(57)【要約】  本発明は、特に、組み換え細胞を用いる２−メチルエリスリトール（２−ＭＥ）、１−デオキシキシルロース（１−ＤＸ）、及びモノアセチル化−２−Ｃ−メチルエリスリトールなどの五炭糖の生物学的生産に関係する、組成物及び方法を提供する。【選択図】図１
2014502844.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
五炭糖の生産方法であって：
（ａ）（ｉ）ＤＸＳ及び／又はＤＸＲポリペプチドをコードしている異種核酸、及び／又は（ｉｉ）ＤＸＳ及び／又はＤＸＲポリペプチドをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピー、を含む、組み換え細胞を培養する工程であって、五炭糖の生産に好適な条件下で前記細胞を培養する工程、並びに
（ｂ）前記五炭糖を生産させる工程、を含む、方法。
【請求項２】
前記組み換え細胞が、（ｉｉｉ）ホスファターゼをコードしている異種核酸及び／又は（ｉｉ）ホスファターゼをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピーを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記五炭糖が、２−メチルエリスリトール（２−ＭＥ）及び１−デオキシキシルロース（１−ＤＸ）からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記五炭糖が２−メチルエリスリトール（２−ＭＥ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記組み換え細胞の累積２−ＭＥ生産力価が、少なくとも約２０ｇ／Ｌである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組み換え細胞の累積２−ＭＥ生産力価が、少なくとも約３０ｇ／Ｌである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記組み換え細胞の累積２−ＭＥ生産力価が、少なくとも約４５ｇ／Ｌである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記組み換え細胞が、ＤＸＳ及び／又はＤＸＲに関与するポリペプチド以外のＤＸＰ経路に含まれるポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、及び／又は（ｉｉ）ＤＸＳ及び／又はＤＸＲに関与するポリペプチド以外のＤＸＰ経路に含まれるポリペプチドをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピー、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチドがＩｓｐＧである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＩｓｐＧポリペプチドがＴ．エロンガタスＩｓｐＧポリペプチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＩｓｐＧポリペプチドが大腸菌（E. coli）ＩｓｐＧポリペプチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記組み換え細胞が、鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチドをコードしている核酸を更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチドが、フェロドキシン及びフラボドキシンから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組み換え細胞が、イソペンテニル−ジホスフェート還元酵素δ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドをコードしている少なくとも１種の異種核酸、あるいはＩＤＩポリペプチドをコードしている内在性核酸の少なくとも１つのコピー、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記組み換え細胞が、バクテリア、藻類、真菌、又は酵母細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞がバクテリア細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記バクテリア細胞が、グラム陽性バクテリア細胞又はグラム陰性バクテリア細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記バクテリア細胞が、大腸菌（E. coli）、Ｐ．シトレア、枯草菌、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレービス、Ｂ．ステアロサーモフィルス、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．クラウシイ、Ｂ．ハロデュランス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サークランス、Ｂ．ロータス、卒倒病菌、Ｓ．アルブス、Ｓ．リビダンス、Ｓ．コエリカラー、Ｓ．グリセウス、シュードモナス属、及びＰ．アルカリゲネス細胞からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記バクテリア細胞が、大腸菌（E. coli）細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＤＸＰ経路関連性酵素が、ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＭＣＴ、ＣＭＫ、ＭＣＳ、ＨＤＲ（ＩｓｐＨ）、及びＩＤＩ群からなるから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記その他のＤＸＰ経路関連性酵素が、ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＨＤＲ（ＩｓｐＨ）、及びＩＤＩからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の組み換え細胞を含む細胞培養物であって、２−ＭＥを少なくとも約４５ｇ／Ｌ生産する、細胞培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、主に米国仮出願特許第６１／４２６，４８３号（２０１０年１２月２２日出願）に関する利益を主張するものであり、該仮出願特許の全体を参照により援用する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、概して、組み換え細胞による２−メチルエリスリトール（２−ＭＥ）、１−デオキシキシルロース（１−ＤＸ）、及びモノアセチル化−２−Ｃ−メチルエリスリトールなどの五炭糖の生物学的生産に関する。
【背景技術】
【０００３】
社会が、持続可能な工業加工への移行を求めるようになったことに伴い、戦略的な関心は、再生可能資源から生化学物質を生産することに向けられるようになった。遺伝子組み換え微生物を用いる発酵法では、穏やかな条件下で、様々な炭素源（糖、脂質など）を、より価値の高い化合物、例えば五炭糖へと直接的に変換することができる。
【０００４】
五炭糖は、例えば、食品添加物／保存料、甘味料として、化粧品処方成分として、医薬品用キラル前駆体として、並びに洗剤及び他の化学物質を製造する際の構成単位として、数多くの工業分野で使用されている。持続可能な手法を用い、商業的に更に効果的に五炭糖を生産する方法が必要とされている。本開示は、この必要を満たすものであり、良好な追加効果を提供する。
【０００５】
本明細書で引用されているすべての刊行物、特許出願及び特許は、個々の刊行物、特許出願又は特許のそれぞれが特定的に及び個々に参照により組み込まれるよう示されているように、参照により本明細書に組み込まれる。特に、本明細書に引用されているすべての刊行物は、本発明に関連して使用され得る組成物及び方法を、説明及び開示する目的で参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、特に、組み換え細胞を用いる２−メチルエリスリトール（２−ＭＥ）、１−デオキシキシルロース（１−ＤＸ）、及びモノアセチル化−２−Ｃ−メチルエリスリトールなどの五炭糖の生物学的生産に関係する、組成物及び方法を提供する。
【０００７】
したがって、一態様では、本発明は、（ａ）（ｉ）ＤＸＳ及び／又はＤＸＲポリペプチドをコードしている異種核酸、及び／又は（ｉｉ）ＤＸＳ及び／又はＤＸＲポリペプチドをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピー、を含む、組み換え細胞を培養する工程であって、五炭糖の生産に好適な条件下で細胞を培養する工程、並びに（ｂ）前記五炭糖を生産させる工程、による五炭糖の製造方法を提供する。一態様では、組み換え細胞は、（ｉｉｉ）ホスファターゼをコードしている異種核酸を更に含み及び／又は（ｉｉ）ホスファターゼをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピーを含む。他の態様では、五炭糖は、２−メチルエリスリトール（２−ＭＥ）及び１−デオキシキシルロース（１−ＤＸ）からなる群から選択される。他の態様では、五炭糖は２−メチルエリスリトール（２−ＭＥ）である。他の態様では、組み換え細胞は、少なくとも約２０ｇ／Ｌの累積力価で２−ＭＥを生産することができる。他の態様では、組み換え細胞は、少なくとも約３０ｇ／Ｌの累積力価で２−ＭＥを生産することができる。他の態様では、組み換え細胞は、少なくとも約４５ｇ／Ｌの累積力価で２−ＭＥを生産することができる。
【０００８】
他の態様では、本発明は、（ａ）（ｉ）ＤＸＳ及び／又はＤＸＲポリペプチドをコードしている異種核酸及び／又は（ｉｉ）ＤＸＳ及び／又はＤＸＲポリペプチドをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピーを含む、組み換え細胞を培養する工程であって、２−ＭＥの生産に好適な条件下で細胞を培養する工程、並びに（ｂ）２−ＭＥを生産させる工程、を含む、２−メチルエリスリトール（２−ＭＥ）の製造方法を提供する。一態様では、細胞は、少なくとも約４５ｇ／Ｌの２−ＭＥを生産することができる。
【０００９】
他の態様では、本発明は、（ａ）（ｉ）ＤＸＳ及び／又はＤＸＲポリペプチドをコードしている異種核酸、及び／又は（ｉｉ）ＤＸＳ及び／又はＤＸＲポリペプチドをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピー、及び／又は（ｉｉｉ）ホスファターゼをコードしている異種核酸、及び／又は（ｉｉ）ホスファターゼをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピー、を含む、組み換え細胞を培養する工程であって、２−ＭＥの生産に好適な条件下で細胞を培養する工程、並びに（ｂ）２−ＭＥを生産させる工程、を含む、２−メチルエリスリトール（２−ＭＥ）の製造方法を提供する。一態様では、細胞は、少なくとも約４５ｇ／Ｌの２−ＭＥを生産することができる。
【００１０】
他の態様では、本発明は、少なくとも１種の五炭糖の製造法を提供し、方法は、（ａ）本開示に記載される、五炭糖の生産に好適な条件下で組み換え細胞を培養する工程、並びに（ｂ）五炭糖を生産させる工程、を含み、ここで、五炭糖は、２−メチルエリスリトール（２−ＭＥ）、１−デオキシキシルロース（１−ＤＸ）、及びモノアセチル化−２−Ｃ−メチルエリスリトールからなる群から選択される。一態様では、細胞は、少なくとも約４５ｇ／Ｌの２−ＭＥを生産することができる。他の態様では、任意の生産方法には、五炭糖を回収する工程も包含される。
【００１１】
他の態様では、本発明は、五炭糖を生産することのできる組み換え細胞を提供し、細胞は、（ａ）（ｉ）ＤＸＳ及び／又はＤＸＲポリペプチドをコードしている異種核酸、及び／又は（ｉｉ）ＤＸＳ及び／又はＤＸＲポリペプチドをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピー、及び所望により（ｉｉｉ）ホスファターゼをコードしている異種核酸、及び／又は（ｉｉ）ホスファターゼをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピー、を含む、組み換え細胞を培養する工程、を含む。一態様では、細胞は、少なくとも約４５ｇ／Ｌの２−ＭＥを生産することができる。
【００１２】
上記の任意の態様では、組み換え細胞は、ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチド（ＤＸＳ及び／又はＤＸＲポリペプチド以外）をコードしている１つ以上の異種核酸、及び／又は（ｉｉ）ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチド（ＤＸＳ及び／又はＤＸＲポリペプチド以外）をコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピー、も含み得る。
【００１３】
本明細書における任意の態様では、組み換え細胞は、バクテリア、藻類、真菌又は酵母であってよい。一態様では、細胞は、バクテリア細胞である。他の態様では、バクテリア細胞は、グラム陽性バクテリア細胞又はグラム陰性バクテリア細胞である。他の態様では、バクテリア細胞は、大腸菌（E. coli）、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレービス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロデュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアグランス（B. coagulans）、Ｂ．サークランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｓ．アルブス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）、及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞からなる群から選択される。他の態様では、組み換え細胞はバクテリア細胞である。上記の任意の態様では、組み換え細胞は大腸菌（E. coli）であってよい。
【００１４】
上記の任意の態様では、ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチドはＩｓｐＧであってよい。一部の態様では、１種類のＩｓｐＧのみを使用する。他の態様では、２種類のＩｓｐＧを使用する。他の態様では、ＩｓｐＧポリペプチドはＴ．エロンガタス（T. elongatus）又は大腸菌（E. coli）由来である。他の態様では、ＤＸＰ経路関連性酵素は、ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＭＣＴ、ＣＭＫ、ＭＣＳ、ＨＤＲ（ＩｓｐＨ）、及びＩＤＩ群から選択される。他の態様では、その他のＤＸＰ経路関連性酵素は、ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＨＤＲ（ＩｓｐＨ）、及びＩＤＩ群から選択される。
