(57)【要約】  医療用複合生体素材に係り、更に詳細にはコラーゲン及びヒアルロン酸誘導体を含む医療用複合生体素材に係り、該生体素材及び哺乳類の臍帯由来幹細胞を利用した軟骨細胞治療剤に係り、該生体素材は免疫反応を引き起こさず、耐久性に優れ、かような生体素材と幹細胞とを含んだ軟骨細胞治療剤は関節鏡を利用した施術が可能であり、患者の苦痛を低減させるだけではなく、効果的に退行性関節炎及び軟骨損傷を治療することが可能である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン、及びヒアルロン酸またはその誘導体を含む組成物。
【請求項２】
上記コラーゲンは哺乳類由来コラーゲンであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上記哺乳類由来コラーゲンはヒト臍帯由来コラーゲンであることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
上記ヒト臍帯由来コラーゲンはＩ型コラーゲンであることを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
上記ヒアルロン酸誘導体はヒアルロン酸をＢＤＤＥを使用して架橋化して製造したことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物を含む医療用複合生体素材。
【請求項７】
幹細胞、コラーゲン、及びヒアルロン酸またはその誘導体を含む軟骨細胞治療剤。
【請求項８】
上記幹細胞は哺乳類由来の幹細胞であることを特徴とする請求項７に記載の軟骨細胞治療剤。
【請求項９】
上記哺乳類由来の幹細胞は臍帯由来幹細胞であることを特徴とする請求項８に記載の軟骨細胞治療剤。
【請求項１０】
上記コラーゲンは哺乳類の臍帯から収得したことを特徴とする請求項７に記載の軟骨細胞治療剤。
【請求項１１】
上記幹細胞は哺乳類の臍帯抽出物を含んだ幹細胞培養培地を利用して、細胞付着タンパク質でコーティングされた容器で培養して製造されたことを特徴とする請求項７に記載の軟骨細胞治療剤。
【請求項１２】
上記幹細胞培養培地は血清を含まないことを特徴とする請求項１１に記載の軟骨細胞治療剤。
【請求項１３】
上記細胞付着タンパク質は哺乳類臍帯由来コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン及びポリ−Ｄ−リシンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１１に記載の軟骨細胞治療剤。
【請求項１４】
上記ヒアルロン酸誘導体はヒアルロン酸またはＢＤＤＥを使用して、架橋化して製造されたことを特徴とする請求項７に記載の軟骨細胞治療剤。
【請求項１５】
上記ヒアルロン酸またはその誘導体と、上記コラーゲンとの組み合わせ比率は３：１ないし１：３であることを特徴とする請求項７に記載の軟骨細胞治療剤。
【請求項１６】
上記ヒアルロン酸またはその誘導体は１％ないし３％であることを特徴とする請求項１５に記載の軟骨細胞治療剤。
【請求項１７】
上記コラーゲンは１％ないし３％であることを特徴とする請求項１５に記載の軟骨細胞治療剤。
【請求項１８】
上記哺乳類の臍帯由来幹細胞は１．０×１０６ないし１×１０８cells／ｍｌの濃度で、ヒアルロン酸誘導体と、哺乳類の臍帯由来コラーゲンゲルと混合することを特徴とする請求項７に記載の軟骨細胞治療剤。
【請求項１９】
上記軟骨細胞治療剤はヒドロゲル状であることを特徴とする請求項７に記載の軟骨細胞治療剤。
【請求項２０】
請求項７に記載の軟骨細胞治療剤を含む軟骨治療用注射剤用組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の軟骨治療用注射剤用組成物を患者に投与する段階を含む損傷された軟骨を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はコラーゲン、ヒアルロン酸誘導体を含む生体素材、更に臍帯由来幹細胞を含む軟骨細胞治療剤を提供することに関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは人体で最もありふれたタンパク質であり、哺乳類でも最も多いタンパク質である。全タンパク質のうち、およそ２５〜３５％を占める。特に、骨、筋、靭帯を構成する主な成分であり、主に臓器の構造を維持する役割を行う。コラーゲンは牛や豚の皮膚から容易に抽出できる。一方、動物から由来したコラーゲンは人体に適用する場合、免疫反応に関する問題が残っている。
【０００３】
一方、ヒアルロン酸はコラーゲンと違い、バクテリアから哺乳類までの種間で化学構造の差異がないため、抗原として作用しない。それ故、ヒアルロン酸はコラーゲンを代替するフィラー物質として開発されている。ヒアルロン酸は全ての種で同一の構造を有するので、コラーゲンフィラーの問題点であった免疫反応が少ないという長所がある。
【０００４】
