(57)【要約】  流体試料を処理するためのシステム及び方法を開示する。流体試料の処理は、一連のマイクロ流体バンプアレイを用いて達成され、生物学的試料由来の粒子をソートし、これらの粒子を溶解して全ＲＮＡ又はＤＮＡを露出させ、当該ＲＮＡ又はＤＮＡを精製し、当該ＲＮＡ又はＤＮＡを化学修飾又は酵素修飾により処理することにより、サイズに応じてＲＮＡ又はＤＮＡ分子を選択し、或いは任意により配列決定ライブラリーを生成するための自動化及び統合型システムを含む。本配列決定ライブラリーは次世代配列決定（ＮＧＳ）に適している。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体流体（biological fluid）の処理のための方法であって、
・生体流体から少なくとも１つの第一の細胞を分離し、
・少なくとも１つの分離された細胞に対して、少なくとも１つの第一の処置を適用することにより、第一の処理溶液を生成し、
・第一の処理溶液に対して、少なくとも１つの第二の処置を適用することにより、第二の処理溶液を生成し、
・第一の処理溶液及び第二の処理溶液の少なくとも一方を、決定論的側方変位（deterministic lateral displacement）を用いて処理することにより、流出溶液を生成する
ことを含む方法。
【請求項２】
生体流体が、全血、尿、脊髄液、唾液、口腔スワブ（buccal swabs）、痰、気管支洗浄液、胃洗浄液、微生物培養培地、糞、軟膜（buffy coat）、血清、血漿、血小板濃縮物、水試料、及び／又は他の任意の生物学的、化学的、及び／又は、生化学的流体、及び／又は、それらの任意の組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
決定論的側方変位が、少なくとも１つのバンプアレイ（bump array）を用いて、第一の処理溶液及び第二の処理溶液の少なくとも一方を処理する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
決定論的側方変位が、複数のバンプアレイの連鎖配列（sequential arrangement of a plurality of bump arrays）を用いて、第一の処理溶液及び第二の処理溶液の少なくとも一方を処理する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
生体流体が全血であり、
少なくとも１つの第一の処置の適用が、全血から分離された細胞を溶解することにより、精製デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を生成することを含み、
少なくとも１つの第二の処置の適用が、精製ＤＮＡを、トランスポゼース複合体（transposase complex）及び少なくとも１つの配列決定アダプター（sequencing adaptor）と混合することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
流出溶液に含まれる少なくとも１つの細胞のサイズに基づいて、流出溶液を分画することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
生体流体の処理のためのシステムであって、
・生体流体を受容し、生体流体から少なくとも１つの第一の細胞を分離するための、少なくとも１つの入側貯留部（input reservoir）と、
・少なくとも１つの入側貯留部に連結され、
少なくとも１つの分離された細胞に対して、少なくとも１つの第一の処置を適用することにより、第一の処理溶液を生成し、
第一の処理溶液に対して、少なくとも１つの第二の処置を適用することにより、第二の処理溶液を生成し、
第一の処理溶液及び第二の処理溶液の少なくとも一方を、決定論的側方変位を用いて処理することにより、流出溶液を生成する
ための少なくとも１つのバンプアレイ機構と、
・流出溶液を受容するための少なくとも１つの出側貯留部（output reservoir）と
を含むシステム。
【請求項８】
生体流体が、全血、尿、脊髄液、唾液、口腔スワブ（buccal swabs）、痰、気管支洗浄液、胃洗浄液、微生物培養培地、糞、軟膜（buffy coat）、血清、血漿、血小板濃縮物、水試料、及び／又は他の任意の生物学的、化学的、及び／又は、生化学的流体、及び／又は、それらの任意の組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
少なくとも１つのバンプアレイが、決定論的側方変位を用いて、第一の処理溶液及び第二の処理溶液の少なくとも一方を処理する、請求項７に記載のシステム。
【請求項１０】
複数のバンプアレイの連鎖配列を用いて、第一の処理溶液及び第二の処理溶液の少なくとも一方を処理することを更に含む、請求項７に記載のシステム。
【請求項１１】
生体流体が全血であり、
少なくとも１つの第一の処置の適用が、全血から分離された細胞を溶解することにより、精製デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を生成することを含み、
少なくとも１つの第二の処置の適用が、精製ＤＮＡを、トランスポゼース複合体（transposase complex）及び少なくとも１つの配列決定アダプター（配列決定 adaptor）と混合することを含む、請求項７に記載のシステム。
【請求項１２】
出側貯留部が、流出溶液に含まれる少なくとも１つの細胞のサイズに基づいて、流出溶液を分画する、請求項７に記載のシステム。
【請求項１３】
連続フロー操作（continuous flow operation）に組み込まれたバンプアレイの連鎖及び連続配列を用いて、全血試料を処理する方法であって、
・バンプアレイの配列内の第一のバンプアレイで全血試料を受容し、
・全血試料を精製して白血球を生成し、
・白血球から核を単離し、
・核からデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を単離し、
・核からＤＮＡを精製し、
・少なくとも１つの化学及び／又は酵素ＤＮＡ処置を用いて精製ＤＮＡを処理する
ことを含む方法。
【請求項１４】
少なくとも１つのバンプアレイを用いた流体試料の処理のための方法であって、
・少なくとも１つのバンプアレイで流体試料を受容し、
・少なくとも１つのバンプアレイを用いて、細胞及び／又は粒子のサイズに基づき、少なくとも１つの所望の核酸含有細胞及び／又は粒子を流体試料から単離し、
・少なくとも１つのバンプアレイを用いて、単離された細胞及び／又は粒子を、少なくとも１つの試薬流と接触させることにより、細胞及び／又は粒子から少なくとも１つの核酸を実質的に純粋な形態で放出させ、
・少なくとも１つのバンプアレイを用いて、少なくとも１つの生成された核酸を試薬流の外部に誘導し、
・少なくとも１つの精製核酸を、少なくとも１つのバンプアレイから除去する
ことを含む方法。
【請求項１５】
複数のバンプアレイが核酸を処理し、ここで複数のバンプアレイ内の個々のバンプアレイは直列に連結され、一のバンプアレイの出流がそれに続く別のバンプアレイの入流として供される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記の受容、単離、接触、及び誘導の工程に、単一のバンプアレイが用いられる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
流体試料が、鳥類全血及び哺乳類全血のうち少なくとも１つを含み、
核酸含有細胞及び／又は粒子が白血球である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
流体試料が、鳥類全血及び哺乳類全血のうち少なくとも１つを含み、
核酸含有細胞及び／又は粒子が循環腫瘍細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
流体試料が、鳥類全血及び哺乳類全血のうち少なくとも１つを含み、
核酸含有細胞及び／又は粒子が、白血球、細菌、ウイルス、真菌、及び寄生性原虫のうち少なくとも１つを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
生体流体が、全血、尿、脊髄液、唾液、口腔スワブ、痰、気管支洗浄液、胃洗浄液、微生物培養培地、糞、軟膜、血清、血漿、血小板濃縮物、水試料、及び／又は他の任意の生物学的、化学的、及び／又は、生化学的流体、及び／又はそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つの化学的及び／又は酵素試薬流を用い、少なくとも１つのバンプアレイを用いた、高分子量（high molecular weight：ＨＭＷ）核酸の順次処理のための方法であって、ここでＨＭＷ核酸の有効流体力学半径は、少なくとも１つのバンプアレイの臨界サイズよりも大きく、ここで当該方法は、
・少なくとも１つのバンプアレイでＨＭＷ核酸を受容し、
・ＨＭＷ核酸を少なくとも１つの化学的及び／又は酵素試薬流と接触させることを含み、
ここで少なくとも１つの化学的及び／又は酵素試薬流を、バンプアレイ内におけるＨＭＷ核酸フローの方向に流通させ、
ここでＨＭＷ核酸が、少なくとも１つの化学的及び／又は酵素試薬流と反応する、方法。
【請求項２２】
少なくとも１つの化学的及び／又は酵素試薬流を用い、少なくとも１つのバンプアレイを用いた、核酸の順次処理のための方法であって、当該方法は、
・核酸を受容し、
・核酸を少なくとも１つのバンプアレイに流通させ、
・少なくとも１つのバンプアレイを用いて、核酸を少なくとも１つの化学的及び／又は酵素試薬流と接触させ、
・少なくとも１つの化学的及び／又は酵素試薬流を用いて核酸を修飾し、
・少なくとも１つのバンプアレイを用いて、精製された核酸を、少なくとも１つの化学的及び／又は酵素試薬流から除去する
ことを含む、方法。
【請求項２３】
複数のバンプアレイが核酸を順次処理し、ここで複数のバンプアレイ内の個々のバンプアレイは直列に連結され、複数のバンプアレイ内の一のバンプアレイの出流が、それに続く複数のバンプアレイ内の別のバンプアレイの入流として供される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２４】
単一のバンプアレイで、流通、接触、修飾、及び除去を実施する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
核酸が高分子量（ＨＭＷ）核酸である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であり、ＤＮＡはバンプアレイ内において、ＤＮＡを担持する少なくとも１つのマイクロ粒子に連結される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ＤＮＡが共有結合及び非共有結合のうち少なくとも１つによって連結される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つのバンプアレイを用いた流体試料の処理のための方法であって、当該方法は、
・少なくとも１つのバンプアレイで流体試料を受容し
・少なくとも１つのバンプアレイを用い、少なくとも１つの所望の核酸含有細胞及び／又は粒子を、細胞及び／又は粒子のサイズに基づいて流体試料から単離し
・少なくとも１つのバンプアレイを用い、単離された細胞及び／又は粒子を、少なくとも１つの試薬流と接触させることにより、細胞及び／又は粒子から少なくとも１つの核酸を実質的に純粋な形態で放出させ、
・核酸を修飾し、
・少なくとも１つのバンプアレイを用い、少なくとも１つの精製された核酸を、試薬流から放出させ、
・少なくとも１つの精製された核酸を、少なくとも１つのバンプアレイから除去する
ことを含む方法。