【００１５】
上記の任意の態様では、組み換え細胞には、鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチドも含有させることができる。鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチドは、フェレドキシン及びフラボドキシンである。
【００１６】
上記の任意の態様では、組み換え細胞には、ＰＧＬポリペプチドをコードしている異種核酸、又はＰＧＬポリペプチドをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピー、も含有させることができる。上記の任意の態様では、ＰＧＬ核酸を、宿主細胞の染色体に組み込む。
【００１７】
上記の任意の態様では、組み換え細胞には、イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、あるいはＩＤＩポリペプチドをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピー、も含有させることができる。
【００１８】
他の態様では、本発明は、本開示に記載の通りの組み換え細胞を含む細胞培養物を提供する。一態様では、この細胞培養物は、少なくとも約４５ｇ／Ｌの２−ＭＥを生産する。
【００１９】
他の態様では、本発明は、本開示に記載の通りの組み換え細胞を用い、２−メチルエリスリトール（２−ＭＥ）、１−デオキシキシルロース（１−ＤＸ）、及びモノアセチル化−２−Ｃ−メチルエリスリトールなどの五炭糖を製造する系も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】イソプレンに関係するＭＶＡ及びＤＸＰ代謝経路（Ｆ．Ｂｏｕｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４４：３５７〜４２９，２００５に基づく）を示す図。以下の説明には、当該経路の各ポリペプチドの代替名、及び示されるポリペプチドの活性を測定するためのアッセイを開示した参考文献が含まれる（これらの参考文献をいずれも参照によりその全容にわたって本明細書に援用する）。メバロン酸経路：ＡＡＣＴ；アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ，ＭｖａＥ，ＥＣ  ２．３．１．９．アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：２１１６〜２１２２，２００２；ＨＭＧＳ；ヒドロメチルグルタリル−ＣｏＡ合成酵素，ＭｖａＳ，ＥＣ  ２．３．３．１０．アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４０６５〜４０７０，２００２；ＨＭＧＲ；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素，ＭｖａＥ，ＥＣ  １．１．１．３４．アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：２１１６〜２１２２，２００２；ＭＶＫ；メバロン酸キナーゼ，ＥＲＧ１２，ＥＣ  ２．７．１．３６．アッセイ：Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ  １９：９〜１４，１９９１．ＰＭＫ；ホスホメバロン酸キナーゼ，ＥＲＧ８，ＥＣ  ２．７．４．２，アッセイ：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：６２０〜６３１，１９９１；ＤＰＭＤＣ；ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ，ＭＶＤ１，ＥＣ  ４．１．１．３３．アッセイ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１３３５５〜１３３６２，１９９４；ＩＤＩ；イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ，ＩＤＩ１，ＥＣ  ５．３．３．２．アッセイ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１９１６９〜１９１７５，１９８９．ＤＸＰ経路：ＤＸＳ；１−デオキシキシルロース−５−ホスフェート合成酵素，ＤＸＳ，ＥＣ  ２．２．１．７．アッセイ：ＰＮＡＳ  ９４：１２８５７〜６２，１９９７；ＤＸＲ；１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−ホスフェート酸化還元酵素，ＤＸＲ，ＥＣ  ２．２．１．７．アッセイ：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：４４４６〜４４５７，２００２；ＭＣＴ；４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール合成酵素，ＩｓｐＤ，ＥＣ  ２．７．７．６０．アッセイ：ＰＮＡＳ  ９７：６４５１〜６４５６，２０００；ＣＭＫ；４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ，ＩｓｐＥ，ＥＣ  ２．７．１．１４８．アッセイ：ＰＮＡＳ  ９７：１０６２〜１０６７，２０００；ＭＣＳ；２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェート還元酵素合成酵素，ＩｓｐＦ，ＥＣ  ４．６．１．１２．アッセイ：ＰＮＡＳ  ９６：１１７５８〜１１７６３，１９９９；ＨＤＳ；１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−ジホスフェート還元酵素合成酵素，ＩｓｐＧ，ＥＣ  １．１７．４．３．アッセイ：Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７０：９１６８〜９１７４，２００５；ＨＤＲ；１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−ジホスフェート還元酵素，ＩｓｐＨ，ＥＣ  １．１７．１．２．アッセイ：ＪＡＣＳ  １２６：１２８４７〜１２８５５，２００４．図１は、ホスファターゼによるリン酸基の除去により、１−デオキシ���Ｄ−キシルロース（すなわち１−ＤＸ）及び２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（すなわち２−ＭＥ）が得られる過程を示す。
【図２】時間対２−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＭＥ）力価のプロットを示す図。試験番号２０１００７０３（白色三角形）、試験番号２０１００９１７（黒色菱型）、及び試験番号２０１０１０１１（白丸）のデータの傾向を示す。図内でＸ軸及びＹ軸にそれぞれ標識をした。
【図３】時間対１−デオキシ−Ｄ−キシルロース（１−ＤＸ）力価のプロットを示す図。試験番号２０１０１０１１（白丸）及び試験番号２０１００７８５（黒色菱型）のデータの傾向を示す。図内でＸ軸及びＹ軸にそれぞれ標識をした。
【図４】２種の異なるＨＰＬＣ法による２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールの解析結果を比較して示す図。このデータでは、２０１０１０１１に対し、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールについて、有機酸カラムＨＰＬＣ解析（黒色三角形）により解析した値と、アミノプロピルカラムＨＰＬＣ解析（白丸）により解析した値とを比較して示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、特に、組み換え細胞を用いる２−メチルエリスリトール（２−ＭＥ）、１−デオキシキシルロース（１−ＤＸ）、及びモノアセチル化−２−Ｃ−メチルエリスリトールなどの五炭糖の生物学的生産に関係する系、組成物及び方法を提供する。本開示に更に詳述する通り、本発明者らは、遺伝子操作を行った微生物（例えば、大腸菌ＢＬ２１株）には、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール又は２−メチルエリスリトール（２−ＭＥ）及び１−デオキシ−Ｄ−キシルロース（１−ＤＸ）などの五炭糖を相当量生産する能力があることを観察した。これらの五炭糖の生産は、デオキシキシルロースホスフェート（ＤＸＰ）経路により、グルコースがイソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）へと変換される工程の一部として行うことができる。これらの五炭糖は様々な工業用途において、例えば、食品添加物／保存料、甘味料として、化粧品処方成分として、医薬品用キラル前駆体として、並びに洗剤及び他の化学物質を製造する際の構成単位として、有用である。
【００２２】
用語の定義
特に記載がない限り、本明細書に使用するすべての技術的及び科学的用語の意味は、本発明が属する当業者に一般的に理解される意味と同様の意味である。本発明に使用される数多くの用語についての一般的な辞書として、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、並びにＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）を提供する。本発明は、記述されている特定の方法論、プロトコル、及び試薬に限定されるものではなく、これらは変更し得るものであることが理解されるべきである。当業者は、本明細書に記述されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料が、本発明の実践又は試験にも使用する工程ができることについても、理解するであろう。本明細書に提供される見出しは様々な態様又は本発明の態様を制限するものではなく、全体として、本明細書に参照として用いることのできるものである。
【００２３】
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」には、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド断片、及び融合ポリペプチドが含まれる。
【００２４】
本明細書で使用するとき、「単離ポリペプチド」は、２、５、１０、２０、又は５０個以上の異なるポリペプチドのライブラリなどといった、ポリペプチドのライブラリの一部を意味するものではなく、天然に生じる少なくとも１つの成分から分離されたポリペプチドを意味する。例えば、ポリペプチドをコードしている組み換え核酸を発現させることで単離ポリペプチドを得ることができる。単離されたタンパク質は非自然発生的なポリペプチドであってもよい。
【００２５】
「異種ポリペプチド」は、宿主細胞と異なる生物、種、又は株由来の核酸配列によりコードされるポリペプチドを意味する。一部の態様では、異種ポリペプチドは、同様の宿主細胞に天然に見られる野生型ポリペプチドと同一ではない。
【００２６】
本明細書で使用するとき、「核酸」は、共有結合により単鎖又は二本鎖のいずれかの形態で連結している、２つ以上のデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドを指す。
【００２７】
「組換え核酸」とは、対象とする核酸が由来する生物において天然に存在するゲノムにおいて、対象とする核酸に隣接する１つ以上の核酸（例えば遺伝子）を含まない、対象とする核酸のことを意味する。したがって、この用語には、例えば、ベクターに組み込まれた、プラスミド又はウィルスに自己複製的に組み込まれた、原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた、又は他の配列とは独立して別個の分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、又はＰＣＲにより生産された若しくは制限エンドヌクレアーゼによる消化により生産されたｃＤＮＡ断片）として存在する、組み換えＤＮＡが包含される。場合によっては、組換え核酸は天然に生じるものではないポリペプチドをコードしている核酸である。
【００２８】
「異種核酸」は、宿主細胞と異なる生物、種又は株由来の核酸配列を意味する。一部の態様では、異種核酸は、同様の宿主細胞に天然に見られる野生型核酸と同一ではない。
【００２９】
本明細書で使用するとき、句「ＤＸＰ経路に関連する様々な遺伝子及びポリペプチド」又は「ＤＸＰ経路関連性の核酸又はポリペプチド」は、限定するものではないが、テルペン合成酵素（例えば、オシメン合成酵素、ファルネセン合成酵素、及びアルテミシニン合成酵素）などのＤＸＰ経路に含まれるポリペプチド又は核酸と、直接的に又は間接的に相互作用する、任意の核酸又はポリペプチドを指す。
【００３０】
本明細書に用いるのに、別途明確に示されている場合を除き、単数形「ａ」、「ａｎ」などは、１つ以上を指す。
【００３１】
本開示において値又はパラメータに付す「約（about）」には、その値又はパラメータ自体を目的とする（及び説明する）態様を含む。例えば、「Ｘについて」という記述には、「Ｘ」の記述が含まれる。数値範囲は、その範囲を画定する端の数字を含む。
【００３２】
本明細書に記述される本発明の態様及び実施形態は、態様及び実施形態「を含む（comprising）」、態様及び実施形態「からなる（consisting）」、及び態様及び実施形態「から本質的になる（consisting essentially of）」を含むことが理解される。
【００３３】
五炭糖生産能をもつ組み換え細胞に関与する組成物及び方法
本開示により詳細に記載し、更に例示する通り、本発明は、組み換え細胞を用いる五炭糖の生物学的生産に関係する組成物及び方法を提供する。製造することのできる五炭糖としては、限定するものではないが、２−メチルエリスリトール（２−ＭＥ）、１−デオキシキシルロース（１−ＤＸ）、及びモノアセチル化−２−Ｃ−メチルエリスリトールが挙げられる。一態様では、本発明は、（ｉ）ＤＸＳ及び／又はＤＸＲポリペプチドをコードしている異種核酸及び／又は（ｉｉ）ＤＸＳ及び／又はＤＸＲポリペプチドをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピー、並びに所望により（ｉｉｉ）ホスファターゼをコードしている異種核酸及び／又は（ｉｉ）ホスファターゼをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピー、を含む、組み換え細胞を用いる、五炭糖の製造に関係する組成物、並びに製造方法を提供する。
【００３４】
