(57)【要約】  本発明は、キナーゼに対する特異的結合親和性を有する第１の固体担体と、キナーゼに対する非特異的結合親和性を有する第２の固体担体と、を備えた２つ以上の層を含むマルチアナライトカラムに関する。また、低存在量キナーゼの検出、化学治療耐性の予測、癌予後の判定、及び治療レジメン有効性の改善を行う方法を含む方法も提供される。
2014532184.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１及び第２の層を含み、
（ａ）前記第１の層が、特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第１の固体担体を含み、且つ
（ｂ）前記第２の層が、非特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第２の固体担体を含む、
マルチアナライトカラム。
【請求項２】
前記第１の固体担体が１種又は複数種のチロシンキナーゼに対する特異的結合親和性を有する、請求項１に記載のマルチアナライトカラム。
【請求項３】
前記第１の固体担体が１種又は複数種のセリン／トレオニンキナーゼに対する特異的結合親和性を有する、請求項１に記載のマルチアナライトカラム。
【請求項４】
前記特異的結合親和性が、Ａｂｌ、ＡＴＫ、ＢＲＡＦ、ｃ−ＫＩＴ、ＣＯＴ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ−３、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩｎｓＲ、ＬＹＮ、ＭＥＫ、ＭＥＴ、Ｐ３８、ＰＤＧＦＲβ、ＰＫＣ／ＧＳＫ３β、Ｓｒｃ、及びＶＥＧＦＲからなる群から選択されるキナーゼに対するものである、請求項１に記載のマルチアナライトカラム。
【請求項５】
前記特異的結合親和性が、Ａｂｌ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＬＹＮ、Ｐ３８、及びＰＫＣ／ＧＳＫ３βからなる群から選択されるキナーゼに対するものである、請求項４に記載のマルチアナライトカラム。
【請求項６】
前記第１の固体担体の各親和性リガンドが２０種以下のキナーゼに結合する、請求項１に記載のマルチアナライトカラム。
【請求項７】
前記親和性リガンドが、ビスインドイルマレイミド−Ｘリガンド、ＧＷ−５７２０１６リガンド、及びＳＢ２０３５８０リガンドからなる群から選択される、請求項６に記載のマルチアナライトカラム。
【請求項８】
前記第２の固体担体の各親和性リガンドが５０種以上のキナーゼに結合する、請求項１に記載のマルチアナライトカラム。
【請求項９】
前記親和性リガンドが、２，４−ジアミノピリミジン、ピラゾールリガンド、ＰＰ５８リガンド、プルバラノールＢリガンド、及びＶＩ１６８３２リガンドからなる群から選択される、請求項８に記載のマルチアナライトカラム。
【請求項１０】
前記特異的結合親和性キナーゼ固体担体及び前記非特異的結合キナーゼ固体担体が、約４：１〜約１：４の範囲内のモル比で存在する、請求項１に記載のマルチアナライトカラム。
【請求項１１】
前記特異的結合親和性キナーゼ固体担体及び前記非特異的結合キナーゼ固体担体が、約１．５：１〜約１：１．５の範囲内のモル比で存在する、請求項１０に記載のマルチアナライトカラム。
【請求項１２】
前記第１の固体担体が、特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも３つの異なる親和性リガンドを含む、請求項１に記載のマルチアナライトカラム。
【請求項１３】
前記第２の固体担体が、非特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも３つの異なる親和性リガンドを含む、請求項１に記載のマルチアナライトカラム。
【請求項１４】
前記第１の固体担体が、特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも３つの異なる親和性リガンドを含み、且つ前記第２の固体担体が、非特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも３つの異なる親和性リガンドを含む、請求項１に記載のマルチアナライトカラム。
【請求項１５】
（ａ）第１及び第２の層を含むマルチアナライトカラムにサンプルを充填することであって、
（ｉ）前記第１の層は、特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第１の固体担体を含み、且つ
（ｉｉ）前記第２の層は、非特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第２の固体担体を含むことと、
（ｂ）前記マルチアナライトカラムを洗浄して何れの非結合タンパク質をも除去することと、
（ｃ）変性剤を用いて、前記マルチアナライトカラムに結合した何れのキナーゼをも溶出させることと、
（ｄ）前記溶出されたキナーゼを検出することと、
を含む、サンプル中の低存在量キナーゼを検出する方法。
【請求項１６】
工程（ｄ）での検出が質量分析により行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が複数のサンプルで行われ、且つ少なくとも１つのサンプルが検出可能標識で標識される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出可能標識がＳＩＬＡＣ（細胞培養に於けるアミノ酸を用いた安定同位体標識）により作製される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
同位体標識スパイクが前記サンプルに添加される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルの５ｍｇタンパク質部分から１５０種超のキナーゼが検出される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記サンプルの５ｍｇタンパク質部分から１８０種超のキナーゼが検出される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
４０種以上のキナーゼが単一のサンプルから検出され、且つ前記キナーゼのリン酸化状態の変化もまた測定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
被験体に於いて化学治療レジメンに対する耐性の発生を予測する方法であって、（ａ）請求項２２に記載の方法により検出された複数のキナーゼのレベルを測定することと、（ｂ）工程（ａ）で測定されたレベルを標準レベルと比較することと、を含み、前記標準レベルを基準にした少なくとも１種のキナーゼの測定レベルの変調が、前記被験体が前記化学治療レジメンに対して耐性を発生するリスクが高いことの指標となる、方法。
【請求項２４】
被験体に於いて癌の予後を判定する方法であって、（ａ）請求項２２に記載の方法により検出された複数のキナーゼのレベルを測定することと、（ｂ）工程（ａ）で測定されたレベルを標準レベルと比較することと、を含み、前記標準レベルを基準にした少なくとも１種のキナーゼの測定レベルの変調が、癌の予後の指標となる、方法。
【請求項２５】
被験体に於いてキナーゼ関連障害に対する治療レジメンの有効性を改善する方法であって、（ａ）請求項２２に記載の方法により検出された複数のキナーゼのレベルを測定することと、（ｂ）工程（ａ）で測定されたレベルを標準レベルと比較してキナーゼプロファイルを取得することと、（ｃ）前記キナーゼプロファイルを用いてより効果的な治療レジメンを決定することと、を含む、方法。
【請求項２６】
（ａ）患者からサンプルを取得することと、
（ｂ）請求項２２に記載の方法により検出された複数のキナーゼのレベルを測定することと、
（ｃ）１種又は複数種のキナーゼ阻害剤を用いて前記患者を治療することと、
（ｄ）前記患者から第２のサンプルを取得することと、
（ｅ）前記第２のサンプルから複数のキナーゼを測定することと、
（ｆ）前記第２のサンプルレベルを工程（ｂ）で測定されたものと比較することと、
（ｇ）治療後の比較に基づいて癌治療レジメンを変更することと、
を含む、癌治療レジメンを変更する方法。
【請求項２７】
（ａ）請求項２２に記載の方法により検出された複数のキナーゼのレベルを測定することと、（ｂ）工程（ａ）で測定されたレベルを標準レベルと比較してキナーゼプロファイルを取得することと、（ｃ）前記キナーゼプロファイルを用いて治療レジメン又は臨床試験に対して患者を層別化することと、を含む、治療レジメン又は臨床試験に対して患者を層別化する方法。
【請求項２８】
（ａ）請求項２２に記載の方法により検出された複数のキナーゼのレベルを測定することと、（ｂ）工程（ａ）で測定されたレベルを標準レベルと比較してキナーゼプロファイルを取得することと、（ｃ）薬剤治療のオンターゲット効果又はオフターゲット効果の測定にキナーゼプロファイルを使用することと、を含む、薬剤治療のオンターゲット効果及びオフターゲット効果を測定する方法。
【請求項２９】
キナーゼ活性モジュレーターを選択する方法であって、次の工程、即ち、
（ａ）細胞、組織、又は生物と化合物とを接触させる工程と、
（ｂ）前記細胞、組織、又は生物からのタンパク質抽出物と、第１及び第２の層を含むマルチアナライトカラムと、を接触させる工程であって、
（ｉ）前記第１の層は、特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第１の固体担体を含み、且つ
（ｉｉ）前記第２の層は、非特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第２の固体担体を含む工程と、
（ｃ）変性剤を用いて、前記固体担体に結合した何れのキナーゼをも溶出させる工程と、
（ｄ）検出された複数のキナーゼのレベルを測定する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）で測定されたレベルを標準レベルと比較してキナーゼプロファイルを取得する工程と、
（ｆ）前記キナーゼプロファイルを用いてキナーゼ活性モジュレーターを選択する工程と、
を含む方法。
【請求項３０】
（ａ）第１及び第２の層を有するマルチアナライトカラムであって、
（ｉ）前記第１の層は、特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第１の固体担体を含み、且つ
（ｉｉ）前記第２の層は、非特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第２の固体担体を含むマルチアナライトカラムと、
（ｂ）癌を有する又は化学治療レジメンで治療されてきた被験体に於ける複数のキナーゼのレベルの測定に関する使用説明書と、
を含むキット。
【請求項３１】
構造：
【化１】
2014532184.tif 000044
（式中、
Ｍは、（ＣＨ２）ｘ、又は（ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙであり、Ｚは、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨＲ１、ＮＲ２Ｒ３、ＳＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ４、ＣＯ２Ｒ５、ＣＯＮＨＮＨ２、Ｗであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、水素又はＣ１〜８アルキル若しくはシクロアルキルから選択され、Ｘは、１〜１６であり、Ｙは、１〜１２であり、且つ
Ｗは、
【化２】
2014532184.tif 000045
、ポリＨｉｓタグ、又は他の親和性リンカーである）
を有する化合物。
【請求項３２】
構造：
【化３】
2014532184.tif 000046
（式中、
Ｍは、（ＣＨ２）ｘ、又は（ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙであり、Ｚは、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨＲ１、ＮＲ２Ｒ３、ＳＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ４、ＣＯ２Ｒ５、ＣＯＮＨＮＨ２、Ｗであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、水素又はＣ１〜８アルキル若しくはシクロアルキルから選択され、Ｘは、１〜１６であり、Ｙは、１〜１２であり、且つ
Ｗは、
【化４】
2014532184.tif 000047
、ポリＨｉｓタグ、又は他の親和性リンカーである）
を有する化合物。
【請求項３３】
構造：
【化５】
2014532184.tif 000048
（式中、
Ｍは、（ＣＨ２）ｘ、又は（ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙであり、Ｚは、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨＲ１、ＮＲ２Ｒ３、ＳＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ４、ＣＯ２Ｒ５、ＣＯＮＨＮＨ２、Ｗであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、水素又はＣ１〜８アルキル若しくはシクロアルキルから選択され、Ｘは、１〜１６であり、Ｙは、１〜１２であり、且つ
Ｗは、
【化６】
2014532184.tif 000049
、ポリＨｉｓタグ、又は他の親和性リンカーである）
を有する化合物。
【請求項３４】
構造：
【化７】
2014532184.tif 000050
（式中、
Ｍは、（ＣＨ２）ｘ、又は（ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙであり、Ｚは、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨＲ１、ＮＲ２Ｒ３、ＳＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ４、ＣＯ２Ｒ５、ＣＯＮＨＮＨ２、Ｗであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、水素又はＣ１〜８アルキル若しくはシクロアルキルから選択され、Ｘは、１〜１６であり、Ｙは、１〜１２であり、且つ
Ｗは、
【化８】
2014532184.tif 000051
、ポリＨｉｓタグ、又は他の親和性リンカーである）
を有する化合物。
【請求項３５】
構造：
【化９】
2014532184.tif 000052
（式中、
Ｍは、（ＣＨ２）ｘ、又は（ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙであり、Ｚは、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨＲ１、ＮＲ２Ｒ３、ＳＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ４、ＣＯ２Ｒ５、ＣＯＮＨＮＨ２、Ｗであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、水素又はＣ１〜８アルキル若しくはシクロアルキルから選択され、Ｘは、１〜１６であり、Ｙは、１〜１２であり、且つ
Ｗは、
【化１０】
2014532184.tif 000053
、ポリＨｉｓタグ、又は他の親和性リンカーである）
を有する化合物。
【請求項３６】
構造：
【化１１】
2014532184.tif 000054
（式中、
Ｍは、（ＣＨ２）ｘ、又は（ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙであり、Ｚは、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨＲ１、ＮＲ２Ｒ３、ＳＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ４、ＣＯ２Ｒ５、ＣＯＮＨＮＨ２、Ｗであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、水素又はＣ１〜８アルキル若しくはシクロアルキルから選択され、Ｘは、１〜１６であり、Ｙは、１〜１２であり、且つ
Ｗは、
【化１２】
2014532184.tif 000055
、ポリＨｉｓタグ、又は他の親和性リンカーである）
を有する化合物。
【請求項３７】
構造：
【化１３】
2014532184.tif 000056
（式中、
Ｍは、（ＣＨ２）ｘ、又は（ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙであり、Ｚは、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨＲ１、ＮＲ２Ｒ３、ＳＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ４、ＣＯ２Ｒ５、ＣＯＮＨＮＨ２、Ｗであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、水素又はＣ１〜８アルキル若しくはシクロアルキルから選択され、Ｘは、１〜１６であり、Ｙは、１〜１２であり、且つ
Ｗは、
【化１４】
2014532184.tif 000057
、ポリＨｉｓタグ、又は他の親和性リンカーである）
を有する化合物。
【請求項３８】
構造：
【化１５】
2014532184.tif 000058
（式中、
Ｍは、（ＣＨ２）ｘ、又は（ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙであり、Ｚは、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨＲ１、ＮＲ２Ｒ３、ＳＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ４、ＣＯ２Ｒ５、ＣＯＮＨＮＨ２、Ｗであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、水素又はＣ１〜８アルキル若しくはシクロアルキルから選択され、Ｘは、１〜１６であり、Ｙは、１〜１２であり、且つ
Ｗは、
【化１６】
2014532184.tif 000059
、ポリＨｉｓタグ、又は他の親和性リンカーである）
を有する化合物。
【請求項３９】
構造：
【化１７】
2014532184.tif 000060
（式中、
Ｍは、（ＣＨ２）ｘ、又は（ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙであり、Ｚは、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨＲ１、ＮＲ２Ｒ３、ＳＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ４、ＣＯ２Ｒ５、ＣＯＮＨＮＨ２、Ｗであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、水素又はＣ１〜８アルキル若しくはシクロアルキルから選択され、Ｘは、１〜１６であり、Ｙは、１〜１２であり、且つ
Ｗは、
【化１８】
2014532184.tif 000061
、ポリＨｉｓタグ、又は他の親和性リンカーである）
を有する化合物。
【請求項４０】
構造：
【化１９】
2014532184.tif 000062
（式中、
Ｍは、（ＣＨ２）ｘ、又は（ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙであり、Ｚは、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨＲ１、ＮＲ２Ｒ３、ＳＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ４、ＣＯ２Ｒ５、ＣＯＮＨＮＨ２、Ｗであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、水素又はＣ１〜８アルキル若しくはシクロアルキルから選択され、Ｘは、１〜１６であり、Ｙは、１〜１２であり、且つ
Ｗは、
【化２０】
2014532184.tif 000063
、ポリＨｉｓタグ、又は他の親和性リンカーである）
を有する化合物。
【請求項４１】
構造：
【化２１】
2014532184.tif 000064
（式中、
Ｍは、（ＣＨ２）ｘ、又は（ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙであり、Ｚは、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨＲ１、ＮＲ２Ｒ３、ＳＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ４、ＣＯ２Ｒ５、ＣＯＮＨＮＨ２、Ｗであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、水素又はＣ１〜８アルキル若しくはシクロアルキルから選択され、Ｘは、１〜１６であり、Ｙは、１〜１２であり、且つ
Ｗは、
【化２２】
2014532184.tif 000065
、ポリＨｉｓタグ、又は他の親和性リンカーである）
を有する化合物。
【請求項４２】
構造：
【化２３】
2014532184.tif 000066
（式中、
Ｍは、（ＣＨ２）ｘ、又は（ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙであり、Ｚは、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨＲ１、ＮＲ２Ｒ３、ＳＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ４、ＣＯ２Ｒ５、ＣＯＮＨＮＨ２、Ｗであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、水素又はＣ１〜８アルキル若しくはシクロアルキルから選択され、Ｘは、１〜１６であり、Ｙは、１〜１２であり、且つ
Ｗは、
【化２４】
2014532184.tif 000067
、ポリＨｉｓタグ、又は他の親和性リンカーである）
を有する化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、代理人整理番号ＵＮＣ１１００１ＵＳＶを有するジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）らの２０１１年１０月１２日出願の（特許文献１）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に基づく特典を主張する。
【０００２】
連邦政府委託の研究又は開発に関する陳述
本発明は、少なくとも部分的には、国立衛生研究所により授与された助成金番号ＣＡ５８２２３、ＤＫ３７８７１、及びＧＭ３０３２４に基づいて政府の支援を受けて行われた。米国政府は、本発明に関する一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、一般的には、キナーゼに対する特異的結合親和性を有する第１の固体担体と、キナーゼに対する非特異的結合親和性を有する第２の固体担体と、を備えた２つ以上の層を含むマルチアナライトカラムの発見に関する。また、低存在量キナーゼの検出、化学治療耐性の予測、癌予後の判定、及び治療レジメン有効性の改善を行う方法を含む方法も提供される。
【背景技術】
【０００４】
２．１．  キナーゼ及びホスファターゼ
真核細胞内のタンパク質のリン酸化状態は、シグナル伝達の多くに関与し、本質的な細胞プロセス、例えば、代謝、転写、細胞周期進行、細胞骨格再構成、及び細胞運動、アポトーシス、並びに分化を制御する。（非特許文献１）。可逆的リン酸化は、レセプター（膜貫通）又は細胞質の何れかであるキナーゼ及びホスファターゼにより行われる。ヒトゲノム中には５１８種の推定プロテインキナーゼが存在し、そのうち９０種がチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）であり、４２８種がセリン／トレオニンキナーゼ（ＰＳＫ）である。（非特許文献２）。推定ホスファターゼは、より少ない１０７種のチロシンホスファターゼ及び約３０種のセリン／トレオニンホスファターゼである。（非特許文献２）。
【０００５】
細胞リン酸化状態（総称してキノーム）は、多種多様な癌、自己免疫疾患、代謝障害、及び神経障害を含む様々な障害に関連付けられてきた。キナーゼを標的とする多くの薬剤が承認されてきており、又は開発途上にある。承認された小分子キナーゼ阻害剤の例は、当初は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）に対して承認された切断点クラスター領域−アベルソン（ＢＣＲ−ＡＢＬ）の阻害剤イマチニブ（グリバック（Ｇｌｅｅｖａｃ）（登録商標））である。他の薬剤シロリムス（ラパミューン（Ｒａｐａｍｕｎｅ）（登録商標））は、哺乳動物ラパマイシン阻害剤（ｍＴＯＲ）の阻害剤であり、当初は免疫抑制剤として承認された。モノクローナル抗体キナーゼ阻害剤の例は、乳癌に対して承認されたＥＲＢ−Ｂ２の阻害剤トラスツズマブ（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標））又は結腸直腸癌に対して承認された血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の阻害剤ベバシズマブ（アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）（登録商標））である。表１には、幾つかの承認されたキナーゼ阻害剤薬剤が列挙されている。（非特許文献３）、（非特許文献４）、並びに（非特許文献５）を参照されたい。
【０００６】
【表１】
2014532184.tif 000003
【０００７】
これらの薬剤の多くは、コンパニオン診断剤と共に使用することが承認されている。たとえば、トラスツズマブ（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標））は、ＥＲＢ−Ｂ２を過剰発現する乳癌に対して承認されており、セツキシマブ（アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）（登録商標））は、野生型ＫＲＡＳを有する患者に対して承認されている。（非特許文献６）、（非特許文献７）。診断剤と共に使用することが承認されている他のキナーゼ阻害剤は、ＡＬＫ再構成に対する蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）試験（バイシスＬＳＩ  ＡＬＫジュアル・カラー（Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＡＬＫ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｒ）ブレイク・アパート・リアレンジメント・プローブ（Ｂｒｅａｋ  Ａｐａｒｔ  Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅ）、アボット・モレキュラー（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）、イリノイ州アボットパーク）と共に承認されているクリゾチニブ（ザーコリ（Ｘａｌｋｏｒｉ）（登録商標））である。（非特許文献８）、（非特許文献９）。ベムラフェニブ（ゼルボラフ（Ｚｅｌｂｏｒａｆ）（登録商標））は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異（コバス４８００ＢＲＡＦ  Ｖ６００ミューテーション・テスト（Ｃｏｂａｓ４８００  ＢＲＡＦ  Ｖ６００  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ）、ロシュ・モレキュラー・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、カリフォルニア州プレザントン）を有する患者で使用することが承認されている。（非特許文献１０）。
【０００８】
２．２．  現在のキノーム研究方法
３０年以上前の２Ｄゲルクロマトグラフィーの当初から、科学者は、タンパク質及び代謝物を分析する為に質量分析技術を使用してきた。この技術は、何十年もかけて大きく前進してきた。然しながら、殆どの手法は、大きいサンプルサイズ又はキナーゼ構造の先験的知識を必要とする。チャーチオ（Ｃｉａｃｃｉｏ）らは、最近、マイクロウェスタンアレイで特異的ホスホ抗体を使用して、ＥＧＦによる刺激後、癌細胞系で６７種のタンパク質上の９１ヵ所のホスホ部位を測定したと報告した。（非特許文献１１）。然しながら、この方法は、抗体結合部位及びリン酸化状態の選択次第で偏りを生じる可能性がある。
【０００９】
ウィッシング（Ｗｉｓｓｉｎｇ）らは、固定化捕獲リガンドとして構造上異なるキナーゼリガンドを有するアフィニティーマトリックスを含有する４個の連続したカラムの使用を報告した。（非特許文献１２）。サンプルの充填及び洗浄の後、カラムを取り外して、カラム特異的溶出手順によりタンパク質を放出させた（対応する遊離の阻害剤を使用した）。ウィッシング（Ｗｉｓｓｉｎｇ）らは、細胞系を分析し、約１０９個の細胞を必要とした。ダウプ（Ｄａｕｂ）らは、３個の連続したカラムで識別可能なオーバーラップしたキナーゼ結合プロファイルを有する５つの異なる固定化キナーゼ阻害剤の使用を報告した（ＶＩ１６８３２、ビスインドイルマレイミド−Ｘ、ＡＸ１４５９６、ＳＵ６６６８、及びプルバラノールＢ。（非特許文献１３）。バンチェフ（Ｂａｎｔｓｃｈｅｆｆ）らは、サンプルと７種の固定化阻害剤ビーズ（キノビーズ）との同時接触及び遊離の阻害剤又は対象の化合物による溶出を報告した。（非特許文献１４）、補遺の方法、２頁、約５ｍｇのタンパク質、（特許文献２）、ドリュース（Ｄｒｅｗｅｓ）ら、４３頁、５０ｍｇのタンパク質、ビーズからの溶出手順、７９頁。
【００１０】
然しながら、これまでの研究は殆どすべて、実際の組織サンプルではなく継代された細胞又は細胞系を用いて行われてきた。細胞及び／又は不死化細胞系の継代に伴う変化は、それらの有用性を低減するアーチファクトを形成する。（非特許文献１５）。所要のサンプル量が理由で、以上の第７節に記載の方法は、ヒト組織由来の少量サンプルの分析に適していないので、患者の生検由来のサンプルの臨床使用に利用できない。
【００１１】
２．３．  標的化癌治療
残念ながら、殆どのキノームの機能は、特に実際のヒト又は動物のサンプルでは、依然として不明である。フェドロフ（Ｆｅｄｏｒｏｖ）らが報告したように、「学術研究は、主に細胞シグナル伝達での役割が十分に確立されたキナーゼに偏っており」、キノームの約５０％は、殆ど特徴付けられていない。（非特許文献１６）。新規なキナーゼ阻害剤組合せ治療を合理的に考案するには、経路での１つ又は少数のキナーゼに及ぼす阻害剤の効果を単に測定するだけではなく、キノーム活性に関する詳細な知識が必要とされる。
【００１２】
更に、腫瘍細胞が単一の阻害剤の作用を回避して耐性の発生を促進した場合、分子標的化癌治療は、失敗する可能性がある。後天的又は選択的な突然変異により治療用キナーゼ阻害剤に対する親和性が低下する可能性があるが、それだけでなく、高特異的阻害剤の作用を回避する代替的キナーゼ活性化により耐性が発生する。（非特許文献１７）、（非特許文献１８）、（非特許文献１９）、（非特許文献２０）、（非特許文献２１）、（非特許文献２２）。これらの知見から、治療に成功するには、複数のキナーゼの阻害が必要となり得ることが示唆される。
【００１３】
２．４．  膵臓癌治療
膵臓癌に対する効果的治療を見いだすことは、依然として殆ど克服不能な問題である。他の癌では標的化治療でかなりの成功を収めているが、膵臓癌に対する開発は、失望するほど遅れてきた。小分子表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤エルロチニブが２００５年にＦＤＡで承認されたにもかかわらず、エルロチニブが広く受け入れられてこなかったので、ゲムシタビンは、単剤又は伝統的化学治療剤の組合せとして、依然として標準治療を構成する。（非特許文献２３）。最近、インスリン様増殖因子１レセプターＩＧＦ１Ｒ（ガニツマブ）又はスムーズンド（サリデゲニブ）（両方とも大きな前臨床的有望性を有すると感じられた）を目指した治療を含めて、他の失望させられる失敗が起こった。（非特許文献２４）。臨床試験の為に作用剤を前臨床的に精査するより良好な手段が必要とされていることは、明らかである。
【００１４】
細胞増殖、繁殖、移動、及び生存を促進する上で重要な役割を果たすプロテインキナーゼは、依然として癌治療の為の最も扱い易い標的である。膵臓癌のほぼ９０％は、催腫瘍性Ｒａｓ突然変異を有するが、キナーゼ突然変異を活性化するものが比較的少数存在する。原発性及び転移性の膵臓癌に関する全エキソーム配列決定研究では、突然変異を有するキナーゼ遺伝子は、僅か２つしか見出されていない（すべての突然変異の３％未満）。（非特許文献２５）、（非特許文献２６）。乳癌での７６個のキナーゼ遺伝子及び肺癌での１４１個のキナーゼ遺伝子の突然変異と比較して、膵臓癌突然変異は、稀である。（非特許文献２７）、（非特許文献２８）。突然変異的活性化キナーゼは、幾つかの癌の「アキレス腱」の最良の例であったが、キナーゼは、遺伝子増幅（例えばＨｅｒ２）又は染色体転座（例えばＢｃｒ−Ａｂｌ）により活性化され得ることを示す証拠が増加している。過剰発現、遺伝子融合、又はトランケーションにより活性化されたキナーゼは、依然としてキナーゼ阻害剤治療の影響を受け得る。（非特許文献２９）。これの最良の例の１つは、ＨＥＲ２増幅乳癌の治療の為のトラスツズマブ及び他の作用剤の成功である。それに加えて、一部の非小細胞肺癌は、ＥＧＦＲ突然変異が存在しなくても小分子ＥＧＦＲ阻害剤に対する反応を示す。更に、４８，１７８通りの薬剤−細胞系の組合せの最近の研究では（薬剤感受性のゲノムマーカーの同定を目指して研究された）、かなりの数の潜在的な薬剤−細胞系の組合せが、突然変異又はゲノムとの明確な関連を有していないことが実証された。（非特許文献３０）。例えば、ゲノム改変では、何故ＲＣＣ細胞系（キナーゼ突然変異が一般的でない他の癌）が複数のＳＲＣキナーゼ阻害剤に感受性であったのかを説明できないことが判明した。
【００１５】
現在、１３０種超のキナーゼ特異的阻害剤が様々な疾患に対して第１〜３相臨床試験中であることから、癌のサブタイプに対する組合せ治療の開発は、極めて扱い易い目標となる筈である。現在、阻害剤に反応するキノームの動的活性を効果的に規定するのに利用可能な機構は、存在しない。そのような技術を用いてグローバルなキノーム挙動及び１種又は複数種の小分子阻害剤に対するその反応を評価できれば、疾患を治療する為の新しい効果的な治療法がもたらされるであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国仮特許出願第６１／５４６，３９９号明細書
【特許文献２】国際公開第２００６／１３４０５６号パンフレット
【特許文献３】米国特許第５，６５４，１７６号明細書
【特許文献４】米国特許第７，５９５，１９８号明細書
【特許文献５】国際公開第２００６／１３４０５６号パンフレット
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１０／０２７９８９１号明細書
【特許文献７】米国特許第５，０１０，１７５号明細書
【特許文献８】米国特許第６，０７５，１２１号明細書
【特許文献９】米国特許第６，０６０，５９６号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，８５８，６７０号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，２８８，５１４号明細書
【特許文献１２】米国特許第５，５３９，０８３号明細書
【特許文献１３】米国特許第５，５９３，８５３号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，５６９，５８８号明細書
【特許文献１５】米国特許第５，５４９，９７４号明細書
【特許文献１６】米国特許第５，５２５，７３５号明細書
【特許文献１７】米国特許第５，５１９，１３４号明細書
【特許文献１８】米国特許第５，５０６，３３７号明細書
【特許文献１９】米国特許第５，２８８，５１４号明細書
【特許文献２０】国際公開第２００５０３０１４０Ａ２号パンフレット
【特許文献２１】国際公開第２００７００２１５７Ａ２号パンフレット
【特許文献２２】英国特許第９６６０８３号明細書
【特許文献２３】米国特許第３１９８７６３号明細書
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】マニング（Ｍａｎｎｉｎｇ）ら著、２００２年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２９８巻、ｐ．１９１２〜１９３４
【非特許文献２】シー（Ｓｈｉ）著、２００９年、セル（Ｃｅｌｌ）、第１３９巻、ｐ．４６８〜４８４
【非特許文献３】ジャンヌ（Ｊａｎｎｅ）ら著、２００９年、ネイチャー・レビューズ・ドラッグ・ディスカバリー（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．）、第８巻、ｐ．７０９〜７２３
【非特許文献４】レビツキー（Ｌｅｖｉｔｚｋｉ）及びクライン（Ｋｌｅｉｎ）著、２０１０年、モレキュラー・アスペクツ・オブ・メディスン（Ｍｏｌ．Ａｓｐｅｃｔｓ  Ｍｅｄ．）、第３１巻、ｐ．２８７〜３２９
【非特許文献５】メラー（Ｍｅｌｌｏｒ）ら著、２０１１年、トキシコロジカル・サイエンスイズ（Ｔｏｘ．Ｓｃｉ．）、第１２０巻、第１号、ｐ．１４〜３２
【非特許文献６】アマド（Ａｍａｄｏ）ら著、２００８年、ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ）、第２６巻、第１０号、ｐ．１６２６〜１６３４
【非特許文献７】アレグラ（Ａｌｌｅｇｒａ）ら著、２００９年、ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ）、第２７巻、ｐ．２０９１〜２０９６
【非特許文献８】シャー（Ｓｈａｈ）ら著、２０１１年、ランセット・オンコロジー（Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ）、第１２巻、ｐ．１００４〜１０１２
【非特許文献９】ショー（Ｓｈａｗ）ら著、２００９年、ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ）、第２７巻、ｐ．４２４７〜４２５３
【非特許文献１０】チャプマン（Ｃｈａｐｍａｎ）ら著、２０１１年、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディスン（ＮＥＪＭ）、第３６４巻、ｐ．２５０７〜２５１６
【非特許文献１１】チャーチオ（Ｃｉａｃｃｉｏ）ら著、２０１０年、ネイチャー・メソッズ（Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．）、第７巻、第２号、ｐ．１４８〜１５７
【非特許文献１２】ウィッシング（Ｗｉｓｓｉｎｇ）ら著、２００７年、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（ＭＣＢ）、ｐ．５３７〜５４７、図１
【非特許文献１３】ダウプ（Ｄａｕｂ）ら著、２００８年、モレキュラー・セル（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ）、第３１巻、ｐ．４３８〜４４８、図１Ｂ
【非特許文献１４】バンチェフ（Ｂａｎｔｓｃｈｅｆｆ）ら著、２００７年、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、第２５巻、第９号、ｐ．１０３５〜１０４４
【非特許文献１５】スタベレン（Ｓｔａｖｅｒｅｎ）ら著、２００９年、バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ・レビュー・オン・キャンサー（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ）、第１７９５巻、第２号、ｐ．９２〜１０３
【非特許文献１６】フェドロフ（Ｆｅｄｏｒｏｖ）ら著、２０１０年、ネイチャー・ケミカル・バイオロジー（Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．）、第６巻、ｐ．１６６〜１６９
