(57)【要約】  本発明は、生物分解性、半結晶性、相分離、熱可塑性マルチブロックコポリマー、該マルチブロックコポリマーを調製する方法、少なくとも一種の生物活性化合物を送達するための組成物、及び生物活性化合物をそれを必要とする対象に送達するための方法に関する。本発明のマルチブロックコポリマーは、ａ）それが少なくとも一種の加水分解性プレポリマー（Ａ）セグメント、及び少なくとも一種の加水分解性プレポリマー（Ｂ）セグメントを含み；ｂ）該マルチブロックコポリマーが生理学的条件下で３７℃以下のＴｇと１１０〜２５０℃のＴｍを有し；ｃ）セグメントが多機能性鎖延長剤により結合しており；ｄ）セグメントがポリマー鎖にわたってランダムに分布し；ｅ）プレポリマー（Ａ）セグメントの少なくとも一部が水溶性ポリマーに由来する；ことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物分解性、半結晶性、相分離、熱可塑性マルチブロックコポリマーであって、
ａ）それが少なくとも一種の加水分解性プレポリマー（Ａ）セグメント、及び少なくとも一種の加水分解性プレポリマー（Ｂ）セグメントを含み；
ｂ）該マルチブロックコポリマーが生理学的条件下で３７℃以下のＴｇと１１０〜２５０℃のＴｍを有し；
ｃ）セグメントが多機能性鎖延長剤により結合しており；
ｄ）セグメントがポリマー鎖にわたってランダムに分布し；
ｅ）プレポリマー（Ａ）の少なくとも一部が水溶性ポリマーに由来する；
ことを特徴とする上記コポリマー。
【請求項２】
前記鎖延長剤が二官能性脂肪族鎖延長剤、好ましくは１，４−ブタンジイソシアネートのようなジイソシアネートである、請求項１記載の生物分解性、半結晶性、相分離、熱可塑性マルチブロックコポリマー。
【請求項３】
プレポリマー（Ａ）が環状モノマー及び／又は非環状モノマーの反応生成物を含み、該非環状モノマーは好ましくは、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、セバシン酸、乳酸、グリコール酸、ヒドロキシ酪酸、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオール、及び／又は１，６−ヘキサンジオールからなる群から選ばれ、該環状モノマーは好ましくは、グリコリド、ラクチド、ε−カプロラクトン、δ−バレロラクトン、トリメチレンカーボネート、テトラメチレンカーボネート、１，５−ジオキセパン−２−オン、１，４−ジオキサン−２−オン（パラジオキサノン）及び／又はオキセパン−２，７−ジオンのような環状無水物からなる群から選ばれる、請求項１又は２記載の生物分解性、半結晶性、相分離、熱可塑性マルチブロックコポリマー。
【請求項４】
前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリテトラメチレンオキシド（ＰＴＭＯ）及びポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）のようなポリエーテル；ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルカプロラクタム、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（ポリ−（ＨＥＭＡ））、ポリホスファゼン、ポリオルトエステル、ポリオルトエステルアミド、又は上述のポリマーのコポリマーからなる群から選ばれ、好ましくは前記水溶性ポリマーが１５０−５０００ｇ／ｍｏｌのＭｎを有するポリ(エチレングリコール)（ＰＥＧ）由来である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の生物分解性、半結晶性、相分離、熱可塑性マルチブロックコポリマー。
【請求項５】
水溶性ポリマーが追加のプレポリマーとして存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の生物分解性、半結晶性、相分離、熱可塑性マルチブロックコポリマー。
【請求項６】
前記プレポリマー（Ｂ）セグメントが、ヒドロキシアルカノアート、グリコリド、Ｌ−ラクチド又はＤ−ラクチド由来の結晶性ポリマーを含み、好ましくは前記プレポリマー（Ｂ）セグメントが、Ｌ−ラクチドプレポリマー及びＤ−ラクチドプレポリマーを、Ｌ−ラクチドとＤ−ラクチドの間のステレオコンプレックス形成が達成される量と比で含み、好ましくは前記プレポリマー（Ｂ）が１０００ｇ／ｍｏｌ以上、好ましくは２０００ｇ／ｍｏｌ以上、より好ましくは３０００ｇ／ｍｏｌ以上のＭｎを有するポリ（Ｌ−乳酸）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の生物分解性、半結晶性、相分離、熱可塑性マルチブロックコポリマー。
【請求項７】
生理学的条件下で１〜４、より好ましくは１〜２、最も好ましくは１〜１．５に亘る膨潤比を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の生物分解性、半結晶性、相分離、熱可塑性マルチブロックコポリマー。
【請求項８】
前記コポリマーが少なくとも０．１ｄｌ／ｇ、好ましくは０．２〜２ｄｌ／ｇの間の固有粘度を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の生物分解性、半結晶性、相分離、熱可塑性マルチブロックコポリマー。
【請求項９】
ｉ）多機能性鎖延長剤の存在下でプレポリマー（Ａ）とプレポリマー（Ｂ）の鎖延長反応を行う（ここでプレポリマー（Ａ）と（Ｂ）はいずれも末端がジオール又は二酸になっており、鎖延長剤の末端がジカルボン酸又はジオールになっている）か、又は
ｉｉ）カップリング剤を用いる鎖延長反応行う（ここでプレポリマー（Ａ）と（Ｂ）はいずれも末端がジオール又は二酸になっており、カップリング剤が好ましくはジシクロヘキシルカーボジイミドである）
ことを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の生物分解性、半結晶性、相分離、熱可塑性マルチブロックコポリマー。
【請求項１０】
薬物送達のための、好ましくはミクロスフェア、ミクロ粒子、ナノ粒子、ナノスフェア、ロッド、インプラント、ゲル、コーティング、フィルム、シート、スプレー、チューブ、膜、メッシュ、繊維、又はプラグの形態での、請求項１〜８のいずれか一項に記載の生物分解性、半結晶性、相分離、熱可塑性マルチブロックコポリマーの使用。
【請求項１１】
マトリクス中にカプセル化された少なくとも一種の生物活性化合物を含む、ホストに少なくとも一種の生物活性化合物を送達するための組成物であって、該マトリクスが少なくとも一種の、請求項１〜８のいずれか一項に記載の生物分解性、半結晶性、相分離、熱可塑性マルチブロックコポリマーを含む上記組成物。
【請求項１２】
前記少なくとも一種の生物活性化合物が非ペプチド非タンパク質の小型の薬物、又は生物活性ポリペプチドである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記非ペプチド非タンパク質の小型の薬物が、抗腫瘍剤、抗菌剤、セファロスポリン、アミノグリコシド、マクロライド、テトラサイクリン、化学療法剤、尿路消毒剤、嫌気性感染用薬剤、結核剤、ハンセン病薬、抗黴剤、抗ウイルス剤、抗蠕虫病薬、抗炎症剤、抗痛風薬、中枢作用（オポイド）鎮痛剤、局所麻酔剤、パーキンソン病薬、中枢作用筋弛緩剤、ホルモン又はホルモン抗アゴニスト、副腎皮質ステロイド、糖質コルチコステロイド、アンドロゲン、アンドロゲン性ステロイド、タンパク質同化ステロイド、抗アンドロゲン、エストロゲン、エストロゲン性ステロイド、抗エストロゲン、プロゲスチン、甲状腺薬、及び抗甲状腺薬からなる群から選ばれる一つ以上を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記生物活性ポリペプチドが、タンパク質／ペプチド薬、酵素、レセプターリガンド、神経伝達物質、阻害性ペプチド、調節性ペプチド、アクティベーターペプチド、サイトカイン、成長因子、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体フラグメント、抗腫瘍ペプチド、抗生剤、抗原、ワクチン、及びホルモンからなる群から選ばれる一つ以上を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記生物活性化合物が、１０００Ｄａ以下のＭｎを有する非ペプチド、非タンパク質の小分子であり、好ましくは前記マルチブロックコポリマーがプレポリマー（Ａ）のセグメントとして、及び／又は追加のプレポリマーとして、ポリ（エチレングリコール）を含み、該ポリ（エチレングリコール）が
ｉ）２００〜１５００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは６００〜１０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有し；
ｉｉ）５重量％〜２０重量％、好ましくは５重量％〜１０重量％の量で存在する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記生物活性化合物が、１００００Ｄａ以下の分子量を有する生物活性ポリペプチドであり、好ましくは前記マルチブロックコポリマーがプレポリマー（Ａ）のセグメントとして、及び／又は追加のプレポリマーとして、ポリ（エチレングリコール）を含み、該ポリ（エチレングリコール）が
ｉ）４００〜３０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは６００〜１５００ｇ／ｍｏｌの分子量を有し；及び／又は
ｉｉ）５重量％〜６０重量％、好ましくは５重量％〜４０重量％の量で存在する、請求項１１、１２又は１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記生物活性化合物が、１００００Ｄａ以上の分子量を有する生物活性ポリペプチドであり、好ましくは前記マルチブロックコポリマーがプレポリマー（Ａ）のセグメントとして、及び／又は追加のプレポリマーとして、ポリ（エチレングリコール）を含み、該ポリ（エチレングリコール）が
ｉ）６００〜５０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは１０００〜３０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有し；及び／又は
ｉｉ）５重量％〜７０重量％、好ましくは１０重量％〜５０重量％の量で存在する、請求項１１、１２又は１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
ミクロスフェア、ミクロ粒子、ナノ粒子、ナノスフェア、ロッド、インプラント、ゲル、コーティング、フィルム、シート、スプレー、チューブ、膜、メッシュ、繊維、又はプラグの形態での、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
ミクロスフェア及び／又はミクロ粒子の平均径が、好ましくは０．１〜１０００μｍの範囲、より好ましくは１〜１００μｍの範囲、さらにより好ましくは１０〜５０μｍの範囲にある、ミクロスフェア及び／又はミクロ粒子の形態での、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
生物活性化合物がポリマーマトリクス全体に溶解しているか分散している、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
ミクロスフェアが、単核又は複核状態でポリマーにより囲まれている、生物活性化合物が含まれたリザーバーを含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
リューマチ性関節炎、肝炎、糖尿病、メタボリックシンドローム、変形性関節症（骨関節炎）、腎疾患、炎症、局所疼痛過程、局所感染症、局所皮膚疾患、腫瘍（又は残っている可能性のある腫瘍細胞を破壊するための手術後処置としての外科的除去後の部位）、前立腺癌又は乳癌、末端肥大症（ａｇｒｏｍｅｇａｌｙ）、加齢黄斑変性症のような眼科疾患、パーキンソン病のような局所脳疾患、及び急性心筋梗塞、慢性心不全、又は関節硬化症のような心血管疾患を治療するための、請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
生物活性化合物をそれを必要とする対象に送達するための方法であって、請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の組成物の効果的用量を該対象に投与することを含む上記方法。
【請求項２４】
請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の組成物を製造する方法であって、
ａ）請求項１〜８のいずれか一項に記載の生物分解性、半結晶性、相分離、熱可塑性マルチブロックコポリマーの、ジクロロメタン又は酢酸エチルのような有機溶媒中への溶液に水溶性生物活性化合物の水溶液を乳化させ；
ｂ）引き続いて、得られたａ）のエマルジョンをポリビニルアルコールのような表面活性剤を含む水溶液に乳化させ、それにより水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）エマルジョンを得；そして
ｃ）有機溶媒を抽出してミクロスフェアを固化する
連続的工程を含む上記方法。
【請求項２５】
請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の組成物を製造する方法であって、
ａ）請求項１〜８のいずれか一項に記載の生物分解性、半結晶性、相分離、熱可塑性マルチブロックコポリマーのジクロロメタン又は酢酸エチルのような有機溶媒への溶液に固体粉末として生物活性化合物を分散させ；
ｂ）得られたａ）の分散液をポリビニルアルコールのような表面活性剤を含む水溶液に乳化させ、それにより水中油中固体（Ｓ／Ｏ／Ｗ）エマルジョンを得；そして
ｃ）有機溶媒を抽出してミクロスフェアを固化する
連続的工程を含む上記方法。
【請求項２６】
請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の組成物を製造する方法であって、
ａ）請求項１〜８のいずれか一項に記載の生物分解性、半結晶性、相分離、熱可塑性マルチブロックコポリマーの、ジクロロメタン又は酢酸エチルのような有機溶媒中への溶液に水溶性生物活性化合物の水溶液を乳化させ；
ｂ）得られたａ）のエマルジョンにシリコンオイルのようなポリマー沈殿剤を添加して初期のミクロ粒子を形成し；そして
ｃ）ポリマー沈殿剤と有機溶媒を抽出してミクロスフェアを固化する
連続的工程を含む上記方法。
【請求項２７】
請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の組成物を製造する方法であって、
ａ）請求項１〜８のいずれか一項に記載の生物分解性、半結晶性、相分離、熱可塑性マルチブロックコポリマーのジクロロメタン又は酢酸エチルのような有機溶媒中への溶液に固体粉末として生物活性化合物を分散させ；
ｂ）得られたａ）の分散液にシリコンオイルのようなポリマー沈殿剤を添加して初期のミクロ粒子を形成し；そして
ｃ）ポリマー沈殿剤と有機溶媒を抽出してミクロスフェアを固化する
連続的工程を含む上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物分解性、半結晶性、相分離、熱可塑性マルチブロックコポリマー、該マルチブロックポリマーの調製方法、少なくとも一種の生物活性化合物の送達用組成物、及び生物活性化合物をそれを必要とする対象へ送達するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチド及びタンパク質は、ともにポリペプチドと呼ばれ、すべての生物学的過程にきわめて重要な役割を果たし、薬物候補として近年注目を浴びてきている。ペプチド及びタンパク質薬学における急速な進歩は、他の技術の中でも組み換えＤＮＡ技術によるこれらの化合物の大規模生産と相俟って、これらの化合物に甚大なる関心を注いできた。不運にも、ペプチド及びタンパク質の開発は、好都合で効率的な送達システムを用いてこれらの化合物を全身的に又は局所的に送達する能力をはるかに凌いでしまっている。
【０００３】
生物分解性ポリマーは、全身的な又は部位特異的な薬物送達のために、長時間作用性の非経口制御放出系に使用するために過去十年に亘ってよりいっそうの注目を浴びてきた。生物分解性制御放出製剤は治療化合物の薬物動力学を大きく改善することができる。これは、全身的な血漿濃度が減少すると同時に、望ましくない副作用も減少するので、慢性疾患の治療に、及び治療的窓口の狭い化合物にとって特に関連性がある。また、新しい生物活性化合物の多くは半減期が短く、治療的に有効な血漿濃度を達成するには高い頻度での注射を必要とする。非経口的に投与された生物活性化合物の高頻度の投与計画に伴う高いコストと対象（患者）の薬剤服用順守は、生物分解性非経口制御放出剤形における関心を増大してきた。
【０００４】
ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）（ＰＤＬＬＡ）、及び乳酸とグリコール酸のコポリマーは、ＰＬＧＡコポリマーとしても知られ、非経口制御放出デポー製剤に使用するための極めて広く適用されている生物分解性ポリマーである。ＰＬＧＡコポリマーは、リスペリドン（ｒｉｓｐｅｒｉｄｏｎｅ）のような小分子、及びリュープロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）、ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）又はオクトレオチド（ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ）のような治療性ペプチドの持続性放出デポー製剤の開発にうまく利用されてきている。
【０００５】
しかし、ＰＬＧＡポリマーはその使用を制限し、ポリペプチドの送達への適正を減じる幾つかの欠点を有している。まず、ＰＬＧＡコポリマーは比較的疎水性のポリマーであり、カプセル化されたタンパク質にとって最適な環境を提供するものではない。タンパク質はポリマーに吸着して、緩慢で不完全な放出、タンパク質アンフォールディング及び／又は凝集を引き起こすことがある。第二に、カプセル化されたポリペプチドのような、より大きな生物活性化合物の放出を操作する能力が、そのような化合物が比較的固く膨潤性のないＰＬＧＡマトリクスに拡散することがほとんどないために、制限されることである。ＰＬＧＡコポリマーからのタンパク質の放出はそれ故、マトリクス中に存在する孔を介した拡散と、マトリクスの分解又は溶解時間に依存する。典型的には、カプセル化されたタンパク質はポリマーマトリクスがその一体性を失うか又は溶解する程度にまで分解される時まで、ポリマーマトリクス中にとらわれたままであり、その結果、ＰＬＧＡベースのデポー製剤について典型的に得られる二相性又は三相性分解依存性放出プロファイルとなる。最後に、ＰＬＧＡコポリマーの分解の間、酸性部分が形成され、これが固い膨潤性のないＰＬＧＡマトリクス中に蓄積して、１〜２程度の低いインシチュｐＨにもなり得るポリマーマトリクス中に酸性マクロ環境を形成する結果となる。このような酸性条件下では、カプセル化されたタンパク質は凝集体を形成して、不完全なタンパク質放出を起こすこともあり得る。さらに、低ｐＨはカプセル化されたペプチド又はタンパク質の構造一体性と生物活性に悪影響を与えるかもしれず、治療効果の減少と免疫原性の増大をもたらす可能性がある。アシル化やアダクト形成のようなタンパク質及びペプチドの化学修飾が報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、タンパク質送達への適性がより優れた生物分解性ポリマーに対する要求が存在する。しかし、ＰＬＧＡ及び関連ポリマーの利点の一つが、これらは臨床使用の実績があることがわかっており、一般的には高度に生体適合性であると考えられ、結果として、またリスク緩和の理由のため、デポー製剤の活性化合物を開発する製薬会社により採用されてきた。そのため、周知で生物学的に安全で、臨床的にも受容できるモノマーからなるポリマーの新しい生物分解性ポリマータンパク質送達系を設計することが望まれている。
【０００７】
