(57)【要約】本発明は一般に、抗ブラジキニンＢ２受容体（ＢＫＢ２Ｒ）抗体、ならびにそれらを作製する方法およびそれらを用いる方法に関する。特に、本明細書で記載される可変領域配列を有する抗ＢＫＢ２Ｒ抗体は、がん、糖尿病、心血管障害、および他の状態などの疾患、障害、および状態を処置するために、ＢＫＢ２Ｒシグナル伝達経路および／またはＧＳＫ−３シグナル伝達経路のうちの１または複数を変化させるのに有用である。一局面では、本発明の抗ＢＫＢ２Ｒ抗体は、重鎖可変領域として、配列番号２２、２３、および２４にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列、およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域として、配列番号４０、４１、および４２にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列、およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
2014502274.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトブラジキニンＢ２受容体（ＢＫＢ２Ｒ）に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、ＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列、およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と；ＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列、およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、以下：
（１）（Ａ）前記ＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列、前記ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列、および前記ＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ、
（ｉ）配列番号１９、２０、および２１、
（ｉｉ）配列番号２２、２３、および２４、もしくは
（ｉｉｉ）配列番号２５、２６、および２７
に示されるアミノ酸配列を含み、かつ、
（Ｂ）前記ＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列、前記ＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列、および前記ＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ、
（ｉ）配列番号３４、３５、および３６、
（ｉｉ）配列番号３７、３８、および３９、もしくは
（ｉｉｉ）配列番号４０、４１、および４２
に示されるアミノ酸配列を含むか；または
（２）（Ａ）前記ＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列、前記ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列、および前記ＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ、
（ｉ）配列番号１３、１４、および１５、もしくは
（ｉｉ）配列番号１６、１７、および１８
に示されるアミノ酸配列を含み、かつ、
（Ｂ）前記ＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列、前記ＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列、および前記ＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ、
（ｉ）配列番号２８、２９、および３０、もしくは
（ｉｉ）配列番号３１、３２、および３３
に示されるアミノ酸配列を含む、
のうちの少なくとも１つが成り立つ、単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記重鎖可変領域が、配列番号２２、２３、および２４にそれぞれ示される前記ＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列、前記ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列、および前記ＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号４０、４１、および４２にそれぞれ示される前記ＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列、前記ＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列、および前記ＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記重鎖可変領域が、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
前記軽鎖可変領域が、配列番号８〜１２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
配列番号３〜７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインをさらに含む、請求項５に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
前記重鎖可変領域が、配列番号３〜７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
配列番号８〜１２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをさらに含む、請求項７に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
前記重鎖可変領域が、配列番号１９、２０、および２１にそれぞれ示される前記ＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列、前記ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列、および前記ＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３７、３８、および３９にそれぞれ示される前記ＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列、前記ＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列、および前記ＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記重鎖可変領域が、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
ヒトブラジキニンＢ２受容体（ＢＫＢ２Ｒ）に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２に示されるＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
前記抗体がヒト化されている、請求項１または請求項１２に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号８〜１２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
配列番号３〜７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインをさらに含む、請求項１４に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１６】
配列番号３〜７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインをさらに含む、請求項１４に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１７】
配列番号７７または配列番号８１に示されるアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域をさらに含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１８】
配列番号７５または配列番号７９に示されるアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリンＩｇＧ２重鎖定常領域をさらに含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１９】
（ａ）配列番号８３〜８７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリンＩｇＧ２重鎖；および
（ｂ）配列番号８８〜９２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリンカッパ軽鎖
の一方または両方を含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２０】
単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体、およびミニボディーからなる群より選択される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２１】
Ｆａｂ断片またはＦａｂ’断片である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２２】
Ｆ（ａｂ’）２断片である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２３】
完全な抗体である、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２４】
ヒトＩｇＧのＦｃドメインを含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２５】
生理学的に許容される担体と、治療有効量の、請求項１から２４のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合断片とを含む組成物。
【請求項２６】
高血糖症、高コレステロール血症、高血圧症、心血管疾患、網膜症、腎症、神経障害、およびインスリン抵抗性から選択される、ＢＫＢ２Ｒ活性と関連する状態を有する、糖尿病の患者を処置するための方法であって、前記患者に請求項２５に記載の組成物を投与し、それによって前記ＢＫＢ２Ｒ活性と関連する状態を処置することを含む、方法。
【請求項２７】
心血管疾患の患者を処置するための方法であって、前記患者に請求項２５に記載の組成物を投与し、それによって前記心血管疾患を処置することを含む、方法。
【請求項２８】
高コレステロール血症の患者を処置するための方法であって、前記患者に請求項２５に記載の組成物を投与し、それによって前記高コレステロール血症を処置することを含む、方法。
【請求項２９】
高血圧症の患者を処置するための方法であって、前記患者に請求項２５に記載の組成物を投与し、それによって前記高血圧症を処置することを含む、方法。
【請求項３０】
ＧＳＫ３−βの阻害に対して感受性のがんを処置または予防するための方法であって、前記がんを有する患者に、請求項２５に記載の組成物を投与し、それによって前記がんを処置または予防することを含む、方法。
【請求項３１】
前記がんが、混合系統系白血病、食道がん、卵巣がん、前立腺がん、腎臓がん、結腸がん、肝臓がん、胃がん、および膵臓がんからなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＢＫＢ２Ｒタンパク質をＧＳＫ３−Ｂシグナル伝達経路において作動可能に発現させるがん細胞の増殖または生存を阻害する方法であって、前記がん細胞と、請求項２５に記載の組成物とを接触させることを含む、方法。
【請求項３３】
ＢＫＢ２Ｒタンパク質を作動可能に発現させる細胞におけるＧＳＫ３−Ｂシグナル伝達経路によるシグナル伝達を阻害する方法であって、前記細胞と、請求項１から２４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片とを接触させることを含む、方法。
【請求項３４】
ＢＫＢ２Ｒ発現細胞において、（ｉ）放射線への曝露、（ｉｉ）インフルエンザ感染、および（ｉｉｉ）脳卒中のうちの少なくとも１つを変化させるための方法であって、前記細胞と、請求項１から２４のいずれか一項に記載の抗ＢＫＢ２Ｒ抗体またはその抗原結合断片とを、前記抗体の前記細胞への特異的結合に十分な条件下で、かつこれに十分な時間にわたり接触させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願と関連する配列表は、紙原稿ではなく、テキストフォーマットで提示され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名称は、２６００６５＿４０１ＰＣ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。このテキストファイルは、約７３ＫＢであり、２０１１年１２月１日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。
【０００２】
背景
本明細書で開示される本発明の実施形態は、一般に、抗ブラジキニンＢ２受容体（ＢＫＢ２Ｒ）抗体、ならびにこのような抗体を作製する方法およびこのような抗体を用いる方法に関する。特に、本明細書で記載される方法は、糖尿病およびがん、ならびに類縁の状態など、ＢＫＢ２Ｒ活性の影響を受ける生物学的シグナル伝達経路と関連する疾患および障害の処置に有用である。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
糖尿病については、一般に２つの形態が認識されている。１型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）では、患者が、グルコースの使用を制御するホルモンであるインスリンをほとんどまたはまったく生成させない。２型糖尿病またはインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）では、患者の血漿インスリンレベルが、非糖尿病被験体と比較して同じであるかまたはなお高いことが多い。しかし、これらの患者は、主要なインスリン感受性組織、すなわち筋肉、肝臓、および脂肪組織におけるグルコース代謝および脂質代謝に対する、インスリン刺激の効果に抵抗性を発達させており、血漿インスリンレベルが上昇しても、顕著なインスリン抵抗性を克服するには不十分となる。
【０００４】
２型ＤＭに対する現行の薬理学的療法は、インスリンの注射、および血中グルコースレベルを低下させるようにデザインされる経口薬剤を包含する。現在のところ、利用可能な経口薬剤には、（ｉ）グルコースに対する膵臓ベータ細胞の感受性を増強し、これにより、所与のグルコース負荷に応答するインスリン分泌を増大させることにより作用するスルホニルウレア；（ｉｉ）グルコースの処理速度を増大させ、肝臓によるグルコース産生を阻害するビグアニド；（ｉｉｉ）核内ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ、例えば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３を参照されたい）との相互作用を介して末梢のインスリン感受性を改善するチアゾリジノン（ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ）、（ｉｖ）ＡＴＰ依存性カリウムチャネルとの相互作用を介してインスリン分泌を増強するレパグリニド；および（ｖ）炭水化物の腸内吸収を低下させるアカルボースが含まれる。注射剤には、メトホルミン、グリニド、アルファ−グルコシダーゼ遮断剤、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１類似体、ならびにＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が含まれる。しかし、これらの従来の抗糖尿病剤または抗高血糖剤の使用は、多様な有害作用と関連する場合があり、最終的に、患者はこれらの薬剤の効果に対して抵抗性となりうるか、または糖尿病がより進行して薬剤がもはや有効でない状態へと進行する。
【０００５】
糖尿病の処置のモニタリングでは、ヘモグロビンＢ鎖の非酵素的糖化産物であるＨｂＡ１ｃ値が、例外的な重要性を有する。その形成が、血糖レベルおよび赤血球の寿命に本質的に依存するので、「血糖記憶」の意味におけるＨｂＡ１ｃ値は、先行する４〜１２週間の平均血糖レベルを反映する。より集中的な糖尿病処置を介してそのＨｂＡ１ｃレベルが長期間にわたり十分にコントロールされた（すなわち、試料中の総ヘモグロビン＜６．５％）糖尿病患者は、糖尿病性細小血管症から著明に良好に保護される。糖尿病に利用可能な処置は、糖尿病被験体に、平均でＨｂＡ１ｃレベル約１．０〜１．５％の改善を施しうる。このＨｂＡ１ｃレベルの低減は、全ての糖尿病において、ＨｂＡ１ｃレベルを、ＨｂＡ１ｃ＜７．０％、好ましくは＜６．５％、およびより好ましくは＜６％とする所望の標的範囲へと収めるのに十分なわけではない。
【０００６】
細胞レベルでは、後期発症型糖尿病に特徴的でありうる変性表現型に、例えば、インスリン分泌障害、低下したＡＴＰ合成、および高レベルの反応性酸素分子種が含まれる。２型ＤＭには、特定の類縁障害が先行または関連しうることを研究は示している。例えば、米国では４千万例の個体が耐糖能異常（ＩＧＴ）に罹患していると推定されている。ＩＧＴ患者におけるグルコース負荷後の循環グルコース濃度は、高レベルへと上がり、ベースラインレベルに戻るのが罹患していない個体より遅い。毎年インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）へと進行するＩＧＴ個体の百分率は小さい（５〜１０％）。糖尿病のこの形態である２型ＤＭは、膵臓ベータ細胞によるインスリン放出の低下、およびインスリンに対する末端臓器の応答の低下と関連する。糖尿病の他の症状および糖尿病に先行するかまたはこれと関連する状態には、肥満、血管病態、末梢神経障害および感覚神経障害、ならびに失明が含まれる。
【０００７】
現行の薬理学的療法のうちのいずれも、２型ＤＭにおける根底的な生化学的欠損を是正しないことが明らかである。現在のところ利用可能なこれらの処置のうちのいずれも、インスリン分泌の障害、インスリン抵抗性、および／または肝臓による過剰なグルコース産生など、２型ＤＭにおける生理学的異常の全てを改善するわけではない。加えて、多剤薬物療法が頻繁に必要であるように、これらの薬剤による処置の失敗は一般的でもある。
【０００８】
哺乳動物における細胞表面ブラジキニンＢ２受容体（ＢＫＢ２Ｒ）（例えば、ヒトＢＫＢ２Ｒ、配列番号７１；マウスＢＫＢ２Ｒ、配列番号７２）はキニンを媒介し、かつ、Ｇタンパク質共役受容体でもある（Ｌｅｅｂ−Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、２００５年、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ、５７巻：２７〜７７頁；Ｂｅｌａｎｇｅｒら、２００９年、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、３０巻：７７７〜７８７頁）。ＢＫＢ２Ｒ受容体は、ブラジキニン（ＢＫ）およびカリジンに対するアフィニティーが高く、ＢＫの公知の生理学的効果の大半を媒介する一因である。ＢＫおよび他のキニンは、多様な臓器保護効果  および心保護効果を及ぼすことが公知である。ＢＫＢ２Ｒを介して、ＢＫは、一酸化窒素、プロスタグランジン、および組織型プラスミノーゲン活性化因子など、臓器保護分子を放出する一助となる。ＢＫはまた、グルコース輸送体であるＧＬＵＴ４の、細胞質から細胞表面の細胞膜への移動も誘発する。したがって、ＢＫＢ２Ｒのアゴニズムは、糖尿病および類縁の状態、ならびに高血圧症、肥大、アテローム性動脈硬化、および虚血性心疾患などの心血管状態において潜在的な治療効果を及ぼすと考えられる。その最も重要な効果のうちの１つが、多種多様な疾患と連関している、下流における主要な薬理学的標的であるグリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ（ＧＳＫ−３β）の阻害である限りにおいて、ＢＫＢ２Ｒの活性化もまた有益であると考えられる（Ｍｅｉｊｅｒら、２００４年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ、２５巻：９号、４７１〜８０頁）。
【０００９】
ＢＫＢ２Ｒのアゴニストであるカリジンはこの受容体を活性化し、下流において、ＧＳＫ−３βの阻害的リン酸化（位置番号９のセリン残基における）を誘発し、グリコーゲン合成の増大をもたらす（Ｓｔａｍｂｏｌｉｃら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ、３０３巻、７０１〜７０４頁）。ＢＫＢ２Ｒ受容体の活性化はまた、一酸化窒素（ＮＯ）の放出も促進して、血管拡張およびインスリンの組織への送達の増大をもたらし、グルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）の細胞表面への移動も誘発して、細胞によるグルコース取込みの増大を亢進する（Ｋｉｓｈｉら、１９９８年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４７巻：４号、５５０〜８頁）。
【００１０】
ＧＳＫ−３βは、細胞内の細胞質内に位置し、したがって、細胞外抗体には大半が接近不能である。ＧＳＫ−３βは、複数のシグナル伝達経路（例えば、Ｗｎｔ経路、インスリン経路）を制御する構成的に活性なキナーゼであり、ＧＳＫ−３βはまた、リン酸化を介して複数の転写因子も制御する（Ｄｏｂｌｅら、２００３年、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ、１１６巻：１１７５〜８６頁）。よって、ＧＳＫ−３βは、いくつかの細胞機能および発生機能（例えば、代謝、細胞周期、細胞の運動性、サイトカイン発現、およびアポトーシス）の主要な中心的メディエーター（「マスタースイッチ」）と考えられる。ＧＳＫ−３β活性は、（ｉ）ＧＳＫ−３ベータの阻害的リン酸化をもたらす、受容体を介するシグナル伝達、（ｉｉ）特定の場合には、ＧＳＫ−３βの基質がＧＳＫ−３βの作用に利用可能となる前に、ＧＳＫ−３β標的タンパク質にあるＧＳＫ−３β基質結合認識配列の、他のキナーゼによる「プライミングリン酸化」が必要とされること、（ｉｉｉ）複数の特定の多重タンパク質複合体とのＧＳＫ−３βの特異的分子間相互作用、および（ｉｖ）ＧＳＫ−３βの細胞内局在化の制御を含めた複数の機構を介して緊密にコントロールされている。細胞における複数の生物学的過程に対するＧＳＫ−３βの中心性を踏まえて、多様な疾患および障害にＧＳＫ−３β制御の破綻（例えば、ＧＳＫ−３β活性が過剰となり有害な帰結を伴う場合）が関係づけられている（Ｄｏｂｌｅら、２００３年、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ、１１６巻：１１７５〜８６頁）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ（１９９８年）４７巻：５０７〜５１４頁
【非特許文献２】Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｌｉｐｉｄｏｌ．（１９９７年）８巻：１５９〜１６６頁；
【非特許文献３】Ｓｔａｅｌｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ（１９９７年）７９巻：９５〜９９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
近年、ＧＳＫ−３βに関心が集まり、製薬業界によりＧＳＫ−３βが薬物開発の標的と名指されているにもかかわらず、有効なＧＳＫ−３β阻害剤の開発は大部分が不成功であった。これは、部分的には、ＧＳＫ−３βが、複数の細胞内経路のメディエーターとして中心的な役割を有し、所望の生物学的効果に選択的に影響を及ぼす特異的なツールが利用可能でないためである。臨床的に重要なコンテクストにおける制御を含めた、ＧＳＫ−３βによる特定の生物学的シグナル伝達の選択的な形での制御を利用する洗練された手法が明らかに必要とされている。本明細書で開示される本発明は、この必要性に取り組み、他の類縁の利点も提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本明細書で記載される本発明の特定の実施形態によれば、ヒトブラジキニンＢ２受容体（ＢＫＢ２Ｒ）に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、ＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列、およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と；ＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列、およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、以下のうちの少なくとも１つが成り立つ単離抗体またはその抗原結合断片が提供される：（１）（Ａ）ＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列、およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ、（ｉ）配列番号１９、２０、および２１、（ｉｉ）配列番号２２、２３、および２４、もしくは（ｉｉｉ）配列番号２５、２６、および２７に示されるアミノ酸配列を含み、かつ、（Ｂ）ＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列、およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ、（ｉ）配列番号３４、３５、および３６、（ｉｉ）配列番号３７、３８、および３９、もしくは（ｉｉｉ）配列番号４０、４１、および４２に示されるアミノ酸配列を含むこと；または（２）（Ａ）ＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列、およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ、（ｉ）配列番号１３、１４、および１５、もしくは（ｉｉ）配列番号１６、１７、および１８に示されるアミノ酸配列を含み、かつ、（Ｂ）ＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列、およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ、（ｉ）配列番号２８、２９、および３０、もしくは（ｉｉ）配列番号３１、３２、および３３に示されるアミノ酸配列を含むこと。
【００１４】
特定のさらなる実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号２２、２３、および２４にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列、およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号４０、４１、および４２にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列、およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。なおさらなる特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む。他の特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号８〜１２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。特定のさらなる実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３〜７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
【００１５】
特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３〜７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。特定のさらなる実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８〜１２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
【００１６】
特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１９、２０、および２１にそれぞれ示されるＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列、およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号３７、３８、および３９にそれぞれ示されるＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列、およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。特定のさらなる実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。他のさらなる特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む。
【００１７】
特定の実施形態では、ヒトブラジキニンＢ２受容体（ＢＫＢ２Ｒ）に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２に示されるＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む単離抗体またはその抗原結合断片が提供される。
【００１８】
上記の単離抗体またはその抗原結合断片についての特定の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。特定のさらなる実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号８〜１２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる特定の実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３〜７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。特定の実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３〜７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
【００１９】
特定の実施形態では、上記の単離抗体またはそれらの抗原結合断片のうちのいずれかは、配列番号７７または配列番号８１に示されるアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域を含む。特定の実施形態では、上記の単離抗体またはそれらの抗原結合断片のうちのいずれかは、配列番号７５または配列番号７９に示されるアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリンＩｇＧ２重鎖定常領域を含む。
【００２０】
上記の対象物質についての特定の実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号８３〜８７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリンＩｇＧ２重鎖；および（ｂ）配列番号８８〜９２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリンカッパ軽鎖の一方または両方を含む。特定の実施形態では、上記の単離抗体またはそれらの抗原結合断片のうちのいずれかは、単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体、およびミニボディーから選択される抗体を含む。特定の実施形態では、上記の単離抗体またはそれらの抗原結合断片のうちのいずれかは、Ｆａｂ断片またはＦａｂ’断片を含む。特定の実施形態では、上記の単離抗体またはそれらの抗原結合断片のうちのいずれかは、Ｆ（ａｂ’）２断片である。特定の実施形態では、上記の単離抗体のうちのいずれかは、完全な抗体（ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。特定の実施形態では、上記の単離抗体またはそれらの抗原結合断片のうちのいずれかは、ヒトＩｇＧのＦｃドメインを含む。
【００２１】
特定の実施形態では、生理学的に許容される担体および治療有効量の上記の単離抗体またはそれらの抗原結合断片のうちのいずれかを含む組成物が提供される。
【００２２】
特定の実施形態では、高血糖症、高コレステロール血症、高血圧症、心血管疾患、網膜症、腎症、神経障害、およびインスリン抵抗性から選択される、ＢＫＢ２Ｒ活性と関連する状態を有する、糖尿病の患者を処置するための方法であって、患者に、生理学的に許容される担体および治療有効量の上記の単離抗体またはそれらの抗原結合断片のうちのいずれかを含む組成物を投与し、それによってＢＫＢ２Ｒ活性と関連する状態を処置することを含む方法が提供される。特定の実施形態では、心血管疾患の患者を処置するための方法であって、患者に、生理学的に許容される担体および治療有効量の上記の単離抗体またはそれらの抗原結合断片のうちのいずれかを含む組成物を投与し、それによって心血管疾患を処置することを含む方法が提供される。特定の実施形態では、高コレステロール血症の患者を処置するための方法であって、患者に、生理学的に許容される担体および治療有効量の上記の単離抗体またはそれらの抗原結合断片のうちのいずれかを含む組成物を投与し、それによって高コレステロール血症を処置することを含む方法が提供される。特定の実施形態では、高血圧症の患者を処置するための方法であって、患者に、生理学的に許容される担体および治療有効量の上記の単離抗体またはそれらの抗原結合断片のうちのいずれかを含む組成物を投与し、それによって高血圧症を処置することを含む方法が提供される。
【００２３】
特定の実施形態では、ＧＳＫ３−βの阻害に対して感受性のがんを処置または予防するための方法であって、がんを有する患者に、生理学的に許容される担体および治療有効量の上記の単離抗体またはそれらの抗原結合断片のうちのいずれかを含む組成物を投与し、それによってがんを処置または予防することを含む方法が提供される。特定の実施形態では、がんが混合系統系白血病、食道がん、卵巣がん、前立腺がん、腎臓がん、結腸がん、肝臓がん、胃がん、および膵臓がんから選択される。特定の実施形態では、ＢＫＢ２Ｒタンパク質をＧＳＫ３−Ｂシグナル伝達経路において作動可能に発現させるがん細胞の増殖または生存を阻害する方法であって、がん細胞を、生理学的に許容される担体および治療有効量の上記の単離抗体またはそれらの抗原結合断片のうちのいずれかを含む組成物と接触させることを含む方法が提供される。
【００２４】
特定の実施形態では、ＢＫＢ２Ｒタンパク質を作動可能に発現させる細胞におけるＧＳＫ３−Ｂシグナル伝達経路を介するシグナル伝達を阻害する方法であって、細胞を、上記の抗体またはそれらの抗原結合断片のうちのいずれかと接触させることを含む方法が提供される。特定の実施形態では、ＢＫＢ２Ｒ発現細胞において、（ｉ）放射線への曝露、（ｉｉ）インフルエンザ感染、および（ｉｉｉ）脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）のうちの少なくとも１つを変化させるための方法であって、細胞を、上記の抗体またはそれらの抗原結合断片のうちのいずれかと、細胞への抗体の特異的結合に十分な条件下で、これに十分な時間にわたり接触させることを含む方法が提供される。
【００２５】
以下の詳細な説明および付属の図面を参照すれば、本明細書で記載される本発明のこれらの態様および実施形態ならびに他の態様および実施形態は明らかとなろう。本明細書で言及されており、かつ／または出願データシートで列挙されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物の全ては、各々が個別に組み込まれたと仮定した場合と同様に、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。必要な場合は、多様な特許、出願、および、出願公開の概念を用いて、なおさらなる実施形態をもたらすために、本発明の態様および実施形態を改変することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体によるｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＧＳＫ−３β阻害の誘導を示す棒グラフである。グラフは、ＧＳＫ−３β阻害の指標としてＥＬＩＳＡにより測定した、３Ｔ３マウス細胞のセリン９におけるＧＳＫ−３βリン酸化のレベルを示す。
【図２】図２は、抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体によるＧＳＫ−３β阻害の誘導を示す棒グラフである。グラフは、ＧＳＫ−３β阻害の指標としてＥＬＩＳＡにより測定した、ＷＩ−３８ヒト細胞のセリン９におけるＧＳＫ−３βリン酸化のレベルを示す。
【図３】図３は、モノクローナル抗体の急性用量反応グラフである。グラフは、注入後における表示される４つの抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体群全てについての平均動脈圧反応の平均をプロットする。各群のデータ点を、平均±標準誤差として提示する。
【図４】図４は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける投与の１、２、３時間後の血圧に対する抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体の効果を示すグラフである。グラフは、各群について平均±ＳＥＭをプロットする（＊５Ｆ１２Ｇ１について、ベースラインと対比してｐ＜０．０５）。
【図５】図５は、Ｔａｍｉｆｌｕ（登録商標）が、ｑＲＴ−ＰＣＲにより決定される、Ａ５４９細胞におけるインフルエンザの複製を低減したことを示す図である。グラフは、インフルエンザＭセグメントの増幅部分と正比例する、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブの移動および開裂の増大を反映した相対蛍光の増大を示す。Ｔａｍｉｆｌｕ濃度の低い試料の蛍光が早期のＣｔ（閾値サイクル）で増大したことから、ウイルス力価の増大が示される。
【図６】図６は、蛍光閾値を１５００蛍光単位とするときのＴａｍｉｆｌｕ（登録商標）濃度（ｘ軸）と対比したＣｔ（ｙ軸）の実測値プロットおよびトレンドプロットを示す図である。Ｔａｍｉｆｌｕ（登録商標）は、ウイルス力価を用量依存的な形で低下させた。
【図７】図７は、抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体である５Ｆ１２Ｇ１（「Ｇ１」）が、ｑＲＴ−ＰＣＲにより決定されるＡ５４９細胞におけるインフルエンザの複製を低減することを証拠立てるグラフを示す。グラフは、インフルエンザＭセグメントの増幅部分と正比例する、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブの移動および開裂の増大を反映した相対蛍光の増大を示す。Ｇ１濃度の低い試料の蛍光が早期のＣｔ（閾値サイクル）で増大したことから、ウイルス力価の増大が示される。
【図８】図８は、蛍光閾値を１５００蛍光単位とするときの抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体である５Ｆ１２Ｇ１（「Ｇ１」）の濃度（ｘ軸）と対比したＣｔ（ｙ軸）の実測値プロットおよびトレンドプロットを示す図である。Ｇ１は、ウイルス力価を用量依存的な形で低下させた。
【図９】図９は、ＭＤＣＫ細胞におけるＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７に対する抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体Ｇ１について、対照細胞に照らした生存百分率および細胞変性効果（ＣＰＥ）低減百分率を示す図である。
【図１０】図１０は、ＭＤＣＫ細胞におけるＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７に対する抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体Ｇ７について、対照細胞に照らした生存百分率およびＣＰＥ低減百分率を示す図である。
【図１１】図１１は、ＭＤＣＫ細胞におけるＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７に対する抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体Ｈ９について、対照細胞に照らした生存百分率およびＣＰＥ低減百分率を示す図である。
【図１２】図１２は、ＭＤＣＫ細胞におけるＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７に対する抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体Ｈ３について、対照細胞に照らした生存百分率およびＣＰＥ低減百分率を示す図である。
【図１３】図１３は、ＭＤＣＫ細胞におけるＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７に対するＴａｍｉｆｌｕ（登録商標）について、対照細胞に照らした生存百分率およびＣＰＥ低減百分率を示す図である。
【図１４】図１４は、ＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザ（ＣＡ／０７／０９）に対する抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体Ｇ１について、対照細胞に照らした生存百分率およびＣＰＥ低減百分率を示す図である。
【図１５】図１５は、ＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザ（ＣＡ／０７／０９）に対する抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体Ｇ７について、対照細胞に照らした生存百分率およびＣＰＥ低減百分率を示す図である。
