(57)【要約】  本発明は、γ−セクレターゼによって媒介されるＡＰＰタンパク質の切断後に得られる、より短いＡβペプチド、すなわちＡｓｓ１−３７、Ａｓｓ３−３７、Ａｓｓ３ｐ−３７、Ａｓｓ１１−３７、およびＡｓｓ１１ｐ−３７、および以下においてＡβｘ−３７ペプチドとも称されるＡＰＰの３７番目のアミノ酸で終結するその他の類似断片である、Ａβ−ペプチド断片を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供する。これは、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、ならびに抗体およびハイブリドーマ細胞を製造する方法；および本発明の抗体を使用する、競合法またはサンドイッチ法によるＡβｘ−３７ペプチドのための免疫測定法；および生物学的サンプルなどのサンプル中のＡβｘ−３７ペプチドレベルを測定する方法をさらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａβｘ−３７ペプチドを特異的に認識する、モノクローナル抗体。
【請求項２】
前記Ａβｘ−３７ペプチドが、Ａβ−ペプチド断片Ａｓｓ１−３７、Ａｓｓ３−３７、Ａｓｓ３ｐ−３７、Ａｓｓ１１−３７、およびＡｓｓ１１ｐ−３７からなる群から選択される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
検出可能に標識される、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
前記検出可能な標識が、放射性標識、酵素標識、ルミネセンス標識、または蛍光標識である、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
担体上に固定化される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
２０１１年２月１日にそれぞれ受入番号ＬＭＢＰ  ８０６２ＣＢおよびＬＭＢＰ  ８０６３ＣＢの下にＢｅｌｇｉａｎ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託された、ハイブリドーマ細胞ＪＲＤ／Ａｂ３７／３  ｓｃｌ１またはＪＲＤ／Ａｂ３７／４  ｓｃｌ１のいずれか、または２０１１年３月３０日に受入番号ＬＭＢＰ  ８０６４ＣＢの下にＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託されたハイブリドーマＪＲＤ／Ａｂ３７／１０  ｓｃｌ１による、請求項１から５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
前記サンプルを請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体に接触させて、前記抗体と前記Ａβｘ−３７ペプチドとの間に免疫複合体が形成されかどうかを測定するステップを含んでなる、サンプル中のＡβｘ−３７ペプチドを測定または検出するための免疫測定法。
【請求項８】
前記サンプルが、哺乳類からの組織サンプルおよび体液サンプルからなる群から選択される、請求項７に記載のＡβｘ−３７ペプチドの存在を測定または検出する方法。
【請求項９】
β−アミロイド関連疾患を診断するための請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１０】
治療を受ける患者の生物学的サンプル中のＡβｘ−３７ペプチド量およびＡβ４２ペプチド量を一定時間毎に測定するステップと、
前記Ａβｘ−３７ペプチド量および前記Ａβ４２ペプチド量の相対変化を経時的に測定するステップとを含んでなる、β−アミロイド関連疾患の治療をモニタリングする方法。
【請求項１１】
前記Ａβｘ−３７ペプチド量を測定するステップが、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体を使用して実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体と、前記抗体運搬手段とを含んでなる、β−アミロイド関連疾患の診断、進行モニタリングまたは治療モニタリングのための免疫測定法キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−アミロイドペプチドに対して特異的な新しい抗体と、診断法、生物マーカー、または治療薬としてのそれらの使用とに関する。より特には、本発明は、β−アミロイドペプチドのＡβｘ−３７断片に対して特異的な抗体について述べる。
【０００２】
本発明は、一般に、β−アミロイド前駆体タンパク質のプロセッシングをモニターする方法および組成物に関する。より具体的には、本発明は、アルツハイマー病およびその他のβ−アミロイドペプチド関連疾患を診断し、予後診断し、治療法に対する応答をモニタリングのためのこのような方法および組成物の使用に関し、ならびにアルツハイマー病およびその他のβ−アミロイドペプチド関連疾患の治療法としての受動的免疫化における、開示された抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶、認知力、論理的思考力、判断、および情動安定性の進行性の喪失によって臨床的に特徴付けられ、著明な精神荒廃を徐々にもたらし、究極的には死に至る退行性脳障害である。ＡＤは、高齢者における進行性精神衰退（認知症）の非常に一般的な原因であり、米国における４番目の最も一般的な医学的死亡原因に相当すると考えられている。ＡＤは世界中の民族で観察されており、主な現在のそして将来の公衆衛生問題を提示する。この疾患は、目下、米国のみで約２００〜３００万人に影響を及ぼしていると推定されている。ＡＤは、現在のところ不治である。ＡＤを効果的に予防し、またはその症状および経過を逆転させる治療は、目下知られていない。
【０００４】
ＡＤがある個人の脳は、老人（またはアミロイド）斑、アミロイド血管症（血管中のアミロイド沈着）、および神経原線維濃縮体と称される特徴的な病変を示す。多数のこれらの病変、特にアミロイドおよび神経原線維濃縮体は、ＡＤ患者において、記憶および認知機能にとって重要なヒト脳のいくつかの領域に一般に見られる。これらの病変の内、解剖学的により限局的に分布するより少数のものは、臨床的ＡＤがない高齢者の大多数の脳内にもまた見られる。アミロイド斑およびアミロイド血管症はまた、２１トリソミー（ダウン症候群）、びまん性レビー小体病、およびオランダ型アミロイド症を伴う遺伝性脳出血（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）がある個人の脳に特徴的である。
