(57)【要約】  本発明は、ヒトパピローマウイルスと関連するがんの処置における使用のための、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、もしくはジアステレオ異性体により表される、フラボン誘導体で置換されたピロリジンに関する。本発明はまた、ヒトパピローマウイルスと関連するがんを処置するための、式（Ｉ）の化合物を含有する医薬組成物にも関する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連がんの処置における使用のための、式（Ｉ）
【化１】
2014517063.tif 000015
［式中、Ａｒは、非置換であるか、またはハロゲン、ニトロ、シアノ、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル、トリフルオロメチル、ヒドロキシル、およびＣ１〜Ｃ４−アルコキシから選択される、１つ、２つ、もしくは３つの同一であるかもしくは異なる置換基で置換されたフェニル基である］
の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、もしくはジアステレオ異性体。
【請求項２】
Ａｒが、塩素、臭素、フッ素、ヨウ素、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル、およびトリフルオロメチルから選択される、１つ、２つ、または３つの同一であるかまたは異なる置換基で置換されたフェニル基である、請求項１に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物。
【請求項３】
Ａｒが、塩素で置換されたフェニル基である、請求項１または２に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物。
【請求項４】
Ａｒが、塩素およびトリフルオロメチルで置換されたフェニル基である、請求項１または２に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物。
【請求項５】
式（ＩＡ）
【化２】
2014517063.tif 000016
［式中、Ａｒは、非置換であるか、またはハロゲン、ニトロ、シアノ、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル、トリフルオロメチル、ヒドロキシル、もしくはＣ１〜Ｃ４−アルコキシから選択される、１つ、２つ、もしくは３つの同一であるかもしくは異なる置換基で置換されたフェニル基である］
により表される（＋）−トランス異性体、または薬学的に許容される塩もしくはその溶媒和物である、請求項１に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物。
【請求項６】
（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシ−メチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（化合物Ａ）である、請求項５に記載の使用のための式（ＩＡ）の化合物。
【請求項７】
（＋）−トランス−３−［２［（２−クロロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシ−メチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（化合物Ｂ）である、請求項５に記載の使用のための式（ＩＡ）の化合物。
【請求項８】
ＨＰＶ関連がんが、肛門がん、外陰がん、膣がん、陰茎がん、子宮頸がん、口腔咽頭がん、口腔がん、肺がん、非黒色腫皮膚がん、および結膜がんから選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物。
【請求項９】
ＨＰＶ関連がんが子宮頸がんである、請求項８に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物。
【請求項１０】
ＨＰＶ関連がんの処置における使用のための、治療有効量の、請求項１から７のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、もしくはジアステレオ異性体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１１】
抗がん活性を有する、少なくとも１つのさらなる薬学的に活性な化合物をさらに含む、請求項１０に記載の使用のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）と関連するがんの処置における使用のための、式（Ｉ）の化合物（本明細書で記載される）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、もしくはジアステレオ異性体により表される、フラボン誘導体で置換されたピロリジンに関する。本発明はまた、ヒトパピローマウイルスと関連するがんの処置における使用のための、式（Ｉ）の化合物を含有する医薬組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）とは、扁平上皮細胞に感染する環状の非エンベロープｄｓＤＮＡウイルスである。ＨＰＶは通常、皮膚の裂け目を介して体内に侵入し、次いで、皮膚の層内の細胞に感染する。ＨＰＶは、皮膚間の接触により伝染する。ＨＰＶ感染は、切り傷または被感染者との性行為を介して生じうる。これには、被感染領域の皮膚への接吻または接触および性交が含まれる。また生殖器にＨＰＶ感染を伴う母体も、陣痛時にウイルスを乳児に伝染させる。
【０００３】
ＨＰＶとは、１２０を超える類縁ウイルスの群であり、それらのうちの３３％は、生殖管に感染することが知られている（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００４、６８（２）：３６２〜３７２）。ヒトパピローマウイルスのうちのいくつかの種類は、正常細胞を、進行してがんを形成しうる非正常細胞に形質転換させる。したがって、これらのウイルスは、高危険性型および低危険性型として分類される。高危険性のＨＰＶは、がんと関連する。生殖器におけるＨＰＶ感染は、極めて一般的であり、肛門生殖器がんをもたらしうる。高危険性ＨＰＶによる持続的な感染は、子宮頸がんの主要な原因である。ＨＰＶ感染はまた、肛門がん、外陰がん、膣がん、および陰茎がんも引き起こす（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２００６、１１８（１２）：３０３０〜４４）。高危険性亜型は、ＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、および６８であり、最も一般的な高危険性亜型は、ＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、および４５である。さらに、ＨＰＶの複数の種類、特に、１６型は、ＨＰＶ陽性口腔咽頭がん、頭頸部がんの形態と関連することが判明している（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２００７、３５６（１９）：１９４４〜５６）。
【０００４】
高危険性のＨＰＶは、ウイルスの複製に必要な２つのがんタンパク質であるＥ６およびＥ７を産生する。ヒトにおけるＨＰＶ感染時には、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質が、腫瘍抑制因子であるｐ５３に結合し、アポトーシスを受ける細胞の能力を減殺させるユビキチン媒介経路により、その分解を促進する。ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質は、網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）に結合してこれを分解して、ｐＲｂが転写因子Ｅ２Ｆを阻害することを妨げる結果として、細胞周期の制御を失わせる。
【０００５】
ＨＰＶは、世界中の全てのがんのうちの約５％の原因であることが推定されている（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２００６、１１８（１２）：３０３０〜３０４４）。
【０００６】
子宮頸部のがんは、世界中の女性において二番目に一般的ながんである。症例のうちの約８６％は、先進国で生じる。子宮頸がんは、女性において生じるがんのうちの１３％を占める（「Ｗｏｒｌｄ：Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｐｉｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｃａｎｅｒｓ，ｓｕｍｍａｒｙ  ｒｅｐｏｒｔ」、２０１０年１１月）。
【０００７】
今日、持続的なヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染は、本質的に全ての子宮頸がんの原因として認識されている。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙによれば、２０１０年には、米国内の約１２，０００人の女性がこの種類のがんを伴うと診断され、４，０００名超がこれにより死亡することになろう。子宮頸がんは、毎年世界中でほぼ５０万人の女性において診断されており、毎年２５万人の生命を奪っている。
【０００８】
外陰がんおよび膣がんは、全ての婦人科がんのうちのそれぞれ約３〜５％および１〜２％を占め、陰茎がんは、米国内の全てのがんのうちの約０．２％を占める。それらの希少性にもかかわらず、外陰がん、膣がん、および陰茎がんは、それらの性に対する有意な影響のために、依然として重要な疾患である。単一の病因的因子は存在しないが、ＨＰＶ感染との関連は強い。ＨＰＶは、陰茎がんのうちの約４０％の一因であると考えられている。多くの研究は、陰茎癌におけるＨＰＶ  １６型およびＨＰＶ  １８型の存在を示している（Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．、１９９１、２２：９０８〜９１３）。ＨＰＶはまた、膣がんのうちの約６５％（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｕｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、２００９、１２４（７）：１６２６〜１６３６）および外陰がんのうちの５０％（Ｖａｃｃｉｎｅ、２００６、２４（増刊３号）：Ｓ１１〜Ｓ２５）の一因でもあり、ＨＰＶ−１６は、両方のがんの大半のＨＰＶ陽性症例の原因である（Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．、２００９、１１３（４）：９１７〜２４）。
【０００９】
ＨＰＶ感染はまた、肛門がんとも関連する。米国内では毎年、女性において約１，６００例の新たなＨＰＶ関連肛門がんの症例が診断され、男性において約９００例の新たなＨＰＶ関連肛門がんの症例が診断されていると推定される。一般に、ＨＰＶは、肛門がんのうちの約９０％の一因であると考えられている（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｕｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、２００９、１２４（７）：１６２６〜１６３６）。とりわけ、ＨＰＶ  １６は、肛門がんの大半の一因であると考えられる。研究によれば、ＨＰＶ  １６は、被験肛門がん検体のうちの８４パーセントにおいて検出された（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｎｒａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９７、３３７（１９）：１３５０〜８）。
【００１０】
頭頸部がんとは典型的に、頭頸部の扁平細胞癌を指す。頭頸部がんは、米国内の全てのがんのうちの約３パーセントを占める（Ａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ、２０１０、６０（５）：２７７〜３００）。頭頸部がんは、それらが発症する領域により同定される。頭頸部がんは典型的に、口腔がん、上頸部の唾液腺がん、副鼻腔がん、鼻腔がん、咽頭がん、鼻咽頭がん、中咽頭がん、下咽頭がん、喉頭がん、およびリンパ節がんとして分類される。口腔がん（舌の前方３分の２、歯肉、口腔粘膜、舌下口底、硬口蓋、および親不知の後方の小領域）および中咽頭がん（軟口蓋、舌の基部、および扁桃腺）は、ＨＰＶにより引き起こされるがんのうちで最も一般的な種類である。研究は、口腔咽頭がんのうちの約６０％が、ＨＰＶにより引き起こされ、特に、ＨＰＶ  １６が、一部の頭頸部扁平細胞癌（ＨＮＳＣＣ）の原因因子であることを示している（Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、２００５、１４（２）：４６７〜４７５）。
【００１１】
ＨＰＶはまた、肺癌とも関連している。公表された文献によれば、肺がんにおけるＨＰＶの発生率は、２４．５％であった（Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ、２００９、６５：１３〜１８）。中国において行われた研究は、ＨＰＶ陽性集団では、肺扁平細胞癌の危険性が、ＨＰＶ陰性集団における場合と比較して３．５倍高く、ＨＰＶ−１６陽性患者について、ＨＰＶ−１６陰性患者より１６．９倍高い（Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．、２００９、２１（６）：１６２７〜３２）ことを明らかにした。
【００１２】
ヒトパピローマウイルスの役割はまた、様々な範囲の他の悪性腫瘍、特に、世界中の色白の皮膚の集団において最も一般的な悪性腫瘍である黒色腫皮膚がんにおいても提起されている。皮膚がんは、致死性であることが稀であり、がんによる死亡の一因となるのは、全体の１％未満である。しかしながら、公衆衛生に対するその影響は、無視できないものである。ヒト皮膚がんにおけるＨＰＶの関与は、稀な遺伝性疾患である疣贅状表皮発育異常症を伴う患者において初めて裏付けられた（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ、２００３、３１号）。
【００１３】
ＨＰＶはまた、結膜の上皮内新生物（０〜８０％）、ならびに結膜、まぶた、および涙嚢の侵襲性癌のうちの６２〜１００％（ＩＡＲＣ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ、６４：１３０）とも関連する。ＨＰＶと結膜パピローマとの間には、強い関連が認められる。ＨＰＶ６／１１型は、結膜パピローマにおいて最も一般的なＨＰＶの種類である（Ｂｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．、２００１、８５：７８５〜７８７）。
【００１４】
ＨＰＶ６、１１、および１３は、これらの種類による感染の発癌可能性は低く、通常は生殖器疣（専門的には尖圭コンジロームとして知られている）、および子宮頸部の軽度の形成異常など、良性病変の形成を結果としてもたらすため、低危険性として分類されることが典型的である。また、ＨＰＶ６および１１は、結膜パピローマとも関連する。
【００１５】
生殖器におけるＨＰＶ感染の発生率の高さ、およびその悪性疾患との関連にもかかわらず、ＨＰＶ感染に有効な抗ウイルス治療は存在しない。Ｇａｒｄａｓｉｌ（登録商標）およびＣｅｒｖａｒｉｘ（登録商標）は、現在市販されている、最も一般的な高危険性のＨＰＶ（ＨＰＶ  １６および１８）のうちの２つに対する２つのワクチンである。しかし、これらは、予防的な部類であるに過ぎず、既存のＨＰＶ関連がんを処置するわけではない。さらに、費用の高さ、社会的受容に関わる問題、およびワクチンを提供しうる医療システムの限界が、特に、ＨＰＶ関連肛門生殖器がん（肛門および生殖器に関する）が最も一般的に見出される先進国における女性にとってのこのワクチンの入手可能性を限界づけている。結果として、ＨＰＶ関連がんを防止および／または処置するための、他のより廉価でより広く利用可能な手法を同定することが依然として必要とされている。
【００１６】
本発明者らは、驚くべきことに、フラボン誘導体で置換されたピロリジンが、ＨＰＶと関連するがんに対して有効であることを見出した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本明細書で記載される本発明は、ヒトパピローマウイルス関連がんを処置するための、式（Ｉ）（本明細書で記載される）により表されるフラボン誘導体で置換されたピロリジンを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の一態様によれば、ヒトパピローマウイルスと関連するがんを処置するための、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体の使用が提供される。
【００１９】
本発明の別の態様によれば、肛門がん、外陰がん、膣がん、陰茎がん、子宮頸がん、口腔咽頭がんおよび口腔がんなどの頭頸部がん、肺がん、非黒色腫皮膚がん、または結膜がんである、ＨＰＶと関連するがんを処置するための、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体の使用が提供される。
【００２０】
本発明のさらに別の態様によれば、子宮頸がんを処置するための、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体の使用が提供される。
【００２１】
本発明の別の態様によれば、ヒトパピローマウイルス関連がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体を投与するステップを含む方法が提供される。
【００２２】
本発明の別の態様によれば、対象における、肛門がん、外陰がん、膣がん、陰茎がん、子宮頸がん、口腔咽頭がんおよび口腔がんなどの頭頸部がん、肺がん、非黒色腫皮膚がん、または結膜がんから選択される、ＨＰＶと関連するがんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体を投与するステップを含む方法が提供される。
【００２３】
本発明のさらに別の態様によれば、子宮頸がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体を投与するステップを含む方法が提供される。
【００２４】
本発明の別の態様によれば、ＨＰＶと関連するがんを処置するための、治療有効量の、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体を薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物が提供される。
【００２５】
本発明の別の態様によれば、ＨＰＶと関連するがんを処置するのに有用な、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体を含む医薬を製造するための方法が提供される。
