(57)【要約】  本発明は、泡形成を低減するとともに、微生物における生物界面活性剤の発現を最大にする方法に関する。本方法は、微生物からの生物界面活性剤を沈殿させる工程を包含し、これは泡（form）形成の低減をもたらす。
2014513937.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞が生物界面活性剤を細胞外に分泌し、前記生物界面活性剤が発酵培地に可溶性である場合、前記発酵培地中での前記宿主細胞による前記生物界面活性剤の生産中に発泡する前記生物界面活性剤の発泡を抑制するための方法であって、前記宿主細胞による前記生物界面活性剤の生産と同時に、前記生物界面活性剤を不溶化する工程を含み、前記工程によって、前記不溶化された生物界面活性剤が発泡しないため発泡が抑制される、方法。
【請求項２】
前記生物界面活性剤が、ヒドロホビンＩＩ、ラムノ脂質、ソホロ脂質又はサーファクチンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記泡低下指数が１を超え、及び／若しくは前記泡低下指数が２を超え、及び／若しくは前記泡低下指数が３を超え、並びに／又は前記発酵培地中の可溶性生物界面活性剤の濃度が、最大で約１ｇ／ｋｇであり、並びに／又は生産された生物界面活性剤の少なくとも２５％が不溶化され、並びに／又は前記方法が、消泡剤を添加することなく行われ、並びに／又は前記方法が、不溶化なしで行われる方法と比較して低減された消泡剤の量を用いて行われ、並びに／又は前記方法が、沈殿剤の添加により及び／若しくは沈殿条件の適用により行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記方法が、発酵培地を生物反応器に供給する工程と、沈殿剤を添加し又は沈殿条件を適用する工程と、不溶化された生物界面活性剤を収集する工程と、発酵培地又は該発酵培地の成分又は宿主細胞を補充する工程と、場合により、不溶化生物界面活性剤とともに収集された任意の発酵培地又は該発酵培地の成分又は宿主細胞を再利用する工程と、を含む連続プロセスである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
宿主細胞が生物界面活性剤を細胞外に分泌し、前記生物界面活性剤が発酵培地に可溶性である場合、前記発酵培地中での前記宿主細胞による前記生物界面活性剤の生産中に発泡する前記生物界面活性剤の発泡を抑制するための方法であって、前記宿主細胞による前記生物界面活性剤の生産と同時に、前記生物界面活性剤を不溶化する工程を含み、前記工程によって、前記不溶化された生物界面活性剤が発泡しないため発泡が抑制され、泡低下指数が１を超え、及び／若しくは前記泡低下指数が２を超え、及び／若しくは前記泡低下指数が３を超え、並びに／又は前記発酵培地中の可溶性生物界面活性剤の濃度が、最大で約１ｇ／ｋｇであり、並びに／又は生産された前記生物界面活性剤の少なくとも２５％が不溶化され、並びに／又は前記方法が、消泡剤を添加することなく行われ、並びに／又は前記方法が、前記生物界面活性剤の不溶化なしで行われる方法と比較して低減された消泡剤の量を用いて行われ、並びに／又は前記方法が、沈殿剤の添加により及び／若しくは沈殿条件の適用により行われる、方法。
【請求項６】
生産中に発泡する、溶液中の生物界面活性剤の発泡を抑制するための方法であって、
前記生物界面活性剤の生産中、条件が泡形成を生じ得る地点と同時に、前記生物界面活性剤を不溶化する工程を含み、前記工程により、前記不溶化された生物界面活性剤が発泡しないため発泡が抑制される、方法。
【請求項７】
前記溶液が発酵培地を含み、前記生産が、前記発酵培地中での宿主細胞による前記生物界面活性剤の発現を含み、前記宿主細胞が前記生物界面活性剤を細胞外に分泌し、前記生物界面活性剤が前記発酵培地に可溶性であり、それにより泡形成が生じ得る、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、
発酵培地を生物反応器に供給する工程と、
沈殿剤を添加し又は沈殿条件を適用する工程と、
不溶化生物界面活性剤を収集する工程と、
溶液若しくは該溶液の成分又は宿主細胞を補充する工程と、場合により、不溶化生物界面活性剤とともに収集された任意の溶液若しくは該溶液の成分又は宿主細胞を再利用する工程と、を含む連続プロセスである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
生産中に発泡する生物界面活性剤の発泡を抑制するための方法であって、
溶液中での宿主細胞による前記生物界面活性剤の生産と同時に、前記生物界面活性剤を不溶化する工程と、
泡低下指数が１を超え、及び／若しくは前記泡低下指数が２を超え、及び／若しくは前記泡低下指数が３を超え、並びに／又は
前記溶液中の可溶性生物界面活性剤の濃度が、最大で約１ｇ／ｋｇであり、並びに／又は
生産された生物界面活性剤の少なくとも２５％が不溶化され、並びに／又は
前記方法が、消泡剤を添加することなく行われ、並びに／又は
前記方法が、不溶化なしで行われる方法と比較して低減された消泡剤の量を用いて行われるように、発泡を抑制する工程と、を含む、方法。
【請求項１０】
前記生物界面活性剤が、ヒドロホビンＩＩ、ラムノ脂質、ソホロ脂質又はサーファクチンを含む、請求項１、５、６又は９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞がトリコデルマリーゼイである、請求項１、５、６又は９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞がバチルスズブチルスである、請求項１、５、６又は９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記宿主細胞がバチルスリケニフォルミスである、請求項１、５、６又は９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記宿主細胞がアスペルギルス種である、請求項１、５、６又は９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１１年３月２９日出願の米国特許出願公開第６１／４６９，０６７号、及び２０１２年３月２８日出願の米国特許出願公開第１３／４３３，０３６号に対する優先権を主張する。２００９年１２月１７日にＰＣＴ国際公開第２００９／１５２１７６号として発行された２００９年６月９日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４６７８３号、及び２０１１年２月１７日にＰＣＴ国際公開第２０１１／０１９６８６号として発行された２０１０年８月１０日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４４９６４号が参照される。
【０００２】
前述の出願、並びにそこに又はそれらの審査中に引用されるすべての文書（「出願引用文献」）及びその出願引用文献において引用又は参照されるすべての文書、そして本明細書において引用又は参照されるすべての文書（「本明細書で引用される文書」）及び本明細書で引用される文書において引用又は参照されるすべての文書は、本明細書若しくは参照することにより本明細書に援用される任意の文書において言及される任意の製品の任意の製造者の指示、説明、製品仕様書、及び製品シートと一緒に、参照することにより本明細書に援用され、発明の実施において用いられてもよい。より詳細には、すべての参照文書は個々の各文書が特に、かつ個々に、参照することにより本明細書に援用されると示されるものと同一の範囲で、参照することにより本明細書に援用される。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、宿主細胞が生物界面活性剤を細胞外に分泌し、生物界面活性剤が発酵培地に可溶性である場合、発酵培地中での宿主細胞による生物界面活性剤の生産中に発泡する生物界面活性剤の発泡を抑制するための方法に関する。本方法は、宿主細胞による生物界面活性剤の生産と同時に、生物界面活性剤を不溶化する工程を含み又は生物界面活性剤を不溶化する工程から本質的になる。このやり方では、生物界面活性剤が発泡しないため、発泡が抑制される。この方法により、泡低下指数は１を超え、及び／又は泡低下指数は２を超え、及び／又は泡低下指数は３を超える。同様に、この方法により、更に又は代替的に、発酵培地中の可溶性生物界面活性剤の濃度は、最大で約１ｇ／ｋｇである。更に又は代替的に、及び／又は生産される生物界面活性剤の少なくとも２５％は不溶化される。更に又は代替的に、本方法は、消泡剤を添加することなく行われ、又は生物界面活性剤を不溶化しない場合に使用されるであろう消泡剤の量を低減する能力を提供し、例えば、生物界面活性剤を不溶化しない場合に使用されるであろう消泡剤の量を２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％以上低減させる。また、更に又は代替的に、本発明は回分式又は流加様式で行われてもよいが、本発明は有利には、連続的であるような方法に関する。本発明はまた、有利には生物界面活性剤が、例えば、ヒドロホビンＩＩなどのヒドロホビンであるような方法にも関連する。本発明ははた、有利には生物界面活性剤が、ラムノ脂質及びソホロ脂質などの糖脂質、又はサーファクチンなどのリポペプチドであるような方法にも関連する。尚、更に、本発明は、本発明の方法、特に本発明の連続的方法を行うための装置に関する。また更に、本発明は、生物界面活性剤の不溶化が、塩、アルコール、水混和性有機溶媒、水溶性ポリマー若しくは陽イオン性ポリマーなどの沈殿剤を加えることにより、又はｐＨを変化させることにより、又は温度を変化させることにより誘導される、本発明の方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
界面活性剤は、様々な工業界において広く使用されている化学製品であり、主として化学的に合成される。多様な微生物により生産される界面活性剤は、合成の対応物と比較して高い生分解性及び低い毒性プロファイルなどの、それらの独特の特性により注目されている。しかしながら、それらの生物学的に生産された界面活性剤の入手可能性及び費用は、一部には効率的な生産方法が存在しないため、限定されている。
【０００５】
工業規模でのタンパク質又は酵素生産用の効率的なシステムは、好気性水中発酵（aerobic submerged fermentation）と、その後の所望の製品を単離するための水性ベースの回収工程と、による。しかしながら、効率性を達成するには泡の抑制が重要である。
【０００６】
発泡は化学工業界、特に生化学的プロセスにおいて重大な問題である。泡は、界面活性剤及びタンパク質などの様々な物質の製造において、特に例えば、通気、揚送又は撹拌を含むものなどの、気液界面付近の有意な剪断力を含むプロセスにおいて、望ましくない結果として生成されることが多い。好気性水中発酵は、微生物が増殖し、所望の製品を生産するのに必要な酸素を供給するための十分な通気に依存する。発酵ブロス中への空気の導入により、微生物が泡を生成するのに必要な酸素が提供される。発酵中の泡の存在は一般に、発酵槽の作業容積又は生産性の低下、及び泡が排出口又はパイプを通じて発酵容器を出るのに十分な高さの、液体発酵ブロスの上方の泡の柱又は頭部の生成などの、フォームアウト（foam out）に関連した汚染の危険性を含む負の影響を、その性能に与える。
【０００７】
通常、消泡剤又は泡制止剤などの添加剤が使用されて、発酵中の泡形成を軽減する。回収工程中に消泡剤が必要に応じて添加されて、泡を抑制する。いくつかの回収プロセス、特に膜ベースの分離プロセスは、消泡剤の存在により悪影響を受ける。タンパク質又は酵素のエンドユーズ用途に応じて、その生産プロセス中に使用される消泡剤は、除去される必要があり、又は除去される必要はない。
【０００８】
しかしながら、泡抑制の化学的方法は、特に製品の品質が非常に重要である食品、飼料及び医薬工業界では、泡抑制により生じ得る問題（即ち、汚染、物質移動の減少）に関連して常に所望されるわけではない。消泡剤は通常、疎水性であるため、滅菌が困難であり、このことは食品及び医薬工業会において問題を提示し得る。加えて、これらの工業界における法的要求事項は、消泡剤及び泡制止剤に使用される、容認できる化学物質（chemistry）を制限している。
【０００９】
残念なことに、工業的規模でタンパク質又は酵素を生産するための従来の水中好気性発酵及び回収プロセスは、生物界面活性剤の生産、即ち生物学的に生産される界面活性剤分子に効率的に適用することができない。これらの分子の界面活性は、同一の培養条件下で、生物界面活性剤分子を発現しない同一の微生物の場合と比較して、発酵ブロス内で遙かに多量の泡を生じるであろう。
【００１０】
消泡剤の添加は、通常、問題の満足な解決法ではない。過剰な泡形成の防止に大量の消泡剤が必要であるだけでなく、界面活性剤が、目標とする用途において意図されるように機能するために、消泡剤を除去することが一般に必要である。場合によっては、大量の消泡剤の添加と、発酵槽容積の比較的小さい作業割合でさえも発泡の抑制に有効ではない。過剰な発泡と、消泡剤の使用による抑制されていない発泡とに関連した課題は、下流の回収工程に継続している。界面活性剤は洗浄力を求められているため、生産工程中に添加された消泡剤は、一般に、除去される必要がある。
【００１１】
本出願におけるいずれの文書の言及又は識別も、そのような文書が本発明の先行技術として利用できることを承認するものではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は部分的に、発酵ブロスに沈殿剤を添加することによって、生物学的に発現された界面活性剤が沈殿し、発泡が低減され、泡が戻らないという本発明者らの驚くべき発見に基づく。
【００１３】
本発明は、微生物により発現される１種以上の界面活性剤を含み得る水性溶液の生産において、泡を抑制することに関する方法及び／又は使用を記載する。このことは、泡形成界面活性剤が不溶化されるように溶液を適切に調整することにより達成することができる。適切な調整には、沈殿、結晶化、及び／又は界面活性剤を不溶性とし、若しくは臨界ミセル濃度を低下させる任意の他の操作を挙げることができる。
【００１４】
本発明は、宿主細胞が生物界面活性剤を細胞外に分泌し、生物界面活性剤が発酵培地に可溶性である場合、発酵培地中での宿主細胞による生物界面活性剤の生産中に発泡する生物界面活性剤の発泡を抑制するための方法及び／又は使用を包含し、方法及び／又は使用は、宿主細胞による生物界面活性剤の生産と同時に、生物界面活性剤を不溶化する工程を含むことができ、工程によって、不溶化された生物界面活性剤が発泡しないため発泡が抑制される。
【００１５】
本発明はまた、宿主細胞が生物界面活性剤を細胞外に分泌し、生物界面活性剤が発酵培地に可溶性である場合、発酵培地中での宿主細胞による生物界面活性剤の生産中に発泡する生物界面活性剤の発泡を抑制する方法及び／又は使用を包含し、方法及び／又は使用は、宿主細胞による生物界面活性剤の生産と同時に、生物界面活性剤を不溶化する工程を含むことができ、工程によって、不溶化された生物界面活性剤が発泡しないため発泡が抑制され、泡低下指数が１を超え、及び／若しくは泡低下指数が２を超え、及び／若しくは泡低下指数が３を超え、並びに／又は発酵培地中の可溶性生物界面活性剤の濃度が、最大で約１ｇ／ｋｇであり、並びに／又は生産された生物界面活性剤の少なくとも２５％が不溶化され、並びに／又は方法が、消泡剤を添加することなく行われ、並びに／又は方法が、生物界面活性剤の不溶化なしで行われる方法と比較して低減された消泡剤の量を用いて行われる。
【００１６】
本発明は、適切なプロセス条件の選択により生物界面活性剤の可溶濃度を低下させることによる、生物界面活性剤が溶液中にある際に、生物界面活性剤により生じる泡形成を低減又は排除するための方法及び／又は使用を提供する。生物界面活性剤の溶解度の低下をもたらすプロセス条件は、生物界面活性剤の性質に依存する。そのようなプロセス条件は、温度及び／又は圧力などの物理的条件の適切な選択を包含することができる。そのようなプロセス条件は更に、生物界面活性剤が存在する液体培地の化学組成を包含することができる。そのような組成の可能な選択は多数存在し、生物学的処理の当業者に周知である。溶解条件を調節する化学的方法は、ｐＨ緩衝化学物質、無機又は有機の酸又は塩基の塩、アルコール、有機溶媒、ポリマー、ポリオール、タンパク質、吸着剤、核酸、脂質を含む、生物界面活性剤を不溶化する添加剤の使用を包含する。この溶解度変更化学物質のリストは、網羅的又は限定的なものではない。
【００１７】
本発明はまた、泡抑制を含む、生物界面活性剤を調製する方法及び／若しくは使用を含み、又は方法及び／若しくは使用の態様を本明細書に提供する。
【００１８】
したがって、本発明は、その場での不溶化、即ち発現と同時の不溶化、例えば、微生物により発現される界面活性剤、即ち生物界面活性剤のその場での不溶化に関し、不溶化は、生物界面活性剤を調製するための回分式プロセス又は連続プロセスを含み、回分式プロセス又は連続プロセスは、その場での不溶化、即ち発現と同時の不溶化、生物界面活性剤のその場での不溶化を含む。不溶化は、沈殿、結晶化、［欧州特許第１３２０５９５号、Ｙｏｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．；Ｓｙｌｄａｔｋ  ｅｔ  ａｌ．／１９８４；Ｄｅｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．／１９９３により］及び／又は界面活性剤を不溶性とする又は臨界ミセル濃度を低下させる任意の他の操作であってもよい。有利には、不溶化は、塩、アルコール、水混和性有機溶媒、水溶性ポリマー若しくは陽イオン性ポリマー（非限定的にＣ５８１など）などの沈殿剤の添加を含み、又は該添加から本質的になり、あるいは不溶化は、ｐＨの低下などのｐＨ調整を含み、又は該調整から本質的になる。不溶化は、温度及び／又は圧力の調整、例えば、温度の上昇又は加熱を含み、又は該調整からなる。特に有利な実施形態では、生物界面活性剤の調製における消泡剤の使用は低減されるか又は完全に回避される。有利な実施形態では、生物界面活性剤、例えば、ヒドロホビンＩＩなどのヒドロホビンは、約０．１ｇ／ｋｇ未満の濃度で溶液中に存在する。
