(57)【要約】  物質を細胞に導入するための、システム、先端アセンブリ、方法、及びキットが提供される。先端アセンブリは、取り付け部分、チャンネル部分、及び収縮部分を含み、これらは、流体がチャンネル部分から収縮部分を通るとき、流体圧力を減少させる機能を果たし、それにより、先端アセンブリは、細胞の膜に孔を形成し、物質を細胞に導入する。物質は、例えば、無機化合物、薬物、遺伝物質、タンパク質、炭水化物、合成ポリマー、及び医薬組成物のグループから選択された１つを含む。【選択図】図１Ａ
2014504509.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体中の組成物を細胞に導入するためのシステムであって、該システムは；
流体を推進させるため正圧及び負圧の少なくとも１つを生成するフローデバイス；及び、
細胞と流体の混合物を通過させるための先端アセンブリを含み、該先端アセンブリは、フローデバイスに近接して接続する取り付け部分、取り付け部分とフローデバイスに隣接する及びそこから遠位にあるチャンネル部分、チャンネル部分と隣接する収縮部分を含み、ここで、収縮部分の内径と収縮部分の断面積は、チャンネル部分の内径と断面積よりも小さく、ここで、収縮部分の遠心端は、流体を排出又は引き抜くための開口部を含み、ここで、チャンネル部分の速度と圧力と比較して、収縮部分における流体速度の増加と流体圧力の減少は、細胞の膜透過性に影響を及ぼし、それにより、前記システムは、膜を通って組成物を細胞に導入する、ことを特徴とする、システム。
【請求項２】
先端アセンブリを通る流体を受けるための開口部に隣接した容器を更に含むことを特徴とする、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
先端アセンブリは、ガラス、金属、プラスチック、ポリマー、ナノベースの組成物、少なくとも２つの異なるタイプの物質を含む複合材料などから成るグループから選択された、少なくとも１つを含み；随意に、以下の中から選択された１以上の特性：
フローデバイスは、シリンジ、プランジャー、バルブ、ダイアフラム、及びコンプレッサーから成るグループから選択された、少なくとも１つを含み；又は、
フローデバイスの操作は、正の流体圧力、負の流体圧力、流体速度、流体加速度、質量流量、最初の速度勾配、出発速度、最大速度、出発位置、流体がフローデバイスによって生成された圧力下にあるカットオフ速度の時間、温度、及びチャンネル部分、収縮部分、又はその両方において流体が保持される時間から成るグループから選択された、少なくとも１つの制御を含み；
フローデバイスは随意に、約０．１ｃｍ／ｓ乃至毎秒約１センチメートル（ｃｍ／ｓ）、約１ｃｍ／ｓ乃至約５ｃｍ／ｓ、約５ｃｍ／ｓ乃至約１５ｃｍ／ｓ、及び約１５ｃｍ／ｓ乃至約２０ｃｍ／ｓから随意に選択される、先端アセンブリの長さに沿って生成される流体速度；毎分約０．０１ミリリッター（ｍｌ／ｍｉｎ）、１ｍｌ／ｍｉｎ、１０ｍｌ／ｍｉｎ、２５ｍｌ／ｍｉｎ、５０ｍｌ／ｍｉｎ、１００ｍｌ／ｍｉｎ、及び１５０ｍｌ／ｍｉｎから随意に選択される、フローデバイスにより生成される質量流量；及び、約０．６μｌ／ｓ／ｓ、約１μｌ／ｓ／ｓ、約６μｌ／ｓ／ｓ、約１０μｌ／ｓ／ｓ、約１２μｌ／ｓ／ｓ、約２４μｌ／ｓ／ｓ、約３６μｌ／ｓ／ｓ、約４８μｌ／ｓ／ｓ、及び約６０μｌ／ｓ／ｓの先端アセンブリ内のフローデバイスにより生成される加速度の少なくとも１つを更に特徴とする：
ことを特徴とする、請求項１又は２に記載のシステム。
【請求項４】
フローデバイスは、手動で制御又は操作されることを特徴とする、請求項１乃至３の何れかに記載のシステム。
【請求項５】
フローデバイスの制御及び操作は、自動化、電気機械式、及びプログラム可能なものから選択された、少なくとも１つであることを特徴とする、請求項１乃至３の何れかに記載のシステム。
【請求項６】
システムは、電源、ユーザーインターフェースと相互作用するコネクター、コンピュータ、携帯端末、送信器、又はディスプレイ；フローデバイスを先端アセンブリに接続させるためのコンジット；センサー；バルブ；及びハウジングのグループから選択された、少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１乃至５の何れかに記載のシステム。
【請求項７】
流体中の組成物を細胞に導入するための先端アセンブリであって、該先端アセンブリは：
流体を方向づけるため正圧と負圧の少なくとも１つを生成するフローデバイスに近接して接続される、大気中に解放された取り付け部分；
取り付け部分とフローデバイスに隣接した及びそこから遠位にあるチャンネル部分；
チャンネル部分に隣接した収縮部分を含み、ここで、収縮部分の内径と収縮部分の断面積は、チャンネル部分の内径と断面積よりも小さく、ここで、収縮部分の遠心端は、流体を排出又は引き抜くための開口部を含み、ここで、チャンネル部分の速度と圧力と比較して、収縮部分における流体速度の増加と流体の圧力の減少は、細胞の膜透過性に影響を及ぼし、それにより、先端アセンブリは、膜を通って組成物を細胞に導入する、ことを特徴とする、先端アセンブリ。
【請求項８】
先端アセンブリは、使い捨て、モジュール式、透明の、及び半透明のものの少なくとも１つから選択され；及び随意に、以下の中から選択される１以上の特性：
取り付け部分、チャンネル部分、及び収縮部分の少なくとも１つは、ガラス、金属、プラスチック、ポリマー、ナノベースの組成物、少なくとも２つの異なるタイプの物質を含む複合材料などのグループから選択された物質を含み；又は、
先端アセンブリの取り付け部分の内径又は外径は、雄雌配置においてそれぞれフローデバイスに適合し；又は、
チャンネル部分の断面積又は収縮部分の断面積は、連続円、楕円、長方形又は正方形などの正多角形によって境界づけられ、及び円多角形又は他の断面形状は連続的又は非連続的であり、ここで、収縮部分の遠心端は、開口部の内径未満又はその内径にほぼ等しい内径を含み；又は、
先端アセンブリは、約２マイクロリッター（μｌ）、約２０μｌ、約５０μｌ、約２００μｌ、約４００μｌ、約５００μｌ、約１ミリリッター（ｍｌ）、約５ｍｌ、及び約１０ｍｌである容積を含み、ここで、チャンネル部分の内径は、約１．０ミリメーター（ｍｍ）乃至約１０．０ｍｍであり、収縮部分の内径の直径は、約０．０５ｍｍ乃至約２．０ｍｍであり、ここで、収縮部分の内径は、チャンネル部分の内径よりも小さい：
ことを特徴とする、請求項７に記載の先端アセンブリ。
【請求項９】
チャンネル部分の曲率と収縮部分の内曲率は、先端アセンブリを通って流れる流体のための流体経路を特徴とし、ここで、組成物を細胞に導入するのに必要なチャンネル部分の曲率と収縮部分の内曲率は、以下によって二次元で表される式：
ｆ（ｘ）＝ｐ１ｘ７＋ｐ２ｘ６＋ｐ３ｘ５＋ｐ４ｘ４＋ｐ５ｘ３＋ｐ６ｘ２＋ｐ７ｘ＋ｐ８
［ここで、ｘは、流体経路上の重心軸から先端の内面までのラジアル距離であり、括弧内の９５％の信頼限界を備えた係数は、次のものを含む：ｐ１は−２．６１１ｅ−１６（−６．０４３ｅ−１６、８．２０６ｅ−１７）であり、ｐ２は３．９５４ｅ−１３（−３．１９５ｅ−１３、１．１１ｅ−１２）であり、ｐ３は−１．８４５ｅ−１０（−７．８２１ｅ−１０、４．１３１ｅ−１０）であり、ｐ４は１．６６２ｅ−０８（−２．３９４ｅ−０７、２．７２６ｅ−０７）であり、ｐ５は７．５３７ｅ−０６（−５．１８６ｅ−０５、６．６９４ｅ−０５）であり、ｐ６は−０．００２１３７（−０．００９３７５、０．００５１０１）であり、ｐ７は−０．００３１８５（−０．４１１４、０．４０５１）であり、及びｐ８＝２６８．６（２６１、２７６．３）であり］、又は、
ｆ（ｘ）＝ｐ１ｘ８＋ｐ２ｘ７＋ｐ３ｘ６＋ｐ４ｘ５＋ｐ５ｘ４＋ｐ６ｘ３＋ｐ７ｘ２＋ｐ８ｘ＋ｐ９
［ここで、ｘは、流体経路上の重心軸から先端の内面までのラジアル距離であり、括弧内の９５％の信頼限界を備えた係数は、次のものを含む：ｐ１は２．２８５（１．３８８、３．１８２）であり、ｐ２は３．４６５（１．７８２、５．１４９）であり、ｐ３は−１５．６８（−２０．０４、−１１．３２）であり；ｐ４は−２０．３８（−２７．２４、−１３．５２）であり；ｐ５は４４．２７（３６．５、５２．０４）であり；ｐ６は５３．９６（４５．６９、６２．２３）であり；ｐ７は−５８．７２（−６４．０２、−５３．４２）であり、ｐ８は−１２３．５（−１２６．４、−１２０．６）であり、及びｐ９は１８６．５（１８５．６、１８７．４）である］を含む
ことを特徴とする、請求項７又は８に記載の先端アセンブリ。
【請求項１０】
取り付け部分の外側表面から横に伸びるショルダーを更に含み、例えば、フローデバイスのより低いエジェクターセクションは、フローデバイスから先端アセンブリを取り外す
ことを特徴とする、請求項７乃至９の何れかに記載の先端アセンブリ。
【請求項１１】
組成物を細胞に導入するための方法であって、該方法は：
貯蔵槽中の細胞を、組成物を含む流体と接触させる工程；
先端アセンブリを貯蔵槽に挿入する工程を含み、ここで、先端アセンブリは、流体を方向づけるため正圧と負圧の少なくとも１つを生成するフローデバイスに近接して接続される、大気中に解放された取り付け部分；取り付け部分とフローデバイスに隣接した及びそこから遠位にあるチャンネル部分；チャンネル部分に隣接した収縮部分を含み、ここで、収縮部分の内径と収縮部分の断面積は、チャンネル部分の内径と断面積よりも小さく、ここで、収縮部分の遠心端は、流体を排出又は引き抜くための開口部を含み、ここで、チャンネル部分の速度と圧力と比較して、収縮部分における流体速度の増加と流体の圧力の減少は、細胞の膜透過性に影響を及ぼし；及び前記方法は、
フローデバイスを使用して少なくとも１回先端アセンブリを通って、細胞と、組成物を備えた流体との混合物を通過させる工程を含み、それにより、混合物を通過させる工程は、膜を通って組成物を細胞に導入する、ことを特徴とする、方法。
【請求項１２】
混合物を通過させる工程は、貯蔵槽に混合物を方向づけ直す工程を含み、又は混合物を通過させる工程は、混合物を容器に分配する工程を更に含み；及び随意に、以下の中から選択された１以上の特性：
細胞は、多くの生細胞、随意に真核細胞の集団を含み、ここで、方法は、細胞生存率の維持を観察する工程を更に含み、細胞生存率は実質的に減少せず、先端アセンブリを通らない対照の細胞の少なくとも約１％、１０％、９０％、又は９５％を含み；又は、
流体は、約２００ナノモーラー（ｎＭ）、約１５０ｎＭ、約１００ｎＭ、又は約７５ｎＭ未満の濃度のＣａ−２を含み、ここで、流体は約２００ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１００ｎＭ、又は約７５ｎＭ未満の濃度のＭｇ＋２を含み；又は、
組成物は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含み、ここで、ＤＮＡは、天然ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡのグループから選択され、及びここで、ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、及びｄｓＲＮＡ、又はそれらの一部分から選択され、並びに方法は更に、細胞のトランスフェクションをアッセイする工程を更に含む：
を更に特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
通過後、核；ミトコンドリア；ゴルジ体；小胞体；葉緑体；有色体；エンドソーム、ベシクル、リソソーム、軸索；細胞膜；核膜；細胞骨格、及び細胞質から選択された、少なくとも１つの細胞内区画への組成物の局在化を観察する工程を更に含み、ここで、局在化を観察する工程は更に、検知可能、蛍光性、比色定量、酵素的、放射性のものから成るグループから選択された、検知可能なマーカーにより組成物を視覚化する工程；及びｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、並びにタンパク質から成るグループから細胞に侵入する組成物の生成物を直接定量化する工程を含み；及び随意に、以下の中から選択された１以上の特性：
細胞は、上皮細胞、造血性細胞、幹細胞、脾臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、肝細胞、神経細胞、膠細胞、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、平滑筋細胞又は横紋筋細胞、精細胞、心臓細胞、肺細胞、視覚細胞、骨髄細胞、胎児の臍帯血細胞、始原細胞、末梢血単核細胞、白血球細胞、リンパ球、生きた分裂終了細胞、生理的に不活性な細胞、阻害された細胞、ＵＶにより不活性化された細胞、除核細胞、無核細胞、熱により死滅させられた細胞、再生しない細胞、及び人工膜を有する合成細胞などから成るグループから選択された、細胞型を含む：
を更に特徴とする、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
通過後、細胞ペレットと上清を得るために混合物を遠心分離する工程、上清を取り除く工程、貯蔵槽に培養液を加える工程、培地中の細胞ペレットを再懸濁する工程、及び細胞を培養する工程を更に含むことを特徴とする、請求項１１乃至１３の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
電界、波長によって特徴付けられた光又は放射線、及び音波パルスから選択された少なくとも１つを、方法の前、その間、又はその後に、混合物に適用する工程を更に含むことを特徴とする、請求項１１乃至１４の何れかに記載の方法。
【請求項１６】
流体中の組成物を細胞に導入するためのキットであって、該キットは：
細胞と流体の混合物を通過させるための先端アセンブリを含み、該先端アセンブリは、流体を方向づけるため正圧と負圧の少なくとも１つを生成するフローデバイスに近接して接続される、大気中に解放された取り付け部分；取り付け部分とフローデバイスに隣接した及びそこから遠位にあるチャンネル部分；チャンネル部分に隣接した収縮部分を含み、ここで、収縮部分の内径と収縮部分の断面積は、チャンネル部分の内径と断面積よりも小さく、ここで、収縮部分の遠心端は、流体を排出又は引き抜くための開口部を含み、ここで、チャンネル部分の速度と圧力と比較して、収縮部分における流体速度の増加と流体の圧力の減少は、細胞の膜透過性に影響を及ぼし、それにより、先端アセンブリは、膜を通って組成物を細胞に導入し；及び前記キットは、
容器を含む
ことを特徴とする、キット。
【請求項１７】
貯蔵槽中の細胞を、組成物を含む流体と接触させる工程；先端アセンブリを貯蔵槽に挿入する工程；先端アセンブリの取り付け部分を、正圧と負圧の少なくとも１つを生成するフローデバイスに接触させる工程；及びフローデバイスを使用して少なくとも１回は先端アセンブリを通って、流体と組成物との混合物を通過させる工程であって、それにより、混合物を通過させる工程が、細胞の膜透過性に影響し、細胞へ組成物を導入する工程を含む使用のための、取扱説明書を更に含むことを特徴とする、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
貯蔵槽を更に含み；及び随意に、トランスフェクション薬剤、バッファー、又は細胞、細胞株、或いは株の型に特異的な培地の少なくとも１つを更に含むことを特徴とする、請求項１６又は１７に記載のキット。
