(57)【要約】本発明は、ヒトＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）の細胞外ドメインにあるエピトープに結合し、そして、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）ならびに／または胸腺および活性化制御ケモカイン（ＴＡＲＣ）のＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供する。特に、そのような抗体を含む免疫複合体および組成物、ならびに、特に医学分野および診断分野での、そのような抗体が関与する方法および使用もまた提供される。【選択図】図１ａ）
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）に結合し、そして、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）および／または胸腺および活性化制御ケモカイン（ＴＡＲＣ）のＣＣＲ４への結合を阻害することができ、そして、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの重鎖可変領域および３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶH）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶH）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号２０または３のアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶH）ＣＤＲ３
を含む抗体。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体であって、前記抗体の前記軽鎖可変領域が
（ｉｖ）配列番号２２、１７または４のアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶL）ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＶL  ＣＤＲ２；および
（ｖｉ）配列番号２４または６のアミノ酸配列を有するＶL  ＣＤＲ３
を含む抗体。
【請求項３】
請求項１〜２のいずれか１項に記載の抗体であって、
前記抗体が、配列番号３９の配列もしくはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を持つＶHドメイン、および／または、配列番号４０の配列もしくはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を持つＶLドメインを持つ抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体であって、前記抗体が完全にヒト抗体である抗体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体であって、前記抗体がＩｇＧ抗体、好ましくはＩｇＧ1抗体である抗体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体であって、前記抗体が変化したグリコシル化パターンを持ち、好ましくは、前記抗体のＦｃ領域に結合したＮ‐グリコシド結合複合型糖鎖全部の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または少なくとも９９％が、前記糖鎖の還元末端のＮ‐アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である、抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体であって、抗体の抗原結合断片、好ましくは、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、単一ドメイン抗体、ＴａｎｄＡｂｓダイマー、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ‐ｓｃＦｖ、Ｆｄ、直鎖型抗体、ミニボディ、ディアボディ、二重特異性抗体断片、バイボディ、トリボディ、ｓｃ‐ディアボディ、カッパ（ラムダ）ボディ、ＢｉＴＥ、ＤＶＤ‐Ｉｇ、ＳＩＰ、ＳＭＩＰ、ＤＡＲＴまたは１つ以上のＣＤＲを含む小抗体模倣物である抗体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体であって、前記抗体が、少なくとも治療薬または診断薬、好ましくは、少なくとも放射線治療薬、化学治療薬、抗血管新生薬剤、アポトーシス誘導薬剤、抗チューブリン薬、抗細胞薬剤または細胞傷害性薬剤、ステロイド、サイトカインアンタゴニスト、サイトカイン発現阻害剤、ケモカインアンタゴニスト、ケモカイン発現阻害剤、抗炎症性コルチコステロイドまたはＮＳＡＩＤ、凝固剤、または、好ましくはヌクレオシド、ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤からなる群より選択される抗ウイルス薬剤に結合している抗体。
【請求項９】
少なくとも請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体を含む組成物であって、前記組成物が、好ましくは、リポソーム組成物またはナノパーティクル組成物などの薬学的に許容可能な組成物であり、そして、少なくとも第２の治療薬を場合によりさらに含む組成物。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列領域を含む核酸分子。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド配列領域が配列番号１１１および／もしくは１１２のヌクレオチド配列、または前記配列のいずれかに対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を持つ、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１０または１１に記載の核酸分子または請求項１２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞またはウイルス。
【請求項１４】
少なくとも第１容器に、
（ａ）請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体；
（ｂ）請求項９に記載の組成物；
（ｃ）請求項１０または１１に記載の核酸分子；
（ｄ）請求項１２に記載の発現ベクター；および／または
（ｅ）請求項１３に記載の宿主細胞もしくはウイルス
を含むキット。
【請求項１５】
抗体を作製する方法であって、
（ａ）請求項１３に記載の宿主細胞を前記のコードされる抗体の発現に効果的な条件で培養すること；および
（ｂ）前記の発現した抗体を前記宿主細胞から得ること
を含む方法。
【請求項１６】
ＣＣＲ４を検出または測定するインビトロ方法であって、ＣＣＲ４を含むことが知られている、または、ＣＣＲ４を含むことが疑われている試料を請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体と、前記ＣＣＲ４と前記抗体の間の複合体を形成させるのに有効な条件下で接触させ、そして、そのようにして形成された前記複合体を検出または測定することを含む方法。
【請求項１７】
治療、画像化または診断に使用される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１８】
ＣＣＲ４の発現もしくは活性に関連する病気の治療、画像化もしくは診断に使用される、または、動物でのＣＣＲ４発現に関連する免疫抑制の低下に使用される、請求項１７に記載の抗体。
【請求項１９】
前記病気はＣＣＲ４が介在する疾患またはＣＣＲ４+細胞の異常増殖を特徴とする疾患、好ましくは、癌、炎症性疾患、免疫疾患または感染症であり、前記病気が、好ましくは、（ａ）全身性アナフィラキシーまたは過敏症、薬品アレルギー、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、刺虫アレルギーおよび食物アレルギーなどのアレルギー性疾患、（ｂ）クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸炎および腸炎などの炎症性腸疾患、（ｃ）膣炎、（ｄ）乾癬、ならびに皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹および掻痒症などの炎症性皮膚疾患、（ｅ）脈管炎、（ｆ）脊椎関節障害、（ｇ）強皮病、（ｈ）喘息、ならびにアレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患および過敏性肺疾患などの呼吸器アレルギー性疾患、（ｉ）（リウマチ性および乾癬性を含む）関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、糸球体腎炎などの自己免疫疾患、（ｊ）（同種移植片拒絶反応および移植片対宿主病を含む）移植片拒絶反応、（ｋ）アテローム性硬化症、筋炎、Ｔ細胞介在性神経変性病、多発性硬化症、脳炎、髄膜炎、肝炎、腎炎、敗血症、サルコイドーシス、アレルギー性結膜炎、耳炎、キャッスルマン病、静脈洞炎、ＬＰＳ誘導性内毒素ショック、ベーチェット症候群および痛風などの、抑制されるべき望ましくない炎症性反応を含む他の疾患、（ｌ）癌、好ましくは、乳癌、大腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、肺癌、黒色腫、卵巣癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮頚部癌、脳癌、前立腺癌、胃癌、成人性Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫、分類不能びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、B細胞性慢性リンパ性白血病、菌状息肉腫、セザリー症候群、（ｍ）エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）感染症、ＨＩＶ感染症および他のウイルスの感染症などの感染症、から選択される、請求項１８に記載の使用法のための請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
請求項１７に記載の使用のための請求項１７に記載の抗体であって、前記の使用が動物でのＣＣＲ４発現に関連する疾患の診断であり、そして、前記使用が、
（ａ）動物を前記抗体と接触させる工程；ならびに、場合により、
（ｂ）前記動物における抗体抗原複合体の存在および／または量および／または位置を測定または検出する工程；ならびに、場合により、
（ｃ）前記動物における抗体抗原複合体の存在および／または量を対照と比較する工程
を含む、抗体。
【請求項２１】
請求項１６に従ってＣＣＲ４を検出または測定すること、および、ＣＣＲ４の発現または活性に関連する病気の診断のためにこの情報を使用することを含む、ＣＣＲ４の発現または活性に関連する病気のインビトロ診断方法。
【請求項２２】
前記動物または試料でのＣＣＲ４量の増加が腫瘍細胞またはウイルス感染細胞の診断的特徴であり、好ましくは、前記のウイルス感染細胞はエプスタイン・バール・ウイルスおよびＨＩＶから選択されるウイルスにより感染されている、請求項２０に記載の診断または請求項２１に記載の方法に使用される、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２３】
ＣＣＲ４関連障害を患う対象の細胞、標的部位、組織または器官によって発現されるＣＣＲ４の存在を検出するための、または、その量を測定するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体の使用であって、検出または測定されたＣＣＲ４の存在または量の健常対照と比較した増大が、前記対象が抗ＣＣＲ４治療法の恩恵を受けている可能性を示す、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は抗体、ＣＣＲ４生物学および関連の治療法の分野に全般的に関連する。より詳細には、本発明はＣＣＲ４に結合する抗体を提供する。そのような抗ＣＣＲ４抗体は、腫瘍中の血管の画像化、癌の治療、ウイルスや他の感染症、および炎症性疾患や免疫疾患の治療などのＣＣＲ４と関連する疾患や病気での診断用途および治療用途を有する。本発明の抗体ベースの組成物および方法はまた免疫複合体および他の治療用配合物の使用、キットおよび方法にまで及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
背景
８００を越えるメンバーをもって、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）はシグナル伝達に関わる細胞表面分子の最大のファミリーを成し、ヒトのゲノムによってコードされる総遺伝子の２％超を占める。ＧＰＣＲスーパーファミリーのメンバーは、３つの細胞内ループと３つの細胞外ループによって連結された細胞外Ｎ末端、細胞内Ｃ末端および７回膜貫通（ＴＭ）らせんという共通の膜トポロジーを共有する。それらが共有するトポロジー上の構造に基づいて、ＧＰＣＲは７回膜貫通（７ＴＭ）受容体とも称される。これらの受容体は、神経伝達、内分泌腺および外分泌腺からのホルモンおよび酵素の放出、免疫反応、心筋および平滑筋の収縮と血圧調節を含む、重要な生理的機能を制御する。それらの機能不全が、最も蔓延しているヒトの疾患のいくつかの原因となる。ＧＰＣＲが癌の進行と転移に重要な役割を持つことを示す実験データおよび臨床データが現れつつある。したがって、いくつかのＧＰＣＲが抗癌薬の適切な標的であり得る可能性がある。
【０００３】
ケモカインは、特に、癌、ウイルスの感染、喘息およびアレルギー性疾患、ならびにリウマチ性関節炎やアテローム性硬化症などの自己免疫病理を含む、様々な疾患における免疫性および炎症性反応で重要な役割を果たす。これらの小分泌性分子は拡大しつつある、保存的な４個のシステインモチーフを特徴とする８〜１４ｋＤａのタンパク質のスーパーファミリーである。
【０００４】
ケモカインの作用は、Ｇタンパク質共役受容体のサブファミリーによって仲介されることが研究によって示されており、そのサブファミリーの中の一員はケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体４またはＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）と命名されている受容体である。ＣＣＲ４の特異的なリガンドには胸腺および活性化制御ケモカイン（ＴＡＲＣ）（ＣＣＬ１７としても知られる）ならびにマクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）（ＣＣＬ２２としても知られる）というケモカインが含まれる。ＣＣＲ４はＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１およびＭＩＰ−１αに結合することもでき、そして、これらのリガンドに応答したＣＣＲシグナル伝達もまた報告されている。
【０００５】
ＣＣＲ４は特にＴ細胞走化性機能および食細胞の炎症部位への遊走において重要であると考えられている。ＣＣＲ４はヘルパーＴ細胞２型（Ｔｈ２）細胞および制御性Ｔ（Ｔreg）細胞で優先的に発現するが、他の健康な細胞または組織では限定的な発現しか起こらない。
【０００６】
腫瘍細胞、特に成人性Ｔ細胞白血病／リンパ腫細胞はＣＣＲ４について陽性であり得る。腫瘍細胞によるＣＣＲ４の発現は皮膚の関与と関連がある。ある種のＴ細胞悪性腫瘍は通常皮膚に位置する。例えば、高レベルのＣＣＲ４が皮膚Ｔ細胞リンパ腫病変に見いだされる。
【０００７】
ある種の固形腫瘍がＣＣＲ４を発現することも最近発見された（国際公開第ＷＯ２００９／０３７４５４号）。ＣＣＲ４の発現は固形腫瘍、特に、子宮頸部、食道、腎臓、脳、乳腺、卵巣、前立腺、胃および膵臓の癌の癌形成における初期の事象であると考えられている。したがって、血液癌の細胞および非血液癌の細胞の両方がＣＣＲ４を発現することができる。結果として、抗ＣＣＲ４抗体を使用してこれらの癌を診断、モニターそして治療することができる。
【０００８】
さらに、ＣＣＲ４は正常免疫および腫瘍免疫で重要な役割を有する。ＣＤ４+ＣＤ２５+制御性Ｔ細胞（Ｔreg）のかなりの部分がＣＣＲ４陽性である（Ｂａａｔａｒ  ｅｔ  ａｌ，  ２００７ｂ）。これらのＴregは様々な機序を介して免疫反応を抑制するが、それらは腫瘍特異的免疫を抑制することができることが示されている。支質、腫瘍それ自体または流入領域リンパ節に浸潤するＴregの数の増加は様々な癌での治療効果の悪化と相関がある。Ｔreg活性の減少により内在性の抗腫瘍免疫性が上昇し、免疫系による抗腫瘍介入の有効性が上昇することがマウスモデルでの研究により示されている。結果として、Ｔreg機能の抑制が腫瘍の免疫療法での有望な戦略となる。その抑制はＴregの殺滅（除去）、それらのサプレッサー機能への干渉、それらの輸送パターンの変更またはそれらの分化の改変によって達成され得る。
【０００９】
ＣＣＲ４+Ｔ細胞白血病／リンパ腫の患者の小集団では、腫瘍細胞それ自体がＴreg細胞として機能し、宿主の抗腫瘍免疫反応に直面して腫瘍が生存する原因となる。他の種類の癌では、腫瘍細胞と腫瘍微小環境がＭＤＣとＴＡＲＣを産生し、そして、ＭＤＣとＴＡＲＣがＣＣＲ４+Ｔreg細胞をその腫瘍に誘引し、そこでそれらは宿主の免疫反応から腫瘍が免れるのに好適な環境を作り出す。以下の癌を有する患者の末梢血でＴｒｅｇのより高い発生頻度が報告されている：乳癌、大腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、肺癌、黒色腫、卵巣癌および膵臓癌。Ｔreg細胞が腫瘍にとって好適な環境を作り出すことが報告されている。したがって、ＣＣＲ４とＭＤＣなどのそのリガンドとの間の相互作用を妨げることが癌、特に上記の癌の治療または予防に有用であり得るであろう。ＳＣＩＤマウスモデルにおいて、ヒトＭＤＣ／ＣＣＬ２２に対する抗体によって、移植されたヒト卵巣腫瘍へのヒトＴreg細胞の浸潤を妨げることができたと報告されている。ヒトの固形腫瘍に存在するＴｒｅｇ細胞が、腫瘍成長および転移の鈍化の原因となり得る免疫エフェクター反応が生じることを妨げると考えられている。したがって、ＣＣＲ４に対する中和性ＭＡｂ（モノクローナル抗体）の使用による、腫瘍塊でのＴreg細胞の殺滅および／またはＴreg細胞の腫瘍部位への遊走の阻止が固形腫瘍に対する免疫反応の増強をもたらすことになり得るし、従来の細胞傷害性治療法および抗ホルモン性治療法への補助手段として機能し得る。
【００１０】
ヒトの死因全てのうち約１３％は癌が原因である。米国癌協会によると、２００７年には世界で７６０万人の人々が癌のために死亡しており、そのため、さらなる抗癌治療薬への強い、そして、緊急の必要性が残されている。
【００１１】
炎症および免疫障害にＣＣＲ４が役割を果たすことが示されている。Ｔｈ２細胞および好塩基球は肺および皮膚でのアレルギー反応に重要な細胞である。アレルゲンで刺激された喘息患者の気管支生検組織でのＣＣＲ４発現Ｔ細胞の存在と気道上皮細胞でのＣＣＲ４リガンド（ＭＤＣ、ＴＡＲＣ）の同時発現について記載する多数の報告がある（Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  ２００１）。ＣＣＲ４+Ｔ細胞はまた、アトピー性皮膚炎の患者で多数発見されており、その疾患が改善すると顕著なＣＣＲ４+Ｔ細胞の減少が観察される。アレルゲンでの刺激の前に抗体でＣＣＲ４をブロックすることによって、気道のアレルギー性炎症ならびに肺でのＴｈ２サイトカインレベルが低下することが喘息のヒト化ＳＣＩＤマウスモデルを使用して示された。ブロッキング抗体の肺送達を介したＣＣＲ４+Ｔ細胞の除去は喘息患者にとって適切な治療オプションであり得る。ＣＣＲ４ブロッキング抗体の皮膚への標的型送達もまたアトピー性皮膚炎の魅力的な治療法であり得る。
【００１２】
アレルギー性喘息では、高レベルのアレルゲン特異的なＩｇＥの存在は、一般的に吸い込まれた環境中のアレルゲンに対する異常なＴｈ２細胞免疫反応の反映である。喘息は、Ｔｈ２リンパ球と好酸球の浸潤およびＴｈ２ケモカインの産生を特徴とする。入ってくる外来の抗原を常にサンプリングする樹状細胞（ＤＣ）によってアレルゲンがＴ細胞に提示される。ＤＣによって適切に活性化されると、罹患した気道に存在するアレルゲン特異的リンパ球が、白血球の血管外湧出、杯細胞過形成および気管支過敏症（ＢＨＲ）をさらに制御するＴｈ２サイトカインであるインターロイキン（ＩＬ）−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３を産生する。ＤＣが産生したＴＡＲＣとＭＤＣが誘因性ＣＣＲ４を介して、Ｔｈ１細胞ではなく、Ｔｈ２細胞の選択的遊走を誘導する（Ｐｅｒｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ，  ２００９）。アレルゲンでの刺激後の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）におけるＣＤ４+Ｔ細胞と好酸球の数、Ｔｈ２サイトカインの産生および気道過敏性が抗ＴＡＲＣ抗体での処理により低下することが喘息のマウスモデルで示された（Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，  ２００１）。対照的に、ＣＣＲ４欠損マウスは気道の炎症とＢＨＲに対する何の防御も示さなかった  （Ｃｈｖａｔｃｈｋｏ  ｅｔ  ａｌ，  ２０００）。アレルゲンでの刺激の前に抗体でＣＣＲ４をブロックすることによって、気道のアレルギー性炎症ならびに肺でのＴｈ２サイトカインレベルが低下することが喘息のヒト化ＳＣＩＤマウスモデルを使用して示された（Ｐｅｒｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ，  ２００９）。これらのデータは、ＣＣＲ４の妨害が、ヒトでのアレルギー性炎症の抑制にとって、実現可能な戦略であることを示す。
【００１３】
Ｔreg細胞は樹状細胞（ＤＣ）を抑制し、それによって疾患、特に、感染症および癌の発生と進行を促進することができる。それ故、Ｔreg細胞による樹状細胞の抑制を妨害することが可能である抗ＣＣＲ４抗体はワクチンのアジュバントとして、特に腫瘍ワクチン接種または感染症に対するワクチン接種におけるアジュバントとして有用であり得る。したがって、抗ＣＣＲ４抗体はワクチンの治療効果を向上することができ、とりわけ、ワクチン誘導性免疫反応を増強する。
【００１４】
ＣＣＲ４結合化合物がマウスでのアレルギー性炎症に効能を示すことが報告されている（Ｐｕｒａｎｄａｒｅ  ｅｔ  ａｌ，  ２００７，Ｂｕｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７）。ＴＡＲＣによって誘導される腹膜への白血球のＣＣＲ４依存性のリクルートがほぼ９０％抑制されたように、ＣＣＲ４結合化合物が妥当な力価をインビボで有することが報告されている。ヨコヤマとその同僚たちが、マウスモデルでの過敏症の低下に有効であることがインビボで判明した、ＣＣＲ４を標的とするキナゾリン誘導体を発表した（Ｙｏｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ，  ２００８ｂ）。この化合物の誘導体は経口投与によって同様のインビボマウスモデルで有効であることが判明した（Ｙｏｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ，  ２００９）。近年、一群の科学者たちがインシリコモデリングアプローチを用いて多数のＣＣＲ４アンタゴニストを同定してきている（Ｂａｙｒｙ  ｅｔ  ａｌ，  ２００８；Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ，  ２００９）。その筆者らは、モデル化されたＣＣＲ４に化合物をドッキングすることによって、膜貫通領域内に結合することができる分子を発見した。１６種の化合物がＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞のＣＣＲ４介在性遊走を抑制した。ＣＣＲ４アンタゴニストが結核菌へのワクチンおよびＢ型肝炎へのワクチンとのアジュバント機能についてインビボで試験されると、細胞性免疫反応と液性免疫反応の両方について免疫原性の上昇が観察された。観察された効果はＴreg活性の阻害が原因であるとされた  （Ｂａｙｒｙ  ｅｔ  ａｌ，  ２００８；Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ，  ２００９）。Ｔreg細胞のかなりの部分がＣＣＲ４陽性であるという事実は当技術分野において周知である（Ｂａａｔａｒ  ｅｔ  ａｌ  ２００７ｂ）。観察された効果が（例えば、ウイルス、細菌、マイコバクテリウムまたは原生動物などの寄生生物が原因の）感染症に対するワクチン接種という関係ばかりか、癌ワクチンという関係でも有用であると考えられている。
【００１５】
これらの化合物のアジュバントとしての効能の理由はＣＣＲ４介在性シグナル伝達を遮断することによるＴregの阻害に基づくので、ＣＣＲ４へ拮抗的に結合する抗体は同様に作用すると予想される。低分子薬と比較した、抗体の薬理学的な利点は当技術分野において周知である。協和発酵による抗ＣＣＲ４抗体ＫＷ−０７６１は当技術分野において公知である。しかしながら、この抗体はＡＤＣＣによってのみ効果的であり、ＣＣＲ４受容体を介したリガンド介在性シグナル伝達を妨害しない。それ故、本発明に記載される抗体はそれらのＴregを介した免疫反応の調節において明らかに優れていることが期待される。
【００１６】
臨床上の用途でＴregが調節される別の適用例は癌の治療である。Ｔregは腫瘍特異的免疫性を抑制することができ、それらの数の増加はいくつかの癌で予後不良および疾患の進行と相関する。Ｔreg活性の低下が内在性の抗腫瘍免疫性を押し上げ、能動的免疫介入の有効性を増大させることがマウスモデルでの研究により示されている。結果として、Ｔreg機能の抑制がヒトの癌の免疫療法において考慮に値する戦略となる（Ｃｕｒｉｅｌ，  ２００８；Ｒｕｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  ２００９）。この抑制はＴregの調節によっても、それらを直接殺滅することによっても達成され得る。
【００１７】
このアプローチの例は、ＣＤ２５のようなＴregの他の表面を標的とする化合物により、当技術分野において記述されている。ダクリズマブ（ゼナパックス（登録商標）；Ｒｏｃｈｅ））およびバシリキシマブ（シムレクト（登録商標）；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）は、自己免疫疾患、移植、およびＨＴＬＶ‐１誘発性成人性Ｔ細胞リンパ腫／白血病（Ｃｈｕｒｃｈ，  ２００３）を含む癌での使用について承認された抗ヒトＣＤ２５抗体である。デニロイキンジフチトクス（オンタック（登録商標）、ＤＡＢ３８９ＩＬ−２；Ｌｉｇａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）は、ジフテリア毒素の活性ドメインをヒトＩＬ−２に融合した組換えタンパク質である。１９９８年にＦＤＡは皮膚Ｔ細胞白血病／リンパ腫の治療にデニロイキンジフチトクスを承認しているが（Ｏｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  ２００１）、それらは通常ＣＤ４+ＣＤ２５+である。デニロイキンジフチトクスはＩＬ−２受容体にターゲットされるが、エンドサイトーシスによりＣＤ２５を介して内部に取り込まれると主張されている。腎臓細胞癌の患者でデニロイキンジフチトクスが腫瘍ワクチンの免疫原性を向上させるという証拠もある（Ｄａｎｎｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ，  ２００５）。さらに、デニロイキンジフチトクスが黒色腫でＴregの数と機能を低下させ、黒色腫特異的な免疫性を向上させることが報告された（Ｍａｈｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ，  ２００７）。
【００１８】
癌治療または癌ワクチンの効果の改善のために標的とされるＴreg上の他の分子にはＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性腫瘍ネクローシス因子受容体関連遺伝子）（Ｌｅｖｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２）、ヒトＴregを含む様々な哺乳類細胞で広範に発現するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  ２００４，Ｒｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  ２００９）および細胞傷害性Ｔリンパ球抗原‐４（ＣＴＬＡ−４；ＣＤ１５２）（Ｓｕｔｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１）が含まれる。現在では抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体治療法の第ＩＩ相および第ＩＩＩ相臨床試験が黒色腫で行われているところであり、他の種類の腫瘍で第Ｉ相および第ＩＩ相試験が行われている。２つのヒトモノクローナル抗体、すなわち、イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０；Ｂｒｉｓｔｏｌ‐Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ／Ｍｅｄａｒｅｘ）およびトレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）（ＣＰ−６７５、２０６；Ｐｆｉｚｅｒ）が研究中である。
【００１９】
特に次の障害、すなわち、成人性Ｔ細胞白血病／リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、分類不能びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）感染症、菌状息肉腫（成熟型Ｔ細胞リンパ腫）、セザリー症候群（菌状息肉腫の異型）、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、喘息、ＬＰＳ誘導性内毒素ショック、アレルギー性炎症、多発性硬化症（ＭＳ）などのＴ細胞介在性神経変性病、乾癬、キャッスルマン病およびリウマチ性関節炎（ＲＡ）などの自己免疫疾患にＣＣＲ４が関係するとされている。
【００２０】
それらの複雑な構造のため、ＧＰＣＲは特異的な抗体を産生させるのが「難しい標的」であると考えられている。それらは溶解した細胞の膜画分から容易に精製することもできないし、正しく折り畳まれた可溶性タンパク質として様々な発現系で組換え技術により作製されることもできない。発明者らの知識によれば、これまで、ファージディスプレイを用いて抗ＧＰＣＲ抗体を作製しようとする他の研究者の公知の試み全てが成功していないことが分かっている。
【００２１】
ＧＰＣＲに対する抗体の作製に関わる困難がＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９において提示されている。さらに、Ｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）は、ＧＰＣＲケモカイン受容体ＣＸＣＲ４に対するヒト抗体を得る試みに関わる困難を説明し、ステップバック選択を組み合わせたパスファインダー法を用いても特異的な抗体を同定することができなかったことを報告している。したがって、ＧＰＣＲの分野では、特異的な抗体の作製は未だ大きな課題である。
【００２２】
ヒトＣＣＲ４と反応する１Ｇ１という名称のマウスモノクローナル抗体がＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎより市販されている。免疫蛍光染色にこの抗体を使用することができるが、その抗体は中和性抗体ではない。
【００２３】
ＫＭ２７６０という名称のＣＣＲ４に対するキメラ抗体がＩｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６で開示されている。この抗体はＣＣＲ４のそのリガンドであるＭＤＣまたはＴＡＲＣへの結合を妨げないことを筆者らは報告している。
【００２４】
ＣＣＲ４を認識するその他の抗体の同定は治療オプションの数を拡大する点で有益であるということを筆者らは認識している。特に、ＣＣＲ４のそのリガンドの１つ以上への結合を妨げる抗体がさらなる治療手段を提供するであろう。
【００２５】
発明者らはまた、免疫学的な観点から忍容性が良好なヒトの治療用の治療薬の開発が有利であると認識している。この点に関し、ヒト抗体は一般に、ヒト治療法での使用に少なくとも３点の潜在的な利点を有する。第一に、ヒト免疫系はその抗体を外来物と認識しないであろう。第二に、ヒト循環系での半減期は天然のヒト抗体と同様であり、より少量で少ない頻度の用量が投与されることを可能にする。第三に、エフェクター部分がヒトのものであるので、ヒト免疫系の他の部分とよく相互作用する。
【００２６】
それ故、当分野は、長期投与を含む、ＣＣＲ４が関わる障害を持つ患者の安全で効果的な治療に使用され得る抗ＣＣＲ４抗体を未だ欠き、そのような抗体の開発を挑戦的なものとしている。
【００２７】
とりわけ、ＣＣＲ４に対するヒト抗体の要求が存在する。ヒト抗体は一般に利点を示すことが認識されているが、ヒトの治療で成功する候補とするのに十分に高い親和性や適切な機能特性を有するヒト抗体の開発は決して簡単ではないことが知られている。このことは、それらの複雑で膜貫通という性質のため、ＧＰＣＲにずっとよく当てはまる。
【００２８】
ＣＣＲ４とＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣなどのそのリガンドの１つ以上との間の結合を妨げることができる抗ＣＣＲ４抗体への強い必要性も依然として存在する。
【発明の概要】
【００２９】
本発明の説明
本発明は、腫瘍、ウイルス感染症、ならびに炎症性障害または免疫障害など、ＣＣＲ４+細胞が関与している他の疾患および病気の安全かつ有効な治療に使用する新規治療用組成物および方法を提供することで、先行技術に存在する一定の限界を克服する。本発明は、ＣＣＲ４、好ましくはＣＣＲ４の細胞外ドメインのエピトープに結合する抗体、特にヒト抗体に基づくものである。そのような抗体は、腫瘍、ウイルス感染症、ならびに炎症性または免疫疾患などのＣＣＲ４+細胞が関与している他の疾患および病気の治療に有効である。本発明の組成物および方法は、この特定のカテゴリーの抗体を使用する免疫複合体および組み合わせの使用にも及ぶものである。
【００３０】
本発明の特別な利点は、提供される抗体がＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣのＣＣＲ４への結合を阻害することである。このことは、ＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣのＣＣＲ４への結合を阻害しない、医療分野における先行の抗体とは対照的である。
【００３１】
発明者らは、ＣＣＲ４に結合するＣＣＲ４特異的抗体を調製した。例えば、この抗体はＣＣＲ４+細胞、具体的にはＣＣＲ４を導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＣＣＲ４を導入したＤＴ４０細胞およびＣＣＲ４を天然に発現しているＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞、ならびにＣＣＲ４を発現している次の細胞、すなわち、Ｈｕｔ７８細胞（皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ＡＴＣＣ寄託番号ＴＩＢ−１６１）、７８６−Ｏ細胞（ヒト腎細胞癌、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１９３２）、ＭＣＦ−７細胞（ヒト乳房腺癌、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＴＢ−２２）、ＫａｔｏＩＩＩ細胞（ヒト胃癌、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＴＢ−１０３）、Ｌ−４２８細胞（非ホジキンリンパ腫、ＤＳＭＺ寄託番号ＡＣＣ１９７）およびＡ−４９８細胞（ヒト腎細胞癌、ＤＳＭＺ寄託番号ＡＣＣ５５）に結合する（実施例２を参照のこと）。ここで重要な事は、ＣＣＲ４-細胞、すなわちＣＣＲ４を発現していない細胞には、この抗体が有意に結合しないことである。したがって、本明細書で開示する抗体は、ＣＣＲ４に特異的に結合し、本明細書で論じる病気の診断や治療に有効な候補となる。
【００３２】
ＣＣＲ４の細胞外ドメインにあるエピトープに結合する本発明の好ましい抗体分子、ならびにそれらの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体のＶHおよびＶLドメインのアミノ酸配列および／またはＤＮＡ配列を、本明細書に挙げる様々な配列番号で示す。
【００３３】
したがって本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつ、ＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体を提供する。前記抗体は、好ましくは単離された抗体である。前記抗体がヒト抗体であることもまた好ましい。好ましくは、前記抗体はＣＣＲ４の細胞外ドメインにあるエピトープに結合する。ＣＣＲ４は好ましくはヒトＣＣＲ４である。したがって、「ＣＣＲ４への結合」への言及はいずれも、「ＣＣＲ４の細胞外ドメインにあるエピトープへの結合」という好ましい実施形態を含む。
【００３４】
したがって本発明は、好ましくはヒトＣＣＲ４の細胞外ドメインにあるエピトープに結合し、かつ、ＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる単離されたヒト抗体を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
一実施形態において本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつ、ＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体であって、本明細書に開示の表に挙げた重鎖ＣＤＲ配列のうちの１つを含む少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ、および／または本明細書で開示の表に挙げた軽鎖ＣＤＲ配列のうちの１つを含む少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む抗体を提供する。前記抗体は、好ましくは少なくとも２つ、または３つの重鎖ＣＤＲおよび／または軽鎖ＣＤＲを含み、ＣＤＲはそれぞれ、本明細書で開示の表に挙げた対応する配列を含む。
【００３６】
一実施形態において本発明の抗体は、配列番号１、２、３、４、５および６；もしくは１、２、３、１７、５および６；もしくは１、２、２０、２２、５および２４；もしくは２６、２７、２０、２２、５、２４、または前述の配列番号のいずれかと実質的に相同な配列からなる群より選択される１つ以上の、例えば少なくとも２つ、３つ、４つまたは５つ、好ましくは６つのＣＤＲを含む。
【００３７】
一実施形態において抗体は、配列番号１もしくは２６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２もしくは２７の重鎖ＣＤＲ２および配列番号３もしくは２０の重鎖ＣＤＲ３、もしくは前述の配列番号のいずれかに実質的に相同な配列、ならびに／または配列番号４、１７もしくは２２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２および／もしくは配列番号６もしくは２４の軽鎖ＣＤＲ３、もしくは前述の配列番号のいずれかに実質的に相同な配列を含む。
【００３８】
したがって一実施形態において抗体は、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２および配列番号２０の重鎖ＣＤＲ３を含む。好ましくは、前記抗体はさらに、本明細書に示す配列から選択される軽鎖ＣＤＲを含む。
