(57)【要約】既存の粒子定量化法の限界を克服するために、本発明者らは、ディスク遠心分離を検出器と組み合わせて用いて、粒子、特に、ウイルス粒子を定量化した。また、ディスク遠心分離機を用いて粒子密度を決定するための方法も提供される。この方法は、ウイルス粒子密度を決定するのに特に有用である。また、粒子密度に基づき粒子サイズを推定する方法も提供される。上記方法は、（ａ）試料中の粒子をディスク遠心分離により分離する（例えば、密度勾配、好ましくはスクロース密度勾配を用いて）ステップと、（ｂ）粒子検出器を用いて粒子を検出するステップと、（ｃ）粒子サイズ分布を測定するステップと、（ｄ）（ｉ）単一モードのサイズ分布の存在に基づき、非凝集ウイルス粒子の存在または非存在を同定し、かつ／または（ｉｉ）多モードのサイズ分布の存在に基づき、凝集ウイルス粒子の存在または非存在を同定するステップなどとを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ディスク遠心分離機を用いて試料中のウイルス粒子を定量化するための方法。
【請求項２】
前記ウイルス試料が、非凝集ウイルス粒子および／または凝集ウイルス粒子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ．前記試料中の粒子をディスク遠心分離により分離するステップ；
ｂ．粒子検出器を用いて前記粒子を検出するステップ；
ｃ．粒子サイズ分布を測定するステップ；
ｄ．ｉ．単一モードのサイズ分布の存在に基づき、非凝集ウイルス粒子の存在または非存在を同定し、かつ／または
ｉｉ．多モードのサイズ分布の存在に基づき、凝集ウイルス粒子の存在または非存在を同定するステップ；
ｅ．ｉ．非凝集ウイルス粒子を含む試料について、前記サイズ分布の最大重量および／もしくは前記サイズ分布の積分重量を決定するか、または
ｉｉ．凝集ウイルス粒子を含む試料について、前記サイズ分布の積分重量を決定するステップ；
ｆ．（ｉ）前記試料についての前記サイズ分布の前記最大重量を、参照のサイズ分布の最大重量と比較し、かつ／または（ｉｉ）前記試料についての前記サイズ分布の前記積分重量を、参照のサイズ分布の積分重量と比較し、これにより、前記試料中の前記ウイルス粒子を定量化するステップ；
を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項３の（ａ）において、密度勾配、好ましくはスクロース密度勾配を用いて前記粒子を分離する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記密度勾配が、
ａ）塩、好ましくは塩化ナトリウム、および／または
ｂ）バッファー、好ましくはリン酸ナトリウム
をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
分離流体のｐＨがｐＨ３〜９の間である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記試料を、生物学的分子に対する特異性を増強させてあり、検出可能な標識を含む化合物で処理する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記検出可能な標識が蛍光標識である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記粒子検出器が蛍光検出器である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ディスク遠心分離機が光沈降速度計である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記粒子検出器が、３００〜６００ｎｍの範囲の検出波長を用いる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
元のウイルス出発材料より小さい粒子サイズの比率において相対的増大を検出することにより、ウイルス粒子全体が破壊されたのかどうかを検出するための、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
試料中の汚染ウイルス粒子の存在または非存在を検出するための、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
試料中の汚染微生物粒子の存在または非存在を検出するための、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料が、分割剤で処理されている、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料が、分割された粒子を含むのかどうかを決定するための、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
化合物の分割効率を決定するための、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
生物学的粒子の分割に対する感受性を決定するための、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
抗原が（１または複数の）アジュバント粒子へと吸着されているのかどうかを同定するための、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記試料中における、（１または複数の）アジュバント粒子へと吸着されている抗原の比率を同定するための、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）アジュバント粒子および抗原を含む試料へと、（ｉ）アジュバント粒子には結合するが、（ｉｉ）可溶性抗原には結合せず、（ｉｉｉ）検出可能な標識を含む（１または複数の）化合物を導入するステップと、
（ｂ）前記試料中の粒子をディスク遠心分離により分離するステップと、
（ｃ）（１または複数の）前記検出可能な標識を検出するのに適する粒子検出器を用いて前記粒子を検出するステップと、
（ｄ）粒子サイズ分布を測定するステップと、
（ｅ）（ｉ）抗原へと吸着されていないアジュバント粒子、
および／または
（ｉｉ）抗原が吸着されているアジュバント粒子
に対応する（１または複数の）粒子サイズ分布の存在または非存在を同定するステップと、場合により、
（ｆ）抗原が吸着されているアジュバント粒子の比率を同定するステップと
を含む、請求項２０または請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アジュバントがアルミニウム塩である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）アジュバント粒子および抗原を含む試料へと、（ｉ）抗原には結合するが、（ｉｉ）アジュバントには結合せず、（ｉｉｉ）検出可能な標識を含む（１または複数の）化合物を導入するステップと、
（ｂ）前記試料中の粒子をディスク遠心分離により分離するステップと、
（ｃ）（１または複数の）前記検出可能な標識を検出するのに適する粒子検出器を用いて前記粒子を検出するステップと、
（ｄ）粒子サイズ分布を測定するステップと、
（ｅ）（ｉ）アジュバントへと吸着されていない抗原、
および／または
（ｉｉｉ）アジュバント粒子へと吸着されている抗原
に対応する（１または複数の）粒子サイズ分布の存在または非存在を同定するステップと、場合により、
（ｆ）アジュバントへと吸着されている抗原の比率を同定するステップと
を含む、請求項２０から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
（ｉ）抗原には結合するが、（ｉｉ）アジュバントには結合せず、（ｉｉｉ）検出可能な標識を含む（１または複数の）前記化合物が、タンパク質特異的および／または核酸特異的である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ワクチンの製造における使用のための、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ウイルス粒子の定量化をリアルタイムで実施する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ワクチンを製造するためのプロセスであって、
（ｉ）先行する請求項のいずれか一項に記載の方法を用いることにより、バルク材料から採取される試料中の非凝集ウイルス粒子および／または凝集ウイルス粒子を定量化するステップと、
（ｉｉ）場合により、前記試料中のウイルス粒子の量に基づき、前記バルク材料中の前記ウイルス粒子の濃度を、ワクチン組成物中で用いるのに適する濃度へと調整するステップと、
（ｉｉｉ）前記ワクチンを前記バルク材料から調製するステップと
を含む、プロセス。
【請求項２９】
ディスク遠心分離機を用いて粒子密度および／または粒子サイズを決定するための方法であって、
ａ．少なくとも２つの異なる分離流体中の試料の沈降速度を測定するステップであって、前記流体が、異なるレオロジー特性を有する、ステップ；
ｂ．回帰分析、好ましくは線形回帰分析を実施するステップ、
を含む方法。
【請求項３０】
粒子の沈殿速度を決定するための方法であって、
ａ．沈降出発点から検出器までの距離を測定するステップ；
ｂ．保持時間を決定するステップ；
ｃ．ステップ（ａ）から得られる値を、ステップ（ｂ）から得られる値で除するステップ、
を含む、方法。
【請求項３１】
密度および／またはサイズの変化において現れる精子形態の同定に使用するための、請求項２９または請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
（ｉ）精液試料中の精子の密度および／またはサイズを参照と比較するステップと、（ｉｉ）前記精液試料中の非典型的な精子の密度および／またはサイズの同定とを含む、請求項３１に記載の方法、
精液試料中の精子粒子を特徴付ける方法であって、
（ａ）前記精液試料中の粒子を、ディスク遠心分離により分離するステップと、
（ｂ）粒子検出器を用いて前記粒子を検出するステップと、
（ｃ）粒子サイズ分布を測定するステップと、
（ｄ）ｉ．単一モードのサイズ分布の存在に基づき、非凝集精子粒子の存在または非存在を同定し、かつ／または
ｉｉ．多モードのサイズ分布の存在に基づき、凝集精子粒子の存在または非存在を同定し、ならびに／あるいは
ｉｉｉ．非凝集精子粒子を含む試料について、前記サイズ分布の最大重量および／もしくは前記サイズ分布の積分重量を決定するか、または
ｉｖ．凝集精子粒子を含む試料について、前記サイズ分布の積分重量を決定するステップと、
ｖ．前記試料についての前記サイズ分布の最大重量を、参照のサイズ分布の最大重量と比較するか、または
ｖｉ．前記試料についての前記サイズ分布の積分重量を、参照のサイズ分布の積分重量と比較し、
これにより、前記試料中の前記ウイルス粒子を定量化するステップと、
場合により、
（Ａ）精子粒子のサイズの変動および／または精子粒子の密度の変動を測定するステップと、
（Ｂ）前記精子粒子のサイズの変動および／または精子粒子の密度の変動を、参照の精子粒子のサイズの変動および／または精子粒子の密度の変動と比較し、
これにより、前記試料中の均質でない精子集団の存在または非存在を同定するステップと
を含む、方法。
【請求項３３】
密度および／またはサイズの変化において現れる精子形態を、ディスク遠心分離機を用いて同定する方法であって、
ａ．精液試料中の精子粒子の沈降速度を測定するステップと、
ｂ．前記精液試料中の精子粒子の前記沈降速度を、沈降速度が公知である参照の沈降速度と比較するステップと、
ｃ．前記精液試料中の前記精子粒子の観察された沈降速度が、前記精液試料中の前記精子粒子の、前記参照に基づき予測される沈降速度と異なるのかどうかを同定するステップと
を含む、方法。
【請求項３４】
生物学的試料中の異常な粒子サイズ、異常な粒子密度、および／または異常な粒子量を、ディスク遠心分離機を用いて同定する方法であって、
ａ．生物学的試料の粒子サイズ分布を測定するステップと、
ｂ．前記生物学的試料の前記粒子サイズ分布を、対照の粒子サイズ分布と比較するステップと、
ｃ．前記生物学的試料中の前記粒子の前記粒子サイズ分布が、対照試料の粒子サイズ分布と異なるのかどうかを同定するステップと、
ｄ．前記生物学的試料が、前記対照と比較して、異常に高レベルの粒子を含有するのか、異常に低レベルの粒子を含有するのか、正常レベルの粒子を含有するのかを決定するステップと
を含む、方法。
【請求項３５】
前記生物学的試料が、精子試料、血液試料、または唾液試料である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
先行する請求項のいずれか一項に記載の方法による使用のための、ディスク遠心分離機。
【請求項３７】
請求項２６もしくは請求項２７に記載の方法または請求項２８に記載のプロセスにより作製されるワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の定量化の分野、特に、ウイルスの定量化の分野にある。
【背景技術】
【０００２】
当技術分野では、ウイルスを定量化するための方法が周知である。ウイルスおよびそれらの凝集体をカウントおよびサイズ決定する能力は、ウイルスの作製およびウイルスワクチンの開発においてますます重要となりつつある。ワクチンの作製において遭遇することが多い問題は、ウイルスの凝集であり、試料中の非凝集（単量体）ウイルス材料および凝集ウイルス材料の相対濃度を決定することが重要である。純度および濃度を知ることは、例えば、作製プロセスの最適化および最終生成物中のウイルス投与量のより正確な計算を可能とする。
【０００３】
ウイルス定量化のためには、多数の方法が利用可能であるが、限界は各々の方法と関連する。さらに、非凝集ウイルス材料および／または凝集ウイルス材料を定量化するための迅速で簡便な手段も提供されていない。
【０００４】
従来のウイルス定量化技法は、緩慢で労力集約的であった。ウイルス滴定アッセイおよびプラークアッセイなどの感染性アッセイは、ウイルスを定量化するための標準的な方法であるが、最大で３〜４日間を要する可能性があり、労力集約的な手作業によるカウント作業を必要とする。蛍光フォーカスアッセイ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｆｏｃｕｓ  ａｓｓａｙ）など、プラークアッセイの変法は、インキュベーション時間の短縮を可能とするが、やはりほぼ２４時間を要する。感染性アッセイに関する別の問題は、それらに、凝集ウイルスと非凝集ウイルスとを識別することが不可能なことである。例えば、プラーク形成単位は、単一のビリオンに由来する場合もあり、複数の感染性ウイルスを含有する単一の凝集体に由来する場合もある。したがって、感染性アッセイは、調製物中の感染性ウイルス含量を過小評価する可能性があり、ウイルス粒子の量（感染性ウイルス粒子および非感染性ウイルス粒子）を決定できない可能性がある。
【０００５】
一部の代替的な技法は、これらの従来の技法より迅速であるが、それらもまた、多数のさらなる欠点と関連する。例えば、一元放射免疫拡散アッセイ（ＳＲＤ）またはヘマグルチニンアッセイなどのタンパク質アッセイは、ウイルス定量化のための迅速な手段を提供しうるが、タンパク質を測定するものであり、ウイルス粒子を測定するものではないという点で、ウイルス濃度の間接的な測定を提供するにとどまる。それらはまた、凝集ウイルスと非凝集ウイルスとを識別することも不可能である。透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を用いて、ウイルスを定量化することができ、また、凝集ウイルスと非凝集ウイルスとの比率も決定することができるが、測定器の費用が高額であり、その操作には大規模な場所および人員が要求されることにより、その一般的な適用は限定されている。
【０００６】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、ウイルス定量化のための現行の「ゴールドスタンダード」を表す。ｑＲＴ−ＰＣＲは、存在度の低い試料の定量化が可能なことの利益を有するが、比較的緩慢であり、特に、存在度の低い試料では、少なくとも２時間を要することが典型的である。ＰＣＲベースの技法はまた、標的核酸だけを測定するものであり、ウイルス濃度を直接測定できないという点でも限定されている。多くの状況では、ウイルスタンパク質の量だけが重要であり、これは、ウイルス粒子の総量と常に関係するわけではなく、核酸の濃度と常に関係するわけでもない。さらに、ＰＣＲベースの技法は、無傷のビリオンと溶液中の「遊離」核酸とを弁別することができず、ｑＲＴ−ＰＣＲにより得られる測定値と、例えば、プラークアッセイにより得られる測定値との間に矛盾をもたらすことが多い。実際、無傷のビリオンと遊離核酸との比が一定であることは稀であるので、ｑＲＴ−ＰＣＲにより得られる測定値は、試料を得る方法に応じて変動しやすい可能性がある。例えば、複数の破壊された生存不可能なウイルスを含有する試料は、ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定されると、人為的に高値の結果をもたらすであろう。これに対し、ウイルスの不活化（例えば、ベータ−プロピオラクトンによる）は、ウイルスＲＮＡを損傷する可能性があり、これは、測定されるウイルス濃度をはるかに低くする。ｑＲＴ−ＰＣＲはまた、凝集ウイルスと非凝集ウイルスとを識別することも不可能である。したがって、ウイルス定量化のためのゴールドスタンダードの技法であってもなお、多数の重大な限界に阻まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の限界を考慮して、試料中の非凝集ウイルス材料および／または凝集ウイルス材料を定量化するためのさらなる改善された方法を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
既存のウイルス定量化技法の限界を克服するために、本発明者らは、ディスク遠心分離を検出器と組み合わせて用いて、ウイルス粒子を定量化した。したがって、本発明は、ディスク遠心分離機を用いて試料中のウイルス粒子を定量化するための方法を提供する。
【０００９】
一実施形態では、ウイルス試料が、非凝集ウイルス粒子および／または凝集ウイルス粒子を含む。
【００１０】
一実施形態では、上記方法は、（ａ）試料中の粒子をディスク遠心分離により分離する（例えば、密度勾配、好ましくはスクロース密度勾配を用いて）ステップと、（ｂ）粒子検出器を用いて粒子を検出するステップと、（ｃ）粒子サイズ分布を測定するステップと、（ｄ）（ｉ）単一モードのサイズ分布の存在に基づき、非凝集ウイルス粒子の存在または非存在を同定し、かつ／または（ｉｉ）多モードのサイズ分布の存在に基づき、凝集ウイルス粒子の存在または非存在を同定するステップと、（ｅ）非凝集ウイルス粒子を含む試料について、（ｉ）サイズ分布の最大重量および／もしくは（ｉｉ）サイズ分布の積分重量を決定するか、または凝集ウイルス粒子を含む試料について、サイズ分布の積分重量を決定するステップと、（ｆ）（ｉ）試料についてのサイズ分布の最大重量を、参照のサイズ分布の最大重量と比較し、かつ／または（ｉｉ）試料についてのサイズ分布の積分重量を、参照のサイズ分布の積分重量と比較し、これにより、試料中のウイルス粒子を定量化するステップとを含む。密度勾配は、塩、好ましくは塩化ナトリウムおよび／またはバッファー、好ましくはリン酸ナトリウムをさらに含みうる。一部の実施形態では、分離流体のｐＨが、ｐＨ３〜９の間である。
【００１１】
一部の実施形態では、試料を、生物学的分子に対して増強した特異性を有し、かつ検出可能な標識を含む化合物で処理する。検出可能な標識が蛍光標識である場合、粒子検出器は、蛍光検出器であることが好ましい。
【００１２】
一部の実施形態では、ディスク遠心分離機が光沈降速度計である。一部の実施形態では、粒子検出器が、３００〜６００ｎｍの範囲の検出波長を用いる。
【００１３】
一部の実施形態では、ウイルスがインフルエンザウイルスである。
【００１４】
一部の実施形態では、上記方法を用いて、元のウイルス出発材料より小さい粒子サイズの比率において相対的増大を検出することにより、ウイルス粒子全体が破壊されたのかどうかを検出する。
【００１５】
一部の実施形態では、上記方法を用いて、試料中の汚染ウイルス粒子の存在または非存在を検出する。
【００１６】
一部の実施形態では、上記方法を用いて、試料中の汚染微生物粒子の存在または非存在を検出する。
【００１７】
一部の実施形態では、試料が、分割剤で処理されている。このような場合、上記方法により、試料が、分割された粒子を含むのかどうかを決定することができる。上記方法はまた、化合物の分割効率を決定するのにも用いることができる。上記方法はまた、生物学的粒子の分割に対する感受性を決定するのにも用いることができる。
【００１８】
一部の実施形態では、上記方法は、（１または複数の）抗原粒子が、（１または複数の）アジュバント粒子へと吸着されているのかどうかを同定するための方法である。上記方法は、試料中の（１または複数の）アジュバント粒子へと吸着されている抗原粒子の比率を同定するために用いることができる。
【００１９】
例えば、上記方法は、（ａ）アジュバント粒子および抗原を含む試料へと、（ｉ）アジュバント粒子には結合するが、（ｉｉ）可溶性抗原には結合せず、（ｉｉｉ）検出可能な標識を含む（１または複数の）化合物を導入するステップと、（ｂ）試料中の粒子をディスク遠心分離により分離するステップと、（ｃ）（１または複数の）検出可能な標識を検出するのに適する粒子検出器を用いて粒子を検出するステップと、（ｄ）粒子サイズ分布を測定するステップと、（ｅ）（ｉ）抗原へと吸着されていないアジュバント粒子、および／または（ｉｉ）抗原が吸着されているアジュバント粒子に対応する（１または複数の）粒子サイズ分布の存在または非存在を同定するステップと、場合により、（ｆ）抗原が吸着されているアジュバント粒子の比率を同定するステップとを含む。アジュバントは、アルミニウム塩であることが好ましい。
