(57)【要約】  本発明は、赤血球を含有するサンプルから細胞を分離する方法および組成物を提供する。本方法は、所望の細胞、赤血球および不要な細胞を含有するサンプルから所望の細胞を回収するためであって、ａ）サンプルと組成物とを接触させるステップであり、前記組成物がｉ）赤血球凝集試薬、ｉｉ）磁性粒子にカップリングしている少なくとも１つの抗原認識部分を含み、ここで前記少なくとも１つの抗原認識部分を持つ前記粒子が、１つまたは複数の不要な細胞成分に対して特異的な少なくとも１つの抗原に特異的に結合するステップと、ｂ）ｉ）赤血球の沈殿のための重力沈殿ならびに、ｉｉ）前記磁性粒子を固定し、ペレットおよび上清相を生成するための前記サンプルに対する磁場勾配を同時に適用するステップと、ｃ）上清相から所望の細胞を回収するステップとを含む方法である。本方法の範囲で使用される組成物も開示する。
2014533957.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の細胞、赤血球および不要な細胞を含有するサンプルから所望の細胞を濃縮ならびに／または回収する方法であって、
ａ）サンプルと組成物とを接触させるステップであって、前記組成物が
ｉ）赤血球凝集試薬
ｉｉ）磁性粒子にカップリングしている少なくとも１つの抗原認識部分であって、前記少なくとも１つの前記抗原認識部分を持つ前記粒子が、１つまたは複数の不要な細胞成分に対して特異的な少なくとも１つの抗原に特異的に結合する抗原認識部分
を含むステップと、
ｂ）
ｉ）赤血球の沈殿のための重力沈殿ならびに、
ｉｉ）前記磁性粒子を固定し、ペレットおよび上清相を生成するための前記サンプルに対する磁場勾配
を同時に適用するステップと、
ｃ）上清相から所望の細胞を回収するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記組成物が、ｉｉｉ）所望の細胞を修飾する１つまたは複数の細胞修飾薬剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粒子が、１００ｎｍ〜１４００ｎｍのサイズである、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの抗原認識部分が、赤血球の細胞表面の抗原および少なくとも１つの他の不要な細胞成分の細胞表面の抗原も認識する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記赤血球凝集試薬が、ヒドロキシエチルスターチ、メチルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）からなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
磁性粒子にカップリングしている前記少なくとも１つの抗原認識部分が抗体である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記粒子が、２つ以上の抗原認識部分とカップリングされ、前記２つ以上の抗原認識部分を持つ前記粒子が、異なる不要な細胞成分に特異的な少なくとも２つの抗原に特異的に結合する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ｉ）赤血球凝集試薬
ｉｉ）少なくとも１つの抗原認識部分がカップリングしている１つまたは複数の単一および／もしくは多重特異的磁性粒子のセットであって、前記少なくとも１つの抗原認識部分を持つ前記粒子が、１つまたは複数の不要な細胞成分に対して特異的な少なくとも１つの抗原に特異的に結合する磁性粒子のセット
を含む組成物。
【請求項９】
ｉｉｉ）所望の細胞を修飾する１つまたは複数の細胞修飾薬剤をさらに含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記セットが、顆粒球および血小板に対する抗原認識部分の抗原特異性を含む、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記セットが、ＣＤ２、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ３６、ＣＤ４３、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ａＩｇＥからなる群から選択される１つまたは複数の、好ましくは全ての抗原認識部分の抗原特異性を含む、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記セットが、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ１２３、ａＩｇＥからなる群から選択される１つまたは複数の、好ましくは全ての抗原認識部分の抗原特異性を含む、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記セットが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ６１、ＣＤ１２３、ＣＤ１９３、ａＩｇＥ、ａＴＣＲａｂからなる群から選択される１つまたは複数の、好ましくは全ての抗原認識部分の抗原特異性を含む、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１４】
前記セットが、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ１２３、ａＩｇＥ、ａＴＣＲｇ／ｄからなる群から選択される１つまたは複数の、好ましくは全ての抗原認識部分の抗原特異性を含む、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１５】
前記セットが、ＣＤ４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ１２３、ａＩｇＥ、ａＴＣＲｇ／ｄからなる群から選択される１つまたは複数の、好ましくは全ての抗原認識部分の抗原特異性を含む、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１６】
前記セットが、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ１２３、ａＩｇＥ、ａＴＣＲｇ／ｄからなる群から選択される１つまたは複数の、好ましくは全ての抗原認識部分の抗原特異性を含む、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１７】
前記セットが、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ１２３、ａＩｇＥ、ａＴＣＲａｂからなる群から選択される１つまたは複数の、好ましくは全ての抗原認識部分の抗原特異性を含む、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１８】
前記セットが、ＣＤ６１、ＣＤ２、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ３０４、ａＩｇＥからなる群から選択される１つまたは複数の、好ましくは全ての抗原認識部分の抗原特異性を含む、請求項８または９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、免疫学の分野、特に細胞の分離のためのプロセスおよび組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞分離方法は、研究、診断、または臨床用途を目的として科学および臨床研究室に広く普及している。細胞分離のほとんどの戦略は、サイズおよび密度など異なる物理的特性に基づいている。
【０００３】
通常は、対象の細胞（白血球）を処理する前に赤血球を取り除かなければならない。これは、様々な方法の中でも、例えば密度勾配遠心分離法、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サンプル調製または赤血球溶解を使用する細胞分離によって行うことができ、その全てが当業者に周知の方法である。
【０００４】
赤血球を除去した後に、細胞の表面抗原を認識する抗原結合部分に付着した固相粒子を使用する方法は、白血球細胞を部分母集団に分離するために利用できる。そのような方法は、磁気ビーズ（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、ドイツ製のカラム型ＭＡＣＳ技術；米国特許第５４１１８６３号、同第５５４３２８９号、同第６０２０２１０号、同第６４１７０１１号；または非カラム型：Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）を用いて、または密度ビーズの重力沈殿を利用して所望のもしくは不要な細胞集団を生体サンプルから分離する非磁気ビーズ、例えば高密度ビーズ（米国特許第６７３０２３０号、同第５５７６１８５号、同第６９０００２９号、同第６００４７４３号）、を用いて実施できる。
【０００５】
全血から直接に、細胞の正の選択を可能にするいくつかの方法、例えばＭＡＣＳ技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、ドイツ）を用いる全血マイクロビーズの使用、がある。しかし、これらの方法は少量の細胞だけに限定される。
【０００６】
多糖および合成ポリマーなどの非イオン性ポリマーは、ｉｎ  ｖｉｖｏで注入されるまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで緩衝液もしくは血漿中の赤血球懸濁液に添加されるとき、赤血球細胞、すなわち赤血球の凝集を促進する。ヒトＲＢＣ凝集を誘導するポリマーの例は、分子量６０，０００〜５００，０００のデキストラン、３６０，０００のポリビニルピロリドンおよび２０，０００のポリオキシエチレン（ＰＯＥ）である。
【０００７】
抗凝固処理血液をチューブ内で沈殿させておく場合、赤血球は、白血球細胞より先に沈殿し、白血球に富む血漿層を１時間半以上後に除去できる。赤血球の自発的に塊になる傾向により、赤血球は白血球より早く沈殿する。上述の凝集試薬の１つを添加することによって赤血球の沈殿を加速することが可能である（ＳｋｏｏｇおよびＢｅｃｋ、１９５６年、Ｂｌｏｏｄ、１１巻：４３６頁）。
【０００８】
密度勾配遠心分離法は、細胞をそれらのサイズ、形状および密度に応じて分離可能にする技術である。密度勾配は、チューブの底で高密度になる様々な密度の溶液を重層することによって遠心チューブ中に形成される。細胞は通常、比較的低い遠心分離速度でも、スクロースまたは他の不活性炭水化物の浅い勾配において分離される。
【０００９】
一般的に、不連続密度勾配遠心分離法を使用して、顆粒球および赤血球から末梢血単核細胞を単離する。例えば、いわゆるＦｉｃｏｌｌ密度分離において、全血は、ＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥ（登録商標）上に重層され、次いで遠心分離される。赤血球、顆粒球およびおよそ５０％の単核細胞は細胞ペレットへと沈殿し、一方で残り５０％の単核細胞はＦｉｃｏｌｌ血漿界面へと沈殿する。全ての密度分離技術には同じ根本的な制限があり、その技術では、リンパ球サブセットなど密度分布が重なっている細胞の部分母集団を分離することができず、時間がかかり面倒な遠心分離ステップも含む。
【００１０】
密度勾配遠心分離の後に、細胞表面抗原に対するアフィニティーを有するモノクローナル抗体を使用して、特異的細胞をさらに分離する。抗体特異的技術と密度勾配遠心分離技術を同時に使用することができる。いくつかの刊行物（米国特許第５，８４０，５０２号、同第５，６４８，２２３号、同第５，６４６，００４号、同第５，４７４，６８７号および同第７，３１６，９３２号）は、不連続密度勾配分離法を使用して所望の／不要な細胞型を選択的に標的し、ペレット化することによって正または負に選択する高密度粒子の使用について記述している。
【００１１】