【請求項２９】
核酸が高分子量（ＨＭＷ）核酸である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であり、ＤＮＡはバンプアレイ内において、ＤＮＡを担持する少なくとも１つのマイクロ粒子に連結される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ＤＮＡが共有結合及び非共有結合のうち少なくとも１つによって連結される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
流体試料が、少なくとも１つの化学的及び／又は酵素試薬流を用い、少なくとも１つのバンプアレイを用いて順次処理される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
核酸が少なくとも１つの化学的及び／又は酵素試薬流を用いて修飾される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
修飾された核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列決定ライブラリー及び組換ＤＮＡライブラリーのうち少なくとも１つを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＤＮＡ配列決定ライブラリーを生成するための試薬システムであって、当該システムは、線状ＤＮＡ試薬と複合化されたトランスポゼース試薬を含み、ここでＤＮＡ試薬は、トランスポゼース認識配列及び配列決定アダプター配列を、ＤＮＡ試薬の各末端に有し、これにより、配列決定の標的となるＤＮＡ分子との反応時に、トランスポゼースがアダプター担持線状ＤＮＡ試薬を、配列決定標的に挿入して、共組込構造（cointegrate structure）を形成し、ここで配列決定標的が単一の位置で開裂し、開裂した標的の末端が、アダプター担持線状ＤＮＡ試薬の末端に連結される、試薬システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は米国仮特許出願第61／515,063（Boles、２０１１年８月４日出願、「マイクロ流体バンプアレイ」（Microfluidic Bump Array））に基づく優先権を主張する。本仮出願の内容はその全体が援用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は概して分子生物学の分野に関し、具体的には高分子量リボ核酸（ＲＮＡ）及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を生物学的試料から単離するのに用いられるシステム及び方法に関する。単離されたＲＮＡ及びＤＮＡ分子はその後、サイズに基づいてソートされ、及び／又は、配列決定ライブラリーに使用される。
【背景技術】
【０００３】
次世代配列決定法（Next-generation sequencing：ＮＧＳ）は、分子生物学、遺伝学、及び医学の多くの分野の研究に革命をもたらした。ＮＧＳ技術がここ数年間でより安価に、且つより広範に利用可能となったことで、ＮＧＳライブラリー世代の試料をより効率的且つ再現可能に調製する方法の必要性に、より注目が集まってきている。従来の方法は、何サイクルもの酵素修飾の後に精製を行わねばならず、斯かるシークエンスは煩雑で時間がかかり、しかも鋳型の損失を招き易い。
【０００４】
分子生物学における従来の処理及び精製法では、核酸を逐次多サイクル処置後に精製を行う。ここで各処置及び精製は個別の試験管や容器で実施されるため、そのワークフロー全体では、異なる反応容器で繰り返し液体を（手作業或いはロボット化ピペッティング装置にて）移送することが必要となる。従来のワークフローによれば、各精製工程では通常、化学抽出、沈殿、及び／又は、固相（例えばマイクロ粒子やフィルター等）への吸着により、前段の反応混合物から核酸を取り出す。斯かる多段階の液体移送及び精製工程は非効率であることから、ユーザーのエラーによる低試料収率及び試料損失は、（例えばＮＧＳに使用されるような）複雑な分子生物学ワークフローにおいては課題となってきた。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ある態様によれば、本発明はマイクロ流体試料調製のためのシステム及び方法を提供する。斯かる調製は、単一の連続フロー技術を用いて達成される。斯かる技術は別名「バンプアレイ」（bump array）、或いは決定論的側方変位（determininstic lateral displacement：ＤＬＤ）とも呼ばれ、粒子様特性を呈する細胞、オルガネラ、マイクロ粒子、及び高分子量（high molecular weight：ＨＭＷ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を操作及び分離するのに使用することができる。
【０００６】
ある態様によれば、本発明は生体流体を処理する方法に関する。斯かる方法は、少なくとも１つの第一の細胞を生体流体から分離し、少なくとも１つの分離された細胞に対して、少なくとも１つの第一の処置を適用することにより、第一の処理溶液を生成し、第一の処理溶液に対して、少なくとも１つの第二の処置を適用することにより、第二の処理溶液を生成し、第一の処理溶液及び第二の処理溶液の少なくとも一方を、決定論的側方変位（deterministic lateral displacement）を用いて処理することにより、流出溶液を生成することを含み得る。
【０００７】
ある態様によれば、本発明は以下の任意の特徴のうち１又は２以上を含んでいてもよい。生体流体としては、例えば全血、尿、脊髄液、唾液、口腔スワブ、痰、気管支洗浄液、胃洗浄液、微生物培養培地、糞、軟膜、血清、血漿、血小板濃縮物、水試料、及び／又は他の任意の生物学的、化学的、及び／又は、生化学的流体、及び／又は、それらの任意の組み合わせのうち少なくとも１つが挙げられる。決定論的側方変位は、第一の処理溶液及び第二の処理溶液の少なくとも一方を処理するのに、少なくとも１つのバンプアレイを用いることができる。決定論的側方変位は、第一の処理溶液及び第二の処理溶液の少なくとも一方を処理するのに、複数のバンプアレイの連鎖配列を用いてもよい。
【０００８】
ある態様によれば、生体流体は、例えば全血である。少なくとも１つの第一の処置の適用には、例えば全血から分離された細胞を溶解し、精製デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を生成することが含まれる。少なくとも１つの第二の処置の適用には、例えば精製ＤＮＡをトランスポゼース複合体及び少なくとも１つの配列決定アダプターと混合することが含まれる。
【０００９】
ある態様によれば、本方法は更に、流出溶液に含まれる少なくとも１つの細胞のサイズに基づいて、流出溶液を分画することを含んでいてもよい。
【００１０】
ある態様によれば、本発明は、生体流体の処理のためのシステムを提供する。斯かるシステムは、生体流体を受容し、生体流体から少なくとも１つの第一の細胞を分離するための、少なくとも１つの入側貯留部（input reservoir）と、少なくとも１つの入側貯留部に連結され、少なくとも１つの分離された細胞に対して、少なくとも１つの第一の処置を適用することにより、第一の処理溶液を生成し、第一の処理溶液に対して、少なくとも１つの第二の処置を適用することにより、第二の処理溶液を生成し、第一の処理溶液及び第二の処理溶液の少なくとも一方を、決定論的側方変位を用いて処理することにより、流出溶液を生成するための少なくとも１つのバンプアレイ機構と、流出溶液を受容するための少なくとも１つの出側貯留部（output reservoir）とを含み得る。ある態様によれば、本発明は、本明細書において論じる種々の任意の特徴を含み得る。
【００１１】
ある態様によれば、本発明は、連続フロー操作（continuous flow operation）に組み込まれたバンプアレイの連鎖及び連続配列を用いて、全血試料を処理する方法に関する。斯かる方法は、バンプアレイの配列内の第一のバンプアレイで全血試料を受容し、全血試料を精製して白血球を生成し、白血球から核を単離し、核からデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を単離し、核からＤＮＡを精製し、少なくとも１つの化学及び／又は酵素ＤＮＡ処置を用いて精製ＤＮＡを処理することを含み得る。
【００１２】
ある態様によれば、本発明は、少なくとも１つのバンプアレイを用いた流体試料の処理のための方法に関する。斯かる方法は、少なくとも１つのバンプアレイで流体試料を受容し、少なくとも１つのバンプアレイを用いて、細胞及び／又は粒子のサイズに基づき、少なくとも１つの所望の核酸含有細胞及び／又は粒子を流体試料から単離し、少なくとも１つのバンプアレイを用いて、単離された細胞及び／又は粒子を、少なくとも１つの試薬流と接触させることにより、細胞及び／又は粒子から少なくとも１つの核酸を実質的に純粋な形態で放出させ、少なくとも１つのバンプアレイを用いて、少なくとも１つの生成された核酸を試薬流の外部に誘導し、少なくとも１つの精製核酸を、少なくとも１つのバンプアレイから除去することを含み得る。
【００１３】
ある態様によれば、本発明は、以下の任意の特徴のうち１又は２以上を含んでいてもよい。複数のバンプアレイによって核酸を処理してもよく、ここで複数のバンプアレイ内の個々のバンプアレイは直列に連結され、一のバンプアレイの出流がそれに続く別のバンプアレイの入流として供されてもよい。或いは、前記の受容、単離、接触、及び誘導の工程に、単一のバンプアレイを用いてもよい。流体試料が、鳥類全血及び哺乳類全血のうち少なくとも１つを含み、核酸含有細胞及び／又は粒子が白血球であってもよい。また、流体試料が、鳥類全血及び哺乳類全血のうち少なくとも１つを含み、核酸含有細胞及び／又は粒子が循環腫瘍細胞であってもよい。流体試料が、鳥類全血及び哺乳類全血のうち少なくとも１つを含み、核酸含有細胞及び／又は粒子が、白血球、細菌、ウイルス、真菌、及び寄生性原虫のうち少なくとも１つを含んでいてもよい。
【００１４】
生体流体としては、全血、尿、脊髄液、唾液、口腔スワブ、痰、気管支洗浄液、胃洗浄液、微生物培養培地、糞、軟膜、血清、血漿、血小板濃縮物、水試料、及び／又は他の任意の生物学的、化学的、及び／又は、生化学的流体、及び／又はそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも１つが挙げられる。
【００１５】
ある態様によれば、本発明は、少なくとも１つの化学的及び／又は酵素試薬流を用い、少なくとも１つのバンプアレイを用いた、高分子量（high molecular weight：ＨＭＷ）核酸の順次処理のための方法であって、ＨＭＷ核酸の有効流体力学半径が、少なくとも１つのバンプアレイの臨界サイズよりも大きい方法に関する。斯かる方法は、斯かる方法は、少なくとも１つのバンプアレイでＨＭＷ核酸を受容し、ＨＭＷ核酸を少なくとも１つの化学的及び／又は酵素試薬流と接触させることを含み得る。ここで少なくとも１つの化学的及び／又は酵素試薬流は、バンプアレイ内におけるＨＭＷ核酸フローの方向に流通し、ＨＭＷ核酸は、バルク流体フローの方向に対して角度を以って流通する。ＨＭＷ核酸は、少なくとも１つの化学的及び／又は酵素試薬流と反応し得る。
【００１６】
ある態様によれば、本発明は、少なくとも１つの化学的及び／又は酵素試薬流を用い、少なくとも１つのバンプアレイを用いた、核酸の順次処理のための方法に関する。斯かる方法は、核酸を受容し、核酸を少なくとも１つのバンプアレイに流通させ、少なくとも１つのバンプアレイを用いて、核酸を少なくとも１つの化学的及び／又は酵素試薬流と接触させ、少なくとも１つの化学的及び／又は酵素試薬流を用いて核酸を修飾し、少なくとも１つのバンプアレイを用いて、精製された核酸を、少なくとも１つの化学的及び／又は酵素試薬流から除去することを含み得る。