【非特許文献１７】チャンダーラパティー（Ｃｈａｎｄａｒｌａｐａｔｙ）ら著、２０１１年、キャンサー・セル（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ）、第１９巻、ｐ．５８〜７１
【非特許文献１８】ホッホグレーフェ（Ｈｏｃｈｇｒａｅｆｅ）ら著、２０１０年、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第７０巻、ｐ．９３９１〜９４０１
【非特許文献１９】ヨハンセン（Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ）ら著、２０１０年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第４６８巻、ｐ．９６８〜９７２
【非特許文献２０】ナザリアン（Ｎａｚａｒｉａｎ）ら著、２０１０年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第４６８巻、ｐ．９７３〜９７７
【非特許文献２１】サン（Ｓｕｎ）ら著、２０１１年、キャンサー・セル（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ）、第１８巻、ｐ．６８３〜６９５
【非特許文献２２】ビリャヌエバ（Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ）ら著、２０１０年、キャンサー・セル（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ）、第１８巻、ｐ．６８３〜６９５
【非特許文献２３】ムーア（Ｍｏｏｒｅ）ら著、２００５年、ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ）、第２３巻、ｐ．１
【非特許文献２４】イエー（Ｙｅｈ）ら著、２００７年、エキスパート・オピニオン・オン・セラピューティック・ターゲッツ（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ）、第１１巻、ｐ．６７３〜６９４
【非特許文献２５】ヤチダ（Ｙａｃｈｉｄａ）ら著、２０１０年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第４６７巻、ｐ．１１１４〜１１１７
【非特許文献２６】ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら著、２００８年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第３２１巻、ｐ．１８０１〜１８０６
【非特許文献２７】スティーブンス（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ）ら著、２００５年、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ）、第３７巻、ｐ．５９０〜５９２
【非特許文献２８】デービス（Ｄａｖｉｅｓ）ら著、２００５年、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）、第６５巻、ｐ．７５９１〜７５９５
【非特許文献２９】マックデルモット（ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ）ら著、２００９年、ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ）、第２７巻、ｐ．５６５０〜５６５９
【非特許文献３０】ガーネット（Ｇａｒｎｅｔｔ）ら著、２０１２年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第４８３巻、ｐ．５７０〜５７５
【非特許文献３１】マニング（Ｍａｎｎｉｎｇ）ら著、２００２年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２９８巻、ｐ．１９１２〜１９３４
【非特許文献３２】ブロックマン（Ｂｒｏｅｋｍａｎ）ら著、２０１１年、ワールド・ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ）、第２巻、第２号、ｐ．８０〜９３
【非特許文献３３】グラビナ（Ｇｒａｖｉｎａ）ら著、２０１０年、モレキュラー・キャンサー（Ｍｏｌ  Ｃａｎ）、第９巻、ｐ．３０５、２０１０年１１月２５日
【非特許文献３４】ジャンヌ（Ｊａｎｎｅ）ら著、２００９年、ネイチャー・レビューズ・ドラッグ・ディスカバリー（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ）、第８巻、ｐ．７０９〜７２３
【非特許文献３５】レビツキー（Ｌｅｖｉｔｚｋｉ）及びクライン（Ｋｌｅｉｎ）著、２０１０年、モレキュラー・アスペクツ・オブ・メディスン（Ｍｏｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  Ｍｅｄ）、第３１巻、ｐ．２８９〜３２９
【非特許文献３６】クリング（Ｋｌｉｎｇ）著、２０１０年、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、第２８巻、第１２号、ｐ．１２３６〜１２３８
【非特許文献３７】マロッタ（Ｍａｒｏｔｔａ）ら著、２０１１年、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ）、第１２１巻、第７号、ｐ．２７２３−２７３５
【非特許文献３８】オット（Ｏｔｔ）及びアダムス（Ａｄａｍｓ）著、２０１１年、イムノテラピー（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）、第３巻、第２号、ｐ．２１３〜２２７
【非特許文献３９】リチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）ら著、２０１１年、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー（Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ）、第１５２巻、第４号、ｐ．３６７〜３７９
【非特許文献４０】ラスチャク（Ｒｕｓｃｈａｋ）ら著、２０１１年、ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・インスティチュート（Ｊ  Ｎａｔ  Ｃａｎｃ  Ｉｎｓｔ）、第１０３巻、第１３号、ｐ．１００７〜１０１７
【非特許文献４１】ツルン（Ｔｈｕｒｎ）ら著、２０１１年、フューチャー・オンコロジー（Ｆｕｔ  Ｏｎｃｏｌ）、第７巻、第２号、ｐ．２６３〜２８３
【非特許文献４２】ベヌゴパル（Ｖｅｎｕｇｏｐａｌ）及びエバンス（Ｅｖａｎｓ）著、２０１１年、カレント・メディカル・ケミストリー（Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ）、第１８巻、第１１号、ｐ．１６５８〜１６７１
【非特許文献４３】ホイッタカー（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）ら著、２０１０年、オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、第４９巻、ｐ．４９８９〜５００５
【非特許文献４４】チャン（Ｚｈａｎｇ）ら著、２００９年、ネイチャー・レビューズ・キャンサー（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ）、第９巻、ｐ．２８〜３９
【非特許文献４５】チャン（Ｚｈａｎｇ）著、２０１１年、ネイチャー・メディスン（Ｎａｔ  Ｍｅｄ）、第１７巻、第４号、ｐ．４６１〜４７０
【非特許文献４６】マニュアル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、デニスＡ．キャシアトー（Ｄｅｎｎｉｓ  Ａ．Ｃａｓｃｉａｔｏ）及びバリーＢ．ロウィッツ（Ｂａｒｒｙ  Ｂ．Ｌｏｗｉｔｚ）編、第４巻、２０００年７月１５日、リトル・ブラウン・アンド。カンパニー（Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、米国
【非特許文献４７】ローレンス（Ｌａｗｒｅｎｃｅ）ら著、２００１年、ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ）、第１９巻、ｐ．２７５４〜６３
【非特許文献４８】ファビアン（Ｆａｂｉａｎ）ら著、１９９３年、ジャーナル・オブ・セルラー・バイオケミストリー（Ｊ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ）、第１７Ｇ巻、ｐ．１５３〜１６０
【非特許文献４９】ボーナー（Ｂｏｅｒｎｅｒ）ら著、１９９９年、キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ）、第８７巻、第１号、ｐ．１９〜２４
【非特許文献５０】ロッテン（Ｒｏｔｔｅｎ）ら著、１９９３年、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・オブステトリクス・アンド・ギネコロジー・アンド・リプロダクティブ・バイオロジー、第４９巻、第３号、ｐ．１７５〜８６
【非特許文献５１】クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら著、２００２年、エンバイロンメンタル・アンド・モレキュラー・ミュータジェネシス（Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｏｌ  Ｍｕｔａｇｅｎ）、第３９巻、ｐ．１２７〜１３３
【非特許文献５２】グリーンバウム（Ｇｒｅｅｎｅｂａｕｍ）ら著、１９８４年、アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・パソロジー（Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ）、第８２巻、第５号、ｐ．５５９−６４
【非特許文献５３】デベロー（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ）ら著、２００２年、ガストロインテスティナル・エンドスコピー（Ｇａｓｔｏｒｉｎｔｅｓｔ．Ｅｎｄｏｓｃ．）、第５６巻、ｐ．３９７〜４０１
【非特許文献５４】ロセル（Ｒｏｓｅｌｌ）ら著、１９９８年、ヨーロピアン・レスピラトリー・ジャーナル（Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．）、第１２巻、第６号、ｐ．１４１５−８
【非特許文献５５】ヒューナーバイン（Ｈｕｎｅｒｂｅｉｎ）ら著、１９９８年、ジャーナル・オブ・ソラシック・アンド・カーディオバスキュラー・サージェリー（Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇｅ．）、第１１６巻、第４号、ｐ．５５４−９
【非特許文献５６】クバレ（Ｋｖａｌｅ）著、１９９６年、チェスト・サージェリー・クリニックス・オブ・ノース・アメリカ（Ｃｈｅｓｔ  Ｓｕｒｇ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．）、第６巻、ｐ．２０５−２２
【非特許文献５７】カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）ら著、１９８２年、ウロロジー（Ｕｒｏｌｏｇｙ）、第１９巻、第６号、ｐ．５８７〜９１
【非特許文献５８】ホップ（Ｈｏｐｐ）ら著、１９８８年、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、第６巻、ｐ．１２０４〜１２１０
【非特許文献５９】ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら著、１９８４年、セル（Ｃｅｌｌ）、第３７巻、ｐ．７６７
【非特許文献６０】チョン（Ｃｈｏｎｇ）ら著、１９９７年、ジーン（Ｇｅｎｅ）、第１９２巻、第２号、ｐ．２７１〜２８１
【非特許文献６１】ゲンツ（Ｇｅｎｔｚ）ら著、１９８９年、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ）、第８６巻、ｐ．８２１−８２４
【非特許文献６２】ナカニシ（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ）ら著、２００８年、カレント・プロテオミクス（Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）、第５巻、ｐ．１６１〜１７５
【非特許文献６３】マックデルモット（ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ）ら著、２００９年、ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ）、第２７巻、第３３号、ｐ．５６５０〜５６５９
【非特許文献６４】セッセル（Ｓｅｓｓｅｌ）及びフェルナンデズ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ）著、２０１１年、カレント・トピックス・イン・メディシナル・ケミストリー（Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ）、第１１巻、ｐ．７８８〜７９９
【非特許文献６５】フォース（Ｆｏｒｃｅ）及びコロジャ（Ｋｏｌｏｊａ）著、２０１１年、ネイチャー・レビューズ・ドラッグ・ディスカバリー（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ）、第１０巻、第２号、ｐ．１１１〜１２５
【非特許文献６６】メラー（Ｍｅｌｌｏｒ）ら著、２０１１年、トキシコロジカル・サイエンスイズ（Ｔｏｘ  Ｓｃｉ）、第１２０巻、第１号、ｐ．１４〜３２
【非特許文献６７】マニング（Ｍａｎｎｉｎｇ）ら著、２００２年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２９８巻、ｐ．１９１２〜１９１８
【非特許文献６８】デローズ（ＤｅＲｏｓｅ）ら著、２０１１年、ネイチャー・メディスン（Ｎａｔ  Ｍｅｄ）、第１７巻、ｐ．１５１４〜１５２０
【非特許文献６９】ドン（Ｄｏｎｇ）ら著、２０１０年、クリニカル・キャンサー・リサーチ（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）、第１６巻、ｐ．１４４２〜１４５１
【非特許文献７０】ヒダルゴ（Ｈｉｄａｌｇｏ）ら著、２０１１年、モレキュラー・キャンサー・セラピューティクス（Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ）、第１０巻、第８号、ｐ．１３１１〜１３１６
【非特許文献７１】ガーバー（Ｇｅｒｂｅｒ）ら著、２００３年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第１００巻、ｐ．６９４０〜６９４５
【非特許文献７２】マン（Ｍａｎｎ）ら著、２００１年、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）、第７０巻、ｐ．４３７〜４７３
【非特許文献７３】ウィッシング（Ｗｉｓｓｉｎｇ）ら著、２００７年、モレキュラー・アンド・セルラー・プロテオミクス（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏ）、第６巻、ｐ．５３７〜５４７
【非特許文献７４】ガーバー（Ｇｅｒｂｅｒ）ら著、２００３年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第１００巻、ｐ．６９４０−６９４５
【非特許文献７５】パトリセリ（Ｐａｔｒｉｃｅｌｌｉ）ら著、２０１１年、ケミストリー・アンド・バイオロジー（Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ）、第１８巻、ｐ．６９９〜７１０
【非特許文献７６】パトリセリ（Ｐａｔｒｉｃｅｌｌｉ）ら著、２００７年、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ）、第４６巻、ｐ．３５０〜３５８
【非特許文献７７】ステマン（Ｓｔｅｍｍａｎｎ）ら著、２００１年、セル（Ｃｅｌｌ）、２００１年、第１０７巻、ｐ．７１５−７２６
【非特許文献７８】ウー（Ｗｕ）ら著、２００６年、ジャーナル・オブ・プロテオミック・リサーチ（Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ）、第５巻、ｐ．６５１〜６５８
【非特許文献７９】バンチェフ（Ｂａｎｔｓｃｈｅｆｆ）ら著、２００７年、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、第２５巻、第９号、ｐ．１０３５〜１０４４
【非特許文献８０】ロス（Ｒｏｓｓ）ら著、２００４年、モレキュラー・アンド・セルラー・プロテオミクス（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏ）、第３巻、ｐ．１１５４〜１１６９
【非特許文献８１】ハルト（Ｈａｒｄｔ）ら著、２００８年、サーモ・サイエンティフィック・アプリケーション・ノート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏｔｅ）：４５１
【非特許文献８２】クーン（Ｋｕｈｎ）ら著、２００４年、プロテオミクス（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）、第４巻、ｐ．１１７５〜１１８６
【非特許文献８３】ダウプ（Ｄａｕｂ）ら著、２００８年、モレキュラー・セル（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ）、第３１巻、ｐ．４３８〜４４８
【非特許文献８４】オング（Ｏｎｇ）ら著、２００２年、モレキュラー・アンド・セルラー・プロテオミクス（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏ）、第１巻、ｐ．３７６〜３８６
【非特許文献８５】ガイガー（Ｇｅｉｇｅｒ）ら著、２０１０年、ネイチャー・メソッズ（Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ）、第７巻、第５号、ｐ．３８３〜３８７
【非特許文献８６】ガイガー（Ｇｅｉｇｅｒ）ら著、２０１１年、ネイチャー・プロトコルズ（Ｎａｔ  Ｐｒｏｔ）、第６巻、第２号、ｐ．１４７〜１５７
【非特許文献８７】ティングホルム（Ｔｈｉｎｇｈｏｌｍ）ら著、２００６年、ネイチャー・プロトコルズ（Ｎａｔ  Ｐｒｏｔ）、第１巻、第４号、ｐ．１９２９〜１９３５
【非特許文献８８】シュテインベルグ（Ｓｈｔｅｙｎｂｅｒｇ）ら著、２０１１年、モレキュラー・アンド・セルラー・プロテオミクス（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）、第１０巻、Ｍ１１１．００７６９０、ｐ．１〜１５
【非特許文献８９】ケラー（Ｋｅｌｌｅｒ）ら著、２００２年、アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．）、第７４巻、ｐ．５３８３〜５３９２
【非特許文献９０】タナー（Ｔａｎｎｅｒ）ら著、２００５年、アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ）、第７７巻、ｐ．４６２６〜４６３９
【非特許文献９１】マスコット（Ｍａｓｃｏｔ）、パーキンス（Ｐｅｒｋｉｎｓ）ら著、１９９９年、エレクトロフォレシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、第２０巻、ｐ．３５５１〜３５６７
【非特許文献９２】タブ（Ｔａｂｂ）ら著、２００７年、ジャーナル・オブ・プロテオミック・リサーチ（Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ）、第６巻、ｐ．６５４〜６６１
【非特許文献９３】ゲール（Ｇｅｅｒ）ら著、２００４年、ジャーナル・オブ・プロテオミック・リサーチ（Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ）、第３巻、ｐ．９５８〜９６４
【非特許文献９４】エング（Ｅｎｇ）ら著、１９９４年、ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ソサイエティー・フォー・マス・スペクトロメトリー（Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ）、第１７巻、ｐ．２３１０〜２３１６
【非特許文献９５】クレイグ（Ｃｒａｉｇ）ら著、２００３年、ラピッド・コミュニケーション・イン・マス・スペクトロメトリー（Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ）、第１７巻、ｐ．２１３０〜２３１６
【非特許文献９６】イボクウェ（Ｉｇｂｏｋｗｅ）ら著、２０１１年、アーカイブス・オブ・パソロジー・アンド・ラボラトリー・メディスン（Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ）、第１３５巻、ｐ．６７〜８２
【非特許文献９７】モンゾン（Ｍｏｎｚｏｎ）及びクン（Ｋｏｅｎ）著、２０１０年、（アーカイブス・オブ・パソロジー・アンド・ラボラトリー・メディスン（Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ）、第１３４巻、ｐ．２１６〜２２４
【非特許文献９８】フルカ（Ｆｕｒｋａ）著、１９９１年、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・アンド・プロテイン・リサーチ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．）、第３７巻、ｐ．４８７−４９３
【非特許文献９９】ホートン（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ）ら著、１９９１年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３５４巻、ｐ．８４−８８
【非特許文献１００】ホッブズ（Ｈｏｂｂｓ）ら著、１９９３年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第９０巻、ｐ．６９０９〜６９１３
【非特許文献１０１】ハギハラ（Ｈａｇｉｈａｒａ）ら著、１９９２年、ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、第１１４巻、ｐ．６５６８
【非特許文献１０２】（ヒルシュマン（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ）ら著、１９９２年、ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、第１１４巻、ｐ．９２１７〜９２１８）
【非特許文献１０３】チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、１９９４年、ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、第１１６巻、ｐ．２６６１（１９９４）
【非特許文献１０４】チョー（Ｃｈｏ）ら著、１９９３年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２６１巻、ｐ．１３０３の（１９９３）
【非特許文献１０５】（キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）ら著、１９９４年、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、第５９巻、ｐ．６５８）
【非特許文献１０６】ボーン（Ｖａｕｇｈｎ）ら著、１９９６年、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．）、第１４巻、第３号、ｐ．３０９−３１４
【非特許文献１０７】リャン（Ｌｉａｎｇ）ら著、１９９６年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２７４巻、ｐ．１５２０−１５２２
【非特許文献１０８】ボーム（Ｂａｕｍ）著、１９９３年、ケミカル・アンド・エンジニアリング・ニュース（Ｃ＆ＥＮ）、１月１８日、ｐ．３３
【非特許文献１０９】ムソリノ（Ｍｕｓｏｌｉｎｏ）ら著、２０１０年、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．）、第８４巻、ｐ．４６３〜４７３
【非特許文献１１０】イッサ（Ｉｓｓａ）著、２０１０年、ヘマトロジー／オンコロジー・クリニックス・オブ・ノース・アメリカ（Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．）、第２４巻、第２号、ｐ．３１７〜３３０
【非特許文献１１１】ハウエル（Ｈｏｗｅｌｌ）ら著、２００９年、キャンサー・コントロール（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）、第１６巻、第３号、ｐ．２００〜２１８
【非特許文献１１２】マークス（Ｍａｒｋｓ）及びブレスロー（Ｂｒｅｓｌｏｗ）著、２００７年、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．）、第２５巻、第１号、ｐ．８４〜９０
【非特許文献１１３】ノーマン（Ｎａｕｍａｎ）ら著、２００８年、ケムバイオケム（ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ）、第９巻、ｐ．１９４〜１９７
【非特許文献１１４】メディナ−フランコ（Ｍｅｄｉｎａ−Ｆｒａｎｃｏ）ら著、２０１０年、モレキュラー・ダイバーシティー（Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．）、第１５巻、第２号、ｐ．２９３−３０４
【非特許文献１１５】オルセン（Ｏｌｓｅｎ）及びガディリ（Ｇｈａｄｉｒｉ）著、２００９年、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．）、第５２巻、第２３号、ｐ．７８３６〜７８４６
【非特許文献１１６】ニシノ（Ｎｉｓｈｉｎｏ）ら著、２００６年、アメリカン・ペプチド・シンポジウム（Ａｍｅｒ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐ．）、第９巻、第７号、ｐ．３９３〜３９４
【非特許文献１１７】ダーディック（Ｄａｒｄｉｃｋ）ら著、２００７年、プラント・フィジオロジー（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、第１４３巻、第２号、ｐ．５７９〜５８６
【非特許文献１１８】リッツェマ（Ｒｉｔｓｅｍａ）ら著、２００７年、プラント・メソッズ（Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、第３巻、第３号、ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４６−４８１１−３−３
【非特許文献１１９】ビアンチ（Ｂｉａｎｃｈｉ）ら著、２００９年、アンチキャンサー・ドラッグス（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ）、第２０巻、ｐ．６１６〜６２４
【非特許文献１２０】フィン（Ｆｉｎｎ）ら著、２００９年、ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ）、第２７巻、ｐ．３９０８〜３９１５
【非特許文献１２１】リット（Ｒｉｔｔ）ら著、２０１０年、モレキュラー・セル・バイオロジー（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ）、第３０巻、ｐ．８０６〜８１９
【非特許文献１２２】サンドリン・マルチェット（Ｓａｎｄｒｉｎｅ  Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ）ら著、２００５年、モレキュラー・セル・バイオロジー（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ）、第２５巻、ｐ．８５４〜８６４
【非特許文献１２３】シアーズ（Ｓｅａｒｓ）ら著、２０００年、ジーンズ・アンド・ディベロップメント（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌ）、第１４巻、ｐ．２５０１〜２５１４
【非特許文献１２４】マランポン（Ｍａｒａｍｐｏｎ）ら著、２００６年、モレキュラー・キャンサー（Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ）、第５巻、ｐ．２〜１７
【非特許文献１２５】ウィアストラ（Ｗｉｅｒｓｔｒａ）及びアルベス（Ａｌｖｅｓ）著、２００８年、ｃ−ｍｙｃプロモーター：未だに謎の難題（Ｔｈｅ  ｃ−ｍｙｃ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ：Ｓｔｉｌｌ  ＭｙｓｔｅｒＹ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）、癌研究の進歩（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ｆ．Ｖ．Ｗ．ジョージ（Ｆ．Ｖ．Ｗ．Ｇｅｏｒｇｅ）及びＫ．ジョージ（Ｋ．Ｇｅｏｒｇｅ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ｐ．１１３〜３３３
【非特許文献１２６】オスター（Ｏｓｔｅｒ）ら著、２０００年、モレキュラー・セル・バイオロジー（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ）、第２０巻、ｐ．６７６８〜６７７８
【非特許文献１２７】クラマン（Ｋａｒａｍａｎ）ら著、２００８年、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、第２６巻、ｐ．１２７〜１３２
【非特許文献１２８】ギルマーチン（Ｇｉｌｍａｒｔｉｎ）ら著、２０１１年、クリニカル・キャンサー・リサーチ（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）、第１７巻、ｐ．９８９〜１０００
【非特許文献１２９】オッパーマン（Ｏｐｐｅｒｍａｎｎ）ら著、２００９年、モレキュラー・アンド・セルラー・プロテオミクス（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏ）、第８巻、ｐ．１７５１〜１７６４
【非特許文献１３０】アミンら著、２０１０年、サイエンス・トランスレーショナル・メディスン（Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ）、第２巻、１６ｒａ１７
【非特許文献１３１】クルチョコ（Ｋｌｕｔｃｈｋｏ）ら著、１９９８年、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ）、第４１巻、ｐ．３２７６〜３２９２
【非特許文献１３２】ダウプ（Ｄａｕｂ）ら著、２００８年）ダサチニブ（ダス（Ｄａｓ）ら著、２００６年、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ）、第４９巻、ｐ．６８１９〜６８３２
【非特許文献１３３】バーカー（Ｂａｒｋｅｒ）ら著、２００１年、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レターズ（Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔ）、第１１巻、ｐ．１９１１〜１９１４
【非特許文献１３４】ガラガー（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ）ら著、１９９７年、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー（Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ）、第５巻、ｐ．４９〜６４
【非特許文献１３５】ツァイ（Ｔｓａｉ）ら著、２００８年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ））、第１０５巻、第８号、ｐ．３０４１−３０４６
【非特許文献１３６】キング（Ｋｉｎｇ）ら著、２００６年、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）、第６６巻、第２３）号、ｐ．１１１００〜５
【非特許文献１３７】カイ（Ｃａｉ）ら著、２０１０年、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ）、第５３巻、ｐ．２０００〜２００９
【非特許文献１３８】米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、２００８年、第１３０巻、第５１号、ｐ．１７５６８〜１７５７４
【非特許文献１３９】ダウプ（Ｄａｕｂ）ら著、モレキュラー・セル（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ）、２００８年、第３１巻、ｐ．４３８〜４４８
【非特許文献１４０】ラングミード（Ｌａｎｇｍｅａｄ）ら著、２００９年、ゲノム・バイオロジー（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第１０巻、Ｒ２５
【非特許文献１４１】モータザビ（Ｍｏｒｔａｚａｖｉ）ら著、２００８年、ネイチャー・メソッズ（Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、第５巻、ｐ．６２１〜６２８
【非特許文献１４２】ティングホルム（Ｔｈｉｎｇｈｏｌｍ）ら著、２００６年、ネイチャー・プロトコルズ（Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌａ）、第１巻、ｐ．１９２９〜１９３５
【非特許文献１４３】シュテインベルグ（Ｓｈｔｅｙｎｂｅｒｇ）ら著、２０１１年、モレキュラー・アンド・セルラー・プロテオミクス（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）、第１０巻、Ｍ１１１．００７６９０、ｐ．１〜１５
【非特許文献１４４】ブレンデル（Ｂｅｎｄｅｌｌ）ら著、米国癌学会（ＡＡＣＲ）、第１０２回年会、２０１１年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
特定の実施形態では、本発明は、第１及び第２の層を含むマルチアナライトカラムを提供するが、この実施形態に限定されるものではない。ここで、第１の層は、特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第１の固体担体を含み、且つ第２の層は、非特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第２の固体担体を含む。
【００１９】
本発明はまた、第１及び第２の層を含むマルチアナライトカラムにサンプルを充填することであって、第１の層は、特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第１の固体担体を含み、且つ第２の層は、非特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第２の固体担体を含むことと、マルチアナライトカラムを洗浄して何れの非結合タンパク質をも除去することと、変性剤を用いて、マルチアナライトカラムに結合した何れのキナーゼをも溶出させることと、溶出されたキナーゼを検出することと、を含む、サンプル中の低存在量キナーゼの検出方法を提供する。
【００２０】
特定の実施形態では、本発明は、キナーゼ活性モジュレーターの選択方法を提供するが、この実施形態に限定されるものではない。本方法は、次の工程、即ち、細胞、組織、又は生物と化合物とを接触させる工程と、細胞、組織、又は生物からのタンパク質抽出物と、第１及び第２の層を含むマルチアナライトカラムと、を接触させる工程であって、第１の層は、特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第１の固体担体を含み、且つ第２の層は、非特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第２の固体担体を含む工程と、変性剤を用いて、固体担体に結合した何れのキナーゼをも溶出させる工程と、検出された複数のキナーゼのレベルを測定する工程と、工程（ｄ）で測定されたレベルを標準レベルと比較してキナーゼプロファイルを取得する工程と、キナーゼプロファイルを用いてキナーゼ活性モジュレーターを選択する工程と、を含む。
【００２１】
特定の実施形態では、本発明は、第１及び第２の層を有するマルチアナライトカラムであって、第１の層は、特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第１の固体担体を含み、且つ第２の層は、非特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第２の固体担体を含むマルチアナライトカラムと、癌を有する又は化学治療レジメンで治療されてきた被験体に於ける複数のキナーゼのレベルの測定に関する使用説明書と、を含むキットを提供するが、この実施形態に限定されるものではない。
【００２２】
特定の実施形態では、本発明は、以下の第５．４節に示される構造を有する化合物を提供するが、この実施形態に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】乃至
【図１Ｉ】ＴＮＢＣのキノームプロファイリングでは、ＥＲＫシグナル伝達の増大が明らかにされる。（図１Ａ）キナーゼ阻害剤組合せ治療の合理的設計の為の実験戦略。キノーム阻害剤反応シグネチャーを規定する為に、発現プロファイリングは、キナーゼ親和性捕獲及びキノーム活性化状態のＭＳ定量的評価と統合される。ＲＮＡｉは、阻害剤に対する生存反応でキナーゼ機能を分析する為に使用される。（図１Ｂ）ＴＮＢＣ患者及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系及びＳＵＭ１５９細胞系にわたりＲＮＡ−ｓｅｑにより規定されたキナーゼ発現を示すベン図。（図１Ｃ）ＴＮＢＣ患者サンプル及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系及びＳＵＭ１５９細胞系にわたりＭＩＢベースのプロテオミクスにより捕獲及び同定されたキナーゼを示すベン図。（図１Ｄ）ＴＮＢＣ患者サンプル及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系及びＳＵＭ１５９細胞系にわたる発現キナーゼ及びＭＩＢ結合キナーゼの分布及び（図１Ｅ）オーバーラップ。マニング（Ｍａｎｎｉｎｇ）らの配置及びサイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）誌に記載のポスターに基づくキノーム系統樹ＥＷ。（非特許文献３１）。ＭＩＢ／ＭＳは、ＲＮＡ配列決定により規定される発現キノームの５０〜６０％を捕獲する。プロテインキナーゼのＭＳ同定に関しては、表３を参照されたい。（図１Ｆ）ＴＮＢＣ患者の腫瘍で活性化されたＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路。ＭＩＢ／ＭＳを用いたＴＮＢＣ患者と対応する非関与乳房組織との定量的比較。線グラフは、ｉＴＲＡＱで測定されたＭＩＢ結合の定量的変化を腫瘍／非関与の比として示している。比＜１は、対照組織に対して腫瘍で低減されたキナーゼのＭＩＢ結合を表し、比＞１は、増大されたＭＩＢ結合を表す。（図１Ｇ）イムノブロッティングでは、ＴＮＢＣ細胞系及びＴＮＢＣ患者サンプルで活性化されたＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路を確認する。（図１Ｈ）ＴＮＢＣ患者の腫瘍のＲＴＫアレイ分析では、ＥＧＦＲ及びＰＤＧＦＲβを含めて、複数のＴｙｒリン酸化ＲＴＫが明らかにされる。図１（Ｉ）は、細胞タンパク質の５ｍｇ抽出物を用いて多重化阻害剤ビーズ中の各アフィニティービーズに結合したキナーゼの数を示している。具体的には、１３種のキナーゼは、Ｂｉｓ−Ｘビーズに結合し、１５種のキナーゼは、ラパチニブビーズに結合し、２６種のキナーゼは、ＳＢ２０３５８０ビーズに結合し、４６種のキナーゼは、ダサチニブビーズに結合し、８８のキナーゼは、プルバナノールＢビーズに結合し、１０４種のキナーゼは、ＰＰ５８ビーズに結合し、そして１２４種のキナーゼは、ＶＩ１６８３２ビーズに結合した。すべてのビーズ間で、１８６種のユニークなキナーゼが結合され、合計で４１６種のキナーゼが結合された（幾つかのキナーゼは、複数のビーズに結合した）。追加材料を充填すれば、キノーム（より多くのユニークなキナーゼ）のより多量の回収が可能になる。実験の詳細に関しては、第５．６．１節のビーズ設計、第６．１８節のクロマトグラフィー、第６．２２節の質量分析を参照されたい。
