(57)【要約】本開示は、がん幹細胞の存在を検出する方法およびがんの予後におけるその使用、がん転移のリスクを評価する方法、薬物候補を同定または確認する方法、および治療効果を決定する方法を提供する。本開示はまた、がん幹細胞の存在を検出するのに有用なキットならびにCAIXインヒビターを用いるがんを治療する方法を提供する。
2014532864.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
（a）がん細胞を推定的がん療法に曝露して、処置されたがん細胞を得ること；
（b）処置された細胞の少なくとも3種のマーカーのレベルを測定すること（ここで、少なくとも3種の各マーカーは、異なるタイプのマーカーであり、該異なるタイプのマーカーは、
（1）がん幹細胞マーカー、
（2）間葉マーカーおよび上皮マーカーから選ばれる上皮間葉移行（EMT）マーカー、
（3）幹細胞性マーカー、
（4）mTORC1マーカー、および
（5）ケモカインマーカー、
から選ばれる）；
（c）ステップ（b）で測定された少なくとも3種の各マーカーのレベルを、少なくとも3種の各マーカーの基準レベルと比較すること；
を含む、推定的がん療法を同定または確認する方法であって、
ステップ（b）で測定されたがん幹細胞マーカー、間葉マーカー、幹細胞性マーカー、mTORC1マーカーおよびケモカインマーカーのレベルの減少、ならびにステップ（b）で測定された上皮マーカーの増加が、推定的がん療法ががんの治療に有効であることを示す方法。
【請求項２】
がん幹細胞マーカーが、CAIX、EpCAM、ALDH1A3、CD44、ESAまたはCD133である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
間葉マーカーが、平滑筋アクチン、Snail-1、Snail-2、Wnt5B、グースコイド、Zeb2、FoxC2またはp23である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上皮マーカーが、E-カドヘリンまたはデスモプラキンである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
幹細胞性マーカーが、Notch 1またはJagged 1である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
mTORC1マーカーが、mTOR、Raptor、4EBP1またはTSC2である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ケモカインマーカーが、RANTES、PIGF、G-CSF、CXCR3またはCXCL10である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
がん幹細胞マーカー、間葉マーカー、上皮マーカー、幹細胞性マーカー、mTORC1マーカーおよびケモカインマーカーから選ばれる少なくとも5種のマーカーのレベルを測定する請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ステップ（b）が、少なくとも3種のマーカーの1種以上の発現レベルを測定することを含む請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
発現レベルが、遺伝子転写発現のレベルである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
発現レベルが、タンパク質発現のレベルである請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも3種のマーカーが、ケモカインマーカーを含み、ステップ（b）が、処置細胞によって分泌されたケモカインマーカーのレベルを測定することを含む請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（b）が、少なくとも3種のマーカーの1種以上のリン酸化レベルを測定することを含む請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
がん細胞が、ヒトがん細胞である請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
がん細胞が、乳がん細胞、脳がん細胞、結腸がん細胞、卵巣がん細胞、膵臓がん細胞、前立腺がん細胞、メラノーマ細胞または多発性骨髄腫細胞である請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
推定的がん療法が、CAIXインヒビターである請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
以下のステップ：
（a）細胞集団の少なくとも3種のマーカーのレベルを測定すること（ここで、少なくとも3種の各マーカーは、異なるタイプのマーカーであり、該異なるタイプのマーカーは、
（1）がん幹細胞マーカー、
（2）間葉マーカーおよび上皮マーカーから選ばれる上皮間葉移行（EMT）マーカー、
（3）幹細胞性マーカー、
（4）mTORC1マーカー、および
（5）ケモカインマーカー、
から選ばれる）；
（b）ステップ（a）で測定された少なくとも3種の各マーカーのレベルを、少なくとも3種の各マーカーの基準レベルと比較すること；
を含む、細胞集団中のがん幹細胞の存在を検出する方法であって、
ステップ（a）で測定されたがん幹細胞マーカー、間葉マーカー、幹細胞性マーカー、mTORC1マーカーおよびケモカインマーカーのレベルの増加、ならびにステップ（a）で測定された上皮マーカーの減少が、細胞集団中のがん幹細胞の存在を示す方法。
【請求項１８】
がん幹細胞マーカーが、CAIX、EpCAM、ALDH1A3、CD44、ESAまたはCD133である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
間葉マーカーが、平滑筋アクチン、Snail-1、Snail-2、Wnt5B、グースコイド、Zeb2、FoxC2またはp23である請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
上皮マーカーが、E-カドヘリンまたはデスモプラキンである請求項１７〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
幹細胞性マーカーが、Notch 1またはJagged 1である請求項１７〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
mTORC1マーカーが、mTOR、Raptor、4EBP1またはTSC2である請求項１７〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
ケモカインマーカーが、RANTES、PIGF、G-CSF、CXCR3またはCXCL10である請求項１７〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
がん幹細胞マーカー、間葉マーカー、上皮マーカー、幹細胞性マーカー、mTORC1マーカーおよびケモカインマーカーから選ばれる少なくとも5種のマーカーのレベルを測定する請求項１７〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（a）が、少なくとも3種のマーカーの1種以上の発現レベルを測定することを含む請求項１７〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
発現レベルが、遺伝子転写発現のレベルである請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
発現レベルが、タンパク質発現のレベルである請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも3種のマーカーが、ケモカインマーカーを含み、ステップ（a）が、細胞集団によって分泌されたケモカインマーカーのレベルを測定することを含む請求項１７〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
ステップ（a）が、少なくとも3種のマーカーの1種以上のリン酸化レベルを測定することを含む請求項１７〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
細胞集団が、ヒト生体サンプルである請求項１７〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
がん幹細胞が、乳がん幹細胞、脳がん幹細胞、結腸がん幹細胞、卵巣がん幹細胞、膵臓がん幹細胞、前立腺がん幹細胞、メラノーマ幹細胞または多発性骨髄腫幹細胞である請求項１７〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
細胞集団が、がん治療後のがん患者由来である請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
以下のステップ：
（a）請求項１７〜３２のいずれかにしたがって、がんサンプル中のがん幹細胞の存在を検出すること（ここで、細胞集団は、がんサンプル由来である）；次いで、
（b）がん幹細胞ががんサンプル中に検出される場合、患者に有効量のCAIXインヒビターを投与すること；
を含む、がんを治療する方法。
【請求項３４】
請求項１７〜３２のいずれかにしたがって、がん幹細胞を有すると診断された患者に、有効量のCAIXインヒビターを投与することを含む、がんを治療する方法。
【請求項３５】
CAIXインヒビターが、MST-104またはMST-205である請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
患者に、有効量のタキサンを投与することをさらに含む、請求項３３〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
タキサンが、パクリタキセルである請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも3種のマーカー（ここで、少なくとも3種の各マーカーは、異なるタイプのマーカーであり、該異なるタイプのマーカーは、
（1）がん幹細胞マーカー、
（2）間葉マーカーおよび上皮マーカーから選ばれる上皮間葉移行（EMT）マーカー、
（3）幹細胞性マーカー、
（4）mTORC1マーカー、および
（5）ケモカインマーカー、
から選ばれる）に対して特異的結合親和性を有するタンパク質結合分子を含むキット。
【請求項３９】
がん幹細胞マーカーが、CAIX、EpCAM、ALDH1A3、CD44、ESAまたはCD133である請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
間葉マーカーが、平滑筋アクチン、Snail-1、Snail-2、Wnt5B、グースコイド、Zeb2、FoxC2またはp23である請求項３８または３９に記載のキット。
【請求項４１】
上皮マーカーが、E-カドヘリンまたはデスモプラキンである請求項３８〜４０のいずれかに記載のキット。
【請求項４２】
幹細胞性マーカーが、Notch 1またはJagged 1である請求項３８〜４１のいずれかに記載のキット。
【請求項４３】
mTORC1マーカーが、mTOR、Raptor、4EBP1またはTSC2である請求項３８〜４２のいずれかに記載のキット。
【請求項４４】
ケモカインマーカーが、RANTES、PIGF、G-CSF、CXCR3またはCXCL10である請求項３８〜４３のいずれかに記載のキット。
【請求項４５】
がん幹細胞マーカー、間葉マーカー、上皮マーカー、幹細胞性マーカー、mTORC1マーカーおよびケモカインマーカーから選ばれる少なくとも5種のマーカーに対する特異的結合親和性を有するタンパク質結合分子を含む、請求項３８〜４４のいずれかに記載のキット。
【請求項４６】
タンパク質結合分子が結合するアレイを含む、請求項３８〜４５のいずれかに記載のキット。
【請求項４７】
少なくとも3種のマーカー（ここで、少なくとも3種の各マーカーは、異なるタイプのマーカーであり、該異なるタイプのマーカーは、
（1）がん幹細胞マーカー、
（2）間葉マーカーおよび上皮マーカーから選ばれる上皮間葉移行（EMT）マーカー、
（3）幹細胞性マーカー、
（4）mTORC1マーカー、および
（5）ケモカインマーカー、
から選ばれる）に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを含むキット。
【請求項４８】
がん幹細胞マーカーが、CAIX、EpCAM、ALDH1A3、CD44、ESAまたはCD133である請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
間葉マーカーが、平滑筋アクチン、Snail-1、Snail-2、Wnt5B、グースコイド、Zeb2、FoxC2またはp23である請求項４７または４８に記載のキット。
【請求項５０】
上皮マーカーが、E-カドヘリンまたはデスモプラキンである請求項４７〜４９のいずれかに記載のキット。
【請求項５１】
幹細胞性マーカーが、Notch 1またはJagged 1である請求項４７〜５０のいずれかに記載のキット。
【請求項５２】
mTORC1マーカーが、mTOR、Raptor、4EBP1またはTSC2である請求項４７〜５１のいずれかに記載のキット。
【請求項５３】
ケモカインマーカーが、RANTES、PIGF、G-CSF、CXCR3またはCXCL10である請求項４７〜５２のいずれかに記載のキット。
【請求項５４】
がん幹細胞マーカー、間葉マーカー、上皮マーカー、幹細胞性マーカー、mTORC1マーカーおよびケモカインマーカーから選ばれる少なくとも5種のマーカーに対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを含む、請求項４７〜５３のいずれかに記載のキット。
【請求項５５】
オリゴヌクレオチドプローブが結合するアレイを含む、請求項４７〜５４のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん幹細胞マーカー、ならびに推定的がん療法を同定または確認すること、がん幹細胞を検出すること、およびがんを治療することにおけるそのようなマーカーの使用の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん幹細胞（CSC）は、腫瘍内にあるがん細胞の小さい、個別の亜集団である。CSCは、自己複製能およびクローン形成能などの幹様特性を有しており、まれに分割して、娘幹細胞を生成し、腫瘍細胞に分化する。CSCは、腫瘍を再生する能力を有するが、腫瘍細胞の大部分は、分化し、この再生能力を欠く。
【０００３】
CSCは、従来の治療を耐え抜き、化学療法耐性および腫瘍の進行を媒介するので、がん患者における再発および転移の原因であると考えられる。したがって、CSCが根絶された場合にのみ、悪性腫瘍を効果的に治癒することができる。
【０００４】
組織の酸素濃度は、乳房などの様々な環境におけるがん幹細胞の調節において重要な役割を演じる。低酸素状態は、炭酸脱水酵素IX（CAIX）などの低酸素応答性遺伝子の発現を誘発する。この金属酵素は、重炭酸塩およびプロトンへの二酸化炭素の水和を触媒し、したがって、細胞内および細胞外pH調節において重要な役割を演じる。
【０００５】
CAIXは、乳房悪性腫瘍などの低酸素状態の腫瘍において上方調節され、ヒト乳がんの遠隔転移および生き残りについての予後不良のマーカーであるとみなされる。これらの乳房腫瘍の低酸素領域において、CAIX活性は、腫瘍pHの調節を通して腫瘍細胞の生存において重要な役割を演じる。CAIXは、低酸素状態によって強要される好ましくない環境において攻撃的な腫瘍細胞を生存させ、生存細胞の増殖および浸潤を促進することによって転移能力を増加させる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