ＷＯ００／７３７９４は、イムノロゼット（ｉｍｍｕｎｏｒｏｓｅｔｔｅｓ）を使用する細胞分離方法を開示している。その方法は、有核細胞および赤血球細胞を含有するサンプルと抗体組成物とを接触させるステップであって、有核細胞の、および赤血球細胞のイムノロゼット形成を可能にするステップを含む。抗体組成物は、二官能性抗体または四量体抗体複合体を含有する。ここでその概念は、（１）サンプルと、（ａ）分離しようとする有核細胞上の抗原に結合する抗体と、これが連結されている（ｂ）少なくとも１つの有核細胞および赤血球のイムノロゼット形成を可能にする条件下で赤血球に結合する少なくとも１つの抗体、を含む抗体組成物とを接触させ、（２）遠心分離によってサンプルからイムノロゼットを除去する。好ましくは、赤血球に対して特異的な抗体は、抗グリコホリンＡである。ヘタスターチのありなしでのＦｉｃｏｌｌを使用するイムノロゼットの手順は、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが公開したマニュアルに記載されている。この方法の短所は、時間がかかり面倒な遠心分離ステップを含むことである。
【００１２】
米国特許第７１６０７２３号において、血液細胞含有サンプルと細胞分離組成物とを接触させることを含む方法が開示されている。この組成物は、ｉ）デキストラン、ｉｉ）抗グリコホリンＡ抗体、およびｉｉｉ）細胞表面抗原に対する１つまたは複数の抗体である。いくつかの場合において、抗体は、この分子を固定するために基質に結合されている。血液細胞サンプルおよび分離試薬を含有する混合物は、３０〜４５分間、穏やかに混合される。凝集した細胞は、３０〜５０分間、懸濁液中に残留している凝集していない細胞と分離可能である。所望の細胞がさらなる処理ステップで利用可能になるまでに１時間より長い時間がかかるプロセスが、この方法の欠点である。加えて、不都合なことに、どちらかといえば所望の細胞の回収率が低い。
【００１３】
本発明は、上述の先行技術を考慮して行われ、本発明の目的は、全血サンプル、臍帯サンプルおよび骨髄サンプルのような生体サンプルから所望の細胞を分離し、不要な細胞を除去するために改善された方法を提供することである。
【発明の概要】
【００１４】
本発明者らは、赤血球を含有するサンプル、例えば全血、から直接細胞を分離するための磁気的な強制沈殿方法および組成物を開発した。先行技術の方法と比較して、本方法および組成物は、サンプルからの所望の細胞の分離および不要な細胞の除去を改善し、すなわち本発明のプロセスを通じて最初にサンプルから赤血球を除去する必要も面倒なサンプルの遠心分離ステップを実施する必要もなく、そのため分離しようとする細胞に対するストレスが極めて少ない非常に早い細胞分離方法になる。全体の手順が単一のステップで実施されるため、全血細胞分離プロセスは加速される。本明細書に開示される方法は、当技術分野において公知の方法より早く、そのため細胞に対するストレスが限定されるため、細胞が損傷するのを防ぐ。加えて、本発明の手順により、当技術分野において公知の方法と比較してより高い回収率および純度の細胞が得られる。
【００１５】
本発明の方法および組成物で得た細胞を使用して、例えば細胞培養、さらなる精製、診断試験または治療的投与のための細胞を効果的に調製できる。通常、本発明によって得られる所望の細胞は、自然のままの細胞であり、すなわち天然の状態である。細胞表面抗原に結合している抗体など本発明の組成物の成分と細胞とのどんな相互作用も、所望の細胞を修飾、例えば刺激しない。加えて、本発明の使用に必要な分離時間の短縮は、処理の間に細胞が通常曝されるストレスをさらに減少させる。したがって本発明は、細心の注意を払いながら所望の細胞を処理し、その後の用途にとって大切な、ストレスが最小限の細胞をもたらす。
【００１６】
驚くべきことに、同時に、（１）赤血球が、試薬（例えば連銭形成薬剤）、すなわちヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）などの赤血球凝集試薬によって凝集され、（２）１つまたは複数の細胞成分、すなわち他の血液細胞および／もしくは血小板が磁性粒子に特異的に結合され、磁性粒子に磁場勾配が適用されて、磁性粒子に結合している細胞が固定され、その結果、細胞ペレットと上清相（液体画分）が生じる場合、サンプル中の細胞の沈殿が加速されることが判明した。ペレットは、赤血球凝集試薬および細胞成分を結合した磁性粒子によって沈殿した細胞を含有する。上清相は実質的に粒子を含まず、沈殿または固定化に利用できなかった細胞を含有する。一般に、これらは所望の細胞である。したがって、サンプルの上清相を除去し、その後のステップにおいて所望の細胞のさらなる分析および／または処理に使用できる。
【００１７】
赤血球および他の細胞などの細胞成分ならびに／または血小板の同時沈殿および固定化は、それらに作用する力に対する応答である。これらの力は、例えば重力沈殿、遠心加速度および電磁気に起因し得る。各力は、単独でもまたは他の力の一方もしくは両方と組み合わせても作用することができる。好ましくは、赤血球および他の細胞などの細胞成分ならびに／または血小板の同時沈殿は、１〜２０ｘｇで、より好ましくは１〜２ｘｇで、最も好ましくは１ｘｇ、すなわち追加の遠心加速度なしで実施される。処理しようとするサンプルを含有する容器が、何もしない（すなわち振とうも遠心分離もしない）状態にあり、液体（すなわち細胞成分を含むサンプル）中の粒子または細胞を容器の底へと沈殿させておく場合、１ｘｇでの重力沈殿が起こる。任意のバリアントにおいて、赤血球は、白血球細胞より先に沈殿する。
【００１８】
細胞の迅速な沈殿のために遠心力を用いる必要性がないことが、本発明の利点である。好ましくは、本方法は、重力沈殿（１ｘｇ）と磁力だけを適用する相乗効果を利用する。好ましくは、磁気供給源は、処理しようとするサンプルを含有する容器の側面に位置する。この配置は、細胞に作用する２つの力を生じ、１つは底への重力沈殿、もう１つは処理しようとするサンプルを含有する容器の側面への磁力である。しかし、磁気供給源（単数）または供給源（複数）の位置を変化させて、細胞に作用する力を異なる方向にすることができる。
【００１９】
加えて予想外なことに、同時に、（１）赤血球が、ＨＰＭＣ−１５などの赤血球凝集試薬によって凝集され、（２）１つまたは複数の不要な細胞成分が、１００〜１４００ｎｍのサイズを有する磁性粒子に特異的に結合され、磁性粒子に磁場勾配が適用されて、磁性粒子に結合している細胞が固定される場合、サンプル中の細胞の沈殿が加速されることが判明した。
【００２０】
加えて驚くべきことに、細胞ペレットの形状は、磁性粒子にカップリングされる抗原認識部分の選択および処理しようとするサンプルを含有する容器に対して相対的な磁気供給源の位置の選択に影響され得ることが判明した。１つまたは複数の不要な細胞成分の表面タンパク質を認識する抗原認識部分を使用するが、それが赤血球の表面タンパク質を認識しない場合、そのペレットは２つの部分に分離される。図１３に図示した通り、磁気供給源が、処理しようとするサンプルを含有する容器の側面に位置する場合、この場合、わずかな移行しか生成されない。赤血球の表面タンパク質および１つまたは複数の不要な他の細胞成分、例えばＣＤ３６、の表面タンパク質も認識する１つもしくは複数の抗原認識部分を使用することにより、沈殿および／または固定させたい全ての細胞成分の磁気的な強制沈殿が得られる。磁気供給源が、図１３に示したのと同じ方法で位置する場合、そのような条件下でペレットは指数関数曲線に似ている異なる形状を形成し、図１４に図示した通り滑らかな移行を生じる。例えばピペットを使用する場合、このまたは類似のペレット形状は、上清を除去するのに有利であり、その結果回収できる上清の容量が増加する（実施例２７）。
【００２１】
本発明の組成物は、ｉ）赤血球凝集試薬ならびにｉｉ）少なくとも１つの抗原認識部分がカップリングしている１つまたは複数の単一および／もしくは多重特異的磁性粒子のセットを含み、ここで前記少なくとも１つの抗原認識部分を持つ前記粒子が、１つまたは複数の不要な細胞成分に対して特異的な少なくとも１つの抗原に特異的に結合する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】１：１の比のモノクローナル抗体ＣＤ６１およびＣＤ１５にコンジュゲートしている異なるサイズの磁気ビーズの血小板除去効率を示す図である。
【図２】１：１の比のモノクローナル抗体ＣＤ６１およびＣＤ１５にコンジュゲートしている異なるサイズの磁気ビーズの顆粒球除去効率を示す図である。
【図３】１：１の比のモノクローナル抗体ＣＤ６１およびＣＤ１５にコンジュゲートしている２５０ｎｍ磁気ビーズの顆粒球および血小板除去効率を示す図である。
【図４】１：１の比のモノクローナル抗体ＣＤ６１およびＣＤ１５にコンジュゲートしている１４００ｎｍ磁気ビーズの顆粒球および血小板除去効率の低下を示す図である。
【図５】ＣＤ１５およびＣＤ６１抗体にコンジュゲートしている１００ｎｍ磁気ビーズコンジュゲートの顆粒球および血小板除去効率を示す図である。
【図６】ＣＤ１９抗体にコンジュゲートしている２４０ｎｍ磁性粒子コンジュゲートのＢ細胞除去効率を示す図である。
【図７】ＣＤ５６抗体にコンジュゲートしている２４０ｎｍ磁性粒子コンジュゲートのＮＫ細胞除去効率を示す図である。
【図８】磁気ビーズを多重特異的抗体にコンジュゲートさせ、実施例１、２および３に記載の手順にしたがって除去成績を評価した表である。
【図９】Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｄｅｌｓａ  Ｎａｎｏ機器での測定により、ＣＤ５６抗体にコンジュゲートしている磁性粒子コンジュゲートのサイズを決定した図である。
【図１０】液体および凍結乾燥形態で貯蔵した後の、非ＮＫ細胞抗体にコンジュゲートしている２２０ｎｍ磁気ビーズおよびＨＰＭＣを含有するＮＫ細胞キットの分離効率を示す図である。
【図１１】異なる緩衝液で再構成した、非ＮＫ細胞抗体にコンジュゲートしている２２０ｎｍ磁気ビーズおよびＨＰＭＣを含有する凍結乾燥ＮＫ細胞キットの、分離効率を示す図である。
【図１２】５０ｎｍ磁性粒子にコンジュゲートしているＣＤ１９抗体の不十分な分離効率を示す図である。
【図１３】ＣＤ３６を含まない抗体カクテルまたは赤血球の表面タンパク質を認識しないが他の不要な細胞成分のそれを認識する他の抗原認識部分が使用される場合のペレットの形状を示す図である。ペレットは、２つの部分からなる。上方部分は、磁石に引きつけられた磁気標識された細胞を含有する。下方部分は、沈殿によって分離された、磁気標識がないかまたは弱い凝集体（赤血球、血小板、細胞凝集体）を含有する。
【図１４】赤血球と他の不要な細胞成分（すなわち対象外の白血球）の両方に結合するＣＤ３６などの抗体を使用する場合、図１３の状態と比較して、赤血球および磁気標識された細胞のペレットが異なる形状を形成することを示す図である。
【図１５】磁石をチューブの底から離して置いた場合に、ペレットが２つの部分に分かれることを示す図である。上方のペレットは、磁石に引きつけられた磁気標識された細胞を含有する。下方のペレットは、磁気標識がないかまたは弱い凝集体（赤血球、血小板、細胞凝集体）を含有する。
【図１６】２つの立方形希土類磁石（８８＊２４＊１０ｍｍ）を保持するための磁石ヨークの設計図である。垂直に向けられた磁石の間に遠心チューブを置いて、細胞を分離することができる。
【図１７】１つの立方形希土類磁石（８８＊２４＊１０ｍｍ）を保持するための磁石ヨークの設計図、磁石の位置および５０ｍＬ遠心チューブを示す図である。
【図１８】ＨＰＭＣ−１５と異なるサイズの抗体カクテルコンジュゲート磁気ビーズとの組合せの沈殿速度を決定する実験（実施例２６）の結果を示す図である。
【図１９】磁性粒子にコンジュゲートした抗体カクテルと異なる赤血球凝集試薬との組合せにおいて単離されたＮＫ細胞の純度および収率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
別段の規定がない限り、本明細書で使用する技術および科学用語は、この発明が属する当業者であれば一般に理解する意味と同一である。
【００２４】
本明細書で使用される用語「細胞成分」とは、例えば、赤血球、白血球および血小板を含む、全血サンプル、末梢血サンプル、白血球分離サンプル、バフィーコートサンプル、臍帯サンプルおよび骨髄サンプルに共通の細胞を指す。特に白血球は、例えばＴ細胞、制御性Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、造血幹細胞など多くの部分母集団の細胞からなる。
【００２５】