【００２６】
本発明の他の態様および本発明の適用可能性のさらなる範囲は、後続する詳細な記載から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】化合物Ａおよび化合物Ｂで処置された細胞におけるｐ５３の有意な上方調節を示すウェスタンブロットの複製を示す図である。
【図１Ｂ】化合物Ａおよび化合物Ｂで処置されたＳｉＨａ細胞におけるＥ６およびＥ７の発現の有意な下方調節を示すウェスタンブロットの複製を示す図である。
【図２】化合物Ａおよび化合物Ｂで処置されたＳｉＨａ細胞およびＨｅＬａ細胞におけるＥ６およびＥ７の転写レベルにおける発現の有意な下方調節を示すＲＴ−ＰＣＲの複製を示す図である。
【図３Ａ】ＳｉＨａ細胞におけるｐ５３−ＥＧＦＰの核移行についてのグラフ表示である。
【図３Ｂ】ＨｅＬａ細胞におけるｐ５３−ＥＧＦＰの核移行についてのグラフ表示である。
【図４】化合物Ａの投与後におけるＳｉＨａ異種移植動物における腫瘍増殖プロファイルのグラフ表示である。
【図５】化合物Ｂの投与後におけるＳｉＨａ異種移植動物における腫瘍増殖プロファイルのグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本開示の文脈では、本明細書の前出および本明細書の後出において用いられる一般的な用語が、別段に示されない限り、以下の意味を有することが好ましい。したがって、本明細書の以下では、本発明の文脈で用いられる一般的な用語の定義が提示される。
【００２９】
単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈により別段に明確に指示されない限り、複数形の言及を包含する。
【００３０】
「置換」または「〜で置換された」は、このような置換が、置換された原子および置換基の許容される価数に従うほか、転位、環化、脱離などの転換を容易に受けない安定的な化合物も表すという暗黙の条件を包含することが理解されるであろう。
【００３１】
「Ｃ１〜Ｃ４アルキル」という用語は、１以上４以下の炭素原子を含有する直鎖状鎖または分枝状鎖を含めた、飽和脂肪族基のラジカルを指す。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルなどが含まれるがこれらに限定されない。
【００３２】
「Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ」という用語は、上記で定義されたアルキル基であって、酸素連結を介して分子の残余部分に接合されたアルキル基を指す。アルコキシの例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなどが含まれるがこれらに限定されない。
【００３３】
「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素を指す。
【００３４】
本明細書で用いられる「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」という用語は、−ＯＨ基を指す。
【００３５】
本明細書で用いられる「治療有効量」という用語は、式（Ｉ）により表される化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体の量であって、このような処置を必要とする対象に投与されると、ＨＰＶにより媒介される疾患が、軽減、処置、または緩和されるように、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の活性を阻害するのに十分な量を指す。
【００３６】
本明細書で用いられる「ＨＰＶ」または「ヒトパピローマウイルス」という用語は、哺乳動物に感染することが可能なウイルスのパピローマウイルスファミリーのメンバーを指す。この用語は、別段に示されない限り、高危険性の種類のＨＰＶおよび危険性の低い種類のＨＰＶの両方を包含する。
【００３７】
本明細書で用いられる「対象」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトであって、ＨＰＶにより媒介される疾患の処置を必要とする動物を指す。本発明の文脈では、対象という用語を、患者という用語と互換的に用いることができる。
【００３８】
本明細書で用いられる「哺乳動物」という用語は、ヒトのほか、ヒトパピローマウイルスによる感染に対して感受性の非ヒト哺乳動物を包摂することを意図する。非ヒト哺乳動物には、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラットおよびマウスなどの家畜動物、および非家畜動物が含まれるがこれらに限定されない。
【００３９】
対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおけるＨＰＶ関連がんに言及する「〜を処置する」、または「処置」、または「処置された」という用語は、（ｉ）がんの阻害、つまりがんの発症の停止；（ｉｉ）がんの軽減もしくは退縮またはがんの緩徐化；（ｉｉｉ）がんの改善、つまりがんと関連する症状の重症度の軽減；（ｉｖ）がんと関連する１または複数の症状のある程度の除去を包含する。
【００４０】
本明細書で用いられる「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤、賦形剤、および／または塩が、そのレシピエントに対して有害ではない処方物の他の成分と適合性でなければならないことを意味する。「薬学的に許容される」はまた、組成物、または剤形が、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題、または合併症を伴わずに、動物、またはヒトのための使用に適する穏健な医学的判断の範囲内にあり、妥当な有益性／危険性比に相応することも意味する。
【００４１】
本発明はさらに、式（Ｉ）の化合物の全ての溶媒和物、例えば、水和物、および、アルコール、エーテル、酢酸エチル、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、もしくはアセトンなどの低級アルキルケトン、またはこれらの混合物など、他の結晶化溶媒と共に形成される溶媒和物を包含する。本発明のいくつかの化合物は、非溶媒和形態のほか、水和形態を含めた溶媒和形態でも存在しうる。本発明のいくつかの化合物は、複数の結晶形態またはアモルファス形態で存在しうる。一般に、全ての物理的形態は、本発明により想定される使用のための同等物であり、本発明の範囲内にあることが意図される。
【００４２】
「ｐ５３」という用語は、腫瘍抑制因子として作用する核リンタンパク質を指す。
【００４３】
「ｐＲｂ」または「網膜芽細胞腫タンパク質」という用語は、がんの多くの種類において機能不全となる腫瘍抑制因子タンパク質を指す。
【００４４】
「下方調節」という用語は、示された活性または発現の部分的または全体的な低減を指す。本発明の文脈では、「がんタンパク質Ｅ６およびＥ７の下方調節」という用語が、Ｅ６およびＥ７それぞれの発現レベルの低下を指す。レベルは、ウェスタンブロットアッセイを含め、当技術分野における任意の適切な方法により決定することができる。
【００４５】
「ｐ５３の上方調節」という用語は、腫瘍抑制因子タンパク質５３の発現レベルの増大を指す。
【００４６】
「老化」という用語は、細胞が分裂するそれらの能力を喪失する状態を指す。
【００４７】
「アポトーシス」という用語は、天然のプログラム細胞死過程を指す。アポトーシスとは、細胞が自身を死滅させる特化された細胞内機構を用いる自己破壊過程である。細胞は、膜結合粒子に分解され、次いで、食作用により消失する。アポトーシスとは、後生動物が細胞数を制御し、動物の生存を脅かす細胞を消失させることを可能とする機構である。
【００４８】
「転写」という用語は、ＤＮＡ配列の相補的なＲＮＡコピーを創出する過程を指す。
【００４９】
「細胞周期の停止」という用語は、正常な段階（Ｇ１、Ｓ、Ｇ２、Ｍ）のうちの１つにおいて、細胞周期の進行を停止させる調節過程を指す。
【００５０】
抗がん活性を伴う化合物とは、細胞増殖を阻害することが可能であるか、または細胞死を誘導することが可能な物質を指す。本発明の組成物における使用に適する抗がん剤の非限定的な例には、（ｉ）タキサンおよびパクリタキセルなどの微小管破壊剤、（ｉｉ）イマチニブ、エルロチニブ、およびＢＡＹ−４３−９００６などのキナーゼ阻害剤、（ｉｉｉ）ラパマイシンなどのｍＴＯＲ阻害剤、（ｉｖ）カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、エトポシド、およびダカルバジンなどの抗新生物剤、ならびに（ｘｖｉ）トポテカンおよびイリノテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤、（ｖｉ）シタラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、トポテカン、ヒドロキシウレア、チオグアニン、メトトレキサートなどの代謝拮抗剤、（ｖｉｉ）ドキソルビシン、ブレオマイシン、およびダクチノマイシンなどの細胞傷害剤が含まれる。
【００５１】
本発明の一態様によれば、ＨＰＶと関連するがんの処置における使用のための、式（Ｉ）
【００５２】
【化１】
2014517063.tif 000002
［式中、Ａｒは、非置換であるか、またはハロゲン、ニトロ、シアノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、トリフルオロメチル、ヒドロキシル、もしくはＣ１〜Ｃ４アルコキシから選択される、１つ、２つ、もしくは３つの同一であるかもしくは異なる置換基で置換されたフェニル基である］
の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、もしくはジアステレオ異性体が提供される。
【００５３】
本発明の一態様によれば、ＨＰＶと関連するがんの処置における使用のための、以下の式（ＩＡ）
【００５４】
【化２】
2014517063.tif 000003
［式中、Ａｒは、非置換であるか、またはハロゲン、ニトロ、シアノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、トリフルオロメチル、ヒドロキシル、もしくはＣ１〜Ｃ４アルコキシから選択される、１つ、２つ、もしくは３つの同一であるかもしくは異なる置換基で置換されたフェニル基である］
に示される式（Ｉ）の化合物の（＋）トランス異性体、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物が提供される。
【００５５】
本発明の別の態様によれば、ＨＰＶと関連するがんの処置における使用のための、Ａｒが、塩素、臭素、フッ素、ヨウ素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、またはトリフルオロメチルから選択される、１つ、２つ、または３つの同一であるかまたは異なる置換基で置換されたフェニル基である、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体が提供される。
【００５６】
本発明の別の態様によれば、ＨＰＶと関連するがんの処置における使用のための、Ａｒが、塩素、臭素、フッ素、またはヨウ素から選択される、１つ、２つ、または３つの同一であるかまたは異なるハロゲンで置換されたフェニル基である、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体が提供される。
【００５７】
本発明の別の態様によれば、ＨＰＶと関連するがんの処置における使用のための、Ａｒが、塩素で置換されたフェニル基である、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体が提供される。
【００５８】
本発明の別の態様によれば、ＨＰＶと関連するがんの処置における使用のための、Ａｒが、塩素およびトリフルオロメチルで置換されたフェニル基である、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体が提供される。
【００５９】
当業者により、式（Ｉ）の化合物は、少なくとも２つのキラル中心を含有し、よって、２つの異なる光学異性体（すなわち、（＋）光学異性体または（−）光学異性体）、２つの異なる幾何異性体（ｃｉｓ幾何異性体およびｔｒａｎｓ幾何異性体）、および４つの異なるジアステレオ異性体の形態で存在することが察知されるであろう。本発明の範囲内には、全てのこのような光学異性体、幾何異性体、ジアステレオ異性体、およびラセミ混合物を含めたこれらの混合物が、包含される。式（Ｉ）の化合物の光学異性体は、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００４００４６３２号、同第ＷＯ２００７１４８１５８号、および同第ＷＯ２００８００７１６９号において開示されている方法により得ることもでき、式（Ｉ）の化合物の光学異性体はまた、キラルＨＰＬＣおよび酵素的分解など、当技術分野でよく知られた方法によっても得ることができる。代替的に、式（Ｉ）の化合物の光学異性体は、光学的に活性な出発材料を用いることにより合成することもできる。
【００６０】
薬学的に許容される塩の形態でありうる式（Ｉ）の化合物の製造、ならびに経口投与、直腸内投与、および／または非経口投与に適する医薬組成物であって、上記の化合物を含有する医薬組成物の製造は一般に、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００４００４６３２号において開示されている。
【００６１】
本明細書の上記で示された通り、式（Ｉ）の化合物は、その塩の形態として使用することができる。式（Ｉ）の化合物の好ましい塩には、酢酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、桂皮酸塩、クエン酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルクロン酸塩、グルタミン酸塩、グリコール酸塩、塩酸塩、水素酸塩、フッ化水素酸塩、ケトグルタル酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、スルファミン酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、トリフルオロ酢酸塩、および当業者に知られている他の酸添加塩が包含される。
【００６２】
本発明の態様によれば、ＨＰＶ関連がんの処置における使用のための式（ＩＡ）の化合物は、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシ−メチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（本明細書では、化合物Ａと称する）、または（＋）−トランス−３−［２［（２−クロロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（本明細書では、化合物Ｂと称する）から選択される。化合物ＡおよびＢは、ＷＯ２００７１４８１５８において開示されており、とりわけ、それぞれ、実施例１０および実施例４４として開示されている。
【００６３】
ＨＰＶ関連がんの処置における使用のための式（ＩＡ）の化合物は、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシ−メチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（化合物Ａ）でありうる。
【００６４】
ＨＰＶ関連がんの処置における使用のための式（ＩＡ）の化合物は、（＋）−トランス−３−［２［（２−クロロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（化合物Ｂ）でありうる。
【００６５】
ＨＰＶと関連するがんは、肛門がん、外陰がん、膣がん、陰茎がん、子宮頸がん、口腔咽頭がんおよび口腔がんなどの頭頸部がん、肺がん、非黒色腫皮膚がん、および結膜がんからなる群から選択される。
【００６６】
式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体は、子宮頸がんを処置するために用いることができる。
【００６７】
ヒトパピローマウイルス関連がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体を投与するステップを含む方法が記載される。
【００６８】
対象における、肛門がん、外陰がん、膣がん、陰茎がん、子宮頸がん、口腔咽頭がんおよび口腔がんなどの頭頸部がん、肺がん、非黒色腫皮膚がん、および結膜がんからなる群から選択されるＨＰＶ関連がんは、それを必要とする対象に、治療有効量の、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体を投与することにより処置することができる。
【００６９】
子宮頸がんは、それを必要とする対象に、治療有効量の、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体を投与することにより処置することができる。
【００７０】
本発明は、ＨＰＶ関連がんを阻害する方法であって、ＨＰＶ感染細胞を式（Ｉ）の化合物と接触させるステップを含む方法を提供する。
【００７１】
本発明の態様によれば、ＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、および６８から選択される高危険性のＨＰＶを阻害する方法であって、ＨＰＶ感染細胞を式（Ｉ）の化合物と接触させるステップを含む方法が提供される。
【００７２】
ある実施形態では、ＨＰＶ  １６、１８、および３１を阻害する方法であって、ＨＰＶ感染細胞を式（Ｉ）の化合物と接触させるステップを含む方法が提供される。
【００７３】
本発明によれば、ＨＰＶ上のがんタンパク質を下方調節することができる。がんタンパク質は、ＨＰＶ上のがんタンパク質Ｅ６およびＥ７でありうる。下方調節は、対象に治療有効量の式（Ｉ）の化合物を投与することにより実行することができる。ＨＰＶ上のがんタンパク質Ｅ６およびＥ７の阻害は、細胞周期の停止、老化、またはアポトーシスを誘導する手段である。
【００７４】
ＨＰＶ上のがんタンパク質Ｅ６およびＥ７は、転写レベルで下方調節することができる。
【００７５】
リンタンパク質ｐ５３は、治療有効量の式（Ｉ）の化合物を、それを必要とする対象に投与することにより活性化することができる。
【００７６】
本発明のさらに別の実施形態によれば、ＨＰＶ  １６と関連するがんを処置する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体を投与するステップを含む方法が提供される。
【００７７】
本発明の別の態様によれば、ＨＰＶと関連するがんを処置するのに有用な、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体を含む医薬を製造するための方法が提供される。
【００７８】