【００１９】
本発明は、生産中に発泡する、溶液中の生物界面活性剤の発泡を抑制するための方法及び／又は使用にも関し、方法及び／又は使用は、生物界面活性剤の生産中、条件が泡形成を生じ得る時点と同時に、生物界面活性剤を不溶化する工程を含んでもよく、工程により、不溶化された生物界面活性剤が発泡しないため、発泡が抑制される。
【００２０】
別の実施形態では、本発明はまた、生産中に発泡する生物界面活性剤の発泡を抑制するための方法及び／又は使用に関連し、方法及び／又は使用は、溶液中での宿主細胞による生物界面活性剤の生産と同時に、生物界面活性剤を不溶化する工程と、泡低下指数が１を超え、及び／若しくは泡低下指数が２を超え、及び／若しくは泡低下指数が３を超え、並びに／又は溶液中の可溶性生物界面活性剤の濃度が、最大で約１ｇ／ｋｇであり、並びに／又は生産された生物界面活性剤の少なくとも２５％が不溶化され、並びに／又は方法が、消泡剤を添加することなく行われ、並びに／又は方法が、不溶化なしで行われる方法と比較して低減された消泡剤の量を用いて行われるように、発泡を抑制する工程を含んでもよい。
【００２１】
更なる別の実施形態では、本発明は、生産中に生物界面活性剤の発泡を抑制するための方法及び／又は使用に関し、方法及び／又は使用は、生物界面活性剤の生産中に組成物中の条件を制御して泡を低減する工程を含んでもよく、工程は、泡低下指数が１を超え、及び／若しくは泡低下指数が２を超え、及び／若しくは泡低下指数が３を超え、発酵培地中の可溶性生物界面活性剤の濃度が最大で約１ｇ／ｋｇであり、並びに／又は生産された生物界面活性剤の少なくとも２５％が不溶化され、並びに／又は方法が、消泡剤を添加することなく行われ、並びに／又は方法が、不溶化なしで行われる方法と比較して低減された消泡剤の量を用いて行われ、並びに／又は方法が、ｐＨ約４．０で行われるように、組成物中の条件を調整して発泡を低減する工程を含んでもよい。
【００２２】
本発明の利益は、発酵、回収、配合、保管、取り扱い、及び輸送を含む、生物界面活性剤処理の全部の段階に適用される。特に、本利益は、非限定的に混合、揚送及び気体放出などの通気を含む生物界面活性剤処理の段階に特に適用される。
【００２３】
本発明は更に、本明細書に記載した方法若しくはプロセス又はその態様の実施に使用されるものを含む、本明細書に記載した装置を含む。
【００２４】
したがって、出願人が本権利を所有し、それによって任意の以前に既知の産物、プロセス、又は方法の権利否認を告知するように、任意の以前に既知の産物、その産物を作製するプロセス、又はその産物を使用する方法を本発明に包含しないことは、本発明の目的である。本発明は、出願人が本権利を所有し、それによって任意の前述の産物、その産物を作製するプロセス、又はその産物を使用する方法の権利否認を告知するように、ＵＳＰＴＯ（３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２、第１パラグラフ）又はＥＰＯ（ＥＰＣ条項８３）の文書記述及び実施可能要件を満たさない、任意の産物、その産物を作製するプロセス、又はその産物を使用する方法を本発明の範囲内に包含することを意図しないことに更に注意する。
【００２５】
本開示において、特に請求項及び／又はパラグラフにおいて、「含む（comprises、comprised、comprising、及び同様の語）」などの用語は、米国特許法においてそれに属する意味を有し得、例えば、それらは「含む（includes、included、including、及び同様の語）」などの用語を意味し得ること、並びに「から本質的になる（consisting essentially of及びconsist essentially of）」などの用語は、米国特許法においてそれらに帰する意味を有し、例えば、それらは明示的に列挙されない要素を許可するが、先行技術において見出されるか、又は発明の基本的特徴若しくは新規特徴に影響する要素を除外することに注意するべきである。
【００２６】
「から本質的になる」の使用により、当該技術分野において入手可能な任意の程度で、米国特許出願公開第２０１００１５１５２５号、並びに例えば、主題及び／又は特許法により（例えば、欧州特許第０８１７１８６８号であり又は該特許の優先権を主張し又は該特許と同一のファミリーに属することにより）それと等価の任意の文書に対して区別されることに特に言及する。例えば、本発明では、カラギーナンの任意の使用にはｐＨの低下、特に例えば３．０若しくは３．５未満への低下及び／又はイオン強度の調整が付随する必要はなく、またｐＨの任意の低下にはカラギーナンの使用及び／又はイオン強度の調整が付随する必要はなく、またイオン強度の任意の調整にはｐＨの低下及び／又はカラギーナン使用が付随する必要はない。したがって、「から本質的になる」は、カラギーナンを添加し、３．５、又は３未満のｐＨを有すること、又はカラギーナンを添加し、３．５又は３未満のｐＨを有し、イオン強度を調整することなどの先行技術の要素を排除する。
【００２７】
また所定の用語は、特に、当該技術分野にあり得る任意の文書に存在するものを排除することを意図することにも言及する。例えば、用語「生物界面活性剤」は、特に、ＰＣＴ国際公開第２００９／１５２１７６号の酵素の主題を除外することを意図する。同様に、添加された消泡剤を有することなく又は添加された消泡剤の不在下で実施する、という表現は、消泡剤の存在又は添加を許可する文書、例えば、米国特許出願公開第２０１００２９１６３０号、及びそれと等価の任意の文書に対して区別するものである。
【００２８】
これら及び他の実施形態は、開示されるか、又は以下の詳細な説明から明らかであり、それらによって包含される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
例として示されるが、説明される特定の実施形態のみに発明を限定することを意図しない以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて最もよく理解され得る。
【図１】混合後のヒドロホビン溶液（左）と、混合及び熱処理後のヒドロホビン溶液（右）。
【図２】変更された発酵を用いて生成されたヒドロホビンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのスペクトル。７１８０のピークは、完全長ヒドロホビン分子に対応する。
【図３Ａ】代表的な生物反応器。細胞、培地、及び／又は栄養素は、インプット１０２を経由して反応器１００に提供されてもよい。インプット１０２は、容器への生物及び／又は培地の供給を制御するのに使用される弁１０４を含んでもよい。細胞及び培地は、インプット１０２を経由して提供されてもよい。多数のセンサ１０６が反応器１００内の至る所に配置されてもよい。センサ１０６は、データをコントローラ１０８、１１０に提供する。コントローラ１０８、１１０は、細胞、培地、栄養素、沈殿剤及び／又は他の構成成分の量を制御することが可能である。沈殿した構成成分は、センサ１０６を使用して検出することできる。いくつかの実施形態では、反応器１００内に窓１１６が存在して、ユーザーが反応器内の状態を観察することを可能にしてもよい。コントローラ１０８は、アウトプット弁１１２に接続されている。コントローラ１１０は、弁１１２を開放して沈殿物がアウトプット１１４を経由して槽を離れるように弁１１２に命令することができる。いくつかの実施形態では、必要に応じてユーザーインプットが弁１１２に対する開放及び／又は閉鎖の命令を制御することが可能であってもよい。栄養素は、インプット１１８を使用して、反応器に提供されてもよい。インプット１１８は供給装置１２０に連結されて、反応器１００に栄養素を提供してもよい。いくつかの実施形態は、ミキサー１２２を含んで、反応器内での構成成分の混合を促進する。
【図３Ｂ】代表的な生物反応器。細胞、培地、及び／又は栄養素は、インプット１０２を経由して反応器１００に提供されてもよい。インプット１０２は、容器への生物及び／又は培地の供給を制御するのに使用される弁１０４を含んでもよい。細胞及び培地は、インプット１０２を経由して提供されてもよい。多数のセンサ１０６が反応器１００内の至る所に配置されてもよい。センサ１０６は、データをコントローラ１０８、１１０に提供する。コントローラ１０８、１１０は、細胞、培地、栄養素、沈殿剤及び／又は他の構成成分の量を制御することが可能である。沈殿した構成成分は、センサ１０６を使用して検出することできる。いくつかの実施形態では、反応器１００内に窓１１６が存在して、ユーザーが反応器内の状態を観察することを可能にしてもよい。コントローラ１０８は、アウトプット弁１１２に接続されている。コントローラ１１０は、弁１１２を開放して沈殿物がアウトプット１１４を経由して槽を離れるように弁１１２に命令することができる。いくつかの実施形態では、必要に応じてユーザーインプットが弁１１２に対する開放及び／又は閉鎖の命令を制御することが可能であってもよい。栄養素は、インプット１１８を使用して、反応器に提供されてもよい。インプット１１８は供給装置１２０に連結されて、反応器１００に栄養素を提供してもよい。いくつかの実施形態は、ミキサー１２２を含んで、反応器内での構成成分の混合を促進する。
【図４】実施例２０に記載するような塩化カルシウム処理後に測定した、サーファクチンを含むバチルスリケニフォルミス（Bacillus licheniformis）発酵ブロス内での泡形成の低下。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
特に定義しない限り、本明細書で用いる技術的及び科学的用語は、当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。以下の略称及び／又は用語は、明確さのために定義される。
【００３１】
本明細書で使用される「生物界面活性剤」又は「生物学的に生産された界面活性剤」は、「発泡を起こす」物質に関連する。生物界面活性剤又は生物学的に生産された界面活性剤は、水と疎水性液体との間又は水と空気との間の界面張力などの表面張力を低下させることができ、生物システムから生成又は獲得することができる。生物界面活性剤又は生物学的に生産された界面活性剤は、タンパク質、糖脂質、リポペプチド、リポタンパク質、リン脂質、中性脂質又は脂肪酸であってもよい。生物界面活性剤は、ヒドロホビンを含む。生物界面活性剤は、サーファクチン、ペプチド−脂質、セラウェッチン、ビスコシン、サブチリシン、グラミシジン、ポリミキシンなどのリポペプチド及びリポタンパク質を含む。生物界面活性剤は、ラムノ脂質、ソホロ脂質、トレハロ脂質（trehalolipid）及びセロビオ脂質（cellobiolipid）などの糖脂質を含む。生物界面活性剤は、エマルサン（emulsan）、バイオディスパーサン（biodispersan）、マンナン−脂質−タンパク質、リポサン（liposan）、炭水化物−タンパク質−脂質、タンパク質ＰＡなどのポリマーを含む。生物界面活性剤は、ベシクル、線毛、及び細胞全体などの微粒子を含む。生物界面活性剤は、サポニンなどの配糖体を含む。生物界面活性剤は、フィブロインなどの繊維性タンパク質を含む。生物界面活性剤は、天然に存在し、又は天然に見出されない変異誘発された若しくは遺伝子組み換えされた変異体であってもよい。この変異体には、生物界面活性剤の溶解度を低下させることにより発泡を抑制することを助ける、溶解度を低下させるように操作された、本発明による生物界面活性剤変異体が含まれる。生物界面活性剤には、本明細書に記載するような、関連する生物界面活性剤、誘導性生物界面活性剤、変異性生物界面活性剤及び相同性生物界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
本明細書で使用される「生物システム」は、微生物、植物、真菌、昆虫、脊椎動物、又は合成生物学により創造された生命形態などの生物を含み、又は該生物に由来する。生物は、伝統的な繁殖、クローン選択、突然変異誘発、及び遺伝的多様性を形成する同様の方法により得られる、天然に見出されない変異体であってもよく、又は組み換えＤＮＡ技術により得られる、遺伝子組み換えされた生物であってもよい。生物は、その全体が使用されてもよく、又は器官培養物、植物栽培品種、懸濁細胞培養物、細胞培養物、接着細胞培養物、若しくは細胞フリー調製物などの、構成成分の供給源であってもよい。
【００３３】
生物システムは、生物界面活性剤を隔離する際、生細胞を含んでも又は含まなくてもよい。生物システムは、天然源から見出され若しくは収集されてもよく、又は飼育、栽培されてもよく、又は工業的条件下で増殖されてもよい。生物システムは、供給された前駆体若しくは栄養素から生物界面活性剤を合成してもよく、又はその環境から生物界面活性剤を富ませてもよい。
【００３４】
本明細書で使用される「生産」は、化学製品及び生物学的製品を生産するための製造方法に関し、回収、収集、圧縮、瀉血、解離、均質化、すり潰し、醸造、発酵、回収、固液分離、細胞分離、遠心分離、濾過（真空濾過など）、配合、保管又は輸送を含むが、これらに限定されない。
【００３５】
本明細書で使用される「プロセス条件」は、本発明の方法に関与する溶媒及び／又は物理的パラメータ（非制限的に温度、圧力、混合又はｐＨなど）の選択を指す。
【００３６】
本明細書で使用される「溶媒」又は「溶液」は、非限定的に身体部分、植物断片、生細胞又は死細胞などの、不溶性生物界面活性剤以外の浮遊粒子を含んでもよい液体に関する［欧州特許第１３２０５９５号、Ｙｏｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．；Ｓｙｌｄａｔｋ  ｅｔ  ａｌ．／１９８４；Ｄｅｓａｉｅｔ  ａｌ．／１９９３により］。
【００３７】
本明細書で使用される「可溶性」は、溶媒又は溶液に溶解される物質に関する。
【００３８】
本明細書で使用される「泡」は、液体中、ゲル中又は半固体中に捕捉される気体泡により形成される物質に関する。
【００３９】
本明細書で使用される「オーバーラン」は、発泡した溶液の体積−開始体積を、開始体積で除算した計算値であり、割合又は百分率として報告される。ゼロのオーバーランは、溶液が泡を含まないことを意味する。ゼロに近い数は、溶液が非常に少ない泡を有することを意味する。初期サンプルが既に泡を含む場合、計算において初期体積を初期重量で置き換える。
【００４０】
本明細書で使用される「泡低下指数」、「泡抑制指数」、又は「泡排除（knockout）指数」は、泡を抑制する処理の有効性の評価基準である。これは、処理溶液に対する未処理溶液のオーバーランの比である。約１に等しい泡低下指数は、未処理及び処理生物界面活性剤溶液が同一のオーバーランを有すること、換言すれば、処理が改善を提供しないことを意味する。１を超える任意の数は、泡低下が存在すること、処理が改善を提供することを意味する。
【００４１】
本明細書で使用される「泡抑制」、「泡低下」又は「泡排除」は、泡を防止、阻止、粉砕、又は破壊することにより、溶液中の泡を低減する作用に関する。
【００４２】
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを指すために互換的に使用される。アミノ酸残基について、本明細書では従来の１文字コード又は３文字コードが使用される。ポリマーは直鎖又は分枝鎖であってよく、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断され得る。この用語は、自然に又は介在によって、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば、標識成分との共役によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、１つ以上のアミノ酸類似体（例えば、非天然アミノ酸、Ｄ−アミノ酸などを含む）を含むポリペプチド、及び当該技術分野で既知の他の変更もまた、この定義の中に含まれる。
【００４３】
本明細書で使用される「培養溶液」は、所望の生物界面活性剤、及び他の可溶性又は不溶性の構成成分を含む液体である。そのような構成成分には、他のタンパク質、例えば、細胞又は細胞残屑、核酸、多糖、脂質、消泡剤などの化学物質、凝集剤、塩、糖、ビタミン、増殖因子、沈殿剤などの非タンパク質性不純物が挙げられる。「培養溶液」は、「タンパク質溶液」、「液体培地」、「透析濾過（diafiltered）ブロス」、「透明化ブロス」、「濃縮物」、「調整培地」、「発酵ブロス」、「溶菌ブロス」、「溶菌液」、「細胞ブロス」、又は単に「ブロス」とも称され得る。存在する場合、細胞は、細菌性、真菌性、植物、動物、ヒト、昆虫、合成性などであってもよい。
【００４４】
本明細書で使用される用語「回収」は、生物界面活性剤と１種以上の不必要な構成成分とを含む液体培養物が、水、細胞及び細胞残屑、他のタンパク質、アミノ酸、多糖、糖、ポリオール、無機又は有機塩、酸及び塩基、並びに微粒子材料などの不必要な構成成分の少なくともいくつかから生物界面活性剤を分離するプロセスに供される、プロセスを指す。
【００４５】
本明細書で使用される「生物界面活性剤製品」は、消費者などのエンドユーザに提供するのに好適な生物界面活性調製物を指す。生物界面活性剤製品は、添加されて又は維持されて機能的保存期限を延長し、又は生物界面活性剤のエンドユーズ用途を容易にする、細胞、細胞残屑、培地構成成分、緩衝剤などの配合賦形剤、塩、防腐剤、還元剤、糖、ポリオール、界面活性剤などを含んでもよい。
【００４６】
