３】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ２９は、遺伝子Ｒ、Ｑ及びＸｉｓのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ２９の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６  ΔＲ、Δｘｉｓ−ｅａ１０、ΔＱである）。
【０１９４】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ３０は、遺伝子Ｒ、Ｓ及びＸｉｓのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ３０の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６  ΔＳ、Δｘｉｓ−ｅａ１０、ΔＲである）。
【０１９５】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ３１は、遺伝子Ｒ、Ｘｉｓ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ３１の一例は、配列ＤＥ３  ΔＲ、Δｘｉｓ−ｅａ１０である）。
【０１９６】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ３２は、遺伝子Ｓ、Ｘｉｓ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ３２の一例は、配列ＤＥ３  ΔＳ、Δｘｉｓ−ｅａ１０である）。
【０１９７】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ３３は、遺伝子Ｑ、Ｘｉｓ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ３３の一例は、配列ＤＥ３  Δｘｉｓ−ｅａ１０、ΔＱである）。
【０１９８】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ３４は、遺伝子Ｓ、Ｒ、Ｘｉｓ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ３４の一例は、配列ＤＥ３  ΔＳ、Δｘｉｓ−ｅａ１０、ΔＲである）。
【０１９９】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ３５は、遺伝子Ｒ、Ｑ、Ｘｉｓ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ３５の一例は、配列ＤＥ３  ΔＲ、Δｘｉｓ−ｅａ１０、ΔＱである）。
【０２００】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ３６は、遺伝子Ｓ、Ｑ、Ｘｉｓ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ３６の一例は、配列ＤＥ３  ΔＳ、Δｘｉｓ−ｅａ１０、ΔＱである）。
【０２０１】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ３７は、遺伝子Ｒ、Ｒｚ、Ｘｉｓ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ３７の一例は、配列ＤＥ３  ΔＲ、Δｘｉｓ−ｅａ１０、ΔＲｚである）。
【０２０２】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ３８は、遺伝子Ｓ、Ｒｚ、Ｘｉｓ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ３８の一例は、配列ＤＥ３  ΔＳ、Δｘｉｓ−ｅａ１０、ΔＲｚである）。
【０２０３】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ３９は、遺伝子Ｒｚ、Ｑ、Ｘｉｓ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ３９の一例は、配列ＤＥ３  ΔＲｚ、Δｘｉｓ−ｅａ１０、ΔＱである）。
【０２０４】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ４０は、遺伝子Ｓ、Ｒ、Ｑ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ４０の一例は、配列ＤＥ３  ΔＳ、ΔＲ、ΔＱである）。
【０２０５】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ４１は、遺伝子Ｓ、Ｒ、Ｒｚ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ４１の一例は、配列ＤＥ３  ΔＳ−Ｃである）。
【０２０６】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ４２は、遺伝子Ｒ、Ｒｚ、Ｑ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ４２の一例は、配列ＤＥ３  ΔＲ、ΔＲｚ、ΔＱである）。
【０２０７】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ４３は、遺伝子Ｓ、Ｒｚ、Ｑ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ４３の一例は、配列ＤＥ３  ΔＳ、ΔＲｚ、ΔＱである）。
【０２０８】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ４４は、遺伝子Ｓ、Ｒ、Ｑ及びＸｉｓのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ４４の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６  ΔＳ、ΔＲ、Δｘｉｓ−ｅａ１０、ΔＱである）。