【００１７】
ある態様によれば、本発明は、以下の任意の特徴のうち１又は２以上を含んでいてもよい。複数のバンプアレイが核酸を順次処理し、ここで複数のバンプアレイ内の個々のバンプアレイは直列に連結され、複数のバンプアレイ内の一のバンプアレイの出流が、それに続く複数のバンプアレイ内の別のバンプアレイの入流として供されてもよい。或いは、単一のバンプアレイで、流通、接触、修飾、及び除去を実施してもよい。核酸は高分子量（ＨＭＷ）核酸であってもよい。或いは、核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であり、ＤＮＡはバンプアレイ内において、ＤＮＡを担持する少なくとも１つのマイクロ粒子に連結されてもよい。ＤＮＡが共有結合及び非共有結合のうち少なくとも１つによって連結されてもよい。
【００１８】
ある態様によれば、本発明は、少なくとも１つのバンプアレイを用いた流体試料の処理のための方法に関する。斯かる方法は、少なくとも１つのバンプアレイで流体試料を受容し、少なくとも１つのバンプアレイを用い、少なくとも１つの所望の核酸含有細胞及び／又は粒子を、細胞及び／又は粒子のサイズに基づいて流体試料から単離し、少なくとも１つのバンプアレイを用い、単離された細胞及び／又は粒子を、少なくとも１つの試薬流と接触させることにより、細胞及び／又は粒子から少なくとも１つの核酸を実質的に純粋な形態で放出させ、核酸を修飾し、少なくとも１つのバンプアレイを用い、少なくとも１つの精製された核酸を、試薬流から放出させ、少なくとも１つの精製された核酸を、少なくとも１つのバンプアレイから除去することを含み得る。
【００１９】
ある態様によれば、本発明は、以下の任意の特徴のうち１又は２以上を含んでいてもよい。核酸は高分子量（ＨＭＷ）核酸であってもよい。或いは、核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であり、ＤＮＡはバンプアレイ内において、ＤＮＡを担持する少なくとも１つのマイクロ粒子に連結されてもよい。ＤＮＡが共有結合及び非共有結合のうち少なくとも１つによって連結されてもよい。流体試料が、少なくとも１つの化学的及び／又は酵素試薬流を用い、少なくとも１つのバンプアレイを用いて順次処理されてもよい。核酸が少なくとも１つの化学的及び／又は酵素試薬流を用いて修飾されてもよい。修飾された核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列決定ライブラリー及び組換ＤＮＡライブラリーのうち少なくとも１つを含んでいてもよい。
【００２０】
ある態様によれば、本発明は、ＤＮＡ配列決定ライブラリーを生成するための試薬システムに関する。斯かるシステムは、線状ＤＮＡ試薬と複合化されたトランスポゼース試薬を含み、ここでＤＮＡ試薬は、トランスポゼース認識配列及び配列決定アダプター配列を、ＤＮＡ試薬の各末端に有し、これにより、配列決定の標的となるＤＮＡ分子との反応時に、トランスポゼースがアダプター担持線状ＤＮＡ試薬を、配列決定標的に挿入して、共組込構造（cointegrate structure）を形成し、ここで配列決定標的が単一の位置で開裂し、開裂した標的の末端が、アダプター担持線状ＤＮＡ試薬の末端に連結されてもよい。
【００２１】
ある態様によれば、複数種の粒子（例えば細胞、オルガネラ、マイクロ粒子、及びＨＭＷ ＤＮＡ分子等）を許容し得る単一の分離技術を用いることにより、例えば、これに限定されるものではないが、複数の逐次処理工程を共通プロセスにより、単一の操作で、そして単一の汎用の（consumable）装置で達成する能力を提供することができる。更に、多工程プロセスでは、処理工程間の試料の移送による損失を実質的に生じることなく、反応工程と反応後の浄化工程とをシームレスに統合することが可能となる。試料の精製は「粒子」サイズのみに基づいて達成することができる。即ち、固相への差分吸着を用いないので、不可逆吸着による試料の損失を回避することができる。ある態様によれば、システムに保持される当初試料の一部であって、更なる処理に供され、或いは最終的に収集されるものを、各プロセスの各工程の後に、例えば（これらに限定されるものではないが）緩衝液交換及び低分子量（low molecular weight：ＬＭＷ）試薬除去等の機構によって、精製することができる。本発明のシステムによれば、ＮＧＳに必要とされる冗長且つ煩雑な試料調製プロセスを、自動で行う手段が提供される。本発明のシステム及び方法によれば、斯かるプロセスの全てを、実質的に使用者の介入を伴うことなく達成することができる。惹いては、使用者の介在によって生じるエラーやばらつきを実質的に回避することができる。バンプアレイＮＧＳ処理は、臨床試験や診断試験等の、定型的且つ品質管理（quality-control：ＱＣ）を要する用途に用いることができる。
【００２２】
原理的に、導入される試料のサイズは、１００マイクロリットル（μｌ）オーダーの全血（例えば１００μＬ〜９９９μＬの全血）から単一の細胞レベルまで幅広い。斯かる特徴によれば、癌研究及び診断における配列決定を促進することが可能となる。
【００２３】
本明細書に記載の本発明の一又は二以上の変形例について、添付の図面及び以下の記載においてその詳細を説明する。本明細書に記載の発明の他の特徴や利点は、本明細書及並びに添付の図面及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【００２４】
添付の図面は本明細書に組み込まれ、本明細書の一部をなすものである。これらの図面は、本明細書に記載の発明の一部の態様を示すと共に、本明細書と併せて考慮することにより、開示される態様に関する一部の原理を説明する助けとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、バンプアレイの一例を示す模式図である。
【００２６】
【図２】図２Ａは、バンプアレイを通じて流通する蛍光マイクロ粒子０．４μｍ（緑）及び１．０μｍ（赤）を示す写真である。λ＝８μｍ、λ／ｄ＝１０。図２Ｂは、所与のバンプアレイにおける、臨界サイズよりも小さい粒子の軌道を示す模式図である。図２Ｃは、所与のバンプアレイにおける、臨界サイズよりも大きい粒子の軌道を示す模式図である。
【００２７】
【図３】図３Ａは、粒子を試薬流の内部及び外部で移動させるためのバンプアレイの一例を示す模式図である。チップ上の障害物のテクスチャーを拡大して示す。図３Ｂは、図３Ａに示すバンプアレイの一例の写真である。
【００２８】
【図４】図４Ａ〜Ｈは、バンプアレイでの大腸菌細胞の溶解を示す連続写真である。
【００２９】
【図５】図５は、本発明のある態様に係る流体試料の処理のためのシステムの一例を示す図である。
【００３０】
【図６】図６は、本発明のある態様に係る流体試料の処理のためのシステムの別の例を示す図である。
【００３１】
【図７】図７は、本発明のある態様に係る流体試料の処理のためのシステムの更に別の例を示す図である。
【００３２】
【図８】図８Ａは、自動バンプアレイ機器での使用に最適化された転位媒介ライブラリー（transposition-mediated library）生成系を示す模式図である。図８Ｂは、転位共組込体（transposition cointegrates）の構造を示す模式図である。
【００３３】
【図９】図９は、本発明のある態様に係る流体試料の処理のための方策の一例を模式的に示す図である。
【００３４】
【図１０】図１０は、本発明のある態様に係る方法の図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明を論ずるに当たり、本発明のシステム及び方法の種々の態様との関連において、種々の用語を援用及び／又は使用する場合がある。斯かる用語の定義を以下に示すが、これらはあくまでも説明を目的とするものであり、本明細書に記載の発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００３６】
「試料」（sample）又は「生物学的試料」（biological sample）とは、例えばバンプアレイによって分離及び処理することが可能な複数の粒子を指す。粒子の例としては、これらに限定されるものではないが、例えば生体流体又は組織内の細胞、核、オルガネラ、高分子量リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）（ＲＮＡ及びＤＮＡを核酸（ＮＡ）と総称する場合がある。）、及び微生物（例えば細菌やウイルス等）が含まれる。腫瘍や新生物の生検等の無傷の組織から粒子を調製する場合、通常は細胞を解砕して流体に再懸濁させてから、斯かる粒子を本明細書の一部の態様のアレイ又はシステムに導入する。
【００３７】
「画分」（fraction）という語は、例えば試料中の粒子の部分集合を指す。画分は、例えばサイズによって定義又は決定することができる。或いは画分は、例えばバンプアレイ内の柱が設けられた領域（field of posts）を横断する際に時間差を生じさせる物理的特性（例えばサイズ等）によって定義又は決定することができる。例えば、よりサイズの小さな粒子を含む画分ほど、一次流体又は流体流がアレイ内を通過する際のベクトル方向により近い経路を通る（例えば図２Ｂ、９、及び１０参照）。これに対して、よりサイズの大きな粒子を含む画分ほど、一次流体又は流体流がアレイ内を通過する際のベクトル方向からより逸脱した経路を通る（即ち、主流方向から偏移又は逸脱する角度がより大きくなる）（例えば図２Ｃ、９、及び１０参照）。
【００３８】
「試料」の例としては、これらに限定されるものではないが、細胞、核、オルガネラ、ＨＭＷ ＲＮＡ（核内、細胞内、又は細胞外）、ＨＭＷ ＤＮＡ（核内、細胞内、又は細胞外）、微生物、細菌、ウイルス、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。「生体流体」（biological fluid）には、これらに限定されるものではないが、例えば房水及び硝子体液、胆汁、血液（全血、血清、血漿、富細胞画分）、母乳、脳脊髄液（cerebrospinal fluid：ＣＳＦ）、内リンパ及び外リンパ、胃液、粘液（例えば痰）、腹水、胸膜液、唾液、皮脂（skin oil）、精液、汗、涙、膣分泌液、嘔吐物、及び尿が挙げられる。「生物学的組織」（biological tissues）としては、これらに限定されるものではないが、例えば内胚葉、中胚葉、又は外胚葉に由来する組織；天然の結合、筋、神経、又は上皮組織；骨、軟骨、腱、骨髄、血液、血管（動脈及び静脈）、平滑筋、骨格筋、心筋（心臓）、中枢神経系（脳、脊髄、脳神経）、末梢神経系（末梢神経）、皮膚、呼吸管、消化管、及び生殖管を含む組織が挙げられる。
【００３９】
核酸としては、ゲノムＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、コーディングＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、モルホリノ、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子、ミトコンドリア核酸、葉緑体核酸、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、及び個別の遺伝物質を有する他のオルガネラに由来するものが挙げられる。更に、試料としては、修飾、合成、又は非天然のヌクレオチド又は構造要素を含む核酸類似体、或いは本技術分野で公知の他の代替／修飾核酸化合物が挙げられる。核酸修飾の更なる例としては、イノシン等の塩基類似物、挿入剤（intercalators）及び副溝結合剤（minor groove binders）の使用が挙げられる。核酸類似物及び代替／修飾核酸化合物の他の例も、同様に使用することができる。
