(57)【要約】  本発明は、カルバミン酸キナーゼの存在下における組成物において、アンモニア、ATP、炭酸水素塩およびCO2またはその水和物形態を反応させるステップを含み、アンモニアおよびCO2またはその水和物形態が、化学反応においてカルバメートに変換され、カルバメートおよびATPが、カルバミン酸キナーゼによる酵素触媒反応においてカルバモイルリン酸に変換され、前記組成物のpHが、約8〜約12である、カルバモイルリン酸を生成する方法に関する。本発明はまた、尿素を生成する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルバミン酸キナーゼの存在下における組成物において、アンモニア、ATP、炭酸水素塩およびCO2またはその水和物形態を反応させるステップを含み、アンモニアおよびCO2またはその水和物形態が、化学反応においてカルバメートに変換され、カルバメートおよびATPが、カルバミン酸キナーゼによる酵素触媒反応においてカルバモイルリン酸に変換され、前記組成物のpHが、約8〜約12である、カルバモイルリン酸を生成する方法。
【請求項２】
pHが、約9〜約11、約9.25〜約11.25、約10.25〜約11.25または約10.5〜約11.5である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
カルバミン酸キナーゼが、超好熱性細菌に由来するか、またはその生物学的に活性な変異体である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
カルバミン酸キナーゼが、
a)配列番号1〜9のうちいずれか1つとして提示されるアミノ酸配列、
b)配列番号1〜9のうちいずれか1つまたは複数に対し少なくとも50%同一であるアミノ酸配列、および/または
c)a)もしくはb)の生物学的に活性な断片
を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
カルバミン酸キナーゼが、
a)配列番号4〜9のうちいずれか1つとして提示されるアミノ酸配列、
b)配列番号4〜9のうちいずれか1つまたは複数に対し少なくとも50%同一であるアミノ酸配列、および/または
c)a)もしくはb)の生物学的に活性な断片
を含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
温度が、約10℃〜約80℃である、請求項2から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
pH11において、0.5μMのカルバミン酸キナーゼが、NaHCO3(0.2M)、ATP(10mM)および20mM NH4OH中での40℃で30分間のインキュベーション後に、少なくとも0.5μmol/min/mg ADPを生成する、請求項2から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
pH11.5において、0.5μMのカルバミン酸キナーゼが、NaHCO3(0.2M)、ATP(10mM)および20mM NH4OH中での40℃で30分間のインキュベーション後に、少なくとも0.25μmol/min/mg ADPを生成する、請求項2から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
pHが、約9〜約10.5または約9.5〜約10.5である、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
カルバミン酸キナーゼが、好熱性細菌に由来するか、またはその生物学的に活性な変異体である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
カルバミン酸キナーゼが、
a)配列番号28〜35のうちいずれか1つとして提示されるアミノ酸配列、
b)配列番号28〜35のうちいずれか1つまたは複数に対し少なくとも50%同一であるアミノ酸配列、および/または
c)a)もしくはb)の生物学的に活性な断片
を含む、請求項9または請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
pH10.5において、0.5μMのカルバミン酸キナーゼが、NaHCO3(0.2M)、ATP(10mM)および200mM NH4OH中での40℃で30分間のインキュベーション後に、少なくとも0.6μmol/min/mg ADPを生成する、請求項9から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
温度が、約10℃〜約60℃である、請求項9から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
温度が、約20℃〜約30℃である、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
カルバミン酸キナーゼが、4℃で1年間の貯蔵および/または40℃で60時間の貯蔵後に、その活性の少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%または少なくとも約80%を維持する、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
圧力が、約0〜約10atmである、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
連続系において行われる、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
カルバミン酸キナーゼが、固体支持体に固定化されている、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
アンモニアの供給源が、廃棄材料である、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
カルバモイルリン酸の少なくとも一部の分解により、シアネートおよびシアン酸の一方または両方をさらに生成する、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
カルバモイルリン酸から化合物を生成する方法であって
i)請求項1から20のいずれか一項に記載の方法を行って、カルバモイルリン酸を生成するステップと、
ii)1つまたは複数のさらなる反応を行って、前記化合物を生成するステップと
を含む方法。
【請求項２２】
前記化合物が、尿素であり、ステップii)が、ステップi)の生成されたカルバモイルリン酸をアンモニアと反応させて、シアネートおよびシアン酸の一方または両方である中間体を経て尿素を生成するステップを含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
少なくともステップii)が、少なくとも約90℃または約90℃〜約100℃の温度で行われる、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
i)固体支持体に固定化されたカルバミン酸キナーゼにより、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法を行うステップと、
ii)ステップi)により生成されたカルバモイルリン酸を固体支持体から分離するステップと、
iii)カルバモイルリン酸を樹脂と結合させるステップと、
iv)アンモニアを含む溶液中で樹脂を洗浄して、シアネートおよびシアン酸の一方または両方である中間体を経て、カルバモイルリン酸を尿素へと変換するステップと
を含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２５】
ステップiv)が、約90℃〜約100℃の温度で行われる、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記化合物が、シトルリン、アルギニノコハク酸、アルギニン、オルニチンおよびこれらの2種以上の組み合わせから選択される尿素回路の中間体である、請求項21に記載の方法。
【請求項２７】
請求項20に記載の方法を行って、シアネートおよびシアン酸の一方または両方を生成するステップと、シアネートおよび/またはシアン酸を求核試薬と反応させるステップとを含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２８】
前記化合物が、ピリミジンである、請求項21または請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
ピリミジンが、ウラシル、シトシンもしくはチミンまたは1、2もしくは3個のリン酸基を有するこれらの誘導体である、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
単一の容器内で行われる、請求項21から23または26から29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項1から30のいずれか一項に記載の方法を行うステップを含む、廃棄材料におけるアンモニアの濃度を低下させる方法。
【請求項３２】
廃棄材料が、水中にある、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
カルバミン酸キナーゼをコードする単離されたおよび/または外因性のポリヌクレオチドであって、配列番号10、12、14、16、18、20、22、24、26または36〜43のいずれか1つとして提示されるヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項３４】
細胞において前記ポリヌクレオチドの発現を導くことのできるプロモーターに作動可能に連結している、請求項33に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３５】
請求項33または請求項34に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３６】
請求項33もしくは請求項34に記載のポリヌクレオチドおよび/または請求項35に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３７】
細菌細胞、酵母細胞または植物細胞である、請求項36に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
カルバミン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で、前記ポリヌクレオチドまたは請求項35に記載のベクターを含む請求項36もしくは請求項37に記載の宿主細胞またはその抽出物を培養するステップを含む、カルバミン酸キナーゼを生成する方法。
【請求項３９】
請求項1から20のいずれか一項に記載の方法を用いて生成されるカルバモイルリン酸。
【請求項４０】
請求項21から32のいずれか一項に記載の方法を用いて生成される化合物。
【請求項４１】
尿素、シトルリン、アルギニノコハク酸、アルギニン、オルニチンまたはピリミジンである、請求項40に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルバミン酸キナーゼの存在下における組成物において、アンモニア、ATP、炭酸水素塩およびCO2またはその水和物形態を反応させるステップを含み、アンモニアおよびCO2またはその水和物形態が、化学反応においてカルバメートに変換され、カルバメートおよびATPが、カルバミン酸キナーゼによる酵素触媒反応においてカルバモイルリン酸に変換され、前記組成物のpHが、約8〜約12である、カルバモイルリン酸を生成する方法に関する。本発明はまた、尿素を生成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
尿素は、最もよく見られる窒素肥料であり、世界中の肥料市場の50%超を占める。この肥料は、現在、Haber法を用いて調製されたアンモニアから、エネルギー集約型のBosch-Meiser法を用いて製造されている。尿素生産における大量のエネルギーおよび天然ガス投入の必要性は、尿素生産を、豊富な化石燃料供給を有する地域に集中させ、その結果、多くの国は、かなりの割合で尿素を輸入することになり、関連輸送費は高い。天然ガスに依存するエネルギー投入の多さおよび輸送費の高さは、供給依存的に敏感に変動する化石燃料の価格に伴う、尿素肥料のコストへと繋がる。尿素肥料のコストにおける将来的な影響についてのさらなる別の検討事項は、肥料生産および輸送に伴うCO2排出の関連コストのための、2015年に整備される炭素汚染削減制度(Carbon Pollution Reduction Scheme)導入の提唱である。
【０００３】
尿素肥料として用いられた窒素の大部分は、動物の排泄物や都市ごみを包含する様々な廃棄物の流れへと失われる。これらの廃棄物の流れは、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニアおよび有機窒素化合物(アミノ酸およびヌクレオチド)としてかなりの量の窒素を含有し、これらは、富栄養化効果(細菌異常発生等)を防ぐために廃棄物の流れから除去する必要がある。廃水処理における窒素は、最終的に、気体の窒素酸化物(強力なGHGであるN2OおよびNO)および窒素(N2)として失われる。これらの系における窒素のリサイクルは、i)低いエネルギー、低いGHG供給源の窒素肥料を提供し、ii)廃棄物の流れから窒素を除去し、下流の富栄養化効果を防ぎ、iii)亜酸化窒素の生成を低下させるであろう。その上、再生廃棄物窒素から得られる尿素肥料の生産は、その地域内で配給される可能性が高く、製品の輸送費用および全体的な環境フットプリントを低下させるであろう。
【０００４】
尿素回路は、一連の5種の酵素により窒素が適切に広がり、動物においてはアンモニアを排泄される尿素へと解毒させ、他の生物においては窒素性代謝中間体を生じる代謝過程である。尿素回路における最初のステップは、酵素、カルバモイルリン酸シンテターゼによる、炭酸、有機リン(ATP)、およびアンモニアまたはグルタメートのいずれかからのカルバモイルリン酸の生成である。
【０００５】
アンモニアは、9.25のpKaを有し、従って、生物学的pHで第一に利用できるのは、アンモニアではなくアンモニウムである。実際には、99.4%のアンモニアは、pH7でプロトン化される。大部分の生物に見出される低レベルのアンモニアのため、尿素回路は、カルバモイルリン酸を尿素に転換するために必要とされる(Jones and Lipman、1960)。カルバモイルリン酸は、別の4種の酵素転換を行い、最終的に尿素を生成する。化学的には、これらの同時発生的ステップは、アンモニア処理によるカルバモイルリン酸から尿素への変換により排除することができる。
【０００６】
カルバモイルリン酸は、生理的pHおよび温度において不安定であり、半減期(t1/2)は5分間である(Wangら、2008)。この不安定性にもかかわらず、これは、さらなる転換を行うと、シトルリン、アルギニン、ピリミジンヌクレオチドおよび尿素を生じる。カルバモイルリン酸の熱分解は、トランスカルバモイラーゼによる安定化により回避される。アスパラギン酸およびオルニチントランスカルバモイラーゼは、カルバモイルリン酸の熱分解速度を5,000倍低下させる。トランスカルバモイラーゼを欠く溶液中で、カルバモイルリン酸は、平面(planar)中間体を経て分解する(Allen and Jones、1964)。この幾何学は、アスパラギン酸およびオルニチントランスカルバモイラーゼの活性部位において妨げられ、これによりカルバモイルリン酸は安定化され、安定的なウレイド産物へと転換することができる。
