(57)【要約】バイオアッセイを行う方法が開示され、有意なシグナルを生成しない潜在形態から検出可能なシグナルを生成可能な形態に加水分解可能なシグナル前駆物質を含むカプセルを活性化するステップを有し、前記活性化ステップは、前記カプセルを熱と酸性又は塩基性の触媒溶液とにより処理するステップを含み、前記熱と前記触媒溶液のｐＨの組合せは、前記シグナル前駆物質を、検出可能なシグナルを生成可能な形態に加水分解するような組合せである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有意なシグナルを生成しない潜在形態から検出可能なシグナルを生成可能な形態へと加水分解可能なシグナル前駆物質を含むカプセルを用いるバイオアッセイにおけるシグナル生成の発動を制御する方法であって、前記カプセルは、アッセイされる試料中の標的分子を特異的に認識し結合して標的カプセル複合体を形成可能な親和性分子をその外表面に有しており、前記方法は、
（i）シグナル前駆物質の有意な加水分解を生じない温度でありかつ
（ａ）シグナル前駆物質が周囲温度にて有意な酸性触媒加水分解を生じるには高すぎるｐＨ、又は、
（ｂ）シグナル前駆物質が周囲温度にて有意な塩基性触媒加水分解を生じるには低すぎるｐＨ
のいずれかに調整されたｐＨ値をもつ調整済みｐＨ処理溶液により前記カプセルを処理するステップと、
（ii）続いて、検出可能なシグナルを生成可能な形態とするべくシグナル前駆物質の加水分解を開始するために、前記調整済みｐＨ処理溶液中の前記カプセルを加熱するステップと、を含む
シグナル生成発動制御方法。
【請求項２】
前記調整済みｐＨが、
（ａ）前記シグナル前駆物質を含む前記カプセルを異なるｐＨの周囲温度の一連の溶液に追加するステップと、
（ｂ）一連の周囲温度の溶液を励起光で照射するステップと、
（ｃ）周囲温度にて強いシグナルを出す溶液を排除するステップと、
（ｄ）周囲温度にて有意なシグナルを出さない溶液を加熱するステップと、
（ｅ）加熱後に有意なシグナルを出さない溶液を排除するステップと、
（ｆ）加熱後に強いシグナルを出す１又は複数の溶液のｐＨ値を調整済みｐＨとして認めるステップと、により予め決定される
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料中の１又は複数の標的分子の検出のためのバイオアッセイを行う方法において、
（i）前記標的分子に対する親和性を有する複数の捕捉分子を基板上に付着させるステップと、
（ii）有意なシグナルを生成しない潜在形態から検出可能なシグナルを生成できる形態へと加水分解可能なシグナル前駆物質を含むカプセルであってその外表面に、前記試料中のいずれかの標的分子を特異的に認識し結合して標的カプセル複合体を形成できる親和性分子を搭載する前記カプセルと前記試料を溶液中で混合するステップと、
（iii）前記溶液を前記基板上の前記捕捉分子と接触させていずれかの標的カプセル複合体を前記捕捉分子と結合させるステップと、
（iv）前記捕捉分子に結合した前記標的カプセル複合体から、標的分子と複合体を形成していないカプセルを分離するステップと、
（v）前記捕捉分子に結合した前記標的カプセル複合体を、請求項１のステップ（i）に記載の温度と調整済みｐＨをもつ調整済みｐＨ処理溶液により処理するステップと、
（vi）請求項１のステップ（ii）に記載の調整済みｐＨ処理溶液中の、前記捕捉分子に結合した前記標的カプセル複合体を加熱するステップと、
（vii）前記調整済みｐＨ処理溶液を、前記基板上の前記捕捉分子の近傍にて励起光により照射するステップと、
（viii）生成されたシグナルを検出するステップと、
を有するバイオアッセイを行う方法。
【請求項４】
前記調整済みｐＨ処理溶液中の前記カプセルを加熱するステップが、４０℃〜７５℃の範囲の温度に前記調整済みｐＨ処理溶液を加熱するステップを有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記調整済みｐＨ処理溶液中の前記カプセルを加熱するステップが、４５℃〜６５℃の範囲の温度に前記調整済みｐＨ処理溶液を加熱するステップを有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記調整済みｐＨ処理溶液中の前記カプセルを加熱するステップが、抵抗加熱装置、輻射加熱装置、マイクロウェーブ加熱装置、誘導加熱装置及びペルティエ素子からなる群から選択される加熱装置を用いて前記調整済みｐＨ処理溶液を加熱するステップを有する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記調整済みｐＨ処理溶液中の前記カプセルを加熱するステップが、超音波により加熱するステップを有する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記超音波が、周波数２０〜６０ｋＨｚの範囲の低周波超音波である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記超音波が、周波数１〜８ＭＨｚの範囲の高周波超音波である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記カプセルに前記調整済みｐＨ処理溶液を追加することに続いて、１００秒から５００秒の間隔の後、前記調整済みｐＨ処理溶液中の前記カプセルを加熱するステップが行われる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記カプセルに含まれる前記シグナル前駆物質が有機材料である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記カプセルが、１カプセル当たり１０７〜１０９の前記シグナル前駆物質を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記シグナル前駆物質が、加水分解性蛍光団、加水分解性発光団、加水分解性発色団、加水分解性生物発光タンパク質、及び加水分解性蛍光性タンパク質からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記シグナル前駆物質が、加水分解性蛍光団である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記シグナル前駆物質が、フルオレセイン二酢酸である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
有意なシグナルを生成しない潜在形態から検出可能なシグナルを生成可能な形態へと加水分解可能なシグナル前駆物質を含むカプセルを活性化するステップを有するバイオアッセイを行う方法において、前記活性化するステップは、前記カプセルを熱と酸性又は塩基性の触媒溶液により処理するステップを有し、前記熱と前記触媒溶液のｐＨとの組合せは、前記シグナル前駆物質を、検出可能なシグナルを生成することができる形態に加水分解するものである、
バイオアッセイを行う方法。
【請求項１７】
前記活性化するステップがさらに、前記カプセルに励起光を照射するステップを有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アッセイされるべき試料中の標的分子を特異的に認識し結合する親和性分子をその外表面上に有して標的カプセル複合体を形成可能なカプセルを用いるバイオアッセイ装置からのシグナル出力を検出するための装置であって、前記カプセルは、有意なシグナルを生成しない潜在形態から検出可能なシグナルを生成可能な形態へと加水分解可能なシグナル前駆物質を含んでおり、前記装置は、
前記カプセルを熱と酸性又は塩基性の触媒溶液により処理することにより前記カプセルを活性化可能な反応ゾーンであって、前記熱と前記触媒溶液のｐＨの組合せは、前記シグナル前駆物質を検出可能なシグナルを生成できる形態に加水分解する組合せである、前記反応ゾーンを照射するための光源と、
前記反応ゾーンにおける溶液を、前記シグナル前駆物質が加水分解を行う温度に加熱するための加熱装置と、を有する装置。
【請求項１９】
前記バイオアッセイ装置から放出される光を検出するための光学検出器をさらに有する、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
前記加熱装置は、前記触媒溶液を４０℃〜７５℃の範囲の温度に加熱することができる、請求項１８又は１９に記載の装置。
【請求項２１】
前記加熱装置は、前記触媒溶液を４５℃〜７０℃の範囲の温度に加熱することができる、請求項１８又は１９に記載の装置。
【請求項２２】
前記加熱装置は、抵抗加熱装置、輻射加熱装置、マイクロウェーブ加熱装置、誘導加熱装置及びペルティエ素子からなる群から選択される、請求項１８〜２１のいずれかに記載の装置。
【請求項２３】
前記加熱装置は、２０〜６０ｋＨｚの範囲の低周波超音波により前記触媒溶液を処理することができる超音波発生装置である、請求項１８〜２１のいずれかに記載の装置。
【請求項２４】
前記加熱装置は、１〜８ＭＨｚの範囲の高周波超音波により前記触媒溶液を処理することができる超音波発生装置である、請求項１８〜２１のいずれかに記載の装置。
【請求項２５】
前記反応ゾーンは、基板上の液体フロー経路の一部を形成する、請求項１８〜２４のいずれかに記載の装置。
【請求項２６】
前記反応ゾーンは、ラテラルフローテスト装置の液体透過性膜上にある、請求項１８〜２４のいずれかに記載の装置。
【請求項２７】
請求項１及び実質的に図１、１９、２０、２１又は２２のいずれかを参照して説明したバイオアッセイにおいてシグナル生成の発動を制御する方法。
【請求項２８】
請求項３及び実質的に図１、１９、２０、２１又は２２のいずれかを参照して説明したバイオアッセイを行う方法。
【請求項２９】
請求項１６及び実質的に図１、１９、２０、２１又は２２のいずれかを参照して説明したバイオアッセイを行う方法。
【請求項３０】
請求項１８及び実質的に図１４〜１８のいずれかを参照して説明したバイオアッセイ装置から出力されるシグナルを検出するための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオアッセイ、例えば食物中の細菌汚染を検出するための、水中での生物学的汚染物質を検出するための、又は、血液及びその成分、鼻咽頭液、尿若しくは唾液等の体液中の抗体、抗原及び核酸等の物質の存在を検出するためのバイオアッセイに関する。検出することが望まれる物質は、多くの場合、一般的に、標的又は分析物と称されている。
【０００２】
特に、本発明は、試料中の標的の存在を示す（質的な）ために、又は、試料中の標的の存在量を示す（量的な）ために、カプセル化されたシグナル生成物質を用いるバイオアッセイに関し、かつ、シグナル前駆物質を含むカプセルからのシグナル生成の発動を制御する方法に関する。そのシグナル前駆物質は、実質的にシグナルを生成しない潜在形態から検出可能なシグナルを生成することができる形態に変換可能である。より特定すると、本発明は、カプセルからのシグナル前駆物質の放出を制御し、かつ、その潜在形態からシグナル生成形態への変換を制御することに関する。以下の記載においては、このプロセスを”活性発動”と称することとする
