(57)【要約】  造血細胞を含む移植片を受容した対象における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を治療または予防する方法が提供される。この方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏの移植片を、移植片中のＴリンパ球の増殖を阻害するためおよび移植片を対象に注入した後の宿主対象におけるＧＶＨＤを治療または予防するために有効な量の粘液腫ウイルスと接触させることを含む。移植片を粘液腫ウイルスと接触させた後、方法はウイルス処理された移植片を対象に移植することを含む。【選択図】  図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血細胞を含む移植片を受容した対象における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を治療または予防する方法であって、
該移植片中のＴリンパ球の増殖を阻害するため、および該移植片を該対象に注入した後の該対象におけるＧＶＨＤを治療または予防するために有効な量の粘液腫ウイルスと該移植片をｅｘ  ｖｉｖｏで接触させること、および
該接触後、該ウイルス処理された移植片を該対象に移植すること、
を含む、方法。
【請求項２】
該移植は、同種異系造血細胞移植、ドナー細胞注入、および支持的血液製剤の輸注からなる群から選択される技術を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該移植片は、同種異系移植片を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該移植片は、骨髄またはヒト末梢血細胞を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該Ｔリンパ球は、ＣＤ３＋Ｔリンパ球を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
生体試料におけるＴリンパ球の増殖を阻害するための方法であって、該生体試料における該Ｔリンパ球の増殖を阻害するために有効な量の粘液腫ウイルスと該生体試料を接触させることを含む、方法。
【請求項７】
該生体試料は、骨髄試料および血液試料からなる群の少なくとも１つの構成要素を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該Ｔリンパ球は、ＣＤ３＋Ｔリンパ球を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
対象におけるガンを治療するための方法であって、
複数の造血細胞を含む移植片を、該移植片におけるＴリンパ球の増殖を阻害するために有効な量のｅｘ  ｖｉｖｏの粘液腫ウイルスと接触させること、
化学療法、生物療法、免疫抑制または放射線治療の少なくとも１つを該宿主対象に施すこと、および
該ウイルス処理された移植片を該対象に移植すること、
を含む、方法。
【請求項１０】
該移植片は、同種異系移植片を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該移植片は、骨髄およびヒト末梢血細胞からなる群の少なくとも１つの構成要素を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
該ガンは、血液悪性腫瘍であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
Ｔリンパ球介在性自己免疫疾患を治療するための方法であって、
複数の造血細胞を含む移植片を、該移植片中のＴリンパ球の増殖を阻害するために有効な量のｅｘ  ｖｉｖｏの粘液腫ウイルスと接触させること、および
該ウイルス処理された移植片を該対象に移植すること、
を含む、方法。
【請求項１４】
該移植片は、同種異系移植片を含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該移植片は、骨髄またはヒト末梢血細胞からなる群の少なくとも１つの構成要素を含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ある量の粘液腫ウイルスで処理された複数の造血細胞を含む細胞集団。
【請求項１７】
造血細胞を含む移植片であって、該移植片中のＴリンパ球の増殖を阻害するために有効な量のｅｘ  ｖｉｖｏの粘液腫ウイルスで処理された、移植片。
【請求項１８】
前記移植片は、骨髄を含むことを特徴とする請求項１７に記載の移植片。
【請求項１９】
前記移植片は、ヒト末梢血細胞を含むことを特徴とする請求項１７に記載の移植片。
【請求項２０】
前記移植片は、減少した量のＴリンパ球を含むことを特徴とする請求項１７に記載の移植片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年６月９日に出願された米国特許仮出願番号第６１／４９５，３４２号に対する優先権を主張する。この出願は、その開示内容全体が参考として本明細書で援用される。
【０００２】
連邦政府の支援を受けた開発に関する記載
本発明の開発は、アメリカ国立衛生研究所によって授与された許可番号第Ｒ０１ＣＡ１３８５４１号によって、また国立癌研究所によって授与された許可番号第Ｒ２１ＣＡ１４９８６９号によって、一部支援を受けた。したがって、米国政府は本発明に一定の権利を有する可能性がある。
【０００３】
技術分野
本発明は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を治療または予防する方法、ならびに生体試料、例えば同種異系細胞用途においてＴリンパ球増殖を阻害する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景技術
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）は、アロ反応性Ｔリンパ球の免疫低下患者への移入から生じる、生命に関わる可能性がある臨床的合併症である。特に、ＧＶＨＤの主原因の１つには、移植された生成物中に存在する成熟ドナーＣＤ３＋Ｔリンパ球の免疫低下レシピエントへの移入が含まれる。一旦注入されると、ドナーＴ細胞は宿主細胞性抗原を認識し、その結果、肝臓、胃腸管および皮膚にしばしば影響を及ぼす免疫反応カスケードが生じる（１、２）。
【０００５】