【０００７】
カルバモイルリン酸は、水性環境において不安定であり、容易に分解する(Wangら、2008)。分解が起こる経路は、pH依存的である。酸加水分解において、分解が起こってアンモニウム、オルトリン酸塩および二酸化炭素となり(Allen and Jones、1964)、一方、アルカリ性条件下に存在するジアニオンは、分解してオルトリン酸塩およびシアネートとなる(Allen and Jones、1964)。さらなる窒素置換は、アンモニアおよび炭酸塩により不可能であるが、シアネートにより容易に起こることが知られているため、分解経路は、その後の転換に重要である(Wen and Brooker、1994)。例えば、炭酸塩がアンモニアで処理される場合、尿素の生成は起こらないが、シアネートがアンモニアで処理される場合、生成は起こり、尿素の生成は、アンモニア濃度の増加と共に増加する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第5,792,924号明細書
【特許文献２】国際公開第00/64539号パンフレット
【特許文献３】米国特許出願公開第20030096741号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第20020168706号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第20020058244号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J. Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning、John Wiley and Sons(1984)
【非特許文献２】J. Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)
【非特許文献３】T.A. Brown(編)、Essential Molecular Biology: A Practical Approach、1および2巻、IRL Press(1991)
【非特許文献４】D.M. Glover and B.D. Hames(編)、DNA Cloning: A Practical Approach、1〜4巻、IRL Press (1995および1996)
【非特許文献５】F.M. Ausubelら(編)、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience(1988、今日までのあらゆる改訂を包含)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
カルバモイルリン酸は、その不安定性から、商業的な中間体として非実用的であると判断されてきた。よって、カルバモイルリン酸を生成する方法と共に、尿素を生成する方法が必要である。さらに、廃棄材料からアンモニアレベルを低下させるための方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、単一の酵素を用いてアンモニアをカルバモイルリン酸に変換することのできる方法を開発した。
【００１２】
よって、第1の態様において、本発明は、カルバミン酸キナーゼの存在下における組成物において、アンモニア、ATP、炭酸水素塩およびCO2またはその水和物形態を反応させるステップを含み、アンモニアおよびCO2またはその水和物形態が、化学反応においてカルバメートに変換され、カルバメートおよびATPが、カルバミン酸キナーゼによる酵素触媒反応においてカルバモイルリン酸に変換され、前記組成物のpHが、約8〜約12である、カルバモイルリン酸を生成する方法を提供する。
【００１３】
好ましい一実施形態において、pHは、約9.9、約9〜約11、約9.25〜約11.25、約10.25〜約11.25または約10.5〜約11.5である。本実施形態において、カルバミン酸キナーゼは、超好熱性細菌に由来する、またはその生物学的に活性な変異体であることが好ましい。超好熱性細菌の例として、パイロコッカス属の種(Pyrococcus sp.)およびサーモコッカス属の種(Thermococcus sp.)が挙げられるがこれらに限定されない。パイロコッカス属の種の例として、パイロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi)、パイロコッカス・エンデボリ(Pyrococcus endeavori)、パイロコッカス・グリコボランス(Pyrococcus glycovorans)、パイロコッカス・ホリコシイ(Pyrococcus horikoshii)およびバイロコッカス・ヴェッセイ(Pyrococcus woesei)が挙げられるがこれらに限定されない。サーモコッカス属の種の例として、サーモコッカス・アシダミノボランス(Thermococcus acidaminovorans)、サーモコッカス・アーガエウス(Thermococcus aegaeus)、サーモコッカス・アグレガンス(Thermococcus aggregans)、サーモコッカス・アルカリフィルス(Thermococcus alcaliphilus)、サーモコッカス・アトランティカス(Thermococcus atlanticus)、サーモコッカス・バロフィルス(Thermococcus barophilus)、サーモコッカス・バロッシ(Thermococcus barossii)、サーモコッカス・セレラ(Thermococcus celer)、サーモコッカス・セレリクレセンス(Thermococcus celericrescens)、サーモコッカス・キトノファガス(Thermococcus chitonophagus)、サーモコッカス・コーレセンス(Thermococcus coalescens)、サーモコッカス・フミコランス(Thermococcus fumicolans)、サーモコッカス・ガンマトレランス(Thermococcus gammatolerans)、サーモコッカス・コーゴナリウス(Thermococcus gorgonarius)、サーモコッカス・グアイマセンシス(Thermococcus guaymasensis)、サーモコッカス・ヒドロサーマリス(Thermococcus hydrothermalis)、サーモコッカス・コダカラエンシス(Thermococcus kodakarensis)、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)、サーモコッカス・マリナス(Thermococcus marinus)、サーモコッカス・メキシカリス(Thermococcus mexicalis)、サーモコッカス・ナウティルス(Thermococcus nautilus)、サーモコッカス・オンヌリネウス(Thermococcus onnurineus)、サーモコッカス・パシフィカス(Thermococcus pacificus)、サーモコッカス・ペプトノフィルス(Thermococcus peptonophilus)、サーモコッカス・プロファンドゥス(Thermococcus profundus)、サーモコッカス・ラジオトレランス(Thermococcus radiotolerans)、サーモコッカス・シビリカス(Thermococcus sibiricus)、サーモコッカス・シクリ(Thermococcus siculi)、サーモコッカス・ステッテリ(Thermococcus stetteri)、サーモコッカス・チオレドゥセンス(Thermococcus thioreducens)、サーモコッカス・ワイマングエンシス(Thermococcus waimanguensis)、サーモコッカス・ワイオタプエンシス(Thermococcus waiotapuensis)およびサーモコッカス・ジリギー(Thermococcus zilligii)が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、このようなカルバミン酸キナーゼの例として、
a)配列番号1〜9のうちいずれか1つとして提示されるアミノ酸配列、
b)配列番号1〜9のうちいずれか1つまたは複数に対し少なくとも50%同一であるアミノ酸配列、および/または
c)a)もしくはb)の生物学的に活性な断片
を含むカルバミン酸キナーゼが挙げられる。
【００１４】
別の一実施形態において、カルバミン酸キナーゼは、
a)配列番号4〜9のうちいずれか1つとして提示されるアミノ酸配列、
b)配列番号4〜9のうちいずれか1つまたは複数に対し少なくとも50%同一であるアミノ酸配列、および/または 
c)a)もしくはb)の生物学的に活性な断片
を含む。
【００１５】
さらに別の一実施形態において、カルバミン酸キナーゼは、
a)配列番号1、8または9として提示されるアミノ酸配列、
b)配列番号1、8または9のうちいずれか1つまたは複数に対し少なくとも50%同一であるアミノ酸配列、および/または
c)a)もしくはb)の生物学的に活性な断片
を含む。
【００１６】
さらに別の一実施形態において、カルバミン酸キナーゼは、
a)配列番号8または配列番号9として提示されるアミノ酸配列、
b)配列番号8または配列番号9のうちいずれか1つまたは複数に対し少なくとも50%同一であるアミノ酸配列、および/または
c)a)もしくはb)の生物学的に活性な断片
を含む。
【００１７】
上述の実施形態において、温度は、約10℃〜約100℃である。ある一実施形態において、温度は、約20℃〜約80℃である。別の一実施形態において、温度は、約20℃〜約60℃である。別の一実施形態において、温度は、約20℃〜約30℃である。
【００１８】
別の好ましい一実施形態において、pH11において、0.5μMのカルバミン酸キナーゼは、NaHCO3(0.2M)、ATP(10mM)および20mM NH4OH中での40℃で30分間のインキュベーション後に、少なくとも0.5μmol/min/mg、少なくとも0.9μmol/min/mgまたは0.5〜3μmol/min/mgの間のADPを生成する。
【００１９】
別の好ましい一実施形態において、pH11.5において、0.5μMのカルバミン酸キナーゼは、NaHCO3(0.2M)、ATP(10mM)および20mM NH4OH中での40℃で30分間のインキュベーション後に、少なくとも0.25μmol/min/mg、少なくとも0.6μmol/min/mgまたは0.25〜2.5μmol/min/mgの間のADPを生成する。
【００２０】
代わりの一実施形態において、pHは、約9〜約10.5または約9.5〜約10.5である。本実施形態において、カルバミン酸キナーゼは、好熱性細菌に由来する、またはその変異体であることが好ましい。好熱性細菌の例として、フェルビドバクテリウム属の種(Fervidobacterium sp.)(例えば、フェルビドバクテリウム・ノドサム(Fervidobacterium nodosum))、サーモシフォ属の種(Thermosipho sp.)(例えば、サーモシフォ・メラネシエンシス(Thermosipho melanesiensis))、アナエロバキュラム属の種(Anaerobaculum sp.)(例えば、アナエロバキュラム・ヒドロジェニフォーマンス(Anaerobaculum hydrogeniformans)およびアミノバクテリウム・コロンビェンス(Aminobacterium colombiense))、サーマナエロビブリオ属の種(Thermanaerovibrio sp.)(例えば、サーマナエロビブリオ・アシダミノボランス(Thermanaerovibrio acidaminovorans))、ハロサーモトリクス属の種(Halothermothrix sp.)(例えば、ハロサーモトリクス・オレニー(Halothermothrix orenii))、コスモトガ属の種(Kosmotoga sp.)(例えば、コスモトガ・オレアリア(Kosmotoga olearia))およびムーレラ属の種(Moorella sp.)(例えば、ムーレラ・サーモアセチカ(Moorella thermoacetica))が挙げられるがこれらに限定されない。このようなカルバミン酸キナーゼの例として、
a)配列番号28〜35のうちいずれか1つとして提示されるアミノ酸配列、
b)配列番号28〜35のうちいずれか1つまたは複数に対し少なくとも50%同一であるアミノ酸配列、および/または
c)a)もしくはb)の生物学的に活性な断片を含むカルバミン酸キナーゼが挙げられる。さらに、ある一実施形態において、温度は、約10℃〜約60℃、約20℃〜約60℃、約20℃〜約40℃、または約20℃〜約30℃である。加えて、ある一実施形態において、pH10.5において、0.5μMのカルバミン酸キナーゼは、NaHCO3(0.2M)、ATP(10mM)および200mM NH4OH中での40℃で30分間のインキュベーション後に、少なくとも0.6μmol/min/mgのADPを生成する。
【００２１】
好ましい一実施形態において、カルバミン酸キナーゼは、4℃で1年間の貯蔵および/または40℃で60時間の貯蔵後に、その活性の少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%または少なくとも約80%を維持する。
【００２２】
さらに別の一実施形態において、圧力は、約0〜約350MPa、あるいは約1atm〜約10atmの間である。
【００２３】
ある一実施形態において、方法は、連続系において行われる。
【００２４】
さらに別の一実施形態において、カルバミン酸キナーゼは、固体支持体に固定化されている。
【００２５】
また別の一実施形態において、アンモニアの供給源は、廃棄材料である。
【００２６】
さらに別の一実施形態において、方法は、カルバモイルリン酸の少なくとも一部の分解により、シアネートおよびシアン酸の一方または両方をさらに生成する。
【００２７】
さらに別の一実施形態において、カルバミン酸キナーゼは、少なくとも1種の他のポリペプチドを含む融合タンパク質である。少なくとも1種の他のポリペプチドは、例えば、カルバミン酸キナーゼの安定性を増強するポリペプチド、細菌細胞または酵母細胞等、細胞から融合タンパク質の分泌を促進するポリペプチド、融合タンパク質の精製を支援するポリペプチドおよび/またはポリペプチドと固体支持体との結合を支援するポリペプチドであり得る。
【００２８】
尿素および/または他の安定的で輸送可能な商品へのカルバモイルリン酸のin situ転換は、効率的な生物学的経路による現在のエネルギー集約型の商業的手法の交替を可能にする。よって、さらに別の一態様において、本発明は、カルバモイルリン酸から化合物を生成する方法であって、
i)本発明の方法を行って、カルバモイルリン酸を生成するステップと、
ii)1つまたは複数のさらに別の反応を行って、前記化合物を生成するステップと
を含む方法を提供する。
【００２９】
本発明者らは、尿素を生成するための簡便な手順を考案した。従って、特に好ましい一実施形態において、化合物は、尿素であり、ステップii)は、ステップi)の生成されたカルバモイルリン酸をアンモニアと反応させて、シアネートおよびシアン酸の一方または両方である中間体を経て尿素を生成するステップを含む。アンモニアは、ステップi)において存在するアンモニアおよび/またはステップii)において添加される追加的なアンモニアであり得る。