【背景技術】
【０００３】
バイオアッセイは、検出されるべき分析物（標的）を有する少なくとも1つの標識化された生体分子の相互作用に基づいている。標識は、標的と排他的に相互作用して結合する生体分子上の意図的に選択された受容体又は親和性分子と、標的との間で反応が行われたことを示すマーカーとして機能する。標識は、多様な技術を用いて測定することができる。
【０００４】
（i）  色素の吸収若しくは蛍光団により放出される蛍光、又は、発光性若しくは化学発光性化合物により放出される発光の測定、又は、凝集ラテックス粒子の光散乱に起因する濁度の測定による、光学的測定
（ii）  放射性同位体の測定による放射能測定
（iii）  メディエーター又は電気活性物質の測定による電気化学的測定
（iv）  磁力の測定による磁気的測定
（v）  質量変化の測定による圧電的測定
【０００５】
周知の標識としては、酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で用いられる酵素と、放射免疫アッセイで用いられる放射性同位体とを含む。他の標識の種類としては、蛍光団、発光団、発色団、リポソーム、免疫凝集アッセイにおけるラテックス粒子、色素、メディエーター、及び金粒子がある。
【０００６】
本発明は、他を排除するものではないが、特に、光学的技術を用いて検出可能な標識に関し、また、最大のシグナル出力の発動を制御することに関し、それにより、シグナル出力の減衰前、又は、希釈及び／又は拡散によるシグナルの放散前の期間に、シグナルを読み取ることができ、かつ望ましくは、読み取りを繰り返すことができるようにする。
【０００７】
本発明におけるカプセル化の目的は、２つ挙げられる。１つ目は、それらのカプセルが、それらのカプセル表面上に付着し特に試料中の目標分子を特異的に認識して結合できる機能故に選択された親和性分子又は受容体のための容器若しくは基板としての役割を果たすことである。２つ目は、それらのカプセルが、シグナル前駆物質の多数の分子（１０７〜１０９又はそれ以上）を収容することである。結論として、標的分子とカプセル表面上の親和性分子とが結合し、それに続いてカプセル内のシグナル前駆物質がその潜在形態からシグナル生成形態に変換すると、何千万あるいは何十億もの検出可能なシグナル生成分子により単一の標的分子の存在を示すことができる。これは、バイオアッセイの検出限界を超えることができる非常に強力な増幅技術である。
【０００８】
バイオアッセイに使用する有機シグナル生成物質を収容するカプセルは、特許文献１により公知であり、その開示はここに参照することにより包含されるものとする。これらの公知のカプセルは、難水溶性又は非水溶性である非荷電の固体有機シグナル生成物質（フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）等）を両親媒性物質（例えば、イオン界面活性剤）で処理することにより調製される。両親媒性物質は、それ自身で固体シグナル生成物質の表面上に配列し、その表面に電荷を付与し、それに続いて荷電した高分子電解質の層により、その後に逆極性に荷電した高分子電解質の複数の交互の層により被覆されやすくする。高分子層は、静電的レイヤバイレイヤ堆積法（electrostatic layer-by-layer deposition）により、固体シグナル生成物質（両親媒性物質からの誘起電荷をもつ）上に自己形成する。このようにして固体コアの周囲に多層高分子シェルを形成する。
【０００９】
コーティング工程は、静電的堆積法を用いるのではなく、被覆層の共有結合のための官能基を有する単一層の物質を用いて行うこともできる。
【００１０】
このようにして得られたカプセルは、その表面に親和性分子を付着させることにより、バイオアッセイで用いるために修飾される。親和性分子は、検出すべき標的分子のタイプによって選択される。
【００１１】
上述したカプセルを用いる検出方法の第１工程において、標的分子の溶液が、標的分子を特異的に認識する親和性分子で修飾されたカプセルとともにインキュベーション（恒温放置）される。インキュベーションは、標的分子−親和性分子複合体（親和性分子はカプセルに結合したままである）を得るために十分な時間に亘って行われる。
【００１２】
検出方法の第２工程において、上記で得られた標的分子−親和性分子−カプセル複合体が、親和性分子が標的分子との複合体を形成しなかったカプセルから分離される。
【００１３】
検出方法の第３工程において、カプセルは、シグナル生成有機物質を溶液中に放出するために崩壊する。例えば、アルコール、ケトン、エステル、エーテル等の有機溶媒でカプセルを処理することにより行う。
【００１４】
検出方法の最終工程において、放出され溶解したシグナル生成有機物質により生成したシグナルが検出され、測定される。検出されたシグナルは、標的分子の量に関係する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第０２／１２８８８号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Caruso, F. Langmuir 2000, 16, 1485-1488.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
しかしながら、この公知の検出方法の欠点の１つは、カプセルの崩壊とシグナル生成物質によるシグナルの生成が、一般的に遅く、非常に時間がかかるということである。これは望ましくないことである。なぜなら、例えば液体透過膜を用いたラテラルフロー試験又はマイクロ流体チャネルを用いた試験においては、ラテラルフローを受けている溶媒流中にシグナル生成分子が放出されるからである。それ故、シグナル生成分子の放出が遅いと、検出可能なシグナルが溶媒流により拡がるために、検出可能なシグナルが拡散してしまうおそれがある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
短い時間内に、カプセル内からのシグナル前駆物質の放出を制御するとともに、シグナル前駆物質の潜在形態からシグナル生成形態への変換を制御する方法がここで発見された。最大シグナルが数秒以内に得られ、シグナルがピーク値にある間に、かつシグナル強度が減衰したりシグナルが拡散や希釈で消失したりする前に読み取ること（そして必要に応じて繰り返すこと）ができる。
【００１９】
これらの方法は、酸性触媒又は塩基性触媒による加水分解によって潜在形態からシグナル生成形態に変換可能なシグナル前駆物質に対して適用可能である。主な特性は、有意な酸性触媒加水分解が生じるには高すぎるか、あるいはそれに代えて、有意な塩基性触媒加水分解が生じるには低すぎるような調整済みｐＨ（balanced pH）を有する処理溶液にカプセル（実際には、カプセル／親和性分子／標的の複合体）を曝し、その後、４５℃〜６５℃の範囲の処理溶液温度とするために熱のバーストに処理溶液を曝すことである。このことは、反応速度を加速し、シグナル生成の活性を発動させる。すなわち、シグナル前駆物質は、その潜在形態から加水分解されてそのシグナル生成形態となり、明確なシグナルとして溶液中で検出可能となる。ある状況下では、生成されるシグナルが裸眼で検出されれば十分な場合がある。例えば、裸眼で検出できる強いシグナルは、標的又は分析物が試料中に存在することを示す質的試験においては十分かも知れない。他の状況下では、試料中に存在する標的又は分析物の量の量的同定のために、生成されたシグナルの量を検出したい場合がある。この場合、シグナルの検出は、リーダー（読み取り）装置を用いて電子的に行われてもよい。
【００２０】
本発明によるラテラルフロー試験又はマイクロ流体試験では、最大シグナルが十分迅速に生成され、シグナルの読み取りを妨げる拡散や減衰がない。また、加熱前の処理溶液は、活性発動ステップが行われる前に反応物と試薬が意図した通りにテストストリップ膜やマイクロ流体チャネルに沿って流れるように十分な長さの時間の間、カプセルを安定な形態に維持することができる。
【００２１】
本発明の一実施形態は、反応速度を改善し、結果をより迅速に得ることを可能とする。シグナル出力は、ユーザによって管理可能でありかつ制御可能である。一実施形態では、最大シグナル出力は、ほぼ即座に実現される。このことは、読み取りをほぼ即座に完了でき、かつ、シグナル出力が減衰し始める前に繰り返し読み取りを行えることを意味する。
【００２２】
一実施形態では、本発明は、有意のシグナルを生成しない潜在形態から検出可能なシグナルを生成可能な形態に加水分解可能なシグナル前駆物質を収容したカプセルを用いたバイオアッセイにおけるシグナル生成の生成を発動する方法を提供する。この方法は、シグナル前駆物質の有意の加水分解を生じないようなｐＨ及び温度の処理溶液でカプセルを処理し、その後、その処理溶液中でカプセルを加熱してシグナル前駆物質の加水分解を開始させることにより、検出可能なシグナルを生成できる形態とするものである。
調整済みｐＨ及び温度にて、シグナル前駆物質は安定であるが、加熱されると加水分解する。加熱するために超音波振動を用いてもよく、同様に、より旧来的な形態の加熱を行ってもよい。
【００２３】
本発明の別の実施形態は、有意のシグナルを生成しない潜在形態から検出可能なシグナルを生成可能な形態に加水分解可能なシグナル前駆物質を収容したカプセルを用いたバイオアッセイを行うための装置を提供する。この装置は、カプセルを含む調整済みｐＨ溶液の周囲温度を加熱する手段を備えている。
【００２４】
本発明の別の実施形態は、有意のシグナルを生成しない潜在形態から検出可能なシグナルを生成可能な形態に加水分解可能なシグナル前駆体を収容したカプセルを用いたバイオアッセイデバイスからシグナル出力を検出するための装置を提供する。この装置は、
（i）  シグナル前駆体の有意の加水分解が生じないような温度と次のいずれかの調整済みｐＨとを有する溶液によりカプセルが処理される反応区画を照射するための光源を具備し、
（a）  前記ｐＨは、前記シグナル前駆物質が周囲温度で有意の酸性触媒加水分解を生じるには高すぎるが、前記シグナル前駆物質が加熱された温度で有意の加水分解を生じるｐＨであるか、又は、
（b）  前記ｐＨは、前記シグナル前駆物質が周囲温度で有意の塩基性触媒加水分解を生じるには低すぎるが、前記シグナル前駆物質が加熱された温度で有意の加水分解を生じるｐＨであり、
（ii）  前記バイオアッセイデバイスから放射される光を検出するための光学検出器と、
（iii）  前記反応区画内の溶液を前記シグナル前駆物質が加水分解する温度に加熱するための加熱装置と、を備える。
