(57)【要約】  本発明は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)触媒アスパラギン結合型(「N結合型」)グリコシル化において使用するための、(a)可能性のあるオリゴ糖供与体、(b)可能性のあるオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)、(c)可能性のあるコンセンサス配列モチーフポリペプチド、および/または(d)可能性のあるグリコシル化阻害剤を同定または設計する方法であって、カンピロバクター・ラリのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)の触媒ドメインおよび/またはポリペプチド結合部位の3次元モデルを生成するステップ、ならびに前記3次元モデルおよび可能性のある成分の立体化学的相補性を最適化する、(a)から(d)から選択される、可能性のある成分を設計または選択するステップを含む方法に関する。
2014516519.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)可能性のあるオリゴ糖供与体、好ましくは脂質結合型オリゴ糖(LLO)供与体またはウンデカプレニルピロリン酸結合オリゴ糖供与体、
(b)可能性のあるオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)、
(c)可能性のあるコンセンサス配列モチーフポリペプチド、および
(d)可能性のあるグリコシル化阻害剤、
からなる群から選択される、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)触媒アスパラギン結合型(「N結合型」)グリコシル化のための可能性のある成分を同定する方法であって、
(i)アミノ酸D56、R147、D154、D156、E319、R375、Y468、およびH485の少なくとも3つ、好ましくは少なくとも4つ、より好ましくは少なくとも6つ、最も好ましくは全てを含む、カンピロバクター・ラリのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)の触媒ドメインの3次元モデルを生成するために、Table 1(表1)、好ましくは骨格原子から±2、より好ましくは±1.5、最も好ましくは±1.0Å根平均二乗偏差(rmsd)の原子座標を用いるステップ、ならびに/または、好ましくはならびに
(ii)アミノ酸M318、R331、W463、W464、D465、およびI572の少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つ、最も好ましくは全てを含む、カンピロバクター・ラリのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)のポリペプチド結合部位の3次元モデルを生成するために、Table 1(表1)、好ましくは骨格原子から±2、より好ましくは±1.5、最も好ましくは±1.0Å根平均二乗偏差(rmsd)の原子座標を用いるステップ、
(iii)好ましくは、(i)および/もしくは(ii)の3次元モデルのアミノ酸の座標で全体の並進および/もしくは回転を行うステップ、
(iv)可能性のある成分(a)から(d)の少なくとも1つを設計もしくは選択するために、(i)、(ii)および/もしくは(iii)の前記3次元モデルを用いるステップ、
(v)前記可能性のある成分(a)から(d)の少なくとも1つを提供するステッップ、ならびに
(vi)前記可能性のある成分(a)から(d)の少なくとも1つを、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)触媒アスパラギン結合型(「N結合型」)グリコシル化に必要なさらなる機能的成分と接触させるステップ、
(vii)(A)機能的オリゴ糖供与体、好ましくは機能的脂質結合型オリゴ糖(LLO)供与体またはウンデカプレニルピロリン酸結合オリゴ糖供与体、
(B)機能的オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)、
(C)機能的コンセンサス配列モチーフポリペプチド、および
(D)機能的グリコシル化阻害剤
からなる群から選択される機能的成分を同定するステップ
を含む方法。
【請求項２】
ステップ(ii)においてカンピロバクター・ラリのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)のポリペプチド結合部位の3次元モデルが、アミノ酸M318、A331、W463、W464、D465およびI572の少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つ、最も好ましくは全てを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
(a)可能性のあるオリゴ糖供与体、好ましくは脂質結合型オリゴ糖(LLO)供与体またはウンデカプレニルピロリン酸結合オリゴ糖供与体、
(b)可能性のあるオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)、
(c)可能性のあるコンセンサス配列モチーフポリペプチド、および
(d)可能性のあるグリコシル化阻害剤、
からなる群から選択される、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)触媒アスパラギン結合型(「N結合型」)グリコシル化のための可能性のある成分を設計する方法であって、
(i)アミノ酸D56、R147、D154、D156、E319、R375、Y468、およびH485の少なくとも3つ、好ましくは少なくとも4つ、より好ましくは少なくとも6つ、最も好ましくは全てを含む、カンピロバクター・ラリのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)の触媒ドメインの3次元モデルを生成するために、Table 1(表1)、好ましくは骨格原子から±2、より好ましくは±1.5、最も好ましくは±1.0Å根平均二乗偏差(rmsd)の原子座標を用いるステップ、ならびに/あるいは、好ましくはならびに
(ii)アミノ酸M318、R331、W463、W464、D465、およびI572の少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つ、最も好ましくは全てを含む、カンピロバクター・ラリのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)のポリペプチド結合部位の3次元モデルを生成するために、Table 1(表1)、好ましくは骨格原子から±2、より好ましくは±1.5、最も好ましくは±1.0Å根平均二乗偏差(rmsd)の原子座標を用いるステップ、
(iii)好ましくは、(i)および/または(ii)の3次元モデルのアミノ酸の座標で全体の並進および/もしくは回転を行うステップ、
(iii.1)前記3次元モデル(i)、(ii)および/もしくは(iii)と、オリゴ糖供与体、好ましくは脂質結合型オリゴ糖(LLO)供与体またはウンデカプレニルピロリン酸結合オリゴ糖供与体、コンセンサス配列モチーフポリペプチド、および可能性のあるグリコシル化阻害剤から選択される、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)触媒アスパラギン結合型(「N結合型」)グリコシル化のための既知のもしくは可能性のある成分との間の立体化学的相補性を評価するために、(i)、(ii)および/もしくは(iii)の前記3次元モデルを用いるステップ、または
(iii.2)(i)、(ii)および/もしくは(iii)の前記3次元モデルにおいて少なくとも1つのアミノ酸を変更し、前記3次元モデル(i)、(ii)および/もしくは(iii)と、オリゴ糖(LLO)供与体、好ましくは脂質結合型オリゴ糖(LLO)供与体もしくはウンデカプレニルピロリン酸結合オリゴ糖供与体、コンセンサス配列モチーフポリペプチド、および可能性のあるグリコシル化阻害剤から選択される、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)触媒アスパラギン結合型(「N結合型」)グリコシル化のための既知のもしくは可能性のある成分との間の立体化学的相補性を評価するために、(i)、(ii)および/もしくは(iii)の前記変更された3次元モデルを用いるステップ、
(iv)(iii.1)、(iii.2)の3次元モデルの変化、またはオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)触媒アスパラギン結合型(「N結合型」)グリコシル化のための成分の変化を観察することにより、反復アプローチにおいて前記立体化学的相補性を最適化するステップ、
(v)前記3次元モデルおよび可能性のある成分の前記立体化学的相補性を最適化する、(a)から(d)から選択される、可能性のある成分を設計するステップ、
(vi.1)最適化された可能性のある成分を場合により提供するステップ、ならびに
(vi.2)前記可能性のある成分(a)から(d)の少なくとも1つを、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)触媒アスパラギン結合型(「N結合型」)グリコシル化に必要なさらなる機能的成分と接触させるステップ、
(vi.3)(A)機能的オリゴ糖供与体、好ましくは機能的脂質結合型オリゴ糖(LLO)供与体またはウンデカプレニルピロリン酸結合オリゴ糖供与体、
(B)機能的オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)、
(C)機能的コンセンサス配列モチーフポリペプチド、および
(D)機能的グリコシル化阻害剤
からなる群から選択される機能的成分を同定するステップ
を含む方法。
【請求項４】
ステップ(ii)においてカンピロバクター・ラリのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)のポリペプチド結合部位の3次元モデルが、アミノ酸M318、A331、W463、W464、D465およびI572の少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つ、最も好ましくは全てを含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
ステップ(i)の特定の3次元触媒部位モデルが、Thr53、Thr54、Asn55、Asp56、Asn146、Arg147、Tyr152、Glu315、Thr316、Ile317、Met318、Glu319、Val320、Asn321、Arg331、Leu374、Arg375、Tyr433、Ser435、Val438、Trp463、Trp464、Asp465、Gly482、His485、Ile572、Val575からなる群から好ましくは選択される、配列番号2の結合ペプチドまでのファンデルワールス距離内に位置する残基を有する群から選択されるアミノ酸の1つまたは複数、好ましくは全てをさらに含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ(i)の特定の3次元触媒部位モデルが、Thr53、Thr54、Asn55、Asp56、Asn146、Arg147、Tyr152、Glu315、Thr316、Ile317、Met318、Glu319、Val320、Asn321、Ala331、Leu374、Arg375、Tyr433、Ser435、Val438、Trp463、Trp464、Asp465、Gly482、His485、Ile572、Val575からなる群から好ましくは選択される、配列番号2の結合ペプチドまでのファンデルワールス距離内に位置する残基を有する群から選択されるアミノ酸の1つまたは複数、好ましくは全てをさらに含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
可能性のある成分が、オリゴ糖供与体(a)、好ましくは脂質結合型オリゴ糖(LLO)供与体またはウンデカプレニルピロリン酸結合オリゴ糖供与体である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
可能性のある成分が、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)(b)である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