【００３０】
ある一実施形態において、尿素を生成する場合、少なくともステップii)は、少なくとも約90℃の温度で行われる。より好ましくは、尿素を生成する場合、少なくともステップii)は、約90℃〜約100℃の温度で行われる。
【００３１】
さらに別の一実施形態において、方法は、
i)固体支持体に固定化されたカルバミン酸キナーゼにより、本発明の方法を行って、カルバモイルリン酸を生成するステップと、
ii)ステップi)により生成されたカルバモイルリン酸を固体支持体から分離するステップと、
iii)カルバモイルリン酸を樹脂と結合させるステップと、
iv)アンモニアを含む溶液中で樹脂を洗浄して、シアネートおよびシアン酸の一方または両方である中間体を経て、カルバモイルリン酸を尿素へと変換させるステップと
を含む。
【００３２】
ステップiv)は、尿素を生成するのみならず、樹脂から分子を遊離させて、樹脂から溶出される材料中の尿素の収集も可能にする。
【００３３】
ある一実施形態において、ステップiv)は、約90℃〜約100℃の温度で行われる。
【００３４】
さらに別の一実施形態において、化合物は、シトルリン、アルギニノコハク酸、アルギニン、オルニチンおよびこれらの2種以上の組み合わせから選択される尿素回路の中間体である。
【００３５】
別の一実施形態において、方法は、本発明の方法を行って、シアネートおよびシアン酸の一方または両方を生成するステップと、シアネートおよび/またはシアン酸を求核試薬と反応させるステップとを含む。
【００３６】
ある一実施形態において、化合物は、ピリミジンである。ピリミジンの例として、ウラシル、シトシンもしくはチミンまたは1、2もしくは3個のリン酸基を有するこれらの誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３７】
ある一実施形態において、方法は、単一の容器内で行われる。
【００３８】
さらに別の一態様において、本発明は、本発明の方法を行うステップを含む、廃棄材料におけるアンモニアの濃度を低下させる方法を提供する。
【００３９】
ある一実施形態において、廃棄材料は、水中にある。
【００４０】
本発明者らは、細菌細胞において発現されると、天然のオープンリーディングフレーム(配列番号11)に優る、配列番号1において提示されるアミノ酸配列を含むカルバミン酸キナーゼのより高レベルの生成をもたらすポリヌクレオチドも同定した。よって、さらに別の一態様において、本発明は、カルバミン酸キナーゼをコードする単離されたおよび/または外因性のポリヌクレオチドであって、配列番号10として提示されるヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチドを提供する。別の一態様において、本発明は、カルバミン酸キナーゼをコードする単離されたおよび/または外因性のポリヌクレオチドであって、配列番号10、12、14、16、18、20、22、24、26または36〜43のうちいずれか1つとして提示されるヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００４１】
好ましい一実施形態において、ポリヌクレオチドは、細胞においてポリヌクレオチドの発現を導くことができるプロモーターに作動可能に連結している。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。
【００４３】
さらに別の一態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよび/または本発明のベクターを含む、宿主細胞またはその抽出物を提供する。適した宿主細胞の例として、細菌細胞、酵母細胞または植物細胞が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、宿主細胞は、細菌細胞である。一実施形態において、細菌細胞は、大腸菌(E. coli)細胞である。さらに別の一実施形態において、方法は、無細胞系において本発明の宿主細胞の抽出物および/または無細胞系において本発明のベクターを用いて行われる。
【００４４】
別の一態様において、本発明は、カルバミン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む本発明の宿主細胞またはその抽出物を培養するステップを含む、カルバミン酸キナーゼを生成する方法を提供する。
【００４５】
ある一実施形態において、方法は、1グラムの細胞から、少なくとも10mg、より好ましくは、少なくとも15mgのカルバミン酸キナーゼを生成する。
【００４６】
さらに別の一態様において、本発明の方法を用いて生成されるカルバモイルリン酸が提供される。
【００４７】
本発明の方法を用いて生成される化合物も提供される。好ましくは、化合物は、尿素、シトルリン、アルギニノコハク酸、アルギニン、オルニチンまたはピリミジンである。
【００４８】
本明細書におけるいかなる実施形態も、他に特段の記述がなければ、他のいずれかの実施形態に適宜変更して適用されるものと解釈するべきである。
【００４９】
本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態による範囲に限定するべきではなく、実施形態は、例証目的のみに企図されている。機能的に均等な生成物、組成物および方法は、本明細書に記載されている通り、明らかに本発明の範囲内に収まる。
【００５０】
本明細書を通して、他に特段の記述がなければ、あるいは文脈がそれ以外を要求しなければ、単一のステップ、物の組成物、ステップの群または物の組成物の群の言及は、1および多数(即ち、1つまたは複数)のこれらステップ、物の組成物、ステップの群または物の組成物の群を包含するものと解釈するべきである。
【００５１】
以下、次の非限定的な例により、添付の図面を参照しつつ本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】(A)カルバモイルリン酸のアニオンの分解を示す図である。(B)カルバモイルリン酸のジアニオンの分解を示す図である。
【図２】a)0.2mM;b)0.4mM;c)0.6mM;およびd)0.8mMの濃度のAMP、ADPおよびATPを含有する複数の標準溶液のHPLC解析を示す図である。
【図３】40℃のNaHCO3(0.2M)、ATP(10mM)およびNH4OH(四角=200mM、菱形=20mM、三角=2mM)におけるADPのPfu CK(0.5μM)触媒生成のpH依存性を示す図である。
【図４】pH9.9のNaHCO3(0.2M)、ATP(10mM)およびNH4OH(20mM)におけるADPのPfu CK触媒生成の温度依存性を示す図である。
【図５】40℃のNaHCO3、ATP(10mM)およびNH4OH(200mMおよび20mM)における30分間インキュベーション後の、ADPのPfu CK触媒生成のpH依存性を示す図である。
【図６】pH7.2、8.4、8.9、9.4、9.9、10.4、10.9および11.4に調整された、水におけるアンモニア(2M)および13C標識炭酸水素ナトリウム(0.2M)溶液中で観察される炭素共鳴の組込みの比較を示す図である。
【図７】40℃のNaHCO3、ATP(10mM)およびNH4OH(200mMおよび20mM)における30分間インキュベーション後の、ADPのCK触媒生成のpH依存性を示す図である。
【図８】pH9.9のNaHCO3(0.2M)、ATP(10mM)およびNH4OH(200mM)におけるADPのCK触媒生成の温度依存性を示す図である。
【図９】pH9.9のNaHCO3(0.2M)、ATP(10mM)およびNH4OH(200mM)におけるADPのCK触媒生成の温度依存性を示す図である。
【図１０】DMSOに溶解したa)1H NMRおよびb)13C NMRによる真正の尿素の解析を示す図である。
【図１１】アンモニア水(2.5M)におけるカルバモイルリン酸(10mg)の100℃4時間のインキュベーション後の尿素生成物の解析を示す図である。DMSOに溶解したa)1H NMRおよびb)13C NMR。
【図１２】炭酸水素ナトリウム(0.2M)、ATP(10mM)およびアンモニア水(2.5M)の溶液におけるPfu CK(0.5μM)の100℃4時間のインキュベーション後の、尿素生成物の解析を示す図である。DMSOに溶解したa)1H NMRおよびb)13C NMR。
【図１３】本発明に有用な数種のカルバミン酸キナーゼのアライメントを示す図である。P.フリオサス(P.furiosus)カルバミン酸キナーゼとは異なるアミノ酸のみ示す。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
配列表の要点
配列番号1 - パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)カルバミン酸キナーゼのアミノ酸配列(NCBI Ref:NP_578405.1)。
配列番号2 - パイロコッカス・ホリコシイのカルバミン酸キナーゼのアミノ酸配列(NCBI Ref:NP_143170)。
配列番号3 - パイロコッカス・アビシのカルバミン酸キナーゼのアミノ酸配列(NCBI Ref:NP_126565.1)。
配列番号4 - サーモコッカス属の種のカルバミン酸キナーゼのアミノ酸配列(NCBI Ref:ZP_04879925.1)。
配列番号5 - サーモコッカス・ガンマトレランスのカルバミン酸キナーゼのアミノ酸配列(NCBI Ref:YP_002958486.1)。
配列番号6 - サーモコッカス・コダカラエンシスのカルバミン酸キナーゼのアミノ酸配列(NCBI Ref:YP_184571.1)。
配列番号:7 - サーモコッカス・オンヌリネウスのカルバミン酸キナーゼのアミノ酸配列(NCBI Ref:YP_002307889.1)。
配列番号8 - サーモコッカス・バロフィルスのカルバミン酸キナーゼのアミノ酸配列(NCBI Ref:YP_004071992.1)。
配列番号9 - サーモコッカス・シビリカスのカルバミン酸キナーゼのアミノ酸配列(NCBI Ref:YP_002995234.1)。
配列番号10 - パイロコッカス・フリオサスのカルバミン酸キナーゼをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列。
配列番号11 - パイロコッカス・フリオサスのカルバミン酸キナーゼをコードするヌクレオチド配列(NCBI Ref:NC_003413)。
配列番号12 - パイロコッカス・ホリコシイのカルバミン酸キナーゼをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列。
配列番号13 - パイロコッカス・ホリコシイのカルバミン酸キナーゼをコードするヌクレオチド配列(NCBI Ref:NC_000961)。
配列番号14 - パイロコッカス・アビシのカルバミン酸キナーゼをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列。
配列番号15 - パイロコッカス・アビシのカルバミン酸キナーゼをコードするヌクレオチド配列(NCBI Ref:NC_000868)。
配列番号16 - サーモコッカス属の種のカルバミン酸キナーゼをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列。
配列番号17 - サーモコッカス属の種のカルバミン酸キナーゼをコードするヌクレオチド配列(NCBI Ref:NZ_DS999059の逆方向の補体(reverse complement))。
配列番号18 - サーモコッカス・ガンマトレランスのカルバミン酸キナーゼをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列。
配列番号19 - サーモコッカス・ガンマトレランスのカルバミン酸キナーゼをコードするヌクレオチド配列(NCBI Ref:NC_012804)。
配列番号20 - サーモコッカス・コダカラエンシスのカルバミン酸キナーゼをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列。
配列番号21 - サーモコッカス・コダカラエンシスのカルバミン酸キナーゼをコードするヌクレオチド配列(NCBI Ref:NC_006624)。
配列番号22 - サーモコッカス・オンヌリネウスのカルバミン酸キナーゼをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列。
配列番号23 - サーモコッカス・オンヌリネウスのカルバミン酸キナーゼをコードするヌクレオチド配列(NCBI Ref:NC_011529)。
配列番号24 - サーモコッカス・バロフィルスのカルバミン酸キナーゼをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列。
配列番号25 - サーモコッカス・バロフィルスのカルバミン酸キナーゼをコードするヌクレオチド配列(NCBI Ref:NC_014804)。
配列番号26 - サーモコッカス・シビリカスのカルバミン酸キナーゼをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列。
配列番号27 - サーモコッカス・シビリカスのカルバミン酸キナーゼをコードするヌクレオチド配列(NCBI Ref:NC_012883)。
配列番号28 - フェルビドバクテリウム・ノドサムのカルバミン酸キナーゼのアミノ酸配列(NCBI Ref:A7HNY8)。
配列番号29 - サーモシフォ・メラネシエンシスのカルバミン酸キナーゼのアミノ酸配列(NCBI Ref:A6LPA8)。
配列番号30 - アナエロバキュラム・ヒドロジェニフォーマンスのカルバミン酸キナーゼのアミノ酸配列(NCBI Ref:D3L0Z7)。
配列番号31 - アミノバクテリウム・コロンビェンスのカルバミン酸キナーゼのアミノ酸配列(NCBI Ref:D5ECR9)。
配列番号32 - サーマナエロビブリオ・アシダミノボランスのカルバミン酸キナーゼのアミノ酸配列(NCBI Ref:D1B8A3)。
配列番号33 - ハロサーモトリクス・オレニーのカルバミン酸キナーゼのアミノ酸配列(NCBI Ref:B8D2J8)。
配列番号34 - コスモトガ・オレアリアのカルバミン酸キナーゼのアミノ酸配列(NCBI Ref:C5CE22)。
配列番号35 - ムーレラ・サーモアセチカのカルバミン酸キナーゼのアミノ酸配列(NCBI Ref:Q2RGN0)。
配列番号36 - フェルビドバクテリウム・ノドサムのカルバミン酸キナーゼをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列。
配列番号37 - サーモシフォ・メラネシエンシスのカルバミン酸キナーゼをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列。
配列番号38 - アナエロバキュラム・ヒドロジェニフォーマンスのカルバミン酸キナーゼをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列。
配列番号39 - アミノバクテリウム・コロンビェンスのカルバミン酸キナーゼをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列。
