(57)【要約】  本発明は、複数個のオリゴヌクレオチドで構成される、制御されたサイズ及び形の核酸構造、及びその合成方法を提供する。この構造は、少なくとも一部には、一本鎖オリゴヌクレオチドの自己組織化によって形成される。得られる構造の各オリゴヌクレオチドの部位は既知である。従って、構造を特異的に修飾し得る。
2014525921.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの平行二重らせん状に配置された、複数個のアニールされたオリゴヌクレオチドであって、各々が少なくとも２個のドメインを含むオリゴヌクレオチド、
を含む核酸構造であって、少なくとも１つの二重らせんがユニークドメインを含む、核酸構造。
【請求項２】
少なくとも１つの二重らせんが２個以上のユニークドメインを含む、請求項１に記載の核酸構造。
【請求項３】
前記二重らせんの少なくとも５０％が１個又は複数個のユニークドメインを含む、請求項１又は２に記載の核酸構造。
【請求項４】
少なくとも５個、少なくとも１０個、又は少なくとも２０個の平行二重らせんを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸構造。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドの第１のサブセットが２個のドメインを含み、オリゴヌクレオチドの第２のサブセットが４個のドメインを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸構造。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが２１〜１０４ヌクレオチド長である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸構造。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸構造。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドがＬ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸構造。
【請求項９】
少なくとも２つの平行二重らせん状に配置された、複数個のアニールされたオリゴヌクレオチドであって、各々が少なくとも２個のドメインを含むオリゴヌクレオチド、
を含む核酸構造であって、少なくとも１つの二重らせんがユニークである、核酸構造。
【請求項１０】
２個以上のユニーク二重らせんを含む、請求項９に記載の核酸構造。
【請求項１１】
前記二重らせんの少なくとも５０％がユニークである、請求項９又は１０に記載の核酸構造。
【請求項１２】
前記二重らせんの少なくとも５０％が１個又は複数個のユニークドメインを含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の核酸構造。
【請求項１３】
少なくとも５個、少なくとも１０個、又は少なくとも２０個の平行二重らせんを含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の核酸構造。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチドの第１のサブセットが２個のドメインを含み、オリゴヌクレオチドの第２のサブセットが４個のドメインを含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の核酸構造。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドが２１〜１０４ヌクレオチド長である、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の核酸構造。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の核酸構造。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドがＬ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の核酸構造。
【請求項１８】
少なくとも２つの平行二重らせん状に配置された、複数個のアニールされたオリゴヌクレオチドであって、各々が少なくとも２個のドメインを含むオリゴヌクレオチド、
を含む核酸構造であって、前記構造中の少なくとも１個のオリゴヌクレオチドがユニークである、核酸構造。
【請求項１９】
前記構造中の前記オリゴヌクレオチドの少なくとも５０％がユニークである、請求項１８に記載の核酸構造。
【請求項２０】
前記構造中の前記オリゴヌクレオチドの全てがユニークである、請求項１８に記載の核酸構造。
【請求項２１】
少なくとも５個、少なくとも１０個、又は少なくとも２０個の平行二重らせんを含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の核酸構造。
【請求項２２】
オリゴヌクレオチドの第１のサブセットが２個のドメインを含み、オリゴヌクレオチドの第２のサブセットが４個のドメインを含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の核酸構造。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドが２１〜１０４ヌクレオチド長である、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の核酸構造。
【請求項２４】
前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の核酸構造。
【請求項２５】
前記オリゴヌクレオチドがＬ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の核酸構造。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の核酸構造の複数個を含む組成物であって、前記複数個が少なくとも５０％の同種性である、組成物。
【請求項２７】
単一のベッセルにおいて複数個の一本鎖オリゴヌクレオチドをアニールする工程であって、それにより核酸構造を形成する工程、
を含む方法であって、前記一本鎖オリゴヌクレオチドが各々少なくとも２個のドメインを含み、且つ少なくとも１つの一本鎖オリゴヌクレオチドが、前記複数個における他のオリゴヌクレオチドのモル濃度より１０倍低いモル濃度で存在する、方法。
【請求項２８】
単一のベッセルにおいて複数個の一本鎖オリゴヌクレオチドをアニールする工程であって、それにより核酸構造を形成する工程、
を含む方法であって、前記一本鎖オリゴヌクレオチドが各々少なくとも２個のドメインを含み、且つ少なくとも１つの一本鎖オリゴヌクレオチドが、前記複数個における他のオリゴヌクレオチドのモル濃度より１００倍低いモル濃度で存在する、方法。
【請求項２９】
アニーリングが、ある時間にわたる温度遷移によって行われる、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記温度遷移が、高温から略室温への温度の変化である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記温度遷移が、約９０℃から略室温への温度の変化である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
アニーリングが約１２〜２４時間にわたり行われる、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
オリゴヌクレオチドの第１のサブセットが２個のドメインを含み、オリゴヌクレオチドの第２のサブセットが４個のドメインを含む、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチドが２１〜１０４ヌクレオチド長である、請求項２６〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項２６〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記オリゴヌクレオチドがＬ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項２６〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
請求項２６〜３６のいずれか一項に記載の方法により調製される核酸構造。
【請求項３８】
スペーサー−リンカーを介して互いにコンジュゲートした、少なくとも２個の請求項１〜２５のいずれか一項に記載の核酸構造、
を含む複合核酸構造。
【請求項３９】
前記スペーサー−リンカーが核酸エレメントと非核酸エレメントとを含む、請求項３８に記載の複合核酸構造。
【請求項４０】
前記スペーサー−リンカーが炭素鎖を含む、請求項３８又は３９に記載の複合核酸構造。
【請求項４１】
前記スペーサー−リンカーがホモ二官能性スペーサー−リンカーである、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の複合核酸構造。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
核酸ナノ構造（又はマイクロ構造）の合成に関する先行研究には、「ＤＮＡ折り紙」手法が含まれた。この手法では、数キロベース長の天然に存在する「足場」ＤＮＡが、複数個のヘルパー鎖を用いて、その各々が足場ＤＮＡの２つ、３つ又はそれを超える数の非隣接領域にハイブリダイズすることで、ある構造に折り畳まれる。かかる折り畳み手法は、一部には、現在使用されている足場（すなわちＭ１３ｍｐ１８ウイルスゲノムＤＮＡ、約７キロベース長）以外の足場の入手可能性によって制限される。また、足場ＤＮＡの求められる折り畳みを作成するために、核酸構造毎に特別な設計及びヘルパー鎖一式が必要であるため、その多用途性も限られている。
【背景技術】
【０００２】
さらなる先行研究には、核酸「タイル」単量体の使用が含まれた。これは、各々、比較的剛性のコア構造とフランキング配列とを有する５個の一本鎖オリゴヌクレオチドから構成され、他の単量体とハイブリダイズすることで核酸構造を形成した。このようなタイル単量体を使用して作られた最も複雑な構造は、４×４の正方形構造であった。
【０００３】
より最近の研究には、同一の一本鎖オリゴヌクレオチドのサブセットを使用した特殊な外周のＤＮＡチューブの形成が含まれた。この研究は、形成可能な構造の種類が少ない（すなわちリボン及びチューブ）ことによって制限された。さらに、エンドユーザーは、構造の作成に使用する一本鎖オリゴヌクレオチドの性質に基づきかかる構造のサイズを大幅に制御することができなかった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概要
本発明は、既知の、且つ予め決められた、従って制御されたサイズ、形及び複雑さの核酸構造を作製する新規方法、並びに核酸構造それ自体を提供する。本発明の核酸構造は、複数個の一本鎖オリゴヌクレオチドを配列特異的な方式で互いに結合することにより作製される。核酸構造及び一本鎖オリゴヌクレオチドは、各構造における各オリゴヌクレオチドの部位が既知となるように、従ってその構造における各部位のヌクレオチド配列が既知となるように設計される。構造における各オリゴヌクレオチドの部位、従って各位置のヌクレオチド配列を知ることができると、定義され且つ制御された方式で構造を修飾することが容易になる。本発明はまた、サイズ、形及び／又は複雑さに関して実質的に単分散である複数個の核酸構造も提供する。この複数個の核酸構造のメンバーはまた、各構造内でのオリゴヌクレオチド位置に関しても互いに同一であってよく、これにより複数個の核酸構造を同じ方式で修飾することが可能になる。従ってこの複数個の構造は、修飾に関しても単分散であるものとして特徴付けられ得る。本明細書に記載されるとおり、この手法の多用途性は、少なくとも一部には、「ワンポット」アニーリング反応を用いて、３１０個のオリゴヌクレオチドのプールに由来するサブセットを使用して少なくとも１０７個の異なる形の核酸構造を作成可能であることにより実証される。
【０００５】
本発明の特定の核構造は、クロスオーバー又は半クロスオーバーを有する平行二重らせん、又はそれらの何らかの組み合わせから構成される。典型的には、複数個の一本鎖オリゴヌクレオチドがアニールして、構造中の二重らせんを形成する。
【０００６】
核酸構造の各オリゴヌクレオチドは、ユニークであってもよく（すなわち、１つの構造につき１度のみ存在し得る）、又は１度、２度、３度、若しくはさらにそれを超える頻度で存在してもよい。本発明は、１個又は複数個のユニークオリゴヌクレオチドを有する核酸構造を企図する。ある場合には、二重らせんに寄与する少なくとも１個のオリゴヌクレオチドが、ユニークである。ある場合には、構造中の少なくとも１つの二重らせんは、当該のらせん又は構造全体における他のあらゆるオリゴヌクレオチドにとってユニークなオリゴヌクレオチドを含む。
【０００７】
本発明はまた、核酸構造の作成に用いられる一本鎖オリゴヌクレオチドも提供する。一本鎖オリゴヌクレオチドの異なる複数個が提供され、それらの複数個の性質及び組成は、所望の構造の、形、サイズ及び複雑さを含めた設計に依存する。本明細書でさらに詳細に説明するとおり、これらの複数個は、典型的には２ドメイン及び４ドメインオリゴヌクレオチドを含む。
【０００８】
本発明は、一本鎖オリゴヌクレオチド及び核酸構造が本質的にモジュール式であることを企図する。本発明の方法では、既知のオリゴヌクレオチドのサブセットを含めたり、及び／又は除外したりすることにより、様々な形の核酸構造を作製することが可能である。本方法はまた、核酸構造を互いにモジュール式に組織化することも企図し、これは例えば、かかる構造を配列特異性に基づき互いにアニールすることによる。これらの実施形態の一部では、互いにアニールされる核酸構造は共通の形を有し得る（例えば、両方がチューブであってもよく、又は両方が格子であってもよい）。本方法はまた、複合核酸構造も企図し、これは、２つ以上の核酸構造を、その核酸構造と一体であっても、又は一体でなくてもよいリンカーを使用して互いに連結することにより作製される。これらの実施形態において、互いに連結される核酸構造は同じ形であっても、又は異なる形であってもよい。
【０００９】
本発明は、単一のベッセルに複数個の既知の一本鎖オリゴヌクレオチドを組み合わせ、好適な条件下でオリゴヌクレオチドを予め決められた方式で自己組織化させることによる、核酸構造の合成をさらに企図する。同様に、単一のベッセルに２つ以上の核酸構造を組み合わせ、好適な条件下でヌクレオチド配列相補性に基づき予め決められた方式で自己組織化させることにより、より大きい核酸構造を形成してもよい。
【００１０】
従って、一態様において、本発明は、少なくとも２つの平行二重らせん状に配置された、複数個のアニールされたオリゴヌクレオチドであって、各々が少なくとも２個のドメインを含むオリゴヌクレオチドを含む核酸構造を提供し、ここで少なくとも１つの二重らせんはユニークドメインを含む。
【００１１】
一部の実施形態では、少なくとも１つの二重らせんが２個以上のユニークドメインを含む。一部の実施形態では、二重らせんの少なくとも５０％が１個又は複数個のユニークドメインを含む。一部の実施形態では、構造は、少なくとも５個、少なくとも１０個、又は少なくとも２０個の平行二重らせんを含む。
【００１２】
別の態様において、本発明は、少なくとも２つの平行二重らせん状に配置された、複数個のアニールされたオリゴヌクレオチドであって、各々が少なくとも２個のドメインを含むオリゴヌクレオチドを含む核酸構造を提供し、ここで少なくとも１つの二重らせんはユニークである。
【００１３】
一部の実施形態では、構造は２個以上のユニーク二重らせんを含む。一部の実施形態では、二重らせんの少なくとも５０％がユニークである。一部の実施形態では、二重らせんの少なくとも５０％が１個又は複数個のユニークドメインを含む。一部の実施形態では、構造は、少なくとも５個、少なくとも１０個、又は少なくとも２０個の平行二重らせんを含む。
【００１４】
別の態様において、本発明は、少なくとも２つの平行二重らせん状に配置された、複数個のアニールされたオリゴヌクレオチドであって、各々が少なくとも２個のドメインを含むオリゴヌクレオチドを含む核酸構造を提供し、ここで構造中の少なくとも１個のオリゴヌクレオチドがユニークである。
【００１５】
