(57)【要約】  本発明は、FeLVに対する動物またはヒトの免疫応答を誘導するためのFeLV抗原を含み、それをin vivoもしくはin vitroで発現するベクター、前記ベクターおよび／またはFeLVポリペプチドを含む組成物、FeLVに対するワクチンの接種方法ならびにこのような方法および組成物に使用するためのキットを提供する。【選択図】図２
2014528699.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)最適化ネコ白血病ウイルス(FeLV)エンベロープ(ENV)ポリペプチドをコードする第1ポリヌクレオチドおよびFeLV GAG/PROポリペプチドをコードする第2ポリヌクレオチドを含む発現ベクター；ならびに
b)薬学的または獣医学的に許容されるビヒクル、希釈剤または賦形剤
を含む組成物。
【請求項２】
最適化FeLV ENVポリペプチドが、FeLV ENVタンパク質のアミノ酸位置527または対応する等価なアミノ酸位置に変異を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
変異が、グルタミン酸(E)のアルギニン(R)、アスパラギン酸(D)またはメチオニン(M)への置換を含む、請求項1または2に記載の組成物。
【請求項４】
ポリヌクレオチドが、配列番号2、4、6、27、28、29、30、31、32、33または34に記載の配列に少なくとも80%の配列同一性を有するFeLV ENVポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドが、FeLV ENVタンパク質のアミノ酸位置527または対応する等価なアミノ酸位置に変異を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項５】
変異が、グルタミン酸(E)のアルギニン(R)、アスパラギン酸(D)またはメチオニン(M)への置換を含む、請求項4に記載の組成物。
【請求項６】
変異が、グルタミン酸(E)のアルギニン(R)への置換を含む、請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
ポリヌクレオチドが、配列番号1、3または5に記載の配列に少なくとも70%の配列同一性を有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項８】
ベクターが、FeLV ENVポリペプチドをコードする第1ポリヌクレオチドおよびFeLV GAG/PROポリペプチドをコードする第2ポリヌクレオチドを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項９】
第1ポリヌクレオチドが、配列番号2、4、6、27、28、29、30、31、32、33または34に記載の配列に少なくとも80%の配列同一性を有するFeLV ENVポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドがFeLV ENVタンパク質のアミノ酸位置527または対応する等価なアミノ酸位置に変異を含み、第2ポリヌクレオチドが、配列番号12に記載の配列に少なくとも80%の配列同一性を有するFeLV GAG/PROポリペプチドをコードする、請求項8に記載の組成物。
【請求項１０】
第1ポリヌクレオチドが、配列番号2または4に記載のアミノ酸配列を有するFeLV ENVポリペプチドをコードし、第2ポリヌクレオチドが、配列番号12に記載のアミノ酸配列を有するFeLV GAG/PROポリペプチドをコードする、請求項8または9に記載の組成物。
【請求項１１】
FeLV ENVポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号1、3または5に記載の配列に少なくとも70%の配列同一性を有し、FeLV GAG/PROポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号10または11に記載の配列に少なくとも70%の配列同一性を有する、請求項8または9に記載の組成物。
【請求項１２】
発現ベクターがアビポックスベクターである、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１３】
組成物が、約105pfu〜約109pfuの投与量範囲で動物に投与される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１４】
最適化FeLV ENVポリペプチドをコードする第1ポリヌクレオチドおよびFeLV GAG/PROポリペプチドをコードする第2ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１５】
第1ポリヌクレオチドが、配列番号2、4、6、27、28、29、30、31、32、33または34に記載の配列に少なくとも80%の配列同一性を有するFeLV ENVポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドが、FeLV ENVタンパク質のアミノ酸位置527または対応する等価なアミノ酸位置に変異を含み、第2ポリヌクレオチドが、配列番号12に記載の配列に少なくとも80%の配列同一性を有するFeLV GAG/PROポリペプチドをコードする、請求項14に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
第1ポリヌクレオチドが、配列番号2または4に記載のアミノ酸配列を有するFeLV ENVポリペプチドをコードし、第2ポリヌクレオチドが、配列番号12に記載のアミノ酸配列を有するFeLV GAG/PROポリペプチドをコードする、請求項14または15に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
FeLV ENVポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号1、3または5に記載の配列に少なくとも70%の配列同一性を有し、FeLV GAG/PROポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号10または11に記載の配列に少なくとも70%の配列同一性を有する、請求項14または15に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
発現ベクターがアビポックスベクターである、請求項14〜17のいずれか1項に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
動物にワクチン接種する方法であって、請求項1〜18のいずれか1項に記載の組成物または発現ベクターの少なくとも1つの投与を含む前記方法。
【請求項２０】
プライム・ブースト投与計画を含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
組成物が約105pfu〜約109pfuの投与量範囲で投与される、請求項19または20に記載の方法。
【請求項２２】
a)最適化FeLVポリペプチド、最適化FeLVポリペプチドの変種または断片、およびそれらの混合物からなる群から選択される1以上のポリペプチドをコードする1以上のポリヌクレオチドを含む発現記ベクター；ならびに
b）薬学的または獣医学的に許容されるビヒクル、希釈剤または賦形剤
を含む組成物。
【請求項２３】
最適化FeLVポリペプチド、最適化FeLVポリペプチドの変種または断片、およびそれらの混合物からなる群から選択される1以上のポリペプチドをコードする1以上のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２４】
プライム・ブーストワクチン接種のためのキットであって、少なくとも2つのバイアル（プライムワクチン接種のための、請求項1〜18のいずれか1項に記載の組成物または発現ベクターを含む第1バイアルおよび、ブーストワクチン接種のための、請求項1〜18のいずれか1項に記載の組成物もしくは発現ベクターまたはサブユニットFeLVワクチンまたはプラスミドFeLVワクチンを含む第2バイアル）を含む前記キット。
【請求項２５】
第1バイアルが請求項10に記載の組成物を含み、第2バイアルが請求項10に記載の組成物を含み、前記組成物が、約105pfu〜約109pfuの投与量範囲で投与される、請求項24に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2011年7月20日出願の米国仮出願第61/509,912号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、動物におけるネコ白血病ウイルス感染と戦うための組成物またはワクチンに関する。本発明は、特に、ネコ白血病ウイルスに対する動物の免疫応答を誘導するための最適化ネコ白血病ウイルスエンベロープ抗原を含み、それをin vivoもしくはin vitroで発現するベクター、前記ベクターを含む組成物、ネコ白血病ウイルスに対するワクチンの接種方法ならびにこのような方法および組成物に使用するためのキットを提供する。
【背景技術】
【０００３】
ネコ白血病ウイルス(FeLV)は、世界中でイエネコ感染の共通原因であり、高い罹患率死亡率を引き起こす。抗原血症の有病率は、健常ネコでは1〜5パーセントであり、病気のネコでは15〜30パーセントであると考えられる(Hosie M.J. et al., Veterinary Records, 1989, 128, 293-297; Braley J., Feline Practice, 1994, 22, 25-29; Malik R. et al., Australian Veterinary Journal, 1997, 75, 323-327; Arjona A. et al., Journal of Clinical Microbiology, 2000, 38, 3448-3449)。このウイルスは、持続性ウイルス血症および致死性転帰を特徴とする終生の感染を引き起こすことができる。感染動物において、大部分のFeLV関連疾患が持続的に生じ、それらは常に重篤であり、ほとんどが致死性である。最も頻繁に診断される状態には、リンパ腫、骨髄性白血病、免疫不全および非再生性貧血がある。感染源である持続性ウイルス血症ネコを同定し隔離することによって、この感染を制御することができる。ワクチンもまた、このウイルスの伝播を抑制するのに役立ってきた。いくつかのFeLVワクチンが利用可能である。それらの大部分は、不活化ウイルスかまたは組換えサブユニットのいずれかを含む。それらの有効性については、議論の的となっている(Sparkes A.H., Journal of Small Animal Practice, 1997, 38, 187-194)。ワクチンの分解が観察されている。
別法には、組換えウイルスベクターの使用が考えられる。FeLV遺伝子の発現のために、カナリーポックスウイルスベクター、特にALVACベクターが試験されている(Tartaglia J. et al., Journal of Virology, 1993, 67, 2370-2375; Poulet H. et al., Veterinary Record, 2003, 153, 141-145)。市販の組換えFeLVワクチンもまた利用可能である（EURIFEL（登録商標）FeLV、Merial社)。
【０００４】
FeLVゲノムは、3つの遺伝子（このウイルスの主要構造成分をコードするGAG遺伝子、エンベロープ糖タンパク質をコードするENV遺伝子およびポリメラーゼタンパク質をコードするPOL遺伝子）をコードする(Thomsen D.R., et al., Journal of General Virology, 73, 1819-1824, 1992)。FeLVエンベロープ(ENV)遺伝子は、gp85前駆体タンパク質をコードし、このタンパク質は、細胞酵素(単数または複数)によるタンパク質分解によってプロセシングされて主要エンベロープ糖タンパク質gp70および関連膜貫通タンパク質p15Eを生じる(DeNoronha, F., et al., 1978, Virology 85:617-621; Nunberg, J.H., et al., 1983, PNAS 81:3675-3679)。膜貫通タンパク質p15Eは、免疫抑制特性を有するガンマレトロウイルス間で保存されている配列を含む(Mathes,L.E.et al.,1978,Nature)。FeLVエンベロープ糖タンパク質は主要な免疫原の1つであり、FeLV特異的細胞傷害性T細胞応答および中和抗体の標的である(Flynn, J.N., et al., 2002, J. Virol.)。米国特許出願US2008/0008683は、それが発現される宿主に対するウイルスタンパク質の免疫抑制特性を調節することができるポリペプチドを論じている。FeLV GAG遺伝子は、プロテアーゼ(FeLV PRO遺伝子)によって切断されてカプシドタンパク質を生じる前駆体ポリタンパク質をコードする。カプシドタンパク質はまた、FeLV特異的細胞傷害性T細胞応答および中和抗体を誘導する主要な免疫原である(Flynn, J.N., et al., 2002, J. Virol.)。POL遺伝子は、3つのタンパク質、プロテアーゼ(PRO)、逆転写酵素およびインテグラーゼをコードする。この遺伝子のプロテアーゼによる自己プロセシングによって、POL領域の3つすべてのタンパク質が生じる(Thomsen D.R., et al., 1992)。
FeLVワクチンの有効性および安全性の改善と、野外条件でのより有効な防御とが一般的に求められている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、組換えベクターまたはウイルスおよび前記ウイルスの製造方法を提供することと、組成物および／またはワクチンならびにFeLVによる感染の治療と予防のための方法を提供することのいずれか1つまたはそれらのすべてであることができる。
本発明は、組換えベクター、例えば組換えウイルス、例えば少なくとも1つの外因性核酸分子を含み発現する組換えポックスウイルスを提供する。前記少なくとも1つの外因性核酸分子は、FeLVタンパク質由来の対象免疫原またはエピトープ、例えばFeLV ENVおよび／またはFeLV GAG/PROをコードする核酸分子を含むことができる。
特に、本発明は、組換えベクター、例えば組換えウイルス、例えば少なくとも1つの外因性核酸分子を含み発現する組換えポックスウイルスを提供する。前記少なくとも1つの外因性核酸分子は、FeLVポリペプチドおよび／または変種またはそれらの断片を含むことができる。
本発明はさらに、このような発現ベクターまたはこのような発現ベクターの発現産物(単数または複数)を含む組成物またはワクチンを提供する。
【０００６】
本発明はさらに、FeLVに対する免疫応答(もしくは免疫原性応答)または防御反応を誘導する方法および、FeLVまたはFeLVによって引き起こされる疾病状態(単数または複数)を予防する方法であって、発現ベクターもしくは発現ベクターの発現産物を投与することまたは発現ベクターを含む組成物もしくは発現ベクターの発現産物を含む組成物を投与することを含む前記方法を提供する。
本発明はまた、ウイルス由来の発現産物、その発現産物またはin vivoでのその発現によって生じる抗体ならびに、このような産物および抗体の診断用途などにおける使用に関する。
これらおよび他の実施形態は、以下の詳細な説明によって開示され、またはそれらから明らかになり、かつそれらに含まれる。
以下の詳細な説明は、例証のためであって、開示された特定の実施形態に本発明を限定するものではない。これらは参照により本願に組み込まれる添付図面を参照して理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１−１】ポリヌクレオチドおよびタンパク質配列に対して付与した配列番号を確認するための表を示す図である。
【図１−２】図１−１続き。
【図２】pH6C5env(208.2)のプラスミドマップを示す図である。
【図３−１】FeLV ENV DNAおよび左右のアームを含むプラスミドpCXL208.2(pH6C5env)断片の配列(配列番号36)ならびにプラスミドpHCMV-ENV FeLVからのFeLV ENVタンパク質の配列(配列番号7)を示す図である。
【図３−２】FeLV ENV DNAおよび左右のアームを含むプラスミドpCXL208.2(pH6C5env)断片の配列(配列番号36)ならびにプラスミドpHCMV-ENV FeLVからのFeLV ENVタンパク質の配列(配列番号7)を示す図である。
【図３−３】FeLV ENV DNAおよび左右のアームを含むプラスミドpCXL208.2(pH6C5env)断片の配列(配列番号36)ならびにプラスミドpHCMV-ENV FeLVからのFeLV ENVタンパク質の配列(配列番号7)を示す図である。
【図４】プラスミドpPB713の制限地図を示す図である。
【図５−１−１】FeLV ENV DNAおよびタンパク質の配列のアラインメントを示す図である。
【図５−１−２】図５−１−１続き。
【図５−２−１】図５−１続き。
【図５−２−２】図５−１続き。
【図５−３−１】図５−１続き。
【図５−３−２】図５−１続き。
【図５−４−１】図５−１続き。
【図５−４−２】図５−１続き。
【図５−５−１】図５−１続き。
【図５−５−２】図５−１続き。
【図５−６−１】図５−１続き。
【図５−６−２】図５−１続き。
【図５−７−１】図５−１続き。
【図５−７−２】図５−１続き。
【図５−８】図５−１続き。
【図５−９】図５−１続き。
【図５−１０−１】図５−１続き。
【図５−１０−２】図５−１続き。
【図５−１１】図５−１続き。
【図５−１２】図５−１続き。
【図６】プラスミドpPB712の制限地図を示す図である。
【図７−１】野生型GAG/PRO DNA(配列番号11)とコドン最適化GAG/PRO DNA(配列番号10)との間のDNA配列のアラインメントを示す図である。
【図７−２】図７−１続き。
【図７−３】図７−１続き。
【図８−１】クローニングスキームを示す図である。
【図８−２】図８−１続き。
【図９】プラスミドpJY1874.1の制限地図を示す図である。
【図１０】FeLV GAG-PROタンパク質配列を示す図である。
【図１１−１】アームおよび挿入物を含むpJY1874.1DNA断片のヌクレオチド配列を示す図である(配列番号38)。
【図１１−２】図１１−１続き。