【００２０】
上記方法はまた、（ａ）アジュバント粒子および抗原を含む試料へと、（ｉ）抗原には結合するが、（ｉｉ）アジュバントには結合せず、（ｉｉｉ）検出可能な標識を含む（１または複数の）化合物を導入するステップ、（ｂ）試料中の粒子をディスク遠心分離により分離するステップ、（ｃ）（１または複数の）検出可能な標識を検出するのに適する粒子検出器を用いて粒子を検出するステップ、（ｄ）粒子サイズ分布を測定するステップ、（ｅ）（ｉ）アジュバントへと吸着されていない抗原、および／または（ｉｉ）アジュバント粒子へと吸着されている抗原に対応する（１または複数の）粒子サイズ分布の存在または非存在を同定するステップ、ならびに、場合により、（ｆ）アジュバントへと吸着されている抗原の比率を同定するステップも含みうる。（ｉ）抗原には結合するが、（ｉｉ）アジュバントには結合せず、（ｉｉｉ）検出可能な標識を含む（１または複数の）化合物は、タンパク質特異的および／または核酸特異的であることが好ましい。
【００２１】
一部の実施形態では、上記方法は、ワクチンの製造における使用のための方法であり、ウイルス粒子の定量化をリアルタイムで実施することができる。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、ワクチンを製造するための方法であって、（ｉ）バルク材料から採取される試料中の非凝集ウイルス粒子および／または凝集ウイルス粒子を、本発明の方法を用いることにより定量化するステップと、（ｉｉ）場合により、バルク材料中のウイルス粒子濃度を、試料中のウイルス粒子の量に基づき、ワクチン組成物中で用いるのに適する濃度へと調整するステップと、（ｉｉｉ）ワクチンをバルク材料から調製するステップとを含む方法を提供する。本発明はまた、ワクチン組成物も提供する。
【００２３】
また、ディスク遠心分離機を用いて粒子密度を決定するための方法、および粒子密度に基づき粒子サイズを推定する方法も提供される。別の実施形態では、本発明は、ディスク遠心分離機を用いて粒子密度および／または粒子サイズを決定するための方法であって、（ａ）少なくとも２つの異なる分離流体中の試料の沈降速度（ｓｅｔｔｌｉｎｇ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ）を測定するステップであって、前記流体が、異なるレオロジー特性を有する、ステップと、（ｂ）回帰分析、好ましくは線形回帰分析を実施するステップとを含む方法を提供する。
【００２４】
一部の実施形態では、粒子の沈殿速度（ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ）を決定するための方法であって、（ａ）沈降出発点から検出器までの距離を測定するステップと、（ｂ）保持時間を決定するステップと、（ｃ）ステップ（ａ）から得られる値を、ステップ（ｂ）から得られる値で除するステップとを含む方法が提供される。
【００２５】
本発明の方法は、例えば、密度および／またはサイズの変化において現れる精子形態（下記を参照されたい）を、ディスク遠心分離機を用いて決定するのに有用であり、（ａ）少なくとも２つの異なる分離流体中の、精液試料中の精子粒子の沈降速度を測定するステップであって、前記流体が、異なるレオロジー特性を有する、ステップと、（ｂ）回帰分析、好ましくは線形回帰分析を実施するステップとを含む。精液試料中の精子の密度および／またはサイズを、参照（例えば、典型的な精子の寸法および／もしくは密度についての教科書中の参照、および／または対照の精液試料などの参照試料）と比較することにより、非典型的な精子の密度および／またはサイズの同定が可能となる。
【００２６】
一部の実施形態では、上記方法は、密度および／またはサイズの変化において現れる精子形態の同定における使用のための方法である。このような方法は、（ｉ）精液試料中の精子の密度および／またはサイズを参照と比較するステップと、（ｉｉ）精液試料中の非典型的な精子の密度および／またはサイズの同定とを含みうる。
【００２７】
一部の実施形態では、精液試料中の精子粒子を特徴付ける方法であって、（ａ）精液試料中の粒子を、ディスク遠心分離により分離するステップと、（ｂ）粒子検出器を用いて粒子を検出するステップと、（ｃ）粒子サイズ分布を測定するステップと、（ｄ）ｉ．単一モードのサイズ分布の存在に基づき、非凝集精子粒子の存在または非存在を同定し、かつ／またはｉｉ．多モードのサイズ分布の存在に基づき、凝集精子粒子の存在または非存在を同定し、ならびに／あるいはｉｉｉ．非凝集精子粒子を含む試料について、サイズ分布の最大重量および／もしくはサイズ分布の積分重量を決定するか、またはｉｖ．凝集精子粒子を含む試料について、サイズ分布の積分重量を決定するステップと、ｖ．試料についてのサイズ分布の最大重量を、参照のサイズ分布の最大重量と比較するか、またはｖｉ．試料についてのサイズ分布の積分重量を、参照のサイズ分布の積分重量と比較し、これにより、試料中のウイルス粒子を定量化するステップと、場合により、（Ａ）精子粒子のサイズの変動および／または精子粒子の密度の変動を測定するステップと、（Ｂ）前記精子粒子のサイズの変動および／または精子粒子の密度の変動を、参照の精子粒子のサイズの変動および／または精子粒子の密度の変動と比較し、これにより、試料中の均質でない精子集団の存在または非存在を同定するステップとを含む方法が提供される。
【００２８】
一部の実施形態では、密度および／またはサイズの変化において現れる精子形態を、ディスク遠心分離機を用いて同定する方法であって、ａ．精液試料中の精子粒子の沈降速度を測定するステップと、ｂ．精液試料中の精子粒子の沈降速度を、沈降速度が公知である参照の沈降速度と比較するステップと、ｃ．精液試料中の精子粒子の観察された沈降速度が、精液試料中の精子粒子の、参照に基づき予測される沈降速度と異なるのかどうかを同定するステップとを含む方法が提供される。
【００２９】
一部の実施形態では、生物学的試料中の異常な粒子サイズ、異常な粒子密度、および／または異常な粒子量を、ディスク遠心分離機を用いて同定する方法であって、ａ．生物学的試料の粒子サイズ分布を測定するステップと、ｂ．生物学的試料の粒子サイズ分布を、対照の粒子サイズ分布と比較するステップと、ｃ．生物学的試料中の粒子の粒子サイズ分布が、対照試料の粒子サイズ分布と異なるのかどうかを同定するステップと、ｄ．生物学的試料が、対照と比較して、異常に高レベルの粒子を含有するのか、異常に低レベルの粒子を含有するのか、正常レベルの粒子を含有するのかを決定するステップとを含む方法が提供される。生物学的試料は、精子試料、血液試料、または唾液試料であることが好ましい。
【００３０】
密度および／またはサイズの変化において現れる精子形態もまた、ディスク遠心分離機を用いて、精液試料中の精子粒子の沈降速度を、沈降速度が公知である参照（例えば、対照の精液試料）の沈降速度と比較し、精液試料中の精子粒子の観察された沈降速度が、精液試料中の精子粒子の、参照に基づき予測される沈降速度と異なるのかどうかを同定することにより決定することができる。
【００３１】
本発明はまた、本発明の方法による使用のためのディスク遠心分離機も提供する。
【００３２】
試料
試料は、ディスク遠心分離機へと導入される。典型的に、試料は、定量化されるべきウイルス粒子を含む。試料中のウイルス粒子濃度は、典型的に未知である。ウイルス粒子は、凝集していない（単量体）場合もあり、かつ／または凝集している場合もある。一部の実施形態ではまた、試料が、ウイルス粒子に加えて、無傷の細胞、細胞破砕物、ならびに／または可溶性タンパク質およびＤＮＡなど、他の細胞構成物質など、細胞の構成要素も含む。無傷の細胞および細胞破砕物は、感染後における細胞培養培地中に存在する可能性があり、細胞の細胞内内容物は、例えば、ウイルス感染後における自発的な細胞溶解に起因して、培地へと放出されうる。加えて、試料は、他の物質、例えば、細胞基質またはそれらの残留物、細胞性核酸（例えば、ＤＮＡ）、卵タンパク質なども含有しうる。ウイルスがインフルエンザウイルスである場合、試料は、ウイルスタンパク質、例えば、ＮＳ１、ＰＢ−１−Ｆ２、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、マトリックスタンパク質（Ｍ１および／またはＭ２）、リボ核タンパク質、核タンパク質、ポリメラーゼ複合体（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ）、またはそのサブユニット、核外搬出タンパク質などを含みうる。ウイルスタンパク質は、凝集していない場合もあり、かつ／または凝集している場合もある。インフルエンザウイルスタンパク質の凝集体は典型的に、マトリックスタンパク質、例えば、ヘマグルチニン−マトリックスタンパク質の凝集体などを含む。試料はまた、非生物学的粒子も含む。
【００３３】
本発明の方法はまた、例えば、試料にウイルスによる汚染が疑われる場合に、試料中のウイルス粒子の可能性のある存在を検出および／または定量化するためにも有用である。このような場合、試料は、ウイルス粒子を含まない可能性がある、すなわち、ウイルスによる汚染を疑われる試料は、汚染されていない。
【００３４】
本発明の方法はまた、ウイルス試料中の微生物汚染、例えば、汚染する細菌、酵母、真菌などの可能性のある存在を検出および／または定量化するためにも有用である。直径が１μｍ以上の粒子の検出は、試料の微生物汚染を示しうる。また、微生物粒子とウイルス粒子とのサイズの差異も、単一の粒子サイズ分布からのウイルスの決定を可能とし、場合により、単一の粒子サイズ分布からの微生物粒子の決定を可能とすることが典型的である。試料中の非ウイルス粒子の定量化は、本明細書で記載される検出法を用いて達成することができる。試料に微生物による汚染が疑われる場合、このような汚染の確認は、異なる時間、例えば、０．２５、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間またはそれより長い時間を隔てた時点において採取される試料の粒子サイズ分布を測定および比較することにより達成することができる。試料が成長する非ウイルス微生物の集団で汚染されている場合、後者の試料から得られる粒子サイズ分布は、直径が１μｍ以上の粒子量の相対的増大を示すことが典型的である。
【００３５】
試料がウイルス粒子を含む場合は、試料が、１ｍｌ当たり少なくとも１Ｅ０７コピーの保護ウイルス、例えば、１ｍｌ当たり約１Ｅ０８、１Ｅ０９、１Ｅ１０、１Ｅ１１、１Ｅ１２、１Ｅ１３、１Ｅ１４、１Ｅ１５、１Ｅ１６、１Ｅ１７コピーなどの保護ウイルス（すなわち、試料１ｍｌ当たりの無傷のウイルス粒子）を含むことが好ましい。１ｍｌ当たりの保護ウイルスのコピー数は、例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲなど、当技術分野で公知の方法を用いて決定することができる。試料がウイルス粒子を含む場合、本発明の方法の検出閾値は、１ｍｌ当たり約５Ｅ０９コピーの保護ウイルスであるので、試料は、１ｍｌ当たり少なくとも５Ｅ０９コピーの保護ウイルスを含むことが最も好ましい。したがって、例えば、１ｍｌ当たりの保護ウイルスが５Ｅ０９コピーより少ない場合は、濃縮が有用でありうる。
【００３６】
一部の実施形態では、試料が「バルク材料」のアリコートである。したがって、このような場合には、試料中のウイルスの濃度が、バルク材料中の濃度を表す。典型的に、試料の体積は、バルク材料の体積より小さい。
【００３７】
バルク材料は典型的に、ウイルスの作製、例えば、実験室規模または産業規模のウイルスの作製に由来するウイルス材料を含む。バルク材料は、未加工の場合もあり、１または複数の下流の加工ステップ、例えば、収集、限外濾過および透析濾過、クロマトグラフィーによる精製、密度勾配による精製などを経ている場合もある。
【００３８】
本発明の一部の実施形態では、試料が、同様に粒子サイズ、密度、量などを決定することが有用な、他の生物学的粒子を含む。このような生物学的試料には、例えば、精液、唾液、尿などが含まれる。このような身体的情報は、例えば、このような生物学的粒子の生物学的機能（または機能異常）を決定するために用いることができる。このような身体的情報はまた、生物学的試料が、例えば、異常に高い微粒子レベルまたは異常に低い微粒子レベルを含有するのかどうかを同定するのにも用いることができる。「異常に高い」レベルは、被験生物学的試料中に通常存在しない粒子（例えば、血液試料または尿試料中の細菌粒子）が単に存在することを包含する。試料中の異常に高い微粒子レベルは、疾患状態、例えば、腎疾患を表しうる尿円柱を示しうる。試料中の異常に低い微粒子レベルもまた、疾患状態を示しうる（例えば、低レベルの網状赤血球は、貧血を示しうる）。
【００３９】
生物学的試料が精液試料である場合は、本発明の方法を、例えば、試料の精子カウントが大きいのか、小さいのか、もしくは平均的であるのか、かつ／または試料に、密度の変化もしくは精子の不均質において現れる精子形態（精子の粒子サイズの変動が大きいこと、および／または密度の変動が大きいことを特徴とする）などが見られるのかどうかを決定することにより、例えば、受精能研究に用いることができる。したがって、本発明はまた、ディスク遠心分離機を用いて、試料中の精子細胞を定量化するための方法も提供する。精子細胞は、幅が約５μｍで、長さが約５０μｍであるので、それらの粒子サイズ分布は、例えば、試料中のウイルス粒子（これらは大幅に小さい）から容易に識別可能である。したがって、試料中の精子粒子の定量化は、試料がウイルス粒子も含む場合にも実施することができ、試料がウイルス粒子を含まない場合にも実施することができる。正確な測定を確保するためには、試料中の粒子濃度に応じて、ディスク遠心分離による解析の前に試料を希釈または濃縮することが必要でありうる。濃度が高過ぎると、沈殿の不安定性および分解能の低下が引き起こされる。試料は、固体含量０．５％未満まで希釈し、多くの場合、固体含量０．１％未満まで希釈することが典型的である。必要とされる希釈は、粒子分布の平均的なサイズ、粒子の屈折率、および粒子サイズ分布幅（または分散度）に依存する。粒子サイズ分布は、粒子の重量（ｙ）に対する粒子サイズ（ｘ）として表されることが典型的である。粒子サイズおよび／または粒子の重量は、絶対的な場合もあり、相対的な場合もある。広範囲にわたる粒子サイズを含有する広い粒子サイズ分布では、解析時に粒子が拡散して、任意の所与の時点に試料中の粒子の総重量のうちの小さな割合しか検出されなくなるため、狭い分布の場合より少ない希釈が必要とされる。粒子分布のピークが少数で狭い試料は、固体含量が０．１％を下回るまで希釈する必要がありうる。これは、遠心分離時に、各ピーク内の粒子がその程度まで拡散しないと、試料中の完全な粒子のうちの大きな割合が、光線の経路内に一度に存在しうるためである。屈折率の大きな粒子を含む試料は通例、濃度が等しくても濁度が大きくなるため、屈折率の小さな粒子を含む試料より多くの希釈を必要とする。一実施形態では、希釈は、試料をディスク遠心分離機へと導入する前に行う、例えば、希釈は、試料をディスク遠心分離機へと導入するのに用いられるシリンジ内で行う。
【００４０】
希釈剤は、バッファーであることが好ましい。希釈剤はまた、水または「ＣＤＭ」（既知組成培地）などの細胞成長培地でもありうる。代替的に、希釈剤は、上記のうちの２つまたは３つの組合せを含みうる。希釈剤として用いられる典型的なバッファーには、例えば、リン酸緩衝食塩水、炭酸水素ナトリウム、シトレート、トリス緩衝食塩水、アミノ−メチル−プロパンジオール、シトレート−ホスフェート、ジエタノールアミン、リン酸ナトリウム、トリス緩衝食塩水、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム食塩水、グリシン−ＨＣｌ、酢酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、イミダゾール、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’，２’’−ニトリロトリエタノール（ビス−トリス）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（ビス−トリスプロパン）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、４−（Ｎ−モルホリノ）ブタンスルホン酸（ＭＯＢＳ）などが含まれる。バッファーは、リン酸バッファー、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウムなどであることが好ましい。各バッファーの濃度は、試料に応じて最適化することができ、０〜２Ｍの間、例えば、約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、１４０ｍＭ、１６０ｍＭ、１８０ｍＭ、２００ｍＭ、２２０ｍＭ、２４０ｍＭ、２６０ｍＭ、２８０ｍＭ、３００ｍＭなどであることが典型的である。バッファーの濃度は、約５０ｍＭ、すなわち、３０〜７０ｍＭの間、好ましくは４０ｍＭ〜６０ｍＭの間、より好ましくは４５ｍＭ〜５５ｍＭの間であることが好ましい。
【００４１】
また、希釈剤のｐＨも変化させて、試料との適合性を維持することができる。典型的に、希釈剤のｐＨは、ｐＨ３〜ｐＨ１１の間である。ｐＨは、ｐＨ５〜ｐＨ９の間、例えば、約ｐＨ５、６、７、８、または９であることが好ましい。ｐＨは、ｐＨ６〜ｐＨ８の間（例えば、ｐＨ７、ｐＨ７．５、またはｐＨ８）であることがより好ましい。
【００４２】
試料中のウイルス粒子の濃縮は、先行技術における任意の適切な方法を用いて、例えば、限外濾過膜の使用、試料の蒸発などを介して達成することができる。
【００４３】
したがって、試料は、バルク材料と比べて濃縮されている場合もあり、希釈されている場合もある。このような場合には、希釈係数または濃縮係数を考慮に入れ、試料中のウイルス粒子濃度を用いて、バルク材料中のウイルス粒子濃度を逆算することができる。
【００４４】
ウイルスの凝集
ウイルス粒子は一般に、単量体、「凝集していない」粒子として存在する。ウイルス粒子はまた、凝集体も形成しうる。凝集体は、ウイルス粒子だけを含む場合（すなわち、２つ以上のウイルス粒子）もあり、他の物質、例えば、無傷の細胞、細胞破砕物または細胞断片など、細胞の構成要素を含む場合（すなわち、他の物質へと付着した１または複数のウイルス粒子）もある。これらは、凝集粒子、ウイルス凝集体、凝集ウイルス、またはウイルス性凝集体と様々に称する。ウイルス凝集体のサイズおよび質量は、単量体の非凝集ウイルス粒子のサイズおよび質量より大きい。
【００４５】
本発明の方法は、凝集ウイルス粒子および／または非凝集ウイルス粒子を含有する試料へと適用することができる。本発明の方法は、特異的相互作用によるのであれ、非特異的相互作用によるのであれ、凝集体がどのようにして形成されるのかに関わらず用いることができる。凝集は、ウイルスの固有の特性でありうる。凝集は、ある特定の状況下で生じる一般的な非特異的イベントとして好適でありうる。例えば、流体内のウイルス濃度が上昇すると、粒子間におけるランダムな衝突の機会の増大に起因して、非特異的凝集体の形成がもたらされうる。温度もまた、ウイルスの凝集に影響しうる。
【００４６】
ウイルス含有流体中にある特定の成分が存在すると、ウイルスの凝集を引き起こす可能性がある。例えば、亜鉛またはマンガンなどの成分は、インフルエンザウイルスの凝集を誘導しうる。宿主細胞タンパク質、例えば、ウイルスの複製およびアセンブリーに関与するタンパク質は、自発的な細胞溶解に起因して培地へと放出される可能性があり、また、ウイルスの凝集を誘導する一因ともなりうる。
【００４７】
ウイルスの精製における一部のステップはまた、ウイルスの凝集も促進しうる。例えば、ヌクレアーゼを用いて、試料中に存在する核酸を分解させることができる。これらの酵素は、凝集を誘導しうるマグネシウムなどの元素を要求することが多い。例えば、ホルムアルデヒドは、ウイルスを不活化するのに用いられることが多いが、また、ウイルスの凝集も引き起こしうる。限外濾過は、精製プロセスの早期においてウイルスを濃縮するのに頻繁に用いられ、また、凝集の増大ももたらしうる。
【００４８】
ディスク遠心分離
ディスク遠心分離は、粒子サイズ分布の迅速な決定を可能とする（３〜１５分間以内であることが典型的）。ディスク遠心分離は、直径約２ｎｍ〜約８０μｍの間の粒子を解析し、１００ｎｇ未満まで秤量することが可能である。ディスク遠心分離は、サイズの差が約２％というわずかな差の粒子を分解しうる。ディスク遠心分離は、例えば、化学物質、医薬（例えば、薬物送達用粒子、診断用粒子、細胞破壊のモニタリング、タンパク質クラスター、リポソーム、マイクロカプセル化された薬物）、半導体、印刷および塗装、ナノ粒子開発など、広範囲にわたる適用において用いられる。先行技術では、ディスク遠心分離を用いて試料中のウイルス粒子を定量化しうることが開示されていない。小型粒子サイズ分布に対するディスク遠心分離の適用可能性から、試料中の凝集しないウイルス粒子および／または凝集するウイルス粒子の存在の決定（しかし、定量化ではない）におけるその使用がもたらされている（例えば、参考文献１を参照されたい）。ナノ粒子（しかし、ウイルス粒子ではない）についての研究は、粒子サイズ分布には、相対データおよび定量データをもたらす可能性があることを見出した（参考文献２を参照されたい）。
【００４９】
ディスク遠心分離による粒子の分離は、試料中の粒子の異なる沈殿速度に基づく。沈殿率は、重力場の強さ（すなわち、遠心分離機ディスクの回転速度）、粒子間の密度差、分離流体の粘性、粒子形状および粒子サイズによって異なる。ストークスの法則に従い、粒子は、重力場の下で（分離）流体中を沈降し、沈殿速度は、粒子直径の二乗に比例して増大する。分離流体を通る粒子の沈降は、それらが検出器を通過するときに検出する。したがって、サイズおよび密度の大きな粒子の沈降速度は大きく、したがって、サイズおよび密度の小さな粒子より速く検出器に達する。粒子の注入と検出との間の時間は、沈降速度を計算することを可能とし、この沈降速度は、粒子サイズと相関しうる。