CAIX経路の関与について腫瘍を評価するためのツールは、任意の患者または腫瘍が治療としてCAIX阻害に影響を受けやすいかどうかを同定するため、および治療の進行をモニターするために、腫瘍を治療することにおいて医学界にとって大きな価値がある可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
簡単な概要
本開示は、以下の実施態様を提供する：
１．以下のステップ：
（a）がん細胞を推定的がん療法に曝露して、処置されたがん細胞を得ること；
（b）処置された細胞の少なくとも3種のマーカーのレベルを測定すること（ここで、少なくとも3種の各マーカーは、異なるタイプのマーカーであり、該異なるタイプのマーカーは、
（1）がん幹細胞マーカー、
（2）間葉マーカーおよび上皮マーカーから選ばれる上皮間葉移行（EMT）マーカー、
（3）幹細胞性マーカー、
（4）mTORC1マーカー、および
（5）ケモカインマーカー、
から選ばれる）；
（c）ステップ（b）で測定された少なくとも3種の各マーカーのレベルを、少なくとも3種の各マーカーの基準レベルと比較すること；
を含む、推定的がん療法を同定または確認する方法であって、
ステップ（b）で測定されたがん幹細胞マーカー、間葉マーカー、幹細胞性マーカー、mTORC1マーカーおよびケモカインマーカーのレベルの減少、ならびにステップ（b）で測定された上皮マーカーの増加が、推定的がん療法ががんの治療に有効であることを示す方法。
２．がん幹細胞マーカーが、CAIX、EpCAM、ALDH1A3、CD44、ESAまたはCD133である実施態様１に記載の方法。
３．間葉マーカーが、平滑筋アクチン、Snail-1、Snail-2、Wnt5B、グースコイド、Zeb2、FoxC2またはp23である実施態様１または２に記載の方法。
４．上皮マーカーが、E-カドヘリンまたはデスモプラキンである実施態様１〜３のいずれかに記載の方法。
５．幹細胞性マーカーが、Notch 1またはJagged 1である実施態様１〜４のいずれかに記載の方法。
６．mTORC1マーカーが、mTOR、Raptor、4EBP1またはTSC2である実施態様１〜５のいずれかに記載の方法。
７．ケモカインマーカーが、RANTES、PIGF、G-CSF、CXCR3またはCXCL10である実施態様１〜６のいずれかに記載の方法。
８．がん幹細胞マーカー、間葉マーカー、上皮マーカー、幹細胞性マーカー、mTORC1マーカーおよびケモカインマーカーから選ばれる少なくとも5種のマーカーのレベルを測定する実施態様１〜７のいずれかに記載の方法。
９．ステップ（b）が、少なくとも3種のマーカーの1種以上の発現レベルを測定することを含む実施態様１〜８のいずれかに記載の方法。
１０．発現レベルが、遺伝子転写発現のレベルである実施態様９に記載の方法。
１１．発現レベルが、タンパク質発現のレベルである実施態様９に記載の方法。
１２．少なくとも3種のマーカーが、ケモカインマーカーを含み、ステップ（b）が、処置細胞によって分泌されたケモカインマーカーのレベルを測定することを含む実施態様１〜８のいずれかに記載の方法。
１３．ステップ（b）が、少なくとも3種のマーカーの1種以上のリン酸化レベルを測定することを含む実施態様１〜８のいずれかに記載の方法。
１４．がん細胞が、ヒトがん細胞である実施態様１〜１３のいずれかに記載の方法。
１５．がん細胞が、乳がん細胞、脳がん細胞、結腸がん細胞、卵巣がん細胞、膵臓がん細胞、前立腺がん細胞、メラノーマ細胞または多発性骨髄腫細胞である実施態様１〜１４のいずれかに記載の方法。
１６．推定的がん療法が、CAIXインヒビターである実施態様１〜１５のいずれかに記載の方法。
１７．以下のステップ：
（a）細胞集団の少なくとも3種のマーカーのレベルを測定すること（ここで、少なくとも3種の各マーカーは、異なるタイプのマーカーであり、該異なるタイプのマーカーは、
（1）がん幹細胞マーカー、
（2）間葉マーカーおよび上皮マーカーから選ばれる上皮間葉移行（EMT）マーカー、
（3）幹細胞性マーカー、
（4）mTORC1マーカー、および
（5）ケモカインマーカー、
から選ばれる）；
（b）ステップ（a）で測定された少なくとも3種の各マーカーのレベルを、少なくとも3種の各マーカーの基準レベルと比較すること；
を含む、細胞集団中のがん幹細胞の存在を検出する方法であって、
ステップ（a）で測定されたがん幹細胞マーカー、間葉マーカー、幹細胞性マーカー、mTORC1マーカーおよびケモカインマーカーのレベルの増加、ならびにステップ（a）で測定された上皮マーカーの減少が、細胞集団中のがん幹細胞の存在を示す方法。
１８．がん幹細胞マーカーが、CAIX、EpCAM、ALDH1A3、CD44、ESAまたはCD133である実施態様１７に記載の方法。
１９．間葉マーカーが、平滑筋アクチン、Snail-1、Snail-2、Wnt5B、グースコイド、Zeb2、FoxC2またはp23である実施態様１７または１８に記載の方法。
２０．上皮マーカーが、E-カドヘリンまたはデスモプラキンである実施態様１７〜１９のいずれかに記載の方法。
２１．幹細胞性マーカーが、Notch 1またはJagged 1である実施態様１７〜２１のいずれかに記載の方法。
２２．mTORC1マーカーが、mTOR、Raptor、4EBP1またはTSC2である実施態様１７〜２１のいずれかに記載の方法。
２３．ケモカインマーカーが、RANTES、PIGF、G-CSF、CXCR3またはCXCL10である実施態様１７〜２２のいずれかに記載の方法。
２４．がん幹細胞マーカー、間葉マーカー、上皮マーカー、幹細胞性マーカー、mTORC1マーカーおよびケモカインマーカーから選ばれる少なくとも5種のマーカーのレベルを測定する実施態様１７〜２３のいずれかに記載の方法。
２５．ステップ（a）が、少なくとも3種のマーカーの1種以上の発現レベルを測定することを含む実施態様１７〜２４のいずれかに記載の方法。
２６．発現レベルが、遺伝子転写発現のレベルである実施態様２５に記載の方法。
２７．発現レベルが、タンパク質発現のレベルである実施態様２５に記載の方法。
２８．少なくとも3種のマーカーが、ケモカインマーカーを含み、ステップ（a）が、細胞集団によって分泌されたケモカインマーカーのレベルを測定することを含む実施態様１７〜２４のいずれかに記載の方法。
２９．ステップ（a）が、少なくとも3種のマーカーの1種以上のリン酸化レベルを測定することを含む実施態様１７〜２４のいずれかに記載の方法。
３０．細胞集団が、ヒト生体サンプルである実施態様１７〜２９のいずれかに記載の方法。
３１．がん幹細胞が、乳がん幹細胞、脳がん幹細胞、結腸がん幹細胞、卵巣がん幹細胞、膵臓がん幹細胞、前立腺がん幹細胞、メラノーマ幹細胞または多発性骨髄腫幹細胞である実施態様１７〜３０のいずれかに記載の方法。
３２．細胞集団が、がん治療後のがん患者由来である実施態様１〜１５のいずれかに記載の方法。
３３．以下のステップ：
（a）実施態様１７〜３２のいずれかにしたがって、がんサンプル中のがん幹細胞の存在を検出すること（ここで、細胞集団は、がんサンプル由来である）；次いで、
（b）がん幹細胞ががんサンプル中に検出される場合、患者に有効量のCAIXインヒビターを投与すること；
を含む、がんを治療する方法。
３４．実施態様１７〜３２のいずれかにしたがって、がん幹細胞を有すると診断された患者に、有効量のCAIXインヒビターを投与することを含む、がんを治療する方法。
３５．CAIXインヒビターが、MST-104またはMST-205である実施態様３３または３４に記載の方法。
３６．患者に、有効量のタキサンを投与することをさらに含む、実施態様３３〜３５のいずれかに記載の方法。
３７．タキサンが、パクリタキセルである実施態様３６に記載の方法。
３８．少なくとも3種のマーカー（ここで、少なくとも3種の各マーカーは、異なるタイプのマーカーであり、該異なるタイプのマーカーは、
（1）がん幹細胞マーカー、
（2）間葉マーカーおよび上皮マーカーから選ばれる上皮間葉移行（EMT）マーカー、
（3）幹細胞性マーカー、
（4）mTORC1マーカー、および
（5）ケモカインマーカー、
から選ばれる）に対して特異的結合親和性を有するタンパク質結合分子を含むキット。
３９．がん幹細胞マーカーが、CAIX、EpCAM、ALDH1A3、CD44、ESAまたはCD133である実施態様３８に記載のキット。
４０．間葉マーカーが、平滑筋アクチン、Snail-1、Snail-2、Wnt5B、グースコイド、Zeb2、FoxC2またはp23である実施態様３８または３９に記載のキット。
４１．上皮マーカーが、E-カドヘリンまたはデスモプラキンである実施態様３８〜４０のいずれかに記載のキット。
４２．幹細胞性マーカーが、Notch 1またはJagged 1である実施態様３８〜４１のいずれかに記載のキット。
４３．mTORC1マーカーが、mTOR、Raptor、4EBP1またはTSC2である実施態様３８〜４２のいずれかに記載のキット。
４４．ケモカインマーカーが、RANTES、PIGF、G-CSF、CXCR3またはCXCL10である実施態様３８〜４３のいずれかに記載のキット。
４５．がん幹細胞マーカー、間葉マーカー、上皮マーカー、幹細胞性マーカー、mTORC1マーカーおよびケモカインマーカーから選ばれる少なくとも5種のマーカーに対する特異的結合親和性を有するタンパク質結合分子を含む、実施態様３８〜４４のいずれかに記載のキット。
４６．タンパク質結合分子が結合するアレイを含む、実施態様３８〜４５のいずれかに記載のキット。
４７．少なくとも3種のマーカー（ここで、少なくとも3種の各マーカーは、異なるタイプのマーカーであり、該異なるタイプのマーカーは、
（1）がん幹細胞マーカー、
（2）間葉マーカーおよび上皮マーカーから選ばれる上皮間葉移行（EMT）マーカー、
（3）幹細胞性マーカー、
（4）mTORC1マーカー、および
（5）ケモカインマーカー、
から選ばれる）に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを含むキット。
４８．がん幹細胞マーカーが、CAIX、EpCAM、ALDH1A3、CD44、ESAまたはCD133である実施態様４７に記載のキット。
４９．間葉マーカーが、平滑筋アクチン、Snail-1、Snail-2、Wnt5B、グースコイド、Zeb2、FoxC2またはp23である実施態様４７または４８に記載のキット。
５０．上皮マーカーが、E-カドヘリンまたはデスモプラキンである実施態様４７〜４９のいずれかに記載のキット。
５１．幹細胞性マーカーが、Notch 1またはJagged 1である実施態様４７〜５０のいずれかに記載のキット。
５２．mTORC1マーカーが、mTOR、Raptor、4EBP1またはTSC2である実施態様４７〜５１のいずれかに記載のキット。
５３．ケモカインマーカーが、RANTES、PIGF、G-CSF、CXCR3またはCXCL10である実施態様４７〜５２のいずれかに記載のキット。
５４．がん幹細胞マーカー、間葉マーカー、上皮マーカー、幹細胞性マーカー、mTORC1マーカーおよびケモカインマーカーから選ばれる少なくとも5種のマーカーに対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを含む、実施態様４７〜５３のいずれかに記載のキット。
５５．オリゴヌクレオチドプローブが結合するアレイを含む、実施態様４７〜５４のいずれかに記載のキット。
【０００８】
以下の記載において、本明細書に提供するいずれかの範囲は、その範囲内のすべての値を含む。他に特記しない限り、用語「または」は一般に、「および／または」（すなわち二者択一の一方、両方またはその組合せ）を包含する意味で用いられることにも留意すべきである。数値または数値範囲に言及している場合の用語「約」は、言及されたその数値または数値範囲が、実験的変動内（または統計的実験誤差内）にある近似値であることを意味し、したがって、数値または数値範囲は、述べられた数値または数値範囲の1%〜15%の間で変化しうる。また、本明細書および請求の範囲で用いられるように、他に特記しない限り、単数形「a」、「an」および「the」は、複数の指示対象を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】正常酸素状態または低酸素状態において、腫瘍スフェア（TS）として培養された4T1-shNSおよび4T1-shCAIX細胞株中のCAIXレベルのウエスタンブロットの複製を示す。アクチン発現レベルは、ローディングコントロールとして示される。
【図２】Mammocult（商標）培地中での7日間培養後の典型的な4T1-shNSまたは4T1-shCAIX TSを示している位相差顕微鏡画像を示す。スケールバー＝100μm。
【図３】様々な条件化でTS形成を開始するのに必要な数値を示す。4T1 shNSおよびshCAIXを2倍希釈で播種し、正常酸素状態または低酸素状態において、TS形成条件下で培養した。3つの独立した実験の平均±SEMを示す。T-検定、＊P＜0.03、＊＊P＜0.006を用いて統計学的有意さを確認した。
【図４】CD44+CD24-/low細胞%±SEMにおける変化を示している代表的なFACSプロットを示す。shNSおよびshCAIX 4T1細胞を、正常酸素状態または低酸素状態において、TSとして培養し、脱凝集し、FACS分析によってCD44+CD24-/low集団を評価した。
【図５】3つの独立した実験からのCD44+CD24-/low細胞%±SEMにおける平均変化を示しているFACSデータのグラフ表示を示す。T-検定、＊P＜0.004、＊＊P＜0.025用いて統計学的有意さを確認した。
【図６】TS成長を開始するために必要な細胞の数のグラフである。親4T1を2倍希釈で播種し、正常酸素状態または低酸素状態において、200μM CAI17またはビヒクルを加えてTS形成条件下で培養した。3つの独立した実験の平均±SEMを示す。T-検定、＊P＜0.001、＊＊P＜0.0060を用いて統計学的有意さを確認した 。
【図７】TS形成フラクションのグラフである。低酸素状態において、TSとして培養した4T1 shNSおよびshCAIXをFACSに付した。両細胞株からのCD44+CD24-/lowまたはCD44-CD24+コントロール細胞を、低酸素状態において、TS形成条件下で2倍希釈で播種し、形成に必要な細胞の数を記録した（生データについては補足的な表１を参照）。4つの独立した実験からの平均TS形成フラクション（±SEM）を用いてTS形成フラクションを計算した。
【図８】正常酸素状態または低酸素状態下、腫瘍スフェアとして定速回転下で培養し、凍結し、切片にした親4T1の免疫染色画像を示す。免疫染色は、がん幹細胞マーカーCD133およびCAIXの発現を評価するために行った。バーバー＝50μm。
【図９】正常酸素状態または低酸素状態において、TSとして培養し、脱凝集し、CD44、CD24について染色し、FACSによって採取した免疫染色親4T1細胞を示す。ガラスカバースリップ上でCD44+CD24-/lowまたはCD44+CD24+細胞を適切に培養し、次いで、固定し、CAIX（図9）について免疫染色した。
【図１０】正常酸素状態または低酸素状態において、TSとして培養し、脱凝集され、CD44、CD24について染色し、FACSによって採取した免疫染色親4T1細胞を示す。ガラスカバースリップ上でCD44+CD24-/lowまたはCD44+CD24+細胞を適切に培養し、次いで、固定し、 E-カドヘリン（図10）について免疫染色した。
【図１１】正常酸素状態または低酸素状態において、TSとして培養し、脱凝集し、CD44、CD24について染色し、FACSによって採取した免疫染色親4T1細胞を示す。ガラスカバースリップ上でCD44+CD24-/lowまたはCD44+CD24+細胞を適切に培養し、次いで、固定し、間葉マーカー、たとえば 平滑筋アクチン（図11）について免疫染色した。
【図１２】正常酸素状態または低酸素状態において、TSとして培養し、脱凝集し、CD44、CD24について染色し、FACSによって採取した免疫染色親4T1細胞を示す。ガラスカバースリップ上でCD44+CD24-/lowまたはCD44+CD24+細胞を適切に培養し、次いで、固定し、EMT調節因子Snail（図12）について免疫染色した。