【図１１−３】図１１−１続き。
【図１１−４】図１１−１続き。
【図１１−５】図１１−１続き。
【図１２】vCP2294プラスミドの作成のためのクローニングスキームを示す図である。
【図１３】プライマー位置を含むvCP2294プラスミドのC3領域地図を示す図である。
【図１４−１】vCP2294プラスミドの配列(注釈付き)を示す図である。
【図１４−２】図１４−１続き。
【図１４−３】図１４−１続き。
【図１４−４】図１４−１続き。
【図１４−５】図１４−１続き。
【図１５】vCP2296プラスミドの作成のためのクローニングスキームを示す図である。
【図１６】プライマー位置を含むvCP2296プラスミドのC5領域地図を示す図である。
【図１７】vCP2295プラスミドの作成のためのクローニングスキームを示す図である。
【図１８−１】vCP2295プラスミドの配列を示す図である。
【図１８−２】図１８−１続き。
【図１８−３】図１８−１続き。
【図１８−４】図１８−１続き。
【図１９】チャレンジ後の各群の平均プロウイルス血症の進展を示すグラフである。
【図２０】チャレンジ後の各群の平均プロウイルス血症およびp27状態の進展を示すグラフである。
【図２１】p27状態と関連する、骨髄におけるプロウイルス血症を示すグラフである。
【図２２】D35におけるFeLV特異的IFNγ応答を示す図である。
【図２３】D35におけるFeLV特異的(ENVペプチドプール番号1)IFNγ応答を示す図である。
【図２４】D35におけるFeLV特異的(ENVペプチドプール)IL-10応答を示す図である。
【図２５】D35におけるFeLV特異的(GAG/PROペプチドプール)IL-20応答を示す図である。
【図２６ａ】D35におけるFeLV特異的(ENV刺激)IFNγ/IL-10比を示す図である。
【図２６ｂ】D35におけるFeLV特異的(ENV刺激)IFNγ/IL-10比を示す図である。
【図２７】D126におけるFeLV特異的(GAG/PRO刺激)IFNγ応答を示す図である。
【図２８ａ】D126におけるFeLV特異的(ENV刺激)IL-10応答を示す図である。
【図２８ｂ】D126におけるFeLV特異的(GAG/PRO刺激)IL-10応答を示す図である。
【図２９】D35におけるFeLV ENVおよびGAG/PROペプチドプールによるFeLV特異的IFNγ/IL-10比を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の詳細な説明
本開示、特にその特許請求の範囲において、用語”含む(comprises)”、”含んだ(comprised)”、”含み”などは、米国特許法においてそれらに対して付与された意味を有しうることに注意されたい。例えば、それらは”含有する”、”含有した”、”含有し”などを意味することができる。また、用語”本質的に〜からなること(consisting essentially of)”および”本質的に〜からなる(consists essentially of)”などは、米国特許法においてそれらに付与された意味を有することにも注意されたい。例えば、それらは、明記されていない要素を許容するが、先行技術中に存在するかまたは本発明の基本的または新規な特徴に影響を及ぼす要素を除外する。
【０００９】
別途記載のない限り、専門用語は、従来の用法に従って用いられる。分子生物学における一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes V.（Oxford University Press刊、1994年）(ISBN 0-19-854287-9); Kendrew ら(編)The Encyclopedia of Molecular Biology（Blackwell Science社刊、1994年）(ISBN 0-632-02182-9);およびRobert A. Meyers(編)Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference（VCH Publishers社刊、1995年）(ISBN 1-56081-569-8)において見出すことができる。
【００１０】
単数用語”ある(a)”、”ある(an)”および”その(the)”は、文脈から明白でない限り複数指示対象を含む。同様に、単語”または(or)”は、文脈から明白でない限り、”および(and)”を含むものとする。単語”または(or)”は、特定のリストのいずれか1つのメンバーを意味するが、そのリストのメンバーの任意の組み合わせもまた含む。
用語”FeLV ENVポリペプチドまたはDNA”は、任意の天然または最適化/変異FeLV ENVポリペプチドまたはDNAならびにそれらの誘導体および変種のことを言う。例えば、最適化/変異FeLV ENV DNAは、FeLV ENV DNAが最適化されてFeLVポリペプチドに1つのアミノ酸変異が生じたコドン最適化FeLV DNAであることができる。最適化/変異FeLV ENVポリペプチドは、1つのアミノ酸変異を含むこともできるし、2つのアミノ酸変異を含むこともできるし、3つのアミノ酸変異を含むこともできる。
【００１１】
本明細書において用いられる用語”動物”は、すべての哺乳動物、鳥および魚類を含む。本明細書において、動物は、ウマ科動物(例えばウマ)、イヌ科動物(例えばイヌ、オオカミ、キツネ、コヨーテ、ジャッカル)、ネコ科動物(例えばライオン、トラ、イエネコ、ヤマネコ、他の大猫ならびにチーターおよびヤマネコを含む他のネコ科動物）、ウシ亜科動物(例えば牛)、ブタ類(例えばブタ)、ヒツジ類(例えばヒツジ、ヤギ、ラマ、バイソン)、鳥類(例えばニワトリ、カモ、ガチョウ、シチメンチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、ダチョウ、エミューおよびヒクイドリ)、霊長類(例えば原猿、メガネザル、サル、テナガザル、類人猿)、ヒトおよび魚類からなる群から選択されることができる。また、用語”動物”は、胚期および胎児期を含むすべての発育段階における個々の動物も含む。
【００１２】
本明細書において、用語”ポリペプチド”と用語”タンパク質”は同義で使用され、連続アミノ酸残基のポリマーを指す。
用語”核酸”、”ヌクレオチド”および”ポリヌクレオチド”は、RNAまたはDNAおよびそれらの誘導体、例えば修飾された主鎖を含むものなどのことを言う。当然のことながら、本発明は、本明細書に記載の配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明に記載のポリヌクレオチドは、種々の方法(例えば化学合成、遺伝子クローニングなど）によって製造することもでき、種々の形態(例えば直鎖もしくは分枝鎖、一本鎖もしくは二本鎖、またはそれらのハイブリッド、プライマー、プローブなど)をとることもできる。
【００１３】
用語”遺伝子”は、生物学的機能と関連するポリヌクレオチドの任意のセグメントを指すために広く用いられる。従って、遺伝子またはポリヌクレオチドは、ゲノム配列でのイントロンおよびエクソンあるいは、cDNAでのコード配列そのもの、例えば開始コドン(メチオニンコドン)から開始して終結シグナル(終止コドン)で終わるオープンリーディングフレーム(ORF)などを含む。また、遺伝子およびポリヌクレオチドは、それらの発現、例えば転写開始、翻訳および転写終結を制御する領域を含むことができる。従って、プロモーターおよびリボソーム結合領域(一般にこれらの調節因子はコード配列または遺伝子の開始コドンの上流おおよそ60〜250ヌクレオチドに位置する;Doree SMら;Pandher Kら;Chung JYら)、転写ターミネーター(一般に、ターミネーターは、コード配列または遺伝子の終止コドンの下流おおよそ50ヌクレオチド以内に位置する;Ward CKら)。また、遺伝子またはポリヌクレオチドは、mRNAもしくは機能性RNAを発現するかまたは特定のタンパク質をコードし、調節配列を含む核酸フラグメントのことも言う。
【００１４】
本明細書において、用語”免疫原性ポリペプチド”または”免疫原性フラグメント”は、対立遺伝子特異的モチーフ、エピトープまたは他の配列を含むポリペプチドまたはポリペプチドの断片であって、ポリペプチドまたはその断片がMHC分子と結合し、免疫原性ポリペプチドまたは免疫原性フラグメントが由来する抗原に対する細胞傷害性Tリンパ球(”CTL”)応答および／またはB細胞反応(例えば、抗体産生)および／またはヘルパーTリンパ球応答および／または遅延型過敏症(DTH)応答を誘導する前記ポリペプチドまたはその断片のことを言う。DTH応答は、T細胞依存性マクロファージ活性化および炎症が組織損傷を引き起こす免疫応答である。抗原の皮下注射に対するDTH反応は、多くの場合、細胞性免疫のアッセイに用いられる。
【００１５】
定義では、エピトープは、ひとたび宿主に投与されれば、体液性免疫応答(B細胞)および／または細胞性免疫応答(T細胞)を引き起こすことができるという意味で免疫学的に活性な抗原決定基である。抗原性分子には、特定の化学基またはペプチド配列が存在する。抗体は、ポリペプチドの特定の抗原エピトープに特異的に結合する。限定するものではないエピトープの具体例は、ポリペプチドにおけるテトラ〜ペンタペプチド配列、多糖におけるトリ〜ペンタグリコシド配列を含む。動物においては、抗原は、数個から多数の抗原決定基を同時に示す。このようなポリペプチドは、免疫原性ポリペプチドとして性格づけることもでき、エピトープは、後で説明されるようにして同定されることができる。
【００１６】
”単離された”生物学的成分(例えば核酸またはタンパク質または細胞小器官)とは、生物体の細胞内の他の生物学的成分から実質的に分離または精製された成分のことを言い、ここで天然に存在する成分は、例えば、他の染色体および染色体外のDNAおよびRNAタンパク質ならびに細胞小器官である。”単離された”核酸およびタンパク質は、標準的精製方法で精製された核酸およびタンパク質を含む。また、本用語は、組換え技術のみならず、化学合成によって製造された核酸およびタンパク質もまた含む。
本明細書において、用語”精製された”は、絶対的な純度を必要としない。むしろ、それは相対用語を意味する。従って、例えば、精製されたポリペプチド調製物は、ポリペプチドが、その自然環境にある該ポリペプチドよりも富化したポリペプチド調製物である。ポリペプチド調製物は、そのポリペプチドが、その調製物の全ポリペプチド含量の少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%であるいくつかの実施形態であるように実質的に精製される。同じことがポリヌクレオチドにも当てはまる。本明細書に記載のポリペプチドは、当該技術分野で公知の手段のいずれかによって精製されることができる。
【００１７】
組換えポリヌクレオチドは、天然に存在しない配列を有するかまたは別々に2つに分離された配列のセグメントの人工の組み合わせによって製造される配列を有するポリヌクレオチドである。この人工の組み合わせは、多くの場合、化学合成によって達成されるか、またはより一般的には、遺伝子工学技術などの、単離された核酸のセグメントの人工の操作によって達成される。一実施形態において、組換えポリヌクレオチドは融合タンパク質をコードする。
【００１８】
一側面において、本発明は、FeLV由来の最適化または変異ポリペプチドを提供する。他の側面において、本発明は最適化または変異FeLV ENVポリペプチドを提供する。さらに他の側面において、本発明は、限定するものではないが、配列番号2、4、6、27、28、29、30、31、32、33、34または43のアミノ酸位置527または配列番号7のアミノ酸位置533に変異が存在する最適化FeLV ENVタンパク質を提供する。さらに他の側面において、変異は、配列番号2、4、6、27、28、29、30、31、32、33、34または43のアミノ酸位置527または配列番号7のアミノ酸位置533におけるグルタミン酸(E)のアルギニン(R)、アスパラギン酸(D)またはメチオニン(M)への置換である。記載の範囲は、配列のアラインメントに基づけば、本願に記載されていない他のFeLV ENVポリペプチドにおける対応するアミノ酸位置での変異であって、対応するアミノ酸位置が配列番号2、4、6、27、28、29、30、31、32、33、34または43のアミノ酸位置527または配列番号7のアミノ酸位置533に等価な前記変異を含むことは当業者には明らかであろう。FeLV ENVポリペプチドのいくつかのタンパク質配列のアラインメントを図1dに例示する。一実施形態において、最適化または変異FeLV ENVポリペプチドは、配列番号6のアミノ酸位置527におけるアミノ酸変異またはFeLV ENVタンパク質の対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸変異を含む。さらに他の実施形態において、最適化または変異FeLV ENVポリペプチドは、配列番号6のアミノ酸位置527またはFeLV ENVポリペプチドの対応するアミノ酸位置におけるEのR、DまたはMによるアミノ酸置換を含む。さらに他の実施形態において、最適化または変異FeLV ENVポリペプチドは、配列番号6のアミノ酸位置527またはFeLV ENVポリペプチドの対応するアミノ酸位置EのRによるアミノ酸置換を含む。さらに他の実施形態において、変異FELV ENVポリペプチドは配列番号2、4、7または43に記載の配列を有する。
【００１９】
さらに、FeLV由来のポリペプチドのホモログは、本発明の範囲内であるものとする。本明細書において、用語”ホモログ”は、オルソログ、アナログおよびパラログを含む。用語”アナログ”は、同じか同様な機能を有するが、類縁性のない生物体において別々に進化した2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドのことを言う。用語”オルソログ”は、異なる種由来であるが、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドのことを言う。通常は、オルソログは、同じか同様な機能を有するポリペプチドをコードする。用語”パラログ”は、ゲノム内の重複によって関連している2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドのことを言う。パラログは、通例、異なる機能を有するが、これらの機能は関連していることができる。野生型FeLVポリペプチドのアナログ、オルソログおよびパラログは、翻訳後修飾、アミノ酸配列の相違またはその両方で野生型FeLVポリペプチドとは異なることができる。特に、本発明のホモログは、一般に、野生型FeLVポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の全部または一部と、少なくとも80〜85%、85〜90%、90〜95%または95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を示し、同様な機能を示す。
【００２０】
他の側面において、本発明は、配列番号2、4、6、27、28、29、30、31、32、33または34に記載の配列を有するポリペプチドに対して、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有する最適化または変異FeLV ENVポリペプチドを提供する。
さらに他の側面において、本発明は、公知の分子生物学技術を用いて当業者が容易に製造できる、上記の最適化または変異FeLV ENVポリペプチドの断片および変種を提供する。
【００２１】
変種は、配列番号2、4、6、27、28、29、30、31、32、33または34に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%アミノ酸配列同一性を有する相同なポリペプチドである。
変種は、対立遺伝子変種を含む。用語”対立遺伝子変種”は、タンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらし、自然集団(例えばウイルス種または変種)内に存在する多型を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドのことを言う。このような、天然の対立遺伝子変異は、一般的には、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおける1〜5%の変化をもたらすことができる。対立遺伝子変種は、多くの異なる種における対象とする核酸配列を配列決定することによって同定することができ、このことは、これらの種における同じ遺伝子座を同定するためにハイブリダイゼーションプローブを用いることによって容易に行うことができる。天然の対立遺伝子変異の結果であり、対象遺伝子の機能活性を変化させない、ありとあらゆるこのような核酸変異および結果として生じるアミノ酸多型または変異は本発明の範囲内であるものとする。
【００２２】
本明細書において、用語”誘導体”または”変種”は、(1)対応するポリペプチドが野生型ポリペプチドと比べて実質的に等価な機能を有する、または(2)このポリペプチドに対して作られた抗体が野生型ポリペプチドに免疫反応性を有する、ような1以上の保存的アミノ酸変異または他の小さな修飾を有するポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸のことを言う。これらの変種または誘導体は、未修飾のカウンターパートポリペプチドと比較して実質的に等価な活性を有するペプチドを生じることができる、最適化または変異FeLV ENVポリペプチド一次アミノ酸配列の小さな修飾を有するポリペプチドを含む。これらの修飾は部位特異的変異誘発による人工的なものであることもでき、自然発生的なものであることもできる。用語”変種”は、さらに、そのポリペプチドが本明細書に記載の免疫学的応答を生じる限りは、その配列への欠失、付加および置換を考える。修飾は、配列番号2、4、6、27、28、29、30、31、32、33、34もしくは43の位置527または配列番号7のアミノ酸位置533以外のアミノ酸位置における任意のアミノ酸変化であることができる。
【００２３】