【請求項１９】
流体中の組成物を細胞に導入するためのフロースルーアセンブリであって、該フロースルーアセンブリは：
流体を侵入チャンネル部分に方向づけるため正圧と負圧の少なくとも１つを生成するフローデバイスに接続される及びそれに近接される、大気中に解放された侵入チャンネル部分；
侵入チャンネル部分とフローデバイスに隣接する及びそこから遠位にある収縮部分；
収縮部分に隣接し、且つフローデバイスと収縮部分から遠位にある出口チャンネル部分を含み、ここで、収縮部分の内径及び収縮部分の断面積は、侵入チャンネル部分と出口チャンネルのそれぞれの内径と断面積より小さく、ここで、出口チャンネル部分の遠心端は、流体を排出又は引き抜くための開口部を含み、ここで、流体は収縮部分を通って何れかの方向に流れ、及びここで、侵入チャンネル部分又は出口チャンネル部分の速度と圧力と比較して、収縮部分における流体速度の増加と流体の圧力の減少は、細胞の膜透過性に影響を及ぼし、それにより、フロースルーアセンブリは、膜を通って組成物を細胞に導入する
ことを特徴とする、フロースルーアセンブリ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〈関連出願〉
この出願は、発明者「Ｔｈｏｍａｓ  Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈ」による、２０１１年２月２日出願の米国仮特許出願第６１／４３８，８２４号、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ｔｉｐ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ａｎｄ  ｋｉｔｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌｓ」と、２０１１年９月１３日出願の、前述の特許出願と表題及び発明者が同じである米国特許一部継続出願第１３／２３１，５９２号の利益を主張するものであり、それらは引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
物質を細胞に導入するためのシステム、先端アセンブリ、方法、及びキットを提供する。細胞へ導入される物質には、無機化合物、薬物、遺伝物質、又は医薬組成物が含まれる。
【背景技術】
【０００３】
生細胞における遺伝物質の誘発発現（例えばＤＮＡ配列）は、分子遺伝学と分子生物学の基礎である。このプロセスにおいて、例えば遺伝子をコードする遺伝物質は、細胞の核へ人為的に導入され、その結果、細胞は、遺伝子工学によって達成されるように、非天然又は修飾されたタンパク質の形態で遺伝子生成物を生成する。微生物学において、１以上の特定の遺伝子因子が受容細胞中で変更される方法は、転移と呼ばれる。真核生物の生物学において、この方法は、トランスフェクション、即ち外来性のクローン化遺伝子又はｃＤＮＡを真核生物ゲノムへ導入することと、時々称される。ウイルス又はプラスミドのベクターは、導入されたＤＮＡ配列のビヒクルである。
【０００４】
多くの方法が、生細胞の核又は細胞質へと遺伝物質を導入するために使用されてきた。これらの方法には制限があり、原形質膜をわたるプラスミドｃＤＮＡの運搬を必要とし、原形質膜は、すべての細胞で見出される脂質分子の異種混合の二分子層である。生細胞の核又は細胞質へと遺伝物質を導入するための周知の方法は、エレクトロポレーションであり、それは、遺伝物質が電子拡散によって細胞に侵入する膜において、直径１２０ｎｍまでの誤差（準安定の水性の孔）を生じる、膜の絶縁破壊に依存する。別の方法は、ＤＮＡと関連して本質的には洗浄剤である、脂質を含むトランスフェクション試薬又は脂肪ベースの試薬（即ち、リポフェクタミン）を使用することであり、それにより、ＤＮＡが原形質膜を通るのを可能にする。
【０００５】
微粒子銃のトランスフェクションは、また別の方法であり、原形質膜を通って高圧で金のナノ粒子に結合された遺伝物質を発射する「遺伝子銃」を含む。機械的な注射も、また別の方法であり、静水圧注射を使用して直接核へと遺伝物質を運ぶため、原形質膜に物理的に穴をあけるガラス針を典型的に使用する。
【０００６】
これら方法の効率は、特に細胞に対する毒性、損傷又は死により、制限があるものと見出されてきた。このような方法のトランスフェクション効率は典型的に、方法と細胞型に依存して非常に低いか又は変化しやすく、処置した細胞の生存度の損失、又は細胞膜を通して遺伝物質を得る方法の不能性に関係する。例えば、異なる細胞株の可変性を処置する遺伝子銃のトランスフェクション効率は、処置した細胞のほんの約１％乃至４％で成功することが観察された。リポフェクションは、処置した細胞のほんの約１０％乃至２０％で成功した組み換え体を産出する。ポリカチオン性の脂質試薬は一般に、４０％の効率を超過しない。最も重要なことに、特定の細胞型は、任意の方法に従順ではなく、そして、分割しないことから一次細胞としてのみ培地で維持される、免疫系細胞、ヒト幹細胞、筋細胞、神経細胞、及び他の細胞型の型を含む。
【０００７】
より多くの生物学的な方法が、ウイルスを媒介としたトランスフェクション又は細胞への遺伝物質の導入に依存する。この方法は、細胞を感染させるためのアデノウイルス、シンドビスウィルス、レトロウイルス、バクロウイルス、又はレンチウイルスなどの株に由来した、特異的に設計されたウイルスベクターを利用する。ウイルスゲノムは、対象の遺伝子配列を運ぶために設計され、結果として、遺伝物質を導入する機械的手段と比べると、比較的時間のかかる且つ労働集約的な方法である。この方法には、遺伝物質を転写且つ翻訳する細胞の効率だけでなく、ウイルスの感染効率にも依存するタンパク質発現を得るための、時間の遅れ又はタイムラグにおいて、著しく方法論的な制限がある。加えて、生きたウイルスの使用は、特別な研究所の安全基準条件（即ち、生物災害レベル２＋）を必要とする。
【０００８】
感染効率は多くの変数に依存し、ウイルスを媒介とした技術は、細胞集団におけるタンパク質発現を観察するために少なくとも１日又は数日の遅延を特徴とする。更に、感染効率は細胞型特異性であり、即ち、特定のウイルスは特定の細胞を感染させない。
【０００９】
以前は任意の市販の方法でトランスフェクトするのが難しい又は不可能であった細胞型を含む、細胞の任意の型へと遺伝物質を導入するための、迅速で、効率的で、普遍的な方法の必要性が残っている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の実施例は、流体中の組成物を細胞に導入するためのシステムを提供し、該システムは、流体を推進させるため正圧及び負圧の少なくとも１つを生成するフローデバイス；及び、細胞と流体の混合物を通過させる（ｐａｓｓａｇｉｎｇ）ための先端アセンブリを含み、該先端アセンブリは、フローデバイスに近接して接続する取り付け部分、取り付け部分とフローデバイスに隣接及びそこから遠位にあるチャンネル部分、チャンネル部分と隣接する収縮部分（ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｐｏｒｔｉｏｎ）を含み、その結果、収縮部分の内径と収縮部分の断面積は、チャンネル部分の内径と断面積よりも小さく、収縮部分の遠心端には流体を排出又は引き抜くための開口部が含まれ、チャンネル部分の速度と圧力と比較して、収縮部分における流体速度の増加と流体圧力の減少は、細胞の膜透過性に影響を及ぼし、前記システムは、膜を通って組成物を細胞に導入する。例えば、チャンネル部分の速度と圧力と比較して、収縮部分における流体速度の増加と流体の圧力の減少は、細胞中の膜孔の形成を促進し、システムは、膜孔を通って組成物を細胞に導入する。
【００１１】
別の実施形態において、システムは、先端アセンブリを通る流体を受けるための開口部に隣接した容器を更に含む。
【００１２】
前記システムの関連する実施形態において、先端アセンブリは、ガラス、金属、プラスチック、ポリマー、ナノベースの組成物、少なくとも２つの異なるタイプの物質を含む複合材料などから成るグループから選択された、少なくとも１つを含み；随意に、フローデバイスは、シリンジ、プランジャー、バルブ、ダイアフラム、及びコンプレッサーから成るグループから選択された、少なくとも１つを含み；随意に、フローデバイスの操作は、正の流体圧力、負の流体圧力、流体速度、流体加速度、質量流量、最初の速度勾配、出発速度、最大速度、出発位置、流体がフローデバイスによって生成された圧力下にあるカットオフ速度の時間、温度、及びチャンネル部分、収縮部分、又はその両方において流体が保持される時間から成るグループから選択された、少なくとも１つの制御を含み；随意に、フローデバイスは、先端アセンブリの長さに沿った流体速度、即ち、約０．１ｃｍ／ｓ乃至毎秒約１センチメートル（ｃｍ／ｓ）、約１ｃｍ／ｓ乃至約５ｃｍ／ｓ、約５ｃｍ／ｓ乃至約１５ｃｍ／ｓ、及び約１５ｃｍ／ｓ乃至約２０ｃｍ／ｓから選択された流体速度を生成し；その結果、フローデバイスは、毎分約０．０１ミリリッター（ｍｌ／ｍｉｎ）、１ｍｌ／ｍｉｎ、１０ｍｌ／ｍｉｎ、２５ｍｌ／ｍｉｎ、５０ｍｌ／ｍｉｎ、１００ｍｌ／ｍｉｎ、及び１５０ｍｌ／ｍｉｎから成るグループから選択された、質量流量を生成し；ここで、フローデバイスは、約０．６μｌ／ｓ／ｓ、約１μｌ／ｓ／ｓ、約６μｌ／ｓ／ｓ、約１０μｌ／ｓ／ｓ、約１２μｌ／ｓ／ｓ、約２４μｌ／ｓ／ｓ、約３６μｌ／ｓ／ｓ、約４８μｌ／ｓ／ｓ、及び約６０μｌ／ｓ／ｓの先端アセンブリにおける加速度を生成する。
【００１３】
システムの１つの実施形態に従い、フローデバイスは、手動で制御又は操作される。別の実施形態に従い、フローデバイスは、自動化、電気機械式、及びプログラム可能なものから選択された、少なくとも１つである。
【００１４】
様々な関連する実施形態において、システムには、電源、ユーザーインターフェースと相互作用するコネクター、コンピュータ、携帯端末、送信器、又はディスプレイ；フローデバイスを先端アセンブリに接続させるためのコンジット；センサー；バルブ；及びハウジングのグループから選択された、少なくとも１つが含まれる。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、流体中の組成物を細胞に導入するための先端アセンブリであり、該先端アセンブリは、流体を方向づけるため正圧と負圧の少なくとも１つを生成するフローデバイスに近接して接続される、大気中に解放された取り付け部分；取り付け部分とフローデバイスに隣接した及び又はそこから遠位にあるチャンネル部分；チャンネル部分に隣接した収縮部分があり；その結果、収縮部分の内径と収縮部分の断面積は、チャンネル部分の内径と断面積よりも小さく、収縮部分の遠心端には流体を排出又は引き抜くための開口部が含まれ、チャンネル部分の速度と圧力と比較して、収縮部分における流体速度の増加と流体の圧力の減少は、細胞の膜透過性に影響を及ぼし、先端アセンブリは、膜を通って組成物を細胞に導入する。例えば、チャンネル部分の速度と圧力と比較して、収縮部分における流体速度の増加と流体の圧力の減少は、細胞中の膜孔の形成を促進し、先端アセンブリは、膜孔を通って組成物を細胞に導入する。
【００１６】
関連する実施形態において、先端アセンブリは、使い捨て、モジュール式、透明の、及び半透明のものの少なくとも１つから選択され；随意に、先端アセンブリは再使用可能であり；随意に、取り付け部分、チャンネル部分、及び収縮部分の少なくとも１つは、ガラス、金属、プラスチック、ポリマー、ナノベースの組成物、少なくとも２つの異なるタイプの物質を含む複合材料などのグループから選択された、少なくとも１つを含み；随意に、先端アセンブリの取り付け部分の内径又は外径は、雄雌配置においてそれぞれフローデバイスに適合し；随意に、チャンネル部分の断面積又は収縮部分の断面積は、連続円、楕円、長方形又は正方形などの正多角形によって境界づけられ、及び円多角形（ｃｉｒｃｌｅ  ｐｏｌｙｇｏｎ）又は他の断面形状は連続的又は非連続的であり、その結果、収縮部分の遠心端には、開口部の内径未満又はその内径にほぼ等しい内径が含まれ；随意に、先端アセンブリには、約２マイクロリッター（μｌ）、約２０μｌ、約５０μｌ、約２００μｌ、約４００μｌ、約５００μｌ、約１ミリリッター（ｍｌ）、約５ｍｌ、及び約１０ｍｌである容積が含まれ、ここで、チャンネル部分の内径は、約１．０ミリメーター（ｍｍ）乃至約１０．０ｍｍであり、収縮部分の内径の直径は、約０．０５ｍｍ乃至約２．０ｍｍであり、ここで、収縮部分の内径は、チャンネル部分の内径よりも小さい。
【００１７】
先端アセンブリの関連する実施形態に従い、チャンネル部分の曲率と収縮部分の内曲率は、先端アセンブリを通って流れる流体のための流体経路を特徴とし、その結果、組成物を細胞に導入するのに必要なチャンネル部分の曲率と収縮部分の内曲率は、以下によって二次元で表される式：
ｆ（ｘ）＝ｐ１ｘ７＋ｐ２ｘ６＋ｐ３ｘ５＋ｐ４ｘ４＋ｐ５ｘ３＋ｐ６ｘ２＋ｐ７ｘ＋ｐ８
［ここで、ｘは、流体経路上の重心軸から先端の内面までのラジアル距離であり、括弧内の９５％の信頼限界を備えた係数は、次のものを含む：ｐ１は−２．６１１ｅ−１６（−６．０４３ｅ−１６、８．２０６ｅ−１７）であり、ｐ２は３．９５４ｅ−１３（−３．１９５ｅ−１３、１．１１ｅ−１２）であり、ｐ３は−１．８４５ｅ−１０（−７．８２１ｅ−１０、４．１３１ｅ−１０）であり、ｐ４は１．６６２ｅ−０８（−２．３９４ｅ−０７、２．７２６ｅ−０７）であり、ｐ５は７．５３７ｅ−０６（−５．１８６ｅ−０５、６．６９４ｅ−０５）であり、ｐ６は−０．００２１３７（−０．００９３７５、０．００５１０１）であり、ｐ７は−０．００３１８５（−０．４１１４、０．４０５１）であり、及びｐ８＝２６８．６（２６１、２７６．３）であり］、又は、
ｆ（ｘ）＝ｐ１ｘ８＋ｐ２ｘ７＋ｐ３ｘ６＋ｐ４ｘ５＋ｐ５ｘ４＋ｐ６ｘ３＋ｐ７ｘ２＋ｐ８ｘ＋ｐ９
［ここで、ｘは、流体経路上の重心軸から先端の内面までのラジアル距離であり、括弧内の９５％の信頼限界を備えた係数は、次のものを含む：ｐ１は２．２８５（１．３８８、３．１８２）であり、ｐ２は３．４６５（１．７８２、５．１４９）であり、ｐ３は−１５．６８（−２０．０４、−１１．３２）であり；ｐ４は−２０．３８（−２７．２４、−１３．５２）であり；ｐ５は４４．２７（３６．５、５２．０４）であり；ｐ６は５３．９６（４５．６９、６２．２３）であり；ｐ７は−５８．７２（−６４．０２、−５３．４２）であり、ｐ８は−１２３．５（−１２６．４、−１２０．６）であり、及びｐ９は１８６．５（１８５．６、１８７．４）である］
を含む。
【００１８】
本発明の別の実施形態において、先端アセンブリは、取り付け部分の外側表面から横に伸びるショルダーをさらに含み、例えば、フローデバイスのより低いエジェクターセクションは、フローデバイスから先端アセンブリを取り外す。
【００１９】
本発明の別の実施形態において、フローデバイスに接続する先端アセンブリの収縮部分は、第２のチャンネルに通じる連続チャンネルを含み、流体はその後、連続チャンネルを通って、随意に貯蔵層、細胞処理装置などの何れかが含まれるシステムの出口部分に向かって流れる。この実施形態において、流体は、侵入チャンネルから、収縮部を通り、その後連続フロースルーシステム中の出口チャンネルを通って流れる。
【００２０】
