(57)【要約】  本発明は、プロリンリッチ膜貫通タンパク質２（ＰＲＲＴ２）遺伝子、並びに発作障害及び運動障害を引き起こすＰＲＲＴ２の変異及びバリエーションの特定に関する。したがって、本発明は、ＰＲＲＴ２遺伝子中の変化を特定することによってそうした障害を診断又は予測するための方法を提供する。ＰＲＲＴ２遺伝子中の変化を特定することによって、そうした障害になりやすい子孫をもつ可能性が増大している対象を特定することも可能となる。本発明は、ＰＲＲＴ２遺伝子中に変化を含む単離核酸分子であって、前記変化が発作及び／又は運動障害の表現型をもたらす単離核酸分子も提供する。発作及び／又は運動障害の表現型をもたらす変化を含む単離ＰＲＲＴ２ポリペプチドも提供する。さらに本発明は、対象の発作及び／若しくは運動障害を診断若しくは予測するための、又は発作及び／若しくは運動障害になりやすい子孫をもつ可能性が増大している対象を特定するためのキットであって、前記対象のＰＲＲＴ２遺伝子中の変化の存在について検査するための１又は２以上の構成要素を含むキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の発作障害を診断又は予測する方法であって、前記対象のプロリンリッチ膜貫通タンパク質２（ＰＲＲＴ２）遺伝子中の変化の存在について検査することを含む方法。
【請求項２】
対象にＰＲＲＴ２遺伝子中の変化が存在することによって、前記対象において障害の可能性が高いことを示す診断又は予測が確証される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象の罹患した親又は血縁者にも存在するＰＲＲＴ２遺伝子中の変化が前記対象にも存在することによって、前記対象において障害の可能性が非常に高いことを示す診断又は予測が確証される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
発作障害になりやすい子孫をもつ可能性が増大している対象を特定する方法であって、前記対象において、ＰＲＲＴ２遺伝子中の変化の存在について検査することを含む方法。
【請求項５】
対象にＰＲＲＴ２遺伝子中の変化が存在することによって、発作障害になりやすい子孫をもつ可能性が増大している対象として前記対象が特定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
対象の罹患した親又は血縁者にも存在するＰＲＲＴ２遺伝子中の変化が前記対象にも存在することによって、発作障害になりやすい子孫をもつ可能性が非常に高い対象として前記対象が特定される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
発作障害がてんかんである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
てんかんが良性家族性乳児てんかん（ＢＦＩＥ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
発作障害が乳児痙攣及び舞踏病アテトーゼ（ＩＣＣＡ）症候群である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ＰＲＲＴ２遺伝子中の変化の存在について検査するための、及び前記変化の種類を特定するための、１又は２以上のアッセイを実施することを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
（１）ＰＲＲＴ２遺伝子中の変化の存在について検査するための１又は２以上のアッセイを実施すること、及びその結果が前記ＰＲＲＴ２遺伝子中の変化の前記存在を示す場合は、
（２）前記ＰＲＲＴ２の変化の種類を特定するための１又は２以上のアッセイを実施すること
を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
１又は２以上のアッセイが、ＤＮＡシーケンシング、ＤＮＡハイブリダイゼーション、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動アッセイ、ＳＳＣＰ分析、ＲＮａｓｅプロテクション、ＤＧＧＥ、酵素アッセイ、ＭＬＰＡ及びイムノアッセイからなる群から選択される、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＰＲＲＴ２の変化がＰＲＲＴ２中のフレームシフト変異である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
フレームシフト変異がＰＲＲＴ２のエキソン２中にある、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
フレームシフト変異が、ＰＲＲＴ２遺伝子のコーディング配列の位置６２９のヌクレオチド残基の後ろに、シトシン（Ｃ）ヌクレオチド残基が挿入された（ｃ．６２９−６３０ｉｎｓＣ）結果であり、前記ＰＲＲＴ２遺伝子のコーディング配列が配列番号９に記述され、GenBank Accession No. ＮＭ＿１４５２３９．２で表される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
フレームシフト変異を含むＰＲＲＴ２のコーディング配列が配列番号１に記述される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
フレームシフト変異が、配列番号２に記述されるアミノ酸配列を含むトランケートされたＰＲＲＴ２ポリペプチド（ｐ．Ｐ２１０ｆｓＸ２２４）をコードする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
フレームシフト変異が、ＰＲＲＴ２遺伝子のコーディング配列の位置６４９のヌクレオチド残基の後ろに、シトシン（Ｃ）ヌクレオチド残基が挿入された（ｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣ）結果であり、前記ＰＲＲＴ２遺伝子のコーディング配列が配列番号９に記述され、GenBank Accession No. ＮＭ＿１４５２３９．２で表される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１９】
フレームシフト変異を含むＰＲＲＴ２のコーディング配列が配列番号３に記述される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
フレームシフト変異が、配列番号４に記述されるアミノ酸配列を含む、トランケートされたＰＲＲＴ２ポリペプチド（ｐ．Ｒ２１７ｆｓＸ２２４）をコードする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＰＲＲＴ２の変化がスプライス部位変異である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
スプライス部位変異がＰＲＲＴ２のイントロン２中に起こる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
スプライス部位変異が、ＰＲＲＴ２のイントロン２の位置＋１でのグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）へのヌクレオチド置換（ＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ｔ）の結果であり、イントロン２のヌクレオチド配列が配列番号１１で表される、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
スプライス部位変異を含むＰＲＲＴ２のヌクレオチド配列が配列番号５に記述される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