用語"保存的変異"は、他の生物学的に類似する残基によるアミノ酸残基の置換または、コードされるアミノ酸残基が変化しないか、もしくはそれが他の生物学的に類似する残基であるような、核酸配列におけるヌクレオチドの置換を意味する。この点において、特に好ましい置換は、一般に性質が保存的な置換、すなわち、アミノ酸のファミリー内で起こる置換である。例えば、アミノ酸は、一般に4つのファミリーに分けられる:(1)酸性--アスパラギン酸およびグルタミン酸;(2)塩基性--リジン、アルギニン、ヒスチジン;(3)非極性--アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン;ならびに(4)非荷電極性--グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは芳香族アミノ酸として分類される場合もある。保存的変異の例は、疎水性残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンの1つと他の疎水性残基との置換、または、極性残基の1つと他の極性残基との置換、例えばアルギニンとリジンの置換、グルタミン酸とアスパラギン酸の置換、グルタミンとアスパラギンの置換など;あるいは、あるアミノ酸と構造的に関連したアミノ酸との、生物活性に大きな影響を与えない同様な保存的置換を含む。参照分子と実質的に同じアミノ酸配列を有するが、タンパク質の免疫原性に実質的に影響しない少数のアミノ酸置換を有するタンパク質は、従って、参照ポリペプチドの定義の範囲内である。これらの修飾によって製造されるポリペプチドのすべてが本明細書に含まれる。用語"保存的変異"はまた、置換ポリペプチドに対して産生された抗体が非置換ポリペプチドとも免疫反応する場合には、非置換親アミノ酸の代わりの置換アミノ酸の使用も含む。
【００２４】
FeLV ENVポリペプチドの免疫原性フラグメントは、配列番号2、4、6、7、27、28、29、30、31、32、33、34もしくは43に記載の配列を有するFeLV ENVポリペプチドまたはそれらの変種の少なくとも8、10、15もしくは20連続アミノ酸、少なくとも21アミノ酸、少なくとも23アミノ酸、少なくとも25アミノ酸または少なくとも30アミノ酸を含む。他の実施形態において、FeLV ENVポリペプチドの断片は、完全長FeLV ENVポリペプチドに見いだされる特定の抗原エピトープを含む。
オーバーラップペプチドライブラリーの作製(Hemmer B.ら)、Pepscan(Geysen H. M.ら、1984; Geysen H. M.ら、1985; Van der Zee R.ら; Geysen H. M.)およびアルゴリズム (De Groot A.ら; Hoop T.ら; Parker K.ら)などのポリペプチドおよびエピトープの断片の決定手順を、過度の実験を要することなく、本発明の実施に用いることができる。一般に、抗体は特定の抗原エピトープに特異的に結合する。限定するものではないエピトープの具体例は、ポリペプチドにおけるテトラ〜ペンタペプチド配列、多糖におけるトリ〜ペンタグリコシド配列を含む。動物においては、抗原は、数個から多数の抗原決定基を同時に示す。好ましくは、エピトープが、より大きな分子のタンパク質フラグメントである場合、そのエピトープは全タンパク質と実質的に同じ免疫学的活性を有する。
【００２５】
一側面において、本発明はFeLV ENVポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。他の側面において、本発明は、最適化または変異FeLV ENVポリペプチドをコードするFeLV ENVポリヌクレオチドであって、配列番号2、4、6、27、28、29、30、31、32、33、34もしくは43のアミノ酸位置527または配列番号7のアミノ酸位置533に変異が存在する前記ポリヌクレオチドを提供する。さらに他の側面において、FeLV ENVポリヌクレオチドは、最適化または変異FeLV ENVポリペプチドであって、変異が、配列番号2、4、6、7、28、29、30、31、32、33、34もしくは43のアミノ酸位置527または配列番号7のアミノ酸位置533におけるグルタミン酸(E)のアルギニン(R)、アスパラギン酸(D)またはメチオニン(M)への置換である前記ポリペプチドをコードする。さらに他の側面において、FeLV ENVポリヌクレオチドは、配列番号6のアミノ酸位置527またはFeLV ENVタンパク質の対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸変異を有する最適化または変異FeLV ENVポリペプチドをコードする。他の側面において、FeLV ENVポリヌクレオチドは、配列番号6のアミノ酸位置527またはFeLV ENVポリペプチドの対応するアミノ酸位置におけるEのR、DまたはMへのアミノ酸変化を有する最適化または変異FeLV ENVポリペプチドをコードする。さらに他の側面において、FeLV ENVポリヌクレオチドは、配列番号6のアミノ酸位置527またはFeLV ENVポリペプチドの対応するアミノ酸位置におけるEのRへのアミノ酸変化を有する最適化または変異FeLV ENVポリペプチドをコードする。さらに他の実施形態において、FeLV ENVポリヌクレオチドは、配列番号2、4、7または43に記載の配列を有するFeLV ENVポリペプチドをコードする。さらに他の実施形態において、FeLV ENVポリヌクレオチドは、配列番号2、4、6、7、27、28、29、30、31、32、33、34もしくは43に記載の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するFeLV ENVポリペプチドあるいは保存的変種、対立遺伝子変種、ホモログまたは、これらのポリペプチドの1つもしくはこれらのポリペプチドの組み合わせの、少なくとも8もしくは少なくとも10連続アミノ酸を含む免疫原性フラグメントをコードする。
【００２６】
他の側面において、本発明は、配列番号12に記載の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するFeLV GAG-PROポリペプチドを提供する。
他の側面において、本発明は、配列番号1、3もしくは5に記載のヌクレオチド配列を有するFeLV ENVポリヌクレオチドまたはそれらの変種を提供する。さらに他の側面において、本発明は、配列番号1、3もしくは5に記載の配列を有するポリヌクレオチドまたはそれらの変種に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するFeLV ENVポリヌクレオチドを提供する。
さらに他の側面において、本発明は、配列番号10もしくは11に記載の配列を有するポリヌクレオチドまたはそれらの変種に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するFeLV GAG-PROポリヌクレオチドを提供する。
【００２７】
これらのポリヌクレオチドは、FeLV ENVまたはGAG-PROポリペプチドをコードするDNA、cDNAおよびRNA配列を含むことができる。FeLV ENVまたはGAG-PROポリペプチドをコードするすべてのポリヌクレオチドもまた、それらが、認められている活性、例えばそのポリペプチドを認識する抗体への結合、そのポリペプチドに対する免疫応答の誘発または、寄生生物に暴露されたかまたはFeLV感染の徴候もしくは症状の抑制を受けるための被験者に投与されたときの白血病疾患の生存に対する効果などを有するポリペプチドをコードする限りは、本明細書に含まれることは言うまでもない。
【００２８】
本開示のポリヌクレオチドは、遺伝コード、例えば特定の宿主の最適化されたコドン使用頻度の結果として縮重した配列を含む。本明細書において、“最適化された”とは、所定の種におけるその発現を増加させるように遺伝子操作されたポリヌクレオチドのことを言う。FMDVポリペプチドをコードする最適化されたポリヌクレオチドを提供するために、1)特定の種において強く発現されている遺伝子に好ましいコドンを含むか;2)前記種において実質的に見出されるヌクレオチド塩基組成でA+TまたはG+C含量を含むか;3)前記種の開始配列を形成させるか;または4)RNAの不安定化、不適切なポリアデニル化、分解および終結を引き起こす配列または二次構造ヘアピンもしくはRNAスプライス部位を形成する配列を除去するようにFMDVタンパク質遺伝子のDNA配列を修飾することができる。前記種におけるFMDVタンパク質の発現増加は、真核生物および原核生物または特定の種におけるコドン使用頻度の度数分布を利用することによって達成することができる。用語“好ましいコドン使用頻度”は、所定のアミノ酸を指定するヌクレオチドのコドン頻度において特定の宿主細胞が示す選択性のことを言う。20の天然アミノ酸が存在するが、その大部分は2以上のコドンによって指定される。従って、ヌクレオチド配列によってコードされるFMDVポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化していない限りにおいて、本開示にはすべての縮重したヌクレオチド配列が含まれる。
【００２９】
2つのアミノ酸配列間の配列同一性は、標準的パラメータを用い、NCBI(国立生物工学情報センター)対比較ブラスト(pairwise blast)およびblosum62マトリックスを用いて確立することができる(例えば、"国立生物工学情報センター"(NCBI、ベセズダ、メリーランド州、米国)サーバーのほかにAltschulらにおいて入手可能なBLASTまたはBLASTXアルゴリズムを参照のこと;従って、本文書においては、アルゴリズムすなわちBLASTまたはBLASTXおよびBLOSUM62マトリックスの使用を用語“ブラスト(blast)”として述べる)。
また、2つのヌクレオチド配列間の配列同一性は、NCBIにおいて入手可能なMyersおよびMillerの”Align”プログラム(“Optimal Alignments in Linear Space”, CABIOS 4, 11-17, 1988)ばかりでなく、NCBIサイトなどのサイトにあるインターネットによって入手可能な同じまたは他のプログラムを用いて決定することもできる。
【００３０】
これに代えて、あるいはこれに加えて、用語“同一性”は、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に関して、2つの配列間の相同性の定量的尺度を示すことができる。配列相同性パーセントは、(Nref-Ndif)*100/Nref(式中、Ndifはアラインメントしたときの2つの配列における同一でない残基の総数であり、Nrefは、配列の1つにおける残基数である)で算出することができる。故に、DNA配列AGTCAGTCは、配列AATCAATCとは75%の配列同一性を有するであろう(Nref=8;Ndif=2)。
これに代えて、あるいはこれに加えて、配列に関する“同一性”は、2つの配列の短い方の配列のヌクレオチド数またはアミノ酸数によって同じヌクレオチドまたはアミノ酸を有する位置の数を割ることによって帰することができる。ここで、2つの配列のアラインメントは、WilburおよびLipmanのアルゴリズム(WilburおよびLipman)に従って、例えば、20ヌクレオチドのウインドウサイズ、4ヌクレオチドのワード長および4のギャップペナルティーを用いて決定することができ、アラインメントを含む配列データのコンピュータ支援分析および解釈は、市販プログラム(例えばIntelligenetics（登録商標）Suite、Intelligenetics社、カリフォルニア州)を用いて好都合に実施することができる。RNA配列がDNA配列と同様であるかまたはDNA配列とある程度の配列同一性もしくは相同性を有すると言う場合、DNA配列におけるチミジン(T)は、RNA配列におけるウラシル(U)と同等であるとみなされる。従って、RNA配列は本発明の範囲内であり、DNA配列におけるチミジン(T)をRNA配列におけるウラシル(U)と等しいとみなすことによって、DNA配列から誘導されることができる。
【００３１】
2つのアミノ酸配列の配列同一性もしくは配列類似性または2つのヌクレオチド配列間の配列同一性は、Vector NTIソフトウェアパッケージ(Invitrogen社、1600 Faraday Ave.、カールズバッド、カリフォルニア州)を用いて決定することができる。
FeLV ENVまたはGAG-PROポリヌクレオチドは、ベクター、自律複製型プラスミドもしくはウイルスまたは原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換えDNAを含むこともできるし、他の配列に無関係の異なる分子(例えばcDNA)で存在する組換えDNAを含むこともできる。
【００３２】
本明細書に開示された組換えベクターは、ポリペプチド、それらの変種またはそれらの断片をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。組換えベクターは、プラスミドおよびウイルスベクターを含むことができ、in vitroまたはin vivo発現に用いることができる。さらに、組換えベクターはシグナルペプチドを含むことができる。シグナルペプチドは、特定の細胞小器官、例えば核、ミトコンドリアマトリックス、小胞体、葉緑体、アポプラストおよびペルオキシソームへの(サイトゾルで合成された）タンパク質の翻訳後輸送を指示する短いペプチド鎖(3〜60アミノ酸長)である。一般的には、天然に存在するFeLV ENVタンパク質はN末端シグナルペプチド配列および”成熟”タンパク質ドメインを有する前駆体として翻訳されることができる。シグナルペプチドは、翻訳後、速やかに切除されることができる。シグナル配列はFeLV ENVタンパク質由来の天然配列であることもできるし、分泌タンパク質由来のペプチドシグナル、例えば組織プラスミノーゲンアクチベータータンパク質(tPA)、特にヒトtPA由来のシグナルペプチド(S. Friezner Degenら; R. Ricklesら; D. Berg.ら)であることもできるし、インスリン様成長因子1(IGF1)、特にウマIGF1(K. Otteら)、イヌIGF1(P. Delafontaineら)、ネコIGF1(WO03/022886)、ウシIGF1(S. Lienら)、ブタIGF1(M. Mullerら)、ニワトリIGF1(Y. Kajimotoら)、シチメンチョウIGF1(GenBankアクセッション番号AF074980)由来のシグナルペプチドであることもできる。IGF1由来のシグナルペプチドは、天然のものであることもできるし、潜在的スプライス部位の除去および／またはコドン使用頻度への適合によって最適化されたものであることもできる。翻訳後、プロセシングされていないポリペプチドは切断部位で切断されて成熟ポリペプチドを生じることができる。切断部位は、Von Heijne(1986)の方法を用いて予測することができる。
プラスミドは、DNA転写ユニット、例えば宿主細胞における複製を可能にする複製起点(原核または真核)などの核酸配列を含むことができる。プラスミドは、当該技術分野で公知の1以上の選択マーカー遺伝子および他の遺伝因子を含むこともできる。環状プラスミドおよび線状プラスミドは本開示に含まれる。
【００３３】
他の側面において、本発明は、最適化もしくは変異FeLV ENVポリペプチドおよび／またはそれらの変種もしくは断片を含み、それらを宿主においてin vivoで発現するポリヌクレオチド配列を含むin vivo発現ベクターに関する。発現ベクターは、さらに、FeLV GAG-PROポリペプチドおよび／またはそれらの変種もしくは断片をコードするポリヌクレオチド含むこともできる。
in vivo発現ベクターは、対象ポリヌクレオチドまたは遺伝子およびそのin vivo発現のための必須のエレメントを含む任意の転写ユニットを含むことができる。これらの発現ベクターは、プラスミドまたは組換えウイルスベクターであることができる。in vivo発現のために、プロモーターはウイルス起源であることもできるし、細胞起源であることもできる。一実施形態において、プロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)初期プロモーター(CMV-IEプロモーター)、SV40ウイルス初期もしくは後期プロモーターまたはラウス肉腫ウイルスLTRプロモーター、細胞骨格遺伝子のプロモーター、例えばデスミンプロモーター(Kwissa M. ら)またはアクチンプロモーター (Miyazaki J. ら)であることができる。同じプラスミドにいくつかの遺伝子が存在する場合、それらは同じ転写ユニットで提供されることもできるし、異なるユニットで提供されることもできる。
【００３４】
本明細書において、用語”プラスミド”は、本発明に記載のポリヌクレオチドおよび、所望の宿主または標的の細胞（単数または複数）におけるそのin vivo発現に必要なエレメントを含む任意のDNA転写ユニットを含むことができる。この点において、スーパーコイルまたは非スーパーコイル環状プラスミドならびに線状形は本発明の範囲内であるものとすることに注意されたい。プラスミドはまた、他の転写調節エレメント、例えばイントロン型の安定化配列を含むこともできる。いくつかの実施形態において、プラスミドは、CMV-IEの第1イントロン(WO89/01036)、ウサギβグロビン遺伝子の第2イントロン(van Ooyenら)、組織プラスミノーゲンアクチベーターによってコードされるタンパク質のシグナル配列(tPA;Montgomeryら)および／またはポリアデニル化シグナル(ポリA)、特にウシ成長ホルモン(bGH)遺伝子のポリA(米国特許第5,122,458号)またはウサギβグロビン遺伝子もしくはSV40ウイルスのポリAを含むことができる。
【００３５】
他の側面において、本発明は、a)in vivo発現ベクターであって、FeLV ENVポリペプチド、FeLV ENVポリペプチドの変種または断片およびそれらの混合物からなる群から選択される1以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む前記ベクター；ならびにb)薬学的または獣医学的に許容されるビヒクル、希釈剤または賦形剤を含む組成物に関する。
他の側面において、本発明は、a)in vivo発現ベクターであって、FeLV ENVポリペプチド、FeLV GAG/PROポリペプチド、FeLV ENVポリペプチドの変種または断片およびそれらの混合物からなる群から選択される1以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む前記ベクター；ならびにb)薬学的または獣医学的に許容されるビヒクル、希釈剤または賦形剤を含む組成物に関する。
さらに他の側面において、本発明は、a)in vivo発現ベクターであって、FeLV ENVポリペプチド、FeLV GAG/PROポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む前記ベクター；ならびにb)薬学的または獣医学的に許容されるビヒクル、希釈剤または賦形剤を含む組成物に関する。
