(57)【要約】  モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮａ）、ｓｉＲＮＡ、またはがん細胞中の発がんタンパク質に対して特異的な抗体、およびトランスフェリン受容体タンパク質に対して特異的な抗体を含む複数の分子モジュールに共有結合的に連結している生分解性、無毒性および非免疫原性ポリ（β−Ｌ−リンゴ酸）ＰＭＬＡをベースとするナノバイオポリマーコンジュゲートは、対象におけるがんの治療に効果的である。
2014504591.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるがんを治療するための薬物送達組成物であって、
腫瘍原性細胞またはがん細胞を標的化する少なくとも１つのモジュール、前記細胞中におけるヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）タンパク質の合成または活性を阻害する少なくとも１つのモジュールおよび細胞質内送達のための少なくとも１つのモジュールを含む生物学的に活性な複数の分子モジュールと、
ポリリンゴ酸ベースの分子スキャホールドと
を含み、前記分子モジュールが前記スキャホールドに共有結合的に連結している、薬物送達組成物。
【請求項２】
前記ＨＥＲタンパク質がＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４を含む群から選択される少なくとも１種のタンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記タンパク質の合成または活性を阻害する前記少なくとも１つのモジュールがアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、抗体、ポリペプチド、オリゴペプチドおよび低分子量薬物を含む群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＡＯＮが、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質のｍＲＮＡ転写物に含有される配列に相補的な配列を有するモルホリノＡＯＮである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＡＯＮが
５’−ＡＧＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＴＴＣＡＴＧＴＣＴＧＴＧ−３’（配列番号１）および
５’−ＣＡＴＧＧＴＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣ−３’（配列番号２）
から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記細胞を標的化する前記少なくとも１つのモジュールが、前記細胞中の脈管構造タンパク質に特異的に結合する抗体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記脈管構造タンパク質がトランスフェリン受容体タンパク質を含む、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
前記抗体が抗ヒト抗体である、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗体が、ラット抗マウス抗体、ラット抗ヒト抗体、ウサギ抗ヒト抗体およびヤギ抗ヒト抗体の少なくとも１つから選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記タンパク質の活性を阻害する前記少なくとも１つのモジュールが、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質に特異的に結合する抗体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗体がＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＡＯＮが、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）タンパク質のｍＲＮＡ転写物に含有される配列に相補的な配列を有するモルホリノＡＯＮである、請求項３に記載の組成物。
【請求項１３】
前記配列が
５’−ＴＣＧＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＣＣＣＧＡＴＣＡＡＴＡＣ−３’（配列番号３）
を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＡＯＮがラミニン−４１１の少なくとも１つのサブユニットのｍＲＮＡ転写物に含有される配列に相補的な配列を有するモルホリノＡＯＮである、請求項３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのサブユニットがα４サブユニットおよびβ１サブユニットから選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
α４サブユニットの前記転写物に相補的な前記配列が、５’−ＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＣＡＴＴＴＣＴＣＣＧＣＴＧＡＣ−３’（配列番号４）を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記β１サブユニットの前記転写物に相補的な前記配列が、５’−ＣＴＡＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＣＡＴＧＣＣ−３’（配列番号５）を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドが、ＥＧＦＲタンパク質をコードする遺伝子に相補的な配列を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項１９】
前記配列が、センス配列およびアンチセンス配列から選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記センス配列が、５’−ＣＣＵＡＵＡＡＵＧＣＵＡＣＧＡＡＵＡＵｔｔ−３’（配列番号６）を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記アンチセンス配列が、５’−ＡＵＡＵＵＣＧＵＡＧＣＡＵＵＵＡＵＧＧａｇ−３’（配列番号７）を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドが、ＨＥＲ２タンパク質をコードする遺伝子に相補的な配列を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項２３】
前記配列が、センス配列およびアンチセンス配列から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記センス配列が、５’−ＧＵＵＧＧＡＵＧＡＵＵＧＡＣＵＣＵＧＡｔｔ−３’（配列番号８）を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記アンチセンス配列が、５’−ＵＣＡＧＡＧＵＣＡＡＵＣＡＵＣＣＡＡＣａｔ−３’（配列番号９）を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記細胞質内送達のための少なくとも１つのモジュールが、エンドソームエスケープユニットを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記エンドソームエスケープユニットが、ロイシンエチルエステルを含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ロイシンエチルエステルの濃度が前記薬物送達組成物の約４０％を構成する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記複数のモジュールが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ＰＥＧが約１，０００Ｄａ、約５，０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、約１５，０００Ｄａ、約２０，０００Ｄａ、約２５，０００Ｄａおよび約３０，０００Ｄａの分子量を有する、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記スキャホールドが、ポリ−β−Ｌ−リンゴ酸（ＰＭＬＡ）を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３２】
前記対象における前記がんの治療に有効な単位用量で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記単位用量が、１μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇから選択される少なくとも１つである、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記単位用量が、少なくとも１ｍｇ／ｋｇである、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
前記単位用量が、約１０ｍｇ／ｋｇ未満である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３６】
前記がんが、胃がん、子宮内膜がん、唾液腺がん、肺がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、卵巣がん、腹膜がん、前立腺がん、結腸直腸がん、乳がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、脳がん（brain cancer）、頭頸部がん、精巣がんおよび奇形腫がんのリストから選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３７】
前記がんが原発性がんを含む、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記がんが転移性がんを含む、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３９】
前記がんが、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体タンパク質を過剰発現している細胞を含む、請求項３６に記載の組成物。
【請求項４０】
前記乳がんが三種陰性乳がんである、請求項３６に記載の組成物。
【請求項４１】
対象におけるがんを治療するための薬物送達組成物であって、
ポリ−β−Ｌ−リンゴ酸（ＰＭＬＡ）を含む重合カルボン酸分子スキャホールドと、
ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体タンパク質の合成を実質的に阻害するアンチセンス分子、
細胞質への前記アンチセンス分子の送達を促進する分子モジュール、
前記受容体タンパク質の活性を阻害する前記受容体タンパク質に対して特異的な少なくとも１つの抗体、
腫瘍脈管構造タンパク質を標的化する少なくとも１つの抗体、および
前記組成物の循環を延長する分子モジュール
を含む生物学的に活性な複数の分子モジュールと
を含み、前記分子モジュールが、前記スキャホールドに共有結合的に連結している、薬物送達組成物。
【請求項４２】
対象におけるがんを治療するための薬物送達組成物であって、
ポリ−β−Ｌ−リンゴ酸（ＰＭＬＡ）を含む重合カルボン酸分子スキャホールドと、
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）タンパク質の合成を実質的に阻害するアンチセンス分子、
ラミニン−４１１の少なくとも１つのサブユニットを実質的に阻害するアンチセンス分子、
前記アンチセンス分子の細胞質への送達を促進する分子モジュール、
腫瘍脈管構造タンパク質を標的化する少なくとも１つの抗体、および
前記組成物の循環を延長する分子モジュール
を含む生物学的に活性な複数の分子モジュールと
を含み、前記分子モジュールが前記スキャホールドに共有結合的に連結している、薬物送達組成物。
【請求項４３】
薬物送達組成物を容器内に含む、がんを有する患者を治療するためのキットであって、前記薬物送達組成物が、ポリ−β−Ｌ−リンゴ酸（ＰＭＬＡ）を含むスキャホールドのナノバイオポリマーコンジュゲートと、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）タンパク質の合成または活性を実質的に阻害するアンチセンス分子、細胞質への前記アンチセンス分子の送達を促進する分子モジュール、前記ＨＥＲタンパク質に対して特異的な少なくとも１つの標的化抗体、腫瘍脈管構造タンパク質に対して特異的な少なくとも１つの抗体、および前記組成物の循環を延長する分子モジュールを含む複数の分子モジュールとを含み、前記ＰＭＬＡが前記分子モジュールに共有結合的に連結している、キット。
【請求項４４】
薬学的に許容される緩衝剤をさらに含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
使用のための説明書をさらに含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４６】
対象におけるがんを治療するための方法であって、
腫瘍原性細胞またはがん細胞を標的化する少なくとも１つのモジュール、前記細胞中のヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）タンパク質の合成または活性を阻害する少なくとも１つのモジュール、および細胞質内送達のための少なくとも１つのモジュールを含む複数の分子モジュールに共有結合的に連結しているポリ−β−Ｌ−リンゴ酸（ＰＭＬＡ）を含む薬物送達組成物に前記対象を接触させるステップと、
前記対象における腫瘍成長の阻害、腫瘍退縮およびがんの消失の少なくとも１つを分析し、それにより前記対象における前記がんを治療するステップと
を含む、方法。
【請求項４７】
前記ＨＥＲタンパク質が、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４を含む群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＨＥＲタンパク質の合成または活性を阻害する前記モジュールが、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、抗体、ポリペプチド、オリゴペプチドおよび低分子量薬物の群から選択される少なくとも１種である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＡＯＮが、ＨＥＲ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）タンパク質およびラミニン−４１１のサブユニットの群から選択される少なくとも１つのタンパク質のｍＲＮＡ転写物に相補的な配列を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＨＥＲ２転写物に相補的な前記配列が、５’ＡＧＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＴＴＣＡＴＧＴＣＴＧＴＧ−３’（配列番号１）および５’−ＣＡＴＧＧＴＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣ−３’（配列番号２）を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＥＧＦＲ転写物に相補的な前記配列が、５’−ＴＣＧＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＣＣＣＧＡＴＣＡＡＴＡＣ−３’（配列番号３）を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
ラミニン−４１１の前記サブユニットが、α４サブユニットを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記配列が、５’−ＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＣＡＴＴＴＣＴＣＣＧＣＴＧＡＣ−３’（配列番号４）を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ラミニン−４１１の前記サブユニットが、β１サブユニットを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記配列が、５’−ＣＴＡＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＣＡＴＧＣＣ−３’（配列番号５）を含む、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドが、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）タンパク質およびＨＥＲ２の少なくとも１つをコードする遺伝子に相補的な配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＥＧＦＲ遺伝子に相補的な前記ｓｉＲＮＡ配列が、５’−ＣＣＵＡＵＡＡＵＧＣＵＡＣＧＡＡＵＡＵｔｔ−３’（配列番号６）および５’−ＡＵＡＵＵＣＧＵＡＧＣＡＵＵＵＡＵＧＧａｇ−３’（配列番号７）から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＨＥＲ２遺伝子に相補的な前記ｓｉＲＮＡ配列が、５’−ＧＵＵＧＧＡＵＧＡＵＵＧＡＣＵＣＵＧＡｔｔ−３’（配列番号８）および５’−ＵＣＡＧＡＧＵＣＡＡＵＣＡＵＣＣＡＡＣａｔ−３’（配列番号９）から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗体が、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質に特異的に結合する、請求項４８に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗体がトラスツズマブＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞を標的化する前記少なくとも１つのモジュールが、トランスフェリン受容体タンパク質に特異的に結合する抗体を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項６２】
前記抗体が、抗ヒト抗体である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記抗体が、ラット抗マウス抗体、ラット抗ヒト抗体、ウサギ抗ヒト抗体およびヤギ抗ヒト抗体の少なくとも１つから選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
細胞質内送達のための前記少なくとも１つのモジュールが、エンドソームエスケープユニットを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項６５】
前記エンドソームエスケープユニットが、ロイシンエチルエステルを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記複数のモジュールが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＰＥＧが、約１，０００Ｄａの分子量を有する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＰＥＧが、約５，０００Ｄａの分子量を有する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
腫瘍成長の阻害を分析するステップが、前記対象における腫瘍成長の約６０％、７０％、８０％または約９０％を超える阻害を観察することを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項７０】
前記対象が哺乳動物である、請求項４６に記載の方法。
【請求項７１】
前記哺乳動物がげっ歯動物である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記げっ歯動物が、実験用ヒト乳房腫瘍保有ヌードマウスである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記対象が、ヒトである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
Ａｋｔリン酸化の抑制を伴うＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体シグナル伝達の前記阻害を、腫瘍成長の阻害と共に観察するステップをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項７５】
追加的治療剤を投与するステップをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項７６】
前記追加的治療剤が抗体、酵素阻害物質、抗菌剤、抗ウイルス剤、ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤、代謝拮抗物質、サイトカイン、サイトカイン遮断剤、接着分子遮断剤および可溶性サイトカイン受容体からなる群から選択される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記組成物に前記対象を接触させるステップが、前記対象における前記がんの治療に有効な単位用量で前記組成物を提供することをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項７８】