【０２０９】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ４５は、遺伝子Ｓ、Ｒ、Ｒｚ及びＸｉｓのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ４５の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６  ΔＳ−Ｃ、Δｘｉｓ−ｅａ１０である）。
【０２１０】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ４６は、遺伝子Ｒ、Ｒｚ、Ｑ及びＸｉｓのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ４６の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６  ΔＲ、ΔＲｚ、Δｘｉｓ−ｅａ１０、ΔＱである）。
【０２１１】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ４７は、遺伝子Ｓ、Ｒｚ、Ｑ及びＸｉｓのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ４７の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６  ΔＳ、ΔＲｚ、Δｘｉｓ−ｅａ１０、ΔＱである）。
【０２１２】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ４８は、遺伝子Ｓ、Ｒ、Ｑ、Ｘｉｓ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ４８の一例は、配列ＤＥ３  ΔＳ、ΔＲ、Δｘｉｓ−ｅａ１０、ΔＱである）。
【０２１３】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ４９は、遺伝子Ｓ、Ｒｚ、Ｑ、Ｘｉｓ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ４９の一例は、配列ＤＥ３  ΔＳ、ΔＲｚ、Δｘｉｓ−ｅａ１０、ΔＱである）。
【０２１４】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ５０は、遺伝子Ｒ、Ｒｚ、Ｑ、Ｘｉｓ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ５０の一例は、配列ＤＥ３  ΔＲ、ΔＲｚ、Δｘｉｓ−ｅａ１０、ΔＱである）。
【０２１５】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ５１は、遺伝子Ｓ、Ｒ、Ｑ、Ｒｚ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ５１の一例は、配列ＤＥ３  ΔＳ−Ｃ、ΔＱである）。
【０２１６】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ５２は、遺伝子Ｓ、Ｒ、Ｒｚ、Ｑ、及びＸｉｓのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１６に対応する（Ｐ５２の一例は、配列ＮＣ＿００１４１６  ΔＳ−Ｃ、Δｘｉｓ−ｅａ１０、ΔＱである）。
【０２１７】
他の実施形態によれば、本発明の遺伝子組換えファージの一つであるＰ５３は、遺伝子Ｑ、Ｘｉｓ及びＩｎｔのコード配列が欠失している配列ＮＣ＿００１４１５に対応する（Ｐ５３の一例は、配列ＤＥ３  Δｘｉｓ−ｅａ１０、ΔＱである）。
【０２１８】
また、本発明は、本発明の組換えファージを産生するためのプロセスに関し、このプロセスには少なくとも２工程での遺伝子の欠失が含まれる。
【０２１９】
一実施形態では、本発明のプロセスは、宿主細胞のゲノムに組み込まれたファージで行われる。
【０２２０】
一実施形態では、宿主細胞は微生物であり、好ましくは原核生物、より好ましくは細菌、より好ましくはグラム陰性菌である。有利には、宿主細胞は、現在適用可能な生物分類学による腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ）科の細菌である。仮に生物分類学が変わるようなことがあれば、当業者は、本発明に用いられうる菌株を推定するためその変化をいかに分類学に適用すべきかがわかるだろう。腸内細菌科の細菌の例は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）属、フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属及びエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属の細菌を含むが、これらに限定されるものではない。好ましい一実施形態によれば、宿主細胞は大腸菌属に属し、より好ましくは、宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【０２２１】
