(57)【要約】  本発明は、アルギン酸ハイドロゲル等のハイドロゲルを調製する改善された方法に関する。本発明のハイドロゲルは、特に細胞材料等の生体材料、例えば精子の固定化及び保存に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギン酸ハイドロゲルの調製におけるヒドロラーゼ及び該ヒドロラーゼにより加水分解可能な基質を使用することを特徴とするヒドロラーゼ及び基質の使用方法。
【請求項２】
請求項１に記載の使用方法において、前記酵素がエステラーゼであることを特徴とする使用方法。
【請求項３】
請求項２に記載の使用方法において、前記エステラーゼがリパーゼであることを特徴とする使用方法。
【請求項４】
請求項３に記載の使用方法において、前記リパーゼがトリアシルグリセロールリパーゼであることを特徴とする使用方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用方法において、前記ヒドロラーゼの基質の加水分解がＨ３Ｏ＋の産生をもたらすことを特徴とする使用方法。
【請求項６】
請求項５に記載の使用方法において、前記酵素がリパーゼであり、前記基質が下記式Ｉで示す化合物であることを特徴とする使用方法。
【化１】
2014533958.tif 000009
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立して、同一又は異なって、直鎖又は分岐鎖、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル鎖を表す）
【請求項７】
請求項２に記載の使用方法において、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、メタノン、エタノン、アセトン、ブタノン、ペンタノン、ヘキサノン、ヘプタノン、オクタノン、ノナノン、デカノン、ドデカノンからなる群より選択されることを特徴とする使用方法。
【請求項８】
請求項６に記載の使用方法において、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、独立して、同一又は異なって、Ｃ１〜Ｃ３アルキルカルボニル鎖を表すことを特徴とする使用方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用方法において、前記基質が、トリアセチン、トリプロピオニン及びトリブチリン、好ましくはトリプロピオニン及びトリブチリンからなる群より選択されることを特徴とする使用方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用方法において、酵素及び基質が、生体材料、好ましくは精子を包埋するアルギン酸ハイドロゲルの調製に使用されることを特徴とする使用方法。
【請求項１１】
ヒドロラーゼを含む溶液と、該ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質を含む溶液とを混合する工程を含み、前記ヒドロラーゼを含む溶液又は前記基質を含む溶液がアルギン酸塩及び二価陽イオン放出化合物を更に含むことを特徴とするアルギン酸ハイドロゲルを調製する方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記ヒドロラーゼを含む溶液が、二価陽イオン放出化合物及びアルギン酸塩を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法において、前記基板を含む溶液が、二価陽イオン放出化合物及びアルギン酸塩を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法において、前記ヒドロラーゼがエステラーゼであることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載の方法において、前記エステラーゼが、リパーゼ、好ましくはトリアシルグリセロールリパーゼであることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法において、前記基質が有機酸のエステルであることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法において、トリアシルグリセロールリパーゼを含む溶液と、前記ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質を含む溶液とを混合する工程を含み、前記基質が下記式Ｉで示す化合物であり、前記リパーゼを含む溶液又は式Ｉの化合物を含む溶液がアルギン酸塩及び二価陽イオン放出化合物を更に含む、アルギン酸ハイドロゲルを調製することを特徴とする方法。
【化２】
2014533958.tif 000010
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立して、同一又は異なって、直鎖又は分岐鎖、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル鎖を表す）
【請求項１８】
請求項１４に記載の方法において、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、メタノン、エタノン、アセトン、ブタノン、ペンタノン、ヘキサノン、ヘプタノン、オクタノン、ノナノン、デカノン、ドデカノンからなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１４に記載の方法において、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、独立して、同一又は異なって、Ｃ１〜Ｃ３アルキルカルボニル鎖を表すことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法において、前記基質が、トリアセチン、トリプロピオニン及びトリブチリン、好ましくはトリプロピオニン及びトリブチリンからなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法において、前記二価陽イオン放出化合物が、Ｃａ２＋、Ｂａ２＋、及びＳｒ２＋からなる群より選択される二価陽イオンを放出することを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１８に記載の方法において、前記二価カチオン放出化合物がカルシウム放出化合物であることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１９に記載の方法において、前記カチオン放出化合物が炭酸カルシウムであることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の方法において、第１の溶液がアルギン酸ハイドロゲル中に包埋される目的物を更に含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２２に記載の方法において、アルギン酸ゲルに包埋される目的物が生体材料であることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２３に記載の方法において、前記生体材料が精子であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２０に記載の方法において、
ｉ）トリアシルグリセロールリパーゼを含む溶液で精子を希釈することにより第１の溶液を形成する工程と、
ｉｉ）工程ｉ）で得られた第１の溶液に、アルギン酸塩、二価陽イオン放出化合物、及び下記式Ｉで示す化合物を含む第２の溶液を添加するとともに、ゲル化を開始する工程と、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた溶液をアルギン酸ハイドロゲルのゲル化用容器に移す工程と、
ｉｖ）任意に、ｉｉｉ）のアルギン酸ハイドロゲルを凍結保存に供する工程と、を含むことを特徴とする方法。
【化３】
