(57)【要約】  本発明は、好中球におけるアポトーシスを誘導するための、ＣＤ８９活性化分子、具体的には、Ｆｃαを含む分子、そしてより具体的には、ＩｇＡの使用に関する。これに代えて、抗ＣＤ８９抗体を使用することができる。ＣＤ８９活性化は、自己免疫障害、炎症障害、ネトーシス（NETosis）、又は嚢胞性線維症などの好中球の増加に関連する種々の疾患の処置に有益である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
好中球におけるアポトーシスを誘導するのに使用するためのＣＤ８９活性化分子。
【請求項２】
Ｆｃα又はその機能的な等価物を含んでなる分子である、請求項１に記載のＣＤ８９活性化分子。
【請求項３】
免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）である、請求項２に記載の分子。
【請求項４】
ＩｇＡが、血清又は血漿由来である、請求項３に記載のＩｇＡ。
【請求項５】
ＩｇＡが、二量体である、請求項３又は４に記載のＩｇＡ。
【請求項６】
ＩｇＡが、単量体である、請求項３又は４に記載のＩｇＡ。
【請求項７】
ＩｇＡ二量体が、Ｊ鎖を含んでなる、請求項５に記載のＩｇＡ。
【請求項８】
ＩｇＡ二量体が、分泌成分を含んでなる、請求項７に記載のＩｇＡ。
【請求項９】
ＩｇＡが、単量体及び二量体のＩｇＡを含んでなる、請求項３又は４に記載のＩｇＡ。
【請求項１０】
ポリクローナルである、請求項３〜９のいずれか１項に記載のＩｇＡ。
【請求項１１】
モノクローナルである、請求項３、又は５〜９のいずれか１項に記載のＩｇＡ。
【請求項１２】
ＩｇＡが、ＩｇＡ１若しくはＩｇＡ２、又はその混合物である、請求項３〜１１のいずれか１項に記載のＩｇＡ。
【請求項１３】
抗ＣＤ８９抗体、好ましくはモノクローナル抗体である、請求項１に記載のＣＤ８９活性化分子。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＣＤ８９活性化分子を含んでなる医薬組成物であって、組成物中のタンパク質の少なくとも５０％がＣＤ８９活性化分子である、上記医薬組成物。
【請求項１５】
好中球が、自己免疫障害又は炎症性状態に罹患している患者内に含まれている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＣＤ８９活性化分子。
【請求項１６】
自己免疫障害又は炎症性状態が、無菌性好中球性炎症、感染性炎症、好中球誘発炎症、炎症性腸疾患及びネトーシス（ＮＥＴｏｓｉｓ）から選択される、請求項１５に記載のＣＤ８９活性化分子。
【請求項１７】
自己免疫障害が、関節炎、特に関節リウマチ、脊椎関節炎、強直性脊椎炎／ベヒテレフ病（ankylosing spondylitis/Morbus Bechterew）、又は反応性関節炎である、請求項１５に記載のＣＤ８９活性化分子。
【請求項１８】
ＣＤ８９活性化分子が局所的に投与される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＣＤ８９活性化分子。
【請求項１９】
好中球が嚢胞性線維症に罹患している患者内に存在する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＣＤ８９活性化分子。
【請求項２０】
好中球のアポトーシスを誘導する方法であって、好中球を有効な量の請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＣＤ８９活性化分子と接触させることを含んでなる、上記方法。
【請求項２１】
好中球が、炎症性サイトカイン又は細菌菌体成分（例えば、ＬＰＳ）などの炎症性刺激物によってプレ活性化されている、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好中球におけるアポトーシスを誘導するための、ＣＤ８９活性化分子（ＣＤ８９活性化分子：CD89 activating molecules）、具体的には、Ｆｃαを含む分子、より具体的には、ＩｇＡの使用に関する。これに代えて、抗ＣＤ８９抗体を使用することができる。ＣＤ８９活性化は、自己免疫障害、炎症障害、ＮＥＴｏｓｉｓ（ネトーシス）、又は嚢胞性線維症などの好中球の増加に関連する種々の疾患の処置に有益である。
【背景技術】
【０００２】
好中球は、自然免疫系の不可欠な部分を形成している。それらは通例、血流中に見出される。炎症、例えば、細菌感染の結果としての急性段階の間では、好中球は、感染又は炎症部位において活性化された内皮細胞、マスト細胞及びマクロファージによって放出されるサイトカイン／ケモカインによって引き寄せられて、走化性によって炎症部位に移動する。好中球はまた、他の細胞種によって炎症反応を増幅するサイトカインを発現し、そして放出する。好中球は、貪食、脱顆粒を用いて侵入病原体に対する防御においてキーとなる役割を演じ、その結果可溶性の抗菌因子が放出され、そしてクロマチン、及び病原菌を細胞外で捕捉して殺すセリンプロテアーゼなどの顆粒タンパク質から構成される網目状の線維から成る好中球細胞外トラップ（neutrophil extracellular traps （ネット：ＮＥＴ））が形成される。ＮＥＴはまた、病原体を捕捉し、それらの更なる伝播を防止することができる。好中球はしばしば、マクロファージによってそれ自身貪食される。
【０００３】