配列番号40 - サーマナエロビブリオ・アシダミノボランスのカルバミン酸キナーゼをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列。
配列番号41 - ハロサーモトリクス・オレニーのカルバミン酸キナーゼをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列。
配列番号42 - コスモトガ・オレアリアのカルバミン酸キナーゼをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列。
配列番号43 - ムーレラ・サーモアセチカのカルバミン酸キナーゼをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列。
配列番号44 - エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)のカルバミン酸キナーゼのアミノ酸配列(NCBI Ref:P0A2X7)。
配列番号45 - クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)のカルバミン酸キナーゼのアミノ酸配列(NCBI Ref:Q890W1)。
配列番号46 - エンテロコッカス・フェカリスのカルバミン酸キナーゼをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列。
配列番号47 - クロストリジウム・テタニのカルバミン酸キナーゼをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列。
配列番号48および49 - オリゴヌクレオチドプライマー。
【００５４】
一般技法および定義
他に特段の定めがない限り、本明細書に用いられているあらゆる専門用語および科学用語は、当業者(例えば、細胞培養、分子遺伝学、酵素学、尿素生成、タンパク質化学および生化学分野の)に一般に理解されているものと同じ意味を有すると解釈されたい。
【００５５】
他に指示がない限り、本発明において利用されている組換えタンパク質、細胞培養および免疫学的技法は、当業者によく知られた標準手順である。このような技法は、J. Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning、John Wiley and Sons(1984)、J. Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)、T.A. Brown(編)、Essential Molecular Biology: A Practical Approach、1および2巻、IRL Press(1991)、D.M. Glover and B.D. Hames(編)、DNA Cloning: A Practical Approach、1〜4巻、IRL Press (1995および1996)およびF.M. Ausubelら(編)、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience(1988、今日までのあらゆる改訂を包含)等の出典における文献を通じて記載および説明されている。
【００５６】
用語「および/または」、例えば「Xおよび/またはY」は、「XおよびY」または「XまたはY」のいずれかを意味すると理解されたく、両方の意味またはいずれかの意味に対する明示的な支持を提示するものと解釈されたい。
【００５７】
本明細書において、用語、約、は、それと反対のことが記述されていない限り、指定の値の+/-20%、より好ましくは、+/-10%、より好ましくは、+/-5%を指す。
【００５８】
本明細書を通して、単語「含む(comprise)」または「含み(comprises)」もしくは「含んでいる(comprising)」等の変種は、記述されている要素、整数もしくはステップまたは要素、整数もしくはステップの群の包含を暗示するが、他のいかなる要素、整数もしくはステップまたは要素、整数もしくはステップの群の除外も暗示しないものと理解されよう。
【００５９】
本明細書において、「好熱性」は、約45℃〜約70℃の温度において生存することのできる生物、好ましくは、細菌である。本明細書において、「超好熱性」は、約70℃〜約120℃の温度において生存することのできる生物、好ましくは、細菌である。
【００６０】
カルバモイルリン酸の合成
カルバモイルリン酸は、生物システムにおける窒素転移に重要な代謝産物であり、カルバモイルリン酸シンテターゼ(CPS)およびカルバミン酸キナーゼ(CK)酵素により合成される。パイロコッカス・フリオサス(Pfu)CK(EC6.3.4.16)(配列番号1)は、その真の基質がカルバメートであり、1モルのATPしか用いないことが発見されるまで、本来CPSとして分類されていた。カルバメート(続いてカルバモイルリン酸となる)を酵素的に生成するCPSとは異なり、Pfu CKは、二酸化炭素およびアンモニアから化学的に生成されたカルバメートを扱う(方程式1)。
【００６１】
【化１】
2014521309.tif 000002
【００６２】
アンモニア、二酸化炭素およびカルバメートにより形成される平衡状態は、CO2対NH3の比率により大部分は決定される(Maniら、2006)。等量のアンモニアとCO2が溶液中に存在する場合、炭酸水素アンモニウムが、一次生成物である(方程式2)。過剰なアンモニアが利用できる場合には、平衡状態は、カルバミン酸アンモニウムの生成に有利となる(方程式3)。
【００６３】
【化２】
2014521309.tif 000003
【００６４】
本発明者らは、単一プロセスにおいてアンモニアをカルバモイルリン酸に変換することができる方法を開発した。この系の利点は、高pHかつ低濃度のアンモニア下で行うことができることである。高pHは、アンモニアの大部分がアンモニウムの形態でないことを確実にする一方、相対的に低濃度のアンモニアは、この方法を、生物および水廃棄物等の供給源からアンモニアの除去に適したものとする。
【００６５】
実施例に提示されている酵素pH-速度プロファイルは、2mM、20mMおよび200mMアンモニアの存在下、およそpH9.9におけるカルバミン酸キナーゼの最大速度を示す。これは、Durbecqら(1997)により報告される結果と対照的である。試験したアンモニア濃度において、より中性pHレベルは、関連するカルバメート可用性低下のために、カルバモイルリン酸合成に実際に有害であることも明らかである。
【００６６】
生成物安定性も、pHによって影響される。カルバモイルリン酸は、水性環境において不安定であり、容易に分解する(Wangら、2008)。分解が起こる経路は、pH依存性である。pH2〜4に存在するアニオンは、アンモニア、炭酸塩およびリン酸塩へと分解し(図1A)、一方、アルカリ性条件において存在するジアニオンは、リン酸塩およびシアネートへと分解する(図1B)。さらなる窒素置換は、アンモニアおよび炭酸塩により不可能であるが、シアネートにより容易に起こることが知られているため、分解経路は、その後の転換に重要である(Wen and Brooker、1994)。例えば、炭酸塩がアンモニアで処理される場合、尿素の生成は起こらないが、シアネートおよびシアン酸の1つまたは複数がアンモニアで処理される場合に生成され、尿素の生成は、アンモニア濃度の増加に伴い増加する。
【００６７】
好ましくは、カルバモイルリン酸を生成するための反応におけるアンモニア濃度は、少なくとも約1mMである。ある一実施形態において、アンモニア濃度は、約1mM〜約5Mである。別の一実施形態において、アンモニア濃度は、約2mM〜約2Mである。高濃度のアンモニアが存在する場合、尿素は、本明細書に記載されている中間体によりカルバモイルリン酸から生成することができる。
【００６８】
ある一実施形態において、ATP濃度は、少なくとも約0.1mMである。別の一実施形態において、ATP濃度は、約0.1mM〜約100mMである。さらに別の一実施形態において、ATP濃度は、約1mM〜約20mMである。また別の一実施形態において、ATP濃度は、約10mMである。
【００６９】
ある一実施形態において、炭酸水素塩は、炭酸水素ナトリウムとして提供される。ある一実施形態において、炭酸水素塩濃度は、少なくとも約10mMである。別の一実施形態において、炭酸水素塩濃度は、約10mM〜約1Mである。さらに別の一実施形態において、炭酸水素塩濃度は、約100mM〜約500mMである。また別の一実施形態において、炭酸水素塩濃度は、約200mMである。
【００７０】
特異的酵素が耐容性を示し得る温度に依存して、反応は、約10℃〜約100℃を包含する温度範囲において行うことができる。ある一実施形態において、温度は、約10℃〜約80℃である。しかし、一部の状況において、約20℃〜約30℃等、酵素の最適温度よりも低い温度で反応を行うことが、より経済的および/または実際的(廃水におけるアンモニウム/アンモニアを用いる場合等)であり得る。配列番号1〜9として提示される酵素等、特定の酵素のため、約90℃〜約100℃等、より高温で、十分なレベルのアンモニアの存在下において、尿素が生成されるであろう。
【００７１】
別の一実施形態において、カルバミン酸キナーゼは、pH10.5、11または11.5においてその最大活性の少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%または少なくとも60%を維持する。これは、例えば、20mMまたは200mMのNH4OH濃度を用いる実施例5に記載されている手順を用いて決定することができる。
【００７２】
本発明は、廃水等、水の材料からアンモニア濃度の除去または少なくとも低下に用いることができる。例えば、廃棄物は、農業または工業プロセスに由来し得る。一実施形態において、廃棄材料は、ダムまたは流れに由来する水等、液体である。別の一実施形態において、廃棄材料は、特に、ヒトおよび/または動物の排泄物を含む下水である。別の一実施形態において、廃棄材料は、排ガス等、気体である。
【００７３】
ある一実施形態において、廃棄材料は、清澄化されて懸濁固体を除去した液体である。清澄化は、除去清澄機(relief clarifier)、研磨フィルター(polishing filter)等、従来の機器を用いて行うことができる。
【００７４】
尿素の合成
アンモニウムおよびシアネート(例えば)から尿素への変換のために、2種の異なる経路が提案されている。第一の経路は、イオン機構NH4++NCO-→CO(NH2)2により、もう一方の経路は、アンモニアおよびシアン酸NH3+HNCO→CO(NH2)2の反応による非イオン機構である。その最も確かな証拠は、Wen and Brooker(1994)により報告された実際の機構である。著者らは、シアネートから尿素への反応速度が、イオン機構を支持する、アンモニアではなくアンモニウム濃度に正比例することを報告した。
【００７５】
本発明の方法を用いて生成されたカルバモイルリン酸は、尿素の合成に用いることができる。アンモニアは、反応に必要とされ、反応は一般に、少なくとも約90℃の高温で行われる。
【００７６】
ある一実施形態において、尿素は、単一の容器内で、好ましくは、連続系で生成される。
【００７７】
代わりの一実施形態において、尿素は、多くの段階で生成される。例えば、CKは、90℃を超える温度(例えば、90℃〜100℃)で機能的であるが、カルバモイルリン酸の生成は通常、より低い温度(例えば、約60℃)でより効率的である。一例において、カルバモイルリン酸は、固体支持体に固定化された酵素により、本発明に従って生成される。生成されたカルバモイルリン酸は続いて、固体支持体から分離されるが、これは例えば、カラムの形態の固体支持体により、カルバモイルリン酸をカラムから溶出させる。次に、溶出されたカルバモイルリン酸を適した樹脂に結合させて、続いてアンモニアを含む溶液中で樹脂を洗浄し、カルバモイルリン酸を、本明細書において定義されている中間体を経て尿素へと変換することができる。この操作は、尿素を生成するのみならず、樹脂から分子を遊離させて、樹脂から溶出される材料において尿素を収集することもできる。
【００７８】
本発明に適した樹脂として、廃水および土壌からリン酸塩の除去のための樹脂等、モノまたはジアニオン樹脂が挙げられる。例として、KFR-3tT-40、SBS-3およびAmberlite IRA-400(Rohm&Haas)が挙げられる。
【００７９】
好ましくは、尿素を生成するための反応におけるアンモニア濃度は、少なくとも約2.5Mである。ある一実施形態において、アンモニア濃度は、約2.5M〜約40Mである。別の一実施形態において、アンモニア濃度は、約2.5M〜約10Mである。
【００８０】
カルバミン酸キナーゼ
本明細書において、「カルバミン酸キナーゼ」または「CK」は、カルバメートをカルバモイルリン酸に変換することができる酵素である。本発明の方法において、アンモニアおよびCO2またはその水和物形態は、化学反応においてカルバメートに変換され、その結果得られるカルバメートおよびATPは、カルバミン酸キナーゼによる酵素触媒反応においてカルバモイルリン酸に変換される。本発明の方法において用いられるカルバミン酸キナーゼは、ある程度のカルバモイルリン酸シンテターゼ(CPS)活性を有していても有していなくてもよく、よって、3ステップでアンモニア、炭酸水素塩およびATPからカルバモイルリン酸を不可逆的に合成することができる。好ましい一実施形態において、カルバミン酸キナーゼは、CPS活性を持たない。
【００８１】
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」および「カルバミン酸キナーゼ」は一般に、互換的に用いられ、非アミノ酸基の付加により修飾されていても修飾されていなくてもよい一本のポリペプチド鎖を指す。このようなポリペプチド鎖は、他のポリペプチドもしくはタンパク質または補助因子等の他の分子と会合し得ることが理解されよう。本明細書における用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「カルバミン酸キナーゼ」は、本明細書に記載されているポリペプチドの変種、変異体、生物学的に活性な断片、修飾、類似体(analogous)および/または誘導体も包含する。
【００８２】
ポリペプチドの%同一性は、gap作成ペナルティー=5およびgap伸長ペナルティー=0.3によるGAP(Needleman and Wunsch、1970)解析(GCGプログラム)により決定される。問い合わせ配列は、少なくとも25アミノ酸の長さであり、GAP解析は、少なくとも25アミノ酸の領域にわたり2配列をアライメントする。より好ましくは、問い合わせ配列は、少なくとも50アミノ酸の長さであり、GAP解析は、少なくとも50アミノ酸の領域にわたり2配列をアライメントする。より好ましくは、問い合わせ配列は、少なくとも100アミノ酸の長さであり、GAP解析は、少なくとも100アミノ酸の領域にわたり2配列をアライメントする。さらにより好ましくは、問い合わせ配列は、少なくとも250アミノ酸の長さであり、GAP解析は、少なくとも250アミノ酸の領域にわたり2配列をアライメントする。さらにより好ましくは、問い合わせ配列は、少なくとも300アミノ酸の長さであり、GAP解析は、少なくとも300アミノ酸の領域にわたり2配列をアライメントする。さらにより好ましくは、GAP解析は、その全長にわたり2配列をアライメントする。