治療有効量の、式（Ｉ）の化合物、薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはそのジアステレオ異性体を薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物が提供される。組成物は、少なくとも１つのさらなる薬学的に活性な化合物であって、抗がん活性を有するさらなる薬学的に活性な化合物を包含しうる。薬学的に活性な化合物は、ブレオマイシン、シスプラチン、トポテカン塩酸塩、イミキモド、ポドフィロックス、トリクロロ酢酸などから選択されうるがこれらに限定されない。
【００７９】
医薬調製は、重量で約１〜９９％、例えば、約５〜７０％、または約５〜約３０％の、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含有しうる。医薬調製物中の、式（Ｉ）の有効成分、またはその薬学的に許容される塩の量は、通常約１〜１０００ｍｇである。
【００８０】
式（Ｉ）の化合物は、経口投与、膣内投与、外陰膣内投与、直腸内投与、局所投与、または非経口投与（静脈内投与、皮下投与、筋内投与、血管内投与を含めた非経口投与または非経口注入）することができる。式（Ｉ）の化合物は、処置される状態に適する任意の経路を介して投与しなければならない場合がある。好ましい経路は、患者の状態と共に変化しうることが察知されるであろう。
【００８１】
医薬としての使用を意図される組成物は、医薬組成物を製造するための当技術分野で知られる任意の方法に従い調製することができる（例えば、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、「Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（２１版）（２００５）；Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」（１１版）（２００６）；およびＡｎｓｅｌ、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」（９版）、Ａｌｌｅｎら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、（２０１１）、「Ｓｏｌｉｄ−Ｓｔａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ」（２版）（１９９９））。
【００８２】
本明細書で記載される組成物は、例えば、錠剤、またはカプセルとしての経口投与に適する形態；例えば、滅菌溶液、滅菌懸濁液、または滅菌エマルジョンとしての非経口注射（静脈内注射、皮下注射、筋内注射、血管内注射を含めた非経口注射、または非経口注入）に適する形態；例えば、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、またはコロジオンとしての局所投与に適する形態；例えば、坐剤、タンポン、ペッサリー、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、または膣内リングとしての直腸内投与、膣内投与、または外因膣内投与に適する形態でありうる。組成物は、外陰など、皮膚表面の外面および／または皮膚の周囲領域に局所投与することができる。加えてまたは代替的に、組成物は、膣内投与することができる。
【００８３】
経口使用のためには、式（Ｉ）の化合物を、例えば、錠剤、またはカプセル、粉末、分散可能な顆粒、もしくは小袋、または水溶液、または懸濁液の形態で投与することができる。経口使用のための錠剤の場合、一般的に使用される担体には、ラクトース、トウモロコシデンプン、炭酸マグネシウム、滑石、および糖が包含され、一般には、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤を添加する。カプセル形態における経口投与のために有用な担体には、ラクトース、トウモロコシデンプン、炭酸マグネシウム、滑石、および糖が包含される。
【００８４】
筋内使用、腹腔内使用、皮下使用、および静脈内使用のためには通常、式（Ｉ）の化合物の滅菌溶液が使用され、溶液のｐＨは、適切に調整および緩衝されるものとする。
【００８５】
軟膏、クリームのためには、式（Ｉ）の化合物が、水中油基剤または油中水基剤において製剤化される。膣クリームは、膣腔内の粘膜表面と接触させるように投与することができる。
【００８６】
直腸内使用または膣使用のためには、式（Ｉ）の化合物を、坐剤の形態で投与することができる。坐剤は、式（Ｉ）の化合物、適切な坐剤基剤、および防腐剤、抗酸化剤、乳化剤などの添加剤を含む。適切な坐剤基剤には、天然もしくは合成のトリグリセリド、またはパラフィン炭化水素が包含される。式（Ｉ）の化合物の膣内使用はまた、膣内クリームの形態でも投与することができる。
【００８７】
経口送達用の組成物は、錠剤、トローチ、水性または油性の懸濁液、顆粒、粉末、エマルジョン、カプセル、シロップ、またはエリキシル剤の形態でありうる。経口投与される組成物は、医薬として口当たりのよい調製物を提供するために、１または複数の任意選択の薬剤、例えば、果糖、アスパラターム、またはサッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、ウィンターグリーン油、またはチェリーなどの香味剤；着色剤；および防腐剤を含有しうる。また、浸透圧的に活性である駆動化合物の周囲の選択的に透過性の膜も、本発明の化合物を経口投与するのに適する。経口組成物は、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な媒体を包含しうる。このような媒体は、医薬グレードであることが好ましい。
【００８８】
さらに、医薬組成物中に含有される本発明の化合物の効果は、適正な処方物により、遅延させることもでき、延長することもできる。例えば、化合物の緩徐に可溶性のペレットを調製し、錠剤またはカプセル内に組み込むことができる。技法は、溶解速度が複数で異なるペレットを作製し、カプセルにペレットの混合物を充填することにより改善することができる。錠剤またはカプセルは、予測される時間にわたり溶解に抵抗する薄膜でコーティングすることができる。長時間作用型の非経口調製物もなお、化合物を、油性媒体または乳化媒体であって、化合物が血清中をごく緩徐に分散することを可能とする媒体中に溶解させるかまたは懸濁させることによっても作製することができる。
【００８９】
直腸内投与用または膣内投与用の組成物は、坐剤である。坐剤とは、直腸または膣に挿入するための固体の塊であって、体内温度で溶融または軟化し、１または複数の薬理学的有効成分または治療有効成分を放出する固体の塊である。直腸内坐剤において使用される、薬学的に許容される物質は、融点を上げる基剤または媒体および薬剤である。基剤の例には、ココアバター（カカオ脂）、グリセリンゼラチン、カーボワックス（ポリオキシエチレングリコール）、および脂肪酸のモノグリセリドと、ジグリセリドグリセリドと、トリグリセリドとの適切な混合物が包含される。多様な基剤の組合せを使用することができる。坐剤の融点を上げるための薬剤には、鯨蝋および蝋が包含される。坐剤は、圧縮法により調製することもでき、鋳型成形により調製することもできる。
【００９０】
式（Ｉ）の化合物の有効用量は、少なくとも処置される状態、送達方式、および医薬処方物の性質に依存し、従来の用量漸増研究を用いて、医師により決定されるであろう。体重１ｋｇ当たり１日当たり約０．１〜約１００ｍｇ、特に、体重１ｋｇ当たり１日当たり約０．１〜約１０ｍｇ、より具体的には、体重１ｋｇ当たり１日当たり約０．１〜約５ｍｇであることを予測することができる。
【００９１】
式（Ｉ）の化合物は、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２００４００４６３２号およびＰＣＴ特許公開第ＷＯ２００７１４８１５８号において開示されている方法に従い調製することができる。
【００９２】
式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の一般的な調製プロセスは、以下のステップ：
（ａ）式ＶＩＡ
【００９３】
【化３】
2014517063.tif 000004
の中間化合物の、光学異性体として純粋な、分解された（−）−トランス光学異性体を、ルイス酸触媒の存在下において無水酢酸で処置して、分解された式ＶＩＩＡ
【００９４】
【化４】
2014517063.tif 000005
のアセチル化化合物を得るステップと、
（ｂ）分解された式ＶＩＩＡのアセチル化化合物を、塩基および溶媒の存在下において、式ＡｒＣＯＯＨの酸、または式ＡｒＣＯＣｌの酸塩化物、または式（ＡｒＣＯ）２Ｏの酸無水物、または式ＡｒＣＯＯＣＨ３［式中、Ａｒは、式（Ｉ）の化合物への言及において本明細書の上記で既定された通りである］のエステルと反応させて、式ＶＩＩＩＡ
【００９５】
【化５】
2014517063.tif 000006
の分解された化合物を得るステップと、
（ｃ）分解された式ＶＩＩＩＡの化合物を、対応する式ＩＸＡ
【００９６】
【化６】
2014517063.tif 000007
［式中、Ａｒは、上記で定義された通りである］
の分解されたβ−ジケトン化合物を得るのに適する溶媒中の塩基で処理するステップと、
（ｄ）式ＩＸＡの分解されたβ−ジケトン化合物を、塩酸などの酸で処理して、式ＸＡ
【００９７】
【化７】
2014517063.tif 000008
の対応する環化化合物を得るステップと、
（ｅ）式ＸＡの化合物を、それを脱アルキル化剤と共に加熱することにより、脱アルキル化にかけて、式（Ｉ）の化合物の（＋）−トランス光学異性体を得、場合によって、対象化合物を、その薬学的に許容される塩に転換するステップとを含む。
【００９８】
上記のステップ（ａ）において使用されるルイス酸触媒は、ＢＦ３、Ｅｔ２Ｏ、塩化亜鉛、塩化アルミニウム、および塩化チタンから選択することができる。
【００９９】
プロセスステップ（ｂ）において使用される塩基は、トリエチルアミン、ピリジン、およびＤＣＣ−ＤＭＡＰの組合せ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドと、４−ジメチルアミノピリジンとの組合せ）から選択することができる。
【０１００】
当業者には、式ＶＩＩＩＡの化合物から対応する式ＩＸＡのβ−ジケトン化合物への転位は、ベーカー−ベンカタラマン転位（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９３３、１３８１；およびＣｕｒｒ．Ｓｃｉ．、１９３３、４、２１４）として知られていることが明らかであろう。
【０１０１】
プロセスステップ（ｃ）において使用される塩基は、リチウムヘキサメチルジシラジド、ナトリウムヘキサメチルジシラジド、カリウムヘキサメチルジシラジド、水素化ナトリウム、および水素化カリウムから選択することができる。好ましい塩基は、リチウムヘキサメチルジシラジドである。
【０１０２】
式ＩＸＡの化合物の脱アルキル化のためのプロセスステップ（ｅ）において使用される脱アルキル化剤は、ピリジン塩酸塩、三臭化ホウ素、三フッ化ホウ素エーテレート、および三塩化アルミニウムから選択することができる。好ましい脱アルキル化剤は、ピリジン塩酸塩である。
【０１０３】
式ＶＩＡの出発化合物の調製は、１−メチル−４−ピペリドンを、氷酢酸中の１，３，５−トリメトキシベンゼン溶液と反応させて、１−メチル−４−（２，４，６−トリメトキシフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリジンをもたらし、これを、三フッ化ホウ素ジエチルエーテレート、ホウ化水素ナトリウム、およびテトラヒドロフランと反応させて、１−メチル−４−（２，４，６−トリメトキシフェニル）ピペリジン−３−オールをもたらすステップを伴う。１−メチル−４−（２，４，６−トリメトキシフェニル）ピペリジン−３−オールの式ＶｌＡの化合物への転換は、化合物である１−メチル−４−（２，４，６−トリメトキシフェニル）ピペリジン−３−オールのピペリジン環上に存在するヒドロキシル基を、トリエチルアミン、ピリジン、炭酸カリウム、または炭酸ナトリウムなどの酸素求核剤の存在下において、塩化ｐ−トルエンスルホニル、塩化メタンスルホニル、トリフルオロメタンスルホン酸無水物、または五塩化リンなどの適切な試薬で処理することにより、トシル、メシル、トリフレート、またはハロゲン化物などの脱離基に転換した後に、イソプロパノール、エタノール、またはプロパノールなどのアルコール溶媒中の酢酸ナトリウム、または酢酸カリウムなど、酸素求核剤の存在下における環縮小を伴う。
【０１０４】
本発明は、これに反する内容が明示的に指定されない限り、多様な代替的な変化形および一連のステップを含むことを理解されたい。さらに、任意の実施例以外において、または別段に示された場合以外において、例えば、明細書および特許請求の範囲において用いられる成分の量を表す全ての数は、全ての場合において、「約」という用語により修飾されていると理解されたい。
【０１０５】
したがって、これに反する内容が示されない限り、以下の明細書および付属の特許請求の範囲において示される数値パラメータは、本発明により得られる所望の特性に応じて変化しうる近似である。特許請求の範囲に対する同等物の原則の適用を限定しようとする試みとしてではなく、最低限に述べれば、各数値パラメータは、少なくとも報告された有効桁数に照らして、かつ、通常の丸め法を適用することにより理解されるものとする。
【０１０６】
本発明の範囲および精神の範囲内では、複数の変化形が可能であることを、当業者は認識するであろう。ここで、本発明を、以下の非限定的な例に言及しながら、より詳細に記載しよう。以下の例は、本発明をさらに例示するが、当然ながら、いかなる形であれ、その範囲を限定するとはみなされないものとする。
【０１０７】
実施例
以下の例および他の箇所では、略号が以下の意味を有する。
【０１０８】
【表１】
2014517063.tif 000009
【実施例１】
【０１０９】
Ａ）（＋）−トランス−２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（化合物Ａ）の調製
融解させたピリジン塩酸塩（４．１ｇ、３５．６ｍｍｏｌ）を、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−５，７−ジメトキシ−クロメン−４−オン（０．４ｇ、０．９ｍｍｏｌ）に添加し、１８０℃で１．５時間にわたり加熱した。反応混合物を２５℃まで冷却し、ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）で希釈し、Ｎａ２ＣＯ３を用いてｐＨ１０に塩基性化した。混合物を濾過し、有機層を濃縮した。残留物を水（５ｍＬ）中に懸濁させ、３０分間にわたり撹拌し、濾過し、乾燥させて、化合物である（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オンを得た。
収量: 0.25 g (70%);
IR (KBr): 3422, 3135, 1664, 1623, 1559cm-1;
1H NMR (CDCl3, 300MHz): δ 7.56 (d, 1H), 7.36 (m, 3H), 6.36 (s, 1H), 6.20 (s, 1H), 4.02 (m, 1H), 3.70 (m, 2H), 3.15 (m, 2H), 2.88 (m, 1H), 2.58 (s, 3H), 2.35 (m, 1H), 1.88 (m, 1H); MS (ES+): m/z  402 (M+1);
分析: C21H20ClNO5; C, 62.24 (62.71); H, 5.07 (4.97); N, 3.60 (3.48); Cl, 9.01 (8.83).
【０１１０】
上記で得られた化合物（０．２ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を、ＩＰＡ（５ｍＬ）中で懸濁させ、３．５％のＨＣｌ（２５ｍＬ）を添加した。懸濁液を加熱して、透明な溶液を得た。溶液を冷却し、濾過して、化合物である（＋）−トランス−２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）クロメン−４−オン塩酸塩を得た。
収量: 0.21 g (97%); mp: 188 - 192 °C; [α] D25 = +21.3°(c = 0. 2, メタノール);
1H NMR (CD3OD, 300MHz): δ 7.80 (d, 1H), 7.60 (m, 3H), 6.53 (s, 1H), 6.37 (s, 1H), 4.23 (m, 1H), 3.89 (m, 2H), 3.63 (m, 1H), 3.59 (dd, 1H), 3.38 (m, 1H), 2.90 (s, 3H), 2.45 (m, 1H), 2.35 (m, 1H); MS (ES+): m/z 402 (M +1)(遊離塩素).
【０１１１】
この化合物をキラルＨＰＬＣにかけた。キラルＨＰＬＣは、カラムであるＣｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＤ−Ｈ（２５０×４．６ｍｍ）およびＴＦＡ（０．４％）を伴う溶媒系であるヘキサン：エタノール（９２：０８）を用いて行った。結果は、溶媒流速を１ｍＬ／分として、２６４ｎｍで記録した。キラルＨＰＬＣは、化合物である（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシ−メチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩の１００％のｅ．ｅを示した。
【０１１２】
Ｂ）（＋）−トランス−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（化合物Ｂ）の調製
化合物である（＋）−トランス−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチルピロリジン−３−イル）−５，７−ジメトキシ−クロメン−４−オン（０．２５ｇ、０．５ｍｍｏｌ）と、ピリジン塩酸塩（０．２５ｇ、２．１６ｍｍｏｌ）と、触媒量のキノリンとの混合物を、１８０℃で２．５時間にわたり加熱した。反応混合物をメタノール（２５ｍＬ）で希釈し、固体Ｎａ２ＣＯ３でｐＨ１０に塩基性化した。反応混合物を濾過し、メタノールで洗浄した。有機層を濃縮し、残留物を、溶離液としてのクロロホルム中に０．１％のアンモニアおよび４．５％のＭｅＯＨを用いるカラムクロマトグラフィーにより精製して、黄色の固体としての化合物である（＋）−トランス−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシ−メチル−１−メチルピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オンを得た。
【０１１３】
収量: 0.15 g (63.7%);
1H NMR (CDCl3, 300MHz): δ 7.99 (m, 2H), 7.83 (d, 1H), 6.65 (s, 1H), 6.41 (s, 1H), 4.24 (m, 1H), 3.90 (m, 2H), 3.70 (m, 1H), 3.60 (m, 1H), 3.41 (m, 1H), 2.99 (s, 3H), 2.54 (m, 1H), 2.28 (m, 1H); MS (ES+): m/z  470 (M+1).
