(57)【要約】  ２型糖尿病を治療する必要がある被験体において２型糖尿病を治療するための方法、および２型糖尿病の治療のための薬学的組成物を開示する。該方法には、有効量のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶを被験体に投与する工程が含まれる。該薬学的組成物には、２型糖尿病の治療に関して被験体に投与するために配合されたアポリポタンパク質Ａ−ＩＶが含まれる。やはり開示するのは、耐糖能を実質的に回復させる必要がある被験体において、正常レベルまで耐糖能を実質的に回復させるための方法、および血液グルコースレベルを低下させる必要がある被験体において、血液グルコースレベルを低下させる方法である。
2014504601.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＩ型糖尿病の治療が必要な被験体において、ＩＩ型糖尿病を治療するための方法であって、被験体に、有効量のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはアポリポタンパク質Ａ−ＩＶに少なくとも９０％の同一性を有するその生物学的活性類似体を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
血液グルコースレベルを低下させる必要がある被験体において、血液グルコースレベルを低下させる方法であって、被験体に、有効量のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶタンパク質またはアポリポタンパク質Ａ−ＩＶに少なくとも９０％の同一性を有するその生物学的活性類似体を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項３】
耐糖能を実質的に回復させる必要がある被験体において、正常レベルまで耐糖能を実質的に回復させるための方法であって、被験体に、有効量のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはアポリポタンパク質Ａ−ＩＶに少なくとも９０％の同一性を有するその生物学的活性類似体を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項４】
生物学的活性類似体がアポリポタンパク質Ａ−ＩＶに少なくとも９９％の同一性を有する、請求項１〜３のいずれか一項の方法。
【請求項５】
被験体がヒトである、請求項１〜４のいずれか一項の方法。
【請求項６】
被験体に有効量のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶを投与する請求項１〜５のいずれか一項の方法であって、該アポリポタンパク質のアミノ酸配列が
【化１】
2014504601.tif 000003
式中、Ｘ１はＧ、Ａ、Ｖであるかまたは存在せず；
Ｘ２はＥまたはＫであり；
Ｘ３はＴまたはＳであり；そして
Ｘ４はＱまたはＨである
前記方法。
【請求項７】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶが全長ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＶである、請求項１〜５のいずれか一項の方法。
【請求項８】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶのアミノ酸が、
【化２】
2014504601.tif 000004
である、請求項７の方法。
【請求項９】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶのアミノ酸配列が：
【化３】
2014504601.tif 000005
である、請求項１〜５のいずれか一項の方法。
【請求項１０】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶがグリコシル化されている、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶがグリコシル化されていない、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶが全身投与される、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体の全身投与が、経口、皮下、静脈内、筋内、および腹腔内投与からなる群より選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体が、約１〜約１０μｇ／ｇの用量で投与される、請求項１〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体が、約０．２５〜約２μｇ／ｇの用量で投与される、請求項１〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体が、約１μｇ／ｇの用量で投与される、請求項１〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体が、１日１回投与される、請求項１〜１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体が、１日約２回投与される、請求項１〜１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
ＩＩ型糖尿病の治療に関して被験体に投与するために配合された、請求項１〜１８のいずれか一項のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体を含む、薬学的組成物。
【請求項２０】
薬学的に許容されうるキャリアーまたは希釈剤をさらに含む、請求項１９の薬学的組成物。
【請求項２１】
液体配合物である、請求項１９または２０の薬学的組成物。
【請求項２２】
水性配合物である、請求項１９〜２１のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
水性配合物が発熱物質不含である、請求項２２の薬学的組成物。
【請求項２４】
ＩＩ型糖尿病を治療する必要がある被験体において、ＩＩ型糖尿病を治療するための方法であって、被験体に、請求項１９〜２３のいずれか一項記載の薬学的組成物の有効量を投与する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国仮出願第６１/４３４，１９６号、２０１１年１月１９日出願の恩典を請求し、該出願の全解説は、本明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
[0001]本開示は、糖尿病を治療する方法に関する。より具体的には、本開示は、有効量のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶを投与することによって、２型糖尿病を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0002]糖尿病の発生は広範であり、米国人口のおよそ８％が糖尿病を患う。糖尿病は、体が有効にインスリンを産生しそして／または用いることができないことに起因する高血糖によって特徴付けられる慢性疾患である。糖尿病は、多様な身体的合併症を導く可能性もあり、これらには、限定されるわけではないが、腎不全、失明、神経損傷、心疾患、睡眠時無呼吸、およびセリアック病が含まれる。例えば、米国において、糖尿病は、腎不全、失明、切断、脳卒中、および心臓発作の主因である。やはり米国において、糖尿病は、死因の六番目であり、そして中年成人の平均余命を約５〜１０年減少させることが示されてきている。
