(57)【要約】本発明は、新規の被験体への形質導入された細胞の送達を増強する方法を提供し、この方法には、形質導入された細胞の選択方法および移植レシピエント中の形質導入された細胞による再構成の増強方法の両方が含まれる。本発明は、さらに、本発明の方法の実施で有用な移入ベクター（レンチウイルスベクターが含まれる）を提供する。本発明の方法およびベクターを、種々の疾患および障害（血液学的疾患および障害が含まれるが、これらに限定されない）の遺伝子治療で使用することができる。
2014504862.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植レシピエント中の形質導入された細胞による再構成の増強方法であって、前記方法は、前記移植レシピエント中への移植前に形質導入された細胞を選択する工程を含み、前記形質導入された細胞が、以下：
（ｉ）幹細胞を含む多分化能細胞を含む第１の細胞集団と、プロモーター配列に作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む移入ベクターとをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させ、それにより、幹細胞を含む形質導入された多分化能細胞を含む第２の細胞集団を生成する工程；および
（ｉｉ）前記第２の細胞集団と、濃度１〜２５μｇ／ｍｌのピューロマイシンとを４日間以下ｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させ、それにより、幹細胞を含む形質導入された多分化能細胞を含む第３の細胞集団を生成する工程であって、前記第３の細胞集団が、前記第２の細胞集団より高い百分率の形質導入された多分化能細胞を含み、前記第３の細胞集団が、前記移入ベクターを含む少なくとも２つの異なる細胞系統の産生を前記第３の細胞集団の移植レシピエントへの移植後ｉｎ  ｖｉｖｏで少なくとも４ヶ月間維持することができる、工程
を含む方法によって選択される、方法。
【請求項２】
複数の前記第３の細胞集団を前記移植レシピエントに移植する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の細胞集団を前記移植レシピエントから得た、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の細胞集団を骨髄、動員末梢血、臍帯血、および／または胚性幹細胞から得た、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも４ヶ月間が、前記移植から２年以内に始まる任意の時点においても起こり得る、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の細胞集団を約５μｇ／ｍｌのピューロマイシンと約２４時間接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の細胞集団が造血幹細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記移入ベクターが、プロモーター配列に作動可能に連結された治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記移入ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記移入ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記レンチウイルスベクターがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベクターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記レンチウイルスベクターがサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）ベクターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記レンチウイルスベクターがウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ベクターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記移入ベクターがトランスポゾンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび前記治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが同一のプロモーター配列に作動可能に連結される、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび前記治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが異なるプロモーター配列に作動可能に連結される、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
前記プロモーターが構成性プロモーターである、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された前記プロモーター配列が、構成性プロモーター、誘導性プロモーター、および組織特異的プロモーターからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記プロモーターが、幹細胞中の活性が前記幹細胞から分化した細胞中のその活性と比較して高い組織特異的プロモーターである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記幹細胞が造血幹細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された前記プロモーター配列が、構成性プロモーター、誘導性プロモーター、および組織特異的プロモーターからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項２２】
前記プロモーターが、多分化能細胞中の活性が前記多分化能細胞から分化した細胞中のその活性と比較して低い組織特異的プロモーターである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記組織特異的プロモーターが赤血球中で活性である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記移入ベクターが自殺遺伝子またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチド配列をさらに含み、前記自殺遺伝子または前記ｃＤＮＡが自殺ポリペプチドをコードする、請求項１または８に記載の方法。
【請求項２５】
前記自殺遺伝子または前記ｃＤＮＡがチミジンキナーゼ誘導体をコードする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記自殺遺伝子または前記ｃＤＮＡがチミジル酸キナーゼ（ＴｍｐＫ）誘導体をコードする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記自殺遺伝子または前記ｃＤＮＡがカスパーゼ誘導体をコードする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記自殺遺伝子または前記ｃＤＮＡを含むポリヌクレオチド配列が、前記移入ベクター中に存在するプロモーター配列に作動可能に連結されない、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記自殺遺伝子または前記ｃＤＮＡを含むポリヌクレオチド配列が、前記移入ベクター中に存在するプロモーター配列に作動可能に連結される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記移入ベクター中に存在し、且つ前記自殺遺伝子または前記ｃＤＮＡを含むポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された前記プロモーター配列が、誘導性プロモーターである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記自殺遺伝子または前記ｃＤＮＡを含むポリヌクレオチド配列および前記治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が前記移入ベクター中に逆方向で存在する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記移入ベクターが、前記自殺遺伝子または前記ｃＤＮＡの上流にスプライス受容配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
前記自殺遺伝子または前記ｃＤＮＡを含むポリヌクレオチド配列が、前記自殺遺伝子または前記ｃＤＮＡの５’末端にコザックコンセンサス配列を含み、前記自殺遺伝子または前記ｃＤＮＡの３’側に転写終結配列を含む、請求項２４または３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記移入ベクターが、前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドおよび前記自殺ポリペプチドをインフレーム融合ポリペプチドとして発現する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
前記融合ポリペプチドが前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドと前記自殺ポリペプチドとの直接的な融合物である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドまたは前記自殺ポリペプチドが、前記移入ベクター中の前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と前記自殺遺伝子または前記ｃＤＮＡを含むポリヌクレオチド配列との間に存在する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の使用によって発現する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドおよび前記自殺ポリペプチドが、前記移入ベクター中の前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と前記自殺遺伝子または前記ｃＤＮＡを含むポリヌクレオチド配列との間に存在する翻訳２Ａシグナル配列の使用によって発現する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３８】
前記移入ベクターが、前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と前記自殺遺伝子または前記ｃＤＮＡを含むポリヌクレオチド配列との間に配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３９】
前記融合ポリペプチドが、前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドと前記自殺ポリペプチドとの間にリンカー配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項４０】
前記リンカー配列がＧｌｙ３リンカー配列を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記リンカー配列が自己触媒性ペプチド切断部位を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記自己触媒性ペプチド切断部位が翻訳２Ａシグナル配列を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記移入ベクターが、前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と前記自殺遺伝子または前記ｃＤＮＡを含むポリヌクレオチド配列との間のジャンク配列をコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記ジャンク配列をコードするポリヌクレオチド配列が、その５’末端で終止コドンに隣接し、その３’末端で開始コドンに隣接する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記第３の細胞集団を第４の細胞集団と組み合わせて被験体に提供する工程をさらに含み、前記第４の細胞集団が前駆細胞を含み、前記第４の細胞集団が前記第４の細胞集団の移植レシピエント中への移植後に造血を短期間支持することができる、請求項２に記載の方法。
【請求項４５】
前記第４の細胞集団を、多分化能細胞の拡大および／または少なくとも部分的な分化を誘導する条件に予め暴露した、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記第４の細胞集団が形質導入されていない、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記第４の細胞集団が、以下：
（ｉ）前記第４の細胞集団と、プロモーター配列に作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む移入ベクターとを接触させる工程、および
（ｉｉ）前記第４の細胞集団と、１〜２５μｇ／ｍｌの濃度のピューロマイシンとを、４日間以下接触させ、それにより、前記ピューロマイシン耐性ポリペプチドを含む形質導入された細胞を選択する工程
を含む方法によって形質導入および選択した細胞を含む、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記第４の細胞集団が造血細胞を含む、請求項４４〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記第１の細胞集団および前記第４の細胞集団を、同一の被験体から得た、請求項４４〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記第１の細胞集団および前記第４の細胞集団を、骨髄、動員末梢血、臍帯血、および／または胚性幹細胞から得た、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記第１の細胞集団、前記第２の細胞集団、または前記第３の細胞集団のうちの少なくとも１つと、接触させた前記細胞集団中に存在する幹細胞の数を増加させることができる１つ以上の薬剤とを接触させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
前記１つ以上の薬剤がアリール水素受容体アンタゴニストを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記アリール水素受容体アンタゴニストがＳＲ１を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記１つ以上の薬剤が成長因子の組み合わせを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記多分化能細胞の数が４日間と２１日間との間の培養期間後に増加する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
少なくとも７５％の前記第３の細胞集団が形質導入される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１１年１月３日に出願された米国仮出願第６１／４２９，４０１号および２０１１年４月１日に出願された米国仮出願第６１／４７０，９４１号（これらの各々は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
政府の利益に関する声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって付与された助成金第１Ｒ４３ＣＡ０９６４５７−１号の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表に関する記述
本出願に添付の配列表をハードコピーの代わりにテキスト形式で提供し、この配列表は、本明細書中に参考として援用される。配列表を含むテキストファイル名は、ＢＬＢＤ＿００１＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ．である。テキストファイルは１０ＫＢであり、２０１１年１２月２７日に作成し、明細書の提出と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂから電子的に提出した。
【０００４】
背景
技術分野
本発明は、遺伝子が形質導入された多分化能細胞（幹細胞が含まれる）を選択するための方法、遺伝子が形質導入された多分化能細胞の移植レシピエントへの送達を増強する方法、および移植レシピエント中の遺伝子が形質導入された多分化能細胞の生着（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）を促進するための方法、ならびに本発明の方法の実施で有用な移入ベクターに関する。
【背景技術】
【０００５】
関連技術の説明
治療ポリペプチドの発現を駆動する移入ベクターを用いた多分化能造血細胞（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）が含まれる）のｅｘ  ｖｉｖｏ形質導入、その後の得られた形質導入された細胞の移植レシピエント中への体内移植による遺伝子治療により、種々の疾患および障害（造血およびリンパ球産生の遺伝病が含まれる）が処置される可能性がある。しかし、有効レベルの治療ポリペプチドの達成する能力は、多数の要因（ドナー細胞集団内の標的多分化能細胞（ＨＳＣなど）の頻度が低いこと、最も原始的なＨＳＣの静止性、ＨＳＣの生着能力に及ぼすｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養の好ましくない影響、および形質導入されたＨＳＣと移植レシピエント中での生着および再増殖について競合する移植された細胞集団中の形質導入されていないＨＳＣの存在が含まれる）によって制限され得る。
【０００６】
所与の遺伝子移入ベクターへの細胞集団の暴露後に首尾よく遺伝子改変された細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで選択することは、遺伝子治療分野で依然として達成されていない目標である。これを達成することは、所与の組織が遺伝子改変細胞の大部分を含まなければならない場合、効力および適切なリスク利益比を達成する多くの場合で不可欠であるが、全遺伝子移入効率が必要な閾値未満である。これまでに考案されてきた種々のｅｘ  ｖｉｖｏ選択アプローチは、初代細胞（ＨＳＣなど）が長期および／または外傷性の物理的操作に耐えられない場合に有用性を示せなかった。これらには、（ｉ）目的の遺伝子と同時発現した膜マーカーの発現についての蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）または磁性ベースのアプローチ、および（ｉｉ）化学物質（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン）に対する耐性を付与する優性かつ選択可能なマーカーの同時発現に基づく選択が含まれる。特に、ＨＳＣはｉｎ  ｖｉｔｒｏで特に脆弱であり、ヒト臨床適用に実用的と考えられるｅｘ  ｖｉｖｏ選択でのあらゆる試みに抵抗してきた。
【０００７】
レトロウイルスベクター中の選択マーカーを使用した遺伝子操作した造血細胞の移植を介した遺伝子治療の現在の改良方法の例には、ｉｎ  ｖｉｖｏでの移植後に送達された場合にグアニン−Ｏ（６）アルキル化能力の高い薬剤（クロロエチルニトロソ尿素またはテモゾロミドなど）に対する耐性を付与するＯ６−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）遺伝子の使用が含まれる（特許および文献）。形質導入された造血幹細胞の選択的拡大はまた、移植後にトリメトレキサートおよびニトロベンジルメルカプトプリンリボシド５’一リン酸を使用したＤＨＦＲ発現細胞の選択のためのジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子の遺伝子移入ベクター選択への組み込みによって行われている（例えば、Ｚｈａｎｇら，２００５）。しかし、これらのアプローチは、ｉｎ  ｖｉｖｏで形質導入されない造血細胞の枯渇に由来する望ましくない血液学的毒性によって制限される。
【０００８】
別のアプローチはｅｘ  ｖｉｖｏ且つ移植前の細胞の事前選択を伴い、その結果レシピエント中の分子キメラ現象が改善される。これは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含むベクターを使用した緑色蛍光タンパク質の発現に基づいて実験的に達成されている（例えば、Ｋａｌｂｅｒｅｒら  ２０００，Ｐａｗｌｉｕｋら，１９９９）が、ヒトに用いる蛍光タンパク質を発現する細胞の単離が非実用的であることおよび物理的な細胞操作中に大部分の細胞が喪失されることによって制限される。
【０００９】
レトロウイルス遺伝子形質導入後の細胞の選択はまた、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシンに対する）を使用し、各抗生物質を添加して、樹立細胞株に対して実験的に行われている。しかし、これらの抗生物質を用いた選択は、培養物中で何日にもわたって適用されている（通常、最短で１０日間）。かかるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの長期間の細胞培養は、遺伝子治療プロトコールで使用すべき多数の初代細胞型の細胞生存度および分化状態を十分に維持するのに適さない。それ故、このアプローチを受けた造血幹細胞集団は、移植レシピエント中でのその生着能力を喪失する。
【００１０】
形質導入されたＨＳＣを使用した遺伝子治療の有効性を制限する別の問題は、移植前に骨髄破壊を受けた移植レシピエントにおける一過性の骨髄抑制の出現である。これらの移植レシピエントは、骨髄破壊後に存在する遅延および形質導入されたＨＳＣが移植レシピエントの造血細胞集団に十分に生着する前の移植に起因する骨髄抑制を頻繁に患う。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
高レベルの形質導入された多分化能細胞（ＨＳＣが含まれる）を達成する新規の方法および形質導入されたＨＳＣの移植後に骨髄抑制を阻害する方法が当該分野で明らかに必要である。本発明は、かかる方法ならびにこれらの方法の実施で有用な移入ベクターの提供によりこのニーズに取り組む。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
概要
本発明は、移植レシピエント中の形質導入された細胞による再構成を増強する新規な方法を含む。特定の実施形態では、これらの方法は、レトロウイルス／レンチウイルスによって形質導入された多分化能細胞のピューロマイシンベースの選択を含み、この方法により、十分に短期間の暴露でｅｘ  ｖｉｖｏにて脆弱な細胞を効率的に選択することができ、それにより、有効性および多分化能細胞の限定された喪失の両方が得られる。さらに、本発明の実施形態は、骨髄破壊およびその後の移植後の一過性の骨髄抑制を軽減または阻害する移植法の開発に基づく。この方法は、長期再増殖可能な形質導入された多分化能細胞（幹細胞など）を一過性または短期再増殖可能な細胞と組み合わせて移植する工程を含む。特定の実施形態では、一過性または短期再増殖を提供するために導入される細胞集団には、長期再増殖を提供するために導入される細胞集団と比較して、長期再増殖を達成する能力が低いか無視できる細胞の割合がより高く、前駆細胞および／または少なくとも部分的に分化した造血細胞が含まれ得る。
【００１３】