上記で得られた化合物（０．１ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、メタノール（２ｍＬ）中で懸濁させ、エーテルを含むＨＣｌで処置し、有機溶媒を蒸発させて、化合物である（＋）−トランス−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩を得た。
収量: 0.1g (92.8%);
1H NMR (CDCl3, 300MHz): δ 8.02 (d, 2H), 7.83 (d, 1H), 6.64 (s, 1H), 6.41 (s, 1H), 4.23 (m, 1H), 3.73 (m, 2H), 3.68 (m, 1H), 3.51 (m, 1H), 3.39 (m, 1H), 2.99 (s, 3H), 2.54 (m, 1H), 2.31 (m, 1H).
【０１１４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究
材料および方法：ＨＰＶゲノムについて陽性の２つの子宮頸がん細胞系であるＳｉＨａおよびＨｅＬａ（ＡＴＣＣ）を、化合物Ａおよび化合物Ｂを評価するために用いた。この細胞系に、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、蛍光タンパク質ＥＧＦＰと融合させたｐ５３タンパク質を発現するプラスミドベクターをトランスフェクトした。４８時間にわたるトランスフェクションの後に、細胞を、１０％のＦＢＳおよび８００μｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を補充したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、型番：Ｄ５５４６）中で３０〜４５日間にわたり維持した。安定的発現細胞を増殖させ、蛍光顕微鏡法下で融合構築物の存在について評価した。２４時間にわたるトランスフェクションの後に、細胞を、化合物Ａおよび化合物Ｂで、２４時間にわたり個別に処置した（以後、処置された細胞と称する）。細胞を採取し、ウェスタンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲによるＥ６、Ｅ７、ｐ５３の状態についての解析のために用いた。化合物Ａおよび化合物Ｂで処置されなかった細胞（以後、処置されていない細胞と称する）は、対照として用いた。ＨＰＶ陰性Ｃ３３Ａ細胞は、陰性対照として用いた。
【０１１５】
新鮮な培地および培養培地という用語は、ＤＭＥＭ（型番：Ｄ５５４６）を指す。
【実施例２】
【０１１６】
ウェスタンブロットによるＥ６、Ｅ７、ｐ５３の状態についての解析
ウェスタンブロット用の全細胞抽出物を調製するために、処置された細胞を、溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％のＮＰ−４０、４０ｍＭのＮａＦ、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、および１０ｍＭのジチオトレイトール、および１μｇ／ｍｌずつのロイペプチンおよびアプロチニンの各々）中で溶解させた。細胞溶解物（５０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解し、分離されたタンパク質（Ｅ６、Ｅ７、およびｐ５３）を、Ｂｉｏ−Ｒａｄエレクトロトランスファー装置を用いる湿潤転写法により、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。０．２％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するトリス緩衝生理食塩液中に１０％の脱脂粉乳でブロッキングした後、膜を、一次抗体に続き、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体と共にインキュベートした。３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）法により、タンパク質を可視化した。処理されていない細胞についても同様の手順を踏んだ。
【０１１７】
以下の抗体を、示された希釈液によるウェスタンブロットのために用いた。
【０１１８】
【表２】
2014517063.tif 000010
【０１１９】
【表３】
2014517063.tif 000011
【０１２０】
結果：化合物Ａおよび化合物Ｂで処置された細胞は、ＳｉＨａ細胞およびＨｅＬａ細胞のいずれにおいても、ｐ５３タンパク質の発現の増大を用量依存的な形で示すことが観察された。しかし、処理されていない細胞では、発現が観察されなかった。ＳｉＨａ細胞におけるＥ６の発現は、濃度５０μｇ／ｍＬの両方の化合物により下方調節された。同様に、Ｅ７の、対照と比較して完全な下方調節も、２５μｇ／ｍＬの化合物Ａで処置された細胞で見られ、Ｅ７の、対照と比較して完全な下方調節はまた、２５μｇ／ｍＬの化合物Ｂで処置された細胞でも見られた（図１Ａおよび図１Ｂ）。
【実施例３】
【０１２１】
ＲＴ−ＰＣＲによるＥ６、Ｅ７、ｐ５３の状態についての解析
転写レベルにおける遺伝子Ｅ６およびＥ７の発現状態を、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により検出した。ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（型番：８０２０４）を用いて処理された細胞および処理されていない細胞から単離した。ＲＮＡの完全性は、アガロースゲル電気泳動の後に、ＵＶ下で可視化することにより点検した。ＲＮＡの量および純度は、Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により解析した。５００ｎｇのＲＮＡを、０．１μｇ／μｌのＯｌｉｇｏ  ｄＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＭＭＬＶ−ＲＴ、ｄＮＴＰ、ＲＮＡ  ｇｕａｒｄ、およびＲＴ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｃＤＮＡに転換し、３７℃で１時間にわたりインキュベートした。反応は、反応混合物を、９０℃で３分間にわたり加熱することにより停止させ、Ｅ６およびＥ７遺伝子をＰＣＲ増幅するために用いた。ＰＣＲは、以下の通りに実行した。
【０１２２】
【表４】
2014517063.tif 000012
プライマーの配列を以下に示す。
【０１２３】
【表５】
2014517063.tif 000013
【０１２４】
結果：ＲＴ−ＰＣＲの定量化は、５０μｇ／ｍＬの化合物Ａまたは化合物Ｂで処置されたＳｉＨａ細胞およびＨｅＬａ細胞の両方におけるＥ６およびＥ７の両方について、有意な転写物の阻害を明らかにした。β−アクチンは、ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおけるデータを標準化するためのハウスキーピング遺伝子として用いた。遺伝子特異的ＰＣＲの特異性は、Ｅ６およびＥ７遺伝子について陰性のＣ３３Ａ細胞を用いて決定した（図２）。
【実施例４】
【０１２５】
ｐ５３核移行アッセイ
材料および方法：ＨＰＶゲノムについて陽性の２つの子宮頸がん細胞系であるＳｉＨａおよびＨｅＬａ（ＡＴＣＣ）を用いた。この細胞系に、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、ｐ５３−ＥＧＦＰを含有する発現ベクターをトランスフェクトした。４８時間にわたるトランスフェクションの後に、細胞を、１０％のＦＢＳおよび８００μｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を補充したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、型番：Ｄ５５４６）中で３０〜４５日間にわたり維持した。安定的発現細胞を、ｐ５３核移行アッセイのために用いた。
【０１２６】
生物学的研究：安定的発現細胞を、９６ウェルイメージングプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＵＳＡ）上に播種し、加湿型ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で４８時間にわたり増殖させた。細胞核を、必須の蛍光核色素Ｈｏｅｃｈｓｔ２２３３４（０．５μｇ／ｍＬの）で５分間にわたり染色した後、新鮮な培地に交換した。ＤＭＳＯ中５０ｍｇ／ｍＬの原液を調製し、さらなる希釈液を作製し、５％のＦＢＳを含有する培養培地中に２〜５０μｇ／ｍＬの濃度を得た。細胞を、異なる濃度（２〜５０μｇ／ｍＬ）の化合物Ａおよび化合物Ｂで個別に処置した。イメージングは、２０倍の対物レンズを用いるＢＤ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｂｉｏｉｍａｇｅｒ（ＢＤ、ＵＳＡ）を用いて１２時間ごとに実行した。核チャネルおよび核について陽性の細胞の数に基づき細胞を分割した（ＥＧＦＰを計算して活性をスコア付けした）。細胞はまた代替的に、ＣＣＤカメラであるＲｅｔｉｇａ  ＥｘｉおよびＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを装備したＮｉｋｏｎ  Ｔｉ倒立蛍光顕微鏡でもイメージングした。また、明視野画像も収集した。
【０１２７】
結果：ＥＧＦＰに連結されたｐ５３タンパク質の核移行についての顕微鏡によるイメージングは、化合物Ａおよび化合物Ｂを添加することにより、ＨｅＬａ細胞およびＳｉＨａ細胞の両方におけるＥＧＦＰ−ｐ５３タンパク質の核移行の増大が結果としてもたらされることを裏付けた。さらにまた、化合物Ａならびに化合物Ｂの濃度を２５〜５０μｇ／ｍＬとすると、核移行が、処理の１２時間後に開始され、２４時間後まで増大したことも注意された。各薬物について、かつ、各薬物の異なる濃度について、ｐ５３  ＥＧＦＰの核内陽性細胞の百分率を示す代表的なグラフを、図３Ａおよび図３Ｂに示す。
【実施例５】
【０１２８】
老化アッセイ
このアッセイは、老化と関連するβ−ガラクトシダーゼ染色を検出して、処置された細胞における老化状態を点検するために実施した。
【０１２９】
材料および方法：ＨＰＶゲノムについて陽性の２つの子宮頸がん細胞系であるＳｉＨａおよびＨｅＬａ（ＡＴＣＣ）を用いた。これらの細胞系に、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、ｐ５３−ＥＧＦＰを含有する発現ベクターをトランスフェクトした。４８時間にわたるトランスフェクションの後に、細胞を、１０％のＦＢＳおよび８００μｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）で補充したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、型番：Ｄ５５４６）中で、３０〜４５日間にわたり維持した。安定的発現細胞を、老化アッセイのために用いた。
【０１３０】
生物学的研究：安定的発現細胞を、化合物Ａおよび化合物Ｂで個別に処置し、３％のホルムアルデヒド中で５分間にわたり固定し、洗浄し、３７℃で、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド溶液（１ｍｇ／ｍｌ）、（４０ｍＭのクエン酸（ｐＨ６．５）、５ｍＭのフェロシアン化カリウム、５ｍＭのフェリシアン化カリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および２ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する溶液中で溶解させることにより調製した）と共にインキュベートした。３７℃で一晩にわたるインキュベーションの後に、組織または細胞を、顕微鏡法により可視化した。細胞質ゾル中の鮮明な青色の染色は、細胞における老化様の特色の誘導を示した。
【実施例６】
【０１３１】
ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
全ての実験は、Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌｓ（ＣＰＣＳＥＡ）のガイドラインに従い、Ｐｉｒａｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｇｏｒｅｇｏａｎ、Ｍｕｍｂａｉ、ＩｎｄｉａにおけるＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＥＣ）の承認を得て実行した。
【０１３２】
ＨＰＶ関連がんを処置するための本発明の化合物のｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性は、ＳｉＨａ（ＨＰＶ  １６陽性の子宮頸がん）細胞系を用いて研究した。
【０１３３】
ＳｉＨａヒト子宮頸がん異種移植マウスモデル
用いられる動物：４〜６週齢で、体重２２〜２５ｇの、ＦＯＸｎ１についてホモ接合性の雄Ｎｕ／Ｊヌード（Ｎｕ）マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳ）。動物は、指定された病原菌を含まない条件下にある動物アイソレーター内で飼育し、１２時間の明期／１２時間の暗期を伴い、２２〜２５℃および５５〜７５％の湿度で維持した。マウスは、７日間にわたり馴致してから、実験にかけた。動物は、層流フード内で取り扱った。全ての食物および水は、オートクレーブ処理した。
【０１３４】
ヌードマウスにおける皮下異種移植腫瘍の生成
ステップ１：ヌードマウスに注射するための単一細胞懸濁液の調製
トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いて付着性のＳｉＨａ細胞（ＳｉＨａ細胞系−ＡＴＣＣ−ＨＢＴ  ３５）を採取し、懸濁液を、８００ｒｐｍで５分間にわたり遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを、１ｍＬの無血清ＭＥＭ培地中に再懸濁させた。細胞カウントは、１：１００の希釈率を用いて得た。細胞を希釈して、懸濁液０．２ｍＬ当たり５×１０６個の細胞を得た。
【０１３５】
ステップ２：ヌードマウスにおける皮下異種移植腫瘍の生成
腫瘍細胞を注射した日に、ステップ１の細胞懸濁液を、層流フード内の氷上で保存した。各ヌードマウスの右脇腹に、０．２ｍＬの細胞懸濁液を皮下注射した。５日間後に、注射部位近傍を触診することにより、動物を腫瘍増殖について観察した。
【０１３６】
化合物および投与用調製物を保管するための条件
化合物Ａ：３．５ｍｇ／ｍＬ；媒体：水中で調製されたデキストロース（５％）。
トポテカン塩酸塩（基準物質として用いられる）：０．２ｍｇ／ｍＬ；媒体：メチルセルロース（０．２５％）。
化合物Ｂ：２０ｍｇ／ｍＬ；媒体：メチルセルロース（０．２５％）。
シスプラチン（基準物質として用いられる）：０．６ｍｇ／ｍＬ；媒体：メチルセルロース（０．２５％）。
基準物質を含めた全ての化合物は、４℃〜８℃で保存した。
【０１３７】
投与
ヌードマウスは、オートクレーブ処理したトウモロコシの鞘による寝床を伴うケージ（フィルタートップケージ）１つ当たり８匹ずつの群で飼育し、食物および水の自由摂取を施した。動物の取り扱いは、標準的なガイドラインに従った。腫瘍容量が約１００ｍｍ３となったときに、処置を開始した。腫瘍保有マウスを、以下の処置群で無作為化した（ｎ＝８）。
ｉ）群１：対照群：媒体を投与された腫瘍保有マウス。
ｉｉ）群２：３５ｍｇ／ｋｇの化合物Ａを毎日１回腹腔内投与された腫瘍保有マウス。
ｉｉｉ）群３：腫瘍保有マウスには、トポテカン（基準物質）２ｍｇ／ｋｇの単回腹腔内投与を施した。
ｉｖ）群４：腫瘍保有マウスには、２００ｍｇ／ｋｇの化合物Ｂを毎日１回経口投与した。
ｖ）群５：腫瘍保有マウスには、シスプラチン（基準物質）６ｍｇ／ｋｇの単回腹腔内投与を施した。
【０１３８】
処置
群１、群２、および群４のヌードマウスは、１〜６日目および１２〜１７日目に処置した。群３および群５のマウスは、１日目に処置した。２３日目には、全ての群の動物を屠殺し、さらなる解析のために試料を採取した。上記の群全てに投与された容量は、１０ｍＬ／ｋｇであった。
【０１３９】
観察および測定
処置の間には、以下のパラメータを観察した。
１．動物の全般的健康を毎日観察した。
２．体重を毎日観察した。
３．腫瘍を、ノギスを用いて、２〜３日間おきに測定した。
腫瘍の比重を１とし、πを３として、長楕円体についての式：
腫瘍容量（ｍｍ３）＝長さ（ｍｍ）×［幅（ｍｍ）２］×０．５
を用いてｍｍ３単位の腫瘍容量を計算した。
式：
【０１４０】
【数１】
2014517063.tif 000014
を用いて、所与の日における対照群に対する処置群の比（ΔＴ／ΔＣ％）を計算した。
式：
Ｘ日目におけるＧＩ＝１００−Ｘ日目におけるΔＴ／ΔＣ％
を用いて、増殖阻害（ＧＩ）を計算した。腫瘍増殖阻害の結果は、図４および図５に示す。
【０１４１】
結論：化合物Ａおよび化合物Ｂは、ＨＰＶを媒介する子宮頸がん異種移植モデルにおいて有意な腫瘍増殖阻害を示した。
【図４】
2014517063.tif 000017
【図５】
2014517063.tif 000018
【図１】
2014517063.tif 000019
【図２】
2014517063.tif 000020
【図３】