組み込まれたファージから遺伝子を欠失させる方法は、当業者に周知である。そのような方法例には、ラムダＲｅｄコード化遺伝子（ｌａｍｂｄａ  Ｒｅｄ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｇｅｎｅｓ）、すなわちｅｘｏ遺伝子、ｂｅｔ遺伝子及びｇａｍ遺伝子を用いる相同組換え（組換え操作（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）ともよばれる）があるが、これに限定されるものではない。プロファージＲａｃ由来でこれらに対応するｒｅｃＥ遺伝子及びｒｅｃＴ遺伝子を用いることも可能である。ｅｘｏ遺伝子及びｒｅｃＥ遺伝子は、３’突出を作る５’−３’エキソヌクレアーゼをコードする。ｂｅｔ遺伝子及びｒｅｃＴ遺伝子は、３’の突出と結合して２つの相補的ＤＮＡ配列間のアニーリングと相同組換えを仲介する、アニーリングタンパク質ともよばれる対合タンパク質をコードする。ｇａｍ遺伝子は、大腸菌ＲｅｃＢＣＤエキソヌクレアーゼのインヒビターをコードし、このようにして目的の直鎖状ＤＮＡ断片を保護する。組換え操作の方法は、複数の研究者によって十分に記述されており、この中にはＤａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ（ＰＮＡＳ  ９７−１２，６６４０−６６４５，２０００）やＳｔｅｗａｒｔら（国際公開第０１／０４２８８号）が含まれる。この方法の原則は、（例えばＰＣＲ増幅によって）組み込むべき断片及び２つの組換えアームを含むＤＮＡ断片を作製することである。これらのアームは、不活性化する遺伝子に隣接した領域に相同である。これらは、目的の断片を挿入するために用いられるであろう。この種のＤＮＡ断片は、相同なアームを含んだプライマーを用いたＰＣＲによって、２０〜６０のヌクレオチドから作り出すことも可能である。
【０２２２】
また、本発明は、本発明の遺伝子組換えファージを含んだ宿主細胞にも関する。好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞は、そのゲノムに遺伝子組換えファージが組み込まれている。
【０２２３】
一実施形態では、宿主細胞は微生物であり、好ましくは原核生物、より好ましくは細菌、より好ましくはグラム陰性菌である。有利には、宿主細胞は、現在適用可能な生物分類学による腸内細菌科の細菌である。仮に生物分類学が変わるようなことがあれば、当業者は、本発明に用いられうる菌株を推定するためその変化をいかに分類学に適用すべきかがわかるだろう。腸内細菌科の細菌の例は、大腸菌属、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、パンテア属、フォトラブダス属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、赤痢菌属、モルガネラ属及びエルシニア属の細菌を含むが、これらに限定されるものではない。好ましい一実施形態によれば、宿主細胞は大腸菌属に属し、より好ましくは、宿主細胞は大腸菌である。本発明で用いられうる大腸菌株の例は、大腸菌Ｋ−１２、大腸菌Ｂ又は大腸菌Ｗ由来の株であり、これらは例えばＭＧ１６５５、Ｗ３１１０、ＤＧ１、ＤＧ２、Ｔｏｐ１０、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ５ａｌｐｈａ、ＨＭＳ１７４、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥを含むが、これらに限定されるものではない。
【０２２４】
一実施形態では、宿主細胞の遺伝子は不活性化されていてもよい。
【０２２５】
一実施形態では、ｔｏｎＡ遺伝子（ｆｈｕＡとしても知られる、配列番号１１）は不活性化されている。ＴｏｎＡ／ＦｈｕＡタンパク質は、ファージＴ１、Ｔ５及びＰｈｉ８０の受容体である。
【０２２６】
一実施形態では、ｇａｌＫ遺伝子（配列番号１２）は不活性化されている。この遺伝子の欠失は、相同組換えに基づく方法によって遺伝子を欠失させるためのｇａｌＫのポジティブ／ネガティブ選択を可能にする。
【０２２７】
一実施形態では、ａｒａＢ遺伝子（配列番号１３）は不活性化されている。他の実施形態では、ａｒａＡ遺伝子（配列番号１４）は不活性化されている。宿主細胞内でプロモーターＰＢＡＤ（アラビノースによって誘導可能）を使用するには、ａｒａＢ及び／又はａｒａＡの不活性化が推奨される。
【０２２８】
一実施形態では、ｌｏｎ遺伝子（配列番号１５）及び／又はｏｍｐＴ遺伝子（配列番号１６）は不活性化されている。Ｌｏｎタンパク質は、ＡＴＰ依存性プロテアーゼである。ＯｍｐＴタンパク質は、外膜プロテアーゼである。ｌｏｎ遺伝子及びｏｍｐＴ遺伝子は、不活性化されていることが好ましい。
【０２２９】
一実施形態では、ｒｃｓＡ遺伝子（配列番号１７）は不活性化されている。ＲｃｓＡタンパク質は被膜合成の正調節因子であり、Ｌｏｎプロテアーゼで分解される。
【０２３０】
一実施形態では、ｈｓｄＲ遺伝子（配列番号１８）及び／又はｍｒｒ遺伝子（配列番号１９）は不活性化されている。ＨｓｄＲタンパク質及びＭｒｒタンパク質は、異なる特異性を有する制限酵素である。ｈｓｄＲ遺伝子及びｍｒｒ遺伝子は、いずれも不活性化されていることが好ましい。
【０２３１】
一実施形態では、ｅｎｄＡ遺伝子（配列番号２０）及び／又はｒｅｃＡ遺伝子（配列番号２１）は不活性化されている。ＥｎｄＡは、ＤＮＡ特異的エンドヌクレアーゼである。ＲｅｃＡは、プロテアーゼ及びヌクレアーゼ活性を有する組換えタンパク質である。ｅｎｄＡ遺伝子及びｒｅｃＡ遺伝子は、いずれも不活性化されていることが好ましい。
【０２３２】
本発明の一実施形態では、遺伝子ｔｏｎＡ、ｇａｌＫ、ａｒａＢ、ａｒａＡ、ｌｏｎ、ｏｍｐＴ、ｒｃｓＡ、ｈｓｄＲ、ｍｒｒ、ｅｎｄＡ及びｒｅｃＡのうち少なくとも１つは不活性化されている。不活性化された遺伝子は欠失していることが好ましい。
【０２３３】
好ましい一実施形態では、遺伝子ｔｏｎＡ、ｇａｌＫ、ａｒａＢ、ｌｏｎ、ｏｍｐＴ、ｒｃｓＡ、ｈｓｄＲ、ｍｒｒ、ｅｎｄＡ及びｒｅｃＡは不活性化されている。遺伝子ｔｏｎＡ、ｇａｌＫ、ａｒａＢ、ｌｏｎ、ｏｍｐＴ、ｒｃｓＡ、ｈｓｄＲ、ｍｒｒ、ｅｎｄＡ及びｒｅｃＡは、欠失していることが好ましい。
【０２３４】
本発明の一実施形態では、本発明の宿主細胞は、米国特許第２００４／０１１５８１１号に記載されているように、毒性分子をコードする核酸配列で形質転換される。毒性分子をコードする核酸配列が存在することによって、目的遺伝子と毒性分子に対する解毒機能を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を組み込んだ組換えクローンの選択が可能になり、この組換えクローンは、自身のゲノムの中にその毒性分子をコードするヌクレオチド配列を有する宿主細胞の中に組み込まれた後、生存するクローンである。
