(57)【要約】  ＩＶＤの変性に関連する疾患又は状態を有する患者を処置する方法を提供する。本方法は、ヒト臍帯組織から得られた細胞を投与すること、あるいはこのような細胞を含む医薬組成物又はこのような細胞から調製された医薬組成物とヒドロゲルを投与することを含む。一部の実施形態では、細胞を投与することにより、患者の変性したＩＶＤ組織の修復及び再生が促進される。本発明の方法に使用するための医薬組成物、並びに本方法を実施するためのキットも提供される。
2014516034.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
椎間板変性症に関連する疾患又は状態を処置する方法であって、ヒドロゲルと、ヒト臍帯組織から得られた均質な単離細胞集団とを含む医薬組成物を、前記疾患又は前記状態の処置に有効な量で椎間板に投与することを含み、前記臍帯組織は、血液をほぼ含まず、かつ前記均質な単離細胞集団は、培養時に自己再生能及び増殖能を示し、分化能を有し、かつＣＤ１１７又はテロメラーゼを発現しない、方法。
【請求項２】
前記単離細胞集団が、次の特性、
（ａ）レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３及び／又は顆粒球走化性タンパク質を発現する、
（ｂ）ＣＤ３１、ＣＤ３４及びＨＬＡ−ＤＲを産生しない、
（ｃ）ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞又は腸骨稜骨髄細胞と比較して、酸化型インターロイキン８及びレチクロン１の発現レベルが増加している、
（ｄ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０を発現する、のうちの１つ又は２つ以上を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記医薬組成物が、注入により投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記医薬組成物が、少なくとも１つのその他の細胞型及び／又は少なくとも１つの剤を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの剤が、栄養因子である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記栄養因子が、ＴＧＦ−β、ＧＤＦ−５、ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＴＩＭＰ１からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのその他の細胞型が、少なくとも１つの外来性遺伝子産物を発現するよう遺伝子操作される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記外来性遺伝子産物が、栄養因子である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記医薬組成物が、変性した椎間板に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記医薬組成物が、前記椎間板の髄核又は線維輪に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒト臍帯組織から得られた均質な単離細胞集団を、インビトロで少なくとも部分的に分化するよう誘導することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記均質な単離細胞集団が、線維輪細胞の表現型を提示する細胞へと分化するよう誘導される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記均質な単離細胞集団が、髄核細胞の表現型を提示する細胞へと分化するよう誘導される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
椎間板変性症に関連する疾患又は状態を処置する方法であって、ヒドロゲルと、ヒト臍帯組織から得られた均質な単離細胞集団とを、前記疾患又は前記状態の処置に有効な量で、椎間板に投与することを含み、前記臍帯組織は、血液をほぼ含まず、かつ前記均質な単離細胞集団は培養時に自己再生能及び増殖能を示し、分化能を有し、かつＣＤ１１７又はテロメラーゼを発現しない、方法。
【請求項１５】
前記単離細胞集団が、次の特性、
（ａ）レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３及び顆粒球走化性タンパク質を発現する、
（ｂ）ＣＤ３１、ＣＤ３４及びＨＬＡ−ＤＲを産生しない、
（ｃ）ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞又は腸骨稜骨髄細胞と比較して、インターロイキン８及びレチクロン１の発現レベルが増加している、
（ｄ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０を発現する、のうちの１つ又は２つ以上を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記均質な単離細胞集団及び前記ヒドロゲルが、注入により投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヒドロゲルが、前記ヒト臍帯組織から得られた均質な単離細胞集団と同時に、又はこれより前に、又は後に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記均質な単離細胞集団が、埋め込み型装置内に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つのその他の細胞型を、前記ヒト臍帯組織から得られた均質な単離細胞集団と同時に、又はこれより前に、又は後に投与することを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのその他の細胞型が、少なくとも１つの外来性遺伝子産物を発現するよう遺伝子操作される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記外来性遺伝子産物が、栄養因子である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記外来性遺伝子産物が、１つ又は２つ以上の細胞外マトリックスタンパク質の発現を調節する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１つの剤を投与することを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの剤が、栄養因子である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記栄養因子が、ＴＧＦ−β、ＧＤＦ−５、ＰＤＧＦ−ＢＢ、及びＴＩＭＰ１からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記栄養因子が、前記ヒト臍帯組織から得られた均質な単離細胞集団に対し栄養作用を及ぼす、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記均質な単離細胞集団及び前記ヒドロゲルが、変性した椎間板に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２８】
前記均質な単離細胞集団及び前記ヒドロゲルが、前記椎間板の髄核に投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記均質な単離細胞集団及び前記ヒドロゲルが、前記椎間板の線維輪に投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ヒト臍帯組織から得られた均質な単離細胞集団を、インビトロで少なくとも部分的に分化するよう誘導することを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項３１】
前記均質な単離細胞集団が、線維輪細胞の表現型を提示する細胞へと分化するよう誘導される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記均質な単離細胞集団が、髄核細胞の表現型を提示する細胞へと分化するよう誘導される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
椎間板変性症に関連する疾患又は状態を処置する方法であって、前記疾患又は前記状態の処置に有効な量でヒドロゲルを投与することを含む、方法。
【請求項３４】
前記ヒドロゲルが、フィブリノゲン及びトロンビンを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ヒドロゲルが、フィブリン糊を含む、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体として細胞療法の分野に関する。一部の態様では、本発明は、椎間板変性症に関係する疾病又は状態を処置するための臍帯由来細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書を通して、特許、公開された出願、技術論文及び学術論文などの各種刊行物が引用される。引用されるこれらの各公表文献は、参照によりその全文において、かつあらゆる目的において本明細書に組み込まれる。
【０００３】
腰痛は最も一般的な身体障害のうちの一つであり、罹患している個人に多大な肉体的及び感情的不快感を生じさせる。腰痛の主因の一つには椎間板（ＩＶＤ）構造の変質が挙げられる。ＩＶＤは、より軟らかいゼラチン状髄核を取り囲み、外側に配置される繊維性の線維輪から形成される。線維輪の繊維は、脊髄の椎体終板に結合し、かつ髄核を捕捉し、等圧性の環境を生み出している。軸方向負荷下では、髄核は圧縮され、放射状に広がり線維輪に負荷がかかる。線維輪の層状の性質により、引張り強度が高くなり、また負荷の伝達に応じて線維輪が放射状に広がる。
【０００４】
健康なＩＶＤでは、髄核内の細胞は、体積にして円板組織のほんの約１％程度を形成する。これらの細胞は、プロテオグリカンを高い割合で含有している細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を産生する。プロテオグリカンは水を保持する硫酸基を含有しており、それにより髄核に緩衝材としての性質をもたらす。髄核細胞は、髄核細胞の代謝調節を助ける少量のサイトカイン及びマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を分泌することもできる。
【０００５】
ＩＶＤ疾患の一部の例では、脊椎の他の部位に力学的な不安定さが生じることによりＩＶＤが徐々に変性する。これらの例では、負荷が増大し、かつ髄核に対する圧力が増大することにより、円板内の細胞（又は湿潤しているマクロファージ）が通常よりも多量に上記サイトカインを放出することになる。ＩＶＤ疾患の他の例では、遺伝因子又はアポトーシスにより、円板細胞数の減少及び／又は毒性量のサイトカイン及びＭＭＰの放出が生じる。一部の例では、円板のポンピング作用が機能不全となり（例えば、髄核内プロテオグリカン濃度の低下に起因）、円板への栄養因子の供給、並びに円板からの老廃物の排出が滞る。このような細胞への栄養供給能及び老廃物排出能が低下することで、細胞生存率及び代謝が低下し、ＥＣＭが更に劣化するのに加え、神経刺激及び疼痛を生じさせ得る高濃度の毒素が蓄積されることになる。
【０００６】
ＩＶＤの変性が進行するにつれ、髄核中に存在する毒性濃度のサイトカイン及びＭＭＰがＥＣＭを劣化させるようになる。詳細には、ＭＭＰ（サイトカインにより介在される）が、プロテオグリカンの水を保持している部分を分解し、水分保持能を低下させるようになる。この分解により髄核の可撓性が低下し、円板内の負荷パターンが変化し、ひいては線維輪が層間剥離する。これらの変化により、力学的に不安定になり、細胞は、より多量のサイトカインを放出するようになり、ＭＭＰが発現上昇することになる。このような有害なカスケードが続き、ＩＶＤの変性が進行し、円板が膨隆し（「椎間板ヘルニア」）、更には最終的には破裂することで、髄核が脊髄に接触するようになり、疼痛が生じる。
【０００７】
現在では、ＩＶＤの変性に際し主要な治療法としては、変性した円板を切除するか又は隣り合う円板と融合させるという外科的処置がとられている。外科療法は、疼痛の緩和と、ＩＶＤ変性に関係するその他の症状の緩和を目的とするものであり、変性したＩＶＤを修復したりあるいは回復させるものではない。変性したＩＶＤ細胞及び組織を処置する手法の一つには、生細胞を投与して、疾患組織を修復、置換及び／又は再構築する、細胞療法を用いるものがある。最近のいくつかの研究により、変性したＩＶＤを対象とした細胞療法の使用が研究されている。例えば、米国特許第６，３５２，５５７号（「Ｆｅｒｒｅｅ」）及び同第６，３４０，３６９号（「Ｆｅｒｒｅｅ  ＩＩ」）は、患者からのＩＶＤ生細胞の採取、細胞の培養、及び罹患ＩＶＤへの培養細胞の移植を教示する。同様にして、Ａｌｉｎｉ，Ｅｕｒ．Ｓｐｉｎｅ  Ｊ．，２００２：１１（Ｓｕｐｐ．２）：Ｓ２１５〜２２０は、髄核からの細胞単離及び培養、バイオマトリックスへの培養細胞の包埋、並びに患者への包埋細胞の注入による、罹患ＩＶＤの機能回復を記載している。これらの手法は有望であるものの、変性したＩＶＤの修復という点での有効性には限界があり、更にはドナー細胞とレシピエント細胞との間の免疫不適合により合併症が発症することが示されている。
【０００８】
別の細胞療法としては、分裂能及び患部組織を構成する細胞への分化能を有する幹細胞の使用が挙げられる。標的組織を再構築するための臨床ツールとして幹細胞移植を利用することにより、生理学的及び解剖学的機能を復元させることができる。幹細胞に関係する本出願の技術は広範に及び、組織工学、遺伝子治療送達及び細胞療法を包含し、すなわち、外部から生細胞又は細胞成分を供給することにより、これらの剤を生産又は含有するバイオ治療薬を標的部位に送達するものである（総括についてはＴｒｅｓｃｏ，Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０００；４２：２〜３７を参照されたい）。幹細胞の識別により、再生医療用に特定の細胞型を選択的に生成することを目的とした研究が促進されている。これまで、治療法として可能性のある幹細胞技術を実現するにあたり、十分な数の幹細胞を得るのが困難であることが障害であった。胚組織又は胎生組織は幹細胞資源のうちの一つである。これまでに、ヒトを含む数多くの哺乳類種から胚幹細胞及び前駆細胞が単離されており、そのうちのいくつかの細胞型は自己再生能及び増殖能を示し、数多くの異なる細胞系統へと良好に分化することが示されている。しかしながら、胚及び胎生資源からの幹細胞の誘導は、多くの倫理的及び道徳的課題を提示しており、これにより胚性幹細胞療法の更なる開発が妨げられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、当該技術分野では、胚性幹細胞及び胎生幹細胞に関係する課題を回避する幹細胞療法が必要とされている。臍帯及び胎盤などの分娩後に得られる組織は、多分化能性、すなわち多能性幹細胞の代替源として関心を集めている。これまでに、例えば、胎盤の灌流による幹細胞の回収法あるいは臍帯血又は組織からの回収法が報告されている。これらの手法では、得られる臍帯血の量又は細胞の質が不十分であり、並びにこれらの資源より得られる細胞集団の性質が均一でなく又は性質に欠くため、幹細胞の調達法としては限界がある。
【００１０】
したがって、信頼でき、特徴がはっきりしており、かつ内在性ＩＶＤ細胞と表現形が類似する細胞への分化能を有するほぼ均一な幹細胞集団を豊富に供給することは、ＩＶＤ細胞の修復、再生及び／又は交換、並びにＩＶＤ組織の再構築及び／又は再構成に関係する各種診断及び治療用途において有益である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様では、本明細書では、ＩＶＤの変性（ＩＤＤ）に関連する疾患又は状態の処置法が提供される。本方法は、疾患又は状態の処置に有効な量で臍帯由来細胞を投与することを含む。この細胞が得られる臍帯組織は、好ましくは血液をほぼ含まない。臍帯由来細胞は、好ましくは培養時に自己再生能及び増殖能を有し、かつ例えば、ＩＶＤ細胞の表現型への分化能を有し；生育にはＬ−バリンを必要とし；少なくとも約５％酸素下で生育することができ；ＣＤ１１７又はＨＬＡ−ＤＲ又はテロメラーゼを産生せず；平滑筋αアクチンを発現し；かつインターロイキン８及びレチクロン１を、ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞又は腸骨稜骨髄細胞と比較して高発現する。
【００１２】
他の態様では、ＩＶＤの変性に関連する疾患又は状態の処置用の医薬組成物が提供され、組成物は、製薬上許容可能な単体、並びに疾患又は状態の処置に有効な量で臍帯由来細胞を含み、この細胞が得られた臍帯組織は血液をほぼ含まず、細胞は、培養時に自己再生能及び増殖能を有し、かつ例えば、ＩＶＤ細胞の表現型への分化能を有し；生育にはＬ−バリンを必要とし；少なくとも約５％酸素下で生育することができ；ＣＤ１１７又はＨＬＡ−ＤＲ又はテロメラーゼを産生せず；平滑筋αアクチンを発現し；かつインターロイキン８及びレチクロン１を、ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞又は腸骨稜骨髄細胞と比較して高発現する。
【００１３】
他の態様によると、ＩＶＤの変性に関連する疾患又は状態を有する患者を処置するためのキットが提供され、キットはＩＶＤの変性に関連する疾患又は状態の処置法にキットを使用する際の取扱説明書、製薬上許容可能な担体並びに疾患又は状態の処置に有効な量の臍帯由来細胞を含み、この細胞が得られる臍帯組織は血液をほぼ含まず、細胞は、培養時に自己再生能及び増殖能を有し、かつ例えば、ＩＶＤ細胞の表現型への分化能を有し；生育にはＬ−バリンを必要とし；少なくとも約５％酸素下で生育することができ；ＣＤ１１７又はＨＬＡ−ＤＲ又はテロメラーゼを産生せず；平滑筋αアクチンを発現；かつインターロイキン８及びレチクロン１を、ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞又は腸骨稜骨髄細胞と比較して高発現する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるキットは、細胞培養用の少なくとも１種の試薬及び／又は取扱説明書を更に含む。一部の実施形態では、本明細書で提供されるキットは、インビトロで少なくとも部分的に分化するよう誘導する際、髄核細胞の表現型及び／又は線維輪細胞の表現型を示す細胞へと分化するよう誘導する際の取扱説明書を含む。
【００１４】
各種実施形態では、本明細書に記載の方法、組成物及び／又はキットに使用される臍帯由来細胞は、酸化型低密度リポタンパク質受容体１、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３及び／又は顆粒球走化性タンパク質２を発現する。一部の実施形態では、本明細書に記載の臍帯由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０を発現する。一部の実施形態では、本明細書に記載の臍帯由来細胞は、線維輪及び／又は髄核細胞への分化能を有する。
【００１５】
各種実施形態では、ＩＶＤの変性に関連する疾患又は状態は、加齢、外傷、自己免疫、炎症反応、遺伝子異常、免疫複合体の沈着、及び／又はこれらの組み合わせにより発症するか、又は誘導され得る。処置の対象とされるＩＶＤは、無傷な状態であっても、又は損傷又は変性の任意の段階にあってもよい。例えば、処置の対象とされるＩＶＤは、ヘルニア、断裂、層剥離及び／あるいは損傷若しくは変性であり得る。
【００１６】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、臍部組織由来の未分化の細胞又は細胞誘導体の投与を含む。ヒト臍帯由来細胞は、限定するものではないが、サイトカイン、増殖因子、プロテアーゼインヒビター、内在性ＩＶＤ前駆体すなわち前駆細胞の生存、生育及び分化を促進する細胞外マトリックスタンパク質などの有益な栄養因子を生産することができる。本明細書に記載の栄養因子は、ヒト臍帯由来細胞を宿主環境に移植することにより直接分泌され得る。栄養因子又はその他の細胞誘導体は、生体外でヒト臍帯由来細胞から回収し、続いて患者に導入することができる。
【００１７】
一部の実施形態では、本明細書に記載の臍帯由来細胞は、細胞の投与前に、後に、又は細胞投与と同時に、生体外で、軟骨細胞系の細胞へと、並びに／あるいは線維輪細胞、髄核細胞及び／又はその他のＩＶＤ様細胞の表現形を提示する細胞へと分化するよう誘導させる。したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、臍帯由来細胞を、インビトロで、少なくとも部分的に分化するよう誘導することを更に含む。
【００１８】
一部の実施形態では、臍帯由来細胞は、限定するものではないが、ＩＶＤ組織の修復及び／又は再生を促進する遺伝子産物などの遺伝子産物を発現するよう遺伝子組み換えされてよい。例えば一部の実施形態では、臍帯由来細胞は、栄養因子又はその他の遺伝子産物を発現するよう遺伝子組み換えされる。一部の実施形態では、遺伝子産物は、栄養効果を発揮し、あるいは臍帯由来細胞、臍帯由来細胞と一緒に投与されるその他の細胞型、内在性ＩＶＤ細胞及び／又は他の内在性細胞の調節を行う。一部の実施形態では、遺伝子産物は、細胞外マトリックス成分であり、又は細胞外マトリックスを調節する剤である。一部の実施形態では、遺伝子産物は１つ又は２つ以上の細胞外マトリックスタンパク質の発現を刺激する。
【００１９】
一部の実施形態では、臍帯由来細胞は、限定するものではないが、線維輪細胞、髄核細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、間葉系幹細胞、脂肪組織由来細胞又はその他の多分化性若しくは多能性幹細胞型などの少なくとも１つのその他の細胞型と共に投与される。少なくとも１つのその他の細胞型は、臍帯由来細胞と同時に、その前に又は後に投与してよい。
【００２０】
一部の実施形態では、臍帯由来細胞は、少なくとも１つの剤と共に投与される。例えば一部の実施形態では、臍帯由来細胞は、限定するものではないが、ＴＧＦ−β、ＧＤＦ−５、ＴＩＭＰ−１及びＰＤＧＦ−ＢＢなどの栄養因子と共に投与される。各種実施形態では、少なくとも１つの剤は、栄養効果を発揮し、あるいは臍帯由来細胞、臍帯由来細胞と一緒に投与される１つ又は２つ以上のその他の細胞型、内在性ＩＶＤ細胞及び／又は他の内在性細胞の調節を行う。一部の実施形態では、少なくとも１つの剤は、１つ又は２つ以上の細胞外マトリックスタンパク質の発現を刺激する。その他の剤としては、限定するものではないが、抗炎症剤、細胞生存剤、疼痛緩和剤及び免疫調節剤が挙げられる。剤は、臍帯由来細胞の投与と同時に、その前に又は後に投与してよい。
【００２１】
各種態様で、細胞は、例えば、変性したＩＶＤ髄核及び／又は線維輪を含むＩＶＤに投与することができ、直接投与することができ、又は注入により投与することができる。一部の実施形態では、細胞は、埋め込み型装置内に封入して投与されるよう、又は細胞を含む装置又はマトリックスを移植することにより投与されるよう、投与又は処方することを目的として、投与される。
【００２２】
本発明の別の実施形態は、椎間板変性症に関連する疾患又は状態を処置する方法であり、少なくとも（１）ヒドロゲルと、（２）ヒト臍帯組織から得られた、疾患又は状態の処置に有効な量の均質な単離細胞集団と、を含む医薬組成物を、椎間板に投与することを含み、臍帯組織は血液をほぼ含まず、均質な単離細胞集団は培養時に自己再生能及び増殖能を示し、並びに分化能を有し、かつＣＤ１１７及び／又はテロメラーゼを発現しない。均質な単離細胞集団は、更に次の特性のうちいずれかを有する：（ａ）ケモカイン受容体リガンド３及び顆粒球走化性タンパク質を発現する；（ｂ）ＣＤ３１、ＣＤ３４及びＨＬＡ−ＤＲを産生する；（ｃ）インターロイキン８及びレチクロン１を、ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞又は腸骨稜骨髄細胞と比較して高発現する；並びに（ｄ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０を発現する。本発明の他の実施形態では、均質な単離細胞集団は、酸化型低密度リポタンパク質受容体１、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３、及び／又は顆粒球走化性タンパク質を発現する。組成物は注射により投与されてよい。一実施形態では、組成物は、（ａ）少なくとも１つの外来性遺伝子産物（例えば、栄養因子など）を発現するよう遺伝子操作されてよい少なくとも１つのその他の細胞型、及び／又は（ｂ）例えば、栄養因子（例えば、ＴＧＦ−β、ＧＤＦ−５、ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＴＩＭＰ１）などの少なくとも１つの剤を更に含む。他の実施形態では、組成物は、変性した椎間板の例えば髄核に、又は椎間板の線維輪に投与される。単離細胞集団には、投与前に、インビトロで少なくとも部分的に分化するよう誘導させてもよい。本発明の一実施形態では、均質な単離細胞集団は、線維輪細胞の表現型を提示する細胞又は髄核細胞の表現型を提示する細胞へと分化するよう誘導させる。
【００２３】