一部の実施形態では、構造中のオリゴヌクレオチドの少なくとも５０％がユニークである。一部の実施形態では、構造中のオリゴヌクレオチドの全てがユニークである。一部の実施形態では、構造は、少なくとも５個、少なくとも１０個、又は少なくとも２０個の平行二重らせんを含む。
【００１６】
別の態様において、本発明は、前述の請求項のいずれかの複数個の核酸構造を含む組成物を提供し、ここで複数個は、少なくとも５０％の同種性である。
【００１７】
別の態様において、本発明は、単一のベッセルにおいて複数個の一本鎖オリゴヌクレオチドをアニールする工程であって、それにより核酸構造を形成する工程を含む方法を提供し、ここで一本鎖オリゴヌクレオチドは、各々少なくとも２個のドメインを含み、且つ少なくとも１つの一本鎖オリゴヌクレオチドが、その複数個における他オリゴヌクレオチドのモル濃度より１０倍低いモル濃度で存在する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、単一のベッセルにおいて複数個の一本鎖オリゴヌクレオチドをアニールする工程であって、それにより核酸構造を形成する工程を含む方法を提供し、ここで一本鎖オリゴヌクレオチドは、各々少なくとも２個のドメインを含み、且つ少なくとも１つの一本鎖オリゴヌクレオチドが、その複数個における他のオリゴヌクレオチドのモル濃度より１００倍低いモル濃度で存在する。
【００１９】
一部の実施形態では、アニールする工程は、ある時間にわたる温度遷移によって行われる。一部の実施形態では、温度遷移は、高温から略室温への温度の変化である。一部の実施形態では、温度遷移は、約９０℃から略室温への温度の変化である。一部の実施形態では、アニールする工程は約１２〜２４時間にわたり行われる。
【００２０】
別の態様において、本発明は、前述の方法のいずれかによって調製される核酸構造を提供する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、スペーサー−リンカーを介して互いにコンジュゲートした、前述の請求項のいずれかの少なくとも２個の核酸構造を含む複合核酸構造を提供する。
【００２２】
一部の実施形態では、スペーサー−リンカーは核酸エレメントと非核酸エレメントとを含む。一部の実施形態では、スペーサー−リンカーは炭素鎖を含む。一部の実施形態では、スペーサー−リンカーはホモ二官能性スペーサー−リンカーである。
【００２３】
前述の態様のいずれかの一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの第１のサブセットが２個のドメインを含み、オリゴヌクレオチドの第２のサブセットが４個のドメインを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは２１〜１０４ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドはＤＮＡオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドはＬ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドはＲＮＡオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、限定はされないが骨格修飾、糖修飾、塩基修飾などの修飾を含む。一本鎖オリゴヌクレオチドは、そのような修飾及び他の修飾に関して同種性又は異種性であってよい。
【００２４】
一態様において、本発明は、複数個のユニークオリゴヌクレオチドを含む核酸構造を提供し、ここでオリゴヌクレオチドは全て１ｋｂ長未満である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは１００塩基長未満である。一部の実施形態では、構造中の一部のオリゴヌクレオチドがｎオリゴヌクレオチド長であり（ここでｎは、１０．５の倍数である整数を表す）、且つ一部のオリゴヌクレオチドがｎ／２長さである。一部の実施形態では、一部のオリゴヌクレオチドが約４２ヌクレオチド長であり（例えば、４ドメインオリゴヌクレオチド）、且つ一部のオリゴヌクレオチドが約２１ヌクレオチド長である（例えば、２ドメインオリゴヌクレオチド）。
【００２５】
本発明は、様々な配置のオリゴヌクレオチドを有する核酸構造を企図する。一部の実施形態では、核酸構造は、例として５個のドメインを含むオリゴヌクレオチドを含み、ここでは２個のかかるドメインが、構造中の異なる別個のオリゴヌクレオチド上の１個のドメインに結合する。一部の実施形態では、別のオリゴヌクレオチドの単一のドメインに結合するこの２個のドメインは、他の単一のドメインに結合するときに互いに隣接しない、又は互いに連結されないものであってよい。一部の実施形態では、構造は半クロスオーバーを含む。一部の実施形態では、構造はクロスオーバーを含む。一部の実施形態では、構造は半クロスオーバーとクロスオーバーとを含む。
【００２６】
前述の概念及び以下でさらに詳細に考察するさらなる概念のあらゆる組み合わせが（但しかかる概念が互いに矛盾しないことを条件として）、本明細書に開示される発明の主題の一部として企図されることは理解されなければならない。特に、本開示の末尾に掲載される特許請求される主題のあらゆる組み合わせが、本明細書に開示される発明の主題の一部として企図される。また、本明細書において明示的に用いられ、参照によって援用される任意の開示にも同様に出現し得る用語には、本明細書に開示される特定の概念と最も一致する意味が認められるべきであることも理解されなければならない。
【００２７】
図面の簡単な説明
図は、必ずしも一定の縮尺でなく、むしろ、本明細書で考察される様々な概念を概略的に説明する際に強調が加えられていることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】４個のドメインを含む一本鎖オリゴヌクレオチド（本明細書において４ドメイン一本鎖オリゴヌクレオチドと称される）の概略図である。各ドメインのヌクレオチド配列は異なる（異なる色で表示され得るとおり）。本明細書において考察されるとおり、各ドメインは、その配列及びその長さにより特徴付けられる。矢頭はオリゴヌクレオチドの３’末端を表し、オリゴヌクレオチドの他方の端部が５’末端である。本発明の特定のオリゴヌクレオチドは、僅か２個のドメインのみを含む（これらは、本明細書では２ドメインオリゴヌクレオチドと称される）。各オリゴヌクレオチドは、そのドメイン数により定義され、かかるドメインに対する順序、及びその全体のヌクレオチド配列により定義される。
【図２Ａ】４ドメイン一本鎖オリゴヌクレオチド（この図では「Ｕ」字形構造によって表される）及び２ドメイン一本鎖オリゴヌクレオチド（最下部に線状構造によって表される、本明細書では境界オリゴヌクレオチドとも称される）を示す核酸構造の領域の概略図である。ドメイン間、オリゴヌクレオチド間結合、及びらせん間の半クロスオーバーが示される。半クロスオーバーもまた示され、この図で分かるとおり、これらはリン酸骨格部分で構成される。半クロスオーバーは、典型的にはヌクレオチドを含まず、従って配列特異的結合には寄与しないとともに、構造におけるオリゴヌクレオチドの部位又は位置に影響しない。説明のため、４ドメインオリゴヌクレオチドのうち９個について、互いの及び／又は他のオリゴヌクレオチドとの結合を示す。この図では、９個全てが互いに対してユニークな配列を有する（異なる色で表示され得るとおり）。
【図２Ｂ】２ドメイン及び４ドメイン一本鎖オリゴヌクレオチドの配置を示す２つの核酸構造の領域の概略図である。上側の概略図では、各４ドメインオリゴヌクレオチドは「Ｕ」字形に構成され、それが寄与する２個の二重らせん間に単一の半クロスオーバーのみを提供する。下側の概略図では、４ドメインオリゴヌクレオチドのうち１個が、それが寄与する二重らせん間の２つの半クロスオーバーに寄与する。従ってこの構造は、あるクロスオーバーと、複数の半クロスオーバーとを含む。この同じオリゴヌクレオチドを、５’  ｄ２−ａ−ｂ−ｃ−ｄ１  ３’のドメイン順序を有するものとして特徴付けることもでき、ここで二重らせんを形成するにあたってドメインｄ１及びｄ２が、ドメインｄ＊に結合する。互いに対してユニークな配列を示すため、ドメインは異なる識別名で表示する。
【図２Ｂ−１】２ドメイン及び４ドメイン一本鎖オリゴヌクレオチドの配置を示す２つの核酸構造の領域の概略図である。上側の概略図では、各４ドメインオリゴヌクレオチドは「Ｕ」字形に構成され、それが寄与する２個の二重らせん間に単一の半クロスオーバーのみを提供する。下側の概略図では、４ドメインオリゴヌクレオチドのうち１個が、それが寄与する二重らせん間の２つの半クロスオーバーに寄与する。従ってこの構造は、あるクロスオーバーと、複数の半クロスオーバーとを含む。この同じオリゴヌクレオチドを、５’  ｄ２−ａ−ｂ−ｃ−ｄ１  ３’のドメイン順序を有するものとして特徴付けることもでき、ここで二重らせんを形成するにあたってドメインｄ１及びｄ２が、ドメインｄ＊に結合する。互いに対してユニークな配列を示すため、ドメインは異なる識別名で表示する。
【図２Ｂ−２】２ドメイン及び４ドメイン一本鎖オリゴヌクレオチドの配置を示す２つの核酸構造の領域の概略図である。上側の概略図では、各４ドメインオリゴヌクレオチドは「Ｕ」字形に構成され、それが寄与する２個の二重らせん間に単一の半クロスオーバーのみを提供する。下側の概略図では、４ドメインオリゴヌクレオチドのうち１個が、それが寄与する二重らせん間の２つの半クロスオーバーに寄与する。従ってこの構造は、あるクロスオーバーと、複数の半クロスオーバーとを含む。この同じオリゴヌクレオチドを、５’  ｄ２−ａ−ｂ−ｃ−ｄ１  ３’のドメイン順序を有するものとして特徴付けることもでき、ここで二重らせんを形成するにあたってドメインｄ１及びｄ２が、ドメインｄ＊に結合する。互いに対してユニークな配列を示すため、ドメインは異なる識別名で表示する。
【図２Ｃ】核酸構造における４ドメインオリゴヌクレオチドのさらに他の企図される配置を示す概略図である。上部構造は複数個のクロスオーバーを含む。下部構造は複数個の半クロスオーバーを含む。上部構造におけるクロスオーバー間の距離は、下部構造における半クロスオーバー間の距離より大きい。例として、上部構造における距離は４ドメインであってよく、一方、下部構造における距離は２ドメインであってよい。上側の配置を含む核酸構造は、実験的に作製されている。
【図３Ａ】１２個の異なるオリゴヌクレオチド（Ａ）で構成される４個の平行二重らせん格子、及び４０個の異なるオリゴヌクレオチド（Ｂ）で構成される８個の平行二重らせん正方形の概略図である。
【図３Ｂ】共通して格子の形に作られているがサイズは異なる核酸構造の概略的なマップである。サイズは、二重らせんの数及び二重らせんあたりのらせんターンの数として表され得る。典型的には、らせんターンの数は、構造中の二重らせん間で同程度又は同じである。これらの図の各々は、ドメインの内容及び順序により特定される複数個のユニークオリゴヌクレオチドで構成される。各ドメインは特定の英数字記号により特定され、各オリゴヌクレオチドは、そのドメインの内容及び順序により特定される。オリゴヌクレオチド、それらの記号、及びそれらのドメイン及び配列組成の一覧は、表１に提供される。図３Ｆの格子は、表１に提供される配列を有する３６２個の異なるオリゴヌクレオチドで構成される２４個の二重らせん格子である。図３Ｂ〜図３Ｄの格子は、これらのオリゴヌクレオチドのサブセットを含み、さらなる２ドメインオリゴヌクレオチドを境界オリゴヌクレオチドとして含み得る。
【図３Ｃ】共通して格子の形に作られているがサイズは異なる核酸構造の概略的なマップである。サイズは、二重らせんの数及び二重らせんあたりのらせんターンの数として表され得る。典型的には、らせんターンの数は、構造中の二重らせん間で同程度又は同じである。これらの図の各々は、ドメインの内容及び順序により特定される複数個のユニークオリゴヌクレオチドで構成される。各ドメインは特定の英数字記号により特定され、各オリゴヌクレオチドは、そのドメインの内容及び順序により特定される。オリゴヌクレオチド、それらの記号、及びそれらのドメイン及び配列組成の一覧は、表１に提供される。図３Ｆの格子は、表１に提供される配列を有する３６２個の異なるオリゴヌクレオチドで構成される２４個の二重らせん格子である。図３Ｂ〜図３Ｄの格子は、これらのオリゴヌクレオチドのサブセットを含み、さらなる２ドメインオリゴヌクレオチドを境界オリゴヌクレオチドとして含み得る。
【図３Ｄ】共通して格子の形に作られているがサイズは異なる核酸構造の概略的なマップである。サイズは、二重らせんの数及び二重らせんあたりのらせんターンの数として表され得る。典型的には、らせんターンの数は、構造中の二重らせん間で同程度又は同じである。これらの図の各々は、ドメインの内容及び順序により特定される複数個のユニークオリゴヌクレオチドで構成される。各ドメインは特定の英数字記号により特定され、各オリゴヌクレオチドは、そのドメインの内容及び順序により特定される。オリゴヌクレオチド、それらの記号、及びそれらのドメイン及び配列組成の一覧は、表１に提供される。図３Ｆの格子は、表１に提供される配列を有する３６２個の異なるオリゴヌクレオチドで構成される２４個の二重らせん格子である。図３Ｂ〜図３Ｄの格子は、これらのオリゴヌクレオチドのサブセットを含み、さらなる２ドメインオリゴヌクレオチドを境界オリゴヌクレオチドとして含み得る。
【図３Ｅ】共通して格子の形に作られているがサイズは異なる核酸構造の概略的なマップである。サイズは、二重らせんの数及び二重らせんあたりのらせんターンの数として表され得る。典型的には、らせんターンの数は、構造中の二重らせん間で同程度又は同じである。これらの図の各々は、ドメインの内容及び順序により特定される複数個のユニークオリゴヌクレオチドで構成される。各ドメインは特定の英数字記号により特定され、各オリゴヌクレオチドは、そのドメインの内容及び順序により特定される。オリゴヌクレオチド、それらの記号、及びそれらのドメイン及び配列組成の一覧は、表１に提供される。図３Ｆの格子は、表１に提供される配列を有する３６２個の異なるオリゴヌクレオチドで構成される２４個の二重らせん格子である。図３Ｂ〜図３Ｄの格子は、これらのオリゴヌクレオチドのサブセットを含み、さらなる２ドメインオリゴヌクレオチドを境界オリゴヌクレオチドとして含み得る。
【図３Ｅ−１】共通して格子の形に作られているがサイズは異なる核酸構造の概略的なマップである。サイズは、二重らせんの数及び二重らせんあたりのらせんターンの数として表され得る。典型的には、らせんターンの数は、構造中の二重らせん間で同程度又は同じである。これらの図の各々は、ドメインの内容及び順序により特定される複数個のユニークオリゴヌクレオチドで構成される。各ドメインは特定の英数字記号により特定され、各オリゴヌクレオチドは、そのドメインの内容及び順序により特定される。オリゴヌクレオチド、それらの記号、及びそれらのドメイン及び配列組成の一覧は、表１に提供される。図３Ｆの格子は、表１に提供される配列を有する３６２個の異なるオリゴヌクレオチドで構成される２４個の二重らせん格子である。図３Ｂ〜図３Ｄの格子は、これらのオリゴヌクレオチドのサブセットを含み、さらなる２ドメインオリゴヌクレオチドを境界オリゴヌクレオチドとして含み得る。
【図３Ｅ−２】共通して格子の形に作られているがサイズは異なる核酸構造の概略的なマップである。サイズは、二重らせんの数及び二重らせんあたりのらせんターンの数として表され得る。典型的には、らせんターンの数は、構造中の二重らせん間で同程度又は同じである。これらの図の各々は、ドメインの内容及び順序により特定される複数個のユニークオリゴヌクレオチドで構成される。各ドメインは特定の英数字記号により特定され、各オリゴヌクレオチドは、そのドメインの内容及び順序により特定される。オリゴヌクレオチド、それらの記号、及びそれらのドメイン及び配列組成の一覧は、表１に提供される。図３Ｆの格子は、表１に提供される配列を有する３６２個の異なるオリゴヌクレオチドで構成される２４個の二重らせん格子である。図３Ｂ〜図３Ｄの格子は、これらのオリゴヌクレオチドのサブセットを含み、さらなる２ドメインオリゴヌクレオチドを境界オリゴヌクレオチドとして含み得る。
【図３Ｅ−３】共通して格子の形に作られているがサイズは異なる核酸構造の概略的なマップである。サイズは、二重らせんの数及び二重らせんあたりのらせんターンの数として表され得る。典型的には、らせんターンの数は、構造中の二重らせん間で同程度又は同じである。これらの図の各々は、ドメインの内容及び順序により特定される複数個のユニークオリゴヌクレオチドで構成される。各ドメインは特定の英数字記号により特定され、各オリゴヌクレオチドは、そのドメインの内容及び順序により特定される。オリゴヌクレオチド、それらの記号、及びそれらのドメイン及び配列組成の一覧は、表１に提供される。図３Ｆの格子は、表１に提供される配列を有する３６２個の異なるオリゴヌクレオチドで構成される２４個の二重らせん格子である。図３Ｂ〜図３Ｄの格子は、これらのオリゴヌクレオチドのサブセットを含み、さらなる２ドメインオリゴヌクレオチドを境界オリゴヌクレオチドとして含み得る。