スプライス部位変異が、ＰＲＲＴ２のイントロン２の位置＋５でのグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）へのヌクレオチド置換（ＩＶＳ２＋５Ｇ＞Ａ）の結果であり、イントロン２のヌクレオチド配列が配列番号１１で表される、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２６】
スプライス部位変異を含むＰＲＲＴ２のヌクレオチド配列が配列番号６に記述される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＰＲＲＴ２の変化がミスセンス変異である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
ミスセンス変異がＰＲＲＴ２のエキソン３中に起こる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
変異が、ＰＲＲＴ２遺伝子のコーディング配列の位置９５０でのグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）へのヌクレオチド置換（ｃ．９５０Ｇ＞Ａ）の結果であり、前記ＰＲＲＴ２遺伝子のコーディング配列が配列番号９に記述され、GenBank Accession No. ＮＭ＿１４５２３９．２で表される、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
ミスセンス変異を含むＰＲＲＴ２のコーディング配列が配列番号７に記述される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ミスセンス変異が、アミノ酸位置３１７でのセリン（Ｓ）からアスパラギン（Ｎ）へのアミノ酸置換（ｐ．Ｓ３１７Ｎ）を含むＰＲＲＴ２ポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドが配列番号８に記述されるアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＰＲＲＴ２遺伝子中に変化を含む単離核酸分子であって、前記変化が発作障害の表現型をもたらす、単離核酸分子。
【請求項３３】
変化がＰＲＲＴ２中のフレームシフト変異である、請求項３２に記載の単離核酸分子。
【請求項３４】
フレームシフト変異がＰＲＲＴ２のエキソン２中にある、請求項３３に記載の単離核酸分子。
【請求項３５】
配列番号１に記述される配列を含む、請求項３２〜３４のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項３６】
配列番号２に記述されるアミノ酸配列を含むＰＲＲＴ２ポリペプチドをコードする、請求項３５に記載の単離核酸分子。
【請求項３７】
配列番号３に記述される配列を含む、請求項３２〜３４のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項３８】
配列番号４に記述されるアミノ酸配列を含むＰＲＲＴ２ポリペプチドをコードする、請求項３７に記載の単離核酸分子。
【請求項３９】
変化がＰＲＲＴ２中のスプライス部位変異である、請求項３２に記載の単離核酸分子。
【請求項４０】
スプライス部位変異がＰＲＲＴ２のイントロン２中に起こる、請求項３９に記載の単離核酸分子。
【請求項４１】
配列番号５又は配列番号６に記述される配列を含む、請求項３９又は４０に記載の単離核酸分子。
【請求項４２】
変化がＰＲＲＴ２中のミスセンス変異である、請求項３２に記載の単離核酸分子。
【請求項４３】
ミスセンス変異がＰＲＲＴ２のエキソン３中に起こる、請求項４２に記載の単離核酸分子。
【請求項４４】
配列番号７に記述される配列を含む、請求項４３に記載の単離核酸分子。
【請求項４５】
配列番号８に記述されるアミノ酸配列を含むＰＲＲＴ２ポリペプチドをコードする、請求項４４に記載の単離核酸分子。
【請求項４６】
発作障害がてんかんである、請求項３２〜４５のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項４７】
てんかんが良性家族性乳児てんかん（ＢＦＩＥ）である、請求項４６に記載の単離核酸分子。
【請求項４８】
発作障害が乳児痙攣及び舞踏病アテトーゼ（ＩＣＣＡ）症候群である、請求項３２〜４５のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項４９】
ＰＲＲＴ２遺伝子のフラグメントを含む単離核酸分子であって、ＰＲＲＴ２中に変異を含み、前記変異が、ｃ．６２９−６３０ｉｎｓＣ、ｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣ、ＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ｔ、ＩＶＳ２＋５Ｇ＞Ａ及びｃ．９５０Ｇ＞Ａからなる群から選択される、単離核酸分子。
【請求項５０】
配列番号１の少なくとも約２０個連続するヌクレオチドと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含み、且つｃ．６２９−６３０ｉｎｓＣ変異を含む、請求項４９に記載の単離核酸分子。
【請求項５１】
配列番号３の少なくとも約２０個連続するヌクレオチドと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含み、且つｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣ変異を含む、請求項４９に記載の単離核酸分子。
【請求項５２】
配列番号５の少なくとも約２０個連続するヌクレオチドと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含み、且つＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ｔ変異を含む、請求項４９に記載の単離核酸分子。
【請求項５３】
配列番号６の少なくとも約２０個連続するヌクレオチドと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含み、且つＩＶＳ２＋５Ｇ＞Ａ変異を含む、請求項４９に記載の単離核酸分子。
【請求項５４】
配列番号７の少なくとも約２０個連続するヌクレオチドと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含み、且つｃ．９５０Ｇ＞Ａ変異を含む、請求項４９に記載の単離核酸分子。
【請求項５５】
変化を含むＰＲＲＴ２ポリペプチドであり、前記変化が発作障害の表現型をもたらす、単離ポリペプチド。
【請求項５６】
変化がトランケーション変異である、請求項５５に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５７】
配列番号２又は配列番号４に記述されるアミノ酸配列を含む、請求項５５又は５６に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５８】
変化がアミノ酸置換変異である、請求項５７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５９】
配列番号８に記述されるアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６０】
発作障害がてんかんである、請求項５５〜５９のいずれかに記載の単離ポリペプチド。
【請求項６１】
てんかんが良性家族性乳児てんかん（ＢＦＩＥ）である、請求項６０に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６２】
発作障害が乳児痙攣及び舞踏病アテトーゼ（ＩＣＣＡ）症候群である、請求項５５〜５９のいずれかに記載の単離ポリペプチド。
【請求項６３】