可能性のある成分が、可能性のあるコンセンサス配列モチーフポリペプチド(c)である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
可能性のある成分が、グリコシル化阻害剤(d)である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
(i)アミノ酸D56、R147、D154、D156、E319、R357、Y468、およびH485の少なくとも1つ、2つまたは3つ、好ましくは少なくとも4つまたは5つ、より好ましくは少なくとも6つまたは7つ、最も好ましくは全てを好ましくは含む、Table 1(表1)、好ましくは骨格原子から±2、より好ましくは±1.5、最も好ましくは±1.0Å根平均二乗偏差(rmsd)の原子座標、ならびに/または、好ましくはならびに
(ii)アミノ酸M318、R331、W463、W464、D465、およびI572の少なくとも1つまたは2つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つまたは5つ、最も好ましくは全てを含む、カンピロバクター・ラリのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)のポリペプチド結合部位の3次元モデルを生成するための、Table 1(表1)、好ましくは骨格原子から±2、より好ましくは±1.5、最も好ましくは±1.0Å根平均二乗偏差(rmsd)の原子座標、
(iii)好ましくは、前記座標で全体の並進および/もしくは回転を行うことにより改変された(i)もしくは(ii)の原子座標
を含む、機械可読な媒体。
【請求項１２】
(ii)アミノ酸M318、A331、W463、W464、D465、およびI572の少なくとも1つまたは2つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つまたは5つ、最も好ましくは全てを含む、カンピロバクター・ラリのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)のポリペプチド結合部位の3次元モデルを生成するための、Table 1(表1)、好ましくは骨格原子から±2、より好ましくは±1.5、最も好ましくは±1.0Å根平均二乗偏差(rmsd)の原子座標
を含む、請求項11に記載の機械可読な媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)触媒アスパラギン結合型(「N結合型」)グリコシル化において使用するための、(a)可能性のあるオリゴ糖供与体、(b)可能性のあるオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)、(c)可能性のあるコンセンサス配列モチーフポリペプチド、および/または(d)可能性のあるグリコシル化阻害剤を同定または設計する方法であって、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)の触媒ドメインおよび/またはポリペプチド結合部位の3次元モデルを生成するステップ、ならびに前記3次元モデルおよび可能性のある成分の立体化学的相補性を最適化する、(a)から(d)から選択される、可能性のある成分を設計または選択するステップを含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
全ての真核生物タンパク質の半分以上は糖タンパク質であると推定されており、これは、特定のアミノ酸側鎖が炭水化物で化学修飾されていることを意味している。これらの修飾の最も豊富な形態は、アスパラギン結合型(「N結合型」)グリコシル化であり、タンパク質折り畳み、生物発達に対する質管理、選別および分泌、ならびに宿主病原体相互作用にわたる数多くの細胞機能に影響を与える。小胞体(ER)の内腔に面するアスパラギンは、コンセンサス「シークオン」Asn-X-Ser/Thrに位置する場合に特異的にグリコシル化される(Xはプロリンを除くいずれのアミノ酸であってもよい)。反応はERを取り巻く膜で起こり、高等真核生物のER膜に埋め込まれたヘテロオリゴマータンパク質複合体、酵素オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)により触媒される(図1b参照)。N結合型グリコシル化の特徴は、ポリペプチド基質に対する広い特異性であり、これは短い認識シークオンの直接の結果である。この特性が、OSTと、セリンまたはトレオニン残基を修飾し(O結合型グリコシル化)、タンパク質基質に対しより高い特異性を示すグリコシルトランスフェラーゼを区別する。
【０００３】
OST触媒グリコシル化における主なステップは、受容体アスパラギンのアミド窒素と脂質結合型オリゴ糖(LLO)供与体の第1サッカリド部分のC1炭素の間のN-グリコシド結合の形成である(図1a参照)。これは、受容体アスパラギンへのオリゴ糖のひとまとめの転移をもたらす。
【０００４】
根底にある反応機構の詳細は、十分に理解されていない。これは、高解像度でのOSTへの構造的洞察が欠如していることが原因であるが、LLO基質の複雑な化学的性質、生体試料におけるOSTの低含量、および水へのOSTの低溶解度にも起因している。対照的に、さまざまな可溶性O-グリコシルトランスフェラーゼの結晶構造が公表されており、この反応機構が極めて詳細に研究された。OSTに関し、現在認められているモデルは、グリコシル化シークオンは、ERへのタンパク質移行中または移行が完了した後に生じ得る折り畳まれていないタンパク質セグメントに位置する場合に認識されることを示唆している。OST内の中心的触媒活性成分はSTT3サブユニットであり、一方他のサブユニットは、OST複合体アセンブリの促進、または受容体タンパク質もしくはLLO基質のサブセットとの相互作用によりプロセスを支援および精緻化し、利用しやすいおよび修飾されたグリコシル化部位の数の増加をもたらすと考えられている。
【０００５】
N結合型グリコシル化は、真核生物に限定されない。類似のプロセスが、古細菌、およびプロテオバクテリアの定義された分類群において見出されている。しかし、原核生物および真核生物キネトプラスト類は、高等真核生物のSTT3サブユニットに相同である単一サブユニットOST酵素を含有する。最もよく研究されている原核生物N-グリコシル化プロセスは、細菌カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)由来のタンパク質グリコシル化遺伝子座pglにより媒介される(Szymanskiら(1999)Molecular Microbiology 32、1022〜1030頁)。該遺伝子座は、真核生物STT3と重要な配列類似性を共有するPglBと呼ばれる内在性膜タンパク質を含有しており、共通の膜形態および反応機構を示唆するものである(図1b参照)。この遺伝子クラスターは、大腸菌(Escherichia coli)細胞に導入される場合、タンパク質グリコシル化を触媒するのに十分である。シークオン含有タンパク質基質のOST触媒原核生物タンパク質グリコシル化は、組換え産生タンパク質をグリコシル化する経済的、効果的および簡便な方法である(Wackerら(2002)、Science 298、1790〜1793頁)。N結合型タンパク質グリコシル化は、大腸菌において非カンピロバクター・ジェジュニ起源の多様なO抗原リポ多糖構造を用いて操作することができ(Feldmanら(2005)PNAS 102(8)、3016〜3021頁)、故に組換えタンパク質基質への真核生物N-グリカンの原核細胞導入を可能にする。Gloverら(2005、Chemistry & Biology 12、1311〜1315頁)は、過剰発現PglBおよびウンデカプレニルピロリン酸結合型オリゴ糖を含む大腸菌細胞膜を用いてインビトロでのタンパク質グリコシル化を初めて実証した。2006年、Kowarikら(2006、EMBO J. 25(9)、1957〜1966頁)は、細菌OSTの基質特異性が、受容体アスパラギンの2位で負に帯電したアミノ酸まで拡大され、コンセンサスシークオンAsp/Glu-X1-Asn-X2-Ser/Thr(X1およびX2は両方ともプロリンではない;配列番号3)をもたらすことを示して、細菌のN-グリコシル化部位コンセンサス配列をさらに規定した。ペプチド基質ライブラリーを用いて、Chenら(2007、Biochemistry 46、5579〜5585頁)は、受容体アスパラギンの2位における負電荷の必要性を確認し、カンピロバクター・ジェジュニPglBの最適基質として配列DQNAT(配列番号4)を同定した。
【０００６】
上記のことから、タンパク質基質に対する小シークオンベースの特異性は、真核生物N-グリカン、原核生物N-グリカンおよび合成N-グリカンを導入するのに使用することができるため、原核生物オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)は広い特異性を有するということになる。基本的に原核生物OSTベースのN-グリコシル化システムは、3つの成分、(a)オリゴ糖供与体、好ましくは脂質結合またはウンデカプレニルピロリン酸結合オリゴ糖供与体、(b)原核生物オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)、(c)可能性のあるコンセンサス配列モチーフポリペプチド基質、および最後に大事なことを付け加えると適切な生理学的微小環境、例えばインビトロまたはインビボでの細胞膜を必要とする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Szymanskiら(1999)分子  Microbiology 32、1022〜1030頁
【非特許文献２】Wackerら(2002)、Science 298、1790〜1793頁
【非特許文献３】Feldmanら(2005)PNAS 102(8)、3016〜3021頁
【非特許文献４】Gloverら(2005、Chemistry & Biology 12、1311〜1315頁)
【非特許文献５】Kowarikら(2006、EMBO J. 25(9)、1957〜1966頁)
【非特許文献６】Chenら(2007、Biochemistry 46、5579〜5585頁)
【非特許文献７】COLLABORATIVE COMPUTATIONAL PROJECT、NUMBER 4. 1994.「The CCP4 Suite:Programs for Protein Crystallography」Acta Cryst. D50、760〜763頁
【非特許文献８】2006 Science 314、148〜1150頁
【非特許文献９】2007 Glycobiology 11、1175〜1182頁
【非特許文献１０】2011 Glycobiology 5、575〜583頁
【非特許文献１１】Lefebre & Valvano、Appl. Environ. Microb. 68、5956〜5964頁(2002)
【非特許文献１２】2011 Bioconjug Chem. 3、488〜496頁
【非特許文献１３】Kabsch、W. Xds. Acta Crystallogr D66、125〜132頁
【非特許文献１４】Mccoyら、Phaser crystallographic software. J. Appl. Crystallogr. 40、658〜674頁、2007
【非特許文献１５】Jonesら、Acta Crystallogr. A47、110〜119頁、1991
【非特許文献１６】Adamsら、Acta Crystallogr D66、213〜221頁、2010
【非特許文献１７】Kelleher & Gilmore、Glycobiology 16、47〜62頁、2006
【非特許文献１８】Maitaら、J. Biol. Chem. 285、4941〜4950頁
【非特許文献１９】Iguraら、Embo J27、234〜243頁、2008
【非特許文献２０】Bailey, S.、Acta Crystallogr D50、760〜763頁、1994
【非特許文献２１】Bause, E.、Biochem. Soc. T12、514〜517頁、1984
【非特許文献２２】Breuerら、Febs Lett. 501、106〜110頁、2001
【非特許文献２３】Zielinskaら、Cell 141、897〜907頁、2010
【非特許文献２４】Schwarzら、Glycobiology 21、45〜54頁、2011
【非特許文献２５】Valliere-Douglassら、J Biol. Chem. 284、32493〜32506頁、2009