１つの実施形態では、本発明は、移植レシピエント中の形質導入された細胞による再構成の増強方法であって、移植レシピエント中への移植前に形質導入された細胞を選択する工程を含み、形質導入された細胞が、以下：（ｉ）多分化能細胞（幹細胞が含まれる）を含む第１の細胞集団をプロモーター配列に作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む移入ベクターとｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させ、それにより、形質導入された多分化能細胞（幹細胞が含まれる）を含む第２の細胞集団を生成する工程；および（ｉｉ）第２の細胞集団を濃度１〜２５μｇ／ｍｌのピューロマイシンと４日間以下ｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させ、それにより、形質導入された多分化能細胞（幹細胞が含まれる）を含む第３の細胞集団を生成する工程であって、第３の細胞集団が、第２の細胞集団より高い百分率の形質導入された多分化能細胞を含み、第３の細胞集団が、移入ベクターを含む少なくとも２つの異なる細胞系統の産生を第３の細胞集団の移植レシピエントへの移植後ｉｎ  ｖｉｖｏで少なくとも４ヶ月間維持することができる、工程を含む方法によって選択される、方法を提供する。一定の実施形態では、第３の細胞集団は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の形質導入された細胞を含む。特定の実施形態では、本方法は、複数の第３の細胞集団を移植レシピエントに移植する工程をさらに含む。一定の実施形態では、第１の細胞集団を移植レシピエントから得た。一定の実施形態では、第１の細胞集団を骨髄、動員末梢血（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｂｌｏｏｄ）、臍帯血、および／または胚性幹細胞から得た。特定の実施形態では、少なくとも４ヶ月間が、移植から２年以内に始まる任意の時点においても起こり得る。したがって、移植と、体内移植され、形質導入された細胞が少なくとも２つの異なる細胞系統の持続的な産生を開始するときとの間に遅滞期が存在し得る。１つの実施形態では、第２の細胞集団を、約５μｇ／ｍｌのピューロマイシンと約２４時間接触させる。一定の実施形態では、第１の細胞集団は造血幹細胞を含む。特定の実施形態では、移入ベクターは、プロモーター配列に作動可能に連結された治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態では、移入ベクターはレトロウイルスベクターである。種々の実施形態では、移入ベクターはレンチウイルスベクターである。種々の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベクター、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）ベクター、またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ベクターである。特定の実施形態では、移入ベクターはトランスポゾンである。
【００１４】
本発明の方法の特定の実施形態では、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは同一のプロモーター配列に作動可能に連結される。一定の実施形態では、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは異なるプロモーター配列に作動可能に連結される。一定の実施形態では、プロモーターは構成性プロモーターである。関連する実施形態では、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター配列は、構成性プロモーター、誘導性プロモーター、および組織特異的プロモーターからなる群より選択される。一定の実施形態では、プロモーターは、幹細胞中の活性が幹細胞から分化した細胞中のその活性と比較して高い組織特異的プロモーターである。特定の実施形態では、幹細胞は造血幹細胞である。一定の実施形態では、治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター配列は、構成性プロモーター、誘導性プロモーター、および組織特異的プロモーターからなる群より選択される。一定の実施形態では、プロモーターは、多分化能細胞中の活性が多分化能細胞から分化した細胞中のその活性と比較して低い組織特異的プロモーターである。特定の実施形態では、組織特異的プロモーターは赤血球中で活性である。
【００１５】
本発明の方法の一定の実施形態では、移入ベクターはプロモーター配列に作動可能に連結された自殺遺伝子またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチドをさらに含み、自殺遺伝子またはｃＤＮＡは自殺ポリペプチド（ｓｕｉｃｉｄｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）をコードする。一定の実施形態では、自殺遺伝子またはｃＤＮＡはチミジンキナーゼ誘導体をコードする。特定の実施形態では、自殺遺伝子またはｃＤＮＡは、チミジル酸キナーゼ（ＴｍｐＫ）またはその誘導体をコードする。一定の実施形態では、自殺遺伝子またはｃＤＮＡは、カスパーゼまたはその誘導体をコードする。特定の実施形態では、自殺遺伝子またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチド配列は、移入ベクター中に存在するプロモーター配列に作動可能に連結されない。他の実施形態では、自殺遺伝子またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチド配列は、移入ベクター中に存在するプロモーター配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、移入ベクター中に存在し、且つ自殺遺伝子またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列は誘導性プロモーターである。一定の実施形態では、自殺遺伝子またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチド配列および治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は移入ベクター中に逆方向で存在する。特定の実施形態では、移入ベクターは、自殺遺伝子またはｃＤＮＡの上流にスプライス受容配列を含む。特定の実施形態では、自殺遺伝子またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチド配列は、自殺遺伝子またはｃＤＮＡの５’末端にコザックコンセンサス配列を含み、自殺遺伝子またはｃＤＮＡの３’側に転写終結配列を含む。特定の実施形態では、移入ベクターは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドおよび自殺ポリペプチドをインフレーム融合ポリペプチドとして発現する。特定の実施形態では、融合ポリペプチドはピューロマイシン耐性ポリペプチドと自殺ポリペプチドとの直接的な融合物である。一定の実施形態では、ピューロマイシン耐性ポリペプチドおよび自殺ポリペプチドは、移入ベクター中に存在する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の使用によって発現し、ＩＲＥＳは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と自殺遺伝子またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチド配列との間に位置し得る。一定の実施形態では、ピューロマイシン耐性ポリペプチドおよび自殺ポリペプチドは、移入ベクター中に存在する翻訳２Ａシグナル配列（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ２Ａ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の使用によって発現する。一定の実施形態では、融合ポリペプチドは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドと自殺ポリペプチドとの間にリンカー配列を含む。特定の実施形態では、リンカー配列はＧｌｙ３リンカー配列を含む。特定の実施形態では、リンカー配列は自己触媒性ペプチド切断部位を含む。特定の実施形態では、自己触媒性ペプチド切断部位は翻訳２Ａシグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、移入ベクターは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と自殺遺伝子またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチド配列との間にジャンク配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む。特定の実���形態では、ジャンク配列をコードするポリヌクレオチド配列は、その５’末端で終止コドンに隣接し、その３’末端で開始コドンに隣接する。
【００１６】
本発明の方法の特定の実施形態では、方法は、第３の細胞集団を第４の細胞集団と組み合わせて被験体に提供する工程をさらに含み、第４の細胞集団は前駆細胞を含み、第４の細胞集団は第４の細胞集団の移植レシピエント中への移植後に造血を一過性にまたは短期間支持することができる。一定の実施形態では、第４の細胞集団を、多分化能細胞の拡大および／または少なくとも部分的な分化を誘導する条件に以前に暴露した。特定の実施形態では、第４の細胞集団は形質導入されていない。他の実施形態では、第４の細胞集団は、以下：（ｉ）第４の細胞集団をプロモーター配列に作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む移入ベクターと接触させる工程；および（ｉｉ）第４の細胞集団をピューロマイシンと濃度１〜２５μｇ／ｍｌで４日間以下接触させ、それにより、ピューロマイシン耐性ポリペプチドを含む形質導入された細胞を選択する工程を含む方法によって形質導入および選択した細胞を含む。一定の実施形態では、第４の細胞集団は造血細胞を含む。一定の実施形態では、第１および第４の細胞集団を、同一の被験体から得た。関連する実施形態では、第１および第４の細胞集団を、骨髄、動員末梢血、臍帯血、および／または胚性幹細胞から得た。
【００１７】
本発明の方法の特定の実施形態では、方法は、第１の細胞集団、第２の細胞集団、または第３の細胞集団のうちの少なくとも１つと、接触した細胞集団中に存在する幹細胞の数を増加させることができる１つ以上の薬剤とを接触させる工程をさらに含む。特定の実施形態では、１つ以上の薬剤はアリール水素受容体（ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）アンタゴニストを含む。１つの実施形態では、アリール水素受容体アンタゴニストはＳＲ１を含む。一定の実施形態では、１つ以上の薬剤は成長因子の組み合わせを含む。特定の実施形態では、多分化能細胞は、４日間と２１日間との間の培養期間後にその数が増加する。一定の実施形態では、少なくとも７５％の第３の細胞集団が形質導入される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明の代表的なＨＩＶ移入ベクター（ＨＰＶ６５４）の概略図を提供する。このベクターは、構成性ｐｇｋプロモーター（ＰＧＫ）に作動可能に連結されたピューロマイシン耐性遺伝子（ＰＵＲＯ）をコードする核酸配列およびβ−グロビン遺伝子座調節領域配列（β−ＬＣＲ）に作動可能に連結された治療ヒトβ−グロビンポリペプチド（ヒトβ−グロビン遺伝子）を含む。
【図２Ａ】図２は、形質導入された細胞のピューロマイシン選択の図を提供する。図２Ａは、１０％（左図）または５０％（右図）上清のいずれかでピューロマイシン耐性を付与する移入ベクター（ＨＰＶ６５４）を使用して形質導入された骨髄ＣＤ３４＋細胞またはＧ−ＣＳＦ動員末梢血ＣＤ３４＋細胞のピューロマイシン選択を示す概略図を提供する。示すように、ＨＰＶ６５４（１０％）を使用して形質導入した骨髄ＣＤ３４＋細胞の５μｇ／ｍｌのピューロマイシンでの２４時間の処理により、１４日間の成長後にピューロマイシン選択を行わなかった形質導入された細胞のたった２３％と比較して１００％の形質導入された細胞が選択された。ＨＰＶ６５４（５０％）を使用して形質導入した細胞の５μｇ／ｍｌのピューロマイシンでの２４時間の処理により、１４日間の成長後にピューロマイシン選択を行わなかった形質導入された細胞のたった１６％と比較して７９％の形質導入された細胞が選択された。同様に、ＨＰＶ６５４（１０％）を使用して形質導入したＧ−ＣＳＦ動員末梢血ＣＤ３４＋細胞の５μｇ／ｍｌのピューロマイシンでの２４時間の処理により、ピューロマイシン選択を行わなかった形質導入された細胞の５５％と比較して８８％の形質導入された細胞が選択された（図２Ｂ）。ＨＰＶ６５４（５０％）を使用して形質導入した細胞の５μｇ／ｍｌのピューロマイシンでの２４時間の処理により、ピューロマイシン選択を行わなかった形質導入された細胞のたった３７％と比較して１００％の形質導入された細胞が選択された。
【図２Ｂ】図２は、形質導入された細胞のピューロマイシン選択の図を提供する。図２Ａは、１０％（左図）または５０％（右図）上清のいずれかでピューロマイシン耐性を付与する移入ベクター（ＨＰＶ６５４）を使用して形質導入された骨髄ＣＤ３４＋細胞またはＧ−ＣＳＦ動員末梢血ＣＤ３４＋細胞のピューロマイシン選択を示す概略図を提供する。示すように、ＨＰＶ６５４（１０％）を使用して形質導入した骨髄ＣＤ３４＋細胞の５μｇ／ｍｌのピューロマイシンでの２４時間の処理により、１４日間の成長後にピューロマイシン選択を行わなかった形質導入された細胞のたった２３％と比較して１００％の形質導入された細胞が選択された。ＨＰＶ６５４（５０％）を使用して形質導入した細胞の５μｇ／ｍｌのピューロマイシンでの２４時間の処理により、１４日間の成長後にピューロマイシン選択を行わなかった形質導入された細胞のたった１６％と比較して７９％の形質導入された細胞が選択された。同様に、ＨＰＶ６５４（１０％）を使用して形質導入したＧ−ＣＳＦ動員末梢血ＣＤ３４＋細胞の５μｇ／ｍｌのピューロマイシンでの２４時間の処理により、ピューロマイシン選択を行わなかった形質導入された細胞の５５％と比較して８８％の形質導入された細胞が選択された（図２Ｂ）。ＨＰＶ６５４（５０％）を使用して形質導入した細胞の５μｇ／ｍｌのピューロマイシンでの２４時間の処理により、ピューロマイシン選択を行わなかった形質導入された細胞のたった３７％と比較して１００％の形質導入された細胞が選択された。
【図３】図３は、レシピエントへの移植前に形質導入された細胞を選択するための本発明のプロセスを示す概略図を提供する。ドナーから得た非形質導入細胞（第１の集団）（多分化能造血幹細胞を含む）を、ピューロマイシン耐性を付与し、且つ治療ポリペプチドをコードする移入ベクターを使用して形質導入し、形質導入された多分化能幹細胞画分（第２の集団）を得た。形質導入後、細胞をピューロマイシンと接触させ、それによって非形質導入細胞が除去されて形質導入された多分化能幹細胞を含む形質導入された細胞（第３の集団）が残存する。これらの形質導入された細胞をレシピエントに移植し、レシピエント内で形質導入された多分化能細胞が非形質導入細胞と競合することなく成長し、最終的に細胞集団が再構成される。
【図４Ａ】図４は、造血再構成を改善するための本発明の方法の実施形態を示す概略図を提供する。本方法は、以下を含む：（Ａ）ピューロマイシン耐性を付与し、移植した宿主中で長期再増殖可能である移入ベクターを使用して形質導入したピューロマイシン選択された形質導入された細胞（第３の集団）への一過性再増殖のみが可能な拡大前駆体（第４の集団）の添加；および（Ｂ）ＨＳＣの拡大を促進する薬剤の存在下での培養による選択された形質導入された細胞の拡大。これらの拡大して形質導入された細胞をレシピエントに移植し、形質導入された前駆体および幹細胞が非形質導入細胞と競合することなく成長し、最終的にレシピエント内で再構成が改良される。図４Ａおよび４Ｂの下のグラフは、骨髄破壊後のレシピエントへの移植後の経時的な骨髄抑制レベル（左のグラフ）および骨髄破壊後のレシピエントへの移植後の経時的な移植細胞からの再増殖（右のグラフ）を示す。
【図４Ｂ】図４は、造血再構成を改善するための本発明の方法の実施形態を示す概略図を提供する。本方法は、以下を含む：（Ａ）ピューロマイシン耐性を付与し、移植した宿主中で長期再増殖可能である移入ベクターを使用して形質導入したピューロマイシン選択された形質導入された細胞（第３の集団）への一過性再増殖のみが可能な拡大前駆体（第４の集団）の添加；および（Ｂ）ＨＳＣの拡大を促進する薬剤の存在下での培養による選択された形質導入された細胞の拡大。これらの拡大して形質導入された細胞をレシピエントに移植し、形質導入された前駆体および幹細胞が非形質導入細胞と競合することなく成長し、最終的にレシピエント内で再構成が改良される。図４Ａおよび４Ｂの下のグラフは、骨髄破壊後のレシピエントへの移植後の経時的な骨髄抑制レベル（左のグラフ）および骨髄破壊後のレシピエントへの移植後の経時的な移植細胞からの再増殖（右のグラフ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
本発明は、レトロウイルス／レンチウイルスによって形質導入された造血細胞のピューロマイシンベースの選択が十分に短期間の暴露でｅｘ  ｖｉｖｏにて脆弱な細胞（幹細胞など）を効率的に選択することができ、それにより、有効性および多分化能細胞の限定された喪失の両方が得られるという予想外の発見に一部基づく。これを、本明細書中では造血幹細胞への遺伝子移入によって例示する。しかし、このアプローチは、脆弱な細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ選択が治療効力を増大させるのに望ましい他の細胞型に適用可能である。さらに、本発明の態様は、骨髄破壊およびその後の移植後の一過性の骨髄抑制を軽減または阻害する移植法の開発に基づく。この方法は、再増殖可能な形質導入された多分化能細胞（幹細胞など）を再増殖を達成する能力が比較的低いか無視できる非形質導入細胞（前駆細胞または少なくとも部分的に分化した造血細胞など）と組み合わせて移植する工程を含む。前駆細胞または少なくとも部分的に分化した造血細胞は、移植レシピエントに一過性に再増殖し、したがって、骨髄抑制を阻害する一方で、形質導入された幹細胞はより長い長期再増殖プロセスを受ける。この方法は、形質導入された細胞が選択を受けた場合に特に有効である。なぜなら、形質導入された細胞が選択されない場合と比較して典型的には移植されている細胞の数は減少し、それにより、移植レシピエントの骨髄抑制リスクが増大するからである。
【００２０】
したがって、本発明は、遺伝病の処置における遺伝子治療の有効性を改善し、それにより、一部の細胞のみしか移入ベクターによって治療効果の付与に不十分なレベルで効率的にターゲティングされないという満たされていない臨床的ニーズに取り組む。本発明は、具体的には、非形質導入（例えば、未修正の）細胞が除去されることが望ましい結果である、細胞の混合集団からの遺伝子操作された細胞の富化および選択に関する。
【００２１】
定義
本明細書中で使用する場合、本発明を説明するために使用される以下の用語および句は、以下に示す意味を有するものとする。
【００２２】
用語「レトロウイルス」は、任意の公知のレトロウイルス（例えば、ｃ型レトロウイルス（モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンド、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）など））をいう。本発明の「レトロウイルス」には、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２）、およびレトロウイルスのレンチウイルスファミリー（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ免疫不全ウイルス（ＥＩＶ）など）、およびレトロウイルスの他のクラスも含まれる。
【００２３】
レトロウイルスは、その複製周期中に逆転写酵素を利用するＲＮＡウイルスである。レトロウイルスゲノムＲＮＡは、逆転写酵素によって二本鎖ＤＮＡに変換される。このウイルスの二本鎖ＤＮＡ形態は、感染細胞の染色体内に組み入れることができ、一旦組み入れられると、「プロウイルス」と呼ばれる。プロウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのテンプレートとしての機能を果たし、必要とされる構造タンパク質および酵素をコードするＲＮＡ分子の発現を指示して新規のウイルス粒子を産生する。
【００２４】
プロウイルスの各末端は「長末端反復」または「ＬＴＲ」と呼ばれる構造である。用語「長末端反復（ＬＴＲ）」は、その天然の配列構成で直接反復であり、且つＵ３、Ｒ、およびＵ５領域を含むレトロウイルスＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインをいう。ＬＴＲは、一般に、レトロウイルス遺伝子の発現（例えば、遺伝子転写物の促進、開始、およびポリアデニル化）およびウイルス複製の基礎となる機能を提供する。ＬＴＲは、多数の調節シグナル（転写調節エレメント、ポリアデニル化シグナル、ならびにウイルスゲノムの複製および組み込みに必要な配列が含まれる）を含む。ウイルスＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５と呼ばれる３つの領域に分類される。Ｕ３領域は、エンハンサーエレメントおよびプロモーターエレメントを含む。Ｕ５領域は、プライマー結合部位とＲ領域との間の配列であり、ポリアデニル化配列を含む。Ｒ（反復）領域は、Ｕ３領域およびＵ５領域に隣接する。Ｕ３、Ｒ、およびＵ５領域から構成されるＬＴＲは、ウイルスゲノムの５’末端および３’末端の両方に出現する。本発明の１つの実施形態では、ＬＴＲ（５’ＬＴＲが含まれる）内のプロモーターは、異種プロモーターに置換される。使用することができる異種プロモーターの例には、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが含まれる。
【００２５】
用語「レンチウイルス」は、徐々に進行する疾患を発症するレトロウイルスの群（または属）をいう。この群内に含まれるウイルスには、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型が含まれる、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体）；ビスナ・マエディ（ヒツジにおいて脳炎（ビスナ）または肺炎（マエディ）を引き起こす）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ヤギにおいて免疫欠損、関節炎、および脳症を引き起こす）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ウマにおいて自己免疫性溶血性貧血および脳症を引き起こす）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）（ネコにおいて免疫欠損を引き起こす）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）（ウシにおいてリンパ節症、リンパ球増加症、およびおそらく中枢神経系感染を引き起こす）；およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）（ヒトより下等な霊長類において免疫欠損および脳症を引き起こす）が含まれる。これらのウイルスによって引き起こされる疾患は、長期潜伏期間および遅延性の経過によって特徴づけられる。通常、ウイルスは潜在的に単球およびマクロファージに感染し、これらから他の細胞に伝播する。ＨＩＶ、ＦＩＶ、およびＳＩＶもまた、Ｔリンパ球（すなわち、Ｔ細胞）に容易に感染する。
【００２６】
用語「ハイブリッド」は、レンチウイルス配列および非レンチウイルスレトロウイルス配列の両方を含むベクター、ＬＴＲ、または他の核酸をいう。
【００２７】
用語「ベクター」または「移入ベクター」は、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子をいう。用語「発現ベクター」には、細胞による発現に適切な（例えば、プロモーターに連結した）形態の遺伝子構築物を含む任意のベクター（例えば、プラスミド、コスミド、またはファージの染色体）が含まれる。プラスミドを一般にベクターの形態で使用するので、本明細書中で、「プラスミド」および「ベクター」を交換可能に使用する。さらに、本発明は、等価な機能を果たす他のベクターが含まれることが意図される。
【００２８】
用語「ウイルスベクター」は、主にウイルスに由来する構造的および機能的な遺伝エレメントを含むベクターをいう。
【００２９】
用語「レトロウイルスベクター」は、主にレトロウイルスに由来する構造的および機能的な遺伝エレメントを含むベクターをいう。
【００３０】
用語「レンチウイルスベクター」は、主にレンチウイルスに由来するＬＴＲの外側に構造的および機能的な遺伝エレメントを含むベクターをいう。
【００３１】