ＰＲＲＴ２ポリペプチドのフラグメントを含む単離ポリペプチドであって、ＰＲＲＴ２中に変異を含み、前記変異がＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ｔ変異（ｐ．Ｐ２１０ｆｓＸ２２４）によってコードされるトランケートされたＰＲＲＴ２ポリペプチド、ＩＶＳ２＋５Ｇ＞Ａ変異（ｐ．Ｒ２１７ｆｓＸ２２４）によってコードされるトランケートされたＰＲＲＴ２ポリペプチド及びＳ３１７Ｎからなる群から選択される、単離ポリペプチド。
【請求項６４】
配列番号８の少なくとも約２０個連続するアミノ酸と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、且つＳ３１７Ｎ変異を含む、請求項６３に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６５】
配列番号２又は配列番号４と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するトランケートされたＰＲＲＴ２ポリペプチドを含む、請求項６３に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６６】
請求項３２〜５４のいずれかに記載の核酸分子を含む、単離細胞。
【請求項６７】
請求項３２〜５４のいずれかに記載の核酸分子を含む、遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項６８】
ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ及び非ヒト霊長類からなる群から選択される、請求項６７に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項６９】
請求項５５〜６５のいずれかに記載のポリペプチドに特異的に結合する、抗体又はそのフラグメント。
【請求項７０】
請求項５５〜５７、６３及び６５のいずれかに記載のポリペプチドを検出する抗体又はそのフラグメントであって、前記ポリペプチドがトランケーション変異を含み、前記抗体又はそのフラグメントが前記ポリペプチドのトランケートされた領域に結合する、抗体又はそのフラグメント。
【請求項７１】
対象の発作障害を診断若しくは予測するための、又は発作障害になりやすい子孫をもつ可能性が増大している対象を特定するためのキットであって、前記対象のＰＲＲＴ２遺伝子中の変化の存在について検査するための１又は２以上の構成要素を含むキット。
【請求項７２】
１又は２以上の構成要素が、
（ｉ）請求項５５〜６５のいずれかに記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体又はそのフラグメント、
（ii）請求項５５〜５７、６３及び６５のいずれかに記載のポリペプチドを検出する抗体又はそのフラグメントであって、前記ポリペプチドがトランケーション変異を含み、前記抗体又はそのフラグメントが前記ポリペプチドのトランケートされた領域に結合する、抗体又はそのフラグメント、並びに
（iii）請求項３２〜５４のいずれかに記載の核酸分子に特異的にハイブリダイズする核酸分子
からなる群から選択される、請求項７１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、２０１１年１０月２８日及び２０１２年１月１８日にそれぞれ出願されたオーストラリア仮特許出願第２０１１９０４４９３号明細書及び第２０１２９００１９０号明細書に対して優先権を主張するものであり、それらの内容は本明細書に参照により組み込まれる。
【０００２】
本発明は、プロリンリッチ膜貫通タンパク質２遺伝子（ＰＲＲＴ２, proline rich transmembrane protein 2 gene）（以下「ＰＲＲＴ２」）、並びにてんかんなどの発作障害及び運動障害及び同様の関連障害を引き起こすＰＲＲＴ２の変異及びバリエーションの特定に関する。ＰＲＲＴ２がこれらの障害の一因となるという発見を考慮すると、本発明は、発作障害及び運動障害を診断又は予測する方法を可能にし、且つそうした障害の治療及び／又は予防のための治療法を特定するための薬物スクリーニングアッセイにおけるＰＲＲＴ２遺伝子及びそれにコードされるポリペプチドの使用を可能にするものである。
【背景技術】
【０００３】
発作障害及び運動障害は、脳の電気活動が周期的に乱され、その結果として、ある程度の一時的な脳機能不全になる場合に生じる障害と大まかに特徴付けることができる。発作障害（例えばてんかんなど）と運動障害の間の境界は定義するのが難しく、一部の症候群又は疾患はこれら２つを併合し得るし、一方の多くの症状発現は他方と類似している。さらに、例えば、てんかんの診断は、運動障害が将来発生することの指標となり得る。それにもかかわらず、臨床的見地からは、発作障害及び運動障害は互いに区別される。
【０００４】
てんかんは、人口の約３％に生涯のどこかで影響を及ぼす発作障害の多様な集まりを構成する。てんかん性の発作は、中枢神経系のニューロン集団の異常な興奮によって引き起こされる、突発性の行動変化であると定義することができる。これは、様々な程度の不随意性筋収縮をもたらし、意識消失をもたらすことも多い。てんかん症候群は、特徴的な症状、発作タイプ、原因、発症年齢及び脳波（ＥＥＧ, Electroencephalography）パターンに基づいて、４０を超える異なるタイプに分類されている（Commission on Classification and Terminology of the International League Against Epilepsy, 1989）。しかし、てんかん性症候群の全てに共通しているただ１つの特色は、不定期且つ予測不可能に発作として発現するニューロンの興奮性が持続的に増大することである。
【０００５】
罹患者のほぼ４０％に、てんかんの病因への遺伝的関与が存在すると推定されている。てんかん性発作は、最終的にニューロンの同調性を乱す幾つかの分子的異常のエンドポイントであり得るので、てんかんの遺伝学的根拠は雑多である可能性が高い。表現型の一部としててんかんを含む、２００を超えるメンデル性疾患が存在する。これらの疾患では、発作は、脳の構造又は機能の乱れなどの神経学的な関与が根底にある徴候である。それとは対照的に、てんかんが罹患者の唯一の症状発現である、幾つかの「純粋な」てんかん症候群も存在する。これらの症候群は特発性と呼ばれ、てんかん症例全ての６０％超を占める。
【０００６】
特発性のてんかんは、部分的サブタイプと全身的サブタイプにさらに分けられている。部分（焦点又は局所）てんかん性のひきつけは局所的な皮質放電から生じ、その結果、特定の筋肉群のみが関与し、意識は維持され得る。しかし、全身てんかんではＥＥＧ放電が焦点を示さず、したがって脳の全ての皮質下領域が関与する。全身てんかんが頻繁に遺伝するという知見は理解できるが、おそらく恒常的に脳で発現する遺伝的欠陥が部分的な発作を引き起こす機構は、ほとんど明らかでない。
【０００７】
新生児及び乳児では、おそらく脳のミエリン形成が不完全であるために、部分てんかんと全身てんかんの区別は、臨床的及び神経生物学的な観点からほとんど明らかでない。生後１年内のてんかんは、大部分は後天性の周産期因子によるものであると以前は見なされていた。しかし今は、２つの良性常染色体優性てんかん症候群が生後１年内によく認められる。第一は、良性家族性新生児てんかん（ＢＦＮＥ, benign familial neonatal epilepsy）であり、これは生後３日あたりで通常現れ、強直性又は間代性発作に特徴付けられる。これらの発作は生後数週間内に止まり、５％の個体が後に熱性発作を、１１％が後にてんかんを有する。研究では、多くの症例での本症候群に関する遺伝学的根拠は、カリウムチャネル遺伝子ＫＣＮＱ２及びＫＣＮＱ３の変異によるものであると示されている。
【０００８】