2014517063.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成26年4月24日(2014.4.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）と関連するがんの処置における使用のための、式（Ｉ）の化合物（本明細書で記載される）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、もしくはジアステレオ異性体により表される、フラボン誘導体で置換されたピロリジンに関する。本発明はまた、ヒトパピローマウイルスと関連するがんの処置における使用のための、式（Ｉ）の化合物を含有する医薬組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）とは、扁平上皮細胞に感染する環状の非エンベロープｄｓＤＮＡウイルスである。ＨＰＶは通常、皮膚の裂け目を介して体内に侵入し、次いで、皮膚の層内の細胞に感染する。ＨＰＶは、皮膚間の接触により伝染する。ＨＰＶ感染は、切り傷または被感染者との性行為を介して生じうる。これには、被感染領域の皮膚への接吻または接触および性交が含まれる。また生殖器にＨＰＶ感染を伴う母体も、陣痛時にウイルスを乳児に伝染させる。
【０００３】
ＨＰＶとは、１２０を超える類縁ウイルスの群であり、それらのうちの３３％は、生殖管に感染することが知られている（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００４、６８（２）：３６２〜３７２）。ヒトパピローマウイルスのうちのいくつかの種類は、正常細胞を、進行してがんを形成しうる非正常細胞に形質転換させる。したがって、これらのウイルスは、高危険性型および低危険性型として分類される。高危険性のＨＰＶは、がんと関連する。生殖器におけるＨＰＶ感染は、極めて一般的であり、肛門生殖器がんをもたらしうる。高危険性ＨＰＶによる持続的な感染は、子宮頸がんの主要な原因である。ＨＰＶ感染はまた、肛門がん、外陰がん、膣がん、および陰茎がんも引き起こす（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２００６、１１８（１２）：３０３０〜４４）。高危険性亜型は、ＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、および６８であり、最も一般的な高危険性亜型は、ＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、および４５である。さらに、ＨＰＶの複数の種類、特に、１６型は、ＨＰＶ陽性口腔咽頭がん、頭頸部がんの形態と関連することが判明している（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２００７、３５６（１９）：１９４４〜５６）。
【０００４】
高危険性のＨＰＶは、ウイルスの複製に必要な２つのがんタンパク質であるＥ６およびＥ７を産生する。ヒトにおけるＨＰＶ感染時には、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質が、腫瘍抑制因子であるｐ５３に結合し、アポトーシスを受ける細胞の能力を減殺させるユビキチン媒介経路により、その分解を促進する。ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質は、網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）に結合してこれを分解して、ｐＲｂが転写因子Ｅ２Ｆを阻害することを妨げる結果として、細胞周期の制御を失わせる。
【０００５】
ＨＰＶは、世界中の全てのがんのうちの約５％の原因であることが推定されている（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２００６、１１８（１２）：３０３０〜３０４４）。
【０００６】
子宮頸部のがんは、世界中の女性において二番目に一般的ながんである。症例のうちの約８６％は、先進国で生じる。子宮頸がんは、女性において生じるがんのうちの１３％を占める（「Ｗｏｒｌｄ：Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｐｉｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｃａｎｅｒｓ，ｓｕｍｍａｒｙ  ｒｅｐｏｒｔ」、２０１０年１１月）。
【０００７】
今日、持続的なヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染は、本質的に全ての子宮頸がんの原因として認識されている。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙによれば、２０１０年には、米国内の約１２，０００人の女性がこの種類のがんを伴うと診断され、４，０００名超がこれにより死亡することになろう。子宮頸がんは、毎年世界中でほぼ５０万人の女性において診断されており、毎年２５万人の生命を奪っている。
【０００８】
外陰がんおよび膣がんは、全ての婦人科がんのうちのそれぞれ約３〜５％および１〜２％を占め、陰茎がんは、米国内の全てのがんのうちの約０．２％を占める。それらの希少性にもかかわらず、外陰がん、膣がん、および陰茎がんは、それらの性に対する有意な影響のために、依然として重要な疾患である。単一の病因的因子は存在しないが、ＨＰＶ感染との関連は強い。ＨＰＶは、陰茎がんのうちの約４０％の一因であると考えられている。多くの研究は、陰茎癌におけるＨＰＶ  １６型およびＨＰＶ  １８型の存在を示している（Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．、１９９１、２２：９０８〜９１３）。ＨＰＶはまた、膣がんのうちの約６５％（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｕｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、２００９、１２４（７）：１６２６〜１６３６）および外陰がんのうちの５０％（Ｖａｃｃｉｎｅ、２００６、２４（増刊３号）：Ｓ１１〜Ｓ２５）の一因でもあり、ＨＰＶ−１６は、両方のがんの大半のＨＰＶ陽性症例の原因である（Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．、２００９、１１３（４）：９１７〜２４）。
【０００９】
ＨＰＶ感染はまた、肛門がんとも関連する。米国内では毎年、女性において約１，６００例の新たなＨＰＶ関連肛門がんの症例が診断され、男性において約９００例の新たなＨＰＶ関連肛門がんの症例が診断されていると推定される。一般に、ＨＰＶは、肛門がんのうちの約９０％の一因であると考えられている（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｕｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、２００９、１２４（７）：１６２６〜１６３６）。とりわけ、ＨＰＶ  １６は、肛門がんの大半の一因であると考えられる。研究によれば、ＨＰＶ  １６は、被験肛門がん検体のうちの８４パーセントにおいて検出された（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｎｒａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９７、３３７（１９）：１３５０〜８）。
【００１０】
頭頸部がんとは典型的に、頭頸部の扁平細胞癌を指す。頭頸部がんは、米国内の全てのがんのうちの約３パーセントを占める（Ａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ、２０１０、６０（５）：２７７〜３００）。頭頸部がんは、それらが発症する領域により同定される。頭頸部がんは典型的に、口腔がん、上頸部の唾液腺がん、副鼻腔がん、鼻腔がん、咽頭がん、鼻咽頭がん、中咽頭がん、下咽頭がん、喉頭がん、およびリンパ節がんとして分類される。口腔がん（舌の前方３分の２、歯肉、口腔粘膜、舌下口底、硬口蓋、および親不知の後方の小領域）および中咽頭がん（軟口蓋、舌の基部、および扁桃腺）は、ＨＰＶにより引き起こされるがんのうちで最も一般的な種類である。研究は、口腔咽頭がんのうちの約６０％が、ＨＰＶにより引き起こされ、特に、ＨＰＶ  １６が、一部の頭頸部扁平細胞癌（ＨＮＳＣＣ）の原因因子であることを示している（Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、２００５、１４（２）：４６７〜４７５）。
【００１１】
ＨＰＶはまた、肺癌とも関連している。公表された文献によれば、肺がんにおけるＨＰＶの発生率は、２４．５％であった（Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ、２００９、６５：１３〜１８）。中国において行われた研究は、ＨＰＶ陽性集団では、肺扁平細胞癌の危険性が、ＨＰＶ陰性集団における場合と比較して３．５倍高く、ＨＰＶ−１６陽性患者について、ＨＰＶ−１６陰性患者より１６．９倍高い（Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．、２００９、２１（６）：１６２７〜３２）ことを明らかにした。
【００１２】
ヒトパピローマウイルスの役割はまた、様々な範囲の他の悪性腫瘍、特に、世界中の色白の皮膚の集団において最も一般的な悪性腫瘍である黒色腫皮膚がんにおいても提起されている。皮膚がんは、致死性であることが稀であり、がんによる死亡の一因となるのは、全体の１％未満である。しかしながら、公衆衛生に対するその影響は、無視できないものである。ヒト皮膚がんにおけるＨＰＶの関与は、稀な遺伝性疾患である疣贅状表皮発育異常症を伴う患者において初めて裏付けられた（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ、２００３、３１号）。
【００１３】
ＨＰＶはまた、結膜の上皮内新生物（０〜８０％）、ならびに結膜、まぶた、および涙嚢の侵襲性癌のうちの６２〜１００％（ＩＡＲＣ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ、６４：１３０）とも関連する。ＨＰＶと結膜パピローマとの間には、強い関連が認められる。ＨＰＶ６／１１型は、結膜パピローマにおいて最も一般的なＨＰＶの種類である（Ｂｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．、２００１、８５：７８５〜７８７）。
【００１４】
ＨＰＶ６、１１、および１３は、これらの種類による感染の発癌可能性は低く、通常は生殖器疣（専門的には尖圭コンジロームとして知られている）、および子宮頸部の軽度の形成異常など、良性病変の形成を結果としてもたらすため、低危険性として分類されることが典型的である。また、ＨＰＶ６および１１は、結膜パピローマとも関連する。
【００１５】
生殖器におけるＨＰＶ感染の発生率の高さ、およびその悪性疾患との関連にもかかわらず、ＨＰＶ感染に有効な抗ウイルス治療は存在しない。Ｇａｒｄａｓｉｌ（登録商標）およびＣｅｒｖａｒｉｘ（登録商標）は、現在市販されている、最も一般的な高危険性のＨＰＶ（ＨＰＶ  １６および１８）のうちの２つに対する２つのワクチンである。しかし、これらは、予防的な部類であるに過ぎず、既存のＨＰＶ関連がんを処置するわけではない。さらに、費用の高さ、社会的受容に関わる問題、およびワクチンを提供しうる医療システムの限界が、特に、ＨＰＶ関連肛門生殖器がん（肛門および生殖器に関する）が最も一般的に見出される先進国における女性にとってのこのワクチンの入手可能性を限界づけている。結果として、ＨＰＶ関連がんを防止および／または処置するための、他のより廉価でより広く利用可能な手法を同定することが依然として必要とされている。
【００１６】
本発明者らは、驚くべきことに、フラボン誘導体で置換されたピロリジンが、ＨＰＶと関連するがんに対して有効であることを見出した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本明細書で記載される本発明は、ヒトパピローマウイルス関連がんを処置するための、式（Ｉ）（本明細書で記載される）により表されるフラボン誘導体で置換されたピロリジンを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の一態様によれば、ヒトパピローマウイルスと関連するがんを処置するための、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体の使用が提供される。
【００１９】
本発明の別の態様によれば、肛門がん、外陰がん、膣がん、陰茎がん、子宮頸がん、口腔咽頭がんおよび口腔がんなどの頭頸部がん、肺がん、非黒色腫皮膚がん、または結膜がんである、ＨＰＶと関連するがんを処置するための、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体の使用が提供される。
【００２０】
本発明のさらに別の態様によれば、子宮頸がんを処置するための、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体の使用が提供される。
【００２１】
本発明の別の態様によれば、ヒトパピローマウイルス関連がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体を投与するステップを含む方法が提供される。
【００２２】
本発明の別の態様によれば、対象における、肛門がん、外陰がん、膣がん、陰茎がん、子宮頸がん、口腔咽頭がんおよび口腔がんなどの頭頸部がん、肺がん、非黒色腫皮膚がん、または結膜がんから選択される、ＨＰＶと関連するがんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体を投与するステップを含む方法が提供される。
【００２３】
本発明のさらに別の態様によれば、子宮頸がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体を投与するステップを含む方法が提供される。
【００２４】
本発明の別の態様によれば、ＨＰＶと関連するがんを処置するための、治療有効量の、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体を薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物が提供される。
【００２５】
本発明の別の態様によれば、ＨＰＶと関連するがんを処置するのに有用な、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体を含む医薬を製造するための方法が提供される。
【００２６】
本発明の他の態様および本発明の適用可能性のさらなる範囲は、後続する詳細な記載から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】化合物Ａおよび化合物Ｂで処置された細胞におけるｐ５３の有意な上方調節を示すウェスタンブロットの複製を示す図である。
【図１Ｂ】化合物Ａおよび化合物Ｂで処置されたＳｉＨａ細胞におけるＥ６およびＥ７の発現の有意な下方調節を示すウェスタンブロットの複製を示す図である。
【図２】化合物Ａおよび化合物Ｂで処置されたＳｉＨａ細胞およびＨｅＬａ細胞におけるＥ６およびＥ７の転写レベルにおける発現の有意な下方調節を示すＲＴ−ＰＣＲの複製を示す図である。
【図３Ａ】ＳｉＨａ細胞におけるｐ５３−ＥＧＦＰの核移行についてのグラフ表示である。
【図３Ｂ】ＨｅＬａ細胞におけるｐ５３−ＥＧＦＰの核移行についてのグラフ表示である。
【図４】化合物Ａの投与後におけるＳｉＨａ異種移植動物における腫瘍増殖プロファイルのグラフ表示である。
【図５】化合物Ｂの投与後におけるＳｉＨａ異種移植動物における腫瘍増殖プロファイルのグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本開示の文脈では、本明細書の前出および本明細書の後出において用いられる一般的な用語が、別段に示されない限り、以下の意味を有することが好ましい。したがって、本明細書の以下では、本発明の文脈で用いられる一般的な用語の定義が提示される。
【００２９】
単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈により別段に明確に指示されない限り、複数形の言及を包含する。
【００３０】
「置換」または「〜で置換された」は、このような置換が、置換された原子および置換基の許容される価数に従うほか、転位、環化、脱離などの転換を容易に受けない安定的な化合物も表すという暗黙の条件を包含することが理解されるであろう。
【００３１】
「Ｃ１〜Ｃ４アルキル」という用語は、１以上４以下の炭素原子を含有する直鎖状鎖または分枝状鎖を含めた、飽和脂肪族基のラジカルを指す。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルなどが含まれるがこれらに限定されない。
【００３２】
「Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ」という用語は、上記で定義されたアルキル基であって、酸素連結を介して分子の残余部分に接合されたアルキル基を指す。アルコキシの例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなどが含まれるがこれらに限定されない。
【００３３】
「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素を指す。
【００３４】
本明細書で用いられる「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」という用語は、−ＯＨ基を指す。
【００３５】
本明細書で用いられる「治療有効量」という用語は、式（Ｉ）により表される化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体の量であって、このような処置を必要とする対象に投与されると、ＨＰＶにより媒介される疾患が、軽減、処置、または緩和されるように、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の活性を阻害するのに十分な量を指す。