【００３９】
一実施形態では、本明細書に開示した抗体の重鎖ＣＤＲ１はいずれも配列ＳＹＡＸＳを有し、ここでＸはいずれのアミノ酸であってもよく（配列番号１１９）、好ましくはＭまたはＩであり（配列番号１２０）；および／または本明細書に開示した抗体の重鎖ＣＤＲ２はいずれも配列ＧＩＩＰＩＦＧＴＸＮＹＡＱＫＦＱＧを有し、ここでＸはいずれのアミノ酸であってもよく（配列番号１２１）、好ましくはＶ、ＩまたはＡであり（配列番号１２２）；および／または本明細書に開示した抗体の重鎖ＣＤＲ３はいずれも配列ＲＸ1ＧＸ2Ｘ3ＦＤＹを有し、ここでＸはそれぞれ独立していずれのアミノ酸であってもよく（配列番号１２３）、好ましくは、Ｘ1はＲまたはＧであり、および／またはＸ2はＳまたはＡであり、および／またはＸ3はＹまたはＫであり、最も好ましくは、Ｘ1はＲまたはＧであり、およびＸ2はＳまたはＡであり、およびＸ3はＹまたはＫであり（配列番号１２４）；および／または本明細書に開示した抗体の軽鎖ＣＤＲ１はいずれも配列ＳＧＳＴＳＮＩＧＳＨＹＶＸを有し、ここでＸはいずれもアミノ酸であってもよく（配列番号１２５）、好ましくはＦ、ＳまたはＶであり（配列番号１２６）；および／または本明細書に開示した抗体の軽鎖ＣＤＲ２はいずれも配列番号５の配列を有し；および／または本明細書に開示した抗体の軽鎖ＣＤＲ３はいずれも配列ＡＶＷＤＸＸＸＸＧＷＶを有し、ここでＸはそれぞれ独立していずれのアミノ酸であってよく（配列番号１２７）、好ましくは、Ｘ1はＡまたはＤであり、および／またはＸ2はＫまたはＴであり、および／またはＸ3はＹまたはＬであり、および／またはＸ4はＲまたはＳであり、より好ましくは、Ｘ1はＡまたはＤであり、およびＸ2はＫまたはＴであり、およびＸ3はＹまたはＬであり、およびＸ4はＲまたはＳである（配列番号１２８）。
【００４０】
このことは、本明細書に開示したＶH、ＶL、ｓｃＦｖおよびＩｇＧ配列に対して適用される。したがってＣＤＲ配列を含む本明細書に開示した配列はいずれも、表１〜９に挙げた対応するＣＤＲ配列の代わりに、好ましくは配列番号１１９〜１２８のうちの１つ以上を含む。
【００４１】
特に好ましい一実施形態において抗体は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２および配列番号３もしくは２０の重鎖ＣＤＲ３を含む。好ましくは、前記抗体はさらに、配列番号４、１７もしくは２２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２および／または配列番号６もしくは２４の軽鎖ＣＤＲ３、または前述の配列番号のいずれかに実質的に相同な配列を含む。
【００４２】
一実施形態において抗体は、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２７の重鎖ＣＤＲ２および配列番号２０の重鎖ＣＤＲ３を含む。好ましくは、前記抗体はさらに、配列番号４、１７もしくは２２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２および／または配列番号６もしくは２４の軽鎖ＣＤＲ３、または前述の配列番号のいずれかに実質的に相同な配列を含む。
【００４３】
一実施形態において抗体は、配列番号４、１７または２２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２および配列番号６または２４の軽鎖ＣＤＲ３を含む。好ましくは、前記抗体はさらに、配列番号１もしくは２６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２もしくは２７の重鎖ＣＤＲ２および／または配列番号３もしくは２０の重鎖ＣＤＲ３、または前述の配列番号のいずれかに実質的に相同な配列を含む。
【００４４】
一実施形態において抗体は、配列番号４または１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２および配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む。好ましくは、前記抗体はさらに、配列番号１もしくは２６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２もしくは２７の重鎖ＣＤＲ２および／または配列番号３もしくは２０の重鎖ＣＤＲ３、または前述の配列番号のいずれかに実質的に相同な配列を含む。
【００４５】
一実施形態において抗体は、配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２および配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ３を含む。好ましくは、前記抗体はさらに、配列番号１もしくは２６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２もしくは２７の重鎖ＣＤＲ２および／または配列番号３もしくは２０の重鎖ＣＤＲ３、または前述の配列番号のいずれかに実質的に相同な配列を含む。
【００４６】
ある特に好ましい抗体は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号３の重鎖ＣＤＲ３ドメインを含み；ならびに、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む。
【００４７】
ある特に好ましい抗体は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号３の重鎖ＣＤＲ３ドメインを含み；ならびに、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む。
【００４８】
ある最も好ましい抗体は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号２０の重鎖ＣＤＲ３ドメインを含み；ならびに、配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む。
【００４９】
特に好ましい抗体は、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号２７の重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号２０の重鎖ＣＤＲ３ドメインを含み；ならびに、配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む。
【００５０】
さらなる実施形態において本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつ、ＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体であって、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域を含む抗体を提供し、ここで前記重鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変（ＶH）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するＶH ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＶH ＣＤＲ３を含み；および／または
前記軽鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号４、１７または２２、好ましくは４または１７のアミノ酸配列を有するＶL ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＶL ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号６または２４、好ましくは６のアミノ酸配列を有するＶL ＣＤＲ３を含む。
【００５１】
さらなる実施形態において本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつ、ＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体であって、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域を含む抗体を提供し、ここで前記重鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変（ＶH）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するＶH ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶH ＣＤＲ３を含み；および／または
軽鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号４、１７または２２、好ましくは２２のアミノ酸配列を有するＶL ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＶL ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号６または２４、好ましくは２４のアミノ酸配列を有するＶL ＣＤＲ３を含む。
【００５２】
さらなる実施形態において本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつ、ＭＤＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体であって、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの重鎖可変領域とおよび３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域を含む抗体を提供し、ここで前記重鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を有する重鎖可変（ＶH）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶH ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶH ＣＤＲ３を含み；および／または
前記軽鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号４、１７および２２、好ましくは２２のアミノ酸配列を有するＶL ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＶL ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）配列番号６または２４、好ましくは２４のアミノ酸配列を有するＶL ＣＤＲ３を含む。
【００５３】
本発明のある特に好ましい実施形態は、ＣＣＲ４に結合し、かつ、ＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体であって、配列番号２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３もしくは４５のアミノ酸配列またはそれらに実質的に相同な配列を有するＶHドメイン、および／または配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４もしくは４６のアミノ酸配列またはそれらに実質的に相同な配列を有するＶLドメインを含む抗体を提供する。
【００５４】
好ましくは、前記ＶＨドメインは３つの重鎖ＣＤＲを含み、および／または前記ＶLドメインは３つの軽鎖ＣＤＲを含む。より好ましくは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、好ましくは３つの軽鎖ＣＤＲ配列は、本明細書に開示した軽鎖ＣＤＲ配列から選択され、および／または少なくとも１つ、少なくとも２つ、好ましくは３つの重鎖ＣＤＲ配列は、本明細書に開示した重鎖ＣＤＲ配列から選択される。
【００５５】
したがって、一実施形態において前記ＶＨドメインは、配列番号２９、３１、３３もしくは３５の配列またはそれらに実質的に相同な配列を有し、ならびに、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号３の重鎖ＣＤＲ３ドメインを含む。
【００５６】
一実施形態において前記ＶＨドメインは、配列番号３７、３９、４１または４３の配列またはそれらに実質的に相同な配列を有し、ならびに、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号２０の重鎖ＣＤＲ３ドメインを含む。
【００５７】
一実施形態において前記ＶＨドメインは、配列番号４５の配列またはそれらに実質的に相同な配列を有し、ならびに、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号２７の重鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号２０の重鎖ＣＤＲ３ドメインを含む。
【００５８】
一実施形態において前記ＶＬドメインは、配列番号３０もしくは３４の配列またはそれらに実質的に相同な配列を有し、ならびに、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む。
【００５９】
一実施形態において前記ＶＬドメインは、配列番号３２もしくは３６の配列またはそれらに実質的に相同な配列を有し、ならびに、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む。
【００６０】
一実施形態において前記ＶＬドメインは、配列番号３８、４０、４２、４４もしくは４６の配列またはそれらに実質的に相同な配列を有し、ならびに、配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、および配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む。
【００６１】
抗体は上で詳しく論じたＶＬ配列およびＶＨ配列のいずれの組み合わせであってもよいが以下の組み合わせが好ましい。
配列番号２９またはそれに実質的に相同な配列のアミノ酸配列を有するＶＨドメインと配列番号３０またはそれに実質的に相同な配列のアミノ酸配列を有するＶＬドメイン。
配列番号３１またはそれに実質的に相同な配列のアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号３２またはそれに実質的に相同な配列のアミノ酸配列を有するＶＬドメイン。
配列番号３３またはそれに実質的に相同な配列のアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号３４またはそれに実質的に相同な配列のアミノ酸配列を有するＶＬドメイン。
配列番号３５またはそれに実質的に相同な配列のアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号３６またはそれに実質的に相同な配列のアミノ酸配列を有するＶＬドメイン。
配列番号３７またはそれに実質的に相同な配列のアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号３８またはそれに実質的に相同な配列のアミノ酸配列を有するＶＬドメイン。
配列番号３９またはそれに実質的に相同な配列のアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号４０またはそれに実質的に相同な配列のアミノ酸配列を有するＶＬドメイン。
配列番号４１またはそれに実質的に相同な配列のアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号４２またはそれに実質的に相同な配列のアミノ酸配列を有するＶＬドメイン。
配列番号４３またはそれに実質的に相同な配列のアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号４４またはそれに実質的に相同な配列のアミノ酸配列を有するＶＬドメイン。
配列番号４５またはそれに実質的に相同な配列のアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号４６またはそれに実質的に相同な配列のアミノ酸配列を有するＶＬドメイン。
【００６２】
一層さらなる実施形態において本発明は、ＣＣＲ４に結合し、かつ、ＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体であって、配列番号４７（前記抗体は本明細書においては２０８  ｓｃＦｖとも呼ばれる）、配列番号４８（前記抗体は本明細書においては３０６  ｓｃＦｖとも呼ばれる）、配列番号４９（前記抗体は本明細書においては３０８  ｓｃＦｖとも呼ばれる）、配列番号５０（前記抗体は本明細書においては４０６  ｓｃＦｖとも呼ばれる）、配列番号５１（前記抗体は本明細書においては５０１  ｓｃＦｖとも呼ばれる）、配列番号５２（前記抗体は本明細書においては５０３  ｓｃＦｖとも呼ばれる）、配列番号５３（前記抗体は本明細書においては６０１  ｓｃＦｖとも呼ばれる）、配列番号５４（前記抗体は本明細書においては６０３  ｓｃＦｖとも呼ばれる）、もしくは配列番号５５（前記抗体は本明細書においては８０３  ｓｃＦｖとも呼ばれる）のアミノ酸配列を含む抗体、またはＣＣＲ４に結合し、かつ、ＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる抗体であって、前述した配列の任意の断片もしくは上述した配列のいずれかに実質的に相同な配列を含む抗体を提供する。
【００６３】
本発明は、モノクローナル抗体２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３によって例示され、その一本鎖型を表１、２、３、４、５、６、７、８および９に示す（それぞれ、配列番号４７、４８、４９、５０、５１、２１、５３、５４および５５）。完全長ＩｇＧ型の抗体２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３も作成し、その配列をそれぞれ、表１０〜１８に示した。２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３抗体のＣＤＲドメイン、ＶHおよびＶLドメインを表１〜９に示す。これらのＣＤＲドメインおよび／またはＶHおよび／またはＶLドメイン（またはそれらに実質的に相同な配列）を含む抗体が本発明の好ましい態様である。
【００６４】
本発明の好ましい実施形態は、配列番号４７を含むまたは配列番号４７からなる２０８抗体のｓｃＦｖ型であり、この抗体は、好ましくは配列番号５６でコードされている。本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号４８を含むまたは配列番号４８からなる３０６抗体のｓｃＦｖ型であり、この抗体は、好ましくは配列番号５７でコードされている。本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号４９を含むまたは配列番号４９からなる３０８抗体のｓｃＦｖ型であり、この抗体は、好ましくは配列番号５８でコードされている。本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号５０を含むまたは配列番号５０からなる４０６抗体のｓｃＦｖ型であり、この抗体は、好ましくは配列番号５９でコードされている。本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号５１を含むまたは配列番号５１からなる５０１抗体のｓｃＦｖ型であり、この抗体は好ましくは配列番号６０でコードされている。本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号５２を含むまたは配列番号５２からなる５０３抗体のｓｃＦｖ型であり、この抗体は、好ましくは配列番号６１でコードされている。本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号５３を含むまたは配列番号５３からなる６０１抗体のｓｃＦｖ型であり、この抗体は、好ましくは配列番号６２でコードされている。本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号５４を含むまたは配列番号５４からなる６０３抗体のｓｃＦｖ型であり、この抗体は、好ましくは配列番号６３でコードされている。本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号５５を含むまたは配列番号５５からなる８０３抗体のｓｃＦｖ型であり、この抗体は、好ましくは配列番号６４でコードされている。
【００６５】
他の好ましい実施形態は、２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３抗体のＩｇＧ型、好ましくは完全長ＩｇＧ型である。これらの抗体のＩｇＧ１型が最も好ましい。
【００６６】
したがって、本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号６７（アミノ酸）の重鎖および／または配列番号６８（アミノ酸）の軽鎖を含む、完全長ＩｇＧ抗体である。配列番号６５でコードされている重鎖、および／または配列番号６６でコードされている軽鎖を含むＩｇＧ抗体もまた好ましい。
【００６７】
本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号７１（アミノ酸）の重鎖および／または配列番号７２（アミノ酸）の軽鎖を含む完全長ＩｇＧ抗体である。配列番号６９でコードされている重鎖および／または配列番号７０でコードされている軽鎖を含むＩｇＧ抗体もまた好ましい。
【００６８】
本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号７５（アミノ酸）の重鎖および／または配列番号７６（アミノ酸）の軽鎖を含む完全長ＩｇＧ抗体である。配列番号７３でコードされている重鎖および／または配列番号７４でコードされている軽鎖を含むＩｇＧ抗体もまた好ましい。
【００６９】
本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号７９（アミノ酸）の重鎖および／または配列番号８０（アミノ酸）の軽鎖を含む完全長ＩｇＧ抗体である。配列番号７７でコードされている重鎖および／または配列番号７８でコードされている軽鎖を含むＩｇＧ抗体もまた好ましい。
【００７０】
本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号８３（アミノ酸）の重鎖および／または配列番号８４（アミノ酸）の軽鎖を含む完全長ＩｇＧ抗体である。配列番号８１でコードされている重鎖および／または配列番号８２でコードされている軽鎖を含むＩｇＧ抗体もまた好ましい。
【００７１】
本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号８７（アミノ酸）の重鎖および／または配列番号８８（アミノ酸）の軽鎖を含む完全長ＩｇＧ抗体である。配列番号８５でコードされている重鎖および／または配列番号８６でコードされている軽鎖を含むＩｇＧ抗体もまた好ましい。
【００７２】
本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号９１（アミノ酸）の重鎖および／または配列番号９２（アミノ酸）の軽鎖を含む完全長ＩｇＧ抗体である。配列番号８９でコードされている重鎖および／または配列番号９０でコードされている軽鎖（実質的に同一の重鎖および２本の実質的に同一の軽鎖）を含むＩｇＧ抗体もまた好ましい。
【００７３】
本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号９５（アミノ酸）の重鎖および／または配列番号９６（アミノ酸）の軽鎖を含む完全長ＩｇＧ抗体である。配列番号９３でコードされている重鎖および／または配列番号９４でコードされている軽鎖を含むＩｇＧ抗体もまた好ましい。
【００７４】
本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号９９（アミノ酸）の重鎖および／または配列番号１００（アミノ酸）の軽鎖を含む完全長ＩｇＧ抗体である。配列番号９７でコードされている重鎖および／または配列番号９８でコードされている軽鎖を含むＩｇＧ抗体もまた好ましい。
【００７５】
当然のことながら、完全長ＩｇＧ抗体は、２本の実質的に同一の重鎖と２本の実質的に同一の軽鎖を含む。
【００７６】
本発明の抗体は、ＫＭ２１６０、ＫＭ３０６０、ＫＭ２７６０およびＫＷ−０７６１を含む既知の抗ＣＣＲ４抗体ファミリーとは異なるエピトープに結合し得ると考えられている。ＫＭ２１６０抗体は、ＣＣＲ４のペプチド断片に対して生じ、ヒトＣＣＲ４（欧州特許第１２７０５９５号明細書）のＮ末端から数えて２〜２９番目に位置するアミノ酸領域に存在するエピトープを認識するマウス抗体である。ＫＭ２７６０は、同じ結合特性を有する抗体のキメラである（欧州特許第１２７０５９５号明細書）。抗体ＫＭ３０６０は、ＫＭ２７６０と同一であるが、高度にフコシル化されている（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４，  ２１２７−２１３３）。ＫＷ−０７６１は、ヒト化したＫＭ２７６０である（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２００８，  ｖｏｌ  １９，  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ４，  ５１３）。
【００７７】
ＫＭ２７６０はＣＣＲ４とＴＡＲＣまたはＭＤＣの相互作用を阻害しないことが報告されており（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６  （１１），  ｐｐ  ５７１６−５７２２）、このことは、同等の抗体であるＫＭ３０６０ｖａｒ（ＫＭ３０６０に相当するが、別の宿主で発現させたことから異なる糖プロファイルを有する可能性がある）を用いた出願人の発見と一致する。一方、本発明の抗体がＣＣＲ４とＭＤＣ相互作用やＣＣＲ４とＴＡＲＣの相互作用を阻害することが分かった（実施例３を参照のこと）。このことは、本発明の抗体が、ＫＭ２１６０、ＫＭ３０６０、ＫＭ２７６０およびＫＷ−０７６１を含む先行技術ファミリーとは別のエピトープに結合することを強く示唆している。
【００７８】
さらに、ＣＣＲ４への結合について、抗体２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３が互いに競合することが分かった。このことは、これらの抗体が同一の、同様のまたは少なくとも重なり合ったエピトープに結合することを示している。これらの抗体はどれも、ＫＷ−０７６１とはＣＣＲ４への結合の点で競合せず、このことは、ＫＷ−０７６１が別のエピトープに結合することを示している（実施例４）。
【００７９】
また、本発明の抗体は、市販されている抗ＣＣＲ４抗体である１Ｇ１とは別のエピトープに結合し得るとも考えられている。ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎはこの抗体に関する技術データシートで、この抗体が中和抗体ではないことを公表している。対照的に、本発明の抗体は、ＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる。このことは、本発明の抗体が１Ｇ１抗体とは別のエピトープに結合することを強く示唆している。
【００８０】
実質的に相同な配列のある特定の例は、開示したアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一な配列である。ある特定の実施形態では、ＣＣＲ４に結合し、かつ、ＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる本発明の抗体は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４または４６のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％または８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％または９８％および最も好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の領域を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域；および／または配列番号２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３または４５のアミノ酸配列領域を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含む。
【００８１】
ある特定の実施形態では、ＣＣＲ４に結合し、かつ、ＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる本発明の抗体は、配列番号２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３または４５のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％または８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％または９８％および最も好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列の領域を含む少なくとも１つの重鎖可変領域；および／または配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４または４６のアミノ酸配列領域を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域を含む。
【００８２】
実質的に相同な配列の他の好ましい例は、開示したアミノ酸配列に保存的アミノ酸置換を含む配列である。好ましくは、実質的に相同な配列は、ＶHドメイン全体にわたって、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個以下の変化したアミノ酸を含み、および／またはＶLドメイン全体にわたって、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個以下の変化したアミノ酸を含む。そのような実施形態では、変化したアミノ酸（もしあれば）はいずれも、フレームワーク領域のみに見られる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、実質的に相同な配列は、開示したＦＲ領域の一方または両方に、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個以下の変化したアミノ酸を含む。したがって好ましくは、実質的に相同な配列は、本明細書に開示した重鎖ＦＲ１、重鎖ＦＲ２、重鎖ＦＲ３、重鎖ＦＲ４、軽鎖ＦＲ１、軽鎖ＦＲ２、軽鎖ＦＲ３、および／または軽鎖ＦＲ４に、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個以下の変化したアミノ酸を含む。
【００８４】
軽鎖ＦＲ１を含む、本明細書に開示した配列のいずれかに実質的に相同な好ましい配列は、軽鎖ＦＲ１の１番目のアミノ酸（セリン）が、別のアミノ酸、好ましくはグルタミン（Ｑ）で置換されており、および／または軽鎖ＦＲ１の２番目のアミノ酸（チロシン）が別のアミノ酸、好ましくはセリン（Ｓ）に置換されている配列である。したがって、配列番号１２、２１または２５に実質的に相同な好ましい配列は、これらの置換の好ましくは一方を、より好ましくは両方を有し、最も好ましくはＳＹの代わりにＱＳのアミノ酸で始まる。配列番号１２、２１または２５を含むいずれの配列も、好ましくはこれらの置換の一方または両方を含む。したがって、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４または４６、４７〜５５、６７、７１、７５、７９、８３、８７、９１、９５または９９に実質的に相同な好ましい配列は、ＦＲ１の１番目のＳの代わりに別のアミノ酸、好ましくはＱ、および／またはＦＲ１の２番目のＹの代わりに別のアミノ酸、好ましくはＳを含む。したがって、配列番号１２の好ましいホモログは、Ｘ1Ｘ2ＶＬＴＱＰＰＳＡＳＧＴＰＧＱＳＶＴＩＳＣであり、Ｘはそれぞれ独立していずれのアミノ酸であってもよく（配列番号１２９）、好ましくは、Ｘ1はＱ、および／またはＸ2はＳである（配列番号１３０）。配列番号２１の好ましいホモログは、Ｘ1Ｘ2ＶＬＴＱＱＰＳＡＳＧＴＰＧＱＳＶＴＩＳＣであり、Ｘはそれぞれ独立していずれのアミノ酸であってもよく（配列番号１３１）、好ましくは、Ｘ1はＱ、および／またはＸ2はＳである（配列番号１３２）。
【００８５】
このことは、本明細書に開示したＶＬ、ｓｃＦｖおよびＩｇＧの配列に必要な変更を加えて適用される。したがって、ＦＲ１配列を含む本明細書に開示したいずれの配列も、好ましくは、表１〜９に挙げた対応するＦＲ１配列の代わりに配列番号１２９〜１３２のうちの１つ以上を含む。
【００８６】
実質的に相同な配列の他の好ましい例は、開示したＣＤＲ領域の１つ以上に、変更したアミノ酸を１つ、２つ、３つまたは４つまで、好ましくは１つまたは２つまで含む配列である。
【００８７】
そのような実施形態の全てにおいて、そのような変更は保存的アミノ酸置換であっても非保存的アミノ酸置換であっても、またはその両方であってもよく、好ましくは、変更は保存的アミノ酸置換である。したがって一実施形態では、変更したアミノ酸は全て、保存的置換である。
【００８８】
本明細書で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似した側鎖をもつ別のアミノ酸残基で置き換わっている置換である。類似した側鎖をもつアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において定義されており、それらには、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
【００８９】
相同性はいかなる適切な方法で評価することもできる。しかしながら、配列間の相同性の程度を決定するには、配列の多重アラインメントを作成するコンピュータープログラム、例えばＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）が有用である。必要に応じて、Ｃｌｕｓｔａｌ  ＷアルゴリズムをＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  １９９２）および１０のギャップ開始ペナルティーおよび０．１のギャップ拡張ペナルティーと共に使用することができ、その結果、一方の配列の全長の少なくとも５０％がアラインメントに含まれる状態で、２つの配列間の一致が最も高くなる。配列をアラインメントさせるために使用することができる他の方法は、２つの配列間の一致が最も高くなるように、かつ、２つの配列間で同一のアミノ酸の数が決定されるようにＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）によって改変された、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）のアラインメント方法である。２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージを計算するための他の方法は、当技術分野で一般的に認知されており、そして、それらには、例えば、Ｃａｒｉｌｌｏ  ａｎｄ  Ｌｉｐｔｏｎ（１９８８）に記載されるもの、およびＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  ｅ．ｄ．  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８，  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓに記載されるものが含まれる。
【００９０】
一般に、そのような計算にはコンピュータープログラムが使用される。配列を比較し、配列対を整列させるプログラム、例えばＡＬＩＧＮ（Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，１９８８）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８；Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０）およびｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、またはＧＣＧ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４）もまたこの目的にとって有用である。さらに、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのＤａｌｉサーバーは、タンパク質配列の構造に基づくアラインメントを提供している（Ｈｏｌｍ、１９９３；１９９５；１９９８）。
【００９１】
基準点を設けることで、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性、配列同一性などを有している本発明に従う配列がＡＬＩＧＮプログラムを初期設定パラメーターと共に用いて（例えば、ＧＥＮＥＳＴＲＥＡＭネットワークサーバー、ＩＧＨ、モンペリエ、フランス、で利用可能）決定され得る。
【００９２】
用語「実質的に相同」とは、本発明のタンパク質または核酸分子と実質的に同じ機能を、実質的に同じ方法で実行する、本発明のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の修飾型または化学的均等物も含む。
【００９３】
いずれの実質的に相同な抗体も、ＣＣＲ４に、好ましくは問題の抗体によって認識されるのと同じＣＣＲ４のエピトープ、例えば、本明細書に記載の本発明のＣＤＲドメインまたは本発明のＶHおよびＶLドメインによって認識されるものと同じエピトープまたは同じ抗原に対する特異的な結合能を保持しているものとする。当技術分野で周知の、かつ、記載されている方法、例えばエピトープマッピングまたは結合アッセイ、例えば競合アッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＢＩＡｃｏｒｅアッセイを用いる方法によって、同じエピトープ／抗原に対する結合を容易に試験することができる。したがって、抗体２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３それぞれと同じ結合特性を持つ他の抗体や抗体断片の同定に結合アッセイを使用できることを、当業者は理解する。以下に例示するように、そのような他の抗体の同定に競合結合アッセイを使用することができる。以下に記載する方法は、適切な競合アッセイのうちのただ１つの例である。当業者は他の適切な方法や変異型を知る。
【００９４】
好ましくは、いかなる実質的に相同な抗体も、抗体の機能、例えば本明細書の他の場所で定義した抗体の機能を保持するものとする。機能特性の保持は、当技術分野で周知の、かつ、記載されている方法で容易に試験することができる。
【００９５】
いくつかの実施形態において実質的に相同な配列は、本明細書に開示した配列と比較して、以下の部位のうちの１つ以上を欠損している。
−脱アミド化および／またはグリコシル化などの翻訳後修飾を受けやすい配列；
−タンパク質分解を受けやすい配列；および／または
−ヒトＭＨＣクラスＩＩ受容体、すなわちＴ細胞エピトープに結合することができる配列。
【００９６】
例えば、脱アミド化やグリコシル化などの翻訳後修飾やタンパク質分解に対する抗体配列の感受性、および／またはヒトＭＨＣクラスＩＩ受容体への結合を判定するために、インシリコ試験を実施してもよい。ヒトＭＨＣクラスＩＩ受容体への結合は、ヒトにおいてＴ細胞応答を引き起こす場合があるため、潜在的なＴ細胞エピトープを特定することは有用であり得る。翻訳後調節もしくはタンパク質分解を受けやすい部位であるか、またはＴ細胞エピトープだと推定されたアミノ酸またはペプチド配列をその後、修飾して感受性を変化させてもよい。したがって、実質的に相同な配列はそのような修飾を１つ以上含んでいてもよい。
