(57)【要約】本発明は、免疫およびワクチン開発、特に天然抗原オリゴマーに基づくワクチンの開発の分野に関する。病原体由来または腫瘍由来の表面露出ポリペプチドのオリゴマーもしくはその抗原部分と、調剤的に許容可能な希釈剤または賦形剤とを含み、オリゴマーは粒子状担体に非共有結合的に結合されている免疫組成物が提供される。また、Ａ）Ｎ−またはＣ−末端抗原領域であって、病原性または腫瘍起源の少なくとも１つの表面露出ポリペプチドもしくはその抗原部分を含み、抗原領域は、Ｂ）オリゴマー化領域（ＯＭＤ）に融合され、オリゴマー化領域は、Ｃ）リンカー領域を介して、Ｄ）単一コピーのＬｙｓＭ領域からなり、ポリペプチドをグラム陽性菌から得られた不活化バクテリア様粒子（ＢＬＰ）への非共有結合性連結を仲介することができる、ペプチドグリカン結合領域（ＰＢＤ）に融合されている組み替えポリペプチドが提供される。【選択図】  図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子型免疫組成物であって、
ｉ．粒子状担体としての、グラム陽性菌から得られた不活化バクテリア様粒子（ＢＬＰ）と、
ｉｉ．前記ＢＬＰに非共有結合的に連結された、組み替えにより製造されたポリペプチドのオリゴマーであって、前記組み替えポリペプチドは、
Ａ）Ｎ−またはＣ−末端抗原領域であって、病原性または腫瘍起源の少なくとも１つの表面露出ポリペプチドもしくはその抗原部分を含み、前記抗原領域は、
Ｂ）オリゴマー化領域（ＯＭＤ）に融合され、前記オリゴマー化領域は、
Ｃ）リンカー領域を介して、
Ｄ）前記ポリペプチドの前記ＢＬＰへの前記非共有結合的連結を仲介する単一コピーのＬｙｓＭ領域からなり、前記ポリペプチド全体として単一コピーのＬｙｓＭ領域のみを含有するペプチドグリカン結合領域（ＰＢＤ）に融合された、前記ポリペプチドのオリゴマーと、
ｉｉｉ．調剤的に許容可能な希釈剤または賦形剤と、を含む免疫組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の免疫組成物であって、
前記組み替えポリペプチドの前記抗原領域における前記表面露出ポリペプチドは、エンベロープを有するウイルスのタンパク質の細胞外ドメインを含み、好ましくは、前記ウイルスは、インフルエンザ・ウイルス、動物コロナウイルス、ヒト呼吸器コロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、またはパラミクソウイルスであり、特に呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）またはメタ肺炎ウイルスである免疫組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の免疫組成物であって、
前記表面露出ポリペプチドまたはその抗原部分は、インフルエンザ・ヘムアグルチニン（ＨＡ）細胞外ドメインまたはその一部分、インフルエンザ・ノイラミニダーゼ（ＮＡ）細胞外ドメインまたはその一部分、コロナウイルス・スパイク（Ｓ）タンパク質の細胞外ドメインまたはその一部分、ＲＳＶ糖タンパク質ＦもしくはＧの細胞外ドメインまたはその一部分、およびＨＩＶｇｐ１４０細胞外ドメインまたはその一部分からなる群より選択される免疫組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫組成物であって、
前記組み替えポリペプチドの前記リンカー領域は、１０〜６０個、好ましくは２０〜５０個、より好ましくは２５〜４０個のアミノ、例えば約３０個のアミノ酸からなる免疫組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の免疫組成物であって、
前記リンカー領域は、ＧＡＳＳＡＧＮＴＮＳＧＧＳＴＴＴＩＴＮＮＮＳＧＴＮＳＳＳＴ、ＧＳＡＳＳＴＮＳＧＧＳＮＮＳＡＳＴＴＰＴＴＳＶＴＰＡＫＰＴＳＱと、ＱＳＡＡＡＳＮＰＳＴＧＳＧＳＴＡＴＮＮＳＮＳＴＳＳＮＳＮＡＳとからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫組成物であって、
前記組み替えポリペプチドの前記オリゴマー化領域（ＯＭＤ）は、二量体化、三量体化または四量体化領域であり、好ましくは前記オリゴマー化領域は、ＧＣＮ４−に基づく二−、三−、または四量体化、Ｔ４フィブリチン（フォルドン）の前記Ｃ−末端領域配列またはその機能性部分あるいはその類似体（Ｃ−末端２７〜３０残基）およびニワトリ軟骨基質（ＣＡＲＴ）タンパク質の前記可溶性三量体化領域から選択される免疫組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の免疫組成物であって、
前記組み替えポリペプチドは、さらに、Ｎ−末端抗原領域の場合は、Ｃ−末端キャッピング配列、またはＣ−末端抗原領域の場合は、Ｎ−末端キャッピング配列を含む免疫組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫組成物であって
前記バクテリアは、非病原性バクテリアであり、好ましくは、食品品質等級のバクテリア、より好ましくは、前記バクテリアは、ラクトコッカス、ラクトバチルス、バチルスおよびミコバクテリウム亜種からなる群より選択される免疫組成物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫組成物であって、
前記粒子状担体は、少なくとも第１の病原体に由来する表面露出ポリペプチドまたはその抗原部分を含むポリペプチドの第１のオリゴマーと第２の病原体に由来する表面露出ポリペプチドまたはその抗原部分を含むポリペプチドの第２のオリゴマーとを非共有結合的に設けられている免疫組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の免疫組成物を用意する方法であって、
ａ）請求項１〜７のいずれか一項に記載の組み替えポリペプチドを用意する工程であって、前記ポリペプチドをエンコードする発現ベクターを含む宿主細胞を適切な培地中に培養し、前記ポリペプチドの発現を許容し、かつ前記ポリペプチドを単離することを含む工程と、
ｂ）グラム陽性菌から得られる不活化バクテリア様粒子（ＢＬＰ）を用意する工程と、
ｃ）一種以上の前記ポリペプチドの前記ＢＬＰへの非共有結合を許容して、病原体由来の表面露出ポリペプチドまたはその抗原部分のオリゴマーを含み、粒子状担体に非共有結合的に結合された免疫複合体を形成する工程と、
ｄ）前記免疫複合体を免疫組成物中に処方する工程と、を備える方法。
【請求項１１】
個体において病原体に対する免疫応答を引き起こす方法であって、
前記個体に請求項１〜９のいずれか一項に記載の前記免疫組成物を投与することを含む方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、
個体においてウィルス疾患に対する免疫応答を引き起こすために、好ましくは、前記ウイルス疾患は、インフルエンザ・ウイルス、動物コロナウイルス、ヒト呼吸器コロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、またはパラミクソウイルス、特に、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）またはメタ肺炎ウイルスにより引き起こされる方法。
【請求項１３】
組み替えポリペプチドであって、
Ａ）少なくとも１つの表面露出ポリペプチド（例えば、病原性または腫瘍細胞由来）またはその抗原部分を含むＮ−またはＣ−末端抗原領域であって、前記抗原領域は、
Ｂ）オリゴマー化領域（ＯＭＤ）に融合され、前記オリゴマー化領域は、
Ｃ）リンカー領域を介して、
Ｄ）単一コピーのＬｙｓＭ領域からなり、グラム陽性菌から得られる不活化バクテリア様粒子（ＢＬＰ）である前記ポリペプチドのペプチドグリカン担体粒子への前記非共有結合性連結を仲介することが可能なペプチドグリカン結合領域（ＰＢＤ）に融合され、かつ前記ポリペプチド全体として単一コピーのＬｙｓＭ領域のみを含む、組み替えポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリペプチドをエンコードする核酸配列。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項１６】
請求項１４に記載の核酸配列または請求項１５に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは前記宿主細胞は真核宿主細胞、より好ましく哺乳動物宿主細胞である宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫およびワクチン開発、特に天然抗原オリゴマーに基づくワクチンの開発の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
病原体および腫瘍細胞の表面露出タンパク質の多くは機能性オリゴマーである。病原体の例は、例えば、ビリオン中でホモ三量体として存在するインフルエンザ・ウイルス・ヘムアグルチニン（ＨＡ）およびホモ四量体として存在するノイラミニダーゼ（ＮＡ）である。また、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）糖タンパク質ｇｐ１４０／ｇｐ１２０はその活性形においてはホモ三量体である。同様に、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）糖タンパク質ＧおよびＦは、ビリオン中でそれぞれ四量体および三量体ホモオリゴマーとして存在する。同様に、コロナウイルスのスパイクは、ヒト呼吸器コロナウイルスの場合およびＳＡＲＳコロナウイルスの場合のようにホモ三量体からなる。腫瘍細胞の例は、例えば、受容体チロシン・キナーゼ（ＲＴＫｓ）である。ＲＴＫｓは、多くのポリペプチド成長因子、サイトカインおよびホルモンのための高親和性細胞表面受容体である。成長因子受容体は、上皮性成長因子受容体、維芽胞細胞成長因子受容体および血小板由来の成長因子受容体を含む。ホルモン受容体は、アンドロゲン受容体およびエストロゲン受容体を含む。表皮性成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の例は、４つの構造的に関連するＲＴＫｓからなるＥｒｂＢタンパク質ファミリーである。このＥｒｂＢタンパク質ファミリーの４つのメンバーは、潜在的な成長因子リガンドのサブセットによる活性化の際に、ホモ二量体、ヘテロ二量体、おそらくはより高次のオリゴマーを形成することができる。ＥｒｂＢ−１は、多くの癌において過剰発現される。血小板由来の成長因子受容体（ＰＤＧＦ）ファミリーは、ＰＤＧＦ−Ａ、−Ｂ、−Ｃおよび−Ｄからなり、これらは、ホモ−またはヘテロ二量体（ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢ、−ＢＢ、−ＣＣ、−ＤＤ）のいずれかを形成する。これら４つのＰＤＧＦｓは、それらの単量体形態において不活性である。病原体および腫瘍細胞のかかるオリゴマータンパク質は、しばしば、発病因子（ウイルス、バクテリア、寄生生物）の病原性および抗原性と、癌の進行とに、それぞれ関わっているので、ワクチン開発の重要な対象となっている。
【０００３】
しかしながら、ワクチン調製の際に、例えば製造工程が病原体の不活化を含んでいる場合、これらのオリゴマー構造の統合性、従って抗原性が悪影響を受けることがある。あるいはまた、（組み替え）サブユニット・ワクチンの製造に使用される製造方法によっては、抗原のオリゴマー状態が得られないことがある。いずれの場合も、これにより、タンパク質の凝集または単量体への解離および／またはミスフォールド（異常な折りたたみ）を生じることがある。
【０００４】
オリゴマーの四次構造に埋め込まれているコンフォメーション・エピトープは、抗原性に大いに寄与している可能性がある（ウェルドン等（Ｗｅｌｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５［２０１０］，ｐｉｉ：ｅ１２４６６）。例えば、デュ等（Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９５［２００９］，３３−４４）は、ウサギの免疫付与では、三量体化されたｇｐ１４０構築物がいくつかのＨＩＶ−１偽ウイルスに、三量体化モチーフを欠くｇｐ１４０と比較して、顕著に改善された中和抗体を誘発したという証拠がないことを見出している。一方、グルントナー等（Ｇｒｕｎｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３３１［２００５］，３３−４６）は、ウサギをｇｐ１４０の三量体を用いて免疫付与すると、ｇｐ１２０または切断不全Ｅｎｖを含む固相プロテオリポゾームよりも効力および広さの大きい中和抗体を生じることを示した。また、ウェイ等（Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２［２００８］，６２００−６２０８）は、三量体ウイルス・スパイクが最適のタンパク質抗原として働き、Ｈ５Ｎ１単離物に対する中和抗体を生じさせることを実証した。他の注意としては、ボシュ等（Ｂｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４［２０１０］，１０３６６−１０３７４）は、汎発性ブタ由来の２００９Ａ（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザ・ウイルスの可溶性三量体ＨＡおよび四量体ＮＡの組合せがアジュバントの存在下にフェレットにおける感染に対する保護を提供するという証拠を提出している。
【０００５】
従って、ワクチンにおける天然オリゴマータンパク質抗原の存在は、ワクチンの保護能力にとってきわめて重要であると考えられる。多くの場合、オリゴマー化は、強いオリゴマー化特性を有するサブドメインによって決定される。また、多くの場合、ワクチン抗原のかかるオリゴマー化サブドメインは、膜中に埋め込まれている。ワクチン・サブユニット抗原のオリゴマー化をリピッド環境の不存在下において可能にするために、天然オリゴマー化サブドメインを類似のコンフォメーション誘導特性を持つ異種のコイルドコイル（コイルされたコイル）モチーフにより置換することができる。成功裡に適用されて天然オリゴマータンパク質構造を得るかかるモチーフの例は、ＧＣＮ４転写因子（ＧＣＮ）の３２−アミノ酸形態、バクテリオファージＴ４フィブリチン（Ｔ４Ｆ）のＣ−末端からの２７−アミノ酸三量体化領域およびニワトリ軟骨基質（ＣＡＲＴ）タンパク質の可溶性三量体化領域である（セルバラジャ等（Ｓｅｌｖａｒａｊａｈ  ｅｔ  ａｌ．），ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．２４［２００８］３０１−３１４；ヤング等（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４［２０００］，５７１６−５７２５）；ヤング等（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６［２００２］，４６３４−４６４２）。
【０００６】
したがって、天然オリゴマーサブユニット・ワクチン抗原を製造する技術は入手可能である。それにもかかわらず、可溶性サブユニット・ワクチン抗原は一般に抗原性が弱く、強固な免疫応答を引き起こすためには、アジュバントおよび／または粒子状担体システムを必要とすることが知られている。近接過去において、ワクチンとして使用し得る抗原の抗原性を増強するために、新規な複製しない抗原提示システムの開発に関心が高まって来た。これらのシステムの多くは、抗原を多価の粒子状構造として提示するように設計されている。高く評価されている例のいくつかは、手足口病ウイルス（ＦＭＤＶ）に遺伝子融合されたＢ型肝炎ウイルスのコアおよび表面タンパク質（クラーク等（Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ  ３３０［１９８７］，３８１−３８４）およびＨＩＶ（マイケル等（Ｍｉｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５［１９８８］，７９５７−７９６１；シュリンジャー等（Ｓｃｈｌｉｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６［１９９２］，２５７０−２５７６）抗原；Ｔｙウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）の抗原担体としての開発（アダムス等（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ  ３２９［１９８７］，６８−７０）である。この場合、抗原は、酵母レトロトランスポゾンＴｙのＴＹＡ遺伝子にエンコードされたタンパク質のＣ−末端に遺伝子融合されて、ハイブリッドＴｙ−ＶＬＰｓ、パルボウイルス様粒子を形成する（宮村等（Ｍｉｙａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１［１９９４］，８５０７−８５１１）。これらの技術により、当該抗原が比較的に大きい粒子において多重コピーで提示されることが保証される。
【０００７】
抗原用の他の既知の粒子状担体は、ビロゾームである。ビロゾームは、リピッドとウイルスの少なくとも１つのエンベロープ・タンパク質とからなる複合体であり、イン・ビトロの手順により製造される。リピッドは、卵または植物から精製されるか、または合成により製造される。リピッドの一部分は、エンベロープ・タンパク質を提供するウイルスに由来する。本質的に、ビロゾームは、元のウイルスの遺伝物質を含むヌクレオカプシドを欠く、再構成された空の（中身のない）ウイルス・エンベロープを意味する。ビロゾームは複製することはできないが、純粋な融合活性小胞である。抗原担体として使用される既知のビロゾームは、免疫増強再構成インフルエンザビロゾーム（ＩＲＩＶｓ）と呼ばれるビロゾームを含む。ＩＲＩＶｓは、球状の、平均直径が１５０ｎｍである単層小胞であり、本質的にホスホリピッド、好ましくはホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）からなる二重リピッド膜を備える。ＩＲＩＶｓは、ホスホリピッド二重層膜内に挿入された機能性ウイルスのエンベロープ糖タンパク質ＨＡおよびＮＡを含んでいてもよい。生物活性ＨＡは、構造的安定性と均質性をビロゾーム製剤に与えるだけでなく、ウイルスの融合活性を維持することにより顕著に免疫特性に寄与する。