【０２３５】
本発明の好ましい一実施形態によれば、解毒性タンパク質及び毒性分子はそれぞれ、抗毒タンパク質（ａｎｔｉ−ｐｏｉｓｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）及び毒タンパク質である。この抗毒タンパク質又は毒タンパク質は、天然又は人工的に毒性を有し、細胞（好ましくは原核生物の細胞）の１つ又は複数の生体機能に影響を与え、この細胞の死につながることもある野生型タンパク質又は修飾されたタンパク質であり得る。
【０２３６】
解毒性タンパク質及び毒性分子は、好ましくは、米国特許出願公開第２００４／０１１５８１１号に記載があるように、ＣｃｄＡ／ＣｃｄＢタンパク質、Ｋｉｓ／Ｋｉｄタンパク質、Ｐｈｄ／Ｄｏｃタンパク質、ＲｅｌＢ／ｒｅｌＥタンパク質、ＰａｓＢ（又はＰａｓＣ）／ＰａｓＡタンパク質、ｍａｚＦ／ｍａｚＥタンパク質からなる群から選択されるか、あるいはプラスミド由来である、又はプラスミド由来でないその他の抗毒／毒性分子の組み合わせから選択される。毒性分子は、天然又は人工的に毒性を有し、（原核生物の）細胞の１つ又は複数の生体機能に影響を与える毒素タンパク質でもあり得る。ｓａｃＢ遺伝子（バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ−ｆａｃｉｅｎｓ）由来）によってコードされるタンパク質、ＧｐＥタンパク質、ＧＡＴＡ−１タンパク質及びＣｒｐタンパク質は、このような毒性分子のその他の例である。ｓａｃＢ遺伝子は、ショ糖を大腸菌に有毒な生成物へと加水分解する触媒であるレバンスクラーゼをコードする（Ｐｉｅｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．８９，Ｎ［ｄｅｇ．］６（１９９２）ｐ．２０５６−２０６０）。ＧｐＥタンパク質は、６つのユニークな制限酵素切断部位を含むバクテリオファージ［ｐｈｉ］Ｘ１７４由来のＥ遺伝子をコードし、大腸菌細胞の溶菌の原因となるｇｐＥをコードする（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．４２（３）（１９８６）ｐ．３４５−３４９）。ＧＡＴＡ−１タンパク質は、Ｔｒｕｄｅｌらによって記述されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９６，Ｖｏｌ．２０（４），ｐ．６８４−６９３）。Ｃｒｐタンパク質は、Ｓｃｈｌｉｅｐｅｒらによって記述されている（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８，Ｖｏｌ．２５７（２），ｐ．２０３−２０９）。
【０２３７】
その毒性分子に対する解毒性タンパク質は、細胞（好ましくは原核生物の細胞）によって毒性分子が作られるとき、対応する毒性分子によるこの細胞への影響を減少又は抑制することができるタンパク質である。
【０２３８】
好ましい一実施形態によれば、本発明の宿主細胞は、ＣｃｄＢタンパク質をコードする核酸配列を含む。ｃｃｄＢ遺伝子の配列は、配列番号２２である。
【０２３９】
また、本発明は、毒タンパク質をコードする遺伝子が挿入されている上述の宿主細胞と、抗毒タンパク質をコードする遺伝子の核酸配列を保有するプラスミドとを含むキットにも関する。が挿入されている。宿主細胞内での抗毒タンパク質の発現は、宿主細胞の生存能力維持にとって必要である。好ましい一実施形態では、毒タンパク質は、ｃｃｄＢ遺伝子によってコードされ、抗毒タンパク質は、ｃｃｄＡ遺伝子（配列番号２３）によってコードされる。
【０２４０】
本発明の一実施形態によれば、このキットのプラスミドは、目的の生体分子の核酸配列をさらに含んでいてもよく、あるいは、さらに含むために修飾されていてもよい。
【０２４１】
また、本発明は、上述の宿主細胞を準備するプロセスにも関する。
【０２４２】
一実施形態では、本発明のプロセスは、本発明による遺伝子組換えファージによって宿主細胞を感染させる工程を含む。本発明の一実施形態では、この感染工程には、ヘルパーファージの使用が含まれる。本発明で意味する「ヘルパーファージ」という用語は、他のファージの欠失又は不活性化を補うために用いられるファージを指す。ヘルパーファージは、他のファージに欠けている機能を与えて細菌に感染することができるようにする、又はファージストックの用意をさせる。ヘルパーファージは、ｃｌマイナスであるため、通常、それ自身では溶原菌をつくることはできない（ヘルパーファージはリプレッサーを持たないため、毒性である）。
【０２４３】
ヘルパーファージを用いて、宿主細胞にファージを感染させるプロセスは、当業者に周知である。第１工程は溶菌液の準備であり、第２工程は溶原化である。簡潔に述べると、ヘルパーファージの溶菌液の準備は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」（２００１，ＩＳＢＮ  ９７８−０８７９６９５７７−４）又はＳｕらによる「Ｌａｒｇｅ−  ａｎｄ  Ｓｍａｌｌ−Ｓｃａｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｌａｍｂｄａ  ｌｙｓａｔｅ  ａｎｄ  ＤＮＡ」Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２５：４４−４６（１９９８年７月）に記載されている標準的な方法を用いて行う。目的のファージの準備は、溶菌サイクルを開始するためのファージ導入（最も使用頻度が高いのは紫外線照射、又は溶原菌がＤＮＡ損傷を受ける何らかの状況、あるいは宿主のＳＯＳ応答又はＣｒｏ産生）の後、欠けている機能を補うためにヘルパーファージを用いつつ、同じ原則を用いて行われる。ヘルパーファージの代わりとなるのは、欠けている機能をコードするプラスミドである。
【０２４４】