【非特許文献２６】Imperiali & Rickert、P. Natl. Acad. Sci. USA92、97〜101頁、1995
【非特許文献２７】Sharmaら、Eur. J. Biochem. 116、101〜108頁、1981
【非特許文献２８】Liu & Mushegian、タンパク質ci. 12、1418〜1431頁、2003
【非特許文献２９】Lairsonら、Annu. Rev. Biochem. 77、521〜555頁、2008
【非特許文献３０】Maedaら、Embo J20、250〜261頁、2001
【非特許文献３１】Bause & Legler、Biochem. J. 195、639〜644頁
【非特許文献３２】Imperialiら、J. Am. Chem. Soc. 114、7942〜7944頁、1992
【非特許文献３３】Wiberg & Breneman、J Am Chem Soc. 114、7942〜7944頁、1992
【非特許文献３４】Cleland & Kreevoy、Science 264、1887〜1890頁、1994
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在の情報の根底にある問題は、既知のOST成分に関して示された情報以外に、極めて多目的な原核生物OSTベースのN-グリコシル化システムに不可欠な成分を予測または設計できないことである。さらに、可能性のあるOSTグリコシル化阻害剤はどんな構造的要件を有さなければならないかの手掛かりがない。このような阻害剤は、顕著な生物学的効果を有することが期待され、非常に医学的、診断的および科学的価値がある可能性がある。他の問題は、OST媒介グリコシル化に関与する成分の可能性のあるバリエーションに関して科学界に洞察を提供する可能性がある、OSTの触媒ドメインおよびポリペプチド結合部位の3次元モデルを提供することがこれまでできなかったことである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の問題は、受容体ヘキサペプチドDQNATF(配列番号5)と複合した一種の細菌OST、カンピロバクター・ラリ由来のPglBタンパク質(カンピロバクター・ジェジュニのPglBと56%配列同一性を共有する)の3次元X線構造の提供により解決された。カンピロバクター・ラリPglBは、コンセンサスシークオンを含有する受容体タンパク質のグリコシル化から明らかなように、大腸菌細胞においてカンピロバクター・ジェジュニpglクラスターと共発現される場合に活性となる(図2参照)。構造解析のため、カンピロバクター・ラリPglBは、インビボアッセイにおいてグリコシル化されたシークオンを含有するヘキサペプチドDQNATF(配列番号5)と共結晶化された。ヘキサペプチドDQNATFは、カンピロバクター・ジェジュニPglBの最適受容体配列として同定されていた(上記Chenら参照)。カンピロバクター・ラリPglBの構造(712個のアミノ酸残基、配列番号1)は、カンピロバクター・ジェジュニPglBのペリプラズムドメインの以前に決定された構造を利用し、実験位相および分子置換の組み合わせを用いて決定された。PglBの共結晶は、小さく脆弱で、最良のネイティブデータを3.4Å分解能まで拡大して異方性回析されたX線であった。構造は、それぞれ23.8および27.1%のR/Rfree値まで精密化された(Table 2)(表2)。カンピロバクター・ラリPglBの構造のさらなる詳細は、下記の実験セクションに提供されている。
【００１０】
この新規3次元構造は、シークオン認識の分子的基盤への洞察を提供し、ならびに該タンパク質の膜貫通ドメインにより形成され、保存酸性側鎖残基および結合二価陽イオンを特色とする触媒部位を明らかにする。これらの結果は、アミド窒素活性化およびグリコシル化に関する機構を初めて示唆するものであり、新規オリゴ糖供与体、新規オリゴサッカリルトランスフェラーゼバリアント(OST)、新規コンセンサス配列モチーフポリペプチド、およびOSTグリコシル化阻害剤を同定および設計するための妥当なアプローチを提供する。これらは全て、組換え糖タンパク質産生、診断、医薬においておよび科学的ツールとして有用性を有する。
【００１１】
上記を考慮して、本発明の第1の態様は、
(a)可能性のあるオリゴ糖供与体、好ましくは脂質結合型オリゴ糖(LLO)供与体またはウンデカプレニルピロリン酸結合オリゴ糖供与体、
(b)可能性のあるオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)、
(c)可能性のあるコンセンサス配列モチーフポリペプチド、および
(d)可能性のあるグリコシル化阻害剤、
からなる群から選択される、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)触媒アスパラギン結合型(「N結合型」)グリコシル化のための可能性のある成分を同定する方法であって、
(i)アミノ酸D56、R147、D154、D156、E319、R375、Y468、およびH485の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、最も好ましくは全てを含む、カンピロバクター・ラリのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)の触媒ドメインの3次元モデルを生成するために、Table 1(表1)、好ましくは骨格原子から±2、より好ましくは±1.5、最も好ましくは±1.0Å根平均二乗偏差(rmsd)の原子座標を用いるステップ、ならびに/または、好ましくはならびに
(ii)アミノ酸M318、R331、W463、W464、D465、およびI572の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、最も好ましくは全てを含む、カンピロバクター・ラリのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)のポリペプチド結合部位の3次元モデルを生成するために、Table 1(表1)、好ましくは骨格原子から±2、より好ましくは±1.5、最も好ましくは±1.0Å根平均二乗偏差(rmsd)の原子座標を用いるステップ、
(iii)好ましくは、(i)および/もしくは(ii)の3次元モデルのアミノ酸の座標で、全体の並進および/もしくは回転を行うステップ、
(iv)可能性のある成分(a)から(d)の少なくとも1つを設計もしくは選択するために、(i)、(ii)および/もしくは(iii)の前記3次元モデルを用いるステップ、
(v)前記可能性のある成分(a)から(d)の少なくとも1つを提供するステップ、ならびに
(vi)前記可能性のある成分(a)から(d)の少なくとも1つを、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)触媒アスパラギン結合型(「N結合型」)グリコシル化に必要なさらなる機能的成分と接触させるステップ、
(vii)(A)機能的オリゴ糖供与体、好ましくは機能的脂質結合型オリゴ糖(LLO)供与体またはウンデカプレニルピロリン酸結合オリゴ糖供与体、
(B)機能的オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)、
(C)機能的コンセンサス配列モチーフポリペプチド、および
(D)機能的グリコシル化阻害剤
からなる群から選択される機能的成分を同定するステップ
を含む方法に関する。
【００１２】
好ましい実施形態において、ステップ(ii)においてカンピロバクター・ラリのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)のポリペプチド結合部位の3次元モデルは、アミノ酸M318、A331、W463、W464、D465およびI572の少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つ、最も好ましくは全てを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】N結合型タンパク質グリコシル化のプロセスの概略図である。a.受容体シークオンを含有するタンパク質(真核生物におけるNxT/S、細菌におけるD/EX1NX2 T/S(配列番号3))が、アスパラギン残基でOSTの作用によりグリコシル化される。化学反応は、アミド窒素の活性化およびグリコシド結合の形成を含む。b.細菌(左のパネル)および真核生物(右のパネル)におけるN結合型グリコシル化の類似性および顕著な特徴。OSTの中心的酵素は、生命の全てのドメインにおける配列および構造に保存されているSTT3(細菌におけるPglB)である。脂質部分およびオリゴ糖は、示されている通り細菌および真核生物で類似しているが、同一ではない。両方とも、グリコシル化段階後に加水分解されるイソプレノイドピロリン酸部分を含有する。
【図２】カンピロバクター・ラリオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBの活性を示す図である。大腸菌細胞は、3つの別個のプラスミド、すなわち、(i)LLOを生成するが、不活化PglBを含有するカンピロバクター・ジェジュニのグリコシル化機構、(ii)シークオンDQNAT(配列番号4)を含有する受容体タンパク質(修飾scFv断片3D5)、および(iii)機能的カンピロバクター・ラリPglBの組み合わせで形質転換された。ここに提示された共結晶構造は、アッセイで使用された配列を含有する受容体ペプチドに結合されたカンピロバクター・ラリPglBを含有することに留意されたい。受容体タンパク質のグリコシル化はペリプラズム抽出物から解析され、一方PglBの発現は細胞抽出物全体から解析された。タンパク質は、scFv基質を検出する抗c-Myc抗体(上段)、グリカン特異的抗血清hR6(中段)、またはPglBを検出する抗HA抗血清(下段)を用いて、免疫ブロットにより解析された。PglB構築物は、レーンの上に示されている:ベクター対照(ev)、野生型(wt)、または1文字表記の変異。3D5のグリコシル化は、非修飾形態(gO)からグリコシル化形態(g1)への移動度シフトをもたらす。機能的PglBは、N535およびN556で部分的に自己グリコシル化され、2つの追加のバンドをもたらす(g1およびg2)。全ての実験は、少なくとも3連で行われ、代表試料が示されている。
【図３】カンピロバクター・ラリPglBの構造および基質結合空洞を示す画像である。a.TMおよびペリプラズムドメインを含む、2方向でのPglBのリボンダイアグラム。膜の推定位置が線で示され、結合基質ペプチドの位置が示されている。b.結合受容体ペプチドを含むPglBの線表現。2つの空洞がタンパク質の反対側に示され(マークされている)、基質へのアクセスを提供している。空洞は、受容体アスパラギンの側鎖を収容する開口部(porthole)によりつながっている(この表示モードでは見えない)。
【図４】PglBによるグリコシル化シークオン認識を示す図である。a.PglBにおけるペプチド結合部位およびシークオン認識を示す画像。受容体ペプチドが線フォーマットで示され、個々のアミノ酸が3文字表記で標識されている。特定のシークオン結合に寄与するPglB残基は、ボールとスティック(ball and stick)フォーマットにあり、アミノ酸番号を含む1文字表記で標識されている。WWDモチーフと受容体ペプチドの+2Thrの間の水素結合は点線により示されている。b.異なるグリコシル化シークオンに対する、カンピロバクター・ラリオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBおよびPglB変異体R331Aの活性。大腸菌細胞は、3つの別個のプラスミド、すなわち、(i)LLOを生成するが、不活化PglBを含有するカンピロバクター・ジェジュニのグリコシル化機構、(ii)シークオンDQNAT(配列番号4)またはシークオンAQNAT(配列番号8)のどちらかを含有する受容体タンパク質(修飾scFv断片3D5)、および(iii)機能的カンピロバクター・ラリPglBまたはPglB変異体R331Aの組み合わせで形質転換された。受容体タンパク質のグリコシル化はペリプラズム抽出物から解析され、一方PglBの発現は細胞抽出物全体から解析された。タンパク質は、scFv基質を検出する抗c-Myc抗体(上段)、グリカン特異的抗血清hR6(中段)、またはPglBを検出する抗HA抗血清(下段)を用いて、免疫ブロットにより解析された。PglB構築物はレーンの上に示され、受容体シークオンは線の上に示されている。3D5のグリコシル化は、非修飾形態(g0)からグリコシル化形態(g1)への移動度シフトをもたらす。機能的PglBは、N535およびN556で部分的に自己グリコシル化され、2つの追加のバンドをもたらす(g1およびg2)。