【００２５】
本発明のさらに別の実施形態においては、有意のシグナルを生成しない潜在形態から検出可能なシグナルを生成できる形態に変換可能なシグナル前駆物質を収容したカプセルを用いてバイオアッセイを行う方法であって、検出工程が、前記カプセルを周囲温度の調整済みｐＨ溶液で処理し、その後、前記シグナル前駆物質をその潜在形態からそのシグナル生成形態へと変換を生じさせるためにその溶液を加熱することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、カプセル化されたシグナル前駆物質分子を用いて標的分子（分析物）を検出するための本発明の実施形態による、バイオアッセイの検出方法の概略図である。
【図２】図２は、異なるｐＨおよび温度条件下でカプセル化されたシグナル前駆物質の活性発動を調べるために用いた実験装置の概略図である。
【図３】図３は、温度制御された試料管ホルダの詳細を示す、図２に示した実験装置の一部の概略図である。
【図４】図４は、励起光源の温度制御された試料管ホルダとの結合及びフォトダイオード検出器の試料管ホルダとの結合を示す、図２に示した実験装置の一部の概略図である。
【図５】図５は、ｐＨ１０．１（ＦＤＡのフルオレセインへの加水分解に必要な値の直ぐ下）を有する塩基性処理液中のカプセル中のフルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）のための熱活性化実験データの種々の特性を示すグラフである。
【図６】図６は、第１のタイプのカプセルのための塩基性処理溶液中のＦＤＡのフルオレセインへの活性化に関する異なる温度及び異なるｐＨ値の効果を示す、別のグラフである。
【図７】図７は、第１のタイプのカプセルのための塩基性処理溶液中のＦＤＡのフルオレセインへの活性化に関する異なる温度及び異なるｐＨ値の効果を示す、別のグラフである。
【図８】図８は、第１のタイプのカプセルのための塩基性処理溶液中のＦＤＡのフルオレセインへの活性化に関する異なる温度及び異なるｐＨ値の効果を示す、別のグラフである。
【図９】図９は、第１のタイプのカプセルのための塩基性処理溶液中のＦＤＡのフルオレセインへの活性化に関する異なる温度及び異なるｐＨ値の効果を示す、別のグラフである。
【図１０】図１０は、第２のタイプのカプセルのための塩基性処理溶液中のＦＤＡのフルオレセインへの活性化に関する異なる温度及び異なるｐＨ値の効果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、第２のタイプのカプセルのための塩基性処理溶液中のＦＤＡのフルオレセインへの活性化に関する異なる温度及び異なるｐＨ値の効果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、第２のタイプのカプセルのための塩基性処理溶液中のＦＤＡのフルオレセインへの活性化に関する異なる温度及び異なるｐＨ値の効果を示すグラフである。
【図１３】図１３は、第２のタイプのカプセルのための塩基性処理溶液中のＦＤＡのフルオレセインへの活性化に関する異なる温度及び異なるｐＨ値の効果を示すグラフである。
【図１４】図１４は、ラテラルフローテストストリップと、テストストリップを受け取るように適応されたリーダー装置の概略斜視図である。
【図１５】図１５は、リーダー装置内に完全に挿入されたテストストリップの側面を示す、線１５’−１５’に沿った図１４に示したリーダー装置の概略断面図である。
【図１６】図１６は、別のラテラルフローテストストリップの概略平面図である。
【図１７】図１７は、図１６及びその関連するリーダ装置の別のラテラルフローテストストリップの概略斜視図である。
【図１８】図１８は、リーダー装置内に完全に挿入されたテストストリップの側面を示す、線１８’−１８’に沿った図１７に示したリーダー装置の概略断面図である。
【図１９】図１９は、シグナル前駆物質を含有するカプセルを用いた代替的な免疫アッセイのための一連のステップを示す図である。
【図２０】図２０は、シグナル前駆物質を含有するカプセルを用いた別の代替的な免疫アッセイを行うための別のスキームの一部を示す図である。
【図２１】図２１は、シグナル前駆物質を含有するカプセルを用いてハイブリダイゼーションアッセイを実施するためのさらに別の代替的なスキームの一部を示す図である。
【図２２】図２２は、シグナル前駆物質を含有するカプセルを用いてハイブリダイゼーションアッセイを行うための別のスキームの一部を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
図１は、標的分子又は分析物と結合させるためにラベル化されたカプセルを用いた本発明の実施形態によるバイオアッセイ検出方法の一例のステップを概略的に示した図である。そのカプセルは、カプセルから放出され、シグナル生成形態に変換可能なシグナル前駆物質を収容している。
【００２８】
＜工程１  −  カプセル表面上での親和性分子と標的分子との複合体の形成＞
第１の工程では、分析物１０を含むと思われる試験試料が、シグナル前駆物質３０を収容するカプセル２０を含む溶液中に混合される。カプセルの壁は、例えば、疎水性頭部２１と親水性尾部２２とをもつ脂質から形成することができる。カプセルは、その表面上に親和性分子４０を有し、それらは分析物と特異的に相互作用しかつ分析物と結合する能力故に選択されたものである。分析物は、もし存在するのであれば、親和性分子の仲介によりカプセルに結合して複合体５０を形成するであろう。
【００２９】
＜工程２  −  複合体の固定化＞
第２の工程では、複合体５０が、捕捉分子７０を表面に付着させた基板６０上に固定化される。捕捉分子７もまた、分析物１０に特異的に結合する能力故に選択されたものであり、よって、分析物に結合しなかったカプセルは捕捉分子７０と相互作用せず、固定化されないこととなる。固定化された複合体は、固定化位置において”サンドイッチ”を形成しており、固定化された捕捉分子７０、分析物１０及び親和性分子４０（カプセル２０に付着したままである）を有している。
【００３０】
＜工程３  −  シグナル前駆物質のシグナル生成形態への変換  −  活性発動＞
第３の工程では、固定化された複合体が処理溶液中で処理されることにより、シグナル前駆物質３０がそのシグナル生成形態へと変換する。その際に、個々のシグナル生成分子８０がカプセルから溶液中に放出され、シグナル検出手段（図示せず）により検出される。
【００３１】
この第３の工程は、固定化された複合体を、調整済みｐＨ溶液中の加熱工程で処理することにより行われる。調整済みｐＨ溶液は、シグナル前駆物質が酸性触媒による加水分解を行ってそのシグナル生成形態となるよりも若干高すぎるｐＨか、又は、シグナル前駆物質が塩基性触媒による加水分解を行ってそのシグナル生成形態となるよりも若干低すぎるｐＨをもつ。カプセルは、調整済みｐＨ処理溶液中で安定であり、かつ、カプセルに収容されたシグナル前駆物質は、認識可能な程度の加水分解を行わない。しかしながら、さらに熱が加えられると、反応速度は変化し、シグナル前駆物質の加水分解が生じてシグナル前駆物質はシグナル生成形態に変換する。
【００３２】
本発明の代替的な実施形態では、固定化された複合体に対する処理溶液の付加と、加水分解（活性発動）の開始との間にほとんど又は全く間隔が必要ない場合、強酸性又は強塩基性の処理溶液を用いることができ、かつ、加熱工程は必要ない。
【００３３】
＜異なるｐＨ及び温度条件の下におけるカプセル化されたシグナル前駆物質の活性発動の実験的同定＞
ここで図２〜図５を参照して、異なるｐＨ及び温度条件の下におけるカプセル化されたシグナル前駆物質の活性発動を評価するために用いた実験の構成を説明する。
【００３４】
図２は、全体的な実験の構成を示す概略図であり、実験を制御するためのコンピュータ２０１と、データ取得ボード２０２と、温度制御された試験管ホルダ２０４内に設置された試験管２０５に収容された試験対象の試料に対して光ファイバ２０９を介して励起光を与える励起光源２０３とを有する。温度コントローラ２０６は、コンピュータ２０１により制御され、試験管ホルダ２０４の温度を調整する。第２の光ファイバ２０９は、検出器２０７に放射光を与え、光パワーメータ２０８は、検出された放射光を数値的読み出し情報に変換し、その情報はコンピュータ２０１にフィードバックされる。
【００３５】
図３は、温度制御された試験管ホルダ２０４の詳細を示す概略図である。試験管ホルダ２０４は、試験管２０５を挿入可能なサーマルブロック３０１と、絶縁ブロック３０２とを有する。サーマルブロック３０１の背面には、試験管２０５内の試料を加熱するために用いられるペルティエ素子３０３がある。サーマルブロック３０１は、ペルティエ素子３０３から試験管２０５内の試料に熱を伝達し、絶縁ブロック３０２は、このシステムを絶縁して構成体から熱が放散することを防止し、周囲空気が熱を付加したり除去したりすることを防止する。ペルティエ素子３０３は、冷却フィン３０５を具備する冷プレート３０４上に装着されている。ファン３０６により強制冷却が可能である。温度制御された試験管ホルダ構成体は、ヒートシンクスタンド３０７上に装着されている。
【００３６】
ここで図４を参照し、光学的構成を説明する。温度制御された試験管ホルダ２０４は、２つの光ファイバ２０９を備えており、それらの光ファイバ２０９は実質的に互いに直角でありかつ試験管２０５がホルダに設置されたとき試験管２０５の縦軸にほぼ垂直に配置された面内に設置されている。光ファイバ２０９の１つは、例えばＬＥＤであるフィルタ付き光源４０１に接続されている。光源４０１からの光は、コリメートレンズ４０２を通過し、シグナル生成分子の活性を発動するような励起に寄与しない波長を遮断する励起フィルタ４０３を通過し、光ファイバ２０９への結合レンズ４０４を通過する。第２の光ファイバは、試験管２０５から放射された光を、試験管内の励起分子からの放射光量を計測する光学的にフィルタリングされた高感度光パワーメータ（図２の２０８）へ伝送するためのものである。この第２の光ファイバ２０９からの光は、コリメートレンズ４０５を通過し、不要の放射波長をフィルタリングする放射フィルタ４０６を通過し、そして焦点レンズ４０７を通過してフォトダイオード４０８に到達する。励起フィルタ４０３と放射フィルタ４０６は、１０ｎｍ広帯域フィルタである。
【００３７】
次の部品は、試験装置を構築するために用いたものである。
温度コントローラ  −  管及び溶液加熱（TE Tech, model: TC-36-25-RS232）
２４V直流電源  （Mean Well, model: SP-320-24）
データ取り込み装置  （Measurement Computing, model: USB-1280FS）
高出力ＬＥＤドライバ（Luminus model: DK-114N-3）
検出ヘッド  （Newport Corp., model: 918D）
光ファイバ  （PVC 被覆, 1000um コア, NA=.50）