本明細書で使用されるように、機能的に及び／又は構造的に類似する生物界面活性剤は、「関連する生物界面活性剤」であると見なされる。そのような生物界面活性剤は、異なる属及び／若しくは種の生物に由来してもよく、又は更には、異なる生物の綱（例えば、細菌及び真菌）に由来してもよい。関連生物界面活性剤は、一次配列分析によって決定されるか、三次構造分析によって決定されるか、又は免疫学的交差反応性によって決定される、相同体も包含する。
【００４７】
本明細書で使用するとき、用語「誘導性生物界面活性剤」は、Ｎ−末端及びＣ−末端のいずれか若しくは両方に１つ以上のアミノ酸を付加することにより、アミノ酸配列中の１つ若しくは多数の異なる部位で１つ以上のアミノ酸を置換することにより、及び／又はタンパク質のいずれか若しくは両方の末端で又はアミノ酸配列中の１つ以上の部位で１つ以上のアミノ酸を欠失させることにより、及び／又はアミノ酸配列中の１つ以上の部位で１つ以上のアミノ酸を挿入することにより、生物界面活性剤から誘導されるタンパク質ベースの生物界面活性剤を指す。生物界面活性剤誘導体の調製は、天然タンパク質をコードするＤＮＡ配列を改変し、このＤＮＡ配列により好適な宿主を形質転換させ、改変されたＤＮＡ配列を発現させてタンパク質誘導体を形成することにより、達成されてもよい。「誘導性生物界面活性剤」は、合成中又は合成後のいずれかに脂質又は炭水化物部分がタンパク質主鎖に結合された生物界面活性剤誘導体も包含することができる。
【００４８】
本明細書で使用される用語「誘導性生物界面活性剤」又は「変異性生物界面活性剤」は、１つ以上の脂質及び／若しくは糖を付加することにより、１つの若しくは多数の異なる部位を１つ以上の脂質及び／若しくは糖で置換することにより、及び／又は分子のいずれかの若しくは両方の末端で若しくは構造内の１つ以上の部位で、１つ以上の脂質及び／若しくは糖を欠失させることにより、並びに／又は構造内の１つ以上の部位に１つ以上の脂質及び／又は糖を挿入することにより、生物界面活性剤から誘導された脂質及び／又は糖ベースの生物界面活性剤を指してもよい。
【００４９】
関連（及び誘導性）生物界面活性剤には、「変異性生物界面活性剤」が含まれる。タンパク質ベースの変異性生物界面活性剤は、少数のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入により、参照／親生物界面活性剤、例えば、野生型生物界面活性剤とは異なる。異なるアミノ酸残基の数は、１つ以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、又はそれ以上のアミノ酸残基であり得る。変異性生物界面活性剤は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は更には、少なくとも約９９％、又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を野生形生物界面活性剤と共有する。変異性生物界面活性剤は、選択したモチーフ、ドメイン、エピトープ、保存領域などにおいても参照生物界面活性剤とは異なり得る。
【００５０】
本明細書で使用される用語「類似配列」は、生物界面活性剤と類似する機能、三次構造、及び／又は保存残基を提供する、タンパク質ベースの生物界面活性剤中の配列を指す。例えば、α−立体らせん又はβ−シート構造を含むエピトープ領域において、類似配列における置き換えアミノ酸は、好ましくは同一の特定構造を維持する。この用語は、ヌクレオチド配列、並びにアミノ酸配列も指す。いくつかの実施形態では、類似配列は、置き換えアミノ酸が、類似する機能又は改善された機能を示す変異酵素を生じるように開発される。いくつかの実施形態では、生物界面活性剤におけるアミノ酸の三次構造及び／又は保存残基は、所望のセグメント若しくは断片に位置するか、又はその付近に位置する。したがって、所望のセグメント又は断片が、α−立体らせん又はβ−シート構造を含む場合、置き換えアミノ酸は、好ましくはその特定の構造を維持する。
【００５１】
本明細書で使用される用語「相同性生物界面活性剤」は、参照生物界面活性剤に類似する活性及び／又は構造を有する生物界面活性剤を指す。相同体が必ず進化的に関連することは意図しない。それ故、この用語は、異なる生物から得られる同一の、類似する、又は対応する生物界面活性剤（即ち、構造及び機能の点で）を包含することが意図される。いくつかの実施形態では、参照生物界面活性剤に類似する四次、三次、及び／又は一次構造を有する相同体を同定することが望ましい。
【００５２】
配列間の相同性の程度は、当該技術分野にて既知の任意の好適な方法を用いて決定することができる（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡなどのプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））；並びにＤｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５参照）。
【００５３】
例えば、ＰＩＬＥＵＰは、配列相同性レベルを決定する有用なプログラムである。ＰＩＬＥＵＰは、ペアワイズアラインメントのプログレッシブ法を用いて、一群の関連する配列から複数の配列のアラインメントを行う。ＰＩＬＥＵＰは、アラインメントを行うのに使用されるクラスタリング関係を示す系統樹をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅの累進アライメント法を単純化したものを使用する（Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１〜３６０）。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐにより記載されるものと類似している（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜１５３）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータとしては、３．００のデフォルトギャップ重みづけ（default gap weight）、０．１０のデフォルトギャップ伸長重みづけ（default gap length weight）、及び重みつき末端ギャップ（weighted end gaps）が挙げられる。有用なアルゴリズムの他の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．により記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０；及びＫａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７）。１つの特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０〜４８０参照）。パラメータ「Ｗ」、「Ｔ」、及び「Ｘ」は、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして１１の単語長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ’５、Ｎ’−４、及び両方の鎖の比較を使用する。
【００５４】
本明細書で使用するとき、少なくとも２つの核酸又はポリペプチドの文脈における語句「実質的に同様である」及び「実質的に同一である」は典型的には、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、参照（すなわち、野生型）配列と比較して、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、又は更には少なくとも約９９％の同一性又はそれ以上の同一性を有する配列を含むことを意味する。配列同一性は、標準パラメータを用いた、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、及びＣＬＵＳＴＡＬなどの既知のプログラムを使用して決定され得る（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５；Ｋａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３；及びＨｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７３：２３７〜２４４を参照されたい）。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）より公的に入手可能である。ＦＡＳＴＡを使用してデータベースを検索してもよい（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４〜２４４８）。２つのポリペプチドが実質的に同一である１つの印は、第一のポリペプチドが第二のポリペプチドと免疫学的に交差反応することである。典型的には、保存アミノ酸置換によって異なるポリペプチドは免疫学的に交差反応する。したがって、例えば、２つのポリペプチドが保存置換のみが異なるポリペプチドの場合は、実質的に第二ポリペプチドと同一である。２つの核酸配列が実質的に同一である他の印は、２つの分子がお互いに厳格な条件（例えば、中程度から高度に厳格な条件の範囲内）において、お互いにハイブリッドすることである。
【００５５】
本明細書で使用される「野生型」及び「天然」生物界面活性剤は、天然に見出されるものである。用語「野生型配列」及び「野生型遺伝子」は、本明細書で交換可能に使用されて、宿主細胞において天然又は自然発生する配列を指す。いくつかの実施形態では、野生型配列は、タンパク質設計計画の出発地点である所望の配列を指す。天然に存在するタンパク質をコードする遺伝子は、当業者に既知の一般的な方法に従って得ることができる。この方法は一般に、生物界面活性剤の領域をコードする推定配列を有する標識プローブを合成する工程と、タンパク質を発現する生物からゲノムライブラリーを調製する工程と、プローブに対するハイブリダイゼーションにより、所望の遺伝子に関してライブラリーをスクリーニングする工程と、を含む。次いで、ポジティブにハイブリダイズするクローンをマッピング及び配列する。
【００５６】
本明細書で使用される「不溶性」又は「不溶化」は、可溶性が乏しい又は非常に乏しい化合物に関連する。１ｍＬのサンプルを１４，０００×ｇで１０分間高速遠心分離することにより、化合物の不溶性部分を可溶性部分から分離することができる。別の方法としては、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ  １Ｌ瓶の頂部フィルターなどの０．４５μｍ膜フィルターを通して濾過することにより、不溶性部分を可溶性部分から分離することができる。不溶性部分は遠心分離後にペレットとなり、又は濾過後にフィルター上に残留するであろう。別の方法としては、以前透明の溶液の不溶化は、濁り又は混濁の外観により認めることができる。別の方法としては、結晶又は沈殿物などの不溶性粒子は、光学顕微鏡検査により検知することができる。
【００５７】
本明細書で使用される「沈殿」は、化学反応による又は物理的条件の変化による、溶液からの化合物の不溶性形態の形成に関連する。本明細書で使用される「沈殿剤（precipitation agent）」又は「沈殿剤（precipitant）」は、沈殿を生じる薬剤に関連する。
【００５８】
本明細書で使用される「ＣＭＣ」は、臨界ミセル濃度に関連し、濃度を超えるとミセルが形成し、系に添加される追加の界面活性剤のほとんど全部がミセルとなる、界面活性剤の濃度を指し得る。ＣＭＣは、界面活性剤の重要な特性である。ＣＭＣに到達する前、界面活性剤の濃度と共に表面張力が強く変化する。ＣＭＣに到達した後、表面張力は比較的一定に維持され、又はより小さい勾配にて変化する。所定の培地中の所定の分散剤に関するＣＭＣ値は、温度、圧力、並びに（時には強く）他の表面活性物質及び電解質の存在及び濃度に依存する。ミセルは、臨界ミセル温度を超える温度でのみ形成する。本明細書で使用されるように、ＣＭＣを低下させることは、溶液中の界面活性剤の濃度を低下させ、ひいては泡形成を低減する点で、生物界面活性剤の溶解度の低下と同一の効果を有する。
【００５９】
本明細書で使用される「宿主細胞」は、天然で又は組み換え方法によって、内部で生物界面活性剤が生産される任意の細胞であってもよい。宿主細胞には、アガリクス（Agaricus）属（例えば、アガリクスビスポラス（Agaricus bisporus））、アグロサイブ（Agrocybe）属（例えば、ポプラキノコ（Agrocybe aegerita））、アジェロミセス（Ajellomyces）属（例えば、アジェロミセスカプスラタス（Ajellomyces capsulatus）、アジェロミセスデルマティティディス（Ajellomyces dermatitidis））、アスペルギルス（Aspergillus）属（例えば、アスペルギルスアルビ（Aspergillus arvii）、アスペルギルスブレビプス（Aspergillus brevipes）、アスペルギルスクラバタス（Aspergillus clavatus）、アスペルギルスデリカウリス（Aspergillus duricaulis）、アスペルギルスエリプティカス（Aspergillus ellipticus）、アスペルギルスフラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルスフミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルスフミシネマタス（Aspergillus fumisynnematus）、アスペルギルスレンタス（Aspergillus lentulus）、アスペルギルスニゲル（Aspergillus niger）、ニホンコウジカビ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルスユニラテラリス（Aspergillus unilateralis）、アスペルギルスビリジニュータンス（Aspergillus viridinutans））、バチルス（Bacillus）属（例えば、バチルスリケニフォルミス又はバチルスズブチルス（Bacillus subtilis））、ボーベリア（Beauveria）属（例えば、ボーベリアバッシアーナ（Beauveria bassiana））、カンジダ（Candida）属（例えば、カンジダボゴリエンシス（Candida bogoriensis）、カンジダボンビコラ（Candida bombicola））、クラビセプス（Claviceps）属（例えば、クラビセプスフシホルミス（Claviceps fusiformis））、コクシジオイド（Coccidioides）属（例えば、コクシジオイドポサダシ（Coccidioides posadasii））、コクリオボラス（Cochliobolus）属（例えば、コクリボルスヘテロストロフス（Cochliobolus heterostrophus））、クリニペリス（Crinipellis）属（例えば、クリニペリスペルニキオサ（Crinipellis perniciosa））、クリフォネクトリア（Cryphonectria）属（例えば、クロフォネクトリアパラシティカ（Cryphonectria parasitica））、ダビディエラ（Davidiella）属（例えば、ダビディエラタシアナ（Davidiella tassiana））、ディクチオネマ（Dictyonema）属（例えば、ディクチオネマグラブラタム（Dictyonema glabratum））、エメリセラ（Emericella）属（例えば、エメリセラニデュランス（Emericella nidulans））、エシェリキア（Escherichia）属（例えば、大腸菌（Escherichia coli））、フラムリナ（Flammulina）属（例えば、フランムリナベルティペス（Flammulina velutipes））、フサリウム（Fusarium）属（例えば、フサリウムクルモラム（Fusarium culmorum））、ギベレラ（Gibberella）属（例えば、ギベレラモニリホルミス（Gibberella moniliformis））、グロメレラ（Glomerella）属（例えば、グロメレラグラミニコラ（Glomerella graminicola））、グリフォラ（Grifola）属（例えば、グリフォラフロンドサ（Grifola frondosa））、ハンゼヌラ（Hansenula）属（例えば、ハンゼヌラポリモルファ（Hansenula polymorpha））、ヘテロバシジオン（Heterobasidion）属（例えば、ヘテロバシジオンアンノサム（Heterobasidion annosum））、ハイポクレア（Hypocrea）属（例えば、ハイポクレアジェコリナ（Hypocrea jecorina）、ハイポクレアリキシ（Hypocrea lixii）、ハイポクレアビレンス（Hypocrea virens）、クリヴェロミセス（Kluyveromyces）属（例えば、クリヴェロミセスラクチス（Kluyveromyces lactis））、ラッカリア（Laccaria）属（例えば、ラッカリアビカラ（Laccaria bicolor））、レンチヌラ属（Lentinula）（例えば、レンチヌラエドーデス（Lentinula edodes））、マグナポルテ（Magnaporthe）属（例えば、マグナポルテオリザエ（Magnaporthe oryzae））、マラスミウス（Marasmius）属（例えば、マラスミウスクラドフィラス（Marasmius cladophyllus））、モニリオフトラ（Moniliophthora）属（例えば、モニリオフトラペルニシオサ（Moniliophthora perniciosa））、ネオサルトリア（Neosartorya）属（例えば、ネオサルトリアアウレオラ（Neosartorya aureola）、ネオサルトリアフェンネリア（Neosartorya