【図５】触媒部位およびアミド窒素の活性化を示す図である。a.PglBの選択された側鎖はボールとスティックフォーマットにあり、アミノ酸番号を含む1文字表記で標識されている。受容体ペプチドが線フォーマットで示され、活性化アスパラギンが標識されている。触媒性二価陽イオンは球として示されている。点線は、距離測定により示唆された水素結合またはリガンド-金属相互作用を示す。b.触媒部位の化学構造は、aでの相互作用を示している。細い点線は、タンパク質骨格およびペプチド骨格を示す。c.アミド基窒素の活性化の推定機構。遊離アスパラギン側鎖は、共鳴式により示されたような窒素の電子対の非局在化/共役を特徴とする。PglBに結合されると、受容体アスパラギンのアミド基は、触媒的に不可欠なD56およびE319のカルボキシル基を有する水素結合を形成し得、C-N結合の周りでの回転を必要とする(矢印)。これは、窒素の共役の破壊および求核性の増加をもたらすことになる。
【図６ａ】提案されたグリコシル化機構を示す図である。a.PglBのTMドメインおよびペリプラズムドメインの表面が示されている。結合受容体ペプチドはボールとスティックフォーマットにあり、黒線はN末端およびC末端を示す。細菌LLOの化学構造が白で概略的に示されて、二価陽イオン(M2+)および保存R375とのピロリン酸基の推定相互作用を強調する一方、求核置換の攻撃基および脱離基の共線配置を可能にする。矢印は活性化アミド窒素の攻撃を示す。イソプレノイド部分が脂質二重層に進入することが期待される、大部分が疎水性の溝はPglBの表面に示されている。
【図６ｂ】提案されたグリコシル化機構を示す図である。b.PglB触媒グリコシル化の提案された3つの段階機構。1つの段階から次に至る分子事象が、矢印の隣に示されている。観察された結晶構造は上段の状態を反映し、外部ループEL5のタンパク質およびC末端の半分に結合された受容体ペプチドは秩序化されている。下段左の状態は基底状態を反映し、結合基質はなく、点線により示された外部ループEL5は無秩序である。下段右の状態において、カンピロバクター・ジェジュニ由来のLLO(イソプレノイド部分の黒線、リン酸のP、サッカリド部分の楕円体)が結合され、受容体アスパラギンがグリコシル化される。
【図７】下記Table 1(表1)に関するコメント参照。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の方法において使用するためのTable 1(表1)の原子座標は、図7に示されている。カンピロバクター・ラリのOST、特に、最適化されたポリペプチド基質DQNAT(配列番号4)と複合体化された触媒部位および/またはポリペプチド結合部位のX線座標は、OST触媒および触媒阻害のための可能性のある成分を同定するのに必要な3次元情報を当業者に提供する。触媒作用およびポリペプチド結合に関与するアミノ酸の個々の原子の化学機能的性質と組み合わせた空間的制約、例えば電子密度、ファンデルワールス力の位置、イオン相互作用、疎水性相互作用等は、(a)可能性のあるオリゴ糖供与体、好ましくは脂質結合型オリゴ糖(LLO)もしくはウンデカプレニルピロリン酸結合オリゴ糖供与体、(b)可能性のあるオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)、(c)可能性のあるコンセンサス配列モチーフポリペプチド、および/または(d)可能性のあるグリコシル化阻害剤、の構造的および空間的必要条件のコンピュータ支援分子モデリングにおける当業者に情報を与える。
【００１５】
前記の通り細菌OSTは、オリゴ糖供与体分子に対する広い特異性を有する。座標情報および本発明の方法を用いて、有用なオリゴ糖供与体のレパートリーは、試行錯誤の合成戦略に戻る必要なく、合理的に設計および拡大され得る。また、OST自体が、触媒部位およびポリペプチド結合ポケットを非機能的にすることなく合理的に変更され得る。このOST変化は、例えば、OSTの触媒潜在能力、ポリペプチド基質特異性および/またはオリゴ糖供与体特異性を修飾するのに有用である。さらに、ポリペプチドオリゴ糖受容体のコンセンサスモチーフは、合理的に変更および設計され得、故に例えば真核生物部位のグリコシル化などのOST有用性の拡大をもたらす。最後に大事なことを付け加えると、本発明3次元X線モデルは、OST活性を妨害し、修飾し、または遅くして生理学的に活性となることが期待できる、可能性のあるグリコシル化阻害剤を設計するための優れた基盤を提供する。これらの阻害剤は、科学的、診断的および治療的ツールを提供するための大きな可能性を有する。
【００１６】
用語「根平均二乗偏差」または「rms偏差」または「rmsd」は、平均からの偏差の平方の算術平均の平方根を意味する。原子オブジェクトの関連において、数はオングストローム(Å)で示される。これは、トレンドまたはオブジェクトからの偏差または変動を表す1つの方法である。
【００１７】
本発明の方法は、アミノ酸D56、R147、D154、D156、E319、R375、Y468、およびH485の少なくとも1つ、2つまたは3つ、好ましくは少なくとも4つ、より好ましくは少なくとも5つまたは6つ、最も好ましくは7つまたは全てを含む、カンピロバクター・ラリのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)の触媒ドメインの3次元モデルを生成するために、Table 1(表1)、好ましくは骨格原子から±2、より好ましくは±1.5、最も好ましくは±1.0Å根平均二乗偏差(rmsd)の原子座標を用いるステップ、ならびに/または、好ましくはならびに
アミノ酸M318、R331(またはA331)、W463、W464、D465、およびI572の少なくとも1つまたは2つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つまたは5つ、最も好ましくは全てを含む、カンピロバクター・ラリのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)のポリペプチド結合部位の3次元モデルを生成するために、Table 1(表1)、好ましくは骨格原子から±2、より好ましくは±1.5、最も好ましくは±1.0Å根平均二乗偏差(rmsd))の原子座標を用いるステップを含む。
【００１８】
ポリペプチド結合部位でW463、W464およびD465は、結合された受容体シークオンにおけるTのβ-ヒドロキシル基と強い水素結合を形成する。これらの残基は、受容体シークオン結合に強く寄与し、SまたはTが受容体アスパラギン(N-X-S/T)の+2位に位置する理由となっている。R331は、受容体ポリペプチドの負に帯電したDと塩橋を形成し、したがって受容体シークオン結合に寄与する。R331は、受容体アスパラギンの-2位で負に帯電したアミノ酸の要求に関与し、および細菌N結合型タンパク質グリコシル化(D/E-X1-N-X2-S/T;配列番号3)のコンセンサスシークオンの伸長に関与する(図4a)。R331は、細菌OSTにおいてのみ保存され、真核生物グリコシル化部位の認識に対するPglBの基質特異性を変更するための標的として機能することができる。実際、R331がAに変異されると、受容体タンパク質(例えば本来はシークオンDQNAT(配列番号4)を含有する修飾scFv断片3D5)における得られたグリコシル化部位AQNAT(配列番号8)はグリコシル化され得る一方、この部位は、野生型酵素の基質として機能しない(図4b)。
【００１９】
触媒部位においてD56、D154およびE319は、触媒に不可欠な結合二価金属イオンの配位に関与しているように思われる。より重要なことには、D56およびE319は、結合受容体シークオンのアスパラギン側鎖のアミド基と水素結合を形成する。この相互作用は、窒素の求核活性化に重要な、アミド基におけるC-N結合の回転をもたらす。D156およびR147は、水素結合ネットワークを安定させ、R375は、結合脂質結合型オリゴ糖(LLO)のリン酸の1つの負電荷を複雑化する。
【００２０】
例えば、ポリペプチド結合部位においてW463、W464およびD456は、2つのHおよび1つのEにより置換することができる(WWD→HHE)。受容体アスパラギンの-2位における負電荷の要求を保つために、R331はKにより置換することができる。この位置で正電荷の要求をもたらすために、R331はDまたはEにより置換することができる。受容体アスパラギンの-2位における負電荷の要求に打ち勝つために、R331はAにより置換することができる(図4)。触媒部位でD154およびD156は、各々Eにより置換することができる。E319はDにより、D56はEによりそれぞれ置換することができる(下記参照)。PglB活性を修飾するには、例えば、D56、D154およびE319が、アラニンまたは対応するアミノ官能基(NまたはQ)により置換され得る。Wは真核生物OSTにおいてこの位置で現れるため、H485はWにより置換することができる。
【００２１】
図7のTable 1(表1)に列挙されたカンピロバクター・ラリ由来のPglBの構造座標は、pdbデータベース(構造バイオインフォマティクス共同研究者(research collaboratory for structural bioinformatics)(RCSB)タンパク質データベース(Protein Database)(PDB))から当業者がダウンロードしやすい。コンピュータおよびPyMOLなどの自由にアクセスできる構造プログラム、または市販の構造プログラムを利用して、当業者は、請求された方法に有用な3次元モデルを容易に生成することができる。
【００２２】
当業者は、タンパク質、タンパク質/基質またはタンパク質/阻害剤複合体またはこれらの部分に対する一連の構造座標は、3次元での形状を規定する相対的な一連の点であることを理解するであろう。故に、全く異なる一連の座標が、類似のまたは同一の形状を規定できることが可能である。この理由のため、Table 1(表1)の原子座標から得られた3次元モデル(i)および/または(ii)のアミノ酸の座標で、全体の並進および/または回転を行うことが好ましい。座標におけるこれらのバリエーションは、構造座標の数学的操作、例えば、構造座標の結晶学的置換、構造座標のセットに対する分割演算もしくは行列演算、または上記の任意の組み合わせによる操作により生成することができる。
【００２３】
次に、上記の生成された3次元モデルは、OSTグリコシル化の可能性のある成分の少なくとも1つ、または可能性のある阻害剤を設計または選択するために用いられる。特定のオリゴ糖供与体、修飾OST、オリゴ糖受容体コンセンサス配列モチーフポリペプチド、またはグリコシル化阻害剤などの分子が、OST触媒反応における分子の機能性を合理的に予測するのに十分に設計されているかどうかを判定するには、さまざまなコンピュータ解析が必要である。性質、原子の位置、回転自由度、電子密度、立体障害、ファンデルワールス、イオン相互作用および疎水性相互作用等の空間的、機能的および化学的考察がなされなければならないであろう。このような解析は、CCP4(COLLABORATIVE COMPUTATIONAL PROJECT、NUMBER 4. 1994.「The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography」Acta Cryst. D50、760〜763頁)などの標準的なソフトウェアアプリケーションにより、コンピュータ上で好都合には実施することができる。
【００２４】
現在のコンピュータ分子類似性アプリケーションは、異なる構造、同じ構造の異なるコンフォメーション、および同じ構造の異なる部分の間の比較を可能にする。比較手順は、4つのステップ、すなわち、(1)構造情報のローディング、(2)これらの構造に関する原子等価性の規定、(3)フィッティング(重ね合わせ)操作の実施、および(4)結果の解析に典型的には分けられる。各構造は、名前により識別される。1つの構造が、次いで、可能性のあるOST成分またはOST阻害剤(すなわち標的構造または固定構造)として同定され、全ての残りの構造は、ワーキング構造(すなわち可動構造)である。リジッドフィッティング(rigid fitting)方法が用いられる場合、ワーキング構造が並進および回転されて標的構造との最適フィット(空間的および機能的相補性)を得る(例えばOST阻害剤が固定構造であり、OSTアミノ酸が並進および回転されて最適フィットを得る)。フィッティング操作は、等価原子の指定されたペアに対するフィットのrmsdが絶対最小値になるように、可動構造に適用される最適な並進および回転を計算するアルゴリズムを用いる。2つの構造を重ね合わせた後、rmsd値が、等価原子の特定のセットについて計算され得る。