ＧＶＨＤを予防および治療するための現行の方法には、移植後の一般的な免疫抑制、強度軽減移植前治療、および輸血前のアロ反応性ドナーＴリンパ球の枯渇または阻害が含まれていた（２、３）。しかしながら、これらの方法の臨床効果はさまざまな副作用によって限定される。例えば、一般的な免疫抑制は、再活性ウイルス感染および日和見感染のリスクの増大に至り、一方、強度軽減移植前処置は再発率の上昇と関連する（３）。現在のところ、ＧＶＨＤの最も見込みのある予防的治療は、ドナーＴリンパ球の枯渇または阻害である。これは、リンパ球除去細胞毒性剤（ｌｙｍｐｈｏａｂｌａｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｇｅｎｔ）、特異的Ｔリンパ球阻害剤、およびＴ細胞枯渇をはじめとする様々な方法により、ＣＤ３４＋造血幹細胞および造血始原細胞（ＨＳＰＣ）について選択することによって達成することができる。これらの方法は、ＧＶＨＤの割合を低下させるのに有効であることが判明した。しかしながら、それらはさらにレシピエント免疫系の再構成の減速、生命を脅かす感染の危険性の増加および潜在的に限定された移植片対白血病効果とも関連する（４、５）。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）治療は致死的ＧＶＨＤを予防する。ＮＳＧマウスを亜致死的に照射し、次いでＰＢＳ（ニセ（ｍｏｃｋ）、ｎ＝５）、１×１０７の一次ヒト骨髄（ＢＭ）（ｎ＝３６）または１×１０７のＭＹＸＶで前処理された一次ヒトＢＭ（ｎ＝３６）のいずれかを移植した。マウスを週２回体重測定して身体状態をモニターした（Ａ）。
【図１Ｂ】そして移植後６週間または身体状態スコア２に達した時点で屠殺した（Ｂ）。ログランク検定を用いて生存の有意差を決定した（Ｐ＜０．０５）。Ｎ．Ｓ．＝有意でない。
【図１Ｃ】死後に、臓器を取り出し、ホルマリンで固定し、薄片にし、ヒトＣＤ３＋リンパ球の存在について染色した（Ｃ）。示された免疫組織化学画像は、５匹の別個のマウスで観察された結果を代表するものである。
【図２Ａ】ＭＹＸＶ処理は、移植後のドナーＴリンパ球のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を予防し、正常なＨＳＰＣの生着を許容する。ＮＳＧマウスを亜致死的に照射し、１×１０７の全ＢＭ細胞を移植した。移植の６週間後に、マウスから骨髄を採取し、フローサイトメトリーによってヒト造血生着（ヒトＣＤ４５＋／ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋二重陽性細胞）について分析した。図２Ａは、ＭＹＸＶでの処理によって、ヒト造血生着が成功した動物の割合である（Ａ）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、マウス骨髄におけるこの生着のレベルである（Ｂ）。ＭＹＸＶでの処理によって、ヒト造血生着が成功した動物の割合（Ａ）またはマウス骨髄におけるこの生着のレベル（Ｂ）は変わらなかった。
【図２Ｃ】１×１０７のＣＤ３４枯渇ＢＭを移植され、照射を受けたマウスは、低い全体的生着レベルを示し、この生着は、ｅｘ  ｖｉｖｏＭＹＸＶ処理によって有意に減少した（Ｃ）。
【図２Ｄ】１×１０５のＣＤ３４＋選択細胞を移植され、照射を受けたマウスは、全ＢＭを移植されたマウスで観察されるものと類似したヒト生着レベルを示した。生着のレベルはｅｘ  ｖｉｖｏＭＹＸＶ処理によって影響を受けなかった（Ｄ）。スチューデントｔ検定を使用して有意性を決定した（Ｐ＜０．０５）。Ｎ．Ｓ＝有意でない。
【図２Ｅ】ＮＳＧマウスを亜致死的に照射し、次いで５×１０６のＦｉｃｏｌｌ濃縮された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を移植した。マウスを週に２回体重測定して身体状態をモニターした（Ｅ）。
【図２Ｆ】移植の６週間後またはそれらの身体状態スコアが２と測定された時点で屠殺した（Ｆ）。生存における有意差は、ログランク検定を使用して決定した（Ｐ＜０．０５）。
【図３Ａ】ＭＹＸＶは一次ヒトＣＤ３＋Ｔリンパ球のサブセットに感染する。ＭＹＸＶがＢＭで見出されるＣＤ３＋Ｔリンパ球に感染し得るかどうかを確認するために、１×１０６の全ＢＭ細胞をｖＭＹＸ−ＧＦＰで感染の多重度（ＭＯＩ）＝１０にて処理した。ＭＹＸＶ暴露の２４時間後、細胞をＣＤ３またはＣＤ３４のいずれかに対する抗体で染色し、フローサイトメトリーを用いて各集団中のＧＦＰ＋細胞のレベルを測定した（Ａ）。
【図３Ｂ】様々な骨髄ドナー間のＣＤ３＋リンパ球の感染のばらつきを決定するために、２１の異なる骨髄試料を前述のように感染させ、分析した。ＧＦＰ＋の発現を示したＣＤ３＋リンパ球のパーセントは１％から４７％までおよんだ（Ｂ）。
【図３Ｃ】ＭＹＸＶがアロ刺激後のＴリンパ球の増殖を阻害するかどうかを確認するために、ニセ処理ＭＹＸＶ処理ＢＭ細胞を１０日間、照射を受けたヒト白血球抗原（ＨＬＡ）不適合フィーダー細胞とともにインキュベートした。照射を受けたフィーダー細胞で刺激されたニセ処理ＢＭは、有意に増加した生存細胞数を示し、一方、ＭＹＸＶ処理ＢＭは示さなかった（Ｃ）。示されたデータは、３つの独立した実験の平均を表す。
【図４Ａ】ＧＶＨＤの発生は、骨髄ドナー間で一貫して観察される。ＮＳＧマウスを亜致死的に照射し、次いで３人の異なるドナーからの１×１０７のＢＭ細胞を移植した（Ａ）。マウスを週２回体重測定して、身体状態をモニターし、注入の６週間後またはそれらが身体状態スコア２に達した時点で屠殺した。生存における有意差を、ログランク検定を用いて測定した（Ｐ＜０．０５）。
【図４Ｂ】死後に、臓器を取り出し、ホルマリン中で固定し、薄片にし、ヒトＣＤ３＋リンパ球の存在について染色した（Ｂ）。示された免疫組織化学画像は、５匹の別のマウスで観察される結果の代表的なものである。
【図５Ａ】ＣＤ３４＋細胞またはＣＤ３４＋枯渇骨髄を注射したマウスは、異なるリンパ球系統の生着を示す。ＮＳＧマウスを亜致死的に照射し、次いで１×１０７ＣＤ３４＋枯渇骨髄または１×１０５ＣＤ３４＋選択ＨＳＰＣのいずれかを移植した。注入の６週間後、マウスを屠殺し、抽出されたネズミ骨髄を、ＨＬＡ−ＡＰＣ、ＣＤ３−ＰＥ、ＣＤ１９−ＦｉｔＣ、ＣＤ１５−ＰＥＲＣＰに対する抗体で共染色することによって、骨髄で見いだされるヒト細胞の系統を決定した。ＣＤ３４＋枯渇骨髄を注入したマウス中のヒト細胞は主にＨＬＡ＋／ＣＤ３＋／ＣＤ１５−／ＣＤ１９−細胞であった（Ａ）。
【図５Ｂ】一方、ＣＤ３４＋選択細胞を注入したマウス中のヒト細胞は主にＨＬＡ＋／ＣＤ３−／ＣＤ１５−／ＣＤ１９＋細胞であった（Ｂ）。
【図６】ＭＹＸＶ処理はＴリンパ球の増殖を阻害する。ＭＹＸＶがアロ刺激後に正常なドナーＴリンパ球の増殖を阻害したかどうかを確認するため、ニセ処理またはＭＹＸＶ処理ＢＭを、照射を受けたＨＬＡ−不適合フィーダー細胞とともに１０日間インキュベートした。照射を受けたフィーダー細胞で刺激されたニセ処理ＢＭは、有意に増加した生存細胞数を示し、一方、ＭＹＸＶ処理ＢＭは示さなかった。この効果は、３人の独立した骨髄ドナー間で一致した。