ペルティエモジュール  （TE Tech, model: TE 63-1.0-1.3）
ペルティエ素子の電圧調整用レジスタネットワーク
ファイバ結合ＬＥＤヘッド  （最大カップリングにカスタマイズ）
温度制御付き管ホルダ
ａ．ファイバアダプタブロック  （最大絶縁にカスタマイズ）
ｂ．サーマル管ブロック  （最小熱容量にカスタマイズ）
ｃ．熱交換機材    （冷プレート、フィン、ファン）
光遮蔽カバー
【００３８】
実験時には、本装置を光遮蔽カバー（図示せず）により覆った。
【００３９】
上述した通り、温度制御された管ホルダ２０４、励起光源２０３及び光パワーメータ２０８は、それぞれコンピュータ２０１と接続され、コンピュータ２０１は、加熱時、励起光の起動時及び光パワーメータの放射光データ収集時に制御する。
【００４０】
各実験の開始時に、既知の容積の調整済みｐＨ活性化溶液が、試験管２０５として機能するマイクロ遠心分離管の中に入れられ、そのマイクロ遠心分離管は、温度制御された管ホルダ２０４の中に配置された。コンピュータは、活性化溶液のみを含む管からの放射光データの連続的な流れを収集した。これを、シグナル前駆物質及びシグナル生成分子が存在しない場合の周囲環境のベースラインとした。
【００４１】
一定のベースラインを確立したとき、シグナル前駆物質として、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）を含有するカプセルの既知の量の溶液を、温度制御された活性化溶液を入れた試験管２０５の中に滴下した。カプセルの溶液は、試験管２０５中の温度制御された活性化溶液と同じ温度であった。フルオロセイン二酢酸は蛍光を発しないが、フルオロセインに加水分解可能であり、フルオロセインは励起下にて強い蛍光を発する。
【００４２】
その後、コンピュータ２０１は、非励起での放射光の”暗”読み取りを行い、そして励起光を起動し、励起された蛍光の読み取りを行うサイクルを開始した。取得したデータには、３つの情報が含まれた。すなわち、サイクル番号、暗読み取りデータ、及び蛍光励起読み取りデータである。
【００４３】
各サイクルは、１秒間とした。各読み取りデータは、光パワーメータ２０８のフォトダイオード４０８上に集束した入射光の１０００個のサンプルの平均とした。このサイクルを、加熱実験全体に亘って続けた。所定のサイクル数（所望する時間遅延に相当する）の後、かつ、サイクルを遮断することなく、コンピュータ２０１はペルティエヒーター３０３を起動し、ヒーターは、反応部分を、数秒以内に高温の設定点まで温度上昇させた。ヒーターが起動されかつ温度が所望するレベルに一旦上昇した後は、残りの実験時間の間、温度を一定に保持した。データは、実験全体を通して連続的に取り込んだ。
【００４４】
カプセルが活性化溶液に導入されたとき、一部の加水分解が生じ、内部発光（autoluminascence）と自己消光（selfquenched）が始まった。溶液からの光出力のベースラインが上昇し、検出器電流は約１０−１１アンペア〜１０−９アンペアまで上昇し、そして熱が加えられるまでほぼ一定に留まった。
【００４５】
’準安定’／’時間遅延’の実験段階の間、励起中の検出光の読み取りは、同時に取得された暗読み取り光レベルよりも常に高かった。この差は、次の２つの原因のためと考えられる。
（i）  少量の励起光が放射光フィルタ４０６を通過する。これは、励起光の一部が放射光集光ファイバ２０９に結合するときに起きる。放射光フィルタの通過帯域外では３桁（１０３）の光遮蔽があるにも拘わらず、この励起光が検出される。
（ii）  励起されたとき、初期加水分解中の放出されるフルオレセインの一部は、自己消光する溶液の能力を超えて蛍光を発する。このフルオレセインが検出される。
【００４６】
どの読み取り（励起又は非励起）が用いられるかに関わらず、溶液中のフルオレセインの量と、放射光フィルタを通過して検出される光の量の間には直接的な相関がある。フルオレセインが自己消光する、すなわちそれ自身の蛍光を吸収することは、周知の現象である。フルオレセインの励起帯域が広いが故である。熱が加えられたときの検出光の減少は、フルオレセインの濃度が上昇するとき、自己消光する溶液の能力もまた増すことを示している。これについては、図５を参照してより詳細に後述する。
【００４７】
＜熱活性化実験データの特性＞
図５は、脂質ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００アミン及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）から形成されかつシグナル前駆物質としてＦＤＡを含有するカプセルからの光出力についての代表的なトレースを示すグラフである。カプセルは、ｐＨ１０．１の活性化溶液中に入れられた。ｐＨ１０．１は、このタイプのカプセル中のＦＤＡが加熱無しにフルオレセインに加水分解するｐＨ値よりやや低い値である。以下では、Ａ〜Ｇの点での挙動を説明する。
【００４８】
Ａ．  時間ゼロにおいて、カプセルが室温のｐＨ１０．１の活性化溶液に追加された。
Ｂ．  励起曲線５ｅにおいては、最初の３０秒間に溶液中のフルオレセインの急激な増加が、検出されるフルオレセインの極大を生じ、それは、励起状態にある近隣のフルオレセイン分子により積極的に消光された。
Ｃ．  非励起曲線５ｎにおいては、自己消光の同時増大が、検出可能な内部発光を減少させた。溶液の検出可能な全光出力は、準安定平衡へ向かった。時間の経過によりこのベースラインは、加熱無しでも増加する。
Ｄ．  励起曲線５ｅにおいては、励起された読み取り中に記録されたベースライン値は、非励起光で得られた読み取りより常に若干高い。理論に縛られることは望まないが、次の２つの要因によると考えられる。
（ａ）放射光フィルタを通しての検出可能な励起光の漏れ
（ｂ）少量の検出可能な増感された蛍光放射
Ｅ．  非励起曲線５ｎにおいては、これが自己消光しない検出可能な内部発光のベースライン値である。
Ｆ．  励起曲線５ｅにおいては、加熱による６５℃への温度上昇により生じたカプセル中のＦＤＡの加水分解によって、蛍光出力の検出可能な増加が見られる。（全光＝増感蛍光＋内部発光−自己消光）
Ｇ．  非励起曲線５ｎにおいては、溶液中のフルオレセインの急激な濃度上昇による内部発光の自己消光の検出可能な増加が見られる。（全光＝内部発光−自己消光）
【００４９】
＜異なる条件下における発動活性化＞
図９〜図６を参照すると、これらは、上述した図５の評価において使用されるＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００アミン及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）から形成されたＦＤＡ含有カプセルの挙動を示す一連のグラフである。
【００５０】
図６は、低ｐＨ値９．５の処理溶液に対し２５０秒後に熱が加えられて室温（２３℃）から４５℃に処理溶液の温度を上昇させたときの、処理溶液中のカプセルからの光出力を示すグラフである。全く活性化は起こらなかった。励起曲線６ｅと、非励起曲線６ｎは、熱を加えた後も実質的に平行に推移し続けている。カプセルは、ｐＨ９．５で４５℃で安定している。
【００５１】
図７は、高ｐＨ値１１．０の処理溶液中のカプセルからの光出力を示すグラフである。前述のように、２５０秒後に溶液温度が室温（２３℃）から４５℃に上昇させられたが、高ｐＨでは、カプセルを溶液に投入するとほぼ即時にかつ加熱工程の前に活性化が発動される。励起曲線７ｅ及び非励起曲線７ｎは、約２５秒後に大きく分離されている。
【００５２】
図８は、調整済みｐＨ値１０．１の処理溶液に対し３００秒後に熱が加えられて室温（２３℃）から６５℃に処理溶液の温度を上昇させたときの、処理溶液中のカプセルからの光出力を示すグラフである。加熱すると、強い活性化が生じた。励起曲線８ｅ及び非励起曲線８ｎは、処理溶液へのカプセルの投入後、５０秒から３００秒の期間は互いに接近している。これは、カプセルがこれらのｐＨ条件及び温度の下で安定であるが、熱により活性化を発動できることを示している。
【００５３】
図９は、高ｐＨ値を有する処理溶液中のカプセルからの光出力を示す別のグラフである。この実験において、ｐＨ値は１２．５であった。２５０秒後、溶液温度は、室温（２３℃）から６５℃に上昇させられたが、高ｐＨでは、カプセルを溶液に投入するとほぼ即時にかつ加熱工程の前に活性化が発動された。励起曲線９ｅと非励起曲線９ｎは、約２５秒後に大きく分離しており、励起曲線９ｅでは２５０秒後に温度上昇させた野木に蛍光出力に若干増加が見られたが、これは有意な増加ではない。この実験は、高ｐＨが、それ自体、遅延無く活性化を発動するために用いることができることを示している。これは、即時の活性化が望まれかつ活性化発動前の安定平衡の期間が不要な状況下では有用である。
【００５４】
ここで図１０〜図１３を参照すると、これらは、特定のｐＨ及び温度条件下における異なるタイプのＦＤＡ含有カプセルの挙動を示す一連のグラフである。このＦＤＡ含有カプセルのバッチは、特許文献１に記載の高分子電解質のレイヤバイレイヤ堆積法を用いて調製された。
【００５５】
図１０は、低ｐＨ値１０．５を有する処理溶液であって２５０秒後に熱を加えられて温度が室温（２３℃）から４５℃に上昇した当該処理溶液中のカプセルからの光出力を示すグラフである。活性化は起きなかった。励起曲線１０ｅ及び非励起曲線１０ｎは、加熱後も実質的に平行な軌跡を持続している。これらのカプセルは、ｐＨ１０．５及び４５℃にて安定である。
【００５６】
図１１は、ｐＨ値１１を有するバランス処理溶液であって３００秒後に熱を加えられて温度が室温（２３℃）から４５℃に上昇した当該処理溶液中のカプセルからの光出力を示すグラフである。加熱により強い活性化が起きた。励起曲線１１ｅ及び非励起曲線１１ｎは、カプセルの処理溶液への投入後、約７０秒後から３００秒後までの期間は互いに接近している。これは、カプセルが室温でのこのｐＨ値の下で安定であることを示している。しかし、適度の熱を加えるのみで速やかに活性化が発動させられる。
【００５７】
図１２は、図１０に類似のグラフであり、より低いｐＨ値１０．０を有する処理溶液であって２５０秒後により大きい熱を加えられて温度が室温（２３℃）から６５℃に上昇した当該処理溶液中のカプセルからの光出力を示すグラフである。再び、活性化が起きなかった。励起曲線１２ｅと非励起曲線１２ｎは、互いに接近したままであり、加熱後も実質的に平行な軌跡を持続している。これらのカプセルは、ｐＨ１０．０では６５℃であっても安定である。
【００５８】
図１３は、図１１に類似のグラフであり、ｐＨ値１１を有するバランス処理溶液であって２５０秒後に熱が加えられて温度が室温（２３℃）から４５℃に上昇した当該処理溶液中のカプセルからの光出力を示すグラフである。加熱により強い活性化が起きた。励起曲線１３ｅと非励起曲線１３ｎは、カプセルの処理溶液への投入後、約７０秒後から２５０秒後までの期間は互いに接近している。これは、カプセルが室温でのこのｐＨ値の下で安定であることを示している。しかし、熱により速やかに活性化が発動させられる。
