(57)【要約】  本発明は、１種以上の免疫グロブリン含有タンパク質を液体から分離する方法に関する。本方法は、先ず液体を、担体に固定化されたリガンドを含む分離マトリックスに接触させる段階、免疫グロブリン含有タンパク質をリガンドとの相互作用によってマトリックスに吸着させる段階、続いて吸着した免疫グロブリン含有タンパク質を洗浄する任意段階、及びタンパク質を遊離させる溶離剤にマトリックスを接触させることで前記免疫グロブリン含有タンパク質を回収する段階を含んでいる。本方法は、従前の分離方法に比べて、各々のリガンドが１以上のプロテインＡドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）又はプロテインＺ或いはその機能的変異体を含み、１以上の単量体が第３のα−ヘリックスの後方にある最もＣ末端のプロリン残基の置換を有する点で改良されている。【選択図】図２(ｄ)
2014502272.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上の免疫グロブリン含有タンパク質を液体から分離する方法であって、
（ａ）該液体を、担体に固定化されたリガンドを含む分離マトリックスに接触させる段階、
（ｂ）前記免疫グロブリン含有タンパク質をリガンドとの相互作用によってマトリックスに吸着させる段階、
（ｃ）吸着した免疫グロブリン含有タンパク質を洗浄する任意段階、及び
（ｄ）タンパク質を遊離させる溶離剤にマトリックスを接触させることで前記免疫グロブリン含有タンパク質を回収する段階
を含んでなる方法において、前記リガンドの各々がブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の１以上のドメイン（単量体）（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）又はプロテインＺ或いはその機能的変異体を含み、１以上のドメインにおける最もＣ末端のプロリンが任意の他のアミノ酸で置換されている点で改良された方法。
【請求項２】
前記プロテインＡの１以上のドメイン又はプロテインＺが同じドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ又はプロテインＺの２以上のコピーである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記プロテインＡの１以上のドメイン又はプロテインＺがドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ及びプロテインＺから選択される２以上のドメインである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記プロテインＡの１以上のドメイン又はプロテインＺがドメインＢ、ドメインＣ及びプロテインＺから選択される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
多量体リガンド中の１以上の単量体における最もＣ末端のプロリンが別のアミノ酸で置換されている、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
多量体リガンド中のすべての単量体における最もＣ末端のプロリンが別のアミノ酸で置換されている、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
１以上の単量体における最もＣ末端のプロリンがＹ、Ｗ、Ｆ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、Ｔから選択されたアミノ酸で置換されている、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
１以上の単量体における最もＣ末端のプロリンがイソロイシンで置換されている、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
１以上の単量体における最もＣ末端のプロリンがＥ、Ａ、Ｌ、Ｈ、Ｍ、Ｑ、Ｋから選択されたアミノ酸で置換されている、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
リガンドが、１以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることでアルカリ安定性を有する、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
リガンドが免疫グロブリンのＦｃ部分に対して親和性を有するが、免疫グロブリンのＦａｂ部分に対する親和性を欠いている、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記リガンドの１以上のグリシンがアラニンで置換されている、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
プロテインＡのＢドメインの２９位に対応するグリシン残基がアラニンに変えられている、請求項１１又は請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
リガンドがプロテインＺであり、そのアルカリ安定性が１以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることで達成されている、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
プロテインＺのアルカリ安定性が、少なくとも２３位のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることで達成されている、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記多量体が二量体である、請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
前記多量体が四量体である、請求項１乃至請求項１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
免疫グロブリン含有タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項１乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
免疫グロブリン含有タンパク質がポリクローナル抗体である、請求項１乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
免疫グロブリン含有タンパク質が別のタンパク質と融合した免疫グロブリンのＦｃ部分を含む融合タンパク質である、請求項１乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
免疫グロブリン含有タンパク質を分離するためのリガンドであって、当該リガンドがブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の１以上のドメイン（単量体）（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）又はプロテインＺ或いはその機能的変異体を含み、１以上のドメインにおける最もＣ末端のプロリンが任意の他のアミノ酸で置換されている、リガンド。
【請求項２２】
前記プロテインＡの１以上のドメイン又はプロテインＺが同じドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ又はプロテインＺの２以上のコピーである、請求項２１記載のリガンド。
【請求項２３】
前記プロテインＡの１以上のドメイン又はプロテインＺがドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ及びプロテインＺから選択される２以上のドメインである、請求項２１記載のリガンド。
【請求項２４】
前記プロテインＡの１以上のドメイン又はプロテインＺがドメインＢ、ドメインＣ及びプロテインＺから選択される、請求項２１記載のリガンド。
【請求項２５】
多量体リガンド中の１以上の単量体における最もＣ末端のプロリンが別のアミノ酸で置換されている、請求項２１乃至請求項２４のいずれか１項記載のリガンド。
【請求項２６】
多量体リガンド中のすべての単量体における最もＣ末端のプロリンが別のアミノ酸で置換されている、請求項２１乃至請求項２５のいずれか１項記載のリガンド。
【請求項２７】