免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）は、獲得粘膜免疫の中心的存在に相当する粘膜面における重要な抗体の種類である。分類不能型免疫不全症（common variable immunodeficiency（CVID））、あるいは完全なＩｇＡ欠損症（complete IgA deficiency）などの全部又は一部のＩｇＡの欠損に関連する疾患は、再発性気道感染症及び胃腸感染症、気管支拡張症及び自己免疫疾患と関連している。こうした免疫病理学的な状態の急性状態における一般的な１つの知見は、毒性メディエーター及び分解酵素の放出によって実質的に付随する組織の損傷が引き起こされる好中球浸潤である。それ故、好中球は多くの有益な機能を有しているけれども、それらはまた、初期の刺激が除去されるときに事実上除去されない場合には、顕著な損傷を引き起こす場合がありうる。
【０００４】
このＩｇＡ受容体ＣＤ８９（ＦｃαＲ）は、病原体に対する免疫学的応答を仲介する、好中球、単球、マクロファージ及び好酸球などの骨髄細胞系列細胞の表面に存在する膜貫通糖タンパク質である。これは、ＩｇＡオプソニン化標的（IgA-opsonised targets）と相互作用し、そして食作用、抗体依存−細胞媒介細胞傷害、炎症メディエーターの放出、及び呼吸バースト活性（respiratory burst activity）のトリガーになることなどの免疫学的防御過程を誘発する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは現在、驚くべきことに、具体的には、ＩｇＡのようなＦｃαを含む分子、又は抗ＣＤ８９抗体によってＣＤ８９を活性化することによって、好中球におけるアポトーシスを誘導することができ、そして好中球が、例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）又はリポタイコ酸（lipoteichoic acid:ＬＴＡ）のような微生物成分、あるいはＧＭ−ＣＳＦ又はＴＮＦ−αなどのサイトカインでプレ活性化（pre-activated）されるとき、この活性化が増強されることを見出した。この所見は、慢性好中球性炎症、例えば、自己免疫性炎症状態、過剰ＮＥＴｏｓｉｓ(ネトーシス）を含む状態、化膿を伴う慢性感染症、又は、病初に感染症部位に好中球の動員をもたらす感染症の消散後、持続し、あるいは慢性になる場合がありうる、無菌性好中球性炎症（sterile neutrophil-mediated inflammation）の状態を含む疾患の処置に大いに関連している。それ故、この発明では、ＣＤ８９を活性化することが、好中球におけるアポトーシス経路の活性化によって、実際に炎症を抑制することになる。
【０００６】
それ故、本発明の一局面は、好中球、好ましくは、プレ活性化された好中球におけるアポトーシスを誘導する際に使用するＦｃαを含む分子、又は抗ＣＤ８９抗体などのＣＤ８９活性化分子である。好ましくは、Ｆｃαを含む分子は、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）である。ＩｇＡは、ポリクローナルでありえ、そしてそれは血清又は血漿、好ましくは、ヒトの血清又は血漿に由来することができる。このＩｇＡは、例えば、二量体であっても、それとも単量体であっても、それともその混合物であってもよい。二量体ＩｇＡはまた、Ｊ鎖を含むことができ、これに加えて分泌成分を含むことができる。モノクローナルＩｇＡの使用もまた意図されている。このＩｇＡは、ＩｇＡ１でも、それともＩｇＡ２でも、それともその混合物でもよい。好ましくは、このＩｇＡは、ヒトであり、しかしながら、霊長類のＩｇＡもまた使用することができる。血清又は血漿由来の二量体ＩｇＡはまた、分泌成分、好ましくは組み換え分泌成分、更により好ましくは、ヒト組み換え分泌成分と結合することができる。ＩｇＡの四量体形態もまた、時折生じることがありうる。
【０００７】
Ｆｃαを含む分子はまた、Ｆｃαそれ自体であっても、それともその機能的な変異体（例えば、テール−トランケート形態、Ｃ末端アミノ酸残基の一部欠如、例えば、１８ Ｃ−末端アミノ酸残基（18 C-terminal amino acid residues）（Pleass, RJ et al, J. Biol. Chem. 274, 23508-23514, 1999を参照されたい）であってもよいが、好ましくは、それはＩｇＡ又はその機能的な変異体のＦｃ部分と、別のタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンなどのアルブミンとの融合タンパク質である。しかしながら、他の可溶性タンパク質もまた、融合パートナーとして使用することができる。これに加えて、一本鎖（single-chain）Ｆｃα部分、又はＦｃαの機能的変異体の一本鎖バージョン、並びにこうした一本鎖Ｆｃα部分の二量体又は多量体も意図されている。我々が、この明細書中でＦｃαに言及する場合には、Ｆｃαの機能的変異体（例えば、テール−トランケート形態及び／又は他の機能的変異体、例えば、ＣＤ８９活性化活性の喪失をもたらさない、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失又は挿入を有するＦｃα分子）もまた、用語“Ｆｃα（Fc-alpha）”に包含されていることを意味している。
【０００８】