【００８３】
本明細書において、「生物学的に活性な断片」は、カルバメートおよびATPをカルバモイルリン酸に変換する能力を維持する、本明細書に記載されているポリペプチドの部分である。生物学的に活性な断片は、定義されている活性を維持する限りにおいていかなるサイズであってもよい。好ましくは、生物学的に活性な断片は、少なくとも200、より好ましくは、少なくとも300アミノ酸の長さである。
【００８４】
定義されているポリペプチドに関して、上述よりも高い%同一性の数値が、好ましい実施形態を包含することが認められよう。よって、適切であれば、最小%同一性の数値を踏まえ、ポリペプチドが、関連する指名の配列番号に対し、少なくとも55%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも91%、より好ましくは少なくとも92%、より好ましくは少なくとも93%、より好ましくは少なくとも94%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、より好ましくは少なくとも99.1%、より好ましくは少なくとも99.2%、より好ましくは少なくとも99.3%、より好ましくは少なくとも99.4%、より好ましくは少なくとも99.5%、より好ましくは少なくとも99.6%、より好ましくは少なくとも99.7%、より好ましくは少なくとも99.8%、さらにより好ましくは少なくとも99.9%同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００８５】
本明細書に記載されているポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、本明細書に定義されている核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは所望のポリペプチドのin vitro合成により調製することができる。このような変異体は、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入または置換を包含する。最終ポリペプチド産物が、所望の特徴を有するのであれば、欠失、挿入および置換の組み合わせを行って、最終コンストラクトに到達することができる。
【００８６】
変異体(変質した)ポリペプチドは、本技術分野において公知のいずれかの技法を用いて調製することができる。例えば、本明細書に記載されているポリヌクレオチドは、in vitro突然変異誘発に付すことができる。このようなin vitro突然変異誘発技法は、ポリヌクレオチドを適したベクターへとサブクローニングするステップと、ベクターを大腸菌XL-1 red(Stratagene)等の「ミューテーター」株へと形質転換するステップと、適した世代数の間、形質転換細菌を繁殖させるステップとを包含し得る。別の一例において、本明細書に記載されているポリヌクレオチド(例えば、配列番号10〜27または36〜43のうち2種以上)は、Harayama(1998)により広く記載されているDNAシャフリング技法に付される。変異/変質したDNAに由来する生成物は、本明細書に記載されている技法を用いて容易にスクリーニングして、これがカルバミン酸キナーゼ活性を有するか決定することができる。
【００８７】
アミノ酸配列変異体の設計において、変異部位の位置および変異の性質は、修飾しようとする特徴に依存するであろう。変異のための部位は、個々にまたは順次、例えば、(1)達成される結果に応じて先ず保存的アミノ酸選択肢と、次により根本的な(radical)選択と置換する、(2)標的残基を欠失させる、または(3)配置部位に隣接する他の残基を挿入することにより修飾することができる。
【００８８】
アミノ酸配列欠失は一般に、約1〜15残基、より好ましくは約1〜10残基、通常は約1〜5個の近接残基に及ぶ。
【００８９】
置換変異体は、ポリペプチド分子において少なくとも1個のアミノ酸残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されている。対象の部位は、様々な株または種から得られた特定の残基が同一である部位である。これらのポジションは、生物学的活性に重要であり得る。これらの部位、特に、少なくとも3種の他の同じく保存された部位の配列内に収まる部位は、好ましくは、相対的に保存的な様式で置換されている。このような保存的置換をTable 1(表1)に示す。
【００９０】
好ましい一実施形態において、変異体/変種ポリペプチドは、天然起源のポリペプチドと比較して1または2または3または4個の保存的アミノ酸変化、あるいは例えば配列番号1〜9または28〜35等、参照配列と比べて最大10または15または20個のアミノ酸変化を有する。保存的アミノ酸変化の詳細をTable 1(表1)に提示する。当業者であれば気づくであろうが、このような僅かな変化は、組換え細胞において発現されたときにポリペプチドの活性を変質しないと合理的に予測することができる。
【００９１】
【表１】
2014521309.tif 000004
【００９２】
P.フリオサスCK(配列番号1)の結晶構造および構造/機能関係性は、Ramon-Maiquesら(2000)により記載されている。著者らの研究は、構造が、その熱安定性にどのように関係するか、また、活性部位の構造が、その機能にどのように関係するかについて考察する。著者らは、酵素の熱安定性が、多数の露出したイオン対に由来する疎水性サブユニット間接触の拡大に起因し得ること、37℃における遅速性が、恐らく緩慢な生成物解離の結果であることを結論付けることができた。Ramon-Maiquesら(2000)は、緩慢な生成物解離を、「Met274とTYR244との間にサンドイッチされた」プリン環の強固な結合と、アデニンNH2と水素結合を形成するHis268およびAla241の酸素原子の結合に起因するものとし、Ala241のNHは、アデニンN1において別の水素結合を形成する。著者らは、これらの結合が、アデニンヌクレオチドの酵素の高度な特異性をもたらす筈であると記述する。さらに、カルバモイル成分は、10Gly-Gly-Asnおよび52Gly-Asn-Glyと相互作用し、リン酸(phosphoryl)転移は、3個の完全に保存されたリシン残基、Lys131、Lys215およびLys277に関与し(Ramon-Maiquesら、2000)、その全ては、実施例5において検査される酵素において保存されている。加えて、2倍対称性を定義するAsp65およびTyr71は、アルファベータヘリックス間の相互作用に関係し、一方、Gln94は、水素結合のネットワークの伸長に関与する。Asp65は、解析した全サーモコッカス(Thermococci)において保存されている。電荷を有する残基は、検査した全カルバミン酸キナーゼを通じてグルタミン酸またはアスパラギン酸として保存されている。P.フリオサスCKのアミノ酸番号71は、全サーモコッカスにおいてチロシンまたはヒスチジンであるが、検査した他のカルバミン酸キナーゼにおいては存在しない。P.フリオサスCKのアミノ酸番号94は、サーモコッカスにおけるグルタミンまたはグリシンであり、検査した他のカルバミン酸キナーゼにおいてアラニンまたはグルタミンである。当業者であれば、Ramon-Maiquesらによる等の研究が、本発明に有用な天然起源のCKの機能的変種の設計に対し、考慮すべき指針を提供することに気づくであろう。
【００９３】
当業者であれば認められようが、本明細書に記載されているポリペプチド(例えば、配列番号1〜9または28〜35のうち2つ以上に提示されている配列を有するポリペプチド)をアライメントして、変種/変異体酵素の設計を支援することができる(例えば、図13を参照)。好ましくは、高度に保存されたアミノ酸が維持されている、あるいは恐らく保存的様式で置換されている(Table 1(表1)を参照)。さらに別の一実施形態において、タンパク質のアミノ酸が変質している場合、これは、配列番号1〜9または28〜35として提示されるカルバミン酸キナーゼの1種等、別のカルバミン酸キナーゼの相当するポジションに見出されるアミノ酸に置換されている。
【００９４】
さらに、必要であれば、非天然アミノ酸または化学的アミノ酸類似体が、本明細書に記載されているポリペプチドへの置換または付加として導入することができる。このようなアミノ酸として、通常のアミノ酸のD-アイソマー、2,4-ジアミノ酪酸、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、2-アミノ酪酸、6-アミノヘキサン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、フルオロ-アミノ酸、β-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、Nα-メチルアミノ酸等のデザイナー(designer)アミノ酸および一般のアミノ酸類似体が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９５】
例えば、ビオチン化、ベンジル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、保護/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、抗体分子または他の細胞リガンドへの結合等により、合成の最中またはその後に異なって修飾されたポリペプチドも本発明の範囲内に包含されている。これらの修飾は、ポリペプチドの安定性および/または生物活性を増加させるよう働く。
【００９６】
本明細書に記載されているポリペプチドは、天然ポリペプチドの生成および回収、組換えポリペプチドの生成および回収ならびにポリペプチドの化学的合成を包含する多種多様な方法で生成することができる。一実施形態において、酵素は、ポリペプチド産生に効果的な条件下でポリペプチドを発現することができる細胞を培養し、ポリペプチドを回収することにより生成される。培養に好ましい細胞は、本明細書に定義されている組換え細胞である。効果的な培養条件として、ポリペプチド生成を可能にする効果的な培地、バイオリアクタ、温度、pHおよび酸素条件が挙げられるがこれらに限定されない。効果的な培地は、細胞が培養されてポリペプチドを産生するいずれかの培地を指す。このような培地は通常、同化可能な炭素、窒素およびリン酸塩供給源ならびに適切な塩、ミネラル、金属およびビタミン等の他の栄養素を有する水性培地を含む。細胞は、従来の発酵バイオリアクタ、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリ皿において培養することができる。培養は、組換え細胞に適切な温度、pHおよび酸素含量で行うことができる。このような培養条件は、当業者の専門知識の範囲内である。代わりの一実施形態において、本明細書に記載されているポリペプチドは、無細胞系において生成することができる。無細胞系は通常、生物学的抽出物および/または規定の試薬を含む反応混合物を含む。反応混合物は、ポリペプチド生成のための鋳型、例えば、DNA、mRNA等;アミノ酸、酵素および合成に必要な他の試薬、例えば、リボソーム、tRNA、ポリメラーゼ、転写因子等を含むであろう。例えば、生物学的抽出物は、ポリペプチドを産生する大腸菌、サーモコッカス属の種またはパイロコッカス属の種の細胞に由来し得る。このような合成反応系は、本技術分野において周知のものであり、文献に記載されている。無細胞合成反応は、本技術分野において公知のバッチ、連続流または半連続流として行うことができる。
【００９７】
ある一実施形態において、酵素は、細胞からポリペプチドの分泌を導くことのできるシグナル配列を含む。多数のこのようなシグナル配列が単離されており、これは、NおよびC末端シグナル配列を包含する。原核生物および真核生物N末端シグナル配列は類似しており、真核生物N末端シグナル配列が、細菌において分泌配列として機能することができることを示した。このようなN末端シグナル配列の例は、よく研究されている配列である、外部環境へのポリペプチドの分泌促進のために広範に用いられている、細菌β-ラクタマーゼシグナル配列である。C末端シグナル配列の例は、大腸菌の溶血素A(hlyA)シグナル配列である。シグナル配列の追加的な例として、アエロリジン、アルカリホスファターゼ遺伝子(phoA)、キチナーゼ、エンドキチナーゼ、α-溶血素、MIpB、プルラナーゼ、YopsおよびTATシグナルペプチドを限定することなく挙げられる。
【００９８】
ポリヌクレオチド
DNA、RNAもしくはこれらの組み合わせ、センスもしくはアンチセンス配向性または両者の組み合わせの、一本または二本鎖、dsRNAまたはその他を包含する「単離されたポリヌクレオチド」により、本出願人らは、これが天然状態では会合またはリンクするポリヌクレオチド配列から少なくとも部分的に分離されたポリヌクレオチドを意味する。好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは、これが天然には会合している他の成分を少なくとも60%、好ましくは少なくとも75%、最も好ましくは少なくとも90%含まない。さらに、用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書において用語「核酸」と互換的に用いられる。
【００９９】
ポリヌクレオチドの文脈における用語「外因性」は、その天然状態と比較して変質した量で細胞または無細胞発現系に存在するときのポリヌクレオチドを指す。一実施形態において、細胞は、このポリヌクレオチドを天然には含まない細胞である。しかし、細胞は、変質した、好ましくは増加した量のコードされたポリペプチドの生成をもたらす非内因性ポリヌクレオチドを含む細胞であり得る。本発明の外因性ポリヌクレオチドは、これが存在するトランスジェニック(組換え)細胞または無細胞発現系の他の成分から分離されていないポリヌクレオチドと、このような細胞または無細胞系において生成されて、その後に少なくとも一部の他の成分から精製されるポリヌクレオチドとを包含する。
【０１００】
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書により提供される分子と比較して、ヌクレオチド残基の欠失、挿入または置換である1つまたは複数の変異を有し得る。変異体は、天然起源(即ち、天然供給源から単離)または合成(例えば、核酸に部位特異的突然変異誘発を行うことによる)のいずれかであり得る。
【０１０１】
通常、ポリヌクレオチドのモノマーは、ホスホジエステル結合またはその類似体によりリンクする。ホスホジエステル結合の類似体は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート(phosphoroselenoate)、ホスホロジセレノエート(phosphorodiselenoate)、ホスホロアニロチオエート(phosphoroanilothioate)、ホスホラニリデート(phosphoranilidate)およびホスホロアミド酸を包含する。
【０１０２】
組換えベクター