【００３６】
本明細書で用いられる「ＨＰＶ」または「ヒトパピローマウイルス」という用語は、哺乳動物に感染することが可能なウイルスのパピローマウイルスファミリーのメンバーを指す。この用語は、別段に示されない限り、高危険性の種類のＨＰＶおよび危険性の低い種類のＨＰＶの両方を包含する。
【００３７】
本明細書で用いられる「対象」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトであって、ＨＰＶにより媒介される疾患の処置を必要とする動物を指す。本発明の文脈では、対象という用語を、患者という用語と互換的に用いることができる。
【００３８】
本明細書で用いられる「哺乳動物」という用語は、ヒトのほか、ヒトパピローマウイルスによる感染に対して感受性の非ヒト哺乳動物を包摂することを意図する。非ヒト哺乳動物には、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラットおよびマウスなどの家畜動物、および非家畜動物が含まれるがこれらに限定されない。
【００３９】
対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおけるＨＰＶ関連がんに言及する「〜を処置する」、または「処置」、または「処置された」という用語は、（ｉ）がんの阻害、つまりがんの発症の停止；（ｉｉ）がんの軽減もしくは退縮またはがんの緩徐化；（ｉｉｉ）がんの改善、つまりがんと関連する症状の重症度の軽減；（ｉｖ）がんと関連する１または複数の症状のある程度の除去を包含する。
【００４０】
本明細書で用いられる「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤、賦形剤、および／または塩が、そのレシピエントに対して有害ではない処方物の他の成分と適合性でなければならないことを意味する。「薬学的に許容される」はまた、組成物、または剤形が、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題、または合併症を伴わずに、動物、またはヒトのための使用に適する穏健な医学的判断の範囲内にあり、妥当な有益性／危険性比に相応することも意味する。
【００４１】
本発明はさらに、式（Ｉ）の化合物の全ての溶媒和物、例えば、水和物、および、アルコール、エーテル、酢酸エチル、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、もしくはアセトンなどの低級アルキルケトン、またはこれらの混合物など、他の結晶化溶媒と共に形成される溶媒和物を包含する。本発明のいくつかの化合物は、非溶媒和形態のほか、水和形態を含めた溶媒和形態でも存在しうる。本発明のいくつかの化合物は、複数の結晶形態またはアモルファス形態で存在しうる。一般に、全ての物理的形態は、本発明により想定される使用のための同等物であり、本発明の範囲内にあることが意図される。
【００４２】
「ｐ５３」という用語は、腫瘍抑制因子として作用する核リンタンパク質を指す。
【００４３】
「ｐＲｂ」または「網膜芽細胞腫タンパク質」という用語は、がんの多くの種類において機能不全となる腫瘍抑制因子タンパク質を指す。
【００４４】
「下方調節」という用語は、示された活性または発現の部分的または全体的な低減を指す。本発明の文脈では、「がんタンパク質Ｅ６およびＥ７の下方調節」という用語が、Ｅ６およびＥ７それぞれの発現レベルの低下を指す。レベルは、ウェスタンブロットアッセイを含め、当技術分野における任意の適切な方法により決定することができる。
【００４５】
「ｐ５３の上方調節」という用語は、腫瘍抑制因子タンパク質５３の発現レベルの増大を指す。
【００４６】
「老化」という用語は、細胞が分裂するそれらの能力を喪失する状態を指す。
【００４７】
「アポトーシス」という用語は、天然のプログラム細胞死過程を指す。アポトーシスとは、細胞が自身を死滅させる特化された細胞内機構を用いる自己破壊過程である。細胞は、膜結合粒子に分解され、次いで、食作用により消失する。アポトーシスとは、後生動物が細胞数を制御し、動物の生存を脅かす細胞を消失させることを可能とする機構である。
【００４８】
「転写」という用語は、ＤＮＡ配列の相補的なＲＮＡコピーを創出する過程を指す。
【００４９】
「細胞周期の停止」という用語は、正常な段階（Ｇ１、Ｓ、Ｇ２、Ｍ）のうちの１つにおいて、細胞周期の進行を停止させる調節過程を指す。
【００５０】
抗がん活性を伴う化合物とは、細胞増殖を阻害することが可能であるか、または細胞死を誘導することが可能な物質を指す。本発明の組成物における使用に適する抗がん剤の非限定的な例には、（ｉ）タキサンおよびパクリタキセルなどの微小管破壊剤、（ｉｉ）イマチニブ、エルロチニブ、およびＢＡＹ−４３−９００６などのキナーゼ阻害剤、（ｉｉｉ）ラパマイシンなどのｍＴＯＲ阻害剤、（ｉｖ）カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、エトポシド、およびダカルバジンなどの抗新生物剤、ならびに（ｘｖｉ）トポテカンおよびイリノテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤、（ｖｉ）シタラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、トポテカン、ヒドロキシウレア、チオグアニン、メトトレキサートなどの代謝拮抗剤、（ｖｉｉ）ドキソルビシン、ブレオマイシン、およびダクチノマイシンなどの細胞傷害剤が含まれる。
【００５１】
本発明の一態様によれば、ＨＰＶと関連するがんの処置における使用のための、式（Ｉ）
【００５２】
【化１】
2014517063.tif 000022
［式中、Ａｒは、非置換であるか、またはハロゲン、ニトロ、シアノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、トリフルオロメチル、ヒドロキシル、もしくはＣ１〜Ｃ４アルコキシから選択される、１つ、２つ、もしくは３つの同一であるかもしくは異なる置換基で置換されたフェニル基である］
の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、もしくはジアステレオ異性体が提供される。
【００５３】
本発明の一態様によれば、ＨＰＶと関連するがんの処置における使用のための、以下の式（ＩＡ）
【００５４】
【化２】
2014517063.tif 000023
［式中、Ａｒは、非置換であるか、またはハロゲン、ニトロ、シアノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、トリフルオロメチル、ヒドロキシル、もしくはＣ１〜Ｃ４アルコキシから選択される、１つ、２つ、もしくは３つの同一であるかもしくは異なる置換基で置換されたフェニル基である］
に示される式（Ｉ）の化合物の（＋）トランス異性体、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物が提供される。
【００５５】
本発明の別の態様によれば、ＨＰＶと関連するがんの処置における使用のための、Ａｒが、塩素、臭素、フッ素、ヨウ素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、またはトリフルオロメチルから選択される、１つ、２つ、または３つの同一であるかまたは異なる置換基で置換されたフェニル基である、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体が提供される。
【００５６】
本発明の別の態様によれば、ＨＰＶと関連するがんの処置における使用のための、Ａｒが、塩素、臭素、フッ素、またはヨウ素から選択される、１つ、２つ、または３つの同一であるかまたは異なるハロゲンで置換されたフェニル基である、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体が提供される。
【００５７】
本発明の別の態様によれば、ＨＰＶと関連するがんの処置における使用のための、Ａｒが、塩素で置換されたフェニル基である、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体が提供される。
【００５８】
本発明の別の態様によれば、ＨＰＶと関連するがんの処置における使用のための、Ａｒが、塩素およびトリフルオロメチルで置換されたフェニル基である、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体が提供される。
【００５９】
当業者により、式（Ｉ）の化合物は、少なくとも２つのキラル中心を含有し、よって、２つの異なる光学異性体（すなわち、（＋）光学異性体または（−）光学異性体）、２つの異なる幾何異性体（ｃｉｓ幾何異性体およびｔｒａｎｓ幾何異性体）、および４つの異なるジアステレオ異性体の形態で存在することが察知されるであろう。本発明の範囲内には、全てのこのような光学異性体、幾何異性体、ジアステレオ異性体、およびラセミ混合物を含めたこれらの混合物が、包含される。式（Ｉ）の化合物の光学異性体は、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００４００４６３２号、同第ＷＯ２００７１４８１５８号、および同第ＷＯ２００８００７１６９号において開示されている方法により得ることもでき、式（Ｉ）の化合物の光学異性体はまた、キラルＨＰＬＣおよび酵素的分解など、当技術分野でよく知られた方法によっても得ることができる。代替的に、式（Ｉ）の化合物の光学異性体は、光学的に活性な出発材料を用いることにより合成することもできる。
【００６０】
薬学的に許容される塩の形態でありうる式（Ｉ）の化合物の製造、ならびに経口投与、直腸内投与、および／または非経口投与に適する医薬組成物であって、上記の化合物を含有する医薬組成物の製造は一般に、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００４００４６３２号において開示されている。
【００６１】
本明細書の上記で示された通り、式（Ｉ）の化合物は、その塩の形態として使用することができる。式（Ｉ）の化合物の好ましい塩には、酢酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、桂皮酸塩、クエン酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルクロン酸塩、グルタミン酸塩、グリコール酸塩、塩酸塩、水素酸塩、フッ化水素酸塩、ケトグルタル酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、スルファミン酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、トリフルオロ酢酸塩、および当業者に知られている他の酸添加塩が包含される。
【００６２】
本発明の態様によれば、ＨＰＶ関連がんの処置における使用のための式（ＩＡ）の化合物は、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシ−メチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（本明細書では、化合物Ａと称する）、または（＋）−トランス−３−［２［（２−クロロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（本明細書では、化合物Ｂと称する）から選択される。化合物ＡおよびＢは、ＷＯ２００７１４８１５８において開示されており、とりわけ、それぞれ、実施例１０および実施例４４として開示されている。
【００６３】
ＨＰＶ関連がんの処置における使用のための式（ＩＡ）の化合物は、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシ−メチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（化合物Ａ）でありうる。
【００６４】
ＨＰＶ関連がんの処置における使用のための式（ＩＡ）の化合物は、（＋）−トランス−３−［２［（２−クロロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（化合物Ｂ）でありうる。
【００６５】
ＨＰＶと関連するがんは、肛門がん、外陰がん、膣がん、陰茎がん、子宮頸がん、口腔咽頭がんおよび口腔がんなどの頭頸部がん、肺がん、非黒色腫皮膚がん、および結膜がんからなる群から選択される。
【００６６】
式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体は、子宮頸がんを処置するために用いることができる。
【００６７】
ヒトパピローマウイルス関連がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体を投与するステップを含む方法が記載される。
【００６８】
対象における、肛門がん、外陰がん、膣がん、陰茎がん、子宮頸がん、口腔咽頭がんおよび口腔がんなどの頭頸部がん、肺がん、非黒色腫皮膚がん、および結膜がんからなる群から選択されるＨＰＶ関連がんは、それを必要とする対象に、治療有効量の、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体を投与することにより処置することができる。
【００６９】
子宮頸がんは、それを必要とする対象に、治療有効量の、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体を投与することにより処置することができる。
【００７０】
本発明は、ＨＰＶ関連がんを阻害する方法であって、ＨＰＶ感染細胞を式（Ｉ）の化合物と接触させるステップを含む方法を提供する。
【００７１】
本発明の態様によれば、ＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、および６８から選択される高危険性のＨＰＶを阻害する方法であって、ＨＰＶ感染細胞を式（Ｉ）の化合物と接触させるステップを含む方法が提供される。
【００７２】
ある実施形態では、ＨＰＶ  １６、１８、および３１を阻害する方法であって、ＨＰＶ感染細胞を式（Ｉ）の化合物と接触させるステップを含む方法が提供される。
【００７３】
本発明によれば、ＨＰＶ上のがんタンパク質を下方調節することができる。がんタンパク質は、ＨＰＶ上のがんタンパク質Ｅ６およびＥ７でありうる。下方調節は、対象に治療有効量の式（Ｉ）の化合物を投与することにより実行することができる。ＨＰＶ上のがんタンパク質Ｅ６およびＥ７の阻害は、細胞周期の停止、老化、またはアポトーシスを誘導する手段である。
【００７４】
ＨＰＶ上のがんタンパク質Ｅ６およびＥ７は、転写レベルで下方調節することができる。
【００７５】
リンタンパク質ｐ５３は、治療有効量の式（Ｉ）の化合物を、それを必要とする対象に投与することにより活性化することができる。
【００７６】
本発明のさらに別の実施形態によれば、ＨＰＶ  １６と関連するがんを処置する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体を投与するステップを含む方法が提供される。
【００７７】
本発明の別の態様によれば、ＨＰＶと関連するがんを処置するのに有用な、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはジアステレオ異性体を含む医薬を製造するための方法が提供される。
【００７８】
治療有効量の、式（Ｉ）の化合物、薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体、またはそのジアステレオ異性体を薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物が提供される。組成物は、少なくとも１つのさらなる薬学的に活性な化合物であって、抗がん活性を有するさらなる薬学的に活性な化合物を包含しうる。薬学的に活性な化合物は、ブレオマイシン、シスプラチン、トポテカン塩酸塩、イミキモド、ポドフィロックス、トリクロロ酢酸などから選択されうるがこれらに限定されない。
【００７９】
医薬調製は、重量で約１〜９９％、例えば、約５〜７０％、または約５〜約３０％の、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含有しうる。医薬調製物中の、式（Ｉ）の有効成分、またはその薬学的に許容される塩の量は、通常約１〜１０００ｍｇである。
【００８０】
式（Ｉ）の化合物は、経口投与、膣内投与、外陰膣内投与、直腸内投与、局所投与、または非経口投与（静脈内投与、皮下投与、筋内投与、血管内投与を含めた非経口投与または非経口注入）することができる。式（Ｉ）の化合物は、処置される状態に適する任意の経路を介して投与しなければならない場合がある。好ましい経路は、患者の状態と共に変化しうることが察知されるであろう。
【００８１】
医薬としての使用を意図される組成物は、医薬組成物を製造するための当技術分野で知られる任意の方法に従い調製することができる（例えば、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、「Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（２１版）（２００５）；Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」（１１版）（２００６）；およびＡｎｓｅｌ、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」（９版）、Ａｌｌｅｎら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、（２０１１）、「Ｓｏｌｉｄ−Ｓｔａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ」（２版）（１９９９））。