１以上の単量体における最もＣ末端のプロリンがＹ、Ｗ、Ｆ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、Ｔから選択されたアミノ酸で置換されている、請求項２１乃至請求項２６のいずれか１項記載のリガンド。
【請求項２８】
１以上の単量体における最もＣ末端のプロリンがイソロイシンで置換されている、請求項２１乃至請求項２７のいずれか１項記載のリガンド。
【請求項２９】
１以上の単量体における最もＣ末端のプロリンがＥ、Ａ、Ｌ、Ｈ、Ｍ、Ｑ、Ｋから選択されたアミノ酸で置換されている、請求項２１乃至請求項２８のいずれか１項記載のリガンド。
【請求項３０】
１以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることでリガンドがアルカリ安定性である、請求項２１乃至請求項２９のいずれか１項記載のリガンド。
【請求項３１】
リガンドが免疫グロブリンのＦｃ部分に対して親和性を有するが、免疫グロブリンのＦａｂ部分に対する親和性を欠いている、請求項２１乃至請求項３０のいずれか１項記載のリガンド。
【請求項３２】
当該リガンドの１以上のグリシンがアラニンで置換されている、請求項２１乃至請求項３１のいずれか１項記載のリガンド。
【請求項３３】
プロテインＡのＢドメインの２９位に対応するグリシン残基がアラニンに変えられている、請求項３１又は請求項３２記載のリガンド。
【請求項３４】
リガンドがプロテインＺであり、そのアルカリ安定性が１以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることで達成されている、請求項２１乃至請求項３３のいずれか１項記載のリガンド。
【請求項３５】
プロテインＺのアルカリ安定性が、少なくとも２３位のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることで達成されている、請求項３４記載のリガンド。
【請求項３６】
前記多量体が二量体又は四量体である、請求項２１乃至請求項３５のいずれか１項記載のリガンド。
【請求項３７】
固体担体にカップリングされた、請求項２１乃至請求項３６のいずれか１項記載のリガンドの１以上を含んでなる分離マトリックス。
【請求項３８】
固体担体が寒天又はアガロースのような多糖類を含む、請求項３７記載の分離マトリックス。
【請求項３９】
固体担体が架橋されている、請求項３７乃至請求項３８のいずれか１項記載の分離マトリックス。
【請求項４０】
リガンドがチオエーテル結合を介してカップリングされている、請求項３７乃至請求項３９のいずれか１項記載の分離マトリックス。
【請求項４１】
マトリックスのリガンド含有量が５〜１５ｍｇ／ｍｌ、例えば５〜１０ｍｇ／ｍｌである、請求項３７乃至請求項４０のいずれか１項記載の分離マトリックス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアフィニティークロマトグラフィーの分野に関し、さらに具体的には、１以上のプロテインＡドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）又はプロテインＺを含むリガンドであって、１以上の単量体における最もＣ末端のプロリン残基がアミノ酸置換を受けているリガンドを含む分離マトリックスに関する。本発明はまた、前述のマトリックスを用いて興味あるタンパク質を分離する方法であって、容量が増加するという利点を有する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンは、世界中で製造又は開発されている最も普及したバイオ医薬製品を代表している。それに対する高い商業的需要、したがってこの特定の治療薬市場の高い価値のため、製薬会社は関連するコストを抑制しながらそれぞれのｍＡｂ製造プロセスの生産性を最大化することに重きを置いてきた。
【０００３】
大抵の場合、これらの免疫グロブリン分子（例えば、モノクローナル又はポリクローナル抗体）の精製における基本段階の１つとしてアフィニティークロマトグラフィーが使用される。特に興味深い部類の親和性試薬は免疫グロブリン分子の不変部に特異的に結合できるタンパク質であり、かかる相互作用は抗体の抗原結合特異性とは無関係である。かかる試薬は、特に限定されないが血清又は血漿製剤或いは細胞培養物由来の供給原料のような様々な試料からアフィニティークロマトグラフィーで免疫グロブリンを回収するのに広く使用できる。かかるタンパク質の一例は、様々な種のＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ及びＦａｂ部分に結合できるドメインを含んだブドウ球菌プロテインＡである。
【０００４】
ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）系試薬は、その高い親和性及び選択性のため、バイオテクノロジー分野で（例えば、抗体の捕捉及び精製並びに検出のためのアフィニティークロマトグラフィーで）広く用いられてきた。現在、ＳｐＡ系アフィニティー媒体は恐らく細胞培養物由来の工業用供給原料を始めとする様々な試料からモノクローナル抗体及びそのフラグメントを単離するために最も広く使用されているアフィニティー媒体である。したがって、プロテインＡリガンドを含む各種のマトリックスが市販されており、例えば、天然プロテインＡの形態のもの（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（ウプサラ、スウェーデン））、組換えプロテインＡからなるもの（例えば、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）などがある。さらに具体的には、市販の組換えプロテインＡ製品で行われている遺伝子操作は、担体に対するそれの結合を容易にすることを目的としたものである。
【０００５】
これらの用途では、他のアフィニティークロマトグラフィー用途と同じく、夾雑物を確実に除去することに包括的な注意を払う必要がある。かかる夾雑物とは、例えばタンパク質、炭水化物、脂質、細菌及びウィルスを始めとする所望されない生体分子や微生物のように、クロマトグラフィー操作で固定相又はマトリックスに吸着された非溶出性の分子であり得る。かかる夾雑物のマトリックスからの除去は、マトリックスを再生してから引き続いて使用するため、所望生成物の最初の溶出の後に行われるのが普通である。かかる除去では、通常クリーニング・イン・プレイス（ＣＩＰ）として知られる操作が行われ、その際には固定相から夾雑物を溶出することのできる薬剤が使用される。かかる薬剤として多用されるものには、前記固定相に流されるアルカリ溶液がある。現時点で最も多用されている洗浄消毒剤はＮａＯＨであり、その濃度は汚染の程度及び性質に応じて０．１Ｍから例えば１Ｍの範囲にわたり得る。この方法では、マトリックスが１３を超えるｐＨ値に暴露されることを伴う。タンパク質系の親和性リガンドを含む多くのアフィニティークロマトグラフィーマトリックスに関しては、かかるアルカリ性環境は極めて過酷な条件であり、そのために関連する高ｐＨに対するリガンドの不安定性によって容量低下を生じる。
【０００６】
そこで、アルカリ性ｐＨ値に耐える能力の向上した人工タンパク質リガンドの開発に集中して多大の研究が行われてきた。例えば、Ｇｕｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ（Ｓｕｓａｎｎｅ  Ｇｕｌｉｃｈ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｌｉｎｈｕｌｔ，Ｐｅｒ−Ａｋｅ  Ｎｙｇｒｅｎ，Ｍａｔｈｉａｓ  Ｕｈｌｅｎ，Ｓｏｐｈｉａ  Ｈｏｂｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８０（２０００），１６９−１７８）は、アルカリ性環境における連鎖球菌のアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）の安定性を改善するためのタンパク質工学を提唱した。Ｇｕｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌは、４つのアスパラギン残基のすべてをロイシン（１残基）、アスパラギン酸（２残基）及びリシン（１残基）で置換したＡＢＤの変異体を作製した。さらに、Ｇｕｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌは、この変異体が天然タンパク質と同様の標的タンパク結合挙動を示すこと、及び人工リガンドを含むアフィニティーカラムがアルカリ性条件に繰返し暴露した後でも非人工親リガンドを用いて調製したカラムより高い結合容量を示すことを報告している。かくして、構造及び機能に顕著な影響を与えることなしに４つのアスパラギン残基のすべてを置換できると結論づけている。