【図７】ＧＦＰを発現する粘液腫ウイルスは、正常な骨髄中の一次Ｔ細胞のサブセットに選択的に感染するが、ＣＤ１９＋Ｂ細胞またはＣＤ３４＋幹細胞には感染しない。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明者らは、同種異系細胞などの生体試料の粘液腫ウイルスでの処理が、生体試料中に存在するＴリンパ球の除去またはＴリンパ球の増殖を阻害することを見出した。このように、粘液腫ウイルスで処理された同種異系移植片はＧＶＨＤを防止する。本明細書中で記載される粘液腫ウイルス処理がなければ、移植片中のアロ反応性Ｔリンパ球は、レシピエントの肝臓、腸、皮膚、および肺をはじめとするいくつかの生命維持に不可欠な臓器に損傷を与える可能性がある。この損傷は、軽度の炎症から腸粘膜破壊、標的細胞の致命的な剥離までおよぶ可能性がある。炎症は、典型的には熱、腹痛、吐き気、嘔吐、下痢、腸内出血、および黄疸として現れる。
【０００８】
本明細書中で用いられる場合、「生体試料」または「試料」という用語は、その自然環境から単離される生物学的物質を指す。試料は、組織試料、生体液試料（たとえば、血液、血漿）、または細胞試料、たとえば造血細胞試料を含んでもよい。試料は、レシピエント宿主対象に移植する前に、当該技術分野で公知の任意の好適な技術によりドナー個体から、組織バンク、または他の供給源から得られる。
【０００９】
本明細書中で用いられる場合、「接触させる」という用語は、生体試料を粘液腫ウイルスに暴露または軽く当てる任意の方法を指し、包含する。
【００１０】
本明細書中で用いられる場合、「有効量」という用語は、所望の結果を達成するために必要な用量および時間で有効な量を意味する。
【００１１】
本明細書中で用いられる場合、「移植片対宿主病」または「ＧＶＨＤ」という用語は、移植された組織と宿主−レシピエントとの間で起こる病的反応を指す。移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）は多くの場合、造血細胞や固形臓器移植後に起こる。ＧＶＨＤでは、アロ反応性Ｔリンパ球はレシピエントの組織を異物として認識する。したがって、それらはレシピエントを攻撃し、レシピエントに炎症性および破壊的応答をもたらす。ＧＶＨＤは上皮組織、特に皮膚、肝臓、および胃腸管粘膜で起こる傾向がある。ＧＶＨＤ自体は、免疫系が大規模な同種免疫反応に関与する場合、著しい免疫低下状態である。加えて、ＧＶＨＤの対象は多くの場合、強い免疫抑制剤で治療され、それによって日和見感染性病原体の影響をなお一層受けやすくなる。
【００１２】
本明細書中で用いられる場合、「移植片」という用語は、本明細書中で定義される対象に導入される試料、たとえば造血細胞試料を指す。移植片は同種異系移植片または自己移植片であってよい。
【００１３】
本明細書中で用いられる場合、本明細書中で用いられる「造血細胞」という用語は、限定されないが、造血幹細胞および始原細胞（ＨＳＰＣ）などの未分化細胞、ならびに巨核球、血小板、赤血球、白血球、顆粒球、単球、リンパ球、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの分化細胞をはじめとする、造血系の任意の種類の細胞を意味する。
【００１４】
本明細書中で用いられる場合、「造血細胞移植」という用語は、血液および骨髄移植、末梢血幹細胞移植、ドナー細胞注入、臍帯血移植、また多能性造血幹細胞の任意の他の供給源を包含し、指す。
【００１５】
本明細書中で用いられる場合、「宿主対象」または「対象」という用語は、ヒトを含む動物界の任意の個々の構成要素を指す。一実施形態において、対象は、本明細書中で記載される移植片を受ける予定であるか、または受けるか、または受けた任意の哺乳類である。哺乳類対象としては、ヒト、サル、ウマ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、ラット、およびマウスを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。具体的な実施形態において、本発明の方法を用いてヒト対象を治療する。
【００１６】
本明細書中で用いられる場合、「免疫低下」、「免疫低下した対象」または「免疫低下した個体」という用語は、対象の免疫系が至適能力で機能しないために感染性疾患を発症する危険性がある対象を指す。一実施形態において、対象は、例えば基礎疾患の治療および／または移植片の拒絶の予防のために設計された治療計画のために免疫低下している。
【００１７】
本明細書中で用いられる場合、「Ｔリンパ球の増殖を阻害する」という慣用句は、対象生体試料からのＴリンパ球の除去もしくは削除および／または生体試料におけるＴリンパ球の増殖の阻害を指す。
【００１８】
本明細書中で用いられる場合、「非病原性ウイルス」という用語は、ウイルス、たとえば粘液腫ウイルスが関心対象に対して病原性でないことを意味する。言い換えると、粘液腫ウイルスは対象において疾患を引き起こさない。
【００１９】
本明細書中で用いられる場合、「予防」または「予防する」という用語は、ＧＶＨＤに関連する症状の停止、遅延、および／または重篤度の軽減を指す。
【００２０】
本明細書中で用いられる場合、「治療」または「治療する」という用語は、臨床結果を含む有益または望ましい結果を得るためのアプローチを指す。有益または望ましい臨床結果としては、１以上の症状または状態の緩和または改善、疾患、例えばＧＶＨＤの程度の縮小、疾患状態の安定化、疾患の発症の予防、疾患の拡大の予防、疾患の進行の遅延または減速、疾患発症の遅延または減速、病状の改善または寛解、および鎮静（部分的または全体的を問わない）を挙げることができるが、これらに限定されるものではなく、検出可能であるかまたは検出不可能であるかどうかは問わない。「治療する」とは、治療をしない場合に予想される患者の生存期間を超えてそれを延長することを意味する可能性もある。さらに、「治療する」とは、疾患の進行を阻害すること、疾患の進行を一時的に減速することも意味する可能性があるが、さらに好ましくは、疾患の進行を恒久的に停止させることを含み得る。当業者には理解されるように、特定の病状を改善しつつも、治療によってもたらされる利益を上回る、治療された対象に対する悪影響が治療の結果もたらされる場合、結果は有益ではない、または望ましくない可能性がある。
【００２１】
本明細書中で用いられる場合、本明細書中で用いられる「移植」という用語は、その発生部位から被移植部位まで移された任意の臓器もしくは体組織、またはそのようにする行為を指す。「移植」という用語は、限定されないが、注入、局所適用、および／または充填による移入を包含する。
【００２２】
本発明の一態様にしたがって、造血細胞を含む移植片を受ける対象においてＧＶＨＤを予防または治療する方法が提供される。方法は、移植片中のＴリンパ球の増殖を阻害するため、および対象に移植片を移植した後に対象におけるＧＶＨＤを治療または予防するために有効な量の粘液腫ウイルスとｅｘ  ｖｉｖｏの移植片を接触させることを含む。加えて、方法は、移植片を粘液腫ウイルスと接触させた後、ウイルス処理された移植片を対象に移植することを含む。移植は、同種異系造血細胞移植、ドナー細胞注入、および支持的血液製剤の輸注などの当該技術分野で公知の任意の好適な技術を含み得る。一実施形態において、注入はハプロタイプ一致移植として実施される。