機能的変異体は、オリジナル分子のＣＤ８９活性化活性の少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０％、５０％、又は６０％、より好ましくは、少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、更により好ましくは、少なくとも９８％を、最も好ましくは全活性を維持する分子である。また、この機能的変異体は、ＣＤ８９活性化活性を高めうるであろうことが意図されている。
【０００９】
抗ＣＤ８９は、ＣＤ８９若しくはそのフラグメント、抗ＣＤ８９抗血清からの精製抗体若しくはそのＣＤ８９結合フラグメント、又はモノクローナル抗ＣＤ８９抗体若しくはそのＣＤ８９結合フラグメントで免疫化することにより生成される抗血清でありうる。好ましくは、モノクローナル抗ＣＤ８９抗体が使用される。一旦所望の活性を有するモノクローナル抗体が同定されると、モノクローナル抗体と同じ効果を有する模倣薬を生成することができる。
【００１０】
本発明の別の局面は、ＣＤ８９活性化分子、好ましくは、上記に述べられている、Ｆｃαを含む分子又は抗ＣＤ８９抗体を含んでなる医薬組成物であって、該医薬組成物は、組成物中のタンパク質の少なくとも５０％は、Ｆｃαを含む分子又は抗ＣＤ８９抗体である。好ましくは、タンパク質の少なくとも６０％、より好ましくは、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％、最も好ましくは、少なくとも９８％は、Ｆｃαを含む分子又は抗ＣＤ８９抗体である。
【００１１】
本発明の別の局面では、ＣＤ８９活性化分子、好ましくは、Ｆｃαを含む分子又は抗ＣＤ８９抗体で処置される好中球は、自己免疫障害又は炎症状態、特に慢性好中球性炎症状態に罹患している患者中に見出される。自己免疫障害又は炎症状態の例には、無菌性好中球性炎症、例えば、胸腔蓄膿、又は子宮（子宮膿腫）などの他の窩洞内の蓄膿、感染性炎症、例えば、膿を伴う髄膜炎、嚢胞性線維症、気管支拡張症、好中球誘発性炎症（neutrophil-induced inflammation）、ＮＥＴｏｓｉｓ（ネトーシス）、関節炎、特に関節リウマチ、脊椎関節炎、強直性脊椎炎／ベヒテレフ病（ankylosing spondylitis/Morbus Bechterew）、又は反応性関節炎（例えば、ライター病）がある。更なる例には、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの好中球によって主として媒介される他の炎症性状態が含まれる。
【００１２】
本発明の別の局面では、ＣＤ８９活性化分子、好ましくは、Ｆｃαを含む分子又は抗ＣＤ８９抗体は、好中球の数が増加した部位に、例えば、関節炎患者の病変関節の中に、特に関節リウマチ患者の病変関節中に、あるいは無菌又は感染炎症部位に、あるいは慢性好中球性炎症部位に局所的に投与される。
【００１３】
好中球はまた、ＮＥＴｏｓｉｓ（ネトーシス）、すなわち、過剰なＮＥＴ（好中球細胞外トラップ）形成が、閉塞性肺機能障害と関連している嚢胞性線維症に罹患している患者の肺の中に見出すことができる。こうした場合には、ＣＤ８９活性化分子、好ましくは、Ｆｃαを含む分子を吸入によって投与するのが有利である。好ましくは、これはＤＮアーゼ（DNase）と組み合わせて投与される。
【００１４】
これに加えて、ＮＥＴｏｓｉｓ（ネトーシス）は、子癇前症（preeclampsia）、敗血症性ショック及び自己免疫性血管炎などの他の自己炎症性状態の発病機序に関連している可能性がある。それ故、本発明の別の局面は、こうした状態の処置に使用するための、好ましくは、こうした状態に罹患している患者に見出される好中球、望ましくは、活性化された好中球におけるアポトーシスの誘導において使用するための、Ｆｃαを含む分子、特に、ＩｇＡ、あるいは抗ＣＤ８９抗体である。
【００１５】
本発明の別の局面は、好中球のアポトーシスを誘導する方法であって、好中球を有効な用量の、Ｆｃαを含む分子又は抗ＣＤ８９抗体などのＣＤ８９活性化分子と接触させることを含んでなる、上記方法である。好ましくは、この好中球は、ＣＤ８９活性化分子と接触させる前、又はその間に、炎症性サイトカイン又は微生物産物（microbial products）又は他の刺激に曝されているか、あるいは曝される。
【００１６】
Ｆｃαを含む分子の有効な量は、血漿におけるＩｇＡの濃度を超えていてもよく、好ましくは、ＩｇＡ血漿濃度の約３倍、より好ましくは、ＩｇＡ血漿濃度の約１０倍、１５倍、又は２０倍、又は更に高くてもよい。
【００１７】
ＣＤ８９活性化分子、好ましくは、Ｆｃαを含む分子又は抗ＣＤ８９抗体は、好ましくは、１つ又は複数の製薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物中に含まれる。これに加えて、この組成物は安定化剤を含んでなることができる。
【００１８】
投与経路は、静脈内、皮下、吸入、鼻内、局所（すなわち、消化管若しくは眼（点眼薬として投与される）を含む皮膚又は粘膜面）、経口でありうるが、好ましくは、投与は局所的に、すなわち、過剰な好中球の浸潤又は活性部位に、例えば、関節炎の関節中に、嚢胞性線維症の場合には吸入によって、無菌感染症などの部位には注入によって行うことができる。投与剤形は、錠剤、カプセル、クリーム、坐薬であってもよいが、好ましくは、滅菌液剤である。生成物は凍結乾燥形態で提供され、使用前に液剤形態にもどしてもよいし、あるいは安定な液剤製剤として提供されてもよい。
