(57)【要約】治療的使用または美容的使用のために、幹細胞系などの細胞系を発生させ、用いる方法。一実施形態では、細胞系を用いて、肥満、糖尿病、高血圧症、および心不全が含まれるがこれらに限定されない、広範にわたる変性障害および代謝性障害を処置する。また、このような細胞系を用いて、多様な過程を調節するのに役割を果たす化合物についてスクリーニングする方法も記載される。本発明の別の態様は、被験体における肥満を処置する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を生成する方法であって、
褐色脂肪組織を得る工程と、
幹細胞を、該褐色脂肪組織から単離する工程と、
該幹細胞を、動物産物を含まない培地で培養し、これにより、幹細胞を生成する工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記褐色脂肪組織が、被験体から得られる試料由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞が、以下の細胞表面マーカー：ＣＤ６３、ＣＤ９０、ＨＬＡ  ＡＢＣ、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ１６６、ＣＤ９、ＣＤ４４のうちの１または複数について陽性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞が、以下の細胞表面マーカー：ＣＤ３４、ＣＤ１９、ＣＤ８６、ＨＬＡ  ＤＲ、Ｌｉｎ、ＣＤ１０６、ＣＤ８０、ＣＤ１１７のうちの１または複数について陰性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
被験体における代謝性障害を処置する方法であって、
幹細胞を、ドナーから取り出す工程と、
該幹細胞を、動物産物を含まない培地で褐色脂肪細胞へと分化させる工程と、
該褐色脂肪細胞を、該被験体内の脂肪沈着物へと投与し、これにより、該被験体における該代謝性障害を処置する工程と
を含む方法。
【請求項６】
前記代謝性障害が、肥満、中心性肥満、糖尿病、高血圧症、心不全、虚血性心疾患、高血圧、トリグリセリド脂質異常症、ＨＤＬ脂質異常症、コレステロール脂質異常症、空腹時血漿グルコースの上昇、レプチン調節異常、およびアディポネクチン（ａｄｉｐｏｎ）調節異常からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記褐色脂肪細胞を、皮下注射により投与する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記褐色脂肪細胞を、全身注射により投与する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記培地が、インスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、およびインドメタシンからなる群から選択される分化剤を含有する、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
被験体における肥満を処置する方法であって、
褐色脂肪を、被験体から取り出す工程と、
該褐色脂肪を、該被験体内の脂肪沈着物へと投与し、これにより、該被験体における肥満を処置する工程と
を含む方法。
【請求項１１】
前記脂肪沈着物が、白色脂肪沈着物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記脂肪沈着物が、褐色脂肪沈着物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
代謝調節に関与する化合物を同定する方法であって、
幹細胞を、褐色脂肪組織から単離する工程と、
該幹細胞を、動物産物を含まない培地で培養する工程と、
該幹細胞を、被験化合物と接触させる工程と、
該被験化合物の存在下における該幹細胞の代謝活性レベルを決定する工程と、
該被験化合物の存在下における該幹細胞の該代謝活性レベルを、該被験化合物の非存在下における該幹細胞の代謝活性レベルと比較する工程と
を含み、
該被験化合物の存在下における代謝活性レベルが、該被験化合物の非存在下における代謝活性レベルと異なれば、該被験化合物が、代謝調節に関与する化合物として同定される方法。
【請求項１４】
前記決定する工程が、脂質生成を測定する工程を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＲＤＭ１６、ＢＭＰ７、ＵＣＰ１、ＵＣＰ２、またはＭＹＦ５のうちの１または複数のレベルを検出する工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記被験化合物が、タンパク質、抗体、ペプチド、ムテイン、ポリヌクレオチド、核酸アプタマー、および低分子からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
幹細胞を褐色脂肪細胞へと分化させる方法であって、
幹細胞を、動物産物を含まない培地と接触させ、これにより、褐色脂肪幹細胞を生成する工程
を含む方法。
【請求項１８】
前記培地が、インスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、インドメタシン、Ｔ３、ロシグリタゾン、ＦＮＤＣ５、およびこれらの組合せからなる群から選択される薬剤を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記培地が、インスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、およびインドメタシンを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記褐色脂肪幹細胞が、ＰＲＤＭ−１６、ＰＧＣ−１、またはこれらの組合せを発現する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記褐色脂肪組織が、被験体から得られる試料由来である、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細胞培養の分野に関し、より具体的には、幹細胞の培養および使用に関する。
【０００２】
関連出願
本願は、２０１１年６月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／５０２，５０８号、２０１２年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／６３２，１２２号、および２０１２年１月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／６３２，５１６号への優先権および利益を主張し、これらの米国仮特許出願の各々の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００３】
背景
褐色脂肪は、ヒト体内で見出される脂肪組織（ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ）の２つの種類のうちの１つである。胚形成の間に、褐色脂肪は、中胚葉の分化から誘導される。褐色脂肪は、熱を供給することが可能な代謝組織をもたらすことにより、発生およびホメオスタシスに関与する。褐色脂肪は、代謝および震えを伴わない熱発生を調節する一助となる。加えて、褐色脂肪は、代謝の調節においても、白色脂肪組織より大きな役割を果たす。褐色脂肪は、ヒト新生児の体重のうちの５パーセントを構成し、成人の体重のうちの１パーセント未満を構成する。
【０００４】
褐色脂肪の代謝活性は、体格指数の増大と共に減少する。同様に、褐色脂肪の代謝活性は、体脂肪パーセントの増大と共に減少する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
幹細胞は、多様な組織において同定および単離されており、白色脂肪組織の幹細胞は、単離および増殖がなされ、機能的治療特徴を有することが示されている。現在のところ、褐色脂肪組織では、幹細胞集団の集団（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）が同定されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
治療的使用または美容的使用のために、幹細胞系などの細胞系を発生させる方法について記載される。例えば、その細胞系を用いて、肥満、糖尿病、高血圧症、および心不全が挙げられるがこれらに限定されない、広範にわたる変性障害および代謝性障害を処置することができる。また、このような細胞系を用いて、メチル化、ホメオスタシスなどであるがこれらに限定されない多様な過程を調節するのに役割を果たす化合物、ならびに体内における褐色脂肪および白色脂肪レベルの代謝の調節、熱発生、活性化、および／または維持に関与する遺伝子についてスクリーニングする方法についても記載される。
【０００７】
一態様では、本発明は、幹細胞を生成する方法を特色とする。一実施形態では、その工程が、褐色脂肪組織を得るｂ工程と、幹細胞を、褐色脂肪組織から単離する工程と、幹細胞を、動物産物を含まない培地で培養し、これにより、幹細胞を生成する工程とを含む。別の実施形態では、褐色脂肪組織が、被験体から得られる試料由来である。別の実施形態では、幹細胞が、以下の細胞表面マーカー：ＣＤ６３、ＣＤ９０、ＨＬＡ  ＡＢＣ、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ１６６、ＣＤ９、ＣＤ４４のうちの１または複数について陽性である。別の実施形態では、幹細胞が、以下の細胞表面マーカー：ＣＤ３４、ＣＤ１９、ＣＤ８６、ＨＬＡ  ＤＲ、Ｌｉｎ、ＣＤ１０６、ＣＤ８０、ＣＤ１１７のうちの１または複数について陰性である。さらになお別の実施形態では、幹細胞が、自家（ａｕｔｏｇｅｎｅｉｃ）のものである。別の実施形態では、幹細胞が、同種異系のものである。別の実施形態では、培地は、フェノールレッドを含まないＬｏｗ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ＤＭＥＭ、０．５〜２０％のヒト血小板溶解物、１倍濃度のＮＥＡＡ、１倍濃度のＧｌｕｔａｍａｘ、１倍濃度のゲンタマイシン、および１０００単位のヘパリンを含む。
【０００８】
別の態様では、本発明は、幹細胞、前駆細胞、または活性化させた褐色脂肪脂肪細胞（例えば、ＵＣＰ−１および／またはＰＲＤＭ１６を発現する褐色脂肪脂肪細胞）などの分化細胞の細胞抽出物を生成し、この抽出物を被験体内の脂肪沈着物へと投与し、これにより、肥満を処置する方法を特色とする。