【００５０】
分離流体は、密度勾配を含むことが好ましい。密度勾配は、ストリーミング効果を伴わない粒子の安定的な沈殿を可能とする。密度勾配は、広い重複ピークを発生させるのではなくて、粒子サイズの狭いバンドの各々について分離したピークを伴う、より高い分解能を可能とする。当技術分野では、密度勾配の作製法が周知であり、手作業で実施することもでき、自動で実施することもできる。
【００５１】
密度勾配は、スクロース、デキストラン、ＮａＢｒ、Ｆｉｃｏｌｌ（親水性の多糖）、セシウム塩、例えば、ＣｓＣｌ、Ｃｓ２ＳＯ４、ギ酸Ｃｓなど、可溶性物質の任意の適切な組合せを含みうる。密度勾配は、水ベース（水性）であることが典型的であるが、有機物質、例えば、トルエンおよびメチルエチルケトン（ＭＥＫ）、炭化水素油、ポリメタクリル酸メチル、Ｎ−プロパノールおよび／またはＮ−ブタノールの場合もある。密度勾配内の濃度勾配は変化しうるが、試料中の粒子の分離を最適化するように、例えば、２〜８％、４〜１２％、８〜２４％、１４〜２０％、２０〜８０％、３１〜３７％、または５１〜５７％（ｗ／ｖ）で日常的に調整することができる。密度勾配内の濃度下限は、０〜１０％の間であることが典型的であり、濃度上限は、５〜３０％の間であることが典型的である。濃度下限と濃度上限との間には、２〜５倍の間の差が存在することが典型的である。密度勾配内への標的粒子の捕捉を回避するために、検出点における密度勾配の密度は、標的粒子の密度より小さくすることが典型的である。
【００５２】
水ベースの勾配は、スクロースおよび／またはデキストラン、好ましくは、スクロースを含むことが典型的である。密度勾配は、光学的に透明であることが好ましい。
【００５３】
試料中の粒子が沈殿時に凝固しないことを確保する一助とするために、密度勾配は、場合により、界面活性剤をさらに含む。界面活性剤は、例えば、アニオン性の場合もあり、カチオン性の場合もあり、非イオン性の場合もあり、両性イオン性の場合もある。用いられる界面活性剤の種類は、試料に依存しうる。界面活性剤はまた、試料中にも存在させることができる。
【００５４】
界面活性剤の濃度は、０〜１％の間（ｗ／ｖ）、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、または２％（ｗ／ｖ）であることが典型的である。界面活性剤の濃度は、０．０２〜０．０８％（ｗ／ｖ）、例えば、０．０５％（ｗ／ｖ）であることが好ましい。
【００５５】
アニオン性界面活性剤には、例えば、スルフェート、スルホネート、ホスフェート、カルボキシレート、ラウリル硫酸アンモニウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ミレス硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、ペルフルオロオクタンスルホネート、ペルフルオロブタンスルホネート、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルアリールエーテルホスフェート、アルキルエーテルホスフェート、脂肪酸塩、ステアリン酸ナトリウム、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、ペルフルオロノナノエートなどが含まれる。
【００５６】
カチオン性界面活性剤には、例えば、一級アミン、二級アミン、または三級アミン、オクテニジンジヒドロクロリド、四級アンモニウムカチオン、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、塩化セチルピリジニウム、ポリエトキシ化獣脂アミン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドなどが含まれる。
【００５７】
非イオン性界面活性剤には、例えば、セチルアルコール、ステアロイルアルコール、セトステアロイルアルコール、オレイルアルコール、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ポリオキシプロピレングリコールアルキルエーテル、グルコシドアルキルエーテル、デシルグルコシド、ラウリルグルコシド、オクチルグルコシド、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ポリオキシエチレングリコールアルキルフェノールエーテル、ノノキシノール−９、グリセロールアルキルエステル、ラウリン酸グリセリル、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル、ポリソルベート、ソルビタンアルキルエステル、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、ドデシルジメチルアミンオキシド、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのブロックコポリマーなどが含まれる。
【００５８】
両性イオン性界面活性剤には、例えば、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１０、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１２、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１６、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート、コカミドプロピルヒドロキシスルタイン、アミノ酸、イミノ酸、コカミドプロピルベタイン、レシチンなどが含まれる。
【００５９】
粒子と密度勾配流体との間には通例、屈折率の差異が存在するであろう。屈折率が正確に同じであり、粒子による光吸収が見られない場合、屈折率が密度勾配と等しい粒子は、光を散乱させないので、粒子は「見えなく」なる。大半の固体物質の屈折率は、大半の流体より大きいので、これが本発明の方法に重要となる可能性は低い。
【００６０】
ディスク遠心分離機は、蒸発防止カバーを含むことが典型的である。場合により、例えば、ドデカン、テトラデカン、鉱油などのさらなる薬剤を用いて、分離流体の蒸発を制限する。蒸発防止カバーの使用および／またはこのようなさらなる薬剤の添加は、分離流体の蒸発および劣化を最小化するので、その完全性を維持しうる。蒸発防止カバーはまた、流体に対する空気の運動に由来する流体表面上の抵抗も消失させる。
【００６１】
分離流体は場合により、例えば、ウイルス粒子の分解、破壊、または脱水を最小化するために、例えば、塩および／またはバッファーもさらに含む。
【００６２】
分離流体が塩を含む場合、１または複数の塩を変化させて、試料との適合性を維持することができる。本明細書で記載される通り、分離流体への塩の添加は、ウイルス粒子の凝集を最小化または防止しうる。分離流体において用いられる典型的な塩には、例えば、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム、および／または塩化マグネシウムなどが含まれる。分離流体中では、他の塩も用いることができる。１または複数の塩を用いる場合は、塩化ナトリウムが好ましい。塩濃度は、分離流体および試料に応じて最適化することができる。分離流体中の各塩の濃度は、０〜１Ｍの間、例えば、２０ｍＭ、４０ｍＭ、６０ｍＭ、８０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、１４０ｍＭ、１６０ｍＭ、１８０ｍＭ、２００ｍＭ、２２０ｍＭ、２４０ｍＭ、２６０ｍＭ、２８０ｍＭ、３００ｍＭなどであることが典型的である。塩濃度は、１００ｍＭ〜１４０ｍＭの間、例えば、１１０ｍＭ〜１３０ｍＭの間、好ましくは１１５ｍＭ〜１２５ｍＭの間、最も好ましくは１２０ｍＭであることが好ましい。
【００６３】
分離流体がバッファーを含む場合はまた、バッファーも変化させて、試料との適合性を維持することができる。分離流体において用いられる典型的なバッファーには、例えば、リン酸緩衝食塩水、炭酸水素ナトリウム、シトレート、トリス緩衝食塩水、アミノ−メチル−プロパンジオール、シトレート−ホスフェート、ジエタノールアミン、リン酸ナトリウム、トリス緩衝食塩水、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム食塩水、グリシン−ＨＣｌ、酢酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、イミダゾール、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’，２’’−ニトリロトリエタノール（ビス−トリス）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（ビス−トリスプロパン）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、４−（Ｎ−モルホリノ）ブタンスルホン酸（ＭＯＢＳ）などが含まれる。バッファーは、リン酸バッファー、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウムなどであることが好ましい。分離流体中の各バッファーの濃度は、０〜２Ｍの間、例えば、約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、１４０ｍＭ、１６０ｍＭ、１８０ｍＭ、２００ｍＭ、２２０ｍＭ、２４０ｍＭ、２６０ｍＭ、２８０ｍＭ、３００ｍＭなどであることが典型的である。バッファーの濃度は、３０〜７０ｍＭの間、より好ましくは４０ｍＭ〜６０ｍＭの間、最も好ましくは４５ｍＭ〜５５ｍＭの間、例えば、５０ｍＭであることが好ましい。
【００６４】
また、分離流体のｐＨも変化させて、試料との適合性を維持することができる。ｐＨは、分離流体全体で同じであることが典型的である。分離流体のｐＨは、ｐＨ３〜ｐＨ１１の間であることが典型的である。ｐＨは、ｐＨ５〜ｐＨ９の間、例えば、ｐＨ５、６、７、８、または９であることが好ましい。ｐＨは、ｐＨ６〜ｐＨ８の間（例えば、ｐＨ７、ｐＨ７．５、またはｐＨ８）であることがより好ましい。代替的に、分離流体全体にｐＨ勾配を存在させることもできる。
【００６５】
分離流体は、回転ディスクへと導入することが典型的である。標的の回転速度は、ディスク遠心分離機が設定される回転速度である。例えば、ディスクの回転速度が標的の回転速度へと加速化されるか、または標的の回転速度から減速される場合、本発明の方法における実際のディスクの回転速度は、標的の回転速度と異なる可能性がある。標的のディスクの回転速度は、約１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、２１０００、２１０００、２３０００、２４０００、２５０００、２６０００、２７０００、２８０００、２９０００、３００００ＲＰＭ以上でありうる。密度勾配の直線化を可能とすることが典型的である。これは、一般に好ましくないが、標的のディスクの回転速度もまた変化させることができる。代替法として述べると、分離流体を、回転していないディスクへと導入した後、前述の標的回転速度のうちのいずれかでディスクを回転させることもできる。分離流体は、ディスクが標的の回転速度で回転しているときにディスクへと導入することもでき、標的の回転速度未満で回転しているときにディスクへと導入することもでき、標的の回転速度を超えて回転しているときにディスクへと導入することもできる。分離流体は、試料を添加する前のある時間にわたり、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０分間などにわたり回転させることが典型的である。分離流体が密度勾配を含む場合、試料を導入する前に密度勾配の直線化を可能とすることが典型的である。
【００６６】
ディスクが回転しているとき、試料は、ディスクの中央部へと挿入することが典型的である。代替法として述べると、ディスクが回転していないとき、試料をディスクの中央部へと挿入する。代替法として述べると、試料は、ディスクの中央部とディスクの外縁部との間に導入する。試料中の一部の粒子は、分離流体より密度が小さいので、通常、「底面」（すなわち、相対密度が最も大きくなるディスクの表面であって、回転軸から最も遠く、また、これと平行でもあるディスクの表面であることが典型的な表面）へと沈降する代わりに、流体「表面」（すなわち、相対密度が最も小さいディスクの表面であって、回転軸に最も近く、また、これと平行でもあるディスクの表面であることが典型的な表面）へと沈殿する。密度の低い試料を、流体表面ではなくて、遠心分離機チャンバーの底面へと送達する技法が開発されている（参考文献３を参照されたい）。これらの密度の低い粒子もまた、ストークスの法則に従い沈殿するが、負の方向（上方）に（すなわち、流体表面へと）沈殿する。
【００６７】
試料は、他の方法もまた用いうるが、例えば、シリンジを用いる注入によりディスクへと導入することが典型的である。シリンジは、例えば、「Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジ」（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ製）、「ＢＤシリンジ」（Ｂｅｃｋｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ製）などでありうる。試料のディスクへの導入は、例えば、試料のディスクへの自動注入を実施するようにプログラムされうる「オートサンプラー」または「オートインジェクター」を用いることにより自動化することができる。オートサンプラーは、試料をバイアルからオートサンプラーのバイアルトレーへと移動させる。オートインジェクター（例えば、ＣＰＳ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）は、試料をあらかじめ充填された多数（典型的には２０）のシリンジを保持するカルーセルを含む。
【００６８】
粒子を分離するために、ディスクは、一定の標的速度、例えば、約１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、２１０００、２１０００、２３０００、２４０００、２５０００、２６０００、２７０００、２８０００、２９０００、３００００ＲＰＭ以上で回転させることが典型的である。また、より速いディスクの標的回転速度も、本発明と共に用いることができる。ディスクの標的回転速度は、試料に応じて最適化することができる。粒子の分離時にはまた、１または複数のディスクの標的回転速度を変化させることもできる。試料は、ディスクが標的の回転速度で回転しているときに挿入することもでき、標的の回転速度未満で回転しているときに挿入することもでき、標的の回転速度を超えて回転しているときに挿入することもできる。粒子サイズ分布が広い試料では、ディスクに、密度勾配を破壊することなく解析時のディスクの速度を変化させる特製の速度ランピングインサート（ＣＰＳ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を装備することができる。これらの速度ランピングインサートは、解析時のディスクの速度を、低速度（例えば、約６００ＲＰＭ）から高速度（例えば、約２４０００ＲＰＭ）へと増大させる（勾配づける）ので、実用的なダイナミックレンジを約７０から約１０００へと増大させる。
【００６９】
分離流体を介する粒子の沈降は、それらが検出器を通過するときに検出する。粒子の検出は、光学的検出であるかまたはＸ線を用いることが典型的である。検出にＸ線を用いる場合は、低感応性のＸ線を用いることが好ましい。光学的検出は、ミー理論による光散乱補正を伴うことが典型的である。光学的検出を用いるディスク遠心分離機は、ディスク遠心分離機光沈降速度計と呼ばれる。Ｘ線を用いるディスク遠心分離機は、Ｘ線ディスク遠心分離機と呼ばれる。
【００７０】
粒子の検出は、光学的であることが好ましい。検出は、ある特定の１または複数の波長における光吸収により実施することが好ましい。本発明による使用のために好ましい粒子の検出波長は、１８５〜７５０ｎｍの範囲である。粒子の検出波長は、１８５〜４００ｎｍ（例えば、２５４）、１８５〜２８０、２５０〜２９０、２８０〜３１５、３１５〜４００、３８０〜７５０、３８０〜４５０（例えば、４０５）、４５０〜４７５、４７６〜４９５、４９５〜５７０、５７０〜５９０、５９０〜６２０、６２０〜７５０ｎｍの間であることが好ましい。この光度測定は、ベール−ランバートの法則に基づく。検出器は、ディスクの中央部からある一定の距離に配置する。各サイズでの粒子濃度は、検出器を通過するときの流体の濁度を連続的に測定することにより決定する、すなわち、検出器を通過する粒子濃度が大きいほど、より多くの光が吸収される。検出器を通過する粒子の重量は、光の回折についてのミー理論およびストークスの法則を適用することにより、公知の粒子の密度から計算することができる。必要とされる場合は、重量分布を、表面積または数の分布へと変換する。
【００７１】
一部の実施形態では、粒子の検出が、粒子に結合し、粒子自体より容易に検出可能な（１または複数の）化合物の使用を伴う。例えば、粒子がウイルス粒子である場合、このような化合物を、例えば、ウイルスＤＮＡおよび／またはウイルスタンパク質へと結合させることができるので、ウイルス粒子を検出する一助とすることができる。このような化合物を用いて、試料中の（１または複数の）低濃度の粒子の検出を改善する一助とすることが典型的である。試料が、（ａ）１または複数の目的の粒子集団（例えば、ウイルス粒子）、および（ｂ）１または複数の非標的粒子集団であって、標的粒子と同様のレオロジー特性を有するが、（１または複数の）化合物には結合しない集団を含有する場合はまた、（１または複数の）化合物を用いて、試料中の標的粒子を検出する一助とすることもできる。当技術分野では、このような（１または複数の）化合物が公知であり、例えば、タンパク質特異的抗体、ＤＮＡ特異的プローブ、Ｈｏｅｃｈｓｔ（ビスベンズイミド）色素、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、ＹＯ−ＰＲＯ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、フルオレセイン色素、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、イソチオシアン酸テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、酢酸アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）など、染料または色素の使用を伴うことが典型的である。このような（１または複数の）化合物には、（１または複数の）蛍光標識、および／または（１または複数の）生物発光標識などが含まれる。このような化合物は、ディスク遠心分離による解析の前に、試料へと添加することが典型的であり、例えば、（１または複数の）生物学的分子と（１または複数の）化合物との結合を可能とするインキュベーション時間を解析の前に必要とし得る。粒子の検出を改善する一助となる（１または複数の）化合物の使用を伴う本発明の方法はまた、化合物を検出するのに適する検出器の使用も必要とすることが典型的である。例えば、化合物が蛍光標識を含む場合、検出器は、蛍光検出器、好ましくはフィルター蛍光光度計または蛍光分光計であることが好ましい。蛍光検出器は、単一チャネル型の場合もあり、多重チャネル型の場合もある。本発明が蛍光標識の使用を伴う場合、本発明はまた、例えば、レーザー、光ダイオード、ランプ、キセノンアーク、水銀灯など、励起供給源の使用も伴うことが典型的である。（１または複数の）フルオロフォアの励起および共時的な発光の検出に適する波長は、容易に決定することができる。
【００７２】
例えば、一部の実施形態では、本発明は、ＤＮＡ会合粒子、例えば、ウイルス粒子を検出するための蛍光検出器と組み合わせた（１または複数の）ＤＮＡ特異的色素、例えば、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎの使用を伴う。同様に、一部の実施形態では、本発明は、タンパク質会合粒子、例えば、ウイルス粒子を検出するための蛍光検出器と組み合わせた（１または複数の）タンパク質特異的色素、例えば、ＦＩＴＣの使用も伴う。
【００７３】
生物学的分子に対する特異性を増強させ、検出可能な標識を含む（１または複数の）化合物の使用は、試料中の非ウイルス粒子（例えば、微生物汚染）の可能性のある存在を検出および／または定量化するための方法に好ましい。
【００７４】
大半の粒子分布解析は、例えば、「ＣＰＳ  ソフトウェア」（ＣＰＳ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）であるがこれらに限定されない、特許権のあるソフトウェアにより実施する。粒子分布解析は、特許権のないソフトウェアを用いて実施することもでき、データの手作業による解析またはコンピュータによる解析を介して実施することもできる。
【００７５】
本発明の方法による使用に有用なディスク遠心分離機は、ＣＰＳディスク遠心分離機（ＣＰＳ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）である。本発明の方法ではまた、他のディスク遠心分離機も用いることができる。
【００７６】
非凝集ウイルス粒子および／または凝集ウイルス粒子の識別
単独の非凝集粒子を含む試料は、単一モードのサイズ分布を提示する（例えば、図１を参照されたい）。したがって、単一モードのサイズ分布の存在は、非凝集粒子の存在を表す。
【００７７】