【０００４】
[0003]糖尿病の最も一般的な型は、２型糖尿病（以後、「Ｔ２ＤＭ」）である。Ｔ２ＤＭは、高血糖、インスリン耐性、β細胞機能不全、および肝臓糖新生制御不全によって特徴付けられる。Ｔ２ＤＭを患うヒトは、インスリン分泌の第一期において、β細胞からの貯蔵されたインスリン顆粒の放出不全に関するグルコース刺激性インスリン分泌喪失を経験する。インスリン分泌の第二期において、Ｔ２ＤＭを患うヒトは、グルコース刺激に反応してインスリンを能動的に合成する能力の漸次喪失を経験する。
【０００５】
[0004]Ｔ２ＤＭの有病率は増加しつつあり、そして２００２年、Ｔ２ＤＭは、１３００億ドルを超える医療費を生じた。こうしたものとして、Ｔ２ＤＭを有効に治療するための新規療法が必要である。
【発明の概要】
【０００６】
[0005]本開示は、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶが、Ｔ２ＤＭの解決に密接に関与する有効な抗糖尿病ペプチドであるという驚くべき発見に基づく。アポリポタンパク質Ａ−ＩＶは、食後の耐糖能に寄与する重要な腸ホルモンであり、そして耐糖能の改善において、以前は正しく評価されていなかった仲介因子として働く。したがって、１つの態様において、Ｔ２ＤＭを治療する必要がある被験体において、Ｔ２ＤＭを治療する方法を開示する。該方法は、被験体に、有効量のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはアポリポタンパク質Ａ−ＩＶに少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一性を有するその生物学的活性類似体を投与する工程を含む。
【０００７】
[0006]別の態様において、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶを含む薬学的組成物を開示する。薬学的組成物は、Ｔ２ＤＭの治療に関して被験体に投与するために配合された、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはアポリポタンパク質Ａ−ＩＶに少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一性を有するその生物学的活性類似体を含む。
【０００８】
[0007]さらに別の態様において、耐糖能を実質的に回復させる必要がある被験体において、正常レベルまで耐糖能を実質的に回復させるための方法を開示する。該方法は、例えばアポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体の全身投与によって、被験体に、有効量のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはアポリポタンパク質Ａ−ＩＶに少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一性を有するその生物学的活性類似体を投与する工程を含む。
【０００９】
[0008]さらにさらなる別の態様において、血液グルコースレベルを低下させる必要がある被験体において、血液グルコースレベルを低下させるための方法を開示する。該方法は、例えば全身投与によって、必要がある被験体に、有効量のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはアポリポタンパク質Ａ−ＩＶに少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一性を有するその生物学的活性類似体を投与する工程を含む。「有効量」は、以下に記載する通りであり、そしてこれには約０．２５〜２μｇ／ｇのアポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体が含まれる。
【００１０】
[0009]本開示にしたがったこれらのおよび他の特徴、ならびにこれらのおよび他の多様な態様は、本明細書に提供する図面、詳細な説明、および請求項を考慮するとより明らかになるであろう。
【００１１】
[0010]本開示の態様の以下の詳細な説明は、以下の図と組み合わせて読んだ際、よりよく理解可能であり、ここで同様の構造を同様の参照数字で示し、そしてこの中で：
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】[0011]図１は、本開示の態様にしたがった薬学的組成物の容器およびシリンジを有するデバイスの側面斜視図である。
【図２】[0012]図２は、腹腔内耐糖能試験に関する、雄アポリポタンパク質Ａ−ＩＶノックアウトおよび野生型マウスにおける、時間（分）に対する血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図３】[0013]図３は、腹腔内耐糖能試験に関する、１６ヶ月齢のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶ野生型およびノックアウト動物における、時間（分）に対する血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図４】[0014]図４は、腹腔内耐糖能試験に関する、雄アポリポタンパク質Ａ−ＩＶノックアウトマウスにおける、組換えアポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（μｇ／ｇ）または生理食塩水溶液の腹腔内投与後の時間（分）に対する血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図５】[0015]図５は、腹腔内耐糖能試験に関する、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶノックアウトマウスにおける、組換えアポリポタンパク質Ａ−Ｉまたは生理食塩水溶液の腹腔内投与後の時間（分）に対する血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図６】[0016]図６は、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶノックアウトマウスにおける、組換えアポリポタンパク質Ａ−Ｉまたは生理食塩水溶液の腹腔内投与後の時間（分）に対するインスリン分泌（ｎｇ／ｍＬ）のグラフである。
【図７】[0017]図７は、腹腔内耐糖能試験に関する、長期間高脂肪食餌を与えられたアポリポタンパク質Ａ−ＩＶノックアウトまたは野生型マウスにおける、時間（分）に対する血漿グルコース（ｍｇ／ｍＬ）のグラフである。
【図８】[0018]図８は、腹腔内耐糖能試験に関する、長期間高脂肪食餌を与えられたアポリポタンパク質Ａ−ＩＶノックアウトマウスにおける、組換えマウスアポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（１μｇ／ｇ）または生理食塩水溶液の腹腔内投与後の時間（分）に対する血漿グルコース（ｍｇ／ｍＬ）のグラフである。