第二は、乳児期の常染色体優性の発作障害である良性家族性乳児てんかん（ＢＦＩＥ, benign familial infantile epilepsy）であり、これは平均年齢６カ月で発作が発症し、数日間にわたる、一群の強直性又は間代性の部分発作又は全身発作を伴う。発作は、通常およそ２歳までに止まるが、個体によっては、後の小児期に発作性ジスキネジア（運動障害）を付随する可能性がある。ＢＦＩＥの原因となる遺伝子は最終的には同定されていないが、第１９、第１及び第１６染色体への大まかな連鎖が以前に報告されており、大多数の家族は、第１６染色体の１６ｐ１１〜１６ｑ１２．１の動原体周辺領域に連鎖を示す。
【０００９】
運動障害は、運動制御及び筋緊張に影響を及ぼす多種多様の神経学的な状態を包含する。こうした状態は、特定の身体動作を制御できないことに代表される。したがって、こうした状態は、患者にとって重要な生活の質の問題を提起する。運動障害の非限定例としては、ジスキネジア、パーキンソン症候群、ジストニア、ミオクローヌス、舞踏病、チック及び振戦が挙げられる。ジストニアは、持続性の不随意運動に特徴付けられる神経障害である。こうした運動によって、典型的には、ねじれた姿勢になる。遺伝的原因、毒素又は薬物誘発性の原因及びジストニアが現れる変性性疾病を含めた多数の条件が、ジストニアをもたらす。
【００１０】
本態性振戦はジストニアとは異なる別のタイプの運動障害であり、成人集団における振戦の最も一般的な原因である。本態性振戦を罹患する患者は、身体部位の不随意性の律動的な振戦又は揺れを示す。一般に本態性振戦は、手、頭又は声に影響を及ぼすが、舌、脚又は体幹にも影響を及ぼし得る。細かな運動制御に関与する作業では、本態性振戦を罹患する患者は、こうしたスキルを行うのが困難な可能性がある。例えば重篤な手の振戦は、ものを食べる動作、ものを飲む動作、ものを書く動作及び更衣動作を難しくする。本態性振戦の正確な原因は不明であるが、遺伝性であることが多い。
【００１１】
さらに別の運動障害は、発作性運動誘発性舞踏病アテトーゼ（ＰＫＣ, paroxysmal kinesigenic choreoathetosis）であり、これは発作性運動誘発性ジスキネジア（ＰＫＤ, paroxysmal kinesigenic dyskinesia）としても知られる。この状態は、座位からの起立などの、びっくりさせられる又は速度が変化させられる他の突然の運動によって引き起こされる、一側性又は両側性の不随意運動に特徴付けられる。発作はジストニア、舞踏病アテトーゼ及びバリズムの組合せを含み、前兆が先行することもあり、意識消失を伴わない。発作は、１日あたり１００回程度の頻度から１月あたりわずか１回まであり得る。発作は、持続時間が通常数秒から５分であるが、数時間続く可能性がある。発症年齢は、小児期及び青年期にあるのが典型的である。現在、家族性のＰＫＣ／ＰＫＤの原因は不明である。
【００１２】
乳児痙攣及び舞踏病アテトーゼ（ＩＣＣＡ, Infantile Convulsions and Choreoathetosis）症候群は、発作及び運動障害である。ＩＣＣＡでは、家族員は、乳児発作、ＰＫＣ／ＰＫＤ又は両方を罹患し得る。ＩＣＣＡ又は家族性の（常染色体優性の）ＰＫＣ／ＰＫＤのみを罹患する家族も、第１６染色体の大きな動原体周辺領域に連鎖を示す。ＩＣＣＡを罹患する家族におけるこれらの障害の共通連鎖領域及び同時出現は、ＢＦＩＥ、ＰＫＣ／ＰＫＤ及びＩＣＣＡが対立形質であり得ると、以前に憶測を呼んだ。
【００１３】
前述の障害に関する原因遺伝子（複数可）の同定が必要である。これらの障害に関与する遺伝子は、本障害を罹患する患者のための診断的及び治療的適用の根拠となる。これによって、罹患者の適切な管理が可能になり、患者の過度の調査及び過度の治療が回避される。
【００１４】
文献、行為、材料、デバイス、物品などの論議は、単に本発明のための文脈を提供する目的のために本明細書に含まれる。いかなる又は全てのこれらの事項も、それらが本出願の各請求項の優先日の前に存在していたために、従来技術の基礎の一部を形成したこと、又は本発明に関連する分野における共通の一般的知識であったことを示唆する又は意味するものではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Commission on Classification and Terminology of the International League Against Epilepsy, 1989
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、発作障害及び運動障害の両方に関する原因遺伝子の同定に部分的に基づく。本発明者らは、良性家族性乳児てんかんを罹患する個体並びに乳児痙攣及び舞踏病アテトーゼ（ＩＣＣＡ）症候群を罹患する個体において、プロリンリッチ膜貫通タンパク質２（ＰＲＲＴ２, proline-rich transmembrane protein 2）遺伝子中の変異を特定した。これによって、発作障害及び運動障害を診断又は予測する方法が可能になり、これらの障害を治療するための潜在的な新しい治療剤を同定するための、ＰＲＲＴ２に基づくスクリーニング方法が可能になる。
【００１７】
したがって第一の態様では、本発明は、対象の、発作及び／又は運動障害を診断又は予測する方法であって、前記対象のプロリンリッチ膜貫通タンパク質２（ＰＲＲＴ２）遺伝子中の変化の存在について検査することを含む方法を提供する。
【００１８】
一実施形態では、対象にＰＲＲＴ２遺伝子中の変化が存在することによって、前記対象において障害の可能性が高いことを示す診断又は予測が確証される。一実施形態では、対象の罹患した親又は血縁者にも存在するＰＲＲＴ２遺伝子中の変化が前記対象にも存在することによって、前記対象において障害の可能性が非常に高いことを示す診断又は予測が確証される。
【００１９】
第二の態様では、本発明は、発作及び／又は運動障害になりやすい子孫をもつ可能性が増大している対象を特定する方法であって、前記対象において、ＰＲＲＴ２遺伝子中の変化の存在について検査することを含む方法を提供する。
【００２０】
一実施形態では、対象にＰＲＲＴ２遺伝子中の変化が存在することによって、発作及び／又は運動障害になりやすい子孫をもつ可能性が増大している対象として前記対象が特定される。一実施形態では、前記対象の罹患した親又は血縁者にも存在するＰＲＲＴ２遺伝子中の変化が前記対象にも存在することによって、発作及び／又は運動障害になりやすい子孫をもつ可能性が非常に高い対象として前記対象が特定される。
【００２１】
本発明の第一及び第二の態様の幾つかの実施形態では、発作障害はてんかんである。一実施形態では、てんかんは良性家族性乳児てんかん（ＢＦＩＥ）である。幾つかの実施形態では、発作障害は乳児痙攣及び舞踏病アテトーゼ（ＩＣＣＡ）症候群である。幾つかの実施形態では、運動障害は発作性運動誘発性舞踏病アテトーゼ（ＰＫＣ）である。
【００２２】
本発明の第一及び第二の態様の幾つかの実施形態では、方法は、ＰＲＲＴ２遺伝子中の変化の存在について検査するための、及び変化の種類を特定するための、１又は２以上のアッセイを実施することを含む。
【００２３】
本発明の第一及び第二の態様の幾つかの実施形態では、方法は、（１）ＰＲＲＴ２遺伝子中の変化の存在について検査するための１又は２以上のアッセイを実施すること、及びその結果がＰＲＲＴ２遺伝子中の変化の存在を示す場合は、（２）ＰＲＲＴ２の変化の種類を特定するための１又は２以上のアッセイを実施することを含む。
【００２４】
幾つかの実施形態では、１又は２以上のアッセイは、ＤＮＡシーケンシング、ＤＮＡハイブリダイゼーション、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動アッセイ、ＳＳＣＰ分析、ＲＮａｓｅプロテクション、ＤＧＧＥ、酵素アッセイ、ＭＬＰＡ及びイムノアッセイからなる群から選択される。
【００２５】
