(57)【要約】本発明は、生きた対象におけるアルツハイマー病の診断およびモニターに関する。より具体的には、本発明は、アルツハイマー病を患う疑いのあるヒト対象より採取した非神経細胞における遺伝子発現の差異を測定することを含み、ここで、測定する遺伝子は、ｍＴＯＲシグナル経路に含まれる遺伝子である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生きたヒト対象におけるアルツハイマー病の診断を補助する方法であって、該ヒト対象より採取した非神経細胞における、細胞分裂阻害剤に対する応答の差異について、対照の非神経細胞と比較してスクリーニングすることを含み、ここで、応答の差異は、表１および２に示す１つ以上の遺伝子の遺伝子発現における阻害剤誘導性の相対的な変化を解析することにより測定する、方法。
【請求項２】
ヒト対象におけるアルツハイマー病進行の危険性を評価する方法であって、該ヒト対象より採取した非神経細胞における細胞分裂阻害剤に対する応答の差異について、対照の非神経細胞と比較してスクリーニングすることを含み、ここで、応答の差異は、表１および２に示す１つ以上の遺伝子の遺伝子発現における阻害剤誘導性の相対的な変化を解析することにより測定する、方法。
【請求項３】
ヒト対象より採取した非神経細胞における細胞分裂阻害剤に対する応答の差異が、以下によって決定される、請求項１または２に記載の方法：
（ａ）アルツハイマー病を患う疑いのあるヒト対象より採取した非神経細胞において細胞分裂を誘導し;
（ｂ）分裂している（ａ）の非神経細胞を、２つのプールに分け、１つの細胞プールを細胞分裂阻害剤で処理し;
（ｃ）細胞分裂阻害剤で処理した細胞プールと未処理の細胞プールにおいて、表１および２に示す１つ以上の遺伝子の発現レベルを測定し;
（ｄ）遺伝子発現における任意の阻害剤誘導性の相対的な変化を決定するために、細胞分裂阻害剤で処理した細胞プールと未処理の細胞プールについて、（ｃ）で解析した１つ以上の遺伝子の発現レベルを比較し;
（ｅ）対照の非神経細胞について、工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返し;
（ｆ）試験非神経細胞と対照非神経細胞の間の、阻害剤誘導性の相対的な遺伝子発現変化における任意の差異であって、アルツハイマー病を示唆している差異を決定するために、試験ヒト対象より採取した非神経細胞で観察される遺伝子発現における任意の阻害剤誘導性の相対的な変化を、対照非神経細胞で観察される遺伝子発現における任意の阻害剤誘導性の相対的な変化と比較する。
【請求項４】
ヒト対象が、アルツハイマー病について無症候性である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ヒト対象が、軽度の認知障害を示す、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ヒト対象が、アルツハイマー病と一致する１つ以上の症候を示す、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
対照の非神経細胞が、同齢の健康な対象より採取される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
非神経細胞がリンパ球である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
細胞分裂阻害剤がＧ１阻害剤である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
細胞分裂阻害剤がｍＴＯＲ阻害剤である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
細胞分裂阻害剤がラパマイシンである、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
遺伝子発現を、ｍＲＮＡレベルを評価することにより解析する、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子発現を、対応する蛋白質のレベルを評価することにより解析する、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
応答の差異を、表１および２に示す少なくとも２つの遺伝子の遺伝子発現における相対的な変化を解析することにより測定する、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
応答の差異を、インターロイキン１ベータ (ＩＬ１Ｂ); インターロイキン２ (ＩＬ−２); インターロイキン６ (ＩＬ−６); およびインターロイキン１０ (ＩＬ−１０)からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現における相対的な変化を解析することにより測定する、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
応答の差異を、２つ以上の遺伝子の遺伝子発現における相対的な変化を解析することにより測定し、第一の遺伝子がインターロイキン１ベータ (ＩＬ１Ｂ)であり、少なくとも１つの他の遺伝子が、インターロイキン２ (ＩＬ−２); インターロイキン６ (ＩＬ−６);およびインターロイキン１０ (ＩＬ−１０)からなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
応答の差異を、インターロイキン１ベータ (ＩＬ１Ｂ); インターロイキン２ (ＩＬ−２); インターロイキン６ (ＩＬ−６);およびインターロイキン１０ (ＩＬ−１０)の遺伝子発現における相対的な変化を解析することにより測定する、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ヒト対象におけるアルツハイマー病の診断を補助するか、または、アルツハイマー病の進行の危険性を評価するために、該ヒト対象がさらに、ＡｐｏＥ遺伝子の多型についてスクリーニングを受けており、ＡｐｏＥ遺伝子型判定の結果を、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法を行って得た結果と組み合わせる、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
該対象が、ＡｐｏＥ４アレルを少なくとも１本有するかどうかについてスクリーニングを受けている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
アルツハイマー病が孤発性のアルツハイマー病である、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
アルツハイマー病の処置において、潜在的に薬理活性を有する化合物を特定する方法であって、非神経細胞において、細胞分裂阻害剤に対する応答の差異についてスクリーニングすることを含み、ここで、
細胞は試験化合物の存在下および非存在下で、Ｇ１／Ｓ移行において細胞周期調節に欠陥を示し、
応答の差異は、表１および２に示す１つ以上の遺伝子の遺伝子発現における阻害剤誘導性の相対的な変化を、対照非神経細胞における表１および２に示す１つ以上の遺伝子の遺伝子発現における阻害剤誘導性の相対的な変化と比較することによって測定し、
Ｇ１／Ｓ移行において細胞周期調節に欠陥を示す非神経細胞において、細胞分裂阻害剤に対する応答の差異を減少させる化合物を、アルツハイマー病の処置において潜在的に薬理活性を有するものとして特定する、
方法。
【請求項２２】
薬剤が特定のヒト個体におけるアルツハイマー病の処置に有用でありそうかどうかを決定する方法であって、上記の特定のヒト個体より採取した非神経細胞において、薬剤の存在下および非存在下で細胞分裂阻害剤に対する応答の差異についてスクリーニングすることを含み、ここで、
応答の差異は、表１および２に示す１つ以上の遺伝子の遺伝子発現における阻害剤誘導性の相対的な変化を、対照の非神経細胞における表１および２に示す１つ以上の遺伝子の遺伝子発現における阻害剤誘導性の相対的な変化と比較することによって測定し、
該ヒト個体より採取した非神経細胞において、細胞分裂阻害剤に対する応答の差異を低下させる薬剤を、該個体におけるアルツハイマー病の処置に有用でありそうなものとして特定する、
方法。
【請求項２３】
特定のヒト個体におけるアルツハイマー病の処置において、薬剤の有効性をモニターする方法であって、上記の特定のヒト個体より採取した非神経細胞において、薬剤の存在下および非存在下で細胞分裂阻害剤に対する応答の差異についてスクリーニングすることを含み、ここで、
応答の差異は、表１および２に示す１つ以上の遺伝子の遺伝子発現における阻害剤誘導性の相対的な変化を、対照非神経細胞における表１および２に示す１つ以上の遺伝子の遺伝子発現における阻害剤誘導性の相対的な変化と比較することによって測定し、
該ヒト個体より採取した非神経細胞において、細胞分裂阻害剤に対する応答の差異を低下させる薬剤を、該個体におけるアルツハイマー病の処置に有効であるとして特定する、
方法。
【請求項２４】
応答の差異を、インターロイキン１ベータ (ＩＬ１Ｂ); インターロイキン２ (ＩＬ−２); インターロイキン６ (ＩＬ−６);およびインターロイキン１０ (ＩＬ−１０)からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の遺伝子発現における相対的な変化を解析することによって測定する、請求項２１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
応答の差異を、２つ以上の遺伝子の遺伝子発現における相対的な変化を解析することにより測定し、第一の遺伝子が、インターロイキン１ベータ (ＩＬ１Ｂ)であり、少なくとも１つの他の遺伝子が、インターロイキン２ (ＩＬ−２); インターロイキン６ (ＩＬ−６);およびインターロイキン１０ (ＩＬ−１０)からなる群から選択される、請求項２１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
応答の差異を、インターロイキン１ベータ (ＩＬ１Ｂ); インターロイキン２ (ＩＬ−２); インターロイキン６ (ＩＬ−６); およびインターロイキン１０ (ＩＬ−１０)の遺伝子発現における相対的な変化を解析することにより測定する、請求項２１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
ヒト細胞におけるｍＴＯＲシグナルをモニターする方法であって、ｍＴＯＲシグナル経路の１つ以上のバイオマーカーを検出することを含み、該バイオマーカーは表１および２に示すラパマイシン感受性遺伝子から選択される、
方法。
【請求項２８】
バイオマーカーが、インターロイキン１ベータ (ＩＬ１Ｂ); インターロイキン２ (ＩＬ−２); インターロイキン６ (ＩＬ−６);およびインターロイキン１０ (ＩＬ−１０)からなるラパマイシン感受性遺伝子の群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ヒト細胞がリンパ球である、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
ヒト細胞が、アルツハイマー病を患う疑いのあるヒト対象より単離される、請求項２７〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