【００２３】
本発明の一態様にしたがって、生体試料におけるＴリンパ球の増殖を阻害するための方法が提供される。方法は、生体試料におけるＴリンパ球の増殖を阻害するために有効な量の粘液腫ウイルスと試料を接触させることを含む。一実施形態において、粘液腫ウイルスは、生体試料または移植片からのＣＤ３＋Ｔリンパ球の増殖を阻害するように作用する。
【００２４】
造血細胞を含む生体試料は、限定されないが、生検および吸引をはじめとする当該技術分野で公知の任意の標準的手順によって対象から得られる。例えば、サイトカイン動員の有無を問わず、患者のアフェレーシスによって造血細胞を集めることができる。典型的には、生体試料を約３５℃〜約３８℃の温度で３０〜１２０分間、好ましくは６０分間維持して、試料を安定化させた後、ポックスウイルスを試料に導入する。一旦本発明の非病原性ポックスウイルスで処理したら、処理された造血細胞を、当該技術分野で公知の任意の公知技術を使用して患者に戻すか、または投与することができる。例えば、細胞を血管内投与により再注入することができる、または患者の体循環に直接戻すことができる。
【００２５】
本発明のさらに別の態様によると、ある量の粘液腫ウイルスで処理された複数の造血細胞を含む細胞集団が提供される。
【００２６】
本明細書中で用いられる粘液腫ウイルスは、ポックスウイルスのレポリポックスウイルス種に属する任意のウイルスであり得る。粘液腫ウイルスは粘液腫ウイルスの野生型株であり得る、または粘液腫ウイルスの遺伝子組み換え株であり得る。粘液腫ウイルスは、その開示内容全体が参考として本明細書で援用される米国特許出願公開第２００６／０２６３３３号で記載されているものをはじめとする当該技術分野で知られている任意の公知方法および処方にしたがって調製し、配合することができる。例えば、培養されたウサギ細胞を使用される粘液腫ウイルス株に感染させることによって粘液腫ウイルスを調製してもよく、ウイルスが培養細胞において複製するように、感染を進行させることが可能である。また、細胞表面を破壊するための当該技術分野で公知の標準的方法によって粘液腫ウイルスを放出させることができ、これによって収集するためのウイルス粒子が放出される。採取したら、ウサギ細胞のコンフルエントな菌叢を感染させ、プラークアッセイを実施することによってウイルス力価を測定することができる（Ｍｏｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１５：１７−３０を参照のこと）。粘液腫ウイルスの宿主トロピズムがヨーロッパカイウサギに高度に限定され、ヒトをはじめとする試験したすべての他の脊椎動物種について非病原性であることに注意することが重要である（ＭｃＦａｄｄｅｎ，  ２００５）。そのゲノムは非分割型であり、長さ１６０，０００ヌクレオチドの１分子の直線状２本鎖ＤＮＡを含有する。ゲノムは、〜４０％のＧ−Ｃ含有量を有し、両端で繰り返す末端重複配列を有する。
【００２７】
生体試料を粘液腫ウイルスと接触させる場合、当業者であれば所望の結果を達成するために好適な処理の量および持続期間を容易に決定することができるであろう。一実施形態において、生体試料は同種異系移植片であり、粘液腫ウイルスで少なくとも１時間、たとえば３時間処理される。加えて、試料における感染の多重度（ＭＯＩ）によって測定することができる、有効量の粘液腫ウイルスで生体試料を処理してもよい。ＭＯＩは感染性病原体（たとえば、ファージまたはウイルス）の感染標的（たとえば細胞）に対する比である。例えば、感染性ウイルス粒子を接種した細胞群に関して、ＭＯＩは、ウェル中に堆積した感染性ウイルス粒子数を、そのウェル中に存在する標的細胞数で割り定義される比である。一実施形態において、試料、たとえば同種異系移植片を粘液腫ウイルスと接触させる場合に使用されるＭＯＩは約１０である。
【００２８】
一実施形態では、粘液腫ウイルスで処理される移植片は、複数の造血細胞を有する骨髄またはヒト末梢血細胞を含んでもよい。特定の実施形態において、移植片は同種異系移植片である。
【００２９】
患者に導入される移植片のｅｘ  ｖｉｖｏ処理は、化学療法、放射線療法または他の抗ウイルス療法をはじめとする他の療法と組み合わせて実施することができることがさらに理解される。一実施形態において、粘液腫ウイルスで処理される移植片は、さまざまな腫瘍細胞型について特異性を示す可能性がある他の腫瘍崩壊ウイルスと組み合わせて、または逐次的方法で、対象に移植することができる。
【００３０】
本発明の別の態様によると、対象においてガンを治療するための方法が提供される。方法は、複数の造血細胞を含む移植片を、移植片中のＴリンパ球の増殖を阻害するために有効な量のｅｘ  ｖｉｖｏ粘液腫ウイルスと接触させることを含む。加えて、方法は、宿主対象に対する化学療法、生物療法、免疫抑制および放射線治療からなる群から選択される少なくとも１つの治療を宿主対象に施すことを含む。その後、方法は、ウイルス処理された移植片を対象に移植することを含む。一実施形態において、移植片は骨髄またはヒト末梢血細胞を含む。
【００３１】
本発明によって治療可能な例示的ガンおよび／またはガン細胞としては、リンパ腫、骨髄腫、白血病、骨髄異形成症候群、神経芽細胞腫、肉腫、肺ガン、小細胞肺ガン、乳ガン、結腸直腸ガン、膵臓ガン、脳ガン、卵巣ガンおよび胃ガンなどの造血器悪性腫瘍を有する患者由来の細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態において、本明細書中で記載される方法は、血液悪性腫瘍を有する対象に関して使用される。血液悪性腫瘍は、白血病、骨髄異形成症候群、リンパ腫、または骨髄腫であり得る。特定の実施形態において、ガンは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または多発性骨髄腫（ＭＭ）のうちの１つである。一実施形態において、ガンは、難治性ガン、たとえば治療に反応しないガン、または治療に対して耐性になったガンである。
【００３２】