【０００５】
アミロイド斑の主要構成物は、β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の切断によって生じる、変種アミロイド−β（Ａβ）ペプチドである。ＡＰＰはＩ型膜貫通タンパク質であり、それはいくつかのいわゆるセクレターゼタンパク質による、タンパク質分解プロセッシングを受ける。過去には、斑および濃縮体がアルツハイマー病の原因であるのか、または単なる結果であるのかどうかという、かなり大きい科学的論争があったが、最近の発見は、アミロイド斑が、原因となる前駆体または要素であることを示唆する。特に、正常にプロセシングされればＡβペプチドを生じないタンパク質である、アミロイド前駆体タンパク質をコードする遺伝子の変異から、Ａβペプチドの生成が帰結し得ることが、発見されている。家族性早発性アルツハイマー病を引き起こす、アミロイド前駆体タンパク質遺伝子における変異の同定は、アミロイド代謝が、疾患に根本的な病原性過程の中心的事象であることの最も有力な証拠である。Ａβは、目下、最重要の診断パラメータと見なされている。
【０００６】
Ｔａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ：ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ  ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  β−ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（Ｏｃｔｏｂｅｒ  １４，２００９）；２９（４１）：１３０４２−１３０５２）は、β−カルボキシル末端断片（βＣＴＦ）プロセッシングの概要を示す。Ａβは、βＣＴＦが、２つの長いＡβであるＡβ４８およびＡβ４９に切断されることで、生成すると思われる。これらは、各段階における３または４個の残基の除去によってさらにプロセシングされ、Ａβ４２およびＡβ４０が生成する。Ａβ４９が、２または３個のトリペプチドの連続的遊離によってＡβ４３／４０に変換される一方で、Ａβ４８は、２個のトリペプチドおよびさらなるテトラペプチドの連続的遊離によって、Ａβ４２／３８に変換される。
【０００７】
病的状態では、および疾患修飾剤を使用した場合は、その他の断片が生じる。
【０００８】
ＡＤおよびその他のＡｓｓ−関連疾患の根本的な機構の理解における進歩にもかかわらず、疾患を診断して治療するための方法および組成物を開発する必要性がなおもある。したがってアミロイド前駆体タンパク質の細胞プロセッシングをモニターする能力は、アルツハイマー病の診断、予後診断、および治療管理において、顕著な価値を有するであろう。特に、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）などの容易に得られる患者サンプル中で、検出可能な診断マーカーをスクリーニングして評価するための、低侵襲性で再現可能な手順を同定することが望ましいであろう。前出のＴ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２１５（１９９６）；１７３−１７６に記載されるようなポリクローナル抗体は、生物学的サンプル中の異なるＡβ−ペプチドを検出するのに有用であるが、各バッチのポリクローナル抗体が異なる事実を踏まえると、これらの抗体は、容易に得られる患者サンプル中で、検出可能な診断マーカーをスクリーニングして評価する、再現可能な手順を実施するツールを提供しない。これに加えて、ポリクローナル抗体の使用では、典型的に非特異的結合がより高く、典型的にウエスタンブロット法の正確度が低下する。
【０００９】
アルツハイマー病のためのいくつかの可能な診断マーカーが、提案されている。本発明にとって特に興味深いのは、ＡＰＰタンパク質のβ−カルボキシル末端断片プロセッシング後に得られる、Ａβ前駆体タンパク質の断片である。これらのマーカーは、それ自体が、および／またはその他の診断マーカーおよび手順と組み合わせて、有用なはずである。好ましくは、診断マーカーは、低侵襲診断手順を利用し得るように、ＣＳＦ、血液、血漿、血清、尿などの体液、組織などの中で検出可能である。また、例えば臨床試験モニタリングなどの新しい治療の開発、または現行の治療の双方で使用される、疾患および／または治療の進行をモニタリングするための生物マーカーに対する必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
Ａβｘ−３７検出のための特異的アッセイは、液状サンプル中の非常に低濃度のＡβｘ−３７を再現可能な一貫した様式で検出し、ならびにサンプル中に存在してもよい、Ａβｘ−３７ペプチドとその他のＡＰＰ断片とを識別できるはずである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、γ−セクレターゼによって媒介されるＡＰＰタンパク質の切断後に得られる、より短いＡβペプチド、すなわちＡｓｓ１−３７、Ａｓｓ３−３７、Ａｓｓ３ｐ−３７、Ａｓｓ１１−３７、およびＡｓｓ１１ｐ−３７、および以下Ａβｘ−３７ペプチドとも称されるＡＰＰの３７番目のアミノ酸で終結するその他の類似断片である、Ａβ−ペプチド断片を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供する。これは、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、ならびに抗体およびハイブリドーマ細胞を製造する方法；および本発明の抗体を使用する競合法またはサンドイッチ法によるＡβｘ−３７ペプチドのための免疫測定法；および生物学的サンプルなどのサンプル中のＡβｘ−３７ペプチドレベルを測定する方法をさらに提供する。
【００１２】
特に本発明は、免疫原としてポリペプチドＨ２Ｎ−ＣＡＩ  ＩＧＬ  ＭＶＧ−ＣＯＯＨを使用して調製された、モノクローナル抗体を提供する。前記抗体は、その他のＡＰＰ断片との交差反応性なしにＡβｘ−３７ペプチドと特異的に反応し、したがってアルツハイマー病の発病におけるＡβｘ−３７の役割を評価する免疫測定法において有用である。
【００１３】
より具体的な実施形態では、モノクローナル抗体は、免疫原としてのポリペプチドＣＡＩＩＧＬＭＶＧに反応性であり、２０１１年２月１日にそれぞれ受入番号ＬＭＢＰ  ８０６２ＣＢおよびＬＭＢＰ  ８０６３ＣＢの下に、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託された、ハイブリドーマＪＲＤ／Ａｂ３７／３  ｓｃｌ１またはＪＲＤ／Ａｂ３７／４  ｓｃｌ１によって、または２０１１年３月３０日に受入番号ＬＭＢＰ  ８０６４ＣＢの下に、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託された、ハイブリドーマＪＲＤ／Ａｂ３７／１０  ｓｃｌ１によって発現される。したがって本発明に従ったモノクローナル抗体を発現する、前述のハイブリドーマ細胞を提供することが、本発明のさらなる実施形態である。