【０００８】
これらの既知の技術はワクチン製剤の免疫特性を強める粒子状担体を提供することができる。しかし、その方法は、一般に、むしろ面倒であり、かつ専門化した設備と要員を必要とする。加えて、ウイルス物質を担体として使用することは、好ましくは避けられるべきである。さらに、既存の技術のいずれも天然オリゴマーのサブユニット・ワクチンの製造に成功裡に適用されたことは報告されていない。
【０００９】
ペプチドグリカン結合配列に融合してグラム陽性菌に由来する粒子に付着させることにより、抗原を免疫システムに提示することは、当技術において知られている（例えば、ＷＯ０２／１０１０２６参照）。しかし、この粒子状担体技術は、これまでは単量体抗原の提示に関連してのみ記載され、かつ適用されてきたに過ぎない。
【００１０】
ＷＯ９９／２５８３６およびボスマ等（Ｂｏｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．）（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７２［２００６］，８８０−８８９）が教示しているのは、抗原がグラム陽性微生物および／またはペプチドグリカン微粒子（ＢＬＰｓ、従前はＧＥＭｓと呼ばれた）への結合性を得るのを仲介するには１つのＬｙｓＭ領域で十分であるということである。このアプローチは、例えば、ラハ等（Ｒａｈａ  ｅｔ  ａｌ．）（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８［２００５］，７５−８１）およびモエイニ等（Ｍｏｅｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９０［２０１０］，７７−８８）によって追随された。しかしながら、単一のＬｙｓＭ領域のみを介する抗原結合は限定されており（ボスマ等（Ｂｏｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．））、かつそれほど安定していないことはラハ等（Ｒａｈａ  ｅｔ  ａｌ．）（図６）に示される通りである。ラハ等（Ｒａｈａ  ｅｔ  ａｌ．）は、５日間の貯蔵期間後に、当初結合されている抗原の近似的に３０〜４５％が失われることを見出した。その観察と一致して、モエイニ等（Ｍｏｅｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）は、図６に単一のＬｙｓＭ領域により結合された抗原の近似的に４０％が５日間の貯蔵期間後に失われることを示している。
【００１１】
ワクチンを成功裏に製造するには、数ヶ月間または時には数年間もの長期保存が必要である。単一のＬｙｓＭ結合領域を使用すると、結合収率が低くなる（ボスマ等（Ｂｏｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．））だけでなく、結合された抗原の安定性も低くなる（ラハ等（Ｒａｈａ  ｅｔ  ａｌ．）、モエイニ等（Ｍｏｅｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．））。従って、このアプローチは、ＢＬＰに基づくワクチンに対する経済的な生ワクチンの製造方法には不適当である。ＢＬＰに基づくワクチンは、抗原の粒子への最適の装荷、すなわち高い装荷収率と組み合わせて長期間にわたって抗原が安定に結合されたままであることが必要である。
【００１２】
本発明に先だって、抗原の結合の有効性と安定性を改善するために一般に抱かれた見解は、ＬｙｓＭ領域の数を増加することであった。事実、当技術において、単一の構築物中の連続したＬｙｓＭ領域（２〜３領域が一列に、シス状態に／分子内）がもっとも最適かつ安定な結合を提供するということが実証された。ボスマ等（Ｂｏｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．）の図３参照。同図は、第２のＬｙｓＭ領域を追加することにより結合親和性が急激に増加すること、およびそのレベルが３つのＬｙｓＭ領域をシス状態で含む野生型ＡｃｍＡのレベルよりも一層高いことを示している。しかしながら、本発明者等の観察では、オリゴマー抗原を結合する場合、２つ（以上）の連続したＬｙｓＭ領域を単一の構築物中に用いるアプローチは、期待される結果を生じない。その理由は、ＬｙｓＭタンデム・リピートは、機能性オリゴマーだけでなく非機能性モノマーも担体に結合されるような強い結合を仲介するからである。ワクチン中の非機能性モノマーの存在は非常に望ましくない。その理由は、そのような異質の複合体は処方されるワクチンを特徴づけるのを困難かつ面倒にするからである。さらに、ＬｙｓＭタンデム・リピートを含む非機能性モノマーは、上の利用可能な結合部位に対して、機能性オリゴマーと強く競合する。もっとも重要なことは、ワクチン中の非機能性モノマーはワクチン接種被験者に健康上のリスクを負わせる可能性があるということである。その理由は、当技術において知られているように、非機能性の、不適切に折り畳まれた抗原は有害な免疫応答を誘発することがあるからである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者等は、従って、改善された抗原性を有するだけでなく、比較的に容易で経済的に魅力的な方法で製造することができる安定な天然オリゴマーのサブユニット・ワクチンを提供することを目的とした。特に、簡単で信頼性のある方法で、一方、病原体その他の安全でない出発物質を使用せずに（現行の）ワクチンの安全性および有効性を増加させることを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
意外にも、抗原がオリゴマー化領域（ＯＭＤ）と組み合わせた単一のＬｙｓＭ領域のみに融合される場合に、機能性オリゴマーの優先的な結合が得られることが見出された（図２参照）。リンカー配列を介してオリゴマー化領域に融合された単一ＬｙｓＭ領域を組合せると、ワクチン中の不所望の、非機能性の不適切に折り畳まれた抗原の存在を最小限に抑え、それによりクチン安全性を高める。さらに、単一のＬｙｓＭ領域およびＯＭＤを含む抗原から作製されたＢＬＰ結合されたオリゴマーを有するワクチンは、長期間貯蔵時に高い安定性を示した（図５参照）。
【００１５】
理論に束縛されるつもりはないが、ＯＭＤを追加すると、単一のＬｙｓＭ領域の結合特性が、おそらくオリゴマー中の多数の分子の分子間相互作用により強められ、単一の分子中の多数のＬｙｓＭ領域についての分子内相互作用により達成される類似のレベルになるように見える。たぶん、単一のＬｙｓＭ領域を用いる際に、機能性オリゴマー抗原と非機能性モノマーの混合物中で、オリゴマーが優先的にＢＬＰｓに結合する。その理由は、モノマー構造中の単一のＬｙｓＭ領域が弱いＢＬＰ結合特性しか持たないからである。一方、オリゴマー構造中の個々の分子それぞれの単一のＬｙｓＭ領域は（ＯＭＤにより）相互にごく接近して（トランスに）配置されているので、単一の分子中の２つ以上のＬｙｓＭ領域に匹敵する高い結合機能が得られる。したがって、本発明の根底にある予想外の洞察は、サブユニット毎の単一のＬｙｓＭ領域が、ＯＭＤを用いて１つのオリゴマー分子に会合させられると、所望の天然オリゴマー抗原に優先的に結合することが可能となるが、この結合は、ＯＭＤが除外されたり、または２つ以上の（分子内の）ＬｙｓＭ領域が使用された場合は、不可能であるということである。
【００１６】
本発見は、また、オリゴマーとモノマーの混合溶液からの所望の天然オリゴマーの選択的結合を可能にする。その理由は、単一のＬｙｓＭ領域を持つモノマーは非常に弱い結合を示すが、単一のＬｙｓＭ領域を持つオリゴマーは非常に効率的に結合するからである。オリゴマーとモノマーの混合溶液からのオリゴマーのこの選択的結合は、２つ以上のＬｙｓＭ結合領域が用いられると不可能である。その理由は、効率的な結合は、それらの場合、モノマーとオリゴマーの両方に観察されるか、またはモノマーがより効率的に結合しさえするからである。
【００１７】
実例として、オリゴマー性サブユニット抗原をそれらの天然の構造（コンフォメーション）において粒子に結合するために、インフルエンザＨＡおよびＮＡ抗原並びに呼吸器合胞体ウイルスＦ抗原がそれぞれＧＣＮ４領域に、およびリンカーを介してペプチドグリカン結合領域（Ｐｒｏｔａｎ）に融合される（Ｎ−末端からＣ−末端へ：ＨＡ−ＧＣＮ４−ＰｒｏｔａｎおよびＰｒｏｔａｎ−ＧＣＮ４−ＮＡ；Ｆ−ＧＣＮ４−Ｐｒｏｔａｎ）。ヒト胚腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞中に製造されたＨＡ−ＧＣＮ４−Ｐｒｏｔａｎ、Ｆ−ＧＣＮ４−ＰｒｏｔａｎおよびＰｒｏｔａｎ−ＧＣＮ４−ＮＡ融合体は、三量体、三量体および四量体化され、それぞれ前記ペプチドグリカン担体粒子（ＢＬＰｓ）に結合することができた。類似の製造がチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞および昆虫細胞を用いて行われた。粒子上に固定化されたＨＡオリゴマーの機能が、前記粒子を用いて実施された血球凝集反応試験において実証された。前記ＨＡオリゴマーを用いて装荷された前記ＨＡ粒子の抗原性はマウスのモデルにおいて実証された。Ｆオリゴマーを装荷された粒子の抗原性は、マウスのモデルにおいて実証され、有効性はコットンラットのモデルにおいて実証された。
【００１８】
本発明は、従って、組み替えポリペプチドであって、
Ａ）少なくとも１つの表面露出ポリペプチド（例えば、病原性または腫瘍細胞由来）またはその抗原部分を含むＮ−またはＣ−末端抗原領域であって、前記抗原領域は、
Ｂ）オリゴマー化領域（ＯＭＤ）に融合され、前記オリゴマー化領域は、
Ｃ）リンカー領域を介して、
Ｄ）単一コピーのＬｙｓＭ領域からなり、グラム陽性菌から得られる不活化バクテリア様粒子（ＢＬＰ）である前記ポリペプチドのペプチドグリカン担体粒子への前記非共有結合性連結を仲介することが可能なペプチドグリカン結合領域（ＰＢＤ）に融合され、かつ前記ポリペプチド全体として単一コピーのＬｙｓＭ領域のみを含む組み替えポリペプチド、に関する。
【００１９】
特に、本発明は、微粒子型免疫組成物であって、
ｉ．粒子状担体としての、グラム陽性菌から得られた不活化バクテリア様粒子（ＢＬＰ）と、
ｉｉ．前記ＢＬＰに非共有結合的に連結された、組み替えにより製造されたポリペプチドのオリゴマーであって、前記組み替えポリペプチドは、
Ａ）Ｎ−またはＣ−末端抗原領域であって、病原性または腫瘍起源の少なくとも１つの表面露出ポリペプチドもしくはその抗原部分を含み、前記抗原領域は、
Ｂ）オリゴマー化領域（ＯＭＤ）に融合され、前記オリゴマー化領域は、
Ｃ）リンカー領域を介して、
Ｄ）前記ポリペプチドの前記ＢＬＰへの前記非共有結合的連結を仲介する単一コピーのＬｙｓＭ領域からなり、前記ポリペプチド全体として単一コピーのＬｙｓＭ領域のみを含有するペプチドグリカン結合領域（ＰＢＤ）に融合された、前記ポリペプチドのオリゴマーと、
ｉｉｉ．調剤的に許容可能な希釈剤または賦形剤とを含む疫組成物、を提供する。
【００２０】
本発明の概念は、このように、下記の予想外の発見、すなわち、オリゴマー融合タンパク質の担体粒子への効率的かつ選択的結合のためには、オリゴマー化領域と組み合わせて、天然の状態では多重コピーの結合領域を含む反復構造の一部分である、単一のコピーのみの結合領域を使用することが有利であることに依存している。例えば、ビロゾーム、リポゾームまたは糖ポリマーに基づく粒子といった、他の担体存在物の粒子であって類似の結合相手（例えば、かかる粒子を分解する酵素に由来する）を有するものに結合するために、オリゴマー構築物において非反復結合領域を含む融合タンパク質を設計することができる。その中から単一のコピーが取り出されてオリゴマー化領域と組み合わせて使用されて担体存在物に結合される他の反復結合領域の例は、下記を含む。
−コリンを含む担体に結合するための、例えば、肺炎球菌酵素ＬｙｔＡ（例えば、Ｐｆａｍ  ＰＦ０１４７３）といったオートリシンからのコリン結合領域。
−グルコース含有ポリマーからなる粒子に結合するための、例えば、グルカンスクラーゼ（例えばＰｆａｍ  ＰＦ０８３６３）といった腔連鎖球菌からのグリコシルトランスフェラーゼグルカン結合領域。
−ホスファチジル・イノシトール−リピッド結合領域、例えばプレクストリン（Ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ）相同（ＰＨ）ドメイン（Ｐｆａｍ  ＰＦ００１６９）。
【００２１】
抗原領域
【００２２】
「表面露出ポリペプチドまたはその抗原部分」という表現はその天然状態において、例えば、病原体の一部分として、または腫瘍細胞上に表面露出されていることが見出されているアミノ酸の任意のストレッチであって、保護的免疫応答を実装することができるものを指すものとする。本発明において、病原体または腫瘍由来の既知のまたは未発見の抗原配列が使用されてもよい。表面露出病原性ポリペプチドは、例えば、ウイルス、バクテリアまたは寄生生物由来である。好適な一実施形態において、表面露出病原性ポリペプチドはウイルスのタンパク質である。例えば、病原体由来の表面露出ポリペプチドは、エンベロープを有するウイルスのタンパク質の細胞外ドメインまたはその抗原部分を含む。例示の、エンベロープを有するウイルスは、インフルエンザ・ウイルス、コロナウイルス、ヒト呼吸器コロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、メタ肺炎ウイルス、パラミクソウイルス、特に、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を含む。特定の態様において、表面露出ポリペプチドまたはその抗原部分は、インフルエンザ・ヘムアグルチニン細胞外ドメインまたはその一部分、インフルエンザ・ノイラミニダーゼ細胞外ドメインまたはその一部分、コロナウイルス・スパイク（Ｓ）タンパク質細胞外ドメインまたはその一部分、ＲＳＶ糖タンパク質Ｆ細胞外ドメインまたはその一部分、ＨＩＶｇｐ１４０またはその一部分、およびＲＳＶ糖タンパク質Ｇ細胞外ドメインまたはその一部分からなる群より選択される。
【００２３】
例示の腫瘍細胞からの抗原は、チロシン・キナーゼ受容体（ＲＴＫｓ）を含む。ＲＴＫｓは、多くのポリペプチド成長因子、サイトカインおよびホルモン用の高親和性の細胞表面受容体である。成長因子受容体は、表皮性成長因子受容体、維芽胞細胞成長因子受容体、および血小板由来の成長因子受容体を含む。ホルモン受容体は、アンドロゲン受容体およびエストロゲン受容体を含む。表皮性成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の例は、４つの構造的に関連するＲＴＫｓのＥｒｂＢタンパク質ファミリーである。ＥｒｂＢタンパク質ファミリーのこの４つのメンバーは、潜在的な成長因子リガンドのサブセットによる活性化の際に、ホモ二量体と、ヘテロ二量体と、おそらく、より高次のオリゴマーを形成することができる。ＥｒｂＢ−１は、多くの癌において過剰発現される。血小板由来の成長因子受容体（ＰＤＧＦ）ファミリーは、ＰＤＧＦ−Ａ、−Ｂ、−Ｃおよび−Ｄからなり、ホモ−またはヘテロ二量体を形成する（ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢ、−ＢＢ、−ＣＣ、−ＤＤ）。４つのＰＤＧＦｓは、それらの単量体形態においては不活性である。
【００２４】
ペプチドグリカン結合領域
【００２５】
本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのペプチドグリカンへの結合を仲介する、単一のコピーのみのＬｙｓＭ（リジン（Ｌｙｓｉｎ）モチーフ）領域の存在によって特徴づけられる。ＬｙｓＭ領域は、当技術において「ＬｙｓＭリピート」とも呼ばれているが、約４５残基の長さである。ＬｙｓＭ領域は、バクテリア細胞壁の分解に関与しているさまざまな酵素中に見出される（ジョリス等（Ｊｏｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．），ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７０［１９９２］，２５７−２６４；アンドレ等（Ａｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．［２００８］，７０７９−７０８６）。このＬｙｓＭ領域は、一般的なペプチドグリカン結合機能を有していると推定される。この領域の構造は既知である（「大腸菌膜に結合された溶解性ムレイン・トランスグリコシラーゼのＤ（ＭｌｔＤ）からのＬｙｓＭ領域の構造」（‘Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ＬｙｓＭ  ｄｏｍａｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ｌｙｔｉｃ  ｍｕｒｅｉｎ  ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ  Ｄ（ＭｌｔＤ）’）ベイトマンおよびバイクロフト（Ｂａｔｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｂｙｃｒｏｆｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９９［２０００］，１１１３−１１１９））。ＬｙｓＭ領域の存在は、バクテリアのタンパク質に限定される。ＬｙｓＭ領域は、また、多数の真核タンパク質中に存在するが、古細菌のタンパク質中には欠けている。細胞壁結合機能がＬｙｓＭ領域を含む多数のタンパク質の前提条件とされている。エンテロコッカス・ヒラエ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ）の部分的に精製されたムラミダーゼ−２、すなわち、ＡｃｍＡに類似し６つのＬｙｓＭ領域を含むタンパク質は同じ菌株のペプチドグリカン断片に結合する。リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のｐ６０タンパク質は、２つのＬｙｓＭ領域を含有し、細胞表面に関連していることが示された。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ムロペプチダーゼＬｙｔＥおよびＬｙｔＦは、それぞれ３つおよび５つのリピートをそれらのＮ−末端に有し、いずれも細胞壁−結合された。