【００９７】
Ｔ細胞エピトープに関する試験には例えば、ｉＴＯＰＥ（商標）（Ａｎｔｉｔｏｐｅ、ケンブリッジ、英国）と呼ばれるプログラムが含まれ得る。ｉＴｏｐｅ（商標）は、ペプチドの３４ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子への結合をモデル化する、分子モデル化技術である。ペプチド結合に対する個々のアミノ酸の貢献度を各対立遺伝子について決定することができ、これによって、ＭＨＣクラスＩＩの結合溝と相互作用する９ｍｅｒ配列の正確な位置に関する情報が提供される。
【００９８】
あるいはまたはそれに加えて、抗体の可変領域中のＴ細胞エピトープを同定し、そして、共通モチーフを同定するためにＢＬＡＳＴ検索によってデータを調べることができるＴＣＥＤ（Ｔ細胞エピトープデータベース）プログラム（Ａｎｔｉｔｏｐｅ、ケンブリッジ、英国）を使用して配列を解析してもよい。
【００９９】
標準的な技法を用いてエピトープマッピングを行うことができる。例えば、エピトープを同定し、定義付けるための以下の方法を本明細書で説明する。ＣＣＲ４のアミノ酸配列は既に分かっているため、エピトープマッピング、例えばＰｅｐｓｃａｎアッセイを使用したエピトープマッピングに合成ペプチドを使用することができる。部位特異的突然変異生成もまた、エピトープマッピングの強力なツールであり、免疫複合体の形成における単一のアミノ酸の役割を評価するために利用することができる。タンパク質フットプリント法は、エピトープが抗体−抗原複合体として結合しているとき、エピトープは切断から保護されるという事に依存する。酵素免疫抗体法（ＥＬＩＳＡ）および血液凝集反応およびスロットブロット法もまた、エピトープマッピングに使用することができる。非直鎖状エピトープをマッピングするために抗体と抗原の結晶化を用いることができる。そのような方法を実施するためのプロトコルは広く利用可能であり、当業者は、エピトープマッピングの適切な別の方法を知る。
【０１００】
フローサイトメトリーを使用した競合アッセイを行う前に、被検抗体の一部を、例えばビオチン化することで標識しなければならない。ビオチン化産物の機能性（細胞結合特性の保持）と、一定数のＣＣＲ４+細胞に対して最大に近い結合を示す本発明のビオチン化抗体（Ａｂ１）の最小濃度を決定する。対数増殖期の培養細胞から、合計１０6個の細胞を回収し、様々な濃度の抗体と、適切な期間、適切な温度で、例えば１時間、４℃でインキュベートする。細胞を洗浄し、適切な検出抗体と共に、適切な期間、適切な温度で、例えばさらに１時間、４℃でインキュベートする。洗浄した後、細胞をフローサイトメトリーで分析する。各被検抗体について、抗体濃度に対する蛍光強度の中間値（ＭＦＩ）をプロットすることにより、データから飽和曲線を作成する。
【０１０１】
競合アッセイのため、上述のようにＣＣＲ４+細胞を調製し、一定の濃度の標識化（ビオチン化）抗体（ｂｉｏ−Ａｂ１）と様々な濃度の標識していない競合抗体との混合物でＣＣＲ４+細胞を２組処理することができる。一定の濃度とは、一定数の腫瘍細胞に対して妥当な蛍光シグナルを生成する、上述のように決定した抗体の最小濃度である。理想的には、ナノモルの単位のこの一定の濃度は、平衡時の処理抗体の親和性（ＫD）より低い。この場合、記載される方法を使用して、競合抗体の親和性を推定することができる（Ｓｃｈｏｄｉｎ  ａｎｄ  Ｋｒａｎｚ，  １９９３，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：２５７５５−７）。抗体混合物を、標的細胞と共に、適切な期間、適切な温度で、例えば１時間、４℃でインキュベートする。細胞を洗浄し、ＦＩＴＣで標識したストレプトアビジンと共にインキュベートすることで、ビオチン化抗体の細胞結合を明らかにする。それぞれの被検試料について測定した蛍光の中間値（ｂｉｏ−Ａｂ１＋Ａｂ２）からバックグランドの蛍光（ＰＢＳ−５％ＦＣＳ）を引いた後、各Ａｂ２濃度「ｃ」の阻害（％）を、阻害（％）＝（１−ＭＦＩbio-Ab1+Ab2「c」／ＭＦＩbio-Ab1）×１００の式にしたがって計算する。
【０１０２】
全ての実施形態において、実質的に相同な配列を含む抗体は、ＣＣＲ４に結合する機能とＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣのＣＣＲ４への結合を阻害する機能を保持している。
【０１０３】
本発明の他の実施形態は、ＣＣＲ４に結合し、かつ、ＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣのＣＣＲ４への結合を阻害する機能を有する結合タンパク質であって、本発明の抗体、本発明のＶHまたはＶLドメイン、または本発明のＣＤＲの１つ以上を含む結合タンパク質を提供する。好ましい実施形態では、そのような結合タンパク質は抗体である。
【０１０４】
本発明の好ましい抗体は、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの重鎖可変領域とおよび３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域を含む。これらのＣＤＲの例示的な配列と好ましい配列を本明細書に記載する。
【０１０５】
本明細書で使用する場合、略語「ＣＣＲ４」は、特段の指定のない限りまたは科学的用語法から明かでない限り、ＣＣケモカイン受容体４（ＣＤ１９４としても知られている）を意味する。ＣＣＲ４は遊離しているＣＣＲ４、例えば組換えたまたは精製したＣＣＲ４であってもよいが、好ましくは天然の状態で、例えば細胞表面上に存在する。
【０１０６】
本発明の抗体または結合タンパク質はまた、ＣＣＲ４の断片に、具体的には、細胞外ドメインを含むもしくは細胞外ドメインからなる断片に結合することもでき、またはＣＣＲ４もしくはＣＣＲ４断片を含むものに結合することができる。実際に、本発明の抗体のエピトープはＣＣＲ４の細胞外ドメインに局在している。
【０１０７】
「ＣＣＲ４」はいずれの型のＣＣＲ４をも、具体的には、哺乳類に種を越えて保存されているＣＣＲ４を指す。したがって、本発明の抗体または抗体断片は例えば、ヒト、サル（例えばカニクイザル）、ウシ（ウシ科）、マウス、ラット、ハムスター、フェレット、モルモットおよび／またはウサギのＣＣＲ４に結合し得る。好ましくは、本発明の抗体または抗体断片は、少なくともヒトＣＣＲ４に結合する。したがって、特段の指定のない限り、「ＣＣＲ４」に関する本明細書中の言及はいずれも、「ヒトＣＣＲ４」を意味するとみなされ得る。特に好ましい実施形態では、本発明の抗体または抗体断片は、少なくともヒトおよびサル（例えばカニクイザル）のＣＣＲ４に結合する。他の好ましい実施形態では、本発明の抗体または抗体断片は、少なくともヒトおよびマウスのＣＣＲ４に結合する。他の好ましい実施形態では、本発明の抗体または抗体断片は、少なくともヒト、サルおよびマウスのＣＣＲ４に結合する。他の好ましい実施形態では、本発明の抗体または抗体断片は、少なくともヒト、サル、モルモットおよびマウスのＣＣＲ４に結合する。いくつかの好ましい実施形態では、本発明の抗体または抗体断片は、少なくともヒトおよびサルのＣＣＲ４に結合するが、マウスのＣＣＲ４には結合しない。他の好ましい実施形態では、本発明の抗体または抗体断片は、ヒトおよびサルのＣＣＲ４に結合するがマウスのＣＣＲ４には結合せず、例えばヒトおよびサルのＣＣＲ４のみに結合する。
【０１０８】
本発明の抗体がヒトおよびサルのＣＣＲ４に結合すること、および本発明の抗体がマウスのＣＣＲ４に結合する能力も有することが実施例で示されている。
【０１０９】
本明細書で使用する場合、本発明の抗体または抗体断片に関する「ＣＣＲ４に結合する」または「抗ＣＣＲ４」という用語は、以下に示す事柄の１つ以上が可能な、好ましくは以下に示す事柄の２つ以上が可能な、最も好ましくは以下に示す事柄の全てが可能な抗体または抗体断片を意味する。
（ａ）細胞の表面上に発現しているＣＣＲ４に結合する。これは例えばフローサイトメトリーまたは免疫組織化学で評価される。
（ｂ）構造依存性の（例えば非直鎖状の）ＣＣＲ４エピトープに結合する。これは例えば非還元条件下でのウェスタンブロットによるＣＣＲ４への結合によって評価される。
（ｃ）遊離しているＣＣＲ４、例えば組み換えによって固相担体上で発現しているＣＣＲ４に結合する。これは例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＢＩＡｃｏｒｅアッセイで評価される。
（ｄ）少なくともヒトＣＣＲ４に、より好ましくはヒトおよびサルのＣＣＲ４に、もしくはヒトおよびマウスのＣＣＲ４に、最も好ましくはヒト、サルおよびマウスのＣＣＲ４に結合する、またはヒトおよびサルのＣＣＲ４に結合するがマウスＣＣＲ４には結合しない。
（ｅ）本明細書の他の部分でも論ずるように説明したように、ヒトのＣＣＲ４に１０ｎＭ以下の結合親和性（Ｋｄ）で、好ましくは５ｎＭ以下、より好ましくは３ｎＭ以下または２ｎＭ以下、最も好ましくは１ｎＭ以下の結合親和性で結合する。
（ｆ）本明細書の他の部分でも論ずるように、同程度の親和性で、例えば１０ｎＭ以下、好ましくは５ｎＭ以下、より好ましくは３ｎＭ以下または２ｎＭ以下、例えば１ｎＭ以下のＫｄで、ヒトおよびサルのＣＣＲ４に、またはヒトおよびマウスのＣＣＲ４に結合する、好ましくはヒトおよびサルのＣＣＲ４に結合するがマウスＣＣＲ４には結合しない。
（ｇ）本明細書の他の部分で説明するように、ＣＣＲ４+細胞のＡＤＣＣを誘導する。
（ｈ）ＣＣＲ４の、少なくともＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣへの、好ましくはＭＤＣおよびＴＡＲＣへの、または好ましくは、少なくともＭＤＣおよび／もしくはＴＡＲＣとＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１およびＭＩＰ−１αから選択される１つ以上への結合を阻害する。
（ｉ）インビボで抗腫瘍効果を誘導する。
（ｊ）腫瘍をもつ動物に投与すると、腫瘍に局在する。
（ｋ）ＣＣＲ４+細胞のＣＤＣを誘導する。
（ｌ）ＣＣＲ４リガンドに対するＣＣＲ４介在性の細胞応答を阻害する。好ましくはＣＣＲ４リガンドに応答した、細胞内のカルシウムイオン濃度の上昇を阻害する。
（ｍ）ＣＣＲ４リガンド（ＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣなど）に対する、ＣＣＲ４+細胞の走化性を抑制する。
【０１１０】
ＣＣＲ４+細胞への結合に関して、本発明の抗体はＣＣＲ４+細胞に結合するが、ＣＣＲ４-細胞には有意に結合しないことと理解されるべきである（実施例２に示す）。
【０１１１】
「ＣＣＲ４-細胞に有意に結合しない」という用語は、ＣＣＲ４-細胞に対する抗体のいかなる結合も、前記抗体の治療または診断目的での使用を妨げるものではないことと理解される。したがって、「有意でない」ＣＣＲ４-細胞への結合は、ＣＣＲ４-細胞に対する抗体の結合が１つ以上のＣＣＲ４+細胞に対する結合よりも弱いことを意味する。そのため、わずかに正常な細胞との交差反応が生じる可能性があるが、このレベルの結合は「バックグランド」結合と見なされる。治療または診断の目的では、治療または診断目的で使用する際に抗体が接触する可能性のあるいずれのＣＣＲ４-細胞とよりも、１つ以上の型のＣＣＲ４+細胞と抗体がより強く結合しなければならないということが、主な課題である。
【０１１２】
本発明の抗体は、「ＣＣＲ４特異的」とも称され得る。「ＣＣＲ特異的」という用語は、ＣＣＲ４を発現している細胞に対する抗体の結合が充分に特異的で、前記抗体を治療または診断目的で使用することができることと解釈されるべきである。標的のＣＣＲ４+細胞に対する結合強度を１つ以上の型のＣＣＲ４-細胞、例えば野生型（すなわちＣＣＲ４で形質転換していない）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＤＴ４０細胞に対する結合強度を比較することで、当業者は、任意の所定の抗体がＣＣＲ４特異的かどうかを容易に決定することができる。
【０１１３】
ＣＣＲ４-細胞と比較したＣＣＲ４+細胞への結合を、例えばフローサイトメトリーを使用して評価してもよいことを当業者は理解し、適切な例を実施例２で記述する。
【０１１４】
当技術分野で周知の免疫組織化学技術を利用して、細胞または試料に対する抗体の結合を点数化してもよい。そのような技術を使用して、特定の抗体の特異性を試験しても、または組織試料中のＣＣＲ４の発現を検出してもよい。簡単に説明すると、例えば、陽性対照（ＣＣＲ４陽性であることが分かっている細胞）と陰性対照（ＣＣＲ４陰性であることが分かっている細胞）を含むヒト組織の高密度アレイ上で、抗体を試験することができる。メンブレンの染色強度を４段階（０、１、２、３）の目視検査で評価することができる。好ましい抗体は、ＣＣＲ４+の組織に対して低いまたは高い点数、好ましくは高い免疫組織化学的な点数を示す。
【０１１５】
ＣＣＲ４抗体のＣＣＲ４陽性細胞株（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ）に対する結合が、ヒト血清の濃度を上昇させても阻害されないことが実施例で示される。したがって本発明の抗体は、好ましくは、血清が存在してもＣＣＲ４に結合することができ、その結合は血清によって有意には阻害されない。
【０１１６】
実施例２で試験した、様々なＣＣＲ４+細胞株に対する本発明の抗ＣＣＲ４抗体の結合プロファイルは、いくつかのＣＣＲ４+細胞株に対する結合が、他のＣＣＲ４+細胞株に対する結合よりも強いことを示している。例えば、Ｌ−４２８に対する結合はＣＣＲＦ−ＣＥＭに対する結合よりも弱い。理論に捉われるつもりはないが、このことは、Ｌ−４２８がＣＣＲ４のリガンドであるＴＡＲＣを分泌しているため、ＣＣＲ４結合部位をめぐって、本発明の抗ＣＣＲ４抗体がそのリガンドと競合しているためであると考えられている（実施例３を参照のこと）。そのため、ＣＣＲ４リガンドを分泌しない細胞を用いて、ＣＣＲ４への結合が最もよく分析される。
【０１１７】
本発明の抗ＣＣＲ４抗体の結合プロファイルは、ＫＷ０７６１の結合プロファイルと異なる。理論に捉われるつもりはないが、このことは、これらの抗体のエピトープ結合部位が異なるためであると考えられる（実施例４に概要を示す）。ＫＷ０７６１はＣＣＲ４とＴＡＲＣの結合を阻害しないため、ＫＷ０７６１はＬ−４２８から分泌されたＴＡＲＣとは競合しない。
【０１１８】
さらに、ＥＣ５０値を決定した（データは示さない）。ＥＣ５０値は細胞株ごとに多様であり、このことは、細胞表面でのＣＣＲ４の発現が、それぞれの細胞型によって異なるためであると考えられる。
【０１１９】
種間での交差反応性を、既知の方法、例えば、ヒトＣＣＲ４と別の種に由来するＣＣＲ４でそれぞれ形質転換した細胞を使用するフローサイトメトリーによって評価することができる。適切なアッセイを実施例８に示す。実施例８では、本発明の抗体がヒト、サル、およびマウスのＣＣＲ４に結合可能であることを示している。
【０１２０】
ＣＣＲ４のそのリガンドであるＴＡＲＣおよびＭＤＣへの結合を、抗体２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３が阻害可能であることを示した（実施例３）。したがって、本発明の抗体は、好ましくは、ＣＣＲ４がその１種以上のリガンドに結合するのを阻害することができる。好ましくは、少なくともＭＤＣに対する結合が阻害される。より好ましくは、ＭＤＣおよびＴＡＲＣに対する結合が阻害される。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ４のＴＡＲＣへの結合が阻害される。本明細書に開示したいずれの態様の実施形態では、本発明の抗体は、ＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣのＣＣＲ４への結合を阻害することができる。
【０１２１】
リガンドのＣＣＲ４への「結合の阻害」とは、抗体が存在する場合のリガンドのＣＣＲ４に対する結合が、抗体が存在しない場合の結合と比較して、少なくとも２０、３０、または４０％、より好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０または７５％、さらに好ましくは少なくとも８０％低下することを意味する。リガンドのＣＣＲ４に対する結合が、少なくとも８５、９０または９５％低下する実施形態も考えられる。別の見方では、まずリガンドをＣＣＲ４と接触させ、その後抗体を加えると、リガンドは、抗体のＣＣＲ４への結合を阻害することができる。
【０１２２】
抗体がリガンドのＣＣＲ４への結合を阻害することができるか否かを決定するためのアッセイはよく知られており、好適なアッセイを実施例３で説明する。簡単に説明すると、ＣＣＲ４+細胞にＡｌｅｘａ６４７で標識したＭＤＣ−ＳＮＡＰを加えてまたは加えずにインキュベートし、次いで抗体を加えた。ＭＤＣ複合体の存在下でのプレインキュベーションにより、抗体のＣＣＲ４への結合が低下することになった。特に、ＭＤＣ（または適切なＭＤＣ複合体）を加えてプレインキュベートされたＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ＣＣＲ４を天然に発現している）への抗体の結合が阻害された。
【０１２３】
リガンドのＣＣＲ４への結合を、抗体が阻害することができるか否かを決定するための別のアッセイとしては、標識したリガンド、例えば放射製標識したリガンドまたはビオチン化リガンドの使用、およびフローサイトメトリーを使用した解析が挙げられる。
【０１２４】
ＭＤＣに関して、この因子がＣＣＲ４以外の少なくとも１つのＧＰＣＲ受容体と高い親和性で結合可能であることに注意されたい。例えば、ＭＤＣがＧＰＣＲ受容体Ｄ６と結合することが報告されており（Ｇｒａｈａｍ，２００９；Ｌｏｃａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、このことが結合アッセイの結果に影響を及ぼす可能性がある。
【０１２５】
本発明の抗体は、好ましくは、ＣＣＲ４リガンドに応答したＣＣＲ４介在性の細胞応答を阻害することができる。具体的には、ＣＣＲ４リガンドに応答した細胞内のカルシウムイオン濃度の上昇を阻害することによって、ＣＣＲ４リガンドに応答したＣＣＲ４介在性の細胞応答を阻害することができる。
【０１２６】
具体的には抗体は、好ましくは、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１１９）でのＭＤＣ誘発性カルシウム流動および／またはＴＡＲＣ誘発性カルシウム流動を阻害できるものである。適切なアッセイ法は既知であり、例を実施例５で説明する。
【０１２７】
他の好ましい特徴としては、本発明の抗体を投与してもインビボで有意な毒性がないこと、および他の副作用がインビボで有意にないことが挙げられる。
【０１２８】
いくつかの実施形態において抗体は、ＣＣＲ４リガンド（ＭＤＣまたはＴＡＲＣなど）へのＣＣＲ４+細胞の走化性を抑制し得る。このことを実施例６で示した。
【０１２９】
いくつかの実施形態において抗体は、ＣＣＲ４+細胞の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導し得るが、他の実施形態では、抗体はＣＤＣを誘導することができない。いくつかの実施形態では、抗体はＣＣＲ４+細胞のアポトーシスを誘導し得るが、他の実施形態では抗体はアポトーシスを誘導することができない。いくつかの実施形態において抗体は、ＣＣＲ４に結合するとＣＣＲ４+細胞の内部に取り込まれ得るが、他の実施形態では、有意な内部移行は起こらない。
【０１３０】
アポトーシスの誘導は、よく知られている標準的な方法、例えば、アネキシンＶ染色を調べる方法によって評価することができる。簡単に説明すると、細胞を抗体と共に適当な期間、例えば２４時間インキュベートしてもよく、細胞を回収し、アネキシンＶで染色した後、ＦＡＣＳ解析（例えばＥａｓｙＣｙｔｅを利用して）でその効果を測定することができる。
【０１３１】
ＣＤＣの誘導は、よく知られている標準的な方法、例えば、アラマーブルーなどの酸化還元色素の取り込みと代謝に基づく生存細胞の相対数を測定する方法を用いて評価することができる。適切なアッセイが、Ｈ  Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １９９７，  ２８；２０２（２）：１６３−７１に開示されている。
【０１３２】
当業者は、内部移行を試験する適切な方法、例えばフローサイトメトリーまたは共焦点顕微鏡で温度差蛍光標識（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）を使用する方法を知っている。適切なアッセイの例としては、ｐＨ感受性色素（ＣｙｐＨｅｒ５Ｅなど）で標識した二次抗体があり、これは（細胞の外側で見られるような）塩基性のｐＨでは最低限の蛍光しか発しないが、（細胞の内側で見られるような）酸性のｐＨでは最も強い蛍光を発する。
【０１３３】
走化性の抑制は、標準的な方法、例えばトランスウェルアッセイを使用して評価することができる。簡単に説明すると、走化性を示すことができ、かつ、ＣＣＲ４を発現する細胞を、１つのチャンバー内で抗体と接触させる。適当な大きさの細孔をもつ膜フィルターで第一のチャンバーとしきられている別のチャンバーにＣＣＲ４のリガンド（例えばＭＤＣ）を入れる。抗体の存在下での走化性と抗体の非存在下での走化性を比較することで、細胞のリガンドへの遊走（走化性）に及ぼす抗体の効果を決定する。実施例６で適切な方法を説明する。
【０１３４】
ＣＣＲ４「リガンド」という用語は、ＣＣＲ４の天然のリガンド（例えばＭＤＣ、ＴＡＲＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１および／またはＭＩＰ−１α）を含み、これらは天然に生産されたものであっても、組換えによって発現させたものであっても、または研究室内で合成してものであってもよい。
【０１３５】
「ＣＣＲ４+細胞」は、細胞表面にＣＣＲ４を、好ましくは、少なくとも実質的に野生型構造のＣＣＲ４を発現している細胞を意味する。ＣＣＲ４+細胞は天然でＣＣＲ４陽性であってよく、または組換えＣＣＲ４を発現する形質転換体であってよい。ＣＣＲ４+には特に、固形腫瘍細胞、血液系腫瘍の細胞および／またはＴregが含まれる。ＣＣＲ４+細胞の、特にインビトロアッセイ用の好ましい例としては、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｌ−４２８、Ｈｕｔ７８、７８６−Ｏ、Ａ４９８およびＫａｔｏＩＩＩが挙げられる。
【０１３６】
したがって、本発明を踏まえると様々な抗ＣＣＲ４抗体を作成することができ、かつ、本明細書の他の部分で論じた任意の障害、特に癌、免疫疾患、炎症性障害および感染の治療を含む様々な実施形態において使用することができる。
【０１３７】
本願全体を通して使用されるように、用語「１つ（ａ）」および「１つ（ａｎ）」は、上限が具体的に示されている例を除き、参照されている要素または工程の「少なくとも１つ」、「少なくとも第一の」、「１つ以上」または「複数」を意味するものとして使用される。そのため、本明細書で使用する場合、１つの「抗体」は、「少なくとも第一の抗体」を意味する。当業者は、任意の単一の薬剤の量と同様に、利用可能な限度および組み合わせのパラメーターを、本開示を考慮することで理解する。
【０１３８】
本発明の好ましい実施形態は、少なくとも１つの本発明の抗ＣＣＲ４抗体またはその抗原結合断片を含む組成物である。
【０１３９】
本明細書で定義した本発明の抗体またはその一部分もしくは断片をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらに実質的に相同な核酸分子は本発明のさらなる態様を形成する。表に開示した核酸配列が好ましい。
【０１４０】
好ましい核酸分子は、配列番号４７（好ましくは配列番号５６もしくはそれに実質的に相同な配列でコードされている）、配列番号４８（好ましくは配列番号５７もしくはそれに実質的に相同な配列でコードされている）、配列番号４９（好ましくは配列番号５８もしくはそれに実質的に相同な配列でコードされている）、配列番号５０（好ましくは配列番号５９もしくはそれに実質的に相同な配列でコードされている）、配列番号５１（好ましくは配列番号６０もしくはそれに実質的に相同な配列でコードされている）、配列番号５２（好ましくは配列番号６１もしくはそれに実質的に相同な配列でコードされている）、配列番号５３（好ましくは配列番号６２もしくはそれに実質的に相同な配列でコードされている）、配列番号５４（好ましくは配列番号６３もしくはそれに実質的に相同な配列でコードされている）または配列番号５５（好ましくは配列番号６４もしくはそれに実質的に相同な配列でコードされている）に示すアミノ酸配列をコードしている配列を含む。
【０１４１】
他の好ましい核酸分子は、配列番号２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３もしくは４５、またはそれらに実質的に相同なアミノ酸配列（好ましくは配列番号１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５もしくは１１７のそれぞれ、またはそれらに実質的に相同な配列でコードされている）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）をコードしている配列、および／または、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４もしくは４６、またはそれらに実質的に相同なアミノ酸配列（好ましくは配列番号１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６もしくは１１８のそれぞれ、またはそれらに実質的に相同な配列でコードされている）を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードしている配列を含む。
【０１４２】
以下の組み合わせをコードしている核酸がより好ましい。配列番号２９と３０；または配列番号３１と３２；または配列番号３３と３４；または配列番号３５と３６；または配列番号３７と３８；または配列番号３９と４０；または配列番号４１と４２；または配列番号４３と４４；または配列番号４５と４６。以下の組み合わせを含む核酸分子もまた好ましい。配列番号１０１と１０２；または配列番号１０３と１０４；または配列番号１０５と１０６；または配列番号１０７と１０８；または配列番号１０９と１１０；または配列番号１１１と１１２；または配列番号１１３と１１４；または配列番号１１５と１１６；または配列番号１１７と１１８。
【０１４３】
前述のように、軽鎖のＦＲ１領域は１番目と２番目の位置にＱとＳの残基を含んでいてもよい。したがって好ましい核酸配列は、１番目と２番目の位置にＱとＳの残基を含む、ＶL５０３（配列番号４０）に実質的に相同なＶLをコードする配列を含むかまたはそのような配列からなる核酸配列であり、配列番号４０と比べた変化に下腺が引かれている以下に示す配列を好ましくは有する：
ＣＡＡＡＧＣＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＣＣＣＧＧＧＣＡＧＡＧＣＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＴＴＣＴＧＧＡＡＧＣＡＣＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＡＡＧＴＣＡＴＴＡＴＧＴＧＧＴＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＧＡＡＣＧＧＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＡＧＧＡＡＴＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＧＧＴＧＧＧＣＴＣＣＧＧＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＧＴＧＴＧＧＧＡＴＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡ（配列番号１３３）。
【０１４４】
他の好ましい核酸分子は、ＩｇＧ型の本発明の抗体、例えば、実施例１に記載されるようなもの、またはマウスキメラ型の本発明の抗体をコードしている配列を含む。
【０１４５】
先に示したように、本発明によって包含される他の核酸分子は本発明のヒト抗体の一部分または断片をコードしている核酸分子、例えば、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）をコードしている核酸分子または抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードしている核酸分子である。他の好ましい核酸分子としては、本発明の抗体の重鎖をコードしている核酸分子（例えば、配列番号６５、６９、７３、７７、８１、８５、８９、９３もしくは９７などの、それぞれ、配列番号６７、７１、７５、７９、８３、８７、９１、９５もしくは９９をコードしている核酸分子、またはそれらに実質的に相同な配列）または抗体の軽鎖をコードしている核酸分子（例えば、配列番号６６、７０、７４、８２、８６、９０、９４もしくは９８などの、それぞれ、配列番号６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、９６もしくは１００をコードしている核酸分子、またはそれらに実質的に相同な配列）がある。
【０１４６】
したがって、本明細書で定義する本発明の抗体の断片、またはそれらに実質的に相同な配列、またはそのような断片をコードしている配列を含む核酸分子は、本発明のさらなる態様を形成する。
【０１４７】
核酸配列との関連で本明細書において使用される場合、「実質的に相同な」という用語は、開示したアミノ酸配列または核酸配列に少なくとも７０％または７５％、好ましくは少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。したがって、本発明の実質的に相同な核酸配列は、本発明の配列に塩基の変化（付加、置換、挿入または欠失）が一つまたは複数入った配列を含む。
【０１４８】
好ましくは、本発明の抗体は、ＩｇＧ型の場合に、ＣＣＲ４に対する結合親和性が高く、例えばそれら抗体の結合親和性（Ｋｄ）は、１×１０-8Ｍの範囲または１×１０-9Ｍ以下の範囲となり得る。そのような親和性を有する抗体は、治療に有用であることが確立されている範囲の親和性をもつということが重要である。好ましくは、本発明の抗体はＩｇＧ型の場合に、Ｋｄが３０ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭまたは１０ｎＭ未満、より好ましくは１０、９．５、９、８．５、８、７．５、７、６．５、６、５．５、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５または１ｎＭ未満、最も好ましくは０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２または０．１ｎＭ未満に相当する、ＣＣＲ４への結合親和性を有する。
【０１４９】
いかなる適切な方法を使用してＫｄを決定してもよいが、好ましくは、様々な濃度の被検抗体を様々な濃度の抗原（ＣＣＲ４）に対してインビトロで試験し、例えばラインウィーバー・バーク法を用いて飽和曲線を生成するか、または、ＢＩＡｃｏｒｅ  １０００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアに入っている１：１結合モデルのような市販の結合モデルソフトウェアを使用してＫｄを決定する。ＣＣＲ+細胞に対するＩｇＧの力価測定から、ソフトウェアＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ、サンディエゴ、カリフォルニア）の「一部位特異的結合」モデルを使用して、Ｋｄ値を算出することができる。
【０１５０】
Ｋｄ値の決定に関しては、実験条件が見かけの結合親和性に影響を及ぼすことから、標的（例えばＣＣＲ４）を発現している細胞を使った結合実験から得た見かけのＫｄ値が親和性の絶対的な指標を示しているとは見なすことができないことを、当業者は理解している。例えば、ＣＣＲ４の発現レベルは細胞を培養した条件に依存する可能性があり、ならびに、細胞型の違いによっても変わる可能性がある。その結果、一連の実験の間に得られた見かけのＫｄ値同士を比較するのが最もよく、ある一連の実験の間に得られたＫｄ値と別の実験で得られたＫｄ値を比較することは、特に実験条件が著しく異なる場合には、常に適切だとは限らない。
【０１５１】
あるいは、細胞表面保持アッセイ（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８、Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｕｍｏｕｒ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｄｉａｂｏｄｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ７７：  １４０５−１２；  Ｌｅ  Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｄｉ−，  ｔｒｉ−  ａｎｄ  ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ１９：  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｖａｌｅｎｃｙ  ｏｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４５３：  １６４−８）を実行することによって、ＣＣＲ４陽性細胞表面での解離定数や抗体半減期を決定することができる。後者の方法の方が、治療条件下のヒト患者の本当の状況をより適切に模倣することができる。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体はヒトＣＣＲ４およびサルＣＣＲ４の両方に結合し得る。そのような種間の交差反応性、具体的にはヒトと前臨床段階動物モデルとして一般的に使用されている種との間のそのような交差反応性は、前臨床研究から臨床利用へのより効果的な転換を可能とするので、利点であり得る。例えば、使用された特定の動物モデルに存在する天然のＣＣＲ４と交差反応する抗体を有するということは、このモデルでの結果がヒト患者での状況を反映している可能性が高く、それによって、例えば、行われる投与のより正確な評価が可能となり、そして、どのような潜在的に関連する、または、問題となる副作用でも特定する見込みが増すことを意味する。例えば、本発明の抗体がヒトＣＣＲ４およびサルＣＣＲ４の両方に結合する能力を有するということは、そのような抗体を前臨床毒性試験で試験して、その治療の有害事象を評価し、そして、適切な耐用量を見つけることができることを意味する。
【０１５３】
さらに，ヒトＣＣＲ４およびマウスＣＣＲ４の両方に結合できるということは、マウスモデル、例えば、免疫適格マウスを使用するマウス同系モデルにおいてそのような本発明の抗体によって示された結果が、ヒト対象での抗体の活性を表している可能性がより高いことを意味する。これは、ヒトＣＣＲ４には結合できるがマウスＣＣＲ４には結合できない抗体は、マウスモデル内でヒトの腫瘍細胞が発現しているＣＣＲ４には結合するが、内在性のマウスＣＣＲ４には結合できないためである。これは、その腫瘍が発現しているＣＣＲ４と内在性のＣＣＲ４が存在するであろうヒト患者の状況とは言うまでもなく異なる。
【０１５４】
このことは特に、マウスＣＣＲ４とヒトＣＣＲ４に対する抗体の親和性が類似している場合について言える。
【０１５５】
そのような状況に欠点があるとすれば、ヒトＣＣＲ４には結合するがマウスＣＣＲ４には結合しないか、またはマウスＣＣＲ４に対する親和性が著しく低い抗体は、免疫不全マウス（例えば、ヌードマウスもしくはＳＣＩＤマウス）のヒト腫瘍異種移植モデルでは良好に機能するかもしれないが、より多くのＣＣＲ４が存在するヒト系では、同じような成績によってこれが反映されることはないかもしれないということである。言い換えれば、ヒトＣＣＲ４には結合できるがマウスＣＣＲ４には結合できない抗体によるマウス異種稙片系での抗腫瘍効果は、臨床における実際よりも良く見える可能性があるということである。対照的に、ヒトＣＣＲ４とマウスＣＣＲ４の両方に結合できる抗体を用いて作業する場合、抗体はマウスモデル系に存在する全ての型のＣＣＲ４に結合し、かつ、抗体がヒトに投与される時の状態をより表している可能性がある。これは特に、マウスＣＣＲ４とヒトＣＣＲ４に対する抗体の親和性が類似している場合について言える。
【０１５６】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ヒトＣＣＲ４とサルＣＣＲ４に、またはヒトＣＣＲ４とマウスＣＣＲ４に同程度の親和性で、例えば１０ｎＭ以下または５ｎＭ以下、より好ましくは３ｎＭ以下または２ｎＭ以下、最も好ましくは１ｎＭ以下のＫｄで結合する。
【０１５７】
「同程度の親和性」とは、ヒトＣＣＲ４と他の目的の種（例えば、サルまたはマウス）のうちの１種以上に対する抗体の結合親和性が同等である、例えば、係数の違いが２０以下であるという意味でもある。より好ましくは、結合親和性の係数の違いは１５未満、より好ましくは１０未満、最も好ましくは５、４、３または２未満である。
【０１５８】
しかしながら他の実施形態では、本発明の抗体は、サルＣＣＲ４に結合しない場合も、および／またはマウスＣＣＲ４に結合しない場合もある。
【０１５９】
本発明の抗体はＣＣＲ４に結合する。したがって、本発明の抗体または結合タンパク質を使用して、ＣＣＲ４を、具体的にはＣＣＲ４+細胞をインビボまたはインビトロで検出することができる。例えば、ＣＣＲ４は特定の腫瘍細胞で発現するため、本発明の抗体または結合タンパク質を使用して、インビボまたはインビトロで腫瘍細胞を検出することができる。加えて、抗体がＣＣＲ４+細胞に局在する能力を有するということは、本発明の抗体が、ＣＣＲ４+細胞が存在している体の部位を標的とし、抗体がその標的部位で作用することができることを意味している。具体的には、抗体がＣＣＲ４+腫瘍細胞に局在する能力を有するということは、本発明の抗体が体のＣＣＲ４+腫瘍細胞が発現している部位を標的とし、抗体がその標的部位で作用することを意味している。
【０１６０】
例えば抗体は、抗ＣＣＲ４+細胞効果それ自体を誘導する可能性がある。すなわち裸の抗体として、例えばＡＤＣＣを活性化するまたは誘導することによって、抗ＣＣＲ４+細胞効果を誘導する可能性がある。裸の抗体として作用するこの能力は長所である。あるいは、またはこれに加えて、抗体は、さらなる治療分子、例えば本明細書に記載の毒素または他の抗癌分子または抗炎症剤に複合体化されることによって、抗ＣＣＲ４+細胞効果を誘導することができる。
【０１６１】
本発明の抗体は、好ましくは、ＣＣＲ４+細胞の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を引き起こす能力を有する。ＡＤＣＣは、当技術分野で良く知られている方法によってインビトロで試験することができる。例えば、ヒトＰＢＭＣ存在下でのＣＣＲ４+細胞株（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ）の殺滅を試験してもよい。例えば、クロム−５１放出アッセイを用いることができる。したがって本発明の抗体はインビトロで、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２２％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％のＣＣＲ４+細胞の殺滅を、例えばヒトＰＢＭＣ存在下で誘導する可能性がある。ＡＤＣＣはいくつかの用途において、特にいくつかの治療用途で有利になる。したがって、好ましい実施形態において抗体は、ＣＣＲ４+細胞、好ましくはＣＣＲ４+腫瘍細胞および／またはＣＣＲ４+Ｔｈ２細胞のＡＤＣＣを誘導することができる。いくつかの実施形態では、抗体介在性ＡＤＣＣはＰＢＭＣ存在下におけるものであるが、ＰＢＭＣが存在しない場合の抗体介在性ＡＤＣＣの実施形態も考えられる。本発明の抗体がＣＣＲ４+細胞のＡＤＣＣを誘導できることを、実施例９に示した。結果は、本発明の抗ＣＣＲ４抗体が、標的とした３種全ての細胞株について、ヒトＰＢＭＣ存在下でＡＤＣＣを誘導することができることをはっきりと示している。ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞で試験した場合、抗体５０３のＥＣ５０が５．３ｐＭであり、ＫＷ０７６１のＥＣ５０が３１５ｐＭであることが分かった。加えて、本発明の抗ＣＣＲ４抗体は、単離したＴreg細胞についてＡＤＣＣを誘導しようとした場合に、同等の最大殺滅活性を示した。