【００１４】
本発明のさらなる態様では、本発明に従った抗体は、β−アミロイド関連疾患をモニターするための生物学的サンプル、およびＡＰＰの細胞内プロセッシングをモニターするための細胞培養からの馴化培地をはじめとして、Ａβｘ−３７ペプチドのあらゆる出現を検出する従来の免疫学的技術で使用される。適切な免疫学的技術は当業者に良く知られており、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット分析、競合またはサンドイッチ免疫測定法などが挙げられ、その他の点では周知のように、それらは全て、抗原−抗体免疫複合体の形成に依存し、そこではアッセイの目的で、抗体が例えば放射性、酵素または蛍光性標識で標識されて検出可能であり得て、またはそれは不溶性担体上に固定化され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＪＲＤ／Ａｂ３７／３ハイブリドーマ細胞によって産生される、抗Ａβ３７抗体の特異性を図示する。
【図２】
【図３】それぞれイヌではＧＳＭ（γ−セクレターゼ調節因子）ＡおよびＢ、サルではＥ２０１２による処置後の、イヌおよびサルＣＳＦ中のＡβ３７増大の測定をそれぞれ示す。
【図４】健常対照（ＨＣ）、神経学的対照（ＮＣ）、およびアルツハイマー病患者（ＡＤ）で測定された、異なるＡβ断片のレベルを示す。
【図５】健常対照（ＨＣ）、神経学的対照（ＮＣ）、およびアルツハイマー病患者（ＡＤ）で測定された、Ａβ断片間の比率を比較する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、βＣＴＦプロセッシングによるＡＰＰタンパク質切断後に得られる、より短いＡβペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体を提供する。本発明の抗体は、ヒトＡβのＡβｘ−３７ペプチド上、またはマウスＡβのＡβｘ−３７ペプチド上に存在する、１つまたは複数のエピトープに対する特異性を有する。
【００１７】
特に、本発明は、免疫原としてＨ２Ｎ−ＣＡＩＩＧＬＭＶＧ−ＣＯＯＨからなるペプチドを使用して調製された、モノクローナル抗体を提供する。
【００１８】
前述のペプチドは、アミノ酸が成長鎖に順次付加される、良く知られているＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成技術などの当該技術分野で公知の方法によって、調製製造されてもよい（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５６）。アミノ酸配列は、上記の（ｓｅｔｈ  ｆｏｒｔｈ  ａｂｏｖｅ）Ａβ断片の配列に基づいてもよく、または天然のまたは遺伝子操作された変異配列を利用してもよい。免疫原として使用するために、このように得られたペプチドは、単独で使用してもよく、またはウシ、ウサギ、およびヒトなどの哺乳類のマレイミド活性化血清アルブミン；ウシ、ウサギ、ヒト、およびヒツジなどの哺乳類のチログロブリン；およびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）や、またはスチレンポリマー、アクリルポリマー、ビニルポリマー、およびプロピレンポリマーをはじめとする合成ポリマー担体などのその他の適切なタンパク質担体などの適切な免疫活性化天然または合成担体とコンジュゲートしてもよい。免疫化のさらに詳細な説明は、実施例にある。
【００１９】
ひとたび十分な量の免疫原が得られたら、生体外または生体内技術をはじめとする技術を使用して、様々な方法によって、Ａβｘ−３７ペプチドに対して特異的なポリクローナル抗体を製造してもよい。生体外技術が免疫原へのリンパ球の曝露を伴う一方で、生体内技術は適切な脊椎動物宿主への免疫原の注射を必要とする。適切な脊椎動物宿主は、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギなどをはじめとする非ヒト動物である。免疫原は、所定のスケジュールに従って動物に注射され、動物は周期的に採血され、後続の採血は改善された力価と特異性を有する。注射は、筋肉内、腹腔内、皮下などで行ってもよく、フロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバントなどのアジュバントを投与して、抗体産生能を増強してもよい。血清力価レベルをスクリーニングする方法は、典型的に標準ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡアッセイを含む。例えばＥＬＩＳＡスクリーニング形式では、（ＢＳＡなどの）担体と共役しているＡβｘ−３７ペプチドまたはＡβｘ−３７ペプチドのいずれかで被覆された固相（例えばマイクロプレートの底）に血清を添加し、次に好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼである酵素、または１２５Ｉなどの放射性同位体などの検出可能な標識とコンジュゲートされた、抗免疫グロブリン抗体（例えば免疫化がマウスで実施される場合は、例えばヒツジ−抗マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）などの抗マウス免疫グロブリン抗体が使用される）を追加する。
【００２０】
所望ならば、モノクローナル抗体は、技術分野の当業者に良く知られている技術を使用して、直上に記載した方法によって、所望の免疫原で過免疫されたマウスなどの脊椎動物宿主から調製し得る。好都合には、高力価抗体を示す脊椎動物宿主は、所望の免疫原で免疫化された動物から選択される。典型的に最終免疫化の２〜５日後、好ましくは４日後に、それから脾臓またはリンパ節を採取して、その中に含有される抗体産生細胞を不死化する。不死化の様式は、重要でない。現在のところ最も一般的な技術は、骨髄腫細胞融合パートナーとの融合である。融合手順は、例えばＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））の方法などの当該技術分野で公知の方法に従って実施し得る。その他の技術としては、ＥＢＶ形質転換、例えば発がん遺伝子、レトロウイルスなどの裸の（ｂａｒｅ）ＤＮＡでの形質転換、または安定した細胞系の維持と、モノクローナル抗体産生を提供する、あらゆるその他の方法が挙げられる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびセンダイウイルスをはじめとする融合促進剤を使用してもよい。特にＰＥＧが、好ましくは使用される。骨髄腫細胞の例としては、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、およびＡＰ−１が挙げられ、ＳＰ２／０細胞が好ましくは使用される。