次に、ファージ溶菌液を標的細菌と混合し、ＬＢプレート上に置いて、溶原菌を得る（Ｎｏｖａｇｅｎ社製ｌａｍｂｄａ  ＤＥ３  ｌｙｓｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ラムダＤＥ３溶原化キット）に記載、ユーザプロトコルＴＢ０３１又はＳｔｕｄｉｅｒ及びＭｏｆｆａｔ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８６，１８９：１１３−１３０に記載の代替法）。選択ファージは、特に目的のファージを含むファージを選択するために用いることができる。この選択ファージは、目的のファージと同じ免疫を有する毒性ファージである。その結果として、選択ファージは、ｃｌリプレッサー（ＤＥ３ラムダファージではＣ２ともよばれる）を産生することから、溶菌斑をつくることができず、また、目的のファージを得るために溶原菌を死滅させることができない。
【０２４５】
このように本発明は、上述のとおり、本発明の組換えファージとヘルパーファージとを含むキットにも関する。ヘルパーファージの例は、ヘルパーファージＢ１０、又は目的のファージとは異なる免疫を有する他のいずれかのラムダ状ファージ（例：免疫４３４、８０などを有するファージ）を含むが、これらに限定されるものではない。いくつかのヘルパーファージ及びそれらの操作は、Ｈａｌｄｉｍａｎｎ及びＷａｎｎｅｒ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８３，６３８４−６３９３，２００１）を含め、文献で十分に記述されている。
【０２４６】
一実施形態では、本発明の宿主細胞を準備するプロセスは、さらに欠失工程を含み、ここでの宿主細胞の核酸配列は欠失している。遺伝子の配列を欠失させる方法は、当業者に周知である。より効率的な方法は、ラムダＲｅｄコード化遺伝子又はプロファージＲａｃ由来のｒｅｃＥ遺伝子とｒｅｃＴ遺伝子によって仲介された相同組換え法である。上述のように、この方法は複数の研究者により十分に記述されており、この中にはＤａｔｓｅｎｋｏとＷａｎｎｅｒ（ＰＮＡＳ  ９７−１２，６６４０−６６４５，２０００）及びＳｔｅｗａｒｔら（国際公開第０１０４２８８号）が含まれる。ＰＣＲ産物は、不活性化すべき遺伝子に隣接する領域と相同である２０−から６０−ｎｔの伸長を伴うプライマーを用いて作製される。少量の細菌のみが目的の断片を効率的に組換えることになるため、これを選択するための強力な選択マーカーが必要である。組換体を選択するために抗生物質マーカーを用いることができ、抗生物質耐性遺伝子を増幅するため、修飾されたプライマーが用いられる。組換え遺伝子の形質転換及び活性化の後、適切な抗生物質を含んだ培地で組換細菌が選択される。この場合、標的遺伝子は抗生物質耐性遺伝子と置換される。次の欠失で同じ方策を用いるためには、第２工程の間にこの抗生物質耐性遺伝子を除去する必要がある。Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒに記されているように、ＦＲＴ（ＦＬＰ認識標識）部位と隣接している抗生物質耐性遺伝子を用いることができる。耐性遺伝子はこの後、ＦＬＰリコンビナーゼをコードするヘルパープラスミドを用いて取り除かれる。抗生物質耐性遺伝子は、この部位特異的リコンビナーゼによって除去されるが、この方法では痕跡が残る。すなわち、抗生物質耐性遺伝子を除去した後も１つの部位特異的組換え部位がなお存在する。
【０２４７】
この部位の存在を回避するため、より好ましくは、本発明の方法ではマーカー遺伝子としてｇａｌＫを用いる。ｇａｌＫの選択原理は、Ｗａｒｍｉｎｇらに記載がある（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５，３３（４））。この方法では、最初の組換え（挿入）の間にｇａｌＫをポジティブ選択マーカー（ガラクトースを含む最少培地で成長する）として用いる。このマーカーは、第２の相同組換え工程の間に除去される。この工程の間、ｇａｌＫは、２−デオキシ−ガラクトース（ＤＯＧ）を含む最少培地で、ネガティブ選択マーカーとして用いられる。ｇａｌＫ遺伝子産物であるガラクトキナーゼは、ガラクトース分解経路の最初の工程を触媒する。ガラクトキナーゼもまた、ＤＯＧガラクトース類似体のリン酸化を効率的に触媒する。この反応の産物はさらに代謝されることができず、毒性分子（２−デオキシ−ガラクトース−１−リン酸）の蓄積を引き起こす。この方法の利点は、標的遺伝子を欠失させ、選択マーカーを除去した後に、特異的組換え部位が残ることを回避することである。
【０２４８】
また、本発明は、目的の生体分子を産生するプロセスにも関し、このプロセスは、
本発明による遺伝子組換えファージ及び目的の生体分子の核酸配列を含む宿主細胞の培養と、
目的の生体分子の回収と、
を含む。
【０２４９】
本発明の一実施形態では、目的の生体分子の核酸配列は、遺伝子組換えファージの発現系の中に含まれている。この実施形態によれば、目的の生体分子の産生は直接的である、すなわち、発現系の遺伝子の発現、例えば発現系に含まれるプロモーターが誘導される培地での培養によって得られる。
【０２５０】
本発明の他の実施形態では、遺伝子組換えファージの発現系は、ｌａｃプロモーター、好ましくはｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの核酸配列を含む。この実施形態によれば、目的の生体分子を産生するプロセスは、Ｔ７プロモーターの制御下にある目的の生体分子の核酸配列を含んだプラスミドを有する宿主細胞の形質転換を含む。Ｔ７プロモーターからの発現は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの制御下にあり、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼはＴ７プロモーターに極めて特異的である、すなわちＴ７プロモーターは、バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼによってのみ利用することができる。ＩＰＴＧが培地に付加されると、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼはｌａｃプロモーターから転写によって発現し、目的の生体分子を発現させる。