【図１３】正常酸素状態または低酸素状態下、腫瘍スフェアとして定速回転下で培養し、凍結し、切片にした親4T1の免疫染色画像を示す。免疫染色は、上皮マーカーE-カドヘリンおよびCAIX（図13）の発現を評価するために行った。バー＝50μm。
【図１４】正常酸素状態または低酸素状態下、腫瘍スフェアとして定速回転下で培養し、凍結し、切片にした親4T1の免疫染色画像を示す。免疫染色は、間葉マーカー平滑筋アクチンおよびCAIX（図14）の発現を評価するために行った。バー＝50μm。
【図１５】正常酸素状態または低酸素状態下、腫瘍スフェアとして定速回転下で培養し、凍結し、切片にした親4T1の免疫染色画像を示す。免疫染色は、EMT調節因子SnailおよびCAIX（図15）の発現を評価するために行った。バー＝50μm。
【図１６】低酸素状態において、TSとして培養し、脱凝集し、CD44、CD24について染色し、FACSによって採取した免疫染色親4T1 shNSおよびshCAIX細胞を示す。生存CD44+CD24-/lowまたはCD44+CD24+細胞を採取し、低酸素状態において、ガラスカバースリップ上で3日間培養し、固定し、E-カドヘリン（図16）の発現について免疫染色によって評価した。
【図１７】低酸素状態において、TSとして培養し、脱凝集し、CD44、CD24について染色し、FACSによって採取した免疫染色親4T1 shNSおよびshCAIX細胞を示す。生存CD44+CD24-/lowまたはCD44+CD24+細胞を採取し、低酸素状態において、ガラスカバースリップ上で3日間培養し、固定し、平滑筋アクチン（図17）の発現について免疫染色によって評価した。
【図１８】低酸素状態において、TSとして培養し、脱凝集し、CD44、CD24について染色し、FACSによって採取した免疫染色親4T1 shNSおよびshCAIX細胞を示す。生存CD44+CD24-/lowまたはCD44+CD24+細胞を採取し、低酸素状態において、ガラスカバースリップ上で3日間培養し、固定し、Snail（図18）の発現について免疫染色によって評価した。
【図１９】様々なEMTマーカーについてのmRNAレベルを示している一連のグラフである。4T1 shNSおよびshCAIX細胞を、低酸素状態において、TSとして培養し、脱凝集し、CD44、CD24について染色し、FACSによって採取した。生存CD44+CD24-/lowまたはCD44+CD24+細胞を採取し、低酸素状態において、ガラスカバースリップ上で3日間培養し、細胞溶解し、ENAを抽出し、様々なEMTマーカーの相対的mRNAレベルQPCRによって評価した。3つの独立した実験の平均およびSEM倍率変化を得る。
【図２０】正常酸素状態において、TSとして培養し、脱凝集し、CD44、CD24について染色し、FACSによって採取した親4T1細胞の画像である。生存CD44+CD24-/lowまたはCD44+CD24+細胞を採取し、50 μM MST-104の存在または不在下で、低酸素状態において、ガラスカバースリップ上で5日間培養し、固定し、E-カドヘリンの発現について免疫染色することによって評価した。
【図２１】インビトロ腫瘍増殖のグラフである。MDA-MB-231 LM2-4luc+をNOD/SCIDマウスに同所移植した。腫瘍が平均200 mm2に達したとき、ビヒクル、38mg/kg MST-104または30mg/kg MST-205のいずれかを動物に投与した。次いで、腫瘍増殖をモニターした。n＝8/グループ。＊P＜0.02、＊＊P＜0.01。
【図２２Ａ】3匹のマウスからのEpCAM+細胞±SEMにおける平均変化を示している代表的なFACSプロット（図22A）である。MDA-MB-231 LM2-4luc+をNOD/SCIDマウスに同所移植した。腫瘍が平均200 mm2に達したとき、ビヒクルまたは38mg/kg MST-104のいずれかを動物に投与した。27日後、原発腫瘍を除去し、分離し、FACS分析によってEpCAM+細胞集団を評価した。T-検定、＊＊＊P＜0.0331、＊＊P＜0.0224を用いて統計学的有意さを確認した。
【図２２Ｂ】3匹のマウスからのEpCAM+細胞±SEMにおける平均変化を示している棒グラフ（図22B）である。MDA-MB-231 LM2-4luc+をNOD/SCIDマウスに同所移植した。腫瘍が平均200 mm2に達したとき、ビヒクルまたは38mg/kg MST-104のいずれかを動物に投与した。27日後、原発腫瘍を除去し、分離し、FACS分析によってEpCAM+細胞集団を評価した。T-検定、＊＊＊P＜0.0331、＊＊P＜0.0224を用いて統計学的有意さを確認した。
【図２３Ａ】NOD/SCIDマウスに同所移植されたMDA-MB-231 LM2-4luc+細胞を示している代表的なFACSプロット（図23A）である。腫瘍が平均200 mm2に達したとき、ビヒクルまたは38mg/kg MST-205のいずれかを動物に投与した。27日後、原発腫瘍を除去し、分離し、FACS分析によってEpCAM+細胞集団を評価した。代表的なFACSプロットを示す。T-検定、＊＊＊P＜0.0331、＊＊P＜0.0224を用いて統計学的有意さを確認した。
【図２３Ｂ】NOD/SCIDマウスに同所移植されたMDA-MB-231 LM2-4luc+細胞を示している棒グラフ（図23B）である。腫瘍が平均200 mm2に達したとき、ビヒクルまたは38mg/kg MST-205のいずれかを動物に投与した。27日後、原発腫瘍を除去し、分離し、FACS分析によってEpCAM+細胞集団を評価した。棒グラフは、3匹のマウスからのEpCAM+細胞±SEMにおける平均変化を示す。T-検定、＊＊＊P＜0.0331、＊＊P＜0.0224を用いて統計学的有意さを確認した。
【図２４】IHC標識腫瘍の画像を示す。MDA-MB-231 LM2-4luc+細胞をNOD/SCIDマウスに同所移植した。腫瘍が平均200 mm2に達したとき、ビヒクルまたは38mg/kg MST-104のいずれかを動物に投与した。27日後、原発腫瘍を固定し、切片にし、IHCに付して、陽性がん幹細胞マーカーALDH1A3の発現を評価した。
【図２５】IHC標識腫瘍の画像を示す。MDA-MB-231 LM2-4luc+細胞をNOD/SCIDマウスに同所移植した。腫瘍が平均200 mm2に達したとき、ビヒクルまたは38mg/kg MST-104のいずれかを動物に投与した。27日後、原発腫瘍を固定し、切片にし、IHCに付して、 CAIXの発現を評価した。
【図２６】インビボ腫瘍増殖のグラフを示す。MDA-MB-231 LM2-4luc+細胞をNOD/SCIDマウスに移植し、10日間腫瘍を確立し、次いで、処置を開始した。静脈内注射によってパクリタキセルを投与し、グラフに概略した投与計画（矢印）にしたがって、腹腔内注射によってMST-104を提供した。n＝7-8/グループ。＊P＜0.02、＊＊P＜0.002。
【図２７】ヒト乳房腫瘍を有するマウスから切除し、エクスビボIVISによる肺転移について分析に付した肺の画像を示す。転移を示しているヒートマップを、肺のグレースケール画像の上に重ねる。
【図２８】ヒト同所乳房腫瘍を有し、従来の化学療法剤であるパクリタキセルとの併用にてMST-104で処置されたマウスからの自然肺転移の定量のグラフを示す。各グループについての平均総フォトンフラックス±SEMを示す。
【図２９】代表的FACSデータを示す。NOD-SCIDマウスの乳房脂肪体にMDA-MB-231 LM2-4乳がん細胞を接種した。パクリタキセルもしくはMST-104、あるいは併用で両方の薬物、またはビヒクルを、マウスに投与した。人道的な終点において、腫瘍を切除し、生存EpCAM陽性集団をFACSによって評価した。
【図３０】MB-231 LM2-4乳がん細胞を接種し、パクリタキセルもしくはMST-104、あるいは併用で両方の薬物、またはビヒクルを静脈内投与したNOD-SCIDマウス乳房脂肪体のFACS分析のグラフを示す。人道的な終点において、腫瘍を切除し、生存EpCAM陽性集団をFACSによって評価した。棒グラフは、グループ当たり3つの腫瘍からの平均±SEMを示す。
【図３１】正常酸素状態（N）または 低酸素状態（H）において、TSとして培養された4T1-shNSおよび4T1-shCAIX細胞によって発現されたmTOR経路のいくつかの成分のタンパク質レベルを実証しているウエスタンブロットを示す。Raptor免疫ブロット下でのRaptor/クチン濃度測定値を示す。アクチンの発現のレベルをローディングコントロールとして示す。
【図３２】低酸素状態において、TSとして培養された親4T1細胞によって発現され、7日間CAIXインヒビターで処置されたmTORおよびRaptorのタンパク質レベルを実証しているウエスタンブロットを示す。チューブリンの発現をローディングコントロールとして示す。
【図３３】ビヒクルまたはMST-104で処置された担がんマウスから単離されたMDA-MB-231 LM2-4Luc+ヒト乳がん細胞によって発現されたいくつかのmTOR経路成分のタンパク質レベルを実証しているウエスタンブロットを示す。アクチンおよびGAPDHの発現をローディングコントロールとして示す。
【図３４】定量的リアルタイムPCRいくつかのケモカイン遺伝子のmRNAレベルにおけるCAIX枯渇の効果を実証しているグラフを示す。正常酸素状態および低酸素状態にて、4T1-shNS、4T1-shCAIX（A）および4T1-shCAIX（B）細胞を24時間培養した。細胞を採取し、mRNAを抽出し、cDNAを調製し、qPCRによって分析した。3つの独立した実験の平均倍率変化±SEMを示す。T-検定、＊P＜0.05によって統計学的有意さを確認した。
【図３５】無血清増殖培地にて低酸素状態において、24時間インキュベートされた4T1-shNSおよび4T1-shCAIX細胞から回収されたならし培地中に存在するマウスCXCL10の量を定量しているELISAデータのグラフを示す。3つの独立した実験の平均倍率変化±SEMを示す。T-検定、P＝0.003によって統計学的有意さを確認した。
【図３６】無血清増殖培地にて低酸素状態において、24時間インキュベートされた4T1-shNSおよび4T1-shCAIX細胞から回収されたならし培地中に存在するマウスG-CSFの量を定量しているELISAデータのグラフを示す。3つの独立した実験の平均濃度±SEMを示す。T-検定、P＝0.008によって統計学的有意さを確認した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
詳細な記載
本開示は、がん幹細胞の存在を検出する方法およびがんの予後におけるその使用、がん転移のリスクを評価する方法、薬物候補を同定または確認する方法、および治療効果を決定する方法を提供する。本開示はまた、がん幹細胞の存在を検出するのに有用なキットならびにCAIXインヒビターを用いるがんを治療する方法を提供する。
【００１１】
本開示は、本発明者らによる以下の発見に一部に基づいている：（1）特定の上皮-間葉転移（EMT）マーカーおよび調節因子の発現、幹細胞性マーカーの発現、および低酸素状態におけるがん幹細胞の拡張には、CAIXが必要である；（2）シグナル伝達経路は、がん幹細胞機能の調節においてCAIXの下流にある重要な経路である；および（3）低酸素状態におけるがん幹細胞によるケモカインの分泌には、CAIXが必要である。したがって、本願発明者らは、CAIXがそのレベルに影響を及すいくつかの異なるタイプのマーカーを発見した。このようなマーカーは、本明細書において「CAIX関連バイオマーカー」または「CAIX関連マーカー」と総称される。
【００１２】
バイオマーカー
本明細書で用いる「バイオマーカー」または「マーカー」は、その存在、不在または量が、特定の細胞型もしくは細胞プロセスに特有であるか、または特定の細胞型もしくは細胞プロセスによって要求される分子（たとえば、遺伝子、mRNAsまたはタンパク質）を指す。本明細書で用いる「バイオマーカー」はまた、特定のシグナル経路の構成要素、または類似した機能を有するタンパク質のグループまたは該タンパク質のグループの遺伝子もしくはmRNAの構成要素を指す。
【００１３】
本明細書で用いる遺伝子またはタンパク質の名前および記号は、他に特記しない限り、対応する遺伝子、mRNA、cDNAs、タンパク質またはそのフラグメントを含むことを意図している。
【００１４】
「がん幹細胞」（CSC）は、特定のがんサンプルに見出されるすべての細胞型を生じさせる能力がある、腫瘍または血液がん内に見出されるがん細胞である。したがって、CSCは、腫瘍原性（腫瘍形成性）であり、自己複製および複数の脂肪型への分化の幹細胞プロセスを通して腫瘍を生成させる可能性がある。
【００１５】
「がん幹細胞マーカー」または「がん幹細胞バイオマーカー」は、他のがん細胞と比較して、がん幹細胞に差別的に存在する分子（たとえば、遺伝子、mRNAsまたはタンパク質）を指す。がん幹細胞中のマーカーのレベルが、他の細胞（非腫瘍原性がん細胞またはがん細胞でない細胞）のレベルとは統計的に異なる（たとえば、以下または以上）ならば、分子は、がん幹細胞に差別的に存在する。統計学的有意さについての一般的検定として、t-検定、ANOVA、クラスカル-ウォリスおよびウィルコクソンが挙げられる。
【００１６】
異なるタイプのがんは、異なるがん幹細胞マーカーを有する可能性がある。たとえば、膀胱がん幹細胞マーカーとして、CD44およびCD47が挙げられる。乳がん幹細胞マーカーとして、アルデヒドデヒドロゲナーゼI-A1（ALDH1A1）、ALDH1A3、BMI-1、CAIX、CD24、CD44、CD133、CXCR4、DLL4、EpCAM、ErbB2、ESA、GLI-1、GLI-2、IL-1アルファ、IL-6 Rアルファ、CXCR1、インテグリンアルファ6およびPTENが挙げられる。結腸がん幹細胞マーカーとして、ALDH1A1、CD44、CD166、DPPIV/CD26、EpCAM、GLI-1およびMusashi-1が挙げられる。胃がん幹細胞マーカーとして、CD44およびDLL4が挙げられる。神経膠腫がん幹細胞マーカーとして、A20、ABCG2、CX3CL1、CX3CR1、CXCR4、HIF-2アルファ、インテグリンアルファ6、L1CAM、Musashi-1、c-Myc、ネスチン、ポドプラニンおよびIL6 Rアルファが挙げられる。頭頸部がん幹細胞マーカーとして、ABCG2、ALDH1A1、BMI-1およびCD44が挙げられる。白血病がん幹細胞マーカーとして、BMI-1、CD34、CD38、CD44、CD47、CD96、GLI-1、GLI-2、IL-3 Rアルファ、MICL、Musashi-2、SCF RおよびTIM-3が挙げられる。肝がん幹細胞マーカーとして、アルファ-フェトプロテイン、アミノペプチダーゼN、CD90およびNF2が挙げられる。肺がん幹細胞マーカーとして、ABCG2、ALDH1A1、CD90、EpCAMおよびSCF Rが挙げられる。メラノーマがん幹細胞マーカーとして、ABCB5、ABCG2、ALCAM、MS4A1、ネスチンおよびNGF Rが挙げられる。骨髄腫がん幹細胞マーカーとして、CD19、CD27、CD38、MS4A1およびシンデカンが挙げられる。骨肉種がん幹細胞マーカーとして、ABCG2、ネスチンおよびSTRO-1が挙げられる。卵巣がん幹細胞マーカーとして、アルファ-メチルアシル-CoAラセマーゼ、CD44およびSCF Rが挙げられる。膵臓がん幹細胞マーカーとして、BMI-1 CD24、CD44、CXCR4およびEpCAMが挙げられる。前立腺がん幹細胞マーカーとして、ABCG2、アルファ-メチルアシル-CoAラセマーゼ、BMI-1、CD44 and c-Mycが挙げられる。特定の好ましい実施態様において、がん幹細胞マーカーとして、CAIX、EpCAM、ALDH1A3、CD44、ESAおよびCD133が挙げられる。
【００１７】
「上皮-間葉転移」（EMT）は、細胞接着の喪失、E-カドヘリン発現の抑制および細胞運動性の増加を特徴とするプロセスである。EMTは、CSC遊走および浸潤を促進し、CSCの播種および転移を可能にする。
【００１８】
「上皮-間葉転移バイオマーカー」（EMTバイオマーカー）または「EMTマーカー」は、そのレベルが上皮-間葉転移中に変化する分子（たとえば、遺伝子、mRNAsまたはタンパク質）を指す。EMTマーカーは、間葉マーカーまたは上皮マーカーであってもよい。