2014533958.tif 000011
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立して、同一又は異なって、直鎖又は分岐鎖、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル鎖を表す）
【請求項２８】
請求項２０に記載の方法において、
ｉ）下記式Ｉで示す化合物を含む溶液で精子を希釈することによって第１の溶液を形成する工程と、
ｉｉ）工程ｉ）で得られた溶液に、アルギン酸塩、二価陽イオン放出化合物、及びトリアシルグリセロールリパーゼを含む第２の溶液を添加するとともに、ゲル化を開始する工程と、
ｉｉｉ）ｉｉ）で得られた溶液をアルギン酸ハイドロゲルのゲル化用容器に移す工程と、
ｉｖ）任意に、ｉｉｉ）のアルギン酸ハイドロゲルを凍結保存に供する工程と、を含むことを特徴とする方法。
【化４】
2014533958.tif 000012
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立して、同一又は異なって、直鎖又は分岐鎖、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル鎖を表す）
【請求項２９】
請求項２５又は２６に記載の方法において、前記基質が、トリアセチン、トリプロピオニン及びトリブチリン、好ましくはトリプロピオニン及びトリブチリンからなる群より選択される方法。
【請求項３０】
請求項１４又は１５に記載の方法において、ｉｉｉ）で得られた溶液を凍結保存に供し、ｉ）及びｉｉ）の第１の溶液及び第２の溶液のそれぞれが凍結保護物質を含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法において、前記アルギン酸塩がグルロン酸に富むアルギン酸塩であることを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項１〜１８のいずれか一項により調製される、アルギン酸ハイドロゲル。
【請求項３３】
アルギン酸ハイドロゲルであって、
ａ）アルギン酸塩と、
ｂ）任意に、アルギン酸ハイドロゲルに包埋される目的物と、
ｃ）アルギン酸ハイドロゲルの調製に使用されるヒドロラーゼと、
を含むことを特徴とするアルギン酸ハイドロゲル。
【請求項３４】
ヒドロラーゼの入った１つの容器と、該ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質の入った第２の容器とを含む、アルギン酸ハイドロゲルキット。
【請求項３５】
請求項２７に記載のキットにおいて、
ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質が、下記式Ｉで示す化合物であることを特徴とするキット。
【化５】
2014533958.tif 000013
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立して、同一又は異なってＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル鎖を表す）
【請求項３６】
請求項２３に記載のキットにおいて、アルギン酸塩及び二価陽イオン放出化合物を更に含むことを特徴とするキット。
【請求項３７】
請求項２８に記載のキットにおいて、ヒドロラーゼを含む溶液の入った１つの容器と、アルギン酸塩、二価陽イオン放出化合物及び前記ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質を含む溶液の入った第２の容器とを含むことを特徴とするキット。
【請求項３８】
請求項２８に記載のキットにおいて、ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質を含む溶液の入った１つの容器と、アルギン酸塩、二価陽イオン放出化合物及びヒドロラーゼを含む溶液の入った第２の容器とを含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイドロゲル、特にアルギン酸ハイドロゲルを調製する改善された方法に関する。本発明のハイドロゲルは幅広い領域の用途を有し、特に生体材料の固定化、より具体的には、例えば精子等の細胞材料の固定化及び保存に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ハイドロゲルは様々な産業分野、特に生物工学及び製薬産業における幅広い領域の用途を有する親水性、含水ネットワークを形成する高分子鎖からなる。例えば、ハイドロゲルは、移植用細胞等の生体材料を固定化するのに、又は例えば薬学的有効成分若しくは栄養素の輸送システムとして使用される。また、ハイドロゲルは、創傷被覆材としても有用な場合がある。さらに、ハイドロゲル、特にアルギン酸ハイドロゲルは、増粘剤として幅広く使用されている。
【０００３】
ハイドロゲルの形成に幅広く使用されている高分子は、アルギン酸塩である。アルギン酸塩は、天然由来の１，４−結合−β−Ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）及びα−Ｌ−グルクロン酸（Ｇ）からなる陰イオン性多糖である（非特許文献１）。商業的なアルギン酸塩は、アスコフィルム・ノドスム（Ascophyllum nodosum）、マクロシスティス・ピリフェラ（Macrocystis pyrifera）、及びラミナリア・ヒペルボレア（Laminaria hyperborea）等、また或る程度はラミナリア・ディギタータ（Laminaria digitata）、ラミナリア・ジャポニカ（Laminaria japonica）、エクロニア・マキシマ（Ecklonia maxima）、レソニア・ニグレッセンス（Lessonia nigrescens）及びホンダワラ属（Sargassum sp.：サルガッスム属）の海藻から抽出される。また、アルギン酸塩は、一部のアルギン酸塩産生細菌、例えば一部のシュードモナス（Pseudomonas）種、及びアゾトバクター・ビネランジイ（Azotobacter vinelandii）からも調製され得る（上記非特許文献１）。
【０００４】
アルギン酸塩は、例えば粘度調節のための安定化剤、又は増粘剤として、特に食品産業において一般的に使用されている。また、アルギン酸塩は、製薬産業及び化粧品産業において安定化剤、増粘剤又は崩壊剤としても幅広く使用されている。様々な目的のため、グルロン酸又はマンヌロン酸のいずれかに富むアルギン酸塩がそれぞれ利用可能である（非特許文献２、特許文献１、特許文献２、特許文献３）。
【０００５】
アルギン酸塩の生体適合性、及び例えばカルシウムイオン等の二価陽イオンの存在下におけるゲル化能力により、アルギン酸塩は、細胞のカプセル封入にも一般的に使用されている（非特許文献３、非特許文献４、特許文献４、特許文献５、特許文献６、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。
【０００６】
また、アルギン酸ゲルは、様々な材料を固定化するためにも有用である。例えば、特許文献７は、精子の保存に有用な生体高分子粒子を記載しており、生体材料は、粒子の全直径を通して固形である高分子粒子中に包埋される。カプセルの液体コア中に精子を残す精子のカプセル封入に代えてアルギン酸ハイドロゲル中に精子を包埋することにより、細胞をアルギン酸ゲルネットワーク内に固定化し、それによって保存中の細胞の運動性を制限する。
【０００７】
様々な材料のカプセル封入又は捕捉に使用されるアルギン酸ハイドロゲル、例えばアルギン酸ゲルは、捕捉される材料の溶液と、アルギン酸ナトリウム溶液とを混合し、この溶液を多価陽イオン、通常はカルシウムイオン等の二価陽イオンを含有する溶液（例えば、ＣａＣｌ２溶液）に添加することによって調製され得る（上記非特許文献１）。
【０００８】
