(57)【要約】  本発明は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体(uPAR)の阻害剤に関する。生成される阻害剤は、足場により連結された、異なる配置にある、細胞外プロテアーゼであるウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(uPA)の受容体結合ドメインと、細胞外マトリックスタンパク質であるビトロネクチン(VN)の受容体結合ドメインとを含有する二価uPARリガンドである。本発明はまた、薬剤としての、特に、癌の治療のため、および診断目的での使用のための上記分子に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1の第11〜第42アミノ酸の、uPAの増殖因子様ドメイン(GFDドメイン)を含む第1のポリペプチド、もしくはuPAオーソロガス遺伝子に由来する対応する領域によりコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体もしくは類似体;および
配列番号2の第5〜第39アミノ酸の、VNのソマトメジンBドメイン(SMBドメイン)を含む第2のポリペプチド、もしくはVNオーソロガス遺伝子に由来する対応する領域によりコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体もしくは類似体;
からなる群より選択される2つのポリペプチドを含み、2つのポリペプチドが分子足場により互いに連結される、ダイマー分子。
【請求項２】
前記第1のポリペプチドが、配列番号2の第5〜第39アミノ酸の、SMBドメイン、もしくはVNオーソロガス遺伝子に由来する同じ領域によりコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体もしくは類似体をさらに含み;
および
前記第2のポリペプチドが、配列番号1の第11〜第42アミノ酸の、GFDドメイン、もしくはuPAオーソロガス遺伝子に由来する同じ領域によりコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体もしくは類似体をさらに含む、
請求項1に記載のダイマー分子。
【請求項３】
前記GFDドメインが配列番号1の第8〜第48アミノ酸から本質的になる、請求項1または2に記載のダイマー分子。
【請求項４】
前記GFDドメインが配列番号1の第1〜第48アミノ酸からなる、請求項1から3のいずれか一項に記載のダイマー分子。
【請求項５】
前記SMBドメインが配列番号2の第1〜第41アミノ酸からなる、請求項1から4のいずれか一項に記載のダイマー分子。
【請求項６】
第1および第2のポリペプチドが、
c)N末端-SMBドメイン-GFDドメイン-C末端の順序の配列を含む、および
d)そのC末端を介して分子足場に連結される、
請求項2から5のいずれか一項に記載のダイマー分子。
【請求項７】
前記SMBドメインおよびGFDドメインが第1のリンカーペプチドにより連結される、請求項2から6のいずれか一項に記載のダイマー分子。
【請求項８】
前記第1のリンカーペプチドが配列番号3の配列から本質的になる、請求項7に記載のダイマー分子。
【請求項９】
第1および第2のポリペプチドのそれぞれが第2のリンカーペプチドにより分子足場に連結される、請求項1から8のいずれか一項に記載のダイマー分子。
【請求項１０】
リンカーペプチドが配列番号4の配列から本質的になる、請求項9に記載のダイマー分子。
【請求項１１】
分子足場が免疫グロブリン定常領域(Fc)、ロイシンジッパー、化学的リンカーまたはペプチドリンカーである、請求項1から10のいずれか一項に記載のダイマー分子。
【請求項１２】
Fcの重鎖定常領域のそれぞれが、本質的に配列番号5の配列を有する、請求項11に記載のダイマー分子。
【請求項１３】
配列番号6の配列の第1のモノマーおよび配列番号7の配列の第2のモノマーから本質的になる、請求項12に記載のダイマー分子。
【請求項１４】
第1および第2のモノマーが配列番号8の配列を有する、請求項12に記載のダイマー分子。
【請求項１５】
医学的使用のための、請求項1から14のいずれか一項に記載のダイマー分子。
【請求項１６】
癌の治療としての使用のための、請求項1から14のいずれか一項に記載のダイマー分子。
【請求項１７】
治療剤にコンジュゲートされる、請求項1から14のいずれか一項に記載のダイマー分子。
【請求項１８】
前記治療剤が放射性核種または毒素である、請求項17に記載のダイマー分子。
【請求項１９】
診断方法における使用のための、請求項1から14のいずれか一項に記載のダイマー分子。
【請求項２０】
uPARにより媒介される病理または腫瘍の診断における使用のための、請求項19に記載のダイマー分子。
【請求項２１】
治療上有効量の請求項1から14のいずれか一項に記載のダイマー分子のそれを必要とする対象への投与を含む、癌の治療方法。
【請求項２２】
請求項1から14のいずれか一項に記載のダイマー分子および好適な賦形剤または添加剤を含む医薬組成物。
【請求項２３】
別の治療剤をさらに含む、請求項22に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記治療剤が放射性核種または毒素である、請求項23に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
請求項1から14のいずれか一項に記載のダイマー分子を含む、uPARにより媒介される病理または腫瘍の診断のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体(uPAR)の阻害剤に関する。生成される阻害剤は、足場により連結された、異なる配置にある、細胞外プロテアーゼであるウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(uPA)の受容体結合ドメインと、細胞外マトリックスタンパク質であるビトロネクチン(VN)の受容体結合ドメインとを含有する二価uPARリガンドである。uPARへのそのような阻害剤の結合は、uPAとVNの両方の結合部位が同時に占有され、かくして、受容体のタンパク質分解とシグナル活性の両方を効率的に遮断する複合体をもたらす。
【背景技術】
【０００２】
ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体(uPAR、CD87とも呼ばれる)は、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーにより細胞膜に繋ぎ止められた膜糖タンパク質である。豊富なin vitro、in vivoおよび臨床的証拠は、uPARが腫瘍成長、浸潤および転移、炎症疾患ならびにウイルス感染などの様々な病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たすことを示唆している。従って、uPAR機能を効率的に阻害する薬剤は、様々な病状における新規治療レジメンを提供し得る。
【０００３】
uPARならびに、その2つの確立したリガンド、セリンプロテアーゼであるウロキナーゼ(uPA)ならびに細胞外マトリックス(ECM)タンパク質であるビトロネクチン(VN)との分子相互作用が、調節細胞外タンパク質分解、細胞接着、移動、浸潤および増殖におけるuPARの活性にとって必要である(Blasi & Carmeliet, 2002; Smith & Marshall, 2010)。uPARへのuPAの結合は、細胞表面プラスミノーゲン活性化を加速することにより細胞外タンパク質分解を促進するが、VNの結合は、p130CasおよびERK1/2シグナル経路のインテグリン依存的活性化を介し、移動および増殖シグナルを増強するECMへの細胞接着を強化する。in vivoにおけるuPAとuPARとの相互作用の重要性は、集中的に研究されており、通常は、抗体、組換えタンパク質、合成ペプチドならびに低分子量化合物を含む様々な特異的アンタゴニストを用いて確認されている。VNとの相互作用の重要性はuPARのシグナル活性にとって重要であると文書で十分に裏付けられている(Madsenら、2007; Smithら、2008)が、この相互作用の重要性について、in vivoでは未だ取り組まれていない。様々なuPAR変異体を過剰発現するヒト癌細胞を用いる腫瘍成長の異種移植マウスモデルにおいて、著者は、VNとの相互作用が腫瘍成長の加速におけるuPARの活性にとって実際に必要であることを最近証明し(原稿準備中)、この相互作用が実際に関連する抗癌標的であるという仮定を支持している。
【０００４】
WO01/17544などのいくつかの国際出願が、ウロキナーゼ受容体のペプチドリガンドを開示する。特に、WO97/35969は、uPARに結合し、インテグリンおよびビトロネクチンの結合を阻害することができるペプチドを開示する。この文献はuPA結合には言及していない。
【０００５】
さらに、WO2008/073312は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体エピトープおよびそれから誘導されたモノクローナル抗体に関する。この文献は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体(uPAR)に特異的な抗体およびその抗原結合断片ならびに癌の治療または予防のためのその使用を開示する。特に、開示された抗体は、uPAR上の特定のエピトープに特異的である。
【０００６】
WO2005116077は、uPA-uPAR二元複合体、uPA-uPARを含む三元複合体およびuPARと、インテグリンなどのuPA以外のタンパク質との複合体に特異的な抗体または他のリガンドを同定する。この抗体は、複合体が相互作用するさらなる分子を用いてuPAとuPARとの相互作用を阻害する。そのような抗体または他のリガンドは、特に癌に対する診断および治療方法において用いられる。
【０００７】
Tressler RJら(APMIS. 1999 Jan;107(1):168〜73頁)は、ヒトおよびマウスの両方のウロキナーゼの増殖因子ドメインに基づくウロキナーゼ受容体アンタゴニストを開示する。そのようなアンタゴニストは、それらの相同な受容体に対してナノモル濃度以下の親和性を示す。ヒトIgGの定常領域との融合物を調製することによるこれらの分子のさらなる改変は、高い親和性および長いin vivo半減期を有する分子をもたらした。バクテリオファージディスプレイとペプチド類似体合成との組合せによって、より小さいペプチド阻害剤が得られた。これらの分子は全て、uPA受容体へのuPAの増殖因子ドメインの結合を阻害し、ビトロネクチンへのuPA受容体の結合を増強する。