【００１９】
「間葉バイオマーカー」または「間葉マーカー」は、他のタイプの細胞（たとえば、上皮細胞）と比較して、間葉細胞に差別的に存在し、そのレベルがEMT中に増加する分子（たとえば、遺伝子、mRNAsまたはタンパク質）を指す。好ましい間葉マーカーとして、平滑筋アクチン、Snail-1、Snail-2（スラッグ）、Wnt5B、グースコイド、Zeb2、FoxC2およびp23が挙げられる。さらなる間葉マーカーとして、ツイスト、TGF-ベータ1、オステオポンチン、タイプIコラーゲン、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）2,MMP-3、MMP-9およびSox10が挙げられる。「上皮バイオマーカー」または「上皮マーカー」は、他のタイプの細胞（たとえば、間葉細胞）と比較して、上皮細胞に差別的に存在し、そのレベルがEMT中に減少する分子（たとえば、遺伝子、mRNAsまたはタンパク質）を指す。好ましい上皮マーカーとして、E-カドヘリンおよびデスモプラキンが挙げられる。さらなる上皮マーカーとして、β-カテニン、サイトケラチン、デスモコリン、デスモグレイン、クラウジンおよびオクルジンが挙げられる。
【００２０】
「幹細胞性」は、未分化細胞としてそれら自体を再生するが、分化する能力を依然として保持している、未分化細胞の能力である。
【００２１】
「幹細胞性バイオマーカー」または「幹細胞性マーカー」は、未分化細胞の幹細胞性を維持するのに必要な分子（たとえば、遺伝子、mRNAsまたはタンパク質）を指す。
【００２２】
好ましい幹細胞性マーカーとして、Notch 1およびJagged 1が挙げられる。さらなる幹細胞性マーカーとして、Oct 4、Sox2およびNanogが挙げられる。「mTOR複合体1」（mTORC1）は、ラパマイシン（mTOR）の哺乳類標的である二つの別個の複合体の一つである。mTORC1は、mTOR、Raptor、GβL（mLST8）、PRAS40およびDeptorからなり、ラパマイシンによって部分的に阻害される。mTORC1は、条件が好都合である場合の細胞増殖、またはストレス中もしくは条件が好都合でない場合のの異化プロセスのいずれかを促進するための増殖因子、栄養素またはエネルギーのアベイラビリティを反映する複数のシグナルを統合する。増殖因子およびホルモン（たとえば、インスリン）は、Aktを介してmTORC1にシグナルを送り、TSC2を不活化してmTORC1の阻害を妨げる。あるいは、低ATPレベルは、TSC2のAMPK-従属性活性化をもたらして、シグナル伝達を減少させる。アミノ酸アベイラビリティは、Ragタンパク質に関与する経路を介してmTORC1にシグナル伝達される。活性mTORC1は、下流標的（4EBP1およびp70 S6キナーゼ）のリン酸化を介するmRNAの翻訳、自食作用の抑制、リボソーム生合成およびミトコンドリア代謝または脂質生成をもたらす転写の活性化などの多くの下流生物学的効果を有する。
【００２３】
「mTORC1バイオマーカー」または「mTORC1マーカー」は、mTORC1シグナル伝達経路の構成要素であるか、または該要素をコードする遺伝子もしくはmRNAである。好ましいmTORC1マーカーとして、mTOR、Raptor、4EBP1およびTSC2が挙げられる。さらなるmTORC1マーカーとして、PRAS40、ATG13およびp70 S6キナーゼ（p70S6K）が挙げられる。「ケモカイン」は、近隣の応答性細胞において方向性のある走化性を誘発する能力がある小さいサイトカイン（細胞によって分泌され、細胞間コミュニケーションにおいて広範囲に用いられる小さいシグナル伝達タンパク質）のファミリーを指す。それらは、サイズが小さく（約8-10 KD）、その三次元形状を形成するのに重要な保存された位置において2〜6個のシステイン残基を有する。
【００２４】
「ケモカインバイオマーカー」または「ケモカインマーカー」は、ケモカインまたは該ケモカインをコードする遺伝子もしくはmRNAを指す。好ましいケモカインマーカーとして、RANTES（CCL5）、PIGF、G-CSF、CXCR3およびCXCL10が挙げられる。さらなるケモカインマーカーとして、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9（CCL10と同じ）、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、XCR1、XCL1、XCL2,CX3CR1およびCX3CL1が挙げられる。
【００２５】
CSCを検出する方法
一つの態様において、本開示は、異なるタイプのマーカーの組合せを用いる、細胞の集団中のがん幹細胞の存在を検出する方法を提供する。該方法は、（a）異なるタイプのマーカーのレベルを測定すること、および（b）このようなレベルを基準レベルと比較し、それによって、細胞の集団中のがん幹細胞の存在または不在を決定することを含む。がん幹細胞は、マーカーの対応する基準レベルと比較して、がん幹細胞マーカー、間葉マーカー、幹細胞性マーカー、mTORC1マーカーおよび／またはケモカインマーカーのレベルが統計的に有意に増加する場合、あるいは上皮マーカーのレベルが統計的に有意に減少する場合に検出される。
【００２６】
本明細書に開示する方法において用いることができる異なるタイプのマーカーとして、以下のものが挙げられる：（1）がん幹細胞マーカー、（2）間葉マーカーおよび上皮マーカーなどのEMTマーカー、（3）幹細胞性マーカー、（4）mTORC1マーカー、および（5）ケモカインマーカー。
【００２７】
本開示の方法は、2種以上の異なるタイプのマーカーからのマーカーを用いることができる。好ましくは、該方法は、本明細書において提供する3、4または5種の異なるタイプのマーカーからのマーカーを用いる。
【００２８】
本開示の方法において用いるマーカーの総数は、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24または少なくとも25種であってもよい。
【００２９】
特定の実施態様において、本開示の方法において用いるマーカーは、（1）がん幹細胞マーカー：CAIX、EpCAM、ALDH1A3、CD44、ESAおよびCD133；（2）間葉マーカー：平滑筋アクチン、Snail-1、Smail-2、Wnt5B、グースコイド、Zeb2、FoxC2およびp23；および上皮マーカー：E-カドヘリンおよびデスモプラキン；（3）幹細胞性マーカー：Notch 1およびJagged 1；（4）mTORC1マーカー：mTOR、Raptor、4EBP1およびTSC2；ならびに（5）ケモカインマーカー：RANTES、PIGF、G-CSF、CXCR3およびCXCL10から選ばれる、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24または少なくとも25種のマーカーであってもよい。
【００３０】
たとえば、方法は、それぞれが、他の2種のマーカーのタイプとは異なるタイプである少なくとも3種の異なるマーカーを用いてもよい。方法は、それぞれが、他の3種のマーカーのタイプとは異なるタイプである少なくとも4種の異なるマーカーを用いてもよい。方法は、それぞれが、他の4種のマーカーのタイプとは異なるタイプである少なくとも5種の異なるマーカーを用いてもよい。マーカーが、（1）がん幹細胞マーカー：CAIX、EpCAM、ALDH1A3、CD44、ESAおよびCD133；（2）間葉マーカー：平滑筋アクチン、Snail-1、Smail-2、Wnt5B、グースコイド、Zeb2、FoxC2およびp23；および上皮マーカー：E-カドヘリンおよびデスモプラキン；（3）幹細胞性マーカー：Notch 1およびJagged 1；（4）mTORC1マーカー：mTOR、Raptor、4EBP1およびTSC2；ならびに（5）ケモカインマーカー：RANTES、PIGF、G-CSF、CXCR3およびCXCL10から選ばれるのが好ましい。
【００３１】
本明細書に開示の方法にしたがって測定されたマーカーのレベルは、マーカーの発現レベルまたは該マーカーの修飾のレベルである。発現レベルは、マーカーの遺伝子転写発現レベルまたはマーカーのタンパク質発現レベルであってもよい。マーカー（タンパク質）の修飾レベルは、マーカー（タンパク質）のリン酸化、グリコシル化、ニトロシル化、シトルリン化またはタンパク質分解処理のレベルであってもよい。
【００３２】
マーカーの遺伝子転写発現レベルは、対象の細胞中のマーカー（タンパク質）をコードするmRNAの量である。このような量は、逆転写PCR（RT-PCR）もしくはリアルタイムRT-PCR、cDNAアレイ、オリゴヌクレオチドアレイまたはノーザンブロットハイブリダイゼーションなどの当技術分野で周知の様々な技術によって測定することができる。遺伝子転写発現レベルを測定するための技術の例は、本開示の実施例においても提供される。
【００３３】
マーカーのタンパク質発現レベルは、対象の細胞中のマーカー（タンパク質）または対象の細胞によって分泌されたマーカー（タンパク質）の量である。対象の細胞によって分泌されたマーカー（タンパク質）の量は、対象の細胞を得る被験者の血清中のマーカー（タンパク質）の量を測定することによって決定することができる。タンパク質発現レベルは、ウエスタンブロット分析、ELISA、免疫組織化学分析および質量分析などの当技術分野で周知の様々な技術によって測定されてもよい。タンパク質発現レベルを測定するための技術の例は、本開示の実施例においても提供される。
【００３４】
マーカーのリン酸化レベルは、対象の細胞中でリン酸化されたマーカー（タンパク質）の量、比率または程度である。このようなレベルは、ウエスタンブロット分析および電気泳動およびP32標識タンパク質のX線撮影aなどの当技術分野で周知の様々な技術によって測定されてもよい。タンパク質リン酸化レベルを測定するための技術の例は、本開示の実施例においても提供される。
【００３５】
本明細書に開示する方法を用いて、がん細胞を含む疑いのあるいずれかの細胞集団中のCSCを検出することができる。このような細胞は、インビトロ培養細胞であってもよく、あるいは、組織生検、針生検、血液、リンパ液、骨髄などの動物（たとえば、非ヒト哺乳動物およびヒト）から切除または採取された生体サンプル由来であってもよい。特定の実施態様において、、1種以上の分泌されたケモカインマーカーのレベルを決定するために、がん組織生検以外のサンプル（たとえば、血液または血清）はがんに罹患しているか、またはがんに罹患する疑いのある被験者から得てもよい。特定の好ましい実施態様において、対象の細胞集団は、低酸素腫瘍または悪性腫瘍由来であり、その1つ以上の部分は、酸素濃度が、健康な組織よりも有意に低い（たとえば、90-95%低い）領域にある。本明細書に開示の方法を用いて、乳房、膀胱、脳、結腸、胃、肝臓、頭頸部、肺、卵巣、骨肉腫、膵臓、前立腺、腎臓、黒色腫および多発性骨髄腫、白血病およびリンパ腫CSCなどの異なるタイプのCSCを検出することができる。異なるタイプのCSCは、異なるCSCマーカーを有することができるので、当業者は、特定のタイプのCSCを検出するための適切なCSCマーカーを選択することができる。様々なタイプのがんに対するCSCマーカーの例は上記のとおりである。
【００３６】
対象のマーカーのレベルを測定した後、これらのレベルを、測定した各マーカーの基準レベルと比較する。マーカーの基準レベルは、好ましくは同じ組織由来の正常細胞または非腫瘍形成性がん細胞などの基準細胞中のマーカーのレベルであってもよい。正常細胞または非腫瘍形成性がん細胞は、対象の細胞集団を得る同じ被験者由来であってもよい。あるいは、これらの細胞は、別の被験者または被験者グループ由来であってもよい。他の被験者または被験者グループは、試験を受ける被験者と1つ以上のがんに関連する特徴を共有するのが好ましい（たとえば、同じタイプまたはサブタイプのがん、同じまたは類似の腫瘍悪性度）。
【００３７】
細胞集団中のCSCの存在は、測定した各マーカーのレベルと各マーカーの基準レベルとの間の差異を決定することによって検出することができる。もし、がん幹細胞マーカー、間葉マーカー、幹細胞性マーカー、mTORC1マーカーおよび／またはケモカインマーカーのレベルにおいて、これらのマーカーの対応する基準レベルと比較して統計的に有意な増加、あるいは上皮マーカーのレベルにおいて、このマーカーの対応する基準レベルと比較して統計的に有意な減少があるならば、がん幹細胞が、細胞集団中に検出される。たとえば、特定の実施態様において、以下の異なるタイプのマーカーの3種から選ばれる3種のマーカーを用いて、CSCを検出する：（1）CSCマーカー、（2）間葉マーカー、（3）幹細胞性マーカー、（4）mTORC1マーカーおよび（5）ケモカインマーカー。このような実施態様において、もし、測定された3種のマーカーのすべてのレベルにおいて、統計的に有意な増加があるならば、CSCが検出される。特定の他の実施態様において、上皮マーカーならびに5種の異なるタイプの他のマーカーのうちの2種から選ばれた2種のマーカーを用いて、CSCを検出する。このような実施態様において、もし、上皮マーカーのレベルにおいて、統計的に有意な減少があり、他の2種のマーカーのレベルにおいて、統計的に有意な増加があるならば、CSCが検出される。
【００３８】
もし、測定されたマーカーの少なくとも60%、70%、80%または90%が、以下の記載を満たすならば、CSCを検出することができる：（1）CSCマーカーのレベルが、基準レベルと比較して、統計的に有意に増加する、（2）間葉マーカーのレベルが、基準レベルと比較して、統計的に有意に増加する、（3）幹細胞性マーカーのレベルが、基準レベルと比較して、統計的に有意に増加する、（4）mTORC1マーカーのレベルが、基準レベルと比較して、統計的に有意に増加する、（5）ケモカインマーカーのレベルが、基準レベルと比較して、統計的に有意に増加する、および（6）上皮マーカーのレベルが、基準レベルと比較して、統計的に有意に減少する。たとえば、特定の実施態様において、5種のマーカーのうち3種または4種のマーカーが、上記記載を満たす。
【００３９】
CSCのCSCマーカー、間葉マーカー、幹細胞性マーカー、mTORC1マーカーおよび／またはケモカインマーカーのレベルは、基準細胞のレベルの少なくとも2X、少なくとも3X、少なくとも4Xまたは少なくとも5Xであってよい。CSCの上皮マーカーのレベルは、基準細胞のレベルの多くとも50%、多くとも40%、多くとも30%、多くとも20%、多くとも10%、多くとも5%または多くとも1%であってよい。
【００４０】
本明細書に開示の方法を用いて、CSCマーカー、間葉マーカー、幹細胞性マーカー、mTORC1マーカーおよび／またはケモカインマーカーのレベルにおいて、これらのマーカーの対応する基準レベルと比較した場合の増加の量、あるいは上皮マーカーのレベルにおいて、このマーカーの対応する基準レベルと比較した場合の減少の量に基づいて、細胞集団中のCSCの量を定量することができる。
【００４１】
CSCを検出する方法を用いて、腫瘍転移のリスクを評価することができる。たとえば、試験細胞集団のCSCマーカー、間葉マーカー、幹細胞性マーカー、mTORC1マーカーおよび／またはケモカインマーカーのレベルにおける増加の量、および／または上皮マーカーのレベルにおける減少の量を、高、中または低転能を有する既知の細胞集団のものと比較することができる。あるいは、試験細胞集団のCSCマーカー、間葉マーカー、幹細胞性マーカー、mTORC1マーカー、ケモカインマーカーおよび／または上皮マーカーのレベルを、高、中または低転能を有する既知の細胞集団のレベルと直接比較してもよい。このような比較は、試験細胞集団を得るがんの転移のリスクを決定するのに役立つ。たとえば、もし、試験集団のマーカーのレベルが、中または低転移能を有する既知の細胞集団よりも、高転移能を有する既知の細胞集団に近いならば、試験集団は、高転移性である可能性が高い。
【００４２】
「高転移能」は、遠隔転移または複数の部位もしくは臓器への転移を形成する傾向を指す。高転移能を有する細胞株の例は、4T1細胞株である。
【００４３】
「中転移能」は、局所的、組織もしくは臓器特異的転移を形成する傾向を指す。中転移能を有する細胞株の例は、66c14細胞株である。
【００４４】