特許文献８は、包埋される細胞と、アルギン酸塩と、カルシウム放出剤とを混合し、その後この混合物にカルシウム放出化合物を添加して架橋ゲルを形成することを含む、アルギン酸ハイドロゲル等の生体適合性ハイドロゲルの別の調製方法を開示する。特許文献８によれば、カルシウム放出剤は、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）であってもよい。
【０００９】
特許文献８に開示される方法は、人工授精に有用な精子を固定化するため（例えば、特許文献７に開示されるアルギン酸ハイドロゲルの調製のため）に使用され得る。例えば、希釈し、冷却（４℃）した精子を、溶解したアルギン酸ナトリウム及び懸濁した炭酸カルシウム、また任意にグリセロール等の凍結保護物質を含む溶液に添加してもよく、その後ＧＤＬを含む溶液を添加することによってゲル化を開始して所望のアルギン酸ハイドロゲルを得ることができる。ＧＤＬの添加は、順次水と反応してＨ３Ｏ＋を形成する、グルコン酸の形成をもたらす。Ｈ３Ｏ＋の増加、及び炭酸カルシウムの存在はＣＯ２及びＣａ２＋の放出を生じる。ＧＤＬを添加することによるＣａ２＋の供給は、包埋された精子を含むアルギン酸ハイドロゲルの形成をもたらす。
【００１０】
ゲル化が起こった後、アルギン酸塩に包埋された精子で満たされた容器を液体窒素中で凍結保存することにより、非常に長い有効保存期間を有する精子の凍結保存を提供することができる。
【００１１】
しかしながら、本発明者らは、特許文献８に開示される方法によるアルギン酸ハイドロゲルの調製におけるＧＤＬの使用は、幾つかの欠点を含むことを経験した。上記方法に従って固定化した精子を含むアルギン酸ゲルを調製する場合、精子のゲル化を回避するためＧＤＬ溶液を調製した直後に溶液にＧＤＬを添加することが極めて重要である。精子に有害な初期に高濃度のグルコン酸を含む局所領域／区域を回避するため、粉末ではなく溶解した形態でＧＤＬを添加しなければならない。さらに、ＧＤＬの添加後、ゲル化反応の開始の結果として粘度が増加する期間が続く。粘度増加により、ハイドロゲルを形成するために使用する容器をかなり素早く満たす必要がある。したがって、溶解したＧＤＬをグルクロン酸に転化するため生じる時間の間、更なるゲル化及び所望の生体材料の固定化のため、溶液を好適な容器（例えば、IMV, L'Aigle, Franceにより提供されるミニストロー等）に移す。したがって、従来技術において開示される方法は、所望の生体材料を含むハイドロゲルを調製するため幾分短く融通の利かない時間スケジュールをもたらし、工業的見地から実質的な不利益である。
【００１２】
上記方法の欠点により、ハイドロゲルを調製する改善された方法、特に工業規模でハイドロゲルを調製するのに好適な方法が必要とされている。
【００１３】
ハイドロゲルを調製する様々な他の方法が従来技術において記載されている。様々な報告が、特定の基質に供されるに際して、最終的には様々な種類の高分子の交差結合（crossbinding）をもたらす様々な反応を提供する、酵素の利用を開示している。
【００１４】
例えば、特許文献９は、特に、高分子ゲルの調製のための酵素触媒法におけるフェノール性ヒドロキシル単位及びジオキシゲナーゼを含む高分子の使用を開示している。
【００１５】
非特許文献１０は、グルコースオキシダーゼを使用する重合されたＰＥＧ系ハイドロゲルの調製を報告している。グルコースオキシダーゼは、β−Ｄ−グルコースの酸化を触媒し、フラビンアデニンジヌクレオチド酵素補因子を生成するための後の酸素の使用によってＨ２Ｏ２が形成される。第一鉄イオンとこの酵素的なＨ２Ｏ２産生とを組み合わせることにより、アクリル化モノマーと更に反応する一次ヒドロキシルラジカル種が産生される。
【００１６】
また、ハイドロゲルの調製におけるＨ２Ｏ２及びセイヨウワサビペルオキシダーゼの使用も報告されており、例えば、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５を参照されたい。
【００１７】
オキシダーゼ及びＨ２Ｏ２の使用により調製されたハイドロゲルは、Ｈ２Ｏ２が強力な酸化剤であることから一部の用途に不適切である。
【００１８】
したがって、アルギン酸ハイドロゲル、特に生体材料を固定化するのに好適なハイドロゲルの調製のため改良され、簡略化された方法が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】国際公開第８６０３７８１号
【特許文献２】米国特許第４，９９０，６０１号
【特許文献３】米国特許第５，６３９，４６７号
【特許文献４】国際公開第２００６／１０６４００号
【特許文献５】欧州特許出願公開第０９２２４５１号
【特許文献６】米国特許第６５９６３１０号
【特許文献７】国際公開第２００８／００４８９０号
【特許文献８】米国特許第６，４９７，９０２号
【特許文献９】中国特許出願公開第１０１４３９２０６号
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Smidsroed and Skjak-Braak, 1990, Trends in biotechnology, vol. 8, no. 3, pp 71-78
【非特許文献２】Mancini et al. (1999), Journal of Food Engineering 39, 369-378
【非特許文献３】Nebel, R.L., Balme, J., Saacke, R.G. and Lim. F. (1985), J. Anim. Sci. 60:1631-1639
【非特許文献４】Lim, F and Sun, A.M., (1980) Science 210: 908-9100
【非特許文献５】Torre et al. (1998), S.T.P. Pharma Sciences, 8 (4), pp. 233-236
【非特許文献６】Torre et al., (2000), Biomaterials, 21, pp. 1493-1498
【非特許文献７】Torre et al. (2002), Journal of Controlled Release, 85, pp. 83-89
【非特許文献８】Faustini et al, (2004),Theriogenology, 61, 173-184
【非特許文献９】Weber et al. (2006), Journal of Biotechnology, 123, pp. 155-163
【非特許文献１０】Johnsen et al. (2010), ACS Applied Materials & Interfaces, 2(7), pp. 1963-1972
【非特許文献１１】Kurisawa et al., (2010),  J. of Materials Chemistry, 20(26), pp. 5371-5375
【非特許文献１２】Sakai et al, (2009), Biomaterials, 30(20), pp. 3371-3377
【非特許文献１３】Sakai and Kawakami (2006), Acta Biomaterialia, 20017, 3, pp. 495-501
【非特許文献１４】Lee et al. (2009), J. of Controlled Release, 134, pp. 186-193
【非特許文献１５】Wang et al.(2010), Biomaterials, 31, pp. 1148-1157
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明の目的は、従来技術の方法の欠点を伴わないアルギン酸ハイドロゲルを調製するための改善された方法を提供することである。
【００２２】
本発明の別の目的は、生体材料を固定化するのに好適なアルギン酸ハイドロゲルの簡略化された調製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
よって、本発明は、ヒドロラーゼ及び該ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質を利用することによりそのゲル化が開始され、Ｈ３Ｏ＋の形成、及び後の二価陽イオン放出剤の存在に起因する二価陽イオンの放出をもたらす、アルギン酸ハイドロゲルに関する。