【０００７】
最近の研究は、プロテインＡ（ＳｐＡ）に変更を加えることで同様な性質に影響を及ぼし得ることを示している。米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号には、１以上のアスパラギン残基をグルタミン又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に変異させた場合、かかる変異は、ＳｐＡのＢドメイン又はプロテインＺ（ＳｐＡのＢドメイン由来の合成構築物（米国特許第５１４３８４４号））のような親ＳｐＡに比べて、最大約１３〜１４までのｐＨ値における向上した化学的安定性を付与することが開示されている。著者らは、これらの変異タンパク質を親和性リガンドとして使用した場合、分離媒体は予想される通りアルカリ剤を用いるクリーニング操作に一層よく耐え得ることを示している。米国特許出願公開第２００６／０１９４９５５号は、変異したリガンドがプロテアーゼに一層よく耐え、したがって分離プロセスでのリガンドの漏出を低減させ得ることを示している。別の出願公開文献である米国特許出願公開第２００６／０１９４９５０号は、アルカリ安定性のＳｐＡドメインをさらに、例えばＧ２９Ａ変異により、リガンドがＦａｂに対する親和性を欠くがＦｃ親和性は保持するように改変し得ることを示している。
【０００８】
歴史的には、５つのＩｇＧ結合ドメインを含む天然プロテインＡが、すべてのプロテインＡアフィニティー媒体の製造に使用されていた。組換え技術を用いて多数のプロテインＡ構築物が製造されてきたが、これらはいずれも４つ又は５つのＩｇＧ結合ドメインを含んでいた。最近の研究では、二量体リガンドが四量体リガンドに比べて同様な結合容量又は増加した結合容量を有することが示された（国際公開第２０１０／０８００６５号）。
【０００９】
当技術分野では、増加した結合容量を有するタンパク質リガンドを含む分離マトリックスを得ることが今なお要望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
米国特許第５３６２８５９号号明細書
【発明の概要】
【００１１】
本発明の目的の１つは、ＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭのような免疫グロブリンを好ましくはそのＦｃフラグメントを介して結合し得るタンパク質リガンドを提供することである。これらのリガンドは、プロテインＡの１以上の単量体ドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）又はプロテインＺにおいて第３のα−ヘリックスの後方にある最もＣ末端のプロリン残基の置換を担持し、かくしてかかる置換を持たないリガンドに比べて高い結合容量を有している。好ましくは、かかるリガンドは多量体、即ちプロテインＡ（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）及びプロテインＺから選択された２以上の単量体ドメインを含むものである。
【００１２】
本発明の別の目的は、上述したように、ＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭのような免疫グロブリンを好ましくはそのＦｃフラグメントを介して結合し得るリガンドを含むアフィニティー分離マトリックスを提供することである。
【００１３】
本発明のさらに別の目的は、本発明のアフィニティーマトリックスを用いて１種以上の免疫グロブリン含有タンパク質を分離する方法を提供することである。上記の置換を有する親和性リガンドを使用することで、本方法は意外にも標的分子に対する結合容量の増加を達成する。
【００１４】
かくして本発明は、純粋な免疫グロブリン画分のような精製生成物又は別法として免疫グロブリンを除去した後の液体を製造する方法、或いは試料中における免疫グロブリンの存在を検出する方法を提供する。本発明に係るリガンドは容量の増加を示し、したがってかかるリガンドはコスト効率の良い大規模操作のための魅力的な候補品となる。
【００１５】
上述した目的の１以上は、添付の特許請求の範囲中に記載したようにして達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１はプロテインＺのアミノ酸配列を示し、５７位のプロリンが太字で示されている（配列番号２）。
【図２（ａ）】図２(ａ)は仮説的な四量体リガンド構造を示し、各単量体はプロテインＡ（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）及びプロテインＺから選択されたドメインであって、これは各単量体における最もＣ末端のプロリンの存在のためドメイン間に６０°の屈曲を含んでいる。
【図２（ｂ）】図２(ｂ)はリガンドとＩｇＧとの間の仮説的な結合を示し、ここでは単一のＩｇＧが２つの単量体ドメインに結合している（両方のＦｃ鎖は円によって表され、各々が１つの単量体ドメインに結合している）。
【図２（ｃ）】図２(ｃ)は、各ドメインにおける最もＣ末端のプロリンが別のアミノ酸残基で置換されたため、単量体ドメイン間が一層直線的で柔軟である仮説的な多量体リガンド構造を示している。
【図２（ｄ）】図２(ｄ)は、プロテインＡの５つのドメインの各々からのアミノ酸配列の整列状態を示している。
【図３】図３は、動的結合容量アッセイに関する代表的なクロマトグラム結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
本明細書中で「タンパク質」という用語は、タンパク質並びにそのフラグメントを記述するために使用される。即ち、三次元構造を示すアミノ酸の連鎖が「タンパク質」という用語に包含され、したがってタンパク質フラグメントも包含される。
【００１８】
本明細書中では、タンパク質の「機能的変異体」という用語は、機能（本発明に関しては親和性及び安定性と定義される）が本質的に保持されている変異タンパク質を意味する。そこで、前記機能とは無関係の１以上のアミノ酸が置換されていてもよい。
【００１９】
本明細書中で「親分子」という用語は、本発明の変異が導入される前の形態の対応タンパク質に関して使用される。
【００２０】
「構造的安定性」という用語は分子の三次元形態の健全性をいい、「化学的安定性」という用語は化学的分解に耐える能力をいう。
【００２１】
「Ｆｃフラグメント結合」タンパク質という用語は、当該タンパク質が免疫グロブリンのＦｃフラグメントに結合できることを意味する。ただし、Ｆｃフラグメント結合タンパク質が免疫グロブリンのＦａｂ領域のような他の領域にも結合できることを排除するものではない。
【００２２】
本明細書中では、アミノ酸について、その正式名称で記載しない場合には慣用の一文字略号で表す。
【００２３】
本明細書中では、変異は置換位置の番号の前に野生型又は非変異型アミノ酸を付し、その後に変異したアミノ酸を付して定義する。例えば、２３位のアスパラギンのトレオニンへの変異はＮ２３Ｔと記載される。
【００２４】
一態様では、本発明は、１種以上の免疫グロブリン含有タンパク質を液体から分離する方法であって、（ａ）該液体を、担体に固定化されたリガンドを含む分離マトリックスに接触させる段階、（ｂ）免疫グロブリン含有タンパク質をリガンドとの相互作用によってマトリックスに吸着させる段階、（ｃ）吸着した免疫グロブリン含有タンパク質を洗浄する任意段階、及び（ｄ）タンパク質を遊離させる溶離剤にマトリックスを接触させることで前記免疫グロブリン含有タンパク質を回収する段階を含んでなる方法に関する。この方法では、リガンドの各々がブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の１以上のドメイン（即ち、単量体）（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）又はプロテインＺ或いはその機能的変異体を含み、１以上のドメインにおける最もＣ末端のプロリンが任意の他のアミノ酸で置換されているようなリガンドを使用することで免疫グロブリン分子に対するリガンドの結合容量の増加が得られる。
【００２５】
