(57)【要約】  本発明は、二機能の腫瘍診断試薬及び方法を提供している。該二機能の腫瘍診断試薬は、癌組織及び／または癌細胞を特異的に識別する蛋白質殻、及びペルオキシダーゼ触媒活性を有する無機ナノコアからなる。該試薬は腫瘍の特異的識別と発色性を同時に実現して、一段階で発色を完成する。その操作は簡単で便利である。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌組織及び／または癌細胞を特異的に識別する蛋白質殻、及びペルオキシダーゼ触媒活性を有する無機ナノコアからなることを特徴とする二機能の腫瘍診断試薬。
【請求項２】
前記蛋白質殻は、アポフェリチン、熱ショックプロテイン、ＤＮＡ結合蛋白質、プテリジンシンターゼ、及びナノキャビティー構造を有するウィルス蛋白質殻を含み、
前記ナノキャビティー構造のウィルス蛋白質殻が、ササゲクロロティックモットルウィルスとササゲモザイクウィルス蛋白質を含むことを特徴とする請求項１に記載の二機能の腫瘍診断試薬。
【請求項３】
前記アポフェリチンは、１２個または２４個のヘビーチェーンサブユニットとライトチェーンサブユニットとが任意の比例で自己組織化してなることを特徴とする請求項２に記載の二機能の腫瘍診断試薬。
【請求項４】
前記アポフェリチンは、天然アポフェリチンまたは遺伝子組み換えのアポフェリチンであり、
前記天然アポフェリチンが真核生物または原核生物から由来しており、好ましくは哺乳動物から由来していることを特徴とする請求項３に記載の二機能の腫瘍診断試薬。
【請求項５】
前記蛋白質殻は、ターゲット分子及び／またはシグナル分子が化学カップリングまたは遺伝子融合された蛋白質殻を含み、
前記ターゲット分子は、ポリペプチドまたは核酸アプタマーを含み、
前記ポリペプチドは、抗体を含み、
前記シグナル分子は、蛍光分子、放射性核種と酵素を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の二機能の腫瘍診断試薬。
【請求項６】
前記無機ナノコアは、磁性酸化鉄ナノ粒子、硫化鉄ナノ粒子、貴金属ドープ酸化鉄ナノ粒子、二金属合金ナノ粒子と酸化セリウムナノ粒子を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の二機能の腫瘍診断試薬。
【請求項７】
前記蛋白質殻は、遺伝子組み換えのフルヘビーチェーンサブユニットフェリチンであり、前記の無機コアは磁性酸化鉄ナノ粒子であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の二機能の腫瘍診断試薬。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の二機能の腫瘍診断試薬とペルオキシダーゼサブストレートを含む腫瘍診断キット。
【請求項９】
蛋白質殻及び無機ナノコアからなるビオニックスフェリチンであって、前記蛋白質殻は遺伝子組み換えのフルヘビーチェーンサブユニットフェリチンであり、前記無機コアは磁性酸化鉄ナノ粒子であるビオニックスフェリチン及びその腫瘍検出試薬の製造における用途。
【請求項１０】
前記個体から生体組織または細胞サンプルを獲得し、該サンプルを請求項１〜７のいずれかに記載の二機能の腫瘍診断試薬に接触させ、サブストレートを加入し直接に発色することで、前記個体における腫瘍の存在を検出することを含み、
好ましくは、前記組織が臨床患者または動物モデルの穿剌活組織検体、術後の病理学的切片または死体解剖組織であり、前記細胞は循環系における剥離細胞、組織溶解細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養細胞である個体における腫瘍の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明はナノ技術、バイオニクス、免疫学と生物医薬のインターディシプリナリ分野に属している。特に、本発明は癌の病巣に対する特異的な識別と発色性の二機能を集合した腫瘍診断試薬、及び前記腫瘍診断試薬を癌組織及び癌細胞に応用する診断方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
悪性腫瘍は、既に人間の生命及び生活質量に悪い影響をもたらす主な病気のひとつである。生検という検査は一番正確で、確実な方法であり、国内外で認可された腫瘍診断の「ゴールド標準」であった（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。今、生検に対する主な染色方法は、ヘマトキシリン−エオシン染色（ＨＥ）、免疫組織化学、免疫蛍光がある。ＨＥ染色においては、主にヘマトキシリンは細胞核内の染色質を紫青色に染色して、エオシンは細胞質と細胞外基質中の成分を赤色に染色していることで、細胞形態学の情報を提供する。病理科の医者は、これらの細胞形態学の変化に基づいて、組織細胞の腫瘍化を概ねに同定する。この染色方法は、操作が便利で、快速であるが、組織形態学の変化を提供できるしかなくて、情報量が少ないので、ちょっと複雑で、ポリタイプの腫瘍に対して、正確に診断できない。免疫組織化学または免疫蛍光においては、一次抗体と被検組織抗原が結合し、蛍光シグナル分子または酵素標識された二次抗体、三次抗体が一次抗体と結合し、後に蛍光シグナルによりまたは酵素サブストレートと反応するにより発色して、検出したい抗原の位置決め及び半定量の情報を提供して、さらに組織細胞の腫瘍化、壊死、炎症細胞の浸潤等の病理変化を同定する。免疫組織化学または免疫蛍光は、ある特定な抗原の分布、含有量及び細胞形態学の詳細な情報を提供できるので、病理学のもっと深い研究に対して非常に意味がある。しかしながら、免疫染色は、一次抗体、二次抗体乃至三次抗体の多段階インキュベート、ＰＢＳで繰り返し洗浄、及び酵素または蛍光分子での標識が必要で、その過程が複雑で、その操作時間が長い。したがって、臨床病理診断の効率を向上して、十分な患者治療時間を獲得するために、豊かな情報を簡単で、快速に提供できる癌組織、癌細胞の検出試薬及び方法を研究する必要がある。
【０００３】
天然なヒトフェリチンは、鉄を貯蔵する球状蛋白質であり、２４個のヘビーチェーンまたはライトチェーンのサブユニットが任意の比例で複合してなるものである。ヘビーチェーンサブユニットとライトチェーンサブユニットは高度な相同性を有して、それらの分子量がそれぞれ２１ｋＤａと１９ｋＤａであった（非特許文献４）。人間は、異なる器官、異なる組織中のフェリチンのサブユニット成分が異なり、心臓中には主にヘビーチェーンサブユニットがあるが、肝臓中にはライトチェーンサブユニットが比較的に多く、二種類のサブユニットも環境のニーズに従い変化でき、生物体に、弾性がある鉄イオンを提供する。しかしながら、ヘビーチェーンサブユニットだけは、酸素ガスを利用して、Ｆｅ２＋をＦｅ３＋に転化して、鉄イオンを順調にフェリチンに入らせることができる。これによって、ヘビーチェーンサブユニットを増加することにより、該細胞の鉄の利用能力を向上でき；ライトチェーンサブユニットを増加することにより、鉄の貯蔵効率を向上できる。フェリチンの球殼中に、鉄イオンがリン酸塩、ヒドロキシルイオンと一緒に結晶を形成し、該結晶が鉱物中の酸化鉄水合物と類似な化学性質を有する（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。