【図９】[0019]図９は、腹腔内耐糖能試験に関する、糖尿病マウスにおける、組換えマウスアポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（１μｇ／ｇ）または生理食塩水溶液の腹腔内投与後の時間（時間）に対する血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図１０】[0020]図１０は、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶノックアウトマウス、野生型マウス、およびアポリポタンパク質Ａ−Ｉノックアウトマウスにおける血清アミロイドＡタンパク質構成要素のレベルのウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図１１】[0021]図１１は、腹腔内耐糖能試験（ＩＰＧＴＴ）中の、雌アポリポタンパク質Ａ−ＩＶノックアウトおよび野生型マウスにおける、時間（分）に対する血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図１２】[0022]図１２は、腹腔内耐糖能試験中の、野生型マウスにおける、１．０μｇ／ｇヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたは生理食塩水溶液の腹腔内投与後の時間（分）に対する血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図１３】[0023]図１３は、腹腔内耐糖能試験中の、雌野生型マウスにおける、１．０μｇ／ｇ組換えマウスアポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたは生理食塩水溶液の腹腔内投与後の時間（分）に対する血漿グルコース（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
【図１４】[0024]図１４は、３ｍＭまたは２０ｍＭグルコースの存在下で、３０ｍＭ  ＫＣｌおよび２５０μＭジアゾキシドによって脱分極されたヒト膵島に対する１０μｇ／ｇヒトアポＡ−ＩＶの影響を示す棒グラフである。
【図１５】[0025]図１５は、全長野生型ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＶのアミノ酸配列を持つタンパク質（配列番号１）である。
【図１６】[0026]図１６は、全長野生型マウスアポリポタンパク質Ａ−ＩＶのアミノ酸配列を持つタンパク質（配列番号２）である。
【図１７】[0027]図１７は、Ｎ末端にグリシンの付加を伴う全長野生型ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＶのアミノ酸配列を持つタンパク質（配列番号３）である。
【図１８】[0028]図１８は、多型置換Ｔ３４７Ｓ、Ｑ３６０Ｈ、および／またはＥ１６５ＫならびにＮ末端へのグリシン、アラニンまたはバリンの場合による付加を示す、ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＶのアミノ酸配列を持つタンパク質（配列番号４）である。
【図１９】[0029]図１９は、全長野生型ヒトアポリポタンパク質Ａ−ＩＶをコードするポリヌクレオチド（配列番号５）である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
[0030]当業者は、図面の要素は単純にそして明確にするために例示され、そして必ずしも縮尺通りに描かれていないことを認識する。例えば、本開示の多様な態様の理解を改善するのを補助するため、図面中の要素のいくつかの寸法は、他の要素に比較して強調されるとともに、慣用的な部分が除去される可能性もある。
【００１４】
[0031]以下の用語を本出願において用いる：
[0032]本明細書において、用語「有効量」は、望ましい生物学的影響を達成するのに必要なまたは十分な量を記載する。任意の特定の適用に関する有効量は、限定されるわけではないが、投与する特定の組成物、被験体のサイズ、ならびに／あるいは治療中の疾患および／または状態の重症度を含む、多様な要因に応じて多様でありうる。１つの態様において、「有効量」は、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体の約０．２５〜１０μｇ／ｇの用量である。あるいは、「アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体の有効量」は、約１〜１０μｇ／ｇ、約０．２５〜２μｇ／ｇ、または約１μｇ／ｇである。アポＡ−ＩＶまたは生物学的活性類似体を１日１回投与する。あるいは、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体を１日約２回投与する。さらに別の代替法において、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体を、１日２回より多く、例えば１日３回投与する。さらに別の代替法において、アポＡ−ＩＶを２日、３日、４日、５日または６日ごとに、あるいは週１回投与する。
【００１５】
[0033]本明細書において、用語「望ましい生物学的影響」は、疾患または状態の影響を減少させ、これらを妨げ、そして／または排除することを記載する。例えば、Ｔ２ＤＭの背景において、望ましい生物学的影響には、限定されるわけではないが、血液グルコースの低下、耐糖能の改善、正常レベルへの耐糖能の実質的な回復、インスリン分泌の改善、および／または正常レベルへのインスリン分泌の実質的な回復が含まれる。
【００１６】
[0034]本明細書において、用語「正常レベル」は、治療の必要がない被験体におけるレベルと実質的に同じレベルを記載する。例えば、Ｔ２ＤＭを治療する背景において、血液グルコースの正常レベルは、食事前に約７０ｍｇ／ｄＬ〜約１３０ｍｇ／ｄＬ、そして食事の約１〜２時間後に約１８０ｍｇ／ｄＬ未満、または食事前に約７０ｍｇ／ｄＬ〜約１００ｍｇ／ｄＬ、そして食事の約１〜２時間後に約１４０ｍｇ／ｄＬ未満である。Ｔ２ＤＭを治療する背景における別の例において、耐糖能の正常レベルは、食事前に約７０ｍｇ／ｄＬ〜約１３０ｍｇ／ｄＬ、そして食事の約１〜２時間後に約１８０ｍｇ／ｄＬ未満、または食事前に約７０ｍｇ／ｄＬ〜約１００ｍｇ／ｄＬ、そして食事の約１〜２時間後に約１４０ｍｇ／ｄＬ未満であるように、被験体が炭水化物を代謝する能力を記載する。Ｔ２ＤＭを治療する背景におけるさらに別の例において、インスリン分泌の正常レベルは、耐糖能の正常レベルを維持するのに必要な量であり、ここでインスリン分泌レベルは、食事の約１５時間後、約１ｎｇ／ｍＬより高い。
【００１７】
[0035]血液グルコースレベルの背景において、用語「回復する」は、被験体の血液グルコースレベルが正常レベルに変化することを記載する。同様に、耐糖能の背景において、用語「回復する」は、被験体のグルコース耐性が正常レベルに変化することを記載する。また、インスリン分泌の背景において、「回復する」は、被験体のインスリン分泌が正常レベルに変化することを記載する。
【００１８】