【００２１】
Ａβｘ−３７ペプチドのＣ末端上に見られるエピトープに対して特異的なハイブリドーマ産生モノクローナル抗体は、例えばＢａｌｂ／ｃマウスなどのそれからハイブリドーマが生成され得る動物を、フロイントアジュバント中の所望の免疫原の初回腹腔内注射と、それに続く２週毎の追加免疫注射によって最初に免疫化することで、最も効果的に生成される。引き続く単離脾臓の融合は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，２９２−２９５（１９７６））の変法によって、好ましくはＳＰ２／０細胞を使用して、当業者に通常知られているあらゆる技術を使用して実施し得る。Ａβｘ−３７ペプチドに対して特異的な抗体をいずれのハイブリドーマが産生するかを判定するスクリーニングは、上文に記載される標準ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡアッセイのいずれかで成し得る。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択および育種は、１０〜２０％のウシ胎仔血清と、例えばＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）またはＥＳＧハイブリドーマ補給剤などのその他の成分とが添加された動物用培地（例えばダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはイーグル最少必須培地（ＭＥＭ））内で通常行われる。したがって一実施形態では、本発明は、２０１１年２月１日にそれぞれ受入番号ＬＭＢＰ  ８０６２ＣＢおよびＬＭＢＰ  ８０６３ＣＢの下に、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託されたハイブリドーマ細胞ＪＲＤ／Ａｂ３７／３  ｓｃｌ１またはＪＲＤ／Ａｂ３７／４  ｓｃｌ１、または２０１１年３月３０日に受入番号ＬＭＢＰ  ８０６４ＣＢの下に、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託されたハイブリドーマＪＲＤ／Ａｂ３７／１０  ｓｃｌ１を提供する。
【００２２】
抗Ａβｘ−３７モノクローナル抗体の分離および精製は、塩析沈殿、アルコール沈殿、等電沈殿、電気泳動、イオン交換材料（例えばＤＥＡＥ）の吸着および脱離、超遠心、ゲル濾過、および抗原結合固相およびプロテインＡまたはプロテインＧ親和性クロマトグラフィーをはじめとする特定の免疫親和性分離技術などの、ポリクローナル抗体の通常の分離および精製と同様に実施される。適切なタンパク質精製技術は、その開示を参照によって本明細書に援用するＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８２，Ｄｅｕｔｃｈｅｒ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９０に記載される。
【００２３】
したがって前述のハイブリドーマ細胞によって発現される単離モノクローナル抗体を提供することが、本発明の目的であり、前記抗体はＡβｘ−３７ペプチドを特異的に認識できる。好ましくはこれらの単離モノクローナル抗体は、２０１１年２月１日にそれぞれ受入番号ＬＭＢＰ  ８０６２ＣＢおよびＬＭＢＰ  ８０６３ＣＢの下にＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託された、ハイブリドーマ細胞ＪＲＤ／Ａｂ３７／３  ｓｃｌ１またはＪＲＤ／Ａｂ３７／４  ｓｃｌ１、または２０１１年３月３０日に受入番号ＬＭＢＰ  ８０６４ＣＢの下にＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託された、ハイブリドーマＪＲＤ／Ａｂ３７／１０  ｓｃｌ１によって発現される。
【００２４】
本発明に従った抗体は、β−アミロイド関連疾患をモニターするための生物学的サンプル、およびＡＰＰの細胞内プロセッシングをモニターするための細胞培養からの馴化培地をはじめとして、Ａβｘ−３７ペプチドのあらゆる出現を検出する従来の免疫学的技術で使用される。適切な免疫学的技術は当業者に良く知られており、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット分析、競合またはサンドイッチ免疫測定法などが挙げられ、さもなければ周知のように、それらは全て、抗原−抗体免疫複合体の形成に依存し、そこではアッセイの目的で、抗体が例えば放射性、酵素、ルミネセンスまたは蛍光性標識で標識されて検出可能であり得て、またはそれは不溶性担体上に固定化され得る。したがってサンプル中のＡβｘ−３７ペプチドを測定または検出するための免疫測定法を提供することが、本発明の目的であり、方法は、抗体を含むサンプルを本発明に従ったＡβｘ−３７ペプチドに接触させて、抗体とＡβｘ−３７ペプチドの間に免疫複合体が形成されるかどうかを判定するステップを含んでなる。これらの方法は、組織サンプルまたは体液サンプルのいずれかにおいて実施し得て、一般に、対象の身体からサンプルを得るステップと；前記サンプルを、イメージング有効量の検出可能に標識された本発明に従った抗体に接触させるステップと；標識を検出して、サンプル中のＡβｘ−３７ペプチドの存在を確立するステップとを含んでなる。
【００２５】
本発明の抗体を使用する測定法は、特に限定的でない。測定溶液中の抗原の量、特にＡβｘ−３７ペプチドの量に対応する、抗体、抗原または抗原−抗体複合体の量が、化学的または物理的手段によって検出され、既知量の抗原を含有する標準溶液の使用によって作成された標準曲線から計算されさえすれば、あらゆる測定法を使用してもよい。例えば比濁分析、競合法、免疫測定法、およびサンドイッチ法が、適切には使用される。感度と特異性に関して、下述のサンドイッチ法を使用することが特に好ましい。
【００２６】