本発明の更に別の実施形態は、椎間板変性症に関連する疾患又は状態を処置する方法であり、ヒドロゲルと、ヒト臍帯組織から得られた、疾患又は状態の処置に有効な量で均質な単離細胞集団とを、椎間板に投与することを含み、臍帯組織は血液をほぼ含まず、かつ均質な単離細胞集団は培養時に自己再生能及び増殖能を示し、並びに分化能を有し、かつＣＤ１１７及び／又はテロメラーゼを発現しない。均質な単離細胞集団は、次の特性のうちのいずれかを更に含む：（ａ）ケモカイン受容体リガンド３及び顆粒球走化性タンパク質を発現する；（ｂ）ＣＤ３１、ＣＤ３４及びＨＬＡ−ＤＲを産生しない；（ｃ）インターロイキン８及びレチクロン１を、ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞又は腸骨稜骨髄細胞と比較して高発現する；及び（ｄ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０を発現する。他の実施形態では、均質な単離細胞集団は、酸化型低密度リポタンパク質受容体１、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３及び顆粒球走化性タンパク質を発現する。ヒドロゲル及び均質な単離細胞集団は注射により投与されてよい。ヒドロゲルは、ヒト臍帯組織から得られた均質な単離細胞集団と同時に、又はこれより前に、又は後に投与される。一実施形態では、均質な単離細胞集団は、埋め込み型装置内に投与される。他の実施形態では、本方法は、少なくとも１つのその他の細胞型を、ヒト臍帯組織から得られた均質な単離細胞集団と同時に、又はこれより前に、又は後に投与することを更に含む。少なくとも１つのその他の細胞型は、少なくとも１つの外来性遺伝子産物（１つ又は２つ以上の細胞外マトリックスタンパク質の発現を調節する栄養因子又は外来性遺伝子産物）を発現するよう遺伝子操作されていてよい。
【００２４】
方法は、例えば、ヒト臍帯組織に由来する均質な単離細胞集団に対し栄養効果を発揮し得る、栄養因子（例えば、ＴＧＦ−β、ＧＤＦ−５、ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＴＩＭＰ１）などの少なくとも１つの剤を投与することを更に含む。一部の実施形態では、均質な単離細胞集団とヒドロゲルとが、変性した椎間板、例えば椎間板の髄核又は椎間板の線維輪などに投与される。他の実施形態では、ヒト臍帯組織から得られた均質な単離細胞集団を、インビトロで少なくとも部分的に分化するよう誘導させる。均質な単離細胞集団は、線維輪細胞の表現型を提示する細胞又は髄核細胞の表現型を提示する細胞へと分化するよう誘導させてもよい。
【００２５】
本発明の更に他の実施形態は、椎間板変性症に関連する疾患又は状態を処置する方法であり、疾患又は状態の処置に有効な量でヒドロゲルを投与することを含む。本方法には、当該技術分野において既知の任意のヒドロゲル（本明細書に開示されるものなど）を使用してよい。一実施形態では、ヒドロゲルは、フィブリノゲン及びトロンビンを含む。他の実施形態では、ヒドロゲルは、例えば、ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）フィブリン糊（ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）フィブリンシーラント（Ｈｕｍａｎ），Ｏｍｒｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｌｔｄ．）などのフィブリノゲン糊を含む。
【００２６】
本発明の前述の特徴及び利点、並びに他の特徴及び利点は、以下の付属の図面に示される本発明の好ましい実施態様のより詳細な説明から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
これまでの発明の概要並びに以降の発明の詳細は、添付の図面と併せて読むことでより良好に理解されるであろう。本発明を例示する目的で、図面の本発明の実施形態を示す。しかしながら、本発明は、図示の厳密な構成、実施例及び手段に限定されないことを理解されたい。
【図１】腰椎のＭＲＩを示す図である（実施例１２を参照のこと）。  正中矢状面のＭＲＩのＴ２強調画像により、対照群の健常な円板を示す。破裂群の円板は変性している（黒化し高さが失われている）。処置群の円板では、破裂群の円板と比べ変性のエビデンスが少ない。具体的には、図１及び２は、０時間（線維輪穿刺前）、３週間後（外科的注入前）、６週間後及び１２週間後（屠殺前）のＬ１−２〜Ｌ５−６の脊椎の正中矢状面のＭＲＩのＴ２強調画像のサンプルを示す。穿刺した円板（Ｌ２−３、Ｌ３−４及びＬ４−５）を囲いにより示す（頂部から下部にかけてＬ２−３、Ｌ３−４及びＬ４−５）。未穿刺円板対照（Ｌ１−２及びＬ５−６）は何ら変性のエビデンスを示していない。予期された通り、対照標本の円板は変性していなかった（図１Ａ）。穿刺した円板（図１Ｂ）は、時間の経過と共により小さくなりかつ暗色を示すようになったため、変性していることが示唆された。穿刺し、かつ担体（図１Ｃ）、細胞＋緩衝液（図２Ａ）及び細胞＋担体（図２Ｂ）により処理した円板では、穿刺した円板と比較して、時間の経過と共に、示される変性のエビデンスが減少した（図１Ｂ）。
【図２】腰椎のＭＲＩを示す図である（実施例１２を参照のこと）。  正中矢状面のＭＲＩのＴ２強調画像により、対照群の健常な円板を示す。破裂群の円板は変性している（黒化し高さが失われている）。処置群の円板では、破裂群の円板と比べ変性のエビデンスが少ない。具体的には、図１及び２は、０時間（線維輪穿刺前）、３週間後（外科的注入前）、６週間後及び１２週間後（屠殺前）のＬ１−２〜Ｌ５−６の脊椎の正中矢状面のＭＲＩのＴ２強調画像のサンプルを示す。穿刺した円板（Ｌ２−３、Ｌ３−４及びＬ４−５）を囲いにより示す（頂部から下部にかけてＬ２−３、Ｌ３−４及びＬ４−５）。未穿刺円板対照（Ｌ１−２及びＬ５−６）は何ら変性のエビデンスを示していない。予期された通り、対照標本の円板は変性していなかった（図１Ａ）。穿刺した円板（図１Ｂ）は、時間の経過と共により小さくなりかつ暗色を示すようになったため、変性していることが示唆された。穿刺し、かつ担体（図１Ｃ）、細胞＋緩衝液（図２Ａ）及び細胞＋担体（図２Ｂ）により処理した円板では、穿刺した円板と比較して、時間の経過と共に、示される変性のエビデンスが減少した（図１Ｂ）。
【図３】ＭＲＩのＴ２強調画像を示す図である（椎間板面積及びＭＲＩインデックス）（実施例１２を参照されたい）。  具体的には、各ウサギ群のＬ２−３、Ｌ３−４及びＬ４−５（処置円板）を合わせた平均的なＮＰ  ＭＲＩ面積（図３Ａ）及びＭＲＩインデックス（図３Ｂ）を０時間に対する割合（％）として表した。穿刺群は時間の経過と共に面積及びインデックスに最も大きい減少を示したのに対し、穿刺し、続いて担体、すなわち細胞と緩衝液（Ｂ＋Ｃ）、あるいは担体中の細胞（Ｃ＋Ｃ）により処理した場合には、面積及びインデックスの減少はより少なかった。図３では、‡は、対照と比較して差が有意であったことを示し、かつ＊は、穿刺群と比較して差が有意であったことを示す。同様にして、図３中のＭＲＩインデックスは次のように決定される：  ＭＲＩインデックス＝ＮＰ面積×シグナル強度
【図４】１２週間後にＬ３−４  ＦＳＵについてプロットした平均的な正規化総置換（傾斜相＋クリープ）曲線を示す図である（実施例１２を参照されたい）。  一定荷重下での時間依存的な置換により、外観の異なるクリープ曲線が生成される。緩衝液＋細胞は、より穿刺群と類似した挙動を示し、担体＋細胞群は、より対照群と類似した挙動を示し、担体単独群はこれらの間の挙動を示した。各条件について平均クリープ曲線を作成した。軸試験によると、試験の初期相（０〜２００秒）において外観の異なるクリープ曲線が生成される。破線により、測定値の標準誤差を表す。穿刺群及び緩衝液＋細胞群について作成された曲線の外見は、対照群及び担体＋細胞について作成された曲線と類似している。これらの各群の外見は、担体処理群について作成された曲線と異なっている。
【図５Ａ】１２週目の屠殺後に各処理群の円板Ｌ４−５の矢状面での切片の、Ｈ＆Ｅ染色により得られた、組織学的な画像（倍率２０倍及び１００倍）を示す図である（実施例１２を参照されたい）。対照群の円板Ｌ４−５の矢状面での切片の組織学的な画像を示す図である。
【図５Ｂ】１２週目の屠殺後に各処理群の円板Ｌ４−５の矢状面での切片の、Ｈ＆Ｅ染色により得られた、組織学的な画像（倍率２０倍及び１００倍）を示す図である（実施例１２を参照されたい）。穿刺群の円板Ｌ４−５の矢状面での切片の組織学的な画像を示す図である。
【図６Ａ】１２週目の屠殺後に各処理群の円板Ｌ４−５の矢状面での切片の、Ｈ＆Ｅ染色により得られた、組織学的な画像（倍率２０倍及び１００倍）を示す図である（実施例１２を参照されたい）。担体群の円板Ｌ４−５の矢状面での切片の組織学的な画像を示す図である。
【図６Ｂ】１２週目の屠殺後に各処理群の円板Ｌ４−５の矢状面での切片の、Ｈ＆Ｅ染色により得られた、組織学的な画像（倍率２０倍及び１００倍）を示す図である（実施例１２を参照されたい）。緩衝液及び細胞群の円板Ｌ４−５の矢状面での切片の組織学的な画像を示す図である。
【図７】１２週目の屠殺後に各処理群の円板Ｌ４−５の矢状面での切片の、Ｈ＆Ｅ染色により得られた、組織学的な画像（倍率２０倍及び１００倍）を示す図である（実施例１２を参照されたい）。図７は、担体及び細胞群の円板Ｌ４−５の矢状面での切片の組織学的な画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書及び特許請求の範囲を通し、本発明の方法及び他の態様に関連する各種用語が使用される。このような用語は、別途記載のない限り当該技術分野における通常の意味として与えられる。他の具体的に定義される用語は、本明細書に提供される定義と一致する様式で解釈される。
【００２９】
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という参照には、２つ又はそれ以上の細胞の組み合わせ、及びこれに類するものなどを含む。
【００３０】
本明細書で使用するとき、量、及び持続時間（temporal duration）などの測定可能な値を指す場合、用語「約」は、具体的な値から、±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、更により好ましくは±１％及び更により好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味し、このような変動は、本開示の方法を実施するにあたり適切なものである。
【００３１】
「由来する（Derived）」は、その細胞が生物資源から得られ、かつ生育され、培養時に増殖し、不死化され、あるいはインビトロで操作されていることを意味する際に使用される。
【００３２】
「単離された」は、「人類の手により」天然の状態から変更を受けていることを意味する。分子又は組成物が天然に生じるものである場合、分子又は組成物が元の環境にあったときの状態から変更を受けているか又は回収されている場合に、あるいはその両方である場合に「単離されて」いる。
【００３３】
核酸分子又は遺伝子に関し、用語「発現する」、「発現させた」又は「発現」は、遺伝子産物の生合成、例えば、ポリペプチドの生合成を指す。
【００３４】
「栄養因子」は、細胞の生存、生育、分化、増殖及び／又は成熟を促進する物質であり、すなわち細胞の生物活性を増大させるよう刺激する物質である。細胞誘導体は細胞から得ることのできる任意の材料を指し、細胞馴化培地、細胞可溶化物、細胞外マトリックスタンパク質、栄養因子、細胞画分、細胞膜を包含する。
【００３５】
「変性」は、ＩＶＤに対する何らかの身体的な損壊、傷害、変性又は外傷を指す。
【００３６】
「病態」は、正常状態の細胞、組織、器官又は系から逸脱した何らかの構造的又は機能的兆候を指し、当該技術分野における何らかの好適な手段により評価される。
【００３７】
「疾患」は、健康、状態、あるいは細胞、組織、器官、系又は全体として生物の機能、の面での、何らかの逸脱又は機能障害であり、当該技術分野における何らかの好適な手段により評価される。
【００３８】
「処置する（Treat）」、「処置している（treating）」又は「処置（treatment）」は、疾患、損傷又は状態の減弱又は寛解（amelioration）における、何らかの成功又は成功の兆候を指し、寛解（abatement）、緩解（remission）、症状（symptoms）の減少、疾患、損傷又は状態を患者にとってより許容できるものにすること、変性又は減退速度を遅くさせること、変性による最終的な衰弱を和らげること、あるいは患者の肉体的又は精神的健康を改善すること、などの、何らかの客観的又は主観的パラメータを含む。症状の処置又は寛解（amelioration）は、身体検査、神経学的検査及び／又は精神医学的評価の結果など客観的又は主観的パラメータに基づくものであってよい。
【００３９】
「有効量」又は「治療有効量」は本明細書において互換的に使用され、化合物、材料又は組成物の量が、本明細書に記載される通りに、限定するものではないが、本明細書に開示、記載又は例示される生物学的な結果などの特定の生物学的な結果を得るのに有効な量であることを指す。このような結果としては、限定するものではないが、当該技術分野における何らかの好適な手段により評価される、対象者のＩＶＤ疾患又は損傷の処置が挙げられる。
【００４０】
「製薬上許容可能な」は、薬理学／毒性学の観点から患者に許容可能であり、かつ組成、製剤、安定性、患者許容性（patient acceptance）及び生物学的利用能に関する物理的／科学的観点から、医薬品製造に関わる薬剤師に許容可能であるこれらの特性及び／又は物質を指す。「製薬上許容可能な担体」は、活性成分の生物活性の有効性に干渉せず、かつ投与を受ける宿主に対して毒性でない媒質を指す。
【００４１】
椎間板（ＩＶＤ）の変性に関連する疾患及び状態は、本明細書に記載の通り臍帯由来細胞を投与することにより処置できることが判明している。有利なことに、本明細書で提供される方法、組成物及びキットは、変性したＩＶＤの修復及び再生を促進することにより、ＩＶＤ変性に関連する１つ又は２つ以上の症状を寛解させる。したがって、一態様では、疾患又は状態を処置するのに十分な量で、臍帯由来細胞をＩＶＤに投与することを含む、ＩＶＤの変性に関連する疾患又は状態を処置するための方法が提供される。
【００４２】
各種実施形態では、ＩＶＤの変性に関連する疾患又は状態は、加齢、外傷、自己免疫、炎症反応、遺伝子異常、免疫複合体の沈着（例えば、瘢痕組織の形成）、及び／又はこれらの組み合わせにより発症し又は誘導され得る。処置の際に標的とされるＩＶＤは、未処置のものであっても、又は損傷若しくは変性の任意の段階のものであってもよい。例えば、処置の際に標的とされるＩＶＤには、ヘルニア（例えば、線維輪の一部が膨隆又は突出している）、破裂（例えば、線維輪の少なくとも一部が破裂し、髄核圧及び／又は髄核体積が減少している）、層剥離（例えば、２層以上の線維輪が分離している）及び／又は損傷若しくは変性（例えば、線維輪が裂溝、亀裂、若しくは断裂などを有している及び／又は細胞外マトリックスが劣化しており又は変化している）が生じていてよい。
【００４３】
各種実施形態では、臍帯由来細胞は、変性したＩＶＤに、例えば、注射、移植、埋め込み、注入により、又はマトリックスと細胞の複合体として、あるいは細胞治療の提供に関わる当該技術分野で既知の任意の他の手法により投与される。一部の実施形態では、細胞は、ＩＶＤの線維輪及び／又は髄核に直接投与される。一部の実施形態では、細胞は、ＩＶＤに間接的に投与される。例えば、細胞を水性担体中に存在させ、装置に封入し又はマトリックスに播種し、続いて変性ＩＶＤに又はその付近に埋め込んでもよい。水性担体としては、限定するものではないが、緩衝食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス平衡緩衝塩溶液、トリス緩衝食塩水及びＨｅｐｅｓ緩衝食塩水などの生理学的緩衝溶液が挙げられる。各種実施形態では、装置、マトリックス又は他の細胞貯蔵物を、線維輪の外壁に取り付けて、又は外側に位置させて、但し線維輪の壁には隣接させないよう、又はＩＶＤ周囲の椎体終板には隣接させないよう埋め込むこともできる。
【００４４】
一部の実施形態では、細胞は、マトリックスと細胞の複合体などの装置形態で投与される。装置材料としては、限定するものではないが、コラーゲンなどの生体再吸収性材料、３５／６５ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）／ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ＰＡＮＡＣＲＹＬ（商標）生体吸収性構造体、ＶＩＣＲＹＬ（商標）ポリグラクチン９１０及び自己集合ペプチド、並びにフッ素ポリマー（例えば、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）フッ素ポリマー）、プラスチック及び金属などの非再吸収性材料が挙げられる。マトリックスとしては、生体吸収性又は非生体吸収性、液体、ゲル、又は固体状の、生体適合性のスキャフォールド、格子、及び自己集合構造などが挙げられる。このようなマトリックスは、細胞療法、外科的修復、組織工学及び創傷治癒の分野で既知である。好ましくは、マトリックスは治療用細胞により前処理される。より好ましくは、マトリックスには、マトリックス又はその空間と密接させて細胞を密集させる。細胞はマトリックスに付着させることができ、あるいはマトリックス空間内に取り込ませるか又は含有させることができる。細胞をマトリックスと密接させて生育させた、マトリックスと細胞の複合体であって、治療に使用した場合に、患者自身のＩＶＤ細胞の、生育、修復及び／又は再生が刺激及び支持され、かつ同様に適切な血管新生も刺激又は支持される複合体が最も好ましい。マトリックス−細胞組成物は、限定するものではないが、埋め込み、注入、外科的取り付け、及び他の組織の移植など当該技術分野において既知の任意の手法により患者の体内に導入することができる。一部の実施形態では、マトリックスは生体内で、又は更により好ましくはその場で形成され、例えば本発明に従って、その場で重合させることのできるゲルを使用して形成させることができる。このようなゲルの例は、当該技術分野において既知である。
【００４５】
一実施形態では、臍帯由来細胞は、変性したＩＶＤに、ヒドロゲルを含む組成物の一部として投与される。他の実施形態では、臍帯由来細胞は、変性したＩＶＤに、ヒドロゲルと一緒に投与される。
【００４６】
本明細書に記載の細胞は、スキャフォールドなどの３次元マトリックスに播種すること、及びインビボに埋め込むこともでき、播種された細胞は、骨格上又は骨格中で増殖し、あるいは他の細胞と協調して又は協調せずにインビボで代替組織を構築する助けとなる。３次元骨格上での臍帯由来細胞の生育により、好ましくは、インビボで利用することのできる、例えば、損傷又は疾患組織の修復及び／又は再生に利用することのできる３次元組織又はこれらの基礎が形成される。
【００４７】
例えば、スキャフォールド、フォーム、静電紡糸スキャフォールド、不織スキャフォールド、多孔質若しくは非多孔性微粒子又はヒドロゲルなどの、３次元骨格又はマトリックス上に細胞を播種することができ、したがって、投与することができる。骨格は、実質的に平ら、実質的に円筒形又は管状などの各種形状に構成することができ、あるいは検討される構造の補正に必要とされる又は望まれる通りの完全に自由な形態であってよい。２つ以上の実質的に平らな骨格を他の骨格の上に重ねて、及び必要に応じ互いに固定して、多層からなる骨格を作製することもできる。
【００４８】
このような３次元骨格上に、細胞を、他の細胞型、又は幹細胞などのその他の軟組織型の前駆体と同時投与することができる。３次元系で生育させた場合に、増殖細胞は成熟し、及び適切に分離して、インビボで天然に見られる対応する組織と類似する成熟組織構成体を形成する。
【００４９】
本明細書に記載され及び例示されるマトリックスは、マトリックス構造がその後分解することなく臍帯由来細胞を支持し、播種した時点から移植組織が宿主組織により再構築されるまでの間細胞を支持し、あるいはマトリックスが分解される時点まで、インビトロでそれ自体を支持するのに十分な機械的一体性を有する組織構造に、播種した細胞を付着させ、増殖及び発達させるよう設計することができる。
【００５０】
本明細書に用いるのに企図される、マトリックス、スキャフォールド、例えば、発泡体、不織、静電紡糸構造体、微粒子及び自己集合系などを、任意の１つ又は２つ以上の細胞、成長因子、薬剤又は他の成分（例えば、本発明の細胞に加え、組織の治癒、再生、修復又は内殖を促進する、あるいは血管新生又はこれらの神経支配を刺激する又は増強する、あるいは治療成績又は実施を向上させる生物活性剤）と組み合わせて埋め込むことができる。
【００５１】
一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞は、培養により自由に生育させ、培地から回収し、３次元骨格上に播種することができる。３次元骨格に、高濃度、例えば、約１０６〜５×１０７個／ｍＬの細胞を播種することで、好ましくは、比較的短い期間で３次元の支持が構築される。更に、一部の用途では、所望される結果に応じてより多量又は少量の細胞を使用することが好ましい場合もある。
【００５２】
一部の態様では、インビボで見られる細胞微小環境を、インビボへの移植前に生育させる際又はインビトロで使用する際の培養時に再現するのは有用であり、この環境は変化させることができる。細胞は、埋め込みに望ましい形状、例えば、ひも状、管状、及び繊維などを形成させる前又は後に骨格上に播種することができる。骨格上への細胞の播種後、好ましくは、適切な増殖培地中で骨格をインキュベートする。インキュベーション期間中に、インキュベートさせた細胞を生育させ、骨格を成長させ、並びに例えば、骨格中の任意の隙腔を埋めさせても、又は部分的に埋めさせてもよい。必須ではないが、修復又は再生させる組織のインビボ細胞密度を反映する適切な程度まで細胞を生育させるのが好ましい。他の実施形態では、細胞は、骨格上に少量存在させた場合でさえ、例えば、損傷又は障害を受けた組織に対し、内在性の健常な細胞を内植させ治癒を促進する。
【００５３】
本発明の態様で使用することのできる、例えば、スキャフォールドなどのマトリックス例としては、マット、多孔質又は半多孔性発泡体（semiporous foams）、自己集合ペプチド及び同様物が挙げられる。例えば、不織マットは、天然又は合成ポリマーからなる繊維を使用して作製することができる。好ましい実施形態では、商品名ＶＩＣＲＹＬ（商標）（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ）で市販されているグリコール酸及び乳酸の吸収性コポリマー（ＰＧＡ／ＰＬＡ）を使用してマットを作製する。米国特許第６，３５５，６９９号に議論される通りに冷凍乾燥法すなわち凍結乾燥法などの工程により作製された、例えば、ポリ（ε−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーからなる発泡体も、スキャフォールドとして提供することもできる。
【００５４】
ゲルは、本明細書で使用される適切なマトリックスも形成する。ゲルの例としては、注入用ゲル、その場で重合させることのできるゲル及びヒドロゲルが挙げられ、ゲルは自己集合ペプチドから構成させてもよい。これらの材料は、組織を生育させる際の支持体として頻用される。例えば、注入用ゲルとして使用する場合、ゲルは、水、生理食塩水又は生理緩衝液と、ゲル化剤から構成され得る。ゲル化材料としては、コラーゲン、エラスチン、トロンビン、フィブロネクチン、ゼラチン、フィブリン、トロポエラスチン、ポリペプチド、ラミニン、プロテオグリカン、フィブリン糊、フィブリン塊、多血小板血漿（ＰＲＰ）塊、乏血小板血漿（ＰＰＰ）塊、自己集合ペプチドヒドロゲル及びアテロコラーゲンのようなタンパク質；ペクチン、セルロース、酸化セルロース、キチン、キトサン、アガロース、ヒアルロン酸のような多糖類；リボ核酸、デオキシリボ核酸のようなポリヌクレオチド、並びに、アルギン酸、架橋アルギン酸、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（オキシアルキレン）、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）のコポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリレート、モノステアロイルグリセロールコ−スクシネート／ポリエチレングリコール（ＭＧＳＡ／ＰＥＧ）コポリマーなどの他の材料、並びにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ゲル化剤（すなわち、ヒドロゲル）は、例えば、組み換えフィブリノゲン又は血液から精製されたフィブリノゲンなどのフィブリノゲン（第Ｉ因子）を含む。別の実施形態では、ヒドロゲルは、フィブリノゲン及びトロンビンを含む。更に他の実施形態では、ゲルは、ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）フィブリン糊（ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）フィブリンシーラント（Ｈｕｍａｎ）、Ｏｍｒｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｌｔｄ．）（ＢＡＣ２（フィブリノゲン）及びトロンビン（thrombrin））である。
【００５５】
一般的に、ヒドロゲルは、自重の２０％以上の水を吸収し、かつ明瞭な三次元構造を維持することのできる架橋ポリマー材料である。加えて、ヒドロゲルは酸素、栄養分及びその他の水溶性代謝生成物に関し高透過性を有する。この定義には、水性環境で膨潤する乾燥架橋ポリマー、並びに水で膨潤させた材料を含む。ポリマーが生物由来のものであろうと、半合成的なものであろうと、又は完全に合成させたものであろうと、親水性ポリマーの母体を架橋してヒドロゲルを製造することができる。ヒドロゲルは、合成ポリマー材料から製造してもよい。このような合成ポリマーは、特性及び予想され得るロット間の不均一さを調整することができ、一般的に免疫原性の心配のない、信頼できる材料源になる。本発明の一実施形態では、ヒドロゲルは、米国特許第５，６７０，４８３号及び同第５，９５５，３４３号、米国特許出願公開第２００２／０１６０４７１号、国際出願第０２／０６２９６９号に記載の通りに自己集合性ペプチドから製造される。これらの特許文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５６】