一部の組み換え細胞（例えば、大腸菌株ＢＬ２１）に、イソプレンを製造する際にＤＸＰ経路を利用するよう遺伝子操作を行ったところ、本発明者らは、イソプレン生産が増加すると五炭糖（２−ＭＥなど）の生産が減少することを観察した。したがって、五炭糖の商業生産には、イソプレン生産量を減少させて、２−ＭＥなどの五炭糖の生産量を増加させ得るよう系を設計することが推奨される。このような設計を実現する非限定例は、イソプレン合成酵素をコードしている異種核酸、又は内在性のイソプレン合成酵素をコードしているその他のコピーを宿主細胞に導入するものではない。一態様では、組み換え細胞は、ＩｓｐＧなどのＤＸＰ経路に含まれるポリペプチドを１種以上含有し、かつイソプレン合成酵素をコードしている異種核酸、又は内在性のイソプレン合成酵素をコードしているその他のコピーは含有しないよう作成する。
【００３５】
図１に示される通り、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース（１−ＤＸ）は、ＤＸＰからリン酸基を除去することで生成され得る。したがって、１−ＤＸの生産は、ＤＸＳ酵素の過剰発現により実施することができる。この過剰発現は、ＤＸＳポリペプチドをコードしている異種核酸、及び／又は（ｉｉ）ＤＸＳポリペプチドをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピー、を導入することで実施できる。最終産物としての１−ＤＸの生産量を増加させるために、当業者は、系に含まれるホスファターゼ量を増量させることでＤＸＰ量を増量させ、１−ＤＸ生産量を増加させることができる。このような生産量の増加は、ホスファターゼをコードしている異種核酸及び／又は（ｉｉ）ホスファターゼをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピーを導入することで達成できる。
【００３６】
図１に示す通り、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（２−ＭＥ）は、ＭＥＰ化合物からリン酸基を除去することで製造され得る。２−ＭＥの生産は、ＤＸＲ酵素を過剰発現させることで実施できる。この過剰発現は、ＤＸＲポリペプチドをコードしている異種核酸、及び／又は（ｉｉ）ＤＸＲポリペプチドをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピーを導入することで実施できる。最終産物としての２−ＭＥの生産量を増加させるために、当業者は、系に含まれるホスファターゼ量を増量させることでＤＸＰ量を増量させ、２−ＭＥ生産量を増加させることができる。このような生産量の増加は、ホスファターゼをコードしている異種核酸及び／又は（ｉｉ）ホスファターゼをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピーを導入することで達成できる。
【００３７】
場合によっては、１−ＤＸ及び２−ＭＥをいずれも生産させることが望ましい。この場合、ＤＸＳ及びＤＸＲ酵素のいずれをも過剰発現させるべきである。１−ＤＸ及び２−ＭＥのいずれもの生産は、（ｉ）ＤＸＳ及び／又はＤＸＲポリペプチドをコードしている異種核酸及び／又は（ｉｉ）ＤＸＳ及び／又はＤＸＲポリペプチドをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピー、並びに所望により（ｉｉｉ）ホスファターゼをコードしている異種核酸及び／又は（ｉｉ）ホスファターゼをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピー、を含有している組み換え細胞を用いることで、実施できる。同様の操作を、モノアセチル化−２−Ｃ−メチルエリスリトール及び他の五炭糖の生産時にも同様に適用できる。
【００３８】
一部の例では、ＤＸＳ及び／又はＤＸＰの発現又は過剰発現と複合させて、他のＤＸＰ経路関連性酵素を過剰発現させて、五炭糖を生産させることもできる。ＤＸＰ経路関連性酵素について、以降に詳述する。使用することのできるこのようなＤＸＰは、ＩｓｐＧ又はＨＤＳである。
【００３９】
ＩｓｐＧ酵素及び系
ＩｓｐＧ酵素は、ＤＸＰ経路の下流で経路に参加する。ＩｓｐＧ遺伝子は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェート（ＭＥ−ＣＰＰ又はｃＭＥＰＰ）を（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イル−ジホスフェート（ＨＭＢＰＰ又はＨＤＭＡＰＰ）へと変換するＨＤＳポリペプチドをコードする。
【００４０】
ＩｓｐＧ活性を増加させるにあたって、大腸菌（E. coli）に内在するＩｓｐＧ系の発現量を増加させるという選択肢がある。本開示の系、組み換え細胞の組成、及び方法は、ＩｓｐＧ活性ひいてはそれに続く五炭糖の生産を増大させる際に、２種類のＩｓｐＧ遺伝子を過剰発現させるという異なるアプローチを利用するものである。一態様では、２種類のＩｓｐＧは大腸菌（E. coli）及びＴ．エロンガタス（T. elongatus）ＩｓｐＧ系である。
【００４１】
大腸菌（E. coli）ＩｓｐＧ系としては、限定するものではないが、酵素ＩｓｐＧ（ｉｓｐＧ遺伝子によりコード）、及び必須のフラボドキシン酸化還元パートナーのＦｌｄＡ（ｆｌｄＡ遺伝子によりコード）が挙げられる。
【００４２】
Ｔ．エロンガタス（T. elongatus）ＩｓｐＧ系としては、限定するものではないが、酵素ＩｓｐＧ（ｇｃｐＥ遺伝子によりコード）、及び必須のフェレドキシン酸化還元パートナーのＦｄ（ｐｅｔＦ遺伝子によりコード）、並びに非必須のフェレドキシン−ＮＡＤＰ（＋）酸化還元酵素の酸化還元パートナーＦｐｒ（ｐｅｔＨ遺伝子によりコード）が挙げられる。
【００４３】
一部の例において、Ｔ．エロンガタス（T. elongatus）ＩｓｐＧの活性がＦｄ補因子によるものであることが判明している場合、Ｆｐｒ活性は、大腸菌（E. coli）内でＴ．エロンガタス（T. elongatus）ＩｓｐＧを機能させるのに必須ではない。大腸菌（E. coli）のｆｐｒ遺伝子は非必須であり、大腸菌（E. coli）内でのＴ．エロンガタス（T. elongatus）ＩｓｐＧ活性は、Ｔ．エロンガタス（T. elongatus）Ｆｄの同時発現に依存する。
【００４４】
理論に束縛されるものではないが、大腸菌（E. coli）ＩｓｐＧ系及びＴ．エロンガタス（T. elongatus）ＩｓｐＧ系は、最終的に触媒として機能するのに必要とされる電子を、一部のフラボドキシン／フェレドキシン−ＮＡＤＰ（＋）酸化還元酵素の活性により、ＮＡＤＰＨから得るものと考えられる。フラボドキシン／フェレドキシン−ＮＡＤＰ（＋）酸化還元酵素活性を有する酵素は、ＩｓｐＧ活性に必須であるフラボドキシン及びフェレドキシンの補因子に必要とされる電子伝達に関し機能することがインビトロで実証されているものの、これらの還元酵素のインビボでの生理学的な関連性は示されていないことから、予測不能である。
【００４５】
代表的なポリペプチド及び核酸
上記の通り、本発明の組み換え細胞及び子孫細胞は、ＤＸＳ及び／又はＤＸＲポリペプチドをコードしている一種以上の異種核酸、並びに／あるいはＤＸＳ及び／又はＤＸＲポリペプチドをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピー、を有するよう設計する。一態様では、組み換え細胞には、１種類のＩｓｐＧ酵素又は２種類のＩｓｐＧ酵素、及び１種以上のＤＸＰ経路に含まれるポリペプチドを含有させることができる。一部の態様では、細胞には、鉄−硫黄クラスタ相互作用を行う各種酸化還元ポリペプチド及び核酸、ＤＸＰ経路関連性ポリペプチド、ＭＶＡ経路に含まれるポリペプチド及び核酸、ＰＧＬポリペプチド及び核酸、並びにＩＤＩポリペプチド及び核酸を更に含有させることができる。
【００４６】
ポリペプチドには、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド断片、及び融合ポリペプチドが含まれる。一部の態様では、融合ポリペプチドは、第１ポリペプチド（例えば、鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチド、ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチド、ＤＸＰ経路関連性ポリペプチド、及びＩＤＩポリペプチド、又はこれらの触媒活性を有する断片）の一部又はすべてと、所望により、第２ポリペプチド（例えば、融合ポリペプチドの精製又は検出を促進する、Ｈｉｓタグなどのペプチド）の一部又はすべてを含有する。一部の態様では、融合ポリペプチドは、ＤＸＰに関与するポリペプチドに関係する２つ以上の活性を有する。
【００４７】
特定の態様では、核酸は、鉄−硫黄クラスタ相互作用を行う酸化還元に関係する任意の核酸、ＩｓｐＧ、ＤＸＰ経路核酸、ＤＸＰ経路に含まれる核酸又はＩＤＩ核酸の核酸配列の断片又はすべてを含有する。一部の態様では、この核酸は、鉄−硫黄クラスタ相互作用を行う酸化還元核酸、ＩｓｐＧ、ＤＸＰ経路に含まれる核酸、ＤＸＰ経路関連性核酸、又はＩＤＩ核酸に由来しかつ少なくとも約５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、又は８００以上が隣接する、ヌクレオチドを含有する。一部の態様では、核酸は、ＩｓｐＧ、鉄−硫黄クラスタ相互作用を行う酸化還元に関与する核酸、ＤＸＰ経路に含まれる核酸、ＤＸＰ経路関連性核酸、又はＩＤＩ核酸の野生型配列（すなわち、天然に生じる配列）に対して１つ以上の変異を有する。一部の態様では、核酸は、ＩｓｐＧ、鉄−硫黄クラスタ相互作用を行う酸化還元核酸、ＤＸＰ経路に含まれる核酸、ＤＸＰ経路関連性核酸、又はＩＤＩ核酸の転写又は翻訳を増大させる変異（例えば、サイレント変異）を１つ以上有する。一部の態様では、核酸は、鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチド、ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチド、ＤＸＰ経路関連性ポリペプチド、又はＩＤＩポリペプチドのいずれかをコードしている核酸の縮重変異体（degenerate valiant）である。
【００４８】
ＤＸＰ経路に含まれる代表的なポリペプチド及び核酸の登録番号は、国際公開第２００９／０７６６７６号の添付書類１に掲載される。
【００４９】
代表的な鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチド及び核酸
鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチドは、イソプレノイド生合成に関係するＤＸＰ経路で重要な役割を果たす。鉄−硫黄クラスタ相互作用を行う代表的な酸化還元ポリペプチドとしては、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチドが示す活性を少なくとも１つ有する融合ポリペプチド、が挙げられる。ポリペプチドが、鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチド活性を有するかどうかは、メトロニダゾール［１−（２−ヒドロキシエチル）−２−メチル−５−ニトロイミダゾール］の還元速度を測定するヒドロゲナーゼ結合アッセイを用いる標準法を使用して、判断することができる（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，９３：２１６〜２２２（１９７９））。
【００５０】
鉄−硫黄クラスタ相互作用を行う代表的な酸化還元に関係するポリペプチドの核酸は、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチドに関係する活性を少なくとも１つ有する融合ポリペプチド、をコードしている核酸を含有している。鉄−硫黄クラスタ相互作用を行う代表的な酸化還元ポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載の任意の生物資源から自然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【００５１】
鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチドは、鉄−硫黄クラスターを含有しているポリペプチドに電子を伝達し得るポリペプチドである。鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチドとしては、限定するものではないが、フラボドキシン（例えば、フラボドキシンＩ）、フラボドキシン還元酵素、フェレドキシン（例えば、フェレドキシンＩ）、フェレドキシン−ＮＡＤＰ＋酸化還元酵素、及びこれらをコードしている遺伝子又はポリペプチド（例えば、ｆｐｒ又はｆｌｄＡ）が挙げられる。例えば、ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチドＨＤＳ（ＧｃｐＥ）は、［４Ｆｅ−４Ｓ］２＋中心を保持する金属酵素であり、フラボドキシン／フラボドキシン還元酵素の存在下で、［４Ｆｅ−４Ｓ］２＋中心の還元により、２段階の連続的な１電子伝達を介在し、ｃＭＥＰＰのＨＭＢＰＰへの還元を触媒する（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５４１：１１５〜１２０（２００３）を参照されたい）。同様にして、ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチドＨＤＲ（ＬｙｔＢ）も、フラボドキシン／フラボドキシン還元酵素／ＮＡＤＰＨ系の存在下で、２段階の連続的な１電子伝達を介在し、ＨＭＢＰＰのＩＰＰ又はＤＭＡＰＰへの還元を触媒するＦｅ／Ｓタンパク質である。例えば、Ｓｅｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４１：４３３７〜４３３９（２００２）；Ｗｏｌｆｆ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５４１：１１５〜１２０（２００３））を参照されたい。
【００５２】
フラボドキシンは電子伝達能を有するタンパク質であり、補欠分子族のフラビンモノヌクレオチドを含有している。エシェリキア・コライ（大腸菌）においては、フラボドキシンはｆｌｄＡ遺伝子によりコードされており、ＦＡＤ含有タンパク質のＮＡＤＰＨ：フェレドキシン酸化還元酵素により還元を受け、イソプレノイド生合成に関し、ＤＸＰ経路において重要な役割を果たす（例えば、Ｋｉａ−Ｊｏｏ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５７９：３８０２〜３８０６，２００５を参照されたい）。
【００５３】
フェレドキシンは電子伝達能を有し、鉄及び不安定な硫黄を等量ずつ含有するタンパク質であり、イソプレノイド生合成に関し、ＤＸＰ経路において重要な役割を果たす。例えば、植物及びラン藻由来のＨＤＳは、フラボドキシン依存性の酵素よりもフェレドキシンを示す（Ｓｅｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，５８０（６）：１５４７〜５２（２００６））。
【００５４】
Ｆｐｒは、フラボドキシン／フェレドキシンＮＡＤＰＨ−酸化還元酵素をコードしており、ＦｌｄＡによりＮＡＤＰＨからＨＤＳ及びＨＤＲへと必須電子を伝達して、触媒として機能する（２００６年２月１３日に発行された、Ｌ．Ａ．Ｆｕｒｇｅｒｓｏｎ，Ｔｈｅ  Ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｔｏ  Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓによる報告において確認される）。