前記単位用量が、１μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇから選択される少なくとも１つである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記単位用量が、少なくとも１つの１ｍｇ／ｋｇである、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記単位用量が、約１０ｍｇ／ｋｇ未満である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
前記がんが、胃がん、子宮内膜がん、唾液腺がん、肺がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、卵巣がん、腹膜がん、前立腺がん、結腸直腸がん、乳がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、脳がん（brain cancer）、頭頸部がん、精巣がんおよび奇形腫がんのリストから選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項８２】
前記がんが、原発性がんを含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記がんが、転移性がんを含む、請求項８１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、発がんタンパク質の合成および活性を阻害するポリリンゴ酸ベースのナノバイオポリマー組成物で細胞増殖性障害を有する患者を治療するための組成物および方法に関する。
【０００２】
政府の支援
本発明は、一部が、国立保健研究所からの助成金ＲＯ１ＣＡ１２３４９５およびＲ０１ＣＡＣＡ１１３６８４１による補助で行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
乳がんは、世界中の女性の多くを冒す疾患である。合衆国において女性の約８分の１（１２から１３％の間）は、彼女の生涯において浸潤性乳がんを発症する。予後および生存率は、がんの種類および段階に応じて大きく変化する。ヒト上皮成長因子受容体−２（ＨＥＲ２）などの遺伝的特徴を発現する乳がんは、予後不良を伴う。
【０００４】
研究は、タンパク質ｐｌ８５ＨＥＲ２を過剰発現する細胞を含むがんの治療のための組換えヒト化モノクローナル抗体の使用に焦点を合わせてきた。この１８５ｋＤａ成長因子受容体は、ｈｅｒ−２がん原遺伝子によってコードされており、ｎｅｕおよびｃ−ｅｒｂＢ−２とも称される(例えば非特許文献１参照)。ｈｅｒ−２遺伝子は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）をコードしている遺伝子に密接に関連する。ｈｅｒ−２遺伝子の増幅は、ヒト乳がん細胞における悪性形質転換に関連している（例えば、非特許文献１参照）。ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現は、乳がん患者の２０〜３０％において同定されており、局所的に進行した疾患、腫瘍再発の可能性の増加および患者生存期間の減少と関連している。胃がん、子宮内膜がん、唾液腺がん、小細胞肺がん、膵臓がん、卵巣がん、腹膜がん、前立腺がんまたは直腸結腸がんを有する患者の３０〜４０％ほども、このタンパク質の過剰発現を呈する場合がある。
【０００５】
「三種陰性」としても周知のＨＥＲ２陰性乳がんのより治療が困難な形態は、いくらかの患者を冒す。この形態は、３種の主な受容体、ＨＥＲ２、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体についての検査で陰性とされる。
【０００６】
ヒト化抗ＨＥＲ２／ｎｅｕモノクローナル抗体トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現する進行性乳がんを有する患者の治療のために、単独で使用されるかまたは化学療法と併用され、抗腫瘍効果が顕著である（例えば、非特許文献２、３および４参照）。しかし、正常器官への深刻な有害作用が報告されている（例えば、非特許文献５および６参照）。さらに、多くの患者は、治療１年以内にＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）への耐性を生じ、これがこの治療を効果のないものとする（例えば、非特許文献７参照）。したがって、非腫瘍組織への副作用が最小の新規薬物が、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍治療を改善するために緊急に必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】スラモン(Slamon)ら、1987年発行、 Science 235,177
【非特許文献２】バセルガ・ジェイ(Baselga J)、2006年発行、Science 312,1175
【非特許文献３】バセルガ・ジェイ(Baselga J)ら、1999年発行、Semin Oncol 26,78
【非特許文献４】スラモン・ディジェイ(Slamon DJ)ら、2009年発行、J Natl Cancer Inst 101,615
【非特許文献５】キーフ・ディエル(Keef DL)、2002年発行、Cancer 95,1592
【非特許文献６】ヴァヒド・ビー(Vahid B)ら、2008年発行、Chest 133,528
【非特許文献７】ツェング・ピーエイチ(Tseng PH)ら、2006年発行、Mol Pharmacol 70,1534
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書において提供される本発明の一実施形態は、対象におけるがんを治療するための薬物送達組成物であって、薬物は腫瘍原性細胞またはがん細胞を標的化する少なくとも１つのモジュール、細胞中のヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）タンパク質の合成もしくは活性を阻害する少なくとも１つのモジュールおよび細胞質内送達のための少なくとも１つのモジュールを有する生物学的に活性な複数の分子モジュールならびにポリリンゴ酸ベースの分子スキャホールドを分子モジュールがスキャホールドに共有結合的に連結するように含む。例えばＨＥＲタンパク質は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４の群から選択される少なくとも１つのタンパク質である。例えばタンパク質の合成または活性を阻害する少なくとも１つのモジュールは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、抗体、ポリペプチド、オリゴペプチドおよび低分子量薬物の群から選択される。関連する一実施形態におけるスキャホールドは、ポリ（−β−Ｌ−リンゴ酸）とも記載されるポリ−β−Ｌ−リンゴ酸（ＰＭＬＡ）を含む。
【００１０】
関連する実施形態におけるＡＯＮは、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質のｍＲＮＡ転写物に含有される配列に相補的な配列を有するモルホリノＡＯＮである。例えばＡＯＮは、５’−ＡＧＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＴＴＣＡＴＧＴＣＴＧＴＧ−３’（配列番号１）および５’−ＣＡＴＧＧＴＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣ−３’（配列番号２）から選択される。
【００１１】
関連する実施形態一では、細胞を標的化する少なくとも１つのモジュールは、細胞中の脈管構造タンパク質に特異的に結合する抗体を含む。例えば脈管構造タンパク質は、トランスフェリン受容体タンパク質を含む。一般に抗体は、抗ヒト抗体、ラット抗マウス抗体、ラット抗ヒト抗体、ウサギ抗ヒト抗体およびヤギ抗ヒト抗体の内の少なくとも１つから選択される。
【００１２】
代替的な一実施形態では、タンパク質の活性を阻害する少なくとも１つのモジュールは、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質に特異的に結合する抗体を含む。例えば抗体は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）である。
【００１３】
代替的実施形態における組成物は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）タンパク質のｍＲＮＡ転写物に含有される配列に相補的な配列を有するモルホリノＡＯＮを含む。例えば配列は、５’−ＴＣＧＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＣＣＣＧＡＴＣＡＡＴＡＣ−３’（配列番号３）を含む。
【００１４】
関連する実施形態における組成物は、ラミニン−４１１の少なくとも１つのサブユニットのｍＲＮＡ転写物に含有される配列に相補的な配列を有するモルホリノＡＯＮを含む。例えばサブユニットは、α４サブユニットおよびβ１サブユニットから選択される。α４サブユニットの転写物に相補的な配列は、５’−ＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＣＡＴＴＴＣＴＣＣＧＣＴＧＡＣ−３’（配列番号４）を含む。β１サブユニットの転写物に相補的な配列は、５’−ＣＴＡＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＣＡＴＧＣＣ−３’（配列番号５）を含む。
【００１５】
代替的な一実施形態では、組成物は、ＥＧＦＲタンパク質をコードする遺伝子に相補的な配列を有するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。例えば配列は、センス配列５’−ＣＣＵＡＵＡＡＵＧＣＵＡＣＧＡＡＵＡＵｔｔ−３’（配列番号６）およびアンチセンス配列５’−ＡＵＡＵＵＣＧＵＡＧＣＡＵＵＵＡＵＧＧａｇ−３’（配列番号７）を含む。
【００１６】
関連する一実施形態におけるｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ＨＥＲ２タンパク質をコードする遺伝子に相補的な配列を含む。例えば配列は、センス配列５’−ＧＵＵＧＧＡＵＧＡＵＵＧＡＣＵＣＵＧＡｔｔ−３’（配列番号８）およびアンチセンス配列５’−ＵＣＡＧＡＧＵＣＡＡＵＣＡＵＣＣＡＡＣａｔ−３’（配列番号９）を含む。
【００１７】
関連する一実施形態では、細胞質内送達のための少なくとも１つのモジュールは、エンドソームエスケープユニット（ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｅｓｃａｐｅ  ｕｎｉｔ）を含む。一般にエンドソームエスケープユニットは、ロイシン残基、バリン残基およびロイシンエチルエステル、すなわち複数のロイシンもしくはバリン残基または単一もしくは複数のロイシン残基あるいはこれらの任意の混合物の群から選択される。例えば、関連する一実施形態では、ロイシンエチルエステルの濃度は、薬物送達組成物の約４０％である。
【００１８】
関連する実施形態における複数のモジュールは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含む。例えばＰＥＧは約１，０００Ｄａ、約５，０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、約１５，０００Ｄａ、約２０，０００Ｄａ、約２５，０００Ｄａおよび約３０，０００Ｄａの分子量を有する。
【００１９】
一実施形態は、患者におけるがんの治療に有効な単位用量で組成物を提供する。例えば単位用量は、１μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇから選択される少なくとも１つである。例えば単位用量は少なくとも１ｍｇ／ｋｇである。例えば単位用量は約１０ｍｇ／ｋｇ未満である。
【００２０】
関連する実施形態では、がんは、胃がん、子宮内膜がん、唾液腺がん、肺がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、卵巣がん、腹膜がん、前立腺がん、結腸直腸がん、乳がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、脳がん（brain cancer）、頭頸部がん、精巣がんおよび奇形腫がん（ｔｅｒａｔｏｍａ  ｃａｎｃｅｒ）のリストから選択される少なくとも１つである。例えば乳がんは三種陰性乳がんである。例えばがんは、原発性がんもしくは転移性がんのいずれかまたは両方を含む。別の実施形態におけるがんは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体タンパク質を過剰発現する細胞を含む。
【００２１】
本明細書中における本発明の一実施形態は、対象におけるがんを治療するための薬物送達組成物であって、ポリ−β−Ｌ−リンゴ酸（ＰＭＬＡ）などの重合したカルボン酸分子スキャホールドと、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体タンパク質の合成を実質的に阻害するアンチセンス分子、細胞質へのアンチセンス分子の送達を促進する分子モジュール、受容体タンパク質に特異的で受容体タンパク質の活性を阻害する少なくとも１つの抗体、腫瘍脈管構造タンパク質を標的化する少なくとも１つの抗体および組成物の循環を延長する分子モジュールを含む、生物学的に活性な複数の分子モジュールとを、分子モジュールがスキャホールドに共有結合的に連結されるように含む、薬物送達組成物である。
【００２２】
一実施形態における本発明は、対象におけるがんを治療するための薬物送達組成物であって、ポリ−β−Ｌ−リンゴ酸（ＰＭＬＡ）などの重合したカルボン酸分子スキャホールドと、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）タンパク質の合成を実質的に阻害するアンチセンス分子、ラミニン−４１１の少なくとも１つのサブユニットを実質的に阻害するアンチセンス分子、細胞質へのアンチセンス分子の送達を促進する分子モジュール、腫瘍脈管構造タンパク質を標的化する少なくとも１つの抗体および組成物の循環を延長する分子モジュールを含む生物学的に活性な複数の分子モジュールとを、分子モジュールがスキャホールドに共有結合的に連結されるように含む、薬物送達組成物を提供する。
【００２３】
別の実施形態における本発明は、がんを有する患者を治療するためのキットであって、ポリ−β−Ｌ−リンゴ酸（ＰＭＬＡ）などのスキャホールドのナノバイオポリマーコンジュゲートと、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）タンパク質の合成または活性を実質的に阻害するアンチセンス分子、細胞質へのアンチセンス分子の送達を促進する分子モジュール、ＨＥＲタンパク質に特異的な少なくとも１つの標的化抗体、腫瘍脈管構造タンパク質に特異的な少なくとも１つの抗体および組成物の循環を延長する分子モジュールを含む複数の分子モジュールとを、ＰＭＬＡが分子モジュールに共有結合的に連結されるように含む薬物送達組成物を、容器内に含む、キットを提供する。関連する実施形態におけるキットは、薬学的に許容される緩衝剤および使用のための説明書をさらに含む。
【００２４】
本明細書中における本発明の一実施形態は、対象におけるがんを治療するための方法であり、この方法は、腫瘍原性細胞またはがん細胞を標的化する少なくとも１つのモジュール、細胞中のヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）タンパク質の合成または活性を阻害する少なくとも１つの分子モジュール、および細胞質内送達のための少なくとも１つの分子モジュールを含む複数の分子モジュールに共有結合的に連結しているポリ−β−Ｌ−リンゴ酸（ＰＭＬＡ）を含む薬物送達組成物に対象を接触させるステップと、対象における腫瘍成長の阻害、腫瘍退縮およびがんの消失の少なくとも１つを分析し、それによって対象におけるがんを治療するステップとを含む。例えばＨＥＲタンパク質は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４を含む群から選択される。
【００２５】
関連する一実施形態では、ＨＥＲタンパク質の合成または活性を阻害するモジュールは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、抗体、ポリペプチド、オリゴペプチドおよび低分子量薬物の群から選択される少なくとも１つである。一般にＡＯＮは、ＨＥＲ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）タンパク質およびラミニン−４１１のサブユニットの群から選択される少なくとも１つのタンパク質のｍＲＮＡ転写物に相補的な配列を有する。例えばＨＥＲ２転写物に相補的な配列は、５’ＡＧＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＴＴＣＡＴＧＴＣＴＧＴＧ−３’（配列番号１）および５’−ＣＡＴＧＧＴＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣ−３’（配列番号２）を含む。例えばＥＧＦＲ転写物に相補的な配列は、５’−ＴＣＧＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＣＣＣＧＡＴＣＡＡＴＡＣ−３’（配列番号３）を含む。関連する実施形態におけるラミニン−４１１のサブユニットは、α４サブユニットおよびβ１サブユニットから選択される。例えばα４転写物配列は、５’−ＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＣＡＴＴＴＣＴＣＣＧＣＴＧＡＣ−３’（配列番号４）を含む。例えばβ１転写物配列は、５’−ＣＴＡＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＣＡＴＧＣＣ−３’（配列番号５）を含む。
【００２６】
方法の関連する実施形態では、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）タンパク質およびＨＥＲ２の少なくとも１つをコードする遺伝子に相補的な配列を含む。例えばＥＧＦＲ配列は、５’−ＣＣＵＡＵＡＡＵＧＣＵＡＣＧＡＡＵＡＵｔｔ−３’（配列番号６）および５’−ＡＵＡＵＵＣＧＵＡＧＣＡＵＵＵＡＵＧＧａｇ−３’（配列番号７）から選択される。例えばＨＥＲ２配列は、５’−ＧＵＵＧＧＡＵＧＡＵＵＧＡＣＵＣＵＧＡｔｔ−３’（配列番号８）および５’−ＵＣＡＧＡＧＵＣＡＡＵＣＡＵＣＣＡＡＣａｔ−３’（配列番号９）から選択される。
【００２７】
方法の代替的な一実施形態では、抗体は、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質に特異的に結合する。例えば抗体はトラスツズマブＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）である。方法の関連する実施形態では、細胞を標的化する少なくとも１つのモジュールは、トランスフェリン受容体タンパク質に特異的に結合する抗体を含む。一般に抗体は、抗ヒト抗体、ラット抗マウス抗体、ラット抗ヒト抗体、ウサギ抗ヒト抗体およびヤギ抗ヒト抗体の内の少なくとも１つから選択される。方法の関連する実施形態では細胞質内送達のための少なくとも１つのモジュールは、エンドソームエスケープユニットを含む。例えばエンドソームエスケープユニットは、ロイシンエチルエステルである。
【００２８】
方法の関連する実施形態では、複数のモジュールは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含む。例えばＰＥＧは、約１，０００Ｄａの分子量を有する。
例えばＰＥＧは約５，０００Ｄａの分子量を有する。
【００２９】
方法の一実施形態は、対象における腫瘍成長の約６０％、７０％、８０％または約９０％を超える阻害を観察することによって腫瘍成長の阻害を分析することに関連する。関連する一実施形態における方法は、Ａｋｔリン酸化の抑制を伴うＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体シグナル伝達の阻害を腫瘍成長の阻害と共に観察することをさらに含む。
【００３０】
一般に、対象は、ヒト、サル、ウマ、ウシなどの哺乳動物または高価値の農業用動物または動物園動物である。例えば哺乳動物は、げっ歯動物である。例えばげっ歯動物は、実験用ヒト乳房腫瘍保有ヌードマウスである。代替的な一実施形態における哺乳動物は、ヒトである。
【００３１】
関連する一実施形態における方法は、追加的治療剤を投与することをさらに含む。例えば追加的治療剤は、抗体、酵素阻害物質、抗菌剤、抗ウイルス剤、ステロイド、非ステロイド性炎症剤、代謝拮抗物質、サイトカイン、サイトカイン遮断剤、接着分子遮断剤および可溶性サイトカイン受容体からなる群から選択される。
【００３２】
方法の一実施形態では、対象を組成物に接触させるステップは、対象におけるがんの治療に有効な単位用量で組成物を提供することをさらに含む。例えば、有効用量は、１μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇおよび１ｇ／ｋｇから選択される少なくとも１つである。
【００３３】