【００２４】
本発明の１つの態様によれば、アルギン酸ハイドロゲルの調製する方法であって、ヒドロラーゼを含む溶液と、該ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質を含む溶液とを混合することを含み、ここで、上記ヒドロラーゼを含む溶液、又は該ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質を含む溶液は、アルギン酸塩及び二価陽イオン放出化合物を更に含む、方法が提供される。２つの溶液の混合により、基質のヒドロラーゼへの結合が該基質の加水分解、及び後のＨ３Ｏ＋の形成をもたらす。さらに、Ｈ３Ｏ＋の産生は、二価陽イオンの放出をもたらし、それによってハイドロゲルの形成を開始する。
【００２５】
１つの実施の形態によれば、ヒドロラーゼを含む溶液中に二価陽イオン放出化合物及びアルギン酸塩が存在する。別の実施の形態によれば、二価陽イオン放出化合物及びアルギン酸塩は、上記基質を含む溶液中に存在する。
【００２６】
上記ヒドロラーゼは、リパーゼ等のエステラーゼであり得る。本発明の１つの実施の形態によれば、本発明による方法において使用されるヒドロラーゼは、トリアシルグリセロールリパーゼである。
【００２７】
本発明の更に別の実施の形態によれば、二価陽イオン放出化合物は、Ｃａ２＋、Ｂａ２＋、及びＳｒ２＋からなる群より選択される二価陽イオンを放出する。
【００２８】
本発明の別の実施の形態によれば、二価陽イオン放出化合物は、例えば炭酸カルシウム等のカルシウム放出化合物である。
【００２９】
本発明の更に別の実施の形態によれば、基質は有機酸のエステルである。
【００３０】
本発明の更に別の実施の形態によれば、トリアシルグリセロールリパーゼを含む溶液と、該ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質を含む溶液とを混合する工程を含み、基質が下記式Ｉで示す化合物であり、上記リパーゼを含む溶液又は下記式Ｉの化合物を含む溶液が、アルギン酸塩及び二価陽イオン放出化合物を更に含む、方法が提供される。
【化１】
2014533958.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立して、同一又は異なって、直鎖又は分岐鎖、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル鎖を表す）
１つの実施の形態によれば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、独立して、同一又は異なって、直鎖、非置換のＣ１〜Ｃ３アルキルカルボニル鎖等の直鎖、非置換のＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル鎖を表す。
【００３１】
本発明の更なる実施の形態によれば、式ＩのＲ１、Ｒ２、及びＲ３は、同一又は異なって、直鎖又は分岐鎖、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ３アルキルカルボニル鎖を表す。
【００３２】
本発明の１つの実施の形態によれば、式ＩのＲ１、Ｒ２、及びＲ３は、メタノン、エタノン、アセトン、ブタノン、ペンタノン、ヘキサノン、ヘプタノン、オクタノン、ノナノン、デカノン、又はドデカノンからなる群より選択される。
【００３３】
具体的には、例えば、精子がアルギン酸ハイドロゲルに包埋される場合、基質は、トリアセチン、トリプロピオニン及びトリブチリン、好ましくはトリプロピオニン及びトリブチリンからなる群より選択され得る。
【００３４】
本発明の別の実施の形態によれば、ヒドロラーゼを含む溶液、又は該ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質を含む溶液は、アルギン酸ハイドロゲル中に包埋される目的物を更に含んでもよい。
【００３５】
アルギン酸ゲルに包埋される目的物は、本発明の１つの態様によれば、生体材料、例えば精子等の細胞材料であってもよい。
【００３６】
本発明の１つの実施の形態によれば、精子を含むアルギン酸ハイドロゲルを調製する方法であって、
ｉ）トリアシルグリセロールリパーゼを含む溶液で精子を希釈することにより第１の溶液を形成する工程と、
ｉｉ）工程ｉ）で得られた第１の溶液に、アルギン酸塩、二価陽イオン放出化合物、及び下記式Ｉで示す化合物を含む第２の溶液を添加するとともに、ゲル化を開始する工程と、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた溶液をアルギン酸ハイドロゲルのゲル化用容器に移す工程と、
ｉｖ）任意に、ｉｉｉ）のアルギン酸ハイドロゲルを凍結保存に供する工程と、を含む、方法が提供される。
【化２】
2014533958.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立して、同一又は異なって、直鎖又は分岐鎖、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル鎖を表す）
【００３７】
本発明の更に別の実施の形態によれば、精子を含むアルギン酸ハイドロゲルを調製する方法であって、
ｉ）下記式Ｉで示す化合物を含む溶液で精子を希釈することによって第１の溶液を形成する工程と、
ｉｉ）工程ｉ）で得られた溶液に、アルギン酸塩、二価陽イオン放出化合物、及びトリアシルグリセロールリパーゼを含む第２の溶液を添加するとともに、ゲル化を開始する工程と、
ｉｉｉ）ｉｉ）で得られた溶液をアルギン酸ハイドロゲルのゲル化用容器に移す工程と、
ｉｖ）任意に、ｉｉｉ）のアルギン酸ハイドロゲルを凍結保存に供する工程と、
含む、方法が提供される。
【化３】
2014533958.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立して、同一又は異なって、直鎖又は分岐鎖、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル鎖を表す）
【００３８】
１つの実施の形態によれば、ｉ）及びｉｉ）の第１の溶液及び第２の溶液は凍結保護物質を更に含み、ｉｉｉ）で得られた溶液は更に凍結保存に供される。さらに、以上に述べたように、本発明による精子を含むアルギン酸ハイドロゲルを調製する場合、ｉｉｉ）で得られた容器は、更に凍結保存に供されてもよく、ここで、工程ｉ）及び／又は工程ｉｉ）の溶液は凍結保護物質を含む。
【００３９】
本発明のこの実施の形態による工程ｉ）及び／又は工程ｉｉ）の溶液に存在する凍結保護物質は、グリセロール、エチレングリコール、メタノール、ＤＭＡ、ＤＭＳＯ、プロピレングリコール、トレハロース、グルコースからなる群より選択され得る。
【００４０】
本発明による精子を含むアルギン酸ハイドロゲルを調製する場合、二価陽イオン放出化合物は、好ましくは炭酸カルシウムであってもよく、ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質は、好ましくはトリアセチン、トリプロピオニン及びトリブチリンからなる群より選択され得る。
【００４１】
本発明の１つの実施の形態によれば、アルギン酸塩はグルロン酸が豊富なアルギン酸塩である。
【００４２】
本発明の別の態様によれば、本発明により調製されるアルギン酸ハイドロゲルが提供される。
【００４３】
本発明の１つの実施の形態において、本発明によるアルギン酸ハイドロゲルは、
ａ．アルギン酸塩と、
ｂ．任意に、アルギン酸ハイドロゲルに包埋される目的物と、
ｃ．アルギン酸ハイドロゲルの調製に使用されるヒドロラーゼと、
を含み得る。
【００４４】
本発明によるアルギン酸ハイドロゲルは、アルギン酸塩のゲル化により形成され、ゲル化は、ヒドロラーゼ基質の加水分解の結果として二価陽イオン放出化合物から二価陽イオンが放出されることによって達成される。よって、形成されたハイドロゲルは、ゲルの形成に使用されたヒドロラーゼを含む。よって、本発明によるハイドロゲル中のヒドロラーゼの存在は、本発明の方法が適用されたことを示す。