本明細書で使用される用語「粒子」とは、コロイド粒子、微小球体、ナノ粒子またはビーズなどの固相を指す。そのような粒子を生成する方法は、当業技術分野において周知である。本発明において、粒子は磁性粒子である。実施例１６に示した通り、本発明において使用する前に、粒子は、溶液もしくは懸濁液であってよくまたは凍結乾燥された状態でもよい。その後凍結乾燥された粒子は、本発明に関して処理しようとするサンプルと接触させる前に、簡便な緩衝液で再構成される。好ましくは、粒子は、最低１００ｎｍ、最大１４００ｎｍの粒径のサイズであってよく、より好ましくは、粒子は、粒径２００〜５００ｎｍのサイズであってよい。少なくとも１つの抗原認識部分が磁性粒子にカップリングされており、ここで前記少なくとも１つの抗原認識部分を持つ前記粒子が、細胞成分に対して特異的な少なくとも１つの抗原に特異的に結合する。
【００２６】
本明細書で使用される用語「磁性粒子」における「磁性」とは、当業者に周知の方法で調製できる磁性粒子の全てのサブタイプ、特に強磁性粒子、超常磁性粒子および常磁性粒子を指す。「強磁性」物質は磁場に強く影響を受け、場が除去されたとき、磁気特性を保持することが可能である。「常磁性」物質は弱い磁化率しか有さず、場が除去されるとそれらの弱い磁性を速やかに消失する。「超常磁性」物質は非常に磁気的影響を受けやすく、すなわち磁場に置いたときには強磁性になるが、常磁性物質のようにそれらの磁性を速やかに消失する。
【００２７】
本明細書で使用される用語「赤血球凝集試薬」とは、血液細胞含有サンプル中で赤血球細胞の凝集を引き起こす、当技術分野において公知の任意の分子を指す。好ましくは、赤血球凝集試薬は、高分子量タンパク質（例えばフィブリノゲンおよび免疫グロブリン）ならびに多糖および合成ポリマーなどの非イオン性ポリマーからなる群から選択される。より好ましくは、赤血球凝集試薬は、デキストラン、ヒドロキシエチルスターチ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、メチルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）からなる群から選択される非イオン性ポリマーである。最も好ましくは、赤血球凝集試薬は、ＨＰＭＣ−１５である。
【００２８】
本明細書で使用される用語「抗原認識部分」とは、抗体または抗原結合性フラグメントを指す。本明細書で使用される用語「抗体」とは、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を指す。抗体は、修飾抗体（例えばオリゴマー、還元、酸化および標識抗体）であってもよい。用語「抗体」は、完全な分子とＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよび一本鎖抗体などの抗体フラグメントの両方を含む。加えて、用語「抗原結合性フラグメント」は、この方法において沈殿させようとする細胞の所望の標的分子に優先的に結合する任意の部分を含む。適切な部分には、所望の標的分子に結合するアプタマーとして公知のオリゴヌクレオチド（ＨｅｒｍａｎｎおよびＰａｎｔｅｌ（２０００年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９巻：８２０〜８２５頁）、炭水化物、レクチンまたは他の任意の他の抗原結合タンパク質（例えば受容体−リガンド相互作用）があるが、これに限定されない。
【００２９】
本明細書で使用される用語「単一特異的粒子」および「多重特異的粒子」とは、単一特異的粒子の場合、１つの抗原認識部分が粒子に、多重特異的粒子の場合、２つ以上の抗原認識部分が粒子にそれぞれカップリングしていることを指す。多重特異的粒子の２つ以上の抗原認識部分、例えば異なる抗体、は、それぞれ細胞の異なる部分母集団に特異的な抗原に優先的に結合する。以下において、「単一特異的粒子」および「多重特異的粒子」を、それらがカップリングする抗原認識部分によって呼ぶ。例えば、抗原ＣＤ６１およびＣＤ１５に対する抗体に結合している粒子を、「ＣＤ６１．ＣＤ１５．粒子」と呼ぶ。
【００３０】
抗ＣＤ６１抗体は血小板に結合し、抗ＣＤ１５抗体は顆粒球に結合する、すなわち、多重特異的粒子は２種類の細胞の部分母集団に結合する。抗体と粒子との間の結合は、共有結合性または非共有結合性であり得る。共有結合は、例えばポリスチレンビーズ上のカルボキシル基に対する、または修飾ビーズ上のＮＨ２もしくはＳＨ２基に対する結合であり得る。非共有結合は、例えば実施例１２に示した通りビオチン−アビジン、または抗発蛍光団抗体に連結されている発蛍光団カップリング粒子を介する。
【００３１】
本明細書で使用される用語「サンプル」とは、実施例１３に典型的に示した通り、赤血球含有サンプル、例えば末梢血サンプル、白血球分離採取物、バフィーコート調製物、臍帯サンプルおよび骨髄穿刺液、を指す。サンプルは、動物、特に哺乳動物由来であり得る。好ましくは、サンプルはヒト由来である。
【００３２】
本明細書で使用される用語「細胞修飾薬剤」とは、例えば、サイトカイン、抗体またはペプチドのような細胞刺激薬剤を指す。加えて、細胞修飾薬剤は、例えばＭＡＣＳ技術を使用するその後の細胞分離のための、磁気ビーズ、例えば超常磁性ビーズ、にカップリングしている抗体であり得る。さらなる細胞修飾薬剤は、蛍光色素カップリング抗体であり、これは、その後の細胞分析のために本発明の細胞分離に使用できる。別法として、細胞修飾試薬、例えば抗体、とコンジュゲートされる磁気ビーズ、例えば超常磁性ビーズ、は、例えばＭＡＣＳ技術を使用するさらなる細胞分離のために、本発明を使用した後に最終の細胞組成物に加えられてもよい（実施例２５を参照されたい）。
【００３３】
本明細書で使用される用語「ペレット」または「細胞ペレット」とは、本発明の結果である非液相を指す。ペレットは、赤血球沈殿物（サンプルに赤血球凝集試薬を適用した結果として、少なくとも部分的には重力沈殿によって生成した）および少なくとも部分的に細胞成分を含有する固定化磁性粒子（サンプルに磁場勾配を適用した結果として）からなる。ペレットまたは細胞ペレットは、本発明の方法を使用して処理しようとするサンプルを含有する容器中で細胞の沈殿によっておよび磁力による細胞の固定化によって生成される全てのペレットの実体である。本発明において赤血球の表面タンパク質を認識するが、１つまたは複数の他の細胞成分の表面タンパク質も認識する抗原認識部分が使用される場合、そのとき赤血球も磁性粒子によって固定される。磁石の位置に依存して、ペレットの形状は、２つのペレットが滑らかに移行している１つの接近したペレットから、２つ以上に分離したペレットまで変化し得る。磁気供給源の配置により２つ以上のペレットが存在する場合、本明細書で使用される用語ペレットとは、全てのペレットを指し、すなわちペレットとは、本発明を適用することによって生成した容器の中の全ての部分ペレットの合計である。磁性粒子は、磁場勾配供給源、すなわち磁石に最も近い表面の近くに蓄積する。粒子は、本発明の単一または多重特異的粒子であり、したがって、ペレット中の粒子の一部は付着した細胞を有することがあり、別の部分は細胞を含まないことがある。
【００３４】
本明細書で使用される用語「上清」または「上清相」とは、ペレットと対比して、本発明の結果としての液相を指す。上清相は、本発明によって生成される凝集複合体の部分ではない全ての細胞成分からなる。どの細胞のサブセットが凝集しないかは、本発明において使用される単一または多重特異的粒子の特異性を選択することによって選択できる。通常、上清相の細胞は、自然のままの細胞であり、分離プロセスのうちの所望の細胞（すなわち標的細胞）である。
【００３５】
本明細書で使用される用語「標的細胞」とは、本発明によって分離される所望の細胞である細胞を指す。用語「標的細胞」および「所望の細胞」は、相互に交換可能であり、本発明に関しては同じ意味を有する。通常、標的細胞は、本発明のプロセスによって生成される上清の自然のままの細胞である。上清中にある所望の細胞、すなわち標的細胞の選択は、本発明のプロセスにおいて使用される抗原認識部分の選択によって定義できる。通常、標的細胞は、本発明のプロセスにおいて使用される粒子（複数可）にカップリングしている抗原認識部分に対する抗原を持たない。
【００３６】
本明細書で使用される用語「不要な細胞」とは、本発明の磁性粒子にカップリングされる少なくとも１つの抗原認識部分によって特異的に結合される細胞のことを指す。これらの細胞は、本発明によって生成されるペレットの部分を形成する。
【００３７】
本発明は、赤血球を含有するサンプルから細胞を単離、濃縮および／または精製する方法および組成物を提供する。
【００３８】
当技術分野において公知の方法と比較して、血液細胞含有サンプル由来の細胞の沈殿は、本発明によって加速される。これは、驚くべきことに、赤血球凝集試薬の存在下で凝集する赤血球と、１つまたは複数の不要な細胞成分に対する特異性をそれぞれ有する単一および／または多重特異的磁性粒子の存在下で沈殿ならびに固定する他の不要な細胞成分の分離との同時分離によって達成される。
【００３９】
赤血球凝集試薬は、赤血球のおよびいくつかの血小板、すなわち栓球、の凝集体形成の生成に関与し、赤血球および血小板の沈殿をもたらす。磁性粒子は、この粒子によって認識される磁場勾配内の不要な細胞成分の凝集に関与し、これら細胞の単一および／または異型集塊の固定化をもたらす。磁場勾配は、磁気供給源、例えば永久磁石または電磁石によって生成される。２つの凝集複合体は、正に干渉し、両方の凝集複合体のより早い沈殿および／または固定化をもたらす。
【００４０】
重力沈殿および処理しようとするサンプルを含有する容器に適用される磁気供給源によって生成される磁力による磁性粒子の固定化、に関する本発明のステップを別々の２つのステップで実施できることは、本発明の範囲内である。しかし、相乗効果を利用することによって、最適な結果（すなわち純度）が得られ、分離手順の時間が節約されるため、これらの２つのステップの同時実行が強く好まれる。
【００４１】
したがって、所望の細胞、赤血球および不要な細胞を含有するサンプルから所望の細胞を濃縮ならびに／または回収する方法であって、
ａ）サンプルと組成物とを接触させるステップであって、前記組成物が
ｉ）赤血球凝集試薬
ｉｉ）磁性粒子にカップリングしている少なくとも１つの抗原認識部分であって、前記少なくとも１つの抗原認識部分を持つ前記粒子が、１つまたは複数の不要な細胞成分に対して特異的な少なくとも１つの抗原に特異的に結合する抗原認識部分、および場合によっては
ｉｉｉ）所望の細胞を修飾する１つまたは複数の細胞修飾薬剤
を含むステップと、
ｂ）
ｉ）赤血球の沈殿のための重力沈殿ならびに、
ｉｉ）前記磁性粒子を固定し、ペレットおよび上清相を生成するための前記サンプルに対する磁場勾配
を同時に適用するステップと、
ｃ）上清相から所望の細胞を回収するステップと
を含む方法を提供することが本発明の目的である。
【００４２】
加えて驚くべきことに、本発明において使用される粒子のサイズが、本発明に対してさらなる影響を有することが判明した。同時に（１）赤血球が、ＨＰＭＣ−１５などの赤血球凝集試薬によって凝集され、（２）１つまたは複数の不要な細胞成分が、粒径の平均サイズ１００〜１４００ｎｍ、好ましくは２００〜５００ｎｍを有する磁性粒子に特異的に結合され、ここで磁性粒子に磁場勾配が適用されて磁性粒子に結合している細胞が固定される場合、サンプル中の細胞の沈殿が加速されることが判明した。本発明において、１００〜１４００ｎｍ、好ましくは２００〜５００ｎｍの平均サイズを有する粒子を使用することにより、より小さいまたはより大きい粒子とそれぞれ比較して、さらなる優れた細胞の分離が得られる（実施例１）。
【００４３】
平均粒径５０ｎｍの小さい磁性粒子は、２００ｎｍ粒子より赤血球沈殿の加速に対する影響が低下し（図１８）、その結果（ＣＤ１９、図１２）にコンジュゲートしているいくつかの抗体に対する除去効率は最適でなくなる。評価した全ての抗体にコンジュゲートさせ（例えば、図６および図７を参照されたい）、約９５％が１００ｎｍ〜１４００ｎｍの範囲にあり、約９０％が２００ｎｍ〜５００ｎｍの範囲にあるサイズ分布を有した（図９）場合、２６０ｎｍ〜２９０ｎｍの平均粒径を持つ粒子がよい除去効率を示した。ＣＤ１５およびＣＤ６１抗体にコンジュゲートさせた場合、１４００ｎｍより大きい粒径の平均サイズを持つ粒子は、顆粒球および血小板に対して不十分な除去効率を示した。
【００４４】