本明細書中で記載される方法において、当該技術分野で公知の化学療法、生物療法、免疫抑制および放射線治療に好適な任意の技術を用いることができる。例えば、化学療法剤は、対象のガン細胞または腫瘍性細胞に対して腫瘍崩壊効果を示す任意の薬剤であり得る。例えば、化学療法剤は、限定されることなく、アントラサイクリン、アルキル化剤、アルキルスルホネート、アジリジン、エチレンイミン、メチルメラミン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、抗生物質、代謝拮抗物質、葉酸アナログ、プリンアナログ、ピリミジンアナログ、酵素、ポドフィロトキシン、白金含有剤またはサイトカインであり得る。好ましくは、化学療法剤は、ガン性または腫瘍性である特定の細胞型に対して有効であることが知られているものである。一実施形態において、チオテパ、シスプラチン系化合物、およびシクロホスファミドなどの化学療法剤は造血器悪性腫瘍の治療において有効である。サイトカインとしては、インターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポイエチン、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン、副甲状腺ホルモンなどが挙げられる。生物療法には、リツキシマブ、ベバシズマブ、血管破壊剤、レナリドミドなどが含まれる。放射線増感剤としては、ニコチンアミドなどが挙げられる。
【００３３】
本発明の態様は生体試料、たとえば移植片のｅｘ  ｖｉｖｏ処理に関するが、ＭｃＦａｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許出願公開第２００９／０３１７３６２号、その開示内容全体が参考として本明細書で援用される、で記載されているようにｉｎ  ｖｉｖｏの対象に粘液腫ウイルスを投与することもできると理解される。ｉｎ  ｖｉｖｏ使用に関して、粘液腫ウイルスを医薬組成物中の成分として処方することができる。組成物は、通常、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、保存料およびさまざまな適合性担体を含んでもよいと理解される。すべての送達形態に関して、粘液腫ウイルスは生理食塩水中で処方することができる。医薬組成物は、抗ガン剤などの他の治療剤をさらに含んでもよい。さまざまな実施形態において、組成物は、化学療法剤、サイトカイン、生物療法剤、および放射線増感剤を含む。
【００３４】
本明細書中で記載される方法は、自己免疫疾患などの病原性および／または自己反応性Ｔリンパ球によって特徴づけられる非悪性疾患を治療するために使用可能なことがさらに理解される。したがって、本発明の別の態様によると、Ｔリンパ球介在性自己免疫疾患を治療するために方法が提供される。方法は、複数の造血細胞を含む移植片を、移植片中のＴリンパ球の増殖を阻害するために有効な量のｅｘ  ｖｉｖｏ粘液腫ウイルスと接触させることを含む。加えて、方法は、ウイルス処理された移植片を対象に移植することをさらに含む。このように、方法は、多発性硬化症などの自己免疫疾患を引き起こす病原性自己反応性Ｔリンパ球を除去および／または阻害するために使用される可能性がある。
【００３５】
以下の実施例は本発明の説明が意図される。しかしながら、本発明の範囲は本明細書に添付される請求項として定義されるべきであり、以下の実施例は、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００３６】
実施例１
以下の実施例では、以下の材料および方法を使用した。
【００３７】
正常なヒト細胞：新鮮な正常ヒト骨髄吸引細胞および末梢血単核細胞はＬｏｎｚａから入手した。骨髄単核細胞を次いで、臨床用Ｓｅｐａｘ装置（Ｂｉｏｓａｆｅ  Ｉｎｃ．）を製造業者の勧告にしたがって使用してＦｉｃｏｌｌ勾配で濃縮した。
【００３８】
粘液腫ウイルスおよびウイルス感染：すべてのウイルス感染は、合成ウイルス初期／後期プロモーターからのウイルスゲノム中の遺伝子間位置でｅＧＦＰを発現するＭＹＸＶ構造物であるｖＭｙｘ−ＧＦＰとともに細胞をインキュベートすることによって実施した（２１）。この構造物によって、ウイルス複製の初期段階を試験細胞内でのＧＦＰ発現に基づいて検出することが可能になる。ヒト骨髄細胞を感染の多重度（ＭＯＩ）１０で３時間、３７℃および５％ＣＯ２の加湿チャンバー中ＰＢＳ＋１０％ＦＢＳ中でｖＭｙｘ−ＧＦＰに暴露した。ニセ（ｍｏｃｋ）処理された細胞を、ウイルスを含まないＰＢＳ＋１０％ＦＢＳ中、同じインキュベーション条件下でインキュベートした。
【００３９】
幹細胞異種移植片：ＧＶＨＤ研究のために、ＮＯＤ／Ｓｃｉｄ／ＩＬ２Ｒγ−／−（ＮＳＧ）マウスを、Ｃｓ１３７源から２００ｃＧｙの全身照射を使用して亜致死的に照射した。照射後２４時間以内に、ニセ処理したまたはｖＭｙｘ−ＧＦＰと接触させた１×１０６〜１０×１０６細胞をマウスに尾静脈から注射した。予防的抗生物質を飲用水中で移植後２週間投与して、日和見細菌感染を予防した。移植の６週間後、マウスを安楽死させ、骨髄を採取した。ヒトＣＤ４５＋およびＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋細胞についてフローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ）を使用してヒト幹細胞生着を定量化した。フローサイトメトリーでヒトＣＤ４５＋／ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋二重陽性であった骨髄中に存在する細胞集団が確認された場合に、マウスを生着したと記録した。各骨髄試料中のＣＤ４５＋／ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋細胞数を生着のレベルとして示す。抽出されたネズミ骨髄を以下の抗体で共染色することによって生着した細胞の系統分析を決定した：ＨＬＡ−ＡＰＣ、ＣＤ３−ＰＥ、ＣＤ１９−ＦｉｔＣ、ＣＤ１５−ＰＥＲＣＰ。
【００４０】
免疫組織化学：６つの死後の組織：肺、肝臓、腎臓、脾臓、皮膚、および腸を外科的に除去することによって、ヒト細胞のネズミ末梢組織への浸潤を分析した。組織を、ＰＢＳで緩衝した１０％ホルマリン中で２４時間固定し、次いで７０％ＥｔＯＨ中でさらに２４時間洗浄した。ホルマリン固定・パラフィン包埋ブロックの５ミクロン切片を切り出し、プラスに荷電したスライド（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に載せた。スライドを脱パラフィンし、一連のキシレンおよび等級付アルコールによって再水和し、３％過酸化物／メタノール中で１０分間ＲＴにてブロックした。熱による抗原回復をＣｉｔｒａ緩衝液ｐＨ６．０中で２５分間実施した。直後に市販のキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を使用して正常ヤギ血清およびアビジン／ビオチンでブロックした。ウサギ抗ＣＤ３を切片に１：１００で一晩４℃にて適用した。ＡＢＣ−Ｅｌｉｔｅキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して染色を完了した。ＤＡＢ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）との反応によって抗原−抗体複合体が観察され、スライドをヘマトキシリンで対比染色した後、カバースリップで覆った。