【００４５】
別の実施の形態によれば、本発明によるアルギン酸ハイドロゲルは、包埋した目的物を含む。別の実施の形態によれば、包埋される上記目的物は、細胞材料、例えば、精子等の生体材料である。
【００４６】
本発明の更に別の態様によれば、ヒドロラーゼの入った１つの容器と、該ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質の入った第２の容器とを含むアルギン酸ハイドロゲルキットが提供される。
【００４７】
本発明のこの態様によれる１つの実施の形態は、ヒドロラーゼを含む溶液の入った１つの容器と、アルギン酸塩、二価陽イオン放出化合物及び該ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質を含む溶液の入った第２の容器とを含む、アルギン酸ハイドロゲルキットに関する。
【００４８】
この態様の更に別の実施の形態は、ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質を含む溶液の入った１つの容器と、アルギン酸塩、二価陽イオン放出化合物及びヒドロラーゼを含む溶液の入った第２の容器とを含む、アルギン酸ハイドロゲルキットに関する。
【００４９】
最後に、本発明は、アルギン酸ハイドロゲルの調製におけるヒドロラーゼ及び該ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質の使用を提供する。１つの実施の形態によれば、この態様により使用される酵素は、リパーゼ、例えばトリアシルグリセロールリパーゼ等のエステラーゼである。
【００５０】
この態様の１つの実施の形態によれば、本発明は、生体材料、好ましくは精子を包埋するアルギン酸ハイドロゲルの調製におけるヒドロラーゼ及び基質の使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
発明の詳細な説明：
本発明は、様々な領域の用途に有用なアルギン酸ハイドロゲルを調製するための新規な方法を提供する。特に、本発明は、生体材料を包埋し固定化するのに特に有用なハイドロゲルを調製する新規な方法を提供する。
【００５２】
本発明によるハイドロゲルを調製するのに、様々な種類のアルギン酸塩を使用することができる。グルロン酸：マンヌロン酸の比は重要ではなく、すなわち、所望の強度特性、安定特性、膨潤特性、浸食特性等に応じて、アルギン酸塩の種類、及びグルロン酸対マンヌロン酸の含有量が選択され得る。例えば、高Ｇアルギン酸塩の使用は、より強い、より安定なハイドロゲルを提供する。
【００５３】
１つの実施形態によれば、ハイドロゲルを形成するために使用されるアルギン酸塩は、グルロン酸に富むアルギン酸塩である。本明細書で使用される「グルロン酸に富むアルギン酸塩」又は「高Ｇアルギン酸塩」の用語は、使用するアルギン酸塩の多糖高分子鎖中にマンヌロン酸に比べて多量のグルロン酸を含むアルギン酸塩を意味する。逆に、本明細書で使用される「高Ｍアルギン酸塩」又は「マンヌロン酸に富むアルギン酸塩」の用語は、グルロン酸に比べて多量のマンヌロン酸を含むアルギン酸塩を意味する。多量のマンヌロン酸又はグルロン酸のいずれかを含むアルギン酸塩それぞれと関連して使用される「高（rich）」の用語は、当業者によく知られており、一般的に使用され、例えば、Britt Iren Glaerum Svanem et al Journal of Biological Chemistry  Vol 276,  No 34,  Aug 24 2001  pp31542-31550、Sumita Jain et al Molecular Microbiology (2003) 47(4),  pp1123-1133、非特許文献２、Applied and Environmental Microbiology, Sept 1982, Vol. 44 No.3  pp754-756、特許文献３、米国特許出願公開第２００６／０１５９８２３号、Ji Minghou (M. H. Chi) et al Hydrobiologia 116/117 (1984), pp554-556を参照されたい。
【００５４】
本発明により使用される好適なアルギン酸塩型の非限定的な例は、ノルウェー、ドランメンのFMC Biopolymer ASから入手可能なＦＭＣ  ＬＦ  １０／４０、ＦＭＣ  ＬＦ  １０／６０及びＦＭＣ  ＬＦ  ２０／６０、ノルウェー、オスロのSigmaから入手可能なＡ２０３３、又は例えばノルウェー、サンヴィカのNovaMatrixから入手可能なＰｒｏｎｏｖａ  ＵＰ  ＭＹＧアルギン酸塩、Ｐｒｏｎｏｖａ  ＵＰ  ＬＶＧアルギン酸塩である。
【００５５】
本発明によるアルギン酸ハイドロゲルの機能は、形成されたハイドロゲルの三次元形状とは独立しており、すなわち、アルギン酸ハイドロゲルは、例えば球状又は円柱状等の種々の形状を有し得る。アルギン酸ゲルの様々な形状は、ゲル化に使用する容器に応じて得ることができる。
【００５６】
また、酵素及び基質に供された際にハイドロゲルからの二価陽イオンの放出をもたらす他の高分子を、本発明により使用することもできる。
【００５７】
本発明によれば、酵素、すなわちヒドロラーゼをそれに対する好適な基質と共に使用し、アルギン酸塩のゲル化を開始する。本明細書で使用される「ヒドロラーゼ」の用語は、基質（複数の場合もあり）を含む溶液とヒドロラーゼを含む別の溶液とを混合する際にＨ３Ｏ＋を産生することを可能にするヒドロラーゼを包含することを意味する。本発明の１つの実施形態によれば、ヒドロラーゼはリパーゼである。本発明の更に別の実施形態によれば、リパーゼはアシルヒドロラーゼであり、より好ましくは、例えば酵母カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）から単離されたトリアシルグリセロールリパーゼ等のトリアシルグリセロールリパーゼである。好適なリパーゼは、Sigma-Aldrich Co. LLC（Ｌ１７５４−Ｔｙｐｅ  ＶＩＩ又はＬ３００１  Ｔｙｐｅ  Ｉ、ＣＡＳ番号９００１−６２−１）から入手可能である。
【００５８】
その基質の加水分解の際にＨ３Ｏ＋純産生をもたらす任意のヒドロラーゼが、本発明により使用され得ることが理解される。よって、使用され得るヒドロラーゼは、カルボン酸エステルヒドロラーゼ、グリコシダーゼ及びケトン物質の炭素−炭素結合に作用する酵素からなる群より選択され得る。
【００５９】
カルボン酸エステルヒドロラーゼの非限定的な例は、カルボキシルエステラーゼ、トリグリセロールリパーゼ、アセチルエステラーゼ、ステロールエステラーゼ、Ｌ−アラビノノラクトナーゼ、グルコノラクトナーゼ、アシルグリセロールリパーゼ、ｇ−アセチルグルコースデアセチラーゼ、リポタンパク質リパーゼ、脂肪酸アシルエチルエステルシンターゼ、及びジアシルグリセロールアシルヒドロラーゼである。
【００６０】
ケトン物質中の炭素−炭素結合に作用するヒドロラーゼの非限定的な例は、アシルピルビン酸ヒドロラーゼ（acylpyruvate hydrolase）及びアセチルピルビン酸ヒドロラーゼである。
【００６１】
グリコシダーゼの非限定的な例は、ａ−ガラクツロニダーゼである。
【００６２】
本発明によりアルギン酸ゲルを形成する場合、ヒドロラーゼ及びその基質は異なる溶液中に存在し、混合によってゲル化プロセスの開始がもたらされ、この２つの溶液のうち１つはアルギン酸塩及び二価陽イオン放出化合物を更に含む。混合の順序、すなわち、酵素を含む溶液を、基質を含む溶液に添加するのか、若しくはその逆であるのか、又は酵素を含む溶液にアルギン酸塩及び二価陽イオン放出化合物を更に含ませるのか、若しくはその逆であるのかは、重要ではない。
【００６３】
本発明によるアルギン酸ハイドロゲルの形成において使用される基質は、酵素への結合によってＨ３Ｏ＋の産生をもたらす基質である。よって、基質は、本発明により使用されるヒドロラーゼの種類に応じて変化し得る。
【００６４】
本発明による好適な基質は、カルボン酸等の有機酸のエステルである。
【００６５】
本発明の１つの実施形態によれば、基質は式Ｉ：