ヒアルロン酸は体内で２つの経路で分解される。その一つはヒアルロニダーゼ（hyaluronidase）による分解であり、もう一つは細胞受容体（cell receptor）に付着後、細胞内で貪食され、リソソーム（lysosome）内の酵素による分解である。ヒアルロン酸の生分解は非常に早く、半日から数日以内で分解が終了すると知られている。経時的に体内で分解されるため、その効果を長続きさせるのに制限がある。
【０００５】
一方、軟骨組織は他の組織とは違い、神経及び血管が存在しない。従って、一度損傷されると、自ら再生できない組織である。それ故、従来の治療方法として人工関節手術、微細穿孔術（microfracture）、モザイクプラスティー（mosaicplasty）方法などの外科的手術が挙げられた。しかしながらながら、このような方法は移植した人工関節の１０年前後の耐久性や手術による二次感染などの問題が残存するため、完治が至難であった。
【０００６】
最近、組織工学及び再生医学の研究が発展するに伴い、ヒト細胞を利用した完全な軟骨組織の再生を目指す軟骨細胞治療剤が開発された（特許文献１）。従来の軟骨細胞治療剤は自家軟骨細胞治療である。 自家軟骨細胞治療法の手順は以下の通りである。患者自身の軟骨組織を一部採取し、体外で４週間ほど大量培養する。患部をきれいに整理した後、患者の脛骨から骨膜（periosteum）組織を採取し、軟骨部位に覆って縫合し、損傷された軟骨部位の空間に培養した細胞を懸濁された状態で移植する。細胞が流れ出さないように、縫合された部位にフィブリン糊（fibrin glue）を塗布する。
【０００７】
しかしながら、この方法は損傷された部位が大きい場合、培養された細胞だけでは治療し難いという限界がある。更に、体重によって患部が押されて細胞が漏れ出し、組織再生が予想通りに行われない短所が存在する。
【０００８】
このような問題点を克服し、効果的な生体材料及び軟骨治療剤を開発する途中、免疫反応が少なく、効能が長く持続する新たな生体材料を開発した。そこに幹細胞を混合させると軟骨治療剤として利用できることが確認され、本発明の完成に至った。更に、架橋化されているヒアルロン酸誘導体とコラーゲンを混ぜたマトリックスで幹細胞を培養するとき、ヒアルロン酸誘導体及びコラーゲン複合体の膨潤及び収縮が起こらない、つまり、体積の変化がない最適の混合比率を見出し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＫＲ１０−２０１０−００８４１４２Ａ公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的はコラーゲン、及びヒアルロン酸またはその誘導体を含む組成物、並びにそれを含む生体用組成物を提供するものである。
【００１１】
本発明の他の目的はコラーゲン、及びヒアルロン酸またはその誘導体、並びに幹細胞を含む軟骨細胞治療剤の提供である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の問題を解決するため、本発明はコラーゲン、及びヒアルロン酸またはその誘導体を含む組成物を提供する。
【００１３】
また、上記の問題を解決するため、本発明は上記の組成物を含む医療用複合生体素材を提供する。
【００１４】
また、上記の問題を解決するため、本発明は幹細胞、コラーゲン、及びヒアルロン酸またはその誘導体を含む軟骨細胞治療剤を提供する。
【００１５】
また、上記の問題を解決するため、本発明は上記の軟骨細胞治療剤を含む軟骨治療用注射剤用組成物を提供する。
【００１６】
また、上記の問題を解決するために、本発明は上記の軟骨治療用注射剤用組成物を患者に投与する段階を含む損傷された軟骨を治療する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の医療用複合生体素材は人間の皮膚組織と類似した組成、即ち、ヒトコラーゲンとヒアルロン酸誘導体とを含むことにより、ヒト細胞に対する親和度が非常に優れる。また、関節鏡を利用するため、外科的手術を使わず、簡単に施術できる。つまり、損傷された軟骨組織部位に注入式で容易に移植ができ、ゲル化された後で固定される。
【００１８】
本発明の軟骨細胞治療剤はヒドロゲル状であるが従来のヒアルロン酸のみを利用する支持体よりも分解される速度が遅いため、軟骨が再生される祭、外部の物理的、機械的な影響にもその形態維持ができ、優秀な治療効果が長期間持続するので、優れた軟骨細胞治療剤として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施例１の臍帯由来幹細胞の増殖能を示し、上記幹細胞の場合、２５回の継代培養が可能であり、およそ２０回の継代培養にわたって６０回の細胞分裂を行った。
【図２】実施例２の臍帯由来幹細胞において、胚芽幹細胞のマーカーがＲＮＡレベルで発現を示唆する結果である。
【図３】実施例３の臍帯由来幹細胞の継代培養による間葉系幹細胞マーカーを分析した結果である。ここでｘ軸は強度（intensity）、Ｙ軸は細胞数（カウント）であり、ｘ軸及びｙ軸の変化より、ＣＤマーカーが識別できる。
【図４】実施例３の臍帯由来幹細胞の継代培養による間葉系幹細胞マーカーを分析した結果である。継代培養２０回まで、間葉系幹細胞の特性であるＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６などの維持が確認でき、２５回目の継代培養に至ると幹細胞のマーカーを喪失している。
