(57)【要約】  本発明者らは、公知の手法よりも簡便かつ低コストである生体液中の乳酸または乳酸塩の決定方法を提案する。本方法は、未熟な人材によって用いられ、使い捨て試験ストリップおよび携帯測定装置で行なわれ得る。本方法は、乳酸と、ＵＶ光の照射時にＦｅ（ＩＩ）に還元されるＦｅ（ＩＩＩ）との光化学反応に基づく。試料中の乳酸塩の量に比例して生成されたＦｅ（ＩＩ）は、電気化学的に決定されるか、または１，１０−フェナントロリンなどの有色錯化剤との反応を用いて決定され、分光光度測定によって決定される。本方法は、低コストの試薬を用いる点、ならびにそれらの短期および長期の安定性の点の両方で有利である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体液中の乳酸または乳酸塩の含有量の決定方法であって、下記ステップ：
−生体液を供給するステップ、
−乳酸または乳酸塩と選択的に反応することができる選択された量の酸化剤を供給すること、
−前記生体液と前記酸化剤とを混合するステップ；
−前記生体液および前記酸化剤の前記混合物にＵＶ光を照射するステップ；
−前記酸化剤の還元種を決定することによって、前記生体液中に含まれる乳酸の量を決定するステップ
を含み、
前記混合物に波長範囲２８０〜４００ｎｍのＵＶ光を照射することを特徴とする、方法。
【請求項２】
−前記生体液が容器または支持体の内部で利用可能であり、
−前記酸化剤を前記容器または支持体内に入れる、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体液を紙材料もしくはポリマー材料または天然組織もしくは合成組織上に吸着させ、前記酸化剤を前記紙材料もしくはポリマー材料または天然組織もしくは合成組織に含浸させる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記量の酸化剤を、紙材料もしくはポリマー材料または天然組織もしくは合成組織またはその他の使い捨て支持体に物理的に吸着もしくは担持させるか、または化学的に結合させ、前記生体液試料を前記支持体上に置く、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生体液が、汗、血清、血漿、唾液、尿、脳脊髄液または羊水である、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
前記生体液と前記酸化剤との前記混合物に波長範囲３００〜４００ｎｍのＵＶ光を照射する、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
前記酸化剤の１つが、Ｆｅ（ＩＩＩ）またはその他のレドックス対酸化金属／還元金属である、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
前記酸化剤が、Ｆｅ（ＩＩ）または前記還元金属種の錯化剤を含んでおり、前記生体液中に含まれる乳酸の量の決定が、錯化された前記酸化剤の還元種を、前記錯体の比色分析または分光光度測定または分光蛍光分析により決定することによって実施される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記生体液中に含まれる乳酸の前記量が、前記酸化剤の前記還元種と前記錯化剤との錯体の適切な波長の吸光度を光度検出することによって実施され、好ましくは、前記錯化剤が１，１０−フェナントロリン（ｐｈｅｎａｎｔｒｏｌｉｎｅ）であり、前記吸光度の光度検出が約５１２ｎｍの波長で実施される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記生体液中に含まれる乳酸の前記量が、前記生体液と前記酸化剤との前記混合物に埋め込まれた２つの電極間の電気化学電位をＵＶ光照射後に測定することによって実施される、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体液中に含まれる乳酸の前記量が、前記レドックス対に特徴的な電位値の一定差に維持され、かつ前記生体液と前記酸化剤との前記混合物に埋め込まれた２つの短絡電極間を流れる電流密度をＵＶ光照射後に測定することによって実施される、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体液中に含まれる乳酸の前記量が、前記レドックス対に特徴的な電位値の一定差に維持され、かつ前記生体液と前記酸化剤との前記混合物に埋め込まれた２つの短絡電極で構成されるセルのインピーダンスをＵＶ光照射後に測定することによって実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
生体液中の乳酸または乳酸塩の含有量を決定するためのキットであって、下記：
−生体液試料を準備するための容器／支持体、
−乳酸または乳酸塩と選択的に反応することができる選択された量の酸化剤を準備するための容器／支持体、
−前記生体液と前記酸化剤とを混合するための容器／支持体；
−前記生体液と前記酸化剤との混合物へのＵＶ光照射手段
を含み、
前記ＵＶ光が、２８０〜４００ｎｍの波長を有することを特徴とする、キット。
【請求項１４】
前記生体液試料を準備するための容器／支持体が、紙材料もしくはポリマー材料または天然組織もしくは合成組織またはその他の使い捨て支持体である、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記酸化剤を準備するための容器／支持体が、前記酸化剤を物理的に吸着もしくは担持させるか、または化学的に結合させる、紙材料もしくはポリマー材料または天然組織もしくは合成組織またはその他の使い捨て支持体である、請求項１３に記載のキット。
【請求項１６】