用語「自己不活化ベクター」（ＳＩＮベクター）は、右側の（３’）ＬＴＲエンハンサー−プロモーター領域（Ｕ３領域として公知）が第１ラウンドのウイルス複製を超えたウイルス転写を防止するために改変された（例えば、欠失または置換による）ベクター（例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）をいう。したがって、ベクターは、感染し、次いで、宿主ゲノムに１回だけ組み込むことができ、さらに継代することはできない。これは、右側の（３’）ＬＴＲＵ３領域がウイルス複製中に左側の（５’）ＬＴＲＵ３領域のテンプレートとして使用され、したがって、Ｕ３エンハンサー−プロモーターを使用しないでウイルス転写物を作製することができないからである。ウイルス転写物が作製されない場合、プロセシングやビリオンへのパッケージングが不可能であり、それ故、ウイルスの生活環が終焉する。したがって、ＳＩＮベクターは、望ましくない複製可能ウイルスが作製されるリスクが大幅に軽減される。何故なら、右側の（３’）ＬＴＲＵ３領域が第１ラウンドの複製を超えたウイルス転写を防止するように改変され、それ故、ウイルスが継代する能力が排除されるからである。
【００３２】
用語「ＴＡＲ」は、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）ＬＴＲのＲ領域中に存在する「トランス活性化応答」遺伝エレメントをいう。このエレメントは、レンチウイルストランス活性化因子（ｔａｔ）遺伝エレメントと相互作用してウイルス複製を増強する。
【００３３】
用語「Ｒ領域」は、キャッピング基（すなわち、転写開始）の始点から始まり、ポリＡトラクトの開始直前で終了するレトロウイルスＬＴＲ内の領域をいう。Ｒ領域を、Ｕ３およびＵ５領域に隣接するとも定義する。Ｒ領域は、一方のゲノム末端から他方への新生ＤＮＡの移行において逆転写中で重要な役割を果たす。
【００３４】
用語「トランスフェクション」は、真核細胞内への外来ＤＮＡの導入をいう。トランスフェクションを、当分野で公知の種々の手段（リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、微量注入、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、および遺伝子銃が含まれるが、これらに限定されない）によって行うことができる。
【００３５】
用語「形質導入」は、トランスフェクションによるよりもむしろウイルス感染によるウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを用いたある遺伝子または他のポリヌクレオチド配列の送達をいう。好ましい実施形態では、レトロウイルスベクターを、細胞との接触前のビリオン内へのベクターのパッケージングによって形質導入する。例えば、レトロウイルスベクターによって保持された抗ＨＩＶ遺伝子を、感染およびプロウイルス組み込みによって細胞に形質導入することができる。一定の実施形態では、ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを使用した感染によって細胞に送達された遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を細胞が含む場合、細胞は「形質導入」されている。特定の実施形態では、形質導入された細胞は、その細胞ゲノム中にウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターによって送達された遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含む。
【００３６】
用語「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方を提供することができる配列を含むＤＮＡのセグメントをいう。例えば、レトロウイルスの長末端反復は、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方を含む。エンハンサー／プロモーターは、「内因性」または「外因性」または「異種性」であり得る。「内因性」エンハンサー／プロモーターは、ゲノム中の所与の遺伝子と天然に連結されるエンハンサー／プロモーターである。「外因性」または「異種性」エンハンサー／プロモーターは、その遺伝子の転写が連結したエンハンサー／プロモーターによって指示されるように遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技術）によって遺伝子の近位に配置されたエンハンサー／プロモーターである。
【００３７】
真核細胞中での組み換えＤＮＡ配列の効率的な発現には、得られた転写物の効率的な終結およびポリアデニル化を指示するシグナルの発現が必要である。転写終結シグナルは、一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見出される。用語「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」は、本明細書中で使用する場合、新生ＲＮＡ転写物の終結およびポリアデニル化の両方を指示するＤＮＡ配列を示す。ポリＡテールを欠く転写物が不安定であり、且つ急速に分解されるので、組み換え転写物の効率的なポリアデニル化が望ましい。発現ベクター中で利用されるポリＡシグナルは、「異種性」または「内因性」であり得る。内因性ポリＡシグナルは、ゲノム内の所与の遺伝子のコード領域の３’末端に天然に見出されるポリＡシグナルである。異種ポリＡシグナルは、ある遺伝子から単離され、別の遺伝子の３’に配置されるポリＡシグナルである。
【００３８】
用語「移行エレメント」は、細胞の核から細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を調節するシス作用転写後調節エレメントをいう。ＲＮＡ移行エレメントの例には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３；およびＣｕｌｌｅｎら（１９９１）Ｃｅｌｌ  ５８：４２３を参照のこと）およびＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＰＲＥ）（例えば、Ｈｕａｎｇら（１９９５）Ｍｏｌｅｃ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５（７）：３８６４；Ｈｕａｎｇら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８（５）：３１９３；Ｈｕａｎｇら（１９９３）Ｍｏｌｅｃ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３（１２）：７４７６）、および米国特許第５，７４４，３２６号を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。一般に、ＲＮＡ移行エレメントを遺伝子の３’ＵＴＲ内に配置し、１つまたは複数のコピーとして挿入することができる。ＲＮＡ移行エレメントを、任意のまたは全ての個別のベクターに挿入して本発明のパッケージング細胞株を生成することができる。
【００３９】
本明細書中で使用する場合、用語「パッケージング細胞株」を、パッケージングシグナルを含まないが、ウイルス粒子の正確なパッケージングに必要なウイルス構造タンパク質および複製酵素（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）を安定してか一過性に発現する細胞株に関して使用する。
【００４０】
句「レトロウイルスパッケージング細胞株」は、ＲＮＡをパッケージングして複製可能なヘルパーウイルスを産生する能力を欠くウイルス粒子を産生するために必要なコード配列を含む細胞株（典型的には、哺乳動物細胞株）をいう。パッケージング機能が細胞株内に提供される場合（例えば、プラスミドベクターによってトランスに）、パッケージング細胞株は組み換えレトロウイルスを産生し、それにより、「レトロウイルス産生細胞株」になる。
【００４１】
用語「核酸カセット」は、本明細書中で使用する場合、ＲＮＡを発現し、その後にタンパク質を発現することができるベクター内の遺伝子配列をいう。核酸カセットは、目的の遺伝子を含む。核酸カセットは、カセット内の核酸をＲＮＡに転写し、必要に応じてタンパク質またはポリペプチドに翻訳し、形質転換された細胞中の活性に必要な適切な翻訳後修飾を受け、適切な細胞内区画へのターゲティングまたは細胞外区画内への分泌によって生物学的活性に適切な区画にトランスロケーションすることができるようにベクター内に位置的および順序的に配向する。好ましくは、カセットは、ベクターへの容易な挿入に適したその３’末端および５’末端を有する（例えば、各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する）。本発明の１つの好ましい実施形態では、核酸カセットは、異常血色素状態を処置するために使用される治療遺伝子の配列を含む。カセットを除去し、単一の単位としてベクターまたはプラスミドに挿入することができる。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、用語「目的の遺伝子」は、発現ベクターのポリリンカーに挿入される遺伝子をいう。一定の実施形態では、目的の遺伝子は、疾患または障害の処置または予防において治療効果を発揮するポリペプチドをコードし、このポリペプチドを、「治療ポリペプチド」ということができる。１つの実施形態では、目的の遺伝子は、異常血色素症の処置のための治療機能を提供する遺伝子をコードする。目的の遺伝子および目的の遺伝子からコードされるポリペプチドには、野生型の遺伝子およびポリペプチドならびにその機能的バリアントおよびフラグメントの両方が含まれる。特定の実施形態では、機能的バリアントは、対応する野生型の基準ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する。一定の実施形態では、機能的バリアントまたはフラグメントは、対応する野生型ポリペプチドの生物学的活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％を有する。
【００４３】
記述「配列同一性」または、例えば、「〜と５０％同一の配列」を含むは、本明細書中で使用する場合、比較ウィンドウにわたってヌクレオチド対ヌクレオチドを基本とするかアミノ酸対アミノ酸を基本として配列が同一な程度をいう。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」を、比較ウィンドウにわたる２つの最適に整列させた配列の比較、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔ）が両方の配列中に存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の全位置数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割ること、および結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算することができる。典型的にはポリペプチドバリアントが基準ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を保持する場合、本明細書中に記載の任意の基準配列（例えば、配列表を参照のこと）に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。
【００４４】
２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列関係を説明するために使用される用語には、「基準配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、および「実質的同一性」が含まれる。「基準配列」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めて少なくとも１２単量体単位であるが、頻繁には１５〜１８単量体単位、しばしば少なくとも２５単量体単位の長さである。２つのポリヌクレオチドは、それぞれ、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似の配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）および（２）２つのポリヌクレオチド間で相違する配列を含むことができるので、２つ（またはそれを超える）ポリヌクレオチドの間の配列比較を、典型的には、配列が類似する局所的領域を同定および比較するための「比較ウィンドウ」にわたる２つのポリヌクレオチド配列の比較によって行う。「比較ウィンドウ」は、２つの配列を最適に整列させた後に配列を同数の連続する位置の基準配列と比較する少なくとも６、通常約５０〜約１００、より通常には約１００〜約１５０の連続する位置の概念的セグメントをいう。比較ウィンドウは、２つの配列の最適なアラインメントのために基準配列（付加や欠失を含まない）と比較して約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。比較ウィンドウの整列のための配列の最適なアラインメントを、アルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された実行または選択された任意の種々の方法によって得られる目視および最良のアラインメント（すなわち、比較ウィンドウにわたって最高の相同性パーセンテージが得られる）によって行うことができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９によって開示のプログラムのＢＬＡＳＴファミリーを参照することもできる。配列分析の詳細な考察を、Ｕｎｉｔ  １９．３  ｏｆ  Ａｕｓｕｂｅｌら，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ，１９９４−１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５に見出すことができる。
【００４５】
用語「プロモーター」は、本明細書中で使用する場合、ＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ鎖の認識部位をいう。プロモーターは、転写活性を開始および駆動するためにＲＮＡポリメラーゼと開始複合体を形成する。複合体を、「エンハンサー」と呼ばれる活性化配列または「サイレンサー」と呼ばれる阻害配列によって改変することができる。
【００４６】
本明細書中で使用する場合、用語「シス」を、同一染色体上の遺伝子の存在に関して使用する。用語「シス作用性」を、同一染色体上に存在する遺伝子に及ぼす調節遺伝子の調節効果に関して使用する。例えば、下流ｍＲＮＡの合成に影響をおよぼすプロモーターはシス作用性調節エレメントである。
【００４７】
用語「自殺遺伝子」を、本明細書中で、自殺遺伝子を発現する細胞に致命的な産物を発現する任意の遺伝子を定義するために使用する。１つの実施形態では、自殺遺伝子は、本発明のベクター上の目的の遺伝子に関してシス作用性である。自殺遺伝子の例は当分野で公知であり、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−Ｔｋ）が含まれる。
【００４８】
用語「作動可能に連結された」は、記載の成分がその意図する様式で機能を果たす関係にあるような近位をいう。１つの実施形態では、この用語は、発現調節配列が第２の配列に対応する核酸の転写を指示する、核酸発現調節配列（プロモーターまたは一連の転写因子結合部位など）と第２の核酸配列の間の機能的連結をいう。
【００４９】
用語「偽型」または「シュードタイピング」は、本明細書中で使用する場合、そのウイルスエンベロープタンパク質が好ましい特徴を保有する別のウイルスのエンベロープタンパク質と置換されたウイルスをいう。ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によってコードされる）は通常はウイルスをＣＤ４＋提示細胞にターゲティングさせるので、例えば、ＨＩＶを水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質でシュードタイピングすることができ、それにより、ＨＩＶを広範な細胞に感染させることが可能である。本発明の１つの好ましい実施形態では、レンチウイルスエンベロープタンパク質をＶＳＶ−Ｇでシュードタイピングする。
【００５０】
本明細書中で使用する場合、用語「パッケージング」は、タンパク質キャプシドの内側にウイルスゲノムを隔離（またはパッケージング）する過程をいい、それにより、ビリオン粒子が形成される。この過程は、キャプシド形成としても公知である。本明細書中で使用する場合、用語「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」は、ウイルスＲＮＡのウイルスキャプシドまたは粒子への挿入に必要なレトロウイルスゲノム内に位置する配列をいう。いくつかのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのキャプシド形成に必要な最小のパッケージングシグナル（プサイ［ψ］配列ともいう）を使用する。したがって、本明細書中で使用する場合、用語「パッケージング配列」、「パッケージングシグナル」、「プサイ」、および記号「ψ」を、ウイルス粒子形成中のレトロウイルスＲＮＡ鎖のキャプシド形成に必要な非コード配列に関して使用する。
【００５１】
本明細書中で使用する場合、用語「複製欠損」は、感染性ビリオンが産生されないように完全で有効な複製が不可能なウイルス（例えば、複製欠損性のレンチウイルスの子孫）をいう。用語「複製可能な」は、ウイルスのウイルス複製によって感染性ビリオンを産生することができるように複製することができる野生型ウイルスまたは変異体ウイルス（例えば、複製可能なレンチウイルスの子孫）をいう。
【００５２】
本明細書中で使用する場合、用語「組み込む」は、ベクターが治療遺伝子産物を細胞内に発現することができるような細胞内へのベクター（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の取り込みまたは移入をいう。組み込みは、ＤＮＡ発現ベクターの組み入れまたはＤＮＡ発現ベクターのエピソーム複製を含むことができるが、必要ではない。
【００５３】
本明細書中で使用する場合、用語「赤血球系細胞特異的発現」または「赤血球特異的発現」は、エリスロサイトまたは赤血球（ＲＢＣ）（本明細書中で交換可能に使用される）中のみで生じる遺伝子発現をいう。
【００５４】
用語「遺伝子送達」または「遺伝子移入」は、外来ＤＮＡの標的細胞（筋肉細胞など）中への確かな挿入のための方法および系をいう。かかる方法により、遺伝子を一過性または長期間発現することができる。遺伝子移入により、後天性疾患および遺伝性疾患の処置のための固有のアプローチが得られる。哺乳動物細胞への遺伝子移入のための多数の系が開発されている。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと。本発明のレンチウイルスベクターを、実質的に全ての循環ＲＢＣ中にて治療レベルで抗鎌状赤血球化タンパク質を発現するように最適化することができる。
【００５５】
用語「幹細胞」は、前駆細胞の由来となる多分化能細胞をいう。幹細胞を、その自己再生能力によって定義する。幹細胞には、例えば、胚性幹細胞および体性幹細胞が含まれる。造血幹細胞は、任意の造血系統の娘細胞を生成することができる。長期造血再構成能を有する幹細胞を、多数の物理的性質および生物学的性質によって分化細胞および前駆細胞と区別することができる（例えば、Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｇ．Ｓ．＆  Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｔ．Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２８１，ｐｐ  ３８１−３８２；Ｖｉｓｓｅｒら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．５９，ｐｐ．１５７６−１５９０，１９８４；Ｓｐａｎｇｒｕｄｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４１，ｐｐ．５８−６２，１９８８；Ｓｚｉｌｖａｓｓｙら，Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．７４，ｐｐ．９３０−９３９，１９８９；Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ，Ｒ．Ｅ．＆  Ｂｒｏｎｓ，Ｒ．Ｈ．Ｃ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，Ｖｏｌ．１７，ｐｐ．２６３−２６６，１９８９を参照のこと）。一定の造血幹細胞は、移植レシピエント中で造血細胞集団を長期再構成する能力を有する。多分化能細胞は、２つ以上の異なる細胞に分化する能力を有する。
【００５６】
本明細書中で使用する場合、用語「前駆体」または「前駆細胞」は、分化細胞の前駆体である細胞をいう。多数の前駆細胞は単一の系統にそって分化するが、非常に広範な増殖能力を有することができる。前駆細胞の例には、造血前駆細胞、骨髄系前駆細胞、およびリンパ球前駆細胞が含まれるが、これらに限定されない。造血前駆細胞は、自己再生しないが、移植レシピエント中で造血細胞集団を一過性または短期間再構成する能力を有する。
【００５７】
用語「グロビン」を、本明細書中で、ヘム部分に共有結合または非共有結合することができ、したがって、酸素を輸送または貯蔵することができる全タンパク質またはタンパク質サブユニットを意味するために使用する。脊椎動物および無脊椎動物のヘモグロビン、脊椎動物および無脊椎動物のミオグロビンのサブユニットまたはその変異体は、用語グロビンに含まれる。グロビンの例には、β−グロビンまたはそのバリアント、β−グロビンまたはそのバリアント、β−グロビンまたはそのバリアント、およびβ−グロビンが含まれる。
【００５８】
本明細書中で使用する場合、「造血」は、前駆細胞からの血球の形成および発生ならびに幹細胞からの前駆細胞の形成をいう。血球には、エリスロサイトまたは赤血球（ＲＢＣ）、網状赤血球、単球、好中球、巨核球（ｍｅｇａｋａｒｙｏｔｅ）、好酸球、好塩基球、Ｂ細胞、マクロファージ、顆粒球、肥満細胞、栓球、および白血球が含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
本明細書中で使用する場合、用語「異常血色素症」または「異常血色素状態」には、血中の異常なヘモグロビン分子の存在を含む任意の障害が含まれる。異常血色素症の例には、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビン鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、鎌状赤血球貧血、およびサラセミアが含まれるが、これらに限定されない。異常ヘモグロビンの組み合わせが血中に存在する異常血色素症（例えば、鎌状赤血球／Ｈｂ−Ｃ病）も含まれる。
【００６０】
用語「鎌状赤血球貧血」または「鎌状赤血球症」を、本明細書中で、赤血球の鎌状赤血球化に起因する任意の症候性貧血状態が含まれると定義する。鎌状赤血球症の症状発現には、以下が含まれる：貧血；疼痛；および／または臓器機能不全（腎不全など）、網膜症、急性胸部症候群、虚血、持続勃起症、および卒中。本明細書中で使用する場合、用語「鎌状赤血球症」は、特にＨｂＳにおける鎌状赤血球置換についてホモ接合体である被験体における鎌状赤血球貧血に伴う種々の臨床上の問題をいう。これらのうち、鎌状赤血球症という用語の使用によって本明細書中で言及される体質上の発現は、成長および発達の遅延、特に肺炎球菌に起因する重症感染症の発症傾向の増大、顕著な脾臓機能障害、循環細菌の有効な排除の阻止であり、再発性梗塞を伴い、最終的に脾組織の破壊が起こる。主に腰椎、腹部、および大腿骨幹に影響を及ぼし、減圧痛と機構および重症度が類似する急性筋骨格痛も用語「鎌状赤血球症」に含まれる。成人では、かかる発作は、一般に、数週間または数ヶ月毎の軽度または中等度の短期間の発作として発現し、この発作は１年間に約１回引き起こされる５〜７日間継続する発作が散見される。その内で、かかる急性発症を引き起こすことが公知の事象はアシドーシス、低酸素症、および脱水症であり、その全てがＨｂＳの細胞内重合を増強する（Ｊ．Ｈ．Ｊａｎｄｌ，Ｂｌｏｏｄ：Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９６，ｐａｇｅｓ  ５４４−５４５）。本明細書中で使用する場合、用語「サラセミア」は、ヘモグロビン合成に影響を及ぼす変異に起因して生じる遺伝性貧血を含む。したがって、本用語には、サラセミア状態（重症またはβサラセミア、重症型サラセミア、中等症サラセミア、αサラセミア（ヘモグロビンＨ症など）など）に起因する任意の症候性貧血が含まれる。
【００６１】