fennelliae）、ネオサルトリアフィッシェリ（Neosartorya fischeri）、ネオサルトリアグラブラ（Neosartorya glabra）、ネオサルトリアヒラツカ（Neosartorya hiratsukae）、ネオサルトリアニシムラ（Neosartorya nishimurae）、ネオサルトリアオータニ（Neosartorya otanii）、ネオサルトリアスードフィッシェリ（Neosartorya pseudofischeri）、ネオサルトリアクアドリシンクタ（Neosartorya quadricincta）、ネオサルトリアスパスラタ（Neosartorya spathulata）、ネオサルトリアスピノサ（Neosartorya spinosa）、ネオサルトリアストラメニア（Neosartorya stramenia）、ネオサルトリアウダガワ（Neosartorya udagawae））、ニューロスポラ（Neurospora）属（例えば、ニューロスポラクラッサ（Neurospora crassa）、ニューロスポラジスクレタ（Neurospora discreta）、ニューロスポラインターメディア（Neurospora intermedia）、ニューロスポラシトフィラ（Neurospora sitophila）、ニューロスポラテトラスペルマ（Neurospora tetrasperma））、ノムラエア（Nomuraea）属（例えば、ノムラエアリレイ（Nomuraea rileyi））、オフィオストマ（Ophiostoma）属（例えば、オフィオストマノボ−ウルミ（Ophiostoma novo-ulmi）、オフィオストマクエルカス（Ophiostoma quercus））、パラコクシジオイド（Paracoccidioides）属（例えば、パラコクシジオイドブラシリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis））、パッサローラ（Passalora）属（例えば、パッサローラフルバ（Passalora fulva））、パキシルス（Paxillus）属（例えば、パキシルスフィラメントサス（Paxillus filamentosus）、パキシラスインボルタス（Paxillus involutus））、ペニシリウム（Penicillium）属（例えば、ペニシリウムカメンベルチ（Penicillium camemberti）、ペニシリウムクリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、ペニシルムマルネッフェイ（Penicillium marneffei））、フレビオプシス（Phlebiopsis）属（例えば、フレビオプシスギガンテア（Phlebiopsis gigantea））、ピチア（Pichia）属（例えば、ピチアパストリス（Pichia pastoris））、ピソリタス（Pisolithus）（例えば、ピソリタスティンクトリウス（Pisolithus tinctorius））、プレウロタス（Pleurotus）属（例えば、プレウロタスオストレアタス（Pleurotus ostreatus））、ポドスポラ（Podospora）属（例えば、ポドスポラアンセリナ（Podospora anserina）））、ポスティア（Podospora）属（例えば、ポスティアプラセンタ（Postia placenta））、シュードモナス（Pseudomonas）属（例えば、シュードモナスアエルギノーザ（Pseudomonas aeruginosam）、シュードモナスフルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナスピオシアネア（Pseudomonas pyocyanea））、ピレノホラ（Pyrenophora）属（例えば、ピレノホラトリティキ−レペンティス（Pyrenophora tritici-repentis））、サッカロマイセス（Saccharomyces）属（例えば、サッカロマイセスセレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae））、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属（例えば、シゾサッカロミセスポンベ（Schizosaccharomyces pombe））シゾフィリウム（Schizophyllum）属（例えば、シゾフィリウムコミューン（Schizophyllum commune））、ストレプトマイセス（Streptomyces）属（例えば、ストレプトマイセスリビダンス（Streptomyces lividans））、タラロマイセス（Talaromyces）属（例えば、タラロマイセスティピタトゥス（Talaromyces stipitatus））、トルロプシス（Torulopsis）属、トリコデルマ（Trichoderma）属（例えば、トリコデルマアスペレラム（Trichoderma asperellum）、トリコデルマアトロビリデ（Trichoderma atroviride）、トリコデルマビリデ（Trichoderma viride）、トリコデルマリーゼイ（Trichoderma reesii）［以前のハイポクレアジェコリナ（Hypocrea jecorina）］）、トリコロマ（Tricholoma）属（例えば、トリコロマテレウム（Tricholoma terreum））、ウンキノカルプス（Uncinocarpus）属（例えば、ウンキノカルプスリーゼイ（Uncinocarpus reesii））、ベルティシリウム（Verticillium）属（例えば、ベルティシリウムダリア（Verticillium dahliae））、キサントダクチロン（Xanthodactylon）属（例えば、キサントダクチロンフランメウム（Xanthodactylon flammeum））、キサントリア（Xanthoria）属（例えば、キサントリアカルシコラ（Xanthoria calcicola）、キサントリアカペンシス（Xanthoria capensis）、キサントリアエクタネオイド（Xanthoria ectaneoides）、キサントリアフランメア（Xanthoria flammea）、キサントリアカロオエンシス（Xanthoria karrooensis）、キサントリアリグラタ（Xanthoria ligulata）、キサントリアパリエティナ（Xanthoria parietina）、キサントリアツルビナタ（Xanthoria turbinata））、又はヤロウィア（Yarrowia）属（例えば、ヤロウィアリポリティカ（Yarrowia lipolytica））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
本発明の方法は、培養溶液からの任意の生物界面活性剤の単離に適用することができる。有利には、生物界面活性剤は、微生物により分泌される可溶性細胞外生物界面活性剤である。例示的な生物界面活性剤の群は、糸状菌により発現され及び／又は糸状菌由来のシステイン−リッチポリぺプチドのクラスであるヒドロホビンである。ヒドロホビンは、細胞及び人工材料を含む物体の表面上に疎水性コーティングを形成する能力で既知の小（〜１００アミノ酸）ポリぺプチドである。１９９１年にシゾフィリウムコミューン（Schizophyllum commune）において最初に発見されたヒドロホビンは、現在多数の糸状菌において認識されている。疎水性親水性指標（ハイドロパシー）及び他の生物物理学的特性における差異に基づいて、ヒドロホビンは、クラスＩ又はクラスＩＩとして分類される。ヒドロホビンは、保存システイン残基の独特の間隙と、疎水性パターンとに基づいて、２つの異なるクラス（Ｉ又はＩＩ）に分割される（Ｋｅｒｓｈａｗ  ａｎｄ  Ｔａｌｂｏｔ  １９９８，Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｂｉｏｌ  ２３：１８〜２３及びＷｏｓｔｅｎ  ２００１，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５５：６２５〜６４６）。クラスＩＩヒドロホビンの例に関しては、例えばＬｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｒｅｖｉｅｗｓ，２９：８７７〜９６、及びＫｕｂｉｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）ＢＭＣ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８：４を参照されたい。
【００６１】
ヒドロホビンの発現は、従来、発酵中に大量の１種以上の抗発泡剤（即ち、消泡剤）の添加を必要とする。さもなくば、ヒドロホビンポリペプチドにより生成される泡は、ブリーザーフィルターを飽和させ、排気口を汚染し、圧力の蓄積を生じ、タンパク質の収量を低下させる。その結果、ヒドロホビンの粗濃縮物は、従来、特にヒドロホビンが食品添加剤として意図される場合、ヒドロホビン調製物中には望ましくない残留量の消泡剤、及び宿主細胞汚染物質を含む。
【００６２】
ヒドロホビンは、その実際の分子量を超える見かけ上の分子量を有する形態で可逆的に存在することができ、このことは、ヒドロホビンを本方法を用いた回収に非常に好適なものとする。ヒドロホビンを含む液体又は泡は、記載したように、タンパク質回収のために発酵槽から連続的に又は周期的に回収されてもよく、又は発酵操作の終わりに回分式に回収されてもよい。
【００６３】
ヒドロホビンは、当該技術分野にて既知の任意のクラスＩ又はクラスＩＩヒドロホビン、例えば、アガリクス属（例えば、アガリクスビスポラス）、アグロサイブ属（例えば、ポプラキノコ）、アジェロミセス属（例えば、アジェロミセスカプスラタス、アジェロミセスデルマティティディス）、アスペルギルス属（例えば、アスペルギルスアルビ、アスペルギルスブレビプス、アスペルギルスクラバタス、アスペルギルスデリカウリス、アスペルギルスエリプティカス、アスペルギルスフラバス、アスペルギルスフミガーツス、アスペルギルスフミシネマタス、アスペルギルスレンタス、アスペルギルスニゲル、アスペルギルスユニラテラリス、アスペルギルスビリジニュータンス）、ボーベリア属（例えば、ボーベリアバッシアーナ）、クラビセプス属（例えば、クラビセプスフシホルミス）、コクシジオイド属（例えば、コクシジオイドポサダシ）、コクリオボラス属（例えば、コクリボルスヘテロストロフス）、クリニペリス属（例えば、クリニペリスペルニキオサ）、クリフォネクトリア属（例えば、クロフォネクトリアパラシティカ）、ダビディエラ属（例えば、ダビディエラタシアナ）、ディクチオネマ属（例えば、ディクチオネマグラブラタム）、エメリセラ属（例えば、エメリセラニデュランス）、フランムリナ属（例えば、フランムリナベルティペス）、フサリウム属（例えば、フサリウムクルモラム）、ギベレラ属（例えば、ギベレラモニリホルミス）、グロメレラ属（例えば、グロメレラグラミニコラ）、グリフォラ属（例えば、グリフォラフロンドサ）、ヘテロバシジオン属（例えば、ヘテロバシイオンアンノサム）、ハイポクレア属（例えば、ハイポクレアジェコリナ、ハイポクレアリキシ、ハイポクレアビレンス）、ラッカリア属（例えば、ラッカリアビカラ）、レンチヌラ属（例えば、レンチヌラエドーデス）、マグナポルテ属（例えば、マグナポルテオリザエ）、マラスミウス属（例えば、マラスミウスクラドフィラス）、モニリオフトラ属（例えば、モニリオフトラペルニシオサ）、ネオサルトリア属（例えば、ネオサルトリアアウレオラ、ネオサルトリアフェンネリア、ネオサルトリアフィッシェリ、ネオサルトリアグラブラ、ネオサルトリアヒラツカ、ネオサルトリアニシムラ、ネオサルトリアオータニ、ネオサルトリアスードフィッシェリ、ネオサルトリアクアドリシンクタ、ネオサルトリアスパスラタ、ネオサルトリアスピノサ、ネオサルトリアストラメニア、ネオサルトリアウダガワ）、ニューロスポラ属（例えば、ニューロスポラクラッサ、ニューロスポラジスクレタ、ニューロスポラインターメディア、ニューロスポラシトフィラ、ニューロスポラテトラスペルマ）、ノムラエア属（例えば、ノムラエアリレイ）、オフィオストマ属（例えば、オフィオストマノボ−ウルミ、オフィオストマクエルカス）、パラコクシジオイド属（例えば、パラコクシジオイドブラシリエンシス）、パッサローラ属（例えば、パッサローラフルバ）、パキシルス属（例えば、パキシルスフィラメントサス、パキシラスインボルタス）、ペニシリウム属（例えば、ペニシリウムカメンベルチ、ペニシリウムクリソゲナム、ペニシルムマルネッフェイ）、フレビオプシス属（例えば、フレビオプシスギガンテア）、ピソリタス（例えば、ピソリサスティンクトリウス）、プレウロタス属（例えば、プレウロタスオストレアタス））、ポドスポラ属（例えば、ポドスポラアンセリナ））、ポスティア属（例えば、ポスティアプラセンタ）、ピレノホラ属（例えば、ピレノホラトリティキ−レペンティス）、シゾフィリウム属（例えば、シゾフィリウムコミューン））、タラロマイセス属（例えば、タラロマイセススティピタタス）、トリコデルマ属（例えば、トリコデルマアスペレラム、トリコデルマアトロビリデ、トリコデルマビリデ、トリコデルマリーゼイ（Trichoderma reesii）［以前のハイポクレアジェコリナ］）、トリコロマ属（例えば、トリコロマテレウム）、ウンキノカルプス属（例えば、ウンキノカルプスリーゼイ）、ベルティシリウム属（例えば、ベルティシリウムダリア）、キサントダクチロン属（例えば、キサントダクチロンフランメウム）、キサントリア属（例えば、キサントリアカルシコラ、キサントリアカペンシス、キサントリアエクタネオイド、キサントリアフランメア、キサントリアカロオエンシス、キサントリアリグラタ、キサントリアパリエティナ、キサントリアツルビナタ）などからのヒドロホビンであってもよい。ヒドロホビンは、例えば、Ｓｕｎｄｅ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｉｃｒｏｎ  ３９：７７３〜８４；Ｌｉｎｄｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．２９：８７７〜９６；及びＷｏｓｔｅｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５：６２５〜４６にて再検討される。
【００６４】
特に有利な実施形態では、ヒドロホビンは、トリコデルマ属（例えば、トリコデルマアスペレラム、トリコデルマアトロビリデ、トリコデルマビリデ、トリコデルマリーゼイ（Trichoderma reesii）［以前のハイポクレアジェコリナ］）、有利にはトリコデルマリーゼイ（Trichoderma reseei）に由来する。
【００６５】
クラスＩ及びクラスＩＩヒドロホビンの両方は、疎水性界面において両親媒性フィルムに自己集合するタンパク質として、真菌中に確認されている。クラスＩヒドロホビンの集団は、一般に、比較的不溶性であるが、クラスＩＩヒドロホビンの集団は、多様な溶媒中に容易に溶解する。有利には、ヒドロホビンは、水溶性であり、水溶性とは、ヒドロホビンが水中に少なくとも０．１％、好ましくは少なくとも０．５％、可溶性であることを意味する。少なくとも０．１％可溶性とは、９９．９ｍＬの水中の０．１ｇのヒドロホビンが、３０，０００ｇの遠心分離に２０℃で３０分間かけられた際、ヒドロホビン沈殿物が存在しないことを意味する。
【００６６】
本出願人らは、他の方法で生産されたヒドロホビンＩＩが、Ｃ末端にクリッピングされた（clipped）１つ以上のアミノ酸をもたらし得ることを観察した。本発明の方法により、特に、ヒドロホビンが沈殿された又は不溶性とされた場合、クリッピングは観察されない。
【００６７】
ヒドロホビン様タンパク質（例えば、「シャプリン（chaplin）」）も、放線菌（Actinomycete）及びストレプトマイセス（Streptomyces）属などの糸状菌中に確認されている（国際公開第０１／７４８６４；Ｔａｌｂｏｔ，２００３，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ，１３：Ｒ６９６〜Ｒ６９８）。これらの細菌タンパク質は、ヒドロホビンに比べると、２つのみのシステイン残基を有し得るため、１つまでのみのジスルフィド架橋を形成し得る。そのようなタンパク質は、ヒドロホビン、及び本明細書の方法の生物界面活性剤の範囲内の他の種類の分子の機能的等価物の一例である。
【００６８】
ラムノ脂質は、シュードモナスアエルギノーザにより生産され及び／又はモナスアエルギノーザ由来の糖脂質の１クラスであり、細菌性界面活性剤を最もよく特徴付けるとして引用されることが多い。ラムノ脂質には、それぞれ１つ又は２つのラムノース基からなるモノラムノ脂質及びジラムノ脂質の２つの主なクラスが存在する。ラムノ脂質は、美容産業界にて保湿剤、練り歯磨き、コンドーム用潤滑剤及びシャンプーなどの製品用に広く使用されており、有機及び重金属汚染部位のバイオレメディエーションに有効である。ラムノ脂質はまた、シュードモナスアエルギノーザによる、原油及び野菜油などの廃棄炭水化物の分解を促進する。
【００６９】
ソホロ脂質は、カンジダ又は関連する酵母種により培養培地中で見出され及び該培地中に分泌され、界面活性剤として既知である。ヒドロキシ脂肪酸の性質は特徴的であり、ヒドロキシル基がｎ又はｎ−１炭素原子上に位置し、１６、１７又は１８の炭素鎖長が、増殖培地の組成物による変更に供される。不飽和Ｃ１８脂肪酸を有するソホロシド（Sophoroside）は、カンジダボゴリエンシス中に認められている。独特のソホロ脂質がトルロプシス属から単離され、このソホロ脂質は、ヒドロキシ脂肪酸のカルボキシ基がソホロースの末端グルコースの４’ヒドロキシル基でエステル化されている大環状ラクトンである点で、既に言及したものとは異なる。２つのアセテート基もその脂質内に存在する。ソホロ脂質は、その両親媒性の構造により、界面活性剤の活性を有する。ソホロ脂質生産物の中でも、カンジダボンビコラは、ソホロ脂質種を大量に生成するため、最も研究されている種である。ソホロ脂質は、硬質表面洗浄及び自動食器洗浄濯ぎ補助配合物に有用であることが示されている。