「低転移能」は、転移の傾向が低いかまたは無いことを指す。低転移能を有する細胞株の例は、NR67細胞株である。
【００４５】
CSCの存在を検出する方法を、がん診断または予後において用いることもできる。たとえば、このような方法を用いて、腫瘍悪性度もしくは腫瘍サブタイプを決定するか、または腫瘍再発の可能性を予測することができる。さらに、本明細書に開示の方法を用いて、異なる時点で被験者から得た生体サンプル中のCSCを検出および／または定量することによって、被験者におけるがんの進行をモニターまたは予測することができる。
【００４６】
薬物候補を同定または確認する方法
もう一つの態様において、本開示は、推定的がん療法を同定または確認する方法を提供する。該方法は、（a）がん細胞を推定的がん療法に曝露して、処置されたがん細胞を得ること、（b）異なるタイプのマーカーのレベルを測定すること、および（c）このようなレベルを基準レベルと比較すること、それによって推定的がん療法を同定または確認することを含む。推定的がん療法は、もしがん細胞を推定的がん療法に曝露したにも、がん幹細胞マーカー、間葉マーカー、幹細胞性マーカー、mTORC1マーカーおよび／またはケモカインマーカーのレベルにおいて、これらのマーカーの対応する基準レベルと比較して、統計的に有意な減少、および／または上皮マーカーのレベルにおいて、このマーカーの対応する基準レベルと比較して、統計的に有意な増加があるならば、同定または確認される。
【００４７】
推定的がん療法に曝露されるがん細胞は、がん細胞から誘導された細胞株のがん細胞などのインビトロで培養されたであってもよい。好ましいインビトロ培養がん細胞は、マウス乳がん細胞株4T1の細胞などの腫瘍スフェアを形成する能力がある細胞である。がん薬物候補を同定または確認するのに有用なさらなるがん細胞株として、マウス乳がん細胞株66cl4およびヒト細胞株MDA-MB-231、MDA-231 LM2-4 MDA-MB-468、HT29、HeLaおよびA549が挙げられる。67NR/hCAIX細胞などのCAIXを過剰発現しているマウス乳がん細胞を用いてもよい。
【００４８】
推定的がん療法へのインビトロで培養されたがん細胞の曝露は、推定的がん療法の存在下で細胞を培養またはインキュベートすることなどのがん細胞を推定的がん療法に接触させるためのいずれかの方法によって行うことができる。特定の好ましい実施態様において、細胞は、低酸素状態において培養される。この文脈で用いる「低酸素状態」は、酸素含量が低下しているを有する雰囲気を指す（すなわち、1%の酸素などの2%以下の酸素）。
【００４９】
推定的がん療法に曝露されるがん細胞は、がんを有する被験者（非ヒト哺乳動物およびヒトなど）のがん細胞であってもよい。がん細胞の推定的がん療法への曝露は、がん細胞に推定的療法を局所的に投与すること、または被験者に推定的療法を全身的に投与することによって行うことができる。
【００５０】
マーカーの異なるタイプ、各タイプの例示的マーカー、マーカーの様々な組合せ、CSCの存在を検出する方法と組み合わせた上述のマーカーの様々なレベルを測定するための技術はまた、推定的がん療法を同定または確認するための方法にも適用されうる。
【００５１】
推定的がん療法で処置された細胞のマーカーのレベルを測定した後、これらのレベルを、測定した各マーカーの基準レベルと比較する。インビトロで培養されたがん細胞にとって、マーカーの基準レベルは、処置されたがん細胞と同じ細胞株の非処置で培養されたがん細胞のマーカーのレベルであってもよい。たとえば、推定的がん療法で処置されずに培養された4T1細胞の特定のマーカー（たとえば、EpCAM）のレベルを、推定的がん療法で処置された後に培養された4T1細胞のこの特定のマーカーのレベルと比較するための基準レベルとして用いてもよい。
【００５２】
がんに罹患している被験者からのがん細胞にとって、マーカーの基準レベルは、処置されたがん細胞と同じがん組織からのがん細胞であるが、被験者を推定的がん療法で処置する前に得られたがん細胞のマーカーのレベルであってもよい。たとえば、推定的がん療法で処置する前の患者からの乳がん細胞の特定のマーカー（たとえば、EpCAM）のレベルを、推定的がん療法で処置された後の同じ患者からの乳がん細胞のこの特定のマーカーのレベルと比較するための基準レベルとして用いてもよい。
【００５３】
あるいは、マーカーの基準レベルは、処置されたがん細胞と同じ組織タイプからのがん細胞であるが、推定的がん療法で処置しなかったもう1人の被験者または被験者のグループから得られたがん細胞のマーカーのレベルであってもよい。他の被験者または被験者のグループが、推定的がん療法で処置された被験者と、1つ以上の一般的ながんに関連する特徴（たとえば、同じタイプまたはサブタイプのがん、同じまたは類似の腫瘍悪性度）を共有するのが好ましい。
【００５４】
推定的がん療法は、測定された各マーカーと各マーカーの基準レベルの間の差異を決定することによって同定または確認することができる。もし、がん幹細胞マーカー、間葉マーカー、幹細胞性マーカー、mTORC1マーカーおよび／またはケモカインマーカーのレベルにおいて、これらのマーカーの対応する基準レベル（たとえば、推定的がん療法による処置無しの、または処置前のがん細胞のレベル）と比較して統計的に有意な減少、あるいは上皮マーカーのレベルにおいて、このマーカーの対応する基準レベル（たとえば、推定的がん療法による処置無しの、または処置前のがん細胞のレベル）と比較して統計的に有意な増加があるならば、推定的がん療法を同定または確認することができる。たとえば、特定の実施態様において、以下の異なるタイプのマーカーの3種から選ばれる3種のマーカーを用いて、CSCを検出する：（1）CSCマーカー、（2）間葉マーカー、（3）幹細胞性マーカー、（4）mTORC1マーカーおよび（5）ケモカインマーカー。このような実施態様において、もし、推定的がん療法で処置されたがん細胞中（in/of）の測定された3種のマーカーのすべてのレベルにおいて、統計的に有意な増加があるならば、推定的がん療法を同定または確認することができる。特定の他の実施態様において、上皮マーカーならびに5種の異なるタイプの他のマーカーのうちの2種から選ばれた2種のマーカーを用いて、推定的がん療法を同定または確認する。このような実施態様において、もし、推定的がん療法で処置されたがん細胞中（in/of）の上皮マーカーのレベルにおいて、統計的に有意な増加があり、他の2種のマーカーのレベルにおいて、統計的に有意な減少があるならば、推定的がん療法が同定または確認される。
【００５５】
もし、測定されたマーカーの少なくとも60%、70%、80%または90%が、以下の記載を満たすならば、推定的がん療法を同定または確認することができる：（1）CSCマーカーのレベルが、基準レベルと比較して、統計的に有意に減少する、（2）間葉マーカーのレベルが、基準レベルと比較して、統計的に有意に減少する、（3）幹細胞性マーカーのレベルが、基準レベルと比較して、統計的に有意に減少する、（4）mTORC1マーカーのレベルが、基準レベルと比較して、統計的に有意に減少する、（5）ケモカインマーカーのレベルが、基準レベルと比較して、統計的に有意に減少する、および（6）上皮マーカーのレベルが、基準レベルと比較して、統計的に有意に増加する。たとえば、特定の実施態様において、5種のマーカーのうち3種または4種のマーカーが、上記記載を満たす。
【００５６】
同定または確認されたがん療法で処置されたがん細胞のCSCマーカー、間葉マーカー、幹細胞性マーカー、mTORC1マーカーおよび／またはケモカインマーカーのレベルは、該がん療法で処置されなかった同じ組織由来のがん細胞のそれらのレベルの多くとも50%、多くとも40%、多くとも30%、多くとも20%、多くとも10%、多くとも5%または多くとも1%であってよい。同定または確認されたがん療法で処置されたがん細胞の上皮マーカーのレベルは、該がん療法で処置されなかった同じ組織由来のがん細胞のそのレベルの少なくとも2X、少なくとも3X、少なくとも4Xまたは少なくとも5Xであってよい。
【００５７】
本明細書に開示の方法を用いて、推定的がん療法を同定または確認することができる。推定的がん療法の例として、小分子、抗体、その抗原結合フラグメント、ポリペプチド、ペプチド、ホルモンおよび核酸（たとえば、アンチセンスポリヌクレオチドならびにsiRNA、miRNAおよびshRNAなどの低分子干渉RNA）が挙げられる。可能性がある治療剤を、化合物、組成物または分子のライブラリーまたはコレクションから同定してもよい。
【００５８】
本明細書に開示するように、本開示は、本発明者らによる以下の発見に一部に基づいている：上皮-間葉転移（EMT）マーカーおよび調節因子の発現、幹細胞性マーカーの発現、および低酸素状態におけるがん幹細胞の拡張には、CAIXが必要である；CAIXは、mTORC1シグナル伝達経路の上流にある；および低酸素状態におけるがん幹細胞によるケモカインの分泌には、CAIXが必要である。したがって、本明細書に開示のマーカーは、がん療法としてのCAIXインヒビターの同定または確認において特に有用である。
【００５９】
がん療法として同定することができるCAIXインヒビターとして、CAIX特異的抗体、CAIX特異的抗体の抗原結合フラグメント、CAIX特異的抗体の抗原結合フラグメントを含む融合タンパク質、小分子CAIXインヒビター、アンチセンスポリヌクレオチド、およびCAIX遺伝子の発現を干渉、低減化または除去する低分子干渉RNA（たとえば、siRNA、miRNAおよびshRNA）が挙げられる。小分子CAIXインヒビターの例として、WO 2012/021963および国際出願番号PCT/IB2011/055312に記載のものが挙げられる。
【００６０】
関連する態様において、本明細書に開示の推定的がん療法を同定または確認する方法を用いて、がん治療計画の有効性を評価することができる。治療計画中または治療後に、本明細書に開示するように、患者からのがん細胞のバイオマーカーのレベルにおける変化をモニターすることによって、がん治療計画が特定の患者において有効であるかどうかを決定することができる。次いで、このような決定は、該治療計画を継続するか、または繰り返すかどうかにおける意思決定を導く。
【００６１】
がんを治療する方法
もう一つの態様において、本開示は、（a）本明細書に開示のバイオマーカーおよび方法を用いて、患者からのサンプル中のCSCの存在を検出すること；および（b）もし、がんサンプル中にCSCが検出されるならば、患者に有効量のCAIXインヒビターを投与すること；を含むがんを治療する方法を提供する。
【００６２】
関連する態様において、本開示は、本明細書に開示のバイオマーカーおよび方法を用いてCSCを有すると診断されたがん患者に有効量のCAIXインヒビターを投与することを含むがんを治療する方法を提供する。
【００６３】
当業者によって理解されるように、用語「治療する」および「治療」は、被験者（すなわち、患者）の疾患、障害または状態の医療的管理を指す（ステッドマン医学大辞典を参照）。「がんを治療する」は、がんの症状の数を減少させること、一つ以上の症状の重篤度を低減化させること、またはがんの進行を遅延化させることを指す。
【００６４】
本明細書に開示の方法を用いて治療されうるがん患者は、CAIXインヒビターを用いる治療以外のがん治療を受けているが、がん治療がその患者のすべてのがん幹細胞を排除していない患者であってもよい。CSCを特異的に対象とするCAIXインヒビターでこのような患者を治療することは、より有効であり、がん再発または転移のリスクを防止または低減化する。
【００６５】
CSCが本明細書に開示のバイオマーカーおよび方法を用いて検出されうる、任意のタイプのがんは、CAIXインヒビターを用いて治療することができ、そのようながんとして、乳がん、膀胱がん、脳がん、結腸がん、胃がん、肝臓がん、頭頸部がん、肺がん、卵巣がん、骨肉腫、膵臓がん、前立腺がん、腎臓がん、黒色腫および多発性骨髄腫、白血病およびリンパ腫が挙げられる。
【００６６】
がん療法として同定されるCAIXインヒビターとして、CAIX特異的抗体、CAIX特異的抗体の抗原結合フラグメント、CAIX特異的抗体の抗原結合フラグメントを含む融合タンパク質、小分子CAIXインヒビター、アンチセンスポリヌクレオチド、およびCAIX遺伝子の発現を干渉、低減化または除去する低分子干渉RNA（たとえば、siRNA、miRNAおよびshRNA）が挙げられる。小分子CAIXインヒビターの例として、WO 2012/021963および国際出願番号PCT/IB2011/055312に記載のものが挙げられる。CAIXに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体の例は、米国特許No. 7,378,091に開示される。CAIXインヒビターのさらなる例として、米国特許公開公報No. 2004/0146955および2008/0095707に開示されるものが挙げられる。CAIXインヒビターの特定の例はまた、本開示の実施例に開示される。
【００６７】
CAIXインヒビターまたはCAIXインヒビターを含む医薬組成物は、経口、局所、経皮、非経口、吸入スプレーにより、経膣、経直腸、または頭蓋内注射によって、あるいはそれらのいずれかの組合せで、投与することができる。いくつかの実施態様において、CAIXインヒビターまたはCAIXインヒビターを含む医薬組成物は、皮下、静脈内、筋肉内または槽内注射を介して、あるいは輸液技術を介してなどの非経口で投与される。
【００６８】
CAIXインヒビターまたはCAIXインヒビターを含む医薬組成物は、治療有効用量で、本明細書に開示の方法にしたがって、CSCを有すると診断された患者に投与される。特定の治療剤の「治療有効用量」は、統計的に有意に、がんの一つ以上の症状の重篤度の低減化、除去または発症もしくは再発の遅延化をもたらすのに十分な治療剤の量を指す。このような用量は、特定の治療剤または医薬組成物、投与経路、患者の状態、すなわち、疾患の病期、疾患によって引き起こされた症状の重篤度、一般的な健康状態、および年齢、性別および体重、ならびに医療当業者には明らかな他の因子などの様々な因子に応じて決定または調整することができる。同様に、疾患または障害を治療するための治療薬の用量は、医療当業者によって理解されるパラメーターにしたがって決定することができる。
最適用量は、一般に、実験モデルおよび／または臨床試験を用いて決定することができる。CAIXインヒビターの最適用量は、被験者の体質量（body mass）、体重または血液量に応じて変わる。たとえば、0.01 mg/kg〜1000 mg/kg（たとえば、約0.１〜1 mg/kg、約１〜10 mg/kg、約10-50 mg/kg、約50-100 mg/kg、約100-500 mg/kgまたは約500-1000 mg/kg）体重の量のCAIXインヒビターを投与することができる（単回用量として、1日1回、週1回、月１回または任意の適切な間隔で投与することができる）。
【００６９】
がんの治療に有用な第二の薬剤との併用でのCAIXインヒビターまたはCAIXインヒビターを含む医薬組成物の投与も企図される。第二の薬剤の例として、生物学的薬剤（たとえば、抗EGFR抗体）、化学療法剤（たとえば、タキサン、プラチナ製剤、フルオロピリミジン、シクロホスファミド、アルキル化剤、有糸分裂インヒビター、抗生物質、代謝拮抗剤および血管新生阻害剤）および放射線療法剤が挙げられる。好ましい実施態様において、第二のがん治療薬は、パクリタキセルである。
【００７０】
特定の実施態様において、CAIXインヒビターおよび第二のがん治療薬を、同じ製剤で同時に投与してもよい。あるいは、第二のがん治療薬を別々の製剤で同時に（すなわち、一方の投与から1時間以内に）投与してもよい。
【００７１】
特定の実施態様において、第二のがん治療薬を、CAIXインヒビターの投与前（すなわち、CAIXインヒビターによる処置の少なくとも１時間前）に投与してもよい。CAIXインヒビターの投与後（すなわち、CAIXインヒビターの投与の少なくとも1時間後）に、第二のがん治療薬を投与することも企図される。
【００７２】
キット
一つの態様において、本開示は、本明細書に開示するバイオマーカーに対して特異的結合親和性を有するタンパク質結合分子を含むキットを提供する。
【００７３】