FeLV ENVおよびFeLV GAG/PROポリペプチドは上述したとおりである。
【００３６】
一実施形態において、本発明は、a)in vivo発現ベクターであって、配列番号6のアミノ酸位置527における、またはFeLVポリペプチドの対応するアミノ酸位置におけるEのR、DもしくはMへのアミノ酸置換を有する最適化もしくは変異FeLV ENVをコードするポリヌクレオチドならびに、配列番号12に記載の配列を有するポリペプチドに少なくとも90%の配列同一性を有するFeLV GAG/PROポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む前記ベクター；ならびにb)薬学的または獣医学的に許容されるビヒクル、希釈剤または賦形剤を含む組成物に関する。さらに他の実施形態において、本発明の組成物は、a)発現ベクターであって、配列番号2または4に記載のアミノ酸配列を有するFeLV ENVポリペプチドをコードする第1ポリヌクレオチドおよび配列番号12に記載のアミノ酸配列を有するFeLV GAG/PROポリペプチドをコードする第2ポリヌクレオチドを含む前記ベクター；ならびにb)薬学的または獣医学的に許容されるビヒクル、希釈剤または賦形剤を含む。
【００３７】
用語”組成物”は、イヌ科動物、ネコ科動物およびヒトを含む宿主に注射された場合、宿主における免疫応答を誘導する、かつ／または白血病から宿主を保護する任意のワクチンもしくは免疫組成物、および／または寄生生物の侵入を防ぐことができる任意のワクチンもしくは免疫組成物、および／または感染した被験者における疾患進行を予防することができる任意のワクチンもしくは免疫組成物、内部臓器への寄生生物のランナウェイの拡散を抑制することができる任意のワクチンもしくは免疫組成物を含む。このことは、サイトカイン分泌、特に本発明に記載のワクチン接種によってIFN-γ分泌の誘発を介して達成されることができる（IFN-γ分泌の測定方法の例として、R&D Systems社からのQuantikine（登録商標）イムノアッセイ(カタログ番号#CAIF00)を用いることができる(Djoba Siawaya JFら))。
【００３８】
薬学的に許容されるビヒクルまたは賦形剤には通常のものが使用される。Remington’s Pharmaceutical Sciences、E. W. Martin著、Mack Publishing Co.、イーストン、ペンシルベニア州、第15版(1975)は、本明細書に開示されたポリペプチド、プラスミド、ウイルスベクターの薬物送達に適した組成物および製剤を記載している。一般に、ビヒクルまたは賦形剤の性質は、用いられる特定の投与方法に左右される。例えば、非経口製剤は、通例、ビヒクルとして、水、生理食塩水、緩衝塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的および生理学的に許容される液体を含む注射用液体を含む。固体組成物(例えば、フリーズドライパステル、粉末、ピル、錠剤またはカプセル形)のためには、従来の無毒の固体ビヒクルまたは賦形剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムを含むことができる。投与される免疫原性組成物は、生物学的に中性なビヒクルまたは賦形剤に加えて、少量の無毒の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、防腐薬ならびにpH緩衝化剤など（例えば酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタン）を含むことができる。
【００３９】
本発明に記載の組成物またはワクチンは、前述のように、本発明に記載の任意のポリヌクレオチドをコードするベクターを含むことができる。
異なる挿入部位または同じ挿入部位を用いて、同じベクターに複数の挿入を行うことができる。同じ挿入部位が用いられる場合、前述の本発明の任意のポリヌクレオチドであることができる各ポリヌクレオチド挿入物は、同じおよび／または異なるプロモーターの制御下に挿入することができる。挿入はtail-to-tail、head-to-head、tail-to-headまたはhead-to-tailで行うことができる。同じおよび／または異なるプロモーターに作動可能に連結されたマルチ挿入物を分離し発現するためにIRESエレメント(内部リボソーム侵入部位、EP0803573参照)を用いることもできる。
一実施形態において、本発明は、前述のポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。発現ベクターは、in vivo発現ベクターであることもできるし、in vitro発現ベクターであることもできる。
より一般的には、本発明は、宿主において、FeLV ENVポリペプチドのポリヌクレオチドまたは遺伝子、それらの変種またはそれらの断片およびそのin vivo発現に必要なエレメントを含みそれを発現する任意のプラスミド(EP-A2-1001025; Chaudhuri P.)を含むin vivo発現ベクターを含む。
【００４０】
限定するものではない特定の例において、ポリヌクレオチド配列の挿入のためのベクターとして、pVR1020もしくはpVR1012プラスミド(VICAL社; Luke C. ら; Hartikka J. ら)、pVR2001-TOPA (もしくはpVR2001-TOPO) (Oliveira F.ら)またはpAB110(米国特許第6,852,705号)を用いることができる。pVR1020プラスミドはpVR1012由来であり、ヒトtPAシグナル配列を含む。pVR1020はVical社(サンディエゴ、カリフォルニア州)から入手できるプラスミドバックボーンであり、これは以前用いられている。例えば米国特許第6,451,769号および第7,078,507号を参照のこと。Oliveiraらに記載されているように、プラスミドpVR2001-TOPO(またはpVR2001-TOPA)は、クローニング部位に隣接したトポイソメラーゼの付加によって改変されたpVR1020であり、分泌タンパク質産生の可能性を増加させる組織プラスミノーゲンアクチベーターなどのシグナルペプチド(tPA)をコードし発現するシグナル分泌ペプチドを含む(Oliveira F.らにおける図1参照)。
【００４１】
各プラスミドは、プロモーターに作動可能に連結された、またはプロモーターの制御下にある、またはプロモーターに依存する本発明に記載のポリヌクレオチドを含むか、含有するかまたは本質的にそれらからなることができるが、該プロモーターは、好都合には、発現が所望されるポリヌクレオチドに隣接していることができる。一般に、真核細胞内で機能する強力なプロモーターを用いるのが有利である。有用なプロモーターの1例は、ヒトまたはマウス起源の前初期サイトメガロウイルスプロモーター(CMV-IE)であることができるが、場合によりラットまたはモルモットなどの他の起源を有することもできる。CMV-IEプロモーターは、エンハンサー部分と関連することもしないこともある実際のプロモーター部分を含むことができる。EP260148、EP323597、米国特許第5,168,062号、第5,385,839号および第4,968,615号ならびにWO87/03905を参照することができる。CMV-IEプロモーターは、好都合には、ヒトCMV-IE(Boshart M.ら)またはマウスCMV-IEであることができる。より一般的には、プロモーターは、ウイルス起源または細胞起源のいずれかを有することができる。本発明の実施に有用に用いることができるCMV-IE以外の強力なウイルスプロモーターは、SV40ウイルスの初期/後期プロモーターまたはラウス肉腫ウイルスのLTRプロモーターである。本発明の実施に有用に用いることができる強力な細胞プロモーターは、細胞骨格の遺伝子のプロモーター、例えばデスミンプロモーター(Kwissa M.ら)またはアクチンプロモーター(Miyazaki J.ら)である。これらのプロモーターの機能的サブフラグメント、すなわち、適切なプロモーター活性を維持するためのこれらのプロモーターの部分は本発明に含まれる。例えばWO98/00166または米国特許第6,156,567号に記載の短縮型CMV-IEプロモーターは、本発明の実施に用いることができる。従って、本発明の実施に有用なプロモーターは、適切なプロモーター活性を維持し、故にプロモーターとして機能し、例えば完全長CMV-IEプロモーターの活性と比較した米国特許第6,156,567号の短縮型CMV-IEプロモーターの活性と同様に、誘導体またはサブフラグメントが誘導される実際のまたは完全長プロモーターのプロモーター活性と実質的に同様なプロモーター活性を好都合に有することができる完全長プロモーターの誘導体および／またはサブフラグメントを含むことができる。従って、本発明の実施におけるCMV-IEプロモーターは、完全長プロモーターのプロモーター部分および／または完全長プロモーターのエンハンサー部分ならびにそれらの誘導体および／またはサブフラグメントを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなることができる。
【００４２】
好都合には、プラスミドは、他の発現調節因子を含むかまたは本質的にそれからなる。特に、安定化配列(単数または複数)、例えばイントロン配列(単数または複数)、例えばhCMV-IEの第1イントロン(WO89/01036)、ウサギβ-グロビン遺伝子の第2イントロン(van Ooyenら)を組み込むのが好都合である。ポックスウイルス以外のプラスミドおよびウイルスベクターのためのポリアデニル化シグナル(ポリA)に関しては、ウシ成長ホルモン(bGH)遺伝子のポリ(A)シグナル(米国特許第5,122,458号)またはウサギβ-グロビン遺伝子のポリ(A)シグナルまたはSV40ウイルスのポリ(A)シグナルを使用することができる。
【００４３】
より一般的には、本発明は、1以上のFeLV ENVおよび／またはそれらの変種もしくは断片ならびにそのin vivo発現に必要な任意のエレメントをコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子を含む任意の組換えウイルスベクターを含むin vivo発現ベクターを含む。
前記組換えウイルスベクターは、例えば、ポックスウイルス、特にトリポックスウイルス、例えば鶏痘ウイルスカナリーポックスウイルスから選択されることができる。一実施形態において、鶏痘ウイルスはTROVAC(WO96/40241参照)である。他の実施形態において、カナリーポックスベクターはALVACである。これらの組換えウイルスベクターの使用および対象ポリヌクレオチドまたは遺伝子の挿入は、鶏痘に関しては米国特許第5,174,993号;米国特許第5,505,941号および米国特許第第5,766,599号に、カナリーポックスに関しては米国特許第5,756,103号に十分に記載されている。複数の対象遺伝子の挿入のために、ウイルスゲノム内の2以上の挿入部位を用いることができる。
一実施形態において、ウイルスベクターはアデノウイルス、例えばヒトアデノウイルス(HAV)またはイヌアデノウイルス(CAV)である。
【００４４】
他の実施形態において、ウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス、特に、ウイルスゲノムのE1領域、特にGenbankのアクセッション番号M73260および引用文献Chroboczekら、1992に開示されたhAd5の配列を参照することによりヌクレオチド約459〜ヌクレオチド約3510を欠失させて複製能力をなくしたアデノウイルス5型である。この欠失アデノウイルスは、E1発現293細胞(Grahamら、1977)またはPER細胞、特にPER.C6細胞(Fallouxら、1998)内で増殖する。これに加えて、あるいはこれに代えて、ヒトアデノウイルスはE3領域、特にヌクレオチド約28592〜ヌクレオチド約30470において欠失されることができる。E1領域における欠失は、E3領域における欠失と組み合わせて行うことができる(例えばShriverら;Grahamら;Ilanら;米国特許第6,133,028号および第6,692,956号;Tripathyら;Tapnell;Danthinneら;Berkner;Berknerら;Chavierらを参照のこと)。挿入部位は、E1および／またはE3領域の部分的または完全な欠失後のE1および／またはE3遺伝子座(領域)であることができる。好都合には、発現ベクターがアデノウイルスである場合、発現されるポリヌクレオチドは、真核細胞内で機能するプロモーター、例えば強力なプロモーター、好都合にはサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター(CMV-IEプロモーター)、特にBoshartらにおけるヌクレオチド約-734〜ヌクレオチド約+7のエンハンサー/プロモーター領域またはPromega社製のpCIベクターからのエンハンサー/プロモーター領域の制御下に挿入される。CMV-IEプロモーターは、好都合にはマウス由来またはヒト由来である。伸長因子1αのプロモーターもまた使用することができる。筋肉特異的プロモーターもまた用いることができる(Liら)。本明細書において、プラスミドベクターに関して、強力なプロモーターもまた論じられる。一実施形態において、スプライシング配列はエンハンサー/プロモーター領域の下流にあることができる。例えば、CMV-IE遺伝子から単離された第1イントロン(Stenbergら)、ウサギもしくはヒトβ-グロビン遺伝子から単離されたイントロン、特にβ-グロビン遺伝子からの第2イントロン、免疫グロブリン遺伝子から単離されたイントロン、SV40初期遺伝子からのスプライシング配列またはPromege社製のpCIベクターから単離されたキメライントロン配列。ポリ(A)配列およびターミネーター配列、例えばウシ成長ホルモン遺伝子、特にGenbankアクセッション番号BOVGHRHを有する配列のヌクレオチド約2339〜ヌクレオチド約2550、ウサギβ-グロビン遺伝子またはSV40後期遺伝子のポリアデニル化シグナルは、発現されるポリヌクレオチドの下流に挿入されることができる。
【００４５】
他の実施形態において、ウイルスベクターはイヌアデノウイルス、特にCAV-2である(例えばFischerら;米国特許第5,529,780号および第5,688,920号;WO95/14102を参照のこと)。CAVに関しては、挿入部位は、E3領域および／または、E4領域と右ITR領域の間に位置する領域にあることができる(米国特許第6,090,393号および第6,156,567号を参照のこと)。一実施形態において、挿入物は、プロモーター、例えばサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター(CMV-IEプロモーター)またはヒトアデノウイルスベクターに関してすでに述べたプロモーターの制御下にある。ポリ(A)配列およびターミネーター配列、例えばウシ成長ホルモン遺伝子またはウサギβ-グロビン遺伝子ポリアデニル化シグナルは、発現されるポリヌクレオチドの下流に挿入されることができる。
【００４６】
他の実施形態において、ウイルスベクターはヘルペスウイルス、例えばネコヘルペスウイルス(FHV)である。一実施形態において、発現されるポリヌクレオチドは、真核細胞内で機能するプロモーター、好都合にはCMV-IEプロモーター(マウスまたはヒト)の制御下に挿入される。ポリ(A)配列およびターミネーター配列、例えばウシ成長ホルモンまたはウサギβ-グロビン遺伝子のポリアデニル化シグナルは、発現されるポリヌクレオチドの下流に挿入されることができる。
【００４７】
ポックスウイルスベクターをベースとする組換えベクターに関して、ワクシニアウイルスまたは弱毒化ワクシニアウイルス(例えば、ニワトリ胚繊維芽細胞でAnkaraワクチン株の570を超える継代培養後に得られた改変Ankara株であるMVA；Stickl&Hochstein-Mintzel参照;Sutterら;ATCC VR-1508として入手可能;またはNYVAC、米国特許第5,494,807号および米国特許第5,494,807号参照、NYVACの構築、Copenhagen株ワクシニアウイルスゲノムから欠失された追加のORFでのNYVACの変異、異種コード核酸分子のこの組換え部位への挿入ならびに適合するプロモーターの使用を論じている;WO96/40241もまた参照のこと)、トリポックスウイルスまたは弱毒化トリポックスウイルス(例えばカナリーポックス、鶏痘、鳩痘、鳩痘、ウズラ痘、ALVACまたはTROVAC;例えば米国特許第5,505,941号、第5,494,807号を参照のこと)を用いることができる。弱毒化カナリーポックスウイルスは米国特許第5,756,103号(ALVAC)およびWO01/05934に記載されている。弱毒化鶏痘株TROVACに関する米国特許第5,766,599号も引用される。アクセス番号VR-111としてATCCから入手できるカナリーポックスが引用される。多数の鶏痘ウイルスワクチン接種株、例えばMERIALによって販売されているDIFTOSEC CT株およびINTERVETによって販売されているNOBILIS VARIOLEワクチンもまた入手可能である。組換え体そのものを製造するために使用する方法および組換え体そのものを投与する方法についての情報に関しては、当業者は、本明細書に引用した文書およびWO90/12882に言及することができる。例えば、ワクシニアウイルスに関しては、特に、米国特許第4,769,330号、第4,722,848号、第4,603,112号、第5,110,587号、第5,494,807号および第5,762,938号が言及され；鶏痘に関しては、特に、米国特許第5,174,993号、第5,505,941号および第5,766,599号が言及され;カナリーポックスに関しては、特に、米国特許第5,756,103号が言及される。発現ベクターがワクシニアウイルスである場合、発現されるポリヌクレオチド（単数または複数）の挿入部位（単数または複数）は、好都合には、チミジンキナーゼ(TK)遺伝子または挿入部位、赤血球凝集素(HA)遺伝子または挿入部位、A型封入体(ATI)をコードする領域である；本明細書に引用された文書、特にワクシニアウイルスに関する文書もまた参照のこと。カナリーポックスの場合は、好都合には、挿入部位（単数または複数）はORF(単数または複数)C3、C5および／またはC6である；本明細書に引用された文書、特にカナリーポックスウイルスに関する文書もまた参照のこと。鶏痘の場合は、好都合には、挿入部位（単数または複数）はORF F7および／またはF8である；本明細書に引用した文書、特に鶏痘ウイルスに関する文書もまた参照のこと。MVAウイルスの挿入部位（単数または複数）は、好都合には、Carroll M. W.ら;Stittelaar K. J.ら;Sutter G.らを含む種々の公報に記載されている；この点において、完全なMVAゲノムはAntoine G., Virologyに記載されていることも指摘されるが、これは、当業者に他の挿入部位または他のプロモーターの使用を可能にする。好都合には、発現されるポリヌクレオチドは、特定のポックスウイルスプロモーター、特に、例えばワクシニアプロモーター7.5kDa(Cochranら)、ワクシニアプロモーターI3L(Riviereら)、ワクシニアプロモーターHA(Shida)、牛痘プロモーターATI(Funahashiら)、ワクシニアプロモーターH6(Taylor J. ら; Guo P. ら J.; Perkus M. ��)の制御下に挿入される。