【図３Ｅ−４】共通して格子の形に作られているがサイズは異なる核酸構造の概略的なマップである。サイズは、二重らせんの数及び二重らせんあたりのらせんターンの数として表され得る。典型的には、らせんターンの数は、構造中の二重らせん間で同程度又は同じである。これらの図の各々は、ドメインの内容及び順序により特定される複数個のユニークオリゴヌクレオチドで構成される。各ドメインは特定の英数字記号により特定され、各オリゴヌクレオチドは、そのドメインの内容及び順序により特定される。オリゴヌクレオチド、それらの記号、及びそれらのドメイン及び配列組成の一覧は、表１に提供される。図３Ｆの格子は、表１に提供される配列を有する３６２個の異なるオリゴヌクレオチドで構成される２４個の二重らせん格子である。図３Ｂ〜図３Ｄの格子は、これらのオリゴヌクレオチドのサブセットを含み、さらなる２ドメインオリゴヌクレオチドを境界オリゴヌクレオチドとして含み得る。
【図３Ｆ】共通して格子の形に作られているがサイズは異なる核酸構造の概略的なマップである。サイズは、二重らせんの数及び二重らせんあたりのらせんターンの数として表され得る。典型的には、らせんターンの数は、構造中の二重らせん間で同程度又は同じである。これらの図の各々は、ドメインの内容及び順序により特定される複数個のユニークオリゴヌクレオチドで構成される。各ドメインは特定の英数字記号により特定され、各オリゴヌクレオチドは、そのドメインの内容及び順序により特定される。オリゴヌクレオチド、それらの記号、及びそれらのドメイン及び配列組成の一覧は、表１に提供される。図３Ｆの格子は、表１に提供される配列を有する３６２個の異なるオリゴヌクレオチドで構成される２４個の二重らせん格子である。図３Ｂ〜図３Ｄの格子は、これらのオリゴヌクレオチドのサブセットを含み、さらなる２ドメインオリゴヌクレオチドを境界オリゴヌクレオチドとして含み得る。
【図３Ｆ−１】共通して格子の形に作られているがサイズは異なる核酸構造の概略的なマップである。サイズは、二重らせんの数及び二重らせんあたりのらせんターンの数として表され得る。典型的には、らせんターンの数は、構造中の二重らせん間で同程度又は同じである。これらの図の各々は、ドメインの内容及び順序により特定される複数個のユニークオリゴヌクレオチドで構成される。各ドメインは特定の英数字記号により特定され、各オリゴヌクレオチドは、そのドメインの内容及び順序により特定される。オリゴヌクレオチド、それらの記号、及びそれらのドメイン及び配列組成の一覧は、表１に提供される。図３Ｆの格子は、表１に提供される配列を有する３６２個の異なるオリゴヌクレオチドで構成される２４個の二重らせん格子である。図３Ｂ〜図３Ｄの格子は、これらのオリゴヌクレオチドのサブセットを含み、さらなる２ドメインオリゴヌクレオチドを境界オリゴヌクレオチドとして含み得る。
【図３Ｆ−２】共通して格子の形に作られているがサイズは異なる核酸構造の概略的なマップである。サイズは、二重らせんの数及び二重らせんあたりのらせんターンの数として表され得る。典型的には、らせんターンの数は、構造中の二重らせん間で同程度又は同じである。これらの図の各々は、ドメインの内容及び順序により特定される複数個のユニークオリゴヌクレオチドで構成される。各ドメインは特定の英数字記号により特定され、各オリゴヌクレオチドは、そのドメインの内容及び順序により特定される。オリゴヌクレオチド、それらの記号、及びそれらのドメイン及び配列組成の一覧は、表１に提供される。図３Ｆの格子は、表１に提供される配列を有する３６２個の異なるオリゴヌクレオチドで構成される２４個の二重らせん格子である。図３Ｂ〜図３Ｄの格子は、これらのオリゴヌクレオチドのサブセットを含み、さらなる２ドメインオリゴヌクレオチドを境界オリゴヌクレオチドとして含み得る。
【図３Ｆ−３】共通して格子の形に作られているがサイズは異なる核酸構造の概略的なマップである。サイズは、二重らせんの数及び二重らせんあたりのらせんターンの数として表され得る。典型的には、らせんターンの数は、構造中の二重らせん間で同程度又は同じである。これらの図の各々は、ドメインの内容及び順序により特定される複数個のユニークオリゴヌクレオチドで構成される。各ドメインは特定の英数字記号により特定され、各オリゴヌクレオチドは、そのドメインの内容及び順序により特定される。オリゴヌクレオチド、それらの記号、及びそれらのドメイン及び配列組成の一覧は、表１に提供される。図３Ｆの格子は、表１に提供される配列を有する３６２個の異なるオリゴヌクレオチドで構成される２４個の二重らせん格子である。図３Ｂ〜図３Ｄの格子は、これらのオリゴヌクレオチドのサブセットを含み、さらなる２ドメインオリゴヌクレオチドを境界オリゴヌクレオチドとして含み得る。
【図３Ｆ−４】共通して格子の形に作られているがサイズは異なる核酸構造の概略的なマップである。サイズは、二重らせんの数及び二重らせんあたりのらせんターンの数として表され得る。典型的には、らせんターンの数は、構造中の二重らせん間で同程度又は同じである。これらの図の各々は、ドメインの内容及び順序により特定される複数個のユニークオリゴヌクレオチドで構成される。各ドメインは特定の英数字記号により特定され、各オリゴヌクレオチドは、そのドメインの内容及び順序により特定される。オリゴヌクレオチド、それらの記号、及びそれらのドメイン及び配列組成の一覧は、表１に提供される。図３Ｆの格子は、表１に提供される配列を有する３６２個の異なるオリゴヌクレオチドで構成される２４個の二重らせん格子である。図３Ｂ〜図３Ｄの格子は、これらのオリゴヌクレオチドのサブセットを含み、さらなる２ドメインオリゴヌクレオチドを境界オリゴヌクレオチドとして含み得る。
【図３Ｇ】２個の同一のオリゴヌクレオチド（５’ａ−ｂ−ｃ−ｄ  ３’と表示される）を有する核酸構造の領域を示す概略図である。
【図４】組み合わせてアニールすることにより格子核酸構造を形成する複数個の一本鎖オリゴヌクレオチドの概略図である。また、精製しない場合のアニーリングプロセス産物のアガロースゲル電気泳動分析、及びそれらの産物の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）像も示す。スケールバーは１００ｎｍを表す。
【図５Ａ】様々な形の核酸構造の概略図（上）及びアニーリング後産物のＡＦＭ像（下）である。スケールバーは１００ｎｍを表す。この概略図はまた、既知のオリゴヌクレオチドマップを有する初期格子構造を使用して様々な形の核酸構造を作成する方法も示す。
【図５Ｂ】異なるサイズの、且つ異なる辺を有する２つの三角形の核酸構造の概略図である。双方の構造とも、実験的に作製されている。
【図５Ｂ−１】異なるサイズの、且つ異なる辺を有する２つの三角形の核酸構造の概略図である。双方の構造とも、実験的に作製されている。
【図５Ｂ−２】異なるサイズの、且つ異なる辺を有する２つの三角形の核酸構造の概略図である。双方の構造とも、実験的に作製されている。
【図５Ｂ−３】異なるサイズの、且つ異なる辺を有する２つの三角形の核酸構造の概略図である。双方の構造とも、実験的に作製されている。
【図５Ｃ】異なるサイズの、且つ異なる辺を有する２つの三角形の核酸構造の概略図である。双方の構造とも、実験的に作製されている。
【図５Ｃ−１】異なるサイズの、且つ異なる辺を有する２つの三角形の核酸構造の概略図である。双方の構造とも、実験的に作製されている。
【図５Ｃ−２】異なるサイズの、且つ異なる辺を有する２つの三角形の核酸構造の概略図である。双方の構造とも、実験的に作製されている。
【図５Ｃ−３】異なるサイズの、且つ異なる辺を有する２つの三角形の核酸構造の概略図である。双方の構造とも、実験的に作製されている。
【図５Ｄ】チューブ状に作製することのできる格子の概略図である。最上列のドメインａ２４．ｘ＊及びｂ２４．ｘ＊がそれぞれ最下列のａ２４．ｘ及びｂ２４．ｘと結合してチューブ形を形成する。
【図５Ｄ−１】チューブ状に作製することのできる格子の概略図である。最上列のドメインａ２４．ｘ＊及びｂ２４．ｘ＊がそれぞれ最下列のａ２４．ｘ及びｂ２４．ｘと結合してチューブ形を形成する。
【図５Ｄ−２】チューブ状に作製することのできる格子の概略図である。最上列のドメインａ２４．ｘ＊及びｂ２４．ｘ＊がそれぞれ最下列のａ２４．ｘ及びｂ２４．ｘと結合してチューブ形を形成する。
【図５Ｄ−３】チューブ状に作製することのできる格子の概略図である。最上列のドメインａ２４．ｘ＊及びｂ２４．ｘ＊がそれぞれ最下列のａ２４．ｘ及びｂ２４．ｘと結合してチューブ形を形成する。
【図５Ｄ−４】チューブ状に作製することのできる格子の概略図である。最上列のドメインａ２４．ｘ＊及びｂ２４．ｘ＊がそれぞれ最下列のａ２４．ｘ及びｂ２４．ｘと結合してチューブ形を形成する。
【図６】オリゴヌクレオチドが欠けている内部領域を有する矩形核酸構造の概略図である。この図は、単純に、構造の予め決められた既知のオリゴヌクレオチドマップに基づき、構造の作製に用いられる複数個から既知のオリゴヌクレオチドを除くだけで、かかる複雑な構造を形成し得るという容易さを説明する。
【図７】図５の矩形格子の長さが３倍且つ幅が３分の１の格子から作製したチューブ状核酸構造の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）像である。これらのチューブは、格子に必要なオリゴヌクレオチドの約８０％を使用して、且つ接続部として働くいくらかの追加的なオリゴヌクレオチドを含めて作成された。
【図８】４個の平行二重らせんの正方形核酸構造とＬ字形核酸構造とのアニーリングを示す概略図である。この図は、本発明に係るモジュール式の核酸構造合成手法を説明する。
【図８−１】４個の平行二重らせんの正方形核酸構造とＬ字形核酸構造とのアニーリングを示す概略図である。この図は、本発明に係るモジュール式の核酸構造合成手法を説明する。
【図８−２】４個の平行二重らせんの正方形核酸構造とＬ字形核酸構造とのアニーリングを示す概略図である。この図は、本発明に係るモジュール式の核酸構造合成手法を説明する。
【図９】スペーサー−リンカーを使用した３個の矩形核酸構造の互いの取付けを示す概略図である。スペーサー−リンカーの配置及び長さに応じて、種々のこれらの複合構造を作製し得る。
【図１０Ａ】「ハンドル」を有する核酸構造を示す概略図（Ａ）及びＡＦＭ像（Ｂ）である。ハンドルは、２ドメイン境界オリゴヌクレオチドに取り付けられるさらなるドメインとして提供され、これにより３ドメイン境界オリゴヌクレオチドとなる。この図では、２番目のドメインと３番目のドメインとの間にダブルＴ（Ｔ２）スペーサーが存在し、ここで３番目のドメインがハンドルドメインに相当する。３番目のドメインと相補的なオリゴヌクレオチドがアニーリング反応に含まれ得る。この図では、この相補オリゴヌクレオチドはｙ＊で示され、その３’末端にビオチン修飾を有する。次にこのビオチン部分を使用してストレプトアビジンを結合することができる。ＡＦＭ像は、標識ストレプトアビジンに結合したかかる構造を示す。本発明は、境界、縁部及び／又は内部を含め、構造の任意の場所にかかるハンドルドメインを組み込むことを企図する。
【図１０Ａ−１】「ハンドル」を有する核酸構造を示す概略図（Ａ）及びＡＦＭ像（Ｂ）である。ハンドルは、２ドメイン境界オリゴヌクレオチドに取り付けられるさらなるドメインとして提供され、これにより３ドメイン境界オリゴヌクレオチドとなる。この図では、２番目のドメインと３番目のドメインとの間にダブルＴ（Ｔ２）スペーサーが存在し、ここで３番目のドメインがハンドルドメインに相当する。３番目のドメインと相補的なオリゴヌクレオチドがアニーリング反応に含まれ得る。この図では、この相補オリゴヌクレオチドはｙ＊で示され、その３’末端にビオチン修飾を有する。次にこのビオチン部分を使用してストレプトアビジンを結合することができる。ＡＦＭ像は、標識ストレプトアビジンに結合したかかる構造を示す。本発明は、境界、縁部及び／又は内部を含め、構造の任意の場所にかかるハンドルドメインを組み込むことを企図する。
【図１０Ａ−２】「ハンドル」を有する核酸構造を示す概略図（Ａ）及びＡＦＭ像（Ｂ）である。ハンドルは、２ドメイン境界オリゴヌクレオチドに取り付けられるさらなるドメインとして提供され、これにより３ドメイン境界オリゴヌクレオチドとなる。この図では、２番目のドメインと３番目のドメインとの間にダブルＴ（Ｔ２）スペーサーが存在し、ここで３番目のドメインがハンドルドメインに相当する。３番目のドメインと相補的なオリゴヌクレオチドがアニーリング反応に含まれ得る。この図では、この相補オリゴヌクレオチドはｙ＊で示され、その３’末端にビオチン修飾を有する。次にこのビオチン部分を使用してストレプトアビジンを結合することができる。ＡＦＭ像は、標識ストレプトアビジンに結合したかかる構造を示す。本発明は、境界、縁部及び／又は内部を含め、構造の任意の場所にかかるハンドルドメインを組み込むことを企図する。
【図１０Ａ−３】「ハンドル」を有する核酸構造を示す概略図（Ａ）及びＡＦＭ像（Ｂ）である。ハンドルは、２ドメイン境界オリゴヌクレオチドに取り付けられるさらなるドメインとして提供され、これにより３ドメイン境界オリゴヌクレオチドとなる。この図では、２番目のドメインと３番目のドメインとの間にダブルＴ（Ｔ２）スペーサーが存在し、ここで３番目のドメインがハンドルドメインに相当する。３番目のドメインと相補的なオリゴヌクレオチドがアニーリング反応に含まれ得る。この図では、この相補オリゴヌクレオチドはｙ＊で示され、その３’末端にビオチン修飾を有する。次にこのビオチン部分を使用してストレプトアビジンを結合することができる。ＡＦＭ像は、標識ストレプトアビジンに結合したかかる構造を示す。本発明は、境界、縁部及び／又は内部を含め、構造の任意の場所にかかるハンドルドメインを組み込むことを企図する。
【図１０Ａ−４】「ハンドル」を有する核酸構造を示す概略図（Ａ）及びＡＦＭ像（Ｂ）である。ハンドルは、２ドメイン境界オリゴヌクレオチドに取り付けられるさらなるドメインとして提供され、これにより３ドメイン境界オリゴヌクレオチドとなる。この図では、２番目のドメインと３番目のドメインとの間にダブルＴ（Ｔ２）スペーサーが存在し、ここで３番目のドメインがハンドルドメインに相当する。３番目のドメインと相補的なオリゴヌクレオチドがアニーリング反応に含まれ得る。この図では、この相補オリゴヌクレオチドはｙ＊で示され、その３’末端にビオチン修飾を有する。次にこのビオチン部分を使用してストレプトアビジンを結合することができる。ＡＦＭ像は、標識ストレプトアビジンに結合したかかる構造を示す。本発明は、境界、縁部及び／又は内部を含め、構造の任意の場所にかかるハンドルドメインを組み込むことを企図する。
【図１０Ａ−５】「ハンドル」を有する核酸構造を示す概略図（Ａ）及びＡＦＭ像（Ｂ）である。ハンドルは、２ドメイン境界オリゴヌクレオチドに取り付けられるさらなるドメインとして提供され、これにより３ドメイン境界オリゴヌクレオチドとなる。この図では、２番目のドメインと３番目のドメインとの間にダブルＴ（Ｔ２）スペーサーが存在し、ここで３番目のドメインがハンドルドメインに相当する。３番目のドメインと相補的なオリゴヌクレオチドがアニーリング反応に含まれ得る。この図では、この相補オリゴヌクレオチドはｙ＊で示され、その３’末端にビオチン修飾を有する。次にこのビオチン部分を使用してストレプトアビジンを結合することができる。ＡＦＭ像は、標識ストレプトアビジンに結合したかかる構造を示す。本発明は、境界、縁部及び／又は内部を含め、構造の任意の場所にかかるハンドルドメインを組み込むことを企図する。
【図１０Ａ−６】「ハンドル」を有する核酸構造を示す概略図（Ａ）及びＡＦＭ像（Ｂ）である。ハンドルは、２ドメイン境界オリゴヌクレオチドに取り付けられるさらなるドメインとして提供され、これにより３ドメイン境界オリゴヌクレオチドとなる。この図では、２番目のドメインと３番目のドメインとの間にダブルＴ（Ｔ２）スペーサーが存在し、ここで３番目のドメインがハンドルドメインに相当する。３番目のドメインと相補的なオリゴヌクレオチドがアニーリング反応に含まれ得る。この図では、この相補オリゴヌクレオチドはｙ＊で示され、その３’末端にビオチン修飾を有する。次にこのビオチン部分を使用してストレプトアビジンを結合することができる。ＡＦＭ像は、標識ストレプトアビジンに結合したかかる構造を示す。本発明は、境界、縁部及び／又は内部を含め、構造の任意の場所にかかるハンドルドメインを組み込むことを企図する。