本発明において抗グリコホリンＡなど赤血球の表面タンパク質を単独で認識する抗原認識部分を含む必要はない。本発明において、抗グリコホリンＡなど赤血球の表面タンパク質のみに対する抗原認識部分を使用することにより、ＷＯ００／７３７９４および米国特許第７１６０７２３号における方法の開示とは対照的に、抗体は正の効果も負の効果も持たない（実施例１５）。
【００４５】
さらに驚くべきことに、本発明によって生成される細胞ペレットの形状は、２つのパラメータ、ｉ）磁性粒子にカップリングされる抗原認識部分の選択およびｉｉ）処理しようとするサンプルを含有する容器に対して相対的な磁気供給源の位置の選択に影響され得ることが判明した。
【００４６】
１つまたは複数の不要な細胞成分の表面タンパク質を認識する抗原認識部分を使用するが、それが赤血球の表面タンパク質を認識しない場合、そのペレットは２つの部分に分離される。図１３に図示した通り、磁気供給源が、処理しようとするサンプルを含有する容器の側面に位置するならば、この場合、わずかな移行しか生成されない。それとは対照的に、赤血球の表面タンパク質を認識するが、１つまたは複数の他の不要な細胞成分の表面タンパク質（すなわち対象外の白血球）も認識する１つまたは複数の抗原認識部分の使用は、細胞ペレットの形状に影響する。赤血球および他の細胞成分の表面タンパク質を認識するそのようなマーカーは、例えばＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４７、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ７５、ＣＤ７５Ｓ、ＣＤ９９、ＣＤ１０８、ＣＤ１１１、ＣＤ１３９、ＣＤ１４７、ＣＤ２２０およびＣＤ２２２である。そのような抗原認識部分、例えばＣＤ３６、を使用することにより、沈殿させたい全ての細胞成分の磁気的な強制沈殿が得られる。図１４に図示した通り、磁場勾配を持つ磁気供給源が、処理しようとするサンプルを含有する容器の側面に位置する場合、ペレットは、指数関数曲線に似た形状になる。しかし一般に、磁気供給源の位置に応じて、ペレットは異なる形状を形成することができる。本発明の方法によって得られる細胞ペレットの形状は、細胞に作用している力の結果である。赤血球沈殿は、部分的には重力により、部分的には磁気による。本発明において赤血球の表面タンパク質を認識するが、１つ以上の他の不要な細胞成分の表面タンパク質も認識する１つまたは複数の抗原認識部分が使用される場合、赤血球は磁化される。したがって、図１４に図示した通り、磁石が、処理しようとするサンプルを含有する容器の底に近く位置する場合、２つの型の細胞ペレット（すなわち重力沈殿によって生成される１方の細胞ペレットおよび磁力によって生成される他方のペレット）の滑らかな移行が生成される。例えばピペットを使用する場合、このまたは類似のペレット形状は、上清を除去するのに有利である。ペレットのこの形状により、非ペレット相、すなわち通常は所望の細胞を含有する上清相のより簡便でより完全な除去が可能になる。しかし、磁場勾配は、処理しようとするサンプルを含有する容器に対して相対的に任意の位置に向きを定めることが可能であり、その結果異なる形態のペレットが得られる。図１５に図示した通り、磁石が、処理しようとするサンプルを含有する容器の底からより離れて位置する場合、分離した２つのペレットが生成される。上方のペレットは、磁性粒子を用いて標識することにより強く磁化された細胞を含有する。赤血球の表面タンパク質を認識する抗原認識部分が使用される場合、このペレットは、赤血球および他の不要な細胞成分を含有する。赤血球の表面タンパク質を認識する抗原認識部分が全く使用されない場合、このペレットは他の不要な細胞成分を含有するが赤血球を含有しない。下方のペレットは、磁性粒子を用いて標識することにより、より弱く磁化された細胞、すなわちほとんどの場合、残りの赤血球を含有する。
【００４７】
したがって、本発明の別の実施形態において、磁性粒子は、赤血球の細胞表面の抗原、加えて少なくとも１つの他の不要な細胞成分の抗原を認識する少なくとも１つの抗原認識部分と共に提供される。
【００４８】
処理しようとするサンプルを含有する容器の底での磁気供給源の使用は、好ましくない。これにより磁気凝集体は、３ｃｍ（チューブ直径）と比較してより高い距離、すなわち１０ｃｍ（チューブ高さ）移動しなければならなくなる。
【００４９】
本発明は、磁気供給源、例えば永久磁石または電磁石によって生成される磁場勾配を利用する。本発明では、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、ドイツから市販されているＭＡＣＳｉＭＡＧTMＳｅｐａｒａｔｏｒのような、任意の型および形態の磁石を使用できる。異なる磁石デザインが、本発明で評価された。ＭＡＣＳｉＭＡＧTMＳｅｐａｒａｔｏｒは、チューブの高さ全体にわたってチューブの壁に磁性粒子および磁気標識された細胞を引きつけるために、より高さがある磁石を用いて改変された。ＳｅｎｓＳｃｒｅｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ドイツ）製およびＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（「Ｅａｓｙ  ５０」Ｅａｓｙ  Ｓｅｐ  Ｍａｇｎｅｔ）製の磁石を含めた５０ｍＬ遠心チューブ用の市販の磁石を評価した。本発明に対して、磁気水槽ガラス清掃具を評価した。これらの清掃具は、磁気ヨークと組み合わされ、プラスチック製筐体に埋め込まれ、水槽ガラスを掃除するために内側の磁石の表面に清掃素材を取り付けた強力な永久磁石からなる。Ｕ字形ヨークおよび垂直なヨークを含めた異なる磁石ヨークに８８ｍｍ＊２４ｍｍ＊１０ｍｍのサイズの立方形永久希土類磁石を使用するために、いくつかの設計図が開発された（図１６および図１７を参照されたい）。ハルバッハ配列も、成功裏に本発明と併用された。
【００５０】
チューブ壁の外側に置かれた磁石の他に、円筒状、立方形または球状のいずれかの磁石をチューブ中に沈めることもできる。
【００５１】
本発明のさらなる目的は、治療上もしくは診断上または科学的に有益な細胞を、例えば末梢血、臍帯血および骨髄から単離、濃縮ならびに／または回収するための組成物を提供することである。
【００５２】
本発明による組成物は、
ｉ）赤血球凝集試薬
ｉｉ）少なくとも１つの抗原認識部分がカップリングしている１つまたは複数の単一および／もしくは多重特異的磁性粒子のセットであって、前記少なくとも１つの抗原認識部分を持つ前記粒子が、１つまたは複数の不要な細胞成分に対して特異的な少なくとも１つの抗原に特異的に結合する磁性粒子のセット、および、場合によっては
ｉｉｉ）所望の細胞を修飾する１つまたは複数の細胞修飾薬剤
を含む。
【００５３】
本発明による細胞分離組成物は、赤血球凝集試薬ならびに１つまたは複数の単一および／もしくは多重特異的磁性粒子を含む。粒子の特異性は、沈殿または固定しようとする細胞、すなわち不要な細胞の抗原に対するものである。細胞分離組成物は、抗原認識部分、例えばＣＤ１１ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ１９３、ＣＤ２、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３、ＣＤ３３５、ＣＤ３６、ＣＤ４、ＣＤ４３、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ３４、ＣＤ１ｃ、ＣＤ２３、ＣＤ３０４、ＣＤ２３５ａ、抗Ｆｃ＿ε、抗Ｔ細胞受容体α／β、抗Ｔ細胞受容体γ／δ、抗ビオチン、抗ＩｇＥ、抗ＨＬＡ−ＤＲおよびそれらの組合せを含めた血液細胞表面抗原に対する、例えば抗体を含有する。
【００５４】
好ましい、前記組成物の磁性粒子は、平均粒径サイズ１００〜１４００ｎｍ、好ましくは２００〜５００ｎｍである。
【００５５】
そのような組成物は、１つの型の単一もしくは多重特異的粒子を含むことができ、または１つより多い単一もしくは多重特異的粒子または単一および多重特異的粒子の混合物を含むことができる。細胞の特異的部分母集団のうち自然のままの細胞を分離するのに便利な組成物は、磁性粒子にカップリングしている抗原認識部分を含むべきであり、ここでそのような抗原認識部分は、対象の細胞、すなわち自然のままであるべき所望の細胞または標的細胞、である細胞のサブセットを認識しない。例えば、上清から血小板を除去したい場合、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ４１に対する抗原認識部分をそれぞれ使用できる。顆粒球を除去したい場合、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１５、ＣＤ１６に対する抗原認識部分をそれぞれ使用できる。単球／大食細胞を除去したい場合、ＣＤ１４、ＣＤ３３をそれぞれ使用できる。Ｂ細胞を除去したい場合、ＣＤ１９、ＣＤ２０をそれぞれ使用できる。Ｔ細胞を除去したい場合、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｔ細胞受容体α／βをそれぞれ使用できる。ＮＫ細胞を除去したい場合、ＣＤ５６、ＣＤ３３５をそれぞれ使用できる。
【００５６】
一般に、粒子にカップリングしている１つの抗原認識部分、例えば抗体、の使用により、本発明の範囲で所望の細胞の一貫した分離が得られる（実施例２）。好ましくは粒径の平均サイズ１００〜１４００ｎｍ、より好ましくは２００〜５００ｎｍの粒子にカップリングしている２つ以上の抗原認識部分、例えば抗体、の使用により、先行技術の方法と比較して、所望のまたは不要な細胞の優れた分離が得られる（実施例３を参照されたい）。
【００５７】
実施例３に示した通り、本発明の範囲の粒子にカップリングしている少なくとも１つの抗原認識部分、例えば抗体、の使用は、これに限定されないが、２、３、４、６、８、１０または１２個の抗原認識部分、例えば抗体、とそれぞれカップリングしている粒子を含み、これら粒子の同等またはより優れた分離特性をもたらす。
【００５８】
粒子にカップリングしている異なる抗原認識部分、例えば抗体、の比は、変化し得る。好ましくは、その比は１：１〜１：５０、より好ましくは１：１〜１：２０である（実施例３を参照されたい）。追加の抗原認識部分が粒子にカップリングされる場合、全ての追加の抗原認識部分は、第１または第２の抗原認識部分に関して、１：１〜１：２０の比である。
【００５９】
本発明は、不要な細胞の除去にかかるインキュベーション時間を５分間以下に短縮する（実施例５を参照されたい）。加えて、沈殿時間を８分間以下に短縮することができ、結果として、当技術分野において公知の方法と比較して、全体としてより早く、約１５分間以内に標的細胞を分離できる（実施例５）。
【００６０】
本発明は、磁性粒子の使用およびそれらに磁場勾配を適用することによって強力に加速される。磁場勾配を使用しない場合、本方法はうまく機能せず、その結果磁場勾配を適用する場合と比較して、追加の沈殿時間が必要となり、細胞の純度は悪くなる（実施例６を参照されたい）。
【００６１】
本発明は、広い範囲のサンプル容量でよく機能し、例えば、１．５ｍｌまたは５０ｍｌサンプルで機能する（実施例７を参照されたい）。
【００６２】
分離しようとする細胞が細胞培養培地でまたは通常の緩衝液に希釈されても、本発明はよく機能する（実施例８を参照されたい）。
【００６３】
本発明は、再現性があり、異なるサンプル間の成績において変動はわずかである（実施例９を参照されたい）。本方法はまた、サンプル中で利用可能な血小板（栓球）の濃度に非依存的である（実施例１０を参照されたい）。
【００６４】
実施例１１に示した通り、赤血球凝集試薬は、デキストラン、ヒドロキシエチルスターチ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、メチルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）からなる群から選択できる。実施例１１に示した通り、ＨＰＭＣ−１５は、他の赤血球凝集試薬より優れている。本発明において使用されるＨＰＭＣ−１５の最適濃度は、例えば全血またはバフィーコート中で、０．２〜０．５％ＨＰＭＣ１５である（実施例１１）。
【００６５】