ヒドロゲルを本発明におけるマトリックスとして特に有用なものにする特性としては、平衡膨潤度、吸着動力学、溶質透過性及びこれらのインビボ性能特性が挙げられる。化合物の透過性の一部は、膨潤度すなわち含水量、及び生分解速度による。ゲルの機械的強度は膨潤強度に正比例することから、複合系により機械的強度を増強させるよう、基質にヒドロゲルを取り付け得ることも、本発明に企図される範囲に含まれる良好な例である。別の実施形態では、ヒドロゲルを多孔質基材に浸透させて、ヒドロゲルの有用な送達特性と共に基材の機械強度を得ることもできる。
【００５７】
分解させることのできるネットワークをその場で形成させることも、本発明に使用するのに好適である（例えば、Ａｎｓｅｔｈ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２００２；７８：１９９〜２０９；Ｗａｎｇ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００３；２４：３９６９〜３９８０；米国特許出願公開第２００２／００２２６７６号（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．）を参照されたい）。これらの材料は、注射に好適な流体として配合し、次いで、その場又はインビボで、分解性ヒドロゲルネットワークを形成するように、様々な手段（例えば、温度、ｐＨ、露光の変更）によって導入することができる。
【００５８】
一部の実施形態では、この骨格は、生体吸収性材料、例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬのコポリマー若しくはブレンド、又はヒアルロン酸から作製された、マルチフィラメント糸で構成することができるフェルトである。圧着、切断、カーディング、及びニードリングからなる、標準的なテキスタイル加工技術を使用して、この糸からフェルトを製造する。本発明の細胞はスキャフォールド上に播種することができ、スキャフォールドは複合体構造であってもよい。加えて、３次元骨格は、修復、置換又は増強させるＩＶＤに又はその周辺に特有の構造などの有用な形状に形作ることもできる。
【００５９】
この骨格は、本発明の細胞の接種前に、細胞の付着を増強させる目的で処理することができる。例えば、本発明の細胞の播種前に、ナイロンマトリックスは、０．１モル／Ｌ酢酸により処理し、ポリリシン、ＰＢＳ中でインキュベートすることができ、及び／又はコラーゲンによりコーティングすることができる。ポリスチレンは、硫酸を使用して、同様に処理することができる。
【００６０】
加えて、三次元骨格の外側表面を、骨格の血漿コーティングにより、あるいは１種以上のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸）、細胞マトリックス、並びに／又は限定するものではないが、とりわけ、ゼラチン、アルギン酸塩、寒天、アガロース、及び植物ゴムなどの他の材料の付加により、細胞の付着若しくは生育、及び組織の分化を向上させるように、改変することができる。
【００６１】
スキャフォールドは、スキャフォールドを非血栓形成性にする材料から構成させることができ、あるいはそのような材料により処理することができる。これらの処理及び材料は、内皮成長、遊走及び細胞外マトリックスの堆積を促進し、維持し得る。これらの材料及び処理の例としては、限定するものではないが、基底膜タンパク質（例えば、ラミニン及びＩＶ型コラーゲン）などの天然材料、ｅＰＴＦＥ及び断片化ポリウレタン尿素シリコーン（例えば、ＰＵＲＳＰＡＮ（登録商標）（Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ））などの合成材料が挙げられる。これらの材料を更に処理して、スキャフォールドに非血栓形成性を与えることもできる。このような処理としては、ヘパリンなどの抗血栓剤、及び血漿コーティングなどの材料の表面電荷に変更を加える処理剤が挙げられる。
【００６２】
各種コラーゲンを異なる割合で、例えば、骨格に対し堆積させると、組織特異的、あるいは後に骨格に播種され得る、又はインビボで構造上で生育させることのできる他の細胞の生育に作用が生じ得る。あるいは、骨格には所望される適切な型のコラーゲンを合成する細胞混合物を播種することもできる。培養される組織に応じ、骨格上に播種するのに又は骨格上に播種した細胞により産生させるのに、適切な型のコラーゲンを選択することができる。例えば、初回接種時のコラーゲン産生細胞対エラスチン産生細胞の割合を制御して、骨格中のコラーゲン繊維及び弾性繊維の相対量を調節することができる。
【００６３】
播種又は摂取させた本発明の三次元骨格には、マトリックスから又はインビボで培養したそれ自体のマトリックスから得られた培養細胞のいずれかを移植又は埋め込みすることができる。本発明に従って、既存の組織の置き換え又は増強、新しい組織の導入又は組織の変更、人工器官の改質、あるいは生物学的な組織又は構造体との結合に、３次元スキャフォールドを使用することができる。
【００６４】
一部の実施形態では、細胞は、小口径の針などの針を介してＩＶＤに投与（例えば、注入）することもできる。一部の実施形態では、ＩＶＤを脱出させてしまう可能性を低減させるため、針は約２２ゲージ以下の口径を有するものである。用量を髄核に注入する場合、薬剤送達量は約３ｍＬ未満、好ましくは約１ｍＬ未満、より好ましくは約０．１〜約０．５ｍＬであることが望ましい。これらを少量で注入した場合、髄核に適切な圧力上昇はもたらされないものと考えられる。直接注入する製剤の体積が、髄核に対象とする圧力上昇を生じさせるのに十分高いものである場合、直接注入する前に好ましくは少なくとも一部の髄核を除去する。一部の実施形態では、除去される髄核の体積は、注入する製剤の体積とほぼ同様である。例えば、除去される髄核の体積は、注入する製剤の体積の約８０〜１２０％以内であってよい。一部の実施形態では、臍帯由来細胞は、投与前に濃縮させる。
【００６５】
本明細書で提供される方法、組成物及びキットに有用な細胞は、正期又は早期妊娠の何れかの終了時又は直後に回収された、例えば出産後に娩出された、又は帝王切開後に外科的に除去された哺乳類の臍帯に由来するものであり得る。細胞を単離する前に、例えば何らかの適切な培地又は緩衝液で洗浄することにより、臍帯組織から血液及び壊死組織片を除去する。
【００６６】
細胞は、機械的な力又は酵素消化により臍帯組織から単離することができる。好ましい酵素は、メタロプロテアーゼ、天然のプロテアーゼ及び粘液溶解プロテアーゼである。例えば、コラゲナーゼ、ディスパーゼ及びヒアルロニダーゼを各種組み合わせて使用して、臍帯組織由来の細胞を解離させることができる。様々な組織源から細胞を単離するための、そのような多くの酵素処理が、当該技術分野において既知であることが、当業者には理解されるであろう。例えば、ＬＩＢＥＲＡＳＥ（登録商標）Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ（Ｒｏｃｈｅ）シリーズの酵素の組合せが、本方法での使用に関して好適である。その他の酵素資源が既知であり、当業者はまた、そのような酵素を、それらの天然資源から直接取得することもできる。当業者はまた、本発明の細胞を単離する際の有用性に関して、新たな、又は追加的な酵素若しくは酵素の組合せを評価するための設備も、十分に備えている。好ましい酵素処理は、０．５時間、１時間、１．５時間、又は２時間以上の長さである。
【００６７】
単離細胞を使用して細胞培養を開始することができる。細胞外マトリックス又はリガンド、例えば、ラミニン、コラーゲン（ネイティブ、未変性、アテロ又は架橋）、ゼラチン、フィブロネクチン、及びその他の細胞外マトリックスタンパク質によりコーティングしていない又はコーティングした組織培養用滅菌容器に単離細胞を移す。臍帯由来細胞を、例えば、限定するものではないが、ＤＭＥＭ（高又は低グルコース）、改変ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ  ２０１、イーグル基本培地、ハムＦ１０培地（Ｆ１０）、ハムＦ−１２培地（Ｆ１２）、ヘイフリック培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、間葉系幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ  １６４０及びＣＥＬＬ−ＧＲＯ−ＦＲＥＥなどといった、細胞の生育を維持することのできる任意の培養培地で培養する。培養培地には、例えば、ウシ胎児血清、好ましくは約２〜１５％（ｖ／ｖ）；ウマ血清；ヒト血清；ウシ胎児血清；β−メルカプトエタノール、好ましくは約０．００１％（ｖ／ｖ）；１つ又は２つ以上の増殖因子、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、白血球阻害因子（ＬＩＦ）及びエリスロポエチン；アミノ酸、例えば、Ｌ−バリン；並びに微生物汚染を制御するための１つ又は２つ以上の抗菌剤及び／又は抗真菌剤、例えば、ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン及びナイスタチン、などの１つ又は２つ以上の成分を単独で、又は組み合わせて添加することができる。
【００６８】
細胞は、細胞増殖を可能にする密度で、培養容器中に播種される。一実施形態では、細胞は、ＣＯ２濃度約０〜約５体積％（空気中）下で培養される。一部の実施形態では、細胞は、Ｏ２濃度約２〜約２５％（空気中）で、好ましくは、Ｏ２濃度約５〜約２０％（空気中）で培養される。細胞は、好ましくは、約２５〜約４０℃で培養され、より好ましくは、約３７℃で培養される。培養容器内の培地は、静的状態とすることができ、又は例えば、バイオリアクターを使用して、攪拌することもできる。臍帯由来細胞は、好ましくは、低酸素ストレス下で生育させ（例えば、グルタチオン、ビタミンＣ、カタラーゼ、ビタミンＥ、Ｎ−アセチルシステインを添加して）、すなわち、フリーラジカルによる培養細胞の損傷を完全に又は最小限に抑える。
【００６９】
臍帯由来細胞は、継代することができ、すなわち、最初に使用したものと同じ種類、若しくは異なる種類の新鮮な培地を入れた別の培養容器に回収することができ、細胞集団は、この別の容器中で、有糸分裂により増殖することができる。本発明の細胞は、継代数０から老化までの任意の時点で、及び連続的に使用することができる。この細胞は、好ましくは、約３回〜約２５回継代され、より好ましくは、約４回〜約１２回継代され、好ましくは、１０回又は１１回継代される。クローニング及び／又はサブクローニングを実行することにより、細胞のクローン集団が単離されていることを確認することができる。
【００７０】
本発明の一実施形態では、細胞はマイクロキャリア上で生育（増殖）させることができる。「マイクロキャリア」は、足場依存性の細胞を培養する際に、この細胞を付着及び生育させるのに有用な粒子、ビーズ又はペレットを指す。マイクロキャリアは、固体、多孔質又は多孔質コーティングを有する固形コアであってよい。代表的な好適なマイクロキャリアとしては、限定するものではないが、Ｃｙｔｏｄｅｘ  １（登録商標）、Ｃｙｔｏｄｅｘ  ２（登録商標）、Ｃｙｔｏｄｅｘ  ３（登録商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）又はＨＩＬＬＥＸ（登録商標）（ＳｏｌｏＨｉｌｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）が挙げられる。代表的な好適なマイクロキャリア及びマイクロキャリア成分は、米国特許出願公開第２００８／０１６６３２８号に開示されており、この開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００７１】
臍帯組織に存在する異なる細胞型を下位集団に分画することができる。分画は、細胞分離のための標準的な手法を使用して行うことができ、それらの手法としては、限定するものではないが、酵素処理、特定の細胞型のクローニング及び選択、例えば、限定するものではないが、形態学的マーカー及び／又は生化学的マーカーに基づく選択；所望される細胞の選択的増殖（正の選択）、不必要な細胞の選択的破壊（負の選択）；例えば大豆凝集素を使用するなど、混合集団中での異なる細胞凝集能に基づく分離；凍結−解凍手順；混合集団中での異なる細胞接着特性；濾過；従来の遠心分離法及びゾーン遠心分離法；遠心溶出法（対向流遠心分離法）；単位重力分離法；向流分布法；電気泳動；及び蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）などが挙げられる。
【００７２】
臍帯組織由来の細胞の例としては、２００４年６月１０日に、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に寄託されており、以下のＡＴＣＣ受入番号が割り当てられているものが挙げられる：（１）菌株表示ＵＭＢ  ０２２８０３（Ｐ７）は、受入番号ＰＴＡ−６０６７が割り当てられ；（２）菌株表示ＵＭＢ  ０２２８０３（Ｐ１７）は、受入番号ＰＴＡ−６０６８が割り当てられている。
【００７３】
臍帯由来細胞は、例えば、生育特性（例えば、集団倍加能力、倍加時間、老化までの継代数）、核型分析（例えば、正常核型；母体系統又は新生児系統）、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ分析）、免疫組織化学及び／又は免疫細胞化学（例えば、エピトープの検出に関する）、遺伝子発現プロファイリング（例えば、遺伝子チップアレイ；ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、逆転写ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、及び従来のＰＣＲ））、タンパク質アレイ、タンパク質分泌（例えば、血漿凝固アッセイ又はＰＤＣ−馴化培地の分析によるもの、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるもの）、混合リンパ球反応（例えば、ＰＢＭＣの刺激の尺度として）、並びに／あるいは当技術分野において既知の他の方法によって、特徴付けることができる。
【００７４】
様々な態様で、臍帯由来細胞は、以下の増殖の特徴のうちの１つ又は２つ以上を保有する：培養下での増殖のためにＬ−バリンを必要とする；約５％〜少なくとも約２０％の酸素を含有する大気；中での増殖が可能である；老化に到達する前に、培養下で少なくとも約４０回倍加する潜在能力を有する；並びに／あるいはコーティングされた、若しくはコーティングされていない組織培養容器上に付着して増殖し、このコーティングされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、又はフィブロネクチンのコーティングを含む。
【００７５】
一部の実施形態では、それらの細胞は、その細胞が継代される際に維持される、正常核型を有する。核型分析は、胎盤由来の母体細胞から、新生児細胞を同定して識別するために、特に有用である。核型分析に関する方法は、当業者に利用可能であり、既知である。
【００７６】
一部の実施形態では、それらの細胞は、組織因子、ビメンチン、及びα−平滑筋アクチンのうちの少なくとも１つの産生；例えば、フローサイトメトリーによって検出されるような、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ細胞表面マーカーのうちの少なくとも１つの産生を含めた、特定のタンパク質の産生によって特徴付けることができる。他の実施形態では、細胞は、フローサイトメトリーなどの任意の好適な手法により検出したときに少なくとも１つのＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ及びＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、並びに／又はＨＬＡ−ＤＱ細胞表面マーカーの産生が欠損していることにより特徴付けられる。一部の実施形態では、組織因子、ビメンチン、及びα−平滑筋アクチンのうちの少なくとも２つを産生する細胞が、好ましい。一部の実施形態では、タンパク質組織因子、ビメンチン、及びα−平滑筋アクチンの３つ全てを産生するような細胞が好ましい。
【００７７】
一部の実施形態では、細胞は、線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞などのヒト細胞と比べて、インターロイキン８；レチクロン１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ増殖刺激活性、α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；腫瘍壊死因子、α誘導タンパク質３のうちの、少なくとも１つをコードする遺伝子の発現を増大させる。
【００７８】
更に他の実施形態では、細胞は、ヒト細胞の線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜の骨髄細胞と比べて、ｓｈｏｒｔ  ｓｔａｔｕｒｅホメオボックス２；熱ショック２７ｋＤａタンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（ストロマ細胞由来因子１）；エラスチン（大動脈弁上狭窄症、ウィリアムズ−ビューレン症候群）；ホモサピエンスｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２由来）；間葉ホメオボックス２（増殖停止特異的ホメオボックス）；ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ１（ドロソフィラ）；クリスタリン、αＢ；形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ関連アクチベータ２；ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質；ニューラリン１の類似体；テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）；ｓｒｃ相同性３（ＳＨ３）及びシステインリッチドメイン；コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ；ｒｕｎｔ関連転写因子３；インターロイキン１１受容体α；プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー；ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ７（ドロソフィラ）；仮定的遺伝子ＢＣ００８９６７；コラーゲン、ＶＩＩＩ型、α１；テネイシンＣ（ヘキサブラキオン）；ｉｒｏｑｕｏｉｓホメオボックスタンパク質５；へファエスチン；インテグリンβ８；シナプス小胞糖タンパク質２；神経芽腫、腫瘍形成抑制１；インスリン様増殖因子結合タンパク質２、３６ｋＤａ；ホモサピエンスｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２２８０  ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４；サイトカイン受容体様因子１；カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、サブファミリーＮ、メンバー４；インテグリン、β７；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；ｓｉｎｅ  ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ２（ドロソフィラ）；ＫＩＡＡ１０３４タンパク質；小胞関連膜タンパク質５（ミオブレビン）；ＥＧＦ含有フィビュリン様細胞外マトリックスタンパク質１；初期増殖応答タンパク質３；ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓホメオボックス５；仮定的タンパク質ＦＬＪ２０３７３；アルド−ケト還元酵素ファミリー１、メンバーＣ３（３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ＩＩ型）；バイグリカン；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；フィブロネクチン１；プロエンケファリン；インテグリン、β様１（ＥＧＦ様リピートドメインを有する）；ホモサピエンスｍＲＮＡの完全長インサートのｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９６８４２２；ＥｐｈＡ３；ＫＩＡＡ０３６７タンパク質；ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）；仮定的タンパク質ＦＬＪ１４０５４；ホモサピエンスｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）のうちの、少なくとも１つをコードする遺伝子発現が減少している。
【００７９】
一部の実施形態では、細胞は、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ｂ、ＲＡＮＴＥＳ及びＴＩＭＰ１のうちの少なくとも１つの分泌によって特徴づけることができる。一部の実施形態では、細胞は、ＥＬＩＳＡにより検出されるような、ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１ａ及びＶＥＧＦのうちの少なくとも１つの分泌の欠損によって特徴づけることができる。
【００８０】
一部の好ましい実施形態では、それらの細胞は、上記の増殖特性、タンパク質／表面マーカーの産生特性、遺伝子発現特性、又は物質分泌特性のうちの２つ以上を含む。一部の実施形態では、３、４又は５つ以上の特性を含む細胞が好ましい。一部の実施形態では、６、７又は８つ以上の特性を含む細胞が好ましい。一部の実施形態では、上記特性をすべて含む細胞が好ましい。他の実施形態では、臍由来細胞は、米国特許第７，５１０，８７３号及び同第７，５２４，４８９号に開示されるいずれかの特性を有する。これらの特許文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８１】
本発明の各種態様で使用するにあたって好ましい細胞は、特に、上述の特性を有する細胞であり、より具体的には、正常核型を有し、継代で正常核型を維持し、更には、マーカーＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれを発現し、掲載されたマーカーに対応する免疫学的に検出可能なタンパク質を産生する細胞である。前述のものに加えて、フローサイトメトリーなどの当該技術分野で好適な任意の手法により検出したときにマーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１又はＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれかに相当するタンパク質を産生しない細胞も好ましい。ＣＤ１１７又はＨＬＡ−ＤＲ又はテロメラーゼを発現していない細胞は非常に好ましい。
【００８２】
一部の好ましい態様では、方法は、ヒト臍帯組織から得られた又は単離された細胞を、変性したＩＶＤに投与することを含み、細胞は、培養時に自己再生能及び増殖能を有し、生育にはＬ−バリンを必要とし、少なくとも約５％酸素下で生育することができ、ＣＤ１１７又はＨＬＡ−ＤＲ又はテロメラーゼを産生せず、平滑筋αアクチンを発現し、かつインターロイキン８及びレチクロン１を、ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞又は腸骨稜骨髄細胞と比較して高発現する。ヒト臍帯組織から単離した細胞は、投与前に培養により増殖させてもよい。一部の実施形態では、ヒト臍帯組織から得られた細胞は、例えば、限定するものではないが、線維輪細胞の表現型又は髄核細胞の表現型などの、ＩＶＤの表現型をもつ細胞へと分化する可能性がある。臍帯由来細胞は、患者のＩＶＤに組み込むことができ、あるいは、天然に存在するＩＶＤ幹細胞の生育を支持することができ、又は分化させるための刺激を提供することができる。投与された細胞の生存は、その細胞使用法の成功又は結果の決定要因ではなく、投与された場所で、ＩＶＤの変性に関連する疾患若しくは状態及び／又は全般的な患者の健康が改善される。一部の実施形態では、患者において、細胞を、好ましくは少なくとも部分的に一体化させ、増殖させ又は生存させる。一部の実施形態では、細胞は、患者において一体化されず又は増殖しないものの、患者は、治療により、例えば、細胞が、ＩＶＤに存在する及び／又は周辺組織に存在する幹細胞又は前駆細胞などの他の細胞の生育を支持する能力により、組織の生育又は血管新生により、並びに／あるいは有益な細胞因子、ケモカイン及びサイトカインなどが存在することにより、効果を体験する。一部の態様では、患者は細胞による治療により利益を得るものの、細胞は患者において長期間生存しない。例えば一部の実施形態では、細胞数、生存率又は生化学活性は徐々に低下する。一部の実施形態では、このような低下は、活性期間、例えば、生育、分裂又は生化学的活性期間前に生じ得る。一部の実施形態では、老化した細胞、生育不能な細胞又は更には死細胞が、有効な治療効果を有し得る。
【００８３】