【図５】実施例４の臍帯由来幹細胞の分化能（軟骨、骨及び脂肪への分化）を示すイメージである。
【図６】実施例５及び実施例７で製造したマトリックスにおいて、コラーゲンとヒアルロン酸誘導体との比率による形態維持を観察した結果である。
【図７】実施例５及び実施例７で製造したマトリックスにおいて、コラーゲンとヒアルロン酸誘導体との比率による形態維持を観察した結果である。
【図８】実施例７で製造したマトリックスに臍帯由来幹細胞を混合して培養した場合、マトリックス内の細胞増殖及び生存率である。統制群であるコラーゲンのみ支持体より、ヒアルロン酸誘導体と臍帯由来コラーゲンを混合した実験群の増殖力と生存率がずっと高く維持されることを示唆する。
【図９】実施例７で製造したマトリックスに臍帯由来幹細胞を混合して培養した場合、マトリックス内の細胞増殖及び生存率である。統制群であるコラーゲンのみ支持体より、ヒアルロン酸誘導体と臍帯由来コラーゲンを混合した実験群の増殖力と生存率がずっと高く維持されることを示唆する。
【図１０】実施例８による臍帯由来幹細胞の生体内分化（マウス皮下）を表すイメージである。
【図１１】実施例８による臍帯由来幹細胞の生体内分化（マウス皮下）を多様な染色法を介して示したイメージである。
【図１２】ウサギ膝関節の軟骨に下骨部位まで損傷を与えた後、如何なる処理もしていない場合（non-treatment）、支持体だけを入れた場合（統制群）、及び臍帯由来幹細胞と支持体とを混合し、移植した場合（実験群）を８週後及び１６週後に比較した結果である。実験群軟骨の完璧な再生を表す示すイメージである。
【図１３】ウサギ膝関節の軟骨に下骨部位まで損傷を与えた後、如何なる処理もしていない場合（non-treatment）、支持体だけを入れた場合（統制群）、及び臍帯由来幹細胞と支持体とを混合し、移植した場合（実験群）を８週後及び１６週後に比較した結果である。実験群軟骨の完璧な再生を表す示すイメージである。
【図１４】実施例９による臍帯由来幹細胞と支持体の混合物が損傷された軟骨を再生させる効果（ウサギ関節）をＨ＆Ｅ染色法を介して示すイメージである
【図１５】実施例９による臍帯由来幹細胞と支持体の混合物が損傷された軟骨を再生させる効果（ウサギ関節）をＩＩ型コラーゲン染色法を介して示すイメージである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
別途の書述がない限り、本明細書において書かれた全ての技術的及び科学的用語は本技術分野で一般的に理解される意味と同様である。本明細書で使用された命名法は本技術分野で一般的に周知され、使用されるものである。
【００２１】
一様相は生体材料組成物を提供するものである。
【００２２】
一具体例で、コラーゲン、及びヒアルロン酸またはその誘導体を含む組成物を提供する。
【００２３】
上記コラーゲンは哺乳類由来コラーゲンであるがヒト臍帯由来コラーゲンが望ましい場合もある。更に、上記ヒト臍帯由来コラーゲンはＩ型コラーゲンでもある。上記哺乳類由来コラーゲンは従来技術により哺乳類の多くの組織から得られる。
【００２４】
特に、上記ヒト臍帯由来コラーゲンは過酸化水素で処理されたヒト臍帯組織を粉砕する段階と上記粉砕された臍帯組織を酢酸及びペプシンで処理した後、遠心分離する段階と上記遠心分離によって得た上澄液のｐＨを７に調整してＮａＣｌを添加し、コラーゲンを沈澱させる段階と上記沈澱されたコラーゲンを分離する段階を含むヒト臍帯由来コラーゲン製造方法によって製造される。
【００２５】
上記ヒアルロン酸誘導体は幹細胞を含んだ細胞治療剤の細胞伝達体として使用される生体適合性及び生分解性に優れるヒアルロン酸、またはその塩の誘導体を製造する方法によって製造される。その場合、上記ヒアルロン酸誘導体はマイクロ粒子（microparticle）形態でもある。
【００２６】
更に、上記ヒアルロン酸誘導体はヒアルロン酸またはブタンジオールグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ：１，４−butandiol diglycidyl ether）を使用して架橋化して得ることができる。また、そのように得た医療用目的のヒアルロン酸誘導体を粉砕し、μｍスケールに製造する方法によって製造される。
【００２７】
ヒアルロン酸は古くからその存在が知られており、自然に広く存在する生親和性（biocompatible）物質である。ヒアルロン酸は細胞外基質（ＥＣＭ：extracellular matrix）に必須な要素であるグリコサミノグリカン（glycosaminoglycan）であり、単量体であるＮ−アセチルグルコサミン（Ｎ−acetylglucosamine）とＤ−グルクロン酸（Ｄ−glucuronic acid）が連続的に連結された線形多糖類（linear polysaccharide）である。ヒアルロン酸は生体組織の基本構成成分で、細胞の形態形成、細胞分化、細胞分裂に必須な物質であり、傷を回復を補助する。ヒアルロン酸はエーテル結合を介するため、水溶液で不溶性ゲルでありながらも優秀な粘弾性と、高い水分吸収能を有する。それ故、生体内で一定期間は形体を維持するが後に分解され、体内吸収される。