【００４０】
ＰＮＡオリゴマーも、本明細書のある態様の試料又は画分の例に含まれる。ＰＮＡオリゴマーとしては、リン酸骨格がペプチド様骨格に置換されたＤＮＡ類似体が挙げられる。
【００４１】
ポリペプチド又はタンパク質は、例えば折り畳まれた１又は２以上の長いポリペプチド鎖を含む、複雑な三次元構造である。ポリペプチド鎖は、アミノ酸と呼ばれる複数の小型の化学単位からなる。天然アミノ酸は通常はL−配座を取る。合成ペプチドは、従来の合成法により、L−アミノ酸、D−アミノ酸、又はL−及びD−アミノ酸の種々の混合物を用いて調製することができる。「ペプチド」（peptide）は、２以上のアミノ酸の組み合わせからなる。天然アミノ酸はL−配座を取る。１０アミノ酸未満のペプチドは「オリゴペプチド」（oligopeptide）、より多数のアミノ酸単位を含むペプチドは「ポリペプチド」（polypeptide）と呼ぶ。「ポリペプチド」という場合にはオリゴペプチドも含むものとする。更に「ペプチド」という場合は、例えばポリペプチド及びオリゴペプチドを含む。アミノ酸配列が異なれば、それによって各々形成されるポリペプチド鎖も異なる。
【００４２】
「核酸分子」（nucleic acid molecule）という語は、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、又はシチジン；ＲＮＡ分子）又はデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、又はデオキシシチジン；ＤＮＡ分子）、或いはその任意のホスホエステル類似体、例えばホスホロチオエートやチオエステル等のリン酸エステルポリマー形態であって、一本鎖形態又は二本鎖へリックスの何れかを取るものを指す。「核酸分子」という語、特にＤＮＡ又はＲＮＡ分子という語は、斯かる分子の一次及び二次構造のみを指すものであり、何ら特定の四次構造に限定されるものではない。即ち、この語は、鎖状又は環状ＤＮＡ分子として見出される二本鎖ＤＮＡ（例えば制限酵素断片）、プラスミド、及び染色体を含み得る。「組換ＤＮＡ分子」（recombinant DNA molecule）は分子生物学的操作を加えたＤＮＡ分子である。
【００４３】
その後の分析における配列の検出又は分析を補助する目的で、或いは本明細書に記載のバンプアレイ及びシステム以外の装置での使用に供するために、本明細書のある態様のバンプアレイ又はシステム内で、核酸を化学反応又は酵素反応により処理し、蛍光、磁気、又は放射能特性をこれらの分子に付与してもよい。
【００４４】
ポリペプチドに関して、「天然の」（native）という語は、例えば非変性ポリペプチドを指す。本明細書のある態様に係るポリペプチドは、天然であるか、或いは編成されたものである。
【００４５】
ある態様によれば、本発明は、単数の「バンプアレイ」及び／又は複数の「バンプアレイ」を用いることにより、処理された生体流体に基づいて次世代配列決定ライブラリーを作製するために、生体流体を処理するためのシステム及び方法に関する。ある態様によれば、生体流体は、これらに限定されるものではないが、例えば全血、尿、脊髄液、唾液、口腔スワブ、痰、気管支洗浄液、胃洗浄液、微生物培養培地、糞、軟膜、血清、血漿、血小板濃縮物、水試料、及び／又は 他の任意の生物学的、化学的、及び／又は、生化学的流体、及び／又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。バンプアレイは決定論的側方変位（determininstic lateral displacement：ＤＬＤ）機構とも呼ばれ、流体から特定サイズの分子を分離することができる。
【００４６】
ある態様によれば、本発明は、単一の連続フロー操作に統合し得る一連のバンプアレイを実施することができる。この場合、粗生物学的試料を出発材料として用い、続いて試料を精製し、試料に含まれる種々の要素（例えば分子、細胞等）を試料から単離し、単離された要素を精製し、単離精製された要素に種々の処理を施すことにより、その試料を処理する。あくまでも例示及び説明の目的であり、限定的な意図はないが、以下の議論では処理対象の生物学的試料として全血を想定する。しかし、本発明は全血の使用に限定されるものではなく、上述及び他の任意の生体流体を含み得る。
【００４７】
生物学的試料として全血を想定した場合、本発明のシステムは以下の操作を実施する。全血からの白血球（ＷＢＣ）の精製、白血球からの核の単離、核からのＤＮＡの単離、核由来ＤＮＡの精製、並びに精製ＤＮＡに対する種々の化学的及び／又は酵素的ＤＮＡ処理の実施である。ある態様によれば、任意の精製核酸を用いて、種々の化学的及び／又は酵素的ＤＮＡ処理を実施することができる。ある態様によれば、本発明ではＤＬＤを用いて、生物学的試料を種々の試薬と接触させ、更には（必要に応じて）試薬流から除去することができる。更にある態様によれば、より小さな核酸についても、本発明ではバンプアレイを用いて、バンプ可能な（bumpable）マイクロ粒子に当該分子を結合させることにより、処理することが可能である。このようにして、粒子を用いてＤＮＡカーゴを、複数の試薬流を通じて牽引することが可能となる。
【００４８】
ある態様によれば、本発明のシステムは、１又は２以上のバンプアレイを有する少なくとも１つのバンプアレイ装置を含み得る。斯かるバンプアレイ装置は、核酸流体試料を逐次的に処理及び精製することができる。斯かる処置及び精製のサイクルは、単一のフロー装置を用い、単一の連続フロー操作で、複数回実施することが可能である。斯かる処理は、例えば化学的及び／又は酵素的処理である。これらの核酸は、例えば細胞及び／又は複合的な生物学的液体試料（例えば全血等）から精製される。バンプアレイ装置を用いて、精製された核酸に対する種々の処理を実施してもよい。斯かる処理の非限定的な例としては、リン酸化反応、脱リン酸化反応、制限酵素消化、ライゲーション、変性、ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼによる処理、蛍光又は放射能標識、ＤＮＡ塩基又は骨格基の化学修飾、修飾塩基の酵素的又は化学的切断、発色団（chromophores）又は蛍光色素分子（fluorophores）等による核酸の染色、及び／又は他の処理、及び／又はそれらの任意の組み合わせのうち少なくとも１つが挙げられる。核酸としては、粒子に結合された核酸、例えばマイクロ粒子に結合された核酸を用いてもよい。これにより、小型の核酸を処理することができる。斯かる粒子に核酸を結合することによって、当該結合された核酸を、製造容易な寸法のアレイ内でバンプすることが可能となる。
【００４９】
ある態様によれば、本発明は流体を処理するためのシステム及び方法を提供する。斯かる処理としては、例えば流体の精製が挙げられる。これは、複合的な流体試料をバンプアレイに流通させ、バンプアレイを用いて核酸含有細胞又は所望の粒子を粒子サイズに応じて単離し、バンプアレイを用いて単離された粒子を１又は２以上の試薬流と接触させて核酸を粒子から実質的に純粋な形態で放出させ、更にバンプアレイを用いて精製された核酸を試薬流から放出させることを含む。試薬流から放出された精製核酸は、例えば、他の細胞要素及び試料要素を実質的に含まず、また、バンプアレイの試薬流要素も実質的に含まない。
【００５０】
ある態様によれば、個々のバンプアレイを直列に接続し、１のバンプアレイの流出がそれに続く別のバンプアレイの導入試料となるようにしてもよい。ある態様によれば、全工程で同一のバンプアレイを使用することができる。更に、細胞分画及び試薬処理を、単一のバンプアレイの物理的に区別された領域で達成してもよい。ある態様によれば、導入試料は例えば鳥類又は哺乳類の全血であり、核酸含有粒子は例えば白血球である。ある態様によれば、導入試料は例えば鳥類又は哺乳類の全血であり、核酸含有粒子は例えば循環腫瘍細胞である。ある態様によれば、導入試料は例えば鳥類又は哺乳類の全血であり、核酸含有粒子は例えば白血球、細菌、ウイルス、真菌、寄生性原虫、及び／又は他の任意の粒子、及び／又はそれらの任意の組み合わせである。
【００５１】
ある態様によれば、本発明は、バンプアレイ上での化学的及び酵素的手段による高分子量核酸の順次処理を提供する。ＨＭＷ核酸の有効流体力学直径は、例えばバンプアレイの臨界直径よりも大きい。また、ＨＭＷ核酸を少なくとも第一の試薬流と接触させてもよい。ここで第一の試薬流は、例えばバルク流体フローの方向に流通する。ここでＨＭＷ核酸は、例えば第一の試薬流を通じてバンプされ、例えば第一の試薬と反応する。
【００５２】
ある態様によれば、本発明は、１又は２以上の化学的又は酵素的手段によるＨＭＷ核酸の順次処理を提供する。これは例えば、ＨＭＷ核酸の試料をバンプアレイに流通させ、バンプアレイを用いてＨＭＷ核酸を、核酸を修飾し得る（例えば化学的、酵素的等）少なくとも１つの試薬流に接触させ、更に任意によりバンプアレイを用いて精製された核酸を試薬流から放出させることにより達成される。
【００５３】
ある態様によれば、個々のバンプアレイを直列に接続し、１のバンプアレイの流出がそれに続く別のバンプアレイの導入試料となるようにしてもよい。これらのバンプアレイは同一のバンプアレイであってもよい（また、細胞分画及び試薬処理を、連続した一のバンプアレイの物理的に区別された領域で実施してもよい）。更に、ＤＮＡ試料をマイクロ粒子に（共有結合又は非共有結合により）結合させてもよく、この場合にはマイクロ粒子はバンプ可能であってもよい。即ち、マイクロ粒子を、修飾反応時にＤＮＡを結合する担体として使用してもよい。
【００５４】
ある態様によれば、本発明は、純粋核酸（pure nucleic acid）を製造するべく全血を処理する方法を提供する。斯かる純粋核酸は、修飾純粋核酸（modified pure nucleic acid）の製造に使用することができる。修飾純粋核酸としては、例えばＤＮＡ配列決定ライブラリー及び／又は組換ＤＮＡライブラリーが挙げられる。
【００５５】
ある態様によれば、本発明は、全血試料を導入として受容し、次世代配列決定（ＮＧＳ）に適したゲノムＤＮＡライブラリーを作製し得る系を提供する。ライブラリーの構築は、単一の自動プロセスにより、使用者が介入することなく実施することができる。斯かる系によって、ＮＧＳ配列決定に斯かる費用及び作業を低減し、ＮＧＳ技術から診断設計への移行を促進することが可能となる。斯かる系のスケールを調整すれば、ごく少数の細胞（例えば単一の細胞レベル）を含む試料への適用も可能である。斯かる適用は、例えば癌及び／又は他の重要な医学的課題の処置に有用である。
【００５６】
ある態様によれば、斯かる系は、例えばマイクロ流体連続フロー設計（microfluidic, continuous flow design）を含む。粒子（例えば細胞や核、更には不規則にコイルを形成したＨＭＷ ＤＮＡ等の巨大高分子）を含む液体試料を、フローセルを通じて駆動してもよい。斯かるフローセルには、ミクロンサイズの柱部（posts）を規則的に配したアレイを設けてもよい。斯かる柱部の間隔及び配列は、例えば臨界サイズを超える粒子が、斯かる柱部によって、バルク液体フローの方向を直角に横切るように配された流通路に「バンプされる」（bumped）ように調整することができる。一方、臨界サイズよりも小さい試料要素は、バルクフローを通じてそのまま真っ直ぐ流通できるようにする。斯かる機構を用いれば、大型の試料要素を小型の要素から、チップの横方向に分離・精製することが可能となる。
【００５７】