【００４８】
本明細書に開示されたポリヌクレオチドは、いずれも、適切な宿主細胞へのDNA導入または発現ベクターによってin vitroで発現させることができる。宿主細胞は原核または真核であることができる。用語”宿主細胞”は、対象宿主細胞の任意の子孫もまた含む。宿主細胞において外来ポリヌクレオチドを継続的に維持することを意味する安定導入の方法は当該技術分野で公知である。宿主細胞は、細菌(例えばエシェリキア・コリ（Escherichia coli）)、酵母、昆虫細胞、および脊椎動物細胞を含むことができる。真核細胞内でDNA配列を発現する方法は当該分野で公知である。in vitro発現のための方法として、本明細書に開示された核酸に組換えバキュロウイルスベクター(例えば、Autographa California Nuclear Polyhedrosis Virus (AcNPV))を用いることができる。例えば、昆虫細胞(例えば、アクセッション番号CRL1711としてATCCで入手可能なSf9細胞またはSf21細胞などのスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞）にはポリヘドリンプロモーターを用いることができる(例えば、Smith ら; Pennock ら; Vialard ら; Verne A.; O'Reilly ら; Kidd I. M. & Emery V.C.; EP 0370573; EP 0265785; 米国特許第4,745,051を参照のこと)。発現のために、Pharmingen社 (Becton Dickinson社)製のBaculoGold Starter Package(カタログ番号21001K)を用いることができる。in vitro発現のための方法として、ベクターを含む組換えE.コリ（E. coli)を用いることができる。例えば、細菌系でのクローニングの場合、誘導性プロモーター、例えばバクテリオファージλのpL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lacハイブリッドプロモーター)などを用いることができる。組換えDNAでの宿主細胞の形質転換は、当業者に公知の慣用法によって行うことができる。宿主がE.コリなどの原核の場合、DNA取り込み能力を有するコンピテント細胞は対数増殖期後に採取した細胞から調製することができ、続いて当該分野で公知の手順を用いてCaCl2法で処理される。あるいはまた、MgCl2またはRbClを用いることもできる。形質転換は、エレクトロポレーションによっても行うことができる。宿主が真核生物の場合、リン酸カルシウム共沈法、マイクロインジェクションなどの従来の機械的手順、エレクトロポレーション、リポソーム中に包埋されたプラスミドの挿入またはウイルスベクターなどのDNAの形質導入方法を用いることができる。真核細胞は、L.ロンギパルピス（L.Iongipalpis）ポリヌクレオチド配列および、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子などの選択表現型をコードする第2異種DNA分子で同時形質転換されることもできる。他の方法には、真核細胞に一過性に形質導入し、タンパク質を発現させるための、ヘルペスウイルスまたはアデノウイルス(例えば、イヌアデノウイルス2型)などの真核ウイルスベクターの使用(上記参照)がある(Gluzman EA)。さらに、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)などのトランスフェクション試薬を用いることができる。
【００４９】
組換え発現されたポリペプチドの分離精製は、調製用クロマトグラフィー(例えば、サイズ排除、イオン交換、親和性クロマトグラフィー)、選択的沈殿および限外濾過を含む慣用法によって行うことができる。使用することができる現在の技術水準の例は、限定するものではないが、Simon Roe（編）”Protein Purification Applications”第2版（Oxford University Press刊）において見出すことができる。このような組換え発現されたポリペプチドは本開示の一部である。前述のような本発明に記載の任意のポリペプチドの製造方法、特に本開示に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターおよび宿主細胞の使用もまた含まれる。
【００５０】
本発明に記載の組換えウイルスベクターを含むワクチンは、好都合には安定化剤と共に凍結乾燥されることができる。凍結乾燥は、公知の標準的凍結乾燥手順に従って行うことができる。薬学的または獣医学的に許容される安定剤は、炭水化物(例えばソルビトール、マンニトール、ラクトース、ショ糖、グルコース、デキストラン、トレハロース)、グルタミン酸ナトリウム(Tsvetkov Tら;Israeli Eら)、タンパク質、例えばペプトン、アルブミン、ラクトアルブミンまたはカゼイン、スキムミルクなどの薬剤を含むタンパク質(Mills CKら;Wolff Eら)および緩衝液(例えばリン酸緩衝液、アルカリ金属リン酸緩衝液)であることができる。凍結乾燥製剤を可溶性にするために、アジュバントを用いることができる。
本発明に記載の任意のワクチン組成物は、好都合には、1以上のアジュバントを含むこともできる。
【００５１】
プラスミドベースのワクチンは、カチオン性脂質、好都合にはDMRIE(N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアンモニウム;WO96/34109)と共に、好都合には中性脂質、例えばDMRIE-DOPEを形成させるためのDOPE(ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン;Behr J. P.)と組み合わされて処方されることができる。一実施形態において、混合物はその場で調製され、適切な混合物を形成させるために、その投与の前に約10分間〜約60分間、例えば、約30分間待つことが好都合である。DOPEが用いられる場合、DMRIE/DOPEのモル比は95/5〜5/95であることができるが、好都合には1/1である。プラスミド/DMRIEまたはDMRIE-DOPEアジュバントの重量比は、例えば、50/1〜1/10または10/1〜1/5または1/1〜1/2である。
【００５２】
場合により、サイトカイン、特にGM-CSFまたは、Th1を誘導するサイトカイン(例えばIL12)を組成物に加えることができる。これらのサイトカインは、サイトカインタンパク質をコードするプラスミドとして組成物に加えることができる。一実施形態において、サイトカインはイヌ科動物起源、例えば遺伝子配列がGenBankデータベースに寄託されたイヌGM-CSF(アクセッション番号S49738)である。この配列は、WO00/77210での方法と同様な方法で前記プラスミドを作成するために使用することができる。
【００５３】
組換えウイルスベクターベースのワクチンは、fMLP(N-ホルミル-メチオニル-ロイシル-フェニルアラニン;米国特許第6,017,537号)および／またはカルボマーアジュバントと併用することができる(Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996)。当業者はまた、少なくとも3つのヒドロキシル基を有し、好都合には8つ以下のヒドロキシル基を有し、少なくとも3つのヒドロキシル基の水素原子は、少なくとも2つの炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルによって置換されているポリヒドロキシル化合物で架橋されたアクリルポリマーが記載されている米国特許第2,909,462号を指摘することもできる。例えば、この基は、2〜4炭素原子を含む基、例えばビニル、アリルおよび他のエチレン性不飽和基である。不飽和ラジカルはまた、メチルなどの他の置換基を含むこともできる。カルボポル(CARBOPOL)（登録商標）(BF Goodrich社、オハイオ州、米国)の名称で販売されている製品が適切である。この製品はアリルスクロースまたはアリルペンタエリスリトールによって架橋されている。好都合には、その中でカルボポル（登録商標）(974P、934Pおよび971P）をあげることができる。
【００５４】
無水マレイン酸とアルケニル誘導体の共重合体の中で、直鎖または架橋された、例えばジビニルエーテルで架橋された無水マレイン酸とエチレンの共重合体である共重合体E（登録商標）(Monsanto社)が好都合である。J. Fieldsらを参照することができる。
アクリル酸またはメタクリル酸ポリマーおよび共重合体EMA（登録商標）は、例えば、次式の基本単位によって形成される：
2014528699.tif 000003
・R1およびR2は同一または異なることができ、HまたはCH3を表し
・x=0または1であり、好ましくはx=1であり
・y=1または2であり、ここでx+y=2である
共重合体EMA（登録商標）に関しては、x=0であり、y=2である。カルボマーに関しては、x=y=1である。
これらのポリマーを水へ溶解することによって酸溶液を生じるが、ワクチン自体が組み込まれるアジュバント溶液を提供するために、この溶液は好都合には生理学的なpHに中和される。このポリマーのカルボキシル基は、それによって部分的にCOO-形になる。
【００５５】
一実施形態において、アジュバント溶液、特にカルボマー溶液 (Pharmeuropa, vol. 8, No.2, June 1996)は、好都合には塩化ナトリウムの存在下で蒸留水で調製され、得られた溶液は酸性pHを示す。このストックは、NaClを添加した水、好都合には生理食塩水(NaCl 9 g/l)で、一度に数回に分けて希釈し、同時またはその後に、好都合にはNaOHで中和(pH7.3〜7.4)して、所望の量(所望の最終濃度を得るために)またはその実質的な部分にされる。生理学的なpHであるこの溶液は、ワクチンと混合するために用いられ、これは、特に、凍結乾燥形、液体形または凍結形で保存することができる。
【００５６】
最終ワクチン組成物のポリマー濃度は、0.01%〜2%w/v、0.06〜1%w/vまたは0.1〜0.6%w/vであることができる。
サブユニットワクチンは、鉱油および／または植物油ならびにブロック共重合体、TWEEN（登録商標）、SPAN（登録商標）などの非イオン性界面活性剤に基づく水中油型、水中油中水型エマルションなどのアジュバントと併用することができる。このようなエマルションは、特に“Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach”, Pharmaceutical Biotechnology, 1995 の147ページに記載のもの、またはTS エマルション、特にTS6 エマルションおよびLF エマルション、特に LF2 エマルションである（TS および LF エマルションに関してWO 04/024027を参照のこと）。他の 適切な アジュバントは、例えば、 ビタミンE、サポニンおよび CARBOPOL（登録商標）(Noveon社;WO99/51269;WO99/44633参照)、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム(“Vaccine Design, The subunit and adjuvant approach”, Pharmaceutical Biotechnology, vol. 6, 1995)、生物学的アジュバント (すなわち C4b、特に マウス C4b (Ogata R T ら) または ウマC4b、GM-CSF、特に ウマ GM-CSF (米国特許第 6,645,740号))、毒素 (すなわち コレラ毒素 CTA または CTB、エシェリキア・コリ 易熱性毒素 LTA または LTB (Olsen C W ら; Fingerut E ら; Zurbriggen R ら Peppoloni S ら)ならびにCpG(すなわちCpG#2395(Jurk Mら参照)、CpG#2142(EP1,221,955における配列番号890)である。
【００５７】
組成物またはワクチンは、1以上のFeLV抗原、例えば、ENVまたはENVおよびGAGまたはENVおよびGAGおよびPRO遺伝子を含有するかまたは含む。
組成物またはワクチンは、少なくとも1つのFeLV抗原、例えば不活化FeLVと関連することもできる。特定の実施形態において、FeLV株はFeLV A型株、またはFeLV A型およびC型株の組み合わせ、またはA型、B型およびC型株の組み合わせであることができる。FeLVのこれらの株は、化学的または物理的方法によって不活化することができる。化学的方法は、特に、BPL、ホルムアルデヒドである。物理的方法は、特に、超音波処理であることができる。ワクチンに使用するためにFeLVを不活化するための方法の1つは、R.Cordeiro Giunchetti et al.,Vaccine,2007に記載されている。不活化FeLVワクチンは、サブユニットワクチンのために前述したアジュバントのようなアジュバントと併用することができる。
【００５８】
本発明の他の側面は、本明細書に開示されたワクチン組成物を用いて、FeLVの宿主にワクチン接種する方法に関する。
宿主は、ネコ科動物(例えば、家猫、子猫、大猫およびヤマネコ)のいずれか1つまたはそれらのすべてであることができる。一実施形態において、宿主はネコ科動物である。
投与経路は、例えば、筋肉内(IM)または皮内(ID)または経皮(TD)または皮下(SC)であることができる。投与手段は、例えば、針付シリンジまたは無針装置または電気的導入(ET)処置に連結された針付シリンジまたはET処置に連結された無針装置であることができる。
本発明の他の側面は、宿主への投与のための本発明に記載のプラスミドベースのワクチンの使用であって、投与がET処置に連結された前記使用に関する。プラスミドベースのワクチンの投与は、好都合には筋肉内である。投与手段は、例えば、シリンジおよび針である。1回または数回の注射を継続的に投与することができる。数回の注射の場合は、2〜6週間時間をおいて、例えば、約3週間時間をおいて行うことができる。一実施形態において、年2回のブースターまたは年1回のブースターがさらに投与される。
【００５９】
プラスミドベースのワクチンのために、有利な投与経路はIDまたはIMであることができる。この投与は、DermojetもしくはBiojector(Bioject社、オレゴン州、米国)またはVetjet（登録商標）(Merial社)もしくはVitajet（登録商標）(Bioject社)などの針付シリンジまたは無針装置の使用によるものであることができる。US2006/0034867を参照のこと。用量は、50μg〜500μg／プラスミドであることができる。DMRIE-DOPEが添加される場合は、100μg／プラスミドを用いることができる。GM-CSFまたは他のサイトカインが用いられる場合、このタンパク質をコードするプラスミドは、約200μg〜約500μgの用量で含まれることができ、200μgであることができる。用量の容量は0.01ml〜0.5mlであることができ、例えば0.25mlであることができる。投与は、複数の注射部位で行うことができる。
【００６０】
あるいはまた、プラスミドベースのワクチンは、電気的導入(ET)処置に連結されたIM経路で投与することができる。ET処置は、電気的導入装置および製造業者の仕様書を用いて行うことができる(すなわちSphergen G250 generator (Sphergen SARL、Evry Genopole、フランス);MedPulser（登録商標）DNAエレクトロポレーションシステム(Innovio Biomedical社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国))。一実施形態において、電気的導入装置は、単極性電界を有する。電界強度は、約50〜約250V/cm、約50〜約200V/cm、または約50〜約175V/cmであることができる。パルス幅は約1〜約50msecまたは約15〜約25msecであることができる。周波数は約1〜約50Hzまたは約5〜約15Hzであることができる。パルス間隔は約1〜1000msecまたは約1〜約200msecであることができる。パルス数は1〜20または5〜10であることができる。組織内強度は、好都合には約2Aまでである。電極間距離は約0.2〜約1cmまたは約0.2〜約0.5cmであることができる。
【００６１】
組換えウイルスベクターベースのワクチンのために、投与経路は、好都合にはSCまたはIMまたはTDまたはIDであることができる。この投与は、DermojetもしくはBiojector(Bioject社、オレゴン州、米国)またはVetjet（登録商標）(Merial社)もしくはVitajet（登録商標）(Bioject社)などの針付シリンジまたは無針装置によって行うことができる。用量は、組換えポックスウイルスベクターについては約103pfu〜約109pfuであることができる。ベクターがカナリーポックスウイルスである場合、用量は、例えば、約105pfu〜約109pfu、約106pfu〜約108pfuまたは約106pfu〜約107pfuであることができる。用量の容量は約0.01ml〜0.2mlであることができ、好都合には0.1mlである。投与は、複数の注射部位を含むことができる。