本明細書中で使用する場合、「サラセミア」は、ヘモグロビン産生の欠損によって特徴づけられる遺伝性障害を示す。サラセミアの例には、βおよびαサラセミアが含まれる。βサラセミアは、βグロビン鎖の変異によって生じ、重症型および軽症型で生じ得る。重症型のβサラセミアでは、小児は正常に出生するが、生後１年間に貧血を発症する。軽症型のβサラセミアは小型の赤血球を産生し、サラセミアはグロビン鎖由来の遺伝子の欠失によって生じる。
【００６２】
本明細書中で使用する場合、「抗鎌状赤血球化タンパク質」には、鎌状赤血球状態においてエリスロサイトの鎌状赤血球化を導く病理学的事象を防止または逆行するタンパク質が含まれる。本発明の１つの実施形態では、本発明の形質導入された細胞を使用して、異常血色素状態を有する被験体に抗鎌状赤血球化タンパク質を送達させる。抗鎌状赤血球化タンパク質には、抗鎌状赤血球化アミノ酸残基を含む変異β−グロビン遺伝子も含まれる。
【００６３】
本明細書中で使用する場合、本明細書中で交換可能に使用される用語「インスレーター」または「インスレーターエレメント」は、ゲノム配列付近の宿主ゲノムへのベクターの組み込みの際に組み入れられた導入遺伝子の発現に影響を及ぼすのを防止するために本発明のベクターに付加することができる外因性ＤＮＡ配列をいう。逆に、インスレーターエレメントは、組み入れられたベクターが近くのゲノム配列の発現に影響を及ぼすのを防止する。一般に、インスレーターが組み入れられたベクターに隣接し（例えば、ＬＴＲ領域内）、組み入れられたＤＮＡ配列を「遮断する」ように作用するようにインスレーターがベクターのゲノム内への組み入れの際に複製される場合にこれが達成される。本発明での使用に適切なインスレーターには、ニワトリβ−グロビンインスレーター（Ｃｈｕｎｇら  Ｃｅｌｌ（１９９３）７４：５０５；Ｃｈｕｎｇら，ＰＮＡＳ（１９９７）９４：５７５；およびＢｅｌｌら  Ｃｅｌｌ  １９９９  ９８：３８７（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）が含まれるが、これに限定されない。インスレーターエレメントの例には、β−グロビン遺伝子座由来のインスレーター（ニワトリＨＳ４など）が含まれるが、これに限定されない。
【００６４】
本明細書中で使用する場合、文脈上そうでないと明記しない限り、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および類似の用語（「処置された」、「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など）は、有利または所望の結果（好ましい臨床結果が含まれる）を得るためのアプローチを示す。処置は、任意選択的に、疾患もしくは状態の症状の軽減もしくは改善または疾患もしくは状態の進行の遅延のいずれかを含むことができる。
【００６５】
本明細書中で使用する場合、文脈上そうでないと明記しない限り、「予防する」および類似の用語（「予防された」、「予防」など）は、疾患または状態の発生または再発の可能性を予防、阻害、または減少させるためのアプローチを示す。これは、疾患もしくは状態の発症もしくは再発の遅延または疾患もしくは状態の症状の発生もしくは再発の遅延もいう。本明細書中で使用する場合、「予防」および類似の用語には、疾患または状態の発症または再発前の疾患または状態の強度、影響、症状、および／または負荷の軽減も含まれる。
【００６６】
本明細書中で使用する場合、薬剤または物質の「有効量」または「治療有効量」は、所望の生物学的効果（有利な結果（臨床結果が含まれる）など）に影響を及ぼすのに十分な量である。
【００６７】
本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容され得るキャリア」には、生理学的に適合可能な任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬、ならびに等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。１つの実施形態では、キャリアは非経口投与に適切である。好ましくは、キャリアは、罹患関節への直接投与に適切である。キャリアは、静脈内投与、腹腔内投与、または筋肉内投与に適切であり得る。薬学的に許容され得るキャリアには、滅菌注射液または注射用分散液の即時調製のための滅菌水溶液または分散液および滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのかかる媒質および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒質または薬剤が形質導入された細胞と適合しない場合を除き、本発明の薬学的組成物中でのその使用が意図される。
【００６８】
以下の説明では、本発明の種々の実施形態の完全な理解のために一定の詳細な説明を記載する。しかし、当業者は、これらの詳細な説明を利用せずに本発明を実施することができると理解するであろう。
【００６９】
文脈上他の意味に解すべき必要がある場合を除き、明細書および特許請求の範囲を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびそのバリアント（「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」など）を、オープンな他の要素を包含することを意味する（すなわち、「〜が含まれるが、これらに限定されない」）と解釈すべきである。本明細書中で使用する場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」を同義語として使用する。
【００７０】
本明細書を通して「１つの実施形態（ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「１つの実施形態（ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」についての言及は、実施形態と併せて記載される特定の特徴、構造、または特性が少なくとも１つの本発明の実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書中の種々の場所の句「１つの実施形態では（ｉｎ  ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「ｉｎ  ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ」の出現は、必ずしも全てが同一の実施形態について言及していない。さらに、特定の特徴、構造、または特性を、１つ以上の実施形態中に任意の適切な様式で組み合わせることができる。
【００７１】
本説明では、他で示さない限り、任意の濃度範囲、百分率の範囲、比の範囲、または整数範囲が、引用した範囲内の任意の整数の値および必要に応じたその分数（整数の１／１０および１／１００など）が含まれると理解すべきである。また、他で示さない限り、任意の物理的特徴（ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの長さなど）に関する本明細書中に引用した任意の数字の範囲は、引用した範囲内の任意の整数が含まれると理解すべきである。
【００７２】
本明細書中で使用する場合、他で示さない限り、「約」は、示した範囲、値、または構造の±２０％を意味する。用語「ａ」および「ａｎ」が、本明細書中で使用する場合、「１つ以上」の列挙した成分をいうと理解すべきである。
【００７３】
代替物（例えば、「または」）の使用は、代替物の一方、両方、またはその任意の組み合わせを意味すると理解すべきである。本明細書中で使用する場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」を同義語として使用する。
【００７４】
さらに、本明細書中に記載の構造および置換物の種々の組み合わせに由来する各ベクターまたはベクター群が、各ベクターまたはベクター群が個別に記載されるのと同一の範囲で本出願によって開示されると理解すべきである。したがって、特定のベクター構造または特定の置換物の選択は、本開示の範囲内である。
【００７５】
形質導入された細胞を産生および選択する方法、それに関連する形質導入された細胞による移植レシピエント中の細胞集団の再構築の増強方法、ならびに治療ポリペプチドの必要とする被験体への送達方法
本発明の一定の態様は、ピューロマイシンベースの選択系が十分な程度の多分化能細胞の質および生着能力を保持しながら形質導入された多分化能細胞（形質導入された幹細胞が含まれる）の選択で有効であり得るという予想外の発見に起因する。この知見の重要な態様は、形質導入された多分化能細胞がその多分化能および生着能力を保持する一方で非形質導入細胞が枯渇するような適切なピューロマイシン濃度およびピューロマイシンへの細胞の適切な曝露時間の同定である。例えば、一定の例では、本発明の方法によって選択されたピューロマイシン選択された形質導入された造血幹細胞は、かかる細胞が移植された移植レシピエントの造血細胞を再構成することができる。この再構成は長期再構成であり得る。
【００７６】
したがって、本発明は、形質導入された多分化能細胞（幹細胞が含まれる）の新規の選択方法、ならびに関連する形質導入された多分化能細胞および形質導入された多分化能細胞中で富化された細胞集団の産生におけるピューロマイシン選択の使用方法を提供する。本明細書中に提供した説明および例が多分化能細胞（特に、造血幹細胞が含まれる）の形質導入および選択に注目する一方で、本発明の方法および移入ベクターを使用して、他の細胞型（多分化能細胞または幹細胞の他の型が含まれる）および治療用途のために形質導入された細胞の選択が以前は不可能であった脆弱な細胞を形質導入して選択することもできる。かかる細胞には、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、および体性幹細胞（造血幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、および臍帯基質幹細胞が含まれる）が含まれ得るが、これらに限定されない。本発明の方法にしたがって使用される細胞を、任意の動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトから得ることができ、細胞を、任意の動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに移植することができる。
【００７７】
図３は、レシピエントへの移植前に形質導入された細胞を選択するための本発明の１つのプロセスを示す概略図を提供する。これらの形質導入された細胞をレシピエントに移植し、形質導入された多分化能細胞が非形質導入細胞と競合することなく成長し、最終的にレシピエント内に細胞集団を再構成する
１つの実施形態では、本発明は、形質導入された多分化能細胞（幹細胞が含まれ得る）の選択方法であって、多分化能細胞（幹細胞が含まれ得る）を含む第１の細胞集団を１〜２５μｇ／ｍｌのピューロマイシンと４日間以下接触させる工程であって、第１の細胞集団をプロモーター配列に作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む移入ベクターと事前に接触させ、それにより、形質導入された多分化能細胞（形質導入された幹細胞が含まれ得る）を含む第２の細胞集団を産生する工程を含む、方法を提供する。特定の実施形態では、第１の細胞集団を、移入ベクターによる細胞の形質導入または細胞のゲノムへのポリヌクレオチド配列の組み入れに十分な条件下および時間で移入ベクターと接触させる。
【００７８】
上記の形質導入された細胞の選択方法を、形質導入された多分化能細胞（形質導入された幹細胞が含まれ得る）の産生の文脈で使用することができる。したがって、関連する実施形態では、本発明は、形質導入された多分化能細胞を産生する方法であって、（ｉ）多分化能細胞（幹細胞が含まれ得る）を含む第１の細胞集団をプロモーター配列に作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む移入ベクターと接触させ、それにより、移入ベクターを含む多分化能細胞（幹細胞が含まれ得る）を含む第２の細胞集団を産生する工程；および（ｉｉ）第２の細胞集団を１〜２５μｇ／ｍｌピューロマイシンと４日間以下接触させ、それにより、第３の細胞集団を産生する工程であって、第３の細胞集団が第２の細胞集団より高い百分率の形質導入された多分化能細胞を含む、工程を含む、方法を提供する。特定の実施形態では、第１の細胞集団を、移入ベクターによる細胞の形質導入または細胞のゲノムへのポリヌクレオチド配列の組み入れに十分な条件下および時間で移入ベクターと接触させる。
【００７９】
本発明の任意のピューロマイシン選択方法の特定の実施形態では、ピューロマイシン選択後に残存する細胞（例えば、第３の集団）の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％が形質導入される。一定の実施形態では、第３の集団中の細胞の少なくとも７５％が形質導入される。
【００８０】
上記の方法は、移植レシピエント内の細胞集団を再構成するために使用することができる形質導入された多分化能細胞（形質導入された幹細胞が含まれる）を含む細胞集団を提供する。したがって、特定の実施形態では、本発明は、被験体内の細胞集団の形質導入された幹細胞による再構成の増強方法であって、上記形質導入された幹細胞を産生する工程および複数の第３の細胞集団を被験体に移植する工程を含む、方法を含む。
【００８１】
特定の実施形態では、第３の細胞集団内の形質導入された多分化能細胞は、必ずしも被験体への細胞の導入直後でなくて良いが、被験体への第３の細胞集団の導入後少なくとも４ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１２ヶ月間移入ベクターを含む少なくとも２つの異なる細胞系統を産生することができる。少なくとも２つの異なる細胞系統の産生は即時でなくて良いが（すなわち、遅滞期が存在し得る）、特定の実施形態では、生きている被験体への第３の細胞集団の導入直後から２４ヶ月、２８ヶ月、３６ヶ月、または４８ヶ月以内に、上記の少なくとも４ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１２ヶ月間の期間が始まると認識される。
【００８２】
本発明の方法にしたがって産生された形質導入された細胞を治療的に使用することができる。例えば、これらの細胞を、必要とする被験体に体内移植することができる。例えば、治療ポリペプチドを発現する形質導入された細胞を、減少した量の治療ポリペプチドを発現するか、治療ポリペプチドの変異体形態を発現するレシピエント被験体に移植することができる。したがって、一定の例では、形質導入すべき細胞を、形質導入された幹細胞による移植（自系移植）を必要とする被験体から得る。他の例では、形質導入すべき細胞を、別のドナー（形質導入された幹細胞による移植（同種異系移植）を必要とする被験体に組織適合し得る）から得る。
【００８３】
細胞を、当該分野で公知であり且つ利用可能な方法を使用してドナー中の種々の異なる供給源から得ることができる。例えば、造血細胞（造血幹細胞（ＨＳＣ）が含まれる）を針を使用して骨髄から得ることができ、末梢血球をアフェレーシスによって得ることができ、細胞を出産後の臍帯血から濾過することができる。細胞を、従来の技術を使用して他の組織成分（脂肪および細胞外基質など）から精製して、細胞集団（幹細胞を含み得る）を産生することができる。
【００８４】
多分化能細胞（幹細胞が含まれる）を、形質導入前に細胞集団から選択するか細胞集団内で富化することができる。例えば、幹細胞を、幹細胞と会合した少なくとも１つのマーカーのその発現に基づくか、物理的な分離手段によって選択することができる。幹細胞に会合したマーカーの例には、ＣＤ３４、Ｔｈｙ−１、およびｒｈｏが含まれる。これらのマーカーを発現する細胞を、種々の手段（１つ以上のマーカーに特異的な抗体を使用した蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）が含まれる）によって細胞集団から精製するか、細胞内で富化することができる。特定の実施形態では、ドナーから得た細胞集団をＣＤ３４＋細胞について富化するか、ＣＤ３４＋細胞を形質導入前に他の細胞から精製する。
【００８５】
細胞の形質導入を、ピューロマイシン耐性ポリペプチドを発現することができる移入ベクター（下記の任意の移入ベクターが含まれる）を使用して行う。したがって、移入ベクターは、それを発現する細胞中でピューロマイシン耐性を付与する任意のポリペプチドであり得るピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。ピューロマイシンＮ−アセチル−トランスフェラーゼ（ＰＡＣ）をコードするｐａｃ遺伝子は、ストレプトマイセス産生株から単離されている（ｄｅ  ｌａ  Ｌｕｎａ，Ｓ．＆  Ｏｒｔｉｎ，Ｊ．（１９９２）．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１６：３７６−３８５；ｄｅ  ｌａ  Ｌｕｎａ，Ｓ．，ら（１９８８）．Ｇｅｎｅ  ６２：１２１−１２６）。この遺伝子は、ピューロマイシン生合成経路を決定する他の遺伝子に連結されたｐｕｒクラスター領域中に存在する。ｐａｃ遺伝子の発現により、この遺伝子を発現するトランスフェクトされた哺乳動物細胞にピューロマイシン耐性が付与される。しかし、外因性ＤＮＡ（細菌起源のピューロマイシン耐性遺伝子など）は、哺乳動物細胞中での発現にあまり適切ではないかもしれない。第１に、細菌におけるコドン使用頻度は、哺乳動物のコドン使用頻度と非常に異なる。さらに、ＣｐＧジヌクレオチドにおける外来（細菌）ＤＮＡの組成は、哺乳動物ＤＮＡにおけるＣｐＧ分布と非常に異なる。この相違により、遺伝子発現に負の影響を及ぼす以下の２つの現象を引き起こす：哺乳動物免疫系による異物としての細菌ＤＮＡの認識および遺伝子サイレンシングを引き起こすＣｐＧのシトシン残基のメチル化。したがって、移入ベクター中でのｐａｃ遺伝子サイレンシングを回避するために、改変ｐａｃ遺伝子を、本発明の移入ベクター中で使用することができる。一定の実施形態では、改変ｐａｃ遺伝子を哺乳動物発現のためにコドン最適化し、そして／またはいくつかまたは全てのＣｐＧモチーフが除去されている。特定の実施形態では、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、ｐａｃ遺伝子または改変ｐａｃ遺伝子のコード領域のみを含む。一定の実施形態では、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１に記載の核酸配列を有する。一定の実施形態では、ピューロマイシン耐性ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。本発明はまた、任意のこれらのピューロマイシン耐性ポリペプチドの機能的フラグメントまたはバリアントの使用を意図する。
【００８６】
特定の実施形態では、ピューロマイシン耐性ポリペプチドを発現する移入ベクターは、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター（ＨＩＶベクターなど））である。レンチウイルス感染は、他の形質導入法を超えるいくつかの利点を有する（分裂している細胞および分裂していない細胞の高効率感染、トランスジェニックの長期安定発現、および低免疫原性が含まれる）。本発明にしたがって使用することができる種々の移入ベクターを、上に記載している。
【００８７】
感染性ウイルス粒子およびウイルスストック溶液の産生を、従来技術を使用して行うことができる。ウイルスストック溶液の調製方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｙ．Ｓｏｎｅｏｋａら（１９９５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６２８−６３３およびＮ．Ｒ．Ｌａｎｄａｕら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５１１０−５１１３に例示されている。例えば、ウイルス粒子を、パッケージング細胞株または感染性ウイルス粒子のパッケージングおよび産生で使用されるウイルスタンパク質を産生するプラスミドと組み合わせた移入ベクターの一過性トランスフェクションのいずれかを使用して産生することができる。適切なパッケージング細胞株の例は、例えば、米国特許第６，９５８，２２６号、同第６，６２０，５９５号、同第５，７３９，０１８号、同第５，６８６，２７９号、および同第５，５９１，６２４号に記載されている。特定の実施形態では、ＨＩＶ１型（ＨＩＶ−１）ベースのウイルス粒子を、産生細胞中でのビリオンパッケージングエレメントおよび移入ベクターの同時発現によって生成することができる。これらの細胞を、多数のプラスミドで一過性にトランスフェクトすることができる。典型的には、３つ〜４つのプラスミドを使用するが、レンチウイルス成分が個別の単位に分けられる程度に応じてより多数であり得る。例えば、１つのプラスミドは、ＨＩＶ−１由来のビリオンのコア成分および酵素成分をコードすることができる。このプラスミドを、パッケージングプラスミドと呼ぶ。別のプラスミドは、典型的には、エンベロープタンパク質、最も一般的には水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質（ＶＳＶ  Ｇ）（その高い安定性および広い親和性のため）をコードする。このプラスミドを、エンベロープ発現プラスミドということができる。さらに別のプラスミドは、標的細胞に移入すべきゲノムをコードし（すなわち、ベクター自体）、移入ベクターと呼ばれる。パッケージングプラスミドを、公知の技術（リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる）によって、一般に、優性の選択可能なマーカー（ネオマイシン、ＤＨＦＲ、グルタミンシンターゼ、またはＡＤＡなど）と共にヒト細胞株に導入し、その後に適切な薬物の存在下で選択し、クローンを単離することができる。選択可能なマーカー遺伝子を、構築物中のパッケージング遺伝子に物理的に連結することができる。数百万形質導入単位／ミリリットル（ＴＵ／ｍｌ）の力価の組み換えウイルスを、この技術およびその異形によって生成することができる。超遠心後、およそ１０９ＴＵ／ｍｌの濃縮ストックを得ることができる。
【００８８】
本発明のレンチウイルスのストック溶液の１つの例示的な生成方法では、レンチウイルス許容性細胞（本明細書中で産生細胞という）を、ウイルス粒子産生に必要なウイルスタンパク質（またはその誘導体）を発現する移入ベクターおよび他のベクターでトランスフェクトする。次いで、細胞を、適切な細胞培養条件下で成長させ、レンチウイルス粒子を上記のように細胞自体または細胞培養液のいずれかから回収する。適切な産生細胞株には、ヒト胚性腎臓細胞株２９３および２９３Ｔ、ウマ真皮細胞株ＮＢＬ−６、ならびにイヌ胎児胸腺細胞株Ｃｆ２ＴＨが含まれるが、これらに限定されない。かかるマルチプラスミドウイルスパッケージング系の例は、米国特許第５，９９４，１３６号、同第６，９２４，１４４号、同第７，２５０，２９９号、同第６，７９０，６４１号、および同第６，０１３，５１６号に記載されている。
【００８９】
感染性ウイルス粒子を、従来技術を使用してパッケージング細胞から回収することができる。例えば、感染性粒子を、当該分野で公知のように、細胞溶解または細胞培養物上清の回収によって回収することができる。任意選択的に、回収されたウイルス粒子を、必要に応じて精製することができる。適切な精製技術は、当業者に周知である。
【００９０】
本発明の一定の実施形態にしたがって利用することができる遺伝子治療におけるウイルスベクターの使用に関する他の方法を、例えば、Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．（１９９７）Ｃｈｅｓｔ  １１１（６  Ｓｕｐｐ．）：１３８Ｓ−１４２Ｓ；Ｆｅｒｒｙ，Ｎ．ａｎｄ  Ｈｅａｒｄ，Ｊ．Ｍ．（１９９８）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：１９７５−８１；Ｓｈｉｒａｔｏｒｙ，Ｙ．ら（１９９９）Ｌｉｖｅｒ  １９：２６５−７４；Ｏｋａ，Ｋ．ら（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１１：１７９−８６；Ｔｈｕｌｅ，Ｐ．Ｍ．ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｊ．Ｍ．（２０００）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１７４４−５２；Ｙａｎｇ，Ｎ．Ｓ．（１９９２）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：３３５−５６；Ａｌｔ，Ｍ．（１９９５）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２３：７４６−５８；Ｂｒｏｄｙ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ  Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．Ｇ．（１９９４）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７１６：９０−１０１；Ｓｔｒａｙｅｒ，Ｄ．Ｓ．（１９９９）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  ８：２１５９−２１７２；Ｓｍｉｔｈ−Ａｒｉｃａ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｓ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｃａｒｄｉｏｌ．Ｒｅｐ．３：４３−４９；およびＬｅｅ，Ｈ．Ｃ．ら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：４８３−８中に見出すことができる。