【００１９】
本発明の別の局面は、抗炎症性化合物、例えば、ＮＳＡＩＤｓ、抗ＣＤ２０（例えば、リツキサン）、抗ＴＮＦ−α（例えば、レミケード、ヒュミラ）などの免疫応答をモジュレートすることができる抗体、抗生物質、ガンシクロビルなどの抗ウイルス性化合物、ボリコナゾールなどの抗真菌性化合物、又は抗原虫性化合物などの他の治療剤と組み合わせて使用される、Ｆｃαを含む分子又は抗ＣＤ８９抗体などのＣＤ８９活性化分子である。
【００２０】
Ｆｃαを含む分子は、例えば、血清又は血漿から、好ましくは、ヒト血清又は血漿から単離されるポリクローナルＩｇＡでありうる。より好ましくは、これは、ヒト血漿のプールから精製される。更により好ましくは、これは、ヒト血漿画分及び／又は、それに続く血漿タンパク質の精製の副産物として、最も好ましくは、プールされたヒト血漿からＩｇＧ調製物（例えば、ＩＶＩｇ又はＳＣＩｇ）を製造する間に生成される副画分（side fraction）から、及び／又は、血漿からＩｇＧ調製物を製造する間に得られた沈殿物から精製される。
【００２１】
好ましくは、ＩｇＡ二量体は、ヒトプール血漿から単離（又は、濃縮）される。より好ましくは、こうした二量体は更に、分泌成分、例えば、組み換え的に生成された分泌成分と結合される。この結果生じる分泌型ＩｇＡは、プロテアーゼのレベルが高い環境、例えば、関節炎の関節の滑液、又は炎症を起こしている肺若しくは消化管でより安定性が向上する可能性がある。大部分の好中球顆粒タンパク質はプロテアーゼであるので、これはこの発明を行なう特に好ましい方法でありうる。
【００２２】
これに代えて、ＩｇＡはモノクローナルでありうる。モノクローナルＩｇＡは、発現プラスミド中に適切なプロモーター及び所望により更に調節エレメントと共に軽鎖及び重鎖のｃＤＮＡを含んでなる、ハイブリドーマ細胞株、又は遺伝子操作された細胞株によって産生することができる。当業者であれば、ハイブリドーマを作製する方法（例えば、ＩｇＡ産生Ｂリンパ球の細胞融合又は不死化による）を十分認識している。抗体の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡを単離する方法、及び適切な発現ベクター中にこうしたｃＤＮＡをクローニングする方法はまた、当技術分野で周知である。次いで、この発現ベクターを細胞株、例えば、ＣＨＯ細胞又はＨＥＫ２９３細胞などの哺乳類細胞株にトランスフェクトすることができ、そして所望の抗体を安定に発現する細胞株を選択することができる。適切な技術は、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM et al. (eds.) John Wiley & Sons,Inc.；http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/中に見出すことができる。用語“ＩｇＡ”がこの明細書中で使用されるときには、ＩｇＡの機能的変異体、例えば、ＣＤ８９活性化活性の喪失をもたらさない１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を有するＩｇＡもまた包含されることを意味している。
【００２３】
Ｆｃαを含む分子はまた、遺伝子操作による融合タンパク質でありうる。例えば、ＩｇＡ重鎖のＦｃα部分をコードするｃＤＮＡは、別のタンパク質、好ましくは、可溶性タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンをコードするｃＤＮＡとフレーム内で融合する。適切なＦｃα ｃＤＮＡ配列の例は、配列番号１及び２中に示されている。
【００２４】
Ｆｃαを含む分子はまた、一本鎖Ｆｖフラグメントを遺伝子操作する方法と同様にして、２つのＦｃα ｃＤＮＡｓが、リンカーペプチドをコードする核酸によって連結される一本鎖Ｆｃαタンパク質でありうる（Woern A, Plueckthun A. J. Mol. Biol, 2001; 305:989-1010）。２つ又はそれより多いこうした一本鎖Ｆｃαタンパク質はまた、結合してＦｃαユニットの二量体又は多量体を形成することができる。こうした分子は、通例行なわれている技法（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM et al. (eds.) John Wiley & Sons, Inc.；http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/中に記載されている）によって生成することができる。例えば、ＩｇＡの重鎖のＦｃα部分は、適切な制限部位を含むように設計されているプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによって、ＩｇＡを産生する細胞から増幅することができる。次いで、この結果生じるｃＤＮＡを相当する制限酵素（複数を含む）で消化し、そして適切に調製された発現ベクター中にクローニングすることができる。リンカーペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチドは、例えば、ｃＤＮＡを適切な制限酵素で消化し、そしてオリゴヌクレオチドを適切に設計された末端でベクター中にライゲートすることによって適切な位置に挿入することができる。次いで、コンプリート発現プラスミドを、標準的な技法を用いて、例えば、大腸菌（E.coli）中で多量作製することができる。精製後、これを哺乳類細胞にトランスフェクトし、そして所望のタンパク質を安定に発現する細胞株を作製することができる。次いで、このタンパク質を精製することができる。標準的な技法はこうした手順を行なうのに利用可能である。