[0036]アポリポタンパク質Ａ−ＩＶの背景において、用語「生物学的活性断片」は、Ｔ２ＤＭを有する被験体において、望ましい生物学的影響を達成することが可能なアポリポタンパク質Ａ−ＩＶの断片を記載する。用語「生物学的活性類似体」は、Ｔ２ＤＭを有する被験体において、望ましい生物学的影響を達成することが可能なアポリポタンパク質Ａ−ＩＶの類似体を記載する。１つの例において、望ましい生物学的影響は、実施例２に記載するようなアポＡ−ＩＶノックアウトマウスにおいて、耐糖能を回復することである。望ましい生物学的影響の別の例は、実施例７に記載するマウスモデルのように、Ｔ２ＤＭの動物モデルにおいて、異常なグルコースレベルの統計的に有意な低下を引き起こすことである。
【００１９】
[0037]本明細書において、用語「肥満の」は、被験体が正常体重をはるかに超えている状態を記載する。１つの特定の例において、用語、肥満の、は、被験体が理想体重を約２０％より多く超えており、そして／または約３０のまたは約３０より大きい肥満度指数を有する状態を記載する。１つの態様において、治療中の被験体は肥満であり；別の態様において、治療中の被験体は肥満ではなく；そしてさらに別の態様において、治療中の被験体は正常体重を有する。
【００２０】
[0038]本開示の態様は、Ｔ２ＤＭの治療が必要な被験体においてＴ２ＤＭを治療するための方法、およびＴ２ＤＭの治療のための薬学的組成物に関する。１つの態様において、糖尿病を治療する方法を開示する。１つの特定の態様において、Ｔ２ＤＭを治療する必要がある被験体においてＴ２ＤＭを治療する方法であって、有効量のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（以後、「アポＡ−ＩＶ」）またはその生物学的活性類似体を被験体に投与する工程を含む、前記方法を開示する。
【００２１】
[0039]１つの態様において、Ｔ２ＤＭを治療する方法は、被験体の血液グルコースレベルを低下させるのに有効である。１つの特定の態様において、方法は、被験体の血液グルコースレベルを約２０〜５０％低下させるのに有効である。さらなる態様において、方法は、被験体の血液グルコースレベルを約４０％低下させるのに有効である。さらにさらなる態様において、方法は、血液グルコースレベルを正常レベルに実質的に回復させるのに有効である。
【００２２】
[0040]別の態様において、Ｔ２ＤＭを治療する方法は、被験体の耐糖能を正常レベルに実質的に回復させるのに有効である。１つの特定の態様において、方法は、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体の用量を投与した後、約２時間以内に、被験体の耐糖能を正常レベルに実質的に回復させるのに有効である。別の態様において、被験体の耐糖能は、約８〜１２時間、正常レベルに実質的に回復される。
【００２３】
[0041]さらに別の態様において、治療は、インスリン分泌を正常レベルに実質的に回復させるのに有効である。１つの特定の態様において、治療は、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体の用量を投与した後、約２時間以内に、インスリン分泌を正常レベルに実質的に回復させるのに有効である。別の態様において、インスリン分泌は、約８〜１２時間、正常レベルに実質的に回復される。さらに別の態様において、治療は、Ｃ反応性タンパク質レベルを低下させるのに有効である。
【００２４】
[0042]１つの態様において、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体を全身投与する。アポＡ−ＩＶまたはその類似体の全身投与は、経口、皮下、静脈内、筋内、および腹腔内投与からなる群より選択される。
【００２５】
[0043]別の態様において、薬学的組成物を開示する。１つの特定の態様において、薬学的組成物は、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体を含む。別の態様において、アポＡ−ＩＶまたはその類似体を、Ｔ２ＤＭの治療に関して被験体に投与するために配合する。この特定の態様において、Ｔ２ＤＭを治療する必要がある被験体においてＴ２ＤＭを治療するための方法であって、被験体に、有効量の薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法も提供する。
【００２６】
[0044]「アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ」（本明細書において、「アポＡ−ＩＶ」とも称される）は、哺乳動物アポＡ−ＩＶを指し、そして全長アポＡ−ＩＶおよびアポＡ−ＩＶの生物学的活性断片を含む。全長ヒトアポＡ−ＩＶは３７６アミノ酸タンパク質（配列番号１）であり、そのアミノ酸配列は図１５に示され；全長マウスアポＡ−ＩＶのアミノ酸配列（配列番号２）は図１６に示される。用語「アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ」にやはり含まれるのは、全長ヒト配列のアポリポタンパク質Ａ−ＩＶのＮ末端にグリシンが付加された既知の類似体（配列番号３、図１７に示されるようなもの）、およびＮ末端グリシンに関する保存的置換（例えばアラニンおよびバリン）を有するその類似体である。「アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ」には、また、配列番号１に示されるヒト配列または配列番号３の対応する位に対するＴ３４７Ｓ、Ｑ３６０Ｈ、またはＥ１６５Ｋ置換を含む、その多型型も含まれる。こうしたものとして、「アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ」には、図１８に示す、配列番号４のタンパク質が含まれる。
【００２７】
アポリポタンパク質Ａ−ＩＶの生物学的活性類似体は、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶに少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一性を有する。先の段落に記載するように、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶには、全長哺乳動物アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（例えばヒトまたは哺乳動物）、その多型型、配列番号３および４のタンパク質、ならびに前述のいずれかの生物学的活性断片が含まれる。生物学的活性類似体におけるアミノ酸変動は、好ましくは、野生型配列に対して保存的置換を有する。「保存的置換」は、同じ純電荷、ならびにほぼ同じサイズおよび形状を有する、別のアミノ酸でのアミノ酸の置換である。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を持つアミノ酸残基は、側鎖中の炭素およびヘテロ原子の総数が、約４より多く異ならない場合には、ほぼ同じサイズを有する。これらは、側鎖中の分枝の数が１より多く異ならない場合には、ほぼ同じ形状を有する。側鎖中にフェニルまたは置換フェニル基を持つアミノ酸残基は、ほぼ同じサイズおよび形状を有すると見なされる。以下に列挙するのは、アミノ酸の５つの群である。同じ群由来の別のアミノ酸残基でアミノ酸残基を置換すると、保存的置換を生じる：
群Ｉ：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、およびＣ１〜Ｃ４脂肪族またはＣ１〜Ｃ４ヒドロキシル置換脂肪族側鎖（直鎖または一分枝）を持つ非天然存在アミノ酸。