【００５９】
この実験は、活性化の発動が温度上昇により生じさせられることも示している。この実験では、図１１におけるよりも５０秒早く熱が加えられ、それに応じて５０秒早く活性化が生じた。故に、活性化の開始は、温度上昇によるものということができ、調整済みｐＨ溶液中でのインキュベーションの持続によるものではない。
【００６０】
＜調整済みｐＨの活性化溶液の決定＞
異なるｐＨ及び温度条件の下でのカプセル化されたシグナル前駆物質の活性発動を調べる上記の実験から、発明者らは、カプセルタイプが異なると、所望するバランス状態を得るために異なるｐＨ値に調整することが必要であることに気付いた。これは、カプセルタイプが異なると、異なる活性化溶液に対する透過性、異なる孔サイズ、異なる壁厚等を有することになるからと予想される。これらは全て、カプセルに含まれるシグナル前駆物質の加水分解速度に影響を及ぼす可能性のある要因である。加えて、シグナル前駆物質を変えた場合、異なるｐＨで加水分解が起きることも、ほぼ間違いないであろう。従って、カプセルタイプとシグナル前駆物質タイプの各組合せについて、調整済みｐＨを決定しなければならない。
【００６１】
このことは、実験により容易に行われる。
カプセルタイプとシグナル前駆物質タイプの選択された組合せのいずれについても、一連の異なるｐＨの室温溶液が調製された後、１回分のカプセルが各溶液に追加される。溶液は、励起光を照射され、もし強いシグナルが検出されたならば、その溶液は調整済みｐＨ範囲外にあると認められる。もしシグナルが検出されなければ、その溶液を４５℃〜６０℃に加熱し、再び励起光を照射される。加熱された溶液が強いシグナルを出したならば、その溶液は調整済みｐＨ範囲内にあると認められる。加熱された溶液がなおシグナルを出さなければ、その溶液は調整済みｐＨ範囲外にあると認められる。
【００６２】
必要であれば、上述した最初の実験ラウンドにより重要なｐＨ範囲と認められたｐＨ範囲内において、ｐＨを細かい増分で変化させた一連の溶液を調製することにより、精細な実験を行うことができる。
【００６３】
まとめると、調整済みｐＨは次のように決定される。
（ａ）一連の異なるｐＨの周囲温度の溶液に対してシグナル前駆物質を含む１回分のカプセルを追加する。
（ｂ）一連の周囲温度の溶液を励起光で照射する。
（ｃ）周囲温度で強いシグナル出す溶液を除外する。
（ｄ）周囲温度で有意のシグナルを出さない溶液を加熱する。
（ｅ）加熱後に有意のシグナルを出さない溶液を除外する。
（ｆ）加熱後に強いシグナルを出す１又は複数の溶液のｐＨ値を、調整済みｐＨとして認める。
【００６４】
好適には、活性化溶液すなわち処理溶液は、アッセイシステムにおいて他の溶液と混合されるときにそのｐＨを維持するために緩衝剤を加えてもよい。
【００６５】
好適には、調整済みｐＨを有する活性化溶液すなわち処理溶液のｐＨ値は、シグナル前駆物質が有意な酸触媒加水分解を行ってそのシグナル生成形態となるｐＨ値より０．５までの値だけ高すぎるか、又は、シグナル前駆物質が有意なアルカリ触媒加水分解を行ってそのシグナル生成形態となるｐＨ値より０．５までの値だけ低すぎる値である。さらに好適には、活性化溶液すなわち処理溶液のｐＨ値は、シグナル前駆物質が有意な酸触媒加水分解を行ってそのシグナル生成形態となるｐＨ値より０．２までの値だけ高すぎるか、又は、シグナル前駆物質が有意なアルカリ触媒加水分解を行ってそのシグナル生成形態となるｐＨ値より０．２までの値だけ低すぎる値である。さらにより好適には、活性化溶液すなわち処理溶液のｐＨ値は、シグナル前駆物質が有意な酸触媒加水分解を行ってそのシグナル生成形態となるｐＨ値より０．１までの値だけ高すぎるか、又は、シグナル前駆物質が有意なアルカリ触媒加水分解を行っててそのシグナル生成形態となるｐＨ値より０．１までの値だけ低すぎる値である。
【００６６】
＜加熱ステップの温度範囲＞
４０℃〜７０℃、好適には４５℃〜６５℃の温度範囲が、試験溶液を上昇させるべき温度範囲である。４０℃は、最も低い”上昇させる”温度として用いるべく選択された。なぜなら、ほとんどの地理的場所において、これが一般的な周囲温度よりも十分に高い温度であり、従って、加熱されていない状態と区別することができるからである。４０℃未満では、完全な活性化に非常に長時間かかるため、本発明が解決しようとするシグナル消失の問題を誘起してしまう。上限の７０℃は、高温ではあるが手で触れても危険であるほどではないので選択された。さらに高い温度とすると、化学系において望ましくない不安定さの要因となる可能性がある。また、発明者らは、簡易な携帯型リーダー装置におい非常に高温となることは非実用的であろうと考慮した。
【００６７】
好適な温度範囲の４５℃〜６５℃においては、最大シグナルが検出される前の時間遅延を制御して計測を行うことが可能である。このことは、本発明の多用途性に貢献する。
【００６８】
＜発明を実施するための装置例＞
図１４〜図１５を参照すると、ラテラルフローテストにおいて本発明を実施するための装置の一例が示されている。
【００６９】
図１４は、ラテラルフローテストストリップ１４１０と、テストストリップ１４１０を受容してそれを後に詳細に述べるように処理するべく構成されたリーダー装置１４０１の概略斜視図である。
【００７０】
リーダー装置１４０１は、ハウジング１４０２を有する。一端にて、ハウジングはスロット１４０３を具備し、その中にテストストリップ１４１０を矢印１４０８のように挿入可能である。スロットは、ハウジング１４０２の内部空間に設けられたトレイ１４０４に続いており、このトレイはテストストリップ１４１０がリーダー装置に挿入されたときガイドの役割を果たす。トレイの下方には加熱装置１４０６が配置され、トレイの上方には加熱装置１４０６に対向する位置に光学システム１４０７が配置され、これは挿入されたテストストリップに励起光を照射しかつ放出光を受けて処理するためのものである。ハウジング１４０２の上面は、開口すなわち観察窓１４０８を有しており、これを通して光学システム１４０７からの読み出しを見ることができる。トレイ１４０４は、面取り隅部１４０５を有する。
【００７１】
テストストリップ１４１０は、不浸透性の細長い支持基板１４１１を有し、支持基板１４１１はポリ塩化ビニル、ポリプロピレン等の熱可塑性樹脂から形成でき、その上にニトロセルロース又はガラス繊維等の吸収性材料で形成された多孔質膜１４０２が搭載され、多孔質膜１４０２は、毛細管作用、ウィッキング、単純な濡らしにより水溶性溶液を輸送することができる。テストストリップ１４１０は、リーダー装置１４０１内のトレイ１４０４の面取り隅部１４０５に対応する形状とされた切り欠き隅部１４０３を有する。この機能は、ユーザがテストストリップ１４１０を誤った方向でリーダー装置１４０１に挿入することを防止するためである。なぜなら、テストストリップ１４１０は、その切り欠き隅部１４１３がトレイ１４０４の面取り隅部１４０５と合致する場合にのみ完全に挿入することができるからである。
【００７２】
切り欠き隅部１４１３を具備する端部にて、テストストリップはウィッキングパッド１４１４を具備し、これは、図中において左から右の方向に多孔質膜１４１２により規定される流体経路に沿って通過する液体を蓄積するためのリザーバーとしての役割を果たす。ウィッキングパッド１４１４は、例えば、軽度に架橋したポリアクリル酸塩を有する吸収材又は超吸収材であってもよく、それらは水中で自重の何倍もの液体を吸収することができる。テストストリップ１４１０の他方の端部又はその近傍には、多孔質膜１４１２上に試料適用ゾーン１４１５があり、ここに、対象とする分析物を含む試料が投与される。試料適用ゾーン１４１５は、シグナル前駆物質含有カプセルを予め投与されていてもよく、そのカプセルは、検出されるべき分析物に特異的に結合するための親和性分子をその表面に具備する。
【００７３】
試料適用ゾーン１４１５とウィッキングパッド１４１４の間に、捕捉分子が固定化されるテストゾーン１４１６があり、捕捉分子も、検出されるべき分析物に特異的に結合する能力を有する。捕捉分子は、周知の方法により吸着、吸収、又はイオン結合若しくは共有結合を用いてテストゾーン１４１６に固定化されてもよい。
【００７４】
テストゾーン１４１６の下流側には、非特異的捕捉分子、すなわち分析物に特異的に結合しないがテストゾーン１４１６を通過する空カプセルに結合することができる捕捉分子を含むコントロールゾーン１４１７がある。コントロールゾーンは重要ではないが、例えば、テストストリップが正しく濡れていたこと、及び、溶液の流れがテストストリップに沿って試料適用ゾーン１４１５からテストゾーン１４１６を通過したことを示すことにより、試験が正確に行われたことを確認する役割を果たす。
【００７５】
図面では、テストゾーン１４１６とコントロールゾーン１４１７を、流体経路に沿って直列に配置しているが、それに替えてテストゾーンとコントロールゾーンを並列させて配置してもよく、又は他の特別な関係で配置してもよい。
【００７６】
ウィッキングパッド１４１４の高吸収性は、テストストリップに沿った液体の流れを促進し、液体がテストゾーン１４１６を確実に通過するようにさせる。
【００７７】
図１５は、図１４の１５’−１５’ライン上でのリーダー装置１４０１の概略断面図であるが、テストストリップ１４１０が完全にスロット１４０３からトレイ１４０４内に挿入された状態の側面を示している。テストストリップ１４１０は、明確とするために、トレイ１４０４の上面からやや浮かせて示している。
【００７８】
この側面図から明らかなように、完全に挿入されたテストストリップ１４１０のテストゾーン１４１６及びコントロールゾーン１４１７は、加熱装置１４０６に重なり、かつ、光学システム１４０７の直下に配置されている。
【００７９】
図１４及び図１５に示した装置の使用について、ここで説明する。
最初に、検出される分析物を含むと思われる試験試料の溶液を、試料適用ゾーン１４１５に投与する。試料適用ゾーンにてテストストリップ上に予め搭載されているカプセルは、投与された液体中に取り込まれ、カプセル表面上の親和性分子を介して、存在する分析物と相互作用する。前述したように、親和性分子は分析物に対して特異的に結合する。
【００８０】
図示したように、溶液は、ウィッキングパッド１４１４の作用により引っ張られ、左から右の方向に多孔質膜１４１２に沿って流れる。溶液とともに、分析物分子とカプセルに付着した親和性分子の間で形成された複合体が流れ、また分析物を結合させていない空カプセルも流れる。
【００８１】
それらが、テストゾーン１４１６の膜上に固定化された捕捉分子を通過すると、分析物と捕捉分子との相互作用により、複合体が溶液から取り除かれる。結合した分析物をもたない空カプセルは、溶液中に留まったままでテストゾーンを通過してコントロールゾーンを通過する。
