(57)【要約】  ＦＧＦＲのＩｇ様ドメインの中間機能性配列（ＩＦＳ）の部分と、ＦＧＦＲの第二Ｉｇドメイン（Ｄ２）と、ＦＧＦＲの第三Ｉｇ様ドメイン（Ｄ３）と、免疫グロブリンのＦｃ領域とを含む融合蛋白質、前記融合蛋白質をコードする核酸分子、ならびに前記各散文詩を含むキャリアおよび宿主細胞が提供される。前記融合蛋白質の製造方法、ならびに前記融合蛋白質、前記融合蛋白質を含む前記核酸分子、または前記核酸分子を含む前記キャリアもしくは細胞の、血管新生調節関連疾患の治療のための医薬の製造における使用。
2014513941.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦＲのＩｇ様ドメインの中間機能性配列（ＩＦＳ）由来の部分と、ＦＧＦＲの第二Ｉｇドメイン（Ｄ２）と、ＦＧＦＲの第三Ｉｇ様ドメイン（Ｄ３）と、免疫グロブリンのＦｃ領域とを含む、単離された可溶性の線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）融合蛋白質。
【請求項２】
体内および／または体外で線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）に結合する、好ましくはＦＧＦ２に結合する、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項３】
前記ＩＦＳ由来の部分が酸性ボックス（ＡＢ）を含みまたは含まず、好ましくは前記ＩＦＳはＡＢを含まない、前記のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項４】
前記ＩＦＳ由来の部分は、配列番号１の１３４〜１６２位、１４５〜１６２位、または１５１〜１６２位のアミノ酸配列を有している、前記のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項５】
ＦＧＦＲの第一Ｉｇ様ドメイン（Ｄ１）またはその一部を含む、前記のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項６】
前記ＦＧＦＲの第一Ｉｇ様ドメインまたはその一部が、
配列番号１の４０〜１１８位に対応するアミノ酸配列を有する、もしくは配列番号１の４０〜１１８位のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性のアミノ酸配列を有する、または
配列番号１の７７〜１１８位に対応するアミノ酸配列を有する、もしくは配列番号１の７７〜１１８位のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性のアミノ酸配列を有する、
請求項５に記載の融合蛋白質。
【請求項７】
前記Ｄ２ドメインが、配列番号１の１６３〜２４７位に対応するアミノ酸配列を有する、または配列番号１の１６３〜２４７位のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性のアミノ酸配列を有する、および／または
前記Ｄ３ドメインが、配列番号１の２７０〜３５９位に対応するアミノ酸配列を有する、または配列番号１の２７０〜３５９位のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性のアミノ酸配列を有する、
前記のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項８】
前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒトＩｇＧ、好ましくはヒトＩｇＧ１のＦｃ領域であり、好ましくは：
配列番号７のアミノ酸配列を有する、もしくは配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性のアミノ酸配列を有する、または
配列番号８のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を有する、もしくは配列番号８のヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を有する、
前記のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項９】
融合蛋白質に含まれる部分、ドメインおよび／または領域の間が、直接連結され、および／またはリンカーにより連結されている、前記のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１０】
ＦＧＦＲ細胞外ドメイン由来の部分と免疫グロブリンＦｃ領域とを含み、前記ＦＧＦＲ細胞外ドメイン由来の部分が
（１）配列番号９の第３５８〜５８０位、配列番号１０の第３０４〜５２６位、配列番号１１の第２７８〜５００位、配列番号１２の第２４６〜４６８位、配列番号１３の第２３５〜４５７位、配列番号１４の第２２９〜４５１位、および配列番号１５の第２２４〜４４６位のうちいずれか一つが示すアミノ酸配列を有する、もしくは配列番号１６の第１０７４〜１７４０位、配列番号１７の第９１２〜１５７８位、配列番号１８の第８３４〜１５００位、配列番号１９の第７３８〜１４０４位、配列番号２０の７０５〜１３７１位、配列番号２１の第６８７〜１３５３位、および配列番号２２の第６７２〜１３３８位のうちいずれか一つが示すヌクレオチド配列にコードされる；
（２）配列番号９の第３５８〜５８０位、配列番号１０の第３０４〜５２６位、配列番号１１の第２７８〜５００位、配列番号１２の第２４６〜４６８位、配列番号１３の第２３５〜４５７位、配列番号１４の第２２９〜４５１位、および配列番号１５の第２２４〜４４６位のうちいずれか１つが示すアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む；または、
（３）配列番号１６の第１０７４〜１７４０位、配列番号１７の第９１２〜１５７８位、配列番号１８の第８３４〜１５００位、配列番号１９の第７３８〜１４０４位、配列番号２０の７０５〜１３７１位、配列番号２１の第６８７〜１３５３位。および配列番号２２の第６７２〜１３３８位のうちいずれか一つに示されるヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、
前記のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１１】
（１）配列番号９〜１５のうちいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含むもしくは該アミノ酸配列からなる、もしくは配列番号１６〜２２のうちいずれか一つに示されるヌクレオチド配列の核酸分子にコードされる；
（２）配列番号９〜１５のうちいずれか一つに示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくは該アミノ酸配列からなる；または、
（３）配列番号１６〜２２のうちいずれか一つに示されるヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を含むもしくは該アミノ酸配列からなる、
前記のいずれか一項に記載のＦｃ融合蛋白質。
【請求項１２】
体外および／または体内でＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ２、に結合する、前記のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１３】
前記のいずれか一項に記載の融合蛋白質をコードする、単離核酸分子。
【請求項１４】
配列番号１６〜２２のうちいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の核酸分子。
【請求項１５】
請求項１３または請求項１４に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターでトランスフェクトされた細胞、好ましくはＣＨＯ細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合蛋白質、請求項１３もしくは請求項１４に記載の核酸分子、請求項１５に記載のベクター、または請求項１６に記載の細胞と、
医薬的に許容可能なキャリアと、
を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
原核細胞または真核細胞、特に哺乳類動物細胞系、で請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合蛋白質を発現させる、血管新生抑制性融合蛋白質の製造方法であって、好ましくは前記哺乳類動物はＣＨＯ細胞系である。
【請求項１９】
哺乳類動物で血管新生を抑制する医薬の製造における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合蛋白質、請求項１３もしくは請求項１４に記載の核酸分子、請求項１５に記載のベクター、請求項１６に記載の細胞、および／または請求項１７に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２０】
腫瘍の治療または予防の薬物の製造における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合蛋白質、請求項１３もしくは請求項１４に記載の核酸分子、請求項１５に記載のベクター、請求項１６に記載の細胞、および／または請求項１７に記載の医薬組成物の使用であって、例えば、前記腫瘍は固形腫瘍であり、好ましくは、腫瘍の治療もしくは予防は、血管新生を抑制することによって、および／または直接的に腫瘍細胞を抑制することによって実現される。
【請求項２１】
必要対象に、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合蛋白質、請求項１３もしくは請求項１４の核酸分子、請求項１５に記載のベクター、請求項１６に記載の細胞、および／または請求項１７に記載の医薬組成物、を有効量投与することを含む、対象における血管新生を抑制する方法。
【請求項２２】
必要対象に請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合蛋白質、請求項１３もしくは請求項１４の核酸分子、請求項１５に記載のベクター、請求項１６に記載の細胞、および／または請求項１７に記載の医薬組成物を有効量投与することを含む、対象において腫瘍を治療または予防する方法であって、例えば、前記腫瘍は固形腫瘍であり、好ましくは、腫瘍の治療もしくは予防は血管新生を抑制することによって、および／または直接的に腫瘍細胞を抑制することによって、実現される。
【請求項２３】
ＦＧＦを請求項１〜１２のいずれか一項の融合蛋白質に接触させることを含む、体外もしくは体内でＦＧＦを結合する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジー領域に属し、疾患治療、特にＦＧＦの過剰発現に関係する疾患の治療、に関する。具体的には、本発明はＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質、および血管新生調節関連疾患の治療におけるその使用に関する。より具体的には、本発明は単離された可溶性ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白、および血管新生関連疾患の治療薬の製造におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）は悪性腫瘍の増殖と転移における主要因子の一つである［１］。血管新生プロセスは多くのファクターによって調節されており、その中には血管新生を誘導する因子と血管新生を抑制する因子があり、その結果、血管新生の調節は極めて複雑な動的平衡プロセスである［２］。抗血管新生治療は、血管新生促進因子を遮断する、または血管新生阻害剤を用いて腫瘍中の血管新生を防止することにより、癌の増殖を制御することを意図している。現在、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）など、数多くの血管新生刺激因子が知られており、これらは血管内皮細胞の分裂、分化、および血管形態発生を刺激できる。上記の因子の中でも、ＶＥＧＦはこれまで知られた最も血管新生特異的かつ最も効果的な成長因子である［３，４］。
【０００３】
腫瘍組織の低酸素低環境において、大量のＶＥＧＦが腫瘍細胞により分泌され、これは血管内皮細胞の分裂や遊走を誘導し、最終的に腫瘍血管網を構築する。多くの動物実験により、ＶＥＧＦを抑制することによって血管新生を阻害し、腫瘍の成長を阻害しうることも示されている。このため、ＶＥＧＦおよびその受容体は抗血管新生医薬の重要なターゲットとなった。現在、臨床試験において顕著な有効性を有することが示されている抗血管新生薬としては、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、商品名Ａｖａｓｔｉｎ）が挙げられ、これは直接的にＶＥＧＦを遮断し、腫瘍血管新生を阻害することができる。ベバシズマブは、２００４年にＦＤＡにより販売承認され、結腸直腸癌の第一選択薬としては、血管新生を抑制することにより抗癌作用を発揮する新薬として、最初に販売が開始された。Ａｖａｓｔｉｎはヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体であり、有名な米国のバイオテクノロジー企業であるＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社によって製造されている。大規模な第三相臨床試験において、Ａｖａｓｔｉｎと化学療法との併用療法によって、直腸癌、肺癌、乳癌、腎がんなどを含む多種の癌患者の生存期間を延長しうる［５，６］。Ａｖａｓｔｉｎの臨床での成功は画期的であり、腫瘍血管系をターゲットとした血管新生阻害治療が臨床上有効な手段であり、腫瘍治療のための新しい道を開くことを示している。西洋国家では、Ａｖａｓｔｉｎは既に腫瘍治療において幅広く使われており、現在、全世界において最大のシェアを保持する薬の一つである。
【０００４】
Ａｖａｓｔｉｎのほかにも、抗ＶＥＧＦシグナリングのためのいくつかの薬剤が外国でヒト臨床試験の後期段階にあり、今後数年の間に臨床応用がされることが期待されている。中でも、米国バイオテクノロジー会社であるＲｅｇｅｎｅｒｏｎとサノフィ・アベンティス社が共同で開発したＡｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ（別称ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ）は、現在、大規模第三相臨床試験中である［７］。Ｉｍｃｌｏｎｅ社の抗ＶＥＧＦ受容体ＩＩ（ＶＥＧＦＲ２）モノクローナル抗体治療薬ＩＭＣ−１１２１Ｂも第三相臨床試験にある［８］。中国においては、新薬開発は、現在、やはり抗血管新生をターゲットとした抗腫瘍薬に焦点に当てている。ＶＥＧＦおよびその受容体、またはその他の血管新生ターゲットを用いた薬剤が、いくつかの中国企業または研究開発機構によって開発途上にある。これらの新薬は、間違いなく、癌の治療に新しい選択肢を提供し、患者に新たな希望を与えるであろう。
【０００５】
抗ＶＥＧＦ薬物は腫瘍の臨床治療において著しい進歩を遂げた。但し、臨床試験によって、抗ＶＥＧＦ療法にはかなりの限界があることも示された。癌の治療効果の点では、Ａｖａｓｔｉｎは直腸癌、結腸癌患者の半数生存期間を約３〜４ヵ月延長させることができ［９，１０］、乳癌患者の半数生存期間を約７〜８ヵ月延長させる［１１］。このため、Ａｖａｓｔｉｎは長期的に腫瘍血管成長を有効に抑制できない。抗血管新生方法の臨床治療効果をさらに高めることは、腫瘍研究者らが解決すべき問題であり、次世代血管新生阻害薬の研究開発の主要点となる。
【０００６】