【００２５】
上記された本発明方法により選択または設計されたOST反応の可能性のある機能的成分または阻害剤は、日常的なOST活性アッセイにおいてこの機能性を検証する場合、当業者に成功の妥当な期待をもたらすであろう。前記目的のため、可能性のある成分は、購入、購入された材料の改変、化学合成および/または組換え合成等により提供されなければならない。この可能性のある成分は、次いで、当然ながらOST活性を可能にする条件下で、OST触媒アスパラギン結合型(「N結合型」)グリコシル化に必要なさらなる機能的成分と接触されなければならないであろう。好ましいOST活性アッセイは、(1)2005 Chemistry & Biology 12、1311〜1315頁、(2)2006 Science 314、1148〜1150頁、(3)2007 Biochemistry 46、5579〜5585頁、(4)2007 Glycobiology 11、1175〜1182頁、および(5)2011 Glycobiology 5、575〜583頁に記載されている。可能性のある成分または阻害剤がOST活性であるか否かは、正または負の基準との比較において好ましくは検証される。例えば、OSTアッセイの機能性は、既知のオリゴ糖受容体ポリペプチド、例えばヘキサペプチドDQNATF(配列番号5)を用いて確立され、次いで、可能性のある機能的コンセンサス配列モチーフポリペプチドが該ヘキサペプチドに対して置換され、および置換ポリペプチドのグリコシル化が決定される。この簡単なOSTアッセイ系は、任意の機能的OST成分、好ましくは、(A)機能的オリゴ糖供与体、好ましくは機能的脂質結合型オリゴ糖(LLO)またはウンデカプレニルピロリン酸結合オリゴ糖供与体、(B)機能的オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)、(C)機能的コンセンサス配列モチーフポリペプチド、および(D)機能的グリコシル化阻害剤からなる群から選択される該成分を同定するのに適合することができる。
【００２６】
第2の態様において、本発明は、(a)可能性のあるオリゴ糖供与体、好ましくは脂質結合型オリゴ糖(LLO)またはウンデカプレニルピロリン酸結合オリゴ糖供与体、(b)可能性のあるオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)、(c)可能性のあるコンセンサス配列モチーフポリペプチド、および(d)可能性のあるグリコシル化阻害剤からなる群から選択される、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)触媒アスパラギン結合型(「N結合型」)グリコシル化のための可能性のある成分を設計する方法であって、
(i)アミノ酸D56、R147、D154、D156、E319、R375、Y468、およびH485の少なくとも1つ、2つまたは3つ、好ましくは少なくとも4つまたは5つ、より好ましくは少なくとも6つまたは7つ、最も好ましくは全てを含む、カンピロバクター・ラリのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)の触媒ドメインの3次元モデルを生成するために、Table 1(表1)、好ましくは骨格原子から±2、より好ましくは±1.5、最も好ましくは±1.0Å根平均二乗偏差(rmsd)の原子座標を用いるステップ、ならびに/あるいは、好ましくはならびに
(ii)アミノ酸M318、R331、W463、W464、D465、およびI572の少なくとも1つまたは2つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つまたは5つ、最も好ましくは全てを含む、カンピロバクター・ラリのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)のポリペプチド結合部位の3次元モデルを生成するために、Table 1(表1)、好ましくは骨格原子から±2、より好ましくは±1.5、最も好ましくは±1.0Å根平均二乗偏差(rmsd)の原子座標を用いるステップ、
(iii)好ましくは、(i)および/もしくは(ii)の3次元モデルのアミノ酸の座標で、全体の並進および/もしくは回転を行うステップ、
(iii.1)前記3次元モデル(i)、(ii)および/もしくは(iii)と、オリゴ糖供与体、好ましくは脂質結合型オリゴ糖(LLO)供与体またはウンデカプレニルピロリン酸結合オリゴ糖供与体、コンセンサス配列モチーフポリペプチド、および可能性のあるグリコシル化阻害剤から選択される、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)触媒アスパラギン結合型(「N結合型」)グリコシル化のための既知のもしくは可能性のある成分との間の立体化学的相補性を評価するために、(i)、(ii)および/もしくは(iii)の前記3次元モデルを用いるステップ、または
(iii.2)(i)、(ii)および/もしくは(iii)の前記3次元モデルにおいて少なくとも1つのアミノ酸を変更し、前記3次元モデル(i)、(ii)および/もしくは(iii)と、オリゴ糖(LLO)供与体、好ましくは脂質結合型オリゴ糖(LLO)供与体もしくはウンデカプレニルピロリン酸結合オリゴ糖供与体、コンセンサス配列モチーフポリペプチド、および可能性のあるグリコシル化阻害剤から選択される、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)触媒アスパラギン結合型(「N結合型」)グリコシル化のための既知のもしくは可能性のある成分との間の立体化学的相補性を評価するために、(i)、(ii)および/もしくは(iii)の前記変更された3次元モデルを用いるステップ、
(iv)(iii.1)、(iii.2)の3次元モデルの変化、またはオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)触媒アスパラギン結合型(「N結合型」)グリコシル化のための成分の変化を観察することにより、反復アプローチにおいて前記立体化学的相補性を最適化するステップ、
(v)前記3次元モデルおよび可能性のある成分の前記立体化学的相補性を最適化する、(a)から(d)から選択される可能性のある成分を設計するステップ、
(vi.1)最適化された可能性のある成分を場合により提供するステップ、ならびに
(vi.2)前記可能性のある成分(a)から(d)の少なくとも1つを、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)触媒アスパラギン結合型(「N結合型」)グリコシル化に必要なさらに機能的な成分と接触させるステップ、
(vi.3)(A)機能的オリゴ糖供与体、好ましくは機能的脂質結合型オリゴ糖(LLO)供与体またはウンデカプレニルピロリン酸結合オリゴ糖供与体、(B)機能的オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)、(C)機能的コンセンサス配列モチーフポリペプチド、および(D)機能的グリコシル化阻害剤
からなる群から選択される機能的成分を同定するステップ
を含む方法に関する。
【００２７】
好ましい実施形態において、ステップ(ii)においてカンピロバクター・ラリのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)のポリペプチド結合部位の3次元モデルは、アミノ酸M318、A331、W463、W464、D465およびI572の少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つ、最も好ましくは全てを含む。
【００２８】
この方法は、前記3次元モデルの少なくとも1つにおいて少なくとも1つのアミノ酸を変更する場合、真上の方法では可能性のあるOST成分が、3次元モデルの変化、またはオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)触媒アスパラギン結合型(「N結合型」)グリコシル化のための成分の変化を観察することにより、反復アプローチにおいて全体の並進および回転を用いてまたは用いずに、3次元モデルに対する立体化学的相補性を最適化することにより設計されること以外、第1の態様の方法に基本的に極めて類似している。
【００２９】
前記3次元モデルに対する最適化された立体化学的相補性に基づき設計された可能性のあるOST成分をいったん選択すると、該成分は、好ましくは、最適化された可能性のある成分を提供すること(化学合成および/または組換え合成、購入、既知の化合物の修飾等により)、前記最適化された可能性のある成分を、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)触媒アスパラギン結合型(「N結合型」)グリコシル化に必要なさらなる機能的成分と接触させることにより、OSTアッセイにおいて場合により検証することができる。最後の任意ステップにおいてOST反応またはこの阻害剤の機能的成分は、OST反応に対する影響により同定される。典型的には、陽性および陰性参照成分がOSTアッセイ活性を検証するのに用いられる。
【００３０】
可能性のあるOST成分を同定または設計するための本発明の方法の好ましい実施形態において、ステップ(i)の特定の3次元触媒部位モデルは、残基が配列番号2の結合ペプチドまでのファンデルワールス距離内に位置するアミノ酸(好ましくは前記ペプチドまで5Åの距離内のアミノ酸から選択される、より好ましくはT53、T54、N55、D56、N146、R147、Y152、E315、T316、I317、M318、E319、V320、N321、R331、L374、R375、Y433、S435、V438、W463、W464、D465、G482、H485、I572、V575からなる群から選択される)の1つまたは複数、好ましくは少なくとも5つ、より好ましくは少なくとも10個、最も好ましくは全てをさらに含む。
【００３１】
さらなる態様において本発明は、
(i)アミノ酸D56、R147、D154、D156、E319、R375、Y468、およびH485の少なくとも1つ、2つまたは3つ、好ましくは少なくとも4つまたは5つ、より好ましくは少なくとも6つまたは7つ、最も好ましくは全てを好ましくは含む、Table 1(表1)、好ましくは骨格原子から±2、より好ましくは±1.5、最も好ましくは±1.0Å根平均二乗偏差(rmsd)の原子座標、ならびに/または、好ましくはならびに
(ii)アミノ酸M318、R331(またはA331)、W463、W464、D465、およびI572の少なくとも1つまたは2つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つまたは5つ、最も好ましくは全てを含む、カンピロバクター・ラリのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)のポリペプチド結合部位の3次元モデルを生成するための、Table 1(表1)、好ましくは骨格原子から±2、より好ましくは±1.5、最も好ましくは±1.0Å根平均二乗偏差(rmsd)の原子座標、
(iii)好ましくは、前記座標で全体の並進および/もしくは回転を行うことにより改変された(i)もしくは(ii)の原子座標
を例えば格納するステップを含む、機械可読な媒体に関する。
【００３２】
上記媒体は、他の細菌由来のOSTのコンピュータ支援薬物設計、創薬およびX線結晶学的解析などのさまざまな目的に特に有用である。
【００３３】
以下において本発明は、添付特許請求の範囲により提示された本発明の範囲を限定すると解釈されるものではない特定の実施形態および実験に関して、さらに例証される。
【００３４】
配列番号1は、カンピロバクター・ラリPglBのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)の712個のアミノ酸を列挙する。
【数１】
2014516519.tif 000003
【００３５】
配列番号2は、OSTの最適化されたオリゴ糖受容体基質を表すヘキサペプチドDQNATF{pN02}(F{pN02}はパラニトロフェニルアラニンである)のアミノ酸を列挙する。このヘキサペプチドは、以下のTable 1(表1)の原子構造座標を得るために、カンピロバクター・ラリPglBのOSTと一緒に結晶化された。Table 1(表1)の統計値はTable 2(表2)に示されている。