方法の関連する一実施形態では、がんは、胃がん、子宮内膜がん、唾液腺がん、肺がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、卵巣がん、腹膜がん、前立腺がん、結腸直腸がん、乳がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、脳がん（brain cancer）、頭頸部がん、精巣がんおよび奇形腫がんのリストから選択される。例えばがんは、原発性がんもしくは転移性がんのいずれかまたは両方を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）によってＨＥＲ２／ｎｅｕ発現を阻害し、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）によってＨＥＲ２／ｎｅｕ−媒介細胞シグナル伝達を減弱させるために設計されたナノバイオポリマーコンジュゲートを示す化学構造図および計画図である。モジュールは、遊離薬物を放出するために細胞質グルタチオンによって切断されるジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）によってＰＭＬＡスキャホールドにコンジュゲートされたＨＥＲ２／ｎｅｕモルホリノＡＯＮ（図中の１で示される）、腫瘍内皮細胞およびがん細胞の標的化、受容体−媒介エンドサイトーシスならびに抗腫瘍効果のためにトランスフェリン受容体タンパク質（ＴｆＲ）に特異的な抗体を単独で、またはマウスＴｆＲ（図中の２ａで示される）、ヒトＴｆＲ（２ｂで示される）に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（２ｃで示される）との組合せのいずれかで含む標的化抗体および／またはエフェクター抗体、薬物保護のためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（３で示される）、薬物のエンドソームエスケープのためにコンジュゲートされたＬ−ロイシンエチルエステル（ＬＯＥｔ）のストレッチ（４で示される）ならびに場合により画像処理のための蛍光レポーター色素（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０）（５で示される）である。ナノポリマーは、溶解度を増強するための遊離未置換ペンダントカルボキシル基および３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネートでの過剰なスルフヒドリルの化学的マスキングから生じた非機能性ジスルフィドも含有する。
【図２】インビトロ細胞生存率アッセイから得られたデータを示す棒グラフのセットである。ＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現乳がん細胞（ＢＴ−４７４およびＳＫＢＲ−３、図３パネルＡにおいても示す）は、表示の種々の薬物で処置された（上列）。７２時間後、細胞生存率はトリパンブルー排除アッセイを用いて決定された。細胞成長の百分率を各群についての平均細胞数として算出し、１００％に設定したＰＢＳで処置した平行試料（対照）と比較して表した。リード化合物Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）で処置した腫瘍細胞の成長は、両方の細胞株で他の処置と比較して顕著に阻害されたことが観察された。ＨＥＲ２／ｎｅｕを低量で発現している細胞株（図３パネルＡ）においてデータが示したのは、リード化合物が細胞成長を阻害する最大の能力を有したことであった（下列）。ＰＢＳ対照処置と比較して、星印１個はｐ＜０．０５を示し、星印２個はＰ＜０．０１を示し、星印３個はＰ＜０．００３を示す。リード化合物は全ての処置群と比較した場合にＰ＜０．００５（上列）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）と比較した場合にＰ＜０．０２（下列）の顕著な差異も示した。
【図３】インビトロでの乳がん細胞の種々の処置から生じたＨＥＲ２／ｎｅｕ発現、Ａｋｔリン酸化およびアポトーシスの観察された変化を示す免疫ブロットの写真のセットである。  パネルＡは、種々の細胞株におけるＨＥＲ２／ｎｅｕおよびＴｆＲ発現の比較を示す。本明細書の実施例において用いられた乳がん細胞株は、高レベルのＴｆＲを発現することが観察された。  パネルＢは、細胞株ＳＫＢＲ−３における種々のマーカーの発現分析を示す。  パネルＣは、細胞株ＢＴ−４７４におけるマーカーの発現を示す。パネルＡにおいて示されたＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現乳がん細胞は、種々の化合物で処置された。  ウエスタンブロット分析は、両細胞株においてＨＥＲ２／ｎｅｕおよびリン酸化Ａｋｔの減少をＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、ＡＯＮのそれぞれでの処置後またはＰ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／ＴｆＲ（Ｈ／Ｍ）処置腫瘍細胞で示し、ＰＢＳ対照処置またはエンドポーターでは示さなかった。リード化合物Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）での処置は、ＨＥＲ２／ｎｅｕおよびｐ−Ａｋｔの両方をさらに減少させた。アポトーシスの測定としての切断されたポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の生成のアッセイは、Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）処置細胞において最も高いレベルが観察された。グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）は、内部添加標準物として用いられた。
【図４】Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒａ６８０で標識された本明細書における種々の化合物の、ＢＴ−乳房腫瘍を有する生きたマウスでのおよび単離された器官中の腫瘍での分布を示す写真のセットである。主な器官の分析は、注射前の乳房腫瘍および器官（左パネル）と静脈注射２４時間後のもの（右パネル）とを比較した。本明細書における生きたマウスは、リード薬物Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）（下列）、陽性対照Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を伴うＰ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ（中央列）および対照コンジュゲートＰ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＩｇＧ（上列）のそれぞれを注射された。対照マウス（上列）は、わずかなＢＴ−４７４腫瘍蓄積を有し、対照ポリマーのほとんどは薬物クリアリング器官（ｃｌｅａｒｉｎｇ  ｏｒｇａｎ）、肝臓および腎臓に蓄積した。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）だけを伴うポリマーＰ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔは、中程度の腫瘍蓄積を有した（中央列）。乳房腫瘍細胞における最も高い蓄積は、リード化合物Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）で処置したマウスにおいて観察された。矢印は腫瘍移植部位を示す。
【図５】ＢＴ−４７４乳房腫瘍細胞における種々の化合物の分布を示す写真のセットである。動物は図４に示すとおり化合物を静脈投与され、薬物注射の２４時間後に屠殺され、腫瘍を切り出され、切片を共焦点顕微鏡によって分析された。核は、ＤＡＰＩで対比染色された（灰色領域）。ＡＬｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０追跡用色素（灰色）を結合された対照コンジュゲートＰ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＩｇＧを注射された動物は、腫瘍細胞蓄積があったとしてもほとんど示さなかった（上列）。Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を注射された動物は、腫瘍細胞におけるかなりの蓄積を示し、最も高い蓄積はリード薬物Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）を注射された動物において観察され、図４における生きた動物での画像処理データと一致した。スケールバー＝５０μｍ。
【図６】マウス腫瘍阻害、病理、シグナル伝達およびアポトーシスマーカー発現を示す写真のセットおよび線グラフである。  パネルＡは、異なる薬物を投与された各群について２匹の代表的動物由来のそれぞれの腫瘍から得られたデータおよび病理組織学的分析を示す写真のセットである。種々の量の死組織が全ての処置群において存在することが観察された。腫瘍サイズ減少データおよび腫瘍細胞の明白な消失がリード薬物Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）での処置後に観察され、主に壊死領域が存在することが観察された。  パネルＢは、マウスにおける腫瘍成長阻害の程度を示す線グラフである。未コンジュゲートＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（四角）および陽性対照Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（三角）のそれぞれでまたはＰ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／ＴｆＲ（Ｈ／Ｍ）（円）で処置された動物は、ＰＢＳ対照（ひし形）と比較して顕著な阻害を示した（Ｐ＜０．０３）。Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）処置（大四角）は、他の処置群と比較して腫瘍成長の最も大きな阻害を生じたことが観察され、追跡期間中に観察された８０から９５％の腫瘍退縮をもたらした（対Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）および他の薬物  Ｐ＜０．０２、対ＰＢＳ  Ｐ＜０．００１）。エラーバーは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。  パネルＣは、インビボでのＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍の処置後の選択マーカーの発現を示す免疫ブロットの写真である。ウエスタンブロット分析データは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−、Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−またはＰ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／ＴｆＲ（Ｈ／Ｍ）−処置マウスのそれぞれでのＨＥＲ２／ｎｅｕおよびｐ−Ａｋｔ（総Ａｋｔではなく）発現における減少を示したが、対照ＰＢＳ−処置マウスでは示さなかった。Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）は、ｐ−Ａｋｔバンドのほとんど消失を伴ってＨＥＲ２／ｎｅｕ発現をさらに阻害した。アポトーシスの測定としてのＰＡＲＰ切断は、他の群においてよりもＰ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）処置マウスにおいて実質的に多いことも観察された。ＧＡＰＨＤは、ゲル添加を標準化するための内部標準であった。
【図７】三種陰性乳房腫瘍を保有している対象での本明細書の組成物による腫瘍成長阻害の程度を示す線グラフである。Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ−ＥＧＦＲ／ＴｆＲ（Ｈ／Ｍ、四角）またはＰ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ−ＥＧＦＲ／α４βｌ／ＴｆＲ（Ｈ／Ｍ、三角）のそれぞれで処置した動物は、ＰＢＳ陰性対照（ひし形）と比較して顕著な阻害を示した。対α４β１でＰ＝０．００２、対ＰＢＳでＰ＝０．０００１。Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ−α４β１／ＴｆＲ（Ｈ／Ｍ）処置は、対照ＰＢＳ処置と比較して腫瘍成長を阻害し、図に示すとおり他のナノバイオポリマーで得られたデータと比較して有効でないことが観察された（対ＰＢＳ  Ｐ＝０．０１）。エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明の組成物および方法は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍への送達のために特に設計したポリ−β−Ｌ−リンゴ酸（ＰＭＬＡ）プラットホームをベースとするナノバイオポリマー薬物を提供する。ポリ−β−Ｌ−リンゴ酸（ＰＭＬＡ）をベースとする標的化ナノバイオポリマーコンジュゲートは、生分解性、無毒性および非免疫原性である。ＰＭＬＡナノプラットホームは、異種間マウスモデルにおけるＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性ヒト乳房腫瘍の反復全身的治療のために合成された。ＨＥＲ２／ｎｅｕ合成を遮断するためにＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｍＲＮＡに対して方向付けられたモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）、乳がん細胞を標的化し同時に受容体活性を阻害するための抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、腫瘍脈管構造を標的化しナノバイオポリマーの宿主内皮系を通じた送達を媒介するためのトランスフェリン受容体抗体の組合せを含む種々の成分がＰＭＬＡに共有結合的に結合された。
【００３６】
本明細書の実施例は、リード化合物の検査を含み、データはこの化合物がインビトロおよびインビボでＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性乳がん細胞の成長を顕著に阻害したことを示し、増強されたアポトーシスおよびＡｋｔリン酸化の抑制を伴うＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体シグナル伝達の阻害が処置細胞および動物において観察された。インビボ画像処理分析および共焦点顕微鏡観察は、リード化合物の設計からもたらされる活性送達機構の結果としての腫瘍細胞におけるナノ薬物の選択的蓄積を実証した。ヒト乳房腫瘍保有ヌードマウスの全身的治療は、遊離またはＰＭＬＡに結合しているかにかかわらず、対照トラスツズマブ単独または対照ＡＯＮ単独で処置したマウスでの部分的（５０％）腫瘍成長阻害と比較して９０％を超える腫瘍成長の阻害および腫瘍退縮をもたらした。本明細書における実施例からのデータは、併用がん療法のためのＰＭＬＡナノプラットホームの使用の前臨床的証拠を提示する。
【００３７】
上皮成長因子受容体または受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーは、上皮成長因子受容体（ＨＥＲ１またはＥｒｂＢ１とも称される）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２またはｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）によって例示される。リガンド結合においてＥｒｂＢファミリーメンバーは、ホモ二量体およびヘテロ二量体を形成し、細胞内キナーゼドメイン内のリン酸化が続く(ヤーデン(Yarden)ら、2001年発行、Nat Rev Mol Cel Biol 2,127)。ＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ２活性化において、これらのタンパク質中のＳｒｃ−ホモロジー２（ＳＨ２）ドメイン中のホスホチロシル化部位は、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２およびＳｏｓなどのアダプタータンパク質のためのドッキング部位として作用し、Ｒａｓ／Ｒａｆ／分裂促進因子−活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）キナーゼ（ＭＥＫ）／ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ／タンパク質キナーゼＢ（ＰＢ）経路の活性化ならびに増殖および有糸分裂誘発の促進をもたらす(ヤーデン(Yarden)ら、2001年発行、Nat Rev Mol Cel Biol 2,127)。
【００３８】
ＨＥＲ２／ｎｅｕがん原遺伝子（ｅｒｂＢ−２としても周知）は、上皮成長因子受容体ファミリーのメンバーである１８５ｋＤａのＩ型膜貫通受容体チロシンキナーゼをコードする(ハインス・エヌイー(Hynes NE)ら、2005年発行、Nat Rev Cancer 5,341、バーグマン・シーアイ(Bargmann CI)ら、1986年発行、Nature 319,226、コーセンス・エル(Coussens L)ら、1985年発行、Science 230,1132)。初期の研究は、卵巣がんおよび乳がんのサブセットを含むいくつかのヒトがんにおいてＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質過剰発現を同定した(ハインス・エヌイー(Hynes NE)ら、1994年発行、Biochim Biophys Acta 1198,165、ディーエミリア・ジェイ(D'Emilia J)ら、1989年発行、Oncogene 4,1233、スラモン・ディージェイ(Slamon DJ)ら、1989年発行、Science 244,707)。ＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現は、このタンパク質がヒトがんの分子機構において役割を演じることから乳がん患者の短い再発時間および短い生存期間に関連している(スラモン・ディージェイ(Slamon DJ)ら、1987年発行、Science 235,177)。
【００３９】
ＥｒｂＢ２遺伝子は、原発性乳がんの３０％までにおいて増幅および過剰発現され、これは患者予後不良と関連する(スラモン・ディージェイ(Slamon DJ)ら、1989年発行、Science 244,707)。ＥｒｂＢ１も原発性浸潤性乳がんの３０％までにおいて過剰発現されており、全生存期間の減少、増殖およびより高い転移可能性と関連する(ツツイ・エス(Tsutsui S)ら、2002年発行、Breast Cancer Res Treat 71,67)。ＥｒｂＢ１シグナル伝達の阻害は、ＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ２の両方の活性を低下させ、ＭＭＴＶ／Ｎｅｕマウスにおいて腫瘍形成を遅延させる(レンフェリンク・エーイージー(Lenferink AEG)ら、2000年発行、Proc Natl Acad Sci 97,9609)。これら２つの受容体による増殖経路の協同的活性化は、抗がん剤としての使用のためのＥｒｂＢファミリーのメンバーの多数の小分子阻害物質の開発を刺激している。
【００４０】
新たに診断されたエストロゲン陽性乳がんは、一般に抗エストロゲン剤タモキシフェンで治療される。エストロゲン陽性乳がんではＥｒｂ１およびＥｒｂ２両方の過剰発現がタモキシフェン治療に対する抵抗性と関連する。ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６）およびタモキシフェンなどの抗がん剤を一緒に投与することは、有利であり、タモキシフェン媒介細胞周期抑制を回復させ、タモキシフェン耐性乳房腫瘍成長を阻害することが示された(チュ・アイ(Chu I)ら、2005年発行、Cancer Res 65,18)。
【００４１】
細胞外到達性、高発現および予後不良との関連などの特徴は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを抗体療法のための魅力的な候補にする。転移性乳がん患者は、現在トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎとしても周知、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）食品医薬品局認可ヒト化モノクローナル抗ＨＥＲ２／ｎｅｕで治療されている(カプタイン・エス(Kaptain S)ら、2001年発行、Diagn Mol Pathol 10,139)。高レベルのＨＥＲ２／ｎｅｕを発現している進行型疾患を有する患者に対する乳がん臨床試験は、単独免疫治療剤としてのトラスツズマブの使用が１２％から２６％の他覚応答率をもたらすことを示した(コブレイ・エムエー(Cobleigh MA)ら、1999年発行、J Clin Oncol 17,2639、バセルガ・ジェイ(Baselga J)ら、1996年発行、J Clin Oncol 14,737、ヴォーゲル・シーエル(Vogel CL)ら、2002年発行、J Clin Oncol 20,719)。進行型疾患を有する対象における続く臨床試験も、トラスツズマブと化学療法との併用による転移性乳がんの標的化が５０％の他覚応答をもたらしたが、罹患したほとんどの症例において疾患がいまだに再発することを示している(スラモン・ディージェイ(Slamon DJ)ら、2001年発行、N Engl J Med 344,783)。付加的に、乳房由来でないＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍に対してトラスツズマブは、相当に活性を欠いている(バースタイン・エイチジェイ(Burstein HJ)ら、2005年発行、N Engl J Med 353,1652)。さらにトラスツズマブに対する耐性は、乳房腫瘍を有する患者において大きな問題になっている。ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現腫瘍を有する患者のための新規治療法がいまだ必要である。