各種表現型に向かう系列に従い分化し得るある種の株は、不安定であり、したがって自発的に分化する場合がある。したがって、一部の実施形態では、自発的には分化を行わない細胞が好ましい。例えば、何らかの好ましい細胞を増殖培地で生育させた場合に、細胞表面上に産生される細胞マーカーはほぼ安定しており、かつ例えば、核酸又はポリペプチドアレイを利用する遺伝子発現プロファイリングにより測定される各種遺伝子の発現パターンはほぼ安定である。このような細胞は、例えば、複数回の集団倍加を経る継代時に、それらの表面マーカー特性を、実質的に一定なまま保持する。
【００８４】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、臍帯由来細胞を、ＩＶＤ細胞経路に沿ってＩＶＤの表現型をもつ細胞、又は前駆細胞又は前述のより未分化な細胞ヘと分化するよう誘導させる。臍帯由来細胞は、患者のＩＶＤに組み込むことができ、あるいは、天然に存在するＩＶＤ幹細胞の生育を支持することができ、又は分化させるための刺激を提供することができる。投与された細胞の生存は、その細胞使用法の成功又は結果の決定要因ではなく、その場所で、ＩＶＤの変性に関連する疾患若しくは状態及び／又は患者の全般的な健康が改善される。一部の実施形態では、患者において、細胞を、好ましくは少なくとも部分的に一体化させ、増殖させ又は生存させる。一部の実施形態では、細胞は、患者において一体化されず又は増殖しないものの、患者は、治療により、例えば細胞が、ＩＶＤに存在する及び／又は周辺組織に存在する幹細胞又は前駆細胞などの他の細胞の生育を支持する能力により、組織の生育又は血管新生により、並びに／あるいは有益な細胞因子、ケモカイン及びサイトカインなどが存在することにより、効果を体験する。一部の態様では、患者は細胞による治療により利益を得るものの、細胞は患者において長期間生存しない。例えば一部の実施形態では、細胞数、生存率又は生化学的活性は徐々に低下する。一部の実施形態では、このような低下は、活性期間、例えば、生育、分裂又は生化学的活性期間前に生じ得る。一部の実施形態では、老化した細胞、生育不能な細胞又は更には死細胞が、有効な治療効果を有し得る。
【００８５】
一部の態様では、本発明の方法には、更に、ＩＶＤ構造及び／又は機能における改善、並びに／あるいは全般的な健康における改善について患者を評価する工程を更に含ませることができる。このような評価は、本明細書に記載されかつ例示されるものなどの、当該技術分野で好適な任意の手段に従って行うことができる。
【００８６】
一部の実施形態では、臍帯由来細胞は、限定するものではないが、他の多分化能性若しくは多能性細胞、又は軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨系統の細胞若しくは骨髄細胞などの、１つ又は２つ以上のその他の細胞型と組み合わせて投与される。種々の型の細胞を、投与の直前若しくは少し前に臍帯由来細胞と混合することができ、又はそれらの細胞と共に、投与前の一定期間にわたって、共培養することもできる。一部の実施形態では、臍帯由来細胞の細胞集団は、臍帯由来細胞と共に投与された１つ又は２つ以上のその他の細胞型の生存、増殖、生育、維持、成熟、分化、及び／又は活性増大を支持し、並びに／あるいは逆もまた同様である。
【００８７】
一部の実施形態では、臍帯由来細胞は、投与されたその他の細胞型に対し栄養面での支持を提供し、並びに／あるいは逆もまた同様である。一部の実施形態では、臍帯由来細胞及び共培養される細胞は接触することが望ましい。この様な接触は、例えば、培養培地中、又は好適な培養基質上に、不均質な細胞集団として、それらの細胞を播種することによって行うことができる。あるいは、臍帯由来細胞は、まずコンフルエンス状態まで生育させた後、共培養される細胞の基質として使用することもできる。他の実施形態では、共培養される細胞は、馴化培地、細胞外マトリックス、及び／又は臍帯由来細胞の細胞可溶化物と接触させて培養してもよい。
【００８８】
各種実施形態では、臍帯由来細胞は、例えば、増殖、分化、及び／又はその他の細胞活性を調節する剤などの、生物学的に活性な剤と組み合わせて投与することができる。剤は、臍帯由来細胞の前に、後に、又は同時に投与することができる。具体的な剤は、患者の処置を目的として、医療専門家によって慎重に選択されたものであってよく、かつ具体的な必要性すなわち患者の状態に従って変化し得る。限定するものではないが、細胞の投与を容易にする、ＩＶＤの修復及び／又は再生を向上する、患者の全般的な健康を改善する、疼痛を減少させる、並びに移植細胞の拒絶を減少又は予防させるなどの、各種目的について選択された剤を使用することができる。
【００８９】
臍帯由来細胞と共に投与され得る剤の例としては、限定するものではないが、ビタミン類及びその他の栄養補給剤；抗血栓剤；抗アポトーシス剤；抗炎症剤；免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、ラパマイシン）；抗酸化物質；ホルモン類；糖タンパク質；フィブロネクチン；ペプチド及びタンパク質；糖質（単糖類及び／又は複合糖類）；プロテオグリカン；オリゴヌクレオチド（センス及び／又はアンチセンスＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；分化誘導因子；抗体（例えば、病原体、腫瘍、剤又はホルモンに対する抗体）；並びに遺伝子治療薬が挙げられる。一部の実施形態では、剤は、ＩＶＤの変性に関連する疾患又は状態の１つ又は２つ以上の症状を緩和する、鎮痛剤、抗炎症剤、麻酔薬、筋弛緩剤、又はこれらの組み合わせなどの薬物である。
【００９０】
一部の実施形態では、追加の剤は、臍帯由来細胞に対し、臍帯由来細胞と共に投与されたその他の細胞に対し、内在性ＩＶＤ細胞に対し（例えば、線維輪細胞、髄核細胞）、及び／又はその他の内在性細胞に対し（例えば、結合組織前駆細胞）、栄養作用を及ぼす栄養因子又はその他の剤である。一部の実施形態では、栄養因子は、臍帯由来細胞により分泌されたものであり、この場合、栄養因子は、臍帯由来細胞製剤又は別の供給源から誘導され得る。このような因子又は剤の例としては、限定するものではないが、酸性及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−２）及びＦＧＦ−４など、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバー；ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＰＤＧＦ−ＡＡなどの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）ファミリーのメンバー；ＥＧＦｓ、ＩＧＦ−Ｉ及び−ＩＩなどのインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）ファミリーのメンバー；ＴＧＦ−β１、２及び３（ＭＰ−５２など）、オステオイド誘導因子（ＯＩＦ）、アンジオゲニン、エンドセリン、肝細胞増殖因子及びケラチノサイト増殖因子などのＴＧＦ−βスーパーファミリー；ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−２、ＯＰ−１、ＢＭＰ−２Ａ、ＢＭＰ−２Ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７及びＢＭＰ−１４など骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリーのメンバー；ＨＢＧＦ−１及びＨＢＧＦ−２；増殖分化因子（ＧＤＦ）；ｉｎｄｉａｎ、ｓｏｎｉｃ及びｄｅｓｅｒｔ  ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質ファミリーのｈｅｄｇｅｈｏｇメンバー；ＡＤＭＰ−１；ＧＤＦ−５；ＴＩＭＰ−１、並びにＣＳＦ−１、Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）ファミリーのメンバー；並びに類似体及びイソ型が挙げられる。
【００９１】
一部の実施形態では、増殖因子は、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β１、ＦＧＦ、ｂＦＧＦ及びＩＧＦ−１からなる群から選択される。これらの増殖因子は、髄核の再生を促進し、軟骨細胞の増殖及び／又は分化を刺激し、かつ細胞外マトリックスの分泌を促進するものと考えられている。一部の実施形態では、増殖因子はＴＧＦ−βである。より好ましくは、ＴＧＦ−βは、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約５０００ｎｇ／ｍＬであり、例えば、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約５００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１００ｎｇ／ｍＬ〜約３００ｎｇ／ｍＬである。
【００９２】
一部の実施形態では、更なる治療薬として血小板濃縮液が提供される。一部の実施形態では、血小板濃縮液は、自己由来である。一部の実施形態では、血小板濃縮液は、多血小板血漿（ＰＲＰ）である。ＰＲＰは、ＥＣＭの成長を再刺激し得る増殖因子を含有し、また、そのフィブリンマトリックスが新組織の生育に適した骨格を提供することから有利なものである。一部の実施形態では、追加の剤は、細胞可溶化物、細胞の可溶性画分、細胞の膜画分、細胞培養培地（例えば、馴化培地）、又は臍帯由来細胞若しくはその他の細胞由来の細胞外マトリックスである。
【００９３】
一部の実施形態では、臍帯由来細胞は、限定するものではないが、シムバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチン、フルバスタチン、セリバスタチン及びアトルバスタチンなどのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤と組み合わせて投与される。
【００９４】
一部の実施形態では、臍帯由来細胞は、限定するものではないが、本明細書に記載の１つ又は２つ以上の追加の治療薬などの、１つ又は２つ以上の剤を発現するよう遺伝子組み換えされている。本発明の細胞は、限定するものではないが、組み込みウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター若しくはアデノ随伴ウイルスベクター；非組み込み複製ベクター、例えば、パピローマウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、アデノウイルスベクター；又は複製欠陥ウイルスベクターなどの、様々なベクターの任意の各種ベクターを使用して遺伝子操作することができる。細胞内にＤＮＡを導入する他の方法としては、リポソーム、電気穿孔法、粒子ガンの使用、又は直接的ＤＮＡ注入によるものが挙げられる。
【００９５】
宿主細胞は、好ましくは、とりわけ、プロモーター配列若しくはエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位などの、１つ又は２つ以上の適切な発現制御配列、及び選択マーカーによって制御されるか、あるいは有効に関連するＤＮＡで、形質転換又は形質移入される。
【００９６】
外来ＤＮＡの導入後に、操作された細胞を、富栄養培地中で増殖させ、次いで、選択培地に切り替えることができる。外来ＤＮＡ中の選択マーカーは、選択耐性を付与し、細胞が、例えば、プラスミド上に、その染色体中に外来ＤＮＡを安定に組み込み、増殖して増殖巣を形成することを可能にし、次にこの増殖巣は、クローン化して細胞株へと増殖することができる。この方法は、有利には、遺伝子産物を発現する細胞株を操作するために、使用することができる。
【００９７】
任意のプロモーターを使用して、挿入遺伝子の発現を駆動することができる。例えば、ウイルスプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０、パピローマウイルス、エプスタイン−バールウイルス、又はエラスチン遺伝子プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、目的の遺伝子の発現を制御するためにこれらの制御配列を使用し、遺伝子の調節発現を可能とすることにより、インビボで必要とされる場合にのみ、その産物が合成される。一過性発現が所望される場合には、構成的プロモーターが、好ましくは、非組み込みベクター及び／又は複製欠陥ベクター内で使用される。あるいは、誘導性プロモーターを使用して、必要とされる際に、挿入遺伝子の発現を駆動することも可能である。誘導性プロモーターとしては、メタロチオネイン及び熱ショックタンパク質に関連するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
本発明の細胞は、植え込み部位での炎症若しくは拒絶反応を促進する因子の発現を、「ノックアウト」又は「ノックダウン」するように、遺伝子組み換えすることができる。標的遺伝子の発現レベル又は標的遺伝子産物の活性レベルの低減のための、負変調技術について以下で説明する。「負変調」とは、本明細書で使用するとき、調節処理の非存在下での標的遺伝子産物のレベル及び／又は活性に対する、標的遺伝子産物のレベル及び／又は活性の低減を指す。遺伝子の発現は、例えば、相同組み換え技術を使用して遺伝子を完全に不活性化させる（一般的には「ノックアウト」と呼ばれる）ことによる発現の阻害などの、数多くの技術を使用して、低減若しくはノックアウトすることができる。通常、タンパク質の重要領域をコードするエクソン（すなわち、その領域に対して５’側のエクソン）が、陽性選択マーカー、例えばｎｅｏによって干渉され、標的遺伝子からの正常なｍＲＮＡの産生が妨げられて、その遺伝子の不活性化がもたらされる。遺伝子はまた、遺伝子の一部に欠失を作り出すことによって、又は遺伝子全体を欠失させることによって、不活性化させることもできる。標的遺伝子と相同であり、ゲノム中では遠く離れている２つの領域を有するコンストラクトを使用することにより、２つの領域間に介在する配列を欠失させることができる（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９１；８８：３０８４〜３０８７）。
【００９９】
本発明に従って、標的遺伝子の発現を阻害するアンチセンス、低分子干渉ＲＮＡ、ＤＮＡザイム及びリボザイム分子を使用して、標的遺伝子の活性レベルを低下させることもできる。例えば、主要組織適合遺伝子複合体（ＨＬＡ）の発現を阻害するアンチセンスＲＮＡ分子は、免疫応答の観点から最も万能であることが示されている。また更には、標的遺伝子活性のレベルを低減する際に、３重らせん分子を利用することもできる。
【０１００】
これらの及びその他の手法は、Ｌ．Ｇ．Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．（１９９４）に、より詳細に記載されている。この文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０１】
ＩＬ−１は、軟骨の再吸収並びに軟骨細胞による炎症メディエーターの産生に関係する強力な刺激剤である（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１９９１；１４７（４）：１２３８〜１２４６）。前述の任意の手法を使用し、本発明の細胞において、ＩＬ−１の発現をノックアウト又はノックダウンさせて、移植軟骨の再吸収又は本発明の細胞による炎症メディエーターの産生に関係するリスクを低下させることができる。同様に、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現も、移植組織が拒絶されるリスクを低下させる目的でノックアウト又はノックダウンさせることができる。
【０１０２】
本発明の細胞に遺伝子組み換えを施した後、これらの細胞は、例えば、抗炎症遺伝子産物など、疾患又は状態に関係する１つ又は２つ以上の症状に対し治療効果を有する産物を産生させることにより、ＩＶＤの変性に関連する疾患又は状態の処置を行うために、患者に直接移植してもよい。あるいは、遺伝子組み換え細胞は、本明細書に記載される通りにインビトロで新しい組織を製造し、次に対象に移植するために、使用することもできる。
【０１０３】
一部の態様では、本明細書に記載される通りの臍帯由来細胞及び製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物が提供される。本明細書で提供される医薬組成物は、ＩＶＤの細胞経路又は系統に沿って、臍帯由来細胞を、髄核細胞の表現型及び／又は線維輪細胞の表現型を提示するよう分化するよう誘導させる。一部の実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、内在性ＩＶＤ細胞及び／又は周辺組織の細胞に関係する、限定するものではないが、細胞分裂、分化及び遺伝子発現などの細胞工程を調節する。一部の実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、変性したＩＶＤの修復及び再生を促進する。
【０１０４】
同様に、本発明に従って、本発明の方法を実施するためのキットも考慮される。一態様では、少なくとも１つのＩＶＤに関する疾患又は損傷を有する患者を処置するためのキットが提供される。キットは、製薬上許容可能な担体、ヒト臍帯組織から得られた、疾患又は状態の処置に有効な量の細胞（本明細書に記載されかつ例示される細胞）、並びにＩＶＤの変性に関係する疾患又は状態を有する患者を処置するための方法におけるキットの使用に関係する指示書を含む。キットは、更に、少なくとも１つの試薬及び細胞培養に関する指示書を含む。キットは、更に、少なくとも１つのその他の細胞型集団及び／又は少なくとも１つの剤を含む。
【０１０５】
一部の態様では、キットは、製薬上許容可能な担体、可溶化液、細胞外マトリックス、又は本明細書に記載されかつ例示される特徴を有するヒト臍帯組織から得られた細胞から調製した馴化培地、を含む。キットは、損傷を受けた又は疾患を有するＩＶＤの修復及び／又は再生を促進させるのに有用である。
【０１０６】
以下の実施例は、より詳細に本発明を説明するために提供される。それらの実施例は、本発明を限定することではなく、例示することを意図するものである。更に、以降の実施例及び本明細書中の他の箇所で使用される通りに、発明の方法に有用な臍帯由来細胞を、米国特許第７，５１０，８７３号及び同第７，５２４，４８９号の開示に従って単離及び特性評価することができる。これらの特許文献は参照によりその全体が組み込まれ、特に臍帯由来細胞に関する説明、単離及び評価が組み込まれる。
【実施例】
【０１０７】
（実施例１）
臍帯由来細胞の単離
臍帯は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から得た。それらの組織は、正常分娩後に得られたものであった。細胞単離プロトコルを、層流フード内で、無菌的に実行した。血液及び残渣を除去するために、臍帯を、抗真菌剤及び抗生物質（１００単位／ｍＬのペニシリン、１００マイクログラム／ｍＬのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ｍＬのアンホテリシンＢ）の存在下で、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で洗浄した。次いで、それらの組織を、１５０ｃｍ２の組織培養プレート内で、５０ｍＬの培地（ＤＭＥＭ−低グルコース又はＤＭＥＭ−高グルコース；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で、組織が微細なパルプ状に細断されるまで機械的に解離させた。細断した組織を、５０ｍＬのコニカルチューブに移した（チューブ１本当り組織約５グラム）。次いで、それぞれ上述の通りに抗真菌剤及び抗生物質を含有させた、ＤＭＥＭ−低グルコース培地若しくはＤＭＥＭ−高グルコース培地中で、この組織を消化させた。一部の実験では、コラゲナーゼとディスパーゼとの酵素混合物を使用した（「Ｃ：Ｄ」；ＤＭＥＭ−低グルコース培地中、コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、５００単位／ｍＬ；及びディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０単位／ｍＬ））。他の実験では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼの混合物（「Ｃ：Ｄ：Ｈ」）を使用した（ＤＭＥＭ−低グルコース中、コラゲナーゼ、５００単位／ｍＬ；ディスパーゼ、５０単位／ｍＬ；及びヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）、５単位／ｍＬ）。これらの組織、培地、及び消化酵素を入れたコニカルチューブを、２２５ｒｐｍの軌道振盪器（Ｅｎｖｉｒｏｎ，Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，ＮＹ）内で、３７℃で２時間インキュベートした。
【０１０８】
消化の後、１５０×ｇで５分間、組織を遠心分離して、上清を吸引した。１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ｄｅｆｉｎｅｄ等級ウシ血清；ロット番号ＡＮＤ１８４７５；Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＬ／１００ｍＬの上述の通りの抗生物質／抗真菌剤を添加した、２０ｍＬの増殖培地（ＤＭＥＭ：低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に、ペレットを再懸濁させた。この細胞懸濁液を、孔径７０μｍのナイロン細胞濾過器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通して濾過した。増殖培地を含む、追加の５ｍＬの洗液を、濾過器に通過させた。次いで、その細胞懸濁液を、孔径４０μｍのナイロン細胞濾過器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通過させ、続いて、増殖培地の洗液を追加で５ｍＬ通過させた。
【０１０９】
この濾液を、増殖培地（総容積５０ｍＬ）に再懸濁させ、１５０×ｇで５分間、遠心分離した。上清を吸引して、５０ｍＬの新鮮増殖培地中に、細胞を再懸濁させた。このプロセスを、更に２回繰り返した。
【０１１０】
最終的な遠心分離の後、上清を吸引して、５ｍＬの新鮮な増殖培地に細胞ペレットを再懸濁させた。トリパンブルー染色を使用して、生存細胞の数を判定した。次いで、標準条件下で、細胞を培養した。
【０１１１】
臍帯から単離した細胞を、上述のような抗生物質／抗真菌剤添加した増殖培地中で、ゼラチンコーティングＴ−７５ｃｍ２フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）上に、５，０００個／ｃｍ２で播種した。２日後に（各種実験で、細胞は、２〜４日間インキュベートした）、フラスコから、培養に使用された培地を吸引した。ＰＢＳで細胞を３回洗浄して、残渣及び血液由来細胞を除去した。次いで、細胞に、増殖培地を補充して、コンフルエンスまで増殖させ（継代数０から約１０日）、継代数１とした。その後の継代（継代数１から継代数２へ、など）の際には、細胞は、４、５日でサブコンフルエンス（７５〜８５％コンフルエンス）に到達した。これらの後続の継代に関しては、細胞を、５０００個／ｃｍ２で播種した。細胞は、５％の二酸化炭素及び大気酸素に設定した加湿インキュベーター内で、３７℃で増殖させた。
【０１１２】
（実施例２）
ヒト分娩後に誘導される細胞表面マーカーのフローサイトメトリーによる評価
臍帯組織をフローサイトメトリーにより特性評価し、臍帯組織から得られた細胞の同一性についてプロファイルを用意した。
【０１１３】
ペニシリン／ストレプトマイシンを有する増殖培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で、細胞を培養した。血漿処理されたＴ７５、Ｔ１５０、及びＴ２２５組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）内で、細胞をコンフルエンスまで培養した。２％（ｗ／ｖ）のゼラチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、室温で２０分間インキュベートすることによって、これらのフラスコの増殖表面をゼラチンでコーティングした。
【０１１４】
フラスコ内の付着細胞を、ＰＢＳ中で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡを使用して剥離させた。細胞を採取して、遠心分離し、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ中に、１×１０７／ｍＬの細胞濃度で再懸濁させた。製造元の指示書に従って、１００μＬの細胞懸濁液に、目的の細胞表面マーカーに対する抗体（下記参照）を添加し、その混合物を、暗所で３０分間、４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離することにより、非結合の抗体を除去した。５００μＬのＰＢＳ中に、細胞を再懸濁させ、フローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ計器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して実行した。
【０１１５】
細胞表面マーカーに対し以下の抗体を使用した。
【０１１６】
【表１】
2014516034.tif 000003
【０１１７】
継代数８、１５及び２０で細胞を解析し、異なるドナー由来の臍帯由来細胞を互いに比較した。加えて、ゼラチンコートフラスコで培養した細胞を、未コートのフラスコで培養した細胞と比較した。
【０１１８】