【００３６】
Table 1(表1)は、図7に示されている。Table 1(表1)は、カンピロバクター・ラリのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)の触媒ドメインの3次元モデルを生成するのに有用な、ペプチド配列DQNATF{pN02}(配列番号2)(B鎖)(OSTグリコシル化の最適基質)と複合体化されたカンピロバクター・ラリの結晶化オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST、A鎖)、および結合二価金属イオン(C鎖)の原子構造座標を列挙する。表は、以下の情報を含有する。
【００３７】
【表１】
2014516519.tif 000004
【００３８】
Table 2(表2)は、図7におけるTable 1(表1)のX線データ収集および精密化統計値を列挙する。
A.データ収集統計値
【００３９】
【表２】
2014516519.tif 000005
【００４０】
B.精密化統計値(ネイティブデータ)
解像度(Å)                                              30-3.4
反射ワーキングセット(テストセット)の回数                21834(2000)
Rwork/Rfree(%)                                            23.8/27.1
理想からのrmsd
結合長(Å)                                          0.011
結合角(°)                                          1.475
平均B因子(Å2)
PglB                                                129
ペプチド                                            117
ラマチャンドラン解析(Molprobity)
好ましいラマチャンドラン(Ramachandran favored)    82.6%
ラマチャンドラン外れ値(Ramachandran outlier)        1.5%
【００４１】
図１は、N結合型タンパク質グリコシル化のプロセスの概略図である。a.受容体シークオンを含有するタンパク質(真核生物におけるNxT/S、細菌におけるD/EX1NX2 T/S(配列番号3))が、アスパラギン残基でOSTの作用によりグリコシル化される。化学反応は、アミド窒素の活性化およびグリコシド結合の形成を含む。b.細菌(左のパネル)および真核生物(右のパネル)におけるN結合型グリコシル化の類似性および顕著な特徴。OSTの中心的酵素は、生命の全てのドメインにおける配列および構造に保存されているSTT3(細菌におけるPglB)である。脂質部分およびオリゴ糖は、示されている通り細菌および真核生物で類似しているが、同一ではない。両方とも、グリコシル化段階後に加水分解されるイソプレノイドピロリン酸部分を含有する。
図２は、カンピロバクター・ラリオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBの活性を示す図である。大腸菌細胞は、3つの別個のプラスミド、すなわち、(i)LLOを生成するが、不活化PglBを含有するカンピロバクター・ジェジュニのグリコシル化機構、(ii)シークオンDQNAT(配列番号4)を含有する受容体タンパク質(修飾scFv断片3D5)、および(iii)機能的カンピロバクター・ラリPglBの組み合わせで形質転換された。ここに提示された共結晶構造は、アッセイで使用された配列を含有する受容体ペプチドに結合されたカンピロバクター・ラリPglBを含有することに留意されたい。受容体タンパク質のグリコシル化はペリプラズム抽出物から解析され、一方PglBの発現は細胞抽出物全体から解析された。タンパク質は、scFv基質を検出する抗c-Myc抗体(上段)、グリカン特異的抗血清hR6(中段)、またはPglBを検出する抗HA抗血清(下段)を用いて、免疫ブロットにより解析された。PglB構築物は、レーンの上に示されている:ベクター対照(ev)、野生型(wt)、または1文字表記の変異。3D5のグリコシル化は、非修飾形態(gO)からグリコシル化形態(g1)への移動度シフトをもたらす。機能的PglBは、N535およびN556で部分的に自己グリコシル化され、2つの追加のバンドをもたらす(g1およびg2)。全ての実験は、少なくとも3連で行われ、代表試料が示されている。
図３は、カンピロバクター・ラリPglBの構造および基質結合空洞を示す画像である。a.TMおよびペリプラズムドメインを含む、2方向でのPglBのリボンダイアグラム。膜の推定位置が線で示され、結合基質ペプチドの位置が示されている。b.結合受容体ペプチドを含むPglBの線表現。2つの空洞がタンパク質の反対側に示され(マークされている)、基質へのアクセスを提供している。空洞は、受容体アスパラギンの側鎖を収容する開口部(porthole)によりつながっている(この表示モードでは見えない)。
図４は、PglBによるグリコシル化シークオン認識を示す図である。a.PglBにおけるペプチド結合部位およびシークオン認識を示す画像。受容体ペプチドが線フォーマットで示され、個々のアミノ酸が3文字表記で標識されている。特定のシークオン結合に寄与するPglB残基は、ボールとスティック(ball and stick)フォーマットにあり、アミノ酸番号を含む1文字表記で標識されている。WWDモチーフと受容体ペプチドの+2Thrの間の水素結合は点線により示されている。b.異なるグリコシル化シークオンに対する、カンピロバクター・ラリオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBおよびPglB変異体R331Aの活性。大腸菌細胞は、3つの別個のプラスミド、すなわち、(i)LLOを生成するが、不活化PglBを含有するカンピロバクター・ジェジュニのグリコシル化機構、(ii)シークオンDQNAT(配列番号4)またはシークオンAQNAT(配列番号8)のどちらかを含有する受容体タンパク質(修飾scFv断片3D5)、および(iii)機能的カンピロバクター・ラリPglBまたはPglB変異体R331Aの組み合わせで形質転換された。受容体タンパク質のグリコシル化はペリプラズム抽出物から解析され、一方PglBの発現は細胞抽出物全体から解析された。タンパク質は、scFv基質を検出する抗c-Myc抗体(上段)、グリカン特異的抗血清hR6(中段)、またはPglBを検出する抗HA抗血清(下段)を用いて、免疫ブロットにより解析された。PglB構築物はレーンの上に示され、受容体シークオンは線の上に示されている。3D5のグリコシル化は、非修飾形態(g0)からグリコシル化形態(g1)への移動度シフトをもたらす。機能的PglBは、N535およびN556で部分的に自己グリコシル化され、2つの追加のバンドをもたらす(g1およびg2)。
図５は、触媒部位およびアミド窒素の活性化を示す図である。a.PglBの選択された側鎖はボールとスティックフォーマットにあり、アミノ酸番号を含む1文字表記で標識されている。受容体ペプチドが線フォーマットで示され、活性化アスパラギンが標識されている。触媒性二価陽イオンは球として示されている。点線は、距離測定により示唆された水素結合またはリガンド-金属相互作用を示す。b.触媒部位の化学構造は、aでの相互作用を示している。細い点線は、タンパク質骨格およびペプチド骨格を示す。c.アミド基窒素の活性化の推定機構。遊離アスパラギン側鎖は、共鳴式により示されたような窒素の電子対の非局在化/共役を特徴とする。PglBに結合されると、受容体アスパラギンのアミド基は、触媒的に不可欠なD56およびE319のカルボキシル基を有する水素結合を形成し得、C-N結合の周りでの回転を必要とする(矢印)。これは、窒素の共役の破壊および求核性の増加をもたらすことになる。
図６は、提案されたグリコシル化機構を示す図である。a.PglBのTMドメインおよびペリプラズムドメインの表面が示されている。結合受容体ペプチドはボールとスティックフォーマットにあり、黒線はN末端およびC末端を示す。細菌LLOの化学構造が白で概略的に示されて、二価陽イオン(M2+)および保存R375とのピロリン酸基の推定相互作用を強調する一方、求核置換の攻撃基および脱離基の共線配置を可能にする。矢印は活性化アミド窒素の攻撃を示す。イソプレノイド部分が脂質二重層に進入することが期待される、大部分が疎水性の溝はPglBの表面に示されている。b.PglB触媒グリコシル化の提案された3つの段階機構。1つの段階から次に至る分子事象が、矢印の隣に示されている。観察された結晶構造は上段の状態を反映し、外部ループEL5のタンパク質およびC末端の半分に結合された受容体ペプチドは秩序化されている。下段左の状態は基底状態を反映し、結合基質はなく、点線により示された外部ループEL5は無秩序である。下段右の状態において、カンピロバクター・ジェジュニ由来のLLO(イソプレノイド部分の黒線、リン酸のP、サッカリド部分の楕円体)が結合され、受容体アスパラギンがグリコシル化される。
図７については、上記Table 1(表1)に関するコメント参照。
【実施例】
【００４２】
方法
インビボ相補性
インビボでのカンピロバクター・ラリ由来のPglBの活性を解析するために、 pglBをコードする遺伝子を、カンピロバクター・ラリ分離株(H. Hachler、ルツェルン、スイスによる好意により提供された試料)ゲノムDNAのpgl遺伝子クラスターから、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅し、PglBに融合したC末端HAタグを有するpMLBADプラスミド(Lefebre & Valvano、Appl. Environ. Microb. 68、5956〜5964頁(2002))にクローン化し、プラスミドpMIK71をもたらした。相補性試験のため、pMIK71またはpMLBAD空ベクターを、プラスミドpCL21(2011 Bioconjug Chem. 3、488〜496頁)またはpCL64およびpACYCpglmut(Wackerら、Science 298、1790〜1793頁(2002))を保有する大腸菌SCM6細胞に形質転換した。pCL21は、DQNAT(配列番号4)グリコシル化部位をリンカー領域に保有する3D5の一本鎖Fv断片および3D5に融合されたC末端Mycタグの発現をコードする。pCL64では、pCL21のDQNAT部位をAQNAT(配列番号8)グリコシル化部位により置換した。pACYCpglmutは、不活化カンピロバクター・ジェジュニpglB 遺伝子(W458AおよびD459A)とのカンピロバクター・ジェジュニ脂質結合型オリゴ糖(LLO)の生合成をコードする。5mL前培養液を単一クローンから接種し、LB培地で37℃、一晩、増殖させた。本培養液を、15mL LB培地に0.05の最適密度(A600)に接種し、0.5のA600に37℃で増殖させた。培養液をアラビノースの添加により0.1%(w/v)に誘導し、24℃で4時間増殖させた。ペリプラズムタンパク質の抽出のため、3.0のA600を有する1mL培養液量の当量を遠心分離により回収し、30mM Tris-HCI、pH8.5; 20%(w/v)スクロース; 1mM EDTAおよび1mg/mLリゾチーム(Sigma)からなる150μL抽出緩衝液に再懸濁し、4℃で1時間インキュベートした。最終遠心分離ステップは、上清にペリプラズムタンパク質を得た。3D5のグリコシル化およびPglBの発現をSDS-PAGE(Lammliにより行った)により解析した。免疫検出を、抗c-Mycモノクローナル抗体(Calbiochem)および抗グリカン血清hR6(Amber S.およびAebi M.、個人的やりとり)で行ってグリコシル化3D5を観察した。カンピロバクター・ラリPglBの免疫検出は、抗HA抗血清(Santa Cruz)で行った。
【００４３】
変異試験
変異体pglB はQuickChange方法により生成した。プラスミドpCL64を、NheIおよびAgeIで消化したプラスミドpCL21へのオリゴヌクレオチドCTAGCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGCCCAGAACGCCAおよびCCGGTGGCGTTCTGGGCACCACCACCAGAACCACCACCACCGのリン酸化二本鎖DNAのライゲーションにより生成した。全ての構築物の得られたプラスミドを、DNA配列決定により検証した。変異体PglBバリアントは、上記の通りpMLBADにクローン化し、相補性アッセイで使用した。
