(57)【要約】  本発明は、哺乳動物のナチュラルキラー細胞のサブグループ、好ましくは表面タンパク質ＣＤ５６及び／又はＣＤ１６を発現することが多いＣＤ３−非Ｔリンパ球由来ＮＫ細胞を同定する方法、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、ＯＳＢＰＬ５等のＯＳＢＰＬのゲノムＤＮＡのバイサルファイト変換へのアクセシビリティ及び／又はＯＳＢＰＬ５等のＯＳＢＰＬの遺伝子、特にその上流及び／又は下流の調節領域、プロモーター、イントロン、エクソン及びイントロン／エクソン境界、並びに上記遺伝子の他の保存領域中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含み、分析対象のサンプルにおけるゲノムＤＮＡのアクセシビリティ及び／又は脱メチル化の増大が、上記ＮＫ細胞のサブグループの指標となる、方法、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。本発明による分析では、ＣＤ５６＋細胞を同定し、それらと他の全ての細胞、例えばＣＤ５６−細胞及び／又はＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ細胞とを区別することができる。本発明の方法はＮＫ細胞の同定、検出、定量化、並びに品質保証及び品質管理に有用である。本発明はさらに、上記の方法の実行用のキット及び本発明の方法又はキットのそれぞれの使用に関する。本発明は、ＯＳＢＰＬ５等のＯＳＢＰＬのゲノムＤＮＡのバイサルファイト変換へのアクセシビリティを分析する改善された方法、及び／又はＯＳＢＰＬ５等のＯＳＢＰＬの遺伝子における少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態の分析を更に提供し、最適品質のサンプル、更には採取直後でない血液サンプル、組織サンプル又は血清サンプル等の準最適品質のサンプルの正確な分析を可能にする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物に由来するサンプル中のナチュラルキラー細胞を同定する方法であって、オキシステロール結合タンパク質様タンパク質（ＯＳＢＰＬ）又はＯＳＢＰＬ５の遺伝子の１つ又は複数の領域中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のバイサルファイト変換へのアクセシビリティ及び／又はメチル化状態を分析することを含み、非ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞及び／又は非ＣＤ５６ｈｉｇｈ細胞の類似位置と比較した、分析対象の前記領域中の前記少なくとも１つのＣｐＧ位置の脱メチル化が、ＣＤ５６ｄｉｍ及び／又はＣＤ５６ｈｉｇｈナチュラルキラー細胞の指標となる、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つのＣｐＧ位置が、転写開始点より上流の５’領域、プロモーター領域、５’非翻訳領域若しくは３’非翻訳領域、イントロン及び／又はエクソン／イントロン境界、又は転写終結点の下流の３’領域中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分析対象の前記領域中の前記少なくとも１つのＣｐＧ位置が、非ＮＫ細胞の類似位置と比較して７０％超、又は８０％超、又は９０％超、又は９５％超脱メチル化されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
分析対象の領域の全体的な脱メチル化が、非ＮＫ細胞の類似領域と比較して７０％超、又は８０％超、又は９０％超、又は９５％超である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのＣｐＧ位置が、配列番号１によるアンプリコンＯＳＢＰＬ５（Ａｍｐ１７４６）に位置するＣｐＧ位置から選択されるか、又はＡｍｐ１７４６の４６位、６６位、１０３位、１３０位、１３５位、１５２位、１６３位、１７３位、１７６位、１８２位又は２２４位から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記バイサルファイト変換へのアクセシビリティ及び／又は前記メチル化状態の分析が、メチル化特異的酵素消化、バイサルファイトシークエンシングから選択される方法、プロモーターメチル化、ＣｐＧ島メチル化、ＭＳＰ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ、ｑＰＣＲから選択される分析、又はＤＮＡの検出による他の方法を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
マーカーＣＤ５６、ＣＤ１６及び／又はＣＤ８の分析を更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記同定が、前記ナチュラルキラー細胞を全ての主要な末梢血液細胞型、非血液細胞及び／又はＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ細胞から区別することを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルが血液サンプル又は全血及び組織サンプルから選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルにおける同定された前記ナチュラルキラー細胞の数及び／又は量を、前記同定に基づいて決定する工程を更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物の免疫状態を、前記サンプルにおける同定された前記ナチュラルキラー細胞の数及び／又は量に基づいて決定する工程を更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物におけるＣＤ５６ｄｉｍ及び／又はＣＤ５６ｈｉｇｈナチュラルキラー細胞のレベルをモニタリングする方法であって、請求項１０に記載の方法と、同定されたナチュラルキラー細胞の量を、同じ哺乳動物から採取された以前のサンプル及び／又は対照サンプルと比較することとを含む、方法。
【請求項１３】
前記哺乳動物が自己免疫疾患、移植片拒絶反応、がん、感染、アレルギー、及び／又はＳＣＩＤ−Ｘ１、及び／又はＮＫ細胞と直接関連する任意の疾患を患っているか、又は患う可能性がある、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物に与えた化学物質及び／又は生体物質に応じた前記ナチュラルキラー細胞の量を測定及び／又はモニタリングすることを更に含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物におけるＣＤ５６ｄｉｍ及び／又はＣＤ５６ｈｉｇｈナチュラルキラー細胞を、オキシステロール結合タンパク質様タンパク質（ＯＳＢＰＬ）又はＯＳＢＰＬ５の遺伝子の１つ又は複数の領域中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のバイサルファイト変換へのアクセシビリティ及び／又はメチル化状態の分析に基づいて同定及び／又はモニタリングするキットであって、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法の実行用の材料を含む、又はａ）バイサルファイト試薬と、ｂ）遺伝子ＯＳＢＰＬ５、配列番号１によるアンプリコン１７４６のＣｐＧ位置から選択されるＣｐＧ位置のメチル化分析用の材料とを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物においてナチュラルキラー細胞及びそのサブグループ、好ましくは表面タンパク質ＣＤ５６及び／又はＣＤ１６を発現することが多いＣＤ３陰性の非Ｔリンパ球由来ＮＫ細胞を同定する方法、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、ＯＳＢＰＬ５等のＯＳＢＰＬのゲノムＤＮＡのバイサルファイト変換へのアクセシビリティ及び／又はＯＳＢＰＬ５等のＯＳＢＰＬの遺伝子、特にその上流及び／又は下流の調節領域、プロモーター、イントロン、エクソン及びイントロン／エクソン境界、並びに上記遺伝子の他の保存領域中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含み、分析対象のサンプルにおけるゲノムＤＮＡの化学的／他の修飾へのアクセシビリティ及び／又は脱メチル化の増大が、上記ＮＫ細胞のサブグループの指標となる、方法、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。