【００５５】
ＤＸＰ経路に含まれる代表的なポリペプチド及び核酸
ＤＸＰ経路に含まれる代表的なポリペプチドとしては、限定するものではないが、次の任意のポリペプチド：ＤＸＳポリペプチド、ＤＸＲポリペプチド、ＭＣＴポリペプチド、ＣＭＫポリペプチド、ＭＣＳポリペプチド、ＨＤＳポリペプチド、ＨＤＲポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＤＸＰ経路のポリペプチドに関係する活性を１つ、又は２つ以上有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）、が挙げられる。特に、ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチドとしては、ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが挙げられる。ＤＸＰ経路に含まれる代表的な核酸としては、ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。ＤＸＰ経路に含まれる代表的なポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。一部の態様では、ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチドをコードしている異種核酸は、常時発現型プロモーターに制御可能なように連結される。一部の態様では、ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチドをコードしている異種核酸は、強力なプロモーターに制御可能なように連結される。
【００５６】
特に、ＤＸＳポリペプチドは、ピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド３−ホスフェートを１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−ホスフェート（ＤＸＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−ホスフェートを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【００５７】
ＤＸＲポリペプチドは、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−ホスフェート（ＤＸＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−ホスフェート（ＭＥＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＤＸＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＲポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【００５８】
ＭＣＴポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−ホスフェート（ＭＥＰ）を４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＭＥＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＭＣＴポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【００５９】
ＣＭＫポリペプチドは、４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）を２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＣＤＰ−ＭＥを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＣＭＫポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【００６０】
ＭＣＳポリペプチドは、２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェート（ＭＥ−ＣＰＰ又はｃＭＥＰＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＣＤＰ−ＭＥＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＭＣＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【００６１】
ＨＤＳポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェートを（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イルジホスフェート（ＨＭＢＰＰ又はＨＤＭＡＰＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＭＥ−ＣＰＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＨＤＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【００６２】
ＨＤＲポリペプチドは、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イルジホスフェートをイソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）及びジメチルアリルジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）ヘと変換する。一実施形態では、ＨＤＲポリペプチドをコードするのにｉｓｐＨ遺伝子を使用することができる。ＩｓｐＨは、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−ジホスフェート還元酵素、４Ｆｅ−４Ｓタンパク質、ＥＣＫ００３０、ＪＷ００２７、ｌｙｔＢ、ｙａａＥ、及びｂ００２９としても知られている。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＨＭＢＰＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＨＤＲポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【００６３】
ＩＤＩポリペプチドは、イソペンテニルジホスフェートをジメチルアリルジホスフェートへと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがイソペンテニルジホスフェートを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＩＤＩポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【００６４】
ＭＶＡ経路に含まれる代表的なポリペプチド及び核酸
本発明の一部の態様では、本明細書に記載の組成物又は方法のいずれかに関し記載する細胞には、ＭＶＡ経路に含まれるポリペプチドをコードしている核酸も含有させることができる。一部の態様では、ＭＶＡ経路に含まれるポリペプチドは内在性ポリペプチドである。一部の態様では、ＭＶＡ経路に含まれるポリペプチドは異種ポリペプチドである。一部の態様では、細胞は、ＭＶＡ経路に含まれるポリペプチドをコードしているその他の異種核酸のコピーを１つ以上含む。一部の態様では、細胞は、ＭＶＡ経路に含まれるポリペプチドをコードしている内在性核酸のコピーを更に１つ以上含む。一部の態様では、ＭＶＡ経路に含まれるポリペプチドをコードしている内在性核酸は、常時発現型プロモータに制御可能なように連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路に含まれるポリペプチドをコードしている内在性核酸は、常時発現型プロモータに制御可能なように連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路に含まれるポリペプチドをコードしている内在性核酸は、強力なプロモーターに制御可能なように連結される。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比べ、内在性ＭＶＡ経路に含まれるポリペプチドが過剰発現するよう設計する。
【００６５】
一部の態様では、ＭＶＡ経路に含まれるポリペプチドは異種ポリペプチドである。一部の態様では、細胞は、ＭＶＡ経路に含まれるポリペプチドをコードしている異種核酸のコピーを１つ以上含む。一部の態様では、ＭＶＡ経路に含まれるポリペプチドをコードしている異種核酸は、常時発現型プロモーターに制御可能なように連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路に含まれるポリペプチドをコードしている異種核酸は、強力なプロモーターに制御可能なように連結される。
【００６６】
ＭＶＡ経路に含まれる代表的なポリペプチドとしては、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）ポリペプチド、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチド、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）ポリペプチド、イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）ポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＭＶＡ経路ポリペプチドの活性を２つ以上有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）が挙げられる。特に、ＭＶＡ経路ポリペプチドとしては、ＭＶＡ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが挙げられる。ＭＶＡ経路に含まれる代表的な核酸としては、ＭＶＡ経路に含まれるポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。ＭＶＡ経路に含まれる代表的なポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。更に、五炭糖の生産を増加させるようなＭＶＡ経路に含まれるポリペプチド変異体も、良好に使用することができる。
【００６７】
使用することのできる、ＭＶＡ経路に含まれるポリペプチド及び／又はＤＸＰ経路に含まれるポリペプチドの種類、並びにＭＶＡ経路に含まれるポリペプチド及び／又はＤＸＰ経路に含まれるポリペプチドをコードしている微生物（例えば、大腸菌（E. coli））の作成方法は、国際公開第２００９／０７６６７６号及び同第２０１０／００３００７号にも記載される。
【００６８】
当業者であれば、任意のＤＸＰ経路に含まれるポリペプチド（ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＨＤＳ又はＩｓｐＧなど）、ＰＧＬポリペプチド、及び／又はＭＶＡ経路に含まれるポリペプチドの発現を最適化する好適なプロモータを容易に選択し、及び／又は使用することができる。同様にして、当業者は、これらのポリペプチドの発現を最適化する好適なベクター（すなわち、輸送ビヒクル）を容易に選択し及び／又は使用することができる。一部の態様では、ベクターは選択マーカーを含有する。選択マーカーの例としては、これらに限定されるものではないが、抗生物質耐性核酸（例えば、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、フェロマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン又はクロラムフェニコール）、及び／又は宿主細胞に栄養的な利点などの代謝的な利点を与える核酸が挙げられる。
【００６９】
一部の態様では、ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチド（ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＨＤＳ又はＩｓｐＧなど）、ＰＧＬポリペプチド、又はＭＶＡ経路に含まれるポリペプチドのいずれかをコードしている核酸を細胞染色体に組み込むものの、選択マーカーは組み込まない。当業者であれば、組み込みは宿主生物にとって機能上必須ではない位置に行うべきであることを認識するであろう。例えば、バクテリア細胞（例えば、大腸菌（E. coli）細胞）では、複製起点（又は染色体に含まれる何らかのその他の必須領域）に組み込みを行うことで、バクテリアの増殖が不能になる可能性がある。したがって、宿主生物の染色体中の必須領域に組み込みが生じないよう注意すべきである。
【００７０】
代表的な生物資源
ＤＸＰ経路に含まれる核酸、ＰＧＬ核酸、鉄−硫黄クラスタ相互作用を行う酸化還元核酸、ＤＸＰ経路関連性核酸、又はＩＤＩ核酸（及びこれらの核酸によりコードされているポリペプチド）は、これらの核酸を天然に含有している任意の生物から得ることができる。したがって、ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＭＣＴ、ＣＭＫ、ＭＣＳ、ＨＤＳ（ＩｓｐＧ）、又はＨＤＲ核酸は、例えば、ＤＸＰ経路を含有している、又はＭＶＡ経路及びＤＸＰ経路をいずれも含有している、任意の生物から得ることができる。ＩＤＩ及びＰＧＬ核酸は、例えば、ＭＶＡ経路、ＤＸＰ経路、又はＭＶＡとＤＸＰ経路の両方を含有する任意の生物から得ることができる。
【００７１】
一部の態様では、鉄−硫黄クラスタ相互作用を行う酸化還元核酸、ＤＸＰ経路に含まれる核酸、ＤＸＰ経路関連性核酸、又はＩＤＩ核酸の核酸配列は、以降の任意の生物により天然において生産される核酸配列と同一である。一部の態様では、鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチド、ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチド、ＤＸＰ経路関連性ポリペプチド、又はＩＤＩポリペプチドのアミノ酸配列は、以降の任意の生物により天然において生産される核酸配列と同一である。一部の態様では、鉄−硫黄クラスタ相互作用を行う酸化還元核酸、ＤＸＰ経路に含まれる核酸、ＤＸＰ経路関連性核酸、又はＩＤＩ核酸、又はこれらの核酸によりコードされるポリペプチドは、本明細書に記載の任意の生物から誘導される変異核酸又はポリペプチドである。本明細書で使用するとき、「から誘導される」は、核酸又はポリペプチド源に１つ以上の変異が導入されることを意味する。例えば、「植物ポリペプチドから誘導された」ポリペプチドは、対象とするポリペプチドが、野生型植物のポリペプチド配列（すなわち、天然に生じる配列）に１つ以上の変異を導入することで得られたポリペプチドであることを意味する。