【図２Ａ】乃至
【図２Ｊ】ＭＥＫ阻害に反応するキノームの再プログラミング。（図２Ａ）５μＭのＡＺＤ６２４４又はＵ０１２６に反応するＳＵＭ１５９細胞の増殖阻害。トリプリケート実験＋ＳＤ。（図２Ｂ）ウェスタンブロットにより示された５μＭのＡＺＤ６２４４の連続的存在下でのＭＥＫ及びＥＲＫの再活性化。（図２Ｃ）ＥＲＫの低下は、ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路のフィードバック及び下流シグナル伝達を調節した。ＳＵＭ１５９細胞を５μＭのＡＺＤ６２４４で１２時間処理し、ＭＩＢ／ＭＳを用いてキノームリン酸化を分析した。（図２Ｄ）ＳＵＭ１５９細胞でのＭＥＫ阻害に反応するキノームの活性化及び抑制。線グラフは、ｉＴＲＡＱで測定されたＭＩＢ結合の定量的変化をＡＺＤ６２４４／ＤＭＳＯの比として示している。比＜１は、対照細胞に対して処理細胞で低減されたキナーゼのＭＩＢ結合を表し、比＞１は、増大されたＭＩＢ結合を表す。（図２Ｅ）ＭＥＫ２及びＥＲＫ１は、ＡＺＤ６２４４阻害を回避する。５μＭのＡＺＤ６２４４で４、１２、及び２４時間処理された又は５μＭのＵ０１２６で２４時間処理されたＳＵＭ１５９細胞からのＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ結合のＭＩＢ／ＭＳプロファイル。（図２Ｆ）ＭＥＫ２及びＥＲＫ１は、ＭＥＫ阻害後、生存を促進する。ＳＵＭ１５９細胞でのＭＡＰＫシグナル伝達成分のｓｉＲＮＡノックダウンは、Ｕ０１２６の存在下でＭＥＫ２の低下を示し、増殖を阻害するが、ＭＥＫ１ではそうではない。（図２Ｇ）ＳＵＭ１５９細胞でのＭＥＫ阻害に対するキノーム反応シグネチャー。ＤＭＳＯを基準にしたＳＩＬＡＣ標識ＳＵＭ１５９細胞±５μＭ  ＡＺＤ６２４４又はＵ０１２６のトリプリケートＭＩＢ／ＭＳ実験。エラーバーは、平均＋ＳＤを表し、キナーゼは、０．０５のＦＤＲで有意である。（図２Ｈ）ＭＩＢ／ＭＳ及びＲＴＫアレイにより決定されたＡＺＤ６２４４反応（薄灰色：ダウンレギュレート、暗灰色：アップレギュレート）のキノームマップ。（図２Ｉ）ＭＥＫ阻害に反応して増大されたＲＴＫのチロシンリン酸化。５μＭのＡＺＤ６２４４で２４時間処理されてＲＴＫアレイにより分析されたＳＵＭ１５９細胞。（図２Ｊ）ＭＥＫ阻害に反応する濃度依存ＲＴＫ再プログラミング。漸増用量のＡＺＤ６２４４で２４時間処理した後、ＳＵＭ１５９細胞でのＲＴＫの発現及び活性の誘導をウェスタンブロットにより測定した。
【図３Ａ】乃至
【図３Ｈ】ＡＺＤ６２４４誘導キノーム再プログラミングは、標的特異的であり、ＲＴＫ及びサイトカインの迅速安定転写のアップレギュレーションに関与する。（図３Ａ）経時的ＡＺＤ６２４４処理では、ＥＲＫが阻害されてＭＫＰ３が蓄積する初期反応が明らかにされる。長時間ＡＺＤ６２４４処理では、増大されたＲＴＫ発現及び下流生存シグナル伝達が起こり、ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達の再活性化と一致する。（図３Ｂ）４８時間の時間経過にわたりｑＲＴ−ＰＣＲにより決定された５μＭのＡＺＤ６２４４処理後のＳＵＭ１５９細胞でのＲＴＫ及び（図３Ｃ）サイトカイン遺伝子発現の時間依存増加。（図３Ｄ）５μＭのＡＺＤ６２４４でＳＵＭ１５９細胞を長期間処理すると、ＲＴＫの安定なアップレギュレーションがもたらされる。ＳＵＭ１５９細胞をＤＭＳＯ又は５μＭのＡＺＤ６２４４で４、２４、４８、又は７２時間処理し、ＲＴＫ抗体アレイを用いてＲＴＫチロシンリン酸化をＳＵＭ１５９−Ｒ細胞と比較する。（図３Ｅ）５μＭのＡＺＤ６２４４で処理すると、ウェスタンブロットにより示される活性化ループを含めて、複数の部位でＰＤＧＦＲβのリン酸化が促進される。（図３Ｆ）５μＭのＡＺＤ６２４４による安定処理後のＡＺＤ６２４４耐性ＳＵＭ１５９細胞の発生。５μＭのＡＺＤ６２４４で７２時間処理されたＳＵＭ１５９細胞と比較して細胞数により測定されたＳＵＭ１５９−Ｒ細胞の増大された細胞増殖（＊ｐ値＜０．００１）。（図３Ｇ）増大された生存シグナル伝達によるＳＵＭ１５９−Ｒ細胞のＲＴＫ再プログラミングの維持。ＤＭＳＯ又は５μＭのＡＺＤ６２４４で４時間処理されたＳＵＭ１５９細胞のキノーム再プログラミングをウェスタンブロットによりＳＵＭ１５９−Ｒ細胞と比較した。（図３Ｈ）ＡＺＤ６２４４及びＢＥＺ２３５は、キノーム反応及び増殖停止のそれらの再プログラミングに関して標的特異的である。５０ｎＭのＢＥＺ２３５によるＳＵＭ１５９細胞の処理は、ＡＺＤ６２４４とは異なるユニークなキナーゼ反応を誘発し、両方とも細胞増殖を阻害する。エラーバーは、トリプリケート実験±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図４Ａ】乃至
【図４Ｑ】ＥＲＫ１／２のＡＺＤ６２４４媒介低下は、ｃ−Ｍｙｃの急速分解、Ｍｙｃ−Ｍａｘ複合体の不安定化、及びＲＴＫ発現の促進を引き起こす。（図４Ａ）ＡＺＤ６２４４処理後のＥＲＫ１／２活性の低下は、ｃ−Ｍｙｃ分解を促進する。ＳＵＭ１５９細胞を５μＭのＡＺＤ６２４４で７２時間処理し、Ｓｅｒ６２でのｃ−ＭｙｃのＥＲＫ媒介リン酸化及びｃ−Ｍｙｃ分解をウェスタンブロットによりモニターした。（図４Ｂ）ＡＺＤ６２４４処理後のｃ−Ｍｙｃ  ＲＮＡレベルの安定抑制。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びＳＵＭ１５９細胞を５μＭのＡＺＤ６２４４で４８時間処理し、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いてｃ−Ｍｙｃ遺伝子発現を測定した。（図４Ｃ）ＡＺＤ６２４４処理後のＭｙｃ−Ｍａｘ複合体の破壊。ＳＵＭ１５９細胞を５μＭのＡＺＤ６２４４で０、４、及び７２時間処理した。核抽出物を抗Ｍａｘ抗体で免疫沈降し、抗Ｍｙｃ抗体及び抗Ｍａｘ抗体を用いて免疫ブロットした。（図４Ｄ）ｃ−ＭｙｃのＲＮＡｉノックダウンは、ＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦＲ２発現をアップレギュレートし、ＥＲＫ１／２シグナル伝達を促進する。ＳＵＭ１５９細胞をｃ−Ｍｙｃ又はＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡで７２時間トランスフェクトし、キノーム再プログラミングをウェスタンブロットにより測定した。（図４Ｅ）ＳＵＭ１５９細胞でのｃ−Ｍｙｃの７２時間ＲＮＡｉノックダウンは、ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定されるＰＤＧＦＲβ、ＶＥＧＦＲ２、及びＰＤＧＦＢ遺伝子発現をアップレギュレートする。（図４Ｆ）ＳＵＭ１５９細胞でのｃ−Ｍｙｃの７２時間ＲＮＡｉノックダウンは、ＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦＲ２リン酸化の増加を伴ってＡＺＤ６２４４処理に類似したＲＴＫチロシンリン酸化を誘発する。（図４Ｇ）ｃ−Ｍｙｃタンパク質レベルは、ＳＵＭ１５９−Ｒ細胞で部分的に回復し、一方、ＡＺＤ６２４４媒介ＲＴＫ再プログラミングは、低減されるが依然として維持される。ＳＵＭ１５９細胞を５μＭのＡＺＤ６２４４で０、４、２４、又は７２時間処理し、ＲＴＫ及びｃ−ＭｙｃレベルをウェスタンブロットによりＳＵＭ１５９−Ｒ細胞と比較した。（図４Ｈ）ＡＺＤ６２４４処理ＳＵＭ１５９細胞を基準にしたＳＵＭ１５９−Ｒ細胞での増大されたｃ−Ｍｙｃ  ＲＮＡレベル。ＳＵＭ１５９細胞をＤＭＳＯ又は５μＭのＡＺＤ６２４４で４時間処理し、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いてｃ−Ｍｙｃ遺伝子発現をＳＵＭ１５９−Ｒ細胞と比較した（＊ｐ値＜０．００１）。（図４Ｉ）ＳＵＭ１５９−Ｒ細胞での低減レベルに維持されたＡＺＤ６２４４誘導ＲＴＫ発現レベル。ＤＭＳＯ処理細胞を基準にして５μＭのＡＺＤ６２４４で２４時間処理されたＳＵＭ１５９細胞又はＳＵＭ１５９−Ｒ細胞を比較したＲＴＫ再プログラミングの遺伝子発現プロファイル。ｑＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現を測定した。（図４Ｊ）ＳＵＭ１５９−Ｒ細胞でのＲＴＫ媒介ＥＲＫ活性化により安定されたｃ−Ｍｙｃ。ＤＭＳＯ又は５μＭのＡＺＤ６２４４で２４時間処理されたＳＵＭ１５９細胞をＳＵＭ１５９−Ｒ細胞と比較して、ウェスタンブロットによりＲＴＫ再プログラミング及びｃ−Ｍｙｃレベルを測定した。（図４Ｋ）ＡＺＤ６２４４の洗浄除去は、ｃ−Ｍｙｃ  ＲＮＡレベルを回復する。７２時間にわたりＳＵＭ１５９−��細胞の培地からＡＺＤ６２４４を除去してｑＲＴ−ＰＣＲによりｃ−Ｍｙｃ  ＲＮＡレベルを測定した。（図４Ｌ）ＡＺＤ６２４４の除去の結果として、ｃ−Ｍｙｃタンパク質の安定化及びＲＴＫ再プログラミングの逆転が起こる。７２時間にわたりＳＵＭ１５９−Ｒ細胞の培地からＡＺＤ６２４４を除去して、ウェスタンブロットによりＲＴＫ再プログラミングを測定した。（図４Ｍ及び図４Ｎ）プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブを用いたｃ−Ｍｙｃタンパク質レベルの安定化は、ＡＺＤ６２４４媒介キノーム再プログラミングを防止する。ＳＵＭ１５９細胞をＡＺＤ６２４４（５μＭ）又はボルテゾミブ（３、１０、若しくは２０ｎＭ）単独又は組合せで２４時間処理した。ボルテゾミブは、ウェスタンブロット及びｑＲＴ−ＰＣＲにより示されるように、ＲＴＫのＡＺＤ６２４４依存誘導を阻止した。（図４Ｏ及び図４Ｐ）ＳＵＭ１５９−Ｒ細胞のボルテゾミブ処理は、ｃ−Ｍｙｃを安定化し、ＲＴＫ再プログラミングを逆転する。ＳＵＭ１５９−Ｒ細胞を１０ｎＭのボルテゾミブで２４時間処理し、ウェスタンブロットによりｃ−Ｍｙｃタンパク質レベル及びＲＴＫ誘導の逆転を示した。ｑＲＴ−ＰＣＲによりｃ−Ｍｙｃ及びＲＴＫの遺伝子発現レベルを測定した。（図４Ｑ）ＥＲＫ活性のＲＴＫ媒介再活性化は、ＡＺＤ６２４４の連続的存在下では完全でない。ＡＺＤ６２４４（５μＭ）をＳＵＭ１５９−Ｒ細胞の培地から１時間除去し、ウェスタンブロットによりｃ−Ｍｙｃ及びＲＳＫ１のＥＲＫ１／２リン酸化を測定した。エラーバーは、トリプリケート実験±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図５Ａ】乃至
【図５Ｉ】ＲＴＫ阻害は、相乗作用してＡＺＤ６２４４誘導増殖停止を促進する（図５Ａ）。ＡＺＤ６２４４処理細胞でのＰＤＧＦＲのＲＮＡｉノックダウンは、ＴＮＢＣ細胞系でＭＥＫ阻害誘導増殖停止を促進する。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＳＵＭ１５９で１．２５μＭのＡＺＤ６２４４の存在下又は不在下でＰＤＧＦＲβノックダウンを９６時間行い、セルタイターグロー（Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ）を用いて細胞増殖をモニターした。（図５Ｂ）ＳＵＭ１５９細胞でのＭＥＫ阻害剤反応性ＲＴＫのＲＮＡｉノックダウンは、Ｕ０１２６に反応して増殖阻害を促進する。５μＭのＵ０１２６の存在下又は不在下でＲＴＫのノックダウンを９６時間行い、セルタイターグロー（Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ）により細胞増殖を測定した。（図５Ｃ）ＡＺＤ６２４４及びソラフェニブによる共処理は、ＳＵＭ１５９細胞の細胞増殖阻害で相乗作用する。ＤＭＳＯ、ソラフェニブ、ＡＺＤ６２４４、又はＡＺＤ６２４４とソラフェニブとの組合せでＳＵＭ１５９細胞を処理し、セルタイターグロー（Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ）により細胞増殖を測定した。（図５Ｄ）ＡＺＤ６２４４とフォレチニブとの組合せによるＳＵＭ１５９細胞の処理は、増殖阻害を促進する。ＤＭＳＯ、フォレチニブ、ＡＺＤ６２４４、又はＡＺＤ６２４４とフォレチニブとの組合せでＳＵＭ１５９細胞を処理し、セルタイターグロー（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ）により細胞増殖を測定した。（図５Ｅ）ＡＺＤ６２４４とソラフェニブとの組合せは、ＡＺＤ６２４４処理単独よりも大きく細胞増殖を阻害する。ＤＭＳＯ、ソラフェニブ、ＡＺＤ６２４４、又はＡＺＤ６２４４とソラフェニブとの組合せでＳＵＭ１５９細胞を処理し、細胞計数により細胞増殖を測定した。（図５Ｆ）ソラフェニブは、ＲＴＫのＡＺＤ６２４４媒介活性化を阻害する。ＤＭＳＯ、ソラフェニブ、ＡＺＤ６２４４、又はＡＺＤ６２４４とソラフェニブとの組合せでＳＵＭ１５９細胞を７２時間処理し、ＲＴＫアレイによりＲＴＫチロシンリン酸化を測定した。（図５Ｇ）ＡＺＤ６２４４及びソラフェニブによるＳＵＭ１５９細胞の組合せ処理は、ＥＲＫ活性の阻害を促進し、アポトーシスになるように細胞を感作する。ＤＭＳＯ、ソラフェニブ、ＡＺＤ６２４４、又はＡＺＤ６２４４とソラフェニブとの組合せでＳＵＭ１５９細胞を７２時間処理し、ウェスタンブロットによりＢＩＭ、サイクリンＤ１発現、及びＥＲＫ活性を測定した。（図５Ｈ）ＥＲＫ１／２のＡＺＤ６２４４活性化は、ＲＴＫ及びＭＥＫの活性を必要とする。ＡＺＤ６２４４耐性ＳＵＭ１５９細胞でのＥＲＫ活性の阻害は、高用量（５０μＭ）ＡＺＤ６２４４処理又は低用量（５μＭ）ＡＺＤ６２４４と２５０ｎＭソラフェニブとの共処理に反応して生じる。（図５１）ＳＵＭ１５９−Ｒ細胞は、薬剤耐性にＡＺＤ６２４４誘導ＲＴＫ活性を必要とする。細胞数により測定された、２５０ｎＭのソラフェニブで７２時間処理されたＳＵＭ１５９−Ｒ細胞の阻害された細胞増殖。＊ｐ値＜０．００１、エラーバーは、トリプリケート実験±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図６Ａ】乃至
【図６Ｆ】ＴＮＢＣのＣ３ＴａｇマウスモデルでのＡＺＤ６２４４媒介キノーム再プログラミング。（図６Ａ）抗ＰＤＧＦＲβ免疫蛍光により測定されたＡＺＤ６２４４（２０ｍｇ／ｋｇ）処理Ｃ３−Ｔａｇ腫瘍でのＰＤＧＦＲ誘導。（図６Ｂ）腫瘍由来Ｃ３Ｔａｇ細胞系は、ＡＺＤ６２４４媒介ｃ−Ｍｙｃ低下及びＲＴＫ誘導を示す。５μＭのＡＺＤ６２４４で４及び２４時間処理されたＣ３Ｔａｇ細胞系並びにウェスタンブロットにより測定されたＲＴＫ再プログラミング。（図６Ｃ）Ｃ３Ｔａｇ  ＧＥＭＭでのＡＺＤ６２４４依存ＲＴＫ再プログラミングは阻害特異的である。ウェスタンブロットにより測定された、未処理Ｃ３Ｔａｇ腫瘍を基準にして２６日間ソラフェニブ（３０ｍｇ／ｋｇ）処理と比較された２８日間ＡＺＤ６２４４（２０ｍｇ／ｋｇ）処理のＣ３Ｔａｇ腫瘍でのＲＴＫ誘導。（図６Ｄ）ＡＺＤ６２４４媒介ｃ−Ｍｙｃ分解は、Ｃ３Ｔａｇ  ＧＥＭＭでＰＤＧＦＲβ発現を誘発する。ＡＺＤ６２４４（２０ｍｇ／ｋｇ）で２及び７日間処理されたＣ３Ｔａｇ腫瘍に対してｃ−Ｍｙｃタンパク質レベルを測定した。（図６Ｅ）ＡＺＤ６２４４キノーム再プログラミングは、ソラフェニブ反応とは異なる。２８日間ＡＺＤ６２４４（２０ｍｇ／ｋｇ）又は２６日間ソラフェニブ（３０ｍｇ／ｋｇ）に反応するＣ３Ｔａｇ腫瘍のＭＩＢ／ＭＳプロファイル。線グラフは、ｉＴＲＡＱで測定されたＭＩＢ結合の定量的変化を阻害剤／未処理の比として示している。比＜１は、対照腫瘍に対して処理細胞で低減されたキナーゼのＭＩＢ結合を表し、比＞１は、増大されたＭＩＢ結合を表す。（図６Ｆ）ＭＥＫ２は、ＡＺＤ６２４４阻害を回避し、一方、ＭＥＫ１は、阻害状態を維持する。未処理を基準にした、２８日間ＡＺＤ６２４４（２０ｍｇ／ｋｇ）処理のＣ３ＴａｇマウスからのＭＥＫ−ＥＲＫ結合のＭＩＢ／ＭＳプロファイル。
【図７Ａ】乃至
【図７Ｇ】ＡＺＤ６２４４とソラフェニブとの組合せは、Ｃ３Ｔａｇ  ＴＮＢＣマウスモデルでアポトーシス及び腫瘍退縮を引き起こす。（図７Ａ）ｃｈｏｗ供給のＡＺＤ６２４４又はソラフェニブは、処理の２及び７日後、Ｃ３Ｔａｇ  ＧＥＭＭでＥＲＫ活性化を引き起こす。ＡＺＤ６２４４とソラフェニブとの組合せは、ＲＴＫ媒介ＥＲＫ活性化を阻害するが、単剤では阻害しない。未処理腫瘍を基準にして、ＡＺＤ６２４４（２０ｍｇ／ｋｇ）及びソラフェニブ（３０ｍｇ／ｋｇ）単独又は組合せで処理された腫瘍で、ウェスタンブロットによりＭＥＫ阻害後のＲＴＫ再プログラミングをモニターした。（図７Ｂ）ＡＺＤ６２４４とソラフェニブとの組合せは、Ｃ３Ｔａｇ腫瘍でｃ−Ｍｙｃ分解を促進する。未処理を基準にして、ＡＺＤ６２４４（２０ｍｇ／ｋｇ）及びソラフェニブ（３０ｍｇ／ｋｇ）単独又は組合せで２日間処理された腫瘍で、ウェスタンブロットによりｃ−Ｍｙｃレベルを測定した。（図７Ｃ）ＡＺＤ６２４４とソラフェニブとを組み合わせると、Ｃ３Ｔａｇマウスの腫瘍でＰＤＧＦＲβ（Ｙ７５１）リン酸化が阻害され、サイクリンＤ１レベルが低減され、且つＢＩＭ発現が増大される。未処理を基準にして、ＡＺＤ６２４４（２０ｍｇ／ｋｇ）及びソラフェニブ（３０ｍｇ／ｋｇ）単独又は組合せで処理された腫瘍に対して、ウェスタンブロットによりＡＺＤ６２４４依存生存に及ぼすソラフェニブの効果を測定した。（図７Ｄ）ソラフェニブは、Ｃ３Ｔａｇ腫瘍由来細胞系で、ＥＲＫのＡＺＤ６２４４依存活性化を阻害して、ｃ−Ｍｙｃ分解及びサイクリンＢ１発現低下を促進する。ＤＭＳＯ、ＡＺＤ６２４４、ソラフェニブ、又はＡＺＤ６２４４とソラフェニブとの組合せでＣ３Ｔａｇ細胞系を処理し、ウェスタンブロットによりＥＲＫ活性化を測定した。（図７Ｅ）ＡＺＤ６２４４及びソラフェニブは、相乗作用してＣ３Ｔａｇ細胞系で細胞増殖を阻害する。ＤＭＳＯ、ＡＺＤ６２４４、ソラフェニブ、又はＡＺＤ６２４４とソラフェニブとの組合せでＣ３Ｔａｇ細胞を処理し、細胞数により細胞増殖を測定した（＊ｐ値＜０．００１、四重実験）。（図７Ｆ）ＡＺＤ６２４４及びソラフェニブによるＣ３Ｔａｇマウスの２１日間組合せ処理は、ＡＺＤ６２４４単独と比較して有意な腫瘍退縮を引き起こす。ＡＺＤ６２４４（２０ｍｇ／ｋｇ）、ソラフェニブ（３０ｍｇ／ｋｇ）、又はＡＺＤ６２４４とソラフェニブとの組合せでＣ３Ｔａｇマウスを処理し、未処理腫瘍と比較した。未処理を基準にした薬剤処理の腫瘍体積の変化パーセントが示されている（＊ウィルコクソンｐ値０．００７）。（図７Ｇ）ＡＺＤ６２４４とソラフェニブとの組合せ処理後のＣ３Ｔａｇマウス腫瘍の増大されたアポトーシス。未処理を基準にして、ＡＺＤ６２４４（２０ｍｇ／ｋｇ）及びソラフェニブ（３０ｍｇ／ｋｇ）単独又は組合せで２日間処理されたＣ３Ｔａｇ腫瘍で、ＴＵＮＥＬ及びＤＡＰＩ染色によりアポトーシスを測定した。
【図８Ａ】乃至
【図８Ｅ】多重化阻害剤ビーズ（ＭＩＢ）へのキナーゼの活性化依存結合。（図８Ａ）多重阻害剤ビーズとして使用したビーズにコンジュゲートされるキナーゼ阻害剤の構造。追加の構造に関しては、第５．４節及び第６．１６節を参照されたい。（図８Ｂ）ＥＧＦ刺激後のＥＧＦＲシグナル伝達成分の増大された結合。ＳＩＬＡＣ標識ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を一晩血清飢餓状態にし、３０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦで１５分間刺激し、採取し、そしてＭＩＢに適用した。ＥＧＦ刺激細胞と対比した血清飢餓細胞からのＭＩＢ結合キナーゼのＳＩＬＡＣベースの定量的比較。（図８Ｃ）過バナジン酸ホスファターゼ阻害剤処理後のＭＩＢへのチロシンキナーゼの増大された結合。１００μＭの過バナジン酸でＳＩＬＡＣ標識慢性骨髄性白血病細胞（Ｍｙｌ）を１５分間処理し、採取し、ＭＩＢを用いてキノームを単離した。過バナジン酸の存在下又は不在下でのＭＩＢ結合キナーゼのＳＩＬＡＣベースの比較を判定した。（図８Ｄ）ラパチニブによる処理に基づくＢＴ４７４細胞の発光変化を示す。７２時間の時間経過（時間点は、０、２４、４８、及び７２時間である）にわたり５０ｎＭのラパチニブでＢＴ４７４細胞を処理し、発光細胞生存能アッセイにより増殖阻害をモニターした。この図は、ラパチニブによるＢＴ４７４細胞の増殖阻害を示している。（図８Ｅ）ラパチニブによる処理の前及び後の様々な臨床関連キナーゼのキノーム変化を示している。実験の詳細に関しては、第６．１８節のクロマトグラフィー及び第６．１１節の質量分析方法を参照されたい。異なる着色は、ＤＭＳＯ対照処理細胞を基準にした５０ｎＭラパチニブ処理の異なる時間点を表す。明色から暗色へ、時間点は、４、２４、及び４８時間ラパチニブ処理である。
【図９Ａ】乃至
【図９Ｆ】ＭＥＫ１／２阻害に反応するＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＴＮＢＣ細胞のキノームプロファイル。（図９Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、５μＭのＵ０１２６又はＡＺＤ６２４４により増殖阻害される。トリプリケート実験＋ＳＤ。（図９Ｂ）４又は２４時間の５μＭ  Ｕ０１２６又はＡＺＤ６２４４処理に反応するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＥＲＫ１／２活性阻害。（図９Ｃ）キナーゼリン酸化は、ＡＺＤ６２４４処理に反応して改変される。５μＭのＡＺＤ６２４４でＳＩＬＡＣ標識ＳＵＭ１５９細胞を処理し、ＭＩＢ溶出のＴｉＯ２富化によりｐＳｅｒ、ｐＴｈｒ、及びｐＴｙｒホスホペプチドの変化を同定した。（図９Ｄ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞でのＭＥＫ１／２阻害に反応するＰＤＧＦＲ誘導。５μＭのＵ０１２６又はＡＺＤ６２４４でＳＩＬＡＣ標識細胞を２４時間処理し、採取し、そしてＭＩＢを用いてキナーゼを単離した。ＤＭＳＯ処理細胞と対比したＭＥＫ１／２阻害剤で処理されたＭＩＢ結合キナーゼの定量的比較。（図９Ｅ）ＭＥＫ１／２阻害後の低クローディン細胞系での増大されたＲＴＫ活性。５μＭのＵ０１２６、ＡＺＤ６２４４、又はＤＭＳＯでＳＵＭ１５９及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を２４時間処理し、ＲＴＫアレイを用いて分析した。（図９Ｆ）低クローディン患者腫瘍で発現された上位４０位までのキナーゼ。ＲＮＡ−ｓｅｑにより決定された各キナーゼのＲＰＫＭ値（＊は、ＳＵＭ１５９／ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞プロファイリングでのＡＺＤ６２４４反応性キナーゼを表す）。
【図１０Ａ】乃至
【図１０Ｇ】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞でのＲＴＫ及びサイトカインの転写アップレギュレーション並びにキノーム反応の特異性。（図１０Ａ）ＡＺＤ６２４４に対するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞反応は、ＳＵＭ１５９反応に匹敵する。（図１０Ｂ）ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定された、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞での５μＭのＡＺＤ６２４４処理後のキナーゼの転写アップレギュレーション。（図１０Ｃ）ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定された、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞での５μＭのＡＺＤ６２４４処理後のサイトカインの転写アップレギュレーション。（図１０Ｄ）ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定された、ＡＺＤ６２４４処理のＳＵＭ１５９細胞と比較されたＳＵＭ１５９−Ｒ細胞のサイクリン発現の回復。（図１０Ｅ）ＳＵＭ１５９細胞は、Ｕ０１２６（５μＭ）、ＡＺＤ６２４４（５μＭ）、及びＢＥＺ２３５（５０ｎＭ）により増殖阻害される。（図１０Ｆ）ＢＥＺ２３５は、ＳＵＭ１５９細胞でｐ７０Ｓ６キナーゼ活性を阻害するが、ＥＲＫ１／２シグナル伝達を阻害しない。（図１０Ｇ）ＢＥＺ２３５（５０ｎＭ）によるＳＵＭ１５９細胞の処理は、ＡＺＤ６２４４又はＵ０１２６（５μＭ）と比較して、ｉＴＲＡＱを用いてＭＩＢ／ＭＳにより測定される識別可能なキノーム反応を誘発する。薬剤処理を未処理ＳＵＭ１５９細胞に標準化し、統計的に有意な変化（ｐ＜０．１）を有するキナーゼのみを示す。エラーバーは、トリプリケート実験＋ＳＤを表す。
【図１１Ａ】乃至
【図１１Ｆ】ｃ−Ｍｙｃ低下は、ＲＴＫ誘導を引き起こす。（図１１Ａ）ｃ−Ｍｙｃ抗体を用いたＣｈＩＰ−ＰＣＲでは、ＳＵＭ１５９細胞でＰＤＧＦＲβプロモーターに対するｃ−Ｍｙｃの富化が示される。（図１１Ｂ）ＥＲＫ１及びＥＲＫ２の両方のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンは、ｃ−Ｍｙｃ発現を抑制し、ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定されるＰＤＧＦＲ転写物の誘導を引き起こす。（図１１Ｃ）ＢＥＺ２３５（１００ｎＭ）によるＰＢＫ／ｍＴＯＲ阻害は、ウェスタンブロットにより測定されるｃ−Ｍｙｃタンパク質レベルに影響しない。（図１１Ｄ）ＳＵＭ１５９−ＲからのＡＺＤ６２４４の洗浄除去は、ｑＲＴ−ＰＣＲにより示されるＲＴＫ及びサイトカイン転写物の低減を引き起こす。（図１１Ｅ）ＡＺＤ６２４４（５μＭ）及び／又はボルテゾミブ（１０ｎＭ）で処理されたＳＵＭ１５９細胞のｑＲＴ−ＰＣＲ。ボルテゾミブによるプロテアソームの阻害は、ｃ−Ｍｙｃ転写物のＡＺＤ６２４４媒介低下を防止する。（図１１Ｆ）ボルテゾミブ（１０ｎＭ）によるＳＵＭ１５９−Ｒ細胞の処理は、野生型に近いレベルまでｃ−Ｍｙｃ転写レベルを安定化する。エラーバーは、トリプリケート実験＋ＳＤを表す。
【図１２Ａ】乃至
【図１２Ｈ】ＳＵＭ１５９及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞でのＡＺＤ６２４４とチロシンキナーゼ阻害剤との組合せ。（図１２Ａ）Ｕ０１２６の存在下に於けるＳＵＭ１５９細胞でのＭＡＰＫ成分又はＰＩ３Ｋ／ＡｋｔのｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンの増殖阻害反応及び合成致死様反応。（図１２Ｂ）Ｕ０１２６の存在下に於ける誘導ＲＴＫのノックダウンによるＭＤＡ−ＭＢ−２３１での合成致死様反応。Ｌｙｎ及びＥｐｈＡ２は、Ｕ０１２６により誘導されない陰性対照である。（図１２Ｃ）ＡＺＤ６２４４は、ソラフェニブと相乗作用してＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞増殖を阻害する。（図１２Ｄ）ＡＺＤ６２４４とフォレチニブとの組合せは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞増殖に殆ど影響を及ぼさない。（図１２Ｅ）ＡＺＤ６２４４及びソラフェニブによるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の７２時間共処理は、ＰＤＧＦＲβのＡＺＤ６２４４媒介チロシンリン酸化を阻害する。（図１２Ｆ）ＡＺＤ６２４４及びソラフェニブによるＳＵＭ１５９細胞の７２時間共処理は、ＡＺＤ６２４４と標的化ＲＡＦ阻害剤ＰＬＸ４７２０又はＳＢ５９０８８５との組合せ処理よりも良好に相乗作用して細胞増殖を阻害する。（図１２Ｇ）ＡＺＤ６２４４及びソラフェニブによるＳＵＭ１５９細胞の７２時間共処理は、ＡＺＤ６２４４と標的化ＲＡＦ阻害剤ＰＬＸ４７２０又はＳＢ５９０８８５との組合せ処理よりも良好に相乗作用して細胞増殖を阻害する。（図１２Ｈ）ウェスタンブロッティングは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞で７２時間ＡＺＤ６２４４／ソラフェニブ組合せ処理により増強されたＢＩＭ発現及びサイクリンＤ１低下を示す。エラーバーは、トリプリケート実験＋ＳＤを表す。
【図１３】Ｃ３Ｔａｇ  ＧＥＭＭでのＡＺＤ６２４４キノーム反応シグネチャー。（図１３）免疫蛍光により示された２０ｍｇ／ｋｇのＡＺＤ６２４４による処理後の２匹の独立したＣ３Ｔａｇマウス由来の腫瘍中でのＰＤＧＦＲ発現の制御及び誘導。代表的な腫瘍領域が示されている。
【図１４Ａ】乃至
【図１４Ｂ】ＡＺＤ６２４４とソラフェニブとの組合せ処理は、Ｃ３Ｔａｇ  ＧＥＭＭで相乗作用してアポトーシスを促進する。（図１４Ａ）ＡＺＤ６２４４及び／又はソラフェニブ処理の２１日間の時間経過に於けるＣ３Ｔａｇ乳房腫瘍の腫瘍体積。（図１４Ｂ）制御。ＴＵＮＥＬ及びＤＡＰＩ染色より示された、単剤処理又は無処理と比較されたソラフェニブ、ＡＺＤ６２４４、又はＡＺＤ６２４４とソラフェニブとの組合せ処理後の３匹の識別可能なＣ３Ｔａｇマウス由来の腫瘍中での増大されたアポトーシス。代表的な腫瘍領域が示されている。
【図１５Ａ】乃至
【図１５Ｂ】レプリケート及びプールデータに対するｌｏｇ２タンパク質比のペアワイズプロットを示している（図１５Ｂ、−ｌｏｇ  ｐ値）。
【図１６】個別のレプリケート間のオーバーラップ／一致が上位２０位までのキナーゼ間では７０％超であることを示している。
【図１７】有意なキナーゼのこれらのリスト間のオーバーラップのベン図を表している。
【図１８】ラパマイシンによる処理の前及び後の頭頸部細胞系でのキノーム変化を示している。
【図１９】ＭＥＲＴＫ阻害剤による処理の前及び後の白血病細胞系でのキノーム変化を示している。
【図２０】ＣＭＶ感染の前及び後のヒト線維芽細胞でのキノーム変化を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
５．１．  定義
本明細書で用いられる場合、「特異的結合親和性」という用語は、５ｍｇの細胞溶解物タンパク質を用いて個別の阻害剤ビーズをプロファイリングすることにより２０種以下のキナーゼに結合するリガンドを意味し且つ包含する。以下の第６．１８節及び図１（Ｉ）も参照されたい。Ｂｉｓ−Ｘ、ラパチニブ、及びＡＺＤ６２４４は、特異的結合親和性を有する。更に、ラパチニブ及びＡＺＤ６２４４は、ＡＴＰ結合部位の一般的活性化状態に結合せずにそれらの選択性を増大させるＩＩ型キナーゼ阻害剤である。
【００２５】
本明細書で用いられる場合、「非特異的結合親和性」という用語は、５ｍｇの細胞溶解物タンパク質を用いて個別の阻害剤ビーズをプロファイリングすることにより測定される５０種以上のキナーゼに結合するリガンドを意味し且つそれを包含する。以下の第５．１８節及び図１（Ｉ）も参照されたい。ＭＩＢで非特異的結合親和性を有するリガンドを記述する他の方法では、２，４−ジアミノピリミジン、ピラゾールリガンド、ＰＰ５８、及びＶＩ１６８３２は、キノームの幾つかのファミリーに結合する汎キナーゼ阻害剤であるとする。更に、ＰＰ５８及びＶＩ１６８３２は、複数のキナーゼに結合し且つ所与のキナーゼに特異的でないように工学操作された。
【００２６】
本明細書で用いられる場合、「固体担体」という用語は、本明細書に開示される親和性リガンドに結合可能な任意の担体を意味し且つそれを包含する。周知の担体又はキャリヤーとしては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び変性セルロース、ポリアクリルアミド、及びマグネタイトが挙げられる。担体材料は、結合親和性リガンドがキナーゼに結合可能である限り、実質上任意の可能な構造形態を有し得る。従って、担体形態は、ビーズのように球状、又は試験管の内表面若しくはロッドの外表面のように円柱状であり得る。他の選択肢として、表面は、シート、テストストリップなどのようにフラットであり得る。一実施形態では、固体担体は、セファロース又はポリスチレンのビーズであり得るが、この実施形態に限定されるものではない。当業者であれば、抗体又は抗原への結合に好適な多くの他のキャリヤーを知っているであろう。又は、通常の実験を用いてそれを確認できるであろう。
【００２７】
本明細書で用いられる場合、「癌の臨床徴候」とは、被験体に於ける癌の存在の任意の兆候又は指標を意味し且つそれを包含し、当業者（例えば、腫瘍医、ナースプラクティショナー）であれば、この徴候又は指標を熟知しているであろう。癌の臨床徴候は、癌に関連することが公知である任意の症状であり得る。幾つかの癌の臨床徴候としては、特に、例えば、慢性疼痛、悪心、嘔吐、異常味覚、便秘、尿路症状（例えば、膀胱痙攣）、呼吸器症状、皮膚障害（例えば、掻痒、脱毛）、発熱が挙げられる。
【００２８】
本明細書で用いられる場合、「寛解」とは、寛解が腫瘍学技術分野で通常定義される通り、癌の症状が軽減又は解消される期間を意味し且つそれを包含する。
【００２９】
本明細書で用いられる場合、サンプル中のキナーゼのレベルを「逐次的にモニターする」とは、２回以上、例えば、１年に４回、２ヶ月に１回、１ヶ月に１回、２週間に１回、１週間に１回、３日毎、１日１回、又は１日数回、サンプル中のキナーゼのレベルを測定することを意味する。レベルの逐次的モニタリングとしては、当業者により必要と見なされる規則的間隔で定期的にキナーゼのレベルを測定することが挙げられる。
【００３０】
本明細書で用いられる「標準レベル」という用語は、１つ又は複数の正常被験体で決定されるキナーゼのベースラインレベルを意味する。例えば、ベースラインは、少なくとも１つの被験体から取得され得る。好ましくは、被験体（例えば、ｎ＝２〜１００又はそれ以上）の平均から取得され、前述の１つ又は複数の被験体は、癌の前歴を有していない。本発明では、キナーゼレベルの測定は、記載の多重化阻害剤ビーズを用いて行われ得る。
【００３１】
本明細書で用いられる場合、標準レベルを基準にしたキナーゼの測定レベルの「上昇」とは、被験体のサンプル中のキナーゼの量又は濃度が、本明細書に記載の方法により検出される標準を基準にして十分に大きいことを意味する。例えば、標準レベルを基準にした測定レベルの上昇は、検出可能な任意の統計的に有意な上昇であり得る。そのような上昇としては、標準を基準にして、約１％、約１０％、約２０％、約４０％、約８０％、約２倍、約４倍、約８倍、約２０倍、若しくは約１００倍、又はそれ以上の上昇が挙げられ得るが、これらに限定されるものではない。本明細書で用いられる「約」という用語は、数値±数値の１０％を意味する。
【００３２】
本明細書で用いられる場合、「複数のキナーゼのレベルを測定する」という表現は、本発明に係る方法により２種以上のキナーゼのレベルを測定することを意味する。幾つかの実施形態では、５０、１００、１５０、２００、２５０種、又はそれ以上のキナーゼのレベル及びリン酸化状態が同時に測定される。本明細書で用いられる場合、キナーゼの量又は濃度が測定され得る親和性リガンドとしては、小分子が挙げられ得るが、これに限定されるものではない。そのような小分子は、ビーズ又は他の固体担体に対する好適なリンカーを有するように修飾されることもあろう。当業者であれば、リンカーがキナーゼへのリガンド結合を妨害しないようにそのようなリンカーを設計する為に、キナーゼの結晶構造及び他の公的に利用可能な文献を如何に使用するかは分かるであろう。リガンドとして機能するように修飾されるであろう小分子構造の例は、次のような市販のキナーゼ阻害剤、即ち、ＢＴ−７３７［８５２８０８−０４−９］、ＡＢＴ−８６９［７９６９６７−１６−３］、ＡＣ−２２０［９５０７６９−５８−１］、アダホスチン、ＡＥＥ−７８８（ＮＶＰ  ＡＥＥ−７８８）、ＡＥＷ−５４１（ＮＶＰ  ＡＥＷ−５４１）、アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２）、ＡＧ１２９６、ＡＧ１３９５８［３１９４６０−９４−１］、ＡＧ１４７８、ＡＧ−４９０、Ａｋｔ−Ｉ−１，２［４７３３８２−４８−８］、Ａｋｔ−Ｉ−１［４７３３８２−３９−７］、ＡＭＧ−４７ａ［８８２６６３−８８−９］、ＡＭＧ４７９、ＡＭＧ−Ｔｉｅ２−１［８７０２２３−９６−４］、アムバチニブ（ＭＰ−４７０［８５０８７９−０９−３］）、ＡＰ２３２３６、ＡＰ２３４６４、アパチニブ（ＹＮ９６８Ｄ１）、ＡＲＱ−１９７、ＡＳ２５２４２４［９００５１５−１６−４］、ＡＴ７５１９［９０２１３５−９１−５］、ＡＴ９２８３［８９６４６６−０４−９］、ＡＶ−４１２［４５１４９２−９５−８］、ＡＶ−９５１［４７５１０８−１８−０］、アキシチニブ（ＡＧ１３７３６）、ＡＺ−９６０［９０５５８６−６９−８］、ＡＺＤ７７６２［８６０３５２−０１−８］、ＡＺＭ４７５２７１、ＢＥＺ２３５（ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５）、ＢＧＴ２２６（ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６）、ＢＩ２５３６（Ｒ−）［７５５０３８−０２−９］、ＢＩＢＷ−２９９２、ＢＩ−Ｄ１８７０［５０１４３７−２８−１］、ＢＩＲＢ７９６、Ｂｉｓ−Ｘ（ビスインドイルマレイミド−Ｘ、ＲＯ−３１−８４２５）、ＢＫＭ１２０（ＮＶＰ−ＢＫＭ１２０）、ＢＬＹ７１９、ＢＭＳ−５、ＢＭＳ５９９６２６（ＡＣ−４８０）、ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）、ブリバニブ（ＢＭＳ５８２６６４）、ＢＸ−７９５［７０２６７５−７４−９］、ＢＸ−９１２［７０２６７４−５６−４］、カボザンチニブ（ＢＭＳ９０７３５、ＸＬ−１８４）、カネルチニブ（ＣＩ１０３３、ＰＤ１８３８０５、ＳＮ２６６０６）、ＣＡＬ−１０１（ＧＳ−１１０１）、ＣＣ−４０１［３９５１０４−３０−０］、セジラニブ（ＡＺＤ２１７１、ＮＳＣ７３２２０８）、ＣＥＰ１１９８１、ＣＥＰ７０５５、ＣＧＰ７６０３０、ＣＧＰ７７６７５、ＣＩ１０４０［２１２６３１−７９−３］、ＣＬ３８７７８５、ＣＰ３５８７７４、ＣＰ５４７６３２、ＣＰ６５��５７７、ＣＰ６９０５５０、ＣＰ７２４７１４、ＣＰ７５１８７１、ＣＰ８６８５９６、クリゾチニブ（ザーコリ（Ｘａｌｋｏｒｉ）（登録商標）、ＰＦ−０２３４１０６６、１０６６）、ＣＵＤＣ−１０１、ＣＵＤＣ−９０７、ＣＸ４９４５［１００９８２０−２１−６］、ＣＹＣ−１１６［６９３２２８−６３−６］、ＣＹＴ１１３８７［１０５６６３４−６８−４］、ダブレフェニブ（ＧＳＫ２１１８４３６）、ダヌセルチブ［８２７３１８−９７−８］、ダサチニブ（ＢＭＳ３５４８２５）、デフォロリムス（ＡＰ２３５７５、ＭＫ８６６９）、ドビチニブラクテート（ＴＫＩ−２５８；ＣＨＩＲ−２５８）、Ｅ７０８０［４１７７１６−９２−８］、ＥＫＢ−５６９、エンザスタウリン（ＬＹ３１７６１５）、エルロチニブ（タルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）（登録商標）、ＯＳＩ−７７４）、エベロリムス（アフィニトール（Ａｆｆｉｎｉｔｏｒ）（登録商標））、ＥＸＥＬ０８６２、フラボピリドール（アルボシジブ）［１４６４２６−４０−６］、フォレチニブ（ＸＬ−８８０；ＧＳＫ  １３６３０８９）、フォスタマチニブ、ＧＤＣ０９４１［９５７０５４−３０−７］、ゲフィチニブ（イレッサ（Ｉｒｅｓｓａ）（登録商標）、ＺＤ１８３９）、ＧＮＥ−４９０［１０３３７３９−９２−２］、ＧＮＥ−４９３［１０３３７３５−９４−２］、Ｇ５６９７６、ＧＳＫ１０７０９１６Ａ、ＧＳＫ６９０６９３［９３７１７４−７６−０］、ＧＳＫ４６１３６４、ＧＳＫ２１２６４５８、ＧＴＰ１４５６４、ＧＷ４４１７５６［５０４４３３−２３−２］、ＩＣ８７１１４［３７１２４２−６９−２］、ＧＷ５０７４、イブルチニブ（ＡＶＬ−２６３）、イコチニブ（ＢＰＩ−２００９Ｈ）、イマチニブメシレート（グリバック（Ｇｌｅｅｖａｃ）（登録商標）、ＳＴＩ５７１、ＣＧＰ５７１４８）、ＩＮＣＢ０１８４２４、ＪＮＪ３８８７７６０５［９４３５４０−７５−８］、ＪＮＪ７７０６６２１［４４３７９７−９６−４］、Ｋｉ２０２２７（＋／−）［６２３１４２−９６−１］、ＫＩ２３８１９、ＫＲＮ−６３３、ＫＲＮ−９５１、ＫＵ００６３７９４［９３８４４０−６４−３］、ＫＵ５５９３３［５８７８７１−２６−９］、ＫＸ２−３９１、Ｌ２１６４９、ラパチニブ（タイケルブ（Ｔｙｋｅｒｂ）（登録商標）、ＧＷ−５７２０１６）、レフルノミド（ＳＵ−１０１）、レスタウルチニブ（ＣＥＰ−７０１）、ＬＦＭ−Ａ１３、リニファニブ（Ｍ１０−９６３；ＡＢＴ−８６９）、マサチニブ（ＡＢ−１０１０）［７９０２９９−７９−５］、Ｍｅｒｃｋ−５［４５７０８１−０３−７］、ミドスタウリン（ＣＧＰ−４１２５１、ＰＫＣ−４１２）、ＭＫ−２２０６（８−（４−（１−アミノシクロブチル）フェニル−９−フェニル［１，２，４］トリアゾロ［３，４ｆ］［１，６］  ナフチリジン３（２Ｈ）−オン、ジヒドロクロリド））、ＭＫ−５１０８（ＶＸ−６８９）、ＭＫＣ−１（Ｒｏ３１７４５３、Ｒ−４４０）、ＭＬＮ８０５４、ＭＬＮ８２３７、モテサニブジホスフェート（ＡＭＧ−７０６）、ＭＰ−４１２、ネラチニブ（ＣＰＤ−８２０、ＨＫＩ−２７２、ＷＡＹ１７９２７２）、ニロチニブ（タシグナ（Ｔａｓｉｇｎａ）（登録商標）、ＡＭＮ１０７）、ニンテダニブ（バーガ���フ（Ｖａｒｇａｔｅｆ）（商標）、ＢＩＢＦ−１１２０）ＮＳ−１８７、ＮＶＰ−ＢＳＫ８０５、ＯＮ０１２３８０、ＯＳＩ−８１７、ＯＳＩ−９０６、ＯＳＩ−９３０、パゾパニブ（ボトリエント（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ）（登録商標）、ＧＷ７８６０３４）、ＰＤ１５３０３５、ＰＤ１５８７８０、ＰＤ１６６３２６、ＰＤ１７３０７４、ＰＤ１７３９５５  ＋  ５６、ＰＤ１８０９７０、ＰＤ３２５９０１［３９１２１０−１０−９］、ＰＤ３３２９９１、ＰＤ４２１７９０３［９５６９０５−２７−４］、ＰＦ４３１３９６［７１７９０６−２９−１］、ＰＦ５６２２７１［７１７９０７−７５−０］、ＰＨＡ６９０５０９［４９２４４５−２８−０］、ＰＩ−１０３［３７１９３５−７４−９］、ＰＩＫ−２９４［９００１８５−０２−６］、ＰＩＫ−７５［３７２１９６−６７−  ３］、ＰＩＫ−９０［６７７３３８−１２−４］、ＰＫＩ−１６６、ＰＬＸ４７２０、ポナチニブ（ＡＰ２４５３４）、ＰＰ１、ＰＰ２、ＰＰ５８、プルバラノールＢ、Ｒ１４８７［４４９８０８−６４−４］、シロリムス（ラパミューン（Ｒａｐａｍｕｎｅ）（登録商標）、ラパマイシン）、ＲＡＦ２６５、レゴラフェニブ（ＢＡＹ  ７３〜４５０６）、ＲＨＯ−１５［８６４０８２−４７−３］、ＲＷＪ−６７６５７［２１５３０３−７２−３］、ＳＢ２０２１９０［１５２１２１−３０−７］、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２１６７６３［２８０７４４−０９−４］、ＳＢ２４２２３５［１９３７４６−７５−７］、ＳＢ５９０８８５、ＳＤ−０６［２７１５７６−８０−８］、ＳＤ−１６９［１６７０−８７−７］、サラカチニブ（ＡＺＤ０５３０）、セリシクリブ（ロスコビチン、ＣＹＣ−２０２、ＮＳＣ７０１５５４）、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４、ＡＲＲＹ−１４２８８６）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、ＳＭＩ−４ａ［４３８１９０−２９−５］、ＳＮＳ−０３２（ＢＭＳ３８７０３２）、ＳＮＳ−３１４［１０５７２４９−４１−８］、ソラフェニブ（ネクサバール（Ｎｅｘａｖａｒ）（登録商標）、ＢＡＹ  ４３−９００６）、ＳＲ３６７７［１０７２９５９−６７−１］、スタウロスポリン、ＳＵ１０９４４、ＳＵ１１３３３  ＋  ３６、ＳＵ１１４６４、ＳＵ１１６５７、ＳＵ１４８１３、ＳＵ５４０２［２１５５４３−９２−３］、ＳＵ５６１４、ＳＵ６６５６、ＳＵ６６６８（ＴＳＵ−６８）、スニチニブ（スーテント（Ｓｕｔｅｎｔ）（登録商標）、ＳＵ１１２４８）、ＴＡＫ−１６５、ＴＡＫ−７１５［３０３１６２−７９−０］、タンデュチニブ（ＭＬＮ５１８、ＣＴ５３５１８）、テラチニブ（ＢＡＹ５７−９３５２）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、ＴＧ１００４３５、ＴＧ１０１３４８、ＴＧＸ−２２１［６６３６１９−８９−４］、ＴＫＩ２５８（ＣＨＩＲ−２５８）、トセラニブ（ＳＵ１１６５４）、トボック（ＴＯＶＯＫ）［４３９０８１−１８−２］、トレメチニブ（ＧＳＫ０１１２０２０１、ＪＴＰ−７４０５７）、チロホスチンＡＧ１０２４、チロホスチンＡＧ９５７、Ｕ０１２６、バンデタニブ（カプレルサ（Ｃａｐｒｅｌｓａ）（登録商標）、ＡＺＤ−６４７４、ＣＨ−３３１、ＺＤ６４７４）、バーガテフ（Ｖａｒｇａｔｅｆ）［６５６２４７−１７−５］、バタラニブ（��ＴＫ７８７、ＺＫ２２２５８４、ＣＧＰ７９７８７）、ベムラフェニブ（ゼルボラフ（Ｚｅｌｂｏｒａｆ）（登録商標）、ＰＬＸ−４０３２）、ＶＩ１６８３２、ＶＸ−３２２、ＶＸ−６８０［６３９０８９−５４−６］、ＶＸ−７０２［７４５８３３−２３−２］、ＷＨＩ−Ｐ１３１、ＷＨＩ−Ｐ１５４、ＷＰ１０３４、ＸＬ−２８１、ＸＬ−６４７、ＸＬ−９９９、ＹＭ２０１６３６［３７１９４２−６９−７］又はＺＫ−ＣＤＫである。括弧［］内の数は、シンキナーゼ（Ｓｙｎｋｉｎａｓｅ）（オーストラリア国メルボルン）から入手可能な化合物のカタログ番号を意味する。キナーゼ阻害剤及び追加のシグナル経路モジュレーターに関しては、（非特許文献３２）、（非特許文献３３）、（非特許文献３４）、（非特許文献３５）、（非特許文献３６）、（非特許文献３７）（ノバルティス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）製のＪＡＫ１／２／３阻害剤ＮＶＰ−ＢＳＫ８０５は、三重陰性乳癌の治療に奏効することが最近示された）、（非特許文献３８）、（非特許文献３９）、（非特許文献４０）、（非特許文献４１）、（非特許文献４２）、（非特許文献４３）、（非特許文献４４）、（非特許文献４５）（それらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）をも参照されたい。