【０００４】
細胞内に鉄を貯蔵するほかに、ヘビーチェーンサブユニットフェリチンはさらに、活性化のリンパ細胞、白血病細胞、子宮頸癌細胞、リンパ腫細胞等を特異的に結合できる（非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。Ｌｉらは、細胞表面のトランスフェリチン受容体１（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、ＴｆＲ１）がヘビーチェーンサブユニットフェリチンの共受容体として、フェリチンと細胞の相互作用を調節することを報告した（非特許文献１３）。トランスフェリチン受容体は、細胞が鉄元素を獲得するキー分子であり、増殖細胞、腫瘍細胞の快速成長に不可欠なものであり、多くの腫瘍、たとえば肝細胞癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌等はすべて、高度にＴｆＲ１を発現して、したがって、ＴｆＲ１は腫瘍識別と治療の特異ターゲットになった（非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６）。ＴｆＲ１がヘビーチェーンサブユニットフェリチンの共受容体であることを利用して、ヘビーチェーンサブユニットフェリチンを腫瘍の特異的な識別に用いることができる。
【０００５】
サイズが異なるナノキャビティー構造の天然蛋白質殻は、主にアポフェリチン、熱ショックプロテイン（ＨＳＰ、直径１２ｎｍ）、ＤＮＡ結合蛋白質（ＤＰｓ、直径９ｎｍ）、プテリジンシンターゼ（ＬＳ、直径１５ｎｍ）とウィルス蛋白質殻、たとえばササゲクロロティックモットルウィルス（ＣＣＭＶ、直径２８ｎｍ）とササゲモザイクウィルス蛋白質（ＣＭＶ、直径３１ｎｍ）を含んでおり、これらのナノキャビティーは、ナノ粒子が成長して、且つナノ粒子が合成過程において集合することを阻止する良好な空間構造を提供する。このような特異的な構造を利用して、そのキャビティー内部で任意のサイズを有する無機ナノ粒子を合成でき、ナノ材料のサイズ、形状、及び結晶体構造の制御合成を実現する（非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１）。そして、これらの構造が異なる蛋白質殻は、化学カップリングまたは遺伝子融合によってターゲット分子とシグナル分子に作用して、癌に対するターゲット識別と検出を実現して、たとえば、アポフェリチンはＲＧＤと遺伝子融合して、癌細胞のターゲット識別を実現できた（非特許文献２２）。シグナル分子Ｃｙ５．５を化学標識したり、ナノキャビティーでアイソトープ６４Ｃｕ、ガドリニウム殻をロードしたりすることで、腫瘍の生体画像化を実現する（非特許文献２３、非特許文献２４）。
【０００６】
われわれの研究チームは、２００７年に酸化鉄ナノ粒子がペルオキシダーゼのような触媒活性を有して、即ち過酸化水素が存在している場合、酸化鉄ナノ粒子がＤＡＢ、ＴＭＢ等のホースラディッシュペルオキシダーゼのサブストレートと反応して、ペルオキシダーゼと同じ反応産物を生成して、それによって、ペルオキシダーゼと類似する触媒作用を産生することができることをはじめて発見した。この発見に基づいて、酸化鉄ナノ粒子模倣酵素の概念を提出した（非特許文献２５、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】中国特許出願第２００６１００５７４１３．９号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００８）  Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  １２９：３５８−３６６
【非特許文献２】Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．，  ８１：３−１２
【非特許文献３】Ｌａｒｓｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ：  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ４１−７３
【非特許文献４】Ｔｈｅｉｌ，  （１９８７）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ５６：２８９−３１５
【非特許文献５】Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １２７５：１６１−２０３
【非特許文献６】Ｌｅｖｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６３：１８０８６−１８０９２
【非特許文献７】Ｆｏｒｄ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ．  Ｒ．  Ｓｏｃ．  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ．  Ｓｃｉ．  ３０４：５５１−５６５
【非特許文献８】Ｆａｒｇｉｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｂｌｏｏｄ  ７１：７５３−７５７
【非特許文献９】Ｍｏｓｓ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｊ．  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．  １１９：２７３
【非特許文献１０】Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２：５９９−６０３
【非特許文献１１】Ｔａｋａｍｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ８８４：３１−３８
【非特許文献１２】Ｆａｒｇｉｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｂｌｏｏｄ，  ７８：１０５６−１０６１
【非特許文献１３】Ｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０７：  ３５０５−３５１０
【非特許文献１４】Ｌａｒｒｉｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９７９）  Ｊ．  Ｓｕｐｒａｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃｔ．１１：５７９−５８６