試料はこれらのバンプアレイを通じて、例えば層流条件下（レイノルド数、Ｒｅ、＜＜１）で流通できるようにする。これにより実質的に側方混合（lateral mixing）を加えずとも、個別の試薬流をアレイに導入することが可能となる。大型の粒子バンプを、斯かる試薬流に対して斜めに（diagonally）導入及び放出し、粒子に対して化学的又は酵素的反応を実施してもよい。本発明のシステムではこの原理を用いることにより、白血球核を精製し、ＤＮＡを精製し、更にはＮＧＳライブラリー生成用にＤＮＡを酵素修飾することができる。
【００５８】
以下の工程は血液試料を用いる場合を例としたものであるが、本プロセスは解砕及び流体に再懸濁可能な細胞を含む任意の生体流体及び／又は任意の組織試料に適用することが可能である（下記の表１にその例を示す）。宿主由来の外来の細胞を単離してもよい。例えば、原材料としては、全血及び／又は全組織由来の細胞溶液が挙げられるのに対して、所望の中間画分としては、ウイルス、宿主由来ではない原核細胞（例えば細菌等）、寄生生物、真菌、病原性微生物、及び／又は、他の任意の画分、要素、流体等、及び／又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【表１】
2014521354.tif 000003
【００５９】
図１はバンプアレイ１００の一例を示す模式図である（バンプアレイの例は、Davis JA, Inglis DW, Morton KJ, Lawrence DA, Huang LR, Chou SY, Sturm JC, Austin RH. “Deterministic hydrodynamics: taking blood apart.” Proc Natl Acad Sci U S A. vol. 103, 14779-84. 2006 に示されている。本文献はその全体が援用により本明細書に組み込まれる。）。バンプアレイ１００は、例えば複数の柱部１０６及び複数の流線１０８を含む。ここで、これらの柱部は流線１０８内に、所定の配置で、不規則な配置で、及び／又は、他の任意の配置で設けられる。柱部１０６は、例えば互いに所定の距離Ｇを置いて配置する。これにより形成された隙間を通じて、分子や粒子等１０２、１０４が流線１０８内の柱部の間を移動することが可能となる。図１に示すように、柱部１０６は所定の水平間隔λを以って配置してもよく、また、所定の列オフセット（raw offset）ｄを有していてもよい。バンプアレイ用途のある態様によれば、パラメーターＧ、λ、及び／又はｄは、バンプアレイ１００によって分離すべき粒子の具体的な寸法に応じて、特異的に設定することができる。斯かる設計仕様の例についてはInglis 等が論じている（Inglis DW, Davis JA, Austin RH, Sturm JC. “Critical particle size for fractionation by deterministic lateral displacement.” Lab Chip. vol. 6, 655-8. 2006 参照。本文献はその全体が援用により本明細書に組み込まれる。）。図１に示すように、種々のサイズの粒子（例えば小型粒子１０２及び大型粒子１０４）を、（矢印に示すように）所定の方式でバンプアレイ１００を通過させることができる。
【００６０】
粒子を含む液体試料は、規則的に柱部が配されたアレイを（図１の矢印に示すように）垂直に流通する。ここで、柱部の水平間隔をλ、列オフセットをｄとすると、各隙間にはλ／ｄの液体流路が形成される。第一の流線の幅よりも半径が大きい粒子１０４は、各隙間において（流線１から２を通じて）斜めにバンプされる。流線の幅よりも半径が小さい小型粒子１０２は、側方に変位することなく、同一の流線内に留まりながらアレイを垂直に通過する。
【００６１】
図２Ａは、直径０．４μｍの蛍光マイクロ粒子２０２（緑）及び直径１．０μｍのマイクロ粒子２０４（赤）が、λ＝８μｍ、λ／ｄ＝１０のバンプアレイを流通するところを示す図である。緑色粒子２０２はバンピングの臨界寸法よりも小さく、バルク液体フローの線に沿って真っ直ぐ進行する。図２Ｂに示すように、粒子２０２は、側方変位を生じない限りで、柱部１０６の間を通ってジグザグの流線１０８を進んでもよい。バンプアレイ１００の臨界サイズよりも直径が小さい粒子２０２の軌道。粒子２０２の経路は柱部１０６の周囲を回ってジグザグ形状となるものの、その流れはバンプアレイ１００の処理対象となる流体試料の全体的な流れと同じ方向に進む。図２Ｃに示すように、赤い粒子２０４は臨界寸法より大きく、斜め方向の流線１０８に沿ってアレイ１００を横断するようにバンプされる。粒子２０４の軌道は、バンプアレイ１００における流体試料の全体的な流れに対して、角度を持った軌道となる。これは、粒子２０４が柱部１０６から外れるように斜めにバンプされるからである。ある態様によれば、バンプアレイ１００は、細胞ソーティング、大型ＤＮＡ（＞２０ｋｂ）のサイズ選択、及びマイクロ粒子のサイズ選択に使用することができる。
【００６２】
図３Ａは、試薬流に対して粒子を導入又は流出するためのバンプアレイ３００を示す（図３Ａ左側）と共に、チップ上の障害物のテクスチャーを拡大して示す（図３Ａ右側）模式図である。図３Ｂは、図３Ａに示すバンプアレイ３００の例を示す。３μｍの蛍光ビーズ３０２がアレイ左下から導入され、バンプ不能な０．５μｍのビーズ３０４で標識された模擬試薬流を通じてバンプされる。
【００６３】
図４Ａ〜Ｈは、バンプアレイにおける大腸菌細胞の溶解を示す連続写真である。蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するスフェロプラスト化細胞を蛍光ＤＮＡ染料で染色し、フロー細胞の上半分に位置するＳＤＳ溶解流体流に向けてバンプする。彗星尾状にＧＦＰが放出される。ヌクレオチドは圧縮されたまま斜めにバンプされる。ＧＦＰは臨界サイズ未満であり、フローと一緒に移動する。
【００６４】
図５は、本発明のある態様に係る、流体試料を処理するためのシステム５００の一例を示す図である。このシステム５００は、血液試料５０２を導入として処理することができる。システム５００は、少なくとも１つの入側貯留部５０８、バンプアレイ５１２、及び少なくとも１つの出側貯留部５１８を含み得る。システム５００の要素は単一の筐体に配置してもよく、個別の筐体に配したものを互いに連結してもよく、及び／又は、他の任意の配置としてもよい。バンプアレイ５１２としては、図１に示すバンプアレイ単一でも、及び／又は、図１に示すバンプアレイを複数配してもよく、後者の場合、これらを直列に接続し、及び／又は、相互に連結して、血液試料５０２を処理する目的に供してもよい。図５に示すように、流体試料は、例えば入側貯留部５０８から出側貯留部５１８へと向かう方向５２０に流れる。入側貯留部５０８は、例えば、血液導入口の両側に配されたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）容器５１０と、細胞溶解緩衝液５０４と、洗浄緩衝液５０６とを含む。血液試料は独立の導入口（又は入口）５４０に導入されて処理され、生成された細胞５１６（例えばＲＢＣ、ＷＢＣ等）がバンプアレイ５１２に導入されて処理される。ある態様によれば、バンプアレイは例えば、血液試料５０２を受容するように設計された、個別独立の導入口５４０を含む。それゆえ、導入口５４０（及び、以下の図６及び７との関連で図示及び説明される他の導入口）は、他の入側貯留部５０４及び５０６から物理的に分離された独立の導入口として機能し得る。血液試料導入口５０２は常に周囲の緩衝液導入口から物理的に個別独立とし、試料流路が明確に画定されるようにすると共に、the 所望の産物が底部流出領域の比較的明確に規定された位置に流出されるように構成してもよい。ある態様によれば、所望の流出液を受容する出側貯留部を（他の廃棄流との混合を防ぐ観点から）物理的に独立とすることを除き、他の出側貯留部は入側貯留部ほど明確に画定しなくてもよい。更に細胞は細胞溶解緩衝液５０４によって溶解され、生じた核５１４が更にバンプアレイ５１２で処理される。血液試料が処理される一方、細胞５１６、核５１４、及び血液試料の残分はバンプアレイ５１２で処理される。血液試料の残分は血漿５２２として出側貯留部に貯留される。細胞溶解緩衝液５０４による溶解処理物の残分を、溶解残滓として出側貯留部５２６に沈殿させてもよい。核５１４は出側核貯留部５２８に沈殿する。洗浄緩衝液の残部を出側緩衝液貯留部５２４に貯留させてもよい。システム５００を用いて、以下に図１０を用いて図示及び説明する処理操作１００２及び１００４を実施してもよい。また、当該システムを用いて、生体流体、例えば血液から細胞（例えば白血球）を精製し、溶解細胞から核を精製してもよい。
【００６５】
図６は、本発明のある態様に係る、流体試料を処理するためのシステムの別の例６００を示す図である。システム６００は、例えば、流体試料を処理し得る２つの分離した要素又は「チップ」６０２及び６０４を含む。チップ６０２は、導入される核試料に適したバンピングをし得るよう、比較的大きな臨界サイズを有する。システム６００を用いて単離細胞核から高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡを精製することができる。チップ６０２は、例えば入側貯留部６１２、バンプアレイ６１４、及び出側貯留部６１６を含む。チップ６０２は、粒子トラップ６１１を含んでいてもよい。チップ６０２は、核を受容するための分離された導入口（又は入口）６４０を含んでいてもよい。チップ６０４は、入側貯留部６３２、バンプアレイ６３４、及び出側貯留部６３６を含んでいてもよい。チップ６０４は、チップ６０２によって処理された材料、即ち、ＤＮＡ＋タンパク質６２１を受容するための分離された導入口（又は入口）６４１を含んでいてもよい。バンプアレイ６１４及び６３４は、図１に示すバンプアレイと同様とすることができる。チップ６０２、６０４における流体フローの全体的な方向を矢印６２０で示す。
【００６６】
チップ６０２は、核洗浄緩衝液６１０、グアニジンイソチオシアナート（ＧｕＳＣＮ）緩衝液６１３、及び緩衝液６１８（これは図５に示す洗浄緩衝液５０６と同様でもよい）を含み得る。核６１５分離導入口６４０に導入された後、バンプアレイ６１４においてＧｕＳＣＮ緩衝液６１３を通過することにより処理される。ＧｕＳＣＮは核を分離させ、全ての核タンパク質６１９をＤＮＡから除去する。ＤＮＡ及びタンパク質の有効直径はバンプアレイ６０２の臨界サイズよりも小さく、アレイからＧｕＳＣＮ溶解試薬流と共に出側容器６２１へと流出する。未融解核物質６２３は粒子トラップ６１１へと誘導される。ＨＭＷ ＤＮＡ及びタンパク質６１９は、ＤＮＡ＋タンパク質出側貯留部６２１へと流通し、その後に更なる処理を受けるべく、チップ６０４の入側試料貯留チャネルへと誘導される。
【００６７】
ＨＭＷ ＤＮＡ及びタンパク質６１９を核溶解物として、チップ６０２から、入側貯留部６３２（及び、特に入側貯留部６４１）で受容してもよい。図５と同様に、チップ６０２及びチップ６０４の入側貯留部６４０及び６４１は、共存する他の任意の材料との混合を避けるように設計してもよい。バンプアレイ６０４は、溶解された試料中のＨＭＷ ＤＮＡをバンプするのに適した、より小さな臨界サイズを有する。ＤＮＡは、バルク流体路（下方向）と共に流通するＧｕＳＣＮ及び変性核タンパク質から、右側のＤＮＡ緩衝液（通常は約１０〜５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５〜８．０、及び約１〜５ｍＭ ＥＤＴＡ）内へとバンプされてもよい。ＤＮＡ６３５は、チップ６０４の出側貯留部６３６の出側貯留部６３７において、バンプアレイから排出される。廃棄溶解流体流及び洗浄緩衝液の残分は、緩衝液出側貯留部６３９に配置されてもよい。以下に図１０を参照して例示及び議論される操作１００６を実施するのに、システム６００を用いてもよい。
【００６８】