本発明の別の実施形態は、組成物を細胞に導入するための方法であり、該方法は、貯蔵槽中の細胞を、組成物を含む流体と接触させる工程；先端アセンブリを貯蔵槽に挿入する工程、ここで、先端アセンブリは、流体を方向づけるため正圧と負圧の少なくとも１つを生成するフローデバイスに近接して接続される、大気中に解放された取り付け部分；取り付け部分とフローデバイスに隣接した及びそこから遠位にあるチャンネル部分；チャンネル部分に隣接した収縮部分を含み；その結果、収縮部分の内径と収縮部分の断面積は、チャンネル部分の内径と断面積よりも小さく、収縮部分の遠心端は、流体を排出又は引き抜くための開口部を含み、チャンネル部分の速度と圧力と比較して、収縮部分における流体速度の増加と流体の圧力の減少は、細胞の膜透過性に影響を及ぼし；及び前記方法は、フローデバイスを使用して少なくとも１回先端アセンブリを通る、細胞と、組成物を備えた流体との混合物を通過させる工程を含み、その結果、混合物を通過させる工程は、膜を通って組成物を細胞に導入する。例えば、チャンネル部分の速度と圧力と比較して、収縮部分における流体速度の増加と流体の圧力の減少は、細胞中の膜孔の形成；及びフローデバイスを使用して少なくとも１回は先端アセンブリを通る、細胞と、組成物を備えた流体との混合物を通過させる工程を促進し、混合物を通過させる工程は、孔を通って組成物を細胞に導入する。
【００２１】
方法の関連する実施形態において、混合物を通過させる工程は、貯蔵槽に混合物を方向づけ直す工程を含み：随意に、混合物を通過させる工程は、混合物を容器に分配する工程を更に含み；随意に、連続チャンネルの収縮部を通って混合物を通過させた後、混合物はその後、出口チャンネルを通って連続的に進み；随意に、細胞は、多くの生細胞、随意に真核細胞の集団であり、方法は、細胞生存率の維持を観察する工程を更に含み、細胞生存率は実質的に減少せず、先端アセンブリを通らない対照の細胞の少なくとも約１％、１０％、３０％、５０％、７５％、９０％、又は９５％を含み；随意に、流体は、約２００ナノモーラー（ｎＭ）、約１５０ｎＭ、約１００ｎＭ、又は約７５ｎＭ未満の濃度のＣａ−２を含み、ここで、流体は、約２００ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１００ｎＭ、又は約７５ｎＭ未満の濃度のＭｇ＋２を含み；随意に、その結果、組成物はＤＮＡ又はＲＮＡを含み、ＤＮＡは、天然ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡのグループから選択され、ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、及びｄｓＲＮＡ、又はそれらの一部分から選択され、方法は更に、細胞のトランスフェクションをアッセイする工程を含む。
【００２２】
他の関連する実施形態に従い、方法は、通過後、少なくとも１つの細胞内区画への組成物の局在化を観察する工程を含み、該細胞内区画は、核；ミトコンドリア；ゴルジ体；小胞体；葉緑体；有色体；エンドソーム、ベシクル、空胞、リソソーム、軸索；細胞膜；核膜；細胞骨格、及び細胞質から選択され、その結果、局在化を観察する工程は更に、検知可能、蛍光性、比色定量、酵素的、放射性のものから成るグループから選択された、検知可能なマーカーにより組成物を視覚化する工程；及びｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、並びにタンパク質から成るグループから細胞に侵入する組成物の生成物を直接定量化する工程を含み；随意に、その結果、細胞は、上皮細胞、造血性細胞、幹細胞、脾臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、肝細胞、神経細胞、膠細胞、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、平滑筋細胞又は横紋筋細胞、精細胞、心臓細胞、肺細胞、視覚細胞、骨髄細胞、胎児の臍帯血細胞、始原細胞、末梢血単核細胞、白血球細胞、リンパ球、生きた分裂終了細胞、生理的に不活性な細胞、阻害された細胞、ＵＶにより不活性化された細胞、除核細胞、無核細胞、熱により死滅させられた細胞、再生しない細胞、及び人工膜を有する合成細胞などから成るグループから選択された、細胞型を含む。
【００２３】
関連する実施形態において、方法は更に、通過後、細胞ペレットと上清を得るために混合物を遠心分離する工程、上清を取り除く工程、貯蔵槽に培養液を加える工程、培地中の細胞ペレットを再懸濁する工程、及び細胞を培養する工程を含む。
【００２４】
他の関連する実施形態において、方法は更に、電界、波長によって特徴付けられた光又は放射線、及び音波パルスから選択された少なくとも１つを混合物に適用する工程を含む。
【００２５】
本発明の別の実施形態は、流体中の組成物を細胞に導入するためのキットであり、該キットは、細胞と流体の混合物を通過させるための先端アセンブリを含み、該先端アセンブリは、流体を方向づけるため正圧と負圧の少なくとも１つを生成するフローデバイスに近接して接続される、大気中に解放された取り付け部分；取り付け部分とフローデバイスに隣接した及びそこから遠位にあるチャンネル部分；チャンネル部分に隣接した収縮部分が含まれ；その結果、収縮部分の内径と収縮部分の断面積は、チャンネル部分の内径と断面積よりも小さく、収縮部分の遠心端は、流体を排出又は引き抜くための開口部を含み、チャンネル部分の速度と圧力と比較して、収縮部分における流体速度の増加と流体の圧力の減少は、細胞の膜透過性に影響を及ぼし、先端アセンブリは、膜を通って組成物を細胞に導入し；及び前記キットは、容器を含む。例えば、チャンネル部分の速度と圧力と比較して、収縮部分における流体速度の増加と流体の圧力の減少は、細胞中の膜孔の形成を促進し、先端アセンブリは、膜孔を通って組成物を細胞に導入する。
【００２６】
関連する実施形態において、キットは、貯蔵槽中の細胞を、組成物を含む流体と接触させる工程；先端アセンブリを貯蔵槽に挿入する工程；先端アセンブリの取り付け部分を、正圧と負圧の少なくとも１つを生成するフローデバイスに接触させる工程；及びフローデバイスを使用して少なくとも１回は先端アセンブリを通って、流体と組成物との混合物を通過させる工程であって、混合物を通過させる工程が、細胞の膜透過性に影響し、細胞へ組成物を導入する工程を含む使用のための、取扱説明書を有する。例えば、フローデバイスを使用して少なくとも１回は先端アセンブリを通って、流体と組成物の混合物を通過させる工程は、細胞に膜孔を形成し、細胞へ組成物を導入する。別の関連する実施形態において、キットはさらに貯蔵槽を含み；随意に、トランスフェクション薬剤、バッファー、又は培地、細胞株或いは株を更に含む。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、流体中の組成物を細胞に導入するためのフロースルーアセンブリであり、該フロースルーアセンブリは、流体を侵入チャンネル部分に方向づけるため正圧と負圧の少なくとも１つを生成するフローデバイスに接続される及びそれに近接される、大気中に解放された侵入チャンネル部分；侵入チャンネル部分とフローデバイスに隣接する及びそこから遠位にある収縮部分；収縮部分に隣接し、且つフローデバイスと収縮部分から遠位にある出口チャンネル部分を含み、ここで、収縮部分の内径及び収縮部分の断面積は、侵入チャンネル部分と出口チャンネルのそれぞれの内径と断面積より小さく、ここで、出口チャンネル部分の遠心端は、流体を排出又は引き抜くための開口部を有し、ここで、流体は収縮部分を通って何れかの方向に流れ、及びここで、侵入チャンネル部分又は出口チャンネル部分の速度と圧力と比較して、収縮部分における流体速度の増加と流体の圧力の減少は、細胞の膜透過性に影響を及ぼし、その結果、フロースルーアセンブリは、膜を通って組成物を細胞に導入する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】典型的なトランスフェクションシステムの一連の写真である。ＵＳＢコンバーター（１０３）、及びジャンプボックス（１０６）の金属蓋（１０５）の内面に構成されるＲＳ２３２インターフェース（１０４）により外部コンピュータに接続された、コンピュータープログラム可能なシリンジポンプ（１０１）（１０２）の写真である。ＵＳＢコンバーター（１０３）へのＲＳ２３２インターフェース（１０４）の接続は、データ解析ソフトウェアＭＡＴＬＡＢ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）を使用する制御のため、ケーブルによって外部コンピュータに接続される。
【図１Ｂ】典型的なトランスフェクションシステムの一連の写真である。ジャンプボックス（１０６）の右に位置付けられた、プログラム可能なシリンジ（１０１）とポンプ機構（１０２）の拡大図である。典型的なシリンジ（１０１）はホウケイ酸ガラスであり、潤滑して且つ耐溶媒性であるＵＨＭＷＰＥ（超高分子量ポリエチレン）シール１０７を備え、及びプランジャー（１０８）を備える。シリンジの一端に接続される、ＴＹＧＯＮ（登録商標）チューブ（１０９）の長さは、ジャンプボックス（１０６）（図１Ａを参照）の金属蓋（１０５）を通って、コネクターにまで、及びソーダ石灰ガラスキャピラリーチューブの近接端部に直接付くチューブにまで及ぶ。
【図１Ｃ】典型的なトランスフェクションシステムの一連の写真である。ジャンプボックス（１０６）の内部の左隅にある電力供給装置（１１０）を示す。
【図１Ｄ】典型的なトランスフェクションシステムの一連の写真である。滅菌状態にある組織培養フローフードの内部にあるジャンプボックス（１０６）の写真を示す。金属蓋（１０５）は閉位置にあり、外蓋（１１１）は開位置にある。先端に接続するためのＴＹＧＯＮ（登録商標）チューブ（１０９）は、金属蓋（１０５）から金属蓋（１０５）の縁部（１１２）にまで及ぶ。
【図２】８つのサイクルを備えた流体サイクル（ｆｌｕｉｄ  ｃｙｃｌｉｎｇ）における、シリンジプランジャー（１０８）の典型的な移動を示す略図である。戻り行程は、実行行程と同じパラメーターに従って作動し、すなわち、流出運動には、流入運動と同じ特徴がある。サイクルは、戻り行程後の実行行程から成る。サイクル中の時点でのシリンジの長さに沿ったプランジャー配置の位置は、縦座標上で表わされ、時間は横座標上で表わされる。プランジャーは、最初に位置０から位置５００（負荷位置（ｌｏａｄ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ））まで移動し、２００ミリ秒（ｍｓ）の間停止し、流量を最初の充填容量未満にまで減らして、先端に循環容量を残す位置４００にまで下がる。１００ｍｓの停止後、プランジャーは位置４００から０まで下がる。各傾斜は、出発速度、最終速度、及び出発速度から最終速度までの加速度を有するように示される。各サイクルには、対称的又は非対称的な行程パラメーターのいずれかがあり、その結果、実行行程と戻り行程は類似するか、又はそれぞれ異なる。
【図３Ａ】流体中の組成物等の物質を細胞に導入するための先端アセンブリの内面の典型的な形状を示す、図面とグラフである。物質、流体、及び圧力のソースの近くに位置する頂部又は近位の開口部、並びに、物質、流体、及び圧力のソースから遠位にある下部又は遠位の開口部を備えた、典型的な先端アセンブリの内面の三次元表現の図面である。図面は、先端アセンブリに、遠位に位置付けた収縮部分より大きな内径及び断面積のチャンネル部分があることを示す。半径方向寸法の変化は、先端アセンブリの遠心端の形状寸法を強調するため、近位−遠位の寸法に対して比例しないと示される。スケールバーは２００マイクロメーター（ミクロン；μｍ）である。
【図３Ｂ】流体中の組成物等の物質を細胞に導入するための先端アセンブリの内面の典型的な形状を示す、図面とグラフである。図３Ａに示される先端アセンブリの曲率を特徴付ける８次多項式関数（ｅｉｇｈｔｈ  ｄｅｇｒｅｅ  ｐｏｌｙｎｏｍｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を使用して適合される、近位の開口部から遠位の開口部までの流体径路に沿った先端の長さと、流体経路上の中心軸から先端アセンブリの内面までのラジアル距離との関係を示す曲線である。流体経路（ミクロン）上の中心軸からの先端アセンブリの内面のラジアル距離は、縦座標に示され、流体経路（ミクロン）に沿った先端の長さは横座標に示される。近位（頂部）開口チャンネル部分及び収縮部から、遠位（下部）開口部までの、先端の内面に沿った流体経路は、左から右までに示される。
【図３Ｃ】流体中の組成物等の物質を細胞に導入するための先端アセンブリの内面の典型的な形状を示す、図面とグラフである。より小さな先端直径（１７５−２００μｍ）を備えた流体中の物質を細胞に導入するための先端アセンブリの典型的な先端と、先端アセンブリの遠位開口部に近接した長さ２５０μｍの収縮部分の写真である。先端アセンブリは、０．８８ｍｍのＩＤ、１．２３ｍｍのＯＤ、及び０．１４ｍｍの壁厚がある、カスタムメイドのガラス管から作られる。
【図３Ｄ】流体中の組成物等の物質を細胞に導入するための先端アセンブリの内面の典型的な形状を示す、図面とグラフである。図３Ｃで示されるような典型的な先端の三次元表現の図面である。図面は、先端開口部が、図３Ａに示される先端の開口部よりも狭いことを示す。図面は。先端アセンブリの遠心端に近接した、２５０μｍの長さの収縮部分も示す。スケールバーは５００μｍである。
【図４Ａ】流体中の材料を細胞に導入するための先端アセンブリ及びフロースルーアセンブリの典型的な形状を示す、一連の図面とグラフである。物質、流体、及び圧力のソースに近接して位置する頂部又は近接した開口部と、物質、流体、及び圧力のソースから遠位にある下部又は遠位の開口部を備えた、典型的な先端アセンブリの内面の三次元表現の図面である。図面は、先端アセンブリに、遠位に位置した収縮部分よりも大きな内径及び断面積のチャンネル部分があることを示す。半径方向寸法の変化は、先端アセンブリの遠心端の形状寸法を強調するため、近位−遠位の寸法に対して比例しないと示される。スケールバーは、２００マイクロメーター（μｍ）である。
【図４Ｂ】流体中の材料を細胞に導入するための先端アセンブリ及びフロースルーアセンブリの典型的な形状を示す、一連の図面とグラフである。図４Ａに示される先端アセンブリの曲率を特徴付ける８次多項式関数を使用して適合される、近位開口部から遠位開口部までの流体径路に沿った先端の長さと、流体経路上の中心軸から先端アセンブリの内面までのラジアル距離との関係を示す曲線である。流体経路（μｍ）上の中心軸からの先端アセンブリの内面のラジアル距離は、縦座標に示され、流体経路（μｍ）に沿った先端の長さは横座標に示される。近位（頂部）開口チャンネル部分及び収縮部からの、遠位（下部）開口部の先端の内面に沿った流体経路は、左から右までに示される。
【図４Ｃ】流体中の材料を細胞に導入するための先端アセンブリ及びフロースルーアセンブリの典型的な形状を示す、一連の図面とグラフである。フロースルーアセンブリーシステムを示す。この実施形態において、流体は、侵入チャンネルを通って侵入し、収縮部を通り抜け、その後、システムから出る前に別のチャンネル（出口チャンネル）を通り抜ける。