【図１６】図１６は、ＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザ（ＣＡ／０７／０９）に対する抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体Ｈ９について、対照細胞に照らした生存百分率およびＣＰＥ低減百分率を示す図である。
【図１７】図１７は、ＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザ（ＣＡ／０７／０９）に対する抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体Ｈ３について、対照細胞に照らした生存百分率およびＣＰＥ低減百分率を示す図である。
【図１８】図１８は、ＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザ（ＣＡ／０７／０９）に対するＴａｍｉｆｌｕ（登録商標）について、対照細胞に照らした生存百分率およびＣＰＥ低減百分率を示す図である。
【図１９】図１９は、多様な濃度の抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体１Ｆ２Ｇ７および５Ｆ１２Ｇ１で処置した場合の、対照細胞に照らした百分率としてのＢｘＰＣ−３細胞の生存度を示す図である。
【図２０】図２０は、多様な濃度の抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体１Ｆ２Ｇ７および５Ｆ１２Ｇ１で処置した場合の、対照細胞に照らした百分率としてのＭＶ−４−１１細胞の生存度を示す図である。
【図２１】図２１は、多様な濃度の抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体１Ｆ２Ｇ７および５Ｆ１２Ｇ１で処置した場合の、対照細胞に照らした百分率としてのＨｅｐ  Ｇ２細胞の生存度を示す図である。
【図２２】図２２は、多様な濃度の抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体１Ｆ２Ｇ７および５Ｆ１２Ｇ１で処置した場合の、対照細胞に照らした百分率としてのＲＳ４；１１細胞の生存度を示す図である。
【図２３】図２３は、多様な濃度の抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体１Ｆ２Ｇ７および５Ｆ１２Ｇ１で処置した場合の、対照細胞に照らした百分率としてのＨＴ−２９細胞の生存度を示す図である。
【図２４】図２４は、多様な濃度の抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体１Ｆ２Ｇ７および５Ｆ１２Ｇ１で処置した場合の、対照細胞に照らした百分率としてのＮＵＧＣ−４細胞の生存度を示す図である。
【図２５】図２５は、多様な濃度の抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体１Ｆ２Ｇ７および５Ｆ１２Ｇ１で処置した場合の、対照細胞に照らした百分率としてのＰＣ−３細胞の生存度を示す図である。
【図２６】図２６は、正常血糖高インスリンクランプ法における抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体Ｆ５１２Ｇ１の場合のグルコース注入速度を、ビヒクル対照の場合と比較して示す図である。
【図２７】図２７は、正常血糖高インスリンクランプ法における抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体Ｆ５１２Ｇ１の場合のグルコース注入速度のＡＵＣを、ビヒクル対照の場合と比較して示す図である。
【図２８】図２８Ａは、多様な用量のモノクローナル抗体５Ｆ１２Ｇ１で処置したＺｕｃｋｅｒラットに対する経口グルコース負荷試験における血中グルコースレベルを示す図である。図２８Ｂは、多様な用量のモノクローナル抗体５Ｆ１２Ｇ１で処置したＺｕｃｋｅｒラットに対する経口グルコース負荷試験における血中グルコースレベルの曲線下面積（ＡＵＣ）を示す図である。
【図２９】図２９Ａは、多様な用量のモノクローナル抗体５Ｆ１２Ｇ１で処置したＺｕｃｋｅｒラットに対する経口グルコース負荷試験における血清インスリンレベルを示す図である。図２９Ｂは、多様な用量のモノクローナル抗体５Ｆ１２Ｇ１で処置したＺｕｃｋｅｒラットに対する経口グルコース負荷試験における血清インスリンレベルの曲線下面積（ＡＵＣ）を示す図である。
【図３０】図３０Ａは、多様な用量のモノクローナル抗体５Ｆ１２Ｇ１で処置したＤＩＯマウスに対する経口グルコース負荷試験における血中グルコースレベルを示す図である。図３０Ｂは、多様な用量のモノクローナル抗体５Ｆ１２Ｇ１で処置したＤＩＯマウスに対する経口グルコース負荷試験における血中グルコースレベルの曲線下面積（ＡＵＣ）を示す図である。
【図３１】図３１は、多様な用量のモノクローナル抗体５Ｆ１２Ｇ１で処置したＤＩＯマウスに対する経口グルコース負荷試験における血清インスリンレベルを示す図である。
【図３２】図３２Ａは、多様な用量のモノクローナル抗体５Ｆ１２Ｇ１、エキセナチド、シタグリプチン、またはＭＧ２ｂ−５７による処置後０日目のＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットに対する経口グルコース負荷試験における血中グルコースレベルを示す図であり、図３２Ｂは、２１日目の経口グルコース負荷試験における血中グルコースレベルを示す図である。
【図３３】図３３は、多様な用量の５Ｆ１２Ｇ１、エキセナチド、シタグリプチン、またはＭＧ２ｂ−５７による処置後２１日目のＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットに対する経口グルコース負荷法における血中グルコースレベルの曲線下面積（ＡＵＣ）を示す図である。
【図３４】図３４Ａは、多様な用量のモノクローナル抗体５Ｆ１２Ｇ１、エキセナチド、シタグリプチン、またはＭＧ２ｂ−５７による処置後０日目のＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットに対する経口グルコース負荷試験における血清インスリンレベルを示す図であり、図３２Ｂは、２１日目のＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットに対する経口グルコース負荷試験における血清インスリンレベルを示す図である。
【図３５】図３５は、多様な用量のモノクローナル抗体５Ｆ１２Ｇ１、エキセナチド、シタグリプチン、またはＭＧ２ｂ−５７による処置後０日目〜２１日目のＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットにおける空腹時血中グルコースレベルを示す図である。
【図３６】図３６は、多様な用量の５Ｆ１２Ｇ１、エキセナチド、シタグリプチン、またはＭＧ２ｂ−５７による処置後２１日目のＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットにおける血清コレステロールレベルを示す図である。
【図３７】図３７は、多様な用量のモノクローナル抗体５Ｆ１２Ｇ１、エキセナチド、シタグリプチン、またはＭＧ２ｂ−５７による処置後２１日目のＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットにおけるグリコシル化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）百分率レベルを示す図である。
【図３８】図３８は、多様な用量の５Ｆ１２Ｇ１、エキセナチド、シタグリプチン、またはＭＧ２ｂ−５７による処置後１４日目のＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットの尿中で検出されるグルコースレベルを示す図である。
【図３９】図３９Ａは、多様な用量の５Ｆ１２Ｇ１、エキセナチド、シタグリプチン、またはＭＧ２ｂ−５７による処置後０日目のＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットにおける収縮期血圧を示す図であり、図３９Ｂは、２１日目における収縮期血圧を示す図である。
【図４０】図４０Ａは、多様な用量の５Ｆ１２Ｇ１、エキセナチド、シタグリプチン、またはＭＧ２ｂ−５７による処置後０日目のＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットにおける拡張期血圧を示す図であり、図４０Ｂは、２１日目における拡張期血圧を示す図である。
【図４１】図４１Ａは、多様な用量の５Ｆ１２Ｇ１、エキセナチド、シタグリプチン、またはＭＧ２ｂ−５７による処置後０日目のＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットにおける心拍数を示す図であり、図４１Ｂは、２１日目における心拍数を示す図である。
【図４２】図４２は、多様な用量の５Ｆ１２Ｇ１、エキセナチド、シタグリプチン、またはＭＧ２ｂ−５７による処置後２１日目の正常血糖高インスリンクランプ法のＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットにおけるグルコース注入速度の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す図である。
【図４３】図４３は、ＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットにおいてグルコースを経口投与した後の、５Ｆ１２Ｇ１またはヒト化抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体の単回投与後における血中グルコース濃度をモニタリングした経口グルコース負荷試験からの曲線下面積（ＡＵＣ）データについて、ビヒクル対照の場合と比較してまとめる図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
配列の簡単な説明
配列番号１は、５Ｆ１２Ｇ１抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のマウス重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００２８】
配列番号２は、５Ｆ１２Ｇ１抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のマウス軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号３は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ１重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号４は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ２重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号５は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ３７重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号６は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ３８重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号７は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ３９重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号８は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ１軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号９は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ２軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号１０は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ３７軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号１１は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ３８軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号１２は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ３９軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号１３は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ１  ＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号１４は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ１  ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号１５は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ１  ＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号１６は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ２  ＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号１７は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ２  ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００４４】
配列番号１８は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ２  ＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号１９は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ３７  ＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００４６】
配列番号２０は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ３７  ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００４７】
配列番号２１は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ３７  ＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００４８】
配列番号２２は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ３８  ＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００４９】
配列番号２３は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ３８  ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００５０】
配列番号２４は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ３８  ＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号２５は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ３９  ＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００５２】
配列番号２６は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ３９  ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００５３】
配列番号２７は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ３９  ＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００５４】
配列番号２８は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ１  ＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００５５】
配列番号２９は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ１  ＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００５６】
配列番号３０は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ１  ＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００５７】
配列番号３１は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ２  ＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００５８】
配列番号３２は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ２  ＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００５９】
配列番号３３は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ２  ＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００６０】
配列番号３４は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ３７  ＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００６１】
配列番号３５は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ３７  ＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００６２】
配列番号３６は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ３７  ＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００６３】
配列番号３７は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ３８  ＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００６４】
配列番号３８は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ３８  ＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００６５】
配列番号３９は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ３８  ＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００６６】
配列番号４０は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ３９  ＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００６７】
配列番号４１は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ３９  ＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００６８】
配列番号４２は、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ３９  ＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００６９】
配列番号４３は、マウス５Ｆ１２Ｇ１抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００７０】
配列番号４４は、マウス５Ｆ１２Ｇ１抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００７１】
配列番号４５は、マウス５Ｆ１２Ｇ１抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００７２】
配列番号４６は、マウス５Ｆ１２Ｇ１抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００７３】
配列番号４７は、マウス５Ｆ１２Ｇ１抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００７４】
配列番号４８は、マウス５Ｆ１２Ｇ１抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００７５】
配列番号４９は、配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、すなわち、５Ｆ１２Ｇ１抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のマウス重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。
【００７６】
配列番号５０は、配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、すなわち、５Ｆ１２Ｇ１抗体のマウス軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。
【００７７】
配列番号５１は、配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、すなわち、抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ１ヒト化重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。
【００７８】
配列番号５２は、配列番号４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、すなわち、抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ２ヒト化重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。
【００７９】
配列番号５３は、配列番号５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、すなわち、抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ３７ヒト化重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。
【００８０】
配列番号５４は、配列番号６のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、すなわち、抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ３８ヒト化重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。
【００８１】
配列番号５５は、配列番号７のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、すなわち、抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＨ３９ヒト化重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。
【００８２】
配列番号５６は、配列番号８のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、すなわち、抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ１ヒト化軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。
【００８３】
配列番号５７は、配列番号９のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、すなわち、抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ２ヒト化軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。
【００８４】
配列番号５８は、配列番号１０のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、すなわち、抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ３７ヒト化軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。
【００８５】
配列番号５９は、配列番号１１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、すなわち、抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ３８ヒト化軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。
【００８６】
配列番号６０は、配列番号１２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、すなわち、抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＬ３９ヒト化軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。
【００８７】
配列番号６１〜６８は、オリゴヌクレオチドＲＡＣＥプライマーの配列である。
【００８８】
配列番号６９〜７０は、オリゴヌクレオチド配列決定プライマーの配列である。
【００８９】
配列番号７１は、ヒトＢＫＢ２Ｒのアミノ酸配列を示す。
【００９０】
配列番号７２は、マウスＢＫＢ２Ｒのアミノ酸配列を示す。
【００９１】
配列番号７３は、免疫原性ヒトＢＫＢ２Ｒペプチド断片のアミノ酸配列を示す。
【００９２】
配列番号７４は、免疫原性マウスＢＫＢ２Ｒペプチド断片のアミノ酸配列を示す。
【００９３】
配列番号７５は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ２重鎖定常領域のアミノ酸配列である。
【００９４】
配列番号７６は、配列番号７５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの配列である。
【００９５】
配列番号７７は、ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列である。
【００９６】
配列番号７８は、配列番号７７のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの配列である。
【００９７】
配列番号７９は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ２重鎖定常領域のアミノ酸配列である。
【００９８】
配列番号８０は、配列番号７９のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの配列である。
【００９９】
配列番号８１は、ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列である。
【０１００】
配列番号８２は、配列番号８１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの配列である。
【０１０１】
配列番号８３は、ヒトＩｇＧ２定常領域を含めた、ヒト化Ｈ１重鎖のアミノ酸配列である。
【０１０２】
配列番号８４は、ヒトＩｇＧ２定常領域を含めた、ヒト化Ｈ２重鎖のアミノ酸配列である。
【０１０３】
配列番号８５は、ヒトＩｇＧ２定常領域を含めた、ヒト化Ｈ３７重鎖のアミノ酸配列である。
【０１０４】
配列番号８６は、ヒトＩｇＧ２定常領域を含めた、ヒト化Ｈ３８重鎖のアミノ酸配列である。
【０１０５】
配列番号８７は、ヒトＩｇＧ２定常領域を含めた、ヒト化Ｈ３９重鎖のアミノ酸配列である。
【０１０６】
配列番号８８は、ヒトＩｇカッパ定常領域を含めた、ヒト化Ｌ１軽鎖のアミノ酸配列である。
【０１０７】
配列番号８９は、ヒトＩｇカッパ定常領域を含めた、ヒト化Ｌ２軽鎖のアミノ酸配列である。
【０１０８】
配列番号９０は、ヒトＩｇカッパ定常領域を含めた、ヒト化Ｌ３７軽鎖のアミノ酸配列である。
【０１０９】
配列番号９１は、ヒトＩｇカッパ定常領域を含めた、ヒト化Ｌ３８軽鎖のアミノ酸配列である。
【０１１０】
配列番号９２は、ヒトＩｇカッパ定常領域を含めた、ヒト化Ｌ３９軽鎖のアミノ酸配列である。
【０１１１】
詳細な説明
本明細書で開示される本発明の特定の実施形態によれば、特定の抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体、および、特に、本明細書で記載されるＶＨＣＤＲ１配列、ＶＨＣＤＲ２配列、およびＶＨＣＤＲ３配列、ならびに／またはＶＬＣＤＲ１配列、ＶＬＣＤＲ２配列、およびＶＬＣＤＲ３配列、ならびに／またはＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列を有するヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ抗体に関する組成物および方法が提供される。また、本明細書で記載される通り、本明細書で開示される抗ＢＫＢ２Ｒ抗体をＢＫＢ２Ｒ発現細胞と接触させたところ、これらの抗体は、予測外にも、ＢＫＢ２Ｒに対するアゴニスト活性も呈示し、驚くべきことに、ＧＳＫ−３βも結果として阻害した。
【０１１２】
本明細書で記載される抗ＢＫＢ２Ｒ抗体は、ＢＫＢ２Ｒ活性および／またはＢＫＢ２Ｒ活性が寄与する生物学的なシグナル伝達経路に対する介入およびこれらの変化（例えば、検出可能な活性レベルなどにおける統計学的に有意な増大または減少）が所望でありうる多数の文脈において用いられる。例えば、非限定的な理論によれば、多数の臨床的に規定された状態は、本明細書で記載される抗ＢＫＢ２Ｒ抗体により予測外にも呈示されたＧＳＫ−３β阻害特性を有益に利用しうるような、過剰なＧＳＫ−３β活性から結果として生じると考えられる。よって、本明細書ではまた、糖尿病ならびに／あるいは、これに随伴する、心血管障害、網膜症、神経障害、もしくは腎症、がん、心血管疾患、および高血圧、血中グルコース濃度の過剰、血清コレステロール濃度の上昇、ウイルス感染、脳卒中、放射線への曝露、または他の疾患を含めた多数の類縁の状態の危険性が含まれうるがこれらに必ずしも限定されない、ＢＫＢ２Ｒ活性と関連する状態を処置するための組成物および方法も提供される。
【０１１３】
ＢＫＢ２Ｒとは、Ｓｅｒ９のリン酸化を介してＧＳＫ−３βの阻害をもたらす、公知の内因性細胞シグナル伝達経路（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ）の開始地点を表す。この経路は、血中グルコースレベルを制御する内因性の一助となるように用いられ、かつ、神経発生過程において、酵素である組織カリクレイン１（ＫＬＫ１）が、キニノーゲンを切断して、ＢＫＢ２Ｒ受容体を活性化するキニン（ブラジキニンおよびカリジン（Ｌｙｓ−ブラジキニン））を放出するときにも用いられる可能性が高い。通常、ＫＬＫ−１は、短寿命であるが（ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて約３０秒間）、強力なＢＫＢ２受容体アゴニスト（Ｋｄ約０．８９ｎＭ）である、カリジンを発生させる。カリジンの結合により、Ｇタンパク質共役受容体であるＢＫＢ２Ｒが始動することから、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を介する下流のシグナル伝達イベントが誘導され、ＧＳＫ−３βのセリン９におけるリン酸化および脱活性化がもたらされる。ＧＳＫ−３βが阻害されると、グリコーゲンの合成が増大する可能性があり、また、Ｔａｕのリン酸化、アポトーシス、および炎症が低下する可能性もある。理論に束縛されることを望まずに述べると、本明細書で記載される本発明の特定の実施形態の抗ＢＫＢ２Ｒ抗体は、ＢＫＢ２受容体上の極めて特異的なタンパク質配列により規定された構造に結合することによりこの経路を模倣し、これにより、ＢＫＢ２Ｒの活性化および下流におけるＧＳＫ−３βの最終的な阻害をもたらすと考えられる。さらに、非限定的な理論によれば、本モノクローナル抗体は、アゴニスト的に作用するように、細胞外のＢＫＢ２Ｒ受容体上に配置されたエピトープを特異的に標的とすると考えられる。このような特異性を介して、本明細書で記載される抗ＢＫＢ２Ｒ抗体は、かつて他のＧＳＫ−３β阻害剤について認められた「標的を外れた」結合の可能性を無化し、以前の阻害剤によるそれほど特異的でない作用機構から結果として生じる、関連する副作用の危険性を低減して有益である。
【０１１４】
ＢＫＢ２Ｒ活性と関連する状態には、ＧＳＫ−３β活性の不適正な制御が関与する多数の疾患および障害が含まれる。非限定的な例示的例には以下が含まれる：
（ａ）放射線への曝露：一部の状況におけるＧＳＫ−３βの阻害は、アポトーシスを誘導するｐ５３に依存する経路である、Ｂａｘシグナル伝達経路を介するアポトーシスを防止し、したがって、有害レベルの全身放射線照射への曝露後における骨髄細胞、および、おそらくは、消化器粘膜組織の喪失を防止しうる。放射線照射後の生存に対するカリクレイン−１（ＫＬＫ−１）について報告された効果が、ＢＫＢ２Ｒ受容体に対するカリジンの作用、もしくは成長因子の活性化、またはこれらの両方の組合せを介するかどうかは公知でないが、ＫＬＫ−１は、放射線への曝露のための処置として研究されている；
（ｂ）ＩＩ型糖尿病および高血圧症：２型糖尿病の主要な併発病態の１つは高血圧症であり、これは、組織へのインスリンの送達を遅延させうるが、ＢＫＢ２Ｒ受容体の活性化を介して軽減することができる；
（ｃ）がん：混合系統系白血病細胞（ＭＬＬ）は、ＧＳＫ−３β阻害に対して感受性である。ＧＳＫ−３βは典型的にアポトーシス経路を活性化するので、この関係は、幾分か直観に反する。この機構は、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を伴わず、固有のがん特異的なバイオマーカーを要請しない（ＢＫＢ２受容体は細胞で普遍的に発現する）。代わりに、細胞死は、ＧＳＫ−３β阻害に対して感受性の細胞だけにおいて生じる。ＧＳＫ−３βはまた、食道がん、卵巣がん、前立腺がん、腎臓がん、結腸がん、肝臓がん、胃がん、および膵臓がんなど、多数の異なるがんにおける潜在的な下流の標的としても示唆されている；
（ｄ）心筋梗塞および脳卒中：ＫＬＫ−１は、心臓を虚血から保護し、虚血後における心臓の回復を改善することが公知である。ＢＫ  Ｂ２受容体アンタゴニスト（例えば、ＨＯＥ  １４０）の使用を介する前臨床研究では、これらの効果が遮断されている；ならびに
（ｅ）インフルエンザ：ＧＳＫ−３βは、宿主細胞へのウイルスの侵入に必要な因子であることが、Ａ型インフルエンザのＲＮＡウイルスにおいて確認されている。ＧＳＫ−３βを阻害または遮断すれば、複製が停止し、よって、感染が緩和されるであろう。
【０１１５】
したがって、本発明の実施形態は、細胞表面において広く発現するＧタンパク質共役受容体タンパク質であるＢＫＢ２Ｒ（例えば、配列番号７１）に結合する抗体、このような抗体を作製する方法、およびＧＳＫ−３βの阻害を結果としてもたらす方法を含め、このような抗体を用いて、ＢＫＢ２Ｒ発現細胞におけるＢＫＢ２Ｒに関連するシグナル伝達経路のイベントを変化させる（例えば、統計学的に有意な形で増大または減少させる）方法に関する。本明細書で記載される方法は、糖尿病、がん、ならびに他の疾患、障害、および状態など、ＢＫＢ２Ｒ活性と関連する状態の処置に有用である。ヒト化抗体またはそれらの抗原結合断片、またはそれらの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含めた例示的抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のアミノ酸配列は、配列番号１〜４８、７５、７７、７９、８１、８３〜９２に示され、配列番号４９〜６０、７６、７８、８０、８２に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされる。
【０１１６】
特定の実施形態では、かつ、非限定的な理論によれば、特定の実施形態においてＧＳＫ−３βを阻害することを含め、ＢＫＢ２Ｒに関連するシグナル伝達経路を誘導または活性化するために、本明細書で記載される抗ＢＫＢ２Ｒ抗体を、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおける細胞を含めた、ＢＫＢ２Ｒ発現細胞と接触させることもでき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける単離細胞と接触させることもできる。「単離された」細胞とは、それが元来存在した天然の環境から摘出された細胞、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて維持したか、増殖させたか、もしくは生成させた細胞の後代である。
【０１１７】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、ＢＫＢ２Ｒ経路の活性を変化させるための方法であって、ＢＫＢ２Ｒ発現細胞を、本明細書で記載される抗ＢＫＢ２Ｒ抗体と、細胞への抗体の特異的結合に十分な条件下で、これに十分な時間にわたり接触させることを含み、ＢＫＢ２Ｒ経路の活性レベルを、抗ＢＫＢ２Ｒ抗体と接触させていない細胞に存在するＢＫＢ２Ｒ経路の活性レベルと比べて変化させる（例えば、統計学的に有意な形で上昇または低下させ、特定の好ましい実施形態では上昇させる）方法を提供する。
【０１１８】
したがって、本明細書で記載される特定の実施形態によれば、これらの系および／または類縁の系を用いて、抗ＢＫＢ２Ｒ抗体によるＢＫＢ２ＲまたはＢＫＢ２Ｒに関連するシグナル伝達経路の活性化または誘導を決定または実施することも可能であり、ＢＫＢ２Ｒ発現細胞における抗ＢＫＢ２Ｒ抗体によるＧＳＫ−３βの阻害を決定または実施することも可能な方法が明示的に想定される。
【０１１９】
本明細書では、ＢＫＢ２Ｒに関連するシグナル伝達経路の活性を決定するための基準が記載されるが、これらは、当技術分野でも公知であり、当業者に理解されよう。特定の場合には、細胞分裂、細胞の生存、アポトーシス、増殖、および分化と関連するシグナル伝達経路を含めた生物学的シグナル伝達のための経路を、「生物学的シグナル伝達経路」または「誘導性シグナル伝達経路」と称することができ、細胞におけるこれらの過程および類似した過程の制御に関与する、細胞内および細胞外の分子的構成要素間における一過性または安定的な会合または相互作用を包含しうる。対象の特定の経路（複数可）に応じて、このような経路（複数可）の誘導を決定するのに適切な１または複数のパラメータを、当技術分野で容認された基準に基づき選択することができる。
【０１２０】
例えば、細胞の複製または増殖と関連するシグナル伝達経路については、例えば、増殖しつつある細胞によるトリチウム化したチミジンの細胞のＤＮＡへの組込み、細胞の呼吸活性についての検出可能な指標（例えば、蛍光分析指標または比色分析指標）（例えば、代謝的に活性な細胞におけるテトラゾリウム塩（黄色）である３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）または３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）の、ホルマザン色素（紫色）への転換）のモニタリング、または細胞カウンティングなどを含めた、周知の多様な方法が、複製または増殖を定量化するのに利用可能である。
【０１２１】
同様に、細胞生物学の技術分野では、顕微鏡法、生化学法、分光光度法、分光法、光散乱法、フローサイトメトリーおよび細胞蛍光分析法を含めたサイトメトリー法、または他の技法（例えば、Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅなどの生体染色色素、ヨウ化プロピジウムなどのＤＮＡ結合フルオロフォア、代謝指標など）を介する生存度の決定を含めた公知の多数の方法のうちのいずれかを介して細胞の生存を評価するための複数の技法、ならびにアポトーシス（例えば、アネキシンＶ結合、ＤＮＡ断片化アッセイ、カスパーゼの活性化、マーカー解析、例えば、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）など）を決定するための複数の技法が公知である。
【０１２２】
他のシグナル伝達経路は、特定の細胞の表現型、例えば、遺伝子発現の特異的な誘導（例えば、転写産物または翻訳産物として検出可能な場合もあり、このような産物のバイオアッセイを介して検出可能な場合もあり、細胞質因子の核局在化として検出可能な場合もある）；細胞内メディエーターレベルの変化（例えば、統計学的に有意な上昇または低下）（例えば、キナーゼまたはホスファターゼの活性化、環状ヌクレオチドレベルまたは生理的に活性なイオン性分子種レベルの変化、１または複数の特異的なリン酸化基質のリン酸化レベルの変化など）；特定の細胞が、ＢＫＢ２Ｒを介するイベント、ＧＳＫ−３βを介するイベント、または他の規定されたシグナル伝達経路を介するイベントを経つつあるかまたはこれらを経たかどうかを決定するために、本明細書で提供される特定の刺激に対する細胞の応答性を容易に同定しうるような、細胞周期プロファイルの変化または細胞形態の変化など（例えば、ＢＫＢ２ＲをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞系などのＢＫＢ２Ｒ発現細胞におけるカルシウムフラックスアッセイ、セリン９のリン酸化またはＧＳＫ−３β活性の阻害などのＧＳＫ−３βリン酸化アッセイ、ＥＬＩＳＡによるＧＳＫ−３βの決定、ＧＳＫ−３β結合アッセイなど）と関連する。