本発明で意味する「Ｔ７プロモーター」という用語は、バクテリオファージＴ７のゲノムに存在するプロモーター、並びにＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写を仲介する能力を有するプロモーターのコンセンサス配列及びバリアントを含む。バクテリオファージＴ７は、１７種のプロモーター配列を含有し、これらすべてが高度に保存されたヌクレオチド配列を含む。
【０２５１】
好ましい一実施形態によれば、目的の生体分子の核酸配列を含んだプラスミドは、ｃｃｄＡの核酸配列をも含み、宿主細胞は、そのゲノムに組み込まれたｃｃｄＢの配列を含む。このため、プラスミドを含んだ組換クローンのみが増殖する。
【０２５２】
一実施形態によれば、目的の生体分子は、発酵ブロスで宿主細胞によって分泌される。この実施形態によれば、目的の生体分子は、発酵ブロスから容易に回収されうる。
【０２５３】
他の実施形態によれば、目的の生体分子は、発酵ブロスの中で宿主細胞によって分泌されない。細胞内の目的の生体分子を回収するための方法は、当技術分野において周知である。このような方法の例は、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）又はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含んだ破砕バッファーを用いて変性条件下で総細胞質タンパク質を回収する方法、又は超音波処理、フレンチプレス、あるいはこれに相当するものを用いて圧力下で細菌を破壊し、本来の（変性していない）条件下で総細胞質タンパク質を回収する方法を含むが、これらに限定されるものではない。次に、目的のタンパク質は、アフィニティー又はイオン変換カラムの使用を含む特異的な方法を用いて精製することができるが、これに限定されるものではない。
【実施例】
【０２５４】
本発明は、以下の実施例によってさらに例証される。
実施例１：ｘｉｓ遺伝子、ｅｘｏ遺伝子、ｂｅｔ遺伝子、ｇａｍ遺伝子、ｋｉｌ遺伝子、ｃIII遺伝子、Ｎ遺伝子及びｒａｌ遺伝子の欠失
ａ）ｘｉｓＤＮＡ領域の欠失及びｇａｌＫによる置換
【０２５５】
まず、ＸｉｓｇａｌＫ開始（５’ ＧＧＧＧＧＴＡＡＡＴＣＣＣＧＧＣＧＣＴＣＡＴＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣＴＴＣＣＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡ  ３’，配列番号２４）及びＸｉｓｇａｌＫ終結（５’ＧＴＴＣＴＧＡＴＴＡＴＴＧＧＡＡＡＴＣＴＴＣＴＴＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＴＧＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＴＧ  ３’，配列番号２５）のプライマーを用いて、ｐＧａｌＫプラスミド上でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ｇａｌＫ遺伝子を増幅した。これらのプライマーは、５’末端に標的ＤＮＡ（イタリック表記）と一致する４０塩基の配列を含む。これらの４０塩基の配列は、組換えアーム（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｒｍｓ）である。３’末端は、ｇａｌＫ遺伝子及びその構成的プロモーターを増幅するよう設計された。ＰＣＲ（１３１５ｂｐ）によって増幅されたＤＮＡ断片は、遺伝子ｘｉｓ、ｅｘｏ、ｂｅｔ、ｇａｍ、ｋｉｌ及びｃIIIを標的にした（５１３３ｂｐのＤＮＡ断片）。すなわち、これらの遺伝子は、相同組換えの間にｇａｌＫ遺伝子及びそのプロモーターによって置換された。Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ（ＰＮＡＳ  ９７−１２，６６４０−６６４５，２０００）にしたがって、Ｔ７（ＤＥ３）プロファージ及びｐＫＤ４６プラスミドを保有するエレクトロコンピテント細菌を準備した。次に、増幅したｇａｌＫ断片は、標準的な手順（各電気穿孔に２００ｎｇのＤＮＡ断片を用いた）にしたがって、これらの細菌内で電気穿孔処理された。ＳＯＣ培地を付加し、３７℃で１時間、細菌をインキュベートした。続いて、Ｍ９最少培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，ＩＳＢＮ  ９７８−０８７９６９５７７−４））で細菌を２度洗浄（遠心分離、培地除去、新しい培地の付加及び再懸濁）し、最少のＭ９培地及び１％のガラクトースを含んだ細菌のプレート上に置いた。プレートを１日又は２日間、３７℃でインキュベートした。
【０２５６】
次の工程は、細菌のスクリーニングであった。Ｘｉｓ１（５’ＧＴＣＴＴＣＡＡＧＴＧＧＡＧＣＡＴＣＡＧ３’，配列番号２６）及びＸｉｓ４（５’ＡＣＣＡＧＧＡＣＴＡＴＣＣＧＴＡＴＧＡＣ３’，配列番号２７）プライマーを用いてコロニー上で直接ＰＣＲスクリーニングを行った。５７７４ｂｐのＤＮＡ断片の増幅は非組換え染色体（非組換えコロニー）に対応し、逆に、１９５５ｂｐのＤＮＡ断片の増幅は、組換え染色体に対応する。１９５５ｂｐのＤＮＡ断片を増幅させる細菌を選択し、これを精製するとともに、染色体の非組換えコピーがあれば除去するため、選択プレート（１％のガラクトースを加えた最少Ｍ９培地）で２回画線した。精製工程の最後にＰＣＲスクリーニングをもう一度行い、１９５５ｂｐのＤＮＡ断片を増幅させる３つの細菌を選択した。同じプライマーを用いて、これらの細菌に対応する増幅されたＤＮＡ断片を配列し、ＤＮＡ組換えとＸｉｓＤＮＡ領域の欠失を確認した（ｘｉｓ遺伝子、ｅｘｏ遺伝子、ｂｅｔ遺伝子、ｇａｍ遺伝子、ｋｉｌ遺伝子及びｃIII遺伝子）。