【非特許文献１５】Ｄａｎｉｅｌｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２１：１４４−１５８
【非特許文献１６】Ｒｙｓｃｈｉｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｅｒ  ４０：１４１８−１４２２
【非特許文献１７】Ｔｕｒｙａｎｓｋａ  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｓｍａｌｌ，  ５：１７３８−１７４１
【非特許文献１８】Ｍｅｌｄｒｕｍ  ＦＣ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５７：５２２−５２３
【非特許文献１９】Ｇａｌｖｅｚ  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｊ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｃｈｅｍ．，  １６：２７５７−２７６１
【非特許文献２０】Ｈｅｎｎｅｑｕｉｎ  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ａｄｖ．  Ｍａｔｅｒ．，  ２０：３５９２−３５９３
【非特許文献２１】Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  ３３：１１５８−１１５９
【非特許文献２２】Ｕｃｈｉｄａ  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １２８：  １６６２６−１６６３３
【非特許文献２３】Ｌｉｎ  Ｘ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，  １１：  ８１４−８１９
【非特許文献２４】Ｇｅｎｉｎａｔｔｉ  ＣＳ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６６：  ９１９６−２０１
【非特許文献２５】Ｇａｏ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ．，  ２：５７７−５８３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明の概要
本発明は、ナノ材料のペルオキシダーゼ活性を利用して、腫瘍識別蛋白質を結合して、そして新規な腫瘍診断試薬及び方法を提供した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の腫瘍診断試薬は、蛋白質殻とナノ粒子コアからなり、その蛋白質殻は特異的に癌組織及び細胞を識別して、ナノ粒子コアはペルオキシダーゼの触媒活性を有して、ホースラディッシュペルオキシダーゼのサブストレートと反応し発色することができる。本発明の腫瘍診断試薬は、組織の特異的な識別、発色性の一段階完成を実現でき、伝統の免疫方法と比べて、一次抗体、二次抗体、三次抗体の多段階インキュベートが必要なくて、抗体が酵素またはシグナル分子に標識される必要もなくて、その操作が簡単で、便利で、快速である。
【００１１】
したがって、本発明は癌組織及び／または癌細胞を特異的に識別する蛋白質殻と、ペルオキシダーゼの触媒活性を有する無機ナノコアからなることを特徴とする二機能の腫瘍診断試薬を提供する。
【００１２】
本発明の癌組織及び／または癌細胞を特異的に識別する蛋白質殻は、本分野で開示された多くの癌組織及び／または癌細胞を特異的に識別する蛋白質から選択できる。ある実施形態においては、本発明に記載の蛋白質殻は、遺伝子組み換えのアポフェリチンまたは天然のアポフェリチンである。ある実施形態においては、アポフェリチンは、１２個または２４個のヘビーチェーンサブユニットとライトチェーンサブユニットが任意の比例で自己組織化してなるものでもよい。本発明においては、天然アポフェリチンは真核生物、原核生物から由来してもよく、好ましくは哺乳動物から由来している。ある実施形態においては、本発明の蛋白質殻は遺伝子組み換えのフルヘビーチェーンサブユニットフェリチンである。
【００１３】
ある実施形態においては、本発明に記載の蛋白質殻は、さらに熱ショックプロテイン（ＨＳＰ、直径１２ｎｍ）、ＤＮＡ結合蛋白質（ＤＰｓ、直径９ｎｍ）、プテリジンシンターゼ（ＬＳ、直径１５ｎｍ）またはウィルス蛋白質殻であり、その中に、ウィルス蛋白質殻はササゲクロロティックモットルウィルス（ＣＣＭＶ、直径２８ｎｍ）とササゲモザイクウィルス蛋白質（ＣＭＶ、直径３１ｎｍ）を含んでいる。
【００１４】
ある実施形態においては、本発明に記載の蛋白質殻はターゲット分子及び／またはシグナル分子を化学カップリングまたは遺伝子融合している。ある前記方案においては、本発明に記載のターゲット分子は、ポリペプチドまたは核酸アプタマーを含んでいる。ある前記方案においては、本発明に記載のターゲット分子は抗体である。ある実施形態においては、本発明に記載のシグナル分子は、蛍光、放射性核種を含んでいる。
【００１５】
ある実施形態においては、本発明に記載の無機ナノコアは、ペルオキシダーゼの触媒活性を有して、サブストレートと反応し発色できで、磁性酸化鉄ナノ粒子、硫化鉄ナノ粒子、貴金属ドープ酸化鉄ナノ粒子、二金属合金ナノ粒子または酸化セリウムナノ粒子を含んでいるが、前記の粒子に限らない。
【００１６】
ある実施形態においては、本発明に記載の蛋白質殻は遺伝子組み換えのフルヘビーチェーンサブユニットフェリチンである。ある実施形態においては、本発明に記載の無機コアは磁性酸化鉄ナノ粒子である。
【００１７】
また、本発明は本発明に記載の二機能の腫瘍診断試薬を含んでいる腫瘍診断キットを提供する。ある実施形態においては、前記キットは、さらにペルオキシダーゼサブストレートを含んでいる。ある実施形態においては、前記ペルオキシダーゼのサブストレートは、ＤＡＢ、ＴＭＢを含んでいる。ある実施形態においては、本発明のキットは、さらに操作説明書を含んでいる。
【００１８】
また、本発明は本発明に記載の二機能の腫瘍診断試薬の腫瘍診断試薬製造における用途を提供している。前記の通り、本発明の二機能の腫瘍診断試薬は、蛋白質殻とナノ粒子コアからなり、該蛋白質殻は癌組織及び細胞を特異的に識別でき、ナノ粒子コアはペルオキシダーゼの触媒活性を有して、ホースラディッシュペルオキシダーゼのサブストレートと反応し発色でき、それによって、腫瘍の診断に用いられる。
【００１９】