【００４１】
磁気活性化細胞選別：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＢｉｏｔｅｃのＣＤ３＋（カタログ番号１３０−０５０−１０１）およびＣＤ３４＋（カタログ番号１３０−０４６−７０２）マイクロビーズ分離キットを製造業者の勧告にしたがって使用して、ＣＤ３＋およびＣＤ３４＋細胞をＳＥＰＡＸ精製正常骨髄（ｎＢＭ）吸引液から分別した。細胞をａｕｔｏＭＡＣＳ  ｐｒｏ分離器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で製造業者の勧告にしたがって分離した。各分別集団の相対的純度を、フローサイトメトリーを使用して分離後に確認した。分別細胞の総数を、分離後に血球計を使用して測定した。
【００４２】
混合リンパ球反応アッセイ：１×１０６ＳＥＰＡＸ精製ｎＢＭ細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに３連で蒔いた。細胞を次いで、Ｃｓ１３７源から１０００ｃＧｙを使用して照射して、複製不全フィーダー細胞を作成した。第２のＨＬＡ不適合ドナーからのＳＥＰＡＸ精製ｎＢＭ細胞をニセ処理、またはＭＹＸＶで処理し、次いで１×１０６細胞を空のウェルまたは照射を受けたフィーダー細胞を含むウェルに３連で蒔いた。指示された時点で、市販のＭＴＴアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を製造業者の勧告にしたがって使用して、各ウェル中の生存細胞の総数を測定した。
【００４３】
統計分析：異なる実験群間の統計的差異をログランクおよびスチューデントｔ検定によって決定した。記録された値は、平均±平均の標準誤差を表す。０．０５未満のＰ値を統計的に有意と見なした。
【００４４】
上述のように、ＧＶＨＤは、免疫低下レシピエントへのアロ反応性Ｔリンパ球の移入に起因する、生命にかかわる可能性がある臨床的合併症である。Ｔ細胞枯渇という従来法があるにもかかわらず、ＧＶＨＤは依然として同種異系造血細胞移植における大きな課題である。以下の実施例で、本発明者らは一次ヒト造血細胞の粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）でのｅｘ  ｖｉｖｏ処理によってＧＶＨＤを予防する新規方法を示す。ＭＹＸＶは、ヨーロッパカイウサギに対してわずかに宿主特異性を有し、マウスやヒトのような他の種に対しては有しないことが知られている。本発明者らは、ヒト骨髄および末梢血単核細胞のＭＸＹＶ処理が、例えば、免疫低下マウスにおけるヒト造血生着を阻害せず、むしろ、粘液腫ウイルスのヒト移植片へのｅｘ  ｖｉｖｏ暴露は、ヒト造血生着を増大させ、移植片対宿主病を除去することによって移植後生存を増大させることを見出した。主要臓器の検査は、ヒトＴリンパ球増殖の除去の証拠を示した。ＭＹＸＶはさらに、アロ反応性Ｔ細胞を除去することによって混合リンパ球反応を抑制した。重度の免疫低下マウスにＭＹＸＶ発疹が無かったことも注目される。以下のデータは、ＭＹＸＶでのｅｘ  ｖｉｖｏウイルス療法が、同種異系造血幹および始原細胞（ＨＳＰＣ）などのアロ反応性リンパ球を潜在的に含む造血製剤の注入、ドナー白血球注入および輸血後のＧＶＨＤを予防するための簡単かつ有効な方法であることを示唆する。
【００４５】
本発明者らは、正常ヒト組織を残しつつ、様々なヒトガンの治療のための新規ウイルス性腫瘍崩壊剤としてのＭＹＸＶの使用を以前に示した（６〜８）。ＭＹＸＶはヒトにおけるウイルス治療薬としていくつかの利点を有する。第１に、ＭＹＸＶの自然宿主域はウサギに厳密に限定される。非ウサギ種で、生ウイルスをヒト対象および免疫低下マウスに注入した後でさえも、ＭＹＸＶ感染症の例は記録されていない（９、１０）。第２に、ＭＹＸＶは腫瘍崩壊に関する特異的細胞表面受容体に依存せず、むしろ、寛容性に関するＡＫＴなどの独自の細胞内経路に依存する。この特性によって、ＭＹＸＶがさまざまなヒトガンと有効に結合し、それを除去することが可能になる。最後に、ＭＹＸＶの医療適用は比較的単純で即時性であり、臨床的投与の興味深い薬剤となる。
【００４６】
最近、本発明者らは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞で汚染された一次ヒト造血細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ処理の結果、正常なヒトＨＳＰＣを残しつつ白血病性クローンが除去されることを示した（１１）。この選択的除去は、導入遺伝子の発現、化学療法剤の添加に依存せず、免疫低下ＮＯＤ／ｓｃｉｄ／ＩＬ２Ｒ（ガンマ）（ＮＳＧ）マウスに移植される前にｅｘ  ｖｉｖｏでＭＹＸＶとともに移植片試料を短時間インキュベーションすることだけを必要とした（１１）。
【００４７】
ＨＳＰＣ移植片を汚染する様々な他のヒト血液学的悪性腫瘍を除去するための臨床薬としてのＭＹＸＶの使用の追跡実験の過程で、健常なヒト骨髄（ＢＭ）を注入された亜致死的に照射を受けたＮＳＧマウスの５０〜７０％が、移植後４〜６週間で致死的消耗性疾患を発症することが観察された（図１Ａおよび図１Ｂ）。この疾患は、ニセ注射された照射を受けた対照マウスまたは確立されたガン細胞系を注射されたマウスでは観察されなかったが、３人の異なる健常ドナーから得られたＢＭの注入後に一貫して観察された（表１および図４）。この疾患は、ＢａｒｎｅｓおよびＬｏｕｔｉｔによって１９６０年代に記載された「二次疾患」［ＰＭＩＤ１３５１７１８１］、これは後にＧＶＨＤと定義された、を連想させた。ＧＶＨＤと一致して、罹患マウス由来の末梢組織の死後組織学によって、重大な浮腫、ならびにヒトＣＤ３＋Ｔリンパ球の、肝臓、腸、皮膚、肺、腎臓および脾臓をはじめとするいくつかの臓器への浸潤が明らかになった（図１Ｃ）（図４Ｂ）。
【００４８】
しかしながら意外にも、本発明者らは、ｅｘ  ｖｉｖｏでＭＹＸＶで前処理された健常なＢＭを注射されたマウスは、消耗の徴候がなく例外なく生存することを見出した（図１Ａおよび図１Ｂ）。さらなる死後組織学によって、ＭＹＸＶ処理骨髄（ＢＭ）を注射されたマウスが主要臓器、例えば脾臓、肺、肝臓、腎臓へのヒトＣＤ３＋Ｔリンパ球の浸潤を実質的に示さないことが明らかになった（例えば、図１Ｃおよび図４Ｂを参照のこと）。このデータは、同種異系ヒト造血細胞移植片のＭＹＸＶでのｅｘ  ｖｉｖｏ処理がＧＶＨＤを予防でき、正常なヒトＨＳＰＣの効率的な生着を許容できるという新しい観察結果を裏付ける。
【００４９】