本発明による分析では、ＣＤ５６＋細胞を同定し、それらと他の全ての細胞、例えばＣＤ５６−細胞及び／又はＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ細胞とを区別することができる。本発明の方法はＮＫ細胞の同定、検出、定量化、並びに品質保証及び品質管理に有用である。本発明はさらに、上記の方法の実行用のキット及び本発明の方法又はキットのそれぞれの使用に関する。本発明は、ＯＳＢＰＬ５等のＯＳＢＰＬのゲノムＤＮＡの化学的変換、例えば特にバイサルファイト処理へのアクセシビリティを分析する改善された方法、及び／又はＯＳＢＰＬ５等のＯＳＢＰＬの遺伝子における少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態の分析を更に提供し、新鮮血液（ＥＤＴＡ血又はヘパリン血等）又は新鮮組織若しくは新鮮凍結組織等の最適品質のサンプル、更には採取直後でない（non-freshly obtained）、例えば凍結血液、ホルマリン固定パラフィン包埋組織又は凍結血清サンプル等の準最適品質のサンプルの両方の正確な分析を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ：Hematopoietic Progenitor Cells）に由来する細胞傷害性リンパ球である。ナチュラルキラー細胞は自然免疫系の不可欠な要素である。ナチュラルキラー細胞は脾臓、肝臓及び末梢血のリンパ球の約２％〜２０％を占め、潜在的により低い頻度であっても骨髄、胸腺、リンパ節、様々な器官等の他の組織及び体の様々な組織においても血流中に又は組織に浸潤して存在する。ナチュラルキラー細胞は当初、感作することなく或る特定の（腫瘍）標的細胞を死滅させる能力によって同定された。この死滅効果はｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで発揮され、標的細胞の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ：Major Histocompatibility Complex）分子の発現によって制限されない。ＮＫ細胞は相当数の、例えば限定されるものではないが（ウイルス）感染細胞及び／又は腫瘍細胞に対しても自然細胞傷害活性を有する。加えて、ＮＫ細胞は、抗体のＦｃ部分に結合する受容体であるＦｃ−γＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を介した標的の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ：Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity）を媒介する。
【０００３】
概して、ヒト非ＮＫＴ  ＮＫ細胞の従来の識別子は、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ：Neural Cell Adhesion Molecule）の１４０ｋＤａアイソフォームであるＣＤ５６の発現を伴う、Ｔ細胞受容体複合体（ＴＣＲ、ＣＤ３）の非存在である。そのＣＤ５６受容体発現密度に基づいて、ヒトＮＫ細胞はＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞又はＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞へと更に細分されることが多い。末梢では、ＮＫ細胞の大半（９０％超）が高発現のＣＤ１６を伴うＣＤ５６ｄｉｍからなることが見出されており、残りのおよそ１０％がＣＤ１６の低発現又は非発現を伴うＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞である。
【０００４】
記載のＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞画分は一般に「古典的細胞傷害性ＮＫ細胞サブセット」とみなされている。ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ画分ははるかに低い細胞傷害性を示すが、ＩＦＮγ及びＴＮＦαを含むサイトカインを大量に産生し、免疫調節機能における主要な役割を示す。したがって、この画分は調節性ＮＫ細胞画分と呼ばれることもある。
【０００５】
末梢血中の非接着性の非マトリックス化細胞を抗体でマーキングし、フローサイトメトリーによって定量化することができるため、免疫細胞の定量化は比較的容易であり、完全に標準化されていると一般に考えられている。細胞が非接着性の単一細胞懸濁液であり、無傷の細胞型特異的表面抗原が利用可能であれば、フローサイトメトリーは実際に精度の高い細胞定量化ツールである。
【０００６】
しかしながら、研究及び医学的日常業務の多くの用途では、かかる正確な測定の指定の必須条件は得られない：
１．多くの場合、測定される材料／サンプルは末梢血に由来しないため、溶解性及び単一細胞懸濁液特性は満たされない。これは例えば、病理学的日常業務において行われるような全ての生検分析にも当てはまる。
２．これらの細胞を、その構造的完全性（「無損傷」）を維持するために、顆粒球等の亜画分が分解し始めるまで凍結するか、又はＥＤＴＡ血として６時間超保管してはならないため、検体が末梢血であっても無傷細胞を有するという必須条件は満たすことが困難である。
３．一般的な認識とは対照的に、全ての免疫細胞型に対する特異性の高い（表面）抗原は存在せず、したがって細胞型の同定は期待され得るほど明確ではない。
３ａ．抗原発現はデジタルプロセスではないため、細胞が陽性画分又は陰性画分のいずれに属するかを決定するのに閾値を規定する必要がある。ＮＫ細胞では、この問題は特に明白である：
上記のように、ＮＫ細胞は主にその表面上のＣＤ５６の発現によって規定される。ＮＫ細胞型の同定については、この発現レベルはＣＤ５６ｎｅｇａｔｉｖｅ、ＣＤ５６ｄｉｍ及びＣＤ５６ｈｉｇｈという３つのカテゴリーに細分される。これらのカテゴリーのいずれについても独立した客観的閾値は存在しない。これら３つの集団は常に、他の画分と比較した相対的なＣＤ５６発現のみに基づいて同定され、区分される。
【０００７】
したがって、多くの用途で免疫細胞の定量的判定の現行の方法論的アプローチには依然として問題がある。例えば臨床用途における定期的検査では、通常は幾らかの時間差、したがって検体のロバスト性及び安定性が必要となる。先に述べたように、末梢血中の細胞の測定に用いられるフローサイトメトリー法は、腫瘍成長時又は炎症時／炎症後に固形組織を含む他の組織に浸潤する免疫細胞に適切ではない。したがって、フローサイトメトリー法はこれらの領域に適用されず、代替方法（大抵は免疫組織化学）は半定量的方法でしかない。
【０００８】
本発明者らは、代替的なより効率的、ロバストかつ統合的な定量的アプローチでＮＫ細胞の同定及び定量化に使用することができるマーカー、細胞型又は細胞状態に特異的なエピジェネティック（ＤＮＡメチル化及び／又はクロマチン構造及び／又はＤＮＡ化学的不活性）マーカーの分析を提示する。臨床的日常業務及び一般的な細胞生物学的慣行では、特異的なエピジェネティックマーカーの同定は、血液細胞型及び免疫細胞型の測定を大きく促進する。