【００２８】
群ＩＩ：グルタミン酸、アスパラギン酸およびカルボン酸置換Ｃ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（非分枝または一分枝点）を持つ非天然存在アミノ酸。
群ＩＩＩ：リジン、オルニチン、アルギニン、およびアミンまたはグアニジノ置換Ｃ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（非分枝または一分枝点）を持つ非天然存在アミノ酸。
【００２９】
群ＩＶ：グルタミン、アスパラギン、およびアミド置換Ｃ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（非分枝または一分枝点）を持つ非天然存在アミノ酸。
群Ｖ：フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシンおよびトリプトファン。
【００３０】
[0045]アポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体はグリコシル化されていてもまたはグリコシル化されていなくてもよい。組換え非グリコシル化ヒトおよびマウスアポリポタンパク質Ａ−ＩＶの調製を実施例１１に記載する。全長野生型ヒトアポリポタンパク質のポリヌクレオチド配列（配列番号１）を図１８の配列番号４に示す。実施例１〜１０に用いるアポリポタンパク質Ａ−ＩＶはグリコシル化されていない。アポＡ−ＩＶは、分子生物学分野に知られる方法にしたがって調製可能である。例えば、アポＡ−ＩＶは、伝統的な分子クローニング技術を通じて調製可能である。
【００３１】
[0046]実施例で用いるアポリポタンパク質Ａ−ＩＶノックアウトマウスは、その全解説が本明細書に援用される、Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．  １９９７  Ｓｅｐ；３８（９）：１７８２−９４に開示される方法にしたがって生成された。
【００３２】
[0047]１つの特定の態様において、薬学的組成物は、薬学的に許容されうるキャリアーをさらに含んでもよい。薬学的に許容されうるキャリアーには、広い範囲の既知の希釈剤（すなわち溶媒）、充填剤、増量剤、結合剤、懸濁剤、崩壊剤、界面活性剤、潤滑剤、賦形剤、湿潤剤および本分野で一般的に用いられる同様のものが含まれる。薬学的組成物は、好ましくは水性であり、すなわち液体配合物であり、そして好ましくは発熱物質不含水を含む。薬学的調製物の形にしたがって、これらのキャリアーを単独でまたは組み合わせて用いてもよい。生じる調製物は、必要であれば、１またはそれより多い可溶化剤、緩衝剤、保存剤、着色剤、香料、フレーバー剤および薬剤調製の分野で広く用いられる同様のものを取り込んでもよい。
【００３３】
[0048]アポリポタンパク質Ａ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体を、錠剤、カプセル、顆粒、丸剤、注射剤、溶液、エマルジョン、懸濁物、およびシロップからなる群より選択される投薬型に配合してもよい。薬学的組成物のための型および投与経路は限定されず、そして適切に選択可能である。例えば、錠剤、カプセル、顆粒、丸剤、シロップ、溶液、エマルジョン、および懸濁物を経口投与してもよい。さらに、注射剤（例えば皮下、静脈内、筋内、および腹腔内）を単独で、またはグルコース、アミノ酸等を含有する慣用的補充剤と組み合わせて静脈内投与してもよいし、あるいは筋内、皮内、皮下および／または腹腔内に単独で投与してもよい。
【００３４】
[0049]薬学的に許容されうるキャリアーを用いて、この種類の薬学的分野で知られる方法にしたがって、Ｔ２ＤＭを治療するための本発明の薬学的組成物を調製してもよい。例えば、錠剤、カプセル、顆粒、丸剤等の経口型を、賦形剤、例えばショ糖、ラクトース、グルコース、デンプン、マンニトール等；結合剤、例えばシロップ、アラビアゴム、ソルビトール、トラガカント、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等；崩壊剤、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロースまたはそのカルシウム塩、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール等；潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、シリカ等；ならびに湿潤剤、例えばラウリン酸ナトリウム、グリセロール等を用いて、既知の方法にしたがって調製する。
【００３５】
[0050]注射剤、溶液、エマルジョン、懸濁剤、シロップ等を、活性成分を溶解するための溶媒、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油等；界面活性剤、例えばソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン、レシチン等；懸濁剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース等を含むセルロース誘導体、トラガカント、アラビアゴム等を含む天然ゴム；ならびに保存剤、例えばパラヒドロキシ安息香酸エステル、塩化ベンザルコニウム、ソルビン酸塩等を適切に用いて、既知の方法にしたがって調製可能である。
【００３６】
[0051]糖尿病を治療するための本発明の薬学的組成物中に含有されるべき活性成分の比率は、広い範囲から適切に選択可能である。
[0052]１つの特定の態様において、Ｔ２ＤＭの治療が必要な被験体は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、ブタ、およびウサギ類（ｌａｇｏｍｏｒｐｈ）からなる群より選択されてもよい。１つの特定の態様において、哺乳動物はヒトである。別の態様において、アポＡ−ＩＶまたはその生物学的活性類似体を、Ｔ２ＤＭの治療のために、肥満である被験体に投与してもよい。あるいは、アポＡ−ＩＶを、Ｔ２ＤＭの投与のために、肥満でない被験体に投与してもよい。
【００３７】
[0053]図１を参照すると、さらに別の態様において、デバイス１が開示される。１つの態様において、デバイス１は、先に上で論じる薬学的組成物の容器１０を含む。さらなる態様において、容器１０はバイアル１２を含む。バイアル１２は、薬学的組成物の機能を阻害しない、いかなる材料で形成されていてもよい。例えば、バイアル１２は、ガラスおよび／またはプラスチックを含んでもよい。さらに、バイアル１２は、そこを通じて薬学的組成物を取り除くことが可能な貫通可能隔膜１４を含んでもよい。使用する際、バイアルの隔膜１４は、シリンジ２０の針２２によって貫通され、薬学的組成物は、バイアル１２からシリンジ２０によって除去され、そして薬学的組成物は、注射を通じて治療が必要な被験体に投与される。
【実施例】
【００３８】
[0054]以下の限定されない実施例は、本開示の方法を例示する。
実施例１：アポＡ−ＩＶノックアウトマウスの耐糖能障害