【０００８】
疾患状態におけるuPAR:VN相互作用のin vivoでの重要性に取り組み、この知識を医療に移転させるためには、強力で特異的な薬剤が必要である。本発明は、現在利用可能である阻害剤よりも約1000倍強力であるuPAR:VNアンタゴニストの遺伝子操作、発現、精製および特性評価を記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】WO01/17544
【特許文献２】WO97/35969
【特許文献３】WO2008/073312
【特許文献４】WO2005116077
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Tressler RJら、APMIS. 1999 Jan;107(1):168〜73頁
【非特許文献２】Okumura Yら、J Biol Chem 2002
【非特許文献３】Madsenら、JCB 2007
【非特許文献４】Rabbani SAら、Neoplasia 2010
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、新しい型のウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体(uPAR)の阻害剤の概念、構築および検証に関する。生成される阻害剤分子(uPAR-lockおよびuPAR-lockV2、また、uPAR-lock分子と命名される)は、共通の足場上で非常に近い位置にある、細胞外プロテアーゼであるウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(uPA)の受容体結合ドメインと細胞外マトリックスタンパク質であるビトロネクチン(VN)の受容体結合ドメインとを含有する二価uPARリガンドである。uPARへのそのような阻害剤の結合は、uPAとVNの両方の結合部位が同時に、および効率的に占有され、かくして、受容体のタンパク質分解活性およびシグナル活性の両活性を遮断する複合体をもたらす。
【００１２】
本発明の阻害剤分子は、物理的および機能的uPAR/VN相互作用およびuPAR/uPA相互作用の強力なアンタゴニストである。
【００１３】
それは受容体へのVN結合を刺激することなく、uPAR中のuPA結合ポケットを標的化する点で非常に有利である。実際、uPARのuPA結合ポケットに結合する、全てではないとしても、多くの公知の薬剤が、uPAR:VN相互作用のアゴニストであり、従ってシグナリングを誘導する。対照的に、本発明の分子uPAR-lockは、シグナリングを遮断する。
【００１４】
さらに、uPAR-lock分子の使用については、種特異性の障壁がない。uPA:uPAR相互作用に対する薬剤の評価における主な問題は、それらが広範囲の種特異性を示し、異種移植モデルにおいて化合物を確実に試験することを困難にするということである。uPAR-lockの特異性は、エフェクタードメインの種の起源を変化させることにより、容易に「設定」することができる。
【００１５】
本発明のアンタゴニスト分子は、Fcタグに起因する長いin vivo半減期などの優れた薬剤特性を示す。さらに、それはヒト配列から構成され、かくして、それは非免疫原性である。
【００１６】
uPAR-lock分子は、遮断剤として機能するように設計されたものである。uPARへのその高い親和性および特異性ならびにFc部分の存在によって、例えば、放射性核種、毒素などの好適なエフェクター分子とのコンジュゲーションにより、uPAR標的化診断および/または療法のために前記分子を好適に用いることができる。
【００１７】
かくして、本発明のアンタゴニスト分子は、多用途の臨床適用を有する。
【００１８】
従って、本発明の目的は、
-配列番号1の第11〜第42アミノ酸のu、PAの増殖因子様ドメイン(GFDドメイン)を含む第1のポリペプチド、もしくはuPAオーソロガス遺伝子に由来する対応する領域によりコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体もしくは類似体;および
-配列番号2の第5〜第39アミノ酸の、VNのソマトメジンBドメイン(SMBドメイン)を含む第2のポリペプチド、もしくはVNオーソロガス遺伝子に由来する対応する領域によりコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体もしくは類似体;
からなる群より選択される2つのポリペプチドを含むダイマー分子であって、2つのポリペプチドが分子足場により互いに連結される、前記分子である。
【００１９】
好ましくは、上記のダイマー分子中、
-第1のポリペプチドは、配列番号2の第5〜第39アミノ酸のSMBドメイン、もしくはVNオーソロガス遺伝子に由来する同じ領域によりコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体もしくは類似体をさらに含み;
および
-第2のポリペプチドは、配列番号1の第11〜第42アミノ酸のGFDドメイン、もしくはuPAオーソロガス遺伝子に由来する同じ領域によりコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体もしくは類似体をさらに含む。
【００２０】
本発明のダイマー分子は、当業界で公知の任意の手段により取得し得る。誘導体は、より長いか、またはより短い配列を有するポリペプチドであってよく、すなわち、酵素に対して耐性であるように改変されたものなどであってよい。
【００２１】
本発明のダイマー分子中、GFDドメインは、好ましくは、配列番号1の第8〜第48アミノ酸から本質的になり、より好ましくは、それは配列番号1の第1〜第48アミノ酸からなる。
【００２２】
本発明のダイマー分子中、SMBドメインは、好ましくは、配列番号2の第1〜第41アミノ酸からなる。
【００２３】
好ましい実施形態において、第1および第2のポリペプチドは、
a)N末端-SMBドメイン-GFDドメイン-C末端の順序の配列を含む、および
b)そのC末端を介して分子足場に連結される。
【００２４】
より好ましくは、SMBドメインおよびGFDドメインは、第1のリンカーペプチドにより連結される。前記第1のリンカーペプチドは、好ましくは、配列番号3の配列から本質的になる。
【００２５】
本発明のダイマー分子中、第1および第2のポリペプチドはそれぞれ、好ましくは、第2のリンカーペプチドを用いて分子足場に連結される。
【００２６】
前記リンカーペプチドは、好ましくは、配列番号4の配列から本質的になる。
【００２７】
本発明のダイマー分子の分子足場は、好ましくは、免疫グロブリン定常領域(Fc)、ロイシンジッパー、化学的リンカーまたはペプチドリンカーである。
【００２８】
本発明の実施形態において、Fcの重鎖定常領域はそれぞれ、本質的に、配列
PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLXaaCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKATPPVLDSDGSFFLXaaSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK、(式中、XaaはYまたはTのいずれかであってよい)(配列番号5)
を有する。
【００２９】
好ましい実施形態において、本発明のダイマー分子は、配列番号6の配列の第1のモノマー、および配列番号7の配列の第2のモノマーから本質的になる。
【００３０】
別の好ましい実施形態において、本発明のダイマー分子の第1および第2のモノマーは、配列番号8の配列を有する。
【００３１】
本発明の別の目的は、医学的使用のため、好ましくは、癌の治療としての使用のための上記ダイマー分子である。
【００３２】
好ましい実施形態において、本発明のダイマー分子は、治療剤にコンジュゲートされ、その治療剤は、好ましくは放射性核種または毒素である。
【００３３】
本発明のさらなる目的は、診断方法における使用のため、好ましくは、uPARにより媒介される病理または腫瘍の診断における使用のための上記ダイマー分子である。
【００３４】
本発明の他の目的は、治療上有効量の本発明のダイマー分子のそれを必要とする対象への投与を含む癌の治療方法であって、医薬組成物が本発明のダイマー分子と、好適な賦形剤または添加剤とを含む、前記方法である。前記医薬組成物はさらに、別の治療剤、好ましくは放射性核種または毒素を含んでもよい。
【００３５】
本発明の別の目的は、本発明のダイマー分子を含む、uPARにより媒介される病理または腫瘍の診断のためのキットである。
【００３６】
ここで、本発明を以下の図面を参照しながら非限定例によって説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】uPAR-lockの強制的近接性概念を例示する略図である。uPA結合により媒介される細胞外タンパク質分解におけるuPARの機能は、uPAの増殖因子様ドメイン(GFD)の受容体結合によって競合的に阻害することができる。VN結合により媒介されるシグナル伝達におけるuPARの機能は、VNのソマトメジンBドメイン(SMB)によって競合的に阻害することができる。以下のD1、D2およびD3はuPARドメインである。(A)競合的uPARアンタゴニストとしてのGFDおよびSMBドメイン。単離されたGFDおよびSMBの混合物を用いるuPAR機能の遮断には、2つの連続する第1の順序の分子間結合反応(1および2)が必要であり、受容体に初めて結合するのがGFDであるか、またはSMBであるかに応じて2つの経路(AおよびB)に従い得る。uPAR:GFD:SMB三元複合体、および従って、受容体阻害の全体の安定性は、最も弱い第2の結合反応、この場合、SMB結合(KD=360nM)によって制限される。既知の場合、個別の結合反応に関する実験的に決定された平衡定数は、Gardsvollら(Gardsvoll & Ploug, 2007)に由来するものである。(B)GFDおよびSMBドメインの両方を含有する分子足場の強制的近接性操作(「uPAR-lock」と命名される)。GFDおよびSMBが、共通の足場(uPAR-lock)への結合によって非常に近い位置に強制される場合、受容体阻害は同じシーケンスの結合反応に従う。しかしながら、重要なことは、第2の結合反応(A2およびB2)がここでゼロオーダー(すなわち、濃度非依存的)の分子内再編成であることである。このシナリオでは、受容体阻害の効率はかくして、最も強い初期結合反応、この場合、GFD部分の結合によってのみ制限される(予想されるKDは約0.29nM)。結果として、好適な足場を用いて作製されたuPAR-lockは、GFDおよびSMBの混合物よりも極めて強力な(1000倍を超える)uPAR機能のアンタゴニストであることが予測される。(C)足場。uPAR-lockを作製するために、いくつかの異なる型の足場を想定することができる。GFDおよびSMB分子を、共有ダイマーを形成する免疫グロブリン重鎖(Fc)の定常領域に結合させることができる。GFDおよびSMBドメインはまた、ヘテロダイマーを形成するように改変されたロイシンジッパー配列を用いてタグ付けすることもできる(Mollら、2001)。また、GFDおよびSMBドメインを、好適なリンカー領域を用いて単一のポリペプチド中に遺伝子操作することができる。