【図１１】本発明において作成される様々な構造の図形をまとめたもの（上側パネル）及び対応するＡＦＭ像（下側パネル）である。
【図１０Ｂ】「ハンドル」を有する核酸構造を示す概略図（Ａ）及びＡＦＭ像（Ｂ）である。ハンドルは、２ドメイン境界オリゴヌクレオチドに取り付けられるさらなるドメインとして提供され、これにより３ドメイン境界オリゴヌクレオチドとなる。この図では、２番目のドメインと３番目のドメインとの間にダブルＴ（Ｔ２）スペーサーが存在し、ここで３番目のドメインがハンドルドメインに相当する。３番目のドメインと相補的なオリゴヌクレオチドがアニーリング反応に含まれ得る。この図では、この相補オリゴヌクレオチドはｙ＊で示され、その３’末端にビオチン修飾を有する。次にこのビオチン部分を使用してストレプトアビジンを結合することができる。ＡＦＭ像は、標識ストレプトアビジンに結合したかかる構造を示す。本発明は、境界、縁部及び／又は内部を含め、構造の任意の場所にかかるハンドルドメインを組み込むことを企図する。
【図１１−１】本発明において作成される様々な構造の図形をまとめたもの（上側パネル）及び対応するＡＦＭ像（下側パネル）である。
【図１１−２】本発明において作成される様々な構造の図形をまとめたもの（上側パネル）及び対応するＡＦＭ像（下側パネル）である。
【図１２】複数個の矩形で内部が輪状の形の構造のＡＦＭ像である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、その広義の意味において、予め決められた、従って制御された形、サイズ及び複雑さの核酸構造を作製する方法に関する。本発明は、一部には、選ばれた複数個の一本鎖オリゴヌクレオチドが自己組織化して、制御された形、サイズ、複雑さ及び修飾の核酸構造を形成し得るという予期しない発見に基づいている。とりわけ、複数個の一本鎖オリゴヌクレオチドのみを使用して様々な予め決められた形及び制御されたサイズの安定した核酸構造を形成し得ることは、意外と考えられた。
【００３０】
本発明の核酸構造は、予め決められた又は既知の方式で（配列特異的アニーリングによって）配置される複数個のオリゴヌクレオチドを含む。結果として、構造における各オリゴヌクレオチドの位置は既知となる。このように、構造を特定の位置で、例えば部分を取り付けることによって修飾し得る。これは、修飾オリゴヌクレオチドを出発物質として使用することによるか、又は構造の形成後に特定のオリゴヌクレオチドを修飾することにより実現し得る。従って、得られた構造における出発オリゴヌクレオチドの各々の位置が既知であることにより、構造に対するアドレサビリティ（addressability）が提供される。
【００３１】
本発明の核酸構造は、ある場合には、一本鎖オリゴヌクレオチドの自己組織化プロセスを用いて作製され得る。これらの自己組織化方法では、単一のベッセルに一本鎖オリゴヌクレオチドを組み合わせ、配列相補性に基づき互いにアニールさせる。ある場合には、このアニーリングプロセスには、オリゴヌクレオチドを高温に置き、次に温度を徐々に下げて配列特異的結合を促進することが含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「自己組織化」は、オリゴヌクレオチド（及びある場合には核酸構造）が、配列特異的な方式で、予測された方式で、且つ外部制御（例えばオリゴヌクレオチド又は核酸構造の逐次的な付加による）なしに、互いにアニールする能力を指す。
【００３２】
従って本発明は、とりわけ、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物、様々な予め決められた又は既知のサイズ、形、複雑さ及び修飾の核酸構造を作製する方法、様々な予め決められた又は既知のサイズ、形、複雑さ及び修飾の核酸構造、核酸構造の複数個であって、サイズ、形、複雑さ及び修飾に関して実質的に単分散であってよいかかる複数個、２つ以上の核酸構造を含む組成物構造、及びかかる複合構造を作製する方法を提供する。本発明はまた、本発明の核酸構造及び複合構造を使用する方法も提供する。本発明のこれらの態様及び実施形態は、本明細書にさらに詳細に記載される。
【００３３】
核酸構造：
本発明の核酸構造は、互いに配列特異的な方式で結合した複数個のオリゴヌクレオチドから構成される。本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的には２個以上のドメインを含む。図１は、４ドメインオリゴヌクレオチドの概略図を提供する。核酸構造を形成するアニーリングプロセス以前は、オリゴヌクレオチドは一本鎖形態である。
【００３４】
概して、オリゴヌクレオチドのあらゆるドメインが、構造中の別のオリゴヌクレオチドの別のドメインに結合する。図２Ａは、構造のある領域における２ドメイン及び４ドメインオリゴヌクレオチドの配置及びそれらの間の結合相互作用の概略図を提供する。２ドメインオリゴヌクレオチドは最下部に直線状の矢印で示され、４ドメインオリゴヌクレオチドはＵ字形の矢印として示される。４ドメインオリゴヌクレオチドは、本発明の核酸構造に存在する場合、約３ｎｍ×７ｎｍの面積を有する。これらは本明細書では、一本鎖タイル（ＳＳＴ）と称され得る。核酸構造との関連において、各ＳＳＴは「分子画素」と見なされ得る。これらの図の各々において矢頭はオリゴヌクレオチドの３’末端を表す。同様の表現が図２Ｂ（上）に提供される。図２Ｂ（下）は代替的実施形態を示し、ここではあるオリゴヌクレオチドが５個のドメインで構成され、それらのドメインのうち２個は、共に物理的に別個のオリゴヌクレオチド上の別のドメインに結合する。ｄ１及びｄ２と示されるこれらの２個のドメインは、他のドメインに結合するとき、互いには直接コンジュゲートせず、むしろそれらの間には本質的に切れ目がある。次にこの構造はまた、５’−ｄ２−ａ−ｂ−ｃ−ｄ１−３’オリゴヌクレオチドの向きに基づくクロスオーバーも含む。さらなる他の配置が図２Ｃに示される。示されるとおり、オリゴヌクレオチドは、構造がクロスオーバー（図２Ｃ上に示されるとおり）、半クロスオーバー（図２Ｃ下に示されるとおり）、又はそれらの組み合わせ（図２Ｂ下に示されるとおり）を含むように配置され得る。オリゴヌクレオチドはまた、限定はされないが、２個のドメイン毎、又は４個のドメイン毎など、クロスオーバー及び／又は半クロスオーバーが異なる距離で生じるように配置されてもよい。従って本発明は、核酸構造内のオリゴヌクレオチドについて様々な結合配置を企図することが理解されなければならない。
【００３５】
しかしながら、ある場合には、核酸構造の特定のドメインが構造中の別のドメインに結合しないこともある。例として、ある場合には、ポリＴドメインを有するオリゴヌクレオチドが構造中に、好ましくは辺縁に、且つポリＴドメインが一本鎖となる配置で存在する。
【００３６】
別の例として、ドメインは、他の構造又は他の部分とのアニーリング用のハンドルとして使用され得る。かかるハンドルドメインは、図１０Ａにおいて格子構造の上辺縁及び下辺縁に示される。ビオチン部分を含むオリゴヌクレオチドをこれらのハンドルに結合させ、続いて構造をストレプトアビジンに接触させた。ストレプトアビジンの結合部位を図１０Ｂに示す。
【００３７】
構造内のオリゴヌクレオチドは、二重らせん（典型的には平行な配置）を形成するようにひとりでに配置される。このような二重らせんは、本明細書ではらせんと同義的に称される。かかる構造の例が、図３Ａに提供される。左側のパネルは４個のらせん格子構造を示し、右側のパネルは８個のらせん格子構造を示す。これらの二重らせんは、選ばれた一本鎖オリゴヌクレオチド集合を互いに配列特異的にアニーリングした結果として形成される。構造中の各二重らせんは複数個のドメインで構成される。それらのドメインが他のオリゴヌクレオチドの相補的なドメインと結合することにより、らせんが形成される。隣接するらせんは互いに半クロスオーバーによって接続される。
【００３８】
本発明は、核酸構造を合成前に設計し得ること、及び合成プロセスにおいて特定の選ばれたオリゴヌクレオチドを使用することにより、そのサイズ、形、複雑さ及び修飾を指定及び制御し得ることを提供する。例として、図３Ｂ〜図３Ｆは、様々なサイズのいくつかの格子のオリゴヌクレオチドマップを示す。構造における各ドメイン及び各オリゴヌクレオチドの位置は既知であり、これらの図に提供される。ドメイン及びオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、表１に提供する。
【００３９】
表１のオリゴヌクレオチドを使用して３１０「画素」のカンバスを作成することができ、そこから様々な形の核酸構造を作成し得る。この表は、４ドメイン内部及び境界オリゴヌクレオチドの配列、並びに２ドメイン境界オリゴヌクレオチドの配列を含む。４ドメイン内部オリゴヌクレオチドが画素に相当し、一方、２ドメイン及び４ドメイン境界オリゴヌクレオチドは、内部オリゴヌクレオチドにより作り出される構造の上縁、下縁及び側縁に結合し、それにより構造の望ましくない凝集を防止する。従ってこの表は、３１０個の４ドメイン（画素又は内部）オリゴヌクレオチドと、２４個の４ドメイン（垂直境界）オリゴヌクレオチドと、２８個の２ドメイン（水平境界）オリゴヌクレオチドとを含む。３１０個の内部オリゴヌクレオチドプールのサブセットを使用して特定の形の構造を作成する場合、内部オリゴヌクレオチドの所望の構造の縁部に存在する配列に応じて、異なる２ドメイン及び４ドメイン境界オリゴヌクレオチドが必要となり得ることが理解されるべきである。当業者は、本明細書に提供される教示を用いて、且つ限定なしに図２Ｂ及び図３Ａを含めた特定の図を参照して、かかる境界オリゴヌクレオチドの配列を決定することができる。
【００４０】
従って、内部オリゴヌクレオチドが構造の所望の形に寄与し、境界オリゴヌクレオチドが構造同士の望ましくない凝集を防止することが理解されなければならない。
【００４１】
また、表１の配列は本質的に典型例であり、本発明が別のオリゴヌクレオチドプールを用いて実施され得ることも理解されなければならない。かかるオリゴヌクレオチドプールは、手動で、又はコンピュータ手段により、本明細書に提供される教示に基づき設計され得る。
【００４２】
例として、オリゴヌクレオチドプールは、配列対称性を最小化するプロセス、又はＳＳＴモチーフに完全にランダムな配列を持たせるプロセスを用いて構築され得る。いずれのプロセスも、Uniquimerなどのソフトウェアを用い得る。配列最小化に基づく設計は、配列作成にいくつかの基準がある。１）ヌクレオチド（すなわちＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）は、一つずつランダムに作成される。２）作成されたヌクレオチドに対する相補ヌクレオチドは、以下の塩基対形成規則に従い適合される：Ａに対してＴ、及びその逆、Ｃに対してＧ、及びその逆。３）特定の長さ（８ｎｔ又は９ｎｔ）を超えるセグメントの繰り返しは許容されない。設計中にかかる繰り返しセグメントが出現する場合、繰り返しセグメントの要件が満たされるまで、直前に作成されたヌクレオチドを変異させる。４）４個の連続するＡ、Ｃ、Ｇ又はＴ塩基は許容されない。５）一本鎖連結点の予め指定されたヌクレオチド（例えば、ほとんどの鎖について、それぞれ２１番目及び２２番目のヌクレオチドのＴ及びＧ）を使用して、連結点周辺での塩基のスライドを回避する。しかしながら、完全にランダムな配列を用いた設計では、工程３〜５の制約は適用されない。
【００４３】
一部又は全てのオリゴヌクレオチドを、手動で設計してもよい。例えば、例示される構造の一部では、ハンドルセグメント配列の設計に（例えばストレプトアビジン標識及びポリＴドメインの連結用の３’ビオチン鎖を受け入れるハンドルセグメント）、手動の設計及び／又は最適化を用いた。加えて、ある場合には、異なるＳＳＴ構造のセグメントを手動で組み合わせ、既存の構造を新しい構造に変形させた。例えば、ＳＳＴのさらなる列を導入して、矩形設計をチューブ設計に変換した（例えば２４Ｈ×２８Ｔの矩形設計を２４Ｈ×２８Ｔのバレル設計に変換、及び２４Ｈ×２８Ｔの矩形設計を８Ｈ×８４Ｔのチューブ設計に変換）。同様に、チューブ設計を手動で矩形設計に変換もした（例えば、１２Ｈ×１７７Ｔチューブを３６Ｈ×４１Ｔの矩形に変換）。
【００４４】
ある場合には、核酸構造の少なくとも１個のドメインがユニークであり、これはつまり、そのドメインが当該の構造に１度のみ現れるという意味である。構造は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個又はそれを超える数のユニークドメインを含め、１個又は複数個のユニークドメインを含み得る。一部の実施形態では、構造中のドメインの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８０％、又は９０％がユニークである。例として、構造は、各々が構造に１度のみ現れる第１の複数個のドメイン（これらのユニークドメインは、構造中の全ドメインの７５％存在し得る）と、各々が構造に２度以上現れる第２の複数個のドメイン（これらの繰り返しドメインは、構造中の全ドメインの２５％に相当する）とを含み得る。他の割合もまた可能であることは明らかであろう。一部の実施形態では、構造中の全てのドメインがユニークである。複合構造（すなわち、スペーサー−リンカーによって互いに連結された２つ以上の核酸構造を含む構造）の全てのドメインがユニークであっても、又はユニークでなくてもよい。
【００４５】
ある場合には、構造における二重らせんの少なくとも１個のドメインがユニークであり、これはつまり、そのドメインが当該の二重らせんに１度のみ現れるという意味である。そのドメインが同じ構造内の他のらせんに存在してもよく、従って、核酸構造全体で見るとユニークでないこともある。これが図３Ｇに示される。５’−ａ−ｂ−ｃ−ｄ−３’と表示されるオリゴヌクレオチドが、構造中に２度存在する。ａと表示されるドメイン及びその相補体ａ＊並びにｂと表示されるドメイン及びその相補体ｂ＊は、構造中の２つのらせんに存在し、ドメインｃ及びその相補体ｃ＊並びにｄ及びその相補体ｄ＊も同様である。あるらせんに、当該のらせんで見てユニークな１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える数のドメインがあってよい。らせんにおけるユニークドメインは、当該のらせん中のドメインの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８０％、９０％、又は１００％に相当し得る。らせんにおけるユニークドメインは、構造の端部又はその近傍に位置してもよい。らせんにおけるユニークドメインは互いに隣接してもよく、又は互いに離間されてもよい。ユニークドメインは繰り返しドメイン（すなわち、らせん中に２度以上現れるドメイン）によって互いに分離されてもよい。
【００４６】
構造は、ユニークドメインを有するらせんを１個又は複数個含み得る。このタイプのらせんは、構造に存在するらせんの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％又は１００％に相当し得る。構造中にこのらせんタイプが２個以上存在する場合、それらは互いに隣接してもよく、又はユニークドメインを含まないらせんを含め、他のらせんによって分離されてもよい。例として、構造において、ユニークドメインを有するらせんがユニークドメインを持たないらせんと交互に並んでもよい。
【００４７】
従って、ある場合には、核酸構造は、各々が１個又は複数個のユニークドメインを有する２個以上のらせんを含んでもよく、ここでドメインは、個々のらせんそれ自体で見てユニークであり、場合によっては構造全体で見てもユニークである。個々のらせんの１つ又は複数のユニークドメインは、構造中の他のらせんに存在し得る。個々のらせんの１つ又は複数のユニークドメインは、構造中の他のらせんの１つ又は複数のユニークドメインであり得る。
【００４８】
ある場合には、構造中の１個又は複数個のらせんは、各々が完全にユニークドメインで構成されてもよく、これはつまり、それらのドメインの各々が１個のらせんにつき１度のみ存在するか、又は１個の構造につき１度のみ存在するという意味である。
【００４９】
従って、ある場合には、本発明の核酸構造は少なくとも１個のユニーク二重らせんを含む。ユニーク二重らせんは、構造中のいかなる他のらせんとも異なるドメイン組成を有するらせんである。従って、ユニーク二重らせんはまた、構造中のいかなる他のらせんとも異なるヌクレオチド配列も有し得る。
【００５０】
さらに他の場合には、本発明の核酸構造は、ユニークドメインから構成されるある領域と、非ユニークドメイン又は繰り返しドメインから構成される別の領域とを含むように設計され得る。
【００５１】