IM経路のために、投与されるワクチンの容量は0.2〜2mlであることができ、特に約0.5〜1mlであることができる。本発明のベクターのいずれについても、同じ用量が用いられる。
【００６２】
サブユニットワクチンのために、投与経路は、好都合には、SCまたはIMまたはTDまたはIDであることができる。この投与は、DermojetもしくはBiojector(Bioject社、オレゴン州、米国)またはVetjet（登録商標）(Merial社)もしくはVitajet（登録商標）(Bioject社)などの針付シリンジまたは無針装置で行うことができる。用量は、約50〜約500μgであることができ、特に約50〜約150μgであることができ、より具体的には約50〜約100μgであることができる。投与されるサブユニットワクチンの容量は0.2〜2mlであり、特に約0.5〜1mlである。
【００６３】
他の側面において、本発明は、プライム・ブースト投与計画に基づくワクチン戦略であって、初回投与およびブースト投与(単数または複数)が、薬学的または獣医学的に許容される賦形剤、希釈剤またはビヒクルならびに、FeLVポリペプチドおよび／またはそれらの変種もしくは断片を含み発現するポリヌクレオチド配列を含むin vivo発現ベクターを含む組成物を用いる前記ワクチン戦略に関する。
本発明は、宿主をFeLVから予防し、かつ／または感染宿主における疾患進行を予防するためのプライム・ブースト投与計画におけるin vivo発現ベクターの使用であって、薬学的または獣医学的に許容されるビヒクル、希釈剤または賦形剤、FeLVポリペプチドおよび／またはそれらの変種もしくは断片をin vivoで発現するためのポリヌクレオチド配列を含むin vivo発現ベクターを含むワクチンの初回投与と、それに続く、薬学的または獣医学的に許容されるビヒクルまたは賦形剤、前述のFeLVポリペプチドおよび／またはそれらの変種もしくは断片をin vivoで発現するためのポリヌクレオチド配列を含むin vivo発現ベクターを含むワクチンのブースト投与を含む前記使用に関する。
【００６４】
プライム・ブースト投与計画は、少なくとも1つの共通のポリペプチドおよび／またはそれらの変種もしくは断片を用いる、少なくとも1つの初回投与および少なくとも1つのブースト投与を含む。初回投与に用いられるワクチンは、その後のブースターワクチンとして用いられるものとは性質が異なることができる。初回投与は、1以上の投与を含むことができる。同様に、ブースト投与は1以上の投与を含むことができる。
投与経路、用量および容量は、前記で本明細書に開示された通りである。
プライム・ブースト投与は、好都合には、2〜6週間時間をおいて、例えば、約3週間時間をおいて行うことができる。一実施形態によれば、好都合には、ウイルスベクターベースのワクチンを用いる、年2回のブースターまたは年1回のブースターもまた考えられる。初回投与の時点で、動物は少なくとも6〜8週齢であることができる。
【００６５】
一実施形態において、プライム・ブースト投与計画は、本発明に記載のプラスミドベースのワクチンの少なくとも1つのプライム投与および、本発明に記載の組換えウイルスベクターベースのワクチンの少なくとも1つのブースト投与を含む。
他の実施形態において、プライム・ブースト投与計画は、本発明に記載の組換えウイルスベクターベースのワクチンの少なくとも1つのプライム投与および、本発明に記載のサブユニットワクチンの少なくとも1つのブースト投与を含む。
他の実施形態において、プライム・ブースト投与計画は、本発明に記載の組換えウイルスベクターベースのワクチンの少なくとも1つのプライム投与および、本発明に記載のプラスミドベースのワクチンの少なくとも1つのブースト投与を含む。
【００６６】
一実施形態において、本発明は、被験者をFeLVから予防し、かつ／または感染被験者における疾患進行を予防するための、FeLVに感受性が高い被験者にワクチン接種する方法であって、プライム・ブースト投与計画を含む前記方法において、前記投与計画が、薬学的または獣医学的に許容されるビヒクル、希釈剤または賦形剤にFeLVポリペプチド、FeLVポリペプチドの変種もしくは断片またはそれらの混合物をin vivoで発現するためのポリヌクレオチドを含むプラスミドを含むワクチンまたは組成物のプライム投与と、それに続く、薬学的または獣医学的に許容されるビヒクルまたは賦形剤に同じFeLVポリペプチド(単数または複数)、それらの変種、それらの断片を発現するためのポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターを含むワクチンのブースト投与を含む前記方法に関する。
【００６７】
他の実施形態において、本発明は、被験者をFeLVから予防し、かつ／または感染被験者における疾患進行を予防するための、FeLVに感受性が高い被験者にワクチン接種する方法であって、プライム・ブースト投与計画を含む前記方法において、前記投与計画が、薬学的または獣医学的に許容されるビヒクル、希釈剤または賦形剤に、FeLVポリペプチド、FeLVポリペプチドの変種もしくは断片またはそれらの混合物をin vivoで発現するためのポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターを含むワクチンまたは組成物のプライム投与と、それに続く、薬学的または獣医学的に許容されるビヒクルまたは賦形剤に、FeLVポリペプチド(単数または複数)、それらの変種、それらの断片を発現するためのポリヌクレオチドを含むプラスミドを含むワクチンのブースト投与を含む前記方法に関する。
【００６８】
さらに他の実施形態において、本発明は、被験者をFeLVから予防し、かつ／または感染被験者における疾患進行を予防するための、FeLVに感受性が高い被験者にワクチン接種する方法であって、プライム・ブースト投与計画を含む前記方法において、前記投与計画が、薬学的または獣医学的に許容されるビヒクル、希釈剤または賦形剤にFeLVポリペプチド、FeLVポリペプチドの変種もしくは断片またはそれらの混合物をin vivoで発現するためのポリヌクレオチド組換えウイルスベクターを含むワクチンまたは組成物のプライム投与と、それに続く、薬学的または獣医学的に許容されるビヒクルまたは賦形剤に、同じFeLVポリペプチド(単数または複数)、それらの変種、それらの断片を含むワクチンのブースト投与を含む前記方法に関する。
【００６９】
本発明の他の側面は、本発明に記載のプライム・ブーストワクチン接種のためのキットに関する。キットは、少なくとも2つのバイアル（プライムワクチン接種のための、本発明に記載のワクチンを含む第1バイアルおよび、本発明に記載のブーストワクチン接種のためのワクチンを含む第2バイアル）を含むことができる。キットは、好都合には、追加のプライムワクチン接種または追加のブーストワクチン接種のための追加の第1または第2バイアルを含むことができる。
【００７０】
一実施形態において、キットは、2つのバイアル（本発明に記載のプライムワクチン接種のためのプラスミドベースのワクチンを含む1つのバイアルと、本発明に記載のブーストワクチン接種のための組換えウイルスベクターベースのワクチンを含むもう1つのバイアル）を含むことができる。
他の実施形態において、キットは、2つのバイアル（本発明に記載のプライムワクチン接種のための組換えウイルスベクターベースのワクチンを含む1つのバイアルと、本発明に記載のブーストワクチン接種のためのサブユニットワクチンを含むもう1つのバイアル）を含むことができる。
他の実施形態において、キットは2つのバイアル（本発明に記載のプライムワクチン接種のための組換えウイルスベクターベースのワクチンを含む1つのバイアル、本発明に記載のブーストワクチン接種のためのプラスミドベースのワクチンを含むもう1つのバイアル）を含むことができる。
【００７１】
ここで、限定するものではない以下の実施例を用いて、本発明をさらに詳細に説明する。
【００７２】
さらに詳細は無くとも、当業者は、前述の説明を用いて本発明を最大限に実施することができると考えられる。以下の実施例は、単に例示と解釈されるべきであって、決して前記の開示を限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、反応剤ならびに反応条件および技術の両方に関して、本手順から適切な変形を直ちに認識するであろう。
DNA挿入物、プラスミドおよび組換えウイルスベクターの構築は、J.Sambrook et al.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989)に記載されている標準的分子生物学技術を用いて行った。本発明に使用されたすべての制限フラグメントは、”Geneclean”キット(BIO 101社、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州)を用いて単離された。
【実施例１】
【００７３】
pH6C5envプラスミドpPB713の構築
FeLV-ENV/ALVAC(2)組換え体の作成のためのC5挿入プラスミドであるpH6C5env-pCXL208.2の構築
C5遺伝子座に挿入したFeLV ENVおよびC3遺伝子座に挿入したGAG/POL(+T5NT)を含むALVAC(1)組換えウイルス(Merial占有物質)を用いてFeLV ENV遺伝子を増幅した。PCR増幅にはプライマー7862CXLおよび7847CXLを用いた。
7862CXL:ACG CCG CTC GAG CGG GGA TCT CTT TAT TCT ATA CTT A(配列番号25)
XhoI          H6プロモーター
7847CXL: CTC GGA TCC AGAAAAA TCA TGG TCG GTC CGG ATC(配列番号26)
BamHI   T5NT   終止コドン 
【００７４】
増幅されたPCR断片(2.1Kb)は、FeLV ENV遺伝子、ENVのすぐ上流のH6プロモーターおよびT5NT配列とそれに続くENVの終止コドンを含む。次いでこのPCR断片をXhoI/BamHIで消化し、XhoI/BamHI消化pH6C5ALVACドナープラスミド(Merial占有物質)にライゲーションしてpCXL208.2を作成し、これを配列決定した。
pCXL208.2のプラスミドマップおよびその配列を図2および3に示す。
【００７５】
pH6C5envプラスミドpPB713の構築
FeLV ENVをグリコシル化し、切断して、糖タンパク質gp70ENVおよびp15E ENVを調製した。株82Kの変異FeLV ENV遺伝子のタンパク質配列を図5に示す。変異は、FeLV ENV遺伝子の位置527におけるGluのArgへの置換である。
【００７６】
プラスミドpHCMV-ENV FeLVは、Institut Gustave-Roussy(ヴィルジュイフ、フランス)から得た。提供された変異FeLV ENV断片の配列(配列番号3)は、参照配列(Glasgow、Genbankアクセッション番号M12500、配列番号35)と比較して5つの変異(ヌクレオチドで)を含む。5つのヌクレオチド変異の中で、2つの変異はサイレント突然変異(アミノ酸変化なし)であるが、新規な制限部位(=FspI)が導入されている。3つの変異によって、FeLV ENVのアミノ酸配列の変異（Gluの代わりにArg；図5に示す、配列番号4)が導入された。
【００７７】
プラスミドphCMV-ENV FeLVをRsrII/SacIIで消化してRsrII-SacII断片を作成した(断片B:520bp)。プラスミドpCXL208.2をRsrII/SacIIで消化してRsrII-SacII断片を作成した(断片A:6231bp)。断片Aと断片BをライゲーションしてプラスミドpPB713(6756bp)を作成した。FspI消化によってpPB713の一致を確認した。pPB713の制限地図およびpPB713配列を図4に示す。
【００７８】
pH6C5envプラスミドpPB712の構築
プラスミドPhCMV-ENV FeLVをRsrII/SacIIで消化してRsrII-SacII断片を作成した(断片A:520bp)。プラスミドpPB575(Merial占有物質)をRsrII/SacIIで消化してRsrII-SacII断片を作成した(断片B:5971bp)。断片Aと断片BをライゲーションしてプラスミドpPB712(6496bp)を作成した。EcoRI消化によってpPB712の一致を確認した。pPB712クローン中に存在するFeLVの変異領域の配列は、M13ユニバーサルプライマーおよびM13リバースプライマーを用いるDNA配列決定(Cogenics社、フランス)によって照査した。2つの候補を選択した(n°1およびn°2)。2つのクローンの配列は同一であったが、配列番号4とは異なっていた(GluからArgへの1つのアミノ酸変異)。8つのヌクレオチド変異が存在するが、ただ1つのアミノ酸変化が導入された。pPB712における変異FeLV(配列番号1)とpHCMV-ENV FeLVにおける変異FeLV(配列番号3)との間のDNAおよびタンパク質の配列比較を図5に示す。種々の株のFeLV ENVタンパク質の配列比較を図5に示す。
【実施例２】
【００７９】
FeLVコドン最適化GAG-PROを発現するALVAC組換え体の作成のためのC3 ALVACドナープラスミドの構築
vCP2294の作成にFeLV(ネコ白血病ウイルス)コドン最適化GAG-PRO遺伝子を用いた。FeLV GAG-PRO遺伝子を哺乳動物細胞における遺伝子発現に最適化した。コドン最適化GAG-PRO遺伝子(配列番号10)と野生型gap-pro遺伝子(Genbankアクセッション番号M18247、配列番号11)とのDNAレベルでの配列比較を図7に示す。
【００８０】
図8に構築スキームの概略を述べる。PCR増幅の鋳型としてH6p-FeLVコドン最適化GAG-PROカセットを含むプラスミドpJY1320.1(Merial占有物質)を用いた。H6pはワクシニアウイルスH6プロモーターである。PCR増幅のためにプライマー13301JYおよび13302JYを用いた。PCR断片をpCR2.1-TOPOベクターにクローニングした。得られたプラスミドpJY1857.5を配列決定し、H6p-FeLV GAG-PROの正しい配列を有することが確認された。pC3FeLV H6p-GAG-PROを構築するために、3’-部分H6プロモーターおよび完全長GAG-PROを含むNruI/SpeI DNA断片をpJY1857.5から単離し、Nru I/Spe I消化pJY1738.2(Merial占有物質)にライゲーションしてpJY1874.1を作成し（図9、10および11に示す)、これが正しい配列を有することを確認した。
フォワードプライマー13301JY(配列番号13)
NruI   H6p(配列番号15)
5’ATTA TCGCGA TATCCGTTAAGTTTGTATCGTA ATG GGA CAG ACC ATC ACC ACC
CCC CTG T
リバースプライマー13302JY(配列番号14)
Spe I
5’ATTA ACTAGT CAAGAAAAA TCA TTA CAG CAC CTG CAG GGG CAG TCC TCT
【００８１】
FeLV感染細胞において、GAG-PROはリードスルーによって産生される。ウイルス構築の後期段階において、GAGはさらに切断されてMA(p15)、CA(p30)およびNCタンパク質を生じる。
【実施例３】
【００８２】
ALVACのC3遺伝子座に挿入されたH6p FeLVコドン最適化GAG-PROを含むALVAC組換え体(vFP2294)の作成と解析
FuGENE-6（登録商標）試薬(Roche社)を用いて、Not I線状化ドナープラスミドpJY1874.1 10μgで初代二ワトリ胚繊維牙細胞(1°CEF)をトランスフェクトすることによって、IVR(in vitro組換え)を行った。in vitro組換えに用いた初代二ワトリ胚繊維牙細胞(1°CEF)は、1x抗生物質/抗真菌薬(P/S/A/A、BRL/Gibco#15240-062)の存在下、4mMグルタミン(BRL/Gibco#25030-081)および1mMピルビン酸ナトリウム(BRL/Gibco#11360-070)を補充した10%FBS(JRH:γ-照射#12107-500M)、DMEM(BRL/Gibco#11960-051or11960-044)で増殖させた。続いて、トランスフェクトされた細胞に、レスキューウイルスとしてALVACをMOI(感染多重度)10で感染させた(ALVAC #HM1372 07 Apr 04)。24時間後、トランスフェクトされた感染細胞を採取し、超音波処理して組換えウイルススクリーニング用に用いた。
【００８３】
西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)で標識された1.4kb FeLV GAG特異的プローブを用いて、製造業者のプロトコル(アマシャム社、カタログ番号RPN3001)に従って、プラークリフトハイブリダイゼーション法によって組換え体プラークをスクリーニングした。5回連続のプラーク精製後、vCP2294.1.1.1.1.1で表わされる組換え体を作成し、ハイブリダイゼーションによって、FeLV GAG挿入物に関して100%陽性であり、C3 ORFに関して100%陰性であることを確認した。
5回目のプラーク精製から単一プラークを選択し、増殖させて、P1(1xT25フラスコ)、P2(1xT75フラスコ)およびP3(6xローラーボトル)を得た。ローラーボトルから感染細胞培養液を採取し、濃縮してウイルスストックvCP2294.1.1.1.1.1を調製した。
組換えvCP2294を作成するためのスキームを図12に示す。
【００８４】
組換え体の解析：以下の解析はP3ストックで行った。
遺伝的純度の確認
ハイブリダイゼーションによって、P3ストックが、FeLV GAGに関して100%陽性であり、C3 ORFに関して100%陰性であることを再確認した。
ゲノム解析
vCP2294.1.1.1.1.1からゲノムDNAを抽出し、BamHI、HindIIIまたはPst Iで消化し、0.8%アガロースゲルで電気泳動した。BamHI、HindIIIまたはPstI消化ゲノムDNAを含むゲルをナイロン膜に移行させ、1.4kb FeLV GAGプローブでプローブすることによってサザンブロット解析を行った。予想サイズに複数のバンドが観察され、C3遺伝子座へのFeLV GAG-PRO遺伝子の正しい挿入が示された。
2014528699.tif 000004
【００８５】
発現解析
1)ウェスタンブロット