図7は、本発明のある態様に係る流体試料の処理のためのシステムの別の例７００を示す図である。システム７００は、例えば入側貯留部７１０、ＨＭＷ ＤＮＡ試料を受容するための個別の導入口（又は入口）７４０、バンプアレイ７２０、及び出側貯留部７３０を含む。要素間の希釈及び／又は混合を防止するために、各入側貯留部７１０を離散的に構成してもよい。システム７００内を流通する流体試料流の全体的な方向を矢印７４０で示す。システム７００への導入流はＨＭＷ ＤＮＡ７０２であってもよく、これは例えば個別の導入口７４０で受容され、導入口のすぐ右にあるアレイに侵入する緩衝液を通じてパンプされる。その後、ＨＭＷ ＤＮＡ７０２はトランスポゼース試薬流７０４に侵入し、そこで図８に示すように、ＨＭＷ ＤＮＡが配列決定ライブラリーアダプターによって修飾される。図８に示すように、本発明のトランスポゾン試薬を用いた反応によれば、生成されたＨＭＷ共組込物を更にバンプすることが可能である。斯かる共組込物７１２を容器７１５から供給される洗浄緩衝液領域にバンプし、遊離アダプター基質及びトランスポゼースをＤＮＡから除去する。続いて、処理された物質を更に、遺伝子改変位置でアダプターを切断する制限酵素試薬流７０６にバンプし（図８Ｂ参照）、最終配列決定ライブラリーを遊離させてもよい。最終的なライブラリーは分子量が低いため、更にバンプすることはできない。結果として、最終的なライブラリー７１６はバンプアレイから制限酵素試薬流７１６と共に放出されてもよい。試薬７０６による処置の結果として放出される最終的な低分子量ライブラリー及び試薬７１６は、出側ポート（又は出口）に蓄積される。斯かる出側ポート（又は出口）は、最終ＬＭＷライブラリー＋試薬を受容すると共に、得られた最終的なＬＭＷライブラリー＋試薬がこのプロセスから排出される他の何らかの化合物と混合するのを防止するように設計されてもよい。トランスポゼース／制限酵素流体流によって処理されないＨＭＷ ＤＮＡはＨＭＷのまま残存するが、これをアレイの遠位右側の粒子トラップ７１４に通してもよい。システム７００を用いて、図１０により図示及び説明する操作１００８、１０１０、１０１２、１０１４を実施してもよい。
【００６９】
図８Ａは、自動バンプアレイ機器での使用に最適化可能な転位媒介ライブラリー生成システム８００を示す模式図である。トランスポゼース酵素を線状組換トランスポゾン基質に導入してもよい。線８０２及び８０４はｄｓＤＮＡ基質を表す。転位反応によって線状トランスポゾン基質をＨＭＷ ＤＮＡ標的内に挿入してもよい。共組込ＤＮＡ産物は転位後も高分子量のままであるため、反応後にトランスポゾン試薬流からバンプして排出させることができる。図８Ｂは、転位共組込物の構造を示す模式図である。ＮＧＳアダプター配列は、トランスポゾン端部に隣接して配置することができる。これにより各末端から挿入物内部への配列決定が可能となる。最終ライブラリーをＨＭＷ共組込から放出するには、アダプターにより終端された配列決定ライブラリーを共組込物の残部から放出させるように改変された制限酵素位置を配置し、斯かる制限酵素位置で切断すればよい（最終切断物は図示せず）。
【００７０】
ＮＧＳライブラリーの産生は本発明の態様の一例ではあるが、本システムには他にも多数の応用例が考えられる。図９はこの点を模式的に示す図であり、ここに示すシステム９００は、順番の定められた複数の処理工程を流体試料に実施するために、複数のバンプアレイ工程を逐次的に実行可能な、本発明のある態様に係るシステムの例である。システム９００は、図１〜７を用いて上に図示及び説明した何れかのシステムの要素と同様の要素を有し得る。システム９００は、例えば導入ソーティングアレイ９０２、第一の処理機構９０４、第二の処理機構９０６、及びサイズ分画アレイ９０８を含む。システム９００に侵入した流体試料は、全体的に方向９２０に進行する。導入ソーティングアレイ９０２に侵入した導入試料は、少なくとも１つの試薬を用いて洗浄及び／又はソートされ、ここで種々の「所望の細胞」（cells of interest）が産生される。他の要素は緩衝液に蓄積させてもよい。所望の細胞は、例えば第一の処理機構９０４で処理される。第一の処理機構９０４は、第一の試薬及び適切な緩衝液を含み得る。第一の処理機構９０４による処置の結果、第一の処理試料−試薬の組み合わせが生成される。続いて、この第一の処理試料−試薬の組み合わせは、例えば第二の処理機構９０６で処理される。第二の処理機構９０６は、第二の試薬及び適切な緩衝液を含み得る。第二の処理機構９０６による処置の結果、第二の処理試料−試薬の組み合わせが生成される。これは続いてサイズ分画アレイ９０８に移送され、ここで小さい粒子から大きい粒子へと順にソートされる。
【００７１】
これらのプロセスをどのように組み合わせるかという点に関しては、システムにフレキシビリティーを持たせてもよい。５つのプロセスを各々、単一機能のフローチップで実施しると共に、これらのチップを直列に連結する構成としてもよい。斯かる構成では、各チップから得られた産物を、それに続くチップの導入口に導入すればよい。或いは、互いに分離された複数の試薬流をチップ上に並列に配置し、各アレイの寸法を、各々の段階でパンプする必要がある中間物のサイズに応じて変更することにより、複数の工程を同一のチップで実施してもよい。
【００７２】
図１０は、本発明のある態様に係るバンプアレイを用いて、血液試料を連続的に処理する方法１０００を示す図である。符号１００２では、生体流体、例えば全血から細胞を分離する。数マイクロリットル（μＬ）の全血が得られる。血液細胞は血漿から分離してもよい。血漿から分離された細胞を緩衝流体流で洗浄してもよい。符号１００４では、細胞が溶解される。洗浄された細胞を、非イオン性界面活性剤（detergent）を含む試薬流にバンプすることにより溶解させる。溶解試薬を除去した後、無傷白血球核を洗浄緩衝液流体流に対して斜めにバンプしてもよい。細胞質構成成分は小さ過ぎてバンプされないため、界面活性剤溶解流体流に担持されてアレイから排出される。符号１００６では、染色体ＤＮＡが単離及び／又は精製される。洗浄された白血球核が核溶解試薬流に対してバンプされ、ＨＭＷ染色体ＤＮＡから全ての脂質及び核タンパク質が除去される。二本鎖ランダムコイル構造を取るＨＭＷ ＤＮＡが溶解試薬流から斜めにバンプされるように、アレイの寸法を選択することができる。核脂質、ＲＮＡ、及びタンパク質は何れも小さ過ぎてバンプされないため、溶解流体流に担持されてアレイから排出される。符号1008では、精製ＤＮＡを例えばトランスポゼース適合試薬と反応させ、ライブラリー共組込物を生成する。配列決定アダプター修飾トランスポゾン末端を予め導入されたトランスポゼース複合体を含む試薬流に対して、精製されたＨＭＷ ＤＮＡをバンプすることができる。本発明によればトランスポゼース複合体が提供される。斯かる複合体では、トランスポザゾーム（transposasome）のトランスポゾン適合末端が同一の線状ＤＮＡ上に存在してもよい。結果として、このシステムでは、トランスポザゾームとＨＭＷ ＤＮＡとの反応によって、ＨＭＷ ＤＮＡ標的のサイズを増加可能な共線上導入産物が生成される。標的ＤＮＡはバンプ可能のまま維持されるので、標的ＤＮＡをトランスポザゾーム試薬流及び未反応アダプターＤＮＡから分離することができる。符号１０１０では、ＨＭＷ共組込がトランスポゼース試薬流から精製される。符号１０１２では、共組込物を制限酵素と反応させることにより、配列決定ライブラリーが生成される。符号１０１４では、ライブラリーを未切断ＨＭＷ ＤＮＡから分離し、バンプアレイから回収する。ある態様によれば、ＨＭＷ共組込ＤＮＡを制限酵素試薬流に対してバンプすることにより、最終配列決定ライブラリーをＨＭＷ共組込ＤＮＡから切断することができる。この酵素は、修飾トランスポゾン内の配列決定アダプターのすぐ外側に存在する改変部位を切断し得る。切断されたライブラリーは分子量が小さいため（最大２００〜２０００ｂｐ）、もはやバンプされない。ライブラリーは制限酵素流体流と共にアレイから流出する。未切断未反応ＨＭＷ ＤＮＡは、試薬流から斜めにバンプ（及び回収）することができる。
【００７３】
ある態様によれば、本発明のシステムは、ミクロンサイズの柱部を有するアレイを含んでいてもよい。斯かる柱部は、流体試料を処理する目的の下、堅牢な構造と高いアスペクト比を有する。このバンプアレイは、シリコン、環状オレフィン樹脂、成型プラスチック製ディスポーザブルフローセル、その他任意の材料から作製される。
【００７４】
ある態様によれば、バンプアレイ及びシステムによって、生体原試料由来の精製又は処理済みポリ核酸検体や画分を分離、分画、分析、及び／又は回収することができる。
【００７５】
ある態様によれば、本発明では、バンプアレイでバンプ可能なマイクロ粒子に核酸を結合させることにより、より小さな核酸分子を処理することも可能である。斯かるマイクロ粒子は、それに結合された核酸を、核酸修飾用の試薬流を通じて運搬するための担体として機能する。例えば、プライマー修飾マイクロ粒子によるエマルションＰＣＲを、ＤＮＡ配列決定鋳型ビーズの生成に用いることができる（Ion Torrent and 454 sequencing methods; Rothberg et al. 2011. Nature v475, pp348-352; Margulies et al., Nature. V437, pp376-380）。ある態様によれば、エマルションＰＣＲ法を用いて、癌患者由来組織における希少変異遺伝子の頻度を評価することができる（Vogelsteinの“BEAMing”法；Diehl et al. Nature Methods. 2006 v3 pp 551-559）。ある態様によれば、本発明を用いれば、洗浄、変性、及びプライマーハイブリダイゼーションを単一のバンプアレイ処理に組み合わせることにより、粒子系エマルションＰＣＲを実施することができる。例えば、バンプアレイの設計に際して、アレイの臨界直径がエマルションＰＣＲに使用されるマイクロ粒子の臨界直径よりも小さくなるように、柱部間隔を決定すればよい。これによって、アレイ内の全ての位置で同様に、マイクロ粒子をバンプすることが可能となる。エマルションＰＣＲの後、エマルションを崩壊させ、水性粒子画分を右上側近傍のアレイに導入する。アレイに侵入した粒子は右側にバンプされる一方、ＰＣＲ試薬はバルクフローの方向と同じく下方に誘導される（方向流は例えば図５〜７に示すものと同様となる）。適切な洗浄緩衝液が、粒子導入口右側に隣接するアレイの上方に導入される。導入流体流からバンプされて導出された粒子は、洗浄緩衝流体流を通じて誘導される。余剰のＰＣＲ試薬を洗い流してもよい。更にアレイ下方へと進行した粒子は、変性試薬流（例えば約２０〜２００ｍＭのＫＯＨ又はＮａＯＨと、約１〜１０ｍＭのＥＤＴＡとを含む）へと侵入する。これにより粒子上の二本鎖アンプリコンが一本鎖形態へと転換される。非共有結合アンプリコン鎖を変性剤流体流と共にアレイから洗い流してもよい。粒子を更に右側にバンプし、例えば次段のハイブリダイゼーション反応に適した中和緩衝液へと誘導してもよい。通常、斯かる中和緩衝液は、緩衝液（例えば２０〜２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５〜８．０）と、ハイブリダイゼーションを支持するための一価イオン（例えば２０〜５００ｍＭのＮａＣｌ）とを含む。続いて、配列決定プライマー（454/Ion Torrent用の場合）又は標識オリゴヌクレオチドプローブ（BEAMing用の場合）を含むハイブリダイゼーション試薬流に対して、粒子をバンプしてもよい。斯かる試薬流は、例えば低マイクロモル濃度範囲（約０．１マイクロモルから約５０マイクロモル）のオリゴプローブを有していてもよく、また、上述の中和緩衝流体流と同等のイオン強度を有していてもよい。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを正確に設定するために、イオン強度は必要に応じて上下に調整してもよい。アレイの最終処理工程において、ハイブリダイズした粒子をハイブリダイゼーション流体流からバンプし、最終洗浄緩衝流体流に誘導してもよい。この最終洗浄緩衝液はその後段で使用される所望の用途（454/Ion用の場合は配列決定、BEAMing���ッセイの場合は蛍光粒子ソーティング）に応じて選択される。ハイブリダイズ及び洗浄済みの粒子は、アレイの右下側近傍に位置する最終洗浄緩衝液の出側ポートから回収される。