タンパク質薬物の制御放出を可能にするためのタンパク質薬物の相溶性が改良された親水性マトリクスを提供する試みにおいて、Ｋｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．１９９６，３９（２），３１５−３２６）は、親水性ポリ（エチレンオキシド）Ｂブロックと、ポリ（Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）からなる、疎水性生物分解性Ａブロックを含むＡＢＡトリブロックコポリマーを合成した。Ｋｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．はポリ（Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）及びポリ（Ｌ−乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（Ｌ−乳酸）コポリマー、即ちＡＢＡ型のポリマー（ここで、Ａは疎水性ブロックであり、Ｂはポリエチレングリコールである。）からなるミクロスフェアから様々なタンパク質性化合物が持続的に放出されることを報告した。これらのコポリマーはしかしながら、Ａ／Ｂ比、即ちポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）含量に制限がある。高分子量ＰＥＧの使用に伴う腎クリアランス問題を防ぐために、これらのＡＢＡトリブロックコポリマーに用いるＰＥＧ部分の分子量は好ましくは５０００ｇ／ｍｏｌを超えるべきではない。従って、低ＰＥＧ分子量を維持しながらＫｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．により記載されたトリブロックポリマーとの高ＰＥＧ含量を得るために、疎水性ブロックもまた短くすべきである。これは、短いブロック長ではガラス転移温度（Ｔｇ）が室温よりも低くなり（発明者らにより決定された）、結晶性（ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）の場合）が極めた低いか存在しないので（Ｄｅ  Ｊｏｎｇ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９８，３１（１９），６３９７−６４０２）、粘着性の材料を生じ、導入された活性物の放出が（あまりにも）速すぎ、ほとんど制御されていないことになるので、生物材料として使用するには望ましくない特性を持ったポリマーを生じることになる。
【０００８】
相分離した、セグメント／ブロックコポリマーの例は、例えば、ＵＳ−Ａ−５，５５４，１７０、ＵＳ−Ａ−５，０６６，７７２、ＵＳ−Ａ−５，２３６、４４４、ＵＳ−Ａ−５，１３３，７３９、及びＵＳ−Ａ−４，４２９，０８０に見出される。これらの公知の材料は生物吸収性のコポリエステルであり、ハードブロックが主として結晶性ポリグリコリド及び／又はポリラクチドから組み立てられている。これらのポリマーは剛性で非膨潤性であり、そのためＰＬＧＡやＰＤＬＡについて述べたのと同じ不利益と制限を有しており、そのためタンパク質の持続放出には適していない。
【０００９】
１種の加水分解性ポリエステルセグメント及び１種の親水性の加水分解的に安定なセグメントを含む生物分解性マルチブロックコポリマーの薬物担持及び放出能力は研究されている（例えば、ε−カプロラクトンセグメント及びポリ（エチレングリコール）セグメントに基づくマルチブロックコポリマーはＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．により記載されている（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．，２００１，７３（２），３１５−３２７））。これらのポリマーは分解性のセグメントを１種しか含んでいないので、分解及び放出特性を制御する能力に制限がある。
【００１０】
一方、２種類の生物分解性プレポリマー（セグメント）の公知のマルチブロックコポリマーは、交互プレポリマー配列でしか作れないので、可能な種類の範囲が制限される（Ｐｅｎｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．２０００，７８（１０），１７２１−１７２８）。
【００１１】
加水分解性ポリエステルセグメントを含む様々な組成の生物分解性マルチブロックコポリマーの例は、ＷＯ−Ａ−２００４／００７５８８に記載されている。これらのマルチブロックコポリマーは、３７℃未満のＴｇ（ガラス転移温度）を有する非晶質で「ソフト」な生物分解性プレポリマー（Ａ）のセグメントと、４０〜１００℃の相転移温度を有する半結晶性で「ハード」な生物分解性プレポリマー（Ｂ）のセグメントとを有する生物分解性相分離コポリマーを含み、それらのセグメントは多機能性の鎖延長剤により結合されている。ＷＯ−Ａ−２００４／００７５８８に開示されているように、４０〜１００℃のＴｍを持ったマルチブロックコポリマーを得るために、Ｂセグメントに用いるためのプレポリマーの選択は、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）（ＷＯ−Ａ−２００４／００７５８８）、ポリ（バレロラクトン）（ＰＶＬ）及び／又はポリジオキサノン（ＰＤＳ）からなるプレポリマーに制限される。ＰＤＳをセグメントＢとして用いる場合、８０〜９０℃のＴｍを持ったマルチブロックコポリマーが得られる（ＵＳ−Ａ−５，７１１，９５８）。ＰＣＬをセグメントＢとして用いる場合、４０〜６０℃のＴｍを持ったマルチブロックコポリマーが得られる（ＷＯ−Ａ−２００４／００７５８８）。ＰＶＬホモポリマーはＰＣＬホモポリマーに近いＴｍを有する（即ち、〜６０℃）。従って、ＰＶＬをセグメントＢとして用いると、４０〜６０℃のＴｍを持つマルチブロックコポリマーが得られるであろう。ＰＤＳ、ＰＣＬ、及びＰＶＬはそれぞれ−１０、−６０及び−６０℃という比較的低いＴｇを有する。ＰＤＳ、ＰＣＬ、及びＰＶＬセグメントの低いＴｇは、得られ得るマルチブロックコポリマー（ここでＴｇは非晶質セグメントＡと半結晶性セグメントＢの非晶質部分の相混合に由来する）のＴｇ範囲を制限するので、放出及び分解特性による制御を制限する。
【００１２】
ＷＯ−Ａ−９９／０２１６８は、ＡＢＡ又はＡＢ型のいずれかのプレポリマーが鎖延長している生物医学応用のための生物分解性マルチブロックコポリマーを記載している。ＡＢＡ又はＡＢ型のいずれかのプレポリマーの鎖延長は交互マルチブロックコポリマーを形成することしかできない。交互ブロックコポリマーはＡＢプレポリマーの鎖延長の場合にはＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢにより表され、またＡＢＡプレポリマーの鎖延長の場合にはＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡにより表される。
【００１３】
ハード及びソフトセグメントを含む生物分解性相分離マルチブロックコポリマーはＵＳ−Ａ−６，１６０，０８４に記載されている。この書類はトリメチルヘキサン−１，６−ジイソシアネート（ＴＨＤＩ）で結合したプレポリマーからなるＰＣＬ−ＰＬＬＡマルチブロックコポリマーの使用を記載している。これらの材料は形状記憶が要求される薬物送達系で有用であると言われている。ＵＳ−Ａ−２００６／０，１４０，９９９号明細書は、薬物放出系で使用するための同様の形状記憶ポリマーの使用を記載しており、形状記憶材料は、カプロラクトン、ラクチド、グリコリド、及びジオキサノンからなる群から選ばれるモノマー由来の単位を含んでいる。例としては、ＰＤＳ―ＰＣＬ及びＰＤＳ―ＰＬＧＡマルチブロックコポリマーが挙げられる。これらの材料は、膨潤によって機械特性の損失を招き、そのため記憶された形状を失うことになるため、（シミュレートされた）生理的条件下では大きな膨潤能力を示すことができない。
【００１４】
他の相分離セグメント化マルチブロックコポリマーとしては、ＵＳ−Ａ−５，９８０，９４８号明細書に記載のポリエーテルエステルコポリマーが挙げられる。これらのコポリマーは結晶性芳香族セグメントと加水分解性エステル結合により結合されたソフトＰＥＧ−含有セグメントからなる。コポリマーには、膨潤性の低い組成物、即ち疎水性芳香族セグメントに富んだ組成物が、芳香族セグメントの高い結晶性と疎水性のために、十分に分解されないという固有の短所を有している。膨潤性の高い組成物、即ちＰＥＧに富んだ組成物も、エステル結合の濃度が低いために、十分に分解されない。対照的に、本発明のマルチブロックコポリマーは、セグメントＡだけでなくセグメントＢにもエステル結合が存在するので、各セグメントＡ／セグメントＢ比で分解可能である。さらに、本発明のマルチブロックコポリマーとは対照的に、ポリエーテルエステルコポリマーのＴｇは変化することができず、常に低く、ＰＥＧのＴｇ、即ち−３０℃の付近である。
【００１５】
本発明の目的は従来技術で見られる短所の一つ以上を克服することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
第一の局面では本発明は、生物分解性、半結晶性、相分離、熱可塑性マルチブロックコポリマーであって、
ａ）それが少なくとも一種の加水分解性プレポリマー（Ａ）セグメント、及び少なくとも一種の加水分解性プレポリマー（Ｂ）セグメントを含み；
ｂ）該マルチブロックコポリマーが生理学的条件下で３７℃以下のＴｇと１１０〜２５０℃のＴｍを有し；
ｃ）セグメントが多機能性鎖延長剤により結合しており；
ｄ）セグメントがポリマー鎖にわたってランダムに分布し；
ｅ）プレポリマー（Ａ）の少なくとも一部が水溶性ポリマーに由来する；
ことを特徴とする上記コポリマーに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】５０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０のＤＳＣサーモグラフ。
【図１Ｂ】３０ＬＰ３０Ｌ４０−ＬＬ４０のＤＳＣサーモグラフ。
【図１Ｃ】５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０のＤＳＣサーモグラフ。
【図２】３０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、５０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、７０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０、及び３０ＣＰ３０Ｃ４０−ＬＬ４０からなるフィルムからのリゾチームの累積的放出。フィルムは１０重量％リゾチームを担持させた。放出はｐＨ７．４（ｎ＝３）のリン酸バッファー中３７℃で測定した。
【図３】３０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、５０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、７０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、３０ＬＰ３０Ｌ４０−ＬＬ４０、及び３０ＣＰ３０Ｃ４０−ＬＬ４０からなるフィルムからのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の累積的放出。フィルムは１０重量％ＢＳＡを担持させた。放出はｐＨ７．４（ｎ＝３）のリン酸バッファー中３７℃で測定した。
【図４】フィルムからのリゾチームの累積的放出に対するマルチブロックコポリマーの親水性ブロックの組成の効果。フィルムは、５０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、５０ＧＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０、又は５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０（２５重量％ＰＥＧ１０００）からなり、１０重量％リゾチームで担持させた。放出はｐＨ７．４（ｎ＝３）のリン酸バッファー中３７℃で測定した。
【図５】１０重量％リゾチーム（３７℃、リン酸バッファーｐＨ７．４）を含む３０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０又は５０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０からなるフィルムから放出されたリゾチームの活性、及び時間の関数として（ｎ＝３）、４と３７℃で保存したリゾチーム溶液（０．０１重量％、リン酸バッファーｐＨ７．４）のリゾチーム活性。
【図６】３〜４重量％のＢＳＡを担持させた３０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０及び５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０からなるミクロスフェアからのＢＳＡのｐＨ７．４（ｎ＝３）のリン酸バッファー中３７℃でのインビトロ放出。
【図７】Ｗ／Ｏの溶媒キャストにより作成したＩＧＦ−１担持５０ＣＰ３０Ｃ４０−ＬＬ４０及び３０ＣＰ３０Ｃ４０−ＬＬ４０フィルムからのＩＧＦ−１のインビトロ放出。放出はｐＨ７．２（ｎ＝３）のリン酸バッファー中３７℃で測定した。実線はＵＰＬＣにより測定したＩＧＦ−１放出を表す。点線はＥＬＩＳＡにより測定されたＩＧＦ−１放出を表す。
【図８】Ｗ／Ｏ／Ｗダブルエマルジョンルートにより調製された、０．２重量％ＩＧＦ−１担持５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０ミクロスフェアのＳＥＭ写真。
【図９】様々なＩＶの５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０から調製された０．２重量％ＩＧＦ−１担持ミクロスフェアからのＩＧＦ−１のインビトロ放出。放出はｐＨ７．２（ｎ＝３）のリン酸バッファー中３７℃で測定した。
【図１０】１及び２週間後の様々なｕｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘ速度を用いて調製された０．２重量％ＩＧＦ−１ターゲット担持の５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０ミクロスフェアから放出されたＩＧＦ−１のＳＤＳ  ＰＡＧＥ結果。
【図１１】２０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、３０ＬＰ６Ｌ２０−ＬＬ４０及び３０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０  （タンパク質Ａ含量５重量％；膜厚８０〜１２０μｍ）からなるフィルムからのタンパク質Ａ（分子量１５０００Ｄａ）インビトロ放出。放出はｐＨ７．４（ｎ＝３）のリン酸バッファー中３７℃で測定した。
【図１２】内部水性相Ａ：０％イヌリン、Ｂ：２％イヌリンで様々な量のイヌリンを用いて調製した３０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０（ＩＶ  ０．７１ｄｌ／ｇ）からなる３〜４重量％タンパク質Ａ担持ミクロスフェアのＳＥＭ写真。１：俯瞰、２：ズームイン。
【図１３】ｐＨ７．４（ｎ＝３）のリン酸バッファー中３７℃での、任意に２又は５重量％のイヌリンで共カプセル化してもよい３〜４重量％タンパク質Ａターゲット担持の３０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０からなるミクロスフェアからのタンパク質Ａのインビトロ放出。
【図１４】ｐＨ７．４（ｎ＝３）のリン酸バッファー中３７℃での、３〜４重量％タンパク質Ａターゲット担持の３０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０及び異なるポリマーＩＶからなるミクロスフェアからのタンパク質Ａのインビトロ放出。
【図１５】１日後（レーン４）、７日後（レーン７）、１４日後（レーン８）、及び２１日後（レーン９）の４重量％タンパク質Ａ及び２重量％イヌリンターゲット担持の３０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０ミクロスフェアから放出されたタンパク質ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果。レーン５：分子量マーカー。レーン６：タンパク質Ａ標準。ただし、暗色の染色部分はリン酸緩衝塩の着色による。
【図１６】担持された２０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０（ペプチド担持５及び１０重量％；膜厚８０〜１００μｍ）からなるフィルムからのペプチドＡ（分子量２５００）のインビトロ放出。放出はｐＨ７．４（ｎ＝３）のリン酸バッファー中３７℃で測定した。
【図１７】２０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０（粒径３０μｍ；ペプチド担持１０重量％）からなるミクロスフェアからのペプチドＡ（分子量２５００）のインビトロ放出。放出はｐＨ７．４（ｎ＝３）のリン酸バッファー中３７℃で測定した。
【図１８】２０ＬＰ１０２０−ＬＬ４０−及び１０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０の様々なブレンドからなるミクロスフェアからのラパマイシンのインビトロ放出。
【図１９】Ｗ／Ｏ／Ｏ法により調製されたゴセレリン担持２０ＬＰ１０２０−ＬＬ４０ミクロスフェアのＳＥＭ写真。
【図２０】Ｗ／Ｏ／Ｏ法により調製された２０ＬＰ１０２０−ＬＬ４０ミクロスフェアからのゴセレリンのインビトロ放出。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のマルチブロックコポリマーは少なくとも二種の異なるセグメントからなることができ、各セグメントは異なる物理的特徴（分解及び膨潤特性を含む）を有している。その独特の構成及びその半結晶性相分離モルホロジーにより、本発明の材料は驚くことに用途が広く、特定の治療剤をカプセル化したり、カプセル化された治療剤を局所的に又は全身循環的に放出することを維持したりするのに有用な薬物送達マトリクス及び薬物溶出コーティングを構成するのに極めて適している。以下、本明細書中に記載するように、本発明の組成物は生物活性ポリペプチドのような生物活性化合物のホストへの制御放出にとって特に利益がある。
【００１９】
本明細書で使用する「相分離された」という用語は、系、特に、二種類以上の異なるプレポリマーからなり、その少なくとも二種は体温以下で（人体のような生理学的条件下で）互いに（部分的に）非相溶性のプレポリマーからなるコポリマーを指すものとする。従って、プレポリマーは組み合わせても、プレポリマーの物理的混合物として組み合わせても、プレポリマーを「化学混合物」として、つまりコポリマーとして、単一の化学種に組み合わせても、均一な混合物を形成しない。
【００２０】
本明細書で使用する「プレポリマー」という用語は、多機能性鎖延長剤によりランダムに結合し、本発明のマルチブロックコポリマーを一緒に作り上げるポリマーセグメントを指すものとする。各プレポリマーは適切なモノマーの重合により得ることができ、従ってそれらのモノマーは各プレポリマーの化学単位となっている。プレポリマーの望ましい特性、結果として本発明のマルチブロックコポリマーの望ましい特性は、適当な組成と分子量（特にＭｎ）のプレポリマーを選択することにより制御することができ、その結果必要なＴｍ又はＴｇが得られる。
【００２１】
本明細書で使用する「マルチブロック」という用語は、ポリマー鎖中に少なくとも二種の異なるプレポリマーセグメントが存在することを指すものとする。
【００２２】
本明細書で使用する「熱可塑性」という用語は、マルチブロックコポリマーの非架橋性の性質を指すものとする。加熱することにより、熱可塑性ポリマーは液状となり、一方（再）冷却することにより固化する。熱可塑性ポリマーは適当な溶媒に可溶である。
【００２３】
本明細書で使用する「加水分解可能な」という用語は、水と反応した際に分子が解裂する能力を指すものとする。加水分解可能な基としてはエステル、カーボネート、ホスファゼン、アミド、及びウレタン基が挙げられる。生理学的条件下では、エステル、カーボネート、及びホスファゼン基だけが合理的な時間スケールで水と反応する。
【００２４】
本明細書で使用する「多機能性鎖延長剤」という用語は、鎖延長剤上に少なくとも二種の反応性基が存在して、反応性プレポリマーを化学的に結合させ、それによりマルチブロックコポリマーを形成できることを指すものとする。
【００２５】
本明細書で使用する「ランダムマルチブロックコポリマー」という用語は、異なるセグメントがポリマー鎖に亘ってランダムに分布しているマルチブロックコポリマーを指すものとする。
【００２６】
本明細書で使用する「水溶性ポリマー」という用語は、生理学的条件下で水性媒体、好ましくは水に良好な溶解性を有するポリマーを指すものとする。このポリマーはより疎水性の部分とコポリマー化すると、得られるコポリマーは水に対して膨潤性になる。水溶性ポリマーはジオール、ジアミン、又は二塩基酸から得られる。ジオール又は二塩基酸は環状モノマーの開環重合を開始させるために適切に用いられる。
【００２７】
本明細書で使用する「膨潤性」という用語は、ポリマーによる水の取り込みを指すものとする。膨潤比は水で膨潤したコポリマーの質量を乾燥コポリマーの質量で割ることにより計算することができる。
【００２８】
本明細書で使用する「半結晶性」という用語は、二つの異なる相、非晶質相と結晶相を含むマルチブロックコポリマーのモルホロジーを指すものとする。好ましくは、マルチブロックコポリマーは非晶質相と結晶相から構成される。
【００２９】
本明細書で使用する「生物活性化合物」という用語は、治療又は予防効果を提供するいかなる剤として広く解釈されることを意図している。このような剤としては、抗菌剤（抗細菌剤及び抗黴剤を含む）、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、ホルモン、及び免疫原剤が挙げられるが、これらには限定されない。
【００３０】
本明細書で使用する「生物活性ポリペプチド」という用語は、哺乳動物の身体で、より多くの場合特に人体で生物学的に活性なペプチド及びタンパク質を指すものとする。