免疫グロブリン結合タンパク質（即ち、リガンド）は、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）又は連鎖球菌プロテインＧ（ＳｐＧ）或いはこれらのタンパク質のＩｇＧ結合ドメインを含む組換えタンパク質のような、天然の免疫グロブリン結合能力を有する任意のタンパク質であり得る。他のかかるタンパク質の総説に関しては、例えば、Ｋｒｏｎｖａｌｌ，Ｇ．，Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｋ．Ｒｅｃｅｐｔｉｎｓ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｅｒｍ  ｆｏｒ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１９９９  Ｊａｎ−Ｆｅｂ；１２（１）：３８−４４を参照されたい。リガンドは、ＳｐＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣドメインの１以上を含み得る。さらに好ましくは、リガンドはプロテインＡのドメインＢ又は人工的に作製されたプロテインＺを含んでいる。
【００２６】
プロリンＺ又はプロテインＡドメインはいずれも、Ｃ末端の近くにプロリン（Ｐ５７）を含んでいる（例えば、図１、図２(ｄ)及び配列番号１〜８を参照されたい）。プロリンは、その構造（即ち、側鎖がα−窒素に結合していること）のため、タンパク質中に屈曲を生じることが知られている。この結合はφ＝約６０°の結合角に限定され、そのためタンパク質中に屈曲を生じる。古典的な例はＩｇＧのヒンジに見られ、そこにはプロリンが見出される。このように、Ｃ末端にプロリンが存在する場合、プロテインＡ又はプロテインＺのすべてのドメインは結合中に６０°の角を成して終わり、ドメイン間に屈曲を生じる（図２(ａ)〜２(ｃ)）。最もＣ末端のプロリンは、Ｆｃ結合にも関与せず（Ｇｒａｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ２０００，９７（１０）：５３９９−５４０４；Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８１，２０（９）：２３６１−２３７０）、またα−ヘリックスの一部でもない（プロリンに関しては不可能である）。
【００２７】
このように、プロテインＡ／プロテインＺリガンドにおける単量体ドメインの不良な使用（トータルオーバローディングで２つの内の１つが使用されること）は、各ドメインにおけるＣ末端プロリンの存在によって引き起こされる構造的制限（即ち、立体障害）に原因することがあり得る。２つのドメインが１つのＩｇＧ分子に結合し、したがっていずれか他方のドメインに対するＩｇＧのアクセスが妨害される可能性がある（図２(ｂ)）。かかる結合はまた、リガンドに対するＩｇＧのより強い結合を意味し得る。本発明の若干の実施形態では、各ドメインの一層高度の使用を達成するため、各ドメインにおける最もＣ末端のプロリン（配列番号１又は配列番号２のＰ５７）が置換され、かくして、恐らくは単量体ドメイン間が一層直線的かつ／又は柔軟な多量体リガンド構造（図２(ｃ)）のため、リガンドの容量の増加が得られる。
【００２８】
図２(ｄ)に示されるように、プロテインＡのつのドメイン間の配列は高度に関連している。欠失や挿入は存在せず、置換の多くは保存的変化であって、タンパク質の構造又は機能に対して起こり得る変化はごくわずかである。例えば、ＢドメインとＣドメインとの間の変化は、５８アミノ酸のポリペプチド全体にわたってわずか４つである。したがって、これらのドメインの各々におけるＣ末端のプロリンは、プロテインＡ又は該ドメインを含むリガンドに対して同様な構造的／機能的寄与をもたらす。同様に、プロリンの変化は、かかる変化を含むリガンドの構造／機能に対して同様な効果を引き起こす。
【００２９】
若干の実施形態では、プロリンは、好ましくはβ−シートを形成するアミノ酸で置換される。好ましくは、プロリンは、バルキーなアミノ酸又は「スチフネス」を与えるアミノ酸（例えば、Ｙ、Ｗ、Ｆ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、Ｔ）で置換される。さらに好ましくは、かかる置換はＰ５７Ｉである。
【００３０】
他の実施形態では、プロリンはα−ヘリックスの形成を生じやすいアミノ酸（例えば、Ｅ、Ａ、Ｌ、Ｈ、Ｍ、Ｑ、Ｋ）で置換される。
【００３１】
若干の実施形態では、親分子は配列番号１乃至配列番号８で規定される配列又はその任意の機能的変異体を含んでいる。
【００３２】
若干の実施形態では、多量体リガンド中の１以上の単量体ドメインにおける最もＣ末端のプロリン残基が置換されている。他の実施形態では、多量体リガンド中のすべての単量体ドメインにおける最もＣ末端のプロリン残基が置換されている。
【００３３】
一実施形態では、リガンドはまた、例えばＳｐＡドメインＢ又はプロテインＺの１以上の単量体ドメインの１以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることでアルカリ安定化される。前述の通り、米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号は、１以上のアスパラギン残基をグルタミン又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に変異させた場合、かかる変異（例えば、Ｎ２３Ｔ）はリガンドに高ｐＨでの向上した化学的安定性を付与することを開示している。さらに、これらのリガンドを含むアフィニティー媒体は、アルカリ剤を用いるクリーニング操作に一層よく耐えることができる。米国特許出願公開第２００６／０１９４９５５号は、変異したリガンドがプロテアーゼにも一層よく耐え、したがって分離プロセスでのリガンドの漏れを低減させ得ることを示している。これらの出願の開示内容は、援用によって本明細書の内容の一部をなしている。
【００３４】
別の実施形態では、こうして製造されたリガンドは、抗体のＦｃ部分に対して親和性を有するものの、抗体のＦａｂ部分に対する実質的な親和性を欠いている。したがって、若干の実施形態では、リガンドの１以上のグリシンがアラニンで置換されている。米国特許出願公開第２００６／０１９４９５０号は、アルカリ安定性ドメインをさらに、例えばＧ２９Ａ変異により、リガンドがＦａｂに対する親和性を欠くがＦｃ親和性は保持するように改変し得ることを示している。この出願の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなしている。本明細書中で使用されるアミノ酸の番号付けは当技術分野で通常使用されているものであり、プロテインＡのドメインＢ上での位置によって例示されており、当業者はＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃの各ドメイン又はプロテインＺに関して変異させるべき位置を容易に認識できよう。
【００３５】
有利な実施形態では、リガンドはドメインＢの多量体コピーから構成されており、ドメインＢのアルカリ安定性は１以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させること（例えば、Ｎ２３Ｔ）で達成されていると共に、アルカリ安定性ドメインＢの２９位のアミノ酸残基の変異（例えば、Ｇ２９Ａ変異）が含まれている。
【００３６】
別の実施形態では、リガンドは、１以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることでアルカリ安定性が達成されたプロテインＺの多量体コピーから構成されている。有利な実施形態では、アルカリ安定性は少なくとも２３位のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることで達成されている。
【００３７】
当業者には容易に理解されるように、Ｐ５７の置換、アルカリ安定性を与えるための変異、及びＧ−Ａ変異は、通常の分子生物学的技法を用いて任意の順序で実施できる。さらに、かかるリガンドは、変異したタンパク質リガンドをエンコードする核酸配列を含むベクターによって発現させることができる。別法として、かかるリガンドはタンパク質合成技法によっても製造できる。所定配列のペプチド及びタンパク質を合成する方法は、当技術分野で公知であって一般に利用できる。
【００３８】
かくして、本発明では、「ブドウ球菌プロテインＡのアルカリ安定性ドメインＢ」という用語は、米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号及び同第２００６／０１９４９５０号に記載されている変異タンパク質のような、ＳｐＡのドメインＢに基づくアルカリ安定化タンパク質、並びに他の起源を有するが機能的に同等なアミノ酸配列を有する他のアルカリ安定性タンパク質を意味する。
【００３９】