【００７０】
サーファクチンは、通常、抗生物質として使用される、非常に強力な界面活性剤である細菌性環状ポリペプチドである。サーファクチンは、グラム陽性内生胞子形成細菌バチルスズブチルスにより生成される２４種類の抗生物質の１つである。サーファクチンの構造は、７つのアミノ酸（Ｌ−アスパラギン、Ｌ−ロイシン、グルタミン酸、Ｌ−ロイシン、Ｌ−バリン、及び２つのＤ−ロイシン）からなるペプチドループと、疎水性脂肪酸鎖とからなり、疎水性脂肪酸鎖に沿った１３〜１５個の炭素が、サーファクチンが細胞膜を貫通する能力を可能にしている。サーファクチンは、他の界面活性剤と同様、サーファクチンが溶解した液体の表面張力に影響を与える。サーファクチンは、２０μＭという低い濃度で、水の表面張力を７２ｍＮ／ｍから２７ｍＮ／ｍへ低下させることができる。
【００７１】
米国特許第７，９０６，３１５号、同第７，８９３，０１５号、同第７，８８７，９０６号、同第７，８５８，３３４号、同第７，７４９，２０３号、同第７，５８１，５９４号、同第７，５５６，６５４号、同第７，５４１，３２１号、同第７，５４０，９２６号、同第７，４７３，３６３号、同第７，４１３，６４３号、同第７，３２５，６０３号、同第７，２２６，８９７号、同第７，１９８，６８０号、同第６，９５６，１２２号、同第６，９２１，３９０号、同第６，７２７，２２３号、同第６，５８２，７３０号、同第６，４７５，９６８号、同第６，３８９，８２０号、同第６，３６９，０１４号、同第６，３４６，２８１号、同第６，３１９，８９８号、同第６，２６２，０３８号、同第６，０６３，６０２号、同第６，０６０，２８７号、同第６，０５１，５５２号、同第５，８６６，３７６号、同第５，７６７，０９０号、同第５，６３５，３９２号、同第５，５５１，９８７号、同第５，４１７，８７９号、同第５，１２８，２６２号、同第４，９４３，３９０号及び同第４，６４０，７６７号、並びに米国特許出願公開第２０１１００６５１６７号、同第２０１１００２７８４４号、２０１００３２３９２８号、同第２０１００１６８４０５号、同第２０１００１４４６４３号、同第２０１００１４３３１６号、同第２０１００００４４７２号、同第２０１０００００７９５号、同第２００９０２８８８２５号、同第２００９０２６９８３３号、同第２００９０２０３５６５号、同第２００９０１７０７００号、同第２００９０１４８８８１号、同第２００９００９８０２８号、同第２００８０２９６２２２号、同第２００８０２９３５７０号、同第２００８０１９３７３０号、同第２００８００８５２５１号、同第２００８００２３０４４号、同第２００８００２３０３０号、同第２００８００２０９４７号、同第２００７０２４９０３５号、同第２００７０２４９０３４号、同第２００７０２１５３４７号、同第２００７０１３４２８８号、同第２００６０１０６１２０号、同第２００５０２７１６９８号、同第２００５０２６６０３６号、同第２００５０２２７３３８号、同第２００５０１７６１１７号、同第２００５０１０６７０２号、同第２００４０２５１１９７号、同第２００４０２４４９６９号、同第２００４０２３１９８２号、同第２００４０１５６８１６号、同第２００４０１５２６１３号、同第２００４００２２７７５号、同第２００３００９６９８８号、同第２００３００１８３０６号、同第２００２０１７６８９５号、同第２００２０１２３０７７号及び同第２００２０１２０１０１号に記載されているような生物界面活性剤も、本発明の方法により生産することができる。Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ４８，ＢＩＯＳＵＲＦＡＣＴＡＮＴＳ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎａｉｍ  Ｋｏｓａｒｉｃ，ｅｄｉｔｏｒ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９３も参照されたい。
【００７２】
生物界面活性剤を生産させる発酵は、生物反応器又は発酵槽内の液体発酵培地中で宿主細胞又は微生物を培養することにより行われる。媒質の組成（例えば、栄養素、炭素源など）、温度及びｐＨは、培養物の増殖、及び／又は生物界面活性剤の生産に適切な条件を提供するように選択される。通常、空気又は酸素に富んだ空気が培地中に散布されて、培養物の呼吸のための酸素が提供される。
【００７３】
本発明は、生物界面活性剤を不溶性にする、培養溶液中で生物界面活性剤を沈殿させる任意の薬剤の添加又は処理に関する。詳細には、本発明の方法によって、生物界面活性剤を沈殿させる任意の薬剤又は処理が使用され得る。生物界面活性剤を沈殿させる薬剤には、塩、ポリマー、酸、溶媒又はアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。生物界面活性剤を沈殿させる物理的条件には、熱における変化、又はｐＨにおける変化が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、生物界面活性剤を沈殿させる条件には、沈殿剤、物理的条件における変化、又はそれらの両方が挙げられることを理解するであろう。
【００７４】
詳細には、本発明はまた、本明細書に記載したプロセスにより生産され得る生物界面活性剤に関する。例えば、発酵が尚進行している間、発酵培地及び条件を変化させることにより従来の発酵技術を変更して、発現されたヒドロホビンをブロスに不溶性とすることにより、発酵中のフォームアウトが防止されたことを本明細書に提示する。変更された発酵を用いて生産されたヒドロホビンの組成物が図２に示され、質量７１８０のピークは、完全長ヒドロホビン分子に対応する。興味深いことに、本明細書に示した方法で生産されたヒドロホビンは、２つの変異体の混合物である天然に存在するヒドロホビンとは異なり、均質な製品をもたらす。したがって、本発明はまた、図２に示したスペクトルを有する任意のヒドロホビンを包含する。
【００７５】
有利には、沈殿剤は、塩であり又は塩を含み、塩は、陽イオン及び陰イオンを含む酸及び塩基の中和反応から生じ得るイオン性化合物、ハライド、例えばクロリド、フロリドブロミド、又はヨージドなど；シトレート；アセテート；ニトレート（又は硝酸塩）、亜硝酸塩、カーボネート；スルフェート；ホスフェート；スルファメート；ホスホネート；又はスルファメートなどの任意の好適な陰イオン；及び任意の好適な陽イオン、例えば、アンモニウム、カルシウム、アルミニウム、鉄、マグネシウム、リチウム、カリウム又はナトリウムなどの金属又は遷移金属を含むイオン性化合物である。塩は、有利には、多原子イオンを含み、より好ましくは硫酸塩を含む。塩は、硫酸アンモニウム、硫酸カルシウム、硫酸鉄、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム若しくは硫酸ナトリウムであってもよく、又はこれらを含んでもよい。特に有利な実施形態では、塩は、硫酸ナトリウムであり、又は硫酸ナトリウムを含む。別の特定の有利な実施形態では、塩は、硫酸アンモニウムであり、又は硫酸アンモニウムを含む。別の実施形態では、塩は、酢酸塩、炭酸塩、塩化物塩、クエン酸塩、ギ酸塩、硝酸塩、又はリン酸塩であってもよい。
【００７６】
別の実施形態では、沈殿剤はアルコールである。アルコールは、メタノール、エタノール又はイソプロピルアルコールなどの一価又は多価Ｃ１〜Ｃ６アルコールなどの一価又は多価アルコールであってもよい。
【００７７】
別の実施形態では、沈殿剤は、水混和性有機溶媒である。溶媒は、アセトン又はケトンであってもよい。
【００７８】
別の実施形態では、沈殿剤は水溶性ポリマーである。ポリマーは、ポリエチレングリコール、又デキストランなどの多糖であってもよい。別の実施形態では、沈殿剤は、非限定的にＣ５８１（Ｃｙｔｅｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄ  Ｐａｒｋ，ＮＪ  ０７４２４））などの陽イオン性ポリマーである。
【００７９】
特に好ましい実施形態では、培養溶液のｐＨは、生物界面活性剤に応じて調整される。例えば、生物界面活性剤がヒドロホビンの場合、ｐＨは、有利には約４．０±０．５である。ｐＨは、約３．９±０．５〜約４．１±０．５、約３．８±０．５〜約４．２±０．５、約３．７±０．５〜約４．３±０．５、約３．６±０．５〜約４．４±０．５、約３．５±０．５〜約４．５±０．５、約３．４±０．５〜約４．６±０．５、約３．３±０．５〜約４．７±０．５、約３．２±０．５〜約４．８±０．５、約３．１±０．５〜約４．９±０．５、約３．０±０．５〜約５．０±０．５、約２．９±０．５〜約５．１±０．５、約２．８±０．５〜約５．２±０．５、約２．７±０．５〜約５．３±０．５、約２．６±０．５〜約５．４±０．５、約２．５±０．５〜約５．５±０．５、約２．４±０．５〜約５．６±０．５、約２．３±０．５〜約５．７±０．５、約２．２±０．５〜約５．８±０．５、約２．１±０．５〜約５．９±０．５又は約２．０±０．５〜約６．０±０．５の範囲であってもよい。
【００８０】
生物界面活性剤がラムノ脂質又はソホロ脂質の場合、ｐＨは有利には約２．５±０．５である。ｐＨは、約２．４±０．５〜約２．６±０．５、約２．３±０．５〜約２．７±０．５、約２．２±０．５〜約２．８±０．５、約２．１±０．５〜約２．９±０．５、約２．０±０．５〜約３．０±０．５、約１．９±０．５〜約３．１±０．５、約１．８±０．５〜約３．２±０．５、約１．７±０．５〜約３．３±０．５、約１．６±０．５〜約３．４±０．５、約１．５±０．５〜約３．５±０．５、約１．４±０．５〜約３．６±０．５、約１．３±０．５〜約３．７±０．５、約１．２±０．５〜約３．８±０．５、約１．１±０．５〜約３．９±０．５、約１．０±０．５〜約４．０±０．５、約０．９±０．５〜約４．１±０．５、約０．８±０．５〜約４．２±０．５、約０．７±０．５〜約４．３±０．５、約０．６±０．５〜約４．４±０．５又は約０．５±０．５〜約４．５±０．５の範囲であってもよい。
【００８１】
別の実施形態では、他の界面活性剤の有利なｐＨは、約ｐＨ  ７．０±０．５、約ｐＨ  ７．１±０．５、約ｐＨ  ７．２±０．５、約ｐＨ  ７．３±０．５、約ｐＨ  ７．４±０．５、約ｐＨ  ７．５±０．５、約ｐＨ  ７．６±０．５、約ｐＨ  ７．７±０．５、約ｐＨ  ７．８±０．５、約ｐＨ  ７．９±０．５、約ｐＨ  ８．０±０．５、約ｐＨ  ８．１±０．５、約ｐＨ  ８．２±０．５、約ｐＨ  ８．３±０．５、約ｐＨ  ８．４±０．５、約ｐＨ  ８．５±０．５、約ｐＨ  ８．６±０．５、約ｐＨ  ８．７±０．５、約ｐＨ  ８．８±０．５、約ｐＨ  ８．９±０．５、約ｐＨ  ９．０±０．５、約ｐＨ  ９．１±０．５、約ｐＨ  ９．２±０．５、約ｐＨ  ９．３±０．５、約ｐＨ  ９．４±０．５、約ｐＨ  ９．５±０．５、約ｐＨ  ９．６±０．５、約ｐＨ  ９．７±０．５、約ｐＨ  ９．８±０．５、約ｐＨ  ９．９±０．５、約ｐＨ  １０．０±０．５、約ｐＨ  １０．１±０．５、約ｐＨ  １０．２±０．５、約ｐＨ  １０．３±０．５、約ｐＨ  １０．４±０．５、約ｐＨ  １０．５±０．５、約ｐＨ  １０．６±０．５、約ｐＨ  １０．７±０．５、約ｐＨ  １０．８±０．５、約ｐＨ  １０．９±０．５、約ｐＨ  １１．０±０．５、約ｐＨ  １１．１±０．５、約ｐＨ  １１．２±０．５、約ｐＨ  １１．３±０．５、約ｐＨ  １１．４±０．５、約ｐＨ  １１．５±０．５、約ｐＨ  １１．６±０．５、約ｐＨ  １１．７±０．５、約ｐＨ  １１．８±０．５、約ｐＨ  １１．９±０．５、約ｐＨ  １２．０±０．５、約ｐＨ  １２．１±０．５、約ｐＨ  １２．２±０．５、約ｐＨ  １２．３±０．５、約ｐＨ  １２．４±０．５、約ｐＨ  １２．５±０．５、約ｐＨ  １２．６±０．５、約ｐＨ  １２．７±０．５、約ｐＨ  １２．８±０．５、約ｐＨ  １２．９±０．５、約ｐＨ  １３．０±０．５、約ｐＨ  １３．１±０．５、約ｐＨ  １３．２±０．５、約ｐＨ  １３．３±０．５、約ｐＨｖ１３．４±０．５、約ｐＨ  １３．５±０．５、約ｐＨ  １３．６±０．５、約ｐＨ  １３．７±０．５、約ｐＨ  １３．８±０．５、又は約ｐＨ  １３．９±０．５であってもよい。
【００８２】
先に述べたように、ｐＨの調整にカラギーナンを含む必要はなく、カラギーナンのいずれの使用も、特にｐＨ  ３．５又は３未満のｐＨ調整を含む必要はない。また、０．５未満、又は０．４未満、又は０．３未満、又は０．２未満へのイオン強度のいずれの調整も、３．５若しくは３未満のｐＨの調整及び／又はカラギーナンの使用を含む必要はない。ｐＨの低下をもたらすｐＨ調整は、硫酸などの酸の添加により達成され得る。
【００８３】
有利には、生物界面活性剤、例えば、ヒドロホビンＩＩなどのヒドロホビンの十分な沈殿若しくは不溶化を達成する量で、沈殿剤、例えば、添加された塩、アルコール、水混和性有機溶媒、水溶性ポリマー若しくは陽イオン性ポリマー、並びに／又はｐＨ調整、並びに／又は温度調整及び／若しくは温度上昇が加えられ、又はｐＨ調整が行われて、消泡剤の使用を回避する。即ち、不溶化は、泡抑制に有利である。換言すれば、不溶化は泡抑制の手段として行われ、沈殿剤の量、又はｐＨ調整若しくは温度調整の量は、不溶化の量により発泡が抑制されるような量である。また、沈殿剤の量又はｐＨ調整若しくは温度調整の量が、細胞若しくは微生物の増殖、及び／又は生物界面活性剤の生産に悪影響を与えないことが有利である。
【００８４】
ヒドロホビンの低溶解度のための好ましいｐＨ範囲は、約３．５〜４．５である。他の界面活性剤の場合、ｐＨ範囲は非常に異なる可能性があり、最適なｐＨ範囲は当業者により決定することができる。
【００８５】
ヒドロホビンの場合、ｐＨは３．５〜４．５の範囲であり、硫酸アンモニウム又は硫酸ナトリウムの必須濃度は、温度依存性である。約３０℃〜約６０℃では、好ましい濃度は約０．１％〜約５％である。約３０℃以下では、硫酸ナトリウムの濃度は、有利には５％を超え、塩の飽和限界までであり、飽和限界は、温度に応じて、硫酸ナトリウムでは約１５％、硫酸アンモニウムでは約３０〜５０％である。
【００８６】
再び、他の生物界面活性剤の場合には、温度とこれらの沈殿剤の濃度との両方が非常に異なる可能性があり、それぞれ実験により決定する必要があるであろう。
【００８７】
別の有利な実施形態では、生物界面活性剤は、ラムノ脂質、ソホロ脂質又はサーファクチンであってもよい。有利には、ラムノ脂質は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム及び／又は陽イオン性ポリマー（非制限的にＣ５８１など）を用いて沈殿され得る。有利には、ソホロ脂質は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム及び／又は陽イオン性ポリマー（非制限的になどＣ５８１）を用いて沈殿され得る。有利には、サーファクチンは、塩化ナトリウム、塩化カルシウム及び／又は硫酸ナトリウムを用いて沈殿され得る。別の有利な実施形態では、ラムノ脂質、ソホロ脂質及びサーファクチンは、バチルスリケニフォルミス、バチルスズブチルス及び／又はトリコデルマリーゼイ（Trichoderma reseei）中で増殖し得る。
【００８８】
８０ｇ／リットル以上の、ヒドロホビンの塩フリー濃縮溶液は、非常に高い温度のみで沈殿して発泡を抑制することができる。例えば、８０℃の温度はその温度までの加熱中に形成された任意の泡を効果的に粉砕し、その温度でのｐＨは約６〜７であった。
【００８９】
ヒドロホビンは、室温でイソプロピルアルコールにより沈殿することができる。２〜３容積のイソプロパノールは、１容積のヒドロホビン水溶液に添加された際、ヒドロホビンを沈殿させるであろう。
【００９０】
別の実施形態では、物理的条件は温度である。
【００９１】
特に好ましい実施形態では、培養溶液の温度が調整される。温度は、本明細書では、生物界面活性剤及び濃度に応じて広い範囲にわたり得、約２０℃〜約９０℃の範囲にわたり得る。ヒドロホビンの場合、温度は３０℃を超える。ラムノ脂質、ソホロ脂質又はサーファクチンの場合、温度は約２０℃〜約３０℃であってもよい。
【００９２】
泡抑制の効果を試験するいくつかの方法が存在する。全容積の有意な低下の証拠として、表面の泡を検査することが最も容易である。混入空気は、ある時間にわたり溶液（liquor）の密度の変化を記録することができる密度計を有する機器と同様の機器を使用して試験することができる。
【００９３】
有利な実施形態では、泡抑制の効果は、処理溶液のオーバーランにより測定することができ、このオーバーランは、発泡した溶液の体積−開始体積を開始体積で除算した計算値であり、割合又は百分率として報告される。ゼロのオーバーランは、溶液が泡を含まないことを意味する。
【００９４】
泡低下指数も、泡を抑制する処理の効果の評価基準として使用することができる。泡低下指数は、処理溶液に対する未処理溶液のオーバーランの比である。
【００９５】
別の実施形態では、泡低下の効果はまた、生物界面活性剤の絶対又は相対不溶性を測定してもよい。泡低下は、生物界面活性剤が少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％、又は不溶性の場合、有効であると決定されてもよい。
【００９６】
泡低下は、０．１ｇ／ｋｇ、０．５ｇ／ｋｇ、１ｇ／ｋｇ、２ｇ／ｋｇ、３ｇ／ｋｇ、４ｇ／ｋｇ、５ｇ／ｋｇ、６ｇ／ｋｇ、７ｇ／ｋｇ、８ｇ／ｋｇ、９ｇ／ｋｇ又は１０ｇ／ｋｇ未満の生物界面活性剤（ｇで測定）が溶液（ｋｇで測定）中に存在する場合、有効であると決定されてもよい。
【００９７】
有利な実施形態では、泡低下は、生物界面活性剤が少なくとも約２５％不溶性であり、及び／又は１ｇ／ｋｇ以下の生物界面活性剤が上清中に存在する場合、有効であると決定されてもよい。
【００９８】