【図２Ａ】uPAR:GFD:SMB三元複合体の結晶構造を示す図である。uPAR(灰色)、uPAの受容体結合ドメイン(GFD、黒色)およびVNの受容体結合ドメイン(SMB、白色)の間の三元複合体の結晶構造。GFDおよびSMBのN末端残基(Gln2およびPro8)ならびにGFD、SMBおよびuPARのC末端残基(Lys48、Pro41、Asp274)を示す。GFD(Lys48)およびSMB(Pro41)のC末端残基はわずかに18.9Å離れており、同じ極性を有し、受容体から、および構造中のuPARのC末端残基(Asp274)により強調された推測される膜固定位置から遠い位置にあることに留意されたい。
【図２Ｂ】ヒト免疫グロブリン定常領域の結晶構造を示す図である。ダイマーヒトIgG重鎖定常領域(Fc)2の結晶構造。N末端残基(下図、Pro238)およびC末端残基(上図、Ser444)。2つのポリペプチドのN末端残基は、uPARに結合したGFDおよびSMBのC末端残基と同様に離れていることに留意されたい。ヘテロダイマー化を助けるように操作することができる2個の残基(Tyr407およびThr366、黒色)(Ridgwayら、1996)が図面の右側および左側に示される。この構造は、タンパク質データベース(PDB)エントリー3BT2および1H3Xに由来するものであり、MacPyMOLソフトウェアを用いて構成されたものである。
【図３】uPAR-lockトランスフェクト細胞の馴化培地がuPAR結合活性を示すグラフ(A)ならびに予測されるuPAR-lock構造の略図およびSDS-PAGEによる精製タンパク質の見かけ(B)を示す図である。(A)可溶性uPAR(5nM)で被覆された96穴プレートを、GFD/FcKおよびSMB/FcH(すなわち、uPAR-lock)を共に同時トランスフェクトしたPhoenix細胞に由来する馴化培地の連続希釈液と共にインキュベートした。ヒトFcを検出する二次試薬を用いて結合したuPARを検出した。uPAR被覆ウェルへの全結合(四角)、非被覆ウェルへの非特異的結合(三角)および特異的結合(丸)を示す。(B)uPAR-lockは、GFD/FcK(FcK=Fc「Knob」=Thr366→Tyr置換を担持するFc)とSMB/FcH(FcH=Fc「Hole」=Tyr407→Thr置換を担持するFc)の間の共有(ジスルフィド結合)ヘテロダイマーである。3μgの精製タンパク質を、非還元(左)および還元(右)条件下での12%SDS-PAGEにより分離し、ゲルをコロイドクマシー染色により染色した。
【図４】uPAR-lockのアンタゴニスト特性を示すグラフである。(A)Fcタグ付uPARは、固定されたuPAに高い親和性で結合する。固定されたuPAを、マウスFcでタグ付けされた増加する濃度のuPAR(uPAR/mFc)と共にインキュベートした。洗浄後、結合したuPAR/mFcを、ビオチン化抗マウスFc抗体およびユーロピウム標識ストレプトアビジンを用いて定量した。uPAR/mFcが固定されたuPAに対する特異的高親和性結合を示すことに留意されたい。(B)uPAR-lockは固定されたuPAへのuPAR結合を阻害する。固定されたuPAを、増加する濃度のuPAR-lock(菱形)またはuPA(丸)の存在下でuPAR/mFc(1nM)と共にインキュベートした。固定されたuPAに結合したuPAR/mFcの量を、上記のように定量した。uPAR-lockおよびuPAは両方とも、固定されたuPAに対するuPAR/mFc結合の競合的アンタゴニストであることに留意されたい。(C)固定されたVNへのuPARの高親和性結合は、uPAを必要とする。固定されたVNを、増加する濃度のuPAと混合したuPAR/mFc(5nM)と共にインキュベートした。洗浄後、結合したuPAR/mFcを上記のように定量した。固定されたVNへのuPAR/Fc結合にとってはuPAが必要であることに留意されたい。(D)uPAR-lockは、VNに対するuPAに誘導されるuPAR結合を阻害する。固定されたVNを、uPAR/mFc(1nM)、uPA(5nM)および増加する濃度のuPAR-lock(菱形)またはuPA(丸)と共に同時インキュベートした。洗浄後、結合したuPAR/mFcを上記のように定量した。uPAとは対照的に、uPAR-lockは、固定されたVNに対するuPAR結合のアンタゴニストであることに留意されたい。
【図５】VNへの細胞接着を示すグラフである。uPAR-lockは、VNへのuPARに媒介される細胞接着を特異的に阻害する。50nMのuPAR-lockの存在下または非存在下で、モックトランスフェクト細胞および293/uPART54A細胞を、VNで被覆された96穴Eプレート中に播種した(20,000個/ウェル)。リアルタイム細胞分析装置(RTCA)中で3時間にわたって2分毎にインピーダンス(細胞指数)を測定することにより、細胞接着を定量した。基底細胞接着(αvβ5インテグリンにより媒介される(Madsenら、2007))がプラトーに達した時、ウェルに最終濃度10nMとなるようにuPAを添加して、VNに対するuPART54A結合を誘導し、記録を継続した。uPAR-lockが293/uPART54A細胞の細胞接着のuPAに誘導される増加を完全に阻害することに留意されたい(uPA添加後の曲線を比較されたい)。uPAR-lockはインテグリン媒介性接着に影響せず(uPA添加前の曲線を比較されたい)、uPAは空のpcDNA5/FRT-TOベクター(293/モック)でトランスフェクトされた細胞の接着を調節しない。
【図６Ａ】uPAR-lockおよび対照変異体の略図である。上記のように、uPAR-lockは、Fcタグ付GFDとSMBドメインとのヘテロダイマーである。GFD/GFDおよびSMB/SMBハイブリッドは、uPAR-lockと同じ方法で構築されるが、両ポリペプチド上にGFDまたはSMBドメインのいずれかを有する。いくつかの実験については、GFD/GFDおよびSMB/SMBの混合物は、uPAR-lockと同じドメイン組成を有するが、GFDおよびSMBドメインは別々の足場上に位置するため、これを用いた。
【図６Ｂ】uPAR-lockおよび対照タンパク質の見かけを示す図である。3マイクログラムの精製タンパク質を、非還元(左)および還元(右)条件下で10%SDS-PAGEにより分離し、ゲルをコロイドクマシー染色により染色した。
【図６Ｃ】固定されたuPARへの結合を示すグラフである。増加する濃度のuPAR-lock(丸)、GFD/GFD(四角)、SMB/SMB(上向きの三角)およびGFD/GFD+SMB/SMB(下向きの三角)を、固定されたuPARに結合させた。結合したタンパク質を、ヒトFcを検出する二次試薬を用いて検出した。最も強い結合はuPAR-lockについて認められることに留意されたい。
【図６Ｄ】uPAR-lockおよび対照タンパク質による固定されたuPAに対するuPAR/mFc結合の阻害を示す図である。固定されたuPAを、uPAR/mFc(1nM)と増加する濃度のuPAR-lockとの混合物と共にインキュベートし、結合したuPAR/mFcを図4Bに記載のアッセイを用いて定量した。GFDドメインを含有する全調製物が競合的uPAR/uPA相互作用アンタゴニストとして作用することに留意されたい。
【図７】VNへのuPAR媒介性細胞接着に対するuPAR-lockの阻害活性にはGFDとSMBとの強制的近接性が必要であることを示すグラフである。293/uPAR(A)および293/uPART54A(B)細胞(20,000個/ウェル)を、uPAR-lock(赤色)、GFD/GFD(黄色)、SMB/SMBまたはGFD/GFD+SMB/SMB(青色)の非存在下(黒色)または存在下、VN被覆された96穴Eプレート中に播種し、接着させた。播種の2時間後、ウェルに10nMとなるようにuPAを添加し、細胞接着の測定をさらに2時間継続した。uPAR-lockがVNへのuPA非依存的uPAR媒介性細胞接着(図7A中のuPA添加前の赤色と黒色の曲線を比較されたい)ならびにuPA誘導性接着(図7Aおよび7B中のuPA添加後の赤色と黒色の曲線を比較されたい)を阻害することに留意されたい。対照的に、GFD/GFDおよびGFD/GFD+SMB/SMBは両方とも、uPAR媒介性VN接着の強力なアゴニストである(図7Aおよび7B中のuPA添加前の黄色および緑色の曲線と黒色の曲線とを比較されたい)。SMB/SMBは、大部分は不活性である。
【図８】uPAR-lockはuPAR媒介性細胞移動を阻害し、GFDとSMBとの強制的近接性が必要であることを示すグラフである。293/uPAR細胞を、完全血清含有培地中、12穴プレート中に播種し、一晩接着させた。次の日、培地を、何も含有しない(左)、またはuPAR-lockを含有する(中央)、またはGFD/GFD+SMB/SMBを含有する(両方とも20nM、右)完全培地と交換し、経時的顕微鏡に移した。以前に記載のように(Madsenら、2007)、無作為細胞移動を記録し、ImageJソフトウェアを用いる手動細胞トラッキングにより定量した。それぞれのドットは単一の細胞を表す。平均移動速度(+/-95%信頼区間)を示す。データを非パラメータ分析により分析し、複数の比較について補正した(***P<0.001、**P<0.01およびns P>0.05)。uPAR-lockが293/uPAR細胞の移動を劇的に阻害することに留意されたい。