一次ヒトＢＭはＣＤ３＋Ｔリンパ球およびＣＤ３４＋ＨＳＰＣを含有する。ドナーＴリンパ球の増殖に影響を及ぼす、または造血幹細胞の長期生着を改変することによって、ＧＶＨＤの発症をＭＹＸＶが予防するかどうかを確認するために、本発明者らは、一次ヒトＢＭからのＣＤ３＋Ｔリンパ球またはＣＤ３４＋ＨＳＰＣの免疫磁気濃縮または枯渇を使用した。本発明者らのＧＶＨＤの診断と一致して、積極的に選択されたＣＤ３＋リンパ球またはＣＤ３４＋細胞を除去したＢＭのいずれかを異種移植されたマウスは、非分画ＢＭを移植されたマウスに類似した動力学でＧＶＨＤに屈した（表１）。対照的に、ＣＤ３＋リンパ球を除去したＢＭまたは積極的に選択されたＣＤ３４＋ＨＳＰＣを移植されたマウスは、ＧＶＨＤを発症しなかった（表１）。全てのコホートで、ＭＹＸＶで前処理されたヒト造血細胞を移植されたＮＳＧマウスは、例外なく生存し、ＧＶＨＤの徴候を示さなかった。
【００５０】
ＭＹＸＶはドナーＴリンパ球同種反応性を予防するという証拠によって、ｅｘ  ｖｉｖｏＭＹＸＶ処理がＨＳＰＣ生着を損なうかどうかを次に試験した。特に、全ＢＭ、積極的に選択されたＣＤ３４＋ＨＳＰＣおよびＣＤ３４＋枯渇移植片を受容する異種移植片モデルを使用した。以前の観察結果（１１）と一致して、ヒト造血移植片のＭＹＸＶでの前処理は、移植の６週間後のヒト造血生着を有するマウスの割合を有意に改変しなかった（図２Ａ）。ｅｘ  ｖｉｖｏ処理した全ＢＭを移植されたマウスでは、マウスの骨髄におけるヒト造血生着のパーセンテージが減少する傾向があった。しかしながら、この傾向は統計的有意性に達しなかった（図２Ｂ）。ｅｘ  ｖｉｖｏ処理されたＣＤ３４＋ＨＳＰＣを移植されたマウスでは、ヒト造血生着のパーセンテージに差異はなく（図２Ｄ）、系統分析によって、異種移植された免疫低下マウスで典型的に見られるＢリンパ球ゆがみを有する多系列生着が明らかになった（図５）。ＣＤ３４＋枯渇ＢＭを移植されたマウスも、移植６週間後の骨髄においてヒト造血細胞生着の徴候を示した。しかしながら、予想どおり、全ＢＭおよびＣＤ３４＋ＨＳＰＣを受けたコホートと比較して、ＣＤ３４＋枯渇コホートは低い生着レベルを示した（図２Ｃ）。系統分析から、Ｔリンパ球ゆがみを有する多系列生着が明らかになった（図６）。これらのデータはヒト造血移植片のｅｘ  ｖｉｖｏＭＹＸＶ処置が免疫低下レシピエントにおいてヒトＨＳＰＣ生着を損なわないことを示す。
【００５１】
ヒトＢＭの異種移植後のＮＳＧマウスにおけるＧＶＨＤの結果は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の異種移植後のＮＳＧマウスにおけるＧＶＨＤの証拠を示す最近の報告を裏付ける（１５）。固定化ＰＢＭＣ移植片は高レベルのＣＤ３＋Ｔリンパ球を含有し、ハプロタイプ一致移植プロトコルおよびドナー白血球注入においてＴ細胞加減として使用される。臨床的に、ＰＢＭＣ注入の目的は、移植片対白血病（ＧＶＬ）を誘発することであり、抗感染免疫を提供する。しかしながら、同種異系ＰＢＭＣ注入はＧＶＨＤのリスクが高い。粘液腫ウイルスが免疫低下マウスにおいてヒトＢＭ移植後のＧＶＨＤを予防するという本発明者らの結果を考慮して、粘液腫ウイルスがＰＢＭＣ注入と関連したＧＶＨＤを予防するかどうかを次に試験した。以前に公開された知見（１５）と一致して、ヒトＰＢＭＣを移植されたＮＳＧマウスは有意な体重減少を示し（図２Ｅ）、そして移植後４０日付近でＧＶＨＤに屈した（図２Ｆ）。対照的に、ＭＹＸＶでｅｘ  ｖｉｖｏ処理されたヒトＰＢＭＣを移植したマウスは、例外なく生存した。これらのマウスは、わずかであるが統計的に有意な体重減少を示し、このことはウイルス処置がモデルにおける潜在的にアロ反応性Ｔリンパ球を部分的にしか除去しない可能性があることを示唆する。
【００５２】
ＭＹＸＶがＢＭ移植後にＧＶＨＤを予防し、ＰＢＭＣ注入後にＧＶＨＤを低減したというｉｎ  ｖｉｖｏ証拠で、ヒトＢＭを合成初期／後期ウイルスプロモーターからＧＦＰを発現したＭＹＸＶで処理または接触させることによって機構の定義を求めた（２１）。ＭＹＸＶ感染を示すＧＦＰ発現は、ＣＤ３＋Ｔリンパ球の小さなサブセットで観察されたが、ＣＤ１９＋Ｂ細胞またはＣＤ３４＋ＨＳＰＣでは見出されなかった（図３Ａおよび図７）。ＭＹＸＶ処理は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＧＶＨＤを予防するその能力において著しく一致することが証明されていたため（図４）、本発明者らは、ＭＹＸＶ感染の証拠を示すＣＤ３＋リンパ球のパーセントが様々な患者骨髄試料間で大幅に異なることを観察して驚いた（図３Ｂ）。したがって、ＭＹＸＶ処理が一方向性混合リンパ球反応（ＭＬＲ）においてアロ抗原刺激によって誘発されたＴリンパ球増殖に対してさらに一貫した効果を有し得るかどうかを試験した。ニセ処理されたヒトＢＭは、致死的に照射を受けたＨＬＡ−不適合ヒトフィーダー細胞に添加された場合、生存細胞において有意な増加を示すことが見出された。対照的に、ＢＭのＭＹＸＶでの前処理は、このＭＬＲ増殖を予防した（図３Ｃ）。この観察結果は、３つの異なる患者骨髄試料で一致していた（図６）。これらのデータは、これらの試料におけるＣＤ３＋リンパ球のＭＹＸＶ感染率に非常にばらつきがあるように見えるにもかかわらず、ＭＹＸＶが複数の一次ドナーからのアロ反応性Ｔリンパ球の増殖を一貫して阻害することを示す。
【００５３】
以前、ＭＹＸＶ処理は、正常ヒトＨＳＰＣを残しつつ、一次ヒトＡＭＬ幹および始原細胞の生着を予防することが示された（１１）。本明細書中のデータは、ａｌｌｏＨＣＴ、ＰＢＭＣ注入および支持的血液製剤の輸注などの同種異系造血細胞が注入される設定で潜在的に投与される、ＭＹＸＶの完全に新しい応用を提示する。粘液腫ウイルス処理によるＧＶＨＤの予防を示すデータが、無傷複製型腫瘍崩壊ウイルスを利用して自己免疫疾患の発症を予防する方策の第一報である。アロ反応性Ｔリンパ球をａｌｌｏＨＣＴ試料から除去することは、自己造血細胞移植片からのガン細胞の除去と根本的に類似したプロセスであることに留意すべきである。どちらも、パージング剤（粘液腫ウイルス）が汚染細胞（自己移植片中のガン細胞または同種異系移植片中のドナーＴリンパ球のいずれか）をその機能が維持されなければならない幹細胞（この場合、造血幹細胞）から区別する能力に基づく。腫瘍崩壊剤としての使用に関して現在調査中である様々なウイルスは、１つの細胞型を別のものから区別するための様々な方法を発展させてきた。本明細書中で提示されるデータは、ＭＹＸＶのようないくつかの腫瘍崩壊ウイルスの潜在的な治療的使用をＴリンパ球またはＢリンパ球媒介性自己免疫疾患などの非悪性疾患の治療にまで拡大できることを示唆する。陽性または陰性細胞分離をはじめとする様々なリンパ球除去法ならびに特異的細胞毒性剤での治療が、血液学的悪性腫瘍の治療のためのａｌｌｏＨＣＴを改善する目的で以前に試みられてきた。しかしながら、これらの方法は、免疫回復の遅延および生着不全のために生命を脅かす感染の危険性が高い（４、５）。本明細書中のデータは、ＭＹＸＶ処理が正常なＨＳＰＣ生着に対して悪影響を及ぼさないようであり、アロ反応性ＣＤ３＋Ｔリンパ球のサブセットの感染のために、直接的抗感染および抗ガン目的のための機能的リンパ球サブセットのレシピエントへの養子移入を可能にし得ることを示す。さらに、ＭＹＸＶ処理は、現行の良好な組織治療（ＧＴＰ）臨床症状において実施可能な移植片注入前に簡単な短時間のウイルス吸着ステップしか必要としない（１１）。したがって、ＭＹＸＶ処理がＧＶＨＤを予防するという観察結果を臨床状況に翻訳することは、ａｌｌｏＨＣＴ、ＰＢＭＣ注入および輸血に関する現行の標準治療から著しく逸脱する必要がない。