【０００９】
本発明の別の態様は、被験体における肥満を処置する方法である。一実施形態では、方法が、褐色脂肪を、被験体から取り出す工程と、褐色脂肪を、被験体内の脂肪沈着物へと投与し、これにより、被験体における肥満を処置する工程とを含む。一実施形態では、脂肪沈着物が、白色脂肪沈着物である。別の実施形態では、脂肪沈着物が、褐色脂肪沈着物である。
【００１０】
別の態様では、本発明は、代謝調節、褐色脂肪の活性化および／または維持に関与する化合物を同定する方法であって、本明細書で記載される方法により生成される自己幹細胞、前駆細胞、または分化細胞を、被験化合物と接触させる工程と、被験化合物の存在下における幹細胞、前駆細胞、または分化細胞の代謝活性、熱発生、および／またはＰＲＤＭ−１６、ｍｙｆ−５、ＵＣＰ−１、ＣＹＣ１、ＮＤＵＦＡ１１、ＮＤＵＦＡ１３、ＣＭＴ１Ａ、ＥＬＯＶＬ３、ＤＩＯ２、ＬＨＸ８、ＣＯＸ８Ａ、ＣＹＦＩＰ２、ＣＩＤＥＡ、Ｃｏｘ８ｂ、Ｇｌｕｔ４など、ある特定の遺伝子の活性化のレベルを決定する工程と、被験化合物の存在下における幹細胞、前駆細胞、または分化細胞の代謝活性、熱発生、および／または遺伝子活性のレベルを、被験化合物の非存在下における幹細胞、前駆細胞、または分化細胞の代謝活性、熱発生、および／または遺伝子活性のレベルと比較する工程とを含み、被験化合物の存在下における代謝活性、熱発生、および／または遺伝子活性のレベルが、被験化合物の非存在下における代謝活性、熱発生、および／または遺伝子活性のレベルと異なれば、被験化合物が、代謝調節、または褐色脂肪の活性化、熱発生、および／もしくは維持に関与する化合物として同定される方法を特色とする。
【００１１】
なお別の態様では、本発明は、被験体における代謝性障害を処置する方法に関する。一実施形態では、方法が、幹細胞を、ドナーから取り出す工程と、幹細胞を、動物産物を含まない培地で褐色脂肪細胞へと分化させる工程と、褐色脂肪細胞を、被験体内の脂肪沈着物へと投与し、これにより、被験体における代謝性障害を処置する工程とを含む。別の実施形態では、代謝性障害が、肥満、中心性肥満、糖尿病、高血圧症、心不全、虚血性心疾患、高血圧、トリグリセリド脂質異常症、ＨＤＬ脂質異常症、コレステロール脂質異常症、空腹時血漿グルコースの上昇、レプチン調節異常、およびアディポネクチン（ａｄｉｐｏｎ）調節異常からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、褐色脂肪細胞を、皮下注射により投与する。さらになお別の実施形態では、褐色脂肪細胞を、全身注射により投与する。別の実施形態では、培地が、インスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、およびインドメタシンからなる群から選択される分化剤を含有する。
【００１２】
本発明のさらになお別の態様は、代謝調節に関与する化合物を同定する方法である。一実施形態では、方法が、幹細胞を、褐色脂肪組織から単離する工程と、幹細胞を、動物産物を含まない培地で培養する工程と、幹細胞を、被験化合物と接触させる工程と、被験化合物の存在下における幹細胞の代謝活性レベルを決定する工程と、被験化合物の存在下における幹細胞の代謝活性レベルを、被験化合物の非存在下における幹細胞の代謝活性レベルと比較する工程とを含み、被験化合物の存在下における代謝活性レベルが、被験化合物の非存在下における代謝活性レベルと異なれば、被験化合物が、代謝調節に関与する化合物として同定される。一実施形態では、決定する工程が、脂質生成の測定を含む。別の実施形態では、方法が、ＰＲＤＭ１６、ＢＭＰ７、ＵＣＰ１、ＵＣＰ２、またはＭＹＦ５のうちの１または複数のレベルを検出する工程をさらに含む。さらになお別の実施形態では、被験化合物が、タンパク質、抗体、ペプチド、ムテイン、ポリヌクレオチド、核酸アプタマー、および低分子からなる群から選択される。
【００１３】
本発明の態様は、幹細胞を褐色脂肪細胞（ｂｒｏｗｎ  ｆａｔ  ｃｅｌｌ）へと分化させることに関する。一実施形態では、方法が、幹細胞を、動物産物を含まない培地と接触させ、これにより、褐色脂肪幹細胞を生成する工程を含む。別の実施形態では、培地は、インスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、インドメタシン、Ｔ３、ロシグリタゾン、ＦＮＤＣ５、およびこれらの組合せからなる群から選択される剤を含む。さらになお別の実施形態では、培地は、インスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、およびインドメタシンを含む。なお別の実施形態では、褐色脂肪幹細胞が、ＰＲＤＭ−１６、ＰＧＣ−１、またはこれらの組合せを発現する。さらになお別の実施形態では、褐色脂肪組織が、被験体から得られる試料由来である。
【００１４】
本明細書で記載される本教示は、添付される図面と併せて読まれる場合、多様な例示的実施形態についての以下の記載からより十分に理解される。下記の図面は、例示だけを目的とするものであり、いかなる形であれ、本教示の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、褐色脂肪細胞または褐色脂肪前駆体細胞を被験体へと注射する例示的な方法について描示する概略図である。
【００１６】
【図２】図２は、継代できる状態にある細胞培養物についての顕微鏡写真である。
【００１７】
【図３】図３は、白色脂肪沈着物および褐色脂肪沈着物におけるＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子の発現を示す画像である。
【００１８】
【図４】図４ＡおよびＢは、幹細胞マーカーで染色された細胞についての蛍光顕微鏡写真である。
【００１９】
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｆは、フローサイトメトリーによる多様な細胞型マーカーの検出を示す一連のグラフである。
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｆは、フローサイトメトリーによる多様な細胞型マーカーの検出を示す一連のグラフである。
【図５Ｃ】図５Ａ〜Ｆは、フローサイトメトリーによる多様な細胞型マーカーの検出を示す一連のグラフである。
【図５Ｄ】図５Ａ〜Ｆは、フローサイトメトリーによる多様な細胞型マーカーの検出を示す一連のグラフである。
【図５Ｅ】図５Ａ〜Ｆは、フローサイトメトリーによる多様な細胞型マーカーの検出を示す一連のグラフである。
【図５Ｆ】図５Ａ〜Ｆは、フローサイトメトリーによる多様な細胞型マーカーの検出を示す一連のグラフである。
【００２０】
【図６】図６は、細胞培養物における脂肪滴の存在を示す顕微鏡写真である。
【００２１】
【図７】図７ＡおよびＢは、オイルレッドＯで染色された細胞についての顕微鏡写真である。図７Ａは、大脂肪滴（２００μｍ）を示す図であり、図７Ｂは、小脂肪滴（５０μｍ）を示す図である。
【００２２】
【図８】図８ＡおよびＢは、分化マーカーで染色された細胞についての顕微鏡写真である。図８Ａは、骨形成のマーカーのアリザリンレッドでの染色を示す図である。図８Ｂは、軟骨形成を示す、オステオカルシン抗体およびアルシアンブルーでの染色を示す図である。
【００２３】
【図９】図９は、褐色脂肪細胞から単離されたエクソソームについての走査電子顕微鏡写真である。
【００２４】
【図１０】図１０は、褐色脂肪前駆細胞で処置されたマウスにおけるグルコースレベルおよび体重の時間経過を示す図である。
【００２５】
【図１１】図１１は、褐色脂肪前駆細胞で処置されたマウスにおけるトリグリセリドレベルおよびコレステロールレベルの時間経過を示す図である。
【００２６】
【図１２】図１２は、褐色脂肪前駆細胞で処置されたマウスにおけるレプチンレベルおよびアディポネクチン（ａｄｉｐｏｎ）レベルの時間経過を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
詳細な説明
本発明は、自己もしくは非自己褐色脂肪細胞または自己もしくは非自己幹細胞などの細胞を単離し、被験体における代謝および／もしくは熱発生を改変し、かつ／または代謝性障害など、被験体における広範にわたる障害を処置するのに用いうることの発見に少なくとも一部基づく（図１）。
【００２８】
本明細書で記載される通り、褐色脂肪細胞および褐色脂肪幹細胞を治療的に用いて、多数の代謝性障害を処置することができる。一部の実施形態では、代謝性障害が、中心性肥満（胴回りが男性において４０インチ以上、または女性において３６インチ以上）；トリグリセリド脂質異常症（１．７ミリモル（ｍｍｏｌ）／Ｌ（１５０ｍｇ／ｄｌ）以上）；ＨＤＬ脂質異常症（男性において４０ｍｇ／ｄｌ未満、女性において５０ｍｇ／ｄｌ未満）；血圧（１３０／８５ｍｍＨｇ以上）；および空腹時血漿グルコースの上昇（６．１ミリモル／Ｌ（１１０ｍｇ／ｄｌ）以上）から選択される。
【００２９】
単離される細胞は、例えば、自己供給源由来である場合もあり、同種異系供給源由来である場合もある。しかしまた、他の供給源も用いることができる。
【００３０】
細胞産物は、細胞抽出物など、縦隔の脂肪沈着物に由来する培養幹細胞から作製することができる。次いで、これらの細胞抽出物を治療的に用いることができる。
【００３１】
褐色脂肪沈着物から単離される、本出願において記載される細胞または幹細胞はまた、褐色脂肪レベル、代謝レベルを上昇させ、かつ／または代謝活性の増大に好適な遺伝子発現プロファイルをもたらす化合物（天然に存在する化合物を含めた）をスクリーニングするのにも用いることができる。同様に、本明細書で記載される細胞、または幹細胞を用いて、褐色脂肪レベル、代謝レベルを低下させ、かつ／または代謝活性の増大に好適でない遺伝子発現プロファイルをもたらす化合物（天然に存在する化合物を含めた）を同定することもできる。一部の実施形態では、スクリーニングが、低分子スクリーニングである。
【００３２】
本明細書で用いられる「処置」とは、疾患または障害の症状のうちの１または複数が改善されるかまたは別の形で有益に改変される任意の様式を意味する。本明細書で用いられる特定の障害の症状の改善とは、恒久的なものであれ、一時的なものであれ、持続性のものであれ、一過性のものであれ、症状の任意の軽減であり、これは本発明の組成物および方法による処置に起因しうるかまたはこれらと関連しうる。
【００３３】
本明細書で用いられる「有効量」および「〜を処置するのに有効な」という用語は、ある期間にわたり利用される（短期投与または長期投与および定期的投与または連続的投与を含めた）、本明細書で記載される組成物の１または複数の量または濃度であって、意図される効果または生理学的帰結をもたらすためのその投与の文脈内で有効な量または濃度を指す。
【００３４】