本発明のいくつかの実施形態において、赤血球凝集試薬はＨＰＭＣ−１５であり、単一特異的粒子は、例えば抗ＣＤ６１モノクローナル抗体とカップリングしている好ましくは１００〜１４００ｎｍのサイズ、より好ましくは２００〜５００ｎｍのサイズの磁性粒子である。抗ＣＤ６１抗体は、血小板に特異的に結合する。ＣＤ６１．粒子、赤血球凝集試薬および全血サンプルを、例えば容量１．５〜４５ｍｌのサンプルを含有するチューブ中で混合し、この混合物を５〜１０分間インキュベートし、例えば振とう機でまたは手で混合することによって、穏やかに混合する。次いで、チューブを立ててラックに置き、磁気標識された細胞を磁場中で８〜１５分間分離する。この間に、赤血球はチューブの底に沈殿する。原理的には、細胞は、上清から、またはチューブの底にある赤血球ペレットおよび磁石によってチューブの側壁に保持されている磁気標識された細胞で構成されるペレット中の細胞ペレットから回収できる。通常、所望の細胞は上清相にある。
【００６６】
本発明のいくつかの実施形態において、赤血球凝集試薬はＨＰＭＣ−１５であり、使用される粒子は、例えば抗ＣＤ６１モノクローナル抗体および抗ＣＤ１５モノクローナル抗体それぞれとカップリングしている好ましくは１００〜１４００ｎｍのサイズ、より好ましくは２００〜５００ｎｍのサイズの少なくとも２つの単一特異的磁性粒子である。ＣＤ１５．粒子、ＣＤ６１．粒子および赤血球凝集試薬および全血サンプルを、例えば容量１．５〜４５ｍｌのサンプルを含有するチューブ中で混合し、この混合物を５〜１０分間インキュベートし、例えば振とう機でまたは手で混合することによって、穏やかに混合する。次いで、チューブを立ててラックに置き、磁気標識された細胞を磁場中で８〜１５分間分離する。この間に、赤血球はチューブの底に沈殿する。細胞は、上清から回収できる。
【００６７】
本発明のいくつかの実施形態において、赤血球凝集試薬はＨＰＭＣ−１５であり、使用される粒子は、例えば１：１の比の抗ＣＤ６１モノクローナル抗体および抗ＣＤ１５モノクローナル抗体とカップリングしている二重特異的磁性粒子である。最適な結果を達成するために、粒子にカップリングさせる抗体の比を変化させることができ、選択された細胞のサブセットに依存する。抗ＣＤ６１抗体は、血小板に特異的に結合し、抗ＣＤ１５抗体は、顆粒球に結合する。
【００６８】
ＣＤ６１．ＣＤ１５．粒子、赤血球凝集試薬および全血サンプルを、例えば容量１．５〜４５ｍｌのサンプルを含有するチューブの中で混合し、この混合物を５〜１０分間インキュベートし、例えば振とう機でまたは手で混合することによって、穏やかに混合する。次いで、チューブを立ててラックに置き、磁気標識された細胞を磁場中で８〜１５分間分離する。この間に、赤血球はチューブの底に沈殿する。細胞は、上清から回収できる。
【００６９】
本発明の他の実施形態において、赤血球凝集試薬はＨＰＭＣ−１５であり、使用される粒子は、例えば１：２０の比の抗ＣＤ６１モノクローナル抗体および抗ＣＤ１５モノクローナル抗体とカップリングしている二重特異的磁性粒子である。ＣＤ６１．ＣＤ１５．ビーズ、赤血球凝集試薬および全血サンプルをチューブ中で混合し、この混合物を５〜１０分間インキュベートし、例えば振とう機でまたは手で混合することによって、穏やかに混合する。次いで、チューブを立ててラックに置き、磁気標識された細胞を磁場中で８〜１５分間分離する。この間に、赤血球はチューブの底に沈殿する。細胞は、上清から回収できる。上清は、例えば濾過、全量濾過またはクロスフロー／中空糸モジュール濾過のいずれかによって濃縮できる。全量濾過の場合、細胞は、孔径例えば１μｍのフィルタ上に加えられる。液体（すなわち、緩衝液で希釈した血清）がフィルタを通って落ちる間に、標的細胞はフィルタ上に保持される。次いで、標的細胞は、ピペット操作によってフィルタ表面から回収される。遺伝子発現プロファイリングなどの用途の場合、標的細胞を含有するフィルタを、ｍＲＮＡ単離用の溶解液が入った容器中に置くことができる。
【００７０】
クロスフロー濾過の場合、細胞はシリンジに入れられ、第２シリンジへと中空糸のモジュールを通過する。いくらかの液体（通常１０〜３０％）が、第３シリンジへと膜の細孔を通過する。次いで細胞懸濁液は、第２から第１シリンジへと通され、そのプロセスを数回反復し、段階的に細胞濃度を増加させる。所望の容量が達成されたら、シリンジを中空糸モジュールにねじ込み標的細胞を回収することができる。
【００７１】
本発明の他の実施形態において、赤血球凝集試薬はＨＰＭＣ−１５であり、使用される粒子は、例えば２．５：２．５：１の比の抗ＣＤ１４モノクローナル抗体、抗ＣＤ３６モノクローナル抗体および抗ＣＤ６１モノクローナル抗体とカップリングしている三重特異的磁性粒子である。ＣＤ１４．ＣＤ３６．ＣＤ６１．ビーズ、赤血球凝集試薬および全血サンプルをチューブ中で混合し、この混合物を５〜１０分間インキュベートし、例えば振とう機でまたは手で混合することによって、穏やかに混合する。次いで、チューブを立ててラックに置き、磁気標識された細胞を磁場中で８〜１５分間分離する。この間に、赤血球はチューブの底に沈殿する。細胞は、上清から回収できる。
【００７２】
本発明の他の実施形態において、赤血球凝集試薬はＨＰＭＣ−１５であり、二重特異的磁性粒子は、例えば抗ＣＤ６１モノクローナル抗体および抗ＣＤ１５モノクローナル抗体とカップリングしている凍結乾燥された磁性粒子である。使用する前に、ＣＤ６１．ＣＤ１５．粒子は、Ｈ2Ｏ様の液体もしくは任意の適切な緩衝液または細胞培養培地に溶解される。次いで、ＣＤ６１．ＣＤ１５．粒子、赤血球凝集試薬および全血サンプルをチューブ中で混合し、この混合物を５〜１０分間インキュベートし、例えば振とう機でまたは手で混合することによって、穏やかに混合する。次いで、チューブを立ててラックに置き、磁気標識された細胞を磁場中で８〜１５分間分離する。この間に、赤血球はチューブの底に沈殿する。細胞は、上清から回収できる。
【００７３】
本発明の他の実施形態において、赤血球凝集試薬はＨＰＭＣ−１５であり、使用される粒子は、例えば抗ＣＤ６１モノクローナル抗体および抗ＣＤ１５モノクローナル抗体とカップリングしている二重特異的磁性粒子である。ＣＤ６１．ＣＤ１５．粒子、赤血球凝集試薬および全血サンプルをチューブ中で混合し、この混合物を５〜１０分間インキュベートし、例えば振とう機でまたは手で混合することによって、穏やかに混合する。次いで、チューブを立ててラックに置き、磁気標識された細胞を磁場中で８〜１５分間分離する。この間に、赤血球はチューブの底に沈殿する。細胞は、上清から回収できる。細胞のサブセットの２回目の分離の場合、上清は、直接にまたは細胞を洗浄もしくは濃縮した後に、細胞の分離に適した方法で使用され、通常はＰＢＭＣまたはＰＢＭＣ様サンプル、例えばＤｙｎａｌ−ＢｅａｄｓまたはＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、ドイツ）に使用される。例えば、ＣＤ３＋細胞の濃縮は、ＣＤ３＋  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを使用することにより実施される。別の例では、Ｔ細胞の濃縮は、Ｔ細胞単離キットを使用することにより実施される。
【００７４】
本発明の他の実施形態において、赤血球凝集試薬はＨＰＭＣ−１５であり、使用される粒子は、例えば抗ＣＤ６１モノクローナル抗体および抗ＣＤ１５モノクローナル抗体とカップリングしている二重特異的磁性粒子である。ＣＤ６１．ＣＤ１５．粒子、赤血球凝集試薬、例えばＣＤ３抗体のような細胞修飾薬剤、および全血サンプルをチューブ中で混合し、この混合物を５〜１５分間インキュベートし、例えば振とう機でまたは手で混合することによって、穏やかに混合する。次いで、チューブを立ててラックに置き、磁気標識された細胞を磁場中で８〜１５分間分離する。この間に、赤血球はチューブの底に沈殿する。細胞は、上清から回収できる。細胞のサブセットの２回目の分離の場合、上清は、さらなる細胞分離のために直接にまたは細胞を濃縮した後にＭＡＣＳカラムに適用される。標的細胞は、正または負のいずれかに選択された細胞であることができる。
【００７５】
本発明の他の実施形態において、赤血球凝集試薬はＨＰＭＣ−１５であり、粒子は、単離キット用に選択されたモノクローナル抗体とカップリングしている単一または多重特異的磁性粒子である（実施例１８〜２４）。抗体コンジュゲート粒子、赤血球凝集試薬および全血サンプルをチューブ中で混合し、この混合物を５〜１５分間インキュベートし、例えば振とう機でまたは手で混合することによって、穏やかに混合する。次いで、チューブを立ててラックに置き、磁気標識された細胞を磁場中で８〜１５分間分離する。この間に、赤血球はチューブの底に沈殿する。細胞は、上清から回収できる。２回目の分離の場合、抗体コンジュゲート粒子（例えばＣＤ２３５ａおよび／またはＣＤ１５粒子）を上清に添加し、この混合物を５分間インキュベートし、チューブを立ててラックに置き、磁気標識された細胞を磁場中で５分間分離する。細胞は、上清から回収される。
【００７６】
本発明のいくつかの実施形態において、細胞分離組成物は、赤血球凝集試薬ならびに少なくとも１つの抗原認識部分がカップリングしている１つまたは複数の単一および／もしくは多重特異的磁性粒子のセットを含み、ここで前記少なくとも１つの抗原認識部分を持つ前記粒子が、１つまたは複数の不要な細胞成分に対して特異的な少なくとも１つの抗原に特異的に結合する。
【００７７】
本発明のいくつかの実施形態において、細胞分離組成物は、赤血球凝集試薬ならびに少なくとも１つの抗原認識部分がカップリングしている１つまたは複数の単一および／もしくは多重特異的磁性粒子のセットを含み、ここで前記少なくとも１つの抗原認識部分を持つ前記粒子が、１つまたは複数の不要な細胞成分に対して特異的な少なくとも１つの抗原に特異的に結合し、前記セットは、顆粒球、例えばＣＤ１５、に対するおよび血小板、例えばＣＤ６１、に対する抗原認識部分の抗原特異性を含む。結果として、赤血球、血小板および顆粒球が除去された本発明の上清中に細胞組成物が得られる（実施例１８）。
【００７８】
本発明の他の実施形態において、細胞分離組成物は、赤血球凝集試薬ならびに少なくとも１つの抗原認識部分がカップリングしている１つまたは複数の単一および／もしくは多重特異的磁性粒子のセットを含み、ここで前記少なくとも１つの抗原認識部分を持つ前記粒子が、１つまたは複数の不要な細胞成分に対して特異的な少なくとも１つの抗原に特異的に結合し、前記セットは、ＣＤ２、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ３６、ＣＤ４３、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ａＩｇＥからなる群から選択される１つまたは複数の、好ましくは全ての抗原認識部分の抗原特異性を含む。全ての特異性の使用により、本発明の上清中にＢ細胞の高純度の細胞組成物が得られる（実施例１９）。
【００７９】
本発明の他の実施形態において、１つまたは複数の、好ましくは全ての抗原認識部分の抗原特異性は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ１２３、ａＩｇＥからなる群から選択される。全ての特異性の使用により、本発明の上清中にＴ細胞の高純度の細胞組成物が得られる（実施例２０）。
【００８０】
本発明の他の実施形態において、１つまたは複数の、好ましくは全ての抗原認識部分の抗原特異性は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ６１、ＣＤ１２３、ＣＤ１９３、ａＩｇＥ、ａＴＣＲａｂからなる群から選択される。全ての特異性の使用により、本発明の上清中にＮＫ細胞の高純度の細胞組成物が得られる（実施例２１）。
【００８１】
本発明の他の実施形態において、１つまたは複数の、好ましくは全ての抗原認識部分の抗原特異性は、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ１２３、ａＩｇＥ、ａＴＣＲｇ／ｄからなる群から選択される。全ての特異性の使用により、本発明の上清中にヘルパーＴ細胞の高純度の細胞組成物が得られる（実施例２３）。
【００８２】
本発明の他の実施形態において、１つまたは複数の、好ましくは全ての抗原認識部分の抗原特異性は、ＣＤ４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ１２３、ａＩｇＥ、ａＴＣＲｇ／ｄからなる群から選択される。全ての特異性の使用により、本発明の上清中に細胞障害性Ｔ細胞の高純度の細胞組成物が得られる（実施例２４）。