ヒト対象がアルツハイマー病について無症候性である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ヒト対象が軽度の認知障害を示す、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ヒト対象がアルツハイマー病と一致する１つ以上の症候を示す、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
ｍＴＯＲシグナルのモニターを、該ヒト対象におけるアルツハイマー病の診断の補助に用いる、請求項３０〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
１つ以上のラパマイシン感受性遺伝子の、ヒト細胞におけるｍＴＯＲシグナル経路のバイオマーカーとしての使用であって、該遺伝子は表１および２に示す遺伝子から選択される、使用。
【請求項３６】
該遺伝子が、インターロイキン１ベータ (ＩＬ１Ｂ); インターロイキン２ (ＩＬ−２); インターロイキン６ (ＩＬ−６);およびインターロイキン１０ (ＩＬ−１０)からなる群から選択される、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
ヒト細胞がリンパ球である、請求項３５または３６に記載の使用。
【請求項３８】
ヒト細胞が、アルツハイマー病を患う疑いのあるヒト対象より単離される、請求項３５〜３７のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生きた対象における、アルツハイマー病の診断およびモニターに関する。具体的には、本発明は、アルツハイマー病の疑いがあるヒト対象より採取した非神経細胞における、遺伝子発現の差異の測定を含む方法に関するが、これに限定されるものではない。本発明はまた、これによりヒト細胞中のｍＴＯＲシグナルをモニターする方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、高齢者の認知症の、最も一般的な形態である。世界中で高齢化が起こっている結果、この疾患の有病率は今後顕著に上昇すると考えられる。そのため、よりよい診断ツールおよびこの疾患を有していると特定された人々に対する新規の処置を開発することが、緊急で必要とされている。
【０００３】
アルツハイマー病は、海馬ならびに脳の側頭葉および前頭葉内の、皮質ニューロンの選択的な損失を特徴とする、慢性的な神経変性障害である。この疾患の病理学的な特徴は、脳内に集積するアミロイド−β斑と、発症ニューロンに存在する、高リン酸化タウ蛋白質からなる神経原線維変化からなる。アルツハイマー病で起こる神経変性プロセスは、進行性の認知障害を伴い、最終的には、発症個体の認知症に至る。
【０００４】
現在のところ、生きた患者において、「至適基準」として受け入れられている、アルツハイマー病の診断試験はない。これは、死後の検査において、この疾患を有していると分類されるであろう患者を特定することが困難であることを反映している。アルツハイマー病の臨床診断は、典型的には、臨床診断基準、例えばNINCDS/ADRDA基準(McKhann, G. et al., (1984) Neurology 34: 939-944) の評価に基づく。これらの基準は、感度は高いが、特異度は低い。具体的には、これらの基準を満たさないが、死後検査においてアルツハイマー病を有しているとわかる患者が有意な割合で存在する。
【０００５】
今日までに使用されている臨床診断基準の問題は、認知症が進行しはじめてから、患者が診断を受けるのが典型的であることにある。しかし、該疾患のこの段階においては、どのような処置であっても、神経変性プロセスによる損傷を逆行させることはもはや可能ではないと考えられる。アルツハイマー病の患者の管理を改善するために、疾患のより早い段階、理想的には認知症状が現れるよりも前での診断を可能にするような、方法およびツールが必要とされている。
【０００６】
この点について、今では、アルツハイマー病の根底にある神経病理は、臨床上認知症であると診断されるよりも何年も前に始まり、１０年前に始まることすらありうることを示唆する、優れた証拠が存在する(Forlenza et al., (2010) BMC Medicine 8:89)。これらの知見に基づいて、アルツハイマー病の連続的な進行は、以下の３つのフェーズに分類される: 
(i)  無症候性アルツハイマー病 (前臨床段階);
(ii)  アルツハイマー病による軽度の認知障害(MCI) (前認知症段階); および
(iii)  臨床的に定義されたアルツハイマー病 (認知症)。
【０００７】
無症候性の疾患の個体を特定することを可能にするような、診断ツールおよび技術は、アルツハイマー病の管理を改善する上で価値のあるものである。さらに、進行して、臨床的に定義されたアルツハイマー病になるような、ＭＣＩを有している患者を同定することができることは、非常に有用なことである。ＭＣＩを特定するのに用いられている現在の診断基準は、アルツハイマー病-関連認知症に進行する危険性があるものを特定するという点では、予後診断的な価値が比較的低い。
【０００８】
この疾患を患う個体をはるかに早い段階で、好ましくは前臨床段階で診断する必要性を考慮に入れるための、アルツハイマー病の診断基準を修正するための対策は既に講じられている(Sperling et al., (2010) Criteria for preclinical Alzheimer's disease [www.alz.org/research/diagnostic_criteria/preclinical_recommendations.pdf])。この点について、疾患を早い段階で検出するためのバイオマーカーの使用を考慮しながら、研究が活発に行われている(Gustaw-Rothenberg et al., (2010) Biomark. Med. 4(1):15-26)。
【０００９】
現在まで、研究者たちは、体液、主に脳脊髄液における、バイオマーカーの測定ならびに、進歩した神経画像処理方法を用いて検出しうるバイオマーカーに着目していた。しかし、これらのアプローチは便利で、幅広い診断試験には特に適しているものではない。
【００１０】
疾患の進行の根底にある分子変化という面において、アルツハイマー病は、神経細胞が再び細胞分裂周期に異所的に入ることに関連している。この変化は、アミロイド-β斑および神経原線維変化の両方の形成に先立つ疾患の病理形成の早期のイベントであると考えられる。以上のことから、これらの知見により、研究者たちは、異常な細胞周期調節は、  アルツハイマー病の結果ではなくむしろ原因であると考えるようになった (Nagy, (2005) J. Cell. Mol. Med. Vol.9, No.3: 531-541)。
さらに、これらの細胞周期の変化の検出は、アルツハイマー病を早期段階で、無症候性の個体さえも診断する手助けとして使用しうると考えられている。
【００１１】
この点において、アルツハイマー病に貢献しているのは、細胞周期に再び入ることそれ自体ではなく、むしろアルツハイマー病患者の神経細胞が、この細胞周期への再進入に適当に応答できないことであることが観察されている。具体的には、アルツハイマー病患者の神経細胞は、Ｇ１/Ｓ調節チェックポイントを欠損しているために、Ｇ１期停止を開始させることならびに、それに続く再分化を行うことができない。
【００１２】
さらに、このＧ１/Ｓ移行における調節の欠損は、アルツハイマー病の個体において、神経細胞以外の細胞、例えばリンパ球でも起こることがわかっている。国際出願第０２/０７３２１２号には、非神経細胞、例えばアルツハイマー病を有している疑いがある個体から単離した培養リンパ球細胞において、Ｇ１／Ｓ期チェックポイントの細胞周期調節の欠損が存在することについてのスクリーニングに基づくアルツハイマー病の診断方法が記載されている。具体的には、該リンパ球細胞のＧ１阻害剤に対する選択性の差異は、アルツハイマー病の患者由来の細胞において、細胞周期調節が欠損していることを検出するのに用いられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際出願第０２/０７３２１２号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】McKhann, G. et al., (1984) Neurology 34: 939-944
【非特許文献２】Forlenza et al., (2010) BMC Medicine 8:89
【非特許文献３】Sperling et al., (2010) Criteria for preclinical Alzheimer's disease
【非特許文献４】Gustaw-Rothenberg et al., (2010) Biomark. Med. 4(1):15-26
【非特許文献５】Nagy, (2005) J. Cell. Mol. Med. Vol.9, No.3: 531-541
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
細胞周期阻害剤、および特にｍＴＯＲ阻害剤であるラパマイシンに対する感受性の差異は、それによりアルツハイマー病を、特に疾患の早期段階において診断し、モニターする新しい方法を特定するのに用いられてきた。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
したがって、本発明の第一の局面によって、生きたヒト対象における、アルツハイマー病の診断を補助する方法であって、該ヒト対象より採取した非神経細胞において、対照となる非神経細胞と比較して、細胞分裂阻害剤に対する応答の差異についてスクリーニングすることを含み、応答の差異は、表１および２に示す１つ以上の遺伝子の遺伝子発現における阻害剤誘導性の相対的な変化を解析することにより測定される、
方法を提供する。
【００１７】
本発明の第２の局面によって、ヒト対象における、アルツハイマー病進行の危険性を評価する方法であって、該ヒト対象より採取した非神経細胞において、対照となる非神経細胞と比較して、該ヒト対象から採取した非神経細胞において、対照となる非神経細胞と比較して、細胞分裂阻害剤に対する応答の差異についてスクリーニングすることを含み、応答の差異は、表１および２に示す１つ以上の遺伝子の遺伝子発現における阻害剤誘導性の相対的な変化を解析することにより測定される、
方法を提供する。
【００１８】
ヒト対象より採取した非神経細胞における、細胞分裂阻害剤に対する応答の差異は以下のように決定しうる:-
（ａ）アルツハイマー病を患う疑いのあるヒト対象より採取した非神経細胞の細胞分裂を誘導する;
（ｂ）分裂している（ａ）の非神経細胞を、２つのプールにわけ、１つの細胞プールを、細胞分裂阻害剤で処理する;
（ｃ）該細胞分裂阻害剤で処理した細胞プールおよび未処理の細胞プールにおける、表１および２に示す遺伝子の１つ以上の発現レベルを決定する;
（ｄ）遺伝子発現における、任意の阻害剤誘導性の相対的な変化を決定するために、（ｃ）で解析した遺伝子の１つ以上の発現レベルを、細胞分裂阻害剤で処理した細胞プールと未処理の細胞プールで比較する;
（ｅ）対照の非神経細胞について、工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返す;
（ｆ）試験および対照の非神経細胞の間での、任意の阻害剤誘導性の遺伝子発現の相対的な変化における差異であって、アルツハイマー病を示唆するような差異を決定するために、試験ヒト対象より採取した非神経細胞において観察される遺伝子発現における任意の阻害剤誘導性の相対的な変化を、対照の非神経細胞で観察される遺伝子発現における任意の阻害剤誘導性の相対的な変化と比較する。
【００１９】
好ましくは、対照の非神経細胞は、正常な認知および／または神経心理学的検査の結果を示す、健康な個体由来のものである。
【００２０】