【００４２】
症例の６６％から８８％ではＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現腫瘍は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）に初回耐性を示す(バセルガ・ジェイ(Baselga J)ら、1999年発行、Semin Oncol 26,78、ナータ・アール(Nahta R)ら、2004年発行、Cancer Res.64,398)。この耐性は、過剰発現されたムチンによるエピトープマスキング、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ軸を通じた生存促進性シグナル伝達に影響を与える受容体の能力の喪失、またはＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達の活性化を導くプロテインホスファターゼＰＴＥＮの喪失によってである場合がある(ツェン・ピーエイチ(Tseng PH)ら、2006年発行、Mol Pharmacol.70,1534-41、ナギイ・ピー(Nagy P)ら、1998年発行、Cytometry32,120、タナー・エム(Tanner M)ら、2004年発行、Cancer Ther.3,1585-92)。
【００４３】
トラスツズマブ耐性を克服するための抗悪性腫瘍剤
モノクローナル抗体、組換えタンパク質抗体および薬物を含む種々の薬剤は、乳がんの治療において活性を有することが周知であり、本明細書に記載の組成物との併用において有用な薬剤であることが本明細書において考えられる。
【００４４】
パクリタキセル（タキソール、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）およびドセタキセル（タキソテール、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）などの他の薬剤とＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）との併用は、奏効率、疾患再発までの時間および全生存期間の増加をもたらした(エステバ・エフジェイ(Esteva FJ)ら、2002年発行、J Clin Oncol. 20:1800、スラモン・ディージェイ(Slamon DJ)ら、2001年発行、N Engl J Med.344,783、ワルドレイ・エーエム(Wardley AM)ら、2009年発行、J Clin Oncol 49,976)。
【００４５】
ＨＥＲ２と他のチロシンキナーゼとの標的化の併用は、代替的戦略を示す。チロシンキナーゼは、乳がん腫瘍形成と関連し、潜在的薬物標的として相当な重要性がある(オカナ・エー(Ocana A)ら、2008年発行、Clin Cancer Res 14,961)。インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、乳がん細胞の成長を増加させることが示されており、トラスツズマブへの耐性の発生にも関与する(ナータ・アール(Nahta R)ら、2006年発行、Nat Clin Pract Oncol 3,269)。ＩＧＦ−１ＲおよびＨＥＲ２の共標的化または同時標的化は、乳がん細胞中での個々のＲＴＫの標的化と比較して利点を提供する(エスパリス−オガンド・エー(Esparis-Ogando A)ら、2008年発行、Ann Oncol 19,1860)。ｖ−ｋｉｔ  Ｈａｒｄｙ−Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ  ４ネコ肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ｃ−ＫＩＴ）ＲＴＫは、三種陰性乳がん（エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨＥＲ２を発現しないもの）において過剰発現されている(ニールセン・ティーオー(Nielsen TO)ら、2004年発行、Clin Res 10,5367)。２つの非受容体サイトゾルチロシンキナーゼ、ｃ−ａｂｌがん遺伝子１（ＡＢＬ１）およびｃ−ＳＲＣチロシンキナーゼ（ＣＳＫ）の活性化は乳がんの攻撃性(フィン・アールエス(Finn RS.)、2008年発行、Ann Oncol 19,1379)および三種陰性乳がんの増殖(フィン・アールエス(Finn RS.)、2008年発行、Ann Oncol 19,1379、フィン・アールエス(Finn RS)ら、2007年発行、Breast Cancer Res Treat 105,319)とそれぞれ関連する。さらにｃ−ＳＲＣは、エストロゲン受容体−陽性乳房腫瘍での抗エストロゲン耐性とも関連している(ファン・アグトーベン・ティー(van Agthoven T)ら、2009年発行、J Clin Oncol 27,542)。
【００４６】
小分子チロシンキナーゼ阻害物質の１つであるダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）は、サイトゾルｃ−ＳＲＣおよびＡＢＬ１キナーゼならびにＲＴＫ  ｃ−ＫＩＴおよび血小板由来成長因子受容体アルファおよびベータを標的化する(フィン・アールエス(Finn RS)ら、2007年発行、Breast Cancer Res Treat 105,319、リックス・ユー(Rix U)ら、2007年発行、Blood 110,4055、ファング・エフ(Huang F.)ら、2007年発行、Cancer Res 67,2226、ファング・エフ(Huang F.)ら、2007年発行、Cancer Res 67,2226)。エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体またはＨＥＲ２／ｎｅｕを発現しない三種陰性乳がんの治療に関するダサチニブの活性(フィン・アールエス(Finn RS)ら、2007年発行、Breast Cancer Res Treat 105,319、ファング・エフ(Huang F)ら、2007年発行、Cancer Res 67,2226)、および頭頸部がんにおけるゲフィチニブとの併用による好ましい抗腫瘍活性(コピッカー・ピー(Koppikar P)ら、2008年発行、Clin Cancer Res 14,4284)から、ＨＥＲ２−陽性乳がんの治療のためのトラスツズマブとダサチニブとの併用が導かれた。この併用は、ＨＥＲ２受容体を過剰発現する乳がん細胞に対して非常に有効であることが見出された。両薬物は、インビトロで細胞増殖を個々に阻害し、抗腫瘍作用を示し、併用はＨＥＲ２受容体過剰発現細胞においてより強力な作用をもたらした。
【００４７】
複合薬は、リン酸化ＨＥＲ２およびリン酸化ＨＥＲ３のレベルを低下させ、低下はこれらの受容体の総量において観察された。併用治療は、細胞の増殖および生存を制御するＥＲＫ１またはＡＫＴ経路などの下流シグナル伝達ルートに影響を与えた(ガルシア・エチェベリア・シー(Garcia-Echeverria C)ら、2008年発行、Oncogene 27,5511、ロバーツ・ピージェイ(Roberts PJ)ら、2007年発行、Oncogene 26,3291)。ダサチニブ単独は、ＥＲＫ１のリン酸化レベルについて複合薬治療と同様に阻害的である。ダサチニブでの治療も複合薬治療と同程度にＳＲＣまたはＦＡＫリン酸化を阻害した。これら２つのキナーゼは、ダサチニブの周知の標的であり(ファング・エフ(Huang F.)ら、2007年発行、Cancer Res 67,2226)、いくつかの発がんプロセスに関与する(キム・エルシー(Kim LC)ら、2009年発行、Nat Rev Clin Oncol 6,587)。併用治療はリン酸化ＡＫＴのレベルを低下させるが、個々の薬物はしないことが観察された。ｐ７０Ｓ６ＫおよびＢＡＤなどのＡＫＴの下流標的も複合薬治療による影響を受けたが、個々の薬物によっては影響を受けず、これらのタンパク質の静止時のリン酸化レベルがトラスツズマブおよびダサチニブでの処置によって低下した。
【００４８】
複合薬によって誘導されたアポトーシスでのカスパーゼ阻害物質の効果の欠如によって決定されたとおり複合薬はカスパーゼ非依存的アポトーシスも誘導する。カスパーゼ非依存的アポトーシスでの１つの可能性のあるメディエーターは、ミトコンドリア膜間腔から特定のアポトーシス性刺激によって放出されるタンパク質ＮＡＩＦ１である。複合薬での治療によるミトコンドリアからサイトゾルへのＮＡＦＩＦ１の放出は、この機構がカスパーゼ非依存性アポトーシスの原因となる場合があることを示した。
【００４９】
複合薬は、ＤＮＡ修復機構にも影響し、チロシンキナーゼによるＤＮＡ修復機構の調節および潜在的な臨床的意味を示す二重鎖切断（ＤＳＢ）の蓄積を導く。
【００５０】
ＥＧＦＲの阻害物質の１つであるエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ、Ｒｏｃｈｅ）は、ＲＡＤ５１フォーカス形成の減少を介して乳がん細胞でのＤＳＢの相同的組換え修復を遮断した(リー・エル(Li L)ら、2008年発行、Cancer Res 68,9141)。以前の研究は、ＲＴＫがＤＮＡ修復を制御する場合があることも示している(タナカ・ティー(Tanaka T)ら、2008年発行、Clin Cancer Res 14,1266、ガナパチフィライ・エスエス(Ganapathipillai SS)ら、2008年発行、Cancer Res 68,5769)。
【００５１】
ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ、Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ  ａｎｄ  Ｔｅｖａ）は、大球性肺がん細胞での電離放射線への応答においてＤＮＡ修復を妨げるＥＧＦＲ阻害物質である(タナカ・ティー(Tanaka T)ら、2008年発行、Clin Cancer Res 14,1266)。浸潤および転移(ベンベヌチ・エス(Benvenuti S)ら、2007年発行、J Cell Physiol 213,316)または薬物耐性(エンゲルマン・ジェイエイ(Engelman JA)ら、2007年発行、Science 316,1039)などのいくつかの発がんプロセスに関連するＭＥＴタンパク質の変異体形態ＲＴＫは、腫瘍細胞においてＲＡＤ５１に結合してリン酸化し、ＤＮＡ修復を促進することが報告されている(ガナパチピライ・エスエス(Ganapathipillai SS)ら、2008年発行、Cancer Res 68,5769)。
【００５２】
ウイリアムズ−ビューレン症候群（ＷＳＴＦ、ＢＡＺ１Ｂとしても周知）に関連する転写因子、ＷＩＣＨ複合体のチロシンキナーゼ構成成分（ＷＳＴＦ−ＩＳＷＩ  ＡＴＰ−依存的クロマチン再構築複合体）は、Ｈ２ＡＸのＴｒｙ１４２のリン酸化を通じてＤＮＡ損傷応答を制御する（シャオ・エー(Xiao A)ら、2009年発行、Nature 457,57）。
【００５３】
本明細書において、ゲフィチニブおよびエルロチニブ(コピッカー・ピー(Koppikar P)ら、2008年発行、Clin Cancer Res 14,4284)などの他の抗悪性腫瘍剤と組合せたダサチニブなどの薬物が本明細書に記載の組成物とさらに併用されることが想定される。
【００５４】
ラパチニブ（Ｔｙｖｅｒｂ（登録商標）、ＧＳＫ）は、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２に高選択性である(カラマン・エムダブリュー(Karaman MW)ら、2008年発行、Nat Biotechnol 26,127)二重ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害物質である(ラスナック・ディーダブリュー(Rusnak DW)ら、2001年発行、Mol Cancer Ther 1,85)。トラスツズマブ耐性の前臨床モデルにおいて、ラパチニブはＨＥＲ２のリン酸化および、トラスツズマブに対するインビトロ耐性の程度に関して特に選んだＨＥＲ２過剰発現乳がん細胞株全体の成長を阻害した(コネキニー・ジーイー(Konechny GE)ら、2006年発行、Cancer Res 66,1630)。さらにトラスツマブと併用してラパチニブで処置すると、いずれかの薬剤単独よりも、生存期間が長くかつ多いアポトーシス誘導が多かった(シャオ(Xia)ら、2005年発行、Oncogene 24,6213)。
【００５５】
トラスツズマブで治療されたＨＥＲ２陽性転移性乳がん患者の相当数は、（内臓疾患とは異なり）トラスツズマブによって十分に制御されない症候性中枢神経系（ＣＮＳ）転移を経験する。ラパチニブは、血管脳関門を越えることが示されているがトラスツズマブでは示されず、ＣＮＳ転移を有する患者においてラパチニブを検査する理論的根拠を提供している(ニールセン・ディーエル(Nielsen DL)ら、2009年発行、Cancer Treat Rev 35,121)。
【００５６】
ラパチニブと併用されるトラスツズマブは、ＨＥＲ２陽性転移性乳がん患者においてラパチニブ単独よりも優れていることが見出された(ブラックウェル・ケーエル(Blackwell KL)ら、2010年発行、J Clin Oncol 28,1124)。
【００５７】
ＨＥＲ２タンパク質の細胞外ドメインに特異的な別のモノクローナル抗体であるペルツズマブ（２ｃ４、ｏｍｎｉｔａｒｇ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、トラスツズマブと比較してＨＥＲ２の異なるエピトープに結合する。ペルツズマブは、ＨＥＲ２とＥＧＦＲまたはＨＥＲ３との間のヘテロ二量体形成を阻害することが観察された(アグス・ディービー(Agus DB)ら、2002年発行、Cancer Cell 2,127)。ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体はＨＥＲ２駆動細胞シグナル伝達において重要であるが、ヘレグリン−依存的ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体はペルツズマブによって破壊され、トラスツズマブによっては破壊されない(ジツンティラ(Jitunttila)ら、2009年発行、Cancer Cell 15,429)。ＨＥＲ２陽性乳がん患者でのペルツズマブとトラスツズマブとでの併用治療に関する第ＩＩ相臨床試験では、処置は２４．２％の奏効率および５０％の病勢コントロール率を示した(バセルガ・ジェイ(Baselga J)ら、2010年発行、J Clin Oncol 28,1138)。
【００５８】
トラスツズマブ−ＤＭ１は、トラスツズマブおよびＤＭ１（マイタンシンから誘導されるチューブリン重合の阻害物質である薬剤）からなる。安定なＭＣＣリンカーはＤＭ１をトラスツズマブにコンジュゲートする。化合物はＤＭ１をＨＥＲ２過剰発現がん細胞に送達するように設計される。前臨床研究は、ＨＥＲ２過剰発現およびトラスツズマブ耐性細胞におけるトラスツズマブ−ＤＭ１の成長阻害効果を示している(ルイス・フィリップス・ジーディー(Lewis Phillips GD)ら、2008年発行、Cancer Res 68,9280)。トラスツズマブに基づく治療にもかかわらず疾患の進行を伴ったＨＥＲ２陽性転移性乳がん患者に関する第ＩＩ相臨床試験では、トラスツズマブ−ＤＭ１は、それぞれ２６．９％および４．６カ月の、独立に調査された奏効率および無増悪生存期間をもたらした。(ヴォーゲル・シーエル(Vogel CL)ら、2009年発行、J Clin Oncol 27,15s(補足、要約1017)。重要なことに、トラスツズマブ−ＤＭ１は、ラパチニブおよびトラスツズマブで以前治療された患者（ｎ＝６６）においてさえ同様の抗腫瘍活性および単独で再調査された２４．２％の奏効率を有した。
【００５９】
ＰＩ３Ｋ経路阻害物質もＨＥＲ２発現腫瘍を治療するために用いられる。ＨＥＲ２過剰発現乳がん細胞は、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路に依存すると考えられており、ＰＩ３Ｋシグナル伝達分子中の多数の遺伝的およびエピジェネティックな変化がトラスツズマブまたは小分子ＨＥＲ２キナーゼ阻害物質への抵抗性を引き起こすことが示されている。ＨＥＲ２過剰発現およびＰＩＫ３ＣＡ変異は、乳がん細胞においてしばしば同時に生じ(オダ・ケー(Oda K)ら、2008年発行、Cancer Res 68,8127)、ＨＥＲ２増幅またはＰＩＫ３ＣＡ変異のいずれかを有する細胞株は同様にＡｋｔ依存的である(シー・キュービー(She QB)ら、2008年発行、PLoS ONE 3,e3065)。したがってＰＩ３Ｋ経路阻害物質は、抗ＨＥＲ２薬剤への抵抗性を克服することにおいて有用でありうる。実際にＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ二重阻害物質およびＡｋｔ阻害物質は、トラスツズマブおよびラパチニブ耐性細胞において細胞成長を有効に阻害することが示された。現在、多数のクラスのＰＩ３Ｋ経路阻害物質が臨床開発中であり、トラスツズマブ耐性を克服することにおけるそれらの役割が将来検査される。
【００６０】
代替的シグナル伝達分子の阻害物質もトラスツズマブ耐性がん細胞を治療するために用いられる。ＩＧＦ−１ＲまたはＭＥＴからの代替的シグナル伝達は、トラスツズマブ耐性と関連する場合がある。ＩＧＦ−１ＲまたはＭＥＴ受容体チロシンキナーゼの低分子量阻害物質ならびに抗ＩＧＦ−１抗体および抗ＨＧＬ抗体は、現在臨床開発中である。したがって単剤療法またはこれらの薬剤とトラスツズマブとでの併用療法は、魅力的な治療戦略である。
【００６１】
ＨＥＲ２細胞外ドメインを標的化するＨＥＲ２ワクチンおよび養子免疫治療は、臨床検査において検査されており、結果は顕著なレベルの永続的なＴ細胞ＨＥＲ２免疫が正常組織に対する自己免疫に関する顕著な事象を伴わずに能動免疫として生成されうることを示している(ベーンハード・エイチ(Bernhard H)ら、2002年発行、Endoctr Relat Cancer 9,33)。高リスク乳がん患者についてのアジュバント療法におけるＨＥＲ２特異的ワクチンの使用可能性を検査する臨床試験からの初期データは、有望な結果を示している(ピープルス・ジーイー(Peoples GE)ら、2008年発行、Clin Cancer Res 14,797)。
【００６２】
エルツマキソマブ（Ｒｅｘｏｍｕｍ、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ、第ＩＩ相研究）は、Ｔ細胞上のＨＥＲ２およびＣＤ３を標的化する無処置二重特異性抗体であり、活性化ＦｃｃＩ／ＩＩＩ型受容体へ優先的に結合し、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞およびナチュラルキラー細胞をＨＥＲ２発現腫瘍部位に再び方向付ける(キーウェ・ピー(Kiewe P)ら、2008年発行、Expert Opin Investig Drugs 17,1553)。第Ｉ相試験ではエルツマキソマブ治療は、広範な先行治療を受けた転移性乳がんを有する患者において完全応答１例、部分応答２例および疾患安定２例を伴った(キーウェ・ピー(Kiewe P)ら、2006年発行、Clin Cancer Res 12,3085)。エルツマキソマブの効果は、第ＩＩ相研究において評価されている。
【００６３】
脱フコシル化トラスツズマブもトラスツズマブ耐性がん細胞を治療するために用いられる。重鎖Ａｓｎ297に結合した抗体オリゴ糖からのフコースの除去（脱フコシル化）は、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を通常抗体の活性と比較して顕著に増強することが示されている。付加的にトラスツズマブの脱フコシル化は、通常のトラスツズマブと比較してインビトロアッセイでＡＤＣＣを増強することも見出された(スズキ・イー(Suzuki E)ら、2007年発行、Clin Cancer Res 13,1875)。ＨＥＲ２増幅乳がんの前臨床モデルにおいて従来のトラスツズマブと比較して脱フコシル化トラスツズマブは、平均無憎悪生存期間を２倍より長くした(ジュンチラ(Juntilla)ら、2010年発行、Cancer Res 70,4481)。
【００６４】
パクリタキセル、ドセタキセル、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、エルツマキソマブ、トラスツズマブ−ＤＭ１、脱フコシル化トラスツズマブ、ＰＩ３Ｋ経路阻害物質およびＨＥＲ２ワクチンを含む任意の前記薬剤は、本明細書に記載の方法によって乳がんを治療するための本明細書のナノバイオポリマーコンジュゲート組成物との併用において有用であると本明細書において想定される。
【００６５】
ＨＥＲ２／ｎｅｕがんの治療のための複数の薬物を保持するためのプラットホームとしてのナノバイオポリマー