【図５】近位開口部（９００）、アタッチメントショルダー（９０１）、取付け部分（９０２）、チャンネル部分（９０３）、収縮部分（９０４）、及び遠位開口部（９０５）を含む本体がある、先端アセンブリの典型的な形状を示す、三次元表現の図面である。流体経路方向は、近位開口部（９００）から遠位開口部（９０５）まで、又は代替的に遠位開口部（９０５）から近位開口部（９００）までである。チャンネル部分（９０３）は、収縮部分（９０４）より大きな内径及び断面積を有するように設計された。スケールバーは２００μｍである。
【図６Ａ】先端アセンブリが、増強された緑色の蛍光性のタンパク質（ＥＧＦＰ）及びヒト・ブタ内在性レトロウイルス受容体（ＨｕＰＡＲ２）の融合タンパク質をコードするプラスミドにより細胞をトランスフェクトするために使用されてから２４時間後の、主要なヒト臍静脈の内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を示す、一連の顕微鏡写真である。ＨｕＰＡＲ２タンパク質は、特に細胞核を囲む細胞内の膜の区画に局在化する。細胞は、ペトリ皿に取り付けるため１５分間、ガラスボトムの３５ミリメーターのペトリ皿上で播種され、３７℃で成長培地中で培養された。増強した緑色の蛍光性のタンパク質（ＥＧＦＰ）とＨｕＰＡＲ２の融合タンパク質をコードする遺伝子を運ぶベクターを備えた、先端アセンブリを使用してトランスフェクトされた、ＨＵＶＥＣ細胞を示す。左の写真は、微分干渉（ＤＩＣ）によって視覚化された細胞を示し；中央の写真は、ＥＧＦＰ蛍光の共焦点レーザー走査顕微鏡法（ＣＬＳＭ）によって視覚化された同じ細胞を示し；及び右の写真は、ＤＩＣ写真と蛍光顕微鏡写真を重ねたものを示す。データから、細胞中のＥＧＦＰ−ＨｕＰＡＲ２融合タンパク質の存在を示す核周囲の細胞内区画において観察される、強い染色（ｉｎｔｅｎｓｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）によって決定されるように、先端アセンブリが、細胞を効果的にトランスフェクトしたことが分かる。蛍光画像における光学的切片の厚みは０．７μｍである。したがって、画像は、細胞内区画内のＥＧＦＰ−ＨｕＰＡＲ２の発現を示す細胞を通る、光学断面積である。スケールバーは１０μｍである。
【図６Ｂ】先端アセンブリが、増強された緑色の蛍光性のタンパク質（ＥＧＦＰ）及びヒト・ブタ内在性レトロウイルス受容体（ＨｕＰＡＲ２）の融合タンパク質をコードするプラスミドにより細胞をトランスフェクトするために使用されてから２４時間後の、主要なヒト臍静脈の内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を示す、一連の顕微鏡写真である。ＨｕＰＡＲ２タンパク質は、特に細胞核を囲む細胞内の膜の区画に局在化する。細胞は、ペトリ皿に取り付けるため１５分間、ガラスボトムの３５ミリメーターのペトリ皿上で播種され、３７℃で成長培地中で培養された。ＥＧＦＰとＨｕＰＡＲ２の融合タンパク質をコードする遺伝子を運ぶ、ベクターを備えた先端アセンブリを使用してトランスフェクトされた、様々なＨＵＶＥＣ細胞の顕微鏡写真である。細胞は、明視野ＤＩＣとＣＬＳＭ蛍光の組み合わせによって視覚化され、ＤＩＣチャンネルと蛍光チャンネルを重ねたものが示された。顕微鏡写真は、ＨＵＶＥＣ細胞におけるＧＦＰ−ＨｕＰＡＲ２タンパク質の重要な核周囲の染色を示す。ＥＧＦＰとＨｕＰＡＲ２の融合タンパク質をコードする遺伝子によりトランスフェクトされたこれら多くのＨＵＶＥＣ細胞の画像は、１つのトランスフェクトされたＨＵＶＥＣ細胞の写真（図６Ａの左の写真）の画像にほぼ類似している。
【図７Ａ】本明細書における方法とシステム使用してプラスミドによりトランスフェクトされ、融合タンパク質ＥＧＦＰ−ＣＤＣ４２（増強した緑色の蛍光性のタンパク質−細胞分裂制御タンパク質４２）をコードする、主要なＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈の内皮細胞）の一連のＣＬＳＭ蛍光画像である。スケールバーは２０μｍである。レーザー走査型共焦点顕微鏡法を使用してトランスフェクションを行った２４時間後に観察された、ＥＧＦＰ−ＣＤＣ４２染色を示す。染色は、細胞の核内の染色がほとんどなかったもの又は全くなかったものと比較して、周辺にある細胞質中で観察されなかった。
【図７Ｂ】本明細書における方法とシステム使用してプラスミドによりトランスフェクトされ、融合タンパク質ＥＧＦＰ−ＣＤＣ４２（増強した緑色の蛍光性のタンパク質−細胞分裂制御タンパク質４２）をコードする、主要なＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈の内皮細胞）の一連のＣＬＳＭ蛍光画像である。スケールバーは２０μｍである。最近分割した１組の娘細胞のトランスフェクションの結果として、ＥＧＦＰ−ＣＤＣ４２発現を示す。発現は、娘細胞間の領域で集中されることが観察された。
【図７Ｃ】本明細書における方法とシステム使用してプラスミドによりトランスフェクトされ、融合タンパク質ＥＧＦＰ−ＣＤＣ４２（増強した緑色の蛍光性のタンパク質−細胞分裂制御タンパク質４２）をコードする、主要なＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈の内皮細胞）の一連のＣＬＳＭ蛍光画像である。スケールバーは２０μｍである。標準ＰＭＴ（光電子増倍管）感度でＥＧＦＰ−ＣＤＣ４２によりトランスフェクトされたＨＵＶＥＣ細胞の、より大きな倍率を示す。蛍光は、大きな果粒に局在化されると観察された。
【図７Ｄ】本明細書における方法とシステム使用してプラスミドによりトランスフェクトされ、融合タンパク質ＥＧＦＰ−ＣＤＣ４２（増強した緑色の蛍光性のタンパク質−細胞分裂制御タンパク質４２）をコードする、主要なＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈の内皮細胞）の一連のＣＬＳＭ蛍光画像である。スケールバーは２０μｍである。ＥＧＦＰ−ＣＤＣ４２によりトランスフェクトされたＨＵＶＥＣ細胞を示し、その画像は、標準ＰＭＴ感度より高い感度で走査される。ＥＧＦＰ−ＣＤＣ４２発現は、図７Ｃで観察され、且つ細胞周辺を含む細胞の至る所に位置する果粒よりも小さなサイズの細胞内果粒において観察された。
【図８Ａ】ＥＧＦＰ−アクチン融合タンパク質をコードする７ｋｂのプラスミドにより、本明細書における方法とデバイスを使用してトランスフェクトされた主要なＨＵＶＥＣ細胞から得たデータを示す、一連の共焦点蛍光顕微鏡画像及び棒グラフである。ＥＧＦＰ−アクチンによりトランスフェクトされた主要なＨＵＶＥＣ細胞のクラスターを示す。ＥＧＦＰのトランスフェクション及び発現は、細胞骨格のアクチンフィラメントに局在化されると観察された。
【図８Ｂ】ＥＧＦＰ−アクチン融合タンパク質をコードする７ｋｂのプラスミドにより、本明細書における方法とデバイスを使用してトランスフェクトされた主要なＨＵＶＥＣ細胞から得たデータを示す、一連の共焦点蛍光顕微鏡画像及び棒グラフである。細胞のアクチンフィラメントにおいてＥＧＦＰの発現を示す、ＥＧＦＰ−アクチンによりトランスフェクトされた主要なＨＵＶＥＣ細胞の画像である。
【図８Ｃ】ＥＧＦＰ−アクチン融合タンパク質をコードする７ｋｂのプラスミドにより、本明細書における方法とデバイスを使用してトランスフェクトされた主要なＨＵＶＥＣ細胞から得たデータを示す、一連の共焦点蛍光顕微鏡画像及び棒グラフである。本明細書における方法とデバイスにより、又はＡＭＡＸＡ  Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ（商標）（Ｌｏｎｚａ  Ｃｏｌｏｇｎｅ  ＧｍｂＨ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のエレクトロポレーション装置によりトランスフェクトされた、ＨＵＶＥＣ細胞におけるＥＧＦＰアクチンｍＲＮＡのコピー数を示す棒グラフである。ＴＣは、本明細書に記載される方法を使用したプラスミドによるトランスフェクションを示し、ＣＴは、ＥＧＦＰアクチンプラスミドが無い制御手順を示す。ＡＭＡＸＡは、データがＡＭＡＸＡ  Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ（商標）のエレクトロポレーション装置により得られることを示す。本明細書に記載の方法によるトランスフェクションは、市販のＡＭＡＸＡトランスフェクションデバイスによるものよりも、かなり多くの１つの細胞当たりのｍＲＮＡのコピー数をもたらした。
【図９】ＥＧＦＰをコードするプラスミドの量（５０μｌの液量につき、２μｇ、５μｇ、又は１０μｇ）でトランスフェクトされたジャーカット細胞のＥＧＦＰ蛍光のフローサイトメトリー定量化を示す、線グラフである。５．０μｇのプラスミドにより処置された細胞は、制御細胞の中で観察された背景蛍光より大きなＥＧＦＰ蛍光を示した。
【図１０Ａ】ＥＧＦＰプラスミド又はＣｙ３により標識化したｍｉＲＮＡにより、本明細書における方法とデバイスを使用してトランスフェクトした、培養された主要なマウス脳の星状細胞の一連の共焦点顕微鏡蛍光画像である。スケールバーは１０μｍである。ＥＧＦＰプラスミドによりトランスフェクトされた、少数の主要なマウス脳の星状細胞の共焦点蛍光顕微鏡画像である。円形の細胞には、背景レベルに近い蛍光強度がある。
【図１０Ｂ】ＥＧＦＰプラスミド又はＣｙ３により標識化したｍｉＲＮＡにより、本明細書における方法とデバイスを使用してトランスフェクトした、培養された主要なマウス脳の星状細胞の一連の共焦点顕微鏡蛍光画像である。スケールバーは１０μｍである。様々なレベルの蛍光強度を備えた細胞を示す、ＥＧＦＰプラスミドによりトランスフェクトされた主要なマウス脳の星状細胞のクラスターの共焦点蛍光顕微鏡画像である。
【図１０Ｃ】ＥＧＦＰプラスミド又はＣｙ３により標識化したｍｉＲＮＡにより、本明細書における方法とデバイスを使用してトランスフェクトした、培養された主要なマウス脳の星状細胞の一連の共焦点顕微鏡蛍光画像である。スケールバーは１０μｍである。蛍光強度の下位レベルを備えた細胞に囲まれた、高い蛍光強度を備えた細胞を示す、ＥＧＦＰプラスミドによりトランスフェクトされた主要なマウス脳の星状細胞のグループの共焦点蛍光顕微鏡画像である。
【図１０Ｄ】形態学的特徴を示す、同じ細胞の明視野画像上のＥＧＦＰプラスミドによりトランスフェクトされた主要なマウス脳の星状細胞の共焦点蛍光顕微鏡画像と、培養細胞の形状の明白な輪郭を重ねたものである。
【図１０Ｅ】ＥＧＦＰプラスミド又はＣｙ３により標識化したｍｉＲＮＡにより、本明細書における方法とデバイスを使用してトランスフェクトした、培養された主要なマウス脳の星状細胞の一連の共焦点顕微鏡蛍光画像である。スケールバーは１０μｍである。内面化されたｍｉＲＮＡを示す、Ｃｙ３により標識化したｍｉＲＮＡによりトランスフェクトされた２つの主要なマウス脳の星状細胞の共焦点蛍光顕微鏡画像であり、それは、小さなラウンドスポット（ｒｏｕｎｄ  ｓｐｏｔ）として細胞質中で大半が局在化される。核を通る共焦点形のセクション内の２つのＣｙ３により標識化した点又は斑点に見られるように、左下にある細胞はまた、核へのｍｉＲＮＡの別個の内面化を示し、トランスフェクションによって細胞の核にｍｉＲＮＡが侵入したことを実証する。
【図１０Ｆ】ＥＧＦＰプラスミド又はＣｙ３により標識化したｍｉＲＮＡにより、本明細書における方法とデバイスを使用してトランスフェクトした、培養された主要なマウス脳の星状細胞の一連の共焦点顕微鏡蛍光画像である。スケールバーは１０μｍである。異なる細胞の中でｍｉＲＮＡの内面化のレベルを変更することを示す、Ｃｙ３により標識化したｍｉＲＮＡによりトランスフェクトされたマウス脳の星状細胞のグループの共焦点蛍光顕微鏡画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
細胞は、脂質及び脂肪分子の二重層を含む原形質膜に囲まれる。原形質膜の保全性は、個々の脂質分子中の静電力によって、及び膜と基礎的な細胞骨格の間の相互作用によって影響される。個々の脂質分子は、二重層の内側の小葉及び外側の小葉の平面を通って拡散する。二重層内のこれら脂質分子の活動は、脂質二重層が負荷され水を忌避し（ｐｏｌａｒ）、且つ細胞への及び細胞からの水の通過を妨げると明示する、原形質膜の流動モザイクモデルを使用して記載される。二重層は、核酸、タンパク質、及び脂肪を含む生体分子のための障壁としても役立つ。
【００３０】
細胞のトランスフェクションのための加圧された流量装置及び方法は、２０１０年３月１２日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２７１０４０（ＷＯ２０１０／１０５１３５  Ａ１）において、Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈ  Ｔ．によって記載される。Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈの方法を使用する細胞のトランスフェクションは、受容細胞において組み換え型タンパク質の発現をもたらす。装置には、パイプ部分及び隣接する先端部分があり、装置は、パイプ部分の近位端部で吸引デバイスに接続される。
【００３１】
本明細書における発明は、物質を細胞に導入するため、例えば、遺伝物質等の組成物を生細胞又は生育不能な細胞に導入するための、システム、先端アセンブリ、方法、及びキットを提供する。本明細書における発明はまた、流体が１つのチャンネルを通って収縮部に侵入し、システムから出る前に別のチャンネルを通って流れる、フロースルーアセンブリを提供する。本明細書における発明によって提供されるシステムにおいて、フローデバイスに接続する先端アセンブリは、再使用可能な先端アセンブリであり、その結果、同じ先端が複数のトランスフェクションに使用される。随意に、使い捨ての先端アセンブリは、以前に未使用の先端アセンブリを各トランスフェクションに使用することを可能にする、フローデバイスに接続する。
【００３２】
任意の特定の理論又は作用の機構によって制限されることなく、本明細書における方法は、流体力学技術（ｆｌｕｉｄ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用し、低いＣａ＋２の条件と組み合わせ、血漿と恐らくは核膜が瞬間的に伸ばされるほど早い速度で細胞を通過させ、それにより、長くて比較的薄い分子形状におけるプラスミド又は線形のＤＮＡの侵入を可能にする膜に、一時的な穴を生成する。細胞の細胞質への物質の侵入は、細胞骨格に沿った輸送と、及び核輸送体の助けにより角膜を通って核に侵入することにより、細胞における目標（例えば、核）に物質を運ぶ、細胞輸送機構によって行われる。単一のＤＮＡらせんの直径は２ナノメーター（ｎｍ）である。しかしながら、環状ＤＮＡプラスミドは、コイル化とスーパーコイル化に晒される。本明細書に記載される方法によって生成された細胞膜の開口部は、細胞へのプラスミドの侵入を可能にすることができる構成を得る。エレクトロポレーションは、直径１２０ｎｍほどの大きな開口部をもたらす。本明細書における実施例は、本明細書における方法が、このサイズ、例えば、少なくとも約１ｎｍ乃至約１０ｎｍ、約１０ｎｍ乃至約６０ｎｍ、約６０ｎｍ乃至約１００ｎｍ、約１００ｎｍ乃至約１２０ｎｍ、又は少なくとも約１２０ｎｍ乃至約１４０ｎｍに類似する膜の開口部をもたらすことを示す。