対照の非神経細胞と比較して、アルツハイマー病のヒト対象より採取した非神経細胞で観察される遺伝子発現における応答の差異は、さらに、アルツハイマー病の処置に使用しうる化合物の特定、または具体的には個体において、アルツハイマー病の処置用に開発された薬剤の評価に利用しうる。
【００２１】
したがって、本発明の第三の局面によって、アルツハイマー病の処置に、潜在的に薬理活性を有する化合物を特定する方法であって、Ｇ１／Ｓ移行において細胞周期調節の欠損を示す、非神経細胞において、試験化合物の存在下および非存在下で、細胞分裂阻害剤に対する応答の差異についてスクリーニングすることを含み、ここで、応答の差異は、表１および２に示す１つ以上の遺伝子の遺伝子発現における阻害剤誘導性の相対的変化を、対照の非神経細胞における表１および表２に示す１つ以上の遺伝子の遺伝子発現における阻害剤誘導性の相対的変化と比較することにより測定する、
方法を提供し、ここで、
Ｇ１／Ｓ移行に細胞周期調節欠損を示す非神経細胞において、細胞分裂阻害剤に対する応答の差異を減少させるような化合物は、アルツハイマー病の処置に潜在的に薬理活性を有するものとして特定される。
【００２２】
本発明の第４の局面によって、特定のヒトの個体において、薬剤がアルツハイマー病の処置に有用でありそうかどうかを決定する方法であって、上記の特定のヒト個体より採取した非神経細胞において、薬剤の存在下および非存在下において、細胞分裂阻害剤に対する応答の差異についてスクリーニングすることを含む方法を提供し、ここで、
応答の差異は、表１および２に示す１つ以上の遺伝子の遺伝子発現における阻害剤誘導性の相対的な変化を、対照の非神経細胞における表１および２に示す１つ以上の遺伝子の遺伝子発現における阻害剤誘導性の相対的な変化と比較することによって測定し、
該ヒト個体より採取した非神経細胞において、細胞分裂阻害剤に対する応答の差異を減少させる薬剤を、該個体におけるアルツハイマー病の処置に有用でありそうなものとして特定する。
【００２３】
本発明の第５の局面によって、特定のヒトの個体における、薬剤のアルツハイマー病の処置における有効性をモニターする方法であって、上記の特定のヒト個体より採取した非神経細胞において、薬剤の存在下および非存在下において、細胞分裂阻害剤に対する応答の差異についてスクリーニングすることを含む方法を提供し、ここで、
応答の差異は、表１および２に示す１つ以上の遺伝子の遺伝子発現における阻害剤誘導性の相対的な変化を、対照の非神経細胞における表１および２に示す１つ以上の遺伝子の遺伝子発現における阻害剤誘導性の相対的な変化と比較することによって測定し、
該ヒト個体より採取した非神経細胞において、細胞分裂阻害剤に対する応答の差異を減少させる薬剤を、該個体における、アルツハイマー病の処置に有効なものとして特定する。
【００２４】
本発明の、上記全ての局面、好ましい態様において、遺伝子発現の相対的な変化を測定するのに用いる１つ以上の遺伝子は、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１Ｂ）；インターロイキン２（ＩＬ−２）；インターロイキン６（ＩＬ−６）およびインターロイキン１０（ＩＬ−１０）からなる遺伝子群より選択される。
【００２５】
さらに、阻害剤であるラパマイシンに対する細胞の感受性の差異を検討することにより、ヒト細胞のｍＴＯＲシグナルをモニターするのに用いうる、ｍＴＯＲシグナル経路の新規なバイオマーカーを特定した。
【００２６】
したがって、本発明の第６の局面において、ヒト細胞におけるｍＴＯＲシグナルをモニターする方法であって、ｍＴＯＲシグナル経路の１つ以上のバイオマーカーを検出することを含み、該バイオマーカーは、表１および２に示すラパマイシン感受性遺伝子から選択される、方法を提供する。
【００２７】
さらに、本発明の第７の局面において、１つ以上のラパマイシン感受性遺伝子の、ヒト細胞におけるｍＴＯＲシグナル経路のバイオマーカーとしての使用であって、該遺伝子が、表１および２に示す遺伝子から選択される、使用を提供する。
【００２８】
本発明の上記全ての局面、好ましい態様において、関心のあるラパマイシン感受性遺伝子は、インターロイキン１ベータ（ＩＬ−１Ｂ）；インターロイキン２（ＩＬ−２）；インターロイキン６（ＩＬ−６）；およびインターロイキン１０（ＩＬ−１０）からなる遺伝子群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】アルツハイマー病（ＡＤ）の患者および対照のヒト対象より採取したリンパ球において測定した、ＩＬ−１ベータ遺伝子の、ラパマイシン誘導性の遺伝子発現の相対的な変化。
【図２】アルツハイマー病（ＡＤ）の患者および対照のヒト対象より採取したリンパ球において測定した、生細胞あたりの、ＩＬ−１ベータ遺伝子の、ラパマイシン誘導性の遺伝子発現の相対的な変化。
【図３】アルツハイマー病（ＡＤ）の患者および対照のヒト対象より採取したリンパ球において測定した、ＩＬ−２遺伝子の、ラパマイシン誘導性の遺伝子発現の相対的な変化。
【図４】アルツハイマー病（ＡＤ）の患者および対照のヒト対象より採取したリンパ球において測定した、生細胞あたりの、ＩＬ−２遺伝子の、ラパマイシン誘導性の遺伝子発現の相対的な変化。
【図５】アルツハイマー病（ＡＤ）の患者および対照のヒト対象より採取したリンパ球において測定した、ＩＬ−６遺伝子の、ラパマイシン誘導性の遺伝子発現の相対的な変化。
【図６】アルツハイマー病（ＡＤ）の患者および対照のヒト対象より採取したリンパ球において測定した、生細胞あたりの、ＩＬ−６遺伝子の、ラパマイシン誘導性の遺伝子発現の相対的な変化。
【図７】アルツハイマー病（ＡＤ）の患者および対照のヒト対象より採取したリンパ球において測定した、ＩＬ−１０遺伝子の、ラパマイシン誘導性の遺伝子発現の相対的な変化。
【図８】アルツハイマー病（ＡＤ）の患者および対照のヒト対象より採取したリンパ球において測定した、生細胞あたりの、ＩＬ−１０遺伝子の、ラパマイシン誘導性の遺伝子発現の相対的な変化。
【図９】ＩＬ１ベータの発現の差異の測定に基づく、アルツハイマー病予測/診断についてのＲＯＣ曲線。
【図１０】ＩＬ１ベータおよびＩＬ−６の発現の差異の測定に基づく、アルツハイマー病予測/診断についてのＲＯＣ曲線。
【図１１】ＩＬ１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−６およびＩＬ−１０の発現の差異の測定に基づく、アルツハイマー病予測/診断についてのＲＯＣ曲線。
【図１２】ＩＬ１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−６およびＩＬ−１０の発現の差異の測定およびＡｐｏＥの遺伝子型状態の決定に基づく、アルツハイマー病予測/診断についてのＲＯＣ曲線。
【図１３】ラパマイシン誘導性の、ＩＬ１ベータの遺伝子発現の変化と、ラパマイシン誘導性の、細胞増殖の変化との相関。
【図１４】ラパマイシン誘導性の、ＩＬ−１０の遺伝子発現の変化と、ラパマイシン誘導性の、細胞増殖の変化との相関。
【図１５】ラパマイシン誘導性の、ＩＬ−２の遺伝子発現の変化と、ラパマイシン誘導性の、細胞増殖の変化との相関。
【図１６】ラパマイシン誘導性の、ＩＬ−６の遺伝子発現の変化と、ラパマイシン誘導性の、細胞増殖の変化との相関。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、生きたヒト対象における、アルツハイマー病の診断方法を提供する。該方法は、この特定の神経変性疾患を患う疑いのある個体または、アルツハイマー病に伴う臨床症状を発症する危険があると考えられる個体を特定するのに使用しうる。
【００３１】
上述したように、アルツハイマー病の臨床診断は、典型的には臨床診断基準、例えばNINCDS/ADRDA診断基準 (McKhann, G. et al., (1984) Neurology 34: 939-944) に基づく。しかしながら、臨床に適用されている診断基準は、認知パラメーターの測定に基づいたものであり、したがって、この疾患の患者の、認知症候の発症に依存している。
【００３２】
現在では、広範な研究より、アルツハイマー病を定義する病態生理学的な変化が、個体において、これらの患者が認知障害の何らかの徴候を示す数年前に検出可能であることが明らかになっている。したがって、アルツハイマー病は以下の３つのフェーズに分類される:
(i)  無症候性アルツハイマー病 (前臨床段階);
(ii)  アルツハイマー病による軽度認知障害 (ＭＣＩ) (前認知症段階);および
(iii)  臨床的に定義されたアルツハイマー病 (認知症)。
【００３３】
本発明の文脈において、「アルツハイマー病の診断」という用語は、非常に広義で用いられ、個体が、上で定義した３つのフェーズのいずれか１つの疾患を有していると診断することを意味すると解するべきである。態様の一において、本発明の方法は、疾患の何の症候もない、例えば、認知障害の兆候が全く見られない個体における、前臨床段階のアルツハイマー病を診断もしくは診断を補助するのに用いられる。他の態様において、同一の方法論は、様々な程度に「症候性」である、対象をスクリーニングするのに使用しうる。例えば、本発明の方法は、標準的な診断基準、例えば、Mayo Clinic 診断基準 (Winblad et al., (2004) J. Intern. Med 256: 240-246)にしたがって、軽度の認知障害(ＭＣＩ)を有していると分類された個体に適用しうる。ＭＣＩを患うと分類された全ての患者が、根底の原因として、アルツハイマー病に伴う型の神経変性を患うわけではない。したがって、本発明の方法は、ＭＣＩを患う個体のうち、アルツハイマー病を根底の原因として患っているため、アルツハイマー病に伴う認知症まで進行を続けそうな個体と、異なる原因または症状によるＭＣＩを患う個体とを区別する、または区別するのを補助するのに用いうる。本発明のさらなる態様において、本発明の方法は、アルツハイマー病と一致する１つ以上の症候を示すヒト対象における、アルツハイマー病の診断または診断の補助に用いうる。
【００３４】
本発明の診断方法はまた、既存の診断基準、例えばNINCDS/ADRDA診断基準と組み合わせて、既存の診断基準で陽性の診断を既に受けているヒト対象における、アルツハイマー病の診断を確証または実証するのに用いうる。該態様において、本発明の方法は、他の診断検査に補助を提供しうるものであり、本発明の方法は、神経心理学的な症候に依存しないものである。特に、認知症の症候が表れている全ての患者が、根源的な原因としてアルツハイマー病を有しているわけではないため、これにより、臨床的なアルツハイマー病の診断がより信頼性の高いものになりうる。
【００３５】
本発明は特に、生きたヒト対象におけるアルツハイマー病の診断または診断の補助に用いられる。生きた対象において、アルツハイマー病を決定的に診断することは、不可能であり、死後に、該患者から取り出した脳組織を病理学的に検査した後にのみ、決定的な診断ができると当該分野では一般的に考えられている。したがって、本発明の方法は、生きた対象においてアルツハイマー病を「診断」しようとしているが、該診断は典型的には、特定の個体が該疾患を有している可能性の評価に基づくものである。この点について、各個体は、現在の診断検査の結果に基づいて、「アルツハイマー病の可能性がある」または「アルツハイマー病の可能性が高い」と分類されうる。
【００３６】
したがって、本発明の方法は、「診断を補助する」のに使用しうるものであり、これは、上述のアルツハイマー病の３つのフェーズのうちいずれか１つのアルツハイマー病を個体が有している可能性を評価するのに用いられるということをさす。好ましい態様において、本発明の方法は、無症候性の患者または軽度認知障害を示す患者における、早期段階のアルツハイマー病の診断の補助に用いうる。
【００３７】