【００８２】
本明細書で記載される組成物は、例えば、錠剤、またはカプセルとしての経口投与に適する形態；例えば、滅菌溶液、滅菌懸濁液、または滅菌エマルジョンとしての非経口注射（静脈内注射、皮下注射、筋内注射、血管内注射を含めた非経口注射、または非経口注入）に適する形態；例えば、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、またはコロジオンとしての局所投与に適する形態；例えば、坐剤、タンポン、ペッサリー、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、または膣内リングとしての直腸内投与、膣内投与、または外因膣内投与に適する形態でありうる。組成物は、外陰など、皮膚表面の外面および／または皮膚の周囲領域に局所投与することができる。加えてまたは代替的に、組成物は、膣内投与することができる。
【００８３】
経口使用のためには、式（Ｉ）の化合物を、例えば、錠剤、またはカプセル、粉末、分散可能な顆粒、もしくは小袋、または水溶液、または懸濁液の形態で投与することができる。経口使用のための錠剤の場合、一般的に使用される担体には、ラクトース、トウモロコシデンプン、炭酸マグネシウム、滑石、および糖が包含され、一般には、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤を添加する。カプセル形態における経口投与のために有用な担体には、ラクトース、トウモロコシデンプン、炭酸マグネシウム、滑石、および糖が包含される。
【００８４】
筋内使用、腹腔内使用、皮下使用、および静脈内使用のためには通常、式（Ｉ）の化合物の滅菌溶液が使用され、溶液のｐＨは、適切に調整および緩衝されるものとする。
【００８５】
軟膏、クリームのためには、式（Ｉ）の化合物が、水中油基剤または油中水基剤において製剤化される。膣クリームは、膣腔内の粘膜表面と接触させるように投与することができる。
【００８６】
直腸内使用または膣使用のためには、式（Ｉ）の化合物を、坐剤の形態で投与することができる。坐剤は、式（Ｉ）の化合物、適切な坐剤基剤、および防腐剤、抗酸化剤、乳化剤などの添加剤を含む。適切な坐剤基剤には、天然もしくは合成のトリグリセリド、またはパラフィン炭化水素が包含される。式（Ｉ）の化合物の膣内使用はまた、膣内クリームの形態でも投与することができる。
【００８７】
経口送達用の組成物は、錠剤、トローチ、水性または油性の懸濁液、顆粒、粉末、エマルジョン、カプセル、シロップ、またはエリキシル剤の形態でありうる。経口投与される組成物は、医薬として口当たりのよい調製物を提供するために、１または複数の任意選択の薬剤、例えば、果糖、アスパラターム、またはサッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、ウィンターグリーン油、またはチェリーなどの香味剤；着色剤；および防腐剤を含有しうる。また、浸透圧的に活性である駆動化合物の周囲の選択的に透過性の膜も、本発明の化合物を経口投与するのに適する。経口組成物は、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な媒体を包含しうる。このような媒体は、医薬グレードであることが好ましい。
【００８８】
さらに、医薬組成物中に含有される本発明の化合物の効果は、適正な処方物により、遅延させることもでき、延長することもできる。例えば、化合物の緩徐に可溶性のペレットを調製し、錠剤またはカプセル内に組み込むことができる。技法は、溶解速度が複数で異なるペレットを作製し、カプセルにペレットの混合物を充填することにより改善することができる。錠剤またはカプセルは、予測される時間にわたり溶解に抵抗する薄膜でコーティングすることができる。長時間作用型の非経口調製物もなお、化合物を、油性媒体または乳化媒体であって、化合物が血清中をごく緩徐に分散することを可能とする媒体中に溶解させるかまたは懸濁させることによっても作製することができる。
【００８９】
直腸内投与用または膣内投与用の組成物は、坐剤である。坐剤とは、直腸または膣に挿入するための固体の塊であって、体内温度で溶融または軟化し、１または複数の薬理学的有効成分または治療有効成分を放出する固体の塊である。直腸内坐剤において使用される、薬学的に許容される物質は、融点を上げる基剤または媒体および薬剤である。基剤の例には、ココアバター（カカオ脂）、グリセリンゼラチン、カーボワックス（ポリオキシエチレングリコール）、および脂肪酸のモノグリセリドと、ジグリセリドグリセリドと、トリグリセリドとの適切な混合物が包含される。多様な基剤の組合せを使用することができる。坐剤の融点を上げるための薬剤には、鯨蝋および蝋が包含される。坐剤は、圧縮法により調製することもでき、鋳型成形により調製することもできる。
【００９０】
式（Ｉ）の化合物の有効用量は、少なくとも処置される状態、送達方式、および医薬処方物の性質に依存し、従来の用量漸増研究を用いて、医師により決定されるであろう。体重１ｋｇ当たり１日当たり約０．１〜約１００ｍｇ、特に、体重１ｋｇ当たり１日当たり約０．１〜約１０ｍｇ、より具体的には、体重１ｋｇ当たり１日当たり約０．１〜約５ｍｇであることを予測することができる。
【００９１】
式（Ｉ）の化合物は、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２００４００４６３２号およびＰＣＴ特許公開第ＷＯ２００７１４８１５８号において開示されている方法に従い調製することができる。
【００９２】
式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の一般的な調製プロセスは、以下のステップ：
（ａ）式ＶＩＡ
【００９３】
【化３】
2014517063.tif 000024
の中間化合物の、光学異性体として純粋な、分解された（−）−トランス光学異性体を、ルイス酸触媒の存在下において無水酢酸で処置して、分解された式ＶＩＩＡ
【００９４】
【化４】
2014517063.tif 000025
のアセチル化化合物を得るステップと、
（ｂ）分解された式ＶＩＩＡのアセチル化化合物を、塩基および溶媒の存在下において、式ＡｒＣＯＯＨの酸、または式ＡｒＣＯＣｌの酸塩化物、または式（ＡｒＣＯ）２Ｏの酸無水物、または式ＡｒＣＯＯＣＨ３［式中、Ａｒは、式（Ｉ）の化合物への言及において本明細書の上記で既定された通りである］のエステルと反応させて、式ＶＩＩＩＡ
【００９５】
【化５】
2014517063.tif 000026
の分解された化合物を得るステップと、
（ｃ）分解された式ＶＩＩＩＡの化合物を、対応する式ＩＸＡ
【００９６】
【化６】
2014517063.tif 000027
［式中、Ａｒは、上記で定義された通りである］
の分解されたβ−ジケトン化合物を得るのに適する溶媒中の塩基で処理するステップと、
（ｄ）式ＩＸＡの分解されたβ−ジケトン化合物を、塩酸などの酸で処理して、式ＸＡ
【００９７】
【化７】
2014517063.tif 000028
の対応する環化化合物を得るステップと、
（ｅ）式ＸＡの化合物を、それを脱アルキル化剤と共に加熱することにより、脱アルキル化にかけて、式（Ｉ）の化合物の（＋）−トランス光学異性体を得、場合によって、対象化合物を、その薬学的に許容される塩に転換するステップとを含む。
【００９８】
上記のステップ（ａ）において使用されるルイス酸触媒は、ＢＦ３、Ｅｔ２Ｏ、塩化亜鉛、塩化アルミニウム、および塩化チタンから選択することができる。
【００９９】
プロセスステップ（ｂ）において使用される塩基は、トリエチルアミン、ピリジン、およびＤＣＣ−ＤＭＡＰの組合せ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドと、４−ジメチルアミノピリジンとの組合せ）から選択することができる。
【０１００】
当業者には、式ＶＩＩＩＡの化合物から対応する式ＩＸＡのβ−ジケトン化合物への転位は、ベーカー−ベンカタラマン転位（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９３３、１３８１；およびＣｕｒｒ．Ｓｃｉ．、１９３３、４、２１４）として知られていることが明らかであろう。
【０１０１】
プロセスステップ（ｃ）において使用される塩基は、リチウムヘキサメチルジシラジド、ナトリウムヘキサメチルジシラジド、カリウムヘキサメチルジシラジド、水素化ナトリウム、および水素化カリウムから選択することができる。好ましい塩基は、リチウムヘキサメチルジシラジドである。
【０１０２】
式ＩＸＡの化合物の脱アルキル化のためのプロセスステップ（ｅ）において使用される脱アルキル化剤は、ピリジン塩酸塩、三臭化ホウ素、三フッ化ホウ素エーテレート、および三塩化アルミニウムから選択することができる。好ましい脱アルキル化剤は、ピリジン塩酸塩である。
【０１０３】
式ＶＩＡの出発化合物の調製は、１−メチル−４−ピペリドンを、氷酢酸中の１，３，５−トリメトキシベンゼン溶液と反応させて、１−メチル−４−（２，４，６−トリメトキシフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリジンをもたらし、これを、三フッ化ホウ素ジエチルエーテレート、ホウ化水素ナトリウム、およびテトラヒドロフランと反応させて、１−メチル−４−（２，４，６−トリメトキシフェニル）ピペリジン−３−オールをもたらすステップを伴う。１−メチル−４−（２，４，６−トリメトキシフェニル）ピペリジン−３−オールの式ＶｌＡの化合物への転換は、化合物である１−メチル−４−（２，４，６−トリメトキシフェニル）ピペリジン−３−オールのピペリジン環上に存在するヒドロキシル基を、トリエチルアミン、ピリジン、炭酸カリウム、または炭酸ナトリウムなどの酸素求核剤の存在下において、塩化ｐ−トルエンスルホニル、塩化メタンスルホニル、トリフルオロメタンスルホン酸無水物、または五塩化リンなどの適切な試薬で処理することにより、トシル、メシル、トリフレート、またはハロゲン化物などの脱離基に転換した後に、イソプロパノール、エタノール、またはプロパノールなどのアルコール溶媒中の酢酸ナトリウム、または酢酸カリウムなど、酸素求核剤の存在下における環縮小を伴う。
【０１０４】
本発明は、これに反する内容が明示的に指定されない限り、多様な代替的な変化形および一連のステップを含むことを理解されたい。さらに、任意の実施例以外において、または別段に示された場合以外において、例えば、明細書および特許請求の範囲において用いられる成分の量を表す全ての数は、全ての場合において、「約」という用語により修飾されていると理解されたい。
【０１０５】
したがって、これに反する内容が示されない限り、以下の明細書および付属の特許請求の範囲において示される数値パラメータは、本発明により得られる所望の特性に応じて変化しうる近似である。特許請求の範囲に対する同等物の原則の適用を限定しようとする試みとしてではなく、最低限に述べれば、各数値パラメータは、少なくとも報告された有効桁数に照らして、かつ、通常の丸め法を適用することにより理解されるものとする。
【０１０６】
本発明の範囲および精神の範囲内では、複数の変化形が可能であることを、当業者は認識するであろう。ここで、本発明を、以下の非限定的な例に言及しながら、より詳細に記載しよう。以下の例は、本発明をさらに例示するが、当然ながら、いかなる形であれ、その範囲を限定するとはみなされないものとする。
【０１０７】
実施例
以下の例および他の箇所では、略号が以下の意味を有する。
【０１０８】
【表１】
2014517063.tif 000029
【実施例１】
【０１０９】
Ａ）（＋）−トランス−２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（化合物Ａ）の調製
融解させたピリジン塩酸塩（４．１ｇ、３５．６ｍｍｏｌ）を、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−５，７−ジメトキシ−クロメン−４−オン（０．４ｇ、０．９ｍｍｏｌ）に添加し、１８０℃で１．５時間にわたり加熱した。反応混合物を２５℃まで冷却し、ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）で希釈し、Ｎａ２ＣＯ３を用いてｐＨ１０に塩基性化した。混合物を濾過し、有機層を濃縮した。残留物を水（５ｍＬ）中に懸濁させ、３０分間にわたり撹拌し、濾過し、乾燥させて、化合物である（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オンを得た。
収量: 0.25 g (70%);
IR (KBr): 3422, 3135, 1664, 1623, 1559cm-1;
1H NMR (CDCl3, 300MHz): δ 7.56 (d, 1H), 7.36 (m, 3H), 6.36 (s, 1H), 6.20 (s, 1H), 4.02 (m, 1H), 3.70 (m, 2H), 3.15 (m, 2H), 2.88 (m, 1H), 2.58 (s, 3H), 2.35 (m, 1H), 1.88 (m, 1H); MS (ES+): m/z  402 (M+1);
分析: C21H20ClNO5; C, 62.24 (62.71); H, 5.07 (4.97); N, 3.60 (3.48); Cl, 9.01 (8.83).
【０１１０】
上記で得られた化合物（０．２ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を、ＩＰＡ（５ｍＬ）中で懸濁させ、３．５％のＨＣｌ（２５ｍＬ）を添加した。懸濁液を加熱して、透明な溶液を得た。溶液を冷却し、濾過して、化合物である（＋）−トランス−２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）クロメン−４−オン塩酸塩を得た。
収量: 0.21 g (97%); mp: 188 - 192 °C; [α] D25 = +21.3°(c = 0. 2, メタノール);
1H NMR (CD3OD, 300MHz): δ 7.80 (d, 1H), 7.60 (m, 3H), 6.53 (s, 1H), 6.37 (s, 1H), 4.23 (m, 1H), 3.89 (m, 2H), 3.63 (m, 1H), 3.59 (dd, 1H), 3.38 (m, 1H), 2.90 (s, 3H), 2.45 (m, 1H), 2.35 (m, 1H); MS (ES+): m/z 402 (M +1)(遊離塩素).
【０１１１】
この化合物をキラルＨＰＬＣにかけた。キラルＨＰＬＣは、カラムであるＣｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＤ−Ｈ（２５０×４．６ｍｍ）およびＴＦＡ（０．４％）を伴う溶媒系であるヘキサン：エタノール（９２：０８）を用いて行った。結果は、溶媒流速を１ｍＬ／分として、２６４ｎｍで記録した。キラルＨＰＬＣは、化合物である（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシ−メチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩の１００％のｅ．ｅを示した。
【０１１２】
Ｂ）（＋）−トランス−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（化合物Ｂ）の調製
化合物である（＋）−トランス−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチルピロリジン−３−イル）−５，７−ジメトキシ−クロメン−４−オン（０．２５ｇ、０．５ｍｍｏｌ）と、ピリジン塩酸塩（０．２５ｇ、２．１６ｍｍｏｌ）と、触媒量のキノリンとの混合物を、１８０℃で２．５時間にわたり加熱した。反応混合物をメタノール（２５ｍＬ）で希釈し、固体Ｎａ２ＣＯ３でｐＨ１０に塩基性化した。反応混合物を濾過し、メタノールで洗浄した。有機層を濃縮し、残留物を、溶離液としてのクロロホルム中に０．１％のアンモニアおよび４．５％のＭｅＯＨを用いるカラムクロマトグラフィーにより精製して、黄色の固体としての化合物である（＋）−トランス−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシ−メチル−１−メチルピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オンを得た。
【０１１３】
収量: 0.15 g (63.7%);
1H NMR (CDCl3, 300MHz): δ 7.99 (m, 2H), 7.83 (d, 1H), 6.65 (s, 1H), 6.41 (s, 1H), 4.24 (m, 1H), 3.90 (m, 2H), 3.70 (m, 1H), 3.60 (m, 1H), 3.41 (m, 1H), 2.99 (s, 3H), 2.54 (m, 1H), 2.28 (m, 1H); MS (ES+): m/z  470 (M+1).
上記で得られた化合物（０．１ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、メタノール（２ｍＬ）中で懸濁させ、エーテルを含むＨＣｌで処置し、有機溶媒を蒸発させて、化合物である（＋）−トランス−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩を得た。
収量: 0.1g (92.8%);
1H NMR (CDCl3, 300MHz): δ 8.02 (d, 2H), 7.83 (d, 1H), 6.64 (s, 1H), 6.41 (s, 1H), 4.23 (m, 1H), 3.73 (m, 2H), 3.68 (m, 1H), 3.51 (m, 1H), 3.39 (m, 1H), 2.99 (s, 3H), 2.54 (m, 1H), 2.31 (m, 1H).