本発明の第一及び第二の態様の幾つかの実施形態では、ＰＲＲＴ２の変化は、ＰＲＲＴ２中のフレームシフト変異である。一実施形態では、フレームシフト変異は、ＰＲＲＴ２のエキソン２中にある。
【００２６】
幾つかの実施形態では、フレームシフト変異は、ＰＲＲＴ２遺伝子のコーディング配列の位置６２９のヌクレオチド残基の後ろに、シトシン（Ｃ）ヌクレオチド残基が挿入された（ｃ．６２９−６３０ｉｎｓＣ）結果であり、前記ＰＲＲＴ２遺伝子のコーディング配列は配列番号９に記述され、GenBank Accession No. ＮＭ＿１４５２３９．２で表される。一実施形態では、フレームシフト変異を含むＰＲＲＴ２のコーディング配列は、配列番号１に記述される。一実施形態では、フレームシフト変異は、配列番号２に記述されるアミノ酸配列を含む、トランケートされたＰＲＲＴ２ポリペプチド（ｐ．Ｐ２１０ｆｓＸ２２４）をコードする。
【００２７】
幾つかの実施形態では、フレームシフト変異は、ＰＲＲＴ２遺伝子のコーディング配列の位置６４９のヌクレオチド残基の後ろに、シトシン（Ｃ）ヌクレオチド残基が挿入された（ｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣ）結果であり、前記ＰＲＲＴ２遺伝子のコーディング配列は配列番号９に記述され、GenBank Accession No. ＮＭ＿１４５２３９．２で表される。一実施形態では、フレームシフト変異を含むＰＲＲＴ２のコーディング配列は、配列番号３に記述される。一実施形態では、フレームシフト変異は、配列番号４に記述されるアミノ酸配列を含む、トランケートされたＰＲＲＴ２ポリペプチド（ｐ．Ｒ２１７ｆｓＸ２２４）をコードする。
【００２８】
本発明の第一及び第二の態様の幾つかの実施形態では、ＰＲＲＴ２の変化はスプライス部位変異である。一実施形態では、スプライス部位変異は、ＰＲＲＴ２のイントロン２中に起こる。
【００２９】
幾つかの実施形態では、スプライス部位変異は、ＰＲＲＴ２のイントロン２の位置＋１でのグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）へのヌクレオチド置換（ＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ｔ）の結果であり、イントロン２のヌクレオチド配列は配列番号１１で表される。一実施形態では、スプライス部位変異を含むＰＲＲＴ２のヌクレオチド配列は、配列番号５に記述される。
【００３０】
幾つかの実施形態では、スプライス部位変異は、ＰＲＲＴ２のイントロン２の位置＋５でのグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）へのヌクレオチド置換（ＩＶＳ２＋５Ｇ＞Ａ）の結果であり、イントロン２のヌクレオチド配列は配列番号１１で表される。一実施形態では、スプライス部位変異を含むＰＲＲＴ２のヌクレオチド配列は、配列番号６に記述される。
【００３１】
本発明の第一及び第二の態様の幾つかの実施形態では、ＰＲＲＴ２の変化はミスセンス変異である。一実施形態では、ミスセンス変異はＰＲＲＴ２のエキソン３中に起こる。
【００３２】
幾つかの実施形態では、変異は、ＰＲＲＴ２遺伝子のコーディング配列の位置９５０でのグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）へのヌクレオチド置換（ｃ．９５０Ｇ＞Ａ）の結果であり、前記ＰＲＲＴ２遺伝子のコーディング配列は配列番号９に記述され、GenBank Accession No. ＮＭ＿１４５２３９．２で表される。一実施形態では、ミスセンス変異を含むＰＲＲＴ２のコーディング配列は、配列番号７に記述される。一実施形態では、ミスセンス変異は、アミノ酸位置３１７でのセリン（Ｓ）からアスパラギン（Ｎ）へのアミノ酸置換（ｐ．Ｓ３１７Ｎ）を含むＰＲＲＴ２ポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドは、配列番号８に記述されるアミノ酸配列を含む。
【００３３】
第三の態様では、本発明は、ＰＲＲＴ２遺伝子中に変化を含む単離核酸分子であって、前記変化が発作及び／又は運動障害の表現型をもたらす単離核酸分子を提供する。
【００３４】
一実施形態では、変化はＰＲＲＴ２中のフレームシフト変異である。一実施形態では、フレームシフト変異はＰＲＲＴ２のエキソン２中にある。幾つかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１に記述される配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号２に記述されるアミノ酸配列を含むＰＲＲＴ２ポリペプチドをコードする。幾つかの実施形態では、核酸分子は配列番号３に記述される配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号４に記述されるアミノ酸配列を含むＰＲＲＴ２ポリペプチドをコードする。
【００３５】
本発明の第三の態様の一実施形態では、変化はＰＲＲＴ２中のスプライス部位変異である。一実施形態では、スプライス部位変異は、ＰＲＲＴ２のイントロン２中に起こる。幾つかの実施形態では、核酸分子は、配列番号５又は配列番号６に記述される配列を含む。
【００３６】
本発明の第三の態様の一実施形態では、変化はＰＲＲＴ２中のミスセンス変異である。一実施形態では、ミスセンス変異はＰＲＲＴ２のエキソン３中に起こる。一実施形態では、核酸分子は、配列番号７に記述される配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号８に記述されるアミノ酸配列を含むＰＲＲＴ２ポリペプチドをコードする。
【００３７】
本発明の第三の態様の幾つかの実施形態では、発作障害はてんかんである。一実施形態では、てんかんは良性家族性乳児てんかん（ＢＦＩＥ）である。幾つかの実施形態では、発作障害は乳児痙攣及び舞踏病アテトーゼ（ＩＣＣＡ）症候群である。幾つかの実施形態では、運動障害は発作性運動誘発性舞踏病アテトーゼ（ＰＫＣ）である。
【００３８】
第四の態様では、本発明は、ＰＲＲＴ２遺伝子フラグメントを含む単離核酸分子であって、前記核酸分子がＰＲＲＴ２中に変異を含み、前記変異がｃ．６２９−６３０ｉｎｓＣ、ｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣ、ＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ｔ、ＩＶＳ２＋５Ｇ＞Ａ及びｃ．９５０Ｇ＞Ａからなる群から選択される、単離核酸分子を提供する。
【００３９】
一実施形態では、核酸分子は、配列番号１の少なくとも約２０個連続するヌクレオチドと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含み、且つｃ．６２９−６３０ｉｎｓＣ変異を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号３の少なくとも約２０個連続するヌクレオチドと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含み、且つｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣ変異を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号５の少なくとも約２０個連続するヌクレオチドと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含み、且つＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ｔ変異を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号６の少なくとも約２０個連続するヌクレオチドと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含み、且つＩＶＳ２＋５Ｇ＞Ａ変異を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号７の少なくとも約２０個連続するヌクレオチドと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含み、且つｃ．９５０Ｇ＞Ａ変異を含む。