本発明の方法はまた、アルツハイマー病の診断に用いる他の方法または検査と組み合わせて、または一緒に、例えばこれらの方法または検査の特異度および／または感度を改善するために使用しうる。特定の態様において、本発明の方法は、特定の個体において、１つ以上のアルツハイマー病のバイオマーカーをモニターするよう設計された検査と組み合わせて実行しうるものであり、上記組合せの結果は、該個体がアルツハイマー病を有している可能性の評価に使用しうる。他の態様において、本発明の方法は、他の診断検査の結果を独立に実証するのに使用しうる。
【００３８】
好ましい態様において、本発明の方法は、個体のＡｐｏＥの状態を決定する方法と組合せて実行しうる。より具体的には、ＡｐｏＥをコードする遺伝子は多型であり、３つの主要な蛋白質のアイソフォーム(ａｐｏＥ２、ａｐｏＥ３およびａｐｏＥ４)に翻訳される、３つの主要なアレルである、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４がある。ＡｐｏＥ４アレルは、様々な人種群における、アルツハイマー病の公知の遺伝的危険因子であり、多くの群のうち、約５０%の症例は、ＡｐｏＥ４アレルによって説明しうる(Waring SC and Rosenberg RN. Genome-Wide Association Studies in Alzheimer Disease. Arch Neurol 2008;65(3):329-334)。ＡｐｏＥ４を１コピーまたは２コピー有する個体は、他のアイソフォームのキャリアと比較して、アルツハイマー病を発症する危険性が高い。ＡｐｏＥ４はまた、アルツハイマー病発症の平均年齢を、非キャリアの８４歳から、ホモ接合体では６８歳へと低下させる (Cedazo-Minguez A. Apolipoprotein E and Alzheimer's disease: molecular mechanisms and therapeutic opportunities. J. Cell. Mol. Med. 2007; 11(6):1227-1238)。
【００３９】
ＡｐｏＥ４アレルは、アルツハイマー病の確立された遺伝的危険因子であるが、このマーカーは、臨床背景において、アルツハイマー病そのものの診断用としては信頼性が高いものではない。したがって、好ましい態様において、本発明の方法を用いて得られた結果はアルツハイマー病の診断または診断の補助のために、同一個体の、ＡｐｏＥの遺伝子型判定より得られた結果と組み合わせうる。ヒト対象は、ＡｐｏＥ４アレルを少なくとも１本持つかどうかについてスクリーニングしうる。
【００４０】
本発明の方法は、多様な背景においてアルツハイマー病の診断および／または診断の補助をする方法を提供することを意図している。態様の一において、本発明の方法は、新規のアルツハイマー病の処置の評価に適した患者の特定、例えば、臨床試験に適した対象の特定のために、アルツハイマー病を患う個体の診断に使用しうる。予防的および／または治療的であるように設計された新規の処置および治療は、無症候性または早期段階の疾患の患者でのみ、成功する最大の可能性を有しうる。したがって、本発明の方法は、これらの患者において、新規の処置を具体的に評価する目的で、無症候性の個体における前臨床性アルツハイマー病の診断もしくは診断の補助、またはアルツハイマー病の病態を原因とするＭＣＩを患う個体の診断もしくは診断の補助に使用しうる。アルツハイマー病の進歩した処置が利用可能なものになるにつれ、本発明の方法はまた、認知減退を予防しうる処置より益を得うる患者を特定するために、個体の診断もしくは診断の補助に使用しうる。
【００４１】
本発明はまた、ヒト対象における、アルツハイマー病の進行の評価方法を提供する。本明細書の文脈において、「アルツハイマー病の進行」は、この疾患に伴う進行性の神経変性および／または根底の原因である神経病理に伴う、認知機能の進行性の減退を意味すると解されるべきである。上記方法は、アルツハイマー病の上述の３つのフェーズのいずれかを患う疑いのある個体またはこの疾患を発症させる危険性があると考えられる個体に適用しうる。
【００４２】
本発明の好ましい態様において、該方法は、アルツハイマー病に伴う認知症を発症するであろう、早期段階のアルツハイマー病を患う個体を特定することによって、ヒト対象において認知減退を評価または予測する方法を提供する。これらの予後的な方法、特にアルツハイマー病の「危険性がある」かまたは初期段階である疑いがある患者についての方法は、本発明の方法論が、認識可能な臨床症候の発症に先立つ病態生理学的な変化を検出できるために可能になる。特定の態様において、試験用の個体またはヒト対象は、アルツハイマー病について無症候状態である。別の態様において、試験用の個体またはヒト対象は、軽度の認知障害または、アルツハイマー病と一致する１つ以上の症候を示す。
【００４３】
アルツハイマー病の進行の危険性を評価する本発明の方法は、例えば、アルツハイマー病の進行を評価する他の方法または検査の特異度および／または感度を改善するために、これらの方法または検査と組み合わせてまたは一緒に用いうる。特定の態様において、アルツハイマー病の進行の危険性を評価するために、本発明の方法を用いて得られた結果を、同一個体のＡｐｏＥの遺伝子型判定から得られた結果と組み合わせてもよい。
【００４４】
上述の本発明の方法の態様は、ヒト対象より採取した非神経細胞における、細胞分裂阻害剤に対する応答の差異のスクリーニングを含む。
【００４５】
以降の文において、このスクリーニング過程の特徴をさらに詳細に記載する。好ましいまたは有利であると記載されている特徴は、非神経細胞における、細胞分裂阻害剤の応答の差異のスクリーニングを含む本発明の全ての局面および／または方法に等しく適用可能なものであることは理解されるべきである。さらに、特にことわらない限りは、好ましいまたは有利であると記載されている特徴はいずれも、同じように記載されている他の任意の特徴と組み合わせうる。
【００４６】
本発明の方法の態様は、ヒト対象より単離した非神経細胞について試験管内で行われるのが最も好ましい。アルツハイマー病の患者において、細胞分裂阻害剤に対して応答の差異を示す任意の種類の非神経細胞を、単離して解析に用いてよい。明白な実践的理由により、対象より容易に入手可能な細胞を用いるのが好ましい。態様の一において、本発明の方法は、該対象より単離され、試験管内で培養したリンパ球について行われる。リンパ球は血液試料から容易に入手できるため、リンパ球を用いるのは特に簡便である。他の態様では、線維芽細胞、特に皮膚の組織診より簡便に入手しうる、皮膚の線維芽細胞を用いることを含む。
【００４７】
該非神経細胞は、任意の細胞分裂阻害剤に対する応答についてスクリーニングしうる。本発明の好ましい態様において、該細胞分裂阻害剤は、任意のＧ１阻害剤、すなわち、細胞周期のＧ１期に細胞周期の停止を引き起こす阻害剤でありうる。さらに好ましい対象において、該細胞分裂阻害剤は、セリン／スレオニンキナーゼｍＴＯＲの阻害剤であり、特に好ましいのは、ｍＴＯＲ阻害剤であるラパマイシンである。
【００４８】
特定の態様において、試験するヒト対象より採取した非神経細胞における、細胞分裂阻害剤に対する「応答の差異」は、本質的に、３段階の工程により測定する。第一に、試験対象より採取した非神経細胞内で起こる、任意の阻害剤誘導性の相対的な遺伝子発現変化は、試験対象より採取した、阻害剤で処理した非神経細胞（処理試料）と、試験対象由来の、阻害剤で処理していない非神経細胞（未処理試料）において、遺伝子発現のレベルを別々に解析し、任意の阻害剤誘導性の相対的な遺伝子発現変化を算出するために処理試料と未処理試料について異原子発現のレベルを比較することにより決定する。
【００４９】
第二の段階において、第一段階に記載する、試験するヒト対象より採取した、非神経細胞における任意の薬剤誘導性の相対的な遺伝子発現変化を決定する工程を、対照の非神経細胞を用いて繰り返す。本明細書中で用いる、「対照の非神経細胞」は、典型的には、正常の認知および／または神経心理学的検査結果を示す健康な個体由来の非神経細胞である。上記の対照の非神経細胞は、試験するヒト個体より採取した非神経細胞と同一の種類の細胞であることが好ましい。また、対照の細胞は、同齢の健康な個体由来であることが好ましい。第二段階の結果は、対照細胞においておこる、任意の阻害剤誘導性の、相対的な遺伝子発現変化を決定するものである。
【００５０】
最後の、第三段階においては、任意の差異を決定するために、試験するヒト対象より採取した非神経細胞において観察される任意の阻害剤誘導性の遺伝子発現の相対的な変化を、対照の非神経細胞で観察される任意の阻害剤誘導性の相対的な遺伝子発現変化と比較する。ヒト対象より採取した非神経細胞における阻害剤誘導性の相対的な遺伝子発現変化を対照の非神経細胞と比較して、何らかの差異が観察された場合、上記の差異は、細胞分裂阻害剤に対する「応答の差異」として分類され、応答の差異は、アルツハイマー病を示唆している。
【００５１】
特に好ましい態様において、試験するヒト対象より採取した非神経細胞における、細胞分裂阻害剤に対する「応答の差異」は、以下の方法により決定される。
【００５２】
第一の工程において、アルツハイマー病を患う疑いのあるヒト対象より採取した非神経細胞において、細胞分裂を誘導する。非神経細胞は、任意の分裂促進刺激、例えば１つ以上の増殖因子を添加することによって分裂を誘導しうる。該方法を、リンパ球を用いて行う場合、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を用いて、細胞分裂を誘導しうる。該細胞は、典型的には、分裂促進刺激の存在下で、さらなる処理を行うより前に、１２〜９６時間の間、好ましくは２４〜７２時間の間、最も好ましくは、４８時間培養する。
【００５３】
第二の工程において、分裂促進刺激に曝露された分裂中の非神経細胞を２つの「プール」に分け、２つのプールのうちの、１つを、細胞分裂阻害剤で処理する（以降、本明細書中で「処理細胞」とよぶ）。本明細書の文脈において、細胞の「プール」は、分離した、細胞の培養物をさす。典型的には、阻害剤で処理していない細胞（以降、本明細書中で「未処理細胞」とよぶ）のプールは、標準の培養培地中で、増殖を続ける。
【００５４】
「処理」および「未処理」の細胞プールまたは培養がある背景にある原理は、処理および未処理の試料における、１つ以上の遺伝子の、遺伝子発現のレベルを決定し、その後、これらの結果を比較できるようにするためである。したがって、「処理」および「未処理」細胞培養の相対的なサイズおよび／または、各プールまたは培養内の細胞の量は、その後の遺伝子発現解析に必要な細胞物質の量に依存する。典型的には、試験ヒト対象より採取し、最初に、分裂促進刺激の添加により分裂を誘導した非神経細胞を、等サイズの２つのプールまたは細胞培養に分け、阻害剤、好ましくはラパマイシンを、プールの片方に添加する。
【００５５】
阻害剤の添加後、処理細胞および未処理細胞は、遺伝子発現解析である第３工程の前に、任意の適当な時間培養しうる。本発明の好ましい態様において、阻害剤処理および未処理の細胞は、阻害剤の添加後、遺伝子発現解析用に回収する前に２４時間培養される。
【００５６】
阻害剤処理細胞および未処理細胞の両方について、１つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルを決定する。解析する遺伝子は、典型的には、ヒトの内在性遺伝子である。本発明の文脈において、「遺伝子発現」という用語は、ＤＮＡまたはｃＤＮＡの鋳型が転写されて、ｍＲＮＡを産生する工程および／またはｍＲＮＡが翻訳されて、対応する蛋白質が産生される工程を意味することを意図する。したがって、遺伝子発現は、当業者に公知の標準的な技術を用いて、ｍＲＮＡレベルまたは蛋白質レベルで解析しうる。
【００５７】