【０００９】
本願の定義の目的上、ＤＮＡ配列中のエピジェネティック差異はＤＮＡメチル化の用語で称されることが多い。科学論文では、メチル化の状態は「高（hyper）」（正常を上回る、正常を超える（ラテン語：super））又は「低（hypo）」（正常を下回る、正常に満たない（ラテン語：sub））メチル化のいずれかで示されることが多い。本発明者の観点では、これらの用語は「正常」状態との差異を示すため不適切である。しかしながら、或る細胞型ではメチル化されていれば正常であり、他の細胞ではメチル化されていなければ正常であるため、健常細胞では異常（non-normal）というものは存在しない。どちらの特徴も完全に正常である。したがって、本発明者にとっては、遺伝子領域はメチル化されているか又はメチル化されていない（非メチル化と同様に等しい：脱メチル化）。細胞型の領域が異常にメチル化されている（高メチル化）か、又は異常に脱メチル化されている（低メチル化）かについての潜在的決定は或る特定の疾患において役割を果たす可能性があり、これに基づいて決定が下され得る。しかしながら、これはＤＮＡのメチル化状態を測定する技術的プロセスにおいて論考される又は見られる問題ではない。それにもかかわらず、原則として高メチル化及び低メチル化が記載されている場合には、脱メチル化及びメチル化の技術的分類を示すと考えられる。
【００１０】
高等生物は、個体のほとんどの細胞がＤＮＡコードの全く同じ相補体を含有するにもかかわらず、様々な組織型において異なるパターンの遺伝子発現を行い、維持する必要がある。大抵の遺伝子調節は細胞の現状に応じた一時的なものであり、外部刺激によって変化する。一方で、持続的な調節は、エピジェネティクス（ＤＮＡの基本的な遺伝コードを変更しない遺伝的な調節パターン）の基本的法則（role）である。ＤＮＡメチル化は後成的調節の典型的な形態であり、安定な細胞記憶として機能し、様々な細胞型の長期同一性を維持する上で重要な役割を果たす。
【００１１】
メチル化の主要な標的は、２ヌクレオチド配列であるシトシン−グアニン（「ＣｐＧ部位」）であり、この状況でシトシン（Ｃ）は簡単な化学修飾を受けて５−メチル−シトシンとなる場合がある。ヒトゲノムにおいては、ＣＧ配列は、「ＣｐＧ島」と呼ばれる或る特定の比較的密なクラスターを除くと予想されるよりもはるかに稀である。ＣｐＧ島は遺伝子プロモーターと関連することが多く、半数を超えるヒト遺伝子がＣｐＧ島を有すると推定されている（非特許文献１）。
【００１２】
オキシステロール結合タンパク質（ＯＳＢＰ）ファミリーの成員をコードする遺伝子は、体内のコレステロールバランスの維持に重要な役割を果たす細胞内脂質受容体群である。大半の成員は、Ｎ末端プレクストリン相同ドメインと高度に保存されたＣ末端ＯＳＢＰ様ステロール結合ドメインとを含有する。種々のアイソフォームをコードする転写変異体が同定されている。
【００１３】
アクセッション番号ＮＧ＿００９５４８は、１１番染色体上のホモサピエンスオキシステロール結合タンパク質様５（ＯＳＢＰＬ５）の８５２３７ｂｐのＤＮＡ配列を表している。
【００１４】
Li et al.（非特許文献２）は、５つのｈＥＳＣ株の３２個の既知のインプリンティング遺伝子の発現プロファイルを記載している。２１個のインプリンティング遺伝子の発現レベルは未分化ｈＥＳＣ株で比較的低く、これらの遺伝子のうち５個（ＴＰ７３、ＣＯＰＧ２、ＯＳＢＰＬ５、ＩＧＦ２及びＡＴＰ１０Ａ）が分化組織において上方調節されていることが見出された。
【００１５】
Higashimoto et al.（非特許文献３）は、ヒト１１ｐ１５．５及びそのオーソロガスマウス７Ｆ４／Ｆ５のインプリンティングドメインを記載している。ＯＢＰＨ１及びＯｂｐｈ１はＩＰＬ／Ｉｐｌ側の推定インプリンティング境界を越えて位置する。Higashimoto et al.は、両方のオーソログの完全長ｃＤＮＡ及び完全なゲノム構造を判定し、その正確なインプリンティング状態及びメチル化状態を調査した。これらのオーソログはゲノム構造及び５’ＣｐＧ島の位置が互いに類似しており、普遍的に発現された。ＯＢＰＨ１及びＯｂｐｈ１は、主に胎盤内の母性対立遺伝子のみから発現され、どちらの種でも５’ＣｐＧ島は低メチル化されており、差次的にメチル化されていなかった。これらの結果から、インプリンティングドメインが推定インプリンティング境界を越えて伸び、どちらの種でも５’ＣｐＧ島のメチル化がインプリンティング状態と関連しないことが示唆された。非特許文献３は細胞型の同定へのメチル化分析の使用を開示しておらず、これらの遺伝子は普遍的に発現されると記載している。
【００１６】
特許文献１には、細胞、組織又は核から単離したＤＮＡのメチル化パターンについての情報を収集することと、得られた情報を分析することとを含む、細胞、組織又は核を同定する方法が記載されている。
【００１７】
特許文献２は、Ｔ細胞のサブグループを記載しており、それらを調節性Ｔ細胞として規定する特徴に関する。この出願には、かかるＴ細胞、それらを含む組成物及び免疫応答調節の際にそれらを動員するケモカインの使用も記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】欧州特許出願公開第１２１３３６０号
【特許文献２】国際公開第２００４／０５０７０６号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Antequera and Bird, ProcNatlAcadSci U S A. 90: 11995-9, 1993
【非特許文献２】Li SS, Yu SL, Singh S. Epigenetic states and expression of imprintedgenes in human embryonic stem cells. World J Stem Cells. 2010 Aug26;2(4):97-102.
【非特許文献３】Higashimoto K, SoejimaH, Yatsuki H, Joh K, Uchiyama M, Obata Y, Ono R, Wang Y, Xin Z, Zhu X, MasukoS, Ishino F, Hatada I, Jinno Y, Iwasaka T, Katsuki T, Mukai T.Characterization and imprinting status of OBPH1/Obph1 gene: implications for anextended imprinting domain in human and mouse. Genomics. 2002 Dec;80(6):575-84.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
上記の点を鑑みると、本発明の目的は、例えば動物／ヒトの血液又は組織に由来する／から得られる所与のサンプル中のＮＫ細胞及びこの細胞型のあらゆるサブセットをより都合よくかつ確実に同定及び定量化するのに優れたツールとしてＤＮＡメチル化分析に基づく改善された方法を提供することである。測定は精製、保管、更には相当の程度（extent）まで組織品質とは無関係に行うことができる。
【００２１】
メチル化の重要性は特に腫瘍細胞において明らかである。この場合、健常な細胞の発生に不可欠な「正常な」メチル化パターンが失われているため、細胞はエピジェネティック異常となるだけでなく、もはや制御することができない。異常なメチル化は本発明の第一の主題ではないが、正確なエピジェネティック調節の明らかな重要性が、がん細胞と不適切なメチル化との間の密接な関連性から明白である。このことから（from）正確なメチル化の重要性を決定することができる。単一遺伝子については、Ｆｏｘｐ３遺伝子座（Baron et al, Eur J Immunol. 2007 Sep;37(9):2378-89、Wieczorek et al. Cancer Res. 2009 Jan 15;69(2):599-608）及びＣＤ３遺伝子座（Sehouli et al. Epigenetics. 2011 Feb 1; 6(2):236-46）によって以前に示されているように、所与の遺伝子座でのＤＮＡの化学的／構造的性質（メチル化状態／インプリント等）は或る特定の細胞の分化及び型と一致する。これにより、エピジェネティックフィンガープリントに基づく健常細胞の細胞型の同定及び定量化が可能となる。本願では、これはＯＳＢＰＬ、特にＯＳＢＰＬ５の遺伝子に基づいて健常ナチュラルキラー細胞で達成され得る。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