【図９Ａ】単一のポリペプチド鎖内にGFDおよびSMBドメインを含有するホモダイマーuPAR-lock変異体の構造を示す略図である。上記のように、uPAR-lockは2つの異なるポリペプチド上に位置し、ヘテロダイマー化を助けるためにKnobおよびhole突然変異を含有するヒトFc定常領域でタグ付けられたGFDおよびSMBを含むジスルフィド結合したヘテロダイマーである。対照的に、GFD-SMB/mFcおよびSMB-GFD/mFcは、同じポリペプチド鎖上にSMBとGFDドメインの両方を含有するホモダイマーである。
【図９Ｂ】ホモダイマーuPAR-lock変異体の阻害活性を示すグラフである。ヒトuPARを発現する293細胞を、VNで被覆された96穴Eプレート中に播種し、リアルタイム細胞分析装置(RTCA、xCELLingence、SP Roche Corp.)に移した。細胞接着の尺度である電気インピーダンス(細胞指数、CIと呼ばれる)を規則的な間隔で記録した。CIが完全な細胞接着を示唆するプラトーに達した時、ウェルに、グラフに示される最終濃度となるように3倍希釈曲線のSMB-GFD/mFcを添加した。Eプレートを装置に戻し、インピーダンスの測定を規則的な間隔で継続した。阻害剤を添加した時点(T=0)および図9Cに示される用量応答曲線の計算に用いられる時点(T=1h)を縦の点線で示す。この曲線は、時間(X軸)の関数として正規化された細胞指数(NCI、Y軸)を示す。全ての細胞指数を、阻害剤添加の直前に測定された細胞指数に対して正規化した。
【図９Ｃ】ホモダイマーuPAR-lock変異体の阻害活性を示すグラフである。IC50値を決定するために、試薬添加の1時間後に測定されたNCIを、同じ時点でビヒクル処理された細胞に関するNCIの%(ΔNCI、Y軸)で算出し、阻害剤濃度(X軸)の関数でグラフ化した。S字状用量応答曲線(可変勾配)を、Prism 5ソフトウェアスイートを用いて適合させ、その誘導されたIC50値を示す。
【図１０Ａ】ヘテロダイマーuPAR-lockおよびホモダイマーuPAR-lockV2、ならびにSMBドメインとuPARとの相互作用を弱めるこのドメイン中に単一のアミノ酸置換(D22A)を担持するこれらの変異体の構造を示す略図である(Okumura Yら、J Biol Chem 2002)。uPAR-lockV2は、uPAR-lockV2中の定常領域(Fc)がヒトIgGから誘導されることを唯一除いて、図9Aに示されるSMB-GFD/mFcと同一である。
【図１０Ｂ】uPAR-lockV2活性および原理の証明を示すグラフである。ヒトuPARを発現する293細胞を、VN(1-66)/FcRADで被覆された96穴Eプレート中に播種し、リアルタイム細胞分析装置(RTCA、xCELLingence、SP Roche Corp.)に移した。細胞を、uPAR-lockおよびuPAR-lockV2の希釈曲線で処理し、図9に示されるように用量応答曲線を算出した。
【図１０Ｃ】uPAR-lockV2活性および原理の証明を示すグラフである。D22A置換されたuPAR-lock変異体を用いた図10Bと同じ実験である。これらの変異体が接着を刺激することに留意されたい。
【図１１】uPAR-lockV2によるin vivoでの腫瘍成長の阻害を示すグラフである。in vivoで増殖した前立腺癌に対するuPAR-lockV2の効果を示す。オスのBalb C nu/nuマウスに、皮下注射経路により(1x106)個のPC-3細胞を接種した。動物をビヒクル(PBS)、10.0mg/kgの対照マウス免疫グロブリンまたはuPAR-lockV2で腹腔内経路により処理した。腫瘍を週に2回測定し、腫瘍体積を材料および方法に記載のように決定した。対照からの有意差を星印で表す(*P<0.05、**P<0.01および***P<0.001)。
【図１２】uPAR-lockはPC-3腫瘍細胞増殖を減少させ、in vivoでアポトーシスを促進することを示す図である。オスの無胸腺nu/nuマウスにPC-3細胞を皮下接種し、腹腔内経路を介するPBSまたは10.0mg/kgのuPAR-lockV2の週2回の注射により処理した。異種移植の8週間後、腫瘍を収穫し、材料および方法の節に記載のように免疫組織化学分析(図12A)にかけた。Ki-67およびカスパーゼ3染色を示し、核をDapiで対比染色する。データの定量化を図12Bに示す。
【図１３】uPAR-lockを用いる腫瘍標的化を示す図である。PC-3腫瘍を担持するマウスに、Alexa488で標識されたuPAR-lockV2またはAlexa488で標識されたマウスIgGを注射し、24時間後、腫瘍を切り出し、蛍光顕微鏡観察により分析した。蛍光の明らかな領域が標識されたuPAR-lockV2を注射された動物に由来する腫瘍中で観察することができる(右図の輪郭を描いた領域)が、標識されたマウスIgGで処理されたマウスに由来する腫瘍中では同様の領域は観察されない。代表的なマイクログラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
実験手順
uPA、VNおよびuPARのアミノ酸配列
斜体で示すシグナルペプチド(Met-20〜Gly-1)、太字で示す成熟タンパク質(Ser1〜Leu411)および太字/下線付きで示すuPAR結合増殖因子様ドメイン(GFD、Ser1〜Lys48)を含むヒトuPAのアミノ酸配列:
【００３９】
【表１】
2014502965.tif 000002
【００４０】
斜体で示すシグナルペプチド(Met-19〜Ala-1)、太字で示す成熟タンパク質(Asp1〜Leu459)および太字/下線付きで示すuPAR結合ソマトメジンBドメイン(SMB、Asp1〜Pro41)を含むヒトVNのアミノ酸配列:
【００４１】
【表２】
2014502965.tif 000003
【００４２】
斜体で示すシグナルペプチド(Met-22〜Gly-1)、下線付きの斜体で示す、Gly283に結合した糖脂質膜アンカーの付加の際の合成中に除去されるC末端ペプチド(Ala284〜Thr313)、および太字で示す成熟タンパク質(Leu1〜Gly283)を含むヒトuPARのアミノ酸配列:
【００４３】
【表３】
2014502965.tif 000004
【００４４】
発現ベクターの構築
Fcタグ付SMBおよびGFDのための発現ベクターは、pFRT/TO-Fcプラスミド(Madsenら、2007)に基づくものであるが、いくつかの改変を導入して、様々なコード領域のシャッフリングを容易にし、ならびにタンパク質収率を改善し、特異的プロテアーゼ切断による組換えタンパク質からのFcタグの除去を可能にした。第1に、Fcコード領域の下流のベクター配列中に位置するXhoI制限部位を、dXu/dXdオリゴを用いる部位特異的突然変異誘発によって破壊した。第2に、PreF/PreRオリゴをアニーリングさせることにより作製したPreScissionプロテアーゼの切断配列をコードするリンカーを、シグナルペプチド/Fc連結部に位置するXhoI部位に挿入した。組換えタンパク質の収率を増加させることがわかった構築物のFc領域中に存在するイントロンを除去するために、ベクターをCHO細胞中にトランスフェクトし、RNAを抽出し、逆転写し、cDNAをhVNukpn/FcNrオリゴを用いて増幅した。PCR産物をKpnI/NotIで消化し、これを用いて親ベクターの対応する断片を置換し、pFRT/TO-Fcを作製した。一過的タンパク質発現のために、FcカセットをpEGFP-N1ベクター(Clontech Inc.)のKpnI/NotIに導入し、pN1-Fcを作製した。Knobおよびhole突然変異(T366YおよびY407T(Ridgwayら、1996))を、FcKnobF/FcKnobRおよびFcHoleF/FcHoleRオリゴ対を用いる部位特異的突然変異誘発によりFc領域中に導入して、それぞれベクターpN1-FcKおよびpN1-FcHを得た。VNのシグナルペプチド(陰性アミノ酸はシグナルペプチド配列を指す)およびSMBドメイン(Met-19〜Pro41、MAPLRPLLILALLAWVALADQESCKGRCTEGFNVDKKCQCDELCSYYQSCCTDYTAECKP(配列番号10の第1〜第60アミノ酸)(シグナルペプチドを斜体で示す)をコードする配列を、hVNukpn/SMBRV2オリゴを用いてVN cDNAを増幅することにより作製し、pN1-FcKおよびpN1-FcH中のKpnI/XhoI部位にクローニングした。uPAのシグナルペプチドおよびGFDドメイン(アミノ酸Met-20〜Lys48、MRALLARLLLCVLVVSDSKGSNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSK(配列番号9の第1〜第68アミノ酸)(シグナルペプチドを斜体で示す)をコードする配列を、ATFkpnF/GFDRVオリゴを用いるヒトuPA cDNAの増幅により作製し、SMBについて記載されたようにクローニングした。このクローニング戦略は、GSGLELEVLFQGPIE(配列番号4)リンカーによりヒトIgG1のヒンジおよびFc領域に接続されたGFD(残基1〜48、(配列番号1))またはSMB(残基1〜41、(配列番号2))から構成される成熟融合タンパク質をもたらす。Fcタグ付uPARのための発現ベクターを、オリゴURfSK/uPARXdオリゴを用いるヒトuPAR cDNAの増幅により作製し、生成物をpFRT/TO-Fc中のKpnI/XhoI部位にクローニングした。マウス免疫グロブリン重鎖定常領域(mFc)でタグ付けしたuPARのための発現ベクターを、pEGFP-N1(KpnI/XhoIで消化)中で(uPAR cDNA、増幅されたURfSK/UpreR2D、Kpn/XhoIで消化)およびIgG1 cDNA(クローンIRAVp968B035D、imaGenes GmbHから入手、増幅されたmFcU/mFcD、XhoI/NotIで消化)を集合させることにより作製した。得られる成熟キメラタンパク質(uPAR/mFc)は、ヒトuPAR残基1〜277、LEVLFQPLEAGAG(配列番号36)リンカーおよびマウス免疫グロブリン重鎖の第216〜第441アミノ酸から構成される((Adetugbo、1978)に従って番号付けられる)。
【００４５】
全てのコード領域の予想される配列を配列決定により確認した。
【００４６】
オリゴヌクレオチド配列:
dXu 5'-gtaaatgagcggccgcgtcgagtctagaggg-3'(配列番号12)
dXd 5'-ccctctagactcgacgcggccgctcattta-3'(配列番号13)
PreF 5'-tcgagctggaagttctgttccaggggccca-3'(配列番号14)
PreR 5'-agctacccggggaccttgtcttgaaggtcg-3'(配列番号15)