【００２５】
例えば、ＩｇＡ１の重鎖に起源する１つの定常ドメイン、及びＩｇＡ２の重鎖に起源する１つの定常ドメインを含んでなるキメラＦｃα部分もまた、意図されている；当業者であれば、この免疫グロブリンドメインを十分認識しており、そしてドメイン境界を識別し、免疫グロブリンドメインを所望の通りに結合させることができる。Ｆｃα部分と、Ｊ鎖との組み合わせもまた含まれる；これに加えて、この結果生じる分子はまた、分泌成分と結合することができる。上記に述べられている如く、Ｆｃαの機能的フラグメント及び機能的変異体もまた使用することができる；融合タンパク質、二量体、多量体、そうした機能的変異体と、Ｊ鎖との、又はＪ鎖及び分泌成分との組み合わせもまた含まれる。
【００２６】
好ましい分泌成分は、少なくとも、１つのヒト多量体免疫グロブリン受容体（ｐＩｇＲ）アミノ酸配列又はその変異体、例えば、異なる哺乳類種に起源する類似の部分のアミノ酸残基１〜残基約６０６の断片を含む。しかしながら、ヒトの配列が好ましい。このヒトｐＩｇＲのタンパク質配列は、スイスプロットアクセッション番号Ｐ０１８３３のもとで見いだすことができる（Krajci et al, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm 158, 783-789もまた参照されたい）。
【００２７】
これに代えて、ＣＤ８９活性化タンパク質は、抗ＣＤ８９でありうる。当業者であれば、抗ＣＤ８９を作製する方法を十分認識している。ＣＤ８９、又はそのフラグメントは、特異的な抗血清を作製するための抗原として使用できる。抗体は、こうした抗血清から単離することができる。モノクローナル抗体もまた作製することができ、そしてそうしたモノクローナル抗体を作製する方法は当業者に周知である。好ましくは、モノクローナル抗ＣＤ８９抗体は、ヒト抗体であり、例えば、該抗体は、不死化されたヒトＢリンパ球から作製されるか、あるいは動物において作製され、動物自身の免疫グロブリン遺伝子が対応するヒト遺伝子によって少なくとも一部分置き換えられる。抗体の作製のために使用される技法は、周知であり、様々な研究室マニュアル、例えば、Ed Harlow & David Lane: Antibodies, A Laboratory Manual, or Sambrook et al: Molecular Cloning, A Laboratory Manual（双方ともＣＳＨＬから）中に詳細に記載されている。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明を、以下の実施例中で例示する。この実施例は本発明を行なう方法の説明として意図されており、本発明を制限するものと考えてはならない。
【００２９】
実施例：好中球におけるアポトーシスの誘導
材料と方法
抗体：抗ＣＤ８９（クローン Ａ５９）（非標識及びフィコエリスリン［ＰＥ］コンジュゲート（phycoerythrin[PE]-conjugated）の双方）、及びＰＥコンジュゲート免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）アイソタイプ・コントロールは、BD Biosciences社（Basel, Switzerland）からのものであった。ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＧａＭ）及び非標識コントロールＩｇＧ１は、Jackson ImmunoResearch Laboratories（Milan Analytica, La Roche, Switzerlandによって販売）から得た。抗ＦａｓアゴニストｍＡｂ（ＣＨ１１）は、LabForce AG（Nunningen, Switzerland）から得た。プールした血清ＩｇＡをCSL Behring AG（Wankdorf, Bern）から得、そして次のように調製した：ＩｇＡを、ＢＡＣ（Naarden, Netherlands）からのCaptureSelectヒトＩｇＡレジンを用い、アフィニティクロマトグラフィーによって、ヒト血漿及びＩＶＩｇ／ＳＣＩｇ製造方法の副画分から精製した。簡潔に述べれば、低温除去ヒトプール血漿（cryo-depleted human pool plasma）又は副画分を、生理学的条件近辺（ｐＨ，伝導性）のもとでカラムのＩｇＡ結合能を超えずに、平衡化ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔヒトＩｇＡカラム上にローディングした。ローディング後、このカラムをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、そしてＩｇＡをｐＨ３で、グリシンバッファーで溶出した。溶出液をｐＨ校正し、そして５０ｍｇ／ｍｌタンパク質まで濃縮した。単量体ＩｇＡを上記に述べられているようにして得た血漿ＩｇＡから分取サイズ排除クロマトグラフィーによって、例えば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲルレジンを用いて精製することができる。