【００２６】
重要なのは、従前の研究、例えば、本出願人によるＷＯ９９／２５８３６とボスマ等（Ｂｏｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．）（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７２［２００６］，８８０−８８９）では、単一のＬｙｓＭ領域はＢＬＰｓへの結合が非常に弱いことと、ＬｙｓＭ領域の数を増加すると、ＢＬＰｓへの結合が増進されることとが示されていることである。これは、大部分の天然に存在するペプチドグリカン結合タンパク質はＬｙｓＭ領域の多重（例えば２−６個）タンデム・リピートを含むことと一致している。対照的に、本発明において次のことが見出された。すなわち、天然オリゴマー・タンパク質抗原の粒子状担体への結合は、単一のＬｙｓＭ領域がオリゴマー化領域（ＯＭＤ）と組み合わせて使用されさえすれば、もっとも効率的に行われる。ただし、この場合、リンカー配列がＯＭＤとＬｙｓＭ領域との間に存在することが必要である。
【００２７】
当業者は、当技術において知られている方法を用いる公的に利用できるタンパク質配列データベースにおいて、相同性に基づく検索を行うことによりＬｙｓＭ領域のアミノ酸配列を同定することができる（ビュイスト等（Ｂｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．），Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８［２００８］，８３８−８４７；Ｖｉｓｗｅｓｗａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９２［２０１１］，９２１−９２８）。ＰＦＡＭウエブサイトは、配列ファミリーの一致の統計的記述を用いる精度の高いデータベース検索を行うのに使用できる２つのプロファイル隠れマルコフ（Ｍａｒｋｏｖ）モデル（プロファイルＨＭＭｓ）を提供する。ＨＭＭＥＲは、タンパク質の配列分析用のプロファイルＨＭＭソフトウエアの自由に配布可能な実装である。本明細書において使用される用語「ＬｙｓＭ領域」は、一般に、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、もっとも好ましくは、少なくとも７０％の、ＬｙｓＭ領域に対するＰＦＡＭ受託番号ＰＦ０１４７６に従う配列への配列類似度を示すアミノ酸配列を指す（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／Ｐｆａｍ／ｇｅｔａｃｃ？ＰＦ０１４７６参照）。
【００２８】
当技術において、ＬｙｓＭ領域が必要とされるペプチドグリカン結合能力を有するか否か当業者が決定することを可能にする多数の結合試験が記載されている。また、以下に記載されているように、宿主細胞は、評価されるべき構築物を用いて物形質転換可能である。その後、宿主細胞は、関心のある組み替えポリペプチドを発現し、培養上清中に分泌することが許容される。分泌されたタンパク質は、次いで、よく確立された酸処理手順により調製された、グラム陽性菌から得られたペプチドグリカン粒子（バクテリア様粒子またはＢＬＰ）への選択的結合を試験される。例えば、０．１５ｍｇＢＬＰｓ（乾燥重量）が、不要物を除去された哺乳動物宿主細胞発現培養上清の過剰量と接触させられ、３０分間、室温にて穏やかに混合しながらインキュベーションされる。結合されたタンパク質を有するＢＬＰｓは、次いで、低速遠心分離により捕集される。このペレットは、ＢＬＰｓに結合されたポリペプチドについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、適切な抗血清を用いたウエスタン・ブロッティングとにより分析される。ＢＬＰに結合されたタンパク質の量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて、例えば、精製ＢＳＡを基準タンパク質として用いるクマシー・ブルー染色を行うことにより決定および定量することができる。
【００２９】
もう一つの例として、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）の表面への結合挙動を検定できる（緑色）蛍光タンパク質を持つ融合物を調製することができる。例えばＨｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８［２０１０］，２４１０−２４１８参照。
【００３０】
一実施形態において、本発明のポリペプチドは、単一のコピーのみのＬｙｓＭ領域を含み、このＬｙｓＭ領域は、エル．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）の主要なオートリシンＡｃｍＡのＣ−末端領域に見出され、非相同配列により分離された３つの相同ＬｙｓＭ領域を含む（Ｐｒｏｔａｎ）。ＡｃｍＡのＣ−末端領域は、オートリシンのペプチドグリカン結合を仲介することが示された（ビュイスト等（Ｂｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７［１９９５］，１５５４−１５６３））。３つのＡｃｍＡ  ＬｙｓＭ領域のアミノ酸配列については、例えば、ＷＯ９９／２５８３６の図２を参照されたい（同公報中においては、３つのＬｙｓＭ領域がＲ１，Ｒ２およびＲ３により示されている）。同公報の内容は参照により本明細書中に引用される。
【００３１】
ＡｃｍＡ  ＬｙｓＭ領域の正確なアミノ酸配列の内の変異も、ペプチドグリカン結合機能が維持される限り、含まれる。従って、アミノ酸の置換、欠失および／または挿入は、ペプチドグリカン結合能力を失うことなく実施することができる。ＡｃｍＡ  ＬｙｓＭ領域のある部分は、例えば、大部分のＬｙｓＭ領域において見出される保存ＧＤＴＬ、ＮおよびＧＱモチーフのように、それほど好適でなく変異されている。他のものは、しかしながら、ＬｙｓＭ領域が担体を結合する効能力に影響することなく変更されることができる。例えば、ＡｃｍＡの３つのＬｙｓＭ領域の内の性質（極性、非極性、親水性、疎水性）の非常に異なる位置におけるアミノ酸残基を修飾することができる。好ましくは、本発明のポリペプチドは、エル．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＡｃｍＡの３つのＬｙｓＭ領域の内の１つに対して少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、例えば、９２％、９５％、９７％または９９％同一である配列を含む。
【００３２】
ポリペプチドについて、７０、８０、９０、９５、９８、９９または１００％配列同一性といった「アミノ酸配列同一性の百分率」は、最適に位置合わせされた２つの配列を比較窓にわたって比較することにより決定されることができる。この場合、ポリペプチド配列の、比較窓内にある部分は、２つのアミノ酸配列の最適の位置合わせのための基準配列（これは追加または欠失を含まない）と比較して、追加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてもよい。この百分率の計算は、（ａ）同一のアミノ酸が両配列中に出現する位置の数を決定して一致した位置の数を得、（ｂ）この一致した位置の数を、比較窓内の位置の総数により除算し、かつ（ｃ）結果に１００を乗算して配列同一性の百分率を得ることにより行われる。比較のための配列の最高の位置合わせが、コンピュータに既知のアルゴリズムを実装することによりまたは視認により行うことができる。容易に入手できる配列比較アルゴリズムおよび多重配列位置合わせアルゴリズムは、それぞれ、基礎局所位置合わせ検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（ＢＬＡＳＴ）（アルチュル等（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５［１９９０］，４０３；アルチュル等（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５［１９９７］，３３８９−３４０２）とＣｌｕｓｔａｌＷプログラムであり、両プログラムともインターネット上で入手できる。
【００３３】
もう一つの例として、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）バクテリオファージ・エンドリシンからのＬｙｓＭ領域の配列（ヒュ等（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．），Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７６［２０１０］，２４１０−２４１８）またはこれに少なくとも７０％の配列同一性を示す配列が本発明において使用される。
【００３４】
オリゴマー化領域
【００３５】
上述のように、本発明のポリペプチドは、オリゴマー化領域（ＯＭＤ）と単一のＬｙｓＭ領域との存在によって特徴づけられる。ＯＭＤは、例えば、二量体化、三量体化または四量体化領域である。かかる領域は、当技術において既知である（オウシー等（Ｏ’Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３［１９８９］，５３４−５４２；ハーベリ等（Ｈａｒｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２［１９９３］，１４０１−１４０７）。例えば、オリゴマー化領域は、ＧＣＮ４−に基づく二量体化、三量体化または四量体化領域である。酵母転写活性化因子ＧＣＮ４のロイシン・ジッパー領域は、アミノ酸配列ＭＫＱＬＥＤＫＶＥＥＬＬＳＫＮＹＨＬＥＮＥＶＡＲＬＫＫＬＶＧＥＲを持つＧＣＮ４−ｐ１二量体化領域を含む。ＧＣＮ４−に基づく三量体化領域（ＧＣＮ４−ｐＩＩ）は、好ましくは、アミノ酸配列ＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫＫＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫを含む。
【００３６】
本明細書において使用される「四量体化領域」という用語は、４つの単量体タンパク質またはそれらの一部分からの四量体の形成を仲介する領域として定義される。好適な四量体化領域は、限定されないが、センダイ・ウイルスのリンタンパク質四量体化領域と、酵母ＧＣＮ４二量体化領域から突然変異により得られた四量体化領域（ＧＣＮ４−ｐＬＩ）とを含む。好適な一実施形態において、組み替えインフルエンザ・ノイラミニダーゼ細胞外ドメインまたはその一部分の四量体化がＧＣＮ４−に基づく四量体化領域により提供される。ＧＣＮ４−に基づく四量体化領域は、好ましくは、アミノ酸配列ＭＫＱＩＥＤＫＬＥＥＩＬＳＫＬＹＨＩＥＮＥＬＡＲＩＫＫＬＬＧＥを含む。
【００３７】
本発明において使用するための他の有用なオリゴマー化領域は、バクテリオファージＴ４フィブリチン（フォルドン）またはその機能性の一部分もしくはその類似体のＣ−末端領域配列、特に、フォルドンのＣ−末端２７〜３０残基（グーテ等（Ｇｕｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３７［２００４］，９０５−９１５）およびニワトリ軟骨基質（ＣＡＲＴ）タンパク質の可溶性三量体化領域を含む。ニワトリ軟骨基質タンパク質のＣ−末端オリゴマー化領域は、３つの同一の４３−残基からなる三量体コイルドコイルである（セルバラジャ等（Ｓｅｌｖａｒａｊａｈ  ｅｔ  ａｌ．），ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，２４［２００８］，３０１−３１４）。
【００３８】
本発明において使用されるオリゴマー化領域は、さらに、抗原領域とコイルドコイル・モチーフとの間において二重システイン・モチーフを含み、オリゴマータンパク質をさらに安定化している（ルイス等（Ｌｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８［２００３］，２０２７８−２０２８６；マグロ等（Ｍａｇｒｏ  ｅｔ  ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０９［２０１２］，３０８９−３０９４）。
【００３９】
リンカー領域
【００４０】
以下に説明する実施例は、ＯＭＤおよび／またはＬｙｓＭ領域の最適の機能のためのリンカー領域の重要性を説明する。従って、ＯＭＤとＬｙｓＭとは、好ましくは１０〜６０個、好ましくは２０〜５０個、より好ましくは２５〜４０個のアミノ酸残基からなるリンカー領域により分離されている。ＯＭＤをＬｙｓＭ領域に直接融合すると、不都合な結果が生じた。非常に良い結果が得られたのは、約３０個（例えば、２８〜３２個）のアミノ酸の長さのリンカー領域を用いた場合である。詳細については実施例２を参照されたい。
【００４１】
一態様において、リンカー領域は、エル．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＡｃｍＡのＣ−末端のＬｙｓＭリピート同士の間に見出されるリンカー配列を含む。例えば、Ｌ１：ＧＡＳＳＡＧＮＴＮＳＧＧＳＴＴＴＩＴＮＮＮＳＧＴＮＳＳＳＴ（２９個のアミノ酸）、Ｌ２：ＧＳＡＳＳＴＮＳＧＧＳＮＮＳＡＳＴＴＰＴＴＳＶＴＰＡＫＰＴＳＱ（３１個のアミノ酸）、またはＬ３：ＱＳＡＡＡＳＮＰＳＴＧＳＧＳＴＡＴＮＮＳＮＳＴＳＳＮＳＮＡＳ（３０個のアミノ酸）である。好適な一実施形態において、リンカー領域は、ＧＡＳＳＡＧＮＴＮＳＧＧＳＴＴＴＩＴＮＮＮＳＧＴＮＳＳＳＴ、ＧＳＡＳＳＴＮＳＧＧＳＮＮＳＡＳＴＴＰＴＴＳＶＴＰＡＫＰＴＳＱ、またはＱＳＡＡＡＳＮＰＳＴＧＳＧＳＴＡＴＮＮＳＮＳＴＳＳＮＳＮＡＳからなる。他の正しい長さ（すなわち、約１０〜６０個のアミノ酸残基）のリンカー領域配列も使用することができる。当業者は、以下に示される実施例と一般的な知識とに基づいて、所与のリンカー配列を製造しその適合性を検定（評価）することができる。
【００４２】
さらに、本発明のポリペプチドの産生は、末端「キャッピング領域」の存在により増進できることが見出された。例えば、Ｎ−末端からＣ−末端へ、ＯＭＤとリンカー配列とを介して単一のＬｙｓＭ領域に融合されたＨＡからなる構築物の発現が、Ｃ−末端キャッピング領域を追加すると増強される（図２Ａ参照）。従って、本発明のポリペプチドは、さらに、Ｎ−末端抗原領域の場合は、Ｃ−末端キャッピング領域を、またはＣ−末端抗原領域の場合は、Ｎ−末端キャッピング領域を含んでいてもよい。キャッピング領域は長さが変化してもよい。例えば、約１０個〜約６０個のアミノ酸残基、好ましくは２０〜５０個のアミノ酸残基、さらに好ましくは２５〜４０個のアミノ酸残基の長さであってもよい。非常に良い結果が得られたのは、ＯＭＤをＬｙｓＭ領域に結合するリンカー領域と同一の配列を有するキャッピング領域を用いた場合である。換言すれば、本発明のポリペプチドにおける単一のコピーのＬｙｓＭ領域は、同一のまたは少なくとも高い（＞９０％）類似度のアミノ酸配列が両側面に配置されていると有利である。従って、特定の一実施形態において、キャッピング領域、および、好ましくはリンカー領域も、ＧＡＳＳＡＧＮＴＮＳＧＧＳＴＴＴＩＴＮＮＮＳＧＴＮＳＳＳＴ、ＳＡＳＳＴＮＳＧＧＳＮＮＳＡＳＴＴＰＴＴＳＶＴＰＡＫＰＴＳＱおよびＱＳＡＡＡＳＮＰＳＴＧＳＧＳＴＡＴＮＮＳＮＳＴＳＳＮＳＮＡＳからなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。
【００４３】
ポリペプチド内のさまざまな領域の相対的な向きは、リンカー領域配列が常にＯＭＤとＬｙｓＭ領域との間に配置されている限り、変化可能である。好適なリンカー領域は上述の通りである。
【００４４】
一実施形態において、ＬｙｓＭ領域は、病原体由来のポリペプチドまたはその抗原部分からＣ−末端側に配置される。例えば、この構造は、インフルエンザ・ウイルスＨＡ、ＨＩＶ  ｇｐ１４０、コロナウイルスＳ  ｅｎ  ＲＳＶ  Ｆといった１型膜タンパク質を含む物質に特に好適である。もう一つの実施形態において、ＬｙｓＭ領域は、病原体由来ポリペプチドまたはその抗原部分からＮ−末端側に配置される。後者の向きは、インフルエンザ・ウイルスＮＡおよびＲＳＶ  Ｇのような２型膜タンパク質にとって好ましい。このポリペプチドは、さらに、組み替え体の発現および／または真核宿主細胞による組み替え体の分泌を容易にする１つ以上の配列を含んでいてもよい。有利な配列は、Ｎ−末端シグナル配列を含む。「シグナル配列」は、本明細書において、タンパク質またはその一部分の輸送を真核細胞の小胞体−分泌経路の入口部位に向けるシグナル・ペプチドとして定義される。シグナル配列は、タンパク質またはその一部分のＮ−末端側に配置することができる。シグナル・ペプチドは、タンパク質を小胞体中に挿入した後に開裂されることができる。例えば、一実施形態において、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞における組み替えタンパク質の発現のためのｐＭＴ／ＢｉＰベクターは、ＢｉＰシグナル配列を含む。もう一つの実施形態において、哺乳動物細胞における組み替えタンパク質の発現のためのｐＣＤ５ベクターは、シグナル配列ＭＰＭＧＳＬＱＰＬＡＴＬＹＬＬＧＭＬＶＡ、例えば、ＣＤ５糖タンパク質のシグナル・ペプチド配列を含む。さらに、別の一実施形態において、天然ではタンパク質に先行するシグナル配列は、前駆体ポリペプチドを分泌経路に向けるのに使用される。
【００４５】
上述のように、製造された本発明の組み替えポリペプチドは微粒子型の免疫組成物の製造に好適に使用される。本発明のさらなる態様は、従って、微粒子型の免疫組成物に関し、該微粒子型の免疫組成物は、粒子状担体として、グラム陽性菌（ＧＥＭ粒子またはバクテリア様粒子（ＢＬＰ））から得られた不活化された球状のペプチドグリカン粒子であって、組み替えにより製造されたポリペプチドのオリゴマーは、前記ＢＬＰに非共有結合的に連結され、各ポリペプチドは上述のように定義されるペプチドグリカン粒子と、調剤的に許容可能な希釈剤または賦形剤とを含む。
【００４６】