【０１６２】
本発明の抗体は、好ましくは、そのようなレベルのＡＤＣＣを達成するのに必要な抗体濃度の点においても、適切な能力をもつことが示される。したがって、ＣＣＲ４+細胞、例えばＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞のインビトロでの５０％細胞溶解濃度（ＥＣ50）に必要となる抗体濃度は、好ましくは７００ｎｇ／ｍｌ、６５０ｎｇ／ｍｌ、６２０ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、５５０ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、４５０ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、３５０ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、４６ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌまたは０．２５ｎｇ／ｍｌ未満である。
【０１６３】
上述した能力は、好ましくは適切な対照レベルと比較した場合に、測定可能なまたは有意なレベルで、より好ましくは統計的に有意なレベルで観察される。
【０１６４】
様々な提供源から調製したＰＢＭＣ（エフェクター細胞）は、非特異的なおよび特異的な腫瘍細胞の溶解度、ならびにＥＣ５０値に関して、著しく多様なＡＤＣＣを示す可能性があることに注意されたい。この現象は、Ｎａｕｎｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００２に説明されている。
【０１６５】
ヒトＩｇＧ１は、Ｆｃ領域に結合した２本のＮ結合型オリゴ糖鎖を有する糖タンパク質である。このオリゴ糖は、核となるフコースを含むもしくは含まないトリマンノシルコア構造、二つに分岐しているＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、および構造の多様性をもたらす末端シアル酸からなる、二分岐型の複合体である。ヒト血清ＩｇＧと治療用の抗体の両方が、高度にフコシル化されていると、通常、良く知られている。
【０１６６】
いくつかの例では、ヒトＩｇＧ１サブクラスのオリゴ糖の状態を操作することによって、ＡＤＣＣが亢進され得ることが報告されている。具体的には、脱フコシル化が、いくつかの抗体のＡＤＣＣ活性を高めることが分かっている（Ｎｉｗａ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。したがって、好ましい実施形態において本発明の抗体は、タンパク質が産生されている／発現している間に、および／または産生された／発現した後に、インビトロで修飾され、特定のグリコシル化パターン、特に、抗体の治療上の使用に有用なグリコシル化パターンを生じる。好ましくは、前記特定のグリコシル化パターンは、フコースベースのグリコシル化の低下または欠如であり、それは、好ましくは、抗体がＡＤＣＣを誘導する能力を高める。したがって、好ましい実施形態において本発明の抗体は、特定のグリコシル化パターン、好ましくは前記抗体のＡＤＣＣを誘導する能力を向上させる特定のグリコシル化パターンを有する。本発明の抗体は、脱フコシル化されている抗体であるか、またはフコシル化されていない抗体であることが好ましい。
【０１６７】
脱フコシル化抗体または非フコシル化抗体の好適な調製方法を当業者は分かっている。例えば、Ｉ型α−マンノシダーゼの選択的阻害剤であり、産生中の分子のフコシル化を低減させるキフネンシン（例えば１００ｎｇ／ｍｌ）存在下で抗体を産生することによって達成することができる。オリゴ糖部分のフコシル化に必要なタンパク質を１つ以上欠損している好適な宿主細胞、例えばフコース転移酵素欠損宿主細胞、を使用して脱フコシル化抗体を産生することができる。好適な宿主細胞の例としては、細胞内糖ヌクレオチド、すなわちＧＤＰ−フコースの合成に関わる酵素の活性および／またはＮ−グリコシド結合複合糖鎖中でフコースの１位が還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とα結合を介して結合している糖鎖の修飾に関わる酵素の活性が低下または欠如している細胞が挙げられる。そのような酵素の例としては、ＧＭＤ（ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ）、Ｆｘ（ＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ，４−レダクターゼ）、ＧＦＰＰ（ＧＤＰ−β−Ｌ−フコースホスホリラーゼ）を含む、ＧＤＰ−フコースの合成に関わる酵素が挙げられる。
【０１６８】
実施例２に記載したように、脱フコシル化した抗体３０６、４０６および５０３を、Ｉ型α−マンノシダーゼの選択的阻害剤であり、細胞培養中での産生中にＩｇＧのフコシル化を停止させるキフネンシンを加えて産生した。
【０１６９】
「脱フコシル化」とは、Ｆｃ領域に結合しているＮ−グリコシド結合複合糖鎖全体の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０、３０、４０  ５０、６０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または少なくとも９９％が、フコースがその糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンと結合していない糖鎖であることを意味する。「非フコシル化」とは、抗体中にフコースが有意なレベルで含まれないことを意味する。
【０１７０】
いくつかの抗体は、結合した細胞の中に移行することができる。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、抗体は内部移行することができる。抗体分子に結合した他の薬剤はいずれも、抗体分子と共に内部移行するため、この特徴は、免疫複合体で使用する場合に特に有用である。他の実施形態では、有意な内部移行は認められない。
【０１７１】
ＣＣＲ４が血小板で発現していること、およびそのリガンドであるＭＤＣとＴＡＲＣが血小板凝集を引き起こすことが分かっている。ＩｇＧ分子には２つのリガンド結合部位があり、２本のアームがそれぞれ別の血小板上にあるＣＣＲ４と結合することができる場合に、ＣＣＲ４を認識することができるＩｇＧが血小板間で交差反応する可能性があるため、このことが問題となる可能性がある。インビボでは血小板凝集が生じる場合がある。医療用途では特に、抗体が有意な血小板凝集を引き起こさないことが要求される。血小板凝集は、既知の方法でアッセイすることができる。本発明の抗体が血小板凝集に及ぼす影響を実施例１１に記載したように試験した。本質的には、抗体を単離した血小板のみと、または良く知られている凝集誘導物質であるＡＤＰ（Ｖａｒｏｎ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｔｒｅ  「Ａｎｔｉｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｇｅｎｔｓ」  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｄｕｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ．  ２６７−７２，  ２００９）も加えてインキュベートした。抗ＣＣＲ４抗体の血小板への結合を観察したが、抗体は血小板凝集については影響を及ぼさなかった。抗体は凝集を引き起こさなかったが、血小板凝集（例えばＡＤＰで誘導した血小板凝集）を阻害もしなかった。したがって、抗体は血小板凝集に関しては、何ら有意な影響を及ぼさない。
【０１７２】
上述のように、Ｔregを含む、あるＰＢＬはＣＣＲ４を発現するため、本発明のいくつかの実施形態において抗体は、ＰＢＬに、好ましくはＴregおよび／またはＴｈ２細胞に結合することができる。これによってＴreg細胞を枯渇させることができるため、この特徴は特に免疫治療において有利である。
【０１７３】
以下の組成物、免疫複合体、医薬品、組み合わせ、混合物、キット、第一のおよび第二の医学的用途、ならびに本発明に係る全ての方法に関する説明では、「抗体」および「免疫複合体」という用語、または抗体結合領域もしくはその断片は、別段の記載のない限り、または科学用語から明かでない限り、抗ＣＣＲ４抗体の範囲、特に２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３の抗体を指す。
【０１７４】
本明細書で使用する場合、「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は広く、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体などのヒト抗原結合ドメインを含む、いずれもの免疫学的な結合剤または分子を指す。重鎖定常ドメインの型に応じて、全ての抗体は５つの主要なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのうちの１つに分類される。本発明の抗体もこれらのクラスのうちのいずれか１つ分類され得る。これらのクラスのうちのいくつかはさらに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのサブクラスまたはイソタイプに分けられる。免疫グロブリンのそれぞれのクラスに対応する、重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれている。それぞれのクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造や三次元配置については良く知られている。
【０１７５】
本発明において抗原結合領域よりも抗体全体が使用される場合には一般に、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭが好ましい。なぜならば、生理学的な条件においてはＩｇＧおよび／またはＩｇＭが最も一般的な抗体であり、かつ、それらが研究室で最も容易に作成できるからである。ＩｇＧ１抗体が特に好ましい。
【０１７６】
哺乳類の抗体の「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列と可変ドメインのフレームワーク領域のいくつかのアミノ酸に基づいて、２つの明確に異なる型、カッパ（κ）とラムダ（λ）に分類される。本発明の抗体では本質的に、κまたはλ軽鎖定常領域どちらが好ましいかといった違いはない。
【０１７７】
当業者が理解するように、用語「抗体」に包含される免疫学的な結合剤には、全ての抗体、二量体抗体、三量体抗体および多量体抗体；二重特異性抗体；キメラ抗体；組換えおよび改変抗体ならびにその断片を含む、全ての抗体およびその抗原結合断片が含まれる。
【０１７８】
したがって、「抗体」という用語は、抗原結合領域を有するいずれの抗体様分子をも指すのにも使われ、かつ、この用語は、抗原結合ドメインを含む抗体断片を含む。抗原結合ドメインには、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、ＴａｎｄＡｂ二量体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、Ｆｄ、直鎖型抗体、ミニボディ、ディアボディ、二重特異性抗体断片、バイボディ、トリボディ（ｓｃＦｖ−Ｆａｂ融合体、それぞれ、二重特異性または三重特異性）；一本鎖二重特異性抗体；カッパ（ラムダ）ボディ（ｓｃＦｖ−ＣＬ融合体）；二重特異性Ｔ細胞結びつけ抗体（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｅｎｇａｇｅｒ  、ＢｉＴＥ）（細胞を引きつけるためにｓｃＦｖとｓｃＦｖ  が一列に並んでいる）；二重可変ドメイン（ｄｕａｌ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ、ＤＶＤ）−Ｉｇ（二重特異性形態）；小免疫タンパク質（ｓｍａｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅｉｎ  、ＳＩＰ）（ミニボディの一種）；  ＳＭＩＰ  （「小さいモジュラー免疫医薬（ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）」ｓｃＦｖ−Ｆｃ二量体；ＤＡＲＴ（二本鎖安定化二重特異性抗体「二重親和性再標的化（Ｄｕａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＲｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ）」）；１つ以上のＣＤＲを含む小抗体模倣物などが含まれる。
【０１７９】
抗体を利用した様々なコンストラクトおよび断片を調製および使用するための技術は当技術分野で周知である（参照することにより具体的に本明細書に組み入れられる、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１を参照のこと。）。特に、ディアボディについては欧州特許第４０４，０９７号明細書および国際公開第９３／１１１６１号にさらに記載があり、直鎖型抗体についてはＺａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）でさらに記載されている。
【０１８０】
標準的な技術によって抗体を断片化することができる。例えば、抗体をペプシンで処理することによって、Ｆ（ａｂ’）2断片を生成することができる。生じたＦ（ａｂ’）2断片を処理してジスルフィド架橋を還元し、Ｆａｂ’断片を生成することができる。パパイン消化によってＦａｂ断片の形成を誘導することができる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）2、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＴａｎｄＡｂ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ディアボディ、二重特異性抗体断片および他の断片はまた、組換え技術によって合成することも、または化学的に合成することも可能である。抗体断片の製造方法は、当技術分野で知られており記述されている。例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ＆Ｈｕｄｓｏｎ，２００５；Ｌｅ  Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｒｅｆｆ＆Ｈｅａｒｄ，２００１；Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５のそれぞれは有効な抗体断片の作製をさらに説明し、そしてそれを可能にする。
【０１８１】
抗体または抗体断片を天然に製造することも、または全体的もしくは部分的に合成することも可能である。したがって抗体は、いかなる適切な供給源、例えば組換えた供給源に由来するものであっても、および／またはトランスジェニック動物もしくはトランスジェニック植物、またはＩｇＹ技術を使用して卵で産生したものであってもよい。したがって、抗体分子をインビトロまたはインビボで産生することができる。
【０１８２】
好ましくは、抗体または抗体断片は、３つのＣＤＲドメインを含む抗体軽鎖可変領域（ＶL）と、３つのＣＤＲドメインを含む抗体重鎖可変領域（ＶH）を含む。前記ＶLおよびＶHは通常、抗原結合部位を形成する。
【０１８３】
「Ｆｖ」断片とは、完全な抗原認識部位と結合部位を含む、最小限の抗体断片である。この領域は、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインが密接に、非共有的に結合した二量体を有する。この配置では、それぞれの可変ドメインの３つの超可変領域（ＣＤＲ）が相互作用し、ＶH−ＶL二量体表面にある抗原結合部位を規定している。６つの超可変領域（ＣＤＲ）が集合して、抗体に対する抗原結合特性を付与している。
【０１８４】
しかしながら抗原への結合には、抗体の軽鎖可変ドメイン由来の３つのＣＤＲと重鎖可変ドメイン由来の３つのＣＤＲの存在が必要ではないことが当技術分野では充分に実証されている。したがって、上述の従来型の抗体断片よりも小さいコンストラクトが有効であることが分かっている。
【０１８５】
例えば、ラクダ化抗体（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）は多数の抗原結合レパートリーを有するが、軽鎖が欠損している。また、ＶHドメインのみ（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，１９９５）またはＶLドメインのみ（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｕｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）を含む単一ドメイン抗体から得られた結果は、これらのドメインが許容可能な高い親和性で抗原と結合可能であることを示している。したがって、３つのＣＤＲは効果的に抗原に結合する。
【０１８６】
また、ＣＤＲは１つでもまたは２つでも抗原に効果的に結合可能であることが分かっている。第一の例として、異種タンパク質（ＧＦＰなど）に挿入されたＶHのＣＤＲ３領域がその異種タンパク質に抗原結合能を付与すること（Ｋｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｎｉｃａｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）を示すことで例示されているように、単一のＣＤＲを異種タンパク質に挿入し、その異種タンパク質に抗原結合能を付与することができる。
【０１８７】
さらに、２つのＣＤＲが効果的に抗原に結合することができ、さらに、親抗体が有する特性よりも優れた特性を付与することも分かっている。例えば、親抗体（ＶH ＣＤＲ１およびＶL ＣＤＲ３領域）由来の２つのＣＤＲが親分子の抗原認識特性を保持し、かつ、より優れた腫瘍貫通性を有することが示されている（Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。天然の親抗体に類似した形でＣＤＲが位置するように、これらのＣＤＲドメインと適切なリンカー配列（例えば、ＶH ＦＲ２由来のリンカー配列）を結合させると、抗原認識がより良くなった。したがって、適切なフレームワーク領域によって、親抗体で見られる配座を維持するように配置された２つのＣＤＲドメイン（好ましくは１つはＶHドメイン由来で、もう１つはＶLドメイン由来であり、より好ましくは、２つのＣＤＲドメインうちの一方はＣＤＲ３ドメインである）を含む抗原結合抗体模倣物の構築が可能であることが当技術分野では知られている。
【０１８８】
このように、本発明の好ましい抗体は６つのＣＤＲ領域（軽鎖由来の３つ、および重鎖由来の３つ）を含んでいるが、６つより少ない数のＣＤＲ領域を含む抗体、および１つもしくは２つと少ない数のＣＤＲ領域を含む抗体も本発明に包含される。加えて、重鎖のみまたは軽鎖のみに由来するＣＤＲを有する抗体もまた考えられる。
【０１８９】
ＣＣＲ４に結合する本発明の好ましい抗体は、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの重鎖可変領域とおよび３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、本明細書に開示した配列を有する重鎖ＣＤＲを含む。
【０１９０】
特定の重鎖ＣＤＲ領域と共に使用するのに好ましい軽鎖ＣＤＲ領域を、本明細書の他の場所に記載する。しかしながら、３つのＣＤＲを含む他の軽鎖可変領域を本発明の重鎖可変領域の共に使用することもまた考えられる。本発明の重鎖可変領域と共に使用することができ、かつ、ＣＣＲ４に結合する抗体を生じる適切な軽鎖可変領域を、当業者は容易に同定することができる。
【０１９１】
例えば、本発明の重鎖可変領域を単一の軽鎖可変領域または軽鎖可変領域のレパートリーと組み合わせて、得られた抗体をＣＣＲ４への結合について試験することができる。そのような、本発明の重鎖可変領域と様々な軽鎖可変領域の組み合わせのうちの妥当な数が、ＣＣＲ４に結合する能力を維持することが期待される。
【０１９２】
同様の方法を用いて、本発明の好ましい軽鎖可変領域と共に使用するための別の重鎖可変領域を同定することもできる。
【０１９３】
特定の実施形態において抗体または抗体断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域などの重鎖定常領域の全体または一部を含む。好ましくは、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１重鎖定常領域またはその一部である。さらに、抗体または抗体断片は、カッパ軽鎖定常領域の全体もしくは一部分、またはラムダ軽鎖定常領域もしくはその一部を含んでいてもよい。そのような定常領域の全体または一部は、天然に産生しても、または完全にもしくは部分的に合成してもよい。そのような定常領域に適切な配列は当技術分野で周知であり、かつ、充分に裏付けられている。本発明の抗体に重鎖および軽鎖に由来する定常領域全体が含まれている場合、そのような抗体は本明細書では基本的に、「完全長」抗体または「完全」抗体と呼ばれる。
【０１９４】
特定の用途、特にＡＤＣＣなどの、Ｆｃ領域がエフェクター機能を仲介しているインビボでの治療用途には、Ｆｃ領域を含む抗体が好ましい。
【０１９５】
さらに、実質的に相同な核酸配列には、開示した核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列（またはその相補的な配列）、例えば、本発明の軽鎖または重鎖ＣＤＲ、本発明の軽鎖または重鎖可変領域、または本発明の抗体のうちの１つ以上をコードしているヌクレオチド配列に（またはそれらの相補的な配列に）、少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、好ましくはストリンジェンシーが高い条件でハイブリダイズする配列も含まれる。
【０１９６】
本発明のタンパク質に実質的に相同な配列にはさらに、これらに限定されるものではないが、抗体のＶH、ＶLまたはＣＤＲドメインに影響を及ぼさない変化（例えば、異なるリンカー配列が使用されているｓｃＦｖ抗体、または抗原への結合に寄与しないタグ配列もしくは他の要素が付加されている抗体）、または１つの型もしくは形態の抗体分子または断片を別の型もしくは形態の抗体分子または断片に（例えば、ＦａｂからｓｃＦｖへまたはその逆に）変換する変化、または抗体分子を特定のクラスもしくはサブクラスの抗体分子に（例えば、抗体分子をＩｇＧもしくはそのサブクラス、例えばＩｇＧ１もしくはＩｇＧ３に）変換する変化も含まれる。
【０１９７】
他の好ましい実施形態では、元の抗ＣＣＲ４抗体よりも高いまたは優れた特性をもつ第二世代抗体（例えば２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３）が提供される。例えば第二世代抗体は、ＣＣＲ４に対するより高い結合親和性、優れた交差反応性プロファイル、ＣＣＲ４+細胞（特に腫瘍細胞）を標的とする高い能力、改善されたＡＤＣＣ誘導能、改善されたＣＤＣ誘導能、本明細書の他の部分で論じた障害のより良い治療を有し得る。
【０１９８】
有効な第二世代抗体を同定するための比較は、例えば、本明細書でまたは当技術分野において詳しく記述されている様々なアッセイのうちの１つ以上を使用することで、容易に実施され、かつ、定量される。２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３抗体として例示される、本発明の抗ＣＣＲ４抗体よりも少なくとも約２倍、５倍、１０倍、２０倍、および好ましくは、少なくとも約５０倍高い生物学的な特性または活性を有する第二世代抗体も、本発明に包含される。
【０１９９】
本発明の抗体、結合タンパク質および核酸分子は通常、それらがヒトもしくは動物の体内で、またはヒトもしくは動物の体に由来する組織試料の中でその場で存在するそのような要素のいずれからも区別される限りにおいて、「単離された」または「精製された」分子である。しかしながら、配列は、ヒトまたは動物の体内で見られる配列に相当するまたは実質的に相同な配列であり得る。したがって本明細書で使用する場合、核酸分子または配列およびタンパク質またはポリペプチド、例えば、抗体に関する、「単離された」または「精製された」という用語は、天然の環境から単離された、精製された、または天然の環境を実質的に含まないそのような分子、例えば、ヒトまたは動物の体から単離したまたは精製した分子（もしそれが天然に生じたものであれば）を指すか、または技術的な方法によって、すなわち組換えを含む技術によって生産された分子や合成された分子を指す。
【０２００】
したがって、核酸分子に関して使用する場合、そのような用語は、他の核酸／遺伝子またはポリペプチドなどの、それらの核酸分子に天然に付随する物質を実質的に含まない核酸を指し得る。これらの用語はまた、組換えＤＮＡ技術によって生産された場合には、細胞性物質もしくは培地を実質的に含まない核酸、または化学的に合成した場合には、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸を指し得る。単離されたまたは精製された核酸はまた、その核酸の元になった核酸と天然では隣接している配列（すなわち、その核酸の５’および３’末端に位置している配列）を、または、例えば遺伝子工学によってその核酸に隣接して作られた配列（例えば、タグ配列または治療効果をもたない他の配列）を実質的に含まない場合もある。
【０２０１】
したがって、タンパク質またはポリペプチド分子、例えば軽鎖ＣＤＲ１、２および３、重鎖ＣＤＲ１、２および３、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、ならびに完全長抗体を含む本発明の結合タンパク質または抗体に関連して使用する場合、「単離された」または「精製された」という用語は通常、そのタンパク質の提供源由来の細胞性材料または他のタンパク質を実質的に含まないタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、特にタンパク質をヒトまたは動物に投与する実施形態では、そのような単離されたまたは精製されたタンパク質は、組み換え技術で生産した場合には培地を、または化学的に合成した場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を、実質的に含まない。そのような単離されたまたは精製されたタンパク質はまた、単離された核酸分子について上述のような、隣接配列を含まない場合もある。
【０２０２】
本明細書で使用する場合、「核酸配列」または「核酸分子」という用語は、天然に存在する塩基、糖および糖間（骨格）結合で構成されている、ヌクレオシド配列またはヌクレオチド配列の単量体を指す。この用語はまた、天然に存在しない単量体もしくはその一部を含む、修飾されたまたは置換された配列も含む。本発明の核酸配列は、デオキシリボ核酸の配列（ＤＮＡ）であってもリボ核酸の配列（ＲＮＡ）であってもよく、天然に存在する塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシル）を含んでいてもよい。また、配列は修飾された塩基を含んでいてもよい。そのような修飾された塩基の例としては、アザおよびデアザアデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシル；およびキサンチンおよびヒポキサンチンが挙げられる。核酸分子は二本鎖であっても一本鎖であってもよい。核酸分子は完全にまたは部分的に合成されたものであってもまたは組み換えられたものであってもよい。
【０２０３】
好ましい実施形態では、本発明の抗体はヒト抗体であり、より好ましくは完全なヒト抗体である。ヒト抗体は一般的に、ヒトの治療においては少なくとも３つの利点をもつ可能性がある。第一に、ヒトの免疫系はその抗体を異物として認識しないはずである。第二に、ヒトの血中での半減期が天然に存在するヒト抗体と同程度であるため、より少量、かつ、低頻度の投与が可能になる。第三に、エフェクタータンパク質がヒトであるため、ヒト免疫系のその他の部分よりも強く相互作用し、例えば、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって、標的細胞がより効率的に破壊される。
【０２０４】
しかしながら、一般的に、ヒト抗体はこれらの利点を示すと認識されているが、ヒトの治療を成功させるための、充分に高い親和性と適切な機能的特徴を有するヒト抗体の開発が決して容易ではないことが分かっている。したがってこの技術分野では、ヒトの治療に使用するための安全かつ有効な抗ＣＣＲ４が未だに存在せず、そのような薬剤を開発するための取り組みがなされている。
【０２０５】
本明細書で使用する場合、抗体分子および結合タンパク質に関連する「ヒト」という用語は第一に、可変領域（例えば、ＶH、ＶL、ＣＤＲまたはＦＲ領域）と、任意で抗体の定常領域を有し、ヒトレパートリーから単離されたもしくはヒトレパートリーに由来する、またはヒトで、例えば、ヒト生殖細胞系または体細胞で見られる配列に由来するもしくはそれらの配列に相当する抗体および結合タンパク質を指す。
【０２０６】
２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３抗体は、可変領域がヒトレパートリーから単離された、そのようなヒト抗体分子の例である。
【０２０７】
本発明の「ヒト」抗体および結合タンパク質はさらに、ヒト配列がコードしていないアミノ酸残基、例えば、ランダムにもしくは部位特異的にインビトロで導入された突然変異、例えばインビトロクローニングもしくはＰＣＲで導入された突然変異を含む。そのような突然変異の具体例としては、抗体または結合タンパク質のＣＤＲの１つ以上を形成している抗体または結合タンパク質の少数の残基、例えば、抗体または結合タンパク質の５個、４個、３個、２個または１個までの残基に、好ましくは例えば、５個、４個、３個、２個または１個までの残基に入っている保存的置換を含む突然変異、または他の突然変異がある。そのような「ヒト」抗体の具体例としては、免疫原性をもつ可能性のある部位の量を減らすための標準的な修飾法にかけられた抗体および可変領域が挙げられる。
【０２０８】
したがって、本発明の「ヒト」抗体は、ヒトで見られる配列に由来する配列やヒトで見られる配列に関係する配列を含むが、それらの配列はインビボでのヒト抗体の生殖細胞系レパートリーに天然に存在するものでなくてもよい。加えて、本発明のヒト抗体および結合タンパク質は、ヒト配列から同定されたヒトで保存されている配列、またはヒトの配列に実質的に相同な配列を含むタンパク質を含む。
【０２０９】
さらに、本発明のヒト抗体および結合タンパク質は、ヒト抗体分子の組み合わせに見られる、ＶH、ＶL、ＣＤＲまたはＦＲ領域の組み合わせには限定されない。したがって、本発明のヒト抗体および結合タンパク質は、それらの領域の組み合わせを含むかまたはそのような組み合わせに対応することができるが、それらの領域はヒトに天然に存在するものである必要はない。
【０２１０】
好ましい実施形態では、ヒト抗体は完全なヒト抗体である。本明細書で使用する場合「完全なヒト」抗体とは、上で定義したような、実質的に非ヒト抗体配列を含まないまたはいかなる非ヒト抗体配列をも含まない「ヒト」可変領域ドメインおよび／またはＣＤＲを含む抗体である。例えば、「実質的に非ヒト抗体配列を含まない」ヒト可変領域ドメインおよび／またはＣＤＲを含む抗体とは、ドメインおよび／またはＣＤＲ中のわずか５個、４個、３個、２個または１個までのアミノ酸のみが、ヒト抗体配列によってコードされていないアミノ酸である抗体である。したがって、「完全なヒト」抗体は、実質的にヒトのものではない可変領域ドメインを使用した、例えば、ヒト抗体に通常存在するアミノ酸とよりよく対応するように特定のアミノ酸が変更されたマウス可変領域ドメインを使用した「ヒト化」抗体とは区別されるものである。
【０２１１】
本発明の「完全なヒト」抗体は、一本鎖抗体になっている、他の実質的な抗体配列を含まないヒト可変領域ドメインおよび／またはＣＤＲであってもよい。あるいは、本発明の「完全なヒト」抗体は、ヒト抗体の１つ以上の定常領域に統合されたまたは操作可能に連結されたヒト可変領域ドメインおよび／またはＣＤＲであってもよい。特に好ましい完全なヒト抗体は、完全なＩｇＧの定常領域を含むＩｇＧ抗体である。
【０２１２】
他の実施形態では、本発明の「ヒト」抗体は、部分的なヒトキメラ抗体である。本明細書で使用する場合「部分的なヒトキメラ」抗体とは、非ヒト種、例えばラットまたはマウスの定常領域に操作可能に連結されたまたは接合された「ヒト」可変領域ドメインおよび／またはＣＤＲを含む抗体である。そのような、部分的なヒトキメラ抗体を例えば前臨床試験で、好ましくは、定常領域が前臨床試験で使用される動物種のものと同じ前臨床試験で使用することができる。これらの部分的なヒトキメラ抗体はまた、例えば、非ヒト種の定常領域が抗体検出に関してさらなる選択肢を提供し得るエクスビボでの診断に使用することもできる。
【０２１３】
本明細書で使用する場合、用語「断片」は、生物学的に適切な断片、例えば、抗原との結合に寄与する、例えば抗原結合部位の一部分を形成する断片、および／またはＣＣＲ４抗原の機能の阻害または低下に寄与する断片を指す。特定の好ましい断片は、本発明の抗体の重鎖可変領域（ＶHドメイン）および／または軽鎖可変領域（ＶLドメイン）を含む。他の好ましい断片は、本発明の抗体の１つ以上重鎖ＣＤＲ（または本発明のＶHドメイン）、または本発明の抗体の１つ以上の軽鎖ＣＤＲ（または本発明のＶLドメイン）を含む。ある好ましい断片は、少なくとも５アミノ酸の長さを有し、かつ、少なくとも１つのＣＤＲ領域、好ましくはＣＤＲ３領域、より好ましくは重鎖ＣＤＲ３領域を含む。
【０２１４】
本発明の抗体が本明細書に開示した配列で規定したいずれかの断片を含む実施形態では、例えば、抗体が本発明のＶHおよび／またはＶLドメインを含んでいる実施形態、または抗体もしくは結合タンパク質が１つ以上の本発明のＣＤＲを含んでいる実施形態では、これらの領域／ドメインは通常、抗体または結合タンパク質の中で離れた位置にあるために、それぞれの領域／ドメインがそれらの生物学的な機能を発揮することができ、そして抗原結合への寄与が保持されている。したがって、ＶHおよびＶLドメインは、好ましくは、適切な足場配列／リンカー配列で分離されており、ＣＤＲは、好ましくは、天然に存在する抗体および／または有効な改変抗体で見られるような適切なフレームワーク領域によって分離されている。したがって、本発明のＶH、ＶLおよび個々のＣＤＲ配列は、好ましくは、抗原との結合を可能にする適切なフレームワークまたは足場の中に入った状態でまたはそれらに組み込まれた状態で提供される。そのようなフレームワーク配列または領域は、適切な足場を形成するのに適している天然に存在するフレームワーク領域である、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／またはＦＲ４に対応するものであってよく、または保存されているフレームワーク領域、例えば天然に存在する様々なフレームワーク領域の比較によって同定された、保存されているフレームワーク領域に対応するものであってもよい。あるいは、非抗体性足場またはフレームワーク、例えば、Ｔ細胞受容体のフレームワークを使用することもできる。
【０２１５】
フレームワーク領域として使用することが可能な適切な配列は当技術分野において周知であり、かつ、充分に裏付けられている。また、これらのいずれをも使用することができる。フレームワーク領域に好ましい配列は、本発明のＶHおよび／またはＶLドメインを構成している１つ以上（すなわち１つ、２つ、３つまたは４つ）のフレームワーク領域、すなわち、表１、２、３または４で開示する１つ以上のフレームワーク領域、またはそれらに実質的に相同なフレームワーク領域であり、具体的には、抗原特異性を維持することが可能なフレームワーク領域、例えば抗体と実質的に同じまたは抗体と同じ三次元構造を生じるフレームワーク領域である。
【０２１６】
特定の好ましい実施形態では、本発明の抗体には、４つ全ての軽鎖可変（配列番号１２、１３、１４および１５）および／または重鎖可変（配列番号７、８、９、１０）、必要に応じて、配列番号４７のＦＲ領域（表１にも示す）もしくはそれに実質的に相同なＦＲ領域が見られる。
【０２１７】
特定の好ましい実施形態では、本発明の抗体には、４つ全ての軽鎖可変（配列番号１２、１３、１４および１５）および／または重鎖可変（配列番号７、８、１６および１０）、必要に応じて、配列番号４８のＦＲ領域（表２にも示す）、またはそれに実質的に相同なＦＲ領域が見られる。
【０２１８】
特定の好ましい実施形態では、本発明の抗体には、４つ全ての軽鎖可変（配列番号１２、１３、１４、１５）および／または重鎖可変（配列番号７、８、１８および１０）、必要に応じて、配列番号４９のＦＲ領域（表３にも示す）、またはそれに実質的に相同なＦＲ領域が見られる。
【０２１９】
特定の好ましい実施形態では、本発明の抗体には、４つ全ての軽鎖可変（配列番号１２、１３、１４および１５）および／または重鎖可変（配列番号１９、８、９および１０）、必要に応じて、配列番号５０のＦＲ領域（表４にも示す）、またはそれに実質的に相同なＦＲ領域が見られる。
【０２２０】
特定の好ましい実施形態では、本発明の抗体には、４つ全ての軽鎖可変（配列番号２１、１３、２３および１５）および／または重鎖可変（配列番号１９、８、９および１０）、必要に応じて、配列番号５１のＦＲ領域（表５にも示す）、またはそれに実質的に相同なＦＲ領域が見られる。
【０２２１】
特定の好ましい実施形態では、本発明の抗体には、４つ全ての軽鎖可変（配列番号１２、１３、２３および１５）および／または重鎖可変（配列番号１９、８、９および１０）、必要に応じて、配列番号５２のＦＲ領域（表６にも示す）、またはそれに実質的に相同なＦＲ領域が見られる。
【０２２２】
特定の好ましい実施形態では、本発明の抗体には、４つ全ての軽鎖可変（配列番号２１、１３、２３および１５）および／または重鎖可変（配列番号７、８、９および１０）、必要に応じて、配列番号５３のＦＲ領域（表７にも示す）、またはそれに実質的に相同なＦＲ領域が見られる。
【０２２３】
特定の好ましい実施形態では、本発明の抗体には、４つ全ての軽鎖可変（配列番号２５、１３、２３および１５）および／または重鎖可変（配列番号７、８、９および１０）、必要に応じて、配列番号５４のＦＲ領域（表８にも示す）、またはそれに実質的に相同なＦＲ領域が見られる。
【０２２４】
特定の好ましい実施形態では、本発明の抗体には、４つ全ての軽鎖可変（配列番号１２、１３、２３および１５）および／または重鎖可変（配列番号７、８、２８および１０）、必要に応じて、配列番号５５のＦＲ領域（表９にも示す）、またはそれに実質的に相同なＦＲ領域が見られる。
【０２２５】
したがって、いくつかの実施形態では重鎖ＦＲ１の２６番目は好ましくはＥであるが、他の実施形態ではＧである。いくつかの実施形態では重鎖ＦＲ３の２２番目は好ましくはＰであるが、他の実施形態ではＳであり、かつ、いくつかの実施形態では２３番目は好ましくはＥであるが、他の実施形態ではＤである。いくつかの実施形態では軽鎖ＦＲ１の７番目は好ましくはＰであるが、他の実施形態ではＱである。いくつかの実施形態では軽鎖ＦＲ３の２０番目は好ましくはＳであるが、他の実施形態ではＧである。
【０２２６】
前述の通り、配列番号１２の好ましいホモログは、配列番号１２９または１３０であり、配列番号２１の好ましいホモログは、配列番号１３１または１３２である。したがって、以上の内容は全て、配列番号１２９〜１３２の参照も含むと見なされる。
【０２２７】
加えて、本発明の好ましい抗体は本発明のＶH、ＶLまたはＣＤＲから構成されるが、本発明の抗体は、本明細書で概略を示した本発明の抗体のＣＣＲ４結合特性または抗ＣＣＲ４特性が維持される場合、本発明のものではない他のＶH、ＶLまたはＣＤＲと組み合わせた１つ以上の本発明のＶH、ＶLまたはＣＤＲをも包含することに注意する。
【０２２８】