[0055]実験プロトコル。雄アポＡ−ＩＶノックアウト（以後、「ＫＯ」）マウスを得た。野生型（以後、「ＷＴ」）マウスを対照として利用した。アポＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスを、シンシナティ大学（オハイオ州シンシナティ）に維持されるコロニーから得た。アポＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスには固形飼料を与えた。耐糖能試験を行う前に、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスおよびＷＴマウスを５時間絶食させた。耐糖能試験において、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスおよびＷＴマウスに、グルコース約２ｍｇ／ｇ体重の用量で、腹腔内注射し、そしてグルコース注射の約０、１５、３０、６０、および１２０分後に、血漿グルコースを測定した。耐糖能試験を２回行い、３ヶ月齢で１回、そして再び、１６ヶ月齢で行った。
【００３９】
[0056]実験結果。図２に示すように、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスは、ＷＴマウスに比較して非耐糖性である。具体的には、図２は、グルコースの腹腔内注射後、２時間、ＷＴマウスにおける血漿グルコースレベルが、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルよりも低かったことを示す。理論によって束縛されるのではないが、これらの研究は、アポＡ−ＩＶが正常グルコース恒常性に必要である（少なくとも雄において）ことを暗示した。さらに、図３に示すように、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスは、１６ヶ月齢で試験した際に、耐糖能障害の増加を示した。具体的には、図３は、１６ヶ月齢で試験したアポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルが、３ヶ月齢で試験したアポＡ−ＩＶ  ＫＯにおける血漿グルコースレベルより高かったことを示す。理論によって束縛されるのではないが、これらの研究は、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスの耐糖能は、年齢とともに悪化することを暗示した。
【００４０】
[0057]雌野生型およびアポＡ−ＩＶノックアウトマウスでの実験
[0058]雌アポＡ−ＩＶ野生型およびノックアウトマウスを、本実施例１に先に記載するような、雄アポＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスに関して用いたものと同じ腹腔内耐糖能試験に供した。結果を図１１に示す。雌アポＡ−ＩＶ−／−マウスは、腹腔内グルコースに曝露されると、雌ＷＴ動物に比較して、増加した血漿グルコースレベルを有するが、統計的に有意な相違はない。一方、雄はＷＴおよびＫＯ動物間に有意な相違を有する。
【００４１】
[0059]
実施例２：アポＡ−ＩＶノックアウトマウスにおける耐糖能の回復
[0060]実験プロトコル。アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスが非耐糖性であることを立証する際、一連の広範な研究を行い、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスへのアポＡ−ＩＶの投与が、耐糖能を正常レベルに回復させるかどうかを決定した。具体的には、一連の研究を行って、投与しようとするアポＡ−ＩＶの量だけでなく、耐糖能試験を行う前にアポＡ−ＩＶを投与するのに最適な時間も決定した。
【００４２】
[0061]アポＡ−ＩＶ雄ＫＯマウスに、重量約０．２５、０．５、１、および２μｇ／ｇの用量のアポＡ−ＩＶを腹腔内注射した。アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにはまた、対照として働く生理食塩水溶液を腹腔内注射した。マウスアポＡ−ＩＶまたは生理食塩水溶液の注射後、先に論じられるように、３ヶ月齢で耐糖能試験を行った。具体的には、アポＡ−ＩＶまたは生理食塩水溶液の注射の約２時間後に耐糖能試験を行った。実験結果は、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおいてグルコース耐性を回復するのに最適な時間は、耐糖能試験を実施する約２時間前にアポＡ−ＩＶを投与することであることを示した。
【００４３】
実験結果。図４に示すように、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスへのアポＡ−ＩＶの投与は、耐糖能を正常レベルに回復させた。具体的には、図４は、アポＡ−ＩＶを注射したアポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルが、生理食塩水溶液を注射したアポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルよりも低いことを示した。さらに、図４に示すように、アポＡ−ＩＶを注射したアポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルは、最高投薬量のアポＡ−ＩＶを注射したアポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおいて最低であり；同様に、アポＡ−ＩＶを注射したアポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルは、最低投薬量のアポＡ−ＩＶを注射したアポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおいて最高であった。したがって、耐糖能の改善の度合いは、投与するアポＡ−ＩＶ用量に依存し、より高い用量は、耐糖能改善を生じることが発見された。
【００４４】
実施例３：アポＡ−ＩＶノックアウトマウスにおいて耐糖能を回復させる際のアポＡ−ＩＶの特異性
[0062]実験プロトコル。アポＡ−ＩＶの際の特異性を評価するため、本発明者らは、アポリポタンパク質ＡＩ（以後、「アポＡ−Ｉ」）をアポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスに投与した。アポＡ−Ｉは、やはりアポＡ−ＩＶも産生する小腸上皮細胞によって作製されるタンパク質である。アポＡ−Ｉは、アポＡ−ＩＶの機能の多くを共有する。アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスに、重量１μｇ／ｇの用量のアポＡ−Ｉを腹腔内注射した。アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにはまた、対照として働く生理食塩水溶液も腹腔内注射した。先に論じられるように、３ヶ月齢で、アポＡ−Ｉまたは生理食塩水溶液を注射した後、耐糖能試験を行った。具体的には、アポＡ−Ｉまたは生理食塩水溶液を注射した約２時間後に、耐糖能試験を行った。
【００４５】
[0063]実験結果。図５に示すように、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスへのアポＡ−Ｉの投与は、耐糖能を回復するかまたは改善するのに失敗した。
実施例４：アポＡ−ＩＶノックアウトマウスにおける耐糖能の回復の機構