ｂ）ＧａｌＫの除去
【０２５７】
ｇａｌＫ遺伝子、Ｎ遺伝子、ｒａｌ遺伝子を除去するため、（３５０ｂｐ及び３４３ｂｐの）大きい組換えアームを含んだＤＮＡ断片をＰＣＲによって作製した。Ｔ７（ＤＥ３）プロファージを含んだ細菌のコロニーで、Ｘｉｓ１及びＸｉｓ２（５’ＣＣＡＡＡＣＧＧＡＡＣＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡＡＧＴＣＡＴＧＡＧ３’，配列番号２８）プライマーを用いて、ＰＣＲによる第1アームの増幅が行われた。３６５塩基のＤＮＡ断片が増幅された。第２アームについても、同じ細菌で、Ｘｉｓ３（５’ＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＴＣＴＧＴＴＣＣＧＴＴＴＧＧＣＴＴＣＣ３’，配列番号２９）及びＸｉｓ６（５’ＧＴＡＡＴＧＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＧＴＣＧ３’，配列番号３０）プライマーを用いて、ＰＣＲにより行われた。３５８塩基のＤＮＡ断片が増幅された。アガロースゲル電気泳動の後、両方の組換えアームを精製した。Ｘｉｓ２プライマー及びＸｉｓ３プライマーは、３０ｂｐの同一の配列を含んだＤＮＡ断片を作製するよう設計された。この配列は、Ｘｉｓ１プライマー及びＸｉｓ６プライマーを用いて、両方の組換えアームを第３のＰＣＲに結合するために用いられた。６９３ｂｐのＤＮＡ断片が作製された。このＤＮＡ断片は、上記で選択され、（Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒの記述にしたがって準備した）ｐＫＤ４６プラスミドを保有する細菌で電気穿孔された。ＳＯＣ培地を付加し、３７℃で１時間、細菌をインキュベートした。次に、細菌をＭ９培地で２度洗浄し、０．２％のグリセリンと１％のＤＯＧを加えたＭ９培地を含む選択プレートに置いた。プレートは、３７℃で２日間インキュベートした。Ｘｉｓ５（５’ＣＡＧＣＣＧＴＡＡＧＴＣＴＴＧＡＴＣＴＣ３’，配列番号３１）及びＸｉｓ７（５’ＣＡＧＣＡＧＧＣＡＴＧＡＴＣＣＡＡＧＡＧ３’，配列番号３２）プライマーを用いて、ＰＣＲによっていくつかのコロニーをスクリーニングした。組換え染色体に対応する１１２２ｂｐの増幅ではなく、非組換えＤＮＡ染色体に対応する３２４６ｂｐの増幅が常に得られた。実験は、３度にわたり完全かつ独立して再現され、そのいずれも成功をみなかった、すなわち、所望の欠失を含んだ細菌は得られなかった。
【０２５８】
この結果から、ＧａｌＫ断片のみを除去し、Ｎ遺伝子及びｒａｌ遺伝子は残すこととした。第１の組換えアーム（３６５ｂｐ）に対してＸｉｓ１、Ｘｉｓ２ｂ（５’ＴＴＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＴＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡＡＧＴＣＡＴＧＡＧ３’，配列番号３３）を、第２組換えアーム（３８４ｂｐ）に対してはＸｉｓ８（５’ＣＴＣＡＴＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＣＡＣＴＧＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＡＧ３’，配列番号３４）及びＸｉｓ４を用いて、組換えアームを含むＤＮＡ断片を上述のように作製した。Ｘｉｓ１プライマー及びＸｉｓ４プライマーを用いてジョイニング（ｊｏｉｎｉｎｇ）ＰＣＲを行い、７１４ｂｐのＤＮＡ断片を作製した。この断片は、ｐＫＤ４６プラスミドを保有する選択された細菌の中で、上述のように電気穿孔された。ＤＯＧを含む選択プレート上に細菌を置き、２日間３７℃でインキュベートした。Ｘｉｓ５プライマーとＸｉｓ６プライマーを用いて、ＰＣＲスクリーニングを行った。（非組換え染色体に対応する３０１０ｂｐの増幅ではなく）１７７０ｂｐの増幅を示す細菌を選択し、精製した。そのＤＮＡ断片を、Ｘｉｓ５プライマーとＸｉｓ６プライマーを用いて配列すると、ｇａｌＫ遺伝子が正しく除去された。この組換えは、細菌が直ちに得られたため、１度のみ行った。
【０２５９】
この結果が示すのは、Ｎ遺伝子及びｒａｌ遺伝子に関連するｇａｌＫを、相同組換えを用いて除去するのは不可能であったということである。しかしながら、まったく同じ手順を用いることで、ｇａｌＫのみを除去することができた。
【０２６０】
結論として、Ｎ遺伝子及びｒａｌ遺伝子を除去することは、細菌の死につながるということが示されたが、これは予期しない結果であった。
【０２６１】
実施例２：ＭＧ１６５５を用いたタンパク質発現
本発明にしたがって作製された株のタンパク質産生効率をテストするため、Ｍ１１（ＤＥ３）とよばれる細菌を用いて、少量の発現テストを行った。この株の遺伝子型は、ＭＧ１６５５ΔｇａｌＫ，ΔｒｅｓＡ，Δｌｏｎ，ΔｈｓｄＲ−ｍｒｒ，ΔｆｈｕＡ，ΔｅｎｄＡ，ΔｒｅｃＡ，ΔａｒａＢ，ΔｏｍｐＴ，λ−ＤＥ３（Ｔ７ｐｏｌ，Δｘｉｓ−ｅａ１０，ΔＳ−Ｃ）である。ＭＧ１６５５は大腸菌Ｋ−１２であるため、タンパク質産生分野で標準的なものとして用いられ、ＨＳＭ１７４（ＤＥ３）（遺伝子型：ｒｅｃＡ１，ｈｓｄＲ，λ−ＤＥ３，（Ｒｉｆ  Ｒ））とよばれる他のＫ−１２株と比較した。両方の株はいずれも、ｐＳＣｈｅｒｒｙ１プラスミドＤＮＡ（Ｄｅｌｐｈｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社、ベルギー）で形質転換された。このプラスミドは、Ｔ７プロモーターの制御下で容易に検出可能な（目視、赤色）「ｃｈｅｒｒｙ」とよばれるタンパク質をコードする。
ＩＰＴＧを用いた少量発現の手順
【０２６２】
１）１０ｍｌのＬＢ培地を含む２つの三角フラスコのそれぞれに、いずれもｐＳＣｈｅｒｒｙ１プラスミドを保有するＨＭＳ１７４（ＤＥ３）及びＭ１１（ＤＥ３）のシングルコロニーを植えつけ、一晩３０℃でインキュベートした。