【００８２】
結合した分析物をもたない空カプセルがテストゾーンを超えて確実に洗い出されるように、バッファ洗浄溶液をテストゾーン１４１６の上流側の多孔質膜に適用してもよい。
【００８３】
コントロールゾーン１４１７が、テストが正確に行われたことを示すとき、調整済みｐＨ処理溶液が、テストゾーンの上流側の多孔質膜１４１２に適用される。
【００８４】
調整済みｐＨ処理溶液は、テストストリップ１４１０がリーダー装置１４０１に挿入される前に多孔質膜１４１２に適用されてもよい。これに替えて、調整済みｐＨ処理溶液は、テストストリップ１４１０がリーダー装置１４０１に挿入された後に追加されてもよく、その場合、リーダー装置１４０１の外側に突出している多孔質膜１４１２の一部に適用する（図１５参照）。
【００８５】
テストストリップ１４１０のリーダー装置１４０１への挿入と、調整済みｐＨ処理溶液の多孔質膜１４１２への適用の順序に関わらず、加熱装置１４０６が稼働して加熱装置１４０６の場所の上方の部分にある容量の処理溶液の温度を上昇させる前に、調整済みｐＨ処理溶液がテストゾーン１４１６まで流れていくための十分な時間が確保できる。このようなテストでは小容量の溶液のみが関係するので、処理溶液の、高温設定値までの温度上昇は極めて迅速である。
【００８６】
カプセル内でのシグナル前駆物質の発動の活性化は、加熱ステップの数秒以内又は零点数秒以内で生じ、個々のシグナル生成分子がカプセルから放出される。
【００８７】
次に、光学システム１４０７が起動される。例えばＬＥＤからの励起光がテストゾーンに向けられることにより、シグナル生成分子が蛍光を発するようになり、放射された蛍光が検出される。検出された蛍光の読み取りは、観察窓１４０８を通して視認可能である。
【００８８】
上述した通り、流体の小容量のみが関係するので、加熱装置１４０６は大出力である必要はない。同様に、光学システム１４０７は大エネルギーが不要であるので、リーダー装置１４０１は、加熱装置１４０６及び光学システム１４０７を駆動するためにハウジング１４０２内にバッテリ（図示せず）を内蔵することにより、独立式装置とすることができる。これに替えて、リーダー装置を外部電源とすることもできる。
【００８９】
上述した零において、テストストリップ１４１０は、シグナル前駆物質を含有しかつその表面に分析物に特異的に結合する親和性分子を有するカプセルを予め搭載された。もちろん、試験溶液を試料適用ゾーン１４１５に適用する前に、試験溶液の試料にカプセルを追加することも可能である。
【００９０】
図１６〜図１８を参照すると、ラテラルフローテストを行う別の形態の装置が示されている。この場合、テストストリップが、試験に用いられる溶液を破断可能なリザーバー内に組み込んでおり、リーダー装置が溶液を開放するためにそのリザーバーを破断するためのアクチュエータを有する。
【００９１】
図１６は、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン等の熱可塑性樹脂で形成することができる液体不透過性バリア基板１６１１を有するテストストリップ１６１０の概略平面図である。ニトロセルロース又はガラス繊維等の吸収性材料で形成された多孔質膜１６１２の細いストリップが、基板１６１１上に実装されている。多孔質膜１６１２は、毛細管作用、ウィッキング又は単純な濡らしによる水溶液の移動のためのフロー経路を規定する。
【００９２】
図示されるようにテストストリップは、その右端において、図示される左から右の方向に多孔質膜１６１２により規定される流体経路に沿って通過する液体を蓄積するためのリザーバーとして機能するウィッキングパッド１６１４を有する。ウィッキングパッド１６１４は、例えば、水中で自重の何倍もの液体を吸収することができる吸収材又は超吸収材であってもよい。
【００９３】
テストストリップ１６１０の他端には、供給ライン１６２１をその右端に有する破断可能なバッファ担体溶液リザーバー１６２０がある。供給ライン１６２１の直ぐ下流には、多孔質膜１６１２に流体が連通する試料適用ゾーン１６１５がある。試料適用ゾーン１６１５は、対象とする分析物を含むと思われる試料を受け入れるためのものである。試料適用ゾーン１６１５は、シグナル前駆物質を含むカプセルを予め搭載されている。カプセルは、その表面に、検出すべき分析物に特異的に結合する親和性分子を有する。
【００９４】
試料適用ゾーン１６１５の下流には、多孔質膜１６１２を破断可能なブロッキング剤リザーバー１６２２に接続する第２の供給ライン１６２３がある。さらに下流には、多孔質膜１６１２を破断可能な活性化溶液リザーバーに接続する第３の供給ライン１６２５がある。
【００９５】
第３の供給ライン１６２５とウィッキングパッド１６１４との間には、捕捉分子が固定化されたテストゾーン１６１６があり、捕捉分子もまた、検出することが意図されている分析物に特異的に結合する能力を有する。捕捉分子は、周知の方法に従って、吸着、吸収、又はイオン結合若しくは共有結合を用いてテストゾーン１６１６に固定してもよい。
【００９６】
ここで図１７を参照する。ここでは、概略斜視図で示されたリーダー装置１６０１に挿入される準備が整ったテストストリップ１６１０の概略斜視図が示されている。リーダー装置１６０１は、図中の左側にテストストリップ１６１０を受け入れるスロット１６０３を有するハウジング１６０２を備えている。スロットは、ハウジング１６０２の内部空間に設けられたトレイ１６０４へと続いており、トレイはテストストリップがリーダー装置内に挿入されるときのガイドとしての役割を果たす。トレイの下方には加熱装置１６０６が配置され、トレイの上方には、加熱装置１６０６の反対側の位置に光学システム１６０７が配置されている。光学システム１６０７は、挿入されたテストストリップを励起光で照射し、放射光を受けて処理するためのものである。ハウジング１６０２の上面には、観察窓１６０８があり、これを通して光学システム１６０７からの読み取りを視認することができる。
【００９７】
リーダー装置１６０１は、アクチュエータ１６３２、１６３３及び１６３８も有しており、これらは、テストストリップ１６１０上の破断可能なリザーバー１６２０、１６２２及び１６２４の各々をそれぞれ破断するために、ハウジング上面の外部から操作可能である。これについては以下でさらに詳述する。アクチュエータ１６３２は、その上端にボタン１６３１を設けられ、このボタンは、ハウジング１６０２の上面を貫通している。ボタンの周囲は、凹部１６３０が取り囲んでいる。同様に、アクチュエータ１６３５はその上端にボタン１６３４を有し、このボタンは、ハウジング１６０２の上面に形成した凹部１６３３により取り囲まれている。同様に、アクチュエータ１６３８はその上端にボタン１６３７を有し、このボタンは、ハウジング１６０２の上面に形成した凹部１６３６により取り囲まれている。
【００９８】
図１８は、図１７のライン１８’−１８’に沿ったリーダー装置１６０１の概略断面図であるが、スロット１６０３からトレイ１６０４内に完全に挿入されたテストストリップ１６１０の側面も示している。テストストリップ１６１０は、明確とするために、トレイ１６０４の上面からやや浮かせて示している。
【００９９】
この側面図から明らかなように、完全に挿入されたテストストリップ１６１０のテストゾーン１６１６は、加熱装置１６０６に重なり、かつ、光学システム１６０７の直下に位置している。さらに、アクチュエータ１６３２は、破断可能なバッファ担体溶液リザーバー１６２０の上方に位置し、アクチュエータ１６３５は、破断可能なブロッキング剤リザーバー１６２２の上方に位置し、アクチュエータ１６３８は、破断可能な活性化溶液１６２４の上方に位置する。
【０１００】
図１６〜図１８に示した装置の使用方法をここで説明することとする。
先ず、テストストリップ１６１０を、スロット１６０３を通してリーダー装置１６０１に挿入する。その後、アクチュエータ１６３５を用いて、ボタン１６３４を下方に押すことにより破断可能なブロッキング剤リザーバー１６２２を破断する。これにより、典型的にはＰＢＳ／ＢＳＡからなるブロッキング剤が放出され、供給ライン１６２３を経て多孔質膜１６１２へ流れる。ブロッキング剤は、ウィッキングパッド１６１４の吸引力に引かれて多孔質膜１６１２に沿って図中の左から右へと流れる。ブロッキング剤は、捕捉分子が固定されたテストゾーン１６１６を通過する。ブロッキング剤は、捕捉分子を搭載されていない反応サイトを予め濡らし、かつ／又は、遮蔽する。このことは、そのような反応サイトが中和されることによりそれらの反応サイトが試験中の試料と相互作用できないようにすることを確保する。
【０１０１】
その後、テストストリップ１６１０を、リーダー装置１６０１から若干引き出して、その試料適用ゾーン１６１５を露出させる。そして、検出されるべき分析物を含むと思われる試験試料の溶液を、試料適用ゾーン１６１５に投下し、再びテストストリップをリーダー装置１６０１に完全に挿入する。テストストリップの試料適用ゾーンに予め搭載されていたカプセルは、投入された試料溶液に取り込まれ、カプセル表面上の親和性分子を仲介として、存在する分析物と相互作用する。上述したように、親和性分子は分析物と特異的に結合する。
【０１０２】
溶液は、ウィッキングパッド１６１４の作用により引かれて、多孔質膜１６１２に沿って図中の左から右へ流れる。分析物分子とカプセルに付着した親和性分子の間で形成された複合体と、分析物が結合していない空カプセルが、溶液に伴われて流れる。
【０１０３】
次に、アクチュエータ１６３２が用いられ、ボタン１６３１を下方に押すことにより、破断可能なバッファ担体溶液リザーバー１６２０を破断する。これにより、バッファ担体溶液が放出され、供給ライン１６２１を通って多孔質膜１６１２へと流れる。バッファ担体溶液は、ウィッキングパッド１６１４の吸引力により引かれて、図中の左から右の方向に多孔質膜１６１２に沿って流れ、分析物分子とカプセルに付着した親和性分子の間で形成された複合体と、分析物が結合していない空カプセルとをテストゾーンに運ぶ。
【０１０４】
それらが、テストゾーン１６１６の多孔質膜上に固定された捕捉分子を通過すると、複合体は、分析物と捕捉分子の間の相互作用により溶液から除去される。バッファ担体溶液は、結合した分析物をもたない空カプセルをテストゾーンの向こう側に洗い流す。
【０１０５】
次に、アクチュエータ１６３８を用いて、ボタン１６３７を下方に押すことにより活性化溶液リザーバー１６２４を破断する。活性化溶液リザーバーは、調整済みｐＨ活性化溶液を含む。リザーバー１６２４が破断されると、これにより調整済みｐＨ活性化溶液が放出され、供給ライン１６２５を通って多孔質膜１６１２に流れる。調整済みｐＨ活性化溶液は、ウィッキングパッド１６１４の吸引力により、多孔質膜１６１２に沿って図中の左から右の方向に流れる。
【０１０６】