臍帯由来細胞は、ＩｇＧ対照と比較して蛍光値が高いことによって示される通り、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの陽性発現を示した。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの検出可能な発現に関しては陰性であり、このことは、ＩｇＧ対照と同等の蛍光値によって示された。陽性曲線の蛍光値の変動を考慮した。陽性曲線の平均（すなわち、ＣＤ１３）及び範囲（すなわち、ＣＤ９０）は、ある程度の変動を示したが、これらの曲線は、正常であると考えられ、均質な集団であることが確認された。双方の曲線が、それぞれＩｇＧ対照よりも高い値を示した。
【０１１９】
継代数８、１５、及び継代数２０の細胞は、全て、ＩｇＧ対照と比較して蛍光値が高いことによって示される通り、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ  ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現していた。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに関しては陰性であり、このことは、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値によって示された。
【０１２０】
各ドナー由来のそれぞれの単離細胞はＩｇＧ対照に対する蛍光値の増大により反映される、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ  ９０、ＰＤＧＦｒ−α及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの陽性発現を示した。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現に関しては陰性であり、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値を有していた。
【０１２１】
ゼラチンフラスコ及び非コートフラスコ上で増殖させた細胞は、全て、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ  ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの発現に関しては陽性であり、ＩｇＧ対照と比較して増大した蛍光値を有していた。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現に関しては陰性であり、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値を有していた。
【０１２２】
したがって、臍帯由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに関しては陽性であり、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに関しては陰性であった。この同一性は、ドナー、継代数、及び培養容器の表面コーティングなどの可変要素を変化させても一貫していた。個々の蛍光値ヒストグラム曲線の平均及び範囲には、ある程度の変動が観察されたが、全ての試験条件下での全ての陽性曲線は正常であり、示された蛍光値は、ＩｇＧ対照よりも大きく、それゆえ、これらの細胞が、マーカーの陽性発現を有する均質な集団を含むことが確認された。
【０１２３】
（実施例３）
細胞の表現型の免疫組織化学的評価
ヒト臍帯組織を採取し、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドにより４℃で一晩浸漬固定した。免疫組織化学は、以下のエピトープに対する抗体を使用して実行した：ビメンチン（１：５００；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、デスミン（１：１５０、抗ウサギ；Ｓｉｇｍａ；又は１：３００、抗マウス；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、ヴォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ；１：２００；Ｓｉｇｍａ）、及びＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００；ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）。更には、以下のマーカーを試験した：抗ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１；１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、及び抗ヒトＮＯＧＯ−Ａ（１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）。外科用メスを使用して、固定標本をトリミングし、エタノールを入れたドライアイス浴上で、ＯＣＴ包理化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ；Ｓａｋｕｒａ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）内部に包埋した。次いで、凍結ブロックを、一般的クライオスタット（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して切片（厚さ１０μｍ）とし、染色のためにスライドガラス上に載置した。
【０１２４】
従来の研究と同様、免疫組織化学的検査を実施した（Ｍｅｓｓｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２００３；１８４：８１６〜２９）。手短に述べると、組織切片を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、及び０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；Ｓｉｇｍａ）からなるタンパク質ブロッキング液に１時間曝露させ、細胞内抗原と接触させた。目的のエピトープが細胞表面上に局在している場合には（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１）、エピトープの減少を防ぐため、この手順の全ての工程でＴｒｉｔｏｎを省いた。更には、一次抗体がヤギに対し産生された場合には（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１、ＮＯＧＯ−Ａ）、手順全体を通して、ヤギ血清の代わりに３％（ｖ／ｖ）ロバ血清を使用した。次いで、ブロッキング液により希釈した一次抗体を、室温で４時間にわたって、これらの切片に用いた。一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ブロック液と、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）及び／又はヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）若しくはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）とを含有させた二次抗体溶液を用いた（室温で１時間）。培養物を洗浄し、１０μＭ  ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間用い、細胞核を可視化した。
【０１２５】
Ｏｌｙｍｐｕｓ倒立エピ蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）において、適切な蛍光フィルターを使用して蛍光を可視化した。陽性染色は、対照染色を上回る蛍光シグナルによって表された。デジタルカラービデオカメラ及びＩＭＡＧＥ−ＰＲＯ（登録商標）ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、代表的な画像を撮影した。３重染色サンプルに関しては、１回に１つのみの発光フィルターを使用して、各画像を撮影した。
【０１２６】
ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦ、及びＣＤ３４マーカーは、臍帯内部に見出される細胞のサブセットで発現した。具体的には、ｖＷＦ及びＣＤ３４の発現は、臍帯内部に含まれる血管に限定されていた。ＣＤ３４＋細胞は、最内層（内腔側）上に存在した。ビメンチンの発現は、臍帯のマトリックス及び血管の全域に見出された。ＳＭＡは、動脈並びに静脈の、マトリックス及び外壁に限定され、血管自体には含まれなかった。ＣＫ１８及びデスミンは、血管内部のみに観察され、デスミンは、中層及び外層に限定された。臍帯組織内にはＧＲＯα、ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１及びＮＯＧＯ−Ａの発現は観察されなかった。
【０１２７】
（実施例４）
オリゴヌクレオチドアレイ解析
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイを使用して、臍帯由来細胞の遺伝子発現プロファイルを、線維芽細胞、ヒト間葉系幹細胞、及びヒト骨髄由来の別の細胞株と比較した。この解析により、分娩後に誘導された細胞の特性評価が提供され、これらの細胞に関係する固有の分子マーカーが特定された。
【０１２８】
ヒト臍帯は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）より、患者の同意を得て、正常な満期分娩から得た。組織を受け取り、上記の通り細胞を単離した。細胞は、増殖培地（ＤＭＥＭ−ＬＧを使用）により、組織培養用ゼラチンコートプラスチックフラスコ上で培養した。この培養物を、５％のＣＯ２を使用して、３７℃でインキュベートした。
【０１２９】
ヒト皮膚繊維芽細胞は、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ；ロット番号９Ｆ０８４４）及びＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５０１（ＣＣＤ３９ＳＫ）より購入した。双方の株を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有する、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で培養した。これらの細胞は、標準的な組織処理プラスチック上で増殖させた。
【０１３０】
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）は、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ；ロット番号２Ｆ１６５５、２Ｆ１６５６、及び２Ｆ１６５７）より購入し、製造元の仕様書に従って、ＭＳＣＧＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で培養した。これらの細胞は、５％のＣＯ２を使用して、３７℃で、標準的な組織培養プラスチック上で増殖させた。
【０１３１】
ヒト腸骨稜の骨髄は、患者の同意を得て、ＮＤＲＩより受け取った。この骨髄を、Ｈｏ，ｅｔ  ａｌ．によって概説される方法（国際公開第２００３／０２５１４９号）に従って処理した。骨髄１部対溶解緩衝液２０部の比率で、この骨髄を、溶解緩衝液（１５５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ３、及び０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．２）と混合した。この細胞懸濁液をボルテックス攪拌して、周囲温度で２分間インキュベートし、５００×ｇで１０分間、遠心分離した。上清を廃棄して、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清及び４ｍＭグルタミンを添加した最小必須培地−α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に、細胞ペレットを再懸濁させた。これらの細胞を、再び遠心分離して、新鮮培地中に細胞ペレットを再懸濁させた。トリパンブルー色素排除（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して、生存単核細胞を計数した。これらの単核細胞を、組織培養プラスチックフラスコ内に、５×１０４個／ｃｍ２で播種した。細胞を、標準大気Ｏ２又は５％  Ｏ２のいずれかで、５％  ＣＯ２に設定して、３７℃でインキュベートした。培地を交換することなく、細胞を５日間培養した。５日間の培養の後、培地及び非接着細胞を除去した。接着細胞は、培養して維持した。
【０１３２】
活発に増殖する細胞の培養物を、冷ＰＢＳを用い、セルスクレーパーによりフラスコから取り出した。これらの細胞を、３００×ｇで５分間、遠心分離した。上清を除去して、新鮮なＰＢＳ中に細胞を再懸濁させ、再び遠心分離した。上清を除去して、細胞ペレットを直ちに凍結させ、−８０℃で保存した。細胞のｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡへと転写させ、次いで、このｃＤＮＡをｃＲＮＡへと転写させ、ビオチンで標識した。このビオチン標識ｃＲＮＡを、ＨＧ−Ｕ１３３Ａ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）オリゴヌクレオチドアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ  ＣＡ）とハイブリダイズさせた。このハイブリダイゼーション及びデータ収集は、製造元の仕様書に従って実行した。解析は「マイクロアレイの有意差解析（Significance Analysis of Microarrays）」（ＳＡＭ）、バージョン１．２１コンピューターソフトウェア（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｔｕｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００２；９８：５１１６〜２１）を使用して実施した。
【０１３３】
１４の異なる細胞の集団を分析した。継代情報、培養基材及び培養培地と共に細胞を表１に掲載する。
【０１３４】
【表２】
2014516034.tif 000004
【０１３５】
データは、これらの細胞で示差的に発現した２９０の遺伝子を分析する、主成分分析によって評価した。この分析により、集団間の類似性に関する、相対的な比較が可能となる。表２は、細胞対の比較用に算出されたユークリッド距離を示す。これらのユークリッド距離は、細胞型間で示差的に発現した２９０の遺伝子に基づく、細胞の比較に基づいたものである。ユークリッド距離は、２９０の遺伝子の発現間の類似性に反比例する（すなわち、距離が大きくなるほど、存在する類似性が少なくなる）。
【０１３６】
【表３】
2014516034.tif 000005
【０１３７】
以下表３及び４は、臍帯由来細胞において発現が増加していた遺伝子（表３）、及び臍帯由来細胞において発現が減少していた遺伝子（表４）を示す。「プローブセットＩＤ」と題される縦列は、チップ上の特定の部位上に配置される、いくつかのオリゴヌクレオチドプローブのセットに関する、製造元の識別コードを指し、これらのプローブのセットは、ＮＣＢＩ（ＧｅｎＢａｎｋ）データベース内の指定の受入番号（縦列「ＮＣＢＩ受入番号」）に見ることができる配列を含む、命名された遺伝子（縦列「遺伝子名」）とハイブリダイズする。
【０１３８】
【表４】
2014516034.tif 000006
【０１３９】
【表５−１】
2014516034.tif 000007
【０１４０】
【表５−２】
2014516034.tif 000008
【０１４１】
表５、６及び７は、ヒト線維芽細胞（表５）、ＩＣＢＭ細胞（表６）及びＭＳＣ
（表７）において発現が増加していた遺伝子を示す。
【０１４２】
【表６】
2014516034.tif 000009
【０１４３】
【表７】
2014516034.tif 000010
【０１４４】
【表８】
2014516034.tif 000011
【０１４５】
前述の解析には、異なる臍帯に由来する３種の細胞及び２種の異なる皮膚線維芽細胞、３種の間葉系幹細胞株及び３種の腸骨稜骨髄細胞株が包含された。これらの細胞が発現したｍＲＮＡを、２２，０００の遺伝子プローブを含むオリゴヌクレオチドアレイを使用して解析した。結果、これら５つの異なる細胞型において、２９０の遺伝子が示差的に発現することが示された。これらの遺伝子には、臍帯由来細胞において特に発現が増加していた７つの遺伝子が包含される。臍帯由来細胞では、５４の遺伝子が、その他の細胞型と比較して明らかに低い発現レベルを有することが判明した。選択された遺伝子の発現は、ＰＣＲにより確認された。これらの結果により、臍帯由来細胞は、例えば、骨髄由来細胞及び線維芽細胞と比較して、異なる遺伝子発現プロファイルを有することが実証された。
【０１４６】
（実施例５）
臍帯由来細胞における細胞マーカー
上記に示した通り、分娩後に得られる細胞に対し遺伝子の「特徴（signature）」を確認した：酸化型ＬＤＬ受容体１、インターロイキン８、レニン、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３（ＣＸＣリガンド３）及び顆粒球走化性タンパク質２（ＧＣＰ−２）。これらの「特徴的な」遺伝子は、分娩後に得られる細胞において比較的高レベルに発現していた。
【０１４７】
この実施例で説明される手順は、マイクロアレイデータを検証して、遺伝子とタンパク質発現との間の一致／不一致を見出すと共に、臍帯由来細胞に関する一意的識別子を検出するための、信頼性の高い一連のアッセイを確立するために実施された。
【０１４８】
臍帯由来細胞（４種の単離株）及び正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ；新生児及び成人）を、ゼラチンコートＴ７５フラスコ中で、ペニシリン／ストレプトマイシン添加増殖培地により生育させた。間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）を間葉系幹細胞増殖培地Ｂｕｌｌｅｔキット（ＭＳＣＧＭ；Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で生育させた。
【０１４９】
ＩＬ−８プロトコルに関しては、細胞を液体窒素から解凍して、ゼラチンコートフラスコ内に５，０００個／ｃｍ２で播種して増殖培地中で４８時間増殖させ、次いで、更に８時間、１０ｍＬの血清飢餓培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、及び０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））中で増殖させた。この処理の後、ＲＮＡを抽出して、１５０×ｇで５分間、上清を遠心分離することにより細胞残渣を除去した。次いで、ＥＬＩＳＡ分析のために、上清を−８０℃で冷凍した。
【０１５０】
臍帯由来の分娩後細胞、並びにヒト新生児包皮由来のヒト線維芽細胞を、ゼラチンコートＴ７５フラスコ内で増殖培地で培養させた。継代数１１で、液体窒素中で細胞を凍結させた。細胞を解凍して、１５ｍＬ遠心管に移した。１５０×ｇで５分間の遠心分離後、上清を廃棄した。４ｍＬの培養培地中に、細胞を再懸濁させ、計数した。１５ｍＬの増殖培地を収容する７５ｃｍ２フラスコ内で、３７５，０００細胞／フラスコで、細胞を２４時間生育させた。この培地を、８時間にわたって、血清飢餓培地に交換した。インキュベーション終了時に、血清飢餓培地を回収し、１４，０００×ｇで５分間、遠心分離した（及び−２０℃で保存）。
【０１５１】
各フラスコ内の細胞数を概算するために、２ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を各フラスコに添加した。フラスコから細胞を剥離した後、８ｍＬの増殖培地によりトリプシン活性を中和した。細胞を１５ｍＬ遠心管に移し、１５０×ｇで５分間、遠心分離した。上清を除去し、各管に１ｍＬの増殖培地を添加して、細胞を再懸濁した。血球計数器を使用して、細胞数を概算した。
【０１５２】
細胞によって血清飢餓培地中へ分泌されたＩＬ−８の量を、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を使用して分析した。全てのアッセイは、製造元によって提供される使用説明書に従って試験した。
【０１５３】
コンフルエントな臍帯由来細胞及び繊維芽細胞から、あるいはＩＬ−８の発現に関しては、上述のように処理した細胞から、ＲＮＡを抽出した。製造元の使用説明書（ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に従って、β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加した３５０μＬの緩衝液ＲＬＴを使用して、細胞を溶解した。製造元の使用説明書（ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に従ってＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅ処理（２．７Ｕ／サンプル）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を施した。５０μＬのＤＥＰＣ処理水によりＲＮＡを溶出させ、−８０℃で保存した。
【０１５４】
ヒト臍帯組織からＲＮＡも抽出した。２−メルカプトエタノールを添加した７００μＬの緩衝ＲＬＴ中に、組織（３０ｍｇ）を懸濁させた。サンプルを機械的に均質化し、製造元の仕様書に従って、ＲＮＡの抽出を進めた。５０μＬのＤＥＰＣ処理水によりＲＮＡを抽出し、−８０℃で保存した。ランダムヘキサマーと、ＴａｑＭａｎ逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａ．）とにより、２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、及び９５℃で１０分間、ＲＮＡを逆転写した。−２０℃で、サンプルを保存した。
【０１５５】
分娩後細胞内で固有に調節されているとして、ｃＤＮＡマイクロアレイによって特定された遺伝子（酸化ＬＤＬ受容体、インターロイキン−８、レンニン、及びレチクロンを含めた、シグネチャー遺伝子）を、リアルタイムＰＣＲ及び従来のＰＣＲを使用して、更に検討した。
【０１５６】
Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（商標）遺伝子発現製品を使用して、ｃＤＮＡサンプルに対してＰＣＲを実施した：酸化ＬＤＬ受容体（Ｈｓ００２３４０２８）；レンニン（Ｈｓ００１６６９１５）；レチクロン（Ｈｓ００３８２５１５）；ＣＸＣリガンド３（Ｈｓ００１７１０６１）；ＧＣＰ−２（Ｈｓ００６０５７４２）；ＩＬ−８（Ｈｓ００１７４１０３）；ＧＡＰＤＨ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａ．）を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００  ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ．）と共に７０００配列検出システムを使用して、製造元の使用説明書（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ．）に従って、ｃＤＮＡ及びＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターミックスと混合した。熱サイクル条件は、最初に５０℃で２分間及び９５℃で１０分間とし、その後に、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の４０サイクルとした。ＰＣＲデータは、製造元の仕様書（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００配列検出システムに関する、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓによるＵｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２）に従って分析した。
【０１５７】
ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を使用して、従来のＰＣＲを実施することにより、リアルタイムＰＣＲからの結果を確認した。ＰＣＲは、２μＬのｃＤＮＡ溶液、１×ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄユニバーサルミックスＰＣＲ反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、及び９４℃で５分間の初回変性を使用して実行した。各プライマーセットに関して、増幅を最適化させた。ＩＬ−８、ＣＸＣリガンド３、及びレチクロンに関しては、（９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、及び７２℃で３０秒間を、３０サイクル）；レンニンに関しては、（９４℃で１５秒間、５３℃で１５秒間、及び７２℃で３０秒間を、３８サイクル）；酸化ＬＤＬ受容体及びＧＡＰＤＨに関しては、（９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、及び７２℃で３０秒間を、３３サイクル）。増幅に使用したプライマーを、表８に掲載する。最終ＰＣＲ反応でのプライマー濃度は、１μＭとしたが、ただし、ＧＡＰＤＨに関しては、０．５μＭとした。ＧＡＰＤＨプライマーは、リアルタイムＰＣＲと同じものとしたが、ただし、製造元のＴａｑＭａｎプローブは、最終ＰＣＲ反応に加えなかった。２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上にサンプルを流し、臭化エチジウム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で染色した。焦点距離ポラロイドカメラ（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）を使用する、６６７  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｔｗｉｎｐａｃｋフィルム（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）を使用して、画像を取り込んだ。