本発明の一実施形態は、宿主細胞へとポリヌクレオチド分子を送達することのできるいずれかのベクターに挿入された、本発明の少なくとも1種の単離された/外因性ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを包含する。組換えベクターは、本発明に有用なカルバミン酸キナーゼの生成に用いることもでき、例えば、配列番号10〜27もしくは36〜43のうちいずれか1つとして提示されるヌクレオチドの配列またはこれらの1つまたは複数に対し少なくとも50%同一のヌクレオチドの配列を含む組換えベクターである。このようなベクターは、天然にはカルバミン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド分子と隣接して見出されず、好ましくは、ポリヌクレオチド分子が由来する種以外の種に由来するポリヌクレオチド配列である、異種ポリヌクレオチド配列を含有する。ベクターは、RNAまたはDNAのいずれか、原核生物または真核生物のいずれかとすることができ、通常、トランスポゾン(米国特許第5,792,924号明細書に記載されている等)、ウイルスまたはプラスミドである。
【０１０３】
ある種の組換えベクターは、発現ベクターに作動可能に連結したポリヌクレオチドを含む。語句、作動可能に連結は、宿主細胞に形質転換されると分子が発現することができるような様式における、発現ベクターへのポリヌクレオチド分子の挿入を指す。本明細書において、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換し、特定のポリヌクレオチド分子の発現をもたらすことのできるDNAまたはRNAベクターである。好ましくは、発現ベクターは、宿主細胞内で複製することもできる。発現ベクターは、原核生物または真核生物のいずれかとすることができ、通常、ウイルスまたはプラスミドである。発現ベクターは、細菌、真菌、内部寄生虫、節足動物、動物および植物細胞を包含する組換え細胞において機能する(即ち、遺伝子発現を導く)いずれかのベクターを包含する。本発明のベクターは、無細胞発現系におけるポリペプチドの生成に用いることもでき、このような系は、本技術分野において周知のものである。
【０１０４】
本明細書における「作動可能に連結」は、2個以上の核酸(例えば、DNA)セグメント間の機能的関係性を指す。通常、これは、転写される配列に対する転写調節エレメントの機能的関係性を指す。例えば、プロモーターは、適切な宿主細胞および/または無細胞発現系においてコード配列の転写を刺激またはモジュレートする場合、本明細書に定義されているポリヌクレオチド等、コード配列に作動可能に連結している。一般に、転写される配列に作動可能に連結したプロモーター転写調節エレメントは、転写される配列に物理的に近接している、即ち、これはシス作用性である。しかし、エンハンサー等、一部の転写調節エレメントは、その転写が増強されるコード配列と物理的に近接またはごく近くに位置している必要はない。
【０１０５】
特に、発現ベクターは、転写制御配列、翻訳制御配列、複製開始点等の調節配列および組換え細胞と適合性であり、ポリヌクレオチド分子の発現を制御する他の調節配列を含有する。特に、組換え分子は、転写制御配列を包含する。転写制御配列は、転写の開始、伸長および終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびリプレッサー配列等、転写開始を制御する配列である。適した転写制御配列は、本明細書に記載されている組換え細胞のうち少なくとも1種において機能し得るいずれかの転写制御配列を包含する。多種多様なこのような転写制御配列は、当業者に知られている。好ましい転写制御配列は、細菌、酵母、節足動物、線虫、植物または動物細胞において機能する配列を包含し、tac、lac、trp、trc、oxy-pro、omp/lpp、rrnB、バクテリオファージラムダ、バクテリオファージT7、T7lac、バクテリオファージT3、バクテリオファージSP6、バクテリオファージSP01、メタロチオネイン、アルファ-接合因子、ピキア属(Pichia)アルコールオキシダーゼ、アルファウイルスサブゲノムプロモーター(シンドビス(Sindbis)ウイルスサブゲノムプロモーター等)、抗生物質抵抗性遺伝子、バキュロウイルス、ヘリオシス・ゼア(Heliothis zea)昆虫ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、アライグマポックスウイルス、他のポックスウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス(前初期(intermediate early)プロモーター等)、サルウイルス40、レトロウイルス、アクチン、レトロウイルス末端反復配列、ラウス肉腫ウイルス、熱ショック、リン酸塩および硝酸塩転写制御配列ならびに原核生物または真核生物細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列等が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０６】
宿主細胞
本発明の別の一実施形態は、本明細書に記載されている1つまたは複数の組換え分子で形質転換された宿主細胞もしくはその後代細胞または宿主細胞の使用を包含する。細胞へのポリヌクレオチド分子の形質転換は、ポリヌクレオチド分子を細胞に挿入することのできるいずれかの方法により達成することができる。形質転換技法として、遺伝子導入、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着およびプロトプラスト融合が挙げられるがこれらに限定されない。組換え細胞は、単細胞のまま維持しても、組織、器官または多細胞生物へと成長させてもよい。形質転換されたポリヌクレオチド分子は、その発現される能力が保持されるような様式で、形質転換した(即ち、組換え)細胞の染色体外に維持しても、染色体内の1つまたは複数の部位へと組込んでもよい。
【０１０７】
形質転換に適した宿主細胞は、本明細書に定義されているポリヌクレオチドで形質転換することのできるいずれかの細胞を包含する。宿主細胞は、本明細書に記載されているポリペプチドを内因的に(即ち、天然に)産生することができる、あるいは本明細書に記載されている少なくとも1種のポリヌクレオチド分子で形質転換された後にこのようなポリペプチドを産生することができる。宿主細胞は、本明細書に定義されている少なくとも1種のタンパク質を産生することができるいずれかの細胞とすることができ、細菌、真菌(酵母を包含)、寄生虫、線虫、節足動物、動物および植物細胞を包含する。宿主細胞の例として、サルモネラ属(Salmonella)、大腸菌属(Escherichia)、バチルス属(Bacillus)、リステリア属(Listeria)、サッカロマイセス属(Saccharomyces)、スポドプテラ属(Spodoptera)、マイコバクテリア、トリコプルシア属(Trichoplusia)、BHK(ベビーハムスター腎臓(baby hamster kidney))細胞、MDCK細胞、CRFK細胞、CV-1細胞、COS(例えば、COS-7)細胞およびベロ細胞が挙げられる。宿主細胞のさらなる例は、大腸菌K-12派生体を包含する大腸菌;チフス菌(Salmonella typhi);弱毒株を包含するネズミチフス菌(Salmonella typhimurium);ヨトウガ(Spodoptera frugiperda);イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni);および非腫瘍原性マウス筋芽細胞G8細胞(例えば、ATCC CRL1246)である。有用な酵母細胞は、ピキア属の種、アスペルギルス属の種(Aspergillus sp.)およびサッカロマイセス属の種を包含する。特に好ましい宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞または植物細胞である。
【０１０８】
組換えDNA技術を用いて、例えば、宿主細胞内のポリヌクレオチド分子のコピー数、これらのポリヌクレオチド分子が転写される効率、その結果得られた転写産物が翻訳される効率および翻訳後修飾効率を操作することにより、形質転換されたポリヌクレオチド分子の発現を改善することができる。ポリヌクレオチド分子の発現の増加に有用な組換え技法として、高コピー数プラスミドへのポリヌクレオチド分子の操作可能なリンク(operatively linking)、1つまたは複数の宿主細胞染色体へのポリヌクレオチド分子の組込み、プラスミドへのベクター安定性配列の付加、転写制御シグナル(例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー)の置換または修飾、翻訳制御シグナル(例えば、リボソーム結合部位、シャイン・ダルガーノ(Shine-Dalgarno)配列)の置換または修飾、宿主細胞のコドン使用に対応するポリヌクレオチド分子の修飾(例えば、配列番号10、12、14、16、18、20、22、24、26または36〜43を参照)および転写産物を不安定化する配列の欠失が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０９】
組成物
本発明に有用な組成物は、本明細書において「許容される担体」とも称される賦形剤を包含する。このような賦形剤として、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、ハンクス溶液および他の水性の生理的に平衡を保つ塩溶液が挙げられる。固定油、ゴマ油、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド等、非水性媒体を用いてもよい。他の有用な製剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストラン等、粘性増強剤を含有する懸濁液を包含する。賦形剤は、等張性および化学的安定性を増強する物質等、少量の添加物を含有することもできる。緩衝液の例として、リン酸緩衝液、炭酸水素緩衝液およびTris緩衝液が挙げられ、一方、保存料の例として、チメロサールまたはo-クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールが挙げられる。賦形剤は、組成物の半減期を増加させるために用いることもでき、例えば、ポリマー型放出制御媒体、生分解性インプラント、リポソーム、細菌、ウイルス、他の細胞、油、エステルおよびグリコールが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１０】
ある一実施形態において、カルバミン酸キナーゼは、固体支持体に固定化されている。この構成は、カルバモイルリン酸の生成および/またはポリペプチドの安定性の増加を増強することができる。例えば、このポリペプチドは、ポリウレタンマトリックスに固定化することができる(Gordonら、1999)、あるいは適切なリポソームにカプセル封入することができる(Petrikovicsら、2000aおよびb)。ポリペプチドは、消火(fire-fighting)において日常的に用いられる組成物等、泡を含む組成物に取り込むこともできる(LeJeuneら、1998)。当業者(skilled addressee)であれば認めるであろうが、カルバミン酸キナーゼは、国際公開第00/64539号パンフレットに開示されているスポンジまたは泡において容易に用いることができる。本発明に有用な他の固体支持体は、アクリル型構造を有する、Sepabeads EC-EP(Resindion srl--Mitsubishi Chemical Corporation)およびEupergit C(Rohm-Degussa)等、エポキシ官能基を有する、またはSepabeads EC-hasおよびEC-EA(Resindion srl--Mitsubishi Chemical Corporation)等、第一級アミノ基を有する樹脂を包含する。いずれの事例においても、ポリペプチドは、固体支持体と接触させられ、官能基(エポキシド)の高い反応性により、またはグルタルアルデヒド等の二官能性剤による支持体の活性化により酵素とマトリックスを結合させて固定化される。本発明に適した他の支持体は、ポリスチレン樹脂、巨大網状(macroreticular)樹脂およびSepabeads EC-Q1A等の塩基性官能基を有する樹脂であり、ポリペプチドは、樹脂上に吸収され、次に二官能性剤(グルタルアルデヒド)で架橋することにより安定化される。
【０１１１】
一実施形態において、組成物は、環境(土壌および水試料を包含)中に組成物を徐々に放出することができる放出制御製剤の形態である。本明細書において、放出制御製剤は、放出制御媒体を含む。適した放出制御媒体として、生体適合性ポリマー、他のポリマー型マトリックス、カプセル、マイクロカプセル、微粒子、ボーラス標品、浸透圧ポンプ、拡散装置、リポソーム、リポ球(liposphere)および経皮性送達系が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい放出制御製剤は、生分解性(即ち、生体内分解性(bioerodible))である。
【０１１２】
酵素の濃度は、例えば、除染しようとする試料の性質、試料におけるアンモニアの濃度および組成物の処方に依存するであろう。組成物内の酵素の効果的な濃度は、本発明の方法を用いて実験的に容易に決定することができる。
【０１１３】
用途
カルバモイルリン酸
in situにおける化学的または生物学的なカルバモイルリン酸の転換は、有用な商品を生じる。カルバモイルリン酸は、本明細書において概要を述べている通り、尿素の生成に用いることができる。
【０１１４】
カルバモイルリン酸は、シアネートおよび/またはシアン酸等の中間体を経て求核試薬と反応するため、数々のカルバモイル誘導体へと転換することができる。アルコールは、シアネートと反応して、カルバメートを生成するであろう(Love and Kormendy、1963)。例えば、フェノール由来のアルコール官能基は、カルバモイルリン酸と反応して、尿素誘導体に通常用いられる合成前駆物質である、カルバミン酸フェニルを生成するであろう(Xiaoら、1997)。同様に、カルバモイルリン酸は、チオールと反応して、除草剤として広範に用いられているカルバモチオエート(carbamothioate)の生成をもたらすことができる(Woottonら、1993)。カルバモイルリン酸は、ペプチドにおける尿素官能性の導入に用いることもできる。
【０１１５】
尿素置換基によるアミド結合の交換は関心の的であり、これら非天然ペプチドは、HIVプロテアーゼ阻害剤(Kempfら、1991)やβ-ターンタンパク質ミミック(Nowickら、1995)として研究されてきた。
【０１１６】
カルバモイルリン酸は、齲蝕に予防的そして恐らく治療的効果を有することを示した。カルバモイルリン酸および他のカルバメート化合物が、骨組織および骨密度の安定化または成長において有益な効果を有することが発見された(米国特許出願公開第20030096741号明細書)。
【０１１７】
カルバモイルリン酸は、反応のためのエネルギー供給源であり得る(米国特許出願公開第20020168706号明細書)。
【０１１８】
カルバモイルリン酸は、アスパラギン酸と反応する場合、ウリジン-5'-一リン酸の生成に用いることができる(米国特許出願公開第20020058244号明細書)。
【０１１９】
ピリミジン、ピリミジンヌクレオシドおよびピリミジンヌクレオチドは、多段階経路によりアスパラギン酸およびカルバモイルリン酸(グルタミンおよびCO2に由来する)から合成される(O'Donovan and Neuhard、1970を参照)。
【０１２０】
尿素回路においてカルバモイルリン酸から生化学的に生成されたシトルリンは、心疾患の治療のための医薬品として用いられる(Barrら、2007)。