前記ＵＶ光照射用装置が、３００〜４００ｎｍの波長の放射エネルギー（ｒａｄｉａｔｉｏｎｓ）を放射する、請求項１３〜１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記酸化剤の１つが、Ｆｅ（ＩＩＩ）またはその他のレドックス対酸化金属／還元金属である、請求項１３〜１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記酸化剤が、Ｆｅ（ＩＩ）または前記還元金属種の錯化剤を含み、前記キットが、適切なＵＶ可視波長の吸光度の光度検出器を含み、好ましくは、前記錯化剤が１，１０−フェナントロリンであり、前記吸光度の光度検出が約５１２ｎｍの波長で実施される、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記支持体に埋め込まれた／接触している一対の電極と、生体液と酸化剤との前記混合物に埋め込まれた２つの電極間の電気化学電位をＵＶ光照射後に測定するための差動ポテンショメータとをさらに含む、請求項１４〜１７に記載のキット。
【請求項２０】
前記支持体に埋め込まれた／接触している一対の電極と、前記レドックス対に特徴的な電位値の一定差に維持され、かつ前記生体液と前記酸化剤との前記混合物に埋め込まれた２つの短絡電極間を流れる電流密度をＵＶ光照射後に測定するための装置とをさらに含む、請求項１４〜１７に記載のキット。
【請求項２１】
前記支持体に埋め込まれた／接触している一対の電極と、前記レドックス対に特徴的な電位値の一定差に維持され、かつ前記生体液と前記酸化剤との前記混合物に埋め込まれた２つの短絡電極で構成されるセルのインピーダンスをＵＶ光照射後に測定するための装置とをさらに含む、請求項２０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の範囲
本発明は、乳酸（または乳酸塩）の臨床分析キットおよび方法、詳しくは、選択的酸化剤の酸化還元反応に基づいて生体液中の乳酸（または乳酸塩）の測定方法に関する。具体的には、酸化還元反応は、生体液−酸化剤の混合物にＵＶ光を照射することによって活性化される。
【背景技術】
【０００２】
技術注記
乳酸（または乳酸塩）は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）酵素によってピルビン酸塩から生じる嫌気性解糖（ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｇｌｉｃｏｌｙｉｓｉｓ）の生成物である。前記乳酸は、ヒトおよび動物の血液および生体液中に見ることができる。
【０００３】
健常成人男性は、通常、１日に約１２０ｇの乳酸を産生する。これらのうち、４０ｇ（３３％）は、専ら嫌気性代謝を特徴とする組織（網膜および赤血球）によって産生される。残りの８０ｇ（６７％）は、実際の酸素利用率に基づいて、その他の組織（ほとんどすべての筋肉）によって産生される。肝臓では、乳酸は、グルコースに再変換される（コリ回路）。心臓は、乳酸を代謝してエネルギーを生成することができる。
【０００４】
乳酸塩／ピルビン酸塩のモル比（Ｌ／Ｐ）は、細胞の嫌気性／好気性代謝の信頼できるマーカーである。したがって、乳酸塩濃度レベルの決定は、組織の酸素需要とその消費との間のバランスを評価するための良いアプローチであり、動物および細胞の生理学研究に有用である。
【０００５】
乳酸の増加（乳酸アシドーシス）は、２つの条件で起こり得る：
ａ）低酸素症、すなわち酸素欠乏（Ａ型乳酸アシドーシス、速い）；
ｂ）高率の嫌気性解糖（Ｂ型乳酸アシドーシス、遅い）。
【０００６】
Ａ型乳酸アシドーシスでは、好気性経路、すなわち、ピルビン酸塩から二酸化炭素と水とへの酸化代謝経路がいくつかの理由で遮断される。これは、先天性ミトコンドリア呼吸鎖異常、心臓血管疾患（虚血、低酸素血症、貧血）およびその他の疾患で起こる。特に、酸素欠乏（組織低酸素症）は最も一般的なものであり、呼吸器障害（低ＰＯ２）、循環障害（Ｏ２の送達不良）、およびヘモグロビン障害（種々の理由による低Ｏ２運搬能力）などの乳酸アシドーシスの難治性の原因であることが多い。
【０００７】
代わって、Ｂ型乳酸アシドーシスでは、嫌気性解糖経路（ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｇｌｙｃｏｌｉｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ）が高速で進行して低ＡＴＰ濃度レベルを引き起こし、生成されたピルビン酸が蓄積し、ＬＤＨによって乳酸に還元される。これは、激しい運動中、および酸化的リン酸化（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｌａｔｉｏｎ）を脱共役するすべての条件で起こり、乳酸塩を蓄積させる。例えば、これは、ＡＴＰが脂肪代謝から生成されるピルビン酸デヒドロゲナーゼ酵素欠損もしくはビタミンＢ１欠乏の場合、または肝疾患もしくは腎疾患または遺伝的もしくは薬物誘発性の糖新生異常により乳酸塩からグルコースへの変換が遅い場合に起こる。代謝性アシドーシスは、化学薬剤への曝露により薬理学的処置中にも発生し得るし、癌細胞は、好気条件下においてさえ正常細胞よりも多くの乳酸塩を産生するので、腫瘍患者でも発生し得る。
【０００８】
また、乳酸塩のモニタリングは、糖尿病の管理およびリハビリテーションに重要である。
【０００９】
筋肉では、運動中に、グルコースおよびグリコーゲンに由来するピルビン酸塩が乳酸塩に還元され、これが再酸化され、安静時にグルコースに部分的に再変換される（コリ回路）。血中乳酸塩濃度は、通常、安静時には１〜２ｍｍｏｌ／Ｌであるが、激しい運動中には筋肉細胞が嫌気性代謝に切り替わるので、２０ｍｍｏｌ／Ｌ超に上昇し得る。
【００１０】
これが増加して嫌気性由来の補助エネルギーを提供したというのが乳酸産生の古典的な説明であった。しかしながら、現在のところ、エネルギー源としての乳酸塩形成の役割はあまり重要ではないというのが一般的な見解である。それに代わって、乳酸産生の増加は、代謝適応であり、好気性ＡＴＰ産生を活性化するのに主に役立つと示唆されている［７］。さらに、乳酸は、ＧＨおよびテストステロンなどの同化ホルモンの分泌に対する強い刺激である。前記理由により、短い休憩時間と組み合わせた高強度のトレーニングは、筋肉量を増加させるのに寄与する。しかしながら、一定レベルの乳酸塩濃度に達すると枯渇が起こり、運動能力が急速に低下する。したがって、スポーツ医学では、それは、運動選手の最大パフォーマンスレベルをモニタリングするのに用いられる。