２）新しい培地を入れた新たな２つのフラスコに、一晩培養した１ｍｌの培養液を植えつけ、ＯＤ６００値が０．６になるまで３７℃で振盪しながらインキュベートした。
３）各フラスコからサンプル（１ｍｌ）を取り出し、遠心分離した。培地を捨て、ペレットを氷冷した。サンプルは、非誘導コントロールであった。残っている培養液でタンパク質の発現を誘導するため、最終的に１ｍＭの濃度になるまで、ＩＰＴＧ（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド、９０μｌの新しい１００ｍＭのストック溶液）を両方のフラスコに付加した。両方のフラスコのインキュベートを４時間継続した。
４）誘導期の最後に、６００ｎｍの光学濃度を各培養液について測定した（Ｍ１１（ＤＥ３）では１．０９、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）では１．１３）。各フラスコの１ｍｌのサンプルを４℃で１０分間最大速度（１３０００ｇ）で遠心分離した。ペレットは、Ｃｈｅｒｒｙタンパク質の発現による赤色であることが認められた。上澄みを捨て、１００μｌの水を付加して、細菌を再懸濁した。１００μｌの「破砕」バッファー（１００ｍＭのＤＴＴ、２％のＳＤＳ、８０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、０．００６％のブロモフェノールブルー、１５％のグリセリン）も付加し、細菌を溶解した。６０μｌの水と６０μｌの破砕バッファーを（サンプルの光学濃度に応じて）用いる以外は同じ手順で、非誘導のサンプルを処理した。
５）サンプルを７０〜１００℃で（１０分間）加熱し、すべてのタンパク質を再懸濁し、タンパク質を変性させた。
６）１０μｌの各サンプルを１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに添加し、１００ボルトで２時間遊走させた。
７）遊走の後、クマシーブルーの染色でタンパク質を色づけした。
【０２６３】
図１に示すように、両株ともに目的のタンパク質（Ｃｈｅｒｒｙタンパク質、配列によって示されている）を産生することができたが、その産生は、Ｍ１１（ＤＥ３）を用いたものが、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を用いたものより５〜１０倍高い。実験は２度行い、まったく同じ結果であった。
【０２６４】
実施例３：ＢＬ２１（ＤＥ３）を用いたタンパク質発現
実施例１にしたがって、Δｘｉｓ−ｅａ１０及び／又はΔＳ−Ｃが欠失しているＢＬ２１（ＤＥ３）株を作製した。細菌（ｉｎｔ遺伝子が欠失し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードするラムダＤＥ３）の染色体にΔＳ−Ｃの欠失のみ又はΔｘｉｓ−ｅａ１０の欠失と組み合わせて挿入した。このようにしてＢＬ２１（ＤＥ３）の２つの誘導体であるＢＬ２１（ＤＥ３）ΔＳ−Ｃ及びＢＬ２１（ＤＥ３）Δｘｉｓ−ｅａ１０，ΔＳ−Ｃを作製した。組換え領域のＰＣＲ増幅により欠失が確認され、この領域が配列された。この配列工程によって、理論上の配列にしたがった対応する欠失の存在が確認された。次に、実施例２にしたがって、ｃｈｅｒｒｙタンパク質（ｐＳＣｈｅｒｒｙ１及びｐＳＳＣ−Ｃｈｅｒｒｙ１、Ｄｅｌｐｈｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社）をコードする２つの異なるプラスミドを用いて、作製した細菌のタンパク質発現をテストした。その結果、ｃｈｅｒｒｙタンパク質をコードするｃｈｅｒｒｙ遺伝子の過剰発現が明確に示された。このタンパク質は目視及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析で容易に検出された。
【０２６５】
したがって、結論は、ラムダＤＥ３ファージが、ファージの切除と細菌の溶菌に必要な機能をコードするｉｎｔ遺伝子、Ｓ遺伝子、Ｒ遺伝子及びＲｚ遺伝子を少なくとも欠失しているため、これらの細菌は、ラムダＤＥファージを原因とする望まれない細菌の溶菌リスクなく、タンパク質を過剰産生できるということである。
【０２６６】
タンパク質中の細菌の溶菌は、成長条件、タンパク質の過剰発現などを含む複数の要因に左右されるため、作製した株が、特異的遺伝子の欠失を原因とする溶菌に耐性であることを示すためのモデル株を設計した。ラムダファージでは、溶菌が進むのを抑制し、プロファージの溶原状態を維持するため、ＣIリプレッサーの構成的発現を有する必要がある。このリプレッサーの変異体（ＣI８５７）は、その温度感受的な能力のため、周知である。すなわち、変異したリプレッサーは、３０℃で完全に活性であり、溶原状態を維持する。しかしながら、より高い温度（３７〜４２℃）では、ＣI８５７は非効率的で、ラムダファージの溶菌状態を誘導する。このＣI８５７変異体及び本発明による欠失を保有する株、すなわち、Ｐ４１を含むＢＬ２１株に対応するＢＬ２１（ＤＥ３）ΔＳ−Ｃ、Ｐ１１を含むＢＬ２１株に対応するＢＬ２１（ＤＥ３）Δｘｉｓ−ｅａ１０及びΔＳ−Ｃ、Ｐ１３を含むＢＬ２１株に対応するＢＬ２１（ＤＥ３）Δｘｉｓ−ｅａ１０，ΔＳ−Ｃ及びΔＱ、Ｐ１５を含むＢＬ２１株に対応するＢＬ２１（ＤＥ３）ΔＱ、及びＰ５３を含むＢＬ２１株に対応するＢＬ２１（ＤＥ３）Δｘｉｓ−ｅａ１０及びΔＱを作製した。
温度を４２℃に変えることによって、溶菌状態が誘導される。本発明の株に、溶菌は認められなかった。加えて、本発明の株では、コントロールと比較して、目的のタンパク質（ｃｈｅｒｒｙタンパク質）の産生収率が改善したことが認められた。
【図１】
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【国際調査報告】
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