構造は、少なくとも一部には、単一のベッセルにおいて複数個の既知のオリゴヌクレオチドをアニールすることにより形成される。これを図４に示す。この図は、アニーリングプロセス後の予想される格子構造の概略図及びＡＦＭ像を示す。アニーリングプロセス後のゲル電気泳動分析は２つのバンドを示し、１つは未結合のオリゴヌクレオチドに対応し、１つは構造に対応する。これらの方法は、特定サイズの格子の作成に使用することのできる既知のオリゴヌクレオチドプールから出発して、異なる形及び／又はサイズの構造を形成するため、選ばれたオリゴヌクレオチドをそのプールから除外し得ることを提供する。
【００５２】
これらの方法を用いて作製され得る様々な構造を図５Ａに示す（上図）。また、かかる方法により得られるアニーリング後の産物も示す。三角形構造の作成に使用することのできる詳細なオリゴヌクレオチドマップもまた、図５Ｂ及び図５Ｃに提供する。チューブ形構造の作成に使用することのできる詳細なオリゴヌクレオチドマップを、図５Ｄに提供する。本発明は、構造の内部にあるオリゴヌクレオチドの除去も同様に企図する。例として、図６は、内部に空隙があるパターン（すなわち、いかなるオリゴヌクレオチドも持たない予め決められた領域）を有する構造を示す。
【００５３】
従って、ある場合には、エンドユーザーは構造の各位置に存在する特定のオリゴヌクレオチドを知ったうえで、例えば特定の長さ及び幅寸法を有する格子などの核酸構造を設計する。事実上、エンドユーザーは、構造内での各オリゴヌクレオチドの正確な部位を示すフィジカルマップを有する。マップにおける（従って核酸構造における）各部位の各オリゴヌクレオチドのアイデンティティが既知であることにより、エンドユーザーは、特定の構造を出発点として使用して、特定のパターン又は形をエンジニアリングすることが可能である。かかるエンジニアリングは、核酸構造を形成するため組み合わされるオリゴヌクレオチドの混合物から１個又は複数個の既知のオリゴヌクレオチドを除外すること、及び／又はさらなる既知のオリゴヌクレオチドを含めることにより行われ得る。
【００５４】
従って、例として、及び本明細書において実証されるとおり、エンドユーザーは、特定の長さ及び幅を有する、且つ複数個のユニークオリゴヌクレオチドで構成される二次元格子を設計してもよい。エンドユーザーにとって、格子の各位置のオリゴヌクレオチドのアイデンティティは既知である。格子それ自体を合成可能であることに加え、エンドユーザーはまた、その格子を出発点として使用して、１つ又は複数の他の核酸構造を設計及び合成することが可能である。本明細書において実証されるとおり、格子全体の作製に用いられ得るプールから１個の、及び通常はそれより多いオリゴヌクレオチドを除外することにより、様々な形の核酸構造を合成し得る。これらの形には、ハート形、山形模様、及び三角形、並びに格子又は内部開口若しくは穴を有する他の構造が含まれる。
【００５５】
従って本発明は、数多くの異なる核酸構造を、各構造をデノボで設計する必要なしに合成する方法を提供する。むしろ、初期核酸構造、例えば格子から出発して、単純に予め選定されたオリゴヌクレオチドを除外し、及び／又は予め選定されたオリゴヌクレオチドを含めるだけで、様々な他の核酸構造を形成し得る。このように、エンドユーザーは、一本鎖オリゴヌクレオチドをモジュール方式で、所望の核酸構造の最終的な形及びサイズに応じて複数個のメンバーを含めたり、又は除外したりして使用する。複数個のなかのオリゴヌクレオチドメンバー間の相互作用に認め得るほどの変化はないものと予想され、従ってエンドユーザーが新しい核酸構造毎に本質的に一から設計する必要はない。代わりに、エンドユーザーは各オリゴヌクレオチドのストックを調製し、様々なストックを、構造におけるそれらの相対頻度に対応する相対濃度で単一のベッセルに共に組み合わせることで、所望の形、サイズ及び複雑さの核酸構造を形成する。
【００５６】
所望の形及びサイズの核酸構造における一本鎖オリゴヌクレオチドの選択及び配置は、手動で、又はコンピュータアルゴリズムにより行うことができる。かかるコンピュータアルゴリズムの例はUniquimerであり、これは公開されていて、一般に利用可能である。
【００５７】
前述の図のいくつかに示されるとおり、本発明の核酸構造のサイズはアニーリングプロセスの間に制御され得る。このサイズ制御は、１個又は複数個のユニークドメイン、又は１個又は複数個のユニークらせんを有する構造を設計して、従ってアニーリングプロセスにオリゴヌクレオチドの選ばれた集合を使用することにより達成される。従って核酸構造のサイズもまた、典型的には予め決められる。
【００５８】
核酸構造のサイズは、その寸法のうち１つ、２つ又は３つの距離で表現され得る。かかる寸法は、各々独立して、数ナノメートル長さ又は数マイクロメートル長さ、又はそれを超える長さであってもよい。例として、構造は、各々が５〜１００ナノメートル、５〜５００ナノメートル、５〜１０００ナノメートル、例えば１０〜１００ナノメートル、１０〜５００ナノメートル、又は１０〜１０００ナノメートルの範囲の長さを有する１つ又は２つの寸法を含み得る。一部の実施形態では、構造は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｎｍ又はそれを超える寸法を１つ又は複数有し得る。一部の実施形態では、構造は約３ｎｍ×７ｎｍ又は約４ｎｍ×７ｎｍである。一部の実施形態では、構造は６０ｎｍ×１００ｎｍである。
【００５９】
核酸構造のサイズはまた、二重らせんの数並びにそれらの二重らせんの長さにより提示されてもよい。二重らせんの長さは、らせん中のらせんターンの数として表現され得る。本発明は、ナノメートル及びマイクロメートルスケール、及びそれを超える大きさの構造の作製を企図することが理解されるべきである。
【００６０】
核酸構造のサイズはまた、それが含む４ドメインオリゴヌクレオチド（ＳＳＴ）の数としても提示され得る。その範囲は１〜１０００個超であってよい。本明細書に例示される構造の多くが、３１０個以下のＳＳＴで構成される。しかしながら、核酸構造に寄与するＳＳＴの数は、所望の構造のサイズ及び／又は所望の修飾及び／又は複雑さの程度に応じて異なり得ることが理解されるべきである。例示される構造の一部は、過去に報告されているワンポットアニーリング構造と比較して、少なくとも４倍多い異なる分子成分を含む。
【００６１】
核酸構造のサイズはまた、それが含むヌクレオチドの数として提示されてもよい。本明細書に例示される構造の一部は少なくとも約１５，０００ヌクレオチドを含み、一部は約４５，０００ヌクレオチドを含む。例示される構造の一部は、典型的なＤＮＡ折り紙構造（すなわち、単一の足場鎖と複数個のステープル鎖とで構成される構造）より少なくとも３倍多いヌクレオチドを含む。
【００６２】
本発明の核酸構造は、任意の形又は形態をとり得る。本発明の方法を用いて作り出され得る様々な形及び形態の例を、図５Ａ〜図５Ｄ、図６、図７及び図１１に示す。重要なことには、本発明の方法論を用いると、核酸構造の形、形態及びサイズを、構造のあらゆる部位におけるオリゴヌクレオチドのアイデンティティ（従って配列）の知識に基づき正確に制御しながら予め決める、従って予め設計することが可能となる。本方法の有効性は、初回の試行で１１０個の目的の構造のうち１０３個が作成された際の９４％の成功率により実証される。初回の試行で作成されなかった７個の構造のうち４個は、主に狭い接続点及び接続領域を取り除くことによって少し設計し直したところ、続いて生成が成功した。顕著には、例えば３１０個のオリゴヌクレオチドプールの異なるサブセットを用いて作製された異なる構造を、それらの異なる構造が同一のＳＳＴを含んでいた場合であっても、構造的完全性を失うことなく合成及び精製後に混合することができた。
【００６３】
本明細書において考察されるとおり、核酸構造は、単一のアニーリング反応で複数個の一本鎖オリゴヌクレオチドを組み合わせてアニールすることにより合成することができ、それにより所望の形、サイズ、複雑さ及び修飾の核酸構造が生じ得る。本発明はまた、個別のより小さい核酸構造を互いにアニールすることによる、モジュール方式での核酸構造の合成も企図する。この手法を図８に示し、ここでは４個の二重らせんの正方形構造とＬ字形構造とが別々に作製され、次に組み合わされて互いにアニールすることで、８個の二重らせんの正方形を形成する。従って、本発明の構造は、図４に示されるとおりオリゴヌクレオチドを互いにアニールすることから作製されても、及び／又は図８に示されるとおり、より小さい構造を互いにアニールすることにより作製されてもよい。この手法を用いて格子形構造が互いに一体に融合され、及びチューブ形構造が互いに一体に融合されている。かかる融合はまた、それらの最初の合成アニーリング反応液から構造を精製する必要なしに行うこともできる。従って、精製されているか否かに関わらず、それらの構造を組み合わせてアニールし得る。
【００６４】
一部の実施形態では、構造は、高温に供して、次に徐冷プロセスに供することにより、アニールされる。高温は約５０℃、約４５℃、又は約４０℃であってよく、冷却プロセスは、溶液を略室温（例えば約２５℃）に冷却することが目的である。冷却期間は、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０時間又はそれを超える時間を含め、数時間であってよい。或いは、核酸構造は、同じ時間長さにわたり単一の温度、例えば室温で組み合わせてアニールさせてもよい。
【００６５】
他の実施形態において、本発明は、全ての構造を同時に混合及びアニーリングする場合と比較したときの、構造の時差的又は逐次的な付加（及びアニーリング）を企図する。逐次的な付加は、より複雑な構造の合成において特に有用であり得る。ある場合には、これらの及び他のアニーリング方法を、静的環境で、或いは流動下で実施することができる。流動環境は、後続の成分を付加する前に、アニールされなかったオリゴヌクレオチド又は核構造を除去することを可能にする。
【００６６】
本発明はまた、複数個の核酸構造も提供する。本明細書で使用されるとき、用語の複数個は２個以上を意味し、用語の集合と同義的に使用され得る。かかる複数個は、１０、５０、１００、５００、１０００個又はそれを超える数の構造を含み得る。かかる複数個は、様々な程度の同種性を有することができ、これはつまり、その複数個における核酸構造のある割合が、サイズ、形、複雑さ及び／又は修飾に関して互いに同じであるという意味である。従って複数個の構造は、特定の特徴を有する構造の点で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％同種性である。例として、複数個の格子形構造が少なくとも５０％同種性であってよく、これはつまり、当該の複数個における構造の少なくとも５０％が格子形であるという意味である。
【００６７】
かかる複数個は単分散であってよく、これはつまり、それらのメンバーが、サイズ、形、複雑さ及び／又は修飾を含む１つ又は複数の特徴の点で同じであってよいという意味である。複数個は、これらの特徴の全てに関して単分散であってよい。一部の実施形態では、複数個は実質的に単分散である。実質的に単分散とは、構造の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はそれを超える割合がほぼ同じ形、サイズ、複雑さであり、及び／又は同じ修飾を有する複数個を指す。一部の実施形態では、構造の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％又はそれを超える割合がほぼ同じ形、サイズ、複雑さであり、及び／又は同じ修飾を有する。例示的な複数個を図１２に示す。
【００６８】
複数個における同種性（及び逆に異種性）の程度は、限定はされないがＡＦＭ又はＴＥＭ、及びゲル電気泳動を含む数多くの技法を用いて決定され得る。これらの技法は、実施例で考察するとおり、調製した構造集合における同種性の程度の決定に用いられている。重要なことに、本明細書に提供されるアニーリング方法は、優勢な核酸構造種を有する集合を再現性よく生じることが分かっている。さらに、当該の優勢種は、本発明の設計及びマッピング手法を用いて目的とされた種と同一のように見える。
【００６９】
いくつかの図に示されるとおり、ある場合には、核酸構造が形成されてもなお、一本鎖のドメインがあり得る。これらは、例えば辺縁に存在し得る。かかる辺縁は、図に提供される構造の左辺縁及び右辺縁によって表される。本発明においては、かかるドメインの性質がアニーリングプロセスの効率及び収率に影響を与え得ることが見出された。より具体的には、これらの一本鎖領域が混合ヌクレオチド配列のものである場合、構造は集塊しやすく、収率が低下する。かかる集塊化は、これらの一本鎖領域のヌクレオチド配列を操作することにより低減し得る。具体的には、配列がポリＴである一本鎖領域は集塊化を生じにくいため、構造の収率が良好となる。これらのポリＴドメインは、例えば図３Ｂ〜図３Ｆに示し、ドメイン中のチミジンの数を示してＴ１０又はＴ１１と表される。ポリＡ及びポリＣ配列もまた用いられ得る。従って、一部の実施形態では、特定の一本鎖ドメインが構造に存在してもよく、かかるドメインは互いに配列が同じであってよい。
【００７０】
特定の実施形態において、辺縁領域は、ポリＴドメインと他の混合配列ドメインとの混合物から構成されてもよく、但し、構造は実質的に集塊しないものとする。このような場合、例えば図８に示されるとおり、混合配列ドメインを使用して２つ以上の構造を互いにアニールすることができる。かかるドメインの数は、６、８、１０個又はそれを超える数であってよい。
【００７１】
本発明の構造は、合成中又は合成後に修飾されてもよい。構造は、修飾されているオリゴヌクレオチドを使用して合成中に修飾されてもよい。例えば、構造の作成に使用される１つ又は複数のオリゴヌクレオチドを、目的の部分にコンジュゲートしてもよい。修飾オリゴヌクレオチドを使用して本発明の構造を作成してもよく、但し、かかる修飾は、そのオリゴヌクレオチドが所望の構造を形成するための必要に応じて他のオリゴヌクレオチドと結合する能力を妨げないものとする。それに加えて又は代えて、構造は合成後に修飾されてもよい。
【００７２】
任意の修飾が企図され、但し、その修飾によって別段意図されるのでない限り、修飾はオリゴヌクレオチドの互いのアニーリングを妨げず、且つ構造の安定性を低下させることがないものとする。修飾は、限定はされないが、本質的に化学的又は酵素的であってよい。修飾には、核酸コンジュゲート部分の使用が含まれてもよい。部分は、限定なしに、本質的に金属、有機及び無機であってよい。部分は、構造中のオリゴヌクレオチドを認識してそれを結合することが可能な核酸にコンジュゲートされ得る。かかる核酸は、例として、トリプレックス形成オリゴヌクレオチドであってよい。他の場合には、１つ又は複数の非核酸部分が、恒久的に又は一過性に、共有結合的に又は非共有結合的に、構造に取り付けられてもよい。本発明は、ユニーク及び／又は非ユニークオリゴヌクレオチドが修飾され得ることを企図する。構造中のオリゴヌクレオチドは、それ自体が、構造に寄与しない１つ又は複数のドメインであって、むしろ部分をその構造に結合するために使用されるドメインにコンジュゲートされてもよい。構造における各オリゴヌクレオチド及び各ドメインの部位は予め決めることができるため、最終的に得られる構造に対するかかる修飾の部位もまた、予め決め得ることが理解されるべきである。換言すれば、構造における各オリゴヌクレオチドの部位が既知であることにより、構造のアドレサビリティが促進される。
【００７３】
一本鎖オリゴヌクレオチド：
本発明の核酸構造は、配列特異的な方式で互いにアニールする複数個の一本鎖オリゴヌクレオチドを使用して設計及び作製される。オリゴヌクレオチドは、その長さ、その配列、及びそのドメイン組成によって特徴付けられ得る。そのドメインの数及び配列が、各オリゴヌクレオチドの結合活性及び部位を左右する。そのドメイン数が、典型的には、構造において各オリゴヌクレオチドが結合するオリゴヌクレオチドの数を左右する。
【００７４】
ある場合には、構造の作製に使用されるオリゴヌクレオチドは、偶数個のドメインを含む。各オリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも２個のドメインを含む。一部の実施形態では、構造の作製に使用されるオリゴヌクレオチドは、２ドメイン及び４ドメインオリゴヌクレオチドであってよい。また、限定なしに２ドメイン及び６ドメインオリゴヌクレオチド、３ドメイン及び６ドメインオリゴヌクレオチド、２ドメイン及び８ドメインオリゴヌクレオチド、４ドメイン及び８ドメインオリゴヌクレオチドなどを含め、他の組み合わせのオリゴヌクレオチドを使用して構造を形成することも可能である。
【００７５】