【０１５８】
【表９】
2014516034.tif 000012
【０１５９】
細胞を、室温で１０分間、４％（ｗ／ｖ）の冷パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で固定した。継代数０で単離したものを１群（Ｐ０）（単離直後）及び継代数１１で単離したものを２群（Ｐ１１）並びに線維芽細胞（Ｐ１１）を使用した。免疫細胞化学は、以下のエピトープに対する抗体を使用して実行した：ビメンチン（１：５００；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、デスミン（１：１５０；Ｓｉｇｍａ、抗ウサギ；又は１：３００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ−抗マウス）、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、ヴォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ；１：２００；Ｓｉｇｍａ）、及びＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００；ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）。更には、継代数１１の分娩後細胞を以下のマーカーについて試験した：抗ヒトＧＲＯ  α−ＰＥ（１：１００；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１；１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、及び抗ヒトＮＯＧＯ−Ａ（１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）。
【０１６０】
培養物を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原にアクセスさせるために、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、及び０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加タンパク質ブロッキング溶液に３０分間曝露した。目的のエピトープが、細胞表面上に位置している場合には（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１）、エピトープの損失を防ぐために、この手順の全ての工程で、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を省略した。更には、一次抗体がヤギに対して産生された場合には（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ  Ｒ１、ＮＯＧＯ−Ａ）、全体を通して、ヤギ血清の代わりに、３％（ｖ／ｖ）ロバ血清を使用した。次いで、ブロッキング溶液中に希釈した一次抗体を、室温で、１時間にわたって、これらの培養物に適用した。一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）及び／又はヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）若しくはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共にブロックを含有する、二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。次いで、培養物を洗浄し、１０μＭのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して、細胞核を可視化した。
【０１６１】
免疫染色の後に、Ｏｌｙｍｐｕｓ倒立エピ蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）上で、適切な蛍光フィルターを使用して、蛍光を可視化した。全ての場合で、陽性染色は、一次抗体溶液の適用を除いて、上記で概説した全手順に従った対照染色を上回る、蛍光シグナルを表した。デジタルカラービデオカメラ及びＩＭＡＧＥ−ＰＲＯ（登録商標）ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、代表的な画像を撮影した。３重染色サンプルに関しては、１回に１つのみの発光フィルターを使用して、各画像を撮影した。次いで、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、階層モンタージュを調製した。
【０１６２】
フラスコ内の付着細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して剥離させた。細胞を採取して、遠心分離し、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）のＦＢＳに、１×１０７／ｍＬの細胞濃度で再懸濁させた。１００μＬのアリコートを、コニカルチューブに移した。細胞内抗原を染色した細胞に対し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により透過処理した。製造元の仕様書に従って、アリコートに抗体を添加し、それらの細胞を、暗所で３０分間、４℃でインキュベートした。インキュベート後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離して過剰な抗体を除去した。二次抗体試験用の細胞を、１００μＬの３％  ＦＢＳ中に再懸濁させた。製造元の仕様書に従って、二次抗体を添加し、それらの細胞を、暗所で３０分間、４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離することにより、過剰な二次抗体を除去した。洗浄した細胞を、０．５ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させ、フローサイトメトリーによって分析した。以下の抗体を使用した：酸化ＬＤＬ受容体１（ｓｃ−５８１３；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＧＲＯａ（５５５０４２；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）、マウスＩｇＧ１  κ（Ｐ−４６８５及びＭ−５２８４；Ｓｉｇｍａ）、ロバ抗ヤギＩｇＧ（ｓｃ−３７４３；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈ）。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して実行した。
【０１６３】
このリアルタイムＰＣＲから得られたデータを、ΔΔＣＴ法によって分析し、対数目盛上に表現した。レチクロン及び酸化ＬＤＬ受容体の発現レベルは、他の細胞と比較して、臍帯由来細胞の方が高かった。分娩後に得られる細胞と、対照との間で、ＣＸＣリガンド３及びＧＣＰ−２の発現レベルに有意差は見られなかった。リアルタイムＰＣＲの結果を、従来のＰＣＲによって確認した。ＰＣＲ産物の配列決定により、これらの観察結果が更に立証された。上記の従来のＰＣＲのＣＸＣリガンド３プライマーを使用したところ、分娩後由来細胞と対照との間には、ＣＸＣリガンド３の発現レベルに有意差は見出されなかった。
【０１６４】
分娩後細胞によるサイトカイン（ＩＬ−８）の産生は、増殖培地で培養した細胞、及び血清飢餓分娩後由来細胞の双方で向上した。リアルタイムＰＣＲの全データは、従来のＰＣＲで、またＰＣＲ産物を配列決定することによって立証された。
【０１６５】
無血清培地中で生育させた細胞の上清をＩＬ−８の存在に関して検査したところ、臍細胞由来の培地、及び一部の胎盤細胞の単離株由来の培地中で、最高量が検出された（表９）。ヒト皮膚繊維芽細胞由来の培地からはＩＬ−８は検出されなかった。
【０１６６】
【表１０】
2014516034.tif 000013
【０１６７】
継代数０のヒト臍帯由来細胞を、選択されたタンパク質の産生に関し、免疫細胞化学的解析法により検査した。単離の直後（継代数０）に、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、６種のタンパク質：ヴォン・ヴィレブランド因子、ＣＤ３４、サイトケラチン１８、デスミン、α−平滑筋アクチン、及びビメンチンに対する抗体に曝露した。臍帯由来細胞は、α−平滑筋アクチン及びビメンチンに関して陽性であり、この染色パターンは、継代数１１まで一貫していた。
【０１６８】
４つの遺伝子：酸化ＬＤＬ受容体１、レンニン、レチクロン、及びＩＬ−８に関し、マイクロアレイ及びＰＣＲ（リアルタイム及び従来の双方）によって測定される遺伝子発現レベル間の一致が確認された。これらの遺伝子の発現は、ＰＰＤＣにおいてｍＲＮＡレベルで異なる調節をなされ、ＩＬ−８はまた、タンパク質レベルでも異なる調節をされていた。継代数０でのヒト臍帯組織を、α−平滑筋アクチン及びビメンチンの発現に関して調査したところ、双方に関して陽性であった。この染色パターンは、継代数１１まで保持された。
【０１６９】
（実施例６）
分娩後に得られる細胞のインビトロでの免疫学的評価
存在する場合には、インビボ移植の際に分娩後由来細胞（ＰＰＤＣ）が誘導する免疫応答を予測する目的で、ＰＰＤＣ細胞を、それらの免疫学的特性に関してインビトロで評価した。ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＢ７−Ｈ２の存在に関して、ＰＰＤＣを、フローサイトメトリーによってアッセイした。これらのタンパク質は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって発現され、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞の直接刺激に必要とされる（Ａｂｂａｓ  ＆  Ｌｉｃｈｔｍａｎ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．（Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２００３；ｐ．１７１））。これらの細胞株はまた、ＨＬＡ−Ｇ（Ａｂｂａｓ  ＆  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，２００３年、上記参照），ＣＤ１７８（Ｃｏｕｍａｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９９；２２４：１８５〜１９６）、及びＰＤ−Ｌ２（Ａｂｂａｓ  ＆  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，２００３年、上掲；Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００３；１７０：１２５７〜１２６６）の発現に関しても、フローサイトメトリーによって分析された。胎盤組織内に存在する細胞による、これらのタンパク質の発現は、子宮内の胎盤組織の免疫特権状態を介在すると考えられる。胎盤由来細胞株及び臍帯由来細胞株が、インビボで免疫反応を誘導する程度を予測するために、それらの細胞株を、一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で試験した。
【０１７０】
細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシン添加増殖培地により、２％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）コートＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）でコンフルエンスまで培養した。
【０１７１】
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で細胞を洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＭＯ）を使用して剥離させた。細胞を採取して、遠心分離し、３％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを添加したＰＢＳに、１×１０７個／ｍＬの細胞濃度で再懸濁させた。製造元の仕様書に従って、１００μＬの細胞懸濁液に、抗体（表１０）を添加し、暗所で３０分間、４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離することにより、未結合の抗体を除去した。５００μＬのＰＢＳに細胞を再懸濁させ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ計器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１７２】
【表１１】
2014516034.tif 000014
【０１７３】
細胞株Ａとして標識される継代数１０の臍帯由来細胞の凍結保存バイアルをドライアイスに載せてＣＴＢＲ（Ｓｅｎｎｅｖｉｌｌｅ，Ｑｕｅｂｅｃ）に送り、ＣＴＢＲ  ＳＯＰ  Ｎｏ．ＣＡＣ−０３１により混合リンパ球反応を実施した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、複数の男性及び女性のボランティアドナーから収集した。刺激側（ドナー）同種異系ＰＢＭＣ、自家ＰＢＭＣ、並びに分娩後細胞株を、マイトマイシンＣで処理した。自家のものであり、マイトマイシンＣ処理した刺激細胞を、受容側（レシピエント）ＰＢＭＣに添加して、４日間培養した。インキュベーション後、各サンプルに［３Ｈ］チミジンを添加して、１８時間培養した。これらの細胞を採取した後に、放射標識ＤＮＡを抽出し、シンチレーション計数器を使用して、［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定した。
【０１７４】
同種異系ドナーに関する刺激指数（ＳＩＡＤ）は、受容側＋マイトマイシンＣ処理同種異系ドナーの平均増殖を、受容側のベースライン増殖によって除算したものとして、算出した。ＰＰＤＣの刺激指数は、受容側＋マイトマイシンＣ処理分娩後細胞株の平均増殖を、受容側のベースライン増殖によって除算したものとして、算出した。
【０１７５】
６つのヒトボランティアのドナー血液をスクリーニングして、他の５つのドナー血液との混合リンパ球反応で強固な増殖反応を示す、単一の同種異系ドナーを特定した。このドナーを、同種異系陽性対照ドナーとして選択した。残りの５つの血液ドナーを、レシピエントとして選択した。同種異系陽性対照ドナー及び胎盤細胞株を、マイトマイシンＣ処理して、５つの個々の同種異系受容側との混合リンパ球反応下で培養した。各プレートに３つ受容細胞を入れた細胞培養プレートを２枚使用し、反応を３重に実施した（表１１）。平均刺激指数は、６．５（プレート１）〜９（プレート２）の範囲であり、同種異系ドナー陽性対照は、４２．７５（プレート１）〜７０（プレート２）の範囲であった（表１２）。
【０１７６】
【表１２】
2014516034.tif 000015
【０１７７】
【表１３】
2014516034.tif 000016
【０１７８】
フローサイトメトリーによって分析された、臍帯由来細胞のヒストグラムは、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値によって認められる通り、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＢ７−Ｈ２の陰性発現を示すが、このことは、臍細胞株には、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を直接刺激するために必要とされる、細胞表面分子が欠如していることを示す。フローサイトメトリーによって分析された、臍帯由来細胞のヒストグラムは、ＩｇＧ対照に対する蛍光値の増大によって認められるような、ＰＤ−Ｌ２の陽性発現を示し、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値によって認められるような、ＣＤ１７８及びＨＬＡ−Ｇの陰性発現を示す。
【０１７９】
臍帯由来細胞株を使用して実施された混合リンパ球反応では、平均刺激指数は６．５〜９の範囲であり、同種異系陽性対照の平均刺激指数は４２．７５〜７０の範囲であった。臍帯由来細胞株は、フローサイトメトリーによって測定された通り、刺激タンパク質ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＢ７−Ｈ２の発現に関しては陰性であった。臍帯由来細胞株は、フローサイトメトリーによって測定された通り、免疫調節タンパク質ＨＬＡ−Ｇ及びＣＤ１７８の発現に関しては陰性であり、ＰＤ−Ｌ２の発現に関しては陽性であった。同種異系ドナーＰＢＭＣは、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ、ＣＤ８、ＣＤ８６、及びＢ７−Ｈ２を発現する、抗原提示細胞を含むことにより、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞の刺激が可能となる。ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞の直接刺激に必要とされる、胎盤及び臍帯由来細胞上の抗原提示細胞表面分子の非存在、並びに免疫調節タンパク質のＰＤ−Ｌ２の存在は、同種異系対照と比較してこれらの細胞によって示されるＭＬＲにおける低い刺激指数を説明し得る。
【０１８０】
（実施例７）
臍帯由来細胞及び胎盤由来細胞による、栄養因子の分泌
臍帯由来細胞からの、選択された栄養因子の分泌を測定した。検出に使用される因子としては、（１）肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．，１９９７；２１２：２１５〜２６）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）（Ｓａｌｃｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，（２０００；９６：３４〜４０）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３；１７０：３３６９〜７６）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．，２００４；７７：８１２〜８）、マトリックスメタロプロテアーゼ１（ＴＩＭＰ１）、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ｂｂ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヘパリン結合性上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ストロマ細胞由来因子１α（ＳＤＦ−１α）など、血管新生作用を有することが既知のもの；（２）脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２００３；２５８：３１９〜３３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、トランスホーミング増殖因子β２（ＴＧＦβ２）など、神経栄養／神経保護活性を有することが既知のもの；並びに（３）マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ１ａ）、マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ１ｂ）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、ランテス（regulated on activation, normal T cell expressed and secreted）、Ｉ３０９、胸腺及び活性化制御ケモカイン（ＴＡＲＣ）、エオタキシン、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、ＩＬ−８など、ケモカイン活性を有することが既知のものが挙げられる。
【０１８１】
臍帯、並びにヒト新生児包皮由来のヒト繊維芽細胞を、ゼラチンコートＴ７５フラスコで、ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した増殖培地により培養した。継代数１１で、細胞を凍結保存し、液体窒素中で保存した。細胞の解凍後、それらの細胞に増殖培地を添加し、その後、１５ｍＬ遠沈管に移して、１５０×ｇで５分間、それらの細胞を遠心分離した。上清を廃棄した。４ｍＬの増殖培地中に、細胞ペレットを再懸濁させ、細胞を計数した。１５ｍＬの増殖培地を入れた、７５ｃｍ２のフラスコ１つ当り、３７５，０００個となるよう細胞を播種し、２４時間培養した。この培地を、無血清培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））に替え、８時間培養した。インキュベーションの終了時に、１４，０００×ｇで５分間遠心分離を行い無血清馴化培地を回収し、−２０℃で保存した。各フラスコ内の細胞の数を概算するために、ＰＢＳで細胞を洗浄し、２ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡを使用して剥離させた。８ｍＬの増殖培地を添加し、トリプシン活性を抑制した。１５０×ｇで５分間、細胞を遠心分離した。上清を除去し、１ｍＬの増殖培地中に、細胞を再懸濁させた。血球計数器を使用して、細胞数を概算した。
【０１８２】
細胞を、５％二酸化炭素及び大気酸素下で、３７℃で増殖させた。胎盤由来細胞（バッチ１０１５０３）は、５％酸素又はβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）下でも増殖させた。各細胞サンプルによって産生された、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１α、ＧＣＰ−２、ＩＬ−８、及びＴＧＦ−β２の量を、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって測定した。全てのアッセイは、製造元の使用説明書に従って実行した。
【０１８３】
ケモカイン（ＭＩＰ１ａ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ−１、Ｒａｎｔｅｓ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、Ｅｏｔａｘｉｎ、ＭＤＣ、ＩＬ８）、ＢＤＮＦ及び血管由来因子（ＨＧＦ、ＫＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＩＭＰ１、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＴＰＯ、ＨＢＦ−ＥＧＦを、ＳＥＡＲＣＨＬＩＧＨＴ（登録商標）プロテオームアレイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）を使用して測定した。このプロテオームアレイは、１ウェル当り２〜１６のタンパク質を定量測定するための、多重サンドイッチＥＬＩＳＡである。これらのアレイは、９６ウェルプレートの各ウェル内に、２×２、３×３、又は４×４パターンの、４〜１６の種々の捕捉抗体をスポットすることによって作製される。サンドイッチＥＬＩＳＡ手順の後に、プレート全体を画像化して、プレートの各ウェル内部の各スポットで生成された、化学発光シグナルを捕捉する。各スポット内で生成されるシグナルの量は、元の標準又はサンプル中の、標的タンパク質の量に比例する。
【０１８４】
臍帯由来細胞及び皮膚線維芽細胞（表１３）はＭＣＰ−１及びＩＬ−６を分泌した。線維芽細胞はＳＤＦ−１αを分泌した。ＢＭＥ又は５％  Ｏ２の存在下で培養した臍帯由来細胞はＧＣＰ−２及びＩＬ−８を分泌した。ＧＣＰ−２はまた、ヒト繊維芽細胞によっても分泌された。ＴＧＦ−β２は、ＥＬＩＳＡアッセイでは検出されなかった。
【０１８５】
【表１４】
2014516034.tif 000017
【０１８６】
ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ１、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ及びＩＬ−８が臍帯由来細胞から分泌された（表１４及び１５）。Ａｎｇ２、ＶＥＧＦ、又はＰＤＧＦ−ｂｂは、検出されなかった。
【０１８７】
【表１５】
2014516034.tif 000018
【０１８８】
【表１６】
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【０１８９】