【００７２】
一部の態様では、生物資源は真菌であり、例えば、Ａ．オリゼ（A. oryzae）及びＡ．ニガー（A. niger）などのアスペルギルス（Aspergillus）属、Ｓ．セレビシエ（S. Cerevisiae）などのサッカロミセス（Saccharomyces）属、Ｓ．ポンベ（S. pombe）などのシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、並びにＴ．リーゼイ（T. reesei）などのトリコデルマ（Trichoderma）属である。一部の態様では、生物資源は糸状真菌細胞である。用語「糸状菌」は、真菌のうち糸状形態をとるものすべてを指す（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．（１９６２），Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。これらの真菌は、キチン、セルロース、及びその他の複合多糖からなる細胞壁を有する栄養菌糸を示すことを特徴とする。糸状菌は、酵母とは、形態学的に、生理学的に、及び遺伝学的に異なる。糸状菌の栄養生長は菌糸の伸展によるものであり、炭素の異化は絶対好気性である。親細胞が糸状菌である場合、細胞は、限定するものではないが、トリコデルマ（Trichoderma）属（例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、これまでＴ．ロンギブラキアタム（T. longibrachiatum）として分類されていたヒポクレア・ジェコリナ（Hypocrea jecorina）の無性形態、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum））（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：４６〜５３，１９８４；ＡＴＣＣ番号５６７６５及びＡＴＣＣ番号２６９２１）、ペニシリウム（Penicillium）属、ヒュミコラ種（Humicola sp.）（例えば、Ｈ．インソレンス（H. insolens）、Ｈ．ラヌギノス（H. lanuginose）、又はＨ．グリセア（H. grisea））、クリソスポリウム属（Chrysosporium sp.）（例えば、Ｃ．ラックノウエンス（C. lucknowense））、グリオクラジウム属（Gliocladium sp.）、アスペルギルス（Aspergillus）属（例えば、Ａ．オリゼ（A. oryzae）、Ａ．ニガー（A. niger）Ａ．ソーヤ（A. sojae）、Ａ．ジャポニクス（A. japonicus）、Ａ．ニデュランス（A. nidulans）、又はアワモリコウジカビ（A. awamori））（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：７３８０７４３，１９９３  ａｎｄ  Ｇｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ  ４１：８９〜９８，２００２）、フザリウム（Fusarium）属（例えば、Ｆ．ロゼウム（F. roseum）、Ｆ．グラミニウム（F. graminum）、Ｆ．セレアリス（F. cerealis）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporuim）、又はＦ．ベネナタム（F. venenatum））、ニューロスポラ（Neurospora）属（例えば、Ｎ．クラッサ（N. crassa）、ヒポクレア属（Hypocrea sp.）、ムコール（Mucor）属（例えば、Ｍ．ミエヘイ（M. miehei））、リゾプス（Rhizopus）属及びエメリセラ（Emericella）属（同様に、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．２２８：２１〜２６，１９８５を参照されたい）に属する。用語「トリコデルマ」又は「トリコデルマ属」又は「トリコデルマｓｐｐ．」は、従来又は現在リコデルマとして分類されている任意の真菌属を指す。
【００７３】
一部の態様では、真菌は、Ａ．ニデュランス（A. nidulans）、アワモリコウジカビ（A. awamori）、Ａ．オリゼ（A. oryzae）、Ａ．アクレタス（A. aculeatus）、Ａ．ニガー（A. niger）、Ａ．ジャポニクス（A. japonicus）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）、Ｔ．ビリデ（T. viride）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）、又はＦ．ソラニ（F. solani）である。アスペルギルス（Aspergillus）株については、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：７３８〜７４３，１９９３  ａｎｄ  Ｇｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  ４１：８９〜９８，２００２に記載されている。特定の態様では、真菌はＴ．リーゼイ（T. reesei）などのトリコデルマ（Trichoderma）株である。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）株は、公知のものであり、非限定的な例としては、ＡＴＣＣ番号１３６３１、ＡＴＣＣ番号２６９２１、ＡＴＣＣ番号５６７６４、ＡＴＣＣ番号５６７６５、ＡＴＣＣ番号５６７６７、及びＮＲＲＬ  １５７０９が挙げられる。一部の態様では、宿主株は、ＲＬ−Ｐ３７の誘導体である。ＲＬ−Ｐ３７については、Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：４６〜５３，１９８４に記載されている。
【００７４】
一部の態様では、生物資源は酵母であり、例えば、サッカロミケス（Saccharomyces）属、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、ピキア（Pichia）属、又はカンジダ（Candida）属である。
【００７５】
一部の態様では、生物資源は、例えば、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）又は枯草菌（B. subtilis）などのバチルス（Bacillus）株、Ｐ．シトレア（P. citrea）などのパントエア（Pantoea）株、Ｐ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）などのシュードモナス（Pseudomonas）株、Ｓ．リビダンス（S. lividans）又はＳ．ルビギノーサス（S. rubiginosus）などのストレプトミセス（Streptomyces）株、Ｔ．エロンガタス（T. elongatus）などのサーモシネココッカス（Thermosynechococcus）株、Ｓ．メリロティ（S. meliloti）などのシノリゾビウム（Sinorhizobium）株、Ｈ．ピロリ（H. pylori）などのヘリコバクター（Helicobacter）株、Ａ．トゥメファシエンス（A. tumefaciens）などのアグロバクテリウム（Agrobacterium）株、Ｄ．ラジオデュランス（D. radiodurans）などのデイノコッカス（Deinococcus）株、Ｌ．モノサイトゲネス（L. monocytogenes）などのリステリア（Listeria）株、Ｌ．ｓｐｐ．などのラクトバチルス（Lactobacillus）株、又は大腸菌（E. coli）などのエシュリキアEscherichia株などといったバクテリアである。
【００７６】
本明細書で使用するとき、「バチルス」（Bacillus）属としては、当業者に既知の「バチルス（Bacillus）属」のすべての種を包含し、限定するものではないが、例えば、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレービス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロデュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアグランス（B. coagulans）、Ｂ．サークランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、及び卒倒病菌（B. thuringiensis）が挙げられる。バチルス属は分類上の再編成を受け続けるものと認識される。したがって、属には、これまでに再分類された種、限定するものではないが、現在では「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）」と命名されているＢ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）などの生物を包含するものと意図される。酸素存在下での、耐久性の高い内生胞子の形成は、バチルス（Bacillus）属を定義する特性であると考慮されるものの、この特性は、現在、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）、アムピバチルス（Amphibacillus）、アネウリニバチルス（Aneurinibacillus）、アノキシバチルス（Anoxybacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、フィロバチルス（Filobacillus）、グラシリバチルス（Gracilibacillus）、ハロバチルス（Halobacillus）、パエニバチルス（Paenibacillus）、サリバチルス（Salibacillus）、サーモバチルス（Thermobacillus）、ウレイバチルス（Ureibacillus）、及びバルジバチルス（Virgibacillus）と命名されている属にも当てはまる。
【００７７】
一部の態様では、生物資源はグラム陽性細菌である。非限定的な例としては、ストレプトミセス（Streptomyces）株（例えば、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）、又はＳ．グリセウス（S. griseus））、バチルス（Bacillus）株、リステリア（Listeria）株（例えば、Ｌ．モノサイトゲネス（L. monocytogenes））又はラクトバチルス（Lactobacillus）株（例えば、Ｌ．ｓｐｐ）が挙げられる。一部の態様では、生物資源は、大腸菌（E. coli）、シュードモナス（Pseudomonas）属、又はＨ．ピロリ（H. pylori）などのグラム陰性細菌である。  一部の態様では、生物資源は植物であり、例えば、マメ科（Fabaceae）、例えばマメ亜科（Faboideae）などの植物である。一部の態様では、生物資源は葛、ポプラ（ウラジロハコヤナギｘトレムラＣＡＣ３５６９６）、アスペン（ヤマナラシなど）、クエルクス・ロブール（Quercus robur）、シロイヌナズナ属（シロイヌナズナ（A. thaliana））、又はトウモロコシ属（トウモロコシなど）である。
【００７８】
一部の態様では、生物資源は、藻類、例えば緑藻、紅藻、灰色藻、クロララクニオン藻、ミドリムシ目、クロミスタ、又は渦鞭毛藻類である。
【００７９】
一部の態様では、生物資源は、形態に基づき次の群：クロオコッカス、プレウロカプサ、ユレモ、ネンジュモ、又はスティゴネマのいずれかに分類される、ラン藻である。一部の態様では、ラン藻はサーモシネココッカス・エロンガタス（Thermosynechococcus elongatus）である。
【００８０】
代表的な宿主細胞
鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチド、ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチド（例えば、ＤＸＳ、ＤＸＲ、及び／又はＩｓｐＧ）、ＤＸＰ経路関連性ポリペプチド、ＭＶＡ経路に含まれるポリペプチド、ＭＶＡ経路関連性ポリペプチド、ＰＧＬポリペプチド又はＩＤＩポリペプチドを発現させ、本開示の方法で五炭糖を生産するにあたって各種宿主細胞を使用できる。代表的な宿主細胞としては、「代表的な生物資源」の見出しで前項において列記した生物のいずれかに由来する細胞が挙げられる。宿主細胞は、イソプレンを自然に生成する細胞であっても、イソプレンを自然には生成しない細胞であってもよい。一部の態様では、宿主細胞は、ＤＸＰ経路により天然に五炭糖を生産する細胞であり、ＤＸＰ経路に含まれる１種以上のポリペプチド、及び鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチドを加えることで、この経路による五炭糖の生産性が向上する。一部の態様では、宿主細胞は、ＤＸＰ経路により天然に五炭糖を生産する細胞であり、ＤＸＰ経路に含まれる１種以上のポリペプチド、鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチド、及びＩＤＩを加えることで、この経路による五炭糖の生産性が向上する。
【００８１】
代表的な形質転換方法
当該技術分野で一般的に知られている標準法により、ＩｓｐＧ核酸、鉄−硫黄クラスタ相互作用を行う酸化還元核酸、ＤＸＰ経路に含まれる核酸、ＤＸＰ経路関連性核酸、又はＩＤＩ核酸、あるいはこれらを含有しているベクターを、宿主細胞（例えば、本明細書に記載の大腸菌（E. coli）細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、又は微生物細胞）に挿入することができる。導入された核酸は、染色体ＤＮＡに組み込まれるか（上記の通り）、染色体外の複製配列として維持され得る。
【００８２】
代表的な細胞培養培地及び培養条件
本発明は、五炭糖を生産する細胞又は細胞集団を培養液中に含有する。「培養液中の細胞」とは、細胞が１回以上の細胞分裂を行うことのできる溶液（例えば細胞培地）中に、２つ以上の細胞が含まれていることを意味する。「培養液中の細胞」には、植物組織に分化した細胞を有する生きた多細胞植物の一部をなす植物細胞は含まれない。様々な態様では、細胞培養は、少なくとも、又は約１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００、若しくはこれよりも多い細胞を含む。
【００８３】
宿主細胞を培養するにあたり使用することができる炭素源は、国際公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、同第２００９／１３２２２０号に記載のものである。一態様では、本発明の組み換え細胞は、次の試薬を用い、１５Ｌスケールのフェドバッチ培養で増殖させることができる。
【００８４】
培地組成（発酵培地１Ｌあたり）：
Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、５０％  Ｈ２ＳＯ４（２．２５ｍＬ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を熱滅菌した（１２３℃、２０分）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、容量にメスアップした。滅菌及びｐＨ調整後に、グルコース１０ｇ、ビタミン溶液１２ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
【００８５】
１０００Ｘ微量金属溶液（１Ｌあたり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を容量までメスアップし、孔径０．２２マイクロメートルのフィルタでろ過滅菌した。
【００８６】
ビタミン溶液（１Ｌあたり）：
チアミン塩酸塩（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、Ｄ−パントテン酸（４．８ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を容量までメスアップし、孔径０．２２マイクロメートルのフィルタでろ過滅菌した。
【００８７】
マクロ塩溶液（１Ｌあたり）：
ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、容量までメスアップし、孔径０．２２マイクロメートルのフィルタでろ過滅菌した。
【００８８】
供給溶液（１ｋｇあたり）：
グルコース（０．５７ｋｇ）、脱イオン水（０．３８ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、１００％  Ｆｏａｍｂｌａｓｔ（１０ｇ）。すべての成分を共に混合し、オートクレーブ処理した。１０００Ｘ微量金属溶液（０．８２ｍＬ）、ビタミン溶液（６．５ｍＬ）及びマクロ塩溶液（５．５ｍＬ）を加え、一度供給溶液を冷却した。
【００８９】
本発明の組み換え細胞を培養するのに使用することのできる他の方法も、実施例の節に記載する。細菌培地の維持及び増殖に適した材料及び方法は、当該技術分野では周知のものである。代表的な手法は、国際公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、及び同第２００９／１３２２２０号、並びにＭａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）又はＢｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．に見ることができる。一部の態様では、宿主細胞に挿入した核酸にコードされているＤＸＰ経路に含まれるポリペプチド（例えば、ＤＸＳ、ＤＸＲ、及び／又はＩｓｐＧ）、鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチド、ＤＸＰ経路関連性ポリペプチド、又はＩＤＩポリペプチドの発現条件下で、培養培地中で細胞を培養する。
【００９０】
細胞増殖に伴い生産される五炭糖の代表的な脱共役方法
本発明の組み換え細胞は、細胞増殖に伴い生産される五炭糖を脱共役させるような手法で増殖させることができる。原料を使用する際、原料由来の炭素が、細胞の増殖及び維持よりも五炭糖への変換に使用されることが望ましい。一部の態様では、低〜中ＯＤ６００に細胞を増殖させ、次に五炭糖の生産を開始させるか、増量させるかする。このストラテジーにより、炭素の大部分を五炭糖へと変換させることができる。当業者は、国際公開第２０１０／００３００７号に記載の教示に従い、本発明の組み換え細胞を増殖させることができる。
【００９１】
一部の態様では、五炭糖は静止期でのみ生産される。一部の態様では、五炭糖は増殖期と静止期の両方で生産される。一部の態様では、五炭糖は増殖期でのみ生産される。一部の態様では、本明細書に記載の各種酵素及びポリペプチドをコードしている核酸を、プロモータ、あるいは増殖期よりも静止期でより活性になる要素の制御下に置く。例えば、１つ以上の鉄−硫黄クラスタ相互作用を行う酸化還元に関与する核酸、ＤＸＰ経路に含まれる核酸、ＤＸＰ経路関連性核酸、及び／又はＩＤＩ核酸を、ＲｐｏＳなどの静止期のσ因子の制御下に置くこともできる。一部の態様では、１つ以上の鉄−硫黄クラスタ相互作用を行う酸化還元に関与する核酸、ＤＸＰ経路に含まれる核酸、ＤＸＰ経路関連性核酸、及び／又はＩＤＩ核酸を、静止期に誘導可能なプロモータ、例えば、静止期に制御因子による活性化に応答して誘導可能になるプロモータなどの、制御下に置く。
【００９２】
五炭糖の生産例
本発明は、特に、組み換え細胞による五炭糖の生産量を増加させるための組成物及び方法を提供し、（ｉ）ＤＸＳ及び／又はＤＸＲポリペプチドをコードしている異種核酸、及び／又は（ｉｉ）ＤＸＳ及び／又はＤＸＲポリペプチドをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピー、所望により、（ｉｉｉ）ホスファターゼをコードしている異種核酸、及び／又は（ｉｉ）ホスファターゼをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピー、を提供する。一態様では、１種類のＩｓｐＧ酵素又は２種類のＩｓｐＧ酵素、１種類以上のＤＸＰ経路関連性酵素（例えば、ＤＸＳ及び／又はＤＸＲ）を含み、所望により、鉄−硫黄クラスタ相互作用酸化還元に関係する遺伝子又はポリペプチド、ＰＧＬ遺伝子及びポリペプチド、並びにＩＤＩ遺伝子及びポリペプチドも含む、培養細胞を使用できる。一部の態様では、組み換え細胞による五炭糖の累積生産力価（総量）は、約１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、又は３００ｇ／Ｌ発酵液以上である。一態様では、２−メチルエリスリトール（２−ＭＥ）は、約１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、又は３００ｇ／Ｌ発酵液以上生産される。他の態様では、１−デオキシキシルロース（１−ＤＸ）は、約１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、又は３００ｇ／Ｌ発酵液以上生産される。他の態様では、モノアセチル化−２−Ｃ−メチルエリスリトールは約１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、又は３００ｇ／Ｌ発酵液以上生産される。他の態様では、１−ＤＸ及び２−ＭＥは、約１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、又は３００ｇ／Ｌ発酵液以上生産される。他の態様では、１−ＤＸ及び２−モノアセチル化−２−Ｃ−メチルエリスリトールは、約１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０又は３００ｇ／Ｌ発酵液以上生産される。他の態様では、２−ＭＥ及び２−モノアセチル化−２−Ｃ−メチルエリスリトールは、約１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、又は３００ｇ／Ｌ発酵液以上生産される。他の態様では、１−ＤＸ、２−ＭＥ及びモノアセチル化−２−Ｃ−メチルエリスリトールは、約１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、又は３００ｇ／Ｌ発酵液以上生産される。
【００９３】
他の態様では、１−ＤＸ、２−ＭＥ、及び／又はモノアセチル化−２−Ｃ−メチルエリスリトールなどの五炭糖は、最大で１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、又は３００ｇ／Ｌ発酵液生産される。
【００９４】
他の態様では、１−ＤＸ、２−ＭＥ及び／又はモノアセチル化−２−Ｃ−メチルエリスリトールなどの五炭糖は、最小で１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、又は３００ｇ／Ｌ発酵液生産される。
【００９５】
各種五炭糖の測定は、当業者に知られている手法により、例えば、本明細書に例示されるＧＣ／ＭＳ、ＧＣ／ＦＩＤ、ＮＭＲ、及び／又はＨＰＬＣなどを用いるなどして、行うことができる。
【００９６】
本発明は、上記の任意の量で五炭糖（例えば、１−ＤＸ、２−ＭＥ、及び／又はモノアセチル化−２−Ｃ−メチルエリスリトール）を生産することのできる組み換え細胞の細胞培養も企図する。本明細書に記載の組み換え細胞を用いる五炭糖の生産系も本発明の範囲内のものであると企図される。このような系には、限定するものではないが、組み換え細胞、発酵ユニット、回収ツール及び／又は精製ツールが包含される。
【００９７】
代表的な精製方法
一部の態様では、本開示の任意の方法は、五炭糖の回収工程を更に包含する。放出気体ではイソプレンが大部分を占めるのとは対照的に、２−ＭＥ、１−ＤＸ、及びモノアセチル化−２−Ｃ−メチルエリスリトールなどの五炭糖は発酵液中に見られる。発酵液から生化学物質を回収する標準的な手法は、当業者に知られている。発酵液から２−ＭＥ、１−ＤＸ、及びモノアセチル化−２−Ｃ−メチルエリスリトールを回収する方法の非限定例も、以降に記載する。
【実施例】
【００９８】
実施例は単に例示目的のものであり、したがって、決して本発明を限定することを意図するものではなく、本発明の上記の態様及び態様を記載し、詳述する。別途記載のない限り、温度は摂氏で表わされ、圧力は大気圧と同等であるか、又はそれに近い。前述の実施例及び発明を実施するための形態は、実例として提供されるものであり、制限を意図するものではない。上記発明は一部の詳細において理解の明確化の目的のために例示及び実施例により説明したが、添付の請求項の趣旨又は範囲から逸脱することなくこれに一定の変更及び修正を加えることができることは、本発明の教示を考慮すれば当業者であれば容易に理解される。
【００９９】
実施例１：１−デオキシ−Ｄ−キシルロース（１−ＤＸ）及び２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（２−ＭＥ）を生成するＤＸＰ経路に関し遺伝子操作を施した株の構築
ＤＸＰ経路に改変を加えたＲＥＭ  Ｆ９＿１７の構築
構築時には、イソプレンを生産するＲＥＭ  Ｄ６＿１２親株は既に記載されている（米国特許出願第１２／８１７，１３４号、実施例２６を参照されたい）。ＲＥＭ  Ｄ６＿１２株は、染色体にコードされている、ＤＸＰ経路に関係する遺伝子ｄｘｓの発現性が高い株である。標準的な電気穿孔法（ＢＩＯ  ＲＡＤ）を用い、Ｐｔａｃ  Ａｎａｂａｅｎａ  ｉｓｐＨ  ａｓｐＡ  ｔｅｒｍ／ｐＥＷＬ４５４プラスミドをＲＥＭ  Ｄ６＿１２株に導入した。記載の電気穿孔法には、ＢＩＯ  ＲＡＤ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒシステム（０．１ｃｍキュベット、カタログ番号１６５−２０８９）を使用した。ＬＢ培地を用い、形質転換体を３７℃で１時間回復させた後、カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）、スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍＬ）及びカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有させたＬＢ寒天培地プレートへと播種した。得られた株をＲＥＭ  Ｆ９＿１７と命名した。
【０１００】
ＤＸＰ経路に改変を加えたＲＥＭ  Ｈ８＿１２の構築
ＤＸＰ経路の最初の２種の酵素（ＰＬ．６−ｄｘｓ及びＧＩ１．６−ｄｘｒをいずれも染色体にコードさせた）、ＤＸＰ経路の最後の酵素（ＧＩ１．６−ｙＩＤＩ、染色体にコードさせた）、ＤＸＰ経路に関与する遺伝子をコードしているその他のプラスミド（ＧＩ１．６−ｆｌｄＡ−ｉｓｐＧ／ｐＣＬ、ＰＴａｃ−Ａｎａｂａｅｎａ  ｉｓｐＨ  ａｓｐＡ  ｔｅｒｍ／ｐＥＷＬ４５４）、ＭＶＡ経路下流（ＰＬ．２−ｍＫＫＤｙＩ、ゲノム中に組み込んだ）、及びウラジロハコヤナギ由来のトランケート型イソプレン合成酵素（ｐＤＷ３３、プラスミドにコードさせた）、を過剰発現させた大腸菌ＢＬ２１株をもとに、ＲＥＭ  Ｈ８＿１２株（米国特許第１２／８１７，１３４号、実施例２９を参照されたい）を構築した。株には、染色体ｐｇｌ遺伝子（ｔ  ｙｂｇＳ：：ｆｒｔ）も復元させて含有させた。ＤＸＰ遺伝子の発現を支配しているプロモーターの強度を変更させた結果、ＲＥＭ  Ｈ８＿１２株では、ＲＥＭ  Ｆ９＿１７株と比較してＤＸＳ及びＤＸＲのいずれもの発現が上昇していた。前述のプロモーターにより駆動されたＤＸＳ及びＤＸＲの蓄積量の変化を、免疫ブロットにより確認した。
【０１０１】
ＤＸＰ経路に改変を加えたＲＥＭ  Ｆ２＿１８の構築
実験時までに報告（米国特許第１２／８１７，１３４号、実施例２９を参照されたい）されていた、イソプレン生産を行う親株ＲＥＭ  Ｉ７＿１１を使用して、ＲＥＭ  Ｆ２＿１８を生成した。ＲＥＭ  Ｉ７＿１１株は、ｆｌｄＡ及びｉｓｐＧをいずれもコードしているプラスミドを保有しており、ｆｌｄＡ及びｉｓｐＧの遺伝子座がＢＬ２１ゲノム内に存在しているのに加え、染色体にコードされている、ＤＸＰ経路に関係する遺伝子ｄｘｓ及びｄｘｒの発現が上昇している。電気穿孔法により、Ｐｔａｃ  Ａｎａｂａｅｎａ  ｉｓｐＨ−Ｔ  ｅｌｏｎｇ  ｉｓｐＧ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｓｐＡ  ｔｅｒｍ／ｐＥＷＬ４５４プラスミドを、ＲＥＭ  Ｉ７＿１１株に導入した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒシステムを用い、０．１ｃｍキュベットを使用して電気穿孔法を実施した（カタログ番号１６５−２０８９）。製造元の推奨するプロトコルに従い、形質転換を実施した。ＬＢ培地を用い、形質転換体を３７℃で１時間回復させた後、スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）、及びカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有させたＬＢ寒天培地プレートへと播種した。得られた株をＲＥＭ  Ｆ２＿１８と命名した。
【０１０２】
実施例２：１−デオキシ−Ｄ−キシルロース及び２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールを生産するＤＸＰ経路に関して遺伝子操作を施した株による発酵
ＲＥＭ  Ｆ９＿１７株の大規模発酵
ＤＸＰ経路に関係する遺伝子を発現している大腸菌（E. coli）株を１５Ｌスケールのフェドバッチ培養により増殖させ、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールを生産させた。次の培地組成を用いた：
培地組成（発酵培地１Ｌあたり）：
Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、５０％  Ｈ２ＳＯ４（２．２５ｍＬ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を熱滅菌した（１２３℃、２０分）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、容量を適量に調整した。滅菌及びｐＨ調整後に、グルコース１０ｇ、ビタミン溶液１２ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