特定の実施態様において、キットは、以下の異なるタイプのマーカーの2、3、4または5種に対して特異的結合親和性を有するタンパク質結合分子を含む：（1）がん幹細胞マーカー、（2）間葉マーカーおよび上皮マーカーなどのEMTマーカー、（3）幹細胞性マーカー、（4）mTORC1マーカーおよび（5）ケモカインマーカー。キットが、本明細書において提供するマーカーの3、4または5種に対して特異的結合親和性を有するタンパク質結合分子を含むのが好ましい。
【００７４】
本開示のキットに包含される、それに対して特異的結合親和性を有するタンパク質結合分子のためのマーカーの総数は、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24または少なくとも25種であってもよい。
【００７５】
特定の実施態様において、本開示のキットに包含される特異的結合親和性を有するタンパク質結合分子のためのマーカーは、（1）がん幹細胞マーカー：CAIX、EpCAM、ALDH1A3、CD44、ESAおよびCD133；（2）間葉マーカー：平滑筋アクチン、Snail-1、Smail-2、Wnt5B、グースコイド、Zeb2、FoxC2およびp23；および上皮マーカー：E-カドヘリンおよびデスモプラキン；（3）幹細胞性マーカー：Notch 1およびJagged 1；（4）mTORC1マーカー：mTOR、Raptor、4EBP1およびTSC2；ならびに（5）ケモカインマーカー：RANTES、PIGF、G-CSF、CXCR3およびCXCL10から選ばれる、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24または少なくとも25種のマーカーであってもよい。
【００７６】
たとえば、キットは、それぞれが、他の2種のマーカーのタイプとは異なるタイプである少なくとも3種の異なるマーカーに対して特異的結合親和性を有するタンパク質結合分子を含んでもよい。キットは、それぞれが、他の3種のマーカーのタイプとは異なるタイプである少なくとも4種の異なるマーカーに対して特異的結合親和性を有するタンパク質結合分子を含んでもよい。それぞれが、他の4種のマーカーのタイプとは異なるタイプである少なくとも5種の異なるマーカーに対して特異的結合親和性を有するタンパク質結合分子を含んでもよい。マーカーが、（1）がん幹細胞マーカー：CAIX、EpCAM、ALDH1A3、CD44、ESAおよびCD133；（2）間葉マーカー：平滑筋アクチン、Snail-1、Smail-2、Wnt5B、グースコイド、Zeb2、FoxC2およびp23；および上皮マーカー：E-カドヘリンおよびデスモプラキン；（3）幹細胞性マーカー：Notch 1およびJagged 1；（4）mTORC1マーカー：mTOR、Raptor、4EBP1およびTSC2；ならびに（5）ケモカインマーカー：RANTES、PIGF、G-CSF、CXCR3およびCXCL10から選ばれるのが好ましい。
【００７７】
「特異的に結合する」または「特異的結合」は、対象のバイオマーカータンパク質を認識し結合するが、対象のバイオマーカータンパク質を含むサンプル中に存在する他の分子を実質的に認識せず結合しない化合物、抗体または抗体の抗原結合フラグメントを指す。
【００７８】
特定の実施態様において、キットは、タンパク質結合分子が結合するアレイまたはマイクロアレイを含む。
【００７９】
「アレイ」は、基質上で位置的に異なる場所にある作用剤（タンパク質、抗体、核酸またはオリゴヌクレオチド）の配列を指す。いくつかの場合、アレイ上の作用剤は、アレイ上のの場所からその作用剤が何であるかを決定することができるように空間的に符号化される。「マイクロアレイ」は、一般に、基質上に作用剤と形成された複合体を検出するための顕微鏡的検出の使用が、検出するために必要であるアレイを指す。アレイ上の「場所」は、隣接した場所から区別できるように各々がそれぞれ決定された、作用剤を含むアレイ表面上の局所領域を指す。典型的に、各場所は、一つのタイプの作用剤を包含するが、このことは、必須ではない。
【００８０】
関連する態様において、本開示は、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／または本明細書に開示のバイオマーカーに対して特異的なプローブを含むキットを提供する。
【００８１】
もし、それが、バイオマーカーである核酸を含むサンプル中の他の核酸に実質的にハイブリダイズすることなく、バイオマーカーである核酸またはその相補体に対して特異的にハイブリダイズするならば、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブは、バイオマーカーである核酸に対して特異的である。
【００８２】
特定の実施態様において、キットは、以下の異なるタイプのマーカーの2、3、4または5種に対するオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを含む：（1）がん幹細胞マーカー、（2）間葉マーカーおよび上皮マーカーなどのEMTマーカー、（3）幹細胞性マーカー、（4）mTORC1マーカーおよび（5）ケモカインマーカー。キットが、本明細書において提供するマーカーの3、4または5種に対するオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを含むのが好ましい。
【００８３】
本開示のキットに包含される、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブの総数は、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24または少なくとも25種であってもよい。
【００８４】
特定の実施態様において、本開示のキットに包含されるオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブのためのマーカーは、（1）がん幹細胞マーカー：CAIX、EpCAM、ALDH1A3、CD44、ESAおよびCD133；（2）間葉マーカー：平滑筋アクチン、Snail-1、Smail-2、Wnt5B、グースコイド、Zeb2、FoxC2およびp23；および上皮マーカー：E-カドヘリンおよびデスモプラキン；（3）幹細胞性マーカー：Notch 1およびJagged 1；（4）mTORC1マーカー：mTOR、Raptor、4EBP1およびTSC2；ならびに（5）ケモカインマーカー：RANTES、PIGF、G-CSF、CXCR3およびCXCL10から選ばれる、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24または少なくとも25種のマーカーであってもよい。
【００８５】
たとえば、キットは、それぞれが、他の2種のマーカーのタイプとは異なるタイプである少なくとも3種の異なるマーカーのためのオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブを含んでもよい。キットは、それぞれが、他の3種のマーカーのタイプとは異なるタイプである少なくとも4種の異なるマーカーのためのオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブを含んでもよい。それぞれが、他の4種のマーカーのタイプとは異なるタイプである少なくとも5種の異なるマーカーのためのオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブを含んでもよい。マーカーが、（1）がん幹細胞マーカー：CAIX、EpCAM、ALDH1A3、CD44、ESAおよびCD133；（2）間葉マーカー：平滑筋アクチン、Snail-1、Smail-2、Wnt5B、グースコイド、Zeb2、FoxC2およびp23；および上皮マーカー：E-カドヘリンおよびデスモプラキン；（3）幹細胞性マーカー：Notch 1およびJagged 1；（4）mTORC1マーカー：mTOR、Raptor、4EBP1およびTSC2；ならびに（5）ケモカインマーカー：RANTES、PIGF、G-CSF、CXCR3およびCXCL10から選ばれるのが好ましい。
【００８６】
特定の実施態様において、キットは、オリゴヌクレオチドプローブが結合するアレイまたはマイクロアレイを含む。
【００８７】
本明細書において提供するキットを用いて、生体サンプル中のバイオマーカーのレベルを検出または定量することができる。たとえば、タンパク質結合分子を含むキットを用いて、バイオマーカーのタンパク質発現レベルを測定することができる。バイオマーカー特異的プライマーまたはプローブを含むキットを用いて、バイオマーカーの遺伝子転写発現レベルを測定することができる。
バイオマーカー。
【００８８】
以下の実施例は、説明のためであり、限定するものではない。
【００８９】
実施例
略語：
CA（炭酸脱水酵素）；TS（腫瘍スフェア）；NS（ノンサイレンシング）；EMT（皮間葉移行）；FACS（蛍光活性化細胞分類）；EpCAM（上皮細胞接着分子）；RNAi（RNA干渉）；shRNA（短ヘアピンRNA）；shNS（短ヘアピンノンサイレンシング配列）；shCAIX（短ヘアピンCAIX特異的配列）；IF（免疫蛍光）。
【００９０】
材料および方法
１．細胞培養
マウス乳がん細胞株4T1を発現しているルシフェラーゼの収集、生成および培養は、記載されている（Lou、Preobrazhenskaら、2008）。以前の記載にしたがって（Ebos、Leeら、2009）、MDA-MB-231 LM2-4Luc+細胞株を、Dr. Robert Kerbel（University of Toronto、Canada）から豊富に提供を受け、培養した。加湿インキュベーター中、5% CO2下、37℃にてすべての細胞をインキュベートした（正常酸素状態）。
【００９１】
低酸素状態において培養するために、密閉された嫌気性ワークステーション内の加湿インキュベーター中、窒素でバランスさせた1% O2および5% CO2下、37℃にて細胞を維持した。以前の記載にしたがって（Lou、McDonaldら、2011）、4T1細胞中のマウスCAIXの安定した枯渇を行った。
【００９２】
２．腫瘍スフェア培養
5%ウシ胎児血清（FBS）（Sigma）を含んでいるDMEM（Gibco）中、週２回の継代培養によって、培養した4T1細胞を単層として増殖させた。続いて、製造業者の使用説明書にしたがって、Mammocult（商標）培地（StemCell Technologies、Vancouver、B.C.、カナダ）中、親のshNSおよびshCAIX 4T1を腫瘍スフェア（TS）として培養した（Lock、McDonaldら、2012）。別法として、攪拌培養によりTSを増殖させるために、以前の記載にしたがって（Oloumi、MacPhailら、2000）、5% CO2に予備平衡させたDMEM（5% FBS）中、37℃、150 RPMにて定速回転下、密封したガラススピナーフラスコ培養フラスコ（Bellco、バインランド、NJ）中、 2X105〜4X105細胞/mlにて、単層細胞をトリプシン処理し、単細胞懸濁液をインキュベートした。培養物を３週間増殖させた。培地は、3日毎に補充した。低酸素状態のために、スピナーフラスコに、窒素でバランスさせた5% O2および5% CO2を3日間連続的に通気した。
【００９３】
３．抗体
FACS抗体：ヒト EpCAM（CD326）-AlexaFluor 647（商標）（Biolegend、サンディエゴ、CA）；マウス-CD24-APC（Biolegend）；マウス/ヒト-CD44-PeCy7（eBioscience、サンディエゴ、CA）。
IHC抗体：ヒトCAIX（R&D systems AF2188）；ALDH1A3（# LS-C97464、Lifespan Biosciences）。
IF抗体：CD133-FITC（eBioscience、サンディエゴ、CA）；E-カドヘリン（BD Transduction labs # 610181）、マウスCAIX（R&D systems AF2344）；平滑筋アクチン（Sigma）；Snail（AbCam #ab17732）；
【００９４】
４．フローサイトメトリー分析および分離
4T1 TSをトリプシンとともにインキュベートし、HF緩衝液（2%ウシ胎児血清含有HBSS）で1回洗浄し、次いで、100μl HF中、0.3 μlの抗体／106細胞を用いて抗-CD24-APCおよび抗-CD44-PECy7で染色し、氷上にて10分間インキュベートした。インキュベーション後、HF緩衝液にて細胞を洗浄し、4’,6-ジアミノ-2-フェニルインドール（DAPI；最終濃度、1 μg/ml）を含んでいるHF緩衝液300μl中に再懸濁させた。Aria（商標）細胞選別機BD（Biosciences、サンノゼ、CA、USA）にて細胞を分離した。前方および側方スキャッターに基づいて生細胞をゲートし、前方スキャッターおよびパルス幅に基づいて単細胞をゲートした。ゲートは、無染色細胞、アイソタイプ特異的コントロールおよび単一染色の分析によって決定した。得られた細胞の数が少なかったので、CD44+CD24-/lowまたはCD44+CD24+細胞の純度は評価しなかった。フローサイトメーターの細胞カウンターを用いて、細胞数を決定した。細胞をDMEM培地またはHF緩衝液に採取した。
【００９５】
インビボマウス腫瘍分析のために、切除した腫瘍を剃刀の刃で細かく刻み、10%コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ混合物を含んでいるDMEM中、37℃にて1.5時間消化し、次いで、トリプシン-EDTA、ディスパーゼおよび塩化アンモニウム（Stem Cell Technologiesから入手した試薬、製造業者の使用説明書にしたがって）で連続的に処理した。DMEM+10%FBS中、標準の組織培養皿上で細胞を一夜培養した。FACS分析のために、プレートしたウエルをトリプシンとともにインキュベートし、HBSS+2% FBS中に再懸濁させた。細胞をマウスFcブロック（#553142、BD Pharmingen）でブロックした。抗体染色および細胞選別を上述のとおり行った。
【００９６】
５．免疫蛍光測定
以前の記載にしたがって（Turner、Broadら、2006）、ガラスカラースリップ上で培養した4T1細胞を固定し、透過性にし、免疫染色した。親4T1の攪拌培養TSを採取し、ドライアイス上のOCT凍結培地に懸濁した。凍結したら、クライオスター（商標）HM560クライオスタット（Microm International, GmbH、ウォルドルフ、ドイツ）を用いて5〜7 μmの切片を調製する。凍結切片を30秒間風乾し、固定のために4%パラホルムアルデヒドに移して20分間置き、PBS（5分間）で3回洗浄し、0.2% トリトン-X-100（10分間）で透過性にした。続いての免疫染色ステップは、以前に記載されている（Lock and Hotchin 2009）。
【００９７】
６．RNA抽出および定量的PCR
FACS選別細胞を72時間培養し、低酸素条件下で細胞溶解した。製造業者の使用説明書にしたがって、QIAGEN RNAeasy（商標）マイクロキット（トロント、オンタリオ、カナダ）を用いて、mRNA抽出を行った。Applied Biosystems（フォスターシティ、CA、USA）7900HTアナライザーにおいてPreAMP RT２マウス上皮間葉移行（EMT）PCRアレイ（PAMM-090、Qiagen）を用い、5〜10 ngのRNAを出発物質として、定量的PCRを行った。標準2-ΔΔct法（Livak and Schmittgen 2001）を用いることによって、遺伝子発現の相対的倍率変化を計算した。
【００９８】
７．薬理学的インヒビター
インビボ研究のために、以前の記載にしたがって（Lou、McDonaldら、2011、Supuran 2008）、CAIX特異的インヒビターCAI017（Supuran 2008）
【化１】
2014532864.tif 000003
、
MST-104、以下の構造式で示される独自のウレイド-スルホンアミド：
【化２】
2014532864.tif 000004
、およびMST-205、以下の構造式で示される独自のグリコシル化クマリン4-メチルウンベリフェル-7-イル-β-L-ラムノピラノシド：