【００４０】
第五の態様では、本発明は、単離ポリペプチドが、変化を含むＰＲＲＴ２ポリペプチドであり、前記変化が発作及び／又は運動障害の表現型をもたらす、前記ポリペプチドを提供する。一実施形態では、変化はトランケーション変異である。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２又は配列番号４に記述されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、変化はアミノ酸置換変異である。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号８に記述されるアミノ酸配列を含む。
【００４１】
本発明の第五の態様の幾つかの実施形態では、発作障害はてんかんである。一実施形態では、てんかんは良性家族性乳児てんかん（ＢＦＩＥ）である。幾つかの実施形態では、発作障害は乳児痙攣及び舞踏病アテトーゼ（ＩＣＣＡ）症候群である。幾つかの実施形態では、運動障害は発作性運動誘発性舞踏病アテトーゼ（ＰＫＣ）である。
【００４２】
第六の態様では、本発明は、ＰＲＲＴ２ポリペプチドのフラグメントを含む単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＰＲＲＴ２中に変異を含み、前記変異が、ＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ｔ変異（ｐ．Ｐ２１０ｆｓＸ２２４）によってコードされるトランケートされたＰＲＲＴ２ポリペプチド、ＩＶＳ２＋５Ｇ＞Ａ変異（ｐ．Ｒ２１７ｆｓＸ２２４）によってコードされるトランケートされたＰＲＲＴ２ポリペプチド及びＳ３１７Ｎからなる群から選択される、単離ポリペプチドを提供する。
【００４３】
一実施形態では、単離ポリペプチドは、配列番号８の少なくとも約２０個連続するアミノ酸と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、且つＳ３１７Ｎ変異を含む。一実施形態では、単離ポリペプチドは、配列番号２又は配列番号４と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する、トランケートされたＰＲＲＴ２ポリペプチドを含む。
【００４４】
第七の態様では、本発明は、本発明の第三又は第四の態様による核酸分子を含む遺伝子改変非ヒト動物を提供する。一実施形態では、非ヒト動物は、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ及び非ヒト霊長類からなる群から選択される。
【００４５】
第八の態様では、本発明は、本発明の第五又は第六の態様によるポリペプチドに特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを提供する。
【００４６】
第九の態様では、本発明は、本発明の第五又は第六の態様によるポリペプチドを検出する抗体又はそのフラグメントであって、前記ポリペプチドがトランケーション変異を含み、前記抗体又はそのフラグメントが、前記ポリペプチドのトランケートされた領域に結合する、抗体又はそのフラグメントを提供する。
【００４７】
第十の態様では、本発明は、対象の発作及び／若しくは運動障害を診断若しくは予測するための、又は発作及び／若しくは運動障害になりやすい子孫をもつ可能性が増大している対象を特定するためのキットであって、前記対象のＰＲＲＴ２遺伝子中の変化の存在について検査するための１又は２以上の構成要素を含むキットを提供する。一実施形態では、１又は２以上の構成要素は、以下からなる群から選択される：（ｉ）本発明の第五又は第六の態様によるポリペプチドに特異的に結合する抗体又はそのフラグメント、（ii）本発明の第五又は第六の態様によるポリペプチドを検出する抗体又はそのフラグメントであって、前記ポリペプチドがトランケート変異を含み、前記抗体又はそのフラグメントが前記ポリペプチドのトランケートされた領域に結合する、抗体又はそのフラグメント、及び（iii）本発明の第三又は第四の態様による核酸分子に特異的にハイブリダイズする核酸分子。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
本発明の態様及び利点をさらに理解するために、添付の図面と併せて以下の詳細な説明に言及する。
【図１】実施例１で調べたＢＦＩＥ又はＩＣＣＡを罹患する１９家族の系図を示す図である。これは、各家族内でのＰＲＲＴ２変異の分離を示す。ＰＲＲＴ２中に変異を有する個体をｍ／＋で示し、変異について検査され且つ陰性であることが分かっている個体を＋／＋で示す。血縁者におけるその存在に基づいて変異の存在が推測された個体を（ｍ／＋）で示す。
【図２】Ａ：実施例１の１９のＢＦＩＥ及びＩＣＣＡ家族で特定された５つの変異を示す配列トレースを示す図である。Ｂ：ＰＲＲＴ２のコーディングエキソン（エキソン２〜４）の遺伝子構造を示す図である。これは、ＢＦＩＥ及びＩＣＣＡ家族における５つの変異の位置を示す。Ｃ：ＰＲＲＴ２タンパク質の構造を示す図である。これも５つの変異の位置を示す。膜貫通（ＴＭ, transmembrane）ドメインを紫で示す。Ｂ及びＣでは、フレームシフト変異をライトブルーで、スプライス部位変異をダークブルーで、及びミスセンス変異をピンクで印をつける。ＢとＣの間の線は、タンパク質のどの領域がＰＲＲＴ２のコーディングエキソンでコードされているかを示す。
【図３】ＰＲＲＴ２遺伝子を含むゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を示す図である。エキソンに対応するヌクレオチド塩基を大文字で示し、イントロン、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲに対応するヌクレオチド塩基を小文字で示す。開始及び終止コドンに下線を引く。
【図４】Ａ〜Ｋ：実施例２で調べたＢＦＩＥ、ＩＣＣＡ又は散発性乳児発作を罹患するさらなる１１家族の系図を示す図である。これは、各家族内でのＰＲＲＴ２変異の分離を示す。ＰＲＲＴ２中に変異を有する個体を＋／ｍで示し、変異について検査され、陰性であることが分かっている個体を＋／＋で示す。
【００４９】
ヌクレオチド及びポリペプチド配列は、配列番号（配列番号, sequence identifier number）によって本明細書で言及する。配列識別子の概要を表１に提供する。配列表は、明細書の終わりにも提供する。
【００５０】
【表１】
2014533939.tif 000002
【発明を実施するための形態】
【００５１】
前述のように、本発明者らは発作障害及び運動障害で変異した遺伝子を同定した。特に、良性家族性乳児てんかん（ＢＦＩＥ）をほぼ確実に罹患する若しくは罹患する可能性のある、又は乳児痙攣及び舞踏病アテトーゼ（ＩＣＣＡ）を罹患する家族からの罹患者の分析を通して、本発明者らは、コードされるＰＲＲＴ２ポリペプチドに変化をもたらす又は変化をもたらす可能性がある、ＰＲＲＴ２遺伝子中の変異を特定した。
【００５２】