第１の態様では、本発明は、哺乳動物に由来するサンプル中のナチュラルキラー細胞（ＣＤ５６ｄｉｍ細胞及び／又はＣＤ５６ｈｉｇｈ細胞）を同定する方法であって、オキシステロール結合タンパク質様タンパク質（ＯＳＢＰＬ）、特にＯＳＢＰＬ５の遺伝子の１つ又は複数の領域中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態及び／又はバイサルファイト変換へのアクセシビリティを分析することを含み、ＣＤ５６陰性細胞の類似位置と比較した、分析対象の上記領域中の上記少なくとも１つのＣｐＧ位置の脱メチル化が、ＣＤ５６陽性ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の指標となる、方法を提供することによって上記課題を解決する。
【００２３】
第２の態様では、本発明は、古典的ＣＤ５６ｄｉｍ細胞を同定及び定量化することの上記の課題を、哺乳動物に由来するサンプル中のＣＤ５６ｄｉｍナチュラルキラー細胞を同定する方法であって、オキシステロール結合タンパク質様タンパク質（ＯＳＢＰＬ）、特にＯＳＢＰＬ５の遺伝子の１つ又は複数の領域中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態及び／又はバイサルファイト変換へのアクセシビリティを分析することを含み、非ＮＫ細胞又は非ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞の類似位置と比較した、分析対象の上記領域中の上記少なくとも１つのＣｐＧ位置の脱メチル化が、ＣＤ５６ｄｉｍナチュラルキラー細胞の指標となる、方法を提供することによって解決する。
【００２４】
好ましい実施の形態では、上記哺乳動物の上記ＣＤ５６ｄｉｍナチュラルキラー細胞はＣＤ３−又はＣＤ３＋である。
【００２５】
Higashimoto et al.（非特許文献３）は、ヒト１１ｐ１５．５及びそのオーソロガスマウス７Ｆ４／Ｆ５がＩＰＬ／ＩｐｌからＨ１９に及ぶインプリンティングドメインとして知られていることを記載している。ＯＢＰＨ１及びＯｂｐｈ１はＩＰＬ／Ｉｐｌ側の推定インプリンティング境界を越えて位置する。これらのオーソログはゲノム構造及び５’ＣｐＧ島の位置が互いに類似しており、普遍的に発現された。ＯＢＰＨ１及びＯｂｐｈ１は、主に胎盤内の母性対立遺伝子のみから発現され、どちらの種でも５’ＣｐＧ島は低メチル化されており、差次的にメチル化されていなかった。これらの結果から、インプリンティングドメインが推定インプリンティング境界を越えて伸び、どちらの種でも５’ＣｐＧ島のメチル化がインプリンティング状態と関連しないことが示唆された。
【００２６】
次に、本発明の更なる実施の形態は、上記少なくとも１つのＣｐＧ位置が、転写開始点より上流の５’領域、プロモーター領域、５’非翻訳領域若しくは３’非翻訳領域、イントロン及び／又はエクソン／イントロン境界、又は転写終結点の下流の３’領域中に存在する、本発明の方法を含む。
【００２７】
次に、本発明のまた更なる実施の形態は、上記少なくとも１つのＣｐＧ位置が、配列番号１によるアンプリコンＯＳＢＰＬ５（Ａｍｐ１７４６）に位置するＣｐＧ位置から選択され、好ましくはアンプリコン番号１７４６の４６位、６６位、１０３位、１３０位、１３５位、１５２位、１６３位、１７３位、１７６位、１８２位又は２２４位から選択される、本発明の方法を含む。
【００２８】
分析対象の特定のＣｐＧについて、理論上は１つの細胞につき（どちらの対立遺伝子もメチル化されている）、（対立遺伝子Ａがメチル化され、対立遺伝子Ｂがメチル化されていない）、（対立遺伝子Ａがメチル化されておらず、対立遺伝子Ｂがメチル化されている）及び（どちらの対立遺伝子もメチル化されていない）という４つの状態が存在する。これにより、１００％メチル化、５０％メチル化及び０％メチル化という３つの異なる結果がもたらされる。このため、理論上はＮＫ細胞（ＣＤ５６ｄｉｍ）は０％メチル化され、非ＮＫ細胞（すなわちＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞）はおよそ１００％メチル化されている。同様の状況が分析対象の領域のバイサルファイト変換へのアクセシビリティを分析するアッセイに見られ、この場合、ＮＫ細胞（ＣＤ５６ｄｉｍ）が０％アクセス可能であり、非ＮＫ細胞（すなわちＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ）がおよそ１００％アクセス可能である。ＯＳＢＰＬ遺伝子領域については、５０％の（脱）メチル化は精製細胞型で観察されなかったが、以下の２つの代替的な場合で生じることが可能である：
１．ランダムメチル化。この場合、調節機能及び機能又は細胞型との関連性の可能性は低い。同時に、およそ５０％のメチル化が「ジャンク（junk）」メチル化を有する遺伝子で観察される場合がある。これは、一方のＤＮＡ鎖内の交互メチル化及びランダムメチル化、又は一方のＤＮＡ鎖のランダムメチル化及びもう一方のＤＮＡ鎖のランダム脱メチル化に起因し得る。
２．主として、この５０％メチル化は細胞型／状態に特異的に調節された遺伝子においても起こり得る。一方で、インプリンティング又はＸ不活性化がこの原因となる場合もある。この場合、１つの対立遺伝子が単一対立遺伝子性の遺伝子発現の要件により完全に不活性化される。したがって、単一対立遺伝子で発現されるが、依然として細胞特異的調節を受ける遺伝子については、一方の対立遺伝子が（通常はエピジェネティック手段により）永久的に生涯にわたって常にオンされ、もう一方の対立遺伝子が選択された細胞型でオンされる。測定に関して、インプリンティング又はＸ不活性化は同等であり、（エピジェネティック測定の観点からはそれほど重要でない）相違は、全ての細胞のインプリンティング遺伝子が同じ対立遺伝子をオフするが、Ｘ不活性化はモザイクであることのみである。
【００２９】
例えばバイサルファイトシークエンシングを利用する実用的測定では、利用した技術の僅かな技術的欠陥及び場合によっては僅かな生物学的差異の両方により理論上に予測される値が曖昧となるため、完全な「純粋な」メチル化パターンは殆ど検出されない。したがって、分析対象の上記領域中の上記少なくとも１つのＣｐＧ位置が、非ＮＫ細胞の類似位置と比較して８０％超、好ましくは９０％超、最も好ましくは９５％超脱メチル化されている、本発明の方法が好ましい。
【００３０】
さらに、本発明は領域（例えば上記のＡＭＰ１７４６領域）中の２個以上のＣｐＧ位置、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個の位置を分析する、方法を含む。この場合、分析対象の領域の全体的なメチル化（又は脱メチル化）を、非ＮＫ細胞の類似領域と比較して判定することができる。したがって、上記領域が、非ＮＫ細胞の（高メチル化又は完全にメチル化された）類似領域と比較して７０％超、好ましくは８０％超又は９０％超、最も好ましくは９５％超脱メチル化（低メチル化）されている、本発明の方法も好ましい。
【００３１】
当業者は、分析する部位、例えば配列番号１によるアンプリコン又は分析対象のＯＳＢＰＬ遺伝子中の任意の他の選択される部分配列上に存在する全ての部位の量を最小限に抑えるために、ＣｐＧ位置の特異的なサブセット、例えば上記のように転写開始点より上流の５’領域、プロモーター領域、５’非翻訳領域若しくは３’非翻訳領域、イントロン及び／又はエクソン／イントロン境界、又は転写終結点の下流の３’領域を更に選択することが可能である。