また、発明は癌組織及び／または癌細胞を特異的に識別する蛋白質殻と、ペルオキシダーゼの触媒活性を有する無機ナノコアからなるビオニックス蛋白質を提供する。ある実施形態においては、本発明のビオニックス蛋白質はビオニックスフェリチンである。ある実施形態においては、本発明に記載の蛋白殻は遺伝子組み換えのアポフェリチンまたは天然のアポフェリチンである。ある実施形態においては、アポフェリチンは、１２個または２４個のヘビーチェーンサブユニットとライトチェーンサブユニットが任意の比例で自己組織化してなってもよい。ある実施形態においては、天然アポフェリチンは、真核生物、原核生物から由来しても良く、好ましくは哺乳動物から由来している。ある実施形態においては、本発明の蛋白質殻は遺伝子組み換えのフルヘビーチェーンサブユニットフェリチンである。本発明はまた、該ビオニックス蛋白質の腫瘍検出試薬製造における用途を提供している。前記の通り、本発明のビオニックス蛋白質は蛋白質殻とナノ粒子コアからなり、該蛋白質殻は癌組織及び細胞を特異的に識別して、ナノ粒子コアは、ペルオキシダーゼの触媒活性を有して、ホースラディッシュペルオキシダーゼのサブストレートと反応し発色でき、それによって腫瘍の診断に用いられる。
【００２０】
また、本発明は、個体から生体組織または細胞サンプルを獲得して、該サンプルを本発明に記載の二機能の腫瘍診断試薬または本発明のビオニックス蛋白質に接触させ、サブストレートを加入して直接に発色することで、前記個体中の腫瘍の存在を測定することを含んでいる、個体における腫瘍を検出する方法を提供する。ある実施形態においては、前記組織は臨床患者または動物モデルの穿剌活組織検体、術後の病理学的切片または死体解剖組織である。ある実施形態においては、前記細胞は生体循環系における剥離細胞、組織溶解細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養細胞である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に記載の試薬と方法は、臨床の癌スクリーニング、早期診断、癌細胞の転移性診断、治療のモニターリング、腫瘍の画像化、死体解剖組織の病理分析または術後の癌再発評価に用いられても良い。本発明の腫瘍診断試薬は組織の特異的な識別、発色の一段階完成を実現でき、伝統の免疫方法に比べて、一次抗体、二次抗体、三次抗体の多段階インキュベートが必要なくて、抗体が酵素またはシグナル分子に標識される必要もなくて、その操作が簡単で、便利で、快速である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
図面の簡単な説明
下の図面を参考して本発明の好ましい実施形態を説明する。
【図１】図１においては、Ａ：ビオニックスフェリチンのＴＥＭ画像；Ｂ：ビオニックスフェリチンは、ペルオキシダーゼ活性を有して、ＨＲＰサブストレートであるＴＭＢを触媒して、色反応する；Ｃ：ビオニックスフェリチンは、ペルオキシダーゼ活性を有して、ＨＲＰサブストレートであるＤＡＢを触媒して、色反応する。
【図２】図２においては、結腸直腸癌細胞ＨＴ２９とビオニックスフェリチンの相互作用をフローサイトメトリーで分析する。Ａ：細胞表面受容体の競争的結合；ａ：ＰＢＳコントロール、ｂ：Ｃｙ５．５標識のビオニックスフェリチン染色、ｃ：過剰の未標識のビオニックスフェリチンに遮断された細胞表面受容体；Ｂ：過剰の抗トランスフェリチン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、ＴｆＲ１）の抗体がビオニックスフェリチン受容体のサイトを競争的に結合する；ａ：ＰＢＳコントロール、ｂ：Ｃｙ５．５標識のビオニックスフェリチン、ｃ：過剰の抗ＴｆＲ１の抗体に遮断された受容体のサイト；Ｃ：ビオニックスフェリチンと細胞の結合の飽和曲線。
【図３】図３：ビオニックスフェリチンはマウスの移植腫瘍を特異的に識別しており、腫瘍組織の着色領域と染色効果は、抗体に匹敵できる（スケール：１００μｍ）。
【図４】図４：ビオニックスフェリチンはヒト肝癌組織切片を特異的に識別して、正常な肝組織または肝炎の肝組織、硬変などの組織を識別していない。Ａ−Ｄ：４ケースの肝細胞癌；Ε：正常な肝組織Ｆ：肝組織の慢性炎症Ｇ：結節性肝硬変Η：胆汁性肝硬変Ｉ：肝細胞癌Ｊ：正常な肝組織Κ：肝細胞癌Ｌ：肝組織の慢性炎症、（スケール：１００μｍ）。
【図５】図５：ビオニックスフェリチンが多種類のヒト癌組織及び正常組織に対する染色。Ａ１：結腸癌ＩＩ期、Α２：結腸の粘膜組織、Ｂ１：乳腺の非特異性浸潤性乳管癌Ｉ期、Β２：乳腺繊維腺症、Ｃ１：卵巣漿液性乳頭状腺癌ＩＩＩ期、Ｃ２：卵巣組織、Ｄ１：前立腺癌４期、Ｄ２：前立腺平滑筋組織、Ｅ１：肺扁平細胞癌ＩＩＩ期、Ε２：うっ血を伴った肺組織、Ｆ１：食道細胞癌ＩＩＩ期、Ｆ２：上皮増殖を伴った慢性食道炎、Ｇ１：胸腺癌、Ｇ２：胸腺組織、Ｈ１：子宮頸扁平細胞癌ＩＩＩ期、Ｈ２：慢性子宮頸炎。
【図６】図６：蛍光標識のビオニックスフェリチン殻が多種類のヒト癌組織に対する特異的識別。Ａ１：結腸癌ＩＩＩ期、Ａ２：上皮増殖を伴った結腸粘膜の慢性炎症、Ｂ１：乳腺の非特異性浸潤性乳管癌Ｉ期、Ｂ２：乳腺組織、Ｃ１：卵巣漿液性乳頭状腺癌ＩＩＩ期、Ｃ２：卵巣組織、Ｄ１：結腸腺癌ＩＩ期、Ｄ２：結腸の粘膜組織、Ｅ１：前立腺癌４期、Ｅ２：ＰＩＮＩ期を伴った前立腺増殖症、Ｆ１：肺扁平細胞癌ＩＩＩ期、Ｆ２：肺組織、Ｇ１：卵巣漿液性乳頭状腺癌ＩＩＩ期、Ｇ２：卵巣組織、Ｈ１：肺扁平細胞癌ＩＩＩ期、Ｈ２：うっ血を伴った肺組織、Ｉ１：食道扁平細胞癌ＩＩＩ期、Ｉ２：上皮増殖を伴った慢性食道炎、Ｊ１：胸腺癌、Ｊ２：胸腺組織、Ｋ１：子宮頸扁平細胞癌ＩＩ期、Ｋ２：子宮頸組織、Ｌ１：子宮頸扁平細胞癌ＩＩＩ期、Ｌ２：慢性子宮頸炎、（スケール：５０μｍ）。
【図７】図７：本発明に用いられるプラスミドのマップ。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明を実施するための形態
以下の実施例を挙げることは目的を説明するためですが、本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【００２４】
実施例１  ビオニックスフェリチンの製造
遺伝子組み換えでフルヘビーチェーンヒトフェリチン殻を獲得して、ヒトバイオミネラル化のメカニズムを利用して、鉄イオンをトランスロードし蛋白質殻に入らせ、酸化鉄ナノ粒子に酸化し、磁性酸化鉄ナノコアを内包しているフルヘビーチェーンヒトフェリチンをビオニックスで合成して、それをビオニックスフェリチンと呼び、腫瘍の検出に用いる。具体的な操作が以下の通りである。まず、ヒトフルヘビーチェーンサブユニットフェリチン遺伝子配列の組み換えプラスミドｐＥＴ１２ｂ−ＨＦｎ（Ｓａｎｔａｍｂｒｏｇｉｏ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．，  １９：２１２−２１８）を構築した。ヒト骨格筋の総ｃＤＮＡライブラリーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社から購入されたものであり（Ｄ８０９０−０１，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）、ＰＣＲ技術を利用してｃＤＮＡからフルヘビーチェーンヒトフェリチン遺伝子を分離して増幅し、デザインされた二つのプライマーが以下のとおりである：フォワードＰＣＲプライマー：５’−Ａ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＡＣＣ  ＧＣＧ  ＴＣＣ−３’で、酵素切断サイトはＮｄｅＩ（下線を施した部分）であり、７つの酵素切断サイトの保護ベースを加えている；リバースＰＣＲプライマー：５’−ＧＣＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＴＡ  ＧＣＴ  ＴＴＣ  ＡＴＴ  ＡＴＣ  ＡＣ−３’で、酵素切断サイトはＢａｍＨＩ（下線を施した部分）であり、３つの酵素切断サイトの保護ベースを加えている。５５２ｂｐの遺伝子産物はフルヘビーチェーンヒトフェリチンのターゲット遺伝子産物であり、その配列は以下の通りである：