【００２８】
天然ヒアルロン酸は体内への注入時、ヒアルロン酸分解酵素（hyaluronidase）によって早く分解されるので、分解速度を調節するため、様々な方法で架橋させたり、ベンジルアルコルなどの化学物質を利用して構造を変形させたヒアルロン酸誘導体を合成したりして使用する。
【００２９】
本発明の医療用複合生体素材において、ヒアルロン酸またはその塩は特別に制限されるものではなく、１％ないし５０％の濃度で０．１Ｎないし１０Ｎの塩基性水溶液に入れ、そこにヒアルロン酸またはその塩の反復単位（repeating unit）を基準に０．０１％ないし２００％の当量比ほど架橋剤を添加するが０．１％当量ないし５０％当量を添加し、ヒアルロン酸またはその塩と均質した状態で混合して製造することが望ましい。混合液を製造する時間は特別に制限されるものではなく、１時間ないし４８時間が望ましい。
【００３０】
上記２つ以上のエポキシ官能基を含む架橋剤は特別に制限されるのではないが望ましい例として、ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＧＥ：ethylene glycol diglycidyl ether）、ヘキサンジオールジグリシジルエーテル（１，６−hexanediol diglycidyl ether）、プロピレングリコールジグリシジルエーテル（propylene glycol diglycidyl ether）、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル（polypropylene glycol diglycidyl ether）、ポリテトラメチレングリコールジグリシジルエーテル（polytetramethylene glycol diglycidyl ether）、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル（neopentyl glycol diglycidyl ether）、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル（polyglycerol polyglycidyl ether）、ジグリセロールポリグリシジルエーテル（diglycerol polyglycidyl ether）、グリセロールポリグリシジルエーテル（glycerol polyglycidyl ether）、トリメチルプロパンポリグリシジルエーテル（tri-methylpropane polyglycidyl ether）、ビスエポキシプロポキシエチレン（１，２−（bis（２，３−epoxypropoxy）ethylene）、ペンタエリトリトールポリグリシジルエーテル（pentaerythritol polyglycidyl ether）及びソルビトールポリグリシジルエーテル（sorbitol polyglycidyl ether）のような化合物が挙げられる。
【００３１】
上記混合液を反応させた後、生理食塩水で洗浄して未反応物を除去し、粉砕機を利用し、マイクロスケールに粉砕した後、生理食塩水で洗浄を遂行する。洗浄された生成物を粉砕し、粒子サイズを調節し、０．５〜１０％、望ましくは１〜３％になるように濃度を調節する。その後、１００℃以上、望ましくは１２１℃以上で加圧滅菌し、最終的に生体に適用できるヒアルロン酸誘導体を製造することにより本発明の医療用複合生体素材組成物として使用できる。
【００３２】
上記架橋化されているヒアルロン酸誘導体は網構造を有しており、ヒドロゲルタイプである。もし、周辺の水分子に遭遇すると膨潤（swelling）してその体積が大きくなる。一方、ゼルタイブのコラーゲンはヒアルロン酸とは逆に、収縮（shrinking）して体積が小くなる。しかしながら、本発明で開発した方法によると、ヒアルロン酸またはヒアルロン酸誘導体がコラーゲンと特定比率で混合した組成物と幹細胞を混合して体外で培養すると膨潤及び収縮が起こらない。
【００３３】
上記ヒアルロン酸誘導体と哺乳類の臍帯由来コラーゲンとの組み合わせ比率は１：１０ないし１０：１であり、１：５ないし５：１でもあるが１：１ないし１：３が望ましい。また、上記哺乳類の臍帯由来幹細胞は１．０×１０４ないし１．０×１０１１cells／ｍｌでもあり、１．０×１０５ないし１．０×１０９cells／ｍｌでもあるが１．０×１０６ないし１×１０７cells／ｍｌの濃度が望ましく、ヒアルロン酸誘導体と哺乳類の臍帯由来コラーゲンゲルとを混合することができる。
【００３４】
本発明の医療用複合生体素材を人体内部に移植すれば、周辺人体組織の細胞が上記医療用複合生体素材内部に移動する。移動した細胞が細胞外基質を分泌し、上記医療用複合生体素材成分が分解されても、上記細胞外基質によって所望の効果が持続する。これは従来技術から全く予測することができない結果である。
【００３５】
他の様相は幹細胞、コラーゲン、及びヒアルロン酸またはその誘導体を含む軟骨細胞治療剤を提供するものである。
【００３６】