抗ＶＥＧＦ治療の失敗または耐性の出現の主因としては、腫瘍血管新生が数多くの因子によって調節されているでありうる。ＶＥＧＦは血管新生に重要な役割を果たしているが、唯一の血管新生刺激因子とは言えない。同時に、腫瘍細胞の非均質性、腫瘍微環境の複雑さ、および生体の代償性反応機構のため、ＶＥＧＦの活性を長時間抑制する、他の血管新生刺激因子が発現し［１２］、このため腫瘍血管成長はもはやＶＥＧＦシグナル伝達経路に依存しない。カリフォルニア大学サンフランシスコ校のＨａｎａｈａｎ教授のグループにより、膵癌腫瘍への抗ＶＥＧＦＲ２治療中における腫瘍で発現される血管成長因子の変化が研究され、抗ＶＥＧＦ療法中にいくつかの遺伝子の発現が変化し、ここでＦＧＦ−２の発現が顕著に上昇したことが示された。ＦＧＦの発現、特にＦＧＦ−２の発現、が抗ＶＥＧＦ治療に耐性の腫瘍中では著しく増加し、血管新生が再び刺激され、ＦＧＦシグナル経路を遮断した後は腫瘍の再生が抑えられることが示された［１３］。ＦＧＦ−２の過剰発現は、腫瘍が抗ＶＥＧＦ治療を回避する能力に密接に関係することが分かる。このため、ＦＧＦ経路を遮断することにより腫瘍の血管新生は効率的に阻止され、腫瘍成長を抑制することができ、よって血管新生関連疾患を抗ＦＳＦ治療のみで、または抗ＦＧＦ及び抗ＶＥＧＦ治療の組合せ治療により治療することが出来る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）はヘパリン結合性成長因子ファミリーであり、哺乳類動物には２２種類の構成員（ＦＧＦ  １〜１４，  １６〜２３）が存在する。ＦＧＦは、例えば、細胞増殖、分化、転移、血管新生、および腫瘍発生などの多くの生物学機能において重要な役割を果たす。線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）は、線維芽細胞増殖因子の構成員に結合する受容体である。ＦＧＦはＦＧＦＲに結合して、胚発生、発育、脈管形成、血管拡張、神経調節、虚血保護、創傷治癒および腫瘍形成などの生理学的および病理学的過程に重要な役割を果たす下流シグナル伝達経路を刺激することができる［１４，１５］。体内でのＦＧＦ／ＦＧＦＲの過剰発現は、腫瘍（繊維腫、神経膠腫、黒色腫、前立腺腫瘍、リンパ腫、白血病、泌尿器腫瘍など）、骨格系疾患（低身長症（ｄｗａｒｆｉｓｍ）、頭蓋縫合早期癒合症、軟骨無形成症、黒色表皮腫）、および腎不全などを含む、いろいろな病気と密接的な関連があることが示されている［１４〜１９］。ＦＧＦおよびその受容体の発現レベルの上昇は直接に腫瘍細胞の生存と増殖を促進させることができ、ＦＧＦをｓｉＲＮＡで下方制御することにより肝癌細胞の生存が顕著に抑制されることが既に示されている［２２］。このため、ＦＧＦに拮抗する能力を有するＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質を構築することによりＦＧＦ経路を遮断することが期待され、このことはＦＧＦ過剰発現関連疾患を治療する潜在能力を有している。
【０００８】
今まで、臨床試験において、ＦＧＦおよびその受容体を標的とする抗血管新生新薬の研究は少ない。米国Ｆｉｖｅ  Ｐｒｉｍｅ社が開発するＦＰ−１０３９は臨床Ｉ段階におけるボランティア募集中である。ＦＰ−１０３９はヒトＦＧＦＲ１の細胞外ドメイン全体とヒトＩｇＧ１のＦｃフラグメントとが融合して形成された蛋白質である。ＷａｎｇとＯｌｓｅｎの研究によって、ヒトＦＧＦＲ１細胞外ドメインの第一Ｉｇ様ドメインと第二Ｉｇ様ドメインとの間のフラグメントがＦＧＦＲ１とＦＧＦとの結合を抑制できることが明らかになっている［２０，２１］。
【０００９】
このため、ＦＧＦと拮抗可能なＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質の構築により、ＦＧＦ信号伝達が遮断し、これにより血管新生を有効的に抑制しまたは腫瘍細胞に直接的に作用してその成長を抑制することが期待される。このことは、ＦＧＦ過剰発現関連疾患を治療する可能性を有し、腫瘍などの血管新生関連疾患の治療を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
蛋白質の空間構造はその生物学機能に密接的な関係がある。ＦＧＦＲの細胞外ドメインの各Ｉｇ様ドメインおよび連結フラグメントの立体構造の違いは、そのＦＧＦ結合能に直接影響する。遺伝子技術方法を用いて、種々の長さのＦＧＦＲ細胞外ドメインフラグメントと種々の組合せのＩｇＧ  Ｆｃとの融合蛋白質を構築することにより、種々の立体構造の融合蛋白質を形成し、高効率でＦＧＦに結合し且つ生物学的活性を有する融合蛋白質をスクリーニングすることができる。
【００１１】
哺乳類動物には四種類のＦＧＦＲ遺伝子、ｆｇｆＲ１〜ｆｇｆＲ４が存在する。線維芽細胞増殖因子受容体は細胞外ドメイン、細胞膜貫通ドメイン、細胞内ドメインからなる。ＦＧＦＲファミリーには、リガンド結合性およびキナーゼドメインがそれぞれ異なるが、細胞外ドメインは類似する多くの構成員がある。細胞外ドメインは、第一Ｉｇ様ドメイン、第二Ｉｇ様ドメイン、および第三Ｉｇ様ドメインという三つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメインを含む。第一と第二のＩｇ様ドメインの間には配列が含まれ、本発明においては、第一Ｉｇ様ドメインと第二Ｉｇ様ドメインとの間の前記配列をＦＧＦＲのＩｇ様ドメイン中間機能性配列と称する（本明細書においては、単にＩＦＳとも称す）。前記中間機能性配列は、酸性ボックス（ａｃｉｄｉｃ  ｂｏｘ）と呼ばれる一つの酸性アミノ酸モチーフを含んでもよい。
【００１２】
本発明は、ＦＧＦＲのＩｇ様ドメインの中間機能性配列に由来する（本明細書中ではＩＦＳとも称す）部分、ＦＧＦＲの第二Ｉｇドメイン（本明細書中ではＤ２とも称す）、第三Ｉｇ様ドメイン（本明細書中ではＤ３とも称す）、および免疫グロブリンのＦｃ領域を含む、単離された可溶性の線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）融合蛋白質に関する。
【００１３】
本発明は、ＦＧＦＲのＩｇ様ドメイン由来の中間機能性配列部分、ＦＧＦＲの第二Ｉｇ様ドメイン、ＦＧＦＲの第三Ｉｇ様ドメイン、および免疫グロブリンＦｃ領域、を含むあるいはこれらからなる、融合蛋白質に関する。ある実施方案においては、前記ＩＦＳ由来部分は酸性ボックスを含まない。ある別の実施方案においては、前記ＩＦＳ部分は、配列番号１の１３４〜１６２位、１４５〜１６２位、もしくは１５１〜１６２位のアミノ酸配列、または配列番号１の１３４〜１６２位、１４５〜１６２位、１５１〜１６２位のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％（好ましくは少なくとも約９３％、９５％、９７％、９８％、９９％）の同一性を有するアミノ酸配列、を含む。
【００１４】
本発明は、ＦＧＦＲの第一Ｉｇ様ドメイン（本明細書ではＤ１ともいう）もしくはその一部、ＦＧＦＲ  Ｉｇ様ドメイン中間機能性配列領域由来の部分、ＦＧＦＲの第二Ｉｇ様ドメイン、ＦＧＦＲの第三Ｉｇ様ドメイン、および免疫グロブリンＦｃ領域、を含むあるいはこれらからなる融合蛋白質に関する。好ましくは、前記Ｄ１ドメインもしくはその一部は：
【００１５】
配列番号１の４０〜１１８位に対応するアミノ酸配列を有するか、あるいは配列番号１の４０〜１１８位のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を有するか；あるいは
【００１６】
配列番号１の７７〜１１８位に対応するアミノ酸配列を有するか、あるいは配列番号１の７７〜１１８位のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１７】
一態様において、本発明は、ＦＧＦＲのＩｇ様ドメインの中間機能性配列領域もしくはその部分、ＦＧＦＲの第二Ｉｇ様ドメイン、ＦＧＦＲの第三Ｉｇ様ドメイン、および免疫グロブリンのＦｃ領域、を含むあるいはこれらからなる融合蛋白質に関し、ここで、
【００１８】
ＦＧＦＲの第二Ｉｇ様ドメインは配列番号１の１６３〜２４７位に対応するアミノ酸配列を有するか；あるいは、配列番号１の１６３〜２４７位のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を有し；および／または、
【００１９】
ＦＧＦＲの第三Ｉｇ様ドメインは：配列番号１の２７０〜３５９位に対応するアミノ酸配列を有し；あるいは配列番号１の２７０〜３５９位のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００２０】
本発明は、ＦＧＦＲ細胞外ドメイン由来の領域および免疫グロブリンＦｃ領域、を含むあるいはこれらからなる融合蛋白質に関する。前記ＦＧＦＲ細胞外ドメイン由来の領域は：
【００２１】
（１）配列番号９の第３５８〜５８０位、配列番号１０の第３０４〜５２６位、配列番号１１の第２７８〜５００位、配列番号１２の第２４６〜４６８位、配列番号１３の第２３５〜４５７位、配列番号１４の第２２９〜４５１位、および配列番号１５の第２２４〜４４６位のうちいずれか一つが示すアミノ酸配列を有しているか、または配列番号１６の第１０７４〜１７４０位、配列番号１７の第９１２〜１５７８位、配列番号１８の第８３４〜１５００位、配列番号１９の第７３８〜１４０４位、配列番号２０の７０５〜１３７１位、配列番号２１の第６８７〜１３５３位、および配列番号２２の第６７２〜１３３８位のうちいずれか一つに示されるヌクレオチド配列にコードされるか；
【００２２】
（２）配列番号９の第３５８〜５８０位、配列番号１０の第３０４〜５２６位、配列番号１１の第２７８〜５００位、配列番号１２の第２４６〜４６８位、配列番号１３の第２３５〜４５７位、配列番号１４の第２２９〜４５１位、および配列番号１５の第２２４〜４４６位のうちいずれか１つが示すアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくは該アミノ酸配列からなるか；あるいは
【００２３】
（３）配列番号１６の第１０７４〜１７４０位、配列番号１７の第９１２〜１５７８位、配列番号１８の第８３４〜１５００位、配列番号１９の第７３８〜１４０４位、配列番号２０の７０５〜１３７１位、配列番号２１の第６８７〜１３５３位、および配列番号２２の第６７２〜１３３８位のうちいずれか一つに示されるヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むもしくは該アミノ酸配列からなる。
【００２４】
本発明は融合蛋白質に関し、前記融合蛋白質は：
【００２５】
（１）配列番号９〜１５のうちいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含む、または、配列番号１６〜２２のうちいずれか一つに示されるヌクレオチド配列にコードされるか；
【００２６】
（２）配列番号９〜１５のうちいずれか一つに示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくは該アミノ酸配列からなるか、あるいは、
【００２７】
（３）配列番号１６〜２２のうちいずれか一つに示されるヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を含むもしくは該アミノ酸配列からなる。
【００２８】
好ましくは、本発明の融合蛋白質中において、前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒトＩｇＧ１のＦｃ領域であり、より好ましくは：
【００２９】
配列番号７に対応するアミノ酸配列、または配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を有するか；あるいは
【００３０】
配列番号８に対応するヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列、または配列番号８のヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を有する。
【００３１】
本発明の一つの実施方案において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は融合蛋白質のＣ末端に存在している
【００３２】
好ましくは、本発明は、例えばＶＥＧＦＲ１シグナルペプチド領域等の分泌シグナルペプチド領域を含む融合蛋白質前駆体も包含し、好ましくは、前記分泌シグナルペプチド領域は配列番号２の１〜２６位のアミノ酸配列、または配列番号２３のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、を有する。前記シグナルペプチド領域は好ましくは前駆体のＮ末端に存在している。
【００３３】
別の一態様において、本発明は、Ｎ末端からＣ末端へと、ＩＦＲ由来の部分、Ｄ２、Ｄ３、および免疫グロブリンＦｃ領域を順番に含む、融合蛋白質に関する。
【００３４】
さらなる一態様において、本発明の融合蛋白質に含まれるドメインおよび／または領域の間は直接連結および／またはリンカーにより連結されている。ある実施方案において、ＦＧＦＲ細胞外ドメイン由来の領域と免疫グロブリンＦｃ領域とは直接連結されている、もう一つの実施方案において、ＦＧＦＲ細胞外ドメイン由来の領域と免疫グロブリンＦｃ領域由来の領域とはリンカーにより連結されている。
【００３５】
一態様において、本発明の融合蛋白質は血管新生を抑制する。別の一態様において、本発明の融合蛋白質は体内および／または体外でＦＧＦに結合し、好ましくはＦＧＦ２に結合する。さらなる一態様において、本発明の融合蛋白質は直接に腫瘍細胞を抑制する。
【００３６】
本発明は、ＦＧＦＲ細胞外ドメイン由来の部分および免疫グロブリンＦｃ領域由来の部分を含むＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質にも関する。特には、前記ＦＧＦＲ細胞外ドメイン由来の部分はＦＧＦＲ１細胞外ドメイン由来の部分である。好ましくは、前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒト免疫グロブリンＦｃ領域であり、例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域である。本発明の一態様では、本発明のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質はＦＧＦへの結合および／または拮抗能力を有するため、血管新生を抑制する。
【００３７】
本発明のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質において、前記ＦＧＦＲ細胞外ドメイン由来の部分は、Ｄ１ドメインもしくはその一部、ＩＦＳ由来の部分、Ｄ２ドメインもしくはその一部、およびＤ３ドメインもしくはその一部、のうち一つまたは複数を含んでもよい。ある実施方案において、前記ＦＧＦＲ細胞外ドメイン由来の部分は、Ｄ１またはその部分、ＩＦＳ由来の部分、Ｄ２ドメイン、およびＤ３ドメインを含んでもよい。別の一実施方案において、前記ＦＧＦＲ細胞外ドメイン由来の部分は、ＩＦＳ由来の部分、Ｄ２ドメイン、およびＤ３ドメイン、を含んでもよく、好ましくは前記ＩＦＳ由来の部分は、配列番号１の１３４〜１６２位、１４５〜１６２位または１５１〜１６２位に対応するアミノ酸配列を有する。いくつかの好ましい実施方案において、本発明のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質はＤ１またはその一部を含まない。別のいくつかの優れた実施方案において、本発明のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質は、配列番号１の１３４〜１６２位、１４５〜１６２位、または１５１〜１６２位に対応するアミノ酸配列の他にはＩＦＳの部分は含まない、
【００３８】
本発明のいくつかの実施方案において、ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質に含まれるそれぞれのドメインおよび／またはそれぞれのドメインは、Ｎ末端からＣ末端までにおけるその順番は任意でよい。他のいくつかの実施方案において、前記順番は図１に示す順番であってもよい。いくつかの実施方案において、前記順番は図１に示す順番と異なっていてもよい。
【００３９】
いくつかの実施方案において、本発明のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質は一つまたは複数の鎖内ジスルフィド結合を含み、好ましくは、Ｉｇ様ドメインに一つまたは複数の鎖内ジスルフィド結合を含む。
【００４０】
本発明の一態様においては、ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質は哺乳類動物細胞系で配列番号１６〜２２のうちいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む核酸が発現することにより産生できる。好ましくは、前記哺乳類動物細胞系はＣＨＯ細胞系である。
【００４１】
その他に、本発明はＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質も提供する、ここで、前記融合蛋白質に含まれるドメインおよび／またはドメインは、有効に連結され、および／またはリンカーにより連結されている。
【００４２】
別の一態様において、本発明は本発明の融合蛋白質または融合蛋白質の前駆体をコードする単離した核酸分子を提供する。好ましくは、前記核酸分子は配列番号１６〜２２のうちいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む。
【００４３】
さらなる一態様において、本発明は本発明の核酸分子を含むベクターを提供する。
【００４４】
さらに、一態様において、本発明は前記ベクターで形質転換された細胞、好ましくは、ＣＨＯ細胞、を提供する。
【００４５】
本発明は、さらに、医薬的に許容可能なキャリアと混合された、本発明の融合蛋白質を含む組成物も提供する。
【００４６】
本発明は、さらに、本発明の融合蛋白質、核酸分子、ベクターもしくは細胞、及び医薬的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物を提供する。
【００４７】
さらなる一態様において、本発明は、原核細胞または真核細胞中で、特に哺乳類動物細胞系中で、本発明の融合蛋白質を発現させることによる、血管新生抑制性融合蛋白質の製造方法を提供する、
【００４８】
本発明は、哺乳類動物細胞系中で本発明の核酸分子を発現させることによる、血管新生抑制性融合蛋白質の製造方法に関する。好ましくは、前記哺乳類動物細胞系はＣＨＯ細胞系である。
【００４９】