【００２５】
【数１】
2014516153.tif 000003
【００２６】
後に、獲得されたＰＣＲターゲット遺伝子産物とｐＥＴ−１２ｂ  ｐｌａｓｍｉｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ，  ＵＳＡ）は、制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩに切断され、ターゲット遺伝子はベクターｐＥＴ−１２ｂにライゲートして、ヒトフルヘビーチェーンサブユニットフェリチン遺伝子配列を内包している組み換えプラスミドｐＥＴ１２ｂ−ＨＦｎを得て、下の図はプラスミドマップで、その中には酵素切断サイトは赤色の矢印で示され、抗生物質抵抗性はアンピシリンである。
【００２７】
獲得されたプラスミドｐＥＴ１２ｂ−ＨＦｎは表現菌株ＢＬ２１ＤＥ３（北京全式金生物技術株式会社から購入）をトランスフェクトしてヘビーチェーンサブユニットフェリチンを表現した。培養された、ターゲット蛋白質を表現する菌液を、超音波で崩壊し、遠心分離し大腸菌デブリーを除去して、上澄み液を６５℃で１０分間に加熱して、不純蛋白質を沈殿して、遠心分離で除去して、上澄み液を排除クロマトグラフィーＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂコラム上で分離し精製して、ヘビーチェーンサブユニットフェリチンを得、純度を電気泳動で同定し、ＢＣＡアッセイにより蛋白質の濃度を測定した。
【００２８】
ビオニックスフェリチンのバイオミネラル化は簡単に以下の通りである：濃度１００ｍＭの塩化ナトリウム溶液を脱気し、精製後のフェリチン殻と一緒に窒素ガス雰囲気下の密閉反応器に加えられて、反応温度を６５℃に保持して、ｐＨ値を８．５に保持して、１０００−５０００個のＦｅ／１個のフェリチン殻の比率で（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２・６Ｈ２Ｏを加入して、酸化剤である過酸化水素とＦｅを同時に加入し、それらの加入量はＨ２Ｏ２：Ｆｅ２＋＝ｌ：３であり、過酸化水素とＦｅを加えた後に、続けて５分間反応して、２００μＬの濃度３００ｍＭのクエン酸ナトリウムを加入し残されたＦｅを複合した。ビオニックス磁性フェリチンの形成メカニズムについて、以下の公式（１）を参照した。産物を集めて排除クロマトグラフィーで精製して、変性した不純蛋白質を除去して、磁化したフルヘビーチェーンサブユニットのビオニックスフェリチンを得た。
【００２９】
【数２】
2014516153.tif 000004
【００３０】
図１Ａは、合成のビオニックスフェリチンのＴＥＭ図であり、該図から、ビオニックスフェリチンが均一に分散し、蛋白質殻の外径が大よそ１２ｎｍで、内径が大よそ８ｎｍであると分かった。
【００３１】
実施例２  ビオニックスフェリチンのペルオキシダーゼ活性
われわれの研究チームの報告に基づいて、磁性酸化鉄ナノ粒子は、ペルオキシダーゼと類似する触媒活性を有して（Ｇａｏ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ．，  ２：  ５７７−５８３．）、ビオニックスフェリチン中に酸化鉄のコアを内包しているので、ペルオキシダーゼ様活性を有するはずである。ホースラディッシュペルオキシダーゼのサブストレートを利用してビオニックスフェリチンの酵素活性を検出して、具体的な方法は以下のようである：ビオニックスフェリチンに３０％  Ｈ２Ｏ２と、ＴＭＢまたはＤＡＢを加入して、色の変化を観測する。図１Ｂに示したように、ＴＭＢ中にビオニックスフェリチンとＨ２Ｏ２を加入した後、暗青色になり、ＤＡＢ中にビオニックスフェリチンとＨ２Ｏ２を加入した後、暗褐色になり、ホースラディッシュペルオキシダーゼと同じ色反応が発生して、ビオニックスフェリチンは、ペルオキシダーゼ様活性を有すると分かった。
【００３２】
実施例３  ビオニックスフェリチン結合腫瘍細胞
ビオニックスフェリチンとヒト腫瘍細胞の結合を研究するために、常用のヒト腫瘍細胞と蛍光分子標識のビオニックスフェリチンを選択してインキュベートして、フローサイトメトリーを利用してビオニックスフェリチンと各腫瘍細胞の結合を検出した。
【００３３】
実験方法が以下のようである：操作書に提供された標識方法に従い、ＮＨＳで活性化されたＣｙ５．５（Ｃｙ５．５−ＮＨＳ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入）をビオニックスフェリチン上に標識した。各株の細胞を１×１０５程度に培養して、トリプシンで消化して、０．３％のＢＳＡ／ＰＢＳで細胞を三回洗って、５０μｇ／ｍｌのＣｙ５．５で標識されたビオニックスフェリチンを加入して、４℃で４５分間インキュベートした。後に０．３％のＢＳＡ／ＰＢＳで細胞を三回洗って、最後にＰＢＳ中に再懸濁して、サンプルの蛍光をフローサイトメトリーで検出した。
【００３４】
その結果は表１に示したように、テストされた１２株の腫瘍細胞において、ビオニックスフェリチンはその中の１１株と反応活性を有して、それぞれ肝細胞癌、結腸直腸癌、乳癌、悪性黒色腫、単球細胞リンパ腫、子宮頸癌、白血病と前立腺癌に属していた。ビオニックスフェリチンが大部の癌細胞と特異的に結合できることを立証した。
【００３５】
【表１】
2014516153.tif 000005
【００３６】
実施例４  癌細胞とビオニックスフェリチンの相互作用
ビオニックスフェリチンと腫瘍細胞表面受容体の結合状況を研究するために、濃度が異なるＣｙ５．５標識のビオニックスフェリチンと結腸直腸癌細胞ＨＴ２９をインキュベートし、ビオニックスフェリチンの結合飽和曲線を得、且つ、過剰の抗ＴｆＲ１の抗体で受容体サイトを遮断し、ＴｆＲ１がビオニックスフェリチンと癌細胞との相互作用を媒介すること立証した。
【００３７】
実験方法が以下のようである：癌細胞ＨＴ２９を１×１０５ぐらいまで培養して、トリプシンで消化し、０．３％のＢＳＡ／ＰＢＳで細胞を三回洗って、濃度が異なるＣｙ５．５標識のビオニックスフェリチンを加入し、４℃で４５分間インキュベートした。後に０．３％のＢＳＡ／ＰＢＳで細胞を三回洗って、最後にＰＢＳ中に再懸濁して、サンプルの蛍光をフローサイトメトリーで検出した。蛍光の強度値とビオニックスフェリチンの濃度に基づいて飽和曲線を作り出した。その結果が図２Ｃに示したように、ビオニックスフェリチンと腫瘍細胞の結合は、可飽和性を有して、この結合は特異で、高い親和力を有すると分かった。