【０１２３】
被験体または生物学的供給源が、２型糖尿病を示す臨床パラメータ内に収まるかどうかを決定することが所望される特定の実施形態では、当業者により容認される２型糖尿病の徴候および症状を用い、これにより、被験体または生物学的供給源に、例えば、Ｇａｖｉｎら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ、２２巻（補遺１巻）：Ｓ５〜Ｓ１９頁、１９９９年、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ）およびその中で引用されている参考文献、または２型糖尿病を診断するために当技術分野において公知の他の手段において言及されている臨床徴候を指定することができる。
【０１２４】
糖尿病および他の特定の代謝疾患または代謝障害では、同化過程の場合もあり、異化過程の場合もある（例えば、それぞれ、物質の蓄積または分解である）、１または複数の生化学過程が、それらが適切な対照個体などの無疾患被験体または正常被験体において生じるレベルと比べて変化する（例えば、統計学的に有意な形で上昇または低下する）か、または調節される（例えば、統計学的に有意な程度に上方制御または下方制御される）。変化は、基質、酵素、共因子、または特定の過程に関与する任意の生化学反応における他の任意の構成要素の増大または減少から結果として生じうる。例えば、糖尿病の存在の決定および特徴付けにおいて用いられるミトコンドリア機能の指標の変化の広範なセットが記載されている（例えば、Ｕ．Ｓ．６，１４０，０６７を参照されたい）。
【０１２５】
ＢＫＢ２Ｒと関連するシグナル伝達経路の構成要素には、インスリンにより誘導されるシグナル伝達経路の構成要素が含まれる場合があり、例えば、本明細書で提示される特定のシグナル伝達経路の構成要素でありうる、インスリン受容体ベータ（ＩＲ−β）、および／または下流のシグナル伝達分子であるＰＫＢ／Ａｋｔ、および／または他の任意の下流のポリペプチドのチロシンリン酸化のレベルを決定することにより評価することができる。ＢＫＢ２Ｒ活性と関連する状態にはまた、ＪＮＫ関連障害（例えば、がん、心肥大、虚血、糖尿病、高血糖症により誘導されるアポトーシス、炎症、神経変性障害）、および異なるシグナル伝達経路と関連する他の障害、例えば、がん、自己免疫、細胞増殖障害、神経変性障害、および感染性疾患などの障害も含まれうる（例えば、Ｆｕｋａｄａら、２００１年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７６巻：２５５１２頁；Ｔｏｎｋｓら、２００１年、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１３巻：１８２頁；Ｓａｌｍｅｅｎら、２０００年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ、６巻：１４０１頁；Ｈｕら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、８５巻：４３２〜４２頁（２００３年）；およびこれらの中で引用されている参考文献を参照されたい）。
【０１２６】
被験体における悪性状態の存在とは、例えば、当技術分野に公知であり、その診断基準および分類基準が確立されている、新生物性細胞、腫瘍細胞、非接触阻害細胞、または腫瘍形成的形質転換細胞など（例えば、腺がん、扁平細胞がん、小細胞がん、燕麦細胞がんなどの癌、軟骨肉腫、骨肉腫などの肉腫）を含めた、被験体における異形性細胞、がん性細胞、および／または形質転換細胞の存在を指す（例えば、ＨａｎａｈａｎおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、２０１１年、Ｃｅｌｌ、１４４巻：６４６頁；ＨａｎａｈａｎおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、２０００年、Ｃｅｌｌ、１００巻：５７頁；Ｃａｖａｌｌｏら、２０１１年、Ｃａｎｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、６０巻：３１９頁；Ｋｙｒｉｇｉｄｅｉｓら、２０１０年、Ｊ．  Ｃａｒｃｉｎｏｇ．、９巻：３頁）。本発明により想定される好ましい実施形態では、例えば、このようながん細胞は、混合系統系白血病、食道がん、卵巣がん、前立腺がん、腎臓がん、結腸がん、肝臓がん、胃がん、および膵臓がんの細胞でありうる。
【０１２７】
抗体およびそれらの抗原結合断片
「抗体」とは、免疫グロブリン分子の可変領域（本明細書ではまた、可変ドメインとも言及される）に位置する少なくとも１つのエピトープ認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的への特異的結合が可能な免疫グロブリン分子である。本明細書で用いられる「抗体」という用語は、完全ポリクローナル抗体または完全モノクローナル抗体だけでなく、また、それらの断片（単一可変領域抗体（ｄＡｂ）断片、またはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片などの他の公知の抗体断片など）、単鎖（ＳｃＦｖ）抗体、それらの合成変異体、自然発生の変異体、要請される特異性を有する抗原結合断片を伴う抗体の一部を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、および要請される特異性を有する抗原結合部位または抗原結合断片（エピトープ認識部位）を含む免疫グロブリン分子の、操作または修飾された他の任意の構成も包含する。また、遺伝子融合により構築される「ダイアボディー」、多価断片、または多重特異性断片（ＷＯ９４／１３８０４；Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻、６４４４〜６４４８頁、１９９３年）も、本明細書で想定される抗体の特定の形態である。本明細書ではまた、ＣＨ３ドメインに接合したｓｃＦｖを含むミニボディーも包含される（Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５６巻、３０５５〜３０６１頁、１９９６年；例えばまた、Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４〜５４６頁（１９８９年）；Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻、４２３〜４２６頁、１９８８年；Ｈｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８５巻、５８７９〜５８８３頁、１９８８年；ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５；ＷＯ９４／１３８０４；Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻、６４４４〜６４４８頁、１９９３年；Ｒｅｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１４巻、１２３９〜１２４５頁、１９９６年；Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５６巻、３０５５〜３０６１頁、１９９６年も参照されたい）。また、ナノボディーおよびマキシボディーも想定される（例えば、Ｕ．Ｓ．６，７６５，０８７；Ｕ．Ｓ．６，８３８，２５４；ＷＯ０６／０７９３７２；ＷＯ２０１０／０３７４０２を参照されたい）。
【０１２８】
本明細書で用いられる「抗原結合断片」という用語は、目的の抗原であって、本明細書で記載される特に好ましい実施形態ではＢＫＢ２Ｒ受容体である抗原に結合する、免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖のうちの少なくとも１つのＣＤＲを含有するポリペプチド断片を指す。この点で、本明細書で記載される抗体の抗原結合断片は、ＢＫＢ２Ｒに結合する抗体に由来する本明細書で示されるＶＨ配列および／またはＶＬ配列のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全てのＣＤＲを含みうる。本明細書で記載されるＢＫＢ２Ｒ特異的抗体の抗原結合断片は、ＢＫＢ２Ｒに結合することが可能である。特定の実施形態では、抗原結合断片が結合することにより、ＢＫＢ２Ｒのリガンド（複数可）（例えば、ブラジキニン（ＢＫ）、カリジン（Ｌｙｓ−ブラジキニン）のＢＫＢ２Ｒ受容体への結合が防止または阻害されることから、そうでなければリガンドの受容体への結合から結果として生じる生物学的反応が遮断される。特定の実施形態では、抗原結合断片は、ヒトＢＫＢ２Ｒに特異的に結合し、かつ／またはその生物学的活性を阻害もしくは調節する。
【０１２９】
「抗原」という用語は、抗体などの選択的結合剤が結合することが可能であり、加えて、動物において、この抗原のエピトープに結合することが可能な抗体を生成させるのに用いることが可能な分子または分子の一部を指す。抗原は、１または複数のエピトープを有しうる。
【０１３０】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体への特異的結合が可能な任意の決定基、好ましくはポリペプチド決定基を包含する。エピトープとは、抗体が結合する抗原の領域である。特定の実施形態では、エピトープ決定基には、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルなど、化学的に活性な表面分子の群分けが含まれ、特定の実施形態では、エピトープ決定基は、特異的な三次元構造的特徴、および／または特異的な電荷特徴を有しうる。特定の実施形態では、抗体は、それがタンパク質および／または高分子の複合混合物中でその標的抗原を優先的に認識する場合に、抗原に特異的に結合するという。特定の実施形態によれば、抗体は、とりわけ、抗体−抗原間結合の平衡解離定数が、１０−６Ｍ以下、または１０−７Ｍ以下、または１０−８Ｍ以下である場合に、抗原に結合するということができる。一部の実施形態では、平衡解離定数は、１０−９Ｍ以下または１０−１０Ｍ以下でありうる。
【０１３１】
タンパク質分解酵素であるパパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断して、それらのうちの２つ（Ｆ（ａｂ）断片）の各々が完全抗原結合部位を包含する、共有結合的ヘテロ二量体を含む複数の断片をもたらす。酵素であるペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、両方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片を含めた複数の断片をもたらすことが可能である。本発明の特定の実施形態に従って用いられるＦｖ断片は、ＩｇＭの優先的なタンパク質分解的切断を介して生成させうるが、まれな場合には、ＩｇＧ免疫グロブリン分子またはＩｇＡ免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断を介して生成させることもできる。しかし、Ｆｖ断片は、より一般的には、当技術分野において公知の組換え法を用いて誘導される。Ｆｖ断片は、天然抗体分子の抗原認識能および抗原結合能の大半を保持する抗原結合部位を含めた、非共有結合的ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を包含する（Ｉｎｂａｒら（１９７２年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、６９巻：２６５９〜２６６２頁；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５巻：２７０６〜２７１０頁；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９巻：４０９１〜４０９６頁）。
【０１３２】
特定の実施形態では、単鎖Ｆｖ抗体またはｓｃＦＶ抗体が想定される。例えば、カッパボディー（Ｉｌｌら、Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇ．、１０巻：９４９〜５７頁（１９９７年）；ミニボディー（Ｍａｒｔｉｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ、１３巻：５３０５〜９頁（１９９４年）；ダイアボディー（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、ＰＮＡＳ、９０巻：６４４４〜８頁（１９９３年））；またはヤヌシン（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０巻：３６５５〜５９頁（１９９１年）、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．、７巻：５１〜５２頁（１９９２年））は、所望の特異性を有する抗体の選択について本出願の教示に従い、標準的な分子生物学法を用いて調製することができる。さらに他の実施形態では、本開示のリガンドを包含する二重特異性抗体またはキメラ抗体を作製することができる。例えば、キメラ抗体が、異なる抗体に由来するＣＤＲおよびフレームワーク領域を含みうるのに対し、とりわけ、１つの結合ドメインを介してＢＫＢ２Ｒに結合し、第２の結合ドメインを介して第２の分子に結合する二重特異性抗体を生成させることができる。これらの抗体は、組換え分子生物学法を介して生成させることもでき、物理的に併せてコンジュゲートすることもできる。
【０１３３】
単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ポリペプチドとは、ペプチドをコードするリンカーにより連結されたＶＨコード遺伝子およびＶＬコード遺伝子を含めた遺伝子融合体から発現する、共有結合的に連結されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である（Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻（１６号）：５８７９〜５８８３頁）。天然では凝集した（しかし、化学的には分離される）軽鎖ポリペプチドおよび重鎖ポリペプチドを、抗体のＶ領域から、抗原結合部位の構造と実質的に類似した三次元構造へとフォールドするｓＦｖ分子へと転換する化学構造を識別する多数の方法が記載されている。例えば、Ｈｕｓｔｏｎらによる米国特許第５，０９１，５１３号および同第５，１３２，４０５号；ならびにＬａｄｎｅｒらによる米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい。
【０１３４】
抗体のｄＡｂ断片は、ＶＨドメインからなる（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４〜５４６頁（１９８９年））。
【０１３５】
特定の実施形態では、本明細書で開示される抗体（例えば、ＢＫＢ２Ｒ特異的抗体）は、ダイアボディーの形態である。ダイアボディーとは、各ポリペプチドが、免疫グロブリン軽鎖の結合領域を含む第１のドメインと、免疫グロブリン重鎖の結合領域を含む第２のドメインとを含むポリペプチドの多量体であって、２つのドメインが連結されている（例えば、ペプチドリンカーを介して）が、互いと会合して抗原結合部位を形成することは可能でなく、抗原結合部位が、多量体内の一方のポリペプチドの第１のドメインの、多量体内の別のポリペプチドの第２のドメインとの会合により形成される多量体である（ＷＯ９４／１３８０４）。
【０１３６】
二重特異性抗体を用いる場合、これらは、多様な方法（ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４巻、４４６〜４４９頁（１９９３年））で作製しうる、例えば、化学的に調製されるか、またはハイブリッド体であるハイブリドーマから調製される、従来の二重特異性抗体の場合もあり、上記で言及した二重特異性抗体断片のうちのいずれかの場合もある。ダイアボディーおよびｓｃＦｖは、このような抗体の投与を受ける被験体における抗イディオタイプ反応などの免疫反応が誘発される可能性または誘発される免疫反応の重症度を潜在的に低減または軽減する可変領域だけを用いて、Ｆｃ領域なしに構築することができる。
【０１３７】
二重特異性完全抗体と対比した二重特異性ダイアボディーはまた、それらを容易に構築し、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させうるため、特に有用でもある。適切な結合特異性を有するダイアボディー（および抗体断片など、他の多くのポリペプチド）は、ファージディスプレイ（ＷＯ９４／１３８０４）を用いて、ライブラリーから容易に選択することができる。ダイアボディーの一方のアームを、例えば、抗原Ｘを指向する特異性により定常に保つ場合、他方のアームを変化させて適切な特異性を有する抗体を選択するライブラリーを作製することができる。二重特異性完全抗体は、ＫＩＨ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）法を介して作製することができる（Ｒｉｄｇｅｗａｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、９巻、６１６〜６２１頁、１９９６年）。
【０１３８】
特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体を、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）の形態で提供することができる。ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）とは、ヒンジ領域を除去したＩｇＧ４抗体である（ＧｅｎＭａｂ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓを参照されたい；例えばまた、ＵＳ／２００９／０２２６４２１も参照されたい）。この特許化抗体法は、現行の低分子抗体フォーマットより治療域が長いと予測される、安定的で、より低分子の抗体形態を創出する。ＩｇＧ４抗体は、不活性であり、したがって、免疫系とは相互作用しないと考えられる。完全ヒトＩｇＧ４抗体は、抗体のヒンジ領域を消失させて、対応する完全ＩｇＧ４と比べて顕著な安定性特性を有する半分子断片を得ることにより改変することができる（ＧｅｎＭａｂ、Ｕｔｒｅｃｈｔ）。ＩｇＧ４分子を二等分することにより、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）には、コグネイト抗原（例えば、疾患の標的）に結合しうる１つの領域だけが残され、したがって、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、標的細胞における１つの部位だけに一価結合する。特定のがん細胞の表面抗原では、この一価結合は、同じ抗原特異性を有する二価抗体を用いるときに見られうるようながん細胞の成長を刺激せず、よって、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）法は、従来の抗体による処置に対して不応性でありうる一部の種類のがんのための処置の選択肢をもたらしうる。ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、通常のＩｇＧ４抗体の約半分のサイズである。このようにサイズが小さいことは、一部の形態のがんを処置し、より大型の充実性腫瘍にわたる分子の良好な分布を可能とし、潜在的に有効性を増大させる場合に大きな有益性でありうる。
【０１３９】
特定の実施形態では、本開示の抗体は、ナノボディーの形態をとりうる。ナノボディーは、単一の遺伝子によりコードされ、ほぼ全ての原核生物宿主および真核生物宿主、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、米国特許第６，７６５，０８７号を参照されたい）、かび（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属）、および酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、またはＰｉｃｈｉａ属（例えば、米国特許第６，８３８，２５４号を参照されたい））において効率的に生成する。生成過程は拡大可能であり、数キログラム量のナノボディーを生成させている。ナノボディーは、保管寿命の長いＲＴＵ（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）溶液として調合することができる。Ｎａｎｏｃｌｏｎｅ（商標）法（例えば、ＷＯ０６／０７９３７２を参照されたい）とは、Ｂ細胞の自動式ハイスループット選択に基づき、所望の標的に対するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（商標）を生成させる特許化方法である。
【０１４０】
特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体およびそれらの抗原結合断片は、ＣＤＲに対する支持体をもたらし、互いと比べたＣＤＲの空間関係を規定する、重鎖フレームワーク領域および軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）のセットのそれぞれの間に挿入される、重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲのセットを包含する。本明細書で用いられる「ＣＤＲセット」という用語は、重鎖Ｖ領域または軽鎖Ｖ領域の３つずつの超可変領域を指す。重鎖または軽鎖のＮ末端から順に、これらの領域を、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と称する。したがって、抗原結合部位は、各重鎖Ｖ領域および各軽鎖Ｖ領域に由来するＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを包含する。本明細書では、単一のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドを「分子的認識単位」と称する。多数の抗原−抗体複合体の結晶構造解析により、ＣＤＲのアミノ酸残基は、結合した抗原との広範な接触であって、抗原との最も広範な接触が重鎖ＣＤＲ３との接触である抗原との接触を形成することが裏付けられている。したがって、分子的認識単位は、抗原結合部位の特異性の主要な一因をなす。
【０１４１】
本明細書で用いられる「ＦＲセット」という用語は、重鎖Ｖ領域または軽鎖Ｖ領域のＣＤＲセットのＣＤＲを枠づけて挟み込む４つのアミノ酸配列を指す。一部のＦＲ残基は、結合した抗原に接触するが、ＦＲ、特に、ＣＤＲに直接隣接するＦＲ残基は、Ｖ領域を抗原結合部位へとフォールドさせる主要な一因をなす。ＦＲ内では、特定のアミノ酸残基および特定の構造特色が極めて高度に保存される。この点で、全てのＶ領域配列は、約９０アミノ酸残基の内部のジスルフィドループを含有する。Ｖ領域が結合部位へとフォールドすると、ＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突出ループモチーフとして提示される。一般に、ＣＤＲループが特定の「カノニカル」構造（ＣＤＲの正確なアミノ酸配列に関わらず）へとフォールドする形状に影響を及ぼす、ＦＲの保存的構造領域が存在することが認知されている。さらに、特定のＦＲ残基は、抗体の重鎖と軽鎖との相互作用を安定化させる非共有結合的なドメイン間接触に関与することも公知である。
【０１４２】
免疫グロブリン可変領域の構造および位置は、Ｋａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、４版、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９８７年、および現在ではインターネット（ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ）で入手可能なその改定版を参照することにより決定することができる。
【０１４３】
「モノクローナル抗体」とは、均一な抗体集団であって、エピトープの選択的結合に関与するアミノ酸（自然発生アミノ酸および非自然発生アミノ酸）を含む抗体集団を指す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一のエピトープを指向する。「モノクローナル抗体」という用語は、完全モノクローナル抗体および全長モノクローナル抗体だけでなく、また、それらの断片（Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片など）、単鎖（ＳｃＦｖ）抗体、それらの変異体、抗原結合部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ならびにエピトープに結合するのに要請される特異性およびエピトープに結合する能力を有する抗原結合断片（エピトープ認識部位）を含む免疫グロブリン分子の他の任意の修飾された構成も包含する。抗体の供給源または抗体が作製される方式（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物などを介する）に関して限定することは意図しない。この用語は、完全免疫グロブリンのほか、上記の断片なども包含する。
【０１４４】
「ヒト化」抗体とは、一般に組換え法を用いて調製され、抗原結合部位がヒト以外の種に由来する免疫グロブリンに由来し、残りの免疫グロブリン分子の構造がヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づくキメラ分子を指す。抗原結合部位は、定常ドメインへと融合させた完全可変領域を含む場合もあり、可変ドメインにおける適切なフレームワーク領域へと移植したＣＤＲだけを含む場合もある。エピトープ結合部位は、野生型の場合もあり、１または複数のアミノ酸置換を介して修飾する場合もある。このキメラ構造は、ヒト個体における免疫原としての非ヒト由来の定常領域は消失させるが、外来の可変領域に対する免疫反応の可能性は残る（ＬｏＢｕｇｌｉｏら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８６巻：４２２０〜４２２４頁；Ｑｕｅｅｎら、ＰＮＡＳ（１９８８年）、８６巻：１００２９〜１００３３頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８年）、３３２巻：３２３〜３２７頁）。本発明の特定の実施形態による例示的ヒト化抗体は、配列番号３〜１２および８３〜９２に示されるヒト化配列を含む。
【０１４５】
別の手法は、ヒト由来の定常領域をもたらすことだけでなく、また、それらをヒト形態に可能な限り酷似させて作り変えるように、可変領域の修飾にも同様に焦点を絞る。また上記で言及した通り、重鎖および軽鎖両方の可変領域が、所与の種において比較的保存され、ＣＤＲの足場をもたらすと推定される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）に挟まれ、問題のエピトープに応じて変化し、結合能を決定する、３つずつの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有することも公知である。特定のエピトープに対する非ヒト抗体を調製する場合、非ヒト抗体に由来するＣＤＲを、改変されるヒト抗体に存在するＦＲに移植することにより、可変領域を「作り変える」または「ヒト化する」場合がある。この手法の多様な抗体への適用は、Ｓａｔｏら（１９９３年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５３巻：８５１〜８５６頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８年）、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら（１９９１年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、４巻：７７３〜３７８３頁；Ｍａｅｄａら（１９９１年）、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、２巻：１２４〜１３４頁；Ｇｏｒｍａｎら（１９９１年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８８巻：４１８１〜４１８５頁；Ｔｅｍｐｅｓｔら（１９９１年）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻：２６６〜２７１頁；Ｃｏら（１９９１年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８８巻：２８６９〜２８７３頁；Ｃａｒｔｅｒら（１９９２年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８９巻：４２８５〜４２８９頁；およびＣｏら（１９９２年）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４８巻：１１４９〜１１５４頁により報告されている。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、全てのＣＤＲ配列（例えば、マウス抗体に由来する６つのＣＤＲ全てを含有するヒト化マウス抗体）を保存する。他の実施形態では、ヒト化抗体は、１または複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ）であって、元の抗体に対して変化させたＣＤＲ、また、元の抗体からの１または複数のＣＤＲ「に由来する」１または複数のＣＤＲとも称するＣＤＲを有する。
【０１４６】
特定の実施形態では、本開示の抗体は、キメラ抗体でありうる。この点で、キメラ抗体は、異なる抗体の異種Ｆｃ部分に作動可能に連結したか、または他の形で融合させた抗ＢＫＢ２Ｒ抗体の抗原結合断片を含む。特定の実施形態では、異種Ｆｃドメインは、ヒト由来である。他の実施形態では、異種Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含めた）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含めた）、およびＩｇＭを含めた親抗体以外のＩｇクラスに由来しうる。特定の実施形態では、異種Ｆｃドメインは、異なるＩｇクラスのうちの１または複数に由来するＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含みうる。ヒト化抗体について上記で言及した通り、抗ＢＫＢ２Ｒキメラ抗体の抗原結合断片は、本明細書で記載される抗体のＣＤＲのうちの１または複数（例えば、本明細書で記載される抗体の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ）だけを含む場合もあり、可変ドメイン（ＶＬ、ＶＨ、またはこれらの両方）の全体を含む場合もある。
【０１４７】
特定の実施形態では、ＢＫＢ２Ｒ結合抗体は、本明細書で記載される抗体のＣＤＲのうちの１または複数を含む。この点で、場合によっては、所望の特異的結合をなお保持しながら、抗体のＶＨＣＤＲ３だけを移動させうることが示されている（Ｂａｒｂａｓら、ＰＮＡＳ（１９９５年）、９２巻：２５２９〜２５３３頁）。また、ＭｃＬａｎｅら、ＰＮＡＳ（１９９５年）、９２巻：５２１４〜５２１８頁、Ｂａｒｂａｓら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．（１９９４年）、１１６巻：２１６１〜２１６２頁も参照されたい。
【０１４８】
Ｍａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９２年、１０巻：７７９〜７８３頁）は、抗体可変ドメインのレパートリーを作製する方法であって、可変ドメイン領域の５’端を指向するかまたはこれに隣接するコンセンサスプライマーを、ヒトＶＨ遺伝子の第３のフレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーと共に用いて、ＣＤＲ３を欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーを作製する方法について記載している。Ｍａｒｋｓらはさらに、どのようにしてこのレパートリーを、特定の抗体のＣＤＲ３と組み合わせうるかについても記載している。類似の技法を用いて、本明細書で記載されている抗体のＣＤＲ３に由来する配列を、ＣＤＲ３を欠くＶＨドメインまたはＶＬドメインのレパートリーと共にシャッフルし、シャッフルされた完全ＶＨドメインまたは完全ＶＬドメインを、コグネイトＶＬドメインまたはコグネイトＶＨドメインと組み合わせて、ＢＫＢ２Ｒに結合する抗体またはその抗原結合断片をもたらすことができる。次いで、適切な抗体またはそれらの抗原結合断片を選択しうるように、ＷＯ９２／０１０４７のファージディスプレイシステムなど、適切な宿主システムによりレパートリーを提示することができる。レパートリーは、少なくとも約１０４およびこれを複数桁上回る個別のメンバー、例えば、約１０６〜１０８または１０１０以上のメンバーからなりうる。また、Ｓｔｅｍｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ、１９９４年、３７０巻：３８９〜３９１頁）は、類似のシャフリング法またはコンビナトリアル法も開示しており、この技法を、β−ラクタマーゼ遺伝子との関連で記載し、この手法を抗体の生成に用いうることを観察している。
【０１４９】
さらなる代替法は、１または複数の選択されたＶＨ遺伝子および／またはＶＬ遺伝子に対するランダム突然変異誘発であって、可変ドメインの全体において突然変異を発生させる突然変異誘発を用いて、本明細書で記載される本発明の実施形態の１または複数のＣＤＲに由来する配列を保有する新規のＶＨ領域またはＶＬ領域を生成させる方法である。このような技法は、エラープローンＰＣＲを用いたＧｒａｍら（１９９２年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：３５７６〜３５８０頁）により記載されている。用いうる別の方法は、突然変異誘発をＶＨ遺伝子またはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域へと方向付ける方法である。このような技法は、Ｂａｒｂａｓら（１９９４年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９１巻：３８０９〜３８１３頁）およびＳｃｈｉｅｒら（１９９６年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２６３巻：５５１〜５６７頁）により開示されている。
【０１５０】
特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体の特異的ＶＨおよび／または特異的ＶＬを用いて、相補的な可変ドメインのライブラリーをスクリーニングして、ＢＫＢ２Ｒに対するアフィニティーの増大など、所望の特性を伴う抗体を同定することができる。このような方法は、例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３年）、１５０巻：８８０〜８８７頁；およびＣｌａｒｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９１年）、３５２巻：６２４〜６２８頁に記載されている。
【０１５１】
また、他の方法を用いてＣＤＲをミックスアンドマッチさせて、ＢＫＢ２Ｒへの結合などの所望の結合活性を有する抗体を同定することもできる。例えば、Ｋｌｉｍｋａら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（２０００年）、８３巻：２５２〜２６０頁は、マウスＶＬと、ＣＤＲ３およびＦＲ４をマウスＶＨから保持したヒトＶＨライブラリーとを用いるスクリーニング過程について記載している。抗体を得た後、ＶＨをヒトＶＬライブラリーに照らしてスクリーニングして、抗原に結合する抗体が得られた。Ｂｅｉｂｏｅｒら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（２０００年）、２９６巻：８３３〜８４９頁は、マウス重鎖の全体とヒト軽鎖ライブラリーとを用いるスクリーニング過程について記載している。抗体を得た後、１つのＶＬを、マウスのＣＤＲ３を保持したヒトＶＨライブラリーと組み合わせた。抗原に結合することが可能な抗体が得られた。Ｒａｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（１９９８年）、９５巻：８９１０〜８９１５頁は、上記のＢｅｉｂｏｅｒらの過程と同様の過程について記載している。
【０１５２】
当技術分野では、記載したばかりのこれらの技法が、それら自体において、それら自体で、それら自体として公知である。しかし、本開示に基づき、当業者は、当技術分野の日常的な方法を用いて、本明細書で記載される本発明の複数の実施形態に従い、抗体またはそれらの抗原結合断片を得るのに、このような技法を用いることが可能である。
【０１５３】
本明細書ではまた、ＢＫＢ２Ｒ抗原に特異的な抗体の抗原結合ドメインを得るための方法であって、本明細書で示されるＶＨドメインのアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸を付加、欠失、置換、または挿入することにより、このＶＨドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＨドメインをもたらすことを含む方法も開示される。場合によっては、このようにして提供されるＶＨドメインを、１または複数のＶＬドメインと組み合わせることができる。次いで、ＶＨドメインまたは１もしくは複数のＶＨ／ＶＬの組合せを調べて、ＢＫＢ２Ｒの特異的結合メンバー、またはＢＫＢ２Ｒに特異的であり、場合によって、１または複数の好ましい特性もさらに有する抗体の抗原結合ドメインを同定することができる。前記ＶＬドメインは、本明細書で実質的に示されるアミノ酸配列を有しうる。類似の方法であって、本明細書で開示されるＶＬドメインの１または複数の配列変異体を、１または複数のＶＨドメインと組み合わせる方法も用いることができる。
【０１５４】
抗体またはポリペプチドに「特異的に結合する」か、またはこれに「優先的に結合する」（本明細書では互換的に用いられる）エピトープとは、当技術分野において十分に理解された用語であり、当技術分野ではまた、このような特異的な結合または優先的な結合を決定する方法も周知である。分子は、それが、特定の細胞または物質と、代替的な細胞または物質との場合より高頻度で、より迅速に、より長い持続期間にわたり、かつ／またはより大きなアフィニティーで反応または会合する場合、「特異的結合」または「優先的結合」を呈示するという。抗体は、それが、他の物質に結合する場合より大きなアフィニティー、アビディティーで、より容易に、かつ／またはより長い持続期間にわたり結合する場合、標的に「特異的に結合する」か、またはこれに「優先的に結合する」。例えば、特定のＢＫＢ２Ｒエピトープに特異的または優先的に結合する抗体とは、１つのＢＫＢ２Ｒエピトープに、他のＢＫＢ２ＲエピトープまたはＢＫＢ２Ｒ以外のエピトープに結合する場合より大きなアフィニティー、アビディティーで、より容易に、かつ／またはより長い持続期間にわたり結合する抗体である。また、この定義を読み取ることにより、例えば、第１の標的に特異的または優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）が、第２の標的に特異的または優先的に結合する場合もあり、結合しない場合もあることも理解される。したがって、「特異的結合」または「優先的結合」は、必ずしも排他的結合を要請するわけではない（排他的結合を包含しうるが）。一般に、結合に対する言及は、優先的結合を意味するが、必ずしもそうであるわけではない。
【０１５５】
免疫的結合とは一般に、免疫グロブリン分子と、この免疫グロブリンがそれに対して特異的である抗原との間で、例えば、例示として述べるものであり、限定として述べるものではないが、静電引力もしくは静電斥力、イオン性引力もしくはイオン性斥力、親水性引力もしくは親水性斥力、および／または疎水性引力もしくは疎水性斥力、立体斥力、水素結合、ファンデルワールス力、ならびに他の相互作用の結果として生じる種類の非共有結合的相互作用を指す。免疫的結合相互作用の強度またはアフィニティーは、この相互作用の解離定数（Ｋｄ）であって、低値のＫｄが大きなアフィニティーを表すＫｄとの関連で表現することができる。選択したポリペプチドの免疫的結合特性は、当技術分野で周知の方法を用いて定量化することができる。このような一方法は、抗原結合部位／抗原の複合体形成および解離の速度を測定することを伴い、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用のアフィニティー、および  いずれの方向の速度にも同等に影響を及ぼす幾何学的パラメータに依存する。こうして、「オン速度定数」（Ｋｏｎ）および「オフ速度定数」（Ｋｏｆｆ）のいずれも、濃度ならびに会合速度および解離速度の実測値を計算することにより決定することができる。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、アフィニティーと関連しない全てのパラメータの相殺を可能とし、したがって、解離定数Ｋｄと同等である。一般に、Ｄａｖｉｅｓら（１９９０年）、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５９巻：４３９〜４７３頁を参照されたい。
【０１５６】
免疫的に活性であるかまたは「免疫的活性を維持する」エピトープに言及する場合の「免疫的に活性な」という用語は、抗体（例えば、抗ＢＫＢ２Ｒ抗体）が、異なる条件下で、例えば、エピトープを還元条件および変性条件にかけた後でエピトープに結合する能力を指す。
【０１５７】
本出願の特定の好ましい実施形態による抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）抗原に特異的に結合し、かつ、（ｉｉ）本明細書で開示されるＶＨドメインおよび／もしくはＶＬドメインを含むか、または本明細書で開示されるＶＨ  ＣＤＲ３、もしくはこれらのうちのいずれかの変異体を含む、本明細書で記載される任意の抗体と、ＢＫＢ２Ｒへの結合について競合する抗体またはその抗原結合断片でありうる。結合メンバー間の競合は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて、かつ／または特定のレポーター分子であって、他のタグ付けされない結合メンバー（複数可）の存在下において検出され、同じエピトープもしくは重複エピトープに結合する特異的結合メンバーの同定を可能としうるレポーター分子を１つの結合メンバーへとタグ付けすることにより、容易にアッセイすることができる。
【０１５８】
したがって、本明細書では、本明細書の実施例において記載される抗体（例えば、クローン５Ｆ１２Ｇ１およびそのヒト化誘導体、例えば、Ｈ１／Ｌ１、Ｈ２／Ｌ２、Ｈ３７／Ｌ３７、Ｈ３８／Ｌ３８、Ｈ３９／Ｌ３９）など、ＢＫＢ２Ｒに結合する、本明細書で記載される抗体と競合する、抗体の抗原結合部位を含む特異的な抗体またはその抗原結合断片が提供される。
【０１５９】