本明細書で使用する場合、「重鎖相補性決定領域」（「重鎖ＣＤＲ」）という用語は、抗体分子の重鎖可変領域（ＶHドメイン）に含まれている超可変領域を指す。重鎖可変領域は、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３と命名されている３つのＣＤＲを有する。重鎖可変領域はさらに、４つのフレームワーク領域（アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を有する。これらのフレームワーク領域によってＣＤＲ同士は隔てられている。
【０２２９】
本明細書で使用する場合、「重鎖可変領域」（ＶHドメイン）という用語は、抗体分子の重鎖の可変領域を指す。
【０２３０】
本明細書で使用する場合、「軽鎖相補性決定領域」（「軽鎖ＣＤＲ」）という用語は、抗体分子の軽鎖可変領域（ＶLドメイン）に含まれる超可変領域を指す。軽鎖可変領域は、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３と命名されている３つのＣＤＲを有する。軽鎖可変領域はさらに、４つのフレームワーク領域（アミノ末端からカルボキシ末端に向かってＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を有する。これらのフレームワーク領域は、ＣＤＲ同士を隔てている。
【０２３１】
本明細書で使用する場合、「軽鎖可変領域」（ＶLドメイン）という用語は、抗体分子の軽鎖の可変領域を指す。
【０２３２】
ＣＤＲの位置を定義する必要がある場合には、本明細書がカバット命名法（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１。参照することにより具体的に本明細書に組み入れられる）にしたがっていることに注意されたい。
【０２３３】
本発明のタンパク質およびポリペプチド、例えば軽鎖および重鎖ＣＤＲ、軽鎖および重鎖可変領域、抗体、抗体断片、および免疫複合体を、当技術分野で周知の、かつ、充分に裏付けられている任意の方法のいくつかを使用して調製してもよいことを当業者は理解するだろうが、最も好ましくは、それらは組換え法によって調製される。
【０２３４】
本発明の抗体の軽鎖および重鎖可変領域をコードしている核酸断片を、任意の適切な方法によって、例えばクローニングまたは合成によって得ることもまたは生産することもできる。例えばそのような配列は、例えばヒト生殖細胞系遺伝子由来の適切な配列をクローニングし、その後この生殖細胞系の配列に、本発明の配列を得るために必要な任意の修飾を、当技術分野で周知の、かつ、充分に裏付けられている方法によって施すことで調製される。より効率的な別の方法としては、適切な軽鎖または重鎖可変領域の配列を重複のあるプライマーとして合成し、プライマーエクステンションで完全な配列を得る方法がある。次いで、その後のクローニングおよび操作、例えば適切な発現ベクターへのクローニングのために、適切な制限酵素部位を含むプライマーを用いたＰＣＲによってこの完全な配列を増幅してもよい。一般的に、１つの可変領域につき５つ〜７つの重複のあるプライマーで十分であり、それによって、この技術が非常に効果的かつ正確なものになっている。
【０２３５】
一旦、本発明の抗体の軽鎖および重鎖可変領域をコードしている核酸断片が得られれば、標準的な組換えＤＮＡ技術によってこれらの断片をさらに操作することができる。例えば可変領域断片を、適切な定常領域ドメインをもつ完全長抗体分子または本明細書の他の部分で論じる特定の形態の抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片などに変換することができる。典型的には、またはこの後の操作の一部としては、本発明の抗体分子をコードしている核酸断片を通常、適切な発現ベクターに組み込み、本発明の抗体の産生を容易にする。
【０２３６】
使用可能な発現ベクターとしては、これらには限定されないが、コスミド、プラスミド、または改変ウイルス（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）が、これらのベクターが使用される宿主細胞と適合可能な限りにおいて、含まれる。発現ベクターは、「宿主細胞の形質転換に適したもの」である。すなわち発現ベクターは、本発明の核酸分子と、発現させるために宿主細胞に応じて選択され、核酸分子に操作可能に連結された制御配列とを含む。操作可能に連結されるとは、核酸が制御配列に、その核酸を発現させることができる方法で連結されていることを意味する。
【０２３７】
本発明は、したがって本発明の核酸分子またはその断片、および本発明の核酸分子によってコードされているタンパク質配列の転写および翻訳に必要な制御配列を含む組換え発現ベクターを考えている。
【０２３８】
適切な制御配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳類、または昆虫の遺伝子などの様々な提供源から得ることができる（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、１９９０に記載されている制御配列を参照のこと）。適切な制御配列の選択は、以下に記載するように選択した宿主細胞に依存し、また、当業者により容易に行うことができ得る。そのような制御配列の例としては、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列（翻訳開始シグナルなど）が挙げられる。加えて、選択した宿主細胞や使用したベクターに応じて、複製開始点、さらなるＤＮＡ制限酵素部位、エンハンサー、および転写の誘導に寄与する配列などの他の配列を、発現ベクターに組み込んでもよい。
【０２３９】
本発明の組換え発現ベクターはまた、本発明の組換え分子を形質転換したすなわち導入した宿主細胞の選抜を容易にする選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。選択マーカー遺伝子の例には、ネオマイシンおよびハイグロマイシン（特定の薬剤に対する耐性を付与する）、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、または免疫グロブリンもしくはその一部分（例えば免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧのＦｃ部分）などのタンパク質をコードしている遺伝子がある。選択マーカー遺伝子の転写は、選択マーカータンパク質（例えばβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはホタルルシフェラーゼ）の濃度の変化によって監視される。選択マーカー遺伝子が、抗生物質耐性（例えばネオマイシン耐性）を付与するタンパク質コードしている場合には、Ｇ４１８を使用して形質転換体を選抜することができる。組み込まれた選択マーカー遺伝子を有する細胞は生き残るが、その他の細胞は殺滅する。これにより、本発明の組換え発現ベクターの発現を可視化および試験することができる。具体的には、変異が発現および表現型に及ぼす影響を決定することができる。選択マーカーを目的の核酸とは別のベクターに導入することもできることが理解される。
【０２４０】
組換え発現ベクターはさらに、組換えタンパク質の発現の亢進や組換えタンパク質の溶解度の向上をもたらし、また、アフィニティー精製においてリガンドとして機能することによって標的組換えタンパク質の精製を補助する融合部分をコードしている遺伝子を含んでいてもよい。例えば、精製および／または同定を可能にする適切な「タグ」、例えば、Ｈｉｓタグまたはｍｙｃタグ、が含まれていてもよい。例えば、融合タンパク質を精製した後に、融合部分から組換えタンパク質を切断できるように、タンパク分解によって切断される部位を標的組換えタンパク質に付加してもよい。一般的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを組換えタンパク質にそれぞれ融合する、ｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ  Ｃｏｒｐ．、メルボルン、オーストラリア）、ｐＭａｌ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ベヴァリー、マサチューセッツ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ピスカタウェイ、ニュージャージー）が挙げられる。
【０２４１】
組換え発現ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換宿主細胞を作成することができる。「形質転換した」、「導入した」、「形質転換」および「導入」という用語は、当技術分野で知られている多くの使用可能な技術のうちの１つによって核酸（例えば、ベクター）を細胞に導入することを包含することを意図している。本明細書で使用する場合、「形質転換宿主細胞」という用語はまた、本発明の組換え発現ベクターで形質転換した、グリコシル化可能な細胞を含むことを意図している。例えば、エレクトロポレーションまたは塩化カルシウム介在性形質転換によって原核細胞を核酸で形質転換することができる。例えば、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムとの共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン介在性形質転換、リポフェクション、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションなどの標準的な方法を介して、核酸を哺乳類の細胞に導入することができる。宿主細胞の形質転換および導入に適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、および他の研究用の教科書に見出すことができる。
【０２４２】
好適な宿主細胞には、広範囲に及ぶ原核宿主細胞や真核細胞が含まれる。例えば、本発明のタンパク質を酵母細胞または哺乳類細胞で発現させてもよい。他の適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９０に見出すことができる。さらに、本発明のタンパク質を大腸菌などの原核細胞で発現させることもできる（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０２４３】
本発明の実施に適切な酵母および真菌宿主細胞には、これらには限定されないが、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア属またはクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属およびアスベルギルス属の様々な種が含まれる。酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で発現させるためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ．  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）、およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、サンディエゴ、カリフォルニア）が挙げられる。当業者は、酵母や真菌を形質転換するための手順をよく分かっている（Ｈｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８；Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，およびＣｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８７を参照のこと）。
【０２４４】
本発明の実施に好適な哺乳類細胞としては特に、ＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１６５０または１６５１）、ＢＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ６２８１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ６１）、ＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ２）、２９３（ＡＴＣＣ寄託番号１５７３）、ＮＳ−１細胞、ＮＳ０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１１７７）、およびＰｅｒ．Ｃ６（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ、ライデン、オランダ）が挙げられる。哺乳類の細胞中での発現を誘導するのに適切な発現ベクターは一般的に、プロモーター（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０などのウイルス性材料由来）、ならびに他の転写および翻訳制御配列を含んでいる。哺乳類の発現ベクターには、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ、Ｂ．，１９８７）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）が含まれる。
【０２４５】
本明細書で提示した教示を考慮すると、適切な型の発現ベクターを植物、鳥類、および昆虫細胞に導入するためのプロモーター、ターミネーター、および方法を容易に達成することができる。例えば一実施形態では、本発明のタンパク質を植物細胞から発現させることができる（アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ベクターの使用についての総説であるＳｉｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７を参照のこと；また、植物細胞用の発現ベクター、特にＰＡＰＳ２０２２、ＰＡＰＳ２０２３、およびＰＡＰＳ２０３４の使用について記載しているＺａｍｂｒｙｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４も参照のこと）。
【０２４６】
本発明の実施に好適な昆虫細胞としては、カイコガ属、イラクサギンウワバ属またはスポドプテラ属由来の細胞や細胞株が挙げられる。培養昆虫細胞（ＳＦ  ９細胞）中でタンパク質を発現させることができるバキュロウイルスベクターには、一連のｐＡｃ（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）および一連のｐＶＬ（Ｌｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９）がある。本発明の組換えタンパク質を発現させるのに適切ないくつかのバキュロウイルス−昆虫細胞発現系が、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ／０２４４２号に記載されている。
【０２４７】
あるいは、本発明のタンパク質を、ラット、ウサギ、ヒツジおよびブタなどの非ヒトトランスジェニック動物で発現させてもよい（Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５；Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３；Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５；Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，１９８５、および米国特許第４，７３６，８６６号）。
【０２４８】
また、固相合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６４；Ｆｒｉｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）または均一な溶液中での合成などの、タンパク質の化学で良く知られている方法で化学的に合成することによって、本発明のタンパク質を調製することもできる。
【０２４９】
他の分子（例えばタンパク質）に複合体化された本発明の抗体およびタンパク質を含むＮ末端またはＣ末端融合タンパク質を、組換え技術を介した融合によって調製してもよい。得られた融合タンパク質は、選択したタンパク質もしくはマーカータンパク質、または本明細書に記載のタグタンパク質に融合した本発明の抗体またはタンパク質を含む。既知の方法によって、本発明の抗体およびタンパク質を他のタンパク質に複合体化することができる。例えば、国際公開第ＷＯ９０／１０４５７号に記載されているヘテロ二官能性チオール含有リンカー、Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロプリオネートまたはＮ−サクシニミジル−５−チオ酢酸で、タンパク質を結合させてもよい。融合タンパク質または複合体の調製に使用することができるタンパク質の例としては、免疫グロブリン、ホルモン、成長因子、レクチン、インスリン、低比重リポ蛋白、グルカゴン、エンドルフィン、トランスフェリン、ボンベシン、アシアロ糖タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、赤血球凝集素（ＨＡ）、および切断型ｍｙｃなどの細胞結合タンパク質が挙げられる。
【０２５０】
最初の抗ＣＣＲ４抗体核酸セグメントの調製方法にかかわらず、さらに、好適な抗体核酸セグメントを標準的な分子生物学的な方法によって調製することができる。どの変異体、突然変異体または第二世代の抗ＣＣＲ４抗体核酸セグメントが本発明の使用に適しているかを確認するために、本発明にしたがって核酸セグメントを試験し、抗ＣＣＲ４抗体の発現を確認する。好ましくは、変異体、突然変異体または第二世代の核酸セグメントをさらに試験し、標準的な、より好ましくは、標準的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションを確認する。好適なハイブリダイゼーション条件の例としては、約７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約０．５ＭのＮａＰＯ4、約１ｍＭのＥＤＴＡ中、約５０℃でのハイブリダイゼーション；および約１％のＳＤＳを使用した約４２℃での洗浄が含まれる。
【０２５１】
様々な抗体を容易に調製することができるため、本発明の治療法は、生物学的に有効な量の少なくとも本発明の第一の抗ＣＣＲ４抗体を患者で発現する少なくとも第一の核酸セグメントもしくは分子を、動物もしくは患者に提供することによって実施することができる。「抗ＣＣＲ４抗体を発現する核酸セグメントまたは分子」は通常、少なくとも発現コンストラクトまたはベクターの形態であり、また、発現コンストラクトもしくはベクターを含むウイルスまたはそれらを含む組換え宿主細胞の形態であってもよい。好ましい本発明の遺伝子治療ベクターは通常、組換えレトロウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などに含まれる、ウイルス性ベクターである。
【０２５２】
さらなる態様は本発明の核酸セグメントまたは分子を１つ以上含む発現コンストラクトまたは発現ベクターを提供する。発現コンストラクトまたはベクターは、好ましくは組換え体である。好ましくは、前記コンストラクトまたはベクターはさらに、本発明の核酸分子によってコードされているタンパク質配列の転写および翻訳に必要な制御配列を含む。
【０２５３】
さらに別の態様は本発明の発現コンストラクトまたは発現ベクターを１つ以上含む宿主細胞またはウイルスを提供する。本発明の核酸分子を１つ以上含む宿主細胞またはウイルスもまた提供する。本発明の抗体を発現している宿主細胞またはウイルスは、一層さらに別の態様を形成する。
【０２５４】
本発明のさらに別の態様は本発明の宿主細胞を培養する工程を含む、本発明の抗体の産生方法を提供する。好ましい方法は、（ｉ）１つ以上の組換え発現ベクターまたは１つ以上の本発明の核酸配列を含む宿主細胞を、コードされている抗体またはタンパク質の発現に適切な条件で培養する工程、および、必要に応じて（ｉｉ）宿主細胞または培地／上清から、抗体またはタンパク質を単離するまたは得る工程を含む。そのような産生方法はさらに、抗体もしくはタンパク質産物を精製する工程、および／または抗体もしくは産物を少なくとも１つの別の成分、例えば薬学上許容可能な担体または賦形剤を含む組成物として処方する工程を含み得る。
【０２５５】
本発明の抗体またはタンパク質が１つ以上のポリペプチド鎖（例えば、Ｆａｂ断片などの特定の断片）で構成されている実施形態では、完全なタンパク質（例えば、本発明の結合タンパク質）が宿主細胞中で組み立てられ、これを宿主細胞から単離または精製できるように、全てのポリペプチドは、好ましくは宿主細胞中で、同じまたは別の発現ベクターのいずれかから発現される。
【０２５６】
本発明の抗体を使用して、ＣＣＲ４に結合するさらなる抗体を産生してもよい。そのような使用には例えば、新しい抗体を作成するために、本明細書の他の場所で定義した本発明の抗体のうちの１つである親抗体のアミノ酸配列中に含まれる１つ以上のアミノ酸を付加、欠損、置換または挿入すること、およびＣＣＲ４に結合する抗体を同定するために、得られた新しい抗体を試験することが含まれる。そのような方法では複数の新しい抗体を作成することができ、新しい抗体は全て、ＣＣＲ４への結合能に関して試験することができる。好ましくは前記１つ以上のアミノ酸の付加、欠損、置換または挿入は、１つ以上のＣＤＲドメイン内で行う。
【０２５７】
そのような親抗体への修飾または変異の導入は、当技術分野で周知であり、かつ、充分に裏付けられている技術を使用した、いかなる適切な方法でも行うことができる。例えば、無作為または部位特異的な突然変異を生成する方法で行うことができる。部位特異的な突然変異生成が行われる場合には、突然変異生成に適切な残基を確認するための一方法では、結合タンパク質−抗原複合体、例えば、Ａｂ−Ａｇ複合体の結晶構造の解析が、抗原結合に関与する重要な残基の同定に活用される（Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，１９９６）。その後、それらの残基を変化させて相互作用を高めることができる。あるいは、単純に１つ以上のアミノ酸残基を標的とした部位特異的突然変異生成を行い、ＣＣＲ４への結合に及ぼす影響を評価してもよい。
【０２５８】
任意の適切な方法によって、例えば、エラープローン（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、鎖シャフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）またはミューテーター大腸菌株を使った無作為突然変異生成を行うことができる。
【０２５９】
したがって、１つ以上の本発明のＶHドメインを、単一のＶLドメインまたは任意の適切な提供源由来のＶLドメインのレパートリーと組み合わせ、得られた新しい抗体を試験して、ＣＣＲ４に特異的な抗体を同定することができる。逆に、１つ以上の本発明のＶLドメインを単一のＶHドメインまたは任意の適切な提供源由来のＶHドメインのレパートリーと組み合わせて、得られた新しい抗体を試験して、ＣＣＲ４に結合する抗体を同定することができる。
【０２６０】
同様に、必要に応じて、１つ以上、または好ましくは３つ全ての本発明のＶHおよび／またはＶLドメインのＣＤＲを接合して、単一のＶHおよび／またはＶLドメイン、またはＶHおよび／またはＶLドメインのレパートリーとし、得られた新しい抗体を試験してＣＣＲ４に結合する抗体を同定してもよい。
【０２６１】
突然変異の標的となるＣＤＲ、特に軽鎖および／または重鎖のＣＤＲ３は、抗体の親和性を高める効果的な技術であることが示されており、かつ、好ましい。好ましくは、ＣＤＲ３のうちの３〜４個のアミノ酸のまとまり、または「ホットスポット」と呼ばれている特定の領域を突然変異生成の標的とする。
【０２６２】
「ホットスポット」とは、インビボで体細胞超変異が生じる配列である（以下のＮｅｕｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９９５も参照のこと）。ホットスポット配列は、特定のコドンによる保存されているヌクレオチド配列として定義することができる。保存されている配列はＲＧＹＷからなる４つのヌクレオチドで、ここで、ＲはＡまたはＧのいずれであってもよく、ＹはＣまたはＴであってもよく、ＷはＡまたはＴのいずれであってもよい（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９９５）。さらに、可変ドメインのＣＤＲ領域では、ヌクレオチドＡＧＹによってコードされているセリン残基がＴＣＮによってコードされているセリンよりも多く含まれており、ＴＣＮがホットスポット配列に対応する可能性がある（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
【０２６３】
したがって、本発明のそれぞれの抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲのヌクレオチド配列を走査して、ホットスポット配列やＡＧＹコドンの有無を確認することができる。その後任意で、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎ  Ｔｉｃｓ  ｄａｔａｂａｓｅ  （ＩＭＧＴ，  ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ｔｅｘｔｅｓ／ｖｑｕｅｓｔ／）を使い、軽鎖および重鎖のＣＤＲ領域中で確認されたホットスポットを、生殖細胞の重鎖および軽鎖の配列と比較することができる（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。生殖細胞系の配列と同一の配列には体細胞変異が起こっていないと示唆されるため、インビボで生じる体細胞の現象を模倣したランダムな突然変異を導入することが、または、部位特異的な突然変異生成、例えばホットスポットおよび／またはＡＧＹコドンへの突然変異生成を行うことができる。それとは対照的に、生殖細胞系の配列とは異なる配列は既に体細胞変異が起こったことを示しているが、インビボでの体細胞変異が最適であったか否かを決定する必要がある。
【０２６４】
突然変異生成に好ましいホットスポットは、分子表面に露出しているアミノ酸をコードしているホットスポットであり、好ましくは、抗原結合部位を形成しているアミノ酸をコードしているホットスポットである。突然変異生成に好ましい他のホットスポットは、非保存アミノ酸をコードしているホットスポットである。分子内部に埋もれているアミノ酸またはＣＤＲに保存されているアミノ酸をコードしているホットスポットには、好ましくは、突然変異を生成しない。これらの残基は通常、構造全体にとって重要であり、かつ、内部に埋もれているため、抗原とは相互作用しない傾向にある。
【０２６５】
アミノ酸およびタンパク質ドメインを操作するための上述した方法は、当業者に周知である。例えば前記操作は、核酸レベルでの遺伝子操作によって都合よく行うことができる。この場合、適切な結合タンパク質およびそのドメインをコードしている核酸分子が修飾され、その結果、得られた発現タンパク質のアミノ酸配列が適切な方法で修飾される。
【０２６６】
１つ以上の抗体が特異的にＣＣＲ４に結合するかの能力を試験する方法は、当技術分野で周知の、かつ、充分に裏付けられている任意の適切な方法によって実施することができる。ＣＣＲ４+細胞株は培養株保存機関から入手しても、あるいは組換えＣＣＲ４を発現させることが可能なコンストラクトでＣＣＲ４陰性株を形質転換することによって調製してもよい。そのような細胞、または固定化したＣＣＲ４を直ちに結合アッセイに、例えばＥＬＩＳＡ、ＢｉａＣｏｎなどの標準的な方法によるアッセイに使用することができる。
【０２６７】
好ましくは、これらの方法によって産生した新しい抗体の機能特性は向上しており、例えば、ＣＣＲ４に対する親和性が親抗体よりも高くまたは強くなっている（または少なくとも同等の親和性をもっている）。また新しい抗体は、本明細書の他の部分で説明したように、本発明の抗体と同じように処理・使用することができる（例えば、治療、診断、組成物に加えるなどのために）。あるいは、またはこれに加えて、新しい抗体は本明細書の他の部分で説明したように、向上した、１つ以上の他の機能特性を有している。
【０２６８】
これらの方法で産生され、入手され、または入手可能な新しい抗体は、本発明のさらに別の態様を形成する。
【０２６９】
本発明はさらに、少なくとも１つの本発明のヒト抗体または抗体断片を含み、必要に応じて希釈剤を含む組成物を提供する。そのような組成物は薬学上許容可能な組成物であっても、または基礎研究で使用するための組成物であってもよい。医薬組成物は、好ましくは、非経口投与用、静脈内投与用、さらには皮下投与用に処方され得る。
【０２７０】
本発明は、本発明のヒト抗体および抗体断片の数多くの方法および使用を提供する。全ての方法に関し、「１つ」（「ａ」および「ａｎ」）という用語は特段の記載のない限り、記載した方法における「少なくとも１つの」、「少なくとも第一の」、「１つ以上の」または「複数の」工程を意味することを目的として使用される。これは特に、治療法における投与工程に適切である。したがって、本発明では様々な用量を用いることができるばかりではなく、様々な投与回数、例えば、複数回の注射までを含む、様々な注射回数を用いることもできる。抗ＣＣＲ４治療用抗体の投与前、投与後、または投与中に併用治療を行ってもよい。
【０２７１】
生物学的に重要な意味をもつ、本発明の抗体または免疫複合体の様々な利用価値のあるインビトロ法および使用を提供する。最初に、ＣＣＲ４を結合させる方法、およびＣＣＲ４の結合の使用を提供する。ＣＣＲ４の結合は通常、ＣＣＲ４を含む組成物と少なくとも第一の本発明の抗ＣＣＲ４抗体、またはその抗原結合断片を効果的に接触させることを含む。したがって、本発明の抗体またはその免疫複合体を結合アッセイに使用することができる。適切な有用な結合アッセイには、免疫ブロット、ウェスタンブロット、ドットブロット、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、免疫沈降、アフィニティクロマトグラフィーなどの、当技術分野で一般的に用いられている方法が含まれる。
【０２７２】
ＣＣＲ４の検出方法およびＣＣＲ４の検出の使用を提供する。ＣＣＲ４の検出には通常、ＣＣＲ４を含んでいると考えられるもしくはＣＣＲ４を含んでいることが分かっている組成物を、本発明の第一の抗体もしくは免疫複合体またはその抗原結合断片と、ＣＣＲ４／抗体複合体の形成を可能にするのに有効な条件で接触させること、および形成された複合体を検出することを含む。検出の方法と使用は、生体試料に関して行っても、例えば腫瘍の診断について行ってもよく、また、それらに基づく診断キットも提供する。
【０２７３】
本発明の抗体を使用して、抗ＣＣＲ４治療が対象に有効かどうかを決定することもできる。したがって、ＣＣＲ４関連障害を患っている対象の細胞、標的部位、組織または器官で発現しているＣＣＲ４の有無またはＣＣＲ４の量を測定するための本発明の抗体の使用を提供し、ここで検出されたまたは測定されたＣＣＲ４の有無または量が健常対照群よりも高いことが、抗ＣＣＲ４治療が前記対象にとって有効であることの指標となる。別の見方では、抗ＣＣＲ４治療が対象に有効かどうかを決定するための方法が提供され、この方法は、有効量の本発明の抗体を対象に投与すること、および前記対象の細胞、標的部位、組織、または器官で発現しているＣＣＲ４の有無を検出または量を測定することを含み、ここで検出されたまたは測定されたＣＣＲ４の有無または量が健常対照群よりも高いことが、抗ＣＣＲ４治療が前記対象にとって有効であることの指標となる。
【０２７４】
前記細胞または標的部位は、好ましくは、固形腫瘍または血液腫瘍であってよい。好ましくは、検出されたまたは測定されたＣＣＲ４の有無または量を使用して、そのＣＣＲ４関連障害が抗ＣＣＲ４剤、好ましくは本発明の抗ＣＣＲ４抗体に感受性であるかどうかを予測する。好ましくは、検出されたまたは測定されたＣＣＲ４の有無または量を使用して、抗ＣＣＲ４剤、好ましくは本発明の抗ＣＣＲ４抗体を投与するかどうかを決定する。
【０２７５】
本発明の方法および使用は特に、ＣＣＲ４の発現もしくは活性が関連している、またはＣＣＲ４が生物学的な役割を担っている任意の疾患もしくは状態を患っている、またはそのような疾患もしくは状態を発症するリスクがある動物および患者に対して使用することを目的としている。そのような疾患および障害には、ＣＣＲ４陽性細胞、典型的にはＣＣＲ４+のＴｈ２またはＴｈ１７細胞が介在する疾患が含まれる。それらの細胞は、リガンドがＣＣＲ４に結合すると、シグナル伝達経路に加わり、障害もしくは疾患を引き起こすまたは障害もしくは疾患に寄与する可能性がある。ＣＣＲ４を発現している細胞が異常に増殖することによって引き起こされる疾患も含まれる。そのような異常増殖細胞は天然でＣＣＲ４+である場合があり、または、それらの細胞は、突然変異が生成され／形質転換され、ＣＣＲ４を発現している場合がある。上述のように、ＣＣＲ４の発現は、この抗原を発現している癌細胞が免疫系から逃れるのを補助する可能性がある。したがって、ＣＣＲ４が介在する疾患もしくは障害、および／またはＣＣＲ４陽性細胞の異常な増殖によって特徴付けられる疾患もしくは障害の治療法を提供する。
【０２７６】
別の見方では、以下の、
（ｉ）ＣＣＲ４+細胞の選択的な除去
（ｉｉ）ＣＣＲ４とその１つ以上のリガンドとの結合の阻害
（ｉｉｉ）ＣＣＲ４リガンドに対するＣＣＲ４介在性細胞応答の阻害、特に走化性またはカルシウムイオン濃度の上昇の阻害（細胞の活性化）
のうちの１つ以上から利益を得ることができる状態の治療を提供する。
【０２７７】
好ましくは、ＣＣＲ４リガンドは、ＭＤＣおよび／またはＴＡＲＣである。
【０２７８】
ＣＣＲ４は多くの疾患や障害に関与しているため、一旦、所定の抗ＣＣＲ４治療が任意の許容可能なモデル系で有効であることが示されれば、ＣＣＲ４の発現に関連した全ての疾患および障害の治療に使用できることを、当業者は理解する。
【０２７９】
一実施形態では、ＣＣＲ４が介在する条件は、ヘルパーＴ細胞２型が介在する免疫疾患である。「ヘルパーＴ細胞２型が介在する免疫疾患」は、アレルゲンに特異的なＴｈ２細胞の発現および活性化に由来する、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）および肥満細胞が関与している疾患を意味する。
【０２８０】
ＣＣＲ４が介在する疾患または障害は、炎症、感染および／または癌（血液癌および非血液癌を含む）に関連する疾患または状態であり得る。そのような疾患または障害を、本発明の抗体および組成物で治療または予防することができる。好ましい疾患または状態としては、（１）アレルギー性疾患（例えば全身性アナフィラキシーまたは過敏性反応、薬物アレルギー、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、昆虫刺傷アレルギーおよび食物アレルギー）、（２）炎症性腸疾患（例えばクローン病、潰瘍性大腸炎、回腸炎および腸炎）、（３）膣炎、（４）乾癬および炎症性皮膚疾患（例えば皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹および掻痒）、（５）脈管炎、（６）脊椎関節症、（７）強皮症、（８）喘息および呼吸アレルギー疾患（例えばアレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、過敏性肺疾患など）、（９）自己免疫疾患（例えば関節炎（リウマチおよび乾癬を含む）、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、糸球体腎炎など）、（１０）移植片拒絶反応（同種移植の拒絶反応や移植片対宿主拒絶反応を含む）、ならびに（１１）望ましくない炎症性応用が阻害されるべき他の疾患（例えばアテローム性動脈硬化症、筋炎、Ｔ細胞介在性神経変性疾患、多発性硬化症、脳炎、髄膜炎、肝炎、腎炎、敗血症、サルコイドーシス、アレルギー性結膜炎、耳炎、キャッスルマン病、副鼻腔炎、ＬＰＳ誘導性内毒素性ショック、ベーチェット症候群および痛風）、（１２）癌（血液癌と非血液癌の両方）、好ましくは乳癌、直腸結腸癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、肺癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、ＣＴＣＬ、特に菌状息肉腫、セザリー症候群、子宮頸癌、腎臓癌、脳腫瘍、前立腺癌、胃癌）（１３）感染（例えばエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染、ＨＩＶ感染および他のウイルス感染）が挙げられる。
【０２８１】
本発明の抗体がＣＣＲ４に結合すると、癌細胞などのＣＣＲ４陽性細胞の宿主免疫系を回避する能力が損なわれる可能性がある。本発明の抗体を使用してＴreg細胞によるＤＣの抑制を阻害し得る。したがって、ワクチンのアジュバントとしての本発明の抗ＣＣＲ４抗体の使用を提供する。ワクチンは、好ましくは癌または感染症のためのワクチンである。ワクチンは予防用のワクチンであっても治療用のワクチンであってもよい。「アジュバント」とは、抗原に対する宿主の免疫応答を高める薬剤を意味する。ワクチンのアジュバントとして使用する場合には、通常、免疫応答を誘導することが望まれる抗原との関連で、またはそのような抗原と併用して、本発明の抗体を投与する。
【０２８２】
本明細書で使用する場合、「異常な増殖」という用語は、正常な、適切な、または予期される経過から逸脱した細胞の増殖を意味する。例えば、異常な細胞増殖には、ＤＮＡまたは他の細胞の構成要素が損傷を受けたまたは欠損している細胞の不適当な増殖が含まれる場合がある。
【０２８３】
異常な細胞増殖には、不適当に高いレベルの細胞分裂、不適当に低いレベルのアポトーシス、またはそれらの両方によって引き起こされる、それらが介在している、またはそれらの結果である徴候と関連する特徴をもつ、細胞増殖が含まれる場合もある。それらの徴候は例えば、細胞の、細胞群の、または組織の単発性または多発性の局所的な異常増殖、癌性または非癌性、良性または悪性によって特徴付けられ得る。
【０２８４】
本明細書では、「腫瘍」という用語はいずれも、「癌」または「癌腫」も指す。原発性腫瘍からの転移を抑制することで、転移性癌も治療することができる。手術後にも患者に残っている、いわゆる「微小残存病変（ＭＲＤ）」が、抗ＣＣＲ４抗体を用いた免疫療法に感受性である場合もある。
【０２８５】
したがって、本発明はさらに、上で定義した疾患を患っている動物または患者に、治療上有効量の本発明の抗ＣＣＲ４抗体、または抗原結合断片またはそのような抗ＣＣＲ４抗体の免疫複合体を投与することを含む、そのような疾患の治療方法および治療の使用を提供する。
【０２８６】
本発明のさらに別の態様は治療、画像化、または診断に使用する組成物または薬物の製造における、本発明の抗体または抗原結合断片またはそのような抗体の免疫複合体の使用を提供する。
【０２８７】
一層さらに別の態様は治療、診断、または画像化で使用するための、本発明の抗体または抗原結合断片またはそのような抗体の免疫複合体を提供する。
【０２８８】
さらに本発明は、本発明の抗体または抗原結合断片またはそのような抗体の免疫複合体と、１つ以上の薬学上許容可能な賦形剤、担体、希釈剤、緩衝液または安定化剤を含む組成物を提供する。
【０２８９】
本明細書に記載したインビボでの方法は通常、哺乳類中で実施される。いかなる哺乳類をも、例えばヒトおよび任意の家畜、飼育動物、または実験動物を治療することができる。具体例としては、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウシおよびサルが挙げられる。しかしながら、哺乳類は好ましくはヒトである。
【０２９０】
したがって、本明細書で使用する場合、「動物」または「患者」という用語には、いかなる哺乳類も、例えばヒトおよび任意の家畜、飼育動物、または実験動物も含まれる。具体例としては、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウシおよびサルが挙げられる。しかしながら、動物または患者は、好ましくはヒト対象である。
【０２９１】
本発明は、非複合体化または裸の抗体およびその断片を使用した上で定義した障害の治療法と、免疫複合体を使用したＣＣＲ４+細胞、好ましくはＣＣＲ４+腫瘍細胞を標的化する方法の双方を関連づけるものであり、この免疫複合体中では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が治療薬に操作可能に連結されている。したがって、特段の記載のない限りまたは科学的な用語から明かでない限り、「抗体およびその断片」という用語は本明細書で使用する場合、別の薬剤（特に治療薬または診断薬）に結合していない、「非複合体化または裸の」抗体または断片を意味する。これらの定義は抗体の修飾、例として示すだけであるが、例えば、抗体の生物学的な半減期、親和性、結合能もしくは他の特性を向上させるための修飾、または抗体と他のエフェクターとの組み合わせを排除するものではない。