【００３８】
次に、飽和曲線によれば、濃度が適応であるＣｙ５．５標識のビオニックスフェリチンを選択し、競争的結合抑制実験を行った。同様に、細胞が１×１０５ぐらいになると、トリプシンで消化し、緩衝液で洗浄した後、濃度が一定のＣｙ５．５標識ビオニックスフェリチンと過剰の未標識ビオニックスフェリチンを同時に加入し、４℃で４５分間インキュベートし、細胞を三回洗って、最後にＰＢＳ中に再懸濁して、サンプルの蛍光をフローサイトメトリーで検出した。その結果が図２Ａに示したように、標識ビオニックスフェリチンと細胞の結合について、その大部は過剰の未標識ビオニックスフェリチンに競争されて、したがって、ビオニックスフェリチンと癌細胞の結合が特異性で、細胞表面には唯に少量の競争されなかった非特異結合分子があることを更に証明した。
【００３９】
文献（Ｌｉ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０７：  ３５０５−３５１０）に、ヒトフェリチンとトランスフェリチンの共通の受容体ＴｆＲ１が報道されて、ＴｆＲ１がビオニックスフェリチンと癌細胞との相互作用を媒介することを証明するために、われわれは過剰の抗ＴｆＲ１の抗体を利用して細胞表面の受容体をＣｙ５．５標識のビオニックスフェリチンと競い合わせた。具体的な実験方法が以下のようである：細胞ＨＴ２９を培養し細胞の数が１×１０５ぐらいになると、トリプシンで消化し、三回洗浄し、過剰のマウス抗ヒトＴｆＲ１の抗体ＣＤ７１（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入）とＣｙ５．５標識のビオニックスフェリチンを同時に加入し、４℃で４５分間インキュベートし、０．３％のＢＳＡ／ＰＢＳで細胞を三回洗って、最後にＰＢＳ中に再懸濁して、サンプルの蛍光をフローサイトメトリーで検出した。その結果が図２Ｂに示したように、約５０％のが競争されてしまい、それは、ＴｆＲ１がビオニックスフェリチンと癌細胞との相互作用を媒介することを証明した。
【００４０】
実施例５  ビオニックスフェリチンのマウス移植腫瘍に対する特異検出
ビオニックスフェリチンが腫瘍組織に対する識別及び染色能力を検出するために、それをヌードマウスの移植腫瘍組織とインキュベートし、且つ、伝統の抗体免疫組織化学結果と比較した。具体的な実験方法が以下のようである：
【００４１】
マウス移植腫のパラフィン切片の製造方法が以下のようである：培養したＨＴ−２９、ＳＭＭＣ−７７２１とＳＫＯＶ−３腫瘍細胞（ＡＴＣＣから購入）を集めて、無血清培地で洗浄し、ＰＢＳ緩衝液中に再懸濁した。雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（北京実験動物センターから購入）に対して、肩部に５×１０６個のＨＴ−２９、ＳＭＭＣ−７７２１またはＳＫＯＶ−３細胞を皮下注射して、腫瘍の直径が０．４−０．６センチになる時、マウスを殺し、腫瘍を取り出し、４％パラホルムアルデヒドで１２−２４時間固定し、７０％エタノール溶液で洗浄し、後に７０−８０−９０−９５−９５−１００％エタノールで３５分間グラジエント脱水し、１：１のエタノール／キシレン溶液に５分間浸入し、取り出し再びキシレン２０分間浸入し、２回透過処理し、熱溶融したパラフィン（融解点５６−５８℃）中に４時間投入し、ワックスを浸した組織を取り出し溶融ワックスを含んだ紙ボックス中に移して、切面が下向き、パラフィンの表面が固めた後に埋め込み、冷たい水中に浸入し凝固し、パラフィン塊を得た。Ｌｅｉｃａパラフィン切片機でパラフィン埋め込み組織を５μｍの切片に切り、スライド上に４２℃で切片を展開し、自然乾燥後に５０℃で６時間焼き、ＨＴ−２９、ＳＭＭＣ−７７２１とＳＫＯＶ−３のマウス移植腫瘍パラフィン切片を製造し得た。
【００４２】
Ａｎｔｉ−ＴｆＲ１抗体ＣＤ７１で移植腫瘍組織をステインする方法が簡単に以下のようである：移植腫瘍パラフィン切片を水に脱ワックスし、ＰＢＳで３回洗浄し、０．３％  Ｈ２Ｏ２を含んだメタノール溶液を加入し、３０分間インキュベートし、組織の内在性ペルオキシダーゼを除去して；さらに１ｍＭクエン酸抗原修復化液を加え、電子レンジ中に３０分間加熱し、抗原修復化を行い；脱イオン水でリンスした後、５％普通のヒツジ血清で３７℃で１時間遮断し、Ａｎｔｉ−ＴｆＲ１抗体ＣＤ７１（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を加え、４℃で一夜にして；ＰＢＳでリンスした後に、１０００倍希釈された二次抗体を加え、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳでリンスした；ＨＲＰ標識の２０００倍希釈された三次抗体を加え、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳでリンスして、１ｍｌ脱イオン水中にＤＡＢキット中のＢｕｆｆｅｒ、Ｈ２Ｏ２、ＤＡＢをそれぞれ１滴加え、均一に混合した後にスライドの組織検体上に滴下し５ｍｉｎに発色し、脱イオン水で洗浄し、ヘマトキシリンで後染色し、脱水し切片をマウントし、画像を顕微鏡で観察した。
【００４３】
ビオニックスフェリチンでマウス移植腫瘍組織をステインする方法が簡単に以下のようである：移植腫瘍組織のパラフィン切片を脱ワックスし、内在性ペルオキシダーゼを除去し、抗原修復化を行い、血清で遮断した後に、ビオニックスフェリチンを加え、室温で４５分間インキュベートし、ＰＢＳでリンスし、ＤＡＢで染色し、ヘマトキシリンで後染色し、普通の脱水を行い切片をマウントし、顕微鏡で観察した。
【００４４】
ＦＩＴＣ標識のビオニックスフェリチンのマウス移植腫瘍に対するステイン：操作書に提供された方法を参照して、イソチオシアネートフルオレセインＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入）でビオニックスフェリチン殻を標識した。移植腫瘍組織パラフィン切片を血清で遮断した後、ＦＩＴＣ標識のビオニックスフェリチン殻を加え、室温で４５分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、ＤＡＰＩで核を１０分間ステインした。クェンチャーを加入し切片をマウントし、共焦点蛍光顕微鏡で観察した。
【００４５】
その結果が図３に示したように、ビオニックスフェリチンは組織中の腫瘍細胞を特異的に識別し、着色領域と抗体ＣＤ７１が一致し、腫瘍の染色効果と抗体を比較でき、細胞形態の変化を明瞭に区別できた。ビオニックスフェリチン殻が腫瘍組織を識別するに関する共焦点蛍光顕微鏡の結果は、さらにビオニックスフェリチン殻が腫瘍に対する特異的識別を実現できたことを立証した。伝統の免疫組織化学方法に比べ、ビオニックスフェリチンは、抗原の特異的識別と染色を一段階で同時に実現でき、伝統の免疫組織化学の一次抗体、二次抗体、三次抗体等の多段階インキュベート過程が必要なく、ＨＲＰ酵素等のシグナル分子の修飾も必要なく、したがって、伝統の免疫組織化学方法に比べ、もっと簡単で、便利で、快速だった。