本明細書で用いられる「被験体」という用語は、本開示の方法に従う処置が施される動物、ヒト、または非ヒトを意味する。獣医学的適用および非獣医学的適用が想定される。この用語は、哺乳動物を含むがこれに限定されない。典型的な被験体には、ヒト、家畜、ならびにネコおよびイヌなどの家庭用ペットが挙げられる。一部の実施形態では、被験体が哺乳動物である。一部の実施形態では、被験体が、ヒト被験体、例えば、肥満のヒト被験体である。一部の実施形態では、被験体が、非ヒト哺乳動物、例えば、実験動物、愛玩動物、または食用に飼育される動物である。
【００３５】
本明細書で用いられる「単離」細胞または「精製」細胞とは、細胞が由来する細胞培養物または組織供給源由来の夾雑成分を実質的に含まない細胞である。「実質的に含まない」とは、選択された細胞の調製物のうちの選択されていない成分が、約５０％未満（例えば、約４０％、３０％、２０％、または１０％未満）であることを意味する。本明細書ではまた、このような選択されていない成分を、「夾雑成分」とも称する。単離細胞を組換えにより産生する場合、単離細胞は、培養培地を実質的に含まない場合がある、すなわち、培養培地は、細胞調製物の容量のうちの約２０％未満（例えば、約１０％または５％未満）を占める。
【００３６】
本明細書で用いられる「幹細胞」とは、自己再生および多くの異なる細胞系列への分化の両方が可能な（多能性の）細胞である。「前駆細胞」とは、幹細胞の表現型と類似する表現型を伴う幹細胞のサブセットを指す。前駆細胞は、自己再生が可能であり、典型的に複能性である。本明細書で用いられる「分化細胞」とは、特定の組織または器官系に特異的な成熟細胞型の表現型を伴う細胞のサブセットを指す。
【００３７】
細胞を得る方法
一般に、本明細書で記載される方法で有用な細胞は、細胞を被験体から単離することなどにより、被験体から得ることもでき、臨床グレードの胚性幹細胞を、商業的供給源から得ることもできる。ある特定の実施形態では、細胞が、被験体由来の褐色脂肪試料などの組織試料の一部である。組織試料を被験体に直接投与することもでき、細胞を組織から単離し、本明細書で記載される通りに処理することもできる。他の実施形態では、細胞が、骨髄生検などからの幹細胞であり、本明細書で記載される通りに処理することができる。
【００３８】
本明細書で記載される方法において用いうるある特定の細胞は、単能性細胞、複能性細胞、または多能性細胞であり、中胚葉由来のものでありうる。一部の実施形態では、細胞が、褐色脂肪前駆細胞、成熟褐色脂肪細胞、または幹細胞である。褐色脂肪前駆細胞、成熟褐色脂肪細胞、または幹細胞は、１または複数の細胞表面における発現マーカーの存在または非存在を決定することにより同定することができる。褐色脂肪前駆細胞、成熟褐色脂肪細胞、または幹細胞を同定するのに用いうる例示的な細胞表面マーカーには、ＭＹＦ５、ＵＣＰ−１、ＰＲＤＭ−１６、ＳＳＥＡ−４、Ｓｃａ−１、ＣＤ４５、Ｍａｃ−１、ＣＤ２９（インテグリンβ１）、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＣＤ１６６（ＡＬＣＡＭ）、デスミン、ビメンチン、およびｃ−ｋｉｔが挙げられるがこれらに限定されない。なお他の方法では、細胞が、褐色脂肪細胞である。
【００３９】
本明細書で記載される方法のうちのいずれにおいても、細胞は、自己、同系、同種異系、または異種のものでありうる。
【００４０】
本明細書で記載される方法において用いるのに適する細胞は、例えば、骨格筋、心筋、平滑筋、前立腺、真皮、心血管系、乳腺、肝臓、新生児皮膚、頭蓋冠、骨髄、腸、脂肪組織（例えば、白色脂肪組織、褐色脂肪組織）、末梢血、動員末梢血、および臍帯が挙げられるがこれらに限定されない、多様な組織および器官において見出すことができる。細胞は、このような組織および器官から、例えば、生検、アフェレーシス、または脂肪吸引を含めた、多数の公知の方途により単離することができる。
【００４１】
一部の実施形態では、細胞を、脂肪組織、例えば、白色または褐色脂肪沈着物から得る。例えば、褐色脂肪組織は、公知の手段を用いて（例えば、生検により）、頸部−鎖骨上領域、縦隔上部領域、および胸鎖乳突筋の表面領域または側面領域など、被験体の特定の解剖学的領域から採取することができる。褐色脂肪組織は、画像化による（例えば、ＰＥＴスキャンによる）など、多数の方法により同定することができる。褐色脂肪組織は、本明細書で記載される通り、最小限の処理（緩衝液、例えば、ＤＰＢＳで洗浄し、部分へと機械的に分離することによるなど）にかけ、被験体に投与することができる。
【００４２】
他の方法では、褐色脂肪細胞、単核細胞、前駆細胞、または幹細胞などの細胞を、組織試料の夾雑成分から単離することができる。例えば、組織試料を、コラゲナーゼ（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型）、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼ、またはエラスターゼなどの酵素で処置し、細胞を濾過または遠心分離により単離することができる。代替的に、組織試料は、ＥＤＴＡによるなど、化学的に処理することもでき、細胞を、例えば、機械的破壊（例えば、ボルテックス）を用いて単離することができる。単離された細胞は、ＤＰＢＳなど、適切な緩衝液で洗浄することができる。
【００４３】
一部の方法では、細胞を、被験体の骨髄試料から単離する。例えば、骨髄試料は、注射針による吸引または他の公知の技法を用いて得ることができる。ある特定の場合には、細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑによる密度勾配を用いて骨髄試料から単離することができる。
【００４４】
なお他の方法では、細胞を、被験体の皮膚から単離する。例えば、パンチ生検を用いて、皮膚試料を得ることができる。例示的な一方法では、パンチ生検を用いて、０．５ｃｍの皮膚小片を得、これを、ＤＰＢＳで３回にわたり洗浄し、真皮を生検から取り出す。次いで、皮膚を小型の（約３ｍｍ）切片へと切断し、６ウェル組織培養プレートのウェルへと播種し、滅菌カバースリップで培養される組織および細胞を覆う。
【００４５】
細胞を培養する方法
ある特定の方法では、より大きな細胞集団を得るために、本明細書で記載される通りに得られた細胞を、適切な培養培地、例えば、動物ベースの産物（ウシ血清または仔ウシ血清など）を含まない培養培地で維持する。培養方法は、細胞に、例えば、所望のサイズ、例えば、被験体に治療効果をもたらすのに十分な数、または安定的な細胞系を確立するのに十分な数のクローン細胞株または異種細胞株のいずれかを産生するのに十分なラウンドの倍加を経させる工程を含みうる。例えば、細胞は、初回の生検後３７℃で３〜６週間にわたり培養することができる。
【００４６】
本明細書で記載される方法において用いられる培養培地は、動物ベースの産物を含まない。本明細書で記載される方法に適する例示的な培養培地は、ヒト血小板溶解物およびヘパリンまたはクエン酸デキストロースなどの抗凝固剤を含むことができる。別の例示的な培養培地は、プールされたヒトＡＢ型血清および抗凝固剤を含む。他の培養培地の例には、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−グルタミン、および抗生剤を補充した改変イーグル培地（ＭＥＭ）（ダルベッコＭＥＭまたはアルファＭＥＭなど）を挙げることができる。例示的な１つの培養培地は、ＤＭＥＭ（低グルコース、フェノールレッドを含まない）；０．５〜２０％のヒト血小板溶解物；１倍濃度の非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）；１倍濃度のＧｌｕｔａｍａｘ；１倍濃度のゲンタマイシン、および１０００単位のヘパリンを含む。
【００４７】
一部の実施形態では、細胞を、例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４年）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，  ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋなどにおいて記載される標準的な条件下の培養培地で維持することができる。
【００４８】
ある特定の実施形態では、細胞を、ヒト血小板溶解物または低温、例えば、被験体において交感神経系による応答を生じさせるのに適する温度へと曝露された被験体に由来するプールされたヒトＡＢ型血清で培養する。
【００４９】
他の実施形態では、細胞を、低酸素環境（例えば、３７℃で０〜約５％のＯ２）中で維持することができる。
【００５０】
ある特定の実施形態では、培養された細胞が、ＭＹＦ−５、ＢＭＰ７、および／またはＰＲＤＭ１６、ＳＳＥＡ４を発現することができる。他の実施形態では、筋組織から培養された細胞が、ＳＣＡ１を発現することができるが、ｃ−ＫｉｔまたはＣＤ４５を発現することができない。
【００５１】
細胞を分化させる方法
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される通りに得られた細胞を、適切な分化培地、例えば、動物ベースの産物を含まない培地で維持する。例えば、幹細胞を、幹細胞の褐色脂肪細胞前駆細胞または褐色脂肪細胞への分化を結果としてもたらすのに十分な期間にわたり、分化培地で維持することができる。特定の実施形態では、細胞を、幹細胞のＭＹＦ５発現細胞への分化を結果としてもたらすのに十分な期間にわたり、分化培地で維持する。ある特定の場合には、細胞を、例えば、１〜５日間、５〜１０日間、１０〜１４日間、１４〜２１日間、２１〜２８日間またはそれより長い期間にわたり、分化培地で維持する。
【００５２】