【００９１】
ウイルスを使用して、当該分野で周知の標準的なトランスフェクション技術を使用してｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に感染させることができる。例えば、細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞、樹状細胞、末梢血球、または腫瘍細胞）をｅｘ  ｖｉｖｏで形質導入する場合、ベクター粒子を、一般にほぼ１〜５０感染多重度（ＭＯＩ）程度（１×１０５〜５０×１０５形質導入単位／１０５細胞のウイルスベクターにも対応する）の用量を使用して細胞と共にインキュベートすることができる。これは、勿論、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、および５０ＭＯＩに対応するベクター量を含む。典型的には、ベクター量を、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、またはＨｅＬａ形質導入単位（ＴＵ）で示すことができる。
【００９２】
一旦細胞がウイルスに感染すると、移入ベクターによって形質導入され、且つピューロマイシン耐性遺伝子を発現する細胞を、ピューロマイシンまたはその機能的フラグメントもしくは誘導体との細胞の接触によって選択する。ピューロマイシンは、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から販売されている。特定の実施形態では、細胞を、ピューロマイシンと５日間以下、４日間以下、３日間以下、２日間以下、または１日間以下接触させる。特定の実施形態では、細胞を、ピューロマイシンと１２〜２４時間、１２〜３６時間、１２〜４８時間、または２４〜４８時間接触させる。典型的には、これは、ピューロマイシンへの細胞の数時間または数日間の連続した曝露を示す。特定の実施形態では、細胞を、ピューロマイシンと１〜２５μｇ／ｍｌ、１〜２０μｇ／ｍｌ、１〜１０μｇ／ｍｌの濃度範囲またはピューロマイシン濃度約２μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、または約１０μｇ／ｍｌで接触させる。添付の実施例で実証されるように、５μｇ／ｍｌという少量のピューロマイシンでの２４時間という短期間の処理により、形質導入された細胞が有意に選択および富化された。
【００９３】
ピューロマイシン選択前、選択中、および／または選択後、細胞を、細胞の維持、成長、または増殖に適切な培地中で培養することができる。適切な培養培地および条件は当該分野で周知である。ピューロマイシン選択後、選択された細胞を、その維持、成長、または増殖に適切な条件下で培養することができる。特定の実施形態では、選択された細胞を、移植前に約７〜約１４日間培養する。
【００９４】
ピューロマイシン選択細胞をアッセイして、移入ベクターで首尾よく形質導入されたかどうか決定することができる。一定の実施形態では、移入ベクターの存在を、非形質導入細胞中に存在しない移入ベクター領域を特異的に増幅するプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって決定する。例えば、ＰＣＲ分析を、個別のコロニーまたはクローン細胞集団に対して行うことができる。特定の実施形態では、ピューロマイシン選択により、得られた選択細胞集団内の形質導入された細胞が富化される。一定の実施形態では、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％の細胞が、移入ベクターで形質導入される。特定の実施形態では、これは、形質導入された細胞の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍の富化を示す。
【００９５】
形質導入された細胞のピューロマイシン選択中またはピューロマイシン選択後に、選択された細胞を、幹細胞または多分化能細胞の拡大を促進する条件下で培養することができる。当該分野で公知の任意の方法を使用することができる。一定の実施形態では、選択中または選択後、細胞を、幹細胞または多分化能細胞の拡大を促進する１つ以上の小分子の存在下で培養する。かかる分子の例には、ＳＲ１（アリール炭化水素受容体をアンタゴナイズする）およびバルプロ酸が含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態では、選択中または選択後、細胞を、幹細胞または多分化能細胞の拡大を促進する１つ以上の成長因子の存在下で培養する。幹細胞または多分化能細胞の拡大を促進する成長因子の例には、マウス造血幹細胞の自己再生を促進することが実証されている胎児肝臓チロシンキナーゼ（Ｆｌｔ３）リガンド、幹細胞因子、ならびにインターロイキン６および１１が含まれるが、これらに限定されない。他には、骨形成タンパク質４の活性化によって始原造血前駆体の増殖を誘導するソニックヘッジホッグ、ＨＳＣの自己再生を刺激するＷｎｔ３ａ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＦ）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ、例えば、塩基性ＦＧＦ、酸性ＦＧＦ、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−８ｂ、ＦＧＦ−８ｃ、ＦＧＦ−９）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ、例えば、ＰＤＧＦＡＡ、ＰＤＧＦＡＢ、ＰＤＧＦＢＢ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、間質細胞由来因子（ＳＣＤＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、またはインターロイキン−３（ＩＬ−３）が含まれる。特定の実施形態では、選択中または選択後、細胞を、幹細胞または多分化能細胞の拡大を促進する１つ以上の小分子および１つ以上の成長因子の両方の存在下で培養する。
【００９６】
一定の状況では、限られた期間中（例えば、ピューロマイシン選択過程中）のみでピューロマイシン耐性ポリペプチドを発現することが望ましいかもしれない。したがって、一定の実施形態では、ピューロマイシン耐性ポリペプチドの発現を形質導入後（例えば、ピューロマイシンでの細胞の接触前および／または接触の間）にオンにし、その後にピューロマイシン耐性ポリペプチドを発現する細胞の選択後にオフにすることができるように、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを一過性誘導性プロモーターに作動可能に連結させる。したがって、ピューロマイシン耐性ポリペプチドは、移植レシピエント中で発現されないであろう。このことは、細胞内での内因性癌遺伝子の活性化または免疫寛容の確立前の移植レシピエントによるピューロマイシン耐性ポリペプチドに対する免疫反応および関連する拒絶などのその発現による可能性のある望ましくない影響を減少または軽減するはずである。
【００９７】
種々の一過性誘導性プロモーター系は当該分野で公知であり、且つ利用可能である（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系、２種のテトラサイクリン応答Ｔｅｔ系（Ｔｅｔ−Ｏｎ、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ）、糖質コルチコイド応答マウス乳腺癌ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶｐｒｏｍ）、エクジソン−誘導性プロモーター（ＥｃＰ）、およびＴ７プロモーター／Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ系（Ｔ７Ｐ）が含まれる）。これらのいずれかを使用して、本発明の一定の実施形態にしたがってピューロマイシン耐性遺伝子の誘導性発現を駆動することができる。
【００９８】
別の実施形態では、ピューロマイシン耐性ポリペプチドの発現が形質導入された幹細胞および多分化能細胞で起こり、したがってピューロマイシン選択が容易になるが、形質導入された細胞のレシピエントへの移植後、ピューロマイシン耐性ポリペプチドの発現が体内移植された形質導入された幹細胞および多分化能細胞から生成された分化細胞中で減少するように、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、幹細胞または多分化能細胞中の活性が分化細胞中でのその活性と比較して高いプロモーターに作動可能に連結される。特定の実施形態では、プロモーターは、赤血球中よりも造血幹細胞中で活性が高い。分化細胞と比較して多分化能細胞（例えば、幹細胞）で高い活性を有する種々のプロモーターが当該分野で公知であり、且つ利用可能である。
【００９９】
上記のように、本発明の方法にしたがって産生された形質導入された細胞を使用して、治療ポリペプチドを必要とする被験体に送達させることができる。したがって、移入ベクターは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列および治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の両方を含むことができる。１つの実施形態では、これらのポリヌクレオチド配列のそれぞれは同一のプロモーターに作動可能に連結されるが、他の実施形態では、ピューロマイシン耐性遺伝子の発現および治療ポリペプチドの発現が独立して調節されるようにこれらのポリヌクレオチド配列のそれぞれは異なるプロモーターに作動可能に連結される。特定の実施形態では、一方または両方のプロモーターが構成性プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターである。一定の実施形態では、上記で考察されるように、ピューロマイシン耐性遺伝子の発現を駆動するプロモーターは誘導性プロモーターである。一定の実施形態では、治療ポリペプチドの発現を駆動するプロモーターは、幹細胞または多分化能細胞中において、かかる幹細胞または多分化能細胞から分化した少なくとも１つの細胞型の活性と比較して低い活性を有する。したがって、治療ポリペプチドの発現を、１つ以上の分化細胞型中で増強され得るか、または１つ以上の分化細胞型に限定され得る。特定の実施形態では、治療ポリペプチドの発現を駆動するプロモーターは、１つ以上の分化した造血細胞（例えば、赤血球など）で活性である。
【０１００】
１つ以上の分化した組織中で発現を優先的に駆動する組織特異的プロモーターは、当該分野で公知であり、且つ利用可能である（例えば、ヒトβ−グロビンプロモーターが含まれる）。組織特異性を、組織特異的エンハンサーエレメントを含めることによってさらに増強することができる。例えば、マウスＧａｔａ１  ＩＥ（第１エクソン赤血球系）プロモーター（ｍＨＳ−３．５）上流のエンハンサーエレメントは、赤血球系細胞および巨核球の発現の両方を指示することができる。
【０１０１】
本発明は、さらに、必要に応じて形質導入された細胞をネガティブ選択することができるような移入ベクター中の自殺遺伝子の含有を意図する。特定の実施形態では、自殺遺伝子は誘導性プロモーターに作動可能に連結される。種々の実施形態では、自殺遺伝子は構成性プロモーターに作動可能に連結される。例えば、自殺遺伝子は構成性に活性であり得、その発現は、必要に応じて作動可能に連結された誘導性プロモーターを使用して誘導される。さらなる例として、自殺遺伝子は誘導性に活性であり得、作動可能に連結された構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターをそれぞれ使用して構成性に発現されたか誘導性に発現される。
【０１０２】
特定の実施形態では、本発明の方法は、ピューロマイシン耐性ポリペプチドおよび条件的自殺遺伝子（単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼなど）の両方の発現を利用する。したがって、移植レシピエントにおけるベクター媒介挿入変異誘発の際に生成され得る腫瘍性細胞を、化学的に誘導された細胞自殺（例えば、ガンシクロビル）によって処置可能にされ得る。他の条件的自殺遺伝子を、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼコード遺伝子の代わりに使用することができる。特定の実施形態では、ピューロマイシン耐性および条件的細胞自殺タンパク質は、（ｉ）ポリシストロニックベクター内の内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によるか、（ｉｉ）前駆体タンパク質の切断によるか、または（ｉｉｉ）融合タンパク質として同時発現することができる。
【０１０３】
哺乳動物細胞での発現のための構成性プロモーターも当該分野で公知且つ利用可能であり、例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびその誘導体（例えば、マウスＰＧＫプロモーター）、サルウイルス４０初期プロモーター（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）、ヒトユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ヒト伸長因子１ａプロモーター（ＥＦ１Ａ）、およびＣＭＶ初期エンハンサーと結合したニワトリβアクチンプロモーター（ＣＡＧＧ）が含まれる。
【０１０４】
上記で考察されるように、本発明の方法を使用して、必要とする被験体への治療ポリペプチドの送達のための形質導入された細胞を産生することができる。特定の実施形態では、これらの方法を実施して、形質導入された幹細胞または多分化能細胞から分化することができる１つ以上の細胞型に対する治療ポリペプチドを得る。一定の実施形態では、１つ以上の細胞型は造血細胞型であり、骨髄系列（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、エリスロサイト、巨核球／血小板、樹状細胞）およびリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）が含まれる。
【０１０５】
特定の実施形態では、本発明の方法にしたがって産生された形質導入された細胞を使用して、造血系の疾患または障害（異常血色素症、貧血、またはサラセミアなど）を処置する。本明細書中で使用する場合、用語「異常血色素症」または「異常血色素状態」には、血中の異常なヘモグロビン分子の存在を含む任意の障害が含まれる。異常血色素症の例には、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビン鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、鎌状赤血球貧血、およびサラセミアが含まれるが、これらに限定されない。異常ヘモグロビンの組み合わせが血中に存在する異常血色素症（例えば、鎌状赤血球／Ｈｂ−Ｃ病）も含まれる。
【０１０６】
用語「鎌状赤血球貧血」または「鎌状赤血球症」を、本明細書中で、赤血球の鎌状赤血球化に起因する任意の症候性貧血状態が含まれると定義する。鎌状赤血球症の症状発現には、以下が含まれる：貧血；疼痛；および／または臓器機能不全（腎不全など）、網膜症、急性胸部症候群、虚血、持続勃起症、および卒中。本明細書中で使用する場合、用語「鎌状赤血球症」は、特にＨｂＳにおける鎌状赤血球置換についてホモ接合体である被験体における鎌状赤血球貧血に伴う種々の臨床上の問題をいう。これらのうち、鎌状赤血球症という用語の使用によって本明細書中で言及される体質上の発現は、成長および発達の遅延、特に肺炎球菌に起因する重症感染症の発症傾向の増大、顕著な脾臓機能障害、循環細菌の有効な排除の阻止であり、再発性梗塞を伴い、最終的に脾組織の破壊が起こる。主に腰椎、腹部、および大腿骨幹に影響を及ぼし、減圧痛（ｂｅｎｄ）と機構および重症度が類似する筋骨格痛の急性エピソードも用語「鎌状赤血球症」に含まれる。成人では、かかる発作は、一般に、数週間または数ヶ月毎の軽度または中等度の短期間の発作として発現し、この発作は、平均で１年間に約１回引き起こされる５〜７日間継続する苦痛のある発作が散見される。その内で、かかる急性発症を引き起こすことが公知の事象はアシドーシス、低酸素症、および脱水症であり、その全てがＨｂＳの細胞内重合を増強する（Ｊ．Ｈ．Ｊａｎｄｌ，Ｂｌｏｏｄ：Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９６，ｐａｇｅｓ  ５４４−５４５）。
【０１０７】
本明細書中で使用する場合、「サラセミア」は、ヘモグロビン産生の欠損によって特徴づけられる遺伝性障害を示す。サラセミアの例には、βおよびαサラセミアが含まれる。βサラセミアは、βグロビン鎖の変異によって生じ、重症型および軽症型で生じ得る。重症型のβサラセミアでは、小児は正常に出生するが、生後１年間に貧血を発症する。軽症型のβサラセミアは小型の赤血球を産生し、サラセミアはグロビン鎖由来の遺伝子の欠損によって生じる。したがって、本用語には、サラセミア状態（重症またはβ−サラセミア、重症型サラセミア、中等症サラセミア、α−サラセミア（ヘモグロビンＨ症など）など）に起因する任意の症候性貧血が含まれる。
【０１０８】
特定の実施形態では、治療ポリペプチドは抗鎌状赤血球化タンパク質である。本明細書中で使用する場合、「抗鎌状赤血球化タンパク質」には、鎌状赤血球状態においてエリスロサイトの鎌状赤血球化を導く病理学的事象を防止または逆行するタンパク質が含まれる。本発明の１つの実施形態では、本発明の形質導入された細胞を使用して、異常血色素状態を有する被験体に抗鎌状赤血球化タンパク質を送達させる。抗鎌状赤血球化タンパク質には、抗鎌状赤血球化アミノ酸残基を含む変異β−グロビン遺伝子（例えば、８７位でのトレオニンのグルタミンとの置換を有する変異β−グロビン）から発現されるポリペプチドも含まれる。治療ポリペプチドをコードする遺伝子またはｃＤＮＡ配列を、当業者に公知の種々の技術による移入ベクターへの挿入のために得ることができる。
【０１０９】
本発明は、さらに、本明細書中に記載の方法にしたがって産生された形質導入された細胞および薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物を含む。１つの実施形態では、キャリアは非経口投与に適切である。キャリアは、静脈内投与、腹腔内投与、または筋肉内投与に適切であり得る。薬学的に許容され得るキャリアには、滅菌注射液または注射用分散液の即時調製のための滅菌水溶液または分散液および滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのかかる媒質および薬剤の使用は、当該分野で周知である。
【０１１０】
移植レシピエントにおける骨髄抑制の軽減方法
本発明の別の態様は、移植レシピエント、特に、形質導入された幹細胞または多分化能細胞（例えば、形質導入された造血幹細胞または多分化能細胞）の移植前に骨髄破壊処置を受けた患者で起こり得る一過性骨髄抑制の阻害、予防、または改善に関する。本発明のこの態様は、特に、形質導入された細胞が移植前に本発明の方法にしたがって選択された場合（事前のｅｘ−ｖｉｖｏピューロマイシン処理に由来する非形質導入細胞（例えば、造血細胞）の喪失に起因する）に関連する。移植細胞数が少ないほど骨髄抑制リスクが高くなる。さらに、幹細胞が実質的に再増殖する前に実質的な時間の遅延が存在し得る。
【０１１１】
したがって、本発明は、ピューロマイシン選択された形質導入された細胞（多分化能細胞が含まれる）の集団を、骨髄抑制を罹患している被験体で枯渇する造血細胞（赤血球、白血球、および／または血小板など）を産生することができる個別の細胞集団と共に被験体に同時移植することによって一過性骨髄抑制を阻害する方法を提供する。特定の実施形態では、この個別の細胞集団は、被験体の自己再生または長期再増殖が可能な幹細胞を含まないか、少量のかかる細胞（例えば、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満、または０．０１％未満）しか含まない。したがって、個別の細胞集団は造血細胞を一過性または短期で再増殖させ、それにより、骨髄抑制を阻害または軽減する一方で、ピューロマイシン選択された形質導入された細胞中に存在する形質導入された多分化能細胞（形質導入された幹細胞が含まれる）は、被験体中の造血細胞を長期再増殖させる。一定の実施形態では、短期再増殖のために含めた細胞集団は、幹細胞（長期再増殖のために使用される形質導入された幹細胞を含む細胞集団）の比率が低いであろう。しかし、これらの異なる細胞集団の一方または両方が、幹細胞、多分化能細胞、前駆細胞、および分化細胞から選択される１つ以上の細胞型を含むことができると理解される。しかし、短期再増殖のために使用される細胞集団（本明細書中に記載の細胞集団が含まれる）中に存在する幹細胞数を減少させるための工程を使用することができる。
【０１１２】
本発明の方法の種々の実施形態によれば、短期再増殖のために使用される細胞は、形質導入された細胞または非形質導入細胞のいずれかであり得る。例えば、一定の実施形態では、短期再増殖のために使用される細胞を、上記のように形質導入および選択するが、次いで、本明細書中に記載のように拡大および／または分化する。
【０１１３】
特定の実施形態では、移植患者内の細胞系統の短期再増殖または一過性再増殖は、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、または少なくとも４ヶ月間の再増殖の持続期間を示す。特定の実施形態では、移植患者内の細胞系統の短期再増殖または一過性再増殖は、１年未満、６ヶ月未満、または４ヶ月未満の再増殖の持続期間を示す。特定の実施形態では、移植患者内の細胞系統の短期再増殖または一過性再増殖は、１ヶ月間と１年間の間、１ヶ月間と６ヶ月間との間、または１ヶ月間と４ヶ月間との間の再増殖の持続期間を示す。
【０１１４】
特定の実施形態では、移植患者内の細胞系統の長期再増殖は、少なくとも４ヶ月間の再増殖の持続時間を示し、この持続時間は移植後のどの時点でも起こり得る。特定の実施形態では、移植患者内の細胞系統の長期再増殖は、１年超、６ヶ月超、または４ヶ月超の再増殖の持続時間を示す。再増殖が起こる期間は、移植後任意の時点であり得る。一定の実施形態では、再増殖は、移植後１年以内、１８ヶ月以内、または２年以内に開始される。
【０１１５】
したがって、１つの実施形態では、本発明は、形質導入された幹細胞の移植レシピエントへの移植後に骨髄抑制を阻害する方法であって、形質導入された幹細胞を含む第１の細胞集団を第１の細胞集団と比較して幹細胞の百分率が低い第２の細胞集団と組み合わせて移植レシピエントに移植する工程を含む、方法を含む。特定の実施形態では、移植レシピエントは移植前に骨髄破壊レジメンを受けており、特定の実施形態では、移植レシピエントは、種々の分化された造血細胞（赤血球など）に分化することができる造血前駆細胞数が減少している。一定の実施形態では、第１の細胞集団は、治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む移入ベクターで形質導入された幹細胞を含む。特定の実施形態では、第１の細胞集団は移植レシピエント内の造血細胞を長期間再増殖することができ、第２の細胞集団は移植レシピエント内の造血細胞を短期間再増殖することができる。特定の実施形態では、第１の細胞集団は形質導入された幹細胞を含む。種々の実施形態では、第２の細胞集団は、形質導入された前駆細胞および／または非形質導入前駆細胞を含む。
【０１１６】
種々の実施形態では、第２の細胞集団を、（任意のその後の培養または改変前に）移植レシピエントまたは別のドナーから得る。したがって、第１の細胞集団を、第２の細胞集団と同一または異なる最初の供給源から得ることができる。例えば、第１の細胞集団を移植レシピエントから得た細胞を使用して産生することができるのに対して、第２の細胞集団を同種異系ドナーから得た細胞から調製する。別の例では、第１の細胞集団および第２の細胞集団の両方を、移植レシピエントから得た細胞から産生させる（同時または異なる時期に）。
【０１１７】