[0064]実験プロトコル。アポＡ−ＩＶがアポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおいて耐糖能を改善する機構を評価するため、本発明者らは、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおけるグルコース誘導性インスリン分泌を測定した。より具体的には、本発明者らは、先に論じられるように、３ヶ月齢で、耐糖能試験中、グルコース誘導性インスリン分泌を測定した。本研究において、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスに、耐糖能試験を行う２時間前に、重量約１μｇ／ｇの用量のマウスアポＡ−ＩＶを腹腔内注射した。アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスに、耐糖能試験を行う約２時間前に生理食塩水を注射して、対照として利用した。
【００４６】
[0065]実験結果。図６に示すように、Ｉ期インスリン分泌は、生理食塩水を注射したアポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスには存在しなかった。しかし、図６に示すように、Ｉ期インスリン分泌は、耐糖能試験を実行する２時間前にアポＡ−ＩＶを注射した際、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおいて回復した。
【００４７】
実施例５：高脂肪食餌を与えられたアポＡ−ＩＶノックアウトおよび野生型マウスにおけるアポＡ−ＩＶの有効性
[0066]実験プロトコル。アポＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスに、長期間、Ｄｙｅｔｓ（ペンシルバニア州ベツレヘム）より購入した高脂肪半精製の栄養的に完全な実験食餌（ＡＩＮ−９３Ｍ）を１０週間与えた。高脂肪食餌は、１００ｇの食餌あたり、約２０ｇの脂肪（すなわち約１９ｇのバター脂肪および必須脂肪酸を提供するための１ｇのダイズ油）を含有する。アポＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスを、約２２±１℃の温度および約１２時間明期／１２時間暗期の光に調節した動物施設において、トウモロコシの穂軸（ｃｏｒｎｃｏｂ）の寝藁を入れた個々のタブ・ケージ中で飼育した。先に論じられるように、３ヶ月齢で耐糖能試験を行った。耐糖能試験を行う前に、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスおよびＷＴマウスを５時間絶食させた。グルコース耐性試験において、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスおよびＷＴマウスに、約２ｍｇ／ｇ体重の用量のグルコースを腹腔内注射した。
【００４８】
[0067]実験結果。図７に示すように、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスは、ＷＴマウスに比較して、より大きい耐糖能障害を示した。具体的には、図７は、グルコースの腹腔内注射後、２時間、ＷＴマウスにおける血漿グルコースレベルが、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルより低かったことを示す。
【００４９】
実施例６：高脂肪食餌を与えられたアポＡ−ＩＶノックアウトおよび野生型マウスにおける耐糖能の回復
[0068]実験プロトコル。３ヶ月齢で、１４週間、高脂肪食餌（重量２０％の脂肪、１９％のバター脂肪および１％のベニバナ（ｓａｆｆｌｏｗｅｒ）油）を与えたアポＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスへのアポＡ−ＩＶの投与に関する、一連の研究を行った。具体的には、アポＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスに、約１μｇ／ｇ体重の用量のマウスアポＡ−ＩＶを腹腔内注射した。アポＡ−ＩＶ  ＫＯおよびＷＴマウスにまた、対照として働く生理食塩水溶液を腹腔内注射した。アポＡ−ＩＶまたは生理食塩水を注射した後、耐糖能試験を行った。具体的には、アポＡ−ＩＶまたは生理食塩水溶液注射の２時間後に、耐糖能試験を行った。
【００５０】
[0069]実験結果。図８に示すように、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおけるアポＡ−ＩＶの投与は、耐糖能を有意に改善した。具体的には、図８は、アポＡ−ＩＶを注射したアポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルが、生理食塩水溶液を注射したアポＡ−ＩＶ  ＫＯマウスにおける血漿グルコースレベルよりも低かったことを示す。［先の文は、次の文が同じことを記載しているため、冗長である。］本明細書にデータは含まれないが、高脂肪食餌を長期間与えられたＷＴマウスにおけるアポＡ−ＩＶの投与がまた、耐糖能を有意に改善することもまた発見された。
【００５１】
実施例７：Ｔ２ＤＭを有するマウスにおける耐糖能の回復
[0070]実験プロトコル。アポＡ−ＩＶがＴ２ＤＭを有する動物における耐糖能を促進する際に有効であることを確証するため、ヘテロ接合体ＫＫ  Ｃｇ−Ａ／Ｊ（以後、「Ｃｇ−Ａ／Ｊ」）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（メイン州バーハーバー）から得た。Ｃｇ−Ａ／Ｊマウスは、８週齢までに、高血糖、高インスリン血症、肥満、および耐糖能障害を発展させる。これらのマウスにおける糖尿病の主因は、アグチ関連タンパク質であり、そしてメラノコルチン−ＩＶ受容体のアンタゴニストをコードする、Ａｙ突然変異を伴う多遺伝子相互作用によって生じるインスリン耐性である。Ｃｇ−Ａ／Ｊマウスには固形飼料を与えた。さらに、固形飼料を与えて１０〜１４週間に、血液グルコースの顕著な増加があった。
【００５２】
[0071]１４週齢で、Ｃｇ−Ａ／Ｊマウスに、腹腔内注射を通じて、マウスアポＡ−ＩＶ（約１μｇ／ｇ体重）または生理食塩水溶液（対照として働く）のいずれかを投与した。次いで、血漿グルコースを約０、０．５、１、２、３、４、５、７、１１、および２４時間で測定した。
【００５３】
[0072]実験結果。図９に示すように、アポＡ−ＩＶは、生理食塩水対照に比較して、Ｃｇ−Ａ／Ｊマウスの血糖レベルを低下させる際に顕著な効果を有する。生理食塩水溶液を注射したＣｇ−Ａ／Ｊマウスが、研究の２４時間の期間全体で、定常の血漿グルコースレベルを維持する一方、アポＡ−ＩＶを注射されたＣｇ−Ａ／Ｊマウスは、１０時間に渡る血漿グルコース減少を経験し、そしてこの期間の大部分の間、血漿グルコースレベルは、研究していたＣ５７ＢＬ／６Ｊ動物に匹敵した。この研究から、本発明者らは、アポＡ−ＩＶの投与は、Ｃｇ−Ａ／Ｊマウスにおいて血漿グルコースを低下させるのに有効であると結論づける。
【００５４】
実施例８：アポＡ−ＩＶ  ＫＯ、アポＡ−Ｉ  ＫＯ、およびＷＴマウスにおける血清アミロイドＰ構成要素のレベル