【００３１】
本発明の半結晶性相分離マルチブロックコポリマーは上記の短所と制限の一つ以上を克服する。水溶性ポリマー（例えば、親水性ＰＥＧセグメント）由来のセグメントの存在により、相分離マルチブロックコポリマーは水性環境下で膨潤し、タンパク質のような生物活性化合物にとって生来の環境を提供する膨潤ヒドロゲルを形成する。本発明のマルチブロックコポリマーを、生物活性化合物を送達するための制御放出製剤のポリマーマトリクスとして応用する場合、マルチブロックコポリマーの膨潤性により、ポリマー鎖の加水分解の間に形成される酸性分解生成物のポリマーマトリクス中への蓄積を防止することができる。代わりに、そのような分解生成物がマトリクスから放出され、それによりカプセル化された生物活性化合物にとって有害となるであろうポリマーマトリクス内酸性ミクロ環境の形成を防止する。さらに、本発明の相分離マルチブロックコポリマーの膨潤性により、カプセル化された化合物はいずれも拡散により徐々に放出されることができ、これによりポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）又はポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）のような非膨潤性生物分解性ポリエステルについて典型的に得られる二相又は三相の放出パターンを防止することができる。
【００３２】
本発明のマルチブロックコポリマーは生理学的条件下で１１０〜２５０℃のＴｍを有する。これはプレポリマーセグメントＢによるものである。セグメントＢはＰＬＬＡ、ポリ（Ｄ−乳酸）（ＰＤＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）若しくはポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）のような結晶性ポリマー、又は結晶性ポリマーの組み合わせに基づいている。最も好ましくは、セグメントＢはＰＬＬＡからなるプレポリマーに基づいている。本発明の相分離マルチブロックコポリマーの非晶質相は主としてソフトＡセグメントからなる。驚くべきことに、本発明者らはハードセグメントＢの非晶質相もまた本発明のマルチブロックコポリマーの全体的な非晶質相に貢献する。
【００３３】
ＷＯ−Ａ−２００４／００７５８８に記載されたマルチブロックコポリマーについて、Ｂセグメントとして用いるべきプレポリマーの選択は、プレポリマー（Ｂ）のＴｍが（生物医学応用に用いられる共通のポリエステルに関し）４０〜１００℃の範囲にあるため、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（バレロラクトン）（ＰＶＬ）、及びポリ（ジオキサノン）（ＰＤＳ）に制限される。本発明に従って、プレポリマー（Ｂ）のＴｍは好ましくは１１０〜２５０℃の範囲にある。結果として、プレポリマー（Ｂ）はこれまでに考慮されなった化学的に異なるプレポリマーのリストから選択することができる。本発明者らは、プレポリマー（Ｂ）の異なる化学反応によりマルチブロックコポリマーを与え、これらがＷＯ−Ａ−２００４／００７５８８に記載されたコポリマーでは得られない有利な特性を発揮することを見出したのである。
【００３４】
ＰＤＳをセグメントＢとして用いる場合、８０〜９０℃のＴｍを有するマルチブロックコポリマー（ＵＳ−Ａ−５，７１１，９５８）が得られる。ＰＣＬをセグメントＢとして用いる場合、４０〜６０℃のＴｍを有するマルチブロックコポリマー（ＵＳ−Ａ−５，７１１，９５８）が得られる。ＰＶＬホモポリマーはＰＣＬホモポリマーと同様におよそ６０℃のＴｍを有する。ＰＶＬセグメントをセグメントＢとして用いる場合、およそ４０〜６０℃のＴｍを有するマルチブロックコポリマーが得られる。ＰＤＳ、ＰＣＬ、及びＰＶＬは半結晶性であり、従ってＴｍのほかにＴｇも有する。ＰＤＳ、ＰＣＬ、及びＰＶＬはすべて、それぞれおよそ−１０℃、−６０℃及び−７０℃というそれぞれの非晶質相の低いＴｇを有する。ブロックＢの温度範囲を１１０〜２５０℃に上げると、ＰＬＬＡ、ＰＤＬＡ、ＰＧＡ、及びＰＨＢを使用する可能性が開けてくる。これらのポリマーはそれぞれ約５０℃、３５℃、及び０℃のより高いＴｇを有している。ハードＢセグメントにいずれのポリマーを用いるかにかかわらず、これらのハードＢセグメントは常にそれ自身で半結晶性、即ち、部分的に非晶質である。驚くべきことに、ハードＢセグメントの非晶質部分はソフトＡセグメントと（部分的に）相混合し、従って両者ともマルチブロックコポリマーの全体Ｔｇに寄与している。それ故、非晶質相のＴｇはセグメントＡのＴｇ及びセグメントＢのＴｇの両方によりセグメントＡ／Ｂのモル比と組み合わせて決定される。Ｔｇはプレポリマー（Ａ）（プレポリマーＡ／Ｂ比が１に近いものを用いる場合）に近いＴｇから、プレポリマー（Ｂ）（プレポリマーＡ／Ｂ比が０に近いものを用いる場合）に近いＴｇにまで変化することができる。重要なことには、ポリマーマトリクス中にカプセル化された活性剤の放出は、活性剤の拡散が非晶質相を介して起こり、密度の高い結晶相を介して起こるのではないため、非晶質相のＴｇに強く依存する。ポリマーの分解速度もまた、非晶質相のＴｇが水流入の速度に影響を与え、それ故加水分解の速度に影響を与えるので、非晶質相のＴｇに強く依存する。比較的高いＴｇを有するＴｍ１１０〜２５０℃のプレポリマー（Ｂ）を使用することにより、Ｔｍ４０〜１００℃と比較的低いＴｇを有するプレポリマー（Ｂ）で得られたであろうよりもずっと広い範囲のＴｇをカバーすることができる。結果として、このようなプレポリマー（Ｂ）を用いて１１０〜２５０℃の範囲のＴｍを有するマルチブロックコポリマーを調製すると、ポリマーのずっと広い範囲の放出及び分解特性が可能となり、従ってまた、様々な生物活性化合物の放出についてより良好な制御が可能になる。
【００３５】
さらに、本発明のマルチブロックコポリマーのより高いＴｍにより、周囲条件でダブルエマルジョン過程により、べたつきがないが依然として短いＢセグメントを有するミクロスフェアの調製が可能になる。結晶化可能なＢセグメントの長さに制限があることは、より高い分子量の結晶性ＰＬＬＡポリマーとは逆に、生理学的条件下で十分に分解するマルチブロックコポリマーを得るために重要である。対照的に、短いＰＣＬブロックはミクロスフェア形成の間、結晶性ドメインを形成しないので、ミクロスフェアは、セグメントＢが短いＰＣＬからなるマルチブロックコポリマーを用いて作成することはできない。結果として、ポリマーは非晶質のままである。非晶質ポリマーの低いＴｇのため、ポリマーは粘着性であり、そのためミクロスフェアが抽出／蒸発プロセス工程の間、凝集して一緒に融合する。ＰＶＬはＰＣＬに近いＴｍを有するので、ミクロスフェアはセグメントＢが短いＰＶＬプレポリマーからなるマルチブロックコポリマーを用いて作成することができないということが予想される。ＰＤＳ又はＰＤＳコポリマーからなるミクロスフェアについては文献には一切言及されていない。文献からは、速い冷却速度及び／又は低いＰＤＳ分子量では、ＰＤＳの結晶化が遅く不完全であることが知られている。これらの結果は、短いＰＤＳブロックであるセグメントＢを有するマルチブロックコポリマーを用いるダブルエマルジョンプロセスによってはミクロスフェアを調製することが可能ではないことを予想させる。
【００３６】
理論的には、１１０〜２５０℃のＴｍを有するプレポリマー（Ｂ）で作成した、周囲条件でのミクロスフェアの保存安定性は、４０〜１００℃のＴｍを有するプレポリマー（Ｂ）に比べて改良されている。Ｔｍが増加するとＴｃを増大させ、従ってミクロスフェアの結晶性を増大させる。結晶性が高くなるとポリマーマトリクス中にカプセル化された生物活性化合物の分子移動性が減少し、生成物の保存安定性が改良されるであろう。結晶性が高くなれば粒子の保存安定性が増大することは文献から知られている。また、１１０〜２５０℃のＴｍを有するプレポリマーＢは４０〜１００℃のＴｍを有するプレポリマー（Ｂ）に比べてより高いＴｇを有している。非晶質粒子と同様、半結晶性粒子について、Ｔｇの上昇が保存安定性を改良することは文献から知られている。
【００３７】
本発明のマルチブロックコポリマーは更に、結晶化可能なセグメントがＰＣＬに基づいているマルチブロックコポリマーに比べて、分解速度が改良されている。これは、本発明のマルチブロックコポリマーにおけるＢセグメントがＰＣＬに比べて疎水性が小さいためである。
【００３８】
結晶化可能なセグメントがＰＤＳに基づいているマルチブロックコポリマーの合成は、ＰＤＳモノマー、ｐ−ジオキサノンの重合が制限されることにより妨害され、通常の溶媒におけるＰＤＳの安定性が制限されることにより妨害される。ｐ−ジオキサノンが比較的低い上限温度を有し、約８０％の最大変換率となることは周知である。対照的に、ラクチドやグリコリドのような、本発明のマルチブロックコポリマーに使用されるモノマーは容易に重合され、９５％を超える転換率とすることができる。ＰＤＳを含むポリマーの溶解性が制限されることはまた、制御放出製剤の調製のためにそれを使用することも制限される。
【００３９】
ＰＬＬＡベースのセグメントＢからなる本発明のマルチブロックコポリマーは、ＰＤＬＡを追加のＢセグメントとして加えることができるというもう一つの利点を有し、結晶性が向上し、分解速度が減少したマルチブロックコポリマーを与えるが、これはＬ−ラクチドエナンチオマーだけからなる結晶性ＰＬＬＡセグメントのＴｍより約５０℃高い、２２０℃ほどの高いＴｍを有するＰＬＬＡ／ＰＤＬＡステレオコンプレックス結晶の形成によるものである。
【００４０】
本発明のマルチブロックコポリマーにおいて、水溶性ポリマー由来のセグメントの含量は、疎水性（結晶性）セグメントのブロック長とは独立に変化させてもよい。それ故、結晶性を維持しながら、水溶性ポリマー由来のセグメントの含量を高くすることもできる。更に、本発明のマルチブロックコポリマーの固有粘度（ＩＶ）は、Ｋｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．により記載されたＡＢＡトリブロックコポリマーとは対照的に、組成とは独立して変化させることができる。本発明のマルチブロックコポリマーの変動率が高いので、望ましい分解特性及び薬物放出動力学を得るためにセグメントの長さ、比、及び組成を容易に調整することができる。
【００４１】
本発明のマルチブロックコポリマーはさらに、紹介例で言及した構造ＡＢＡのブロックコポリマーよりも有利な点がある。ホモ又はランダムコポリマーの代わりに異なるコポリマーのブロックを有するブロックコポリマーを用いることによりポリマー特性を大きく改善することができるが、これらＡＢＡコポリマーは依然として或る不利な点を有している。
【００４２】
ＡＢＡコポリマーの最小分子量を得るために、シーケンスＡとＢは或る長さを有していなければならない。ブロックは同様の組成を持った個々のホモポリマーとして独立に作用するかもしれない。ＡＢＡ型のコポリマーの特性はＡ及びＢブロックの組成を変化させることにより調整することができるだけである。他の不利な点は、ブロックコポリマーはすべてのモノマーの完全な変換と、十分な分子量を得るために、不活性条件下で比較的高温（＞１００℃）で調製しなければならない。第一の不利な点はブロック又はセグメントがはるかに短く、１００℃未満の温度で行われた化学反応によって一緒に結合されたマルチブロックコポリマーを用いることにより解決することができる。分解作用といった特性は、セグメント長、比、及び組成の適切な組み合わせを選択することによりはるかに良好に調整することができる。
【００４３】
さらに、ＡＢＡブロックコポリマー（及びその誘導体）を調製するプロセスで用いられる比較的高温のために、常にエステル交換反応の可能性があり、その結果、一定量の相の混合が生じる。本発明のマルチブロックコポリマーは、あらかじめ決定したモノマー組成で、かなり低い温度（＜１００℃）でプレポリマーを結合することにより調製することができ、それによりエステル交換反応や、望ましくない分解や他の副生物の生成を起こすかもしれない他の副反応を避けることができるので、この不利な点を被ることがない。このことは、ランダムコポリマーの合成に通常適用されるように、コポリマーのモノマーシーケンス長が反応時間や温度によってよりもむしろ、構成成分の選択により決定づけられることを意味している。多機能性鎖延長剤を用いてプレポリマーを結合することにより調製された本発明のマルチブロックコポリマーのもう一つの利点は、プレポリマーセグメントがコポリマー中にランダムに分布し、そのため特性を調整する可能性をはるかに多く提供することである。ランダムマルチブロックコポリマーは例えばＡＢＢＢＢＡＢＡＡＡＢＢＡＡＡＡＡ．．．などである。本発明のランダムマルチブロックコポリマーは、交互的なマルチブロックコポリマーでは得られない多くの利点を提供する。
【００４４】
まず、Ａ及びＢブロックの鎖延長剤により得られるランダムマルチブロックコポリマーにはＡ対Ｂの比に制限がない。Ａ：Ｂは例えば、１０：９０でもよいが、同様に９０：１０であってもよい。逆に、交互マルチブロックコポリマーにおけるブロックの比は鎖延長されたポリマーで用いられる比に制限される。例えば、ＡＢの鎖延長剤の場合には、マルチブロックコポリマーにおけるＡ：Ｂ比は５０：５０である。本発明のマルチブロックコポリマーのランダムな性質は材料の組成の可能性を大きく広げ、そのため物理的及び化学的特性の制御を大きく向上させる。これには、水への膨潤性能、モルホロジー（相分離、非晶質／結晶性）、及びポリマー分解の良好な制御も含んでいる。
【００４５】
第二に、本発明のランダムマルチブロックコポリマーの合成方法は、交互マルチブロックコポリマーの合成に比較して時間も労力もはるかに少なくて済む。交互マルチブロックコポリマーでは、ＡＢジブロックの場合セグメントＡもＢも、又はＡＣＡトリブロックの場合のセグメントＡ及びＣは、鎖延長に先立って結合しておかなければならない（或いはマクロ鎖延長剤を合成しておく必要がある）。ランダムマルチブロックコポリマーでは、別々のＡ及びＢブロックは、例えば、市販の鎖延長剤で鎖延長される。
【００４６】
本発明のマルチブロックコポリマーのもう一つの利点は、それらが多機能性（好ましくは脂肪族）鎖延長剤に基づいていることである。鎖延長剤のタイプ及び量を選択することにより、ポリマーの特性は影響を受ける（例えば、鎖延長剤は柔軟剤として作用することもでき、又は相分離の程度に影響を与えることもできる）。そのため、望ましい特性を持ったポリマーを得るための自由度の総合的な程度は、従来技術のポリマーに比べて増大する。
【００４７】
本発明によれば、水性環境下、投与時の生理学的環境下で十分に膨潤して、カプセル化したペプチド又はタンパク質の水性ミクロ環境を提供し、ペプチド及びタンパク質の拡散制御放出を可能にする相分離マルチブロックコポリマーが提供される。かくして材料は機械的強度の顕著な減少を示す。そのような材料は乾燥条件下で形状記憶材料として用いることができ、記憶された形状に移る前に大きな機械的強度の減少（例えば、外部からの引き金として温度や光による）を示すこともないのであるが、これらの材料は水和条件下で大きさの有意な変化や機械的強度の有意な減少を示すのである。これは単に、これらの材料がその親水性能により有意の量の水を吸収し、材料が大きな膨潤と可塑化をひきおこすからである。結果として、ヒトや動物の体内で見られる生理学的条件のような水和条件下では、これらの材料から調製された構成体の大きさは大きく変化し、これらの材料の機械的特性は桁違いに変化する。本発明のマルチブロックコポリマーとは対照的に、ＵＳ−Ａ−５，７１１，９５８に記載された形状記憶材料は、ヒトや動物の体内で見られる生理学的条件のような水和性条件下でもほとんど膨潤しないのである。
【００４８】
本発明の相分離ポリエステル又はポリエステル−カーボネートは有望な一群のバイオ材料であり、薬物放出に対し優れた制御を提供し、ポリペプチドのような生物活性化合物の放出を可能にするため、様々な薬物送達用途に用いることができる。
【００４９】
マルチブロックコポリマーのモルホロジー（又はそれから作成された構築物）は環境条件に依存する。ＤＳＣ（示差走査熱量測定）測定は不活性（乾燥）条件下で行うことができ、結果は乾燥材料の熱特性を決定するのに用いることができる。しかし、生理学的条件下（即ち体内での）モルホロジー及び特性は周囲条件下（乾燥、室温）でのモルホロジー及び特性とは異なるかもしれない。本明細書において用いられる転移温度Ｔｇ及びＴｍが、インビボで適用されたときの；つまり、体温で水蒸気で飽和された雰囲気で平衡にある場合の、材料の対応する値を指すものであることは理解されるべきである。これは材料を水飽和雰囲気で平衡にさせた後にＤＳＣ測定を実行することによりインビトロでシミュレートすることができる。乾燥状態では、本発明で用いる材料は哺乳類の体内条件よりも幾分高いＴｇ値を有することがある。即ち、乾燥材料をＤＳＣに付したときに、最初の変曲点はより高温で、例えば４２℃又は５０℃、或いはそれ以上で生じるかもしれない。しかし、インビボでの適用では、乾燥材料のＴｇ及び／又はＴｍは水の吸収の結果として降下し、これがポリマーを可塑化し、この最終的なＴｇは本発明によれば体温周辺以下となるはずである。最終的なＴｍは生理学的条件下で１１０℃と２５０℃の間の温度に存在するはずである。
【００５０】
例えば、ソフトセグメントにＰＥＧを含むポリマーは周囲温度の乾燥状態で結晶化しうるが、湿潤条件下では非晶質であり、非晶質柔軟化ＰＥＧとポリエステル／カーボネートにより形成されたソフトセグメントの混合したＴｇ又は二つの別々のＴｇを与える。本発明のコポリマーの相分離特性はＴｇ又はＴｍのプロファイルに反映される。相分離コポリマーは少なくとも二つの相転移によって特徴付けられ、その各々はコポリマー中に含まれているプレポリマーの対応するＴｇ又はＴｍ値に関連する（が、一般にそれと同一ではない）。Ｔｇは、例えばＤＳＣにより測定することができるように、特異的なヒートジャンプの中点を取ることにより求められる。Ｔｍは、図１に模式的に示すように、融点のピーク最大値であり、これはＴｇとＴｍによって特徴付けられるコポリマーの熱流量吸熱であることを示している。本明細書で定義したように、特定のプレポリマーのＴｇ及びＴｍの値はコポリマーについて測定された値を反映している。プレポリマーが完全に非相溶性の場合は、コポリマーのＴｇは非晶質「ソフト」プレポリマーのＴｇによってのみ支配される。しかし、実際には、マルチブロックコポリマーの結晶性及び非晶質の相の組成はソフトＡセグメントと半結晶性Ｂセグメントの組成と同一ではない。プレポリマーを形成する元のハードセグメントの非晶質部分はプレポリマー（Ａ）を形成するソフトセグメントと混合するであろうし、従って非晶質相の一部となる。非晶質相のＴｇ値はそのため使用したプレポリマーのそれとは異なる。相溶性の程度（それ故、Ｔｇ及び／又はＴｍと対応するプレポリマーのＴｇ及び／又はＴｍとの偏差）はコポリマーのプレポリマー組成、比及びセグメント長に依存する。コポリマーセグメントのＴｇは一般に相混合コポリマーのＴｇ値と分離プレポリマーのＴｇ値との間に存する。
【００５１】
マルチブロックコポリマーの物理化学的特性（例えば、分解、膨潤及び熱特性）はプレポリマーを形成するソフト及びハードセグメントのモノマーのタイプや鎖長や鎖比を変えることにより、また鎖延長剤のタイプと量を選択することにより、容易に調整することができる。更に、相転移温度は融解しているポリマーを処理するのに十分なほどに低い。モノマー比とコポリマーの分布は重合条件を変えることにより容易に制御できる。
【００５２】
結晶性セグメントＢが通常非粘着性材料を得るために望ましい。また、ポリマーマトリクスの膨潤を制御するために、相分離モルホロジーは非晶質及び結晶質ドメインとともに、生理学的条件（即ち、体温での水性環境）に曝露している間維持しなければならない。膨潤度の制御はカプセル化された化合物の放出を制御するためには非常に重要である。結晶性Ｂセグメントは、より親水性の高いソフトセグメントの膨潤を制御する物理的架橋として作用する。ハードセグメントＢの含量により影響を受けるほか、ポリマーの膨潤度はソフトＡセグメント中の水溶性ポリマーの含量及び分子量／長さに依存する。
【００５３】
先述のように、相分離セグメント化コポリマーの要件は、生理学的条件下で、ポリエステルセグメントＢのＴｍが１１０〜２５０℃の範囲にあり、セグメントＡのＴｇが３７℃以下であるということである。マルチブロックコポリマーにおけるセグメントＢのＴｍは一般的に、反応していないプレポリマー（Ｂ）のそれよりも低いが、これはプレポリマーがマルチブロックコポリマー中に組み込まれると鎖の柔軟性が減少し、結晶相でマルチブロックコポリマーの他の化合物の相混合が考えられるためである。良好な相分離を有するセグメント化されたコポリマーの重要なクラスは、結晶性ＰＬＬＡからなるハードセグメントＢに基づくコポリマーである。本発明者らは、ＰＬＬＡベースのＢセグメントを有するマルチブロックコポリマーが生理学的条件下で少なくとも１１０℃のＴｍを有することを示した。これらのマルチブロックコポリマーは幾つかの利点を提供する。広い範囲の分解速度が得られる。ハードセグメントＢを形成するプレポリマー（Ｂ）は結晶性ＰＬＬＡに基づいており、そのようなポリマーは分解が極めて遅いことが知られている。一方、プレポリマー（Ａ）は水溶性ポリマー及び非晶質ポリエステルに基づくポリマーである。このようなポリマーは分解が比較的速いことが知られている。最終分解速度はセグメントＡ／セグメントＢ比により決定され、従って容易に調整することができる。放出はとりわけマルチブロックコポリマーの分解速度により支配されるので、これもまたセグメントＡ／セグメントＢ比により調整することができる。また、結晶性はＰＬＬＡをＰＤＬＡと混合してステレオコンプレックスを形成することにより容易に上昇させることができる。ステレオコンプレックス形成は単一のエナンチオマーに比べてより高い結晶性をもたらし、またより高い（単一エナンチオマーより〜５０℃高い）Ｔｍをもたらす。更に、ＰＬＬＡベースのＢセグメントを有するマルチブロックコポリマーのＴｇは約−４０から４０℃までの広い範囲で変化しうる（乾燥条件下で測定）。分解速度と放出速度はとりわけ、マトリクスのＴｇにより支配されるので、この広いＴｇ範囲はまた放出と分解特性の大きな調整をもたらす。