【００３３】
試験の為のアッセイとの関連での「機能的効果」という表現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、組織サンプル、細胞培養、又はｉｎ  ｖｉｖｏの何れかで、キナーゼ関連障害に関連付けられる表現型又は遺伝子をモジュレートする化合物を意味する。これはまた、化学的効果又は表現型効果、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでのキノームプロファイルの改変、例えば、高リスクキノームプロファイルから低リスクプロファイルへの変化、キナーゼ関連障害に関連付けられる遺伝子の発現の改変、キナーゼ関連障害で低若しくは高メチル化される遺伝子の転写活性の改変、又は酵素活性を有するタンパク質の活性若しくは活性化状態の改変、及びこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質の下流効果であり得る。機能的効果としては、転写の活性化又は抑制、細胞の増殖能、キナーゼ関連障害進行中の細胞内での発現、及び他の細胞特性が挙げられ得る。「機能的効果」としては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏの活性が挙げられる。「機能的効果を測定する」とは、キナーゼ関連障害に間接的又は直接的に関連付けられる遺伝子の転写、タンパク質の翻訳、又は酵素活性を有するタンパク質の活性化状態（例えば、リン酸化状態又はキナーゼ活性）を増大又は低減する化合物をアッセイすることを意味する。そのような機能的効果は、当業者に公知の任意の手段、例えば、分光学的特性（例えば、蛍光、吸光度、屈折率）の変化、流体力学（例えば、形状）、クロマトグラフィー、又はタンパク質の溶解性、リガンド結合アッセイ、例えば、抗体への結合、誘導マーカー若しくはマーカーの転写活性化の測定、酵素活性の変化の測定、細胞増殖、アポトーシス、細胞周期停止を増大若しくは低減する能力、細胞表面マーカーの変化の測定により測定可能である。
【００３４】
また、キナーゼ関連障害の発生又は進行に及ぼす化合物の機能的効果の検証は、マウスモデルを用いた研究などの当業者に公知のアッセイを用いて行うことが可能である。機能的効果は、当業者に公知の多くの手段、例えば、モルフォロジー特性の改変の定量的若しくは定性的な尺度を得る為の顕微鏡法、キナーゼ関連障害に関連付けられる他の遺伝子に対するＲＮＡ又はタンパク質のレベルの変化の測定、ＲＮＡ安定性の測定、下流若しくはレポーター遺伝子の発現の同定（ＣＡＴ、ルシフェラーゼ、β−ｇａｌ、ＧＦＰなど）、例えば、化学発光、蛍光、比色反応、抗体結合、誘導マーカーなどにより評価することが可能である。
【００３５】
マーカーの「阻害剤」、「アクチベーター」、及び「モジュレーター」とは、キナーゼ関連障害で高若しくは低メチル化される遺伝子の発現、キナーゼ関連障害に関連付けられる突然変異、又はそれによりコードされる翻訳タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いて同定される活性化分子、阻害分子、又はモジュレート分子を意味すべく用いられるものである。また、阻害剤、アクチベーター、又はモジュレーターとしては、天然に存在する及び合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、ペプチド、環状ペプチド、核酸、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ分子、小有機分子などが挙げられる。阻害剤及びアクチベーターのそのようなアッセイは、例えば、（１）（ａ）ｍＲＮＡ発現、又は（ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、細胞、若しくは細胞抽出物に於けるキナーゼ関連障害で高若しくは低メチル化される遺伝子により発現されるタンパク質、（２）推定モジュレーター化合物の適用、及び（３）以上に記載される活性に及ぼす機能的効果の測定を含む。
【００３６】
キナーゼ関連障害のｉｎ  ｖｉｖｏ測定、又はキナーゼ関連障害で高若しくは低メチル化される遺伝子を潜在的なアクチベーター、阻害剤、若しくはモジュレーターで処理することを含むアッセイは、阻害の程度を調べる為に、阻害剤、アクチベーター、又はモジュレーターを用いない対照アッセイと比較される。対照（未処理）は、１００％の相対活性値に割り当てられる。キナーゼ関連障害に関連付けられる遺伝子発現、タンパク質発現の阻害は、対照を基準にした活性値が約８０％、好ましくは５０％、より好ましくは２５〜０％である場合に達成される。キナーゼ関連障害に関連付けられる遺伝子発現又はタンパク質の活性化は、対照（アクチベーターで処理されない）を基準にした活性値が１１０％、より好ましくは１５０％、より好ましくは２００〜５００％（即ち、対照を基準にして２〜５倍）、より好ましくは１０００〜３０００％高い場合に達成される。
【００３７】
本明細書で用いられる「試験化合物」又は「薬剤候補物質」又は「モジュレーター」という用語又は文法的等価表現は、キナーゼ関連障害に関連付けられる遺伝子型又は表現型を直接的又は間接的にモジュレートする能力が試験される天然に存在する又は合成の任意の分子、例えば、タンパク質、オリゴペプチド、小有機分子、ポリサッカリド、ペプチド、円形ペプチド、脂質、脂肪酸、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドなどを記述する。試験化合物は、試験化合物のライブラリー、例えば、十分な多様性範囲を提供するコンビナトリアルライブラリー又はランダム化ライブラリーの形態であり得る。試験化合物は、任意選択で、融合パートナー、例えば、標的化化合物、レスキュー化合物、二量化化合物、安定化化合物、アドレス指定可能化合物、及び他の機能部分に連結される。従来方式では、有用な性質を有する新しい化学物質は、幾つかの望ましい性質又は活性、例えば、阻害活性を有する試験化合物（「リード化合物」と呼ばれる）を同定し、リード化合物の変異体を形成し、そしてそれらの変異体化合物の性質及び活性を評価することにより発生される。多くの場合、高スループットスクリーニング（「ＨＴＳ」）方法がそのような分析に利用される。化合物は、約５０ダルトン超且つ約２５００ダルトン未満、好ましくは約２０００ダルトン未満、好ましくは約１００〜約１０００ダルトン、より好ましくは約２００〜約５００ダルトンの分子量を有する天然に存在する又は合成の有機分子である「小有機分子」であり得る。
【００３８】
他の実施形態では、本発明は、被験体に於いて化学治療レジメンに対する耐性の発生を予測する方法を包含する。但し、被験体は、好ましくは、化学治療レジメンで治療されてきており、この方法は、寛解期間中に被験体から取得されたサンプル中の複数のキナーゼのレベルを逐次的にモニターすることと、測定されたレベルを標準レベルと比較することと、を含み、標準レベルを基準にした測定レベルの上昇は、被験体が化学治療レジメンに対して耐性を発生するリスクが高いことの指標となる。
【００３９】
被験体が耐性になった化学治療レジメンとしては、癌、特に、キナーゼの異常な発現及び／又は活性に関連付けられる癌を治療する為の当技術分野で公知の任意の化学療法治療、限定されるものではないが、１つ又は複数のシグナル伝達経路を対象とする化学治療剤による治療が挙げられ得る。
【００４０】
当技術分野で公知のシグナル伝達経路モジュレーター又は化学治療剤の例としては、５−フルオロウラシル、アスパラギナーゼ、ベバシズマブ（アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）（登録商標））、ブレオマイシン、カンパテシン、セツキシマブ（アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）（登録商標））、クリゾチニブ（ザーコリ（Ｘａｌｋｏｒｉ）（登録商標））、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダサチニブ（スプリセル（Ｓｐｒｙｃｅｌ）（登録商標））、ダウノルビシン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（ＤＮＭＴ）、例えば、アザシチジン（ビダーザ（Ｖｉｄａｚａ）（登録商標））及びデシタビン、ドキソルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エルブスタチン、エルロチニブ（タルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）（登録商標））、エストラムスチン、エトポシド、エトポシド、ゲフィチニブ（イレッサ（Ｉｒｅｓｓａ）（登録商標））、ゲムシタビン、ゲニステイン、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチルトランスフェラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ）、例えば、ベリノスタット、エンチノスタット（ＭＳ−２７５）、パノビノスタット、ＰＣＩ−２４７８１、ロミデプシン（デプシペプチド、ＦＫ−２２８）、バルプロ酸、ボリノスタット（ゾリンザ（Ｚｏｌｉｎｚａ）（登録商標）、ＳＡＨＡ）、又は熱ショックタンパク質阻害剤（ＨＳＰ９０を含む）、阻害剤、例えば、アルベスピマイシン（ＩＰＩ−４９３）、ＡＴ１３３８７、ＡＵＹ９２２（レソルシノール系イソオキサゾールアミド）、ＣＮＦ２０２４（ＢＩＩＢ０２１）、ＨＳＰ９９０、ＭＰＣ−３１００、レタスピマイシン（ＩＰＩ−５０４）、ＳＮＸ−２１１２、ＳＮＸ−５４２２、ＳＴＡ−９０９０、タネスピマイシン（１７−ＡＡＧ；ＫＯＳ−９５３）、又はＸＬ８８８、ハービマイシンＡ、ヘキサメチルメラミン、ヘッジホッグ経路阻害剤、例えば、サリデジブ（ＩＰＬ−９２６）、ビスモデギブ（エリベッジ（ＥＲＩＶＥＤＧＥ）（商標））、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ（グリベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）（登録商標））、イリノテカン、ラパチニブ（タイケルブ（Ｔｙｋｅｒｂ）（登録商標））、ラベンダスチンＡ、ロイコボリン、レバミソール、メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトキサントロン、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムス（アフィニトール（Ａｆｉｎｉｔｏｒ）（登録商標））、シロリムス（ラパミューン（Ｒａｐａｍｕｎｅ）（登録商標））、テムシロリムス（トーリセル（Ｔｏｒｉｓｅｌ）（登録商標））、ニロチニブ（タシグナ（Ｔａｓｉｇｎａ）（登録商標））、ニトロソウレア、例えば、カルムスチン及びロムスチン、パクリタキセル、パニツムマブ（ベクティビックス（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）（登録商標））、パゾパニブ（ボトリエント（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ）（登録商標））、ペガプタニブ（マクジェン（Ｍａｃｕｇｅｎ）（登録商標））、白金化合物、例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、プリカマイシン、プロカルビジン、プロテアソーム阻害剤、例えば、ボルテゾミブ（ベルケイド（Ｖｅｌｃａｄｅ）（登録商標））、ラニビズマブ（ルセンティス（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）（登録商標））、ソラフェニブ（ネクサバール（Ｎｅｘａｖａｒ）（登録商標））、スニチニブ（スーテント（Ｓｕｔｅｎｔ）（登録商標））、タキサン、例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、タキソール、チオグアニン、トポテカン、トラスツズマブ（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標））、チロシンキナーゼ阻害剤、チロホスチン、バンデタニブ（カプレルサ（Ｃａｐｒｅｌｓａ）（登録商標））、ベムラフェニブ（ゼルボラフ（Ｚｅｌｂｏｒａｆ）（登録商標））、ビンブラスチン、ビンカアルカロイド、ビンクリスチン、又はビノレルビンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施形態では、化学治療剤は、ベバシズマブ（アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）（登録商標））、セツキシマブ（アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）（登録商標））、クリゾチニブ（ザーコリ（Ｘａｌｋｏｒｉ）（登録商標））、ダサチニブ（スプリセル（Ｓｐｒｙｃｅｌ）（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）（登録商標））、エベロリムス（アフィニトール（Ａｆｉｎｉｔｏｒ）（登録商標））、ゲフィチニブ（イレッサ（Ｉｒｅｓｓａ）（登録商標））、イマチニブ（グリベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）（登録商標））、ラパチニブ（タイケルブ（Ｔｙｋｅｒｂ）（登録商標））、ニロチニブ（タシグナ（Ｔａｓｉｇｎａ）（登録商標））、パニツムマブ（ベクティビックス（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）（登録商標））、パゾパニブ（ボトリエント（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ）（登録商標））、シロリムス（ラパミューン（Ｒａｐａｍｕｎｅ）（登録商標））、ソラフェニブ（ネクサバール（Ｎｅｘａｖａｒ）（登録商標））、スニチニブ（スーテント（Ｓｕｔｅｎｔ）（登録商標））、テムシロリムス（トーリセル（Ｔｏｒｉｓｅｌ）（登録商標））、トラスツズマブ（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標））、バンデタニブ（カプレルサ（Ｃａｐｒｅｌｓａ）（登録商標））、又はベムラフェニブ（ゼルボラフ（Ｚｅｌｂｏｒａｆ）（登録商標））である。化学治療剤の更なる例は、標準的出版物及び教科書に見出しうる。たとえば、国立総合癌ネットワーク（ＮＣＣＮガイドライン）並びに（非特許文献４６）を参照されたい。
【００４１】
本発明は更に、癌を有する被験体に於いて癌治療の有効性を改善する方法を包含する。この方法は、寛解を達成するように治療レジメンで被験体を治療することと、寛解期間中に被験体から取得されたサンプル中の複数のキナーゼのレベルを逐次的にモニターすることと、測定されたレベルを標準レベルと比較することと、を含み、標準レベルを基準にした少なくとも１種のキナーゼの測定レベルの上昇は、被験体が治療変更を必要とすることを示唆する。
【００４２】
５．２．  サンプル
本発明に係る方法の為のサンプルは、侵襲的又は非侵襲的技術により被験体から取得可能な任意のサンプルを包含する。本発明の目的に合ったサンプルとしては、生体液、例えば、血清、血漿、尿、若しくは血液、組織サンプル、又は組織抽出物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。そのようなサンプルは、当技術分野で公知の任意の標準的方法、例えば、指穿刺血液サンプル、口腔スワブ、生検試料、テープストリップなどにより取得され得る。
【００４３】
好ましい実施形態では、本発明に係る方法の為のサンプルは、生検サンプル、血液若しくは血清のサンプル、又は被験体から取得された血液サンプルから単離された有核細胞であるが、この実施形態に限定されるものではない。本発明に係る方法に従って使用されるサンプルは、腫瘍の発生源となった特定の組織から取得する必要はない。特定の作用機序により拘束しようとするものではないが、多くのキナーゼがユビキタスに発現されるとこを考慮して、治療、例えば、化学治療が、特定のキナーゼを標的とする場合、そのキナーゼは、生体全体にわたり標的とされるであろう。従って、特定のキナーゼ阻害剤治療に対する耐性が発生した後、それは、腫瘍の発生源となった特定の組織からだけでなく、生体全体にわたり検出可能であろう。
【００４４】
本発明は、癌を有する被験体からサンプルを取得する為の当技術分野で公知の任意の組織サンプリング技術又は生検技術の使用を包含する。幾つかの実施形態では、被験体が乳癌又は乳癌の病歴を有する場合、当業者に公知の任意の乳房組織取得方法、限定されるものではないが、コア生検及び細針吸引を使用することが可能である（たとえば、（非特許文献４７）、（非特許文献４８）、（非特許文献４９）、（非特許文献５０）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。他の実施形態では、本発明は、癌を有する被験体から乳房組織サンプルを取得する為の洗浄及び乳管流体の乳頭吸引を包含する。洗浄及び乳管流体の乳頭吸引の為の例示的な方法は、（非特許文献５１）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に提示されている。
【００４５】
幾つかの実施形態では、被験体が結腸癌を有する場合、限定されるものではないが、針吸引及び固体生検を含めて、当技術分野で公知の生検又は組織サンプリング技術は何れも、本発明の範囲内である。たとえば、（非特許文献５２）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００４６】
肺癌の場合、本発明は、限定されるものではないが、細針吸引、ＥＵＳガイド下細針吸引、気管支生検、経食道生検、及び気管支肺胞洗浄を含めて、当技術分野で公知の方法の任意の組織サンプリング方法及び生検方法の使用を包含する。例えば、（非特許文献５３）、（非特許文献５４）、（非特許文献５５）、（非特許文献５６）（それらはすべてその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。他の実施形態では、被験体が前立腺癌又は前立腺癌の病歴を有する場合、限定されるものではないが、針生検及び経直腸吸引生検を含めて、当技術分野で公知の生検技術は何れも、本発明に係る方法で使用可能である。例えば、（非特許文献５７）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００４７】
５．３．  組成物
幾つかの実施形態では、本発明は、第１及び第２の層を含み、第１の層が、特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第１の固体担体を含み、且つ第２の層が、非特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第２の固体担体を含むマルチアナライトカラムを提供するが、これらの実施形態に限定されるものではない。第１の固体担体は、１種又は複数種のチロシンキナーゼ又は１種又は複数種のセリン／トレオニンキナーゼに対する特異的結合親和性を有し得る。
【００４８】
特異的結合親和性は、Ａｂｌ、ＡＴＫ、ＢＲＡＦ、ｃ−ＫＩＴ、ＣＯＴ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ−３、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＮＳＲ  ＬＹＮ、ＭＥＫ、ＭＥＴ、Ｐ３８、ＰＤＧＦＲβ、ＰＫＣ／ＧＳＫ３β、Ｓｒｃ、及びＶＥＧＦＲからなる群から選択されるキナーゼに対するものであり得る。一実施形態では、特異的結合親和性は、Ａｂｌ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＬＹＮ、Ｐ３８、及びＰＫＣ／ＧＳＫ３βからなる群から選択されるキナーゼに対するものであり得る。
【００４９】
第１の固体担体の各親和性リガンドは、２０種以下のキナーゼに結合し得る。また、親和性リガンドは、ビスインドイルマレイミド−Ｘリガンド、ＧＷ−５７２０１６リガンド、及びＳＢ２０３５８０リガンドからなる群から選択され得る。
【００５０】
第２の固体担体上の非特異的結合剤は、ＡＬＫ、ＥＭＬ−ＡＬＫ、ＦＧＦＲ１、及びＦＧＦＲ２に結合し得る。
【００５１】
第２の固体担体の各親和性リガンドは、５０種以上のキナーゼに結合し得る。また、２，４−ジアミノピリミジン、ピラゾールリガンド、ＰＰ５８リガンド、プルバラノールＢリガンド、及びＶＩ１６８３２リガンドからなる群から選択され得る。
【００５２】
更に、親和性リガンドは、Ｂ−Ｒａｆ、ＥＧＦＲ、ＭＥＫの活性化突然変異体、より一般的には、キナーゼ融合体及び／又は活性化突然変異体に結合するように設計される。
【００５３】
マルチアナライトカラムの幾つかの実施形態では、特異的結合親和性キナーゼ固体担体及び非特異的結合キナーゼ固体担体は、約４：１〜約１：４／又は約１．５：１〜約１：１．５の範囲内のモル比で存在する。
【００５４】
マルチアナライトカラムの幾つかの実施形態では、第１の固体担体は、特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも３つの異なる親和性リガンドを含む。他の実施形態では、第２の固体担体は、非特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも３つの異なる親和性リガンドを含む。更に他の実施形態では、第１の固体担体は、特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも３つの異なる親和性リガンドを含み、且つ第２の固体担体は、非特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも３つの異なる親和性リガンドを含む。
【００５５】
５．４．  親和性リガンド構造
特定の実施形態では、本発明は、以下の構造を有する化合物を提供するが、この実施形態に限定されるものではない。
【化１】
2014532184.tif 000004
【化２】
2014532184.tif 000005
【化３】
2014532184.tif 000006
式中、
Ｍは、（ＣＨ２）ｘ、（ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙであり、
Ｚは、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨＲ１、ＮＲ２Ｒ３、ＳＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ４、ＣＯ２Ｒ５、ＣＯＮＨＮＨ２、Ｗであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、水素又はＣ１〜８アルキル若しくはシクロアルキルから選択され、
Ｘは、１〜１６であり、
Ｙは、１〜１２であり、
Ｗは、
【化４】
2014532184.tif 000007
、ポリＨｉｓタグ、又は第５．５節に記載の他のリンカーである。
幾つかの実施形態では、
Ｍは、（ＣＨ２）ｘ、（ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙであり、
Ｚは、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、ＯＨ、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨＲ１、ＣＯＮＨＮＨ２、Ｗであり、
Ｒ１は、Ｃ１〜８アルキル又はシクロアルキルであり、
Ｘは、１〜１６であり、
Ｙは、１〜１２であり、
Ｗは、
【化５】
2014532184.tif 000008
、ポリＨｉｓタグ、又は第５．５節に記載の他のリンカーである。
他の実施形態では、
Ｍは、（ＣＨ２）ｘ、（ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙであり、
Ｚは、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、又はＷであり、
Ｘは、１〜１６であり、
Ｙは、１〜１２であり、
Ｗは、
【化６】
2014532184.tif 000009
、ポリＨｉｓタグ、又は第５．５節に記載の他のリンカーである。
他の実施形態では、親和性リガンドは、図８Ａに示されるリガンドの１つの構造を有する。
他の実施形態では、親和性リガンドは、以下の構造を有する。
【化７】
2014532184.tif 000010
【化８】
2014532184.tif 000011
【化９】
2014532184.tif 000012
【化１０】
2014532184.tif 000013
【化１１】
2014532184.tif 000014
【化１２】
2014532184.tif 000015
【化１３】
2014532184.tif 000016
【化１４】
2014532184.tif 000017
【化１５】
2014532184.tif 000018
【化１６】
2014532184.tif 000019
【化１７】
2014532184.tif 000020
【００５６】
５．５．  カップリング方法
親和性リガンドを固体担体に装着する為に、多種多様の適切なカップリング方法を使用し得る。カップリングは、共有結合、例えば、アミド結合（例えば、アミノＮＨＳ−エステル）、エステル結合、ホスホエステル結合、又はジスルフィド結合を用いて行われ得る。また、カップリングは、親和性タグ、例えば、抗原タグなどの方法又は他の結合方法を用いて行われ得る（例えば、抗体−プロテインＡ、ビオチン−ストレプトアビジン、ＦＬＡＧタグ（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、（非特許文献５８））、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／グルタチオン、ヘマグルタニン（ＨＡ）（非特許文献５９）、インテイン融合発現系（ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、米国）（非特許文献６０）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ））、ポリＨｉｓ−（Ｎｉ又はＣｏ）（非特許文献６１）、又はチオール−金。また、タンパク質のＮ末端にＧＳＴタグを含有する融合タンパク質が（特許文献３）（Ｓｍｉｔｈ）に記載されている。また、ストレパビジン−ダイナビーズ（Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ−ＤｙｎａＢｅａｄｓ）（登録商標）（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、米国）などの磁気分離技術も使用され得る。他の選択肢として、光切断性リンカー、例えば、（特許文献４）（オレジニク（Ｏｌｅｊｎｉｋ）及びロスチャイルド（Ｒｏｔｈｃｈｉｌｄ））に記載のものを使用し得る。ポリスチレン親和性ペプチドを含めて、多種多様なカップリング方法がナカニシ（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ）らによりレビューされている。（非特許文献６２）（この参照文献及びこの節の他の参照文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。多くの他の系が当技術分野で公知であり、本発明で使用するのに好適である。
【００５７】
５．６．  方法
本発明はまた、第１及び第２の層を含むマルチアナライトカラムにサンプルを充填することであって、第１の層は、特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第１の固体担体を含み、且つ第２の層は、非特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第２の固体担体を含むことと、マルチアナライトカラムを洗浄して何れの非結合タンパク質をも除去することと、変性剤を用いて、マルチアナライトカラムに結合した何れのキナーゼをも溶出させることと、溶出されたキナーゼを検出することと、を含む、サンプル中の低存在量キナーゼの検出方法を提供する。
【００５８】
検出は、質量分析により行われ得る。この方法は、複数のサンプルで行われ得るが、少なくとも１つのサンプルは、検出可能標識で標識される。検出可能標識は、ＳＩＬＡＣ（細胞培養に於けるアミノ酸を用いた安定同位体標識）により調製され得る。他の選択肢として、同位体標識スパイクがサンプルに添加される。
【００５９】
幾つかの実施形態では、サンプルの５ｍｇタンパク質部分から１５０種超のキナーゼが検出される。他の実施形態では、サンプルの５ｍｇタンパク質部分から１８０種超のキナーゼが検出される。他の実施形態では、単一のサンプルから４０種以上のキナーゼが検出され、キナーゼのリン酸化状態の変化もまた、測定される。
【００６０】
特定の実施形態では、本発明は、キナーゼ活性モジュレーターの選択方法を提供するが、この実施形態に限定されるものではない。本方法は、次の工程、即ち、細胞、組織、又は生物と化合物とを接触させる工程と、細胞、組織、又は生物からのタンパク質抽出物と、第１及び第２の層を含むマルチアナライトカラムと、を接触させる工程であって、第１の層は、特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第１の固体担体を含み、且つ第２の層は、非特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第２の固体担体を含む工程と、変性剤を用いて、固体担体に結合した何れのキナーゼをも溶出させる工程と、検出された複数のキナーゼのレベルを測定する工程と、既に測定されたレベルを標準レベルと比較してキナーゼプロファイルを取得する工程と、キナーゼプロファイルを用いてキナーゼ活性モジュレーターを選択する工程と、を含む。
【００６１】
本発明はまた、被験体に於いて癌の予後を判定する方法を包含する。この方法は、（ａ）以上の方法により検出された複数のキナーゼのレベルを測定することと、（ｂ）工程（ａ）で測定されたレベルを標準レベルと比較することと、を含み、標準レベルを基準にした少なくとも１種のキナーゼの測定レベルの変調は、癌の予後の指標となる。
【００６２】
本発明はまた、被験体に於いてキナーゼ関連障害に対する治療レジメンの有効性を改善する方法を包含する。この方法は、（ａ）以上の方法により検出された複数のキナーゼのレベルを測定することと、（ｂ）工程（ａ）で測定されたレベルを標準レベルと比較してキナーゼプロファイルを取得することと、（ｃ）キナーゼプロファイルを用いてより効果的な治療レジメンを決定することと、を含む。
【００６３】
本発明はまた、患者からのサンプルを取得することと、以上の方法により検出された複数のキナーゼのレベルを測定することと、１種又は複数種のキナーゼ阻害剤を用いて患者を治療することと、患者から第２のサンプルを取得することと、第２のサンプルから複数のキナーゼを測定することと、第２のサンプルレベルを既に測定されたものと比較することと、治療後の比較に基づいて癌治療レジメンを変更することと、を含む、癌治療レジメンの変更方法を包含する。
【００６４】
本発明はまた、（ａ）以上の方法により検出された複数のキナーゼのレベルを測定することと、（ｂ）工程（ａ）で測定されたレベルを標準レベルと比較してキナーゼプロファイルを取得することと、（ｃ）キナーゼプロファイルを用いて治療レジメン又は臨床試験に対して患者を層別化することと、を含む、治療レジメン又は臨床試験に対して患者を層別化する方法を包含する。そのような層別化は、キナーゼ耐性が発生するか否かを判定する為に、及びどの追加のキナーゼ薬剤が初期治療を補完するかを判定する為に、治療前に又は治療の過程で行われ得る。たとえば、（非特許文献６３）を参照されたい。
【００６５】
本発明はまた、（ａ）以上の方法により検出された複数のキナーゼのレベルを測定することと、（ｂ）工程（ａ）で測定されたレベルを標準レベルと比較してキナーゼプロファイルを取得することと、（ｃ）薬剤治療のオンターゲット効果又はオフターゲット効果の測定にキナーゼプロファイルを使用することと、を含む、薬剤治療のオンターゲット効果及びオフターゲット効果を測定する方法を包含する。
【００６６】
キナーゼ活性モジュレーターの選択方法は、次の工程、即ち、細胞、組織、又は生物と化合物とを接触させる工程と、細胞、組織、又は生物からのタンパク質抽出物と、第１及び第２の層を含むマルチアナライトカラムと、を接触させる工程であって、第１の層は、特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第１の固体担体を含み、且つ第２の層は、非特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第２の固体担体を含む工程と、変性剤を用いて、固体担体に結合した何れのキナーゼをも溶出させる工程と、検出された複数のキナーゼのレベルを測定する工程と、既に測定されたレベルを標準レベルと比較してキナーゼプロファイルを取得する工程と、キナーゼプロファイルを用いてキナーゼ活性モジュレーターを選択する工程と、を含む方法である。
【００６７】
５．６．１．  ビーズの設計方法
本発明の一態様は、創薬、特定的には、前臨床小分子の開発であろう。対象の化合物（コンビナトリアルケミストリーにより見出し得るリード化合物）から始めて、次の工程、即ち、（ａ）ＩＣ５０に関して精製標的キナーゼでプロファイリングする工程と、（ｂ）関連疾患モデル（腫瘍、細胞系）でＭＩＢ／ＭＳを用いてリード化合物に対するキノーム反応をプロファイリングする工程と、（ｃ）リード化合物のＭＩＢ／ＭＳキノーム反応プロファイルを構造活性相関及び標的キナーゼに対するＩＣ５０に相関付ける工程と、（ｄ）観察されたキノーム再プログラミングに基づいてリード化合物のオンターゲット／オフターゲット活性を規定する工程と、に従い得る。
【００６８】
キノーム反応再プログラミングからの情報を用いて、好ましい毒性プロファイルを有する化合物を選択することが可能である。単一の薬剤又は１種又は複数種のキナーゼ阻害剤の組合せに対して、これを使用することが可能である。セッセル（Ｓｅｓｓｅｌ）及びフェルナンデズ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ）は、水素結合、特異性、及びオンターゲット／オフターゲット活性を改変する為の薬剤足場の修飾を記載している。（非特許文献６４）。同様に、キノーム再プログラミングを用いて、改良された薬剤の組合せを設計したり又は新しい薬剤を試験したりすることが可能である。
【００６９】