標識物質を使用した測定法では、標識薬剤として、放射性同位体、酵素、蛍光性物質、発光性物質などが使用される。放射性同位体の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、および１４Ｃが挙げられる。酵素は、通常、検出可能な反応を触媒する適切な基質の共役によって検出可能にされる。その例としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、およびリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｄｅｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼが挙げられる。発光性物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、エクオリン、およびルシフェラーゼが挙げられる。さらにアビジン−ビオチン系もまた、本発明の抗体および免疫原標識のために使用し得る。
【００２７】
免疫原または抗体が不溶化される場合、タンパク質または酵素の不溶化または固定化のために通常用いられる、物理吸着または化学結合のいずれかを使用してもよい。担体の例としては、アガロース、デキストラン、およびセルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、およびシリコーンポリマーなどの合成樹脂、およびガラスが挙げられる。
【００２８】
サンドイッチ法では、試験溶液を不溶化された抗Ａβｘ−３７ペプチド捕捉抗体と反応させ（第１の反応）、さらに標識された抗Ａβｘ−３７ペプチド検出抗体を反応させて（第２の反応）、次に不溶化担体上の標識薬剤の活性をアッセイし、それによって検査溶液中のＡβｘ−３７ペプチドの量を判定し得る。第１の反応および第２の反応は、同時にまたは順次実施してもよい。
【００２９】
β−アミロイド関連疾患を診断するためのさらなる実施形態では、組織や、ＣＳＦ、血液、血漿、血清、尿などの体液をはじめとする生物学的サンプルを収容して、適切量の初回抗体と接触させ、免疫複合体を生成させる。接触は、典型的に、第１の抗体で被覆された固体マトリックスに、サンプルを添加することを伴う。サンプルを第１の抗体に接触させることで生じる複合体は、溶出によってサンプルから分離される。しかしその他の回収方法を用いてもよい。回収された複合体は、抗原上の抗原決定基を対象として複合体中の抗原と結合できる、少なくとも１つの第２の抗体に接触させる。抗原性実体の多エピトープ性のために、第２の抗体が対象とする抗原決定基は、第１の抗体が対象とするものと同一であってもよい。上で説明した標識のいずれかを使用して、第１のまたは第２の抗体のいずれかを検出可能にしてもよい。特定の実施形態では、第２の抗体が検出可能にされる。第１のおよび第２の抗体に結合する抗原からなる複合体に結合する、検出可能な抗体の存在は、技術分野で既知の技術を使用して容易に検出されてもよい。生物学的サンプルで得られる結果と、対照サンプルで得られる結果とを比較することで、改変Ａβｘ−３７ペプチドレベルの存在を判定してもよい。
【００３０】
したがって以下被覆抗体と称される、固体マトリックスに被覆された第１の抗体が、Ａβｘ−３７ペプチドを認識する抗体からなり、検出可能にされた第２の抗体が、ＡβペプチドのＮ−末端を特異的に認識する、サンドイッチアッセイを提供することが、本発明の目的である。有利には、被覆抗体は、ヒトＡβｘ−３７ペプチドを認識し、より具体的な実施形態では、被覆抗体は、Ａβｘ−３７を特異的に認識する、モノクローナル抗体ＪＲＦ／Ａｂ３７／３、ＪＲＦ／Ａｂ３７／４、およびＪＲＦ／Ａｂ３７／１０からなる群から選択される。有利な実施形態では、第２の抗体は、ハイブリドーマ細胞ＪＲＦ／Ａβ／Ｎ２５によって発現されるモノクローナル抗体である。
【００３１】
サンドイッチアッセイを提供して、Ａβｘ−３７ペプチドと、Ａβ３８、Ａβ４０またはＡβ４２ペプチドとの比率を判定することもまた、本発明の目的である。この実施形態では、Ａβ３８、Ａβ４０またはＡβ４２ペプチドを認識し、その上Ａβｘ−３７ペプチドとの交差反応性を示さない、追加的な第２の抗体が使用される。したがって被覆抗体が、Ａβｘ−３７ペプチドを特異的に認識するが、完全長Ａβ４０およびＡβ４２ペプチド、モノクローナル抗体ＪＲＦ／Ａｂ３７／３、ＪＲＦ／Ａｂ３７／４、およびＪＲＦ／Ａｂ３７／１０との交差反応性を示さない抗体からなる、サンドイッチアッセイを提供することが本発明の目的である。
【００３２】
本発明のモノクローナル抗体はまた、例えば、競合法および比濁分析などのサンドイッチ法以外のアッセイシステムで使用し得る。競合法では、試験溶液中の抗原と標識免疫原が、抗体と競合的に反応し、それに続いて、未反応の標識免疫原（Ｆ）が、標識免疫原（ｉｍｕｎｏｇｅｎｓ）（Ｂ）に結合する抗体から分離される（Ｂ／Ｆ分離）。次にＢまたはＦのいずれかの標識量を測定して、試験液中の免疫原の量を判定する。これらの反応法としては、可溶性抗体が抗体として使用され、ポリエチレングリコールと、前述の抗体に対する第２の抗体とがＢ／Ｆ分離のために使用される液相法、および固化抗体が第１の抗体として使用され、または可溶性抗体が第１の抗体として使用され、固化抗体が第２の抗体として使用される、固化法が挙げられる。
【００３３】
比濁分析では、ゲルまたは溶液中において、抗体−抗原反応の結果として生成した不溶性沈殿物の量が測定される。抗原の量が軽微であり、沈殿物が少量のみ得られる場合でさえも、レーザー散乱を使用するレーザー比濁分析が、適切に使用される。
【００３４】
さらなる態様では、本発明は、本発明の抗体を用いた治療をモニターする方法を対象とする。より特には、本発明の抗体および検出法を使用して、アルツハイマー病患者における、多様な疾患修飾薬の効果をモニターし得る。このような疾患修飾薬の例としては、いわゆるＧＳＭ（γセクレターゼ調節因子）、ＧＳＩ（γセクレターゼ阻害剤）またはＢＡＣＥ阻害化合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３５】