ＢＬＰｓは、不活化され、無傷の表面タンパク質と細胞内容物とを除かれており、無傷の細胞を前記細胞壁物質由来のタンパク質、（リポ）テイコ酸または炭水化物といった細胞壁成分を除去することができる溶液を用いて、機械的破砕をすることなく、厚いペプチドグリカン細胞壁が無傷のまま残るように処理することにより、得られる。得られた本質的に球状のペプチドグリカン微粒子は、グラム陽性菌の大きさと形状を反映している。好ましくは、バクテリアは、非病原性バクテリア、より好ましくは食品品質等級のバクテリアである。バクテリアは、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびミコバクテリウム亜種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｓｐ．）からなる群より選択することができる。
【００４７】
さまざまな実施形態が構想される。例えば、粒子状担体は、少なくとも、第１の病原体に由来する表面露出ポリペプチドまたはその抗原部分を含むポリペプチドの第１のオリゴマーと、例えば同じ病原体由来の、または第２のはっきりと異なる病原体由来の表面露出ポリペプチドまたはその抗原部分を含むポリペプチドの第２のオリゴマーを非共有結合的に設けられていてもよい。このはっきりと異なるオリゴマーは、例えば、異なるＨＡ血清型、ＨＡおよびＮＡ、ＨＡおよびＳ、および／またはＲＳＶ  Ｆを含む。ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはその少なくとも１０個のアミノ酸残基を有する免疫活性断片は、ＲＳＶに対する保護的抗体反応を仲介するという観点から好ましいものである。Ｆタンパク質は、ＲＳＶの主要な株（サブグループＡおよびサブグループＢ）の双方にわたって保存度が高い。Ｆタンパク質は、非融合型６７ｋＤａ前駆体（Ｆ０）として合成され、フーリンによりタンパク質分解による開裂を受けて、ジスルフィドで結合された２つのポリペプチドＦ１およびＦ２を生成する。Ｆタンパク質は、Ｆ１ポリペプチドのＮ−末端を介して細胞膜内に入り、一方、膜貫通セグメントは、Ｃ−末端の近くに配置される。これら２つの領域に隣接して、ＨＲ−ＣおよびＨＲ−Ｎと表示される２つの７個組（ｈｅｐｔａｄ）リピート配列があり、これらはヘアピン様構造の安定な三量体を形成し、これらのヘアピン様構造はコンフォメーション変化を受けてウイルスおよび細胞の膜がウイルスの進入前に並べられるのを可能にする。好適な一実施形態において、Ｆ細胞外ドメインは、２つの突然変異により変化した開裂部位を含み、開裂されなかったポリペプチドが前融合（ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ）構造（コンフォメーション）にロックされる。
【００４８】
好適な一実施形態において、微粒子型免疫組成物が提供される。この微粒子型免疫組成物は、インフルエンザ・ウイルスまたはその抗原部分由来の表面露出ポリペプチドのオリゴマーであって、粒子状担体に非共有結合的に結合されたオリゴマーと、調剤的に許容可能な希釈剤または賦形剤とを含む。本発明による免疫組成物は、例えば、１つの組み替え三量体インフルエンザ・ヘムアグルチニン細胞外ドメインまたはその一部分、あるいは１つの組み替え四量体インフルエンザ・ノイラミニダーゼ細胞外ドメインまたはその一部分を含む。かかる免疫組成物は、個体に、インフルエンザ・ウイルス亜型または株、あるいは１つより多い関連したインフルエンザ・ウイルス亜型または株に対する免疫応答を引き起こすのに特に好適である。ある実施形態においては、しかしながら、本発明による免疫組成物は、１つ以上の三量体ヘムアグルチニン細胞外ドメインまたはその一部分、および／または１つ以上の四量体ノイラミニダーゼ細胞外ドメインまたはその一部分の組合せを含む。
【００４９】
従って、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の三量体ヘムアグルチニン細胞外ドメインまたはその一部分をＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５および／またはＨ１６のように組み合わせることができる。あるいは２、３、４、５、６、７、８または９個の四量体ノイラミニダーゼ細胞外ドメインまたはその一部分をＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８および／またはＮ９のように組み合わることができる。加えて、本発明による免疫組成物は、異なるインフルエンザ亜型の、１つ以上の三量体ヘムアグルチニン細胞外ドメインまたはその一部分と、１つ以上の四量体ノイラミニダーゼ細胞外ドメインまたはその一部分との組合せを含んでいてもよい。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の三量体ヘムアグルチニン細胞外ドメインまたはその一部分と、１、２、３、４、５、６、７、８または９個の四量体ノイラミニダーゼ細胞外ドメインまたはその一部分とを、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８および／またはＮ９のように組み合わせることができる。当業者には明らかなように、「１つ以上の細胞外ドメイン」という用語は、例えば、インフルエンザＡウイルスおよびインフルエンザＢウイルスといった、１つ以上のインフルエンザ・ウイルス亜型に由来する、１つ以上の細胞外ドメインを包含する。従って、本発明による微粒子型免疫組成物は、１つの組み替え三量体インフルエンザ・ヘムアグルチニン細胞外ドメインまたはその一部分、あるいは、１つの組み替え四量体インフルエンザ・ノイラミニダーゼ細胞外ドメインまたはその一部分を含む免疫組成物と比較して、インフルエンザ・ウイルス感染に対する改善された保護が達成される多価組成物であってもよい。追加的にまたは代替的に、多価組成物を用いると、１つより多いインフルエンザ・ウイルス型またはインフルエンザ・ウイルス亜型もしくは株に対するより広汎な保護が達成される。さらに、本発明による免疫組成物は、従来の不活化または弱毒性インフルエンザ・ウイルス・ワクチンよりも抗原変化に対する感受性を低くすることができる。
【００５０】
本発明のさらなる一実施形態は、微粒子型免疫組成物を用意する方法に関する。この方法は、（ａ）本発明による組み替えポリペプチドを用意する工程と、（ｂ）グラム陽性菌（ＢＬＰ）から得られる不活化球状ペプチドグリカン粒子を用意する工程と、（ｃ）前記ポリペプチドのＢＬＰへの前記非共有結合性結合を許容して、病原体または腫瘍由来の表面露出ポリペプチドもしくはその抗原部分を含むポリペプチドのオリゴマーを含み、粒子状担体に非共有結合的に結合された免疫複合体を形成する工程と、（ｄ）前記免疫複合体を免疫組成物中に処方する工程とを備える。
【００５１】
工程（ｂ）については、ペプチドグリカン微粒子（ＢＬＰｓ）を用意する手段および方法は当技術において既知である。例えば、ＷＯ０２／１０１０２６およびＵＳ６，８９６，８８７を参照されたい。これらの公報明細書が開示している、グラム陽性菌の細胞壁物質を取得する方法は、タンパク質、（リポ）テイコ酸または炭水化物といった細胞壁成分を前記細胞壁物質から除去することが可能な溶液を用いて前記細胞壁物質を処理する方法であって、前記細胞壁物質は、本質的に球状のペプチドグリカン微粒子を含む。このようにして得られる粒子は、組み替えにより製造された１種以上のポリペプチドを含む調製物（例えば、細胞培養上清または精製されたポリペプチド）と単に混合してもよい。それらのＬｙｓＭ領域とＯＭＤにより、このポリペプチドは、担体に結合することができる。この結合に伴って、先行して、および／または追随してそれらの天然オリゴマー構造への会合が行われる。
【００５２】
本発明によるポリペプチドをエンコードする核酸配列並びにこの核酸配列を含むベクターも提供される。本明細書において使用される「ベクター」という用語は、プラスミド、バクテリオファージまたは動物、ウイルスといった異種の核酸配列を宿主細胞中に導入することが可能な核酸分子として定義される。本発明によるベクターは、宿主細胞中の異種の核酸配列によりエンコードされたタンパク質またはその一部分を発現または産生することを可能にする。本発明による方法において好適なベクターは、限定されないが、ｐＣＤ５（プヤニおよびシード（Ｐｏｕｙａｎｉ  ａｎｄ  Ｓｅｅｄ），Ｃｅｌｌ  ８３［１９９５］，３３３−３４３）とｐＣＡＧＧＳ（丹羽等（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．），Ｇｅｎｅ  １０８［１９９１］，１９３−１９９）とを含む。「宿主細胞」は、ベクターといった核酸分子により形質転換された細胞または形質転換が可能である細胞である。「形質転換」という用語は、本明細書において、受容細胞中への異物の核酸の導入として定義される。受容細胞の形質転換の結果、前記細胞による組み替えタンパク質が一時的に発現することができる。これは、組み替えタンパク質は定義された期間内にのみ発現されるということである。代替的に、受容細胞の形質転換の結果、安定に発現することができる。これは、核酸が細胞のゲノム中に導入され、従って、次世代に伝えられたということである。加えて、組み替えタンパク質の誘発可能な発現を達成することができる。誘発可能な発現システムは、関心のある核酸配列の発現を可能にする分子の存在または不存在を必要とする。誘発可能な発現システムの例は、限定されないが、Ｔｅｔ−ＯｎおよびＴｅｔ−Ｏｆｆ発現システムと、例えば、エクジソンにより誘発可能な遺伝子発現システムといった、ホルモン誘発可能な遺伝子発現システムと、アラビノース誘発可能な遺伝子発現システムと、誘発可能なメタロチオネイン・プロモーターを含むｐＭＴ／ＢｉＰベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるショウジョウバエ誘発可能な発現システムとを含む。
【００５３】
さらなる一実施形態は、本発明による核酸配列またはベクターを含む宿主細胞に関する。かかる宿主細胞は、本明細書において開示されているポリペプチドの組み替え産生に有利に使用される。
【００５４】
本発明の組み替えポリペプチドは、例えば、原核生物細胞または植物細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞または昆虫細胞といった真核細胞において発現される。加えて、本発明による組み替えオリゴマー細胞外ドメインまたはその一部分は、植物において発現可能である。原核および真核細胞は当技術において周知である。原核細胞は、例えば、大腸菌またはエル．ラクティス（Ｌ．  ｌａｃｔｉｓ）である。植物および／または植物細胞の例は、限定されないが、トウモロコシ（細胞）、コメ（細胞）、ウキクサ（細胞）、タバコ（ＢＹ−２またはＮＴ−１細胞といった細胞）およびジャガイモ（細胞）を含む。酵母細胞の例は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）である。昆虫細胞の例は、限定されないが、Ｔｎ５、ＳＦ−９およびＳＦ−２１細胞といったヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞およびショウジョウバエシュナイダー２（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２）（Ｓ２）細胞といったショウジョウバエ細胞を含む。本発明による組み替えタンパク質を発現するのに好適な哺乳動物細胞の例は、限定されないが、アフリカミドリザル腎臓（Ｖｅｒｏ）細胞、新生児ハムスター腎臓（例えば、ＢＨＫ−２１）細胞、ヒト網膜細胞（例えば、ＰｅｒＣ６細胞）、ヒト胚腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）、Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙ犬腎臓（ＭＤＣＫ）細胞、ニワトリ胚維芽胞細胞（ＣＥＦ）、ニワトリ胚腎臓細胞（ＣＥＫ細胞）、胚盤−由来胚幹細胞（例えばＥＢ１４）、マウス胚維芽胞細胞（例えば、３Ｔ３細胞）、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびマウス骨髄腫（例えば、ＮＳ０およびＳＰ２／０）、およびこれらの細胞型の派生型を含む。好適な一実施形態において、哺乳動物ＣＨＯ細胞またはＳ２昆虫細胞が使用される。
【００５５】
これにより、本発明は、また、本発明による組み替えポリペプチドを用意する方法を提供する。この方法は、上記の宿主細胞を適切な培地において培養し、前記ポリペプチドの発現を許容し、かつ、この物質を単離することを含む。好ましくは、この方法は、真核宿主細胞、好ましくは哺乳動物宿主細胞、例えば、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ、ＣＨＯまたはＰｅｒＣ６細胞、あるいは昆虫細胞、例えばＳ２細胞を用いる。
【００５６】
さらに、本発明により提供されるのは、哺乳動物の個体において病原体に対する免疫応答を引き起こす方法であって、前記個体に本発明による免疫組成物投与することを含む方法である。
【００５７】
本発明は、ワクチンとして使用することができる免疫組成物を提供する。これらのワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防）または治療的（すなわち、感染を治療）であるが、一般に、予防的である。本発明は、また、哺乳動物における免疫応答を増強する方法を提供する。この方法は、有効量の本発明の免疫組成物を投与する工程を含む。この免疫応答は、好ましくは、保護的であり、好ましくは、抗体および／または細胞媒介免疫が関与している。この方法は、追加免疫応答を引き起こすことがある。哺乳動物は、好ましくはヒトである。ワクチンが予防的に使用される場合、ヒトは、好ましくは小児（例えば、２〜４歳児または乳児）またはティーンエイジャである。ワクチンが治療的に使用される場合、ヒトは、好ましくはティーンエイジャ、成人である。小児用ワクチンは、例えば、安全性、薬用量、抗原性等を評価するために成人に投与してもよい。本発明により調製されるワクチンは、小児および成人の両方を治療するのに使用されてもよい。従って、ヒトの患者は、１歳未満、５歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳または少なくとも５５歳であってもよい。ワクチンを受けるのに好ましい患者は年配者（例えば＞５０歳、＞６０歳、および好ましくは＞６５歳）である。ワクチンはこれらの年齢群に対してのみ好適である訳ではなく、より一般的に、若年（例えば＜５歳）、入院患者、医療従事者、軍務・軍隊要員、妊婦、慢性病または免疫不全患者を含む集団においても使用することができる。
【００５８】
例えば、本発明は、個体においてウイルス疾患に対する免疫応答を引き起こす方法であって、好ましくは、ウイルス疾患がインフルエンザ・ウイルス、動物コロナウイルス、ヒト呼吸器コロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）または、特に、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）またはメタ肺炎ウイルスである方法を提供する。この方法は、本発明の天然オリゴマー・サブユニット・ワクチンを前記個体に投与することを含む。該ワクチンは、
Ａ）病原体由来の少なくとも１つの表面露出ポリペプチドまたはその抗原部分を含むＮ−またはＣ−末端抗原領域であって、インフルエンザ・ヘムアグルチニン（ＨＡ）細胞外ドメインまたはその一部分、インフルエンザ・ノイラミニダーゼ（ＮＡ）細胞外ドメインまたはその一部分、コロナウイルス・スパイク（Ｓ）タンパク質細胞外ドメインまたはその一部分、ＲＳＶ糖タンパク質ＦまたはＧ細胞外ドメインまたはその一部分、およびＨＩＶ  ｇｐ１４０細胞外ドメインまたはその一部分からなる群より選択されるＮ−またはＣ−末端抗原領域を含み、前記抗原領域は、
Ｂ）オリゴマー化領域（ＯＭＤ）に融合され、前記オリゴマー化領域は、
Ｃ）リンカー領域を介して、
Ｄ）単一コピーのＬｙｓＭ領域からなり、グラム陽性菌から得られる不活化バクテリア様粒子（ＢＬＰ）である前記ポリペプチドのペプチドグリカン担体粒子への前記非共有結合性連結を仲介することが可能なペプチドグリカン結合領域（ＰＢＤ）に融合され、かつ前記ポリペプチド全体として単一コピーのＬｙｓＭ領域のみを含む。
【００５９】
本発明による組成物は、当業者に知られた任意方法により投与することができるが、経鼻、舌下、経口または非経口投与経路によることが好ましい。好適な一実施形態において、投与経路は経鼻経路である。本発明は、また、本発明の免疫組成物を予め充填された送達装置を提供する。適切な送達装置は、予め充填された（スプレイ）容器と注射器を含む。本発明の組成物は、一般に、患者に直接に投与される。直接送達は、非経口注射（例えば皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内または組織の間質腔）、または粘膜経由で、例えば直腸、舌下、経口（例えば、錠剤、スプレイ）、膣内、局所、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）または経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、鼻腔内、眼内、耳腔内（ａｕｒａｌ）、経肺（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）その他の粘膜投与により達成することができる。上述のように、筋肉内投与が一般的である。
【００６０】
本発明は、全身性および／または粘膜免疫を引き起こすのに使用されてもよく、好ましくは増進された全身性および／または粘膜免疫を引き起こすのに使用されてもよい。
【００６１】
投薬は、一回投与計画または複数回投与計画によるものであってもよい。複数回投薬は、一次免疫計画において、および／または追加免疫計画において使用することができる。複数回投与計画においては、さまざまな薬用量を同じ経路によりまたは異なる経路により与えることができる。例えば、非経口で一次免疫かつ粘膜で追加免疫、粘膜で一次免疫かつ非経口で追加免疫等。複数回投薬は、一般に、少なくとも１週間（例えば約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間等）離して投与される。本発明の免疫組成物は同じ患者に毎年、２年毎に、３年毎に等の間隔で投与することができる。