ＰＲＲＴ２遺伝子に関する情報は、国立バイオテクノロジー情報センター（www.ncbi.nlm.nih.gov）のGenBankデータベースで見出すことができる。例えばヒトＰＲＲＴ２の遺伝子ＩＤ番号は１１２４７６であり、このGenBank記録の内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。ＰＲＲＴ２は、機能未知の３４０アミノ酸プロリンリッチ膜貫通タンパク質をコードする。ヒト組織のメッセンジャーＲＮＡ発現データ（ensembl）によって、主として脳でのＰＲＲＴ２の発現が示され、大脳皮質及び小脳で高発現しており（GeneNote）、この発現は、ＢＦＩＥ、及びＩＣＣＡの症状発現である発作性運動誘発性舞踏病アテトーゼ（ＰＫＣ）の臨床的発現と関連している可能性が高い。その生物学的役割への手がかりは酵母ツーハイブリッド試験によるものであり、これは、ＰＲＲＴ２がシナプトソーム関連タンパク質２５Ｄａ（ＳＮＡＰ２５）と相互作用することを示すものである。ＳＮＡＰ２５は、シナプス小胞からの神経伝達物質放出に関与するシナプス前原形質膜結合タンパク質である。理論に拘束されることを望むものではないが、その結合パートナーであるＰＲＲＴ２は、このプロセスを調節する可能性がある。
【００５３】
本発明者らは、ＢＦＩＥを罹患する家族及びＩＣＣＡを罹患する家族で５つの異なるＰＲＲＴ２変異を特定した。さらに本発明者らは、散発性乳児発作を罹患する個体においてＰＲＲＴ２中のデノボ変異を特定した。まとめると、変異は以下を含む：
−  ２つのフレームシフト変異、すなわち（配列番号１及び２によって代表される）ｃ．６２９−６３０ｉｎｓＣ、ｐ．Ｐ２１０ｆｓＸ２２４及び（配列番号３及び４によって代表される）ｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣ、ｐ．Ｒ２１７ｆｓＸ２２４、
−  タンパク質トランケーションを引き起こすことがそれぞれ予想される（図２を参照されたい）、２つのスプライス部位変異、すなわち（配列番号５によって代表される）ＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ｔ及び（配列番号６によって代表される）ＩＶＳ２＋５Ｇ＞Ａ、並びに
−  ミスセンス変異、すなわち（配列番号７及び８によって代表される）ｃ．９５０Ｇ＞Ａ、Ｓ３１７Ｎであって、ヒトからゼブラフィッシュまで進化的に保存されている膜貫通ドメイン中のアミノ酸残基を変化させ、このタンパク質は脊椎動物のみに見出される、ミスセンス変異。各変異の種類の決定では、野生型のＰＲＲＴ２ヌクレオチド及びアミノ酸配列に対して配列比較を行った。野生型のＰＲＲＴ２ヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれGenBank Accession No. ＮＭ＿１４５２３９及びＮＰ＿６６０２８２に包含され、配列番号９、１０及び１１に記述される（説明のために表１を参照されたい）。
【００５４】
したがって本発明は、上記で特定したものを含めたＰＲＲＴ２中の変化／変異の存在の検査に基づく、（ＢＦＩＥ並びに他の新生児及び乳児てんかんを含めた）てんかん及びＩＣＣＡなどの発作障害及び運動障害を診断又は予測する方法を可能にする。
【００５５】
したがって第一の態様では、本発明は、対象の、発作及び／又は運動障害を診断又は予測する方法であって、前記対象の、ＰＲＲＴ２遺伝子中の変化の存在について検査することを含む方法を提供する。
【００５６】
本明細書で使用する場合、単語「診断」は、疾患、障害若しくは状態を識別すること若しくは特定すること、又は特定の疾患、障害若しくは状態を罹患する対象を識別すること若しくは特定することを指す。本明細書で使用する用語「予測」は、変化が、特定の疾患、障害又は状態の発生に関して有するほぼ確実な転帰の予想を指す。今回は、疾患、障害又は状態は発作及び／又は運動障害である。
【００５７】
本発明をヒト「対象」と関連して記載してきたが、本発明はそのようには限定されない。したがって本明細書で使用する場合、用語「対象」は、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、シカ、ブタ、げっ歯類並びに発作障害及び／又は運動障害を示すことが知られているいかなる他の動物も含めた、いかなる動物も（例えば哺乳動物）指すと解釈されるべきである。したがって、ヒトＰＲＲＴ２ヌクレオチド及びアミノ酸配列について本明細書で言及してきたが、本発明の方法はヒトに限定されないことを理解されたい。様々な種の関連するＰＲＲＴ２の核酸及びアミノ酸配列の詳細は、GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）及びUniProt（www.uniprot.org）データベースから容易にアクセスすることができる。例えば、マウスＰＲＲＴ２の遺伝子ＩＤ番号は６９０１７であり、マウスＰＲＲＴ２のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれGenBank Accession No. ＮＭ＿００１１０２５６３．１及びＮＰ＿００１０９６０３３に包含される。
【００５８】
本明細書で使用する場合、用語「発作障害」は、結果が中枢神経系中のニューロン集団の異常な興奮によって引き起こされる突発性の行動の変化である障害を意味すると解釈される。これは、様々な程度の不随意性筋収縮をもたらし、意識消失をもたらすことが多い。発作障害の例としては、これらに限定されないが、（乳児てんかん、例えば良性家族性乳児てんかん−ＢＦＩＥを含めた）てんかんが挙げられる。全てのてんかん性症候群に共通しているただ１つの特色は、不定期且つ予測不可能に発作として発現するニューロンの興奮性が持続的に増大することである。本明細書で使用する用語「運動障害」は、運動制御及び筋緊張に影響を及ぼす神経学的な状態を指すと解釈される。運動障害の例としては、これらに限定されないが、（本明細書で発作性運動誘発性ジスキネジア（ＰＫＤ）とも呼ぶ発作性運動誘発性舞踏病アテトーゼ（ＰＫＣ）を含めた）ジスキネジア、パーキンソン症候群、ジストニア、ミオクローヌス、舞踏病、チック及び振戦が挙げられる。障害の中には、発作障害及び運動障害の両方を構成すると見なすことができるものもある。例としては、乳児痙攣及び舞踏病アテトーゼ（ＩＣＣＡ）症候群が挙げられる。
【００５９】
本明細書で使用する場合、ＰＲＲＴ２中の「変化」又は「変異」という用語は、同義であると解釈される。すなわち、ＰＲＲＴ２中の「変化」又は「変異」は、野生型ＰＲＲＴ２のヌクレオチド若しくはアミノ酸配列、又は発作若しくは運動障害を罹患していない個体のＰＲＲＴ２のヌクレオチド若しくはアミノ酸配列と比較した場合の、ＰＲＲＴ２のヌクレオチド又はアミノ酸配列中の変化に対する言及である。前述のように、野生型ヒトＰＲＲＴ２のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれGenBank Accession No. ＮＭ＿１４５２３９及びＮＰ＿６６０２８２に包含され、それぞれ配列番号９及び１０に記述される。ＰＲＲＴ２遺伝子を含むゲノムＤＮＡも、配列番号１１に記述され、図３に示される。
【００６０】
ＰＲＲＴ２のヌクレオチド配列中の変化に関しては、変化は、ＰＲＲＴ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド残基だけで起こり得るのではなく、コーディング領域に付随するゲノムヌクレオチド配列でも起こり得る。そうしたゲノムヌクレオチド配列には、調節領域（例えばプロモーター領域）、イントロン、非翻訳領域並びにコーディング領域に付随する他の機能的及び／又は非機能的な配列領域が含まれる。
【００６１】
以下に詳述するように、ＰＲＲＴ２遺伝子中の変化についてスクリーニングした家族のうち、発作障害（この場合ＢＦＩＥ）を罹患するスクリーニングした２４家族のうちの１９家族（７９％）がＰＲＲＴ２中に変異を有しており、運動障害（この場合ＩＣＣＡ）を罹患するスクリーニングした家族の１０／１１（９１％）がＰＲＲＴ２中に変異を有していた。したがって、一実施形態では、ＰＲＲＴ２遺伝子中の変化の存在によって、対象において障害の可能性が高いことを示す診断又は予測が確証される。