hVNukpn 5'-cggggtaccatggcacccctgaga-3'(配列番号16)
FcNr 5'-ttgcggccgctcatttacccggagacag-3'(配列番号17)
FcKnobF 5'-aaccaggtcagcctgtactgcctggtcaaaggc-3'(配列番号18)
FcKnobR 5'-gcctttgaccaggcagtacaggctgacctggtt-3'(配列番号19)
FcHoleF 5'-ggctccttcttcctcaccagcaagctcaccgtg-3'(配列番号20)
FcHoleR 5'-cacggtgagcttgctggtgaggaagaaggagcc-3'(配列番号21)
ATFkpnF 5'-gcggtacccgccaccatgagagccctgctggcgcgc-3'(配列番号22)
GFDRV 5'-gcctcgagtcctgatccttttgacttatctatttcaca-3'(配列番号23)
SMBRV2 5'-gcctcgagtcctgatccgggcttgcactcagccgt-3'(配列番号24)
URfSK 5'-gcgtcgacggtacccgccaccatgggtcacccgccgctgctg-3'(配列番号25)
uPARXd 5'-agcctcgagcccactgcggtactggacatc-3'(配列番号26)
UpreR2D 5'-gcctcgaggggcccctggaacagaacttccagatccaggtctgggtggttacagccac-3'(配列番号27)
mFcU 5'-gcctcgaggcaggagcaggacccagggattgtggttgtaa-3'(配列番号28)
mFcD 5'-gcgcggccgctcatttaccaggagagtg-3'(配列番号29)
【００４７】
uPAR-lockの組成
上記のように構築されたuPAR-lockの組成は、分子、特に、2つのポリペプチドGFD/FcKおよびSMB/FcHから構成されるジスルフィド結合したヘテロダイマーであり、以下のアミノ酸組成を有する(N末端からC末端、IUPAC)。
【００４８】
【表４】
2014502965.tif 000005
【００４９】
以下のものから構成される:
太字:ヒトuPA(第1〜第48アミノ酸)*(配列番号1に対応する)、斜体:人工リンカー領域**ならびに太字の斜体:「Knob」置換(Y407T、下線付き)を含有するヒト免疫グロブリン(IgG)ヒンジおよび定常領域(Fc)***。
*より短い、および長いuPAの小片も機能し得る。第11〜第42アミノ酸 (下線付き)を含む配列は、最少の機能的配列を表してもよい。
**異なる長さおよび配列のリンカー領域が同等に、またはより良好に機能し得る。最少の長さは0であってよい(すなわち、リンカーなし)。
***この研究では「Knob」置換を用いて、発現の間に形成されるヘテロダイマーの量を増加させるが、ヘテロダイマーの阻害品質に対する効果を有さないと予測される。
【００５０】
【表５】
2014502965.tif 000006
【００５１】
以下のものから構成される:
太字:ヒトVN(第1〜第41アミノ酸)*(配列番号2に対応する)、斜体:人工リンカー領域**ならびに太字の斜体:「Hole」置換(T366Y、下線付き)を含有するヒト免疫グロブリン(IgG)ヒンジおよび定常領域(Fc)***。
*より短い、および長いVNの小片も機能し得る。第5〜第39アミノ酸 (下線付き)を含む配列は、最少の機能的配列を表してもよい。
**異なる長さおよび配列のリンカー領域が同等に、またはより良好に機能し得る。最少の長さは0であってよい(すなわち、リンカーなし)。
***この研究では「Hole」置換を用いて、発現の間に形成されるヘテロダイマーの量を増加させるが、ヘテロダイマーの阻害品質に対する効果を有さないと予測される。
【００５２】
組換えタンパク質の発現および精製
Phoenix細胞(半集密の10cmプレート)を、予め温めた無血清DMEMで1回洗浄し、8mlのOptiMEM(Invitrogen)を添加した。uPAR-lock(すなわち、GFD/SMB-FcK/H)について、培養物を、Fugeneトランスフェクション試薬(Roche)を製造業者の説明書に従って用いて、pN1-GFD/FcKおよびpN1-SMB/FcHの混合物(3+3μg/10プレート)でトランスフェクトした。対照タンパク質GFD/GFDおよびSMB/SMBを、それぞれpN1-GFD/hFcK + pN1-GFD/hFcHおよびpN1-SMB/hFcK + pN1-SMB/hFcHを同時トランスフェクトすることにより発現させた。トランスフェクトされた培養物を6〜8日間静置した後、上清を回収し、濾過した(0.45μm)。タンパク質をプロテインAセファロース上で精製し、0.1M Glycine pH2.8、0.5M NaClを用いて溶出し、PBSに対して大規模に透析した。
【００５３】
in vitro結合アッセイ
96穴イムノプレート(NUNC MaxiSorb、blackwell)を、4℃ONでコーティングバッファー(50mM炭酸ナトリウム、pH9.6)に希釈したpro-uPAまたはVN(100μl、10nM)で被覆した。プレートを、洗浄バッファー(0.1%Tween-20(PBS-T)を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS))で洗浄し、RTで1〜2時間、ブロッキングバッファー(2%ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するPBS)を用いて非特異的結合部位を遮断した(0.15ml/ウェル)。PBS-Tで洗浄した後、希釈バッファー(1%BSAを含有するPBS)中で調製された試験しようとするアゴニストおよびアンタゴニストの存在下または非存在下で、ウェルをuPAR/mFc(1nM)と共にインキュベートした。RTで1〜2時間、結合を起こさせ、プレートを洗浄バッファーで3回洗浄した。ビオチン化ヤギ抗マウスFc抗体(Sigma)およびEu3+標識ストレプトアビジン(Perkin Elmer)との連続的インキュベーションにより、結合したuPAR/mFcを検出した。DELFIAプロトコルを用いるEnvision Xciteプレートリーダー(Perkin Elmer)を用いる解離-増強時間分解蛍光測定により、結合したEu3+を定量した。
【００５４】
細胞系
293/uPAR、293/uPART54Aおよび293/モック細胞系を、以前に詳細に記載されたように(Madsenら、2007)、野生型ヒトuPAR cDNA(293/uPAR)、Thr54Ala置換を含むuPAR cDNA(293/uPART54A)を含有するpcDNA5/FRT-TO発現ベクターまたは空の発現ベクター(293/モック)を用いるHEK293 Flp-In T-REx細胞(Invitrogen Corp.)の安定なトランスフェクションにより作製した。
【００５５】
接着アッセイ
細胞をE-プレート(Roche)のウェル中に播種し、リアルタイム細胞分析装置(RTCA、xCELLingence SP、Roche)を用いて規則的な間隔で細胞接着をモニターした。RTCAシステムは、組織培養96穴E-プレートの底部で一体化された互いに入り込んだ微小電極間の電気インピーダンスを測定するものである。電極頂部の細胞の存在は、電極/溶液境界面での局所イオン環境に影響し、電極インピーダンスの増加をもたらす。細胞接着が強くなるほど、電極インピーダンスが増加する。
【００５６】
移動アッセイ
CO2および温度を制御するためのインキュベーションチャンバ(OKOlab)を備えたOlympus IX80倒立顕微鏡を用いて、37℃、5%CO2で経時的生細胞画像化を実施した。細胞を、1x105細胞/ウェルの集密度で12穴プレート(Nunc)中に塗布した。経時的画像化は血清を含有する増殖培地中で実施した。10x(uPlan FLN 10X Ph1、N.A. 0.30;Olympus)対物レンズを通して細胞を観察し、5hにわたって5分毎に写真を撮影した。獲得システムは、デジタルカメラ(Hamamatsu Orca-ER)およびSystem Control Software Olympus ScanRを含む。明るさ/コントラスト、スムージングおよび画像の鮮明さの調整を、ImageJ 1.42qを用いて行い、常に全画像に適用した。細胞の移動速度を、プラグイン「マニュアルトラッキング」を用いるImageJ 1.42qを用いて定量した。この実験では、無作為に選択された細胞を追跡し、実験を通じたその平均移動速度を算出した。
【００５７】
SMB-GFD/mFcおよびGFD-SMB/mFcのクローニング
マウスIgG定常領域でタグ付けした組換えタンパク質のための発現ベクター(pFRT/TO-mFc)を、pFRT/TO-FcのヒトFc領域をuPAR/mFc発現ベクターから取ったマウスFc領域と(Xho1/Not1)で置換することにより作製した。GFD-SMBキメラを作製するために、ヒトuPA cDNAをATFkpnF/GLINKRオリゴを用いて増幅し、ヒトVN cDNAをSLINKF/SMBRV2オリゴを用いて増幅した。2つのPCR産物を精製し、ATFkpnF/SMBRV2オリゴを用いて同時増幅した。SMB-GFDキメラを作製するために、ヒトVN cDNAをhVnUkpn/SLINKRオリゴを用いて増幅し、ヒトuPA cDNAをGLINKF/GFDRVオリゴを用いて増幅した。2つのPCR産物を精製し、VnUkpn/GFDRVオリゴを用いて同時増幅した。GFD-SMBおよびSMB-GFDキメラを、pFRT/TO-mFc中のKpn1/Xho1にクローニングして、GFD-SMB/mFcおよびSMB-GFD/mFcをコードする発現ベクターを作製した。ヒトFcでタグ付けしたSMB-GFDキメラをコードする発現ベクター(SMB-GFD/Fc、uPAR-lockV2)を、SMB-GFDキメラをpFRT/TO-Fc中のKpn1/Xho1にクローニングすることにより作製した。
【００５８】
組換えタンパク質の発現および精製
pFRT/TO-GFD-SMB/mFc、pFRT/TO-SMB-GFD/mFcおよびpFRT/TO-SMB-GFD/Fc発現ベクターを、CHO Flp-In細胞(Invitrogen Corp.)中にトランスフェクトし、以前に記載のように(Madsenら、JCB 2007)、無血清条件下で組換えタンパク質を発現させた。標準的なプロテインAアフィニティクロマトグラフィーにより、馴化培地から組換えキメラを精製し、PBSに対して大規模に透析した。