【００５４】
一般に、（一つの融点と少なくとも一つの低Ｔｇ値により反映される）望ましい相分離モルホロジーは組成物を変更することにより、例えばＡ及びＢプレポリマーの数平均分子量Ｍｎを選択することにより得ることができる。セグメントＡ／セグメントＢ比を変化させることにより相分離モルホロジーに影響を与えることもできる。
【００５５】
本発明のセグメント化マルチブロックコポリマーは、生理学的（体内）条件で加水分解可能で典型的には完全に非晶質であるプレポリマー（Ａ）由来のソフトセグメント（Ａ）を含む。更に、プレポリマー（Ａ）は好ましくは、生理学的（体内）条件下で測定したとき３７℃以下、好ましくは２５℃以下のＴｇである少なくとも一つの相転移を有する。このセグメントはマルチブロックコポリマー中で非晶質相の一部をなすことになり、この非晶質相は本願明細書では相（Ａ）と呼ぶ。本発明のコポリマーはまた、プレポリマー（Ｂ）由来のハードセグメントＢを含み、典型的には生理学的（体内）条件で測定したとき１１０〜２５０℃のＴｍを有する半結晶性の加水分解性のポリマーを含む。セグメントＢは相（Ｂ）に大きく貢献する。「ソフト」及び「ハード」セグメントをそれぞれ形成するプレポリマーＡ及びＢは多機能性鎖延長剤により結合される。典型的には、結晶相はハードセグメントＢからなり、非晶質相はソフトセグメントＡと、セグメントＢの非晶質部分からなる。結晶性及び非晶質相は体内条件では非相溶性であるか、又は部分的にしか相溶性ではなく、即ち相分離している。多機能性鎖延長剤は好ましくは脂肪族分子である。
【００５６】
得られた本発明のマルチブロックコポリマーは、好ましくは式（１）の構造を有する。
−[Ｒ１−Ｈ−Ｒ１−Ｑ１−Ｒ４−Ｑ２]ｘ−[Ｒ２−Ｑ３−Ｒ４−Ｑ４]ｙ−[Ｒ３−Ｑ５−Ｒ４−Ｑ６]ｚ−    （１）
ここでＲ１はセグメントＡの一部であり、これは相（Ａ）の一部でもあり、非晶質ポリエステル、非晶質ポリエーテルエステル、若しくは非晶質ポリカーボネート；又は組み合わせたエステル、エーテル、及び／又はカーボネート基から得られる非晶質プレポリマーであってもよい。ＨはセグメントＡの中央ブロックであり、水溶性ポリマーに由来する。水溶性ポリマー由来のブロックは室温で非晶質又は半結晶性であることができる。しかし、セグメントＡにこのように導入されたブロックＨは生理学的条件で非晶質となる。この水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリテトラメチレンオキシド（ＰＴＭＯ）、及びポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）のようなポリエーテル；ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルカプロラクタム、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（ポリ（ＨＥＭＡ））、ポリホスファゼン、ポリオルトエステル、ポリオルトエステルアミド、又は上記ポリマーのコポリマーからなる群から選ばれる。好ましくは、ＨはＰＥＧであり、これはＲ１を形成する環状モノマーの開環重合の開始剤である。
【００５７】
Ｒ２はセグメントＢであり、主として又は全体的に相（Ｂ）に貢献する。Ｒ２は結晶性又は半結晶性のポリエステル、ポリエーテルエステル、ポリカーボネート、若しくはポリ無水物；又は組み合わせたエステル、エーテル、無水物、及び／又はカーボネート基でもよい。相Ｒ２の一部は非晶質である可能性もあり、この場合Ｒ２のこの部分は相（Ａ）に貢献する。Ｒ１とＲ２は同一でないことが好ましい。変数ｚはゼロか正の整数である。変数ｘとｙはいずれも正の整数である。
【００５８】
セグメントＲ３は任意的に存在する。このセグメントは、Ｈについて述べたポリマーの群から選ばれる水溶性ポリマーに由来する。Ｒ３は生理学的条件下では非晶質相（Ａ）の一部となるであろう。Ｒ３が存在する場合は、本発明のマルチブロックコポリマーは水溶性ポリマーを追加のプレポリマーとして含む。好ましくは、この水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリテトラメチレンオキシド（ＰＴＭＯ）、及びポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）のようなポリエーテル；ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルカプロラクタム、ポリ（ヒドロキシメチルメタクリレート）（ポリ（ＨＥＭＡ））、ポリホスファゼン、ポリオルトエステル、ポリオルトエステルアミド、又は上記ポリマーのコポリマーからなる群から選ばれる。例えば、該水溶性ポリマーセグメントは１５０〜５０００ｇ／ｍｏｌのＭｎを有するＰＥＧ由来である。
【００５９】
Ｒ４は鎖延長剤由来であり、脂肪族Ｃ２−Ｃ８アルキレン基（任意にＣ１−Ｃ１０アルキレンで置換されてもよい）からなり、脂肪族基は直鎖又は環状である。Ｒ４は好ましくはブチレン‐（ＣＨ２）４‐基である。Ｃ１−Ｃ１０アルキレン側鎖基は保護されたＳ、Ｎ、Ｐ又はＯ部分を含んでもよい。芳香族基を含む鎖延長剤は、望ましくない分解生成物を生じる可能性があるので一般には適さない。そのため、脂肪族鎖延長剤が好ましい。
【００６０】
Ｑ１−Ｑ６はプレポリマーと多機能性鎖延長剤との反応により得られる結合単位である。Ｑ１−Ｑ６の各々は、アミン、ウレタン、アミド、カーボネート、エステル、及び無水物から独立に選択することができる。すべての結合基Ｑが異なる場合は稀であり、通常は好ましくない。
【００６１】
典型的には、鎖延長剤の一つのタイプは、同じ末端基を有する３つのプレポリマーとともに用いることができ、その結果、６つの同様の結合基を持った式（１）のコポリマーが得られる。
【００６２】
プレポリマーＲ１とＲ２が異なる末端基を有する場合、二つのタイプの基Ｑが存在することになる。例えば、Ｑ１とＱ２は二つの結合したセグメントＲ１の間では同じであるが、Ｒ１とＲ２が結合している場合はＱ１とＱ２は異なる。式（１）の例は二官能性の鎖延長剤と二官能性のプレポリマーとの反応の結果を示す。
【００６３】
式（１）に関し、本発明のポリエステルはまた、セグメント（ＡＢ）ｒのランダム分布を有するマルチブロック又はセグメント化コポリマーとして表されてもよく、「Ａ」はセグメントＡに対応し、「Ｂ」はセグメントＢに対応する（ｚ＝０）。（ＡＢ）ｒにおいて、Ａ／Ｂ比（式（１）のｘ／ｙに対応）は１であってもよく、１からはずれてもよい。プレポリマーは望ましい量で混合することができ、多機能性鎖延長剤、即ちプレポリマーを化学的に結合するために用いることのできる少なくとも二種の官能基を有する化合物、で結合することができる。これは二官能性鎖延長剤であることが好ましい。ｚ≠０の場合、すべてのセグメントのランダム分布は、３つの異なるプレポリマー(一つはＰＥＧのような水溶性ポリマー由来のセグメント）があらゆる可能性のある比率でランダムに分布した（ＡＢＣ）ｒによって提示される。
【００６４】
ａ及びｂ（場合によりｃ）セグメントが（ＡＢ）ｒ及び（ＡＢＣ）ｒ中に形成されたプレポリマーは多機能性鎖延長剤により結合される。この鎖延長剤は好ましくはジイソシアネート鎖延長剤であるが、これはまた、二酸又はジオール化合物であることができる。プレポリマーがすべて、水酸基末端基を含み、ジイソシアネート鎖延長剤が使用される場合には、結合単位はウレタン基であろう。プレポリマー(の一つ）がカルボン酸末端である場合は、結合単位はアミド基である。構造（ＡＢ）ｒ及び（ＡＢＣ）ｒを持ったマルチブロックコポリマーはまた、エステル結合を形成するＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）のような結合剤を用いて、ジカルボン酸末端プレポリマーとジオール鎖延長剤、又はその逆（ジオール末端プレポリマーと二酸鎖延長剤）の反応によって調製することができる。
【００６５】
上述のように、ランダムにセグメント化されたコポリマーは、セグメントＡ及びＢのランダム分布を持った(即ち、交互ではない）コポリマーのことを指す。セグメントＡ及びＢの場合は、これは（ＡＢ）ｒで表され、セグメントＡ、Ｂ及びＣの場合は、これは（ＡＢＣ）ｒで表される。
式（１）の加水分解可能なセグメントＲ１−Ｈ−Ｒ１はプレポリマー（Ａ）の反応により得られる。
【００６６】
プレポリマー（Ａ）は例えば、開環重合により調製することができる。従って、プレポリマー（Ａ）は、好ましくはランダムなモノマー分布を有するジオール又は二酸化合物によって開始される開環重合によって調製される加水分解可能なコポリマーであってもよい。ジオール化合物は好ましくは脂肪族ジオール又はＰＥＧのような低分子量ポリエーテルである。ポリエーテルは開始剤として用いることによりプレポリマー（Ａ）の一部であり、プレポリマー（Ａ）と付加的に混合して、式（１）の追加的な親水性セグメントＲ３を形成する。プレポリマー（Ａ）は加水分解可能な、ポリエステル、ポリエーテルエステル、ポリカーボネート、ポリエステルカーボネート、ポリ無水物又はそれらのコポリマーであってもよい。例えば、プレポリマー（Ａ）は、ジオール、二カルボン酸、及びヒドロキシカルボン酸から選ばれる、エステル形成モノマーの反応生成物を含む。プレポリマー（Ａ）は環状モノマー及び／又は非環状モノマーの反応生成物を含むことができる。例示的な環状モノマーとしては、グリコリド、ラクチド、ε‐カプロラクトン、δ‐バレロラクトン、トリメチレンカーボネート、テトラメチレンカーボネート、１，５−ジオキセパン‐２‐オン、１，４−ジオキサン‐２‐オン（パラジオキサノン）及び／又はオキセパン‐２，７−ジオンのような環状無水物が挙げられる。一例では、Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド及び／又はＤ，Ｌ−ラクチドが用いられる。
【００６７】
Ｔｇ３７℃未満という要件を満たすために、上記のモノマー又はモノマーの組み合わせの幾つかは他のものよりも好ましい。例えば、モノマーラクチド及び／又はグリコリドを含むプレポリマー（Ａ）は、好ましくは、他に言及された環状コモノマー（ε‐カプロラクトン、δ‐バレロラクトン、トリメチレンカーボネート、１，４−ジオキサン‐２‐オン及びそれらの組み合わせ）のいずれかと組み合わせられる。これはそれ自身でＴｇを下げることができる。或いは、プレポリマーは十分な分子量を持ったＰＥＧで開始され、マルチブロックコポリマーのＴｇを下げる。
【００６８】
プレポリマーＡがポリ(Ｄ，Ｌ−ラクチド)を含む場合、ラクチドのＬ／Ｄ比は単一の値からはずれる（５０／５０以外）ことがありうる。例えば、８５／１５と１５／８５の間のＬ／Ｄ比は完全に非晶質のホモポリマーを与える。さらに、一つの異性体（Ｌ又はＤ）が他方よりも過剰となるとポリ(Ｄ，Ｌ−ラクチド)のＴｇを上昇させることは知られている。非晶質相を構築する上記の他の少量のモノマーは、プレポリマー又はブロックを形成する結晶相中に存在していてもよい。
【００６９】
さらに、プレポリマー（Ａ）はヒドロキシ酸（例えば、乳酸、グリコール酸、ヒドロキシ酪酸）、二酸（例えば、グルタール酸、アジピン酸、又はコハク酸、セバシン酸）及びエチレングリコール、ジエチレングリコール、１，４−ブタンジオール又は１，６−ヘキサンジオールのようなジオールのような、エステル及び／又は無水物加水分解性部分を形成する、縮合（非環状）型モノマー（の混合物）に基づくことができる。
【００７０】
式（１）のセグメントＲ２は、モノマーＬ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、ヒドロキシブチレート、グリコリド、又はこれらのモノマーの組み合わせであって、生理学的条件下で１１０℃と２５０℃の間で相転移を有するステレオコンプレックスを形成するモノマーに由来するプレポリマー（Ｂ）の反応によって得ることができる。好ましくは、セグメントＢはＬ−ラクチドモノマーの反応により得られる。
【００７１】
典型的には、プレポリマー（Ｂ）は１０００ｇ／ｍｏｌ以上、好ましくは２０００ｇ／ｍｏｌ以上、より好ましくは３０００ｇ／ｍｏｌ以上のＭｎを有する。一般に、プレポリマー（Ｂ）のＭｎは１００００ｇ／ｍｏｌ以下である。コポリマー中のプレポリマー（Ｂ）の含量は、マルチブロックコポリマーの総重量に対して、好ましくは１０〜９０重量％、より好ましくは２５〜７０重量％、最も好ましくは３０〜５０重量％である。
【００７２】
プレポリマーは好ましくは、反応性末端基を有する直鎖又はランダム（コ）ポリエステル、ポリエステル−カーボネート、ポリエーテルエステル、又はポリ無水物である。これらの末端基は水酸基又はカルボキシル基であってもよい。ジヒドロキシ末端コポリマーを有することが好ましいが、ヒドロキシ−カルボキシル又はジカルボキシル末端ポリマーもまた使用できる。ポリマーが直鎖状でなければならない場合は、スターターとして二官能性成分（ジオール）で調製することができるが、３つ以上の官能性ポリオールを用いる場合は、星型ポリエステルが得られる。プレポリマー（Ａ）中のジオールは脂肪族ジオール又は低分子量ポリエーテルであることができる。
【００７３】
開環重合によるプレポリマー合成は好ましくは触媒の存在下で行われる。適当な触媒はＭ／Ｉ＝５０００〜３００００（Ｍ／Ｉはモノマーの開始剤に対する比である）のＳｎ（Ｏｃｔ）２である。触媒なしで合成を行うことも可能である。
【００７４】
ポリエステル、ポリカーボネート及びポリ無水物を調製する条件は当業界で知られている。
【００７５】
本発明のコポリマーは一般的に直鎖状である。しかし、分岐状のコポリマーを調製することも可能である。本発明のこれらの非直鎖状コポリマーは、トリイソシアネートのような三官能性（又はそれ以上の官能性の）鎖延長剤を用いることにより得ることができる。分岐状コポリマーは改良されたクリープ特性を示すことができる。
【００７６】
結晶化可能なハードセグメントについて、プレポリマーの長さ（Ｍｎ）はコポリマー中で結晶化できるのに十分な長さでなければならない。例えば、プレポリマーを形成するＰＬＬＡハードセグメントは好ましくは７００ｇ／ｍｏｌ以上、より好ましくは２０００ｇ／ｍｏｌ以上、最も好ましくは３０００ｇ／ｍｏｌ以上のＭｎを有する。ＰＬＬＡプレポリマーが長いほど、より少ないハードセグメント含量で相分離モルホロジーが得られることが期待される。相分離が観察されるプレポリマー比はそのためプレポリマー長さに依存する。一般に、コポリマー中でソフト及びハードセグメントを形成するプレポリマーの長さは、相分離モルホロジーが観察される値でなければならず、相分離（非相溶性）の程度は生物医学装置の望ましい特性にとって好都合である。
【００７７】
プレポリマー（Ａ）を形成するソフトセグメントは５００ｇ／ｍｏｌ以上、好ましくは１０００ｇ／ｍｏｌ以上、より好ましくは２０００ｇ／ｍｏｌ以上のＭｎを有することができる。プレポリマーの長さは、プレポリマーが、得られるコポリマーの良好な相分離モルホロジーと良好な機械的熱的特性を得るのに必要な程度に大きくなるように選ばなければならない。プレポリマー長は重合温度で鎖延長剤とともに混和性である程度に十分低いものでなければならない。典型的には、これはＭｎが１００００ｇ／ｍｏｌ以下であるときに達成される。
【００７８】
一般に、ハードセグメント含量がマルチブロックコポリマーの総重量に対して１０〜９０重量％、好ましくは２５〜９０重量％の範囲であれば、応用時の温度（即ち、医療用途では約３７℃）で良好な分解及び膨潤特性を持った柔軟性のある熱可塑性の材料が得られる。
【００７９】
更なる局面では、本発明は、本発明の相分離、熱可塑性マルチブロックコポリマーを調製する方法であって、多機能性鎖延長剤の存在下でプレポリマー（Ａ）とプレポリマー（Ｂ）の鎖延長反応を含み、それによりランダムセグメント化マルチブロックコポリマーを得る上記方法に関する。
【００８０】
（ＡＢ）ｒ及び（ＡＢＣ）ｒ構造を有するセグメント化されたマルチブロックコポリマーは、Ｒ１、Ｈ及びＲ２セグメント、場合によりＲ３セグメントのモノマーを形成するハード及びソフトセグメントを、等量の多機能性鎖延長剤、好ましくは脂肪族分子、より好ましくは１，４−ブタンジイソシアナート（ＢＤＩ）のようなジイソシアナートとともに望ましい比率で含む、プレポリマーの混合物を鎖延長することにより作製することができる。（ＡＢ）ｒ及び（ＡＢＣ）ｒ構造のセグメント化コポリマーは好ましくは溶液中で作成される。適切には、プレポリマーを不活性有機溶媒に溶解し、鎖延長剤をそのまま又は溶液で添加する。重合温度はプレポリマーの最も高い相転移温度と同じかそれよりもずっと低くてもよい。ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）とのカップリング反応は好ましくは溶液で行われる。２種（又は３種）のプレポリマーで末端がすべてジオール又は二酸のものをそれぞれ、二酸又はジオール末端の鎖延長剤とともに溶液で混合することができ、その後ＤＣＣを添加する。
【００８１】
重合は０．１ｄｌ／ｇ以上（クロロホルム中２５℃で測定）のコポリマーの固有粘度を得るのに十分な時間行う。低い重合温度と短い重合時間であればエステル交換反応を避けることができ、相分離モルホロジーが得られ、モノマー分布がコポリマーを構築するプレポリマーと同じになる。逆に、すべてのモノマーの取り込みを十分に行うには、高分子量ランダムコポリマーをより高い温度（＞１００℃）でずっと長い時間をかけて調製しなければならない。その時間の間、エステル交換反応が起こり、よりランダムな（即ち、よりブロック性の少ない）モノマー分布が得られる。
バルクでの鎖延長により得られる材料も押出機中でインシチュで製造することができる。
【００８２】
もし鎖延長剤が二官能性の脂肪族分子で、プレポリマーが直鎖状であれば、直鎖状コポリマーが作成される。もし反応物の一つ（鎖延長剤又は少なくとも一つのプレポリマーのいずれか）又は両方が二つを超える官能基を有する場合は、分岐構造が十分低い転換率で得られるであろう。鎖延長剤は二官能性脂肪族鎖延長剤、好ましくは１，４−ブタンジイソシアナートのようなジイソシアナートとすることができる。
【００８３】
結晶性及び非晶質相形成プレポリマー又はモノマーの組み合わせは、望ましい分解、膨潤、物理的又は熱特性を持った相分離セグメント又はブロックコポリエステル又はポリエステル‐カーボネートが得られるように選ばれる。典型的には、固有粘度（クロロホルム中２５℃で測定）は０．１ｄｌ／ｇより大きく、１０ｄｌ／ｇより小さく、好ましくは０．１〜２ｄｌ／ｇの間、より好ましくは０．２〜１ｄｌ／ｇの間である。
【００８４】
マルチブロックセグメント化コポリマーは、例えば乳化プロセス、押出、成形、溶媒キャスト、スプレー乾燥、スプレー凍結乾燥、エレクトロスピニング、又は凍結乾燥のような公知の技術を用いて、様々な形状と大きさの製剤に形成することができる。後者の技術は多孔性材料を形成するのに用いられる。多孔性は共溶媒、非溶媒、及び／又は浸潤（ｌｅａｃｈａｂｌｅｓ）の添加により調整することができる。コポリマーは（固体又は多孔性のいずれかで）、ミクロスフェア、ミクロ粒子、ナノスフェア、ロッド、フィルム、シート、スプレー、チューブ、膜、メッシュ、ファイバー、プラグ、コーティング、及び他の物品に加工することができる。生成物は固体、中空、又は（微）多孔性であることができる。広い範囲の生物医学インプラントは、例えば、傷治療、皮膚回復、神経再生、人工血管、薬物送達、メニスカス再生、組織工学、外科器具のコーティング、靭帯及び腱再生、歯科及び整形外科修復への応用のために製造することができる。コポリマーは単独で使用することができ、或いは他の吸収性又は非吸収性ポリマーとともにブレンド及び／又は共押出することができる。
【００８５】
更に、それらは薬学的用途、例えば、薬物送達、例えばミクロスフェア、固体インプラント、ゲル、コーティング、フィルム、シート、スプレー、チューブ、膜、メッシュ、ファイバー、プラグ、及び他の配置の形態で用いることができる。
【００８６】
後述の実施例で説明するように、本発明の材料は従来技術で記載されたコポリマーと比較して、熱的、機械的、処理的特性を含む特性が改良されている。
【００８７】
更に他の局面では、本発明は少なくとも一種の生物活性化合物（例えば、生物活性小分子、タンパク質、又はペプチド）のホストへの送達のための組成物であって、該少なくとも一種の生物活性化合物がマトリクスにカプセル化されており、該マトリクスが本明細書で定義されるような、少なくとも一種の相分離、熱可塑性マルチブロックコポリマーを含む上記組成物に関する。
【００８８】
本発明の生物分解性マルチブロックコポリマーが特にポリペプチドの送達用ビヒクルとして適しており、ポリペプチドのマトリクスからその環境への（例えば、対象の体内への）制御放出を可能にすることが見出された。
【００８９】
本発明のマルチブロックコポリマーは特定の応用のために送達組成物の放出特性を調整するために多くの選択肢を有している。生物活性化合物の放出速度は例えば以下により増大させることができる：