複合薬の利点は、ナノバイオポリマーコンジュゲートなどの単一分子実体において提供されうる。これらの化合物は、腫瘍標的化抗体の存在によって増強されたがん細胞特異性を提供し、がん細胞の細胞質へのポリマー結合薬物の送達によって薬物耐性を迂回し、単一プラットホーム上に複数の薬物を保持できる(ウー・ケー(Wu K)ら、2010年発行、Angew Chem Int Ed Engl.9,1451)。腫瘍へのナノバイオポリマー結合薬物の効果的な送達は、腫瘍に典型的な透過性滞留性亢進（ＥＰＲ）効果を通じた受動的標的化によって (マエダ・エイチ(Maeda H)ら、2009年発行、Eur J Pharm Biopharm 71,409)、および付加的に抗ＴｆＲなどの抗体を用いる能動的標的化によって増大される(マエダ・エイチ(Maeda H)ら、2009年発行、Eur J Pharm Biopharm 71,409、リュー・エックス(Liu X)ら、2008年発行、Cancer Gene Ther.15,126、ピーターソン・シーエム(Peterson CM)ら、2003年発行、Adv Exp Med Biol.519,101)。表１は、本明細書の実施例において用いられるコンジュゲートの大きさ（３０ｎｍより小さい）を示す。
【００６６】
わずかに陰性のζポテンシャルがコンジュゲートと細胞膜との相互作用を促進し、細胞内内部移行を増強する(ウィルヘルム・シー(Wilhelm C)ら、2003年発行、Biomaterials 24,1001-11)。
【００６７】
抗がん薬物に伴う一般的な問題は特異的な腫瘍標的化の欠如であり、無作為な組織蓄積の広がりおよび正常組織への顕著な副作用をもたらす(シュクラ・アール(Shukla R)ら、2008年発行、Nanotech 19,1、シュクラ・アール(Shukla R)ら、2006年発行、Bioconjug Chem 17,1109)。この欠点を回避するために腫瘍標的化抗体が薬物担体としてまたは治療剤として直接（例えばＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））用いられている。結合したＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を有するデンドリマーナノコンジュゲートは、動物モデルの乳がん細胞において増強された蓄積を示した(シュクラ・アール(Shukla R)ら、2006年発行、Bioconjug Chem 17,1109)。メトトレキサート添加デンドリマーは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）媒介複合体内部移行から生じたインビトロでの腫瘍細胞における細胞毒性効果をもたらした(シュクラ・アール(Shukla R)ら、2008年発行、Nanotech 19,1)。しかしこれらのナノ薬物の効力は、効果的なエンドソーム放出ユニットの欠如のために限定的であった(シュクラ・アール(Shukla R)ら、2008年発行、Nanotech 19,1)。薬物はがん細胞に特異的に送達され、脳神経膠腫保有動物における血管新生と同様に腫瘍成長は阻害された(フジタ・エム(Fujita M)ら、2006年発行、Angiogenesis 9,183、ジュビモバ・ジェイワイ(Ljubimova JY)ら、2008年発行、Chem Biol Interact.171,195)。ポリマーの効果は、腫瘍標的化の特性、１つより多い腫瘍マーカーへのＡＯＮ薬物の同時使用および標的細胞内での薬物放出を確実にするエンドソーム破壊成分の存在と関連する(グラスマイアー・ビー(Gasslmaier B)ら、2000年発行、Eur J Biochem.267,5101)。
【００６８】
【表１】
2014504591.tif 000003
【００６９】
ＰＭＬＡは、粘菌、真正粘菌（Ｐｈｙｓａｒｕｍ  ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ）から得られる天然ポリマーである(リー・ビーエス(Lee BS)ら、2006年発行、Bioconjug Chem 17,317、リー・ビーエス(Lee BS)ら、2002年発行、ドイ・ワイエスエー(Doi YSA)編,Biopolymers,Weinheim,Wiley-VCH,2002 pp.75-103の「水溶性脂肪性ポリエステル、ポリ（リンゴ酸）(Water-soluble aliphatic polyesters:poly(malic acid)s)」)。ＰＭＬＡはインビトロおよびインビボで無毒性、非免疫原性および生分解性であり、血流中で安定であり、水溶性が高い(グラッスルマイアー・ビー(Gasslmaier B)ら、1997年発行、Eur J Biochem 250,308、グラッスルマイアー・ビー(Gsslmeier B)ら、2000年発行、Eur J Biochem 267,5101)。腫瘍脈管構造特異的タンパク質ラミニン−４１１（以前はラミニン−８）のα４およびβ１鎖に特異的なヌクレオチド配列を有するモルホリノＡＯＮの頭蓋内神経膠芽腫への全身的送達は、腫瘍血管新生および成長の著しい阻害をもたらすことが示された(ジュビモバ・ジェイワイ(Ljubimova JY)ら、2008年発行、Nanomedicine 3,247、ディング・エイチ(Ding H)ら、2010年発行、Proc Natl Acad Sci オンライン出版)。さらに腫瘍脈管構造を標的化するために、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対するｍＡｂを同じナノプラットホームに結合させた。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、抗ＴｆＲ抗体およびＨＥＲ２／ｎｅｕに対するＡＯＮのそれぞれを保持しているナノバイオポリマー組成物は、本明細書においてＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性乳がんに対する特異性および抗腫瘍効果を増強することが示される。いかなる特定の理論および分子機構によって限定されることなく、本明細書において検査されたリード化合物は、いくつかの分子レベルで作用し、ＡＯＮを有する新規ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体の合成を阻害し、および腫瘍細胞膜に存在するＨＥＲ２／ｎｅｕの活性をＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）で遮断するために設計されたナノプラットホームである。
【００７０】
ｍＲＮＡに特異的に結合し、タンパク質合成を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）は、遺伝子発現をサイレンシングするための特異的なツールである。しかし、腫瘍の全身的治療におけるＡＯＮおよびｓｉＲＮＡの効果的な送達は、いまだ重要な問題を示している(パチル・エスディー(Patil SD)ら、2005年発行、AAPS 7:E61、ティエリ(Thierry)ら、2003年発行、Curr Opin Mol Ther 5,133)。がん治療のためのＡＯＮの前臨床研究は有望な結果を示し、血漿中のＡＯＮの安定性はこれらの分子に全身的治療の可能性を与える(ブッシュ・アールケー(Busch RK)ら、1994年発行、Cancer Lett 86,151、セクホン・エイチエス(Sekhon HS)ら、2008年発行、Lung Cancer 60,347、ガーブゼンコ・オービー(Garbuzenko OB)ら、2010年発行、Proc Natl Acad Sci 107,10737)。さらに、ジストロフィンに特異的なモルホリノＡＯＮは、インビボのデュシェンヌ型筋ジストロフィーマウスモデルにおいてジストロフィー筋肉細胞におよび患者に送達されている(ウー・ビー(Wu B)ら、2010年発行、Gene Ther 17,132、キナリ・エム(Kinali M)ら、2009年発行、Lancet Neurol 8,918)。ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なＡＯＮは、インビトロにおいてＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体のｍＡｂ阻害よりも腫瘍性細胞増殖をより強力に阻害することが観察された(ロー・エイチ(Roh H)ら、2000年発行、Cancer Res 60,560)。インビトロでのＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性乳がん細胞のＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＡＯＮと従来の化学療法剤とでの併用治療は、アポトーシスの活性化による腫瘍細胞成長の相乗的阻害をもたらす(ライト・エーエス (Rait AS)ら、2001年発行、Cancer Gene Ther 8,728、ルイス・ピージーディー(Lewis PGD)、2008年発行、Cancer Res 68,9280)。
【００７１】
ナノ粒子は薬物送達において小分子および大分子のための担体として用いられる。ナノ粒子は、１０〜１０００ｎｍの範囲のサイズを有する粒子状分散剤または固体粒子として定義される。薬物は、ナノ粒子マトリクスに溶解される、封入される、被包されるまたは結合される(ランガー・アール(Langer R.)、2000年発行、Acc Chem Res 33,94)。ナノ粒子は粒子と薬物カーゴとの間に共有結合を有さず、一般に単に薬物を漏出し、したがって腫瘍細胞内に直接カーゴを輸送および放出できないことから本発明のナノバイオポリマーはナノ粒子とは異なる。
【００７２】
ナノ粒子とは対照的に、本明細書において提供されるナノバイオポリマー組成物は、次の、共有結合で結合した腫瘍細胞標的化抗体、２つ以上の抗腫瘍薬物、エンドソーム破壊成分および腫瘍細胞の細胞質内に薬物を放出するためのグルタチオン切断可能結合の内の複数を含む機能的モジュールを有する単一の単位分子実体を含む。そのような構造物は漏出を減らすように機能し、非腫瘍蓄積を抑制し、それにより副作用を最小化し、血漿中の組成物の薬物残存半減期を増加させる。結果として腫瘍取り込みおよび薬物特異性が、増強されることが本明細書の実施例において観察され、腫瘍成長および腫瘍体積の顕著な減少を導いた。さらにＡｋｔ活性化の阻害および腫瘍細胞アポトーシスの増加を介する併用薬の作用も本明細書の実施例において観察された。
【００７３】
本発明のナノバイオポリマーは、がん療法において大きな可能性を提供する。表１は、本明細書の実施例における使用のために合成されたナノバイオポリマー薬物を要約する。
【００７４】
定義
本明細書において用いられる用語「分子スキャホールド」は、共有結合的にコンジュゲートした薬物を標的化された組織に輸送し、組織の細胞表面受容体に結合し、エンドソームに内部移行し、エンドソームから細胞質に漏出し、グルタチオンおよび細胞質内容物の他のスルフヒドリル基との化学反応によって反応性遊離薬物を細胞質に放出する少なくとも２つ以上のモジュールを有する分子を意味する。高分子質量薬物ビヒクルおよび粒子の特異性は、腫瘍特異的にコンジュゲートされた標的化分子ならびにそれらの増強された透過性および（２００００を超えるなどの高分子質量に由来する）腫瘍での滞留によって主に腫瘍組織標的化のままである(ダンカン・アール(Duncan R.)、1999年発行、Research Focus 2:441、シーモア・エルダブリュー(Seymour LW)ら、1995年発行、Eur J Cancer Res 31A,766)。
【００７５】
本明細書において用いられる用語「ポリリンゴ酸」またはＰＭＬＡは、ポリマー（例えば主鎖エステル結合を含有し、生分解性であり、高い分子屈曲性を有し、水に（イオン化した場合）および有機溶媒に（その酸形態で）可溶性であり、無毒性、ならびに非免疫原性であるホモポリマー）を意味する(リー・ビーズ(Lee Bs)ら、Biopolymers,vol.3a(ドイ・ワイ、スタテインビューヘル・エー(Doi Y,Steinbuchel A)編,pp75-103,Wiley-VCH,New York 2002年発行の「水溶性脂肪性ポリエステル、ポリ（リンゴ酸）(Water-soluable aliphatic polyesters:poly(malic acid)s)」)。ＰＭＬＡを保持する薬物は、誘導体化されたリンゴ酸ラクトンの開環重合によって合成される。ドキソルビシン−ポリ−リンゴ酸は、合成ポリ−β−Ｄ、Ｌ−リンゴ酸から合成されている(アブデラウイ・ケー(Abdellaoui K)ら、1998年発行、Eur J Pharmaceutical Sciences 6,61)。担体はポリ（β−Ｌ−リンゴ酸）からなり、次の機能、細胞質で有効になる放出可能な機能的モジュールを介したプロ薬物の送達、細胞の表面に結合することによって担体を特定の組織に方向付けること、例えばモノクローナル抗体（ｍＡＢ）、エンドソームを通じた（通常標的化された表面受容体の内部移行を介する）標的化細胞への内部移行、エンドソーム膜に組み込まれ最終的にエンドソーム膜を破壊する疎水性機能ユニットの効力によるエンドソームから細胞質への漏出の促進、リソソームへの経路中でのエンドソームの酸性化の際の有効性の増大、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）による分解酵素活性（例えばペプチダーゼ、プロテアーゼなど）からの保護の内の少なくとも１つを実行する種々のモジュールそれぞれと定められた比率でそのカルボキシル基において化学的にコンジュゲートされる分子骨格またはスキャホールドを表して本明細書においてポリ−β−Ｌリンゴ酸またはＰＭＬＡと称される。
【００７６】
本明細書において用いられる用語「モジュール」は、本明細書の組成物の一部を形成する生物学的に活性な分子構造（例えば小さな薬物分子もしくは発色団分子、抗体もしくはレクチンなどのタンパク質分子または組成物の構築においてＰＭＬＡに共有結合的に結合するこれらの一部）を意味する。本明細書の実施例では、生物学的に活性なモジュールは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体タンパク質に特異的なモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）によって例示される。組織標的化は、トランスフェリン受容体タンパク質を特異的に認識するおよびそれに結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）モジュールの使用によって例示される。
【００７７】
本明細書において用いられる用語「トランスフェリン受容体タンパク質」は、内皮細胞表面上に（特定の腫瘍では上昇したレベルで）発現される受容体を意味する(リー・ジェイエイチ(Lee JH)ら、2001年発行、Eur J Biochem 268,2004、コバー・エムケー(Kovar MK)ら、2003年発行、J Drug Targeting 10,23)。トランスフェリン受容体は、トランスフェリンに化学的に結合する（例えば、トランスフェリン受容体に結合し、それにより血管脳関門と関連する内皮を通じて経細胞輸送を達成するモノクローナル抗体を用いて）、本明細書の組成物における薬物送達系のための標的として用いられる。トランスフェリン受容体への抗体結合およびエンドソームへの内部移行は、実証されている(ブロードウエル・アールディー(Broadwell RD)ら、1996年発行、Exp Neurol 142,47)。トランスフェリン受容体の場合、任意の適切な抗体モノクローナル抗体、例えばヒト化もしくはキメラ抗体またはレクチンまたはトランスフェリン受容体に特異的な別のリガンドが用いられうることは理解される。多数の細胞表面受容体または抗原に対する他の適切なリガンドは、本明細書の組成物における標的として用いられることができ、トランスフェリン受容体は単なる例示である。
【００７８】
本明細書において用いられる句「エンドソームエスケープユニット」は、エンドソームビヒクルのリソソームへの成熟の際の酸性化によって活性になるＰＭＬＡスキャホールドに結合する担体モジュールを意味する(バルムス・ヴィー(Bulmus V)ら、2001年発行、Cancer Research 61,5601、ラッキイ・シーエー(Lackey CA)ら、2002年発行、Bioconjugate Chem 13,996)。担体モジュールは、アミド結合でＰＭＬＡスキャホールドに連結している複数のロイシンもしくはバリン残基またはロシンエチルエステルを含む。リソソームへの途中のエンドソームの酸性化の際に、担体分子のこれらのストレッチは、電荷が中和され、疎水性になり、膜を破壊できるようになる。リソソームのｐＨで電荷が中和される他の分子も、ＰＭＬＡおよびエンドソームエスケープユニットモジュールを含有している組成物の構築においてロイシンもしくはバリン残基またはロイシンエチルエステルの代わりに用いられうる。
【００７９】
一般にＰＥＧ化は、コンジュゲートタンパク質のインビボ半減期を増大させるため、循環時間を延長するため、および標的化した固形腫瘍への血管外漏出を増強するために薬物設計において用いられる(アルピコ・エス(Arpicco S)ら、2002年発行、Bioconjugate Chem 13,757、マルヤマ・ケー(Maruyama K)ら、1997年発行、FEBS Letters 413,1771)。半減期を増加させることが周知の他の分子も本明細書の組成物の設計において用いられうる。
【００８０】
本明細書において用いられる用語「がん」および「がん性の」は、細胞の集団が制御されていない細胞成長によって特徴付けられる哺乳動物での生理学的状態を意味する。がんの例は、細胞腫、リンパ腫、芽腫、肉腫および白血病を非限定的に含む。そのようながんのより詳細な例は、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、肺の扁平上皮がん、腹膜のがん、肝細胞がん、胃がん、膵臓がん、神経膠芽腫、子宮頸部がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞種、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝がんおよび頭頸部がんの種々の種類を含む。
【００８１】
用語「増殖性障害」および「増殖性疾患」は、がんなどの異常な細胞増殖を伴う障害を意味する。
【００８２】
本明細書において用いられる用語「腫瘍」および「新生物」は、前がん病変を含んで良性（非がん性）または悪性（がん性）のいずれかの過剰な細胞成長または増殖に由来する組織の任意の腫瘤を意味する。
【００８３】
用語「原発性がん」は、がんが生じた元の部位を意味する。例えば乳房において生じたがんは、原発性乳がんと呼ばれる。転移する（すなわち脳へ広がる）場合は、がんは脳に転移する原発性乳がんと称される。
【００８４】
本明細書において用いる用語「転移」は、それによりがんが元の部位から身体の他の領域に類似するがん性病変の発症を伴って（すなわち同じまたは実質的に同じ生化学的マーカーを有して新たな位置に）広がるまたは移行するプロセスを意味する。「転移性の」または「転移する」細胞は、（隣接する細胞との接着性接触に関する活性が低下しており、血流によってもしくはリンパ液中で疾患の原発部位から追加的な遠位部位に、例えば隣接する身体構造または遠位構造に浸潤するように）移動するものである。
【００８５】
用語「がん細胞」「腫瘍細胞」および文法的等価物は、非腫瘍原性細胞および腫瘍原性細胞（すなわちがん幹細胞）の両方を含む腫瘍または前がん病変由来の細胞を意味する。
【００８６】
本明細書で用いる用語「腫瘍原性」は、自己再生（すなわち追加的腫瘍原性がん細胞を生じさせる）および他の腫瘍細胞を生成するための増殖（すなわち分化した、したがって非腫瘍原性の腫瘍細胞をがん細胞が腫瘍を形成するように生じさせる）の特性を含む固形腫瘍幹細胞の機能的特質を意味する。
【００８７】
本明細書において用いる句「腫瘍原性細胞またはがん細胞を標的化する」は、腫瘍（すなわち腫瘍原性細胞）内の腫瘍形成細胞の集団に組成物を送達することを意味する。腫瘍内の細胞の他の集団と比較してがん細胞の腫瘍原性集団への組成物の優先的送達は、本明細書においてがん細胞を排除するための標的化、組成物の特異性および効力を改善する特性とみなされる。
【００８８】
用語「抗体」は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質または前述の組合せなどの標的を、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を通じて認識し、特異的に結合する能力のために本明細書の組成物に含まれる機能的モジュールである免疫グロブリン分子を意味して本明細書において用いられる。特定の実施形態では、本明細書の組成物に機能的モジュールとして含まれる抗体は、アンタゴニスト抗体として記載されるクラスを含み、がん幹細胞マーカータンパク質に特異的に結合し、例えばリガンド結合、受容体二量体化、がん幹細胞マーカータンパク質の発現、および／またはがん幹細胞マーカータンパク質の下流シグナル伝達を干渉する。代替的実施形態では、本明細書の組成物の機能的モジュールとしての抗体は、がん幹細胞マーカータンパク質に特異的に結合し、例えばリガンド結合、受容体二量体化および／またはがん幹細胞マーカータンパク質によるシグナル伝達を促進するアゴニスト抗体を含む。代替的実施形態では、がん幹細胞マーカータンパク質の生物学的活性を干渉または促進しない抗体は、代わりに例えば抗体内部移行および／または免疫系による認識によって腫瘍成長を阻害するように機能する。
【００８９】