本発明の方法にしたがって用い得る、ｍＲＮＡの適当な検出／定量方法は、当該分野で公知であり、ハイブリダイゼーション技術、例えばノーザンブロッティングまたはマイクロアレイ技術、および増幅に基づいた技術、例えばＲＴ−ＰＣＲまたは核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
本発明の好ましい態様において、遺伝子発現は、対応する蛋白質のレベルを評価することにより解析される。蛋白質レベルを評価する適当な技術は、当該分野で公知であり、フローサイトメトリー、免疫ブロット解析、ＥＬＩＳＡ、ＥｌｉｓｐｏｔおよびＦｌｕｏｒｏｓｐｏｔアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様において、これらのアッセイは、蛋白質レベルを決定するのに、関心蛋白質に結合する市販の抗体と組み合わせて使用しうる。
【００５９】
第４工程において、阻害剤誘導性の遺伝子発現における「相対的な変化」は、阻害剤処理した非神経細胞と阻害剤未処理の非神経細胞を比べて、関心遺伝子について、ｍＲＮＡ転写レベルまたは対応する蛋白質のレベルのいずれかの変化を算出することにより、決定しうる。
【００６０】
アルツハイマー病を患う疑いのあるヒト対象より採取した非神経細胞における、阻害剤に対する「応答の差異」があるかどうか決定するために、試験対象より採取した非神経細胞について算出した阻害剤誘導性の遺伝子発現における相対的な変化を、対照の非神経細胞を用いて算出した阻害剤誘導性の遺伝子発現における任意の相対的な変化と比較する。
【００６１】
上述のように、「対照の非神経細胞」は、典型的には正常な認知および／または神経心理学試験結果を示す健康な個体由来の非神経細胞である。したがって、上で詳細に述べた、阻害剤誘導性の遺伝子発現における相対的な変化を決定する過程を、対照の非神経細胞を用いて繰り返す。
【００６２】
阻害剤誘導性の遺伝子発現の相対的な変化を、試験ヒト対象由来の非神経細胞（「試験」）および対照の非神経細胞（「対照」）の両方について決定すると、最終工程は、何らかの差異を検出するために、「試験」と「対照」について、遺伝子発現の変化を比較することである。試験ヒト対象由来の非神経細胞（試験非神経細胞）を用いて得られた結果と、対照の非神経細胞を用いて得られた結果の比較を介して、任意の阻害剤誘導性の遺伝子発現の相対的な変化における差異を、このように算出または特定することにより、アルツハイマー病の診断の補助および／またはアルツハイマー病の進行または認知の減退の危険性を評価するために必要な最終的な結果が提供される。具体的には、試験非神経細胞と対照非神経細胞の間の差異は、アルツハイマー病を示唆している。
【００６３】
陽性の試験結果を得るために、有意とみなされる、「差異」の度合いは、診断および／またはモニター目的で、本明細書中に記載の方法を用いる感度および／または特異度によって確立しうる。さらに、対象をその相対的な危険性、例えば、特定の個体がアルツハイマー病を患う相対的な可能性に基づいて階層化するのに、異なる「カットオフ」または差異のレベルを用いうる。
【００６４】
本発明の方法において、遺伝子発現の変化は、表１および２に示す遺伝子の１つ以上の発現をモニターすることにより測定する。表１に示す３１の遺伝子は、ラパマイシン処理に応答して、リンパ球で発現が低下していること、ならびに、表２に示す７３の遺伝子は、ラパマイシン処理に応答して、リンパ球内で発現が上昇していることがわかった。
【００６５】
両方の表に示す遺伝子は、細胞が分泌するか、または典型的に細胞質内に局在する蛋白質をコードしている。該蛋白質は、その細胞外および／または細胞質に局在していることにより、容易に検出できるため、蛋白質の相対的な発現を測定することを含む方法は、実際的に有利な点があることが明白である。例えば、分泌蛋白質はＥＬＩＳＡまたは、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイまたは関連Ｆｌｕｏｒｏｓｐｏｔアッセイのような類似のアッセイにより容易に検出しうる。したがって、細胞周期阻害剤、特に阻害剤であるラパマイシンに対する感受性の差異を利用し、それにより、該阻害剤の下流で調節される遺伝子を特定することにより、本発明の方法は、非神経細胞において、細胞分裂阻害剤に対する応答の差異が評価されうる過程を有意に単純化する。
【００６６】
表１および２に示すラパマイシン感受性遺伝子は、サイトカイン、酵素、増殖因子、キナーゼ、ペプチダーゼ、ホスファターゼおよびトランスポーター蛋白質を含む、様々な種類の蛋白質をコードする。表１の蛋白質は、細胞間シグナリング、抗原提示、細胞移動、細胞死および細胞成長および増殖を含む、多様な一連の分子および細胞の機能に関連している。表２ の蛋白質は、同様に多様であり、細胞成長および増殖、細胞形態、細胞発生、抗原提示および分子輸送に関連している。
【００６７】
さらに、表１に示す遺伝子がコードする蛋白質は、血液疾患、感染性疾患、炎症応答、内分泌系障害および代謝疾患を含む多様な疾患および障害に関連している。同様に、表２に示す遺伝子がコードする蛋白質は、内分泌系障害、遺伝障害、代謝疾患、心血管疾患およびがんに関連している。
【００６８】
両方の表に示す遺伝子がコードする蛋白質は、様々な生理学的なシステムの発生および機能に関連している。これらには、血液系の発生および機能／造血、免疫細胞の輸送、組織の発生および形態ならびにリンパ組織の構造および発生が含まれる。
【００６９】
本発明の方法は、表１および２に示す、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、１０４以下の遺伝子の発現の、阻害剤誘導性の相対的な変化を測定することを含みうる。遺伝子を組合せて試験する場合、これらの遺伝子は、表１のみから、または表２のみから選択しても、両方の表から選択してもよい。
【００７０】
好ましい態様において、本発明の方法は、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１Ｂ）；インターロイキン２（ＩＬ−２）；インターロイキン６（ＩＬ−６）；およびインターロイキン１０（ＩＬ−１０）より選択される１つ以上の遺伝子の、阻害剤誘導性の相対的な変化を測定することを含む。さらに好ましい態様において、本発明の方法は、２つ以上の遺伝子の発現の、阻害剤誘導性の相対的な変化を測定することを含み、ここで、第一の遺伝子はインターロイキン１ベータ（ＩＬ１Ｂ）であり、少なくとも１つの他の遺伝子は、インターロイキン２（ＩＬ−２）；インターロイキン６（ＩＬ−６）；およびインターロイキン１０（ＩＬ−１０）より選択される。さらに好ましい態様において、本発明の方法は、インターロイキン１ベータ (ＩＬ１Ｂ)、インターロイキン２ (ＩＬ−２)、インターロイキン６ (ＩＬ−６)およびインターロイキン１０ (ＩＬ−１０)の発現の、阻害剤誘導性の相対的な変化を測定することを含む。これらの本発明の好ましい態様において、遺伝子発現は、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１０遺伝子から産生される対応の蛋白質のレベルを、例えばＥＬＩＳＡにより解析することで測定するのが好ましい。該態様において、細胞分裂阻害剤はラパマイシンであるのが好ましい。
【００７１】
本発明の方法が、表１または２に示す１つ以上の遺伝子の発現変化を測定することを含む場合、各遺伝子の発現は、別々のアッセイで測定してもよい。あるいは、多数の遺伝子の発現変化は、例えば、多数のｍＲＮＡ種を検出するために、核酸マイクロアレイを用いて、または、多数の蛋白質を検出するために、蛋白質もしくは抗体アレイを用いて、同時に測定してもよい。本発明の文脈において、「多数の」という用語は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つなどをさすと解されるべきである。
【００７２】
上述した本発明の方法は、アルツハイマー病を患う疑いがあるか、またはこの疾患を発症する危険性が高いと考えられる任意の固体を診断するおよび／または評価するのに用いうる。好ましい態様において、該方法は、孤発性のアルツハイマー病を患う疑いのある個体の診断および／または評価に用いる。他の態様において、本発明の方法は、家族型のアルツハイマー病を患う疑いのある対象に適用しうる。
【００７３】
さらなる局面において、本発明はまた、アルツハイマー病の処置において、潜在的に薬理活性を有する化合物を特定する方法を提供する。該方法はまた、非神経細胞（「試験」細胞）、および特に、アルツハイマー病患者由来の非神経細胞であって、Ｇ１／Ｓ移行において細胞周期調節に欠陥を示す非神経細胞における細胞分裂阻害剤に対する応答の差異にういてスクリーニングすることを含む。応答の差異は、「試験」細胞について測定した表１および２に示す１つ以上の遺伝子の遺伝子発現における相対的な変化を、対照の非神経細胞について測定した表１および２に示す１つ以上の遺伝子の遺伝子発現における相対的な変化と比較することにより測定する。上記に詳述する診断および予後方法の観点で記載されたスクリーニング過程の全ての態様は、本発明のこのさらなる局面に準用されるため、簡潔さのために繰り返して記載しない。
【００７４】
上述したスクリーニング方法を、アルツハイマー病の処置において潜在的に薬理活性を有する化合物を特定するために用いるためには、Ｇ１／Ｓ移行において細胞周期調節に欠陥を示す試験非神経細胞の、試験化合物への曝露の前後両方における応答の差異をモニターすることが必要でありうる。好ましい態様において、該試験非神経細胞は、アルツハイマー病を患っていることがわかっているか、もしくはその疑いがあるヒト対象より事前に単離されたものであり、その後、試験管内での試験のために、試験化合物に曝露される。
【００７５】
Ｇ１／Ｓ細胞周期移行において、調節に欠陥を示す非神経細胞で観察される細胞分裂阻害剤に対する応答の差異に対して、試験化合物が効果を有するかどうかを決定するために、以下の段階の解析を行ってもよい。第一の段階において、試験化合物に曝露していない「試験非神経細胞」を、該試験化合物に曝露しておらず、健康な個体から単離されている「対照非神経細胞」と比較する。この比較は、上述の方法論を用いて「試験」および「対照」の両方の非神経細胞について、任意の阻害剤誘導性の遺伝子発現の相対的な変化を決定し、その後、その結果を比較し、該阻害剤に対する任意の「応答の差異」を決定することを含む。第二段階において、試験化合物に曝露した「試験非神経細胞」を、試験化合物に曝露していない「対照非神経細胞」と比較し、観察される阻害剤誘導性の遺伝子発現の相対的な変化における任意の差異を、任意の「応答の差異」を決定するのに用いる。第三段階において、解析の第一段階において測定した任意の応答の差異を、解析の第二段階で測定した任意の応答の差異と比較する。第二段階で、試験非神経細胞を試験化合物に曝露した後に、（「試験」および「対照」非神経細胞の比較によって）検出される任意の応答の差異が減少している場合、該試験化合物は、アルツハイマー病の処置において、潜在的に薬理活性を有しているものとして特定される。
【００７６】
上述の方法は、低分子阻害剤および、抗体のような生物学的な薬剤を含む、当業者に公知の任意の化合物をスクリーニングするのに用いうる。好ましい態様において、試験化合物は、アルツハイマー病の処置用であると知られていないものである。さらに、本方法の態様は、アルツハイマー病の処置における、薬剤としての可能性について、試験化合物のパネルまたはライブラリーを試験することを含みうる。
【００７７】
さらなる局面において、本発明は、薬剤が、特定のヒト個体におけるアルツハイマー病の処置において、有用でありそうかどうかを決定する方法を提供する。本発明の初期の局面の態様はまた、このさらなる局面に準用される。
【００７８】