加熱装置１６０６の場所の上方に位置する容量の調整済みｐＨ活性化溶液の温度を上昇させるために加熱装置をオンする前に、調整済みｐＨ活性化溶液がテストゾーン１６１６に流れるように十分な時間がとられる。加熱装置１６１６の上方の多孔質膜１６１２には小容量の溶液のみが存在するので、活性化溶液の高温設定点までの温度上昇は極めて迅速である。
【０１０７】
カプセル内のシグナル前駆物質の活性の発動は、数秒又は十分の数秒以内の加熱ステップで生じ、そして個々のシグナル生成分子がカプセルから放出される。
【０１０８】
次に、光学システム１６０７が起動される。例えばＬＥＤからの励起光がテストゾーンに向けられて、シグナル生成分子に蛍光を生じさせ、生じた蛍光が検出される。検出された蛍光の読み取りは、観察窓１６０８を通して視認可能である。
【０１０９】
上述した方法の変形として、テストストリップがエンドユーザに渡る前に、ブロッキング剤で予処理されている場合は、ブロッキング剤を用いてカプセル分子を搭載していない反応サイトを遮蔽するステップを省くことができる。これらの状況においては、テストストリップは破断可能なブロッキング剤リザーバーを含む必要がなく、テストストリップ１６１０をリーダー装置１６０１に最初に挿入する前に試験試料の溶液を試料適用ゾーン１６１５に投入することができる。
【０１１０】
＜加熱装置の別形態＞
活性を発動させるべく活性化溶液の所望する加熱を得るために、種々のタイプの加熱装置を用いることができる。限定しないが、抵抗、輻射、マイクロウェーブ、又は誘導による加熱装置が含まれる。別の例では、上述した異なるｐＨと温度条件下でのシグナル前駆物質含有カプセルの挙動を調べた実験で用いたようなペルティエ素子がある。超音波を適用して活性化溶液を加熱することも可能である。例えば、活性化溶液を、２０〜６０ｋＨｚの範囲の低周波超音波を加えることにより加熱してもよい。それに替えて、活性化溶液を、１〜８ＭＨｚの範囲の高周波超音波を加えることにより加熱してもよい。
【０１１１】
＜活性化発動後のカプセル挙動及びカプセルの別形態＞
活性化発動後のカプセル壁の挙動は、買い手のアッセイの性能に影響を与えるとは思われない。特許文献１においては、カプセルは崩壊するが、現在は、カプセル挙動のより良い理解が得られており、それは、シグナル前駆物質が封入から放出されシグナル生成分子に活性化された後に特定のタイプのカプセルは無傷のままであることが判明していると報告された。
【０１１２】
カプセル壁が界面活性剤の場合、封入された前駆物質が加水分解すると、加水分解されたシグナル生成分子が拡散して出ていくことによりミセルと同等の空の界面活性剤カプセルとなるか、あるいは、界面活性剤の濃度が臨界ミセル濃度より低いためにカプセルが離れて落下するか、のいずれかとなる。
【０１１３】
一方、カプセル壁がポリマーと結合した界面活性剤の場合、カプセルは無傷のままとなる場合がある。非特許文献１を参照されたい。
【０１１４】
本発明に関連するシグナル前駆物質をカプセル化するためのカプセルの調製に用いることができる界面活性剤には、以下を含む。
（i）陽イオン性界面活性剤：
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）アミンベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、ブロニドックス（Bronidox）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド、ラウリルメチルグルセス−１０ヒドロキシプロピルジモニウムクロリド、テトラメチルアンモニウムヒドロキシド。
【０１１５】
（ii）陰イオン性界面活性剤：
ラウリル硫酸アンモニウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、パーフルオロブタンスルホン酸、パーフルオロノナン酸、パーフルオロオクタンスルホン酸、パーフルオロオクタン酸、ラウリル硫酸カリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、ミレス硫酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、パレス硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、牛脂脂肪酸ナトリウム
【０１１６】
（iii）両イオン性界面活性剤：
両親媒性物質、ＣＨＡＰＳ洗剤、コカミドプロピルベタイン、コカミドプロピルヒドロキシスルタイン、ヒドロキシスルタイン、レシチン、ラウロアンホ酢酸ナトリウム
【０１１７】
（iv）非イオン性界面活性剤：
セトマクロゴール１０００、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コカミドＤＥＡ、コカミドＭＥＡ、デシルグルコシド、ラウリン酸グリセリル、イソセテス−２０、ラウリルグルコシド、ナローレンジエトキシレート、ノニデットＰ−４０（登録商標）、ナノキシノール９、ナノキシノール、ＮＰ−４０、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクチルグルコシド、オレイルアルコール、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ポロキサマー、ポロキサマー４０７、ポリグリセロールポリリシノレート、ポリソルベート、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ステアリルアルコール、トリトンＸ−１００（登録商標）
【０１１８】
（v）極性非荷電分子：
ステロール、炭水化物、等
【０１１９】
本発明に関連したシグナル前駆物質をカプセル化するためのカプセルの調製に用いることができるポリマーとして、以下のものを含む。
（vi）塩基性ポリマー：
ＰＡＨ  ポリ（アリルアミン塩酸塩）、ＰＶＰ  （ポリビニルピロリドン）、ＰＥＩ  （ポリエチレンイミン）、ＰＥＧ  （ポリエチレングリコール）、ポリリジン、
ポリペプチド（ヒストン、リボソームタンパク質、プロタミンを含む）
【０１２０】
（vii）酸性ポリマー：
ＰＳＳ  ポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、核酸、等
【０１２１】
カプセルはまた、界面活性剤とポリマーの組合せを用いて調製することができる。
【０１２２】
＜バイオアッセイの別形態＞
上述では、図１を参照してバイオアッセイ手順を説明し、その場合の第１ステップでは分析物１０を含むと思われる試料サンプルが、シグナル前記物質３０を含むカプセル２０と溶液中で混合された。当然に理解されることだが、これがバイオアッセイを行う際の第１ステップでなければならないということではない。図１９〜図２２を参照して、別の手順をここで簡単に説明する。
【０１２３】
図１９は、シグナル前駆物質を含むカプセルを用いて免疫アッセイを行うための一連のステップを示す図である。
【０１２４】
基板１９２上に固定化された特異的捕捉抗体１９１を有する装置が用いられる。基板１９２上に固定化された捕捉抗体１９１は、例えば、図１４〜図１８に関連して説明したようなラテラルフローテスト装置におけるテストゾーンの固定化された捕捉分子に対応する。捕捉抗体１９１は、免疫アッセイにおいて検出されるべき標的種である抗原１９５に対して親和性がありかつ特異的に結合することができる。
【０１２５】
第１ステップ（図示せず）においては、捕捉抗体１９１を表面に固定化された基板１９２が、リン酸緩衝生理食塩水中の牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ／ＢＳＡ）による処理により予め濡らされるか、かつ／又は、遮蔽されている。これにより、基板１９２上の反応サイトが中和されることにより、後で適用される抗原とそれらが相互作用できないようにする。そうしないと、遮蔽されていない反応サイトは誤った読み取りを生じる可能性がある。
【０１２６】
第２ステップにおいては、図の上段左に示されるように、抗原１９５を含むと思われる溶液が、装置に流される。抗原が存在する場合、捕捉抗体１９１に結合することにより、少なくともその一部が捕捉されることになる。簡素化するために、図１９では１つの抗原１９５が１つの抗体１９１に結合しているものを示す。実際には、装置の捕捉ゾーンは、基板１９２上に固定化された多くの捕捉抗体１９１を有しており、これらの捕捉抗体のいずれもが抗原１９５に結合することができる。抗体／抗原結合サイトの形状において非常に特異的な性質をもつので、捕捉抗体１９１の各々は１つの抗原１９５にのみ結合することができる。
【０１２７】
第３ステップにおいては、シグナル前記物質３０を含みその表面に抗体１９４の形態の親和性分子をもつカプセル１９３の溶液が、装置に流される。捕捉抗体１９１のように、カプセル１９３の表面上の抗体１９４は、抗原１９５に親和性を有しかつ特異的に結合することができる。簡便のために、その表面に抗体１９４を有するカプセルを、Ａｂ結合カプセル１９６と称することとする。カプセル１９３の親和性分子として作用する抗体１９４により、また、抗原１９５に対する抗体１９４の親和性により、Ａｂ結合カプセル１９６は、捕捉抗体１９１により捕捉されている抗原１９５に結合するようになる。こうして、捕捉複合体１９７が形成される。
【０１２８】
第４ステップにおいては、捕捉複合体１９７を有する装置を洗浄することにより、捕捉されていない全てのＡｂ結合カプセルを除去し、その後、調整済みｐＨの処理溶液を装置に適用する。所望するインキュベーション期間の後、処理溶液が加熱されることにより、カプセルの活性化を発動させる。シグナル前駆物質３０は加水分解し、シグナル生成物質の個々の分子８０の形態でカプセルから放出される。
【０１２９】
最終ステップ（図示せず）においては、シグナル生成分子８０が励起光で照射されて放射光（生成されたシグナル）が検出され、計測される。
【０１３０】
図２０は、シグナル前駆物質を含むカプセルを用いた免疫アッセイを行うための別の代替方式の一部を示す図である。
【０１３１】
この代替方式では、標識化検出抗体２０７が用いられ、これは、検出装置の基板２０２上に固定化された捕捉抗体２０１に結合する。捕捉抗体２０１に結合することができる適切な標識（図では符号Ｌで示す）を用いることにより、同じ捕捉抗体２０１を、多くの異なるアッセイに用いることができる。なぜなら、アッセイ特異性は、検出抗体２０７に由来するものだからである。
【０１３２】
第１ステップ（図示せず）においては、その表面上に固体化された捕捉抗体２０１を有する基板２０が、リン酸緩衝生理食塩水中の牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ／ＢＳＡ）による処理により予め濡らされるか、かつ／又は、遮蔽されている。これにより、基板２０２上の反応サイトが中和されることにより、後で適用される抗原とそれらが相互作用できないようにする。そうしないと、遮蔽されていない反応サイトは誤った読み取りを生じる可能性がある。