凝集粒子を含む試料は、多モードのサイズ分布を提示する（例えば、図２を参照されたい）。多モードの試料は、２つ以上のモード、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のモードを含みうる。したがって、多モードのサイズ分布の存在は、凝集ウイルス粒子の存在を表す。
【００７８】
サイズ分布は、単量体のウイルス粒子および／または凝集体（例えば、ウイルス粒子）について予測されることが妥当な近似のサイズ範囲内で測定されることが好ましい。予測される近似のウイルス粒子サイズ範囲内でサイズ分布を測定することにより、非標的粒子（サイズが異なる）の、ウイルス粒子サイズ分布データに対する影響を最小化することが可能である。単量体のウイルス粒子および／または凝集体について予測されるサイズは、例えば、実験により得ることもでき、文献から得ることもできる。代替的に、ウイルス粒子サイズは、本明細書で提示される方法を用いることにより、粒子密度、例えば、浮遊密度から計算することもできる。ウイルス粒子サイズは、例えば、平均粒子サイズまたは粒子サイズの範囲として提示するかまたは得ることができる。
【００７９】
本発明の方法は、粒子サイズ分布特徴に基づき、ウイルス粒子の定量化を可能とする。試料は、非凝集ウイルス粒子だけ、または凝集ウイルス粒子だけを含む必要はない。実際、「凝集」試料は、凝集粒子を含むが、また、非凝集粒子も含む。したがって、凝集粒子を含むと称する試料は、１００％の凝集粒子を含む場合もあり、例えば、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％を超えるなどの凝集粒子を含む場合もある。これは、粒子に対応する、サイズ分布における単一モードピークであって、粒子分布内に、例えば、９９％、９７％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％を超えるなどの粒子を含む単一モードピークの存在により決定することができる。
【００８０】
本発明の方法はまた、例えば、ウイルスタンパク質の凝集体について推定されるサイズ範囲内の多モードのサイズ分布の存在または非存在を検出することにより、試料中の凝集ウイルスタンパク質の可能性のある存在を検出および／または定量化するにも有用である。凝集ウイルスタンパク質のサイズおよび質量は、非凝集ウイルスタンパク質のサイズおよび質量より大きいことが典型的である。一実施形態では、ウイルスタンパク質の凝集体が、ウイルス粒子を含まない。
【００８１】
本発明の方法はまた、例えば、加工ステップが、ウイルスタンパク質の凝集に影響を及ぼすのかどうかを検出するのにも有用である。ウイルスタンパク質の凝集は、例えば、単量体ウイルスタンパク質について予測されるサイズおよび質量を伴う粒子の比率の相対的低下により検出することもでき、かつ／または凝集ウイルスタンパク質について予測されるサイズおよび質量を伴う粒子の比率の上昇により検出することもできる。
【００８２】
サイズ分布の最大重量の決定
サイズ分布の最大重量（すなわち、最大値）は、試料中の、大部分が凝集していない粒子の量と相関する。サイズ分布の最大重量は、例えば、図１上の垂線により示され、また、図５および８によっても示される（「最大値」と表示される）、粒子サイズ分布データ内のピークから決定することができる。サイズ分布の最大重量は、定量化する（例えば、参照と比較することにより）こともでき、相対的に規定することもできる。
【００８３】
サイズ分布の積分重量の決定
サイズ分布の積分重量は、試料中の、大部分が凝集していない粒子の量および／または大部分が凝集している粒子、例えば、ウイルス粒子の量と相関する。サイズ分布の積分重量は、図２の曲線下の影を付した面積により示されるサイズ分布データから決定することができ、また、図５および８の曲線下の影を付した面積により示されるサイズ分布データから決定することもできる（「ピーク積分」と表示される）。サイズ分布の積分重量は、定量化することもできる（例えば、参照と比較することにより）、相対的に規定することもできる。凝集粒子は、複数のモードを引き起こしうるので、積分重量は、近似粒子サイズ範囲内で決定して、非標的凝集体の影響を最小化することが好ましい。凝集体は、複数の単量体粒子、例えば、複数のウイルス粒子を含みうる。例えば、単量体粒子（例えば、ウイルス粒子）について予測されるサイズに、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上を乗じることにより、凝集体サイズの範囲を推定することが可能である。
【００８４】
試料の定量化
定量化は、絶対定量化の場合もあり、相対定量化の場合もある。
【００８５】
ディスク遠心分離機により得られる生データは通例、吸収に対する時間のフォーマットにある。その粒子サイズ分布を参照のサイズ分布と比較することにより、試料中のウイルス粒子を定量化することが可能である。参照は、公知の粒子濃度を有し、試料と同じ様式で解析されることが好ましい。粒子サイズおよび粒子密度が公知の参照を用いて、解析時間を粒子サイズへと変換することができる。参照についての粒子サイズ分布データは、本明細書で記載される方法のうちのいずれかにより得られる。参照中の粒子は、物理的に均質である、例えば、参照中の粒子のうちの少なくとも９５％は、サイズおよび／または重量が、平均の±０〜６０％、例えば、±１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０％であることが好ましい。
【００８６】
参照は、試料の前に試行されることが典型的である。代替法として述べると、参照は、試料の間で試行することができる。代替法として述べると、参照は、試料の後で試行することができる。代替法として述べると、参照は、試料と同時に試行することができる。例えば、試料が内部較正されるように、参照を試料へと添加する。好ましくは、これらの手法の組合せを用いる、すなわち、参照を試料の前に試行し、かつ、試料の間で試行するか、または参照を試料の間で試行し、かつ、試料の後で試行するか、または参照を試料の前に試行し、かつ、試料の間で試行し、かつ、試料の後で試行する。上記方法をあらかじめ較正してある場合は、参照を試行することが必ずしも必要ではない。上記方法を準備する場合は、試料中のウイルス粒子の正確な定量化を達成しうるように、参照を試行することが典型的に必要である。上記方法をあらかじめ較正してある場合、参照を試行し、精度を増大させることができる。
【００８７】
参照は、非生物学的および／または生物学的粒子を含みうる。
【００８８】
参照中では、例えば、ＰＶＣ粒子、ポリスチレン粒子、ポリブタジエン粒子、単結晶ダイアモンド粒子、ポリメタクリル酸メチル粒子、ポリビニリデンクロリド粒子、ＰＶＣホモポリマー粒子など、任意の適切な非生物学的粒子を用いることができる。
【００８９】
参照中では、任意の適切な生物学的粒子、例えば、ウイルス粒子を用いることができる。試料がウイルス粒子を含む場合、参照中のウイルス型は、試料中のウイルス型と同じ型であることが好ましい、例えば、参照および試料の両方は、インフルエンザウイルス粒子を含む。参照は、試料中のインフルエンザウイルス粒子と同じ株であるインフルエンザウイルス粒子を含むことが好ましい。代替法として述べると、参照は、２つ以上のウイルス型および／またはウイルス株を含みうる。
【００９０】
参照中の１または複数のウイルスの濃度は、例えば、感染性アッセイ、ＦＦＡ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｆｏｃｕｓ  ａｓｓａｙ）、タンパク質アッセイ、ＴＥＭ、ＥＬＩＳＡアッセイ、ｑＲＴ−ＰＣＲなど、当技術分野で公知のウイルス定量化法のうちのいずれか１つを用いることにより決定することができる。参照中の１または複数のウイルスは、ＴＥＭまたはｑＲＴ−ＰＣＲを用いて定量化することが好ましい。
【００９１】
粒子サイズ分布は、粒子濃度の関数であるので、粒子サイズ分布の最大重量および／または積分重量を粒子濃度と相関させることができる。非凝集粒子では、サイズ分布の最大重量および／または積分重量が、粒子濃度と相関する。凝集粒子の場合、サイズ分布の積分重量が、粒子濃度と相関する。この相関を知り、（１または複数の）最大重量および／または（１または複数の）積分重量を、参照の（１または複数の）最大重量および／または（１または複数の）積分重量と比較することにより（すなわち、粒子濃度未知の（１または複数の）試料のサイズ分布特徴を、参照のサイズ分布特徴と比較することにより）、粒子濃度が未知の１または複数の試料中の粒子濃度を計算することが可能である。
【００９２】
また、サイズ分布の最大重量と積分重量との直接的な相関も予測される。凝集粒子の非凝集粒子に対する同じ分解能および比率（異なる濃縮試料のサイズ分布をｃｆ（ｘ）とすると［式中、ｆ（ｘ）は、元のサイズ分布であり、ｃは、濃度係数である］）、サイズ分布の直線性の最大重量および積分重量（総重量）は、
【００９３】
【化１】
2014531030.tif 000002
に等しい。
【００９４】
粒子サイズおよび粒子密度はまた、例えば、沈降出発点から検出器までの距離を、保持時間で除することにより、粒子集団の沈殿速度を決定するのにも用いることができる。沈殿速度の決定は、例えば、速度ゾーン遠心分離による粒子集団の調製的分離を可能とし、試料に由来する物質または他の粒子集団に干渉することなく、さらなる解析を可能とする。
【００９５】
このような本発明の方法は、例えば、密度および／またはサイズの変化において現れる精子形態を決定するのに有用である。精液試料中の精子の密度および／またはサイズを、参照（例えば、典型的な精子の寸法および／もしくは密度についての教科書中の参照、および／または対照の精液試料などの参照試料）と比較するステップは、非典型的な精子の密度および／またはサイズの同定を可能とする。
【００９６】
ウイルス
本発明は、エンベロープウイルスおよび非エンベロープウイルスの両方を含めた多様な型のウイルスを定量化するのに有用である。本発明は、ＲＮＡゲノム（一本鎖または二本鎖の）を有するウイルスと共に用いることもでき、ＤＮＡゲノム（一本鎖または二本鎖の）を有するウイルスと共に用いることもでき、一本鎖ゲノムは、＋センス鎖の場合もあり、−センス鎖の場合もある。本発明は、分節化ゲノムを有するウイルスと共に用いることもでき、非分節化ゲノムを有するウイルスと共に用いることもできる。本発明は、カプシド（単一または複数の）を有するウイルスと共に用いることもでき、カプシドを有さないウイルスと共に用いることもできる。したがって、試料は、以下のうちの１または複数を含有しうる。
【００９７】
・オルトミクソウイルス：本発明を用いて、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、またはＣ型インフルエンザウイルスなどのオルトミクソウイルスを不活化することができる。Ａ型インフルエンザウイルスまたはＢ型インフルエンザウイルスは、大流行間期（年ごと／季節ごと）株の場合もあり、大流行の発生を引き起こす可能性を伴う株に由来する場合もある（すなわち、現在循環する株におけるヘマグルチニンと比較して新たなヘマグルチニンを伴うインフルエンザ株、または鳥類被験体において病原性であり、ヒト集団にも水平伝播する可能性を有するインフルエンザ株、またはヒトに対して病原性のインフルエンザ株）。特定の季節および株の性質に応じて、Ａ型インフルエンザウイルスは、以下のヘマグルチニン亜型のうちの１または複数：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６に由来しうる。
【００９８】
・Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス：本発明を用いて、肺炎ウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶ）、およびモルビリウイルス（麻疹）など、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスを不活化することができる。
【００９９】
・肺炎ウイルス：本発明を用いて、肺炎ウイルスまたはメタニューモウイルス、例えば、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ウシＲＳウイルス、マウスの肺炎ウイルス、およびシチメンチョウ鼻気管炎ウイルスを不活化することができる。肺炎ウイルスは、ＲＳＶまたはヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）であることが好ましい。
【０１００】
・パラミクソウイルス：本発明を用いて、１型パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、２型ＰＩＶ、３型ＰＩＶ、または４型ＰＩＶ、ムンプスウイルス、センダイウイルス、５型サルウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス、およびニューカッスル病ウイルスなどのパラミクソウイルスを不活化することができる。パラミクソウイルスは、ＰＩＶまたはムンプスウイルスであることが好ましい。
【０１０１】
・モルビリウイルス：本発明を用いて、麻疹ウイルスなどのモルビリウイルスを不活化することができる。
【０１０２】
・ピコルナウイルス：本発明を用いて、エンテロウイルス、ライノウイルス、へパルナウイルス、カルジオウイルス、およびアフトウイルスなどのピコルナウイルスを不活化することができる。
【０１０３】
・エンテロウイルス：本発明を用いて、１型ポリオウイルス、２型ポリオウイルス、または３型ポリオウイルス、Ａ１型コックサッキーウイルス〜Ａ２２型コックサッキーウイルス、およびＡ２４型コックサッキーウイルス、Ｂ１型コックサッキーウイルス〜Ｂ６型コックサッキーウイルス、１型エコーウイルス（ＥＣＨＯウイルス）〜９型ＥＣＨＯウイルス、１１型ＥＣＨＯウイルス〜２７型ＥＣＨＯウイルス、および２９型ＥＣＨＯウイルス〜３４型ＥＣＨＯウイルス、ならびに６８型エンテロウイルス〜７１型エンテロウイルスなどのエンテロウイルスを不活化することができる。エンテロウイルスは、ポリオウイルス、例えば、Ｍａｈｏｎｅｙ株またはＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株などの１型株、ＭＥＦ−Ｉ株などの２型株、またはＳａｕｋｅｔｔ株などの３型株であることが好ましい。
【０１０４】
・へパルナウイルス：本発明を用いて、Ａ型肝炎ウイルスなどのへパルナウイルス（また、ヘパトウイルスとも称する）を不活化することができる。
【０１０５】
・トガウイルス：本発明を用いて、ルビウイルス、アルファウイルス、またはアルテリウイルスなどのトガウイルスを不活化することができる。風疹ウイルスなどのルビウイルスが好ましい。不活化が有用なアルファウイルスには、サケ膵臓病ウイルスおよび睡眠病ウイルスなどの水生アルファウイルスが含まれる。
【０１０６】
・フラビウイルス：本発明を用いて、ダニ媒介性脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、デングウイルス（１型、２型、３型、または４型）、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、西ナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポワッサン脳炎ウイルスなどのフラビウイルスを不活化することができる。
【０１０７】
・Ｃ型肝炎ウイルス：本発明を用いて、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を不活化することができる。
【０１０８】
・ペスチウイルス：本発明を用いて、ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）またはボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）などのペスチウイルスを不活化することができる。
【０１０９】
・ヘパドナウイルス：本発明を用いて、Ｂ型肝炎ウイルスなどのヘパドナウイルスを不活化することができる。
【０１１０】
・ラブドウイルス：本発明を用いて、リッサウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）およびベシクロウイルス（ＶＳＶ）などのラブドウイルスを不活化することができる。
【０１１１】
・Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ科：本発明を用いて、ノーウォークウイルス、ならびにハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルスなどのノーウォーク様ウイルス、ならびにブタ水疱疹ウイルスなどのベシウイルスなどのＣａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ科を不活化することができる。
【０１１２】
・コロナウイルス：本発明を用いて、ＳＡＲＳ、ヒト呼吸器コロナウイルス、ニワトリ伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）などのコロナウイルスを不活化することができる。
【０１１３】
・レトロウイルス：本発明を用いて、がんウイルス、レンチウイルス、またはスプマウイルスなどのレトロウイルスを不活化することができる。がんウイルスは、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、またはＨＴＬＶ−３でありうる。レンチウイルスは、ＳＩＶ、ＨＩＶ−１、またはＨＩＶ−２でありうる。
【０１１４】
・レオウイルス：本発明を用いて、オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、またはコルチウイルスなどのレオウイルスを不活化することができる。
【０１１５】
・パルボウイルス：本発明を用いて、Ｂ１９型パルボウイルスまたはボカウイルスなどのパルボウイルスを不活化することができる。
【０１１６】
・他の肝炎ウイルス：本発明を用いて、デルタ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、またはＧ型肝炎ウイルスを不活化することができる。
【０１１７】
・ヒトヘルペスウイルス：本発明を用いて、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、６型ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ６）、７型ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ７）、および８型ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ８）などのヒトヘルペスウイルスを不活化することができる。
【０１１８】
・パポバウイルス：本発明を用いて、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスなどのパポバウイルスを不活化することができる。パピローマウイルスには、ＨＰＶ血清型１、２、４、５、６、８、１１、１３、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４１、４２、４７、５１、５７、５８、６３、および６５が含まれる。
【０１１９】
・Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ科：本発明を用いて、Ａ型ヒトアデノウイルス、Ｂ型ヒトアデノウイルス、Ｃ型ヒトアデノウイルス、Ｄ型ヒトアデノウイルス、Ｅ型ヒトアデノウイルス、Ｆ型ヒトアデノウイルス、またはＧ型ヒトアデノウイルスのうちのいずれかを含めたアデノウイルスを不活化することができる。
【０１２０】
ウイルスは、意図的に存在させる場合もあり（例えば、ウイルスを成長させた後に、ワクチンを調製するために）、かつ／または汚染物質として存在する場合もある。
【０１２１】
ウイルスの作製
ウイルスは、任意の適切な基質上、例えば、細胞系培養物中、初代細胞培養物中、卵内などで増殖させることができる。細胞培養物では、ハムスター細胞、畜牛細胞、霊長動物（ヒトおよびサルを含めた）細胞、およびイヌ細胞など、哺乳動物細胞を用いることが多い。腎細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞など、多様な細胞型を用いることができる。適切なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣという名称の細胞系である。適切なサル細胞は、例えば、Ｖｅｒｏ細胞系などの腎細胞などのアフリカミドリザル細胞である（参考文献４〜６を参照されたい）。適切なイヌ細胞は、例えば、ＣＬＤＫ細胞系およびＭＤＣＫ細胞系などの腎細胞である。したがって、適切な細胞系には、ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６；ＷＩ−３８などが含まれるがこれらに限定されない。インフルエンザウイルスを成長させるのに好ましい哺乳動物細胞系には、メイディン−ダービーイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞（参考文献７〜１０を参照されたい）；アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓に由来するＶｅｒｏ細胞（参考文献１１〜１３を参照されたい）；またはヒト胚性網膜芽細胞に由来するＰＥＲ．Ｃ６細胞（参考文献１４を参照されたい）が含まれる。これらの細胞系は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション（参考文献１５を参照されたい）、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（参考文献１６を参照されたい）、またはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広く入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６、およびＣＲＬ−１５８７の下で多様な異なるＶｅｒｏ細胞を提供しており、カタログ番号ＣＣＬ−３４の下でＭＤＣＫ細胞を提供している。ＰＥＲ．Ｃ６は、ＥＣＡＣＣから、寄託番号９６０２２９４０の下で入手可能である。哺乳動物細胞を用いるほかに、ウイルスは、アヒルに由来する細胞系（例えば、アヒル網膜）またはニワトリに由来する細胞系、例えば、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）などを含めた鳥類細胞または鳥類細胞系において成長させることもできる（例えば、参考文献１７〜１９を参照されたい）。例には、ニワトリ胚性幹細胞であるＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４−０７４（参考文献２１を参照されたい）に由来するＥＢｘ細胞系を含めた鳥類胚性幹細胞（参考文献１７および２０を参照されたい）が含まれる。