別の一態様において、本発明は、必要対象に、本発明のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質、それをコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、および／または前記のうちいずれか一つを含む医薬組成物を、血管新生抑制有効量投与することを含む、血管新生抑制方法を提供する。好ましくは、前記方法は哺乳類動物で行う。
【００５０】
別の一態様において、本発明は、必要対象に、本発明ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質、それをコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、および／または前記のうちいずれか一つを含む医薬組成物を、治療または予防有効量投与することを含む、哺乳類動物で腫瘍を治療または予防する方法を提供する。好ましくは、前記腫瘍は固形腫瘍である。
【００５１】
別の一態様において、本発明は、必要対象に、本発明のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質、それをコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、および／または前記のうちいずれか一つを含む医薬組成物を、治療または予防有効量投与することを含む、哺乳類動物で眼内血管新生関連疾患を治療または予防する方法を提供する。好ましくは、前記眼内血管新生関連疾患は加齢黄斑変性である。
【００５２】
本発明は、血管新生抑制薬の製造における、本発明のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質、それをコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、および／または前記のうちいずれか一つを含む医薬組成物、の使用にも関する。その他、本発明は、血管新生関連疾患の治療薬もしくは予防薬の製造における、ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質、それをコードする核酸分子、それをコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、および／または前記いずれか一つを含む医薬組成物、の使用に関する。好ましくは、前記血管新生関連疾患は腫瘍または眼の血管新生関連疾患である。
【００５３】
国によって特許制度は保護対象について規定が異なることを考慮し、本明細書に開示された内容はさらに上記の方法に対応する製薬用途および特定用途の薬をも提供する。これら種々の製薬用途および薬物も、それらが本明細書中に具体的に記載されている場合と同様に、本発明の保護範囲に属している。
【００５４】
本明細書の開示は、ただ例を挙げて、保護が請求される対象の一具体的実施方案について説明しているが、その中では一つまたは複数の技術方案に記載された技術的特徴は、任意に一つまたは複数の技術方案と組合せることができ、これら組合せによる技術方案も、それらが本明細書中に具体的に記載されている場合と同様に、本発明の保護範囲に属する。
【００５５】
付属図面と下記のより詳細な説明とを組み合わせて、例を挙げながら本発明を説明する。ただし、下記の説明は、本発明で保護が請求される技術方案の例を挙げて説明したものに過ぎず、何らこれらの技術方案を制限するものではない。本発明の保護範囲は、付属の特許請求の範囲に基づく。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１はＦＧＦＲ１−Ｆｃ融合蛋白質構造図であり、その中で、ＦＧＦＲ１−Ｆｃ融合蛋白質は実線で表され、欠失したアミノ酸は点線で表され、抗体様ドメインは環状線で表され、種々の抗体様ドメインはアルファベット１−３で表され、ジスルフィド結合はｓｓで表され、ヒトＩｇＧ１Ｆｃは灰色ボックスで表され、ＳＰはＶＥＧＦＲ１信号ペプチドを表し、酸性ボクッスはＡＢの文字のボックスで表される。
【図２】図２は種々のＦＧＦＲ１−Ｆｃ融合蛋白質のＦＧＦ−２への結合についての比較図である。ＥＬＩＳＡ法を用いて、２０ｎｇ／ｍＬのそれぞれのＦＧＦＲ１−Ｆｃ融合蛋白質と５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２（１００ｎｇ／ｍＬのヘパリンを含む）または５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２単独との結合状況を計測した。
【図３】図３に２６号ＦＧＦＲ１−Ｆｃ融合蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ図を表す。
【図４】図４に２６号ＦＧＦＲ１−Ｆｃ融合蛋白質勾配のＦＧＦ−２への結合を表す。
【図５】図５に２６号のＦＧＦＲ１−Ｆｃ融合蛋白質のＦＧＦ−２との親合力を表す。
【図６】図６に２６号のＦＧＦＲ１−Ｆｃ融合蛋白質の、ＦＧＦ−２誘導性ＨＵＶＥＣ細胞分裂に対する影響を表す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
定義
特に断りの無い限り、本明細書で用いられる技術用語は当該技術分野の当業者が共通して理解する意味と同じ意味を有する。本分野の定義と科学技術用語に関し、当業者は具体的にはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照できる。アミノ酸残基の略語は、本技術分野で用いられている、２０個の常Ｌ−アミノ酸の一つを表す三文字コードおよび／または１文字コードで表される。
【００５８】
本発明において数値範囲とパラメーター近似値は広い範囲で記載されているが、具体的な実施例に示す数値はできるだけ正確に記載してある。しかし、いかなる数値も元来、それぞれの測定における標準偏差に起因する一定の誤差を含む。また、本明細書に開示される全ての範囲は、その中に含まれる全てかつ任意の部分範囲をも包含することが理解されるべきである。例えば、記載された「１〜１０」の範囲は最小値１と最大値１０の間（端点も含む）に含まれる全てかつ任意の部分範囲をも包含する、つまり、最小１あるいはこれを超える数値から始まる全ての部分範囲、例えば１〜６．１、及び最大１０あるいはこれ未満の数値で終わる全ての部分範囲、例えば５．５〜１０などである。その他、「本明細書に取り込む」と述べられている参考文献は全て、その全体が取り込まれることが理解される。
【００５９】
その他注意すべきこととして、本明細書で用いられている単数の表現は、明瞭かつ明確にその表す対象が一つであると限定されている場合以外は、その表す対象が複数の場合をも含む。前後の文脈からそうでないことが明瞭に示されている場合を除き、「または」の語と「および／または」の語は互換的に使用される。
【００６０】
本明細書で用いられる用語「Ｆｃ」、「Ｆｃ領域」、「Ｆｃフラグメント」または「免疫グロブリンＦｃ領域」などは、免疫グロブリンの結晶化可能なフラグメントを示す。本発明者記載のＦｃ領域は好ましくはヒトＩｇＧ１のＦｃ領域である。
【００６１】
用語「Ｆｃ融合蛋白質」とは、異種蛋白質の結合特異性と免疫グロブリンの定常領域のエフェクター機能が結合した抗体様分子である。構造面では、Ｆｃ融合蛋白質は結合特異性に必要なアミノ酸配列および免疫グロブリンの定常領域配列を含む。Ｆｃ融合蛋白質は通常、受容体またはリガンドの結合部位を含む。前記免疫グロブリン定常領域配列は、任意の免疫グロブリンから得られたものであってよく、その例としては、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３もしくはＩｇＧ−４のサブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭがある。
【００６２】
本明細書で用いられる用語「可溶性」蛋白質とは、生物学的に関係する温度、ｐＨレベルおよび浸透圧下において水溶性の蛋白質である。本明細書に用いられる「可溶性融合蛋白質」は、本融合蛋白質が膜貫通領域や細胞内領域を含まないことを表す。
【００６３】
本明細書で用いられる用語「単離された」とは、下記の物質および／または実体を指す：（１）最初に製造された時（天然環境中および／または試験装置中に存在）およびそれに関連する際に存在する少なくともいくつかの成分から分離されたもの、および／または（２）人工的に生産、調製および／または製造されたもの。単離された物質および／または実体は、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、実質１００％、または１００％の、最初に関連する他成分から分離されたものであってもよい。
【００６４】
用語「部分」および「フラグメント」とは、互換的に、ポリペプチド、核酸またはその他の分子構築物の一部を表す。
【００６５】
本明細書で用いられる用語「Ｉｇ様ドメイン」とは、免疫グロブリン様ドメインを表す。このドメインは、いろいろな蛋白質ファミリーに見られ、細胞−細胞認識、細胞表面受容体、免疫機能などを含む、様々な生物学機能に関与する。
【００６６】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）はヘパリン結合性成長因子ファミリーであり、哺乳類動物には２２種類のファミリーメンバー（ＦＧＦ１〜１４，１６〜２３）が存在する。ＦＧＦは、例えば、細胞の増殖や分化、転移、血管新生および腫瘍発生などの、いろいろな生物学機能を発揮する。ＦＧＦは、細胞表面にあるＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）に結合し活性化することによって、さまざまな生物機能を発揮する。（参考、例えば、Ｅｓｗａｒａｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．  １６：  １３９〜１４９，  ２００５）。線維芽細胞増殖因子受容体（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＦＧＦＲ）は線維芽細胞増殖因子のファミリーメンバーに結合する受容体である。線維芽細胞増殖因子受容体の一部は疾患発生に関与する。哺乳動物には四種類のＦＧＦＲ遺伝子、ｆｇｆＲ１〜ｆｇｆＲ４、が存在する。線維芽細胞増殖因子受容体は細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインからなる。ＦＧＦＲファミリーメンバーには多くの構成員があり、これらはリガンド結合性およびキナーゼドメインが異なるが、類似する細胞外ドメインを有する。細胞外ドメインは  三つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン、つまり第一Ｉｇ様ドメイン、第二Ｉｇ様ドメイン、および第三Ｉｇ様ドメイン、を含む。第一と第二のＩｇ様ドメインの間には、一定の配列が含まれる。本明細書では、第一Ｉｇ様ドメインと第二Ｉｇ様ドメインとの間の前記配列を、ＦＧＦＲのＩｇ様ドメイン中間制御配列と称する。前記中間制御配列は、酸性ボックス（ａｃｉｄｉｃ  ｂｏｘ）と呼ばれる一つの酸性モチーフを含む。
【００６７】
本明細書に用いられている用語「ＦＧＦＲ第一Ｉｇ様ドメイン」または「第一Ｉｇ様ドメイン」とは、ＦＧＦＲ蛋白質のＮ末端から一つ目のＩｇ様ドメインを表し、好ましくは、配列番号１の４０〜１１８位に対応するアミノ酸配列を有する。同様に、「ＦＧＦＲの第二Ｉｇ様ドメイン」または「第二Ｉｇ様ドメイン」は、ＦＧＦＲ蛋白質のＮ末端から二つ目のＩｇ様ドメインを表し、例えば、配列番号１の１６３〜２４７位に対応するアミノ酸配列を有する。用語「ＦＧＦＲの第三Ｉｇ様ドメイン」または「第三Ｉｇ様ドメイン」は、ＦＧＦＲ蛋白質のＮ末端から一つ目のＩｇ様ドメインを表し、例えば配列番号１の２７０〜３５９位に対応するアミノ酸配列を有する。好ましくは、前記ＦＧＦＲはＦＧＦＲ１であり、ＦＧＦＲの第一Ｉｇ様ドメインはＦＧＦＲ１の第一Ｉｇ様ドメインであり、ＦＧＦＲの第二Ｉｇ様ドメインはＦＧＦＲ１の第二Ｉｇ様ドメインであり、ＦＧＦＲの第三Ｉｇ様ドメインはＦＧＦＲ１の第三Ｉｇ様ドメインである。
【００６８】
ｈＦＧＦＲ１の部分配列を以下に示す。影の部分は、各Ｉｇ様ドメインを表す。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＡＡＨ１５０３５．１を参照可能。
【００６９】
【数１】
2014513941.tif 000003
【００７０】
ＦＧＦＲ１のアミノ酸配列は配列番号１に見られ、それをコードするヌクレオチド配列は配列番号４に見られる。
【００７１】
本明細書で用いられる用語「ＦＧＦＲのＩｇ様ドメインの中間機能性配列領域」または「ＦＧＦＲのＩｇ様ドメインの中間機能性配列」または「ＩＦＳ」とは、ＦＧＦＲ蛋白質の第一Ｉｇ様ドメインと第二Ｉｇ様ドメインとの間の配列を表し、好ましくは、ＩＦＳ配列は配列番号１の１１８〜１６２位に対応するアミノ酸配列を有する。本発明者は、予想外に、前記中間機能性配列領域がＩｇ様ドメインの機能に対して著しい影響を有することを見いだした。いくつかの実施方案において、本発明は、長さの異なる複数の前記中間機能性配列領域由来の部分を含むＦＧＦＲ融合蛋白質を提供し、特に好ましくは、前記中間機能性配列領域由来の部分は酸性ボックスを含まない。より好ましくは、前記ＩＦＳ由来部分は、配列番号１の１３４〜１６２位、１４５〜１６２位、または１５１〜１６２位に対応するアミノ酸配列を含む。前記ＦＧＦＲ蛋白質は、好ましくは、ＦＧＦＲ１（配列番号１）であり、特にはヒトＦＧＦＲ１蛋白質である。ヒトＦＧＦＲ１蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号１に見られ、そのｃＤＮＡ配列は配列番号４に見られる。
【００７２】
本明細書で用いられる用語「ＦＧＦＲ」とは、線維芽細胞増殖因子であり、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３および／またはＦＧＦＲ４であってもよい。好ましくは、本発明のＦＧＦＲはＦＧＦＲ１であり、さらに好ましくは、ヒトＦＧＦＲ１である。
【００７３】
本明細書で用いられる用語「縮退変異体」は、前記縮退変異体がアミノ酸コドンの第３番目に縮退変化を含み、この縮退変異体が同じアミノ酸をコードすることを示し、例えば、三文字コドンのウォブル位置（ｗｏｂｂｌｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）は一つまたは複数の改変変異体を含み、これらは同義変異体とも呼ばれる。
【００７４】
本明細書で用いられる用語「対象」とは、哺乳動物を表し、例えば、人類であるが、他の動物、例えば、家庭で飼育される動物（犬、猫など）、家畜（牛、羊、豚、馬など）または実験動物（猿、ラビット、マウス、ウサギ、モルモットなど）を含む。
【００７５】
本明細書で用いられる用語「一致性」、「パーセント一致性」、「ホモロジー」または「同一性」は二つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の間の配列同一性を示す。二つの配列を整列させることによって、パーセント一致性を確認できる。パーセント一致性は、整列させた配列において同じ位置に同じ残基（アミノ酸或はヌクレオチド）が存在する数を指す。配列の整列と比較には、本分野の標準的計算方法（例えば、Ｓｍｉｔｈ  とＷａｔｅｒｍａｎ，  １９８１，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２；  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  と  Ｗｕｎｓｃｈ，  １９７０，  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３；  Ｐｅａｒｓｏｎ  と  Ｌｉｐｍａｎ，  １９８８，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ，  ＵＳＡ，  ８５：２４４４）またはこれらの計算方法のコンピュータ化バージョン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を使用できる。公衆に利用可能な前記コンピュータ化バージョンはＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡである。その他、アメリカ国立衛生研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ）を通じ利用可能なＥＮＴＲＥＺも配列の比較に使用できる。ＢＬＡＳＴとギャプＢＬＡＳＴシステムを使うときは、それぞれのシステムのデフォルト（例えば、ＢＬＡＳＴＮ、国立生物工学情報センターのウェブサイトで使用可能）パラメーターを使用できる。一つの実施方案においては、それぞれのアミノ酸ギャップに対する重み付けが、各アミノ酸に与えられた重みが二つの配列間にある単一のアミノ酸ミスマッチであるかのように見えるよう、ギャップ重みが１のＧＣＧを用いて、二つの配列のパーセンテージ同一性を確認する。あるいは、ＧＣＧ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）配列比較プログラムパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（２．０版）を用いてもよい。