【００５９】
オリゴヌクレオチド配列
SLINKF: 5'-tcaggcggaggtggctctggcggtggcggacaagagtcatgcaagggc-3'(配列番号30)、
GLINKR: 5'-agagccacctccgcctgaaccgcctccaccggtttttgacttatctat-3'(配列番号31)、
SLINKR: 5'-agagccacctccgcctgaaccgcctccaccgggcttgcactcagccgt-3'(配列番号32)、
GLINKF: 5'-tcaggcggaggtggctctggcggtggcggaccatcgaactgtgactgt-3'(配列番号33)。
【００６０】
異種移植実験
6週齢のオスのBalb C nu/nuマウスを、Charles Riverから取得した。接種前に、血清含有培地中で増殖しているPC-3細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、トリプシン処理により収穫し、1200rpmで7分間沈降させた。細胞(1.0x106個)を、20%Matrigelを含む200μlのPBS中に再懸濁した。動物をAvertinの腹腔内(i.p.)注射により麻酔し、1.0x106個の細胞を、26ゲージの針を用いて麻酔したマウスの右脇腹に皮下(s.c.)接種した。異種移植の5日後、動物を、ビヒクル(n=5、PBS)、非免疫マウスIgG1(n=5、10mg/kg)でi.p.で週に2回処理する2つの対照群と、動物をuPAR-lock V2(n=5、10mg/kg)で処理する実験群とに動物を無作為化した。動物を、腫瘍の発生および増殖について7週間にわたって週に2回モニターした。腫瘍体積を、式:腫瘍体積=短い方の直径2x長い方の直径/2に従って決定した。明白な腫瘍を生じなかった2匹のマウス(1匹はIgG対照群由来であり、1匹はuPAR-lock V2群由来である)を分析から排除した。PBSおよびIgG処理動物において腫瘍成長の有意差はなく(データは示さない)、これらのマウスに由来するデータを、uPAR-lock V2実験群(n=4)との比較のためにプールした(n=9)。結果を平均±SEとして分析し、実験データの比較を、対応のない両側等分散t検定により分析した。
【００６１】
GFD-SMB/mFc、SMB-GFD/mFcおよびSMB-GFD/hFc(uPAR-lockV2)の比較
上記構築物の組成は、分子、特に、2つのポリペプチドGFD-SMB/mFcまたはSMB-GFD/mFcまたはSMB-GFD/hFcから構成されるジスルフィド結合したホモダイマーであり、以下のアミノ酸組成を有する(N末端からC末端まで、IUPAC)。
【００６２】
【表６】
2014502965.tif 000007
【００６３】
GFD-SMB/mFcは、ヒトuPAの残基1〜49(GFD、標準文字)、GGGGSGGGGSGGGG(配列番号3)リンカー(下線付き)、ヒトVNの残基2〜41(SMB、太字)、GSGLEAGAG(配列番号34の第104〜第112アミノ酸)リンカー(下線付きの斜体)およびマウス免疫グロブリンに由来する重鎖定常領域(mFc、斜体)から構成される。
【００６４】
【表７】
2014502965.tif 000008
【００６５】
SMB-GFD/mFcは、ヒトVNの残基1〜41(SMB、標準文字)、GGGGSGGGGSGGGG(配列番号3)リンカー(下線付き)、ヒトuPAの残基8〜48(GFD、太字)、GSGLEAGAG(配列番号34の第104〜第112アミノ酸)リンカー(下線付きの斜体)およびマウス免疫グロブリンに由来する重鎖定常領域(mFc、斜体)から構成される。
【００６６】
【表８】
2014502965.tif 000009
【００６７】
GFD-SMB/hFc(uPAR-lockV2)は、ヒトVNの残基1〜41*(SMB、標準文字)(配列番号2に対応する)、GGGGSGGGGSGGGG(配列番号3)リンカー**(下線付き)、ヒトuPAの残基8〜48***(GFD、太字)(配列番号1の第8〜第48アミノ酸に対応する)、GSGLELEVLFQGPIE(配列番号4)リンカー**(下線付きの斜体)およびヒト免疫グロブリンに由来する重鎖定常領域(hFc、斜体)から構成される。
*より短い、および長いVNの小片も機能し得る。第5〜第39アミノ酸 (灰色の影付き)を含む配列は、最少の機能的配列を表してもよい。
**異なる長さおよび配列のリンカー領域が同等に、またはより良好に機能し得る。最少の長さは0である(すなわち、リンカーなし)。
***より短い、および長いuPAの小片も機能し得る。第11〜第42アミノ酸 (下線付きの太字)を含む配列は、最少の機能的配列を表してもよい。
【００６８】
免疫組織化学分析
免疫組織化学分析のために、原発腫瘍を切り出し、4%パラホルムアルデヒド(ホルマリン)中で固定し、最適切断温度(OCT)樹脂(Killik、BIO-OPTICA)中に埋込んだ。組織ブロックを8μmで切片化し、免疫染色のために正に荷電したガラススライド上に載せた。Ki-67染色のために、切片を4℃で1分間、アセトンと共にインキュベートした。スライドをPBSで洗浄した後、RTで1h、予備インキュベーションバッファー(6%BSAおよび10%FBSを含むPBS)中でブロッキングした。スライドを4℃で一晩、Ki-67抗体(1:500に希釈)と共にインキュベートした後、PBSで洗浄した。検出のために、抗ウサギCy3(1:200)およびDAPI(1:2500)を用いた。スライドをVectamount AQを用いてマウントした。アポトーシス細胞の検出のために、切片を室温で1分間、80%エタノールと共にインキュベートした。スライドをPBSで洗浄した後、RTで1h、予備インキュベーションバッファー中でブロッキングした。一次抗体(切断されたカスパーゼ3、1:200)のインキュベーションを4℃で一晩行った後、PBSで洗浄した。Ki-67染色されたスライドに関して検出を行った。細胞増殖およびアポトーシスの定量のために、動物あたり合計24個の切片を、それぞれ10倍の倍率で分析した。データを、視野あたりの陽性細胞の平均数として示す。
【００６９】
腫瘍画像化実験のために、uPAR-lockV2およびマウスIgGを、製造業者の説明書に従ってAlexa488染料で標識した。PC-3腫瘍を担持するマウス(異種移植後8週間)に、腹腔内経路により50μgの標識タンパク質を注入し、24時間後に腫瘍を収穫した。腫瘍組織を、免疫組織化学分析について記載されたように加工した。
【００７０】
結果
uPAR-lockの原理
uPAの増殖因子様ドメイン(GFD)およびVNのソマトメジンBドメイン(SMB)は、無傷分子のuPAR結合決定因子の全部を含有するが、細胞外タンパク質分解および細胞シグナリングにおけるその生物活性を欠く。その結果、これらのドメインは、それぞれuPAR:uPAおよびuPAR:VN相互作用の特異的競合的アンタゴニストである。uPARのuPAとVNの両方により媒介される生物活性の完全な阻害には、受容体上の両結合部位の占有が必要であり、これは図1Aに例示される通り、単離されたGFDおよびSMBドメインを用いて達成することができる。阻害には2つの連続的な1番目の分子間結合反応(1および2)が必要であり、どのリガンドが受容体に最初に結合するかに応じて2つの経路(AまたはB)に従い得る。この手法によるin vivoでのuPAR阻害の有効性は、異なる相互作用の親和性および従って、in vivoで達成および維持することができるGFDおよびSMBの濃度に応じて制限される。GFDおよびSMBドメインはむしろ小さいため、それらは循環から迅速に消失する可能性が非常に高い。SMBドメインは受容体に対するGFDの親和性(KD=0.29nM)よりも約1000倍弱いuPARに対する親和性を有するため(KD=360nM)(Gardsvoll & Ploug、2007)、このドメインの結合はこの手法の有効性を制限する可能性が特に高い。
【００７１】
uPAR機能を遮断するためのGFDおよびSMBを用いる有効性を有意に改善するために、著者は、共通の足場への結合による2つのドメイン間の強制的近接性が、単離されたドメインと比較して大きく改善された阻害特性を有する化合物(uPAR-lockと命名された)をもたらし得るとの仮説を立てた(図1B)。uPAR-lockにおいては、GFDおよびSMBドメインは共通の足場上に位置するため、阻害にとって必須である第2の結合反応(A2およびB2)はここでゼロオーダーの分子内再配置である(すなわち、濃度非依存的)。この第2の結合反応は分子内結合反応よりも数桁規模でより効率的であると予想されるため、uPAR-lockの阻害活性は、初期の結合(反応A1またはB1)およびいかによく足場が設計されるかによってのみ制限される。その結果、uPAR-lockはGFDよりも強力なuPAアンタゴニスト(類似した結合速度、低下した解離速度)であり、SMBよりも非常に強力なVNアンタゴニスト(>1000倍)(類似した結合速度、劇的に低下した解離速度)である。
【００７２】
GFD/SMB-足場は、図1Cに示されるものと異なる方法で作製することができる。GFDおよびSMBドメインを免疫グロブリン重鎖定常領域(Fc)に結合させ、共有ヘテロダイマーを単離することができる。また、所望のGFD/SMB-足場をロイシンジッパーのようなダイマーを形成するペプチド配列を用いて作製することもできる。最後に、GFDおよびSMBドメインを、好適なリンカーを含有する単一のポリペプチドとして発現させることができる。一例として、本研究では、免疫グロブリン足場を用いた。より長いか、またはより短い小片のGFDおよびSMBも同様に機能し得る。さらに、GFDおよびSMBはオルトログ遺伝子から誘導することができる。GFDおよびSMBを足場に接続するリンカーの長さおよび配列を変化させることにより、活性をさらに改善することができる。uPAR結合を改善するSMBおよびGFD中の突然変異を導入することもできる。ロイシンジッパーおよび単一ペプチド足場手法も好適である。「uPAR-lock」はGFDおよびSMBドメインに基づくものである必要は必ずしもない。これらの構成要素の一方または両方を、他のuPAR結合ドメイン(抗体断片など)またはuPA結合部位および/もしくはVN結合部位と同一であるか、またはそれと重複する部位でuPARに結合するペプチドと置換することができる。
【００７３】
uPAR-lockの構築