【０１２２】
１つの有用な細胞系は、メイディン−ダービーイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ（参考文献２２〜２４を参照されたい）である。元のＭＤＣＫ細胞系は、ＡＴＣＣからＣＣＬ−３４として入手可能である。ＭＤＣＫ細胞の派生細胞もまた用いることができる。例えば、参考文献７は、懸濁培養物中で成長させるために適合させたＭＤＣＫ細胞系（「ＭＤＣＫ  ３３０１６」；ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として寄託されている）について開示している。同様に、参考文献２５は、ＭＤＣＫに由来する細胞系であって、無血清培養物の懸濁液中で成長させる細胞系（「Ｂ−７０２」；ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４４９として寄託されている）について開示している。参考文献２６は、「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０２）、および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）を含めた、非腫瘍原性ＭＤＣＫ細胞について開示している。参考文献２７は、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞  （ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２０４２）を含めた、感染に対する感受性が高いＭＤＣＫ細胞系について開示している。これらのＭＤＣＫ細胞系のうちのいずれかを用いることができる。
【０１２３】
ウイルスは、懸濁培養物（例えば、参考文献７、２８、および２９を参照されたい）中で成長させることもでき、付着培養物中で成長させることもできる。懸濁培養物に適する１つのＭＤＣＫ細胞系は、ＭＤＣＫ  ３３０１６である（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として寄託されている）。代替法として述べると、マイクロキャリア培養を用いることができる。
【０１２４】
ウイルスは、無血清培養培地中で成長させることもでき、かつ／またはタンパク質非含有培地中で成長させることもできる。本発明の文脈では、培地がヒト由来または動物由来の血清からの添加物を含有しない場合、これを無血清培地と称する。タンパク質非含有とは、細胞の増殖が、タンパク質、成長因子、他のタンパク質添加物および非血清タンパク質を除外して生じるが、場合により、ウイルスの成長に必要でありうるトリプシンまたは他のプロテアーゼなどの外因性タンパク質を含む培養物を意味すると理解される。
【０１２５】
一実施形態では、本発明の方法を、ウイルス粒子濃度のリアルタイムのモニタリングに用いる。リアルタイムのモニタリングは、自動式の場合もあり、手作業による場合もある。
【０１２６】
本発明はまた、試料中のウイルス粒子の量が、例えば、加工ステップの後における試料中のウイルス粒子の量の減少により示される通り、加工ステップにより減少するのかどうかを決定するにも有用である。加工ステップの前後における試料中のウイルス粒子の量は、絶対的に決定することもでき、相対的に決定することもできる。一部の加工ステップ、とりわけ、それらのサイズに従う粒子の分離、例えば、濾過を伴う加工ステップは、とりわけ、試料が粒子サイズ分布を含む場合、試料中のウイルス粒子の量の減少をもたらしうる。例えば、フィルター内の孔の断面積が、単量体粒子の断面積よりも大きいかそれと同じであるが、凝集粒子の断面積より小さい場合、凝集粒子は、フィルターを通過しないであろう。このような場合、濾液は、供給物（ｆｅｅｄ）より少ないウイルス粒子を含有するであろう。したがって、試料中のウイルス粒子の量が、加工ステップ、例えば、濾過後にも実質的に同じまま（例えば、濾液中のウイルス粒子が、供給物の少なくとも８５、８７．５、９０、９２．５、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、または１００％）である場合、これは、試料が、凝集ウイルス粒子を含まないことを示す。これに対し、加工ステップ、例えば、濾過の後における試料中のウイルス粒子の量の減少は、試料中の凝集ウイルス粒子の存在を表す。また、加工ステップの前後における試料中のウイルス粒子の量を比較することにより、加工ステップの前における試料中の単量体：凝集ウイルス粒子の比率を決定することも可能である。一部の実施形態では、加工ステップの前後における粒子サイズ分布を比較するだけで十分でありうる。加工ステップにより凝集ウイルスは除去されるが、分布の変化が見られない場合、元の試料は、凝集ウイルスを含有しなかったと結論することができる。
【０１２７】
ウイルスの作製および／またはワクチンの作製はまた、微生物汚染を試料、例えば、ウイルス試料から除去するための１または複数の滅菌濾過ステップも伴いうる。このような場合、本発明はまた、このような（１または複数の）滅菌濾過ステップが成功したのかどうかを決定し、試料が、大きな微生物負荷を含有しない（濾過された試料は微生物汚染を実質的に含まないことが好ましい）ことを確認するにも有用である。上記で論じた通り、直径が１μｍ以上の粒子の検出は、試料の微生物汚染を示すことが典型的である。したがって、滅菌濾過後における、直径が１μｍ以上の粒子に対応する粒子サイズ分布の非存在は、濾液が微生物汚染を含有しないことを示す。この方法はまた、（１または複数の）滅菌濾過ステップの効率を決定するのにも用いることができる。
【０１２８】
ワクチン
ワクチン組成物は、生ウイルス、不活化ウイルスを用いて調製することもでき、例えば、スプリットワクチンまたは表面抗原ワクチンをインフルエンザウイルスから調製する場合のように、（１または複数の）免疫原性タンパク質をウイルスから精製することにより調製することもできる。
【０１２９】
本発明の定量化された材料は、インフルエンザワクチンを調製するのに理想的である。今日では、多様な形態のインフルエンザウイルスワクチンが入手可能であり（例えば、参考文献３０の１７および１８章を参照されたい）、現行のワクチンは、不活化ウイルスまたは生弱毒化ウイルスに基づく。不活化ワクチン（ウイルス全体、スプリットビリオン、または表面抗原）は、筋内注入または皮内注入により投与されるのに対し、生ワクチンは、鼻腔内投与される。本発明は、これらのワクチン形態の全てと共に用いることができる。
【０１３０】
本発明の一部の実施形態では、表面抗原（不活化された）インフルエンザワクチンを用いる。このようなワクチンは、スプリットワクチンまたは全ビリオンワクチンより少ないウイルス構成要素を含有する。それらの構成要素には、表面抗原であるヘマグルチニンが含まれ、また、ノイラミニダーゼも含まれることが典型的である。当技術分野では、これらのタンパク質を、インフルエンザウイルスからの精製形態で調製するためのプロセスが周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮ（商標）、ＡＧＲＩＰＰＡＬ（商標）、およびＩＮＦＬＵＶＡＣ（商標）といった製品は、表面抗原インフルエンザワクチンの例である。
【０１３１】
本発明で表面抗原インフルエンザワクチンを用いる場合、このウイルスは、卵内または細胞培養物中で成長させておくことができる（上記を参照されたい）。ワクチン用のインフルエンザウイルスを成長させるための現行の標準的な方法では、ＳＰＦ孵化鶏卵を用い、ウイルスは卵の内容物（尿膜腔液）から精製する。卵ベースのウイルス成長を用いる場合は、１または複数のアミノ酸を、ウイルスと併せて、卵の尿膜腔液へと導入することができる（参考文献３６を参照されたい）。ウイルスはまず、卵内で成長させる。次いで、感染させた卵から、ウイルスを収集する。ビリオンは、尿膜腔液から、多様な方法により収集することができる。例えば、精製プロセスは、ビリオンを破壊するための洗浄剤を含む線形スクロース勾配溶液を用いるゾーン遠心分離を伴いうる。次いで、任意選択の希釈の後、透析濾過により抗原を精製することができる。ウイルスを不活化するための化学的手段には、有効量の、以下の薬剤：洗浄剤、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、メチレンブルー、ソラーレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはこれらの組合せのうちの１または複数による処理が含まれる。当技術分野では、例えば、ＵＶ光照射またはガンマ線照射など、ウイルス不活化の非化学的方法が公知である。
【０１３２】
本発明の方法を用いて、例えば、ウイルス不活化剤の投与の前後におけるウイルス試料の粒子サイズ分布を比較することにより、ウイルス不活化剤のウイルスの凝集に対する効果を決定しうる。不活化時または不活化の後に誘導される粒子の凝集は、例えば、不活化後濾過の後におけるウイルスの喪失をもたらしうるため、ウイルス不活化剤のウイルス粒子の凝集に対する効果を知ることは有用である。粒子の凝集を誘導しないウイルス不活化剤が典型的に好ましい。
【０１３３】
ウイルス粒子を不活化する場合はまた、試料がウイルス粒子の凝集体を含むのかどうかを決定することも有用である。これは、本明細書で記載される本発明の方法により達成することができる。ウイルス不活化剤は、凝集体を透過し、内部のウイルス粒子を不活化することが可能でないので、（１または複数の）ウイルス粒子の凝集体を含む試料が、不活化に対してそれほど感受性でない場合がある。このような場合には、試料が生ウイルス粒子を依然として含有する危険性が存在し、これは、所望されない場合がある。したがって、試料が凝集ウイルス粒子を含む場合は、例えば、より高濃度の不活化剤を用い、侵襲性がより高い不活化剤を用い、不活化剤をより長時間にわたり投与することなどが必要でありうる。本発明の一部の実施形態では、ウイルス全体、スプリットウイルス、ウィロソーム、生弱毒化ウイルス、または組換えヘマグルチニンを用いることができる。これらのワクチンは、例えば、余分なインフルエンザウイルスタンパク質の存在についてそれらの抗原を調べることにより、表面抗原ワクチンから容易に識別することができる。
【０１３４】
全不活化ウイルスは、ビリオンをウイルス含有流体から収集することにより得（例えば、卵または培養培地から得）、次いで、それらを上記の通りに処理することができる。
【０１３５】
スプリットビリオンは、「Ｔｗｅｅｎエーテル」による分割プロセスを含め、精製ビリオンを、洗浄剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコール酸塩、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ９など）で処理して、サブビリオン調製物を作製することにより得る。当技術分野では、例えば、インフルエンザウイルスを分割する方法が周知である。例えば、参考文献３１〜３６などを参照されたい。ウイルスの分割は、感染性の場合であれ、非感染性の場合であれ、ウイルス全体を、破壊濃度の分割剤で破壊または断片化することにより実行することが典型的である。破壊は、ウイルスタンパク質の完全または部分的な可溶化を結果としてもたらし、ウイルスの完全性を変化させる。好ましい分割剤は、非イオン性界面活性剤およびイオン性（例えば、カチオン性）界面活性剤、例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレン−アルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、ＮＰ９、四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ−ＭＡ、オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１などのＴｒｉｔｏｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。１つの有用な分割手順では、デオキシコール酸ナトリウムとホルムアルデヒドとの逐次効果を用い、最初のビリオン精製時に（例えば、スクロース密度勾配溶液中で）分割を起こさせることができる。したがって、分割プロセスは、ビリオン含有材料の清澄化（非ビリオン材料を除去するための）、収集されたビリオンの濃縮（例えば、ＣａＨＰＯ４吸着などの吸着法を用いる）、全ビリオンの非ビリオン材料からの分離、密度勾配遠心分離ステップにおいて分割剤を用いるビリオンの分割（例えば、デオキシコール酸ナトリウムなどの分割剤を含有するスクロース勾配を用いる）、および、次いで、所望されない材料を除去する濾過（例えば、限外濾過）を伴いうる。スプリットビリオンは、リン酸ナトリウム緩衝等張性塩化ナトリウム溶液中に再懸濁させると有用である。スプリットワクチンの例は、ＢＥＧＲＩＶＡＣ（商標）、ＩＮＴＡＮＺＡ（商標）、ＦＬＵＡＲＩＸ（商標）、ＦＬＵＺＯＮＥ（商標）、およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤ（商標）といった製品である。
【０１３６】
ウィロソームとは、核酸非含有ウイルス様リポソーム粒子である（参考文献３７を参照されたい）。ウィロソームは、ウイルスを洗浄剤で可溶化させた後で、ヌクレオカプシドを除去し、ウイルス糖タンパク質を含有する膜を再構成することにより調製することができる。ウィロソームを調製するための代替的な方法は、ウイルス膜糖タンパク質を過剰量のリン脂質へと添加して、それらの膜内にウイルスタンパク質を伴うリポソームをもたらすステップを伴う。
【０１３７】
生弱毒化ウイルスは、ウイルス（卵内または細胞培養物中で成長させた）から得られるが、ウイルスを不活化するわけではない。不活化されるのではなくて、ウイルスは、例えば、ヒトインフルエンザ感染のフェレットモデルにおいてインフルエンザ様の疾病をもたらさないように弱毒化される（「ａｔｔ」）。生弱毒化ウイルスはまた、低温適応（「ｃａ」）株でもありうる、すなわち、生弱毒化ウイルスは、多くの野生型インフルエンザウイルスの複製にとって制約的な温度である２５℃で効率的に複製しうる。生弱毒化ウイルスはまた、温度感受性（「ｔｓ」）でもありうる、すなわち、多くの野生型インフルエンザウイルスが効率的に成長する温度（３７〜３９℃）ではその複製が制約される。ｃａ表現型、ｔｓ表現型、およびａｔｔ表現型の累積効果は、弱毒化ワクチン中のウイルスが、鼻咽頭で複製されて、典型的なヒト患者における防御的免疫は誘導するが疾患は引き起こさない、すなわち、弱毒化ワクチン中のウイルスが標的のヒト集団に対する一般的な投与にとって安全なことである。これらのウイルスは、例えば、遠心分離による流体の清澄化、次いで、バッファー（例えば、スクロース、リン酸カリウム、およびグルタミン酸一ナトリウムを含有する）による安定化の後において、ビリオンを、ビリオン含有流体から精製することにより調製することができる。生ワクチンには、ＦＬＵＭＩＳＴ（商標）という製品が含まれる。
【０１３８】
ワクチン組成物には通例、それらの抗原に加えて、構成要素を含む、例えば、ワクチン組成物には、（１または複数の）薬学的キャリアおよび／または（１または複数の）賦形剤を含むことが典型的である。このような構成要素についての完全な議論は、参考文献３８において利用可能である。ワクチン組成物にはまた、例えば、参考文献３９および４０において開示されているアジュバント（例えば、１または複数のアルミニウム塩を含むか、またはサブミクロンの水中油エマルジョンを含むアジュバント）も含むことができる。
【０１３９】
ワクチン組成物は、特に、投与の時点において水性形態であることが好ましいが、ワクチン組成物はまた、非水性の液体形態または乾燥形態でも存在することが可能であり、例えば、ゼラチンカプセルまたは凍結乾燥物などとしても存在しうる。
【０１４０】
ワクチン組成物には、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなど、１または複数の保存剤を含むことができる。水銀非含有組成物が好ましく、保存剤非含有ワクチンも調製することができる。
【０１４１】
ワクチン組成物は、例えば、張度を制御するために、ナトリウム塩などの生理学的塩を含むことができる。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が典型的であり、１〜２０ｍｇ／ｍｌの間で存在しうる。存在しうる他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが含まれる。
【０１４２】
ワクチン組成物の質量オスモル濃度は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、例えば、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、または２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの間とすることができる。
【０１４３】
ワクチン組成物には、１または複数のバッファーを含むことができる。典型的なバッファーには、リン酸バッファー；トリスバッファー；ホウ酸バッファー；コハク酸バッファー；ヒスチジンバッファー（特に、水酸化アルミニウムアジュバントを伴う）；またはクエン酸バッファーが含まれる。バッファーは、５〜２０ｍＭの範囲で含まれることが典型的である。
【０１４４】
ワクチン組成物のｐＨは、５．０〜９．５の間、例えば、６．０〜８．０の間であることが典型的である。
【０１４５】
ワクチン組成物は、無菌であることが好ましい。
【０１４６】
ワクチン組成物は、非発熱性である、例えば、１用量当たり＜１ＥＵ（内毒素単位、標準的な尺度）を含有し、好ましくは１用量当たり＜０．１ＥＵを含有することが好ましい。
【０１４７】
ワクチン組成物は、グルテン非含有であることが好ましい。
【０１４８】
ワクチン組成物は、洗浄剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎ」として公知の）、オクトキシノール（オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールなど）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウムを含むことができる。洗浄剤は、痕跡量でのみ存在しうる。
【０１４９】
ワクチン組成物は、単回投与用の材料を含むこともでき、複数回にわたる免疫化のための物質（すなわち、「複数回用量」キット）を含むこともできる。保存剤の含有は、複数回用量のための設定に有用である。複数回用量組成物中への保存剤の含有に対する代替法として（または加えて）は、組成物は、材料を取り出すための滅菌アダプターを有する容器に含有させることができる。
【０１５０】
ワクチン組成物は、小児には半用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）を投与しうるが、約０．５ｍｌの用量で投与することが典型的である。
【０１５１】
ワクチン組成物は、多様な様式で投与することができる。最も好ましい経路は、筋内注入（例えば、腕部または脚部への注入）であるが、他の利用可能な経路には、皮下注入、鼻腔内、経口、皮内、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ、ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）なども含まれる。
【０１５２】
ワクチン組成物は、動物（および、特に、ヒト）患者への投与に適し、したがって、ヒト使用および獣医科使用の両方を包含する。ワクチン組成物は、患者に免疫応答をもたらす方法であって、組成物を患者へと投与するステップを含む方法において用いることができる。
【０１５３】
これらの方法によりもたらされる免疫応答には一般に、抗体応答、好ましくは、防御的抗体応答が含まれる。当技術分野では、ウイルスによるワクチン接種の後における抗体応答、中和能力、および防御を評価するための方法が周知である。インフルエンザウイルスでは、例えば、ヒト研究により、ＨＡに対する抗体力価は、防御と相関することが示されている。
【０１５４】
上記で言及した通り、ワクチン組成物は、組成物を施された患者において誘発される免疫応答（体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答）を増強するように機能しうる、１または複数のアジュバントを含むことができる。有用なアジュバントは、１または複数のアルミニウム塩を含みうる。別の有用なアジュバントは、水中油エマルジョンを含みうる。当技術分野では、他の有用なアジュバントも公知である。