ドメインは、本明細書で使用されるとき、ヌクレオチド配列（すなわち、配列特異的な方式でその相補体に結合可能ないくつかの隣接ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体）を指す。複数個のオリゴヌクレオチド又は核酸構造におけるドメインは、それらが別のオリゴヌクレオチドのドメインに結合するように設計される。オリゴヌクレオチドの全ドメインの総体としての相補性により、かかるオリゴヌクレオチドの自己組織化による核酸構造の形成が促進される。
【００７６】
ドメイン長さは様々であり得る。同じらせんに寄与する２個の隣接ドメインの合計長さは、典型的にはｈ×ｋである長さを有する（ここで、ｈは、完全ならせんターンを作製するのに必要な単量体単位（例えばヌクレオチドなど）の数を表し、ｋは１以上の任意の整数を表す）。例として、Ｂ型ＤＮＡは、典型的には１らせんターンにつき１０．５ヌクレオチドあり、一方ＲＮＡは、１らせんターンにつき１１ヌクレオチドある。従って、本質的にＢ型ＤＮＡであるドメインは、同じらせんに寄与する２個の隣接ドメインの合計長さを１０．５＊ｋ（四捨五入で整数に丸める）として表すことができる（ここでｋは１以上の整数を表し、＊は乗算記号を示す）。
【００７７】
同じオリゴヌクレオチドの２個の隣接ドメインが同じらせんに寄与する状況では、２個のドメインの長さは相互に関連し得る。２個のかかるドメインの合計長さがｘであるとする（ここでｘは、上記に定義するとおりのｈ＊ｋである）。この場合、一方のドメインがｙの長さを有し、他方のドメインがｘ−ｙの長さを有する（但し、ｙは１以上であるものとする）。例として、一実施形態において、第１及び第２のＤＮＡドメインの各々は、１〜２０ヌクレオチドの長さ範囲であり得る（但し、２個のドメインの合計長さは２１ヌクレオチドであるものとする）。
【００７８】
一部の実施形態では、同じらせんに寄与する２個の隣接ドメインは、約２１±２ヌクレオチド長、又は１０．５ヌクレオチドの任意の整数倍の合計長さを有し得る。従って、単一のドメインは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２ヌクレオチドの長さを有し得る。２個の隣接ドメインは、例えば、１９、２０、２１、２２又は２３ヌクレオチドの全合計長さを有し得る。２ドメインオリゴヌクレオチドは、例えば、２１±２ヌクレオチドの長さを有し得る。４ドメインオリゴヌクレオチドは、例えば、４２±４ヌクレオチドの長さを有し得る。
【００７９】
従って一般に、上記に定義するとおりの全長ｘ＝ｈ＊ｋの同じ二重鎖に関与する２個の連続するドメインは、ｘがｈ＊ｋ±ａであり得る（ここでａ＝０、１、２、．．．、ｙ、ｙ＝（ｈ／２）＊ｋ（四捨五入で整数に丸める））。例えば、一実施形態において、ｈ＝１１（ＲＮＡの場合）、ｋ＝１、及びｙ＝６である。従って、ｘは１１±０、１、２、３、４、５、又は６であり得る。別の例として、ｈ＝１０．５（Ｂ型ＤＮＡの場合）について、ｋ＝２、ｙ＝１０である。従って、ｘは２１±１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０であり得る。
【００８０】
一部の重要な実施形態において、ドメインは１０又は１１ヌクレオチドの長さを有し、２個の隣接ドメインは２１ヌクレオチドの長さを有し、及び４ドメインオリゴヌクレオチドは４２ヌクレオチドの長さを有する。本発明は、２１ヌクレオチドの倍数の長さを有する２個の隣接ドメイン（双方が単一のらせんに寄与する）を有するオリゴヌクレオチドを企図することが理解されるべきである。
【００８１】
１０−１１−１１−１０、１１−１０−１０−１１、１１−１０−１１−１０、及び１０−１１−１０−１１（ここで１番目の数は第１のドメインの長さを表し、２番目の数は第２のドメインの長さを表し、３番目の数は第３のドメインの長さを提供し、及び４番目の数は第４のドメインの長さを表して、４個のドメインは図１のとおりに配置される）などのドメイン長さの組み合わせが、本発明により企図される。
【００８２】
典型的には、所与の合成方法又は得られる構造において、同じドメイン数を有するオリゴヌクレオチドは、また同じ長さを有し得る。例として、一実施形態において、全ての４ドメインオリゴヌクレオチドが同じ長さであり、且つ全ての２ドメインオリゴヌクレオチドが同じ長さであり得る（しかしその長さは、４ドメインオリゴヌクレオチドの長さとは異なり得る）。より具体的には、一部の実施形態は、ある長さ（例えばｎヌクレオチド）の４ドメインオリゴヌクレオチドと、その長さの半分（例えばｎ／２ヌクレオチド）の２ドメインオリゴヌクレオチドとを使用し得る。
【００８３】
４ドメイン「内部」オリゴヌクレオチドは、本発明の構造の単量体単位に相当する。単体の単量体としては、４ドメインオリゴヌクレオチドは十分に定義された構造を有しない。しかしながら、隣接する２ドメイン及び／又は４ドメインオリゴヌクレオチドと相互作用すると、それがタイル様の形に折り畳まれる。これは、定義された構造的に剛性（又は半剛性）の本体といくつかの付着末端とを有する多重鎖構造に単体として折り畳まれる過去のタイル単量体と対照をなす。
【００８４】
本発明は、任意の数の一本鎖オリゴヌクレオチドを含む核酸構造を企図する。例として、核酸構造は、限定なしに、僅か４個の、及び１０００個もの（又はそれを超える数の）オリゴヌクレオチドを含み得る。同様に、核酸構造の作成に用いられる複数個のオリゴヌクレオチドは、僅か４個の異なるタイプのオリゴヌクレオチド（ヌクレオチド配列により定義されるとき）、及び１０００個もの（又はそれを超える数の）異なるオリゴヌクレオチド種（ヌクレオチド配列により定義されるとき）を限定なしに含み得る。従って、実施形態に応じて、核酸構造は、４、５、６、７、８、９、１０、１５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００個、又はそれを超える数のオリゴヌクレオチドを含み得る。同様に、実施形態に応じて、核酸構造の作成に用いられる複数個のオリゴヌクレオチドは、４、５、６、７、８、９、１０、１５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００個、又はそれを超える数の異なるオリゴヌクレオチドを含み得る。
【００８５】
オリゴヌクレオチドは、本発明との関連では、Ｄ型ＤＮＡ及びＬ型ＤＮＡなどのＤＮＡ及びＲＮＡ、並びにそれらの様々な修飾型を含む。修飾には、塩基修飾、糖修飾、及び骨格修飾が含まれる。これらの非限定的な例を以下に提供する。
【００８６】
本発明において用いられ得るＤＮＡ変異体の非限定的な例は、Ｌ−ＤＮＡ（ＤＮＡの骨格鏡像異性体、文献から公知である）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ビスＰＮＡクランプ、疑似相補的ＰＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、又はＤＮＡ−ＬＮＡ共核酸などの上記の共核酸である。本発明の生成物及び方法に用いられるオリゴヌクレオチドは、本質的に同種性であっても又は異種性であってもよいことが理解されるべきである。例として、そうしたオリゴヌクレオチドは、本質的に完全にＤＮＡであってもよく、又はＤＮＡ及び非ＤＮＡ（例えばＬＮＡ）の単量体又は配列から構成されてもよい。従って、核酸エレメントの任意の組み合わせが用いられ得る。オリゴヌクレオチド修飾により、オリゴヌクレオチドは一定の条件下で安定性が高まり、及び／又は分解しにくくなり得る。例えば、ある場合には、オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ耐性を有する。
【００８７】
オリゴヌクレオチドは、同種骨格（例えば、完全にリン酸ジエステル又は完全にホスホロチオエート）を有し得るか、又は異種（又はキメラ）骨格を有し得る。ホスホロチオエート骨格修飾により、オリゴヌクレオチドは（天然のリン酸ジエステル骨格核酸と比較したとき）一定の条件下でヌクレアーゼの影響を受けにくくなり、ひいては安定性が高まる。オリゴヌクレオチドに対してより高い安定性を提供し得る他の結合としては、限定なしに、ホスホロジチオエート結合、メチルホスホネート結合、メチルホスホロチオエート結合、ボラノホスホネート結合、ペプチド結合、アルキル結合、デホスホ型結合などが挙げられる。従って、ある場合には、オリゴヌクレオチドは天然に存在しない骨格を有する。
【００８８】
オリゴヌクレオチドはインビトロで合成されてもよい。核酸の合成方法もまた、自動核酸合成を含め、当該技術分野において公知である。ホスホロチオエート結合を含む骨格などの修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドは、キメラ修飾骨格を含むものを含め、ホスホルアミデート化学又はＨ−ホスホン酸化学のいずれかを利用する自動化された技術を用いて合成されてもよい（F. E. Eckstein, “Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach” IRL Press, Oxford, UK, 1991、及びM. D. Matteucci and M. H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 21, 719 (1980)）。例えば米国特許第４，４６９，８６３号に記載されるとおり、アリール−及びアルキル−ホスホン酸結合が作製されてもよく；及び、例えば米国特許第５，０２３，２４３号及び欧州特許第０９２，５７４号に記載されるとおり、アルキルホスホトリエステル結合（ここでは荷電酸素部分がアルキル化される）が、市販の試薬を使用して自動化された固相合成により調製されてもよい。他のＤＮＡ骨格修飾及び置換の作製方法については記載がある。Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev 90:544；Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1:165；Crooke ST et al. (1996) Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:107-129；及びHunziker J et al. (1995) Mod Synth Methods 7:331-417。
【００８９】
オリゴヌクレオチドは、それに加えて又は代えて、その糖に修飾を含んでもよい。例えば、β−リボース単位又はβ−Ｄ−２’−デオキシリボース単位を修飾糖単位に置換することができ、ここで修飾糖単位は、例えば、β−Ｄ−リボース、α−Ｄ−２’−デオキシリボース、Ｌ−２’−デオキシリボース、２’−Ｆ−２’−デオキシリボース、アラビノース、２’−Ｆ−アラビノース、２’−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルリボースから選択され、好ましくは２’−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルリボースは、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニルリボース、２’−［Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル］−リボース、２’−ＮＨ２−２’−デオキシリボース、β−Ｄ−キシロフラノース、α−アラビノフラノース、２，４−ジデオキシ−β−Ｄ−エリスロヘキソピラノース、及び炭素環状糖類似体（例えば、Froehler J (1992) Am Chem Soc 114:8320に記載される）及び／又は鎖状糖類似体（例えば、Vandendriessche et al. (1993) Tetrahedron 49:7223に記載される）及び／又は二環状糖類似体（例えば、Tarkov M et al. (1993) Hely Chim Acta 76:481に記載される）である。
【００９０】
オリゴヌクレオチドは、その塩基に修飾を含んでもよい。修飾塩基には、修飾シトシン（５−置換シトシンなど（例えば、５−メチルシトシン、５−フルオロシトシン、５−クロロシトシン、５−ブロモシトシン、５−ヨードシトシン、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−ジフルオロメチルシトシン、及び非置換又は置換５−アルキニルシトシン）、６−置換シトシン、Ｎ４−置換シトシン（例えば、Ｎ４−エチルシトシン）、５−アザシトシン、２−メルカプトシトシン、イソシトシン、擬イソシトシン、縮合環系を有するシトシン類似体（例えば、Ｎ，Ｎ’−プロピレンシトシン又はフェノキサジン）、並びにウラシル及びその誘導体（例えば、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ブロモビニルウラシル、４−チオウラシル、５−ヒドロキシウラシル、５−プロピニルウラシル）、修飾グアニン、例えば、７−デアザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン（７−デアザ−７−（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニルグアニンなど）、７−デアザ−８−置換グアニン、ヒポキサンチン、Ｎ２−置換グアニン（例えばＮ２−メチルグアニン）、５−アミノ−３−メチル−３Ｈ，６Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２，７−ジオン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、プリン、インドール、アデニン、置換アデニン（例えばＮ６−メチルアデニン、８−オキソアデニン）、８−置換グアニン（例えば８−ヒドロキシグアニン及び８−ブロモグアニン）、及び６−チオグアニンが含まれる。核酸は、ユニバーサル塩基（例えば、３−ニトロピロール、Ｐ塩基、４−メチルインドール、５−ニトロインドール、及びＫ塩基）及び／又は芳香環系（例えばフルオロベンゼン、ジフルオロベンゼン、ベンズイミダゾール又はジクロロベンズイミダゾール、１−メチル−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−カルボン酸アミド）を含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドに組み込まれ得る特定の塩基対は、Yang et al. NAR, 2006, 34(21):6095-6101により報告されるｄＺ及びｄＰ非標準核酸塩基対である。ピリミジン類似体であるｄＺは、６−アミノ−５−ニトロ−３−（１’−β−Ｄ−２’−デオキシリボフラノシル）−２（１Ｈ）−ピリドンであり、及びプリン類似体であるそのワトソン−クリック相補体ｄＰは、２−アミノ−８−（１’−β−Ｄ−１’−デオキシリボフラノシル）−イミダゾ［１，２−ａ］−１，３，５−トリアジン−４（８Ｈ）−オンである。
【００９１】
合成方法：
本発明は、アニーリングプロセスを介した核酸構造の合成を企図する。一手法では、一本鎖オリゴヌクレオチドを特定して合成（例えば、Bioneerなどの商業的な供給業者を使用して）したところで、それらを、限定はされないが、チューブ、ウェル、バイアルなどの単一のベッセルに組み合わせる。用いられるオリゴヌクレオチドのモル量は、所望の構造における各オリゴヌクレオチドの頻度及び所望の構造の量に依存し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは等モル濃度で存在し得る。一部の実施形態では、各オリゴヌクレオチドは約１００ｎＭの濃度で存在し得る。オリゴヌクレオチドは溶液中に入れる。好ましくは溶液は緩衝されるが、アニーリング反応は緩衝液が存在しなくても起こり得る。溶液は、限定はされないがＭｇ２＋などの二価カチオンをさらに含んでもよい。カチオン又は塩濃度は様々であり得る。例示的濃度は約２５ｍＭである。溶液はまた、オリゴヌクレオチドの分解を防ぐため、ＥＤＴＡ又は他のヌクレアーゼ阻害薬も含み得る。
【００９２】
アニーリング反応は、溶液を加熱して、次にその溶液を徐々に放冷させることにより実施される。反応の温度は、ヘアピン構造などの任意の望ましくない二次構造を融解させて、オリゴヌクレオチド種が他の非相補オリゴヌクレオチドに誤って結合しないことを確実にするのに十分な高さでなければならない。従って温度は、一部の実施形態では初めに約１００℃、約９５℃、約９０℃、約８５℃、８０℃、７５℃、７０℃、６５℃又は６０℃に上昇させる。温度は、ベッセルを湯浴又は加熱ブロック又はＰＣＲ機械などの温度制御が可能な装置に置くことによって上昇させてもよい。ベッセルはその環境に数秒間又は数分間維持され得る。典型的には、約１〜１０分のインキュベーションで十分である。