【００３２】
更に別の態様は、バイサルファイト変換へのアクセシビリティ及び／又はメチル化状態の分析がメチル化特異的酵素消化、バイサルファイトシークエンシングから選択される方法、プロモーターメチル化、ＣｐＧ島メチル化、ＭＳＰ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ、ｑＰＣＲから選択される分析、又はゲノムＤＮＡ、化学的若しくは酵素的に修飾されたＤＮＡ、若しくは増幅されたゲノムＤＮＡ、若しくは化学的若しくは酵素的に修飾されたＤＮＡの検出による他の方法を含む、本発明による方法に関する。マーカーＣＤ５６、ＣＤ１６及び／又はＣＤ８の付加的な分析も好ましい。
【００３３】
本発明の別の実施の形態は、上記同定が、上記ナチュラルキラー細胞を全ての主要な末梢血液細胞型又は非血液細胞から区別すること、及び任意で更に定量化することを含み、上記哺乳動物の免疫状態を、同定された上記ナチュラルキラー細胞に基づいて決定する工程を更に含む、上記の方法に関する。これにより、全血又は様々な亜画分及び組織又は組織の単離亜画分を含む哺乳動物のサンプルにおいて、ＮＫ細胞を分析される遺伝子におけるその（独特の）メチル化パターンにより同定及び定量化することができる。メチル化の喪失がＮＫ細胞と厳密に相関するため、これに基づいてＮＫ細胞を定量化することもできる（例えば図２及び表２を参照されたい）。
【００３４】
本明細書中では個体の「免疫状態」は、任意の所与の疾患状況の任意の所与の組織型での所与の状況における所与の個体の免疫系の状態を意味するものとする。例えば、固形腫瘍を患っている個体の（腫瘍）組織生検では免疫状態を判定することが重要であり得る。また、個体の健康状態を判定するために、末梢血での（推定上）健常な個体の免疫状態を判定することが適切であり得る。この場合、分析される遺伝子のメチル化コピー及び非メチル化コピーの所与の数によって定量化される細胞の増加又は減少の両方が、疾患、例えば体の未知の部位での腫瘍の存在、又は自己免疫反応若しくは慢性感染の指標となり得る。
【００３５】
特に、本発明者らは、本明細書に記載の方法が例えばＤＮＡチップ上での日常用途に好適であると考える。サンプルは、哺乳動物の体液、好ましくはヒト血液サンプル（血清サンプル）、又は腫瘍性若しくは非腫瘍性の固形組織サンプル、器官若しくは細胞型の血液サンプルを含む新鮮サンプル、新鮮凍結サンプル又は完全に調製された（例えばホルマリン固定パラフィン包埋）サンプルから選択される。これらのサンプルは哺乳動物、好ましくはマウス、ラット、サル、ウシ、ブタ又はヒトのものであるものとする。哺乳動物がとりわけ好ましく、自己免疫疾患、ウイルス感染若しくは細菌感染、移植片拒絶反応、固形がん及び非固形がんを含むがん、及び／又はアレルギー、又は表現型がＳＣＩＤ−Ｘ１によって表される疾患等であるが、これに限定されないＮＫ細胞と直接関連する任意の疾患を患っているか、又は患う可能性があるヒトが最も好ましい。
【００３６】
更に別の態様は、上記サンプルにおける同定された上記ＣＤ５６ｄｉｍナチュラルキラー細胞の数及び／又は量を、上記同定及び定量化に基づいて決定する工程を更に含む、本発明による方法に関する。ＯＳＢＰＬ遺伝子、特にＯＳＢＰＬ５遺伝子及び配列番号１によるアンプリコンの脱メチル化が、ナチュラルＮＫ細胞表現型に非常に厳密に関係するため（例えば表２を参照されたい）、上記方法の最も都合の良い実施の形態では、上記ナチュラルキラー細胞（特にＣＤ５６＋及び／又はＣＤ５６＋及びＣＤ５６＋＋によって定義される細胞）の数及び／又は量を、アッセイにおけるコピー数及び／又は被検体の性別に対して正規化した場合に、脱メチル化分析の結果と直接相関させることができる。他の代替形態では、付加的な対照実験（例えば並行した脱メチル化ＧＡＰＤＨの分析）を適用することができる。
【００３７】
更なる態様では、本発明の方法は、本発明による方法と、同定されたナチュラルキラー細胞の量を、同じ哺乳動物から採取された以前のサンプル及び／又は対照サンプルと比較することとを含む、哺乳動物におけるＣＤ５６ｄｉｍナチュラルキラー細胞のレベルのモニタリングに有用である。
【００３８】
更に別の態様は、上記哺乳動物の免疫状態を、上記サンプルにおける同定された上記ナチュラルキラー細胞の数及び／又は量に基づいて決定する工程を更に含む、本発明による方法に関する。
【００３９】
更に別の態様は、上記哺乳動物が自己免疫疾患、移植片拒絶反応、がん、感染、アレルギー、及び／又はＳＣＩＤ−Ｘ１等であるが、これに限定されないＮＫ細胞と直接関連する任意の疾患を患っているか、又は患う可能性がある、本発明による方法に関する。
【００４０】
本発明の別の態様では、この方法は、上記哺乳動物に与えた化学物質及び／又は生体物質に応じた上記ナチュラルキラー細胞の量の測定及び／又はモニタリングにも有用である。
【００４１】
更に別の態様では、本発明は配列番号１によるアンプリコンを提供する。該アンプリコンは、本発明による方法におけるツールとして使用することができる。
【００４２】
本発明はまた、本発明による方法の実行用の材料を含む、哺乳動物におけるＣＤ５６ｄｉｍナチュラルキラー細胞を、オキシステロール結合タンパク質様タンパク質（ＯＳＢＰＬ）、特にＯＳＢＰＬ５の遺伝子の１つ又は複数の領域中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態の分析に基づいて同定及び／又はモニタリングするキットを提供する。
【００４３】
かかる本発明のキットは、好ましくは限定されるものではないが、ａ）バイサルファイト試薬と、ｂ）遺伝子ＯＳＢＰＬ５、配列番号１によるアンプリコン１７４６のＣｐＧ位置から選択されるＣｐＧ位置のメチル化分析用の材料とを含む。
【００４４】
本発明は、ＮＫ細胞、特にＣＤ５６ｄｉｍ及びＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ及びＣＤ１６ｌｏｗ又はＣＤ１６ｈｉｇｈＮＫ細胞の検出及びそれらの区別には、Ｒ＆Ｄの本質的に全ての用途、特に全ての臨床（日常）用途で問題があるという上記の課題を、哺乳動物のＮＫ細胞を同定する方法であって、ＯＳＢＰＬ、例えばＯＳＢＰＬ５の遺伝子の１つ又は様々な、例えば調節領域、潜在的に差次的にメチル化された領域中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含み、脱メチル化及び／又はバイサルファイト変換へのアクセシビリティが、ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞（「古典的」ＮＫ細胞）に高度に特異的であるか、又はその指標となる、方法を提供することによって解決する。
【００４５】
本発明の別の好ましい実施の形態では、本発明者は、ヒト全血サンプル又は任意の所与の（固形）組織、器官若しくは細胞型を含む全てのヒト体液中のＮＫ細胞をモニタリングするために、新規のより特異的な方法を更に提示する。
【００４６】
本発明の概念は概して、ＮＫ細胞中のＯＳＢＰＬ、例えばＯＳＢＰＬ５領域のＤＮＡの特異的な脱メチル化及び／又はバイサルファイトへのアクセシビリティ及び他の化学的な塩基特異的変換に基づく。簡単かつ正確な定量的ＰＣＲ法（例えば核酸分子のコピーの判定を可能にする正確な定量的ＰＣＲ法又は他の方法）をシグナル増幅方法として用いて、本発明者は、ＯＳＢＰＬ５等のＯＳＰＢＬの脱メチル化及び／又はバイサルファイト変換へのアクセシビリティが、血液又は組織におけるリンパ球数の代替マーカーであることを示す。これにより、本発明者らは、ナチュラルキラー細胞の存在と機能的に関与する又は確実に関連する遺伝子であるＯＳＢＰＬ５等のＯＳＰＢＬ内の特定の新たな領域を同定した。
【００４７】