一部の実施形態では、分化培地は、１または複数の化学的分化誘導剤もしくはホルモン性分化誘導剤および／またはチアゾリジンジオン（例えば、Ｋｌｉｅｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７４巻：３４７９５〜３４８０２頁（１９９９年）、Ｈａｕｎｅｒら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、８４巻：１６６３〜１６７０頁（１９８９年）において記載されている）を含む。場合によっては、分化培地は、インスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、ならびにインドメタシンおよびロシグリタゾンを含む。例示的な１つの分化培地は、ＤＭＥＭ（低グルコース、フェノールレッドを含まない）；０．５％〜２０％のヒト血小板溶解物；１倍濃度のＮＥＡＡ；１倍濃度のＧｌｕｔａｍａｘ；１倍濃度のゲンタマイシン；１０００単位のヘパリン；１０ｕｇ／ｍＬのインスリン；１ｕＭのデキサメタゾン；２００ｕＭのインドメタシン；および０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチンを含む。別の実施形態では、分化培地は、ＢＭＰ７を含む。別の実施形態では、分化培地は、ＤＭＥＭ（低グルコース、フェノールレッドを含まない）；０．５％〜２０％のヒト血小板溶解物；１倍濃度のＮＥＡＡ；１倍濃度のＧｌｕｔａｍａｘ；１倍濃度のゲンタマイシン；１０００単位のヘパリン；０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン、１２５ｎＭのインドメタシン、５ｕＭのデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈｏｓａｏｎｅ）、８５０ｎＭのインスリン、１ｎＭのＴ３、および１ｕＭのロシグリタゾンを含む。別の実施形態では、分化培地は、ＤＭＥＭ（低グルコース、フェノールレッドを含まない）；０．５％〜２０％のヒト血小板溶解物；１倍濃度のＮＥＡＡ；１倍濃度のＧｌｕｔａｍａｘ；１倍濃度のゲンタマイシン；１０００単位のヘパリン；０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン、１２５ｎＭのインドメタシン、５ｕＭのデキサメタゾン、８５０ｎＭのインスリン、１ｎＭのＴ３、ならびに１ｕＭのロシグリタゾンおよび２０ｎＭのＦＮＤＣ５を含む。
【００５３】
場合によっては、細胞を、褐色脂肪細胞への分化についての１または複数のマーカーが検出されるまで、分化培地で維持する。分化マーカーの非限定的な例には、細胞死誘導性ＤＦＦ４５様エフェクターＡ（ＣＩＤＥＡ）、ＩＩ型脱ヨード酵素（ｄｅｉｏｄｉｎａｉｅ）、ＰＰＡＲガンマコアクチベーター（ＰＧＣ）−１アルファ、ＰＧＣ−１ベータ、脱共役タンパク質（例えば、ＵＣＰ１）、ＰＲＤＭ１６、またはＣＩＧ３０、ＰＲＤＭ−１６、ＣＹＣ１、ＮＤＵＦＡ１１、ＮＤＵＦＡ１３、ＣＭＴ１Ａ、ＥＬＯＶＬ３、ＤＩＯ２、ＬＨＸ８、ＣＯＸ８Ａ、ＣＹＦＩＰ２、Ｃｏｘ８ｂ、Ｇｌｕｔ４の発現が挙げられる。
【００５４】
一部の実施形態では、方法が、４℃〜２５℃で１時間にわたる毎日のサイクルで細胞を培養するかまたは分化させることによって、細胞を低温ショックへと曝露した後に、標準的な条件（３７℃、５％のＣＯ２、または低酸素条件）で培養する工程を含む。
【００５５】
一部の実施形態では、方法が、分化培地で維持した後の脂質生成レベルを評価する工程を含む。脂質生成は、例えば、脂質蓄積（例えば、オイルレッド−ｏ（ＯＲＯ）染色を用いて）、細胞の形態（例えば、細胞の視覚的精査、例えば、顕微鏡による精査を用いて）、または細胞の熱力学的性質（例えば、シトクロムオキシダーゼ活性、Ｎａ＋−Ｋ＋−ＡＴＰアーゼ酵素単位、または褐色脂肪細胞による熱発生に関与する他の酵素）を測定することにより評価することができる。加えて、一部の実施形態では、分化後における機能的褐色脂肪による脂質生成を、脂肪酸取込みアッセイまたは酸素消費速度により決定することもできる。
【００５６】
さらなる処理法
一部の実施形態では、本明細書で記載される通りに得られた細胞を、追加の処理にかけてから、被験体に投与することができる。ある特定の実施形態では、本明細書で記載される通りに得られた細胞を、１または複数の遺伝子、例えば、褐色脂質生成に関与する遺伝子を発現するように組換えにより改変することができる。例えば、細胞に、ＤＦＦ４５様エフェクターＡ（ＣＩＤＥＡ）、ＩＩ型脱ヨード酵素、ＰＰＡＲガンマコアクチベーター（ＰＧＣ）−１アルファ、ＰＧＣ−１ベータ、脱共役タンパク質（例えば、ＵＣＰ１）、ＰＲＤＭ１６、またはＣＩＧ３０、ＰＲＤＭ−１６、ＣＹＣ１、ＮＤＵＦＡ１１、ＮＤＵＦＡ１３、ＣＭＴ１Ａ、ＥＬＯＶＬ３、ＤＩＯ２、ＬＨＸ８、ＣＯＸ８Ａ、ＣＹＦＩＰ２、Ｃｏｘ８ｂ、Ｇｌｕｔ４、またはこれらの遺伝子の組合せをコードする１または複数の核酸をトランスフェクトしてから、被験体に投与することができる。
【００５７】
他の実施形態では、細胞が、非多能性細胞から人工的に誘導された（例えば、分化させるかまたは部分的に分化させた）多能性幹細胞でありうる。例えば、皮膚線維芽細胞などの皮膚細胞を、ＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ、またはＳＳＥＡ４によるトランスフェクションを介して、多能性状態へと再プログラム化することができる。当技術分野では、このような細胞が、人工多能性幹細胞として公知である。他の実施形態では、細胞を、多能性となった後で、ＤＦＦ４５様エフェクターＡ（ＣＩＤＥＡ）、ＩＩ型脱ヨード酵素、ＰＰＡＲガンマコアクチベーター（ＰＧＣ）−１アルファ、ＰＧＣ−１ベータ、脱共役タンパク質（例えば、ＵＣＰ１）、ＰＲＤＭ１６、またはＣＩＧ３０、ＰＲＤＭ−１６、ＣＹＣ１、ＮＤＵＦＡ１１、ＮＤＵＦＡ１３、ＣＭＴ１Ａ、ＥＬＯＶＬ３、ＤＩＯ２、ＬＨＸ８、ＣＯＸ８Ａ、ＣＹＦＩＰ２、Ｃｏｘ８ｂ、Ｇｌｕｔ４、またはこれらの遺伝子の組合せ（すなわち、ＰＰＡＲＧ２、ＣＥＢＰＢ、ＰＲＤＭ１６）をコードする１または複数の核酸によるトランスフェクションを介してさらに操作することができる。
【００５８】
さらなる実施形態では、細胞を、有糸分裂的に不活化してから、被験体に投与することができる。理論により束縛されることを望まないが、本明細書で記載される通りに得られ、かつ／または処置された細胞は、被験体へと投与されると、周囲の細胞および組織に対してパラクリン効果を有しうるある特定の因子を発現すると考えられる。したがって、有糸分裂的不活化は、さらなる細胞分裂を防止しながら、不活化された細胞にパラクリン効果を維持させる。ある特定の実施形態では、細胞を有糸分裂的に不活化するのに十分な化学物質またはガンマ線照射で細胞を処理することができる。
【００５９】
一部の実施形態では、細胞抽出物または細胞溶解物を、本明細書で記載される細胞から調製し、被験体に投与することができる。例えば、細胞を得、培養し、約１０６〜約１０１０個の細胞を回収し、公知の方法を用いて無細胞抽出物を調製するのに用いることができる。例示的な一方法では、回収された細胞を、エタノール／ドライアイス浴を用いる凍結融解サイクル（例えば、１、２、３、４、５回またはそれより多くの凍結融解サイクル）にかけることにより、抽出物を調製する。次いで、抽出物を遠心分離（例えば、約１４，０００ｒｐｍで）して、不溶性物質を除去する。次いで、抽出物を、被験体に投与することができる。
【００６０】
発現法
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される細胞を、１または複数の遺伝子を発現するように組換えにより改変することができる。このような核酸は、発現ベクターへと組み込むことができる。本明細書で記載される核酸配列を含む発現ベクターは、任意の有効なキャリア、例えば、成分遺伝子を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて細胞へと有効に送達することが可能な任意の製剤または組成物で投与することができる。手法には、遺伝子の、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、および単純ヘルペスウイルス１を含めたウイルスベクター、または組換え細菌プラスミドもしくは組換え真核細胞プラスミドへの挿入が含まれる。ウイルスベクターは、細胞に直接トランスフェクトするが、プラスミドＤＮＡは、裸で送達することもでき、例えば、カチオン性リポソーム（リポフェクタミン）もしくは誘導体化（例えば、抗体コンジュゲート）、ポリリシンコンジュゲート、グラミシジンＳ、人工ウイルスエンベロープ、または他のこのような細胞内キャリアの他、遺伝子構築物の直接の注射もしくはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて実行されるＣａＰＯ４沈殿の助けを借りて送達することもできる。
【００６１】
一部の実施形態では、発現ベクターが、１または複数の核酸配列（例えば、ｃＤＮＡ）を含有するウイルスベクターである。レトロウイルスベクターは、当業者に公知の通り、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて外来性遺伝子を特にヒトへと移入するための組換え遺伝子送達系として用いることができる。組換えレトロウイルスを生成し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてこのようなウイルスを細胞に感染させるためのプロトコールは、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９８９年）、９．１０〜９．１４節、および他の標準的な実験室マニュアルにおいて見出すことができる。本方法において有用な別のウイルス遺伝子送達系は、アデノウイルスに由来するものを利用する。核酸を送達するのに有用ななお別のウイルスベクター系は、当業者に公知のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。
【００６２】
上記で例示されたものなどのウイルスによる移入法に加えてまた、ウイルスによらない方法を使用して、核酸を本明細書で記載される細胞に発現させることもできる。典型的に、ウイルスによらない遺伝子移入法は、高分子を取り込み、細胞内輸送するために哺乳動物細胞により用いられる通常の機構に依拠する。一部の実施形態では、ウイルスによらない遺伝子送達系が、標的とされる細胞が対象遺伝子を取り込むためのエンドサイトーシス経路に依拠しうる。この種類の例示的な遺伝子送達系には、リポソームに由来する系、ポリアミンおよびポリリシンなどのポリカチオン性コンジュゲート、ならびに人工ウイルスエンベロープが挙げられる。他の実施形態には、当業者に公知のプラスミド注射系が挙げられる。他の非ウイルスベクターには、足場／マトリックス付着領域（Ｓ／ＭＡＲ）ベースのベクターが挙げられる。特定の実施形態では、本明細書で記載される細胞に、Ｓ／ＭＡＲ−ＰＲＤＭ１６構築物、Ｓ／ＭＡＲ−ＢＭＰ−７／ＰＲＤＭ１６構築物、またはＳ／ＭＡＲ−ＢＭＰ−７構築物をトランスフェクトする。別の実施形態では、細胞に、ＤＦＦ４５様エフェクターＡ（ＣＩＤＥＡ）、ＩＩ型脱ヨード酵素、ＰＰＡＲガンマコアクチベーター（ＰＧＣ）−１アルファ、ＰＧＣ−１ベータ、脱共役タンパク質（例えば、ＵＣＰ１）、ＰＲＤＭ１６、またはＣＩＧ３０、ＰＲＤＭ−１６、ＣＹＣ１、ＮＤＵＦＡ１１、ＮＤＵＦＡ１３、ＣＭＴ１Ａ、ＥＬＯＶＬ３、ＤＩＯ２、ＬＨＸ８、ＣＯＸ８Ａ、ＣＹＦＩＰ２、Ｃｏｘ８ｂ、Ｇｌｕｔ４、またはこれらの遺伝子の組合せまたはそれらの組合せ（すなわち、ＰＰＡＲＧ２、ＣＥＢＰＢ、ＰＲＤＭ１６）をコードする１または複数の核酸を含有するＳ／ＭＡＲ構築物をトランスフェクトする。