uPAR、uPAのアミノ末端断片(ATF)およびVNのソマトメジンBドメイン(Huaiら、2008)の間の三元複合体の結晶構造の精査は、uPAおよびVNのペプチド骨格がいくつかの位置で近くに位置することを示している。特に、uPA中のLys48とVN中のPro41は約19Å離れているに過ぎない(図2A)。これらの位置のuPAおよびVNのペプチド骨格極性はほぼ平行であり、受容体から外側に向かっており、膜固定位置から遠い。かくして、uPAの残基1〜48(すなわち、GFD)およびVNの残基1〜41(すなわち、SMB)をそのC末端を介して共通の足場に接続することにより、uPARへの両ドメインの同時的および構成的結合を助けるキメラが生成されると予測される。
【００７４】
共通の足場上にGFDおよびSMBを連結するために、著者は、近くに位置する2つのN末端を有するこれらの形態の安定なダイマーとしてヒトIgGの定常領域(Fc)を選択する(図2B)。GFDについては、著者はヒトuPAの第1〜第48アミノ酸 (SNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSK(配列番号1))、PreScissionプロテアーゼ切断部位を含有する短いリンカー領域(GSGLELEVLFQGPIE(配列番号4)およびヒトIgG1免疫グロブリン重鎖のヒンジおよび定常領域（Fc）
(PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(位置150のXaaがTであり、位置191のXaaがYである配列番号5)から構成される成熟ポリペプチド(GFD/Fcと命名)をコードする発現ベクターを構築した。対応するSMB/Fcポリペプチドは、ヒトVNの第1〜第41アミノ酸 (DQESCKGRCTEGFNVDKKCQCDELCSYYQSCCTDYTAECKP(配列番号2))および同一のリンカーおよびFc領域(Fc領域は、KnobおよびHole突然変異について以外は同一である)を有する。
【００７５】
Fcタグ付GFDおよびSMBの間のヘテロダイマー化を助けるために、著者は、以前に記載されたように(Ridgwayら、1996)、Fc領域を改変して「knob」(T366Y、FcK)または「hole」(Y407T、FcH)置換を担持させた。キメラタンパク質GFD/FcKおよびSMB/FcHの哺乳動物細胞中での同時発現は、GFD/FcK-SMB/FcHヘテロダイマー(すなわち、uPAR-lock)の顕著な(>90%)産生ならびに(GFD/FcK)2および(SMB/FcH)2ホモダイマーならびにGFD/FcKおよびSMB/FcHモノマーの少量(合計<10%)の産生をもたらす。
【００７６】
uPAR-lockはuPARに特異的に結合する
uPAR-lockの受容体結合活性を確認するために、固定された可溶性uPARを、等量のGFD/FcKおよびSMB/FcH発現ベクターと共に同時トランスフェクトしたPhoenix細胞の馴化培地の連続希釈液と共にインキュベートした。洗浄後、結合したuPAR-lockを、ビオチン化抗ヒトFc抗体およびEu標識ストレプトアビジンとの連続的インキュベーションを用いて検出した。図3Aに示されるように、uPAR-lockでトランスフェクトされた細胞の馴化培地は、特異的および用量依存的なuPAR結合活性を実際に含む。
【００７７】
uPAR-lockの精製
uPAR-lockをより良好に特徴付けるために、標準的なプロテインAアフィニティクロマトグラフィーによりトランスフェクト細胞の馴化培地からタンパク質を精製した。SDS-PAGEにより分析した場合(図3B)、非還元的条件下ではuPAR-lockはアミノ酸組成から予測される分子量と良好に一致する約75kDaの見かけの分子量を有する。還元的条件下では、SMB/FcHおよびGFD/FcKモノマーを表す2つの主要なペプチド(40および45kDa)が観察される。しかしながら、これらの間には分子量の小さな違いがあるため、ヘテロダイマー化の効率を確実に見積もることは不可能である。
【００７８】
uPAR-lockはuPA/uPAR相互作用の競合的アンタゴニストである
uPAR:uPAのアンタゴニストとしてのuPAR-lockの活性を試験するために、著者は、マウスFcでタグ付けした精製されたuPAR(uPAR/mFc)を固定されたuPAに結合させる結合アッセイを用いた(図4A)。このアッセイでは、uPAR/mFcは飽和可能な様式で、高い親和性でuPAに結合する。uPAR-lockのアンタゴニスト特性を決定するために、著者は、増加する濃度のuPAR-lockまたはuPAと混合した固定濃度のuPAR/mFc(5nM)を用いる同じアッセイを用いた(図4B)。このアッセイでは、uPAR-lockおよびuPAは、非常に類似した用量応答で固定されたuPAへのuPAR/mFcの結合を阻害し(uPAのIC50=0.21nM、uPAR-lockのIC50=0.31nM)、uPAR-lockが実際にuPAR:uPA相互作用の効率的な競合的アンタゴニストであることを実証している。
【００７９】
uPAR-lockはuPAR/VN相互作用の強力なアンタゴニストである
uPAR:VN相互作用のアンタゴニストとしてのuPAR-lockの活性を試験するために、著者は、uPAR/mFcをuPAの存在下で固定されたVNに結合させる結合アッセイを用いた(図4C)。このアッセイでは、uPAR/mFcはuPA依存的様式で高い親和性で固定されたVNに結合する。uPAR-lockの活性を試験するために、著者は、固定濃度のuPAR/mFc(1nM)および比較のために増加する濃度のuPAR-lockまたはuPAと混合した過剰のuPA(5nM)を用いる実験を行った(図4D)。このアッセイでは、uPAR-lockは、固定されたVNへのuPARの結合の非常に強力な阻害剤である(IC50=0.22nM、95%信頼区間0.19〜0.25nM)。これは、VNへのuPARの結合にとって必要とされるuPAとは全く対照的であり(図4C)、過剰に存在する場合でも相互作用を顕著に阻害することができない(図4Cおよび4D)。これらの実験は、uPAR-lockがin vivoでuPAR:VN相互作用の強力なアンタゴニストであることを示している。
【００８０】
uPAR-lockはVNへのuPARにより媒介される細胞接着の強力な機能的阻害剤である
生細胞中でのuPARシグナリングの阻害におけるuPAR-lockの活性を評価するために、著者は、リアルタイム細胞分析装置(RTCA、xCELLingence SP、Roche)を用いるインピーダンス測定によってVNで被覆されたウェルへの細胞接着を定量した(図5)。これらの実験では、著者は、uPAの非存在下では非常に低いVN結合活性を示し、uPAの存在下では完全な活性を示す、条件的uPAR突然変異体(uPART54A(Madsenら、2007))を発現する293細胞を用いた。293/モックおよび293/uPART54A細胞をVN上に播種した場合、それらは1〜1.5時間後にプラトーに達する細胞指数の時間依存的増加により示される通り、基質に弱く接着した。uPAのその後の添加により、細胞指数の劇的な増加によりここで証明される通り、293/uPART54A細胞(Madsenら、2007)の接着の迅速で強力な増加が誘導される(黒色の線)。対照細胞(293/モック)へのuPAの添加は、これらの細胞がuPARを発現せず、細胞指数の顕著な変化も一貫して誘導しないため、細胞接着を促進しない(Madsenら、2007)(褐色の線)。293/uPART54A細胞をuPAR-lockの存在下で播種した場合(赤色の線)、細胞接着の初期段階は未処理の細胞、またはモックトランスフェクト細胞のものと類似しており、uPAR-lockが基本的なインテグリンに媒介される細胞接着に影響しないことを示している。重要なことは、uPAR-lockを用いる処理が、uPAの添加により誘導される293/uPART54A細胞指数の増加をほぼ完全に無効化するということである。これらのデータは、uPAR-lockがVNに対するuPAに誘導される、uPARに媒介される細胞接着の強力で特異的な阻害剤であることを示している。
【００８１】
GFDとSMBとの間の強制的近接性はuPA:uPAR相互作用の拮抗におけるuPAR-lockの活性に寄与する
uPAR-lockの構築の背後にある原理は、共通の足場への結合によるGFDおよびSMBドメインの間で生成される強制的近接性がその強力なアンタゴニスト活性にとって必須であると予測するものである。この予測に実験的に取り組むために、著者は、図6Aに示されるように同一の足場を有するが、2つのGFDドメイン(GFD/GFDと命名)または2つのSMBドメイン(SMB/SMBと命名)のいずれかを担持するuPAR-lockの変異体を構築した。これらのタンパク質のSDS-PAGEゲルを図6Bに示す。組換えSMB/SMBおよびGFD/GFDタンパク質、ならびにこれらの1:1混合物(GFD/GFD + SMB/SMB)の結合を、固定されたuPARへの結合に関してuPAR-lockと比較した(図6C)。GFD/GFDとSMB/SMBの1:1混合物は、この試料がuPAR-lockと同量の組成のGFD、SMBおよび足場ドメインを有するが、GFDとSMBが別の足場上に位置するため、特に良好な対照である。SMB/SMBを除いて、全てのタンパク質調製物がuPARへの用量依存的結合を示し、uPAR-lockの結合が最も強かった。これは、それが相互作用を「誘導する」GFDとuPARとの高親和性相互作用であるという予測と一致する。GFD/GFD + SMB/SMB混合物がuPAR-lockと比較してあまりよく結合しないという事実は、uPAR-lock上のSMBドメインがuPARとのその相互作用を安定化するという仮定を支持する。また、同じタンパク質調製物を、固定されたuPAへのuPAR/mFcの結合の競合におけるその活性についても試験した。非常に類似した結果が得られた(図6D)。このアッセイでは、GFD/GFD調製物はuPAR-lockよりも活性が高く、等しい濃度のuPAR-lock(すなわち、GFD/SMB)およびGFD/GFDでは、後者のタンパク質は2倍の数の高親和性uPAR結合ドメイン(すなわち、それは二価ホモダイマーである)を含むという事実と一致する。
【００８２】
GFDとSMBとの強制的近接性はuPARに媒介される細胞接着に対するuPAR-lockの機能的アンタゴニスト活性にとって必須である