該局面において、特定の個体についての特定の薬剤の適合性を、上記の特定のヒト個体より採取した非神経細胞における細胞分裂阻害剤に対する応答の差異を、薬剤の存在下および非存在下でスクリーニングすることにより評価し、ここで、応答の差異は、表１および２に示す１つ以上の遺伝子の遺伝子発現における阻害剤誘導性の相対的な変化を、対照の非神経細胞における表１および２に示す１つ以上の遺伝子の遺伝子発現における阻害剤誘導性の相対的な変化と比較することにより測定する。
【００７９】
好ましい態様において、本発明のスクリーニング方法は、インターロイキン１ベータ(ＩＬ１Ｂ); インターロイキン２ (ＩＬ−２); インターロイキン６ (ＩＬ−６);およびインターロイキン１０ (ＩＬ−１０)から選択される１つ以上の遺伝子の発現の薬剤誘導性の相対的な変化を測定することを含む。さらに好ましい態様において、本発明のスクリーニング方法は、２つ以上の遺伝子の発現の阻害剤誘導性の相対的な変化を測定することを含み、ここで、第一の遺伝子は、インターロイキン１ベータ(ＩＬ１Ｂ)であり、少なくとも１つの他の遺伝子は、インターロイキン２ (ＩＬ−２); インターロイキン６ (ＩＬ−６);およびインターロイキン１０ (ＩＬ−１０)から選択される。さらに好ましい態様において、本発明の方法は、インターロイキン１ベータ (ＩＬ１Ｂ)、インターロイキン２ (ＩＬ−２)、インターロイキン６ (ＩＬ−６)およびインターロイキン１０ (ＩＬ−１０)の発現の、阻害剤誘導性の相対的な変化を測定することを含む。これら本発明の好ましい態様において、遺伝子発現はＩＬ１Ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−６および/またはＩＬ−１０遺伝子から産生される対応する蛋白質のレベルを、例えばＥＬＩＳＡによって解析して、測定するのが好ましい。該態様において、細胞分裂阻害剤はラパマイシンであることが好ましい。
【００８０】
特定の態様において、試験に用いる薬剤は、アルツハイマー病の処置に用いられることが知られているものであり、具体的には、公知のＧ１/Ｓ細胞周期阻害剤である。さらに、試験に用いる薬剤は、細胞が生体内で該薬剤に曝露されるように、ヒト対象に直接投与しうる。これらの環境下では、非神経細胞を、処置前および処置後の細胞より回収する。あるいは、非神経細胞を最初に、ヒト対象より単離した後、試験管内で薬剤に対する曝露の前後両方で試験する。処置後の個体より採取した非神経細胞において、観察される応答の差異を減少させる薬剤を、上記の特定の個体の処置に有益でありそうなものとして特定する。
【００８１】
本発明のなおさらなる局面において、特定のヒト個体における、アルツハイマー病の処置において、薬剤の有効性をモニターする方法を提供する。該方法は、臨床試験で、試験されている新規の薬剤を評価するのに使用しうる。あるいは、該方法は、試験管内の結果に基づき、有効であると予測される薬剤、または他のアルツハイマー病の個体で、成功した処置に用いたことが知られている薬剤の投与を受けている特定の個体の臨床的な進行を評価するのに用いうる。
【００８２】
薬剤の、特定の個体または患者における、アルツハイマー病の処置における有効性を評価するために、以下の段階の解析を実行しうる。第一の工程において、「試験」非神経細胞試料を、処置を始める前に個体より採取する。この最初の試験試料を、上述のスクリーニング方法を用いて、任意の細胞周期阻害剤に対する応答の差異について解析する。これには、具体的には、表１または２に示す１つ以上の遺伝子の任意の阻害剤誘導性の遺伝子発現の相対的な変化を、対照の非神経細胞について測定した表１または２に示す１つ以上の遺伝子の任意の阻害剤誘導性の遺伝子発現の相対的な変化と比較することを含み、ここで、対照の非神経細胞は健康な個体由来のものである。ひとたび個体の処置が始まると、様々な時間間隔で、さらに「試験」試料を採取してもよく、これらの試験試料は、対照の非神経細胞との比較に基づいて、細胞周期阻害剤に対する任意の応答の差異について解析する。その後、時間にわたって観察される応答の差異自体を比較し、該薬剤が、阻害剤に対する任意の応答の差異について、時間にわたる減少を引き起こしているかどうかを決定する。ここで、減少は、処置を受けた特定の個体の該薬剤に対する陽性の応答を示す。この種類の評価の結果は、特定の薬剤に応答する個体の臨床的な進行の評価に使用しうるものであり、それにより、該患者の進行中の処理、処方計画についての決断がなされる。
【００８３】
本明細書中の別の箇所に記載するように、本発明の方法において解析する遺伝子は、表１および２に示す、ラパマイシン感受性遺伝子より選択されうる。阻害剤であるラパマイシンは、ヒト細胞において、セリン／スレオニンキナーゼであるｍＴＯＲを阻害し、それにより、この蛋白質の下流のシグナルを低下させることが知られている。
【００８４】
したがって、さらなる局面において、本発明はまた、ヒト細胞においてｍＴＯＲシグナルをモニターする方法であって、ｍＴＯＲシグナル経路の１つ以上のバイオマーカーを検出することを含む方法を提供し、ここで、該バイオマーカーは、表１および２に示すラパマイシン感受性遺伝子から選択される。
【００８５】
好ましい態様において、バイオマーカーは、インターロイキン １ ベータ (ＩＬ１Ｂ); インターロイキン２ (ＩＬ−２); インターロイキン６ (ＩＬ−６)およびインターロイキン１０ (ＩＬ−１０)からなる、ラパマイシン感受性遺伝子の群より選択される。
【００８６】
キナーゼであるｍＴＯＲは、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２として知られる、２つの細胞質蛋白質複合体内で機能する。しかし、阻害剤であるラパマイシンに感受性を示すのは、ｍＴＯＲＣ１複合体のみである。したがって、本発明のこの局面の好ましい態様において、ヒト細胞における、ｍＴＯＲＣ１シグナルをモニターする方法を提供する。
【００８７】
細胞質キナーゼであるｍＴＯＲは、幅広い多様な上流シグナルにより刺激または活性化される。これらには、栄養感知、低酸素および／または増殖因子およびその同族の受容体の活性化により産生されるか、もしくは引き起こされるシグナルが含まれる。ｍＴＯＲの活性化は、そのキナーゼ活性も上昇させ、それにより、ｍＴＯＲを介する、細胞内の下流の標的蛋白質のリン酸化も上昇する。ほとんどの場合、ｍＴＯＲの直接の標的である下流の蛋白質は、広範のさらなる分子標的と相互作用し、それにより、広範の細胞応答を刺激し、例えば、蛋白質合成が増加し、細胞の成長および増殖が促進される。ｍＴＯＲを介する、その直接の標的蛋白質のリン酸化の下流で引き起こされる一連の分子イベントを、本明細書中では、「ｍＴＯＲシグナル経路」と定義する。
【００８８】
本発明の本局面の方法により、ｍＴＯＲシグナルをモニターすることが可能になる。「モニター」という語は、ｍＴＯＲキナーゼの下流の活性レベル、例えば、下流のシグナル経路に存在する蛋白質の活性レベルを決定することを意図している。本明細書中で用いる、「モニター」という用語はまた、ｍＴＯＲ経路内での、蛋白質の活性レベルの変化を、例えば、化合物もしくは薬剤の存在下または非存在下で決定することならびに、ヒト細胞内で、ｍＴＯＲシグナル経路の機能的な統合性を決定することをさすと解されるべきである。
【００８９】
本局面において、ｍＴＯＲシグナル経路の「バイオマーカー」は、ヒト細胞におけるｍＴＯＲシグナルを特徴づけるか、またはモニターするのに用いられる。本明細書中で用いる、「バイオマーカー」という用語は、広義には、そのレベルが、分子または細胞の経路、この場合はｍＴＯＲシグナル経路の活性と相関する任意の分子をさす。該バイオマーカーを用いることにより、関心のある経路の活性を代替として測定することができる。本発明の方法は、ｍＴＯＲシグナル経路の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上および１０４以下のバイオマーカーを検出することを含みうる。
【００９０】
本発明の文脈において、ｍＴＯＲシグナル経路のバイオマーカーは、表１および２に示すラパマイシン感受性遺伝子、具体的には、その発現産生物より選択される。好ましい態様において、本発明の方法で用いるｍＴＯＲシグナル経路のバイオマーカーは、表１および２に示すラパマイシン感受性遺伝子にコードされる蛋白質より選択される。バイオマーカーの組合せを試験する場合は、これらのバイオマーカーは、表１のみから、表２のみからまたは両方の表から選択してもよい。
【００９１】
好ましい態様において、本発明の方法に用いるｍＴＯＲシグナル経路のバイオマーカーは、インターロイキン１ベータ (ＩＬ１Ｂ); インターロイキン２ (ＩＬ−２); インターロイキン６ (ＩＬ−６);およびインターロイキン１０ (ＩＬ−１０)からなるラパマイシン感受性遺伝子の群から選択され、これらにコードされる蛋白質も含まれてよい。
【００９２】
表１に示す３１個の遺伝子は、ラパマイシン処理に応答して、リンパ球で発現低下を示すことがわかっており、表２に示す７３個の遺伝子は、ラパマイシン処理に応答して、リンパ球で発現上昇を示すことがわかった遺伝子である。したがって、本発明の好ましい態様において、本発明の方法は、ヒト細胞におけるｍＴＯＲシグナルの低下を検出するのに用いられ、該方法は、表１に示す１つ以上のバイオマーカーの低下および／または表２に示す１つ以上のバイオマーカーの上昇を検出することを、含む。本発明のさらに好ましい態様において、本発明の方法は、ヒト細胞におけるｍＴＯＲシグナルの上昇を検出するのに用いられ、該方法は、表１に示す１つ以上のバイオマーカーの上昇および／または表２に示す１つ以上のバイオマーカーの低下を検出することを、含む。
【００９３】
当業者ならば、「バイオマーカーを検出する」のに用いる技術は、バイオマーカー分子の厳密な性質に依存することを理解するであろう。例えば、バイオマーカーが表１または２に示す遺伝子の任意の１つにコードされる蛋白質である場合、検出は、蛋白出を検出する方法として当該分野で公知の技術のいずれか、例えば、免疫ブロッティング、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、Ｅｌｉｓｐｏｔ、Ｆｌｕｏｒｏｓｐｏｔなどを用いて行いうる。
【００９４】
検出するバイオマーカーが、表１および２に示す任意の遺伝子にコードされるｍＲＮＡ種である場合、ｍＲＮＡ検出に適当な技術を使用しうる。当該分野では様々な技術が公知であり、ハイブリダイゼーション技術、例えばノーザンブロッティングまたはマイクロアレイ技術、および増幅に基づく技術、例えばＲＴ−ＰＣＲまたは核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。
【００９５】
本発明の方法は、任意の種類のヒト細胞における、ｍＴＯＲシグナルをモニターするのに使用しうる。例えば、ヒト細胞は、薬理学的な阻害剤のような化合物で前処理した細胞でありうる。本発明の好ましい態様において、ヒト細胞はリンパ球である。
【００９６】
さらに、本発明の好ましい態様において、ヒト細胞は、特定の症状もしくは疾患を患うか、または、特定の疾患、最も好ましくはアルツハイマー病を発症する危険性があると考えられる個体またはヒト対象より採取しうる。該ヒト対象がアルツハイマー病を患うか、または発症する疑いがある場合、細胞は、アルツハイマー病については無症候性である対象か、軽度の認知障害を示す対象か、または、アルツハイマー病と一致する１つ以上の症候を示す対象より採取しうる。
【００９７】
特定の疾患を患う疑いがあるか、特定の疾患の危険性があると考えられる個体または対象より採取した細胞において、ｍＴＯＲシグナルをモニターする目的は、該対象の疾患の診断または予後を補助することでありうる。ヒト細胞が、アルツハイマー病を患う疑いがあるヒト対象より単離したものである、本発明の好ましい態様において、本発明の方法は、アルツハイマー病の診断を補助するために行われうる。本発明の方法は、無症候性の対象または軽度の認知減退を示す対象における、アルツハイマー病の早期段階での診断を補助するために用いるのが、特に好ましい。