・プレポリマー（Ａ）の一定の分子量の下、プレポリマー（Ａ）中の水溶性ポリマーの分子量を上げること；
・プレポリマー（Ａ）とプレポリマー（Ｂ）のモル比を上げること；
・プレポリマー（Ａ）中のより速く分解するポリマーを与えるモノマーの含量を上げること、例えばε‐カプロラクトンをＤ，Ｌ−ラクチド又はグリコリドで置き換えたり、Ｄ，Ｌ−ラクチドをグリコリドで置き換えたりすることによる；
・プレポリマー（Ａ）とプレポリマー（Ｂ）のモル比を一定にしてプレポリマー（Ｂ）の分子量を下げること（これはプレポリマー（Ａ）重量百分率を上げ、またプレポリマー（Ｂ）のＴｍと存在する結晶相の総量を下げる）；
・一定の水溶性ポリマーの分子量とプレポリマー（Ａ）とプレポリマー（Ｂ）のモル比でプレポリマー（Ａ）の分子量を下げること；及び／又は
・水溶性ポリマー由来の、追加の第三のセグメントを用いて、水溶性ポリマーの含量を上げること。
【００９０】
放出速度が上述のように反対の変化により減少させることができるが、以下によっても減少させることができる。
・セグメントＢのＴｍを上げること、例えばプレポリマー（Ｂ）として（ＰＬＬＡ単独の代わりに）ＰＬＬＡとＰＤＬＡの混合物を、ＰＬＬＡとＰＤＬＡの間でステレオコンプレックス形成が生じるような比率で用いることによる；
・水溶性ポリマージオール由来の、追加の第三のセグメントを用いて、ジイソシアナートを鎖延長剤として用い、水溶性ポリマー含量を一定に保つか、或いは減少させること。第三のセグメントにおける水溶性ポリマーはマルチブロックコポリマー中、プレポリマー（Ａ）中の水溶性ポリマーのより速く分解するエステル結合に比べてゆっくりと分解するウレタン結合で構築されている。
【００９１】
マルチブロックコポリマーマトリクス中に含ませることができる生物活性化合物は、例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）−コ−ＰＥＧ−コ−ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）−ｂ−ＰＬＬＡ  （（ＰＤＬＬＡ−コ−ＰＥＧ−コ−ＰＤＬＬＡ）−ｂ−ＰＬＬＡ）マトリクス又はポリ（ε−カプロラクトン）−コ−ＰＥＧ−コ−ポリ（ε−カプロラクトン）−ｂ−ＰＬＬＡ  （（ＰＣＬ−コ−ＰＥＧ−コ−ＰＣＬ）−ｂ−ＰＬＬＡ）マトリクスであり、これらとしては、一般に１０００Ｄａ以下の分子量を有する非ペプチド、非タンパク質小型薬剤及び生物活性ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
（ＰＤＬＬＡ−コ−ＰＥＧ−コ−ＰＤＬＬＡ）−ｂ−ＰＬＬＡマトリクス又はＰＣＬ−コ−ＰＥＧ−コ−ＰＣＬ）−ｂ−ＰＬＬＡマトリクスのようなポリエーテルエステルウレタンマトリクスに含ませてもよい非ペプチド、非タンパク質小型薬剤の例としては、抗腫瘍剤、抗菌剤（抗生物質、セファロスポリン、アミノグリコシド；マクロライド；テトラサイクリンを含む）、化学療法剤（スルホンアミド；尿路殺菌剤；嫌気性感染用薬剤；結核用薬剤を含む）；ハンセン病用薬剤、抗黴剤、抗ウイルス剤、抗蠕虫病剤、抗炎症剤、抗痛風薬、中枢作用（オポイド）鎮痛薬、局所麻酔薬、パーキンソン病薬、中枢作用筋弛緩剤、ホルモン及びホルモンアンチアゴニスト、コルチコステロイド、糖質コルチコステロイド、アンドロゲン、アンドロゲン性ステロイド、タンパク同化ステロイド、抗アンドロゲン、エストロゲン、エストロゲン性ステロイド、抗エストロゲン、プロゲスチン；甲状腺剤、及び抗甲状腺剤が挙げられるが、これらには限定されない。
【００９３】
上述のような小型薬剤を（ＰＤＬＬＡ−コ−ＰＥＧ−コ−ＰＤＬＬＡ）−ｂ−ＰＬＬＡマトリクスに含ませる場合は、コポリマーのＰＥＧ成分は好ましくは２００〜１５００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは６００〜１０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有し、コポリマー中に、コポリマーの重量の５重量％から２０重量％の量で、好ましくはコポリマーの重量の５重量％から１０重量％までの量で存在する。一般に、ＰＬＬＡはコポリマーの重量の２０重量％から９０重量％の量で、好ましくはコポリマーの３０重量％から７０重量％の量でコポリマー中に存在する。少なくとも一種の小型薬物分子が０．１重量％から８０重量％、好ましくは１．０重量％から４０重量％、最も好ましくは５から２０重量％の量でマトリクス中に存在してもよい。マルチブロックコポリマーの親水性を上げて、それによりコポリマーの分解速度と、添加された生物活性化合物の放出速度を上げることを望む場合は、親水性セグメントのＤ，Ｌ−ラクチドをグリコリドで部分的に又は完全に置き換えることにより、及び／又はより高分子量のＰＥＧ成分を用いることにより、又はプレポリマーセグメント中のＰＥＧ成分の重量分画を上げることにより、コポリマーを修飾してもよい。ポリマーの親水性を下げて、それによりコポリマーの分解速度と、添加された生物活性化合物の放出速度を下げることを望む場合は、親水性セグメントのＤ，Ｌ−ラクチドをε−カプロラクトンで部分的に又は完全に置き換えることにより、及び／又はより低分子量のＰＥＧ成分を用いることにより、又はプレポリマーセグメント中のＰＥＧ成分の重量分画を下げることにより、コポリマーを修飾してもよい。
【００９４】
ポリペプチドはペプチド結合で結合したアミノ酸からなる。短いポリペプチドはまたペプチドとも呼ばれるが、より長いポリペプチドは典型的には、タンパク質と呼ばれる。構成アミノ酸から合成で作るのに十分短いポリペプチド鎖はタンパク質よりもペプチドと呼ぶのが一つの慣習である。しかし、より優れた合成手法の出現により、ユビキチンのような完全タンパク質を含めて、数百個のアミノ酸の長さのポリペプチドを作ることができる。非公式ではあるが、約５０個のアミノ酸の長さで境界線を引くという慣習もある。この定義はいささか任意のところもある。アルツハイマー病に関連したアミロイドβペプチドのような長いポリペプチドはタンパク質とみなすことができ、インシュリンのような小さいタンパク質はペプチドとみなすことができる。いずれにせよ、当業者であれば本質的にどのタイプのポリペプチドもカプセル化することができ、その後コポリマーマトリクスから放出することができると理解するであろう。
【００９５】
一つの態様では、本発明の組成物は生物活性ペプチド又は生物活性タンパク質を含む。カプセル化されたポリペプチドは天然アミノ酸だけを含むのが好ましいが、非天然アミノ酸（即ち、天然には存在しないがポリペプチド鎖中に導入することができる化合物）及び／又は当業界で知られているようなアミノ酸アナログを代替的に用いることができる。また、ポリペプチド中の一つ以上のアミノ酸を修飾してもよい。例えば、炭水化物（糖質）基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、共役のための結合基、官能化、又は他の修飾（例えば、αアミド化）等のような化学物質の追加によって修飾してもよい。
【００９６】
より好ましい態様では、ペプチドの修飾により、より安定なペプチド（例えば、インビボでより大きな半減期）にされる。これらの修飾はペプチドの環化、Ｄ−アミノ酸の導入等を含んでもよい。修飾のいずれもペプチドの望ましい生物活性に実質的に干渉すべきではない。或る態様では、ペプチドの修飾により、生物活性により優れたペプチドが得られる。
【００９７】
生物活性ポリペプチドは好ましくは、タンパク質／ペプチド薬剤、酵素、レセプターリガンド、神経伝達物質、阻害ペプチド、制御ペプチド、アクチベーターペプチド、サイトカイン、成長因子、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体断片、抗腫瘍ペプチド、抗生物質、抗原、ワクチン及びホルモンからなる群から選ばれる。カプセル化すべきポリペプチドの例はＵＳ−Ａ−５，９８０，９４８及びＣｒｏｍｍｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２００３，２６６（１−２），３−１６に記載されている。もちろん、２種以上の異なる（生物活性）ポリペプチドをカプセル化することもまた意図される。
【００９８】
ポリペプチドの大きさは変えることができる。一つの態様では、ポリペプチドは１０，０００Ｄａ以下の分子量を有する。そのようなサイズのポリペプチドは、プレポリマー（Ａ）及び／又は追加のプレポリマーのセグメントとしてＰＥＧを含むコポリマーであって、該ＰＥＧが４００〜３０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは６００〜１５００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量を有するものであるコポリマーのマトリクスでカプセル化するのに特に適している。代替的に、又は追加的に、当該ＰＥＧはコポリマーの全重量に対して５重量％〜６０重量％、好ましくは５重量％〜４０重量％の量で存在する。
【００９９】
他の態様では、該ポリペプチドは１０，０００Ｄａ以上の分子量を有する生物活性タンパク質である。これらのより大きなポリペプチドは好ましくはプレポリマー（Ａ）のセグメントとして、及び／又は追加的なプレポリマーとして、ＰＥＧを含むコポリマーのマトリクス中にカプセル化され、ここで該ＰＥＧは６００〜５０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは１０００〜３０００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量を有し、及び／又は該ＰＥＧはコポリマーの全重量に対し、５重量％〜７０重量％の、より好ましくは１０重量％〜５０重量％の量で存在する。
【０１００】
本発明の組成物はいかなる望ましい外観又は形状を有することができる。一つの態様では、本発明のマルチブロックコポリマーはミクロスフェア、ミクロ粒子、スプレー、インプラント、コーティング、ゲル、フィルム、フォイル、シート、膜、又はロッドの形態で処理される。
【０１０１】
一つの特別な態様は、ミクロスフェアの形態の組成物に関する。一般に、ミクロスフェアは１０００μｍ未満の直径を有し、生物活性化合物を含有する微小な球状粒子である。ミクロスフェアは生物活性化合物がポリマーマトリクス全体に溶解しているか分散している均一な又はモノリシックなミクロスフェアであってもよい。また、ミクロスフェアは生物活性化合物が単核状態又は複核状態でポリマーに囲まれているリザーバータイプのものである可能性もある。生物活性化合物は小型の水溶性薬物である場合は、その薬物はまず疎水性又は親油性賦形剤に分散させ、次いでその組み合わせをポリマーマトリクス中に粒子、液滴、又は微小懸濁液（ミクロサスペンジョン）の形態で分散させることができる。ミクロスフェアを次いでエマルジョンから形成することができる。
【０１０２】
ミクロスフェアは当業者に知られた技術で調製することができ、コアセルベーション、溶媒抽出／蒸発、スプレー乾燥、又はスプレー凍結技術が挙げられるが、これらに制限されない。
【０１０３】
一つの態様では、ミクロスフェアは、ジクロロメタンのような有機溶媒にマルチブロックコポリマーを溶解すること、及びポリビニルアルコールのような乳化剤を含む水相にそのマルチブロックコポリマー溶液を乳化させることを含む溶媒抽出／蒸発技術によって調製することができる（特に、Ｏｋａｄａ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．１９９７，２８（１），４３−７０に記載されている）。
【０１０４】
そのように形成されたミクロスフェアの粒径、多孔性（孔隙率）、及び薬物担持のような特徴は、粘度、水性ポリビニルアルコール相の濃度、マルチブロックコポリマー溶液の濃度、活性の水溶液に対するジクロロメタンの比率、ポリビニルアルコール相に対する一次エマルジョンの比率、及び攪拌速度のようなプロセスパラメータに依存する。
【０１０５】
ミクロスフェアをスプレー乾燥プロセスにより形成する場合は、ジクロロメタンのような有機溶媒中、０．５重量％〜５重量％、好ましくは約２重量％の低濃度のマルチブロックコポリマーが用いられる。スプレー乾燥により一般に多孔性の不規則な形状の粒子が形成される。
【０１０６】
ミクロスフェアが形成されると、生物活性化合物がミクロスフェア又はミクロ粒子中にカプセル化される。一般に、溶媒抽出／蒸発技術を使って親油性化合物をカプセル化する場合は、化合物をまずジクロロメタン又は酢酸エチルのような有機溶媒中マルチブロックコポリマーの溶液に溶解する。引き続いて有機溶液をポリビニルアルコール水溶液に乳化し、水中油（Ｏ／Ｗ）エマルジョンが得られる。有機溶媒を次いで水相に抽出し、蒸発させてミクロスフェアを固化する。
【０１０７】
一般に、溶媒蒸発技術を用いて水溶性化合物をカプセル化する場合は、化合物の水溶液をまずジクロロメタンのような有機溶媒中マルチブロックコポリマーの溶液に乳化する。この一次エマルジョンを次いでポリビニルアルコール水溶液に乳化し、水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）エマルジョンを得る。ジクロロメタン又は酢酸エチルのような有機溶媒を次いでＯ／Ｗプロセスルートと同様に抽出してミクロスフェアを固化する。或いは、水溶性剤をマルチブロックコポリマーの有機溶媒中溶液に直接分散させてもよい。得られた分散液は次いでポリビニルアルコールのような界面活性剤を含む水溶液に乳化させて、水中油中固体（Ｓ／Ｏ／Ｗ）エマルジョンを得る。次いで有機溶媒をＯ／Ｗプロセスルートと同様に抽出してミクロスフェアを固化する
【０１０８】
Ｗ／Ｏ／Ｗ及びＳ／Ｏ／Ｗ乳化ルートを用いて水溶性化合物をカプセル化する場合、十分なカプセル化効率でミクロスフェアを得ることは難しいかもしれない。化合物の水溶性特性により、化合物の一部がポリビニルアルコール水溶液のような水性抽出媒体に失われるかもしれない。外部水相に内部水相中の化合物が拡散するのを減少させるために、ゼラチンのような粘性剤を内部水相に用いることができる。また、外部水相に添加剤を加えて外部水相への化合物の溶解性を落としてもよい。この目的のために、塩を用いてもよく、或いはｐＨを調整してもよい。
【０１０９】
油中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｏ）又は油中油中固体（Ｓ／Ｏ／Ｏ）乳化ルートは、十分なカプセル化効率でミクロスフェアを得るための興味深い代替手段を提供する。Ｗ／Ｏ／Ｏプロセスにおいて生物活性化合物は、Ｗ／Ｏ／Ｗプロセスと同様に、水溶液中に溶解し、典型的には、ジクロロメタン又は酢酸エチルのような有機溶媒へのポリマーの溶液で乳化される。次いで、シリコン油のようなポリマー沈殿物を攪拌下ゆっくりと加え初期のミクロ粒子を形成し、次いでこれをヘプタン又はヘキサン中に注いでシリコン油と有機溶媒を抽出し、ミクロスフェアを固化する。ミクロ粒子を減圧ろ過により集め、追加の溶媒ですすぎ、減圧化で乾燥することができる。Ｓ／Ｏ／Ｏ乳化ルートで、生物活性化合物は、Ｓ／Ｏ／Ｗプロセスと同様に、ジクロロメタン又は酢酸エチルのような有機溶媒へのポリマー溶液中の固体粉末として分散される。次いで、シリコン油のようなポリマー沈殿物を攪拌下ゆっくりと加え初期のミクロ粒子を形成し、次いでこれをヘプタン又はヘキサン中に注いでシリコン油とジクロロメタンを抽出し、ミクロスフェアを固化する。
【０１１０】
安定化剤をタンパク質の水溶液に加えて、ミクロスフェアへの処理の間、タンパク質活性の損失を防止してもよい。そのような安定化剤の例は、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、及びトレハロース、イヌリン及びショ糖のような炭化水素である。
【０１１１】
スプレー乾燥技術を用いると、化合物の水溶液が上記のように、メチレンクロリドのような有機溶媒へのポリマーの溶液中に乳化される。油中水エマルジョンを次いでスプレードライヤーを用いてスプレー乾燥する。
【０１１２】
更なる態様では、本発明の組成物はコーティング、注入可能なゲル、インプラント（好ましくは注入可能なインプラント）又はコートされたインプラントの形態である。コーティングの形態の組成物は、例えば、血管若しくは尿管ステント、整形外科プロテーゼ又は眼科インプラントのような医療用インプラント上に薬物溶出コーティングとして適用することができる。
【０１１３】
生物活性化合物は押出機を介して注入可能な固体インプラントに成形することができる。典型的には、化合物及びマルチブロックコポリマー粉末を物理的に混合し、その後、得られた粉末ブレンドを押出機に導入し、加熱し、処理して、小径円筒状ロッドのような望ましい形状と大きさの製剤を得る。化合物及びマルチブロックコポリマー粉末の物理的混合の代わりに、化合物とポリマーを適当な溶媒に共溶解するか、或いは適当な溶媒へのポリマー溶液中への化合物の分散物を調製し、次いで凍結乾燥と凍結乾燥粉末の押出を行うことができる。後者は一般的に、インプラントのブレンドの均一性と含量均一性を改善する。
【０１１４】
更に別の態様では、本発明は生物活性化合物を、それを必要とする対象に送達する方法に関し、これは該対象に上で定義した組成物の有効用量を投与することを含む。
【０１１５】
対象は典型的には、哺乳類、好ましくはヒトである。しかし、本発明の獣医学的使用もまた意図される。この方法は治療的、予防的、及び／又は化粧品的目的を有することができる。適当な投与の方法は状況に応じて選択することができる。例えば、投与は、組成物の、非経口、経口、動脈内、関節内、腎内（ｉｎｔｒａ−ｖｅｎａｌ）、眼球内、硬膜外、くも膜下、筋肉内、腹腔内、静脈内、膣内、直腸、局所、又は皮下投与を含むことができる。一つの態様では、本発明は、関心のある生物活性ポリペプチドをそれを必要とする対象に送達する方法であって、本発明の組成物の有効用量を該対象に投与することを含み、組成物がミクロスフェア、注入可能なインプラント、又はインシチュで形成するゲルの形態であり、組成物が眼球内、動脈内、筋肉内、又は皮下で投与される上記方法を提供する。
【０１１６】
局所投与のために、ミクロスフェアはゲル、クリーム、又は軟膏に含ませることができ、必要であれば、バリアで覆うことができる。従って、ミクロスフェアは、乾癬、湿疹、脂漏症、及び皮膚炎のような皮膚疾患の治療に用いられる１種以上の生物活性化合物を含むことができる。
【０１１７】
他の態様では、ミクロスフェアは、ヒアルロン酸ゲル又は巨大分子多糖類ゲルのようなゲルに含ませることができる。このような態様は特に、外科手術中及び後のような、非経口適用に適用できる。
【０１１８】
注射を介して投与する場合は、ミクロスフェアは、水、生理食塩水溶液（例えば０．９％）のような薬学的担体、又は０．１ｗ／ｖ％〜０．５ｗ／ｖ％の量で界面活性剤を含む溶液に含ませてもよい。使用できる界面活性剤の例としては、Ｔｗｅｅｎ８０界面活性剤が挙げられるが、これに限定されるものではない。薬学的担体はさらにナトリウムカルボキシメチルセルロースのような粘性剤を含むことができる。
【０１１９】
注射を介して投与する場合は、ミクロスフェアは１μｍ〜２００μｍ、好ましくは５μｍ〜１００μｍ、最も好ましくは１０μｍ〜５０μｍの平均径を有する。このようなミクロスフェアは、許容可能な薬学的担体と組み合わせて投与する場合は、カプセル化された生物活性化合物に依存して、様々な疾患又は障害の治療に用いることができる。従って、本発明のミクロスフェアを含む注射可能な製剤は、関節リウマチ、肝炎、糖尿病、又はメタボリック症候群のような全身性疾患、及び変形性関節症、腎疾患、炎症、局所疼痛プロセス、局所感染、局所皮膚疾患、腫瘍（又は残存している可能性のある腫瘍細胞を破壊するための術後治療としての外科的除去の後の部位）、前立腺癌又は乳癌、末端肥大症（ａｇｒｏｍｅｇａｌｙ）のような局所限定疾患、加齢（性）黄斑変性症のような眼科疾患、局所脳疾患（例えばパーキンソン病）、及び急性心筋梗塞、慢性心不全、又は関節硬化症のような心臓血管性疾患の治療に用いることができる。このような注射可能な製剤はまた、長期間の療養治療、例えば、コルチコステロイド、アンドロゲン、抗アンドロゲン、エストロゲン、抗エストロゲン、黄体ホルモン薬、又は甲状腺ホルモンでの治療、又は抗結核剤、抗ハンセン病薬、又は抗マラリア薬での治療に用いることができる。
【実施例】
【０１２０】
以下の実施例では様々な生物分解性半結晶性、相分離、マルチブロックコポリマーが合成され、その処理及び制御放出特性が評価された。ポリマーは、融点（Ｔｍ）を有する結晶性Ｌ−ラクチドベースのハードセグメントＢと、生理学的条件下で体温より低いガラス転移温度（Ｔｇ）を有する親水性ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ベースのセグメントＡからなるものであった。以下の実施例では、ＰＥＧはその分子量（ＭＷ）とともに示される。例えばＰＥＧ１０００とはＭＷ１０００ｇ／ｍｏｌのＰＥＧを指す。
【０１２１】
実施例１
この実施例では、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−ＰＥＧ）プレポリマー（Ａ）の調製のための一般的な手順を提供する。モノマーを窒素雰囲気下で三つ頸容器に秤り取り、減圧下で少なくとも１６時間、グリコリド及びＤ，Ｌ−ラクチドの場合は５０℃で乾燥した。ＰＥＧを窒素雰囲気下でモノマーに加えた。続いて第一スズオクトアートを加え、混合物をマグネチックスターラーで攪拌し、１４０℃で数日間反応させた。１Ｈ−ＮＭＲ測定をＶＸＲ  Ｕｎｉｔｙ  Ｐｌｕｓ  ＮＭＲ測定器（Ｖａｒｉａｎ社）を３００ＭＨｚで操作して行った。ｄ１待ち時間は２０秒に設定し、スキャンの数は１６とした。スペクトルは０から１４ｐｐｍまで記録した。変換とプレポリマーＭｎは１Ｈ−ＮＭＲから決定した。１Ｈ−ＮＭＲ試料は１０ｍｇのポリマーを１ｍｌの重水素クロロホルムに溶解することにより調製した。