【００８３】
本発明の他の実施形態において、１つまたは複数の、好ましくは全ての抗原認識部分の抗原特異性は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ１２３、ａＩｇＥ、ａＴＣＲｇ／ｄからなる群から選択される。全ての特異性の使用により、本発明の上清中にＴ細胞受容体α／β陽性Ｔ細胞の高純度の細胞組成物が得られる。
【００８４】
本発明の他の実施形態において、１つまたは複数の、好ましくは全ての抗原認識部分の抗原特異性は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ１２３、ａＩｇＥ、ａＴＣＲａｂからなる群から選択される。全ての特異性の使用により、本発明の上清中にＴ細胞受容体γ／δ陽性Ｔ細胞の高純度の細胞組成物が得られる。
【００８５】
本発明の他の実施形態において、１つまたは複数の、好ましくは全ての抗原認識部分の抗原特異性は、ＣＤ６１、ＣＤ２、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ３０４、ａＩｇＥからなる群から選択される。全ての特異性の使用により、本発明の上清中に単球の高純度の細胞組成物が得られる（実施例２２）。
【００８６】
記載の細胞分離成分は、キットとして提供されるのに適している。各キットは、本明細書に記載の方法を用いて血液細胞含有サンプルから所望の細胞の分離を実施し、それにより前述の細胞組成物を得るのに必要な成分を含有する。
【００８７】
本明細書に述べた通り、必須の成分は赤血球凝集試薬および単一または多重特異的粒子である。単一および／または多重特異的粒子は、液体、例えば緩衝液、または凍結乾燥された形態のキットで利用できる。キットは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞障害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、好中球、好酸球、好塩基球、造血幹細胞、α／β  Ｔ細胞およびγ／δ  Ｔ細胞の単離に使用できる。
【００８８】
ここで提示したその全ての実施形態において、本発明は、臨床応用にも使用できる。典型的には、細胞は、白血球分離採取物から単離される。処理しようとする除去療法容量は、通常は１５０〜２５０ｍＬになり、血液バッグなどの閉鎖系で処理される。上清の除去は、例えば血漿分離器によって、手作業または自動化のいずれかで行われることになる。標的細胞は、患者に直接与えられる（例えばドナーリンパ球注入）または治療適用の前に操作される（例えば、培養、刺激および／もしくは増殖または分化される）。標的細胞は、患者（自家使用）または健康なドナー（同種間使用）由来であり得る。
【００８９】
本開示のＴ細胞集団、ＮＫ細胞集団、単球などの標的細胞集団は、単独で、あるいは希釈剤とおよび／またはＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５もしくは他のサイトカインまたは細胞集団などの他の成分と組み合わせた医薬組成物として投与することができる。簡潔には、本開示の医薬組成物は、本明細書に記載の標的細胞集団を、薬学的にまたは生理学的に許容できる１つまたは複数の担体、希釈剤もしくは賦形剤と組み合わせて含むことができる。そのような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などのような緩衝液、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；酸化防止剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および防腐剤を含むことができる。医薬組成物は、ａ）標準的な手順にしたがって治療上有効な量に増殖されるＴ細胞の集団、およびｂ）薬学的にまたは生理学的に許容できる１つまたは複数の担体、希釈剤もしくは賦形剤を含むことができる。
【００９０】
別の医薬組成物は、ａ）標準的な手順にしたがって樹状細胞を生成するために培養される単球の集団、およびｂ）薬学的にまたは生理学的に許容できる１つまたは複数の担体、希釈剤もしくは賦形剤を含むことができる。
【００９１】
別の医薬組成物は、ａ）標準的な手順にしたがって治療上有効な量に増殖されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団、およびｂ）薬学的にまたは生理学的に許容できる１つまたは複数の担体、希釈剤もしくは賦形剤を含むことができる。
【００９２】
本開示の医薬組成物は、治療（または予防）すべき疾患に適切な様式で投与することができる。適切な用量は臨床試験によって決定できるが、投与の量および頻度は、患者の症状、ならびに患者の疾患の型および重症度などの因子によって決定されることになる。
【実施例】
【００９３】
以下に、実施例を参照して、本発明をより詳細におよび具体的に記載するが、実施例は本発明を制限することを目的としない。
【００９４】
実施例１：粒子のサイズ
実施例４に記載の異なるプロセスパラメータで磁気ビーズを製造し、異なるサイズの粒子を得た。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｄｅｌｓａ  Ｎａｎｏ機器によって粒子サイズを特徴付けた。ＣＤ１５およびＣＤ６１抗原を認識するモノクローナル抗体（１：１の比）を、磁気ビーズに共有結合させ、ＯＤ４５０＝１０の濃度で４０ｕｇ抗体／ｍＬビーズ懸濁液を得た。
【００９５】
異なる量のコンジュゲートビーズおよび２％ヒドロキシプロピルメチルセルロース保存溶液０．２ｍＬを、５ｍＬ  ＦＡＣＳチューブ中のヒト全血由来バフィーコート１ｍＬに加え、ＭＡＣＳｍｉｘTMチューブ回転装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）内で１５分間混合し、ＭＡＣＳｉＭａｇTMＳｅｐａｒａｔｏｒに２０分間置いた。ピペットを使用して上清を完全に除去し、ＦＡＣＳチューブに移し、Ｓｙｓｍｅｘ  ＫＸ２１血液分析器を使用して細胞を計数し、ＭＡＣＳｑｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒフローサイトメータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して細胞を分析した。
【００９６】
粒径２１４ｕｍ、２５０ｕｍ、２９０ｕｍのコンジュゲート粒子を使用した場合、赤血球、血小板および顆粒球が、＞９９％の効率で全血から除去された。１４００ｕｍ粒子を使用した場合、血小板および顆粒球の除去は効率が低かった（図１〜図４を参照されたい）。
【００９７】
実施例２：単一特異的粒子
ＣＤ１５およびＣＤ６１を認識するモノクローナル抗体を、磁気ビーズに別々にコンジュゲートさせた（実施例４、平均粒径１００ｎｍ）。ビーズコンジュゲート抗体を、全血１．３ｍＬ、ＰＢＳ緩衝液０．７ｍＬおよびＨＰＭＣ１５保存溶液２００ｕＬに加えた。顆粒球および血小板のそれぞれ、または組合せが、９８％〜＞９９％除去された（図５を参照されたい）。
【００９８】
ＣＤ１９およびＣＤ５６を認識するモノクローナル抗体を、磁気ビーズに別々にコンジュゲートさせた（実施例４、平均粒径２２０ｕｍ）。ビーズコンジュゲート抗体を、全血１．３ｍＬ、ＰＢＳ緩衝液０．７ｍＬおよびＨＰＭＣ１５保存溶液２００ｕｌに加えた。Ｂ細胞およびＮＫ細胞それぞれが、＞９８％除去された（図６および図７を参照されたい）。
【００９９】
実施例３：多重特異的粒子
以前に評価した抗体比で、１００ｎｍまたは２００ｎｍのいずれかの磁気ビーズに２、３、４、６または８個の異なる抗体のいずれかをコンジュゲートさせた（実施例４を参照されたい）。抗体比は、単一特異的コンジュゲートを滴定すること、および細胞サブセットの完全な除去に十分な最少量の抗体を個別に決定することによって決定した。比を算出するために個々の抗体濃度を使用した。ビーズコンジュゲート抗体を、全血１．３ｍＬ、ＰＢＳ緩衝液０．７ｍＬおよび２％ＨＰＭＣ１５保存溶液２００ｕｌに加え、ＭＡＣＳｍｉｘTMチューブ回転装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）内で１５分間混合し、ＭＡＣＳｉＭａｇTMＳｅｐａｒａｔｏｒに２０分間置いた。ピペットを使用して上清を完全に除去し、ＦＡＣＳチューブに移し、Ｓｙｓｍｅｘ  ＫＸ２１血液分析器を使用して細胞を計数し、ＭＡＣＳｑｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒフローサイトメータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して細胞を分析した。分析した細胞集団の９２％より多くが、除去された、図８を参照されたい。
【０１００】
実施例４：粒子の生成
参照により共に含まれる米国特許第５５４３２８９号に、本明細書で使用される超常磁性粒子の生成が開示されている。達成されるビーズサイズの範囲は、ビーズの析出中に使用するデキストラン濃度におよび使用する鉄塩に影響され得る。
【０１０１】
他のビーズは、市販であった：２５０ｎｍ  ＫｉｓｋｅｒＢｅａｄｓをＫｉｓｋｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ドイツ）から、マイクロメートルサイズ粒子をＳｅｎｓＳｃｒｅｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ドイツ）またはＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（ＭＡＣＳｉＢｅａｄｓ）から購入した。
【０１０２】
図９は、米国特許第５５４３２８９号を改良した方法によって生成したＣＤ５６抗体にコンジュゲートしている磁性粒子のサイズ分布を示す。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｄｅｌｓａ  Ｎａｎｏ機器での測定により、ＣＤ５６抗体にコンジュゲートしている磁性粒子コンジュゲートのサイズを決定した。平均粒径は、２６０ｎｍである。ビーズの約９５％が粒径１００ｎｍ〜１４００ｎｍの範囲内にあり、ビーズの約９０％が粒径２００ｎｍ〜５００ｎｍの範囲内にある。
【０１０３】
実施例５：インキュベーションおよび沈殿時間
本発明は、ＣＤ４／ＣＤ６１磁気ビーズコンジュゲート（粒径２００ｎｍ）を使用して実施例１、２および３に記載の手順にしたがって使用された。
【０１０４】
０、５、１０および１５分間のインキュベーション時間を比較した。沈殿時間は、常に２０分間にした。５分間のインキュベーション時間により、１５分間のインキュベーション時間と同等の除去が得られた。
【０１０５】
第２実験において、５分間のインキュベーション時間の後に、８、１０、１２、１５および２０分間の沈殿時間を比較した。８分間の沈殿時間により、２０分間の沈殿時間と同等の除去が得られた。赤血球は、８分間未満の沈殿時間で十分に沈殿しなかったので、さらなる沈殿時間の短縮については評価しなかった。
【０１０６】
実施例６：重力による分離
抗体コンジュゲート磁気ビーズのカクテル（２００ｎｍサイズ、実施例１９および２１を参照されたい）を、実施例１、２および３に記載の手順にしたがって使用して、重力沈殿による沈殿と磁気的な強制沈殿による沈殿とを比較した。
【０１０７】
ＮＫ細胞は、全血中での６．４％から、それぞれ８．１％および７０．２％に濃縮された。Ｂ細胞は、４．５％から、それぞれ２３．４％および８５．５％に濃縮された。
【０１０８】
したがって、標的細胞の濃縮は、非磁気的な強制沈殿によっても一般に可能であるが、磁気的な強制沈殿が適用される場合よりも明らかに悪い。沈殿が磁気的に強制される場合、標的細胞の純度は著しく改善される。
【０１０９】
実施例７：異なる容量のサンプルの分離
実施例１、２および３と類似の手順を使用して、異なるスケールの細胞分離を比較した。ヒト全血由来バフィーコートを使用し、バフィーコート１．３ｍＬ／９ｍＬ／３０ｍＬを半容量のリン酸緩衝食塩水溶液で希釈して使用し、分離のスケールを２ｍＬ対１３．５ｍＬ対４５ｍＬにした。使用した抗体コンジュゲートは、１００ｎｍおよび２００ｎｍ磁気ビーズに二重特異的にコンジュゲートしたＣＤ６１およびＣＤ１５抗体であった。