【００７６】
本明細書で用いられる用語「ハイブリダイゼーション」とは、二つの一本鎖ポリヌクレオチドの非共有結合により安定な二本鎖ポリヌクレオチドが形成されることを表す。用語「ハイブリダイゼーション」は三本鎖のハイブリダイゼーションをも指しうる。（普通に）産生された二本鎖のポリヌクレオチドは「ハイブリッド」または「二本鎖」である。「ハイブリダイゼーション条件」は、一般的には、約１Ｍ未満の塩濃度、より一般的には、約５００ｍＭ未満の塩濃度および約２００ｍＭ未満の塩濃度である。ハイブリダイゼーションの温度は５℃という低温でもよいが、一般的には約２２℃より高く、さらに一般的には約３０℃より高く、好ましくは約３７℃より高い。ハイブリダイゼーションは、通常は厳しい条件で（つまり、プローブがその標的配列とハイブリダイズする条件で）行う。厳しいハイブリダイゼーション条件は配列により定まり、異なる状況では差異が存在する。長いフラグメントは特異的ハイブリダイゼーションのためにより高い温度を必要としうる。他のパラメーター（相補鎖の塩基の組成と長さ、有機溶媒の存在、塩基のミスマッチの程度）もハイブリダイゼーションの厳しさに影響を与えうるため、パラメーターの組合せは、いずれか一つのパラメーターの絶対値よりも重要である。一般に、厳しい条件は特定のイオン強度およびｐＨの下での当該配列のＴｍよりも約５℃低く選択される。例示的な厳しい条件は、ｐＨ７．０〜８．３、ナトリウムイオン濃度（または他の塩イオン）０．０１Ｍ〜１Ｍ、および２５℃以上の温度である。厳しい条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ＦｒｉｔｓｃｈｅとＭａｎｉａｔｉｓ．  「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」  第２版  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」  第１版，  ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  （１９９９）が参照可能であり、これらはその全体が、前記のすべての目的で、参照により本明細書に取り込まれる。
【００７７】
本明細書で用いられる用語「リンカー」、「ペプチドリンカー」、「連結配列」または「リンカー配列」とは、本発明の融合蛋白質に含まれている各ドメインおよび／または領域を連結している短いアミノ酸配列を表し、普通は０〜２０個アミノ酸長であり、好ましくは２〜１０個アミノ酸である。
【００７８】
本明細書で用いられる、融合蛋白質、部分またはドメインにおける「配列番号Ｎに対応するアミノ酸配列」の語とは、前記融合蛋白質、部分またはドメインが配列番号Ｎにより実質的に表されるアミノ酸配列を有することを表し、好ましくは、その中に１、２、３、４、５、１０または２０個以下のアミノ酸置換、付加または欠失を含み、更に好ましくは、前記融合蛋白質、部分またはドメインは配列番号Ｎにより表されるアミノ酸配列に対し８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％以上の同一性を有し、より好ましくは前記融合蛋白質、部分またはドメインは配列番号Ｎにより表されるアミノ酸配列を有する。
【００７９】
本明細書で用いられる用語「ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質」とは、ＦＧＦＲ細胞外ドメイン由来の部分と免疫グロブリンＦｃ領域由来の部分とを含む融合蛋白質を表す。ＦＧＦＲ細胞外ドメイン由来の部分は：（１）配列番号９〜１５のうちいずれか一つに示すアミノ酸配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくは該アミノ酸配列からなるか；（２）配列番号１６〜２２のうちいずれか一つに示されるヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むもしくは該アミノ酸配列からなるか；あるいは（３）配列番号９〜１５のうちいずれか一つに示すアミノ酸配列、または配列番号１６〜２２のいずれか一つに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００８０】
いくつかの好ましい実施方案において、前記ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質は、ＦＧＦＲ細胞外ドメイン由来の部分をコードするヌクレオチド配列が、厳しいハイブリダイゼーション条件で配列番号１６〜２２のうちいずれか一つに示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズする配列に相補的な配列を含んでいる、あるいは配列番号１６〜２２のうちいずれか一つに示されるヌクレオチド配列の縮退変異体を含んでいる、ヌクレオチド配列によりコードされていてもよい。いくつかの好ましい実施方案において、免疫グロブリンＦｃ領域の部分をコードするヌクレオチド配列は、厳しいハイブリダイゼーション条件で配列番号８に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする配列に相補的な配列を含む、あるいは配列番号８に示されるヌクレオチド配列の縮退変異体を含む。
【００８１】
いくつかの好ましい実施方案において、前記ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質はＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質変異型を含む。ある実施方案において、前記変異型は配列番号１の１３４〜１６２位、１４５〜１６２位、または１５１〜１６２位に示されるアミノ酸配列に対応するＩＦＳ由来の部分に、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下または１０個以下のアミノ酸置換、付加または欠失変異を含む変異型を包含し、前記変異型は好ましくは血管新生抑制機能を保持している。別の実施方案においては、前記変異型は配列番号１の１６３〜２４７位に示されるアミノ酸配列に対応するＤ２ドメインに２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、１０個以下または２０個以下のアミノ酸置換、付加または欠失変異を含む変異型を包含し、前記変異型は好ましくは血管新生抑制機能を保持している。別の実施方案においては、前記変異型は配列番号１の２７０〜３５９位に示されるアミノ酸配列に対応するＤ３ドメインに２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、１０個以下または２０個以下のアミノ酸置換、付加または欠失変異を含む変異型を包含し、前記変異型は好ましくは血管新生抑制機能を保持している。またある実施方案においては、前記置換、付加または欠失はリンカーまたは連結部分に存在している。
【００８２】
ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質は、ＦＧＦＲ細胞外ドメイン由来の部分または免疫グロブリンＦｃ領域由来の部分における天然修飾以外の、翻訳後修飾部分を含んでもよい。これらの修飾は、アセチル化、カルボキシル化、糖化、リン酸化、エステル化、アシル化を含むが、これらに限定されない。その結果、修飾されたＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質は、例えば、ポリエチレングルコール、脂質、多糖もしくは単糖、またはリン酸などの非アミノ酸成分を含んでいてもよい。これらの非アミノ酸成分のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質機能に対する作用は、本明細書における他のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質変異型について説明したのと同様にテストすることができる。ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質が細胞で産生されるとき、翻訳後修飾は正しいフォールディングおよび／または蛋白質機能にとって重要でありうる。それぞれの細胞（例えば、ＣＨＯ、Ｈｅｌａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ２９３）には、これらの翻訳後修飾活性のための特別な細胞機械と特有の機構が存在し、ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質の正しい修飾とプロセシングを確保するために種々の細胞を選択することができる。
【００８３】
本明細書に記載の融合蛋白質は本分野に知られている方法で生産される。例えば、  化学合成または核酸発現で生産することができる。本分野で知られた確立された標準液体、または好ましくは固相ペプチド合成法により、本発明のペプチドを簡単に調製することができる（例えば、Ｊ．  Ｍ．  ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ．  Ｄ．  Ｙｏｕｎｇ，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  （１９８４）  ，  ｉｎ  Ｍ．  Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ、ならびにＡ．  Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ，    Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８４）を参照）。本分野で既知の技術を使って前記融合蛋白質を生産し、この蛋白質に含まれるポリペプチド配列内のシステイン残基の間に一つまたは複数の分子内架橋を形成させることができる（例えば、米国特許Ｎｏ．５４７８９２５参照）。その他、本明細書に記載の蛋白質に対しては、蛋白質のＣ末端またはＮ末端にシステインまたはビオチンを付加させる通常の修飾を行ってもよい。
【００８４】
本明細書で用いられる「治療有効量」または「有効量」とは、薬物が投与対象に対し有益な効果を発揮するために十分な投与量を指す。実際に投与される量、速度および時間的過程は、治療患者の状態と病気の重篤性により定められる。治療の処方（例えば、薬剤量の決定）は最終的には総合診療医その他の医師の責任によるもので、通常は、医師にとって既知の因子である治療対象の疾病、患者個体の状況、薬物伝達部位、投与方法その他により、決定される。
【００８５】
本発明者は、ＦＧＦと結合可能で、ＦＧＦが誘導する細胞分裂を有効に抑制する、一連の単離可溶性ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質を構築した。前記融合蛋白質は、好ましくは、ＩＦＳ由来の部分、Ｄ２、Ｄ３、および免疫グロブリンＦｃ領域を含む。
【００８６】
本発明者は、意外にも、前記ＩＦＳ由来の部分の長さが前記融合蛋白質とＦＧＦとの結合に顕著に影響を与えることを見いだした。このため、いくつかの実施方案においては、本発明は、種々の長さを有するＩＦＳ由来の部分を含む融合蛋白質を提供する。好ましくは、前記ＩＦＳ由来の部分は酸性ボックスを含まず、より好ましくは、配列番号１の１３４〜１６２位、１４５〜１６２位、または１５１〜１６２位に対応するアミノ酸配列を有する。いくつかの好ましい実施方案において、前記ＩＦＳ由来の部分が配列番号１の１４５〜１６２位に対応するアミノ酸配列を有する融合蛋白質は、とりわけ高いＦＧＦ親和力を有し、ＦＧＦが誘導する細胞分裂を特に効率的に抑制する。
【００８７】
いくつかの実施方案において、本発明は、Ｄ１、ＩＦＳ由来の部分、Ｄ２、Ｄ３、および免疫グロブリンＦｃ領域を含む可溶性ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質を提供する。その中で、好ましくは、前記ＩＦＳ由来の部分は酸性ボックスを含まず、より好ましくは、配列番号１の１３４〜１６２位、１４５〜１６２位、または１５１〜１６２位に対応するアミノ酸配列を有する。
【００８８】
いくつかの実施方案において、本発明は、Ｄ１の一部、ＩＦＳ由来の部分、Ｄ２、Ｄ３、および免疫グロブリンＦｃ領域を含む可溶性ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質を提供する、その中で、好ましくは、前記ＩＦＳ由来の部分は酸性ボックスを含まず、より好ましくは、配列番号１の１３４〜１６２位、１４５〜１６２位、または１５１〜１６２位に対応するアミノ酸配列を有する。
【００８９】
いくつかの実施方案において、本発明は、ＩＦＳ由来の部分、Ｄ２、Ｄ３、および免疫グロブリンＦｃ領域からなる可溶性ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質を提供する、好ましくは、前記ＩＦＳ由来の部分は酸性ボックスを含まず、より好ましくは、配列番号１の１３４〜１６２位、１４５〜１６２位、または１５１〜１６２位に対応するアミノ酸配列を有する。
【００９０】
いくつかの実施方案において、本発明は、Ｎ末端からＣ末端へ順番に、ＩＦＳ由来の部分、Ｄ２、Ｄ３、および免疫グロブリンＦｃ領域からなる可溶性ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質を提供する。その中で、好ましくは、前記ＩＦＳ由来の部分は酸性ボックスを含まず、より好ましくは、配列番号１の１３４〜１６２位、１４５〜１６２位、または１５１〜１６２位に対応するアミノ酸配列を有する。
【００９１】
他のいくつかの実施方案において、本発明は、直接または間接的に腫瘍細胞を抑制するＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質を提供する。好ましくは、本発明のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質は直接的に腫瘍細胞を抑える。より好ましくは、本発明のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質は腫瘍細胞の増殖を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、８０％、９０％、９５％等々抑制する。前記腫瘍細胞はどの種類の腫瘍細胞でもよく、例えば、白血病、肺癌、肝臓癌、頭頸部癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸癌などである。特には、前記抑制は腫瘍細胞に直接結合することによって、実現される。
【００９２】
いくつかの実施方案において、本発明は、（ｉ）ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質または（ｉｉ）該融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドの、血管新生媒介または血管新生関連疾患の治療のための組成物または薬の製造における使用、を含む。例えば、一つの実施方案において、本発明は、（ｉ）ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質または（ｉｉ）該融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドの、血管新生抑制剤としての医薬の製造における使用を包含する。
【００９３】
いくつかの実施方案において、本発明のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質は、哺乳類動物細胞系で配列番号１６〜２２のうちいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を発現させることによって産生される。特には、前記哺乳動物細胞系はＣＨＯ細胞系である。
【００９４】
その他に、本発明は、ＦＧＦＲ細胞外ドメイン由来の部分と免疫グロブリンＦｃ領域とがリンカーによりまたはリンカーによらずに融合された、ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質を提供する。
【００９５】
いくつかの実施方案において、本発明はＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質をコードする単離核酸分子を含む。本発明は、該分子の薬物製造における使用も含む。前記核酸は組み換え体、合成物または本分野において使用可能な任意の方法で生産でき、前記方法には標準的技術を用いたクローニングも含まれる。
【００９６】
いくつかの実施方案において、本発明は、本発明の単離核酸分子を含むベクターを含む。前記ベクターは発現ベクターであってもよく、前記核酸は核酸の宿主細胞中における発現を可能とする調節配列に作動可能に連結している。種々のベクターが使用可能である。例えば、適合ベクターは、ウイルス（例えば、天然痘ウイルス、アデノウイルス、バクロウイルスなど）、酵母ベクター、バクテリオファージ、染色体、人口染色体、プラスミド、コスミドを含む。
【００９７】