【００１１】
これに基づいて、簡便、安価、高速、精密かつ正確な方法を用いて、生体液（汗、血清、血漿、唾液、尿、髄液、羊水・・・）中の乳酸塩の量を決定することが重要である。
【００１２】
乳酸塩およびピルビン酸塩の決定は、通常、血漿または尿中で実施され、酵素反応、特にＬＤＨに基づくものである。前記方法は、吸収分光法または蛍光分光法を用いてＮＡＤＨを決定することに基づくものである。酵素的方法の欠点は、ｐＨ＞８で行なう必要性、ならびに酵素およびＮＡＤＨ補因子の不安定性の両方である。
【００１３】
代替的には、乳酸塩は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー質量分析検出（ＬＣ−ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定される。しかしながら、ＧＣおよびＨＰＬＣ機器のコストは、典型的には高く、測定が長い。
【００１４】
血液分析は侵襲的な行為であり、血液のサンプリングは、厳格な衛生規則および感染リスクを考慮して、有資格者の医療スタッフによって実施されなければならない。
【００１５】
前記理由、ならびに特に、日々のパラメータを管理しなければならない患者、血液採取が困難な人々（血友病患者、新生児、高齢者）、身体的および生化学的な状態を推定しトレーニング方法を評価しようとする運動選手にとっての身体的および精神的な負担を避けるという理由の両方により、血液以外の媒体中の代謝産物の測定は、ますます重要になっている。
【００１６】
汗を分析試料として用いることは、およそ７０年代に遡る。汗中に存在する代謝産物の分析は、安全かつ簡便である。嚢胞性線維症の診断では、電解質濃度の汗分析は、依然として研究の「ゴールドスタンダード」である。
【００１７】
汗分析の利点は、試料の採取が容易であること、感染リスクがないこと、ならびに患者および運動選手に対するストレスをほとんど伴わずにサンプリングを頻繁に繰り返すことができることである。何人かの著者は、汗および血液中の乳酸塩濃度間の良好な相関関係を示した。
【００１８】
現在の技術水準によれば、汗中の乳酸塩の決定は、酵素アッセイ、アンペロメトリックバイオセンサーおよび電気化学発光バイオセンサー（ＥＣＬ）に基づくものである。
【００１９】
米国再発行特許発明第３２０１６号明細書には、乳酸オキシダーゼ（ＬＯ）酵素を用いる高コストな侵襲的方法を用いて、血液中の乳酸塩を決定する従来技術が提案されている。ＬＯは、乳酸塩からピルビン酸塩と過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）とへの酸化を触媒する。乳酸の量は、ペルオキシダーゼによって触媒される副反応および比色分析を用いて検出されたＨ２Ｏ２の生成量に基づいて決定される。米国特許第３５７３１７１号明細書では、乳酸塩の決定は、ＬＤＨおよびグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、補酵素ＮＡＤ＋、酵素安定化剤ならびにピルビン酸イオン捕捉剤によって実施されている。
【００２０】
米国特許第４２５４２２２号明細書には、テトラゾリウム塩、ピリジンヌクレオチド、電子運搬体およびアッセイ（乳酸およびβヒドロキシ酪酸）で決定される酵素に特異的なデヒドロゲナーゼ酵素を用いることが記載されている。米国特許第５７５９７９６号明細書には、ＬＯ、ＬＤＨおよび西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて、食品化学における関心対象の有機物中の乳酸を決定する方法であって、酸素選択性アンペロメトリック電極を用いて、乳酸の酸化中に生成される酸素の濃度を測定する方法が記載されている。米国特許第４４６７８１１号明細書では、ＬＯ酵素によって乳酸から生成されたＨ２Ｏ２のポーラログラフィーを用いて乳酸を決定しているが、米国特許第５７５７００２号明細書では、ケモメトリック法と併用された赤外分光法を用いて乳酸が決定されている。
【００２１】
米国特許第７３１９０１８号明細書には、参照電極と作用電極とを含む乳酸塩用のバイオセンサーストリップが記載されている。２つの電極は、電気的に絶縁された支持基体上に配置されている。作用電極は、イモビライザＬＯと電子伝達体とで修飾された無機グラファイトで構成されている。グラファイト層は、作用電極の銀層上に配置されている。参照電極は、塩化銀層を参照電極の銀層上に配置することによって構成されている。米国特許出願公開第２００９／００４７１７７号明細書では、測光を用いて、生体液中の乳酸塩が測定されている。
【００２２】
特開２００７１２７４２２号公報には、成分採取部を有する吸収パッチ上に試験材料を採取し、採取された試験材料を酵素分析試薬と反応させることによって、皮膚表面上に存在する乳酸などの成分を測定するための方法が提供されている。試薬は、乳酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、ニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド酸化剤および発色試薬を含む。反射光測定装置を用いて、発色現像によって乳酸の量が測定されている。
【００２３】
米国特許出願公開第２００４１４１９６０号明細書には、酵素補因子ＮＡＤを含むシグナル生成溶液の反応によって生成された乳酸および／または乳酸塩を決定することによって、患者における齲蝕リスクを決定する方法が開示されている。
【００２４】
中国特許出願公開第１０１６３９４４６号明細書には、化学発光法を用いることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで血液中の乳酸を検出するための方法が開示されている。
【００２５】