【０１１０】
赤血球、血小板および顆粒球の除去は、３つ全てのスケールで同等であった。除去は、赤血球の場合＞９９％、血小板の場合＞９９％、顆粒球の場合＞９５％であった。
【０１１１】
実施例８：緩衝液の代わりに培地を用いる分離
希釈ステップにＰＢＳ緩衝液の代わりにＲＰＭＩ  １６４０細胞培養培地を用いて分離を実施し、自家血清６７％および細胞培養培地３３％（細胞培養アッセイに直接使用できる構成である）の細胞懸濁液を得た。ヒト全血、ＨＰＭＣ１５保存溶液２００ｕＬ、およびＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ６１、ＣＤ１２３に対する抗体のカクテルにコンジュゲートしている２００ｎｍ磁気ビーズを使用して、５ｍＬ  ＦＡＣＳチューブ中で２ｍＬスケールで分離を評価した。０．５％ウシ血清アルブミンで補充された、ＲＰＭＩ  １６４０細胞培養培地とＰＢＳ緩衝液の両方の使用で、単離されたＮＫ細胞の純度および収率は同等だった。
【０１１２】
実施例９：異なる患者サンプルによって誘導される成績の変動
本発明を使用して１０人のドナーからＮＫ細胞を単離し、分離成績を市販の全血ＮＫ細胞単離キット（Ｒｏｓｅｔｔｅ  Ｓｅｐ  ＮＫ細胞単離キット、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と比較した。
【０１１３】
ＣＤ６１．ＣＤ３ビーズ、ＣＤ６１．ＣＤ１４ビーズ、ＣＤ６１．ＣＤ１５ビーズ、ＣＤ６１．ＣＤ１９ビーズ、ＣＤ６１．ＣＤ４ビーズ（その全てが抗体比１：１９である）からなる二重特異的抗体磁気ビーズコンジュゲート（粒径２００ｎｍ）のカクテルを使用して、本発明を評価した。２％ＨＰＭＣ１５保存溶液２００ｕｌを使用した。試薬を１５分間インキュベートし、ＭＡＣＳｉＭＡＧTMＳｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して磁気的な強制沈殿を２０分間実施した。リンパ球の中から単離したＮＫ細胞の純度は、Ｒｏｓｅｔｔｅ  Ｓｅｐシステムを使用した７４．１％±１１％と比較して７６．１％±１０．２％だった。ＮＫ細胞の収率は、６６±１１％（本発明）対４４±１９％であった。
【０１１４】
ＮＫ細胞の純度および収率は、市販の製品と同等またはより優れており、収率の変動は著しく低い。
【０１１５】
実施例１０：血小板濃度の非依存性
本発明において、赤血球、血小板および目的ではない細胞（すなわち対象外の白血球）の並行した除去を実施する。全血中の血小板含有量の高低が、標的細胞の分離成績および純度に影響を与えるかどうか評価した。血液サンプルを２００ｇで１０分間遠心分離し、赤血球および白血球をペレット化し、ほとんどの血小板を上清に残した。血液サンプルの上清を、除去するかまたは他のサンプルに加えて、血小板濃度を増減させた。実施例１、２および３に記載の手順にしたがって、細胞分離を実施した。
【０１１６】
標的細胞（ＮＫ細胞）の純度および収率は、同一だった。したがって、処理しようとするサンプルの血小板濃度は、本発明の分離成績に影響を及ぼさない。
【０１１７】
実施例１１：赤血球凝集試薬
異なる量および濃度の赤血球沈殿試薬ＨＰＭＣ−１５を、ＮＫ細胞選択手順の成分として評価した：２ｍＬスケールで、ヒト全血またはバフィーコートのいずれか１ｍＬ当たり２％ＨＰＭＣ１５保存溶液１００、２００、３００、４００、５００、６００ｕｌを使用した。より高濃度のＨＰＭＣ１５は、標的細胞（ＮＫ細胞）の収率を低下させ、ＮＫ細胞の純度を増加させた。２％ＨＰＭＣ１５保存溶液の最適量は、全血またはバフィーコートの２００〜２５０ｕｌ／ｍＬであり、最終濃度約０．２％ＨＰＭＣ１５であった。
【０１１８】
２００ｎｍ磁気ビーズにコンジュゲートしているＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ６１およびＣＤ１２３抗体のカクテルを使用して、ＨＰＭＣ１５を他の赤血球沈殿試薬、すなわち、デキストランＴ２５０、デキストランＴ５００、ＰＶＰ  ３６０と比較した。全ての組合せでＮＫ細胞の濃縮が得られ、ＨＰＭＣ１５でＮＫ細胞の最高の純度および収率が得られた（純度６１．８％および収率８６％対デキストランＴ２５０、デキストランＴ５００およびＰＶＰそれぞれについて純度５３．８％、５２．０％、４９．４％および収率６３％、６３％、６６％；図１９）。
【０１１９】
抗体コンジュゲート磁性粒子と組み合わせない場合の赤血球凝集試薬についても比較した。血小板含有量は、ＨＰＭＣ−１５を使用して７６％、デキストランＴ２５０を使用してわずか８％、デキストランＴ５００を使用してわずか１３％およびＰＶＰを使用してわずか４７％低下した。ＨＰＭＣ−１５の高い血小板除去効率は、磁性粒子にコンジュゲートしている血小板結合抗体（ＣＤ６１など）と相乗的に組み合わせることができる。
【０１２０】
実施例１２：抗体と間接的にカップリングしている粒子
二次抗体の定常領域または抗体コンジュゲートの蛍光色素を認識する抗体にコンジュゲートしているＭａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ（粒径＜１００ｎｍ）を、二次抗体／ＣＤ３およびＣＤ１９抗原を認識する抗体コンジュゲートと共にロードした。ＴおよびＢ細胞はそれぞれ、ＣＤ３−ＰＥとＣＤ１９−ＰＥを使用して９１．５％および９９．１％、ＣＤ３−ＡＰＣとＣＤ１９−ＡＰＣを使用して９４％および９９．９％、ＣＤ３−ＦＩＴＣとＣＤ１９−ＦＩＴＣを使用して９５．３％および９８．６％、ＣＤ３とＣＤ１９抗体（および抗ＩｇＧ磁気ビーズ）を使用して９４．１％および９９．４％、ＣＤ３−ビオチンとＣＤ１９−ビオチンを使用して８８％および９８．６％それぞれ除去された。
【０１２１】
全ての間接的な分離系は、磁気ビーズに直接コンジュゲートされた抗体の使用と比較して、同等の分離成績を示した。
【０１２２】
実施例１３：異なるサンプルの使用
２００ｎｍ磁気ビーズにコンジュゲートしているＣＤ１５およびＣＤ６１抗体を使用して、異なる赤血球含有細胞産物、すなわち白血球分離採取物、臍帯血、骨髄穿刺液に対して本発明を評価した。全ての場合において、＞９９％の顆粒球および＞９６％の血小板が除去された。
【０１２３】
２００ｎｍ磁気ビーズにコンジュゲートしているＣＤ１９およびＣＤ５６抗体を使用して、骨髄穿刺液に対して本発明を評価した。９９％のＢ細胞および８７％のＮＫ細胞が除去された。
【０１２４】
１００ｎｍ磁気ビーズにコンジュゲートしているＣＤ６１およびＣＤ１５抗体および１００ｎｍ磁気ビーズにコンジュゲートしているＣＤ６１およびＣＤ１９抗体を使用して、全血由来バフィーコート調製物に対して本発明を評価した。９９．７％の血小板および９７％の顆粒球、９９．４％の血小板および９７％のＢ細胞が除去された。
【０１２５】
したがって、本発明は、これらのサンプルに制限されないが、全血、バフィーコート調製物、白血球分離採取物、臍帯血および骨髄穿刺液などのサンプルに対して成功裏に使用され得る。本発明は、赤血球および他の細胞成分を含有する任意のサンプルで機能することになる。そのようなサンプルは、例えば、もともと赤血球を含有しないサンプル、例えば細胞培養、に赤血球を添加することによって人工的に生成されてもよい。
【０１２６】
実施例１４：遠心分離しないＲｏｓｅｔｔｅ  ｓｅｐの原理
現行技術が、遠心分離ステップなしに全血から直接細胞分離できるかどうか評価するために、米国特許第６，８７２，５６７号Ｂ２に規定された実施例にしたがって、赤血球凝集試薬としてデキストランまたはＨＰＭＣ１５を使用して、赤血球ロゼット形成法（ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を評価した。ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｃｋｔａｉｌを、ヒト全血由来バフィーコート５ｍＬ、およびデキストランＴ５００またはＨＰＭＣ１５のいずれかと１０分間インキュベートした。赤血球細胞は、抗体カクテルなしの対照実験において沈殿したにもかかわらず、沈殿しなかった。
【０１２７】
細胞懸濁液を、５０ｘｇで５分間遠心分離した。上清を回収し、フローサイトメトリによって分析した。Ｆｉｃｏｌｌ手順を用いてキットを使用した場合、供給元によって提供された参照値である純度７１±９％および収率５７±２３％と比較して、単球は、８．９２％からそれぞれ３７．９％（デキストラン）および３５．２％（ＨＰＭＣ）へと収率２８．３％／１１．５％で濃縮された。
【０１２８】
赤血球沈殿および対象外の細胞ロゼット形成と赤血球との組合せは、遠心分離なしでは全く機能せず、遠心分離後でも十分な分離成績を得られなかった。
【０１２９】
実施例１５：ＣＤ２３５ａ抗体のありなしでの全血分離方法
抗体のカクテル（実施例３を参照されたい、特異性については、実施例２１を参照されたい）を磁性粒子（＞２００ｎｍ）にコンジュゲートさせ、実施例１、２および３に規定される手順にしたがって使用し、分離成績を、ＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）抗体を同種の磁性粒子にコンジュゲートさせ、第２ステップに使用して赤血球含有量をさらに低下させるかまたはコンジュゲートさせた抗体カクテルと組み合わせる実験と比較した。ＣＤ２３５ａコンジュゲートの添加によって、単離されるＮＫ細胞の純度が著しく改善されることはなかった（９４．２％対９２．８）。最終細胞調製物中の赤血球含有量は、４４％（４．６Ｅ＋０６  ＲＢＣ対８．２Ｅ＋０６、すなわち０．０７３％対０．１３０％（初期数））しか低下しなかった。対照的に、第２ステップにおいてＣＤ２３５ａ陽性赤血球を除去することによって、赤血球含有量を検出限界以下に低下させることができた。すなわち、ＣＤ２３５ａコンジュゲートビーズの添加は、高純度を得るのに必要でなく、赤血球を完全に除去するには不十分である。赤血球の完全な除去は、第２分離ステップにおいてＣＤ２３５ａ磁気ビーズを使用することによって達成できる。
【０１３０】
実施例１６：凍結乾燥試薬対液体試薬
本発明に基づいて、ＮＫ細胞単離キットを構成した（実施例２１を参照されたい）。試薬を、４℃で、凍結後に−７０℃で保管した、または補助剤と共に当技術分野で公知の手順で凍結乾燥した。凍結乾燥した試薬を、０．７５ｘリン酸緩衝食塩水で再構成した。組成物を、本発明によるＮＫ細胞単離に使用した。ＮＫ細胞を、それぞれ収率７２％、７１％、８３％でそれぞれ純度９０％、９２％、９０％に精製した（図１０を参照されたい）。
【０１３１】
実施例１７：異なる緩衝液で再構成した凍結乾燥試薬
本発明に基づいて、ＮＫ細胞単離キットを構成した（実施例２１を参照されたい）。試薬を、補助剤と共に当技術分野で公知の手順で凍結乾燥した。凍結乾燥した試薬を、異なる補助剤、
−０．３１２５％  ＢＳＡ／０．７５％  ＨＰＭＣ
−０．３１２５％  ＢＳＡ／０．７５％  ＨＰＭＣ／０．０３％  プルロニック／０．０５％  ＮａＡｚｉｄ
−０．７５％  ＨＰＭＣ／０．０３％  プルロニック／０．０５％  ＮａＡｚｉｄ
−０．７５％  ＨＰＭＣ／０．０３％  プルロニック
−０．７５％  ＨＰＭＣ／緩衝食塩水
と共に０．７５ｘリン酸塩で再構成した。
組成物を、本発明によるＮＫ細胞単離に使用した。ＮＫ細胞を、収率６３〜７１％で、純度８７〜８８％に精製した（図１１を参照されたい）。
【０１３２】
実施例１８：末梢血単核細胞キット組合せ
磁性粒子（実施例４）を、ＣＤ１５およびＣＤ６１を認識する抗体にコンジュゲートさせた。抗体ビーズコンジュゲートをヒト全血に対して滴定し、最適濃度を決定した。磁気ビーズ抗体コンジュゲートを、以前に決定した量でカクテルに混合した。
【０１３３】
抗体カクテルを、ヒト全血１．５ｍＬに加え、混合し、ＭＡＣＳｍｉｘTMチューブ回転装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）中で５分間インキュベートし、磁石に８分間置いた（図１７）。上清を、ピペット操作によって新しいチューブに回収した。蛍光色素コンジュゲート抗体の組合せを使用して、単離した末梢血単核細胞をＭＡＣＳｑｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒフローサイトメータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で分析した。