【０１３３】
第２ステップにおいては、抗原２０５を含むと思われる溶液が、Ａｂ結合カプセル２０６及び標識化検出抗体２０７と予め混合される。Ａｂ結合抗体２０６は、シグナル前駆物質３０を含むカプセル２０３から形成され、その表面上に抗体２０４の形態で親和性分子をもつ。抗体は、抗原２０５に結合することができる。同様に、標識化検出抗体２０７も抗原２０５に結合することができる。この予め混合するステップにより、抗原２０５が存在するときはサンドイッチ複合体２０８が形成される。抗原２０５は、Ａｂ結合カプセル２０６の抗体２０４の１つと、標識化検出抗体２０７の１つとの間に”サンドイッチされる”。
【０１３４】
次のステップにおいては、サンドイッチ複合体２０８の予め混合された溶液が、装置に流される。標識化検出抗体２０７の標識Ｌの、固定化捕捉抗体２０１に対する親和性により、サンドイッチ複合体２０８は、捕捉複合体２０９として捕捉される。
【０１３５】
第４ステップにおいては、捕捉複合体２０９を有する装置が洗浄され、捕捉されていないサンドイッチ複合体２０８を全て除去する。洗浄後、調整済みｐＨ活性化溶液が装置に適用され、その後、所望するインキュベーション期間の後、活性化溶液が加熱され、カプセル活性化の発動が行われる。シグナル前駆物質３０は加水分解され、シグナル生成物質の個々の分子８０の形態でカプセルから開放される。
【０１３６】
最終ステップ（図示せず）においては、シグナル生成分子８０が励起光により照射され、放射光（生成されたシグナル）が検出され、計測される。
【０１３７】
図２０に示した方式は、次のような要件を有する。第１に、捕捉抗体２０１が基板２０２上に固定化される。これは、化学結合により行うことができ、あるいはそれに替えて、捕捉抗体をポリスチレン等のプラスチック基板上に直接吸着させることにより行うことができる。第２に、カプセル２０３は、検出されるべき標的に結合することができる親和性分子としての抗体２０４に結合させなければならない。第３に、標識”Ｌ”に特異的な抗体が必要であり、それもまた、検出されるべき標的に結合することができなければならない。標識”Ｌ”は、普通に入手可能な、抗体に対する結合体のいずれでもよく、例えば、ＤＮＰ、ジゴキシン、又は種々の染料がある。
【０１３８】
図２１は、シグナル前駆物質を含むカプセルを用いてハイブリダイゼーションアッセイを実施するためのさらに別に代替方式の一部を示す図である。この方式では、検出装置が、基板２１２に固定化された核酸断片（オリゴヌクレオチド）２１１を有する。核酸断片は、図１９及び図２０と関連して上述した捕捉抗体１９１及び２０１と同じ方法で機能し、そして、それらの捕捉抗体と同様に、図１４〜図１８に関連して上述したようなラテラルフローテスト装置の捕捉ゾーンにおける捕捉分子の例と考えることができる。
【０１３９】
第１ステップ（図示せず）においては、オリゴヌクレオチド２１１をその表面に固定化された基板２１２がリン酸緩衝生理食塩水中の牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ／ＢＳＡ）による処理により予め濡らされるか、かつ／又は、遮蔽されている。これにより、基板１９２上の反応サイトが中和されることにより、後で適用される、相補的核酸配列を含む標的溶液とそれらが相互作用できないようにする。そうしないと、遮蔽されていない反応サイトは誤った読み取りを生じる可能性がある。
【０１４０】
別のステップにおいては、シグナル前駆物質を含むカプセル２１３の溶液が調製され、カプセル２１３は、検出されるべきオリゴヌクレオチド２１４に結合している。簡便のために、オリゴヌクレオチドに結合したカプセルは、核酸複合体２１６と称することとする。
【０１４１】
次のステップは、図に示されている。核酸複合体２１６の溶液が、装置に流される。基板２１２上の固定化されたオリゴヌクレオチド２１１に対して相補的なオリゴヌクレオチド２１４を有するそれらの複合体２１６は、２つの相補的オリゴヌクレオチド２１１と２１４のハイブリダイゼーションにより捕捉されるようになり、それにより捕捉された複合体２１５を形成する。その捕捉された複合体２１５をもつ装置が洗浄されることにより、捕捉されていない拡散複合体２１６を除去する。
【０１４２】
図示の第２ステップにおいては、調整済みｐＨ活性化溶液が装置に適用され、そして所望するインキュベーション期間の後、活性化溶液が加熱され、カプセルの活性化発動が行われる。シグナル前駆物質３０は加水分解され、シグナル生成物質の個々の分子８０の形態でカプセルから開放される。
【０１４３】
最終ステップ（図示せず）においては、シグナル生成分子８０が励起光により照射され、放射光（生成されたシグナル）が検出され、計測される。
【０１４４】
図２１に示されたハイブリダイゼーション方式は、次の要件を有する。第１に、オリゴヌクレオチド２１１が基板２１２上に固定化されている。これは、何らかの形態の化学的結合と方向制御を必要とし、それにより、５’−３’方向が、各固定化されたオリゴヌクレオチドにおいて同じとなるようにし、かつオリゴヌクレオチド２１４がカプセル２１３上に固定化されるのとは反対方向となるようにする。第２に、オリゴヌクレオチド２１４は、カプセル２１４に結合し、この場合も方向制御される。第３に、オリゴヌクレオチド２１１は、検出されるべきオリゴヌクレオチド２１４に対して相補的でなければならない。
【０１４５】
図２２は、シグナル前駆物質を含むカプセルを用いてハイブリダイゼーションアッセイを行う別の方式の一部を示す図である。
【０１４６】
この方式では、検出装置が、基板２２２上に固定化された第１の拡散断片（オリゴヌクレオチド）２２１を有し、図２１に示したハイブリダイゼーション方式で用いた装置とほぼ同じである。故に、オリゴヌクレオチド２２１は、図１４〜図１８に関連して上述したラレラルフローテスト装置のテストゾーンに用いた捕捉分子の例と考えることができる。
【０１４７】
前述の通り、基板２２２上に固定化された第１のオリゴヌクレオチド２２１を有する検出装置が、ＰＢＳ／ＢＳＡによる処理により予め濡らされかつ／又はブロックされる。これにより、基板２２２上の反応サイトが中和され、読み取りの誤りを排除する。
【０１４８】
図示の第１のステップにおいては、シグナル前駆物質を含むカプセル２２３の溶液が調製される。カプセル２２３は検出されるべきオリゴヌクレオチド２２４に結合されている。このために、第３の核酸断片（オリゴヌクレオチド）を含む溶液が取り扱われ、これをここでは”ブリッジ”オリゴヌクレオチド２２７と称することとする。ブリッジオリゴヌクレオチド２２７は、カプセル２２３に結合しているオリゴヌクレオチド２２４とハイブリダイズし、ブリッジオリゴヌクレオチド複合体２２６を形成する。これは、更なるハイブリダイゼーションを行うことができるテール２２８を有する。
【０１４９】
次のステップにおいては、ブリッジオリゴヌクレオチド複合体２２６の溶液が、装置に流される。複合体２２６のテール２２８は、基板２２２上に固定化されたオリゴヌクレオチド２２１に相補的であり、従って更なるハイブリダイゼーションが生じて、複合体２２６はこの更なるハイブリダイゼーションにより装置上に捕捉されることとなり、捕捉複合体２２５を形成する。その捕捉複合体２２５を有する装置は洗浄されることにより、捕捉されていない核酸複合体２２６を全て除去する。
【０１５０】
次のステップにおいては、調整済みｐＨ活性化溶液が装置に適用され、その後、所望するインキュベーション期間の後、活性化溶液が加熱され、カプセルの活性化の発動が行われる。シグナル前駆物質３０が加水分解し、シグナル生成物質の個々の分子８０の形態でカプセルから開放される。
【０１５１】
最後のステップ（図示せず）においては、シグナル生成分子８０が励起光により照射され、放射光（生成されたシグナル）が検出され、計測される。
【０１５２】
図２２に示したハイブリダイゼーション方式は、次の要件を有する。第１に、オリゴヌクレオチド２２１は、基板２２２上に固定化されなければならない。これは、化学的結合と方向制御を必要とし、それにより、５’−３’方向が、各固定化されたオリゴヌクレオチドにおいて同じとなるようにし、かつ、カプセル２２３に結合したオリゴヌクレオチド２２４の５’−３’方向と同じとなるようにする。第２に、オリゴヌクレオチド２２４は、カプセル２２３と結合されなければならず、ここでも方向制御される。第３に、オリゴヌクレオチド２２１は、ブリッジオリゴヌクレオチド２２７に対して相補性を有していなければならず、ブリッジオリゴヌクレオチド２２７自体は、検出されるべきオリゴヌクレオチド２２４に対して相補性を有していなければならない。
【０１５３】
＜カプセル及びその結合方法に用いる異なる親和性分子のタイプの例＞
検出されるべき標的分子に依存して、親和性分子は、次の物質群から選択された生体認識分子とすることができる。
【０１５４】
（ａ）抗体、遺伝的に改変された抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、受容体、抗原、レクチン、アビジン、オリゴペプチド、リポタンパク質、糖タンパク質、ペプチドホルモン及びそれらのアレルゲン又はその一部からなる群から選択されるペプチド又はタンパク質；
（ｂ）ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、アプタマー及びその一部からなる群から選択される核酸；
（ｃ）単糖類、オリゴ糖類および多糖類、糖脂質、プロテオ多糖類及びその一部からなる群から選択される炭水化物；又は
（ｄ）ビオチン、ビオチン誘導体、ステロイド、ホルモン、補因子、活性化因子、阻害剤、医薬品、アレルゲン又はハプテンからなる群から選択される低分子量リガンド
【０１５５】
親和性分子は、カプセルの外表面に、例えばファンデルワールス力、水素結合又は静電相互作用により結合することができ、あるいは、親和性分子は、カプセルの外表面に直接又はリンカー分子を介して共有結合することができる。リンカー分子は、通常、生体分子であり、好適には、アビジン、ストレプタビジン、ニュートラビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、レクチン又は低分子架橋剤である。
【０１５６】
本発明は特定の実施形態及び実施例を参照して説明したが、これらは非限定的であり、他の変形及び変更が、以下の請求の範囲に規定される本発明の範囲から逸脱することなく可能であることは、当業者によって理解されるであろう。
【符号の説明】
【０１５７】
１０  分析物
２０  カプセル
３０  シグナル前駆物質
４０  親和性分子
５０  複合体
６０  基板
７０  捕捉分子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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