[0073]実験プロトコル。アテローム生成食餌を与えたアポＡ−ＩＶ  ＫＯ、アポＡ−Ｉ  ＫＯ、およびＷＴマウスにおいて、血清アミロイドＡタンパク質構成要素（以後、「ＳＡＰ」）のレベルを決定することに関連する一連の研究を行った。アポＡ−ＩＶ  ＫＯ、アポＡ−Ｉ  ＫＯ、およびＷＴマウスを、シンシナティ大学から得た。ＳＡＰは、アミロイドＰ構成要素（以後、「ＡＰ」）の血清型であり、アミロイドと称されるｉｎ  ｖｉｖｏ病理学的沈着の五角形構成要素として最初に同定された、２５ｋＤａ五量体タンパク質である。ＳＡＰは、ヒトにおいて、Ｃ反応性タンパク質のように振る舞う。具体的には、アポＡ−ＩＶ  ＫＯ、アポＡ−Ｉ  ＫＯ、およびＷＴマウスにおいて、アテローム生成食餌を１２週間与えた後、アポＡ−ＩＶ  ＫＯ、アポＡ−Ｉ  ＫＯ、およびＷＴマウスにおける血漿ＳＡＰレベルを測定した。血漿ＳＡＰレベルをウェスタンブロット分析を通じて測定した。
【００５５】
[0074]実験結果。図１０に示すように、アポＡ−ＩＶ  ＫＯマウス（マウス番号１、８、および１０に対応する）におけるＳＡＰのレベルは、アポＡ−Ｉ  ＫＯマウス（マウス番号２８、２９、および３０に対応する）およびＷＴマウス（マウス番号１９、２０、および２５に対応する）におけるＳＡＰのレベルに比較して増加した。
【００５６】
[0075]本開示を記載し、そして定義する目的のため、用語「約」および「実質的に」は、本明細書において、定量的比較、値、測定、または他の提示いずれかに起因しうる内在性の度合いの不確実性を表すように利用されることが注目される。用語「約」および「実質的に」はまた、本明細書において、問題となっている主題の基本的機能において変化を生じることなく、定量的提示が、言及する参照から多様でありうる度合いを提示するためにも利用される。
【００５７】
[0076]上記説明および図面は、本開示の特徴および利点を達成する例示的な態様の例示としてのみ考慮されるべきである。本開示の意図および範囲から逸脱することなく、記載する特徴および工程に、修飾および置換を行うことも可能である。したがって、本開示は、前述の説明および図によって限定されると見なされてはならず、付随する請求項の範囲によってのみ限定される。
【００５８】
実施例８：ヒトアポＡ−ＩＶは、腹腔内耐糖能試験を受けている野生型マウスにおいて、血液グルコースレベルを低下させる
[0077]実験プロトコル。野生型マウスにヒトアポＡ−ＩＶを投与すると、耐糖能試験を受けているマウスにおける血液グルコースレベルが影響を受けるかどうかを決定する研究を行った。
【００５９】
[0078]３ヶ月齢の野生型マウスに、重量１μｇ／ｇの用量のヒトアポＡ−ＩＶを腹腔内注射した。対照として、別の群の野生型マウスに、生理食塩水溶液を腹腔内注射した。ヒトアポＡ−ＩＶまたは生理食塩水溶液を注射した後、耐糖能試験を行った。具体的には、耐糖能試験を、アポＡ−ＩＶまたは生理食塩水溶液を注射した約２時間後、そして絶食５時間後に行った。尾の血液を収集し、そして糖測定装置（ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ）によって測定した。
【００６０】
[0079]実験結果。図１２に示すように、ヒトアポＡ−ＩＶは、耐糖能試験を受けている野生型マウスにおいて、血液グルコースを低下させるのに有効であった。
実施例９：腹腔内耐糖能試験を受けている野生型雌マウスにおけるマウスアポＡ−ＩＶの影響
[0080]実験プロトコル。雌野生型マウスへのマウスアポＡ−ＩＶの投与が、耐糖能試験を受けているマウスにおいて、血液グルコースレベルに影響を及ぼすかどうかを決定する研究を行った。
【００６１】
[0081]３ヶ月齢の雌野生型マウスに、重量約１μｇ／ｇの用量のマウスアポＡ−ＩＶを腹腔内注射した。対照として、別の群の雌野生型マウスに、生理食塩水溶液を腹腔内注射した。ヒトアポＡ−ＩＶまたは生理食塩水溶液を注射した後、耐糖能試験を行った。具体的には、アポＡ−ＩＶまたは生理食塩水を注射した約２時間後、そして絶食５時間後、耐糖能試験を行った。尾の血液を収集し、そして糖測定装置によって測定した。
【００６２】
実験結果。図１３に示すように、マウスアポＡ−ＩＶは、耐糖能試験を受けている野生型雌マウスにおいて、血液グルコースを低下させるのに有効であった。
実施例１０  ヒトアポＡ−ＩＶは、ヒト膵島において、インスリン放出を刺激する
[0082]高純度ヒト膵島は、バージニア大学、Ａｘｏｎ  Ｃｅｌｌｓによって提供された。１０％ＦＢＳおよび１１ｍＭグルコースを含有するＲＰＭＩ  １６４０中で、９５％空気および５％ＣＯ２の加湿大気中、３７℃で４８時間、膵島を培養した。次いで、５０ＩＥＱ膵島の４つの群を、３．０ｍＭグルコースを含有する通常のＫＲＢ（１２９ｍＭ  ＮａＣｌ、４．８ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび０．２％  ＢＳＡ）中で、３７℃で１時間、プレインキュベーションした。最初の２群の膵島を、次いで、３．０ｍＭグルコースを含有する通常のＫＲＢ中で、１０μｇ／ｍｌヒトＡ−ＩＶの存在下または非存在下で、１時間インキュベーションし、そしてさらに、２０ｍＭグルコースと、１０μｇ／ｍｌヒトＡ−ＩＶの存在下または非存在下で、さらに１時間インキュベーションした。最後の２群の膵島を、３．０ｍＭグルコースを含有する２５０μｍｏｌ／ｌジアゾキシドを加えた、３０ｍＭ  ＫＣｌ  ＫＲＢ（１０３．８ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび０．２％  ＢＳＡ）中で、１０μｇ／ｍｌヒトＡ−ＩＶの存在下または非存在下で、１時間インキュベーションし、そしてさらに、２０ｍＭグルコースと、１０μｇ／ｍｌヒトＡ−ＩＶの存在下または非存在下で、さらに１時間インキュベーションした。各１時間のインキュベーションの終わりに、培地を収集した。インスリンレベルをＥＬＩＳＡキット（Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ）によって測定した。
【００６３】
[0083]図１４からわかるように、ヒト膵島を３０ｍＭ  ＫＣｌに加えて２５０μＭジアゾキシドによって最大限に脱分極させると、１０μｇ／ｍｌ  ｈＡ−ＩＶは、インスリン分泌に対して有意な刺激性の影響を示した。
【００６４】
実施例１１  非グリコシル化アポＡ−ＩＶの調製
[0084]ヒトおよびマウスアポＡ−ＩＶ  ｃＤＮＡはｐＳＰ６５維持ベクター中に含有され、そして成熟アポＡ−ＩＶタンパク質のコーディング配列のすぐ５’を操作してＡｆｌＩＩＩ制限酵素部位を作製した。遺伝子を維持ベクターから切り出し、そしてｐＥＴ３０発現ベクター内に連結した。構築物を大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＢＬ−２１（ＤＥ３）細胞にトランスフェクションし、そしてカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を補ったルリア−ベルタニ培養中で、３７℃で増殖させた。細胞におけるアポＡ−ＩＶタンパク質合成の誘導の後、細胞を採取し、そして超音波処理した。Ｈｉｓ結合アフィニティカラムクロマトグラフィーおよび透析によって、溶解物由来のアポＡ−ＩＶタンパク質を精製した。生じたアポＡ−ＩＶタンパク質を、生理食塩水中、１．０ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで希釈した。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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