【実施例】
【００７６】
実施例１
全血から白血球核を精製するためのバンプアレイプロセス
単一のアレイによって図１０に示す操作１００２及び１００４を実施する。これらはそれぞれ血漿からの細胞の分離及び白血球核の単離を含む（図５に示す）。斯かるアレイは、図５に模式的に示すものであり、直径が＞３〜４μｍの全粒子をバンプするように設計される。臨界寸法をこのサイズに設定することで、細胞（赤血球細胞（ＲＢＣ）６〜８μｍ、白血球（ＷＢＣ）６〜１６μｍ）及び核（５〜９μｍ）が流通方向に対して斜めにバンプされる。血液はアレイ上の緩衝生理食塩水を満たした領域に誘導される。この領域にバンプされた細胞から、血漿が洗い落とされる。細胞は更にアレイに対して横方向に進行し、溶解緩衝液の流体流へと誘導される。溶解緩衝液は、ＲＢＣ及びＷＢＣを溶解させるが、ＷＢＣの核は溶解させないような濃度の非イオン性界面活性剤を含む。核は依然としてアレイの臨界直径（３〜４ｍｍ）よりも大きいので、細胞と同じく斜め方向の軌道を辿る。溶解緩衝液から放出された核は洗浄緩衝液（界面活性剤を含まない溶解緩衝液）の流体流に誘導され、アレイの右下側近傍の出側貯留部で回収される。
【００７７】
このアレイの柱部の間隔は、Davis et al., 2006. Proc Natl Acad Sci U S A. v103, pp14779-84（本文献はその全体が援用により本明細書に組み込まれる）に記載の細胞ソーティングアレイ（“ＦＤ”デバイス）を簡略化した構成を基とする。この装置では、柱部の直径は一定（２２μｍ）、ギャップのサイズも一定（図１の「Ｇ」、１０μｍ）であるが、列オフセットの距離（図１の「ｄ」）を小さな値から大きな値へと段階的に変化させている。Davisのアレイで使用されている最小のオフセット距離は約０．５μｍであり、これによればバンプされる臨界粒子直径は〜３μｍとなる。予測される核（及び細胞）の最小直径は〜５μｍであるから、斯かる構成は本システムの核単離アレイに適している。斯かる理由から、このシステムではアレイ全体を通じてオフセットを０．５μｍという一定の値とする。
【００７８】
アレイの全体寸法もDavisソーティングアレイから導かれる。斯かるアレイのスループットはＤＮＡ配列決定用途に適しているからである。この装置の処理速度は１時間当たり全血１μＬである。これは１時間当たりゲノムＤＮＡ約６６ｎｇ（１０４ＷＢＣ／μＬ×０．００６６ｎｇＤＮＡ／細胞）に相当する。ＮＧＳライブラリープロトコールに推奨される標準的なＤＮＡ導入量は着実に減少しており、熟練した研究者の中には５０〜１００ｎｇのゲノムＤＮＡを用いてライブラリーを再現性良く作製できるものもいる。
【００７９】
界面活性剤の濃度及び種類は、核の収量が最適化されるように、必要に応じて調整することができる。種々のチップ導入材料に割り当てる相対的なアレイ面積は、核の収量及び純度が最適化されるように検討すればよい。例えば、溶解緩衝液流体流の幅を調整することにより、細胞又は核の溶解試薬内での滞在時間を変更することができる。同様に、洗浄緩衝液流体流の幅を広げることにより、界面活性剤又は溶解された血液要素を核からより厳密に除去することができる。これらの事項の検討を容易にするために、チップの初期プロトタイプには、規則的な間隔を以って多数の入側貯留部を配置してもよい。斯かるプロトタイプでは、隣接する入側貯留部に試薬を充填することにより、試薬流の幅を広げることができる。
【００８０】
実施例２
単離された白血球核からＨＭＷ ＤＮＡを精製するためのバンプアレイプロセス
次のプロセスは細胞核からのＤＮＡの精製である。このシステムでは斯かる作業を実現するために、カオトロピック塩溶液（４Ｍチオシアン酸グアニジン、ＧｕＳＣＮ）を用いて核を溶解し、染色体タンパク質をＤＮＡから解離させている。カオトロープによる溶解は、一般的なＳＤＳ−プロテナーゼＫプロトコールよりも早くて確実である。高濃度のカオトロープの存在下で、酸化ケイ素表面に結合するのを防止するため、シリコンアレイをフルオロシランによって科学的に被覆する。
【００８１】
このプロセスには、柱部の配置が異なる複数のバンプアレイからなる組が用いられる（図６参照）。第一のアレイは、核（臨界粒子直径＝最大3〜4μｍ）をバンプするのに適した配置を有する。この領域では、導入された核の流体流がＧｕＳＣＮ流体流に誘導され、ここで核が溶解される。ＤＮＡ及び解離した核タンパク質は臨界粒子直径よりも小さく、溶解試薬と共に流通する。大型の粒子（＞3〜4μｍ）、例えば部分的に未溶解の核等は、右側にバンプされて装置右端の粒子トラップに捕捉される。このトラップは多数の入り口を有する蛇行（serpentine）流体チャネルであって、アレイの全長に亘って配置される。不所望の粒子はトラップチャネルに導入され、ここで長いチャネルをゆっくりと縦走しながら、ＤＮＡ精製プロセスを通じて維持される。ＤＮＡ及び変性タンパク質を有する溶解流体流は第二のアレイの導入口へと誘導される。第二のアレイは臨界粒子直径が約０．６μｍであり、＞〜４０ｋｂの二本鎖線状分子をバンプする。結果として、ＨＭＷ ＤＮＡはバンプされてＧｕＳＣＮ流体流から導出され、緩衝液流体流で洗浄されながら右側に移動し、右下隅の収集容器に誘導される。
【００８２】
このプロセスにおける最も重要な課題は、核が溶解し始める際にどのような挙動を示すかという点である。極めて大型の染色体サイズのＤＮＡ分子（＞２００ｋｂ）が、部分的に溶解された核から漏出し、アレイの柱部及び／又は他の核に絡まって、アレイに滞留してしまう恐れがある。関連する課題として、斯かる極めて大きなＤＮＡ分子は、たとえ精製された状態であっても、アレイに滞留してしまう恐れがあるという点も挙げられる。これらの課題を解消するために、例えば核の溶解前に低濃度のヌクレアーゼ又は化学的切断剤で核を処理し、核ＤＮＡの平均サイズを予め低減してもよい。好ましくは、平均ＤＮＡサイズを、バンプアレイ技術が好適に機能するサイズである５０〜２００ｋｂまで低減してもよい。好ましい試薬としては、ミクロコッカス・ヌクレアーゼやレアカット（rare−cutting）制限酵素等の二本鎖エンドヌクレアーゼが挙げられる。任意により、切断試薬流を第一のアレイにおいて核試料導入位置の右隣り（ＧｕＳＣＮ導入流体流の左）に配置することにより、核を溶解流体流に導入する前に切断剤に導入・導出することができる。或いは、切断プロセス工程を実施例１のアレイ（図１０の操作１００２の例）に挿入してもよい。
【００８３】
このプロセスにおける他の重要なパラメーターは、有効な溶解を達成するのに必要なＧｕＳＣＮ試薬への暴露時間である。ＧｕＳＣＮ層の幅、アレイのバンプ角度（アレイのギャップ及びオフセットを変更することにより調整可）、及びフロー速度が、暴露時間を変更する上で操作可能な臨界的変数となる。アレイを通過する核を顕微鏡観察することにより、溶解プロセスはリアルタイムで監視される。ＤＮＡの回収及び純度は、標準的なＤＮＡ及びタンパク質アッセイを用いて測定される。
【００８４】
実施例３
ＮＧＳライブラリー形成のためのバンプアレイプロセス
実施例２のアレイ（図１０に示す操作１００６及び１００８の例）により精製されたＨＭＷゲノムＤＮＡを、転位媒介ライブラリー形成反応（図７参照）を実施するアレイに導入する。斯かるライブラリーアレイのアレイ配置は、実施例２の第二のアレイ（図１０に示す操作１００８の例）と同様である。即ち、〜４０ｋｂ以上のＤＮＡが右にバンプされ、トランスポゼース系ライブラリー形成試薬流に導入される（図７参照）。
【００８５】
このライブラリー形成反応は、Nexteraライブラリーコンセプト（Epicentre Biotechnologies/Illumina）の変形である。Nexteraシステムに対して、本システムでは、両トランスポゾン末端を同一の線状二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子上に有する組換トランスポゾン基質を用いる（図８Ａ〜Ｂ参照）。転位反応によって、組換トランスポゾン全体がＨＭＷゲノム標的ＤＮＡ内に挿入される。この反応の重要な特徴は、共組込産物が高い分子量を有するため、バンプアレイプロセスを用いて、反応生成物を遊離トランスポゼース及び未反応トランスポゾン基質から分離できるという点である。
【００８６】
共組込ＤＮＡをトランスポゼース試薬流からバンプさせて導出（即ちトランスポゼース試薬流を除去）した後、共組込ＤＮＡを緩衝液流体流で洗浄し、制限酵素試薬流へと誘導する。制限酵素によってトランスポゾン末端５’側ＮＧＳアダプター配列の外側が切断される（図８Ａ〜Ｂ参照）。最終ライブラリーは低分子量であり（断片サイズは〜２００〜２０００ｂｐ）、制限酵素流体流と共にアレイから回収される。ライブラリーをシーケンサーに導入する前に、ライブラリーを更に精製して制限酵素を除去してもよい。
【００８７】
ＮＧＳライブラリーの構築に適したトランスポゼース酵素は市販されている（Nextera、変異Tn5トランスポゼース）。Epicentre社からは挿入突然変異及びSanger配列決定用の線状Tn5トランスポゾン基質も販売されている（EZ-Tn5(登録商標)＜oriV／KAN−2＞トランスポゾン導入キット）。ここで提案するバンプアレイプロセスの初期試験にはこれらの線状基質を用いる。例えば、市販のTn5-KAN-2 基質は、所定のＨＭＷ標的、例えばファージλＤＮＡに導入することができる。転位効率は最終ＤＮＡ産物の電気泳動、制限酵素マッピング（トランスポゾン及びλは各々単一の酵素XhoI部位を有する）、又はブロットハイブリダイゼーションにより決定される。
【００８８】
商業化に際しては、Tn5末端、ＮＧＳアダプター配列、及びライブラリー遊離用レアカット（rare-cutting）制限部位を有する組換トランスポゾン基質を、標準的な組換ＤＮＡ法を用いて構築する。或いは、他の高活性のインビトロ転位システム、例えばS. aureus由来のTn552を用いてもよい。
【００８９】
図１０に示す操作１０１４では、ゲノムＤＮＡ（及び試薬）を効率的に利用するために、二つの酵素ライブラリー構築反応が最適化される。前述のように、試薬濃度、バンプ角度、試薬流の幅、柱部アレイの間隔、及びフロー速度の何れを調整することによっても、試薬−ＤＮＡ接触時間を最適化することができる。
【００９０】
実施例４
ヒト血液試料からの細菌ＤＮＡの単離のためのバンプアレイプロセス
工程１．ＲＢＣ及びＷＢＣが溶解されるがＷＢＣ核は無傷に維持される条件下で、ヒト血液の試料を非イオン性界面活性剤で処理する（０．３２Ｍスクロース、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％ Triton X−100、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６）。これらの条件は細菌を溶解させるほど強くはないが、細菌は溶解物中で無傷細胞形態として維持される。
【００９１】
工程２．直径３〜４ミクロンの粒子をバンプさせるように設計された第一の柱部アレイに溶解物を導入する。実施例１の柱部アレイは本願に適した間隔を有する。溶解物を左上隅近傍のアレイに導入する。ＷＢＣ核や部分的に溶解されたヒト細胞等の大きな粒子は右にバンプされる一方、細菌細胞等のより小さい粒子はバルク流体フローと同方向、即ちアレイの左側を真下に向けて進行し、アレイ左側底部から回収される。
【００９２】