【００３０】
細胞：血液好中球は、健常個体及び急性関節炎症に関連する関節リウマチ（ＲＡ）に罹患している患者から単離した。簡潔に述べれば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Seromed-Fakola AG, Basel, Switzerland）によって遠心分離によって分離した。主として顆粒球及び赤血球である下相を、赤血球溶解液（１５５ｍＭ
ＮＨ4Ｃｌ，１０ｍＭ ＫＨＣＯ3，及び０．１ｍＭ ＥＤＴＡ［エチレンジアミン四酢酸］，ｐＨ ７．３）で処理した。この結果生じた細胞集団は、大部分は好中球を含んでいた。ＲＡに罹患している患者からの関節液の好中球を同じプロトコルを用いて単離した。細胞純度を、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ（Baxter, Duedingen, Switzerland）で染色し、そして光学顕微鏡分析によって評価した。この結果生じた集団の純度は、好中球は、少なくとも９５％であった。
【００３１】
免疫蛍光：ＣＤ８９の表面発現を、ＰＥコンジュゲート抗ＣＤ８９及びアイソタイプのマッチしたＰＥコンジュゲートコントロールｍＡｂの飽和濃度で細胞をインキュベーションした後、フローサイトメトリーによって解析した。
【００３２】
細胞培養：好中球を、サイトカイン又はＬＰＳ及び／又は抗体の存在下若しくは不存在下で、指示された時間、完全培養培地（１０％ ウシ胎児血清［ＦＣＳ］及び２００ＩＵ／ｍＬ ペニシリン／１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０，すべてLife Technologies, Basel, Switzerlandから）を用いて、１×１０6／ｍＬで培養した。別途指示のない限り、細胞は、１７．５μｇ／ｍＬ 抗ＣＤ８９ｍＡｂ又は１０ｍｇ／ｍｌ 血漿ＩｇＡで刺激された。ＧＭ−ＣＳＦ（Novartis Pharma GmbH, Nuernberg, Germany）は、２５ｎｇ／ｍＬで、抗Ｆａｓ ｍＡｂ（ＣＨ１１）は、１μｇ／ｍＬで用いた。ＬＰＳ（Sigma Aldrich, Buchs, Switzerland）は、１００ｎｇ／ｍｌで用いた。ヤギ抗マウス（Goat anti-mouse）は、３０μｇ／ｍｌで、Ｇ−ＣＳＦ（Aventis Pharma, Zurich, Switzerland）は、２５ｎｇ／ｍＬで、ＩＦＮ−γ（R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany）は、８５ｎｇ／ｍＬで、ＩＦＮ−α（PBL Biomedical Laboratories, Alexisによって販売）は、５００Ｕ／ｍＬで、ＴＮＦ−α（R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany）は、２５ｎｇ／ｍＬで、そしてＬＴＡ（T. Hartung University of Konstanzからの寄贈）は、１０μｇ／ｍＬで用いた。カスパーゼ阻害剤 ｑＶＤ−ＯＰｈ（キノリン−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ジフルオロフェノキシメチルケトン）は、２０μＭで用いた。
【００３３】
細胞死及びアポトーシスの判定：細胞死は、１μＭ 臭化エチジウムの取り込み、及びフローサイトメトリー解析（FACSCalibur, Becton Dickinson）によって評価した。細胞死の形態を判定するために、形態学的解析（morphologic analysis）及びアネキシンＶ解析を行なった。形態学的解析の場合には、細胞を１５時間培養し、そしてGiemsa-May-Gruenwald（Diff-Quik）で染色した。６３０／１．４ 油浸（ｏｉｌ）対物レンズを備えたAxiovert 35顕微鏡を用いた（Carl Zeiss, Heidelberg, Germany）。画像をAdobe Photoshop 5.0ソフトウェア（Adobe, San Jose, CA）を用いて処理した。細胞死がアポトーシスであるか否かを判定するために、好中球メンブレン上のホスファチジルセリン（ＰＳ）の再分布（redistribution）を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Gunten S et al., Blood 2005; 106:1423-1431から）の存在下で、アネキシンＶ染色及びフローサイトメトリー（FACSCalibur, Becton Dickinson）によって、市販のアポトーシス検出キットを用いて製造業者のプロトコル（BD Biosciences）に従って測定した。アポトーシスの典型的な顕著な特徴であるＤＮＡ断片化を検出するために、細胞を低張蛍光色素液（５０μｇ／ｍｌ ヨウ化プロピジウム，０．１％ クエン酸ナトリム，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）によって透過性処理すると、細胞からのＤＮＡ多量体（１８２ ｂｐ）の漏出がもたらされる。次いで、この残存している、減少した量のＤＮＡをＤＮＡインターカレート剤、ヨウ化プロピジウムによって染色し、そしてフローサイトメトリーによって解析した（Nicoletti I et al., J Immunol. Methods 1991;139:271-279）。