臍帯由来細胞は数多くの非常に有効な栄養因子を分泌していた。これらの栄養因子の内、代謝阻害剤のＴＩＭＰ１はマトリックスメタロプロテアーゼによる細胞外マトリックスの分解の予防に重要な役割を果たす。ＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ＭＣＰ−１及びＩＬ−８は、細胞の生存及び細胞の分化機能に重要な役割を果たす。ＢＤＮＦ及びＩＬ−６などの、他の栄養因子は、神経再生に重要な役割を果たす。
【０１９０】
（実施例８）
増殖させたヒト臍帯由来細胞におけるＩＦＮ−γ誘導型のＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ発現をＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤により阻害
培養により増殖させたヒト臍帯由来細胞（０２２８０３  Ｐ４）を６穴組織培養プレートに播種し、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）低グルコース、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、βメルカプトエタノール（ＢＭＥ）で、およそ７０％コンフルエントになるまで培養した。次に、１０μＭの各ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（シンバスタチン酸（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｌａｕｓｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の１０ｍＭ原液としてＤＭＳＯに配合）を添加した培地、又はＤＭＳＯ溶媒０．１％（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）により細胞を処理し、並びに一晩インキュベートした。培地を吸引して除去し、５００Ｕ／ｍＬ  ｒｈＩＦＮ−γ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）及び１０μＭの各ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を含有させた培地に取り替え、３日間インキュベートした。３日目に、トリプシンを用い細胞を回収した。
【０１９１】
回収した細胞をＰＢＳで１回洗浄し、２０μｌ  ＦＩＴＣ標識ＨＬＡ−ＤＲ，ＤＰ，ＤＱ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）又はＦＩＴＣ標識ＩｇＧ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を添加した１００μｌの３％  ＦＢＳ／ＰＢＳに再懸濁し、１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、５００μＬのＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）で解析した。
【０１９２】
【表１７】
2014516034.tif 000020
【０１９３】
表１６に示す通り、炎症性サイトカインＩＦＮ−γとインキュベートしたヒト臍帯由来細胞の未処理及び０．１％  ＤＭＳＯ溶媒対照群は、フローサイトメトリーにより検出された蛍光が増加したことにより示される通り、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現の上昇を示した。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤で前処理し、続いてＩＦＮ−γとインキュベートしたヒト臍帯由来細胞は、未処理及び溶媒対群と同様にＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現を示した。
【０１９４】
このデータにより、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素は、ヒト臍帯由来細胞において、炎症性サイトカインにより介在されるＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現を阻害することが示唆される。
【０１９５】
（実施例９）
椎間板変性症のウサギモデルにおけるヒト臍帯由来細胞（ｈＵＴＣ）の有効性
試験を実施して、ヒト臍帯由来細胞（ｈＵＴＣ）が椎間板（ＩＶＤ）変性症のウサギモデルにおいて有効であるか判定した。障害部位に細胞を注入し、円板の寸法をＸ線撮像により評価した。組織の解析には剖検を実施した。
【０１９６】
椎間板（ＩＶＤ）変性症に対するヒト臍帯由来細胞（ｈＵＴＣ）の有効性を評価するため、穿刺したＩＶＤにｈＵＴＣを注入した。週２回Ｘ線撮像を行い、円板を損傷させ溶媒処理した対照群のものと円板の高さを比較した。ｈＵＴＣでの処理により、溶媒対照群と比較して円板の高さは増加し、並びに回復速度も増加した。
【０１９７】
椎間板変性症モデルの作製法：系統的バイアスを何ら含めずに６ヶ月齢の雌性ＮＺＷウサギを選択した。ウサギは登録前にタグ付けし、剖検直前に計量した。ウサギには、鎮静させる前にグリコピロレート（glycopyrolate）（０．０１〜０．０２ｍｇ／ｋｇ  ＳＱ）を投与し、経口気管内の分泌を減少させ、麻酔に関連する徐脈（bradychardia）を和らげた。先制鎮痛として、手術前にブプレノルフィン（ブプレノルフィンＨＣｌ  ０．０３ｍｇ／ｋｇ）を投与した。ケタミン塩酸塩（２５ｍｇ／ｋｇ）及びアセプロマジンマレエート（１ｍｇ／ｋｇ，１０ｍｇ／ｍＬ）を投与してウサギに麻酔をかけ、気管内挿管を容易にした。手術前にベースライン対照としてＸ線撮像を行った。手術前のＸ線撮像の終了後、５ｍｇ／ｋｇでキシラジンを皮下又は筋肉内投与した。ウサギはイソフルラン吸入下で維持した（２〜３％で導入し、０．５〜２％に維持した）。
【０１９８】
ウサギ（体重３．５ｋｇ）を横向きにして腹臥位で配置した。前処理し、覆布した後、腰筋を鈍的に切開し腹膜後域の後外側から腰椎ＩＶＤを曝露させた。３つの連続する腰椎ＩＶＤ（Ｌ２／３、Ｌ３／４及びＬ４／５）の前側表面を曝露させた。固定装置に１８Ｇの針を使用して深さ５ｍｍまで針を刺し込み、線維輪の腹側面からＬ２／３及びＬ４／５レベルの髄核を穿刺した。Ｌ３／４レベルの腰筋に、マーカーとして、血管ステープル及び縫合糸を配置した。生じた手術創は層状に修復した。ステープルにより皮膚を縫合した。
【０１９９】
術後、術後Ｘ線撮像を行い穿刺の程度を確認した。１．５ｍｇのメロキシカムを経口投与した（手術の１日前及び手術の２〜３日後）。獣医と相談の上、必要とされる場合には鎮痛剤（ブプレノルフィンＨＣｌ：０．０１〜０．０３ｍｇ／ｋｇ）を日に２回２〜３日間投与した。麻酔からの回復後、ウサギはケージに戻し、自由に運動させた。ウサギにはウサギ用ジャケットを着用させ、ウサギが術創に触る及びかく／裂開させる、並びにステープルを外すのを予防した。
【０２００】
処置の評価：最初の手術（線維輪の穿刺）から４週間後、初回の手術時に作製された傷口からの出血を避け、同様の外科手術を反対面に行った。Ｘ線画像及び目視検査により、手術による円板の変性が確認されたならば、２８Ｇの針を使用して、マイクロシリンジにより、各ウサギに対しＬ２／３及びＬ４／５レベルの両方で、ＰＢＳ、１，０００，０００個又は１００，０００個の細胞を髄核領域に椎間板内注入した。Ｌ３／４は未穿刺未処理対照として残した。手術創の修復後、ウサギはケージに戻し、厳重に監視した。これまでに記載した通り、３日間抗生物質及び鎮痛剤を投与した。各ウサギには１．５ｍｇのメロキシカムを口腔投与した（手術の１日前及び手術の２〜３日後）。挙動、食欲及び体重変化を厳重に監視し、かつ獣医及び治験責任医師が術後ストレスを監視した。
【０２０１】
注入したすべての材料は無菌条件下で調製した。本試験には、無菌性、マイコプラズマ、核型及び病原菌についてした試験済みの研究等級のｈＵＴＣ（ロット番号Ｑ０３０３０６）を使用した。低温保存した細胞を迅速に解凍しＰＢＳに希釈した。細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。細胞をＰＢＳに再懸濁し、計数して細胞の最終濃度を１μＬあたり１００，０００個又は１０，０００個のいずれかにした。トリパンブルーを使用して生存率を評価した。滅菌マイクロシリンジに１０μＬの細胞を装填し、上記の通りＩＶＤに注入した。
【０２０２】
穿刺の２、４、６、８、１０、１２、１４及び１６週後並びに穿刺の１６週後の屠殺後に、ＩＶＤの高さを測定するため、ケタミン塩酸塩（２５ｍｇ／ｋｇ）及びアセプロマジンマレアート（１ｍｇ／ｋｇ）を投与し、Ｘ線撮像を行った。
【０２０３】
最初の線維輪の穿刺から１６週後に（注入（細胞）から１２週後に相当）、ケタミン塩酸塩（２５ｍｇ／ｋｇ）及びアセプロマジンマレアート（１ｍｇ／ｋｇ）により各群の８羽のウサギに麻酔を行った後、過剰量のペントバルビタール（９０ｍｇ／ｋｇ，安楽死用Ｂ溶液：Ｈｅｎｒｙ  Ｓｃｈｅｉｎ  Ｉｎｃ．，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を投与し屠殺した。
【０２０４】
穿刺前後及び安楽死の各時点でＸ線フィルムを得てデジタル化し、椎骨重量及び円板高さを測定した。ＩＶＤの高さは、公開されている方法に従ってＤＨＩとして示す（Ｃｈｕｊｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｉｎｅ，２００６；３１：２９０９〜１７；Ｍａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｉｎｅ，２００６；３１：７４２〜５４）。処理群については伏せて、整形外科により全てのＸ線画像を独立的に解釈させた。椎体の高さ及びＩＶＤの高さを含む、デジタル化したＸ線画像、測定値を、ＭＡＴＬＡＢソフトウェア（Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）のカスタムプログラムにより解析した。データをソフトウェアのエクセルに移行し、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｉｎｅ，２２：１８２８〜３４（１９９７）に記載の手法にわずかに修正を加え、これを元にＩＶＤ高さを円板高さ指数（ＤＨＩ＝ＩＶＤの高さ／隣接するＩＶＤの高さ）として表した。ＩＶＤの前方、中央及び後方部位から得られた測定値を平均して平均ＩＶＤ高さ（ＤＨＩ）を算出し、隣接する錐体の高さの平均値により除した。ＤＨＩ（％）は（術後ＤＨＩ／術前ＤＨＩ）×１００として表した。更に、対照レベルとしてＬ３／４レベルを使用し、ＤＨＩ（％）を正規化した。正規化させたＤＨＩ（％）＝（実験段階のＤＨＩ（％）／Ｌ３／４ＤＨＩ（％））×１００。同様に、回復速度は次の通りに算出した：（ＤＨＩ（％）（時点）−ＤＨＩ（％）（４Ｗ［穿刺］））／（１００−％ＤＨＩ（４Ｗ［穿刺］））。
【０２０５】
Ｘ線測定値によるデータの平均値間の差の有意性を、二元配置分散分析又は一元配置分散分析、並びにｈｏｃ後試験としてフィッシャーのＰＬＳＤ法により解析した。すべてのデータは平均値±標準誤差として表す。有意水準をｐ＜０．０５に設定し、Ｓｔａｔｖｉｅｗ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０，ＳＰＳＳ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）プログラムパッケージにより統計解析を実施した。
【０２０６】
上記のように、週に２回椎体高さを評価した。欠損が１０％未満の椎体は試験から除外した。データ（表１７に示す）によると、移植後２〜１２週間では、円板の高さは、１００，０００個のｈＵＴＣを投与した場合には対照と比較して増加し、１，０００，０００個を投与した場合には減少していた（穿刺後６〜１６週）（移植後２、４、６及び１４週はｐ＜０．０５，ｈＵＴＣ（１，０００，０００）対ｈＵＴＣ（１００，０００）；移植後８週はｐ＜０．０１）。
【０２０７】
【表１８】
2014516034.tif 000021
【０２０８】
回復速度は上記の通りに測定した。欠損が１０％未満の椎体は試験から除外した。データ（表１８に示す）によると、移植後２〜１２週（穿刺後６〜１６週）の時点では、回復速度は１００，０００個のｈＵＴＣを投与した場合には対照と比較して増加し、１，０００，０００個を投与した場合には減少していた。（移植後２及び１４週はｐ＜０．０５，対照対ｈＵＴＣ（１００，０００個）；移植後１２週はｐ＜０．０１）。
【０２０９】
【表１９】
2014516034.tif 000022
【０２１０】
したがって、ウサギＩＶＤ変性モデルの穿刺ＩＶＤにｈＵＴＣを１，０００，０００個及び１００，０００個注入することにより、ＩＶＤ変性に対するｈＵＴＣの効果を評価した。週２回Ｘ線撮像を行い、未処理穿刺対照群のものと円板の高さを比較した。データによると、円板高さは、１００，０００個ｈＵＴＣ濃度で処理した場合にはＰＢＳ処理対照群と比較して増加し、１，０００，０００個濃度で処理した場合には減少していた（表１７）。更なるデータ解析により、ｈＵＴＣ（１００，０００）により処理した円板の回復速度（回復量／正規化した総ＤＨＩ（％）の減少度）は、対照と比較して大きかったことが明らかになった（表１８）。
【０２１１】
（実施例１０）
インビトロでのヒト臍帯由来細胞による細胞外マトリックスタンパク質の発現
インビトロで、ｈＵＴＣによる、３種の細胞外マトリックスタンパク質、すなわちアグリカン、Ｉ型コラーゲン及びＩＩ型コラーゲンの発現レベルを決定するために試験を実施した。細胞を、単独の場合、並びに栄養因子、ＴＧＦ−β、ＧＤＦ−５及びＰＤＧＦ−ＢＢにより刺激した場合について試験した。
【０２１２】
ヒト臍帯由来細胞（ｈＵＴＣ；ロット番号１２０３０４）は、標準的な条件下で培養し、維持した。手短に述べると、細胞を５０００個／ｃｍ２でＴフラスコに播種し、３〜４日毎に継代及び再播種を行った。栄養因子試験を実施した細胞はアルギン酸塩ビーズに封入し、かつ標準的な増殖培地に栄養因子を添加し処理した。培地には１００μｇ／ｍＬでアスコルビン酸を添加した。試験した因子はＰＤＧＦ−ＢＢ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＴＧＦβ−１（５ｎｇ／ｍＬ）及びＧＤＦ−５（２００ｎｇ／ｍＬ）である。５つの処理群を用意した。すなわち、ｈＵＴＣ単独対照群、ＧＤＦ−５によるｈＵＴＣ処理群、ＴＧＦ−β１によるｈＵＴＣ処理群、ＰＤＧＦ−ＢＢによるｈＵＴＣ処理群並びにＴＧＦ−β１及びＧＤＦ−５によるｈＵＴＣ処理群を用意した。
【０２１３】
培養開始から２週間後、細胞はアルギン酸塩から放出させ、洗浄し、ペレット化し、凍結させた。ＲＮＡを単離し、逆転写してｃＤＮＡを生成した。リアルタイムＰＣＲにより、アグリカン、Ｉ型及びＩＩ型コラーゲンの発現についてサンプルを解析した。
【０２１４】
５種の異なる培養条件下での発現を、リアルタイムＰＣＲ解析の結果として示す。表１９に、増殖因子処理していないｈＵＴＣに対する相対的な発現量として結果を示す。ＰＤＧＦ−ＢＢ処理群及びＧＤＦ−５／ＴＧＦ−β１処理群は、アグリカン、Ｉ型コラーゲン及びＩＩ型コラーゲンの比較可能な発現を示した。ＴＧＦ−β１により処理した細胞では、Ｉ型コラーゲン及びＩＩ型コラーゲンである程度の発現誘導を示し、アグリカンにより誘導した場合にはおよそ１０〜２０倍の発現を示した。発現誘導はＧＤＦ−５処理群が最も高かった。細胞は、アグリカン並びにＩ型コラーゲンにおいて約５０倍の発現上昇を示し、ＩＩ型コラーゲンの発現においては３００倍超の発現上昇を示した。
【０２１５】
【表２０】
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【０２１６】
（実施例１１）
臍由来細胞内でのテロメラーゼ発現
テロメラーゼは、染色体の完全性を保護し、また細胞の複製寿命を延長するために役立つ、テロメア繰り返し体を合成するように機能する（Ｌｉｕ，Ｋ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＮＡＳ，１９９９年：９６：５１４７〜５１５２）。テロメラーゼは、テロメラーゼＲＮＡテンプレート（ｈＴＥＲＴ）、及びテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）の、２つの成分からなる。テロメラーゼの調節は、ｈＴＥＲＴではなく、ｈＴＥＲＴの転写によって決定される。したがって、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、細胞のテロメラーゼ活性を判定する際に公認された方法である。
【０２１７】
細胞単離。リアルタイムＰＣＲ実験を実施して、ヒト臍帯由来細胞のテロメラーゼ産生を評価した。ヒト臍帯由来細胞を、上述の実施例に従って調製した。全般的には、正常な分娩後の、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）から得た臍帯を洗浄して、血液及び残渣を除去し、機械的に解離させた。次いで、この組織を、培養培地中、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼを含む消化酵素と共に、３７℃でインキュベートした。ヒト臍帯由来細胞を、上記の実施例に記載される方法に従って培養した。間葉系幹細胞及び正常真皮線維芽細胞（ｃｃ−２５０９ロット番号９Ｆ０８４４）をＣａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ）から得た。多能性ヒト精巣胚性癌腫（奇形腫）細胞株ｎＴｅｒａ−２細胞（ＮＴＥＲＡ−２  ｃｌ．Ｄｌ）（Ｐｌａｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００６；２４（３）：５３１〜５４６を参照されたい）をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）から購入し、上記の方法に従って培養した。
【０２１８】
全ＲＮＡの単離。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａ．）を使用して、ＲＮＡを細胞から抽出した。５０μＬのＤＥＰＣ処理水によりＲＮＡを溶出させ、−８０℃で保存した。ランダムヘキサマーと、ＴａｑＭａｎ（登録商標）逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａ．）とを使用し、２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、及び９５℃で１０分間、ＲＮＡを逆転写した。−２０℃で、サンプルを保存した。
【０２１９】
リアルタイムＰＣＲ。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｓｓａｙｓ−Ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（商標）（ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイとしても既知）を、製造元の仕様書（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って使用して、ｃＤＮＡサンプルに対してＰＣＲを実施した。この市販のキットは、ヒト細胞内のテロメラーゼをアッセイする際に広く使用されるものである。簡潔に述べると、ｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ遺伝子）（ＨｓＯＯ１６２６６９）及びヒトＧＡＰＤＨ（内部対照）を、ＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ  ７０００  ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に７０００配列検出システムを使用して、ｃＤＮＡ及びＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターミックスと混合した。熱サイクル条件は、最初に５０℃で２分間及び９５℃で１０分間とし、その後に、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の４０サイクルとした。ＰＣＲデータは、製造元の仕様書に従って分析した。
【０２２０】
ヒト臍帯由来細胞（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６０６７）、線維芽細胞、及び間葉系幹細胞を、ｈＴＥＲＴ及び１８Ｓ  ＲＮＡに関してアッセイした。表２０に示すように、ヒト臍帯由来細胞では、ｈＴＥＲＴ、ひいてはテロメラーゼは検出されなかった。
【０２２１】
【表２１】
2014516034.tif 000024
【０２２２】
ヒト臍帯由来細胞（単離株０２２８０３、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６０６７）及びｎＴｅｒａ−２細胞をアッセイしたところ、ヒト臍帯由来細胞の２つのロットで得られた結果はテロメラーゼの発現を示さなかったが、一方で、テラトーマ細胞株は、高レベルの発現を表した（表２１）。
【０２２３】
【表２２】
2014516034.tif 000025
【０２２４】
したがって、本発明のヒト臍帯由来細胞は、テロメラーゼを発現しないということを、結論付けることができる。
【０２２５】
（実施例１２）
髄核へのヒト臍帯由来細胞の注入インビボでの椎間板変性症の進行の変更
本実施例では、ヒト臍帯由来細胞（ｈＵＴＣ）を髄核（ＮＰ）に直接注入することの有用性を、外科的にＩＶＤ変性を施したインビボモデルにより調査した。ヒドロゲル担体を用い、あるいは用いずにｈＵＴＣを注入した。本試験は、最初のＭＲＩによる調査と、本変性モデルでの処置に対する生体力学的応答試験の間に行う。
【０２２６】
方法
以下により詳細に記載される通り、椎間板変性症について予め評価されているウサギ線維輪外科術（annulotomy）モデルに（Ｓｏｂａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｐｉｎｅ．２００５；３０（１）：１５〜２４を参照されたい）、骨格が成熟しているニュージーランド種ウサギを３０羽使用した（対照ｎ＝６、穿刺ｎ＝６、ヒドロゲル担体ｎ＝６、細胞＋ＰＢＳ緩衝液ｎ＝６、細胞＋ヒドロゲル担体ｎ＝６）。椎体Ｌ２−３、Ｌ３−４及びＬ４−５を１６Ｇ針で穿刺し、変性を誘導し、続いてヒドロゲル担体を用い又は用いずにヒト臍帯由来細胞により処理した。３Ｔニーコイルを使用し、０、３、６及び１２週の時点で連続的な脊椎のＭＲＩを得て、これまでに有効性が確認されている手法にしたがって、変性の痕跡について解析した。ウサギは１２週の時点で屠殺し、円板Ｌ４−５を組織学的に解析した。短軸充填正規化配置試験（uniaxial load-normalized displacement testing）により、円板Ｌ３−４の粘弾性特性を解析した。これまでに有効性が確認されている二相指数モデル（two-phase exponential model）に従い、クリープ曲線を数学的にモデル化した。
【０２２７】
ウサギ
本試験には、骨格が成熟している３０羽のニュージーランドホワイト種ウサギを使用した（雌性、１歳齢、体重５ｋｇ）。ウサギを、非穿刺対照群（ｎ＝６）、穿刺群（ｎ＝６）、穿刺後担体のみを注入した群（ｎ＝６）、穿刺後細胞ＰＢＳ溶液を注入した群（ｎ＝６）並びに穿刺後細胞を入れた担体を注入した群（ｎ＝６）とに割り付けた。
【０２２８】
サンプルの調製
ヒト臍帯組織は、膣又は帝王切開による出産のいずれかを行いかつ同意の得られた提供者から得た。一人の提供者の臍帯からヒト臍帯由来細胞（ｈＵＴＣ）を単離し、増殖させた。簡潔に述べると、臍帯を手技により細切れにし、０．５Ｕ／ｍＬコラゲナーゼ（Ｎｏｒｄｍａｒｋ）、５．０Ｕ／ｍＬディスパーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）及び２Ｕ／ｍＬヒアルロニダーゼ（ＩＳＴＡ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）の混合物により、ほぼ完全に消化されるまで消化した。細胞懸濁液をシーブに通過させて未消化の組織を除去し、細胞を遠心分離し、増殖培地１（ＤＭＥＭ低グルコース（Ｃａｍｂｒｅｘ／ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１５％（体積／体積）ウシ胎児血清（ｄｅｆｉｎｅｄグレード、ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、０．００１％  βメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、５０Ｕ／ｍＬペニシリン並びに５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ））を入れたブタゼラチンコートフラスコに５，０００個／ｃｍ２で播種した。細胞を、標準的な組織培養条件下、すなわち、５％二酸化炭素の大気酸素下、３７℃下で、Ｔフラスコで、集団倍加（ＰＤ）が５回行われるまで静置培養により増殖させ、保存した。次に（than）、増殖培地２（ＤＭＥＭ低グルコース、１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎児血清（ｄｅｆｉｎｅｄグレードＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を入れたＴフラスコで、静置培養により細胞を増殖させ累積約１２回集団倍加させ、保管した。次に、増殖培地２を入れたスピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）で、細胞を更にＨＩＬＬＥＸ（登録商標）ＩＩマイクロキャリア（ＳｏｌｏＨｉｌｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）上で増殖させた。細胞を入れたスピナーフラスコを、６０ｒｐｍに設定したスピナープレートに配置し、細胞を標準条件下、すなわち、二酸化炭素濃度５％の大気酸素の存在下、３７℃にて、累積集団倍加数が約２５〜３０回に達するまで培養した。ＴｒｙｐＬＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してマイクロキャリアから細胞を回収し、凍結保存し、低温貯蔵温度にて保存した。保存した細胞のアリコートを、安全性及び同一性を確実にするため、生存率、回収率、無菌性、内毒素、マイコプラズマ、核相、及び細胞表面マーカーの免疫表現型などについての特性評価試験を実施するために解凍した。細胞は、継代初期にウィルス性の病原菌についてＰＣＲ系の手法により試験し、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＣＭＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＴＬＶ及びＥＢＶに特異的な核酸配列を検出した。使用時まで並びに送達直前の注入準備まで細胞を低温貯蔵温度で保存した。実験動物への注入直前に、細胞バイアルを３７℃の水浴で解凍し、次にＰＢＳで洗浄した。細胞懸濁液のアリコートを取り出し、トリパンブルーと混合し、血球計数器により計数した。送達にあたり、細胞濃度を適切な密度に調製した。担体溶液には、ＰＢＳか、あるいはＥＶＩＣＥＬ（登録商標）フィブリン糊（ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）フィブリンシーラント（ヒト），Ｏｍｒｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｌｔｄ．）の成分から誘導されるインサ��ツ形成型ヒドロゲル担体を使用した。ヒドロゲルに細胞を充填するにあたり、細胞はヒトフィブリノゲン（６．８〜１０．６ｍｇ／ｍｌ）のＰＢＳ溶液と混合した。この試薬をヒトトロンビン（０．４〜０．６Ｕ／Ｍｌ）ＰＢＳ溶液と混合した。混合後すぐにゲル化が生じた。