本発明の軟骨細胞治療剤において、上記幹細胞は哺乳類由来でもある。上記哺乳類の臍帯由来幹細胞は哺乳類の臍帯抽出物を含み、哺乳類の臍帯由来幹細胞の分離用または培養用の培地組成物を含み、細胞付着タンパク質（cell adhesion protein）でコーティングされた容器で連続的に継代培養を遂行して製造される。その時、上記幹細胞培養培地は血清を含まない。
【００３７】
また、上記哺乳類の臍帯由来幹細胞（ｉ）は哺乳類の臍帯抽出物を含むが血清を含まない哺乳類の臍帯由来幹細胞分離用または培養用の培地組成物を含む。また、細胞付着タンパク質でコーティングされた容器に血液が除去されて細切りにされた哺乳類の臍帯組織を入れて培養する段階（ｉｉ）と上記培養後、幹細胞分離酵素を含む培地で処理し、哺乳類の臍帯由来幹細胞を分離する段階を含む哺乳類の臍帯からの幹細胞分離方法によって製造される。また、上記哺乳類はヒト、豚、馬、牛、マウス（mouse）、ラット（rat）、ハムスター、ウサギ、ヤギまたは羊でもある。
【００３８】
また、上記哺乳類の臍帯抽出物（ｉ）は細切りにされた臍帯を緩衝液に入れて撹拌する段階（ｉｉ）と上記段階（ｉ）で得られた溶液の上澄液を回収する段階を含む哺乳類の臍帯抽出物製造方法によって製造される。
【００３９】
上記哺乳類の臍帯からの幹細胞分離方法において上記段階（ｉｉ）の幹細胞分離酵素はコラゲナーゼでもあるがＩ型コラゲナーゼが望ましい。上記段階（ｉｉ）で、上記Ｉ型コラゲナーゼが１８０Ｕ／ｍｌないし２２０Ｕ／ｍｌ含まれ、２時間ないし６時間処理される。また、上記段階（ｉｉ）は上記段階（ｉ）開始後、１日後ないし１０日後に遂行される。
【００４０】
また、上記細胞付着タンパク質は哺乳類臍帯由来コラーゲン、ゼラチン（gelatin）、フィブロネクチン（fibronectin）、ラミニン（laminin）またはポリ−Ｄ−リシン（poly-D-lysin）でもあるがそれらに制限されるものではない。更に、上記哺乳類の臍帯由来幹細胞はヒト臍帯由来幹細胞でもある。
【００４１】
本発明の軟骨細胞治療剤において、上記コラーゲンは哺乳類の臍帯から収得されるものでもある。上記コラーゲンは多様な方法によって収得される。しかしながら、上記哺乳類の臍帯由来コラーゲンは過酸化水素で処理された哺乳類の臍帯組織を粉砕する段階と上記粉砕された臍帯組織を酢酸及びペプシンで処理した後、遠心分離する段階と上記遠心分離によって得た上澄液のｐＨを７に合わせ、ＮａＣｌを添加してコラーゲンを沈澱させる段階と上記で沈澱されたコラーゲンを分離する段階を含む哺乳類の臍帯由来コラーゲン製造方法による製造が望ましい。
【００４２】
本発明の軟骨細胞治療剤において、上記ヒアルロン酸誘導体は幹細胞を含んだ細胞治療剤の細胞伝達体として使用される生体適合性及び生分解性に優れるヒアルロン酸またはその塩の誘導体を製造する方法によって製造される。その場合、上記ヒアルロン酸誘導体はマイクロ粒子状でもある。
【００４３】
更に、上記ヒアルロン酸誘導体はヒアルロン酸またはブタンジオールグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）を使用して架橋化し、医療用目的のヒアルロン酸誘導体を粉砕し、μｍサイズに製造する方法によって製造される。
【００４４】
本発明の軟骨細胞治療剤において、ヒアルロン酸またはその塩は特別に制限されるものではなく、１％ないし５０％の濃度で、０．１Ｎないし１０Ｎの塩基性水溶液に入れ、それに、ヒアルロン酸またはその塩の反復単位を基準に、０．０１％ないし２００％の当量比ほど架橋剤を添加し、望ましくは２０．１％当量ないし５０％当量を添加し、ヒアルロン酸またはその塩と均質した状態で混合して製造することが望ましい。混合液を製造する時間は特別に制限されるものではなく、１時間ないし４８時間が望ましい。
【００４５】
上記混合液を反応させた後、生理食塩水で洗浄して未反応物を除去し、粉砕機を利用して、マイクロスケールに粉砕した後、生理食塩水で洗浄を行う。洗浄された生成物を粉砕し、粒子サイズを調節し、１〜３％になるように濃度を調節した後、１００℃以上、望ましくは１２１℃以上で加圧滅菌し、最終的に生体に適用することができるヒアルロン酸誘導体を製造することにより、本発明の軟骨細胞治療剤組成物として使用することができる。
【００４６】
本発明の軟骨細胞治療剤において、上記ヒアルロン酸誘導体と上記コラーゲンとの組み合わせ比率は１：１０ないし１０：１でもあり、１：５ないし５：１でもあり、望ましくは１：１ないし１：３である。また、上記幹細胞は１．０×１０４ないし１．０×１０１１cells／ｍｌでもあり、１．０×１０５ないし１．０×１０９cells／ｍｌでもあり、望ましくは１．０×１０６ないし１．０×１０８cells／ｍｌの濃度で、ヒアルロン酸誘導体とコラーゲンゲルとを混合することができる。
【００４７】
本発明の軟骨細胞治療剤はヒドロゲル状の剤形を有することが望ましい。これにより、軟骨損傷部位に容易に注入することができる。また、上記軟骨細胞治療剤を含む軟骨治療用注射剤用組成物の形態に利用される。
【００４８】
用語「注射剤用組成物または注射剤用細胞治療剤」とは組織の欠陥を治療するために、幹細胞を含み、非経口投与、すなわち、注射の形態で、欠陥部位またはその隣接部位に注射され、欠陥を矯正することができる薬学組成物を意味する。
【００４９】