VNに対するuPARに媒介される細胞接着に対するuPAR-lockの阻害活性に関するGFDとSMBとの密接な近接性の重要性を決定するために、著者は固定されたVNに対する293/uPAR(図7A)および293/uPART54A(図7B)細胞の接着プロセスにおけるインピーダンスの変化を測定した。293/uPAR細胞においては、uPAR-lock(赤色の線)は、未処理の細胞(黒色の線)と比較してVNに対する基本的な細胞接着を減少させ、uPAに対する応答を無効化する。同じ細胞において、SMB/SMB(青色の線)は本質的には活性を示さないが、GFD/GFD(黄色の線)およびGFD/GFD + SMB/SMB(緑色の線)はアゴニスト活性を示す。293/uPART54A細胞においては、uPAR-lockはアゴニスト活性を有さず、uPAにより誘導される細胞接着を完全に遮断する。これらの細胞において、GFD/GFDキメラおよびGFD/GFD + SMB/SMB混合物のアゴニスト効果はさらにより顕著であり、SMB/SMBキメラは不活性である。これらのデータは、uPAR-lock中のGFDおよびSMBドメインの密接な近接性が、VNへの細胞接着におけるuPARシグナリングに対する分子の阻害活性の原因であり、それにとって必要であることを明確に示している。
【００８３】
GFDとSMBとの強制的近接性はuPARに媒介される細胞移動に対するuPAR-lockの機能的アンタゴニスト活性にとって必須である
細胞接着の下流の、293細胞におけるuPARの発現も、血清被覆表面上での無作為な細胞移動を刺激する(Madsenら、2007)。一貫して、著者は、uPAR-lockが293/uPAR細胞の基本的移動を非常に有意に阻害することを見出した(図8)。このuPAR-lock活性には、SMBとGFDドメインとの強制的近接性が必要である。
【００８４】
uPAR-lock V2
単一のポリペプチド中にSMBとGFDドメインを含有するuPAR-lockの変異体を作製することができ、これはいくつかの利点を有する可能性がある。第1に、これらの製造は、単一のポリペプチドのみを発現させる必要があるため、あまり複雑ではない。第2に、ヘテロダイマー化を要するuPAR-lock調製物中に低レベルで存在するSMB/FcおよびGFD/Fcのような望ましくない、非阻害的な、および/またはアゴニスト変異体の形成を防止する単一のポリペプチド鎖中に存在する場合、SMBおよびGFDドメインの数は常に等しい。
【００８５】
この目的を考慮して、本発明者らはSMBおよびGFDドメインが単一のポリペプチド鎖中に遺伝子操作し、C末端マウスFcタグでタグ付けしたキメラを構築した。2つの変異体が作製された。第1(SMB-GFD/mFc)は、N末端SMBドメイン、リンカー、GFDドメインおよびC末端マウス免疫グロブリン定常領域(mFc)から構成される。第2(GFD-SMB/mFc)は、同様の構成を有するが、SMBおよびGFDドメインの相対位置が逆転している。これらの分子の構造を例示する略図を図9Aに示す。これらのホモダイマータンパク質をCHO細胞中で発現させ、プロテインAアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。GFD-SMB/mFcおよびSMB-GFD/mFcの機能的阻害活性を決定するために、本発明者らは、VNに対するuPARに媒介される細胞接着の阻害におけるその効力を測定した(図9、パネルBおよびC)。図9Bから明らかな通り、SMB-GFD/mFcキメラは、VNに対するuPARを発現する293細胞の接着の迅速な用量および時間依存的減少を誘導した。SMB-GFD/mFc、GFD-SMB/mFcおよびuPAR-lockによる1時間の処理における用量応答曲線を図9Cに示し、これはSMB-GFD/mFcキメラ(IC50=6.3nM)がuPAR-lock(IC50=17nM)またはGFD-SMB/mFcキメラ(IC50=20nM)よりも約3倍強力であることを示している。これらの試薬はヒトでの使用のために作製されたものであるため、本発明者らは、SMB-GFDキメラをヒトFcタグを有するように再クローニングし、この化合物をuPAR-lockV2と呼んだ。これらのデータは、同じポリペプチド鎖中に位置するSMBおよびGFDドメインを有する機能的uPAR-lock変異体を作製することができること、およびエフェクタードメイン(すなわち、SMBおよびGFD)のこの再編成でも、より強力な阻害剤をももたらし得ることを示している。さらに、これらの実験は、uPAR-lockのようなキメラを作製する場合に、大きい柔軟度が可能になることを実証する。
【００８６】
図9Bおよび9Cに示される実験から明らかな通り、uPAR-lock変異体によるVNへの293/uPAR細胞の接着の最大阻害は、約60%の最大阻害で不完全である。この残存する細胞接着は、VNに対するインテグリンに媒介される細胞接着により引き起こされる可能性があり、これはuPAR-lockによっては阻害することができない。この可能性に直接取り組むために、本発明者らは、VN被覆と、uPAR結合において完全に活性であるが、VNの45RGD47配列中の単一のアミノ酸(G46A)置換に起因してインテグリン結合が欠損している組換えタンパク質VN(1-66)/FcRAD(Madsenら、JCB 2007)とを置換する接着実験を繰り返した。図10Bに認められるように、uPAR-lockV2は293/uPAR細胞接着をほぼ完全に阻害するが、最も高い試験濃度でのuPAR-lock事象については、残存する接着(約20%)が依然として観察される。また、uPAR-lockV2のIC50(0.59nM)は、uPAR-lockのもの(2.3nM)よりも優れている。
【００８７】
総合すると、これらのデータは、uPAR-lockV2がuPAR-lockよりも優れていることを示す。
【００８８】
概念の証明
uPAR-lockおよびuPAR-lockV2によるuPAR機能の阻害は、受容体へのSMBおよびGFDドメインの両方の同時結合を必要とすると予測され、これは図7においてuPAR-lockについて主に実証された。この点をより的確で包括的な方法で証明するために、本発明者らは、uPARとの相互作用を遮断することが知られる(Okumura Yら、J Biol Chem 2002)SMBドメイン中に単一のアミノ酸置換を含有するuPAR-lockおよびuPAR-lock V2の変異体を作製した。これらの変異体、uPAR-lockD22AおよびuPAR-lockV2D22Aのドメイン構造を図10Aに例示し、これはSMBドメイン中の単一のAsp22Ala置換について以外はuPAR-lockおよびuPAR-lockV2のものと同一である。細胞接着アッセイにおいて生物活性についてアッセイした場合(図10C)、uPAR-lockD22AおよびuPAR-lockV2D22Aは両方とも、阻害活性を示さず、実際、用量依存的アゴニスト活性を示す。総合すると、これらのデータは、単一の足場上の機能的GFDおよびSMBドメインの存在が、uPAR機能のuPAR-lock様阻害剤に対する基礎的要件であることを示している。
【００８９】
uPAR-lock V2はin vivoで腫瘍成長を阻害する
in vivoでのuPAR-lockの潜在的な抗腫瘍活性を決定するために、本発明者らは、前立腺癌異種移植モデルを用いる試験を行った。このモデルにおいては、100万個のPC3細胞を、皮下経路を介してオスのBalb C nu/nuマウスの右脇腹に接種した。異種移植された動物を、腹腔内注射によりuPAR-lockV2で週2回処理し、腫瘍の体積をキャリブレーションによりモニターした。図11に示される通り、uPAR-lockV2で処理した動物は、対照動物と比較して有意に減少した腫瘍体積を示した。処理した動物は、腫瘍体積の約50%の減少を示し、これは抗uPAR阻害抗体ATN-658を用いて他者により観察されたもの(Rabbani SAら、Neoplasia 2010)よりも良好である。
【００９０】
uPAR-lockで処理された動物のPC-3腫瘍における細胞増殖の低下およびアポトーシスの増強
uPAR-lockで処理された動物におけるPC-3腫瘍成長の低下の生物学的理由を精査するために、本発明者らは、異種移植の8週間後に動物から採取した腫瘍切片の免疫組織化学分析を行った(図12)。腫瘍細胞増殖を評価するために、本発明者らは、増殖細胞抗原Ki-67について染色し、アポトーシスを評価するために、本発明者らは、活性化された(切断された)カスパーゼ3について染色した。図12Aに示される通り、uPAR-lockV2で処理されたマウスから採取した腫瘍は、切断されたカスパーゼ3の反応性により証明されるようにアポトーシスを受ける細胞数の強力な増加を示し、Ki-67陽性性により示されるように増殖細胞数の顕著な減少を示す。これらのデータの定量を図12Bに示す。同じ結果はuPAR-lockについても得られた。総合すると、これらのデータは、uPAR-lockが、アポトーシスを促進し、細胞増殖を低下させることにより腫瘍成長を抑制することを示唆している。
【００９１】
uPAR-lockを用いる腫瘍画像化および薬剤送達
癌の増殖を低下させるその直接的活性に加えて、uPAR-lockを画像化腫瘍のために、および/または薬剤送達ビヒクルとして潜在的に用いることもできる。この可能性に直接取り組むために、本発明者らは、マウスにPC-3細胞を異種移植し、薬剤の介入なしに8週間、一次腫瘍を増殖させた。次いで、本発明者らは、腹腔内経路により50マイクログラムのAlexa488標識uPAR-lockV2またはAlexa488標識マウスIgGを腫瘍担持動物に注射した。標識タンパク質の注射の24時間後、腫瘍を切除し、固定し、包埋し、切片化し、腫瘍組織中の緑色蛍光シグナルの存在について顕微鏡により観察した。図13に示されるように、標識されたuPAR-lockを注射したマウスに由来する腫瘍は、顕著な蛍光の領域を示したが、標識されたIgGを受ける動物においては同様の蛍光は観察されなかった。同じ結果が、uPAR-lockについても得られた。これらの領域の細胞の性質は不明であるが、データは、uPAR-lockが蛍光染料を腫瘍組織に標的化することができることを明確に示し、これはuPAR-lockを腫瘍画像化のため、および/または薬剤送達ビヒクルとして潜在的に用いることができることを示している。
［参考文献］
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【図２Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図１３】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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