これらの方法は、すべて、非常に高価な酵素試薬および複雑な実験機器を必要とする。いくつかの方法および機器は、熟練の人材を必要とする。したがって、それらの使用は、高度専門臨床検査室に限定されている。これらの方法は、運動選手のトレーニングをモニタリングするための乳酸決定に、または生体液中の乳酸塩の簡便で、かつ低コストでの在宅モニタリングには適用されていない。
【００２６】
本発明は、乳酸／乳酸塩濃度を簡便に測定するための方法を提供し、非医療スタッフが健康管理を容易に実施するのを有効に可能にするための非侵襲的手段を提供する。
【００２７】
本発明の技術的特徴は、前述の目的にしたがって、以下に報告する特許請求の範囲の内容中に明らかに見出される。
【発明の概要】
【００２８】
発明の目的
本目標は、生体試料の提供、乳酸または乳酸塩と選択的に反応することができる選択された量の酸化剤の提供、前記生体液と前記酸化剤との混合、前記生体液と前記酸化剤との前記混合物へのＵＶ光の照射、ならびに前記酸化剤の還元種を決定することによる前記生体液中に含まれる乳酸の量の決定を含む、生体液中の乳酸または乳酸塩の含有量の決定方法によって達成される。
【００２９】
前記生体液は、容器または支持体の内部で利用可能であり得、前記酸化剤は、前記容器または支持体内に入れられる。
【００３０】
同様に、前記生体液を紙材料もしくはポリマー材料または天然組織もしくは合成組織上に吸着させることができ、前記酸化剤を前記紙材料もしくはポリマー材料または天然組織もしくは合成組織に含浸させ、ならびに前記量の酸化剤を、紙材料もしくはポリマー材料または天然組織もしくは合成組織またはその他の使い捨て支持体に物理的に吸着もしくは担持させるか、または化学的に結合させることができ、前記生体液試料が前記支持体上に載置されうる。
【００３１】
前記生体液は、汗、血清、血漿、唾液、尿、脳脊髄液または羊水であり得る。
【００３２】
本発明の第２の実施形態は、本発明の方法による生体液中の乳酸または乳酸塩の含有量を決定することを可能にする簡便なコンポーネントキットを作ることを目的とする。
【００３３】
本発明のこれらのおよびその他の特徴は、請求項１〜２１に記載されており、以下に説明される。
【００３４】
本発明が十分に理解され得るように、単なる例証として添付の線図を参照して本発明をこれから説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、ＵＶランプを用いて照射する前（Ｂ）および後（Ｃ）において、乳酸添加あり（Ｂ、Ｃ）または乳酸添加なし（Ａ）の試薬溶液のＵＶ／可視スペクトルを示す。
【図２】図２は、ｂ）タイプのＵＶランプ（図６を参照のこと）を用いて６０秒間照射した後の、０．３ｍＭ乳酸と試薬溶液との間の反応の動態（反応時間に対する５１２ｎｍの吸光度）を示す。
【図３】図３は、試薬溶液と反応させ、ＵＶ照射した後に、漸増濃度の乳酸を含む溶液の５１２ｎｍの吸光度値をプロットすることによって得られた検量線を示す。
【図４】図４は、本発明の一実施形態による電気化学的検出器の線図を示す。
【図５】図５は、試薬溶液と反応させ、ＵＶ照射した後に、漸増濃度の乳酸を含む溶液の電位値（ｍＶ）の差をプロットすることによって得られた検量線を示す。乳酸塩濃度は、１〜１５０ｍＭ（図５Ａ）および０．１〜５．０ｍＭ（図５Ｂ）である。
【図６】図６は、ａ）ＬＥＤ３７０Ｅ、ｂ）ネイルゲル硬化用のＵＶランプ、ｃ）高圧Ｈｇランプ、ｄ）低圧Ｈｇランプ、ｅ）ＵＳＢランプの発光スペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
発明の詳細な説明
溶液中のクエン酸および乳酸などのカルボン酸は、Ｆｅ３＋などの酸化剤を含む溶液と混合した場合、光に曝露すると穏やかに酸化される傾向にある。本発明によれば、酸化の不可逆反応は、紫外線（ＵＶ）照射で触媒される。光化学過程は、Ｆｅ３＋のＦｅ２＋への還元、二酸化炭素の発生、および酸化生成物の形成からなる。乳酸の場合、反応は、以下のとおりである：
【００３７】
【数１】
2014528086.tif 000002
【００３８】
本発明の第１の好ましい実施形態によれば、本方法は、生成されたＦｅ２＋の検出系として化合物１，１０−フェナントロリン：
【００３９】
【化１】
2014528086.tif 000003
【００４０】
を用いて乳酸を決定するために、本タイプの反応を用いる。
【００４１】
Ｆｅ２＋と１，１０−フェナントロリンとの反応により赤橙色の錯体が生じ、これにより、Ｆｅ２＋−１，１０−フェナントロリン錯体の最大吸収波長である波長範囲４８０〜５２５ｎｍ、好ましくは５１２ｎｍまでの単色光線の吸収を利用して分光光度測定することが可能になる。前記吸収は、錯体濃度に正比例するので、キャリブレーションテーブルを用いることにより、生体液中の乳酸塩濃度に正比例する。
【００４２】
１，１０−フェナントロリンの他に、Ｆｅ（ＩＩ）を錯化して簡便かつ安価な方法でＦｅ（ＩＩ）の決定を可能にし得るその他の物質は、以下のとおりである：
【００４３】
ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）またはフェリシアニド［（Ｆｅ（ＩＩＩ）（ＣＮ）６］３−（黄色）は、Ｆｅ（ＩＩ）と反応して、フェリシアン化第一鉄Ｆｅ３［（Ｆｅ（ＩＩＩ）（ＣＮ）６］２（青色）を生じ、過剰なフェリシアニドの存在下では、緑色の溶液を生じる；
【００４４】
α’−ジピリジル［Ｉ］は、５２５ｎｍで吸収する赤色の可溶性錯体を形成する。
【００４５】
【化２】
2014528086.tif 000004
【００４６】
ジメチルグリオキシム［ＩＩ］は、Ｆｅ（ＩＩ）のアンモニア溶液と反応して、赤色の可溶性錯体を形成する。ニッケルは、この試みに干渉して、赤色の不溶性錯体を形成する。
【００４７】
本発明において記載される試薬組成物、ならびに乳酸および乳酸塩の検出方法は、従来の液体アッセイに用いることができる。すべての試薬を粉末形態で供給し、使用直前に水で再構成してもよい。本タイプの試薬組成物は、明らかに本発明に含まれる。
【００４８】