本発明は、前述の方法で使用し得るキットをさらに提供する。一実施形態では、キットは、１つまたは複数の容器内に、２０１１年２月１日にそれぞれ受入番号ＬＭＢＰ  ８０６２ＣＢおよびＬＭＢＰ  ８０６３ＣＢの下に、Ｂｅｌｇｉａｎ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託された、ハイブリドーマ細胞ＪＲＤ／Ａｂ３７／３  ｓｃｌ１またはＪＲＤ／Ａｂ３７／４  ｓｃｌ１、または２０１１年３月３０日に受入番号ＬＭＢＰ  ８０６４ＣＢの下にＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託された、ハイブリドーマＪＲＤ／Ａｂ３７／１０  ｓｃｌ１によって発現される、好ましくは精製抗体、より好ましくはモノクローナル抗体、なおもより好ましくは単離モノクローナル抗体である、本発明の抗体を含んでなる。特定の実施形態では、本発明のキットは、キットに含まれる抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含んでなる、実質的に単離されたポリペプチドを含有する。さらなる実施形態では、このエピトープは、Ａβｘ−３７ペプチドのＣ末端上に存在する。好ましくは、本発明のキットは、サンドイッチアッセイで使用するために準備され、対象ポリペプチドと特異的に反応しない被覆抗体をさらに含んでなり、特定の実施形態では、この被覆抗体は、ヒトＡβ１−３７ペプチドなどのＡβ１−３７ペプチド、ヒトＡβ１−３８、Ａβ１−４０またはＡβ１−４２などのＡβ１−３８、Ａβ１−４０またはＡβ１−４２を認識する。特定の実施形態では、被覆抗体はＪＲＦ／Ａβ／Ｎ２５である。本発明に従った代案のサンドイッチアッセイでは、キットは、ヒトＡβｘ−３７ペプチドなどのＡβｘ−３７ペプチドを特異的に認識する、被覆抗体を含んでなる。より具体的な実施形態では、キットは、被覆抗体として、２０１１年２月１日にそれぞれ受入番号ＬＭＢＰ  ８０６２ＣＢおよびＬＭＢＰ  ８０６３ＣＢの下にＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託された、ハイブリドーマ細胞ＪＲＤ／Ａｂ３７／３  ｓｃｌ１またはＪＲＤ／Ａｂ３７／４  ｓｃｌ１によって、または２０１１年３月３０日に受入番号ＬＭＢＰ  ８０６４ＣＢの下にＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託された、ハイブリドーマＪＲＤ／Ａｂ３７／１０  ｓｃｌ１によって発現される単離モノクローナル抗体と、さらなる抗体として、検出可能な標識にコンジュゲートされたモノクローナル抗体ＪＲＦ／Ａβ／Ｎ２５とを含んでなる。
【００３６】
別の特定の実施形態では、本発明のキットは、抗体と対象ポリペプチドとの結合を検出する手段を含有する（例えば抗体は、蛍光性化合物、酵素基質、放射性化合物またはルミネセンス化合物などの検出可能な基質とコンジュゲートしていてもよく、または第１の抗体を認識する第２の抗体は、検出可能な基質とコンジュゲートしていてもよい）。特にキットは、抗体とＡβｘ−３７ペプチドとの結合を検出する、好ましくはＡβｘ−３７ペプチドのＣ末端に存在するエピトープとの結合を検出する手段を含有する。前述のサンドイッチアッセイでは、検出可能な基質にコンジュゲートされる抗体は、被覆抗体でない。
【００３７】
追加的な実施形態では、本発明は、組織や、ＣＳＦ、血液、血漿、血清、尿などの体液などをはじめとする生物学的サンプルのスクリーニングで使用される、診断キットを含む。前記生物学的サンプルは、Ａβｘ−３７ペプチドを含有する。診断キットは、Ａβｘ−３７ペプチドと、特にＡβｘ−３７ペプチドのＣ末端上に存在するエピトープと、特異的に免疫反応性である実質的に単離された抗体と、抗体と免疫原の結合を検出する手段とを含む。一実施形態では、抗体は固体支持体に付着する。特定の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、特に、２０１１年２月１日にそれぞれ受入番号ＬＭＢＰ  ８０６２ＣＢおよびＬＭＢＰ  ８０６３ＣＢの下にＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託された、ハイブリドーマ細胞ＪＲＤ／Ａｂ３７／３  ｓｃｌ１またはＪＲＤ／Ａｂ３７／４  ｓｃｌ１によって、または２０１１年３月３０日に受入番号ＬＭＢＰ  ８０６４ＣＢの下にＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託された、ハイブリドーマＪＲＤ／Ａｂ３７／１０  ｓｃｌ１によって発現されるモノクローナル抗体であってもよい。
【００３８】
上記アッセイの固体表面試薬は、タンパク質材料をポリマービーズ、ディップスティック、９６ウェルプレートまたは濾過材料などの固体支持体材料に付着させる既知の技術によって調製される。これらの付着法としては、支持体へのタンパク質の非特異的吸着、または典型的に遊離アミン基を通じた、固体支持体上の活性化カルボキシル、ヒドロキシル、またはアルデヒド基などの化学的反応基へのタンパク質の共有結合が、一般に挙げられる。代案としては、ビオチン化抗原と併用して、ストレプトアビジン被覆プレートを使用し得る。
【００３９】
したがって本発明は、この診断方法を実施するためのアッセイシステムまたはキットを提供する。キットは、一般に、本発明に従った表面結合抗体がある支持体と、抗体と免疫原との結合を検出するレポーター標識抗体とを含む。
【００４０】
本発明は、以下の実験の詳細を参照してより良く理解されるが、当業者は、これらが、その後に続く特許請求の範囲でより詳しく説明される本発明を単に例証するものであることを容易に理解するであろう。さらに本出願全体を通じて、様々な刊行物が引用される。これらの刊行物の開示は、本発明に関係する最先端技術をより詳しく説明するために、参照によって本出願の明細書に援用される。
【実施例】
【００４１】
実験
材料と方法
モノクローナル抗体の作成
２匹のＢａｌｂ／ｃマウスを完全フロイントアジュバント中のＨ２Ｎ−ＣＡＩＩＧＬＭＶＧ−ＣＯＯＨ（配列番号０１）で初回刺激した。製造会社の使用説明書に従って、ＰｉｅｒｃｅのＩｍｊｅｃｔ  Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍｃ  ＫＬＨ／ＢＳＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）などの市販されるキットを使用して、ＣＯＯＨ−末端システイン（ｃｙｓｔｅｉｎ）残基を介して、ペプチドをマレイミド活性化ｍｃ（鍵穴カサガイ（Ｍｅｇａｔｈｕｒａ  ｃｒｅｎｕｌａｔａ））ＫＬＨに、またはマレイミド活性化ウシ血清アルブミンにカップリングして、免疫化のために準備した。マウスを、最初に完全フロイントアジュバント中の、引き続いて不完全フロイントアジュバント中の１００μｇまたは２００μｇのＫＬＨ共役ペプチドで、２週毎に追加免疫した。
【００４２】