【００６２】
また、構想されるのは、異なる呼吸器ワクチンを被験者に同時に、共投与すること、例えば、肺炎球菌ワクチンを同時にインフルエンザ・ワクチンとして投与することである。組合せワクチンは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原と組み合わせられた肺炎球菌サッカライド（接合または非接合）のように、２種類以上のワクチンが混合物として投与されるが、インフルエンザ・ウイルス抗原といった多数の他の抗原を追加することも可能であると考えられる。例えば、本発明は、ＲＳＶの融合（Ｆ）、連結（Ｇ）およびマトリックス（Ｍ）タンパク質とインフルエンザ・ワクチンとの組合せを含む組合せワクチンの製造に適用することができる。
【００６３】
本発明は、また、上述のワクチン組成物またはワクチン組成物の調製方法の使用、であって、哺乳動物に天然のコンフォメーション抗原に対する免疫力、特にインフルエンザまたはＲＳＶ感染に対する免疫力を付与するための使用、またはコンフォメーション抗原、例えばＨＡ、ＮＡまたはＲＳＶ抗原、に対する抗体を製造するための使用に関する。一態様において、本発明は、本発明による組み替えポリペプチドの、インフルエンザまたはＲＳＶ感染を予防または治療するためのワクチンまたは免疫組成物の調製のための使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】さまざまなＨＡ融合タンパク質の概略説明（パネルＡおよびＢ）およびＢＬＰｓへの結合（パネルＣおよびＤ）、および多量体化状態（Ｅ）を説明する図である。
【図２Ａ】ＨＡ−Ｐ２ＬｔｒｉおよびＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉ変異体並びにワクチン産生のためのそれらのＢＬＰｓへの結合の概略説明図である。
【図２Ｂ】ＨＡ−Ｐ２ＬｔｒｉおよびＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉ変異体並びにワクチン産生のためのそれらのＢＬＰｓへの結合の概略説明図である。
【図３】ＯＭＤを有するおよび有しないＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ変異体のＢＬＰｓに対する結合量を示す図である。
【図４】ＢＬＰｓに結合されたオリゴマーＨＡ（単量体ＨＡと対照的に）は凝集テストにおいて生物学的な機能を有することを示す図である。
【図５】ＢＬＰｓに結合されたＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉの安定性を示す図である。
【図６】μｇ／ｍｌ表示の抗Ｈ１ＭＩｇＧ抗体の平均量（パネルＡ）；血清中に存在するＨＩタイター（力価）（パネルＢ）；およびマウスの鼻洗浄液中に存在するＳ−ＩｇＡ（パネルＣ）を説明する図である。
【図７】さまざまなＰｒｏｔａｎ部分を有するＧＣＮ４（ＯＭＤ）含有融合タンパク質であるＨＡｔｒｉ−Ｐｒｏｔａｎの発現およびＢＬＰ結合特性を説明する図である。
【図８】概略説明（Ａ）、発現（Ｂ）、多量体化状態（Ｃ）およびＰｒｏｔａｎ−ＮＡのＢＬＰｓへの結合（Ｄ）を説明する図である。
【図９】ＮＡ変異体のノイラミニダーゼ活性を示す図である
【図１０】さまざまなＦ融合タンパク質の概略説明（ＡおよびＢ）並びに発現およびＢＬＰｓへの結合（Ｃ）の説明図である。
【図１１】ＢＬＰｓに結合された三量体Ｆタンパク質（ＢＬＰ−Ｆｔｒｉ）は、マウスにおいて鼻腔内投与後にＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）様抗体反応を誘発することを説明する図である。
【図１２】ＢＬＰ−Ｆｔｒｉを用いてコットンラットにワクチンの鼻腔内接種をした後の有効性（パネルＡ）、血清学（パネルＢ）および安全性（パネルＣ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
図１は、さまざまなＨＡ融合タンパク質の概略説明（パネルＡおよびＢ）およびＢＬＰｓへの結合（パネルＣおよびＤ）、および多量体化状態（Ｅ）を説明する図である。三量体（ＨＡ−Ｐｔｒｉと略称される）およびモノマー（ＨＡ−Ｐｍｏｎと略称される）として存在するＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ（パネルＢ）を形成することができる線状ＨＡ−ＯＭＤ−Ｐｒｏｔａｎ（パネルＡ）の概略説明。ＯＭＤはＧＣＮ４−ｐＩＩである。融合体のＰｒｏｔａｎ部分（＝ＰＢＤ）の大きさは変化する。タンパク質融合体名の略称中の文字Ｐに続く数は、Ｐｒｏｔａｎ部分におけるＬｙｓＭ領域の数を示す。Ｌ１−２：リンカー配列。タンパク質融合体名の略称中の文字Ｌに続く数は、最Ｃ−末端ＬｙｓＭ領域の後のＣ−末端リンカー領域の存在を示す。ＬｙｓＭ１−２：ＬｙｓＭ（ペプチドグリカン結合）領域。
【００６６】
パネルＣおよびＤは、ＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ融合タンパク質がＧＣＮ４領域（ＯＭＤ）を含む場合、ＢＬＰｓに効率的に結合するためには、１つのＬｙｓＭ領域しか必要とされないことを示す。ＧＣＮ４三量体化モチーフを持たない３つの異なるＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ融合タンパク質変異体と、ＧＣＮ４モチーフを含む１つのそのような融合タンパク質がＨＥＫ２９３Ｓ（ＧＮＴＩ−）細胞内で発現された。これはＨ１Ｍ（パネルＣ）およびＸ３１（パネルＤ）に由来するＨＡタンパク質に対して重複して行われた。得られたＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ融合タンパク質はＢＬＰｓに結合される。この結合は、１５０μｇ（乾燥重量）の粒子を過剰量の近似的に３０−４５μｇの融合タンパク質と共にインキュベートし、その後、粒子を捕集することにより行われる。次いで、５０μｇの各ＢＬＰ−画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー・ブルー染色により分析した［パネルＩ］。対照として、発現を細胞培地からのサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡｂＰＡ９０（α−Ｐｒｏｔａｎ）を用いるウエスタン・ブロッティングにより検査した［パネルＩＩ］。すべての融合タンパク質が十分に発現された。まとめて、これらの実験は、タンパク質のＢＬＰｓへの効率的な結合のためには、ＯＭＤと組み合わせられた単一のＬｙｓＭ領域で十分であるが、一方、ＯＭＤが存在しない場合、効率的な結合のためには２つのＬｙｓＭ領域が必要とされることを示す。パネルＥ：ＯＭＤ含有ＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ融合タンパク質は主にオリゴマーである。青色天然ゲル電気泳動とそれに続くＰｒｏｔａｎ抗体α−ＰＡ９０を用いるウエスタン・ブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）とによる異なるＨＡ−ＧＣＮ４−Ｐｒｏｔａｎ変異体の分析各変異体について、等量の不要物を除去された細胞培養上清を、ゲルに適用する前に、１０秒間（１０’’）、３０秒間（３０’’）または３分間（３’）煮沸した。分析されたＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ融合タンパク質は、Ｈ１Ｍウイルス由来のＨＡ−Ｐ１ｔｒｉおよびＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉタンパク質であった。これらのＨＡタンパク質は、すべて、非常に短時間の加熱（１０秒間）の後、三量体の移動度に相当する移動度で移動した。しかし、煮沸時間が長くなると、二量体と単量体に解離した。ＨＡ−Ｐ１ｔｒｉおよびＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉ三量体は、長時間サンプルを煮沸した後でさえも検出可能状態を保った。均等なＨＡ−Ｐｍｏｎ変異体は、すべて、モノマーの移動度で移動した。加えて、これらのＨＡ−Ｐｍｏｎタンパク質の大部分が、不定の、時には高分子量の会合体（ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）を形成する強い傾向を示した（アステリスクにより示した）。これは、おそらくこれらの非天然タンパク質の折り畳みおよび安定性が乏しい結果である。
【００６７】
図２Ａ、２Ｂは、ＨＡ−Ｐ２ＬｔｒｉおよびＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉ変異体並びにワクチン産生のためのそれらのＢＬＰｓへの結合の概略説明図である。パネルＡ：ＨＡ−Ｐ２ＬｔｒｉおよびＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉの産生の結果、主に三量体変異体が生じるが、少量の不所望の正しく折り畳まれていない単量体変異体も産生される。パネルＢ：単量体および三量体ＨＡ−Ｐ２Ｌｔｒｉ変異体をＢＬＰｓに結合した後、引き続いて洗浄すると、天然オリゴマーＨＡと、不所望の正しく折り畳まれていない単量体ＨＡとが結合されたＢＬＰワクチンが得られる。単量体および三量体ＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉ変異体をＢＬＰｓに結合した後、引き続いて洗浄すると、天然オリゴマーＨＡが結合され、不所望の正しく折り畳まれていない単量体ＨＡは持たないＢＬＰワクチンが得られる。従って、単一のＬｙｓＭ領域をＧＣＮ４といったＯＭＤと組み合わせて用いてタンパク質のＢＬＰｓに結合すると、所望の天然の生物活性オリゴマー・タンパク質の選択的結合が可能になる。
【００６８】
図３は、ＯＭＤを有するおよび有しないＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ変異体のＢＬＰｓに対する結合量を示す図である。増加する量（０〜４μｇ）のＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉ（Ｈ１−ＧＣＮ４−Ｐ１Ｌ）およびＨＡ−Ｐ２Ｌｍｏｎ（Ｈ１−Ｐ２Ｌ）が一定量（０．３ｍｇ）のＢＬＰｓに結合された。結合後、結合されたＨＡの量が決定された。この実験は、重複して実施された。明らかに、ＨＡ−Ｐ２Ｌｍｏｎに使用されるのと同様の濃度において、より多くのＨＡ−Ｐ１ＬｔｒｉがＢＬＰｓに結合する。従って、単一のＬｙｓＭ領域とＧＣＮ４といったＯＭＤとの組み合わせを用いてタンパク質をＢＬＰｓに結合するのは、２つのＬｙｓＭ領域を用いるが、ＯＭＤを用いない場合よりもより効率的である。
【００６９】
図４は、ＢＬＰｓに結合されたオリゴマーＨＡは（単量体ＨＡと対照的に）凝集テストにおいて生物学的な機能を有することを示す図である。Ａ．血球凝集反応試験の概略説明。パネル１：赤血球細胞（ＲＢＣｓ；ｅｒｙ）と混合されたインフルエンザ・ウイルスは、ＲＢＣｓに結合し、凝集を引き起こす網状組織（ネットワーク）を形成することができる。パネル２：ＢＬＰｓ（ＢＬＰ−ＨＡｔｒｉ）に付着され、ＲＢＣｓと混合されたＨＡ三量体は、ＲＢＣｓ結合することが可能であり、凝集を引き起こす網状組織（ネットワーク）を形成することができる。パネル３：ＢＬＰｓ（ＢＬＰ−ＨＡｍｏｎ）に付着され、ＲＢＣｓ混合されたＨＡモノマーは、ＲＢＣｓに結合することができず、凝集を引き起こす網状組織（ネットワーク）を形成することができない；マイクロタイター・プレートのウエル内のＲＢＣｓ堆積物（点として見える）。パネル４：ＲＢＣｓと混合されたＢＬＰｓは、ＲＢＣｓと結合することができず、凝集を引き起こさない。パネル５：ＨＡ三量体（ＨＡｔｒｉ）はＲＢＣｓに結合するが、凝集を引き起こす網状組織（ネットワーク）を形成することができない。
Ｂ．シチメンチョウＲＢＣを用いる血球凝集反応試験。融合に使用されるＨＡはＨ１Ｍである。レーン１：陰性対照、ＲＢＣｓ＋緩衝液。レーン２：ＲＢＣｓ＋ＢＬＰ。レーン３：ＲＢＣｓ＋４μｇのＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉを結合されたＢＬＰ。レーン４：ＲＢＣｓ＋２μｇのＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉを結合されたＢＬＰ。レーン５：ＲＢＣｓ＋１μｇのＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉを結合されたＢＬＰ。レーン６：ＲＢＣｓ＋０．５μｇのＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉを結合されたＢＬＰ。レーン７：ＲＢＣｓ＋４μｇのＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉ。レーン８：ＲＢＣｓ＋４μｇのＨＡ−Ｐ２Ｌｍｏｎを結合されたＢＬＰ。レーン９：ＲＢＣｓ＋２μｇのＨＡ−Ｐ２Ｌｍｏｎを結合されたＢＬＰ。レーン１０：ＲＢＣｓ＋１μｇのＨＡ−Ｐ２Ｌｍｏｎを結合されたＢＬＰ。レーン１１：ＲＢＣｓ＋０．５μｇのＨＡ−Ｐ２Ｌｍｏｎを結合されたＢＬＰ。レーン１２：ＲＢＣｓ＋４μｇのＨＡ−Ｐ２Ｌｍｏｎ。この実験が明らかに示しているように、オリゴマーＨＡのみがＢＬＰｓ（ＢＬＰ−ＨＡｔｒｉ）に結合されていると、生物学的な機能を有するが、これに対して、単量体ＨＡがＢＬＰｓ（ＢＬＰ−ＨＡｔｒｉ）に結合されている場合は、生物学的な機能を有しない。
【００７０】
図５は、ＢＬＰｓに結合されたＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉの安定性を示す図である。パネルＡ：ＢＬＰｓに結合されたＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉ（比率  ３．３μｇのＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉが１ｍｇのＢＬＰｓに結合）が分取され、２〜８℃において貯蔵された。製剤化後Ｔ＝０、３、６および９ヶ月後に、ＢＬＰｓに結合されたＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉの量についてアリコートが試験された（Ｔ＝０において測定された量を１００％とした）；およびパネルＢ：凝集テストにおける生物活性。ＡＵ；凝集単位。この実験が明らかに示しているように、ＢＬＰｓに結合されたＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉは完全に安定しており、ＰＢＳ中２〜８℃における少なくとも９ヶ月までの貯蔵後にも生物学的機能を有している。
【００７１】
図６は、μｇ／ｍｌ表示の抗Ｈ１ＭＩｇＧ抗体の平均量（パネルＡ）；血清中に存在するＨＩタイター（力価）（パネルＢ）；およびマウスの鼻洗浄液中に存在するＳ−ＩｇＡ（パネルＣ）を説明する図であり、該マウスは鼻腔内に下記を用いて３回接種された。（ｉ）可溶性三量体ＨＡ（ＨＡｔｒｉ）［０．３３μｇ／投薬］；（ｉｉ）ＢＬＰ（ＢＬＰ＋ＨＡｔｒｉ）［０．３３μｇＨＡｔｒｉおよび０．１ｍｇＢＬＰ／投薬］と混合した可溶性三量体ＨＡ；（ｉｉｉ）ＢＬＰｓ（ＢＬＰ−ＨＡｔｒｉ）に結合された三量体ＨＡ（ＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉ）［０．３３μｇＨＡｔｒｉおよび０．１ｍｇＢＬＰ／投薬］、および（ｉｖ）ＢＬＰｓ（ＢＬＰ−ＨＡｍｏｎ）に結合された単量体ＨＡ（ＨＡ−Ｐ１Ｌｍｏｎ）［０．３３μｇＨＡｔｒｉおよび０．１ｍｇＢＬＰ／投薬］。明らかに、ＢＬＰ−ＨＡｔｒｉ粒子状製剤は、可溶性三量体ＨＡ（ＨＡｔｒｉ）、およびＢＬＰと混合された可溶性三量体ＨＡ（ＢＬＰ＋ＨＡｔｒｉ）と比較してもっとも免疫活性の高い製剤であった。機能性抗体試験（ＨＩ力価；パネルＢおよびＳ−ＩｇＡ；パネルＣ）に関して、オリゴマーＢＬＰ−ＨＡｔｒｉ粒子状製剤は、単量体ＢＬＰ−ＨＡｍｏｎ粒子状製剤よりも高い応答を引き起こした。これは、生物学的機能を有するＨＡｔｒｉがもっとも免疫活性が高い構造（コンフォメーション）であることを示している。
【００７２】
図７は、さまざまなＰｒｏｔａｎ部分を有するＧＣＮ４（ＯＭＤ）含有融合タンパク質であるＨＡｔｒｉ−Ｐｒｏｔａｎの発現およびＢＬＰ結合特性を説明する図である。パネルＡ：ＨＥＫ２９３細胞は、それぞれの発現プラスミドを用いて形質転換され、インキュベーションされた後、培養上清が抽出され、細胞が溶解された。それぞれのサンプルがＰｒｏｔａｎ部分（α−ＰＡ９０）に対する抗体を用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン・ブロッティングにより分析された。亜型Ｈ３（Ｘ３１）およびＨ１（Ｈ１Ｍ）の一連のＧＣＮ４含有ＨＡタンパク質（それらの三量体化製剤能力を示すためにＨＡ−Ｐｔｒｉと呼ぶ）の産生が示される。ＨＡ−Ｐｔｒｉ変異体はすべて容易に発現され、細胞培養培地中に効率的に分泌された。これは、細胞溶解産物中におけるそれらの存在が限定されていることから判断される。Ｘ３１ＨＡ−Ｐｔｒｉ融合タンパク質は、Ｈ１Ｍ  ＨＡ−Ｐｔｒｉ融合タンパク質よりも若干その産生量が少ない。一方、一般に、Ｐ１ＬおよびＰ２Ｌに融合されたＨＡタンパク質は、最高の産生レベルを示すが細胞内における保持は最低レベルに限定されているように見える。パネルＢ：異なるＧＣＮ４含有ＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ融合タンパク質がＢＬＰｓへの結合を比較された。これは、等量の粒子を過剰量の融合タンパク質の存在下にインキュベートし、ＢＬＰ−結合タンパク質の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン・ブロッティングにより分析することにより行われた。ＨＡ−Ｐｔｒｉ変異体はすべて結合することが見出されたが、効率は著しく変動した。Ｈ１ＭおよびＸ３１ウイルス由来ＨＡタンパク質の両方について、変異体ＨＡ−Ｐ１ｔｒｉ、ＨＡ−Ｐ１ＬｔｒｉおよびＨＡ−Ｐ２ＬｔｒｉはＢＬＰｓにもっとも効率的に結合された。Ｈ１Ｍ１およびＸ３１  ＨＡ−Ｐ２ｔｒｉタンパク質のＢＬＰｓへの結合効率が低いことが観察された。この結果は、ＢＬＰｓへの優れた結合を可能にするには、１つのＬｙｓＭ領域をＯＭＤと組み合わせれば十分であることを示している。パネルＣ：ウエスタン・ブロットは抗ＨＡ（抗Ｈ１Ｍ）を用いてインキュベーションした。レーン１：標識タンパク質、大きさがマージンにｋＤａで表示されている。レーン２：ＢＬＰ粒子、３０μｇ。レーン３：ＨＡｔｒｉ、Ｐｒｏｔａｎ延長部（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）の代わりにＳｔｒｅｐタグ（ＨＡ−Ｓｔｒｅｐｔｒｉ）を担持している（４０ｎｇ）。レーン４：ＨＡ−Ｓｔｒｅｐｔｒｉ（８４０ｎｇ）を用いたインキュベーションから回収されたＢＬＰｓ（３０μｇ）。レーン５：ＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉ、４４ｎｇ。レーン６：ＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉ（８８０ｎｇ）を用いたインキュベーションから回収されたＢＬＰｓ（３０μｇ）。全体的に見て、これらの実験が示しているように、融合タンパク質はよく発現され、哺乳動物細胞から分泌され、Ｃ−末端におけるバクテリアＰｒｏｔａｎ領域存在は、ＨＡ−オリゴマー融合タンパク質の効率的な分泌に干渉しなかった（パネルＡ）。さらに、この実験が明らかに示すように、ＢＬＰｓへの優れた結合を得るためには１つのＬｙｓＭ領域で十分であり、ＧＣＮ４領域は、単一のＬｙｓＭ領域の結合を強めるために必要とされるが、ＢＬＰｓには結合しない（パネルＣ）。