【００３３】
本明細書で使用されるように、用語「導入する」は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）又はインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の何れかにおいて、巨大分子又は低分子量の分子などの組成物を細胞に送達するための様々な方法の何れかを指し、前記方法は、変形、形質導入、トランスフェクション、及び感染を含む。ベクターには、プラスミドベクターとウイルスベクターが含まれる。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、或いは、アデノウイルスベクター又はアデノ関連のベクターなどの他のベクターを含む。ベクターを構築する方法は、例えば「Ｅｒｉｃｓｓｏｎ，  Ｔ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  ２００３  ＰＮＡＳ  ｖｏｌ．  １００  （１０）：  ６７５９−６７６４」に示される。
【００３４】
用語「細胞」は、生細胞、新陳代謝しない細胞、休止細胞又は阻害細胞、及び再生しない細胞を含む。本明細書における方法のため、細胞は、容器中の流体又は培地において懸濁され、圧力差は原形質膜にわたって適用される。圧力差は、とりわけ、培地、細胞質のイオンの成分によってかけられた異なる圧力、及び培地にかかる圧力によって引き起こされる。培地の圧縮性は、圧力差に影響する因子である。細胞は、様々なタイプの溶媒に、一般的には血液又は組織などの、生物学的に及び自然発生する流体を含む水性溶媒に、都合良く入れられる。水は比較的圧縮不可能であり、圧縮性は、水性溶媒中の細胞に課された、観察された圧力差と関係がない。定常性の場合の水温は、定常性のまま残る流体密度に影響しない。非圧縮性流体のこの圧力は、静圧と称される。
【００３５】
本明細書で使用されるように、用語「通過（ｐａｓｓａｇｅ）」は、先端アセンブリの一部又は長さの少なくとも１つを通る流体と細胞の通過（ｔｒａｎｓｉｔ）、或いは、貯蔵槽から先端アセンブリを通る容器までの細胞の輸送を指す。一つの通過は、先端アセンブリを通って細胞を備えた流体を少なくとも促進又は運ぶことを含む。複数の通過の反復は、流体が容器に集められ、先端アセンブリを通って吸引によって後ろに運ばれる通過サイクルを含み得る。関連する実施形態において、通過は、全体的に先端アセンブリを通って流体を推進させることを意味し、容器から細胞の懸濁液を除去してチャンネル部分へ移すこと、及び細胞を同じ容器に戻すこと、又は先端アセンブリ部分を通って細胞を複数の容器に、或いは複数の容器の少なくとも１つに分配することを含む。
【００３６】
一般に、通過中に圧力下で混合物を排出することは、特定の周波数を有する圧力波を生成することを含む。句「力学的な波」は、物質媒体の弾性及び慣性の特性に依存する波の速さで、物質媒体（固体、液体、又は気体）を通って伝わる波を指す。力学的な波の波動には、縦波と横波が含まれる。一般に、本明細書における方法において、圧力波は縦波であり、粒子変位は波が伝わる方向と平行である。
【００３７】
流体中の分子は、常に移動している状態であり、全圧と称される圧力を、容器の壁にかける。方向付けられた移動又は順序づけられた移動に設定されると、分子を移動させる運動量に関連した圧力の更なるタイプである動圧が、生成される。したがって、分子の移動は、静圧（すなわち動圧）に寄与する。動圧を静圧に加えることで、フローイングシステム（ｆｌｏｗｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）に全圧が生じる。故に、流体中の細胞は、多くの原動力及び動圧にさらされる。
【００３８】
追加の流体の動的因子は、コンジット又はチューブを通って、狭窄した又は収縮した部分に向かう流体の条件下で考慮される。変化する断面積を備えたチューブを通る、流体速度の変化に付随する圧力の変化は、流体がチューブの断面積の減少によって流れた場合に、付随する圧力の減少及び流体速度の増加が観察されるであろうと提示する、ベルヌーイ方程式によって記載される。ベルヌーイ方程式は、以下の式を提示する：
ｖ２／２＋ｇｚ＋ｐ／ｒ＝定常
ここで、ｖは、流線形（ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ）における点での流体の流速であり、ｇは重力による加速度であり、ｚは、重力の加速度の方向に対向するｚ方向による基準面上の点までの上昇であり、ｐは圧力であり、ｒは流体密度である。ベルヌーイの原理は、流体圧力の減少をもたらすチューブ直径の減少、即ち、ヴェンチュリ効果として知られているプロセスを解明する。
【００３９】
ヴェンチュリ効果は、質量を保存するため、収縮部における流体速度を増加させる収縮部を通過する流体から、エネルギー保存の法則の達成の結果として生じる。流体の速度が増加するにつれ、運動エネルギーが増加する。したがって、流体圧力の減少は、運動エネルギーの増加に反作用するように生じる。
【００４０】
流体で満たされたチャンネル又は通路を移動する細胞は、より狭い直径の出射口を通る際に、チャンネルの収縮部において速度の増加を受ける。懸濁液中のこれら細胞は、高圧力又はそれより高い圧力から、低圧力又はそれより低い圧力までの突然の変化を経験する。低圧力は、細胞の一時的な伸縮、又は原形質膜の流動性の一時的な変化をもたらし、それにより、細胞膜に一時的な穴、孔、又は小さな裂け目を作り、限定されないが、遺伝物質、ｃＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡを含む。流体又は溶液中の低いＣａ＋２濃度は、細胞膜の密閉に要求される時間の延長を促進し、更に、濃度勾配を下げる物質が、膜の穴を通って細胞内部に侵入することを促進する。ベルヌーイの原理は、流体圧力が、ＤＮＡなどの大きな分子、又は薬物を含む小さな分子などの流体中の他の分子の、細胞への侵入を促進する構造である。
【００４１】
本明細書における実施例は、細胞膜に孔又は穴を作るため、チャンネル部分と収縮部が含まれる先端アセンブリを利用する。先端アセンブリの形状の典型的な三次元表現の図面は、図３Ａで示される。任意の特定の理論又は作用の機構に制限されることなく、細胞が例えば図３に示されるような狭窄部又は収縮部を通った後、２方向の通過のための曲線状の縁部を備えた遠位開口部、１つの実施形態において、同じ、大きな又は小さな直径を有するセクションへの、チャンネルの更に遠位の収縮部の拡大があることを想定する。図３Ａに示される形状の内曲率は、断面として二次元で表わされる（図３Ｂ）。先端アセンブリの断面は、流量と平行である。１つの実施形態において、流量の典型的な曲率と先端アセンブリの形状は、以下の方程式によって二次元で特徴化され：
ｆ（ｘ）＝ｐ１ｘ８＋ｐ２ｘ７＋ｐ３ｘ６＋ｐ４ｘ５＋ｐ５ｘ４＋ｐ６ｘ３＋ｐ７ｘ２＋ｐ８ｘ＋ｐ９
ここで、ｘは、流体経路上の中心軸から先端の内面までのラジアル距離であり、係数（括弧内に９５％の信頼限界を備えた）は以下のものである：ｐ１は２．２８５（１．３８８、３．１８２）であり；ｐ２は３．４６５（１．７８２、５．１４９）であり；ｐ３は−１５．６８（−２０．０４、−１１．３２）であり；ｐ４は−２０．３８（−２７．２４、−１３．５２）であり；ｐ５は４４．２７（３６．５、５２．０４）であり；ｐ６は５３．９６（４５．６９、６２．２３）であり；ｐ７は−５８．７２（−６４．０２、−５３．４２）であり、ｐ８は−１２３．５（−１２６．４、−１２０．６）であり；及びｐ９は１８６．５（１８５．６、１８７．４）である。適合度を得るため適用されるパラメーターは、次の通りであった：エラー（ＳＳＥ）による平方和は６６．５であり、ｒ−正方形（Ｒ２）は０．９９９７であり、調節されたＲ２は０．９９９７であり、及び二乗平均平方根のエラー（ＲＭＳＥ）は１．３４１である。
【００４２】
当業者は、圧力が流量中に変化する速度を変化させるため、先端アセンブリの曲率の変化の程度を変える。例えば、様々なチャンネル部分は、物質を細胞に導入するのに必要な流体の容積、流体圧力、又は流体速度に依存する、様々な長さを有するように構築される。例えば、近接端部で１ミリメーター（ｍｍ）の内径を有する２センチメーター（ｃｍ）のチャンネル部分は、先端アセンブリを通る５０μｌの流体を十分に加速するために構築される。故に、曲率は、図３Ａ及びＢに示される曲率の実施形態よりも急勾配で、又は、浅くされる。より浅い曲率が、図４Ａに三次元で示される。二次元での流体経路の内曲率の断面形状は、図４Ｂに示される。この２次元曲線は、以下に示される８次多項式を使用して適合される：
ｆ（ｘ）＝ｐ１ｘ７＋ｐ２ｘ６＋ｐ３ｘ５＋ｐ４ｘ４＋ｐ５ｘ３＋ｐ６ｘ２＋ｐ７ｘ＋ｐ８
ここで、ｘは、流体経路上の中心軸から先端の内面までのラジアル距離であり、係数（括弧内に９５％の信頼限界を備えた）は、以下の通りである：ｐ１は−２．６１１ｅ−１６（６．０４３ｅ−１６、８．２０６ｅ−１７）であり；ｐ２は３．９５４ｅ−１３（−３．１９５ｅ−１３、１．１１ｅ−１２）であり；ｐ３は−１．８４５ｅ−１０（−７．８２１ｅ−１０、４．１３１ｅ−１０）であり；ｐ４は１．６６２ｅ−０８（−２．３９４ｅ−０７、２．７２６ｅ−０７）であり；ｐ５は７．５３７ｅ−０６（−５．１８６ｅ−０５、６．６９４ｅ−０５）であり；ｐ６は−０．００２１３７（−０．００９３７５、０．００５１０１）であり；ｐ７は−０．００３１８５（−０．４１１４、０．４０５１）であり；及びｐ８＝２６８．６（２６１、２７６．３）である。適合度を得るために使用されるパラメーターは、次の通りであった：ＳＳＥは３１．０９であり、Ｒ２は０．９９９８であり、調整されたＲ２は０．９９９７であり、ＲＭＳＥは１．１８９である。
【００４３】
任意の特定の理論又は作用の機構に制限されることなく、先端アセンブリの曲率の変化は、使用される流体の特徴（例えば粘性、温度、及び分子の成分）のため、及びまた、より大きな細胞がより大きな収縮部のサイズを必要とし得るために利用される細胞のタイプ上でカスタマイズされる。血液細胞は例えば、直径約５μｍ乃至約１０μｍしかない。対照的に、アフリカツメガエルの卵母細胞は、直径１０００μｍ又は１ｍｍである。体積比率に対してより大きな表面積を有する細胞（すなわちより小さな細胞）は一般に、より小さな直径の収縮部とより大きな減圧による、本明細書における方法において使用される。例えば、本明細書における先端アセンブリの適切な減圧は、少なくとも約０．１％、約０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は約９５％を含む。遠位開口部に通じる経路の直径の減少から結果として生じる圧力降下は、容積の流量及び直径の変化に依存する。例えば、１ｍｍから０．２５ｍｍまでの直径の段階的な減少が行われると、水の５ｍｌ／ｍｉｎの流量により、圧力降下は０．２８ミリバール（ｍｂａｒ）になり；１０ｍｌ／ｍｉｎの流量により、圧力降下は５．５５ｍｂａｒになり；１０ｍｌ／ｍｉｎの流量により、圧力降下は５．５５ｍｂａｒになり；５０ｍｌ／ｍｉｎの流量により、圧力降下は２７．９ｍｂａｒになり；１００ｍｌ／ｍｉｎの流量により、圧力降下は５５．６ｍｂａｒになり；及び１５０ｍｌ／ｍｉｎの流量により、圧力降下は２６４３．４ｍｂａｒになる。本明細書における先端アセンブリは、動物細胞、植物細胞、及び原核細胞を含む、より小さな又はより大きな細胞を含む任意の細胞型に使用される。
【００４４】
流体経路の直径の減少の範囲は、流体圧力の減少を決定する。流体圧力が減少する方法及び程度は、流体経路を移動する細胞の細胞膜における孔形成の速度及び量に影響する。図３Ａ及び図４Ａは、狭くなり、従って流体圧力を減少させ、並びに流体経路中の細胞の孔形成を促進する、典型的な流体経路とチャンネル形状を示す。収縮部の近くに位置するチャンネルは、遠位の狭窄部又は収縮部に通じる、均一な不変の形状を有する。本明細書において想定される先端アセンブリには、上記の式によって例証される流体経路又は曲率がある。
【００４５】
先端アセンブリは、様々な適切な材料及び適切な開口サイズの何れかの様々な実施形態において製造される。関連する実施形態における先端は撥水剤などのポリマーから製造され、又は流体の正確な分配を防ぐ細胞の先端アセンブリへの接着又は液滴形成を妨げるための薬剤でコーティングされる。
【００４６】
先端を構築する方法には、吹込成形、真空成形、及び熱成形が含まれ、それらは、２００８年１月１５日、２００２年１１月１９日、及び２０００年９月１２日に発行された、Ｓｍｉｔｈの米国特許第７，３１８，９１１号、第６，４８２，３６２号、及び第６，１１７，３９４号；２０１０年９月１４日に発行された、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒらの米国特許第７，７９４，６６４号；２００３年７月２２日に発行された、Ｔａｇｇａｒｔらの米国特許第６，５９６，２４０号；及び１９９４年８月９日に発行された、Ｔｅｚｕｋａらの米国特許第５，３３６，４６８号に記載される。ホウケイ酸ガラス材料及び方法は、例えば、２００８年３月１１日に発行された、Ｍａｒｑｕｅｓの米国特許第７，３４１，９６６号、及び１９９８年４月７日に発行された、Ｗａｔｚｋｅらの米国特許第５，７３６，４７６号に示される。
【００４７】
方法と先端アセンブリは、迅速な高スループット方法においてＤＮＡを細胞に確実に導入するため、自動ロボットシステムへの組み込みに適している。例えば、本明細書における先端アセンブリは、細胞の汚染を少なくする自動の方法において、細胞をトランスフェクトして形質導入するために使用される。本明細書における先端アセンブリは、様々な実施形態において、手動ピペット及び自動ピペットに付着するように、並びに単一の先端ピペットシステム及び複数先端ピペットシステム等のシステムをそれぞれ分配するように想定される。
【００４８】
本発明を更に制限することなく、１以上の代替の機構が、観察されたトランスフェクション効果を生み出すように操作され得ることが、本明細書で想定される。孔を通る輸送（ｐｏｒｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）のエネルギー学に影響を及ぼす衝撃、ｐＨ、高エネルギー、又は超音波に依存する、大半の既存の方法とは異なり、これらの他の仮定された機構は、狭窄チャンネルを流れる細胞から生じる変形ではなく、それ自体での細胞変形に依存する。
【００４９】
細胞の形状が球状と偏球の間で変わる方法で、流体懸濁液中の細胞を、歪曲に繰り返し曝すことにより、原形質膜の基礎にある皮質の細胞骨格の転位が引き起こされ得、脂質又は脂質ラフトの可動性に影響し、或いは、膜の代謝回転に影響し、それは、膜の孔の形成に影響を及ぼし得る。細胞膜の流動性は、（「Ｓｖｅｎｔｉｎａ  ｅｔ．  ａｌ．，  ２００４，  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ６２：  １０７−１１３」による、赤血球において明示された方法に類似した方法で）根本的な細胞骨格の変化によって影響を受けることがあり；及び、（細胞の平滑化等の）全体の細胞の変形は、流動性の変化に寄与し得る。流量と無関係である繰り返しの圧縮／拡張に細胞を暴露し得る圧力変化（即ち、静的な停止（ｓｔａｔｉｃ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ））はまた、孔形成自体が膜の流動性に依存するため、潜在的に孔形成を引き起こし得る。既存の音波周波数又は超音波周波数よりも略低い速度でのこのような反復はまた、静的な細胞状態下にある孔に広がる障壁エネルギーに影響を及ぼし得る、細胞の蠕動又は低周波パルスをもたらすように、視覚化され得る。特定の細胞及びトランスフェクション薬剤に対するこの効果を最適化するために、このような効果の範囲が、静止流体柱内に突然の圧力変化又は配列の変化を導入するため、異なる試験計器を使用して、試験され、定量化され、又は他に立証され得る。このフローフリー機構は、先行技術のトランスフェクションプロトコルにおいて細胞を傷つけると知られている、潜在的に破壊的なせん断条件が比較的無い。