【００３４】
統計的解析：統計的解析を、スチューデントのｔ検定を用いることによって行なった。平均レベルが提示される場合には、平均の標準誤差（ＳＥＭ）及び独立した実験の数（ｎ）がそれぞれの場合に指摘される。０．０５未満の確率値が統計的に有意であると見なされた。
【００３５】
実施例１：ＬＰＳ又はＧＭ−ＣＳＦを用いての刺激に対する好中球のＣＤ８９発現
好中球を上記に述べられているように健常者ボランティアの血液から単離した。細胞を炎症性刺激物（１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ又は１０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ）の存在下、又は不存在下で８時間インキュベートした。次いで、この細胞をフィコエリスリン（ＰＥ）標識抗ＣＤ８９又はＰＥ標識アイソタイプマッチコントロール抗体と共にインキュベートした。次にＣＤ８９発現をフローサイトメトリーによって評価した。
【００３６】
好中球は、炎症性刺激物の不存在下でＣＤ８９を発現し（図１Ａ）、そして細胞をＬＰＳ（図１Ａ、左のパネル）又はＧＭ−ＣＳＦ（図１Ａ、右のパネル）のような炎症性刺激物の存在下でインキュベートすると、ＣＤ８９の発現が増加した。コントロール抗体を用いて染色した細胞のプロフィルもまた示されている。
【００３７】
図１Ｂは、ＬＰＳ及びＧＭ−ＣＳＦでのＣＤ８９アップレギュレーションの時間的経過を示す。発現の有意なアップレギュレーションが４時間後に観察された。
【００３８】
実施例２：ＣＤ８９ライゲーションは好中球細胞死を刺激する
好中球を上記に述べられているように単離した。次いでこの細胞を、それぞれ、ヤギ抗マウス抗体（ＧａＭ）の存在下、及び不存在下で、抗ＣＤ８９モノクローナル抗体、抗Ｆａｓ抗体、抗体Ｆａｓ＋抗ＣＤ８９と共にインキュベートした。細胞死を、臭化エチジウムの取り込み、及びフローサイトメトリー解析によって評価した。抗ＣＤ８９モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によるＣＤ８９のライゲーションは、好中球細胞死の有意な増加をもたらし（図２Ａ）、抗Ｆａｓによって誘導された細胞死の場合と同様であった。ＣＤ８９媒介死は、更にクロスリンキングによって有意に増強された。２２時間培養の結果を示した（ｎ＝５）。（Ｂ）２２時間の好中球培養における抗ＣＤ８９ｍＡｂの濃度作用曲線（concentration effect curve）では、１７．５μｇ／ｍｌ（ｎ＝５）において最大死作用を示した（図２Ｂ）。
【００３９】
血漿から単離されたＩｇＡ、又はモノクローナルＩｇＡ、及び他のＦｃαを含む分子は、特にＣＤ８９のクロスリンキングが行なわれる場合に、同様な作用を示すであろう。
【００４０】
実施例３：血清ＩｇＡ及びＣＤ８９は、好中球細胞死を誘導する
血液好中球を上記に述べられているように健常者ボランティアから単離した。この細胞を種々の炎症性刺激物の存在下で、１０ｍｇ／ｍｌにおいて血漿ＩｇＡ（図３Ａ）、又は１７．５μｇ／ｍｌにおいて抗ＣＤ８９ｍＡｂ（図３Ｂ）の存在下又は不存在下で、培地でインキュベートした。ＩｇＡは、活性化された好中球中で細胞死を明瞭に増加させた（図３Ａ）。同様な結果を、抗ＣＤ８９モノクローナル抗体の場合に得た（図３Ｂに示されていた）。全血漿ＩｇＡ（単量体及び二量体を含む）、及び血漿ＩｇＡの単量体副分画（monomeric subtraction）は、好中球細胞死を誘導する際に同じように有効であった（図３Ｃ）。
【００４１】
実施例４：強直性脊椎関節炎患者由来の好中球は、高いレベルのＣＤ８９を発現する
好中球を健常者ボランティア及び強直性脊椎関節炎患者の血液から単離した。次いでそれらをＰＥ標識抗ＣＤ８９ｍＡｂ又はＰＥ標識コントロール抗体と共にインキュベートし、そしてＣＤ８９発現をフローサイトメトリーによって解析した。強直性脊椎関節炎患者由来の好中球は、健常者ドナー（図４、点線）と比較してＣＤ８９の表面発現の有意な増加を示した（図４、実線）。好中球の同じサンプルのアイソタイプマッチコントロールｍＡｂでの染色の場合も示されている。
【００４２】
実施例５：患者から単離した好中球は、抗ＣＤ８９細胞死及びＩｇＡ媒介細胞死に対して感受性が増している
好中球をコントロール目的のための健常者ボランティアの血液から、そして関節炎患者（関節リウマチ、強直性脊椎関節炎、乾癬性関節炎、及び“原因不明（unknown）”の関節炎に罹患している患者）の関節／滑液から単離し、そして抗ＣＤ８９抗体の存在下又は不存在下、又は培地において２４時間培養した；その後、好中球の細胞死を上記に述べられているように解析した。抗ＣＤ８９は、関節炎患者由来の滑液の好中球における高い比率の死をもたらした。死の比率は、図５Ａに示されているように健常者ボランティアの血液からの好中球のそれと比較して有意に高かった。同じ作用は１０ｍｇ／ｍｌでの血漿ＩｇＡの場合に観察された（図５Ｂ）。
【００４３】
実施例６：パン−カスパーゼ阻害剤 ｑＶＤ−ＯＰｈは、好中球におけるＩｇＡ媒介細胞死を抑制する