【化３】
2014532864.tif 000005
を可溶化し、投与した。インビトロ研究のために、CAI017を、200 mMにてビヒクルなしでTS培養培地に直接加えた。MST-104をDMSOに可溶化し、50 μMにて、ビヒクルコントロールに加えた同体積のDMSOとともに培養培地に加えた。
【００９９】
８．マウス腫瘍モデル
すべての動物手順および研究は、BC Cancer Research Centreの実験動物委員会およびブリティッシュコロンビア大学（バンクーバー、BC、カナダ）によって認可されたプロトコルにしたがって行った。以前の記載にしたがって（Lou、McDonaldら、2011）、原発性乳房腫瘍異種移植のために、2x106個のMDA-MB-231 LM2-4Luc+変異細胞を、50%マトリゲル（商標）/PBS溶液に懸濁し、6〜8週齢の雌性NOD.CB17-prkdcscid/Jマウスに同所移植した。腫瘍が200 mm3に達したときに、療法を開始した。修正楕円体の式（LxW2）/2を用い、キャリパー測定から原発性腫瘍増殖速度を計算した。以前の記載にしたがって（Lou、McDonaldら、2011）、腫瘍生成および転移の進行を、生物発光の画像化を使用して、モニターし、定量した。
【０１００】
９．免疫組織化学
以前の記載にしたがって（Lou、McDonaldら、2011）、腫瘍を採取し、パラフィン包埋し、CAIX（Santa Cruz Biotechnology）について腫瘍切片を染色した。
【０１０１】
１０．統計学
GraphPad（商標）ソフトウェアを用い、両側T-検定および記述統計を行った。他に特記しない限り、誤差バーは、3つの独立した実験の最小に対するSEMを表す。
【０１０２】
１１．ケモカイン mRNAのレベルを分析するためのRNA抽出
翌日80%の集密度に達するように4T1-shNSおよび4T1-shCAIX細胞を播種した。PBSで細胞を2回洗浄し、次いで、無血清培地を細胞に加えた。21%または1% O2中で24時間細胞をインキュベートした後、培地を除去し、それぞれのO2張力において細胞溶解した。RNeasyミニキット（QIAGEN、トロント、オンタリオ、カナダ）を用い、製造業者の使用説明書にしたがって、細胞溶解物からmRNAを抽出した。ナノドロップによって、RNA量を決定し、2%アガロースゲル上の電気泳動によってインテグリティを決定した。
【０１０３】
１２．ケモカインmRNA分析のためのcDNA調製および定量的リアルタイムPCR
Superscript III First-Strand合成キット（Life Technologies、カールズバッド、カリフォルニア、USA）を用いるcDNAの製造において、各サンプルからの全RNA500 ngを用いた。Applied Biosystems 7900HT（フォスターシティ、カリフォルニア、USA）においてFAST SYBR Green MasterミックスリアルタイムqPCRを用いてDNAの増幅を行った。式：q＝E^-CT（式中、Eはプライマー効率を表し、CTは閾値サイクルを表す）を用い、個々の遺伝子のレベルの定量を行った（Rebollo、Miceli-Royerら、2012）。
【０１０４】
１３．ならし培地回収
上述のとおり、4T1-shNSおよび4T1-shCAIX細胞を増殖させた。24時間後、それぞれのO2張力において培地を採取し、4℃にて1500 rpmで5分間の遠心分離によって清澄にした。0.2 μmシリンジフィルターを通して培地をろ過し、-80℃にて保管した。
【０１０５】
１４．ELISA
製造業者の使用説明書にしたがって、マウス特異的CXCL10およびG-CSF Quantikine（登録商標）ELISAキット（R and D Systems、ミネアポリス、ミネソタ、USA）を用い、ならし培地から分泌されたケモカインレベルを評価した。総タンパク質レベルに基づいて、ならし培地を標準化した。
【実施例１】
【０１０６】
がん幹細胞の特徴にとってCAIX発現が必要である
非接着性腫瘍スフェアとしての、無血清条件下での懸濁液中のインビトロ増殖が、乳がん細胞の特徴であることが実証されている（Ponti、Costaら、2005）。
【０１０７】
RNA干渉（RNAi）を用いて、RNAiノンサイレンスコントロール（4T1-shNS）と比較して、4T1マウス乳がん細胞株（4T1-shCAIX）におけるCAIX発現を安定にノックダウンした（図１参照）。4T1細胞を単細胞として播種し、非接着性腫瘍スフェア（TS）として超低接着性プレートを用い、規定の無血清培地中で培養した（図２）。これらのTS形成条件は、がん幹細胞増殖を促進することが明らかにされている（Yip、Fombonら、2011、Stingl、Eavesら、2001、Dontu、Abdallahら、2003）。4T1-shNSおよび4T1-shCAIX細胞の単細胞懸濁液を、2倍希釈にて播種し、正常酸素状態（20%酸素）または低酸素状態（1%酸素）において、TS形成条件下で7日間培養した。
【０１０８】
ポジティブなTS増殖に必要な細胞の最小数として、TS形成能力を評価した。正常酸素状態において、shNS-4T1とshCAIX4T1との間に、TSを形成するのに必要な細胞の数において有意な差異はなかった。低酸素状態においてTSを形成するのに必要な4T1-shNS細胞の数は、有意に減少した（図３）。しかしながら、CAIX発現のRNAi媒介性ノックダウンは、低酸素状態においてTSを形成するのに必要な播種細胞の数を有意に増加させたが、このことは、CAIX発現が、コントロール細胞において観察される低酸素状態におけるCSC増殖にとって必要であることを示唆する（Lock、McDonaldら、2012）。
【０１０９】
CD44+CD24-/low細胞サイン（cell signature）は、以前に乳がん細胞集団として記載されており（Ponti、Costaら、2005、Al-Hajj、Wichaら、2003）、ヒト患者においてハイリスクな腫瘍特性および骨髄転移を伴う（Reuben、Leeら、2011）。
【０１１０】
インビトロでの低酸素乳がん幹細胞ニッチを維持することにおけるCAIXの役割をさらに評価するために、正常酸素状態または低酸素状態において、TS形成条件下で、shNS-4T1およびshCAIX4T1を培養し、FACSを用いて、CD44+CD24-/lowであると標識されたCSC集団を定量した(図４および図５)。shNSコントロールにおいては、正常酸素コントロールと比較して、低酸素培養条件下でCD44+CD24-/low集団は増加された。しかしながら、CAIXのRNAi媒介性ノックダウンは、低酸素状態において、この集団を枯渇させる（図５）。これらのデータは、これらの細胞におけるTS形成能力において述べた差異と相関する（図３）。
【実施例２】
【０１１１】
CAIXインヒビターは、がん細胞における幹細胞挙動を低下させる能力がある
これらのデータを確認するために、十分に特徴付けられたCAIX小分子インヒビターであるCAI017を用いて、親4T1細胞株におけるCAIX活性を阻害した（Lou、McDonaldら、2011、Supuran 2008）。実施例１と同じ実験方法を用いて、親4T1の単細胞懸濁液を、規定の無血清培地に2倍希釈にて播種し、CAI17またはビヒクルを加え、正常酸素状態または低酸素状態において、非接着性TSとして7日間培養した。今回も、TSを形成するための親4T1細胞の数は、正常酸素状態コントロールと比較して、低酸素状態において、有意に減少し、CAIX活性の阻害は、低酸素状態においてTSを形成するのに必要な播種細胞の数を有意に増加させたが、このことは、CAIX活性単独で、この細胞株においてがん幹細胞様集団を調節しうることを示唆する（図６）。
【０１１２】
FACSによって定量されたCD44+CD24-/low CSC集団の「幹細胞性」特性を確認するために、4T1 shNSおよびshCAIX細胞培養TSをFACSに付し、CD44+CD24-/lowおよびコントロールCD44-CD24+集団を採取し、低酸素状態において、TS培養条件下、2倍希釈にて播種した。7日後、TSを形成するのに必要な細胞の数を記録し、低酸素状態においてTSを連続的に継代培養した。TS形成フラクションを、（1÷TSを形成するのに必要な細胞の数）として計算した。TS形成が観察されなかった場合、これは、0の値が付与される。図７に示すように、生存shNS CD44+CD24-細胞は相対的に低い細胞数から、すべての実験においてTSを形成し、勢いよく増殖した。生存shCAIX CD44+CD24-細胞は、多くの場合、TSを形成するのに失敗した。TS形成が観察された場合、これは、shNS CD44+CD24-/low集団よりも有意に大きい細胞数を必要とした（図７）。生存コントロール非CSC集団であるshNS CD44-CD24+ and shCAIX CD44-CD24+は、同様の乏しいTS形成フラクションを示した。TSが連続的継代培養とそれに続く低酸素性TS培養条件に付された場合、shNS CD44+CD24- TSは、7継代まで（培養が終了した場合）十分継代に生き残ったが、このことは、この集団における幹細胞性を示す。TS増殖が、shCAIX CD44+CD24-/low集団において観察された場合、この特徴は、前の継代1を生き残らなかった。どちらかの細胞由来のコントロールCD44-CD24+集団は、同様に、継代1を越えて継代培養されることは不可能であった。これらのデータは、CAIX枯渇CD44+CD24-low細胞が、CD44+CD24-/lowサインを発現するにもかかわらず、インビトロ幹細胞性を伴う特徴を示さないことを示唆する（Lock、McDonaldら、2012）。
【０１１３】
表１
CAIX発現は、低酸素状態における4T1 CD44+CD24-/low腫瘍スフェア形成能に必要である
2014532864.tif 000006
【０１１４】
表１のデータのために、低酸素状態において、TSとして4T1 shNSおよびshCAIX細胞を培養し、脱凝集し、CD44およびCD24について染色し、FACSによって採取した。CD44+CD24-/lowまたはCD44-CD24+コントロール細胞を採取し、低酸素状態において、腫瘍形成条件下で2倍希釈にて播種し、腫瘍スフェア形成効率を記録した。
【実施例３】
【０１１５】
親4T1 CD44+CD24-/low CSCの間葉表現型は、正常酸素状態および低酸素状態において観察される
親4T1細胞を、正常酸素状態および低酸素状態において、腫瘍スフェア（TS）形成条件下で培養した。7日後、TSを採取し、解離させ、CD44およびCD24について細胞染色した。CD44+CD24-/low細胞またはコントロールCD44+CD24+集団を、正常酸素または低酸素状態にて、ガラスカバースリップ上で3日間培養し、次いで、固定し、CAIX（図９）またはEMTマーカー（図８、９および１０）について免疫染色した（Lock、McDonaldら、2012）。CD44+CD24-/lowおよびCD44+CD24+コントロール集団の両方において、低酸素培養物におけるCAIXの発現は、上方調節された。正常酸素培養物においては有意なCAIX染色は観察されなかった（図９）。正常酸素状態および低酸素状態において、CD44+CD24+コントロール集団の細胞境界では、有意なE-カドヘリン発現が観察されたが、正常酸素状態および低酸素状態において、CD44+CD24-/low細胞細胞においては、上皮マーカーであるE-カドヘリンの発現の有意な喪失が観察された（図１０）。CD44+CD24-/low間葉表現型のさらなる証拠は、CD44-CD24+コントロール集団におけるごくわずかな染色と比較して、CD44+CD24-/low 4T1細胞において観察された間葉マーカーである平滑筋アクチンが上方調節されることによって確認された（図１１）。Snailについての免疫蛍光染色もまた、コントロールCD44+CD24+集団において染色が少ないことと比較して、正常酸素状態および低酸素状態のCD44+CD24-/low集団においてこのEMT調節因子が上方調節されることを実証した（図１２）。
【０１１６】
これらのデータは、インビトロで確認された。親4T1マウス乳がん細胞を、TSとして定速回転下で3週間培養した。TSが直径約150 μmに達したとき、培養物を分割し、正常酸素状態または低酸素状態下で3日間さらに培養した。TSを凍結させ、切片にし、免疫染色に付して、CAIXおよびがん幹細胞マーカーであるCD133の発現を評価した。結果は、と世情酸素コントロールと比較して、低酸素TSにおいてCD133発現が上方調節されたことを示す。これらの細胞において、CAIX発現もまた上方調節された。
【０１１７】
低酸素状態におけるTSとしての4T1培養物の上皮表現型を評価するために、上皮マーカーであるE-カドヘリンおよびCAIXについて切片を共染色した（図１３）。正常酸素状態腫瘍スフェアにおいて、細胞境界におけるE-カドヘリン発現とともに非常に少ないCAIX発現が観察された。低酸素状態において、腫瘍スフェア培養物では、CAIX発現の増加とともに、E-カドヘリン発現が下方調節された。間葉マーカーである平滑筋アクチンおよびEMT調節因子Snailの発現を、これらの腫瘍スフェアにおいても評価した。平滑筋アクチン発現ならびにCAIX発現は、正常酸素コントロールと比較して、低酸素状態において上方調節された（図１４）。正常酸素コントロールと比較して、低酸素TSにおいて、SnailおよびCAIX発現は、増加した（図１５）。まとめると、これらのデータは、親4T1マウス乳がん細胞において、低酸素腫瘍スフェア培養物が、がん幹細胞マーカー発現およびEMT表現型と相関するCAIX発現を引き起こすということをサポートする。これらのデータは、この細胞株におけるEMTの低酸素誘導および幹細胞表現型の維持を確認する。
【実施例４】
【０１１８】
低酸素状態において、4T1 CD44+CD24-/LOW細胞の間葉および「幹細胞性」表現型にはCAIXが必要である
がん細胞のCSC「幹細胞性」を維持することにおけるCAIX発現のための要件を、EMT表現型を評価することによってさらに分析した。shNSおよびshCAIX 4T1細胞を、低酸素状態において7日間培養し、解離させ、CD44+CD24-/lowおよびコントロール集団をFACSによって採取した。細胞を、低酸素状態において、ガラスカバースリップ上で3日間培養し、固定し、IFによって評価した（Lock、McDonaldら、2012）。上皮マーカーであるE-カドヘリンの発現は、コントロールと比較して、shNS CD44+CD24-/low細胞において有意に減少し（図１６）、これは、shNS CD44+CD24-/low細胞、が4T1 および／またはやCD44+CD24-/low集団と同様に、EMTを受けることを示唆する。対照的に、shCAIX CD44+CD24-/low細胞は、shCAIX CD44+CD24+ control細胞に匹敵するE-カドヘリンを発現し続ける（図１６）。
【０１１９】
間葉マーカーである平滑筋アクチンの発現も評価した。shNS CD44+CD24-/low細胞は、shNS CD44+CD24+コントロール細胞に観察される非常に少ない染色と比較して、平滑筋アクチンについて強い染色を示す。対照的に、CAIX枯渇に続いて、shCAIX CD44+CD24-/low細胞は、shCAIX CD44+CD24+コントロールと同様に、非所に低レベルの平滑筋アクチン発現を示す（図１７）。これらのデータを確認するために、EMT調節因子であるSnailの発現も、IFによって評価した。Snail発現は、shNS CD44+CD24-/low細胞において、shCAIX CD44+CD24-/low細胞およびコントロールと比較して、上方調節された（図１８）。
【０１２０】