【００９３】
高温でのインキュベーションの完了後、温度をいくつかの方法で降下させてもよい。温度は、温度を一定量ずつ降下させて当該温度を一定時間維持した後、温度を再び降下させるコンピュータアルゴリズムを用いて、自動化された方式で降下させてもよい。かかる自動化された方法は、段階毎に１度ずつ又は段階毎に数度ずつ温度を降下させることを含み得る。従ってベッセルは、同じ装置で加熱及び冷却され得る。
【００９４】
例示的プロセスを提供する。約９０℃から約２５℃への温度降下をもたらすため、温度を９０℃から６１℃まで、１度ずつ、１度につき１０分の速度で（すなわち、９０℃１０分間、８９℃１０分間等）変化させる。次に温度を６０℃から２５℃まで、１度ずつ、且つ１度につき約２０分の速度で（すなわち、６０℃２０分間、５９℃２０分間等）変化させる。このプロセスの総アニーリング時間は約１７時間である。本発明においては、これらの条件下でオリゴヌクレオチドは自己組織化し、予め決められた所望の形及びサイズの核酸構造となる。
【００９５】
或いは、ベッセルを、例えば室温環境（例えば約２５℃）を含め、異なる環境に置いてもよい。ベッセルをそこに長期間維持することにより、オリゴヌクレオチドを互いに予め決められた方式でアニールさせる。冷却期間は、限定なしに１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０時間又はそれを超える時間を含め、数時間続き得る。ある場合には、冷却期間は２０時間より長く、２５、３０、２５、４０、５０、５５、６０時間、又はそれを超える時間であってもよい。
【００９６】
実施例は、トリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液中１００ｎＭのオリゴヌクレオチドを使用して、その溶液を約９０℃に加熱し、次に溶液を約１７時間かけて約２５℃まで、上記に記載したとおり９０℃〜６１℃の間は１度につき１０分の降下、及び６０℃〜２５℃の間は１度につき１０分の降下で冷却する特別なアニーリングプロセスを記載する。
【００９７】
さらに別の一連の自己アニーリング条件には、ＴＥ／Ｍｇ２＋緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．６、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）及び同一の温度低下プロセスが含まれる。
【００９８】
オリゴヌクレオチドの化学量論は、厳密に調節される必要はない。
【００９９】
アニーリングプロセス後、反応混合物は直接使用してもよく、又は核酸構造産物をさらに単離するためさらに分画されてもよい。例として、反応混合物を２％天然アガロースゲル電気泳動などのゲル電気泳動に供することにより、目的の構造を他の構造又は物質と物理的に分離することができる。典型的には、単一の優勢なバンドが観察される。このバンドをゲルから抽出し、さらに、例えば遠心により精製してもよい。精製産物が、次に再びゲル電気泳動に供されてもよく、再び単一のバンドが予想される。精製産物は、ＡＦＭ又はＴＥＭによってイメージングしてもよい。かかるイメージングにより、精製産物の寸法、任意の修飾（例えば、ストレプトアビジン修飾）の程度及び部位が明らかとなり、収率及び純度の決定に用いることができる。かかる分析により、ほぼ予想される寸法を有する構造の形成が明らかとなっている。
【０１００】
所望の産物の収率はまた、アニーリング後に決定されてもよい。「組織化収率」は、初めに天然ゲル電気泳動により推定されてもよく、ここでは試料がＳＹＢＲセーフ（SYBR safe）で染色される。この収率（「ゲル収率」と称される）は、所望の産物バンドの蛍光強度とレーン全体の蛍光強度（バックグラウンド補正後）との比として計算される。従って、この比が収率の指標となる。測定ゲル収率は６〜４０％の範囲である。本発明によれば、ＳＹＢＲセーフの染色効率には構造及び配列に依存した見かけの変動があるため、かかる比は過大評価となり得ることが分かっている。ある場合には、収率は測定ゲル収率の約６０〜１００％であり得る。
【０１０１】
アニーリングプロセスの効率はまた、「うまく形成されている」構造の割合を、ＡＦＭ視野において同定可能な全ての形に対する百分率として計測することにより決定されてもよい。構造は、それがその予想される外形に直径１５ｎｍより大きい欠陥を有さず、且つその内部に直径１０ｎｍより大きい欠陥を有しない場合に、「うまく形成されている」と見なされる。上記の基準に従い、約２０〜８５％の範囲の「うまく形成されている」の比、すなわち「ＡＦＭ収率」が、一連の構造にわたり観察された。場合によっては、この比は、ある場合に構造の相対的な脆弱性、及び試料の沈殿又はイメージングの間に起こり得る重大な精製後損傷に起因して、精製産物内の「うまく形成されている」構造の実際の比を過小評価しているように思われる。かかる脆弱性は、例えば４−オリゴヌクレオチドＳＳＴの両端のライゲーション又は隣接する４−オリゴヌクレオチドＳＳＴの架橋によって、組織化する構造により多くの共有結合を導入して軽減することができる。
【０１０２】
奥行を有する一部の構造は（例えば、チューブ又はバレル）、うまく形成されている構造の程度を、ＴＥＭイメージングを用いて決定してもよい。このような例では、ＴＥＭ収率は、らせんターンあたり３．５ｎｍの推定に基づき、予想される完全長（例えば、チューブ又はバレル長さ）からの偏差が５ｎｍ以内の同定可能な構造（例えば、チューブ又はバレル）の割合として定義した。
【０１０３】
本発明は、本発明の構造を合成する手動の又は自動的な手段を企図する。自動的手段の例であるコンピュータプログラム（例えば、MATLABプログラム）は、構造を作製し得るカンバスを表示するグラフィカルインタフェースを提供する（例えば、３１０オリゴヌクレオチドプールの場合、矩形カンバスが出発点である）。このカンバスに所望の構造がマッピングされ、当該の構造の合成に必要な画素（又はＳＳＴ）が同定される。このプログラムはまた、液体操作ロボット（Bravo、Agilent）を使用した鎖を選び取り混合するプロセスの自動化にも役立ち得る。従って、エンドユーザーがグラフィカルインタフェースに構造をマッピングし終えると、コンピュータプログラムがロボット液体ハンドラに対し、続くアニーリングに好適な鎖を選び取って混合するように命令を出力する。次にこの鎖混合物が標準的なワンポットアニーリングに使用され、ＡＦＭイメージング用に形が生成される。様々な試験において、各ロボットバッチは約４８時間で４８個の形を生成することが分かっており、１つの形につき数時間の人的労働工数が１時間の機械工数に効果的に削減され、且つ人的ミスの可能性が回避された。かかるロボットシステムを使用して、本明細書に記載される形の４４個が作成された。
【０１０４】
プログラムインタフェースは３つの機能を特徴として備える：（１）形状設計、（２）ピペット配列作成、及び（３）プロトコル出力。このプログラムの使用では、目標の形の設計及びその形用のプレアニーリング鎖混合物の作成に３工程が関わる。第一に、プログラムが２Ｄ格子の概略図を表示し（「分子カンバス」）、それによりユーザーは、一から形を描くか、又は画像をアップロードして、それを目標の形に変えることが可能になる。次に、その形用の構成鎖のリストが作成される。ロボットにより用いられる９６ウェルプレートにおける供給源鎖の配置に基づき、続いてこの鎖リストがピペット配列のリストに変換される。最後に、命令の集合（ランセット（runset））がｘｍｌ形式で作成され、これを直接ロードして、ロボット制御ソフトウェア（VWorks、Agilent）により実行させることができる。
【０１０５】
複合構造：
本発明は、本明細書に記載される核酸構造それ自体を、高次構造又は複合構造を形成するため本質的に単量体又は構成要素として使用し得ることをさらに企図する。本発明の複合構造は、スペーサー−リンカーを使用して互いに連結された核酸構造で構成される。リンカーは、典型的には核酸構造と一体ではないが、好適な官能基を介して構造に結合され得る。２つ以上の核酸構造を共に結合可能であることにより、より大きいサイズ及び複雑さの構造を作製することができる。かかる構造及び配置の例を図９に示す。
【０１０６】
このような複合構造の寸法は、限定なしに５００ｎｍ〜１００ミクロン、又は１〜１０００ミクロンの範囲であってよい。
【０１０７】
適用：
本発明の核酸構造は、１つ又は複数の部分をナノメートル又はミクロンスケールで正確に位置決め可能で、且つ重要なことには配列可能であることにより利益を受け得る適用を含め、様々な適用に用いられ得る。
【０１０８】
例として、この構造は、エレクトロニクス、プラズモニクス、及び量子コンピューティング適用において有用なものなどの無機材料を配列又はパターニングするための鋳型として使用することができる。核酸構造に結合させ得る部分としては、金ナノ粒子などの金属粒子（参考文献５、３５）、量子ドット（参考文献６）、カーボンナノチューブ（参考文献７）などが挙げられる。このように、本発明により提供される核酸構造は、ナノメートルの精度及び制御で他の部分を配列し得る、及び／又は他の構造を合成し得る足場として働く。例えば、カーボンナノチューブは機能分子エレクトロニクスシステムに構造化することができる；金ナノ粒子の可同調性幾何学的配列を使用して、機能分子エレクトロニクス回路及び新規プラズモニクス回路を作製することができる；磁性粒子の構造化された予め決められた配列を使用して、ナノインダクタ又は記憶装置を作製することができる；及び量子ドットの構造化された、且つ予め決められた配列を使用して、新規の量子コンピュータを作製することができる。
【０１０９】
他の態様において、本発明は、本発明の核酸構造を金属化してエレクトロニクス部品を作製し得ることを企図する。ＤＮＡチューブは、ナノワイヤに金属化されている（参考文献４、１５、１９）。本発明の核酸構造の制御された金属化を使用して、とりわけ、制御された直径の、ひいては制御された電子特性のナノワイヤを作製することができる。さらに、本発明により提供されるストラット（strut）ベースの核酸構造の制御された金属化により、新規モレキュラーエレクトロニクス部品及び回路を作製することができる。
【０１１０】
核酸構造はまた、生体分子又は有機分子の鋳型としても使用することができる。かかる鋳型化される分子及びシステムは、例えば診断及び研究適用において有用であり得る。生体分子又は有機分子としては、限定なしに、タンパク質及びペプチド、例えば抗体及び抗体断片、酵素及び酵素ドメイン、受容体及び受容体ドメイン、生体リガンド、例えばホルモン及び他のシグナル伝達部分、多糖類、細胞、細胞凝集体などが挙げられる。ＤＮＡ格子上のタンパク質の鋳型化については、多様な戦略が実証されている（参考文献４、２３、３６）。タンパク質をプログラム可能なナノメートル精度で指定された幾何学的パターンに構造化することを用いて、例えば、生体モータータンパク質の協調挙動を研究することができる（参考文献３７）。特定の核酸構造はまた、細胞又は組織培養にも用いられ得る。これらの実施形態では、例として、構造が成長因子及び細胞外マトリックス成分などの生体部分で機能化されてもよい。このようにして、機能化された構造が培養下で編成され、二次元又は三次元生体内環境を模倣し得る。さらなる例として、任意の特定の生体部分の濃度勾配を呈する高次機能化構造を作製し得ることが企図される。次にこれらのシステムを使用して、どのような細胞型でも細胞の発生、分化及び／又は運動を研究することができる。さらに他の場合には、本発明の高次構造は、インビトロ又はインビボで細胞を成長及び分化させる足場として使用することができる。
【０１１１】
種々のこれらの適用において、本発明は、本発明の構造で構成される核酸足場が、鋳型であることを止めた後、保持されてもよく、又は（例えば消化又は分解により）除去されてもよいことをさらに企図する。例えば、目標が金粒子の予め決められた配列を作り出すことであり、且つかかる粒子が核酸足場とは無関係に互いに所望のとおり接続されている場合、足場を除去し、金ナノ粒子の網状組織のみを残してもよい。
【０１１２】
以下の実施例は説明のために含めるもので、本発明の範囲を限定する意図はない。
【実施例】
【０１１３】
実施例
実施例１．
材料と方法
試料調製。Integrated DNA Technology, Inc.又はBioneer CorporationによりＤＮＡ鎖が合成された。構造を組織化させるため、ＤＮＡ鎖を、構造の大部分について鎖種あたり１００ｎＭの略等モル終濃度となるように、１２．５又は２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を補足した０．５×ＴＥ緩衝液（５ｍＭのトリス、ｐＨ７．９、１ｍＭのＥＤＴＡ）中に混合した（２４Ｈ×２８Ｔ矩形ベースの種々の形は例外、これらは２００ｎＭで調製した）。濃度は製造業者の仕様書に基づき、さらなるインハウスの較正は実施しなかった。従って、鎖の化学量論は、厳密には制御されなかった。次に混合物を、種々の冷却プログラムで、ＰＣＲサーモサイクラーにおいて９０℃から２５℃まで１７〜５８時間にわたり冷却することによりアニールした。次にアニールした試料を、氷水浴中での１．５又は２パーセントアガロースゲル電気泳動にかけた（ゲルは、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を補足した０．５×ＴＢＥ緩衝液中に調製し、ＳＹＢＲセーフで予め染色したもの）。次に、標的ゲルバンドを切り出し、Freeze 'N Squeezeカラム（Bio-Rad Laboratories, Inc.）に入れる。カラム内のマイクロチューブペッスルによりゲル片を細片に砕き、次にカラムを直接４３８ｇで３分間の遠心に供した。カラムを通じて遠心された試料を回収し、２６０ｎｍでの紫外線吸収を計測することにより濃度を推定した。かかる推定は、ＡＦＭ又はＴＥＭイメージングの前に希釈係数を推定するのに有用であり得る。
【０１１４】
ストレプトアビジン標識。２つの異なる手法でストレプトアビジン標識を行った。１）２４Ｈ×２８Ｔ矩形の最上列及び最下列又は内部位置の標識。２４Ｈ×２８Ｔ矩形の最上列及び最下列（又は内部位置）の各タイルを、３’１７ｎｔハンドルを有するように修飾した（スペーサーとしてのＴＴとＧＧＡＡＧＧＧＡＴＧＧＡＧＧＡ、配列番号３６３、配列がＴＣＣＴＣＣＡＴＣＣＣＴＴＣＣ−ビオチン、配列番号３６４である３’ビオチン修飾鎖と相補的でなければならない）。最上列及び最下列（又は内部位置）の特別なタイル、及び矩形格子の残りの構成タイルを、特別なタイルのハンドル配列と相補的な１〜２×濃度の３０個のビオチン修飾鎖（特別な構成タイル及び共通の構成タイルの濃度が１００ｎＭであり、１４個の異なる特別なタイル種があるとき、１×濃度の３’ビオチン修飾鎖は、１００×１４＝１４００ｎＭであった）と、０．５×ＴＥ緩衝液（２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中に混合した。次にこれらを１７時間にわたりアニールし、アガロースゲル電気泳動後に精製した。次に精製した試料をＡＦＭイメージングに供した。イメージングの初回ラウンド後、再びイメージングする前に、ストレプトアビジン（０．５×ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中１０ｍｇ／ｍＬの１μＬ）をイメージング試料（約４０μＬ）に加えて２分間インキュベートした。２）チューブ構造のポリＴ端部の標識。チューブ精製後、３’ビオチン修飾ポリＡ鎖（ポリＴカウンターパートに対して５〜１０×）を室温で一晩、試料と混合した。次に試料をＡＦＭイメージングに供した。イメージングの初回ラウンド後、再びイメージングする前に、ストレプトアビジン（０．５×ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中１０ｍｇ／ｍＬの１μＬ）を雲母上のイメージング試料に加えて２分間インキュベートした。
【０１１５】
試料調製のロボットオートメーション。複雑な形の設計を支援して鎖の混合を液体操作ロボット（Bravo、Agilent）により自動化するため、MATLABプログラムを設計した。各形について、水溶液中１０μＭの各一本鎖タイルのうち５μＬを選び取り、２ｍＬ未満の最終容量となるように混合し（正確な容量は、目標の形を構成する鎖の数により決定した）、次に２００μＬの２５０ｎＭ溶液になるよう真空蒸発した。次にこの混合物に５０μＬの６２．５ｍＭ  Ｍｇ２＋緩衝液を補足して２５０μＬの最終混合物に達することで、アニーリングの準備が整った。このプレアニーリング溶液は、以下の終濃度を有した：ＳＳＴ種あたり２００ｎＭのＤＮＡ鎖及び１２．５ｍＭのＭｇ２＋。各ランが４８個の形を提供し、終了までに約２日を要した。