多くの小分子キナーゼ阻害剤は、ＡＴＰ模倣体であり、心筋細胞及び他の心臓筋細胞は、大量のＡＴＰを消費する。従って、このクラスの薬剤では、心臓毒性が主要な関心事である。（非特許文献６５）並びに（非特許文献６６）。承認されたキナーゼ阻害剤、現在臨床試験中のキナーゼ阻害剤、前臨床キナーゼ阻害剤、又はこれらのキナーゼ阻害剤の２つ、３つ、若しくはそれ以上の組合せの心臓毒性プロファイルを研究する為に、本明細書に記載のＭＩＢ／ＭＳ技術を使用することが可能である。より広範には、キナーゼ阻害剤の組合せに対する毒性、安全性、及び有効性プロファイルをプロファイリングする為に、ＭＩＢ／ＭＳ技術を使用することが可能である。
【００７０】
５．６．２．  患者管理の為のＭＩＢの設計
本発明の他の適用は、患者を選択する為に又は単一の薬剤若しくは薬剤の組合せで起こりうる反応を予測する為に、カスタム多重化阻害剤ビーズ（ＭＩＢ）を設計することであろう。（ａ）患者サンプル、遺伝子工学操作マウスモデル（ＧＥＭＭ）、異種移植片、又は対象の細胞系を用いて、ＭＩＢの組合せを評価すること。ＭＩＢ上のリガンドの例は、ラパチニブ、ＳＢ２０３５８０、ｂｉｓ−Ｘ、ＭＥＫ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ソラフェニブ、ダサチニブ、プルバラノールＢ、ＰＰ５８、ＶＩ１１６８３２、２，４−ジアミノピリミジン、ピラゾール阻害剤である。（ｂ）ＭＩＢキノームプロファイルに関してＭＩＢの組合せを例示的な基準と比較すること（キナーゼファミリー範囲）：チロシンキナーゼファミリー（ＴＫ）＝６５％、チロシンキナーゼ様ファミリー（ＴＫＬ）＝５１％、酵母ｓｔｅｒｉｌｅ７、ｓｔｅｒｉｌｅ１１、ｓｔｅｒｉｌｅ２０キナーゼファミリーのホモログ（ＳＴＥ）＝５５％、カゼインキナーゼ１ファミリー（ＣＫ１）＝６７％、プロテインキナーゼＡ、Ｇ、及びＣファミリー（ＡＧＣ）＝４２％、カルシウム／カルモジュリン依存プロテインキナーゼファミリー（ＣＡＭＫ）＝３８％、ＣＤＫ、ＭＡＰＫ、ＧＳＫ、ＣＬＫファミリー（ＣＭＧＣ）＝６６％（（非特許文献６７）を参照されたい）。（ｃ）疾患タイプに対してキノームシグネチャーを規定すること。（ｄ）阻害剤に対するキノーム再プログラミングを規定すること。（阻害剤に反応して活性化されたキナーゼを決定する基準：ＭＩＢ／ＭＳ結合で＞２倍増加）。（ｅ）ＭＩＢ／ＭＳキノーム阻害剤反応プロファイルに基づいて組合せ治療を予測すること。（ｆ）ＧＥＭＭ、異種移植片、及び細胞系を用いて薬剤の組合せを前臨床試験すること。（ｇ）臨床ウィンドウ試験（以下を参照されたい）の為の阻害剤媒介キノーム反応を捕えるべくカスタムＭＩＢを設計すること。（ｈ）薬剤治療の前及び後に患者腫瘍生検でカスタム化ＭＩＢ／ＭＳを用いて薬剤反応の絶対定量を行うこと。（ｉ）個別の患者に対して薬剤反応を予測し、新しい治療剤の組合せを設計すること。
【００７１】
５．７．  臨床ＭＩＢ適用
５．７．１．  薬剤に対する治療反応を試験する為のウィンドウ試験へのＭＩＢ／ＭＳの適用
マルチアナライトＭＩＢカラムを用いて、治療反応のシグネチャー及び治療に対する潜在的耐性は、臨床現場でいわゆる「ウィンドウ試験」により生検で到達可能な腫瘍から取得される。
【００７２】
研究概要：  マルチアナライトカラムを用いた化学プロテオミクス手法を用いて、細胞及び腫瘍で発現されたキノームの有意パーセント（約６０−７５％）の活性を規定して治療反応を予測し得る。この技術は、細胞及び腫瘍で発現されたキナーゼの大部分を捕獲する為にビーズ上に固定された汎キナーゼ阻害剤の使用を必要とする。発現されたキノームの活性化状態は、捕獲されたキナーゼの質量分析を用いて分析可能である。この技術は、三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）などの特定の癌に対して、単一の作用剤又は作用剤の組合せを用いたキナーゼ阻害剤治療を調べてから、その治療を合理的にデザインする為に使用される。この技術は、生検で到達可能な任意の癌のタイプに適用可能である。例えば、生検は、副腎皮質癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨転移、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳癌、未知起源の癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイングファミリー腫瘍、眼癌、胆嚢癌、胃腸管カルチノイド腫瘍、胃腸間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭・下咽頭癌、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、肝臓癌、肺癌非小細胞（ＮＳＣＬＣ）、肺癌小細胞、肺カルチノイド腫瘍、皮膚（悪性中皮腫）のリンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔・副鼻腔癌、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔・中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、基底・扁平上皮細胞皮膚癌、皮膚癌・黒色腫、小腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、腟癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、又はウィルムス腫瘍に基づくものであり得る。
【００７３】
例は、根治的手術（乳腺腫瘤摘出、乳房切除、又はオリゴ転移性疾患の外科的切除の何れか）を受ける予定になっている第Ｉ〜ＩＶ期ＴＮＢＣ患者に対するウィンドウ試験である。登録患者は、手術の７〜２８日前に（手術スケジュールに依存する最終継続期間で）、キノーム反応及び耐性シグネチャーが解析される治療前後の組織に規定用量の薬剤の投与を受ける。注目すべきこととして、試験治療の継続期間は、手術スケジュールにより規定され、そのような試験の目的では、標準的治療に遅れを生じない。
【００７４】
キノームプロファイリングウィンドウ試験：  （１）薬剤による治療の前及び後で癌患者の腫瘍で示差的に発現されたキナーゼを同定する。（２）ＭＩＢを用いた示差的キナーゼプロファイリングを使用して、癌の治療に最適な阻害戦略の為の合理的単剤治療及び治療薬剤の組合せを予測する。（３）患者に於いて薬剤治療の前及び後に全キノームプロファイリングを行い、特定の癌を有する何人かの患者についてベースラインキノームパターン変動を測定する。
【００７５】
臨床サンプルのキノームプロファイリング：  （１）患者の腫瘍の薬剤治療前のコア生検を外科医が採取する。サンプルをフラッシュ凍結してキノームの活性化状態を保存する。（２）処方薬剤治療後（幾つかの場合には、薬剤を患者に与えなくてもよく、切除された腫瘍は、事前のコア生検サンプルを用いずに分析される）、腫瘍は、外科的に切除され、フラッシュ凍結により保存される。マルチアナライトＭＩＢカラムを用いて、治療の前及び後の腫瘍キナーゼを単離し、質量分析によりキノームを分析する。
【００７６】
５．７．２．  マウス中ヒト原発性腫瘍モデル
最近、数人の研究者は、ヒト癌を模倣する為に及び／又は個別の患者治療を設計する為に、免疫低下マウスへの原発患者腫瘍細胞の留置を報告した。文献では、これらの系は、同所腫瘍モデル、患者由来異種移植片（ＰＤＸ）、腫瘍移植片、又は異種移植片にように様々に呼ばれている。例としては、デローズ（ＤｅＲｏｓｅ）らにより報告された乳癌モデル及びドン（Ｄｏｎｇ）らにより報告されたＮＳＣＬＣモデルが挙げられる。（非特許文献６８）、（非特許文献６９）。ヒダルゴ（Ｈｉｄａｌｇｏ）らは、ＮＳＣＬＣ、ＣＲＣ、膵臓癌などの難治性進行癌の治療の指針を与える為に、そのようなマウス中ヒト移植組織を用いた他の例を報告している。（非特許文献７０）。本明細書に記載のキノームプロファイリング方法は、そのようなモデルから取得されるサンプルを用いて腫瘍をプロファイリングしたり、又は所与の癌に対して複数のキナーゼ阻害剤を含む特定の治療レジメンを設計、モニター、若しくは精密化したりするのに好適である。
【００７７】
５．８．  キナーゼのマルチアナライトＭＩＢ捕獲を用いたバイオマーカー分析
限られたタンパク質含有率の患者生検サンプルに対して、重アミノ酸（重ペプチド）で標識されたペプチドが、複雑なキノーム混合物中に非常に低濃度で存在するキナーゼの定量に使用される。何百もの異なるキナーゼに対する異なる質量の重ペプチドを患者の生検からの単一キナーゼ調製物に添加することが可能である。（２）重ペプチドは、一般的には、１５個までのアミノ酸から成り、１５Ｎ、１３Ｃ、又は２Ｈで標識されたアミノ酸で標識される。ペプチドは、ＰＤＧＦＲβ、ＶＥＧＦＲ２、ＤＤＲ１、Ｓｒｃ、ＡＫＴ、ＲＳＫ１などのキナーゼの天然タンパク質分解断片に対応する。重ペプチドは、５１８種の異なるキナーゼに対応するキノーム内のキナーゼの其々に対して作製することが可能である。それに加えて、例えば、キナーゼの活性化状態に対応するリン酸化重ペプチドを合成することが可能であり、この場合、リン酸化されていない重ペプチドは、キナーゼの不活性形に対応するであろう。（非特許文献７１）。（３）キナーゼの非リン酸化（不活性）状態及びリン酸化（活性）状態の特定のキナーゼに対応する重ペプチドは、マルチアナライトＭＩＢカラムを用いて患者の生検から単離されたキナーゼのタンパク質分解消化物に添加される。サンプルは、質量分析により「キナーゼの活性状態ｖｓ不活性状態」（キナーゼ活性化比）の絶対定量の為に分析される。（４）キナーゼ活性化比は、腫瘍生検のキナーゼの活性状態を規定する為に又は特定の薬剤治療が治療中にキナーゼを活性化若しくは阻害するかを規定する為に使用される。例は、マルチアナライトＭＩＢカラム上に捕獲される異なるレセプターチロシンキナーゼ、細胞質チロシンキナーゼ、又はセリン／トレオニンキナーゼのリン酸化及び非リン酸化活性化ループに対する重ペプチドであろう。
【００７８】
５．９．  癌特異的患者キナーゼプロファイリングの為のマルチアナライトＭＩＢカラムのカスタム化
多種多様な癌タイプからのＲＮＡ−ｓｅｑデータ及び遺伝子アレイデータと組み合わせてマルチアナライトＭＩＢ／ＭＳ分析を用いて有意数の患者腫瘍をプロファイリングすれば、癌キノームロードマップが提供されるであろう。ＲＮＡ−ｓｅｑデータ及び遺伝子アレイデータは、異なる腫瘍でのキナーゼの発現を規定するであろう。一方、ＭＩＢ／ＭＳは、異なる癌でキノームの重要な活性化状態を提供する。このデータを用いれば、患者の生検分析に使用されるマルチアナライトＭＩＢカラムの組成物がカスタム化されるであろう。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ（ＥＲＢＢ１〜４）を発現する腫瘍では、ラパチニブ結合ビーズがマルチアナライトカラムに含まれるであろう。ＰＤＧＦＲα及びβ、ＤＤＲ１及び２、ＶＥＧＦＲ２、及びＲｏｎを含むチロシンキナーゼを発現する腫瘍では、ソラフェニブ結合ビーズがマルチアナライトカラムに含まれるであろう。マルチアナライトカラムのカスタム化は、腫瘍のキナーゼ発現プロファイル及び図８Ｂで既に決定された阻害剤−ビーズ結合プロファイルに基づく。カスタム化マルチアナライトカラムは、少なくとも３つの異なる阻害剤ビーズからなり、以上に記載の重ペプチド定量方法を用いた患者サンプル中の特定のキナーゼバイオマーカーでのトレーニングを促進するであろう。
【００７９】
５．１０．  質量分析法
好ましい一実施形態では、多重化ビーズに結合されたタンパク質が、質量分析（ＭＳ）により分析される。多種多様な質量分析技術、例えば、以下が当技術分野で公知である：（非特許文献７２）、（非特許文献７３）。たとえば、タンデムＭＳ、（非特許文献７４）、（特許文献５）（ドリュース（Ｄｒｅｗｅｓ）ら）、ＡＤＰ又はＡＴＰに基づくアシルリン酸不可逆プローブ、（非特許文献７５）、（非特許文献７６）、ギギ（Ｇｙｇｉ）及び同僚により開発されたＡＱＵＡペプチド（非特許文献７７）、ｃＩＣＡＴ（切断可能同位体コード化親和性タグ）（非特許文献７８）、ｉＴＲＡＱ（絶対定量及び相対定量の為のアイソバリックタグ）（非特許文献７９）、（非特許文献８０）、ＭＲＭ  ＭＳ（多重反応モニタリング質量分析）（非特許文献８１）、（非特許文献８２）、ＳＩＬＡＣ（細胞培養に於けるアミノ酸を用いた安定同位体標識）、（特許文献６）（ダウプ（Ｄａｕｂ）ら）。（非特許文献８３）、（非特許文献８４）、スーパーＳＩＬＡＣ、ＳＩＬＡＣ用のスパイクインミックス、（非特許文献８５）、（非特許文献８６）、ホスホペプチドの二酸化チタン富化、（非特許文献８７）（それらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００８０】
本明細書で用いられるアイプロフェット（ｉＰｒｏｐｈｅｔ）及びペプチドプロフィット（ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｆｉｔ）を含めて、様々な方法がペプチド及びタンパク質の分析の為に報告されてきた。アイプロフェット（ｉＰｒｏｐｈｅｔ）、（非特許文献８８）、ペプチドプロフェット（ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｐｈｅｔ）、（非特許文献８９）。質量スペクトル分析の他の方法としては、インスペント（Ｉｎｓｐｅｃｔ）、マスコット（Ｍａｓｃｏｔ）、ミリマッチ（ＭｙｒｉＭａｔｃｈ）、オムッサ（ＯＭＳＳＡ）、シークエスト（ＳＥＱＵＥＳＴ）、Ｘ！タンデム（Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ）が挙げられる。インスペント（Ｉｎｓｐｅｃｔ）、（非特許文献９０）、（非特許文献９１）、ミリマッチ（ＭｙｒｉＭａｔｃｈ）、（非特許文献９２）、オムッサ（ＯＭＳＳＡ）、（非特許文献９３）、シークエスト（ＳＥＱＵＥＳＴ）、（非特許文献９４）、Ｘ！タンデム（Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ）、（非特許文献９５）を参照されたい。それらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８１】
５．１１．  組合せ方法
本発明に係るマルチアナライトカラムは、特に、固形腫瘍に対して、癌の診断、予後予測、病期分類の他の方法と組み合わせて使用するのに好適である。抗体染色、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、細胞遺伝学、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、遺伝子型解析（ＳＮＰ解析）、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、ｍＲＮＡ発現プロファイリング、メチル化プロファイリングなどの方法は、公知であり、キット又はサービスは、入手可能である。そのような技術の例は、（非特許文献９６）及び（非特許文献９７）（それらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）などの参照文献中に見出し得る。
【００８２】
５．１２．  化合物の同定方法
キナーゼ関連障害をモジュレートする及びキナーゼ関連障害の進行を防止又は処置する化合物を同定する為に、様々な方法を使用し得る。典型的には、測定容易なパラメーターを提供するアッセイは、本明細書に記載の試験化合物のライブラリーのメンバーのスクリーニングを促進する為に、マルチウェルプレートのウェルで行うように適合化される。従って、一実施形態では、適切な数の細胞をマルチウェルプレートの各ウェル中にプレーティングすることが可能であり、キナーゼ関連障害に関連付けられるキノームプロファイルに及ぼす試験化合物の効果を測定することが可能である。試験される化合物は、任意の低分子化学化合物又は高分子、例えば、タンパク質、糖、核酸、又は脂質であり得る。典型的には、試験化合物は、小化学分子及びペプチドであろう。本質的には、本発明のこの態様で、試験化合物として任意の化学化合物を使用することが可能であるが、多くの場合、水性溶液又は有機溶液（特にＤＭＳＯ系）に溶解可能な化合物が使用される。アッセイは、アッセイ工程を自動化し、任意の便利な供給源から化合物をアッセイに提供することにより、大きい化学ライブラリーをスクリーニングするように設計され、典型的には、並行して行われる（例えば、ロボットアッセイによりマイクロタイタープレート上でマイクロタイター方式で）。当然のことながら、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（ミズーリ州セントルイス）、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）（ミズーリ州セントルイス）、シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（ミズーリ州セントルイス）、フルカ・ケミカ−バイオケミカ・アナリティカ（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｋａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ）（スイス国ブーフス）などをはじめとする、化学化合物の多くの供給業者が存在する。
【００８３】
好ましい一実施形態では、多数の潜在的治療用化合物を含有するコンビナトリアル化学ライブラリー又はペプチドライブラリーを提供することを含む高スループットスクリーニング方法が使用される。次いで、そのような「コンビナトリアル化学ライブラリー」又は「リガンドライブラリー」を本明細書に記載される１種又は複数種のアッセイでスクリーニングして、所望の特性活性を呈するライブラリーメンバー（特定の化学種又はサブクラス）を同定する。この例では、キナーゼ関連障害に関連付けられるキノームプロファイルをモジュレートする能力に関して、そのような化合物をスクリーニングする。コンビナトリアル化学ライブラリーとは、化学的合成又は生物学的合成のいずれかにより、試薬のような幾つかの化学的「ビルディングブロック」を組み合わせることにより、生成されたさまざまな化学化合物のコレクションのことである。たとえば、ポリペプチドライブラリーのようなリニアコンビナトリアル化学ライブラリーは、所与の化合物長さ（即ち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）に対してできるかぎりの方法で一連の化学的ビルディングブロック（アミノ酸）を組み合わせることにより形成される。化学的ビルディングブロックのそのようなコンビナトリアル混合を介して、何百万もの化学化合物を合成することが可能である。
【００８４】
コンビナトリアル化学ライブラリーの調製及びスクリーニングは、当業者に周知である。そのようなコンビナトリアル化学ライブラリーとしては、ペプチドライブラリーが挙げられるが、これに限定されるものではない。例えば、（特許文献７）（ラター（Ｒｕｔｔｅｒ）及びサンティ（Ｓａｎｔｉ））、（非特許文献９８）、及び（非特許文献９９）を参照されたい。化学的多様性ライブラリーを作製する為の他の化学を使用することも可能である。そのような化学としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。（特許文献８）（バートレット（Ｂａｒｔｌｅｔｔ）ら）ペプトイド、（特許文献９）（ラーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）ら）コードペプチド、（特許文献１０）（ラム（Ｌａｍ）ら）ランダムバイオオリゴマー、（特許文献１１）（エルマン（Ｅｌｌｍａｎ））ベンゾジアゼピン、（特許文献１２）（クック（Ｃｏｏｋ）ら著）ペプチド核酸ライブラリー、（特許文献１３）（チェン（Ｃｈｅｎ）及びラドマー（Ｒａｄｍｅｒ））炭水化物ライブラリー、（特許文献１４）（アシュビー（Ａｓｈｂｙ）及びライン（Ｒｉｎｅ））イソプレノイド、（特許文献１５）（ホームズ（Ｈｏｌｍｅｓ））チアゾリジノン及びメタチアザノン、（特許文献１６）（タカラダ（Ｔａｋａｒａｄａ）ら）及び（特許文献１７）（アセバド（Ａｃｅｖａｄｏ）及びエベール（Ｈｅｂｅｒｔ））ピロリジン、（特許文献１８）（サマートン（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ）及びウェラー（Ｗｅｌｌｅｒ））モルホリノ化合物、（特許文献１９）（エルマン（Ｅｌｌｍａｎ））ベンゾジアゼピン、ダイバーソマー、例えば、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、及びジペプチド（非特許文献１００）、ビニロガスポリペプチド（非特許文献１０１）、グルコース足場を有する非ペプチド性ペプチド模倣体（非特許文献１０２）、低分子化合物ライブラリーのアナログ有機合成（非特許文献１０３）、オリゴカルバメート（非特許文献１０４）、及び／又はペプチジルホスホネート（非特許文献１０５）、核酸ライブラリー（いずれも上掲のオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）、及びサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）を参照されたい）、抗体ライブラリー（たとえば、（非特許文献１０６）を参照されたい）、炭水化物ライブラリー、例えば、（非特許文献１０７）、小有機分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、（非特許文献１０８）を参照されたい）。コンビナトリアルライブラリーの調製の為のデバイスは、市販品として入手可能である（例えば、３５７ＭＰＳ、３９０ＭＰＳ、アドバンスド・ケム・テック（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ）、ケンタッキー州ルーイビル、シンフォニー（Ｓｙｍｐｈｏｎｙ）、レイニン（Ｒａｉｎｉｎ）、マサチューセッツ州ウォバーン、４３３Ａ、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスターシティ、９０５０プラス（９０５０Ｐｌｕｓ）、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マサチューセッツ州ベッドフォードを参照された）。それに加えて、多数のコンビナトリアルライブラリーが、市販品として入手可能である（例えば、コムジェネックス（ＣｏｍＧｅｎｅｘ）（ニュージャージー州プリンストン）、アシネックス（Ａｓｉｎｅｘ）（ロシア国モスクワ）、トリポス・インコーポレイテッド（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）（ミズーリ州セントルイス）、ケムスター・リミテッド（ＣｈｅｍＳｔａｒ，Ｌｔｄ．）（ロシア国モスクワ）、３Ｄファーマシューティカルズ（３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（ペンシルバニア州エクストン）、マーテック・バイオサイエンス（Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（メリーランド州コロンビア）などを参照されたい）。
【００８５】
メチル化修飾剤は、公知であり、幾つかの承認された薬剤のベースになってきた。主要クラスの酵素は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）、及びヒストンアセチラーゼ（ＨＡＴ）である。ＤＮＭＴ阻害剤アザシチジン（ビダーザ（Ｖｉｄａｚａ）（登録商標））及びデシタビンは、骨髄異形成症候群で承認された（レビューに関しては、（非特許文献１０９）、（非特許文献１１０）、（非特許文献１１１）（参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられるものとする）を参照されたい）。ＨＤＡＣ阻害剤ボリノスタット（ゾリンザ（Ｚｏｌｉｎｚａ）（登録商標）、サハ（ＳＡＨＡ））は、進行性、持続性、又は再発性の疾患を有する患者の皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）を治療する為にＦＤＡにより承認された。（非特許文献１１２）。化合物ライブラリーの特定例としては、ケム・ディブ（Ｃｈｅｍ  Ｄｉｖ）（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手可能なＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）阻害剤ライブラリー、環状ペプチド（非特許文献１１３）、天然物ＤＮＭＴライブラリー（非特許文献１１４）、環式α３β−テトラペプチドライブラリーからのＨＤＡＣ阻害剤（非特許文献１１５）、又はクラミドシンからのＨＤＡＣ阻害剤（非特許文献１１６）が挙げられる。
【００８６】
５．１３．  キット
また、第１及び第２の層を有するマルチアナライトカラムであって、第１の層は、特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第１の固体担体を含み、且つ第２の層は、非特異的キナーゼ結合親和性を有する少なくとも２つの異なる親和性リガンドを有する第２の固体担体を含むマルチアナライトカラムと、癌を有する又は化学治療レジメンで治療されてきた被験体に於ける複数のキナーゼのレベルの測定に関する使用説明書と、を含むキットも提供される。
【００８７】
キットは、任意選択で、サンプル中のキナーゼの量の定量に有用な標準又は対照として使用する為の所定量の精製キナーゼ、キナーゼ由来のペプチド、又はキナーゼ由来のホスホペプチドの入った容器を更に含み得る。それは、Ｃ１３、Ｎ１５、Ｏ１８などの同位体で標識された材料を含み得る。各キットはまた、本明細書に記載の実施形態の１つ又は複数に従った本発明の実施を説明する印刷された使用説明書及び／又は印刷されたラベルも含み得る。キット容器は、任意選択で、滅菌容器であり得る。キットはまた、臨床サンプル、研究用サンプル、細胞系、及び／又は一次細胞にかかわらず、研究専用の用途に合うように構成され得る。また、キット、ビーズ、及び／又はカラムは、創薬（例えば、以上の第５．１３節の化合物同定方法）、化合物の検証、治療ウィンドウの最適化、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系、ｉｎ  ｖｉｖｏ系、動物モデル（細胞系異種移植片、動物中一次ヒト細胞異種移植片）でのキノーム毒性（例えば、心臓毒性）の研究などの使用に合うように構成され得る。キットはまた、これらの系の何れかでの機序若しくは作用の理解又はキノームの基礎研究に合うように構成され得る。当業者であれば、キノーム関連障害のヒト、動物、植物の疾患、特に癌を研究又は改善する為の本明細書に記載のツール及び方法のきわめて多数の使用を容易に理解するであろう。キノームは、学習、免疫学的疾患、及び発生生物学に極めて重要である。植物キノームに関しては、コメキノーム及びアラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）キノームに関する例示的研究を参照されたい。（非特許文献１１７）、（非特許文献１１８）。
【００８８】
本明細書全体を通じて、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（〜を含む）」という語又は「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（〜を含む）」若しくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（〜を含む）」のような派生語は、明記された要素、整数、若しくは工程又は一群の要素、整数、若しくは工程を包含することを意味するが、何らかの他の要素、整数、若しくは工程又は一群の要素、整数、若しくは工程を除外することを意味しないとみなされるものとする。本発明は、好適には、特許請求の範囲に記載の工程、要素、及び／又は試薬を「含む」か、「それらからなる」か、又は「それらから本質的になる」。
【００８９】
以下の実施例により本発明をさらに例示するが、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００９０】
６．１．  緒言
キナーゼ阻害剤は、腫瘍がその作用を回避するので、癌治療で限られた成果を有する。ＭＥＫ阻害に反応するキノーム活性を三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）細胞及び遺伝子工学操作マウス（ＧＥＭＭ）で評価した。ＭＥＫ阻害は、ＥＲＫ活性の急激な低下を引き起こし、その結果、急速なｃ−Ｍｙｃ分解をもたらして、幾つかのレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の発現及び活性化を誘導した。ＥＲＫ又はｃ−ＭｙｃのＲＮＡｉノックダウンは、ＭＥＫ阻害剤により引き起こされるＲＴＫ誘導を模倣したが、プロテアソーム阻害によるｃ−Ｍｙｃ分解の防止は、キノーム再プログラミングを阻止した。ＭＥＫ阻害剤により誘導されるＲＴＫ刺激は、ＭＥＫ１阻害ではなくＭＥＫ２阻害を克服することにより、ＥＲＫを再活性化し、薬剤耐性を生成した。ＴＮＢＣのＣ３Ｔａｇ  ＧＥＭＭは、同様に、ＭＥＫ阻害に反応してＲＴＫを誘発した。阻害剤により誘導されるＲＴＫのプロファイルから、単一の作用剤が効果的でないＧＥＭＭ腫瘍アポトーシス及び退縮を生成するキナーゼ阻害剤の組合せ治療が提案された。この手法は、薬剤耐性の機序を規定し、癌に対する組合せ治療の合理的設計を可能にする。
【００９１】
細胞及び腫瘍で発現される有意パーセントのキナーゼの活性及び薬剤反応性を規定する為に、化学プロテオミクス手法を開発した。この技術の適用により、現在奏功する標的化治療が欠如している三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）に対する効果的なキナーゼ阻害剤の組合せ治療を合理的に設計することが可能になった。ＴＮＢＣ患者の分析により、活性化されたＲＡＦ−ＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２（これ以降ではＭＥＫ及びＥＲＫとして参照される）シグナル伝達が示されたことから、ＴＮＢＣでＭＥＫが標的として裏付けられた。然しながら、ＴＮＢＣ細胞系及びＧＥＭＭ腫瘍でのＭＥＫ阻害後、キノームは、元のＭＥＫ−ＥＲＫ阻害をバイパスするＴｙｒ及びＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼの誘導発現及び活性により急速に再プログラミングされた。このグローバル技術を用いることにより、これまで発見されなかったＴｙｒ及びＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ活性化が、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２の示差的感受性並びに転写因子ｃ−Ｍｙｃの低下を含むキノーム再プログラミングのロバスト機序により、ＭＥＫ阻害剤に反応して観察された。ＭＥＫ阻害剤キノーム反応シグネチャーから、ＴＮＢＣに対する新規な小分子組合せ治療が予測され試験された。組合せは、ＴＮＢＣ細胞系の増殖を相乗的に阻害して、基底様／低クローディンＴＮＢＣのＣ３Ｔａｇ  ＧＥＭＭでアポトーシス及び腫瘍退縮を引き起こした。
【００９２】
６．２．  ＴＮＢＣのキノームプロファイリング結果
単一キナーゼ阻害剤のＴＮＢＣ臨床試験は、代替生存シグナル伝達経路の薬剤誘導活性化に相応して、ほとんど失敗した。図１Ａは、組合せ治療の合理的設計をもたらすエンドポイントを規定する目的で、キノームダイナミクスを調べる戦略を概説している。ＲＮＡ−ｓｅｑにより、転写レベルで発現されたキノームを規定し、内因性キナーゼのアフィニティー捕獲及びそれに続く定量的質量分析により、腫瘍及び細胞でキノーム活性プロファイルを測定した。プロテオミクス評価を用いて、キナーゼの標的化阻害に対するキノーム反応を規定した。ＲＮＡｉにより、阻害剤に反応して活性化されたキナーゼの増殖機能及び生存機能を試験し、累積結果を用いて、ＴＮＢＣのモデルで試験すべきキナーゼ阻害剤の組合せを合理的に予測した。
【００９３】
ＲＮＡ−ｓｅｑにより、患者の低クローディン乳房腫瘍並びに２つの低クローディンＴＮＢＣ系ＳＵＭ１５９及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１のキノーム転写物発現プロファイルを規定した。低クローディンヒトＴＮＢＣ腫瘍及び細胞系で、５１８種のヒトタンパク質キナーゼ転写物のうち４００種超が発現される（図１Ｂ）。低クローディン患者腫瘍で発現されたキナーゼの約１０％は、低クローディン細胞系と比較してユニークであったが、これは恐らく、腫瘍の複雑な細胞組成に起因する。発現されたキナーゼの大多数は、腫瘍と低クローディン細胞系との間で共通していることから、阻害剤に対する細胞キノーム反応を調べることは、患者腫瘍に適合することが示唆される。
【００９４】
異なるキナーゼ（特異的キナーゼ結合親和性）（ビスインドリルマレイミド−Ｘ、ＳＢ２０３５８０、ダサチニブ、及びラパチニブ）並びに比較的広範な汎キナーゼ阻害剤（非特異的キナーゼ結合親和性）（ＶＩ１６８３２、プルバラノールＢ、及びＰＰ５８）に対して中程度の選択性の共有結合固定化リンカー適合化キナーゼ阻害剤を有するセファロースビーズの混合物をからなる多重化阻害剤ビーズ（ＭＩＢ）を用いて、腫瘍及び細胞系でキナーゼ活性のプロファイリングを行った（図８Ａ）。ダウプ（Ｄａｕｂ）ら著、２００８年。キナーゼ捕獲は、再現性があり、キナーゼ発現、異なる固定化阻害剤に対するキナーゼの親和性、及びキナーゼの活性化状態の関数である。バンチェフ（Ｂａｎｔｓｃｈｅｆｆ）ら著、２００７年。活性化依存結合の急激な変化は、ＥＧＦ刺激細胞でのＭＡＰＫ経路キナーゼの結合の増大及びＴｙｒホスファターゼ阻害剤過バナジン酸で処理された細胞からのＴｙｒキナーゼの保持の増大により実証された（図８Ｂ及び８Ｃ）。ＭＩＢは、ＲＮＡ−ｓｅｑにより推定された発現キノームの大多数を捕獲し、癌の治療に使用される刺激又はキナーゼ阻害剤に反応して改変されたキノーム活性プロファイルを検出することがデータから示された。
【００９５】
ＭＩＢ及び質量分析を用いて、細胞系及び腫瘍（表３）から累積で３２０種超の発現されたキナーゼの配列を同定した。浸潤性腺管癌乳房腫瘍及び２つの低クローディン細胞系のＭＩＢ／ＭＳプロファイリングにより、転写レベルで発現されたキノームの約５０〜６０％を同定した（図１Ｃ〜１Ｅ）。すべての主要キノームサブファミリーからのキナーゼが捕獲されたが、大部分は、非標的キノームに対応する（フェドロフ（Ｆｅｄｏｒｏｖ）ら著、２０１０年）。そのほかに、ＭＩＢ精製キナーゼから誘導されたペプチドのｉＴＲＡＱ標識を用いて、近接非関与乳房組織と比較して、患者の浸潤性腺管癌でキナーゼを定量的にプロファイリングした（図１Ｆ）。検出されたキナーゼに関して、一般に腫瘍キナーゼのＭＩＢ結合の増加があったことから、非関与乳房組織と比較して腫瘍でのキノーム活性の増大が示唆される。例えば、ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路は、ＥＲＫ活性がＴＮＢＣ増殖のドライバーであることに相応して、対照組織を基準にして腫瘍ではＭＩＢ結合で増大される。免疫ブロットにより、患者の浸潤性腺管癌でＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達の活性化を確認した（図１Ｇ）。ＲＴＫアレイを用いて、患者の浸潤性腺管癌及び低クローディン乳房腫瘍で、Ｔｙｒリン酸化ＲＴＫを確認した。これは、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＰＤＧＦＲβ、ＣＳＦＩＲ、ＲＯＮ、及びＥＰＨＢ２のリン酸化を示した（図１Ｈ）。患者の腫瘍でＴｙｒリン酸化ＥＧＦＲ及びＰＤＧＦＲβの潜在的重要性がデータから示唆されたが、これらのＲＴＫを標的とする臨床試験は、ほとんど失敗した。（非特許文献１１９）、（非特許文献１２０）。ＴＮＢＣでの単剤ＲＴＫ阻害剤の失敗は、複数のキナーゼの薬剤誘導活性化及び補償腫瘍キノーム反応に相応する。多くの発現されたＲＴＫは、ＥＲＫ活性化を駆動するので、ＭＥＫ阻害（例えば、現在臨床試験中のＡＺＤ６２４４）の後、低クローディン乳癌細胞をプロファイリングして、動的キノーム再プログラミングが起こるか調べた。１つの目標は、より効果的な合理的にデザインされた組合せ治療を示唆するキノーム改変を規定することであった。
【００９６】
６．３．  ＭＥＫ阻害に反応するキノームの再プログラミング
ＭＥＫ阻害剤ＡＺＤ６２４４又はＵ０１２６は、ＳＵＭ１５９細胞（図２Ａ）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（図９Ａ）の増殖を阻害した。ＭＥＫ阻害剤への暴露の４時間後、ＥＲＫは、阻害状態を維持したが、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２の両方を認識するホスホ抗体により規定されるＭＥＫリン酸化は、促進された（図２Ｂ）。２４時間の阻害剤処理の結果、ＭＥＫ及びＥＲＫは両方とも、更に活性化されたので、両方の系は、初期ＭＥＫ阻害を克服したことが実証された（図２Ｂ及び９Ｂ）。ホスホプロテオミクス分析により、ＢＲＡＦ及びＭＥＫ１の両方のＥＲＫ媒介フィードバック調節の低下が明らかにされた（図２Ｃ）。ＢＲＡＦ及びＭＥＫ１上のＥＲＫリン酸化部位（これらは負のフィードバック調節部位である）の低減から、ＥＲＫ経路上の抑制的フィードバック効果から逃避したことが示唆される。（非特許文献１２１）。ＭＩＢ単離プロテインキナーゼの分析により、リン酸化の低減を有する５２種のペプチド及び増大を有する５９種のペプチドが同定されたが、３６５種のホスホペプチドのリン酸化状態は、ＭＥＫ阻害後、不変であった（図９Ｃ）。これらのリン酸化部位の大多数は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＰｒｏ指向Ｓｅｒ／Ｔｈｒ部位であったが、Ｐ−Ｔｙｒ変化も含まれていた。このことから、ＡＺＤ６２４４に反応してキノーム活性が広範に変化することが示唆される。
【００９７】
次に、我々は、ＭＩＢ／ＭＳを用いて、ＡＺＤ６２４４への４、１２、及び２４時間暴露後、ＳＵＭ１５９キノーム反応をプロファイリングした（図２Ｄ）。ＭＥＫ阻害の結果、１４０種超のキナーゼで時間依存ＭＩＢ結合変化のプロファイルが得られた。ＭＩＢ結合の変化は、細胞周期調節キナーゼ、ＭＡＰＫ経路キナーゼ、ＲＴＫ、サイトゾルＴｙｒキナーゼ、及び多くのＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼで見られた。図２Ｅは、ＳＵＭ１５９細胞のＭＥＫ阻害剤反応の時間経過にわたりＭＡＰＫ成分キナーゼのＭＩＢ結合ダイナミクスを強調表示する。４時間のＡＺＤ６２４４処理で、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２は両方とも、ＭＩＢ結合の低下により測定されるように阻害された。然しながら、ＭＥＫ１結合は、大きく阻害された状態を維持し、一方、ＭＩＢに結合するＭＥＫ２は、１２時間の処理で増大し、２４時間では、対照細胞に類似していたことから（ＡＺＤ６２４４／ＤＭＳＯ比＝１）、ＭＥＫ２活性の回復が示唆される。ＭＩＢへのＭＥＫ２結合の回復と併行して、ＭＩＢへのＲＡＦ１及びＥＲＫ１結合は、これらのキナーゼの活性化と相関して、ＡＺＤ６２４４処理の時間経過にわたり増大する。ＭＡＰＫ経路で各キナーゼに対してＲＮＡｉを用いて、発現のノックダウンが、ＭＥＫ阻害に反応して、示差的増殖効果を有するかを判定した（図２Ｆ）。ＭＥＫ２及びＥＲＫ１の低下は、ＭＥＫ阻害剤の存在下でＳＵＭ１５９細胞増殖を阻害し、ＭＥＫ１ノックダウンは、増強された増殖阻害を生成しなかったことが、ＲＮＡｉノックダウンから示される。ＭＩＢ／ＭＳ分析に相応して、ＭＥＫ２及びＥＲＫ１は、ＡＺＤ６２４４による阻害から逃避するＭＥＫ／ＥＲＫキナーゼであることから、それらは、ＡＺＤ６２４４の存在下でＳＵＭ１５９細胞増殖に極めて重要であることが示唆される。
【００９８】
図２Ｇ及び２Ｈは、ＭＥＫ阻害剤に反応して再プログラミングされたキノームを規定する２１種のキナーゼシグネチャーを示している。２１種のキナーゼシグネチャーは、３つの生物学的レプリケート実験に対して第６．１８節に概説された方法を用いて規定された。薬剤処理後の３つすべてのレプリケートにわたるキナーゼＭＩＢ結合の統計的変化により、薬剤反応性キナーゼとしての資格が与えられる。シグネチャーは、アッセイされる癌タイプ、例えば、膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、ホルモン難治性転移性前立腺癌、黒色腫、転移性結腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、又は膵臓癌に依存するであろう。変化倍率は、ＡＺＤ６２４４又はＵ０１２６でＳＵＭ１５９細胞を処理する３つの独立した実験の平均である。このシグネチャーは、増殖阻害及びＭＩＢへのＥＲＫ結合の増大に相応して、サイクリン依存キナーゼの低下を示すことから、ＭＥＫ阻害が克服されたことが示唆される。ＡＸＬ、ＤＤＲ１、及びＰＤＧＦＲβを含むＲＴＫ、サイトゾルＴｙｒキナーゼＦＡＫ２及びＪＡＫ１並びにまた、アクチビンレセプターＳｅｒキナーゼはすべて、ＭＩＢ結合を示した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＡＺＤ６２４４に対してロバスト性の低いキノーム反応を有しているが、ＭＩＢに対するＰＤＧＦＲβ結合の強い増加を含む有意なキノーム再プログラミングを呈した（図９Ｄ）。