免疫グロブリンの定常領域は、可変領域ほど配列多様性を示さず、重要な生化学イベントを誘発する多数の天然のタンパク質の結合の一因である。ヒトでは、ＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を包含する）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を包含する）、およびＩｇＭを含めた、抗体の５つの異なるクラスが存在する。Ｖ領域にも微妙な差違が存在しうるが、これらの抗体クラスの間の識別特色はそれらの定常領域である。
【０１６０】
抗体のＦｃ領域は、多数のＦｃ受容体およびリガンドと相互作用し、エフェクター機能と称する一連の重要な機能的能力を付与する。ＩｇＧの場合、Ｆｃ領域は、ＩｇドメインのＣＨ２およびＣＨ３、ならびにＣＨ２へと連なるＮ末端のヒンジを含む。ＩｇＧクラスのＦｃ受容体の重要なファミリーは、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）である。これらの受容体は、抗体と免疫系の細胞性アームとの間のコミュニケーションを媒介する（Ｒａｇｈａｖａｎら、１９９６年、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、１２巻：１８１〜２２０頁；Ｒａｖｅｔｃｈら、２００１年、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９巻：２７５〜２９０頁）。ヒトでは、このタンパク質ファミリーは、アイソフォームであるＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、およびＦｃγＲＩｃを含めたＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームであるＦｃγＲＩＩａ（アロタイプであるＨ１３１およりＲ１３１を含めた）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含めた）、およびＦｃγＲＩＩｃを含めたＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；ならびにアイソフォームであるＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプであるＶ１５８およびＦ１５８を含めた）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプであるＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含めた）を含めたＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を包含する（Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、２００２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ、８２巻：５７〜６５頁）。これらの受容体は、典型的に、Ｆｃへの結合を媒介する細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞内の一部のシグナル伝達イベントを媒介しうる細胞内ドメインを有する。これらの受容体は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびＴ細胞を含めた多様な免疫細胞において発現する。Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成により、これらのエフェクター細胞は、抗原が結合した部位へと動員され、この結果として典型的に、細胞内ではシグナル伝達イベントがもたらされ、炎症メディエーターの放出、Ｂ細胞の活性化、エンドサイトーシス、食作用、および細胞傷害性の攻撃など、その後の重要な免疫反応がもたらされる。
【０１６１】
細胞傷害エフェクター機能および食作用エフェクター機能を媒介する能力は、抗体が標的とする細胞を破壊する潜在的な機構である。ＦｃγＲを発現させる非特異的な細胞傷害性細胞が、標的細胞に結合した抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす細胞介在性反応を、抗体依存性介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）と称する（Ｒａｇｈａｖａｎら、１９９６年、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、１２巻：１８１〜２２０頁；Ｇｈｅｔｉｅら、２０００年、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８巻：７３９〜７６６頁；Ｒａｖｅｔｃｈら、２００１年、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９巻：２７５〜２９０頁）。ＦｃγＲを発現させる非特異的な細胞傷害性細胞が、標的細胞に結合した抗体を認識し、その後標的細胞の食作用を引き起こす細胞介在性反応を、抗体依存性細胞介在性食作用（ＡＤＣＰ）と称する。全てのＦｃγＲは、Ｆｃ上の同じ領域である、Ｃｇ２（ＣＨ２）ドメインのＮ末端および上流のヒンジに結合する。この相互作用は、構造的に十分特徴付けられており（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら、２００１年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、３０９巻：７３７〜７４９頁）、ヒトＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインに結合したヒトＦｃの複数の構造が解明されている（ｐｄｂ受託コード：１Ｅ４Ｋ）（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら、２０００年、Ｎａｔｕｒｅ、４０６巻：２６７〜２７３頁）（ｐｄｂ受託コード：１ＩＩＳおよび１ＩＩＸ）（Ｒａｄａｅｖら、２００１年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７６巻：１６４６９〜１６４７７頁）。
【０１６２】
異なるＩｇＧサブクラスは、ＦｃγＲに対して異なるアフィニティーを有し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３のＦｃγＲ受容体に対する結合は、典型的に、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の場合より実質的に強い（Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、２００２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ、８２巻：５７〜６５頁）。全てのＦｃγＲは、ＩｇＧ  Ｆｃの同じ領域に結合するが、アフィニティーが異なる：高アフィニティーで結合するＦｃγＲＩのＩｇＧ１に対するＫｄが１０−８Ｍ−１であるのに対し、低アフィニティーの受容体であるＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは一般に、それぞれ、１０−６および１０−５で結合する。ＦｃγＲＩＩＩａの細胞外ドメインとＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインとは９６％同一であるが、ＦｃγＲＩＩＩｂは、細胞内シグナル伝達ドメインを有さない。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｃ、およびＦｃγＲＩＩＩａが、免疫複合体により誘発される活性化の正の制御因子であり、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞内ドメインを有することを特徴とするのに対し、ＦｃγＲＩＩｂは、免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、したがって、阻害性である。したがって、前者を活性化受容体と称し、ＦｃγＲＩＩｂを、阻害性受容体と称する。異なる免疫細胞ではまた、受容体の発現パターンおよび発現レベルも異なる。
【０１６３】
複雑性のさらに別のレベルは、ヒトプロテオームにおける多数のＦｃγＲ多型の存在である。臨床的な重要性を伴う特に関与性の多型は、Ｖ１５８／Ｆ１５８  ＦｃγＲＩＩＩａである。ヒトＩｇＧ１は、Ｆ１５８アロタイプに対する場合より大きなアフィニティーでＶ１５８アロタイプに結合する。このアフィニティーの差違、ならびに、おそらくはＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰに対するその効果の差違は、抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブ（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの登録商標であるＲｉｔｕｘａｎ（登録商標））の有効性の重要な決定要因であることが示されている。Ｖ１５８アロタイプを有する患者は、リツキシマブ処置に対する応答が良好であるが、低アフィニティーであるＦ１５８アロタイプを有する患者の応答は良好でない（Ｃａｒｔｒｏｎら、２００２年、Ｂｌｏｏｄ、９９巻：７５４〜７５８頁）。ヒトのうちのおよそ１０〜２０％はＶ１５８／Ｖ１５８ホモ接合性であり、４５％はＶ１５８／Ｆ１５８ヘテロ接合性であり、ヒトのうちの３５〜４５％はＦ１５８／Ｆ１５８ホモ接合性である（Ｌｅｈｒｎｂｅｃｈｅｒら、１９９９年、Ｂｌｏｏｄ、９４巻：４２２０〜４２３２頁；Ｃａｒｔｒｏｎら、２００２年、Ｂｌｏｏｄ、９９巻：７５４〜７５８頁）。したがって、ヒトのうちの８０〜９０％は応答不良例である、すなわち、少なくとも１つのＦ１５８  ＦｃγＲＩＩＩａ対立遺伝子を有する。
【０１６４】
Ｆｃ領域はまた、補体カスケードの活性化にも関与する。古典的な補体経路では、Ｃ１が、ＩｇＧまたはＩｇＭのＦｃ断片に対するそのＣ１ｑサブユニットであって、抗原（複数可）と複合体を形成したＣ１ｑサブユニットと結合する。本発明の特定の実施形態では、Ｆｃ領域に対する修飾が、本明細書で記載されるＢＫＢ２Ｒ特異的抗体が補体系を活性化する能力を変化させる（増強または減殺する）修飾を含む（例えば、米国特許第７，７４０，８４７号を参照されたい）。補体の活性化を評価するためには、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）アッセイを実施することができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．、２０２巻：１６３頁（１９９６年）を参照されたい）。例えば、多様な濃度の（Ｆｃ）変異体ポリペプチドおよびヒト補体を、緩衝液で希釈することができる。（Ｆｃ）変異体抗体、希釈したヒト補体、および抗原（ＢＫＢ２Ｒ）を発現させる細胞の混合物を、平底の組織培養用９６ウェルプレートに添加し、３７℃および５％ＣＯ２で２時間にわたりインキュベートして、補体介在性細胞溶解を促進することができる。次いで、５０マイクロリットルのアラマーブルー（Ａｃｃｕｍｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を各ウェルに添加し、３７℃で一晩にわたりインキュベートすることができる。吸光度は、励起波長を５３０ｎｍとし、発光波長を５９０ｎｍとする９６ウェル蛍光測定器を用いて測定することができる。結果は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表すことができる。試料濃度は、検量線から計算し、変異体でない抗体と比較した活性百分率を、目的の変異体抗体について報告することができる。
【０１６５】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣの増強、または特定のＦｃγＲに対する結合アフィニティーの増強などの機能的特性を変化させた、修飾Ｆｃ領域を有する抗ＢＫＢ２Ｒ抗体を提供する。Ｆｃ領域の例示的な修飾には、例えば、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎら、２００７年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６７巻：８８８２頁において記載される修飾が含まれる。本明細書で想定される他の修飾Ｆｃ領域は、例えば、取得された米国特許第７，３１７，０９１号；同第７，６５７，３８０号；同第７，６６２，９２５号；同第６，５３８，１２４号；同第６，５２８，６２４号；同第７，２９７，７７５号；同第７，３６４，７３１号；米国出願公開第ＵＳ２００９０９２５９９号；同第ＵＳ２００８０１３１４３５号；同第ＵＳ２００８０１３８３４４号；および国際出願公開第ＷＯ２００６／１０５３３８号；同第ＷＯ２００４／０６３３５１号；同第ＷＯ２００６／０８８４９４号；同第ＷＯ２００７／０２４２４９において記載されている。
【０１６６】
抗ＢＫＢ２Ｒ抗体の所望の機能的特性は、ＢＫＢ２Ｒ発現細胞によるカルシウム放出、アフィニティー／結合アッセイ（例えば、表面プラズモン共鳴、競合的阻害アッセイ）、細胞傷害作用アッセイ、細胞生存度アッセイ（例えば、Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ、ヨウ化プロピジウムなどの色素排除を用いるアッセイ）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルまたはｉｎ  ｖｉｖｏモデル（例えば、細胞増殖および／またはコロニー形成アッセイ、アンカー形成依存性増殖アッセイ、標準的ヒト腫瘍異種移植モデル）を用いるがん細胞および／または腫瘍の成長阻害が含まれるがこれらに限定されない、当業者に公知の多様な方法を用いて評価することができる（例えば、Ｃｕｌｐ  ＰＡら、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１６巻（２号）：４９７〜５０８頁を参照されたい）。細胞内グリコーゲン合成についてのアッセイ、および／またはＧＳＫ−３β阻害の指標としての、ＧＳＫ−３βのセリン９におけるリン酸化のＥＬＩＳＡを介する決定のためのアッセイなど、他のアッセイでは、本明細書で記載される抗体が通常のＢＫＢ２Ｒを介する反応を遮断する能力を調べることができる。このようなアッセイは、本明細書における開示および当技術分野における知識に基づき、例えば、当業者に公知の十分に確立されたプロトコール（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．  Ａｓｓｏｃ．  Ｉｎｃ．  ＆  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＮＹ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａｄａ  Ｍ．  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄａｖｉｄ  Ｈ．  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅｔｈａｎ  Ｍ．  Ｓｈｅｖａｃｈ編、Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ、２００１年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、ＮＹを参照されたい）を用いて実施することもでき、市販のキットを用いて実施することもできる。
【０１６７】
一実施形態では、本明細書で記載される抗ＢＫＢ２Ｒ抗体は、キニン（ブラジキニンおよびカリジン（Ｌｙｓ−ブラジキニン））またはＢＫＢ２Ｒに対する他の任意のリガンドのＢＫＢ２Ｒ受容体への結合を遮断する。結合アッセイおよび競合的阻害アッセイを用いて、本明細書で記載される抗体、またははそれらの変異体もしくは抗原結合断片の遮断活性を決定することができる。
【０１６８】
特定の実施形態では、本明細書で記載される抗ＢＫＢ２Ｒ抗体は、ＢＫＢ２Ｒに結合し、ＢＫＢ２Ｒシグナル伝達経路における下流のシグナル伝達イベントを刺激するか、活性化するか、または他の形で誘導する。具体的な実施形態では、抗ＢＫＢ２Ｒ抗体によりもたらされるＢＫＢ２Ｒシグナル伝達の刺激レベルが、ＢＫＢ２Ｒを介するシグナル伝達レベルにおける、本明細書で開示される抗ＢＫＢ２Ｒ抗体の非存在下におけるＢＫＢ２Ｒシグナル伝達レベルと比べて統計学的に有意な、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の上昇でありうる。特定の実施形態では、ＢＫＢ２Ｒシグナル伝達の刺激レベルにおける統計学的に有意な上昇が、本明細書で開示される抗ＢＫＢ２Ｒ抗体の非存在下において検出可能なレベルを少なくとも１００％超えて過剰であることが可能であり、これは、場合によって、２００％、３００％以上の上昇でありうる。
【０１６９】
したがって、本開示は、ＧＳＫ−３βシグナル伝達経路の構成要素を調節する抗ＢＫＢ２Ｒ抗体を提供する。「調節する」とは、ＧＳＫ−３βシグナル伝達経路の構成要素の活性、タンパク質レベル、遺伝子発現レベル、またはリン酸化状態を統計学的に有意な形で変化させる（例えば、適切な対照を用いて測定すると、統計学的に有意な形で阻害するか、または統計学的に有意な形で上昇させる）ことを意味する。Ｇタンパク質共役受容体であるＢＫＢ２Ｒの構成要素は、セリン９におけるＧＳＫ−３βのリン酸化および脱活性化が含まれるがこれらに限定されない、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路を介する下流のシグナル伝達イベントを誘導する。
【０１７０】
特定の実施形態では、ＢＫＢ２Ｒシグナル伝達経路の構成要素の調節が、この経路の１または複数の構成要素のリン酸化状態の調節を含みうる。特定の実施形態では、本発明の抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のＢＫＢ２Ｒ受容体への結合が、セリン９におけるＧＳＫ−３βのリン酸化の増大およびその脱活性化を統計学的に有意な形で引き起こしうる。
【０１７１】
当技術分野では、抗体が、ＢＫＢ２Ｒシグナル伝達を変化させる（例えば、統計学的に有意な形で増大または減少させる）かどうかを決定するためのｉｎ  ｖｉｖｏアッセイおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが公知である。例えば、カルシウム動員誘導アッセイなど、細胞ベースのアッセイ、または本明細書で記載される抗ＢＫＢ２Ｒ抗体または他の関与性の刺激による誘導後の細胞溶解物におけるＧＳＫ−３βなど、ＢＫＢ２Ｒと関連する経路の構成要素の免疫化学的検出を用いるアッセイを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＢＫＢ２Ｒシグナル伝達レベルを測定することができる（例えば、Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ（登録商標）ＧＳＫ−３β酵素免疫測定アッセイ；Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）。このようなアッセイの例についてはまた、本明細書の実施例１および９でも記載される。また、ＢＫＢ２Ｒ結合抗体が存在する場合の、ＢＫまたはカリジンなどのＢＫＢ２Ｒリガンドの存在下におけるＢＫＢ２Ｒシグナル伝達レベルも、ＢＫＢ２Ｒ結合抗体が存在しない場合のシグナル伝達レベルと比較することができる。本明細書の実施例では、抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体のＢＫＢ２Ｒシグナル伝達に対する効果を評価するための細胞ベースのアッセイの使用についての非限定的な特定の例が提示される。加えて、ＢＫＢ２Ｒ結合抗体のシグナル伝達に対する効果は、ＧＳＫ−３βが関与する認知された経路のうちの１または複数など、ＢＫＢ２Ｒと関連する経路の構成要素により制御される遺伝子の発現レベルに対する抗体の効果を測定することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて測定することもでき、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて測定することもできる。当業者には、ＢＫＢ２Ｒシグナル伝達経路の構成要素の調節を決定するための他のアッセイおよび市販のシステムが公知である。
【０１７２】
特定の実施形態では、本発明は、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合断片をコードする単離核酸、例えば、ＣＤＲまたはＶＨドメインもしくはＶＬドメインをコードする核酸を提供する。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。これらの実施形態および類縁の実施形態は、本明細書で記載されるＢＫＢ２Ｒに結合する抗体をコードするポリヌクレオチドを包含しうる。本明細書で用いられる「単離ポリヌクレオチド」という用語は、ゲノム由来、ｃＤＮＡ由来、もしくは合成由来、またはこれらの何らかの組合せであるポリヌクレオチドであって、その由来により、（１）その単離ポリヌクレオチドが天然において見出されるポリヌクレオチドの全部または一部と会合しないか、（２）天然ではそれが連結されないポリヌクレオチドに連結されるか、または（３）天然でより長大な配列の一部としては生じないポリヌクレオチドを意味するものとする。
【０１７３】
「作動可能に連結した」という用語は、この用語が適用される構成要素が、適切な条件下でそれらがそれらの固有の機能を果たすことを可能とする関係にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結した」転写制御配列は、タンパク質コード配列の発現を、制御配列の転写活性と適合可能な条件下で達成するように、タンパク質コード配列にライゲーションされる。
【０１７４】
本明細書で用いられる「制御配列」という用語は、それらがライゲーションされるかまたは作動可能に連結する、コード配列の発現、プロセシング、または細胞内局在化に影響を及ぼしうるポリヌクレオチド配列を指す。このような制御配列の性質は、宿主生物に依存しうる。具体的な実施形態では、原核生物の転写制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を包含しうる。他の具体的な実施形態では、真核生物の転写制御配列は、転写因子、転写エンハンサー配列、転写終結配列、およびポリアデニル化配列の１または複数の認識部位を含むプロモーターを包含しうる。特定の実施形態では、「制御配列」は、リーダー配列および／または融合パートナー配列を包含しうる。
【０１７５】
本明細書で言及される「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖の核酸ポリマーを意味する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドの場合もあり、デオキシリボヌクレオチドの場合もあり、ヌクレオチドのいずれかの種類の修飾形態の場合もある。前記修飾には、ブロモウリジン修飾などの塩基修飾、アラビノシド修飾および２’，３’−ジデオキシリボース修飾などのリボース修飾、ならびにホスホロチオエート修飾、ホスホロジチオエート修飾、ホスホロセレノエート修飾、ホスホロジセレノエート修飾、ホスホロアニロチオエート修飾、ホスホルアニラデート修飾、およびホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）修飾などのヌクレオチド間連結修飾が含まれる。「ポリヌクレオチド」という用語は、とりわけ、ＤＮＡの一本鎖形態および二本鎖形態を包含する。
【０１７６】
「自然発生ヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを包含する。「修飾ヌクレオチド」という用語は、糖基が修飾または置換されたヌクレオチドなどを包含する。「オリゴヌクレオチド結合」という用語は、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロセレノエート結合、ホスホロジセレノエート結合、ホスホロアニロチオエート結合、ホスホルアニラデート結合、ホスホルアミデート結合などのオリゴヌクレオチド結合を包含する。例えば、それらの開示が任意の目的で参照により本明細書に組み込まれる、ＬａＰｌａｎｃｈｅら、１９８６年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１４巻：９０８１頁；Ｓｔｅｃら、１９８４年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１０６巻：６０７７頁；Ｓｔｅｉｎら、１９８８年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６巻：３２０９頁；Ｚｏｎら、１９９１年、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、６巻：５３９頁；Ｚｏｎら、１９９１年、ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、８７〜１０８頁（Ｆ．  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｔｅｃら、米国特許第５，１５１，５１０号；ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ、１９９０年、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０巻：５４３頁を参照されたい。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの検出またはそのハイブリダイゼーションを可能とする検出可能な標識を包含しうる。
【０１７７】
「ベクター」という用語は、コード情報を宿主細胞へと導入するのに用いられる任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）を指すのに用いられる。「発現ベクター」という用語は、宿主細胞の形質転換に適し、挿入された異種核酸配列の発現を方向付け、かつ／またはコントロールする核酸配列を含有するベクターを指す。発現には、転写、翻訳、および、イントロンが存在する場合は、ＲＮＡスプライシングなどの過程が含まれるがこれらに限定されない。
【０１７８】
当業者が理解する通り、ポリヌクレオチドは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現させる場合もあり、これらを発現させるように適合させる場合もある、ゲノム配列、ゲノム外配列、およびプラスミドによりコードされる配列、ならびにより低分子の遺伝子操作されたセグメントを包含しうる。このようなセグメントは、天然で単離される場合もあり、当業者が合成的に改変する場合もある。
【０１７９】
これもまた当業者が認知する通り、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コード鎖またはアンチセンス鎖）の場合もあり、二本鎖の場合もあり、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ）分子の場合もあり、ＲＮＡ分子の場合もある。ＲＮＡ分子は、イントロンを含有し、ＤＮＡ分子に一対一で対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子を包含しうる。本開示に従うポリヌクレオチドには、さらなるコード配列または非コード配列を存在させることもできるが必ずしも存在させなくともよく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持物質に連結することもできるが必ずしも連結しなくともよい。ポリヌクレオチドは、天然配列を含む場合もあり、このような配列の変異体または誘導体をコードする配列を含む場合もある。
【０１８０】
したがって、これらの実施形態および類縁の実施形態によれば、配列番号４９〜６０、７６、７８、８０、および８２のうちの任意の１または複数に示されるポリヌクレオチド配列の一部または全部、配列番号４９〜６０、７６、７８、８０、および８２のうちの任意の１または複数に示されるポリヌクレオチド配列の相補体、ならびに配列番号４９〜６０、７６、７８、８０、および８２のうちの任意の１または複数に示されるポリヌクレオチド配列の縮重変異体を含むポリヌクレオチドが提供される。特定の好ましい実施形態では、本明細書で示されるポリヌクレオチド配列は、本明細書の他の箇所に記載される、ＢＫＢ２Ｒに結合する抗体またはそれらの抗原結合断片をコードする。特定の好ましい実施形態では、本明細書で示されるポリヌクレオチド配列は、配列番号１〜４８、７５、７７、７９、８１、および８３〜９２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
【０１８１】
他の類縁の実施形態では、ポリヌクレオチドの変異体は、本明細書の配列番号４９〜６０、７６、７８、８０、および８２で開示される配列に対する実質的な同一性を有することが可能であり、例えば、本明細書で記載される方法（例えば、下記の標準的パラメータを用いるＢＬＡＳＴ解析）を用いて、本明細書で開示される配列など、基準のポリヌクレオチド配列と比較した、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を含む配列でありうる。当業者は、コドンの縮重性、アミノ酸の類似性、リーディングフレームの配置などを考慮に入れることにより、これらの値を適切に調整して、２つのヌクレオチド配列によりコードされる対応するタンパク質の同一性を決定しうることを認識するであろう。
【０１８２】
典型的に、ポリヌクレオチドの変異体は、好ましくは、変異体のポリヌクレオチドによりコードされる抗体の結合アフィニティーが、とりわけ、本明細書で示されるポリヌクレオチド配列によりコードされる抗体と比べて実質的に減殺されないように、１または複数の置換、付加、欠失、および／または挿入を含有する。
【０１８３】
他の特定の類縁の実施形態では、ポリヌクレオチド断片は、本明細書で開示される配列のうちの１または複数と同一であるかまたは相補的な多様な長さの配列の連続的な連なりを含む場合もあり、本質的にこれらからなる場合もある。例えば、本明細書で開示される配列のうちの１または複数のうちの少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、３００、４００、５００、または１０００以上の連続的なヌクレオチドのほか、これらの中間の長さ全てのヌクレオチドを含むか、または本質的にこれらからなるポリヌクレオチドが提供される。この文脈における「中間の長さ」とは、２００〜５００の全体、５００〜１，０００の全体などの全ての整数を含め、５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３など、列挙した値の間の任意の長さを意味することが容易に理解されるであろう。本明細書で記載されるポリヌクレオチド配列は、一端または両端において、天然配列では見出されないさらなるヌクレオチドにより伸長させることができる。このさらなる配列は、開示される配列の片側端または開示される配列の両端において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドからなりうる。
【０１８４】
別の実施形態では、中程度〜高度な厳密さの条件下において、本明細書で提示されるポリヌクレオチド配列もしくはその断片またはその相補的な配列とハイブリダイズさせることが可能なポリヌクレオチドが提供される。分子生物学法の技術分野では、ハイブリダイゼーション法が周知である。例示を目的として述べると、本明細書で提供されるポリヌクレオチドの他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを調べるのに適する中程度に厳密な条件は、５倍濃度のＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）による溶液中であらかじめ洗浄すること、５倍濃度のＳＳＣ中、５０℃〜６０℃で一晩にわたりハイブリダイズさせた後で、０．１％のＳＤＳを含有する２倍濃度、０．５倍濃度、および０．２倍濃度の各ＳＳＣにより、６５℃で２０分間ずつ２回にわたり洗浄することを包含する。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩含量および／またはハイブリダイゼーションを実施する温度を変化させることを介するなど、ハイブリダイゼーションの厳密さを容易に操作しうることを理解するであろう。例えば、別の実施形態では、高度に厳密な適切なハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション温度を、例えば、６０〜６５℃または６５〜７０℃まで上昇させることを除き、上記の条件を包含する。
【０１８５】
特定の実施形態では、上記のポリヌクレオチド、例えば、ポリヌクレオチドの変異体、断片、およびハイブリダイズ配列は、ＢＫＢ２Ｒに結合する抗体またはそれらの抗原結合断片をコードする。他の実施形態では、このようなポリヌクレオチドは、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、およびより好ましくは少なくとも約９０％の強さでＢＫＢ２Ｒに結合する抗体またはそれらの抗原結合断片もしくはＣＤＲ、ならびに本明細書で具体的に示す抗体配列をコードする。さらなる実施形態では、このようなポリヌクレオチドは、本明細書で示す抗体より大きなアフィニティーでＢＫＢ２Ｒに結合する、例えば、定量的に述べると、少なくとも約１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、または１１０％の強さでＢＫＢ２Ｒに結合する抗体またはそれらの抗原結合断片もしくはＣＤＲ、ならびに本明細書で具体的に示す抗体配列をコードする。
【０１８６】
選択された天然または非天然のアミノ酸による１または複数のアミノ酸の置換、付加、欠失、または挿入を、このようにして誘導される構造的変異体が、本明細書で開示される分子種の空間充填特性を保持するかどうかを決定する目的で事実上モデル化しうるように、日常的な方法を介して、代表的なポリペプチド（例えば、本明細書で提供される変異体のＢＫＢ２Ｒ特異的抗体、例えば、本明細書で提供される抗原結合断片を有する抗体タンパク質）の三次元構造の決定を行うことができる。例えば、Ｄｏｎａｔｅら、１９９４年、Ｐｒｏｔ．  Ｓｃｉ．、３巻：２３７８頁；Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０９巻：１８６８〜１８７１頁（２００５年）；Ｓｃｈｕｅｌｅｒ−Ｆｕｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１０巻：６３８頁（２００５年）；Ｄｉｅｔｚら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０３巻：１２４４頁（２００６年）；Ｄｏｄｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４５０巻：１７６頁（２００７年）；Ｑｉａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４５０巻：２５９頁（２００７年）；Ｒａｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２７巻：１０１４〜１０１８頁（２０１０年）を参照されたい。本明細書で提供されるＢＫＢ２Ｒ特異的抗体およびそれらの抗原結合ドメインの合理的なデザインなど、これらの実施形態および類縁の実施形態のために用いうるコンピュータアルゴリズムの一部のさらなる非限定的な例は、生体高分子系の高速シミュレーションのためにデザインされた並列分子動力学コードであるＮＡＭＤ、ならびに３Ｄ画像ビルトインスクリプト記述を用いて生体高分子系を表示、動画表示、および解析するための分子画像化プログラムであるＶＭＤを包含する（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６巻：１７８１〜１８０２頁、２００５年；Ｈｕｍｐｈｒｅｙら、「ＶＭＤ  −  Ｖｉｓｕａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ」、Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｇｒａｐｈｉｃｓ、１９９６年、１４巻、３３〜３８頁を参照されたい；また、ｋｓ．ｕｉｕｃ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｖｍｄ／におけるＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ａｔ  Ｕｒｂａｎａ−Ｃｈａｍｐａｇｎｅのウェブサイトも参照されたい）。当技術分野では、以下の他の多くのコンピュータプログラムが公知であり、当業者に利用可能であり、エネルギーを最小化した立体配座の空間充填モデル（ファンデルワールス半径）から原子の大きさを決定することを可能とする：異なる化学基に対する高アフィニティー領域を決定し、これにより、結合を増強しようとするＧＲＩＤ、数学的配列を計算するモンテカルロ法、およびＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓら（１９８３年）、Ｊ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｃｈｅｍ．、４巻：１８７〜２１７頁）、ならびに力の場の計算および解析を評価するＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒら（１９８１年）、Ｊ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｃｈｅｍ．、１０６巻：７６５頁）（また、Ｅｉｓｅｎｆｉｅｌｄら（１９９１年）、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２６１巻：Ｃ３７６〜３８６頁；Ｌｙｂｒａｎｄ（１９９１年）、Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｅｌｇ．、４６巻：４９〜５４頁；Ｆｒｏｉｍｏｗｉｔｚ（１９９０年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、８巻：６４０〜６４４頁；Ｂｕｒｂａｍら（１９９０年）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、７巻：９９〜１１１頁；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ（１９８５年）、Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．、６１巻：１８５〜１９０頁；およびＫｉｎｉら（１９９１年）、Ｊ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｄｙｎ．、９巻：４７５〜４８８頁も参照されたい）。また、Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）製のプログラムなど、多様で適切な計算用コンピュータプログラムも市販されている。
【０１８７】
本明細書で記載されるポリヌクレオチドまたはそれらの断片は、コード配列それ自体の長さに関わらず、それらの全体的な長さが大幅に変化しうるように、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、複数のクローニング部位、他のコードセグメントなど、他のＤＮＡ配列と組み合わせることができる。したがって、全長が調製の容易さおよび意図される組換えＤＮＡプロトコールにおける使用により限定されることが好ましい、ほぼ任意の長さの核酸断片を用いうることが想定される。例えば、全長が約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対の長さなど（全ての中間の長さを含めた）である例示的なポリヌクレオチドセグメントは、有用であると想定される。
【０１８８】
ポリヌクレオチド配列を比較する場合、下記の通りに対応が最大となるようにアラインメントしたときに、２つの配列におけるヌクレオチド配列が同じであれば、２つの配列を「同一である」という。２つの配列の間の比較は、典型的に、局所的な配列類似性の領域を同定および比較するために、配列を比較域にわたり比較することにより実施する。本明細書で用いられる「比較域」とは、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、４０〜約５０の連続的な位置のセグメントであって、配列が、同数の連続的な位置を有する基準配列と、これら２つの配列を最適にアラインメントされた後で比較されるセグメントを指す。
【０１８９】
比較のための最適の配列アライメントは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅスーツのバイオインフォーマティックスソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）におけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラムでデフォルトのパラメータを用いて実施することができる。このプログラムは、以下の参考文献において記載されている複数のアライメントスキームを統合する：Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ｍ．Ｏ．（１９７８年）、Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ、Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ｍ．Ｏ．（編）、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、５巻、補遺３巻、３４５〜３５８頁；Ｈｅｉｎ  Ｊ．、Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ、６２６〜６４５頁（１９９０年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，  Ｐ．Ｍ．、ＣＡＢＩＯＳ、５巻：１５１〜１５３頁（１９８９年）；Ｍｙｅｒｓ，  Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．、ＣＡＢＩＯＳ、４巻：１１〜１７頁（１９８８年）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｅ．Ｄ．、Ｃｏｍｂ．  Ｔｈｅｏｒ、１１巻：１０５頁（１９７１年）；Ｓａｎｔｏｕ，  Ｎ．  Ｎｅｓ，  Ｍ．、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．、４巻：４０６〜４２５頁（１９８７年）；Ｓｎｅａｔｈ，  Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，  Ｒ．Ｒ．、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  −  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ（１９７３年）；Ｗｉｌｂｕｒ，  Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，  Ｄ．Ｊ．、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．、Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８０巻：７２６〜７３０頁（１９８３年）。