いくつかの実施方案において、本発明は、これらのベクターで形質転換され、ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質を発現する細胞も含む。本発明において用いられる宿主細胞は原核細胞または真核細胞であってもよい。それらの宿主細胞には細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母、昆虫細胞、および哺乳類動物細胞が含まれる。使用可能な哺乳類動物細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、サルとヒト細胞系、またはそれらから派生した細胞系などが含まれる。
【００９８】
別の一態様において、本発明は、必要とする対象に、本発明のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質を投与することを含む、血管新生抑制の方法を提供する。好ましくは、前記方法は哺乳類動物で行われる。
【００９９】
別の一態様において、本発明は、ＦＧＦを本発明の融合蛋白質と接触させることを含む、体外または体内でＦＧＦを結合する方法を提供する。
【０１００】
別の一態様において、本発明は、必要とする対象に、本発明のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質を投与することを含む、哺乳類動物において腫瘍を治療または予防する方法を提供する。好ましくは、前記腫瘍は固形腫瘍である。
【０１０１】
別の一態様において、本発明は、必要とする対象に本発明のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質を投与することを含む、哺乳類動物において眼内血管新生関連疾患を治療または予防する方法を提供する。好ましくは、前記眼内血管新生関連疾患は加齢黄斑変性である。
【０１０２】
本発明は、ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質の、血管新生抑制性医薬の製造における使用に関する。その他にも、本発明は、ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質の、血管新生関連疾患の治療と予防のための医薬の製造における使用に関し、好ましくは、前記血管新生関連疾患は腫瘍または眼内血管新生関連疾患である。
【０１０３】
本発明における前記血管新生関連疾患は血管新生依存性腫瘍に限らず、固形腫瘍、造血組織性腫瘍（例えば、白血病）および腫瘍転移；良性腫瘍、例えば、血管腫、聴神経腫（ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｍａ）、神経線維腫（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍａ）、トラコーマ（ｔｒａｃｈｏｍａ）、膿原性肉芽腫（ｐｙｏｇｅｎｉｃ  ｇｒａｎｕｌｏｍａ）、関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）；乾癬（Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）；ルベオーシス（ｒｕｂｅｏｓｉｓ）；遺伝性出血性毛細血管拡張症（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ症候群）、心筋血管新生（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、動脈硬化性粥腫血管新生（ｐｌａｑｕｅ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、毛細血管拡張症（ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、血友病性関節（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａｃ  ｊｏｉｎｔ）、および血管繊維腫（ａｎｇｉｏｆｉｂｒｏｍａ）を含む。
【０１０４】
前記方法のいくつかの実施方案においては、一つまたは複数のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質を一緒に（同時に）または時間をずらして（順次）、投与する。その他、前記融合蛋白質は癌治療または血管新生抑制のための医薬と一緒に投与してもよい。
【０１０５】
いくつかの実施方案において、本開示の主題方法は単独で使用可能である。または、前記主題方法は、増殖性疾患（例えば、腫瘍）の治療または予防のための通常の抗癌治療法と組合せて使用してもよい。例えば、これらの方法は癌予防ならびに癌再発および手術後転移の予防に用いることができ、他の癌治療の補助手段として用いられてもよい。本開示によれば、標的ペプチド治療剤を使うことによって、通常の腫瘍療法（例えば、化学療法、放射線療法、光線療法、免疫療法、および手術）の有効性を増強できる。
【０１０６】
眼内で、血管新生は、例えば、糖尿病網膜症、未熟児網膜症（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ  ｏｆ  ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）、加齢黄斑変性、角膜移植の際の拒絶反応、血管新生緑内障、および後水晶体線維増殖症（ｒｅｔｒｏｌｅｎｔａｌ  ｆｉｂｒｏｐｌａｓｉａ）に関与している。本開示のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合蛋白質は眼内投与またはほかの投与方法によって投与できる。角膜における血管新生に関連する他の疾患には、流行性乾性角結膜炎（ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｋｅｒａｔｏｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ、ＥＫＣ）、ビタミンＡ欠乏症（Ｖｉｔａｍｉｎ  Ａ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、コンタクトレンズオーバー ウエアー（ｃｏｎｔａｃｔ  ｌｅｎｓ  ｏｖｅｒｗｅａｒ）、アトピー性角膜炎（Ａｔｏｐｉｃ  ｋｅｒａｔｉｔｉｓ）、  上位辺縁系角膜炎（ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｌｉｍｂｉｃ  ｋｅｒａｔｉｔｉｓ）、乾燥翼状片角膜炎（ｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｔｉｓ  ｓｉｃｃａ）、シェーグレン症候群  （ｓｊｏｇｒｅｎ）、  酒さ性ざ瘡（ａｃｎｅ  ｒｏｓａｃｅａ）、フリクテン症（ｐｈｙｌｅｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ）、梅毒  （ｓｙｐｈｉｌｉｓ）、マイコバクテリア感染  （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、脂肪変性  （ｌｉｐｉｄ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、化学的熱傷  （ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｕｍ）、細菌性潰瘍  （ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｕｌｃｅｒ）、真菌性潰瘍  （ｆｕｎｇａｌ  ｕｌｃｅｒ）、単純ヘルペス感染  （Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、帯状疱疹感染  （Ｈｅｒｐｅｓ  ｚｏｓｔｅｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、原虫感染  （ｐｒｏｔｏｚｏａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、カポジ肉腫  （Ｋａｐｏｓｉ  ｓａｒｃｏｍａ）、モーレン潰瘍  （Ｍｏｏｒｅｎ  ｕｌｃｅｒ）、テリエン周辺角膜変性症  （Ｔｅｒｒｉｅｎ’ｓ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、辺縁表皮剥離  （ｍａｒｉｇｉｎａｌ  ｋｅｒａｔｏｌｙｓｉｓ）、関節リウマチ、全身性狼瘡  （ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ）、多発性動脈炎  （ｐｏｌｙａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、外傷  （ｔｒａｕｍａ）、ウェジナーサルコイド症  （Ｗｅｇｅｎｅｒｓ  ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ）、強膜炎  （Ｓｃｌｅｒｉｔｉｓ）、スティーブンス・ジョンソン症候群  （Ｓｔｅｖｅｎ′ｓ  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、放射状角膜切開  （ｐｅｒｉｐｈｉｇｏｉｄ  ｒａｄｉａｌ  ｋｅｒａｔｏｔｏｍｙ）および角膜移植片拒絶反応  （ｃｏｍｅａｌ  ｇｒａｐｈ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、鎌状赤血球症（ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｎｅｍｉａ）、サルコイドーシス（ｓａｒｃｏｉｄ）、弾力線維性仮性黄色腫（ｐｓｅｕｄｏｘａｎｔｈｏｍａ  ｅｌａｓｔｉｃｕｍ）、パジェット病（Ｐａｇｅｔｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、静脈閉塞症（ｖｅｉｎ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、動脈閉塞症（ａｒｔｅｒｙ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、頸動脈閉塞症（ｃａｒｏｔｉｄ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｕｖｅｉｔｉｓ／ｖｉｔｒｉｔｉｓ）、分枝杆菌感染（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）、ライム病（Ｌｙｍｅ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｉｓ��、未熟児網膜症（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ  ｏｆ  ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）、イールズ病（Ｅａｌｅｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ベーチェット氏病（Ｂｅｃｈｅｔｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、網膜炎（ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ）または脈絡膜炎（ｃｈｏｒｏｉｄｉｔｉｓ）に至る感染、推定眼ヒストプラズマ症（ｐｒｅｓｕｍｅｄ  ｏｃｕｌａｒ  ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）、ベスト病（Ｂｅｓｔｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、近視（ｍｙｏｐｉａ）、乳頭小窩ピット（ｏｐｔｉｃ  ｐｉｔ）、シュタルガルト病（Ｓｔａｒｇａｒｔｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、扁平部睫状体炎（ｐａｒｓ  ｐｌａｎｉｔｉｓ）、慢性網膜剥離（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ）、過粘着性症候群（ｈｙｐｅｒｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）、トキソプラズマ病（ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）、外傷（ｔｒａｕｍａ）およびレーザー後合併症（ｐｏｓｔ−ｌａｓｅｒ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が含まれるが、これらに限定されない。他の疾病としては、すべての種類の増殖性硝子体網膜症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｖｉｔｒｅｏｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）を含め、隅角血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｇｌｅ）に関係する疾病および繊維血管（ｆｉｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ）または繊維組織（ｆｉｂｒｏｕｓ  ｔｉｓｓｕｅ）によって誘発される異常肥厚化に誘導される疾患があるが、これらに限定されない。
【０１０７】
投与
本発明の融合蛋白質は単独でも使用できるが、好ましくは医薬組成物として用いられ、該医薬組成物は通常、意図された投与計画方式に沿って選択された適切な医薬賦形剤、希釈剤またはキャリアを含む。融合蛋白質は、任意の適切な方法によって、必要とする患者に投与することができる。正確な投与量は、当該融合蛋白質の正確な性質などの数多くの因子により決定される。
【０１０８】
適切な投与経路の中には、経口投与、直腸投与、鼻腔投与、局部投与（口腔内投与および舌下投与を含む）、皮下投与、膣内投与または非経口投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮内投与、くも膜下投与または硬膜外投与を含む）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０９】
静脈および病巣部位に対する注射のためには、活性成分は、発熱性因子を含まず、適当なｐＨ値、等張性および安定性を有する非経口投与上許容できる水溶液の形態にある。
【０１１０】
本分野の当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張賦形剤を用いて、適切な溶液を好ましく調製できる。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤および／またはその他の添加剤を加えてもよい。経口投与の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、粉末剤または経口液などの形態としうる。錠剤は、ゼラチンおよびアジュバントなどの固体キャリアを含んでいてもよい。液体医薬組成物は、通常、水、石油、動物もしくは植物油、鉱油、または合成油などの液体キャリアを含む。また、生理食塩水、ブドウ糖その他の糖溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコール類を含んでいてもよい。
【０１１１】
以上説明した技術と方案の例または本発明に用いられるその他の技術と方案はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’  ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｌｏ，  Ａ．  （ｅｄ）  ，  １９８０．に見いだされる。
【０１１２】
融合蛋白質のクローニングと発現ベクターの構築
ＦＧＦ受容体フラグメントは対応する受容体のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅して得られる。ＩｇＧ１Ｆｃフラグメントはヒト由来のＩｇＧ１のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅して得られる。ＰＣＲプライマーを設計する際、異なるフラグメント間には連結配列を挿入し、これらの異なるフラグメントを最後にオーバーラップＰＣＲで連結させて、それぞれの融合蛋白質のリーディングフレームを形成できる。同時に、ｃＤＮＡの両端にエンドヌクレアーゼＢｓｐＥＩおよびＰｓｔＩのサイトを付加させる。それぞれの融合蛋白質のｃＤＮＡはエンドヌクレアーゼＢｓｐＥＩおよびＰｓｔＩで切断した後、発現プラスミドにクローニングする。クローニングしたプラスミドはエンドヌクレアーゼ消化、電気泳動、そして最後はＤＮＡシークエンシングで確認される。
【０１１３】
融合蛋白質の発現と精製