【００９９】
ＲＴＫアレイにより、ＭＥＫ阻害に反応してＰＤＧＦＲβを含む複数のＲＴＫのＴｙｒリン酸化の増大が確認された（図２１及び９Ｅ）。ＳＵＭ１５９細胞では、ＶＥＧＦＲ２、ＡＸＬ、及びＲＥＴもまた、ＡＺＤ６２４４に反応して有意にＴｙｒリン酸化を増大させた。ＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦＲ２は、ＡＺＤ６２４４の濃度の増加に伴ってＴｙｒリン酸化及びタンパク質発現の増大を示すので、ＳＵＭ１５９細胞のＡＺＤ６２４４反応は、用量依存性である（図２１）。これらの結果から、有意数のキナーゼがＭＥＫ阻害に反応して誘導されることが実証される。ＭＥＫ阻害に対するキノーム変化に関連して、図９Ｆには、低クローディン患者腫瘍の４０種までの発現されたキナーゼ転写物が列挙されている。これらの４０種のキナーゼのうち、１４種（２４％）は、ＡＺＤ６２４４に反応してＳＵＭ１５９細胞及び／又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞でＭＩＢへの結合が動的に調節されたことから、患者腫瘍は、標的キナーゼ阻害に反応して類似の動的キノーム再プログラミングを有しうることが示唆される。
【０１００】
６．４．  ＭＥＫ阻害は、ＲＴＫの転写、発現、及び活性化をデレギュレートする
図３Ａ及び１０Ａは、ＳＵＭ１５９細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞でＡＺＤ６２４４に対する初期（１５ｍｉｎ〜４ｈ）及び後期（１２〜７２時間）再プログラミング反応を規定する。ＭＥＫ及びＥＲＫは、急速に阻害されたので、ＥＲＫを不活性化するＭＡＰＫホスファターゼＭＫＰ３の蓄積が可能であった。（非特許文献１２２）。ＭＫＰ３発現の増大は、ＭＥＫ阻害剤との組合せによりＥＲＫ活性を強く抑制するが、ＭＫＰ３タンパク質は、ＭＡＰＫ経路活性が回復するにつれて失われる。経時的に、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲβ、及びＤＤＲ１発現は、ＨＥＲ３及びＡＸＬのリン酸化と同様に、ＡＺＤ６２４４処理で増大された。ＡＺＤ６２４４で処理されたＳＵＭ１５９細胞（図３Ｂ）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（図１０Ｂ）のｑＲＴ−ＰＣＲ分析により、これらのＲＴＫの幾つかでＲＮＡレベルの改変が実証された。１２時間まで、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＰＤＧＦＲβ、ＲＯＮ、ＶＥＧＦＲ２、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ３に対するＳＵＭ１５９細胞転写物が増大された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＰＤＧＦＲ、ＥＰＨＡ３、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ３転写物の増大を示した。サイトカインＲＮＡ発現の分析により、ＥＧＦ、Ｇａｓ６、ＰＤＧＦＢ、及びＰＤＧＦＤの誘導が示されたことから、ＲＴＫ活性化に対するオートクリン／パラクリンループの確立が示唆される（図３Ｃ及び１０Ｃ）。ＲＴＫホスホ抗体アレイにより、ＰＤＧＦＲβ、ＶＥＧＦＲ２、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ３（ＤＤＲ１及びＤＤＲ２はアレイ上に存在しない）のＴｙｒリン酸化の時間依存増加が更に示された（図３Ｄ）。ＰＤＧＦＲβ（そのＲＮＡ及びタンパク質の発現は、ＡＺＤ６２４４に反応して誘導される）は、ＰＩ３Ｋ及びＰＬＣγのレセプターキナーゼ活性化及び動員に必要とされる部位Ｔｙｒ７５１、８５７、及び１００９でリン酸化された（図３Ｅ）。
【０１０１】
ＡＺＤ６２４４への３０日間の連続暴露後、ＳＵＭ１５９細胞は、ＭＥＫ阻害剤誘導増殖停止に対して有意に耐性となった（図３Ｆ）。サイクリンＡ２及びＢ１の発現は、増殖の増大に相応して回復した（図１０Ｄ）。ＡＺＤ６２４４耐性細胞（ＳＵＭ１５９−Ｒ）は、再プログラミングされたキノームを継続して有し、この際、ＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦＲ２は、発現及びＴｙｒリン酸化の両方の増大を呈し、ＡＸＬは、Ｔｙｒリン酸化の増大を示した（図３Ｇ及び３Ｈ）。これらのＲＴＫの活性化は、リン酸化されたＡＫＴ、ＲＡＦ、ｐ７０Ｓ６キナーゼ、ＭＥＫ、ＥＲＫ、及びＲＳＫ１の増大により達成されることから、細胞は、ＥＲＫ、ＡＫＴ、及びｍＴＯＲ経路（図３Ｇ）のＲＴＫ活性化によりＭＥＫのＡＺＤ６２４４阻害を克服したことが示される。
【０１０２】
これらの知見から、標的化ＭＥＫ阻害は、複数のキナーゼの活性を有意に改変することが示唆される。従って、キナーゼ活性の変化がＭＥＫ阻害又は増殖阻害機能に特異的であるかを測定することが重要であった。ＢＥＺ２３５は、ＳＵＭ１５９細胞を強力に増殖停止させる二重ＰＩ３Ｋ・ｍＴＯＲ阻害剤である（図Ｓ３Ｅ）。ＢＥＺ２３５は、ｍＴＯＲ阻害に相応してｐ７０Ｓ６キナーゼ活性を阻害するが、ＥＲＫ経路に殆ど影響を及ぼさない（図１０Ｆ）。ＢＥＺ２３５及びＡＺＤ６２４４に対するＳＵＭ１５９キノーム反応を比較して、キノーム再プログラミングが阻害剤特異的であるか又は増殖停止機能であるかを決定した。ＡＺＤ６２４４は、ＰＤＧＦＲβ、ＶＥＧＦＲ２、及びＡＸＬリン酸化を誘導したが、ＢＥＺ２３５処理は、ホスホＡＸＬの増加以外は、ＲＴＫリン酸化プロファイルを変化させなかった（図３Ｈ）。ＭＩＢ／ＭＳプロファイルにより、ＡＺＤ６２４４は、ＢＥＺ２３５とは異なりキノームプロファイルを改変することが示されたことから、薬剤誘導キノーム再プログラミングは、標的特異的であることが示唆される（図１０Ｇ）。
【０１０３】
６．５  ＭＥＫ−ＥＲＫ阻害はｃ−Ｍｙｃ分解を誘導してＲＴＫ再プログラミングをもたらす
ＥＲＫは、Ｓｅｒ６２で転写因子ｃ−Ｍｙｃをリン酸化し、そのプロテアソーム分解を防止することによりｃ−Ｍｙｃタンパク質を安定化する（シアーズＲ（Ｓｅａｒｓ  Ｒ）、２０００年）。（非特許文献１２３）。ＡＺＤ６２４４で細胞を処理すると、ｃ−Ｍｙｃタンパク質及びｃ−Ｍｙｃ  ｍＲＮＡが急速に低下する（図４Ａ及びＢ）。ホスホｃ−Ｍｙｃの低下は一過性であり、ＥＲＫ再活性化と同時に回復する。然しながら、全ｃ−Ｍｙｃタンパク質及びｍＲＮＡは、ＡＺＤ６２４４の連続的存在下では抑制された状態を維持し、結果的に、転写のｍｙｃ調節に必要とされるＭｙｃ−Ｍａｘヘテロ二量体化は、低減された（図４Ｃ）。（非特許文献１２４）、（非特許文献１２５）。ＭＥＫ−ＥＲＫ活性化が２４〜７２時間後に実質的に回復したとは言え、完全なｃ−Ｍｙｃ発現は、ＡＺＤ６２４４の連続的存在下では抑制された状態を維持した（図４Ａ〜Ｃ）。
【０１０４】
ｃ−Ｍｙｃは、ヒトＰＤＧＦＲβのプロモーターに結合し（図１１Ａ）、ＰＤＧＦＲβの発現を抑制する。（非特許文献１２６）。ＡＺＤ６２４４再プログラミング反応に於けるｃ−Ｍｙｃ低下の役割を規定する為に、ＲＮＡｉ技術をｃ−Ｍｙｃの発現のノックダウンに適用した。その作用は、ＡＺＤ６２４４処理で見られたＲＴＫ再プログラミング及びサイトカインシグネチャーを模倣することであった（図４Ｄ〜Ｆ）。ＡＺＤ６２４４反応に類似して、ｃ−Ｍｙｃのノックダウンは、ＰＤＧＦＲβ、ＶＥＧＦＲ２、及びＰＤＧＦＢの発現を誘導し、ＰＤＧＦＲβ、ＶＥＧＦＲ２、ＨＥＲ３、及びＡＸＬのＴｙｒリン酸化を増大させた。ＥＲＫ１及び２のＲＮＡｉノックダウンを用いて、ＥＲＫ阻害が、キノームのＡＺＤ６２４４再プログラミングに於いてｃ−Ｍｙｃ  ｍＲＮＡ発現の初期シグナル誘導低下であるかを確認した。二重ＥＲＫ１／２ノックダウンにより、ｃ−Ｍｙｃが低減し且つＰＤＧＦＲ発現が増大した（図１１Ｂ）。従って、ＡＺＤ６２４４に反応するＲＴＫの再プログラミングは、ｃ−ＭｙｃのＥＲＫ媒介安定化の低下及びｃ−Ｍｙｃにより負に調節されるＲＴＫ及びサイトカインの後続の転写脱抑制により起こる。ｍＴＯＲ及びＰＩ３ＫのＢＥＺ２３５阻害は、細胞増殖を阻害するが、ＥＲＫ活性、ｃ−Ｍｙｃ発現（図１１Ｃ）、又はＲＴＫ再プログラミング（図１１Ｇ）を変化させないことから、ｃ−Ｍｙｃレベルの制御に於けるＭＥＫ−ＥＲＫの特異性が確認される。
【０１０５】
５μＭのＡＺＤ６２４４中で連続増殖されたＡＺＤ６２４４耐性ＳＵＭ１５９−Ｒ細胞では、ｃ−Ｍｙｃタンパク質及びＲＮＡレベルは、ｃ−Ｍｙｃを安定化するＥＲＫ活性の増大が理由で部分的に回復した（図４Ｇ〜４Ｉ）。これは、ＭＥＫ阻害剤で短時間処理された細胞と比較して、増殖速度が増大されたＳＵＭ１５９−Ｒ細胞と相関する（図３Ｆ）。然しながら、ｃ−Ｍｙｃタンパク質のレベルは、ＲＴＫ発現を完全に抑制するには不十分であり、対照細胞と比較して増大された状態を維持するが、２４〜７２時間のＡＺＤ６２４４処理で見られたよりも低いレベルである（図４Ｇ及び４１）。高用量のＭＥＫ阻害剤は、より効果的にＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達のＲＴＫ刺激再活性化を阻害しうるので、ＳＵＭ１５９−Ｒ細胞でＡＺＤ６２４４の濃度を５倍の２５μＭに増大させると、ＥＲＫ活性化が阻害される（図４Ｊ）。その結果、５μＭのＡＺＤ６２４４で処理された対照ＳＵＭ１５９細胞で見られたものに類似して、ホスホｃ−Ｍｙｃ及び全ｃ−Ｍｙｃタンパク質の低下並びに対応するＲＴＫ発現の増加が起こる（図４Ｊ）。２５μＭ用量のＡＺＤ６２４４では、ＳＵＭ１５９−Ｒ細胞は、短時間処理された対照ＳＵＭ１５９細胞に類似して、サイクリンＢ１及びＡ２発現の低下を伴って増殖が停止された。これとは対照的に、ＳＵＭ１５９−Ｒ細胞培養物からＡＺＤ６２４４を洗浄除去したところ、ＥＲＫ活性、ｃ−Ｍｙｃ発現の安定化、及びＲＴＫ発現の抑制が増大された（図４Ｋ及び４Ｌ）。従って、ＭＥＫ阻害剤の除去により、キノーム再プログラミングが完全に逆転された（図４Ｌ及び図１１Ｄ）。
【０１０６】
Ｓｅｒ６２のリン酸化が欠如したｃ−Ｍｙｃのプロテアソーム分解は、ＡＺＤ６２４４誘導キノーム再プログラミングを開始する。骨髄腫で臨床的に使用されるプロテアソーム阻害剤ボルテゾミブにより細胞を処理したところ、ＡＺＤ６２４４誘導ｃ−Ｍｙｃ分解（図４Ｍ）及びｃ−Ｍｙｃ  ＲＮＡの低下（図１１Ｅ及び１１Ｆ）が防止された。また、ボルテゾミブは、ＲＴＫのアップレギュレーションを阻害し（図４Ｍ及び４Ｎ）、ＳＵＭ１５９−Ｒ細胞でＲＴＫ発現を容易に逆転させた（図４０及び４Ｐ）。これらの知見から、ＡＺＤ６２４４誘導ｃ−Ｍｙｃプロテアソーム分解は、キノーム再プログラミング及びＲＴＫアップレギュレーションに関与することが示される。ＡＺＤ６２４４洗浄除去又はプロテアソーム阻害によりｃ−Ｍｙｃを安定化させたところ、ＡＺＤ６２４４に対する耐性の発生が防止され、ＳＵＭ１５９−Ｒ細胞の耐性が逆転した。然しながら、ＡＺＤ６２４４  ＥＲＫの連続的存在下では、再活性化は、ＲＴＫ再プログラミングを十分に逆転するには不十分であるように思われることから、ＥＲＫ、十分に再活性化され得ないことが示唆される。これは、ＳＵＭ１５９−Ｒ細胞からの僅か１時間のＡＺＤ６２４４洗浄除去後、２種のＥＲＫ基質ＲＳＫ１及びｃ−Ｍｙｃのリン酸化を測定することにより示された（図４Ｑ）。基質及びホスホＥＲＫのリン酸化は両方とも増大されたことから、ＭＥＫ阻害剤の除去によりＥＲＫが更に活性化されることが実証される。まとめると、これらのデータから、長時間ＡＺＤ６２４４処理ではＥＲＫ１／２リン酸化の回復にもかかわらずＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達が持続的にＡＺＤ６２４４媒介抑制されることが示唆される。
【０１０７】
６．６．  ＲＴＫ再プログラミングはＡＺＤ６２４４誘導増殖停止から細胞をレスキューする
ＳＵＭ１５９細胞でＰＤＧＦＲβのＲＮＡｉノックダウンを行ったところ、ＭＥＫ阻害に反応して増殖阻害が増大されたことから、ＲＴＫシグナル伝達の誘導は、ＡＺＤ６２４４により増殖阻害された細胞の生存及び回避に極めて重要であることが示唆される（図５Ａ）。ＭＥＫ阻害に対する細胞のレスキュー反応に於ける追加のＲＴＫの役割を試験する為に、ＳＵＭ１５９細胞（図５Ｂ）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（図１２Ａ）でＵ０１２６に反応して転写誘導及び／又はＴｙｒリン酸化されることが見いだされたＲＴＫに対して、ｓｉＲＮＡノックダウンを行った。対照として、ＢＲＡＦ、ＲＡＦ１、ＥＲＫ１及び２をノックダウンするｓｉＲＮＡを使用した。各経路メンバーのノックダウンを行ったところ、ＭＥＫ阻害で観察された増殖停止が促進された（図１２Ａ及び１２Ｂ）。ＰＩ３Ｋ及びＡＫＴのノックダウンでは、突然変異体ＰＩ３ＫがＳＵＭ１５９細胞のドライバーであることに相応して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞よりもＳＵＭ１５９で大きい増殖停止反応を起こした。Ｌｙｎ及びＥＰＨＡ２のｓｉＲＮＡノックダウンは、ＭＥＫ阻害剤の存在下又は不在下で何れの細胞型の増殖にも影響を及ぼさなかった（Ｌｙｎ及びＥＰＨＡ２は両方とも、ＡＺＤ６２４４又はＵ０１２６に反応してＭＩＢ結合の低下を示すことから、それらの活性の阻害が示唆される）。ＨＥＲ２又はＨＥＲ３のノックダウンは、ＳＵＭ１５９細胞ではほとんど影響を及ぼさず、ＨＥＲ３は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞ではほぼ中程度の影響を及ぼす。これとは対照的に、ＡＸＬ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＰＤＧＦＲ、及びＶＥＧＦＲ２のノックダウンは其々、Ｕ０１２６の存在下で合成致死様効果を生じた。即ち、ＲＴＫ発現の低下は、単独では増殖阻害をほとんど生じなかったが、ＭＥＫ阻害剤の存在下では相乗的に増殖を阻害した。従って、ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達の低下により、複数のＲＴＫが関与する反応が開始され、其々、ＭＥＫ阻害の影響をなくす上で何らかの役割を果たす。
【０１０８】
６．７．  ＲＴＫ阻害剤と組み合わされたＡＺＤ６２４４
我々の結果から、ＡＺＤ６２４４とＲＴＫ阻害剤とを組み合わせることにより、再プログラミングされたキノームの増殖促進活性を阻止しうることが示唆された。ＡＺＤ６２４４活性化ＲＴＫのレパートリーを考慮して、細胞増殖を阻害する能力に関して、ソラフェニブ及びフォレチニブを単剤として又ＡＺＤ６２４４と組み合わせて試験した（図５Ｃ及び５Ｄ）。２つのＲＴＫ阻害剤は、単剤としては効果がなかったが、両方とも、ＡＺＤ６２４４との組合せでは相乗的に細胞増殖を阻害し、ソラフェニブは、最も効果的であった。細胞計数アッセイでは、ＳＵＭ１５９細胞を用いてＡＺＤ６２４４＋ソラフェニブの組合せの強力な相乗的増殖停止が裏付けられ（図５Ｅ）、ＲＴＫアレイでは、ＡＺＤ６２４４により誘導された複数のＲＴＫのＴｙｒリン酸化がソラフェニブにより阻害されることが検証された（図５Ｆ）。ＡＺＤ６２４４＋ソラフェニブの組合せは、ＡＺＤ６２４４単独と比較して、ＥＲＫ１／２の阻害を促進し、サイクリンＤ１レベルの低減を促進し、アポトーシス促進性Ｂｉｍタンパク質の発現を増大されたことから、細胞はアポトーシス可能な状態になっていることが示唆される（図５Ｇ及び１２Ｈ）。
【０１０９】
ソラフェニブは、ＰＤＧＦＲα及びβ、ＶＥＧＦＲ２、ＤＤＲ１、並びにＤＤＲ２を阻害するだけでなく、ＢＲＡＦ及びＲＡＦの阻害剤でもある。従って、他のＢＲＡＦ／ＲＡＦ１阻害剤によりソラフェニブの効果を模倣しうるかを調べる為に、ＡＺＤ６２４４と組み合わされる異なるＲＡＦ阻害剤の作用をアッセイした（図１２Ｆ及び１２Ｇ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞では、おそらくＢＲＡＦ中のＧ４６４Ｖ活性化突然変異に起因して、逆説的ＢＲＡＦ／ＲＡＦ活性化は観察されない。ＲＡＦ阻害剤ＳＢ５９０８８５は、増殖のドライバーとして観察されたＲＴＫ再プログラミングの下流のＢＲＡＦ活性化の役割に相応して、ＡＺＤ６２４４との組合せでソラフェニブと同程度までＭＤＡ−ＭＢ−２３１増殖を阻害した。ＡＺＤ６２４４と組み合わされたＲＡＦ阻害剤は、ＰＬＸ４７２０及びＳＢ５９０８８５の両方による野生型ＲＡＦシグナル伝達の活性化に相応して、ＳＵＭ１５９細胞の増殖を実際に刺激した（図１２Ｆ）。低用量のソラフェニブは、有意には増殖を刺激しなかったが、これらの知見から、弱い増殖促進が存在し得ることが示唆される。試験された最大用量では、ソラフェニブは、ＺＤ６２４４との組合せでＡＳＵＭ１５９細胞の増殖を相乗的に阻害した。従って、ＡＺＤ６２４４と組み合わされたソラフェニブは、ＲＴＫ及びＲＡＦキナーゼの両方を標的とすることにより、ＢＲＡＦ阻害剤よりも効果的にＳＵＭ１５９細胞の増殖を阻害することが可能である。
【０１１０】
ＡＺＤ６２４４に対して耐性になったＳＵＭ１５９−Ｒ細胞は、薬剤耐性に関してＥＲＫのＲＴＫ駆動再活性化に依拠する。１０倍用量のＡＺＤ６２４４（５０μＭ）を使用すれば、ＥＲＫ活性を阻害することが可能である（図５Ｇ）。耐性ＳＵＭ１５９−Ｒ細胞を生成するように使用されたより低用量の５μＭのＡＺＤ６２４４では、ソラフェニブの添加は、ＥＲＫ活性及び細胞増殖を阻害した（図５Ｈ）。この知見は重要である。なぜなら、そのことから、上流ＲＴＫ−ＲＡＦ経路のＡＺＤ６２４４誘導活性化が、ＥＲＫ活性化を駆動していること、及びソラフェニブが、ＲＴＫシグナルを阻害してＥＲＫの再活性化を防止可能であることが示唆されるからである。ＳＵＭ１５９−Ｒ細胞では、低治療用量のＡＺＤ６２４４とソラフェニブとの組合せは、高用量のＡＺＤ６２４４がＥＲＫ活性化及び細胞増殖を阻害するのに効果的であるのと同様に効果的である（図５Ｈ及び５Ｉ）。
【０１１１】
６．８．  Ｃ３Ｔａｇ  ＴＮＢＣ  ＧＥＭＭに於けるキノーム再プログラミング
遺伝子工学操作Ｃ３Ｔａｇマウスモデルは、ヒトＴＮＢＣに類似した遺伝子発現シグネチャーを有する。マウスでは、ＡＺＤ６２４４の経口送達の前又は後、種々の時間で腫瘍組織を採取した。図６Ａ及び１３では、Ｃ３Ｔａｇ乳癌の腫瘍細胞及び間質の両方でＡＺＤ６２４４に反応してＰＤＧＦＲβの発現増大が示されることから、ＰＤＧＦＲβのｉｎ  ｖｉｖｏ誘導が実証される。図６Ｂでは、腫瘍由来Ｃ３Ｔａｇ乳癌細胞系が、ＰＤＧＦＲβ及びＤＤＲ  ＲＴＫのアップレギュレーションを伴ってＡＺＤ６２４４に反応することが示されることから、ＭＥＫ阻害剤に対する腫瘍細胞反応が確認される。
【０１１２】
次に、我々は、ＡＺＤ６２４４又はソラフェニブでＣ３Ｔａｇマウスを処理した後、ＥＲＫ経路をプロファイリングした（図６Ｃ）。両方の薬剤に反応して、腫瘍ＭＥＫ及びＥＲＫは、未処理動物と比較して強力に活性化された。ＡＺＤ６２４４処理では、ＳＵＭ１５９細胞で見られたように、ＲＴＫの発現は、未処理マウスからの腫瘍に見られるレベルを超えて増大された。ソラフェニブでは、Ｃ３Ｔａｇ腫瘍は、逆説的ＥＲＫ活性化を有するが、ＲＴＫ発現を改変しない。図６Ｄは、ＡＺＤ６２４４でマウスを処理した後、ＰＤＧＦＲβ及びｃ−Ｍｙｃ発現を比較する。ＡＺＤ６２４４に反応して、Ｓｅｒ６２のｃ−ＭｙｃのＥＲＫ媒介リン酸化は、２及び７日間の処理後、失われて、ｃ−Ｍｙｃの分解を促進し、ｃ−Ｍｙｃの低下を伴って、ＰＤＧＦＲβ発現が強力に誘導される。
【０１１３】
次に、我々は、ＭＩＢ／ＭＳを用いて、ＡＺＤ６２４４対ソラフェニブで処理されたマウスからのＣ３Ｔａｇ腫瘍のキノームプロファイルを比較した（図６Ｅ）。２つの阻害剤のＭＩＢキナーゼ結合シグネチャーは、オーバーラップするが、有意差を呈することから、キノームの選択的再プログラミングが実証される。ＳＵＭ１５９細胞で示されたように、ＭＩＢ／ＭＳプロファイルは、ＡＺＤ６２４４阻害からのＭＥＫ２及びＥＲＫ１の回避を示す（図６Ｆ及び２Ｅ）。ソラフェニブ処理は、既に報告されたソラフェニブ標的ＢＲＡＦ、ＰＤＧＦＲβ、ＣＳＦ１Ｒ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＫＩＴ、ＭＬＴＫ、及びＦＲＫのＭＩＢ結合を低減させた。（非特許文献１２７）。
【０１１４】
６．９．  ソラフェニブ＋ＡＺＤ６２４４は腫瘍退縮を引き起こす
単独及び組合せのＡＺＤ６２４４及びソラフェニブに対するＣ３Ｔａｇ腫瘍の反応を測定した（図７Ａ）。僅か２日間のＡＺＤ６２４４処理又はソラフェニブ処理の後、ＶＥＧＦＲ２及びＰＤＦＧＲＰの発現が増大された。同時に、Ｓｅｒ３３８のＲＡＦのリン酸化の増大が観察されることから、ＲＡＦの活性化が実証される。ＥＲＫは、単剤ＡＺＤ６２４４又はソラフェニブに反応して活性化されたが、この反応は、ＡＺＤ６２４４とソラフェニブとの組合せにより強力に阻害された。個別の作用剤に対する反応は、７日間の処理で持続されたが、ＶＥＧＦＲ２及びＰＤＧＦＲβのソラフェニブ誘導増加は、一過性であるように思われた。ソラフェニブに反応するＲＴＫの誘導は、ＳＵＭ１５９細胞では見られず、Ｃ３Ｔａｇ腫瘍ではＥＲＫ活性の初期阻害又は過渡阻害に起因するものであり得る。ＳＵＭ１５９細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の場合とまったく同様に、Ｃ３Ｔａｇ腫瘍では、ＭＥＫ阻害はｃ−Ｍｙｃの低下を引き起こした（図７Ｂ）。ＡＺＤ６２４４による処理は、ＰＤＧＦＲの発現及び活性化を誘導し、ＡＺＤ６２４４とソラフェニブとの組合せによる動物の処理は、ＰＤＧＦＲβ及びＥＲＫリン酸化の両方を阻害した（図７Ｃ）。図７Ｄは、腫瘍由来Ｃ３Ｔａｇ乳癌細胞系でのＡＺＤ６２４４反応を示しており、ＰＤＧＦＲの誘導及びｃ−Ｍｙｃの低下を明らかにしている。ＡＺＤ６２４４とソラフェニブとの組合せは、ＥＲＫ活性化を阻止し、ｃ−Ｍｙｃ分解を促進し、且つＰＤＧＦＲ−β及びサイクリンＢ１の発現を低減させる。また、ＡＺＤ６２４４及びソラフェニブによる共処理は、Ｃ３Ｔａｇ乳癌細胞系で強力な増殖停止を引き起こした（図７Ｅ）。
【０１１５】
我々の知見から、ＡＺＤ６２４４とソラフェニブとの組合せは、２及び７日間処理されたＣ３Ｔａｇマウス及びＣ３Ｔａｇ腫瘍細胞系で、ＥＲＫ活性化の阻害に有意により効果的であったことが示される。従って、Ｃ３Ｔａｇマウスで腫瘍を発生させ、次いで、単独又は組合せでＡＺＤ６２４４又はソラフェニブで２１日間処理した（図７Ｆ及び図１４Ａ）。ソラフェニブ処理は、腫瘍進行に効果がなかったが、ＡＺＤ処理マウスの３０パーセントは、有意な腫瘍退縮を示した。これとは対照的に、ＡＺＤ６２４４及びソラフェニブで処理されたマウスの７７パーセントに腫瘍退縮があったことから、ＡＺＤ６２４４単独に対して組合せ治療の有意により大きい効力が実証される。腫瘍のタネルアッセイでは、ＡＺＤ６２４４とソラフェニブとの組合せが、単剤処理とは対照的に、僅か２日間の処理で強力なアポトーシス反応を誘導することが示された（（図７Ｇ及び図１４Ｂ）。
【０１１６】
６．１０．  考察
プロテインキナーゼネットワークの再プログラミングを「集団で」研究する新規な手法を記載する。この方法では、細胞及び腫瘍からのプロテインキナーゼの単離及び分析が可能であり、発現されたキノームの約５０％が単一の質量分析実験でアッセイされる。キナーゼのＭＩＢ結合のプロファイリングは、多数のキナーゼの活性化及び阻害を同時にモニターする高感度の方法である。このプロファイリング技術は、配列の分かっているキナーゼの照合を可能にするが、生物学的な知識若しくは表現型の知識又は試薬の利用能が不足している為、研究段階にある。後者の例は、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２の変化を識別する能力である。
【０１１７】
この技術により、選択的ＭＥＫ１／２キナーゼ阻害剤ＡＺＤ６２４４に対するキノーム反応シグネチャーを同定した。ＭＥＫに対して規定された基質は、ＥＲＫ１及び２だけにすぎないが、キノームのすべてのサブファミリーで、ＭＥＫ阻害に反応してキナーゼ活性の変化が観察された。キノーム評価は、ＲＡＦ及びＭＥＫのＥＲＫフィードバック調節の初期低下を含む、更にはＭＫＰ３タンパク質の安定性を増大させる、時間依存再プログラミングを示した。ＭＫＰ３の発現の増大、はＥＲＫ不活性化を促進するように機能する。これとは対照的に、ＲＡＦ及びＭＥＫフィードバック阻害の低下は、経路の上流の活性化を可能にするであろう。ＰＤＧＦＲβやＤＤＲ１などの特異的ＲＴＫのＭＩＢ結合の時間依存変化は、容易に検出され、其々ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路を刺激可能な複数のＲＴＫの発現及び活性化がＭＥＫ阻害により駆動されているという重要な実験観測を提供した。重要なこととして、ｃ−Ｍｙｃ分解は、キノーム再プログラミングを媒介する重要な機序として同定された。即ち、低リン酸化ｃ−Ｍｙｃのプロテアソーム分解の防止は、再プログラミング反応を阻害した。ＥＲＫ又はｃ−ＭｙｃのＲＮＡｉノックダウンは、幾つかのＲＴＫのＭＥＫ阻害剤誘導発現及びＴｙｒリン酸化を再現したことから、ｃ−Ｍｙｃ安定性のＥＲＫ制御が特異的キナーゼの発現及び活性化の制御に極めて重要であることが実証される。ＭＥＫ阻害に反応して複数のＲＴＫが活性化されるという事実から、単一のキナーゼ阻害剤を用いて腫瘍進行を停止するのは困難であることが実証される。
【０１１８】
６．１１．  ＭＥＫ２は阻害を回避する
定量的質量分析と組み合わされたＭＩＢ結合は、キナーゼ阻害のグローバル効果を測定する非常に高感度且つ選択的な方法であり、伝統的に研究段階にある又は対応すする試薬が利用可能ではないキナーゼに特に重要である。ＡＺＤ６２４４で処理された細胞のＥＲＫ経路の分析では、ＭＩＢに結合するＢＲＡＦ／ＲＡＦ、ＭＥＫ２、ＥＲＫ１、及びＲＳＫ１の時間依存レスキューが示された。これらのキナーゼのＭＩＢ結合は、それらの活性化の関数であることが実証された。回収の時間経過は、ＡＺＤ６２４４誘導ＲＴＫ発現に類似している。Ｃ３Ｔａｇ腫瘍では、ＳＵＭ１５９細胞で観測された再プログラミング反応に類似して、ＡＺＤ６２４４処理後にＭＥＫ２及びＥＲＫ１結合が同様に増加することが示された。（ＡＺＤ６２４４と同様に）ＭＥＫアロステリック調節部位に結合する類似のＭＥＫ阻害剤（ＧＳＫ１１２０２１２）を用いた既報の研究では、ＭＥＫ２が如何にして阻害を回避するかが洞察されている。（非特許文献１２８）。活性化ループセリンがリン酸化されたＭＥＫは、ＧＳＫ１１２０２１２に対して非リン酸化ＭＥＫの１／２０の親和性を有するので、ＭＥＫのアロステリック部位阻害を効果的に軽減する。ＥＲＫ活性は経時的に増大するので、ＭＥＫ１は、その負の調節部位Ｔｈｒ２９２でフィードバックリン酸化され、ＲＴＫ再プログラミングの状況下でさえもＭＥＫ１再活性化が防止されるが、ＭＥＫ２は、この調節部位が欠如しており、阻害を選択的に回避する。このことから、上流シグナル伝達経路の活性化が標的キナーゼに対する阻害剤のＩＣ５０を増大させるというユニークなパラダイムが示唆される。このパラダイムは、現在の試薬で検出するのが困難であったであろう。
【０１１９】
６．１２．  組合せ治療の合理的設計
多くの腫瘍タイプでは、Ｔｙｒキナーゼは、トランスフォーメーションの分子ドライバーであり、更には治療に対する耐性で主要な役割を果たす。乳癌の一形態では、標的キナーゼ阻害に対する腫瘍反応は、薬剤耐性に寄与する複数のＲＴＫの誘導及び／又は活性化を含むことが実証された。低クローディンＳＵＭ１５９細胞及びＣ３−Ｔａｇ乳癌ＧＥＭＭは、ＡＺＤ６２４４に対する反応が著しく類似しており、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＳＦＲ１、ＤＤＲ１／ＤＤＲ２、及びＡＸＬの誘導及び活性化を伴う。低クローディンＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系は、それほど反応性ではないが、ＡＺＤ６２４４処理によりＰＤＧＦＲβ、ＤＤＲ１、及びＤＤＲ２の誘導並びにＡＸＬの活性化を示した。異なるＲＴＫのＲＮＡｉノックダウンでは、各キナーゼがＳＵＭ１５９細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞で生存反応に寄付することが示唆された。ＡＺＤ６２４４処理で発現及び活性が誘導されるＲＴＫのレパートリーを考慮して、ソラフェニブとＡＺＤ６２４４との組合せ治療は、有意な治療効果を生成するのに十分な程度にキナーゼ標的化を「拡張する」ことが予測された。組合せ治療は、Ｃ３Ｔａｇ  ＴＢＮＣ  ＧＥＭＭで其々の薬剤単独と比較してアポトーシス及び腫瘍退縮を有意に増大させた。
【０１２０】
細胞系及びＣ３Ｔａｇ腫瘍でＭＩＢ／ＭＳとイムノブロッティングとの組合せを用いてＡＺＤ６２４４誘導ＲＴＫ（及びＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ）を同定した。こうして治療反応耐性のシグネチャーを形成することにより、コンビナトリアル治療の合理的予測を可能にした。この手法は、手術前に標的化作用剤で患者を治療してキノーム耐性シグネチャーに関して切除位で腫瘍を分析するいわゆる「ウィンドウ試験」を用いて、ヒト腫瘍にまで拡張することが可能である。重要なこととして、キノーム反応は、異なるキナーゼを標的とする阻害剤にユニークであることが示された。また、共通の阻害剤に対する異なる腫瘍タイプの反応は、様々で有り得る。従って、様々な薬剤及び生検で到達可能な腫瘍タイプに対する耐性のパターンを規定する一助として、この系のキノーム手法を適用することが可能である。
【０１２１】
６．１３．  実験手順
細胞培養：  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、１０％ＦＢＳが追加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２中で増殖させた。ＳＵＭ１５９細胞は、１０％ＦＢＳ、１ｇ／ｍＬヒドロコルチゾン、及び５μｇ／ｍＬインスリンが追加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２中で増殖させた。ＳＵＭ１５９−Ｒ細胞は、５μＭ  ＡＺＤ６２４４の存在下で断続的に増殖させた。ＳＩＬＡＣ標識の為に、非標識Ｌ−アルギニン（４２ｍｇ／Ｌ）及びＬ−リシン（７１ｍｇ／Ｌ）、又は等モル量の重同位体標識［１３Ｃ６、１５Ｎ４］アルギニン（Ａｒｇ１０）及び［１３Ｃ６］リシン（Ｌｙｓ６）（ケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリーズ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））の何れかが追加されたアルギニン・リシン枯渇培地（以上の通り）中で、５回倍加処理で細胞を増殖させた。増殖は、セルタイターグロー（Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ）発光細胞生存能アッセイ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて定量した。ＤＭＳＯ又はキナーゼ阻害剤を含有する新しい培地を毎日１回添加し、トリプリケート方式で実験を行った。
【０１２２】
多重化阻害剤ビーズアフィニティークロマトグラフィー：  既に記載されているように、細胞及び腫瘍を溶解し、採取した。（オッパーマン（Ｏｐｐｅｒｍａｎｎ）ら著、２００９年）。（非特許文献１２９）。簡潔に述べると、溶解物を１Ｍ  ＮａＣｌにしてから、洗浄済み阻害剤コンジュゲートビーズ（ビスインドイルマレイミド−Ｘ、ＳＢ２０３５８０、ラパチニブ、ダサチニブ、プルバラノールＢ、ＶＩ１６８３２、ＰＰ５８）のカラムに通して、溶解物からプロテインキナーゼを単離する（ＭＩＢ調製の為の補足の実験手順を参照されたい）。高塩緩衝液及び０．１％ＳＤＳを用いてキナーゼ結合阻害剤ビーズを洗浄し、高温下、０．５％ＳＤＳ溶液で溶させた。クロロホルム／メタノール抽出を用いてタンパク質を精製し、ＳＩＬＡＣ又はｉＴＲＡＱに対して、其々、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．０）又は５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）中に再懸濁させた。配列決定用グレードの修飾トリプシン（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて３７℃でサンプルを一晩消化させた。ｉＴＲＡＱ  ４プレックス試薬（エービー・サイエックス（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ））を用いて、暗所、室温で、消化ペプチドのｉＴＲＡＱ標識化を２時間行った。ペプチドを乾燥減量し、ストロング・カチオン・エクスチェンジ・カラム・ミニ（Ｓｔｒｏｎｇ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ，Ｍｉｎｉ）を用いて分離し、そしてペプクリーンＣ−１８スピン・カラム（ＰｅｐＣｌｅａｎ  Ｃ−１８  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ）（サーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））で単離した。
【０１２３】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ  ５８００（エービー・サイエックス（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ））を用いてＭＳ及びＭＳ／ＭＳのデータを取得した。プロテインパイロット・ソフトウェア（ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）バージョン３．０（エービー・サイエックス（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ））を用いてペプチドを分析し、ユニプロットＫＢ／スイス−プロット（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）データベース（２００９年１０月１５日発売）を用いて同定した。少なくとも１種のユニークなペプチドが９９％の信頼度で同定された場合にのみ、タンパク質を受け入れた。プロ・グループ・アルゴリズム（Ｐｒｏ  Ｇｒｏｕｐ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を利用し、プロテインパイロット・ソフトウェア（ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）３．０により、ＭＩＢへのキナーゼ結合の変化を同定及び定量した。殆どのタンパク質は発現が変化しないという仮定の下で、異なる標識サンプルの組合せ時の不均等混合に起因する偏りに対して、定量比を補正した。報告されたタンパク質比に対して、タンパク質比が１であるという帰無仮説の下でスチューデントのｔ分布に基づいて、ｐ値を計算した。細胞系のＭＩＢ／ＭＳ分析は、２〜３回の独立した実験で行った。ＡＺＤ６２４４又はＤＭＳＯで処理されたＳＩＬＡＣ標識ＳＵＭ１５９細胞を用いた一群の３つの独立した実験を用いて、ＭＩＢ／ＭＳの統計的有意性及び再現性を評価し、キノーム反応（補足の方法）をプロファイリングした。
【０１２４】
ウェスタンブロッティング及びＲＴＫアレイ：  ウェスタンブロッティング及びＲＴＫアレイ分析は、以上に記載したように行った（アミン（Ａｍｉｎ）ら著、２０１０年）。（非特許文献１３０）。詳細な方法及び抗体は、補足の実験手順に提供されている。
【０１２５】
ｑＲＴ−ＰＣＲ：  ＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）（登録商標）プラスミニキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて、ヒト乳癌細胞系又はネズミ腫瘍から全ＲＮＡを単離した。アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）７５００迅速リアルタイムＰＣＲシステム（標準プログラム）及び目録ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイを用いて、希釈ｃＤＮＡでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。各ｃＤＮＡサンプルをトリプリケート 方式でアッセイした。基準物質に対する変化倍率は、トリプリケート値の平均に対応し、エラーバーは、平均値の範囲に対応する（信頼度９５％）。
【０１２６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍化実験：  動物の取扱い及び手順は、ノースカロライナ大学チャペルヒル校の動物管理使用委員会により承認され、ＮＩＨガイドラインに従った。雄Ｃ３Ｔａｇマウスを野生型雌と交配して実験仔を生成した。触知可能塊が見られるまで、腫瘍に関してマウスを毎週１回調べた。同一日に処理を開始した。腫瘍サイズは、腫瘍領域（（幅）２×長さ））／２のカリパス測定により２１日間にわたり毎週２回評価した。腫瘍体積の変化パーセントは、（最終体積−初期体積）／初期体積を用いて計算し、Ｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）を用いてグラフ化した。薬剤は、ＡＺＤ６２４４  ２０ｍｇ／ｋｇ及びソラフェニブ３０ｍｇ／ｋｇの一日用量になるようにマウスの食餌中に組み込んだ。食品は、不断給餌で提供し、１日食物摂取量は、ジャクソン・ラボ・フェノム・データベース（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ  Ｐｈｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）を用いて予め決定した。採取時に腫瘍を半分にカットし、何れも液体窒素中でスナップ凍結し、そして−８０℃で貯蔵したか又は中性緩衝１０％ホルマリン溶液中に配置した。
【０１２７】
ヒト乳房組織の調達：  ヒト乳房組織はすべての、法律及びノースカロライナ大学チャペルヒル校ＩＲＢ委員会により承認された施設ガイドラインに従って組織調達施設から入手した。臨床試料は、チャールズ  Ｍ．ペロウ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｍ．Ｐｅｒｏｕ）博士の研究室で行われた遺伝子発現解析により分子表現型解析に付した。
【０１２８】
６．１４．  補足のデータ及び実験
補足のデータは、補足の実験手順、５つの表、及び７つの図を含む。
【０１２９】
細胞培養：  Ｍｙｌ  ＣＭＬ細胞は、１０％ウシ胎仔血清（アトランタ・バイオロジカルズ（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ジョージア州ノークロス）及び１％抗生物質／抗真菌剤（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））が追加されたＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールズバッド）中で培養した。ＳＩＬＡＣ標識の為に、細胞は、既に記載したように（オングＳＥ（Ｏｎｇ  ＳＥ）著、２００２年）、非標識Ｌ−アルギニン（８４ｍｇ／Ｌ）及びＬ−リシン（４８ｍｇ／Ｌ）、又は等モル量の重同位体標識［１３Ｃ６、１５Ｎ４］アルギニン（Ａｒｇ１０）及び［１３Ｃ６］リシン（Ｌｙｓ６）（ケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリーズ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））のいずれかが追加されたアルギニン・リシン枯渇培地（以上の通り）中で５回倍加処理で増殖させた。
【０１３０】
ＡＺＤ６２４４耐性ＳＵＭ１５９細胞の生成：  ＳＵＭ１５９細胞は、５μＭのＡＺＤ６２４４を含有する１０％ＦＢＳ培地が追加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２で培養した。培地は、２日ごとに交換し、５μＭのＡＺＤ６２４４の阻害剤濃度を維持した。