【０２２９】
外科的穿刺
滅菌手術条件下の獣医用手術室で、全身麻酔にかけたウサギの腰椎を、左前外側からアプローチをとり曝露させた。腸骨稜に対する位置をもとにＬ４−５円板を確認し、針の先端が椎間板の中央に来るよう、１６ゲージの針を５ｍｍの深さまで刺した。斜角部を頭部に向け、針を終板と平行に円板に刺し入れた。続いて直接観察し、触診して椎間板Ｌ３−４及びＬ２−３を確認し、上記の通りに穿刺した。外科手術後、ウサギを、移動を制限しない大型のプライベートケージに収容した。本手法によるウサギＩＶＤに対する線維輪外科術（annulotomy）により、連続的にＴ２強調画像ＭＲＩにより説明することのできる、緩徐で、信頼のおける、再現可能な変性カスケードが誘導された（Ｍａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｐｉｎｅ．２００５；３０（１）：５〜１４を参照されたい）。
【０２３０】
外科的注入
処理群のウサギに対し、最初の穿刺手術から３週間後に再度外科手術を行った。右前外側からのアプローチをとり、脊椎を曝露させた（最初の穿刺手術とは反対側になる）。ハミルトン１００マイクロリットルシリンジ（１７１０ＴＰＬＴ；製品番号８１０４１）及びハミルトン３０ゲージ鋭角針とプラスチック製ハブ（ＫＦ  ７３０  ＮＤＬ  ６／パック，３０Ｇ／２”；製品番号９０１３０）を使用して、ＮＰの中央に治療用の注射を行った。担体群については、１５μＬのヒドロゲルをシリンジに吸引し、次にゆっくりと（ゲル化する前に液体を注入しやすくするため４．５分未満で）各円板に注入した。細胞＋緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水）群については、１５μＬの滅菌ＰＢＳ中１０５個の細胞を各円板に注入した。担体群の細胞については、１５μＬのヒドロゲル担体中１０５個の細胞を注入した。注入はＣアームによるガイダンス下で実施し、針が確実に円板の中央に位置するようにした。円板圧の急激な上昇並びにそれに伴う圧出を避けるため、工程にわたってすべての注入は意図的に緩徐にかつ一定速度で実施した。ウサギを縫合し、覚醒させ、穿刺術について記載した通りに世話した。
【０２３１】
磁気共鳴映像法
０時間（線維輪穿刺の前）、３週間（注入術の前）、６週間並びに１２週間（屠殺前）の時点で矢状面のＭＲＩを得た。３  Ｔｅｓｌａ  Ｓｉｅｍｅｎｓの磁場システム並びに標準的なヒトニーコイルを使用してＴ１強調画像（ＴＲ＝６５０ｍｓ、ＴＥ＝１４ｍｓ、スライス厚＝０．６ｍｍ）及びＴ２強調画像（ＴＲ＝３８００ｍｓ、ＴＥ＝１１４ｍｓ、スライス厚＝０．６ｍｍ）を得た。ウサギを鎮静させ、背臥位でニーコイルに置いた。Ｔ１強調画像を使用して、脊椎中の何らかの骨異常について定性的な確認を行った。Ｔ２強調画像を使用して、円板の変性度を定量化した。熟練の医師により、椎体、脊髄並びに棘突起の幅をもとに、一連の正中矢状面のＴ２強調画像を確認した。目的とするＮＰ領域を同定するにあたり、これまでに有効性の確認されている自動分割法（automated segmentation method）を採用した（Ｂｅｃｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌｏｇｙ．２０１０；３１（９）：１６４０〜１６４４を参照されたい）。ＭＲＩインデックスは、対象とする領域内の各ピクセルにピクセル強度を乗じた画素面積の合計として算出した。第０週でのＮＰ領域、及び対照値に対するＭＲＩインデックスを、３つの対象とする円板に関し平均化し、時点に対してプロットした。スチューデントのｔ検定（ｐ＜０．０５）により統計的有意性を算出した。
【０２３２】
屠殺及びサンプル加工
最初の穿刺手術から１２週後（最後のＭＲＩを得た後）にすべてのウサギを屠殺した。屠殺直後に脊椎をまとめて切り出した。組織学的解析のため椎間板Ｌ４−５を用意した。円板を固定し、ＤＥＣＡＬＣＩＦＩＥＲ  Ｉ（登録商標）（Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓ．，Ｉｎｃ．）により２週間脱灰させ、次に組織診断用の脱水包埋装置で脱水させ、パラフィンに包埋した。次に、厚さ５μｍで円板の矢状面の切片を作製した。標準的な組織診断法を使用し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）（Ｓｉｇｍａ）により切片を染色し、Ｎｉｋｏｎ  Ｅ８００顕微鏡により撮影した。
【０２３３】
生体力学
生体力学的解析のため、屠殺後、円板の機能単位（ＦＳＵ，骨−円板−骨）として円板Ｌ３−４を切り出した。後に記載の溶液（posterior elements）によりサンプルを洗浄し、エポキシ樹脂に包埋し、Ｍａｔｌａｂ（Ｍａｔｌａｂ  Ｒ２００８ａ，Ｔｈｅ  Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）ファジー理論プログラムにより制御した軸方向試験装置（axial testing machine）のカスタム式固定具に取り付けた。生理食塩水に浸したガーゼによりすべての円板を包み、脱水を最小限に抑え、屠殺と同日に試験を実施した。標本を２０サイクルの圧縮荷重（０〜１．０ＭＰａ，０．１ｍｍ／ｓ）により前条件付けし、次に１１００秒間、一定の圧力（１．０ＭＰａ）にかけた。日常的な活動によりヒトＩＶＤが経験する圧力に相当するという点でこの荷重目標を選択した（ウサギの円板に合わせて大きさを小さくして調整した）（Ｗｉｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｐｉｎｅ．１９９９；２４（８）：７５５〜７６２）。試験開始から２００μ秒を初期傾斜相として定義し、試験の残りの期間をクリープ相して定義する。移行の試験では、クリープ曲線を２相指数モデルと適合させた。
【数１】
2014516034.tif 000026
式中、ｄ（ｔ）は、経時的な軸方向変位量であり、Ｌ０は適用した軸方向荷重であり、Ｓ１及びＳ２は弾性減衰係数（Ｎ／ｍｍ）であり、η１及びη２は粘稠性減衰係数（Ｎｓ／ｍｍ）である。平均曲線を作製し、各条件について指数モデルと適合させた。
【０２３４】
結果
ウサギ
いずれの群にも処置の結果としての副作用は観察されなかった。
【０２３５】
ＭＲＩ
円板Ｌ２−３、Ｌ３−４及びＬ４−５の正中矢状面のＭＲＩのＴ１強調画像により、著しい変化、すなわち骨棘形成は存在していなかったことが示された。穿刺群の円板正中矢状面のＭＲＩのＴ２強調画像は、非穿刺対照群のものと比較して変性していた（関心領域が暗く、かつ０〜１２週で崩壊した）。全３種の処理群では、図１及び図２に示す通り、穿刺群と比較して、質的な変性が少なかった。穿刺（かつ非処理）円板は、ＮＰ面積の５９％が減少し、かつ時点間のＭＲＩインデックスが６４％減少しており、最も変性を示した。全３種の処理群では、穿刺群と比較して総ＮＰ面積及びＭＲＩインデックスのいずれもで変性の程度が低かった。処理群間では担体＋細胞群が、最も面積及びＭＲＩインデックスの減少の度合いが少なく、最も対照群に酷似していた（図３）。０週目及び３週目の時点では、対照群と３種の処理＋穿刺群との間に、あるいは穿刺群と処理群との間に、ＭＲＩインデックス又は面積に関し統計的に優位な差は見られなかった。有効な変性モデルであることが見込まれた通り、６及び１２週目の時点での、対照群及び穿刺群のＭＲＩインデックスと面積には、統計的に優位な差が存在した。対照群及び担体処理群では、６及び１２週の時点で、ＭＲＩインデックスに関し、並びに１２週の時点で面積に関し統計的に優位な差が示された。対照及び緩衝液＋細胞群では、１２週目のＭＲＩインデックスで統計的に有意な差が示された。対照群及び担体＋細胞群では、６及び１２週目のいずれの時点においても、ＭＲＩインデックス及び面積のいずれもで統計的に優位な差が示された。穿刺群並びに担体群は、ＭＲＩによる定量化において、時点間で統計的に優位な差を示さなかった。穿刺群及び緩衝液＋細胞群では、６及び１２週目のいずれの時点においても、ＭＲＩインデックス及び面積のいずれもで統計的に優位な差が示された。穿刺群及び担体＋細胞群では、１２週目にＭＲＩインデックス及び面積に有意な差があった。
【０２３６】
生体力学
総荷重を正規化した置換を表す曲線（初期傾斜相及びそれに続くクリープ相）を図４に示す。群間に差が生じる傾向がある。具体的には、対照群により作成した曲線は、担体＋細胞群のものと類似しており、穿刺群のものは緩衝液＋細胞群のものと類似しており、担体群の曲線はこれらの群の間に存在する。群間のばらつきのほとんどは初期傾斜相から存在していた。これらの傾向にもかかわらず、曲線のクリープ層が２相指数モデルと適合させたときに、初期及び後期粘稠度及び弾性減衰係数には、統計的に優位な差はなかった（データ不掲載）。
【０２３７】
組織学的所見
円板Ｌ４−５の代表的な矢状面の切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）により染色し、倍率２０倍及び１００倍で観察した（図５、６及び７）。対照の円板は構造を維持していた。見込まれた通り、穿刺した円板では、ＮＰにおいて、細胞充実性の低下及び線維症が観察され、変性が示唆された。穿刺した円板をヒドロゲル担体により処理した場合には、細胞充実性にはある程度の低下が見られたものの、頑強な細胞外マトリックスを維持した。細胞＋緩衝液の場合、ＮＰ領域は比較的保存されていたものの、有意な線維症が観察された。細胞＋担体により処理した場合、穿刺した円板と比較して細胞充実性及び構造は改善された。
【０２３８】
考察
本実施例には、椎間板変性症（ＩＤＤ）の定量だけでなく、円板変性症を対象とした処置に対する応答を示すことも目的とした、新規ＭＲＩ技術及びバイオメカニクスなどの広範かつ多様な計測結果が含まれる。本実施例で詳細に議論される通り、処置群は対照及び穿刺群のものとは異なる粘弾性特性を示した。
【０２３９】
ＭＲＩ、組織学及び生体力学的な基準に基づくと、ウサギ腰椎椎間板（ＩＶＤ）に、ＩＤＤとｈＵＴＣを担体と共に注入すると、担体単独又は細胞＋緩衝液単独のいずれかで処理した場合と比較して有効な効果が得られる。全３種の処理群は、穿刺した未処理円板と比較して明らかに有効な効果を示した。ＭＲＩによると、全３種の処理群の髄核（ＮＰ）領域及びインデックスは、対照（非変性）及び穿刺（最も変性）条件の間の状態を示しているため、処置は円板の高さ及びシグナル強度の変化を一部遅延させる助けとなることが示唆される。軸荷重により作成された置換曲線は各条件ごとに異なっていた。組織診断によると、処置により、円板の構造及び細胞充実性が可変性に復元したことが示された。
【０２４０】
細胞＋ＰＢＳ群では、対照及び穿刺性のものの間に当てはまるＭＲＩデータが生成され、かつ担体群のＭＲＩデータと非常に類似していた。しかしながら、この群の置換曲線は穿刺状態のものと最も類似していたことから、この処理は、ＮＰ領域の部分的な復元及びＭＲＩのシグナル強度に有効であったものの、椎間板が従来示す機械的特性を復元させる強い効果を発揮する程ではなかったことが示唆される。
【０２４１】
担体単独処理群では、穿刺及び非穿刺群の間に当てはまるＭＲＩデータが生成された。本試験では、ヒドロゲル群の置換曲線も穿刺群及び非穿刺群の間に当てはまったため、ヒドロゲル担体は、天然又は移植細胞による何らかの細胞外マトリックス合成とは独立して、何らかの機械的特性を円板に復元し得ることが示唆される。組織診断によると、担体処理群は、非細胞処理群に予想されるものよりも、より細胞充実性を有していたことから、ヒドロゲルが、ネイティブな細胞を成長させることのできる安全な場を提供する可能性があることが示唆される。
【０２４２】
細胞＋担体処理群は、他の２群の細胞移植群及びヒドロゲル注入群の両方の特性を併せ持っていた。本群は一致していたものの、ＭＲＩによる変性度の測定に関しては明らかな傾向は有しておらず、他の２つの処理群よりも良好であった（最も対照の状態と近かったものの、それでも尚対照の値とは明らかに異なっていた）。同様に、本群は、対照群の曲線とほとんど同様の置換曲線も有していたことから、機械的な応答は最も良好であったことが示唆される。本群の組織診断結果では、穿刺群と比較して細胞充実性が顕著に増加しており、相対的に構造が保存されているものの、線維症のエビデンスが見られた。
【０２４３】
ヒト細胞をウサギ円板に移植したことにより免疫応答が生じたことを示す組織学的なエビデンスは存在しなかった。処理群のウサギは病気の兆候を示したが、炎症反応に関係する組織学的なエビデンスは示さなかった。
【０２４４】
胚性幹細胞又は胎児細胞に関連する倫理的衝突を生まずにドナー組織を容易に入手しやすく、かつ細胞を容易に播種することができることから、ヒト分娩後臍部組織は治療用細胞の魅力的な資源である。
【０２４５】
要約すると、予想された通り、穿刺群は、非穿刺群と比較して、変性に関係するＭＲＩ及び組織学的エビデンスを示した。処置群は、穿刺群と比較して、変性に関係するＭＲＩ及び組織学的エビデンスが少なかった。処置群は対照及び穿刺群のものとは異なる粘弾性特性を示した。本試験により、穿刺したウサギ腰椎ＩＶＤに（ａ）ｈＵＴＣ及び（ｂ）ヒドロゲルを注入することで、ＩＶＤの変性の進行が緩やかになることが示される。ヒドロゲルに入れた細胞を注入することで、（ａ）ｈＵＴＣ単独又は（ｂ）ヒドロゲル単独のいずれかの場合よりも変性の進行が緩やかになる。したがって、本試験によると、穿刺したウサギ椎間板を、ヒドロゲル担体溶液を用いあるいは用いずにヒト臍帯由来細胞（ｈＵＴＣ）により処置することは、非穿刺対照群のものに近いＭＲＩ、組織診断結果及びバイオメカニカル特性の復元に有効であることが示される。
【０２４６】
〔実施の態様〕
（１）  椎間板変性症に関連する疾患又は状態を処置する方法であって、ヒドロゲルと、ヒト臍帯組織から得られた均質な単離細胞集団とを含む医薬組成物を、前記疾患又は前記状態の処置に有効な量で椎間板に投与することを含み、前記臍帯組織は、血液をほぼ含まず、かつ前記均質な単離細胞集団は、培養時に自己再生能及び増殖能を示し、分化能を有し、かつＣＤ１１７又はテロメラーゼを発現しない、方法。
（２）  前記単離細胞集団が、次の特性、
（ａ）レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３及び／又は顆粒球走化性タンパク質を発現する、
（ｂ）ＣＤ３１、ＣＤ３４及びＨＬＡ−ＤＲを産生しない、
（ｃ）ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞又は腸骨稜骨髄細胞と比較して、酸化型インターロイキン８及びレチクロン１の発現レベルが増加している、
（ｄ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０を発現する、のうちの１つ又は２つ以上を有する、実施態様１に記載の方法。
（３）  前記医薬組成物が、注入により投与される、実施態様１に記載の方法。
（４）  前記医薬組成物が、少なくとも１つのその他の細胞型及び／又は少なくとも１つの剤を更に含む、実施態様１に記載の方法。
（５）  前記少なくとも１つの剤が、栄養因子である、実施態様４に記載の方法。
【０２４７】
（６）  前記栄養因子が、ＴＧＦ−β、ＧＤＦ−５、ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＴＩＭＰ１からなる群から選択される、実施態様５に記載の方法。
（７）  前記少なくとも１つのその他の細胞型が、少なくとも１つの外来性遺伝子産物を発現するよう遺伝子操作される、実施態様４に記載の方法。
（８）  前記外来性遺伝子産物が、栄養因子である、実施態様４に記載の方法。
（９）  前記医薬組成物が、変性した椎間板に投与される、実施態様１に記載の方法。
（１０）  前記医薬組成物が、前記椎間板の髄核又は線維輪に投与される、実施態様９に記載の方法。
【０２４８】
（１１）  前記ヒト臍帯組織から得られた均質な単離細胞集団を、インビトロで少なくとも部分的に分化するよう誘導することを更に含む、実施態様１に記載の方法。
（１２）  前記均質な単離細胞集団が、線維輪細胞の表現型を提示する細胞へと分化するよう誘導される、実施態様１１に記載の方法。
（１３）  前記均質な単離細胞集団が、髄核細胞の表現型を提示する細胞へと分化するよう誘導される、実施態様１１に記載の方法。
（１４）  椎間板変性症に関連する疾患又は状態を処置する方法であって、ヒドロゲルと、ヒト臍帯組織から得られた均質な単離細胞集団とを、前記疾患又は前記状態の処置に有効な量で、椎間板に投与することを含み、前記臍帯組織は、血液をほぼ含まず、かつ前記均質な単離細胞集団は培養時に自己再生能及び増殖能を示し、分化能を有し、かつＣＤ１１７又はテロメラーゼを発現しない、方法。
（１５）  前記単離細胞集団が、次の特性、
（ａ）レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３及び顆粒球走化性タンパク質を発現する、
（ｂ）ＣＤ３１、ＣＤ３４及びＨＬＡ−ＤＲを産生しない、
（ｃ）ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞又は腸骨稜骨髄細胞と比較して、インターロイキン８及びレチクロン１の発現レベルが増加している、
（ｄ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０を発現する、のうちの１つ又は２つ以上を有する、実施態様１４に記載の方法。
【０２４９】
（１６）  前記均質な単離細胞集団及び前記ヒドロゲルが、注入により投与される、実施態様１４に記載の方法。
（１７）  前記ヒドロゲルが、前記ヒト臍帯組織から得られた均質な単離細胞集団と同時に、又はこれより前に、又は後に投与される、実施態様１４に記載の方法。
（１８）  前記均質な単離細胞集団が、埋め込み型装置内に投与される、実施態様１４に記載の方法。
（１９）  少なくとも１つのその他の細胞型を、前記ヒト臍帯組織から得られた均質な単離細胞集団と同時に、又はこれより前に、又は後に投与することを更に含む、実施態様１４に記載の方法。
（２０）  前記少なくとも１つのその他の細胞型が、少なくとも１つの外来性遺伝子産物を発現するよう遺伝子操作される、実施態様１９に記載の方法。
【０２５０】
（２１）  前記外来性遺伝子産物が、栄養因子である、実施態様２０に記載の方法。
（２２）  前記外来性遺伝子産物が、１つ又は２つ以上の細胞外マトリックスタンパク質の発現を調節する、実施態様２１に記載の方法。
（２３）  少なくとも１つの剤を投与することを更に含む、実施態様１４に記載の方法。
（２４）  前記少なくとも１つの剤が、栄養因子である、実施態様２３に記載の方法。
（２５）  前記栄養因子が、ＴＧＦ−β、ＧＤＦ−５、ＰＤＧＦ−ＢＢ、及びＴＩＭＰ１からなる群から選択される、実施態様２４に記載の方法。
【０２５１】
（２６）  前記栄養因子が、前記ヒト臍帯組織から得られた均質な単離細胞集団に対し栄養作用を及ぼす、実施態様２５に記載の方法。
（２７）  前記均質な単離細胞集団及び前記ヒドロゲルが、変性した椎間板に投与される、実施態様１４に記載の方法。
（２８）  前記均質な単離細胞集団及び前記ヒドロゲルが、前記椎間板の髄核に投与される、実施態様２７に記載の方法。
（２９）  前記均質な単離細胞集団及び前記ヒドロゲルが、前記椎間板の線維輪に投与される、実施態様２７に記載の方法。
（３０）  前記ヒト臍帯組織から得られた均質な単離細胞集団を、インビトロで少なくとも部分的に分化するよう誘導することを更に含む、実施態様１４に記載の方法。
【０２５２】
（３１）  前記均質な単離細胞集団が、線維輪細胞の表現型を提示する細胞へと分化するよう誘導される、実施態様３０に記載の方法。
（３２）  前記均質な単離細胞集団が、髄核細胞の表現型を提示する細胞へと分化するよう誘導される、実施態様３０に記載の方法。
（３３）  椎間板変性症に関連する疾患又は状態を処置する方法であって、前記疾患又は前記状態の処置に有効な量でヒドロゲルを投与することを含む、方法。
（３４）  前記ヒドロゲルが、フィブリノゲン及びトロンビンを含む、実施態様３３に記載の方法。
（３５）  前記ヒドロゲルが、フィブリン糊を含む、実施態様３３に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2014516034.tif 000034
【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年1月22日(2014.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
椎間板変性症に関連する疾患又は状態を処置するための医薬組成物であって、ヒドロゲルと、ヒト臍帯組織から得られた均質な単離細胞集団とを含み、前記臍帯組織は、血液をほぼ含まず、かつ前記均質な単離細胞集団は、培養時に自己再生能及び増殖能を示し、分化能を有し、かつＣＤ１１７又はテロメラーゼを発現しない、組成物。
【請求項２】
前記単離細胞集団が、次の特性、
（ａ）レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３及び／又は顆粒球走化性タンパク質を発現する、
（ｂ）ＣＤ３１、ＣＤ３４及びＨＬＡ−ＤＲを産生しない、
（ｃ）ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞又は腸骨稜骨髄細胞と比較して、酸化型インターロイキン８及びレチクロン１の発現レベルが増加している、
（ｄ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０を発現する、のうちの１つ又は２つ以上を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記医薬組成物が、注入により投与するためのものである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記医薬組成物が、少なくとも１つのその他の細胞型及び／又は少なくとも１つの剤を更に含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つの剤が、栄養因子である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記栄養因子が、ＴＧＦ−β、ＧＤＦ−５、ＰＤＧＦ−ＢＢ、及びＴＩＭＰ１からなる群から選択される、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１つのその他の細胞型が、少なくとも１つの外来性遺伝子産物を発現するよう遺伝子操作される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記外来性遺伝子産物が、栄養因子である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記医薬組成物が、変性した椎間板に投与されるためのものである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記医薬組成物が、前記椎間板の髄核又は線維輪に投与されるためのものである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ヒト臍帯組織から得られた均質な単離細胞集団が、インビトロで少なくとも部分的に分化するよう誘導される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記均質な単離細胞集団が、線維輪細胞の表現型を提示する細胞へと分化するよう誘導される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記均質な単離細胞集団が、髄核細胞の表現型を提示する細胞へと分化するよう誘導される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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