【０１５５】
水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知のアジュバントは、単独で用いることもでき、組み合わせて用いることもできる。これらの名称は従来のものであるが、いずれも、存在する実際の化学化合物についての正確な記載ではないので、簡便さだけのために用いられる（例えば、参考文献４１の９章を参照されたい）。本発明では、アジュバントとして一般的に用いられる「水酸化物」アジュバントまたは「リン酸塩」アジュバントのうちのいずれも用いることができる。患者へと投与するための組成物中のＡｌ＋＋＋の濃度は、好ましくは５ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどである。好ましい範囲は、０．３〜１ｍｇ／ｍｌの間である。１用量当たり最大０．８５ｍｇが好ましい。
【０１５６】
多様で有用な水中油エマルジョンアジュバントが公知であり、それらには、少なくとも１つの油および少なくとも１つの界面活性剤が含まれ、（１または複数の）油および（１または複数の）界面活性剤は生体分解性（代謝性）で生体適合性であることが典型的である。エマルジョン中の油滴は一般に、直径が１μｍ未満であり、これらの小さなサイズは、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒにより達成され、安定的なエマルジョンをもたらす。液滴は、フィルター滅菌にかけるので、平均直径が＜２２０ｎｍであることが好ましい。有用なアジュバントには、スクアレンおよび／またはポリソルベート８０が含まれうる。用いられうる適切なアジュバントには、ＭＦ５９およびＡＳ０３として公知のアジュバントが含まれうる。
【０１５７】
ワクチン組成物は、単回用量スケジュールで投与することもでき、複数回用量スケジュールで投与することもできる。複数回用量は、一次免疫化スケジュールにおいて用いることもでき、かつ／または追加免疫化スケジュールにおいて用いることもできる。複数回用量のスケジュールでは、多様な用量を、同じ経路で与えることもでき、または例えば、非経口初回刺激（ｐｒｉｍｅ）および粘膜追加刺激（ｂｏｏｓｔ）、粘膜初回刺激および非経口追加刺激など、異なる経路で与えることもできる。１よりも多い用量（典型的には２回の用量）の投与は、免疫学的にナイーブな患者において特に有用である。複数回用量は、少なくとも１週間（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）離して投与することが典型的である。
【０１５８】
本発明の方法は、生物学的試料（例えば、ウイルス試料）が分割されたのかどうかを決定し、場合により、生物学的試料がどの程度分割されたのかを、例えば、分割の前後における粒子サイズ分布の変化により決定するのに有用である。本発明の方法はまた、分割剤の分割効率および／または生物学的粒子の分割に対する感受性を決定するのにも用いることができる。生物学的粒子を分割する方法は周知であり、上記で略述した。例えば、完全な分割は、生物学的粒子、例えば、ウイルス粒子に対応する粒子ピークの非存在により検出される。部分的な分割および完全な分割は、生物学的粒子、例えば、ウイルス粒子に対応する粒子ピークの減少により検出することができる。分割されていない生物学的粒子は、分割剤による処理後における粒子ピークに対する変化がみられないかまたは最小限であることにより同定される。
【０１５９】
本発明の方法はまた、特に、不溶性アジュバント粒子、例えば、アルミニウム塩粒子について、試料中のアジュバント粒子の検出、特徴付け、および定量化にも有用である。
【０１６０】
本発明の方法は、アジュバント粒子（例えば、アルミニウム塩）へと吸着されている抗原の比率を同定するのに有用である。これは、例えば、抗原、アジュバント粒子、およびアジュバントへと吸着されている抗原を含む粒子（このように吸着されたアジュバント粒子は、抗原が吸着されていないアジュバント粒子より大型であることが典型的である）の粒子サイズ分布を比較することにより達成することができる。典型的に、抗原のアジュバントへの吸着は、（ｉ）アジュバントだけに対応する粒子の比率の減少、および（ｉｉ）アジュバントへと吸着されている抗原に対応する粒子の比率の増大をもたらす。
【０１６１】
このような同定は、アジュバント粒子には結合するが、可溶性抗原には結合しない（１または複数の）化合物であって、アジュバント粒子自体より検出（例えば、検出可能な標識を介する）が容易な化合物の使用を伴いうる。したがって、（１または複数の）検出可能な標識は、抗原粒子が吸着されうるアジュバント粒子を「飾る」。（ａ）抗原がアジュバント粒子へと吸着されているのかどうか、および／または（ｂ）試料中のいかなる比率の抗原がアジュバント粒子へと吸着されているのかの同定は、例えば、（ｉ）アジュバント、好ましくはアルミニウム塩アジュバント；（ｉｉ）抗原；（ｉｉｉ）アジュバントには結合するが、可溶性抗原には結合せず、検出可能な標識を含む化合物の使用；および（１または複数の）検出可能な標識の検出を含みうる。例えば、上記方法は、（ａ）アジュバント粒子および抗原を含む試料へと、アジュバントには結合するが、可溶性抗原には結合せず、検出可能な標識を含む化合物を導入するステップと、（ｂ）試料中の粒子をディスク遠心分離により分離するステップと、（ｃ）（１または複数の）検出可能な標識を検出するのに適する粒子検出器を用いて粒子を検出するステップと、（ｄ）粒子サイズ分布を測定するステップと、（ｅ）（ｉ）アジュバント粒子および／または（ｉｉ）アジュバント粒子へと吸着されている抗原に対応する（１または複数の）粒子サイズ分布の存在または非存在を同定するステップと、（ｆ）抗原が吸着されているアジュバントの比率を同定するステップとを含みうる。
【０１６２】
同定はまた、抗原には結合する（例えば、（１または複数の）タンパク質特異的試薬および／またはＤＮＡ特異的試薬などの（１または複数の）検出可能な標識を用いて）が、アジュバントには結合しない（１または複数の）化合物の使用も伴いうる。したがって、（１または複数の）検出可能な標識は、アジュバントへと吸着されうる抗原を「飾る」。（ａ）抗原がアジュバント粒子へと吸着されているのかどうか、および／または（ｂ）試料中のいかなる比率の抗原がアジュバント粒子へと吸着されているのかの同定は、例えば、（ｉ）アジュバント、好ましくはアルミニウム塩アジュバント；（ｉｉ）抗原；（ｉｉｉ）抗原には結合するが、アジュバントには結合せず、検出可能な標識を含む化合物の使用；および（１または複数の）検出可能な標識の検出を含みうる。例えば、上記方法は、（ａ）抗原およびアジュバント粒子を含む試料へと、抗原には結合するが、アジュバントには結合せず、検出可能な標識を含む化合物を導入するステップと、（ｂ）試料中の粒子をディスク遠心分離により分離するステップと、（ｃ）適切な粒子検出器を用いて（１または複数の）検出可能な標識を検出するステップと、（ｄ）粒子サイズ分布を測定するステップと、（ｅ）標識された、アジュバントへと吸着されている抗原に対応する（１または複数の）粒子サイズ分布の存在または非存在を同定するステップと、場合により、（ｆ）アジュバントへと吸着されている抗原の比率を同定するステップとを含みうる。
【０１６３】
このような同定はまた、（ａ）アジュバント粒子には結合するが、可溶性抗原には結合せず、検出可能な標識を含む（１または複数の）化合物、および（ｂ）抗原には結合する（例えば、（１または複数の）タンパク質特異的試薬および／またはＤＮＡ特異的試薬などの（１または複数の）検出可能な標識を用いて）が、アジュバントには結合しない（１または複数の）化合物の使用も伴い、その後で、上記で概観したステップを行う。このような場合、抗原に結合する化合物およびアジュバント粒子に結合する化合物は、例えば、各々の検出可能な標識を検出するのに適する検出器を用いて、同じ試料について、好ましくは同時に検出を実施しうるように、異なる検出可能な標識を含むことが好ましい。抗原のアジュバント粒子への吸着は、粒子サイズ分布における検出可能な標識の共局在化により同定可能であることが典型的である。
【０１６４】
本発明の方法はまた、アジュバント粒子の作製を最適化するのにも有用である。本発明の方法は、作製法（例えば、ウイルス粒子および／または（１または複数の）アジュバント粒子を作製するための）により、意図される（１または複数の）粒子サイズまたは所望される（１または複数の）粒子サイズが作製されるのかどうかを決定するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】図１は、凝集しないインフルエンザウイルス（インフルエンザＨ３Ｎ２株）について、単一モードのサイズ分布を示す図である。
【図２】図２は、凝集するインフルエンザウイルス（インフルエンザＨ１Ｎ１株）について、多モードのサイズ分布を示す図である。
【図３】図３は、サイズ分布の積分重量を、水中の２６３ｎｍのＰＶＣ粒子の濃度の変化と対比して示す図である。高い相関係数Ｒ２は、注入された粒子の濃度とサイズ分布の積分重量との線形相関を示す。測定は、３連で実施した。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図４】図４は、サイズ分布の最大重量を、水中の２６３ｎｍのＰＶＣ粒子の濃度の変化と対比して示す図である。高い相関係数Ｒ２は、注入された粒子の濃度とサイズ分布の最大重量との線形相関を示す。測定は、３連で実施した。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図５】図５は、図３および４において異なる希釈率で調べたＰＶＣ粒子のサイズ分布を示す図である。測定は、ｐＨ７．５の５０ｍＭ  ＮａＰＯ４中に２〜８％（ｗ／ｖ）のスクロース勾配を用いて実施した。
【図６】図６は、サイズ分布の積分重量を、水中のインフルエンザＨ３Ｎ２粒子の濃度と対比して示す図である。高い相関係数Ｒ２は、注入された粒子の濃度とサイズ分布の積分重量との線形相関を示す。測定は、３連で実施した。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図７】図７は、サイズ分布の最大重量を、水中のインフルエンザＨ３Ｎ２粒子の濃度と対比して示す図である。高い相関係数Ｒ２は、ディスクへと注入された粒子の濃度とサイズ分布の最大重量との線形相関を示す。測定は、３連で実施した。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図８】図８は、図６および７において異なる希釈率で調べたＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス粒子の代表的なサイズ分布を示す図である。測定は、ｐＨ７．５の５０ｍＭ  ＮａＰＯ４中に２〜８％（ｗ／ｖ）スクロース勾配を用いて実施した。
【図９】図９は、被験インフルエンザ粒子の作製に用いた下流プロセスの概要を示す図である。
【図１０】図１０は、サイズ分布の最大重量（最大値と表示される）の、１ｍｌ当たりの注入された保護コピーの数との相関、および図９にまとめられる下流プロセスを用いて精製した、異なるＨ３Ｎ２試料についてのヘマグルチニンレベルを示す図である。
【図１１】図１１は、サイズ分布の積分重量の、１ｍｌ当たりの注入された保護コピーの数との相関、および図９にまとめられる下流プロセスを用いて精製した、異なるＨ３Ｎ２試料についてのヘマグルチニンレベルを示す図である。
【図１２】図１２は、サイズ分布の最大重量（最大値と表示される）の、１ｍｌ当たりの保護コピーの数との相関、および図９にまとめられる下流プロセスを用いて精製した、異なるＨ１Ｎ１試料についてのヘマグルチニンレベルを示す図である。Ｈ１Ｎ１株は、一部のバッファーについて凝集を示し、サイズ分布の最大重量と注入された粒子の濃度との線形相関は、凝集時に低減される。
【図１３】図１３は、サイズ分布の積分重量（ピーク積分と表示される）の、１ｍｌ当たりの保護コピーの数との相関、および図９にまとめられる下流プロセスを用いて精製した、異なるＨ１Ｎ１試料についてのヘマグルチニンレベルを示す図である。
【図１４】図１４は、サイズ分布の最大重量（最大値と表示される）の、１ｍｌ当たりの保護コピーの数との相関、および図９にまとめられる下流プロセスを用いて精製した、インフルエンザのＢ株の試料についてのヘマグルチニンレベルを示す図である。
【図１５】図１５は、サイズ分布の積分重量（ピーク積分と表示される）の、１ｍｌ当たりの保護コピーの数との相関、および図９にまとめられる下流プロセスを用いて精製した、インフルエンザのＢ株の試料についてのヘマグルチニンレベルを示す図である。
【図１６】図１６は、図９にまとめられる下流プロセスを用いて精製した、インフルエンザの３つの被験株全てについて、サイズ分布の最大重量（最大値と表示される）の、１ｍｌ当たりの保護コピーの数との相関を示す図である。
【図１７】図１７は、図９にまとめられる下流プロセスを用いて精製した、インフルエンザの３つの被験株全てについて、サイズ分布の積分重量（ピーク積分と表示される）の、１ｍｌ当たりの保護コピーの数との相関を示す図である。
【図１８】図１８は、勾配密度流体として用いた純水の、生理学的バッファー（ｐＨ７．５の５０ｍＭ  ＮａＰＯ４）に対する凝集の影響を示す図である。
【図１９】図１９は、低ｐＨ密度勾配の、インフルエンザ試料のサイズ分布に対する影響を示す図である（ｐＨ７．５の５０ｍＭ  ＮａＰＯ４を、ｐＨ５．７の５０ｍＭ  ＮａＰＯ４と対比する）。
【図２０】図２０は、密度勾配中の塩の、Ｈ３Ｎ２インフルエンザ株のインフルエンザ試料のサイズ分布に対する影響を示す図である（ｐＨ７．５の５０ｍＭ  ＮａＰＯ４を、ｐＨ７．５の１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４と対比する）。
【図２１】図２１は、１５００バールの高圧ホモジナイゼーションによるインフルエンザ凝集体の離解を、凝集インフルエンザ株の元の材料と対比して示す図である。
【図２２】図２２は、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株のサイズ分布を示す図である。曲線は、元の材料およびベータ−プロピオラクトンで不活化させた材料に関する。ディスク遠心分離機は、サイズ分布の最大重量を用いる定量化によるわずか７％の喪失、およびサイズ分布の積分重量を通した定量化による８％の喪失を示す。
【図２３】図２３は、ＭＤＣＫ細胞内で、感染後の異なる時点：２４時間後、４２時間後、４８時間後、および６９時間後において産生されたＨ３Ｎ２インフルエンザ株のサイズ分布を示す図である。
【図２４】図２４は、粘性および密度が異なる流体中の、２つの粒子溶液（インフルエンザ粒子およびＰＶＣ粒子）の沈降の例を示す図である。密度および粘性が大きいときは、重力が小さくなるために（流体密度が大きく、抵抗が大きいために（粘性が大きいために））、粒子の沈降時間が長くなる。
【図２５】図２５は、密度は異なるが粘性は一定の異なる流体について、密度１．３８５ｇ／ｍｌの粒子による沈降時間のシミュレーションを、流体密度と対比して示す図である。
【図２６】図２６は、流体密度に対する沈降時間の逆数変換により、線形相関がもたらされることを裏付ける図である。
【図２７】図２７は、トマトモザイクウイルスの粒子密度の推定についての回帰分析を示す図である。
【図２８】図２８は、ＰＶＣ粒子の粒子密度の推定についての回帰分析を示す図である。全ての測定は３連で行い、エラーバーは、標準偏差を示す。回帰直線の横軸との交点は、粒子密度に対応する。
【図２９】図２９は、滅菌濾過の前（曲線Ａ）および後（曲線Ｂ）における微生物汚染の検出（＞１μｍにおける）を示す図である。
【図３０】図３０は、完全な分割ステップの例を示す図である（分割の前における、ウイルス粒子全体を含有する試料（曲線Ｂ）と比較して、分割の後には、完全な粒子の残存を検出することができなかった（曲線Ａ））。
【図３１】図３１は、不完全な分割ステップの例を示す図である。図３０とは対照的に、分割作用の弱い薬剤を用いた（曲線ＡおよびＢ）ところ、ウイルス粒子全体の残存を検出することができたので、不完全な分割が結果としてをもたらされた。曲線Ｃは、分割されていない天然試料（対照）を示す。
【図３２】図３２は、各々の流体力学的径が約６μｍであり、測定されたアジュバント粒子（水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム）の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１６６】
ＰＶＣ標準物質の直線性および再現性
ディスク遠心分離により得られる粒子サイズ分布データを用いて、粒子濃度を計算しうるのかどうかを決定するために、本発明者らはまず、サイズおよび密度が公知の認定ＰＶＣ標準粒子（ＣＰＳ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて研究を実施した。それらが、その後の実験において用いられるウイルス粒子とほぼ同じサイズであるため、２６３ｎｍおよび２２５ｎｍのＰＶＣ標準粒子を選んだ。
【０１６７】
ＰＶＣ粒子を、水中で、出発材料の８０％、６０％、４０％、および２０％（ｖ／ｖ）まで希釈した。非希釈のＰＶＣ出発材料もまた用いた。全ての測定を３連で実施して、再現性について調べた。測定値の標準偏差により示される通り、この方法は、高度に再現可能であることが示される（図３〜５を参照されたい）。
【０１６８】
ディスク遠心分離機の操作  
本研究において用いられるディスク遠心分離機は、ＣＰＳ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（モデル：２４０００ＵＨＲ）により製造された。２％（ｗ／ｖ）スクロース溶液および８％（ｗ／ｖ）スクロース溶液を用いて、それぞれ、ｐＨ７．５の５０ｍＭ  ＮａＰＯ４ならびにｐＨ７．５の５０ｍＭ  ＮａＰＯ４および１２０ｍＭのＮａＣｌ中で希釈して、手作業により密度勾配溶液を調製した。次いで、これらの溶液を混合して、２、２．７５、３．５、４．２５、５、５．７５、６．５、７．２５、８％（ｗ／ｖ）を含有する９つのスクロース溶液を得た。ディスク遠心分離機は、２４０００ＲＰＭに設定した。２４０００ＲＰＭに達し、蒸発防止カバーをかけた後に、８％（ｗ／ｖ）溶液で始めて２％（ｗ／ｖ）溶液で終わる１．６ｍｌずつのスクロース溶液をディスクへと注入した。蒸発をさらに防止し、安定性を延長するため、０．５ｍｌのドデカンを、確立された密度勾配へと適用した。密度勾配の直線性を可能とする２０〜３０分間の試行時間の後、正確な容量を注入するため、シリンジを用いて２００μＬの試料を注入した。測定パラメータは、粒子密度：１．１６ｇ／ｍｌ、最大サイズ：２μｍ、最小サイズ：０．０４μｍ、粒子の屈折率：１．５４、粒子の吸収：０．００１であった。
【０１６９】
結果
本発明者らは、粒子濃度と相関するＰＶＣサイズ分布の２つの特徴：サイズ分布の最大重量（すなわち、最大値）およびサイズ分布の積分重量を同定した。結果を、図３〜５に示す。サイズ分布の積分重量および最大重量のいずれも、注入されたＰＶＣ粒子濃度に対する線形相関を示した。これは、注入されたＰＶＣ粒子濃度とサイズ分布の最大重量および積分重量との高い相関係数により示される（それぞれ、０．９９７９および０．９９７７）。全ての値は高度に再現可能であり、標準偏差の最大は５％未満であった。
【０１７０】
ウイルス試料の直線性および再現性
ディスク遠心分離から導出されるサイズ分布と合成粒子濃度との間には相関を観察しうることを決定したので、本発明者らは、同様の相関が、ウイルス粒子を含む試料を用いて観察しうるのかどうかについても調べた。用いたウイルスは、凝集しないインフルエンザウイルスＨ３Ｎ２（Ａ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７Ｘ−１７５Ｃ）株であった（図１を参照されたい）。元のウイルス出発材料を、ｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム中で、出発材料の８０％、６０％、４０％、および２０％（ｖ／ｖ）へと希釈した。また、非希釈のウイルス材料も用いた。多様な濃度のウイルス粒子を用いて、４０ｎｍ〜２μｍの範囲のウイルス粒子のサイズ分布の最大重量および積分重量の直線性について調べた。ｑＲＴ−ＰＣＲにより決定される、１ｍｌ当たり１．３７×１０１２の保護コピーを含む、元のウイルス調製物について調べた。また、元のウイルス調製物を、５０ｍＭのＮａＰＯ４中で希釈して、元の材料と比較した８０％、６０％、４０％、２０％（ｖ／ｖ）希釈物も用意した。また、非希釈のウイルス調製物についても調べた。
【０１７１】
結果
結果を図６〜８に示す。サイズ分布の積分重量および最大重量について、注入された粒子の濃度との高い相関係数が観察された（それぞれ、０．９８４３および０．９８７）。これは、（非凝集）ウイルス粒子濃度とサイズ分布特徴との驚くべき線形関係を示す。再現性を評価するために、全ての測定は、３連で実施したところ、最大の標準偏差は１３％であった。推定粒子密度を１．１６ｇ／ｃｍ３としたところ、約９５ｎｍの流体力学的径が観察されたが、これは、８０〜１２０ｎｍの間の参照直径［参考文献４５］と符合し、単独粒子を示す。測定バッファー中に、凝集体は観察されなかった。
【０１７２】
したがって、サイズ分布の最大重量および積分重量は、試料中の非凝集ウイルス粒子の濃度と相関する。
【０１７３】
多様な下流の加工ステップにより得られるインフルエンザ試料
次いで、本発明者らは、ＰＶＣ標準物質および単一の非凝集ウイルスを用いて観察される相関が、異なる量のウイルス粒子ならびに培地、少量の塩、および生理学的バッファーを含めた異なるバッファー条件を含有するさらなる加工ステップを経たウイルス調製物を、試料中に翻訳するのかどうかについて探索した。本発明者らは、ＭＤＣＫ細胞内で成長させた３つの異なる株（Ｈ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１、およびＢ型）に由来する異なるインフルエンザ調製物について調べた。下流の加工ステップの概要を、図９に提示する。Ｈ３Ｎ２は凝集しない株であり（図１）、Ｈ１Ｎ１は凝集する株である（図２を参照されたい）。ウイルス調製物は、収集、限外濾過および透析濾過、クロマトグラフィーによる精製、または密度勾配による精製により得、ディスク遠心分離を用いて測定した。