【０１９０】
代替的に、比較のための最適の配列アライメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｄ．  ＡＰＬ．  Ｍａｔｈ、２巻：４８２頁（１９８１年）による局所的な同一性アルゴリズムを介して実施することもでき、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４３頁（１９７０年）による同一性アライメントのアルゴリズムを介して実施することもでき、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻：２４４４頁（１９８８年）による類似性の検索法（ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ）を介して実施することもでき、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩによるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）をコンピュータに実装することにより実施することもでき、目視により実施することもできる。
【０１９１】
配列同一性および配列類似性の百分率を決定するのに適するアルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９７７年）、およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）において記載されている。例えば、本明細書で記載されるパラメータによりＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を用いて、２つ以上のポリヌクレオチド間における配列同一性の百分率を決定することができる。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを介して公開されている。例示的な一例では、ヌクレオチド配列には、パラメータＭ（マッチする残基対に対するリウォードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチする残基に対するペナルティースコア；常に＜０）を用いて累積スコアを計算することができる。各方向へのワードヒットの伸長は、累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下する場合；１または複数の負のスコアをもたらす残基アライメントが累積するために、累積スコアがゼロ以下に低下する場合；いずれかの配列の端点に達した場合に停止させる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータであるＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）では、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：１０９１５頁（１９８９年）を参照されたい）によるアライメント、（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を用いる。
【０１９２】
特定の実施形態では、「配列同一性の百分率」は、最適にアラインメントした２つの配列を、少なくとも２０の位置による比較域であって、ポリヌクレオチド配列の一部が、２つの配列の最適のアライメントのための基準配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる比較域にわたり比較することにより決定する。百分率は、両方の配列で同一な核酸塩基が生じてマッチした位置数をもたらす位置数を決定し、マッチした位置数を基準配列における位置の総数（すなわち、比較域のサイズ）で除し、結果を１００で乗じて配列同一性の百分率をもたらすことにより計算する。
【０１９３】
当業者は、遺伝子コードの縮重性の結果として、本明細書で記載される抗体をコードする多くのヌクレオチド配列が存在することを理解しよう。これらのポリヌクレオチドのうちの一部は、ＢＫＢ２Ｒに結合する抗体をコードする、本明細書で記載されるポリヌクレオチドなど、天然のポリヌクレオチドまたは元のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と最小限の配列同一性を保有する。それにも拘らず、本開示では、コドン使用の差違に起因して変化するポリヌクレオチドが明示的に想定される。特定の実施形態では、哺乳動物における発現のためにコドンを最適化した配列が、とりわけ想定される。
【０１９４】
したがって、本発明の別の実施形態では、本明細書で記載される抗体の変異体および／または誘導体を調製するために、部位特異的突然変異誘発などの突然変異誘発法を用いることができる。この手法では、それらをコードする根底的なポリヌクレオチドの突然変異誘発を介して、ポリペプチド配列における特定の修飾を行うことができる。これらの技法は、配列変異体を調製して調べる簡便な手法、例えば、１または複数のヌクレオチド配列の変化をポリヌクレオチド内に導入することにより、前出の検討項目のうちの１または複数を組み込む手法を提供する。
【０１９５】
部位特異的突然変異誘発は、所望の突然変異のＤＮＡ配列のほか、十分なサイズおよび配列の複雑性を有するプライマー配列をもたらして、横断される欠失接合部の両側において安定的な二重鎖を形成するのに十分な数の隣接するヌクレオチドをコードする特異的なオリゴヌクレオチド配列の使用を介する突然変異体の生成を可能とする。選択したポリヌクレオチド配列における突然変異を用いて、ポリヌクレオチドそれ自体の特性を改善するか、変化させるか、低下させるか、修飾するか、もしくは他の形で変えることもでき、かつ／またはコードされるポリペプチドの特性、活性、組成物、安定性、もしくは一次配列を変化させることもできる。
【０１９６】
特定の実施形態では、本発明者らは、開示されるポリヌクレオチド配列の突然変異誘発であって、抗体もしくはその抗原結合断片の結合アフィニティー、または特定のＦｃ領域の機能、またはＦｃ領域の特定のＦｃγＲに対するアフィニティーなど、コードされるポリペプチドの１または複数の特性を変化させる突然変異誘発を想定する。部位特異的突然変異誘発法は当技術分野において周知であり、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方の変異体を創出するのに広く用いられる。例えば、部位特異的突然変異誘発は、ＤＮＡ分子の特異的部分を変化させるのに用いられることが多い。このような実施形態では、典型的に約１４〜約２５ヌクレオチドぐらいの長さを含むプライマーを用い、配列接合部の両側において約５〜約１０残基を変化させる。
【０１９７】
当業者には理解される通り、部位特異的突然変異誘発法ではしばしば、一本鎖形態および二本鎖形態の両方で存在するファージベクターが用いられている。部位指向的突然変異誘発において有用な典型的ベクターには、Ｍ１３ファージなどのベクターが含まれる。これらのファージは、市販品の入手が容易であり、それらの使用は一般に当業者に周知である。二本鎖プラスミドはまた、対象の遺伝子をプラスミドからファージへと導入するステップを消失させる部位指向的突然変異誘発でも日常的に用いられている。
【０１９８】
一般に、本明細書に従う部位指向的突然変異誘発は、まず所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列をその配列内に包含する、一本鎖ベクターを得るか、または二本鎖ベクターの２つの鎖の一部を溶融させることにより実施する。所望の突然変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーは、一般に合成を介して調製する。次いで、突然変異保有鎖の合成を完結させるために、このプライマーを、一本鎖ベクターとアニールさせ、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片などのＤＮＡ重合化酵素下に置く。こうして、一方の鎖が元の非突然変異配列をコードし、第２の鎖が所望の突然変異を保有するヘテロ二重鎖が形成される。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞などの適切な細胞を形質転換し、突然変異配列の配置を保有する組換えベクターを包含するクローンを選択する。
【０１９９】
部位指向的突然変異誘発を用いて、選択されたペプチドをコードするＤＮＡセグメントの配列変異体を調製することにより、潜在的に有用な分子種を生成させる手段がもたらされるが、ペプチドの配列変異体およびそれらをコードするＤＮＡ配列を得うる他の方途も存在するので、これは、限定的であることを意味するわけではない。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターは、ヒドロキシルアミンなどの突然変異誘発剤で処理して、配列変異体を得ることができる。これらの方法およびプロトコールに関する特定の詳細は、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２年、前出、ならびに各々がその目的で参照により本明細書に組み込まれる、分子生物学法および分子遺伝学法ならびに関連する方法について以下で引用される他の情報源の教示において見出される。
【０２００】
「オリゴヌクレオチド指向的突然変異誘発手順」という用語は、増幅など、結果として、特異的な核酸分子濃度のその初期濃度と比べた上昇、または検出可能なシグナル濃度の上昇をもたらす、鋳型依存的過程およびベクターを介する増殖を指す。「オリゴヌクレオチド指向的突然変異誘発手順」という用語は、プライマー分子の鋳型依存的な伸長を伴う過程を指すことを意図する。「鋳型依存的過程」という用語は、核酸の新たに合成される鎖の配列が相補的な塩基対合についての周知の規則（例えば、Ｗａｔｓｏｎ、１９８７年を参照されたい）により規定される、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の核酸合成を指す。典型的に、ベクターを介する方法は、核酸断片のＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターへの導入、ベクターのクローン増幅、および増幅された核酸断片の回収を伴う。このような方法の例は、とりわけ、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第４，２３７，２２４号により提示される。
【０２０１】
ポリペプチド変異体を生成させるための別の手法では、米国特許第５，８３７，４５８号において記載される、再帰的配列組換えを用いることができる。この手法では、組換えおよびスクリーニングまたは選択の反復的サイクルを実施して、例えば、結合アフィニティーを増大させた個別のポリヌクレオチドの変異体を「発展」させる。また、特定の実施形態では、本明細書で記載される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写カセットまたは発現カセットの形態における構築物も提供する。
【０２０２】
特定の類縁の実施形態によれば、本明細書で記載される１または複数の構築物を含む組換え宿主細胞と；任意の抗体、ＣＤＲ、ＶＨドメインもしくはＶＬドメイン、またはその抗原結合断片をコードする核酸と；コードされる産物を生成させる方法であって、それをコードする核酸からの発現を含む方法とが提供される。発現は、核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することにより達成しうるので簡便である。発現を介する生成の後、抗体またはその抗原結合断片は、任意の適切な技法を用いて単離および／または精製し、次いで、所望の通りに用いることができる。
【０２０３】
本明細書で提供される抗体またはそれらの抗原結合断片、ならびにコード核酸分子およびベクターは、例えば、それらの天然の環境から、実質的に純粋または均一な形態で単離および／または精製することもでき、核酸の場合、所望の機能を伴うポリペプチドをコードする配列以外に由来する核酸または遺伝子を含まないかまたは実質的に含まずに単離および／または精製することもできる。核酸は、ＤＮＡを含む場合もあり、ＲＮＡを含む場合もあり、完全に合成する場合もあり、部分的に合成する場合もある。本明細書で示されるヌクレオチド配列に対する言及は、配列を指定したＤＮＡ分子を包含し、配列を指定したＲＮＡ分子を包含するが、この場合、文脈により別段に要請されない限り、ＵをＴで置換する。
【０２０４】
多様な異なる宿主細胞においてポリペプチドをクローニングして発現させるための系が周知である。適切な宿主細胞には、細菌、哺乳動物細胞、酵母系、およびバキュロウイルス系が含まれる。異種ポリペプチドを発現させるのに当技術分野で利用可能な哺乳動物細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウス黒色腫細胞、および他の多くの細胞が含まれる。一般的な好ましい細菌宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【０２０５】
当技術分野では、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞における抗体および抗原結合断片の発現が十分に確立されている。総説には、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻：５４５〜５５１頁（１９９１年）を参照されたい。当業者にはまた、培養物中の真核細胞における発現も、抗体またはそれらの抗原結合断片を生成させるための選択肢として利用可能であり、近年の総説、例えば、Ｒｅｆ（１９９３年）、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、４巻：５７３〜５７６頁；Ｔｒｉｌｌら（１９９５年）、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、６巻：５５３〜５６０頁を参照されたい。
【０２０６】
必要に応じて、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および他の配列を含めた適切な制御配列を含有する適切なベクターを選択または構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミドの場合もあり、ウイルスの、例えば、ファージの場合もあり、ファージミドの場合もある。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｃｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照し、また、分子生物学法に関する、以下で引用されるさらなる参考文献も参照されたい。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞への導入、および遺伝子発現、ならびにタンパク質の解析において核酸を操作するための多くの公知の技法およびプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９２年、またはこれに対するその後の改定版において詳細に記載されている。
【０２０７】
「宿主細胞」という用語は、本明細書で記載される抗体のうちの１または複数をコードする核酸配列を導入したか、または導入することが可能な細胞、および本明細書で記載される任意の抗体をコードする遺伝子など、選択された対象の遺伝子をさらに発現させるか、またはこれを発現させることが可能な細胞を指すのに用いられる。この用語は、選択された遺伝子が存在する限りにおいて、後代が形態または遺伝子組成において元の親細胞と同一の場合であれ、そうでない場合であれ、親細胞の後代を包含する。したがってまた、このような核酸を宿主細胞へと導入することを含む方法も想定される。導入では、任意の利用可能な技法を用いうる。真核細胞の場合、適切な技法には、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン法、電気穿孔、リポソームを介するトランスフェクション、およびレトロウイルスもしくは他のウイルス、例えば、牛痘ウイルス、または、昆虫細胞細胞の場合、バキュロウイルスを用いる形質導入が含まれうる。細菌細胞の場合、適切な技法には、塩化カルシウムによる形質転換、電気穿孔、およびバクテリオファージを用いるトランスフェクションが含まれうる。導入後、例えば、遺伝子を発現させるための条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸からの発現をもたらすかまたは核酸から発現させることができる。一実施形態では、核酸を、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）内に組み込む。組込みは、標準的な技法に従い、組換えを促進する配列をゲノムと共に組み入れることにより促進することができる。
【０２０８】
特定の実施形態では、本発明はまた、本明細書で記載されるＢＫＢ２Ｒ特異的抗体など、特定のポリペプチドを発現させるために、上記で言明された構築物を発現系において用いることを含む方法も提供する。「形質導入」という用語は、通常は１つの細菌から別の細菌へのファージを介する遺伝子の導入を指すのに用いられる。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核細胞配列の捕捉および導入も指す。「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来ＤＮＡまたは外因性ＤＮＡ取込みを指すのに用いられ、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されたとき、細胞は「トランスフェクト」されている。当技術分野では、多数のトランスフェクション法が周知であり、本明細書でも開示されている。例えば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻：４５６頁；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｄａｖｉｓら、１９８６年、ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；およびＣｈｕら、１９８１年、Ｇｅｎｅ、１３巻：１９７頁を参照されたい。このような技法は、１または複数の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞へと導入するのに用いることができる。
【０２０９】
本明細書で用いられる「形質転換」という用語は、細胞における遺伝子特徴の変化を指し、新規のＤＮＡを含有するように改変されたとき、細胞は形質転換されている。例えば、その天然状態から遺伝子的に改変される場合、細胞は形質転換される。トランスフェクションまたは形質導入後において、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体へと物理的に組み込まれることにより細胞のＤＮＡと再結合する場合もあり、複製されることなくエピソームエレメントとして一過性に維持される場合もあり、プラスミドとして独立に複製される場合もある。ＤＮＡが細胞分裂により複製される場合、細胞は安定的に形質転換されたと考えられる。核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などの生物学的物質との関連で用いられる場合の「自然発生の」または「天然の」という用語は、天然において見出され、ヒトにより操作されていない物質を指す。同様に、本明細書で用いられる「非自然発生の」または「非天然の」とは、天然において見出されないか、またはヒトにより構造的に修飾されるかもしくは合成された物質を指す。
【０２１０】
「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」、ならびに「糖タンパク質」という用語は、互換的に用いられ、いかなる特定の長さにも限定されないアミノ酸のポリマーを意味する。この用語は、ミリスチル化、硫酸化、グリコシル化、リン酸化、およびシグナル配列の付加または欠失などの修飾を除外しない。「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、１または複数のアミノ酸鎖であって、各鎖が、ペプチド結合により共有結合的に連結されたアミノ酸を含み、前記ポリペプチドまたはタンパク質が、天然タンパク質、すなわち、自然発生細胞、および、とりわけ、非組換え細胞を介して生成させたタンパク質、または遺伝子操作された細胞もしくは組換え細胞を介して生成させたタンパク質の配列を有する、ペプチド結合により非共有結合的および／または共有結合的に併せて連結された複数の鎖を含むことが可能であり、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然配列の１もしくは複数のアミノ酸からの欠失、これらに対する付加、および／もしくはこれらに対する置換を有する分子を含みうるアミノ酸鎖を意味する。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、とりわけ、本開示のＢＫＢ２Ｒ、または抗ＢＫＢ２Ｒ抗体の１もしくは複数のアミノ酸からの欠失、これらに対する付加、および／もしくはこれらに対する置換を有する配列に結合する抗体を包含する。したがって、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸鎖のうちの１つ（「  単量体」と称する）または複数（「多量体」と称する）を含みうる。
【０２１１】
タンパク質に関して本明細書で言及される「単離された」という用語は、対象タンパク質が、（１）典型的には天然においてそれと共に見出される少なくとも他の一部のタンパク質を含まないこと、（２）同じ供給源に由来する他のタンパク質、例えば、同じ種に由来する他のタンパク質を本質的に含まないこと、（３）異なる種に由来する細胞を介して発現すること、（４）それが天然において会合するポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、もしくは他の物質のうちの少なくとも約５０パーセントから分離されていること、（５）「単離タンパク質」が天然において会合するタンパク質の一部と会合（共有結合的相互作用を介する場合もあり、非共有結合的相互作用を介する場合もある）しないこと、（６）それが天然において会合しないポリペプチドと作動可能に会合（共有結合的相互作用を介する場合もあり、非共有結合的相互作用を介する場合もある）すること、または（７）天然において発生しないことを意味する。このような単離タンパク質は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または他のＲＮＡによりコードされる場合もあり、合成由来の場合もあり、これらの任意の組合せの場合もある。特定の実施形態では、単離タンパク質が、その天然の環境において見出される、その使用（治療的使用、診断的使用、予防的使用、研究のための使用、または他の形の使用）に干渉するタンパク質もしくはポリペプチドまたは他の夾雑物を実質的に含まない。
【０２１２】
「ポリペプチド断片」という用語は、自然発生のポリペプチドまたは組換えにより生成させたポリペプチドのアミノ末端の欠失、カルボキシル末端の欠失、および／または内部の欠失もしくは置換を有する、単量体の場合もあり、多量体の場合もあるポリペプチドを指す。特定の実施形態では、ポリペプチド断片は、少なくとも５〜約５００アミノ酸長のアミノ酸鎖を含みうる。特定の実施形態では、断片が、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０アミノ酸長であることが理解されよう。特に有用なポリペプチド断片は、抗体の抗原結合ドメインまたは抗原結合断片を含めた機能的ドメインを包含する。抗ＢＫＢ２Ｒ抗体の場合、有用な断片には、ＣＤＲ領域、とりわけ、重鎖または軽鎖のＣＤＲ３領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、抗体鎖の一部または２つのＣＤＲを含めたそのちょうどの可変領域などが含まれるがこれらに限定されない。
【０２１３】
ＢＫＢ２Ｒ機能のモジュレーター、アゴニスト、またはアンタゴニストである、本明細書で記載されるＢＫＢ２Ｒ結合抗体またはそれらの抗原結合断片は、想定される実施形態内に明示的に包含される。これらのアゴニスト、アンタゴニスト、およびモジュレーター抗体、またはそれらの抗原結合断片は、ＢＫＢ２Ｒの抗原決定基部位、またはＢＫＢ２Ｒのエピトープ断片もしくは変異体のうちの１または複数と相互作用する。
【０２１４】
当業者により認識される通り、標準的な技法を含め、ＢＫＢ２Ｒなどの特定の抗原に結合する抗体を作製する多くの公知の方法が存在する（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年を参照されたい）。一般に、とりわけ、本明細書で明示的に開示されるＢＫＢ２Ｒ結合抗体のそれらのコグネイト抗原への結合を遮断する抗体などの抗体は、本明細書で記載されるモノクローナル抗体の生成（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）を含めた細胞培養物法を介して生成（ｐｒｏｄｕｃｅｄ）させることもでき、組換え抗体の生成（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）を可能とするために、適切な細菌細胞宿主または哺乳動物細胞宿主への抗体遺伝子のトランスフェクションを介して生成（ｐｒｏｄｕｃｅｄ）させることもできる。特定の実施形態では、まず、ポリペプチド抗原（例えば、配列番号７１に示されるアミノ酸配列を含むヒトＢＫＢ２Ｒタンパク質、または配列番号７３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドなどのその断片）を含む免疫原を、多種多様な哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはヤギ）のうちのいずれかに注射する。このステップでは、ポリペプチドを、修飾を伴わない免疫原として用いることができる。代替的に、特に、比較的短いポリペプチドでは、場合によって、このポリペプチドをウシ血清アルブミンまたはスカシガイヘモシアニンなどの担体タンパク質に接合しても、良好な免疫反応を誘発しうる。好ましくは１回または複数回の追加投与による免疫化を組み込む所定のスケジュールに従い、免疫原を動物宿主に注射し、動物から定期的に採血する。次いで、ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体を、このような抗血清から、例えば、適切な固体の支持体へと連結したポリペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーを介して精製することができる。
【０２１５】
特定の実施形態では、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６巻：５１１〜５１９頁、１９７６年による技法、ならびにこれに対する改良法を用いて、対象の抗原ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を調製することができる。略述すると、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、対象のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を生成させることが可能な不死化細胞系の調製を伴う。このような細胞系は、例えば、上記の通りに免疫化した動物から得られる脾臓細胞から生成させることができる。次いで、例えば、骨髄腫細胞の融合パートナー、好ましくは免疫化した動物と同系の融合パートナーと融合させることにより脾臓細胞を不死化させる。多様な融合法を用いることができる。例えば、脾臓細胞および骨髄腫細胞を、非イオン性洗浄剤と数分間にわたり混合し、次いで、ハイブリッド細胞の成長は支援するが、骨髄腫細胞の成長は支援しない選択培地上に低密度で播種する。好ましい選択法では、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を用いる。十分な期間の後、通常は約１〜２週間後、ハイブリッド体のコロニーを観察する。単一のコロニーを選択し、それらの培養上清をポリペプチドに対する結合活性について調べる。反応性および特異性の高いハイブリドーマが好ましい。
【０２１６】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマコロニーを増殖させる上清から単離することができる。加えて、マウスなど、適切な脊椎動物宿主の腹腔へのハイブリドーマ細胞系の注射など、収量を増強する多様な技法も用いることができる。次いで、モノクローナル抗体を、腹水または血液から採取することができる。クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿、および抽出など、従来の技法を介して、夾雑物を抗体から除去することができる。精製過程、例えば、アフィニティークロマトグラフィーステップでは、ポリペプチドを用いることができる。
【０２１７】
使用法および医薬組成物
本明細書では、ＢＫＢ２Ｒに結合する抗体を用いる処置法が提供される。一実施形態では、本発明の抗体を、ＢＫＢ２Ｒをアゴナイズすることにより、その活性を変化させうる（例えば、統計学的に有意な形で上昇または低下させうる）生物学的なシグナル伝達経路を伴う疾患、障害、または状態であって、本開示の文脈では、例えば、存在するタンパク質の量もしくは活性の変化（例えば、統計学的に有意な増大または減少）、または突然変異体タンパク質の存在、あるいはこれらの両方に起因する、ＢＫＢ２Ｒ活性および／またはＧＳＫ−３β活性の異常を特徴とするる疾患および障害を包含することを意味する疾患、障害、または状態を有する患者に投与する。過剰は、通常検出可能な活性と比べた、分子レベルにおける過剰発現、作用部位における長期にわたるかもしくは累積的な出現、またはＧＳＫ−３βの活性の増大（例えば、統計学的に有意な形での増大）が含まれるがこれらに限定されない任意の原因に起因しうる。ＧＳＫ−３β活性のこのような過剰は、ＧＳＫ−３βの正常な発現、出現、または活性と比べて測定することができ、前記測定は、本明細書で記載される抗体の開発および／または臨床試験において重要な役割を果たしうる。
【０２１８】
特に、本明細書で記載される本抗体は、ＢＫＢ２Ｒへの結合および後続のシグナル伝達イベントを介して、糖尿病、および、とりわけ、糖尿病の特定の合併症を処置するのに有用である。したがって、特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体は、耐糖能異常、インスリン抵抗性、または関連症状を含めた他の類縁の障害もしくは状態、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、心血管疾患、高血圧症、腎症、網膜症、および神経障害など、２型糖尿病を含めた糖尿病と関連する疾患の処置に有用である。
【０２１９】
ＩＩ型糖尿病では、インスリンへの抵抗性の結果として、骨格筋などの組織によるグルコース取込みの欠如がもたらされる。インスリン抵抗性の結果として、血中グルコースレベルの上昇がもたらされ、この血中グルコースレベルの上昇を補完するために膵臓の生成させるインスリンが増大する。身体運動研究により、インスリン抵抗性と、骨格筋によるグルコース取込みと、ＢＫＢ２Ｒとの間の関連が発見された。身体運動時において、骨格筋内では、局在化されたキニン放出の上昇がみられる。この上昇の結果として、筋細胞表面におけるグルコース輸送体であるＧＬＵＴ−４の発現の上昇、および筋細胞へのグルコース取込みの改善がもたらされる（Ｋｉｓｈｉら、１９９８年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４７巻：４号、５５０〜８頁）。筋細胞のインスリン抵抗性は、ＩＩ型糖尿病のために、ＢＫＢ２Ｒに作用するキニンを添加することにより改善されることが示されている（Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎら、１９９８年、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７５巻（１号：２部）：Ｒ４０〜５頁）。
【０２２０】
２型糖尿病におけるインスリン抵抗性の動物モデルでは、活性過剰なグリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ（ＧＳＫ−３β）が、インスリン抵抗性の一因であることが見出された。ＧＳＫ−３βを下方制御する結果として、インスリン抵抗性の軽減および身体によるグルコース使用の改善（Ｔａｎａｂｅら、２００７年、ＰＬｏｓ  Ｂｉｏｌ、６巻：３０７〜３１８頁）がもたらされた。第一には自己免疫ベースの疾患であるが、Ｉ型糖尿病は今では、インスリン抵抗性の構成要素を有するものとしても認知されている（Ｘｕら、２００７年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ、３０巻：２３１４〜２０頁）。インスリン抵抗性は、正常血糖高インスリンクランプ法を介して診断することができる。本発明の特定の実施形態のＢＫＢ２Ｒ抗体は、インスリン抵抗性を呈示する糖尿病患者に投与することができる。
【０２２１】
１型および２型糖尿病の合併症には、腎臓への重度の損傷（腎症）、眼への重度の損傷（網膜症）、および／または神経への重度の損傷（神経障害）をもたらす、長期にわたる高血糖症およびインスリン抵抗性の結果が含まれる可能性があり、加えて、または代替的に、心血管疾患（例えば、心筋梗塞、心筋症、および脳卒中）をもたらす高コレステロール血症および／または高血圧症も含まれうる。ＢＫＢ２Ｒの活性化は、糖尿病性腎症からの腎臓の保護に著明に寄与することが示されており（Ａｌｌａｒｄら、２００８年、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２９４巻：Ｆ１２４９〜５６頁；Ｙｕａｎら、２００７年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４８巻；２０１６〜２０２６頁）、特定のＢＫＢ２Ｋ多型が糖尿病性腎症の危険性を増大させる（Ｍａｌｔａｉｓら、２００２年、Ｃａｎ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、８０巻：３２３〜７頁）。ＢＫＢ２Ｒの発現は、糖尿病性網膜症において重要な役割を果たすと考えられ、ＢＫＢ２Ｒの活性化は、糖尿病性網膜症（Ｋａｔｏら、２００９年、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒａｍｃｏｌ、６０６巻：１８７〜９０頁）のほか、神経障害（Ｋａｋｏｋｉら、２０１０年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０７巻：１０１９０〜５頁）も改善するはずである。したがって、特定の想定される実施形態によれば、本明細書で提示される抗ＢＫＢ２Ｒ抗体を糖尿病患者に投与して、腎症、神経障害、または網膜症のさらなる発症を可逆化または防止することができる。
【０２２２】
糖尿病はまた、心血管疾患とも関連する。組織カリクレインは、ブラジキニンＢ２受容体（ＢＫＢ２Ｒ）の活性化を介して、心保護において重要な役割を果たす。ブラジキニンＢ２受容体ノックアウトマウスは、血管周囲線維症および修復性線維症と関連する拡張型心筋症を発症することを示した（Ｅｍａｎｕｅｌｉら、１９９９年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１００巻；２３５９〜２３６５頁）。組織カリクレイン遺伝子を保有するアデノウイルスを全身送達したところ、高血圧ラットにおいて、血圧の低下ならびに心肥大および線維症の緩和がもたらされた（Ｃｈａｏら、１９９９年、Ｓｔｒｏｋｅ；３０巻；１９２５〜１９３２頁）。さらに、カリクレイン遺伝子を導入したところ、心筋梗塞後の正常血圧ラットおよび見かけ上血圧に影響を及ぼさない遺伝子的高血圧ラットにおける心肥大および線維症が緩和された。さらに、ＢＫＢ２Ｒを活性化することにより、心機能が改善され、心筋梗塞後の梗塞サイズおよび心室細動の発症率が低減され、イカチバントによりこれらの有益な効果が消失した（Ｙｉｎら、２００５年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２８０巻、８０２２〜８０３０頁）。また、心筋梗塞後にＢＫＢ２Ｒペプチドアゴニストを用いることにより、心機能に有益な効果が付与されることも注意される（Ｍａｒｋｅｔｏｕら、２０１０年、Ａｍ  Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ、２３巻：５６２〜５６８頁）。キニンは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび培養細胞において、キニンＢ２受容体−Ａｋｔ−ＧＳＫ−３ｂシグナル伝達経路およびＡｋｔ−Ｂａｄ−１４−３−３シグナル伝達経路の刺激を介して虚血／潅流誘導性心筋細胞アポトーシスから保護する。加えて、一酸化窒素（ＮＯ）も、酸化ストレス、ＴＧＦ−ｂ１／Ｓｍａｄ２シグナル伝達経路、およびＪＮＫ／ｐ３８ＭＡＰＫシグナル伝達経路、ならびにＮＦ−ｋＢの活性化を抑制することにより、ＢＫＢ２Ｒを介する、心筋虚血／潅流誘導性の炎症および心室リモデリングからの保護において重要な役割を果たす。これらの知見は、血圧に影響を及ぼす場合もあり、影響を及ぼさない場合もあるが、カリクレインが、心傷害から保護し、心機能を改善することを示す。まとめると、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究からの結果は、組織カリクレインが、ＢＫＢ２Ｒの活性化を介して、ＮＯの形成を増大させ、酸化ストレスを介在させるシグナル伝達カスケードを抑制することから、アポトーシス、炎症、肥大、および線維症を阻害することにより、心傷害から保護することを示す。したがって、特定の明示的に想定される実施形態によれば、本明細書で記載される抗ＢＫＢ２Ｒ抗体を糖尿病患者に投与し、心血管疾患のさらなる発症を可逆化または防止することができる。
【０２２３】
別の実施形態は、細胞を、コレステロールレベルを低下させるのに十分な量の、本明細書で開示されるＢＫＢ２Ｒ特異的抗体と接触させることにより、ＢＫＢ２Ｒを発現させる細胞におけるＧＳＫ−３β経路によるシグナル伝達を阻害する方法を提供する。簡潔な背景として述べると、高コレステロール血症は、血中コレステロールの存在が極めて高度である場合に生じる。長期にわたる高コレステロール血症の結果として、動脈硬化（アテローム性動脈硬化）ならびに心筋梗塞および脳卒中の危険性の増大を伴う心血管疾患がもたらされる。循環中の総コレステロール濃度は２００ｍｇ／ｄＬ未満であることが所望されるが、２００〜２３９ｍｇ／ｄＬが典型的に高レベルの境界として考えられ、２４０ｍｇ／ｄＬ超が高レベルと考えられる。心血管疾患の危険性を低減するために、総コレステロールは、２００ｍｇ／ｄＬ未満まで低下させることが望ましく、この場合、ＬＤＬコレステロールは、１００ｍｇ／ｄＬを下回るか、または危険性が極めて高い患者では７０ｍｇ／ｄＬを下回り、ＨＤＬコレステロールは、４０ｍｇ／ｄＬを下回ることが理想的である。食餌および身体運動は、総コレステロールレベルを低下させるのに寄与しうるが、このようなレジメンだけで常に奏効するわけではなく、したがって、さらなる薬物療法が適応でありうる。糖尿病を有する被験体は、危険性が高いと考えられ、したがって、典型的にはコレステロールレベルを注意深くコントロールするように推奨される。カリクレインはまた、ストレプトゾトシン誘導糖尿病ラットにおいて、ＢＫＢ２Ｒの活性化を介して、心機能、血清グルコースプロファイル、およびコレステロールを含めた脂質プロファイルを改善することにより、心筋症からも保護した（Ｍｏｎｔａｎａｒｉら、２００５年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５４巻；１５７３〜１５８０頁）。高脂肪食餌動物モデルの２型糖尿病では、組換えレトロウイルスを介する組織カリクレイン遺伝子発現の導入により、総コレステロールレベルの、非処置動物と比較して有意な低減がもたらされた（Ｙｕａｎ，  Ｇら、２００７年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４８巻；２０１６〜２０２６頁）。したがって、特定の実施形態によれば、本アゴニスト性抗ＢＫＢ２Ｒ抗体の投与を介する、本明細書で開示される治療的介入は、循環コレステロールレベルを有益に低下させることが想定される。
【０２２４】
他の特定の実施形態によれば、本明細書で記載される抗体による高血圧症の処置については、キニン（Ｌｙｓ−ブラジキニンおよびブラジキニン）が、構成的に発現する細胞表面受容体であるＢＫＢ２Ｒ（ブラジキニン２型受容体）に結合し、血管における平滑筋の弛緩をもたらす結果として血圧の降下をもたらすことが公知である。アンジオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）は、それらがもはやＢＫＢ２Ｒ結合できないように、さらにそれらを代謝することにより、これらのキニンの低血圧特性に対抗する。血圧の制御におけるＢＫＢ２Ｒの重要性は、受容体の発現をノックアウトした場合の血圧の上昇によりさらに強調される（Ｍａｄｅｄｄｕら、１９９６年、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、２８巻：９８０〜９８７頁）。別の研究では、高血圧症動物モデルにおいてＢＫＢ２Ｒを介して作用する組織カリクレインを過剰発現させたところ、血圧の持続的な低減がもたらされた（Ｗａｎｇら、１９９５年、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．、９５巻：１７１０〜１７６０頁）。したがって、これらの実施形態および類縁の実施形態では、本明細書で記載されるＢＫＢ２Ｒ抗体を患者に投与して高血圧症を処置する。
【０２２５】
特に、本抗体は、ＢＫＢ２Ｒおよび／またはＧＳＫ−３βの発現および／または活性と関連する多様ながんの処置に有用である。例えば、本発明の一実施形態は、がん患者に、治療有効量の、本明細書で開示されるＢＫＢ２Ｒ特異的抗体を投与することにより、混合系統系白血病、食道がん、卵巣がん、前立腺がん、腎臓がん、結腸がん、肝臓がん、胃がん、および膵臓がんが含まれるがこれらに限定されない、がんを処置するための方法を提供する。投与後において、がんの進行および／または転移を、統計学的に有意な形で（すなわち、当業者に公知の適切な対照と比べて）阻害するか、防止する、または遅延させる量が、有効であると考えられる。
【０２２６】