本発明において記載される適切な量の全アッセイ成分は、当然のことながら、乳酸または乳酸塩の定性的または半定量的アッセイをもたらすために、異なる性質の吸着材料マトリックス中に埋め込んでもよい。乳酸塩または乳酸の分析に適切な典型的な材料は、例えばポリマー、組織であり、その他の材料は、下記特許：米国特許第３０９２４６５号明細書、米国特許第３４１８０９９号明細書、米国特許第３４１８０８３号明細書、米国特許第２８９３８４３号明細書、米国特許第２８９３８４４号明細書、米国特許第２９１２３０９号明細書、米国特許第３００８８７９号明細書、米国特許第３８０２８４２号明細書、米国特許第３７９８０６４号明細書、米国特許第３２９８７３９号明細書、米国特許第３９１５６４７号明細書、米国特許第３９１７４５３号明細書、米国特許第３９３３５９４号明細書、米国特許第３９３６３５７号明細書、米国特許第７４７６２０２Ｂ２号明細書、およびこれらの中で引用されているその他のものに記載されている。さらに、本発明において記載される試薬組成物および方法は、検体の決定が、多層要素、例えば米国特許第３９９２１５８号明細書、米国特許第７８７１５６８号明細書、およびこれらの中で引用されているその他のものに記載されているもので行われる場合に特に有用である。
【００４９】
本発明において記載される方法は、様々な分析手順および機器設定を用いて、生体液（汗、血清、血漿、髄液、尿、唾液、羊水など）中の乳酸または乳酸塩を決定するのに用いることができる：
ａ）Ｆｅ（ＩＩＩ）／１，１０−フェナントロリン混合物を前記のものなどの公知の多層材料上に含浸させる。この場合、一滴の分析対象の溶液を、一滴の試薬と共にプレートウェル内に載置するか、または規定濃度の試薬を予め含浸させたろ紙またはその他の材料上に載置する。ＵＶ光を照射した後にのみ、乳酸塩によるＦｅ（ＩＩＩ）からＦｅ（ＩＩ）への還元、１，１０−フェナントロリンとのＦｅ（ＩＩ）の錯化のために、オレンジ色の染みが形成される；
ｂ）Ｆｅ（ＩＩＩ）／１，１０−フェナントロリン混合物を、例えば、汗を予め採取された吸着材料上に添加するか、または汗採取用のその他の装置内に添加し、ＵＶ光を照射する；
ｃ）適切な濃度のＦｅ（ＩＩＩ）／１，１０−フェナントロリン溶液およびＵＶ光を用いた分光光度キュベットまたはＥＬＩＳＡプレート；
ｄ）フローインジェクションシステムを用いたオンライン反応；
ｅ）Ｆｅ（ＩＩＩ）／１，１０−フェナントロリン混合物およびＵＶ照射によるオンラインポストカラム誘導体化にカップリングされた液体クロマトグラフィー分析（ＨＰＬＣ）。
【００５０】
有利には、試薬の設定方法のこれらの好ましい実施形態は、長年にわたって安定な低コストの試薬を用いて乳酸を決定することを可能にする。
【００５１】
例えば、１，１０−フェナントロリンのコストは、４．５４ユーロ／ｇである。したがって、試薬（１，１０−フェナントロリンおよびＦｅ（ＩＩＩ）溶液）１０ｇ／ｌのコストは、約０．００２ユーロ／試験単位である。
【００５２】
酵素試薬のコストは、桁違いに高く、それらの安定性は６〜１２ヶ月に限定される。
【００５３】
本発明者らは、以下にいくつかの実施例を報告するが、これらは、本発明の範囲に含まれる組成物の全可能性を網羅することを意図するものではない。
【実施例】
【００５４】
本発明者らは、乳酸−Ｆｅ（ＩＩＩ）反応で５つのランプを試験した：
ａ）低コストのＬＥＤ３７０Ｅ  Ｕｌｔｒａ  Ｂｒｉｇｈｔ  Ｄｅｅｐ  Ｖｉｏｌｅｔ  ＬＥＤ（ＴｈｏｒＬａｂ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；
ｂ）ネイルゲル硬化用のＵＶランプ；
ｃ）高圧Ｈｇランプ；
ｄ）低圧Ｈｇランプ。
ｅ）ＵＳＢランプ
【００５５】
図６は、ａ）低コストのＬＥＤ３７０Ｅ  Ｕｌｔｒａ  Ｂｒｉｇｈｔ  Ｄｅｅｐ  Ｖｉｏｌｅｔ  ＬＥＤ（ＴｈｏｒＬａｂ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（鎖線）；ｂ）ネイルゲル硬化用のＵＶランプ（太実線）；ｃ）高圧Ｈｇランプ（短鎖線）；ｄ）低圧Ｈｇランプ（細実線）；ｅ）ＵＳＢランプ（二点鎖線）の発光スペクトルを示す。
【００５６】
表１は、ブランク測定溶液に対する３ｍＭ乳酸塩のシグナル変化として表した結果をまとめたものである（ΔはｍＶ単位）。
【００５７】
最も良い結果は、高圧ランプを用いて、およびＬＥＤ３７０Ｅを用いて得られた。後者の場合、焦点照射領域が狭く、１ｍＬの試料を撹拌することによって均質化する必要性があるので、照射時間をより長くすると（６０秒間に代えて１２０秒間）、良好な結果が得られた。この明らかな欠点は、試料の小滴を適切な装置内で照射しなければならない場合には利点である。
【００５８】
【表１】
2014528086.tif 000005
【００５９】
４００〜７００ｎｍの範囲（可視）の発光スペクトルを有するＵＳＢランプは、いかなる活性化能も示さなかった。したがって、乳酸塩／Ｆｅ（ＩＩＩ）反応を活性化するのに最良の照射波長は、３００〜４００ｎｍの範囲内である。
【００６０】
実施例番号１．比色／分光光度分析を用いるキュベット中での試験：ヒト汗中の乳酸塩の分析。
Ａ）検量線用の標準溶液および試薬の調製。
分光光度／比色アッセイには、下記溶液が必要である：
ａ）１５ｍｇ／ｍｌ（１５，０００ｐｐｍ、または８３．３ｍＭ）１，１０−フェナントロリンの標準溶液。前記溶液は、７５ｍｇの粉末を１ｍｌのエタノールに溶解させ、４ｍｌの水を添加することによって調製される；
ｂ）１０ｇ／ｌ（１０，０００ｐｐｍ、または１７９ｍＭ）Ｆｅ（ＩＩＩ）の０．１Ｍ  ＨＮＯ３標準溶液；
ｃ）１．３１Ｍ乳酸の標準溶液（１００μｌの乳酸（Ｌ６４０２  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｆｌｕｋａ）を希釈することによって得られたもの、分子量９０．０８、密度＝１．２ｍｇ／ｍｌ（脱イオン水９００μｌ中））。
【００６１】
下記組成を有する溶液を得るために、石英キュベット中で、ａ）およびｂ）の溶液を希釈し、混合する：５ｍＭ  １，１０−フェナントロリン＋５ｍＭ  Ｆｅ（ＩＩＩ）（（ｄ）溶液）。
【００６２】