本発明の融合蛋白質は、本分野で常用されている技術により発現および精製できる。Ｑｉａｇｅｎのプラスミド精製キット（ＭＡＸ）を用いて、前記融合蛋白質プラスミドに対応するＤＮＡを精製し、紫外可視分光光度法でプラスミドＤＮＡの濃度を確認した。ＦＵＧＥＮＥ６リボソーム（Ｒｏｃｈｅ）を用いてプラスミドをＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。具体的な形質転換方法については製品の取扱説明書を参照した。求められる蛋白質発現量が異なるため、本研究では二種類の方法を用いて蛋白質発現を行った：第一の方法は一過性の発現であり、通常、トランスフェクトした４８〜７２時間後に融合蛋白質を含む培養液上清を収穫し、ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡで融合蛋白質の相対含有量を確認し、これにより迅速に効率的に融合蛋白質が得られる；第二の方法では、組み換え蛋白質薬物の発現を用いて、常用のＤＨＦＲ欠陥型ＣＨＯ細胞発現システムを生産し、安定発現細胞系を構築する。その基本的なプロセスは、細胞のトランスフェクション、安定にトランスフェクトした細胞の選択、クローンの選択、ストレスによる増幅、培地とプロセスの最適化などを含み、最終的に無血清培地でのＣＨＯ工程細胞株の大規模懸濁培養を実現する。培養産物を回収し、プロテインＡアフィ二ティーカラムを用いて融合蛋白質を精製した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて、精製した蛋白質を分析し、そして必要な発現産物を含む溶出液を全て合わせて、０．２２μｍ口径のフィルターで濾過し、Ｌｏｗｒｙ法など種々の方法で蛋白質定量を行った。本研究のＣＨＯ細胞培養の体積は１０リットルのバイオリアクターの規模に達し、精製で得られた融合蛋白質は動物試験に必要な蛋白量を満足した。また、将来的に、この精製方法を拡大するための基礎を築いた。
【０１１４】
蛋白質レベルでの、融合蛋白質のＦＧＦに対する中和作用の検証
ＣＨＯ細胞により発現された融合蛋白質を回収した後、本研究においては蛋白質レベルで融合蛋白質のＦＧＦへの結合能について評価した。本研究では、受容体結合実験と親和力実験を検証のために用いた。受容体結合実験の手順は：まず、９６穴ＥＬＩＳＡプレートにＦＧＦ−２をコーティングし、ＢＳＡを用いてコーティングされたウェルをブロッキングし、同濃度の各種融合蛋白質を加え、洗浄後、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ二次抗体をさらに加え、現像した。現像終了後、ＥＬＩＳＡリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、信号の強さによって、ＦＧＦ−２との結合能を有する融合蛋白質をスクリーニングした。親和力実験は溶液系における融合蛋白質のＦＧＦ−２への親和力を決定することを目的として行われた。まず、９６穴ＥＬＩＳＡプレートにＦＧＦ−２捕捉抗体を吸着させ、ウェルをＢＳＡバッファーでブロッキングし、そして、予め調製またはインキュベートした融合蛋白質とＦＧＦ−２との混合液および希釈勾配標準品を添加し、インキュベートし、そしてＨＰＲラベルした検出抗体（遊離ＶＥＧＦまたはＦＧＦ−２を特異的に検出する抗体２を使用）を添加し、現像し、現像後、ＥＬＩＳＡリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定し、融合蛋白質とＦＧＦ−２の混合液における遊離ＦＧＦ−２の相対濃度を検出した。以上の実験によって、ＦＧＦ−２に対する遮断作用を有する融合蛋白質がスクリーニングされた。
【０１１５】
細胞レベルでの、融合蛋白質のＦＧＦに対する中和作用の検証
融合蛋白質のＦＧＦ−２への結合能を蛋白質レベルで確認した後、本研究では融合蛋白質の血管新生に対する抑制作用を細胞レベルで検証した。本研究では、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）分裂試験およびＨＵＶＥＣ細胞遊走試験を用いて、融合蛋白質が血管内皮細胞の分裂力と遊走力を抑制する能力を検証した。融合蛋白質がＨＵＶＥＣ細胞の分裂を抑制する能力は、ＨＵＶＥＣ細胞分裂試験によって測定できる。この実験では、まず、９６穴ＥＬＩＳＡプレートにウェル当たり３０００個のＨＵＶＥＣ細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養し、ＦＧＦ−２および種々の濃度の融合蛋白質とＦＧＦ−２との混合液をそれぞれ加え、３〜４日培養した。次に、１０％のＣＣＫ−８を添加し、２時間培養した後に、ＥＬＩＳＡプレート上で４５０ｎｍの吸光度を測定した。吸光度の差異によって、前記融合蛋白質が有する、ＦＧＦ−２に誘導される血管内皮細胞の分裂を抑制する能力を評価し、ＦＧＦ−２抑制についての融合蛋白質の半数効果濃度が得られた。融合蛋白質がＨＵＶＥＣ細胞の遊走を抑制する能力をＨＵＶＥＣ細胞遊走試験により測定した。この実験では、まず、上室に５００００個のＨＵＶＥＣ細胞と種々の濃度の融合蛋白質とを接種し、下室にＦＧＦ−２含有培養液を６００μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで２０〜２４時間培養し、上室の膜の正面にある細胞を除去し、膜の背面の細胞を固定、染色し、ＰＢＳで洗浄した。そして、倒立顕微鏡で観察、計数した。膜の背面のＨＵＶＥＣ細胞数を計数することによって、ＦＧＦ−２刺激により誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の遊走状況が分かり、培養液に種々の濃度の融合蛋白質を添加することによって、融合蛋白質が血管内皮細胞の遊走を抑制する能力を検証できた。以上の実験によって、本研究で構築される新規融合蛋白質がＦＧＦ−２により誘導される血管内皮細胞の分裂と遊走を抑制する能力を検証した。このことは、次の動物実験のための基礎を築いた。
【０１１６】
腫瘍モデルによる融合蛋白質の腫瘍増殖に対する抑制力の検証
蛋白質レベルと細胞レベルでの実験により、本研究の新規融合蛋白質がＦＧＦ−２信号を遮断する作用を証明した後、本研究では動物腫瘍モデルでその抗腫瘍力を検証した。本研究では、血管新生と腫瘍の治療薬研究で一般的に使用されるモデル、例えば、ＬＬＣマウス肺癌由来腫瘍細胞、Ｕ８７悪性ヒト神経膠芽腫細胞、Ｂ１６黒色腫など、を用いて、融合蛋白質の抗血管新生および抗腫瘍効果を検証した。動物試験では、一般的な対象群の他に、同類薬物対象群、例えばＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、ＦＰ−１０３９、も含み、抗腫瘍力の比較性データを得た。実験中、１００μＬの適切な数の腫瘍細胞を皮下注射でＣ５７マウスの背中後ろの側面に注入し、ノギスで毎週二回、腫瘍の体積を測定した。腫瘍が約２００立方ミリメートルに成長したら、種々の濃度の融合蛋白質を皮下注射し、２〜３週後にマウスを致死させた。ノギスで腫瘍の体積を測定し、腫瘍の大きさによって融合蛋白質の抗腫瘍作用を検証した。さらに、免疫組織化学などの手法を用いて各腫瘍組織を分析し、血管新生の調節機構を探索した。
【実施例】
【０１１７】
実施例１：ＦＧＦＲ１−Ｆｃ融合蛋白質の組み換えプラスミドの構築
ＦＧＦ受容体フラグメントは、ＰＣＲによってＦＧＦ受容体のｃＤＮＡテンプレートを増幅することで、ＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントは、ＰＣＲによってヒトＩｇＧ１のｃＤＮＡを増幅することで得られる。市販のｃＤＮＡ（ＰＣＲ  Ｒｅａｄｙ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ、  成人結腸癌組織由来、ＢｉｏＣｈａｉｎ社）をＦＧＦＲ１フラグメントのテンプレートとした。ヒト血液ＲＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて健康人の血液からトータルＲＮＡを抽出した。逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の取扱説明を参照して、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、得られたｃＤＮＡをＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントのテンプレートとした。逆転写キットの取扱説明に従って、ＲＴ−ＰＣＲを行った。具体的な手順は：オリゴｄＴ、ｄＮＴＰ、トータルＲＮＡおよびＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏを均一に混合し、７０℃で１０分間反応させ、氷上に５分間置いて、ＲＮａｓｅ阻害剤を添加し、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素および反応バッファーを添加し、４２℃で１時間反応させ、次に７０℃で１５分間反応させ、得られたｃＤＮＡをテンプレートとして用いた。
【０１１８】
成人結腸癌組織由来ｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲによって種々のＦＧＦＲ１フラグメントを各々増幅し（プライマーは下記の表１に記載）、ヒト血液ｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲによって、ＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントを増幅した（プライマーは下記の表１及び表２に記載）。ＰＣＲの反応条件は：９８℃で５分間予備変性、９８℃で３０秒変性、次に５６℃で４５秒アニーリング、そして７２℃で２分間伸長し、このサイクルを３０回行い、最後に１０分間伸長反応するというものであった。ＰＣＲプライマーを設計する際、ＦＧＦＲ１フラグメントとＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントの間に２０個またはそれ以上の数の相補的塩基対を連結配列として導入し、ＦＧＦＲ１フラグメントとＩｇＧ１  ＦｃフラグメントをオーバーラップＰＣＲで繋いで、それぞれの融合蛋白質のリーディングフレームを形成し、同時に、ＰＣＲ産物の両端にＢｓｐＥ  ＩとＰｓｔ  Ｉの制限酵素サイトを添加した。
【０１１９】
その後、オーバーラップＰＣＲを行い、増幅によって各ＦＧＦＲ１−Ｆｃ融合蛋白質フラグメントを得た。オーバーラップＰＣＲの反応条件は、２つのラウンドに分かれ、第１のラウンドでは、連結されるフラグメントは含まれるが、プライマーは含まれず、条件は：９８℃で５分間予備変性、９８℃で３０秒変性、次に５６℃で４５秒アニーリング、そして７２℃で５分間伸長し、このサイクルを６回行い、最後に７２℃でさらに１０分間伸長するというものであった。次に、両端用のプライマーを添加して、第２ラウンドのＰＣＲを行った。反応条件は：９８℃で５分間予備変性し、９８℃で３０秒変性し、次に５６℃で４５秒アニーリングし、そして７２℃で２分間伸長し、このサイクルを３０回行い、最後に７２℃で１０分間伸長するというものであった。これにより、それぞれの融合蛋白質のリーディングフレームを形成し、同時に、ｃＤＮＡの両端にＢｓｐＥ  ＩとＰｓｔ  Ｉヌクレアーゼサイトを添加した。
【０１２０】
増幅の後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＬＡＧＥＮ社）を用いて、ＰＣＲで増幅されたフラグメントを精製した。それぞれの融合蛋白質のｃＤＮＡおよび真核発現プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ）を、それぞれ、ＢｓｐＥ  ＩおよびＰｓｔ  Ｉで消化した。９０Ｖの電圧下で、１％アガロースゲル電気泳動を行い、ＱＬＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＬＡＧＥＮ社）を用いて目的フラグメントを回収し、１６℃で１時間リガーゼ（ＮＥＢ社）によるライゲーションを行った。ライゲーション反応の混合物を、大腸菌Ｔｏｐ１０コンピテントセルにトランスフォームし、ここでトランスフォーメーションの条件は：４２℃で９０秒反応させ、３分間氷上に置き、無菌で抗体を含有しないＬＢ培養液を添加し、３７℃で２５０回転／分の培養シェーカーで１時間培養した。次に、アンピシリン添加ＬＢプレートに塗布し、３７℃のインキュベーターで一晩培養した。単一コロニーを採取し、アンピシリン含有のＬＢ培養液に添加し、２５０回転／分のシェーカーで３７℃で一晩培養し、アルカリ溶菌法によってプラスミドを抽出した。制限エンドヌクレアーゼを使用して消化し、９０Ｖの電圧で１％アガロースゲル電気泳動で検定し、エンドヌクレアーゼ消化結果が正しい組み換えプラスミドは、ＤＮＡシークエンシングで確認した。以上の手順によって、ＦＧＦＲ１−Ｆｃ融合蛋白質の発現プラスミド１９＃、１３＃、２２＃、２３＃、２６＃、２９＃および８＃を構築した。それぞれの融合蛋白質について、ＦＧＦＲ１−Ｆｃの蛋白質配列およびそれをコードするヌクレオチド配列を表３に示した。融合蛋白質の構造図は図１に見られる。
【０１２１】
【表１】
2014513941.tif 000004
【０１２２】
【表２】
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【０１２３】
【表３】
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【０１２４】
実施例２：融合蛋白質の一過性発現および定量
ＭＡＸプラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、当該融合蛋白質プラスミドのＤＮＡを精製した。紫外・可視吸光光度法によってプラスミドＤＮＡの濃度を確認し、組換えプラスミド１μｇとリポソーム６μＬ（ＦｕＧＥＮＥ  ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ，  Ｒｏｃｈｅ社）を１００μＬの新鮮ＩＭＤＭ培養液（ＧＩＢＣＯ社）に均一に混合した。１５分間放置した後、３×１０５／ｍＬの細胞密度で６穴プレートに接種しオーバーナイト培養したＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ）に前記混合液を添加した。１０％のＦＢＳ、１％のＨＴおよび１％のグルタミンを含むＩＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社商品）である細胞完全培養液で、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで４８時間培養した。次に、上清液を回収し、ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ蛋白質定量キット（ＢＥＴＨＹＬ社）を用いて、ＣＨＯ細胞が分泌した発現融合蛋白質の相対含有量を決定した。具体的な手順は以下の通りであった：アフィニティー精製された１００μＬの１０μｇ／ｍＬ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ蛋白質を９６穴ＥＬＩＳＡプレート（ＩＭＭＵＬＯＮ社）にコーティングし、一晩経過し、３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液を用いて五回洗浄した。次に、２００μｌの新たに調製したブロッキング溶液（ＫＰＬ社、ブロッキング原液：ＰＢＳ＝１：１９）で各ウェルをブロッキングし、３７℃で１時間インキュベートした。３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液を用いて５回洗浄した後、標準としての勾配希釈されたＩｇＧ溶液（起点は２００ｎｇ／ｍＬ、ＰＢＳを用いて２倍ずつ希釈）１００μＬおよび勾配希釈された各融合蛋白質の培養上清（起点は各培養上清の濃度、ＰＢＳで５倍ずつ希釈）を各ウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で五回洗浄した後、ＰＢＳで１：１００００希釈された抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ二次抗体（ＢＥＴＨＹＬ社）１００μＬを添加した、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、１００μＬの現像液（ＫＰＬ社）で現像し、最後に、１００μＬ停止液（ＫＰＬ社）を添加して現像を停止させ、そしてＥＬＩＳＡプレートの４５０ｎｍの波長での吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで測定した。標準曲線から、種々の融合蛋白質の濃度が分かる。
【０１２５】
実施例３：融合蛋白質の結合実験