本明細書で用いる用語「抗体」は、無処置ポリクローナル抗体、無処置モノクローナル抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片など）、１本鎖Ｆｖ（ｓｖＦｖ）変異体、少なくとも２つの無処置抗体から生成される二重特異性抗体などの多選択性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質および、抗原認識部位を含む（抗体が望まれる生物学的活性を呈する限り）任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それらの重鎖定常ドメインのアイデンティティーに基づいてアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューとそれぞれ称される免疫グロブリンの主な５個のクラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭまたはそれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えばＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌおよびＩｇＡ２）全てを含む。抗体は、ネイキッドであってよく、または毒素、放射性同位元素などの他の分子にコンジュゲートされてよい。他の実施形態では、抗体は融合抗体である。
【００９０】
本明細書で用いる用語「抗体断片」は、無処置抗体の部分を意味し、無処置抗体の抗原決定可変領域を意味する。抗原断片の例は、これだけに限らないがＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、直鎖抗体、１本鎖抗体および抗体断片から形成された多選択性抗体を含む。
【００９１】
「Ｆｖ抗体」は、完全な抗原認識部位および結合部位を２本鎖として（重鎖可変ドメイン１本および軽鎖可変ドメイン１本が非共有結合二量体を形成している）または１本鎖（ｓｃＦｖ）として（重鎖可変ドメイン１本および軽鎖可変ドメイン１本が可動性ペプチドリンカーによって共有結合的に連結しており、それにより２本の鎖が二量体構造のように会合している）のいずれかで含有する最小抗体断片を意味する。この立体配置では、各可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）はＦｖ二量体の抗原結合特異性を決定するように相互作用する。代替的に１本鎖可変ドメイン（またはＦｖの半分）は、（一般に低い親和性を有するが）抗原を認識するおよび結合するために用いられうる。
【００９２】
本明細書において用いられる「モノクローナル抗体」は、単一の抗原決定基またはエピトープの特異的認識および結合に関与する均一な抗体集団を意味する。ポリクローナル抗体は、それぞれが異なる抗原決定基に方向付けられた抗体種の集団を含む。用語「モノクローナル抗体」は、全長モノクローナル抗体および抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）の両方、１本鎖（ｓｃＦｖ）変異体、抗体の部分を含む融合タンパク質および抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。さらに「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ発現、ファージ選択、組換え発現を非限定的に含むがこれらに限定されない方法によっておよびトランスジェニック動物によって得られたものを意味する。
【００９３】
医薬組成物
本発明の一態様では、医薬組成物は、発がんタンパク質の発現を阻害する機能的モジュールであるアンチセンス分子およびタンパク質に特異的な抗体である少なくとも１つのモジュールに共有結合的に連結しており、場合により発がん脈管構造タンパク質に特異的な抗体であるモジュールおよび薬学的に許容される担体をさらに含む本明細書でポリ−β−Ｌ−リンゴ酸またはＰＭＬＡと称されるポリ（β−Ｌ−リンゴ酸）のナノバイオポリマーコンジュゲートを含んで提供される。特定の実施形態では、組成物は、場合により追加的治療剤である１つまたは複数の追加的モジュールをさらに含む。特定の実施形態では、１つまたは複数の追加的治療剤は、成長因子、抗炎症剤、血管収縮剤、コラゲナーゼ阻害物質、局所ステロイド、マトリクスメタロプロテイナーゼ阻害物質、アスコルビン酸、アンギオテンシンＩＩ、アンギオテンシンＩＩＩ、カルレティキュリン、テトラサイクリン、フィブロネクチン、コラーゲン、トロンボスポンジン、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）およびヒアルロン酸からなる群から選択される。
【００９４】
本明細書で用いる用語「薬学的に許容される担体」は、望まれる具体的な投与形態に好適であるありとあらゆる溶媒、希釈剤または他の液体ビヒクル、分散剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、濃化剤または乳化剤、保存剤、固形結合剤、潤滑剤などを含む。ゲネロ(Gennaro)によって編集されたRemington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing,Easton,PA,1995年発行は、医薬組成物の製剤において用いられる種々の担体およびそれらの調製のための周知の技術を開示している。薬学的に許容される担体として役立ちうる材料のいくつかの例は、これだけに限らないがラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖、コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン、セルロースならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよびセルロースアセテートなどのその誘導体、粉末化トラガント、麦芽、ゼラチン、タルク、カカオバターおよび坐薬用ワックスなどの賦形剤、ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油などの油、グリコール、プロピレングリコールなど、エチルオレートおよびエチルラウレートなどのエステル、アガー、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、アルギン酸、発熱物質不含有水、等張生理食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、ならびにリン酸緩衝液を含み、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の無害適合性潤滑剤、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香料および芳香剤、保存剤および抗酸化剤も考案者の判断に従って組成物中に存在できる。
【００９５】
治療有効量
さらに別の態様では、本発明の治療の方法により具体的な種類のがんの治療のための方法は本明細書に記載される。したがって本発明は、受容体の少なくとも１つのリガンドの発現を阻害する活性剤を含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に、望まれる結果を達成するために必要である量でおよび必要な時間にわたって投与するステップを含む具体的な受容体に関連するがんの治療のための方法を提供する。これが治療手段としてがんの退縮を促進するためまたはさらなる進行もしくは転移を阻止するためあるいは腫瘍もしくはがんの進行に伴う合併症を最少化するための予防手段として本発明の医薬品を投与することを包含することは理解される。本発明の特定の実施形態では、医薬組成物の「治療有効量」は、がんもしくはがん化成長のさらなる進行を阻止するためにおよびがんの退縮に作用するために有効な量である。本発明の方法による組成物は、がんの進行の阻止のために有効な任意の量および任意の投与経路を用いて投与されうる。したがって本明細書で用いる表現「発がんタンパク質の発現または活性を阻害するために有効な量」は、がんの発症を阻止するまたは遅らせ、さらにがんまたは固形腫瘍の退縮を生じさせるために十分な組成物の量を意味する。がんは固形腫瘍に限定される必要はなく、種々の種類のリンパ腫および白血病を含む。
【００９６】
正確な投与量は、治療される患者の必要性を考慮して個々の医師によって選ばれる。投与量および投与は、活性剤（複数可）の十分なレベルを提供するためまたは望まれる効果を維持するために調整される。考慮される場合がある追加的要因は、疾患状態の重症度（例えばがんのサイズおよび位置）、年齢、体重および患者の性別、食事、時間および投与頻度、薬物の組合せ、反応感度および治療への耐性／応答を含む。長時間作用性医薬組成物は、具体的な組成物の半減期およびクリアランス速度に応じて３から４日ごと、１週間ごと、または２週間ごとに１回投与されてよい。
【００９７】
本発明の活性剤は、投与の簡便性および投与量の均一性のために単位剤形で好ましくは製剤される。本明細書で用いる表現「単位剤形」は、治療される患者に適する活性剤の物理的に分離された単位を意味する。しかし、本発明の組成物の一日の使用量の合計は、妥当な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることは理解される。本明細書の実施例１に示すとおり、任意の活性剤について治療有効量は、細胞培養アッセイまたは動物モデル（通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタ）のいずれかにおいて最初に概算されうる。動物モデルは望まれる濃度範囲および投与経路を得るためにも用いられうる。次いでそのような情報は、ヒトにおける投与のために有用な用量および経路を決定するために用いられうる。治療有効量は、症状および状態を回復させる活性剤の量を意味する。活性剤の治療効力および毒性は、標準的薬学的手順によって細胞培養または実験動物において決定されうる、例えばＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効である用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に致死である量）。毒性作用に対する治療作用の用量比は治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現されうる。本明細書の医薬組成物は、大きな治療指数を示す。本明細書の動物研究から得られたデータは、ヒトへの使用のための投与量の範囲を案出するために用いられる。
【００９８】
ＦＤＡによって認可されたヒトの治療のためのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の初回用量は、１週間に４ｍｇ／ｋｇに続いて２ｍｇ／ｋｇで合計５２用量である。マウスの治療に効果的な、本明細書の組成物の用量は、測定された４０μｇ／ｍｌを１００μｌであり、これはヒトでの使用についての約３．２ｍｇ／ｋｇと等価である。
【００９９】
医薬組成物の投与
適切な薬学的に許容される担体との望まれる投与量での製剤後に、本発明の医薬組成物はヒトおよび他の哺乳動物に、がんまたは治療される他の状態の重症度および位置に応じて局所的に（粉末、軟膏または液滴として）、経口で、直腸に、非経口的に、大槽内に、膣内に、腹腔内にまたは静脈内に投与されうる。静脈内投与は、ボーラスとしてまたは点滴としての注射を含む。
【０１００】
本発明の医薬組成物の局所的または経皮的投与のための剤形は、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤およびパッチを含む。活性剤は、滅菌条件下で薬学的に許容される担体および必要に応じて任意の必要な保存剤または緩衝剤と混合される。例えば眼球または皮膚の感染は、水性液滴、噴霧剤、乳剤またはクリームで治療される場合がある。投与は治療的であってよく、または予防的であってもよい。予防的製剤は、潜在的な腫症の部位または腫瘍の元となる位置に存在または添加されてよい。本発明は、開示された組成物を含有するデバイス、手術用デバイス、聴能学的デバイスまたは製品（例えばガーゼ絆創膏またはストリップ）およびそのようなデバイスまたは製品を作製するまたは使用する方法を含む。これらのデバイスは、開示の組成物でコートされ、浸漬され、結合されまたは他に処置されてよい。
【０１０１】
軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本発明の活性剤に加えて動物性および植物性の脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、酸化亜鉛またはこれらの混合物などの賦形剤を含有できる。
【０１０２】
粉末および噴霧剤は、本発明の薬剤に加えてラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、ポリアミド粉末またはこれらの物質の混合物などの賦形剤を含有できる。噴霧剤は、追加的にクロロフルオロハイドロカーボンなどの従来の噴霧剤を含有できる。
【０１０３】
経皮パッチは、有効成分の身体への制御された送達を提供する追加的利点を有する。そのような剤形は、適切な媒体に化合物を溶解または調剤することによって作製されうる。吸収増強剤も皮膚を通過する化合物の流れを増加させるために用いられうる。速度は速度調節膜を提供することまたは化合物をポリマーマトリクスもしくはゲル中に分散することのいずれかによって調節されうる。
【０１０４】
注射可能な調製物（例えば滅菌注射可能水性溶液または油性の分散剤）は、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて当技術分野で周知のとおり製剤されうる。滅菌注射可能な調製物は、無害の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中で（例えば１，３−ブタンジオール中の溶液として）滅菌注射可能な溶液、懸濁剤または乳剤に製剤されうる。用いられうる許容されるビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐおよび等張塩化ナトリウム溶液である。追加的に滅菌の固定油は、従来法において溶媒または懸濁媒体として用いられる。この目的のために合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の穏やかな固定油は、用いられうる。追加的にオレイン酸などの脂肪酸は、注射可能な調製物中で用いられる。注射可能な製剤は、例えば細菌保持フィルターによるろ過によってまたは（使用前に滅菌水または他の滅菌注射可能媒体に溶解または分散されうる）滅菌固形組成物の形態での滅菌剤を組み込むことによって滅菌されてよい。活性剤の効果を延長するために、皮下または筋肉内注射からの薬剤の吸収を遅くすることはしばしば望ましい。非経口的に投与された活性剤の吸収遅延は、薬剤を油ビヒクルに溶解するまたは懸濁することによって達成されうる。注射可能な徐放性製剤形態は、本明細書およびジュビモバ(Ljubimova)らの２００９年６月１６日発行の米国特許第７，５４７，５１１号明細書、ジュビモバ(Ljubimova)らの２００９年１０月２２日公開の米国特許出願第１２／４７３，９９２号明細書、ジュビモバ(Ljubimova)らの２００７年１１月８日公開の米国特許出願第１０／５８０，９９９号明細書およびディング(Dign)らの２００９年４月１０日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４０２５２号明細書に記載のとおりポリ乳酸−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中で薬剤のマイクロエンカプセルマトリクスを形成することによって作製される。活性剤の放出速度は、活性剤のポリマーに対する比によっておよび用いる具体的なポリマーの性質によって調節される。他の生分解性ポリマーの例は、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）を含む。徐放性の注射可能製剤は、身体組織に適合性であるリポソームまたはマイクロ乳剤に薬剤を封入することによっても調製される。
【０１０５】
直腸内および膣内投与のための組成物は、本発明の活性剤（複数可）を好適な非刺激性賦形剤またはカカオバター、ポリエチレングリコールもしくは（環境温度では固体であるが身体温度では液体であり、それにより直腸腔または膣腔で溶解し、活性剤（複数可）を放出する）坐薬ワックスなどの担体と混合することによって調製されうる好ましくは坐薬である。
【０１０６】
医薬組成物の使用
上で考察され、および本明細書に添付の文書中の実施例においてより詳細に記載され、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈでの出版が受理されたとおり、発がんタンパク質の発現または活性の少なくとも１つの阻害は、がん状態の進行または転移を阻止するために有用である。一般にこれらの阻害物質は、これだけに限らないが乳がん、皮膚がん、卵巣がん、子宮頸がん、網膜芽細胞腫、結腸がんおよび消化管の内膜から生じるなどの他のそのような状態、肺がんおよび呼吸器のがん、腎がんおよび尿細管の内側表面から生じる他の腫瘍、白血病およびリンパ腫および血液のそのような障害、ならびにパピローマウイルスの種々の系統に関連するものを含む生殖器がんの他の種類、脳腫瘍、ならびに子宮、膣、尿道のがんを含む具体的な種類のがんのさらなる成長を阻止することにおいて臨床的に有用であると考えられている。
【０１０７】
本発明によって包含される診断、予後および治療方法がヒトの状態の治療に限定されず、これだけに限らないがウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、マウスおよびウマ種を含む任意の哺乳動物における同様の状態を治療するために用いられうることは理解される。所与の種における腫瘍を治療する場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドが種において天然に存在するものと塩基配列において実質的に同じであるヌクレオチド配列を有することは好ましいが必要ではない。
【０１０８】
本発明について詳述したが、本発明は、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈでの発行が受理され、その全体を参照することにより本明細書に援用されているサトシ・イノウエ(Satoshi Inoue)らによる研究論文「ポリリンゴ酸ベースのナノバイオポリマーは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体の合成および活性の両方を阻害することによって効果的な乳がん全身的治療を提供する(Polymalic acid-based nanobiopolymer provides efficient systemic breast cancer treatment by inhibiting both HER2/neu receptor synthesis and activity)」においてさらに例示されている。
【０１０９】
以上、本発明について詳述したが、本発明は、以下の実施例および特許請求の範囲において例示され、これらは、さらなる限定として解釈されない。本明細書に引用した参考文献は、その全体を参照することにより本明細書に援用されている。
【実施例】
【０１１０】
実施例１
試薬
本明細書の実施例において用いられるモルホリノ（商標）−３’−ＮＨ２アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）は、Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ（Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ、ＯＲ）によって受注生産されたものである。
【０１１１】
ＨＥＲ２／ｎｅｕに対して特異的なＡＯＮは、２つの配列
バージョン１  ５’−ＡＧＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＴＴＣＡＴＧＴＣＴＧＴＧ−３’（配列番号１）、および
バージョン２  ５’−ＣＡＴＧＧＴＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣ−３’（配列番号２）
を含んでいた。
【０１１２】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対して特異的なＡＯＮは、
５’−ＴＣＧＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＣＣＣＧＡＴＣＡＡＴＡＣ−３’（配列番号３）
を含んでいた。
【０１１３】
ラミニン−４１１のα４およびβ１サブユニットに対して特異的なＡＯＮは、
α４サブユニット、５’−ＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＣＡＴＴＴＣＴＣＣＧＣＴＧＡＣ−３’（配列番号４）、および
β１サブユニット、５’−ＣＴＡＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＣＡＴＧＣＣ−３’（配列番号５）
を含んでいた。
【０１１４】
ＥＧＦＲに対して特異的なｓｉＲＮＡは、次の配列
センス、５’−ＣＣＵＡＵＡＡＵＧＣＵＡＣＧＡＡＵＡＵｔｔ−３’（配列番号６）、および
アンチセンス、５’−ＡＵＡＵＵＣＧＵＡＧＣＡＵＵＵＡＵＧＧａｇ−３’（配列番号７）
を含んでいた。
【０１１５】
ＨＥＲ２受容体タンパク質に対して特異的なｓｉＲＮＡは、
センス、５’−ＧＵＵＧＧＡＵＧＡＵＵＧＡＣＵＣＵＧＡｔｔ−３’（配列番号８）、および
アンチセンス、５’−ＵＣＡＧＡＧＵＣＡＡＵＣＡＵＣＣＡＡＣａｔ−３’（配列番号９）
を含んでいた。
【０１１６】
ｓｉＲＮＡ配列の３’−末端の小文字「ｔｔ」、「ａｇ」および「ａｔ」は、ｓｉＲＮＡをＤＮＡ分子にアニールするために合成されたＤＮＡオリゴヌクレオチドを記載している。
【０１１７】