【化４】
2014533958.tif 000005
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立して、同一又は異なって、直鎖又は分岐鎖、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル鎖、例えば、メタノン、エタノン、アセトン、ブタノン、ペンタノン、ヘキサノン、ヘプタノン、オクタノン、ノナノン、デカノン、ドデカノン等を表す）の化合物である。１つの実施形態によれば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれメタノンである。１つの実施形態によれば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれエタノンである。さらに別の実施形態によれば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はアセトンである。式Ｉの基質は、本発明によるヒドロラーゼとしてトリアシルグリセロールリパーゼを使用してアルギン酸ハイドロゲルを形成する場合に特に有用である。
【００６６】
一次希釈液に存在する酵素への結合により、上記式Ｉのエステルはグリセロールとカルボン酸とに分割され、すなわち、そのようにしてＨ３Ｏ＋を提供する。
【００６７】
アルキルカルボニル鎖は、分岐鎖あってもよく、又は非分岐鎖であってもよい。さらに、アルキルカルボニル鎖は、置換されていてもよく、又は非置換であってもよい。当業者であれば、式Ｉによって包含される様々な基質を使用することができ、本明細書の教示に基づき、本明細書により使用される適切な基質を選択し得ることを認めるであろう。よって、当業者であれば、アルキル鎖の長さを、基質のグリセロール及びカルボン酸を産生する酵素の能力に影響を及ぼすことなく変化させることができ、そのようにしてＨ３Ｏ＋イオンの放出がもたらされることを認めるであろう。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態によれば、基質は、下記式のトリアセチン、トリプロピオニン及びトリブチリンの群より選択される。
【化５】
2014533958.tif 000006
【００６９】
よって、１つの実施形態よれば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はＣ１〜Ｃ４のアルキルカルボニルを表す。
【００７０】
本発明の更に別の実施形態によれば、存在する基質は、トリプロピオニン及びトリブチリンからなる群より選択される。
【００７１】
本発明によれば、上記に規定されるヒドロラーゼ及び基質の混合は、Ｈ３Ｏ＋の産生をもたらす。さらに、上記Ｈ３Ｏ＋は、二価陽イオン放出剤からの二価陽イオンの放出をもたらす。「二価陽イオン放出剤」の用語は、例えば、Ｃａ２＋、Ｂｒ２＋又はＳｒ２＋の放出をもたらす化合物を包含することを意味する。
【００７２】
本発明の１つの実施形態によれば、二価陽イオン放出剤は、ＣａＣＯ３、ＢｒＣＯ３又はＳｒＣＯ３等の炭酸塩（carbonate salt）である。好ましい実施形態によれば、二価陽イオン放出剤は、例えば炭酸カルシウム等のカルシウム放出剤である。
【００７３】
本発明の１つの実施形態によれば、本発明の方法は、ハイドロゲルの高分子マトリクス中に様々な材料を包埋するために提供される。本明細書で使用される「包埋する（embed）」又は「包埋している（embedding）」の用語は、本発明のアルギン酸ハイドロゲル中に材料を固定化するものとして理解されるべきであり、ここで、（ハイドロゲルが、高分子ネットワークを含まない液体コアの周囲に壁を形成するカプセル封入とは対照的に）アルギン酸塩ネットワークはハイドロゲルの全直径を通して存在する。
【００７４】
「生体材料」の用語は、生体適合性ハイドロゲルにおける固定化又はカプセル封入に好適な任意の種類の生体材料を包含すると理解される。生体材料の非限定的な一覧は例えば、例えばインスリン産性細胞、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、又は人工授精及び他の生殖工学に利用される精子等の移植用細胞である。
【００７５】
包埋される材料が精子である場合、包埋により、精子が生得的な運動能力を有することが阻止される。固定化の程度は、機械的強度、及び例えば授精後のレシピエント動物における分解能等のアルギン酸ハイドロゲルの特性に応じて変化し得る。
【００７６】
１つの好ましい実施形態によれば、本方法により固定化される生体材料は精子である。本発明により調製されたアルギン酸ハイドロゲル中に固定化された精子は、任意に、液体窒素中での保存のため凍結保存され得る。本発明により調製した固定化された精子を含むアルギン酸ハイドロゲルを、アルギン酸ハイドロゲル中に好適な量の精子を固定化し、所望の大きさ、形状及び体積を有する、人工授精の手順において一般的に使用されるストロー等の容器中でゲル化することによって既製の（ready-to-use）授精一回用量で調製することができる。
【００７７】
本発明のある１つの実施形態によりハイドロゲル中に精子を包埋（固定化）するため、精子を採取した後、酵素又は基質のいずれかを含む希釈液に希釈する。上記精子の希釈溶液は、任意に、およそ４℃まで冷却される。また、精子を希釈するのに使用する溶液を、本明細書においてエクステンダー溶液（例えば、実施例１を参照）と名付ける。
【００７８】
本発明の好ましい実施形態によれば、基質又は酵素を含まないエクステンダー溶液に精子を一次希釈する。その後、二次希釈工程において基質又は酵素を添加し、ここで、使用されるエクステンダー溶液は、その後、酵素又は基質のいずれかを更に含む。
【００７９】
１つの実施形態によれば、精子に対して、ヒドロラーゼ酵素を含むエクステンダー溶液中に２度目の希釈を行う。そのようにして得られた溶液を、その後、アルギン酸塩、炭酸カルシウム、及び任意にグリセロール等の凍結保護物質、並びに希釈した精子及び酵素を含む第１の溶液中に存在する酵素に対する基質を含む第２の溶液と混合する。２つの溶液の添加及び混合により、酵素は基質に結合して酸の形成をもたらし、それによりＨ３Ｏ＋のレベルが上昇する。バッファーとして作用する炭酸カルシウムは、ｐＨの上昇を阻止してＣａ２＋の放出とＣＯ２の産生をもたらす。Ｃａ２＋の放出は、アルギン酸塩の多糖鎖の交差結合をもたらし、それによりアルギン酸ハイドロゲルの形成がもたらされる。
【００８０】
また、精子は、本発明により使用される酵素によって加水分解可能な基質を含むエクステンダー溶液に希釈し、その後それを、酵素、炭酸カルシウム、及び任意に凍結保護物質を含む第２の溶液と混合してもよいことが理解される。
【００８１】
よって、精子は、エクステンダー溶液で最初に希釈され、その後、更に基質を含む更なるエクステンダー溶液を添加することによって二次希釈に供され得る。そのようにして得られた溶液は、その後、酵素、アルギン酸塩、炭酸カルシウム、及び任意にグリセロール等の凍結保護物質を含む溶液と混合され得る。２つの溶液の混合により、ゲル化が開始される。
【００８２】
精子を希釈するために使用される溶媒の温度、及び更なるゲル形成工程の温度は、例えば、精子の種類及び供給源に応じて変化し得る。よって、本発明の方法は、冷蔵条件又は室温（例えば、２０℃〜４０℃）又は例えば３０℃〜３５℃等の一層高い温度で実施され得る
【００８３】
本発明の方法は、使用する酵素の量を変化させることによってゲル化プロセスの速度を制御することを可能とする。さらに、使用するアルギン酸塩の濃度は、形成されるハイドロゲルの機械的特性に影響を及ぼすことから、ハイドロゲルの溶解特性にも影響を及ぼす。よって、アルギン酸塩の濃度は、所望のハイドロゲルの特性に応じて、またハイドロゲルの適用領域に応じて変化し得る。当業者であれば、本明細書の教示に基づき、所望のゲル強度及び所望のゲル化時間を得るために、酵素、基質及びアルギン酸塩の好適な使用量を選択することができる。
【００８４】