ＥＬＩＳＡ法を用いて、上記のとおり構築した融合蛋白質１９＃、１３＃、２２＃、２３＃、２６＃、２９＃および８＃のＦＧＦ−２への結合能を測定した。まず、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（ＩＭＭＵLＬＯＮ社）に、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を含有し、１００ｎｇ／ｍＬのヘパリン（Ｓｉｇｍａ社）および５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２を含有する溶液を１００μＬそれぞれコーティングし、そして３００  μＬのＰＢＳＴ洗浄液で五回洗浄し、コーティングされた各ウェルを２００μＬの新たに調製したブロッキング溶液（ＫＰＬ社）（ブロッキング原液：ＰＢＳ＝１：１９）を用いてブロッキングし、３７℃で１時間インキュベートし、３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で五回洗浄し、濃度２０ｎｇ／ｍＬの各融合蛋白質（ＰＢＳに溶解、ｐＨ＝７．２）を１００μＬ加え、３７℃で２時間インキュベートし、３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で五回洗浄した。次に、ＰＢＳで１：１００００希釈された抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ二次抗体（ＢＥＴＨＹＬ社）１００μＬを添加し、３７℃で１時間インキュベートし、３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で五回洗浄した。次に、１００μＬの現像液（ＫＰＬ社）を加えて、遮光下室温で発色するまで現像し（約１５分）、最後に１００μＬの停止液（ＫＰＬ社）を添加して現像を停止させた。そして、ＥＬＩＳＡプレートの波長４５０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで測定した。融合蛋白質のＦＧＦ−２への結合能が強いほど、吸光度が高くなり、シグナルが強くなる。シグナルの強さに基づいて、融合蛋白質２６＃がＦＧＦ−２に対する結合性が最も高いことが分かった。種々の融合蛋白質のＦＧＦ−２結合能の比較が図２に示されている。図２から、本発明で構築された融合蛋白質１９＃、１３＃、２２＃、２３＃、２６＃および２９＃はヘパリンが存在する場合、ＦＧＦへ結合するがその程度はそれぞれ異なり、特に、２３＃、２６＃および２９＃の結合の程度は対照よりはるかに高く、また１９＃、１３＃、および２２＃に比べても高かった。このことから、酸性ボックスを含まない本発明の融合蛋白質が優れる効果を有することが分かる。中でも、２６＃は特段に高い結合能を示し、このことは本発明の融合蛋白質が特定の長さを有するＦＧＦＲ  Ｉｇ様ドメイン中間機能性配列由来の部分を含む場合に、より顕著に良好な結合効果を有することを示している。
【０１２６】
実施例４：融合蛋白質の安定発現と精製
ＦＧＦ−２と高効率の結合能を有する融合蛋白質＃２６の組み換え発現プラスミドをリボソーム（Ｒｏｃｈｅ社）により、ＤＨＦＲ欠陥型ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクトした。具体的には、組み換えプラスミド５μｇおよび３０μＬのリボソーム（ＦｕＧＥＮＥ  ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｒｏｃｈｅ社）を１００  μＬの新鮮なＩＭＤＭ培養液（ＧＩＢＣＯ社）に均一に混合し、１５分放置した。次に、３×１０５／ｍＬの細胞密度で１０ｃｍ細胞培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に接種後一晩培養したＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ）に前記混合物を接種し、１０％のＦＢＳ、１％のＨＴ、および１％のグルタミンをＩＭＤＭ培地（全てＧＩＢＣＯ社から入手）に含む細胞完全培養液を用いて３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで２〜３日培養し、トリプシン（ＧＩＢＣＯ社）で細胞を消化し、３×１０５／ｍＬ細胞密度で３０ｍＬの無血清３０２培地（ＳＡＦＣ社）の入ったフラスコに接種し、１００回転／分、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで１０６／ｍＬの細胞密度まで培養した。３０００個の細胞を１０ｃｍ細胞培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に接種し（培養液は、ＩＭＤＭ培地中、１０％のＦＢＳおよび１％グルタミンを含有する）、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養し、モノクローンを形成した。モノクローンを選択肢、９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）で培養し、ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ蛋白定量キット（ＢＥＴＨＹＬ社）を用いて、それぞれのモノクローンが発現および分泌した融合蛋白質の相対含有量を確認した。その具体的な条件と手順は、実施例２における融合蛋白質の相対含有量の測定の場合と同じとした。一番高い発現量のクローンをスクリーニングし、６穴プレートに移してコンフルエンス率７０％程度まで培養した。トリプシンで細胞を消化し、１０ｃｍ培養皿に移して培養し、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ，  ＭＴＸ）（Ｓｉｇｍａ社）を添加し、徐々にストレスを増加させた（ＭＴＸ濃度は、１０ｎＭ、２０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、および５００ｎＭ）。ストレスを増加した後、トリプシンで細胞を消化し、３×１０５／ｍＬで振とうフラスコ培養し、単一細胞の発現レベルを測定し、特定の融合蛋白質を発現する改変ＣＨＯ細胞株が得られた。最後に、改変ＣＨＯ細胞株の大規模懸濁培養（体積１０Ｌ）を、３７℃、５％ＣＯ２、４０％溶存酸素、８０回転／分でｐＨ７．０の無血清３０２培地（ＳＡＦＣ社）中で行い、遠心で培養産物を回収し、上清液を取って０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で濾過した。次に、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー（ＧＥ社）の取扱説明書に従って、アフィニティークロマトグラフィーを行った。具体的には、まず、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ：７．０）でＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティーカラムを平衡化し、上清をカラムにロードし、ＰＢＳバッファーで平衡化し、最後にクエン酸バッファー（ｐＨ：３．０）で溶出し、溶出液を回収して０．４５μｍフィルターで濾過した。Ｓ／Ｄ（０．３％リン酸トリプチル／１％Ｔｗｅｅｎ８０）を添加して２４℃で６時間放置してウィルスを不活性化した。そして、分子篩を用いて、��的蛋白を精製した。これには、まず、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの溶出液を透析袋（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に入れてＰＢＳバッファーで透析し、次に１０ＫＤ限外ろ過カップ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒａ社）に入れ蛋白質を濃縮し；限外ろ過カップで濃縮された液体を、ＰＢＳバッファーで平衡化された分子篩クロマトグラフィーカラムＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＣＥ社）にロードし、そして、ＰＢＳバッファーで溶出し、溶出ピークを回収した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて、精製蛋白質を分析した（図３）。次に、必要な発現産物を含有する溶出液を一緒にして、０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で濾過した後、Ｌｏｗｒｙ法など種々の方法で蛋白定量を行った。
【０１２７】
実施例５：融合蛋白質の勾配結合実験
実施例３と同様に、ＥＬＩＳＡ法を用いて、上記のとおり構築した融合蛋白質のＦＧＦ−２への結合能を測定した。まず、９６穴ＥＬＩＳＡプレートに５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を含有する溶液を１００μＬのコーティングした。そして、３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で五回洗浄し、コーティングされた各ウェルを２００μＬの新たに調製したブロッキング溶液（ＫＰＬ社）（ブロッキング原液：ＰＢＳ＝１：１９）を用いてブロッキングし、３７℃で１時間インキュベートした。３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で五回洗浄し、種々の融合蛋白質を種々の濃度で含む溶液（当初の蛋白質の含有量は１６０００ｐＭ；３倍希釈）を１００μＬ加え、３７℃で２時間インキュベートした。３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で五回洗浄し、ＰＢＳで１：１００００の比で希釈された抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＰＲ二次抗体（ＢＥＴＨＹＬ社）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で五回洗浄した後、１００μＬの現像液（ＫＰＬ社）で現像し、最後に、１００μＬの停止液（ＫＰＬ社）を添加して現像を停止させた。そして、ＥＬＩＳＡプレートの波長４５０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定した。信号の強さによって、融合蛋白質のＦＧＦ−２への結合能勾配を確認した。上記の実験操作における具体的な条件および工程は図３に見られる。融合蛋白質２６＃のＦＧＦ−２への結合勾配は、図４で比較されている。融合蛋白質２６＃のＦＧＦ−２への結合能は量に依存することが分かる。本実施例から、波長４５０ｎｍにおけるシグナルがより強いことから示されるように、融合蛋白質２６＃のモル濃度が上昇するとＦＧＦ−２への結合能が上昇することが示唆される。また、融合蛋白質２６＃のモル濃度を勾配を付けて減少すると共に、ＦＧＦ−２への結合能も減少する。
【０１２８】
実施例６：融合蛋白質の親和力実験
親和力実験を用いて、溶液系における融合蛋白質のＦＧＦ−２への親和力を測定した。まず、９６穴ＥＬＩＳＡプレートに２．０μｇ／ｍＬのＦＧＦ−２キャプチャー抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を１００μＬコーティングした。３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で五回洗浄した後、被覆されたウェルをブロッキング溶液（ＫＰＬ社）を用いてブロッキングし（実施例３を参照）、３７℃で１時間インキュベートし、３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で五回洗浄した。次に、予め調製およびインキュベート（４℃で一晩）した融合蛋白質とＦＧＦ−２の混合液および勾配希釈の標準品（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を加えた。具体的な調製方法は以下のとおりである。融合蛋白質２６＃の開始濃度は４００ｐＭ（ＰＢＳに溶かす）であり、２倍ずつ希釈され、融合蛋白質の溶液は２０ｐＭのＦＧＦ−２溶液（ＰＢＳに溶解）と１：１混合され、つまり調製された混合溶液中における各蛋白質の起点の最終濃度は２００ｐＭであり、ＦＧＦ−２の最終濃度は１０ｐＭであった。３７℃で２時間インキュベートし、３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で五回洗浄し、そして１００μＬのＦＧＦ−２検出抗体溶液（２５０ｎｇ／ｍＬ）を添加した（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＦＧＦ−２抗体を特異的に検出可能）。３７℃で２時間インキュベートし、３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で５回洗浄し、次にＨＲＰラベルされたストレプトアビジン（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を添加した（ＰＢＳで１：２００に希釈）。３７℃で２時間インキュベートし、３００μＬのＰＢＳＴ洗浄液で５回洗浄し、そして１００μＬの現像液（ＫＰＬ）を添加してウェルを暗所下室温で適切な時間、現像した（約１５〜３０分）。最後に１００μＬの停止液（ＫＰＬ社）を加えて現像を停止させ、そしてＥＬＩＳＡプレートの波長４５０ｎｍにおける吸収をＥＬＩＳＡリーダーで測定した。融合蛋白質とＦＧＦ−２との混合液中における遊離のＦＧＦ−２の相対濃度を決定した。溶液系における融合蛋白質２６＃とＦＧＦ−２との間の親和性は、図５に示される。本実施例に示されるように、融合蛋白質２６＃は溶液系でＦＧＦ−２に対する高い親和性を有する。融合蛋白質の濃度を上昇させると遊離のＦＧＦ−２の量が減少したことから分かるように、濃度が上昇するにつれて親和性も上昇した。溶液系における融合蛋白質２６＃とＦＧＦ−２との間の親和性は、図５に示される。本実施例に示されるとおり、融合蛋白質２６＃は溶液系においてＦＧＦ−２に対する親和性を有する。遊離のＦＧＦ−２の量が減少したことから分かるように、濃度が上昇するとこの親和性も上昇した。
【０１２９】
実施例７：ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の分裂抑制試験
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）分裂試験により、融合蛋白質が血管内泌細胞の分裂を阻害する能力を測定した。ＨＵＶＥＣ完全培養地（ＡｌｌＣｅｌｌｓ社）を用いて、ＨＵＶＥＣ細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ社）を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで細胞対数増殖期に達するまで培養した。トリプシンで消化し、ＨＵＶＥＣ細胞をカウントした。ＨＵＶＥＣ細胞を３０００個／穴で９６穴プレート中の１％ＦＢＳ含有ＨＵＶＥＣ基本培地（ＡｌｌｅＣｅｌｌｓ社）に接種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで一晩培養した。１％ＦＢＳ含有ＨＵＶＥＣ基本培地で希釈された１００μＬのＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社）溶液（終濃度は５ｎｇ／ｍＬ）、および種々の量の融合蛋白質２６＃とＦＧＦ−２との混合液１００μＬ（融合蛋白質の終濃度は４０ｐＭ、１％ＦＢＳ含有ＨＵＶＥＣ基本培地で１０倍希釈、ＦＧＦ−２の終濃度は５ｎｇ／ｍＬ）を添加し、さらに３〜４日培養した。培地を取り、１０％ＣＣＫ−８試薬（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を含有する培地を添加してさらに２時間培養し、９６穴プレートの波長４５０ｎｍにおける吸光度を直接ＥＬＩＳＡリーダーで測定した。吸光度の差異によって、融合蛋白質がＦＧＦ−２に誘導される血管内皮細胞の分裂を抑制する能力を決定した。ＦＧＦ−２に誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の分裂に対する融合蛋白質の影響は図６に示される。本実施例に示されるとおり、融合蛋白質２６＃は細胞レベルで生物学活性と機能を有し、ＦＧＦ−２に誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の分裂を抑制することができ、ＦＧＦ−２への結合能を有する。この結合能は、ＦＧＦ−２に誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の分裂が抑制されることから分かるように、融合蛋白質２６＃のモル濃度の増加に伴い上昇する。
【０１３０】
本発明を、具体例（実施例）によって説明した。但し、本分野における当業者は、本発明が各々の具体的な実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲内において当業者が種々の修正や変更を行うことが可能で、本発明の精神と範囲から外れることなく、本明細書に記載の各技術的特徴を組み合わせることが可能であることを理解する。そのような修正および変更もまた、本発明の範囲内である。
【０１３１】
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［５］  Ｊｅｎａｂ−Ｗｏｌｃｏｔｔ  Ｊ，  Ｇｉａｎｔｏｎｉｏ  ＢＪ．  Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ：  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２００９，  ９（４）：５０７−１７．