【００９８】
上で詳述したように、アルツハイマー病の対象由来の神経細胞およびいくつかの非神経細胞は、細胞周期調節に欠陥を示し、そのため、細胞分裂阻害剤、例えばラパマイシンに対して、差異的に応答することがわかっている。したがって、本発明の方法は、アルツハイマー病を患う疑いのあるヒト対象より、採取した非神経細胞、好ましくはリンパ球を、細胞分裂阻害剤、好ましくはラパマイシンで処理した後に、対照の非神経細胞と比較して、該ヒト対象の非神経細胞における、任意の応答の差異を検出するために、ｍＴＯＲシグナルをモニターするのに用いうる。
【００９９】
本発明の方法はまた、ｍＴＯＲ経路を介するシグナルの調節不全が根底の原因または結果であるような、他の疾患または症状、例えばがん、ＩＩ型糖尿病、脳損傷後の認知症もしくは卒中の、診断および／または診断の補助に使用しうる。
【０１００】
本発明のさらなる局面において、ヒト細胞における、ｍＴＯＲシグナル経路のバイオマーカーとして、１つ以上のラパマイシン感受性遺伝子の使用を提供し、ここで該遺伝子は、表１および２に示す遺伝子から選択される。ヒト細胞におけるｍＴＯＲシグナルをモニターする方法という点について、記載されている全ての態様は、上述の本発明の使用に準用されるため、簡潔さのために繰り替えさない。
【０１０１】
【表１−１】
2014521315.tif 000003
【表１−２】
2014521315.tif 000004
【表１−３】
2014521315.tif 000005
【０１０２】
【表２−１】
2014521315.tif 000006
【表２−２】
2014521315.tif 000007
【表２−３】
2014521315.tif 000008
【表２−４】
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【表２−５】
2014521315.tif 000010
【０１０３】
本発明は以下の実施例によりさらに理解されるが、これらによって限定されるものではない。
【実施例】
【０１０４】
実施例 １. ラパマイシン処理したリンパ球の遺伝子発現マイクロアレイ解析
Two-colour microarray based gene expression analysis (Agilent Technologies)を用いて、未処理のままのリンパ球に比べて、ラパマイシン処理したリンパ球で発現に差異を示した遺伝子を特定した。用いたマイクロアレイは、Agilent Whole Human Genome Microarray: 4x44Kである。
【０１０５】
１.１ ラパマイシンの存在下または非存在下でのリンパ球の培養
１０% ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ培地中で、培養培地１ｍｌあたり細胞１x１０６個の濃度で、２つの平行するリンパ球培養を準備した。フィトヘマグルチニン(ＰＨＡ)を、最終濃度が２２μg/mlになるように培養物に添加し、リンパ球を活性化させた。培養物を、５% ＣＯ２を含む加湿雰囲気下で、４８時間、３７℃にてインキュベートした。４８時間培養した後、１つの培養物を１００ng/ml ラパマイシンで処理し、もう一方は対照として未処理のままに保った。さらに２４時間後、それぞれの培養リンパ球細胞を遠心により回収した。
【０１０６】
１.２ ＲＮＡ抽出
TRI Reagent（登録商標）を、標準のプロトコルにしたがって用いて、リンパ球のペレットから、ＲＮＡを抽出した。ＤＮＡの混入がないことを確実にするために、該ＲＮＡを製造者の標準プロトコルにしたがって、DNase (Qiagen)で処理した。ＲＮＡの品質は、Agilent 2100 Bioanalyserを用いて、これも標準プロトコルにしたがって、ＲＮＡナノチップ解析により測定した。
試料のＲＮＡ品質の範囲は、８〜１０RIN (RNA Integrity Number)であり、遺伝子発現マイクロアレイを行うのに適した、品質の良いＲＮＡであることが示された。
【０１０７】
１.３ ＲＮＡのｃＤＮＡへの変換
ＲＮＡ２００ngを、low-input quick amplification labelling kit (Agilent, 5190-2305)を用いてｃＤＮＡに変換した。Spike Mix AとBは、別々に調製した。それぞれ、spike mixを融解させ、ボルテックスにかけ、３７℃で５分間インキュベートし、用意された希釈バッファーに希釈した（希釈プロトコルについての表３を参照のこと）。希釈したspike mix Aおよびspike mix B ２μlを、それぞれラパマイシン処理したリンパ球と未処理のリンパ球由来の、体積１.５μlの、ＲＮＡ２００ngに添加した。Ｔ７プロモーターのプライマーを表４に示すように調製し、試料３．５μlごとに、１.８μl添加した。試料を、６５℃で１０分間インキュベートし、氷上に５分間置いた。ｃＤＮＡのマスターミックスを、表５に示すように、使用の直前に準備した。ｃＤＮＡマスターミックスを試料ごとに４.７μl添加し、試料を４０℃で２時間; ７０℃で１５分間インキュベートし; 氷上に５分間置いた。
【表３】
2014521315.tif 000011
【表４】
2014521315.tif 000012
【表５】
2014521315.tif 000013
【０１０８】
１.４ ｃＤＮＡの標識化ｃＲＮＡへの変換
low-input quick amplification labelling kit (Agilent, 5190-2305)を用いて、ｃＤＮＡを、標識化したｃＲＮＡに変換した。転写マスターミックスを表６に示すように、使用の直前に準備した。Spike Mix A試料を、シアニン３−ＣＴＰ (緑)とともに調製した転写マスターミックスに添加し、Spike Mix B試料を、シアニン５−ＣＴＰ (赤)とともに調製した転写マスターミックスに添加した。ｃＤＮＡ試料１０μlにつき、転写マスターミックス６μlを添加し、４０℃で２時間インキュベートした。
【表６】
2014521315.tif 000014
【０１０９】
１.５ ｃＲＮＡ精製および定量
ｃＲＮＡを、標準のRNeasy mini column protocol (Qiagen)により精製した。該ｃＲＮＡを、マイクロアレイ設定のナノドロップ分光光度計を用いて定量した。算出したｃＲＮＡ試料の収量および特異的な活性は以下のとおりであった:
収量 = ｃＲＮＡの濃度 x 残存しているｃＲＮＡの体積 / １０００
特異的な活性 = Ｃｙ３またはＣｙ５の濃度/ ｃＲＮＡの濃度 x １０００
【０１１０】
全ての試料の特異的な活性および収量は、それぞれ６ngおよび８２５ngより高く、ハイブリダイゼーションに適当であることを示していた。
【０１１１】
１.６ ハイブリダイゼーション
標識化ｃＲＮＡ８２５ngを、表７に示すような、様々なフラグメンテーション構成成分に添加し、６０℃で３０分間インキュベートし、氷上で１分間冷却した。その後、GEx Hybridisation buffer HI-RPM ５５μlを添加してフラグメンテーションを停止させた。試料を混合し、毎分回転数１３０００ (RPM: rotations per minute)で１分間遠心し、マイクロアレイ組み立ての準備のために氷上に静置した。選択したマイクロアレイは、4x44K Agilent Whole Human Genome Microarrayである。きれいなガスケットスライドをチャンバーの底に置き、試料をウェルごとに１００μl分注し、アレイをガスケットスライド上に置いて、ハイブリダイゼーションを促進させた。該ガスケットスライドおよびマイクロアレイスライドを共に固定し、６５℃で１７時間インキュベートした。
【表７】
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【０１１２】
ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを表８に示すような、様々な洗浄溶液で洗浄した。要約すると、マイクロアレイを、ハイブリダイゼーションアセンブリから取り除き、洗浄緩衝液１に完全に浸した状態でガスケットスライドから注意深く離した。スライドを１分間洗浄し、洗浄緩衝液２に、３７℃にて１分間移し、アセトニトリル中で１０秒間洗浄した。最後の洗浄は、安定化および乾燥溶液中で３０秒間行った。スライドを風乾し、窒素に富む環境下で遮光スライドボックスに保存した後、Agilent C Scannerでスキャンを行った。AgilentHD_GX_２color プログラムを用い、設定は表９に示すように変更した。
【表８】
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【表９】
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【０１１３】
１.７ データ解析
特徴抽出プログラムを用いて、マイクロアレイの配置を、スキャナーの出力した結果と照合した。出力結果を、マイクロアレイ上に存在する種々のハウスキーピング遺伝子で標準化し、結果の処理により、ラパマイシン処理リンパ球で、未処理のリンパ球と比較して、発現に差異があった遺伝子のリストを得た。ＦＤＲ (false discovery rate)の評価を各遺伝子について示した。出願人らの研究の目的のために、ＦＤＲが１０％までの遺伝子を、発現に差異があると認めた。ラパマイシンに応答して発現が低下した、ならびに上昇したと決定した遺伝子をそれぞれ、表１および２に示す。
【０１１４】
実施例２. ヒト対象より単離したリンパ球における、ラパマイシン感受性遺伝子の発現解析
リンパ球を、試験するヒト対象由来の静脈血試料より単離する。静脈血試料は、患者から、ヘパリンバキュテナーで採取し、４８時間以内に室温にて研究室に輸送する。リンパ球は、血液から、Lymphoprep、Histopaque、Ficollまたは相当する標準の試薬を用いて、標準のプロトコルにしたがって分離する。
【０１１５】
あるいは、静脈血は、直接ヘパリンナトリウム入りBD Vacutainer（登録商標） CPTＴＭ細胞調製チューブ（cell preparation tube）に回収し、上述の技術の１つを用いてリンパ球の分離をすぐに行う。その後、リンパ球試料を解析のために研究室に輸送する。
【０１１６】
ヒト対象より採取したリンパ球試料のそれぞれについて、１０% ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ培地中で、培養培地１mlあたり細胞１x１０６個の濃度で、平行の２つのリンパ球の培養を準備する。フィトヘマグルチニン (ＰＨＡ)を最終濃度が２２μg/mlになるように培養に添加し、リンパ球を活性化させる。培養物を５% ＣＯ２を含む加湿雰囲気下で４８時間、３７℃にてインキュベートする。４８時間培養後、培養物のうちの１つを１００ng/mlラパマイシンで処理し、もう片方の未処理の培養物を対照として維持する。さらに２４時間後、各培養リンパ球の細胞を−８０℃で冷凍し、さらに解析を行うまでこの温度で保存する。
【０１１７】
遺伝子発現の解析は、標的である関心遺伝子に対応する蛋白質のレベルを解析することによって行う。蛋白質レベルは、標準のプロトコルにしたがって、例えば製造者の指示にしたがって、ＥＬＩＳＡを行って決定する。
【０１１８】
実施例３  アルツハイマー病患者において測定した、ラパマイシンに応答する遺伝子発現の差異
３.１ 血液回収およびリンパ球分離
高齢対象由来の末梢血液試料は、倫理面の承認と、患者および介護人の同意を得て、ＯＰＴＩＭＡ（Oxford Project to Investigate Memory and Ageing）より提供を受けた。 提供を受けた試料は、ＡＤの可能性が高い、NINCDS-ARDRA基準を満たすアルツハイマー患者 (ｎ=２４)または同齢の健康な対照(ｎ=２１)由来である。試験を開始する前に、適切な同意および倫理面の承認を求めた。