【０２９２】
本発明の治療法および使用はまた、非複合体化または裸の抗体と免疫複合体の双方の使用を包含する。免疫複合体を使用した治療法では、本発明の抗体、またはその抗原結合断片は、好ましくは、第二の治療薬に操作可能に連結されている（抗ＣＣＲ４抗体それ自体が第一の治療薬である）。治療薬は例えば、コルチコステロイドおよび非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）などの抗癌剤または抗炎症剤であってもよい。
【０２９３】
前述の治療法および使用は通常、経皮注入、筋内注入、静脈内注入などによる、動物または患者への薬学的に有効な組成物の全身的な投与を伴う。しかしながら、治療薬を腫瘍部位または部位に局在させることが可能ないかなる投与経路も許容可能である。そのため、他の適切な送達経路には、経口経路、経鼻経路または呼吸器経路および局所経路が含まれる。
【０２９４】
本明細書で使用する場合、「投与」とは、治療効果、例えば抗腫瘍効果を発揮するのに有効な量および期間、抗ＣＣＲ４抗体治療薬を供給または送達することを意味する。一般的には、タンパク質製剤の受動投与が、一つには、単純で再現性があることから好ましい。
【０２９５】
しかしながら、本明細書で使用される「投与」という用語は、本発明の抗ＣＣＲ４抗体を標的部位に送達するか、さもなければ標的部位に供給するいずれのおよび全ての手段を指す。したがって、「投与」には、本発明の抗ＣＣＲ４抗体を産生する細胞を、標的部位に送達するのに有効な方法で供給することを含む。そのような実施形態では、選択的な透過性を示す膜、構造または移植可能な装置に細胞を処方するまたは梱包することが望ましい場合がある。通常、これらの膜、構造または装置を除去することで、治療を止めることができる。さらに、一般的には、本発明の外生抗ＣＣＲ４抗体が好ましい。なぜならば、本発明の外生抗ＣＣＲ４抗体は、厳重に監視・制御可能な非侵襲的な方法であるためである。
【０２９６】
本発明の治療法および使用はまた、本発明の抗ＣＣＲ４抗体をコードしている核酸を、それらを腫瘍の近傍で発現させるまたはそれらを標的部位に局在させるのに有効な方法で供給することも包含する。いかなる遺伝子治療技術も、例えば裸のＤＮＡの送達、組換え遺伝子およびベクター、患者の細胞をエクスビボで操作することを含む細胞を用いた送達なども、使用することができる。
【０２９７】
本発明の抗ＣＣＲ４抗体を使用して、他の治療薬または診断薬を標的部位に送達することもできる。そのような実施形態では、その他の治療薬または診断薬は一般的に、本発明の抗ＣＣＲ４抗体に操作可能に連結されている。
【０２９８】
本発明で使用される「治療上有効量」とは、少なくとも一部の標的ＣＣＲ４+細胞を特異的に殺滅させる；標的ＣＣＲ４+細胞の少なくとも一部でアポトーシスを特異的に誘導する；標的ＣＣＲ４+細胞の少なくとも一部で壊死を特異的に誘導する；ＣＣＲ４リガンドのＣＣＲ４への結合を阻害する；ＣＣＲ４リガンドに対するＣＣＲ４介在性細胞応答を阻害する、好ましくはＣＣＲ４リガンドに応答した細胞内でのカルシウムイオン濃度の上昇を阻害する；炎症を抑制する；および／またはＣＣＲ４+腫瘍を呈している動物または患者に投与した場合に腫瘍の退縮または寛解を誘導するのに有効な、本発明の抗ＣＣＲ４抗体またはその免疫複合体の量である。好ましくは、そのような効果が達成されるが、動物または患者の、正常な健康組織に含まれる細胞への結合または正常な健康組織に含まれる細胞の殺滅をほとんど、または、全く示さず、そして、無視できる、または管理可能な有害副作用を正常な健康組織に及ぼす。
【０２９９】
「標的部位」は、障害に介在している、または障害を引き起こすもしくは増悪させる異常な形で増幅しているＣＣＲ４+細胞の位置を意味する。したがって、標的部位は例えば、腫瘍またはＣＣＲ４介在性炎症が起こっている場所であり得る。「標的細胞」は、障害に介在している、または障害を引き起こすもしくは増悪させる異常な形で増幅しているＣＣＲ４+細胞である。したがって、標的細胞は例えば、ＣＣＲ４+腫瘍細胞、ＣＣＲ４+Ｔreg細胞および／またはＣＣＲ４+Ｔｈ２細胞を含み得る。
【０３００】
したがって、ＣＣＲ４+細胞（例えばＣＣＲ４+腫瘍細胞）を殺滅させることもしくはアポトーシスの誘導もしくは壊死の誘導または炎症の抑制または腫瘍の退縮もしくは寛解の誘導に関して本明細書で使用する場合、「優先的に」および「特異的に」という用語は、本発明の抗ＣＣＲ４抗体またはその免疫複合体が機能して、ＣＣＲ４+標的細胞の破壊、例えば腫瘍細胞の破壊および／または腫瘍壊死が起こることを意味している。これは実質的に動物または対象の標的部位に限定されるものであり、実質的に、正常な健康組織の破壊および／または組織壊死の誘導までに及ぶものではない。
【０３０１】
本発明の抗ＣＣＲ４抗体または治療用複合体は好ましくは、１つ以上の放射線治療薬、化学療法薬、血管新生阻害剤、アポトーシス誘導剤、抗チューブリン薬、抗細胞剤または細胞毒物、サイトカインまたはケモカインアンタゴニスト、サイトカインまたはケモカインの発現阻害剤、ＡＴＰアーゼ阻害剤、抗炎症薬、他の抗体（例えば二重特異的抗体として）または凝固剤（凝固因子）または抗炎症薬（例えばコルチコステロイド、好ましくはグルココルチコイド、または非ステロイド系抗炎症薬、すなわちＮＳＡＩＤ）に結合される。
【０３０２】
したがって本発明は、抗ＣＣＲ４抗体と少なくとも１つの他の治療薬または診断薬が操作可能に連結している、様々な複合体化抗体とその断片を提供する。「免疫複合体」という用語は広い意味で使われ、抗体と別の有効な薬剤との操作可能な連結を定義しているが、単に任意の型の操作可能な連結のみを指すことを意図しているわけではなく、特に化学的な「共役」に限定されるものでもない。特に、組換え融合タンパクが考えられる。送達剤または標的化剤が標的に結合可能であり、かつ、治療薬または診断薬が送達に際して充分にその機能を発揮するかぎり、その結合様式は好適である。
【０３０３】
抗体の炭水化物部分を介した薬剤の結合も考えられている。抗体では、Ｏ−結合型およびＮ−結合型両方のグリコシル化が自然に生じる。組換え抗体を修飾して、さらなるグリコシル化部位を再形成または形成することができる。必要に応じて、抗体の一次配列に適切なアミノ酸配列（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ、Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒなど。Ｘはプロリン以外のいかなるアミノ酸であってもよい）を単に加えることによって達成される。
【０３０４】
本発明の抗ＣＣＲ４抗体または治療用複合体ならびに関連した方法および使用で使用するのに好ましい現行の薬剤としては、抗体の効果を補完するまたは向上させる薬剤および／または特定の型の障害（例えば腫瘍型）または患者のために選択された薬剤がある。
【０３０５】
「抗体の効果を補完するまたは向上させる治療薬」としては、放射線治療薬、化学療法薬、血管新生阻害剤、アポトーシス誘導剤、抗チューブリン薬、抗細胞剤または細胞毒物、凝固剤、サイトカインまたはケモカインアンタゴニスト、サイトカインまたはケモカインの発現阻害剤、ＡＴＰアーゼ阻害剤、抗炎症薬（例えばコルチコステロイド、好ましくはグルココルチコイド、または非ステロイド系抗炎症薬、すなわちＮＳＡＩＤ）、他の抗体（例えば二重特異的抗体として）が挙げられ、これらのうちの１つ以上はいずれも、本発明の使用に好ましい。
【０３０６】
現行の好ましい抗癌剤、特に抗白血病薬には、ダウノルビシン、ドキソルビシン、シタラビン、６−チオグアニン、ミトキサントロン、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ（商標））、プレドニゾン、ビンクリスチン硫酸塩（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、クロラムブシル、フルダラビン、ペントスタチンおよびクラドリビンなどのアントラサイクリン系薬剤が含まれる。
【０３０７】
ＡＴＬの治療に好ましい現行の薬剤には、ジドブジン（アジドチミジン）およびＣＨＯＰ療法がある。ＣＨＯＰは、シクロホスファミド、ヒドロキシダウノルビシン（アドリアマイシン）、オンコビン（ビンクリスチン）、プレドニゾン／プレドニゾロンの略である。
【０３０８】
現行の好ましい血管新生阻害剤としては、アンギオスタチン、エンドスタチン、アンギオポエチン類のうちのいずれか１種、バスキュロスタチン、カンスタチンおよびマスピンがある。
【０３０９】
本明細書で使用する場合「抗チューブリン薬」とは好ましくは、細胞の有糸分裂に必須のチューブリン活性、好ましくはチューブリンの重合または脱重合を、直接または間接的に阻害することによって、細胞の有糸分裂を阻害する、いかなる薬剤、薬物、プロドラッグまたはその組み合わせを意味する。現行の好ましい抗チューブリン薬としては、コルヒチン、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデスチン（ｖｉｎｄｅｓｃｉｎｅ）および１種以上のコンブレスタチン類が挙げられる。
【０３１０】
現行の好ましいＮＳＡＩＤとしては、ＣＯＸ−２阻害剤、スルホンアニリド、リコフェロン（ｌｉｃｏｆｅｌｏｎｅ）およびオメガ−３脂肪酸が挙げられる。
【０３１１】
好ましい薬剤と本発明の抗ＣＣＲ４抗体の結合または会合により、「免疫複合体」が生じる。そのような免疫複合体は、増強された、さらには相乗的な治療特性、例えば抗腫瘍特性または抗炎症性特性を有することが多い。
【０３１２】
抗細胞剤および細胞毒物を使用することで本発明のＣＣＲ４抗体「免疫毒素」が得られ、凝固剤を使用することで本発明の抗ＣＣＲ４抗体「コアグリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄｓ）」が得られる。
【０３１３】
少なくとも２種類の治療薬を使用することもまた考えられる。例えば、放射線治療薬、化学療法薬、血管新生阻害剤、アポトーシス誘導剤、抗チューブリン薬、抗細胞剤または細胞毒物、サイトカインまたはケモカインアンタゴニスト、サイトカインまたはケモカインの発現阻害剤、ＡＴＰアーゼ阻害剤、抗炎症薬（例えばコルチコステロイド、好ましくはグルココルチコイド、または非ステロイド系抗炎症薬、すなわちＮＳＡＩＤ）、他の抗体（例えば二重特異的抗体として）および凝固因子の１つ以上の組み合わせが考えられる。
【０３１４】
特定の用途では、本発明の抗ＣＣＲ４抗体治療薬を、細胞成長または細胞分裂を停止させるまたは抑制する能力を有する細胞毒物、細胞分裂抑制剤あるいは抗細胞剤に操作可能に連結させる。好適な抗細胞剤には、化学療法薬や細胞毒物および細胞分裂抑制剤が含まれる。細胞分裂抑制剤は通常、標的細胞の自然な細胞周期をかく乱する薬剤、好ましくは、標的細胞を細胞周期から逸脱させる薬剤である。
【０３１５】
化学療法薬の例としては、ホルモン（例えばステロイド）；代謝拮抗剤（例えばシトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサートまたはアミノプテリン）；アンスラサイクリン；マイトマイシンＣ；ビアンカアルカロイド；抗生物質；デメコルチン；エトポシド；ミトラマイシン；および抗腫瘍アルキル化剤（例えばクロランブシルまたはメルファラン）が挙げられる。特定の好ましい抗細胞剤には、ＤＮＡ合成阻害剤（例えばダウノルビシン、ドキソルビシン／アドリアマイシンなど）がある。総合すると、タキソール／パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、ゲムシタビン、コンブレスタチンおよびドキソルビシン／アドリアマイシンが現行の好ましい抗癌剤である。
【０３１６】
サリチルイハラミド、コンカナマイシンまたはバフィロマイシンなどのＶ型ＡＴＰアーゼもまた現在好ましいものであり、プリムベリン（ｐｓｙｍｂｅｒｉｎ）、ペデリン、イルシニアスタチンＡなどのタンパク質合成阻害剤も同様である。
【０３１７】
毒素の多くがもたらす細胞殺滅効果が、他の使用可能な薬剤よりもかなり大きいため、特定の治療用途には毒素部分が好ましい。そのため、本発明の抗ＣＣＲ４抗体コンストラクトに好ましい特定の抗癌剤は、植物、真菌、または細菌に由来する毒素である。毒素の例としては、エピポドフィロトキシン；細菌性内毒素または細菌性内毒素の脂質部分；リボソーム不活性化タンパク質（例えばサポリンまたはゲロニン）；ａ−サルシン；アスペルギリン；レストリクトシン；リボヌクレアーゼ（例えば胎盤のリボヌクレアーゼ）；ジフテリア毒素および緑膿菌外毒素が挙げられる。現行の好ましい例には、リシン、ゲロニン、アブリン、ジフテリア、緑膿菌および百日咳毒素がある。
【０３１８】
特定の好ましい毒素は、リシンＡ鎖などの毒素Ａ鎖である。最も好ましい毒素部分は、炭水化物残基を修飾または除去するように処理されているリシンＡ鎖、いわゆる「脱グリコシル化Ａ鎖」（ｄｇＡ）であることが多い。脱グリコシル化リシンＡ鎖の効果が高いこと、半減期が長いこと、また、臨床に適したグレードおよび規模での製造が経済的に実現可能なことから、脱グリコシル化リシンＡ鎖が好ましい。組換えおよび／または切断型リシンＡ鎖を用いることもできる。
【０３１９】
本発明の抗ＣＣＲ４抗体治療薬は、凝固を促進することができる成分、すなわち凝固剤を含んでいてもよい。この場合、目的の抗体を直接または間接的に、例えば別の抗体を介して、直接または間接的に凝固を刺激する因子に結合させることができる。
【０３２０】
そのような使用に好ましい凝固剤には、組織因子（ＴＦ）およびＴＦ誘導体（例えば切断型ＴＦ（ｔＴＦ）、二量体、三量体、重合した／多重結合したＴＦ）、ならびにＶＩＩ因子を活性化する能力を欠損したＴＦ変異体がある。他の適切な凝固因子としては、ビタミンＫ依存性凝固剤（例えばＩＩ／ＩＩａ因子、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、ＩＸ／ＩＸａ因子およびＸ／Ｘａ因子）；Ｇｌａ修飾を欠損しているビタミンＫ依存性凝固因子；ラッセルクサリヘビ毒Ｘ因子活性化剤；血小板活性化化合物（例えばトロンボキサンＡ2およびトロンボキサンＡ2合成酵素）；および繊維素溶解阻害剤（例えばα２−抗プラスミン）が挙げられる。総合すると、切断型組織因子（ｔＴＦ）が現在好まれている。
【０３２１】
一般的に、免疫複合体および免疫毒素の調製は当技術分野において周知である（例えば，米国特許第４，３４０，５３５号を参照のこと）。さらに、下記の特許はそれぞれ、免疫毒素の生成、精製および使用に関する本発明の教示をさらに補う目的で、参照することにより本明細書に組み入れられる。米国特許第６，００４，５５４号；同第５，８５５，８６６号；同第５，９６５，１３２号；同第５，７７６，４２７号；同第５，８６３，５３８号；同第５，６６０，８２７号および同第６，０５１，２３０号。
【０３２２】
様々な化学療法および他の薬剤を本発明の抗ＣＣＲ４抗体治療薬に複合体化することができる。抗体に複合体化されている抗腫瘍薬の例としては、ドキソルビシン、ダウノマイシン、メトトレキサートおよびビンブラスチンが挙げられる。さらに他の薬剤、例えばネオカルチノスタチン、マクロマイシン（ｍａｃｒｏｍｙｃｉｎ）、トレニモン（ｔｒｅｎｉｍｏｎ）およびα−アマニチンの結合については記載がある（それぞれ本明細書に組み入れられる、米国特許第５，６６０，８２７号；同第５，８５５，８６６号；および同第５，９６５，１３２号を参照のこと。
【０３２３】
コアグリガンドの調製も容易に実施することができる。免疫毒素について上で記載したように、本発明の抗ＣＣＲ４抗体と１つ以上の凝固因子を操作可能に連結させることは直接的な結合となり得る。あるいは、操作可能な連結は間接的な結合であってもよく、この場合、例えば、抗体を第二の結合領域、好ましくは凝固因子に結合する抗体または抗体の抗原結合領域に操作可能に連結させる。本発明の抗ＣＣＲ４抗体を、凝固因子の凝固機能をもつ部位とは離れた場所に結合させなければならず、分子の結合には特に共有結合が用いられる。
【０３２４】
本発明の方法では、二重特異性または三重特性抗体を使用してもよい。そのような抗体も本発明の抗体であり、そのような抗体では一本のアームがＣＣＲ４に結合する。二重特異性抗体の調製方法は当技術分野で周知であり、かつ、詳しく記述されている。
【０３２５】
免疫複合体、免疫毒素およびコアグリガンドの調製には、組換え発現を用いてもよい。選択した本発明の抗ＣＣＲ４抗体をコードしている核酸配列と、治療薬、毒素または凝固剤をコードしている核酸配列を発現ベクター中で、インフレームで結合させる。組換え発現によって核酸配列が翻訳され、所望の免疫複合体が得られる。化学架橋剤およびアビジンとビオチンの架橋も、治療薬を本発明の抗ＣＣＲ４抗体に連結させることができる。
【０３２６】
本発明の組成物および方法を他の治療薬および診断薬と組み合わせても良い。本発明にしたがって、抗ＣＣＲ４抗体と「組み合わせて」使用される生物製剤、好ましくは診断薬または治療薬に関し、「組み合わせて」という用語は簡潔に使用され、多岐にわたる実施形態を包含する。したがって「組み合わせて」の用法は、別段の記載のない限りまたは科学的な用語から明かでない限り、組成物、医薬品、混合物、キット、方法、ならびに第一のおよび第二の医学用途の様々な形態の組み合わせに適用される。
【０３２７】
したがって本発明の「組み合わせた」実施形態には、例えば、本発明の抗ＣＣＲ４が裸の抗体であり、本発明の抗ＣＣＲ４が、この抗体に操作可能に連結されていない薬剤または治療薬と組み合わせて使用される実施形態がある。そのような例では、薬剤または治療薬は、標的としていないまたは標的としている形態で使用することができる。「標的としていない形態」では、薬剤特に治療薬は通常、当技術分野におけるそれらの標準的な方法にしたがって使用される。「標的としている形態」では、薬剤は通常、標的疾患部位に薬剤または治療薬を送達する別の抗体または標的化領域に操作可能に連結されている。そのような標的としている形態の生物製剤、診断薬と治療薬の両方、の使用もまた、当技術分野では非常に標準的である。
【０３２８】
本発明の他の「組み合わせた」実施形態では、本発明の抗ＣＣＲ４抗体は免疫複合体であり、この場合、抗体自体が薬剤または治療薬に操作可能に連結されているかまたは組み合わせられている。操作可能な連結は、本明細書に記載のおよび当技術分野で知られている、全ての型の直接的および間接的な結合を含む。
【０３２９】
特に治療薬と併用される本発明の抗ＣＣＲ４抗体に関しては、「組み合わせた」使用はさらに、組み合わせた組成物、医薬品、混合物、キット、方法、ならびに第一のおよび第二の医学的用途を含み、この場合、治療薬はプロドラッグの形態である。そのような実施形態では、プロドラッグを、機能型の薬剤に変換することができる活性化成分もまた、ここでも、本発明の抗ＣＣＲ４抗体に操作可能に連結される。
【０３３０】
特定の好ましい実施形態では、治療用組成物、組み合わせ、医薬品、混合物、キット、方法、ならびに第一のおよび第二の医学的用途は、「プロドラッグの組み合わせ」である。当業者に理解されるように、「プロドラッグの組み合わせ」という用語は、特にことわりがない限り、本発明の抗体が、プロドラッグを活性薬剤へと変換することが可能な成分に操作可能に連結されていることを意味しており、抗体がプロドラッグ自体に結合しているのではないことを意味している。しかしながら、本発明のプロドラッグの実施形態を、プロドラッグの組み合わせとして使用する必要はない。したがってプロドラッグは、ＡＤＥＰＴおよび他の形態を含む当技術分野で使用されているいかなる方法においても、使用することができる。
【０３３１】
したがって、好ましくは診断薬に、より好ましくは治療薬に関し、組み合わせた組成物、医薬品、混合物、キット、方法、ならびに第一のおよび第二の医学的用途についての記述がある場合、組み合わせには裸の抗体である抗ＣＣＲ４抗体と免疫複合体が含まれ、本発明の実施形態のインビボにおける実施には、裸の抗体または免疫複合体および生物学的な診断薬または治療薬を、先に、同時に、または後で投与することが含まれる。ただし、いくつかの複合体化型または非複合体化型では、いくつかの形態の抗体およびいくつかの形態の生物学的な診断薬または治療薬の全体的な供給が達成される場合に限られる。
【０３３２】
腫瘍に及ぼす本発明の効果に関する上述のおよび他の説明は、作業の組み合わせ方、結合剤の型などを簡単に説明するためのものである。この記述方法を、本発明の抗ＣＣＲ４抗体の有益な特性の過小評価または過度の単純化のいずれとしても見なすべきではない。したがって、そのような抗体はそれら自体が抗ＣＣＲ４特性を有し、そのような抗体の免疫複合体はこれらの特性を維持し、免疫複合体はその特性を連結した薬剤の特性と組み合わせ、さらに、抗体と任意の連結した薬剤の組み合わせた効果は、通常、抗体自体がもつ効果よりも向上しているおよび／または拡大していることが理解される。
【０３３３】
したがって本発明は、任意で、少なくとも第一の組成物または容器中に入った、生物学的に有効な量の少なくとも第一の本発明の抗ＣＣＲ４抗体、またはそのような抗ＣＣＲ４抗体の抗原結合断片もしくは免疫複合体；および、生物学的に有効な量の少なくとも第二の生物製剤、成分または系を含む、組成物、医薬組成物、治療用キットおよび医療用混合物を提供する。
【０３３４】
「少なくとも第二の生物製剤、成分またはシステム」は、治療用または診断用の製剤、成分または系であることが多いが、それらである必要はない。例えば、少なくとも第二の生物製剤、成分またはシステムは、抗体を修飾するための成分および／または他の薬剤を抗体に結合させるための成分を含んでいてもよい。特定の好ましい第二の生物製剤、成分またはシステムは、プロドラッグか、またはプロドラッグを生成するためのおよび使用するための成分である。このような成分には、プロドラッグそのものを生成するための成分や、本発明の抗体を適応させて、そのようなプロドラッグまたはＡＤＥＰＴ実施形態中で機能させるための成分が含まれる。
【０３３５】
治療薬または診断薬が少なくとも第二の生物製剤、成分またはシステムとして含まれる場合には、そのような治療薬および／または診断薬は通常、上で定義した１つ以上の障害の治療または診断に関連して使用するための薬剤である。
【０３３６】
したがって特定の実施形態では、「少なくとも第二の治療薬」は、治療用キットまたは治療用混合物に含まれる。「少なくとも第二の治療薬」という用語は、第一の治療薬である本発明の抗ＣＣＲ４抗体を参考にして選択される。したがって本発明の抗体は、化学療法薬、放射線治療薬、サイトカインもしくはケモカインアンタゴニスト、サイトカインもしくはケモカインの発現阻害剤、血管新生阻害剤、アポトーシス誘導剤または抗癌性免疫毒素またはコアグリガンド、または抗炎症剤（コルチコステロイドやＮＳＡＩＤなど）と組み合わせてもよく、それらのうちのいくつかの例については本明細書の他の部分で論じる。
【０３３７】
他の抗癌剤の例としては、例えば、ネオマイシン、ポドフィロトキシン、ＴＮＦ−α、αvβ3アンタゴニスト、カルシウムイオノフォア、カルシウム流動誘導剤、およびそれらの誘導体またはプロドラッグのいずれもが含まれる。現行の好ましい抗チューブリン薬としては、コルヒチン、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデスチン（ｖｉｎｄｅｓｃｉｎｅ）、コンブレスタチンまたはそれらの誘導体もしくはプロドラッグが挙げられる。
【０３３８】
本発明の組成物、キットおよび／または薬剤については、組み合わせた有効量の治療薬を、単一の容器もしくは入れ物に入れてもよいし、または別個の容器もしくは入れ物に入れることもできる。混合物を組み合わせて使用する場合には、通常、混合物を混ぜ合わせる。静脈内投与用に処方された薬剤が好ましいことが多い。画像化剤を加えてもよい。キットには、キットに入っている少なくとも第一の抗体と１つ以上の他の生物製剤を使用するための説明を加えてもよい。
【０３３９】
一般的に、少なくとも第二の治療薬は、単一の医薬組成物もしくはほぼ同時に投与される２つの医薬組成物として、動物または患者に、本発明の抗ＣＣＲ４抗体と実質的に同時に投与され得る。
【０３４０】
あるいは、本発明の抗ＣＣＲ４抗体と少なくとも第二の治療薬を順次、動物または患者に投与することもできる。本明細書で使用する場合、「順次」は「ずらす」こと、すなわち、少なくとも第二の抗癌剤を動物または患者に、本発明の抗ＣＣＲ４抗体の投与とは別の時点で投与することを意味する。一般に、充分に時間をあけて２つの薬剤を投与し、２つの薬剤がそれぞれの治療効果を発揮することができるようにする。すなわち、２つの薬剤を「生物学的に有効な時間間隔」で投与する。少なくとも第二の治療薬を、生物学的に有効な時間間隔をあけて、本発明の抗ＣＣＲ４抗体の前に動物または患者に投与することも、または生物学的に有効な時間間隔をあけて、本発明の抗ＣＣＲ４抗体の後に投与することもできる。
【０３４１】
したがって本発明は、腫瘍を患っている動物または患者の治療方法を提供し、この方法は、
（ａ）動物または患者に、腫瘍量をかなり減少させる第一の治療を施すこと；および
（ｂ）続いて、少なくとも第一の本発明の抗ＣＣＲ４抗体またはその抗原結合断片を投与することを含み、抗体または断片は必要に応じて、第二の治療薬と操作可能に連結されている。
【０３４２】
好ましい第一の治療としては、外科的切除および化学療法による介入が挙げられる。
【０３４３】
他の実施形態において本発明は、ＣＣＲ４介在性疾患を患っている動物または患者の治療法を提供し、この治療法は、
（ａ）動物または患者に、ＣＣＲ４が介在している負荷、例えば炎症を十分に軽減させる第一の治療を施すこと；および
（ｂ）続いて、少なくとも第一の本発明の抗ＣＣＲ４抗体またはその抗原結合断片を投与することを含み、抗体または断片は必要に応じて、第二の治療薬と操作可能に連結されている。
【０３４４】
特定の他の実施形態では、本発明の抗体および免疫複合体と１つ以上の診断薬、一般的には、上で定義した障害の診断に関して使用される診断薬と組み合わせてもよい。したがって、本発明には多様な診断用組成物、キットおよび方法が包含される。
【０３４５】
さらに別の態様は対象を診断する方法または画像化する法を提供する。これらの方法は、本明細書で定義した、適切な量の本発明の抗体または他のタンパク質を対象に投与すること、および対象における本発明の抗体または他のタンパク質の有無および／または量および／または位置を検出することを含む。
【０３４６】
一実施形態において本発明は、ＣＣＲ４の発現と関連している、動物での免疫抑制を軽減する方法を提供し、この方法は、前記動物中のＣＣＲ４と複合体を形成するのに有効な量の本発明の抗体またはその免疫複合体を投与することを含み、その結果、ＣＣＲ４の発現と関連している動物での免疫抑制が軽減する。
【０３４７】
上述の使用および方法にしたがって画像化するまたは診断するのに適した疾患には、本明細書の他の部分で説明したような、任意の疾患、そして好ましくは任意の癌が含まれる。
【０３４８】
一実施形態において本発明は、動物の疾患を診断する方法または疾患の進行を監視する方法を提供し、これらの方法は、
（ａ）前記動物から得た試験試料と本発明の抗体またはその免疫複合体を接触させる工程、を含む。
【０３４９】
さらなる実施形態において本発明は、動物の疾患を診断する方法または疾患の進行を監視する方法を提供し、これらの方法は、
（ａ）前記動物から得た試験試料と本発明の抗体またはその免疫複合体を接触させる工程；
（ｂ）試験試料中における、抗体−抗原複合体の有無および／または量および／または位置を測定するまたは検出する工程；および、任意で、
（ｃ）試験試料中の抗体−抗原複合体の有無および／または量を対照と比較する工程、を含む。
【０３５０】
上述の方法では、抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件で、前記接触させる工程を実施する。当業者は適切な条件を容易に決定することができる。
【０３５１】
上述の方法では、いかなる適切な試験試料も、例えば疾患に罹患している疑いのある細胞生検、組織もしくは器官、または組織切片も使用することができる。
【０３５２】
上述の方法のうちのあるものでは、試験試料中に多少なりとも抗体−抗原複合体が存在することが、疾患が存在していることの指標となる。確実に診断するためには、好ましくは、試験試料中の抗体−抗原複合体量は適切な対照試料で見られる量よりも高く、好ましくは有意に高い。より好ましくは、有意に高いレベルは、統計的に有意なレベルであり、好ましくは確率値が＜０．０５の場合のレベルである。統計的な有意差を決定するのに適した方法は当技術分野で周知であり、かつ、詳しく記述されており、また、これらのいずれを使用してもよい。
【０３５３】
疾患の進行を監視することは、試験試料中の抗体−抗原複合体の有無および／または量を時間経過に沿って監視することを含み得る。したがって監視することは、（ｄ）第一の試験試料中の抗体−抗原複合体の有無および／または量と、前記動物から得た第二の試料中の抗体−抗原複合体の有無および／または量を比較することを含み得る。「第一の試験試料」とは、「第二の試験試料」を採取するよりも前に、例えば第二の試験試料を採取するよりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２日前に、何週間か前に、何ヶ月か前にまたは何年か前に得た試料を意味する。第二の試験試料中の抗体−抗原複合体の量が、第一の試験試料と比較して減少している場合、これは疾患が退行していることの指標となり、量の増加は疾患が進行していることの指標となる。
【０３５４】
当業者は、適切な対照試料を容易に選択することができる。例えば、特定の疾患を診断する場合には、その疾患を患っていない対象由来の試料が適切な対照となる。また、全ての試験で対照「試料」についての試験を行わなくても、例えば当技術分野において既知の正常対象の範囲を参照することで、適切な対照「値」を容易に決定することができる。
【０３５５】
診断用途または画像化用途で使用する場合、本発明の抗体を検出可能なマーカー、例えば、放射線不透過性または放射性同位元素（3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、123Ｉ、125Ｉ、131Ｉなど）；放射線放出体（例えば、α、βまたはγ線放出体）；蛍光（蛍光色素分子）または化学発光化合物（発色団）（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンまたはルシフェリンなど）；酵素（アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼなど）；画像化剤；または金属イオン；または化学部分（特定の同族の検出可能部分、例えば標識されたアビジン／ストレプトアビジンへの結合によって検出することができるビオチンなど）で標識してもよい。結合タンパク質、例えば抗体または抗体断片に標識を結合させる方法は当技術分野で知られている。そのような検出可能なマーカーによって、試験試料中の結合タンパク質−抗原複合体の有無、量または位置の解析が可能になる。
【０３５６】
インビボで使用するための好ましい検出可能なマーカーには、Ｘ線により検出することができる化合物（例えば、ビスマス（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、ランタン（ＩＩＩ）もしくは鉛（ＩＩ））；放射性イオン（例えば銅67、ガリウム67、ガリウム68、インジウム111、インジウム113、ヨウ素123、ヨウ素125、ヨウ素131、水銀197、水銀203、レニウム186、レニウム188、ルビジウム97、ルビジウム103、テクネチウム99mもしくはイットリウム90）；核磁気スピン共鳴同位体（例えば、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、クロム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）もしくはイッテルビウム（ＩＩＩ）など）；またはローダミンもしくはフルオレセインがある。
【０３５７】
本発明はまた、検出可能なシグナルを生成する標識に、直接または間接的に結合した、本発明の抗体を含む診断薬または画像化剤を含む。適切な標識については、本明細書の別の部分で記述する。
【０３５８】
本発明はさらに、１つ以上の本発明の抗体、免疫複合体もしくは組成物、または本発明の抗体をコードしている１つ以上の核酸分子、または本発明の核酸配列を含んでいる１つ以上の組換え発現ベクター、または本発明の組換え発現ベクターまたは核酸配列を含んでいる１つ以上の宿主細胞もしくはウイルスを含むキットを包含する。前記キットは、好ましくは本発明に記載の方法および使用で、例えば、本明細書に記載の治療、診断または画像化法で用いるためのものであるかまたは、本明細書に記載のインビトロでのアッセイまたは方法で使用するためのものである。そのようなキットに含まれる抗体は、好ましくは、本明細書の他の部分で説明するような、抗体複合体、例えば、検出可能な部分との複合体であってもまたは免疫複合体であってもよい。前記キットは好ましくは、キットの構成要素の、例えば診断で使用する場合の使用説明書を含む。前記キットは好ましくは、本明細書の他の部分で説明したような、疾患の診断または治療のためのものであり、任意で、そのような疾患の診断または治療で使用する場合の、キットの構成要素に関する使用説明書を含む。
【０３５９】
本明細書で定義したように、本発明の抗体を、インビトロでのまたはインビボでの用途およびアッセイ用の分子ツールとして使用してもよい。抗体には抗原結合部位があるため、抗体は特定の結合対のメンバーとして機能することができ、特定の結合対のメンバーが必要とされる任意のアッセイで、これらの分子を使用することができる。
【０３６０】
したがって本発明の一層さらなる態様は、本明細書で定義した本発明の抗体を含む試薬と、そのような抗体の分子ツールとしての使用、例えばインビトロまたはインビボアッセイでの使用を提供する。
【０３６１】
癌治療はまた、
（ａ）腫瘍を患っている動物または患者に、診断量の少なくとも第一の検出可能に標識した本発明の抗ＣＣＲ４抗体（本発明の抗ＣＣＲ４抗体に操作可能に連結した診断薬を含む）を投与し、その結果検出可能な腫瘍の画像を生成することで、腫瘍の画像を生成すること；および
（ｂ）同じ動物または患者に、治療上最適化量の少なくとも第一の本発明の裸の抗ＣＣＲ４抗体または、そのような抗体を用いた治療薬−抗体コンストラクトを続いて投与し、その結果抗腫瘍効果を誘導すること、によって行うことができる。
【０３６２】
配列番号１６と１８は同一であり、そのため、本明細書に開示したいずれの実施形態においても、配列番号１６の参照は配列番号１８の参照も含むと見なされ、そしてその逆もまた同じである。
【０３６３】
次に、表および図を参照して、以下の非限定的な例において本発明がより詳細に説明される。
表１は抗体２０８に関連して本明細書に開示される配列のいくつかを記載する。
表２は抗体３０６に関連して本明細書に開示される配列のいくつかを記載する。
表３は抗体３０８に関連して本明細書に開示される配列のいくつかを記載する。
表４は抗体４０６に関連して本明細書に開示される配列のいくつかを記載する。
表５は抗体５０１に関連して本明細書に開示される配列のいくつかを記載する。
表６は抗体５０３に関連して本明細書に開示される配列のいくつかを記載する。
表７は抗体６０１に関連して本明細書に開示される配列のいくつかを記載する。
表８は抗体６０３に関連して本明細書に開示される配列のいくつかを記載する。
表９は抗体８０３に関連して本明細書に開示される配列のいくつかを記載する。
表１０は抗体２０８のＩｇＧ型に関連して本明細書に開示される配列のいくつかを記載する。可変領域には下線が引かれている。
表１１は抗体３０６のＩｇＧ型に関連して本明細書に開示される配列のいくつかを記載する。可変領域には下線が引かれている。
表１２は抗体３０８のＩｇＧ型に関連して本明細書に開示される配列のいくつかを記載する。可変領域には下線が引かれている。
表１３は抗体４０６のＩｇＧ型に関連して本明細書に開示される配列のいくつかを記載する。可変領域には下線が引かれている。
表１４は抗体５０１のＩｇＧ型に関連して本明細書に開示される配列のいくつかを記載する。可変領域には下線が引かれている。
表１５は抗体５０３のＩｇＧ型に関連して本明細書に開示される配列のいくつかを記載する。可変領域には下線が引かれている。
表１６は抗体６０１のＩｇＧ型に関連して本明細書に開示される配列のいくつかを記載する。可変領域には下線が引かれている。
表１７は抗体６０３のＩｇＧ型に関連して本明細書に開示される配列のいくつかを記載する。可変領域には下線が引かれている。
表１８は抗体８０３のＩｇＧ型に関連して本明細書に開示される配列のいくつかを記載する。可変領域には下線が引かれている。
表１９は、ＴＡＲＣ介在性カルシウム流動阻害から得られる、ＩＣ50の計算値を示す。
表２０は、標識化リガンドを使用する、抗ＣＣＲ４ＩｇＧのリガンド干渉性結合実験からのＩＣ50の実測値を示す（実施例３）。ＫＷ０７６１について数値は決定されなかった。適合度は最小自乗（Ｒ2）値により判定される。
表２１はリガンド介在性カルシウム流動実験での抗ＣＣＲ４抗体の拮抗性特性の概要である（実施例５）。ＴＡＲＣ誘導性カルシウム流動の場合、ＩＣ50値が測定され、適合度が最小自乗（Ｒ2）により判定される。ＭＤＣ誘発性シグナル伝達への阻害効果は１０μｇ／ｍｌの濃度で抗ＣＣＲ４抗体の最大阻害として提示され、％単位で表される。ＫＷ０７６１について数値は決定されなかった。
表２２は、抗ＣＣＲ４抗体によるリガンド誘導性遊走（ＴＡＲＣおよびＭＤＣ）の抑制からのＩＣ50実測値および残存遊走の割合（％）の概要である。ＩＣ50値は、実施例６に記載されるように、リガンドの存在下でのタイトレーション曲線から得られた。適合度は最小自乗（Ｒ2）値により判定される。ＭＤＣの阻害の場合、１０μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度での最大阻害が提示される。
表２３は、７８６‐Ｏ細胞への抗ＣＣＲ４抗体５０３によるＴＡＲＣ誘導性侵入の抑制からのＩＣ50実測値の概要である。ＩＣ50値は、実施例６に記載されるように、ＴＡＲＣ（２５および１２５ｎＭ）の存在下でのタイトレーション曲線から得られた。適合度は最小自乗（Ｒ2）値により判定される。
表２４は、血液腫瘍細胞株ＣＣＲＦ‐ＣＥＭおよびＬ‐４２８に対する、実施例９に記載されるＡＤＣＣ実験からのＥＣ50実測値の概要である。ＥＣ50実測値は、ＧｒａｐｈＰａｄ（Ｐｒｉｓｍ）を使用して、データを「ｌｏｇ（アゴニスト）ｖｓ．反応モデル」に当てはめることにより得られた。細胞傷害性の最大値が所与の濃度で提示される。
表２５：腎臓細胞腫瘍マイクロアレイ（ＴＭＡ）とその妥当な対照組織（胎盤および正常な腎臓）についての免疫組織化学（ＩＨＣ）実験からのスコア表。１つのＴＭＡについて染色されたコアの総数から陽性染色のコアの数が与えられる。損傷を受けたコアはスコアされなかったので、染色されたコアの数は各染色で異なる。ゼロは染色されたものが無かったことを意味し、１は中間の染色を意味し、２は強い染色を意味する。
【図面の簡単な説明】
【０３６４】
【図１ａ）】実施例２の結果：ＣＣＲ４を発現する標的細胞への抗ＣＣＲ４  ｓｃＦｖの結合。二量体の状況をシミュレートするために抗Ｍｙｃ−抗体（マウス）を使用してｓｃＦｖが架橋され、１０μｇ／ｍｌから始めて、３倍に希釈された。ＲＰＥ複合体化抗マウスＩｇＧを使用して、結合したｓｃＦｖを検出した。ａ）ＣＣＲ４陽性ＤＴ４０細胞への結合。ｂ）ＣＣＲ４陰性ＤＴ４０細胞への結合。
【図１ｂ）】同上
【図２】実施例２の結果：ＣＣＲ４陰性Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞と比較した、ＣＣＲ４発現Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞への抗ＣＣＲ４  ｓｃＦｖ２０８の結合。二量体の状況をシミュレートするために抗Ｍｙｃ−抗体（マウス）を使用してｓｃＦｖが架橋され、１０μｇ／ｍｌから始めて、３倍に希釈された。ＲＰＥ複合体化抗マウスＩｇＧを使用して、結合したｓｃＦｖを検出した。
【図３】実施例２の結果：ＣＣＲ４を発現する天然の標的細胞（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ）への抗ＣＣＲ４ｓｃＦｖの結合。二量体の状況をシミュレートするために抗Ｍｙｃ−抗体（マウス）を使用してｓｃＦｖが架橋され、２０μｇ／ｍｌから始めて、３倍に希釈された。ＲＰＥ複合体化抗マウスＩｇＧを使用して、結合したｓｃＦｖを検出した。