当業者には理解される通り、発現されたタンパク質は、担体に固定化する前に適当な程度まで精製すべきである。かかる精製方法は当技術分野で公知であり、担体へのタンパク質系リガンドの固定化は標準的な方法を用いて容易に実施される。好適な方法及び担体は以下に一層詳しく記載される。
【００４０】
したがって一実施形態では、本発明に係る変異タンパク質は、アスパラギン変異が２１位にないことを条件として、配列番号１又は配列番号２で規定される配列の約７５％以上、例えば約８０％以上、好ましくは９５％以上を含んでいる。
【００４１】
本明細書中では、次の配列番号１はＳｐＡのＢドメインのアミノ酸配列を規定する。
Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ
Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ
Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ
Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ
Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｇｌｎ
Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ。
次の配列番号２はプロテインＺとして知られるタンパク質を規定する。
Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ
Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ
Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ
Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ
Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｇｌｎ
Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ。
【００４２】
プロテインＺは、２９位のグリシンがアラニンに置換されたＳｐＡのＢドメイン由来の合成構築物である。例えば、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｍ．Ｃ．Ｆｌｅｃｋｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｓ．Ｗ．Ｄｒｅｗ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，８−２２のＳｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ，  １９９９：  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇを参照されたい。
【００４３】
一実施形態では、上述の変異タンパク質は、Ｐ５７の置換を含む、配列番号１又は配列番号２で規定されるアミノ酸配列或いはその機能的変異体から構成されている。別の実施形態では、上述の変異タンパク質は、Ｐ５７の置換を含む、配列番号４乃至配列番号８で規定されるアミノ酸配列或いはその機能的変異体から構成されている。本文脈中で使用される「機能的変異体」という用語は、免疫グロブリンに対する変異タンパク質の親和性又はｐＨ値の上昇した環境におけるその向上した化学的安定性に影響を及ぼさないアミノ酸位置における１以上の追加変異を含む任意の類似配列を包含する。
【００４４】
有利な実施形態では、本発明のＰ５７置換は、バルキーなアミノ酸又は「スチフネス」を与えるアミノ酸（例えば、Ｙ、Ｗ、Ｆ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、Ｔ）からなる群から選択され、かつ親分子は配列番号１乃至配列番号８で規定される配列又はその任意の機能的変異体を含んでいる。他の実施形態では、Ｐ５７はα−ヘリックスの形成を生じやすいアミノ酸（例えば、Ｅ、Ａ、Ｌ、Ｈ、Ｍ、Ｑ、Ｋ）で置換され、かつ親分子は配列番号１乃至配列番号８で規定される配列又はその任意の機能的変異体を含んでいる。さらに好ましくは、かかる置換はＰ５７Ｉである。
上述の通り、アルカリ性条件下で長期にわたって高い結合容量を有するリガンドとして有用な変異タンパク質を得るためには、２１位のアスパラギン残基の変異は回避される。一実施形態では、３位のアスパラギン残基は変異されない。
【００４５】
若干の実施形態では、多量体リガンド中の１以上の単量体における最もＣ末端のプロリン残基が置換されている。他の実施形態では、多量体リガンド中のすべての単量体における最もＣ末端のプロリン残基が置換されている。
【００４６】
有利な一実施形態では、ロイシン残基とグルタミン残基との間に位置するアスパラギン残基が例えばトレオニン残基に変異されている。かくして、一実施形態では、配列番号２で規定される配列の２３位のアスパラギン残基が、例えばトレオニン残基に変異されている。特定の実施形態では、配列番号２で規定される配列の４３位のアスパラギン残基も例えばグルタミン酸に変異されている。アミノ酸番号４３が変異された実施形態では、当該変異を１以上の追加変異（例えば、Ｎ２３Ｔ）と組み合わせるのが最も有利であるように思われる。
【００４７】
かくして、本発明は上述した単量体型変異タンパク質を包含する。ただし、かかるタンパク質単量体を合体させて二量体、三量体、四量体、五量体などの多量体リガンドとすることもできる。したがって、本発明の別の態様は、本発明に係る１以上の変異タンパク質を１以上の追加単位（好ましくはやはり本発明に係る変異タンパク質）と共に含んでなる多量体である。かくして、本発明は例えば２つの反復単位からなる二量体又は４つの反復単位からなる四量体である。
【００４８】
若干の実施形態では、多量体リガンドは、プロリンＡのドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ又はプロテインＺ或いは任意の機能的変異体から選択された同一単量体ドメインの２以上（例えば、２〜４）のコピーを含んでいる。
【００４９】
他の実施形態では、多量体リガンドは、プロリンＡのドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ又はプロテインＺ或いは任意の機能的変異体から選択された２以上（例えば、２〜４）の異なる単量体ドメインを含んでいる。
【００５０】
一実施形態では、本発明に係る多量体は、好ましくは０〜１５のアミノ酸（例えば、０〜１０又は５〜１０のアミノ酸）からなるアミノ酸ストレッチで連結された単量体単位を含んでいる。かかる連結の性質は、好ましくはタンパク質単位の空間的コンホメーションを不安定にすべきでない。さらに、前記連結は好ましくはアルカリ性環境中で変異タンパク質単位の特性を損なわないように十分安定であるべきである。
【００５１】
別の実施形態では、本発明の二量体リガンドは次の配列番号３の配列を含んでいる。
ＡｌａＧｌｎＶａｌＡｓｐＡｌａＬｙｓＰｈｅＡｓｐＬｙｓＧｌｕＧｌｎＧｌｎＡｓｎ
ＡｌａＰｈｅＴｙｒＧｌｕＩｌｅＬｅｕＨｉｓＬｅｕＰｒｏＡｓｎＬｅｕＴｈｒＧｌｕ
ＧｌｕＧｌｎＡｒｇＡｓｎＡｌａＰｈｅＩｌｅＧｌｎＳｅｒＬｅｕＬｙｓＡｓｐＡｓｐ
ＰｒｏＳｅｒＧｌｎＳｅｒＡｌａＡｓｎＬｅｕＬｅｕＡｌａＧｌｕＡｌａＬｙｓＬｙｓ
ＬｅｕＡｓｎＡｓｐＡｌａＧｌｎＡｌａＩｌｅＬｙｓＶａｌＡｓｐＡｌａＬｙｓＰｈｅ
ＡｓｐＬｙｓＧｌｕＧｌｎＧｌｎＡｓｎＡｌａＰｈｅＴｙｒＧｌｕＩｌｅＬｅｕＨｉｓ
ＬｅｕＰｒｏＡｓｎＬｅｕＴｈｒＧｌｕＧｌｕＧｌｎＡｒｇＡｓｎＡｌａＰｈｅＩｌｅ
ＧｌｎＳｅｒＬｅｕＬｙｓＡｓｐＡｓｐＰｒｏＳｅｒＧｌｎＳｅｒＡｌａＡｓｎＬｅｕ
ＬｅｕＡｌａＧｌｕＡｌａＬｙｓＬｙｓＬｅｕＡｓｎＡｓｐＡｌａＧｌｎＡｌａＩｌｅ
ＬｙｓＣｙｓ。
【００５２】
さらに別の実施形態では、二量体リガンドは次の配列番号９の配列を含んでいる。
ＡｌａＧｌｎＶａｌＡｓｐＡｓｎＬｙｓＰｈｅＡｓｎＬｙｓＧｌｕＧｌｎＧｌｎＡｓｎ
ＡｌａＰｈｅＴｙｒＧｌｕＩｌｅＬｅｕＨｉｓＬｅｕＰｒｏＡｓｎＬｅｕＴｈｒＧｌｕ
ＧｌｕＧｌｎＡｒｇＡｓｎＧｌｙＰｈｅＩｌｅＧｌｎＳｅｒＬｅｕＬｙｓＡｓｐＡｓｐ
ＰｒｏＳｅｒＶａｌＳｅｒＬｙｓＧｌｕＩｌｅＬｅｕＡｌａＧｌｕＡｌａＬｙｓＬｙｓ
ＬｅｕＡｓｎＡｓｐＡｌａＧｌｎＡｌａＩｌｅＬｙｓＶａｌＡｓｐＡｓｎＬｙｓＰｈｅ
ＡｓｎＬｙｓＧｌｕＧｌｎＧｌｎＡｓｎＡｌａＰｈｅＴｙｒＧｌｕＩｌｅＬｅｕＨｉｓ
ＬｅｕＰｒｏＡｓｎＬｅｕＴｈｒＧｌｕＧｌｕＧｌｎＡｒｇＡｓｎＧｌｙＰｈｅＩｌｅ