【００５０】
遺伝子物質等の組成物を細胞に導入するための、本明細書における方法は、該方法が急速で、信頼でき、（高価な試薬を必要とすること無く）経済的であるため、先行技術にわたって著しい改善を提供し；受容細胞は、非常に高い生存度及び発現効率を特徴とする。本明細書における方法は有利に、潜在的な伝染性により生物学的安全性のレベル２を必要とするウイルス（例えば、組み換え型のアデノウイルス）を必要としない。
【００５１】
本明細書における方法は、有毒化学物質、複雑な手順、又はウイルスを使用することなく実行される。組織から又は培養皿の表面から分離される細胞は、本明細書における方法で使用するのに適切な物質である。したがって、本明細書における方法は、分離によって得られた組織の細胞に、及び細胞懸濁液（例えば、一次細胞、細胞株の培養細胞）に適用可能である。
【００５２】
エレクトロポレーションの先行技術の方法を使用して、得られた最も高い効率は、核酸を発現する受容細胞のわずか約４０％である。アデノウイルス感染症の発現に関して、得られた最も高い効率は約３０％乃至８５％であり、一般に低い。遺伝子銃は、１％と５％の効率の間で典型的に達成する。対照的に、本明細書における方法は、約８５％乃至９０％のトランスフェクション効率で、一次細胞のＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈内皮細胞）における可視のタンパク質発現をもたらした。
【００５３】
本明細書における方法は、インサイツ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）における組織、及び培養液中の細胞の単層にも適用可能である。本明細書における方法は、機能分析のため遺伝子を発現させるために、化学的又はウイルスのベクターを必要とする比較的長い時間（数時間又は数日）を回避する（ｂｙｐａｓｓ）。カチオン試薬、遺伝子銃、及びエレクトロポレーション等の方法は、使用され得るｃＤＮＡのサイズ又は長さによって制限され、それにより、実験又はスクリーンにおいて取り組まれ得るタンパク質のタイプを制限する。
【００５４】
本明細書における実施例は、大きなプラスミド、増強した緑色の蛍光性のタンパク質（ＥＧＦＰ）−アクチン（７ｋｂ）の使用を示す。実施例７におけるデータは、プラスミドが、ＡＭＡＸＡ  Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ（商標）の装置（Ｌｏｎｚａ，  Ｃｏｌｏｇｎｅ  ＧｍｂＨ，  Ｃｏｌｏｇｎｅ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）などのエレクトロポレーションを使用する従来の方法を使用するよりも、本明細書におけるシステム、先端アセンブリ、及び方法を使用する方がより効果的及び効率的に細胞に導入されたことを示す。本明細書の実施例における方法には、１つのトランスフェクション薬剤又は複数のトランスフェクション薬剤を使用する工程が含まれる。例えば、トランスフェクション薬剤は、ナノ粒子、リポソーム、ウイルスベクター、バクテリオファージ、及び洗浄剤である。例えば、トランスフェクション薬剤はリポフェクタミンである。
【００５５】
典型的な方法は、少なくとも１つの通過、又は複数の通過を含み、例えば、通過の約５乃至１０の反復は、１分以内に行われる。例えば、１回の通過又は通過の複数の反復、１回以上行われる繰り返しの通過は、急速に行なわれる。細胞型に依存して、方法には、特定の時間内（例えば、約１時間、約２時間、又は約５時間の間）に、１０分ごとに通過を５回繰り返す工程が含まれる。例えば、複数の通過は、短期間で急速に行われ、例えば、１分で１０乃至５０、又は５０乃至１００が流れる。
【００５６】
一般に、複数の通過が、物質（例えば、遺伝物質及び薬物）を複数の細胞に導入するのに十分であったことが観察された。細胞は、１回の処置後、又は処置の間に、適切な温度（例えば３７℃）で細胞培地中に維持された。
【００５７】
本明細書における方法は、異なる細胞型上で実行され、異なる細胞型の幾つかは、遺伝子操作に抵抗性があるものとして以前は分類されていた。細胞型には、例えば、不死化細胞、活発に増殖する細胞（例えば、培養液中の細胞）、一次細胞、及び本明細書において同定して実証された細胞株が含まれる。本明細書における実施例は、過去に都合良く、トランスフェクション試薬、又はエレクトロポレーションに順調に応答せず、低い生存度、又はトランスフェクション効果における細胞型の特異的差異をもたらした細胞を用いる方法の成功的な使用を実証する。
【００５８】
一般に、システムから細胞を排出する工程は、細胞の核への物質（例えば遺伝物質）の局在化をもたらす。代替的に、排出は、細胞（例えば、小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア、及びリソソーム）の細胞質の部分への物質の局在化をもたらす。
【００５９】
一般に、細胞は複数の細胞である。方法の実施形態において、細胞は、生細胞の母集団内の生細胞であり、細胞の生存度は実質的に減少されない。
【００６０】
一般に、遺伝物質はＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ＤＮＡはｃＤＮＡである。例えば、ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、及びｄｓＲＮＡから成るグループから選択された、ＲＮＡの少なくとも１つの分類である。他の実施形態における物質は、インスリン、ＥＧＦ、ＥＰＯ、又はＩＧＦ  ＩＩなどの、タンパク質又はポリペプチドである。また他の実施形態における物質は、デキストラン又はアミロース等の多糖類である。
【００６１】
一般に、細胞は、以下のものから成るグループから選択された細胞型を含む：上皮細胞、造血性細胞、幹細胞、脾臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、肝細胞、神経細胞、膠細胞、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、平滑筋細胞又は横紋筋細胞、精細胞、心臓細胞、肺細胞、視細胞、骨髄細胞、胎児の臍帯血細胞、始原細胞、末梢血単核細胞、白血球細胞、リンパ球、生きた分裂終了細胞、生理的に不活性な細胞、阻害された細胞、ＵＶにより不活性化された細胞、除核細胞、無核細胞、熱により死滅させられた細胞、再生しない細胞、及び人工膜を有する合成細胞など。
【００６２】
一般に、組織は哺乳動物の組織である。例えば、哺乳動物の組織は、ヒト組織（例えば、皮膚、腎臓、膵臓、肝臓、肺、心臓、脳、脊髄、骨髄、及び目）である。単層の実施形態は、幹細胞（例えば、造血細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ）、血管芽細胞、間充織、肝細胞、膵臓、肺、神経、胎児、及び胚から選択された、少なくとも１つの幹細胞）を含む。組織はまた、マウス、ラット、ブタ、ヤギ、ウマ、サル、魚類、及び鳥類を含む他の脊椎動物種から由来し得る。代替的に、方法はまた、線虫、扁形動物、軟体動物、昆虫、棘皮動物などを含む無脊椎動物種由来の生細胞、又は、植物細胞或いは酵母菌由来の生細胞と共に使用され得る。
【００６３】
本発明が現在十分に記載され、説明的であって更なる制限を意図しない以下の実施例及び請求項によって、更に示される。当業者は、所定の実験だけを、本明細書に記載される具体的な手順に対する多くの同等物を使用して、認識するか又は確認することができる。このような同等物は、本発明及び請求項の範囲内にある。本出願の全体にわたって引用される、発行された特許及び公開された特許出願を含む、すべての引用文の内容は、その全体を引用により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００６４】
〈実施例１：トランスフェクションデバイスの実施形態の設計〉
本明細書に記載されているトランスフェクションデバイスの実施形態は、図１のパネルＡからＤに示される。デバイスの主要構成要素は、先端アセンブリ、ＵＳＢコンバーター（１０３）とＲＳ２３２インターフェース（１０４）によって先端アセンブリへ接続されたコンピュータープログラム可能なシリンジポンプ（１０１）、（１０２）、そして電力供給装置（１１０）である。図１のパネルＡに示されるように、シリンジポンプ（１０１）、（１０２）は、ジャンプボックス（１０６）の金属蓋（１０５）の内部側面へ付けられている。ＵＳＢコンバーター（１０３）及び、前記シリンジポンプを外部コンピュータへ接続するＲＳ２３２インターフェース（１０４）も、ジャンプボックス（１０６）の金属蓋（１０５）の内部側面に付けられている。ハードウェアは、実験室における前記デバイスの使用中は見えない。ＲＳ２３２インターフェース（１０４）及びＵＳＢコンバーター（１０３）を介して通信する外部コンピュータは、データ解析ソフトウェアＭＡＴＬＡＢ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）を用いて、シリンジポンプ（１０１）、（１０２）を制御するために使用される。代替的に、トランスフェクションデバイスは、単純なグラフィカルユーザーインターフェース・ソフトウェア（ＬａｂＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）／ＣＶＩ  Ｒｕｎ−Ｔｉｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅ  ８．５．１（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）を使用する。
【００６５】
ジャンプボックス（１０６）の右側にあるプログラム可能なシリンジ及びポンプ機構（１０１），（１０２）の位置は、図１Ｂに示される。ホウケイ酸ガラスシリンジ（１０１）は、潤滑及び耐溶剤性のためのＵＨＭＷＰＥ（超高分子量ポリエチレン）シール（１０７）を有する。タイゴン（登録商標）チューブ（１０９）は、ジャンプボックス（１０６）の金属蓋（１０５）を通じて、追加のチューブによってソーダ石灰ガラスキャピラリーチューブ（先端）の近接端部に接続する。前記キャピラリーチューブは、寸法：内径１．１−１．２ｍｍ、壁厚０．２ｍｍ、長さ７５ｍｍである典型的な先端（図３パネルＡ）である。
【００６６】
電力供給装置（１１０）は、ジャンプボックス（１０６）内部の左下に位置する（図１パネルＣ）。電力供給装置（１１０）は、ディストリビュータ・ボード及び平らなコントロールパネルの基準である、単相２４Ｖ、２．５Ａ電力供給装置（ＰＨＯＥＮＩＸ  ＣＯＮＴＡＣＴ  ＧｍｂＨ  Ｃｏ．  ＫＧ，  Ｓｔｅｐ  Ｐｏｗｅｒ，  Ｂｌｏｍｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）である。電力供給装置（１１０）は待機損失が少なく、高効率である。代替的に、電力アダプターは２４Ｖ、２．５Ａの出力をもつＦＳＰ６０−１１（ＦＳＰ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ）である。電源は、１００−２４０Ｖ、２．０Ａ、５０−６０Ｈｚの入力を要する。
【００６７】
図１パネルＤ内に示されるように、ジャンプボックス（１０６）は、滅菌状態にある組織培養フローフード内に位置する。使用中、金属蓋（１０５）は閉位置に、外蓋は開位置（１１１）にとどまる。
【００６８】
〈実施例２：トランスフェクション中の流体サイクルパラメーター〉
本実施例は、本明細書中に記載されている方法及びシステム、又はデバイスで用いられる先端アセンブリの先端を通じた流体サイクル中の一般的な流体パラメーターを示す。
【００６９】
流体中の細胞へ導入されるべき細胞及び組成物を含有する混合物は、本明細書に記載されているトランスフェクションデバイスの先端へ反復的に引き込まれ、なおかつ前記先端から押し出されることで、結果的に流入と流出のサイクルを生じる。戻り行程が後続する実行行程はサイクルを構成する。戻り行程及び実行行程は同じパラメーターに従って作動する。実施例１に記載されているプログラム可能なシリンジ（１０１）、（１０２）は、フローサイクルを生む。図２において、流体サイクルの実施形態におけるシリンジプランジャー（１００８）の動きを示した略図が示され、横軸には時間、縦軸には表示されているサイクル間に、その時間でプランジャーが位置するシリンジの長さに沿った位置が示されている。
【００７０】
この実施形態において、以下のコマンドシーケンスが使用された：
／１Ｌ１４ｖ４００Ｖ９００ｃ２００Ａ５００Ｍ２００ｇＬ２０ｖ１００ｖ１０００ｃ１０００Ａ４００Ｍ１００Ａ０Ｇ８Ｌ１４ｖ４００Ｖ９００ｃ２００Ａ０Ｒ
【００７１】
左から右へ進むこのコマンドシーケンスにおけるプランジャー運動及び関連するパラメーターが本明細書に記載される。前記コマンドシーケンスでのプランジャー位置は、接頭辞としてとして加えられた文字Ａで、図２内の縦座標上に示されたプランジャー位置と対応する。例えば、図２内でのプランジャー位置（５００）は、コマンドシーケンスにおける位置Ａ（５００）である。図２は、以下のように実行された８つのサイクルを示す：
【００７２】
Ｌ１４は初速ランプ（加速）であり、ｖ４００は始動速度であり、Ｖ９００はこのランプ間での最大速度である。Ａ５００は、シリンジプランジャー（１０８）が先端を充填し（ｌｏａｄｉｎｇ）、最初に移動する位置である。Ａ５００は充填位置と呼ばれる。プランジャーがＡ５００に達する場合、ｃ２００は遮断速度である。Ｍ２００は充填位置での２００ミリ秒（ｍｓ）の一次停止である。サイクルは２００ｍｓの一時停止の後に始まり、コマンドシーケンスでのｇで示される。サイクルのランプには、加速Ｌ１４がある初速ランプを除いて、最大加速Ｌ２０、始動速度１００（ｖ１００）、最大速度１０００（ｖ１０００）及び終速又は終了速度１０００（ｃ１０００）がある。位置Ａ４００への下降運動は、流量を最初の充填容量未満までに減らし、循環容量を先端に残す。Ｍ１００は、ランプ位置がＡ４００からＡ０まであった後の、１００ミリ秒の一次停止を示す。これは、最初のサイクルの終了を表わし、コマンドシーケンスでのＧで示される。数字８は、このコマンドシーケンスが８つのサイクルを有していることを示す。最初のサイクルは、充填工程を含む点で、後続するサイクルとは異なる。コマンドシーケンスの終わりは、速度ランプＬ１４、始動速度ｖ４００、最大速度Ｖ９００、終了位置Ａ０、及び終速ｃ２００のサイクルである。文字「Ｒ」は終端で実行コードを表わす。