その剤形によって、必要な場合、懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫黄還元剤、酸化防止剤などを適切に添加することができる。
【００５０】
懸濁剤の例としてはメチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートなどを挙げることができる。
【００５１】
溶液補助剤としてはポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マクロゴール、ひまし油脂肪酸エチルエステルなどを挙げることができる。安定化剤としてはデキストラン４０、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ硫酸ナトリウムなどを挙げることができる。
【００５２】
等張化剤としては例えば、Ｄ−マンニトール、ソルビトールなどを挙げることができる。
【００５３】
保存剤としては例えば、パラオキシベンゾ酸メチル、パラオキシベンゾ酸エチル、ソーブサン、フェノール、クレゾール、クロロクレゾールなどを挙げることができる。
【００５４】
吸着防止剤としては例えば、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、酸化エチレン・酸化プロピレン共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリエチレングリコールなどを挙げることができる。
【００５５】
含硫黄還元剤としては例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、Ｃ１−Ｃ１７チオアルカン酸などのスルフヒドリル基を有するものなどを挙げることができる。
【００５６】
酸化防止剤としては例えば、エリソルブ酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピル、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウムなどのキレート剤を有することができる。
【００５７】
本発明による注射製品は患者の体質及び欠陥の種類によって、当業界に一般的に公知の分量を取って充填された注射状に製造される。
【００５８】
本発明による注射製品は治療する欠陥に隣接した部位または欠陥部位に注射されて利用される。
【００５９】
本発明の更に他の様相は上記軟骨治療用注射剤用組成物を患者に投与する段階を含む損傷された軟骨を治療する方法を提供するものである。
【００６０】
上記注射剤用組成物は患者の軟骨損傷部位に直接注入され、損傷された軟骨損傷近辺に注入される。特に、損傷された軟骨部位の外科的手術なしに、関節鏡を利用して施術することができる。
【００６１】
以下、下記実施例または図面を挙げて、本発明について更に具体的に説明する。しかしながら、以下の実施例または図面に係わる説明は本発明の具体的な実施例を特定して説明するものに過ぎず、本発明の内容はそこに記載された内容に限定されたり、あるいは本発明の権利範囲を実施例の範囲に制限解釈しようと意図するものではない。
【実施例】
【００６２】
＜実施例１＞臍帯幹細胞の分離能及び増殖能の分析
本研究に使用された臍帯は正常産婦の分娩後、捨てられる臍帯を産婦の同意下に採取して使用した。採取後２４時間内に実験に使用した。
【００６３】
臍帯外部の血液をＣａ２＋とＭｇ２＋とが含まれていないＤＰＢＳで除去した組織の外部羊膜を剥がして動脈２本を除去した後、１ｍｍ３サイズで切った後、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（penicillin）、０．１μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（streptomycin）、臍帯抽出物０．２μｇ／ｍＬが含まれたα−ＭＥＭ（minimum essential medium）に入れて７日間培養した後、底に付着した細胞が見え始めれば、５００Ｕ／ｍｌのＩ型コラゲナーゼ（collagenase type Ι）が含まれたα−ＭＥＭを４時間処理して細胞を分離した。その後、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、０．１μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、臍帯抽出物０．２μｇ／ｍＬが含まれたα−ＭＥＭに、培養皿１ｃｍ２当たり２×１０３の細胞を臍帯由来コラーゲンがコーティングされた培養容器に接種し、３７℃温度で、５％のＣＯ２が供給される培養器内で培養した。１週に３回培養液を交換し、培養容器の７０％から８０％ほどに細胞が育てば、０．１２５％のトリプシン（trypsin）と、１ｍＭのＥＤＴＡとを３分間処理して細胞を取り離した後、培養皿１ｃｍ２当たり２×１０３の細胞を入れ、５％のＣＯ２が供給される培養器内で培養した。
【００６４】
＜実施例２＞ＲＴ−ＰＣＲを介した胚芽幹細胞マーカー確認