ＧｌｎＳｅｒＬｅｕＬｙｓＡｓｐＡｓｐＰｒｏＳｅｒＶａｌＳｅｒＬｙｓＧｌｕＩｌｅ
ＬｅｕＡｌａＧｌｕＡｌａＬｙｓＬｙｓＬｅｕＡｓｎＡｓｐＡｌａＧｌｎＡｌａＩｌｅ
ＬｙｓＣｙｓ。
【００５３】
別の実施形態では、四量体リガンドは次の配列番号１０の配列を含んでいる。
ＡｌａＧｌｎＶａｌＡｓｐＡｌａＬｙｓＰｈｅＡｓｐＬｙｓＧｌｕＧｌｎＧｌｎＡｓｎ
ＡｌａＰｈｅＴｙｒＧｌｕＩｌｅＬｅｕＨｉｓＬｅｕＰｒｏＡｓｎＬｅｕＴｈｒＧｌｕ
ＧｌｕＧｌｎＡｒｇＡｓｎＡｌａＰｈｅＩｌｅＧｌｎＳｅｒＬｅｕＬｙｓＡｓｐＡｓｐ
ＰｒｏＳｅｒＧｌｎＳｅｒＡｌａＡｓｎＬｅｕＬｅｕＡｌａＧｌｕＡｌａＬｙｓＬｙｓ
ＬｅｕＡｓｎＡｓｐＡｌａＧｌｎＡｌａＩｌｅＬｙｓＶａｌＡｓｐＡｌａＬｙｓＰｈｅ
ＡｓｐＬｙｓＧｌｕＧｌｎＧｌｎＡｓｎＡｌａＰｈｅＴｙｒＧｌｕＩｌｅＬｅｕＨｉｓ
ＬｅｕＰｒｏＡｓｎＬｅｕＴｈｒＧｌｕＧｌｕＧｌｎＡｒｇＡｓｎＡｌａＰｈｅＩｌｅ
ＧｌｎＳｅｒＬｅｕＬｙｓＡｓｐＡｓｐＰｒｏＳｅｒＧｌｎＳｅｒＡｌａＡｓｎＬｅｕ
ＬｅｕＡｌａＧｌｕＡｌａＬｙｓＬｙｓＬｅｕＡｓｎＡｓｐＡｌａＧｌｎＡｌａＩｌｅ
ＬｙｓＶａｌＡｓｐＡｌａＬｙｓＰｈｅＡｓｐＬｙｓＧｌｕＧｌｎＧｌｎＡｓｎＡｌａ
ＰｈｅＴｙｒＧｌｕＩｌｅＬｅｕＨｉｓＬｅｕＰｒｏＡｓｎＬｅｕＴｈｒＧｌｕＧｌｕ
ＧｌｎＡｒｇＡｓｎＡｌａＰｈｅＩｌｅＧｌｎＳｅｒＬｅｕＬｙｓＡｓｐＡｓｐＰｒｏ
ＳｅｒＧｌｎＳｅｒＡｌａＡｓｎＬｅｕＬｅｕＡｌａＧｌｕＡｌａＬｙｓＬｙｓＬｅｕ
ＡｓｎＡｓｐＡｌａＧｌｎＡｌａＩｌｅＬｙｓＶａｌＡｓｐＡｌａＬｙｓＰｈｅＡｓｐ
ＬｙｓＧｌｕＧｌｎＧｌｎＡｓｎＡｌａＰｈｅＴｙｒＧｌｕＩｌｅＬｅｕＨｉｓＬｅｕ
ＰｒｏＡｓｎＬｅｕＴｈｒＧｌｕＧｌｕＧｌｎＡｒｇＡｓｎＡｌａＰｈｅＩｌｅＧｌｎ
ＳｅｒＬｅｕＬｙｓＡｓｐＡｓｐＰｒｏＳｅｒＧｌｎＳｅｒＡｌａＡｓｎＬｅｕＬｅｕ
ＡｌａＧｌｕＡｌａＬｙｓＬｙｓＬｅｕＡｓｎＡｓｐＡｌａＧｌｎＡｌａＩｌｅＬｙｓ
Ｃｙｓ。
【００５４】
本発明では意外にも、リガンドの容量を比較した場合、リガンドの１以上の単量体ドメインにおけるＣ末端プロリン（Ｐ５７）の置換が非置換リガンドに比べてより高い容量を与えることが見出された。
【００５５】
本発明の一態様は、免疫グロブリン含有タンパク質を分離するためのリガンドに関する。かかるリガンドはブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の１以上のドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）又はプロテインＺ或いはその機能的変異体を含み、１以上のドメインにおける最もＣ末端のプロリンが別のアミノ酸で置換されている。かかるリガンドは、固体担体材料上に固定化した場合、この置換を有しないリガンドに比べて増加した免疫グロブリン容量を与える。かかるリガンドは、上記に記載した任意の実施形態に従って構築できる。
【００５６】
一態様では、本発明は、アフィニティー分離用のマトリックスであって、免疫グロブリン結合タンパク質を含むリガンドが固体担体にカップリングされてなるマトリックスに関する。好ましくは、プロテインＡの１以上の単量体ドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）又はプロテインＺにおいて第３のα−ヘリックスの後方にある最もＣ末端のプロリン残基（Ｐ５７残基）が別のアミノ酸に置換されている。好ましくは、かかるリガンドは多量体、即ちプロテインＡ（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）及びプロテインＺから選択された２以上の単量体ドメインを含むものである。本発明のマトリックスは、この置換を有しないマトリックスと比較した場合、増加した結合容量を示す。変異タンパク質リガンドは好ましくはＦｃフラグメント結合タンパク質であり、ＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭ（好ましくはＩｇＧ）の選択的結合のために使用できる。
【００５７】
本発明に係るマトリックスは、任意の実施形態に関して上記に記載したような変異タンパク質をリガンドとして含むことができる。最も好ましい実施形態では、固体担体上に存在するリガンドは上記に記載したような置換を含んでいる。
【００５８】
本発明に係るマトリックスの固体担体は、任意適宜の公知タイプのものであり得る。通常のアフィニティー分離マトリックスは大抵は有機質のものであり、使用する水性媒体に親水性表面が露出されたポリマー、即ちその外面に（及び存在する場合には内面にも）ヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）、カルボキサミド（−ＣＯＮＨ2或いはＮ置換型）、アミノ（−ＮＨ2或いは置換型）、オリゴ又はポリエチレンオキシ基が露出されたポリマーを基材としている。一実施形態では、ポリマーは例えばデキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、寒天、アガロースなどの多糖類系のものであり得る。かかるポリマーは、有利には適当な多孔性及び剛性を与えるため、例えばビスエポキシド、エピハロヒドリン、１，２，３−トリハロ置換低級炭化水素で架橋され、或いは米国特許第６６０２９９０号に記載された方法に従って架橋されている。最も好ましい実施形態では、固体担体は多孔質の寒天又はアガロースビーズである。本発明で使用される担体は逆懸濁ゲル化（Ｓ．Ｈｊｅｒｔｅｎ：  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７９（２），３９３−３９８（１９６４））のような標準的方法に従って容易に製造できる。別法として、ベースマトリックスはＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦ又はＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）のような市販品である。大規模分離のために特に有利な実施形態では、担体は、その剛性が増大し、したがってマトリックスが高い流量に対して一層適するように改変されている。
【００５９】
別法として、固体担体は、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドなどの合成ポリマーを基材としている。ジビニル及びモノビニル置換ベンゼン系マトリックスのように疎水性ポリマーの場合には、上述のような親水性基が周囲の水性液体に露出されるようにマトリックスの表面を親水化処理することが多い。かかるポリマーは標準的方法に従って容易に製造されるが、例えば“Ｓｔｙｒｅｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｂｙ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”（Ｒ．Ａｒｓｈａｄｙ：  Ｃｈｉｍｉｃａ  ｅ  Ｌ'Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ  ７０（９），７０−７５  （１９８８））を参照されたい。別法として、ＳＯＵＲＣＥ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）のような市販品が使用される。
【００６０】
別の代替法では、本発明に係る固体担体は、例えばシリカ、酸化ジルコニウムなどの無機質の担体を含んでいる。
【００６１】
さらに別の実施形態では、固体担体は表面、チップ、毛管又はフィルターのような別の形態を取る。
【００６２】
本発明に係るマトリックスの形状に関しては、一実施形態では、マトリックスは多孔質モノリスの形態である。別の実施形態では、マトリックスはビーズ又は粒子形態であり、これは多孔質でも非多孔質でもよい。ビーズ又は粒子形態のマトリックスは充填ベッドとして使用することもできるし、或いは懸濁形態で使用することもできる。懸濁形態には膨張ベッドとして知られるもの及び純然たる懸濁物が包含され、そこでは粒子又はビーズが自由に運動できる。モノリス、充填ベッド及び膨張ベッドの場合、分離手順は一般に濃度勾配を用いる通常のクロマトグラフィーに従う。純然たる懸濁物の場合には、回分方式が使用される。
【００６３】