【０１３１】
Ｃ３Ｔａｇ腫瘍からの不死化細胞系の生成。Ｃ３Ｔａｇマウスからの自発性腫瘍を切除し、０．２５％トリプシン（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））の存在下で無菌方式で解離させた。次いで、細胞を４０ミクロン細胞ストレーナーに通して、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳの存在下で増殖させた。細胞を単離し、ＳＶ４０ラージＴ（ＥＭＤバイオサイエンス（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、モノクローナル、クローンＰＡｂ４１６）に特異的な抗体で免疫ブロットすることによりＳＶ４０Ｔ抗原の発現を検証した。
【０１３２】
６．１５．  化合物：
ソラフェニブ、Ｕ０１２６、及びボルテゾミブは、ＬＣラボ（ＬＣ  Ｌａｂｓ）（マサチューセッツ州ウォバーン）から購入した。ＢＥＺ２３５は、シェレック（Ｓｅｌｌｅｃｋ）（テキサス州ヒューストン）から、ビスインドリルマレイミド−Ｘは、アレキス（Ａｌｅｘｉｓ）（エンゾー・ライフ・サイエンス（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．）、ニューヨーク州ファーミンデール）から・プルバラノールＢは、トクラス（Ｔｏｃｒｉｓ）（英国ブリストル）から購入した。フォレチニブ及びＡＺＤ６２４４は、２つの特許出願（（特許文献２０）、（特許文献２１））に記載の手順に従って合成した。ＰＰ５８（非特許文献１３１）、ＶＩ１６８３２（非特許文献１３２）、ラパチニブ（非特許文献１３３）、ＳＢ２０３５８０（非特許文献１３４）。ＰＬＸ４７２０及びＳＢ５９０８８５は、既に記載の方法に従ってカスタム合成したものであり、特にＰＬＸ−４７２０、（非特許文献１３５）、及びＳＢ５９０８８５、（非特許文献１３６）。
【０１３３】
６．１６．  親和性リガンドの合成
６．１６．１．  一般的手順
すべての化合物のＨＰＬＣスペクトルは、２２０ｎｍに設定されたＵＶ検出器を備えたアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）６１１０シリーズシステムから取得した。サンプルは、アジレント・エクリプス・プラス（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ）４．６×５０ｍｍ、１．８μＭ、Ｃ１８カラムに室温で注入した（５μΕ）。Ａリニアグラジエント１０％〜１００％Ｂ（ＭｅＯＨ＋０．１％酢酸）で５．０分間、続いて、１００％Ｂで更に２分間ポンプ注入。ＡはＨ２Ｏ＋０．１％酢酸である。流量は、１．０ｍｌ／分であった。質量スペクトル（ＭＳ）データは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源を備えたアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）６１１０単一四重極質量分析計を用いて正イオンモードで取得した。高分解能（正イオン）質量スペクトル（ＨＲＭＳ）は、島津ＬＣＭＳ−ＩＴ−Ｔｏｆ飛行時間型質量分析計を用いて取得した。核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、プロトン（１Ｈ  ＮＭＲ）では４００ＭＨｚ及びカーボン（１３Ｃ  ＮＭＲ）では１００ＭＨｚでバリアン・マーキュリー（Ｖａｒｉａｎ  Ｍｅｒｃｕｒｙ）分光計により記録した。化学シフトは、ｐｐｍ（δ）単位で報告する。
【０１３４】
６．１６．２．  （２−（６−（４−（３−アミノプロピル）ピペラジン−１−イル）−２−メチルピリミジン−４−イルアミノ）チアゾール−５−イル）（２−クロロ−６−メチルフェニル）メタノンの合成
（２−（６−（４−（３−アミノプロピル）ピペラジン−１−イル）−２−メチルピリミジン−４−イルアミノ）チアゾール−５−イル）（２−クロロ−６−メチルフェニル）メタノンの調製：
【化１８】
2014532184.tif 000021
【０１３５】
２０ｍＬのジオキサン中の５７３ｍｇ（１．４５ｍｍｏｌ）の２−（６−クロロ−２−メチルピリミジン−４−イルアミノ）−Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）チアゾール−５−カルボキサミド（ダス（Ｄａｓ）ら著、２００６年）の溶液に、１．７ｇ（７．２９ｍｍｏｌ）のｔｅｒｔ−ブチル３−（ピペラジン−１−イル）プロピルカルバメート及び０．５８ｍＬの（２．７５ｍｍｏｌ）のＮ−エチルジイソプロピルアミンを添加した。得られた混合物を一晩還流した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をエーテルで繰返し洗浄し、濾過して淡黄色固体として粗生成物ｔｅｒｔ−ブチル３−（４−（６−（５−（２−クロロ−６−メチルフェニルカルバモイル）チアゾール−２−イルアミノ）−２−メチルピリミジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）プロピルカルバメートを与え、更なる精製を行うことなくこれを次の反応に使用した。得られた固体を５ｍＬのエチルアセテートに溶解させた。その溶液に、０℃で３０分間かけて激しく攪拌しながらエチルアセテート中のヒドロクロリド溶液を滴下した。沈殿物を濾過により捕集し、エーテルで繰返し洗浄した。真空中で乾燥させた後、固体を３０ｍＬの水性水酸化ナトリウムと３０ｍＬのエチルアセテートとの間で分配させた。分離された水相を３０ｍＬのエチルアセテートで２回抽出した。捕集された有機相をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、そして減圧下で溶媒を蒸発させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して純粋な生成物を与えた。
収量４６２ｍｇ（７５％）
ＨＰＬＣ９９％、Ｒｔ：３．６７０ｍｉｎ、分子量５０１［Ｍ＋１］＋、ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ２３Ｈ３０ＣｌＮ８ＯＳ［Ｍ＋１］＋に対する計算値、５０１．１９５２、実測値５０１．１９３８。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ８．１８（ｓ，１Ｈ）、７．３４（ｄｄ，Ｊ＝７．１，２．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．２７−７．１９（ｍ，２Ｈ）、６．３１（ｓ，１Ｈ）、４．０２（ｂｓ，４Ｈ）、３．４３（ｓ，４Ｈ）、３．３０−３．２４（ｍ，２Ｈ）、３．０４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）、２．５４（ｓ，３Ｈ）、２．３０（ｓ，３Ｈ）、２．２２−２．１０（ｍ，２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ１６５．５、１６３．６、１６２．７、１６１．５、１５８．０、１４０．５、１３４．３、１３４．２、１３０．３、１３０．０、１２８．５、８５．７、５５．０、５２．７、４２．８、３８．０、２３．５、１８．８。
【０１３６】
６．１６．３．  ６−（２−アミノエトキシ）−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−ジメトキシキナゾリン−４−アミンの調製：
【化１９】
2014532184.tif 000022
１００ｍＬのアセトニトリル中の６．４ｇ（１５ｍｍｏｌ）の６−（２−ブロモエトキシ）−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−ジメトキシキナゾリン−４−アミン（バーカー（Ｂａｒｋｅｒ）ら著、２００１年）、３．３ｇ（１８ｍｍｏｌ）の溶液を一晩還流させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を１００ｍＬのエタノール中に再溶解させた。次いで、１．０３ｍＬ（１８ｍｍｏｌ）のヒドラジンヒドレートを添加し、得られた混合物を２時間撹拌した。エタノールを減圧下で除去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して純粋な生成物を与えた。
収量３ｇ（５６％）
ＨＰＬＣ９９％、Ｒｔ：３．６９０ｍｉｎ、分子量３６３［Ｍ＋１］＋、ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１７Ｈ１７ＣｌＦＮ４Ｏ２［Ｍ＋１］＋に対する計算値、３６３．１０２４、実測値３６３．１０１２。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ８．４７（ｓ，１Ｈ）、８．０３（ｄｄ，Ｊ＝６．７、２．６Ｈｚ，１Ｈ）、７．７３（ｓ，１Ｈ）、７．７１−７．６８（ｍ，１Ｈ）、７．２７（ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．１９（ｓ，１Ｈ）、４．２３（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ）、４．０３（ｓ，３Ｈ）、３．１４（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ１５８．３９、１５７．１６、１５６．８４、１５４．７３、１５３．９０、１５０．４４、１４７．７９、１３７．４８、１２５．７７、１２３．８４、１２３．７７、１２１．４４、１２１．２５、１１７．４７、１１７．２５、１１１．４１  、１１０．４４、１０７．３２、１０３．７２、７２．０４、５６．６３、４１．７３。
【０１３７】
６．１６．４．  ６−（２−アミノエトキシ）−Ｎ−（３−クロロ−４−（３−フルオロベンジルオキシ）フェニル）−７−ジメトキシキナゾリン−４−アミンの調製：
【化２０】
2014532184.tif 000023
１００ｍＬのジメチルホルムアミド中の１０ｇ（２４ｍｍｏｌ）の４−（３−クロロ−４−（３−フルオロベンジルオキシ）フェニルアミノ）−７−ジメトキシキナゾリン−６−オール（非特許文献１３７）、６．６ｇ（４８ｍｍｏｌ）の溶液を５０℃で１０時間攪拌した。水を添加は、混合物をジクロロメタンで３回抽出した。捕集された有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水し、そして溶媒を減圧下で蒸発させた。次いで、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、５ｇ（１１．８ｍｍｏｌ、収率４２％）の化合物６−（２−ブロモエトキシ）−Ｎ−（３−クロロ−４−（３−フルオロベンジルオキシ）フェニル）−７メトキシ−３，４−ジヒドロキナゾリン−４−アミンを与え、これを８０ｍＬのアセトニトリル中に溶解させた。その溶液に２．６ｇ（１４ｍｍｏｌの）カリウム１，３−ジオキソイソインドリン−２−イドを添加し、得られた混合物を一晩還流させた。溶媒を減圧下で除去し、残渣を１００ｍＬのエタノール中に再溶解させた。次いで、１．０３ｍＬ（１８ｍｍｏｌ）のヒドラジンヒドレートを添加し、反応混合物の撹拌及び還流を２時間行った。エタノールを減圧下で除去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して純粋な生成物を与えた。
収量２．７ｇ（６３％）
ＨＰＬＣ９９％、Ｒｔ：４．５１６ｍｉｎ、分子量４６９［Ｍ＋１］＋、ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ２４Ｈ２３ＣｌＦＮ４Ｏ３［Ｍ＋１］＋に対する計算値、４６９．１４４３、実測値４６９．１４３３。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ８．４１（ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．８７（ｄｄ，Ｊ＝２．５、１．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．７１（ｓ，１Ｈ）、７．５７（ｄｄｄ，Ｊ＝８．９、２．６、１．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．４５−７．４０（ｍ，１Ｈ）、７．３３（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ）、７．２７（ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．１８−７．１２（ｍ，２Ｈ）、７．１０−７．０５（ｍ，１Ｈ）、５．２２（ｓ，２Ｈ）、４．２２（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ）、４．０２（ｓ，３Ｈ）、３．１４（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ１６５．６１、１６３．１８、１５８．５９、１５６．７２、１５４．０１、１５２．２０、１５０．２９、１４７．６２、１４１．２３、１４１．１６、１３４．３６、１３１．３８、１３１．２９、１２６．３２、１２３．９３、１２３．９０、１２３．８７、１２３．７９、１１５．６７、１１５．４６、１１５．４４、１１４．９９、１１４．７７、１１０．３８、１０７．２９、１０３．８７、７１．９２、７１．２２、７１．２０、５６．６０、４１．７０。
【０１３８】
６．１６．５．  ２，４，ジアミノピリミジン，ピラゾールリガンド合成：
【化２１】
2014532184.tif 000024
中間体１は、（非特許文献１３８）に記載の手順に従って調製した。中間体２は、（特許文献２２）／（特許文献２３）に記載の手順に従って調製した。
【０１３９】
４ｍＬのＭｅＯＨ中の中間体１（４６０ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）、中間体２（６６８ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）、及び濃ＨＣｌ（３０滴）の溶液をマイクロ波照射により８０℃で４０分間加熱した。溶液を室温に冷却して濾過した。固体をＭｅＯＨで洗浄して所望の２，４ジアミノピリミンジンピラゾール化合物（３６４ｍｇ、４６％）を与えた。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）：δｐｐｍ８．１３（ｂｒ，１Ｈ）、７．８９（ｂｒ，１Ｈ）、７．４１（ｂｒ，２Ｈ）、７．１６（ｂｒ，２Ｈ）、６．４４（ｂｒ，１Ｈ）、３．６２（ｂｒ，２Ｈ）、２．９２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ）、１．９７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、１．９２−１．８７（ｍ，１Ｈ）、０．９７−０．９３（ｍ，２Ｈ）、０．６０（ｂｒ，２Ｈ）。ＨＰＬＣ：９５％、ＲＴ１．６７８ｍｉｎ、ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ、３６５．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１４０】
６．１６．６．  ３−（２−（５−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−２，８−ジアザスピロ［４．５］デカン−８−イル）プロパン−１−アミンの合成
【化２２】
2014532184.tif 000025
【０１４１】
合成スキーム：
【化２３】
2014532184.tif 000026
【０１４２】
合成手順：
ベンジル８−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロピル）−２、８−ジアザスピロ［４．５］デカン−２−カルボキシレート
【化２４】
2014532184.tif 000027
イソプロパノール（３０ｍＬ）中のベンジル２，８−ジアザスピロ［４．５］デカン−２−カルボキシレート（Ａ、１．１ｇ、４．０１ｍｍｏｌ）及びｔｅｒｔ−ブチル３−クロロプロピ−ルカルバメート（Ｂ、１．１６ｇ、６．０１ｍｍｏｌ）の溶液にＴＥＡ（２．０ｍＬ、１３．８ｍｍｏｌ）を添加した。ＴＬＣでＡが消費されたことが示されるまで、混合物を加熱して２０時間還流した（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、１０：１、発色試薬ニンヒドリン）。イソプロパノールを減圧下で除去し、残渣をフラッシュカラム（シリカゲル、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、３０：１）により精製して軟白色固体（６００ｍｇ、３５％）としてＣを提供した。
【０１４３】
ｔｅｒｔ−ブチル３−（２，８−ジアザスピロ［４．５］デカン−８−イル）プロピルカルバメート（Ｄ）
【化２５】
2014532184.tif 000028
ベンジル８−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロピル）−２、８−ジアザスピロ［４．５］デカン−２−カルボキシレート（Ｃ、５８０ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中に溶解させた。溶液を真空／窒素サイクル（×３）でパージし、その後、真空下でＰｄ／Ｃ（１４０ｍｇ、２４％）を添加した。そして混合物を真空／水素サイクル（×３）でパージした。次いで、得られた混合物をＨ２下で６時間撹拌した。混合物をセライト（Ｃｅｌｉｔｅ）に通して濾過し、濾液を真空中で濃縮して白色固体４９０ｍｇとしてＤを提供し、これを更なる精製を行うことなく次の工程で直接使用した。
【０１４４】
ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（５−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−２，８−ジアザスピロ［４．５］デカン−８−イル）プロピル
【化２６】
2014532184.tif 000029
ＤＭＳＯ（５ｍＬ）中の４，５−ジクロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（Ｅ、２７１ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）及びｔｅｒｔ−ブチル３−（２，８−ジアザスピロ［４．５］デカン−８−イル）プロピルカルバメート（Ｄ、４７２ｍｇ、１．５９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．５ｍＬ、２．８８ｍｍｏｌ）を添加し、続いて、エチルアセテート（５ｍＬ）を添加した。ＴＬＣでＥが消費されたことが示されるまで、得られた反応混合物を１０２℃で一晩撹拌した（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、１０：１）。反応混合物を室温に冷却し、Ｈ２Ｏ（６０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（２５ｍＬ×３）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、真空中で濃縮して残渣を与え、これをフラッシュカラム（シリカゲル、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、３０：１）に通して精製することにより、帯黄色固体（１８０ｍｇ、２８％）としてＦを提供した。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）：δ１１．５９７（１Ｈ，ｂｒｓ）、８．２８４（１Ｈ，ｓ）、７．１２０（１Ｈ，ｓ）、５．５８７（１Ｈ，ｂｒｓ）、３．９５０（２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、３．７３０（２Ｈ，ｓ）、３．２０５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ）、２．６２３−２．４５９（６Ｈ，ｍ）、１．８８５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、１．７８２−１．６４２（６Ｈ，ｍ）、１．４４６（９Ｈ，ｓ）。
【０１４５】
３−（２−（５−クロロ７Ｈピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−２，８−ジアザスピロ［４．５］デカン−８−イル）プロパン−１−アミン（Ｇ）
【化２７】
2014532184.tif 000030
ＤＣＭ（５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（５−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−２，８−ジアザスピロ［４．５］デカン−８−イル）プロピルカルバメート（Ｆ、１９８ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（０．５ｍＬ）を添加した。ＴＬＣでＦが消費されたことが示されるまで、得られた反応混合物を室温で撹拌した（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、１０：１）。溶媒を除去し、残渣をＨＰＬＣにより精製して、ＴＦＡ塩中に所望の化合物を与えた。飽和水性Ｎａ２ＣＯ３溶液で洗浄後、ＤＣＭで抽出し、最終化合物Ｇを黄色固体（８５ｍｇ、５５％）として取得した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｃｄ３ｏｄ）δ８．０８（ｓ，１Ｈ）、７．１７（ｓ，１Ｈ）、３．８９（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ）、３．７１（ｓ，２Ｈ）、３．３４（ｓ，１Ｈ）、２．９９（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ）、２．６１（ｂｓ，２Ｈ）、２．５３（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）、２．４３（ｂｓ，２Ｈ）、１．９４−１．８８（ｍ，２Ｈ）、１．８２（ｐ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ）、１．６８（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，４Ｈ）。
【０１４６】
６．１６．７．  Ｎ−（２−（４−（８−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−イル）−７−オキソ−７，８−ジヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）アミノ）フェノキシ）エチル−５−（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ１Ｈチエノ［３，４ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミドの合成
【化２８】
2014532184.tif 000031
０℃でＤＭＦ（１．０ｍＬ）中のＶＩ１６８３２（８３ｍｇ、０．２１２ｍｍｏｌ）（発表の手順（非特許文献１３９）に従って調製した）及びビオチン（７８ｍｇ、０．３１８ｍｍｏｌ）の溶液にＤＭＡＰ（５ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）及びＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ、８１ｍｇ、０．４２４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、分取ＨＰＬＣにより精製して黄色固体（９６ｍｇ、７３％）として標記化合物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）δ８．５８（ｓ，１Ｈ）、７．６５（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．６０−７．５１（ｍ，２Ｈ）、７．００−６．８９（ｍ，２Ｈ）、６．２９（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ）、５．３４（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）、４．４１（ｄｄ，Ｊ＝７．９，４．３Ｈｚ，１Ｈ）、４．１９（ｄｄ，Ｊ＝７．９，４．５Ｈｚ，１Ｈ）、４．０５（ｔ，＝５．４Ｈｚ，２Ｈ）、３．６２−３．５２（ｍ，２Ｈ）、３．１１−３．０３（ｍ，１Ｈ）、２．８５（ｄｄ，Ｊ＝１２．７，５．０Ｈｚ，１Ｈ）、２．６９−２．５７（ｍ，２Ｈ）、２．５０−２．４３（ｍ，１Ｈ）、２．４２−２．３４（ｍ，１Ｈ）、２．２４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、２．２０−２．１１（ｍ，１Ｈ）、１．８３−１．５０（ｍ，７Ｈ）、１．４８−１．３４（ｍ，３Ｈ）、１．３３−１．２０（ｍ，２Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）：６１８［Ｍ＋Ｈ］＋。ＨＰＬＣ：１００％、Ｒｔ：４．６９ｍｉｎ。
【０１４７】
６．１６．８．  Ｎ−（２−（４−（８−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−イル）（−７オキソ−７，８−ジヒドロピリド［２，３ｄ］ピリミジン−２−イル）アミノ）フェノキシ）エチル−１−（５−（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）（−２−オキソヘキサヒドロ１Ｈチエノ［３及び４日間］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６−ドデカオキサノナトリアコンタン−３９−アミドの合成
【化２９】
2014532184.tif 000032
以上の化合物に関連して記載した手順に従って、所望の化合物を調製した。黄色油（４６ｍｇ、収率６２％）として標記化合物を得た。１Ｈ  ＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）δ８．６１（ｓ，１Ｈ）、７．６８（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．６０−７．５３（ｍ，２Ｈ）、７．０２−６．９４（ｍ，２Ｈ）、６．３３（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ）、５．３４−５．２７（ｍ，１Ｈ）、４．４９（ｄｄｄ，Ｊ＝７．９，４．９，０．８Ｈｚ，１Ｈ）、４．３０（ｄｄ，Ｊ＝７．９，４．５Ｈｚ，１Ｈ）、４．０７（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ）、３．８６−３．３２（ｍ，５２Ｈ）、３．２３−３．１７（ｍ，１Ｈ）、２．９２（ｄｄ，Ｊ＝１２．７、５．０Ｈｚ，１Ｈ）、２．７０（ｄ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ，１Ｈ）、２．６３−２．５６（ｍ，１Ｈ）、２．５１−２．４６（ｍ，３Ｈ）、２．４０−２．３５（ｍ，１Ｈ）、２．２１（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）、２．１９−２．１２（ｍ，１Ｈ）、１．８２−１．５２（ｍ，７Ｈ）、１．５０−１．３３（ｍ，３Ｈ）、１．３２−１．１９（ｍ，２Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）：１２１８［Ｍ＋Ｈ］＋。ＨＰＬＣ：１００％、Ｒｔ：４．９０ｍｉｎ。
【０１４８】
ＲＮＡ配列決定：  ダイナル（Ｄｙｎａｌ）オリゴ（ｄＴ）ビーズ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて１０μｇの全ＲＮＡからポリアデニル化（ポリＡ）ｍＲＮＡを単離した。
アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）製の断片化緩衝液を用いて、７０℃で５分間かけてポリＡ  ｍＲＮＡを断片化した。第一鎖ｃＤＮＡ合成では、ランダムヘキサマープライマー及びスーパースクリプトＩＩ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用した。第二鎖ｃＤＮＡ合成では、ＤＮＡｐｏｌＩ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて行われ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲスピン・カラム（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて精製された。ライブラリー調製は、製造業者の使用説明書に従って行われた（イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ））。
【０１４９】
ＲＮＡ配列アライメント及び転写物発現解析：  低クローディン腫瘍（３レーン）、ＳＵＭ１５９（４レーン）、及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（３レーン）に対する７６ｂｐイルミナＲＮＡ−ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＲＮＡ−ｓｅｑ）リードをＴＣＧＡから取得し、ボウタイ（Ｂｏｗｔｉｅ）を用いてＮＣＢＩ  ｂｕｉｌｄ  ３７  （ｈｇｌ９）からのＵＣＳＣ  ｈｕｍａｎ  ｋｎｏｗｎＧｅｎｅ  ｍＲＮＡにアライメントした。（非特許文献１４０）。各リードで１つのミスマッチのみを許容してアライメントを行い、アライメントされリードに対して得られた最良アライメントを報告した。ピカード（Ｐｉｃａｒｄ）（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｃａｒｄ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）を用いてディデュプリケートリードを除去し、インハウススクリプトを用いてプロテインキナーゼに対するリードカウントを取得した。各キナーゼ遺伝子のすべてのアイソフォームに対してリードカウントを合計した。次いで、ローキナーゼ転写物リードカウントをリード／キロベースエキソンモデル／１００万マップリード（ＲＰＫＭ）の計算で規格化した。（非特許文献１４１）。ＲＰＫＭ式中の「Ｎ」（マッピング可能なリードの全数）の値を、アライメントされたリードの全数−ディデュプリケートリードとして規定した。そのほかに、ＲＰＫＭ計算では、各遺伝子に対する平均アイソフォーム長さを使用した。各細胞タイプに対するリードカウント及びＲＰＫＭ値はすべて、表Ｓ１にある。
【０１５０】
ウェスタンブロッティング：  細胞溶解物からのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィーにより分離し、ニトロセルロース膜に移し、指定の一次抗体でプローブした。ｐＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｐＡＫＴ（Ｔ３０８）、ＡＵＲＡ、ｐＡＸＬ（Ｙ７０２）、ＡＸＬ、ｃ−Ｍｙｃ、ＤＤＲ１、ＥＧＦＲ、ｐＥＲＫ１／２（Ｔ２０２／Ｙ２０４）、ｐＨＥＲ３（Ｙ１１９７）、ＭＡＸ、ｐＭＥＫ１／２（Ｓ２１７／Ｓ２２１）、ＭＥＫ１／２、ＭＫＰ３、ｐＰ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ３８９）、ｐＰＤＧＦＲ（Ｙ７５１）、ｐＰＤＧＦＲβ（Ｙ１００９）、ｐＰＤＧＦＲ（Ｙ８５７）、ＰＤＧＦＲβ、ｐＲＡＦ（Ｓ３３８）、ｐＲＳＫｌ（Ｔ３５９／Ｓ３６３）、ｐＶＥＧＦＲ２（Ｙ１１７５）、ＶＥＧＦＲ２を認識する抗体は、セル・シグナリング・テクノロジー（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から取得した。サイクリンＡ２、サイクリンＢ１、サイクリンｄｌ、ＥＲＫ２、ＲＡＦ、及びｐＲＡＦ（Ｓ２５９）の為の抗体は、サンタ・クルーズ・バイオテクノロジーＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから取得した。Ｂｉｍを認識する抗体は、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）から取得した。ｐ−ｃ−Ｍｙｃ（Ｓ６２）を認識する抗体は、アビーム（Ａｂｅａｍ）から取得した。二次のＨＲＰ抗ウサギ及びＨＲＰ抗ヤギ二次抗体は、ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びサンタ・クルーズ・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から得た。ウェスタンブロットは、スーパーシグナル・ウェスト・ピコ・ケミルミネセント（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（サーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を用いてインキュベーションにより可視化した。
【０１５１】
核抽出物沈澱及び免疫沈降：  ＤＭＳＯ又は５μＭのＡＺＤ６２４４で４及び７２時間処理されたＳＵＭ１５９細胞から核抽出物を単離した。簡潔に述べると、溶解物は、２００μＬの（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１．５ｍＭ  ＭｇＣ１２、１０ｍＭ  ＫＣ１、０．５％  ＮＰ４０、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、及び各１％のホスファターゼ阻害剤カクテル２及び３（シグマ（Ｓｉｇｍａ）））中に採取した。氷上に１０分間置いた後、５，０００ｒｐｍ、４０Ｃで細胞を１５分間遠心分離した。上清を除去することにより核画分を捕集し、ペレットを１００μＬの（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、２５％グリセロール（ｖ／ｖ）、１．５ｍＭ  ＭｇＣ１２、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＫＣ１、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））及び各１％のホスファターゼ阻害剤カクテル２及び３（シグマ（Ｓｉｇｍａ）））中に再懸濁させ、そして氷上で１時間インキュベートした。１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、上清を単離し、そしてブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイによりタンパク質濃度を測定した。免疫沈降では、抗ＭＡＸ（セル・シグナリング（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ））及びプロテインＧセファロース（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて細胞溶解物（３００μｇタンパク質）を４０Ｃで一晩免疫沈降した。４０μＬのサンプル緩衝液中で５分間煮沸された細胞溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭβ−グリセロホスフェート、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１μｇ／ｍＬロイペプチン）でプロテインＧセファロースペレットを５回洗浄し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで解像させた。次いで、移動されたニトロセルロース膜を抗Ｍｙｃ（セル・シグナリング（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）抗体でプローブしてＭｙｃ−Ｍａｘ複合体を検出した。
【０１５２】
ＲＴＫアレイ：  ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ８．０）、１％ＮＰ−４０、１０％グリセロール、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１×ＥＤＴＡフリーのプロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、及び各１％のホスファターゼ阻害剤カクテル１及び２（シグマ（Ｓｉｇｍａ））の各を含有するＲＴＫアレイ溶解緩衝液中に細胞を採取した。氷上で２０分間インキュベートした後、細胞デブリを４℃でペレット化した。溶解物（５００μｇタンパク質）をＲ＆Ｄシステムズ・プロテオーム。プロファイラー（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ）（商標）ヒューマン・ホスホ（Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＲＴＫ）抗体アレイに適用した。製造業者の使用説明書に従って洗浄工程及び二次抗体工程を行った」。（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（サーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））によりＲＴＫアレイを可視化した。
【０１５３】
ＣｈＩＰ−ＰＣＲ：  細胞を１％のホルムアルデヒド中で１０分間固定し、超音波処理し（ＶＣＸ１３０ウルトラソニケーター（ＶＣＸ１３０  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒ））、そして５μｇの抗ｃ−Ｍｙｃ及びプロテインＡダイナビーズ（ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で免疫沈降した。６５℃で一晩インキュベートすることにより架橋を逆転させ、ミンエルート（ＭｉｎＥｌｕｔｅ）ＰＣＲ精製キット（キアジェン（ＱＩＡＧＥＮ））でＤＮＡを精製した。アブソリュート・ブルーＳＹＢＲグリーン・ミックスＰＣＲ（Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｂｌｕｅ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｍｉｘ）（サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を用いたリアルタイムＰＣＲにより、ＣｈｌＰアッセイを定量した。ゲノムＤＮＡからのフォワード断片を増幅するように設計された次のＰＣＲプライマーを用いて２＾−ΔＣＴ方法により、フォールド富化を測定した。（配列番号１〜４）フォワード５’−ＧＧＣＴＴＴＧＡＧＡＣＧＴＧＡＡＡＡＧＧＡ−３’及びリバース５’−ＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＡＴＴＧＧＡ−３’、フォワード５’−ＴＧＧＧＣＣＴＴＧＧＴＴＴＧＴＣＣＴＴ−３’及びリバース５’−ＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＧＡＡＡＧＡＴＣＣＴ−３’。
【０１５４】
６．１７．  阻害剤ビーズカップリング手順
６．１７．１．  カルボジイミドカップリング
各キナーゼ阻害剤を５０：５０ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）：エタノール（ｖ／ｖ）中に再懸濁させて、約１６ｍＭの最終濃度を与える。次いで、５０：５０ＤＭＦ：エタノールで予備洗浄された同体積のＥＣＨ（又はＥＡＨ）セファロース４Ｂビーズ（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を、カルボジイミドＥＤＣ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））と共に、０．２Ｍの最終濃度になるように阻害剤溶液に添加する。薬剤−ビーズ懸濁液を４℃で一晩インキュベートし、続いて、１Ｍエタノールアミン及び０．２Ｍ  ＥＤＣ（５０：５０ＤＭＦ：エタノール中）中、室温で２時間インキュベートした。次いで、結合ビーズを酸性及び塩基性の緩衝液で交互に洗浄し、貯蔵の為に２０％エタノール中に再懸濁させる。