【０１２１】
尿素
世界の尿素生産の90%超は、窒素放出肥料として用いられる。尿素は、よく用いられている全固体窒素性肥料の中で最高窒素含量を有する。多くの土壌細菌は、尿素分子から2個のアンモニア分子および1個の二酸化炭素分子への変換を触媒する酵素ウレアーゼを有し、よって、尿素肥料は、土壌においてアンモニウム形態へと非常に急速に転換される。アンモニアおよび硝酸塩は、植物により容易に吸収され、植物成長のための主要な窒素供給源である。尿素は、水に高度に可溶性であり、従って、肥料溶液(硝酸アンモニウムとの組み合わせ)における、例えば、「葉面栄養補給(foliar feed)」肥料における使用にも非常に適している。肥料用途のために、顆粒は、機械的投与の利点であるそのより狭い粒子径分布のため、小球よりも好ましい。
【０１２２】
尿素は通常、40〜300kg/haの間の比率で散布されるが、比率は変動する。より少量の投与は、浸出によるより低い損失を被る。夏の間、尿素は多くの場合、雨の直前または最中に散布されて、揮発による損失を最小化する(窒素がアンモニアガスとして大気へと失われる過程)。尿素は、スプレーとして適用するため、あるいは灌漑システムにより水に溶解する。
【０１２３】
尿素は大気から吸湿するため、従って通常、パレット上の閉鎖/密封バッグ内で、あるいは大量に貯蔵する場合、防水シートによるカバーの下で貯蔵される。多くの固体肥料と同様に、冷えて乾燥した、十分に換気された場所における貯蔵が推奨される。
【０１２４】
尿素は、一部のプラスチック(例えば、尿素-ホルムアルデヒド樹脂)、一部の接着剤(例えば、マリン合板(marine plywood)に用いられる尿素-ホルムアルデヒドまたは尿素-メラミン-ホルムアルデヒド)、シアン酸カリウム(工業用原料)および硝酸尿素(爆発物)等、多くの重要な化合物の製造のための原材料である。
【０１２５】
自動車システムにおいて、尿素は、ディーゼル、2系統燃料および希薄燃焼天然ガスエンジンの燃焼由来の排ガスにおけるNOx汚染物質を還元するための選択的非触媒還元および選択的触媒還元反応において用いられる。BlueTecシステムは、例えば、水に基づく尿素溶液を排気システムに注入する。尿素の加水分解により生成されたアンモニアは、窒素酸化物排出と反応し、触媒的変換器内で窒素および水へと変換される。
【０１２６】
尿素は、燃料電池におけるその後の発電のための水素供給源として機能することができる。尿/廃水に存在する尿素は、直接的に用いることができる(細菌は通常、尿素を急速に分解するが)。尿素溶液の電気分解による水素の生成は、水の電気分解(1.2v)よりも低い電圧(0.37v)で起こり、よって、より少ないエネルギーを消費する。
【０１２７】
医学的用途に関しては、尿素は、皮膚の水分補給を促進するための局所用皮膚科学的製品において用いられる。密封包帯で覆われている場合、爪の非外科的デブリードマンに40%尿素標品を用いることもできる。特定の種類のインスタント冷湿布(またはアイスパック)は、水および隔離された尿素結晶を含有する。内部水袋の破裂は、吸熱反応を開始し、腫れを低下させるために湿布の使用を可能にする。生理食塩水と同様に、尿素注入は、中絶の実施に用いられる。尿素は、尿療法と称される代替的薬物治療の主成分である。炭素-14または炭素-13で標識された尿素は、消化性潰瘍に関連するヒトの胃および十二指腸における細菌ピロリ菌(Helicobacter pylori)の存在の検出に用いられる、尿素呼気検査において用いられる。
【０１２８】
本発明の方法を用いて生成された尿素の他の可能な用途として、ニトロセルロース爆発物における安定剤、動物飼料の成分、道路凍結防止用岩塩の非腐食性代替物、スノーボードハーフパイプおよび野外パーク施設(terrain parks)の再舗装、巻きタバコの風味増強用添加物、脱毛剤における成分、工場生産されたプレッツェルにおける褐変剤(browning agent)、一部の皮膚クリーム、保湿剤およびヘア・コンディショナーにおける成分、一部のすぐに使える応急使用の冷却用湿布における反応物、人工降雨剤(cloud seeding agent)、難燃剤(flame-proofing agent)および歯科用ホワイトニング製品における成分、食器用洗剤における成分、糖からエタノールへの発酵のための酵母栄養素、地球工学目的の海洋の富栄養化実験においてプランクトンに利用される栄養素、膠の作業温度および開放時間を拡大する添加物、布地染色またはプリントの染浴に対する溶解性増強用および湿度保持用添加物ならびにタンパク質変性剤が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２９】
(実施例)
(実施例1)
パイロコッカス・フリオサスのカルバミン酸キナーゼの生成
Pfu CKの発現のための現在の文献の方法は、イニシエータATGにNcoI部位および終止コドンの下流にBlpI部位を導入するよう設計された合成オリゴヌクレオチドプライマー(5'-GTGGTTTCCATGGGTAAGAGGGTAGTGATTGC-3'(配列番号48)および5'-GCATTCGCTAAGCTGGGTCTTCTAAAGTTCCTCAGG-3'(配列番号49))を用いた酵素のゲノムDNA(cpkA、Y09829.1)のPCR増幅を伴う(Dubecqら、1997)。次に、PCR産物をNcoIおよびBlpI制限酵素で消化し、プラスミドpET-15bの対応する部位に挿入し、組換えPfu CKプラスミド(pCPS184)を大腸菌DH5α細胞に形質転換する。追加的なプラスミド(pSJS1240)も形質転換して、アルギニン(AGAおよびAGG)およびイソロイシン(ATA)のtRNAコドンを発現させる(これらのコドンは、大腸菌において稀に用いられ、Pfu CK遺伝子において高頻度に生じる)。次に、形質転換した大腸菌DH5α細胞を、振盪インキュベーター内で3LのLuria-Bertani培地(0.1mg/mLアンピシリンおよび0.05mg/mLスペクチノマイシンを補充)において37℃で一晩培養し、1mMイソプロピルβ-D-チオガラクトシドによる3時間の誘導後に、遠心分離により細胞を収集する。この発現方法を用いて、およそ10gの細胞を得ることができる(Dubecqら、1997)。
【０１３０】
次に、一連の精製プロセスを用いて、0〜4℃でこれらの細胞からPfu CKを単離する。第一に、50mM Tris-HCl、pH7.5において細胞を懸濁し、超音波処理(音波発振器、250W、10kHz、20分間)により溶解し、遠心分離(80000×g、30分間)する。次に、硫酸アンモニウムを添加して40%飽和とし、溶液を30分間撹拌し、遠心分離(12000×g、20分間)した。次に、硫酸アンモニウム濃度を増加させて80%飽和とし、溶液を30分間再度撹拌して、遠心分離(12000×g、20分間)する。この硫酸アンモニウム分画後に得られるPfu CKペレットを50mM Tris-HCl、pH7.2において懸濁し、同じ緩衝液において透析し、一連のクロマトグラフィー精製においてPfu CKを単離する(DEAE sepharose、Blue Sepharose、DEAE Affi-gel Blue(Bio-Rad))。この発現および精製方法の使用により、50gの細胞は、およそ0.75mgのタンパク質(0.015 mg/g)を生じる(Uriateら、1999)。
【０１３１】
この低タンパク質収量に取り組むため、再設計した酵素発現および精製プロトコールを用いてPfu CKを代わりに得た。第一に、大腸菌発現に対してPfu CKゲノムDNA配列を最適化し、pSJS1240の使用を不要にした。次に、最適化したcpkA遺伝子を、N末端(His)6タグによるその後の発現のためにT7プロモーターベクターpETMCSIIIのNdeIおよびEcoRI制限部位間に挿入し、組換えプラスミドを大腸菌BL21(DE3)に形質転換した。形質転換細胞を、振盪インキュベーター内で100mLのLuria-Bertani培地(0.1mg/mLアンピシリンを補充)において37℃で一晩培養し、遠心分離(4000×g、5分間)により細胞を収集した。およそ1gの細胞を得た。
【０１３２】
Pfu CKの単離を0〜4℃で行った。細胞を、500mM NaClおよび20mMイミダゾールを補充した20mMリン酸ナトリウム、pH7.4において懸濁し、フレンチプレスを用いて溶解した。次に、遠心分離(12000×g、30分間)により細胞デブリを除去し、500mM NaClおよび500mMイミダゾールを補充した20mMリン酸ナトリウム、pH7.4により溶出させて、金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(His GraviTrap(GE Healthcare))により上清からPfu CKを単離した。最初の1g細胞ペレットからおよそ16mgのPfu CKが単離された。これは酵素収量の1,000倍の改善を表す。
【０１３３】
(実施例2)
カルバモイルリン酸の生成
Pfu CKによるATPからADPへの触媒的代謝回転の以前の解析は、ピルビン酸キナーゼおよび乳酸脱水素酵素の連動したアッセイを伴っている(Uriarteら、1999)。ホスホエノールピルビン酸(phophoenolpyruvate)の存在下で、ピルビン酸キナーゼは、ADPをATPに変換し、ピルビン酸を生成し、次にこれは、NADHの酸化により乳酸脱水素酵素により乳酸に変換される。定常状態において、UVモニターによるNADH濃度の減少は、Pfu CK触媒ADP生成の尺度として用いられる。この動態解析は、二次生成物の検出に基づくため、Pfu CK触媒ADP生成をより直接的に測定する代わりのアッセイを設計した。このアッセイは、HPLCモニターによるtRNAシンテターゼ活性のためのBuchan(2009)による設計に基づく。
【０１３４】
Table 2(表2)において概要を述べる溶媒系に従って、水における60mM無水リン酸アンモニウム(ammonium dihydrogen phosphate)および5mM無水リン酸テトラブチルアンモニウム(溶媒A)ならびにメタノールにおける5mMリン酸テトラブチルアンモニウム(溶媒B)の勾配により溶出するAlltech Alltima HP C18カラムを用いて、AMP、ADPおよびATP標準溶液のHPLC分離を達成した。AMP、ADPおよびATP標準の観察された保持時間は、それぞれ7.9分間、17.4分間および25.6分間であった。HPLC解析を早めるため、AMPまたはADPの共溶出なしで27分間解析毎に4注入をモニターできることが決定された(図2を参照)。
【０１３５】
次に、様々な条件において、ATPからADPへの触媒的変換についてのPfu CKの活性をモニターした。0.2M炭酸水素ナトリウムおよび10mM ATPのアッセイ溶液を、2mM、20mMまたは200mMアンモニアを含有するよう作製し、2M NaOHによりpH8.9〜11.4の間となるようpHを調整した。アッセイ温度は40℃に維持した。緩衝アッセイがpH8で行われるように、アッセイ混合物に0.1M Tris-HClを添加し、5M HClを用いてpHを調整した(対照アッセイは、Tris-HClの添加が酵素活性に影響しないことを確認した)。Pfu CK(0.5μM最終濃度)の添加により反応を開始し、水における0.1%ドデシル硫酸ナトリウムにより20μL反応アリコートをクエンチすることにより、4時間にわたりADP濃度をモニターし、続いてTable 2(表2)に概要を述べる通りにHPLC解析を行った。標準較正を用いて反応アリコートにおけるADP濃度を決定し、ADP濃度の変化の速度をバックグラウンドに対し補正した。
【０１３６】
【表２】
2014521309.tif 000005
【０１３７】
2mM、20mMおよび200mMアンモニアの存在下におけるPfu CKのpH-速度プロファイルを図3に示す。最大速度は、全3種のアンモニア濃度でおよそpH9.9において観察される。このpHにおいて、200mMから20mMへのアンモニア濃度の10分の1低下は、ADP生成速度において無視できる効果を有し、どちらの条件も、およそ1.2μmol/min/mg酵素の速度におけるADP生成を可能にする。しかし、2mMへのアンモニア濃度のさらに10分の1低下は、pH9.9において、0.26μmol/min/mg酵素への速度の78%低下をもたらす。これらの結果は、pH9.9において、カルバメートが、≧20mMアンモニアと0.2M炭酸水素ナトリウムの混合後に酵素飽和濃度において化学的に合成できることを示す。これらの結果は、37℃では7.8〜8の間で最大活性が得られ、60℃ではpH7.6付近の値が得られたことを示す(Dubecqら、1997)の結果と対照的である。
【０１３８】
図3から分かる通り、200mMから20mMへのアンモニア濃度の10分の1低下は、pH9.9を下回る場合、酵素活性に負の効果を有する。この結果は、20mMアンモニアが、これらの条件における飽和濃度においてカルバメートを生成する能力がより低いことを示す。これは、酵素に利用できるカルバメートの濃度を限定するアンモニア/アンモニウム比を低下させる、アンモニアのpKa(9.25)を下回るpHにより説明することができる。従って、アンモニア濃度を10倍(200mM)増加させることによるこの比率の増加は、飽和レベルのさらに近くまでカルバメート濃度を増加させる。このような傾向は、2mMアンモニアを用いるとさらに明らかであり、全pHにおける速度の減少は、カルバメート濃度のさらなる低下を示す。
【０１３９】
最適温度条件を調査するさらなる実験も行った。これは、上述の通りpH9.9における20mMアンモニアの存在下でのPfu CKのアッセイの反復を伴ったが、アッセイ温度は、40℃から60℃および80℃へと増加させた。これらの修正温度におけるADPの生成に関するPfu CKの活性を図4に示す。40℃から60℃への温度増加において、ADP生成のおおよそ3倍増加が観察された。しかし、80℃へのさらなる温度増加は同様の増加をもたらさず、ADP生成は、60℃に観察されたものとほぼ同じであった。これらの観察は、60℃〜80℃の間におけるPfu CK酵素活性の最適温度を示唆する。
【０１４０】
要約すると、Pfu CKは、種々の温度において、高pHで、低濃度のアンモニアにより操作することができ、従って、廃水から毒性アンモニアの除去に用いて、カルバモイルリン酸を生成することができる。
【０１４１】
(実施例3)
カルバモイルリン酸生成のさらなる解析
実施例2に示すデータを得た後に、本発明者らは、パラメータの一部を最適化するさらなる解析を行った。用いた手順は、実施例1に記載されている通りのものであるが、細胞デブリは20,000×g、60分間で遠心分離し、酵素収量における1,000倍改善を得た。
【０１４２】
Table 3(表3)に概要を述べる溶媒系に従って、水における60mM無水リン酸アンモニウムおよび5mM無水リン酸テトラブチルアンモニウム(溶媒A)ならびにメタノールにおける5mMリン酸テトラブチルアンモニウム(溶媒B)の勾配により溶出するAlltech Alltima HP C18カラムを用いて、AMP、ADPおよびATP標準溶液のHPLC分離を達成した。AMP、ADPおよびATP標準の観察された保持時間は、それぞれ8分間、17.5分間および25.5分間であった。
【０１４３】
【表３】
2014521309.tif 000006
【０１４４】