【００７３】
本明細書に記載されている実施例において、類似のサイクルが、細胞、プラスミドＤＮＡ又はｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡと共に使用された。
【００７４】
〈実施例３：先端アセンブリの設計〉
生細胞へ物質を導入するデバイスを生産するために、ホウケイ酸ガラスチューブは、開口部の大きさを縮小するため１つの端（先端）を精密に火炎研磨された。このデバイスを用いて、細胞は、細胞の通過用にこれまで使用されてきたものよりも、直径がかなり小さく、異なる先端形状を有する通路を通じて送られ、結果通路の直径が狭まったため細胞の速度がかなり上昇した。ガラスチューブの出口先端アセンブリの狭小化は、生細胞への遺伝物質の導入のためにより大きな流体速度を生み出した。最も重要なこととして、前記細胞は、流体速度の変化の結果として、必然的に流体圧力の迅速な変化を経験した。流体経路の狭まった部分の内面の曲率は、細胞孔形成及び細胞膜の開口に寄与した。さらに、高度に研磨された端は、細胞が流体経路に沿ったエッジに遭遇した際に、剪断力が生じるのを防ぐために作られため、研磨された端は、細胞の生存率を向上させたことが観察された。
【００７５】
本明細書に記載されている実施例は、先端アセンブリ及び細胞へ物質を導入するための使用方法を記載する。図３パネルＡ及び図４パネルＡは、流体、収縮部につながるチャンネル部分、及び流体を放出するための遠位の開口部を推進するポンプなど、圧力を適用するフローデバイスに近接した、上端開口部を有する先端の内面の典型的な形状を示した三次元表現の図面である。チャンネル部分は、収縮部より大きな内径及び断面積を有する。
【００７６】
図３パネルＢ及び図４パネルＢは、それぞれ図３パネルＡ及び図２パネルＢの先端アセンブリのプロットを示すために用いられる８次多項式関数のグラフである。前記グラフは、横座標上の先端の長さに応じて、縦座標上で流体経路の中心軸からの先端のラジアル距離を示す。前記プロットは、以下のものを含む長さに沿った流体経路を示す：チャンネル部分及び収縮部に近接する開口部から遠位の開口部までの先端の内面。
【００７７】
図４Ｃは、先端アセンブリの代わりにフロースルーアセンブリを有するシステムのフロースルー実施形態を示す。この実施形態において、流体はフローデバイスに近接する侵入チャンネル部分を通過した後、収縮に入り、次に別のチャンネル部分である出口チャンネル部分に入る。先端アセンブリの場合のように、前記収縮は、遠位端にある代わりに、２つのチャンネル部分の間にある。流体は、前記収縮を通して前後に通過するか一度流れる。類似又は非類似の直径又は形状をもつ多数の収縮は、前記フロースルーアセンブリの関連実施形態において想定される。前記フロースルーアセンブリは、流体が容器へ流れ込まずむしろ前記システムを出る前に出口チャンネルを通して続くような先端アセンブリとは異なる。
【００７８】
〈実施例４：先端アセンブリの構成及び適応〉
本明細書における方法での使用に適した先端アセンブリは、様々な異なる物質、及び異なる大きさと形状で構成されたものを含む。細胞及び物質を有する流体は先端アセンブリへ導入され、物質を細胞へ導入するための先端アセンブリの有効性は、細胞ランスフェクションの技術者によって決定される。先端アセンブリの設計の適応は、変化する流体経路形状、収縮部分の数、及び有機又は無機の薬剤の存在を含む組成物における物質の濃度を変動することによって、構造を作り出すことを含む。
【００７９】
先端アセンブリは様々な既知の種類の貯蔵槽及びフローデバイスと共に使用され得る。例えば、貯蔵槽は、遠心分離チューブ、ビン、バッグ又はボトルであり、前記フローデバイスは、携帯型の２００μＬピペットまたは手押ポンプである。先端アセンブリの各々は、多数の先端アセンブリの各々、及び先端アセンブリにおける物質の変動濃度の各々についてデータ（例えば圧力差、細胞膜多孔度、トランスフェクション効率、細胞内での物質の存在、及び細胞の生存率）を得ることにより適応される。
【００８０】
図５は、貯蔵層と流体フローデバイスに近接する頂部に示される開口部である近接開口部（９００）、取り付け部分（９０２）、フローデバイスに取り付けられたときに先端アセンブリを取り外すための先端アセンブリショルダー（９０１）、チャンネル部分（９０３）、収縮部分（９０４）、及び一番下に示されている遠位の開口部（９０５）を含むボディを有する、典型的な先端アセンブリの三次元表現の図面である。流体経路方向は近接開口部（９００）から遠位の開口部（９０５）へ進行する。チャンネル部分（９０３）は、収縮部分（９０４）より大きな内径及び断面積を有する。先端アセンブリショルダー（９０１）は、取り付け部分（９０２）の外部表面から横方向へ伸びる。フローデバイスの実施形態のより低いエジェクターセクションは、先端をフローデバイスから取り除く。
【００８１】
作動するために、特定の実施形態におけるフローデバイス又は流体取扱デバイスは、前記取付け部分で先端アセンブリに取り付けられた。細胞及び物質を含有している流体は、先端アセンブリのねじれ部分からチャンネル部分を通って、遠位の開口部から先端アセンブリへと引き込まれる。流体表面の頂部メニスカスとフローデバイスの端は、異なる物質が各先端で使用され得るように、流体の間でフローデバイスとの接触を防ぐのに充分な距離で離れている。流体デバイスは、チャンネル部分からねじれ部分及び遠位の開口部を通じて流体を促進し、前記チャンネル部分と比べて減少した圧力がねじれ部分で達成され、流体中で含有される細胞において孔を形成し、前記流体に含まれる物質は前記細胞へと導入される。関連実施形態において、前記細胞を含有する流体は、先端アセンブリの収縮部分を通り抜ける際、十分な流体速度が得られるようにより長い流体経路へ引き込まれる。
【００８２】
先端アセンブリは、上記の実施例の条件の下、使用された方法によって評価される。得られたデータは細胞の生存率及び前記細胞内の物質の存在を測定ために使用された。データは、生細胞と非分裂細胞中において、流体の流体圧力を低下させ、細胞の膜多孔度を上昇させることにより、先端アセンブリ物質を細胞の中へ導入したことを示す。これらの先端アセンブリは、以前の方法及びデバイスよりも、物質を細胞へ導入することについて、より効果的、より効率的、より便利であることが本明細書の実施例により示された（実施例６参照）。
【００８３】
〈実施例５：ヒト内皮細胞における遺伝物質の発現〉
ほとんどの一次細胞に類似するヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーションのような既知のトランスフェクション方法を用いた、及びリポフェクタミンのような現在のトランスフェクション製品を用いた、未熟なトランスフェクション率によって特徴づけられる。本明細書の方法及び先端アセンブリは、ＨＵＶＥＣ細胞を、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）とヒト・ブタ内在性レトロウイルス受容体（ＨｕＰＡＲ２）の融合タンパク質をコードするプラスミド（核周囲の細胞内の膜の区画に特異的に局在化するタンパク質）でトランスフェクトするために使用された。
【００８４】
本明細書の実施例は、高感度ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）標識Ｃ末端ＨｕＰＡＲ−２融合タンパク質（ＨｕＰＡＲ−２／ＥＧＦＰ）を産生した。ＨｕＰＡＲ−２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＫｐｎＩとＢｇｌＩＩの制限部位を含有しているプライマー：５′−ＡＣＧＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＧＧＴＣＴＡＣＡＣＡＧＴＣＣＴＴＴ−３′（配列番号：１）及び５′−ＡＣＧＣＡＧＡＴＣＴＡＧＣＡＴＣＴＴＴＧＧＡＣＣＴＡＣＣＴＡＧ−３′（配列番号：２）を使用することによってＴｏｐｏ−ｐＣＲＩＩクローンから増幅された。産生物は、Ｔｏｐｏ−ｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へクローンを作成され、ＫｐｎＩとＢｇｌＩＩを使用して切り取られた。この断片は、ＥＧＦＰ融合ベクターＥＧＦＰ−Ｎ１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＣＬＯＮＴＥＣＨ；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）のＫｐｎＩ及びＢｇｌＩＩの断片においてＥＧＦＰ  ＯＲＦの上流及びイン・フレームでクローンを作成された。
【００８５】
ＨＵＶＥＣ細胞はＡＴＣＣ内皮細胞培地中で育成され、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ）内の懸濁されたＥＧＦＰとＨｕＰＡＲ２の融合タンパク質をコードするベクター（３５μｇ／ｍｌ；７００５塩基対）と接触させられた。トランスフェクションは本明細書の前記システムと方法を使用用いて行なわれた。３５ｍＭガラス底ペトリ皿の表面に定着及び付着させるために、細胞は１５分間前記皿上に播種された。増殖培地は加えられ、前記細胞は５％のＣＯ２及び３７°Ｃで２４時間培養された。
【００８６】
細胞は、レーザー走査共焦点蛍光顕微鏡及び、コントラストが高められた明視野顕微鏡検査、すなわちＤＩＣ（微分干渉工学顕微鏡）を使用して視覚化され、蛍光はトランスフェクションの２４時間後に１０つの無作為に選ばれた顕微鏡視野で分析された。ＨＵＶＥＣ細胞の総数及びＧＦＰ−ＨｕＰＡＲ２蛍光を示す細胞の数が測定され、ＧＦＰ−ＨｕＰＡＲ２蛍光とのＨＵＶＥＣ細胞の割合が計算され、比較された（表１）。表２は、データの統計解析を示す。
【００８７】
ＨＵＶＥＣ細胞の顕微鏡写真は蛍光顕微鏡法を使用して分析された。７０％のトランスフェクション効率より高い平均が培養ＨＵＶＥＣ細胞について達成されたことが観察された。表１及び表２を参照。ひとつの細胞、及び複数の細胞についての代表的なＤＩＣ顕微鏡写真データ及び蛍光顕微鏡写真データは図６パネルＡとＢに示され、これらのデータは前記細胞が効率的にトランスフェクトされた細胞であったことを示す。暗い果粒は、ひとつのＨＵＶＥＣ細胞（図６パネルＡ左の顕微鏡写真）及び複数のＨＵＶＥＣ細胞（図６パネルＢ）の核を囲む膜区画においてＤＩＣによって観察された。ＨＵＰＡＲ２タンパク質は、特に、核周囲の細胞内の膜区画内で局在化し、本明細書で観察される細胞は、本明細書の方法及びシステムを用いてＧＦＰ−ＨｕＰＡＲ２プラスミドをトランスフェクトされた細胞の核周囲の細胞内の膜区画内において染色する、有意なＧＦＰ蛍光を示した。図６パネルＡの中央の顕微鏡写真。ＤＩＣ顕微鏡写真及び蛍光顕微鏡写真を重ね合わせると、ＧＦＰ−ＨｕＰＡＲ２が特に核周囲の細胞内の膜区画内において局在化されたことを示す。これらのデータは、ＨＵＶＥＣ細胞がシステム、本明細書の方法を使用して、うまくトランスフェクトされたことを示す。
【００８８】
【表１】
2014504509.tif 000003
【００８９】
【表２】
2014504509.tif 000004
【００９０】
この実施例における細胞は、大きなプラスミド（７００５塩基対）であるあらかじめ冷凍されたベクターをトランスフェクトされ、本明細書の方法及び先端アセンブリは、遺伝物質をトランスフェクト及び形質導入する際、及び他の方法によってはるかに非効率的であると証明されている環境下において驚くほどより効率的であった。
【００９１】
〈実施例６：ＨＵＶＥＣ細胞へのＥＧＦＰ−ＣＤＣ４２プラスミドの導入〉
本明細書の方法及びシステム又はデバイスは、長年実験室において増殖されてきた形質転換細胞よりも、トランスフェクションに対してより繊細かつ通常より脆弱な一次細胞をトランスフェクトすることにより検証された。一次ＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈内皮細胞）はこの目的のために選ばれた。
【００９２】
ＨＵＶＥＣは、ＥＧＦＰ−ＣＤＣ４２（高感度緑色蛍光タンパク質−細胞分裂制御タンパク質４２）融合タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトされた。細胞と混合されたプラスミド濃度は７０μｇ／ｍｌであった。細胞は、トランスフェクションの前に２日間培養することによりコンフルエントとなるようにされ、細胞培養基質から細胞を脱離され、トランスフェクションのために流体中で懸濁された。
【００９３】
トランスフェクションは以下のパラメーターを使用して行なわた：流体加速度６μｌ／ｓ／ｓ、流量１６０μｌ／ｓ、循環容量５０μｌ、サイクルの２回連続セットで各セットは２．５ｍｌのシリンジによって促進された先端を介して流体の流出入を２５つ有する。６３μｌの容積は、５００，０００個の細胞及びプラスミドを含有していた。
【００９４】
トランスフェクションの２４時間後にレーザー走査蛍光顕微鏡で撮られた細胞の画像は、点状の（又は斑点のある）細胞内ＥＧＦＰ−ＣＤＣ４２蛍光を示した。蛍光は細胞質であり細胞の周囲にあり、ＣＤＣ４２の局所化と一致しており、核から排除された（図７パネルＡ）。２０つの無作為に選択された２０ｘ拡大顕微鏡視野において蛍光性細胞がサンプルされた。結果は、前記細胞の８８．２％（１３５／１５３）のプールされた平均がＥＧＦＰ蛍光様のＣＤＣ４２を表示したことを示した。ＡＭＡＸＡ  Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ（商標）（Ｌｏｎｚａ  Ｃｏｌｏｇｎｅ  ＧｍｂＨ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）エレクトロポレーション・ユニットを使用するトランスフェクションは比較のために検証され、トランスフェクションがなかった又はトランスフェクション効率が低い（３０％未満）ことが観察された。
【００９５】
本明細書の方法及びトランスフェクションデバイスを用いてＥＧＦＰ−ＣＤＣ４２プラスミドをトランスフェクトされたＨＵＶＥＣ細胞の画像は、画像化前に分裂した細胞内でのＥＧＦＰ発現のうちの１つを含む（図７パネルＢ）。細胞分裂における役割があるタンパク質の発現パターンと一致して、ＥＧＦＰ蛍光は娘細胞間の部位に局在化する。
【００９６】
本明細書の方法及びトランスフェクションデバイスを用いてＥＧＦＰ−ＣＤＣ４２をトランスフェクトされたＨＵＶＥＣ細胞のＥＧＦＰ蛍光は、正常なＰＭＴ感受性で観察され、より高いＰＭＴ感受性で観察されたものと比較された（図７パネルＣ及びＤ）。正常なＰＭＴ感受性では、ほとんどの蛍光は、大きな果粒へ局在化されることが観察された（図７パネルＣ）。より高いＰＭＴ感受性では、ＥＧＦＰ−ＣＤＣ４２発現は、よりサイズの小さい多数の細胞内果粒内の細胞のサブセットにおいて検出された（図７パネルＤ）。より高いＰＭＴ感度で走査することは、正常なＰＭＴ感度の大きな果粒で観察された潜在的な自己蛍光をオフセットすることが観察された。より小さな顆粒における蛍光は、走査方式の高感度レーザー光線を用いて光退色することにより検証され、ＥＧＦＰ−ＣＤＣ４２融合タンパク質の発現に特異的なものであることが観察された。
【００９７】