【０１７４】
ウイルス粒子を定量化するための外部測定値として、逆転写酵素ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて、保護コピーの数を決定した。処理前試料の一部として、ＲＮアーゼＡ／Ｔ１ミックス（２ｍｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡと５０００Ｕ／ｍｌのＲＮアーゼＴ１とのミックス）（１：１１に希釈し、室温で３０分間にわたりインキュベートした）を用いて、破壊されたウイルス粒子および遊離ＲＮＡの影響を取り除いた。定量化のために所望される範囲へとＣＤＭにより希釈した後、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  Ｖｉｒｕｓ／Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｍｉｄｉ  ＫｉｔによるＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙを用いてウイルスＲＮＡを抽出した。次いで、５μＬの抽出されたＲＮＡを、マトリックス遺伝子保存領域の０．４０μＭのフォワードプライマー（ヌクレオチド配列：インフルエンザＡが、５’−ＣＡＧＧＣＣＣＣＣＴＣＡＡＡＧＣ−３’（配列番号１）、インフルエンザＢが、５’−ＧＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＴＴＧＣＣＴＡＣＣ−３’（配列番号２））およびリバースプライマー（ヌクレオチド配列：インフルエンザＡが、５’−ＧＣＧＴＣＴＡＣＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣ−３’（配列番号３）、インフルエンザＢが、５’−ＧＣＡＧＡＴＡＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＴＴＡＧＴＧ−３’（配列番号４））、これに合致する０．２μｍのＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（ヌクレオチド配列：インフルエンザＡが、５’−６ＦＡＭ−ＡＧＧＴＧＡＣＡＧＧＡＴＴＧＧＴＣＴＴＧＴＣＴＴＴＡＧＣＣ−ＢＢＱ−３’（配列番号５）、インフルエンザＢが、５’−６ＦＡＭ−ＡＧＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＡＣＴＡＧＣ−ＢＢＱ−３’（配列番号６））、最終濃度１倍の反応ミックス１２．５μＬ、０．５μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ／Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｍｉｘ、ならびに６．３５μＬのＰＣＲグレード水を含有する２０μＬのＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘへと添加した。ＰＣＲ反応は、一本鎖ＲＮＡの二本鎖ｃＤＮＡへの逆転写を可能とする、５０℃で１５分間にわたる最初のステップと、９５℃で２分間にわたる最初のＴａｑ活性化とを包含した。次いで、９４℃で１５秒間および６０℃で４５秒間の４５サイクルを実施した。蛍光の検出は、６０℃の各ステップの後で実行した。解析のために、各反応物を、そのサイクル閾値により特徴付けした。これにより、蛍光があらかじめ定められたサイクル閾値を超えるときのサイクルが同定され、これは、２０蛍光単位であった。サイクル閾値の上昇は、検量線を作成するために用いられる初期標準物質である、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写物の対数量の減少と相関しうるであろう。全ての反応物は、公知濃度のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔによる転写物と対比して定量化される。
【０１７５】
異なるウイルス試料は、９．５Ｅ１０９〜２．９Ｅ１０１２の範囲にある、１ｍｌ当たりの保護コピーの数により示される、異なる量のウイルス粒子を含有した。
【０１７６】
ヘマグルチニンの定量化は、既に記載されている［参考文献４２］一元放射免疫拡散アッセイを用いて実施した。ダルベッコＰＢＳ中に１％のアガロースと、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＮＩＢＳＣ、Ｌｏｎｄｏｎ）により提供されている特異的抗体とを含有する、４ｍｍの孔を伴うゲルを調製した。凝集を防止するために、各試料を、１％（ｗ／ｖ）のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４溶液で処理した。試料は、ダルベッコＰＢＳを用いて、元の材料に対して７５％、５０％、および２５％（ｖ／ｖ）へと希釈した。また、非希釈の出発材料も用いた。２０μＬの試料をゲルの一切れへと導入した。１８時間にわたるインキュベーションの後、ゲルをクーマシーブルー溶液（５００ｍｌの脱染色溶液中に１．５ｇのＳｅｒｖａ  Ｂｌｕｅ  Ｒ）中で１０分間にわたり染色し、脱染色溶液中（水中に１１．８％（ｖ／ｖ）の酢酸および３０％（ｖ／ｖ）のメタノールを含有する）で少なくとも３０分間にわたり脱染色した。次に、２つの直交方向にあるエッジの直径を測定することにより、抗原−抗体沈殿物によるリングの面積を決定した。解析は、希釈物上のリングの直径についての試料による傾きと参照標準物質による傾きとの関係によりヘマグルチニンの濃度を定量化しうる、傾き比モデルを用いて実施した。定量化の限界は、十分高く濃縮されたインフルエンザ試料のヘマグルチニンの定量化だけを許容した。
【０１７７】
凝集しないインフルエンザ株（Ｈ３Ｎ２）についての結果
図１０〜１１は、Ｈ３Ｎ２株について、ウイルス／ヘマグルチニン濃度にわたるサイズ分布の最大重量および積分重量を示す。サイズ分布には凝集体が観察されず（図１を参照されたい）、ディスクへと注入されたウイルス粒子の量とサイズ分布の最大値との線形相関が観察された。注入されたウイルス粒子の量とサイズ分布の最大重量との間では、０．８８９７（ｑＲＴ−ＰＣＲ）および０．７２５２（ＳＲＤ）という高い相関係数が観察された。また、注入されたウイルス粒子の量とピーク積分との間でも、０．７４５５（ｑＲＴ−ＰＣＲ）および０．８０３３（ＳＲＤ）という高い相関係数が観察された。これらは、注入されたウイルス粒子の量とサイズ分布の特性係数との線形関係を示す。低濃度のインフルエンザ粒子を含有する試料については、ヘマグルチニン濃度が、ＳＲＤアッセイの定量化限界に達するほど十分には高くなかったために、ｘの範囲が狭くなり、より低いＲ２値が結果としてもたらされたことに注意されたい。さらに、ＳＲＤの値およびｑＲＴ−ＰＣＲの値は、それぞれ、１０％未満および２０％未満の典型的な標準偏差で測定され、このために、既知の値との相関に関連する相関係数の上限が低下したことについても考慮しなければならない。
【０１７８】
したがって、本発明者らは、注入された非凝集ウイルス粒子の量とサイズ分布特徴（サイズ分布の最大重量およびサイズ分布の積分重量）との間に線形関係を観察した。
【０１７９】
凝集するインフルエンザ株（Ｈ１Ｎ１）についての結果
試料は、収集、限外濾過／透析濾過、クロマトグラフィーによる精製、および密度勾配による精製を含めた異なる作製技法により得た（図９）。したがって、これらの試料は、異なるバッファーならびに凝集ウイルス粒子および非凝集ウイルス粒子の異なる比を含有した。Ｈ３Ｎ２株については、注入された粒子の量とサイズ分布の最大重量との線形相関が観察され、相関係数は０．９０７７（ｑＲＴ−ＰＣＲ）および０．８８２６（ＳＲＤ）であった（図１２および１３を参照されたい）。注入された粒子の量とウイルスピークの積分重量との間では、０．９７３４（ｑＲＴ−ＰＣＲ）および０．９８９（ＳＲＤ）の線形相関が観察された。
【０１８０】
下記に示す通り、密度勾配調製物に用いられるバッファーの選択は、粒子のコンフォメーションに影響するので、単独粒子の量と比べて同量の凝集体を維持することが重要である。全ての粒子は非凝集性であることが理想的であり、したがって、全ての試料に対して１つの測定バッファーを用いることにより、等しいバッファー屈折率および凝集における等しい影響を確保することができる。前処理時に不可逆性の凝集条件を用いない限り、相関係数が大きければ、異なる（加工時に用いられたバッファー条件が異なる）インフルエンザ含有試料のサイズ分布は、主に、ディスク遠心分離機内の密度勾配バッファーの関数であることが示される。本発明者らは、凝集を誘導する条件下では、サイズ分布の最大重量と注入された凝集ウイルスの量との間の線形関係が失われることを見出した。これにも関わらず、本発明者らは、凝集粒子を包含するほどの十分に大きな積分区間を使用することを選択する。本発明者らは、驚くべきことに、サイズ分布は、試料中の注入されたウイルス粒子の量と依然として相関するが、これは、サイズ分布の積分重量だけについて成り立つことを見出した（図１３）。これにより、非凝集ウイルス粒子と凝集ウイルス粒子との混合物を含有するウイルス粒子を含む試料を定量化する、驚くべき新たな様式であって、先行技術では容易に達成されなかった様式がもたらされる。
【０１８１】
本発明者らはまた、単一モードのサイズ分布が、粒子凝集の非存在についての陽性対照をもたらしうることも観察した。これはまた、面積：体積比が、測定、例えば、ＥＬＩＳＡに影響しうる他の定量的アッセイデータを検証するのにも用いることができる。
【０１８２】
凝集するインフルエンザＢ株（Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８）についての結果
勾配調製物にｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーを用い、収集、分離収集、限外濾過／透析濾過、および密度勾配またはクロマトグラフィーによる精製材料を用いたところ、このインフルエンザＢ株は凝集を示さなかった。異なるウイルス含有試料は、ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定される、１ｍｌ当たり１Ｅ１０〜２Ｅ１２の範囲の保護コピーの数により示される、異なる量のウイルス粒子を含有した。サイズ分布の最大重量と１ｍｌ当たりの保護粒子の注入された量との間では、高い相関係数（ｑＲＴ−ＰＣＲによる０．８９１２およびＳＲＤによる０．８８０１）が観察された（図１４を参照されたい）。高い相関係数はまた、積分されたサイズ分布と注入された粒子の濃度との間でも観察され、０．９３７６（ｑＲＴ−ＰＣＲ）／０．７２０１（ＳＲＤ）の値であった（図１５を参照されたい）。これらの強い相関は、これらのサイズ分布パラメータと注入されたウイルスの濃度との間に強い線形関係を示す。
【０１８３】
全ての被験インフルエンザ株についての結果
図１６および１７に実証される通り、全ての被験インフルエンザ株は、同じ種に属し、形態および構造におけるわずかな差異だけを有する。Ｈ１Ｎ１株は、ｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中で凝集を示したが、１２０ｍＭのＮａＣｌを添加することにより凝集が低減され、サイズ分布の最大重量と注入された粒子の濃度との間に相関が可能となった。１２０ｍＭのＮａＣｌの添加は、他の被験株のサイズ分布に影響を及ぼさなかったので、屈折率などの測定値に影響する他のパラメータは一定のままであった。全ての被験インフルエンザ株は、１ｍｌ当たりの保護コピーの濃度とサイズ分布の最大重量との間で、同様の傾きの線形関係を示し、また、積分重量についても、同様のことを示した。
【０１８４】
ウイルス粒子のコンフォメーション状態が大部分で非凝集性（サイズ分布から容易に決定され得る）の場合は、インフルエンザ粒子の異なる株を、株特異的に較正することなく定量化することができる。しかし、異なる株を個別に評価する場合、わずかな株特異的差異に起因して、相関係数が大きくなる可能性がある。さらに、異なる株は、非凝集粒子の凝集粒子に対する異なる比または異なるサイズ範囲を有することから、幅が異なり、したがって、振幅が異なるピークをもたらしうる。例えば、同じ勾配溶液を全ての測定に用いる場合に、非凝集粒子の凝集粒子に対する同じ分解能および同じ比が確保されるならば、サイズ分布の最大重量に基づく定量化で十分な場合がある。１つの株の産生でのマスバランシング（ｍａｓｓ  ｂａｌａｎｃｉｎｇ）など、一部の粒子定量化適用では、絶対量ではなくて相対量を用いることもできる。
【０１８５】
バッファーの選択の凝集体の形成に対する影響
本発明者らは、分離流体（例えば、密度勾配）において用いられるバッファーの選択が、測定される粒子のコンフォメーションに影響しうるのかどうかについて調べた。
結果
本実施例では、生理学的バッファー（５０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７．５）により、Ｈ１Ｎ１株のわずかな凝集が誘導された（凝集体のほか、単独の非凝集粒子も観察された；図１８）。
【０１８６】
ウイルスサイズのサイズ分布の最大値の増大により示される通り、１２０ｍＭの最終濃度までＮａＣｌを添加することにより、凝集体の減少および非凝集粒子の増大がもたらされた（図２０）。これにより、本発明者らによる、密度勾配調製物に用いられるバッファーは、サイズ分布の測定に対して大きな影響を及ぼすという観察が再確認される。
【０１８７】
参考文献４３において記載される通り、純水中で（図１８）、または低ｐＨで（図１９）密度勾配を調製したところ、強いウイルスの凝集が誘導された。これに対し、参考文献１において記載される通り、高圧ホモジナイザーを用いるホモジナイゼーションは、サイズ分布ピークの最大重量の上昇およびＴＣＩＤ５０／ｍｌの上昇により示される、凝集の低減および非凝集粒子数の増大をもたらした（図２１）。
【０１８８】
凝集粒子の場合、超音波処理、高圧ホモジナイゼーション（参考文献１を参照されたい）、または塩の添加などの離解条件／プロセスを用いれば、凝集を最小化する一助としうるであろう。主要なウイルスピークに対するサイズ分布の最大重量により、凝集するウイルスを定量化することが可能でありうる。これは、非凝集ウイルス（図１０〜１１）が、特異性のさらなる増大を提供し得るサイズ分布特徴とともに、凝集ウイルスより高い相関係数を示したため、有益である可能性がある。積分した重量分布を用いると、細胞性粒子または細胞の構成要素を伴うウイルス粒子の凝集体の包含に対する感受性が大きくなる。
【０１８９】
先行技術における方法を凌駕するディスク遠心分離の利益
本発明者らは、本発明のディスク遠心分離方法が、ウイルス定量化のための現行のゴールドスタンダードであるｑＲＴ−ＰＣＲを含めた先行技術におけるウイルス定量化方法とどのようにして比較するかについて試験した。ベータ−プロピオラクトンによる不活化インフルエンザウイルス試料を、本発明のディスク遠心分離法、ＴＥＭ、および現行のゴールドスタンダードであるｑＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。ｑＲＴ−ＰＣＲおよびＴＥＭを用いて測定されるウイルス粒子の量を表１に示し、本発明のディスク遠心分離法を用いて測定されるウイルス粒子の量を図２２に示す。
【０１９０】
【表１】
2014531030.tif 000003
ベータ−プロピオラクトンによる不活化は、インフルエンザウイルスのＲＮＡを損傷する。ｑＲＴ−ＰＣＲによる定量化は、元の試料中に実際に存在する粒子の数より４３％小さな値をもたらす。時間がかかるが、ＴＥＭは、ｑＲＴ−ＰＣＲより正確であり、元の粒子数の８１％であるウイルスカウントを提示した。しかし、驚くべきことに、本発明のディスク遠心分離機ベースの方法は、従来の先行技術における技法よりはるかに容易で正確であることが判明し、サイズ分布の最大重量を用いた場合は元の粒子数の９３％を検出し、サイズ分布の積分重量を用いた場合は元の粒子数の９２％を検出した。
【０１９１】
したがって、本発明は、ウイルス含量を定量化するための迅速で正確な方法であって、先行技術において利用可能な方法より優れた方法を提供する。本発明はまた、例えば、元のウイルス出発材料より小さい粒子サイズの比率において相対的増大により示される通り、ウイルス粒子全体が破壊されたのかどうかをモニタリングするのにも有用である。図２３において示される通り、本発明はまた、バイオリアクター内のウイルスレベルをモニタリングするのにも有用である。図２３はまた、本発明が、高力価の発酵を定量化するのに特に有用であることも裏付ける。図２３に基づくと、本明細書で詳述される装置を用いる上記方法の検出限界は、ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定される１ｍｌ当たり約５Ｅ０９の保護ウイルスコピーであると評価された。検出限界は、試料中の粒子の種類および粒子サイズ分布を決定するために用いられる装置によって異なりうる。
【０１９２】
結論
本発明は、試料中の非凝集ウイルス粒子および／または凝集ウイルス粒子を定量化するための迅速な方法であって、物理的な粒子測定法に基づく方法を提供する。本発明の方法は、ウイルス粒子（例えば、インフルエンザ粒子）を含む試料を１５分間以内に定量化することを可能とする。本発明者らは、驚くべきことに、光吸収検出器などの検出器と組み合わせたディスク遠心分離を用いて、インフルエンザウイルス粒子などのウイルス粒子を定量化しうることを見出した。本明細書で用いられる実験条件下では、インフルエンザのＨ３Ｎ２株およびＢ株が、非凝集ウイルスを表す単一モードのサイズ分布を示した。（ｑＲＴ−ＰＣＲにより決定される）インフルエンザ粒子の量と、（ＳＲＤにより測定される）ヘマグルチニンの量と、サイズ分布の最大重量との間では、また、サイズ分布の積分重量との間でも、高い相関が観察された。
【０１９３】
本明細書で用いられる実験条件下では、ｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーを用いたところ、インフルエンザのＨ１Ｎ１株が凝集を示した。サイズ分布の積分重量（非凝集粒子および凝集粒子を含む）と、注入されたウイルス粒子の量との間では、強い相関が観察された。本発明者らはまた、１２０ｍＭのＮａＣｌの添加により凝集を減殺することが可能であり、この結果として、サイズ分布の積分重量の、注入されたウイルス粒子／ヘマグルチニンの量との間に強い相関をもたらし、また、サイズ分布の最大重量の、注入されたウイルス粒子／ヘマグルチニン粒子の量との間に強い相関をもたらしうることを見出した。本発明の方法は、ウイルスの作製における使用に適する、例えば、ウイルス粒子の量をモニタリングするのに適する。
【０１９４】
さらに、本発明の方法は、注入された粒子の量とサイズ分布の特性係数との間で直線性を示し、これにより、対数的な希釈ステップが力価の推定に必要とされ、それゆえ対数のスケーリングに起因する誤差の増大を結果としてもたらすＥＬＩＳＡまたはウイルス滴定など既存のウイルス定量化法を用いる場合に遭遇することが多い誤差が最小化される。同様に、先行技術における定量化法に必要とされることが多い段階希釈ステップも、各希釈ステップと共に導入される誤差に起因する測定誤差を増進しうる。
【０１９５】
ディスク遠心分離による粒子密度および粒子サイズの決定
本発明者らは、また、ディスク遠心分離を用いて、例えば、ウイルス粒子の粒子密度を決定することができ、また、例えば、ウイルス粒子の粒子サイズも決定しうるのかどうかについても調べた。これにより、外部で測定された（例えば、先行技術におけるウイルス定量化法のうちのいずれかによる）粒子密度、または文献から導出される粒子密度に対する必要が取り除かれるであろう。この方法は、例えば、粒子密度および／または粒子サイズを決定するのに有用である。粒子は、生物学的粒子、例えば、ウイルス粒子の場合もあり、非生物学的粒子の場合もある。
【０１９６】
これらの実験は、複数の原理に基づいた。粒子の注入と粒子の検出との間の時間を用いて、粒子の沈降速度を決定することができる。沈降速度は、粒子サイズと相関しうる。特に、粘性および密度が大きい流体中の粒子は、検出器による検出までの沈降時間が長い（図２４）。分離流体のレオロジー特性（密度、粘性など）は、公知の密度およびサイズ（流体力学的径）を有する標準物質、例えば、ＰＶＣ標準粒子を用いて計算することができる。したがって、ディスク遠心分離により粒子密度および粒子サイズを測定するには、先行技術における他のサイズ測定技法、例えば、動的光散乱と比較して小さなパラメータセットだけが必要とされる。極めて重要なパラメータは、浮遊密度である。
【０１９７】
本発明者らは、粘性および／または密度が異なる流体中の粒子についての沈降速度の変化が、粒子密度の計算のための回帰分析の実施を可能とするのかどうかについて調べた。
【０１９８】
ディスク遠心分離機の操作
ディスク遠心分離により粒子密度および粒子サイズを決定するために、上部の濃縮された溶液を下部の濃縮された溶液と混合して、９つの溶液（それぞれ、２％、２．７５％、３．５％、・・・８％のスクロースを伴う溶液、および１４％、１４．７５％、・・・２０％のスクロースを伴う溶液）を提供することにより、ｐＨ７．５の５０ｍＭ  ＮａＰＯ４中に２〜８％（ｗ／ｖ）および１４〜２０％（ｗ／ｖ）のスクロース勾配を調製した。非生物学的材料については、ｐＨ７．５の５０ｍＭ  ＮａＰＯ４中に３１〜３７％（ｗ／ｖ）および５１〜５７％（ｗ／ｖ）スクロース勾配によりさらなる測定を実施した。ディスクの回転は、生物学的粒子には２４０００ＲＰＭに設定し、非生物学的材料には１００００ｒｐｍに設定した。設定されたＲＰＭに達した後、最高濃度の溶液で始めて最低濃度の溶液で終わる１．６ｍｌずつのスクロース溶液をディスクへと注入した。次いで、水の蒸発を防止するために、０．５ｍｌのドデカンを注入した。２０〜３０分間にわたる平衡時間の後、測定を開始した。０．０５％のＰＶＣを含有する、２２６ｎｍおよび２６３ｎｍの標準物質ＰＶＣ粒子溶液を較正に用いてから特徴付けを行った。その後のデータ解析のために、試料測定の前後に、１００μＬの標準物質粒子溶液を測定した。次いで、第２のスクロースバッファー勾配を用いる測定を実施した。全ての試料注射には、Ｈａｍｉｌｔｏｎ製のシリンジを用いた。