【０１２２】
実施例２
この実施例は、Ｍｎ２０００ｇ／ｍｏｌのポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−ＰＥＧ１０００）（ｐＬＰ１０Ｌ２０）の調製を記載する。１４９．８４グラム（１．０４ｍｏｌ）のＤ，Ｌ−ラクチド（Ｐｕｒａｃ）を秤り取り、１４９．２１ｇ（０．１４９ｍｏｌ）のＰＥＧ  ＭＷ１０００（Ｉｎｅｏｓ，ＰＵグレード）を加えた。７１．６ｍｇの第一スズオクトアート（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｒｐ）を加え（モノマー／触媒モル比＝５９００）、混合物をマグネチックスターラーで攪拌し、１４０℃で２４５時間反応させた。１Ｈ−ＮＭＲ測定は９４．８％のモノマー変換率を示した。重量からの分子量（Ｍｎ）の計算値は２０００ｇ／ｍｏｌであった。１Ｈ−ＮＭＲにより決定された分子量は１９５０ｇ／ｍｏｌであった。
【０１２３】
実施例３
この実施例は、Ｍｎ４０００ｇ／ｍｏｌのポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−ＰＥＧ３０００）（ｐＬＰ３０Ｌ４０）の調製を記載する。５０．３５グラム（０．３４９ｍｏｌ）のＤ，Ｌ−ラクチド（Ｐｕｒａｃ）を秤り取り、１５１．０８ｇ（５０．４ｍｍｏｌ）のＰＥＧ  ＭＷ３０００（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｒｐ）を加えた。３７．５ｍｇの第一スズオクトアート（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｒｐ）を加え（モノマー／触媒モル比＝４３００）、混合物をマグネチックスターラーで攪拌し、１４０℃で９０時間反応させた。１Ｈ−ＮＭＲ測定は９３．４％のモノマー変換率を示した。重量からの分子量（Ｍｎ）の計算値は４０００ｇ／ｍｏｌであった。１Ｈ−ＮＭＲにより決定された分子量は３９４０ｇ／ｍｏｌであった。
【０１２４】
実施例４
この実施例は、Ｍｎ２０００ｇ／ｍｏｌのポリ（ε−カプロラクトン−コ−ＰＥＧ１０００）プレポリマー（ｐＣＰ１０Ｃ２０）の調製を記載する。１００．８１グラム（０．１０１ｍｏｌ）のＰＥＧ  ＭＷ１０００（Ｉｎｅｏｓ，ＰＵグレード）を窒素雰囲気下で三つ頸容器に秤り取り、９０℃、減圧下で少なくとも１６時間、乾燥した。１０１．７６ｇ（０．８９２ｍｏｌ）のε−カプロラクトン（Ａｃｒｏｓ、あらかじめ乾燥し、減圧下ＣａＨ２上で蒸留）を窒素雰囲気下でＰＥＧに加え、混合物を１３５℃に加熱した。５７．９ｍｇの第一スズオクトアート（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｒｐ）を加え（モノマー／触媒モル比＝６２００）、混合物をマグネチックスターラーで攪拌し、１３５℃で７６時間反応させた。１Ｈ−ＮＭＲ測定は１００％のモノマー変換率を示した。重量からの分子量（Ｍｎ）の計算値は２０１０ｇ／ｍｏｌであった。１Ｈ−ＮＭＲにより決定された分子量は１９５０ｇ／ｍｏｌであった。
【０１２５】
実施例５
この実施例は、Ｍｎ４０００ｇ／ｍｏｌのポリ（ε−カプロラクトン−コ−ＰＥＧ３０００）プレポリマー（ｐＣＰ３０Ｃ４０）の調製を記載する。１７６．６０グラム（５８．９ｍｍｏｌ）のＰＥＧ  ＭＷ３０００（Ｉｎｅｏｓ、ＰＵグレード）を窒素雰囲気下で三つ頸容器に秤り取り、９０℃、減圧下で少なくとも１６時間乾燥した。５９．４ｇ（０．５２０ｍｏｌ）のε−カプロラクトン（Ａｃｒｏｓ、あらかじめ乾燥し、減圧下ＣａＨ２上で蒸留）を窒素雰囲気下でＰＥＧに加え、混合物を１３５℃に加熱した。６９．６ｍｇの第一スズオクトアート（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｒｐ）を加え（モノマー／触媒モル比＝３０００）、混合物をマグネチックスターラーで攪拌し、１３５℃で２４３時間反応させた。１Ｈ−ＮＭＲ測定は１００％のモノマー変換率を示した。重量からの分子量（Ｍｎ）の計算値は２０１０ｇ／ｍｏｌであった。１Ｈ−ＮＭＲにより決定された分子量は１９５０ｇ／ｍｏｌであった。
【０１２６】
実施例６
この実施例は、１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）から始めた、Ｍｎ＝４０００ｇ／ｍｏｌのポリ（Ｌ−乳酸）プレポリマー（ＬＬ４０００）の調製を記載する。３９９．８９グラム（２．７７ｍｏｌ）のＬ−ラクチド（Ｐｕｒａｃ）を窒素雰囲気下で三つ頸容器に秤り取り、５０℃、減圧下で少なくとも１６時間乾燥した。９．３６ｇ（０．１０４ｍｏｌ）のＢＤＯ（Ａｃｒｏｓ、あらかじめ減圧下で蒸留）を窒素雰囲気下でＬ−ラクチドに加えた。４３４ｍｇのジオキサン（Ａｃｒｏｓ、あらかじめ乾燥しナトリウムワイヤ上で蒸留）を加えＬ−ラクチドとＢＤＯを溶解し、混合物を８０℃に加熱した。８７．８ｍｇの第一スズオクトアート（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｒｐ）を加えた（モノマー／触媒モル比＝１２８００）。混合物をマグネチックスターラーで攪拌し、８０℃で５０．６時間反応させた。ポリマーをジオキサンから、７２時間凍結乾燥し、最終温度を５０℃にすることにより回収した。ジオキサンに溶解したポリマーの場合は、ジオキサンを５０℃、減圧下でまず取り除いた。１Ｈ−ＮＭＲ測定は９６．５％のモノマー変換率を示した。重量からの分子量（Ｍｎ）の計算値は３９４０ｇ／ｍｏｌであった。１Ｈ−ＮＭＲにより決定された分子量は３９００ｇ／ｍｏｌであった。凍結乾燥後のジオキサン含量を１Ｈ−ＮＭＲにより決定した（３００ＭＨｚ、５０ｍｇのポリマーを１ｍｌの重水素クロロホルムに溶解した。ｄ１＝３０秒、３２スキャン）。５ｍｇのジブロモベンゼン（Ａｃｒｏｓ）をジオキサンの定量のために試料に溶解した。ジオキサン含量は１１９３ｐｐｍであった。
【０１２７】
実施例７
この実施例はマルチブロックコポリマーの調製に用いられる一般的手順を記載する。ε−カプロラクトン−コ−ＰＥＧ−コ‐ε‐カプロラクトン（ＣＰＣ）又はＤ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＥＧ−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチドプレポリマー（ＬＰＬ）（Ｍｎ２０００ｇ／ｍｏｌ）をより液状になるまで５０〜８０℃に加熱した。ＬＬ４０００プレポリマー（Ｍｎ４０００ｇ／ｍｏｌ）及びＣＰＣ又はＬＰＬプレポリマーのおよその量を、窒素の入り口を設けた、５０℃で少なくとも４８時間乾燥したガラスアンプルに量り取った。次いで、ガラスアンプルに機械的攪拌器を取り付けた。１，４−ジオキサン（Acros、ナトリウム上で蒸留）を３０重量％のポリマー濃度に添加し、アンプルの内容物を８０℃に加熱して、プレポリマーを溶解した。０．９００−０．９９０当量（プレポリマー水酸基に関して）の１，４−ブタンジイソシアネート（Ｂａｙｅｒ、減圧下蒸留）を加え、反応混合物を１６〜２２時間機械的に攪拌した。非蒸留ジオキサンを２０重量％のポリマー濃度に加え、未反応イソシアネート基をクエンチした。反応混合物をさらに非蒸留ジオキサンで蒸留して１０重量％のポリマー濃度にした。アンプルを室温にまで冷やし、反応混合物をトレーに注ぎ、−１８℃で凍結した。次いで、凍結反応混合物を３０℃、減圧下に置くことにより取り除いた。ポリマーは−１８℃で密封したパッケージで保存した。少量部分のバッチを熱特性（ｍＤＳＣ）、ジオキサン含量（ガスクロマトグラフィー）、固有粘度及びポリマー組成（１Ｈ−ＮＭＲ）について分析した。熱解析は調節示差走査熱量測定（ｍＤＳＣ）により行った。５〜１０ｍｇの試料をＤＳＣパンに秤量した。測定は、調整温度プログラムを用いるＤＳＣ  Ｑ１０００（ＴＡインスツルメント）で行った。アンプリチュードは１℃に、調整時間は６０秒に、及び加熱速度は５℃／分に設定した。試料を−８０℃から１００〜２００℃に加熱した（ポリマーのタイプによる）。固有粘度を、水浴を含むＳｃｈｏｔｔ  ＡＶＳ−４５０粘度計を備えた、ウベローデ粘度計（ＤＩＮ）、タイプ０Ｃ、０ａ、又はＩ、Ｓｃｈｏｔｔ  Ｇｅｒａｅｔｅを用いて測定した。測定は室温でクロロホルムにて行った。クロロホルム中のポリマー濃度は、相対粘度が１．２〜２．０の範囲にあるようにした。ジオキサン含量はＧＣ−ＦＩＤヘッドスぺース法を用いて測定した。測定はＡｇｉｌｅｎｔ  Ｃｏｌｕｍｎ，ＤＢ−６２４／３０ｍ／０．５３ｍｍを備えたＧＣ−ＦＩＤ  Ｃｏｍｂｉ  Ｓａｍｐｌｅｒで行った。試料はＤＭＳＯで調製した。ジオキサン含量はジオキサン校正標準を用いて測定した。
【０１２８】
実施例８
この実施例は、２０（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＥＧ１０００−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）２０００−８０（Ｌ−ラクチド）４０００（２０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０）の調製を記載する。４２．０２ｇのＬＬ４０プレポリマー（Ｍｎ４０４０ｇ／ｍｏｌ、１０．４０ｍｍｏｌ）及び１０．１６ｇのＤ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＥＧ１０００−Ｄ，Ｌ−ラクチドプレポリマー（Ｍｎ２０００ｇ／ｍｏｌ、５．０８ｍｍｏｌ）を秤り取り、８０℃で１００ｍｌの１，４−ジオキサンに溶解した。１．８４６６ｇ（１３．２ｍｍｏｌ）の１，４−ブタンジイソシアナート（プレポリマー水酸基に関して０．８５１当量）を２０ｍｌの１，４−ジオキサンとともに加えた。１７時間後、反応を８８ｍｌの非蒸留ジオキサンでクエンチし、更に２５５ｍｌの非蒸留ジオキサンで希釈した。凍結反応混合物を３０℃、減圧下に置くことによりジオキサンを除去した。
【０１２９】
実施例９
この実施例は、３０（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＥＧ１０００−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）２０００−７０（Ｌ−ラクチド）４０００（３０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０）の調製を記載する。３４．４４ｇのＬＬ４０プレポリマー（Ｍｎ４０２０ｇ／ｍｏｌ、８．５７ｍｍｏｌ）及び１４．９５ｇのＤ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＥＧ１０００−Ｄ，Ｌ−ラクチドプレポリマー（Ｍｎ２０４０ｇ／ｍｏｌ、７．３３ｍｍｏｌ）を秤り取り、８０℃で１００ｍｌの１，４−ジオキサンに溶解した。２．７３８６ｇ（１９．５ｍｍｏｌ）の１，４−ブタンジイソシアナート（プレポリマー水酸基に関して１．２３１当量）を２０ｍｌの１，４−ジオキサンとともに加えた。２０時間後、反応を８５ｍｌの非蒸留ジオキサンでクエンチし、更に２４０ｍｌの非蒸留ジオキサンで希釈した。凍結反応混合物を３０℃、減圧下に置くことによりジオキサンを除去した。
【０１３０】
実施例１０
この実施例は、５０（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＥＧ１０００−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）２０００−５０（Ｌ−ラクチド）４０００（５０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０）の調製を記載する。１９．５９ｇのＬＬ４０プレポリマー（Ｍｎ４０６０ｇ／ｍｏｌ、４．８３ｍｍｏｌ）及び１９．５７ｇのＤ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＥＧ１０００−Ｄ，Ｌ−ラクチドプレポリマー（Ｍｎ２０４０ｇ／ｍｏｌ、９．５９ｍｍｏｌ）を秤り取り、８０℃で７８ｍｌの１，４−ジオキサンに溶解した。２．００１８ｇ（１４．３ｍｍｏｌ）の１，４−ブタンジイソシアナート（プレポリマー水酸基に関して０．９９１当量）を２０ｍｌの１，４−ジオキサンに加えた。２０時間後、反応を６７ｍｌの非蒸留ジオキサンでクエンチし、更に１８９ｍｌの非蒸留ジオキサンで希釈した。凍結反応混合物を３０℃、減圧下に置くことによりジオキサンを除去した。
【０１３１】
実施例１１
この実施例は、７０（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＥＧ１０００−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）２０００−３０（Ｌ−ラクチド）４０００（７０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０）の調製を記載する。８．５９ｇのＬＬ４０プレポリマー（Ｍｎ４０２０ｇ／ｍｏｌ、２．１４ｍｍｏｌ）及び１９．９６ｇのＤ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＥＧ１０００−Ｄ，Ｌ−ラクチドプレポリマー（Ｍｎ２０４０ｇ／ｍｏｌ、９．７８ｍｍｏｌ）を秤り取り、８０℃で４８ｍｌの１，４−ジオキサンに溶解した。１．６４８ｇ（１１．８ｍｍｏｌ）の１，４−ブタンジイソシアナート（プレポリマー水酸基に関して０．９８６当量）を２０ｍｌの１，４−ジオキサンとともに加えた。２１時間後、反応を４９ｍｌの非蒸留ジオキサンでクエンチし、更に１４７ｍｌの非蒸留ジオキサンで希釈した。凍結反応混合物を３０℃、減圧下に置くことによりジオキサンを除去した。
【０１３２】
実施例１２
この実施例は、３０（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＥＧ３０００−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）４０００−７０（Ｌ−ラクチド）４０００（３０ＬＰ３０Ｌ４０−ＬＬ４０）の調製を記載する。２９．９６ｇのＬＬ４０プレポリマー（Ｍｎ４０３０ｇ／ｍｏｌ、７．４３ｍｍｏｌ）及び１４．０１ｇのＤ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＥＧ１０００−Ｄ，Ｌ−ラクチドプレポリマー（Ｍｎ４０００ｇ／ｍｏｌ、３．５０ｍｍｏｌ）を秤り取り、８０℃で８３ｍｌの１，４−ジオキサンに溶解した。１．５２ｇ（１０．８ｍｍｏｌ）の１，４−ブタンジイソシアナート（プレポリマー水酸基に関して０．９９２当量）を２０ｍｌの１，４−ジオキサンとともに加えた。２１時間後、反応を７４ｍｌの非蒸留ジオキサンでクエンチし、更に２２２ｍｌの非蒸留ジオキサンで希釈した。凍結反応混合物を３０℃、減圧下に置くことによりジオキサンを除去した。
【０１３３】
実施例１３
この実施例は、５０（ε−カプロラクトン−コ−ＰＥＧ１０００−コ−ε−カプロラクトン）２０００−５０（Ｌ−ラクチド）４０００（５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０）の調製を記載する。２４．３４ｇのＬＬ４０プレポリマー（Ｍｎ４０３０ｇ／ｍｏｌ、６．０４ｍｍｏｌ）及び２３．８７ｇのε−カプロラクトン−コ−ＰＥＧ１０００−ε−カプロラクトンプレポリマー（Ｍｎ２０１０ｇ／ｍｏｌ、１１．９ｍｍｏｌ）を秤り取り、８０℃で９５ｍｌの１，４−ジオキサンに溶解した。２．４０９８ｇ（１７．２ｍｍｏｌ）の１，４−ブタンジイソシアナート（プレポリマー水酸基に関して０．９６０当量）を２０ｍｌの１，４−ジオキサンとともに加えた。１８時間後、反応を８２ｍｌの非蒸留ジオキサンでクエンチし、更に２４６ｍｌの非蒸留ジオキサンで希釈した。凍結反応混合物を３０℃、減圧下に置くことによりジオキサンを除去した。
【０１３４】
実施例１４
この実施例は、３０（ε−カプロラクトン−コ−ＰＥＧ３０００−コ−ε−カプロラクトン）４０００−７０（Ｌ−ラクチド）４０００（３０ＣＰ３０Ｃ４０−ＬＬ４０）の調製を記載する。３５．８４ｇのＬＬ４０プレポリマー（Ｍｎ４０３０ｇ／ｍｏｌ、８．８９ｍｍｏｌ）及び１４．７９ｇのε−カプロラクトン−コ−ＰＥＧ３０００−ε−カプロラクトンプレポリマー（Ｍｎ４０１０ｇ／ｍｏｌ、３．６９ｍｍｏｌ）を秤り取り、８０℃で１００ｍｌの１，４−ジオキサンに溶解した。１．７４２８ｇ（１２．４ｍｍｏｌ）の１，４−ブタンジイソシアナート（プレポリマー水酸基に関して０．９８８当量）を２０ｍｌの１，４−ジオキサンとともに加えた。１８時間後、反応を８３ｍｌの非蒸留ジオキサンでクエンチし、更に２４０ｍｌの非蒸留ジオキサンで希釈した。凍結反応混合物を３０℃、減圧下に置くことによりジオキサンを除去した。
【０１３５】
実施例１５
合成されたマルチブロックコポリマーを化学組成、分子量、及び残留ジオキサン含量について分析した。表１は、２０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、３０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、５０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、７０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、３０ＬＰ３０Ｌ４０−ＬＬ４０、５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０、３０ＣＰ３０Ｃ４０−ＬＬ４０について集めた分析結果を示す。コポリマーの実際の組成は、１Ｈ−ＮＭＲによりＬ／Ｐ及びＣ／Ｐモル比から決定したように、標的組成に十分近似していた。すべてのポリマーは０．７と１．１ｄｌ／ｇの間の固有粘度を有していた。ジオキサン含量は１０００ｐｐｍを十分に下回り、それは真空乾燥によりジオキサンが効率的に取り除かれたことを示していた。
【０１３６】
マルチブロックコポリマーをその熱特性について分析し、相分離モルホロジーを確認した。結果を表２に示す。図１は５０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０（図１Ａ）、３０ＬＰ３０Ｌ４０−ＬＬ４０（図１Ｂ）及び５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０（図１Ｃ）マルチブロックコポリマーの典型的なＤＳＣサーモグラフを示す。すべてのマルチブロックコポリマーは、ＬＬ４０セグメントの融解により、約１２０〜１３３℃で融点（Ｔｍ）を示した。期待したように、結晶性ＬＬＡ４０セグメントの融解エンタルピー（ΔＨｍ）はセグメントの量の増加とともに増加した。７０ＬＰ１０Ｌ４０−ＬＬ４０、５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０も約８５℃にＴｍを示し、これはＬＬ４０の完全性に欠ける結晶の融解によるものである。ＰＥＧ３０００を含むコポリマーは、ＰＥＧの融解により、約４０℃にＴｍを示した。マルチブロックコポリマーのガラス転移点（Ｔｇ）は一般にプレポリマー（Ａ）とプレポリマー（Ｂ）のガラス転移点の間にあり、これは非晶質プレポリマー（Ａ）とプレポリマー（Ｂ）の非晶質分との相混合を示している。ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０タイプのマルチブロックコポリマーのＴｇは、ＬＬＡ４０セグメントを３０から８０重量％に増加させたときに、−１８から５０℃へと増大した。これらのマルチブロックコポリマーのＴｇはプレポリマー（Ａ）（ｐＬＰ１０Ｌ２０、Ｔｇ−３７°Ｃ)とプレポリマー（Ｂ）（ＬＬ４０、Ｔｇ〜５０℃）のＴｇの間にあり、従って半結晶性ＬＬ４０ブロックの非晶質ポリラクチドとＰＥＧの混合によるものである。５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０は−４８℃のＴｇを有しており、これは同様に非晶質ＰＥＧ、ポリカプロラクトン、及びポリラクチドの混合によるものである。表３はマルチブロックコポリマーの膨潤度を示す。ポリマーの膨潤特性を測定するために、ポリマーフィルムを１３重量％ポリマーのジクロロメタン溶液（約３００ｍｇのポリマーと１．５ｍｌのジクロロメタン）をガラス板上に注ぎ、ポリマー溶液をキャスティングナイフで広げるか、テフロン（登録商標）鋳型に注ぐことにより作成した。ジクロロメタンを一晩かけてゆっくりと蒸発させ、残ったジクロロメタンを２０℃で真空乾燥により除去した。得られたフィルムは１００〜２００μｍの厚みを有していた。膨潤試験については、直径約２５ｍｍの１５〜４０ｍｇの円形フィルムの重さを量り、１０ｍｌのリン酸バッファーｐＨ７．４（ＩＳＯ−１５８１４）を含むフラスコに漬けた。試料を３７℃のオーブンで保存した。各サンプリング時点で試料を集め、過剰のバッファー溶液を表面から除去し、その後試料の重さを４小数天秤はかりで量った。すべての試験は二度行った。膨潤度はコポリマーのＰＥＧの含量、及びおよそ一定のＰＥＧ含量ではＰＥＧのＭＷとともに徐々に増加することがわかった。
【０１３７】