【００６３】
一部の実施形態では、当業者に公知の通り、核酸を、裸のＤＮＡ構築物および／またはＤＮＡベクターベースの構築物を用いて発現させることができる。一部の実施形態では、ＤＮＡベクターを、従来の形質転換法またはトランスフェクション法を介して標的細胞へと導入することができる。本明細書で用いられる、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウム共沈殿または塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストランを介するトランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔、遺伝子銃、ソノポレーション、またはマグネトフェクションを含め、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を標的細胞へと導入するための、当技術分野で認知された多様な技法を指すことを意図する。
【００６４】
本明細書で記載される発現構築物を生成するのに要求される全ての分子生物学的技法は、当業者により十分に理解される標準的な技法である。
【００６５】
投与法
本明細書で記載される方法は、組織または細胞、例えば、本明細書で記載される通りに得られるかまたは単離される細胞を、処置される被験体に移植する工程を含みうる。細胞は、分化させた褐色脂肪細胞（例えば、単離された褐色脂肪細胞または本明細書で記載される通りに生成される分化した脂肪細胞）の場合もあり、幹細胞または未分化細胞の場合もあり、これらの細胞またはそれらの後代（すなわち、娘細胞）は、移植後に褐色脂肪細胞へと分化する。これらの方法は、例えば、本明細書で記載される通り、被験体における代謝を改変するのに有用である。
【００６６】
被験体に投与する前に、細胞を洗浄（例えば、等張性ＰＢＳで）して、組織試料の夾雑成分、培養培地、または分化培地を含めた、任意の夾雑物を除去してから、移植することができる。要求される細胞の数は可変的であり、用いられる細胞型、細胞の移植部位（例えば、用いうる細胞の数は、移植の解剖学的部位により制限されうる）、ならびに被験体の年齢、表面積、および臨床的状態が挙げられるがこれらに限定されない多様な因子に依存する。一部の実施形態では、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、または約１０１０個の細胞を、被験体へと移植する。
【００６７】
当技術分野では、細胞を被験体内に移植する方法、例えば、被験体への細胞の導入を可能とするように構成された送達系を用いる方法が公知である。一般に、送達系は、細胞を含有する容器およびこの容器と流体連通された注射針を含みうる。このような送達系もまた、本発明の範囲内にある。一般に、このような送達系を、滅菌的に維持する。多様な投与経路および多様な部位（例えば、腎被膜下移植、皮下移植、中枢神経系（髄腔内を含めた）移植、血管内移植、肝内移植、内臓内移植、腹腔内（大網内を含めた）移植、筋内移植）を用いることができる。
【００６８】
細胞は、細胞を付着させうる足場、マトリックス、または他の移植用デバイスを伴うかまたは伴わずに、薬学的に許容されるキャリア（例には、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、多糖、フィブリン、ゼラチン、およびこれらの組合せから作製されたキャリアが含まれる）に存在させることができる。まず、１，０００，０００個の細胞を多孔性の細胞外足場上に播種し、５日間にわたり培養した。
１０％のヒト血小板溶解物；
１倍濃度のＮＥＡＡ；１倍濃度のＧｌｕｔａｍａｘ；
１倍濃度のゲンタマイシン；
１０００単位のヘパリン；
０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン、
１２５ｎＭのインドメタシン、
５ｕＭのデキサメタゾン、
８５０ｎＭのインスリン、
１ｎＭのＴ３、
１ｕＭのロシグリタゾン
を含有するＤＭＥＭ（低グルコース、フェノールレッドを含まない）を添加することにより、褐色脂肪への分化を開始し、細胞をこの培地で２日間にわたり成長させた後、
ＤＭＥＭ（低グルコース、フェノールレッドを含まない）；
１０％のヒト血小板溶解物；
１倍濃度のＮＥＡＡ；１倍濃度のＧｌｕｔａｍａｘ；
１倍濃度のゲンタマイシン；
１０００単位のヘパリン；０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン、
１２５ｎＭのインドメタシン、
５ｕＭのデキサメタゾン、
８５０ｎＭのインスリン、
１ｎＭのＴ３、
１ｕＭのロシグリタゾン
２０ｎＭのＦＮＤＣ５
からなる培地でさらに１８日間にわたりさらに分化させた。
【００６９】
足場を用いて移植される細胞は、走査電子顕微鏡法下で足場へと付着することが示された。細胞による脂肪酸取込みのさらなる測定は、細胞が代謝的に活性であることを示した。
【００７０】
特定の場合には、細胞を、被験体における白色脂肪もしくは褐色脂肪へと移植し、かつ／または白色脂肪もしくは褐色脂肪を含有する解剖学的領域へと、またはその近傍へと移植する。
【００７１】
免疫学的に適合性でない細胞を用いる場合（例えば、非自己細胞を被験体に投与する場合）、免疫抑制化合物、例えば、薬物または抗体を、細胞の拒絶の阻害を達成するのに十分な投与量で被験体へと投与することができる。当技術分野では、免疫抑制薬のための投与量範囲が公知である。投与量値は、個体の疾患状態、年齢、性別、および重量などの因子に従い変化しうる。
【００７２】
被験体
本明細書で記載される方法および組成物は、代謝性障害を処置するのに有用である。一般に、方法は、有効量の、本明細書で記載される細胞を、このような処置を必要とすると診断された被験体を含めた、それらを必要とする被験体に投与する工程を含む。被験体には、哺乳動物が含まれうる。
【００７３】
一部の実施形態では、方法が、処置を必要とする被験体（例えば、代謝性障害を有するかまたはこれを発生させる危険性がある被験体）を同定する工程と、被験体に、有効量の、本明細書で記載される組織または細胞を投与する工程とを含む。ある特定の場合には、被験体が、例えば、体格指数（ＢＭＩ）が２５〜２９もしくは３０もしくは３０超である、過剰体重もしくは肥満の被験体、または体重に関連する障害を有する被験体であると診断される。本明細書で記載される方法による処置を必要とする被験体は、被験体の体重または体格指数に基づき選択することができる。一部の実施形態では、方法が、被験体を、体重、脂肪組織貯蔵量、脂肪組織の形態、インスリンレベル、インスリン代謝、グルコースレベル、熱発生能、および低温感受性のうちの１または複数について評価する工程を含む。一部の実施形態では、被験体の選択が、被験体における褐色脂肪組織の量または活性を評価する工程と、これらの観察結果を記録する工程とを含みうる。
【００７４】
評価は、本明細書で記載される細胞の投与前に実施することもでき、投与の間に実施することもでき、かつ／または投与後に実施することもできる。例えば、評価は、本明細書で記載される細胞を投与する少なくとも１日、２日、４、７、１４、２１、３０日またはそれよりも前および／または該細胞を投与した少なくとも１日、２日、４、７、１４、２１、３０日またはそれよりも後に実施することができる。
【００７５】
代謝および代謝性障害
代謝とは、生存する生物が、それらの維持、成長、および生殖する能力に影響を及ぼす内在性因子および外在性因子を調節し、これらを維持し、これらに応答する機構を調節する化学反応のカスケードである。この代謝活性の平衡が失われると、下流において、多数の変性障害を引き起こしうる細胞イベントがもたらされうる。このような障害は、広範にわたる疾患の症状をもたらしうるだけでなく、男性生殖細胞および女性生殖細胞の刷込みパターンの適正なメチル化にも干渉する可能性があり、したがって、新たな世代における変性障害への遺伝的素因を確立する可能性もある。
【００７６】
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される組織または細胞を被験体に投与して、被験体における代謝活性を改変する、例えば、被験体における代謝活性を増大させる。ある特定の実施形態では、被験体が、肥満、変形性関節症、高血圧症、糖尿病、自己免疫障害、脳卒中、腎不全、新生物、または虚血性心疾患などの心不全などであるがこれらに限定されない障害を有する。特定の場合には、本明細書で記載される細胞を投与することにより、その障害を処置する。
【００７７】
他の実施形態では、被験体を、ＤＦＦ４５様エフェクターＡ（ＣＩＤＥＡ）、ＩＩ型脱ヨード酵素、ＰＰＡＲガンマコアクチベーター（ＰＧＣ）−１アルファ、ＰＧＣ−１ベータ、脱共役タンパク質（例えば、ＵＣＰ１）、ＰＲＤＭ１６、またはＣＩＧ３０、ＰＲＤＭ−１６、ＣＹＣ１、ＮＤＵＦＡ１１、ＮＤＵＦＡ１３、ＣＭＴ１Ａ、ＥＬＯＶＬ３、ＤＩＯ２、ＬＨＸ８、ＣＯＸ８Ａ、ＣＹＦＩＰ２、Ｃｏｘ８ｂ、Ｇｌｕｔ４、および／またはＢＭＰ７など、脂質生成マーカーのレベル、ならびに肥満、高血圧症、糖尿病または虚血性心疾患についての診断ツールとして用いられる情報についてスクリーニングすることができる。例えば、脂肪組織試料または血液試料を、被験体から得ることができ、試料中におけるＤＦＦ４５様エフェクターＡ（ＣＩＤＥＡ）、ＩＩ型脱ヨード酵素、ＰＰＡＲガンマコアクチベーター（ＰＧＣ）−１アルファ、ＰＧＣ−１ベータ、脱共役タンパク質（例えば、ＵＣＰ１）、ＰＲＤＭ１６、またはＣＩＧ３０、ＰＲＤＭ−１６、ＣＹＣ１、ＮＤＵＦＡ１１、ＮＤＵＦＡ１３、ＣＭＴ１Ａ、ＥＬＯＶＬ３、ＤＩＯ２、ＬＨＸ８、ＣＯＸ８Ａ、ＣＹＦＩＰ２、Ｃｏｘ８ｂ、Ｇｌｕｔ４、および／またはＢＭＰ７のレベルを測定することができる。ＤＦＦ４５様エフェクターＡ（ＣＩＤＥＡ）、ＩＩ型脱ヨード酵素、ＰＰＡＲガンマコアクチベーター（ＰＧＣ）−１アルファ、ＰＧＣ−１ベータ、脱共役タンパク質（例えば、ＵＣＰ１）、ＰＲＤＭ１６、またはＣＩＧ３０、ＰＲＤＭ−１６、ＣＹＣ１、ＮＤＵＦＡ１１、ＮＤＵＦＡ１３、ＣＭＴ１Ａ、ＥＬＯＶＬ３、ＤＩＯ２、ＬＨＸ８、ＣＯＸ８Ａ、ＣＹＦＩＰ２、Ｃｏｘ８ｂ、Ｇｌｕｔ４、および／またはＢＭＰ７のレベルが、所定のレベルを下回れば、被験体が、肥満、高血圧症、糖尿病または虚血性心疾患などの代謝性障害を有するか、またはこれを発生させる危険性があることが示される。所定のレベルは、代謝性障害を有さない被験体由来の対応する試料中のマーカーのレベルでありうる。なお他の実施形態では、被験体における褐色脂肪レベルおよび白色脂肪レベルを、例えば、ＰＥＴスキャンを用いて測定することができ、褐色脂肪の白色脂肪に対する比を決定することができる。褐色脂肪の白色脂肪に対する比が所定のレベル未満であれば、被験体が、肥満、高血圧症、糖尿病または虚血性心疾患などの代謝性障害を有するか、またはこれを発生させる危険性があることが示されうる。