【００４４】
PglB精製
pgIBをコードする遺伝子を、PglBに融合したC末端デカヒスチジン親和性タグを有する修飾pBAD(Invitrogen)発現プラスミドにクローン化し、プラスミドpSF2を得た。適用されたクローニング戦略によりPglBは変異K2Eを保有し、プラスミドはDNA配列決定(Microsynth)により確認した。カンピロバクター・ラリ由来のPglBは、30L発酵槽(Infors)で大腸菌BL21-Gold(DE3)(Stratagene)細胞におけるpSF2から過剰発現させた。1%グリセロール(w/v)を補充したTerrific Broth培地で細胞を37℃で10.0の最適密度(A600)に増殖させた後、培養液を0.1%アラビノース(w/v)の添加により2時間誘導した。全ての以下のステップは、別に指定されない限り4℃で行った。細胞を遠心分離により回収し、25mM Tris-HCI、pH8.0; 250mM NaClに再懸濁し、15.000psi外圧でM-1 10Lマイクロフリュイダイザー(Micro-fluidics)で破壊した。膜は100.000gで0.5時間、超遠心分離によりペレット化した。PglBを、25mM Tris-HCI、pH 8.0; 250mM NaCI; 10%グリセロール(v/v)および1%N-ドデシル-β-D-マルトピラノシド(w/v)(DDM、Anatrace)で1時間可溶化した。
【００４５】
全てのこの後の緩衝液は、洗浄剤としてDDMを含有した。上清は25mMイミダゾールを補充し、NiNTAスーパーフローアフィニティ(superflow affinity)カラム(Qiagen)に添加し、60mMイミダゾールで洗浄した後、PglBを200mMイミダゾールで溶出した。タンパク質を、10mM MES-NaOH、pH6.5; 100mM NaCl; 0.5mM EDTA; 3%グリセロール(v/v); 3%ポリエチレングリコール400(v/v)に脱塩し、100kDaの分子量カットオフによりAmicon Ultra-15濃縮器(Millipore)で7〜10mg/mLに濃縮した。
【００４６】
天然結晶
ペプチドAc-DQNATF{4NO2}-NH2(配列番号6)を0.75mMの最終濃度まで濃縮PglBに添加し、0.5時間インキュベートし、100mMグリシン、pH9.4; 50mM酢酸マグネシウム; 6%ジメチルスルホキシド(DMSO)(v/v)、および23〜34%(v/v)ポリエチレングリコール400のリザーバーに対して、20℃でシッティングドロップにおける蒸気拡散により結晶化した。シッティングドロップにおけるタンパク質対リザーバー容積比は2:1であった。結晶は、典型的には3〜4週間後に現れ、6週間以内にフルサイズに成熟する。結晶を、データ収集前に液体窒素に浸漬して直接急速冷凍した。
【００４７】
重金属誘導体
天然結晶を、液体窒素での浸漬によるバックソーキング(back-soaking)および急速冷凍前に、1mMリン酸エチル水銀(EMP)で30〜60分間浸漬した。
【００４８】
データ収集
結晶は、非対称ユニットに1つのPglB-ペプチド複合体を有する、空間基P212121に属した。結晶の全ての切片が同様に良好に回析されるわけではないため、ネイティブデータは、Swiss Light Source(SLS、ビリゲン)でマイクロディフラクトメータービームラインX06SAで収集した。EMP2およびEMP3誘導体データセット(上記Table 2(表2)参照)は同じステーションで収集し、一方EMP1は同じビームラインの高分解能ステーションで収集した。データを処理し、XDS(Kabsch、W. Xds. Acta Crystallogr D66、125〜132頁、(2010)またはHKL2000(HKL Research、Inc.)と併合した。
【００４９】
構造決定
構造は、一方では、検索モデルとしてのカンピロバクター・ジェジュニPglB(pdbコード3AAG)のペリプラズムドメイン、およびPhaser(Mccoyら、Phaser crystallographic software. J. Appl. Crystallogr. 40、658〜674頁、2007)を用いた分子置換の組み合わせを、他方ではSHARP(Global Phasing Limited)を用いた異常分散による多重同形置換(multiple isomorphous replacement with anomalous scattering)(MIRAS)を用いて決定した。位相計算およびモデル構築(Oを用いた; Jonesら、Acta Crystallogr. A47、110〜119頁、1991)ならびに精密化(Phenixを用いた; Adamsら、Acta Crystallogr D66、213〜221頁、2010)のプロセスを、ペリプラズムドメインで開始し、TMドメイン(TM1〜4およびTM10〜13)とこれに続くTM5〜9の最も秩序化された領域に拡大して繰り返した。TMドメインにおける3つのシステインの位置(Hg異常ピークにより示された)は、極めて良好な密度がかさ高い残基の配置を可能にし、配列レジスタを確認するまで、追跡の開始点として機能した。最終構造は、PglBの2つの無秩序なループ(残基283〜306および残基605〜607)およびC末端ポリヒスチジンタグを除外する。データ収集および精密化統計値を、上記Table 2(表2)に示す。
【００５０】
結果および結論
カンピロバクター・ラリPglBの構造
以前の予測(Kelleher & Gilmore、Glycobiology 16、47〜62頁、2006)と一致して、X線構造は、PglBが、2つのドメイン(図3a)、残基1〜432を含む膜貫通(TM)ドメインおよび残基433〜712を含むペリプラズムドメインからなることを明らかにした。共有結合に加えて、2つのドメインは、膜平面と平行に位置する2つのヘリックス(EL1-h1およびEL1-h2)を形成するTMドメインの第1外部ループ(EL1)により主に提供される非共有相互作用を通じて、専ら相互作用する。ペリプラズムドメインは、該タンパク質ファミリーの最も保存された配列モチーフを有する混合α/β構造を明らかにする(下記参照)。2つの関連するペリプラズムドメイン(1つはカンピロバクター・ジェジュニPglB由来、もう1つはパイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)AglB由来)の構造が、以前に報告されている(Maitaら、J. Biol. Chem. 285、4941〜4950頁、2010; Iguraら、Embo J27、234〜243頁、2008)。しかし、これらの単離されたドメインは、触媒的に不活性であり、受容体ペプチドを結合することができなかった。完全長PglBの本構造は、該TMドメインが、ペプチド結合および触媒の両方に不可欠であることを明らかにして、この観察に対する分子基盤を提供するものである。
【００５１】
ペリプラズムドメインとは対照的に、該TMドメインは、長い外部ループEL1およびEL5を著しい例外として、比較的短い細胞質内および外部(細胞質外)ループによりつながった13TMセグメントを有する、新たな折り畳みを特徴とする。配列アライメントおよびTMセグメント予測に基づき、観察されたトロポジーは、STT3タンパク質ファミリーに保存されているようである。TM1-4およびTM10-13は、シークオン結合部位および触媒部位を形成し、ペリプラズムドメインとの界面の大部分を提供するのに対し、TM5-9は、膜平面に垂直な、短い平行するTMヘリックスである。これらは、オリゴ糖部分もしくはバクトプレノール部分と相互作用し得、またはEL5の遠隔結合(remote attachment)のスペーサーを提供し得る(下記参照)。EL1がよく秩序化され、ペリプラズムドメインと強く相互作用するのに対し、EL5は、部分的にのみ秩序化され、25残基が電子密度マップにおいて不完全または完全に無秩序な状態である。EL5の秩序化されたセクションは、ペリプラズムドメインおよび結合受容体ペプチドの両方と相互作用し、シークオンの動員および結合における重要な役割を示唆している。ペプチドの非存在下でEL5は、完全に柔軟であり、無秩序であることが考えられ、PglBの結晶は受容体ペプチドの非存在下では成長しなかったという知見を説明している。ペプチド結合状態において、PglBは、膜表面の上に2つの大きな空洞を形成し、両方ともペリプラズム空間からアクセス可能であるが、タンパク質の反対側に位置する(図3)。左側の空洞は、該構造における結合ペプチドの存在により示唆されるように、受容体タンパク質へのアクセスを提供し、一方右側の空洞は触媒残基を有し(下記参照)、LLO基質に対する結合ポケットとして恐らく機能している。2つの空洞は、小さな開口部によりつながっており、開口部を通じて結合ペプチドの受容体アスパラギンは、ペプチド結合部位から推定触媒部位に達する。
【００５２】
受容体シークオン結合および認識
PglBの構造は、ヘキサペプチドDQNATF(配列番号5)との複合体で決定され、受容体アスパラギンが膜表面の約15Å上にくる位置でペプチドの明確な密度が観察された(図3a)。ペプチド結合部位および触媒部位は、構造の最も秩序化された領域であり、電子密度は、受容体ペプチドレジスター(peptide register)の曖昧な割り当てを可能にする。ペプチドの接触表面のほぼ80%(areaimolにより計算された; Bailey, S.、Acta Crystallogr D50、760〜763頁、1994)が、TMおよびペリプラズムドメインの界面で埋没しており、強く押し付けられたコンフォメーションに沿って極めて強い結合を示唆している。ヘキサペプチドは、180°の回転をほぼ完成させるループを形成する。したがって、ポリペプチド基質は、このグリコシル化シークオンを十分に大きい柔軟な表面露出したループにおいて提示しなければならない。この理由は、PglBのペプチド結合空洞が、十分に折り畳まれたタンパク質ドメインにフィットするように現れないためである。ペプチドとのTMドメインの相互作用の重要な部分は、ペプチドの鞍(saddle)に似たメチオニン残基も特徴とする外部ループEL5により提供される。ペプチドの観察されたコンフォメーションは、+1プロリンがグリコシル化シークオンにあってはならないという観察と一致して、+1位でプロリン残基と不適合となるであろう。N結合型グリコシル化の特徴は、受容体シークオンの+2位でのセリンまたはトレオニンの要求である。PglB構造は、結合ペプチドの+2 Thrのβ-ヒドロキシル基が3つの水素結合を形成する(1つは、STT3タンパク質に厳密に保存された「WWDモチーフ」の各側鎖を有する)ことを明らかにして、分子的説明を提供する(図4)。WWDモチーフは、ペリプラズムドメインに位置し、2つのトリプトファン側鎖およびアスパラギン酸側鎖の相互作用が、セリンおよびトレオニンにのみ存在する官能基、β-ヒドロキシル基の水素結合能力を飽和させる。配置は、受容体アスパラギンから+2 Thrを物理的に離し、WWDモチーフはポリペプチド基質特異性を規定するが、該酵素の触媒活性に直接関与していないと考えられる。特に、構造は、グリコシル化シークオンの+2位での優先性および偏差も説明することができる。+2 Thrのγ-メチル基は、PglBの保存されたイソロイシンI572とファンデルワールス接触している(I572のγ-メチル基まで3.6Å距離、図4)。セリンが+2位にある場合、この安定化相互作用はない。これは、+2 Thrを含有する受容体シークオンは、受容体シークオンが+2セリンを含有する場合より40倍効率的にグリコシル化されることを説明することができる(Bause, E.、Biochem. Soc. T12、514〜517頁、1984)。構造は、非天然のS-立体配置トレオニンが、I572との立体衝突を引き起こすであろうことを示唆している。S-立体配置トレオニンは、実際、+2位にあってはならず、R-立体配置トレオニンと比べてグリコシル化効率が15'000倍低下する(Breuerら、Febs Lett. 501、106〜110頁、2001)。I572は、細菌で保存され、およびMxxIモチーフの一部であることが示唆されている(配列番号7; Maitaら、J. Biol. Chem. 285、4941〜4950頁、2010)。しかし、古細菌AglBタンパク質において対応する残基は、リジンであることが見出され(Iguraら、Embo J27、234〜243頁、2008)、真核生物STT3相同体との配列アライメントは、I572の明確な保存を明らかにせず、イソロイシン以外の残基は、相同タンパク質における+2 Thr���の接触をもたらすことができることを示唆している。