好ましい一実施の形態では、この同定に好ましい領域は、ＯＳＢＰＬ５等のＯＳＰＢＬの遺伝子のプロモーター領域又はイントロン／エクソン領域、並びにＣＤ１６及びＣＤ８を同様に発現していても又は発現していなくてもよいＣＤ５６を発現する細胞、ＣＤ５６ｈｉｇｈ細胞又はＣＤ５６ｄｉｍ細胞において、例えばバイサルファイトシークエンシング法又はリアルタイムＰＣＲ分析を用いて、ＣＤ５６を発現しない他の細胞と比較してＤＮＡの差次的メチル化状態及び／又はバイサルファイトへの差次的アクセシビリティ及び他の化学的な塩基特異的変換を示す多数のＣｐＧモチーフを含有する他の領域である。
【００４８】
本発明の主要な態様は、ナチュラルＮＫ細胞の機能的に異なる画分、すなわち一方では細胞傷害性亜画分（表面マーカーＣＤ５６ｄｉｍ及び場合によってはＣＤ１６ｈｉｇｈを特徴とすることが多い）、並びに他方ではサイトカインを産生する亜画分（すなわち、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ及びＣＤ１６ｌｏｗ／ｍｅｄｉｕｍとして表されることが多い）及び他のヒト／動物細胞型間の区別である。代替的には、上記方法によって、ＣＤ８陽性及びＣＤ８陰性のＮＫ細胞画分又はＮＫ細胞の任意の他の亜画分が区別される。一方、一般的ＮＫ細胞集団の同定については、特定の好ましい実施の形態は二峰性マーカーＮＫＧ７による同定であり、本発明者らは、マーカーＮＫＧ７、ＣＸ３ＣＲ１、ＦＧＲ及び／又はＧＮＬＹとＯＳＢＰＬ５等の本発明のマーカーＯＳＰＢＬとの組合せを用いたＣＤ８陽性又はＣＤ８陰性等のサブグループの分画を、好ましい実施の形態とみなす。この場合、例えばＮＫＧ７脱メチル化細胞の割合によって全ＮＫ集団をタイピング及び定量化する一方で、ＯＳＢＰＬ５等のＯＳＰＢＬの完全脱メチル化によってＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ集団又は代替的にはＣＤ５６ｄｉｍ集団を判定することができる。実行例は、完全血液のサンプルにおいて、非メチル化ＮＫＧ７領域を有する細胞の数によってＮＫ様細胞の絶対数を判定する一方で、ＯＳＢＰＬ５等のＯＳＰＢＬが脱メチル化された細胞の数によってＣＤ５６ｄｉｍ集団の割合を判定することであり得る。このような状況では、一実施の形態として、ＯＳＢＰＬ５等のＯＳＰＢＬの脱メチル化のみの使用によって、他のＮＫ又は他の細胞画分の量を判定することなく、ＣＤ５６ｄｉｍ集団のみの同定がもたらされ得る。
【００４９】
本発明者らは、全てのＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞ではＣｐＧモチーフがほぼ完全に（すなわち７０％超、好ましくは８０％超、好ましくは９０％超、最も好ましくは９５％超まで、上記を参照されたい）脱メチル化されており、一方で同じモチーフが全ての非ＮＫ細胞及び非ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞では完全にメチル化されていることを実証することができた。したがって、ＯＳＢＰＬ５等のＯＳＰＢＬの遺伝子座のメチル化状態の判定は、必要とされるようにＮＫ細胞の同定に有益なツールであるか、又は望まれる場合に自己免疫疾患、（ウイルス）感染、移植片拒絶反応、がん、感染、アレルギー、若しくは単に任意の想定可能な状況でのＮＫ細胞に関連する免疫状態におけるＮＫ細胞の測定に少なくとも何らかの価値がある。このアッセイは、精製又は任意の染色手順なしにＮＫ細胞の測定を可能にする。特に好ましい実施の形態として、本明細書に記載のマーカーのいずれかによるＮＫ細胞の測定は、腫瘍性組織又は非腫瘍性組織を含む健常又は病的な性質の固形組織サンプルからＮＫ細胞を容易に検出及び定量化することができる。かかる分析では、新鮮組織、新鮮凍結組織又は任意のタイプの保存された（例えば、ホルマリン固定及び／又はパラフィン包埋）組織から分析を行うことが可能である。別の好ましい実施の形態は、一方でＮＫ細胞と、他方でＣＤ３＋Ｔリンパ球、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞、ＦＯＸＰ３  ＣＤ２５  ＣＤ３＋細胞、単球及び／又は顆粒球との間、並びにＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞に対するＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞、全リンパ球に対するＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞、全白血球に対するＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞、又は全細胞傷害性細胞に対するＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞の比率を判定することである。
【００５０】
本発明者らは、哺乳動物免疫細胞のＮＫ細胞特性を形成する可能性が、ＯＳＢＰＬ５等のＯＳＰＢＬの遺伝子のエピジェネティックな、すなわちＤＮＡメチル化に基づく調節と同時に起こることを示した。ＤＮＡメチル化は、長期的な遺伝子発現変化をもたらす生物学的及び化学的に安定なエピジェネティック修飾である。本発明者らは、ヒトＯＳＢＰＬ５遺伝子座での脱メチル化及び／又はゲノムＤＮＡのバイサルファイト変換へのアクセシビリティが、全ての主要な末梢血液細胞型及び選択された異なる非血液細胞型／株に対して試験した場合に、ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞に制限されることを見出した。これらのデータから、ＯＳＢＰＬ５遺伝子座等のＯＳＰＢＬ遺伝子座におけるエピジェネティック修飾が、任意の遺伝子の発現に関わらず、ＮＫ細胞の表現型を有する細胞の同定に有益なマーカーとなることが示された。
【００５１】
本発明は、ＯＳＢＰＬ５遺伝子の特定の領域、いわゆる「ＮＫ−ＳＤＲ」（ＮＫ細胞特異的に脱メチル化した領域）では、ＣｐＧモチーフが７０％超、好ましくは８０％超、より好ましくは９０％超、好ましくは９１％超、更により好ましくは９２％超、最も好ましくは９５％超までほぼ完全に脱メチル化されており、同じモチーフが全ての非ＮＫ細胞で完全にメチル化されているという驚くべき発見（上記を参照されたい）に基づく。このため、この領域から本発明による診断分析に有益かつ信頼性のあるツールがもたらされる。
【００５２】
メチル化による遺伝子調節を受ける付加的な重要な遺伝子調節要素、例えば不可欠な転写調節因子の結合部位であるエンハンサー領域は、所与の遺伝子のオープンリーディングフレームの上流及び下流に位置することが多いことが当該技術分野で確立されている。このため、本発明の好ましい実施の形態として、ＯＳＢＰＬ５の転写開始部位の上流の１００００塩基、好ましくはＯＳＢＰＬ５の上流の９０００塩基、８０００塩基、７０００塩基、６０００塩基、５０００塩基、４０００塩基、３０００塩基又は２０００塩基、更により好ましくはＯＳＢＰＬ５の転写開始部位の上流の１０００塩基の領域内に位置するＮＫ−ＳＤＲ、最も好ましくはＯＳＢＰＬ５の転写開始部位の上流の最初の５００塩基中のＮＫ−ＳＤＲが提供される。しかしながら、本発明のＮＫ−ＳＤＲがＯＳＢＰＬ５の遺伝子プロモーター内に位置することが特に好ましい。
【００５３】
さらに、本発明の付加的な好ましい実施の形態は、ＯＳＢＰＬ５のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の下流、好ましくはＯＳＢＰＬ５のＯＲＦの下流の１００００塩基、より好ましくはＯＳＢＰＬ５の下流の８０００塩基、更により好ましくはＯＳＢＰＬ５のＯＲＦの下流の６０００塩基の領域、好ましくはＯＳＢＰＬ５の下流の４０００塩基内のＮＫ−ＳＤＲ、最も好ましくはＯＳＢＰＬ５のＯＲＦの下流の最初の２０００塩基中のＮＫ−ＳＤＲである。
【００５４】
本発明は更に好ましくは、ＯＳＢＰＬ５の上述の好ましいＮＫ−ＳＤＲと上記の、例えば配列番号１中の領域との任意の可能な組合せを含むＯＳＢＰＬ５のＮＫ−ＳＤＲ群を提供する。
【００５５】