生存している、FACS選別された細胞を、低酸素状態において3日間培養した。RNAを抽出し、定量的PCRを用いて、EMT標的遺伝子の相対的遺伝子転写レベルを評価した（Lock、McDonaldら、2012）。上皮マーカーであるデスモプラキンの転写において、コントロールと比較して平均3.5倍の減少が、shNS CD44+CD24-/low細胞において観察され、観察されたshCAIX CD44+CD24-/low細胞においては有意な減少はなかった（図１９）。E-カドヘリン転写においても同様のパターンが観察された（データ示さず）。hNS CD44+CD24-/low細胞において、コントロールと比較して、間葉マーカーであるビメンチンの転写の増加が観察されたが、shCAIX CD44+CD24-/low細胞においては、差異はなかった（データ示さず）。EMT- 標的遺伝子転写におけるこれらの差異は、低酸素状態においてCAIX発現shNS CD44+CD24-/low細胞において観察された、確認されたEMT表現型と比較すると、 CAIX枯渇が、D44+CD24-/low集団の上皮表現型を維持することを確認する。
【０１２１】
コントロールと比較して、EMT調節因子Snail1（Snail）（45.8倍）（Cano、Perez-Morenoら、2000）およびWnt5b（11.57倍）（Yook、Liら、2005、Malizia、Laceyら、2009）の有意な転写倍率増加が、shNS CD44+CD24-/low細胞において観察された。大部分のヒト乳房腫瘍において過剰発現し、転移を促進する既知のEMT調節因子であるグースコイド（Gsc）もまた、shNS CD44+CD24-/low細胞において5.23倍に上方調節された（Hartwell、Muirら、2006）。驚くべきことに、shCAIX CD44+CD24-/low細胞では、これらの3つのEMT調節因子の転写の有意な増加は観察されなかった（図１９）。EMT調節因子Zeb2の転写（Vandewalle、Van Royら、2009）もまた、shCAIX CD44+CD24-/low細胞およびコントロールと比較して、shNS CD44+CD24-/low細胞において上方調節された（データ示さず）。侵襲性のヒト乳がんにおいて上方調節されるEMTプロモーターであるFOXC2の転写（Mani、Yangら、2007）もまた、同様のパターンを示した。これらの結果は、低酸素状態における間葉表現型および乳がん幹細胞の維持には、CAIXが必要であるということを実証する。
【０１２２】
Notchシグナル伝達経路調節因子であるNotch1およびそのリガンドであるJagged1のメンバーの転写もまた評価された（Lock、McDonaldら、2012）。shNS CD44+CD24-/low細胞におけるNotch1およびその下流のエフェクターであるJagged 1の両方の転写は、コントロールと比較して、それぞれ平均6.09および3.12倍の増加を示した。対照的に、CAIX枯渇shCAIX CD44+CD24-/low細胞集団においては、これらの幹細胞性の調節因子のいずれかの転写において有意な上方調節は観察されなかった（図１９）。
【０１２３】
分析された細胞集団間で有意な差異を示さなかった、定量的PCRによって評価されたいくつかの遺伝子を表２に示す。
【０１２４】
表２
非反応性バイオマーカー
2014532864.tif 000007
【０１２５】
4T1 shNSおよびshCAIX細胞を、低酸素状態において、TSとして培養し、CD44、CD24について細胞染色し、FACSによって採取した。生存しているCD44+CD24-/lowまたはCD44+CD24+細胞を採取し、低酸素状態において3日間ガラスカバースリップ上で培養し、細胞溶解し、RNAを抽出し、様々なEMTマーカーの相対的mRNAレベルをQPCRによって評価した。表２は、すべての細胞集団にわたって有意な変化を示さない遺伝子標的の選択を示す。3つの独立した実験の平均およびSEMの倍率変化を示す。
【０１２６】
これらのデータを確認するために、親4T1のTSを、FACSによって分析し、CD44+CD24-/lowおよびコントロールCD44-CD24+細胞集団を、CAIXインヒビターであるMST-104の存在下または不在下で低酸素状態においてガラスカバースリップ上で培養した。細胞を固定し、上皮マーカーであるE-カドヘリンについて染色した。予想されるように、ビヒクル処置CD44-CD24+細胞は、細胞-細胞境界に局在する強いE-カドヘリン染色を示す。対照的に、ビヒクル処置CD44+CD24-/low細胞は、E-カドヘリン発現が非常に少ないか、または全く無かった。重要なことには、CAIXインヒビターであるMST-104で処置したCD44+CD24-/low細胞は、MST-104またはビヒクルで処置したCD44-CD24+細胞と非常によく似た強いE-カドヘリン染色を示し、このことは、これらの細胞の上皮表現型を確認する（図２０）。
【実施例５】
【０１２７】
CAIX特異的インヒビターは、インビボで腫瘍増殖およびがん幹細胞集団を遅延化させる
インビボでの腫瘍増殖およびがん幹細胞拡張におけるCAIX阻害の効果を評価するために、MDA-MB-231細胞株のの変異体であるMDA-MB-231 LM2-4Luc+を用いて、原発性乳房腫瘍異種移植片を作った。これらの細胞は、インビボにおいて転移性が高く、低酸素状態においてCAIX発現を強く誘発する。細胞を同所的に移植し、腫瘍形成が確認されたら、2つの以前に述べたCAIX特異的インヒビターであるグリコシルクマリンMST-205およびウレイド-スルホンアミドMST-104でマウスを処置した（Lou、McDonaldら、2011、Lock、McDonaldら、2012、Pacchiano、Cartaら、2011）。キャリパー測定およびIVIS画像化によって腫瘍増殖を評価した。これまでの報告と同様に、腫瘍体積測定は、ビヒクルコントロールと比較して、いずれかのインヒビターで処置されたマウスにおいて原発性腫瘍増殖の有意な阻害を示した（図２１）（Lou、McDonaldら、2011）。
【０１２８】
インビボでの原発性腫瘍がん幹細胞集団におけるCAIX阻害の効果を定量した。接種の27日後に原発性腫瘍を除去し、解離させ、がん幹細胞マーカーであるEpCAM（ESAとしても知られる）で細胞を標識し、FACSによって評価した。ビヒクル処置LM2-4Luc+腫瘍は、平均10%のEpCAM+集団を含んだ。比較すると、MST-104処置腫瘍は、EpCAM+集団の統計的に有意な減少を示した（図２２Ａおよび２２Ｂ）。もう一つのクラスのCAIXインヒビターであるMST-205もまた、ビヒクル処置コントロール腫瘍と比較して、有意に減少した集団を示した（図２３Ａおよび２３Ｂ）。
【０１２９】
CAIX阻害後の推定的がん幹細胞集団において観察された差異を確認するために、免疫組織化学（IHC）によって、腫瘍をALDH1A3発現についても評価した（図２４）。ビヒクル処置腫瘍において、壊死領域周辺に、ALDH1A3陽性細胞の小集団が観察された。連続的組織切片染色もまた、これらの領域におけるCAIX発現を確認した（図２５）。CAIXインヒビター処置腫瘍において、ALDH1A3染色は、壊死周辺領域において大部分に存在しなかったが、CAIX発現は依然として観察された。
【実施例６】
【０１３０】
EPCAM+ MDA-MB-231 LM2-4亜集団は、インビボにおいて腫瘍原性が高い
選択されたEpCAM+ MDA-MB-231 LM2-4細胞が腫瘍を形成するかどうかを試験するために、我々は、それぞれ50、500および5000個のEpCAM+またはEpCAM- MDA-MB-231 LM2-4細胞をNOD/SCIDマウスの乳房脂肪体に注入した（50,000個のEpCAM-ve細胞もまた注入した）。腫瘍形成が、2、3日以内に、非常に少数のEpCAM+細胞の出発集団から観察され得たので、EpCAM+細胞は、腫瘍原性が高かった。EpCAM-細胞もまた、より多くの細胞が注射された場合に腫瘍を形成することができたが、EpCAM誘導腫瘍の体積は、常に、EpCAM+誘導腫瘍の大きさよりもはるかに小さかった（Lock、McDonaldら、2012）。腫瘍進行速度は、EpCAM-誘導腫瘍において、EpCAM+誘導腫瘍よりも遅かったが、これは、EpCAM+細胞が、より侵攻性の腫瘍を形成することを示している。
【０１３１】
これらの結果は、MDA-MB-231 LM2-4のがん幹細胞が、EpCAM+選択によって強化されたことを示唆する。これらのデータは、EpCAM+/PROCR+またはEpCAM-/PROCR-  MDA-MD-231乳がん幹細胞の異種移植後に観察された腫瘍増殖における差異に類似している（Hwang-Verslues、Kuoら、2009）。
【実施例７】
【０１３２】
CAIX阻害は、インビボにおけるパクリタキセル駆動CSC拡張を救助する
パクリタキセルは、迅速に分割する腫瘍細胞を標的とする強力な有糸分裂インヒビターであり、標準的乳がん療法のため現在の第一選択化学療法薬である。腫瘍を有するマウスにおけるパクリタキセル処置の有無によるCAIX特異的インヒビター処置の効力が研究された（Lock、McDonaldら、2012）。サンプル結果の記載：NOD-SCIDマウス乳房脂肪体をLM24乳がん細胞とともにインキュベートした。10日後、マウスにパクリタキセルまたはMST-104を、あるいは両方の薬物を併用で、あるいはビヒクルを投与した。キャリパー測定によって腫瘍体積を評価し（図２６）、肺転移のIVIS画像化を図２７に示す。パクリタキセルと併用でのCAIXインヒビター処置は、NOD-SCIDマウスにおいて、LM 2-4腫瘍増殖および転移を抑制した（図２６−２８）。人道的な終点において、腫瘍を切除し、FACSによって生存しているEpCAMポジティブ集団を評価した（図２９Ａ−２９Ｅ）。図３０に示すように、パクリタキセル単独による処置は、ビヒクルコントロールと比較して、EpCAM+ CSCの平均パーセンテージの増加をもたらした。MST-104単独による処置は、EpCAM+集団において有意な現象をもたらした。重要なことには、パクリタキセルと併用でのMST-104処置は、ビヒクル処置マウスに見られるのと同様のレベルまで、EpCAM+集団を救助した（図３０）。これらのデータは、腫瘍サイズおよびCSC集団の調節における、CAIX特異的阻害の臨床的可能性を実証する。
【実施例８】
【０１３３】
CAIX発現の枯渇またはCAIX活性の阻害は、mTOR経路を阻害する
正常酸素状態および低酸素状態において培養した4T1 TS細胞溶解液にてmTORC1シグナル伝達を評価した（Lock、McDonaldら、2012）（図３１）。低酸素状態におけるCAIXの枯渇は、mTORC1の構成要素であるmTORおよびRaptorの発現を減少させ、翻訳調節因子4EBP1への下流シグナル伝達を阻害し（図３１）、4EBP1リン酸化の減少および移動度の増加をもたらした（矢印）（図３１）。これらのデータは、mTORおよびその下流エフェクターが、低酸素状態においてCAIXに依存していることを実証する。低酸素状態においてCAIXインヒビターとともに培養された親4T1 TSにおけるCAIX阻害後に、同様の結果が観察され（図３２）、このことは、mTOR経路の構成要素が、がん細胞によるCAIX機能の阻害への反応のバイオマーカーとして使用されうることを実証する。
【０１３４】
インビボでの乳がん細胞によるmTOR経路におけるCAIX活性の阻害の効果を評価するために、MDA-MB-231 LM2-4Luc+細胞を用いて、同所性ヒト原発性乳房腫瘍を、NOD/SCIDマウスに定着させ、ビヒクルまたはCAIX特異的インヒビターであるMST-104で担がん動物を処置した。実験終点にて、原発性腫瘍を除去し、解離させ、生存している腫瘍細胞を溶解し、ウエスタンブロッティングに付した（Lock、McDonaldら、2012）。インビトロでのCAIX枯渇および阻害と同様に（図３１および３２）、インビボでのCAIX活性の減衰は、mTORC1シグナル伝達経路の阻害をもたらした（図３３）。CAIX阻害は、Ser939TSC2のリン酸化を減少させ、mTORC1シグナル伝達を阻害した（図３３）。インビボでのCAIX阻害後、Raptor発現は調節されなかった（Raptor/アクチン デンシトメトリー：ビヒクル 0.64 平均±0.05 SEM；U-104 平均0.69±0.14 SEM）。しかしながら、mTORC1構成要素であるmTORの発現は無効にされ、下流翻訳調節因子4EBP1のリン酸化および発現の枯渇をもたらした（図３３）。これらの結果は、インビボでの腫瘍細胞におけるmTORシグナル伝達にはCAIX活性が必要であることを示し、mTOR経路の構成要素が、インビボでのCAIX標的化療法への反応のバイオマーカーであることを実証する。
【実施例９】
【０１３５】
低酸素状態において、がん細胞によるいくつかのケモカインの分泌にはCAIXが必要である
十分に確立された乳がんの4T1モデルを用いて、CAIXの枯渇が転移をブロックし、最終的に、腫瘍体積の縮小をもたらすことが明らかにされている（Lou、McDonaldら、2011）。正常酸素状態および低酸素状態において増殖させた4T1 shNSおよびshCAIX細胞からのmRNAレベルの分析は、CAIXを標的とするXshRNA配列が、CAIXメッセージを減少させることにおいて非常に有効であることを明らかにしたが（図３４）、これによってタンパク質レベルにおけるこれまでの分析が実証される（Lou、McDonaldら、2011）。CAIXの枯渇は、腫瘍細胞によって生成され、転移に関与する、「活性，正常T細胞の発現および分泌を調節するケモカイン（RANTES）」、「顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）」、「CXCケモカイン受容体3（CXCR3）」および「CXCL10」（図３４）などのいくつかのケモカインのmRNAレベルの有意な減少をもたらした（Yu、Kortylewskiら、2007）。CAIXのサイレンシングもまた、胎盤増殖因子（PlGF）のmRNAレベルの減少をもたらした。さらに、CAIXレベルの減少は、IL-1αメッセージの減少をもたらさなかったが、これは上述のケモカインにおける効果が特異的であることを実証する。G-CSFおよびCXCL10 mRNAレベルの減少は、ELISAによって、タンパク質レベルにおいてさらに確認された（図３５および３６）。低酸素状態において増殖させた4T1 shCAIX細胞から単離されたならし培地中のCXCL10（図３５）およびG-CSF（図３６）の両方のタンパク質レベルは、同じ条件で培養されたノンサイレンシングコントロール細胞よりも有意に低かった。これらのデータは、低酸素状態におけるがん細胞によるCAIX発現が、腫瘍の微小環境に役立つ分泌された因子のプールに影響を及ぼすことを示唆し、これらの因子は、がん細胞によるCAIX発現および／または活性の阻害に対する応答のバイオマーカーである。
【０１３６】
上述の様々な実施態様を組み合わせて、さらなる実施態様を提供することができる。本明細書に言及された、および／または出願データシートにリストされたすべての米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国出願、外国特許出願および非特許文献は、その全体において参照することによって本明細書に援用される。実施態様の局面は、必要に応じて、様々な特許、出願および文献の概念を用いるように変更して、さらなる実施態様を提供することができる。
【０１３７】
上記の詳細な記載を考慮して、実施態様に、これらまたは他の変化を施すことができる。一般に、以下の特許請求の範囲において用いた用語は、特許請求の範囲を、明細書および特許請求の範囲に開示された特定の実施態様に限定するものと解釈されるべきではなく、このような特許請求の範囲が付与する等価物の全範囲とともに、すべての可能な実施態様を包含すると解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、開示によって限定されない。
【０１３８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９ＡＢ】
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【図２９ＣＤ】
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【図２９Ｅ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【国際調査報告】
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