［６］  Ｓｕｍｍｅｒｓ  Ｊ，  Ｃｏｈｅｎ  ＭＨ，  Ｋｅｅｇａｎ  Ｐ，  Ｐａｚｄｕｒ  Ｒ．  ＦＤＡ  ｄｒｕｇ  ａｐｐｒｏｖａｌ  ｓｕｍｍａｒｙ：  ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ  ｐｌｕｓ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｆｏｒ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ．  ２０１０，  １５（１）：１０４−１１．
［７］  Ｈｓｕ  ＪＹ，  Ｗａｋｅｌｅｅ  ＨＡ．  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  ＢｉｏＤｒｕｇｓ．  ２００９，  ２３（５）：２８９−３０４．
［８］  Ｋｒｕｐｉｔｓｋａｙａ  Ｙ，  Ｗａｋｅｌｅｅ  ＨＡ．  Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ，  ａ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ｍＡｂ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ＶＥＧＦＲ−２  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ．  ２００９，  １０（６）：５９７−６０５．
［９］  Ｈｕｒｗｉｔｚ  Ｈ，  Ｆｅｈｒｅｎｂａｃｈｅｒ  Ｌ，  Ｎｏｖｏｔｎｙ  Ｗ，  Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ  Ｔ，  Ｈａｉｎｓｗｏｒｔｈ  Ｊ，  Ｈｅｉｍ  Ｗ，  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｊ，  Ｂａｒｏｎ  Ａ，  Ｇｒｉｆｆｉｎｇ  Ｓ，  Ｈｏｌｍｇｒｅｎ  Ｅ，  Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ，  Ｆｙｆｅ  Ｇ，  Ｒｏｇｅｒｓ  Ｂ，  Ｒｏｓｓ  Ｒ，  Ｋａｂｂｉｎａｖａｒ  Ｆ．  Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ  ｐｌｕｓ  ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ，  ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ，  ａｎｄ  ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２００４，  ３５０（２３）：２３３５−４２．
［１０］  Ｓａｎｄｌｅｒ  Ａ，  Ｇｒａｙ  Ｒ，  Ｐｅｒｒｙ  ＭＣ，  Ｂｒａｈｍｅｒ  Ｊ，  Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  ＪＨ，  Ｄｏｗｌａｔｉ  Ａ，  Ｌｉｌｅｎｂａｕｍ  Ｒ，  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＤＨ．  Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ−ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ  ａｌｏｎｅ  ｏｒ  ｗｉｔｈ  ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ  ｆｏｒ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２００６，  ３５５（２４）：２５４２−５０．
［１１］  Ｊｅｎａｂ−Ｗｏｌｃｏｔｔ  Ｊ，  Ｇｉａｎｔｏｎｉｏ  ＢＪ．  Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ：  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ，  ２００９，  ９（４）：５０７−１７．
［１２］  Ｄｏｒｒｅｌｌ  ＭＩ，  Ａｇｕｉｌａｒ  Ｅ，  Ｓｃｈｅｐｐｋｅ  Ｌ，  Ｂａｒｎｅｔｔ  ＦＨ，  Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ  Ｍ．  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｏｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００７，  １０４（３）：９６７−７２．
［１３］  Ｃａｓａｎｏｖａｓ  Ｏ，  Ｈｉｃｋｌｉｎ  ＤＪ，  Ｂｅｒｇｅｒｓ  Ｇ，  Ｈａｎａｈａｎ  Ｄ．  Ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｂｙ  ｅｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＶＥＧＦ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｌａｔｅ−ｓｔａｇｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．  ２００５，  ８（４）：２９９−３０９．
［１４］  Ａ  Ｂｅｅｎｋｅｎ，  Ｍ  Ｍｏｈａｍｍａｄｉ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．，  ２００９，  ８（３）：  ２３５〜５３．
［１５］  Ｍ  Ｍｏｈａｍｍａｄｉ，  Ｓ  Ｋ  Ｏｌｓｅｎ，  Ｏ  Ａ  Ｉｂｒａｈｉｍｉ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，  ２００５，  １６：  １０７〜１３７．
［１６］  Ｍ  Ｐｒｅｓｔａ，  Ｐ  Ｄ  Ｅｒａ，  Ｓ  Ｍｉｔｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，  ２００５，  １６（２）：  １５９〜１７８．
［１７］  Ｒ  Ｇｒｏｓｅ，  Ｃ  Ｄｉｃｋｓｏｎ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，  ２００５，  １６（２）：  １７９〜１８６．
［１８］  Ｙ  Ｈ  Ｃａｏ，  Ｒ  Ｈ  Ｃａｏ，  Ｅ  Ｍ  Ｈｅｄｌｕｎｄ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．，  ２００８，  ８６（７）：  ７８５〜７８９．
［１９］  Ｍ  Ｊ  Ｃｒｏｓｓ，  Ｌ  Ｃ  Ｗｅｌｓｈ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．，  ２００１，  ２２（４）：  ２０１〜２０７．
［２０］  Ｗａｎｇ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９９５，  ２７０：１０２３１−１０２３５
［２１］Ｏｌｓｅｎ  ＳＫ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００４，  １０１：９３５−９４０
［２２］Ｇａｕｇｌｈｏｆｅｒ  Ｃ，  Ｓａｇｍｅｉｓｔｅｒ  Ｓ，  Ｓｃｈｒｏｔｔｍａｉｅｒ  Ｗ，  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｃ，  Ｒｏｄｇａｒｋｉａ−Ｄａｒａ  Ｃ，  Ｍｏｈｒ  Ｔ，  Ｓｔaｔｔｎｅｒ  Ｓ，  Ｂｉｃｈｌｅｒ  Ｃ，  Ｋａｎｄｉｏｌｅｒ  Ｄ，  Ｗｒｂａ  Ｆ，  Ｓｃｈｕｌｔｅ−Ｈｅｒｍａｎｎ  Ｒ，  Ｈｏｌｚｍａｎｎ  Ｋ，  Ｇｒｕｓｃｈ  Ｍ，  Ｍａｒｉａｎ  Ｂ，  Ｂｅｒｇｅｒ  Ｗ，  Ｇｒａｓｌ−Ｋｒａｕｐｐ  Ｂ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．  ２０１１  Ｍａｒ；５３（３）：８５４−６４．
【図１】
2014513941.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年10月18日(2013.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦＲのＩｇ様ドメインの中間機能性配列（ＩＦＳ）由来の部分と、ＦＧＦＲの第二Ｉｇドメイン（Ｄ２）と、ＦＧＦＲの第三Ｉｇ様ドメイン（Ｄ３）と、免疫グロブリンのＦｃ領域とを含む、単離された可溶性の線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）融合蛋白質。
【請求項２】
体内および／または体外で線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）に結合する、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項３】
前記ＩＦＳ由来の部分が酸性ボックス（ＡＢ）を含みまたは含まず、請求項１または請求項２に記載の融合蛋白質。
【請求項４】
前記ＩＦＳ由来の部分は、配列番号１の１３４〜１６２位、１４５〜１６２位、または１５１〜１６２位のアミノ酸配列を有している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項５】
ＦＧＦＲの第一Ｉｇ様ドメイン（Ｄ１）またはその一部を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項６】
前記ＦＧＦＲの第一Ｉｇ様ドメインまたはその一部が、
配列番号１の４０〜１１８位に対応するアミノ酸配列を有する、もしくは配列番号１の４０〜１１８位のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％の同一性のアミノ酸配列を有する、または
配列番号１の７７〜１１８位に対応するアミノ酸配列を有する、もしくは配列番号１の７７〜１１８位のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％の同一性のアミノ酸配列を有する、
請求項５に記載の融合蛋白質。
【請求項７】
前記Ｄ２ドメインが、配列番号１の１６３〜２４７位に対応するアミノ酸配列を有する、または配列番号１の１６３〜２４７位のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％の同一性のアミノ酸配列を有する、および／または
前記Ｄ３ドメインが、配列番号１の２７０〜３５９位に対応するアミノ酸配列を有する、または配列番号１の２７０〜３５９位のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％の同一性のアミノ酸配列を有する、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項８】
前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒトＩｇＧである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項９】
融合蛋白質に含まれる部分、ドメインおよび／または領域の間が、直接連結され、および／またはリンカーにより連結されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１０】
ＦＧＦＲ細胞外ドメイン由来の部分と免疫グロブリンＦｃ領域とを含み、前記ＦＧＦＲ細胞外ドメイン由来の部分が
（１）配列番号９の第３５８〜５８０位、配列番号１０の第３０４〜５２６位、配列番号１１の第２７８〜５００位、配列番号１２の第２４６〜４６８位、配列番号１３の第２３５〜４５７位、配列番号１４の第２２９〜４５１位、および配列番号１５の第２２４〜４４６位のうちいずれか一つが示すアミノ酸配列を有する、もしくは配列番号１６の第１０７４〜１７４０位、配列番号１７の第９１２〜１５７８位、配列番号１８の第８３４〜１５００位、配列番号１９の第７３８〜１４０４位、配列番号２０の７０５〜１３７１位、配列番号２１の第６８７〜１３５３位、および配列番号２２の第６７２〜１３３８位のうちいずれか一つが示すヌクレオチド配列にコードされる；
（２）配列番号９の第３５８〜５８０位、配列番号１０の第３０４〜５２６位、配列番号１１の第２７８〜５００位、配列番号１２の第２４６〜４６８位、配列番号１３の第２３５〜４５７位、配列番号１４の第２２９〜４５１位、および配列番号１５の第２２４〜４４６位のうちいずれか１つが示すアミノ酸配列に対し少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；または、
（３）配列番号１６の第１０７４〜１７４０位、配列番号１７の第９１２〜１５７８位、配列番号１８の第８３４〜１５００位、配列番号１９の第７３８〜１４０４位、配列番号２０の７０５〜１３７１位、配列番号２１の第６８７〜１３５３位。および配列番号２２の第６７２〜１３３８位のうちいずれか一つに示されるヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１１】
（１）配列番号９〜１５のうちいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含むもしくは該アミノ酸配列からなる、もしくは配列番号１６〜２２のうちいずれか一つに示されるヌクレオチド配列の核酸分子にコードされる；
（２）配列番号９〜１５のうちいずれか一つに示されるアミノ酸配列に対し少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくは該アミノ酸配列からなる；または、
（３）配列番号１６〜２２のうちいずれか一つに示されるヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を含むもしくは該アミノ酸配列からなる、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＦｃ融合蛋白質。
【請求項１２】
体外および／または体内でＦＧＦに結合する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合蛋白質をコードする、単離核酸分子。
【請求項１４】
配列番号１６〜２２のうちいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の核酸分子。
【請求項１５】
請求項１３または請求項１４に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターでトランスフェクトされた細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合蛋白質、請求項１３もしくは請求項１４に記載の核酸分子、請求項１５に記載のベクター、または請求項１６に記載の細胞と、
医薬的に許容可能なキャリアと、
を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
原核細胞または真核細胞、特に哺乳類動物細胞系、で請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合蛋白質を発現させる、血管新生抑制性融合蛋白質の製造方法。
【請求項１９】
哺乳類動物で血管新生を抑制する医薬の製造における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合蛋白質、請求項１３もしくは請求項１４に記載の核酸分子、請求項１５に記載のベクター、請求項１６に記載の細胞、および／または請求項１７に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２０】
腫瘍の治療または予防の薬物の製造における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合蛋白質、請求項１３もしくは請求項１４に記載の核酸分子、請求項１５に記載のベクター、請求項１６に記載の細胞、および／または請求項１７に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２１】
必要対象に、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合蛋白質、請求項１３もしくは請求項１４の核酸分子、請求項１５に記載のベクター、請求項１６に記載の細胞、および／または請求項１７に記載の医薬組成物、を有効量投与することを含む、対象における血管新生を抑制する方法。
【請求項２２】
必要対象に請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合蛋白質、請求項１３もしくは請求項１４の核酸分子、請求項１５に記載のベクター、請求項１６に記載の細胞、および／または請求項１７に記載の医薬組成物を有効量投与することを含む、対象において腫瘍を治療または予防する方法。
【請求項２３】
ＦＧＦを請求項１〜１２のいずれか一項の融合蛋白質に接触させることを含む、体外もしくは体内でＦＧＦを結合する方法。
【国際調査報告】
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