表１  マルチブロックコポリマー２０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、３０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、５０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、７０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、３０ＬＰ３０Ｌ４０−ＬＬ４０、５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０、３０ＣＰ３０Ｃ４０−ＬＬ４０の化学組成、固有粘度、及び残留ジオキサン含量に関する結果の収集
【表１】
2014521762.tif 000002
【０１３８】
表２  マルチブロックコポリマー（ＭＢＣＰ）  ２０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、３０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、５０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、７０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、３０ＬＰ３０Ｌ４０−ＬＬ４０、５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０、３０ＣＰ３０Ｃ４０−ＬＬ４０とそれらのプレポリマー（ＰＰ）Ａ及びＢの熱特性
【表２】
2014521762.tif 000003
【０１３９】
表３  マルチブロックコポリマー２０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、３０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、５０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、７０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、３０ＬＰ３０Ｌ４０−ＬＬ４０、５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０、３０ＣＰ３０Ｃ４０−ＬＬ４０の組成と膨潤
【０１４０】
【表３】
2014521762.tif 000004
【０１４１】
実施例１６
この実施例では、上記実施例で記載された様々な親水性相分離マルチブロックコポリマーを、モデルタンパク質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、６９ｋＤａ）及びリゾチーム（１４ｋＤａ）を用いて、そのタンパク質放出特性について評価した。
【０１４２】
１０重量％のタンパク質を含むタンパク質担持フィルムを、約１５０μｌの２０重量％タンパク質溶液と、３００ｍｇのポリマーを含む１．５ｍｌのジクロロメタンとを、１８０００ｒｐｍでＵｌｔｒａ  ｔｕｒｒａｘにより３０秒間混合することにより調製した。エマルジョンをガラス板の上にキャスティングナイフで広げるか、或いはテフロン（登録商標）鋳型に注いだ。ジクロロメタンを終夜かけてゆっくりと蒸発させ、残ったジクロロメタンを２０℃で真空乾燥により除去した。得られたフィルムの厚さは８０〜１２０μｍであった。
【０１４３】
放出試験のため、２０ｍｇのタンパク質担持フィルムを秤量し、５ｍｌのリン酸バッファーｐＨ７．４を含むバイアルに浸漬し、３７℃のオーブン中で保存した。各サンプリング時点で、１ｍｌの放出媒体をサンプリングし、１ｍｌの新しいバッファーで置き換えた。放出試料のタンパク質含量を、Ｅａｓｙｓ  Ｅｘｐｅｒｔ  ９６穴プレートリーダーを用いてビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）で測定した。
【０１４４】
放出されたリゾチームの生物活性を溶菌試験により測定した。リゾチームを担持したフィルムを上述のように調製した。０．０１重量％のリゾチーム溶液を、２．１ｍｇのリゾチームを秤量し、２０ｍｌのリン酸バッファーを添加することにより調製してコントロールとした。リゾチーム担持フィルムの重さを量り、５ｍｌのｐＨ７．４リン酸バッファーを含むバイアルに浸漬した。リゾチーム担持フィルムを含むバイアルと、調製したばかりのリゾチーム溶液とを、３７℃のオーブンで保存した。各サンプリング時点で、１ｍｌの放出培地をサンプリングし、１ｍｌの新鮮なバッファーで置き換えた。放出サンプルのタンパク質含量を上述のようにＢＣＡにより測定した。（放出された）リゾチームの活性を、１０μｌの試料を添加した細菌分散液（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ，Ｓｉｇｍａ，０．２１ｍｇ／ｍｌ）の濁度変化を３分間、４５０ｎｍで追跡することにより測定した。ＵＳ−ＶＩＳ分光計（Ｖａｒｉａｎ）をこの目的で用いた。必要に応じて試料を希釈し、５〜１００μｇ／ｍｌのリゾチーム濃度を得た。試料のリゾチーム活性を、得られた曲線の傾き（傾きがリゾチーム活性に関連する）を、新鮮なリゾチーム溶液で得られた曲線の傾きと比較することにより計算した。
【０１４５】
図２及び３はそれぞれフィルムからのリゾチームとウシ血清アルブミンの放出を示す。この結果は、ＰＥＧ含量とＰＥＧＭＷを変化させることにより、放出速度とプロファイルが変化しうることを示している。リゾチームを数日から約３ヶ月までの期間に亘って放出させた。より大きなサイズにより、ＢＳＡの放出速度はより低くなり、その結果数日から約４ヶ月までの期間に亘る放出となった。更に、リゾチームの放出は、マルチブロックコポリマーの親水性ブロック中のＰＥＧ基に隣接する様々なモノマー（の組み合わせ）を導入することにより調整することができた。得られたマルチブロックコポリマー（５０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０、５０ＧＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０、及び５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０）は２５重量％ＰＥＧ１０００を含んでおり、同様の膨潤度を示したが、様々な分解速度によりカプセル化されたリゾチームについて様々な放出プロファイルを示すに至った（図４）。
【０１４６】
図５は３０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０又は５０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０（リン酸バッファーｐＨ７．４、３７℃）の１０重量％リゾチーム担持フィルムから放出したリゾチームの活性を示す。対照として、４℃又は３７℃で保存した０．０１重量％リゾチーム溶液４のリゾチームの活性を測定した（リン酸バッファーｐＨ７．４）。結果は、約１ヶ月の期間に亘ってフィルムから放出されたリゾチームがその生物活性を保持していたことを示しており、これはリゾチームの構造的完全性と生物活性がカプセル化工程の間保存されただけでなく、放出前の３７℃での水和膨潤ポリマーマトリクス内でリゾチームが長期間存在していた間にも保存されたことを示している。
【０１４７】
実施例１７
この実施例では、３０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０（ＩＶ  ０．８５ｄｌ／ｇ）及び５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０（ＩＶ  １．０６ｄｌ／ｇ）型の相分離コポリマーを用いてミクロスフェア中にＢＳＡを配合した。
【０１４８】
ＢＳＡ担持ミクロスフェアを、Ｋｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．１９９６，３９（２），３１５−３２６及びＭｅｉｎｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２００１，７０（１−２），１９３−２０２により開示された手順を用いて溶媒蒸発法により、５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０（ＩＶ  １．０６ｄｌ／ｇ）及び３０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０（ＩＶ  ０．８５ｄｌ／ｇ）親水性相分離マルチブロックコポリマーから調製した。（２５〜５０ｍｇの）ＢＳＡを約１５０ｍｇの超純水に溶解し、ジクロロメタン中５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０（１５ｗ／ｖ％）又は３０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０（２３ｗ／ｖ％）の溶液２〜３ｍｌで、２００００ｒｐｍで操作したＵｌｔｒａ  ｔｕｒｒａｘ  ＩＫＡ  Ｔ１８を用いて６０秒間乳化させて、油中水（Ｗ／Ｏ）エマルジョンを得た。このように得られた１次エマルジョンを次いで、４．０重量％ＰＶＡを含む約８０〜１３０ｍｌの超純水（ＵＰ水）で、Ｕｌｔｒａ  ｔｕｒｒａｘ  ＩＫＡ  Ｔ１８を１４０００ｒｐｍで操作して用いて３０秒間乳化させ、水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）エマルジョンを得た。このようにして得られた２次エマルジョンを室温、６００ｒｐｍで２時間ゆっくりと攪拌した。ジクロロメタンの蒸発により、ポリマーが溶液から沈殿しミクロスフェアを得た。３時間後（ジクロロメタンのほぼ完全な蒸発を達成するのに必要な時間、形成されたミクロスフェアを遠心分離により収集し、ミクロスフェアを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０の超純水中水溶液１００〜１２０ｍｌで３回洗浄した。最後にミクロスフェアを凍結乾燥した。
【０１４９】
ＩＶＲ試験のために、３０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０ミクロスフェアの場合は１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４、０．０２重量％ＮａＮ２）を、５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０ミクロスフェアの場合は２５ｍＭＮａＰｉバッファー（ｐＨ７．２、１０５ｍＭＮａＣｌ、０．０１重量％Ｔｗｅｅｎ８０、０．０２重量％ＮａＮ３）の２ｍｌを２０ｍｇのミクロスフェアに添加した。試料を３７℃でインキュベートし、各サンプリング時点で、１．８ｍｌの試料を取り出し、放出バッファーを再び注いだ。ＢＳＡ含量を３０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０ミクロスフェアの場合はＢＣＡタンパク質アッセイで、５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０ミクロスフェアの場合はＵＰＬＣ（溶出液Ａ：超純水中１重量％ＴＦＡ、溶出液Ｂ：アセトニトリル中０．０８５重量％ＴＦＡ、２５分で５／９５  Ａ／Ｂに対して９５／５  ｖ／ｖ  Ａ／Ｂ）で測定した。
【０１５０】
ミクロスフェアの粒径分布をコールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）カウンターで測定した。約１ｍｇのミクロスフェアを５０〜１００ｍｌのイソトロン（Ｉｓｏｔｒｏｎ）ＩＩ溶液にゆっくりと攪拌しながら分散し、粒径を１００μｍ測定セルを備えたコールターカウンターで測定した。
【０１５１】
ミクロスフェアのＢＳＡ含量を、精確に秤量した５〜１０ｍｇのミクロスフェアを５．０ｍｌのアセトニトリルに溶解することにより決定した。遠心分離の後、４ｍｌの上清を取り除き、５ｍｌのＰＢＳを加えた。ＢＳＡ含量をＵＰＬＣで測定した（溶出液Ａ：超純水中１重量％ＴＦＡ、溶出液Ｂ：アセトニトリル中０．１重量％ＴＦＡ、４分で１０／９０  ｖ／ｖ  Ａ／Ｂに対して９０／１０  ｖ／ｖ  Ａ／Ｂ）。
【０１５２】
表４は調製されたＢＳＡ担持ミクロスフェアの粒径、カプセル化効率（ＥＥ）をリストする。図６は５重量％のＢＳＡ標的を担持した３０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０ミクロスフェアと、１０重量％のＢＳＡ標的を担持した５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０ミクロスフェアからのＢＳＡのインビトロ放出を示す。ＢＳＡは有意の突然の上昇もなく直線的にほぼ３ヶ月間３０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０ミクロスフェアから放出した。５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０ミクロスフェア有意の突然の上昇もなくほぼ３ヶ月間直線的にＢＳＡを放出し、その後よりゆっくりとした放出がさらに１．５ヶ月続いた。
【０１５３】
表４  ＢＳＡ担持５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０及び３０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０ミクロスフェアの平均粒径、ＢＳＡ含量及びカプセル化効率
【表４】
2014521762.tif 000005
【０１５４】
実施例１８
この実施例では、上記実施例で記載されるように調製された様々な親水性相分離マルチブロックコポリマーを用いてインシュリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ‐Ｉ）担持フィルム及びミクロスフェア製剤を調製した。
【０１５５】
０．１８ｇのポリマーを１．４６ｇのジクロロメタンに溶解し、次いで超純水中に溶解したＩＧＦ−１とともにＵｌｔｒａ  ｔｕｒｒａｘｉｎｇで３０秒間１８０００ｒｐｍで乳化させるか、又は５秒間１００Ｗで超音波を用いて乳化することにより、ＩＧＦ−１担持フィルムを調製した。エマルジョンをテフロン（登録商標）鋳型に注いだ。ジクロロメタンを終夜かけて蒸発させ、残りのジクロロメタンを終夜真空乾燥により除去した。２０ｍｇのフィルムをカットし、１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、２５Ｍ  ｐＨ７．２、１０５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１重量％Ｔｗｅｅｎ８０及び０．０２重量％ＮａＮ３）とともに３７℃での放出のために置いた。あらかじめ決めておいた時点で試料を取り出し、サンプリングした量を新鮮なバッファーで入れ替えた。
【０１５６】
ＩＧＦ−１担持ミクロスフェアを溶媒抽出／蒸発ベースのＷ／Ｏ／Ｗ乳化プロセスにより調製した。２．７８ｍｇのＩＧＦ−１及び５１．８ｍｇのＢＳＡをエッペンドルフコップ中の１４３μｌの超純水に溶解し、Ｕｌｔｒａ  ｔｕｒｒａｘ（２０，０００ｒｐｍ、６０秒）を用いて２．６２ｇのジクロロメタン中０．４７ｇの５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０（ＩＶ１．０５ｄｌ／ｇ）の溶液に乳化させた。次いで、このように得られた１次エマルジョンを、Ｕｌｔｒａ  ｔｕｒｒａｘ（１４，０００ｒｐｍ、６０秒間）を用いて、４．０重量％のＰＶＡを含む８１ｍｌの超純水に乳化させ、室温で６００ｐｐｍで２時間攪拌した。得られたミクロスフェアを５μｍ膜フィルター上に集め、０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１ｌの超純水で洗浄した。最後にミクロスフェアを凍結乾燥した。
【０１５７】
約１ｍｇのミクロスフェアを５０〜１００ｍｌのイソトロンＩＩ溶液にゆっくりと攪拌することにより分散させ、１００μｍ測定セルを備えたコールターカウンターで粒径を測定した。
【０１５８】
ＩＧＦ−１及びＢＳＡ含量を、精確に秤量した５ｍｇのミクロスフェアを０．３ｍｌのアセトニトリルに溶解することにより決定した。続いて１．２ｍｌのＰＢＳを加え、やさしく振った。遠心分離の後、上清中のＩＧＦ−１とＢＳＡ含量をＵＰＬＣにより決定した。手順を３回行った。
【０１５９】
市販のサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ）を用いて、試料中のヒトインシュリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−１）の濃度を測定して、マイクロカプセル化され放出されたＩＧＦ−１が放出後もまだ捕獲検出抗体と結合することができ、従ってそのレベルでタンパク質分解が起こっていないことを確認した。キットの捕獲検出抗体は天然及び組み換えＩＧＦ−１に特異的であり、標準組み換えＩＧＦ−１として特異的であった。
【０１６０】
放出ＩＧＦ−１の構造的完全性を調べるために、放出試料から集めた１００〜３００ｎｇのＩＧＦ−１をＬａｅｍｌｉ／β−メルカプトエタノールバッファーを用いて変性させ、「ａｎｙ  ＫＤ  ＴＧＸ」プレキャストミニゲルの上に担持し、分離バッファーとして１ ×  Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＳＤＳを用いて１００−２００ Ｖで変性条件下で分離し、コロイダルＣＢＢ染色剤で一晩染色した。デュアルエクストラプロテインマーカー（Ｄｕａｌ  Ｘｔｒａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍａｒｋｅｒ）（バイオラッド）を用いて分離タンパク質のタンパク質サイズを決定した。
【０１６１】
図７は、ＵＰＬＣ及びＥＬＩＳＡにより測定した０．６重量％のＩＧＦ−１で担持された５０ＣＰ３０Ｃ４０−ＬＬ４０及び３０ＣＰ３０Ｃ４０−ＬＬ４０ポリマーフィルムからの、ＩＧＦ−１のインビトロ放出を示す。５０ＣＰ３０Ｃ４０−ＬＬ４０フィルムからＩＧＦ−１は約７日で放出されたが、３０ＣＰ３０Ｃ４０−ＬＬ４０ポリマーフィルムからはＩＧＦ−１は２８日後約４０％の累積放出でゆっくりと放出された。ＵＰＬＣにより測定されたＩＧＦ−１の累積放出は、ＥＬＩＳＡにより測定されたＩＧＦ−１の累積放出とほぼ同一だったので、放出されたＩＧＦ−１は構造的に完全であり生物活性であると結論した。
【０１６２】
０．５重量％のＩＧＦ−１標的担持のミクロスフェアを二重乳化プロセスにより、ＩＶ  １．０５及び０．６８ｄｌ／ｇで５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０から調製した。ミクロスフェアは滑らかな表面（図８）を有しており、カプセル化効率は４０％と６０％の間で変化した。１００μｍ測定セルを備えたコールターカウンターで測定した体積平均粒径（ｄ５０）は５４．４μｍでＣＶ（変動係数）は６１％であった。図９はインビトロでのこれらのミクロスフェアからのＩＧＦ−１放出を示す。２日以内でＩＧＦ−１の完全な放出が、ＩＶ０．６８ｄｌ／ｇの５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０からなるミクロスフェアについて得られた。ＩＶ１．０５ｄｌ／ｇの５０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０からなるミクロスフェアからのＩＧＦ−１放出は、より遅く、約６日後に完全な放出を達成した。放出されたＩＧＦ−１は構造的に完全であることが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果から結論付けられた（図１０）が、タンパク質の分解も凝集も示さなかった。
【０１６３】
実施例１９
この実施例では、上記実施例で記載されたように調製した様々な親水性相分離マルチブロックコポリマー（２０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０（ＩＶ０．５８ｄｌ／ｇ）、３０ＬＰ６Ｌ２０−ＬＬ４０（ＩＶ０．６０ｄｌ／ｇ）及び３０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０（ＩＶ０．７１ｄｌ／ｇ））を用いて、１５ｋＤａ（タンパク質Ａ）の分子量を有する高水溶性生物活性ポリペプチドで担持されたフィルム製剤を調製した。更に、様々なＩＶ（０．８１、０．７１及び０．６５ｄｌ／ｇ）を有する３０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０マルチブロックコポリマーを用いて、タンパク質Ａをミクロスフェア製剤中に配合した。
【０１６４】
タンパク質Ａ担持フィルムを溶媒キャスト法により調製した。１０ｍｇのタンパク質Ａを１２３ｍｇの超純水に溶解し、０．１８ｇのポリマーの１．４６ｇのジクロロメタン中溶液に、Ｕｌｔｒａ  ｔｕｒｒａｘ（１８，０００ｒｐｍ、６０秒）を用いて乳化させた。このようにして得られた１次エマルジョンをテフロン（登録商標）鋳型に注ぎ、ジクロロメタンを終夜蒸発させた。残りのジクロロメタンを真空乾燥により除去した。
【０１６５】