【０１３４】
実施例１９：Ｂ細胞キット組合せ
磁性粒子（実施例４）を、ＣＤ２、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ３６、ＣＤ４３、ＣＤ５６、ＣＤ６１およびａＩｇＥを認識する抗体にコンジュゲートさせた。抗体ビーズコンジュゲートをヒト全血に対して滴定し、最適濃度を決定した。磁気ビーズ抗体コンジュゲートを、以前に決定した量でカクテルに混合した。
【０１３５】
抗体カクテルを、ヒト全血１．５ｍＬに加え、混合し、ＭＡＣＳｍｉｘTMチューブ回転装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）中で５分間インキュベートし、磁石に８分間置いた（図１７）。上清を、ピペット操作によって新しいチューブに回収した。蛍光色素コンジュゲート抗体の組合せを使用して、単離したＢ細胞をＭＡＣＳｑｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒフローサイトメータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で分析した。
【０１３６】
実施例２０：Ｔ細胞キット組合せ
磁性粒子（実施例４）を、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ１２３、ａＩｇＥを認識する抗体にコンジュゲートさせた。抗体ビーズコンジュゲートをヒト全血に対して滴定し、最適濃度を決定した。磁気ビーズ抗体コンジュゲートを、以前に決定した量でカクテルに混合した。
【０１３７】
抗体カクテルを、ヒト全血１．５ｍＬに加え、混合し、ＭＡＣＳｍｉｘTMチューブ回転装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）中で５分間インキュベートし、磁石に８分間置いた（図１７）。上清を、ピペット操作によって新しいチューブに回収した。蛍光色素コンジュゲート抗体の組合せを使用して、単離したＴ細胞をＭＡＣＳｑｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒフローサイトメータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で分析した。
【０１３８】
実施例２１：ＮＫ細胞キット組合せ
磁性粒子（実施例４）を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ６１、ＣＤ１２３、ＣＤ１９３、ａＩｇＥ、ａＴＣＲａｂを認識する抗体にコンジュゲートさせた。抗体ビーズコンジュゲートをヒト全血に対して滴定し、最適濃度を決定した。磁気ビーズ抗体コンジュゲートを、以前に決定した量でカクテルに混合した。
【０１３９】
抗体カクテルを、ヒト全血１．５ｍＬに加え、混合し、ＭＡＣＳｍｉｘTMチューブ回転装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）中で５分間インキュベートし、磁石に８分間置いた（図１７）。上清を、ピペット操作によって新しいチューブに回収した。蛍光色素コンジュゲート抗体の組合せを使用して、単離したＮＫ細胞をＭＡＣＳｑｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒフローサイトメータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で分析した。
【０１４０】
実施例２２：単球キット組合せ
磁性粒子（実施例４）を、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ１２３、ＣＤ１９３、ＣＤ３０４、ＣＤ３３５、ａＩｇＥを認識する抗体にコンジュゲートさせた。抗体ビーズコンジュゲートをヒト全血に対して滴定し、最適濃度を決定した。磁気ビーズ抗体コンジュゲートを、以前に決定した量でカクテルに混合した。
【０１４１】
抗体カクテルを、ヒト全血１．５ｍＬに加え、混合し、ＭＡＣＳｍｉｘTMチューブ回転装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）中で５分間インキュベートし、磁石に８分間置いた（図１７）。上清を、ピペット操作によって新しいチューブに回収した。蛍光色素コンジュゲート抗体の組合せを使用して、単離した単球をＭＡＣＳｑｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒフローサイトメータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で分析した。
【０１４２】
実施例２３：ヘルパーＴ細胞キット組合せ
磁性粒子（実施例４）を、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ１２３、ａＩｇＥ、ａＴＣＲｇ／ｄを認識する抗体にコンジュゲートさせた。抗体ビーズコンジュゲートをヒト全血に対して滴定し、最適濃度を決定した。磁気ビーズ抗体コンジュゲートを、以前に決定した量でカクテルに混合した。
【０１４３】
抗体カクテルを、ヒト全血１．５ｍＬに加え、混合し、ＭＡＣＳｍｉｘTMチューブ回転装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）中で５分間インキュベートし、磁石に８分間置いた（図１７）。上清を、ピペット操作によって新しいチューブに回収した。蛍光色素コンジュゲート抗体の組合せを使用して、単離したヘルパーＴ細胞をＭＡＣＳｑｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒフローサイトメータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で分析した。
【０１４４】
実施例２４：細胞障害性Ｔ細胞キット組合せ
磁性粒子（実施例４）を、ＣＤ４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ１２３、ａＩｇＥ、ａＴＣＲｇ／ｄを認識する抗体にコンジュゲートさせた。抗体ビーズコンジュゲートをヒト全血に対して滴定し、最適濃度を決定した。磁気ビーズ抗体コンジュゲートを、以前に決定した量でカクテルに混合した。
【０１４５】
抗体カクテルを、ヒト全血１．５ｍＬに加え、混合し、ＭＡＣＳｍｉｘTMチューブ回転装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）中で５分間インキュベートし、磁石に８分間置いた（図１７）。上清を、ピペット操作によって新しいチューブに回収した。蛍光色素コンジュゲート抗体の組合せを使用して、単離した細胞障害性Ｔ細胞をＭＡＣＳｑｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒフローサイトメータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で分析した。
【０１４６】
実施例２５：２つのパラメータ種類
実施例１８に開示した発明を使用して、ヒト全血２０ｍｌから末梢血単核細胞を単離した。単離した末梢血単核細胞を、３００ｘｇの遠心分離ステップで洗浄し、平衡化したＭＡＣＳ  ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に適用した。通過画分を採取し、細胞を計数し、製造業者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）の説明書にしたがってＣＤ１９  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓを使用して、１００ｕｌ中で１Ｅ７白血球細胞を磁気標識した。ＭＡＣＳ  ＭＳカラムを使用して、Ｂ細胞を収率７９．８％で純度８１．２％に精製した。比較のために、実施例１８の本発明を使用して末梢血単核細胞を単離した。ＭＡＣＳ  Ｂ細胞単離キットを使用して、１００ｕｌ中で単離した末梢血単核細胞１Ｅ７を磁気標識した。Ｂ細胞を、収率９５％で８９．７％に精製した。
【０１４７】
実施例２６：沈殿速度
赤血球凝集溶液（ＨＰＭＣ−１５）、または赤血球凝集溶液とモノクローナル抗体（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ６１、ＣＤ１２３、抗ＩｇＥ）のカクテルにコンジュゲートしている異なるサイズ（５０ｎｍ、２００ｎｍ、３５００ｎｍ）の磁気ビーズのいずれかで補充したヒト全血の沈殿速度を、除去できる上清の容量を決定することによって評価した。驚くべきことに、赤血球凝集溶液（ＨＰＭＣ）だけを使用した場合の８．５分間と比較して、ＨＰＭＣ−１５と２００ｎｍのサイズの抗体コンジュゲート磁気ビーズとの組合せは、３分間以内に赤血球を完全に沈殿させた。より小さいまたはより大きい磁気ビーズを使用した場合、沈殿はより遅かった。図１８は、実験の結果を示す。
【０１４８】
実施例２７：ＣＤ３６コンジュゲート磁気ビーズの使用
全血２．５ｍＬを使用し、ＨＰＭＣ−１５と、ＣＤ４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ１２３、ａＩｇＥ、ａＴＣＲｇ／ｄ抗体にコンジュゲートしている単一特異的磁性粒子（２２０ｎｍ）のカクテルとを用いて、本発明によるＣＤ８陽性細胞障害性リンパ球を単離した。ＣＤ３６抗体コンジュゲートビーズをカクテルに添加したまたはＣＤ３６抗体を添加することなくカクテルを使用した。ＣＤ３６抗体コンジュゲート粒子なしの手法を用いて、初期量の７３％のＣＤ８陽性細胞を純度８０．４％で含有する上清２．４ｍＬを回収できた。図１３に図示した通り、ペレット形状は、沈殿したペレットと上清相の間に平面界面を形成した。ＣＤ３６抗体コンジュゲート磁性粒子を使用した場合、沈殿したペレットの指数形状（図１４）により、回収される上清の容量が大きくなり（２．６ｍｌ；＋８％）、純度８０．７％で収率７８％に増加させることができた。
【０１４９】
実施例２８：磁石デザインの比較
本発明（２００ｎｍ磁性粒子にコンジュゲートしている１：１の比のＣＤ６１およびＣＤ１５抗体、４ｍＬで希釈するためのＨＰＭＣ−１５含有緩衝液）を異なる磁石と組み合わせて使用して、全血由来バフィーコート８ｍＬから赤血球、血小板および顆粒球を除去した。ＭＡＣＳｉＭＡＧ  ｓｅｐａｒａｔｏｒは、９９．１％の顆粒球および９９．２％の血小板を除去し、磁気水槽ガラス清掃具は、それぞれ９７．６％および９８．７％、Ｕ字形ヨークに３個の磁石がある設計は、それぞれ９９．７％および９８．０％、ＳｅｎｓＳｃｒｅｅｎ磁石は、それぞれ９６．７％および９８．６％除去した。
【０１５０】
全血１ｍＬ、ＨＰＭＣ−１５含有ＰＢＳ緩衝液、２４０ｎｍ磁性粒子にコンジュゲートしている非ＮＫ細胞結合抗体からなるＮＫ細胞単離キットを使用して、図１７による磁石をＭＡＣＳｉＭＡＧ  ｓｅｐａｒａｔｏｒと比較した。血液を試薬と５分間インキュベートし、沈殿時間は８分間にした。ＮＫ細胞は、図１７による磁石を使用して収率６７％で純度８１％に、ＭＡＣＳｉＭＡＧ  ｓｅｐａｒａｔｏｒを使用して収率６６％で純度７７．６％に精製された。
【０１５１】
実施例２９：５０ｎｍ磁性粒子を使用するＢ細胞除去
Ｂ細胞上のＣＤ１９を認識するモノクローナル抗体を、磁気ビーズにコンジュゲートさせた（実施例４、平均粒径５０ｎｍ、ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）。ビーズコンジュゲート抗体を、全血由来バフィーコート１．３ｍＬ、ＰＢＳ緩衝液０．７ｍＬ、ＨＰＭＣ１５保存溶液２００ｕｌに加えた。７５％より多いＢ細胞がサンプルの中に残ったままであり、Ｂ細胞は不十分にしか除去されなかった（図１２を参照されたい）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2014533957.tif 000017
【図１６】
2014533957.tif 000018
【図１７】
2014533957.tif 000019
【図１８】
2014533957.tif 000020
【図１９】
2014533957.tif 000021
【国際調査報告】
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