初代CEF細胞をMOI 10でvCP2294.1.1.1.1.1のP3ストックに感染させ、37℃で24時間インキュベートした。次いで培養上清および細胞を採取した。Roche社製のレポーター遺伝子アッセイ溶解緩衝液(カタログ番号1 897 675)で細胞ペレットを溶解した。抗酸化物質を添加したNuPage（登録商標）Systemで上清および溶解物の両方を調製した。NuPage（登録商標）10%Bis-Trisプレキャストゲルでタンパク質を分離し、次いでPVDF膜に移行させた。抗FeLV GAG抗体によって、〜70kDaタンパク質が上清および細胞ペレットの両方で検出され、〜57kDaタンパク質が細胞ペレットのみにおいて検出されたことが明らかになった。
【００８６】
2)イムノプラークアッセイ
組換えvCP2294.1.1.1.1.1集団の均一性は、FeLV GAGタンパク質に対して100%陽性であった。これは、抗FeLV GAG抗体を用いるイムノプラークアッセイによって証明された。
【００８７】
配列解析
C3遺伝子座の隣接アームおよびFeLV挿入物のPCR増幅および配列解析によって、P3ストックゲノムDNAのより詳細な解析を行った。ALVACゲノムのC3遺伝子座のアームを超えて位置するプライマー8103JYおよび8104JYを用いて全C3L-FeLV-C3R断片を増幅した。ALVACのFeLV挿入物ならびにC3LおよびC3Rの配列が正しいという結果が示された。
【００８８】
FeLV GAGプローブを増幅するためのプライマー：
11369JY:5’ ATGATGAACGTGGGCTGGCCT 3’(配列番号17)
11377JY:5’ TCTCCTAAGTTGAGCAGGGTG 3’(配列番号18)
C3L-FeLV GAG-PROカセット-C3RのPCR増幅のためのプライマー
8103JY:5’ GAGGCATCCAACATATAAAGAAGACTAAAG 3’(配列番号19)
8104JY:5’ TAGTTAAATACTCATAACTCATATCTG 3’(配列番号20)
【００８９】
図13は、プライマー位置を示すvCP2294 C3領域地図を示す。vCP2294配列を図14に示す。
【実施例４】
【００９０】
vCP2294のC5遺伝子座に挿入されたFeLV修飾ENV遺伝子を含むALVAC組換え体、ALVAC C3 H6p FeLVコドン最適化GAG-PRO-vCP2296の作成および解析
FuGENE-6（登録商標）試薬(Roche社)を用いて、Not I線状化ドナープラスミドpPB713 10μgで1°CEF細胞をトランスフェクトすることによってIVRを行った。続いて、トランスフェクトされた細胞に、レスキューウイルスとしてvCP2294(ALVAC C3 H6p FeLVコドン最適化GAG-PRO、実施例2)をMOI 10で感染させた。24時間後、トランスフェクトされた感染細胞を採取し、超音波処理して組換えウイルススクリーニング用に用いた。
【００９１】
製造業者のプロトコル(アマシャム社、カタログ番号RPN3001)に従って、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)で標識された503bp FeLV ENV特異的プローブを用いるプラークリフトハイブリダイゼーション法によって組換え体プラークをスクリーニングした。4回連続のプラーク精製後、vCP2296.6.1.1.2で表わされる組換え体を作成し、ハイブリダイゼーションによって、FeLV ENV挿入物に関して100%陽性であり、空C5部位に関して100%陰性であることを確認した。
【００９２】
4回目のプラーク精製から単一プラークを選択し、増殖させて、P1(1xT25フラスコ)、P2(1xT75フラスコ)およびP3(6xローラーボトル)ストックを得た。ローラーボトルから感染細胞培養液を採取し、濃縮してウイルスストックvCP2296.6.1.1.2を調製した。
vCP2296の構築を図15に示す。
【００９３】
組換え体の解析：以下の解析はP3ストックで行った。
遺伝的純度の確認
ハイブリダイゼーションによって、P3ストックが、FeLV GAGおよびFeLV ENVの両方に関して100%陽性であり、C3およびC5 ORFの両方に関して陰性であることを再確認した。
【００９４】
発現解析
1)ウェスタンブロット:
初代CEF細胞をMOI 10でvCP2296.6.1.1.2のP3ストックに感染させ、37℃で24時間インキュベートした。次いで培養上清および細胞を採取した。Roche社製のレポーター遺伝子アッセイ溶解緩衝液(カタログ番号1 897 675)で細胞ペレットを溶解した。抗酸化物質を添加したNuPage（登録商標）Systemで上清および溶解物の両方を調製した。NuPage（登録商標）10%Bis-Trisプレキャストゲルでタンパク質を分離し、次いでPVDF膜に移行させた。抗FeLV GAG抗体によって、〜70kDaタンパク質が上清および細胞ペレットの両方で検出され、抗FeLV ENV抗体でインキュベートすることによって、上清および細胞ペレットの両方において〜80kDaタンパク質もまた発現されたことが明らかになった。
【００９５】
2)イムノプラークアッセイ:
組換えvCP2296.1.1.2集団の均一性は、FeLV ENVタンパク質に対して100%陽性であった。これは、抗FeLV ENV抗体を用いるイムノプラークアッセイによって証明された（添付のvCP2296イムノプラーク資料におけるIP確認走査画像を参照のこと）。
【００９６】
配列解析
vCP2296.6.1.1.2のC5部位におけるFeLV ENV遺伝子挿入物をPCRによって増幅した。ALVACゲノムおけるC5遺伝子座のアームを超えて位置するプライマー7931DCおよび7932DC（図16参照)を用いて全C5L-FeLV-C5R断片を増幅した。
FeLV ENVプローブを増幅するためのプライマー：
7900CXL5’ AGGAGGGCTTTAGTCCCTGTTCCGA 3’(配列番号21)
7934CXL5’ ACTAAAGACTGTTGGCTCTGCCTG 3’(配列番号22)
C5L-FeLV ENVカセット-C5RのPCR増幅のためのプライマー：
7931DC5’ GAATCTGTTAGTTAGTTACTTGGAT 3’(配列番号23)
7932DC5’ TGATTATAGCTATTATCACAGACTC 3’(配列番号24)
【実施例５】
【００９７】
vCP2294、ALVAC C3 H6p FeLVのC5遺伝子座に挿入されたFeLV天然ENV遺伝子を含むALVAC組換え体の作成および解析
コドン最適化GAG-PRO-vCP2295
ドナープラスミドpCXL208.2は天然ENV遺伝子(配列番号5)を含む。
FuGENE-6（登録商標）試薬(Roche社)を用いて、Not I線状化ドナープラスミドpCXL208.2 10μgで1°CEF細胞をトランスフェクトすることによって、IVRを行った。続いて、トランスフェクトされた細胞に、レスキューウイルスとしてvCP2294(実施例2)をMOI 10で感染させた。24時間後、トランスフェクトされた感染細胞を採取し、超音波処理して組換えウイルススクリーニング用に用いた。
【００９８】
製造業者のプロトコル(アマシャム社、カタログ番号RPN3001)に従って、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)で標識された503bp FeLV ENV特異的プローブを用いるプラークリフトハイブリダイゼーション法によって組換え体プラークをスクリーニングした。4回連続のプラーク精製後、vCP2295.2.2.2.1で表わされる組換え体を作成し、ハイブリダイゼーションによって、FeLV ENV挿入物に関して100%陽性であり、空C5部位に関して100%陰性であることを確認した。
4回目のプラーク精製から単一プラークを選択し、増殖させて、P1(1xT25フラスコ)、P2(1xT75フラスコ)およびP3(6xローラーボトル)を得た。ローラーボトルから感染細胞培養液を採取し、濃縮してウイルスストックvCP2295.2.2.2.1を調製した。組換えvCP2295を作成するスキームを図17に示す。
【００９９】
組換え体の解析：以下の解析はP3ストックで行った。
遺伝的純度の確認
ハイブリダイゼーションによって、P3ストックが、FeLV GAGおよびFeLV ENVの両方に関して100%陽性であり、C3およびC5 ORFの両方に関して陰性であることを再確認した。
【０１００】
発現解析
1)ウェスタンブロット
初代CEF細胞をMOI 10でvCP2295.2.2.2.1のP3ストックに感染させ、37℃で24時間インキュベートした。次いで培養上清および細胞を採取した。Roche社製のレポーター遺伝子アッセイ溶解緩衝液(カタログ番号1 897 675)で細胞ペレットを溶解した。抗酸化物質を添加したNuPage（登録商標）Systemで上清および溶解物の両方を調製した。NuPage（登録商標）10%Bis-Trisプレキャストゲルでタンパク質を分離し、次いでPVDF膜に移行させた。抗FeLV gag抗体によって、〜70kDaタンパク質が上清および細胞ペレットの両方で検出され、抗FeLV ENV抗体でインキュベートすることによって、上清および細胞ペレットの両方において〜80kDaタンパク質もまた発現されたことが明らかになった。
【０１０１】
2)イムノプラークアッセイ:
組換えvCP2295.2.2.2.1集団の均一性は、FeLV ENVタンパク質に対して100%陽性であった。これは、抗FeLV ENV抗体を用いるイムノプラークアッセイによって証明された。
【０１０２】
配列解析
C5遺伝子座の隣接アームおよびFeLV挿入物のPCR増幅および配列解析によって、P3ストックゲノムDNAのより詳細な解析を行った。ALVACゲノムのC5遺伝子座のアームを超えて位置するプライマー7931DCおよび7932DCを用いて全C5L-FeLV-C5R断片を増幅した。ALVACのFeLV挿入物ならびにC5LおよびC5Rの配列が正しいという結果が示された。
組換えvCP2295配列を図18に示す。
【実施例６】
【０１０３】
ワクチン接種/チャレンジモデルによる、皮下に投与されたカナリーポックスをベクターとするワクチン(vCP2296、FeLV ENV)の有効性の評価
材料/方法
最初のワクチン接種時に57〜63日齢(平均58日齢;標準偏差1.3日齢)の44頭の雌雄のネコを、22頭の動物の2つの群に無作為に割り付けた。第1群のネコには、0日目および21日目に、106.2半数組織培養物感染用量(TCID50)/mlのFeLV-カナリーポックスベクターワクチン(vCP2296)1mlを皮下(SQ)にワクチン接種した。第2群のネコには、0日目および21日目に、滅菌生理的食塩水を含むプラセボワクチン1mlを2回投与し、陰性対照とした。42日目および43日目(2回目ワクチン接種後3週間)に、すべてのネコを、104.5および104.7TCID50/ml含むFeLV(61-E)毒性株懸濁液1mlでチャレンジした。（42日目および43日目に、それぞれ）口鼻経路で投与した。-6日目、42日目(チャレンジ前)に、チャレンジ後おおよそ3週間目に、そして各週ごとに12週間連続で(62日目〜146日目)血液試料を採取し、FeLV抗原血症(FeLV p27タンパク質)に関して血清を試験した。
最初のワクチン接種の2日前から42日目まで臨床評価を行った。-2日目〜0日目(ワクチン接種前)、1日目〜2日目、19日目〜21日目(ワクチン接種前)および22日目〜23日目に直腸温を毎日記録した。さらに、各ワクチン接種後最初の2日間およびワクチン接種後チャレンジ日まで各週ごとに注射部位を評価し、腫れ、発赤および触診時の痛みを含めた。
【０１０４】
結果:チャレンジ後のFeLV p27抗原血症の持続性
ネコが3週連続または非連続5週間FeLV p27陽性と試験された場合、そのネコを持続性FeLV p27抗原血症を有するとみなした。プラセボ群では、22頭のネコのうち19頭のネコ(86.4%)が持続的にFeLV抗原血症になったのに対し、ワクチン接種群では5/21(23.8%)であった。FeLVチャレンジに起因する持続性FeLV抗原血症ネコの罹患率は、プラセボ群よりも、ワクチン接種群において有意に低かった(p=0.00005)。推定予防分画は72.43%であり、95%の信頼区間は43.04%〜89.78%であった。従って、プラセボ群の動物と比較して、ワクチン接種群の動物において、持続性FeLV抗原血症を発症する可能性は72％低かった。
【０１０５】
結論
以下の結果によって証明されるように、Merial’s FeLV-Canarypox Vectored Vaccine(vCP2296)のSQ経路での2回の投与は、FeLVチャレンジに対して有効であることが見出された。
1.チャレンジ後、ワクチン接種／チャレンジネコ21頭のうち16頭(76.2%)において持続性FeLV抗原血症の予防に本試験ワクチンが有効であることが示された。対照と比較して、持続性抗原血症を発症しているワクチン接種されたネコの頭数は有意に低かった(p=0.00005;予防分画72%;有効性の主要評価項目)。
2.対照ネコの86%(19/22)における持続性FeLV抗原血症の発症によって証明されるように、効力のあるチャレンジの有効性が検証された。
3.ワクチン接種されたネコは、いずれも、ワクチン接種後に局所反応または全身反応を示さなかった。
【実施例７】
【０１０６】
ネコにおけるチャレンジによる、天然ENV遺伝子を有する組換えカナリーポックス-FeLV(vCP2295)と、最適化ENV遺伝子を有する組換えカナリーポックス-FeLV(vCP2296)の有効性の比較
材料/方法
8週齢〜12週齢(D0で平均して9週齢）の合計30頭のSPF(特定病原体不在)子猫（雄15頭、雌15頭）を、性別、同腹子および齢に従って10頭の3群に無作為に割り付けた。
表1.試験の実験計画
2014528699.tif 000005
*群C:ネコの頭数=D1にネコ1頭が死んだため、D1から最後まで9頭
**log10CCID50/mLで
SC:皮下
BS:採血
【０１０７】
D0およびD28において、ワクチン接種前に、すべての子猫を身体状態に関してモニターした。次いで、群Aおよび群Bのネコに、全身麻酔下、肩甲骨間領域への皮下注射によってワクチン接種した。D44に、チャレンジ株を37℃で解凍し、株32mLを、10%ウシ胎児血清を含むF15培地8mLと混合し、接種前に砕氷上に保存した。すべてのネコに全身麻酔をかけた。次いで、各ネコに、口鼻経路で接種物1mL(各鼻腔に0.25mL)および経口0.5mL(舌、咽頭および扁桃)を接種した。
【０１０８】
結果
覚醒ネコからD0、D5、D7、D15、D26、D35、D49、D70、D77、DB4、D91、D96、D105、D112、D133に採血し、全身麻酔(Zoletll”50 0.1〜0.2mL/kg、筋肉内経路)下、D44、D56、D63、D119、D126、D140およびD147に採血した。
【０１０９】
1.抗原血症試験
ワクチン接種前D0、チャレンジ前D44、ならびにチャレンジ後第3週から毎週、すなわち、D63、D70、D77、D84、D91、D98、D105、D112、D119、D126、D133、D140およびD147に、Witness FeLVキット(Synbiotics社、ミズーリ州、米国)でのFeLV p27抗原滴定のために、乾燥チューブに血液試料を採取した。応答は2値応答(存在/非存在)であった。3つのカテゴリーの応答が定義された:a)0:抗原血症なし(すべての滴定が陰性)、b)1:一過性抗原血症(3連続未満の滴定陽性および5回未満の滴定陽性）c)2:持続性抗原血症（少なくとも5回陽性または少なくとも3連続滴定陽性）。
【０１１０】
vCP2295ワクチン接種群(群A)において、ネコの40%で持続性抗原血症が予防された：4/10のネコは陽性を示さず、6/10のネコは持続性抗原血症を示した。vCP2296-ワクチン接種群(群B)において、ネコの60%でp27持続性抗原血症が予防された。5/10は陽性を示さず、1/10のネコは一過性抗原血症を示した：D63およびD84において、このネコの血清でp27は検出された。4/10のネコは持続性抗原血症を示した。対照群(群C)において、ネコの100%が持続性抗原血症を示した。結果を表2に示す。
【０１１１】
表2.p27抗原血症結果(比率)
2014528699.tif 000006
*持続的感染ではないネコの頭数/ネコの頭数
**試験中に死んだ1頭のネコは、4回連続陽性を示した
NA:適用なし:対照群
【０１１２】
抗原血症なし(抗原血症=0)、一過性抗原血症(抗原血症=1)または持続性抗原血症(抗原血症=2)を示すネコの頻度に関する3群の比較は、有意なP値を示した(”Fisherの直接確率検定”:p=0.028)。群Bと群Cの間の有意性の傾向が証明された(Bonferroni法での調整P値:A対C:p=0.260、B対C:p=0.056、A対B:p=1)。
【０１１３】
2.プロウイルス血症試験
プロウイルスコピー数/50,000WBC(白血球)における白血球数を用いてプロウイルス血症を表した。定量PCRを用いる、PBMC(末梢血単核球)に関する白血球数およびFeLVプロウイルス血症モニタリングのために、チャレンジ前のD44およびチャレンジ後の3週間毎に、すなわちD63、D84、D105、D126およびD147に、EDTAチューブに血液試料を採取した。基準の繰り返し測定の性質および個々のランダム効果のために、繰り返し測定での混合モデルを用いてプロウイルス血症データを解析した。
a)血液におけるプロウイルス血症
図19は、チャレンジ後の、各群の平均プロウイルス血症の進展を示す。図17は、チャレンジ後の、各群の平均プロウイルス血症の進展およびp27抗原血症状態を示す。両方のワクチン接種群において、p27抗原血症はプロウイルス血症とよい相関を示した(図20)。
b)骨髄におけるプロウイルス血症
p27陰性ネコにおける骨髄のプロウイルス血症のレベルは、3〜5log10であったのに対し、p27陽性ネコにおいては8〜9log10に達した。プロウイルス血症のレベルは、関連性を示すp27抗原血症の個々の状態および個々の血液プロウイルス血症と良い相関を示した(図21に示すように)。
【０１１４】
3.細胞性免疫応答
FeLVの免疫モニタリングのために、D5、D7、D15、D28、D35、D49、D56、D63、D119およびD126にヘパリン処理チューブに血液試料を採取した。D35およびD126に、FeLVペプチドプールを負荷した樹状細胞(DC)によってPBMCを刺激した後に、エリスポットによってIFNγ-細胞性免疫応答をモニターした。D35、D63およびD126に、FeLVペプチドプールによってPBMCを刺激した後に、エリスポットによってIL10による免疫をモニターした。D5、D15、D35、D49、D63およびD126に調節性T細胞をモニターした。