リガンドは、例えばリガンド中に存在するアミノ基及び／又はカルボキシ基を利用した通常のカップリング技法で担体に結合できる。ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、ＣＮＢｒ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などがよく知られたカップリング試薬である。担体とリガンドとの間には、スペーサーとして知られる分子を導入することができ、これはリガンドの利用可能性を向上させ、担体へのリガンドの化学的カップリングを容易にする。別法として、リガンドは物理的吸着又は生物特異的吸着のような非共有結合によって担体に結合することもできる。マトリックスのリガンド含有量は５〜１５ｍｇ／ｍｌマトリックスであり、有利には５〜１０ｍｇ／ｍｌであり得る。
【００６４】
有利な実施形態では、本発明のリガンドはチオエステル結合で担体にカップリングされている。かかるカップリングの実施方法は当技術分野で公知であり、標準的な技法及び機器を用いて当業者が容易に実施できる。有利な実施形態では、最初に、後にカップリングで使用するための末端システイン残基をリガンドに設ける。当業者は適切な精製段階も容易に実施できる。
【００６５】
本発明の若干の実施形態では、吸着段階のための条件は常用されている任意のものであってよく、標的抗体の性質（例えば、そのｐＩ）に応じて適切に改変することができる。任意の洗浄段階は、ＰＢＳ緩衝液のような常用緩衝液を用いて実施できる。
【００６６】
溶出は、任意の常用緩衝液を用いて実施できる。
【００６７】
本発明の方法は、例えば治療用又は診断用の抗体の精製プロトコルの第１段階として、標的抗体を捕捉するために有用である。一実施形態では、７５％以上の抗体が回収される。有利な実施形態では、８０％以上、例えば９０％以上、好ましくは９５％以上の抗体が、個々のリガンド系に関して適当なｐＨを有する溶離剤を用いて回収される。本発明の方法に続いて、他のクロマトグラフィー段階のような１以上の追加段階を実施することができる。かくして、特定の実施形態では、約９８％を超える抗体が回収される。
【００６８】
ＳｐＡ（ドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）又はプロテインＺリガンドに関して前述した通り、１以上のアスパラギン残基をグルタミン又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に変異させた場合、これらの変異リガンドを含むアフィニティー媒体は、アルカリ剤を用いる洗浄操作に一層よく耐えることができる（米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号）。向上した安定性は、免疫グロブリンに対する変異タンパク質の初期親和性が長期にわたって本質的に保持されることを意味する。したがって、その結合容量はアルカリ性環境中では親分子の結合容量よりゆっくりと減少する。かかる環境はアルカリ性と定義することができ、ｐＨ値の上昇した環境を意味する。上昇したｐＨ値とは、例えば約１０超から約１３又は１４まで（即ち、１０〜１３又は１０〜１４）のｐＨ値であり、これは一般にアルカリ性条件と表される。別法として、かかる条件はＮａＯＨ濃度で定義することもでき、その濃度は約１．０Ｍ以下（例えば、０．７Ｍ、特に約０．５Ｍ）、したがって０．７〜１．０Ｍの範囲内であり得る。
【００６９】
このように、免疫グロブリンに対する親和性（即ち、上述したようなアスパラギン変異の存在下における本発明のリガンドの結合性）、したがってマトリックスの容量は、アルカリ剤での処理によって本質的に経時的な変化を示さない。通常、アフィニティー分離マトリックスのクリーニング・イン・プレイス処理に使用されるアルカリ剤はＮａＯＨであり、その濃度は０．７５Ｍ以下（例えば、０．５Ｍ）である。したがって、０．５Ｍ  ＮａＯＨで７．５時間処理した後の結合容量の低下は約７０％未満、好ましくは約５０％未満、さらに好ましくは約３０％未満（例えば約２８％）である。
【００７０】
さらに別の態様では、本発明は、本発明に係るリガンド又はマトリックスを使用してＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭのような免疫グロブリンを単離する方法に関する。かくして本発明は、上述のリガンド又はマトリックスへの吸着によって１種以上の標的化合物を液体から分離するクロマトグラフィープロセスを包含する。所望の生成物は分離された化合物又は液体であり得る。かくして本発明のこの態様は、広く用いられている公知の分離技法であるアフィニティークロマトグラフィーに関する。簡単に述べれば、最初の工程では、標的化合物（好ましくは上述したような抗体）を含む溶液を、分離マトリックス上に存在するリガンドへの標的化合物の吸着を可能にする条件下で分離マトリックスに流す。かかる条件は、例えばｐＨ及び／又は塩濃度（即ち、溶液中のイオン強度）によって制御される。マトリックスの容量を超えないように注意すべきであり、換言すれば、流量は満足すべき吸着が起こるように十分遅くすべきである。この段階では、溶液の他の成分は原則として妨害されずに通過する。任意には、保持された物質及び／又は緩く結合した物質を除去するため、次いでマトリックスが例えば水溶液で洗浄される。本発明のマトリックスは、溶剤、塩又は洗浄剤或いはこれらの混合物を用いる中間洗浄段階と共に使用するのが最も有利である。次の段階では、溶離剤といわれる第２の溶液を、標的化合物の脱着（即ち、遊離）が起こる条件下でマトリックスに流す。かかる条件は、通常はｐＨ、塩濃度（即ち、イオン強度）、疎水性などの変化によってもたらされる。勾配溶出及び段階的溶出のような様々な溶出スキームが知られている。溶出はまた、マトリックス上の所望抗体に置き換わる競合物質を含む第２の溶液で達成することもできる。アフィニティークロマトグラフィーの原理に関する一般的な総説としては、例えば、Ｗｉｌｃｈｅｋ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｃｈａｉｋｅｎ，Ｉ．２０００．Ａｎ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：  １−６を参照されたい。
【実施例】
【００７１】
以下、本発明を実施例によって説明する。これらの実施例は例示を目的としたものにすぎず、したがって添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の技術的範囲を限定するものと解すべきでない。本明細書で引用したすべての参考文献の開示内容は、援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００７２】
実施例１
プロトタイプ
変異体Ｚ(Ｐ５７Ｉ)２：各々がＰ５７Ｉ置換を含んだプロテインＺの２つのコピーを含むリガンド二量体（Ｚ(Ｐ５７Ｉ)２）（配列番号３）であって、５．８ｍｇ／ｍｌのリガンド密度を有する。
【００７３】
変異体Ｚ(Ｐ５７Ｉ)４：各々がＰ５７Ｉ置換を含んだプロテインＺの４つのコピーを含むリガンド四量体（Ｚ(Ｐ５７Ｉ)４）（配列番号１０）であって、９．７ｍｇ／ｍｌのリガンド密度を有する。
【００７４】
変異体Ｃ(Ｐ５７Ｉ)２：各々がＰ５７Ｉ置換を含んだプロテインＡ  Ｃドメインの２つのコピーを含むリガンド二量体（Ｃ(Ｐ５７Ｉ)２）（配列番号９）であって、７．２ｍｇ／ｍｌのリガンド密度を有する。
【００７５】
正常Ｚ２：プロテインＺの２つのコピーを含むリガンド二量体（Ｚ２ｒｅｇ）（Ｐ５７Ｉ置換を含まない配列番号３）であって、６．１ｍｇ／ｍｌのリガンド密度を有する。
【００７６】
タンパク質
Ｇａｍｍａｎｏｒｍ  １６５ｍｇ／ｍｌ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ社）、平衡化緩衝液で１ｍｇ／ｍｌに希釈。
【００７７】
平衡化緩衝液
ＡＰＢリン酸緩衝液２０ｍＭ＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（Ｅｌｓｉｃｈｒｏｍ  ＡＢ）。
【００７８】
吸着緩衝液
ＡＰＢリン酸緩衝液２０ｍＭ＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（Ｅｌｓｉｃｈｒｏｍ  ＡＢ）。
【００７９】
溶出緩衝液
ＡＰＢクエン酸緩衝液０．１ｍＭ、ｐＨ３（Ｅｌｓｉｃｈｒｏｍ  ＡＢ）。
【００８０】
ＣＩＰ
０．１Ｍ  ＮａＯＨ。
【００８１】
実験の詳細及び結果：
タンパク質の変異誘発