【０１１９】
末梢血を、ヘパリンバキュテナーに回収し、室温で輸送した。リンパ球の分離は、確立されたプロトコル [Lymphoprep]を用いて回収の２４時間以内に行った。端的には、該血液をＰＢＳ(CaおよびMg不含有、Sigma)で１:１に希釈した。希釈した血液１０ｍｌを１５-mlコニカル遠心チューブ中で、注意深くLymphoprep (Axis Shield UK) ４mlの上に層にした。試料を室温にて、正確に３０分間、８００ x gで遠心した。上層 (不透明な界面の０.５cm以内)を捨てた。単核細胞を含む不透明な界面を注意深くＰＢＳ (ＣａおよびＭｇ不含有、Sigma)を含む１５mlコニカル遠心チューブに取り、チューブを２、３回優しく転倒して混合した。細胞を室温にて、４００ x gで１０分間遠心した。上層をペレットから約１ｃｍのところまで吸引して捨てた。このチューブに、等張ＰＢＳ (ＣａおよびＭｇ不含有、Sigma)２mlを添加し、ペレットをpastetteで粉砕(３回吸引) して再懸濁した後、体積を１４ mlにし、２、３回優しく転倒して混合した。細胞懸濁液を室温にて１０分間、４００ x gで遠心した。上清を吸引して捨てた。細胞ペレットを９:１ ＦＣＳ:ＤＭＳＯで再懸濁し、液体窒素に入れる前に、（少なくとも２４時間）-７０℃で保存した。
【０１２０】
３.２ リンパ球のラパマイシン処理
冷凍リンパ球を処理単位で融解し、RPMI-1640で洗浄して、冷凍培地を除いた。その後、細胞をＬ−グルタミン (２%)、ペニシリン/ストレプトマイシン (１%)、ＰＨＡ (２.５% PAA PHA)およびウシ胎児血清(１５%) を加えたRPMI-1640培地中で、４８時間培養した(１ x １０６個/mlの密度)。
【０１２１】
各患者由来の細胞につき、９６ウェルプレート中に、同一の培養細胞を２セット準備した(各セット６ウェル)。最初に４８時間培養した後、各セットの培養物の半分をラパマイシン(１００ng/ml)で、後の半分をＤＭＳＯ (ラパマイシンの溶媒)のみで、さらに２４時間処理した。処理時間の最後に(全部で７２時間の培養)、培養物の１セットを、試料を-２００℃で冷凍させてＬＤＨアッセイ用に回収した。２番目の培養細胞のセットを、試料を−７０℃で冷凍して、ＥＬＩＳＡ用に回収した。
【０１２２】
３.３ ＥＬＩＳＡによる遺伝子発現解析
インターロイキン１ベータ (ＩＬ１Ｂ)、インターロイキン２ (ＩＬ−２)、インターロイキン６ (ＩＬ−６)およびインターロイキン１０ (ＩＬ−１０)の発現を、以下の標準キットを用いてＥＬＩＳＡにより蛋白質レベルで測定した:
Human IL-1 beta Ready-SET-Go 10 plate kit (eBiosciences、88-7010-86)
Human IL-6 Ready-SET-Go 10 plate kit (eBiosciences、88-7066-86)
Human IL-10 Ready-SET-Go 10 plate kit (eBiosciences、88-7106-86) 
Human IL-2 Screening Set (Thermo-Fisher、ESS0010)。
【０１２３】
該キットは、適切なキャプチャー抗体、標準として用いるリコンビナント蛋白質、ビオチン検出抗体、アビジン−ＨＲＰ、アッセイ希釈剤、ＴＭＢ溶液およびコーティング緩衝液とともに提供される。
【０１２４】
ヒトリコンビナントＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−６およびＩＬ−１０蛋白質の希釈系列を、標準検量線を作成するために調製した。各ＥＬＩＳＡの一番上の標準濃度は以下のとおりであった：
【表１０】
2014521315.tif 000018
【０１２５】
リコンビナント蛋白質調製の２倍の系列希釈は、試料と同じ培地 (RPMI) で行い、濃度が順番に低下する７つの標準を調製した(１/１、１/２、１/４、１/８、１/１６、１/３２、１/６４、０)。
【０１２６】
ＥＬＩＳＡを以下のように行った:-
高結合（high-bonding）９６ウェルプレートをコーティング抗体(１X アッセイ希釈剤中、１０００μg/mL) １００μL/ウェルでコートし、該プレートを密封して一晩インキュベートするか(ＩＬ−１ベータおよびＩＬ−６) または４℃で二晩インキュベートした (ＩＬ−１０およびＩＬ−２)。
【０１２７】
結合していないコーティング抗体はいずれも、ウェルの吸引およびELx405 plate washerでの洗浄によりウェルから取り除いた(プログラム１３ (Ｅ１); ３００μL/ウェル 洗浄溶液、および５回の洗浄工程の間に１分間浸漬)。過剰な洗浄溶液は、吸収紙でブロットすることでウェルから取り除いた。
【０１２８】
コートしたウェルを、１X アッセイ希釈剤３００μL/ウェルでブロックした。ブロッキング溶液を添加した後、プレートを密封し、室温で１時間インキュベートした。
【０１２９】
セクション３.２に上述する試料を含むプレートを、−８０℃冷凍庫から取り出した。完全に融解させた後、短時間スピンして、蓋から凝固物を取り除いた。試料をマルチチャンネルピペットで、各列について清潔なチップを用いて、数回優しくピペッティングして混合した。
【０１３０】
ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートのウェルから、吸引により液体を吸い取り、ウェルをELx405 plate washer (プログラム１３)で洗浄した。過剰の洗浄溶液を、清潔な吸収紙を用いて除いた。
【０１３１】
ＥＬＩＳＡプレートの列１に各濃度の蛋白質標準を１００μL添加して、検量線を設定した。マルチチャンネルピペットと清潔なチップを用いて、試料を各１００μL、ＥＬＩＳＡプレートの２〜１２列に分配した。プレートを密封し、４℃にて一晩インキュベートした。
【０１３２】
試料を含むＥＬＩＳＡプレートを４℃から出し、ウェルを吸引し、ELx405 plate washer (プログラム１３)で洗浄した。過剰の洗浄溶液を清潔な吸収紙を用いて除いた。
【０１３３】
検出抗体１００μL(１X アッセイ希釈剤中、２５０ng/mL)を各ウェルに添加し、プレートを密封し、室温で１時間インキュベートした。液体を吸引によりウェルより取り除き、ウェルをELx405 plate washer (プログラム１３)で洗浄した。過剰な洗浄溶液を、清潔な吸収紙で取り除いた。
【０１３４】
１X ストレプトアビジン-ＨＲＰ １００μLを各ウェルに添加し、プレートをホイルで覆い、室温で３０分間インキュベートした。液体を吸引によりウェルから取り除き、ウェルをELx405 plate washer (プログラム１３)で洗浄した。過剰な洗浄溶液を清潔な吸収紙を用いて取り除いた。
【０１３５】
１X基質 １００μLを各ウェルに添加し、プレートをホイルで覆い、室温で１５分間インキュベートした。１X ストップ溶液 １００μLまたは２N Ｈ２ＳＯ４ ５０μLを各ウェルに添加して反応を停止させた。吸着値を４５０nmで読み取った。
【０１３６】
３.４ 結果
ラパマイシン応答による、分裂しているリンパ球におけるＩＬ１ベータ全体のレベルの低下は、図１に示すように、対照では、ＡＤ患者よりも大きかった。ラパマイシン応答による、分裂しているリンパ球におけるＩＬ１ベータ／生細胞 の低下もまた、図２で示すように、ＡＤ患者よりも対照で顕著に見られた。
【０１３７】
ラパマイシン応答による、分裂しているリンパ球におけるＩＬ２レベルの低下は、図３に示すように、対照ではＡＤ患者よりも小さかった。ラパマイシン応答による、分裂しているリンパ球におけるＩＬ２／生細胞 の低下もまた、図４で示すように、対照では、ＡＤ患者程顕著に見られなかった。
【０１３８】
ラパマイシン応答による、分裂しているリンパ球におけるＩＬ６レベルの低下は、図５に示すように、対照ではＡＤ患者よりも小さかった。ラパマイシン応答による、分裂しているリンパ球におけるＩＬ６レベル／生細胞 の低下もまた、図６で示すように、対照では、ＡＤ患者程顕著に見られなかった。
【０１３９】
ラパマイシン応答による、分裂しているリンパ球におけるＩＬ１０レベルの低下は、図７に示すように、対照ではＡＤ患者よりも大きかった。ラパマイシン応答による、分裂しているリンパ球におけるＩＬ１０レベル／生細胞 の低下もまた、図８で示すように、対照では、ＡＤ患者より顕著であった。
【０１４０】
３.４.１ ＩＬ１ベータについてのロジスティック回帰およびＲＯＣ曲線解析
ロジスティック回帰およびＲＯＣ曲線解析により、ラパマイシンへの応答における、全体のＩＬ１ベータレベルと、細胞あたりのＩＬ１ベータレベルの変化の組合せのみで、ＡＤ患者と対照を区別しうることを示唆している（図９および以下の解析を参照のこと）。
【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【０１４１】
３.４.２ ＩＬ２についてのロジスティック回帰およびＲＯＣ曲線解析
ロジスティック回帰およびＲＯＣ曲線解析により、ラパマイシンによるＩＬ２発現の変化の組合せのみで、ＡＤ患者と対照を区別しうることを示唆している（以下の解析を参照のこと）。
【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【０１４２】
３.４.３ ＩＬ−６と組み合わせた、ＩＬ１ベータについてのロジスティック回帰およびROC曲線解析
ＩＬ６の変化をＩＬ１ベータの変化と組み合わせることにより、ＥＬＩＳＡの結果から、患者を正しく診断することが可能になった(図１０および以下の解析を参照のこと)。
【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【０１４３】
３.４.４ ＩＬ１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−６およびＩＬ−１０の組合せについてのロジスティック回帰およびＲＯＣ曲線解析
４つのインターロイキン全てについて測定したパラメーターを組み合わせて考慮にいれ、細胞数で標準化した場合、患者を正しく予測できる可能性はさらに増加した。(図１１および以下の解析を参照のこと)。
【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【０１４４】
３.４.５ ＩＬ １ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−６およびＩＬ−１０と、ＡｐｏＥ状態との組み合わせについてのロジスティック回帰およびＲＯＣ曲線解析
患者のＡｐｏＥの状態を解析に含めた場合、予測はより正確になる (図１２および以下の解析を参照のこと)。
【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【０１４５】
３.４.６細胞増殖およびインターロイキン発現に対するラパマイシンの効果
ラパマイシンにより誘導された、これらの培養細胞におけるインターロイキンの発現の変化と細胞増殖（実際の細胞数）の変化の間の関係についても解析した。
インターロイキンレベルにおいて誘導された変化は、細胞数において誘導された変化とは有意な関係がないことが見出された(図１３: ＩＬ１ベータ、ｐ＝０.３２、Ｒ２＝２.３７%; 図１４: ＩＬ１０、ｐ＝０.７３、Ｒ２＝０.３%; 図１５: ＩＬ２、ｐ＝０.１７、Ｒ２＝４.５%; 図１６: ＩＬ６、ｐ＝０.２１、Ｒ２＝３.７%)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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