【０１１４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究
材料および方法：ＨＰＶゲノムについて陽性の２つの子宮頸がん細胞系であるＳｉＨａおよびＨｅＬａ（ＡＴＣＣ）を、化合物Ａおよび化合物Ｂを評価するために用いた。この細胞系に、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、蛍光タンパク質ＥＧＦＰと融合させたｐ５３タンパク質を発現するプラスミドベクターをトランスフェクトした。４８時間にわたるトランスフェクションの後に、細胞を、１０％のＦＢＳおよび８００μｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を補充したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、型番：Ｄ５５４６）中で３０〜４５日間にわたり維持した。安定的発現細胞を増殖させ、蛍光顕微鏡法下で融合構築物の存在について評価した。２４時間にわたるトランスフェクションの後に、細胞を、化合物Ａおよび化合物Ｂで、２４時間にわたり個別に処置した（以後、処置された細胞と称する）。細胞を採取し、ウェスタンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲによるＥ６、Ｅ７、ｐ５３の状態についての解析のために用いた。化合物Ａおよび化合物Ｂで処置されなかった細胞（以後、処置されていない細胞と称する）は、対照として用いた。ＨＰＶ陰性Ｃ３３Ａ細胞は、陰性対照として用いた。
【０１１５】
新鮮な培地および培養培地という用語は、ＤＭＥＭ（型番：Ｄ５５４６）を指す。
【実施例２】
【０１１６】
ウェスタンブロットによるＥ６、Ｅ７、ｐ５３の状態についての解析
ウェスタンブロット用の全細胞抽出物を調製するために、処置された細胞を、溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％のＮＰ−４０、４０ｍＭのＮａＦ、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、および１０ｍＭのジチオトレイトール、および１μｇ／ｍｌずつのロイペプチンおよびアプロチニンの各々）中で溶解させた。細胞溶解物（５０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解し、分離されたタンパク質（Ｅ６、Ｅ７、およびｐ５３）を、Ｂｉｏ−Ｒａｄエレクトロトランスファー装置を用いる湿潤転写法により、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。０．２％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するトリス緩衝生理食塩液中に１０％の脱脂粉乳でブロッキングした後、膜を、一次抗体に続き、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体と共にインキュベートした。３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）法により、タンパク質を可視化した。処理されていない細胞についても同様の手順を踏んだ。
【０１１７】
以下の抗体を、示された希釈液によるウェスタンブロットのために用いた。
【０１１８】
【表２】
2014517063.tif 000030
【０１１９】
【表３】
2014517063.tif 000031
【０１２０】
結果：化合物Ａおよび化合物Ｂで処置された細胞は、ＳｉＨａ細胞およびＨｅＬａ細胞のいずれにおいても、ｐ５３タンパク質の発現の増大を用量依存的な形で示すことが観察された。しかし、処理されていない細胞では、発現が観察されなかった。ＳｉＨａ細胞におけるＥ６の発現は、濃度５０μｇ／ｍＬの両方の化合物により下方調節された。同様に、Ｅ７の、対照と比較して完全な下方調節も、２５μｇ／ｍＬの化合物Ａで処置された細胞で見られ、Ｅ７の、対照と比較して完全な下方調節はまた、２５μｇ／ｍＬの化合物Ｂで処置された細胞でも見られた（図１Ａおよび図１Ｂ）。
【実施例３】
【０１２１】
ＲＴ−ＰＣＲによるＥ６、Ｅ７、ｐ５３の状態についての解析
転写レベルにおける遺伝子Ｅ６およびＥ７の発現状態を、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により検出した。ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（型番：８０２０４）を用いて処理された細胞および処理されていない細胞から単離した。ＲＮＡの完全性は、アガロースゲル電気泳動の後に、ＵＶ下で可視化することにより点検した。ＲＮＡの量および純度は、Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により解析した。５００ｎｇのＲＮＡを、０．１μｇ／μｌのＯｌｉｇｏ  ｄＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＭＭＬＶ−ＲＴ、ｄＮＴＰ、ＲＮＡ  ｇｕａｒｄ、およびＲＴ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｃＤＮＡに転換し、３７℃で１時間にわたりインキュベートした。反応は、反応混合物を、９０℃で３分間にわたり加熱することにより停止させ、Ｅ６およびＥ７遺伝子をＰＣＲ増幅するために用いた。ＰＣＲは、以下の通りに実行した。
【０１２２】
【表４】
2014517063.tif 000032
プライマーの配列を以下に示す。
【０１２３】
【表５】
2014517063.tif 000033
【０１２４】
結果：ＲＴ−ＰＣＲの定量化は、５０μｇ／ｍＬの化合物Ａまたは化合物Ｂで処置されたＳｉＨａ細胞およびＨｅＬａ細胞の両方におけるＥ６およびＥ７の両方について、有意な転写物の阻害を明らかにした。β−アクチンは、ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおけるデータを標準化するためのハウスキーピング遺伝子として用いた。遺伝子特異的ＰＣＲの特異性は、Ｅ６およびＥ７遺伝子について陰性のＣ３３Ａ細胞を用いて決定した（図２）。
【実施例４】
【０１２５】
ｐ５３核移行アッセイ
材料および方法：ＨＰＶゲノムについて陽性の２つの子宮頸がん細胞系であるＳｉＨａおよびＨｅＬａ（ＡＴＣＣ）を用いた。この細胞系に、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、ｐ５３−ＥＧＦＰを含有する発現ベクターをトランスフェクトした。４８時間にわたるトランスフェクションの後に、細胞を、１０％のＦＢＳおよび８００μｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を補充したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、型番：Ｄ５５４６）中で３０〜４５日間にわたり維持した。安定的発現細胞を、ｐ５３核移行アッセイのために用いた。
【０１２６】
生物学的研究：安定的発現細胞を、９６ウェルイメージングプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＵＳＡ）上に播種し、加湿型ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で４８時間にわたり増殖させた。細胞核を、必須の蛍光核色素Ｈｏｅｃｈｓｔ２２３３４（０．５μｇ／ｍＬの）で５分間にわたり染色した後、新鮮な培地に交換した。ＤＭＳＯ中５０ｍｇ／ｍＬの原液を調製し、さらなる希釈液を作製し、５％のＦＢＳを含有する培養培地中に２〜５０μｇ／ｍＬの濃度を得た。細胞を、異なる濃度（２〜５０μｇ／ｍＬ）の化合物Ａおよび化合物Ｂで個別に処置した。イメージングは、２０倍の対物レンズを用いるＢＤ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｂｉｏｉｍａｇｅｒ（ＢＤ、ＵＳＡ）を用いて１２時間ごとに実行した。核チャネルおよび核について陽性の細胞の数に基づき細胞を分割した（ＥＧＦＰを計算して活性をスコア付けした）。細胞はまた代替的に、ＣＣＤカメラであるＲｅｔｉｇａ  ＥｘｉおよびＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを装備したＮｉｋｏｎ  Ｔｉ倒立蛍光顕微鏡でもイメージングした。また、明視野画像も収集した。
【０１２７】
結果：ＥＧＦＰに連結されたｐ５３タンパク質の核移行についての顕微鏡によるイメージングは、化合物Ａおよび化合物Ｂを添加することにより、ＨｅＬａ細胞およびＳｉＨａ細胞の両方におけるＥＧＦＰ−ｐ５３タンパク質の核移行の増大が結果としてもたらされることを裏付けた。さらにまた、化合物Ａならびに化合物Ｂの濃度を２５〜５０μｇ／ｍＬとすると、核移行が、処理の１２時間後に開始され、２４時間後まで増大したことも注意された。各薬物について、かつ、各薬物の異なる濃度について、ｐ５３  ＥＧＦＰの核内陽性細胞の百分率を示す代表的なグラフを、図３Ａおよび図３Ｂに示す。
【実施例５】
【０１２８】
老化アッセイ
このアッセイは、老化と関連するβ−ガラクトシダーゼ染色を検出して、処置された細胞における老化状態を点検するために実施した。
【０１２９】
材料および方法：ＨＰＶゲノムについて陽性の２つの子宮頸がん細胞系であるＳｉＨａおよびＨｅＬａ（ＡＴＣＣ）を用いた。これらの細胞系に、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、ｐ５３−ＥＧＦＰを含有する発現ベクターをトランスフェクトした。４８時間にわたるトランスフェクションの後に、細胞を、１０％のＦＢＳおよび８００μｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）で補充したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、型番：Ｄ５５４６）中で、３０〜４５日間にわたり維持した。安定的発現細胞を、老化アッセイのために用いた。
【０１３０】
生物学的研究：安定的発現細胞を、化合物Ａおよび化合物Ｂで個別に処置し、３％のホルムアルデヒド中で５分間にわたり固定し、洗浄し、３７℃で、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド溶液（１ｍｇ／ｍｌ）、（４０ｍＭのクエン酸（ｐＨ６．５）、５ｍＭのフェロシアン化カリウム、５ｍＭのフェリシアン化カリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および２ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する溶液中で溶解させることにより調製した）と共にインキュベートした。３７℃で一晩にわたるインキュベーションの後に、組織または細胞を、顕微鏡法により可視化した。細胞質ゾル中の鮮明な青色の染色は、細胞における老化様の特色の誘導を示した。
【実施例６】
【０１３１】
ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
全ての実験は、Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌｓ（ＣＰＣＳＥＡ）のガイドラインに従い、Ｐｉｒａｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｇｏｒｅｇｏａｎ、Ｍｕｍｂａｉ、ＩｎｄｉａにおけるＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＥＣ）の承認を得て実行した。
【０１３２】
ＨＰＶ関連がんを処置するための本発明の化合物のｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性は、ＳｉＨａ（ＨＰＶ  １６陽性の子宮頸がん）細胞系を用いて研究した。
【０１３３】
ＳｉＨａヒト子宮頸がん異種移植マウスモデル
用いられる動物：４〜６週齢で、体重２２〜２５ｇの、ＦＯＸｎ１についてホモ接合性の雄Ｎｕ／Ｊヌード（Ｎｕ）マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳ）。動物は、指定された病原菌を含まない条件下にある動物アイソレーター内で飼育し、１２時間の明期／１２時間の暗期を伴い、２２〜２５℃および５５〜７５％の湿度で維持した。マウスは、７日間にわたり馴致してから、実験にかけた。動物は、層流フード内で取り扱った。全ての食物および水は、オートクレーブ処理した。
【０１３４】
ヌードマウスにおける皮下異種移植腫瘍の生成
ステップ１：ヌードマウスに注射するための単一細胞懸濁液の調製
トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いて付着性のＳｉＨａ細胞（ＳｉＨａ細胞系−ＡＴＣＣ−ＨＢＴ  ３５）を採取し、懸濁液を、８００ｒｐｍで５分間にわたり遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを、１ｍＬの無血清ＭＥＭ培地中に再懸濁させた。細胞カウントは、１：１００の希釈率を用いて得た。細胞を希釈して、懸濁液０．２ｍＬ当たり５×１０６個の細胞を得た。
【０１３５】
ステップ２：ヌードマウスにおける皮下異種移植腫瘍の生成
腫瘍細胞を注射した日に、ステップ１の細胞懸濁液を、層流フード内の氷上で保存した。各ヌードマウスの右脇腹に、０．２ｍＬの細胞懸濁液を皮下注射した。５日間後に、注射部位近傍を触診することにより、動物を腫瘍増殖について観察した。
【０１３６】
化合物および投与用調製物を保管するための条件
化合物Ａ：３．５ｍｇ／ｍＬ；媒体：水中で調製されたデキストロース（５％）。
トポテカン塩酸塩（基準物質として用いられる）：０．２ｍｇ／ｍＬ；媒体：メチルセルロース（０．２５％）。
化合物Ｂ：２０ｍｇ／ｍＬ；媒体：メチルセルロース（０．２５％）。
シスプラチン（基準物質として用いられる）：０．６ｍｇ／ｍＬ；媒体：メチルセルロース（０．２５％）。
基準物質を含めた全ての化合物は、４℃〜８℃で保存した。
【０１３７】
投与
ヌードマウスは、オートクレーブ処理したトウモロコシの鞘による寝床を伴うケージ（フィルタートップケージ）１つ当たり８匹ずつの群で飼育し、食物および水の自由摂取を施した。動物の取り扱いは、標準的なガイドラインに従った。腫瘍容量が約１００ｍｍ３となったときに、処置を開始した。腫瘍保有マウスを、以下の処置群で無作為化した（ｎ＝８）。
ｉ）群１：対照群：媒体を投与された腫瘍保有マウス。
ｉｉ）群２：３５ｍｇ／ｋｇの化合物Ａを毎日１回腹腔内投与された腫瘍保有マウス。
ｉｉｉ）群３：腫瘍保有マウスには、トポテカン（基準物質）２ｍｇ／ｋｇの単回腹腔内投与を施した。
ｉｖ）群４：腫瘍保有マウスには、２００ｍｇ／ｋｇの化合物Ｂを毎日１回経口投与した。
ｖ）群５：腫瘍保有マウスには、シスプラチン（基準物質）６ｍｇ／ｋｇの単回腹腔内投与を施した。
【０１３８】
処置
群１、群２、および群４のヌードマウスは、１〜６日目および１２〜１７日目に処置した。群３および群５のマウスは、１日目に処置した。２３日目には、全ての群の動物を屠殺し、さらなる解析のために試料を採取した。上記の群全てに投与された容量は、１０ｍＬ／ｋｇであった。
【０１３９】
観察および測定
処置の間には、以下のパラメータを観察した。
１．動物の全般的健康を毎日観察した。
２．体重を毎日観察した。
３．腫瘍を、ノギスを用いて、２〜３日間おきに測定した。
腫瘍の比重を１とし、πを３として、長楕円体についての式：
腫瘍容量（ｍｍ３）＝長さ（ｍｍ）×［幅（ｍｍ）２］×０．５
を用いてｍｍ３単位の腫瘍容量を計算した。
式：
【０１４０】
【数１】
2014517063.tif 000034
を用いて、所与の日における対照群に対する処置群の比（ΔＴ／ΔＣ％）を計算した。
式：
Ｘ日目におけるＧＩ＝１００−Ｘ日目におけるΔＴ／ΔＣ％
を用いて、増殖阻害（ＧＩ）を計算した。腫瘍増殖阻害の結果は、図４および図５に示す。
【０１４１】
結論：化合物Ａおよび化合物Ｂは、ＨＰＶを媒介する子宮頸がん異種移植モデルにおいて有意な腫瘍増殖阻害を示した。
【配列表フリーテキスト】
【０１４２】
配列番号１〜６は、プライマー配列である。
【国際調査報告】
2014517063.tif 000035
2014517063.tif 000036
2014517063.tif 000037
2014517063.tif 000038