【０１０３】
１０００Ｘ微量金属溶液（１Ｌあたり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を容量までメスアップし、孔径０．２２マイクロメートルのフィルタでろ過滅菌した。
【０１０４】
ビタミン溶液（１Ｌあたり）：
チアミン塩酸塩（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、Ｄ−パントテン酸（４．８ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を容量までメスアップし、孔径０．２２マイクロメートルのフィルタでろ過滅菌した。
【０１０５】
マクロ塩溶液（１Ｌあたり）：
ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸一水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、容量までメスアップし、孔径０．２２マイクロメートルのフィルタでろ過滅菌した。
【０１０６】
供給溶液（１ｋｇあたり）：
グルコース（０．５７ｋｇ）、脱イオン水（０．３８ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、１００％  Ｆｏａｍｂｌａｓｔ（１０ｇ）。すべての成分を共に混合し、オートクレーブ処理した。１０００Ｘ微量金属溶液（０．８２ｍＬ）、６．５ｍＬビタミン溶液、及び５．５ｍＬマクロ塩溶液を加え、一度供給溶液を冷却した。
【０１０７】
ＲＥＭＦ９＿１７株を用い１５Ｌのバイオリアクタで発酵を実施した。この発酵は２０１００７０３として参照する（図２を参照されたい）。ｐＨ  ７．０及び３４℃にてこの発酵を行った。大腸菌（E. coli）を凍結させたバイアル瓶から解凍し、バイオリアクタ用のトリプトン−酵母エキス培地に接種した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度が１．０になるまで培養物を増殖させた後、培養物のうち５００ｍＬを１５Ｌバイオリアクタに接種し、初期槽容量を５Ｌにメスアップした。発酵のもととなるフラスコ及び発酵槽には、抗生物質のカルベニシリン、スペクチノマイシン、及びカナマイシンをそれぞれ各５０ｕｇ／ｍＬ濃度で含有させた。
【０１０８】
バッチに含まれるグルコースが枯渇したら、グルコースの供給を開始した。最初の２０分は初期供給量３ｇ／ｍｉｎで供給した。その後、発酵槽にはグルコースのパルス供給を３０分間行った。ｐＨを７．０５超に上昇させてパルス供給を導入した。総二酸化炭素放出速度（ｍｍｏｌ／ｈ）を係数３００で除算することで、パルス周期を算出した。５０時間の発酵にわたって、パルス供給により達成されたグルコースの最高供給速度は、８．２ｇ／分であった。
【０１０９】
イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の１０ｍｇ／ｍＬ原液を添加することによって誘導を実施した。開始時点で３ｍＬを添加した（２５ｕＭ）。以降、二酸化炭素放出速度（ＣＥＲ）が２５ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ（３ｍＬ）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ（６ｍＬ）、及び１００ｍｍｏｌ／Ｌｈ（６ｍＬ）になった時点で更に添加した。有機酸カラムＨＰＬＣ定量法（以降に記載の方法を参照されたい）によりＭＥ力価を測定した。結果を図２に示す。
【０１１０】
ＲＥＭ  Ｈ８＿１２株の大規模発酵
ＤＸＰ経路に関係している遺伝子を発現している大腸菌（E. coli）株により、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールを生産させ、１５Ｌスケールでフェドバッチ培養を行い、増殖させた。次の培地組成を用いた：
培地組成（発酵培地１Ｌあたり）：
Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、１０００Ｘ微量金属溶液（１．５ｍＬ）、マクロ塩溶液（３．４ｍＬ）、５０％  Ｈ２Ｓ０４（２．２５ｍＬ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を熱滅菌した（１２３℃、２０分）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、容量を適量に調整した。滅菌及びｐＨ調整後に、グルコース１０ｇ、Ｍｅｒｃｕｒｙビタミン溶液１２ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
【０１１１】
１０００Ｘ微量金属溶液（１Ｌあたり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を容量までメスアップし、孔径０．２２マイクロメートルのフィルタでろ過滅菌した。
【０１１２】
ビタミン溶液（１Ｌあたり）：
チアミン塩酸塩（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、Ｄ−パントテン酸（４．８ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を容量までメスアップし、孔径０．２２マイクロメートルのフィルタでろ過滅菌した。
【０１１３】
マクロ塩溶液（１Ｌあたり）：
ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸一水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、容量までメスアップし、孔径０．２２マイクロメートルのフィルタでろ過滅菌した。
【０１１４】
供給溶液（１ｋｇあたり）：
グルコース（０．５７ｋｇ）、脱イオン水（０．３８ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、及び１００％  Ｆｏａｍｂｌａｓｔ（１０ｇ）。すべての成分を共に混合し、オートクレーブ処理した。
【０１１５】
ＲＥＭ  Ｈ８＿１２株を用い１５Ｌのバイオリアクタで発酵を実施した。この発酵は２０１００９１７として参照する（図２〜４を参照されたい）。ｐＨ  ７．０及び３４℃にてこの発酵を行った。大腸菌（E. coli）を凍結させたバイアル瓶から解凍し、バイオリアクタ用のトリプトン−酵母エキス培地に接種した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度が１．０になるまで培養物を増殖させた後、培養物のうち５００ｍＬを１５Ｌバイオリアクタに接種し、初期槽容量を５Ｌにメスアップした。発酵のもととなるフラスコ及び発酵槽には、抗生物質のスペクチノマイシン及びカナマイシンをそれぞれ各５０ｕｇ／ｍＬ濃度で含有させた。
【０１１６】
バッチに含まれるグルコースが枯渇したら、０．３５ｇ／ｍｉｎでグルコース供給溶液の供給を始め、供給速度が２．７２ｇ／ｍｉｎに達するまで、供給速度を対数的に増加させてグルコースの供給を行った。供給速度が２．７２ｇ／ｍｉｎに達したならば直ちに供給速度の増分を一次関数的な増分に切り替え、発酵の間、供給を行った。５３時間の時点で供給速度は３．７５ｇ／ｍｉｎにまで上昇していた。５３時間におよぶ発酵中にバイオリアクタに供給したグルコースの総量は２．６ｋｇであった。
【０１１７】
イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の１０ｍｇ／ｍＬ原液を用い誘導を実施した。開始時点で３ｍＬを添加した（２５ｕＭ）。以降、二酸化炭素放出速度（ＣＥＲ）が２５ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ（３ｍＬ）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ（６ｍＬ）、及び１００ｍｍｏｌ／Ｌｈ（６ｍＬ）になった時点で更に添加した。
【０１１８】
１Ｌの発酵液を遠心分離し、メチルエリスリトール（ＭＥ）の回収（以降に記載する）に上清を用いた。有機酸カラムＨＰＬＣ定量法により２−ＭＥの力価を測定した（図２を参照されたい）。
【０１１９】
ＤＸＰ経路及びイソプレン合成酵素に関係する遺伝子を発現している大腸菌（E. coli）を１５Ｌスケールのフェドバッチ培養により増殖させ、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールを生産させた。次の培地組成を用いた：
培地組成（発酵培地１Ｌあたり）：
Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、１０００Ｘ微量金属溶液（１．０ｍＬ）、５０％  Ｈ２ＳＯ４（２．２５ｍＬ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を熱滅菌した（１２３℃、２０分）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、容量を適量に調整した。滅菌及びｐＨ調整後に、グルコース１０ｇ、Ｍｅｒｃｕｒｙビタミン溶液８ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
【０１２０】
１０００Ｘ微量金属溶液（１Ｌあたり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を容量までメスアップし、孔径０．２２マイクロメートルのフィルタでろ過滅菌した。
【０１２１】
ビタミン溶液（１Ｌあたり）：
チアミン塩酸塩（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、Ｄ−パントテン酸（４．８ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を容量までメスアップし、孔径０．２２マイクロメートルのフィルタでろ過滅菌した。
【０１２２】
マクロ塩溶液（１Ｌあたり）：
ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸一水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、容量までメスアップし、孔径０．２２マイクロメートルのフィルタでろ過滅菌した。
【０１２３】
供給溶液（１ｋｇあたり）：
グルコース（０．５７ｋｇ）、脱イオン水（０．３８ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、及び１００％  Ｆｏａｍｂｌａｓｔ（１０ｇ）。すべての成分を共に混合し、オートクレーブ処理した。溶液を２５℃に冷却した後、マクロ塩溶液１１．１ｍＬ、１０００Ｘ微量金属溶液１．６ｍＬ及びビタミン溶液１３．１ｍＬを添加した。
【０１２４】
リン酸溶液（１Ｌあたり）：
ＫＨ２ＰＯ４（６８ｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（６８ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、容量までメスアップし、３０分オートクレーブ処理した。
【０１２５】
ＲＥＭ  Ｆ２＿１８株を用い１５Ｌのバイオリアクタで発酵を実施した。この発酵は実施２０１０１０１１と称される（図２〜４を参照されたい）。ｐＨ  ７．０及び３４℃にてこの発酵を行った。大腸菌（E. coli）を凍結させたバイアル瓶から解凍し、バイオリアクタ用のトリプトン−酵母エキス培地に接種した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度が１．０になるまで培養物を増殖させた後、培養物のうち５００ｍＬを１５Ｌバイオリアクタに接種し、初期槽容量を５Ｌにメスアップした。発酵のもととなるフラスコ及び発酵槽には、抗生物質のカルベニシリン、スペクチノマイシン、及びカナマイシンをそれぞれ各５０ｕｇ／ｍＬ濃度で含有させた。
【０１２６】
バッチに含まれるグルコースが枯渇したら、０．３５ｇ／ｍｉｎでグルコース供給溶液の供給を始め、供給速度が２．７５ｇ／ｍｉｎに達するまで、供給速度を対数的に増加させてグルコースの供給を行った。供給速度が２．７５ｇ／ｍｉｎに達したならば、速度の増分を直ちに一次関数的増分に切り替えた。６２．４時間のＥＦＴで最高速度は４ｇ／ｍｉｎに固定した。
【０１２７】
二酸化炭素放出速度（ＣＥＲ）５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈにて、上記のリン酸溶液の供給を０．２１ｇ／ｍｉｎで開始し、供給開始から１６時間後に０．１１ｇ／ｍｉｎに低下させ、残りの発酵時間中この速度で供給を続けた。
【０１２８】
イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の１０ｍｇ／ｍＬ原液を用い誘導を実施した。開始時点で３ｍＬを添加した（２５ｕＭ）。以降、二酸化炭素放出速度（ＣＥＲ）が２５ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ（３ｍＬ）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ（６ｍＬ）、及び１００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ（６ｍＬ）になった時点で更に添加した。以降に示す、有機酸カラムによるＨＰＬＣ定量法、及びアミノプロピルカラムによるＨＰＬＣ定量法の両方により、ＭＥ力価を測定した。図２及び４は、２種のＨＰＬＣにより解析されたＭＥ測定値の一致度を示す。
【０１２９】
ＲＥＭ  Ｉ４＿１８の大規模培養
ＲＥＭ  Ｉ４＿１８の遺伝子型は、ＢＬ２１  ｐｇｌ＋ＰＬ．６−ｄｘｓ  ＧＩ１．６−ｄｘｒ  ＧＩ１．６−ｙＩＤＩ  ＰＬ．２−ｌｏｗｅｒ  ＭＶＡ＋ｐＤＷ３３（ｃａｒｂ  ５０）＋Ｐｔａｃ−Ａｎａｂａｅｎａ  ｉｓｐＨ−Ｔ．ｅｌｏｎｇ．ｉｓｐＧ−ｆｄ−ｆｎｒ／ｐＥＷＬ４５４（ｋａｎ５０）である。ＤＸＰ経路及びイソプレン合成酵素に関係する遺伝子を発現している大腸菌（E. coli）にイソプレンを生産させ、１５Ｌスケールでのフェドバッチ培養により増殖させた。
【０１３０】
培地組成（発酵培地１Ｌあたり）：
Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、５０％  Ｈ２ＳＯ４（２．２５ｍＬ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を熱滅菌した（１２３℃、２０分）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、容量を適量に調整した。滅菌及びｐＨ調整後に、グルコース１０ｇ、ビタミン溶液１２ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
【０１３１】
１０００Ｘ微量金属溶液（１Ｌあたり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を容量までメスアップし、孔径０．２２マイクロメートルのフィルタでろ過滅菌した。