次に、様々な条件下で、ATPからADPへの触媒的変換に関するPfu CKの活性をモニターした。0.2M炭酸水素ナトリウムおよび10mM ATPのアッセイ溶液を作製し、20mMまたは200mMアンモニアを含有させ、5M HClまたは2M NaOHにより8.9〜11.4の間にpHを調整した。アッセイ温度を40℃に維持した。Pfu CK(0.5μM最終濃度)の添加により反応を開始し、水における0.1%ドデシル硫酸ナトリウムで20μL反応アリコートをクエンチし、続いてTable 3(表3)に概要を述べる通りにHPLC解析を行うことにより、4時間にわたりADP濃度をモニターした。標準較正を用いて反応アリコートにおけるADP濃度を決定した。
【０１４５】
10〜30分間の代表的な定常状態における、20mMおよび200mMアンモニアの存在下におけるPfu CKのpH-活性プロファイルを図5に示す。最大速度は、およそpH9.9において観察される。より重要なことに、活性は、非常に高いpHにおいて維持され、pH11.4において最大の3分の1〜3分の2へと縮小しただけであった。これは、最大pHを上回ると急激な活性減少を示すことが報告されている中温性カルバミン酸キナーゼ(Jones、1962)と対照的である。これらの結果は、Pfu CKが、9.9(40℃)において最大速度を有することを示すが、一方、この最大は、7.8〜8の間であると以前に報告されている(Dubecqら、1997)。加えて、これは、Pfu CKが、40℃で11.4もの高pHにおいて活性を有することの最初の報告である。より高いアンモニア/アンモニウム比が、高pHにおいて酵素に利用できるカルバメートの濃度を増加させ、これが、高pHにおける驚くべき酵素活性に寄与することが可能である。
【０１４６】
(実施例4)
カルバメート化学種同定(Speciation)
カルバメート濃度が、Pfu CK pHプロファイルに関係するか決定するため、pHに応じたカルバメート濃度をモニターする実験を行った。塩酸または水酸化ナトリウムのいずれかを用いて、pH7.2、8.4、8.9、9.4、9.9、10.4、10.9および11.4のそれぞれとなるよう、水におけるアンモニア(2M)および13C標識炭酸水素ナトリウム(0.2M)の溶液を調整し、D2O同軸性挿入を用いた13C NMR分光法により解析した。pH7.2において、159.5ppmにおいて炭素共鳴を観察した。このピークを、急速に交換する炭酸水素塩/炭酸塩ペアに割り当てた。8.4へのpH増加は、このピークの160.0ppmへのシフトを引き起こし、第2の炭素共鳴は、164.9ppmで現れた。この第2のピークを、アンモニアと炭酸水素塩との反応により生成されたカルバメートに割り当てた(Maniら、2006)。次に、7.2〜11.4のpH間隔の範囲にわたり、これらのピークおよびこれらの相対的な組込みをモニターした。これらの化合物は、1個の炭素原子のみを含有し、NMR解析において非常に類似の緩和時間を表示する可能性が高いため(Maniら、2006)、これらのピークの組込みを、溶液におけるこれらの相対濃度の尺度として用いた。これらの組込みおよび化学的シフトをTable 4(表4)に示す。相対組込みにおける傾向を図6にも示す。
【０１４７】
【表４】
2014521309.tif 000007
【０１４８】
Table 4(表4)に示す通り、pH7.2(159.5ppm)において炭酸水素塩/炭酸塩の交換ペアに割り当てた炭素共鳴は、pHの増加につれて、より高い化学的シフトへと移動した。この効果は、カルバメートに割り当てた炭素共鳴により観察されず、164.9ppmの一定の化学的シフトが全pH値で観察された。炭酸水素塩/炭酸塩およびカルバメートの共鳴の相対組込み(図6)も、炭酸水素塩/炭酸塩と比べた32%存在量のカルバメートにより、カルバメート濃度が、pH9.9において最高であることを示した。この結果は、変動濃度のカルバメート基質が、Pfu CKの活性プロファイルに寄与し得ることを示す。
【０１４９】
(実施例5)
追加的な酵素の選択および解析
Pfu CKのpH-活性プロファイルが、パイロコッカス・フリオサスに特有であるか決定するため、他の生物由来の一連のカルバミン酸キナーゼを解析のために選択し、これらの活性をPfu CKの活性と比較した。本発明者らは、Pfu CKと同様の構造を有する、他の超好熱性生物由来のカルバミン酸キナーゼならびに好熱性および中温性種由来のカルバミン酸キナーゼを検査した。Pfu CKと比べたアミノ酸配列相同性に基づき、カルバミン酸キナーゼ構造を比較した。さらなる解析のために選んだ6種の酵素を、Table 5(表5)に収載する。
【０１５０】
【表５】
2014521309.tif 000008
【０１５１】
サーモコッカス・シビリカス由来のカルバミン酸キナーゼ(TS CK、Table 5(表5))は、配列解析に基づき予測された(Mardanovら、(2009))が、現在まで単離されていなかった。同様に、サーモコッカス・バロフィルス(TB CK、Table 5(表5))の完全ゲノム配列は、2011年3月に報告されたが、TB CKは単離されていなかった(Vannierら、2011)。フェルビドバクテリウム・ノドサムのゲノム配列は2007年に完成した。この研究は、米国エネルギー省科学局(US Department of Energy's Office of Science)、生物学・環境研究プログラム(Biological and Environmental Research Program)およびカリフォルニア大学(University of California)により為された。フェルビドバクテリウム・ノドサム由来のカルバミン酸キナーゼ(FN CK、Table 5(表5))は、単離されていなかった。サーモシフォ・メラネシエンシス由来のカルバミン酸キナーゼ(TM CK、Table 5(表5))は、やはり単離されていなかったが、そのゲノムは2009年に報告された(Zhaxybayevaら、2009)。エンテロコッカス・フェカリス (かつてはフェカリス菌(Streptococcus faecalis)と呼ばれていた)由来のカルバミン酸キナーゼ(EF CK、Table 5(表5))は、1964年より広範に研究されていた(Kalman and Duffield、1964)。クロストリジウム・テタニ由来のカルバミン酸キナーゼ(CT CK、Table 5(表5))は、以前に単離されていなかった。ゲノム配列は2003年に完成した(Bruggemannら、2003)。Table 6(表6)は、検査した異なる酵素間のアミノ酸同一性の概略を提示する。
【０１５２】
【表６】
2014521309.tif 000009
【０１５３】
TB CKを除き、Table 5(表5)に収載されている酵素を、Pfu CKに最適化した上述のプロトコールを用いて発現および精製した。TB CKは、IPTG(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド)を用いた化学的誘導による過剰発現が成功した。IPTG誘導のため、37℃で一晩培養した10mL前培養物を、1L LBA培地に接種した。ODが0.55に達するまで細胞を培養し、次に1mL IPTG(1M、最終1mM)を添加した。IPTGにより誘導された細胞を一晩37℃で培養した。遠心分離5,000rpm、15分間、4℃により細胞を収集した。追加的な全酵素の精製収量をTable 7(表7)に収載する。EF CKの収量は、100mL当たり7mgであり、以前に報告された発現(Marinaら、1998)からおよそ3倍の改善を表す。さらに、用いたプロトコールでは、1日で容易に完了する単一精製ステップを伴うが、以前の報告は、報告された3日間の期間にわたる複数ステップ(2カラムおよび2沈殿を包含)を伴うものである(Marinaら、1998)。
【０１５４】
【表７】
2014521309.tif 000010
【０１５５】
発現および単離後に、CK酵素をHPLC活性アッセイに付した。活性は、10分間のプレインキュベーション後の20分間アッセイに基づいており、適用したいかなる条件下においても活性を持たず、さらなる試験を行わなかった中温性芽胞形成細菌酵素CT CK以外の、全pHプロファイルを図7に示す。活性結果は、Pfu CKに対し高い配列相同性を有する2種の超好熱性酵素(TS CKおよびTB CK、Table 5(表5))が、Pfu CKと同様のpH活性プロファイルを呈したことを示す(図7)。上に記す通り、Pfu CKは、異常に高いpHにおいてその活性を維持している。Pfu CK、TS CKおよびTB CKは、9.4〜9.9の間の最大pH-速度を有し、pH11.4においてこの活性のかなりの割合を保持している。これらの結果に基づき、CK Pfuに対し高い配列相同性を有するカルバミン酸キナーゼは、同様のpH-活性プロファイルを有するであろうことが予想される。
【０１５６】
Pfu CKに対しより低い配列相同性を有する2種のカルバミン酸キナーゼ好熱性(FN CKおよびTM CK)(Table 5(表5)およびTable 6(表6))は、中温菌に報告されたもの(Jones and Lipmann、1960)と同様のpH-活性プロファイルを有し、急激な活性減少が、pH9.4から10.4で観察され(下落が僅かまたは全くないPfu CK、TS CKおよびTB CKと比較)、pH10.9〜11.4において活性を保持しない(図7)。
【０１５７】
上に記述する通り、中温性芽胞形成細菌酵素CT CKは、いかなる条件下においても活性がなかった。他の中温性酵素EF CKは、好熱性FN CKおよびTM CKと同様のpH-活性プロファイルを有し、pH9.5より上で急激に活性減少した(図7)。
【０１５８】
このように、選択された酵素のpH-活性プロファイルは、Pfu CKと比較したそのアミノ酸配列相同性によりカテゴライズすることができる。
【０１５９】
(実施例6)
異なるカルバミン酸キナーゼの温度プロファイル
構造と活性との間の相関をさらに調査するため、温度-活性実験を行った。
【０１６０】
20℃、40℃、60℃および80℃のアッセイ温度を維持しつつ、上述のpH9.9における200mMアンモニアの存在下のアッセイを行った。図8は、指定の温度における、時間に応じた定常状態温度プロファイルを表示する。超好熱性生物由来の、Pfu CKに対し高い配列相同性を有するカルバミン酸キナーゼ(TS CKおよびTB CK、Table 5(表5))は全て、温度と共に増加する活性を有し、4種の指定の温度のうち80℃で最大活性を有した。20℃において、ADPの酵素生成は、ほぼバックグラウンドレベルまで低下する。好熱性由来の、Pfuに対しより低い配列相同性を有するカルバミン酸キナーゼ(FN CKおよびTM CK、Table 5(表5))は、より高い温度において活性がより低い(図8)。FN CKは、40℃において活性が最も高く、TM CKは、40〜60℃において最も高かった。中温菌(EF)由来の活性カルバミン酸キナーゼは、40℃において活性が最も高く(図8)、60℃または80℃において活性をほとんど示さなかった。図8のEF CKプロファイルにおける80℃におけるADP生成は、恐らくバックグラウンドATP加水分解による人為的結果である。
【０１６１】
温度プロファイル概略グラフを図9に示す。80℃において、Pfu CKと共に、Pfu CKに対し高い配列相同性を有するカルバミン酸キナーゼは、5〜9.5μmol/min/mgに及ぶ活性を有するが、他のカルバミン酸キナーゼは、この温度において活性を持たなかった。
【０１６２】
(実施例7)
異なるカルバミン酸キナーゼの安定性
Pfu CKおよび類似の配列相同性酵素TS CKおよびTB CKは、高pHで安定的であり、予想外に機能する。加えて、これらは、安定的で機能し、温度上昇において活性を増加し、貯蔵において機能および構造を保持する可能性が高いことにつながる。これらの尋常でない特徴は、商業的応用のための重要な属性であり、従って本発明者らは、カルバミン酸キナーゼの安定性の評価を開始する。
【０１６３】
Pfu CK、TS CK、TB CK、FN CK、TM CKおよびEF CKに対し、予備的安定性アッセイを行った。40℃60時間のインキュベーション後に、Pfu CK、TS CKおよびTB CKは、その活性を実質的に維持したが、他は不活性であった。さらに、Pfu CKは、1年間4℃の貯蔵後にその活性を保持し、その商業的応用の可能性を実証した。
【０１６４】
(実施例8)
尿素の生成
生合成したカルバモイルリン酸から尿素へのin situ化学変換の実行可能性を決定するため、モデル研究を行って、様々な濃度のアンモニアの存在下でカルバモイルリン酸の反応性を決定した。-78℃におけるカルバモイルリン酸(50mg)および液体アンモニア(10mL)の混合後に、最小の溶解が観察された。液体アンモニアの取り扱いに必要とされた低温は、カルバモイルリン酸溶解性に受け入れられなかったと考えられた。従って、カルバモイルリン酸溶解性を促進するさらなる実験を行った。カルバモイルリン酸(10mg)を、アンモニア水(1mL、14.8M)と混合し、100℃で4時間加熱した。これらの修正条件を用いて、カルバモイルリン酸の溶解が観察された。粗反応生成物の乾燥後に、真正の試料との比較による解析(TLC、1H/13C NMR、HPLC)は、カルバモイルリン酸から尿素への変換が達成されたことを確認した(スペクトル解析のため図10および図11を参照)。10M、5Mおよび2.5Mの減少濃度のアンモニアとカルバモイルリン酸を混合する追加的な実験は、HPLC解析により示す通り、尿素生成において無視できる効果を示した。しかし、2.5Mを下回るアンモニア濃度へと進むと、観察される尿素濃度の明らかな低下をもたらした。
【０１６５】
次に、これらのモデル研究に由来する条件を、生合成したカルバモイルリン酸を尿素に変換する試みにおいて、Pfu CKのアッセイに適用した。0.2M炭酸水素ナトリウム、10mM ATPおよび2Mアンモニア(pH11)の溶液に、Pfu CK(0.5μM最終濃度)を添加し、反応物を100℃で4時間加熱した。次に、溶液を窒素により乾燥させ、1Hおよび13C NMRにより解析した(図12)。これらの解析は、尿素が合成されたことを確認した。
【０１６６】
本願は、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する、2011年6月17日に出願された米国特許出願第61/498,395号明細書に対する優先権を主張するものである。
【０１６７】
当業者であれば、広く記載されている通り本発明の精神または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示す通り、数多くの変種および/または修正が本発明に対して為され得ることが認められよう。従って、本実施形態は、あらゆる点において、限定的ではなく説明的であると考慮するべきである。
【０１６８】
本明細書に記述および/または参照されているあらゆる刊行物は、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する。
【０１６９】
本明細書に包含されている文書、行為、材料、装置、物品その他のいかなる記述も、単に本発明に文脈を提供するためのものである。これらの事項のいずれも、これが本願の各請求の優先日より前に存在したため、先行技術基盤の一部を形成する、あるいは本発明に関連性のある分野における共通の一般知識であることの承認として解釈するべきではない。
【０１７０】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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