【００４６】
実施例６  ビオニックスフェリチンの臨床ヒト肝癌組織に対するステイン・識別
肝組織サンプルが北京安貞病院と北京腫瘍病院から来た。すべての肝組織サンプルは、手術で切除された腫瘍及び隣接組織のバルクサンプルである。すべての組織をパラフィンで埋め込んだ。
【００４７】
ビオニックスフェリチンで組織切片をステインする方法が簡単に以下のようである：パラフィンで埋め込まれた肝癌組織と正常の肝組織に対して脱ワックス処理を行い、内在性ペルオキシダーゼを除去し、抗原修復化を経て、血清で遮断した後にビオニックスフェリチンを加え、室温で４５分間インキュベートし、ＰＢＳでリンスし、ＤＡＢで染色し、ヘマトキシリンで後染色し、普通の脱水を行い切片をマウントし、顕微鏡で観察した。
【００４８】
ビオニックスフェリチンで組織切片を蛍光ステインするのが簡単に以下のようである：パラフィンで埋め込まれた肝癌組織と正常の肝組織に対して脱ワックス処理を行い、血清で遮断した後、ＦＩＴＣ標識ビオニックスフェリチン殻を加え、室温で４５分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄しＤＡＰＩで核を１０分間ステインした。クェンチャーを加入し切片をマウントし、共焦点蛍光顕微鏡で観察した。
【００４９】
その結果は図４に示したように、ビオニックスフェリチンが肝組織中の癌性の細胞を特異的に識別して、腫瘍周りの正常組織を染色・識別しなかった；肝組織の慢性炎症、結節性肝硬変、胆汁性肝硬変等の組織も識別しなかった。すべての検出された肝細胞癌の組織においては陽性率が５４／５５であり、正常な肝組織、肝炎、肝硬変の陽性率が７／４５であった。ビオニックスフェリチンが肝癌組織を特異的に識別できることを立証した。
【００５０】
実施例７  ビオニックスフェリチンの多種類のヒト癌組織に対する特異的識別
ビオニックスフェリチンが腫瘍化組織とヒト正常組織に対する特異的識別能力を系統的に研究するために、ヒト腫瘍組織と４８ケースのヒトの正常組織または炎症組織のパラフィン切片サンプルを選び、ビオニックスフェリチンで染色した。患者の組織サンプルは北京安貞病院、北京腫瘍病院と西安オメイ生物バイオテック株式会社から来た。すべての組織サンプルは、手術で切除された腫瘍及び隣接組織のバルクサンプルである。すべての組織をパラフィンで埋め込んだ。
【００５１】
ビオニックスフェリチンで組織切片をステインすることは簡単に以下のようである：パラフィンで埋め込まれた腫瘍組織と正常の組織または相応な炎症組織に脱ワックス処理を行い、内在性ペルオキシダーゼを除去し、抗原修復化を経て、血清で遮断した後、ビオニックスフェリチンを加え、室温で４５分間インキュベートし、ＰＢＳでリンスし、ＤＡＢで染色し、ヘマトキシリンで後染色し、普通の脱水を行い切片をマウントし、顕微鏡で観察した。その組織の識別結果について図５と表２に示した。
【００５２】
ビオニックスフェリチンで組織切片を蛍光ステインすることは簡単に以下のようである：パラフィンで埋め込まれた腫瘍組織または正常な組織、炎症組織に対して脱ワックス処理を行い、血清で遮断した後、ＦＩＴＣ標識ビオニックスフェリチン殻を加え、室温で４５分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、ＤＡＰＩで核を１０分間ステインした。クェンチャーを加入し切片をマウントし、共焦点蛍光顕微鏡で観察した結果を図６に示した。
【００５３】
図５、６に示したように、ビオニックスフェリチンは、結腸癌、乳癌、卵巣癌、結腸腺癌、肺扁平細胞癌、前立腺癌、食道扁平細胞癌、胸腺癌及び子宮頸扁平細胞癌等に対してすべて強力な結合性を有しているが、それと対応する慢性結腸炎、乳腺組織、卵巣組織、結腸粘膜組織、肺組織、前立腺増殖、慢性食道炎、胸腺組織、子宮頸組織及び慢性子宮頸炎等に対して相応的な結合がない。表２の分析結果から、ビオニックスフェリチンは、肝細胞癌（５４／５５）、肺扁平細胞癌（５０／５２）、胸腺癌（４／４）、子宮頸扁平細胞癌（４／４）、食道癌（３／３）、結腸癌（６／６）及び卵巣癌（４／４）等に対して非常に良いステイン感度と特異性を有していることと分かった。図５、図６の組織の識別効果は、ビオニックスフェリチンは多種類のヒト癌組織を特異的に識別し、特に肝細胞癌、肺癌、胸腺癌、子宮頸癌、卵巣癌と結腸癌を強力にステインし識別できるが、相応的な正常組織または炎症組織を識別できないことを立証した。伝統の抗体免疫組織化学方法に比べ、ビオニックスフェリチンに基づいた癌組織の検出識別方法は、腫瘍に対する特異的識別とステインを一段階で同時に実現でき、一次抗体、二次抗体、三次抗体等の多段階インキュベートまたはＨＲＰ等の酵素またはシグナル分子の標識が必要なく、操作が簡単で、便利であり、且つ、腫瘍組織に対する染色効果は抗体の免疫組織化学方法に匹敵できる。
【００５４】
【表２】
2014516153.tif 000006
【００５５】
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１５．Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＰＭ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｔｈｅ  ｆｅｒｒｉｔｉｎｓ：  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  ｉｒｏｎ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １２７５：１６１−２０３．  
１６．Ｌｅｖｉ  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８），  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｆｅｒｒｉｔｉｎ  ｉｒｏｎ  ｕｐｔａｋｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈ−ｃｈａｉｎ  ａｎｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｅｒｒｏ−ｏｘｉｄａｓｅ  ｓｉｔｅ−Ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｉｒｏｎ  ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ｆｅｒｒｏ−ｏｘｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ−ｌｉｖｅｒ，  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈ−ｃｈａｉｎ  ｆｅｒｒｉｔｉｎｓ，  ａｎｄ  ｏｆ  ２Ｈ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔｓ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６３：１８０８６−１８０９２．  