細胞ペレット（pellet）をＣａ２＋とＭｇ２＋とが含まれていないＤＰＢＳを利用して洗浄し、１ｍｌの細胞溶解緩衝液（lysis buffer）（ｉＮｔＲＯＮ Biotechnology）を添加した後、メーカー使用マニュアルによって、全てのＲＮＡ（total ＲＮＡ）を分離した。１μｇのＲＮＡはｃＤＮＡ合成キット（ｉＮｔＲＯＮ Biotechnology）を使用して、反応緩衝液（reaction buffer）、１ｍＭのｄＮＴＰ混合液（mixture）、０．５μｇ／μＬのoligo（ｄＴ）１５、２０ＵのＲＮＡ分解酵素阻害剤（ＲＮａｓｅ inhibitor）、２０ＵのＡＭＶ逆転写酵素（reverse transcriptase）が混合された２０μＬ反応溶液で逆転写させた。上記反応は４２℃で６０分間進められた。得られたＲＴ産物（ｃＤＮＡｓ）を２Ｘ ＰＣＲマスターミックス溶液キット（master mix solution kit）（ｉＮｔＲＯＮ Biotechnology）を使用して、１×のＴａｑ緩衝液、０．２５ＵのＴａｑ重合酵素（polymerase）、１０ｐＭのセンス（sense）とアンチセンス（antisense）との遺伝子特異的プライマー（gene-specific primers）が混合された１０μＬ反応溶液でＰＣＲを遂行した。増幅は全３２サイクル遂行し、各サイクルは９４℃で３０秒間の変性（denaturation）過程、３０秒間のアニーリング（annealing）過程、７２℃で３０秒間の伸張（extension）過程から構成された。反応終結後、ＰＣＲ生成物は２％アガロースゲル（agarose gel）に充填（loading）し、電気泳動を実施した。電気泳動後、臭化エチジウム（ethidium bromide）で染色し、紫外線を利用してＤＮＡの映像を得た。
【表１】
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【００６５】
＜実施例３＞ＦＡＣＳ分析を介した間葉系幹細胞マーカーの発現分析
分離された細胞の特性を分析するために、柔細胞分析法を遂行した。柔細胞分析のために、細胞をＰＢＳを使用して洗浄した後、トリプシン−ＥＤＴＡを処理し、単一細胞群にした後、２％ＦＢＳと１ｍ ＭＥＤＴＡとが含有されたＰＢＳで洗浄する。その後、フルオレシンイソチオシアネート（ＦＩＴＣ：fluorescein isothiocyanate）またはフィコエリトリン（ＰＥ：phycoerythrin）が結合された幹細胞マーカーを処理し、アイスで２０分間反応させた後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（BectonD ickinson）を介して分析した。
【００６６】
＜実施例４＞臍帯幹細胞の分化能確認
＜４−１＞脂肪細胞への分化誘導
１ｃｍ２当たり２×１０３個の臍帯由来幹細胞を２４ウェルプレートに入れ、３日間培養した後、ＤＭＥＭに、１０％のＦＢＳ、１μＭのデキサメタゾン（dexamethasone）、０．５μＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（3-isobutyl-1-methylxanthine）、０．０５ｍｇ／Ｌのヒトインシュリン（human insulin）、２００μＭのインドメタシン（indomethacin）が含まれた分化培養液に交換した。そして、１週に３回培養液を交換した。３週培養後、オイルレッドＯ（Oil Red Ｏ）染色を行い、脂質が蓄積された脂肪細胞の存在いかんを観察した。
【００６７】
＜４−２＞骨細胞への分化誘導
１ｃｍ２当たり２×１０３の臍帯由来幹細胞を２４ウェルプレートに入れ、３日間培養した後、ＤＭＥＭに、１０％のＦＢＳ、０．１μＭのデキサメタゾン、１００ｍＭのβ−グリセロールホスフェート（β-glycerol phosphate）、５０μＭのアスコルビン酸−２−ホスフェート（ascorbic acid-2-phosphate）が含まれた分化培養液に交換した。そして、１週に３回培養液を交換した。３週培養後、ＡＬＰ染色を遂行した後、分化いかんを観察した。
【００６８】
＜４−３＞軟骨細胞への分化誘導
１ｃｍ２当たり２×１０３の臍帯由来幹細胞をコラーゲンゲルと混合し、培養皿に１００μｌずつ接種した後、３７℃インキュベータに１０分間静置し、コラーゲンがゲル化された後、ＤＭＥＭに、０．１μＭのデキサメタゾン、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸−２−ホスフェート、１００μｇ／ｍＬのピルビン酸ナトリウム（sodium pyruvate）、１０ｎｇ／ｍＬの転換成長因子−β３（transforming growth factor−β３）、５０ｍｇ／ｍＬのＩＴＳプラスプレミックス（ＩＴＳ plus premix）（各６．２５μｇ／ｍＬのインシュリン、トレンスフェリン（transferrin）、亜セレン酸（selenious acid）が含まれた分化培養液を添加して培養した。そして、１週に３回培養液を交換するが全体体積の半分だけ新たな培地に交換した。３週培養後、ＩＩ型コラーゲン（collagen type ＩＩ）染色を施行して分化いかんを観察した。
【００６９】
＜実施例５＞ヒアルロン酸誘導体の製造