PglB構造は、コンセンサスシークオンからの許容偏差も説明することができる。システインのβ-スルフヒドリル基は、β-ヒドロキシル基と類似した水素結合を形成することができるため、マウスグリコプロテオームの実験的に決定されたグリコシル化部位の約2.2%に存在する受容体配列N-X-C(Zielinskaら、Cell 141、897〜907頁、2010)は、恐らく許容される。グリシン、アラニンおよびバリンも、少量でのみではあるがグリコシル化シークオンの+2位で報告されている(Zielinskaら、Cell 141、897〜907頁、2010; Schwarzら、Glycobiology 21、45〜54頁、2011; Valliere-Douglassら、J. Biol. Chem. 284、32493〜32506頁、2009)。これらの残基は、サイズが同じであるまたはトレオニンより小さいため、原理的にPglBの結合ポケットに収まり得る。しかし、Xがトレオニンより大きいN-G-Xなどのシークオン、またはT/S-X-Nのシークオン(「逆シークオン(reverse sequon)」)(Valliere-Douglassら、J. Biol. Chem. 284、32493〜32506頁、2009)のグリコシル化は、PglBの構造により説明することができない。真核生物の酵素と比べて、細菌OSTは、受容体シークオンに対する追加の要件を有する。すなわち、グリコシル化は、負に帯電した残基(AspまたはGlu)が-2位に存在する場合にのみ効率的であり、コンセンサスシークオンD/E-X1-N-X2-S/Tをもたらす(配列番号3; Kowarikら、Embo. J. 25、1957〜1966頁、2006)。PglBにおいてアルギニン残基R331は、受容体ペプチドの-2 Aspへの塩橋を提供し(図4a)、これによりPglB-ペプチド相互作用を強化する。R331は、細菌で保存されるが、-2位での負電荷の要求が観察されない真核生物では保存されない。拡大されたシークオン認識は、受容体ポリペプチドの局所濃度が真核生物より低い可能性がある細菌における、より強いペプチド結合の必要性を反映している可能性がある。事実、AlaへのR331の変異は、DQNATグリコシル化部位を含有する3D5受容体タンパク質のグリコシル化効率の低下をもたらす(図4b)。しかし、R331A変異体は、野生型PglB(図4b)によりグリコシル化されないAQNAT(配列番号8)部位を含有する3D5のグリコシル化を可能にする。したがって、R331A変異体は、野生型PglBにより使用されないグリコシル化部位を選択的に占有するのに使用することができる。その結果、野生型酵素およびR331A変異体の組み合わせは、同じ糖タンパク質内の異なるグリカンの部位特異的結合を可能にする。
【００５３】
触媒部位
触媒ポケットは、PglBの右側の空洞に位置し(図3b)、膜境界の約8Å上に位置する結合陽イオンを特徴とする。結晶化溶液における高濃度のマグネシウム塩のため、触媒ポケットはMg2+としてモデル化された。全てのOSTのように、PglBは、二価陽イオンが結合された状態でのみ機能性である(Imperiali & Rickert、P. Natl. Acad. Sci. USA92、97〜101頁、1995; Sharmaら、Eur. J. Biochem. 116、101〜108頁、1981)。生理学的陽イオンは、Mn2+であることが示唆されているが、PglBはMg2+においても活性であり(未発表)、他の金属依存性グリコシルトランスフェラーゼについて以前に観察された特性である(Liu & Mushegian、Protein Sci. 12、1418〜1431頁、2003)。PglBの触媒ポケットは、TMドメインにより提供され、およびM2+を調整する3つの酸性側鎖(D56、D154、E319)を特徴とする(図5a)。現在の分解能では、M2+の追加のリガンドである可能性がある水分子はモデル化できない。触媒ポケットに位置する残基は、STT3タンパク質に保存されている。アスパラギン酸D154およびD156は、以前に報告されたD-X-Dモチーフに属し、およびPglB(GT-C)(Lairsonら、Annu. Rev. Biochem. 77、521〜555頁、2008); Liu & Mushegian、Protein Sci. 12、1418〜1431頁、2003)と同じグリコシルトランスフェラーゼファミリーのメンバー、マンノシルトランスフェラーゼGPI-MT-1におけるアラニンへのどちらかのアスパラギン酸の変異は、この酵素の活性を無効にした(Maedaら、Embo J20、250〜261頁、2001)。対照的に、D56およびE319は、触媒関連として以前に同定されていないが、これらのカルボキシル基は、受容体アスパラギンの金属イオンおよびアミド基と両方を相互作用させている。3つの酸性M2+結合残基の触媒関与を確かめるため、これらはアラニンに個別に変異され、得られたPglB変異体の活性が相補性アッセイにおいてテストされた(図2)。OSTは、本発明者らのアッセイにおいて制限的でないとしても、変異D154Aは観察されたグリコシル化収量を>50%低下させ、変異体D56AおよびE319Aは該収量を>90%低下させ、二重変異体D56A/E319Aは完全に不活性であった。
【００５４】
受容体アスパラギンのアミド基が、どのように活性化され得て、N結合型グリコシル化における主な段階、LLO基質のC1炭素に対する求核攻撃を行うのか、賛否両論の議論がある。窒素の自由電子対がカルボニル基の二重結合に共役されるため、アミドは弱い求核剤である(図5c)。結果として、N-C結合は二重結合特性を有し、および窒素の求核性は低い。アミド基の反応性を説明するために、アミド基の求核性の増加に対する+2 Ser/Thrのβ-ヒドロキシル基の直接の関与を引き合いに出し、受容体ペプチドの特定のコンフォメーション(「βターン」または「Asxターン」などの)が提案された(Bause & Legler、Biochem. J. 195、639〜644頁、1981; Imperialiら、J. Am. Chem. Soc. 114、7942〜7944頁、1992)。本発明者らのPglB構造におけるWWDモチーフへの+2 Thrの強い結合を考えれば、このような機構は除外され得る。代わりに、PglBの構造が、アミド窒素活性化を説明する明確な可能性を示す。すなわち、2つの触媒的に不可欠な酸性残基D56およびE319は、受容体アスパラギンのアミドプロトンと水素結合を形成するのに最適に配置されている。このような水素結合の形成は、アミド基のN-C結合の回転を必要とすることになり、これにより窒素原子の自由電子の非局在化を無効にし、およびカルボニル基との共役を壊す(図5c)。これは、アミド窒素の電気陰性の性質を増加させることになるだけでなく(N-H結合の分極および窒素上の電子密度の増加により)、活性化オリゴ糖基質(LLO)のC1炭素に対する求核攻撃に対し、最適に配置された反応性の孤立電子対を有するsp3ハイブリダイズ窒素も生成することになる。ほとんどのアミドにおいてN-C結合を回転させるためのエネルギー障壁は、16〜20kcal/molであると推定され、図5cに示された270°アミドコンフォメーションは、平面的なコンフォメーションと比較して、約18.6kcal/molのエネルギーを有すると計算されていた(Wiberg & Breneman、J Am Chem Soc. 114、7942〜7944頁、1992)。故に受容体アスパラギンのカルボキシアミド基の共役を永久に壊すのに十分なエネルギーを提供するには、1〜2つの低障壁水素結合を要することになる(Cleland & Kreevoy、Science 264、1887〜1890頁、1994)(各々が約10kcal/molに相当)。D56またはE319のカルボン酸は、グリコシル化反応の遷移状態においてこのような相互作用をもたらし得るが、水素結合の長さを確実に測定するにはより高い分解能構造を必要とするであろう。アスパラギン(D56N)へのD56の変異は、アラニンへのトランケーションよりさらに顕著な阻害効果を有し、E319Q変異体は完全に不活性である(図2)。これは、D56およびE319のカルボキシル基により提供される負電荷は触媒に不可欠であり、酸性側鎖は対応する等電子アミドにより置換できないことを示している。立体効果は、D56Aと比べたD56N、およびE319Aと比較したE319Qの阻害の増加を説明し得る。
【００５５】
グリコシル化機構
PglBが、洗浄剤(精製および結晶化に使用)に可溶化されたときでさえ活性であることを考えると、提供される構造は、機能的にコンピテントな状態を獲得している可能性がある。グリコシル化反応は、第1糖部分の置換C1炭素での立体配置の反転により生じる。ジ-N-アセチル-バシロサミン部分が活性化アミド窒素による求核攻撃に対して適正に整列され、脱離ピロリン酸基が二価金属イオンおよび保存R375と接触するように、LLO基質はPglB構造にモデル化された(図6a)。この配置は、追加のサッカリド部分をPglBの右手の空洞に置き、該空洞で追加のサッカリド部分は、TMおよびペリプラズムドメインの両方からの表面残基と接触することができる。該配置はまた、第1サッカリド部分(細菌および真核生物のLLOに存在するN-アセチル基)のC2置換基も保存チロシン残基(Y468)付近に置く。ここでは、結合水分子と一致する密度が観察される。図6aに示されているようにモデル化された場合、LLOの脂質テイルは、PglBの表面のほとんどが疎水性の溝に位置し、該テイルのイソプレノイド部分を脂質二重層に向ける。PglBにおける結合二価陽イオンの機能は、故に2倍になるようだ。すなわち、一方では、受容体アスパラギンと相互作用する酸性側鎖を方向付け、他方では、置換(脂質-ピロリン酸)の脱離基を安定化させ、故に反応を加速させる。これは、金属イオンが脱離基の安定化に役立つのみのGT-Aファミリーの金属依存性立体配置反転グリコシルトランスフェラーゼとは異なるであろう(上記Lairson参照)。
【００５６】
該構造に存在する受容体ペプチドおよび暫定的にモデル化されたLLO分子により、PglB触媒グリコシル化の塩基性の3状態触媒サイクルが提案され得る(図6b)。提案された機構の重要な要素は、結合受容体ペプチドの非存在下(基底状態)では柔軟であり、無秩序であると疑われる外部ループEL5の結合および遊離である。ペプチドが結合すると、このループは部分的に秩序化されるようになり、ペリプラズムドメインに対してペプチドを固定化し、これによりペプチドの動きを制限する。基本的なE319はEL5の部分であるため、これは同時に、受容体Asnが正しく方向付けられおよび活性化される触媒部位の形成をもたらす。この状態は、柔軟な露出されたタンパク質ループからのコンセンサスシークオンが結合ポケットに挿入される場合にのみ達し得る。次の段階では、活性化アミド窒素が第1サッカリド部分に求核攻撃を行うとすぐ、LLO結合がグリコシル化をもたらすと期待される。グリコシド結合がいったん形成されると、新たに結合された糖は、PglBに対し(具体的にはIle317およびHis485に対し)強く押し付けられ、EL5の遊離により解放され得る立体的緊張(steric tension)を引き起こす。これが、受容体Asn開口部を開き、グリコペプチドを該酵素から解離できるようにする。脂質結合ピロリン酸無水物のこの後の切断、およびグリコシル化タンパク質ドメインの折り畳みが、該反応の原動力に主に寄与している可能性がある。PglBは、ペプチドを結合する前にLLOも結合する可能性があることが知られており、事象の厳密な配列を示唆する実験的証拠はない。
【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図７−１６】
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【図７−９０】
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【図７−９２】
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【図７−９３】
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【図７−９４】
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【図７−９５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2014516519.tif 000109
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