このように、溶液ｃ）の適切な希釈を実施することによって、漸増濃度の乳酸を溶液ｄ）に添加する。ｂ）タイプのＵＶランプを用いて、乳酸（例えば、０．３ｍＭ）を含む溶液ｄ）に６０秒間照射する。
【００６３】
図１は、ｂ）タイプのＵＶランプを用いて６０秒間照射する前（曲線Ｂ）および後（曲線Ｃ）における溶液ｄ）（曲線Ａ）および溶液ｄ）＋０．３ｍＭ乳酸のＵＶ／可視スペクトルを示す。乳酸を含まない溶液ｄ）は、黄色である。０．３ｍＭ乳酸を添加し、ｂ）タイプのＵＶランプを用いて６０秒間照射した後、前記溶液は、橙赤色になる。
【００６４】
図２は、ｂ）タイプのＵＶランプを用いて６０秒間照射した後の、０．３ｍＭ乳酸と試薬溶液（ｄ）との間の反応動態（反応時間に対する５１２ｎｍの吸光度）を示す。図２によれば、１０分後の吸光度値は、最大プラトー値の９０％に達することになる。したがって、検量線を実施するために、１０分間の反応時間を選択した。
【００６５】
図３は、試薬溶液ｄ）と反応させ、ｂ）タイプのＵＶランプを用いて６０秒間ＵＶ照射し、それらを調製した１０分後に分析した後に、漸増濃度の乳酸を含む溶液の５１２ｎｍの吸光度値をプロットすることによって得られた検量線を示す。
【００６６】
前記方法は、０．０５〜１ｍＭ乳酸において直線的なダイナミックレンジを示す（直線部分のフィッティングパラメータは、傾き＝２．２１ｍＭ−１（ＳＤ＝０．１１６）、Ｒ２＝０．９８６４、Ｎ＝６である）。定量限界（ＬＯＱ）は、０．０５ｍＭである。精度は、３．１％である（変動係数パーセント）。
【００６７】
提案された方法を、身体的な運動負荷を受けた運動選手の汗中の乳酸の決定に適用した。
【００６８】
血漿中の乳酸塩濃度は、一般に２ｍＭ未満であるが、汗中では１０〜１５ｍＭの範囲またはそれ以上である。この一部は、解糖生成物として汗腺の代謝に由来するものである。その他の部分は血漿の乳酸塩に由来するものであり、したがって、身体活動の結果としての乳酸塩の変動に従う。
【００６９】
Ｂ）試料の調製
ａ）各決定には、２０〜５００ｍｇの汗が必要である。エクリン汗は、例えば、運動中に背下部から採取するが、身体のその他の領域で採取することもできる。具体例では、運動中に接着パッチを用いて、サンプリングのための確立された時間にわたって適所に保持されたろ紙（４２Ｗｈａｔｍａｎ  ａｓｈｌｅｓｓ，ｎ．１４４２０７０、直径７０ｍｍ）上に汗を採取する。代替的には、医療行為で既に採用されているその他の方法、例えば毛細管装置によって、汗を採取することができる；
ｂ）ろ紙を用いるサンプリング方法の場合、おおよそ１：１０の希釈物を得るために、１．５〜３ｍｌの脱イオン水で汗を抽出する。毛細管を用いるのと同じように汗を採取する場合、脱イオン水で約１０倍希釈しなければならない（１００μｌ＋９００μｌの水）；
ｃ）汗の希釈溶液１００μｌを９００μｌの試薬（すなわち、５ｍＭ  １，１０−フェナントロリン＋５ｍＭ  Ｆｅ（ＩＩＩ）混合物、溶液ｄ）に添加し、このようにして前記方法の直線的なダイナミックレンジ（０．０５〜１ｍＭ）に含まれる濃度値を得る。
ｄ）次いで、希釈された汗＋試薬（溶液ｄ）の混合物を分光光度分析用キュベット（容量１ｍＬ）に移し、ｂ）タイプのＵＶランプを用いて６０秒間照射する。１０分間の反応時間の後、分光光度計または比色計で、前記溶液の５１２ｎｍの吸光度を読み取る。
ｅ）分光光度計を５１２ｎｍの波長に設定し、ブランク溶液を用いて較正する（汗試料を含まない溶液（ｄ）を添加し、ｂ）タイプのＵＶランプを用いて６０秒間照射し、照射から１０分後に分析する）。この後、試料溶液の吸光度を測定する。
【００７０】
測定時間は、２分間未満である。
【００７１】
表２は、例として、２つのヒト汗試料中に見られる乳酸塩濃度を、クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ）によって求めた乳酸塩濃度値と比較した結果を示す。希釈係数（１０×１０＝１００）を考慮して、前記値を補正した。
【００７２】
【表２】
2014528086.tif 000006
【００７３】
結果は、２つの試料１および試料２について、それぞれ８８％および１１５％の精度を示している。現在のところ、認定された汗分析方法は報告されていないことを考慮すると、これらの精度値は良好である。
【００７４】
実施例番号２．比色／分光光度分析を用いるキュベットでの試験：ヒト唾液中の乳酸塩の分析。
Ａ）検量線用の標準溶液および試薬の調製。
分光光度／比色アッセイには、下記溶液が必要である：
ａ）１５ｍｇ／ｍｌ（１５，０００ｐｐｍ、または８３．３ｍＭ）１，１０−フェナントロリンの標準溶液。前記溶液は、７５ｍｇの粉末を１ｍｌのエタノールに溶解させ、４ｍｌの水を添加することによって調製される；
ｂ）１０ｇ／ｌ（１０，０００ｐｐｍ、または１７９ｍＭ）Ｆｅ（ＩＩＩ）の０．１Ｍ  ＨＮＯ３標準溶液；
ｃ）１．３１Ｍ乳酸の標準溶液（１００μｌの乳酸（Ｌ６４０２  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｆｌｕｋａ）を希釈することによって得られたもの、分子量９０．０８、密度＝１．２ｍｇ／ｍｌ（脱イオン水９００μｌ中））。
【００７５】
下記組成を有する溶液を得るために、石英キュベット中で、ａ）およびｂ）の溶液を希釈し、混合する：５ｍＭ  １，１０−フェナントロリン＋５ｍＭ  Ｆｅ（ＩＩＩ）（（ｄ）溶液）。
【００７６】
このように、溶液ｃ）の適切な希釈を実施することによって、漸増濃度の乳酸を溶液ｄ）に添加する。ｂ）タイプのＵＶランプを用いて、乳酸（例えば、０．３ｍＭ）を含む溶液ｄ）に６０秒間照射する。
【００７７】
Ｂ）試料の調製
ａ）各決定には、１００〜２００マイクロリットルの唾液が必要である。
ｂ）１００μｌの唾液を９００μｌの試薬（すなわち、５ｍＭ  １，１０−フェナントロリン＋５ｍＭ  Ｆｅ（ＩＩＩ）混合物、溶液ｄ）に添加し、このようにして前記方法の直線的なダイナミックレンジ（０．０５〜１ｍＭ）に含まれる濃度値を得る。