ヒトの遺伝子ＮＫＧ７は１９番染色体のリバース鎖上に位置する。この遺伝子領域は、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ、４つのエクソン及び３つのイントロン領域を含むおよそ１．３ｋｂにわたる（Ensembl release 53, March 2009）。最終ＮＫＧ７タンパク質産物の１６５アミノ酸をコードする８２６ヌクレオチドの成熟転写産物である遺伝子の単一スプライス変異体の証拠のみが存在する。更なる態様では、好ましいＮＫ−ＳＤＲは、ＮＫＧ７の５’ＵＴＲ又は好ましくはＮＫＧ７の３’ＵＴＲである。さらに、本発明のナチュラルキラー細胞に特異的な脱メチル化領域は、この遺伝子のイントロン配列内に位置する。特に、ＮＫＧ７のエクソン−イントロン境界、好ましくは第１のエクソン及び第１のイントロン、及び／又は第１のイントロン及び第２のエクソン、及び／又は第２のエクソン及び第２のイントロン、及び／又は第２のイントロン及び第３のエクソン、及び／又は第３のエクソン及び第３のイントロン、及び／又は第３のイントロン及び第４のエクソン、又は上記の任意の可能な好ましい組合せの間の境界の周辺に位置するＮＫ−ＳＤＲも好ましい。
【００５６】
ヒトの遺伝子ＣＸ３ＣＲ１は３番染色体のリバース鎖上に位置する。この遺伝子領域は、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ、３つのエクソン及び２つのイントロン領域を含むおよそ１８．５ｋｂのゲノムＤＮＡにわたる（Ensembl release 53, March 2009）。サイズが３５５アミノ酸〜３８７アミノ酸の範囲の最終タンパク質産物をコードする転写産物の３つの選択的にスプライシングされた変異体が存在する。更なる態様では、好ましいＮＫ−ＳＤＲは、ＣＸ３ＣＲ１の５’ＵＴＲ又は好ましくはＣＸ３ＣＲ１の３’ＵＴＲである。さらに、本発明のナチュラルキラー細胞に特異的な脱メチル化領域は、この遺伝子のイントロン配列内に位置する。特に、ＣＸ３ＣＲ１のエクソン−イントロン境界、好ましくは第１のエクソン及び第１のイントロン、及び／又は第１のイントロン及び第２のエクソン、及び／又は第２のエクソン及び第２のイントロン、及び／又は第２のイントロン及び第３のエクソン、又は上記の任意の可能な好ましい組合せの間の境界の周辺に位置するＮＫ−ＳＤＲも好ましい。
【００５７】
別の実施の形態では、上記メチル化状態の分析が配列番号１によるアンプリコンの増幅に有用なプライマー対の少なくとも一方のプライマーを用いた増幅を含む、本発明による方法が好ましい。
【００５８】
好ましくは増幅には、ポリメラーゼ酵素、ＰＣＲ増幅反応若しくは化学的増幅反応、又は当業者に既知の、例えばＭＳＰ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ、ＭＳ−ＳＮＵＰＥ、ＭｅｔｈｙｌＬｉｇｈｔ、シークエンシング又はメチル特異的制限アッセイの状況における他の増幅方法が含まれる。増幅により、本発明による方法（複数の場合もあり）の実行に特に好ましい「ツール」である、本明細書に記載のＯＳＢＰＬ５等のＯＳＰＢＬの遺伝子又は任意のパラログ若しくはオーソログのＮＫ−ＳＤＲのアンプリコン又は任意の他の領域が産生される。結果として、配列番号１又は配列番号２による領域及びその一部の増幅用のプライマー対は、本発明の好ましい実施の形態である。
【００５９】
さらに、細胞マーカーＣＤ５６、ＣＤ１６及び／又はＣＤ８を分析する工程を更に含む、本発明による方法が好ましい。これらの付加的マーカーを分析するために、抗体を用いた方法及び／又はメチル化分析といった発現を分析する任意の既知の方法を使用することができる。これらのマーカーの分析は、好ましくは分析の精度を更に改善し、細胞サブセットの同定を可能とし得る。このため、本発明による方法は、上記ナチュラルキラー細胞と全ての主要な末梢血液細胞型又は非血液細胞との区別である同定を含む。
【００６０】
本発明による方法は、上記のマーカー又はそのオーソログ若しくはパラログを有する任意の哺乳動物で行うことができ、該哺乳動物がマウス、ラット、ブタ又はウシ、サル又はヒト、好ましくはヒトである、本発明による方法が好ましい。
【００６１】
本発明による方法（複数の場合もあり）はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。概して、好適な細胞又は対象の細胞の好適なＤＮＡを含有する限り、全ての生物学的サンプルを使用することができる。該サンプルが哺乳動物の体液、好ましくはヒト全血サンプル、血清サンプル、又は腫瘍性若しくは非腫瘍性の固形組織、器官若しくは細胞型の血液サンプル、血液リンパ球若しくはその画分のサンプルを含む新鮮サンプル、新鮮凍結サンプル又は完全に調製されたサンプルから選択される、方法が好ましい。
【００６２】
次に、本発明の別の好ましい態様は、診断における上記の本発明による方法の使用及び疾患のモニタリングにおける使用に関する。このため、代替的な実施の形態では、本発明は、上記哺乳動物の免疫状態を、同定された上記ナチュラルキラー細胞に基づいて決定する工程を更に含む、本発明による方法に関する。本発明による上記方法では、任意で例えばＮＫＧ７、ＣＸ３ＣＲ１、ＦＧＲ及びＧＮＬＹから選択される少なくとも第２の遺伝子中の少なくとも１つのＣｐＧ位置の脱メチル化と組み合わせた、ＯＳＢＰＬ５等のＯＳＰＢＬから選択される第１の遺伝子中の少なくとも１つのＣｐＧ位置の脱メチル化が、ＣＤ５６ｄｉｍ又はＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔナチュラルキラー細胞の指標となる。
【００６３】
次に、本発明の別の重要な態様は、哺乳動物におけるＣＤ５６発現ナチュラルキラー細胞、特にＣＤ５６ｄｉｍ若しくはＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ、及び／又はＣＤ１６＋若しくはＣＤ１６−、及び／又はＣＤ８＋若しくはＣＤ８−ナチュラルキラー細胞のレベルをモニタリングする本発明による方法であって、上記の本発明による方法と、同定されたナチュラルキラー細胞の量を、同じ哺乳動物から採取された以前のサンプル及び／又は対照サンプルと比較することとを含む、方法に関する。好ましくは、上記方法は自己免疫疾患、移植片拒絶反応、がん、感染、アレルギー、及び／又はＳＣＩＤ−Ｘ１等であるが、これに限定されないＮＫ細胞と直接関連する任意の疾患を患っているか、又は患う可能性がある哺乳動物に由来するサンプルで行われる。
【００６４】
次に、更に好ましくは、本発明による上記方法は、上記哺乳動物に与えた化学物質及び／又は生体物質に応じたナチュラルキラー細胞の量を測定及び／又はモニタリングすることを更に含む。すなわち、例えば疾患の治療（例えば本明細書に記載のもの）、並びにナチュラルキラー細胞に対する効果に関する該治療の成功及び／又は進行に起因するナチュラルキラー細胞の量又は比率の変化は、この方法を用いて追跡することができる。本明細書中のマーカーに基づくメチル化パターンの追跡は、場合によっては表現型変化が観察される前でもある、上記化学物質及び／又は生体物質に対する応答による細胞における変化を示す。
【００６５】
本発明の更に別の態様では、本発明は、本明細書に記載のマーカーを発現するナチュラルキラー細胞を選択的に調整する化学物質及び／又は生体物質を同定する方法であって、１つ又は複数の上記化学物質及び／又は生体物質と上記ナチュラルキラー細胞とを接触させることと、上記化学物質及び／又は生体物質が分析対象のＣｐＧ位置のメチル化を調整するか否か、及び／又は上記１つ又は複数の化学物質及び／又は生体物質がマーカーを発現するナチュラルキラー細胞の量及び／又は比率を選択的に調整するか否かを検出することとを含む、方法を提供する。上記ナチュラルキラー細胞の量及び／又は比率を増大させる上記ナチュラルキラー細胞の調整が特に好ましい。
【００６６】