【０１１６】
ＡＦＭイメージング。Digital Instruments Nanoscope Vコントローラ（Vecco）でＳＰＭマルチモードを使用して、ＡＦＭ像を取得した。切断したばかりの雲母の表面に、精製を伴ったアニール試料の５μＬ液滴（２〜５ｎＭ）を加え、続いて０．５×ＴＥ（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）の４０μＬ液滴を加えて、約２分間放置した。ときどき、試料のさらなる希釈を実施して所望の試料密度を達成した。数度目に、補足の１０ｍＭ  ＮｉＣ１２を加えて、ＤＮＡ−雲母の結合強度を増加させた。液体タッピングモードを使用して試料をイメージングした。使用したＡＦＭ先端は、ＳＮＬ−１０窒化ケイ素カンチレバーチップ（Vecco Probes）の短くて細いカンチレバーであった。
【０１１７】
ＴＥＭイメージング。イメージングのため、３．５μＬの試料（１〜５ｎＭ）をグロー放電炭素被覆ＴＥＭグリッドに４分間吸着させ、次に２５ｍＭ  ＮａＯＨを含有する２％ギ酸ウラニル水溶液を使用して１分間染色した。JEOL JEM-1400を８０ｋＶで動作させて使用して、イメージングを実施した。
【０１１８】
ＳＹＢＲセーフ染色による収率定量化。初めに天然アガロースゲル電気泳動分析によって収率を推定した。標的バンドの蛍光強度とレーン全体の蛍光強度との比をとることにより、構造形成の総収率を求めた。２４Ｈ×２８Ｔ矩形については、独立した代替的な定量手順として、標的バンドの強度を標準試料（１ｋｂラダーミックスの１５００ｂｐ  ＤＮＡ）と比較した。標的バンドの質量値を、標準試料に基づく強度−質量曲線から推定し、それを使用して所望の構造の収率を計算した。
【０１１９】
計測及び統計。Veecoにより提供されるNanoscope Analysis（バージョン１．２０）を使用して、ＡＦＭ計測値を得た。距離計測タスク（種々のサイズの矩形の長さ及び幅）には、断面関数を適用した。計測用に「うまく形成されている」構造を選択した。NIHによるImageJ（バージョン１．４３ｕ）を使用して、チューブのＴＥＭ像を分析した。チューブの幅を計測するため、「直線（Straight Line）」関数を適用した。チューブの輪郭長さの強調表示及び計測には「線分（Segmented Line）」関数を適用した。各距離計測（例えば２４Ｈ×２８Ｔ矩形の幅）につき３０個の標本点を集め、統計（例えば平均値、標準偏差）は、これらの３０個のデータ点に基づいた。
【０１２０】
実施例２．
本明細書に記載される方法を用いて、本発明者らは、複数個の一本鎖オリゴヌクレオチドを使用することにより、先行技術のＤＮＡ折り紙手法により作製されるものと同程度の大きさのＤＮＡ構造を構築した。より具体的には、本発明者らは、３６２個の異なる一本鎖ＤＮＡを自己組織化させることにより、約６０ｎｍ×約１００ｎｍのサイズの矩形格子、及びその派生構造を構築した。
【０１２１】
オリゴヌクレオチドを合成し（例えば、Bioneer）、ＭｇＣｌ２（濃度２５ｍＭ）を含むＴＥ緩衝液中に所望の濃度（例えば１００ｎＭ）で共に混合した。この混合物を、徐冷（例えば、本明細書に記載されるとおり、約９０℃で開始し、１７時間をかけて約２５℃で終了する）を含むアニーリング手順に供した。このアニーリング手順によりオリゴヌクレオチドの自己組織化が可能となり、それにより核酸構造が形成された。
【０１２２】
アニーリングの完了後、構造の精製前及び精製後に反応混合物を分析した。アガロースゲル電気泳動、ＡＦＭ及びＴＥＭを用いて構造を特徴付けた。
【０１２３】
この手法を用いて作製した構造としては、図３Ｂ〜図３Ｆ、図５Ｂ〜図５Ｄ、及び図１０Ａに示すものが挙げられる（以下の表１に関連する図に示すオリゴヌクレオチドを使用）。図４及び図５に示す構造もまた、この手法を用いて作製された。
【０１２４】
実施例３．
次に本発明者らは、各々がチューブ形である２個の核酸構造を接続してより大きい高次構造を形成させることも試みた。
【０１２５】
初めに、本明細書に記載されるとおりオリゴヌクレオチドを混合及びアニールすることにより、チューブ状構造の各々を作製した。オリゴヌクレオチドを組み合わせ、約９０℃から約２５℃への約１７時間をかけた温度遷移を用いてアニールした。次に得られた核酸構造を共に混合して、約４５℃から約２５℃への約７時間をかけた温度遷移を用いてさらにアニールした。このプロセスは、単純に構造を室温で同じ時間維持するのと比較して、収率の向上をもたらした。加えて、初回のアニーリング工程の後に精製したかどうかに関わらず、構造を十分にアニールし得たことが注記された。
【０１２６】
【表１】
2014525921.tif 000003
【０１２７】
【表２】
2014525921.tif 000004
【０１２８】
【表３】
2014525921.tif 000005
【０１２９】
【表４】
2014525921.tif 000006
【０１３０】
【表５】
2014525921.tif 000007
【０１３１】
【表６】
2014525921.tif 000008
【０１３２】
【表７】
2014525921.tif 000009
【０１３３】
【表８】
2014525921.tif 000010
【０１３４】
【表９】
2014525921.tif 000011
【０１３５】
【表１０】
2014525921.tif 000012
【０１３６】
【表１１】
2014525921.tif 000013
【０１３７】
【表１２】
2014525921.tif 000014
【０１３８】
参考文献
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【０１３９】
均等物
本明細書にいくつかの発明の実施形態を記載及び例示したが、当業者は、本明細書に記載される機能を実施し、及び／又は結果及び／又は利点の１つ又は複数を達成するための様々な他の手段及び／又は構造を容易に想定することができ、かかる変形例及び／又は改良例の各々が、本明細書に記載される発明の実施形態の範囲内にあるものと見なされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載される全てのパラメータ、寸法、材料、及び構成が例示を意図したものであり、実際のパラメータ、寸法、材料、及び／又は構成は、本発明の教示が用いられる具体的な１つ又は複数の適用に依存し得ることを容易に理解し得る。当業者は、本明細書に記載される具体的な発明の実施形態に対する多くの均等物を認識することができ、又はルーチン程度に過ぎない実験を用いてそれを確認することが可能である。従って、前述の実施形態は単に例として提供され、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内で、具体的に記載及び特許請求されるのとは別様に発明の実施形態を実施し得ることが理解されるべきである。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載される各々の個別的な特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法に関する。加えて、２つ以上のかかる特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法の任意の組み合わせが、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法が互いに矛盾しない限り、本開示の発明の範囲内に含まれる。
【０１４０】
本明細書で定義及び使用されるとおりの定義は全て、辞書的定義、参照によって援用される文献の定義、及び／又は定義される用語の通常の意味を統一することが理解されなければならない。
【０１４１】
本明細書に開示される全ての参考文献、特許及び特許出願は、ある場合にはその文献全体を包含し得る、各々が引用される主題に関して、参照により援用される。
【０１４２】
不定冠詞「a」及び「an」は、ここで明細書及び特許請求の範囲において使用されるとき、明確に反する旨が示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されなければならない。
【０１４３】
語句「及び／又は」は、ここで明細書及び特許請求の範囲において使用されるとき、そのように等位接続される要素の「いずれか又は両方」、すなわちある場合には連言的に存在し、他の場合には選言的に存在する要素を意味するものと理解されなければならない。「及び／又は」を用いて列挙される複数の要素も、同じように、すなわちそのように等位接続される要素の「１つ又は複数」であるものと解釈されなければならない。「及び／又は」節で具体的に特定される要素以外に、それらの具体的に特定される要素と関係があるか否かに関わらず、他の要素が場合により存在し得る。従って、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」という記述は、「〜を含んでいる（comprising）」などのオープンエンド型の用語と共に用いられるとき、一実施形態では、Ａのみ（場合によりＢ以外の要素を含む）を指し；別の実施形態では、Ｂのみ（場合によりＡ以外の要素を含む）を指し；さらに別の実施形態では、Ａ及びＢの両方（場合により他の要素を含む）を指し得る等となる。
【０１４４】
ここで明細書及び特許請求の範囲において使用されるとき、「又は」は、上記に定義するとおりの「及び／又は」と同じ意味を有するものと理解されなければならない。例えば、リスト中の項目が分けられるとき、「又は」又は「及び／又は」は、包含的である、すなわち要素の数又はリストのうち少なくとも１つを包含するが、その２つ以上も包含し、且つ場合により、列挙されていないさらなる項目も包含すると解釈されるものとする。「〜のうち１つのみ」又は「〜の正確に１つ」、或いは特許請求の範囲で用いられるとき、「〜からなる」など、明確に反する旨が示される用語のみが、要素の数又はリストの正確に１つの要素の包含を指し得る。一般に、用語「又は」は、本明細書で使用されるとき、「いずれか」、「〜の一方」、「〜のうち一方のみ」、又は「〜の正確に一方」などの排他性の用語が後ろに付く場合のみ、排他的な二者択一（すなわち「一方又は他方、但し両方ではない」）を示すと解釈されるものとする。「〜から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用されるとき、特許法の分野で用いられるとおりのその通常の意味を有するものとする。
【０１４５】
ここで明細書及び特許請求の範囲において使用されるとき、１つ又は複数の要素のリストに関連して、語句「少なくとも１つ」は、要素リスト中の要素のうち任意の１つ又は複数から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、必ずしも、要素リスト内に具体的に列挙されるありとあらゆる要素の少なくとも１つを包含し、且つ要素リスト中の要素の任意の組み合わせを除外するものではないことが理解されなければならない。この定義はまた、語句「少なくとも１つ」が参照している要素リスト内に具体的に特定される要素以外の要素が、それらの具体的に特定される要素に関係するか否かに関わらず、場合により存在し得ることを許容する。従って、非限定的な例として、「Ａ及びＢの少なくとも１つ」（又は等価に「Ａ又はＢの少なくとも１つ」、又は等価に「Ａ及び／又はＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、少なくとも１つのＡ（場合により２つ以上のＡを含む）で、Ｂは存在しない（及び場合により、Ｂ以外の要素を包含する）ことを指し；別の実施形態では、少なくとも１つのＢ（場合により２つ以上のＢを含む）で、Ａは存在しない（及び場合により、Ａ以外の要素を包含する）ことを指し；さらに別の実施形態では、少なくとも１つのＡ（場合により２つ以上のＡを含む）、及び少なくとも１つのＢ（場合により２つ以上のＢを含む）（及び場合により他の要素を包含する）を指し得る等となる。
【０１４６】
また、明確に反する旨が示されない限り、２つ以上の工程又は動作を含むここに特許請求される任意の方法において、その方法の工程又は動作の順序は、必ずしもその方法の工程又は動作が記載される順序に限定されないことも理解されなければならない。
【０１４７】
特許請求の範囲において、並びに上記の明細書において、「〜を含む（comprising）」、「〜を包含する（including）」、「〜を保有する（carrying）」、「〜を有する（having）」、「〜を含有する（containing）」、「〜が関わる（involving）」、「〜を保持する（holding）」、「〜で構成される（composed of）」などの移行句は全て、オープンエンド形式である、すなわち、包含するが限定はされないことを意味するものと理解されるべきである。米国特許局審査手続便覧の第２１１１．０３章に記載されるとおり、移行句「〜からなる（consisting of）」及び「〜から本質的になる（consisting essentially of）」のみが、それぞれクローズド又はセミクローズド形式の移行句であるものとする。
【図１】
2014525921.tif 000015
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
2014525921.tif 000025
【図３Ｅ−１】
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【図３Ｅ−２】
2014525921.tif 000027
【図３Ｅ−３】
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【図３Ｅ−４】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｆ−１】
2014525921.tif 000031
【図３Ｆ−２】
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【図３Ｆ−３】
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【図３Ｆ−４】
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【図３Ｇ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｂ−１】
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【図５Ｂ−２】
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【図５Ｂ−３】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｃ−１】
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【図５Ｃ−２】
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【図５Ｃ−３】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｄ−１】
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【図５Ｄ−２】
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【図５Ｄ−３】
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【図５Ｄ−４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ａ−１】
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【図１０Ａ−２】
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【図１０Ａ−３】
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【図１０Ａ−４】
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【図１０Ａ−５】
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【図１０Ａ−６】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2014525921.tif 000069
2014525921.tif 000070