例えば、本発明による２つの溶液を混合した後に得られる精子／アルギン酸塩溶液１リットル当たり３ｇのトリアシルグリセロールリパーゼ、及び１００ｍｌ当たり０．３ｇ〜１ｇの基質の使用は、溶液が約４℃で維持された場合に約２時間〜３時間のゲル化時間をもたらす。さらに、基質の量は、使用する酵素の種類によって変化し得る。
【００８５】
さらに、２つの溶液を混合する際の酸の量及びそれにより産生されるＨ３Ｏ＋の量は、第２の希釈液に存在する基質の量によって制御され得る。このことから、上記方法のゲル加速度及び最終ｐＨの両方を制御することが可能であり、これは産業的な見地から有利である。酵素又は基質のいずれかを含むエクステンダー溶液に希釈した精子を混合する際にゲル化が始まることから、いつでも生産の観点から好適なゲル化を行うことができる、改善されたより容易な生産方法が提供される。
【００８６】
生体材料の包埋のため、混合される溶液は例えば、例えば抗体、エクステンダー、抗酸化剤、バッファー等の保存目的に有用な化合物を更に含んでもよいことが理解される。特許文献７を参照されたい。
【００８７】
本発明によるアルギン酸ハイドロゲルに包埋される生体材料、例えば生細胞の濃度は、材料の種類／供給源に応じて変化し得る。精子を包埋する場合、濃度は、品種、レシピエント動物、授精技術、追加の化合物の存在（例えば、保存目的のため）等に応じて更に変化する場合がある。例えば特許文献７を参照されたい。
【００８８】
本発明は、細胞又は組織の形態の生体材料をアルギン酸ゲルに包埋するために特に有用であるが、本発明により調製されたアルギン酸ゲルは、生体材料以外の他の目的物の包埋又は固定化を含む他の用途範囲、またハイドロゲル自体を含む用途をも有することが理解される。よって、本発明は、本明細書中の実施例に具体的に開示される用途に限定するものと解釈されるものではない。
【００８９】
よって、他の対象となる目的物もまた、本発明によって調製されたアルギン酸ハイドロゲルに包埋され得る。本明細書で使用される「アルギン酸ハイドロゲルに包埋される目的物」の用語は、ハイドロゲルに固定化されるのに好適な任意の材料を包含することを意味する。例えば、本発明によるアルギン酸ハイドロゲルが、放出制御システムとして使用される場合、包埋される目的物は薬学的活性成分であってもよい。例えば、本発明によって調製されるアルギン酸ゲルは、薬学的活性成分等の広範な化合物に対する放出制御又は徐放性送達システムとして使用されてもよい。例えば、国際公開第９８／４６２１１号、米国特許第ＵＳ４，６９５，４６３号、米国特許第６，６５６，５０８号（引用することにより本明細書の一部となる）を参照されたい。本発明によりアルギン酸ハイドロゲルに包埋される薬学的活性成分の非限定的な群は、例えば、成長因子、ホルモン、抗体、インターフェロン、インターロイキン等の組換え若しくは天然由来のタンパク質若しくはポリペプチド、天然若しくは合成若しくは半合成の化合物である。また、本発明によるアルギン酸ハイドロゲルは、食品産業における、例えば栄養素の包埋に対する有用性も有し得る。
【００９０】
また、本発明により調製されたハイドロゲルは、それ自体を他の産業目的、製薬産業若しくは化粧品産業（例えば、増粘剤として、創傷被覆材において、口腔衛生製品及び方法において）の両方、又はヒト及び動物の食品産業（例えば、再構成食品の調製において、増粘剤として等）において使用され得る。
【００９１】
本発明は、従来技術と比較して利益を提供する。例えば、特許文献８に記載される技術を使用する場合、反応速度及び酸の産生量は、ＧＤＬの濃度を変化することにより影響を受け得る。しかしながら、ＧＤＬ濃度の変化は、同時に、酸の産生量、ひいてはゲルの最終ｐＨにも影響を与える。ゲル化を開始するのに酵素及び該酵素によって加水分解可能な基質を使用するアルギン酸ハイドロゲルの調製は、反応速度及び最終ｐＨを、酵素及び基質の濃度を各々変化させることによって個別に制御することができることから、反応速度及び酸の産生量（ゲルのｐＨ）の顕著に良好な制御を可能にする。
【００９２】
本発明の更に別の態様によれば、本発明は、ヒドロラーゼの入った容器と、該ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質の入った別の容器とを含むアルギン酸ハイドロゲルキットを提供する。また、本発明によるキットは、本発明によるアルギン酸ハイドロゲルをキャスティングするのに必要な他の化合物を含んでもよい。よって、上記キットは、アルギン酸塩及び二価陽イオン放出化合物も含み得る。上記化合物は、ヒドロラーゼの入った容器、該ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質の入った容器に含まれてもよく、又はそれらは別々の容器（複数の場合もあり）に含まれてもよい。
【００９３】
また、容器は、本発明のキットを使用してキャストされるアルギン酸ハイドロゲルの使用に応じて、具体的な対象となる他の化合物を含んでもよい。
【００９４】
例えば、キットが、細胞材料、例えば、精子等の生体材料を含むゲルをキャスティングするために使用され、得られるアルギン酸ハイドロゲルが更に凍結保存に供される場合、上記キットは、例えばグリセロール、エチレングリコール、メタノール、ＤＭＡ、ＤＭＳＯ、プロピレングリコール、トレハロース、グルコース等の凍結保護物質を更に含んでもよい。上記凍結保護物質（複数の場合もあり）は、ヒドロラーゼの入った容器、該ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質の入った容器に含まれてもよく、又はそれらは別々の容器（複数の場合もあり）に含まれてもよい。
【００９５】
また、キットは、当業者に既知の、例えば抗生物質、エクステンダー、抗酸化剤、バッファー等の保存目的に有用な他の化合物を含んでもよい。例えば、特許文献７を参照されたい。
【００９６】
説明するのに、以下の実施例を提示する。下記実施例は本発明の範囲を限定するものとして解釈されるものではないことが理解される。上記本発明の様々な実施形態の説明は、本発明の概略的な特徴を明らかにするものであり、当業者であればハイドロゲルの領域の一般的な知識を適用することによって、過度な実験を伴うことなく、本発明の一般概念及び同封された特許請求の範囲から逸脱することなく、容易に本発明の方法を改変し及び／又は適合させるであろう。よって、かかる適合又は改変は、本明細書に提示される教示及び指針に基づき、開示される実施形態と均等な意味の範囲内であることが意図される。本明細書で使用される専門用語は、説明目的のためであって限定を目的とするものではないことが理解される。よって、本明細書の専門用語は、当業者の知識と組み合わせ、本明細書に提示される教示及び指針に照らして当業者により解釈されるものである。
【実施例】
【００９７】
実施例１：ウシ精子の固定化
材料及び方法
材料
以下の化学物質を使用した：Sigma（アメリカ、セントルイス）よりトリズマ塩酸塩及びＥＤＴＡ、Riedel de Haeen（ドイツ、ゼールツェ）よりＮａＨＣＯ３、ＮａＣｌ、グリセロール（９９％超）、クエン酸ナトリウム及びピルビン酸ナトリウム、Norsk Medisinaldepot（ノルウェー、オスロ）よりフルクトース及びグルコース一水和物、KSL staubtechnik gmbh（ドイツ、ラウインゲン）より炭酸カルシウム、並びにFMC Biopolymer A/S（ノルウェー、ドランメン）よりアルギン酸ナトリウム（ＰＲＯＴＡＮＡＬ  ＬＦ  １０／６０）。
【００９８】
精子の供給源
ノルウェー、トロンハイムのハルシュタインガード及びシュタンゲのストーレリーのGeno施設でウシ精子を採取した。
【００９９】
バッファー溶液
以下のエクステンダー溶液を使用した：
【０１００】
精子の一次希釈用エクステンダー：１．４５ｇ／ｌのトリズマ塩酸塩グルコース、０．４ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム、１ｇ／ｌのフルクトース、０．２２ｇ／ｌのピルビン酸ナトリウム、及び２００ｍｌ／ｌの卵黄。ＮａＯＮを添加して溶液のｐＨを６．４に調整した。
【０１０１】