タンパク質Ａ担持ミクロスフェアを溶媒抽出／蒸発ベースのＷ／Ｏ／Ｗ乳化プロセスにより調製した。２１ｍｇのタンパク質Ａ（５重量％標的担持）をエッペンドルフコップ中のイヌリンを含んでもよい１５６μｌの超純水に溶解し、０．４ｇのポリマーの２．１ｇのジクロロメタン中溶液にＵｌｔｒａ  ｔｕｒｒａｘ（２０，０００ｒｐｍ、６０秒）を用いて乳化させた。このようにして得られた１次エマルジョンを次いで、４．０重量％のＰＶＡを含む７０ｍｌの超純水に、ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ（１４０００ｒｐｍ、６０秒間）を用いて乳化させ、室温で２時間、６００ｒｐｍで攪拌した。得られたミクロスフェアを５μｍ膜フィルター上に集め、０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１００ｍｌの超純水で３回洗浄した。最後にミクロスフェアを凍結乾燥した。
【０１６６】
約１０ｍｇのミクロスフェアを５０〜１００ｍｌのイソトロンＩＩ溶液にゆっくりと攪拌することにより分散させ、１００μｍ測定セルを備えたコールターカウンターで粒径を測定した。
【０１６７】
タンパク質Ａ含量を、精確に秤量した５ｍｇのミクロスフェアを０．３ｍｌのアセトニトリルに溶解することにより決定した。遠心分離の後、上清を取り除いて、残りのＡＣＮを蒸発させた。１．９５ｍｌのＰＢＳを加えた。タンパク質Ａ含量をＵＰＬＣ（溶出液Ａ：超純水中１重量％ＴＦＡ、溶出液Ｂ：アセトニトリル中０．１重量％ＴＦＡ、３分で１０／９０  Ａ／Ｂに対して８０／２０  ｖ／ｖ  Ａ／Ｂ）で測定した。
【０１６８】
ＳＥＭイメージングのために、少量のミクロスフェアを炭素導電性テープにくっつけ、３分間金蒸着した。試料は１０ｋＶ電子ビームを用いて撮像した。
【０１６９】
タンパク質Ａ担持フィルムとミクロスフェアのインビトロ放出動力学を１００ｍＭのリン酸バッファーｐＨ７．４（２ｍｌ中２０ｍｇのフィルム）中で測定した。試料を３７℃でインキュベートした。各サンプリング時点で１．８ｍｌの試料を取り出し、１．８ｍｌのリン酸バッファーを再び注いだ。タンパク質Ａ含量をＵＰＬＣ（溶出液Ａ：超純水中１重量％ＴＦＡ、溶出液Ｂ：アセトニトリル中０．１重量％ＴＦＡ、３分で１０／９０  Ａ／Ｂに対して８０／２０  ｖ／ｖ  Ａ／Ｂ）で測定した。
【０１７０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは４〜２０％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲルを用いて還元モードで行った。試料とタンパク質Ａ標準について、スロット（溝）毎に２０μｌのタンパク質溶液を適用した。マーカーについては、２μｌをスロットに適用した。スロットあたり添加したタンパク質の量は７５又は１５０ｎｇであった。試料を１２ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４で、又は超純水で、１５０又は３００ｎｇ／２０μｌのタンパク質Ａ濃度に希釈して調製した。続いて、Ｌａｅｍｍｌｉ作用溶液（１％のメルカプトエタノールを含むＬａｅｍｍｌｉバッファー）を１：１体積比で加えた。試料を５分間、９０℃に加熱し、ゲルに適用した。ゲルを電気泳動セルにクランプし、ランニングバッファー（Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ  ｐＨ８．３）を加えた。試料と標準をゲルに適用し、ゲルを１００ｋＶで１５分走らせた。電圧を引き続いて２００ｋＶに設定し、分子量標準の良好な分離が得られるまでゲルを走らせた。ゲルを超純水で洗浄し、銀試薬で染色した。
【０１７１】
図１１は、２０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０（１０重量％のＰＥＧＭＷ１０００）、３０ＬＰ６Ｌ２０−ＬＬ４０（９重量％のＰＥＧＭＷ６００）及び３０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０（１５重量％のＰＥＧＭＷ１０００）からのタンパク質Ａのインビトロ放出を示す。３０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０ベースフィルムは比較的速くタンパク質Ａを放出し、３ヵ月後に１００％のタンパク質Ａの累積放出を示した。ＰＥＧ１０００をＰＥＧ６００に置き換えることにより、膨潤度が減少し、タンパク質Ａの放出をスローダウンすることができ、ほぼ一次の拡散制御放出動力学が得られ、４ヵ月後には〜７５％の累積放出となった。タンパク質Ａの放出速度の減少はまた、ポリマー中の親水性ＬＰ１０Ｌ２０ブロックの重量分画を減少させることにより達成することができた。２０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０（１０重量％ＰＥＧ１０００）を用いることにより、放出を更にスローダウンさせることができ、初期に１５％未満の小さなバーストの後は、タンパク質Ａの十分に制御された放出動力学が得られ、累積放出は６ヶ月で〜６５％であった。データは明らかに、タンパク質Ａ放出動力学がポリマーの選択により制御できることを示している。
【０１７２】
タンパク質Ａ担持ミクロスフェアを、３〜４重量％のタンパク質Ａで担持した３０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０から調製した。場合により、２又は５重量％のイヌリンを共カプセル化してタンパク質Ａの放出速度を増大させた。タンパク質放出動力学に対するポリマー分子量の効果を、様々な固有粘度の３０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０ポリマーからなるミクロスフェアからのタンパク質Ａの放出動力学を調べることにより検討した。すべてのタンパク質Ａ担持ミクロスフェアについて、球形のミクロスフェアが得られた。共カプセル化イヌリンでのミクロスフェアについて、図１２のＳＥＭ写真で示されるように、表面多孔性はイヌリン含量を上げると増加した。表５はミクロスフェアの粒径とタンパク質Ａのカプセル化効率（ＥＥ）を列挙するものである。図１３は、小さな初期バーストの後に、タンパク質Ａが一定速度で放出されたことを示す。イヌリン含量を下げるとともにバーストは減少し、直線性が増大したことが観察された。イヌリンの存在なしでは、〜７０％が３ヶ月で放出したが、２又は５重量％のイヌリンを共カプセル化した場合は、９０〜１００％が放出した。２又は５重量％の共カプセル化イヌリンを含む３０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０フィルムからのタンパク質Ａの放出は同様であった。放出データを〜４ヶ月まで示す。３０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０ミクロスフェアからのタンパク質Ａの期待される放出時間は約６ヶ月である。
【０１７３】
図１４は、ポリマーの様々な固有粘度（ＩＶ）を持った３０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０フィルムからのタンパク質Ａの放出動力学を示す。タンパク質Ａの放出速度はポリマーＩＶを増大させると増加した。ＩＶ０．７１又は０．８１ｄｌ／ｇの３０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０ポリマーについては、タンパク質Ａの持続的な放出が得られ、２ヵ月後の累積放出は６０〜７０％であった。０．５８ｄｌ／ｇのＩＶの３０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０からなるミクロスフェアからのタンパク質Ａの放出動力学は有意に異なっていた。１ヶ月までの初期放出速度は有意に低かったが、タンパク質Ａ放出は１〜３ヶ月の間加速し、その後再びスローダウンし、約５ヶ月の合計放出期間となった。データは、タンパク質Ａを少なくとも４ヶ月間直線的にミクロスフェアから放出させることができ、放出動力学をイヌリンのような糖の共カプセル化によって、並びにポリマーの固有粘度によって制御することができることを明確に示している。
【０１７４】
ミクロスフェアから放出したタンパク質Ａの構造的完全性をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検討した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、少なくとも２１日間で放出したタンパク質Ａは主として生来のタンパク質からなっていたことを確認した（図１５）。これらの結果は、３０ＣＰ１０Ｃ２０−ＬＬ４０ミクロスフェアが、構造的に完全なタンパク質Ａの長期間放出に適したマトリクスを提供することを示している。
【０１７５】
表５：３〜４重量％タンパク質Ａ標的担持を有するタンパク質Ａ担持ミクロスフェア特性の概要
【表５】
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【０１７６】
実施例２０
この実施例では、上記実施例で記載されたように調製した親水性相分離マルチブロックコポリマー２０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０（ＩＶ０．７３ｄｌ／ｇ）を用いて、２．５ｋＤａ（ペプチドＡ）の分子量を有する生物活性ポリペプチドで担持されたフィルム及びミクロスフェア製剤を調製した。
【０１７７】
ペプチドＡ担持フィルムを溶媒キャスト法により調製した。１０ｍｇ（５重量％担持に対して）又は２０ｍｇ（１０重量％担持に対して）のペプチドＡを１２３ｍｇの超純水に溶解し、０．１８ｇの２０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０（ＩＶ０．７６ｄｌ／ｇ）の１．４６ｇのジクロロメタン中溶液に、Ｕｌｔｒａ  ｔｕｒｒａｘ（１８０００ｒｐｍ、３０秒）を用いて乳化させた。このようにして得られた１次エマルジョンをテフロン（登録商標）鋳型に注ぎ、ジクロロメタンを終夜蒸発させた。残りのジクロロメタンを真空乾燥により除去した。
【０１７８】
タンパク質Ａ担持ミクロスフェアを溶媒蒸発ベースのダブルエマルジョンプロセスにより調製した。５０ｍｇのペプチドＡをＰＢＳに溶解し、０．５ｇの２０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０（ＩＶ０．７３ｄｌ／ｇ）の２ｇのジクロロメタン中溶液にＵｌｔｒａ  ｔｕｒｒａｘ（２４０００ｒｐｍ、６０秒）を用いて乳化させた。このようにして得られた１次エマルジョンを次いで、４．０重量％のポリビニルアルコールを含む２００ｍｌの超純水に、ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ（１４０００ｒｐｍ、３０秒間）を用いて乳化させ、室温で３時間、６００ｒｐｍで攪拌した。得られたミクロスフェアを遠心分離し、上清を取り除き、０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２００ｍｌの超純水で３回洗浄した。最後にミクロスフェアを凍結乾燥した。粒径分布をコールターカウンターで測定した。約１０ｍｇのミクロスフェアを５０〜１００ｍｌのイソトロンＩＩ溶液にゆっくりと攪拌することにより分散させ、１００μｍ測定セルで粒径を測定した。
【０１７９】
ミクロスフェアのペプチドＡ含量を、精確に秤量した５〜１０ｍｇのミクロスフェアを５．０ｍｌのアセトニトリルに溶解することにより決定した。遠心分離の後、４ｍｌの上清を取り除き、５ｍｌのＰＢＳをくわえた。ペプチドＡ含量を、ＨＰＬＣ（溶出液Ａ：超純水中１重量％ＴＦＡ、溶出液Ｂ：アセトニトリル中０．０８５重量％ＴＦＡ、２５分で５／９５  Ａ／Ｂに対して９５／５  ｖ／ｖ  Ａ／Ｂ）で測定した。
【０１８０】
フィルムとミクロスフェアからのペプチドＡのインビトロ放出動力学を３７℃、ＰＢＳｐＨ中で測定した。フィルム又はミクロスフェア（５〜２０ｍｇ）を含むペプチドＡをバイアル中に秤量し、２ｍｌのＰＢＳを加えた。バイアルを３７℃でインキュベートし、あらかじめ決めておいた時点でサンプリングした。各サンプリング時点で、７５〜９０％の放出媒体を集め、新鮮なＰＢＳで置き換えた。放出試料のペプチドＡ含量をＨＰＬＣ（溶出液Ａ：超純水中１重量％ＴＦＡ、溶出液Ｂ：アセトニトリル中０．０８５重量％ＴＦＡ、２５分で５／９５  Ａ／Ｂに対して９５／５  ｖ／ｖ  Ａ／Ｂ）で測定した。
【０１８１】
図１６は、２０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０フィルムからのペプチドＡのインビトロ放出を示す。ペプチドＡは、５重量％担持２０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０フィルムから、有意のバーストもなく少なくとも５ヶ月間直線的に放出された。より高いペプチドＡ担持（１０重量％）の２０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０フィルムについては、バースト放出が１５％に増大した。約２ヵ月後、放出は５重量％担持フィルムと同様であった。
【０１８２】
ペプチドＡ担持２０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０ミクロスフェアは３０μｍの平均粒径と１０．３重量％のペプチドＡ含量を有し、１００％のカプセル化効率を表していた。図１７はペプチドＡ  ＭＳＰが約１０重量％の低いバースト放出を示し、次いで少なくとも４０日間ゼロ次の放出動力学を示したことを示す。
【０１８３】
実施例２１
この実施例では、親水性相分離マルチブロックコポリマー（２０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０（実施例８）及び１０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０を用いて、ラパマイシン（ＭＷ９１４Ｄａ）を担持したミクロスフェアを調製した。ポリマーのポリエチレングリコール成分は１０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有していた。
【０１８４】
２０重量％のラパマイシンの目標担持量を有するラパマイシン担持ミクロスフェアを、単一の水中油（Ｏ／Ｗ）エマルジョンルートを用いて溶媒蒸発法により調製した。ポリマーを、ジクロロメタン中様々なブレンド比で約２０重量％の濃度に溶解し、ラパマイシンの必要量を加えた。ポリマー／ラパマイシン溶液を次いで、４．０重量％のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含む２００ｍｌの超純水に、Ｕｌｔｒａ  ｔｕｒｒａｘ（１４，０００ｒｐｍ、３０秒）を用いて乳化させ、次いで室温、３００ｒｐｍで３時間、マグネチックスターラーで攪拌した。ミクロスフェア分散液を遠心分離で濃縮し、ミクロスフェアを５０ｍｌの０．０５重量％  Ｔｗｅｅｎ２０水溶液で３回洗浄した。最後に、ミクロスフェアを凍結乾燥した。
【０１８５】
粒径分布をコールターカウンターで測定した。約１０ｍｇのミクロスフェアを５０〜１００ｍｌのイソトロンＩＩ溶液にゆっくりと攪拌しながら分散させ、１００μｍ測定セルで粒径を測定した。
【０１８６】
ミクロスフェアのラパマイシン含量を、精確に秤量した５〜１０ｍｇのミクロスフェアを５．０ｍｌのアセトニトリルに溶解することにより決定した。遠心分離の後、４ｍｌの上清を取り除き、５ｍｌのＰＢＳを加えた。ラパマイシン含量をＨＰＬＣで測定した（溶剤：アセトニトリル／水  ７０／３０ｖ／ｖ；２７８ｎｍ）。
【０１８７】
ミクロスフェアからのラパマイシンのインビトロ放出動力学を、０．５重量％ＳＤＳを含む１０ｍＬ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４中、３７℃で測定し、ラパマイシン含有ミクロスフェア（５〜２０ｍｇ）をバイアル中に量り取り、２ｍｌの放出溶媒を加えた。バイアルを３７℃でインキュベートし、あらかじめ決めておいた時点でサンプリングした。各サンプリング時点で７５〜９０％の放出媒体を集め、新鮮なＰＢＳで置き換えた。放出試料のラパマイシン含量をＨＰＬＣで決定した。
【０１８８】
このように調製したラパマイシンミクロスフェアは３５μｍの平均サイズを有し、ラパマイシン含量は１７〜２０重量％で変化し、これは８９％〜１００％のカプセル化効率を表す。図１８は、２０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０及び１０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０の様々なブレンドからなるミクロスフェアからのラパマイシンの放出を示す。２０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０ベースのミクロスフェアからのラパマイシン放出は比較的速かったが、１０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０ベースのミクロスフェアからのラパマイシンの放出は極めて遅かった。二つのポリマーをブレンドすることにより、中間放出プロファイルを有するミクロスフェアが得られた。
【０１８９】
実施例２２
この実施例では、親水性相分離マルチブロックコポリマー  ２０ＬＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０から、油中油中水プロセスにより、酢酸ゴセレリン担持ミクロスフェアを調製した。６２．６ｍｇの酢酸ゴセレリンを１５０μｌの超純水（２９．４重量％）に溶解し、シンチレーションバイアル（Ｕｌｔｒａ  ｔｕｒｒａｘ、２０，０００ｒｐｍ、６０秒）中の、０．５ｇの２０ＬＰ１０−ＬＬＡ４０ポリマーの７．４ｇのジクロロメタン中溶液で乳化させた。１３．５ｇのポリマー沈殿（シリコンオイル、３５０ｃＳｔ）を次いでゆっくりと一定攪拌下（１２，０００ｒｐｍ）で加え（２〜５分）、初期のミクロ粒子を形成した。次いで初期のミクロ粒子を室温で５５０ｍｌのヘプタンに注いだ（ジクロロメタン対ヘプタン溶媒の比  １３．５：１）。抽出容器を閉めて抽出媒体の過剰な蒸発を防いだ。約３時間の抽出後、ミクロ粒子を減圧濾過で集め、追加のヘプタンですすぎ、減圧下で乾燥した。ミクロスフェアは６７μｍの平均サイズ、８．３％のゴセレリン含量を示し、それは８８％のカプセル化効率を表す。
【０１９０】
粒径分布をコールターカウンターで測定した。約１０ｍｇのミクロスフェアを５０〜１００ｍｌのイソトロンＩＩ溶液にゆっくりと攪拌しながら分散させ、１００μｍ測定セルで粒径を測定した。
【０１９１】
ミクロスフェアのゴセレリン含量を、精確に秤量した５〜１０ｍｇのミクロスフェアを５．０ｍｌのアセトニトリルに溶解することにより決定した。遠心分離の後、４ｍｌの上清を取り除き、５ｍｌのＰＢＳを加えた。ゴセレリン含量をＨＰＬＣで測定した（溶剤：水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸  ７２／２８／０．１、２２０ｎｍ）。
【０１９２】
ミクロスフェアからのゴセレリンのインビトロ放出動力学を、ＰＢＳ（１９２ｍＭ、ｐＨ７．４、０．０１％ｔｗｅｅｎ  ８０及び０．０２％ナトリウムアジドを含む）中、３７℃で測定した。ゴセレリン含有ミクロスフェア（５〜２０ｍｇ）をバイアル中に量り取り、２ｍｌの放出溶媒を加えた。バイアルを３７℃でインキュベートし、あらかじめ決めておいた時点でサンプリングした。各サンプリング時点で７５〜９０％の放出媒体を集め、新鮮なＰＢＳで置き換えた。放出試料のゴセレリン含量をＨＰＬＣで決定した。
【０１９３】
このように調製したゴセレリン担持２０ＬＰ１０−ＬＬａ４０ミクロスフェアは球形で滑らかな外観（図１９）、７１μｍ（ＣＶ４７％）の平均サイズ、８．３％のゴセレリン含量を有し、これは８８％のカプセル化効率を表す。図２０は、ミクロスフェアからのゴセレリンの放出を示す。
【０１９４】
実施例２３
この実施例では、親水性相分離マルチブロックコポリマー３０ＣＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０から、油中油中固体プロセス（Ｓ／Ｏ／Ｏ）により、リゾチーム担持ミクロスフェアを調製した。０．４３ｇの３０ＣＰ１０Ｌ２０−ＬＬ４０をシンチレーションバイアル中の７．４ｇのジクロロメタンに溶解し（５．４重量％）、０．０７４ｇの粒径１〜２μｍのスプレー乾燥イヌリン安定化リゾチームミクロ粒子（リゾチーム／イヌリン比：１：２ｗ／ｗ）をポリマー溶液に加え、分散液をＵｌｔｒａ  ｔｕｒｒａｘ（２０,０００ｒｐｍ、６０秒）によりホモジナイズした。１１．４６ｇのポリマー沈殿（シリコンオイル、３５０ｃＳｔ）を次いでゆっくりと一定攪拌下（１２，０００ｒｐｍ）で加え（２〜５分）、初期のミクロ粒子を形成した。次いで初期のミクロ粒子を室温で５５０ｍｌのヘプタンに注いだ（ジクロロメタン対ヘプタン溶媒の比  １３．５：１）。抽出容器を閉めて抽出媒体の過剰な蒸発を防いだ。約３時間の抽出後、ミクロ粒子を減圧濾過で集め、追加のヘプタンですすぎ、減圧下で乾燥した。ミクロスフェアは５９μｍの平均サイズ、４．１〜５．６％のリゾチーム含量を示し、それは８０〜１００％のカプセル化効率を表す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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