有利な実施形態では、生物界面活性剤がタンパク質の場合、タンパク質の不溶性は、沈殿物（不溶性）及び上清（可溶性）中のタンパク質の量を測定することにより定量することができる。絶対及び相対不溶性は、沈殿物（不溶性）及び上清（可溶性）中のタンパク質を定量することにより決定することができる。タンパク質の定量方法は、当業者に既知である。
【００９９】
沈殿物中及び溶液中の非タンパク質生物界面活性剤の定量方法は、当業者に周知である。
【０１００】
垂直走査と結合した光多重散乱は、製品の分散状態を監視することにより不安定化現象を確認及び定量するのに最も広く使用されている技術である［Ｒｏｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２６３（２００３）８５〜９４，Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０〜８（２００３）１２８４〜１２９２，Ｍｅｎｇｕａｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｓｐｅｃｔｓ  １５２（１９９９）１１１〜１２３，Ｂｒｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  Ｅｄ  Ｔ．Ｐｒｏｖｄｅｒ  ａｎｄ  Ｊ．Ｔｅｘｔｅｒ（２００４））。これは、泡を含む任意の濃縮分散物に、希釈することなく機能する。光がサンプルを通して送られた際、光は気泡により後方散乱される。後方散乱強度は、分散相のサイズ及び体積分率と直接比例する。したがって、濃度の局所変化（排水、離漿）及びサイズの全体的な変化（熟成、合体）が検出及び監視される。伝導率を使用して、増殖培地中の成分の濃度、及び濁度を監視してもよい。
【０１０１】
本発明による特定の利点は、生物界面活性剤を生産するためのプロセスが連続的であり得ることである。例えば、本発明の実施において、生物反応器又は発酵槽は、可溶化生物界面活性剤、例えば、ヒドロホビンを除去するための手段、例えば、弁制御流体管を有することができ、この流体管から可溶化生物界面活性剤が生物反応器又は発酵槽から除去されてもよい。弁は、弁の開放及び閉鎖に関してプロセッサ又はマイクロプロセッサと関連して作動することができる。プロセッサ又はマイクロプロセッサは、溶液中の生物界面活性剤の濃度若しくは濃度変化、又は溶液の濁度、又は泡の量などの他のパラメータを指示するセンサなどのセンサからの信号を受信し得、そのセンサ信号に基づいて弁を開放又は閉鎖して可溶化生物界面活性剤を除去するよう指示することができ、又はマイクロプロセッサ又はプロセッサは、長期間を含み、いつから沈殿剤及び／若しくは沈殿条件が添加され若しくは適用されたか、沈殿剤の濃度の達成、並びに／又は沈殿条件の達成などの他のパラメータに基づいて弁を開放若しくは閉鎖させることができる。生物反応器又は発酵槽はまた、沈殿剤、流体、又は沈殿条件を達成するための他の条件を加える手段、例えば、弁制御流体管を含むことができ、これにより、沈殿剤、例えば、塩、有利には溶液中の塩、アルコール、又は沈殿条件を達成するための流体、例えばｐＨを低下させる酸を添加すること、又はヒーターを含むことができる。弁又はヒーターは、プロセッサ又はマイクロプロセッサと関連して、弁を開放及び閉鎖し、又はヒーターをオンにすること又はオフにすることができる。プロセッサ若しくはマイクロプロセッサは、溶液中の生物界面活性剤の濃度、濃度変化、又は泡などの他のパラメータを指示するセンサなどのセンサからの信号を受信することができ、そのセンサ信号に基づいて弁の開放若しくは閉鎖、又はヒーターのオン若しくはオフを指示して、沈殿剤、流体、若しくは可溶化させる他の手段を添加することができ、又はマイクロプロセッサ若しくはプロセッサは、いつから可溶化生物界面活性剤が除去されたかなどの他のパラメータに基づいて弁を開放若しくは閉鎖させることができる。更に、生物反応器又は発酵槽は、培地、及び／又は細胞、微生物、若しくは生物界面活性剤を生産する培地の他の成分を添加するための手段を含んでもよい。必然的に、可溶化生物界面活性剤を除去する際、幾分かの培地、及び／又は細胞、微生物、若しくは生物界面活性剤を生産する培地の他の成分は、可溶化界面活性剤と共に損失され、生物反応器若しくは発酵槽は補充のための手段を含むであろう。この補充手段は、例えば、弁制御流体接続手段であってもよく、これから細胞、生物、培地、又は培地の他の成分が生物反応器又は発酵槽に供給される。弁は、弁の開放及び閉鎖に関してプロセッサ又はマイクロプロセッサと関連することができる。プロセッサ若しくはマイクロプロセッサは、細胞、微生物、若しくは培地の他の成分の濃度若しくは濃度変化、又は溶液の濁度、又は他のパラメータを指示するセンサなどのセンサからの信号を受信し得、センサ信号に基づいて補充のための弁の開放若しくは閉鎖を指示すること、又はマイクロプロセッサ若しくはプロセッサは、時間などの他のパラメータに基づいて弁を開放若しくは閉鎖させることができる。細胞、微生物、培地、又は培地の成分が可溶化界面活性剤と共に回収された際、それらの細胞、微生物、培地、又は培地の成分は、可溶化生物界面活性剤から分離され、例えば、補充手段を経由して、発酵槽又は生物反応器に戻って再利用されてもよい。前述のセンサは、生物反応器若しくは発酵槽内の、又は該生物反応器若しくは発酵槽と関連した１つ以上のセンサであってもよい。
【０１０２】
このやり方で、生物界面活性剤、例えば、ヒドロホビンＩＩなどのヒドロホビン、ラムノ脂質、ソホロ脂質若しくはサーファクチンを生産するための及びこれらを生産する培地が、生物反応器若しくは発酵槽に供給され、泡が生じるとき、泡が生じているとき、又は泡が有意に生じる前に、又は培地が生物反応器若しくは発酵槽内にある時間の後、沈殿剤若しくは沈殿条件が添加され若しくは適用され、例えば、硫酸ナトリウムが添加され及び／又はアルコールが添加され及び／又は熱が適用され及び／又はｐＨが有利には下方に調整され、それにより泡が抑制され及び生物界面活性剤が沈殿し又は不溶化される。不溶化生物界面活性剤は、生物反応器又は発酵槽から除去される。そして、培地又はその成分、例えば、細胞又は微生物、栄養素、又は培地の他の成分は、生物反応器又は発酵槽内に供給され、即ち培地又はその成分、例えば細胞又は微生物、栄養素、又は培地の他の成分の補充が存在する。場合により、不溶化生物界面活性剤と共に出された培地又はその成分、例えば、細胞又は微生物、栄養素、又は培地の他の成分は、生物反応器又は発酵槽に戻って再利用される。したがって、生物界面活性剤の連続的生産が存在し得る。
【０１０３】
本方法は、反応器、例えば、生物反応器内で行われてもよい。本明細書で使用される「生物反応器」は、生物学的に活性な環境を支持することが可能な、製造又は設計された任意の装置又はシステムを指す。例えば、生物反応器は、内部で１つ以上の化学的及び／又は生物学的プロセスが生じる容器を含んでもよい。いくつかの実施形態では、これらのプロセスは、生物、又はそのような生物を由来とする生物学的に活性な物質に関与する。いくつかの実施形態では、生物又は細胞は、生物反応器内で増殖されてもよい。いくつかの実施形態では、生物は、使用中、反応器内にて浮遊又は固定化されてもよい。
【０１０４】
この方法に関連して使用される反応器には、回分式反応器、流加反応器、連続撹拌槽反応器などの連続反応器、移動培地、充填層、繊維層、膜反応器、又は当該技術分野にて既知の若しくは未だ発見されていない任意の他のシステムを挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、連続反応器の使用により、反応器を通して材料を連続的に揚送することが可能となる。揚送される材料の流れは、混合を促進することができる。いくつかの実施形態では、反応器内でバッフルなどの静的ミキサー、及び／又は機械的撹拌を使用して、構成成分の混合を促進してもよい。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本方法は、生物反応器を使用して行うことができる。細胞及び培地はインプットを経由して生物反応器に提供されてもよく、インプットには、孔、パイプ、チューブ、ホース、及び／又は当該技術分野にて既知の任意の他のインプット装置が挙げられるがこれらに限定されない。多数のインプットを使用して細胞、培地、及び／又は栄養素を反応器に提供してもよい。
【０１０７】
１つ以上のセンサ、及び１つ以上のコントローラを含む制御システムを使用して、反応器内の条件を制御することができる。コントローラには、プロセッサ、マイクロプロセッサ、又は当該技術分野にて既知の他のコントローラが挙げられるが、これらに限定されない。反応器条件を制御するのに使用される情報は、１つ以上のセンサから、及び／又はユーザーからコントローラに提供されてもよい。
【０１０８】
センサは、温度、ｐＨ、組成物、泡の存在、泡の量、圧力、沈殿物の存在、沈殿物の量、及び／又は当該技術分野にて既知の任意の他の関連する測定値を含むがこれらに限定されない、反応器内の条件を測定するのに使用することができる。多数のセンサが反応器の周りに配置されて、特定の位置における条件を測定してもよい。例えば、沈殿物の量又は存在を決定するセンサは、いくつかの実施形態では、反応器の底の付近に配置されてもよい。実施形態は、インプット開口部の付近、槽内の様々な位置、及び／又は所望の任意の位置の泡の存在を決定するセンサを含み得る。当該技術分野にて既知の任意のセンサを使用することができる。
【０１０９】
いくつかの実施形態は、観察のための窓又は開口部を槽内に含んでもよい。いくつかの反応器は、反応器内の状態を観察するための、反応器内に配置された照明を含んでもよい。操作者は槽内の状態を観察し、１つ以上のコントローラに接続されたユーザーインターフェース内にデータをインプットして、槽内の条件を調整することができる。
【０１１０】
例えば、センサ及び／又はユーザーインプットからのデータに基づいて、弁は反応器内の必要性に基づいて開放又は閉鎖されてもよい。いくつかの実施形態では、インプット上の弁は、栄養素、緩衝剤、培地、生物及び／又は他の構成成分の添加を制御してもよい。
【０１１１】
いくつかの実施形態は、反応器の内側チャンバ内での細胞の増殖を可能にすることを含んでもよい。栄養素、培地及び細胞は、所望の生物の増殖を最適にするのに十分な比で、反応器に添加されてもよい。いくつかの実施形態では、添加される材料の組成は、所望の構成成分の生産を最適にするよう制御される。例えば、所望の構成成分は、タンパク質又は化合物であってもよい。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、所望の構成成分の濃度が増大するにつれて、発泡が起こり始める場合がある。窓及び／又はセンサを使用して、反応器内の発泡を検知してもよい。例えば、センサ又は窓を使用して、発泡が起こっているか否かを決定することができる。一旦発泡が検知されたら、コントローラは沈殿剤を反応器に添加するよう命令してもよい。いくつかの実施形態では、この沈殿剤により、所望の構成成分が溶液から沈殿することが可能となり得る。沈殿した構成成分は、反応器の底に蓄積し得る。
【０１１３】
いくつかの実施形態は、反応器の底の付近に配置された１つ以上のセンサを含んで、沈殿物が存在するか否か、及び／又は存在する沈殿物の量を決定することができる。これらのセンサは、１つ以上のコントローラと通信し得る。コントローラはこの入力を使用して、沈殿物が反応器から退出するように、反応器の底の付近の弁を開放することを決定する。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、インプット及びアウトプットに沿ってポンプが使用されてインプット及びアウトプット内の材料の移動を容易にする。
【０１１５】
図３に示すように、いくつかの実施形態は、反応器１００を使用する方法を行うことを含んでもよい。細胞、培地、及び／又は栄養素は、インプット１０２を経由して反応器１００に提供されてもよい。図３に示すように、インプット１０２は、容器への生物及び／又は培地の供給を制御するのに使用される弁１０４を含んでもよい。いくつかの実施形態では、多数のインプットを使用して、生物及び／又は培地を反応器の異なる位置に供給してもよい。いくつかの実施形態では、図３に示すように、細胞及び培地はインプット１０２を経由して提供される。多数のセンサ１０６が反応器１００内の至る所に配置されてもよい。センサ１０６は、データをコントローラ１０８、１１０に提供する。コントローラ１０８、１１０は、細胞、培地、栄養素、沈殿剤及び／又は他の構成成分の量を制御することが可能である。いくつかの実施形態では、コントローラは、反応器、インプット、及び／又はアウトプットにおける条件を制御するよう調整を行ってもよい。
【０１１６】
いくつかの実施形態は、反応器の内側チャンバ内での細胞の増殖を可能にすることを含んでもよい。所望の構成成分の濃度が増大するにつれて、発泡が起こり始める場合がある。いくつかの実施形態では、窓及び／又はセンサを使用して、反応器内の発泡を検知してもよい。一旦発泡が検知されたら、沈殿剤を反応器に添加してもよい。いくつかの実施形態では、この沈殿剤により、所望の構成成分が溶液から沈殿することが可能となり得る。沈殿した構成成分は、センサ１０６を使用して検知することできる。いくつかの実施形態では、反応器１００内に窓１１６が存在して、ユーザーが反応器内の状態を観察することを可能にしてもよい。
【０１１７】
コントローラ１０８は、アウトプット弁１１２に接続されている。コントローラ１１０は、弁１１２を開放して沈殿物がアウトプット１１４を経由して槽を離れるように弁１１２に命令することができる。いくつかの実施形態では、必要に応じてユーザーインプットが弁１１２に対する開放及び／又は閉鎖の命令を制御することが可能であってもよい。
【０１１８】
図３に示すように、非限定的に空気、酸素又は当該技術分野にて既知の任意の他の栄養素を含む栄養素を、インプット１１８を使用して反応器に提供してもよい。インプット１１８は供給装置１２０に連結されて、反応器１００に栄養素を提供してもよい。いくつかの実施形態では、供給装置は、反応器内の任意の位置に配置されてもよい。いくつかの実施形態は、ミキサー１２２を含んで、反応器内での構成成分の混合を促進する。
【０１１９】
本発明及びその利点を詳細に記載してきたが、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更、置換及び修正を本発明に為し得ることを理解するべきである。
【０１２０】
例示のみを目的とし、本発明を如何様にも限定することを意図しない以下の実施例にて本発明を更に説明する。
【実施例】
【０１２１】
実施例１：透明化未精製ヒドロホビン溶液
硫酸ナトリウム及びｐＨ調整を用いた、透明化ヒドロホビン溶液中の泡形成を低減する方法を、本実施例に示す。ヒドロホビン溶液は、従来の生産方法を用いて得られた。ヒドロホビン溶液の濃度は、３３ｇ／ｋｇであった。硫酸ナトリウム処理は、無水硫酸ナトリウムを添加して、穏やかに混合し溶解させて最終濃度２．５％  ｗ／ｗに到達させることにより達成された。１％硫酸を使用してｐＨを４．０に調整した。溶液を１０℃で１６時間混合した。２×５ｍＬのＮａ２ＳＯ４処理濃縮物を遠心分離して、液体部分を除去した。沈殿物のそれぞれを、水中で初期ヒドロホビン濃縮物と同一の容積に再懸濁した。スパチュラを使用して、沈殿物を解き再懸濁した。２×５ｍＬの未処理ヒドロホビン濃縮物を調製した。この濃縮物の１つと、Ｎａ２ＳＯ４処理濃縮物の１つとを、振盪により混合した。
【０１２２】
写真を撮り、各チューブの総容積を直ちに及び４時間後に記録した。結果を表１に示す。硫酸ナトリウム処理溶液は、１ｇ／Ｌの可溶性ヒドロホビン濃度を有する。硫酸ナトリウムの添加後、９７％のヒドロホビンが不溶性である。
【０１２３】
【表１】
2014513937.tif 000003
【０１２４】
実施例２：精製ヒドロホビン溶液
熱を使用した、ヒドロホビン溶液の泡形成を低減する方法を本実施例に示す。ヒドロホビン溶液は、１３０ｇ／ｋｇの濃度を有する。５００ｍＬ  Ｐｙｒｅｘ内の３２０ｇのヒドロホビン溶液を混合した際、瓶の上部空間に泡が満ちた（図１、左の写真）。同様に混合した他のヒドロホビン溶液を８０℃に加熱した際、堆積物が形成し、泡が崩壊した（図１、右の写真）。結果を表２に示す。
【０１２５】
【表２】
2014513937.tif 000004
【０１２６】
実施例３：従来の技術を用いた発酵
表３は、組み換えセルラーゼ又は組み換えヒドロホビンのいずれかを発現するトリコデルマリーゼイを発酵させるための従来の手法を行った際のブロスの外観を記載する。発酵培地、条件、及び回収手順は同一であった。発酵の終わりに、発現されていた標的分子は、両方の場合において完全に可溶性であった。表３は、結果を示す。
【０１２７】
【表３】
2014513937.tif 000005
【０１２８】
実施例４：ヒドロホビン発酵ブロスの泡低下
図３及び４に示す従来の発酵及び回収技術を使用した、組み換えヒドロホビンを発現したトリコデルマリーゼイを培養することによって調製された発酵ブロス中の泡を低下させるための硫酸ナトリウムの使用を、本実施例に示す。
【０１２９】
回収ブロスを２．５％硫酸ナトリウムで処理し、１０％硫酸を用いて２８℃で２時間、ｐＨを３．９に調整し、１０℃で保管した。処理ブロスは、０．２ｇ／ｋｇの可溶性ヒドロホビンを有する。
【０１３０】
実施例５：ヒドロホビン発酵ブロスの泡低下
従来の発酵及び回収技術を使用した、組み換えヒドロホビンを発現したトリコデルマリーゼイを培養することによって調製された発酵ブロス中の泡を低下させるための硫酸ナトリウムの使用を、以下に記載する。
【０１３１】
５％硫酸アンモニウムを用いて回収ブロスを２２℃で処理した。得られたブロスは処理後、泡を全く含まなかった。このブロスは針形状のヒドロホビン結晶を含む。
【０１３２】
実施例５：ヒドロホビン発酵物回収中の泡抑制