【００７３】
図８は、概略説明（Ａ）、発現（Ｂ）、多量体化状態（Ｃ）およびＰｒｏｔａｎ−ＮＡのＢＬＰｓへの結合（Ｄ）を説明する図である。パネルＡ：四量体（Ｐ−ＮＡｔｅｔと略称される）を形成することができる線状Ｐｒｏｔａｎ−ＯＭＤ−ＮＡとモノマー（Ｐ−ＮＡｍｏｎと略称される）融合体として存在するＰｒｏｔａｎ−ＮＡの概略説明。ＯＭＤは、ＮＡ構築物中のＧＣＮ４−ｐＬＩである。融合体のＰｒｏｔａｎ部分（＝ＰＢＤ）は、リンカーを有するか、または有しない１つのＬｙｓＭ領域を含む。タンパク質融合体名の略称中のＬに続く数は、ＬｙｓＭ領域の後のＣ−末端リンカー領域の存在を示す。パネルＢ：ＧＣＮ４四量体化モチーフを有するか、または有しないＰｒｏｔａｎ−ＮＡ融合タンパク質の発現を示す。ＨＥＫ２９３細胞は、それぞれの発現プラスミドを用いて形質転換され、インキュベーションされ、その後、培養上清が抽出され、細胞が溶解される。それぞれのサンプルは、Ｐｒｏｔａｎ部分（α−ＰＡ９０）に対する抗体を用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン・ブロッティングにより分析される。ＨＡ−Ｐｒｏｔａｎタンパク質と同様に、すべてのＰｒｏｔａｎ−ＮＡ変異体が細胞培養上清中に分泌されることが見出された。より少ない細胞内保持がＧＣＮ４四量体化モチーフを含むＰｒｏｔａｎ−ＮＡ変異体について観察された。パネルＣ：ＯＭＤ含有ＮＡ−Ｐｒｏｔａｎ融合タンパク質はオリゴマーであることを示す。ここに、ＧＣＮ４を有する（＋）および有しない（−）Ｐ１Ｌ−ＮＡ変異体のオリゴマー状態が比較された。これらのＰ１Ｌ−ＮＡ変異体のサンプルが青色天然ゲル電気泳動により分析された。大部分のＰ１Ｌ−ＮＡｍｏｎタンパク質はモノマーとして移動し、その一部分が二量体として移動した。しかしながら、四量体は検出できなかった。対照的に、Ｐ１Ｌ−ＮＡｔｅｔタンパク質は、四量体として移動し、モノマーまたは二量体は検出されなかった。全体的に見て、これらの実験が示すように、ＮＡ融合タンパク質はよく発現され、哺乳動物細胞から分泌され、Ｎ−末端におけるバクテリアＰｒｏｔａｎ領域の存在はＮＡ−オリゴマー融合タンパク質の効率的な分泌に干渉しなかった（Ｃ−末端にＰｒｏｔａｎを有するＨＡ−オリゴマー融合タンパク質について観察されるように）。さらにＧＣＮ４モチーフは、ＨＡ融合タンパク質について観察されるように、ＮＡ融合タンパク質におけるオリゴマー状態を誘発し安定化する。パネルＤ：異なるＮＡ−Ｐｒｏｔａｎ融合タンパク質が、ＢＬＰｓへのそれらの結合特性について分析された。ＬｙｓＭ領域のＣ−末端にリンカーを有するおよび有しない、かつＯＭＤ（ＧＣＮ４）を有するおよび有しないＰｒｏｔａｎＰ１変異体がＢＬＰｓに結合された。この結合は１５０μｇ（乾燥重量）の粒子を過剰量の近似的に３０〜４５μｇの量の融合タンパク質とインキュベートし、その後、粒子を捕集することにより行われた（Ｂで示されたレーン）。Ｓで示されるレーンは、結合後、培地中に残存するＮＡを示す。緩衝液を用いたＢＬＰｓの模擬インキュベーションを陰性対照と一緒に行った。次いで、５μｇのＢＬＰ−画分が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、ウサギ抗ＰＡ９０血清（抗Ｐｒｏｔａｎ）を用いるウエスタン・ブロ���トとにより分析された。ＧＣＮ４四量体化モチーフを欠くＰ１Ｌ−ＮＡｍｏｎおよびＰ１−ＮＡｍｏｎ融合タンパク質については、ＨＡ−Ｐ１ｍｏｎ構築物について観察されるように、結合が得られないか、または乏しい。しかしながら、明らかに、Ｐ１Ｌ−ＮＡｔｅｔ融合タンパク質を用いると効率的なＢＬＰの結合が観察された。対照的に、ＬｙｓＭ領域とＯＭＤ領域の間のリンカーを欠くＰ１−ＮＡｔｅｔ構築物は乏しい結合を示した。明らかに、ＬｙｓＭ領域とＯＭＤ領域の間にリンカー領域が存在する限り、オリゴマーＰｒｏｔａｎ形態の効率的な結合のためには単一のＬｙｓＭモチーフですでに十分である。
【００７４】
図９は、ＮＡ変異体のノイラミニダーゼ活性を示す図である。ノイラミニダーゼ変異体Ｐ１およびＰ１Ｌ−いずれもＧＣＮ４を有しないおよびＧＣＮ４を有する−がフェチュインに基づくノイラミニダーゼ活性試験を用いてノイラミニダーゼ活性を試験された。Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ウエルプレートは１００μｌの５−μｇ／ｍｌフェチュインを塗布され、４℃において一昼夜置かれた。同様の量のＮＡ（ウエスタン・ブロッティングにより確認された）を含む細胞培養培地サンプルの１００μｌが連続希釈され、フェチュイン塗布ウエルに添加された。３７℃において１時間インキュベーションした後、プレートは洗浄され、次いでノイラミニダーゼ活性が測定された。この測定は、ペルオキシダーゼ−標識されたピーナッツ・アグルチニン（２．５μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を添加し、室温にて１時間インキュベートし、プレートを洗浄し、そして１００μｌのペルオキシダーゼ基質（ＴＭＢ）を各ウエルに添加することにより行われた。５分後、１００μｌの０．３Ｍリン酸を添加することにより反応が停止され、４５０ｎｍにおけるＯＤ値が酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）読み取り機（ＥＬ−８０８［ＢｉｏＴＥＫ］）を用いて測定された。グラフに示されるように、ＧＣＮ４四量体化モチーフを含むＰｒｏｔａｎ−ＮＡｔｅｔタンパク質は濃度に応じたシアリダーゼ活性を示した。ＧＣＮ４四量体化モチーフを欠くＰｒｏｔａｎ−ＮＡ融合タンパク質については、シアリダーゼ活性が見出されなかった。これらの結果は、明らかに、Ｐｒｏｔａｎ−ＮＡのオリゴマー形態が酵素機能を有することを実証している。
【００７５】
図１０は、さまざまなＦ融合タンパク質の概略説明（ＡおよびＢ）並びに発現およびＢＬＰｓへの結合（Ｃ）の説明図である。三量体（Ｆ−Ｐｔｒｉと略称される）を形成することができる線状Ｆ−ＯＭＤ−Ｐｒｏｔａｎ（パネルＡ）と、モノマー（Ｆ−Ｐｍｏｎと略称される）として存在するＦ−Ｐｒｏｔａｎ（パネルＢ）との概略説明。ＯＭＤは、Ｆ構築物中のＧＣＮ４−ｐＩＩ配列である。融合体のＰｒｏｔａｎ部分（＝ＰＢＤ）の大きさは変動する。タンパク質融合体名称の略称中の文字Ｐに続く数字は、Ｐｒｏｔａｎ部分中のＬｙｓＭ領域の数を示す。Ｌ１−３：リンカー配列。タンパク質融合体名称の略称中のＬに続く数字は、もっともＣ−末端のＬｙｓＭ領域の後のＣ−末端リンカー領域の存在を示す。ＬｙｓＭ１−２：ＬｙｓＭ（ペプチドグリカン結合）領域パネルＣにおいて、ＧＣＮ４を有するおよびＧＣＮ４を有しない異なるＦ−Ｐｒｏｔａｎ融合タンパク質がＢＬＰｓへの結合について比較された。この比較は、等量粒子を過剰量の融合タンパク質の存在下にインキュベートし、ＢＬＰ−結合されたタンパク質の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥと、ウエスタン・ブロッティングとにより分析することにより行われた。１つのＬｙｓＭおよびＧＣＮ４領域を有するＦ−Ｐｔｒｉ変異体および２つのＬｙｓＭ領域を有するＦ−Ｐｍｏｎ変異体は、ＢＬＰｓに効率的に結合することが見出された。ＢＬＰｓへの低い結合効率が観察されたのは、１つのＬｙｓＭ領域を有するがＧＣＮ４を欠くＦ−Ｐｍｏｎ変異体についてである。この結果は、１つのＬｙｓＭ領域をＯＭＤと組み合わせれば、ＨＡおよびＮＡについて観察されるのと同様に、Ｆタンパク質のＢＬＰｓへの優れた結合を可能にするのに十分であることを示している。Ｐｒｏｔａｎ−Ｆ融合タンパク質の発現を研究するために、ＨＥＫ  ２９３細胞がそれぞれの発現プラスミドを用いて形質転換された後、インキュベーションされ、培養上清が抽出され、そして溶菌された。サンプルはそれぞれ、Ｐｒｏｔａｎ部分（α−ＰＡ９０）に対する抗体を用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン・ブロッティングにより分析された。ＨＡ−ＰｒｏｔａｎおよびＰｒｏｔａｎ−ＮＡタンパク質と同様に、Ｆ−Ｐｒｏｔａｎ変異体は、すべて、細胞培養上清中に分泌されることが見出された。
【００７６】
図１１は、ＢＬＰｓに結合された三量体Ｆタンパク質（ＢＬＰ−Ｆｔｒｉ）は、マウスにおいて鼻腔内投与後にＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）様抗体反応を誘発することを説明する図である。パネルＡ；Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）競合ＥＬＩＳＡの概略説明であり、マイクロタイター・プレートのウエルにタンパク質が塗布される。これらのウエルは、ワクチン接種をされたマウスの血清の２倍連続希釈液を用いてインキュベーションされる。インキュベーション後、血清希釈液は洗浄により除去され、次いで非飽和量のＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を用いてインキュベーションされる。インキュベーション後、非結合Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）が第２のプレートに移され、結合後、二次抗体を用いて検出される。検出された結合Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）の量は、ワクチン接種をされたマウスの血清中のＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）様抗体の量の一つの尺度である。パネルＢ：競合ＥＬＩＳＡ結果。これは、明らかに、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）様抗体がワクチンの鼻腔内接種をされたマウスの血清中に誘発されることを示す。
【００７７】
図１２は、ＢＬＰ−Ｆｔｒｉを用いてコットンラットにワクチンの鼻腔内接種をした後の有効性（パネルＡ）、血清学（パネルＢ）および安全性（パネルＣ）を示す図である。コットンラットは、１４日間隔で３回、（ｉ）可溶性Ｆ（Ｆｍｏｎ）［４μｇ／投薬］、（ｉｉ）ＢＬＰｓに結合された三量体Ｆ（Ｆ−Ｐ１Ｌｔｒｉ）（ＢＬＰ−Ｆｔｒｉ）［４μｇ  ＨＡｔｒｉおよび０．５ｍｇ  ＢＬＰ／投薬］、および（ｉｉｉ）陰性対照としてのＰＢＳを鼻腔内接種される。ホルマリン−不活化ＲＳＶとアルミニウム塩の錯体（ＦＩ−ＲＳＶ）が、増強された疾患対照として筋肉内投与された。１４日目、最後のワクチン接種後に、すべての動物にＲＳＶ／ａ／Ｌｏｎｇが抗原投与された。ウイルス中和力価（ＶＮ）を調べるために、０、２８および４２日目に動物から採血された。抗原投与後５日目に、ウイルス滴定と組織病理学を行うために、全ての動物が殺され、肺全体が摘出され、両断され、増進された疾患特性が採点された。パネルＡは、ＦｍｏｎまたはＰＢＳワクチン接種と比較した、ＢＬＰ−Ｆｔｒｉワクチン接種後のウイルス力価の有意の低下を示す。この低いウイルス力価は、２８日目および４２日目における最高レベルのＶＮ力価と一致した（パネルＢ）。明らかに、ＢＬＰ−Ｆｔｒｉ粒子状製剤は、可溶性Ｆ（Ｆｍｏｎ）およびＰＢＳと比較してもっとも免疫源性および保護力を有する製剤であった。パネルＣ：ワクチン接種されたコットンラットの肺の組織病理切片が間質性肺炎および肺胞炎について採点された。ＢＬＰ−Ｆｔｒｉワクチン接種に続いてＲＳＶを感染させると、ＦＩ−ＲＳＶワクチン接種に続いてＲＳＶ抗原投与した後に観察されるスコアと比較して、肺の組織病理学スコアのみが低い結果となった。明らかに、ＢＬＰ−Ｆｔｒｉ粒子状製剤は、コットンラットにおいて増進された疾患を誘発しなかった。
【００７８】
実験の部
【００７９】
材料および方法
【００８０】
１．１．遺伝子および発現ベクター
【００８１】
インフルエンザ・ウイルスＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８  Ｈ３Ｎ２（Ｘ３１）およびＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９  Ｈ１Ｎ１（Ｈ１Ｍ）のヘムアグルチニン（ＨＡ）細胞外ドメイン（アミノ酸（ａ．ａ．）１７−５２２）、Ａ／Ｍａｌｌａｒｄ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２／２００５Ｈ５Ｎ２（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：５７１４６９）のノイラミニダーゼ（ＮＡ）ヘッド領域（アミノ酸（ａ．ａ．）７５−４６９）、および呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）亜型Ａの融合タンパク質（Ｆ）細胞外ドメイン、分離株ＧＡ７ＳＡ９９ＶＲ３６０（アミノ酸（ａ．ａ．）２６−５１３）をエンコードするヒト・コドン最適化遺伝子が合成され（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で発現させるためにクローン化されてｐＣＤ５ベクター、発現プラスミドＳ１−Ｉｇの派生型、とした（リ等（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ  ４２６［２００３］，４５０−４５４）。
【００８２】
ＨＡ遺伝子の両隣には、Ｎ−末端側に、ＣＤ５シグナル配列と、Ｃ−末端側に、人工のＧＣＮ４三量体化配列（ＧＣＮ４−ｐＩＩ）（ハーベリ等（Ｈａｒｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２［１９９３］，１４０１−１４０７）と、それに続いて４つのＰｒｏｔａｎ領域変異体の内の１つとをエンコードする配列とをエンコードする配列がそれぞれ配置されている（図１Ａ）。これらの構築物の内の３つは発現し、ＢＬＰｓによく結合することが証明された。これらの変異体について、三量体化配列を欠く構築物も構築された（図１Ｂ）。ＮＡ遺伝子の両隣には、Ｎ−末端側にＣＤ５シグナル配列と、それに続いてＰ１またはＰ１Ｌ  Ｐｒｏｔａｎ領域と、人工のＧＣＮ４四量体化配列（ＧＣＮ４−ｐＬＩ）（ハーベリ等（Ｈａｒｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２［１９９３］，１４０１−１４０７）とをそれぞれエンコードする配列が配置されている（図８Ａ）。これらの構築物に基づいて、人工のＧＣＮ４四量体化配列を欠く２つの追加の構築物が生成された（図８Ａ）。Ｆ遺伝子の両隣には、Ｎ−末端側にＣＤ５シグナル配列と、Ｃ−末端に人工のＧＣＮ４三量体化配列（ＧＣＮ４−ｐＩＩ）（ハーベリ等（Ｈａｒｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２［１９９３］，１４０１−１４０７）と、それに続く１つのＰｒｏｔａｎ領域とをそれぞれエンコードする配列が配置されている（図１０Ａ）。三量体化配列を欠き、１つまたは２つのＰｒｏｔａｎ領域が続く、２つの構築物も構築された（図１０Ｂ）。
【００８３】
１．２  タンパク質発現とＢＬＰｓへの結合
【００８４】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＨＡ、ＦまたはＮＡをエンコードする配列を含むｐＣＤ５発現ベクターでポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を１：５の比（μｇＤＮＡ：μｇＰＥＩ）で用いて形質転換される。移入後６時間目において、移入培地を、２９３  ＳＦＭＩＩ発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であって、重炭酸ナトリウム（３．７ｇ／リットル）、グルコース（２．０ｇ／リットル）、Ｐｒｉｍａｔｏｎｅ  ＲＬ−ＵＦ（３．０ｇ／リットル、Ｋｅｒｒｙ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ、オランダ国）、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、ｇｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）および１．５％ＤＭＳＯを補充したものに交換した。組織培養上清が、移入後５〜６日目に抽出された。ＨＡ−ＰｒｏｔａｎおよびＰｒｏｔａｎ−ＮＡタンパク質の発現が、Ｐｒｏｔａｎ（ＬｙｓＭ）特異的多クローン性のウサギ抗血清α−ＰＡ９０を一次抗体として用い、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼと接合された抗ブタ−α−ウサギ抗体（Ｄａｋｏ）を二次抗体として用いるウエスタン・ブロッティングと、ＥＣＬＴＭ（ＡｍｅｒｓｈａｍＴＭ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる検出とにより確認された。