高度に精製された、内毒素不含有ポリ−β−Ｌリンゴ酸、Ｍｗ（平均量）＝１００ｋＤａ、多分散＝１．１を真正粘菌の培養ブロスから得た。ラット抗マウスＴｆＲ  ｍＡｂ  Ｒ１７２１７（ｍＴｆＲ）をＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）から購入した。システアミン（２−メルカプトエチル−１−アミン塩酸塩）、Ｎ−ヒロドキシサクシニミド、他の試薬および溶媒は入手可能な最高純度であり、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。
【０１１８】
実施例２
ポリリンゴ酸ナノバイオポリマーの合成
ナノバイオポリマーは５から６個の構成成分、骨格としてのＰＭＬＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質合成を阻害するためのモルホリノＡＯＮ、標的化抗ＴｆＲ  ｍＡｂ、抗腫瘍Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、細胞質内ＡＯＮ送達を達成するためのエンドソームエスケープユニットとしての４０％ロイシンエチルエステル（ＬＯＥｔ）および血流における安定性を増加させる５％ＰＥＧ5000を含む機能的モジュールを含有する（図１）。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）含有コンジュゲート上の抗マウスＴｆＲ  ｍＡｂは、腫瘍脈管構造を標的化するために用いた。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を含まずにＡＯＮを含むコンジュゲートは、それに結合した抗ヒトＴｆＲ  ｍＡｂをヒト腫瘍細胞への薬物結合およびその内部移行を促進するために含んだ。４０％ＬＯＥｔ、５％ＰＥＧ5000および１０％システアミン（％は、ポリリンゴ酸中のペンダントカルボキシル基の総量を基準とする）を含有しているプレコンジュゲートは、既に記載された方法(リー・ビーエス(Lee BS)ら、2006年発行、Bioconjug Chem 17,317)によって合成した。プレコンジュゲートとコンジュゲートした抗体をサイズ排除ＨＰＣＬによって定性的および定量的にアッセイした。精製ＴｆＲおよびＨＥＲ２／ｎｅｕでのＥＬＩＳＡを結合した抗体の機能的反応性を評価するために記載のとおり(フジタ・エム(Fujita M)ら、2007年発行、J Control Release.122,356)用いた。
【０１１９】
画像処理のためのコンジュゲートをスルフヒドリル基とチオエーテルを形成することによってＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０  Ｃ２−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で蛍光標識した。次いで抗体コンジュゲートをＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＡＯＮと反応させた（図１）。対照コンジュゲートは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を含有したが（図１）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的ＡＯＮは含有しなかった。
【０１２０】
実施例３
ナノバイオポリマー特徴付け
重合体ナノバイオコンジュゲートの化学的および物理的特徴付けを、６Ｍ  ＨＣｌの存在下、１００℃でのナノバイオポリマー加水分解後のＬ−リンゴ酸脱水素酵素アッセイ、ＰＥＧ比色分析決定およびタンパク質定量、サイズおよびζポテンシャル、ＨＰＬＣならびにＥＬＩＳＡを含む種々の方法によって実施した。ＨＰＬＣはＨｉｔａｃｈｉ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｅｌｉｔｅ  ＬａＣｈｒｏｍ  ＨＰＬＣ−ＵＶ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｈｉｔａｃｈｉ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）上で、サイズ排除はＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ  ３０００  ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）で実施した。ナノバイオポリマー変種を非侵襲的後方散乱（ＮＩＢＳ）に基づいてそれらのサイズ（水力学的径）によっておよび電気泳動Ｍ３−ＰＡＬＳを用いるヘルムホルツ−スモルコフスキー（Ｈｅｌｍｈｏｌｔｚ−Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ）の式に基づく電気泳動移動度からのζポテンシャルによって特徴付けた(ガッスラー・ビー(Gasslaier B)ら、1997年発行、Eur J Biochem 250:308)。両測定は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＺＳ９０（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）で実施した。分子サイズおよびζポテンシャルについてのデータは、３回の独立した測定から得た平均±標準偏差を表す。
【０１２１】
実施例４
細胞株および培養条件
ヒト乳がん細胞株ＢＴ−４７４、ＳＫＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＭＣＦ−７は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得た。ＢＴ−４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＭＣＦ−７は、１０％ウシ胎児血清および抗生物質を含むＤＭＥＭ中で培養した。ＳＫＢＲ−３は、１０％ウシ胎児血清および抗生物質を含むＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地で培養した。
【０１２２】
実施例５
命名法
用語「ナノバイオポリマー」は、ナノプラットホームとしてのＰＭＬＡならびにＡＯＮ、ラット抗マウスまたはマウス抗ヒト標的化ＴｆＲ  ｍＡｂ（それぞれＭおよびＨ）およびエンドソームエスケープユニットモジュールとしてのＬＯＥｔを含むＰＭＬＡに共有結合的に結合した機能的モジュール基を含む薬物送達系を記載する。ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性乳がんを治療するための本明細書に記載のナノバイオポリマー薬物（図１および表１）は、薬物ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＡＯＮもしくは薬物Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）のいずれかまたはＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＡＯＮ＋Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の両方を含有する。
【０１２３】
実施例６
細胞増殖アッセイ
ＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現乳がん細胞ＢＴ−４７４またはＳＫＢＲ−３それぞれを６ウエルプレートに細胞３×１０5個／ウエルで播種した。翌日細胞をエンドポーター（４μΜ、対照）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（４０μｇ／ｍｌ）、Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（４０μｇ／ｍｌ）、エンドポーター（４μΜ）およびＡＯＮ（４μΜ）、Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／ＴｆＲ（Ｈ／Ｍ）、Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）ならびにＰＢＳ対照のいずれか１つで処置した。処置の７２時間後、細胞をトリパンブルーで染色した。細胞生存率を各処置群についての細胞数（三重反復）の平均を算出することによって決定し、ＰＢＳで処置した細胞の数に対して標準化した処置細胞の総数の百分率として表した。
【０１２４】
実施例７
ウエスタンブロット
ＢＴ−４７４およびＳＫＢＲ−３乳がん細胞をＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（４０μｇ／ｍｌ）、Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）４０μｇ／ｍｌと当量）、エンドポーター（４μΜ）およびＡＯＮ（４μΜ）、Ｐ／  ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／ＴｆＲ（Ｈ／Ｍ）、Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）、ＰＢＳ対照または４μΜエンドポーターで処置した。細胞可溶化物を７２時間後に回収し、以前記載されたとおり（イノウエ・エス(Inoue S)ら、2005年発行、Mol Ther. 12,707-15)ウエスタンブロットによって分析した。種々の処置後に切除した乳房腫瘍の可溶化物をこれらの方法によって分析した。次の抗ヒト一次抗体、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、Ａｋｔ、リン酸化Ａｋｔ（ｐ−Ａｋｔ）、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ、ゲル添加を標準化するため）（全てＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡから）およびポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いた。
【０１２５】
実施例８
ヌードマウスでの腫瘍異種移植
Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可されたプロトコールに従って動物実験を実施した。胸腺欠損マウス（ＣｒＴａｃ、ＮＣｒ−Ｆｏｘｎｌｎｕ  Ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ、Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ）を用いた。０．７２ｍｇ、９０日間放出１７βエストラジオールペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ）を注射の７日前に各マウスの背部に皮下挿入した。１５０μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）中に懸濁したＢＴ−４７４細胞１×１０7個の量を３５匹のマウス（各群５匹）それぞれの右側腹部に注射し、腫瘍が＞１２０ｍｍ3の平均サイズに達したときに（注射の２１日後）処置を開始した。マウスを５個の処置群に分け、各群に滅菌ＰＢＳ（対照）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（４０μｇ／ｍｌ）、Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）４０μｇ／ｍｌと当量）、Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／ＴｆＲ（Ｈ／Ｍ）またはＰ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）のいずれかを尾静脈に１週間に２回投与した。処置は３週間の間に６回実施した。
【０１２６】
腫瘍異種移植片をノギスで１週間に２回測定し、腫瘍体積を式（長さ×幅2）×（π／６）を用いて決定した。
【０１２７】
最終処置の１８日後、動物を３％イソフルラン−空気混合物で麻酔し、安楽死させた。形態学的観察のために腫瘍試料をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。データは２つの独立例の平均である。
【０１２８】
実施例９
共焦点顕微鏡観察
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０−標識ナノバイオポリマー（Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＩｇＧ、対照）、Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）４０μｇ／ｍｌまたはＰ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ））それぞれをマウスの尾静脈に注射した。薬物投与の２４時間後、マウスを安楽死させ、腫瘍を、蛍光シグナルを検出するために採取し、液体窒素中でスナップ冷凍し、共焦点顕微鏡（ＴＣＳ  ＳＰ５  Ｘ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）観察のためにＯＣＴ化合物中に包埋した。
【０１２９】
実施例１０
インビボ画像処理
ＢＴ−４７４ヒト乳がん細胞を記載のとおりマウスの右大腿に移植した。腫瘍サイズが１２０ｍｍ3に達したときに１６０μｌのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０標識ナノバイオポリマーを静脈注射した（４μＭ）。Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＩｇＧを陰性対照として用いた。薬物分布および局在を腫瘍保有マウスにおいてＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  ２００ｉｍａｇｅｒ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）を用いてさまざまな時点、薬物投与前、薬物投与１時間後、３時間後、６時間後および２４時間後）に評価した。薬物投与２４時間後、マウスを安楽死させ、循環している薬物を動脈内ＰＢＳ灌流によって除去した。腫瘍および主な器官を、蛍光シグナルを検出するために回収した。
【０１３０】
実施例１１
統計解析
スチューデントｔ−検定（２つの群について）および分散分析（ＡＮＯＶＡ、３つ以上の群について）を実験結果の有意性を算出するために用いた。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４  ｐｒｏｇｒａｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を全ての算出のために利用した。データは、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表す。有意水準はＰ＜０．０５に設定した。
【０１３１】
実施例１２
ポリマーコンジュゲートの合成
ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的ＡＯＮ配列で、別のバージョンと比較してＨＥＲ２／ｎｅｕ発現を十分に阻害しないバージョンが観察され、それにより有効なバージョンだけをポリマープラットホームにコンジュゲートした。ナノバイオポリマーのリードバージョン（図１）の絶対分子量は、光散乱により１，３００ｋＤａであり、設計に基づく算出値に近い。図１のナノバイオポリマーの水力学的直径（ナノサイズ）およびζポテンシャルを表１に要約する。−４．１から−５．７ｍＶの範囲のζポテンシャルについてのパラメーターが細胞膜結合およびナノ粒子内部移行と適合性である他のナノ粒子について報告されている(ローレンツ・エムアール(Lorenz MR)ら、2006年発行、Biomaterials 27,2820、ウィルヘルム・シー(Wilhelm C)ら、2003年発行、Biomaterials.24,1001)。
【０１３２】
実施例１３
Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）およびＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＡＯＮの両方を保持するリードナノバイオポリマー（Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ））は、インビトロで乳がん細胞の成長を阻害した
抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＡＯＮおよびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の投与後の乳がん細胞成長阻害を最初に調査した。実験の最適化に基づいて、４μＭ  Ｅｎｄｏｐｏｒｔｅｒ（インビトロ  ＡＯＮ送達剤、ＧｅｎｅＴｏｏｌｓ）を含む４μＭでの各ＡＯＮおよび４０μｇ／ｍｌでのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を分析した。図２の結果はＨＥＲ２／ｎｅｕ高発現細胞ＢＴ−４７４およびＳＫＢＲ−３について、ならびに低発現細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５について示す。使用した濃度では、遊離ＡＯＮおよびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）のそれぞれがＨＥＲ２／ｎｅｕ高発現細胞においていくらかの成長阻害をもたらすことが観察された。低発現細胞株は、これらの処置に有意に低い反応性であることが観察された。
【０１３３】
次いでこれらのナノバイオポリマーコンジュゲート（図１に示す二薬物化合物および単一薬物化合物）を腫瘍細胞成長阻害効果について検査した。ナノバイオポリマー、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）および遊離ＡＯＮは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ高発現細胞においてＰＢＳ対照と比較して有意な成長阻害を生じた（図２上、Ｐ＜０．０１）。リード２種薬物化合物は、検査した他のナノバイオポリマーよりも有意に高く、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）よりも高い、最強の阻害作用をもたらした（全ての群と比較してＰ＜０．０５）。ＨＥＲ２／ｎｅｕ低発現細胞においては、ＡＯＮ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）およびＴｆＲ（Ｍ）を含むリード化合物だけがＰＢＳと比較して統計的に有意な腫瘍成長の阻害を誘導できた（図２下、Ｐ＜０．０２）。
【０１３４】
実施例１４
リード化合物は、インビトロでＨＥＲ２／ｎｅｕおよびｐ−Ａｋｔの発現を阻害し、ＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現乳がん細胞のアポトーシスを誘導する
ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）およびその下流標的、セリン／トレオニン／キナーゼＡｋｔは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性乳がん細胞成長および増殖においてならびにＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の抗腫瘍作用において重要な役割を演じる(セング・ピーエイチ(Tseng PH)ら、2006年発行、Mol Pharmacol.70,1534、ヤケ・エフエム(Yakes FM)ら、2002年発行、Cancer Res.62,4132)。ＨＥＲ２／ｎｅｕシグナル伝達は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲカスケードを活性化でき、活性化されたＡｋｔは細胞サイズ、代謝および生存期間の増加を促す(プラス・ディーアール(Plas DR)ら、2005年発行、Oncogene 24,7435)。
【０１３５】
したがって、リードナノバイオポリマーの増強された成長阻害効果に関与する機構を調査するために、関連するシグナル伝達マーカーＨＥＲ２／ｎｅｕ、Ａｋｔおよびｐ−Ａｋｔの発現およびリン酸化への薬物効果を評価した。
【０１３６】
ＨＥＲ２／ｎｅｕ高発現細胞株ＢＴ−４７４およびＳＫＢＲ−３を用いた（図３パネルＡ）。ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＡＯＮおよびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の両方を保持しているナノバイオポリマーがアポトーシスを誘導するかどうかを決定するために、ＰＡＲＰ切断をウエスタンブロット分析によって調査した。
【０１３７】
ＨＥＲ２／ｎｅｕ高発現細胞株においてＨＥＲ２／ｎｅｕ発現は、対照と比較してＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、ＡＯＮおよびナノバイオポリマーの単一薬物バージョン［Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＨｅｒｃｅｐｔｉｎおよびＰ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／ＴｆＲ（Ｈ／Ｍ）］のそれぞれによって異なる程度に阻害された。ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現の最も強い阻害は、ＰＭＬＡ担体分子に結合したＡＯＮおよびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を有するリードナノバイオポリマーでの処置において観察された。