ｃ）次いで、唾液＋試薬（溶液ｄ）の混合物を分光光度分析用キュベット（容量１ｍＬ）に移し、ｂ）タイプのＵＶランプを用いて６０秒間照射する。１０分間の反応時間の後、分光光度計または比色計で、前記溶液の５１２ｎｍの吸光度を読み取る。
ｄ）分光光度計を５１２ｎｍの波長に設定し、ブランク溶液を用いて較正する（汗試料を含まない溶液（ｄ）を添加し、ｂ）タイプのＵＶランプを用いて６０秒間照射し、照射から１０分後に分析する）。この後、試料溶液の吸光度を測定する。
【００７８】
測定時間は、２分間未満である。
【００７９】
希釈補正係数（１：１０）を考慮すると、唾液試料中に見られる乳酸塩濃度値は、２．１±０．０７ｍＭであった。
【００８０】
実施例番号３．使い捨てデバイスを用いる乳酸の定性分析。
一般的なパッチから５つの正方形を切り取り、２００μｌの反応混合液（すなわち、５ｍＭ  １，１０−フェナントロリン＋５ｍＭ  Ｆｅ（ＩＩＩ）混合物、溶液ｄ）を含浸させて乾燥した。次いで、漸増濃度の乳酸溶液（０、０．３２５、３．２５、６．５、６５ｍＭ）１００μｌを各正方形の上に載置し、ｂ）タイプのＵＶ光を用いて６０秒間照射した。
【００８１】
より強い色は、より高濃度の乳酸を含む試料に対応している。本操作は、例えば、トレーニング時の汗中の乳酸が閾値と比較して過度なレベルであることを示すために定性的に用いることもできるし、または前記混合物を支持体に物理的に吸着させるかもしくは化学的に結合させ、携帯読取器（糖尿病患者の血中グルコース測定に用いられるものと同様のもの）用の任意の使い捨て診断試験ストリップに吸収させることができる場合はいつでも定量的に用いることもできるし、またはスキャン後に色強度に関して画像処理することによって用いることもできる。
【００８２】
当然のことながら、かつ有利には、本発明を実施するさらなる方法によれば、本発明において記載される乳酸塩の光化学反応に必要な適切な濃度のＦｅ（ＩＩＩ）溶液を吸着材料マトリックスに組み込むことにより、電気化学技術などの物理化学的技術を用いて乳酸または乳酸塩を定量的に決定するのに適切な使い捨て試験ストリップを得ることができる。
【００８３】
好ましい設定によれば、試薬溶液に浸漬された使い捨て電気化学ストリップ、および分析対象の生体液にＵＶ光を適切に照射し、次いで、試料にＵＶ光を選択時間照射するための試料ホルダを備えるように改変された市販の携帯計測器を用いて電気化学的試験に供する。
【００８４】
電気化学的技術は、種々の分析手順および機器設定を用いて汗、血清、血漿、尿、唾液などの生体液中の乳酸または乳酸塩を決定するのに用いられ、成功している：
【００８５】
ａ）白金電極とカロメル参照電極とによって構成されるポテンシオメトリックセルでは、適切な濃度のＦｅ（ＩＩＩ）溶液を乳酸溶液に添加し、混合物にＵＶ光を照射した後に測定を行なう；
ｂ）フローインジェクションシステムにおいて直列の白金微小電極と参照Ａｇ／ＡｇＣｌ微小電極とによって構成されるポテンシオメトリックセル（図４）では、適切な濃度のＦｅ（ＩＩＩ）溶液を乳酸溶液に添加し、混合物にＵＶ光を照射した後に測定を行う；
ｃ）適切な濃度のＦｅ（ＩＩＩ）溶液を含浸材料または多層材料上に担持する。この場合、乳酸塩を含む一滴の試料溶液を、試薬を予め含浸させた材料上に添加する／毛細管現象により吸収させる。
【００８６】
実施例番号４．ポテンシオメトリックセルでの試験：ヒト汗中の乳酸塩の分析。
Ａ）検量線用の標準溶液および試薬の調製。
電位差アッセイには、下記溶液が必要である。
ａ）１０ｇ／ｌ（１０，０００ｐｐｍ、または１７９ｍＭ）Ｆｅ（ＩＩＩ）の０．１Ｍ  ＨＮＯ３標準溶液；
ｂ）３．７Ｍ乳酸の標準溶液（５ｇの乳酸（Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ製）を１５ｍｌの完全脱イオン水で希釈することによって得られたもの、分子量９０．０８、密度＝１．２１ｇ／ｍＬ）。
【００８７】
５ｍＭ  Ｆｅ（ＩＩＩ）溶液（溶液ｃ）を得るためには、溶液ａ）を適切に希釈しなければならない。
【００８８】
このように、溶液ｂ）の適切な希釈によって得られた漸増濃度の乳酸を溶液ｃ）に添加する。
【００８９】
ｃ）タイプのＵＶランプを用いて、漸増濃度の乳酸を含む各溶液ｃ）に６０秒間照射する。
【００９０】
測定システムは、カロメル参照電極（Ｈｇ｜Ｈｇ２Ｃｌ２｜Ｃｌ−）と白金作用電極とによって構成されるポテンシオメトリックセルがデジタル電位差読取器（ｍＶ単位）に接続されたものである。
【００９１】
図５は、溶液ｃ）と反応させ、ｃ）タイプのＷＵＶランプを用いて６０秒間照射し、調製直後に分析した後に、漸増濃度の乳酸（０、０．２５、０．５、１、２、３、５、１０、５０、１００、１５０、２００ｍＭ）を含む８つの溶液で記録された電位差（ｍＶ）の値から得られた検量線を示す。
【００９２】
検量線（乳酸塩濃度の対数に対する電位差）は、５〜１０ｍＭの間では直線的な不連続性を示しており、０．２５〜１０ｍＭ乳酸塩の間（図５Ｂ）および１０〜２００ｍＭ乳酸の間（図５Ａ）では線形である。後者は、安静時および激しい運動中のヒト汗で典型的に見られる乳酸塩濃度の範囲である。例えば、ヒト血液中でより低濃度を検出するためには、図５Ｂの検量線を用いることが適切である。
【００９３】
表３は、検量線（乳酸塩濃度の対数に対する電位差）の０．２５〜５および５〜１０ｍＭ乳酸塩の範囲におけるデータフィッティングのパラメータをまとめたものである。
【００９４】
【表３】
2014528086.tif 000007
【００９５】
乳酸塩の定量限界（ＬＯＱ）は、０．１ｍＭである。精度は、変動係数パーセント（ＣＶ％）として表すと２．２％である。
【００９６】
実施例番号５．フローインジェクションシステム（ＦＩＡ）と電位差検出器とによる乳酸塩の分析：ヒト汗中の乳酸塩の分析。
Ａ）検量線用の標準溶液および試薬の調製。
電位差アッセイには、下記溶液が必要である。
ａ）１０ｇ／ｌ（１０，０００ｐｐｍ、または１７９ｍＭ）Ｆｅ（ＩＩＩ）の０．１Ｍ  ＨＮＯ３標準溶液；
ｂ）３．７Ｍ乳酸の標準溶液（５ｇの乳酸（Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ製）を１５ｍｌの完全脱イオン水で希釈することによって得られたもの、分子量９０．０８、密度＝１．２１ｇ／ｍＬ）。