最高血清力価を示すマウスを融合のために選択した一方で、第２のマウスの脾臓を単離して液体窒素中で冷凍した。融合または脾臓抽出の４日前に、生理食塩水中のｍｃＫＬＨと共役する１００μｇのＨ２Ｎ−ＣＡＩＩＧＬ  ＭＶＧ−ＣＯＯＨで、全てのマウスに腹腔内追加免疫した。Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，２９２−２９５（１９７６））の変法によって、マウス脾臓細胞をＳＰ２／０細胞と融合した。３０×９６ウェルプレート内にハイブリドーマを接種して、０．５μｇ／ウェルの非共役ペプチドＡｓｓ１−３７上の直接ＥＬＩＳＡ（ＡｎａＳｐｅｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＵＳＡ）で、１０日後にスクリーニングした。０．５μｇ／ｍｌの被覆Ａｓｓ１−３７、Ａｓｓ１−３８、およびＡｓｓ１−３９ペプチド（ＡｎａＳｐｅｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＵＳＡ）上で、陽性細胞を交差反応性について試験して、即座にサブクローニングした。陽性クローンを液体窒素中で冷凍した。
【００４３】
全てのハイブリドーマは、１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｅｕｒｏｐｅ）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（２％）（Ｒｏｃｈｅ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、２％ＨＴ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）、１ｍＭのナトリウムピルビン酸、２ｍＭのＬグルタミン、およびペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）を添加した、ダルベッコ変法イーグル培地中で培養した。製品は全て、Ｌｉｆｅ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｕ．Ｋ．）から市販され、購入された。細胞を加湿８％ＣＯ２空気インキュベーター内で培養した。
【００４４】
抗体選択のための直接ＥＬＩＳＡ
抗Ａｓｓｘ−３７抗体の検出のために使用されたスクリーニングＥＬＩＳＡは、５０μｌ／ウェルの被覆緩衝液（１０ｍＭトリス、１０ｍＭのＮａＣｌ、および１０ｍＭのＮａＮ３、ｐＨ８．５）中で、ＮＵＮＣ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）平底高結合型９６ウェルマイクロタイタープレート内に４℃で一晩被覆させた、０．５μｇ／ｍｌ遊離ヒトＡｓｓ１−３７ペプチドによる、直接ＥＬＩＳＡであった。翌日、プレートを７５μｌ／ウェルのＰＢＳ中０．１％カゼインによって、室温で６０分間被覆して、非特異的結合を低下させた。次に５０μｌのハイブリドーマ上清を添加して、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、５０μｌ／ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼ共役ヒツジ抗マウスＩｇＧによって、３７℃、１時間で結合モノクローナル抗体を検出した（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）。双方の試薬を０．１％カゼイン／ＰＢＳ中で希釈した。プレートを洗浄して、５０μｌの１００ｍＭクエン酸および１００ｍＭリン酸水素二ナトリウム中の０．４２ｍＭの３，５，３’，５’−テトラメチル−ベンジジンおよび０．００３％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＨ２Ｏ２溶液（ｐＨ４．３）を基質として添加した。プレート振盪機上で反応を室温で最大１５分間進行させ、その後、５０μｌ／ウェルの２ＮＨ２ＳＯ４で発色を停止させて、４５０ｎｍのマイクロタイタープレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上でプレートを読み取った。選択されたモノクローナル抗体と全長ヒト遊離Ａｓｓ１−３８およびＡｓｓ１−３９ペプチドとの交差反応性を、スクリーニングアッセイと同一の直接ＥＬＩＳＡで試験した。
【００４５】
選択性試験のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ
ヒトＡβ１−３７、Ａβ１−３８、Ａβ１−３９、Ａβ１−４０、およびＡβ１−４２標準物質を０．１ｍｇ／ｍＬでジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して、−８０℃で保存した。ＥＬＩＳＡで使用するために、ペプチドをＰＢＳ中の０．１％カゼインで１ｐｇ／ｍＬにさらに希釈した。被覆緩衝液中の濃度１．５μｇ／ｍＬのモノクローナル抗体で、９６ウェルプレート（ハーフエリア黒色プレート、Ｃｏｓｔａｒ）を４℃で一晩被覆した。ＪＲＤ／Ａβ３７／３をＡβ１−３７の捕捉抗体として使用した。翌日、プレートをＰＢＳ中の０．１％カゼインで、室温で１〜４時間洗浄してブロックした。ＨＲＰＯ標識二次抗体ＪＲＦ／Ａβ／Ｎ２５（全長ヒトＡβペプチドのＮ末端を特異的に認識する抗体（Ｍｅｒｃｋｅｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ  ２１，Ｓ４１（２０００））と共に、標準物質および未希釈サンプルを４℃で一晩培養した。一晩のインキュベーション後プレートを洗浄し、製造会社の推奨事項に従って、Ｑｕａｎｔａｂｌｕ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）でＡβ１−３７アッセイを発色させた。
【００４６】
免疫ブロット−Ａβ３７モノクローナル抗体の特異性
５μｇの各合成ペプチド（Ａβ１−３７、Ａβ１−３８、Ａβ１−３９、Ａβ１−４０、Ａβ１−４２）をＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ビス−トリス１２％ゲル上に装填し、製造会社の使用説明書に従って、ｉＢｌｏｔシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の使用によって、ニトロセルロース膜上にブロットした。脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）（５％ｗ／ｖ；Ｂｉｏｒａｄ）を含有する、トリス緩衝食塩水Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ；１Ｍトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ８．５）で膜を１時間ブロックし、ＴＢＳ−Ｔ中で３回洗浄した。ＮＦＤＭ（５％ｗ／ｖ）含有ＴＢＳ−Ｔで希釈された一次抗体（５μｇ／ｍｌ）と共に、４℃で一晩インキュベーションした。Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ（登録商標）増強化学発光（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって、ＨＲＰＯ（ＴＢＳ−Ｔ中の１：２００００、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）共役ヒツジ抗マウスＩｇを使用して、一次抗体を検出した。Ｌｕｍｉ−ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）によって、シグナルを捕捉した。