第２の細胞集団中に存在する細胞をレシピエントに移植して細胞区画（造血系など）の一過性再増殖を得ることを考慮して、本発明の一定の実施形態は、第２の細胞集団が第１の細胞集団より低い百分率の幹細胞を有することを意図する。したがって、長期の生着および再増殖を、第１の細胞集団中に存在するピューロマイシン選択された形質導入された幹細胞によって行うであろう。したがって、特定の実施形態では、例えば、一定の成長因子の組み合わせによって一過性に再増殖する造血前駆体集団を維持または拡大しながら、第２の細胞集団を、長期再増殖する幹細胞集団が枯渇する条件下で培養する。したがって、特定の実施形態では、本発明のこの態様の方法は、第２の細胞集団を、集団から幹細胞を枯渇または除去する薬剤、幹細胞の成長または増殖を阻害する薬剤、または幹細胞の前駆細胞への分化を誘導または促進する薬剤と接触させる工程を含む。特定の実施形態では、幹細胞は造血幹細胞である。
【０１１８】
集団からの幹細胞の枯渇または除去のために使用することができる薬剤には、幹細胞上に発現する細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ３４、Ｓｃａ１、Ｌｉｎ、ｃ−ｋｉｔ）に特異的な抗体が含まれるが、これらに限定されず、これらの薬剤を使用して、幹細胞を結合し、細胞集団から幹細胞を除去するか富化することができる。幹細胞の成長または増殖を阻害するために使用することができる薬剤には、当該分野で公知の任意の薬剤が含まれる。
【０１１９】
多分化能幹細胞（例えば、幹細胞）の前駆細胞への分化を誘導または促進するために使用することができる薬剤には、例えば、種々のサイトカインおよび成長因子ならびにその組み合わせが含まれる。かかるｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大または分化のために使用することができるサイトカインの例には、ＩＬ−１（すなわち、ＩＬ−１β）、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびそのアナログが含まれるが、これらに限定されない。ｅｘ  ｖｉｖｏ拡大に適切な成長因子を、ｃ−ｋｉｔリガンド（ＳＣＦまたはＳＦ）、ＦＬＴ−３リガンド（ＦＬ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、およびそのアナログから選択することができる。本明細書中で使用する場合、アナログには、天然に存在する形態の特徴的な生物学的活性を有する種々のサイトカインおよび成長因子のバリアントが含まれる。１つの実施形態では、その基剤組成物中のサイトカインおよび成長因子の混合物は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＬＴ−３リガンド（ＦＬ）、およびトロンボポエチン（ｔｈｒｏｍｏｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）（ＴＰＯ）を有する。他の実施形態では、サイトカインおよび成長因子の混合物は、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびその組み合わせ、特に、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、およびその組み合わせから選択されるさらなるサイトカインを有する。したがって、１つの実施形態では、サイトカインおよび成長因子の混合物が組成物ＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、およびＩＬ−３を有する一方で、別の実施形態では、混合物は、組成物ＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、およびＩＬ−６を有する。さらなるサイトカインの１つの組み合わせは、サイトカインおよび成長因子の混合物が組成物ＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、ＩＬ−６、およびＩＬ−１１を有するようなＩＬ−６およびＩＬ−１１である。骨髄系前駆細胞を拡大するためのサイトカインおよび成長因子の混合物を含む培養培地中での造血幹細胞の培養方法はまた、米国特許出願公開第２００６／０１３４７８３号に記載されている。この出願は、出発集団としてＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋ＨＳＣを使用した骨髄系前駆細胞集団の拡大を記載している。細胞を、任意選択的に骨髄系拡大に相乗効果を及ぼすと考えられるＩＬ−６と組み合わせたＫＩＴＬ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、およびＩＬ−３の組み合わせで処理する。特定の組み合わせには、任意選択的にＩＬ−３、さらに任意選択的にＩＬ３、ＩＬ−６、およびＩＬ−１１の組み合わせを有するＫＩＴＬ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯが含まれる。
【０１２０】
特定の実施形態では、第２の細胞集団は、同一の組織型の完全な分化細胞の前駆体である比較的未熟な細胞である前駆体または前駆細胞を含む。前駆体または前駆細胞（例えば、造血前駆細胞）は増殖することができるが、１つを超える細胞型への分化能力は制限されている。さらに、前駆体または前駆細胞は、長期自己再生能力を欠く。特定の実施形態では、造血前駆細胞は、レシピエントへの移植後約３〜４ヶ月間または３〜６ヶ月間造血を回復することができる。特定の実施形態では、造血前駆細胞は、少なくとも２つの異なる造血細胞への分化能力を有する。
【０１２１】
第２の細胞集団は、形質導入されていても形質導入されていなくても良い。一定の実施形態では、第２の細胞集団を、治療ポリペプチドを発現する移入ベクターで形質導入する。なぜなら、第２の細胞集団が移植レシピエントにおいて再増殖する期間中にこれらの細胞の少なくとも一部が治療ポリペプチドを発現することが有利であり得るからである。特定の実施形態では、形質導入された第２の細胞集団をピューロマイシンに供さない。したがって、一定の実施形態では、同一の治療ポリペプチドが第１および第２の細胞集団中の形質導入された細胞によって発現されない一方で、同一または異なる移入ベクターを使用して、第１および第２の細胞集団のそれぞれを形質導入することができる。特定の実施形態では、第１の細胞集団を形質導入するために使用される移入ベクターがピューロマイシン耐性遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む一方で、第２の細胞集団を形質導入するために使用される移入ベクターは、かかるポリヌクレオチドを含んでいても含んでいなくても良い。
【０１２２】
したがって、一定の実施形態では、本発明は、以下：（１）上記のように産生され、且つピューロマイシン選択された形質導入された幹細胞または多分化能細胞を含む細胞集団、および（２）特定の実施形態では、本明細書中に記載されているように調製される可能性がある第３の細胞集団と比較して幹細胞の比率が低い別の細胞集団の両方を必要とする被験体に提供する工程を含む骨髄抑制を軽減または阻害する方法を提供する。例えば、この他の細胞集団は、幹細胞の少なくとも部分的な分化を誘導する条件下に暴露している可能性がある。この他の細胞集団は形質導入されていても形質導入されていなくてもよく、ピューロマイシンと接触していても接触していなくても良い。この他の細胞集団は造血前駆細胞を含むことができる。細胞集団のいずれかまたは両方を、骨髄、動員末梢血、臍帯血、または胚性幹細胞から得た細胞から産生することができる。
【０１２３】
同様に、一定の実施形態では、本発明は、移植レシピエントへの形質導入された幹細胞の移植後に骨髄抑制を軽減または阻害する高度に関連した方法であって、形質導入された幹細胞を含む第１の細胞集団を、第１の細胞集団と比較して幹細胞の百分率が低い第２の細胞集団と組み合わせて移植レシピエントに移植する工程を含む方法を提供し、第１の細胞集団を形質導入された細胞について選択することを含む手順によって産生し、選択が第１の細胞集団を１〜２５μｇ／ｍｌのピューロマイシンと４日間以下接触させることを含み、第１の細胞集団を、プロモーター配列に作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む移入ベクターと第１の細胞集団内の複数の細胞のゲノム内にポリヌクレオチドを組み入れるのに十分な条件下および期間予め接触させた。
【０１２４】
特定の実施形態では、第１の細胞集団は、治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む移入ベクターで形質導入された幹細胞を含む。したがって、これらの方法を、種々の疾患および障害（下記の任意の疾患および障害ならびに特定の実施形態では、造血系の疾患が含まれる）の処置で使用することができ、処置には、移植レシピエントの内因性の骨髄または造血細胞の骨髄破壊（ｍｙｅｌｏｂｌａｔｉｏｎ）が含まれる。特定の実施形態では、第１および第２の細胞集団は、１つ以上の造血細胞（例えば、赤血球など）に分化することができる細胞を含む。特定の実施形態では、第１の細胞集団は、移植レシピエント中に生着し、細胞区画（例えば、造血細胞）を長期再増殖する能力を有するのに対して、第２の細胞集団は、移植レシピエント中に生着し、細胞区画（例えば、造血細胞）を短期または一過性に再増殖する能力を有する。
【０１２５】
１つの実施形態では、本発明は、形質導入された多分化能細胞の移植レシピエントへの移植後に骨髄抑制を阻害する方法であって、形質導入された多分化能細胞を含む第１の細胞集団を第１の細胞集団と比較して多分化能細胞の百分率が低い第２の細胞集団と組み合わせて移植レシピエントに移植する工程であって、第２の細胞集団は移植レシピエントを一過性に再増殖することができる、工程を含む、方法を含む。特定の実施形態では、第１の細胞集団は、治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む移入ベクターで形質導入された多分化能細胞を含む。種々の実施形態では、第２の細胞集団は形質導入されているか、形質導入されていない。一定の実施形態では、第１の細胞集団は、移植レシピエントへの第１の細胞集団の移植後ｉｎ  ｖｉｖｏで少なくとも４ヶ月間にわたり少なくとも２つの異なる細胞系統を産生することができる。一定の実施形態では、第２の細胞集団は、移植レシピエントの造血系を一過性に再増殖することができる。特定の実施形態では、移植レシピエントは、移植前に骨髄破壊治療を受けていた。一定の実施形態では、第１および第２の細胞集団は造血細胞を含む。特定の実施形態では、第２の細胞集団は、第１の細胞集団と比較して多分化能細胞の百分率が減少している。特定の実施形態では、第２の細胞集団を、移植前に多分化能細胞の拡大および／または少なくとも部分的な分化を誘導する条件に暴露した。一定の実施形態では、第２の細胞集団を、移植前に培養物中で拡大した。種々の実施形態では、第１および第２の細胞集団を、移植レシピエントから得た。一定の実施形態では、第１および／または第２の細胞集団を、骨髄、動員末梢血、臍帯血、および／または胚性幹細胞から得た。一定の実施形態では、第１の細胞集団を、形質導入された細胞を選択することを含む手順によって産生した。この手順は第１の細胞集団を１〜２５μｇ／ｍｌのピューロマイシンと４日間以下接触させることを含み、第１の細胞集団は、プロモーター配列に作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む移入ベクターと第１の細胞集団内の複数の細胞のゲノム内にポリヌクレオチドを組み入れるのに十分な条件下および期間予め接触させていた。
【０１２６】
本発明の特定の実施形態では、上記の「形質導入された細胞を産生および選択する方法、それに関連する形質導入された細胞による移植レシピエント中の細胞集団の再構築の増強方法、ならびに治療ポリペプチドの必要とする被験体への送達方法」という表題の任意の方法を、「移植レシピエントにおける骨髄抑制の軽減方法」という表題の任意の本明細書中に記載の方法と組み合わせ、それにより、骨髄抑制を軽減しながら移植され、形質導入された幹細胞の再構成を増強するための特定の実施形態を得ることができる。
【０１２７】
したがって、１つの実施形態では、本発明は、形質導入された幹細胞を移植レシピエント中に移植する方法であって、方法が、（ｉ）多分化能細胞（幹細胞が含まれる）を含む第１の細胞集団をプロモーター配列に作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む移入ベクターとｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させ、それにより、形質導入された多分化能細胞（幹細胞が含まれる）を含む第２の細胞集団を生成する工程；（ｉｉ）第２の細胞集団を濃度１〜２５μｇ／ｍｌのピューロマイシンと４日間以下ｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させ、それにより、形質導入された多分化能細胞（幹細胞が含まれる）を含む第３の細胞集団を生成する工程であって、第３の細胞集団が、第２の細胞集団より高い百分率の形質導入された多分化能細胞を含み、第３の細胞集団が、移入ベクターを含む少なくとも２つの異なる細胞系統の産生を第３の細胞集団の移植レシピエントへの移植後ｉｎ  ｖｉｖｏで少なくとも４ヶ月間維持することができる、工程；（ｉｉｉ）移植レシピエント中に複数の第３の細胞集団を第４の細胞集団と組み合わせて移植する工程であって、第４の細胞集団は前駆細胞を含み、第４の細胞集団が第４の細胞集団の移植レシピエント中への移植後に造血を短期間支持することができる、工程を含む、方法を提供する。第３および第４の細胞集団を組み合わせて移植する場合、これは第３および第４の細胞集団を同時に移植することを必ずしも意味せず、その代わりに、２つの集団のうちの１つを他の集団による移植の前、同時、または後に移植することができると理解される。しかし、両集団は、ある期間中に移植レシピエント中に存在するであろう。一定の実施形態では、両集団を、同時、互いに１時間以内、２時間以内、または２４時間以内に移植することができる。
【０１２８】
一過性または短期で再増殖させるために移植された第４の細胞集団が一過性または短期で再増殖させることを意図する細胞集団について上記の任意の特徴を有することができると理解される。したがって、特定の実施形態では、第４の細胞集団を、多分化能細胞の拡大および／または少なくとも部分的な分化を誘導する条件に予め暴露した。種々の実施形態では、第４の細胞集団は形質導入されていないか、形質導入されている。したがって、第４の細胞集団は、形質導入された細胞を含んでも含んでいなくても良い。１つの実施形態では、第４の細胞集団は、（ｉ）第４の細胞集団をプロモーター配列に作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む移入ベクターと接触させる工程；および（ｉｉ）第４の細胞集団を濃度１〜２５μｇ／ｍｌのピューロマイシンと４日間以下接触させ、それにより、ピューロマイシン耐性ポリペプチドを含む形質導入された細胞について選択する工程を含む方法によって形質導入および選択された細胞を含む。
【０１２９】
特定の実施形態では、第４の細胞集団は造血細胞を含む。一定の実施形態では、第１および第４の細胞集団を同一の被験体から得た。特定の実施形態では、第１および第４の細胞集団を、骨髄、動員末梢血、臍帯血、および／または胚性幹細胞から得た。
【０１３０】
図４Ａは、本発明の生着の改善方法を示す概略図を提供する。この方法は、以下の両方を含む：（１）ピューロマイシン耐性を付与する移入ベクターで形質導入された細胞（多分化能細胞（造血幹細胞（ＨＳＣ）など）が含まれる）の選択；および（２）選択された形質導入された細胞（多分化能細胞（ＨＳＣなど）が含まれる）の拡大された非形質導入前駆細胞と組み合わせた移植。移植後、拡大された非形質導入前駆細胞は短期再増殖する一方で、選択された形質導入されたＨＳＣは非形質導入ＨＳＣと競合することなく成長し、最終的にレシピエント内で細胞集団が再構成される。図の下のグラフは、骨髄破壊後のレシピエントへの移植後の経時的な骨髄抑制レベル（左のグラフ）および骨髄破壊後のレシピエントへの移植後の経時的な移植細胞からの再増殖（右のグラフ）を示す。示すように、移植レシピエントは拡大された前駆細胞と組み合わせて形質導入されたＨＳＣを移植した場合に非形質導入細胞の除去後の形質導入された細胞のみの移植後のより遅い回復と比較して迅速な回復を示すと予想される。さらに、移植レシピエントは拡大された前駆細胞から一過性に再増殖し、形質導入されたＨＳＣから持続的に再増殖すると予想される。
【０１３１】
図４Ｂは、本発明の生着の改善方法を示す概略図を提供する。この方法は、以下の両方を含む：（１）ピューロマイシン耐性を付与する移入ベクターで形質導入された細胞（多分化能細胞（造血幹細胞（ＨＳＣ）など）が含まれる）の選択；および（２）ＨＳＣの拡大を促進する薬剤（アリール水素受容体アンタゴニスト（ＳＲ１）など）の存在下での培養による選択された形質導入された細胞の拡大。これらの拡大して形質導入された細胞をレシピエントに移植し、形質導入された多分化能細胞が非形質導入細胞と競合することなく成長し、最終的にレシピエント内で細胞集団が再構成される。図の下のグラフは、骨髄破壊後のレシピエントへの移植後の経時的な骨髄抑制レベル（左のグラフ）および骨髄破壊後のレシピエントへの移植後の経時的な移植細胞からの再増殖（右のグラフ）を示す。示すように、移植レシピエントは拡大されたＨＳＣを移植された場合に非形質導入細胞の除去後の非拡大細胞の移植後のより遅い回復と比較して迅速に回復し、より早期の疾患の是正も付随すると予想される。さらに、移植レシピエントは拡大された形質導入されたＨＳＣを移植した場合に形質導入された細胞の選択後の非拡大細胞の移植後の低い再増殖と比較して高いレベルの生着および持続的再構成を示すと予想される。
【０１３２】
移入ベクター
本発明は、さらに、本発明の方法を実施するために使用することができる移入ベクターを提供する。これらのベクターを、ピューロマイシン耐性ポリペプチドを発現し、それにより、形質導入された細胞の選択が容易になるようにデザインする。好ましい実施形態では、移入ベクターを、治療ポリペプチドを発現するようにさらにデザインする。
【０１３３】
当業者は、かかる移入ベクターを種々の異なるウイルスベクターを使用して産生することができると認識する一方で、特定の実施形態では、移入ベクターはレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。これは、その一部の理由として、レンチウイルスベクターがｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で導入遺伝子を非分裂細胞に効率的に送達させ、組み入れ、長期発現することができるからである。種々のレンチウイルスベクターが当該分野で公知であり、Ｎａｌｄｉｎｉら，（１９９６ａ，１９９６ｂ，および１９９８）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら，（１９９７）；Ｄｕｌｌら，１９９８，米国特許第６，０１３，５１６号；および同第５，９９４，１３６号（これらのいずれかを本発明の移入ベクターを産生させるために適合させることができる）を参照のこと。一般に、これらのベクターはプラスミドベースまたはウイルスベースであり、治療ポリペプチドをコードする核酸の宿主細胞への移入に不可欠な配列を保有するように構成する。
【０１３４】
レンチウイルスゲノムおよびプロウイルスＤＮＡには、レトロウイルス中で見出される３つの遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）が含まれ、これらは２つの長末端反復（ＬＴＲ）配列に隣接している。ｇａｇ遺伝子は内部構造（マトリックス、キャプシド、およびヌクレオカプシド）タンパク質をコードし、ｐｏｌ遺伝子はＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、プロテアーゼ、およびインテグラーゼをコードし、ｅｎｖ遺伝子はウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。５’および３’ＬＴＲ’は、ビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化をそれぞれ促進する機能を果たす。レンチウイルスは、さらなる遺伝子（ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｆ、およびｖｐｘが含まれる）を有する。５’ＬＴＲに隣接する配列は、ゲノムの逆転写（ｔＲＮＡプライマー結合部位）およびウイルスＲＮＡの粒子への効率的なキャプシド形成（Ｐｓｉ部位）に必要な配列である。
【０１３５】
さらなる実施形態では、レンチウイルスベクターはＨＩＶベクターである。したがって、ベクターは、ヒト免疫不全−１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全−２（ＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ジュンブラナ病ウイルス（Ｊｅｍｂｒａｎａ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｖｉｒｕｓ）（ＪＤＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、およびヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）などに由来し得る。ＨＩＶベースの構築物がヒト細胞の形質導入で最も効率的であるという点で、ＨＩＶベースのベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用性配列エレメントならびにＨＩＶのｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子）を、一般に、本発明のほとんどの態様と併せることが好ましい。
【０１３６】
特定の実施形態では、本発明の移入ベクターは、左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲ；レトロウイルス移行エレメント、任意選択的にレンチウイルスＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）；目的の遺伝子（例えば、治療ポリペプチドをコードする）に作動可能に連結されたプロモーターまたはその活性部分（および任意選択的に遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）、またはその活性部分）；プロモーターに作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列；および右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲを含む。本発明の移入ベクターは、他のエレメント（１つ以上のセントラルポリプリントラクト（ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）（例えばψパッケージングシグナルおよび／またはＨＩＶ−１由来のｃＰＰＴ／ＦＬＡＰが含まれる）など）をさらに含むことができる。
【０１３７】
一定の実施形態では、５’ＬＴＲのプロモーターを、異種プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが含まれる）と置換する。
【０１３８】
本発明の１つの実施形態では、ベクターのＬＴＲ領域（３’ＬＴＲなど）をＵ３および／またはＵ５領域で改変し、自己不活性化（ＳＩＮ）ベクターが作製される。かかる改変は、遺伝子送達用のベクターの安全性の増大に寄与する。１つの実施形態では、本発明のＳＩＮベクターは、Ｕ３領域の一部がインスレーターエレメントに置換された３’ＬＴＲの欠失を含む。例示的なＳＩＮベクターは、例えば、米国特許出願公開第２００６／００５７７２５号ならびに米国特許第７，２５０号および同第６，１６５，７８２号に記載されている。インスレーターは、ベクター内のエンハンサー／プロモーター配列がゲノム付近の遺伝子の発現に影響を及ぼすのを防止し、その逆もまた同様であり、付近のゲノム配列がベクター内の遺伝子の発現に影響を及ぼすのを防止する。例示的なインスレーター配列は、例えば、米国特許出願第２００６／００５７７２５号および米国特許第５，６１０，０５３号に記載されている。本発明のさらなる実施形態では、Ｕ５領域を、例えば、理想的なポリ（Ａ）配列と置換するように３’ＬＴＲを改変する。ＬＴＲの改変（３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、または３’ＬＴＲと５’ＬＴＲとの両方の改変など）も本発明に含まれることに留意すべきである。
【０１３９】