１７．Ｆｏｒｄ  ＧＣ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４），  Ｆｅｒｒｉｔｉｎ：  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｒｏｎ−ｓｔｏｒａｇｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ，  Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ．  Ｒ．  Ｓｏｃ．  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ．  Ｓｃｉ．，  ３０４：５５１−５６５．
１８．Ｆａｒｇｉｏｎ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｆｅｒｒｉｔｉｎ  Ｈ−ｃｈａｉｎ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．  Ｂｌｏｏｄ  ７１：７５３−７５７．
１９．Ｍｏｓｓ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｅｒｒｉｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  （ＭＯＬＴ−４）  ｃｅｌｌｓ，  Ｊ．  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．  １１９：２７３−２７９．
２０．Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ  ＭＳ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｒｒｉｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃｏａｔｅｄ  ｐｉｔｓ  ｏｎ  ｇｉａｎｔ  ＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２：５９９−６０３．
２１．Ｔａｋａｍｉ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｈｕｍａｎ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｆｅｒｒｉｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ８８４：３１−３８．
２２．Ｆａｒｇｉｏｎ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｈ−ｆｅｒｒｉｔｉｎ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｏｎｔｒｏｌ，  Ｂｌｏｏｄ  ７８：１０５６−１０６１．
２３．Ｍｏｓｓ  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｅｒｒｉｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ，  ｈｅｐａｔｏｍａ，  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ａｎｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ，  Ｊ．  Ｉｎｏｒｇ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４７：２１９−２２７．
２４．Ｌｉ  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０），  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  Ｈ−ｆｅｒｒｉｔｉｎ  ａｒｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １０７：  ３５０５−３５１０．
２５．Ｌａｒｒｉｃｋ  ＪＷ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９７９），  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｉｒｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｂｙ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，  Ｊ．  Ｓｕｐｒａｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃｔ．，  １１：５７９−５８６．
２６．Ｄａｎｉｅｌｓ  ＴＲ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６），  Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐａｒｔ  Ｉ：  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ，  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２１：  １４４−１５８．
２７．Ｒｙｓｃｈｉｃｈ  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４），  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｅｒ，  ４０：１４１８−１４２２．
２８．Ｓａｎｔａｍｂｒｏｇｉｏ  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００），  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｏｕｓｅ  Ｈ−  ａｎｄ  Ｌ−ｆｅｒｒｉｔｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．，  １９：  ２１２−２１８．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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