【００７８】
脂質生成化合物についてスクリーニングする方法
本明細書で記載される通りに単離または培養された細胞を用いて、代謝活性を改変する、例えば、代謝活性を増大させるかまたは低減する化合物についてスクリーニングすることができる。一部の実施形態では、細胞、例えば、褐色脂肪細胞前駆細胞、分化細胞、または幹細胞を被験化合物と接触させ、脂質生成についてのマーカー、例えば、本明細書で記載されるマーカー（例えば、ＰＲＤＭ１６、ＢＭＰ７、ＵＣＰ１、またはＭＹＦ５）のレベルを、測定することができる。脂質生成についてのマーカーのレベルを、被験化合物と接触させていない細胞と比べて上昇させる被験化合物を、代謝活性を増大させる化合物として同定するのに対し、脂質生成についてのマーカーを低減する被験化合物を、代謝活性を減少させる化合物として同定する。別の実施形態では、細胞が白色脂肪細胞であり、細胞に、ＤＦＦ４５様エフェクターＡ（ＣＩＤＥＡ）、ＩＩ型脱ヨード酵素、ＰＰＡＲガンマコアクチベーター（ＰＧＣ）−１アルファ、ＰＧＣ−１ベータ、脱共役タンパク質（例えば、ＵＣＰ１）、ＰＲＤＭ１６、またはＣＩＧ３０、ＰＲＤＭ−１６、ＣＹＣ１、ＮＤＵＦＡ１１、ＮＤＵＦＡ１３、ＣＭＴ１Ａ、ＥＬＯＶＬ３、ＤＩＯ２、ＬＨＸ８、ＣＯＸ８Ａ、ＣＹＦＩＰ２、Ｃｏｘ８ｂ、Ｇｌｕｔ４、またはこれらの組合せの制御下において、レポーター遺伝子（すなわち、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ）を発現する構築物をトランスフェクトする。脂質生成についてのマーカーのレベルを、被験化合物と接触させていない細胞と比べて上昇させる被験化合物を、代謝活性を増大させる化合物として同定するのに対し、脂質生成についてのマーカーを低減する被験化合物を、代謝活性を減少させる化合物として同定する。
【００７９】
例示的な一方法では、本明細書で記載される細胞に、誘導的プロモーターの制御下において、ＤＦＦ４５様エフェクターＡ（ＣＩＤＥＡ）、ＩＩ型脱ヨード酵素、ＰＰＡＲガンマコアクチベーター（ＰＧＣ）−１アルファ、ＰＧＣ−１ベータ、脱共役タンパク質（例えば、ＵＣＰ１）、ＰＲＤＭ１６、またはＣＩＧ３０、ＰＲＤＭ−１６、ＣＹＣ１、ＮＤＵＦＡ１１、ＮＤＵＦＡ１３、ＣＭＴ１Ａ、ＥＬＯＶＬ３、ＤＩＯ２、ＬＨＸ８、ＣＯＸ８Ａ、ＣＹＦＩＰ２、Ｃｏｘ８ｂ、Ｇｌｕｔ４、ＢＭＰ７、ＭＹＦ５、またはこれらの組合せをコードする核酸を含む発現ベクターをトランスフェクトする。このようなプロモーターの非限定的な例には、化学的に調節されるプロモーター（すなわち、テトラサイクリン、ステロイド、および金属）、または被験体の通常の体温を下回る温度などの許容的な温度において発現を活性化させて促進する温度特異的プロモーターが挙げられる。
【００８０】
一例では、温度特異的プロモーターを、ＤＦＦ４５様エフェクターＡ（ＣＩＤＥＡ）、ＩＩ型脱ヨード酵素、ＰＰＡＲガンマコアクチベーター（ＰＧＣ）−１アルファ、ＰＧＣ−１ベータ、脱共役タンパク質（例えば、ＵＣＰ１）、ＰＲＤＭ１６、またはＣＩＧ３０、ＰＲＤＭ−１６、ＣＹＣ１、ＮＤＵＦＡ１１、ＮＤＵＦＡ１３、ＣＭＴ１Ａ、ＥＬＯＶＬ３、ＤＩＯ２、ＬＨＸ８、ＣＯＸ８Ａ、ＣＹＦＩＰ２、Ｃｏｘ８ｂ、Ｇｌｕｔ４、またはこれらの組合せ、ＭＹＦ５、および／またはＢＭＰ７をコードする核酸の上流において、ウイルスベクター内または非ウイルスベクター内に入れる。脂肪組織（白色または褐色）、骨髄、皮膚、筋肉、または臍帯から単離された細胞に、このベクターをトランスフェクトする。次いで、細胞を、被験化合物の存在下または非存在下、許容的な温度下で培養し（これにより、プロモーターからの遺伝子の発現が可能となる）、被験化合物の脂質生成に対する効果を決定する。
【００８１】
被験化合物には、例えば、タンパク質（抗体を含めた）、ムテイン、ポリヌクレオチド、核酸アプタマー、ホルモン（すなわち、イリシン）、およびペプチド、ならびにペプチド以外の有機低分子が挙げられる。被験化合物は、天然の供給源から単離することもでき、合成または組換えにより調製することもでき、これらの任意の組合せでもありうる。被験化合物の特定の非限定的な例には、２，４−ジニトロフェノール、エフェドリン、シブトラミン、ＦＧＦ２１、胆汁酸、およびベータ−３アドレナリン作動性受容体アゴニストが挙げられる。
【００８２】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。加えて、材料、方法、および例は、例示的なものであるに過ぎず、限定的であることを意図するものではない。別段に規定されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試験では、本明細書で記載される方法および材料と類似するかまたは同等の方法および材料を用いうるが、本明細書では、適切な方法および材料が記載される。
【００８３】
本開示は、以下の実施例によりさらに例示される。実施例は、例示だけを目的として提示される。それらは、いかなる形であれ、本開示の範囲または内容を限定するものとしてはみなすべきでない。
【実施例】
【００８４】
（実施例１）
褐色脂肪の単離処理
一例では、患者にまず、１８Ｆ−フルオロデオキシグルコース（１８Ｆ−ＦＤＧ）ＰＥＴ−ＣＴスキャンを施して、褐色脂肪沈着物を同定した。ＰＥＴ−ＣＴスキャンを施す前に、１日当たり１〜２時間ずつ、１カ月間にわたり、患者を、１℃〜２５℃の範囲の温度へと曝露した（１８Ｆ−ＦＤＧの取込みを増大させるため）。頸部−鎖骨上エリア内および縦隔エリア内で同定された沈着物に、注射針を用いて生検を施した。褐色脂肪生検を、ＤＰＢＳ（−）中で３回にわたり洗浄し、強く振とうしながら、３７℃にて０．０７５％〜０．２％のＩＡ型コラゲナーゼで３０〜６０分間にわたり処理するか、またはＥＤＴＡで３０分間にわたり処理し、５〜３０分間にわたり機械的な組織破壊にかけた。組織／細胞を、ＤＰＢＳ（−）で３回にわたり洗浄し、１×１０６〜１×１０１０個の細胞を、患者における白色脂肪沈着物へと注射した。必要に応じて、酵素的または機械的な組織／細胞の単離の後、組織／細胞を、１〜４８時間にわたり低温（０℃〜４℃）へと曝露してから注射した。
【００８５】
（実施例２）
褐色脂肪の培養
この実施例では、細胞を培養してから、患者へと注射した。実施例１から得られた細胞を、この実施形態では、
フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ  Ｌｏｗ  Ｇｌｕｃｏｓｅ
０．５〜２０％のヒト血小板溶解物
１倍濃度のＮＥＡＡ
１倍濃度のＧｌｕｔａｍａｘ
１倍濃度のゲンタマイシン
１０００単位のヘパリン
を含む培養培地中１ｃｍ２当たりの細胞１０００個の濃度でハイパーフラスコへと播種した。
【００８６】
細胞は、３〜６週間にわたり培養した。次いで、細胞を、フローサイトメトリーにより特徴付け、以下のマーカー：ＳＣＡ−１、ＣＤ３４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ４、ＯＣＴ４、ＣＤ３１、Ｗｎｔ５ａ、テロメラーゼ活性、アルファ−ＳＭＡ、ＳＴＲＯ−１、ＭＹＦ５、ＰＲＤＭ１６、またはＵＣＰ１のうちの１または複数の発現について解析した。次いで、患者の白色脂肪沈着物へと移植するため、細胞を、１×１０６〜１×１０１０個の濃度まで増殖させた。
【００８７】
（実施例３）
細胞の褐色脂肪細胞への分化
この実施例では、患者の褐色脂肪沈着物から得られる細胞（幹細胞または前駆体の褐色脂肪細胞など）を分化させ、その後、患者へと注射した。実施例１から得られた細胞を、この実施形態では、
フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ  Ｌｏｗ  Ｇｌｕｃｏｓｅ
０．５〜２０％のヒト血小板溶解物
１倍濃度のＮＥＡＡ
１倍濃度のＧｌｕｔａｍａｘ
１倍濃度のゲンタマイシン
１０００単位のヘパリン
１０ｕｇ／ｍＬのインスリン
１ｕＭのデキサメタゾン
２００ｕＭのインドメタシン
０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン
を含む分化培地を含有するハイパーフラスコ内に、１ｃｍ２当たりの細胞１０００個で播種した。代替的な実施形態では、分化培地は、
ＤＭＥＭ（低グルコース、フェノールレッドを含まない）
０．５％〜２０％のヒト血小板溶解物；
１倍濃度のＮＥＡＡ；１倍濃度のＧｌｕｔａｍａｘ；
１倍濃度のゲンタマイシン；
１０００単位のヘパリン；
０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン、
１２５ｎＭのインドメタシン、
５ｕＭのデキサメタゾン、
８５０ｎＭのインスリン、
１ｎＭのＴ３、
１ｕＭのロシグリタゾン
を含み、この培地において２〜６日間にわたり細胞を成長させた後、
ＤＭＥＭ（低グルコース、フェノールレッドを含まない）；
０．５％〜２０％のヒト血小板溶解物；
１倍濃度のＮＥＡＡ；１倍濃度のＧｌｕｔａｍａｘ；
１倍濃度のゲンタマイシン；
１０００単位のヘパリン；０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン、
１２５ｎＭのインドメタシン、
５ｕＭのデキサメタゾン、
８５０ｎＭのインスリン、
１ｎＭのＴ３、
１ｕＭのロシグリタゾン
２０ｎＭのＦＮＤＣ５
からなる培地において、さらに６〜２１日間にわたり、さらに分化させた。
【００８８】
分化培地において１０〜３０日間にわたり維持した後、細胞を、ＤＦＦ４５様エフェクターＡ（ＣＩＤＥＡ）、ＩＩ型脱ヨード酵素、ＰＰＡＲガンマコアクチベーター（ＰＧＣ）−１アルファ、ＰＧＣ−１ベータ、脱共役タンパク質（例えば、ＵＣＰ１）、ＰＲＤＭ１６、またはＣＩＧ３０、ＰＲＤＭ−１６、ＣＹＣ１、ＮＤＵＦＡ１１、ＮＤＵＦＡ１３、ＣＭＴ１Ａ、ＥＬＯＶＬ３、ＤＩＯ２、ＬＨＸ８、ＣＯＸ８Ａ、ＣＹＦＩＰ２、Ｃｏｘ８ｂ、Ｇｌｕｔ４の発現により特徴付けた。次いで、患者へと注射するために、１×１０６〜１×１０１０個の細胞を調製する。
【００８９】
（実施例４）
胚性幹細胞の培養および分化
この実施例ではまず、臨床グレードの胚性幹細胞を成長および増殖させた。次いで、細胞を、一実施形態では、以下の培地：
フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ  Ｌｏｗ  Ｇｌｕｃｏｓｅ
０．５〜２０％のヒト血小板溶解物
１倍濃度のＮＥＡＡ
１倍濃度のＧｌｕｔａｍａｘ
１倍濃度のゲンタマイシン
１０００単位のヘパリン
１０ｕｇ／ｍＬのインスリン
１ｕＭのデキサメタゾン
２００ｕＭのインドメタシン
０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン
へと曝露することにより、細胞を、褐色脂肪の前脂肪細胞または完全に分化した褐色脂肪脂肪細胞へと分化させた。
【００９０】
別の実施形態では、細胞を、
ＤＭＥＭ（低グルコース、フェノールレッドを含まない）；
０．５％〜２０％のヒト血小板溶解物；
１倍濃度のＮＥＡＡ；
１倍濃度のＧｌｕｔａｍａｘ；
１倍濃度のゲンタマイシン；
１０００単位のヘパリン；
０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン、
１２５ｎＭのインドメタシン、
５ｕＭのデキサメタゾン、
８５０ｎＭのインスリン、
１ｎＭのＴ３、
１ｕＭのロシグリタゾン
を含む培地において、２〜６日間にわたり成長させた。
【００９１】
この後、
ＤＭＥＭ（低グルコース、フェノールレッドを含まない）；
０．５％〜２０％のヒト血小板溶解物；
１倍濃度のＮＥＡＡ；
１倍濃度のＧｌｕｔａｍａｘ；
１倍濃度のゲンタマイシン；
１０００単位のヘパリン；
０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン、
１２５ｎＭのインドメタシン、
５ｕＭのデキサメタゾン、８５０ｎＭのインスリン、
１ｎＭのＴ３、
１ｕＭのロシグリタゾン、
２０ｎＭのＦＮＤＣ５
からなる培地において、さらに６〜２１日間にわたり、さらに分化させる。
【００９２】
必要に応じて、分化前または分化後において、細胞に、非ウイルスベクター（足場／マトリックス付着領域（Ｓ／ＭＡＲ））であって、ＰＲＤＭ−１６遺伝子をそれ自身で含むか、あるいはＣＡＧＧＳまたはＰＧＫなどの強力なプロモーターにより駆動される、ＢＭＰ−７もしくはＭＹＦ−５、またはＤＦＦ４５様エフェクターＡ（ＣＩＤＥＡ）、ＩＩ型脱ヨード酵素、ＰＰＡＲガンマコアクチベーター（ＰＧＣ）−１アルファ、ＰＧＣ−１ベータ、脱共役タンパク質（例えば、ＵＣＰ１）、ＰＲＤＭ１６、またはＣＩＧ３０、ＰＲＤＭ−１６、ＣＹＣ１、ＮＤＵＦＡ１１、ＮＤＵＦＡ１３、ＣＭＴ１Ａ、ＥＬＯＶＬ３、ＤＩＯ２、ＬＨＸ８、ＣＯＸ８Ａ、ＣＹＦＩＰ２、Ｃｏｘ８ｂ、Ｇｌｕｔ４、またはこれらの組合せをタンデムに含む非ウイルスベクターをトランスフェクトした。次いで、細胞を、マイトマイシンＣなどの化学物質ベースの方法またはガンマ線照射で不活化し、細胞１×１０６〜１×１０１０個の濃度で患者へと移植した。
【００９３】
（実施例５）
ヒト褐色脂肪沈着物の生検
この実施例では、患者に、１８Ｆ−ＰＥＴ−ＣＴスキャンを施して、代謝活性を有する組織を同定した。代謝活性が高いエリアを、患者のヒト縦隔領域内で同定した。加えて、この患者には、日常的な心胸郭部の手術も施すものとした。手術時において、領域を露出させ、この領域内の５×５ｃｍの褐色脂肪沈着物を切り出し、滅菌食塩液中に入れた。
【００９４】
褐色脂肪沈着物は、白色脂肪沈着物から単離される幹細胞を含めた他の幹細胞内で見出されるマーカーとは異なる固有のマーカーを発現する幹細胞集団を含有する縦隔内で発見された。これらの新たに同定された幹細胞は、縦隔における褐色脂肪沈着物から分離し、２０継代超にわたり培養したが、やはり通常の核型を保持していた。これらの細胞はまた、脂質生成（白色および褐色）、骨形成、および軟骨形成を経ることも可能である。
【００９５】
（実施例６）
ヒト褐色脂肪沈着物の生検からの細胞の単離
実施例５で単離されたヒト褐色脂肪沈着物を、滅菌食塩液中で５〜１０回にわたり洗浄した。生検を、小片が約０．１〜０．５ｃｍのサイズとなるまで、ハサミを用いて切断した。１２００ｒｐｍで５分間にわたり遠心分離することにより、材料を３回にわたり洗浄した。次いで、コラゲナーゼまたはディスパーゼを用いて、３７℃に設定した振とう水浴中で１時間以内にわたり材料を消化させた。消化が完了した後、等容量の完全培地を添加することにより、酵素反応を終結させた。次いで、１００ｕＭのフィルターを用いて材料を濾過し、単一細胞懸濁物を、完全培地で３回にわたり洗浄した。
【００９６】
（実施例７）
ヒト褐色脂肪沈着物の生検から単離された細胞の培養
実施例６で記載した単一細胞懸濁物を、１ｃｍ２当たりの細胞５，０００〜１０，０００個の濃度で、細胞培養フラスコへと播種した。約３〜６日後、細胞は、継代できる状態であった（図２）。１０継代超を経た後の細胞は、正常の核型を示した。培養された褐色脂肪細胞についてのＲＴ−ＰＣＲ解析により、それらがＣＥＢＰＢ、ＵＣＰ−１、ＵＣＰ−２、ＰＰＡＲＧ、ＰＧＣ−１、ＰＲＤＭ−１６について陽性であることが実証された。白色脂肪沈着物から単離された細胞は、ＰＲＤＭ−１６およびＰＧＣ−１について陰性であることに注意することが重要である（図３）。したがって、ＰＲＤＭ−１６および／またはＰＧＣ−１の発現を用いて、白色脂肪細胞と褐色脂肪細胞とを区別することができる。さらに、ＣＥＢＰＢ、ＵＣＰ−１、ＵＣＰ−２、ＰＰＡＲＧ、ＰＧＣ−１、ＰＲＤＭ−１６を、褐色脂肪細胞を同定するためのマーカーとして用いることができる。
【００９７】
細胞の染色は、それらが幹細胞マーカーであるＨＣＡＭおよびＣＤ９０について陽性であることを示した（図４ＡおよびＢ）。増殖した細胞はまた、エクソソームも発現した（図９）。細胞集団についてのフローサイトメトリーにより、細胞は、以下の細胞表面マーカー：ＣＤ３４、ＣＤ１９、ＣＤ８６、ＨＬＡ  ＤＲ、Ｌｉｎ、ＣＤ１０６、ＣＤ８０、ＣＤ１１７について陰性であることが実証された。細胞集団はまた、ＳＳＥＡ４およびＳｔｒｏ−１についても低値であった。細胞は、未分化の褐色脂肪幹細胞についてのマーカーである、ＣＤ６３、ＣＤ９０、ＨＬＡ  ＡＢＣ、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ１６６、ＣＤ９、ＣＤ４４について陽性であった（図５Ａ〜Ｆ）。
【００９８】
（実施例８）
細胞の脂肪（白色および褐色）への分化
増殖させた細胞を、細胞培養プレートに播種し、脂質生成分化培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充した。培地は、３日ごとに替え、１４日間にわたり分化を持続させた。誘導培地での７日後に、培養物中の脂肪滴が目視可能となった（図６）ことから、細胞が脂肪細胞へと分化し始めたことが示される。
【００９９】
オイルレッドＯによる染色により、脂肪（ａｄｉｐｏｓｅ）細胞への陽性の分化が実証された（図７）。
【０１００】
分化が陽性である褐色脂肪滴の同定は、より大きな脂肪滴を産生する白色脂肪沈着物に由来する細胞から分化した細胞で見出されるもの（図７Ａ）と比較して、より小さい脂肪滴の蓄積（図７Ｂ）により行われた。
別の実施形態では、幹細胞を、１ウェル当たり細胞５０，０００個の密度で、６ウェルディッシュに播種した。白色脂質生成分化培地または褐色脂質生成分化培地を添加した。褐色脂質生成の場合、既に記載されている通り、誘導の６日後にＦＮＤＣ５を添加した。０．３％のオイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、細胞内の脂質蓄積を検出するための染色に用いた。
【０１０１】
（実施例９）
細胞の軟骨形成および骨形成の誘導
増殖させた細胞を、細胞培養プレートに播種し、骨形成培地および軟骨形成培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充した。培地は、３日ごとに替え、２１日間にわたり分化を持続させた。軟骨芽細胞および骨芽細胞への分化の確認を、アリザリンレッド（ａｌｉｚａｒｉａｎ  ｒｅｄ）またはオステオカルシン抗体およびアルシアンブルーでの細胞の染色により行った（図８ＡおよびＢ）。これらのデータは、褐色脂肪沈着物から単離された前駆細胞が、白色脂肪や褐色脂肪以外の多様な細胞型へと分化する能力を維持することを示す。
【０１０２】
（実施例１０）
褐色脂肪前駆細胞の治療的使用
ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスは、重度の免疫不全であり、ヒト細胞ベースの療法について試験するためのモデル系として用いられている。マウスを、試験期間全体にわたり、高脂肪／高炭水化物の食餌で飼育した。マウスを２群に分けた：１０匹の未処置マウスは対照として用いられ、１０匹のマウスには、背部皮膚の下方に、実施例５〜９で記載した通りに培養された、約１００万個のヒト褐色脂肪前駆細胞の単回皮下注射を施した。以下の解析物：血漿グルコース、トリグリセリド、コレステロール、レプチン、およびアディポネクチン（ａｄｉｐｏｎ）について、注射後４カ月間にわたり測定した。体重もまたモニタリングした。ベースラインは、対照群が２３±５ｇであり、処置群が２５±７ｇである。対照群には、細胞を含まないキャリア溶液（ＤＰＢＳ）の偽注射を施した。
【０１０３】
細胞なしのキャリア溶液（ＤＰＢＳ）だけの偽注射を施された対照群と比較して、細胞１，０００，０００個の用量を施された実験コホートは、４カ月間のモニタリング期間にわたり、血漿グルコース、トリグリセリド、コレステロール、および体重増加の減少を示した。また、アディポネクチンレベルおよびレプチンレベルも、施された細胞用量に起因して、改善レベルと相関した。これは、偽キャリア溶液を施された未処置対照マウスと比較して好対照をなす（図１０〜１２）。
【０１０４】
同等物
本開示を、それについての詳細な説明と共に記載してきたが、上記の記載は例示であって、付属の特許請求の範囲の範囲により規定される本発明の範囲を限定するものではないと意図することを理解されたい。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
【図１】
2014520531.tif 000002
【図２】
2014520531.tif 000003
【図４Ａ】
2014520531.tif 000004
【図４Ｂ】
2014520531.tif 000005
【図６】
2014520531.tif 000006
【図９】
2014520531.tif 000007
【図３】
2014520531.tif 000008
【図５Ａ】
2014520531.tif 000009
【図５Ｂ】
2014520531.tif 000010
【図５Ｃ】
2014520531.tif 000011
【図５Ｄ】
2014520531.tif 000012
【図５Ｅ】
2014520531.tif 000013
【図５Ｆ】
2014520531.tif 000014
【図７】
2014520531.tif 000015
【図８】
2014520531.tif 000016
【図１０】
2014520531.tif 000017
【図１１】
2014520531.tif 000018
【図１２】
2014520531.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成26年3月17日(2014.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を生成する方法であって、該方法は、