特定の実施形態では、本発明の移入ベクターは、左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲ；レトロウイルス移行エレメント、任意選択的にレンチウイルスＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）；目的の遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターまたはその活性部分および遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）またはその活性部分；プロモーターに作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列；および右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲを含む。本発明のレトロウイルスベクターは、セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）（例えば、ＨＩＶ−１由来のｃＰＰＴ／ＦＬＡＰが含まれる）をさらに含むことができる。別の実施形態では、５’ＬＴＲのプロモーターを、異種プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが含まれる）と置換する。特定の実施形態では、左側の（５’）ＬＴＲ、右側の（３’）ＬＴＲ、または左側および右側のＬＴＲの両方のＵ５領域の全部または一部を理想的なポリ（Ａ）配列と置換するように改変し、左側の（５’）長末端反復（ＬＴＲ）、右側の（３’）ＬＴＲ、または左側および右側のＬＴＲの両方のＵ３領域を、１つ以上のインスレーターエレメントを含むように改変する。１つの実施形態では、Ｕ３領域を、Ｕ３領域のフラグメントの欠失およびこのフラグメントのインスレーターエレメントとの置換によって改変する。特定の実施形態では、右側の（３’）ＬＴＲのＵ５領域を、Ｕ５領域の欠失およびこの領域のＤＮＡ配列（例えば、理想的なポリ（Ａ）配列）との置換によって改変する。さらに別の実施形態では、ベクターは、β−グロビン遺伝子座由来のインスレーター（例えば、ニワトリＨＳ４が含まれる）を含むインスレーターエレメントを含む。
【０１４０】
本発明の移入ベクターは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくはフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む。典型的には、機能的バリアントは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を含み、機能的フラグメントはピューロマイシン耐性を付与するのに十分なピューロマイシン耐性ポリペプチドの一部を含む。かかる機能的バリアントおよびフラグメントは、これらが発現される細胞中でこれらが由来する野生型ピューロマイシン耐性ポリペプチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のピューロマイシン耐性活性を付与することができる。当業者は、ピューロマイシン耐性活性を容易に決定することができる。一定の実施形態では、ピューロマイシン耐性遺伝子は、ピューロマイシンＮ−アセチル−トランスフェラーゼ（ＰＡＣ）、またはその機能的バリアントもしくはフラグメントをコードするｐａｃ遺伝子またはそのコドン至適化バリアントである。
【０１４１】
本発明の移入ベクター（レンチウイルスベクターが含まれる）は、目的の遺伝子（例えば、目的のポリペプチドまたは治療ポリペプチドを発現するポリヌクレオチド配列が含まれる）を含むことができる。特定の実施形態では、治療ポリペプチドを、ポリペプチドが低減されたレベルで、または変異し、機能性がより低い形態で発現される患者に提供する。目的の遺伝子およびその発現されたポリペプチドの例には、副腎脳白質ジストロフィ（ＡＬＤ）遺伝子またはそのコード領域、およびＡＬＤタンパク質（米国特許第５，６４４，０４５号に記載）；グロビン遺伝子または抗鎌状赤血球化タンパク質をコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、本発明のレトロウイルスベクター中で発現されるグロビン遺伝子は、β−グロビン、δ−グロビン、またはγ−グロビンである。別の実施形態では、ヒトβ−グロビン遺伝子は、野生型ヒトβ−グロビン遺伝子またはヒトβＡ−グロビン遺伝子である。別の実施形態では、ヒトβ−グロビン遺伝子は、１つ以上のイントロン配列の欠失を含むか、少なくとも１つの抗鎌状赤血球化アミノ酸残基をコードする変異ヒトβ−グロビン遺伝子である。抗鎌状赤血球化アミノ酸は、ヒトδ−グロビンまたはヒトγ−グロビンに由来し得る。別の実施形態では、変異ヒトβ−グロビン遺伝子は、コドン８７でのトレオニン−グルタミン変異をコードする（βＡ−Ｔ８７Ｑ）。本発明にしたがって使用することができるグロビン配列の例は、米国特許第５，８６１，４８８号に提供されており、グロビン配列を含む例示的移入ベクターは、米国特許第５，６３１，１６２号にも記載されている。
【０１４２】
移入ベクターのプロモーターは、特定の遺伝子の５’隣接領域と天然に（すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞と共に生じるので）または非天然に会合されたプロモーターであり得る。プロモーターは、真核生物ゲノム、ウイルスゲノム、または合成配列に由来し得る。プロモーターを、非特異的（全組織中で活性）であるか、組織特異的であるか、天然の調節過程によって調節されるか、外因的に適用された薬物によって調節されるか、特異的な生理学的状態によって調節される（急性期反応中に活性化するプロモーターまたは複製細胞中のみで活性化するプロモーターなど）ように選択することができる。本発明におけるプロモーターの非限定的な例には、レトロウイルスＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス最初期プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）が含まれる。プロモーターを、状態（異常血色素症が含まれるが、これに限定されない）に関連することが見出され得る選択された細胞型で特異的に発現することが示されたプロモーターから選択することもできる。本発明の１つの実施形態では、プロモーターは、遺伝子発現が赤血球に制限されるように細胞特異的である。エリスロサイト特異的発現を、ヒトβ−グロビンプロモーター領域および遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）の使用によって達成することができる。
【０１４３】
ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、同一または異なるプロモーター配列に作動可能に連結することができる。ピューロマイシン耐性ポリペプチドおよび／または治療ポリペプチドを、１つ以上の構成性プロモーターから発現することができる。しかし、本発明の移入ベクターは、１つまたは両方の治療ポリペプチドおよび／またはピューロマイシン耐性遺伝子の一時性発現または組織特異的発現が可能な１つ以上のプロモーターまたはエンハンサーエレメントを含むことができる。特定の実施形態では、哺乳動物中で天然に発現される細胞中のみで治療ポリペプチドを発現することが望ましいかもしれない。したがって、治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、細胞中での治療ポリペプチドの発現を選択的に駆動する組織特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結させることができる。赤血球中での発現を駆動するために使用することができる組織特異的プロモーターの一例は、β−グロビンプロモーターおよびＬＣＲである。
【０１４４】
一定の実施形態では、誘導性プロモーターを使用してピューロマイシン耐性ポリペプチドを発現することが望ましいかもしれない。その結果、このポリペプチドは、被験体内へ移入ベクターを使用して形質導入された細胞の導入後に発現されないか、無視出来るほどしか発現されないであろう。例えば、形質導入後およびピューロマイシン選択過程前またはその間にピューロマイシン耐性ポリペプチドの発現を誘導することが望ましいかもしれない。他の実施形態では、体内移植および再構成に有利であり得る形質導入された幹細胞の選択を増強するために前駆体または分化細胞と比較して幹細胞中でピューロマイシン耐性遺伝子を優先的に発現することが望ましいかもしれない。したがって、移入ベクター中で、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、前駆体または分化細胞よりも幹細胞中で活性な誘導性プロモーターおよび／またはエンハンサーまたはプロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結することができる。
【０１４５】
使用することができる種々の誘導性プロモーターおよび／またはエンハンサーは当該分野で公知であり、例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系、２種のテトラサイクリン応答Ｔｅｔ系（Ｔｅｔ−Ｏｎ、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ）、糖質コルチコイド応答マウス乳腺癌ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶｐｒｏｍ）、エクジソン−誘導性プロモーター（ＥｃＰ）、およびＴ７プロモーター／Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ系（Ｔ７Ｐ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４６】
１つの特定の実施形態では、ＨＩＶベースの組み換え移入ベクターは、５’→３’方向に、５’隣接ＨＩＶ  ＬＴＲ、パッケージングシグナルまたはψ＋、ＨＩＶ−１のセントラルポリプリントラクトまたはＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、ヒトβ−グロビン遺伝子３’エンハンサー、目的の遺伝子（βＡ８７  Ｔｈｒ：Ｇｌｎ変異を含むヒトβ−グロビン遺伝子バリアントなど）、２６６ｂｐのヒトβ−グロビンプロモーター、２．７ｋｂのヒトβ−グロビンＬＣＲ、ＰＧＫプロモーターまたは誘導性プロモーター、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリプリントラクト（ＰＰＴ）、および３’隣接ＨＩＶ  ＬＴＲを含む。ＬＴＲ領域は、Ｕ３領域およびＵ５領域ならびにＲ領域をさらに含む。Ｕ３領域およびＵ５領域を、自己不活化し、それにより遺伝子送達で用いるベクターの安全性が増大する移入ベクターを作製するために共にまたは独立して改変することができる。Ｕ３領域およびＵ５領域を、インスレーターエレメントを含むようにさらに改変することができる。本発明の１つの実施形態では、インスレーターエレメントはニワトリＨＳ４である。
【０１４７】
他の実施形態では、本発明の移入ベクターは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドおよび自殺遺伝子産物（例えば、条件的自殺遺伝子単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼを使用）の両方を発現する。さらに、移入ベクターは、治療ポリペプチドまたは目的の遺伝子を発現することができる。したがって、移植レシピエントにおけるベクター媒介挿入変異誘発の際に生成され得る腫瘍性細胞を、化学的に誘導された細胞自殺（例えば、ガンシクロビル；Ｎａｕｊｏｋ  Ｏ．ら  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖ．２０１０  Ｓｅｐ；６（３）：４５０−６１）によって処置可能にされる。他の条件的自殺遺伝子を、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼコード遺伝子の代わりに使用することができる。特定の実施形態では、ピューロマイシン耐性および条件的細胞自殺タンパク質は、（ｉ）ポリシストロニックベクター内の「内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）」によるか、（ｉｉ）前駆体タンパク質の切断によるか、（ｉｉｉ）融合タンパク質として同時発現される。
【０１４８】
したがって、本発明の別の実施形態では、移入ベクターは、自殺遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、自殺遺伝子はＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−Ｔｋ）である。移入ベクターはまた、細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ選択のための遺伝子（ｉｎ  ｖｉｖｏ選択のための遺伝子（例えば、メチルグアニンメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）遺伝子）など）を含むポリヌクレオチドを含むことができる。特定の実施形態では、自殺遺伝子は、構成性または誘導性プロモーター（本明細書中に記載の任意のプロモーターが含まれる）に作動可能に連結される。１つの実施形態では、自殺遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド配列は、ベクター中の５’ＬＴＲの下流および治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドの下流に存在する。一定の実施形態では、自殺遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド配列は、自殺遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターの５’末端が治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端に向かって存在し（治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、自殺遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド配列と比較して逆方向に存在し、したがって、治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端は５’ＬＴＲよりも３’ＬＴＲに近い）、自殺遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド配列の３’末端がｐｐｔおよび／または３’ＬＴＲの５’末端に向かって存在するように配向する。
【０１４９】
一定の実施形態では、自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチドを、その発現がベクター中のプロモーターによって駆動されないようにベクター中に方向づける。したがって、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ベクター内のプロモーターに作動可能に連結されない。むしろ、細胞プロモーターの影響下で細胞の染色体ＤＮＡの領域にベクターを挿入する場合に自殺遺伝子が発現する。特定の実施形態では、自殺タンパク質は、条件的または構成性であり得る。１つの実施形態では、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ベクター中の５’ＬＴＲの下流および治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドの上流に存在する。一定の実施形態では、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端が５’ＬＴＲに向かって存在し、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’末端が治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’末端に向かって存在するように方向づける。したがって、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、逆方向で存在し得る。これらのエレメントが存在するベクターの特定の実施位形態では、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ベクター中のｃＰＰＴ／ＦＬＡＰおよび／またはＲＲＥエレメントの上流に存在し得る。自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドが５’ＬＴＲの下流およびｃＰＰＴ／ＦＬＡＰおよび／またはＲＲＥエレメントの上流に存在する特定の実施形態では、スプライス受容配列を、自殺タンパク質の５’側（例えば、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドのすぐ隣り）に含めることができる。一定の実施形態では、スプライス受容配列は、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドの２０塩基、１０塩基、５塩基、またはそれ未満の塩基の上流に存在する。
【０１５０】
１つの実施形態では、移入ベクターは、ベクター内のプロモーターに作動可能に連結されない自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドは５’ＬＴＲの下流およびｃＰＰＴ／ＦＬＡＰおよび／またはＲＲＥエレメントの上流に存在し、スプライス受容部位は自殺タンパク質の５’側（例えば、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドのすぐ隣りまたは、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドの２０塩基、１０塩基、５塩基、またはそれ未満の塩基の上流の範囲内）に含まれる。
【０１５１】
一定の実施形態では、ピューロマイシン耐性タンパク質および自殺タンパク質は、インフレーム融合タンパク質またはポリペプチドとして発現される。特定の実施形態では、これらのタンパク質は、ピューロマイシン耐性ポリペプチドと自殺ポリペプチドとの直接的な融合物として発現される。一定の実施形態では、融合ポリペプチドは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドと自殺ポリペプチドとの間にリンカー配列を含む。
【０１５２】
ペプチドリンカー配列を使用して、確実にポリペプチドドメインがその所望の機能を果たすことが可能なように各ポリペプチドがその適切な二次構造および三次構造に折りたたまれるのに十分な距離で任意の２つ以上のポリペプチド成分を分離することができる。かかるペプチドリンカー配列を、当該分野で標準的な技術を使用して融合ポリペプチドに組み込む。適切なペプチドリンカー配列を、以下の要因に基づいて選択することができる：（１）可撓性の伸長されたコンフォメーションを採用する能力；（２）第１および第２のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用することができる二次構想を採用することができないこと；および（３）ポリペプチド機能的エピトープと反応することができる疎水性残基または荷電残基を欠くこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ残基、Ａｓｎ残基、およびＳｅｒ残基を含む。他の中性付近のアミノ酸（ＴｈｒおよびＡｌａなど）もリンカー配列中で使用することができる。リンカーとして有用に使用することができるアミノ酸配列には、Ｍａｒａｔｅａら，Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６，１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２５８−８２６２，１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号、および米国特許第４，７５１，１８０号に開示のアミノ酸配列が含まれる。特定の融合ポリペプチドセグメントが機能的ドメインを分離して立体干渉を防止するために使用することができる非必須Ｎ末端アミノ酸領域を含む場合にリンカー配列は必要ない。好ましいリンカーは、典型的には、組み換え融合タンパク質の一部として合成される可撓性アミノ酸サブシーケンスである。リンカーポリペプチドは、１アミノ酸長と２００アミノ酸長との間、１アミノ酸長と１００アミノ酸長との間、または１アミノ酸長と５０アミノ酸長との間（その間の全ての整数値が含まれる）であり得る。
【０１５３】
例示的なリンカーには、以下のアミノ酸配列が含まれるが、これらに限定されない：ＧＧＧ；ＤＧＧＧＳ（配列番号１６）；ＴＧＥＫＰ（配列番号１７）（例えば、Ｌｉｕら，ＰＮＡＳ  ５５２５−５５３０（１９９７）を参照のこと）；ＧＧＲＲ（配列番号１８）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら  １９９５，ｓｕｐｒａ）；（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１９）（Ｋｉｍら，ＰＮＡＳ  ９３，１１５６−１１６０（１９９６．）；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号２０）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６−１０７０）；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号２１）（Ｂｉｒｄら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号２２）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号２３）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号２４）；ＬＲＱＫｄ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰ（配列番号２５）。あるいは、可撓性リンカーを、ＤＮＡ結合部位およびペプチド自体の両方をモデリングすることができるコンピュータプログラム（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ  ＆  Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ  ９０：２２５６−２２６０（１９９３），ＰＮＡＳ  ９１：１１０９９−１１１０３（１９９４））を使用するかファージディスプレイ法によって合理的にデザインすることができる。
【０１５４】
一定の実施形態では、リンカー配列は、３つのグリシン残基を含むＧｌｙ３リンカー配列を含む。
【０１５５】
特定の実施形態では、リンカー配列が切断可能である。特定の実施形態では、リンカー配列は自己触媒性ペプチド切断部位を含む。例示的なポリペプチド切断シグナルには、ポリペプチド切断認識部位（プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、稀な制限酵素認識部位、自己切断型リボザイム認識部位）、および自己切断型ウイルスオリゴペプチド（ｄｅＦｅｌｉｐｅ  ａｎｄ  Ｒｙａｎ，２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８）；６１６−２６を参照のこと）など）が含まれる。
【０１５６】
適切なプロテアーゼ切断部位および自己切断ペプチドは、当業者に公知である（例えば、Ｒｙａｎら，１９９７．Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８，６９９−７２２；Ｓｃｙｍｃｚａｋら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．５，５８９−５９４を参照のこと）。例示的なプロテアーゼ切断部位には、ポティウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビモウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＮＩａプロテアーゼ、ビモウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＲＮＡ−２コードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（ライスツングロスフェリカルウイルス（ｒｉｃｅ  ｔｕｎｇｒｏ  ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  ｖｉｒｕｓ））３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップイエローフレックウイルス（ｐａｒｓｎｉｐ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｅｃｋ  ｖｉｒｕｓ））３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子、およびエンテロキナーゼの切断部位が含まれるが、これらに限定されない。その高い切断ストリンジェンシーのために、ＴＥＶ（タバコエッチ病ウイルス）プロテアーゼ切断部位が好ましい（１つの実施形態では、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号３）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号４）およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号５）（式中、Ｘは任意のアミノ酸を示す（ＴＥＶによってＱとＧとの間またはＱとＳとの間が切断される））。