プロリン置換をコードするオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによって部位指向変異誘発を実施した。鋳型として、Ｚ又はＣの単一ドメインを含むプラスミドを使用した。ＰＣＲフラグメントをＥ．ｃｏｌｉの発現ベクター（ｐＧＯ）中に連結した。ＤＮＡ配列決定を用いて、挿入されたフラグメントの正しい配列を確認した。Ｚ(Ｐ５７Ｉ)及びＣ(Ｐ５７Ｉ)の多量体を形成するため、Ｃ又はＺドメインの開始コドン（ＧＴＡＧＡＣ）中に位置する、アミノ酸ＶＤに対応するＡｃｅＩ部位を使用した。ｐＧＯ  Ｚ(Ｐ５７Ｉ)１及びｐＧＯ  Ｃ(Ｐ５７Ｉ)１をＡｃｅＩで消化し、ＣＩＰ処理した。各変異体に対して特異的なＡｃｅＩ付着末端プライマーを消化し、各鋳型から２種のオーバーラップＰＣＲ生成物を生成した。ＰＣＲ生成物を精製し、２％アガロースゲル上でＰＣＲ生成物を比較することで濃度を推定した。等量のペアワイズＰＣＲ生成物を連結緩衝液中でハイブリダイズした（４５分で９０℃→２５℃）。得られた生成物では、約１／４のフラグメントがＡｃｅＩ部位に連結されていると思われる（正しいＰＣＲフラグメント及び／又は消化ベクター）。連結及び形質転換後、コロニーをＰＣＲスクリーニングすることで、Ｚ(Ｐ５７Ｉ)２，Ｚ(Ｐ５７Ｉ)４，Ｃ(Ｐ５７Ｉ)２及びＣ(Ｐ５７Ｉ)４を含む構築物を同定した。陽性クローンをＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００８２】
構築物の発現及び精製
標準培地中でのＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２の発酵により、構築物を細菌ペリプラズム中で発現させた。発酵後、細胞を熱処理することで、ペリプラズム内部物を培地中に放出させた。培地中に放出された内容物を、０．２μｍの孔径を有する膜を用いるミクロ濾過によって回収した。
【００８３】
今では濾過段階からの透過液中にある各構築物を親和性によって精製した。透過液を、固定化ＩｇＧを含むクロマトグラフィー媒体上に装填した。装填生成物をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、ｐＨを低下させることで溶出した。
【００８４】
溶出プールを中性ｐＨに調整し、ジチオトレイトールの添加によって還元した。次いで、試料を陰イオン交換体上に装填した。洗浄段階後、構築物をＮａＣｌ勾配中で溶出することで、それを夾雑物から分離した。溶出プールを限外濾過によって４０〜５０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【００８５】
精製リガンドをＬＣ−ＭＳで分析することで、純度を決定すると共に、分子量が（アミノ酸配列に基づいて）予想される値に一致することを確認した。
【００８６】
活性化
使用したベースマトリックスは、米国特許第６６０２９９０号の方法に従って製造された、平均直径８５ミクロンの硬質架橋アガロースビーズであった。これはまた、Ｇｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９１，ｐｐ  ６−１３に記載された方法に従えば、Ｍｗ  １１０ｋＤａのデキストランに対して０．７０の逆ゲル濾過クロマトグラフィーＫａｖ値に相当する孔径を有していた。
【００８７】
１００ｍＬフラスコ内において、２５ｍＬ（ｇ）の排水ベースマトリックス、１０ｍＬの蒸留水及び２．０２ｇのＮａＯＨ（ｓ）を機械的撹拌により２５℃で１０分間混合した。４．０ｍＬのエピクロロヒドリンを添加し、反応を２時間進行させた。活性化ゲルを１０ゲル沈降体積（ＧＶ）の水で洗浄した。
【００８８】
カップリング
５０ｍｌファルコン管に入れた２０ｍＬの連結溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）に、１６９ｍｇのＮａＨＣＯ3、２１ｍｇのＮａ2ＨＣＯ3、１７５ｍｇのＮａＣｌ及び７ｍｇのＥＤＴＡを添加した。ファルコン管をローラーテーブル上に５〜１０分間置き、次いで７７ｍｇのＤＴＥを添加した。還元を＞４５分間進行させた。次いで、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を充填したＰＤ１０カラム上でリガンド溶液を脱塩した。脱塩溶液中のリガンド含有量を、２７９ｎｍのＵＶ吸収を測定することで求めた。
【００８９】
活性化ゲルを３〜５ＧＶの｛０．１Ｍリン酸塩／１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．６｝で洗浄し、次いでリガンドを米国特許第６３９９７５０号に記載された方法に従ってカップリングした。本実験で使用したすべての緩衝液は、窒素ガスによって５〜１０分間以上脱気した。
【００９０】
固定化後、ゲルを３×ＧＶの蒸留水で洗浄した。ゲル＋１ＧＶの｛０．１Ｍリン酸塩／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１０％チオグリセロール  ｐＨ８．６｝を混合し、管を振盪テーブル上に室温で一晩放置した。次いで、ゲルを３×ＧＶの｛０．１Ｍ  ＴＲＩＳ／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．６｝及び０．５Ｍ  ＨＡｃで交互に洗浄し、次いで８〜１０×ＧＶの蒸留水で洗浄した。ゲル試料を外の部実験室に送ってアミノ酸分析を行い、総アミノ酸含有量からリガンド含有量（ｍｇ／ｍｌゲル）を算出した。
【００９１】
容量の測定
ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００、ＡＬ  Ｅ１００。
ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０システムを用いて、２．４分及び６分の滞留時間での漏出容量を標準として測定した。安定な基線が得られるまで、吸着緩衝液をバイパスカラムに流した。これはオートゼロイングに先立って行った。１００％ＵＶ信号が得られるまで、試料をカラムに適用した。次いで、安定な基線が得られるまで、吸着緩衝液を再び適用した。
【００９２】
カラムを吸着緩衝液で平衡化した後、最大吸光度の８５％のＵＶ信号に達するまで試料を装填した。次いで、０．５ｍｌ／分の流量で最大吸光度の２０％のＵＶ信号に達するまで、カラムを吸着緩衝液で洗浄した。１０ＣＶの溶出緩衝液を０．５ｍｌ／分の流量で用いてタンパク質を溶出した。次いで、０．１Ｍ  ＮａＯＨを０．５ｍｌ／分の流量で用いてカラムをクリーニングし、吸着緩衝液で再平衡化した後、２０％エタノールでクリーニングした。最後の段階は、１００％ＵＶ信号が得られるまでバイパスカラムを通して試料を装填することにより、試料濃度をチェックするためのものであった。
【００９３】
１０％での漏出容量を算出するためには、下記の式を使用した。それは、カラム流出液中のＩｇＧの濃度が供給液中のＩｇＧ濃度の１０％になるまでカラム上に装填されるＩｇＧの量である。
【００９４】
【数１】
2014502272.tif 000003
【００９５】
Ａ100%＝１００％ＵＶ信号、
Ａsub＝非結合ＩｇＧサブクラスからの吸光度寄与、
Ａ(Ｖ)＝所定適用体積での吸光度、
Ｖc＝カラム容積、
Ｖapp＝１０％漏出点までの適用体積、
Ｖsys＝システムの死容積、
Ｃ0＝供給液濃度。
【００９６】
動的結合容量に関する典型的な試験例を図３に示す。１０％漏出点での動的結合容量（ＤＢＣ）を算出し、曲線の外観を調べた。また、結合、溶出及びＣＩＰピークに関しても曲線を調べた。
【００９７】
５％、１０％及び８０％漏出点に関して動的結合容量（ＤＢＣ）を算出した。結果を表１に示す。Ｐ５７Ｉ置換を有するリガンドに関しては、親のＰ５７リガンドに比べて高い容量が認められた。
【００９８】
【表１】
2014502272.tif 000004
【００９９】
上記の実施例は本発明の特定の態様を例示するものであり、いかなる点でもその技術的範囲を限定することはなく、そのように解すべきでない。上記に示した本発明の教示の恩恵を受ける当業者は、それに対して多数の修正を施すことができる。これらの修正は、添付の特許請求の範囲に示す本発明の技術的範囲内に包含されると解すべきである。さらに、様々な実施形態の特徴を組み合わせ得ることはもちろんである。
【図１】
2014502272.tif 000005
【図２（ａ）】
2014502272.tif 000006
【図２（ｂ）】
2014502272.tif 000007
【図２（ｃ）】
2014502272.tif 000008
【図２（ｄ）】
2014502272.tif 000009
【図３】
2014502272.tif 000010
【配列表】
2014502272000001.xml
【国際調査報告】
2014502272.tif 000016
2014502272.tif 000017
2014502272.tif 000018
2014502272.tif 000019
2014502272.tif 000020
2014502272.tif 000021