非胚性幹細胞を、得られた褐色脂肪組織から単離する工程と、
該非胚性幹細胞を、動物産物を含まない培地で培養し、これにより、幹細胞を生成する工程と
を含み、
該幹細胞が、以下の細胞表面マーカー：ＣＤ６３、ＣＤ９０、ＨＬＡ  ＡＢＣ、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ１６６、ＣＤ９、ＣＤ４４のうちの１または複数について陽性であり、そして
該幹細胞が、以下の細胞表面マーカー：ＣＤ３４、ＣＤ１９、ＣＤ８６、ＨＬＡ  ＤＲ、Ｌｉｎ、ＣＤ１０６、ＣＤ８０、ＣＤ１１７のうちの１または複数について陰性である、方法。
【請求項２】
代謝調節に関与する化合物を同定する方法であって、該方法は、
非胚性幹細胞を、得られた褐色脂肪組織から単離する工程と、
該非胚性幹細胞を、動物産物を含まない培地で培養する工程と、
該非胚性幹細胞を、被験化合物と接触させる工程と、
該被験化合物の存在下における該非胚性幹細胞の代謝活性レベルを決定する工程と、
該被験化合物の存在下における該非胚性幹細胞の該代謝活性レベルを、該被験化合物の非存在下における該幹細胞の代謝活性レベルと比較する工程と
を含み、
該被験化合物の存在下における代謝活性レベルが、該被験化合物の非存在下における代謝活性レベルと異なれば、該被験化合物が、代謝調節に関与する化合物として同定され、
該非胚性幹細胞が、以下の細胞表面マーカー：ＣＤ６３、ＣＤ９０、ＨＬＡ  ＡＢＣ、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ１６６、ＣＤ９、ＣＤ４４のうちの１または複数について陽性であり、そして
該非胚性幹細胞が、以下の細胞表面マーカー：ＣＤ３４、ＣＤ１９、ＣＤ８６、ＨＬＡ  ＤＲ、Ｌｉｎ、ＣＤ１０６、ＣＤ８０、ＣＤ１１７のうちの１または複数について陰性である、方法。
【請求項３】
前記決定する工程が、脂質生成を測定する工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＰＲＤＭ１６、ＢＭＰ７、ＵＣＰ１、ＵＣＰ２、またはＭＹＦ５のうちの１または複数のレベルを検出する工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記被験化合物が、タンパク質、抗体、ペプチド、ムテイン、ポリヌクレオチド、核酸アプタマー、および低分子からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
非胚性幹細胞を褐色脂肪細胞へと分化させる方法であって、該方法は、
単離された非胚性幹細胞を、動物産物を含まない培地と接触させ、これにより、非胚性褐色脂肪幹細胞を生成する工程
を含み、
該非胚性幹細胞が、以下の細胞表面マーカー：ＣＤ６３、ＣＤ９０、ＨＬＡ  ＡＢＣ、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ１６６、ＣＤ９、ＣＤ４４のうちの１または複数について陽性であり、そして
該非胚性幹細胞が、以下の細胞表面マーカー：ＣＤ３４、ＣＤ１９、ＣＤ８６、ＨＬＡ  ＤＲ、Ｌｉｎ、ＣＤ１０６、ＣＤ８０、ＣＤ１１７のうちの１または複数について陰性である、方法。
【請求項７】
前記培地が、インスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、インドメタシン、Ｔ３、ロシグリタゾン、ＦＮＤＣ５、およびこれらの組合せからなる群から選択される薬剤を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記培地が、インスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、およびインドメタシンを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記非胚性褐色脂肪幹細胞が、ＰＲＤＭ−１６、ＰＧＣ−１、またはこれらの組合せを発現する、請求項６に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明の態様は、幹細胞を褐色脂肪細胞（ｂｒｏｗｎ  ｆａｔ  ｃｅｌｌ）へと分化させることに関する。一実施形態では、方法が、幹細胞を、動物産物を含まない培地と接触させ、これにより、褐色脂肪幹細胞を生成する工程を含む。別の実施形態では、培地は、インスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、インドメタシン、Ｔ３、ロシグリタゾン、ＦＮＤＣ５、およびこれらの組合せからなる群から選択される剤を含む。さらになお別の実施形態では、培地は、インスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、およびインドメタシンを含む。なお別の実施形態では、褐色脂肪幹細胞が、ＰＲＤＭ−１６、ＰＧＣ−１、またはこれらの組合せを発現する。さらになお別の実施形態では、褐色脂肪組織が、被験体から得られる試料由来である。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
幹細胞を生成する方法であって、
褐色脂肪組織を得る工程と、
幹細胞を、該褐色脂肪組織から単離する工程と、
該幹細胞を、動物産物を含まない培地で培養し、これにより、幹細胞を生成する工程と
を含む方法。
（項目２）
前記褐色脂肪組織が、被験体から得られる試料由来である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記幹細胞が、以下の細胞表面マーカー：ＣＤ６３、ＣＤ９０、ＨＬＡ  ＡＢＣ、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ１６６、ＣＤ９、ＣＤ４４のうちの１または複数について陽性である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記幹細胞が、以下の細胞表面マーカー：ＣＤ３４、ＣＤ１９、ＣＤ８６、ＨＬＡ  ＤＲ、Ｌｉｎ、ＣＤ１０６、ＣＤ８０、ＣＤ１１７のうちの１または複数について陰性である、項目１に記載の方法。
（項目５）
被験体における代謝性障害を処置する方法であって、
幹細胞を、ドナーから取り出す工程と、
該幹細胞を、動物産物を含まない培地で褐色脂肪細胞へと分化させる工程と、
該褐色脂肪細胞を、該被験体内の脂肪沈着物へと投与し、これにより、該被験体における該代謝性障害を処置する工程と
を含む方法。
（項目６）
前記代謝性障害が、肥満、中心性肥満、糖尿病、高血圧症、心不全、虚血性心疾患、高血圧、トリグリセリド脂質異常症、ＨＤＬ脂質異常症、コレステロール脂質異常症、空腹時血漿グルコースの上昇、レプチン調節異常、およびアディポネクチン（ａｄｉｐｏｎ）調節異常からなる群から選択される、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記褐色脂肪細胞を、皮下注射により投与する、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記褐色脂肪細胞を、全身注射により投与する、項目５に記載の方法。
（項目９）
前記培地が、インスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、およびインドメタシンからなる群から選択される分化剤を含有する、項目５に記載の方法。
（項目１０）
被験体における肥満を処置する方法であって、
褐色脂肪を、被験体から取り出す工程と、
該褐色脂肪を、該被験体内の脂肪沈着物へと投与し、これにより、該被験体における肥満を処置する工程と
を含む方法。
（項目１１）
前記脂肪沈着物が、白色脂肪沈着物である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記脂肪沈着物が、褐色脂肪沈着物である、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
代謝調節に関与する化合物を同定する方法であって、
幹細胞を、褐色脂肪組織から単離する工程と、
該幹細胞を、動物産物を含まない培地で培養する工程と、
該幹細胞を、被験化合物と接触させる工程と、
該被験化合物の存在下における該幹細胞の代謝活性レベルを決定する工程と、
該被験化合物の存在下における該幹細胞の該代謝活性レベルを、該被験化合物の非存在下における該幹細胞の代謝活性レベルと比較する工程と
を含み、
該被験化合物の存在下における代謝活性レベルが、該被験化合物の非存在下における代謝活性レベルと異なれば、該被験化合物が、代謝調節に関与する化合物として同定される方法。
（項目１４）
前記決定する工程が、脂質生成を測定する工程を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
ＰＲＤＭ１６、ＢＭＰ７、ＵＣＰ１、ＵＣＰ２、またはＭＹＦ５のうちの１または複数のレベルを検出する工程を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記被験化合物が、タンパク質、抗体、ペプチド、ムテイン、ポリヌクレオチド、核酸アプタマー、および低分子からなる群から選択される、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
幹細胞を褐色脂肪細胞へと分化させる方法であって、
幹細胞を、動物産物を含まない培地と接触させ、これにより、褐色脂肪幹細胞を生成する工程
を含む方法。
（項目１８）
前記培地が、インスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、インドメタシン、Ｔ３、ロシグリタゾン、ＦＮＤＣ５、およびこれらの組合せからなる群から選択される薬剤を含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記培地が、インスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、およびインドメタシンを含む、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記褐色脂肪幹細胞が、ＰＲＤＭ−１６、ＰＧＣ−１、またはこれらの組合せを発現する、項目１７に記載の方法。
（項目２１）
前記褐色脂肪組織が、被験体から得られる試料由来である、項目１７に記載の方法。
【国際調査報告】
2014520531.tif 000020
2014520531.tif 000021
2014520531.tif 000022