【００８５】
分泌されたＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ、Ｆ−ＰｒｏｔａｎまたはＰｒｏｔａｎ−ＮＡタンパク質は、０．１５ｍｇのＢＬＰｓ（乾燥重量）を過剰量の、不要物を除去されたＨＥＫ２９３Ｔ発現培養上清に添加し、３０分間室温にて穏やかに混合しながらインキュベートすることにより、ＢＬＰｓに選択的に結合された。結合されたタンパク質を有するＢＬＰｓは、次いで、低速遠心分離により捕集され、ペレットはＤＰＢＳを用いて３回洗浄された。最後に、ペレットは、添加されたＢＬＰｓの当初の体積と同じ体積のＤＰＢＳ中に再懸濁された。ＨＡ、ＦおよびＮＡ融合タンパク質のＢＬＰｓへの結合の評価は、α−ＰＡ９０抗血清を用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン・ブロッティングにより行われた。一方、ＢＬＰに結合されたタンパク質の量の決定は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、これに続く、精製されたＢＳＡを基準タンパク質として用いるクマシー・ブルー染色とにより行われた。
【００８６】
融合タンパク質のオリゴマー状態の決定は、青色天然ゲル中の電気泳動とそれに続く、α−ＰＡ９０を用いるウエスタン・ブロッティングとにより行われた。
【００８７】
１．３  組み替えＨＡ−ＰｒｏｔａｎおよびＰｒｏｔａｎ−ＮＡ融合タンパク質の生物学的性質
【００８８】
ＢＬＰ−結合されたＨＡの生物活性の評価は、ニワトリまたはシチメンチョウ赤血球を用いる血球凝集反応試験により行われた。それらの表面に結合された機能性三量体ＨＡタンパク質を有する場合にのみ、ＢＬＰｓは、架橋された赤血球のネットワーク（「メッシュ」）の形成を仲介する。これは凝集として知られるプロセスである。三量体ＨＡまたはＢＬＰだけでは赤血球は架橋しない。試験中、９６ウエル中において、２５μｌの可溶性ＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ、ＢＬＰ−結合されたＨＡ、またはＢＬＰｓが、９６−ウエル（Ｖ字状ＣｅｌｌＳｔａｒ（登録商標）、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）内において２５μｌのＤＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中に連続希釈された。最後の希釈液から２５μｌを捨てて全てのウエル内で等しい体積となるようにした。全てのウエルに等体積の０．５％ニワトリ赤血球が添加され、懸濁液が静かに混合され、４５分間４℃にてインキュベーションされて、赤血球の架橋および／または沈殿が許容された。
【００８９】
可溶性Ｐｒｏｔａｎ−ＮＡ融合タンパク質の機能は、フェチュイン固相試験（ランブル等（Ｌａｍｂｒｅ  ｅｔ  ａｌ）．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ［１９９１］１９８：１８３−１９３）を用いて評価された。Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ウエルプレートが１μｇ／ｍｌのフェチュインを１００μｌ塗布され、４℃にて一昼夜置かれた。同様の量のＰｒｏｔａｎ−ＮＡ融合タンパク質を含む、不要物を除去されたＨＥＫ２９３Ｔ発現培養上清（Ｐｒｏｔａｎの量に基づき、ウエスタン・ブロッティングにより決定される）がＰＢＳ−Ｃａ／Ｍｇ［０．９０１ｍＭ／０．４９３ｍＭ］中で連続希釈され、その後、１００μｌの混合物がフェチュインを塗布されたウエルに添加された。３７℃にて１時間インキュベーション後、プレートは洗浄され、次いでノイラミニダーゼ活性が測定された。この測定は、ペルオキシダーゼ標識されたピーナッツ・アグルチニン（２．５μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を添加し、１時間室温にてインキュベートし、プレートを洗浄し、１００μｌのペルオキシダーゼ基質（ＴＭＢ）を各ウエルに添加することにより行った。５分後、１００μｌの０．３Ｍリン酸を添加することにより、反応を停止し、４５０ｎｍにおけるＯＤ値が、ＥＬＩＳＡ読み取り機（ＥＬ−８０８［ＢｉｏＴＥＫ］）を用いて測定された。
【００９０】
１．４  オリゴマー・タンパク質製剤を用いたマウスの免疫付与
【００９１】
１０匹の６〜８週令雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの４つの群が、１０日間隔で３回鼻腔内に４種の異なるＨＡ製剤（Ｈ１Ｍ）：（ｉ）可溶性三量体ＨＡ（ＨＡｔｒｉ）［１μｇ／投薬］、（ｉｉ）ＢＬＰと混合された可溶性三量体ＨＡ（ＢＬＰ＋ＨＡｔｒｉ）［１μｇＨＡｔｒｉおよび０．３ｍｇＢＬＰ／投薬］、（ｉｉｉ）ＢＬＰｓに結合された三量体ＨＡ（ＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉ）（ＢＬＰ−ＨＡｔｒｉ）［１μｇＨＡｔｒｉおよび０．３ｍｇＢＬＰ／投薬］、および（ｉｖ）ＢＬＰｓに結合された単量体ＨＡ（ＨＡ−Ｐ２Ｌｍｏｎ）（ＢＬＰ−ＨＡｍｏｎ）［１μｇＨＡｍｏｎおよび０．３ｍｇＢＬＰ／投薬］を接種される。三次免疫付与後１４日目に、ＥＬＩＳＡ分析のために血清と鼻洗浄液が捕集され、抗Ｈ１Ｍ  ＩｇＧ（血清サンプル）および抗Ｈ１Ｍ  Ｓ−ＩｇＡ（鼻洗浄液）応答が決定された。このために、プレートに２００ｎｇのＨＡ（Ｈ１Ｍ）／ウエルが塗布された。血清の連続希釈液が、９０分間インキュベーションされ、Ｈ１Ｍ−特異的ＩｇＧおよびＩｇＡの結合がそれぞれ抗マウスＩｇＧおよびＩｇＡ−ＨＲＰ接合体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて検出された。検量曲線作成のために、マウスＩｇＧが３倍希釈された（第１のウエル０．５μｇ／ｍＬ）（マウスＩｇＧ１、Ｓｉｇｍａ）（血清ＩｇＧについてのみ）．染色後、４９２ｎｍにおける吸光度が、ＥＬＩＳＡマイクロタイター・プレート読み取り機を用いて決定された。血清中の特異的抗ＨＡ  ＩｇＧ抗体（μｇ／ｍＬで表現される）を計算するために、検量曲線が使用される（曲線のパラメータは４母数フィットにより決定される）。鼻洗浄液中の特異的抗ＨＡ  ＩｇＡ抗体を計算するために、（バックグラウンド補正の後、Ａ４９２＝０．３に一致する計算されたサンプル希釈率の逆数である力価で表現される）曲線のパラメータは４母数フィットにより決定される。ＨＡ−特異的血球凝集反応阻害力価（ＨＩ）が、各群の（各個体動物）の３４日目に捕集された血清を用いて決定された。血清サンプルは５６℃にて３０分間不活化され、次いで、室温にて一昼夜カオリンとともにインキュベーションされてａ−特異的ヘムアグルチニンが低減された。カオリン処理されたサンプルは、連続２倍希釈液において、マルチチャンネル・ピペットを用いてプレート上に重複して適用され、適切な相同不活化インフルエンザ・ウイルス（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１），４  ＨＡＵ；ＮＩＢＳＣ，ＵＫ）と混合され、４０分間室温にてインキュベーションされた。次に、１％モルモット赤血球溶液が各ウエルに添加された。ヘムアグルチニンは、２時間反応の進行が許容され、最高希釈において血球凝集が観察された。
【００９２】
１０匹の６〜８週令雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの２つの群に、１０日間隔で２種類の異なるＢＬＰ−Ｆｔｒｉ製剤：（ｉ）ＢＬＰｓに結合されたＦ（ＢＬＰ−Ｆｔｒｉ  低）［０．６μｇＦｔｒｉおよび０．５ｍｇＢＬＰ／投薬］および（ｉｉ）ＢＬＰｓに結合されたＦ（ＢＬＰ−Ｆｔｒｉ  高）［２．２μｇＦｔｒｉおよび０．５ｍｇＢＬＰ／投薬］が３回鼻腔内に接種された。三次免疫付与後１４日目に、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）競合ＥＬＩＳＡ分析のために血清サンプルが群ごとに捕集され、プールされ、誘発されたＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）様抗体のレベルが決定された。このために、プレートに１００ｎｇ／ウエルのＦが塗布された。血清（前免疫血清を含む）の連続希釈液が９０分間インキュベーションされ、次いで洗浄された。次いで、プレートが飽和未満量のＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）を用いてインキュベーションされた。インキュベーション後、非結合Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）が第２のＦ塗布プレートに移され、結合後、二次抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて検出が行われた。発色が４９２ｎｍにおいて測定された。
【００９３】
１．５  コットンラットのオリゴマーＦ−Ｐｒｏｔａｎを用いた免疫付与およびそれに続くＲＳＶを用いた抗原投与
【００９４】
５匹の若い成獣コットンラット（６〜８週令）の４つの群が、４種類の異なる製剤：（ｉ）ＰＢＳ（陰性対照）、（ｉｉ）可溶性単量体Ｆ（Ｆｍｏｎ）［４μｇ／投薬］、（ｉｉｉ）ＢＬＰｓに結合された三量体Ｆ（Ｆ−Ｐ１Ｌｔｒｉ）（ＢＬＰ−Ｆｔｒｉ）［４μｇＨＡｔｒｉおよび０．５ｍｇＢＬＰ／投薬］、並びに（ｉｖ）アルミニウム塩中に処方されたホルマリン−不活化ＲＳＶワクチン（ＦＩ−ＲＳＶ）［Ｌｏｔ＃１００（１：１２５）］を用いて、１４日間隔で３回接種された。群１〜３のワクチン接種は鼻腔内接種であり、群４のワクチン接種は筋肉内接種であった。
【００９５】
０、２８および４２日目に、ウイルス中和分析のために血清が捕集された。このために、熱不活化血清が９６ウエルプレートのウエル内で連続希釈された。各ウエルに、２５〜５０プラーク形成単位（ＰＦＵ）が添加される。希釈プレートは、１時間２５〜３０℃においてインキュベーションされて、血清サンプルとウイルスとが相互作用させられた。次いで、ウイルス血清混合物は、ウイルス力価測定のためにＨＥｐ−２細胞に移される。これらの細胞はウイルス血清混合物とともに１時間インキュベーションされ、次いでメチルセルロース・オーバーレイが添加される。細胞は、４日間３７℃においてインキュベーションされた後、オーバーレイが除去される。クリスタル・バイオレット染色剤が添加され、２〜４時間２５〜３０℃において固定させられる。染色剤は冷水を用いてリンスすることにより除去される。次いで、プレートは読み取り前に完全に風乾させられる。ウエル当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ）の数が、解剖顕微鏡を用いて測定された。４２日目に、各動物に、１０５ｐｆｕ／動物のＲＳＶ／Ａ／Ｌｏｎｇを１００μＬ用いて抗原投与された。抗原投与後５日目に、動物が殺され、肺全体が摘出され、ウイルス力価測定（左切片）および組織病理学（右切片）のために解剖された。組織病理学切片は、間質性肺炎および肺胞炎について採点された。
【実施例１】
【００９６】
ＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ、Ｆ−ＰｒｏｔａｎおよびＰｒｏｔａｎ−ＮＡ融合タンパク質の発現
【００９７】
可溶性ＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ、Ｆ−ＰｒｏｔａｎおよびＰｒｏｔａｎ−ＮＡキメラ・タンパク質を哺乳動物細胞において発現するために、細胞外ドメイン−コード配列がまず適切な発現ベクターにクローン化された。ＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ融合タンパク質を発現するｐＣＤ５ベクターにおいて、ＨＡ−細胞外ドメイン配列は、シグナル・ペプチドをエンコードする配列に先行され、組み替えタンパク質の効率的な分泌が可能であり、かつ、４つのＰｒｏｔａｎ領域変異体の内の１つと、ＨＡとＰｒｏｔａｎ領域変異体の間の人工のＧＣＮ４三量体化モチーフ（ＧＣＮ４−ｐＩＩ；ＯＭＤ）とをエンコードする配列がこれに続いている（図１Ａ）．もっとも効率的に発現され、かつ分泌された３つのＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ融合タンパク質変異体（下記参照）について、ＧＣＮ４三量体化配列を欠く融合タンパク質も構築され、発現された（ＯＭＤ；図１Ｂ）。
【００９８】
Ｐｒｏｔａｎ−ＮＡキメラ・タンパク質を発現するｐＣＤ５ベクターにおいて、ＮＡ−ヘッド領域配列は、シグナル・ペプチドをエンコードする配列に先行され、組み替えタンパク質の効率的な分泌が可能であり、かつ、Ｐｒｏｔａｎ領域とＮＡ配列との間に配置された人工のＧＣＮ４四量体化モチーフ（ＧＣＮ４−ｐＬＩ；ＯＭＤ）を有するか、または有しないＰｒｏｔａｎ領域変異体（１つのＬｙｓＭ領域）をエンコードする配列がこれに続いている（図８Ａ）。
【００９９】
Ｆ−Ｐｒｏｔａｎ融合タンパク質を発現するｐＣＤ５ベクターにおいて、Ｆ−細胞外ドメイン配列は、シグナル・ペプチドをエンコードする配列に先行され、組み替えタンパク質の効率的な分泌が可能であり、かつ、１つのＬｙｓＭ領域変異体と、ＦとＬｙｓＭ領域との間の人工のＧＣＮ４三量体化モチーフ（ＧＣＮ４−ｐＩＩ；ＯＭＤ）とをエンコードする配列がこれに続いている（図１０Ａ）。ＧＣＮ４三量体化配列（ＯＭＤ）を欠き、１つおよび２つのＬｙｓＭ領域を持つ、２種類のＦ−Ｐｒｏｔａｎ融合タンパク質もそれぞれ構築し、発現させた（図１０Ｂ）。
【０１００】
人工の三量体、三量体または四量体ＧＣＮ４多量体化モチーフ（ＯＭＤ）を有し、または有しないＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ、Ｆ−ＰｒｏｔａｎおよびＰｒｏｔａｎ−ＮＡ融合タンパク質の発現は、それぞれ、発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に移入することにより達成された。ＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ、Ｆ−ＰｒｏｔａｎおよびＰｒｏｔａｎ−ＮＡタンパク質の発現および分泌は、細胞培養上清をゲル電気泳動にかけ、次いで、Ｐｒｏｔａｎ部分に対する抗体（α−ＰＡ９０）を用いるウエスタン・ブロッティングを行うことにより実証された。ＧＣＮ４領域（ＯＭＤ）を含むＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ融合タンパク質およびＦ−Ｐｒｏｔａｎ融合タンパク質は、それぞれＨＡ−ＰｔｒｉおよびＦ−Ｐｔｒｉと略称され、これらの融合タンパク質の三量体化の潜在力を示している。ＧＣＮ４領域（ＯＭＤ）を欠くＨＡ−ＰｒｏｔａｎおよびＦ−Ｐｒｏｔａｎ融合体は、それぞれＨＡ−ＰｍｏｎおよびＦ−Ｐｍｏｎと略称され、タンパク質の単量体状態を示している。同様に、Ｐｒｏｔａｎ−ＮＡ融合体は、ＧＣＮ４領域（ＯＭＤ）を含む変異体については、Ｐ−ＮＡｔｅｔと略称され、融合タンパク質の四量体化潜在力を示しており、ＧＣＮ４領域（ＯＭＤ）を欠く変異体については、Ｐ−ＮＡｍｏｎと略称され、タンパク質の単量体状態を示している。Ｘ３１およびＨ１Ｍインフルエンザ・ウイルスの両方に由来するＨＡｓのＨＡ−Ｐ変異体は、すべて、容易に発現され、かつ細胞培養培地中に効率的に分泌され、細胞内における融合タンパク質の保持はごくわずかであった。これは、ＨＡ−Ｐｔｒｉ変異体について図７Ａに示される通りである。Ｘ３１  ＨＡ−Ｐｔｒｉ融合タンパク質は、Ｈ１ＭのＨＡ−Ｐｔｒｉタンパク質と比較して若干少なく産生される。ＨＡ−スピーシーズにより発現レベルに差異が生じ得るが、一般に、Ｐ１ＬおよびＰ２Ｌに融合されたＨＡは、それぞれＰ１およびＰ２変異体と比較して、最高の産生レベルを示し、細胞内の融合タンパク質の保持はもっとも限定されているように見える。ＨＡ−Ｐｒｏｔａｎタンパク質と同様に、Ｐｒｏｔａｎ−ＮＡおよびＦ−Ｐｒｏｔａｎ変異体は、すべて、細胞培養上清中に分泌されることが見出された（図８Ｂおよび１０Ｃ）。ほんの一部の限定された細胞内保持がＧＣＮ４四量体化モチーフを含むＰｒｏｔａｎ−ＮＡ変異体について観察された（図８Ｂ）。
【０１０１】
明らかに、バクテリアＰｒｏｔａｎ領域変異体がＮ−またはＣ−末端上に存在していても、哺乳動物発現細胞によるＨＡ−およびＮＡ−オリゴマー融合タンパク質の効率的な分泌は阻害されなかった。
【実施例２】
【０１０２】
ＨＡ−ＧＣＮ−Ｐｒｏｔａｎ、Ｆ−ＧＣＮ−ＰｒｏｔａｎおよびＰｒｏｔａｎ−ＧＣＮ−ＮＡ融合タンパクのＢＬＰｓへの結合
【０１０３】
さまざまなＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ、Ｆ−ＰｒｏｔａｎおよびＰｒｏｔａｎ−ＮＡ融合タンパク質の０ＢＬＰｓへの結合特性は、過剰量のさまざまなＰｒｏｔａｎ融合タンパク質の存在下に、ＢＬＰｓへの結合を比較することにより決定された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン・ブロッティング分析により、すべてのＨＡ−Ｐｔｒｉ変異体が結合することが実証された。ＧＣＮ４領域は、単一のＬｙｓＭ領域（１Ｌ）構築物の結合特性を強く向上させる。これは、いくつかのＢＬＰｓに結合されたＨＡ−Ｐ構築物を用いた実験において実証された。図１ＣおよびＤは、重複して試験された、ＯＭＤのＧＣＮ４を欠く３つのＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ変異体：Ｐｒｏｔａｎ変異体Ｐ２Ｌｍｏｎ、Ｐｒｏｔａｎ変異体Ｐ１ＬｍｏｎおよびＰｒｏｔａｎ変異体Ｐ１ｍｏｎを、Ｐｒｏｔａｎ変異体Ｐ１Ｌｔｒｉを有する、ＧＣＮ４含有ＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ融合タンパク質と比較して示す。クマシー染色の結果（パネルＩ）は、ＧＣＮ４領域を欠く単量体構築物（Ｐ１ＬｍｏｎおよびＰ１ｍｏｎ）において、延長部がただ１つのＬｙｓＭ領域を含む場合、結合が乏しい（Ｈ１Ｍ）か、またはほとんど結合しない（Ｘ３１）ことを一貫して実証している。単量体融合タンパク質が２つのＬｙｓＭ領域を有する（Ｐ２Ｌｍｏｎ）場合、期待通り、より効率的な結合が生じた。対照的に、ＧＣＮ４を有するＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ融合タンパク質の場合、１つのＬｙｓＭ領域（Ｐ１Ｌｔｒｉ）を用いて効率的な結合がすでに達成されている。明らかに、単量体ＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ融合タンパク質とは異なり、単一のＬｙｓＭモチーフは、三量体ＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ形態の効率的な結合にとって、すでに十分である。