好中球を上記に述べられているように健常者ボランティアの血液から単離した。次いで、この細胞を、炎症性刺激物（ＬＰＳ，ＧＭ−ＣＳＦ）の存在下、又は不存在下で、２４時間培養し、そしてＩｇＡ及び／又はパン−カスパーゼ阻害剤 ｑＶＤ−ＯＰｈ（２０μＭ）の不存在下、又は存在下で細胞死を評価した。この結果を図６に示した。このパン−カスパーゼ阻害剤 ｑＶＤ−ＯＰｈは、ＬＰＳ及びＧＭ−ＣＳＦの存在下及び不存在下の双方で血漿ＩｇＡ媒介好中球細胞死をブロックした。コントロールとして、抗Ｆａｓ ｍＡｂの場合のアポトーシス誘導及びｑＶＤ−ＯＰｈでのその抑制が示されている。こうした知見によって、ＩｇＡ媒介好中球細胞死は、カスパーゼ依存性のプログラムされた細胞死、すなわち、アポトーシスであることが示された。
【００４４】
実施例７：アネキシンＶ染色によって示される、好中球に結合するプールされた血清ＩｇＡに対してのホスファチジルセリン再分布（redistribution）
好中球を上記に述べられているように健常者ボランティアの血液から単離し、血漿ＩｇＡ又は抗ＣＤ８９ｍＡｂの存在下、又は不存在下で、培地中で、ＧＭ−ＣＳＦ又はＬＰＳを含む培地中でインキュベートした。コントロールとして好中球をアポトーシス誘導体抗抗Ｆａｓ ｍＡｂを加えてインキュベートした。６時間後、ホスファチジルセリン分布をアネキシンＶ染色及びフローサイトメトリーによって評価した。１０時間後、ＤＮＡ断片化をヨウ化プロピジウム染色及びフローサイトメトリーによって評価した。
【００４５】
ＧＭ−ＣＳＦ又はＬＰＳの存在下でプールされた血清ＩｇＡライゲーション（pooled serum IgA ligation）は、強いホスファチジルセリン再分布（図７Ａ）、そしてＤＮＡ断片化（図７Ｂ）をもたらし、双方とも好中球のアポトーシスの誘導を示している。同等な結果が、血漿ＩｇＡの代わりに、抗ＣＤ８９ｍＡｂを用いて得られた（図７Ａ、７Ｂ）。こうした散布図（scatter plots）によって、５からの１つの代表的な実験が示されている。各クワドラント（quadrant）における細胞のパーセンテージが示されている。図７Ｂでは、アポトーシス細胞の相対数（パーセンテージ）が各ヒストグラム中に示されている。
【００４６】
実施例８：ＣＤ８９媒介好中球死の形態学
好中球を上記に述べられているように健常者ボランティアの血液から単離した。それらを、抗ＣＤ８９の存在下及び不存在下で、培地だけ、ＧＭ−ＣＳＦ又はＬＰＳの存在下において１５時間培養した。それらをGiemsa-May-Gruenwald（Diff-Quik）で染色し、顕微鏡を使用することによって検討した。ＣＤ８９媒介好中球死によって、古典的なアポトーシス（細胞体積の減少、核の断片化）の典型的な形態学的特徴が示された。ＩｇＡ媒介好中球死によって、同じ形態が示されることが見込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】炎症性刺激物を用いての好中球のＣＤ８９発現の結果を示すグラフで、Ａは刺激物の不存在下、ＬＰＳ及びＧＭ−ＣＳＦの存在下の発現を示し、ＢはＬＰＳ及びＧＭ−ＣＳＦでのＣＤ８９アップレギュレーションの時間的経過を示す。
【図２】ＣＤ８９ライゲーションが好中球細胞死を刺激する結果を示すグラフで、Ａは、抗ＣＤ８９ｍＡｂ、抗Ｆａｓ、これらのクロスリンキングの結果を示し、Ｂは抗ＣＤ８９ｍＡｂの濃度作用曲線を示す。
【図３Ａ】血清ＩｇＡ及びＣＤ８９が、好中球細胞死を誘導する結果を示すグラフで、種々の炎症性刺激物の存在下でのＩｇＡの結果を示す。
【図３Ｂ】血清ＩｇＡ及びＣＤ８９が、好中球細胞死を誘導する結果を示すグラフで、ＣＤ８９ｍＡｂの存在下、非存在下での誘導の結果を示す。
【図３Ｃ】血清ＩｇＡ及びＣＤ８９が、好中球細胞死を誘導する結果を示すグラフで、血漿ＩｇＡ、血漿ＩｇＡ単量体副分画による誘導の結果を示す。
【図４】強直性脊椎関節炎患者由来の好中球が、高レベルのＣＤ８９を発現する結果を示すグラフである。
【図５Ａ】種々の関節炎の患者から単離された好中球が細胞死に対して感受性を増す結果を示すグラフで、抗ＣＤ８９細胞死に対する結果を示す。
【図５Ｂ】種々の関節炎の患者から単離された好中球が細胞死に対して感受性を増す結果を示すグラフで、ＩｇＡ媒介細胞死に対しても同様である結果を示す。
【図６】パン−カスパーゼ阻害剤がｑＶＤ−ＯＰｈが好中球における細胞死を抑制する結果を示すグラフである。
【図７Ａ】好中球に結合するプールされた血清ＩｇＡに対してのホスファチジルセリンの再分布の結果を示す図であり、ホスファチジルセリン再分布を示す。
【図７Ｂ】好中球に結合するプールされた血清ＩｇＡに対してのホスファチジルセリンの再分布の結果を示す図であり、ＤＮＡ断片化の結果を示す。
【図１】
2014502962.tif 000002
【図２】
2014502962.tif 000003
【図３Ａ】
2014502962.tif 000004
【図３Ｂ】
2014502962.tif 000005
【図３Ｃ】
2014502962.tif 000006
【図４】
2014502962.tif 000007
【図５Ａ】
2014502962.tif 000008
【図５Ｂ】
2014502962.tif 000009
【図６】
2014502962.tif 000010
【図７Ａ】
2014502962.tif 000011
【図７Ｂ】
2014502962.tif 000012
【配列表】
2014502962000001.app
【国際調査報告】
2014502962.tif 000013
2014502962.tif 000014
2014502962.tif 000015
2014502962.tif 000016