組み換えヒドロホビンを発現した、従来通り発酵させたトリコデルマリーゼイブロスの回収中の泡の抑制方法を、本実施例に示す。ヒドロホビンを発酵させる従来の方法によるフォームアウトの問題は、回収中に悪化する。回収中、加圧された発酵槽の内容物を周囲圧力に戻す必要があり、このことは溶解空気のガス放出をもたらす。驚くべきことに、この発泡の傾向は、発酵ブロスに沈殿剤、詳細には硫酸ナトリウムを添加することにより、効果的に抑制することができる。ブロス中でのヒドロホビンの沈殿により、減圧中でも、抑制可能な地点まで発泡が低減される。
【０１３３】
発酵の終わりに（「発酵ブロスの終点」と称する）、発酵槽の作動パラメータが以下のように変更された。気流を底部フィードからスパージャーに向け直して、発酵槽の上部空間内に供給し、圧力を１３７．９ｋＰａ（２０ｐｓｉｇ）、温度を２８℃、振盪を１６０ｒｐｍのままとした。１５％  ｗ／ｗ  Ｎａ２ＳＯ４及びｐＨ  ２．８の硫酸ナトリウム原液を、得られたブロスが２．５％のＮａ２ＳＯ４＝濃度に到達するまで、６リットル／分の速度で発酵槽内に揚送した。得られたブロスは、ｐＨ  ４を有した（「Ｎａ２ＳＯ４／ｐＨ  ４減圧前ブロス」と称する）。次いで、気流を１６００ＬＰＭから１００ＬＰＭへ減少させ、また同時に圧力を１３７．９ｋＰａ（２０ｐｓｉｇ）から０Ｐａ（０ｐｓｉｇ）に低下させることにより（両方とも１時間かけて線形に）、発酵槽をゆっくりと減圧した。このブロスを「Ｎａ２ＳＯ４／ｐＨ  ４減圧ブロス」と称する。減圧後、ブロスを混合した状態で２８℃で発酵槽内に保つ一方、ｐＨの変化が観察されなくなるまでｐＨを監視し、ｐＨを４に調整した。このブロスを「Ｎａ２ＳＯ４／ｐＨ  ４回収ブロス」と称する。
【０１３４】
表４は、回収処理の様々な段階中に得られたブロスサンプルの物理的外観の結果を示す。この処理は、ブロスの密度を０．６０５ｇ／ｍＬから１．０４２ｇ／ｍへ増大させた。開始重量を使用してオーバーランを計算する。処理ブロスの可溶性ヒドロホビン濃度は０．２ｇ／ｋｇであり、未処理ブロスの可溶性ヒドロホビン濃度と比較して約２６倍低い。
【０１３５】
【表４】
2014513937.tif 000006
【０１３６】
実施例７：ヒドロホビン発酵中の泡抑制
発酵が尚進行している間、発酵培地及び条件を変化させることにより従来の発酵技術を変更して、発現されたヒドロホビンをブロスに不溶性とすることにより、発酵中のフォームアウトが防止されたことが、本実施例に示される。表５は、変更及び結果を示す。変更を有した全試験における回収ブロスの上清中のヒドロホビンの濃度は、０．５ｇ／ｋｇ未満であった。
【０１３７】
【表５】
2014513937.tif 000007
【０１３８】
実施例８：ヒドロホビン発酵中の消泡剤使用の低減
発酵が尚進行している間、従来の発酵培地及び条件を変化させて、発現されたヒドロホビンをブロスに不溶性となるようにすることによる、従来の発酵技術の変更が、必要な消泡剤の量を低減してフォームアウトを防止したことを本実施例に示す。
【０１３９】
従来の発酵試験にて３３ｇ／ｋｇの消泡剤を測定し、これは「ヒドロホビン発酵中の泡抑制」にて上記に示した変更された発酵と比較して６．１〜７．５倍高い。
【０１４０】
実施例９：ヒドロホビン組成物
変更された発酵により生産されたヒドロホビンの組成物を、図２に示す。質量７１８０のピークは、完全長ヒドロホビン分子に対応する。
【０１４１】
実施例１０：ラムノ脂質透明化溶液中の泡低下
透明化ラムノ脂質（製品ＪＢＲ５１５  Ｌｏｔ  ＃  １１０３２１、Ｊｅｎｅｉｌ  Ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｃｏ．，ＬＬＣ（４００  Ｎ．Ｄｅｋｏｒａ  Ｗｏｏｄｓ  Ｂｌｖｄ，Ｓａｕｋｖｉｌｌｅ，ＷＩ  ５３０８０）から贈与）溶液中の泡形成の低減を、ｐＨ調整、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム及び陽イオン性ポリマーＣ５８１（Ｃｙｔｅｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｗｏｏｄｌｎａｄ  Ｐａｒｋ，ＮＪ  ０７４２４））処理後に測定した。０．２１グラムのＪＢＲ５１５を９３グラムの脱イオン水に加え、５分間穏やかに混合することによりラムノ脂質溶液を調製した。
【０１４２】
泡形成の低減を試験するために、５グラムの調製溶液を１５ｍＬの透明コニカルチューブに移動し、処理化学物質を加え、化学物質が分散又は溶解するまで、反転により穏やかに混合した。処理溶液及び未処理溶液を２０回振盪し、デジタルカメラを使用してサンプルの外観を直ちに捕らえた。サンプルの液体部分の外観を、未処理サンプルに対する目視検査により評価した。各振盪溶液によって占められる容積を記録し、オーバーラン及び泡低下指数を計算した。これらを表６に示す。ＨＡＣＨ  ２１００ＡＮ  Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｅｒ（Ｈａｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｌｏｖｅｌａｎｄ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ））を使用して濁度測定を行い、表６にＮＴＵ（Ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ  Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ  Ｕｎｉｔｓ）値として報告する。
【０１４３】
【表６】
2014513937.tif 000008
【０１４４】
実施例１１：ソホロ脂質透明化溶液中の泡低下
透明化ソホロ脂質（製品ＳＯ＿ＳＯＰＨＳ  Ｌｏｔ＃  １０１７５Ａ，ＳｏｌｉａｎｃＥ（Ｒｏｕｔｅ  ｄｅ  Ｂａｚａｎｃｏｕｒｔ  ５１１１０  Ｐｏｍａｃｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ））溶液中の泡形成の低減を、ｐＨ調整、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム及び陽イオン性ポリマーＣ５８１処理後に測定した。０．２８グラムのＳＯ＿ＳＯＰＨＳを１２２グラムの脱イオン水に加え、１Ｎ  ＮａＯＨを使用してｐＨを１０．１に調整することによりソホロ脂質溶液を調製した。ｐＨ調整中、溶液を穏やかに混合した。泡形成の低減をラムノ脂質透明化溶液の節に記載したように測定した。各振盪溶液によって占められる容積を記録し、オーバーラン及び泡低下指数を計算した。これらを表７に示す。ＨＡＣＨ  ２１００ＡＮ  Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｅｒ（Ｈａｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌｏｖｅｌａｎｄ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）を使用して濁度測定を行い、表７にＮＴＵ（Ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ  Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ  Ｕｎｉｔｓ）値として報告する。
【０１４５】
【表７】
2014513937.tif 000009
【０１４６】
実施例１２：サーファクチン透明化溶液中の泡低下
透明化サーファクチン（Ｐａｒｔ  ＃  Ｓ３５２３−５０ＭＧ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｒｉｃｈ（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  ９５１５２４  Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ  ７５３９５−１５２４））溶液中の泡形成の低減を、ｐＨ調整、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、及び硫酸ナトリウム処理後に測定した。サーファクチンを収容しているバイアルに２．０３グラムの脱イオン水を直接加え、１Ｎ  ＮａＯＨを使用してｐＨを６〜７（ｐＨストリップ紙で測定して）に調整することによりサーファクチン原液を調製した。８．９ｇの脱イオン水を０．７９ｇの原液に加えることにより原液を更に希釈した。泡形成の低減をラムノ脂質透明化溶液の節に記載したように測定した。サンプルの液体部分の外観を、未処理サンプルに対する目視検査により評価した。表８は、実行した処理のそれぞれに関するオーバーラン、泡低下指数、及び液体部分の外観を示す。
【０１４７】
【表８】
2014513937.tif 000010
【０１４８】
表９は、室温で０．５時間保った処理及び未処理溶液に関するオーバーラン、泡低下指数及び液体部分の外観を示す。
【０１４９】
【表９】
2014513937.tif 000011
【０１５０】
実施例１３：ラムノ脂質を含むバチルスリケニフォルミス発酵ブロス中の泡低下
ラムノ脂質（実施例１０に記載した）を含むバチルスリケニフォルミス発酵ブロス中の泡形成の低減を、ｐＨ調整、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム及び陽イオン性ポリマーＣ５８１処理後に測定した。５．６５グラムのＪＢＲ５１５を、当該技術分野にて既知の技術を用いて生成した１００グラムのバチルスリケニフォルミス発酵ブロスに加え、溶液を５分間穏やかに混合した。得られたブロス溶液は、ｐＨ  ６．５２を有する。泡形成の低減をラムノ脂質透明化溶液の節に記載したように測定した。表１０は、実行した処理のぞれぞれに関するオーバーラン及び泡低下指数を示す。
【０１５１】
【表１０】
2014513937.tif 000012
【０１５２】
実施例１４：ラムノ脂質を含むトリコデルマリーゼイ発酵ブロス中のラムノ脂質
ラムノ脂質（実施例１０に記載した）を含むトリコデルマリーゼイ発酵ブロス中の泡形成の低減を、開始溶液からのｐＨの調製、並びに／又は塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム及び陽イオン性ポリマーＣ５８１処理後に測定した。６．５３グラムのＪＢＲ５１５を、２８グラムの脱イオン水、及び当該技術分野にて既知の技術を用いて生成した１００グラムのトリコデルマリーゼイ発酵ブロスに加え、ｐＨを６．１５に調整し、５分間穏やかに混合した。泡形成の低減をラムノ脂質透明化溶液の節に記載したように測定した。泡形成の低減を直ちに及び３０分にて測定し、したがって発泡低減の継続時間が存在する。表１１は、実行した処理のそれぞれに関するオーバーラン及び泡低下指数を示す。
【０１５３】
【表１１】
2014513937.tif 000013
【０１５４】
実施例１５：ラムノ脂質を含むバチルスズブチルス発酵ブロス中の泡低下
ラムノ脂質（ラムノ脂質透明化溶液の節に記載した）を含むバチルスズブチルス発酵ブロス中の泡形成の低減を、ｐＨ調整、並びに／又は塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム及び陽イオン性ポリマーＣ５８１処理後に測定した。２．７１グラムのＪＢＲ５１５を、当該技術分野にて既知の技術を用いて生成した４０．１グラムのバチルスズブチルス発酵ブロスに加え、溶液を５分間穏やかに混合した。泡形成の低減をラムノ脂質透明化溶液の節に記載したように測定した。表１２は、実行した処理のそれぞれに関するオーバーラン及び泡低下指数を示す。
【０１５５】
【表１２】
2014513937.tif 000014
【０１５６】
実施例１６：ソホロ脂質を含むバチルスリケニフォルミス発酵ブロス中の泡低下
ソホロ脂質（ソホロ脂質透明化溶液の節に記載した）を含むバチルスリケニフォルミス発酵ブロス溶液中の泡形成の低減を、ｐＨ調整、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム及び陽イオン性ポリマーＣ５８１処理を用いて測定した。７．６３グラムのＳＯ＿ＳＯＰＨＳを、当該技術分野にて既知の技術を用いて生成した１０２．２グラムのバチルスリケニフォルミス発酵ブロスに加え、溶液を５分間穏やかに混合した。得られたブロスのｐＨを７．２３に調整した。泡形成の低減をラムノ脂質透明化溶液の節に記載したように測定した。表１３は、実行した処理のそれぞれに関するオーバーラン及び泡低下指数を示す。
【０１５７】
【表１３】
2014513937.tif 000015
【０１５８】
実施例１７：ソホロ脂質を含むトリコデルマリーゼイ発酵ブロス中の泡低下
ソホロ脂質（ソホロ脂質透明化溶液の節に記載した）を含むトリコデルマリーゼイ発酵ブロス溶液中の泡形成の低減を、ｐＨ調整、並びに／又は塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム及び陽イオン性ポリマーＣ５８１処理を用いて測定した。５．５グラムのＳＯ＿ＳＯＰＨＳを、２８グラムの脱イオン水、及び当該技術分野にて既知の技術を用いて生成した１００．２グラムのトリコデルマリーゼイ発酵ブロスに加え、溶液を５分間穏やかに混合した。泡形成の低減をラムノ脂質透明化溶液の節に記載したように測定した。表１４は、実行した処理のそれぞれに関するオーバーラン及び泡低下指数を示す（ＮＤ−測定せず）。
【０１５９】
【表１４】
2014513937.tif 000016
【０１６０】
実施例１８：ソホロ脂質を含むバチルスズブチルス発酵ブロス中の泡低下
ソホロ脂質（ソホロ脂質透明化溶液の節に記載した）を含むバチルスズブチルス発酵ブロス溶液中の泡形成の低減を、ｐＨ調整、並びに／又は塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム及び陽イオン性ポリマーＣ５８１処理を用いて測定した。２．６１グラムのＳＯ＿ＳＯＰＨＳを、当該技術分野にて既知の技術を用いて生成した４０．６グラムのバチルスズブチルス発酵ブロスに加え、溶液を５分間穏やかに混合した。得られたブロスのｐＨは、７．２７であった。泡形成の低減をラムノ脂質透明化溶液の節に記載したように測定した。表１５は、実行した処理のそれぞれに関するオーバーラン及び泡低下指数を示す。
【０１６１】
【表１５】
2014513937.tif 000017
【０１６２】
実施例１９：サーファクチンを含むバチルスズブチルス発酵ブロス中の泡低下
サーファクチン（サーファクチン透明化溶液の節に記載した）を含むバチルスズブチルス発酵ブロス中の泡形成の低減を、塩化ナトリウム処理後に測定した。サーファクチンを収容しているバイアルに２．０３グラムの脱イオン水を加え、１Ｎ  ＮａＯＨを使用してｐＨを６〜７（ｐＨストリップ紙で測定して）に調整することによりサーファクチン原液を調製した。０．７１ｇの原液を、当該技術分野にて既知の技術を用いて調製した１．９ｇのバチルスズブチルス発酵ブロスに加えることにより、原液を更に希釈し、溶液を５分間穏やかに混合した。サーファクチン含有ブロスを２０回振盪し、デジタルカメラを使用して振盪サンプルの外観を捕らえた。０．０２２ｇのＮａＣｌを同一のサーファクチン含有ブロスに加え、２０回振盪し、写真に撮った。追加の０．０４６ｇ及び０．０３２ｇのＮａＣｌを同一のブロスに連続して加え、ブロスを２０回振盪し、写真に撮った。表１６は、各処理後のブロス中の総ＮａＣｌ濃度と、各処理後の対応するオーバーラン及び泡低下指数と、を示す。
【０１６３】
【表１６】
2014513937.tif 000018
【０１６４】
実施例２０：サーファクチンを含むバチルスリケニフォルミス発酵ブロス中の泡低下
サーファクチン（サーファクチン透明化溶液の節に記載した）を含むバチルスリケニフォルミス発酵ブロス中の泡形成の低減を、塩化カルシウム処理後に測定した。サーファクチンを収容しているバイアルに２．０３グラムの脱イオン水を加え、１Ｎ  ＮａＯＨを使用してｐＨを６〜７（ｐＨストリップ紙で測定して）に調整することによりサーファクチン原液を調製した。０．７１ｇの原液を、当該技術分野にて既知の技術を用いて調製した１．９ｇのバチルスリケニフォルミス発酵ブロスに加えることにより、原液を更に希釈し、溶液を５分間穏やかに混合した。サーファクチン含有ブロスを２０回振盪し、デジタルカメラを使用して振盪サンプルの外観を捕らえた。０．０２５ｇのＣａＣｌ２を同一のサーファクチン含有ブロスに加え、２０回振盪し、写真に撮った。追加の０．０２１ｇ  ＣａＣｌ２を同一の含有ブロスに加え、２０回振盪し、写真に撮った。表１７は、各処理後のブロス中の総塩化カルシウム濃度と、各処理後の対応するオーバーラン及び泡低下指数と、を示す。
【０１６５】
【表１７】
2014513937.tif 000019
【０１６６】
図４は、上述した各処理後のサンプルの外観を示す。
【０１６７】
本発明は、番号付けされた以下のパラグラフにより更に記載される。
【０１６８】
１．宿主細胞が生物界面活性剤を細胞外に分泌し、生物界面活性剤が発酵培地に可溶性である場合、発酵培地中での宿主細胞による生物界面活性剤の生産中に発泡する生物界面活性剤の発泡を抑制するための方法であって、宿主細胞による生物界面活性剤の生産と同時に、生物界面活性剤を不溶化する工程を含み、この工程によって、不溶化された生物界面活性剤が発泡しないため発泡が抑制される、方法。
【０１６９】
２．生物界面活性剤が、ヒドロホビンＩＩ、ラムノ脂質、ソホロ脂質又はサーファクチンを含む、パラグラフ１の方法。
【０１７０】
３．不溶化する工程が、発酵培地に沈殿剤を添加する工程、及び／又は発酵培地のｐＨを低下させる工程、及び／又は発酵培地の温度を上昇させる工程、を含む、パラグラフ２の方法。
【０１７１】
４．不溶化する工程が、発酵培地に沈殿剤を添加する工程を含む、パラグラフ３の方法。
【０１７２】
５．沈殿剤が、塩、アルコール、水混和性有機溶媒、水溶性ポリマー又は陽イオン性ポリマーである、パラグラフ４の方法。
【０１７３】