【０１０４】
もう一つの実験において、ＯＭＤと組み合わせられた単一のＬｙｓＭ領域を有するＨＡ構築物（ＨＡ−ＧＣＮ４−Ｐ１ＬまたはＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉ）の結合効率が、２つのＬｙｓＭ領域を有する単量体ＨＡ構築物と比較された（図３）。このために、増加する量（０〜４μｇ）の、いずれもＢＬＰｓへの効率的な結合を示した、ＨＡ−Ｐ１ＬｔｒｉおよびＨＡ−Ｐ２Ｌｍｏｎ（図１Ｃ／Ｄ参照）が一定量（０．３ｍｇ）のＢＬＰｓに結合させられた。ＨＡ−Ｐ２Ｌｍｏｎに対して使用されるのと同様の濃度において、より多くのＨＡ−Ｐ１ＬｔｒｉがＢＬＰｓに結合された。従って、オリゴマー構築物において、ＧＣＮ４といったＯＭＤと組み合わせられた単一のＬｙｓＭ領域を用いる、ＢＬＰｓへのタンパク質の結合は、単量体構築物中に２つのＬｙｓＭ領域を有する場合よりも効率的である。
【０１０５】
もう一つの実験（図５Ａ）において、ＨＡ−ＧＣＮ４−Ｐ１ＬのＢＬＰへの結合の安定性は、２〜８℃においてＰＢＳ中に長期保存して評価された。データが示すように、単一のＬｙｓＭ領域を有し、ＯＭＤと組み合わせられたＨＡ構築物は、少なくとも９ヶ月間ＢＬＰｓに安定に結合されたままであった。これは、ラハ等（Ｒａｈａ  ｅｔ  ａｌ．）（２００５）およびモエイニ等（Ｍｏｅｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１０）の観察と大きく異なる。ラハ等（Ｒａｈａ  ｅｔ  ａｌ．）（２００５）およびモエイニ等（Ｍｏｅｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１０）の実験は、単一のＬｙｓＭ領域を用いてバクテリアに結合されたタンパク質が、５日間以内貯蔵で４０％を超えるタンパク質が失われることを示した。
【０１０６】
異なるＰｒｏｔａｎ−ＮＡおよびＦ−Ｐｒｏｔａｎ融合タンパク質のＢＬＰ−結合は、単一のＬｙｓＭ領域をＯＭＤと組み合わせると効率的な結合が得られるというＨＡ構築物での観察を裏付けた。図８Ｄおよび１０Ｃにおいて、ＧＣＮ４多量体化モチーフを欠くＰ１Ｌ−ＮＡｍｏｎ、Ｐ１−ＮＡｍｏｎおよびＰ１Ｌ−Ｆｍｏｎ融合タンパク質について、結合が得られないか、または弱い結合が得られたが、これは、ＨＡ−Ｐ１ｍｏｎ構築物について観察されたのと同様である。しかしながら、明らかに、効率的なＢＬＰ結合が、Ｆ−Ｐ１Ｌｔｒｉ、Ｆ−Ｐ２ＬｍｏｎおよびＰ１Ｌ−ＮＡｔｅｔ融合タンパク質を用いた場合に観察された。
【０１０７】
対照として、ＯＭＤ自体はＢＬＰ粒子への結合を可能にしないことが示された。このために、ＨＡ−Ｓｔｒｅｐｔｒｉ−Ｐｒｏｔａｎ延長部（ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）の替わりにＳｔｒｅｐタグを担持する−の結合とＨＡ−１ＬｔｒｉのＢＬＰ粒子への結合とが比較された。図７Ｃは、ＨＡ−Ｓｔｒｅｐｔｒｉ（レーン３）がＢＬＰｓと混合されるウエスタン・ブロットを示す。ＢＬＰｓは回収され、ゲル（レーン４）上に装荷された。ＨＡ−Ｓｔｒｅｐｔｒｉの結合は生じなかった。対照的に、効率的な結合が、ＨＡ−１Ｌｔｒｉについて観察された（レーン５および６を比較されたい）。
【０１０８】
加えて、Ｈ１Ｍ（図１Ｃ）およびＸ３１ウイルス由来ＨＡタンパク質（図７Ｂ）のいずれについても、変異体ＨＡ−Ｐ１ｔｒｉ、ＨＡ−Ｐ１ＬｔｒｉおよびＨＡ−Ｐ２Ｌｔｒｉは、ＢＬＰｓにもっとも効率的に結合された。Ｈ１Ｍ１およびＸ３１  ＨＡ−Ｐ２ｔｒｉタンパク質のＢＬＰｓに対する低い結合効率が観察された。これは、ＬｙｓＭ領域とＯＭＤ領域との間のリンカーを欠くＰ１−ＮＡｔｅｔ構築物についても観察され、弱い結合が示された。明らかに、ＬｙｓＭ領域とＯＭＤとの間のリンカー領域が、ＢＬＰｓに適切に結合するために必要である。
【０１０９】
単量体ＡｃｍＡにおいて観察される天然の状況では、３つの連続した分子内のＬｙｓＭ領域（シス配置）が効率的な結合を促進している。この数が１つのＬｙｓＭ領域に減少すると、結合能力が強く低下する（ボスマ等（Ｂｏｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．）［２００６］）とともに、安定性が低下する（ラハ等（Ｒａｈａ  ｅｔ  ａｌ．）［２００５］およびモエイニ等（Ｍｏｅｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）［２０１０］）。総合すれば、これらの結果から示されることは、単一のＬｙｓＭ領域が高効率のおよび高安定性のＢＬＰｓへの結合を促進することができるのは、中に配置され、それぞれが単一のＬｙｓＭ領域を含むサブユニットがＯＭＤにより多量体化される多量体分子間構造（コンフォメーション）（ＬｙｓＭ領域はトランス配置で相互作用する）中に配置されている場合である。さらに、ＬｙｓＭ領域とＯＭＤとの間に存在するリンカー領域は、産生と結合能力とをさらに向上する。
【０１１０】
単一のＬｙｓＭ領域の使用にはいくつかの利点がある。（ｉ）結合領域の大きさが低減する。（ｉｉ）２以上のＬｙｓＭ領域が使用される場合に依然として該当するように、免疫源性が劣る単量体融合体の結合が防止される（ＨＡ−Ｐ１ＬｍｏｎはＢＬＰｓに結合しない、対、ＨＡ−Ｐ２ＬｍｏｎはＢＬＰｓに結合する、図１ＣおよびＤ、パネルＩおよびＩＩ参照；Ｆ−Ｐ１ＬｍｏｎはＢＬＰｓに結合する、対、ＨＡ−Ｐ２ＬｍｏｎはＢＬＰｓに結合する、図１０Ｃ参照）。ここに、単一のＬｙｓＭ領域は、融合タンパク質の疫源性にもっとも関連性がある（すなわち多量体）形態の選択的結合を促進する（２参照）。
【実施例３】
【０１１１】
ＨＡ−ＧＣＮ−ＰｒｏｔａｎおよびＰｒｏｔａｎ−ＧＣＮ−ＮＡ融合タンパク質の機能
【０１１２】
融合タンパク質のオリゴマー状態
【０１１３】
人工のＯＭＤ、三量体または四量体ＧＣＮ４多量体化モチーフを有するか、または有しないＨＡ−ＰｒｏｔａｎおよびＰｒｏｔａｎ−ＮＡタンパク質のオリゴマー状態が、それぞれ、青色天然ゲル電気泳動により分析された。ＢＬＰｓに結合することが示されているＨＡ−Ｐｒｏｔａｎ融合タンパク質、すなわち、Ｈ１Ｍウイルス由来ＨＡ−Ｐ１ｔｒｉおよびＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉタンパク質のサンプルが１０秒間、３０秒間または３分間煮沸されて、ＨＡ三量体が解離させられる。ＨＡ−Ｐｔｒｉタンパク質は、すべて、短時間加熱される（１０秒間煮沸）とゲル中を三量体の移動度に従う移動度で移動し、これらのＨＡ−三量体は、長時間サンプル煮沸後、二量体および単量体形態に解離した（図１Ｅ、左側パネル）。ＨＡ−Ｐ１ｔｒｉおよびＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉ三量体はサンプルの長時間煮沸後でさえも検出可能のままであった。対照的に、均等なＨＡ−Ｐｍｏｎ変異体は、すべて、モノマーの移動度で移動した。加えて、これらのＨＡ−Ｐｍｏｎタンパク質の大部分は、変化し得るが、場合によって、高分子量の会合体を形成する強い傾向を示す（図１Ｅ、右側パネル、アステリスクによって示される）。これは、たいがいこれらの非天然タンパク質の弱い折り畳みと低い安定性の結果である。
【０１１４】
ＧＣＮ４を有するか、または有しないＰ１Ｌ−ＮＡ変異体のサンプルが青色天然ゲル電気泳動により分析された（図８Ｃ）。大部分のＰ１Ｌ−ＮＡｍｏｎタンパク質はモノマーとして移動し、その一部分は二量体として移動した。しかしながら、四量体は検出できなかった。Ｐ１Ｌ−ＮＡｔｅｔタンパク質は四量体に従って移動し、モノマーまたは二量体は検出されなかった。
【０１１５】
これらのデータから明らかに実証されるように、天然の四次構造を有する安定なオリゴマー・タンパク質を得るのに、ＧＣＮ４モチーフといったＯＭＤの存在が必要とされる。
【０１１６】
融合タンパク質の生物活性
【０１１７】
粒子に存在する天然のＨＡの生物活性は、赤血球を用いる血球凝集反応試験により評価することができる（図４Ａ）。この試験で、ＨＡタンパク質のシアール酸受容体結合機能−三量体ＨＡによってのみ示される生物学的性質−が評価される。上述の試験における血球凝集が、ＢＬＰｓに結合されたＨＡモノマーの存在よりもＢＬＰｓに結合されたＨＡオリゴマーの存在に決定的に依存することを実証するために、ＨＡ−Ｐ１ＬｔｒｉおよびＨＡ−Ｐ２Ｌｍｏｎ（ともにＨ１Ｍ）がＢＬＰｓ結合された。図４Ｂに明らかに示されるように、ＢＬＰｓに結合されたＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉは、濃度依存的に赤血球細胞の凝集を引き起こすことができる（レーン３〜６）が、ＢＬＰｓに結合されたＨＡ−Ｐ２Ｌｍｏｎはこの凝集を引き起こすことができない（レーン８〜１１）。これらの結果は、明らかに、ＢＬＰｓに結合されたＨＡのオリゴマー形態のみが生物活性を有することを示している。
【０１１８】
可溶性単量体並びにオリゴマーＰ１−ＮＡおよびＰ１Ｌ−ＮＡタンパク質の生物機能の検討が、シアール酸付加された血糖タンパク質フェチュインを基質とした固相結合試験を用いてそれらのシアリダーゼ活性を測定することにより行われた。Ｐｒｏｔａｎ−ＮＡによるデシアリレーションが、ＰＮＡレクチン結合活性を用いて測定された。詳細は「物質と方法」の項に説明されている。図９に示されるように、ＧＣＮ４四量体化モチーフを含むＰｒｏｔａｎ−ＮＡｔｅｔタンパク質は濃度に依存したシアリダーゼ活性を示した。ＧＣＮ４四量体化モチーフ（Ｐ−ＮＡｍｏｎ）を欠くＰｒｏｔａｎ−ＮＡ融合タンパク質については、シアリダーゼ活性は見出されなかった。これらの結果から明らかに実証されるように、Ｐｒｏｔａｎ−ＮＡのオリゴマー（単量体ではない）形態が機能を有する。
【０１１９】
結論として、異なるＰｒｏｔａｎ変異体に融合された、生物活性を有する可溶性三量体ＨＡおよび可溶性四量体ＮＡタンパク質が、哺乳動物細胞において効率的に製造された。ＢＬＰｓへの効率的な結合は、融合タンパク質がＧＣＮ４オリゴマー化領域といったＯＭＤを含む限り、１つのＬｙｓＭ領域を用いてすでに達成されている。換言すれば、単一のＬｙｓＭ領域に媒介される効率的な結合は、オリゴマー状態で存在するタンパク質に依存し、かつ該タンパク質を選別する。さらにオリゴマー状態でＢＬＰに結合されたタンパク質は、天然のタンパク質に類似の生物活性を示す。
【実施例４】
【０１２０】
微粒子型オリゴマーＨＡ−Ｐｒｏｔａｎの抗原性
【０１２１】
ＢＬＰｓ（ＢＬＰ−ＨＡｔｒｉ）に結合された三量体ＨＡ（ＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉ）の抗原性がマウスにおいて２回の筋肉内投与後に評価された。使用されたＨＡ亜型は、Ｈ１Ｍである。ＢＬＰ−ＨＡｔｒｉ粒子状製剤が、可溶性三量体ＨＡ（ＨＡｔｒｉ）およびＢＬＰと混合された可溶性三量体ＨＡ（ＢＬＰ＋ＨＡｔｒｉ）と比較された。製剤中のＨＡｔｒｉの量は０．３３μｇ／投薬であった。二次免疫付与後１０日目に、ＥＬＩＳＡ分析のために血清が捕集され、群毎にプールされ、抗Ｈ１ＭＩｇＧ応答が決定された。図６Ａの結果から明らかなように、ＢＬＰ−ＨＡ粒子状製剤は、可溶性三量体ＨＡ（ＨＡｔｒｉ）およびＢＬＰと混合された可溶性三量体ＨＡ（ＢＬＰ＋ＨＡｔｒｉ）と比較して、血清ＨＡ−特異的ＩｇＧ応答に関してもっとも免疫源性の高い製剤であった。しかしながら、関連性がより高いのは、ＢＬＰｓに結合された三量体ＨＡ（ＢＬＰ−ＨＡｔｒｉ）はＢＬＰｓに結合された単量体ＨＡ（ＢＬＰ−ＨＡｍｏｎ）と比較して、血球凝集阻害（ＨＩ）力価として測定される機能性抗体力価が高いという観察（図６Ｂ）である。加えて、ＢＬＰｓに結合された三量体ＨＡ（ＢＬＰ−ＨＡｔｒｉ）だけが、鼻の粘膜分泌物中に有意のレベルのＨＡ−特異的に分泌されたＩｇＡ（Ｓ−ＩｇＡ）を生じさせた。これらの結果は、たぶん、ＢＬＰｓに結合された三量体ＨＡ（ＢＬＰ−ＨＡｔｒｉ）の正しい折り畳みと機能の反映である。
【０１２２】
従って、結合された天然オリゴマー抗原組成物を含む粒子状ＢＬＰ製剤−ＯＭＤと単一のＬｙｓＭ領域の使用により確立された−は、可溶性オリゴマー結合製剤および単量体結合製剤よりも免疫源性が高く、かつ効能が強くかつ定性的により関連性が高い応答を生じさせる。
【実施例５】
【０１２３】
微粒子型オリゴマーＦ−Ｐｒｏｔａｎの抗原性、効能および安全性
【０１２４】
ＢＬＰｓ結合された三量体Ｆ（ＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉ）の（ＢＬＰ−Ｆｔｒｉ）に対する抗原性が、マウスにおいて３回の鼻腔内投与を行った後に評価が行われた。ＢＬＰ−Ｆｔｒｉ粒子状製剤の３つの用量（０．６および２．２μｇ／投薬）が使用された。三次免疫付与後１０日目に、血清が捕集され、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）競合ＥＬＩＳＡ分析（図１１Ａ）のために群毎にプールされ、抗Ｆ抗体反応が決定された。この試験では、マウスにおいて中和Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）抗体により認識されるＦエピトープに結合するワクチンにより誘発された抗体は、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）の結合を阻害する。従って、試験において測定される非結合Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）の量は、ワクチンにより生成されたＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）様抗体の測定手段である。図１１Ｂの結果が明らかに示すように、ＢＬＰｓに結合された三量体Ｆ（ＢＬＰ−Ｆｔｒｉ）は、用量に応じた方法でＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）様抗体を生じさせる。前免疫血は、期待されるように陰性であった。
【０１２５】
結論として、結合された天然オリゴマーＦ抗原を含む粒子状ＢＬＰ製剤−ＯＭＤと単一のＬｙｓＭ領域の使用により確立された−は、免疫源性が高く、中和型抗体を生じさせる。
【０１２６】
コットンラットは、疾患の昂進として知られる、１９６０年代におけるＲＳＶワクチンの失敗に関連した悲惨な病理学の結果をきっちりと繰り返している。１９６０年代、米国では、アルミニウム塩中に処方されたホルマリン−不活化ＲＳＶワクチン（ＦＩ−ＲＳＶ）を用いて乳児に試験が行われた。引き続き行われる天然のＲＳＶへの暴露の際に、ワクチンを接種された乳児におけるウイルス感染率は、パラインフルエンザ・ワクチンを接種された対照群における感染率よりも下回ることはなかった（そして、おそらく高くさえあった）。もっとも注目すべきことに、ＲＳＶワクチン接種者の８０％が入院を必要としたのに対して、対照パラインフルエンザ・ワクチン接種者の内わずか５％のそのような感染が入院を必要とした。ワクチン接種した乳児の内２名が死亡した。従って、保護するというよりは、むしろ、ＦＩ−ＲＳＶは天然のＲＳＶ感染源に暴露された際に幼い乳児に悪化した疾患を引き起こす悪名高いワクチン候補であった。ＦＩ−ＲＳＶをコットンラットに投与した後、ＲＳＶに感染させると、その結果、間質性肺炎および肺胞炎により特徴づけられる（肺）疾患が同等に昂進された。このため、コットンラットにおけるＲＳＶワクチンという概念の安全性試験（昂進される疾患の不存在）がＲＳＶワクチンの開発における必須の工程である。
【０１２７】
ＢＬＰｓに結合された三量体Ｆ（ＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉ）（ＢＬＰ−Ｆｔｒｉ）の効能および安全性（昂進された疾患の兆候の欠落）が、コットンラットにおいて３回の鼻腔内投与を行った後に評価され、単量体Ｆ（Ｆｍｏｎ）と比較された。ワクチンにより生成された血清抗体のＲＳＶの複製を阻害する能力が、それぞれのワクチンの投与後１４日目に採取されたサンプルにおけるウイルス中和試験において決定された。安全性の評価のために、アルミニウム塩中に処方されたホルマリン−不活化ＲＳＶワクチン（ＦＩ−ＲＳＶ）が、追加の動物群に筋肉内投与された。ＦＩ−ＲＳＶは、既知のコットンラットの肺に、昂進された疾患（間質性肺炎および肺胞炎）の兆候に関連した疾患を生じさせることが知られている。最終免疫付与後１４日目に、各動物にＲＳＶを用いて抗原投与が行われた。抗原投与後５日目に、動物が殺され、ウイルス力価の決定のために、肺が摘出され、ウイルス中和力価並びに組織病理学による間質性肺炎および肺胞炎の採点が行われた。結果から明らかに示される（図１２Ａ）ように、ＢＬＰｓに結合された三量体Ｆ（ＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉ）（ＢＬＰ−Ｆｔｒｉ）は、単量体Ｆ（Ｆｍｏｎ）と比較して、肺のウイルス力価を低減するのに効果がある。この観察は、ＢＬＰ−Ｆｔｒｉを接種された動物からの血清のウイルス中和能力がＦｍｏｎのウイルス中和能力と比較して高いことと非常によく相関している（図１２Ｂ）。重要なのは、ＢＬＰｓに結合された三量体Ｆ（ＨＡ−Ｐ１Ｌｔｒｉ）（ＢＬＰ−Ｆｔｒｉ）の向上した有効能は、昂進された疾患（肺における間質性肺炎および肺胞炎）の兆候の欠落−本モデルにおけるＦＩ−ＲＳＶの使用にとって典型的である−と関連している（図１２Ｃ）。
【０１２８】
結論として、結合された天然オリゴマーＦ抗原を含む粒子状ＢＬＰ製剤−ＯＭＤと単一のＬｙｓＭ領域との使用により確立される−は効能が高く、ウイルス中和抗体を生じさせ、かつ十分な安全性プロファイルを有する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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