【００５４】
理論によって拘束されることを望まないが、アロ反応性Ｔリンパ球を他のＴリンパ球サブセットおよびＨＳＰＣから識別するＭＹＸＶの能力の機序ならびにヒト造血生着の点でＭＹＸＶに関するその安全性は、ＭＹＸＶが正常なヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣと結合できないことに基づくと考えられる。ほとんどの哺乳類細胞と結合するポックスウイルスの非常に幅広い性質のために（１８）、これはＭＹＸＶが、さまざまな非幹細胞を、ドナーＴリンパ球を含む造血移植片から、また汚染ガン細胞をさまざまな造血悪性腫瘍から機能的に除去するために有効な薬剤であり得ることを示唆する。興味深いことに、この研究で、本発明者らはごく小さなサブセットのＣＤ３＋Ｔリンパ球だけがＭＹＸＶに感染し、一方で、ウイルスはＧＶＨＤを全ての異種移植片で完全に抑止することを観察した。この選択的感染は、ＭＹＸＶがＧＶＨＤを阻害することを可能にし、一方で、一部の機能的Ｔリンパ球のａｌｌｏＨＣＴレシピエントへの養子移入を依然として可能にし、したがって有益な抗菌および抗癌免疫をもたらす（１９）。ＭＹＸＶは、ガン細胞に必ずしも感染するわけではなくガン細胞と単に結合することによって、腫瘍崩壊活性を誘発すること（２０）を考慮すると、ＭＹＸＶが完全な増殖性ウイルス感染の非存在下でＣＤ３＋リンパ球の選択的亜集団の移植後増殖を単に阻害することによって、ＧＶＨＤを予防する可能性もある。いずれにしても、同種異系造血細胞注入前のｅｘ  ｖｉｖｏＭＹＸＶウイルス療法は、ＧＶＨＤの発病予防および重篤な疾患のリスク低減の可能性をもたらすだけでなく、例えば、適合しない非血縁ドナーおよびハプロタイプ一致のドナーからのＨＬＡ不同性がより大きい同種異系移植片の移植の機会を可能にし、それによってさらに多数の患者にａｌｌｏＨＣＴの可能性を広げる。
【００５５】
さまざまな本発明の実施形態を本明細書中で示し、記載してきたが、そのような実施形態は例示のみのために提供されていることは明らかであろう。本明細書中の本発明から逸脱することなく、多くの変形、変更および置換を行うことができる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲によってのみ限定されることが意図される。
【００５６】
参考文献
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２１．Ｊ．Ｂ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７，５８７７（Ｍａｙ，２００３）
【００５７】
本明細書中で言及される全ての特許、特許出願、特許公報、技術刊行物、科学出版物、および他の参考文献は、本発明が属する技術分野をより完全に記載するために本出願で参考として本明細書で援用されることに留意すべきである。
【００５８】
特定の緩衝液、培地、試薬、細胞、培養条件など、またはそのあるサブクラスに関する言及は、限定することを意図せず、その議論が行われる特定の文脈で関心があり価値があると当業者が認めるそのような関連する材料全てを包含すると解釈されるべきである。例えば、１つの緩衝液系または培養培地を別のものと置換して、異なるが公知の方法を使用して、示唆される方法、材料または組成物の使用が目指すものと同じ目標を達成することが多くの場合可能である。
【００５９】
本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、当然のことながら本明細書中で特に別段の規定がない限り、当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有することが意図されるということが本発明の理解にとって重要である。本明細書中で用いられる技術も、特に記載しない限り、当業者に公知のものである。本明細書中で開示され、請求される発明をさらに明確な理解を促進するために、以下の定義を記載する。
【００６０】
多くの本発明の実施形態を本発明に関連して本明細書中で示し、記載してきたが、そのような実施形態は例示のみのために提供され、限定するものではない。本明細書中の発明から実質的に逸脱することなく、多くの変形、変更および置換が当業者には思い当たるであろう。例えば、本発明は本明細書中で開示されるベストモードに限定される必要はない。なぜなら、他の応用が本発明の教示から等しく恩恵を受け得るからである。さらに、請求項において、ミーンズプラスファンクションおよびステッププラスファンクション条項は、列挙される機能および構造的等価物または作動的等価物だけでなく、等価な構造または等価な作動もそれぞれ実施すると記載されるようにそれぞれ本明細書中で記載される構成および作動を網羅することが意図される。したがって、そのような修飾はすべて、それらの解釈に関して関連する規則にしたがって、以下の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【００６１】
【表１】
2014520115.tif 000003
【図１Ａ】
2014520115.tif 000004
【図１Ｂ】
2014520115.tif 000005
【図１Ｃ】
2014520115.tif 000006
【図２Ａ】
2014520115.tif 000007
【図２Ｂ】
2014520115.tif 000008
【図２Ｃ】
2014520115.tif 000009
【図２Ｄ】
2014520115.tif 000010
【図２Ｅ】
2014520115.tif 000011
【図２Ｆ】
2014520115.tif 000012
【図３Ａ】
2014520115.tif 000013
【図３Ｂ】
2014520115.tif 000014
【図３Ｃ】
2014520115.tif 000015
【図４Ａ】
2014520115.tif 000016
【図４Ｂ】
2014520115.tif 000017
【図５Ａ】
2014520115.tif 000018
【図５Ｂ】
2014520115.tif 000019
【図６】
2014520115.tif 000020
【図７】
2014520115.tif 000021
【国際調査報告】
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