６．沈殿剤が塩であり、塩が、その陰イオンとして、ハライド、シトレート、アセテート、ニトレート、カーボネート；スルフェート；ホスフェート；スルファメート；ホスホネート、スルファメートを含み、又は亜硝酸塩であり、その陽イオンとしてアンモニウム、カルシウム、鉄、マグネシウム、リチウム、カリウム又はナトリウムを含む、パラグラフ５の方法。
【０１７４】
７．塩が、硫酸塩又は塩化物塩を含む、パラグラフ６の方法。
【０１７５】
８．塩化物塩が、塩化カルシウム又は塩化ナトリウムであり、硫酸塩が、硫酸アンモニウム又は硫酸ナトリウムである、パラグラフ７の方法。
【０１７６】
９．沈殿剤がアルコールであり、アルコールが、一価又は多価アルコールＣ１〜Ｃ６アルコールを含む、パラグラフ５の方法。
【０１７７】
１０．沈殿剤溶媒がケトンである、パラグラフ５の方法。
【０１７８】
１１．ケトンがアセトンである、パラグラフ１０の方法。
【０１７９】
１２．沈殿剤がポリエチレングリコール（polythyene glycol）又は多糖である、パラグラフ５の方法。
【０１８０】
１３．多糖がデキストランである、パラグラフ１２の方法。
【０１８１】
１４．沈殿剤が、メタノール、エタノール又はイソプロピルアルコールを含む、パラグラフ９の方法。
【０１８２】
１５．不溶化する工程が、発酵培地のｐＨを低下させる工程、及び／又は発酵培地の温度を上昇させる工程、を含む、パラグラフ３の方法。
【０１８３】
１６．泡低下指数が１を超え、及び／若しくは泡低下指数が２を超え、及び／若しくは泡低下指数が３を超え、並びに／又は発酵培地中の可溶性生物界面活性剤の濃度が、最大で約１ｇ／ｋｇであり、並びに／又は生産された生物界面活性剤の少なくとも２５％が不溶化され、並びに／又は方法が、消泡剤を添加することなく行われ、並びに／又は方法が、不溶化なしで行われる方法と比較して低減された消泡剤の量を用いて行われ、並びに／又は方法が、ｐＨを上昇させ若しくは低下させることにより行われ、並びに／又は方法が、温度を上昇させ若しくは低下させることにより行われる、パラグラフ１〜１５のいずれか１つの方法。
【０１８４】
１７．方法が、発酵培地を生物反応器に供給する工程と、沈殿剤を添加し又は沈殿条件を適用する工程と、不溶化された生物界面活性剤を収集する工程と、発酵培地又は発酵培地の成分又は宿主細胞を補充する工程と、場合により、不溶化生物界面活性剤とともに収集された任意の発酵培地又は発酵培地の成分又は宿主細胞を再利用する工程と、を含む連続プロセスである、パラグラフ１〜１５の方法。
【０１８５】
１８．方法が、発酵培地を生物反応器に供給する工程と、沈殿剤を添加し又は沈殿条件を適用する工程と、不溶化された生物界面活性剤を収集する工程と、発酵培地又は発酵培地の成分又は宿主細胞を補充する工程と、場合により、不溶化生物界面活性剤とともに収集された任意の発酵培地又は発酵培地の成分又は宿主細胞を再利用する工程と、を含む連続プロセスである、パラグラフ１６の方法。
【０１８６】
１９．宿主細胞が生物界面活性剤を細胞外に分泌し、生物界面活性剤が発酵培地に可溶性である場合、発酵培地中での宿主細胞による生物界面活性剤の生産中に発泡する生物界面活性剤の発泡を抑制するための方法であって、宿主細胞による生物界面活性剤の生産と同時に、生物界面活性剤を不溶化する工程を含み、該工程によって、不溶化された生物界面活性剤が発泡しないため発泡が抑制され、泡低下指数が１を超え、及び／若しくは泡低下指数が２を超え、及び／若しくは泡低下指数が３を超え、並びに／又は発酵培地中の可溶性生物界面活性剤の濃度が、最大で約１ｇ／ｋｇであり、並びに／又は生産された生物界面活性剤の少なくとも２５％が不溶化され、並びに／又は方法が、消泡剤を添加することなく行われ、並びに／又は方法が、生物界面活性剤の不溶化なしで行われる方法と比較して低減された消泡剤の量を用いて行われ、並びに／又は方法が、ｐＨを上昇させ若しくは低下させることにより行われ、並びに／又は方法が、温度を上昇させ若しくは低下させることにより行われる、方法。
【０１８７】
２０．生物界面活性剤が、ヒドロホビンＩＩ、ラムノ脂質、ソホロ脂質又はサーファクチンを含む、パラグラフ１９の方法。
【０１８８】
２１．不溶化する工程が、発酵培地に沈殿剤を添加することを含む、又は発酵培地に沈殿剤を添加することから本質的になる、パラグラフ１９又は２０の方法。
【０１８９】
２２．沈殿剤が塩を含み、又は塩から本質的になり、該塩が、その陰イオンとして、ハライド、シトレート、アセテート、ニトレート、カーボネート；スルフェート；ホスフェート；スルファメート；ホスホネート、スルファメートを含み、又は亜硝酸塩であり、その陽イオンとしてアンモニウム、カルシウム、鉄、マグネシウム、リチウム、カリウム又はナトリウムを含む、パラグラフ２１の方法。
【０１９０】
２３．塩が、硫酸塩を含む、又は硫酸塩から本質的になる、パラグラフ２２の方法。
【０１９１】
２４．沈殿剤が、アルコールを含む、又はアルコールから本質的になる、パラグラフ２１の方法。
【０１９２】
２５．生産中に発泡する、溶液中の生物界面活性剤の発泡を抑制するための方法であって、
生物界面活性剤の生産中、条件が泡形成を生じ得る地点と同時に、生物界面活性剤を不溶化する工程を含み、該工程により、不溶化された生物界面活性剤が発泡しないため発泡が抑制される、方法。
【０１９３】
２６．溶液が発酵培地を含み、生産が、発酵培地中での宿主細胞による生物界面活性剤の発現を含み、宿主細胞が生物界面活性剤を細胞外に分泌し、生物界面活性剤が発酵培地に可溶性であり、それにより泡形成が生じ得る、パラグラフ２５の方法。
【０１９４】
２７．生産が真空濾過を含み、真空濾過により泡形成が生じ得る、パラグラフ２５の方法。
【０１９５】
２８．生産が回収を含み、回収により泡形成が生じ得る、パラグラフ２５の方法。
【０１９６】
２９．生産が収集を含み、収集により泡形成が生じ得る、パラグラフ２５の方法。
【０１９７】
３０．生産が圧縮を含み、圧縮により泡形成が生じ得る、パラグラフ２５の方法。
【０１９８】
３１．生産が瀉血を含み、瀉血により泡形成が生じ得る、パラグラフ２５の方法。
【０１９９】
３２．生産が解離を含み、解離により泡形成が生じ得る、パラグラフ２５の方法。
【０２００】
３３．生産が均質化を含み、均質化により泡形成が生じ得る、パラグラフ２５の方法。
【０２０１】
３４．生産がすり潰しを含み、すり潰しにより泡形成が生じ得る、パラグラフ２５の方法。
【０２０２】
３５．生産が醸造を含み、醸造により泡形成が生じ得る、パラグラフ２５の方法。
【０２０３】
３６．生産が回収を含み、回収により泡形成が生じ得る、パラグラフ２５の方法。
【０２０４】
３７．生産が固液分離を含み、固液分離により泡形成が生じ得る、パラグラフ２５の方法。
【０２０５】
３８．生産が遠心分離を含み、遠心分離により泡形成が生じ得る、パラグラフ２５の方法。
【０２０６】
３９．生産が細胞分離を含み、細胞分離により泡形成が生じ得る、パラグラフ２５の方法。
【０２０７】
４０．生産が任意の通気プロセスを含み、プロセスにより泡形成が生じ得る、パラグラフ２５の方法。
【０２０８】
４１．生産が、液体を揚送する工程、及び／又は機器を満たす工程、及び／又は機器を空にする工程、及び／又は機器を清掃する工程、及び／又は機器を濯ぐ工程、を含み、これらにより泡形成が生じ得る、パラグラフ２５の方法。
【０２０９】
４２．生物界面活性剤が、ヒドロホビンＩＩ、ラムノ脂質、ソホロ脂質又はサーファクチンを含む、パラグラフ２５の方法。
【０２１０】
４３．生物界面活性剤を不溶化する工程が、
沈殿剤を溶液に添加する工程、
溶液のｐＨを上昇又は低下させる工程、及び／又は
溶液の温度を上昇又は低下させる工程、を含む、パラグラフ２５の方法。
【０２１１】
４４．生物界面活性剤を不溶化する工程が、
溶液に沈殿剤を添加する工程を含む、パラグラフ２５の方法。
【０２１２】
４５．沈殿剤が、塩、アルコール、水混和性有機溶媒、又は水溶性ポリマー若しくは陽イオン性ポリマーである、パラグラフ４３又は４４の方法。
【０２１３】
４６．沈殿剤が塩であり、該塩が、その陰イオンとして、ハライド、シトレート、アセテート、ニトレート、カーボネート；スルフェート；ホスフェート；スルファメート；ホスホネート、スルファメートを含み、又は亜硝酸塩であり、その陽イオンとしてアンモニウム、カルシウム、鉄、マグネシウム、リチウム、カリウム又はナトリウムを含む、パラグラフ４３又は４４の方法。
【０２１４】
４７．塩が、塩化物塩又は硫酸塩を含む、パラグラフ４２の方法。
【０２１５】
４８．ハロゲン化物塩が、塩化カルシウム又は塩化ナトリウムであり、硫酸塩が、硫酸アンモニウム又は硫酸ナトリウムである、パラグラフ４３の方法。
【０２１６】
４９．沈殿剤がアルコールであり、アルコールが、一価又は多価アルコールＣ１〜Ｃ６アルコールを含む、パラグラフ４２の方法。
【０２１７】
５０．沈殿剤が、メタノール、エタノール又はイソプロピルアルコールを含む、パラグラフ４２の方法。
【０２１８】
５１．生物界面活性剤を不溶化する工程が、
酵培地のｐＨを低下させる工程、及び／又は
発酵培地の温度を上昇させる工程、を含む、パラグラフ２５の方法。
【０２１９】
５２．泡低下指数が１を超え、及び／又は泡低下指数が２を超え、及び／又は泡低下指数が３を超え、
方法が、消泡剤を添加することなく行われ、
方法が、不溶化なしで行われる方法と比較して低減された消泡剤の量を用いて行われるように、発泡を抑制する工程を含む、パラグラフ２５〜５１のいずれか１つの方法。
【０２２０】
５３．方法が、
発酵培地を生物反応器に供給する工程と、
沈殿剤を添加し又は沈殿条件を適用する工程と、
不溶化生物界面活性剤を収集する工程と、
溶液又は溶液の成分又は宿主細胞を補充する工程と、場合により、不溶化生物界面活性剤とともに収集された任意の溶液又は溶液の成分又は宿主細胞を再利用する工程と、を含む連続プロセスである、パラグラフ２５〜５１のいずれか１つの方法。
【０２２１】
５４．溶液の可溶性生物界面活性剤の濃度が、約１０ｇ／ｋｇ未満である、パラグラフ２５〜５１のいずれか１つの方法。
【０２２２】
５５．溶液の可溶性生物界面活性剤の濃度が、約０．１ｇ／ｋｇ〜約１０ｇ／ｋｇの範囲内である、パラグラフ２５〜５１のいずれか１つの方法。
【０２２３】
５６．溶液の可溶性生物界面活性剤の濃度が、約０．１ｇ／ｋｇ〜約５ｇ／ｋｇの範囲内である、パラグラフ２５〜５１のいずれか１つの方法。
【０２２４】
５７．溶液の可溶性生物界面活性剤の濃度が、約０．１ｇ／ｋｇ〜約１．０ｇ／ｋｇの範囲内である、パラグラフ２５〜５１のいずれか１つの方法。
【０２２５】
５８．生産された生物界面活性剤の少なくとも５０％が不溶化される、パラグラフ２５〜５１のいずれか１つの方法。
【０２２６】
５９．生産された生物界面活性剤の少なくとも７５％が不溶化される、パラグラフ２５〜５１のいずれか１つの方法。
【０２２７】
６０．生産された生物界面活性剤の少なくとも９０％が不溶化される、パラグラフ２５〜５１のいずれか１つの方法。
【０２２８】
６１．生産された生物界面活性剤の少なくとも９５％が不溶化される、パラグラフ２５〜５１のいずれか１つの方法。
【０２２９】
６２．溶液中の可溶性生物界面活性剤の濃度が、約０．１ｇ／ｋｇ〜約１０ｇ／ｋｇの範囲内であり、生産された生物界面活性剤の少なくとも５０％が不溶化される、パラグラフ２５〜５１のいずれか１つの方法。
【０２３０】
６３．溶液が発酵培地を含む、パラグラフ２５〜５１のいずれか１つの方法。
【０２３１】
６４．生産中に発泡する生物界面活性剤の発泡を抑制するための方法であって、
溶液中での宿主細胞による生産と同時に、生物界面活性剤を不溶化する工程と、
泡低下指数が１を超え、及び／若しくは泡低下指数が２を超え、及び／若しくは泡低下指数が３を超え、並びに／又は
溶液中の可溶性生物界面活性剤の濃度が、最大で約１ｇ／ｋｇであり、並びに／又は
生産された生物界面活性剤の少なくとも２５％が不溶化され、並びに／又は
方法が、消泡剤を添加することなく行われ、並びに／又は
方法が、不溶化なしで行われる方法と比較して低減された消泡剤の量を用いて行われるように、発泡を抑制する工程と、を含む、方法。
【０２３２】
６５．溶液が発酵培地であり、
生産が、発酵培地中での宿主細胞による生物界面活性剤の発現を含み、
宿主細胞が生物界面活性剤を細胞外に分泌し、
生物界面活性剤が、発酵培地に可溶性であり、それにより泡形成が生じ得る、パラグラフ６４の方法。
【０２３３】
６６．生産が真空濾過を含み、真空濾過により泡形成が生じ得る、パラグラフ６４の方法。
【０２３４】
６７．生産が回収を含み、回収により泡形成が生じ得る、パラグラフ６４の方法。
【０２３５】
６８．生産が収集を含み、収集により泡形成が生じ得る、パラグラフ６４の方法。
【０２３６】
６９．生産が圧縮を含み、圧縮により泡形成が生じ得る、パラグラフ６４の方法。
【０２３７】
７０．生産が瀉血を含み、瀉血により泡形成が生じ得る、パラグラフ６４の方法。
【０２３８】
７１．生産が解離を含み、解離により泡形成が生じ得る、パラグラフ６４の方法。
【０２３９】
７２．生産が均質化を含み、均質化により泡形成が生じ得る、パラグラフ６４の方法。
【０２４０】
７３．生産がすり潰しを含み、すり潰しにより泡形成が生じ得る、パラグラフ６４の方法。
【０２４１】
７４．生産が醸造を含み、醸造により泡形成が生じ得る、パラグラフ６４の方法。
【０２４２】
７５．生産が回収を含み、回収により泡形成が生じ得る、パラグラフ６４の方法。
【０２４３】
７６．生産が固液分離を含み、固液分離により泡形成が生じ得る、パラグラフ６４の方法。
【０２４４】
７７．生産が遠心分離を含み、遠心分離により泡形成が生じ得る、パラグラフ６４の方法。
【０２４５】
７８．生産が細胞分離を含み、細胞分離により泡形成が生じ得る、パラグラフ６４の方法。
【０２４６】
７９．生産が任意の通気プロセスを含み、プロセスにより泡形成が生じ得る、パラグラフ６４の方法。
【０２４７】
８０．生物界面活性剤が、ヒドロホビンＩＩ、ラムノ脂質、ソホロ脂質又はサーファクチンを含む、パラグラフ６４又は６５の方法。
【０２４８】
８１．生物界面活性剤を不溶化する工程が、溶液に沈殿剤を添加する工程を含む、又は溶液に沈殿剤を添加する工程から本質的になる、パラグラフ６４、６４、又は８０の方法。
【０２４９】
８２．沈殿剤が塩を含み、又は塩から本質的になり、塩が、その陰イオンとして、ハライド、シトレート、アセテート、ニトレート、カーボネート；スルフェート；ホスフェート；スルファメート；ホスホネート、スルファメートを含み、又は亜硝酸塩であり、その陽イオンとしてアンモニウム、カルシウム、鉄、マグネシウム、リチウム、カリウム又はナトリウムを含む、パラグラフ８１の方法。
【０２５０】
８３．塩が硫酸塩を含む、又は硫酸塩から本質的になる、パラグラフ８２の方法。
【０２５１】
８４．沈殿剤が、アルコールを含む、又はアルコールから本質的になる、パラグラフ８１の方法。
【０２５２】
８５．生産中に生物界面活性剤の発泡を抑制するための方法であって、
生物界面活性剤の生産中の組成物の条件を制御して、泡を低下させる工程であって、
組成物中の条件を調整して、
泡低下指数が１を超え、及び／若しくは泡低下指数が２を超え、及び／若しくは泡低下指数が３を超え、
発酵培地中の可溶性生物界面活性剤の濃度が、最大で約１ｇ／ｋｇであり、並びに／又は生産された生物界面活性剤の少なくとも２５％が不溶化され、並びに／又は
方法が、消泡剤を添加することなく行われ、並びに／又は方法が、不溶化なしで行われる方法と比較して低減された消泡剤の量を用いて行われるように、発泡を低減する工程、を含む、方法。
【０２５３】
８６．組成物中の条件を調整する工程が、
組成物のｐＨを調整する工程、及び
組成物の温度を調整する工程、を含む、パラグラフ８５の方法。
【０２５４】
８７．
生産中に組成物の物理的状態を監視して、発泡が生じたときを決定する工程と、
組成物に沈殿剤を提供して発泡を低減する工程と、を含む、パラグラフ８５の方法。
【０２５５】
８８．沈殿剤が、塩、アルコール、水混和性有機溶媒、水溶性ポリマー又は陽イオン性ポリマーを含む、パラグラフ８７の方法。
【０２５６】
８９．沈殿剤が、塩を含み、塩が、その陰イオンとして、ハライド、シトレート、アセテート、ニトレート、カーボネート；スルフェート；ホスフェート；スルファメート；ホスホネート、スルファメートを含み、又は亜硝酸塩であり、その陽イオンとしてアンモニウム、カルシウム、鉄、マグネシウム、リチウム、カリウム又はナトリウムを含む、パラグラフ８７の方法。
【０２５７】
９０．塩が塩化物塩又は硫酸塩を含む、パラグラフ８９の方法。
【０２５８】
９１．塩化物塩が塩化カルシウム又は塩化ナトリウムであり、硫酸塩が硫酸アンモニウム又は硫酸ナトリウムである、パラグラフ９０の方法。
【０２５９】
９２．沈殿剤がアルコールを含む、パラグラフ８８の方法。
【０２６０】
９３．宿主細胞がトリコデルマリーゼイ（Trichoderma reesei）である、パラグラフ１、２、１７〜２０、２６、４２、５３、６４、６５又は８０のいずれか１つの方法。
【０２６１】
９４．宿主細胞がバチルスズブチルスである、パラグラフ１、２、１７〜２０、２６、４２、５３、６４、６５又は８０のいずれか１つの方法。
【０２６２】
９５．宿主細胞がバチルスリケニフォルミスである、パラグラフ１、２、１７〜２０、２６、４２、５３、６４、６５又は８０のいずれか１つの方法。
【０２６３】
９６．宿主細胞がアスペルギルス種である、パラグラフ１、２、１７〜２０、２６、４２、５３、６４、６５又は８０のいずれか１つの方法。
【０２６４】
本発明の好ましい実施形態を詳細に記載してきたが、上記のパラグラフに定義した本発明は、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく多数の明らかな変形が可能であるため、上記に記載した特定の詳細に限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【国際調査報告】
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