工程３．第一のアレイ（左側から）の小さな粒子を含む流出物は、細菌細胞をバンプするように設計された第二の柱部アレイ（バンプ臨界直径約０．７ミクロン）に導入される。斯かるアレイの設計法はMorton等の２００８年の文献に記載されている（Morton KJ, Loutherback K, Inglis DW, Tsui OK, Sturm JC, Chou SY, Austin RH. 2008. Lab Chip. v8, pp 1448-1453；本文献はその全体が援用により本明細書に組み込まれる）。第一のアレイからの小さな粒子の溶解物は、アレイの左上隅近傍に導入される。第二のアレイは、溶解物導入口の右側からアレイに侵入する３つの独立の試薬流を有するように構成される。試料及び試薬（試薬流１〜３）の計４つの導入口は洗浄緩衝液口によって隔てられ、バンプされた要素が次の試薬流に侵入する前に、低分子量化合物が洗い流されるように構成される。
【００９３】
工程４．溶解物フローが第二の柱部アレイに侵入すると、細菌細胞は溶解物流体流から右にバンプされ、等張洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．１２５Ｍスクロース；Morton et al., 2008）に導入される。細菌細胞は更にアレイの下方に移動しながら、右にバンプされて第一の試薬流に導入される。第一の試薬流は、等張洗浄緩衝液中に、細菌の細胞壁を分解する酵素（ニワトリ卵白リゾチーム、ムタノリシン（mutanolysin））と、細菌膜を溶解する界面活性剤とを含む（０．４ｍｇ／ｍｌのリゾチーム及びムタノリシン、８重量／体積％のスクロース、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１ＭのＮａＣｌ、０．５％のBrij 58、0.2％のデオキシコール酸）。細菌細胞はこの試薬流で溶解されるが、細菌染色体は核様体（nucleoid）と呼ばれる圧縮されたバンプ可能な形態で維持される（Worcel A, Burgi E. 1972. J. Mol. Biol. v71, pp 127-147；本文献はその全体が援用により本明細書に組み込まれる）。核様体が更にアレイ内を移動しながらバンプされ、緩衝液流体流に導入されると、ここで第一の試薬流の要素が除去され、核様体が次の試薬流に適した条件とされる（５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．９）。
【００９４】
工程５．核様体は第二の試薬流へとバンプされる。第二の試薬流は、希少配列特異性を有する制限酵素（例えば酵素NotI又はSfiI、何れもNew England Biolabsより入手可能）を、酵素活性を支持する緩衝液（NotIの場合、条件は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．９、１００マイクログラム／ｍｌウシ血清アルブミン、１ｍＭジチオトレイトール（thiothreitol））中に含む。この処理によって、細菌染色体はサイズ４０ｋｂ〜１０００ｋｂの断片に切断される（Smith CL, Econome JG, Schutt A, Klco S, Cantor CR. 1987. Science. v236, pp 1448-1453、本文献はその全体が援用により本明細書に組み込まれる）が、核様体は圧縮された形態のまま維持され、パッケージタンパク質との結合も維持される。制限酵素切断の目的は、核様体内の平均ＤＮＡ断片サイズを低減することにより、パッケージタンパク質がＤＮＡから除去される次段において、染色体ＤＮＡがアレイ内に滞留するのを防止することである。依然として折り畳まれた核様体はアレイを下方に進みながら、第二の試薬流からバンプされ、酵素を有しない洗浄緩衝液へと導入される（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）。
【００９５】
工程６．核様体は高濃度のカオトロープ（４Ｍグアニジンイソチオシアナート）を含む第三の試薬流に導入される。この処理によって、核様体は完全に遊離タンパク質とＤＮＡとに解離される。細菌ＤＮＡの大部分は４０ｋｂ超の断片に分解される。このサイズの線状ＤＮＡ分子は直径約１ミクロンの粒子としての挙動を示す（Robertson RM, Laib S, Smith DE. 2006. Proceedings of the National Acad USA. v103, pp 7310-7314、本文献はその全体が援用により本明細書に組み込まれる）ことから、細菌細胞及び核様体と同様にアレイ内で右にバンプされる。関連する核様体タンパク質は小さ過ぎてアレイによってバンプされず、カオトロープ試薬流と共にアレイをまっすぐ下降する。ＤＮＡはカオトロープ試薬流から右にバンプされて、ＤＮＡ貯蔵に適した最終緩衝液、或いは、次の処理工程に適した緩衝液へと侵入する。精製された最終ＤＮＡ産物はアレイ右下隅近傍のチャネルから排出される。
【００９６】
工程７．工程６の精製ＤＮＡを任意により、実施例１で説明したようなＤＮＡ配列決定ライブラリー生成用のアレイに導入してもよい。得られた配列情報は感染の診断や、感染生物の薬物耐性や感受性を決定することによる治療法決定の補助に用いることができる。
【００９７】
ある態様によれば、本発明は、種々の計算システム及び／又はコンピュータープログラム製品を用いて実施することもできる。斯かるシステム及び製品を用いて、本発明のシステム種々の要素を処理し、監視し、収集し、及び／又は、他の手法で補助することができる。斯かるコンピュータープログラム製品は、インストラクションを恒久的に保存するコンピューター読み取り可能媒体を含んでいてもよい。斯かるインストラクションは、１又は２以上の計算システムの１又は２以上のデータプロセッサーで実行した場合に、少なくとも１つデータプロセッサーに本明細書記載の動作を実施させる。同様に、斯かるコンピューターシステムは、１又は２以上のデータプロセッサーと、当該１又は２以上のデータプロセッサーに連結されたメモリーとを含み得る。メモリーは、本明細書に記載の１又は２以上の動作を少なくとも１つのプロセッサーに実施させるインストラクションを、一時的又は継続的に保存する。また、方法は１又は２以上のデータプロセッサーで実施してもよく、この場合は単一の計算システム内で行っても、２以上の計算システム間で分散させて実施してもよい。
【００９８】
本明細書に開示のシステム及び方法と一緒に使用可能な計算システム及び／又は製品は、種々の形態で実現することができる。例としてはデータプロセッサー、例えばデータベース、デジタル電子回路、ファームウェア、ソフトウェア、又はこれらの組み合わせを含むコンピューターが挙げられる。更には、本発明の開示の態様の上記の特徴や他の側面及び原理を、種々の環境で実現することができる。斯かる環境及び関連する用途は、本発明開示の態様に係る種々のプロセス及び操作を実施するように構築してもよいが、汎用のコンピューター又は計算プラットフォームを用いて、必要な機能を提供するコードにより選択的にアクチベート又はリコンフィギュアしてもよい。本明細書に開示のプロセスは何ら特定のコンピューター、ネットワーク、アーキテクチャー、環境、或いは他の装置等に限定されるものではなく、ハードウェア、ソフトウェア、及び／又はファームウェアの適切な組み合わせによって実現することができる。例えば種々の汎用機器を、本発明開示の態様の開示に応じて記載されたプログラムと共に用いてもよいが、必要な方法及び技法を実施するべく、専用の装置又はシステムを構築した方が効率的な場合もある。
【００９９】
本明細書に開示のシステム及び方法は、コンピュータープログラム製品、即ち機器により読み取り可能な保存装置や伝播シグナル等の情報媒体により具現化されるコンピュータープログラムとして実現することができる。斯かるプログラムは、例えばプログラム可能なプロセッサー、コンピューター、又は複数のコンピューター等のデータ処理装置の実行に、又はその操作を制御するために用いられる。コンピュータープログラムは、コンパイル言語かインタープリタ型言語かを問わず、如何なる形態のプログラミング言語で記載されたものでもよい。また、スタンドアロンプログラムか、モジュール、要素、サブルーチン等の計算環境での使用に適した任意のユニットかを問わず、いかなる形で展開されたものでもよい。コンピュータープログラムは単一のコンピューターで展開されて実施されてもよく、単一の場所に存在する複数のコンピューターや、複数の場所に分散されて通信ネットワークで連結された複数のコンピューターで展開されて実施されてもよい。
【０１００】
本明細書で使用する場合、「ユーザー」（user）という語は、ヒト又はコンピューターを含む任意の実体を指す。
【０１０１】
例えば第一、第二等の数詞は、文脈によっては順番を指すが、本明細書では必ずしも順番を指すとは限らない。例えば、数詞は単に、あるものを他の物から区別するために用いられる場合もある。例えば、第一の事象は第二の事象から区別する必要があるが、何らかの時系列や固定された参照系を必ずしも意味しない（即ち、本明細書のある段落における第一の事象は、本明細書の別の段落における第一の事象とは異なる場合がある。）。
【０１０２】
本明細書の上記の記載は、本発明を例示することを意図するものであり、本発明の態様の範囲を限定するものではない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定される。添付の特許請求の範囲には、他の態様も含まれる。
【０１０３】
ユーザーとのインターアクションを提供するべく、本明細書に記載の発明を実現するためのコンピューターは、例えばユーザーに対して情報を表示するためのディスプレイ装置（陰極線管（ＣＲＴ）又は液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）モニター等）と、ユーザーがコンピューターに情報を入力するためのキーボート又はポインティング装置（例えばマウスやトラックボール等）とを備える。他の種類の装置を用いてユーザーとのインターアクションを提供することも可能である。例えば、ユーザーに供されるフィードバックは、どのような形態の感覚的なフィードバックでもよい。例としては視覚的フィードバック、聴覚的フィードバック、触覚的フィードバックが挙げられる。ユーザーからのインプットもどのような形態でもよい。例としては、これらに限定されるものではないが、音響、言語、或いは触覚によるインプットが挙げらる。
【０１０４】
本明細書の上記の態様は、本明細書に記載の発明の全態様を表すものではない。そうではなく、これらは単に、本明細書記載の発明に関する側面に即した例を示すものに過ぎない。幾つかの変形例を上に詳細に記載したものの、他の修飾や付加も可能である。特に、本明細書に記載の特徴や変形に加えて、更なる特徴及び／又は変形を提供することも可能である。例えば上記記載の態様を、上記開示の種々の特徴の組み合わせ又はその一部の組み合わせ、及び／又は、上記開示の更なる特徴のうち幾つかの組み合わせ又はその一部の組み合わせに適用してもよい。更に、添付の図面に図示し、及び／又は、本明細書に記載したフローは、所望の結果を達成する上で、必ずしもそこに記載の特定の順序で逐次的に実施する必要はない。添付の特許請求の範囲には、他の態様も含まれる。
【０１０５】
本発明の方法及び要素の態様の例を本明細書に記載した。別途記載したように、これらの態様の例は例示目的で記載したにすぎず、限定的なものではない。他の態様も可能であり、これらも本発明によってカバーされる。斯かる態様は、本明細書の教示に接した当業者には明らかである。即ち、本発明の範囲は上記態様の一例に何ら限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲及びその均等物によってのみ定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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