【００４７】
一次抗体としてのＪＲＤ／Ａβ３７／３で検出することにより、選択されたＡβ３７モノクローナル抗体と、ヒトＡβ１−３８、Ａβ１−３９、Ａβ１−４０、およびＡβ１−４２合成ペプチドとの交差反応性を評価した。ＪＲＦ／ＡβＮ／２５モノクローナル抗体による検出を実施して、異なるペプチドの正しい装填を確認した。
【００４８】
結果を図１に示す。レーンは次のように装填した。
【００４９】
【表１】
2014520825.tif 000002
【００５０】
イヌＣＳＦ中のＡβ１−３７の定量化
１２匹のビーグル犬に、流動食と共にメトセル懸濁液中の２つのＧＳＭ化合物（国際公開第２０１１／００６９０３パンフレットからのＧＳＭＡ：化合物９７およびＧＳＭＢ：化合物１５７）の１つを経口投与した。処置に先だって、および投薬の４、８、２４、および４８時間後に、脳脊髄液（ＣＳＦ）を採取した。流動食は、１２０ｍｌの濃縮流動食（Ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｕｐｐｏｒｔ（登録商標）、１袋を１１２．５ｍｌの温水に溶解した）であり、投薬は給餌直前に実施した。
【００５１】
選択性試験のために、上述したような直接ＥＬＩＳＡ中で、ＪＲＤ／Ａβ３７／３によってイヌ中のＡβレベルを定量化した。
【００５２】
結果を図２に示す。
【００５３】
サルＣＳＦ中のＡβ１−３７の定量化
大槽（ｃｉｓｔｅｒｎ  ｍａｇｎａ）カテーテルが外科的に埋め込まれた、７匹の幼若カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）をＧＳＭ  Ｅ−２０１２の単回経口投与で処置した。処理に先だって（０時間）および投与後の複数の時点（０．５、１、２、４、６、８、１２、１６、２４、４８時間）で、脳脊髄液（ＣＳＦ）および血液を採取した。動物を臨床徴候について毎日観察し、投薬に先だって体重を記録した。
【００５４】
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）法で、ＣＳＦサンプル中のＡβレベルを定量化した。Ａβ１−３７合成ペプチド標準物質を０．１ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯに溶解して、−８０℃で保存した。アッセイで使用するために、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０添加ＰＢＳ中の０．１％カゼインで、ペプチドを１０ｐｇ／ｍＬにさらに希釈した。製造会社の使用説明書に従って、非結合受容体ビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）をモノクローナル抗体と共役させた。Ａβ１−３７アッセイで使用するために、抗体ＪＲＤ／Ａβ３７／３を受容体ビーズと共役させた。製造会社の使用説明書に従って、ＣｈｒｏｍａＬｉｎｋ（商標）ビオチン３５４Ｓ（ＳｏｌｕＬｉｎｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＪＲＦ／ＡβＮ／２５をビオチン化した。
【００５５】
３８４ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅ内で、共役結合受容体ビーズ（１２．５μｇ／ｍＬ）およびＪＲＦ／ＡβＮ／２５ビオチン化抗体と共に、標準物質および予備希釈ＣＳＦサンプル（１／２希釈）を室温で１時間インキュベートした。引き続いて、ストレプトアビジン標識ドナービーズ（２５μｇ／ｍＬ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を反応混合物に添加した。室温で３０分のインキュベーション後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎマイクロタイタープレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上でプレートを読み取った。結果を図３に示す。
【００５６】
図２および３で提示されるデータは、ＧＳＭ処置をモニターするための薬力学マーカーとして、Ａｓｓ１−３７ペプチド定量化を使用し得ることを示す。
【００５７】
ヒトＣＳＦ中のＡβ１−３７の定量化
ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ装置ＳＩ６０００およびＭＳＤプロトタイプ４−ｐｌｅｘプレートを使用して、Ａβ３７、Ａβ３８、Ａβ４０、およびＡβ４２について、９人の健常対照、６人の神経学的対照、および９人のアルツハイマー病患者からのＣＦＳサンプルをスクリーニングした。このアッセイでは、Ａｂｅｔａ３７（ＪＲＤ／Ａβ３７／３）、Ａｂｅｔａ３８（Ｊ＆ＪＰＲＤ／Ａβ３８／５）、Ａｂｅｔａ４０（ＪＲＦ／ｃＡβ４０／２８）、およびＡｂｅｔａ４２（ＪＲＦ／ｃＡβ４２／２６）に対して特異的な精製モノクローナル抗体で、ＭＳＤ４−ｐｌｅｘプレートを被覆して、スルホタグ標識ＪＲＦ／ＡβＮ／２５抗体を検出抗体として使用した。ＭＳＤの電気化学発光検出技術を使用して、Ａｂｅｔａ３７、Ａｂｅｔａ３８、Ａｂｅｔａ４０、およびＡｂｅｔａ４２の同時の特異的検出を実施した。スルホタグは、４−ｐｌｅｘプレートの電極表面で開始される電気化学刺激時に、発光する。
【００５８】
結果を表２および図４に示す。
【００５９】
【表２】
2014520825.tif 000003
【００６０】
Ａβ断片の相対量間で、平均比を計算し得る。結果を表３および図５に示す。
【００６１】
【表３】
2014520825.tif 000004
【図１】
2014520825.tif 000005
【図２】
2014520825.tif 000006
【図３】
2014520825.tif 000007
【図４】
2014520825.tif 000008
【図５】
2014520825.tif 000009
【配列表】
2014520825000001.app
【国際調査報告】
2014520825.tif 000010
2014520825.tif 000011