別の実施形態は、細胞を、シグナル伝達を阻害し、がん細胞の成長を阻害するのに十分な量の、本明細書で開示されるＢＫＢ２Ｒ特異的抗体と接触させることにより、ＢＫＢ２Ｒを発現させる細胞におけるＧＳＫ−３β経路によるシグナル伝達を阻害する方法を提供する。特定のがんは、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ（ＧＳＫ−３β）の阻害に対して感受性であることが決定されている。とりわけ、膵臓癌、肝細胞がん、胃がん、および結腸直腸がんは、ＧＳＫ−３βの発現を、非新生物性組織と比較して増大させることを示した。ＧＳＫ−３βを阻害する結果として、がん細胞の生存および増殖の緩和、ならびに細胞培養物およびマウスへの異種移植片におけるアポトーシスの増大がもたらされた（Ｍａｉら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００９年；１５巻（２２号）、６８１０〜６８１９頁）。本明細書で記載される抗ＢＫＢ２Ｒ抗体はまた、肝細胞がん、胃がん、および結腸直腸がんに由来する細胞系の成長を阻害するのにも有効である。食道がんでも同様に、ＧＳＫ−３β阻害の結果として、培養物中の細胞系の細胞周期の停止がもたらされた（Ｗａｎｇら、Ｗｏｒｌ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、２００８年；１４巻（２５号）：３９８２〜３９８９頁）。
【０２２７】
前立腺がんでは、ＧＳＫ−３βの阻害により、アンドロゲン受容体の発現が抑制され、前立腺がん細胞系の成長が阻害された（Ｍａｚｏｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００４年；２３巻；７８８２〜７８９２頁）。卵巣がんでは、ＧＳＫ−３β活性が、培養物および動物モデルの両方においてヒト卵巣がん細胞の増殖に関与した。ＧＳＫ−３βの阻害は、ヌードマウスにおいてヒト卵巣がん細胞系から生成させた腫瘍の形成を防止した（Ｃａｏら、２００６年、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；１６巻；６７１〜６７７頁）。ＭＬＬ（骨髄性／リンパ性白血病または混合系統系白血病）では、ＧＳＫ−３βが、ＭＬＬのがん原遺伝子において突然変異を伴うヒト白血病を維持する、発がん性の要件として裏付けられている。ＧＳＫ−３βを阻害する結果として、培養物中のいくつかのＭＬＬ細胞系の細胞周期の停止がもたらされた。ヒトＭＬＬ白血病の前臨床マウスモデルでは、ＧＳＫ−３βを阻害する結果として、マウスの生存の有意な延長がもたらされた（Ｗａｎｇら、２００８年、Ｎａｔｕｒｅ；４５５巻；１２０５〜１２１０頁）。本明細書で記載される抗ＢＫＢ２Ｒ抗体は、前立腺がんおよびＭＭＬ白血病に由来する細胞系の成長を阻害するのに有効であった。
【０２２８】
別の実施形態は、細胞を、放射線への曝露に対抗するのに十分な量の、本明細書で開示される抗ＢＫＢ２Ｒ特異的抗体と接触させることにより、ＢＫＢ２Ｒを発現させる細胞におけるＧＳＫ−３β経路によるシグナル伝達を阻害する方法を提供する。多様な供給源（核による事故、核兵器の爆発、がんの放射線療法）に由来する放射線への曝露は、極めて重度で致死性の身体欠損および神経欠損をもたらしうる。ＧＳＫ−３βの阻害は、細胞レベルで放射線への曝露に対抗する方途であることが可能であり、がんの放射線療法に由来する神経欠損を克服する一助となることが注意されている（Ｙａｚｌｏｖｔｓｋａｙａら、２００６年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６６巻：１１１７９〜８６頁）。
【０２２９】
別の実施形態は、細胞を、インフルエンザウイルス感染への曝露に対抗するのに十分な量の、本明細書で開示されるＢＫＢ２Ｒ特異的抗体と接触させることにより、ＢＫＢ２Ｒを発現させる細胞におけるＧＳＫ−３β経路によるシグナル伝達を阻害する方法を提供する。気道のインフルエンザウイルス感染は、毎年世界中で疾病および死亡の主な原因である。現在のところ、インフルエンザに対して用いた場合、オセルタミビルなどの抗ウイルス治療剤は、ウイルスの急速な突然変異速度のために有効でなくなりつつある。インフルエンザウイルスは、ウイルスの侵入および複製に対する宿主細胞の機構に依拠する。インフルエンザにより要請される、同定された宿主細胞タンパク質のうちの１つがＧＳＫ−３βであり（Ｋｏｎｉｇ，  Ｒら（２０１０年）、Ｎａｔｕｒｅ、４６３巻：８１３〜８１７頁）、ＧＳＫ−３βの発現をｓｉＲＮＡでノックアウトしたところ、ウイルス複製の大幅な低減がもたらされた。したがって、本明細書で開示される特定の実施形態は、本明細書で提示される抗ＢＫＢ２Ｒ抗体のアゴニストのシグナル伝達活性を介してＧＳＫ−３βを阻害することにより、非限定的な理論によれば、ウイルス抵抗性を結果としてもたらす可能性が高くないインフルエンザ（ｉｎｆｌｕｅｎｚｅ）ウイルス感染を処置するための治療法を想定する。
【０２３０】
別の実施形態は、細胞を、脳卒中患者を処置するためにＧＳＫ−３β経路を介するシグナル伝達を阻害するのに十分な量の、本明細書で開示されるＢＫＢ２Ｒ特異的抗体と接触させることにより、ＢＫＢ２Ｒを発現させる細胞におけるＧＳＫ−３β経路によるシグナル伝達を阻害する方法を提供する。虚血性脳卒中は、脳への血管が、その結果として脳への血流を失わせる血栓により遮断されている場合に生じる。脳へ血流の喪失の結果として、消耗性の傷害をもたらす特定の領域における脳組織への損傷がもたらされる。ＢＫＢ２Ｒは、虚血性脳卒中におけるその保護的な役割について公知である。ＭＣＡＯ虚血性脳卒中モデルを用いたところ、梗塞容量および神経欠損スコアは、ＢＫＢ２Ｒ欠損マウスにおいて、正常マウスと比較してより顕著であることが見出された（Ｃｈａｏら、２００６年、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ、１１巻：１３２３〜７頁）。ＢＫＢ２Ｒ欠損マウスでは、生存度もまた低下することが見出された。よって、本明細書で開示される特定の実施形態は、本明細書で記載される抗ＢＫＢ２Ｒ抗体を投与することにより、脳卒中を処置するための方法に関する。
【０２３１】
本明細書で記載されるＢＫＢ２Ｒ特異的抗体の、純粋形態または適切な医薬組成物による投与は、容認される薬剤の投与方式であって、同様の有用性をもたらす投与方式のうちのいずれかを介して実施することができる。医薬組成物は、抗体または抗体含有組成物を、生理学的に許容される適切な担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせることにより調製することができ、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル、マイクロスフェア、およびエアゾールなど、固体形態、半固体形態、液体形態、または気体形態の調製物へと調合することができる。組成物中には、加えて、塩、緩衝剤、および安定化剤など、他の薬学的有効成分および／または適切な賦形剤も存在させうるが、必ずしも存在させなくともよい。投与は、経口経路、非経口経路、鼻腔内経路、静脈内経路、皮内経路、皮下経路、または局所経路を含めた多様な異なる経路を介して達成することができる。好ましい投与方式は、処置または予防される状態の性質に依存する。投与後にがんの進行および／または転移を低減するか、阻害するか、防止するか、または遅延させる量を有効であると考える。
【０２３２】
特定の実施形態では、投与される量が、結果として治療的介入が適応である特定のパラメータのうちの１または複数における統計学的に有意な低下により示される、血圧の低減、および／または血中グルコース濃度の低下、および／または血清コレステロール濃度の低下、および／またはウイルス負荷の低減、および／または腫瘍の退縮、および／または心血管疾患、網膜症、神経障害、もしくは腎症の危険性の低減、および／または脳卒中後もしくは放射線への曝露後における罹患率もしくは死亡率の低減をもたらすのに十分である。正確な用量および処置の持続期間は、処置される疾患の関数であり、公知の試験プロトコールを用いて経験的に決定することもでき、組成物を当技術分野において公知のモデル系において調べ、これらから外挿することにより経験的に決定することもできる。また、比較臨床試験も実施することができる。用量はまた、緩和される状態の重症度によっても変化しうる。医薬組成物は一般に、有害な副作用を最小化しながら治療的に有用な効果を及ぼすように調合および投与する。組成物は、１回で投与することもでき、多数の少用量へと分割して、ある時間間隔で投与することもできる。任意の特定の被験体について、特定の用量レジメンを、個別の必要に従い、ある時間にわたり調整することができる。
【０２３３】
したがって、限定せずに述べると、これらの医薬組成物および類縁の医薬組成物を投与する典型的な経路には、経口経路、局所経路、経皮経路、吸入経路、非経口経路、舌下経路、口腔内経路、直腸内経路、膣内経路、および鼻腔内経路が含まれる。本明細書で用いられる非経口経路という用語には、皮下注射、静脈内注射法または静脈内注入法、筋肉内注射法または筋肉内注入法、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）注射法または胸骨内注入法が含まれる。本発明の特定の実施形態による医薬組成物は、組成物を患者へと投与したときに、その中に含有された有効成分がバイオアベイラビリティーを示すように調合する。被験体または患者に投与される組成物は、１または複数の用量単位であって、例えば、錠剤が単一の用量単位の場合もあり、エアゾール形態における本明細書で記載されるＢＫＢ２Ｒ特異的抗体の容器が複数の用量単位を保持する場合もある用量単位の形態をとりうる。このような剤形を調製する実際の方法は公知であるか、または当業者に明らかであろう（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０版（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年）を参照されたい）。いずれにせよ、投与される組成物は、本明細書の教示に従う対象の疾患または状態を処置するための治療有効量の本開示の抗体を含有する。
【０２３４】
医薬組成物は、固体形態の場合もあり、液体形態の場合もある。一実施形態では、組成物が、例えば、錠剤形態または粉末形態であるように、担体（複数可）は微粒子である。担体（複数可）は液体であり、組成物は、例えば、経口油、注射液、または、例えば、吸入投与において有用なエアゾールでありうる。経口投与用に意図される場合、医薬組成物は、固体形態または液体形態であることが好ましく、半固体、半液体、懸濁液、およびゲル形態が、本明細書で固体または液体として考えられる形態内に包含される。
【０２３５】
経口投与用の固体組成物として、医薬組成物を、粉末、顆粒、圧縮錠、丸薬、カプセル、チューインガム、ウェハーなどへと調合することができる。このような固体組成物は典型的に、１または複数の不活性希釈剤または可食性担体を含有する。加えて、以下のうちの１または複数が存在しうる：カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、結晶セルロース、トラガカントガム、またはゼラチンなどの結合剤；デンプン、ラクトース、またはデキストリンなどの賦形剤；アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、トウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｘなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香味料などの芳香剤；および着色剤。医薬組成物が、カプセル形態、例えば、ゼラチンカプセルの場合、それは、上記の種類の物質に加えて、ポリエチレングリコールまたは油などの液体担体を含有しうる。
【０２３６】
医薬組成物は、液体の形態、例えば、エリキシル剤、シロップ、溶液、エマルジョン、または懸濁液でありうる。２つの例として、液体は、経口投与用の場合もあり、注射を介する送達用の場合もある。経口投与用が意図される場合、好ましい組成物は、本化合物に加えて、甘味剤、防腐剤、色素／着色剤、および芳香増強剤のうちの１または複数も含有する。注射を介して投与することが意図される組成物では、界面活性剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、緩衝剤、安定化剤、および等張剤のうちの１または複数が包含されうる。
【０２３７】
それらが溶液であれ、懸濁液であれ、他の同様の形態であれ、液体の医薬組成物は、以下の補助剤のうちの１または複数を包含しうる：注射用水、食塩液、好ましくは生理食塩液、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウムなどの滅菌希釈剤、溶媒もしくは懸濁媒として用いうる合成モノグリセリドもしくは合成ジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒；  ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸などのキレート化剤；酢酸、クエン酸、またはリン酸などの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調整するための薬剤。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブルのシリンジ、または複数の用量バイアル内に封入することができる。生理食塩液は、好ましい補助剤である。注射用医薬組成物は、滅菌であることが好ましい。
【０２３８】
非経口投与用または経口投与用を意図される液体の医薬組成物は、適切な用量が得られるように、本明細書で開示されるＢＫＢ２Ｒ特異的抗体の量を含有するべきである。典型的に、この量は、組成物中に少なくとも０．０１％の抗体である。経口投与用が意図される場合、この量は、組成物重量の０．１〜約７０％で変化させることができる。特定の経口医薬組成物は、約４％〜約７５％の間の抗体を含有する。特定の実施形態では、非経口用量単位が、希釈前の０．０１〜１０重量％の抗体を含有するように、本発明による医薬組成物および医薬調製物を調製する。
【０２３９】
医薬組成物は、局所投与用を意図することもでき、この場合、担体は、溶液ベース、エマルジョンベース、軟膏ベース、またはゲルベースを含むことが適切でありうる。ベースは、例えば、以下のうちの１または複数を含みうる：ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜蝋、鉱物油、水およびアルコールなどの希釈剤、ならびに乳化剤および安定化剤。増粘剤は、局所投与用の医薬組成物中に存在させることができる。経皮投与用を意図する場合、組成物は、経皮パッチを包含する場合もあり、イオントフォレーシスデバイスを包含する場合もある。医薬組成物は、例えば、直腸内で溶融して薬物を放出する、坐剤の形態による直腸内投与を意図する場合もある。直腸内投与用の組成物は、適切な非刺激性賦形剤としての油性ベースを含有しうる。限定せずに述べると、このようなベースには、ラノリン、ココアバター、およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０２４０】
医薬組成物は、固体または液体の用量単位の物理的形態を改変する多様な物質を包含しうる。例えば、組成物は、有効成分の周囲にコーティングシェルを形成する物質を包含しうる。コーティングシェルを形成する物質は、典型的に不活性であり、例えば、糖、セラック、および他の腸溶性のコーティング剤から選択することができる。代替的に、有効成分は、ゼラチンカプセル内に包み込むこともできる。固体形態または液体形態の医薬組成物は、本発明の抗体に結合し、これにより化合物の送達の一助となる薬剤を包含しうる。この能力において作用しうる適切な薬剤には、他のモノクローナルまたはポリクローナル抗体、１または複数のタンパク質またはリポソームが含まれる。医薬組成物は、本質的にエアゾールとして投与しうる用量単位からなる場合がある。エアゾールという用語は、コロイド性の系〜高圧パッケージからなる系の範囲にわたる多様な系を示すのに用いられる。送達は、液化ガスまたは圧縮ガスを介する場合もあり、有効成分を分注する適切なポンプシステムを介する場合もある。有効成分（複数可）を送達するために、エアゾールは、単相系で送達することもでき、二相系で送達することもでき、三相系で送達することもできる。エアゾールの送達は、併せてキットを形成しうる、必要な容器、アクチベーター、バルブ、部分容器などを包含する。当業者は、不要な実験なしに、好ましいエアゾールを決定することができる。
【０２４１】
医薬組成物は、製薬技術分野で周知の方法を介して調製することができる。例えば、注射を介して投与されることを意図される医薬組成物は、本明細書で記載されるＢＫＢ２Ｒ特異的抗体と、場合によって、溶液を形成するように滅菌蒸留水を伴う、塩、緩衝液、および／または安定化剤のうちの１または複数とを含む組成物を組み合わせることにより調製することができる。界面活性剤を添加して、均一な溶液または懸濁液の形成を容易にすることができる。界面活性剤とは、水性送達系における抗体の溶解または均一な懸濁を容易にするように、抗体組成物と非共有結合的に相互作用する化合物である。
【０２４２】
組成物は、用いられる特定の化合物（例えば、ＢＫＢ２Ｒ特異的抗体）の活性；化合物作用の代謝安定性および長さ；患者の年齢、体重、全般的な健康、性別、および食餌；投与方式および投与期間；排泄速度；薬物の組合せ；特定の障害または状態の重症度；ならびに治療を受ける被験体を含めた多様な因子に依存して変化する治療有効量で投与することができる。一般に、治療的に有効な毎日の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、０．０７ｍｇ）〜約１００ｍｇ／ｋｇ（すなわち、７．０ｇ）（７０ｋｇの哺乳動物の場合）であり、好ましくは、治療有効用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、０．７ｍｇ）〜約５０ｍｇ／ｋｇ（すなわち、３．５ｇ）（７０ｋｇの哺乳動物の場合）であり、より好ましくは、治療有効用量は、約１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、７０ｍｇ）〜約２５ｍｇ／ｋｇ（すなわち、１．７５ｇ）（７０ｋｇの哺乳動物の場合）である。
【０２４３】
本明細書で記載されるＢＫＢ２Ｒ特異的抗体を含む組成物は、がんなど、本明細書で記載される疾患に罹患する個体に投与することができる。ヒト疾患を処置するためにｉｎ  ｖｉｖｏで用いる場合は一般に、本明細書で記載される抗体を、投与前に医薬組成物へと組み込む。医薬組成物は、本明細書の他の箇所に記載される、生理学的に許容される担体または賦形剤と組み合わせた、本明細書で記載される抗体のうちの１または複数を含む。医薬組成物を調製するには、有効量の１または複数の化合物を、特定の投与方式に適切であることが当業者に公知である任意の医薬担体（複数可）または医薬賦形剤と混合する。医薬担体は、液体の場合もあり、半液体の場合もあり、固体の場合もある。非経口適用、皮内適用、皮下適用、または局所適用に用いられる溶液または懸濁液には、例えば、滅菌希釈剤（水など）、食塩液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；抗微生物剤（ベンジルアルコールおよびメチルパラベンなど）；抗酸化剤（アスコルビン酸および亜硫酸水素ナトリウムなど）；およびキレート化剤（エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）など）；緩衝液（酢酸、クエン酸、およびリン酸など）が含まれうる。静脈内投与する場合、適切な担体には、生理食塩液またはリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）、ならびにグルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびこれらの混合物などの増粘剤および可溶化剤を含有する溶液が含まれる。
【０２４４】
本明細書で記載されるＢＫＢ２Ｒ特異的抗体を含む組成物は、徐放処方物またはコーティングなど、体内からの急速な消失から抗体を保護する担体と共に調製することができる。このような担体には、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系、ならびにエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、および当業者に公知の他のポリマーなどの生体分解性ポリマー、生体適合性ポリマーなどであるがこれらに限定されない、制御放出処方物が含まれる。
【０２４５】
本明細書の全体において、文脈により別段に要請されない限り、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、言明された要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の包含は含意するが、他の任意の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の除外は含意しないと理解される。
【０２４６】
文脈により別段であることが明確に規定されない限り、本明細書で用いられる単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」は、複数態を包含する。したがって、例えば、「ある細胞」への言及は、単一の細胞のほか、２つ以上の細胞も包含し、「ある薬剤」への言及は、１つの薬剤のほか、２つ以上の薬剤も包含するなどである。
【０２４７】
別段に明示的に言明されない限り、本明細書で記載される各実施形態は、変更すべき部分を変更して、他の全ての実施形態にも適用されるものとする。
【０２４８】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換のための標準的な技法を用いることができる（例えば、電気穿孔、リポフェクション）。製造元の仕様に従い、または当技術分野において一般的に達成される通りに、または本明細書で記載される通りに、酵素反応および精製技法を実施することができる。これらの技法および手順ならびに類縁の技法および手順は、当技術分野において周知の従来の方法に従い、かつ、本明細書全体で引用されて論じられる、微生物学法、分子生物学法、生化学法、分子遺伝学法、細胞生物学法、ウイルス学法、および免疫学法における多様な一般的参考文献およびより専門的な参考文献において記載される通り、一般に実施することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２００８年７月改定）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩおよびＩＩ巻（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ  ＵＳＡ、１９８５年）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａｄａ  Ｍ．  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄａｖｉｄ  Ｈ．  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅｔｈａｎ  Ｍ．  Ｓｈｅｖａｃｈ編、Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ、２００１年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、ＮＹ）；Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｊｕｌｉｅ  Ｌｏｇａｎ、Ｋｉｒｓｔｉｎ  ＥｄｗａｒｄｓおよびＮｉｃｋ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ編、２００９年、Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｏｒｆｏｌｋ、ＵＫ；Ａｎａｎｄ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ、（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２年）；ＧｕｔｈｒｉｅおよびＦｉｎｋ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．  Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、���９８６年）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｊａｎｉｔｚ、２００８年、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｐａｒｋ編、３版、２０１０年、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）；論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．  Ｈ．  ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．  Ｐ．  Ｃａｌｏｓ編、１９８７年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９８年）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７年）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．  Ｍ．  ＷｅｉｒおよびＣＣ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年）；Ｒｉｏｔｔ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６版（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８８年）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｕｒｓｔａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ編、２００２年）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ：  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｕｒｓｔａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ編、２００６年）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩ：  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｕｒｓｔａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ編、２００６年）；Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｕｒｓａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ編、２００６年）；Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｄａｒｗｉｎ  Ｊ．  Ｐｒｏｃｋｏｐ、Ｄｏｎａｌｄ  Ｇ．  Ｐｈｉｎｎｅｙ、およびＢｒｕｃｅ  Ａ．  Ｂｕｎｎｅｌｌ編、２００８年）；Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ａ．  ＫｌｕｇおよびＣｒａｉｇ  Ｔ．  Ｊｏｒｄａｎ編、２００１年）；Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｅｖｉｎ  Ｄ．  Ｂｕｎｔｉｎｇ編、２００８年）；Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｌｅｓｌｉｅ  Ｐ．  Ｗｅｉｎｅｒ編、２００８年）を参照されたい。
【０２４９】
特定の定義を提示しない限り、本明細書で記載される分子生物学、分析化学、有機合成化学、ならびに創薬化学および製薬化学との関連で用いられる命名法ならびにこれらの実験室における手順および技法は、周知の命名法ならびに手順および技法であり、当技術分野において一般的に用いられている。標準的な技法は、組換え法、分子生物学法、微生物学法、化学合成法、化学的分析法、医薬の調製、処方、および送達、ならびに患者の処置に用いることができる。
【０２５０】
文脈により別段に要請されない限り、本明細書および特許請求の範囲の全体において、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、ならびに「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変化形は、開かれた、包含的な意味で、すなわち、「〜が含まれるがこれらに限定されない」として解釈されるものとする。「〜からなる」とは含めること（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味し、典型的に、「〜からなる」という語句に後続する任意の全ての語句に限定される。「本質的に〜からなる」とは、この語句に後続して列挙され、列挙される要素の開示において指定される活動または作用に干渉または寄与しない他の要素に限定される任意の要素を含めることを意味する。したがって、「本質的に〜からなる」という語句は、列挙される要素が要求されるかまたは必須であるが、他の要素は要求されず、それらが列挙される要素の活動または作用に影響を及ぼすかどうかに依存して、存在する場合もあり、存在しない場合もあることを示す。
【０２５１】
本明細書および付属の特許請求の範囲では、内容により別段であることが明確に規定されない限り、単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」は、複数の言及を包含する。本明細書で用いられる、具体的な実施形態では、数値に先行する場合の「約」または「およそ」という用語は、その値±５％、６％、７％、８％、または９％の範囲を示す。他の実施形態では、数値に先行する場合の「約」または「およそ」という用語は、その値±１０％、１１％、１２％、１３％、または１４％の範囲を示す。さらに他の実施形態では、数値に先行する場合の「約」または「およそ」という用語は、その値±１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％の範囲を示す。
【０２５２】
本明細書全体における「一実施形態」または「ある実施形態」または「ある態様」への言及は、その実施形態との関連で記載される特定の特色、構造、または特徴が、本発明の少なくとも１つの実施形態に包含されることを意味する。したがって、本明細書全体の多様な箇所における「一実施形態では」または「ある実施形態では」という語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指すわけではない。さらに、特定の特色、構造、または特徴は、１または複数の実施形態で任意の適切な形に組み合わせることができる。
【実施例】
【０２５３】
（実施例１）
ＢＫ  Ｂ２受容体に対するモノクローナル抗体のスクリーニングおよび選択
この実施例は、ＢＫＢ２Ｒポリペプチドに対する免疫化を介して生成させる抗体を含有するハイブリドーマ上清の、ｐ−ＧＳＫ３βを活性化する能力についてのスクリーニングについて記載する。活性化は、抗ＢＫＢ２Ｒハイブリドーマ上清による処置の６０分後にＷＩ−３８ヒト線維芽細胞から調製した溶解物中、および抗ＢＫＢ２Ｒハイブリドーマ上清による処置の１０分後に３Ｔ３マウス線維芽細胞から調製した溶解物中で、イムノアッセイによりＧＳＫ３βを決定することにより評価した。
【０２５４】
マウスは、ＢＫＢ２Ｒポリペプチド（配列番号７３および７４）で免疫化し、ハイブリドーマは、標準的なプロトコールを用いて単離した。５０のハイブリドーマを、マウス配列（配列番号７４）で免疫化した動物の融合脾臓細胞から成長させ、また、５０のハイブリドーマを、ヒト配列（配列番号７３）で免疫化した動物の融合脾臓細胞からも成長させた。各ハイブリドーマに由来する抗体を、ＢＫＢ２ＲペプチドであらかじめコーティングしたＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加し、ペプチドの結合を測定した。
【０２５５】
５０のハイブリドーマ上清を、３Ｔ３マウス線維芽細胞およびＷＩ−３８ヒト線維芽細胞の両方におけるＧＳＫ−３β（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ）のリン酸化を刺激することが可能な抗ＢＫＢ２Ｒ抗体の存在についてスクリーニングした。ＧＳＫ−３βのリン酸化は、この抗体によるＢＫ  Ｂ２受容体の活性化を介するＧＳＫ−３βの脱活性化の指標である。
【０２５６】
３Ｔ３細胞の刺激：マウス３Ｔ３細胞は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を補充したＤＭＥＭ中で培養した。刺激の４８時間前に、ＦＢＳを伴う培養培地１ｍＬ中、１２ウェルプレート上１ｃｍ２当たりの細胞５×１０４個（ウェル１つ当たり１ｍｌ当たりの細胞およそ１．８×１０５個）で細胞を播種した。刺激の１２〜２４時間前に、培養培地を１ｍＬの無血清ＤＭＥＭで置換した。
【０２５７】
試薬：血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ：Ｓｉｇｍａ；Ｐ８１４７−１ＶＬ、２５０ｎｇ）を、０．１％のＢＳＡを含有する４ｍＭのＨＣｌ中で再構成して、ＰＤＧＦを５μｇ／ｍＬで含有する溶液を得、これを、さらに４ｍＭのＨＣＬ／０．１％のＢＳＡ中で希釈し、ＰＤＧＦを１０００ｎｇ／ｍＬで含有する原液を得た。この原液を、無血清培地中１：１０（ｖ／ｖ）にさらに希釈して、１００ｎｇ／ｍＬ（「２倍」）溶液を得、次いで、これを、試料と共に１：１に希釈して、５０ｎｇ／ｍＬの最終試料処理濃度を達成した。
【０２５８】
溶解緩衝液（「ＲＩＰＡ  ＣＬＢ」）は、５μｌ／ｍＬのプロテアーゼ阻害剤カクテル（「ＰＩＣ」：Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；カタログ番号：Ｐ８３４０）、２ｍＭのＮａＶＯ４、２０ｍＭのＮａ４Ｐ２Ｏ７、および１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含有した。
【０２５９】
試料：３Ｔ３細胞の培養物から培養培地を除去し、血清が添加されていないウェル１つ当たり０．５ｍＬの新鮮なＤＭＥＭで置換し、培養ウェルへの細胞の付着を乱さないように注意した。陽性対照ウェルには、ＤＭＥＭ／ＦＢＳ中に５０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦを施し、陰性対照ウェルには、ＤＭＥＭ／ＦＢＳだけを施した。被験ウェルには、０．５ｍＬのハイブリドーマ上清を施した。３７℃における１０分のインキュベーション後、吸引により培地を除去し、付着した細胞をＰＢＳで静かにすすぎ、プレートを氷上で保持した。
【０２６０】
溶解：０．５ｍｌの溶解緩衝液を各ウェルに添加し、細胞を、氷上で３０分間にわたり溶解させた。セルリフターを用いて各ウェルの内容物をマイクロ遠心管へと移した。上清を１５分間にわたりマイクロ遠心分離して、不溶性物質を除去した。次いで、上清を回収し、未使用の試験管に入れ、−８０℃で保管した。
【０２６１】
ＥＬＩＳＡ：製造元の指示書に従い、Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ（登録商標）キット（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｉｎｃ．、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ；カタログ番号：９００−１２３）を用いて、細胞溶解物中のＧＳＫ−３βを定量化するためのイムノアッセイを実施した。試料および対照を１：５０に希釈した。結果を図１に示す。２つのハイブリドーマクローン（試料番号８および１７）を増殖させるために、それらの活性レベルの高さに基づき選択した。
【０２６２】
ＷＩ−３８細胞（ヒト）の刺激：ヒトＷＩ−３８細胞を、１０％のＦＢＳ、１％のＰ／Ｓ、および２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＭＥＭ培地中で培養した。刺激の４８時間前に、細胞を、ＦＢＳを伴う培養培地１ｍＬ中に、１２ウェルプレート上１ｃｍ２当たりの細胞５×１０４個（ウェル１つ当たり１ｍＬ当たりの細胞約１．８×１０５個）で播種した。刺激の１２〜２４時間前に、培地を、１ｍＬの無血清ＭＥＭ培地で置換した。
【０２６３】
試薬：ＰＤＧＦは、上記の通りに調製した。カリクレイン（ＫＬＫ、Ｓｉｇｍａカタログ番号：Ｋ３６２７）を、１０％のＦＢＳを含有するＭＥＭ培地中に溶解させ、２００μｇ／ｍＬ（２倍）へと希釈し、５００μＬのＫＬＫ溶液を選択した培養ウェルに添加して、１００μｇ／ｍＬの最終濃度を達成した。ＬｉＣｌ（Ｓｉｇｍａ：Ｌ−８８９５）をＰＢＳ中に溶解させ、ＭＥＭ／１０％のＦＢＳ中４０ｍＭへと希釈し、選択した培養ウェルに５００μＬのＬｉＣｌ溶液を添加して、２０ｍＭの最終濃度を達成した。溶解緩衝液（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｉｎｃ．製のＲＩＰＡ  ＣＬＢ；ＭＢＬ＃０６１７０８Ｃ）は、上記の通りとした。
【０２６４】
試料：ＷＩ−３８細胞培養物から培養培地を除去し、血清が添加されていないウェル１つ当たり０．５ｍＬの新鮮なＤＭＥＭで置換し、培養ウェルへの細胞の付着を乱さないように注意した。対照ウェルには、以下の処置のうちの１つ：（Ａ）ＤＭＥＭ／ＦＢＳ中に５０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦ；（Ｂ）ＬｉＣｌ（２０ｍＭ）、（Ｃ）ＫＬＫ（５００μｇ／ｍＬ）、（Ｄ）ＫＬＫ（１００μｇ／ｍＬ）、（Ｅ）陰性対照であるＤＭＥＭ／ＦＢＳ単独、（Ｆ）陰性対照である無血清ＤＭＥＭを施した。被験ウェルには、０．５ｍＬのハイブリドーマ上清を施した。３７℃における６０分のインキュベーション後、吸引により培地を除去し、付着した細胞をＰＢＳで静かにすすぎ、プレートを氷上で保持した。
【０２６５】
ＧＳＫ−３βを定量化するための溶解およびＥＬＩＳＡイムノアッセイは、上記の通りとした。結果を図２に示す。複数のハイブリドーマ上清が、ＧＳＫ−３βを、バックグラウンドレベルを上回って有意に誘導した。とりわけ、ハイブリドーマ上清試料番号５５、６５、および６６は、バックグラウンドを上回って３０００ｐｇ／ｍＬを超えるｐ−ＧＳＫ−３Ｂを示した。
【０２６６】
抗ＢＫＢ２Ｒ抗体を含有するハイブリドーマ上清は、ＢＫＢ２Ｒ受容体を活性化し、ＧＳＫ−３Ｂの不活化（リン酸化を介する）を誘発したと考えられる。
【０２６７】
（実施例２）
Ｗｉｓｔａｒラットモデルを用いる抗ＢＫＢ２Ｒ抗体の血圧に対する急性効果
この実施例は、麻酔下にあるＷｉｓｔａｒラットにおけるいくつかの抗ＢＫＢ２Ｒ抗体の血圧に対する急性効果について記載する。
【０２６８】
研究デザイン：雄Ｗｉｓｔａｒラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）は、７．０〜７．６週齢、平均体重２４５グラムであり、ラット用Ｐｕｒｉｎａ  ５００１飼料に適宜維持した。１週間の実験室馴化後、大腿部カテーテル手術のための処置および薬物投与を１日以内に実施し、同じ日に測定を開始し、３週間にわたり進行する追跡期間において継続した。処置群は、（１）３Ｈ３Ｈ３（抗ＢＫＢ２Ｒ）抗体群（ｎ＝８）、（２）３Ｈ３Ｈ９（抗ＢＫＢ２Ｒ）抗体群（ｎ＝８）、（３）１Ｆ２Ｇ７（抗ＢＫＢ２Ｒ）抗体群（ｎ＝３）、（４）５Ｆ１２Ｇ１（抗ＢＫＢ２Ｒ）抗体群（ｎ＝８）であった。
【０２６９】
血圧の測定：ラットを、ケタミン（３０ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）およびＩｎａｃｔｉｎ（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔した。大腿動脈には血圧測定のためのカニューレを植え込み、大腿静脈には薬物投与のためのカニューレを植え込んだ。動脈ラインは、１０ＵＩ／ｍｌのヘパリンを伴う生理食塩液で満たして実験中のこのラインの開存を保ち、動脈ラインの頻繁なフラッシングを回避した。１５〜２０分間の平衡化時間後において、かつ、血圧が安定したら、ベースラインの血圧を１５分間にわたり記録し、次いで、薬物を投与し、その血圧に対する効果を評価した。抗体については、単回用量（０．５ｍｇ／ｋｇ）を投与し、３時間にわたり血圧を記録した。全ての薬物を生理食塩液またはＰＢＳ中で希釈して、１ｍｌ／ｋｇの総容量を達成した。薬物を、平均４０秒間でゆっくりと投与した。実験中、動物を３７℃に保った。実験が終了したら、動物を安楽死させ、血液も組織も回収しなかった。
【０２７０】
計算：ベースラインの血圧、薬物に対する血圧反応の長さ、血圧反応についての最大血圧変化および曲線下面積（ＡＵＣ）。抗体について、注入の１、２、および３時間後における血圧。
【０２７１】
結果：４つの抗ＢＫＢ２Ｒ抗体全てが、静脈内投与直後に始まる一過性効果を、血圧に対して及ぼした。５Ｆ１２Ｇ１は、投与後全ての時点において、血圧に対する低度ではあるが有意な低減を示した。この群では、ベースラインにおける血圧が１０９±３ｍｍＨｇであり、抗体を投与した１時間後に９５±３ｍｍＨｇへと低下し、２時間後に９４±３ｍｍＨｇへと低下し、３時間後に９５±３ｍｍＨｇへと低下した。これらの群については、ピークの血圧反応値および反応の長さ（血圧がベースラインへと復帰するまでの長さ）の値を表１に提示し、図３および４のグラフ形態に示す。
【０２７２】
【表１】
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（実施例３）
モノクローナル抗体によるＡ５４９細胞におけるウイルス力価の低減についてのＱＲＴ−ＰＣＲ解析
定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）法は、インフルエンザウイルスを用いる作用機構研究のために、主要なロースループットスクリーニングとして、確認用スクリーニングとして用いられている。この実施例は、被験化合物の存在下のウイルス感染した細胞における、複製されたウイルス粒子数との直接的な相互関連物としてのウイルスゲノムＲＮＡの量を測定するｑＲＴＰＣＲアッセイの使用について記載する。アッセイは、作用機構もまた示唆しうる、直接的で信頼できる測定を提供する。このアッセイと共に、ウイルス集団を定量化するための、単離されたｃＤＮＡの９６ウェルロースループット配列決定も開発した。
【０２７３】
実験デザインおよび方法
Ａ５４９細胞の培養およびインフルエンザウイルスの感染：Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５；ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を組織培養プレート内で約９５％のコンフルエンシーまで成長させた。１０％のＦＢＳおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を補充したＤＭＥＭ中で細胞を維持および播種した。播種の２４時間後、抗体５Ｆ１２Ｇ１（「Ｇ１」）、１Ｆ２Ｇ７（「Ｇ７」）、３Ｈ３Ｈ９（「Ｈ９」）、および３Ｈ３Ｈ３（「Ｈ３」）、ならびに陽性対照薬Ｔａｍｉｆｌｕ（登録商標）を、培養培地中の希釈液としてプレートに添加し、その後、プレートを戻して、３７℃／５％ＣＯ２で１時間にわたりインキュベートした。次いで、細胞にウイルスを感染またはモック感染させた。０．１感染多重度（ＭＯＩ）のインフルエンザ株Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／０７（Ｈ１Ｎ１）を用いて感染させた。細胞に感染させるため、成長培地を除去し、細胞を３回にわたりＤＰＢＳで洗浄した。ウイルスをＤＭＥＭ−ＰＳＧ中で希釈し（またはウイルスを含有しないＤＭＥＭ−ＰＳＧだけをモック感染に用い）、細胞に添加した。新鮮な抗体調製物を再度添加し、その後、プレートを戻して、３７℃／５％ＣＯ２で１時間にわたりインキュベートした。次いで、細胞をインキュベーターから取り出し、感染培地を、適切な抗体、対照薬、またはＯｐｔｉＰｒｏ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）無血清培地／２μｇ／ｍＬのトリプシン中のモック希釈液を含有する新鮮な培地で置換し、細胞をインキュベーターへと戻した。細胞を３７℃／５％ＣＯ２中でインキュベートし、感染の７２時間後、ｑＲＴ−ＰＣＲ解析のために採取した。陰性対照として、非感染細胞を同じ手順にかけた。また、投与される抗体だけを伴う対照プレート（ウイルス感染を伴わない）も解析して、Ａ５４９細胞における各抗体用量による細胞傷害作用の程度を決定した。対照プレートは、上記の通りに調製したが、細胞にはウイルスを添加しなかった（培地のモック感染）。７２時間後に細胞生存度を決定した。