【図４】実施例３の結果：Ａｌｅｘａ６４７標識化ＭＤＣ−ＳＮＡＰを用いる抗ＣＣＲ４  ｓｃＦｖのリガンド干渉性結合実験。一定濃度のＭＤＣ−ＳＮＡＰ（５０ｎＭ）の存在下、５μｇ／ｍｌ（１５０ｎＭ）の濃度で、そして、１２希釈点にわたって３倍ずつｓｃＦｖを希釈して、ｓｃＦｖをインキュベートした。
【図５】実施例３の結果：ＴＡＲＣおよびＭＤＣの存在下での抗ＣＣＲ４  ｓｃＦｖのリガンド干渉性結合実験。一定濃度のリガンド（１μｇ／ｍｌ）と２．５μｇ／ｍｌのマウス抗Ｍｙｃ−抗体（マウス）の存在下、０．５μｇ／ｍｌの濃度でｓｃＦｖをインキュベートし、抗マウス−ＲＰＥ複合体化抗体を用いて染色した。ｓｃＦｖは実施例１に記載される通り（候補６０１は提示されず）。シグナルが、抗体対照のみで染色された細胞（バックグランド）ならびに未染色細胞（未染色）と比較された。
【図６】実施例４の結果：ビオチン化ＫＷ０７６１−ＩｇＧの存在下での抗ＣＣＲ４抗体２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０、８０３およびＫＭ３０６０ｖａｒとの間の競合実験。ＰＥ複合体化ストレプトアビジンを使用してビオチン化ＫＷ０７６１−ＩｇＧを検出した。
【図７】実施例５の結果：ＫＭ３０６０ｖａｒと比較した、抗ＣＣＲ４  ｓｃＦｖ抗体によるＴＡＲＣ介在性カルシウム流動の阻害。ｓｃＦｖの濃度を上昇させつつ、２８．６ｎｇ／μｌ（３．６ｎＭ）の終濃度のＴＡＲＣをインキュベートし、０．５μｇ／ｍｌの濃度で始まる６点のｓｃＦｖの希釈点にわたってＴＡＲＣの力価測定を行った。ＴＡＲＣリガンドはあるが、ｓｃＦｖ抗体が無いなかで記録されたシグナルを１００％シグナル伝達として、シグナルが％単位で表された。
【図８】実施例５の結果：抗ＣＣＲ４  ｓｃＦｖ抗体によるＭＤＣ介在性カルシウム流動の阻害。１０μｇ／ｍｌという一定の濃度のｓｃＦｖの存在下で、５ｎｇ／μｌ（６．２５ｎＭ）の終濃度のＭＤＣをインキュベートした。ＭＤＣリガンドはあるが、ｓｃＦｖ抗体が無いなかで記録されたシグナルを１００％シグナル伝達として、シグナルが％単位で表された。
【図９】実施例６の結果：抗ＣＣＲ４  ｓｃＦｖ抗体の濃度が上昇するなかでの（０．３６〜３３３ｎＭ）、ＣＣＲ４+ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞のＴＡＲＣ介在性走化性の抑制。ＴＡＲＣの濃度は３．５ｎＭという一定の濃度であった。ＴＡＲＣリガンドはあるが、ｓｃＦｖ抗体が無いなかでの細胞の遊走を１００％として、シグナルが％単位で表された。グラフはフィットさせられた。
【図１０】実施例２の結果：ＣＣＲ４を発現する標的細胞への抗ＣＣＲ４  ＩｇＧの結合。規定濃度のＩｇＧをインキュベートし、ＲＰＥ複合体化抗ヒトＩｇＧを使用して、結合したＩｇＧを検出した。ａ）ＣＣＲ４陽性ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞への結合。ＩｇＧを１μｇ／ｍｌで始まる８点にわたって４倍ずつ希釈した。ｂ）ＣＣＲ４陽性Ｈｕｔ７８細胞への結合。ＩｇＧを１μｇ／ｍｌで始まる８点にわたって４倍ずつ希釈した。ｃ）ＣＣＲ４陽性Ｌ−４２８細胞への結合。ＩｇＧを１０μｇ／ｍｌで始まる８点にわたって３倍ずつ希釈した。
【図１１】実施例２の結果：ヒト血清の存在下でのＣＣＲ４発現標的細胞（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ）への結合。０％のヒト血清（ＦＡＣＳ緩衝液）か１０％および５０％のヒト血清の存在下で１０μｇ／ｍｌの濃度のビオチン化試料をインキュベートした。ＰＥ複合体化ストレプトアビジンにより試料を検出した。ａ）記録された結合シグナルの比較。ｂ）％単位に換算された残存結合シグナル。
【図１２】実施例３の結果：標識化リガンドを使用する抗ＣＣＲ４  ＩｇＧのリガンド干渉性結合実験。ａ）一定の濃度のＡｌｅｘａ６４７標識化ＭＤＣ−ＳＮＡＰ（５０ｎＭ）の存在下で５μｇ／ｍｌ（３５ｎＭ）の濃度のＩｇＧと８希釈点にわたって４倍ずつ希釈したＩｇＧをインキュベートした。ｂ）一定の濃度のビオチン化ＴＡＲＣ（３．１２μＭ）の存在下で２．５μｇ／ｍｌ（１７．５ｎＭ）の濃度のＩｇＧと８希釈点にわたって４倍ずつ希釈したＩｇＧをインキュベートした。ＰＥ複合体化ストレプトアビジンを使用して、残っている結合したビオチン化ＴＡＲＣを検出した。
【図１３】実施例６の結果：７８６−Ｏ細胞のＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ介在性侵入の抑制。抗ＣＣＲ４抗体５０３の濃度（μｇ／ｍｌ）を上昇させつつ、２つの異なる濃度のＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ（２５ｎＭおよび１２５ｎＭ）と細胞がインキュベートされた。実施例６に概説されるように、遊走した細胞を染色し、解析し、％単位に換算した。破線（ｙ＝２５％）はアッセイ中の７８６−Ｏ細胞の基底侵入能力を示す。
【図１４】実施例９の結果：ＣＣＲ４発現細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ａ）およびＬ−４２８（ｂ）に対するＡＤＣＣの誘導。ヒトＰＢＭＣの存在下で、実施例１に記載されるように、様々な濃度の抗ＣＣＲ４抗体とカルセイン標識化標的細胞をインキュベートした。ＫＷ０７６１が対照としてインキュベートされた。トライトンＸ‐１００で処理した後の１００％溶解した細胞での試料の蛍光強度に基づき、ＡＤＣＣの誘導を％単位に換算した。非線形回帰分析により用量反応曲線を算出した。
【図１５】実施例９の結果：ＣＣＲ４を発現する単離されたＴreg細胞に対するＡＤＣＣの誘導。実施例９に記載されるようにＴreg細胞が単離され、カルセインで標識化され、そして、自己ＰＢＭＣの存在下で４．５μｇ／ｍｌという単一濃度の抗ＣＣＲ４抗体と共にインキュベートされた。トライトンの存在下での細胞からのカルセインの放出最大値に対して正規化することにより、細胞傷害性を％単位に換算した。殺滅のパーセンテージが示される。
【図１６】実施例１０の結果：成人性Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）のヒト異種移植片モデルにおける抗ＣＣＲ４抗体のインビボ効力。腫瘍移植（ＴＩ）後の試験の間に様々な群で測定された体重が示される。Ａ群（対照群）は大きい腫瘍体積のため２３日後に殺処理を受けた。ａ）処理時間に対する平均体重（ｇ単位）。ｂ）処理時間に対する相対的体重（％単位）。
【図１７】実施例１０の結果：成人性Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）のヒト異種移植片モデルにおける抗ＣＣＲ４抗体のインビボ効力。腫瘍移植（ＴＩ）後の試験の間に様々な群（ａ〜ｅ）で測定された腫瘍体積の比較。腫瘍移植（ＴＩ）後の時間に対して個々の（ｍｍ3単位で測定された）腫瘍体積がプロットされている。対照群（Ａ群）は腫瘍体積が大きいため第２３日に殺処理を受けなければならなかった。
【図１８】実施例１０の結果：成人性Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）のヒト異種移植片モデルにおける抗ＣＣＲ４抗体のインビボ効力。ａ）様々な実験群の間での腫瘍の平均値。各群内で生存している動物の数が示される。ｂ）個々の処理群（抗体）と未処理（対照）群の比較により計算された生存率。抗ＣＣＲ４抗体３０６および５０３について統計的有意値が特定された。ｃ）第２３日での腫瘍倍化時間の計算値。抗ＣＣＲ４抗体５０３についての統計的有意差が特定された（*で印される）。
【図１９】実施例１２の結果：腎臓細胞癌（ＲＣＣ）患者由来の腫瘍マイクロアレイに対する抗ＣＣＲ４抗体５０３の結合。パラフィン包埋組織切片についてＩｇＧ５０３の結合を評価した。３μｇ／ｍｌの濃度で抗体をインキュベートし、ビオチン複合体化ヤギ抗ヒト抗体（１：５００）とインキュベートし、そして、基質としての３，３ジアミノベンジジンとベクタステイン・エリートＡＢＣキットを使用して抗体を可視化した。顕微鏡の倍率はｘ倍で示されている。脾臓由来の陽性対照組織で染色を最適化し（ａ）、そして、正常なヒト胎盤組織で特異性について確認した（ｂ）。ＲＣＣの患者由来の組織への結合はｃ）およびｄ）に示される。
【実施例】
【０３６５】
比較情報
先に考察したように、公知の抗ＣＣＲ４抗体ファミリーはＫＭ２１６０、ＫＭ３０６０、ＫＭ２７６０およびＫＷ−０７６１を含み、それらは、ヒトＣＣＲ４のＮ末端アミノ酸の位置２〜２９の領域にあるエピトープを認識する（欧州特許第１２７０５９５号）。
【０３６６】
本明細書において報告される実験のいくつかでは、本発明者らはＫＭ３０６０ｖａｒ（「ＫＭ３０６０ｖ）とも称される）を使用しており、それはＫＭ３０６０に対応するが、異なる宿主で発現されたので、異なる糖プロファイルを有する可能性がある。ｓｃＦｖ型でこの抗体を使用した。
【０３６７】
本明細書において報告される実験のいくつかでは、本発明者らはＩｇＧ型のＫＷ０７６１を使用した。
【０３６８】
ＫＭ２７６０はＣＣＲ４とＴＡＲＣまたはＭＤＣの間の相互作用を妨げないことが報告されている（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６  （１１），  ｐｐ  ５７１６−５７２２）。出願者のＫＭ３０６０ｖａｒを使用した発見はこの報告と一致する。
【０３６９】
ＫＭ２７６０がＣＣＲ４のシグナル伝達を阻害しないことも報告されている。出願者は、ＫＭ３０６０ｖａｒがＭＤＣまたはＴＡＲＣ誘導性カルシウム流動を阻害しないことを発見している。出願者はまた、ＫＭ３０６０ｖａｒがＭＤＣまたはＴＡＲＣ介在性走化性をあまり抑制しないことを発見した。
【０３７０】
実施例１：新規抗体
ＣＣＲ４に特異的に結合する９つのヒト抗体を同定した。ｃ−ｍｙｃタグエピトープおよび６×ヒスチジンタグエピトープを含むｐＨＯＧ２１プラスミドに単鎖形態の抗体をクローン化した。ＴＧ１バクテリアを形質転換し、ＩＰＴＧ誘導でｓｃＦｖを発現させた。精製したｓｃＦｖの結合をＥａｓｙＣｙｔｅにより確認した（実施例２を参照のこと）。
【０３７１】
抗体の重鎖および軽鎖を産生するクローンのヌクレオチド配列が解析された。抗体は２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３と名付けられた。２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３の軽鎖および重鎖の、特に、ＣＤＲ領域の配列が表１〜９に、それぞれ、示される。
【０３７２】
ＩｇＧ形態の抗体２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３もまた作製された。標準的な方法を用いてＩｇＧを調製した。簡単に述べると、対応する可変ドメインをコードする遺伝子が、ヒト定常ドメインを含む哺乳類発現ベクターｐＬＮＯ（Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７）にクローン化された。細胞工場で抗体が発現され、そして、プロテインＡカラムで最初の採取物が精製され、そして、サイズ排除クロマトグラフィーによって単量体に分画された。ＩｇＧはそれらのＣＣＲ４に特異的に結合する能力を保持していた。
【０３７３】
ＩｇＧ形態のこれらの抗体はＩｇＧ１アイソタイプの抗体であり、２本の重鎖と２本の軽鎖を含む。各重鎖はＶHドメイン（配列は適切な表に示される）とヒトＩｇＧ１定常領域を含む。各軽鎖はＶLドメイン（配列は適切な表に示される）とヒトλ軽鎖定常領域を含む。実施例７において説明されるように、脱フコシル化形態のＩｇＧ抗体が作製された。ＩｇＧ形態の本発明の抗体を用いる、本明細書において記載されるいずれのアッセイも脱フコシル化形態の抗体を使用する。
【０３７４】
実施例２：抗ＣＣＲ４抗体の標的発現細胞への結合
実施例１において開示された抗体のＣＣＲ４特異性を示すために、ｓｃＦｖ２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３を用いる染色についてのフローサイトメトリーにおいて、自分でＣＣＲ４を形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＤＴ４０細胞、および非形質移入型のそれらの細胞、および天然のＣＣＲ４+ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞株を使用した。陽性対照として、自分でクローン化し、発現したＫＭ３０６０ｖａｒ  ｓｃＦｖを使用した。（緑色蛍光タンパク質に対して生じた）抗ＧＦＰ  ｓｃＦｖ抗体を陰性対照として使用した。
【０３７５】
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（急性リンパ芽球性白血病、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−１１９）、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７（ヒト腎臓、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１１２６８）およびＤＴ４０（ニワトリリンパ腫、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−２１１１）細胞株を米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド州）から入手した。
【０３７６】
ヒトＣＣＲ４での一過性形質移入のため、Ｔ７５（ＮＵＮＣ）フラスコに２×１０6細胞のＨｅｋ２９３Ｔ／１７細胞を蒔いた。播種４８時間後に、形質移入剤としてＦｕｇｅｎｅ（ＲＯＣＨＥ）を使用して、ヒトＣＣＲ４をコードするｐｃＤＮＡ３．１プラスミドで前記細胞を形質移入した。Ｔ７５あたり４０μｌのＦｕｇｅｎｅと１６μｇのＤＮＡを使用する。形質移入の４８時間後にその細胞をアッセイに使用した。
【０３７７】
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞とＤＴ４０細胞はＲＰＭＩ‐１６４０培地で維持し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）培地に維持した。ウシ胎児血清を用いて全ての細胞を維持したが、濃度はＤＴ４０細胞とＨＥＫ２９３Ｔ細胞には１０％で、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞には２０％であった。全ての培地にはペニシリンとストレプトマイシンが添加された。
【０３７８】
フローサイトメトリー実験のため、培養フラスコから細胞を回収し、ＰＢＳで２回細胞を洗浄し、０．２％ＢＳＡと０．０９％ＮａＮ3を含むＰＢＳに細胞を再懸濁し、最後に、Ｖ型９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、フリッケンハウゼン、ドイツ）にウェルあたり１×１０5細胞の割合で分注した。４００×ｇで５分間、細胞を遠心分離し、そして、様々に希釈したｓｃＦｖと４℃で６０分間インキュベートした。
【０３７９】
細胞に添加する前にｓｃＦｖを架橋するために、全てのｓｃＦｖ調製物をマウス抗ｍｙｃ−抗体（９Ｅ１０．２、Ｄｉａｔｅｃ、オスロ、ノルウェイ）とプレインキュベートし、そして、１０μｇ／ｍｌの濃度から始めて、３倍ずつ希釈した。
【０３８０】
０．２％ＢＳＡと０．０９％ＮａＮ3を含むＰＢＳで洗浄した後、１μｇ／ｍｌのＲＰＥ複合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、デュッセルドルフ、ドイツ）を用いて細胞を４℃で３０分間染色した。染色した細胞を洗浄し、０．２％ＢＳＡと０．０９％ＮａＮ3を含む２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、そして、ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ヘイワード、カリフォルニア州、米国）でのデータ獲得のため、Ｕ型９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、スキポール‐ライク、オランダ）に移した。
【０３８１】
ｓｃＦｖ２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３はＣＣＲ４に特異的であることが得られた結果より明らかに示されている。図１に、ＣＣＲ４陰性ＤＴ４０細胞と比較した、ｓｃＦｖ２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３のＣＣＲ４陽性ＤＴ４０細胞への結合が示される。ＣＣＲ-ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較した、ｓｃＦｖ２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３のＣＣＲ４+ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への選択的結合もまた示される（図２；抗体２０８についてのデータのみが示される）。図３にｓｃＦｖ２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３のＣＣＲ４発現ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞への結合が示される。
【０３８２】
ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞とヒトＣＣＲ４を発現するように形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞への結合を比較することにより、脱フコシル化ＩｇＧ1型（実施例７を参照のこと）の抗体３０６、４０６および５０３のＣＣＲ４特異性も確認された。これらの抗体はまた、ＣＣＲ４陽性細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｌ−４２８、Ｈｕｔ７８、７８６−Ｏ、Ａ４９８、ＫａｔｏＩＩＩおよびＭＣＦ−７への結合について、フローサイトメトリーを用いて試験された。
【０３８３】
抗ＣＣＲ４抗体１Ｇ１（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国）、抗ＣＣＲ４抗体Ａｂ１６６９（Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、英国）ならびに自家製のＫＷ０７６１ＩｇＧ（上記を参照）のいずれかを陽性対照として使用した。オピオイド系薬物であるヘロインと結合するアイソタイプ対照抗体６−ＭＡＭと（緑色蛍光タンパク質に対して生じた）抗ＧＦＰ抗体を陰性対照として使用した。両方の抗体をＩｇＧ1分子として自作した。
【０３８４】
ヒト血清の存在下での標的発現細胞への結合を示すために、ＥＺ−リンク・マレイミド−ＰＥＧ固相ビオチン化キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、ロックフォード、イリノイ州、米国）のマニュアルに従って、システインを介して抗ＣＣＲ４抗体３０６、４０６、５０３およびＫＷ０７６１をビオチン化した。
【０３８５】
ＣＣＲ４陽性細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｈｕｔ７８（皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ＡＴＣＣ寄託番号ＴＩＢ−１６１）、７８６−Ｏ（ヒト腎臓細胞腫、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１９３２）、ＭＣＦ−７（ヒト乳腺腺癌、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＴＢ−２２）、ＫａｔｏＩＩＩ（ヒト胃癌、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＴＢ−１０３）およびＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞株を米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド州）から入手した。Ｌ−４２８細胞（非ホジキンリンパ腫、ＤＳＭＺ番号ＡＣＣ１９７）およびＡ−４９８（ヒト腎臓細胞腫、ＤＳＭＺ番号ＡＣＣ５５）を「ドイツ微生物培養細胞系統保存機関」（ＤＳＭＺ、ブラウンシュバイク、ドイツ）から入手した。ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｌ−４２８、Ｈｕｔ７８、７８６−ＯおよびＫａｔｏＩＩＩ細胞はＲＰＭＩ‐１６４０培地で維持した。ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞およびＭＣＦ−７細胞はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＰＡＡ由来、カタログ番号Ｅ１５−８１０））培地で維持した。Ａ−４９８細胞はＥＭＥＭ培地で培養した。ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｌ−４２８、Ｈｕｔ７８およびＫａｔｏＩＩＩは２０％のウシ胎児血清の存在下で維持されたことを例外として、全ての細胞が１０％のウシ胎児血清（ＰＡＡ由来、カタログ番号Ａ１５−２５２）で維持された。全ての培地にペニシリンとストレプトマイシン（ＰＡＡ由来、カタログ番号Ｐ１１−０１０）が添加された。
【０３８６】
フローサイトメトリー実験のため、懸濁細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｈｕｔ７８およびＬ−４２８を培養フラスコから直接回収した。接着性細胞株Ｈｅｋ２９３Ｔ／１７、７８６−Ｏ、Ａ−４９８、ＫａｔｏＩＩＩおよびＭＣＦ−７はＰＢＳで２回洗浄し、そして、製造業者の方法に従って室温で３分間アキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）（ＰＡＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、リンツ、オーストリア）とインキュベートすることにより培養フラスコから剥離させた。０．２％ＢＳＡと０．０９％ＮａＮ3を含むＰＢＳに全ての細胞を再懸濁し、最後に、Ｖ型９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、フリッケンハウゼン、ドイツ）にウェルあたり１×１０5細胞の割合で分注した。４００×ｇで５分間、細胞を遠心分離し、そして、様々に希釈したＩｇＧと４℃で６０分間インキュベートした。ヒト血清の存在下での結合については、１０％か５０％のヒト血清（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州、米国）と様々なＩｇＧ溶液を３７℃で６０分間ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞とインキュベートした。
【０３８７】
０．２％ＢＳＡと０．０９％ＮａＮ3を含むＰＢＳで洗浄した後、１μｇ／ｍｌのＲＰＥ複合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、デュッセルドルフ、ドイツ）を用いて細胞を４℃で３０分間染色した。染色した細胞を洗浄し、０．２％ＢＳＡと０．０９％ＮａＮ3を含む２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、そして、ＥａｓｙＣｙｔｅ（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ヘイワード、カリフォルニア州、米国）でのデータ獲得のため、Ｕ型９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、スキポール‐ライク、オランダ）に移した。
【０３８８】
ＩｇＧ抗体３０６、４０６および５０３はＣＣＲ４に特異的であることが得られた結果より明らかに確認されている。ＩｇＧ３０６、４０６および５０３のＣＣＲ４陽性Ｈｅｋ２９３Ｔ／１７細胞に対する結合はＣＣＲ４陰性Ｈｅｋ２９３Ｔ／１７細胞に対する結合よりも著しく高かった。対照抗体１Ｇ１もまたＣＣＲ４陽性Ｈｅｋ２９３Ｔ／１７細胞に結合したが、生じたシグナルは弱かった。
【０３８９】
図１０にＩｇＧ抗体３０６、４０６および５０３の血液系ＣＣＲ４発現Ｌ４２８細胞およびＨｕｔ７８細胞、ならびにＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞への結合が示される。３０６、４０６および５０３の７８６−Ｏ、Ａ４９８、ＫａｔｏＩＩＩおよびＭＣＦ−７への結合もまた確認されたが、陰性対照抗体はこれらの細胞株に結合しなかった（データは示さない）。
【０３９０】
安心させるために言うと、抗ＣＣＲ４抗体のＣＣＲ４陽性細胞への結合は、図１１に細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭとの関連で示されるように、ヒト血清の濃度が上昇しても阻害されない。
【０３９１】
図１１はまた、抗体３０６、４０６および５０３の結合は抗体ＫＷ０７６１の結合よりもまさっていることを示している。細胞株ＫａｔｏＩＩＩ、ＭＣＦ−７およびＡ４９８への結合がアッセイされたとき、同様の観察がなされた（データは示さない）。
【０３９２】
抗ＣＣＲ４抗体３０６、４０６および５０３の様々なＣＣＲ４+細胞株への結合プロファイルは、他のＣＣＲ４+細胞株と比較して増加した、いくつかのＣＣＲ４+細胞株への結合を示す。例えば、Ｌ−４２８への結合はＣＣＲＦ−ＣＥＭと比較して減少する。Ｌ−４２８はＣＣＲ４のリガンドであるＴＡＲＣ（Ｉｓｈｉｄａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｏｌ  ２０，  ２００６を参照のこと）を分泌することが知られており、抗ＣＣＲ４抗体３０６、４０６および５０３はＴＡＲＣとＣＣＲ４の結合部位について競合する（実施例３を参照のこと）。
【０３９３】
抗ＣＣＲ４抗体３０６、４０６および５０３の結合プロファイルはＫＷ０７６１の結合プロファイルと異なる。例えば、ＫＷ０７６１はＬ−４２８への結合の増加を示す。論理にとらわれるつもりではないが、これは（実施例４に概説されるように）これらの抗体の異なるエピトープ結合部位によるものであると考えられている。ＫＷ０７６１はＣＣＲ４およびＴＡＲＣの結合を妨げず、Ｌ−４２８により分泌されるＴＡＲＣと競合しない。
【０３９４】
さらに、細胞株毎に異なる値を有するＥＣ50値を決定したが（データは示さない）、それは、様々な細胞種の表面でのＣＣＲ４発現の差によるものと考えられている。
【０３９５】
実施例３：リガンド結合への抗ＣＣＲ４抗体の干渉
実施例１由来の抗ＣＣＲ４抗体がＣＣＲ４リガンドの受容体への結合を干渉するか判定するために、競合実験を行った。この目的のために、ｓｃＦｖの濃度を上昇させつつ、一定の濃度のＭＤＣ−ＳＮＡＰとＣＣＲ４陽性ＣＣＲＦ−ＣＥＭ標的細胞をインキュベートした。ＳＮＡＰタグがＭＤＣのＣ末端に融合するように、ＳＮＡＰタグのＮ末端にＭＤＣを遺伝学的に融合した。ＳＮＡＰタグは２０ｋＤａのＤＮＡ修復タンパク質であるＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼに由来する。その遺伝子をＧｅｎｅａｒｔ社（レーゲンスブルク、ドイツ）に注文し、ＭＤＣ−ＳＮＡＰ融合タンパク質をコードするその遺伝子でＨＥＫ２９３／Ｔ細胞を一過的に形質移入した。５〜６日後に、Ｎｉ−ＮＴＡ親和性カラムに続いてサイズ排除により融合タンパク質を精製してＭＤＣ−ＳＮＡＰ単量体画分を単離した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ標識化キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州）のマニュアルの手順に従って、Ａｌｅｘａ６４７でＭＤＣ−ＳＮＡＰを標識化した。ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞に対する走化性アッセイでＣＣＲ４に結合するＭＤＣ−ＳＮＡＰの機能性を確認した（データは示さない）。
【０３９６】
培養フラスコからＣＣＲ４+ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を回収し、ＲＰＭＩ‐１６４０培地で２回細胞を洗浄し、Ｖ型９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、フリッケンハウゼン、ドイツ）にウェルあたり１×１０5細胞の割合で分注した。５００×ｇで５分間、細胞を遠心分離し、そして、上清を吸引した。ｓｃＦｖ２０８、３０６、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３（試料３０８は含まれなかった）を５μｇ／ｍｌ（１５０ｎＭ）から初めて、８希釈点にわたって３倍ずつ希釈し、０．２％ＢＳＡと０．０９％ＮａＮ3を含むＰＢＳ中の１４０ｎｇ／ｍｌという一定の濃度のＭＤＣ−ＳＮＡＰ（５０ｎＭ）の存在下で、細胞と４℃６０分間インキュベートした。０．２％ＢＳＡと０．０９％ＮａＮ3を含むＰＢＳで３回洗浄した後に、０．２％ＢＳＡと０．０９％ＮａＮ3を含む２００μｌのＰＢＳに細胞を再懸濁し、そして、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルク、ドイツ）を使用するフローサイトメトリーのためにＵ型９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、スキポール‐ライク、オランダ）に移し、Ａｌｅｘａ６４７標識化ＭＤＣ−ＳＮＡＰ融合タンパク質のシグナルを記録した。ｓｃＦｖ濃度の上昇とともに染色シグナルが明らかに減少することが結果により示された（図４）。このことは、抗体がリガンド結合に干渉し、したがって、ＣＣＲ４ブロッキング活性を有することを示している。
【０３９７】
実施例１に記載されるｓｃＦｖがＣＣＲ４へのＴＡＲＣリガンド結合およびＭＤＣリガンド結合に干渉するか試験するために同様の実験を行った。それ故、ＣＣＲ４+ＤＴ４０細胞を培養フラスコから回収し、ＲＰＭＩ‐１６４０培地で２回細胞を洗浄し、Ｖ型９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、フリッケンハウゼン、ドイツ）にウェルあたり１×１０5細胞の割合で分注した。５００×ｇで５分間、細胞を遠心分離し、そして、上清を吸引し、その後、ＲＰＭＩ‐１６４０培地中の０または１μｇ／ｍｌのＴＡＲＣまたはＭＤＣ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ、ロンドン、英国）と３７℃で３０分間インキュベートした。５００×ｇで５分間の遠心分離工程の後に上清を吸引し、０．５μｇ／ｍｌのｓｃＦｖ２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３ならびに２．５μｇ／ｍｌのマウス抗ｃ−Ｍｙｃ（９Ｅ１０．２；ＤＩＡＴＥＣ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ、オスロ、ノルウェイ）と４℃で１時間細胞をインキュベートした。５００×ｇで５分間、細胞を遠心分離し、その後、１μｇ／ｍｌのＲＰＥ複合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、米国、カリフォルニア州）と細胞を４℃で４５分間インキュベートした。細胞を洗浄し、０．２％ＢＳＡと０．０９％ＮａＮ3を含む２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、そして、ＥａｓｙＣｙｔｅ装置（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ヘイワード、カリフォルニア州、米国）を使用するフローサイトメトリーのためにＵ型９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、スキポール‐ライク、オランダ）に移した。ＴＡＲＣおよびＭＤＣの存在下でｓｃＦｖをインキュベートしたとき、染色シグナルが減少することが結果により示された（図５）。このことは、実施例１に記載されるｓｃＦｖがリガンド結合に干渉し、したがって、ＣＣＲ４ブロッキング活性を有することを示している。
【０３９８】
ＩｇＧ1形態の３０６、４０６および５０３のリガンド結合への影響を試験するために実質的に同じ方法を用いた。比較のためにＫＷ０７６１を使用した。ソフトウェアＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）の「ｌｏｇ（阻害剤）ｖｓ．反応」モデルを使用して非線形回帰カーブフィットにより実験データをフィットさせたが、表２０に実験データが要約される。
【０３９９】
ＫＷ０７６１を例外として、ＩｇＧの濃度の増加と共に、標識化リガンドのＭＤＣとＴＡＲＣの両方の染色シグナルの明らかな減少が結果により示された（図１２）。このことは、このＩｇＧ1形態の３０６、４０６および５０３がリガンド結合に干渉し、したがって、ＣＣＲ４ブロッキング活性を有することを示している。
【０４００】
実施例４：抗ＣＣＲ４抗体間の競合
抗ＣＣＲ４抗体２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３によって認識されるエピトープをＫＭ３０６０ｖａｒと比較して解析するために、フローサイトメトリーを用いて競合実験を行った。ビオチン化ＫＷ０７６１ＩｇＧ抗体のＣＣＲ４+ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞への結合が様々な濃度の単鎖型の非ビオチン化抗ＣＣＲ４抗体（２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３、８０３およびＫＭ３０６０ｖａｒ）の存在下で検証された。ＣＣＲ４+ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を培養フラスコから回収し、ＲＰＭＩ‐１６４０培地で２回細胞を洗浄し、Ｖ型９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、フリッケンハウゼン、ドイツ）にウェルあたり１×１０5細胞の割合で分注した。５００×ｇで５分間、細胞を遠心分離し、そして、上清を吸引した。標準的な方法を用いて抗体ＫＷ０７６１−ＩｇＧをビオチン化した。５μｇ／ｍｌから始まり、８抗体価測定点にわたって３倍ずつ希釈された抗ＣＣＲ４  ｓｃＦｖ２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３、８０３およびＫＭ３０６０ｖａｒの存在下で、ビオチン化ＫＷ０７６１−ＩｇＧを１μｇ／ｍｌという一定の濃度でＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞と４℃で１時間インキュベートした。０．２％ＢＳＡと０．０９％ＮａＮ3を含むＰＢＳで洗浄した後、ビオチン化ＫＷ０７６１−ＩｇＧの検出のために、２．５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ＲＰＥ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）で細胞を４℃で３０分間染色した。染色した細胞を洗浄し、０．２％ＢＳＡと０．０９％ＮａＮ3を含む２５０μｌのＰＢＳに再懸濁し、そして、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルク、ドイツ）を使用するデータ獲得のため、Ｕ型９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、スキポール‐ライク、オランダ）に移した。
【０４０１】
図６に示される結果は、実施例１に記載される抗ＣＣＲ４抗体のいずれも細胞への結合についてＫＷ０７６１と競合せず、抗体ＫＷ０７６１−ＩｇＧとＫＭ３０６０ｖａｒ  ｓｃＦｖの間での競合だけが観察されることを示している。このことは、抗体２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３はＫＭ３０６０ｖａｒまたはＫＷ０７６１と同じエピトープに結合しないことを示している。
【０４０２】
ＩｇＧ1形態の３０６、４０６および５０３のＫＷ０７６１との、および、互いとの競合をアッセイするために、実質的に同じ方法を用いた。抗体３０６、４０６および５０３は互いに競合するが、ＫＷ０７６１とは競合しないことがこの実験により確認された（データは示さない）。
【０４０３】
実施例５：拮抗性活性
天然のＣＣＲ４+ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞株で抗体２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３がリガンド誘導性カルシウム流動を低減させる能力を評価した。通常の条件下で培養したＣＣＲＦ−ＣＥＭ標的細胞を遠心分離により沈降させ、ＲＰＭＩ‐１６４０培地に２回再懸濁した。Ｆｌｕｏ−４−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバード、カリフォルニア州）、プルロニックＦ−１２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバード、カリフォルニア州）およびプロベネシドを、それぞれ、１μＭ、０．０２％および１ｍＭの終濃度まで１ｍｌ中の２．５×１０6細胞と混合した。細胞を回転培養器（７ｒｐｍ）で３７℃、３０分間培養した。１ｍＭプロベネシドの存在下でその後の全ての工程を行った。１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ‐１６４０で２回、測定緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、０．８ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２２ｍＭグルコース）で細胞を１回洗浄した。ＴＡＲＣおよびＭＤＣ介在性カルシウム流動の阻害を２つの測定に分けた。
【０４０４】
ＰｈｅｒａＳｔａｒＦＳハイスループット・リーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ、オッフェンブルク、ドイツ）を使用して、ｓｃＦｖ２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３の存在下でのＴＡＲＣ介在性カルシウム流動の阻害を評価した。抗体ＫＭ３０６０ｖａｒを陰性対照として使用した。細胞を１．６×１０6細胞／ｍｌの終濃度にまで希釈した。２５μｌの体積の細胞を黒色９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロチェスター、ニューヨーク州、米国）に移し、２５μｌのｓｃＦｖ抗体の存在下、暗条件、室温で１５分間インキュベートした。ｓｃＦｖを、０．５μｇ／ｍｌから始まり、６抗体価測定点にわたって１０倍ずつ用量設定した。全てのｓｃＦｖを３反復試験に適用し、試料ＫＭ３０６０ｖａｒを比較のためインキュベートした。ＰｈｅｒａＳｔａｒＦＳリーダーにプレートを移し、自動的に、２８．６ｎｇ／μｌ（３．６ｎＭ）の終濃度のリガンドを各ウェルに別々に注入した。４８５〜５２０ｎｍのバンドパスフィルターを使用して、総計で１６点（リガンドの注入前の５点（範囲１）；リガンドの注入中の１点（範囲２の開始点）；リガンドの注入後の１０点（範囲２））にわたって蛍光の変化を測定した。次に数式を用いて活性化のパーセンテージを計算した：
｛ＩｇＧでの（範囲２の生データの合計−（１１×範囲２の開始点））−緩衝液での（範囲２の生データの合計−（１１×範囲２の開始点））｝／リガンドでの（範囲２の生データの合計−（１１×範囲２の開始点））。
【０４０５】
ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルク、ドイツ）を使用して、ｓｃＦｖ２０８、３０６、３０８、４０６、５０１、５０３、６０１、６０３および８０３の存在下でのＭＤＣ介在性カルシウム流動の阻害を評価した。上に記載したように細胞を染色し、そして、１．２×１０6細胞／ｍｌの終濃度に希釈した。等量の細胞、ｓｃＦｖ抗体を含む測定緩衝液またはｓｃＦｖ抗体を含まない測定緩衝液、およびリガンド（ＭＤＣ）を混合した。最初の２つの成分（細胞および抗体）をリガンドの添加前に１５分間、前もってインキュベーションした。ｓｃＦｖの終濃度は１０μｇ／ｍｌであったが、ＭＤＣは５ｎｇ／ｍｌであった。ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルク、ドイツ）上の５１５〜５４５ｎｍのバンドパスフィルターを使用して試料を直ぐに解析した。評価のために、それ以外は未処理の染色した細胞の平均シグナルを全ての試料から減算した。染色した細胞からｓｃＦｖ抗体は無いがＭＤＣの存在下で記録されたシグナルが１００％のシグナル伝達として設定され、ＭＤＣおよびｓｃＦｖ抗体の存在下の細胞のシグナルが％単位に換算された。