【０１３８】
ｐ−Ａｋｔ、ＨＥＲ２／ｎｅｕシグナル伝達の鍵となる下流メディエーター(セング・ピーエイチ(Tseng PH)ら、2006年発行、Mol Pharmacol. 70,1534)の発現は、ＰＢＳまたはＡＯＮ形質導入試薬エンドポーターで処置した対照細胞と比較してＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、ＡＯＮまたはナノバイオポリマーの単一薬物バージョンで処置した腫瘍細胞において異なる程度に阻害された。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）およびＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＡＯＮの両方を保持しているリード薬物での両乳がん細胞株の処置におけるｐ−Ａｋｔシグナルは、任意の他の薬剤での処置と比較して顕著に低いことが観察された（図３パネルＢ）。ウエスタンブロットでの総Ａｋｔの量はそれぞれの処置によって変化しないままであった。
【０１３９】
ＰＡＲＰ切断によって評価したアポトーシスは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、ＡＯＮおよび単一薬物ナノバイオポリマーのそれぞれによってＨＥＲ２／ｎｅｕ高発現細胞（例えばＢＴ−４７４細胞株）においてある程度誘導された。意味深いことにリード化合物、Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）は、他の薬剤と比較して増加したＰＡＲＰ切断によって示されるとおり両方の細胞株において他の薬剤よりも大きな程度でアポトーシスの引き金を引いた（図３パネルＢ）。
【０１４０】
実施例１５
リード化合物、Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）は、インビボでＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現乳房腫瘍において特異的に蓄積する
インビボでの画像処理研究は、同じＰＭＬＡ分子上に組合せた抗マウスＴｆＲおよび抗ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕを有するリード化合物Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）が、宿主内皮系を通じて皮下ヒト乳房腫瘍への腫瘍特異的薬物送達を提供したことを示した。薬物注射の２４時間後、化合物が主に腫瘍ならびに排出器官、腎臓および肝臓に蓄積することが観察された（図４）。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）だけを有するナノバイオポリマーは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、ＡＯＮおよび抗ＴｆＲｍＡｂを有するバージョン（リード薬物）よりも腫瘍により低い程度で蓄積した。これらのデータは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）と比較して抗ＴｆＲ  ｍＡｂでの腫瘍脈管構造の増強された標的化を示す。ＩｇＧを有する対照ナノバイオポリマーは、ごく少量の腫瘍蓄積を示した（図４）。
【０１４１】
共焦点顕微鏡観察を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０標識薬物の静脈注射の２４時間後に除去した脳腫瘍の切片について実施した。対照コンジュゲートＰ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＩｇＧについてよりもＰ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）について腫瘍細胞における顕著に強いシグナルが観察され、最も高い腫瘍蓄積は、他のナノバイオポリマーと比較してリード化合物で観察された（図５）。
【０１４２】
実施例１６
リード化合物Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）はインビボでＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性乳房腫瘍成長を顕著に阻害する
ヒト乳房腫瘍異種移植の皮下マウスモデルにおける本明細書の組成物の静脈投与後の治療効果を調査した。細胞株ＢＴ−４７４を、そのＨＥＲ２／ｎｅｕ高発現および腫瘍原性により、インビボ分析のために選択した。ＢＴ−４７４腫瘍保有マウスのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、単一薬物ナノバイオポリマーおよびリード化合物Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）での処置を実施し、陰性対照ＰＢＳと比較した。体重または罹患率および死亡において増加は観察されず、各処置が十分許容されたことを示していた。
【０１４３】
各化合物は、６回の処置後（腫瘍移植の２１〜３８日後から）および５６日目までの追跡中に腫瘍成長を阻害した（図６パネルＢ）対照未コンジュゲートＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は、ＰＭＬＡ結合Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）と同様の腫瘍成長阻害を時間の関数として示した。これら両薬物は、ＰＭＬＡに結合したＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＡＯＮよりもいくらか強い効果を作りだした（図６パネルＢ）。この効果は、これらの単一薬物化合物の３種全てについて有意であった（対ＰＢＳ  Ｐ＜０．０３）。１つのナノバイオポリマー上で組み合わされたＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）およびＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＡＯＮの両方を有する化合物は、単一薬物処置と比較して明確な相乗効果を伴って腫瘍成長の最も高い程度の阻害を示した（図６パネル、対ＰＢＳ  Ｐ＜０．００１、対他の処置群  Ｐ＜０．０３）。Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）での処置後に観察された腫瘍退縮は、追跡開始時の８０％から期間の最後での９５％までであった（５６日目、図６パネルＢ）。さらにこのリード化合物で処置した群における腫瘍は、最初の処置後２週間以内に退縮し始め、この群の腫瘍は処置が終了した時点まで、さらに２０日間抑制されたままであった。
【０１４４】
ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）またはＰ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／ＴｆＲ（Ｈ／Ｍ）のそれぞれで処置された腫瘍がＰＢＳ（対照）処置腫瘍と比較していくつかの細胞死領域を示したことを明らかにした。意味深いことにリード化合物での処置は、影響を受けていない腫瘍組織がわずかに残ったままで広範囲の形態的壊死性領域の出現を導いていた（図６パネルＡ）。
【０１４５】
この抗腫瘍効果の機構を、さまざまな処置後の皮下ＢＴ−４７４乳房腫瘍の可溶化物を用いるウエスタンブロット分析によってさらに調査した。腫瘍ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現は、ＰＢＳ対照と比較してＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、ＡＯＮおよびＰＭＬＡナノバイオポリマーの単一薬物バージョン［Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）およびＰ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／ＴｆＲ（Ｈ／Ｍ）］のそれぞれによって部分的に阻害された（図６パネルＣ）。リード化合物Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍発現の最も高い阻害を生じ、インビトロウエスタンブロット分析と一致した。リン酸化Ａｋｔも薬物処置後に減少した。再度リード薬物Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）が、わずかなｐ−Ａｋｔシグナルが観察されたままで最も明白な減少を生じた（図６パネルＣ）。インビトロ実験においてと同様に総Ａｋｔは、処置において変化しないままであった。
【０１４６】
ＰＡＲＰ切断によって評価されたアポトーシスは、ＰＢＳ処置と比較してＨＥＲ２／ｎｅｕ高発現腫瘍において各化合物によってある程度誘導された。意味深いことにリードＰ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）は、他の処置と比較してＰＡＲＰ切断を顕著に増加させ、このナノバイオポリマーが用いた他の薬物と比較してより大きな程度アポトーシスを誘導したことを示している（図６パネルＣ）。
【０１４７】
実施例１７
ナノバイオポリマーコンジュゲートは、インビボで三種陰性乳がん成長を顕著に阻害した
表２のそれぞれの化合物の静脈投与後の潜在的治療効果をヒト三種陰性乳がん（ＴＮＢＣ）異種移植の皮下マウスモデルを用いて調査した。細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８を、これらがエストロゲンおよびプロゲステロンの発現を欠いており、ＨＥＲ２タンパク質がこれらの細胞において正常に発現されることからインビボ分析のために選択した。ＴＮＢＣ腫瘍保有マウスの処置は、ラミニン−４１１のα４およびβ１サブユニットに特異的なＡＯＮを含有している単一薬物ナノバイオポリマーで、または上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）タンパク質に特異的なＡＯＮを含有している単一薬物ナノバイオポリマーで、またはＥＧＦＲタンパク質に特異的なＡＯＮとラミニン−４１１のα４およびβ１サブユニットに特異的なＡＯＮとを組合せた二薬物ナノバイオポリマーコンジュゲートで、表２に示す処置プロトコール計画を用いて陰性対照ＰＢＳと比較して実施した。
【０１４８】
【表２】
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【０１４９】
ＥＧＦＲに特異的なＡＯＮを保持している単一薬物ならびにＥＦＧＲに特異的なＡＯＮおよびラミニン−４１１のα４β１サブユニットに特異的なＡＯＮの両方を保持している二薬物化合物が、腫瘍細胞の移植後１９〜５２日の間に投与された６回の処置後に腫瘍成長を阻害したことが観察された（図７）二薬物化合物は、ＥＧＦＲに特異的なＡＯＮだけを保持している単一薬物化合物よりも強い治療効果を生じたことが観察され、データは単一薬物化合物および二薬物化合物のそれぞれについて統計的に有意であった（対ＰＢＳ、Ｐ＝０．１）。さらに８回処置の計画での投与は、腫瘍のより大きな退縮について６回処置より有効であることが観察された。
【０１５０】
実施例１８
ナノバイオポリマーの利点
ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現乳がん治療に特に適合したナノバイオポリマーコンジュゲートのセットを設計し、インビトロおよびインビボで検査した。薬物は、特異的ＡＯＮでＨＥＲ２／ｎｅｕの合成をおよびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）への結合による受容体の内部移行を同時に遮断することによるＨＥＲ２／ｎｅｕ阻害に基づいた。次いで、ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現および機能をより効果的に阻害するためにリード薬物Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）を設計した。インビトロデータは、リード薬物Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）が、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）またはＰ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／ＴｆＲ（Ｈ／Ｍ）よりもＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性乳がん細胞株の増殖を実際に抑制することを示した（図２）。驚くべきことにリードナノバイオポリマーは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ高発現および低発現ＨＥＲ２／ｎｅｕ乳がん細胞株の両方について有効であった。ＨＥＲ２／ｎｅｕ低発現細胞に関してリード薬物は、以前用いられインビトロでそれらの成長を阻害しなかったＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＡＯＮよりも優れていた(ロー・エイチ(Roh H)ら、2000年発行、Cancer Res.60:560)。さらにＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）およびＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＡＯＮの両方を保持しているリード薬物は、他の処置と比較してＨＥＲ２／ｎｅｕ発現およびＡｋｔリン酸化の両方の最も高い阻害および増強された腫瘍細胞アポトーシスをもたらした。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ分解またはＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体のエンドサイトーシス破壊もしくはＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達の下方制御のいずれかを促進することによって(クラーク・エーエス(Clark AS)ら、2002年発行、Mol Cancer Ther 1,707-17)、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体二量体化を阻害することによっておよび免疫活性化を誘導することによっても(ヒューディス・シーエー(Hudis CA)、2007年発行、N Engl J Med 357,39)、ＨＥＲ２陽性細胞において抗増殖効果を媒介する。
【０１５１】
本明細書の実施例は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）およびＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＡＯＮの両方を保持しているリード薬物の腫瘍細胞へのインビトロ成長阻害効果が、ＨＥＲ２／ｎｅｕ合成のＡＯＮ媒介同時阻害によっておよびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）への結合を通じた表面ＨＥＲ２／ｎｅｕの下方制御によって増強されたことを示す。この場合のＡｋｔリン酸化のより強い阻害は、ＨＥＲ２／ｎｅｕシグナル伝達の顕著な減衰から生じうる。
【０１５２】
本明細書の実施例においてリード薬物Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）は、ヌードマウスにおける乳房腫瘍に直ちに蓄積し、ヒト乳がん成長を劇的に阻害することが観察された（図６）。重要なことにこのリード薬物の抗腫瘍効果の規模は、インビボでＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＡＯＮとＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）との間の相乗効果を示した（図６）。それに対し高ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現細胞におけるほぼ完全なインビボ阻害とは対照的にインビトロ効果は、約５０％成長阻害を示した。いかなる具体的な理論および作用機構によって限定されることなくインビボでの相乗的抗腫瘍作用は、いくつかの効果の組合せ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を伴うＡＯＮによるＨＥＲ２／ｎｅｕ媒介腫瘍成長における低下の増強、ＥＰＲ効果(マエダ・エイチ(Maeda H)ら、2009年発行、Eur J Pharm Biopharm 71,409)と抗体での活性標的化(ジュビモバ・ジェイワイ(Ljubimova JY)ら、2008年発行、Chem Biol Interact 171,195)とを組合せることによって媒介される優先的腫瘍蓄積、ならびに複数回処置による有効薬物濃度の維持）から生じうる。異種移植片ＢＴ−４７４腫瘍に対して同様に有効であった(ロー・エイチ(Roh H)ら、2000年発行、Cancer Res. 60,560)以前用いられたドキソルビシンを伴うＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＡＯＮの組合せと比較して、本明細書のナノバイオポリマーコンジュゲートは、有毒なドキソルビシンの欠如ならびにＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）および抗ＴｆＲを介した効果的な腫瘍標的化のために副作用がないことが想定される。
【０１５３】
本明細書の実施例は、リードナノバイオポリマーＰ／ｍＰＥＧ／ＬＯＥｔ／ＡＯＮ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＴｆＲ（Ｍ）が、ＨＥＲ２／ｎｅｕおよびＡｋｔリン酸化の両阻害を介してＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性乳房腫瘍成長を効果的に遮断し、結果として増強された腫瘍細胞アポトーシスを促進したことを確認した。ナノバイオポリマーの特質の組合せは、腫瘍組織および腫瘍細胞内部における特異性の高い薬物蓄積をもたらした。
【０１５４】
実施例１９
乳がんを治療するための薬物の組合せのためのナノバイオポリマープラットホーム
本明細書のナノバイオポリマー組成物は、機能的モジュール（抗体、薬物またはＡＯＮ単独または組合せ）の少なくともいずれか１つを含むように操作されうる。この特徴により、本明細書のナノバイオポリマーコンジュゲートは、具体的な腫瘍細胞に典型的なさまざまな分子腫瘍マーカーを同時に標的化するために適合されたナノ薬物であり、したがって種々の腫瘍に対して非常に効果的である。
【０１５５】
より効果的ながん治療のために、本発明のナノバイオポリマーコンジュゲートは、次の群、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２受容体タンパク質を標的化するチロシンキナーゼ阻害物質ラパチニブ、ＨＥＲ２受容体に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ペルツズマブ、ＨＥＲ２およびＦ(γＲＩ／ＩＩＩに対して特異的な二重特異性抗体エルツマキソマブ、ＨＥＲ２に対して特異的なｍＡｂ−毒素トラスツズマブ−ＤＭ１、ＩＦＧ−１Ｒに対して特異的なｍＡｂ  ＣＰ−７５１，８７１、ＭＥＴおよびＶＥＧＦＲを標的化するチロシンキナーゼ阻害物質フォレチニブ（ＧＳＫＩ３６０８９）、ｍＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ経路のＢＥＺ２３５標的化タンパク質、Ａｋｔ経路標的化ペリフィストン、ｍＴＯＲ標的化テムシロリムス、ｍＴＯＲ標的化エベロリムス、ＨＥＲ２ペプチドをベースとするワクチン、ＨＥＲ２に特異的なｍＡｂ脱フコシル化トラスツズマブ、サイトゾルｃ−ＳＲＣおよびＡＢＬ１キナーゼならびにＲＴＫ  ｃ−ＫＩＴならびに血小板由来成長因子受容体アルファおよびベータを標的化する小分子チロシンキナーゼ阻害物質ダサチニブ、さらにＥＧＦＲの阻害物質ゲフィチニブおよびエルロチニブから選択された１つまたは複数の抗悪性腫瘍薬に共有結合的に連結される。これらのナノ薬物およびナノ薬物組合せがヒト患者を含む対象でのインビボにおけるがん細胞の治療のために有効であることが想定される。
【０１５６】
ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現がん細胞および／または三種陰性がん細胞の治療のために用いられるナノバイオポリマーに基づく治療は、重要な臨床的影響をもたらす。
【０１５７】
次の特許請求の範囲は、単なる例示であり、さらなる限定として解釈されない。当業者は、実施例および特許請求の範囲から、本明細書中の本発明の範囲内である多数の均等物を容易に決定する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2014504591.tif 000012
【図６Ｃ】
2014504591.tif 000013
【図７】
2014504591.tif 000014
【配列表】
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【国際調査報告】
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