【０１５５】
阻害剤−コンジュゲートビーズの調製：
ＥＣＨセファロース４Ｂ（ラパチニブ、ビスインドイルマレイミド−Ｘ、ＳＢ２０３５８０、ダサチニブ、ＰＰ５８、及びＶＩ１６８３２）又はＥＡＨセファロース４Ｂ（プルバラノールＢ）（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））へのキナーゼ阻害剤のカルボジイミドカップリングにより、阻害剤ビーズを調製した。簡潔に述べると、ＥＣＨセファロース及びＥＡＨセファロースビーズを５０％ＤＭＦ／ＥｔＯＨで洗浄し、続いて、５０％ＤＭＦ／ＥｔＯＨ及び０．１Ｍ  ＥＤＣ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））中  ｐＨ５〜６、４０Ｃ、暗所で、キナーゼ阻害剤と共に一晩インキュベートした。カップリング後、過剰残存基を５０％ＤＭＦ／ＥｔＯＨ  １Ｍエタノールアミン（ＥＣＨ−セファロース）中の０．１Ｍ  Ｎ−エチル−Ｎ”−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）又は５０％ＤＭＦ／ＥｔＯＨ（ＥＡＨ−セファロース）中の２０ｍＭ  ＨＡｃを用いてブロック化した。続いて、５０％ＤＭＦ／ＥｔＯＨでビーズを洗浄し、そして其々０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）緩衝液と０．１Ｍアセテート（ｐＨ４．０）緩衝液とで、交互に洗浄する。阻害剤ビーズは、暗所、４℃、２０％エタノール中に貯蔵された。
【０１５６】
６．１７．２．  ビオチン−ストレパビジンカップリング
各ビオチン化キナーゼ阻害剤を５〜１５ｍＭの最終濃度で、結合緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（０．１Ｍホスフェート、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中に再懸濁させる。次いで、結合／洗浄緩衝液（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））中で予備洗浄された等体積の高容量ストレプトアビジンアガロースビーズ（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））を阻害剤溶液に添加し、４℃で３０分間又は一晩インキュベートする。次いで、薬剤−ビーズ懸濁液を１０カラム体積の結合緩衝液（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））で洗浄し、貯蔵の為に２０％エタノール中に再懸濁させる。
【０１５７】
キノームアフィニティー精製では、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．５％トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭフッ化ナトリウム、２．５ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、及び各１％のホスファターゼ阻害剤カクテル２及び３（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含有する溶解緩衝液中に細胞を氷上で２０分間溶解する。細胞溶解物を氷上で超音波処理し（３×１０ｓ）、４℃で１５分間（１３，０００ｒｐｍ）遠心分離し、上清を捕集し、そして０．２μＭ  ＳＦＣＡ膜に通してシリンジ濾過する。濾過された溶解物（１実験あたり約２０〜４０ｍｇのタンパク質）を１Ｍ  ＮａＣｌになるようにし、５００μｌのブロック化洗浄済みＨＳ活性化セファロース４ファースト・フロー・ビーズ（４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ｂｅａｄｓ）（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））の上を流動させることにより予備清澄化した。フロースルーを捕集し、層状ビオチン化阻害剤コンジュゲートビーズ（ビスインドイルマレイミド−Ｘ（５０μｌ）、ＳＢ２０３５８０（５０μｌ）、ラパチニブ（１００μｌ）、ダサチニブ（１００μｌ）、プルバラノールＢ（１００μｌ）、ＶＩ１６８３２（１００μｌ）、ＰＰ５８（１００μｌ））のカラムに通して、溶解物からプロテインキナーゼを単離した。其々、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．５％トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、及び１０ｍＭフッ化ナトリウム、及び１Ｍ  ＮａＣｌ又は１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する、２０ｍｌの高塩緩衝液及び１０ｍｌの低塩緩衝液を用いて、キナーゼ結合阻害剤ビーズを洗浄した。１ｍｌの０．１％ＳＤＳの最終洗浄液をカラムに適用し、その後、高温で１ｍｌの０．５％ＳＤＳ溶液により溶出させた。すべてのカラムからの溶出液を組みわせ、そして６０℃でＤＴＴ（最終濃度５ｍＭ）と共に２０分間、及びヨードアセトアミド（最終濃度２０ｍＭ）と共に室温で３０分間、逐次的に暗所でインキュベートすることにより、システインをアルキル化した。溶出液を１００μｌにスピン濃縮し、そしてクロロホルム／メタノール抽出により清浄剤を除去した。簡潔に述べると、４００μｌのＨＰＬＣグレードメタノール及び１００μｌのＨＰＬＣグレードクロロホルム及び３００μｌのＨＰＬＣグレード水を１００μｌの濃縮溶出液に添加した。但し、各添加間で、撹拌及び１３，０００ｒｐｍでの遠心分離を行った。最終混合後、サンプルを５分間遠心分離してタンパク質を境界面でペレット化させ、そして上相を位注意深く除去してタンパク質ペレットを無傷で残した。タンパク質ペレット及び下側相を３００μｌのメタノール中に再懸濁させ、再び、サンプルを撹拌し、５分間遠心分離し、チューブの底部でタンパク質をペレット化させた。上清を除去し、１回以上のメタノール洗浄を行って、清浄剤を確実に除去する。
【０１５８】
６．１８．  多重化阻害剤ビーズアフィニティークロマトグラフィー
其々、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．５％トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭフッ化ナトリウム、２．５ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、５０ｎｇ／ｍＬカリクリンＡ、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、及び各１％のホスファターゼ阻害剤カクテル２及び３（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含有する溶解緩衝液中に氷上で細胞を２０分間溶解させた。細胞溶解物を氷上で超音波処理（３×１０ｓ）し、４℃で１５分間（１３，０００ｒｐｍ）遠心分離し、上清を捕集し、そして０．２μＭ  ＳＦＣＡ膜に通してシリンジ濾過した。濾過された溶解物（１実験あたり約４０ｍｇのタンパク質）を１Ｍ  ＮａＣｌになるようにし、５００μｌのブロック化洗浄済みＮＨＳ活性化セファロース４ファースト・フロー・ビーズ（４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ｂｅａｄｓ）（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））の上を流動させることにより予備清澄化した。フロースルーを捕集し、層状阻害剤コンジュゲートビーズ（ビスインドイルマレイミド−Ｘ（５０μｌ）、ＳＢ２０３５８０（５０μｌ）、ラパチニブ（１００μｌ）、ダサチニブ（１００μｌ）、プルバラノールＢ（１００μｌ）、ＶＩ１６８３２（１００μｌ）、ＰＰ５８（１００μｌ））のカラムに通して、溶解物からプロテインキナーゼを単離した。其々、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．５％トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、及び１０ｍＭフッ化ナトリウム、及び１Ｍ  ＮａＣｌ又は１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する、２０ｍＬの高塩緩衝液及び１０ｍＬの低塩緩衝液を用いて、キナーゼ結合阻害剤ビーズを洗浄した。１ｍＬの０．１％ＳＤＳの最終洗浄液をカラムに適用し、その後、高温で１ｍＬの０．５％ＳＤＳ溶液により溶出させた。すべてのカラムからの溶出液を組み合わせ、そして６０℃でＤＴＴ（最終濃度５ｍＭ）と共に２０分間、及びヨードアセトアミド（最終濃度２０ｍＭ）と共に室温で３０分間、逐次的に暗所でインキュベートすることにより、システインをアルキル化した。溶出液を１００μＬにスピン濃縮し、そしてクロロホルム／メタノール抽出により清浄剤を除去した。
【０１５９】
簡潔に述べると、４００μＬのＨＰＬＣグレードメタノール及び１００μＬのＨＰＬＣグレードクロロホルム及び３００μＬのＨＰＬＣグレード水を１００μＬの濃縮溶出液に添加した。但し、各添加間で、撹拌及び１３，０００ｒｐｍでの遠心分離を行った。サンプル中のタンパク質は、水の添加により沈降し、生成する境界面に局在化する。最終混合後、サンプルを５分間遠心分離してタンパク質を境界面でペレット化させ、そして上相を位注意深く除去してタンパク質ペレットを無傷で残した。タンパク質ペレット及び下側相を３００μＬのメタノール中に再懸濁させ、再び、サンプルを撹拌し、５分間遠心分離し、チューブの底部でタンパク質をペレット化させた。上清を除去し、少なくともあと１回メタノール洗浄を行って、清浄剤の完全除去を確保する。
【０１６０】
６．１９．  ＭＩＢ統計解析
ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦから得られたデータをプロテインパイロット（ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ）ソフトウェア（バージョン３．０）で処理し、パラゴン（Ｐａｒａｇｏｎ）アルゴリズムを用いてデータベース検索からのタンパク質を同定しかつＭＩＢへのキナーゼの結合の変化を定量した。検索結果をプロ・グループ（Ｐｒｏ  Ｇｒｏｕｐ）アルゴリズムにより更に処理し、最少数の適正な一群の検出可能なタンパク質及び相対的なタンパク質レベルを決定した。ＡＺＤ６２４４（２「重」、１「軽」）又はＤＭＳＯで処理されたＳＩＬＡＣ標識ＳＵＭ１５９細胞の３つのレプリケートを試験して、ＭＩＢキナーゼアフィニティー捕獲の再現性を評価した。合計で１１３種のユニークなキナーゼが同定される。各キナーゼに対して、３つのレプリケートにわたりプールタンパク質比及びｐ値を次のように計算した。
【０１６１】
ｙｉｊは、レプリケートｊ、ｊ＝１、２、３中のキナーゼｉ、ｉ＝１、．．．、１１３に対するｌｏｇ２タンパク質比を表すものとする。キナーゼｉに対するプールタンパク質比は、２ｙｉとして定義される。式中、
【数１】
2014532184.tif 000033
方向性の矛盾を回避する為に、プロテインパイロット（ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ）で報告された両側ｐ値を片側ｐ値に変換し、それをｐｉｊとして表した。スタウファーのｚスコア法を適用してｐ値を組み合わせた。ｚｉｊ＝Φ−１（１−ｐｉｊ）。ただし、Φは、標準的ガウス累積分布関数である。組合せＺスコアを
【数２】
2014532184.tif 000034
として定義する。キナーゼｉに対する組合せ両側ｐ値は、Ｐｉ＝２（１−Φ｜ｚｉ｜）として与えられる。
【０１６２】
図１５Ａは、レプリケート及びプールデータに対するｌｏｇ２タンパク質比（図１５Ｂ、−ｌｏｇ  ｐ値）のペアワイズプロットを示している。上側コーナーに印刷されたピアソン相関係数は、ＭＩＢキナーゼアフィニティー捕獲技術の高い再現性を示している。
【０１６３】
次いで、レプリケートの任意の２つのペアに対して、ｐ値により順位付けられたキナーゼ間のオーバーラップ／一致を評価した。以下の図１６は、個別のレプリケート（Ｒｅｐ）間のオーバーラップ／一致が上位２０位までのキナーゼ間では７０％超であることを示している。それに加えて、オーバーラップは、多重比較を説明するように０．０５のＦＤＲでベンジャミニ・ホッホバーグ調整ｐ値に基づいて発現の統計的に有意な変化を呈するキナーゼを同定する。レプリケート１、２、及び３に対して、其々２４、１３、及び１０種のキナーゼが統計的に有意であると同定される。図１７は、有意なキナーゼのこれらのリスト間のオーバーラップのベン図を表している。一方、プール（Ｐｏｏｌ）ｐ値では、２４種のキナーゼが統計的に有意であると同定される。有意なキナーゼのリストは、表２に挙げている。
【０１６４】
【表２】
2014532184.tif 000035
【０１６５】
６．２０．  プロテインキナーゼのｓｉＲＮＡノックダウンを用いた細胞生存能アッセイ
対象の遺伝子に対するｓｉＧＥＮＯＭＥプールｓｉＲＮＡは、ダーマコン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、サーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手した。ＲＮＡｉアッセイは、９６ウェル又は３８４ウェルの何れかの透明底プレートで行った。アッセイ前、ダーマフェクト（Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ）トランスフェクション試薬並びにＧＡＰＤＨ（陰性対照）及びＵＢＢ（致死性対照）に対するｓｉＲＮＡを用いて、ＳＵＭ１５９細胞又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対してトランスフェクション条件を最適化した。ダーマフェクト（Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ）とｓｉＲＮＡとの４０μｌ混合物をマルチチャネルピペットにより各ウェル中にプレーティングし、それに続いてマイクロプレートディスペンサーを用いて１６０μｌ細胞懸濁液を添加した。最終アッセイ体積は、２５ｎＭ  ｓｉＲＮＡの用量で２００μｌであった。細胞をプレーティングする前、薬剤又は媒体溶媒を細胞懸濁液に添加した。アッセイは、トリプリケート方式で行われ、各プレートは、クォドラプルの陽性対照（ＵＢＢ）及び陰性対照（ＧＡＰＤＨ）を有していた。５％ＣＯ２を用いて３７℃で９６時間インキュベートした後、フェラスター（Ｐｈｅｒａｓｔａｒ）マイクロプレートリーダーを用いて発光生存能アッセイにより各ウェル中の生存細胞数を決定した。活性％は、陽性対照及び陰性対照の平均に対して計算した（活性％＝１００×（１−［ロー値−σｐ］／［σｎ−σｐ］。ここで、σｐ及びσｎは、其々陽性対照及び陰性対照に対するロー値の平均である。トリプリケートの各メジアンを図中の活性％の代表例として使用した。各細胞系及びｓｉＲＮＡを用いて２〜３回の独立した実験を行った。
【０１６６】
６．２１．  ｓｉＲＮＡプールのデコンボリューション
標的タンパク質をノックダウンする能力に対してスマートプール（ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ）からの個別のｓｉＲＮＡを試験した。スマートプール（ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ）の表現型を認めるのに、標的ノックダウンを示す４種の個別のｓｉＲＮＡのうちの２種が必要とされた。それに加えて、細胞をＡＺＤ６２４４又はＵ０１２６で処理した場合、ＰＤＧＦＲβの安定なｓｈＲＮＡノックダウンは、ＳＵＭ１５９及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の両方で合成致死様表現型を有することが示された。
【０１６７】
６．２２．  ＭＩＢのホスホプロテオミクス分析
既に記載されたように、ＴｉＯ２ビーズを用いてＭＩＢ溶出消化物からホスホペプチドを富化した。（非特許文献１４２）。ナノアキティー（ｎａｎｏＡｑｕｉｔｙ）ＵＰＬＣシステム（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）インコーポレイテッド（Ｉｎｃ））を用いて、逆相ナノＨＰＬＣによりトリプシンペプチドを分離した。最初に、２ｃｍトラッピングカラム（ＩＤ７５μｍ、粒子サイズ２．５μｍのＣ１８ビーズ、細孔サイズ２００Å）中にペプチドを閉じ込め、次いで、室温で自己充填２５ｃｍカラム（ＩＤ７５μｍ、粒子サイズ２．５μｍのＣ１８ビーズ、細孔サイズ１００Å）で分離した。ベロス−オービトラップ（Ｖｅｌｏｓ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ）質量分析計（サーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を用いて、溶出ペプチドの同定及びリン酸化状態測定を行った。具体的には、ＦＴフルスキャン後、動的排除を考慮してフルスキャンからの９つの最も高い強度のイオンに関して３つの解離方法の１つによりＭＳ２スペクトルデータを取得した。イオン解離の為に、衝突誘起解離（ＣＩＤ）、高エネルギー衝突誘起解離（ＨＣＤ）、又はＣＩＤ／ＨＣＤトグルを利用した。全体を通じて、４４５．１２００３０のポリシロキサンロック質量を使用した。すべての生データをｍｚＸＭＬ形式に変換し、次いで、ソーセラー（Ｓｏｒｃｅｒｅｒ）２．０プラットフォーム（セージＮリサーチ（Ｓａｇｅ  Ｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、カリフォルニア州ミルピタス）上のシークエスト（Ｓｅｑｕｅｓｔ）を用いて検索した。検索は、デコイとして逆方向配列が追加されたヒトＩＰＩデータベース（１０／３／２０１０）に対してセミトリプシン方式であった。リン酸化されたセリン、トレオニン、及びチロシンに対しては、動的修飾を使用し、カルバミドメチル化されたシステインに対しては、静的修飾を使用した。また、ＮＩＳＴヒトイオントラップデータベース（１／１４／２０１０）を用いて、トランスプロテオミック・パイプライン（Ｔｒａｎｓｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ｐｉｐｅｌｉｎｅ）（ＴＰＰ）バージョン４．４．１に搭載されたスペクトラＳＴ（ＳｐｅｃｔｒａＳＴ）アルゴリズムにより、他の検索も行った。ＴＰＰのペプチドプロフェット（ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｐｈｅｔ）を用いてシークエスト（Ｓｅｑｕｅｓｔ）及びスペクトラＳＴ（ＳｐｅｃｔｒａＳＴ）の検索結果を解析し、次いで、アイプロフェット（ＩＰｒｏｐｈｅｔ）（非特許文献１４３）を用いて結合した。ＳＩＬＡＣ比は、ＴＰＰ内のＸＰＲＥＳＳアルゴリズムを用いて計算した。ＸＰＲＥＳＳパラメーターは、質量差１０の重アルギニンのもの及び質量差６の重リシンのものであった。タンパク質同定は、ＴＰＰのプロテインプロフェット（ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｐｈｅｔ）により出力された。
【０１６８】
６．２３．  免疫蛍光アッセイ及びタネルアッセイ
腫瘍をスナップ凍結し、６μｍに凍結切片化し、そして４％パラホルムアルデヒド中で１５分間固定した。ガラススライド上に載せた切片を１：１０００希釈でＰＤＧＦＲβウサギ抗体（セル・シグナリング（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）＃３１６９）と共に一晩インキュベートした。二次抗体は、アレキサ（Ａｌｅｘａ）５５５ヤギ抗ウサギであった。凍結切片を染色する為に、セル・シグナリング（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）により提供されたプロトコルに従った。製造業者プロトコル（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、＃１２１５６７９２）に従って、イン・シチュ・デス・ディテンション・キット（Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ）を用いてタネルアッセイを行った。
【０１６９】
６．２４．  追加の疾患／組織からのキナーゼ
以上に記載の方法を用いて、頭頸部癌細胞系に対するキノームを治療の前及び後で調べた。細胞系は、ＨＮ１２頭頸部癌細胞系であった。１５０ｍＬ培養フラスコ中で標準的方法を用いて細胞を培養し、１００ｎＭラパマイシンで１時間処理し、そして以上の第６．１８節のカラム手順及び第６．２２節の質量分析方法を用いて、概説した標準的ＭＩＢカクテルにより２０ｍｇのタンパク質を処理した。図１８は、ＤＭＳＯ中のラパマイシンによる処理の前及び後のキノームの変化を示している。
【０１７０】
以上に記載の方法を用いて、白血病細胞系に対するキノームをＭＥＲＴＫ阻害剤による処理の前及び後で調べた。６９７個の白血病細胞を５０ｎＭの対象のＭＥＲＴＫ阻害剤で２時間処理し、そして過バナジン酸で１０分間処理した後、採取した。以上に概説した標準的ＭＩＢカクテルにより２０ｍｇのタンパク質を処理した。第６．１８節のクロマトグラフィー及び第６．２２節の質量分析方法を参照されたい。図１９は、ＤＭＳＯ中のＭＥＲＴＫ阻害剤による処理の前及び後の白血病細胞系でのキノームの変化を示している。
【０１７１】
以上に記載の方法を用いた、ＣＭＶ感染の前及び後の細胞に対するキノーム。具体的には、一次ヒト包皮繊維芽細胞にＣＭＶ（ＡＤ１６９株）を７２時間感染させ、そして７ｍｇのタンパク質を標準的ＭＩＢカクテル及び質量分析により処理した。第６．１８節のクロマトグラフィー及び第６．２２節の質量分析方法を参照されたい。図２０は、ＣＭＶ感染の前及び後の線維芽細胞に対するキノームの変化を示している。
【０１７２】
６．２５．  膵臓癌での暫定的結果
膵臓癌に対する新しい治療の期待外れが続いたことと、知見を迅速に診療に生かす必要性が高いことと、が相まって、原発性及び転移性の膵臓癌で活性化キノームを規定するシステムベースの手法が促進されてきた。キナーゼ突然変異が一般的でないで膵臓癌では、キナーゼ活性化プロファイルの決定は、治療が成功するようにキナーゼ阻害剤の使用を調整する鍵となるであろう。膵臓癌のキノームプロファイリングが成功するように、以上に記載の新規なＭＩＢ／ＭＳ手法、スナップ凍結膵臓腫瘍形態のライブラリー、膵臓癌の３８超の異なる患者由来異種移植片（ＰＤＸ）の拡大ライブラリー、及び汎クラス１ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤ＢＫＭ１２０を用いた積極的臨床試験を含めて、幾つかの資源が同時に利用される。これは、膵臓癌で計画された第ＩＩ相拡大コホートを含む第Ｉ／ＩＩ相臨床試験である。第Ｉ相は、２０１２年５月に登録を開始した。
【０１７３】
本明細書に記載の方法及び細胞系でも腫瘍でも同様に定量的プロテオミクスにより広範にわたるキノームを測定する能力は、きわめてユニークである。この化学的プロテオミクス技術の使用に於ける主要な進歩は、「標的となっていない研究段階の」キノームの活性依存的測定である。これらのキナーゼの多くは、対応する試薬が単に存在しないことから、それらの制御についての理解が制約される。ＭＩＢ／ＭＳは、これらの制約を克服して、抗ホスホ抗体などの試薬が近縁のキナーゼでは識別できないキナーゼの変化（例えば、ＭＥＫ１対ＭＥＫ２、ＥＲＫ１対ＥＲＫ２の異なる活性状態）を検出する。それに加えて、ＭＩＢ／ＭＳは、関連するレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、例えば、利用可能な抗体が限られているＤＤＲ１及びＤＤＲ２の制御を容易に識別する。
【０１７４】
膵臓癌患者から独自に採取された腫瘍のキノームを調べる為にこれらの方法を適用すれば、従来の難題及び研究の妥当性を二次元細胞系から患者に移すのに必要な時間が解消される。この手法では、キナーゼ活性化の根底をなす遺伝的機序又は他の機序を知る必要性が本質的に排除され、どのキナーゼが活性化されるかについて最初に重点的に取り組まれる。キノーム活性化の内因的状態の決定は、原発性及び転移性の腫瘍の両方の腫瘍サブタイプに対する特異的キナーゼ阻害剤に研究の重点を絞る上で重要である。それに加えて、ＭＩＢ／ＭＳを用いたキノーム活性化の定量的同時評価は、治療の為のコンビナトリアル手法の合理的決定を可能にする。このリバース法は、１５０〜３２０種のキナーゼのどれに重点を置くかを先験的に決定し、そして診療に適用可能な新しい治療戦略を検証及び設計すべく、十分に確立された前臨床モデルを用いて、主要なキナーゼに関する研究を更に迅速に拡張する。
【０１７５】
複数の経路を同時に標的とする手法が個別化治療の将来像になるであろうことを示す証拠が増加している。コンビナトリアル治療が発展するにつれて、ドライバー改変を先験的に同定して治療を調整する必要性が極めて高い。例えば、ＰＩ３Ｋ経路活性化は、ＭＥＫ阻害剤治療に対する耐性に関与することが研究から示唆される。実際に、ＰＩ３Ｋ阻害剤とＭＥＫ阻害剤とを用いた組合せ治療の現在進行中の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験は、進行性固形腫瘍の患者で近い将来有望であることが示された（非特許文献１４４）。ＭＥＫ阻害剤に対するキノーム反応のＭＩＢ／ＭＳプロファイリングを用いたこれまでの研究では、ＴＮＢＣの前臨床モデルで薬剤耐性の新規な驚くべき機序が明らかにされた。ＴＮＢＣの忠実な遺伝子工学操作マウスモデル（ＧＥＭＭ）を用いて、以上の試験は、ＭＥＫ阻害剤に反応して活性化されるＲＴＫを阻害することによりＭＥＫ阻害剤への感受性を回復できるので、腫瘍退縮を誘発することを示した。ＭＩＢ／ＭＳを用いた「キノーミング（ｋｉｎｏｍｉｎｉｎｇ）」は、Ｃ３−Ｔａｇ  ＴＮＢＣ  ＧＥＭＭで有効であった組合せ治療の合理的予測をもたらす活性化ＲＴＫのプロファイルを同定した。
【０１７６】
ＬＣＣＣ１０３６は、転移性膵臓癌患者の計画された拡大コホートを含む進行性固形腫瘍患者に於ける修飾（ｍ）ＦＯＬＦＯＸ（５−フルオロウラシル、ロイコボリン、及びオキサリプラチン、ｍＦＯＬＦＯＸ６）と組み合わされたＢＫＭ１２０の第Ｉ相試験である。複数のＰＩ３Ｋ阻害剤が膵臓癌前臨床的に有望であることが示されたので、患者に於いてそれらの有効性を評価する試験が進行中である。ＭＩＢ／ＭＳ手法は、患者からのコア生検などの少量サンプルを正確にアッセイするという事実を含めて、幾つかの点で特有である。
【０１７７】
ＰＩ３Ｋ阻害剤に対する膵臓癌細胞系及びＰＤＸ腫瘍について、キノーム反応を調べた。ＭＥＫ阻害に反応してＲＴＫの発現及び活性化を介してキノーム再プログラミングが起こった乳癌に関する以上の試験に類似して、膵臓癌細胞系及び腫瘍もまた、キナーゼ阻害剤処理に反応してキノーム活性化プロファイルを改変する。ＢＫＭ１２０治療を受けている患者でキノーム再プログラミングを実証できるかを評価することが重要である。この特定の臨床試験の組込みの理論的根拠は、多元的である。第１に、患者からの転移性腫瘍の分析は、膵臓腫瘍の既存のライブラリーでキノーム活性化に関する試験のユニークな検証機会を提供するであろう。第２に、前臨床モデルでの試験は、薬剤耐性を付与しうる取扱い可能な数の候補キナーゼに素早く重点を置くように、この試験に直接相関するであろう。第３に、ＢＫＭ１２０が患者に明らかに有効であるかどうかにかかわらず、臨床試験及び前臨床試験を同時に利用することにより、どのコンビナトリアル戦略をＢＫＭ１２０に使用すべきかを正確に決定し得る。最後に、ＬＣＣＣ１０３６で既に治療を受けた患者からの追加の情報は、１つ又は複数の追跡臨床試験を確保する為のキナーゼ阻害剤を同定するであろう。
【０１７８】
キナーゼ遺伝子発現は候補サブタイプを同定する：  膵臓癌の全エキソーム配列決定は、原発性腫瘍内及び転移間で有意な異質性を示した。コンセンサス・クラスター・プラス（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ＣｌｕｓｔｅｒＰｌｕｓ）（ＣＣＰ）アルゴリズムを用いて７０個の原発性腫瘍及び６個の転移性腫瘍の遺伝子発現データセットを解析し、転写レベルでプロテインキナーゼ発現に有意な異質性があるかを決定した。腫瘍キナーゼプロファイルにより４つのサブタイプに分類することができた。インジェニュイティー・パスウェイ・アナリシス（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＩＰＡ、インジェニュイティー（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ））を用いた機能的経路富化分析に基づいて、４つのサブタイプは、（１）ＲＴＫ、（２）移動、（３）生存、及び（４）増殖である。キノームサブタイプの特性解析は、腫瘍でのプロテインキナーゼ発現のさらに詳細な定量的尺度を与えるＲＮＡｓｅｑにより更に調べられている。
【０１７９】
ＭＩＢ／ＭＳ技術の再現性：  ＭＩＢキナーゼアフィニティー捕獲技術の高い再現性は、以上に記載された。トリプリケート実験では、ｌｏｇ２キナーゼ比（ｒ２≒０．６）、−ｌｏｇ  ｐ値（ｒ２≒０．５５）、及びペプチドの数（ｒ２≒０．９５）の間で大きいペアワイズピアソン相関係数が示された。個別のＭＩＢ／ＭＳレプリケート間のオーバーラップ／一致は、上位２０位までのキナーゼでは７０％超であった。
【０１８０】
キナーゼ遺伝子発現は４つの可能なサブタイプを規定する：  キナーゼのリストは、ジーン・オントロジー（Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｎａｍｅｓ．ｏｒｇ）から導出した。ヒト原発性及び転移性腫瘍のマイクロアレイデータセットからキナーゼの遺伝子発現を抽出し、これを用いてコンセンサスクラスタープラス（ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＣｌｕｓｔｅｒＰｌｕｓ）により膵臓癌のキノームサブタイプを規定できるかを調べた。
【０１８１】
膵臓癌のキノームランドスケープ及びキノームサブタイプ：  乳癌を用いた試験では、キノームの活性化状態及び特異的キナーゼ阻害剤（例えば、ラパチニブ、ＡＺＤ６２４４、ソラフェニブ）に対する再プログラミング反応は、各サブタイプ（ルミナルＡ／Ｂ、Ｈｅｒ２＋、ＴＮＢＣ基底、及び低クローディン）にユニークであることが示された。ＭＩＢ／ＭＳプロファイリングは、薬剤に反応するキナーゼの活性化及びキノーム活性化の変化に関して効果的にかつ再現性よく腫瘍のキノームシグネチャーを規定した。従って、ＭＩＢ／ＭＳプロファイリングは、機能的膵臓腫瘍キノームサブタイプを同定する薬剤に対するキノーム活性化及び反応のパターンを規定する初めての可能性を有する。ＭＩＢ／ＭＳ技術を用いて、最初の一群の１２個の原発性膵臓ＰＤＸ腫瘍をプロファイリングした。この最初の一群の原発性腫瘍に対してＣＣＰを用いて、原発性膵臓癌の３つの潜在的キナーゼサブタイプを見出した。機能的富化分析（ＩＰＡ、インジェニュイティー（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ））を用いて、３つのサブタイプは、増殖、生存、及び移動の機能に関して富化されたキナーゼを含有していた。この少数の一群のサンプルでさえも、キナーゼ活性化のダイナミックレンジから、この分類は、サンプルサイズ増加するにつれてより明確になることが示唆される。
【０１８２】
膵臓癌でのキノーム再プログラミング−細胞タイプ特異的及び阻害剤特異的。また、現在第Ｉ／ＩＩ相臨床試験中の３つのキナーゼ阻害剤、即ち、ＢＫＭ１２０（ノバルティス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ））、経口汎クラス１ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＧＳＫ２１２６２５８（グラクソ・スミスクライン（Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ−Ｋｌｉｎｅ））、ＡＴＰ競合ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤、及びＭＥＫ１／２の可逆アロステリック阻害剤ＧＳＫ１１２０２１２（グラクソ・スミスクライン（Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ−Ｋｌｉｎｅ））を用いて、３つの膵臓癌細胞系（ＨＰＡＣ、ＡｓＰＣ−１、ＨＰＡＦ−ＩＩ）での薬剤に対するキノーム反応を評価した。ＭＩＢ／ＭＳ及びＲＴＫアレイを用いて、ＧＳＫ２１２６４５８及びＧＳＫ１１２０２１２に対するキノーム反応を比較し、キノーム再プログラミングが阻害剤特異的であるかを決定した。ＨＰＡＣ細胞では、ＧＳＫ２１２６４５８は、ｍＴＯＲ阻害に相応してｐ７０Ｓ６キナーゼ活性を阻害し、一方、ＧＳＫ１１２０２１２は、ＭＥＫ１活性化を阻害した。ＧＳＫ２１２６４５８は、ＡＬＫ、ＲＥＴ、ＩＮＳＲ、及びＩＧＦ−１Ｒリン酸化を誘導し、一方、ＢＫＭ１２０又はＧＳＫ１１２０２１２を用いた処理は何れも、誘導しなかった。また、ＭＩＢ／ＭＳプロファイリングから、ＧＳＫ２１２６２５８は、ＧＳＫ１１２０２１２とは異なりキノームプロファイルを改変することが示された。従って、キノーム再プログラミングは、標的特異的である。
【０１８３】
ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、及びＣＤＫＮ２中に共通のドライバー突然変異を保有するにもかかわらず、ベースラインＲＴＫリン酸化は、３つの細胞系にわたり異なっていた。それに加えて、３つの阻害剤を用いた処理に反応するＲＴＫリン酸化プロファイルは、異なる。従って、内因性キノームプロファイル及びキノーム再プログラミングは、細胞系特異的である。
【０１８４】
ＰＤＸプログラム：  原発性ヒト腫瘍のマウスモデルは、従来の細胞系異種移植片モデルよりも有意な進歩を提供することが次第に認識されつつある。４４の異なる膵管腺癌（ＰＤＡＣ）ＰＤＸをうまく移植して、幾つかの患者由来異種移植片モデル（ＰＤＸ）が確立された。肺癌、膵癌、及び結腸癌、さらには膠芽腫（ＧＢＭ）の最近の報告では、免疫無防備状態のマウス中に直接外植された患者腫瘍が、ヒダルゴ（Ｈｉｄａｌｇｏ）、２０１１年、デローズ（ＤｅＲｏｓｅ）、２０１１年で観察されたものと一致する反応率を細胞傷害性治療又は標的化治療に対して呈することが示唆されている。プラスチックディッシュ上で生存可能なサブ集団に依存する樹立細胞系と異なり、これらの腫瘍は、元の腫瘍の異質性及びそれらの元の組織学的特徴を維持する。
【０１８５】
ＢＫＭ１２０処理後の膵臓癌のＰＤＸモデル中でのキノーム再プログラミング：  ＭＩＢ／ＭＳを用いてＢＫＭ１２０処理に対する膵臓癌ＰＤＸのキノーム反応を評価した。ＢＫＭ１２０は、ＰＩ３Ｋ阻害に相応してＡＫＴリン酸化を阻害した。
【０１８６】
膵臓癌細胞系でのキノーム再プログラミング：  ＨＰＡＣ、ＡｓＰＣ−１、及びＨＰＡＦ−ＩＩ細胞系をＧＳＫ１１２０２１２、ＧＳＫ２１２６４５８、ＢＫＭ１２０、又は媒体対照で処理し、４８時間で採取した。処理の４時間後及び７２時間後、ＲＴＫアレイの規格化スポット強度を測定し、そしてＧＳＫ１１２０２１２又はＧＳＫ２１２６４５８のいずれかに反応して活性化及び抑制されたＲＴＫを測定した。ＢＫＭ１２０による処理では、予想通り及び予想外の両方のキノーム変化を生じた。サンプルサイズは小さかったが、ＢＫＭ１２０は、ＰＤＸモデルでは明らかに有効でなかった。このデータをまとめると、ＢＫＭ１２０に反応して活性化された上流のシグナル伝達経路は、ＢＫＭ１２０耐性に関与する可能性があり、研究対象であるべきであることが示唆される。これらのデータは、ＢＫＭ１２０治療に対するコンビナトリアル戦略の決定に役立つであろう。
【０１８７】
ＰＤＸモデルでのキノーム再プログラミング：  患者からの匿名化腫瘍を免疫無防備状態のマウス中に移植し、経過観察した。マイクロアレイ及び突然変異分析を用いて、すべての腫瘍を特徴付けた。手術時及び１．５年間にわたり幾つかの経過期間で、患者腫瘍のヘマトキシリン染色及びエオシン染色は、包囲間質と類似の腺性構造を示す。膵臓癌ＰＤＸにわたり様々なレベルのｐＥＲＫ１／２及びｐＡＫＴ（Ｓ４７３）が観察された。中程度のレベルのｐＡＫＴを有するＰＤＸ  ＰＩ００４２２をＢＫＭ１２０処理の為に選択した。媒体処理されたＰＤＸ腫瘍と対比したＢＫＭ１２０のｐＡＫＴ発現。媒体対照（ｎ＝３）又はＢＫＭ１２０（ｎ＝３）のいずれかでマウスを毎日１回処理し、最終投与の４〜６時間後、腫瘍を採取した。ＰＤＸ腫瘍を２８日間にわたり毎日１回処理した。ＢＫＭ１２０増殖の４つの腫瘍は、対照と比較して腫瘍増殖阻害を示した。３つの媒体対照及びｐＡＫＴの阻害を示す３つのＢＫＭ１２０処理腫瘍をＭＩＢ／ＭＳにより分析した。ＰＤＸ  ＰＩ  ００４２２に於けるＰＩ３Ｋ阻害に反応するキノームの活性化及び抑制。
【０１８８】
ＭＥＫ阻害剤ＧＳＫ１１２０２１２を用いたＴＮＢＣでのウィンドウ試験では、患者腫瘍キノーム再プログラミングが示される。ＭＥＫ阻害剤ＧＳＫ１１２０２１２で治療されたＴＮＢＣ患者でのキノーム再プログラミングは、評価中である（ＬＣＣＣ１１２２）。このウィンドウ試験では、前処理コア針生検は、手術時に得られた処理７日後の腫瘍の類似の量と比較される。この試験からの暫定的結果は、２つの重要な点を示す。第１に、これは、コア生検から得られる少ないタンパク質量を用いてＭＩＢ／ＭＳプロファイリングを使用する能力を実証し、ＭＩＢ／ＭＳを用いた患者膵臓腫瘍試験に対する概念実証を提供する。第２に、ＧＳＫ１１２０１２１は、ＭＥＫ−ＥＲＫ経路を効果的に阻害し、ＭＲＣＫＧ、ＦＥＲ、及びＤＤＲ１のアップレギュレーションを伴うキノーム再プログラミングをもたらすことが、結果から示される。
【０１８９】
【表３】
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【０１９０】
【表４】
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【０１９１】
【表５】
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【０１９２】
【表６】
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【０１９３】
【表７】
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【０１９４】
【表８】
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【０１９５】
【表９】
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【０１９６】
【表１０】
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【０１９７】
本発明をその詳細な説明と組み合わせて説明してきたが、以上の説明は、例示することを意図したものであって、本発明の範囲を限定することを意図したものではないことを理解すべきである。本発明の他の態様、利点、及び変更は、以下に示す特許請求の範囲内にある。本明細書に引用された出版物、特許、及び特許出願はすべて、其々個々の刊行物又は特許出願が具体的且つ個別的に明示されて参照により組み込まれたものとして参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図４Ｌ】
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【図４Ｍ】
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【図４Ｎ】
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【図４Ｏ】
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【図４Ｐ】
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【図４Ｑ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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