精子の二次希釈用エクステンダー溶液：４ｇ／ｌの炭酸カルシウム（別段の指定がない限り）、５４ｇ／ｌのフルクトース、１７０ｇ／ｌのグリセロール及び２４ｇ／ｌのＬＦ１０/６０アルギン酸ナトリウム。いずれのエクステンダーもＥＵ  ｄｉｒ  ８８／４０７で要求される最終濃度を少なくとも与える標準抗生物質カクテルを含有する。改変ＩＶＴ：３ｇ／ｌのグルコース、２０ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム、２．１ｇ／ｌのＮａＨＣＯ３、１．１６ｇ／ｌのＮａＣｌ、３ｇ／ｌのＥＤＴＡ（ｐＨ７．３５）。エクステンダー溶液に以下に規定される酵素（Ｓｉｇｍａ  Ｌ１７５４）又は基質のいずれかを添加した。
【０１０２】
ウシ精子の希釈、固定化及び凍結保存
ウシ精子をGeno施設で採取し、以下に記載の通り希釈した：採取の直後、一次希釈用エクステンダー溶液中１ｍｌ当たり２１９×１０６細胞の濃度まで精子を希釈した。その後、この溶液を直ちに等容量の更なる希釈用エクステンダーと混合した。ここでは上記エクステンダー溶液は、酵素又は基質のいずれかを含んでいた。その後、得られた希釈した精子を含有する溶液を４℃まで冷却した。４℃まで冷却した後、溶液を等容量の三次希釈用エクステンダー溶液と混合した。ここでは上記エクステンダーは、前工程由来の希釈された精子が酵素を含んでいた場合にはいずれかの基質（トリアセチン、トリプロピオニン又はトリブチリン）を含み、又は前工程由来の希釈された精子が基質を含んでいた場合には酵素を含んでいた。さらに、上記エクステンダーは、この時、二価陽イオン放出化合物として炭酸カルシウムと、アルギン酸塩とを含んでいた。その後、得られた溶液を授精ストローに移し、４℃にておよそ３時間平衡化させた。その後、授精ストローをＮ２冷凍庫に移し、ウシ精液用の標準的手順に従って凍結した。
【０１０３】
運動性の評価
精子の運動性を顕微鏡的判定により評価した。凍結した精液ストローを３７℃のウォーターバスに３０秒間保持することによって解凍した。測定前に改変ＩＶＴ溶液でアルギン酸ゲルを液化した。授精ストローの内容物を０．９ｍｌのＩＶＴ溶液に添加し、およそ１０分間チューブタンブラー上で注意深く振盪した。運動性の評価の前に、チューブを３７℃のヒートブロックにおいて最低１５分間予熱した。およそ３μｌの溶液を予熱した顕微鏡スライドに添加し、光学顕微鏡を使用して直ちに検査した。各試料中の運動性精子の数を最近傍５％間隔と推定した。実質的に可能であれば、評価中、オペレータは試料の属性について知らされていなかった。
【０１０４】
結果
ａ）基質としてトリアセチンを使用するウシ精子の固定化
上記手順に従って精子を回収し、希釈した。二次希釈用エクステンダー溶液に、精子を含有する最終溶液中６ｇ／ｌの濃度まで酵素（Ｓｉｇｍａ  Ｌ１７５４）を添加した。三次希釈用エクステンダー溶液は８ｇ／ｌの炭酸カルシウムを含有し、そこに０．５ｇ／１００ｍｌの濃度までトリアセチンを添加した。二次希釈のおよそ４時間後、精子を固定化したゲルが形成された。４℃でのおよそ２４時間の保存の後、ゲルを液化し、固定化した精子の運動性を評価した。その際、およそ６０％の精子が運動性であった。
【０１０５】
ｂ）トリプロピオニンを基質として使用するウシ精子の固定化
上記手順に従って精子を回収し、希釈、固定化して凍結保存した。二次希釈用エクステンダー溶液に、希釈した精子を含有する最終溶液中６ｇ／ｌの濃度まで酵素（Ｓｉｇｍａ  Ｌ１７５４）を添加した。三次希釈用エクステンダー溶液は４ｇ／ｌの炭酸カルシウムを含有し、そこに０．３０ｇ／１００ｍｌの濃度までトリプロピオニンを添加した。二次希釈のおよそ３時間後、ゲルが形成され、固定化した精子を含むストローを凍結した。精液ストローを、解凍して運動性を評価するまで液体Ｎ２中で数日保存した。解凍及びゲルの液化後、およそ６０％の精子が運動性であった。
【０１０６】
ｃ）トリプロピオニンを基質として使用するウシ精子の固定化
上記手順に従って精子を回収し、希釈し、固定化して凍結保存した。二次希釈用エクステンダー溶液に、希釈した精子を含有する最終溶液中０．３０ｇ／１００ｍｌの濃度までトリプロピオニンを添加した。三次希釈用エクステンダー溶液は４ｇ／ｌの炭酸カルシウムを含有し、そこに６ｇ／ｌの濃度まで酵素Ｓｉｇｍａ  Ｌ１７５４を添加した。二次希釈のおよそ２時間後、ゲルが形成された。４℃でのおよそ２４時間の保存の後、ゲルを液化し、固定化した精子の運動性を評価した。その際、およそ６０％の精子が運動性であった。
【０１０７】
ｄ）トリブチリンを基質として使用するウシ精子の固定化
上記手順に従い、精子を回収し、希釈し、固定化して凍結保存した。二次希釈用エクステンダー溶液に、希釈した精子を含有する最終溶液中６ｇ／ｌの濃度まで酵素（Ｓｉｇｍａ  Ｌ１７５４）を添加した。三次希釈用エクステンダー溶液は、４ｇ／ｌの炭酸カルシウムを含有し、そこに０．３５ｇ／１００ｍｌの濃度までトリブチリンを添加した。二次希釈のおよそ３時間後、ゲルが形成され、固定化した精子を含むストローを凍結した。精液ストローを、解凍して運動性を評価するまで液体Ｎ２中で数日保存した。解凍及びゲルの液化後、およそ６０％の精子が運動性であった。
【０１０８】
実施例２  リパーゼ酵素及びトリアセチン基質又はトリオクタノエート基質を使用するアルギン酸カルシウムゲルの制御された調製
【０１０９】
材料及び方法
材料
FMC Biopolymer A/S（ノルウェー、ドランメン）よりアルギン酸ナトリウム（ＰＲＯＴＡＮＡＬ  ＬＦ  １０／６０）、Sigma（アメリカ、セントルイス）より酵素Ｌ３００１及びＬ１７５４、Sigma（アメリカ、セントルイス）よりトリアセチン及びトリオクタノエート、KSL staubtechnik gmbh（ドイツ、ラウインゲン）より炭酸カルシウム。
【０１１０】
溶液
以下の溶液を使用した。溶液Ｌ１．１：蒸留水中のＬ３００１酵素の１０ｇ／ｌ溶液、溶液Ｌ１．２：蒸留水中０．２ｇ／ｌのトリアセチン。溶液Ｌ２．１：蒸留水中４ｇ／ｌの炭酸カルシウム、２４ｇ／ｌのＬＦ１０/６０アルギン酸ナトリウム、及び０．１ｇ／ｌのトリアセチン。溶液Ｌ２．２：蒸留水中４ｇ／ｌの炭酸カルシウム、２４ｇ／ｌのＬＦ１０／６０アルギン酸ナトリウム、及び０．２ｇ／ｌのトリアセチン。溶液Ｌ２．３：蒸留水中４ｇ／ｌの炭酸カルシウム、２４ｇ／ｌのＬＦ１０／６０アルギン酸ナトリウム、及び０．３ｇ／ｌのトリアセチン。溶液Ｌ２．４：蒸留水中４ｇ／ｌの炭酸カルシウム、２４ｇ／ｌのＬＦ１０／６０アルギン酸ナトリウム、及び１０ｇ／ｌのＬ３００１酵素。溶液Ｌ２．５：蒸留水中４ｇ／ｌの炭酸カルシウム、２４ｇ／ｌのＬ１０/６０アルギン酸ナトリウム及び０．３ｇ／ｌのトリオクタノエート。
【０１１１】
ゲル化の開始
Ｌ１溶液のうちの１つと等容量のＬ２溶液のうちの１つとを混合することによってゲル化を開始した。溶液を表１に従って混合した。
【０１１２】
【表１】
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【０１１３】
混合前、全ての溶液は常温であり、ゲル化のため溶液を常温に置いた。溶液の目視検査によりゲル化反応の時間経過を追った。
【０１１４】
結果
酵素Ｌ３００１（コムギ胚芽由来リパーゼ）及びＬ１７５４（カンジダ・ルゴサ由来リパーゼ）と、基質トリアセチン及びトリオクタノエートとを、アルギン酸ナトリウム溶液の制御されたゲル化に使用した。酵素及び基質の溶液を調製し、表１に従って混合した。酵素と基質との間の反応は、溶液中に懸濁した炭酸カルシウムと反応するＨ３Ｏ＋イオンを産生する。この反応は、溶液中のアルギン酸塩高分子鎖と相互作用するカルシウムイオンを放出し、ゲルが形成される。実験においてゲルが形成される前の観察時間を表２に示す。酵素が添加されなかった実験５において、ゲルは形成されなかった。結果は、反応時間は、選択された基質及び酵素の種類、また使用した酵素及び基質の濃度の両方に依存することを示す。
【０１１５】
【表２】
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【国際調査報告】
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