この方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又は好適な動物で行うことができる。この態様では、本発明は、ナチュラルキラー細胞に特異的な薬物及びそれぞれの医薬組成物の開発の出発点として使用することができる、上記のマーカーの発現を調整する化学物質及び／又は生体物質を同定しようとする方法（「スクリーニング法」と呼ばれる場合もある）を提供する。本発明の方法は、本明細書中で同定されるマーカー遺伝子がナチュラルキラー細胞の発生の中心的役割を果たすはずであることが広く認められているという事実に基づく。したがって、マーカー発現を刺激する因子は患者の治療にとって興味深い。ナチュラルキラー細胞の発生／比率／量の安定な修飾、好ましくは誘導をもたらすかかる因子は、本発明で記載の方法を用いて検出することができる。
【００６７】
スクリーニング化合物として好適な化学物質及び／又は生体物質は当業者に既知であり、例えば小分子、ペプチド及びタンパク質、並びに抗体又はその断片を含む。さらに、スクリーニングは、民間の化合物ライブラリを、最適にはロボット等の好適な自動化とともに用いて行うことができる。化学物質及び／又は生体物質を同定する方法の好ましい一実施の形態では、上記物質は、分析対象のＣｐＧ位置の少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の脱メチル化をもたらす。
【００６８】
次に、本発明の別の重要な態様は、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、がん、アレルギー、及び／又はＳＣＩＤ−Ｘ１等であるが、これに限定されないＮＫ細胞と直接関連する任意の疾患を患っているか、又は患う可能性がある患者に治療を行う工程を更に含む、本発明による方法に関し、ここで上記治療は、上記の好ましくはがん患者においてＮＫ細胞の量及び／又は割合を調整、好ましくは増大する。上記治療が、上記患者においてＮＫ細胞を選択的に刺激する化学物質及び／又は生体物質の提供、又は上記患者の上記ＮＫ細胞において上記のマーカー遺伝子の発現を刺激するか、若しくは上記マーカー遺伝子の生物活性を支持する治療から選択される、本発明による方法が好ましい。かかる治療の好ましい例は、上記遺伝子のメチル化の低減をもたらす脱メチル化剤である。かかる治療の他の好ましい例は、自己免疫疾患の場合にＮＫ細胞の数の減少をもたらす薬剤である。
【００６９】
本発明の更に別の好ましい態様は、本明細書で上記した方法を含む、マーカー遺伝子発現及び／又は脱メチル化に関連する疾患、例えば自己免疫疾患、移植片拒絶反応、がん、アレルギー、及び／又はＳＣＩＤ−Ｘ１等であるが、これに限定されないＮＫ細胞と直接関連する任意の疾患の治療の改善された方法に関する。「治療」という用語は、マーカー遺伝子発現及び／又は脱メチル化に関連する疾患の予防も含む。
【００７０】
本発明の更に別の態様では、本発明は、哺乳動物におけるＣＤ５６ｄｉｍナチュラルキラー細胞、及び／又は哺乳動物におけるＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ及び／又はＣＤ１６＋若しくはＣＤ１６−及び／又はＣＤ８＋若しくはＣＤ８−ナチュラルキラー細胞の同定及び／又はモニタリングへの本発明によるアンプリコン又は本発明によるキットの使用に関する。
【００７１】
ここで、本発明をその好ましい実施形態の形で以下の実施例に更により詳細に記載するが、本発明はこれに限定されない。本発明の目的上、本明細書に引用される全ての参考文献は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】ａ）ゲノム配列中のアンプリコンＡＭＰ１７４６（太字）のアラインメントを示す図である。さらに、ＯＳＢＰＬ５のエクソン１４に下線を引いている。これによると、エクソン１４はＡＭＰ１７４６よりも小さく、したがってエクソン１４の５’及び３’イントロン／エクソン境界、並びにｂ）アンプリコンＡＭＰ１７４６の配列（配列番号１）、並びにＣｐＧ（網掛け）、ＴｐＧ及びＣｐＧに特異的なオリゴ（下線）及びＴａｑｍａｎプローブ（灰色のヌクレオチド）も含む。
【図２】種々の血液細胞サブタイプでのＯＳＢＰＬ５（ＡＭＰ１７４６、図１を参照されたい）遺伝子座のバイサルファイト変換及びシークエンシングを示す図である。分析対象の位置は上から下に、それぞれ４６、６６、１０３、１３０、１３５、１５２、１６３、１７３、１７６、１８２及び２２４である。灰色のコードは各細胞型のメチル化レベルを示し、濃い灰色は完全メチル化を表し、薄い灰色は大きく減少したメチル化を示す。
【図３】ＯＳＢＰＬ５のゲノム配列（特にＯＳＢＰＬ５−００１を参照されたい）中のアンプリコンＡＭＰ１７４６の位置（上部の矢印）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
配列番号１はＡＭＰ１７４６のヌクレオチド配列を示し、
配列番号２はＡＭＰ１７４６の周囲のヒトゲノム領域のヌクレオチド配列を示し、
配列番号３及び配列番号４は、実施例で使用されるＴｐＧ及びＣｐＧに特異的なオリゴのヌクレオチド配列を示し、
配列番号５は実施例で使用されるＴａｑＭａｎプローブのヌクレオチド配列を示す。
【実施例】
【００７４】
実施例１
本発明者らは、ＣＤ３／ＣＤ４、ＣＤ３／ＣＤ８ナイーブ及びメモリーＴリンパ球、ＮＫＴ  ＣＤ３＋ＣＤ５６＋、ＣＤ３−ＣＤ５６＋、ＣＤ３−ＣＤ５６＋＋等のＣＤ５６ナチュラルキラー細胞の様々な異なる画分、並びにＣＤ１９ナイーブ及びメモリーＢ細胞、ＣＤ１４単球、ＣＤ１５顆粒球、並びに非リンパ系細胞株（表１を参照されたい）を含む様々な血液サブセットを精製した。精製細胞に由来するＤＮＡをバイサルファイト処理し、様々なＣｐＧジヌクレオチドモチーフで分析した。次いで、本発明者らは、メチル化状態（元の（ゲノム）配列でメチル化されたシトシンについての結果Ｃに対する、元の配列でメチル化されていないシトシンについての結果Ｔ）を比較した。
【００７５】
驚くべきことに、以下の表１から分かるように、ＯＳＢＰＬ、特にＯＳＢＰＬ５の遺伝子のゲノム領域中の特定の部分が、ナチュラルキラー細胞において任意の他の細胞型と比較して有意に脱メチル化されていることが見出された。
【００７６】
表１：種々の血液細胞サブタイプ及び種々の細胞株におけるＰＣＲ分析
分析したサンプル
【表１】
2014520560.tif 000002
【００７７】
このデータから、ＮＫ古典的ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋細胞サンプルでは脱メチル化され、一方で他の全ての血液細胞型、例えばＣＤ５６＋＋細胞では完全にメチル化されているＯＳＢＰＬ５遺伝子の領域中の様々なＣｐＧ部位及びモチーフが示される。
【００７８】
次に、差次的メチル化の結果に基づいて、本発明者は、より大きなゲノム領域を、バイサルファイトシークエンシングを用いて分析した。この手順は、差次的にメチル化された領域の探索及び拡張に役立ち、例えば図１に示されるＯＳＢＰＬ５の差次的にメチル化された遺伝子領域で行った。
【００７９】
実施例２
本実験では、顆粒球ＤＮＡを用いたスパイキングアッセイにおける本発明によるアッセイの特異性、ロバスト性及び精度を試験した。このアッセイによって、表２に示されるようにＮＫ細胞ＤＮＡが分析対象の範囲の大部分に対して高い特異性及び精度で同定される（０．６２５％に対して２０％のＤＮＡ）ことが見出された。
【００８０】
表２：ＰＣＲ分析：顆粒球ＤＮＡにおけるＮＫ細胞ＤＮＡのスパイキング
分析したサンプル
【表２】
2014520560.tif 000003
【図１】
2014520560.tif 000004
【図２】
2014520560.tif 000005
【図３】
2014520560.tif 000006
【配列表】
2014520560000001.app
【国際調査報告】
2014520560.tif 000007
2014520560.tif 000008
2014520560.tif 000009
2014520560.tif 000010