【０２７４】
マトリックスの種類により要請される通りにＱｉａｇｅｎ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて、生物学的マトリックス（例えば、組織、体液、または排泄物）に由来するＤＮＡ量およびＲＮＡ量についての解析を実施した。抽出したＲＮＡ試料の濃度を、光学濃度（Ａ２６０）を介して測定した。プライマーを、インフルエンザＭセグメントの２００ヌクレオチドの部分に相補的な、特別注文によりデザインした、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、リアルタイムＰＣＲによりｃＤＮＡ配列を定量化した。まず、販売元の指示書に従い、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いて、ＲＮＡ試料をｃＤＮＡへと転写し、上記のＤＮＡと同じ形でｃＤＮＡを定量化した（ｑＲＴ−ＰＣＲ）。ｑＲＴ−ＰＣＲによるこの解析のために、二連試料をプールして解析し、また、陽性対照、陰性対照、および鋳型なしの対照も解析した。公知の量の鋳型（例えば、インフルエンザＭ遺伝子を含有するプラスミド）を用いて検量線を作成した。Ｃｔ値を公知の鋳型のコピー数と対比してプロットすることにより、線形比較を行った。次いで、このプロットを用いて、未知の試料中のｃＤＮＡ量を推定した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いて統計学的解析を実施し、グラフ表示した。
【０２７５】
結果：結果を表２および図５〜８にまとめる。ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果は、Ｔａｍｉｆｌｕ（登録商標）対照により、測定されたウイルスゲノムのコピー数が用量応答的な形で低減されることを示す。抗ＢＫＢ２Ｒ抗体であるＧ１（５Ｆ１２Ｇ１）は、１００μｇ／ｍＬの被験最高濃度でウイルス力価の強力な低減（ウイルス力価を１００分の１に低減する）を示し、したがって、インフルエンザウイルスを処置するための候補物質と考えられた。
【０２７６】
【表２】
2014502274.tif 000004
（実施例４）
抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体はＭＤＣＫ（形質転換）細胞に対する細胞傷害作用を呈示する
この実施例は、抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体の、不死化され形質転換された腎臓上皮細胞系であるメイディン−ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞系（Ｋｕｓｈｉｄａら、１９９９年）に対する効果について記載する。驚くべきことに、抗ＢＫＢ２Ｒ抗体がＭＤＣＫ細胞に対して細胞傷害性であることから、これらの抗体候補物質が腎臓がん用などのがん治療剤として用いられることが観察された。
【０２７７】
方法：抗ウイルス毒性アッセイは検証されており、本質的にＮｏａｈら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．、２００７年１月；７３巻（１号）：５０〜９頁において記載される通りにこれを実施した。メイディン−ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を用いて、抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体または他の化合物の、インフルエンザ感染により誘導される細胞変性効果（ＣＰＥ）の防止における有効性を調べた。各試行には、陽性対照化合物としてオセルタミビルカルボキシレート（Ｔａｍｉｆｌｕ（登録商標））を組み入れた。細胞生存度（細胞傷害作用）を解析するために、サブコンフルエントのＭＤＣＫ細胞培養物を９６ウェルプレートへと播種した。播種時には、抗体または他の薬物を細胞に添加した。２４時間後、ＣＰＥウェルにはまた、１００組織培養感染用量（１００ＴＣＩＤ５０）のインフルエンザウイルスも施した。７２時間後、細胞生存度を決定した。細胞生存度は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて評価した。細胞数を５０％および９０％低減した薬物の毒性濃度（それぞれ、ＴＣ５０およびＴＣ９０）を計算した。
【０２７８】
細胞生存度についてのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）検出アッセイ：インフルエンザ誘導ＣＰＥの測定は、代謝的に活性な細胞の指標であるＡＴＰの定量化に基づいた。ＣＰＥアッセイでは、販売元の指示書に従い、市販のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて、培養物における細胞傷害作用および細胞増殖を決定した。略述すると、細胞培養物のインキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）試薬（細胞型に応じて、半減期が５時間を超える）を、既に培養した培地中のサブコンフルエント細胞へと直接添加し、細胞溶解と、存在するＡＴＰ量（細胞生存度についてのバイオマーカーとしての）に比例する生物発光シグナルの生成とを誘導した。
【０２７９】
１日目には、ＭＤＣＫ細胞を９０％のコンフルエンシーまで成長させ、次いで、トリプシン化し、回収し、遠心分離し、ＰＢＳ中で２回にわたり洗浄して、残存する血清を除去した。細胞を、ＤＭＥＭ／ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン中で再懸濁化および希釈し、９６ウェルプレートへとアリコート分割し、３７℃で１８時間にわたりプレートに付着させた。次いで、抗体（抗ＢＫＢ２Ｒ  ｍＡｂ）もしくは他の被験化合物、またはビヒクル（培地）対照を被験ウェルへと添加した。
【０２８０】
２日目に、目視観察により細胞生存度を確認したところ、コンフルエンシーは目視で８０〜９０％であると推定された。１００ＴＣＩＤ５０（７２時間で５０％の致死率を引き起こす組織培養感染用量の１００倍）の各ウイルス（最終濃度で２μｇのトリプシンを含有する）を被験ウェルに添加した。対照ウェルには、培地だけ（トリプシンもまた含有する）を添加した。最終ウェル容量は、１００ｍＬであった。プレートを、３７℃／５％ＣＯ２で７２時間にわたりインキュベートした。
【０２８１】
５日目に、１００ｍｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）試薬を各ウェルに添加し、その後、プレートを、発光の検出を介して解析した。
【０２８２】
ＭＤＣＫ細胞における細胞傷害作用についての抗体の試験：１日目、アッセイの１８時間前に、９０％コンフルエントの単層から回収したＭＤＣＫ細胞を、２日目の非感染細胞について９０％コンフルエンシーを達成するように選択した細胞密度で９６ウェルプレートに播種した。播種の直後、１％未満のＤＭＳＯを含有する培養培地中で希釈した被験化合物（抗ＢＫＢ２Ｒ  ｍＡｂまたはＴａｍｉｆｌｕ（登録商標））を、多連ウェル（有効性の決定は三連、細胞傷害作用の決定は二連）へと添加し、対照ウェルには培地だけを施した。抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のための被験化合物（「薬物」）調製物の最終濃度は、１００、３３、１１、３．７、１．２、０．４、０．１４、０．０５μｇ／ｍＬであり、Ｔａｍｉｆｌｕ（登録商標）調製物の最終濃度は、０．０２３、０．０７、０．２、０．６、１．９、５．５、１６．６、５０ｍＭであった。培養物を３７℃／５％ＣＯ２で一晩にわたり維持し、２日目にウイルスを添加した。有効性の決定を実施する各ウェルには、１００ＴＣＩＤ５０のウイルス（最終被験濃度）を添加し、ウイルスを施さなかったウェルは、細胞傷害作用の決定に用いた。プレートを、３７℃／５％ＣＯ２でさらに７２時間にわたりインキュベートし、その後、上記の通りにＰｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）キットを用いる発光解析を介して、細胞生存度を測定した。
【０２８３】
結果：被験濃度を高くすると、被験抗ＢＫＢ２Ｒ抗体の全てが、ＭＤＣＫ細胞において細胞傷害作用を示した。図９〜１８は、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７およびインフルエンザＣＡ／０７／０９に対する多様な抗体による結果を、グラフ形態でまとめる。
【０２８４】
（実施例５）
抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体は、多様ながん細胞系に対する細胞傷害作用を呈示する
この実施例は、がん細胞系のパネルに照らした、本明細書で記載される抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体の細胞傷害活性の特徴付けについて記載する。ＢｘＰＣ−３とは、元来膵臓（膵臓がん）から単離されたヒト腺がん細胞系である（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１６８７；Ｔａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．、４巻：１５〜２３頁、１９８６年；ＰｕｂＭｅｄ：３７５４１７６）。ＭＶ−４−１１とは、元来末梢血から単離されたヒト混合型Ｂ細胞骨髄単球性白血病（混合系統系白血病、ＭＬＬ−ＡＦ４）細胞系である（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−９５９；Ｌａｎｇｅら、Ｂｌｏｏｄ、７０巻：１９２〜１９９頁、１９８７年；ＰｕｂＭｅｄ：３４９６１３２）。Ｈｅｐ  Ｇ２とは、肝臓（肝臓がん）から単離されたヒト肝細胞がん細胞系である（ＡＴＣＣ＃ＨＢ−８０６５；Ａｄｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２８２巻：６１５〜６１６頁、１９７９年；ＰｕｂＭｅｄ：２３３１３７）。ＲＳ４；１１とは、骨髄から単離されたヒト急性リンパ芽球性白血病（混合系統系白血病、ＭＬＬ−ＡＦ４）細胞系である（ＡＴＴＣ＃ＣＲＬ−１８７３；Ｓｔｏｎｇら、Ｂｌｏｏｄ、６５巻：２１〜３１頁、１９８５年；ＰｕｂＭｅｄ：３９１７３１１）。ＨＴ−２９とは、結腸（結腸がん）から単離されたヒト結腸直腸腺がん細胞系（ＡＴＴＣ＃ＨＴＢ−３８）である（Ｆｏｇｈら、Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、５８巻：２０９〜２１４頁、１９７７年；ＰｕｂＭｅｄ：８３３８７１）。ＮＵＧＣ−４とは、胃周囲（ｐａｒａｇａｓｔｉｒｉｃ）の胃リンパ節から単離されたヒト胃癌細胞系である（ＪＣＲＢ＃ＪＣＲＢ０８３４；Ａｋｉｙａｍａら、Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｓｕｒｇ．、１８巻：４３８〜４４６頁、１９８８年）。ＰＣ−３とは、元来骨転移（前立腺がん）から単離された、ヒト前立腺腺がん細胞系である（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１４３５；Ｋａｉｇｈｎら、Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｕｒｏｌ．、１７巻：１６〜２３頁、１９７９年；ＰｕｂＭｅｄ：４４７４８２）。
【０２８５】
がん細胞系であるＢｘＰＣ−３、ＭＶ−４−１１、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＲＳ４；１１、ＨＴ−２９、およびＮＵＧＣ−４における細胞傷害作用についての抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体（１Ｆ１２Ｇ７および５Ｆ１２Ｇ１）の試験：細胞系は、各細胞系についてのＡＴＣＣガイドライン（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）により推奨される培地、血清、および培養条件を用いて成長させた。０日目に、容量０．１ｍＬの完全培地中ウェル１つ当たりの細胞３０，０００個で、細胞を９６ウェル培養プレートに播種した。次いで、プレートを、２４時間にわたり、３７℃の、５％ＣＯ２および９５％のＨＥＰＡで濾過した室内空気を伴う加湿式インキュベーターに入れた。次に、各被験抗体をその中で所望の最終濃度（５０，０００ｎｇ／ｍＬ、２５，０００ｎｇ／ｍＬ、１２，５００ｎｇ／ｍＬ  ６，２５０ｎｇ／ｍＬ、３１２５ｎｇ／ｍＬ、１５６３ｎｇ／ｍＬ、７８１ｎｇ／ｎｌ、３９１ｎｇ／ｍＬ、１９５ｎｇ／ｍＬ、または９８ｎｇ／ｍＬ）の２倍に希釈した（２倍濃度）０．１ｍＬの無血清培地を、表示されるウェルに添加し、プレートを１２０時間（５日間）にわたりインキュベーターに戻した。陽性対照である２倍濃度の抗がん薬シスプラチン０．１ｍＬを、以下の濃度：３００，０５０．０００ｎｇ／ｍＬ、７５，０１２．５００ｎｇ／ｍＬ、１８，７５３．１２５ｎｇ／ｍＬ、４，６８８．２８１ｎｇ／ｍＬ、１，１７２．０７０ｎｇ／ｍＬ、２９３．０１８ｎｇ／ｍＬ、７３．２５４ｎｇ／ｍＬ、１８．３１４ｎｇ／ｍＬ、４．５７８ｎｇ／ｍＬ、または１．１４５ｎｇ／ｍＬで用いた。
【０２８６】
ＭＴＴアッセイ：ＡＴＣＣのＭＴＴ細胞増殖アッセイ（カタログ番号：３０−１０１０Ｋ）を用いて、表示される細胞系に対する被験化合物の抗増殖活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて評価した。薬物（例えば、抗ＢＫＢ２Ｒ  ｍＡｂまたはシスプラチン）との１２０時間のインキュベーション後、ＭＴＴ試薬を各ウェルに添加し、さらに４時間にわたりインキュベートすることにより、細胞増殖を測定した。次いで、このステップの後、細胞溶解／ＭＴＴ可溶化試薬を添加し、一晩にわたりインキュベーションした。被験ウェルの吸光度（５７０ｎｍ）を測定し、次いで、薬物を施さなかった対照ウェルと比べて定量化した。結果を、化合物濃度と対比した阻害百分率として表し、図１９〜２５に示す通り、ＢｘＰＣ−３、ＭＶ−４；１１、ＨｅｐＧ２、ＲＳ−４；１１、ＨＴ−２９、ＮＵＧＣ−４、およびＰＣ−３のそれぞれの細胞系についてグラフ表示した。これらの結果に基づき、各細胞系における各抗体のＥＣ５０濃度を計算し、シスプラチン処置対照と比較して以下の表３に一覧にした。被験抗ＢＫＢ２Ｒ  ｍＡｂのいずれもが、曝露の１２０時間後において、全ての被験がん細胞系に対する顕著な細胞傷害作用を示した。
【０２８７】
【表３】
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（実施例６）
ブラジキニン受容体アゴニストであるモノクローナル抗体５Ｆ１２Ｇ１はインスリン感受性を増大させる
正常血糖高インスリンクランプ法は、２型糖尿病薬のインスリン感受性効果を測定する標準的なｉｎ  ｖｉｖｏ法と考えられている。この手順では、被験動物にインスリンを投与してインスリン濃度を上げる一方、グルコースを注入して正常血糖を維持する。正常血糖を維持するのに必要とされるグルコース注入速度（ＧＩＲ）は、インスリンの作用または改善されたインスリン感受性の反映である。正常血糖クランプ研究では、ブラジキニン受容体アゴニスト（抗ＢＫＢ２Ｒ）のモノクローナル抗体クローンである５Ｆ１２Ｇ１を調べ、それがインスリン感受性を改善する能力を測定した。
【０２８８】
材料および方法：体重が２７５〜３００ｇである健常な若齢雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを研究に用いた（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）。ラットを、温度を７０〜７２°Ｆ、湿度を３０〜７０％、１２時間の明期および１２時間の暗期による光周性を伴う制御された環境で維持した。ラットには、タンパク質１８％の食餌であるＴＥＫＬＡＤ（商標）２０１８−Ｇｌｏｂａｌおよび水分摂取を適宜施した。７日の馴化後、ラットを４つの群に群分けした。
【０２８９】
正常血糖高インスリンクランプ法：ケタミン＋キシラジンカクテルの腹腔内注射により動物に麻酔をかけ、右側頸静脈および左側頸動脈に、皮弁における切開を介して外部からカテーテル挿入した。カテーテル挿入した動物を、５日間にわたり回復させた。５日の回復後、動物を６時間にわたり空腹状態に置き、ヒトインスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を４ｍＵ／ｋｇ／分の一定の速度で連続注入しながら、１２０分間にわたる正常血糖高インスリンクランプ法を適用した。同時に、２０％グルコース溶液を様々な速度で注入し、速度を１０分ごと調整して、標的の血中グルコースレベル１１５±５ｍｇ／ｄｌを維持した。インスリンおよびグルコースのいずれも、カテーテル挿入した右側頸静脈を介して注入し、血中グルコースレベルは、カテーテル挿入した頸動脈からモニタリングした。動脈血中グルコースレベルおよび血漿インスリンレベルは、グルコース測定器（Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋ（商標）、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）およびラットインスリンＥＬＩＳＡキットを用いて、注入前のｔ＝−１２０、−９０、−３０、−１５、および０分に測定し、次いで、１２０分間（ｔ＝１２０）にわたり１０分ごとに測定した。クランプは１２０分間にわたり（ｔ＝１２０）継続し、その後、実験を終えた。ビヒクル群には、ｔ＝−３０分にＰＢＳを（筋肉内）注射し、５Ｆ１２Ｇ１処置群には、ｔ＝−３０分に０．５ｍｇ／ｋｇの濃度で抗体を（筋肉内）注射した。
【０２９０】
抗体５Ｆ１２Ｇ１により処置したところ、グルコース注入速度は有意に増大し、ピークがビヒクル（ｔ＝６０分）と比較して２９１％増大し（ｐ＝０．００６６）、総グルコース注入速度のＡＵＣもビヒクルと比較して１７９％増大した（ｐ＝０．００３５）。これらの結果は、５Ｆ１２Ｇ１が、インスリンの作用を改善することによりインスリン感受性を有意に増大させる能力を裏付けた。結果を表に示し、グルコース注入速度を、時間の関数としてグラフ表示し（図２６）、曲線下面積（ＡＵＣ）として示した（表４および図２７）。
【０２９１】
【表４】
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（実施例７）
ＺＵＣＫＥＲ糖尿病性脂肪質ラットのＯＧＴＴにおける５Ｆ１２Ｇ１の効果
この実施例は、５Ｆ１２Ｇ１モノクローナル抗体で処置されたＺｕｃｋｅｒ糖尿病性脂肪質（ＺＤＦ  ｆａ／ｆａ）ラットにおける経口グルコース負荷の評価について記載する。雄ＺＤＦ  ｆａ／ｆａラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に、Ａｒｒｏｗｈｅａｄ飲用水を伴うＨａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌｅｄ飼料に適宜維持し、１週間にわたり馴化させた。１群当たり６匹ずつの動物を以下の処置群に従い処置した：群１：滅菌ＰＢＳ（ビヒクル対照）；群２：１．０ｍｇ／ｋｇのマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である５Ｆ１２Ｇ１（配列番号１を含むＶＨ、配列番号２を含むＶＬ）；群３：０．２ｍｇ／ｋｇのｍＡｂである５Ｆ１２Ｇ１；群４：０．０４ｍｇ／ｋｇのｍＡｂである５Ｆ１２Ｇ１。
【０２９２】
経口グルコース負荷試験：一晩にわたり（１６時間）空腹状態に置いたラットに対して、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）を実施した。ビヒクル対照（ＰＢＳ）または５Ｆ１２Ｇ１モノクローナル抗体を、グルコース負荷の３０分前に皮下投与した。Ｄ−グルコースは蒸留水中で調製し、体重１ｋｇ当たり２ｇで経口投与した。
【０２９３】
複数の時点（０、１５、３０、６０、９０、および１２０分）において、およそ５０μｌずつの血液試料を回収し、血漿を単離するために処理した。血漿試料を、インスリンについて、超感受性マウスインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．、Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）を用いるＥＬＩＳＡ法を介して解析した。ＥＬＩＳＡデータをまとめ上げ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）またはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．００  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）により平均±標準誤差（ＳＥＭ）を計算するのに用いた。
【０２９４】
結果：結果を図２８Ａ、２８Ｂ、２９Ａ、および２９Ｂに示す。ビヒクル対照による処置と比較して、モノクローナル抗体である５Ｆ１２Ｇ１（１．０、０．２および０．０４ｍｇ／ｋｇ）の単回投与は、ＤＩＯラットのグルコース経口負荷法後における血中グルコース濃度の曲線下面積（ＡＵＣ）を減少させた。血中グルコースＡＵＣの減少は、１．０ｍｇ／ｋｇによる場合が高く、体重１ｋｇ当たり０．２ｍｇおよび０．０４ｍｇによる場合がこれに続いた。モノクローナル抗体である５Ｆ１２Ｇ１は、ＯＧＴＴ  ＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットにおけるインスリン活性を用量依存的に増大させた。
【０２９５】
（実施例８）
ＤＩＯマウスのＯＧＴＴにおける５Ｆ１２Ｇ１の効果
この実施例は、抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体である５Ｆ１２Ｇ１（配列番号１を含むＶＨ、配列番号２を含むＶＬ）で処置された食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）マウスにおける経口グルコース負荷の評価について記載する。雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）に、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔによる６０ｋｃａｌ％の脂肪性食餌およびＡｒｒｏｗｈｅａｄ飲用水を適宜維持し、８週間にわたり馴化させた。１群当たり１０匹ずつの動物を以下の処置群に従い処置した：群１：滅菌ＰＢＳ（ビヒクル対照）；群２：１．０ｍｇ／ｋｇのマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である５Ｆ１２Ｇ１；群３：０．２ｍｇ／ｋｇのｍＡｂである５Ｆ１２Ｇ１；群４：０．０４ｍｇ／ｋｇのｍＡｂである５Ｆ１２Ｇ１。
【０２９６】
経口グルコース負荷試験：一晩にわたり（１６時間）空腹状態に置いたマウスに対して、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）を実施した。ビヒクル対照（ＰＢＳ）または５Ｆ１２Ｇ１モノクローナル抗体を、グルコース負荷の３０分前に皮下投与した。Ｄ−グルコースは蒸留水中で調製し、体重１ｋｇ当たり２ｇで経口投与した。ビヒクルまたは５Ｆ１２Ｇ１の投与前（−３０分）、グルコース負荷の直前（０分）、および続く１５、３０、６０  ９０、および１２０分の時点において、製造元の指示書に従い、Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋ（商標）グルコース測定器（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて血中グルコースレベルを測定した。
【０２９７】
複数の時点（０、１５、３０、６０、９０、および１２０分）において、およそ５０μｌずつの血液試料を回収し、血漿を単離するために処理した。血漿試料を、インスリンについて、超感受性マウスインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．、Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）を用いるＥＬＩＳＡ法を介して解析した。ＥＬＩＳＡデータをまとめ上げ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）またはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．００  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）により平均±標準誤差（ＳＥＭ）を計算するのに用いた。
【０２９８】
結果：結果を図３０Ａ、３０Ｂ、および３１に示す。ビヒクル対照による処置と比較して、モノクローナル抗体である５Ｆ１２Ｇ１（１．０、０．２および０．０４ｍｇ／ｋｇ）の単回投与は、ＤＩＯマウスのグルコース経口負荷法後における血中グルコース濃度の曲線下面積（ＡＵＣ）を減少させた。血中グルコースＡＵＣの減少は、１．０ｍｇ／ｋｇによる場合が高く、体重１ｋｇ当たり０．２ｍｇおよび０．０４ｍｇによる場合がこれに続いた。モノクローナル抗体である５Ｆ１２Ｇ１は、ＯＧＴＴ  ＤＩＯマウスにおけるインスリン活性を用量依存的に増大させた。
【０２９９】
（実施例９）
５Ｆ１２Ｇ１はヒトブラジキニンＢ２受容体のアゴニストである
この実施例は、下流における細胞内カルシウム放出を介して測定した、抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体である５Ｆ１２Ｇ１の、ブラジキニン受容体Ｂ２に対する用量依存的な刺激反応試験について記載する。スクリーニングには、ヒトＢＫＢ２受容体を発現させる安定的なＣＨＯ細胞系（ＣＨＯ−Ｋ１／Ｂ２／Ｇα１５）を用いた。抗体を、０．５ｍｇ／ｍｌから３倍ずつ希釈率を増大させることにより、５つの異なる濃度まで希釈し、二連の細胞試料についてスクリーニングした。
【０３００】
ＣＨＯ−Ｋ１／Ｂ２／Ｇα１５細胞系におけるヒトＢＫＢ２受容体の発現および機能的活性は、陽性対照であるブラジキニンへと曝露することにより検証した。ＥＣ５０値は、ブラジキニンについて報告された値と同様であった。５１２Ｇ１抗体の刺激活性を陽性対照に照らして標準化し、データを活性化％としてまとめ上げた。
【０３０１】
アッセイを実施するため、実験日の２０時間前に、ＣＨＯ−Ｋ１／Ｂ２／Ｇα１５細胞を、３８４ウェルの壁面が黒色で底部が透明なプレートのウェルに、２０μＬの成長培地中ウェル１つ当たりの細胞２０，０００個の密度で播種し、３７℃／５％ＣＯ２で維持した。２０μＬの色素ローディング溶液（ＦＬＩＰＲ（商標）Ｃａｌｃｉｕｍ  ４アッセイキット、Ｍｏｃｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を、各ウェルに添加し、プレートを、３７℃で６０分間の後、室温で１５分間にわたりインキュベーター内に入れた。読取りの合計時間は、１２０秒間であった。ベースラインを確立する２０秒間にわたる読取りの後、選択したウェルに抗体またはアゴニストを添加し、さらなる１００秒間（２１秒後〜１２０秒後）にわたり蛍光シグナルを捕捉した。１％ＤＭＳＯを含有するアッセイ緩衝液（０．０３％Ｎａ３Ｎ  ＰＢＳ）で刺激した細胞を含有するウェルからの読取りを、スクリーニングのためのバックグラウンド値として選択し、アゴニストであるブラジキニン（１０ｕＭ）で刺激した細胞を含有するウェルからの読取りを、陽性対照として選択した。
【０３０２】
結果：ｍＡｂである５Ｆ１２Ｇ１で処置された細胞については、０．５ｍｇ／ｍｌにおける活性化の百分率が７２．７±３．５％（平均±ＳＤ、ｎ＝２）であり、ＥＤ５０は０．２４ｍｇ／ｍｌであった。ブラジキニンで処置された細胞については、活性化の百分率が９３．１±５．７％（平均±ＳＤ、ｎ＝２）であり、ＥＤ５０は０．９５ｎｍ／ｌであった。したがって、モノクローナル抗体である５Ｆ１２Ｇ１への曝露の結果としてヒトブラジキニン受容体Ｂ２を発現させる細胞の活性化％の上昇がもたらされた。
【０３０３】
（実施例１０）
慢性２型糖尿病における５Ｆ１２Ｇ１抗体投与の効果
この実施例は、２１日間にわたる、ＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットの慢性ＩＩ型糖尿病モデルにおける、３つの異なる用量の抗ＢＫＢ２Ｒ  ｍＡｂである５Ｆ１２Ｇ１の、エキセナチド、シタグリプチン、およびｍＡｂであるＭＧ２ｂ−５７と比較した効果の評価について記載する。
【０３０４】
ＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットとは、インスリン抵抗性をもたらす遺伝性の肥満遺伝子突然変異により引き起こされる耐糖能異常に基づく２型糖尿病のモデルである。ＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットではまず、約７週齢で高血糖症が発症し、肥満雄ラットは、およそ１２週間で完全に糖尿病となる。７〜１０週齢で、これらの動物における血中インスリンレベルが上昇する（高インスリン血症）が、膵臓ベータ細胞がグルコース刺激に対する応答を停止するので、インスリンレベルはその後降下する。
【０３０５】
まず１０〜１２週齢で現れる空腹時高血糖症は、加齢と共に進行し、インスリン抵抗性および耐糖能異常は、老齢と共にますます悪化する。処置せずに放置されたＺＤＦラットは、軽度の高血圧症を結果としてもたらす、高脂血症、高トリグリセリド血症、および高コレステロール血症を最終的に呈示する。
【０３０６】
この研究で用いた被験化合物およびビヒクルは：１．マウス抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体である５Ｆ１２Ｇ１（ＩｇＧ２ｂ，κ）；２．５Ｆ１２Ｇ１のアイソタイプマッチ対照（ＩｇＧ２ｂ，κ）として選択され、非関与性の抗原特異性を有するマウスモノクローナル抗体であるＭＧ２ｂ−５７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）（例えば、陰性対照）；３．シタグリプチン（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＬＬＣ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）；４．エキセナチド（Ｂａｃｈｅｍ  Ａｍｅｒｉｃａｓ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）であった。
【０３０７】
シタグリプチン（Ｊａｎｕｖｉａ（登録商標））とは、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ−４）阻害剤クラスの抗高血糖剤（抗糖尿病薬）である。シタグリプチンは、摂食に応答して放出される消化器ホルモンであるインクレチンのＧＬＰ−１およびＧＩＰを分解する酵素であるジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ−４）を競合的に阻害するように作用する。ＧＬＰ−１およびＧＩＰの不活化を防止することにより、それらは、インスリンの分泌を増大させ、膵臓によるグルカゴンの放出を抑制することが可能である。この効果は、血中グルコースレベルを、正常レベルへと駆動する。
【０３０８】
エキセナチドとは、糖制御効果を伴うインスリンの分泌促進剤である、３９アミノ酸のペプチドである。エキセナチドは、グルコース代謝およびインスリン分泌の制御因子であるヒトグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）と類似した生物学的特性を表すホルモンである、エキセンディン４の合成変化形である。エキセナチドは、膵臓ベータ細胞を介するグルコース依存性のインスリン分泌を増強し、不適切に上昇したグルカゴン分泌を抑制し、胃内容排出を緩徐化する。
【０３０９】
動物：雄ＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットは、ＣＲＬ（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、ＮＹ）から入手した。到着時において、ラットは７週齢であった。ラットは、１２時間にわたる明期および１２時間にわたる暗期による光周性、ならびに７０〜７２°Ｆの周囲温度を伴う室内のケージ１つ当たりに１匹ずつ収容され、通常の齧歯動物用の食餌および水分を適宜施された。１１週齢時に、ラットを、空腹時血中グルコースレベルに基づき、１群当たりのラット８匹ずつの６群へと分けた（表５）。１群当たりのラット４匹ずつの亜群を、主群と並行して維持し、正常血糖高インスリンクランプ研究のために２１日間にわたり同様に投与した。
【０３１０】
【表５】
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被験化合物である５Ｆ１２Ｇ１およびＭＧ２ｂ−５７を、３日ごとに１回皮下投与した。２１日間にわたり、エキセナチドは、毎日２回腹腔内投与し、シタグリプチンは、毎日１回経口投与した。５Ｆ１２Ｇ１は、３つの異なる用量である０．２、０．４、および０．００８ｍｇ／ｋｇで投与し、エキセナチドは１μｇ／ｋｇ、シタグリプチンは１０ｍｇ／ｋｇ、ＭＧ２ｂ−５７は０．２ｍｇ／ｋｇでそれぞれ投与した。
【０３１１】
経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）は、０、７、１４、および２１日目において、各研究群について実施した。血漿試料は、ＯＧＴＴ中の各時点において回収し、また、インスリンレベルも測定した。体重、食物摂取量、および水分摂取量は、毎週２回ずつ測定した。血圧および心拍数は、０、７、１４、および２１日目において、非侵襲的なテールカフ法を用いてモニタリングした（測定されたラット１匹当たり５回ずつの読取りを行い、次いで、平均した）。トリグリセリドレベルおよび総コレステロールレベルを決定するために、空腹時血清試料を０、７、１４、および２１日目のＯＧＴＴ前に回収した。７および１４日目に、糖尿を決定するために尿試料を回収した。研究の終了時に糖化（グリコシル化）ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を測定した。これらの研究のためのアッセイキットは表６に提示した通りであり、販売元の指示書に従い用いた。
【０３１２】
【表６】
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経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）
この研究の開始時におけるラットの週齢のために、ＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットは、ＯＧＴＴにおいて正常より大きな血中グルコースレベルの上昇を結果としてもたらす軽微なインスリン抵抗性を有することが予測された。ラットにおけるインスリン抵抗性は、２１日間にわたる研究において動物が加齢するにつれて増大し、その後のＯＧＴＴにおいてより高い血中グルコースレベルを結果としてもたらすことが予測された。
【０３１３】
ＯＧＴＴは、０、７、１４日目および２１日目に実施した。ラットを一晩にわたり空腹状態に置き、空腹時血中グルコースレベルを測定し（ｔ＝０分）、次いで、各ラットに、経口強制投与を介して、グルコース溶液（脱イオン化水中で可溶化させた体重１ｋｇ当たり２ｇのＤ−（＋）−グルコース（Ｇ７５２８；Ｓｉｇｍａ））１．５ｍｌの単回用量を施した。次いで、血中グルコースレベルを、１５、３０、６０、９０、および１２０分にグルコース測定器を介して測定し、グルコースの血中からのクリアランス速度を、経時的に観察した。ＯＧＧＴの各時点では、およそ５０〜６０μｌずつの血液を回収し、血漿へと処理して、インスリンレベルを測定した。
【０３１４】
０日目には、予測される通り、血中グルコースレベルが時点０における約１００ｍｇ／ｄｌから増大し、ｔ＝３０分の約３４０〜３７０ｍｇ／ｄｌでピークに達し、次いで、次の６０〜９０分間にわたり、徐々にベースラインへと復帰した（図３２Ａを参照されたい）点で、全ての群がＯＧＴＴに対する血糖反応の類似したパターンを示した。７、１４、および２１日目には、陰性対照であるＭＧ２ｂ−５７群のラットが、空腹時血中グルコースレベルのさらなる上昇、ピーク血中グルコースレベルの上昇を呈示し、グルコースレベルは、ＯＧＴＴ中のますます長期間にわたり上昇した。ＺＤＦラットは、２型糖尿病を発症し、血糖コントロールはますます失われるので、この結果が予測される。２１日の処置後、陰性対照であるＭＧ２ｂ−５７群におけるラット、およびシタグリプチン処置群における動物は、ＯＧＴＴ開始時における空腹時血中グルコースレベル（２２８ｍｇ／ｄｌ）が有意に高く、血中グルコースレベルは、３０分の時点に４８８ｍｇ／ｄｌへと上昇し、高値を維持した（図３２Ｂ）。ＯＧＴＴ中のこの血中グルコースレベルの上昇は、予測される通り、ＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットが、２型糖尿病を発症しつつあることを示した。しかし、５Ｆ１２Ｇ１で処置されたラットは、ＯＧＴＴ開始時における血中グルコースレベル（０．２ｍｇ／ｋｇ群では１５０±２０ｍｇ／ｄｌであり、０．０４ｍｇ／ｋｇ群では１６３±４０ｍｇ／ｄｌであり、０．００８ｍｇ／ｋｇ群では１９０±４０ｍｇ／ｄｌである）が、陰性対照ラットと比較して有意に低かった。５Ｆ１２Ｇ１についての、ＯＧＴＴ中２１日目における血中グルコースプロファイルは、０日目におけるプロファイルと類似し（図３２Ｂを参照されたい）、血中グルコースレベルは、３０分の時点に、０．２ｍｇ／ｋｇでは３１２ｍｇ／ｄＬ、０．０４ｍｇ／ｋｇでは３５５ｍｇ／ｄＬ、０．００８ｍｇ／ｄＬでは４００ｍｇ／ｄＬでピークに達し、次いで、低下した。エキセナチドで処置されたラットのＯＧＴＴプロファイルは、低用量の５Ｆ１２Ｇ１の場合と類似した。これらの結果は、抗ＢＫＢ２Ｒ  ｍＡｂである５Ｆ１２Ｇ１による処置が、インスリン抵抗性および２型糖尿病の発症を防止または遅延させることを示唆した。
【０３１５】
上記のＯＧＴＴ中に測定した総血中グルコースレベルは、曲線下面積（ＡＵＣ）として表した。０日目における全ての群におけるラットの血中グルコースのＡＵＣは、２７０４４〜３１１６７（ｍｇ／ｄＬ（分））の範囲であった（図３３を参照されたい）。予測される通り、７、１４、および２１日目に、陰性対照群（ＭＧ２ｂ−５７）における血中グルコースレベルは、２型糖尿病の発症のために上昇し、その後のＯＧＴＴの各々において、有意に高いグルコースＡＵＣを結果としてもたらした（データは示さない）。２１日目までに、ＭＧ２ｂ−５７で処置されたラットのＡＵＣ量は５０５６９．８８±４１２４．６２ｍｇ／ｄＬ（分）であり、シタグリプチン処置群のＡＵＣ量は５３７６５．７５±２２８１．４５ｍｇ／ｄＬ（分）であり、これは、エキセナチドにより得られる血糖ＡＵＣ（３９４５０．１３±６０８７．８９ｍｇ／ｄＬ（分））と等しかった。これに対し、２１日目における５Ｆ１２Ｇ１（０．２ｍｇ／ｋｇ）処置群のグルコースＡＵＣは３３２４１．１３±３９１０．６２ｍｇ／ｄＬ（分）であり、７、１４、および２１日目における血糖ＡＵＣは、シタグリプチンおよびＭＧ２ｂ−５７と比較して統計学的に低値であった。７、１４、および２１日目における、５Ｆ１２Ｇ１で処置されたラットの血中グルコースレベルのＡＵＣが０日目におけるＡＵＣと同様であったことから、５Ｆ１２Ｇ１による処置が、さらなるインスリン抵抗性の発症を防止し、グルコースコントロールを維持したことが示される。
【０３１６】
ＺＤＦラットにおけるインスリンレベルは、１１週齢を過ぎると有意に低下することが予測された。平均血漿インスリン濃度は、ＯＧＴＴ中の０日目に測定したが、これを図３４Ａに示す。予測される通り、０日目には、群間の有意差は観察されず、平均空腹時インスリンレベルはおよそ８〜１１ｎｇ／ｍｌであり、これは、ＯＧＴＴ中１５分の時点におよそ１５〜１９ｎｇ／ｍｌへと上昇した。しかし、７日目に、陰性対照であるＭＧ２ｂ−５７で処置されたラットのインスリンレベルは、０日目の空腹時およびＯＧＴＴ中と比較して有意に低下した。ＯＧＴＴ中７日目における５Ｆ１２Ｇ１で処置された動物のインスリンレベルは、０日目のインスリンレベルと同等であった。２１日目までに、０．２、０．０４、および０．００８ｍｇ／ｋｇの５Ｆ１２Ｇ１で処置された動物のインスリンレベルは、０日目のインスリンレベルと同等であり、ＭＧ２ｂ−５７、シタグリプチン、およびエキセナチドと比較して有意に高いインスリンレベルであった（図３４Ｂを参照されたい）。０．２、０．０４、および０．００８ｍｇ／ｋｇの５Ｆ１２Ｇ１で処置された動物の空腹時インスリンレベルは、それぞれ、１７±５、１２±３、および１４±３ｎｇ／ｍｌであり、ＯＧＴＴの１５分の時点に３０±７、２６±３、および２４±６ｎｇ／ｍｌへと上昇し、ベースラインへと復帰した。これに対し、陰性対照群における動物の空腹時インスリンレベルは、４±１．６ｎｇ／ｍｌであり、１５分の時点に９±２．８へと上昇した。シタグリプチン（ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎｅ）およびエキセナチドで処置されたラットの空腹時インスリンレベルは、それぞれ、１０±３．５および７±２．５ｎｇ／ｍｌであり、いずれの群においても１５分後に１５±４ｎｇ／ｍｌへと上昇し、ゆっくりと低下した。２１日目の５Ｆ１２Ｇ１で処置された群における正常レベルに近いインスリン分泌の検出は、インスリン感受性の維持（インスリン抵抗性、高インスリン血症の防止）、血糖コントロール、および全体的なベータ細胞機能に起因した可能性が高い。
【０３１７】
ＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットの研究開始時における空腹時血中グルコースレベルは、わずかに上昇することが予測された。空腹時血中グルコースレベルのこの上昇は、ラットの週齢と共に増大すると予測された。空腹時血中グルコースレベルは、０、７、１４、および２１日目に測定した。０日目の全ての群における空腹時血中グルコースレベルは、およそ１１７〜１２０ｍｇ／ｄｌであった。予測される通り、７、１４、および２１日目の陰性対照群における空腹時血中グルコースレベルは、シタグリプチン群におけるレベルと同様に上昇した。２１日目までに、陰性対照（ＭＧ２ｂ−５７）群およびシタグリプチン群における空腹時血中グルコースレベルはベースラインの１１６．５±２５．８ｍｇ／ｄｌから、それぞれ、２２７．５±３４．３ｍｇ／ｄｌおよび２４７±１４ｍｇ／ｄｌへと上昇し（図３５を参照されたい）、ＭＧ２ｂ−５７では、１１１．０±１２．１ｍｇ／ｄｌの上昇であった。５Ｆ１２Ｇ１群（０．２ｍｇ／ｄｌ）における空腹時血中グルコースレベルは、２１日目までに、１１７．６±１４．２ｍｇ／ｄｌから、それぞれ、およそ１５０．８±５６．５、１６３±２１および、１９０±４０ｍｇ／ｄｌへと上昇するにとどまり、ベースラインから３３．１±１９．７ｍｇ／ｄｌの上昇に過ぎなかった。高用量の５Ｆ１２Ｇ１で処置されたＺＤＦラットの空腹時血中グルコースレベルの上昇は、陰性対照動物と比較して有意に小さかった（ｐ＝０．００５８）。また、２１日目におけるエキセナチド処置群の空腹時血中グルコースレベルの上昇も、１６７±２２ｍｇ／ｄｌへと比較的少量であった。５Ｆ１２Ｇ１による処置は、空腹時血中グルコースレベルの上昇に対して用量依存的な形で保護的であった。空腹時血中グルコースレベルにより測定される５Ｆ１２Ｇ１による２型糖尿病の発症の保護は、エキセナチドの場合と同様であり、シタグリプチンを上回る改善であり、血糖コントロールおよびインスリン感受性の維持を示した。