【０１１５】
A)方法
a)ネコPBMCの分離
PANCOLL（登録商標）密度勾配遠心分離(600g、ブレーキなしで30分間)によってPBMCを分離した。滅菌PBS(リン酸緩衝化生理食塩水)でPBMCを2回洗浄し（400gで10m分間遠心分離）、続いて、ロボット化されたABX Pentra 120細胞計数器で計数した。細胞をPBSで最後にもう一度洗浄し、滅菌RPMI完全培地(=RPMI+ペニシリン-ストレプトマイシン(PS)+βメルカプトエタノール(βM))+10%ウシ胎児血清(FCS)）に5.106/mlの濃度で再懸濁した。
b)樹状細胞の調製
Ficollで分離したPBMCを、平らな6ウェルプレート中で20時間培養した。非接着細胞を除去し、ネコIL-4およびネコGM-CSFを加えた新しい完全培地をウェルに加えた。DCへの単球の分化は7日間続いた。
【０１１６】
c)IFNγエリスポットアッセイ:
動物の種々の群におけるFeLV特異的細胞性免疫応答の強度は、IFNγエリスポットアッセイを利用することにより定量した。HAエリスポットプレートを、終夜+4℃で、炭酸/重炭酸緩衝液(0.2M、pH9.6)で希釈した精製された抗イヌIFNγ mAb(1/25)100μl/ウェルでコーティングした。コーティングしたプレートを滅菌PBSで3回洗浄し、非占有部位を、室温(RT)で2時間、滅菌10%FCS添加RPMI完全培地でブロックした。
D+15、D+35およびD+126に、FeLV ENVおよびGAGタンパク質をコードするペプチドプールを樹状細胞に装荷した。簡潔に言えば、10%FCS添加RPMI完全培地100μ1の最終容量にlμg/mlのペプチドプール番号1および番号2（FeLV ENV）またはペプチドプール番号2、番号3、番号6および番号8（FeLV GAG-PRO）で100.103DCを個々に再刺激した。装荷した樹状細胞をエリスポットプレートに移し、500.103PBMCを各ウェルに加えた。陰性対照として、無関係なペプチドを樹状細胞に装荷した。37℃+5%CO2で細胞を20〜24時間刺激した。次いで細胞を除去し、細胞を溶解させた。各ウェルに冷蒸留水(200μl)をRTで5分間加えた。次いで、PBS-0.05%ツイーンでプレートを3回洗浄し、+4℃で、ビオチン化抗ネコγIFN MAb（PBS-0.05%ツイーンで1/100に希釈）100μlでインキュベートした。次いでプレートをPBS-0.05%ツイーンで3回洗浄し、各ウェルに希釈したHRP-ストレプトアビジン溶液100μlを37℃で1時間加えた。次いでプレートをPBS-0.05%ツイーンで3回洗浄し、暗所、室温で15分間、AEC基質溶液でインキュベートした。プレートを十分に洗浄し乾燥した。CCDカメラシステム(Microvision社、レドモンド、ワシントン州、米国)でスポット数を計数した。ペプチド特異的IFNγ-スポット形成細胞(SFC)の頻度を以下のように算出した：ペプチド特異的IFNγSFC数=個々のFeLVペプチドプール再刺激によるIFNγ SFC-無関係なペプチドプール再刺激によるIFNγ SFC数。結果をlog10で表した。
【０１１７】
d)IL-10エリスポットアッセイ
製造業者の使用説明書(R&D Systems社、ミネアポリス、ミネソタ州、米国)に従ってエリスポットIL-10を行った。500.103の精製されたPBMCを、10%FCS添加RPMI完全培地200μ1の最終容量にlμg/mlでFeLV ENVおよびGAG-PRO配列をコードするオーバーラップペプチドプールを用いて直接に再刺激し、IFNγをコーティングしたエリスポットプレートに配置した。陰性対照として、無関係なペプチドで500.103PBMCを再刺激した。ペプチド特異的IL-10スポット形成細胞(SFC)の頻度を以下のように算出した：ペプチドプール特異的IL-l0SFC数=個々のFeLVペプチドプール再刺激によるIL-10 SFC数-無関係なペプチド再刺激によるIL-l0 SFC数。
結果をlog10で表した。
【０１１８】
B)結果
a)ワクチン接種後の細胞性免疫応答
i)ワクチン接種後の、FeLV特異的IFNγ分泌細胞反応のモニタリング
IFNγ-エリスポットアッセイを用いて、FeLV ENVおよびGAG-PROペプチドプールで負荷したDCでの再刺激に応じてIFNγを産生するPBMCの能力を解析した。FeLV ENVおよびGAG-PRO配列をコードするペプチドプールで負荷した樹状細胞でのin vitro活性化により誘導されたIFNγ+SFC(スポット形成細胞)の合計の解析は、vCP2295ワクチン接種と比較して、vCP2296ワクチン接種は、35日目において、より高い頻度のFeLV特異的IFNγ分泌細胞を誘導したことを示した。ワクチン非接種群は、任意のIFNγ分泌細胞を誘導しなかった(図22)。
IFNγ-産生細胞を誘導する能力におけるvCP2295とvCP2296の間の差異は、FeLV ENVプール番号1および番号2特異的反応に焦点を合わせることによってより明確になった。ペプチドプール番号1のFeLV ENV(FeLV ENV配列の最初をコードする）を装荷した樹状細胞でのin vitro活性化によるPBMC内のIFNγ+SFCの頻度の解析は、35日目の血液におけるvCP2296ワクチン接種(群B)とvCP2295ワクチン接種(群A)の差異を示した。ワクチン非接種群は、任意のIFNγ分泌細胞を誘導しなかった(図23)。
【０１１９】
ii)ワクチン接種後の、FeLV特異的IL-10分泌細胞のモニタリング
FeLV特異的IL-I0分泌細胞モニタリング:血液におけるFeLV ENV特異的反応の解析
ワクチン接種後35日目において、FeLV ENVペプチドプール再刺激に応じてIL-10を産生するPBMCの能力を、IL-l0エリスポットアッセイを用いて解析した。vCP2295ワクチン接種群は、vCP2296ワクチン接種群および対照群と比較して、より高い頻度のFeLV ENV特異的IL-l0分泌細胞を誘導した(図24)。
【０１２０】
FeLV特異的IL-10分泌細胞モニタリング:血液におけるFeLV GAG-PRO特異的反応の解析
ワクチン接種後35日目において、FeLV GAG-PROペプチドプール再刺激に応じてIL-10を産生するPBMCの能力を、IL-10エリスポットアッセイを用いて解析した。vCP2295ワクチン接種群は、vCP2296ワクチン接種群よりも、FeLV GAG-PRO特異的IL-10分泌細胞をより誘導する傾向を示した(図25)。
結論として、vCP2295ワクチン接種群(群A)は、vCP2296ワクチン接種群(群B)および対照群(群C)と比較して、末梢血において、より高い頻度のFeLV特異的IL-10分泌細胞を誘導した。
【０１２１】
iii)ワクチン接種後の、FeLV特異的IFNγ産生細胞とIL-10産生細胞の比率
2つの組換えワクチンおよび、Th1応答と調節応答との間のバランスをさらに評価するために、各ワクチン接種群に関するENVまたはGAG-PRO in vitro再刺激後のFeLV特異的IFNγ SFC数とFeLV特異的IL-10 SFC数との間の比率を算出した。各群に関するFeLV特異的IFNγ・IL-10 SFC比の比較によって、vCP2296ワクチン接種は、IL-10応答に偏ったvCP2295ワクチン接種によって誘導される免疫応答と比較して、よりバランスのとれた応答を誘導したことが明らかになった。この差異は、GAG-PRO再刺激と比較して、FeLV ENV再刺激における応答においてより明らかであった(図26aおよび26b)。
【０１２２】
b)実験チャレンジ後の細胞性免疫応答モニタリング
i)チャレンジ後のFeLV特異的IFNγ分泌細胞反応のモニタリング
チャレンジ(D126)後、FeV ENVおよびGAG-PROペプチドプールで負荷したOCでの再刺激に応じてIFNγを産生するPBMCの能力を、IFNγ-エリスポットアッセイを用いて解析した。vCP2296でワクチン接種されたネコは、vCP2295でワクチン接種されたネコと比較して、チャレンジ(D126)後に、PBMCにおけるより高い頻度のFeLV ENV特異的IFNγ分泌細胞を維持した。任意の群に関して、この時点で、FeLV GAG-PRO特異的IFNγ分泌細胞を観察することはできなかった(図27)。
ii)チャレンジ後の、FeLV特異的IL-10分泌細胞反応のモニタリング
チャレンジ(D126)後に、FeLV ENVまたはGAG-PROペプチドプール再刺激に応じてIL-10を産生するPBMCの能力をIL-10エリスポットアッセイを用いて解析した。FeLVチャレンジは、35日目の応答と比較して、すべての群においてFeLV ENV特異的IL-10細胞反応を特異的にブーストし、3群の間で差異はなかった(図28a)。このチャレンジは、FeLV GAG-PRO領域に指向性を有する抗原特異的反応に影響を及ぼさず、vCP2295でワクチン接種されたネコは、FeLV GAG-PRO特異的IL-10応答を維持した(図28b)。チャレンジ後、vCP2295でワクチン接種されたネコ(群A)はFeLV特異的IL-10免疫応答のみを示したのに対し、vCP2296でワクチン接種されたネコ(群B)は、FeLV特異的IL-10免疫応答を生じ、そのFeLV特異的IFNγ応答もまた維持した。
【０１２３】
c)保護動物および感染動物におけるFeLV特異的IFNγ産生細胞およびIL-10産生細胞の頻度
p27抗原血症結果に従って、保護動物および感染動物を同定した。各群内で保護動物と感染動物を分離し(図29)、ワクチン接種後にIFNγ/IL-I0 SFC比が保護を示すことができるかどうかを評価するために、各部分群に関してIFNy/IL-I0比を算出した。
vCP2296ワクチン接種群において、10頭のネコのうち4頭のネコが、高いIFNγ応答および低いIL-10応答に関連する高いIFNγ/IL-I0比を示し、保護された。10頭のネコのうち2頭のネコは、なんらIFNγまたはIL10応答を示さず、保護された。10頭のネコのうち4頭のネコは、高いIL-10応答に関連する低いIFNγ/IL-I0比を示した。これらのネコのうち3頭は、高いIFNγ応答を示したが、それらのうち1頭は任意のIFNγ応答を示さなかった。これらのネコは保護されなかった。
vCP2295ワクチン接種群において、10頭のネコのネコのうち8頭のネコは、高いIL-10応答および低いIFNγ応答に関連する低いIFNγ/IL-10比を示した。それらのうち6頭は感染し、それらのうち2頭は保護された。10頭のネコのうち2頭はIFNγ応答およびIL-10応答の両方を示し、高いIFNγ/lL-10比を示した。これらのネコは保護された。
vCP2295ワクチン接種群またはvCP2296ワクチン接種群のいずれかからの保護されたネコは、感染したネコと比較して、血液における高いIFNγ/IL-10比を示した(図26)。さらに、vCP2296ワクチン接種群からの保護されたネコは、vCP2295ワクチン接種群からの保護されたネコと比較して、高いIFNγ/IL-10 SFC比を有する。
保護は、IFNγ/IL-10比の増加と関連性を示し、vCP2296ワクチン接種からの保護されたネコは、vCP2295でワクチン接種されたネコと比較して、IFNγ産生に偏ったFeLV特異的細胞性免疫を引き起こした。
【０１２４】
結論
vCP2296(最適化ENV遺伝子)をワクチン接種されたネコの60パーセントは、持続性抗原血症に対して保護され、vCP2295(天然ENV遺伝子)をワクチン接種されたネコの40%は、持続性抗原血症に対して保護された。3つの群の比較は、ワクチン接種群とワクチン非接種群の間の保護の有意差および、最適化ENV遺伝子(vCP2296)をワクチン接種された群Bと天然ENV遺伝子(vCP2295)をワクチン接種された群Aの間の有意差の傾向を示した。
プロウイルス血症と抗原血症結果とは良い相関を示した。持続性抗原血症ネコは、本研究の終わりまで、重篤な持続性プロウイルス血症を示した。非抗原血症ネコは、より弱い退行したプロウイルス血症を示した。P27陰性ネコはプロウイルス血症を抑制することができた。ワクチン接種相およびチャレンジ相中の、FeLV特異的IFNγ産生細胞およびIL-l0産生細胞の誘導によるvCP2295ワクチン接種とvCP2296ワクチン接種の間の差異が明らかにされた。FeLVカナリーポックスワクチンによるFeLV特異的IFNγ産生細胞の誘導、特にENV遺伝子がその免疫抑制配列において変異した場合(vCP2296)の誘導が明らかにされた。興味深いことに、vCP2296ワクチン接種によって誘導されたこれらのIFNγ産生FeLV特異的細胞は、チャレンジ後100日を超えてなお検出され、vCP2296ワクチン接種がFeLV特異的記憶T細胞の生成を誘導したことが明らかになった。逆に、vCP2295は、FeLV特異的IL-l0産生細胞の分化をより強力に誘導した。ワクチン接種後に、vCP2295ワクチン接種ネコにおいて、vCP2296および非ワクチン接種対照ネコと比較して、FeLV特異的IL-l0産生細胞の頻度は高かった。IL-l0は、免疫応答の抑制またはその停止に関与するその特性が知られている。ワクチン接種後の高いFeLV特異的IFNγ/IL-10 SFC比は、保護(抗原血症によって評価した)と相関していた。高いIFNγ/IL-l0比および低いIL-l0応答を示すすべてのネコは保護された。この観察は、IL-l0産生細胞の免疫抑制的役割とIFNγ産生細胞の抗ウイルス機能に潜在的に一致していた。vCP2296ワクチンにおけるENV遺伝子の修飾は、この構築物の免疫抑制を低下させ、vCP2295における天然ENV遺伝子と比較して、この構築物の免疫学上の利点を提供する。
【０１２５】
FeLVのENV遺伝子の修飾は、持続性抗原血症に対するより優れた防御と関連する、異なる性質の免疫応答をもたらすことを本研究は示した。FeLVのENV遺伝子の修飾は、天然ENV FeLV遺伝子での同じ構築物よりも低投与量で作用するカナリーポックス-FeLVを可能にする。
【０１２６】
記載された本方法の正確な詳細は、記載された開示の精神から逸脱することなく変更または修飾が可能であることは明らかであろう。我々は、下記の特許請求の範囲の範囲および精神の範囲内であるこのような修飾および変更をすべて請求する。
本明細書で引用または参照された全ての文書（“本明細書引用文書”）並びに本明細書引用文書中で引用または参照された全ての文書は、本明細書または参照により本明細書に含まれる一切の文書に記載された一切の製品についての一切の製造業者による指示、記載、製品明細書およびプロダクトシートとともに参照により本明細書に含まれ、さらに本発明の実施に利用することができる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図５−９】
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【図５−１０−１】
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【図５−１０−２】
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【図５−１１】
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【図５−１２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６ａ】
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【図２６ｂ】
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【図２７】
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【図２８ａ】
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【図２８ｂ】
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【図２９】
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【図２】
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【図４】
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【図５−１−１】
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【図５−１−２】
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【図５−２−１】
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【図５−２−２】
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【図５−３−１】
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【図５−３−２】
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【図５−４−１】
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【図５−４−２】
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【図５−５−１】
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【図５−５−２】
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【図５−６−１】
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【図５−６−２】
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【図５−７−１】
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【図５−７−２】
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【図５−８】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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