【０１３２】
ビタミン溶液（１Ｌあたり）：
チアミン塩酸塩（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、Ｄ−パントテン酸（４．８ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を容量までメスアップし、孔径０．２２マイクロメートルのフィルタでろ過滅菌した。
【０１３３】
マクロ塩溶液（１Ｌあたり）：
ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸一水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、容量までメスアップし、孔径０．２２マイクロメートルのフィルタでろ過滅菌した。
【０１３４】
供給溶液（１ｋｇあたり）：
グルコース（０．５７ｋｇ）、脱イオン水（０．３８ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、１００％  Ｆｏａｍｂｌａｓｔ（１０ｇ）。すべての成分を共に混合し、オートクレーブ処理した。１０００Ｘ微量金属溶液（０．８２ｍＬ）、ビタミン溶液（６．５ｍＬ）、及びマクロ塩溶液（５．５ｍＬ）を添加し、一度供給溶液を冷却した。
【０１３５】
大腸菌ＢＬ２１細胞（株名ＲＥＭ  Ｉ４＿１８）を用い１５Ｌのバイオリアクタで発酵を実施した。この発酵は実施２０１００７８５と称される（図３を参照されたい）。
【０１３６】
ｐＨ  ７．０及び３４℃にてこの発酵を行った。大腸菌（E. coli）を凍結させたバイアル瓶から解凍し、バイオリアクタ用のトリプトン−酵母エキス培地に接種した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度が１．０になるまで培養物を増殖させた後、培養物のうち５００ｍＬを１５Ｌバイオリアクタに接種し、初期槽容量を５Ｌにメスアップした。発酵のもととなるフラスコ及び発酵槽には、抗生物質のカルベニシリン及びカナマイシンをそれぞれ各５０ｕｇ／ｍＬ濃度で含有させた。
【０１３７】
バッチに含まれるグルコースが枯渇したら、グルコース供給溶液を供給した。最初の２０分は初期供給量３ｇ／ｍｉｎで供給した。その後、発酵槽にはグルコースのパルス供給を３０分間〜２０時間行った。ｐＨを７．０５超に上昇させてパルスが導入された。総二酸化炭素放出速度（ｍｍｏｌ／ｈ）を係数４００及び６００で除算することで、誘導速度を算出した。供給開始の２７時間後から、発酵終了時（５１時間後）まで、供給は３．５ｇ／ｍｉｎの一定速度で行った。
【０１３８】
イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の１０ｍｇ／ｍＬ原液を添加することによって誘導を実施した。二酸化炭素放出速度２５の時点で２４ｍＬ加えた（２００ｕＭ）。
【０１３９】
実施例３：糖及び有機酸の解析法−アミノプロピルＨＰＬＣカラムの使用による解析
試料の調製及び代謝性生物の抽出
ＨＰＬＣによる糖の解析に関し、発酵液試料を６５℃で５分加熱処理し、細胞を溶解させた。以降の実験に備え、試料を湿らせた氷の上で保持した。次に試料を、−９℃、１６０００ＲＰＭで５分間遠心分離した。上清を回収し、除去した上清と等量の脱イオン水に細胞ペレットを再懸濁した。懸濁液を、−９℃、１６０００ＲＰＭで５分間遠心分離した。遠心分離後の上清を、最初に回収した上清画分と併せ、ペレットを廃棄する。試料を一晩凍結乾燥した。凍結乾燥した抽出物を等量か、それよりも少量の８５％アセトニトリルに再懸濁した。試料を遠心分離して不溶性の夾雑物を除去し、ＨＰＬＣ解析までの間、上清を４℃以下で保持した。
【０１４０】
ＨＰＬＣ解析法
アミノプロピルカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｌｕｎａ  ＮＨ２−２５０ｍｍ×２．０ｍｍ×５μｍ）を使用しＨＰＬＣ解析を実施した。移動相は８５％アセトニトリルから構成されていた。２０ｕＬの試料をカラムに注入し、カラム温度は４０℃に設定して均一濃度で１５分実施した。ＲＩＤ（示差屈折率検出器）を、４０℃、ｐｏｓｉｔｉｖｅモードで使用し、２−Ｃ−メチルエリスリトールを検出した。およそ２．３分の時点で２−Ｃ−メチルエリスリトールのピークを観察した。Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（カタログ番号Ｉ−Ｍ０５１Ａ）から購入した２−Ｃ−メチルエリスリトールにより作成した検量線をもとに、２−Ｃ−メチルエリスリトールを定量した。０．１ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌの範囲を網羅する直線的な検量線を作成した。定量限界は０．１ｇ／Ｌで見られたが、検出限界は約０．０５ｇ／Ｌであった。
【０１４１】
実施例４：糖及び有機酸の解析法−有機酸カラムによる解析
試料の調製及び代謝性生物の抽出
２％  Ｈ２ＳＯ４の５００ｕＬアリコートを２ｍＬチューブに加えた。１６７ｕＬの発酵液を各チューブに加え、２％  Ｈ２ＳＯ４と混合した。チューブを１４０００ＲＰＭで５分間遠心処理し、細胞片を除去した。上清を、ＨＰＬＣ用の３００ｕＬコニカルボトムバイアルにデカントし、バイアルに気泡が含まれていないか確認した。ＨＰＬＣ解析までの間、試料を４℃以下で維持した。
【０１４２】
ＨＰＬＣ解析法
Ｍｉｃｒｏｇｕａｒｄ  Ｃａｔｉｏｎガードカラム（ＢｉｏＲａｄ、Ｍｉｃｒｏｇｕａｒｄ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｈ−３０ｍｍ×４．６ｍｍ）を併用し、イオン排除カラム（ＢｉｏＲａｄ、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ−３００ｍｍ×７．８ｍｍ）によりＨＰＬＣ解析を実施した。Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓより市販の硫酸（カタログ番号Ｈ３７８−０７）を使用し、移動相として０．０１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４緩衝液（５ｍＭ相当）を調製し、０．６ｍＬ／ｍｉｎでＨＰＬＣを実施した。カラム温度を５０℃に設定し、試料２０μＬをカラムに注入した。
【０１４３】
実施例５：発酵液からの２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール及びアセチル化２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールの単離
清澄化させた発酵液試料（約１．５Ｌ）を減圧下で濃縮し、茶色の油性懸濁液を生成した。ジクロロメタン：メタノール（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ）（８０：２０、０．５Ｌ）により希釈し、及びシリカゲルプラグ（１７ｃｍ×１７ｃｍ）でろ過し、続いてこのシリカプラグをジクロロメタン：メタノール（８０：２０、５×１Ｌ）により更に洗浄した。減圧下で黄色ろ液を濃縮し、茶色の粘調な油を得た。シリカゲルカラム（シリカゲル、２００〜４００メッシュ、６０Å、６０ｃｍ×６ｃｍ）を通して、勾配溶離（９０：１０ジクロロメタン：メタノール〜８５：１５ジクロロメタン：メタノール）により生成を行い、２種の生成物を得た。生成物番号１は、茶色の粘調な液体（約９ｇ）であり、１−Ｏ−アセチル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（１ａ）及び４−Ｏ−アセチル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（１ｂ）の１：２比混合物からなることが１Ｈ  ＮＭＲにより同定された。この構造解析結果を更に確認するために、生成物番号１の少量の試料（１００ｍｇ）を、水酸化ナトリウム（２．６ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、０．２等量）／メタノール（３ｍＬ）により、室温で１時間脱アセチル化条件で処理した。この処理により、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（２）の標本とともに、より極性の高い生成物が共溶出されたことがＴＬＣ（９：１比ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨにより溶出）により確認された。生成物番号２は、黄色のろう様固体であり（約２４ｇ）、文献１中に記載のものと同一の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを有していた。
【０１４４】
【化１】
2014502844.tif 000003
【０１４５】
１−Ｏ−アセチル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（１ａ）：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ４．１３，４．０２（２Ｈ，ＡＢｑ，Ｊ１，１’＝１１．５Ｈｚ，Ｈ１，１’）；３．８５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ３，４＝２．４Ｈｚ，Ｊ３，４’＝１１．４Ｈｚ，Ｈ−３）；３．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ３，４＝２．４Ｈｚ，Ｊ４，４’＝１１．４Ｈｚ，Ｈ−４）；３．５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ４，４’＝１１．４Ｈｚ，Ｈ−４’）；２．１３（３Ｈ，ｓ，ＣＯＣＨ３）；１．１６（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３）。
【０１４６】
４−Ｏ−アセチル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（１ｂ）：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ４．３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ３，４＝２．４Ｈｚ，Ｊ４，４’＝１１．４Ｈｚ，Ｈ−４）；４．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ４，４’＝１１．４Ｈｚ，Ｈ−４’）；３．８６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ３，４＝２．４Ｈｚ，Ｊ３，４’＝１１．４Ｈｚ，Ｈ−３）；３．６０，３．４９（２Ｈ，ＡＢｑ，Ｊ１，１’＝１１．５Ｈｚ，Ｈ１，１’）；２．１２（３Ｈ，ｓ，ＣＯＣＨ３）；１．１５（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３）。
【０１４７】
２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（２）：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ３．８３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ３，４＝２．４Ｈｚ，Ｊ３，４’＝１１．４Ｈｚ，Ｈ−３）；３．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ３，４＝２．４Ｈｚ，Ｊ４，４’＝１１．４Ｈｚ，Ｈ−４）；３．６０（１Ｈ，ｄ，Ｊ４，４’＝１１．４Ｈｚ，Ｈ−４’）；３．５８，３．４７（２Ｈ，ＡＢｑ，Ｊ１，１’＝１１．５Ｈｚ，Ｈ１，１’），１．１３（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３）。
【０１４８】
Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｉ．，Ｉｃｈｉｍｕｒａ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｏｈｒｕｉ，Ｈ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００），６４（９），１９１５〜１９２２。
【０１４９】
実施例６：２−メチル−Ｄ−エリスリトールの生産性の向上
ＤＸＰ経路に関係する遺伝子操作を行い、既存の株による２−メチル−Ｄ−エリスリトールの生産効率を改良するために、各種プロトコルを実施する。
【０１５０】
まず始めに、ｄｘｓ及びｄｘｒ遺伝子の発現を上方制御し、ＩｓｐＤＦ、及び２−メチル−Ｄ−エリスリトール−５−ホスフェート（ＭＥＰ）を利用するその他の遺伝子の発現を下方制御する。細胞増殖を維持するのに必要とされるＩＰＰ／ＤＭＡＰＰのレベルを維持するのに十分なレベルでＭＶＡ経路も発現していた株において、ｉｓｐＤＦを完全にノックアウトした。例えば、ｉｓｐＤＦの発現レベルを低下させたい場合、内在性プロモーターの代わりにＧＩ１．０プロモーターを挿入する。
【０１５１】
第２に、ホスファターゼ発現を誘導するために、低濃度リン酸条件下で株を培養する。ホスファターゼは、ＭＥＰと、恐らくその他のＤＸＰ代謝産物（ｃＭＥＰＰ）を、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールへと変換するのに必要とされる。
【０１５２】
第３に、正常な細胞代謝を妨げないよう、十分に高いＫｍを有する異種ホスファターゼ（例えば、ウシホスファターゼ）を過剰発現させる。一部の場合では、この系は、プールしたＭＥＰ中間体を脱リン酸化し得る。
【０１５３】
第４に、この株において２−ＭＥ生産に関与する内在性大腸菌ホスファターゼを同定し、過剰発現させる。ゲノムライブラリ又はＡＳＫＡコレクションを用いるアプローチにより、ＭＥＰホスファターゼを同定する。
【０１５４】
第５に、２−ＭＥの１−及び４−モノアセチル誘導体への変換に関与するアセチルトランスフェラーゼをノックアウトさせるか、発現を下方制御するかして２−ＭＥの収率を上昇させる。それとは反対に、これらのモノアセテートが望ましい場合には、これらのアセチルトランスフェラーゼを過剰発現させる。一例では、Ｋｍの高いアセチルトランスフェラーゼのＬａｃＡ遺伝子を更に過剰発現させる。
【０１５５】
実施例７：１−デオキシ−Ｄ−キシルロース生産性の向上
１−デオキシ−Ｄ−キシルロースの生産性を向上させるために、実施例６に記載したものと同様の戦略を使用して、ＤＸＰ経路に関し遺伝子操作を行ったこの株を用い、１−デオキシ−Ｄ−キシルロースの生産性を向上させる。ただし、この場合、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスフェート（ＤＸＰ）を蓄積させ、続いて、脱リン酸化させて１−デオキシ−Ｄ−キシルロースを生成するために、ｄｘｒ遺伝子はノックアウトさせるか、発現を下方制御させる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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