【０１９９】
粒子溶液
以下のウイルス粒子溶液：ＣＤＭ／ＰＦ培地中のＭＤＣＫ細胞（３３０１６  ＰＦ）内で成長させた、１つのインフルエンザＢ株（株Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８）および２つのインフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）株（Ａ／Ｈ３Ｎ２、株Ａ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７  Ｘ−１７５Ｃ、および株Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９  Ｘ−１８７）；タバコ植物体内で成長させたタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）；タバコ植物体内で成長させたトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）；ニワトリ胚線維芽細胞内で成長させた狂犬病（Ｆｌｕｒｙ  ＬＥＰ）ウイルスを用いた。以下のＰＶＣ標準物質：３７７ｎｍのポリ塩化ビニル粒子溶液、および２２６ｎｍのポリ塩化ビニル粒子溶液を用いた。また、酸化ケイ素も用いた。
【０２００】
結果
本発明者らは、試料中の粒子の浮遊密度の推定を可能とする、したがって、正確な絶対サイズ（流体力学的径）の推定を可能とするモデルを導出した。モデルは、異なるレオロジー特性を有する（少なくとも）２つの異なる流体中の試料の（少なくとも）１つの測定に続く回帰分析に基づく。粘性および密度が高い分離流体中の粒子は、検出までに長い沈降時間を呈示し、この逆も成り立つことが見出された（図２７を参照されたい）。
【０２０１】
ＰＶＣ粒子およびウイルス粒子のサイズを決定するためのこのモデルの適用可能性は、推定浮遊密度および推定サイズを、文献中の参照値と比較することにより裏付けられる（表２）。
【０２０２】
粘性を一定とする粒子密度および粒子サイズの測定プロセスのモデル化
定常状態における沈殿は、ストークスの法則による抵抗：
【０２０３】
【化２】
2014531030.tif 000004
［式中、
Ｆｓ＝抵抗
Ｄ＝直径
η＝動的粘度
Ｒ＝半径
ｔ＝沈降時間
ｖ＝沈降速度］
と、遠心力：
【０２０４】
【化３】
2014531030.tif 000005
［式中、
Ｆｃ＝遠心力
Ρｐ＝粒子密度
ρＦ＝流体密度
ω＝角加速度
Ｒ＝半径］
が釣り合うことから、
【０２０５】
【化４】
2014531030.tif 000006
を導くことにより記載される。これを積分して、
【０２０６】
【化５】
2014531030.tif 000007
を得る。
【０２０７】
例として、密度を１．３８５ｇ／ｍｌとする粒子について、流体密度に対する一定の沈降距離（検出点ＲＤと最初の沈降点Ｒ０との距離）、粘性、直径および角加速度、沈降時間ｔを図２６に示す。粒子密度が流体密度と等しいとき、沈降時間は、遠心力の減少に起因してゼロに近づく。したがって、沈降時間は、無限大に収束する。
【０２０８】
流体密度に対する沈降時間の逆数変換により、線形関係
【０２０９】
【化６】
2014531030.tif 000008
が導かれる（図２６を参照されたい）。したがって、流体密度に対して１／ｔをプロットし（例えば、１ｍｌの分離流体を秤量することにより）、回帰分析を施し、回帰の絶対項を負の傾き：
【０２１０】
【化７】
2014531030.tif 000009
で除することにより、一定の粘性について粒子密度を推定することができる。
【０２１１】
したがって、異なる（しかし、公知の）密度および一定の粘性を有する２つの異なる分離流体中の同じ試料を同じ速度で測定し、ディスク内で同量の流体を測定することにより、浮遊密度を推定しうる回帰が導かれる。密度の異なる２つの流体に対する一定の粘性とは、強力な仮定である。次のステップは、レオロジー特性、とりわけ、粘性が異なる２つの流体中の試料測定を可能とするモデルによる一般化をもたらす。
【０２１２】
粘性の外部での測定を回避する、可変の粘性での粒子密度および粒子サイズの測定プロセスのモデル化
粘性を可変とするが既知とすると、式（４）のモデルから、
【０２１３】
【化８】
2014531030.tif 000010
を導出することができる。この場合、粘性を公知とすると、ρＦに対するη／ｔのプロットにより、上記と同様にして、未知の粒子密度の計算が導かれる。しかし、流体粘性は、多数のパラメータ、例えば、流体の温度および化学組成に高度に依存する。したがって、このようなデータがともかく入手可能であると仮定して文献中のデータにより作業すれば、大きな誤差が結果としてもたらされうる。したがって、分離流体の粘性については推定が必要とされる。較正には標準物質、例えば、ＰＶＣ粒子が必要とされるので、流体の粘性は、
【０２１４】
【化９】
2014531030.tif 000011
［式中、
Ρｐ，Ｓｔｄ＝較正標準物質の密度
ＤＳｔｄ＝較正標準物質の直径
ｔＳｔｄ＝較正標準物質の沈降時間］
により導出することができる。
【０２１５】
（８）を（７）へと代入することにより、
【０２１６】
【化１０】
2014531030.tif 000012
が導かれる。したがって、標準物質の粒子密度と流体密度との差に、標準物質粒子の沈降時間を試料粒子の沈降時間で除した商を乗じて、流体密度に対してプロットし、線形回帰の傾きをｙ切片で除することにより、粒子密度を推定することができる。
【０２１７】
【化１１】
2014531030.tif 000013
公知でなければならないのは較正標準物質の密度だけであり、較正標準物質のサイズは、全ての被験流体密度について同じでなければならない。さらに、式（８）はまた、
【０２１８】
【化１２】
2014531030.tif 000014
により、較正標準物質のサイズと対比した粒子の流体力学的径の推定も可能とする。
【０２１９】
このモデルを適用するのに必要な条件は、
・沈降の出発点〜粒子の検出点の沈降距離が一定であること、これは、実際には、適用される勾配流体について、ディスクへと注入される流体体積が同じとなるように適用することである
・少なくとも２つの分離流体のレオロジー特性（密度、粘性など）が異なること
・分離流体の密度は公知でなければならないこと
・密度が公知の標準物質粒子を適用すること
・１分間当たりの回転数が、全ての測定について一定であること
・両方の流体の間で直径の変化が見られないこと（例えば、バッファー１中で粒子の凝集がみられず、かつ、バッファー２中でも凝集がみられないこと）。これには、総密度がディスク密度勾配内の最小密度より大きな試料をディスク内に入れる場合に生じうるストリーミングが含まれる。試料自体または試料流体の部分が、粒子として挙動しうること
である。
【０２２０】
これらの必要条件の全てはおそらく、最後の条件を除き、容易に満たされる。にも関わらず、凝集または少なくともサイズのシフトは、サイズ分布解析により容易に同定することができる。凝集が生じた場合、これは、分布サイズの大幅なシフトまたは高度に幅広のピークにより同定することができる。「不正確な」密度で作業しても、同じサイズの粒子は、異なる流体中で同じ「不正確な」サイズを有するはずである。そうでなければ、ストリーミング効果または他のサイズ変化プロセス、例えば、凝集が生じうる。
【０２２１】
流体密度は比較的容易に決定され、粘性ほど温度変化の影響を受けやすくはない。しかし、外部密度を特徴付けするときの温度差およびディスク遠心分離時間における温度差は制御が困難であり、測定に影響を及ぼす可能性がある。代替的に、流体密度は、第２の較正標準物質の導入により決定することができる。この方法では、両方の較正標準物質について密度および直径が公知でなければならない。この場合は、線形回帰分析を可能とする遠心分離速度、流体密度、流体粘性、および沈降出発点〜検出点の距離は変化させず、流体密度の代わりに標準物質の粒子密度を変化させる。
【０２２２】
【化１３】
2014531030.tif 000015
ここでもまた、ρＰに対して１／ｔＤ２をプロットし、負のｙ切片を流体密度への線形回帰の傾きで除することにより、
【０２２３】
【化１４】
2014531030.tif 000016
が導かれる。
【０２２４】
流体密度は容易に測定することができ、第２の較正標準物質は入手可能でなかったので、この方法をさらに評価することはなかった。にも関わらず、この方法によれば、２つの較正標準物質を用いるパラメータの外部測定に対する必要が完全に回避されるであろう。
【０２２５】
結果
多様なウイルスおよび非生物学的粒子について測定される粒子密度を表２に示す。トマトモザイクウイルスの粒子密度の推定についての回帰分析を図２２に示し、ＰＶＣ粒子の粒子密度の推定についての回帰分析を図２３に示す。参考文献４５によれば、全ての測定される粒子についての、「実際の」密度と比較した推定密度の誤差が５％未満であったことから、ディスク遠心分離による最適サイズの近似が裏付けられる。
【０２２６】
【表２】
2014531030.tif 000017
本発明は、ディスク遠心分離による粒子サイズの強力な近似を提供する。狂犬病ウイルス、ＴＭＶ、およびＴｏＭＶは棒状で長型の粒子であるので、文献では、流体力学的径が得られない。にも関わらず、参考文献４４によれば、棒状粒子の流体力学的径は、
【０２２７】
【化１５】
2014531030.tif 000018
［式中、
ｄＳｔｏｋｅｓ＝ストークスの直径
ｄｃ＝円筒直径
ｌ＝長さ
β＝長さ／軸比］
により推定することができる。
【０２２８】
したがって、ＴｏＭＶおよびＴＭＶは、長さが３００ｎｍであり、直径が１８ｎｍであり（参考文献４５を参照されたい）、したがって、流体力学的径は３４ｎｍであることが予測される。狂犬病ウイルスの長さは１６０ｎｍであり、直径は７５ｎｍであることが報告されているので、流体力学的径は９４ｎｍであることが予測される。ＴｏＭＶとＴＭＶとは同じウイルス科に属するので、同様の密度およびサイズが予測される。
【０２２９】
ＴｏＭＶ株とＴＭＶ株との間の推定密度および推定サイズの差異は２％未満であり、実際の密度に照らした誤差は５％未満であり、実際のサイズに照らした誤差は２０％未満である。同様に、推定密度値と文献値との差異（参考文献４５による）も３％未満であった。また、狂犬病ウイルスについても、推定密度と実際の密度との差異は４％未満の誤差であることから、計算された実際の流体力学的径に照らした１３％未満の誤差を有する、同様のサイズが導かれる。
【０２３０】
評価された非生物学的粒子は、ポリ塩化ビニル粉末および酸化ケイ素（ＩＶ）粉末であり、これらについての推定密度と参照密度との差異は２％未満（ポリ塩化ビニル）および１５％（酸化ケイ素（ＩＶ））であった。粒子標準物質の使用は、ディスク遠心分離による最も重要なパラメータの直接的な測定を可能とする（参考文献４６を参照されたい）ので、再現可能で正確なサイズ分布を得ることができる。ウイルス粒子を適用したところ、標準偏差により示される、測定されるサイズの再現性は、２％未満であることが見出された（３連で測定、データは示さない）。さらに、流体間の密度差が増大するほど、ｙ方向の偏差によりもたらされる誤差の影響は小さくなる。最終的に、密度勾配内に粒子が捕捉されることを回避するためには、検出点における流体密度が、標的粒子密度より小さくなければならない。
【０２３１】
したがって、粒子標準物質の使用と組み合わせたディスク遠心分離により、粒子サイズおよび粒子密度を決定するために必要とされるパラメータの大半が直接測定される（また、参考文献４６も参照されたい）。したがって、本発明のこの方法を用いて、再現可能で正確なサイズ分布を得ることができる。本発明者らは、この方法が、ウイルス粒子の解析に特に有用であり、測定の標準偏差を２％未満とする（データは示さない）ことから、上記方法が高度に再現可能であることが示されることを見出した。また、この方法を介して得られるデータも、製造元の情報と符合する。
【０２３２】
誤差の近似は実施しなかったが、ディスク遠心分離を用いる密度の推定を最適化するには、多数の因子を用いうるであろう、例えば、流体の密度の間の差異が大きくなれば、ｙ方向の偏差によりもたらされるいかなる誤差の影響も減殺されるであろう。検出点における流体の密度は、測定される粒子の密度より低いことが理想的であり、そうでなければ、試料中の粒子は密度勾配内に捕捉され、検出器には達しないであろう。２つの異なる流体中のウイルス粒子の密度を推定するために実施した測定は１回だけであるが、良好な近似が観察された。ストークスおよび遠心力に基づいて提起されるモデルの正確さは、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）粒子および酸化ケイ素（ＩＶ）粒子を、４つの異なる勾配中、３連で測定することにより評価した。０．９９９３（ＰＶＣ、図２８）および０．９８８３（酸化ケイ素、データは示さない）という高い相関係数により、用いたパラメータの間の線形関係が確認され、これにより、提起されるモデルが検証された。小さな密度差（回帰ベースのｘ値）に対して最大で６．５倍の大きな粘性差（最大の場合は、式８を、標準物質粒子による、粘性の最も小さい流体の測定値で除することによる）だけを用いたが、標準偏差は、ＰＶＣおよび酸化ケイ素（ＩＶ）粒子について、それぞれ、０．９％および１．２％未満であった。
【０２３３】
適用された全ての粒子について、提起される方法による密度の決定は、決定された粒子密度と参照粒子密度との良好な近似を結果としてもたらし、差異は最大で１５％であった。ウイルス粒子については、２つの測定流体（２〜８％（ｗ／ｖ）のスクロースおよび１４〜２０％（ｗ／ｖ）のスクロースを含有する）だけを用いたところ、粒子密度と流体密度の差異が小さいことに起因して、差異を４％未満とする密度の決定が可能となった。明らかに、用いられた条件は、粒子密度の推定を高い精度で可能とするのに適切である。さらに、式（７）の使用は、頑健で高度に再現可能な沈降速度の計算を可能とした。密度の変化は２０％だけであるが、動的粘度の変化は６５０％である、４つの異なる密度勾配中で３連の測定は、各々１．２％未満の標準偏差を示した。再現性の大きさと併せた、線形回帰のための０．９８を超える相関係数は、頑健性の大きさのほか、良好なモデル近似を示した。また、利用可能であっても、時間がかかり（ウイルス滴定または電子顕微鏡法の場合、最大で数日間にわたる）、誤差を生じやすい、ウイルス滴定、電子顕微鏡法、またはＥＬＩＳＡなど、粒子定量化のためのさらなる方法の使用も回避することができる。測定されたウイルス粒子に対して、２つの異なる流体を用いる（ウイルス粒子サイズに依存する）密度の決定は、１時間以内で可能であった。したがって、この方法であれば、例えば、未知のウイルスについての粒子密度の決定に用いうるであろう。次いで、決定されたウイルス粒子密度を用いて、下流の加工ステップ、例えば、等密度画分化を伴う密度勾配による遠心分離のデザインおよび最適化を支援しうるであろう。
【０２３４】
さらなる測定またはさらなる流体により、粒子密度の推定がさらに改善されうるであろう。
【０２３５】
試料中の微生物汚染の評価
本発明者らはまた、ディスク遠心分離を用いて、試料中の微生物の存在を同定しうるのかどうかについても調べた。微生物粒子は典型的に、直径が１μｍ以上であり、したがって、大半のウイルス粒子よりはるかに大きい。したがって、それらの各々のピークは、ウイルス粒子および微生物粒子を含む粒子サイズ分布において、互いから容易に識別することができる。図２９（曲線Ａ）は、約１．１μｍにおいて異なるピークを示し、これは、被験試料中の微生物粒子に対応する。
【０２３６】
次いで、本発明者らは、この滅菌濾過ステップが、微生物汚染を除去するのに有効であるのかどうかを決定するために、汚染試料に対して滅菌濾過ステップを実施した。約１．１μｍにおけるピークの無視できない低減により示される通り、図２９（曲線Ｂ）は、滅菌濾過ステップにより、微生物汚染物が試料から有効に除去されたことを示す。
【０２３７】
これらの結果は、本発明が、試料中の微生物汚染を同定するため有用であり、また、滅菌濾過ステップが成功したのかどうかを決定するためにも有用であることを裏付ける。
【０２３８】
分割の評価
本発明者らはまた、分割剤を投与することにより、生物学的粒子を分割するのに成功しうるのかどうか、およびどのくらいの分割剤を投与すれば、生物学的粒子を分割するのに成功しうるのかを、ディスク遠心分離を用いて決定しうるのかどうかについても調べた。この場合、生物学的粒子は、ウイルス粒子であった。図３０は、インフルエンザ粒子を含有する試料についての粒子サイズ分布を明確に示す（曲線Ｂ）。図３０（曲線Ａ）は、ウイルスの分割後における同じ試料についての粒子サイズ分布を示す。ウイルスの分割の成功は、ウイルス粒子に対応するピークの有効な除去により明確に明らかである。
【０２３９】
ディスク遠心分離を用いて、不完全なウイルスの分割を同定しうるのかどうかを調べるために、本発明者らは、ウイルス試料を、分割作用の弱い薬剤で処理した（すなわち、図３１の曲線ＡおよびＢ）。図３１の曲線ＡおよびＢ（処理曲線）が対照曲線Ｃと同様であることから、分割作用の弱い薬剤による処理は、完全な分割を結果としてもたらさなかったことが裏付けられる。用いられた量の分割剤が、実質的に全てのウイルス粒子を分割したわけではなかったが（例えば、図３０の曲線Ａにおいて示される通り）、曲線ＡおよびＢのサイズ分布の最大重量は、曲線Ｃのサイズ分布の最大重量より小さいことを見ることができ、これにより、ウイルス粒子全体の量がわずかに減少した（すなわち、スプリットウイルス粒子の量が増大した）ことが示される。
【０２４０】
これらの結果は、試料（例えば、ウイルス試料）が、特に、分割剤による処理の後におけるスプリット（ウイルス）粒子を含むのかどうかを同定するために、本発明の方法が有用であることを裏付ける。この手法はまた、分割剤の有効性を決定するためにも用いることができ、また、分割に対する生物学的試料の感受性を決定するためにも用いることができる。この手法はまた、粒子分割プロトコールにおいて用いられる分割剤の最適量を同定するのにも用いることができる。
【０２４１】
アジュバント粒子の評価
本発明者らはまた、ディスク遠心分離を用いて、アジュバント粒子などの無機粒子を再現可能に定量化しうるのかどうかについても調べた。図３２は、各々の流体力学的径が約６μｍである２つの異なるアジュバント粒子（水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム）についての粒子サイズの分布３連での測定を示す。図３２は、ディスク遠心分離により、アジュバント粒子を正確に、かつ、再現可能に定量化しうることを示す。これらのデータはまた、ディスク遠心分離が、流体力学的径が大きな粒子を解析するのにもまた適することも示す（この場合、約６μｍ）。
【０２４２】
結論
本発明者らは、ディスク遠心分離が、粒子サイズを決定するための迅速な方法であって、粒子の沈降速度および光度検出に基づく方法（参考文献４６を参照されたい）もまたもたらすことを見出した。他の先行技術における方法、例えば、動的光散乱と比較して、ディスク遠心分離は、高分解能の結果をもたらす（参考文献４７および４８を参照されたい）。これは、例えば、流体のレオロジー特性の測定を再現可能で正確なものとする標準物質の適用に起因する。
【０２４３】
さらに、測定プロセスについて推定するのが困難な粘性などのパラメータは、使用者が知らなくてもよい。粒子の正確な絶対サイズのために最も極めて重要な因子は、粒子密度である。かつて、使用者は、文献中のデータまたは外部の粒子密度測定に依存した。ここで、本発明者らは、粒子密度を推定するためのモデルを提供する。本発明のこの方法を適用することにより、本発明者らは、ディスク遠心分離を単独で用いて絶対粒子サイズを決定し、これにより、文献ならびに多数の外部測定および外部技法への依拠を排しうることを裏付けた。必要とされる唯一の外部測定パラメータは、少なくとも２つの分離流体の密度であり、これらは、先行技術において周知の方法を用いて容易に導出しうる。
【０２４４】
さらに、本発明者らは、密度の異なる２つの粒子標準物質を用い、これにより、流体密度を含めたあらゆるパラメータの外部測定に対する必要を完全に排することにより、本発明のこの方法を改善しうることも見出した。
【０２４５】
本発明の方法は、ウイルス粒子の密度およびサイズを決定するために特に有用である。密度が公知のウイルス粒子の解析は、本発明に、ウイルス粒子の密度を正確に推定することが可能なことを明らかにした。粒子密度のかつての測定は、上記で概観した多数の問題と関連する。本発明は、粒子密度を推定するための方法であって、迅速で正確で再現可能であり、外部測定に依存しない方法を提供する。この、本発明の方法は、ディスク遠心分離により得られる２つという少数の測定を用いて粒子の定量化を可能とするものであり、必要とされるのは、容易に測定可能なパラメータの小さなサブセットだけである。
【０２４６】
【化１６】
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【０２４７】
【化１７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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