上記の実施例は、本明細書に記載されている方法及びデバイスが、一次細胞へのプラスミドの効率的な移動をもたらし、前記プラスミドがｍＲＮＡへ転写され、前記ｍＲＮＡはタンパク質へ翻訳され、そして前記タンパク質は正確な局在化を発現し、それによりトランスフェクションの成功をもたらしたことを実証する。
【００９８】
〈実施例７：ＨＵＶＥＣ細胞への７ｋｂのＥＧＦＰ−アクチンプラスミドの導入〉
トランスフェクションの成功は、トランスフェクションに続くｍＲＮＡの複製数の測定を用いて検証され得る。ｍＲＮＡの複製数の測定は、発現されている蛍光性タンパク質特有の性質により蛍光シグナルが弱い場合、又は高い自己蛍光バックグラウンドがある場合のような状況において、有用である。
【００９９】
Ｐ５マウスからの一次ＨＵＶＥＣ細胞は、細胞骨格のアクチンフィラメント成分におけるＥＧＦＰアクチンの発現を観察するために、本明細書に記載されている方法及びデバイスを用いてＥＧＦＰアクチン融合タンパク質をコードする７ｋｂのプラスミドをトランスフェクトされた。５００，０００個の細胞は、終末濃度７０μｇ／ｍｌのＥＧＦＰアクチン発現プラスミドが加えられ、細胞と混合された１５００μｌ遠心分離チューブ内の１００μｌのリン酸塩緩衝食塩水において懸濁された。
【０１００】
以下のパラメーターがトランスフェクションに用いられた：流体加速６μｌ／ｓ／ｓ、流量１６０μｌ／ｓ、循環容量６０μｌ、使用されたシリンジの容量２．５ｍｌ、及び先端を介した流体運動の２５サイクルの３連続セットから成る連続するフローサイクル。細胞は培養内で４８時間育成され、トランスフェクションから結果として生じるｍＲＮＡの産生は、１細胞当たりのｍＲＮＡの正確な複製数を測定する方法を使用して評価された。Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５，Ｅｘｐ  Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  ７９：１４。
【０１０１】
結果は、図８パネルＡ、Ｂ及びＣに示される。トランスフェクションされたデバイスでトランスフェクトされた細胞は、図８パネルＣにおいてＴＣとして表示される。対照として、細胞もプラスミドの不在下でトランスフェクションプロトコルを受ける。これらの細胞は、ＥＧＦＰアクチンｍＲＮＡの複製数について検査もされた（図８パネルＣでＣＴと表示される）。細胞はＡＭＡＸＡ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）エレクトロポレーション・ユニットを用いてトランスフェクトもされ、図８パネルＣでＡＭＡＸＡと表示される。ＡＭＡＸＡ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）エレクトロポレーターを用いてトランスフェクトされた細胞は、対照細胞については１細胞当たりのｍＲＮＡの複製が平均たったの０．０８のバックグラウンドであったのに反し、１細胞当たり平均１１５２．７５のｍＲＮＡの複製の産生をもたらした。対照的に、トランスフェクションデバイスでトランスフェクトされた細胞は、１細胞当たり平均３６５２．６６のＥＧＦＰアクチンｍＲＮＡの複製の産生をもたらした（図８パネルＣ）。類似の条件下で行なわれた別の試験において、比較可能な平均のｍＲＮＡの複製数が観察された（ＡＭＡＸＡ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）エレクトロポレーターでのトランスフェクションで１細胞当たりｍＲＮＡの１１５２．７５の複製対本明細書に記載されているトランスフェクションデバイスでのトランスフェクションで１細胞当たりｍＲＮＡの３８５３．９５の複製）。これらの結果は、本明細書に記載されているトランスフェクションデバイスを使用したトランスフェクションが、１細胞当たりのＥＧＦＰアクチンｍＲＮＡの複製数の劇的な増加をもたらし、そしてこの増加が再現可能であったことを示す。
【０１０２】
故に、ｍＲＮＡ複製数の測定は、本明細書に記載されている方法及びデバイスが、一次細胞においてでさえ効率的なトランスフェクションを達成するのに有用であることを裏付けた。
【０１０３】
〈実施例８：ジャーカット細胞への遺伝物質の導入〉
本明細書の方法及びシステムを用いて、トランスフェクション受容体として不応性（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ）だと知られている細胞であるタイプジャーカット細胞は、ＥＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）でトランスフェクション効率について検証された。およそ２５０，０００個の細胞が５０μｌのトランスフェクション培地（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ）、ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）不在のカルシウム又はマグネシウムにおいて懸濁され、０．２％ｗ／ｖのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含有した。対照として、模擬のトランスフェクトされたサンプルは、プラスミド不在でトランスフェクトされた。他のトランスフェクションは、プラスミドの２．０μｇ（細胞との全容量５５μｌ、３６μｇ／ｍｌ）、５．０μｇ（細胞との全容積６２．５μｌ、８０μｇ／ｍｌ）、又は１０．０μｇ（細胞の全容積７５μｌ、１３０μｇ／ｍｌ）を含有していた。トランスフェクション・パラメーターは以下の通りであった：液体加速６μｌ／ｓ／ｓ、流量１６０μｌ／ｓ、２．５ｍｌのシリンジを用いた循環容量６０μｌ、先端を介した２５の流出入から成る連続的なサイクル。細胞は培養内で４８時間育成され、ＥＧＦＰ蛍光（ＦＬ１−Ｈチャンネル内）はフローサイトメトリー（図９）を用いて定量化された。
【０１０４】
細胞の１０％がＥＧＦＰ蛍光の最大強度の５０−９０％を示したことが観察された。５．０μｇのプラスミドで処理された細胞から得られたデータは、プラスミド不在の対照トランスフェクション内で観察されたバックグラウンドレベルよりも高いＥＧＦＰ蛍光を示した。２．０又は１０．０μｇのプラスミドのいずれかを用いて観察された蛍光強度は、バックグラウンドレベルにあった。
【０１０５】
〈実施例９：本明細書のトランスフェクションシステムを用いた一次のマウスの脳の星状細胞のトランスフェクション〉
本明細書に記載されている方法及びトランスフェクションシステム又はデバイスは、幾つかの変更を伴い、一次細胞の別の種類のトランスフェクションを検証するために使用された。
【０１０６】
一次星状細胞（１−２００万個の細胞）はマウス脳から分離され、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ変法イーグル培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｄｂａｄ、ＣＡ）内で懸濁され、トランスフェクションまで細胞培養インキュベーター（加湿、３７°Ｃ及び５％ＣＯ２）内で維持された。トランスフェクションのために、細胞は、２０μｇ／ｍｌのＥＧＦＰ対照プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）又は２０μｇ／ｍｌのＣｙ３標識ｍｉＲＮＡ（ＡＭ１７０１１、２５塩基対設計ＲＮＡオリゴヌクレオチド、Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を含有する１００μｌのＨＢＳＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋ｆｒｅｅ）内で遠心分離にかけられ再懸濁された。
【０１０７】
細胞は以下のように準備された先端を用いてトランスフェクトされた。０．８８ｍｍの内径、１．２３ｍｍの外径、０．１４ｍｍｍの壁厚をもつ特注生産のフリントグラスチューブは、本明細書に記載されているような曲率を得るために加熱された。先端の開口部に最も近い、縮小するほぼ円筒状の部分をもつ２５０μｍ長のさらなる追加のマイクロチャンネルが、前記先端の構成へ加えられた。前記先端は最終的に直径１７５から２００μｍの小さな先端開口部となった。（図３パネルＣ及びＤ）。
【０１０８】
ＥＧＦＰプラスミドでのトランスフェクションは、２００μｍの直径の先端を用いて行われ、Ｃｙ３標識ｍｉＲＮＡでのトランスフェクションは、１７５μｍの直径の先端を用いて行なわれた。
【０１０９】
細胞の混合物とＥＧＦＰプラスミド又はｍｉＲＮＡは、本明細書に記載されている方法及びトランスフェクションデバイスを使用して、６０−１００回反復的に先端を通過した。混合物は６０−８０μｌの循環容量で先端へ引き込まれた。このトランスフェクションで用いられる先端開口部のより小さな直径を考慮して、循環パラメーターは実施例６から８で用いられたもの、実施例２で一般に記載されたものから変更された。流入パラメーターのみが変更された。詰まることなく細胞懸濁が先端へスムーズに移入できるよう、流入速度は５０−８０μｌ／ｓに減らされ、加速は１−４μｌ／ｓに減らされた。故に、より低い流入及び最大流出速度（２４０μｌ／ｓ）の非対称のサイクルが利用される。トランスフェクション後、細胞は３日間細胞培養インキュベーター内で培養されインキュベートされ、次に、共焦点顕微鏡を用いて画像化のためにスライドガラスに固定され、取り付けられた。
【０１１０】
より縮小した先端開口部を備え、近接端部に追加のマイクロチャンネルを含有する先端アセンブリ（図３Ｃ及びＤ）を用いた一次星状細胞のトランスフェクションは、細胞へのＥＧＦＰプラスミド又はＣｙ３識別ｍｉＲＮＡのトランスフェクションの成功をもたらした。トランスフェクションの３日後に観察された代表的な画像は、図１０パネルＡ−Ｆに示される。パネルＡ及びＢは、ＥＧＦＰ蛍光強度の変動レベルをもつ細胞を示す。パネルＣは、バックグラウンド蛍光と同等又はほんの少し高い蛍光強度を備えた細胞のクラスター中の一つの明るい蛍光性細胞を示す。図Ｄは、トランスフェクトされた一次星状細胞の蛍光画像の、同じ細胞の明視野画像上への重ね合わせを示す画像である。画像は、高感度蛍光トランスフェクトされた細胞は、一次マウス脳星状細胞の形態特性を有する培養基質上に広がることを示す。
【０１１１】
上記のバックグラウンドの蛍光を有する細胞を観察することにより、トランスフェクションの１日後に測定されたトランスフェクション効率は、１３．８％（５つの異なる顕微鏡視野から２３７個の細胞）であると測定された。効率は、トランスフェクションの３日後には２９．８％まで上昇することが観察された（１３の異なる顕微鏡視野から１８８個の細胞）。
【０１１２】
パネルＥ及びＦは、細胞の細胞質における内部以降されたＣｙ３標識ｍｉＲＮＡの中等レベル（パネルＥ）又は高いかバックグラウンドレベル（パネルＦ）のどちらかを有しているトランスフェクトされた一次マウス脳星状細胞を示す。ｍｉＲＮＡは核から排除される。標識ｍｉＲＮＡは、小さな丸い蛍光性スポットとして現れる。バックグラウンドより上に蛍光を有する細胞を観察することにより、トランスフェクションの３日後に測定されたトランスフェクション効率は、４０．９％（３つの顕微鏡視野から４１個の細胞）であると測定された。
【０１１３】
この実施例はさらに、一次細胞のトランスフェクションの成功のために、本明細書に記載されている方法及びトランスフェクションデバイスの適用可能性を実証し、それによって、本明細書の方法及びデバイスの実用性を拡大する。
【０１１４】
〈実施例１０：本明細書のシステム及び方法を用いた細胞内の遺伝物質の発現〉
本明細書に記載されているシステム及び方法は、次のものから成る群から選ばれた細胞へ遺伝物質を導入するために使用される：上皮細胞、造血性細胞、幹細胞、脾臓細胞、腎細胞、膵臓細胞、肝細胞、神経細胞、膠細胞、平滑又は横紋筋細胞、精細胞、心細胞、肺細胞、眼球細胞、骨髄細胞、胎児臍帯血細胞、始原細胞、末梢血単核細胞、白血球細胞、リンパ球、生きている分裂終了細胞、生理学的に不活発な細胞、阻害された細胞、ＵＶ不活性化細胞、除核細胞、無核細胞、熱殺菌された細胞、非再生細胞、原核細胞、及び人工膜を有する合成細胞。
【０１１５】
細胞とＧＦＰ−ＨｕＰＡＲ２をコードするプラスミド（実施例５参照）又は別のプラスミドとの混合物、又は、例えば、治療上のタンパク質だけをコードするプラスミド又はＥＧＦＰのような蛍光性タンパク質をコードするレポータープラスミドをもつプラスミドの混合物を含有する流体は、本明細書のトランスフェクションデバイスの先端へ反復的に引き込まれそして押し出され、流体サイクルを生み出した。（実施例２及び図２）。流体サイクルは、トランスフェクションをもたらす。前記システムは、実施例３−４及び図３−４に記載されている先端アセンブリを使用する。トランスフェクションの後、育成培地が加えられ、細胞は１２−２４時間３７°Ｃ及び５％のＣＯ２でインキュベートされる。次に前記細胞は、レーザー走査共焦点蛍光顕微及びコントラストが高められた明視野顕微鏡を用いて、生存率について評価され、さらには視覚化される。細胞は、トランスフェクションのために負の対照をもたらすためにプラスミドの不在下でトランスフェクトされる。
【図１Ａ】
2014504509.tif 000005
【図１Ｂ】
2014504509.tif 000006
【図１Ｃ】
2014504509.tif 000007
【図１Ｄ】
2014504509.tif 000008
【図３Ａ】
2014504509.tif 000009
【図３Ｂ】
2014504509.tif 000010
【図３Ｃ】
2014504509.tif 000011
【図３Ｄ】
2014504509.tif 000012
【図４Ａ】
2014504509.tif 000013
【図４Ｂ】
2014504509.tif 000014
【図４Ｃ】
2014504509.tif 000015
【図５】
2014504509.tif 000016
【図６Ａ】
2014504509.tif 000017
【図６Ｂ】
2014504509.tif 000018
【図７Ａ】
2014504509.tif 000019
【図７Ｂ】
2014504509.tif 000020
【図７Ｃ】
2014504509.tif 000021
【図７Ｄ】
2014504509.tif 000022
【図８Ａ】
2014504509.tif 000023
【図８Ｂ】
2014504509.tif 000024
【図１０Ａ】
2014504509.tif 000025
【図１０Ｂ】
2014504509.tif 000026
【図１０Ｃ】
2014504509.tif 000027
【図１０Ｄ】
2014504509.tif 000028
【図１０Ｅ】
2014504509.tif 000029
【図１０Ｆ】
2014504509.tif 000030
【図２】
2014504509.tif 000031
【図８Ｃ】
2014504509.tif 000032
【図９】
2014504509.tif 000033
【国際調査報告】
2014504509.tif 000034
2014504509.tif 000035
2014504509.tif 000036
2014504509.tif 000037
2014504509.tif 000038
2014504509.tif 000039
2014504509.tif 000040