【０３１８】
体重は、実験室用天秤を用いて投与前に測定し、その後毎週２回測定した。ＺＤＦラットは、１１週齢になってもそれらの最大体重に達することがなく、体重の増大が予測された。５Ｆ１２Ｇ１で処置された動物の体重が、全ての用量群で２１日目までにおよそ１３±１パーセント増大したのに対し、２１日目の陰性対照処置群、エキセナチド処置群、およびシタグリプチン処置群における動物の体重の増大は、１０±２パーセントであった。５Ｆ１２Ｇ１で処置された動物における体重の増大は、動物の健康の改善、とりわけ、２型糖尿病の発症の防止に起因した可能性が高い。
【０３１９】
食物および水分の摂取（ｉｎｔａｋｅ）は、毎週２回、測定量の食物および水分を供給し、残りの食物および水分の測定量を減じることにより測定した。食物摂取（ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ）は、５Ｆ１２Ｇ１群（全ての用量群）においてわずかに低く、ＭＧ２ｂ−５７処置群、シタグリプチン処置群、およびエキセナチド処置群と比較して有意に異なった。全ての動物の食物摂取は、０日目に１日当たりラット１匹当たりおよそ２９〜３０ｇであった。２１日目までの食物摂取は、ＭＧ２ｂ−５７処置群が１日当たりラット１匹当たり３３±１ｇであり、エキセナチド処置群が１日当たりラット１匹当たり３１±１ｇであり、シタグリプチン処置群が１日当たりラット１匹当たり３１±２ｇであり、５Ｆ１２Ｇ１群（０．２ｍｇ／ｋｇでは１日当たりラット１匹当たり２８±１ｇであり、０．０４ｍｇ／ｋｇでは１日当たりラット１匹当たり２７±２ｇであり、０．００８ｍｇ／ｋｇでは１日当たりラット１匹当たり３０±０．５ｇであった）と比較してわずかに多かった。しかし、水分摂取（ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ）は、ＭＧ２ｂ−５７（１日当たりラット１匹当たり５９±１０ｍｌ）、エキセナチド（１日当たりラット１匹当たり４８±４ｍｌ）で処置された動物、およびシタグリプチン（１日当たりラット１匹当たり４８±７ｍｌ）処置群において、３つの用量群全てにおける５Ｆ１２Ｇ１で処置された動物（０．２ｍｇ／ｋｇでは１日当たりラット１匹当たり２６±３ｍｌであり、０．０４ｍｇ／ｋｇでは１日当たりラット１匹当たり４０±１０ｍｌであり、１日当たりラット１匹当たり２８±４ｍｌ）と比較して有意に多かった。陰性対照群およびシタグリプチン群において水分摂取が多いことは、結果として多尿症をもたらす血中グルコースレベルの上昇に起因した可能性がある。５Ｆ１２Ｇ１処置群において水分摂取が少ないことは、血糖コントロールが良好であり、動物が糖尿病を発症しなかったことを示した可能性がある。また、対照動物と比較して５Ｆ１２Ｇ１で処置された動物の食物摂取が少なく体重が増大することも良好な血糖コントロールを示す。
【０３２０】
血清の回収：０、７、１４、および２１日目に、テールスニップすることにより血液試料を空腹状態のラットから血清分離管（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）に回収し、血液を室温で３０分間にわたり静置した。次いで、試料を遠心分離し、血清上清を、ピペットを介して０．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）マイクロ遠心管へと移し、総コレステロールレベルおよびトリグリセリドレベルについて解析するため、−８０℃で保管した。
【０３２１】
血漿の回収：ＯＧＴＴ試験中、０、７、１４、および２１日目の各時点（０、１５、３０、６０、９０、および１２０分）において、テールスニップすることにより血液試料をラットからヘパリンリチウム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を含有する試験管へと回収し、氷上で保存した。次いで、血漿を分離するために試料を４℃で遠心分離し、血漿上清を、ピペットを介して０．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）試験管へと移し、インスリンレベルについて解析するため、−８０℃で保管した。
【０３２２】
尿の回収：７および１４日目（ＯＧＴＴの２４時間後）において、スポット回収法により尿試料を各ラットから回収した。製造元の指示書に従い、Ａｕｔｏｋｉｔ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．）を用いて、尿試料を糖尿について解析した。
【０３２３】
血漿、血清、および尿の解析：上記の通り、処置せずに放置されたＺＤＦラットは、軽度の高血圧症を結果としてもたらす、高脂血症、高トリグリセリド血症、および高コレステロール血症を最終的に呈示した。Ｗａｋｏ製キット（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）を用いて、血清試料を、トリグリセリド濃度および総コレステロール濃度について解析した。Ａｕｔｏｋｉｔ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）を用いて、尿試料を解析した。０、７、１４、および２１日目において、血清中の総コレステロールレベルを測定した（図３６を参照されたい）。１１週齢の０日目における総コレステロールは、ＺＤＦラットでは、１４４〜１６９ｍｇ／ｄｌの範囲であり、正常ラットのおよそ２倍であった。予測される通り、２１日目におけるＭＧ２ｂ−５７で処置された動物の血清コレステロールレベル（１９８±１１ｍｌ／ｄｌ）は有意に高く、ベースラインから２８±１１ｍｇ／ｄｌの上昇であり、２１日目にエキセナチド処置ラットにおいて測定した血清コレステロールレベル（１９５±１１ｍｌ／ｄｌ）と同様であった。０．２ｍｇ／ｋｇの５Ｆ１２Ｇ１で処置された動物における血清コレステロールは、処置中に低下し、２１日目に１４５±２６ｍｇ／ｄｌであり、ベースラインから１２±８ｍｇ／ｄｌの低下であった。０．０４ｍｇ／ｋｇの５Ｆ１２Ｇ１処置群および０．００８ｍｇ／ｋｇの５Ｆ１２Ｇ１処置群における血清コレステロールは、研究中わずかに上昇し、２１日目までに、それぞれ、１６２±１８および１６７±７ｍｇ／ｄｌであった。シタグリプチン処置群における血清コレステロールは、２１日目までに１７０±１４ｍｇ／ｄｌであった。５Ｆ１２Ｇ１による処置は、陰性対照と比較して、ＺＤＦラットにおける高コレステロール血症の発症を防止し、５Ｆ１２Ｇ１の最高用量群では、統計学的な有意差がみられた（ｐ＝０．０１５６）。
【０３２４】
トリグリセリドレベルは、０、７、１４、および２１日目において測定した。０日目における血清トリグリセリドレベルは、６００〜７５０ｍｇ／ｄｌ、または、ＺＤＦラットでは、正常ラットと比較しておよそ３倍であった。研究全体において、いずれの群の間でも血清トリグリセリドレベルには有意差が観察されなかった。
【０３２５】
２１日目にはグリコシル化ヘモグロビンＡ１ｃまたは糖化ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）の百分率を測定したが、図３７に平均値を示す。動物が週齢と共に高血糖性となるので、ＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットにおけるＨｂＡ１ｃレベルは、上昇することが予測された。予測される通り、２１日目までに、ＭＧ２ｂ−５７で処置された動物では有意に高い百分率（８．８±０．７％）のＨｂＡ１ｃが検出され、エキセナチド処置群（７．９±０．８％）およびシタグリプチン処置群（８．８±０．４％）でも、同様な百分率のＨｂＡ１ｃが検出された。５Ｆ１２Ｇ１の全ての用量群では、有意に低百分率のＨｂＡ１ｃが検出され、高用量５Ｆ１２Ｇ１群の百分率は６．３±０．５％であり、低用量群ではわずかに高量であった。高用量５Ｆ１２Ｇ１動物と陰性対照動物とのＨｂＡ１ｃ百分率の差違は、−２．５８±０．８５であり、統計学的に有意であった（ｐ＝０．０１０３）。これらの結果は、５Ｆ１２Ｇ１で処置されたラットにおいて検出された血中グルコースレベルの低さと符合し、５Ｆ１２Ｇ１が、ＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットにおいて、エキセナチドまたはシタグリプチンより良好な、ＨｂＡ１ｃの上昇からの保護をもたらすことが示唆された。
【０３２６】
ＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットは、研究が進行するにつれて、尿中グルコースレベルを上昇させることが予測された。ラットが２型糖尿病を発症すると、血中グルコースレベルの上昇は、最終的な結果として、尿における過剰なグルコースの出現をもたらす。尿中グルコースレベルは７および１４日目に測定したが、１４日目の結果を図３８に示す。１４日目には、有意差が観察され、ＭＧ２ｂ−５７で処置されたラットの尿中でグルコースの最高レベル（９８±１４ｍｇ／ｄＬ）が検出され、また、エキセナチドおよびシタグリプチンで処置されたラットにおいても尿中グルコースの上昇が検出された。０．２、０．０４、および０．００８ｍｇ／ｋｇの５Ｆ１２Ｇ１で処置された群の全ての尿中グルコースレベル（それぞれ、３１±２、４９±６、および５４±１１ｍｇ／ｄＬ）は、ＭＧ２ｂ−５７、エキセナチド、およびシタグリプチンと比較して有意に低かった。これらの結果により、５Ｆ１２Ｇ１による処置が、ラットにおける高血糖症の発症を防止することがさらに確認された。
【０３２７】
血圧のモニタリングおよびデータ収集のためのソフトウェアを用いて、血圧の測定を実施した。測定は、０、７、１４、および２１日目において、血圧モニタリング前のおよそ１０〜１５分間にわたり、ラットに、温度を制御するための温熱パッドを伴う専用の拘束具を着けることにより実施した。次いで、閉塞カフの後、ＶＰＲ（容量圧力記録）センサーカフを尾の起点へとスライドさせた。ＶＰＲセンサーでは、示差圧トランスデューサーを用いて、尾における血液容量を非侵襲的に測定し、収縮期血圧、拡張期血圧、および心拍数を決定した。ラット１匹当たり５回ずつ読取りを行い、データは平均として提示した。
【０３２８】
０、７、１４、および２１日目において、収縮期血圧、拡張期血圧、および心拍数をモニタリングしたが、データを図３９、４０、および４１に示す。予測される通り、０日目には群間で収縮期血圧、拡張期血圧、および心拍数の測定値の有意差が観察されなかった（図３９Ａ、４０Ａ、および４１Ａ）。２１日目に、５Ｆ１２Ｇ１の投与を施される全ての動物を観察した（図３９Ｂ、４０Ｂ、および４１Ｂを参照されたい）ところ、収縮期血圧、拡張期血圧、および心拍数の測定値はＭＧ２ｂ−５７対照群を下回った。ＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットにおける５Ｆ１２Ｇ１による処置の結果として、収縮期血圧および拡張期血圧の低下がもたらされ、また、心拍数の減少ももたらされたが、これは、２型糖尿病の発症の防止を介する可能性が高い。とりわけ、最高用量の５Ｆ１２Ｇ１による処置の結果として、収縮期血圧のベースラインからの０．１２±４．４ｍｍＨｇの上昇がもたらされたが、これを２５．５±２．９の上昇であった陰性対照群と比較すると、統計学的な有意差（ｐ＝０．０００４）が認められる。
【０３２９】
正常血糖高インスリンクランプ研究：低血糖症を引き起こすことなくインスリンレベルの上昇を補完するのに必要なグルコース量を測定するため、インスリン抵抗性を探索および定量化するためのゴールドスタンダードは、いわゆる正常血糖高インスリンクランプ法である。２１日の処置後、前出の試験にかけなかった亜群における動物（１つの処置当たりのＮ＝４）を、一晩にわたり空腹状態に置き、亜群の動物に対して１２０分間にわたる正常血糖高インスリンクランプ研究を実施した。動物に麻酔をかけ、手順全体にわたり、イソフルランによる麻酔下で維持した。伏在静脈および大腿動脈にカテーテル挿入した。伏在静脈カテーテルを用いてヒトインスリン（Ｈｕｍａｌｉｎ（登録商標）Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）および２０％グルコース溶液を注入した。大腿動脈カテーテルを用いて血液試料を回収し、動脈血中グルコースレベルをモニタリングした。クランプ研究の開始時、インスリンを８ｍＵ／ｋｇ／分の定速で注入した。インスリンの注入から結果として生じる血中グルコースレベルの降下を補完するために、２０％グルコース溶液を、速度を１０分ごとの調整により変化させて注入し、標的の血中グルコースレベルを維持した。動脈血中グルコースレベルは、グルコース測定器（Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、注入前のｔ＝−１２０、−９０、−３０、および０分に測定し、次いで、１２０分間（ｔ＝１２０）にわたり１０分ごとに測定した。試験中のグルコース注入速度（ＧＩＲ）により、インスリン感受性を決定した。インスリンの注入を補完するために高ＧＩＲが要請される場合は、動物をインスリン感受性と考えた。低ＧＩＲが要請される場合は、動物をインスリンの作用に対して抵抗性であると考えた。
【０３３０】
正常血糖高インスリンクランプ研究中のグルコース注入速度（ＧＩＲ）、ＡＵＣ−ＧＩＲ、および動脈血中グルコースを測定したが、ＡＵＣ−ＧＩＲのデータを図４２に示す。予測される通り、陰性対照であるＭＧ２ｂ−５７で処置されたラットは、インスリンに対して抵抗性であり、ＡＵＣ−ＧＩＲは低値であった。０．２および０．０４ｍｇ／ｋｇの５Ｆ１２Ｇ１で処置された動物のＡＵＣ−ＧＩＲは有意に高値であったことから、これらの処置により、２１日後のこれらの動物におけるインスリン感受性が保持されたことが示される。シタグリプチンおよびエキセナチドで処置された群のＡＵＣ−ＧＩＲは、５Ｆ１２Ｇ１の高用量処置群の場合と同様であった。２１日間にわたる５Ｆ１２Ｇ１による処置は、ＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットにおけるインスリン感受性を保持した。
【０３３１】
データ解析：Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）またはＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．００  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）から得られるデータを、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として提示する。Ｐ値は、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアによるＴ検定解析を用いて計算した。群間差は、Ｐ＜０．０５で有意と考えた。
【０３３２】
共分散解析を用いてベースラインレベルに調整して、ベースライン（０日目）〜２１日目における空腹時血中グルコース（ｍｇ／ｄＬ）、血清コレステロール（ｍｇ／ｄＬ）、および収縮期血圧（ｍｍＨｇ）の平均変化を、高用量（５Ｆ１２Ｇ１、０．２ｍｇ／ｋｇ）群と陰性対照（ＭＧ２ｂ−５７、０．２ｍｇ／ｋｇ）群との間で比較した。不等分散の独立した２標本によるｔ検定を用いて、高用量（５Ｆ１２Ｇ１、０．２ｍｇ／ｋｇ）ラットにおける平均ＨｂＡ１ｃ百分率を、陰性対照（ＭＧ２ｂ−５７、０．２ｍｇ／ｋｇ）ラットの平均ＨｂＡ１ｃ百分率と比較した。全ての検定にα＝０．０５の有意性レベルを用い、全ての解析は、ＳＡＳ統計学ソフトウェア（ｖｓ．９．２、Ｃａｒｙ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて実施した。
【０３３３】
全体的に、異なる用量の５Ｆ１２Ｇ１の投与に対する忍容性は良好であり、毒性作用は認められなかった。
【０３３４】
ＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットに対する５Ｆ１２Ｇ１の、毎日０．２ｍｇ／ｋｇおよび０．０４ｍｇ／ｋｇずつ２１日間にわたる投与は、インスリン抵抗性の発症を防止し、ＯＧＴＴ、インスリン分泌、血中グルコースレベル、およびＨｂＡ１ｃを介して測定される血糖コントロールを維持した。ＭＧ２ｂ−５７、シタグリプチン、およびエキセナチドで処置された動物は全て、上記のパラメータの有意な悪化を示した。５Ｆ１２Ｇ１による処置はまた、血圧、心拍数、トリグリセリド、およびコレステロールレベルの上昇も、他の処置群と比較して防止した。
【０３３５】
（実施例１１）
抗ＢＫＢ２Ｒ抗体の配列
この実施例は、抗ＢＫＢ２Ｒマウスモノクローナル抗体である５Ｆ１２Ｇ１の配列決定について記載する。ハイブリドーマ５Ｆ１２Ｇ１に由来する全ＲＮＡは、製造元（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）の指示書に従いＲＮＡｅａｓｙ（商標）キットを用いて抽出した。ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて、５’−ＲＡＣＥ（商標）キット（ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡキット；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）の指示書に記載される方法を改変することにより、ｃＤＮＡを合成した。
【０３３６】
以下のうちの１つをＲＡＣＥ特異的プライマーとして用いて、記載の通り（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ（商標）キット）に５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲを実施した：
マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａに対してＭＯＣＧ１２ＦＯＲ（ＣＴＣ  ＡＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＧＣ）（配列番号６１）、マウスＩｇＧ２ｂに対してＭＯＣＧ２ｂＦＯＲ（ＣＴＣ  ＡＡＧ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＣＧＴ  ＧＧＴ  ＧＣ）（配列番号６２）、マウスＩｇＧ３に対してＭＯＣＧ３ＦＯＲ（ＣＴＣ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＣＴＴ  ＧＡＴ  ＣＡＡ  ＣＴＣ  ＡＧＴ  ＣＴ）（配列番号６３）、ＩｇＭに対してＭＯＣＭＦＯＲ（ＴＧＧ  ＡＡＴ  ＧＧＧ  ＣＡＣ  ＡＴＧ  ＣＡＧ  ＡＴＣ  ＴＣＴ）（配列番号６４）、マウスκに対してＣＫＭＯｓｐ  （ＣＴＣ  ＡＴＴ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＧＡＣ  ＡＡＴ  ＧＧＧ）（配列番号６５）、マウスλ１に対してＣＬ１ＦＯＲｓｐ  （ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＡＣＧ  ＧＧＡ  ＣＡＡ  ＡＣＴ  ＣＴＴ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＡＧＴ）（配列番号６６）、ＣＬ２ＦＯＲｓｐ（ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＴＧＣ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＡＣＴ  ＣＴＴ  ＴＴＣ  ＣＡＣ  ＡＧＴ）（配列番号６７）、およびＣＬ４ＦＯＲｓｐ（ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＡＣＧ  ＧＧＡ  ＣＡＡ  ＡＣＴ  ＣＴＴ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＡＴＧ）（配列番号６８）。（Ａ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｃＤＮＡ  ｂｙ  ＲＡＣＥ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２版、２０１０年）。
【０３３７】
ｃＤＮＡは、標準的な鎖終結法を用いて両端から配列決定するほか、Ｔｏｐｏ  ＴＡクローニングキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｐＣＲ−Ｔｏｐｏ２．１へとクローニングした。ｃＤＮＡを含有するクローンは、Ｍ１３ｒｅｖプライマー（ＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡ）（配列番号６９）およびＴ７フォワードプライマー（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ）（配列番号７０）を用いて配列決定した。
【０３３８】
結果として生じる配列は、配列番号４９に示される、マウス５Ｆ１２Ｇ１免疫グロブリン重鎖可変領域ドメインをコードする配列、および配列番号５０に示される、マウス５Ｆ１２Ｇ１免疫グロブリン軽鎖可変領域ドメインをコードする配列であった。マウス５Ｆ１２Ｇ１免疫グロブリン重鎖可変領域ドメインの推定翻訳アミノ酸配列を配列番号１に示し、マウス５Ｆ１２Ｇ１免疫グロブリン軽鎖可変領域ドメインの推定翻訳アミノ酸配列を配列番号２に示す。
【０３３９】
次いで、とりわけ、ヒトＢＫＢ２Ｒに結合し、本明細書で開示されるアゴニスト効果を及ぼしたマウスハイブリドーマｍＡｂである５Ｆ１２Ｇ１をヒト化させて、マウスモノクローナル抗体に対する潜在的なヒト免疫反応（免疫原性）を回避し、ヒトにおける抗体の複数回の注射および／または長期にわたる使用を可能とする抗ＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体を得た。
【０３４０】
抗体のヒト化過程は、所望の結合特性の一因となる適切なマウス相補性決定領域（ＣＤＲ）のコードセグメントを、ヒト抗体の「足場」へと挿入することにより達成した。Ｋａｂａｔによる方法（Ｋａｂａｔ  ＥＡら（１９９１年）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ第９１−３２４２号）を用いて、抗体の重鎖（配列番号４３〜４５）における３つのマウスＣＤＲ領域と、軽鎖（配列番号４６〜４８）における３つのＣＤＲ領域とを同定し、ヒトＶＨドナー足場領域およびヒトＶＬドナー足場領域へと移植した。ＣＤＲの移植法は、当初マウス抗体のヒト化について記載され（Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．（１９８９年）１２月；８６巻（２４号）：１００２９〜３３頁）、近年ではＴｓｕｒｕｓｈｉｔａおよびＶａｓｑｕｅｚ（２００４年）、ならびにＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ（２００８年）（Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ  Ｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００４年１２月；２９５巻（１〜２号）：９〜１９頁；Ａｌｍａｇｒｏ  ＪＣおよびＦｒａｎｓｓｏｎ  Ｊ．、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．（２００８年）、１３巻：１６１９〜３３頁）により総説された。
【０３４１】
マウスＣＤＲを最良の形で受容し、なおもエピトープへの結合を可能としうるヒト抗体遺伝子の配列を決定するために、マウス５Ｆ１２Ｇ１モノクローナル抗体配列周囲のＦＶ領域を解析し、Ｐａｎｏｒａｍａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）およびＬａｋｅＰｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｌｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）により提供される特許化方法を用いて最適なドナーヒト遺伝子の配列を選択するのに最良の適合法を用いた。
【０３４２】
略述すると、生殖細胞系列であるかまたは生殖細胞系列に近縁のヒト抗体フレームワーク配列を用いた。とりわけ、生殖細胞系列遺伝子ＶＨ３〜３３、ＶＨ３〜７３、ＶＨ３〜７と類縁のヒトＶＨ配列が、最良のマッチをもたらした。とりわけ、生殖細胞系列遺伝子ＶＫ２〜２８、ＶＫ２〜３０と類縁のヒトＶＬ配列が、最良のマッチをもたらした。モデルを作成するための、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの組合せを用いて、標的抗体のＦｖについてのいくつかの３Ｄモデルを構築した。骨格を選択するために用いた検討項目の一部は、ヒト鋳型が、マウス５Ｆ１２Ｇ１配列から予測されるＣＤＲの長さおよびカノニカル構造を伴う、ＣＤＲの長さおよびカノニカル構造にマッチしたことである。マウスとヒトとの間で異なり、抗原への結合に影響を及ぼした可能性があるアミノ酸位置を、フレームワーク領域内で同定した。特定の抗体遺伝子がヒト抗体レパートリーにおけるフレームワーク骨格の高度な使用を呈示したことは、構造的に重要なフレームワーク位置における良好な保存が他の生殖細胞系列の選択と比べてそうであるのと同様、正の選択因子であった。
【０３４３】
Ｐａｎｏｒａｍａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）により実施された、特許化されたヒト化の最適化は、配列表において、それぞれ、配列番号３〜４および８〜９として示される、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ免疫グロブリンの重（Ｈ１、Ｈ２）鎖可変領域ドメインおよび軽（Ｌ１、Ｌ２）鎖可変領域ドメインをもたらした。ＬａｋｅＰｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｌｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）により実施された、特許化されたヒト化の最適化は、配列表において、それぞれ、配列番号５〜７および１０〜１２として示される、ヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ免疫グロブリンの重（Ｈ３７、Ｈ３８、Ｈ３９）鎖可変領域ドメインおよび軽（Ｌ３７、Ｌ３８、Ｌ３９）鎖可変領域ドメインをもたらした。
【０３４４】
こうして、上記の両方の場合から、マウス５Ｆ１２Ｇ２クローン、ならびに、配列表において配列番号３〜４８、５１〜６０、および７５〜９２として示されるＣＤＲ、Ｖ領域、ならびにＨ鎖およびＬ鎖を含めたアミノ酸およびこれらをコードするポリヌクレオチド配列に基づき、ヒト化軽鎖の５つの異なる変化形およびヒト化重鎖の５つの変化形を創出した。
【０３４５】
（実施例１２）
ヒト化抗ヒトＢＫＢ２Ｒモノクローナル抗体の発現および精製
Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２
Ｈ１ヒト化可変領域配列（配列番号３）、Ｈ２ヒト化可変領域配列（配列番号４）、Ｌ１ヒト化可変領域配列（配列番号８）、およびＬ２ヒト化可変領域配列（配列番号９）それぞれのコード配列である、配列番号５１、５２、５６、および５７を、ＤＮＡ構築物（ＢｉｏＢａｓｉｃ、Ｍａｒｋｈａｍ  Ｏｎｔａｒｉｏ）へ合成により作製した。Ｈ１重鎖およびＨ２重鎖のＤＮＡ配列の各々を、ヒトＩｇＧ２のＦｃ領域とインフレームでｐＤＨ２ベクターへとクローニングした。同様に、Ｌ１ヒト化軽鎖およびＬ２ヒト化軽鎖の各々も、ヒトカッパ定常領域とインフレームでｐＤＨ２ベクターへとクローニングした。標準的な脂質ベースのトランスフェクションプロトコールを用いて、ヒト化ＶＬ、ヒト化ＶＨまたはキメラＶＬおよびキメラＶＨの多様な組合せ（ミックスアンドマッチ法）を、少なくとも１００ｍｌの２９３由来細胞（例えば、２９３Ｆ）へと一過性にトランスフェクトした。とりわけ、配列Ｈ１をコードするベクターを、Ｌ１をコードするベクターもしくはＬ２をコードするベクター、または元のマウス５Ｆ１２Ｇ１  ＶＬと共トランスフェクトした。同様に、Ｈ２をコードするベクターを、Ｌ１またはＬ２をコードするベクターと共トランスフェクトし、元のマウス５Ｆ１２Ｇ１  ＶＨをコードするベクターを、Ｌ１またはＬ２と共トランスフェクトした。Ｇｉｂｃｏ製のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ無血清培地を用いて、ＨＥＫ−２９３細胞を培養物懸濁液中で培養した。５％のＣＯ２と９５％の空気とを含む大気中、３７℃で培養物をインキュベートした。５００ｍＬの滅菌ディスポーザブル式Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコを用いて１００ｍＬの被験発現物を生成させ、Ｃｏｒｎｉｎｇ製の３リットル滅菌ディスポーザブル式フラスコを用いて５００ｍＬおよび１リットルの発現を実施した。培養物懸濁液を、撹拌速度を１００ｒｐｍとするシェーカープラットフォームに置いた。細胞密度が１ｍＬ当たりの細胞１．５×１０６個に達したら、培養物に選択したプラスミド対をトランスフェクトした。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、２５ｋＤａの直鎖、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｓ）を、トランスフェクション試薬として、プラスミドＤＮＡと４：１の比で用いた。各培養物１リットルにつき、合計１ｍｇずつのプラスミドを用いた。トランスフェクトした細胞を１２０時間にわたりインキュベートし、上清を採取し、０．２ミクロンの真空フィルターユニット（Ｎａｌｇｅｎｅ）を用いて滅菌濾過した。滅菌上清は、精製前に２〜８℃で保管した。
【０３４６】
アフィニティークロマトグラフィーを用いて、培養上清中に存在する組換えＩｇＧを精製した。１００ｍＬの発現物につき、１ｍＬずつのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、ｐＨ７．４のＰＢＳを用いて平衡化し、上清に直接添加した。ＩｇＧは、２〜８℃で静かに撹拌しながら１６時間にわたりバッチ吸収させた。インキュベーション後、樹脂／上清混合物を円錐形の遠心分離用ボトルに移し、樹脂を堆積させた。上清（流過物）をデカントし、樹脂をディスポーザブル式のカラム（ＧＥ）へと移した。樹脂を、重力流を用いて、２０容量のＰＢＳで洗浄した。ＩｇＧを、ｐＨ３．０の０．１Ｍグリシンを用いて、１ｍＬずつの３〜５画分中で溶出させた。１容量のｐＨ９．０の１Ｍトリスを各画分の試験管に添加して、グリシン緩衝液のｐＨを中和した。溶出物試料および流過物を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色）を介して解析し、ＩｇＧを含有する画分をプールした。プールした溶出物を透析濾過し（ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）、遠心分離用限外濾過フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ；分画分子量５０ｋＤａ）を用いてＰＢＳへと濃縮した。可能な場合は、最終産物を、０．２ミクロンのシリンジフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＰＥＳ）を用いて精密濾過滅菌した。各試料のタンパク質濃度は、Ａ２８０における吸光度および減衰係数１．４を用いて決定した。試料を送付前に２〜８℃で保管した。５００ｍＬおよび１リットルの培養物に用いた条件は、４ｍＬの樹脂を用いてＩｇＧを捕捉したことを除き、上記で概観した条件と同一であった。プラスミド対は、表７にまとめる通りに発現させた。
【０３４７】
【表７】
2014502274.tif 000009
多様な精製ＩｇＧ調製物についての非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルがもたらした電気泳動図から、完全ＩｇＧ抗体の予測重量が裏付けられ、したがって、適正な抗体の発現および精製が確認された。
【０３４８】
Ｈ３７、Ｈ３８、Ｈ３９、Ｌ３７、Ｌ３８、Ｌ３９
上記と同様の戦略を用いてヒト化重鎖Ｈ３７のＬ３７、Ｌ３８、Ｌ３９との組合せ；Ｈ３８のＬ３７、Ｌ３８、またはＬ３９との組合せ；およびＨ３９のＬ３７、Ｌ３８、またはＬ３９との組合せを生成させた。ＶＨ配列およびＶＬ配列を、ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域またはヒトＩｇＧ２軽鎖定常領域をコードするｐｃＤＮＡ３．３ベクターへとインフレームでクローニングした。全長重鎖配列および全長軽鎖配列を含有するプラスミドを、Ｌａｆｅｃｔｉｎｅトランスフェクション試薬（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ；カタログ番号：４５０２０３０）により、ＣＨＯ細胞へとトランスフェクトした。トランスフェクションの４日後、上清を回収し、Ｆｃ  ＥＬＩＳＡ（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ；カタログ番号：２００１００２）を用いて上清中の総ＩｇＧレベルを決定した。ＣＨＯへの一過性トランスフェクションからの上清は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）ビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上のプロテインＡリガンドを用いて精製した。ビーズによって捕捉した抗体は、ｐＨ３．０の酢酸によって溶出させ、ｐＨ７．５の２００ｍＭトリス、０．４％の酢酸ナトリウム、および１５０ｍＭのＮａＣｌ中で保管した。抗体調製物は、およそ０．９〜１．７ｍｇ／ｍｌの濃度で単離されたタンパク質（およそ０．３〜０．８５ｍｇ）を含有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、重鎖の予測分子量（５０ｋＤａ）および軽鎖の予測分子量（２５ｋＤａ）について９５％を超える純度が裏付けられた。
【０３４９】
（実施例１３）
結合アフィニティーおよび結合アビディティー
ヒト化抗体またはキメラ（ヒトＩｇＧ２骨格における５Ｆ１２Ｇ１のＶＨおよびＶＬ）抗体の全ての組合せに対応するタンパク質を、配列番号７３のヒトＢＫＢ２Ｒに由来するエピトープペプチドへの結合について調べた。
【０３５０】
ＦｏｒｔｅＢｉｏ（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）Ｏｃｔｅｔ（登録商標）プラットフォームを用いて、ヒト化モノクローナル抗体のペプチドエピトープ（配列番号７３）への結合アフィニティーおよび結合特徴を、元のマウスモノクローナル抗体である５Ｆ１２Ｇ１と比較して解析した。このプラットフォームでは、２つの表面：バイオセンサーチップ上に固定化したタンパク質の層および内部の基準層から反映した白色光の干渉パターンの光学的解析を介して、生体分子間相互作用を測定するための無標識法を用いた。バイオセンサーチップに結合した分子数の任意の変化により、リアルタイムで測定される干渉パターンのシフトが引き起こされた。結合特異性ならびに会合速度および解離速度をモニタリングした。
【０３５１】
Ｏｃｔｅｔ研究では、抗体の反応速度を滴定することにより、抗体を解析した。抗体は、反応速度緩衝液（０．００１Ｍのリン酸緩衝生理食塩液（０．０１３８ＭのＮａＣｌ、０．０００２７ＭのＫＣｌ）；２５℃でｐＨ７．４の０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．００２％  Ｔｗｅｅｎ、および０．００５％アジ化ナトリウム）中で調製した後、１：２で系列希釈した。
【０３５２】
センサーの準備：Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｉｎｃ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）を、ペプチド（配列番号２−ＰＥＧ−ビオチン）（Ｂｉｏｓｙｎ、Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ、Ｔｅｘａｓ）を含有する溶液中で、５０μｇ／ｍｌ（３００秒間／１０００ｒｐｍの振とう）でインキュベートすることによりコーティングした。試験には９６ウェル半容量プレートを用いた。ウェル１つ当たり９０μＬの試料を播種した。センサーを、反応速度緩衝液中でベースラインへと平衡化させた（６０秒間／１０００ｒｐｍ）。次いで、センサーを多様な抗体希釈液に入れ、５００秒間／１０００ｒｐｍにわたりプローブに結合（会合）させ、測定を行った。次いで、センサーを、解離させるための抗体を伴わない反応速度緩衝液へと移し（５００秒間／１０００ｒｐｍ）、測定を行った。Ｏｃｔｅｔシステムソフトウェアにより、オン速度／オフ速度／アフィニティーについての反応速度定数を計算した。
【０３５３】
対照のマウス抗体である５Ｆ１２Ｇ１（試料番号：ａｂ  ４０４）を、３０００ｎＭ（４５０μｇ／ｍｌ）の初期濃度の後、１：２の希釈率で調べた。被験ヒト化モノクローナル抗体では、用いる最高濃度を５００ｎＭとした後、１：２の希釈率とした。各濃度について２回ずつ調べた。ＨＣおよびＬＣとは、元のマウス５Ｆ１２Ｇ１のＶＨ配列およびＶＬ配列を表した。例示的なデータを、表８および９に示す。
【０３５４】
【表８】
2014502274.tif 000010
【０３５５】
【表９】
2014502274.tif 000011
軽鎖Ｌ２を重鎖Ｈ１またはＨ２と連結したヒト化モノクローナル抗体は、元のマウスモノクローナル抗体より強力な結合（低ＫＤ）を裏付けた。また、Ｈ３８／Ｌ３８、Ｈ３８／Ｌ３９、およびＨ３９／Ｌ３７の組合せも、元のマウスモノクローナル抗体より強力な結合（低ＫＤ）を裏付けていると考えられた。
【０３５６】
（実施例１４）
ヒト化モノクローナル抗体の生体活性についての試験
この実施例は、Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病性脂肪質（ＺＤＦ  ｆａ／ｆａ）ラットにおける、マウスｍＡｂ  ５Ｆ１２Ｇ１およびその１２のヒト化クローンの、動物におけるインスリン感受性に対する効果の評価について記載する。Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病ラットは、２型糖尿病と類似した症状を発症し、遺伝子的にインスリンに対して抵抗性である。Ｚｕｃｋｅｒラットは、ＯＧＴＴにおける血中グルコースレベルの過剰な上昇を裏付ける。したがって、Ｚｕｃｋｅｒラットは、モノクローナル抗体が、とりわけ、ＯＧＴＴにおいてインスリン感受性を増大させる能力を調べるのに良好なモデルである。
【０３５７】
雄ＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、ＯＮ）から入手した。到着時において、ラットは１０週齢であった。ラットは、１２時間にわたる明期および１２時間にわたる暗期による光周性、ならびに７０〜７２°Ｆの周囲温度を伴う室内のケージ１つ当たりに１匹ずつ収容され、通常の齧歯動物用の食餌および水分を適宜施された。７日の馴化後、ラットを、１群当たりのラット３匹ずつの１４群へと群分けした（表１０）。
【０３５８】
【表１０】
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経口グルコース負荷試験：一晩にわたり（１６時間）空腹状態に置いたラットに対して、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）を実施した。ラットに、ヒト化ｍＡｂ、マウスｍＡｂである５Ｆ１２Ｇ１（陽性対照）、およびＰＢＳ（ビヒクル対照）の皮下投与を、グルコース投与の３０分前に、体重１ｋｇ当たり０．２ｍｇの用量で施した。Ｄ−グルコースは蒸留水中で調製し、体重１ｋｇ当たり２ｇで経口投与した。血中グルコースレベルは、ヒト化ｍＡｂ、５Ｆ１２Ｇ１、またはビヒクルの投与前（ｔ＝−３０分）、およびグルコース負荷の直前（０分）、ならびに３０、６０、９０、および１２０分の時点において、Ａｃｃｕ−ｃｈｅｋ（商標）グルコース測定器を用いて測定した。
【０３５９】
結果およびデータ解析：データ（図３４）は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）またはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．００  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）から得られる平均±標準誤差（ＳＥＭ）として提示した。
【０３６０】
ビヒクル対照と比較して、５Ｆ１２Ｇ１に由来するヒト化抗ＢＫＢ２Ｒ  ｍＡｂおよび５Ｆ１２Ｇ１（０．２ｍｇ／ｋｇ）の単回投与は、ｍＡｂ  Ｌ１／Ｈ１を除き、ＺＤＦ  ｆａ／ｆａラットのグルコース経口投与後における血中グルコース濃度の曲線下面積（ＡＵＣ）を減少させた。血中グルコースＡＵＣの減少は、Ｈ３８／Ｌ３９の場合が大きく、効果の順に、Ｈ３７／Ｌ３８、Ｌ２／Ｈ２、Ｈ３８／Ｌ３８、Ｈ３７／Ｌ３７、Ｈ３８／Ｌ３８、Ｈ３９／Ｌ３７、Ｈ３９／Ｌ３９、Ｈ３７／Ｌ３７、Ｈ３９／Ｌ３８、Ｈ３７／Ｌ３９、およびＬ１／Ｈ１が続いた。また、ｍＡｂ  ５Ｆ１２Ｇ１も耐糖能の改善を示した。
【０３６１】
上記の多様な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態をもたらすことができる。本明細書で言及されており、かつ／または出願データシートで列挙されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物の全ては、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。必要な場合は、多様な特許、出願、および、出願公開の概念を用いて、なおさらなる実施形態をもたらすために、実施形態の態様を改変することができる。
【０３６２】
上記の詳細な説明に照らして、実施形態にこれらの変化および他の変化を施すことができる。一般に、以下の特許請求の範囲では、用いられる用語が、特許請求の範囲を、本明細書および特許請求の範囲で開示される特定の実施形態へと限定するものとみなすべきではなく、このような特許請求の範囲が権利を付与される全範囲の同等物を伴う全ての可能な実施形態を包含するとみなすべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示により限定されるものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年9月27日(2013.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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