０．２５Ｎ ＮａＯＨ溶液に、ヒアルロン酸ナトリウムを１００ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解させた。上記溶液に、ＢＤＤＥ（1,4-butanediol diglycidyl ether）を添加した。３０℃で３６時間反応させた後、生理食塩水で洗浄して未反応物を除去した。洗浄された生成物を粉砕し、粒子サイズを調節し、２０ｍｇ／ｍｌになるように濃度を調節し、ヒアルロン酸誘導体を製造した。
【００７０】
＜実施例６＞ヒト臍帯由来ヒューマンコラーゲンの製造
凍結された臍帯を常温で解凍させた。臍帯を１〜２ｃｍ長に切断した後、精製水で洗浄した。７０％エタノール溶液を処理した後、４時間から２４時間反応させた。精製水で洗浄した後、３％Ｈ２Ｏ２溶液処理を行い、４時間から１２時間ないし２４時間マグネチックバーを利用して撹拌した。精製水で２回以上洗浄し、０．５Ｍ酢酸溶液を入れ、ブレンダ（blender）と均質機（homogenizer）とを使用して組織を粉砕した。ペプシン処理を行い、４℃で２４時間反応させた。１０，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。
【００７１】
遠心分離後、ＮａＯＨを使用して、回収した上澄液のｐＨを７に合わせ、ペプシン酵素の活性を除去した。ｐＨを調整した溶液に、ＮａＣｌ処理を行い、ＮａＣｌが全て溶けるまで撹拌した後、４℃でコラーゲンが塩析されて沈澱されるように、１２〜２４時間静置を行った。１０，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間の遠心分離後、塩析されたコラーゲンペレットを分離し、限外濾過装置（ultrafiltration system）で脱塩及び濃縮を行った。最終的に、濾過方法で除菌し、凍結乾燥して保管した。製造されたコラーゲン溶液をヒドロキシプロリン（hydroxyprolin）分析法で定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して純度を確認した。
【００７２】
＜実施例７＞複合ヒドロゲル製造及び生体外（invitro）三次元培養
２％（ｗ／ｖ）ヒアルロン酸誘導体と、製造された３％（ｗ／ｖ）コラーゲンとの最適の混合比率を決定するために、多様な条件の体積比で、２つの物質と幹細胞細胞とを混合した後、細胞培養液内で体積の変化を確認した（図６及び図７）。複合ヒドロゲルの体積が培養時間が過ぎても変わっていない比率を選定した後、最終複合ヒドロゲルを製造した。
【００７３】
２つの物質の最適比率に選定されたヒドロゲルを製造した後、０．０５Ｎ ＮａＯＨ溶液に、ＮａＨＣＯ３とＨＥＰＥＳとを入れて作った緩衝溶液と、細胞とを混合し、培養容器に２０〜４０μｌずつ分周した。３７℃温度で５％のＣＯ２が供給される培養器に２０分間入れ、細胞が含まれたマトリックスが不透明になったことを確認した後、培地を入れて培養し、３日ごとに培地を交換した。
【００７４】
＜実施例８＞生体内分化能（マウスモデル）
実験用マウス（ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ Ｓｌｃ）はメスであり、生後５週齢になったもので実験を進めた。各実験群に、１０ｎｇのＴＧＦ−β３を添加し、１００μｌ皮下注射を施した後、４週後にサンプルを採取した。サンプルを４％中性緩衝ホルマリン（neutral buffered formalin）で固定した後、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ：hematoxylin ＆ eosin）、アルシアンブルー（Alcian blue）、サフラニン−Ｏ（Safranin−Ｏ）染色及びＩＩ型コラーゲン（type II collagen）免疫染色を介して軟骨化程度を観察した。
【００７５】
＜実施例９＞生体内効力試験（ウサギ関節モデル）
実験用ウサギ（New Zealand white rabbit）はメスであり、重さが３〜３．５ｋｇになったもので実験を進めた。ウサギに麻酔をかけた後、膝を切開し、膝骨軟骨部位に半径２．５ｍｍに、軟骨下骨部位まで損傷を与えた後、統制群として、何の処理も行っていない群、及び支持体のみを処理した群とした。実験群としては臍帯幹細胞と支持体とを共に移植して実験を進めた。８週後、１６週後にサンプルを採取し、４％中性緩衝ホルマリンで固定した後、ヘマトキシリン及びエオシン染色、ＩＩ型コラーゲン免疫染色を介して軟骨再生の効力を確認した。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明のコラーゲン及びヒアルロン酸誘導体を含む組成物はさまざまな用途の医療用複合生体素材に利用される。また、それらに、幹細胞を混合する場合、効果的な軟骨治療剤に利用される。現在軟骨治療は外科的治療がほとんどをなしているが本発明の組成物を利用する場合、外科的手術なしにも、効果的に軟骨治療が可能であるので、産業的利用可能性が非常に高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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