【００９７】
５ｍＭ  Ｆｅ（ＩＩＩ）溶液（溶液ｃ）を得るためには、溶液ａ）を適切に希釈しなければならない。
【００９８】
このように、溶液ｂ）の適切な希釈によって得られた漸増濃度の乳酸を溶液ｃ）に添加する。
【００９９】
ｃ）タイプのＵＶランプを用いて、漸増濃度の乳酸を含む各溶液ｃ）に６０秒間照射する。
【０１００】
用いられた測定システムは、図５に図式化したポテンシオメトリックセルであり、液体試料のオンラインインジェクションシステム（４）と廃棄管（５）とを備え、銀参照微小電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）（１）と白金作用微小電極（２）（それぞれモデル１６−７０２および１６−７０５が改造されたもの、Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＮＨ）とによって構成されるポテンシオメトリックセルがデジタル電位差読取器（ｍＶ単位）（３）に電気的に接続されたものである。
【０１０１】
２つの異なるＦｅ（ＩＩＩ）濃度レベル（１および５ｍＭ）で調製された溶液ｃ）と反応させ、ｃ）タイプのＷＵＶランプを用いて６０秒間照射し、調製直後に前記システムに注入した後に、漸増濃度の乳酸（０〜１０ｍＭ）を含む種々の溶液で測定された電位差（ｍＶ）の値をプロットすることによって、検量線を得る。
【０１０２】
検量線（乳酸塩濃度の対数に対する電位差）は、０．１〜５ｍＭ乳酸塩の間では線形である。表３は、データの線形フィッティングの値をまとめたものである。
【０１０３】
乳酸塩の定量限界（ＬＯＱ）は、０．１ｍＭである。精度は、変動係数パーセント（ＣＶ％）として表すと２．２％である。
【０１０４】
検量線（乳酸塩濃度の対数に対する電位差）の０．１〜５ｍＭ乳酸塩の範囲におけるデータフィッティングのパラメータを表４に報告する。
【０１０５】
【表４】
2014528086.tif 000008
【０１０６】
提案された方法を、身体的な運動負荷を受けた運動選手の汗中の乳酸の決定に適用した。
【０１０７】
Ｂ）試料の調製
ａ）各決定には、２０〜５００ｍｇの汗を要する。エクリン汗は、例えば、運動中に背下部から採取するが、身体のその他の領域で採取することができる。具体例では、運動中に接着パッチを用いて、サンプリングのための確立された時間にわたって適所に保持されたろ紙（４２Ｗｈａｔｍａｎ  ａｓｈｌｅｓｓ，ｎ．１４４２０７０、直径７０ｍｍ）上に汗を採取する。代替的には、医療行為で既に採用されているその他の方法、例えば毛細管装置を用いて、汗を採取することができる；
ｂ）ろ紙を用いるサンプリング方法の場合、おおよそ１：１０の希釈物を得るために、１．５〜３ｍｌの脱イオン水で汗を抽出する。毛細管を用いるのと同じように汗を採取する場合、脱イオン水で約１０倍希釈しなければならない（１００μｌ＋９００μｌの水）；
ｃ）汗の希釈溶液１ｍｌに５．６μｌの試薬（すなわち、１ｍＭ  Ｆｅ（ＩＩＩ））を添加する。
ｄ）次いで、ｃ）タイプのＷＵＶランプを用いて、希釈された汗＋１ｍＭ  Ｆｅ（ＩＩＩ）の混合物に６０秒間照射し、２つの微小電極を含むＦＩＡ装置に注入する。ＰＣによって、電位差の値を記録する。
ｅ）本操作では、ｃ）タイプのＷＵＶランプを用いて６０秒間照射し、照射直後に分析されたブランク溶液（汗試料の１または５ｍＭ  Ｆｅ（ＩＩＩ）溶液を添加）の測定も必要である。測定時間は、１分間未満である。
【０１０８】
前記機器設定は、少量の試料溶液（汗の希釈溶液０．５〜１ｍｌ）しか必要としないという利点を有する。
【０１０９】
表５は、例として、３つのヒト汗試料中に見られる乳酸を、クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ）で求めた同じ試料中の乳酸濃度値と比較した分析結果を示す。希釈係数（１０×１０＝１００）を考慮して、前記値を補正した。
【表５】
2014528086.tif 000009
【０１１０】
結果は、８３〜９５％の範囲の精度を示している。
【０１１１】
実施例番号６．フローインジェクションシステム（ＦＩＡ）と電位差検出器とによる乳酸塩の分析：ヒト尿中の乳酸塩の分析。
Ａ）検量線用の標準溶液および試薬の調製。
前記電位差アッセイには、実施例番号５で報告したのと同じ溶液が必要である。
【０１１２】
検体添加技術を用いて尿を脱イオン水で１：１希釈すること、すなわち、希釈された尿試料を既知量の検体でスパイクすることによって、尿中の乳酸塩の決定を実施する。ｃ）タイプのＷＵＶランプを用いて６０秒間ＵＶ照射した後に前記溶液を注入することによって求めた乳酸濃度の関数として電位差（ｍＶ）の値をプロットすることにより、検体添加曲線を得る。
【０１１３】
Ｂ）試料の調製
ａ．０〜５ｍＭの範囲の標準溶液からの漸増濃度の乳酸塩を１ｍｌの希釈尿（１：１）に添加する。このように、２８μｌの試薬溶液（すなわち、５ｍＭ  Ｆｅ（ＩＩＩ））を添加する。
ｂ．ｃ）タイプのＷＵＶランプを用いて、希釈尿（乳酸塩標準溶液でスパイされたものまたはスパイクされていないもの）＋５ｍＭ  Ｆｅ（ＩＩＩ）の混合物に６０秒間照射し、２つの参照電極と作用電極とを備えるＦＩＡシステムに注入する。このようにして、各溶液について、電位差の値を測定する。
【０１１４】
添加乳酸塩濃度に対する電位差（ｍＶ）の線形プロットのｘ軸上のインターセプト値から、尿試料中の乳酸塩濃度を決定した（検体添加技術）。
【０１１５】
健常ボランティアに由来する検査された尿試料では、内因性の乳酸塩濃度は、検出限界（０．０３ｍＭ）未満であった（カーブフィッティングパラメータ：ｙ軸のインターセプト＝５．６７±２ｍＭ；傾き＝−５．３±０．７、Ｒ２＝０．９２６）。
【図１】
2014528086.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2014528086.tif 000017
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