【０１５７】
特定の実施形態では、自己切断ペプチドには、ポティウイルスおよびカルジオウイルス２Ａペプチド、ＦＭＤＶ（口蹄疫ウイルス）、ウマ鼻炎Ａウイルス、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス、およびブタテッショウウイルスから得たポリペプチド配列が含まれる。
【０１５８】
一定の実施形態では、自己切断ポリペプチド部位は、２Ａまたは２Ａ様部位、配列、またはドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，２００１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１）。
【０１５９】
例示的な２Ａ部位には、以下の配列が含まれる。
【０１６０】
【表１】
2014504862.tif 000003
【０１６１】
１つの実施形態では、自己触媒性ペプチド切断部位は、翻訳２Ａシグナル配列（例えば、１８アミノ酸配列であるアフトウイルス口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）ポリタンパク質の２Ａ領域など）を含む。使用することができる２Ａ様配列のさらなる例には、昆虫ウイルスポリタンパク質、Ｃ型ロタウイルスのＮＳ３４タンパク質、およびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．中の反復配列（例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００１），８２，１０２７−１０４１に記載）が含まれる。
【０１６２】
さらなる実施形態では、移入ベクターは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と自殺遺伝子またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチド配列との間に存在する「ジャンク」配列を含む。本明細書中で使用する場合、用語「ジャンク配列」は、公知の機能を有さないＤＮＡ配列をいう。一定の実施形態では、ジャンク配列は、哺乳動物細胞中で有意または検出可能なプロモーター活性またはエンハンサー活性を持たず、任意のまたは任意の公知の機能活性を有する任意のポリペプチドや任意のポリペプチドをコードしない。一定の実施形態では、ジャンク配列をコードするポリヌクレオチド配列は、その５’末端で終止コドンに隣接し、そして／またはその３’末端で開始コドンに隣接する。
【０１６３】
種々の実施形態では、移入ベクターは自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むことができ、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列はピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの上流に存在するか、その逆のいずれかである。１つの実施形態では、移入ベクターは、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、構成性または誘導性プロモーター（本明細書中に記載の任意のプロモーターが含まれる）に作動可能に連結される。
【０１６４】
１つの実施形態では、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド配列は、ベクター中の５’ＬＴＲの下流および治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドの下流に存在する。一定の実施形態では、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド配列を、プロモーターの５’末端が治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端に向かって存在し（治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド配列と比較して逆方向に存在し、したがって、治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端は５’ＬＴＲよりも３’ＬＴＲに近い）、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド配列の３’末端がｐｐｔおよび／または３’ＬＴＲの５’末端に向かって存在するように方向づける。
【０１６５】
１つの実施形態では、移入ベクターは、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターの５’側（例えば、プロモーターのすぐ隣り）にスプライス受容配列を含む。一定の実施形態では、スプライス受容配列は、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターの２０塩基、１０塩基、５塩基、またはそれ未満の塩基の上流に存在する。
【０１６６】
さらなる実施形態では、スプライス受容配列は、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターの５’側および／または自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の５’側および／またはピューロマイシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の５’側にその任意の適切な組み合わせで含まれる。スプライス受容配列は、これらのポリヌクレオチド配列のそれぞれまたは全ての２０塩基、１０塩基、５塩基、またはそれ未満の塩基の上流に存在し得る。
【０１６７】
一定の実施形態では、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、その発現がベクター中のプロモーターによって駆動されないようにベクター中に方向づける。したがって、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ベクター内のプロモーターに作動可能に連結されない。むしろ、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現は、細胞プロモーターの影響下で細胞の染色体ＤＮＡ領域にベクターが挿入される場合に起こる。１つの実施形態では、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ベクター中の５’ＬＴＲの下流および治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドの上流に存在する。一定の実施形態では、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、自殺タンパク質またはピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端が５’ＬＴＲに向かって存在し、自殺タンパク質またはピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’末端が治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’末端に向かって存在するように方向づける。したがって、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドと逆方向で存在し得る。これらのエレメントが存在するベクターの特定の実施形態では、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ベクター中のｃＰＰＴ／ＦＬＡＰおよび／またはＲＲＥエレメントの上流に存在し得る。自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドが５’ＬＴＲの下流およびｃＰＰＴ／ＦＬＡＰおよび／またはＲＲＥエレメントの上流に存在する特定の実施形態では、スプライス受容配列は、自殺タンパク質および／またはピューロマイシン耐性タンパク質の５’側（例えば、自殺タンパク質および／またはピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドのすぐ隣りまたは２０塩基、１０塩基、５塩基、またはそれ未満の塩基の上流の範囲内）に含まれ得る。
【０１６８】
１つの実施形態では、移入ベクターは、ベクター内のプロモーターに作動可能に連結されない自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、ここで、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは５’ＬＴＲの下流およびｃＰＰＴ／ＦＬＡＰおよび／またはＲＲＥエレメントの上流に存在し、スプライス受容部位は、自殺タンパク質および／またはピューロマイシン耐性タンパク質の５’側（例えば、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドのすぐ隣りまたは２０塩基、１０塩基、５塩基、またはそれ未満の塩基の上流の範囲内）に含まれる。
【０１６９】
移入ベクターは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドおよび／または自殺タンパク質の発現を駆動するプロモーターの上流にスプライス受容配列を含むことができる。一定の実施形態では、ベクターは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドおよび自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の発現を駆動するプロモーター配列のすぐ上流にスプライス受容配列を含む。種々の実施形態では、移入ベクターは、自殺タンパク質およびピューロマイシン耐性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列はピューロマイシン耐性遺伝子をコードするポリヌクレオチドの上流に存在し、その逆もまた同様であり、その発現を駆動するプロモーターの上流にスプライス受容配列をさらに含む。
【０１７０】
一定の実施形態では、ベクターは、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドの上流にピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドの開始コドンの上流またはピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の開始コドンの上流にスプライス受容配列をさらに含む。一定の実施形態では、ベクターは、ピューロマイシン耐性遺伝子をコードするポリヌクレオチドの上流に自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドの開始コドンの上流またはピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の開始コドンの上流にスプライス受容配列をさらに含む。
【０１７１】
一定の実施形態では、自殺遺伝子またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチドは、自殺遺伝子の５’末端にコザックコンセンサス配列を含み、自殺遺伝子またはｃＤＮＡの３’側に転写終結配列を含む。使用することができる例示的な強力なコザック配列は、コンセンサス配列、（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号２６）（式中、Ｒはプリン（ＡまたはＧ）である）である（Ｋｏｚａｋ，１９８６．Ｃｅｌｌ．４４（２）：２８３−９２およびＫｏｚａｋ，１９８７．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５−４８）。
【０１７２】
特定の実施形態では、移入ベクターは、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドとの間に配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。ＩＲＥＳは、ｍＲＮＡの中央で翻訳を開始させるヌクレオチド配列である。したがって、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと自殺タンパク質をコードするポリヌクレオチドとの間のＩＲＥＳの存在により、ピューロマイシン耐性タンパク質および自殺タンパク質を個別に翻訳可能である。ウイルスゲノムおよび哺乳動物ＲＮＡ由来の種々のＩＲＥＳは公知であり、本発明にしたがって使用することができる（例えば、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来のＩＲＥＳが含まれる）。
【０１７３】
移入ベクターを、当該分野で公知の日常的な分子生物学技術を使用して作製することができる。例えば、目的の治療遺伝子（例えば、ヒトβ−グロビンなど）のｃＤＮＡを、ＰＣＲによって適切なライブラリーから増幅する。遺伝子を、所望のプロモーターまたは遺伝子発現調節配列（ヒトβ−グロビンプロモーターおよびＬＣＲエレメントなど）を含むプラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）など）にクローン化する。制限酵素消化または所望のＤＮＡ配列を得るための当業者に公知の他の方法の後、次いで、図１に示すように、プロモーターおよびＬＣＲエレメントならびに目的の治療遺伝子を含む核酸カセットを、レンチウイルスベクターの適切なクローニング部位に挿入する。
【０１７４】
本発明の移入ベクター（レンチウイルスベクターが含まれる）を、遺伝子治療（異常血色素症の処置が含まれる）で使用することができる。本発明はまた、例えば、本発明のベクターを含む（例えば、トランスフェクトされた）宿主細胞を含む。１つの実施形態では、宿主細胞は、胚性幹細胞、体性幹細胞、または前駆細胞である。
【０１７５】
他の実施形態では、本発明は、赤血球系細胞中で安定した高レベルの遺伝子発現を達成するための（例えば、赤血球系特異的疾患を処置するため）前述の至適化ベクターの使用方法を提供する。
【実施例】
【０１７６】
実施例１
ピューロマイシン選択による形質導入されたＣＤ３４＋細胞の富化
この実施例は、ピューロマイシン耐性遺伝子を発現するレンチウイルスベクターを使用した首尾の良い形質導入および形質導入されたＣＤ３４＋細胞の選択、それにより形質導入された細胞中で富化した細胞集団の産生を実証する。
【０１７７】
これらの実験で使用したレンチウイルスベクター（ＨＰＶ６５４）を、ｈＰＧＫプロモーターに作動可能に連結されたピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を改変ヒトβ−グロビンポリペプチドを発現する以前に記載のベクター（米国特許出願公開第２００６／００５７７２５号に記載のβＡ−Ｔ８７Ｑ−グロビンレンチウイルス）に挿入することによって構築した。この改変したヒトβＡ−グロビン遺伝子バリアントは、コドン８７でβ−グロビンのほとんどの抗鎌状赤血球化活性を担うと考えられているグルタミンをコードするように変異している［βＡ８７Ｔｈｒ：Ｇｌｎ（βＡ−Ｔ８７Ｑ）］（Ｎａｇｅｌら（１９７９）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７６７：６７０）。ＨＰＶ６５４ベクターの概略図を、図１に提供する。図１中に示すように、ベクターは、ＨＩＶ  ＬＴＲ（ＨＩＶ１型長末端反復）；ψ＋（ｐｓｉ＋パッケージングシグナル）；ｃＰＰＴ（セントラルポリプリントラクト）／ＤＮＡフラップ；ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）；Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ヒトβ−グロビン遺伝子エクソン；介在配列；βグロビンプロモーター（ＳｎａＢＩ部位からＣａｐ部位まで）；３’βグロビンエンハンサー（ＡｖｒＩＩ部位下流まで）、およびＤＮアーゼＩ高感受性部位（ＬＣＲのＨＳ２（ＳｍａＩからＸｂａＩ）、ＨＳ３（ＳａｃＩからＰｖｕＩＩ）、およびＨＳ４（ＳｔｕＩからＳｐｅＩ））、ＰＧＫ（ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター）；ｐｕｒｏ（ピューロマイシン耐性遺伝子）、ｐｐｔ（ポリプリントラクト）；Ｕ３  ｄｅｌ  ＨＩＶ  ＬＴＲ；およびウサギグロビンポリＡを含む。
【０１７８】
水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質−Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）でシュードタイピングした組み換えウイルスのストックを、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ−Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、Ｔａｔ、およびＶＳＶ−Ｇを発現する個別のプラスミドと共にＨＰＶ６５４ベクターを使用した２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって生成した。ウイルスを４℃での超遠心によって濃縮し、ウイルスペレットをＳｔｅｍＰｒｏ−３４無血清培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，Ｍｄ．）に懸濁した。ウイルス力価を、プロウイルスコピー数を調節した形質導入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞のｑＰＣＲ分析によって決定した。
【０１７９】
正常なヒトドナー由来の新鮮な骨髄（ＢＭ、Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）または低温保存したＧ−ＣＳＦ動員末梢血（ｍＰＢ、ＡｌｌＣｅｌｌｓ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）ＣＤ３４＋精製細胞のいずれかを使用した。１×１０６／ｍｌの細胞濃度で、ＣＤ３４＋細胞を、Ｌ−グルタミン、１００ｎｇ／ｍｌ  ｈＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ  ｈＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍｌ  ｈＦＬＴ３−Ｌ、および２０ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−３（ＢＭ用）または６０ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−３（ｍＰＢ用）を補足したＳｔｅｍＰｒｏ−３４  ＳＦＭ中にて２４時間（ＢＭ）または１８時間（ｍＰＢ）予め刺激した。次いで、細胞を、８μｇ／ｍｌ硫酸プロタミンおよびＨＰＶ６５４上清（１０％（最終曝露力価３×１０７ＩＵ／ｍｌ（ＭＯＩ７．５）（ＢＭ用）および１×１０７ＩＵ／ｍｌ（ＭＯＩ３．３）（ｍＰＢ用））または５０％（最終曝露力価１．５×１０８ＩＵ／ｍｌ（ＭＯＩ３７．５）（ＢＭ用）および５×１０７ＩＵ／ｍｌ（ＭＯＩ１６．７）（ｍＰＢ用））のいずれか）をさらに補足したサイトカインを含む同一の培地中で濃度４×１０６（ＢＭ）または３×１０６（ｍＰＢ）細胞／ｍｌに懸濁した。ＨＰＶ６５４上清添加の２４時間後、新鮮なサイトカイン含有培地を添加して細胞を２．０×１０６／ｍｌ（ＢＭ用）または１．５×１０６／ｍｌ（ｍＰＢ用）に希釈し、さらに２４時間培養した。次いで、２つの各感染細胞集団を以下の２つのサンプルに分けた：図２に示すように、各細胞集団由来の一方のサンプルを５μｇ／ｍｌピューロマイシンで２４時間処理し、他のサンプルをピューロマイシンで処理しなかった。次いで、細胞をピューロマイシン除去のために洗浄し、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（登録商標）Ｈ４４３４（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）に３ｍｌ中で１×１０３および４×１０３細胞（ピューロマイシン未処理）ならびに４×１０３および４×１０４（ピューロマイシン処理）の用量でプレートした。次いで、コロニー形成単位−顆粒球／マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）を、１４日間培養して成長させた。次いで、各コロニーを、エリスロポエチン遺伝子（ＢＭ用）およびヒトアクチン遺伝子（ｍＰＢ用）のプライマーならびにレンチウイルスベクターに特異的なプライマー（ＧＡＧ（ＢＭ用）およびＬＴＲ（ｍＰＢ用））を使用した各コロニーのＰＣＲ分析によってレンチウイルスベクターの存在について分析した。図２Ａに示すように、１０％ＨＰＶ６５４上清で形質導入した骨髄ＣＤ３４＋細胞について、ピューロマイシン選択を使用しないで生成した４／１７（２３％）コロニーがレンチウイルスベクターに陽性であったのに対して、ピューロマイシン選択を使用して生成した２０／２０（１００％）コロニーはレンチウイルスベクターに陽性であった。５０％ＨＰＶ６５４上清で形質導入した細胞について、ピューロマイシン選択を使用しないで生成した３／１９（１６％）コロニーがレンチウイルスベクターに陽性であったのに対して、ピューロマイシン選択を使用して生成した１５／１９（７９％）コロニーはレンチウイルスベクターに陽性であった。
【０１８０】
１０％ＨＰＶ６５４上清で形質導入したＧ−ＣＳＦ動員ＣＤ３４＋細胞についての図２Ｂに示す第２の実験では、ピューロマイシン選択を使用しないで生成した１０／１８（５５％）コロニーがレンチウイルスベクターに陽性であったのに対して、ピューロマイシン選択を使用して生成した１５／１７（８８％）コロニーはレンチウイルスベクターに陽性であった。５０％ＨＰＶ６５４上清で形質導入した細胞について、ピューロマイシン選択を使用しないで生成した６／１６（３７％）コロニーがレンチウイルスベクターに陽性であったのに対して、ピューロマイシン選択を使用して生成した１８／１８（１００％）コロニーはレンチウイルスベクターに陽性であった。
【０１８１】
これらの実験は、形質導入されたＣＤ３４＋細胞の富化を、細胞をピューロマイシンと２４時間という短い期間にわたり接触させるピューロマイシン選択によって行うことができることを実証する。かかる選択を有利に使用して、高比率で形質導入された細胞を含む細胞集団を産生し、それにより、その後の移植レシピエント中の形質導入された細胞の生着および再増殖を増強することができる。
【０１８２】
上記の種々の実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書中で言及され、そして／または出願データシート中に列挙された全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は、その全体が本明細書中で参考として援用される。おさらなる実施形態を得るために種々の特許、出願、および刊行物の概念を使用することが必要な場合、実施形態の態様を修正することができる。
【０１８３】
上記の詳細な説明を考慮して、実施形態のこれらの変更および他の変更を行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用した用語によって特許請求の範囲が明細書および特許請求の範囲に開示の特定の実施形態に制限されると解釈すべきではないが、権利化されるかかる特許請求の範囲の全範囲の等価物と共に全ての可能な実施形態が含まれると解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、開示に制限されない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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