【０４０６】
図７および８で示される結果は、実施例１に記載される全てのｓｃＦｖがＴＡＲＣおよびＭＤＣの阻害剤として作用することを明確に示した。ＴＡＲＣ阻害から得られたＩＣ50値が表１９に示される。
【０４０７】
ＫＷ０７６１と比較した、ＩｇＧ1形態の３０６、４０６および５０３によるリガンド誘導性カルシウム流動への影響を測定するために、実質的に同じ方法を用いた。抗体３０６、４０６および５０３がリガンド誘導性カルシウム流動を低下させるが、ＫＷ０７６１は低下させないことがこの実験により確認された。ソフトウェアＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）の「ｌｏｇ（阻害剤）ｖｓ．反応」モデルを使用して、非線形回帰カーブフィットにより実験データを当てはめた。
【０４０８】
本発明の抗体がＴＡＲＣおよびＭＤＣ誘導性カルシウム流動の阻害剤として作用することが結果により明示された。ＴＡＲＣ阻害から得られたＩＣ50値が表２１に提示される。様々な実験条件下で推測された値を有するこれらの推定値は必ずしも適正ではないということが理解されるものとする。
【０４０９】
実施例６：走化性の抑制
１つの容器内で化学遊走が可能であるＣＣＲ４+細胞をｓｃＦｖ抗体と接触させ、一方、適切な孔径を有する膜またはフィルターで最初の容器と分けた別の容器にＣＣＲ４のリガンド（ＭＤＣまたはＴＡＲＣ）を設置することにより、実施例１のｓｃＦｖ抗体による走化性の抑制をアッセイした。リガンドに向かう細胞の遊走（走化性）に対する抗体の効果を、抗体が無いときの走化性と抗体が有るときの走化性を比較することにより決定した。実施例１に記載される全てのｓｃＦｖ抗体がＭＤＣおよびＴＡＲＣに向かうＣＣＲ４陽性細胞の走化性を抑制することがわかった。
【０４１０】
実施例２に記載されるように培養されたＣＣＲ４+ＣＣＲＦ−ＣＥＭ標的細胞を遠心分離により沈降させ、ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ‐１６４０培地に２回再懸濁した。３回目の遠心分離工程で、１％のＦＣＳを添加したＲＰＭＩ‐１６４０培地に細胞を再懸濁し、１．６×１０7細胞／ｍｌの終密度に調整した。並行して、マルチスクリーン−ＭＩＣプレート９６ウェル（孔径８μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国、ＭＡＭＩＣ５Ｓ１０）の下部容器のそれぞれに３．５ｎＭの濃度でＴＡＲＣまたはＭＤＣを含む１％ＦＣＳが添加された１５０μｌのＲＰＭＩを加えた。ｓｃＦｖを架橋し、二量体性ＩｇＧ型をシミュレートするためにマウス抗ｍｙｃ−抗体（９Ｅ１０．２、Ｄｉａｔｅｃ、オスロ、ノルウェイ）の存在下でｓｃＦｖ抗体を３３３ｎＭから０．３６ｎＭまで段階希釈した。５０μｌのｓｃＦｖ抗体を５０μｌの細胞（３．９×１０5細胞／ｍｌの終濃度）と混合し、マルチスクリーン−ＭＩＣ９６チャンバープレートの上部区画に添加し、そして、３７℃で３時間インキュベートした。フィルターを取り除き、そして、再懸濁の後に（下部の容器から）１００μｌの細胞を９６ウェルＣＯＡＳＴＡＲプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、フリケンハウゼン、ドイツ）に移した。さらに１００μｌの体積の（０．２％ＢＳＡと０．０９％ＮａＮ3を添加した）ＰＢＳを試料に添加した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルク、ドイツ）を使用して、ゲートで囲まれた細胞の数を数えることにより遊走を評価した。
【０４１１】
ｓｃＦｖ抗体は無いが、ＴＡＲＣまたはＭＤＣの存在下で遊走した細胞の数を１００％遊走として設定し、リガンドとｓｃＦｖ抗体の存在下で遊走した細胞の数を％単位に換算した。
【０４１２】
実施例１に記載される全てのｓｃＦｖ抗体がＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞のＴＡＲＣ誘導走化性を抑制したことが図９に提示されるデータにより示されている。さらに、同じｓｃＦｖ抗体がＭＤＣ介在性走化性を抑制した（データは示さない）。
【０４１３】
ＩｇＧ1形態の３０６、４０６および５０３を用いて実質的に同じ実験を行い、ＩｇＧ1形態もＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞のＴＡＲＣ誘導走化性ならびにＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞のＭＤＣ誘導走化性を抑制することが確認された。Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いるｌｏｇ（阻害剤）ｖｓ．反応機能を使用してデータを当てはめることにより結果を解析し、ＩＣ50値を抽出した。表２２にＩＣ50測定値が要約される。
【０４１４】
さらなる実験で、ＴＡＲＣの存在下での固形腫瘍細胞株７８６−Ｏの遊走への抗ＣＣＲ４抗体５０３（ＩｇＧ1形態）の効果を、トランスウェルプレートアッセイを用いて測定した。
【０４１５】
被覆のために５０μｌの１μｇ／ｍｌのマトリゲル溶液（ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ、カタログ番号３５６２３０、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルク、ドイツ）を孔の上部に分注してマルチスクリーン−ＭＩＣ９６ウェルプレート（孔径８μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国、ＭＡＭＩＣ８Ｓ１０）の準備をした。マトリゲルを３７℃で１時間重合させた。ＰＢＳで孔を洗浄して、反応しなかったマトリゲルを除去した。上に概説したように、７８６−Ｏ細胞を培養した。ＰＢＳで２回洗浄し、アキュターゼ（ＰＡＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、リンツ、オーストリア）と室温で３分間インキュベートすることにより培養フラスコから剥離させた後にフラスコから細胞を回収した。０．１％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ‐１６４０に細胞を８．０×１０5細胞／ｍｌの終細胞密度になるように分注した。並行して、０．１％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ‐１６４０に６０μｇ／ｍｌの濃度になるようにＩｇＧ抗体５０３を希釈し、そして、５点にわたって５倍ずつ段階希釈した。抗体の調剤緩衝液中に存在する塩の量は一定に保たれた。０．１％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ‐１６４０にリガンドＴＡＲＣを１０００ｎｇ／ｍｌおよび２００ｎｇ／ｍｌという２つの終濃度にまで希釈した。抗体の調剤緩衝液中に存在する塩の量は一定に保たれた。１５０μｌの体積のリガンドをトランスウェル・マルチスクリーン−ＭＩＣプレート９６ウェルプレート（孔径８μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国、ＭＡＭＩＣ８Ｓ１０）の底部容器に分注した。５０μｌの抗体希釈液と等体積の５０μｌの細胞を混合した。マトリゲル被覆膜上に混合物を設置し、３７℃で３時間インキュベートした。マトリゲル被覆膜に上にある遊走しなかった細胞をこすり落とすことにより機械的に除去し、セルタイターｇｌｏ生物発光細胞生存性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン州、米国）の手順書に従ってマトリゲル被覆膜を通って遊走した細胞を染色した。染色された試料を９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ、平底、黒色）に移し、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００リーダー（Ｔｅｃａｎ、メナードルフ、スイス）で生物発光を解析した。抗体は無いが、ＴＡＲＣの存在下で遊走した細胞の数を１００％遊走と設定し、リガンドと抗体の存在下で遊走した細胞の数を％単位に換算した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いるｌｏｇ（阻害剤）ｖｓ．反応機能を使用してデータを当てはめることにより結果を解析し、ＩＣ50値を抽出した。抗体５０３が固形腫瘍細胞株７８６−ＯのＴＡＲＣ誘導性遊走を抑制することが結果により示される（図１３）。表２３にＩＣ50測定値が要約される。
【０４１６】
マウス腎臓細胞癌細胞株ＲＥＮＣＡで同様の発見がなされたが、その発見では、抗ＣＣＲ４抗体５０３は標的細胞のマウスＴＡＲＣ誘導性遊走を妨げることができた（データは示さない）。
【０４１７】
実施例７：脱フコシル化抗ＣＣＲ４ＩｇＧ1分子の作製
ヒトＩｇＧ1サブクラス上のオリゴ糖の状態を操作することによりＡＤＣＣの増強を達成することができることが報告されている（Ｎｉｗａ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，  ＣａｎＲｅｓ，  Ｖｏｌ．６４，  ２００４）。フコースの量の改変がＡＤＣＣに有益な効果を持つことが示された。それ故、クラスＩα‐マンノシダーゼの選択的阻害剤であるキフネンシンの存在下で抗体３０６、４０６および５０３を作製し、培養細胞での産生中にＩｇＧのフコシル化の停止を誘導した。同じ条件下で抗体ＫＷ０７６１を作製した。
【０４１８】
キフネンシン（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州、米国）の存在下でＩｇＧを作製した。細胞培養液を回収した後に、まず、プロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ、５ｍｌ、プロテインＡ；ＧＥ）を使用する親和性精製でＩｇＧを単離した。クエン酸緩衝液（ｐＨ３）を使用してＩｇＧを溶出し、１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ９）中に移した。２番目の精製の前にＩｇＧ試料を濃縮し、そして、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｈｉ  Ｌｏａｄ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ２００、ＧＥ；移動緩衝液２０ｍＭリン酸ナトリウム／１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に負荷した。単量体画分を収集し、再度ＩｇＧを濃縮した。
【０４１９】
実施例８：種間交差反応性
抗体３０６、４０６および５０３のヒト以外の種に由来するＣＣＲ４と交差反応する能力についてそれらを試験した。
【０４２０】
一過性形質移入のために、Ｔ７５（ＮＵＮＣ）フラスコに２×１０6細胞のＨｅｋ２９３Ｔ／１７細胞を蒔いた。播種から４８時間後に、Ｆｕｇｅｎｅ（ＲＯＣＨＥ）を用いて細胞を形質移入した。Ｔ７５あたり４０μｌのＦｕｇｅｎｅと１６μｇのＤＮＡを使用する。形質移入から４８時間後にアッセイのために細胞を使用した。
【０４２１】
形質移入試薬としてＦｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ヒトＣＣＲ４をコードするｐｃＤＮＡ３．１プラスミドまたはマウスＣＣＲ４（ＧｅｎｅＢａｎｋ  ＣＡＡ６２３７２）かサル（アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ））ＣＣＲ４（ＰｕｂＭｅｄアクセス番号ＸＰ＿００１０９８８０７）のどちらかをコードするｐＬＮＯプラスミド（Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７）でＨＥＫ−２９３Ｔ／１７細胞への一過性形質移入を行った。非形質移入（ＣＣＲ４陰性）細胞を陰性対照とした。通常の条件下でさらに４８時間細胞を培養し、先に記載したようにフラスコから細胞を回収した。Ｖ型９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、フリケンハウゼン、ドイツ）にウェルあたり１×１０5細胞の割合で細胞を分注した。細胞を遠心分離し（４００ｘｇ、５分、４(Ｃ）、０．２％ＢＳＡと０．０９％ＮａＮ3を含むＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌの濃度の抗体（３０６、４０６、５０３およびアイソタイプ対照６−ＭＡＭ）５０μｌに再懸濁し、そして、４℃で６０分間インキュベートした。ＰＥ複合体化マウス抗ヒトＣＣＲ４抗体１Ｇ１の存在下で、またはＰＥ複合体化ハムスター抗マウスＣＣＲ４抗体２Ｇ１２（Ｂｉｏｌｇｅｎｄ；サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を用いてそれらの細胞をインキュベートすることにより、ヒトＣＣＲ４とマウスＣＣＲ４の発現を確認した。その後、試料を遠心分離し、１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁することで２回洗浄した。最後に、抗体３０６、４０６、５０３とアイソタイプ対照ＩｇＧ６−ＭＡＭの検出のために３μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ（ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ、デュッセルドルフ、ドイツ）５０μｌに細胞ペレットを再懸濁し、４℃で４５分間インキュベートした。上に記載したように試料を２回洗浄し、そして、２５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、そして、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンホセ、カリフォルニア州）でのフローサイトメトリーのためにＵ型９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、スキポール‐ライク、オランダ）に移した。
【０４２２】
ヒトＣＣＲ４とサルＣＣＲ４の両方に抗体３０６、４０６および５０３が結合することがわかり、そして、マウスＣＣＲ４に対する低下した親和性が検出された（データは示さない）。
【０４２３】
実施例９：抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
天然のＣＣＲ４+細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｌ−４２８およびＨｕｔ７８に対してＡＤＣＣを誘導する抗ＣＣＲ４抗体３０６、４０６および５０３の能力を評価し、ＫＷ０７６１と比較した。さらに、ＫＷ０７６１との比較で抗ＣＣＲ４抗体３０６、４０６および５０３を使用して、単離した制御性Ｔ細胞（Ｔreg細胞）に対するＡＤＣＣの誘導を試験した。癌疾患の進行中の固形腫瘍の免疫逃避にＴreg細胞が重要な役割を果たすことがよく証明されている（Ｗｏｌｆ  ＡＭ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｖｏｌ  ９，  ２００３を参照のこと）。重要なことに、腫瘍の支質領域に向かい、そこで腫瘍に対する免疫反応を抑制するＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞でＣＣＲ４が発現することが記載されている。ＣＣＲ４を介したこれらのＴreg細胞の（ＭＤＣにより誘導される）遊走の抑制も（ＡＤＣＣによる）直接的な殺滅も、転移を妨害する、または、固形腫瘍の増殖を低下させる将来性のある方法であり得る。
【０４２４】
懸濁細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｌ−４２８およびＨｕｔ７８へのＡＤＣＣのために、実施例２に記載したような通常の条件下で細胞を培養した。遠心分離により細胞を沈降させ、ＲＰＭＩ‐１６４０培地に細胞を再懸濁した。この工程を１回繰り返した。２．５×１０6細胞を含む１ｍｌと混合してカルセイン−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバード、カリフォルニア州）の終濃度を１０μＭとし、その後、回転培養器上で（７ｒｐｍ）３７℃３０分間インキュベートした。１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ‐１６４０中で細胞を３回洗浄し、細胞密度を３×１０5／ｍｌに調整した。これとは別に、従来の手順に従って（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ濃度勾配遠心分離で濃縮して）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製し、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ‐１６４０中で洗浄し、そして、６×１０6細胞／ｍｌに再懸濁した。各標的細胞およびエフェクター細胞５０μｌを９６ウェルマイクロタイタープレートの同じウェルに加え、２０：１というエフェクター細胞と標的細胞の比（Ｅ：Ｔ）が生じた。４反復試料について１００μｌの体積の各ウェルに抗体を添加し、次のような濃度範囲になった：ＣＣＲＦ−ＣＥＭの場合０．２μｇ／ｍｌから０．００２ｎｇ／ｍｌまで；Ｌ−４２８の場合１μｇ／ｍｌから０．３２ｎｇ／ｍｌまで；Ｈｕｔ７８の場合１μｇ／ｍｌから０．１ｎｇ／ｍｌまで。その後、３７℃で４時間マイクロタイタープレートをインキュベートし、そして、ウェルのいくつかについては３時間４５分後に２０μｌの０．９％トライトン‐Ｘ１００を添加して標的細胞の完全な溶解を達成した。その後、各試料の１００μｌの上清を黒色のマイクロタイタープレートに移し、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００リーダー（Ｔｅｃａｎ、メナードルフ、スイス）で蛍光（励起光：４８８ｎｍ、蛍光：５１８ｎｍ）を解析した。抗体が無い試料での蛍光強度を他の試料の強度から減算した。トライトンＸ−１００での処理後に１００％細胞溶解が起きた試料の蛍光強度に基づき、抗体を用いた試料での溶解のパーセンテージを推定した。ソフトウェアＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を用いる非線形回帰解析と３パラメーター当てはめモデルにより用量反応曲線を算出した。
【０４２５】
Ｔreg細胞へのＡＤＣＣの誘導を試験するために、次のプロトコルを確立し、そして、抗ＣＣＲ４抗体（１Ｇ１、カタログ番号５５１２６６、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルク、ドイツ）を用いて設定を確立した。
【０４２６】
健康なドナーの血液中のＴreg細胞のパーセンテージは５％と１０％の間であると報告されている（Ｗｏｌｆ  ＡＭ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｖｏｌ９，  ２００３を参照のこと）。このことが、かなりの量の単離されたＴreg細胞を得るために健康なドナーのＰＢＭＣからＴreg細胞を濃縮しなくてはならなかったことの理由である。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞キット（カタログ番号１１３−６３Ｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）のプロトコルに従って単離を行い、３つの異なる集団を得た（ＰＢＭＣ、ＣＤ４+およびＴｒｅｇ）。精製の特定の段階で、品質管理としていくらかの細胞を保存し、そして、適切に染色した。遠心分離によりＰＢＭＣ、ＣＤ４+細胞およびＴreg細胞を沈降させ、０．２％ＢＳＡと０．０９％ＮａＮ3を添加したＰＢＳ中に１×１０6細胞／ｍｌになるように再懸濁した。各実験のため、９６ウェルＶ型プレートに２００μｌの分けられていない２×１０5個のＰＢＭＣと単離されたＣＤ４+細胞および１００μｌの１×１０5個の単離されたＴreg細胞を移し、４００×ｇ、４℃で５分間遠心分離した。ピペットを用いて上清を除去し、０．２％ＢＳＡと０．０９％ＮａＮ3を添加した５０μｌのＰＢＳに、またはＴreg細胞の特定に役立つ（Ｓｉｍｏｎｅｔｔａ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｖｏｌ９，  ２０１０を参照のこと）５０μｌのビオチン化抗ＣＤ１２７（カタログ番号５５８６３３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルク、ドイツ）か５０μｌのビオチン化抗ＣＣＲ４抗体（１Ｇ１、カタログ番号５５１２６６、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルク、ドイツ）に細胞ペレットを再懸濁し、４℃で１時間インキュベートした。（０．２％ＢＳＡと０．０９％ＮａＮ3を添加した）ＰＢＳで試料を３回洗浄し、４００×ｇ、４℃で５分間遠心分離した。ピペットを用いて上清を除去し、（０．２％ＢＳＡと０．０９％ＮａＮ3を添加した）５０μｌのＰＢＳかビオチン化抗ＣＣＲ４（１Ｇ１、カタログ番号５５１２６６、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルク、ドイツ）を含む、または含まない５０μｌの抗ＣＤ４−ＦＩＴＣと抗ＣＤ２５−ＡＰＣ（カタログ番号１１−００４９−４２およびカタログ番号１７−０２５９−４２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）とストレプトアビジン−ＰｅｒＣＰ（カタログ番号５５４０６４、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルク、ドイツ）の混合液に細胞ペレットを再懸濁し、そして、４℃で１時間インキュベートした。（０．２％ＢＳＡと０．０９％ＮａＮ3を添加した）ＰＢＳで試料を３回洗浄し、４００×ｇ、４℃で５分間遠心分離した。ピペットを用いて上清を除去し、抗ＣＣＲ４−ＰＥを含む細胞ペレットと未染色の細胞ペレットを２００μｌの（０．２％ＢＳＡと０．０９％ＮａＮ3を添加した）ＰＢＳに再懸濁し、９６ウェルＵ型プレートに移した。様々なフルオロクロームを用いる補正がＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルク、ドイツ）で実行され、そして、試料を解析した。抗ＦｏｘＰ３抗体（カタログ番号５６００４��、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルク、ドイツ）を用い、ＦｏｘＰ３染色緩衝液キット（カタログ番号００−５５２３−００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓサンディエゴ、カリフォルニア州、米国）に記載されるプロトコルに従って残りの試料を染色した。細胞を２００μｌの（０．２％ＢＳＡと０．０９％ＮａＮ3を添加した）ＰＢＳに再懸濁し、そして、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルク、ドイツ）を使用するフローサイトメトリーでの解析のため、９６ウェルＵ型プレートに移した。抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ／抗ＣＤ２５−ＡＰＣでの二重陽性シグナルならびに抗ＦｏｘＰ３−ＰＥ／抗ＣＣＲ４（ストレプトアビジン−ＰｅｒＣｐを使用するビオチン化１Ｇ１の検出）での二重陽性シグナルにより、単離されたＴreg細胞は純粋なＴreg細胞であると判断された。単離された細胞のおよそ９５％がＣＤ４+ＣＤ２５+細胞であり、これらの６６％がＦｏｘＰ３−ＣＣＲ４陽性であることが分かった。
【０４２７】
実施例１に記載される抗ＣＣＲ４抗体の単離されたＴreg細胞に対する効果を評価するために、自家性ＰＢＭＣからの単核細胞の単離収率が低いことからＥ：Ｔ（この場合、自家性ＰＢＭＣから単離されたエフェクター細胞；標的細胞はＴreg細胞）比を１５に下げたことを例外として、記載したようにＡＤＣＣ実験を行った。３反復試験において、３．３ｎＭという単一濃度で抗体３０６、４０６、５０３およびＫＷ０７６１をインキュベートした。単離された自家性ＰＢＭＣは機能的であるということを確認するために、ＣＣＲ４+ＣＣＲＦ−ＣＥＭ標的細胞に対するＡＤＣＣを並行して行った（データは示さない）。
【０４２８】
図１４に示される結果と要約されたＥＣ50計算値（表２４を参照のこと）は、本発明の抗ＣＣＲ４抗体が３つの標的細胞株全てに対してヒトＰＢＭＣの存在下でＡＤＣＣを誘導することができたことを明らかに示す（Ｈｕｔ７８は示されない）。最も効果的な抗ＣＣＲ４抗体５０３は、ＫＷ０７６１の３１５ｐＭと比較して、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞に対して試験すると、５．３ｐＭのＥＣ50を有すると判断された。Ｌ−４２８細胞に対して試験すると、ＫＷ０７６１と比較して、実施例１に記載される全ての抗ＣＣＲ４抗体について殺滅活性の低下が観察された。このことは、この細胞株はＣＣＲ４−リガンドＣＣＬ１７／ＴＡＲＣを分泌することが示されており、それによって抗体のＣＣＲ４への結合と競合するという事実によって説明され得る。
【０４２９】
さらに、抗ＣＣＲ４抗体はまた、単離されたＴreg細胞に対するＡＤＣＣについて検証されると、かなりの最大殺滅活性を示した（図１５を参照のこと）。
【０４３０】
実施例１０：成人性Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）のインビボモデル
脱フコシル化ＩｇＧ1分子を使用して、ヒトＴ細胞リンパ腫異種移植片モデルでの腫瘍成長を低下させる能力について、実施例１に記載される抗ＣＣＲ４抗体３０６、４０６および５０３を試験した。ＡＴＬＬについてインビボ有効性を有することが以前に示されている抗体（Ｎｉｗａ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，  ＣａｎＲｅｓ，  Ｖｏｌ  ６５，  ２００４）に基づいている、ＫＷ０７６１が陽性対照として含まれた。記載される全ての実験はＥＰＯ（ベルリン、ドイツ）で行われた。
【０４３１】
ＣＣＲ４+血液系成人性Ｔ細胞リンパ腫細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭの腫瘍小片（３×３×３ｍｍのサイズ）をＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、ニューヨーク州、米国）に皮下移植した。次のように、様々な試料で、全体で５群を並行して処理した：Ａ群＝５匹の動物からなる対照群（実施例２に記載されるようなベヒクル調剤緩衝液）；Ｂ群＝５匹の動物からなるＫＷ０７６１−ＩｇＧ；Ｃ群＝１０匹の動物からなる３０６−ＩｇＧ；Ｄ群＝１０匹の動物からなる４０６−ＩｇＧ；Ｅ群＝１０匹の動物からなる５０３−ＩｇＧ。腫瘍がおよそ１００ｍｍ3の触知できるサイズに達したときに抗体試料を静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。次の等式を用いて腫瘍体積を計算した。
腫瘍体積（ｍｍ3）＝０．５×（一番長い直径）×（一番短い直径）2
マウスを４週間にわたって週に２回（全体で８回の処理）、２０ｍｇ／ｋｇ（１匹あたり２５ｇの平均体重を仮定して、マウスあたり５００μｇのＩｇＧ）の用量で処理した。処理開始後、全体で６週間にわたって動物をモニターし、週に２回腫瘍体積と体重を測定した。腫瘍サイズが１．５ｃｍ3超のサイズを超えたとき、動物を殺処理した。腫瘍体積が大きいため、２３日後に対照群を殺処理しなくてはならなかった。ソフトウェアＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用して、得られたデータの実験群間での統計学的有意性を解析した。処理（抗体）群と未処理（対照）群を比較することによりＭａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定を用いて生存率を分析した。分散分析（ＡＮＯＶＡ）と独立ｔ検定分析により腫瘍倍化時間を分析した。
【０４３２】
図１６、１７および１８に試験の結果が提示および要約されている。体重の喪失が無いことから評価可能であるように、前記抗体でのマウスの処理がよく忍容された（図１６）。図１７に、異なる群に由来する個々の腫瘍体積の比較が示される。おそらくは、誘導期後に速い腫瘍成長を引き起こすことができる腫瘍小片を接種された腫瘍モデルであったという事実のため、１つの群の中でも腫瘍体積の変動が高いことを見て取ることができる。腫瘍移植から２３日後に、大きい腫瘍サイズのため、Ａ対照群を殺処理しなくてはならなかった。試験した抗ＣＣＲ４抗体全てについて腫瘍体積の明らかな減少を見て取ることができた。第２３日で測定された、対照群と比較した最小平均腫瘍体積の値が（処理群対対照群、％単位；Ｔ／Ｃ）が、それぞれ、抗ＣＣＲ４抗体５０３について３５％、ＫＷ０７６１の場合は６７％、３０６では５０％、そして、４０６の場合は６２％と決定された。対照群と比較して、抗ＣＣＲ４抗体５０３については腫瘍倍化時間の統計学的有意差も判定された（６．２８±１．０３日対２．５８±０．２５日；Ｐ＝０．０２７３、独立ｔ検定）。腫瘍体積と腫瘍倍化時間のこの差異は、Ａ対照群の２２日と対照的に、生存期間中央値が２６日と判定された当該Ｅ群（抗ＣＣＲ４抗体５０３）の動物の生存曲線に反映されている。
【０４３３】
こうして、実施例１に記載される３つの抗ＣＣＲ４抗体全てがインビボで腫瘍撲滅効力を有することが示された。抗体５０３については統計学的に有意なデータが得られた。
【０４３４】
実施例１１：血小板凝集能測定
ＣＣＲ４は血小板で発現することが知られており、そのリガンドであるＭＤＣとＴＡＲＣは血小板の凝集を誘導することが知られている。ＩｇＧ分子は２つのリガンド結合部位を持ち、それ故、両方のアームが異なる血小板上のＣＣＲ４に結合することができる場合、ＣＣＲ４を認識可能であるＩｇＧが血小板を架橋することが可能である場合もあるという可能性があるので、このことは潜在的に問題を含み得る。このことがインビボで血液凝固を引き起こし得る。それ故、実施例１に記載されるような抗ＣＣＲ４抗体の血小板凝集への効果を検討した。単離した血小板のみと、または、よく記述されている凝集の誘導因子であるＡＤＰと併せて抗体をインキュベートした（Ｖａｒｏｎ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｔｒｅ  “Ａｎｔｉｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｇｅｎｔｓ”  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｄｕｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ．  ２６７−７２，  ２００９）。
【０４３５】
クエン酸ナトリウムを含むチューブに総計で５０ｍｌの新鮮なドナーからの血液を採取した。１８５ｇ、室温（ＲＴ）で１５分間遠心分離することにより血小板に富む血漿を得た。血小板含有血漿を新しいチューブに移した。ベースラインを規定するため、１ｍｌの血小板に富む血漿を１２００ｇ、室温で５分間遠心分離することによって、血小板を除いた血漿を調製した。新しいチューブに上清を移し、そして、次の、血小板に富む試料と同じ方法で処理した。ＡｇｇＲａｍ血小板凝集計（Ｈｅｌｅｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ボーモント、テキサス州、米国）を使用して、撹拌しながら３７℃で凝集測定を行った。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．２％ＢＳＡ、０．０９％ＮａＮ3）中の１０μｇ／ｍｌの濃度でＩｇＧ（５０３、４０６、３０６および陰性対照として抗ＧＦＰ）を血小板とインキュベートした。ＡＤＰが凝集の陽性対照となり、５μＭの終濃度でＡＤＰを使用した。ＡＤＰを用いて得られたシグナルを１００％と設定し、設定された実験全てで並行して測定されたベースライン０は血小板除去血清により規定された。
【０４３６】
実施例１に記載される抗ＣＣＲ４抗体の血小板への結合が観察された（データは示さない）。凝集の誘導は観察されず、また、ＡＤＰの存在下での凝集の抑制も観察されなかった（データは示さない）。これらの結果から、実施例１に記載される抗ＣＣＲ４抗体は血小板に結合するが、血小板の凝集には何の効果も無いことが結論され得る。それらは凝集を誘導することも、例えば、ＡＤＰ誘導性血小板凝集を抑制することもない。
【０４３７】
実施例１２：ヒト腎臓細胞腫への結合
ＣＣＲ４は淡明細胞型腎臓癌細胞（ＣＣＲＣ；特許出願国際公開第ＷＯ２００９／０３７４５４号を参照のこと）の固形腫瘍細胞株に含まれ、それらによって発現されていることが知られている。腎臓細胞癌（ＲＣＣ）の患者から調製した組織に存在するＣＣＲ４への特異的な結合を示すことを目的として、免疫組織化学実験を行った。癌研究所応用分子腫瘍学センター（バート・ロンドン医科歯科学校、ロンドン大学クイーン・メアリー、チャーターハウス・スクエア）にて記載される全ての実験を行った。抗ＣＣＲ４抗体５０３を使用して染色を行い、陽性抗ＣＣＲ４抗体と染色を比較した。
【０４３８】
ステージＩＶと診断された患者に由来するＲＣＣ腫瘍マイクロアレイ（ＴＭＡ）は、バート・ロンドン医科歯科学校（ロンドン大学クイーン・メアリー、チャーターハウス・スクエア、ロンドン、英国）により提供されたが、それは３つの異なる群（ＴＭＡ１、２および３）のセットを含むものであった。パラフィン包埋切片を４μｍの厚さで切り出し、そして、アルコール濃度勾配により脱ワックスと水和を行った。抗原アンマスキング溶液（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国）中で沸点まで９分間電子レンジにかけて抗原賦活化を行った。次に、ＰＢＳに希釈した５％ヤギ血清か２０％ウサギ血清（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州、米国）の中で、室温で１時間切片をブロックした。ＣＣＲ４の検出のため、次の抗体を用いてＴＭＡを染色した：３μｇ／ｍｌの濃度の抗ＣＣＲ４抗体５０３を用いてＣＣＲ４を検出し、ヤギ抗ＣＣＲ４抗体Ａｂ１６６９（３μｇ／ｍｌ；Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、英国）と比較した。抗ＣＣＲ４抗体５０３の結合特異性を示すためにヒトアイソタイプ対照抗体（カタログ番号１−００１−Ａ、３μｇ／ｍｌで使用；ＲｎＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州、米国）を含めた。対応するブロッキング剤中で抗体（ＰＢＳで希釈した５％ヤギ血清中のヒト抗体；ＰＢＳで希釈した２０％ウサギ血清中のＡＢ１６６９）を４℃で一晩インキュベートした。翌日、１回あたり３０から５０ｍｌの量のＰＢＳでスライドを３回洗浄した。１：５００に希釈したビオチン複合体化ヤギ抗ヒト二次抗体（カタログ番号ＡＰ１１２Ｂ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの一部門、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国）を用いてヒト抗体５０３とＲｎＤのアイソタイプ対照抗体を検出した。１：２００に希釈したビオチン複合体化ウサギ抗ヤギ抗体（ＢＡ−１０００；Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国）と室温で４５分間インキュベーションして抗ＣＣＲ４抗体Ａｂ１６６９を検出した。１回あたり３０から５０ｍｌの量のＰＢＳでスライドを２回洗浄した。３０％Ｈ2Ｏ2との混合液中にメタノール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州、米国）を室温で２０分間混合することにより内在性ペルオキシダーゼをブロックした。１回あたり３０から５０ｍｌのＰＢＳでスライドを３回洗浄した。ベクタステイン・エリートＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国）を用い、そして、３、３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州、米国）を用いて現像して抗原を可視化した。高発現のＣＣＲ４を有すると報告されており、したがって、抗ＣＣＲ４抗体の陽性対照として働く脾臓組織上の抗ＣＣＲ４抗体３０６、４０６および５０３に対して同様の染色法を行った（データは示さない）。ＣＣＲ４のリガンドであるＴＡＲＣとＭＤＣの検出を並行して行った。染色法は上に概説した通りであるが、次の抗体を用いた。ウサギ抗ヒトＴＡＲＣ抗体（ａｂ９８１６、Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、英国）を用いてＴ���ＲＣを検出した。１：５０に希釈してその抗体を使用し、そして、１：２００に希釈したビオチン複合体化ヤギ抗ウサギ抗体（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国）を使用してその抗体を検出した。１：２０に希釈したウサギ抗ヒトＭＤＣ抗体（５００−Ｐ１０７、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、プリンストン、ニュージャージー州、米国）を用い、ビオチン複合体化抗ウサギ抗体を用いてＭＤＣを検出した。Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、東京、日本）を用いて全ての結合パターンを解析した。
【０４３９】
さらに、上記の試験された抗体全てについて、陰性対照組織への結合を正常ヒト胎盤組織および腎臓組織で評価した。
【０４４０】
ＲＣＣの患者に由来する腫瘍マイクロアレイの染色の結果は、抗ＣＣＲ４抗体５０３がＲＣＣ患者の組織で発現するＣＣＲ４に結合することをＩＨＣで示した（図１９）。さらに、抗ＣＣＲ４抗体５０３は淡明細胞型腎臓細胞腫の領域に結合するが、乳頭状腎臓細胞腫には結合しない（データは示さない）ことが示された。納得のいくことに、その結合パターンは抗ＣＣＲ４陽性対照抗体Ａｂ１６６９と一致する。胎盤由来の正常なヒト組織へのわずかな結合が観察された。しかしながら、胎盤は血管が非常に発達した器官なので、これらの結合パターンは、ＣＣＲ４が発現することが知られている血管に関連している可能性がある。ＣＣＲ４の発現はＣＣＲ４のリガンドであるＴＡＲＣとＭＤＣの発現パターンと一致した。表２５にＩＨＣ実験の結合結果の要約が提示されている。抗ＣＣＲ４抗体５０３はＲＣＣで治療薬または診断薬として働き得ることをこれらのデータは示唆している。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１４】
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【表２０】
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【表２５】
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【０４４１】
引用文献
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【図１ａ）】
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【図１ｂ）】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
2014513519000001.app
【国際調査報告】
2014513519.tif 000066
2014513519.tif 000067
2014513519.tif 000068
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