【００６２】
発作障害及び運動障害を罹患する家族の分析を通して、本発明者らは、対象における特定のＰＲＲＴ２の変化の存在が前記対象の罹患血縁者にも見出されることを発見した。したがって、本発明の第一の態様の幾つかの実施形態では、前記対象の罹患した親又は血縁者にも存在する、前記対象におけるＰＲＲＴ２遺伝子中の変化によって、前記対象において障害の可能性が非常に高いことを示す診断又は予測が確証される。
【００６３】
さらに、発作及び／又は運動障害がほぼ確実又は可能性があると以前に臨床的に診断された対象においてＰＲＲＴ２の変化を特定することによって、前記対象が障害を有する可能性が増大する。またさらに、てんかん（特にＢＦＩＥ）に関しては、ＢＦＩＥ又は他の関連する家族性てんかん症候群の診断を示唆するのに使用することができる発症年齢に関する情報は、ＰＲＲＴ２の変化を特定することができないことによって除外される可能性がある。この情報は対象にとって正しい治療計画を開始するために重要であり、この情報によって、前記対象にとって不必要な検査及び付随する外傷が回避される。
【００６４】
ＰＲＲＴ２遺伝子中の変異の遺伝によって、その遺伝的保因状態を確定するために対象をスクリーニングすることが可能になる。疾患、障害又は状態の遺伝的保因者である対象は、遺伝性の遺伝形質又は変異を有する対象であるが、その形質を示さないか疾患、障害若しくは状態の症状を示すいずれかの対象、又は過去に疾患、障害若しくは状態の症状を現したことに気づいていない対象である。しかし前記対象は、遺伝形質又は変異をその子孫に伝えることができ、次にその子孫が、その疾患、障害又は状態を発生する可能性がある。保因状態を確定することは、例えば、子供を持とうと考えている夫婦にとって有用である。
【００６５】
したがって、第二の態様では、本発明は、発作及び／又は運動障害になりやすい子孫をもつ可能性が増大している対象を特定する方法であって、前記対象において、ＰＲＲＴ２遺伝子中の変化の存在について検査することを含む方法を提供する。このことによって、前記対象にＰＲＲＴ２遺伝子中の変化が存在することによって、発作及び／又は運動障害になりやすい子孫をもつ可能性が増大している対象として前記対象が特定されることになる。さらに、前記対象の罹患した親又は血縁者にも存在するＰＲＲＴ２遺伝子中の変化が前記対象にも存在することによって、発作及び／又は運動障害になりやすい子孫をもつ可能性が非常に高い対象として前記対象が特定される。
【００６６】
ＰＲＲＴ２遺伝子中の変化の種類は、全ての形態の遺伝子配列のバリエーションを包含することができ、これらには、コーディング領域、及びプロモーター、イントロン又は非翻訳領域などの非コーディング領域中の欠失、挿入、再構成及び点変異が含まれる。欠失は遺伝子全体のもの、又は遺伝子の一部のみの可能性があるが、点変異及び挿入は終止コドンの導入、フレームシフト又はアミノ酸置換をもたらす可能性がある。ＰＲＲＴ２遺伝子中のフレームシフトは、不安定である場合もあればそうでない場合もあるトランケートされたＰＲＲＴ２ポリペプチドの翻訳を導く可能性があり、又はほとんど若しくは全くＰＲＲＴ２タンパク質の翻訳をもたらさない可能性がある。プロモーター中などのＰＲＲＴ２の調節領域中に起こる点変異は、ＰＲＲＴ２のｍＲＮＡの発現を喪失若しくは低下させる可能性があり、又は適切なｍＲＮＡプロセシングを無効にし、これによりｍＲＮＡの安定性若しくは翻訳効率を低下させる可能性がある。
【００６７】
本発明の前述の態様の幾つかの実施形態では、方法は、ＰＲＲＴ２遺伝子中の変化の存在について検査するための、及び変化の種類を特定するための１又は２以上のアッセイを実施することを含む。
【００６８】
幾つかの実施形態では、方法は、ＰＲＲＴ２遺伝子中の変化の存在について検査するための１又は２以上のアッセイを実施すること、及びその結果がＰＲＲＴ２遺伝子中の変化の存在を示す場合は、ＰＲＲＴ２の変化の種類を特定するための１又は２以上のアッセイを実施することを含む。
【００６９】
幾つかの実施形態では、対象におけるＰＲＲＴ２遺伝子中の変化の存在は、前記対象から採取した生体試料の分析から判定する。用語「試料」には、生体試料、例えば細胞（血液又は頬に存在するものを含める）、組織（組織生検材料、外科標本又は剖検材料を含める）、エキソソーム及び体液が含まれることが意図される。「体液」には、これらに限定されないが、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、胸膜液、涙、ラクタール（lactal）管液、リンパ液、痰、尿、羊水及び精液が含まれ得る。試料には、「無細胞」体液が含まれ得る。「無細胞体液」は、約１％（ｗ／ｗ）未満の全細胞物質を含む。血漿又は血清は、無細胞体液の一例である。加えて、胎児細胞、胎盤細胞又は羊水を検査することによって、出生前検査を達成することができる。
【００７０】
幾つかの実施形態では、核酸又はタンパク質を試料から最初に単離してから、ＰＲＲＴ２遺伝子中の変化の存在について検査する。核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はタンパク質は、当業者に周知のいかなる方法によっても試料から単離することができ、例えば、Sambrook et al. （Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000）を参照されたい。
【００７１】
当業者なら理解するように、ＰＲＲＴ２の変化の存在について検査するために、及び変化の種類を判定するために使用することができる幾つかのアッセイ系が存在し、本発明は、以下に提供する例によって制限されない。
【００７２】
例えば一実施形態では、用いるアッセイ系は、対象から採取される試料中のＰＲＲＴ２核酸を野生型ＰＲＲＴ２核酸と比較して分析することに依拠し得る。幾つかの実施形態では、ゲノムＤＮＡを分析に使用することができ、ゲノムＤＮＡは上記のような幾つかの供給源から得ることができる。ゲノムＤＮＡは、単離してアッセイに直接使用することができ、又は分析前にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ, polymerase chain reaction）によって増幅することができる。同様に、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを、ＰＣＲ増幅の有無にかかわらず使用することもできる。
【００７３】
一実施形態では、核酸ハイブリダイゼーションアッセイを用いることができる。そうしたアッセイの１つでは、１又は２以上の制限酵素で消化されたＤＮＡの一連のサザンブロットを調べることができる。各ブロットは、正常な個体由来の一連の消化されたＤＮＡ試料及び１又は２以上の被検対象由来の一連の消化されたＤＮＡ試料を含有することができる。ＰＲＲＴ２遺伝子近傍又はＰＲＲＴ２遺伝子を含む配列でプローブした時に、正常なＤＮＡとは長さが異なるハイブリダイゼーションフラグメントを示す試料は、ＰＲＲＴ２変異の可能性を示す。非常に大きな制限フラグメントをもたらす制限酵素を使用する場合は、次いでパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ, pulsed field gel electrophoresis）を用いることができる。
【００７４】
ＰＲＲＴ２遺伝子のエキソンに対して特異的なハイブリダイゼーションアッセイも用いることができる。プローブベースのこのタイプのアッセイは、野生型形態のＰＲＲＴ２遺伝子のエキソンへ特異的且つ選択的にハイブリダイズする少なくとも１種のプローブを利用する。したがって、核酸プローブを含有する二本鎖核酸ハイブリッドの形成がないことは、遺伝子中に変異が存在することを指し示している。プローブベースの検査は特異性が高いために、いかなる陰性の結果も変異の存在を高く指し示しているが、さらに以下に記述するように、さらなる調査的アッセイを用いて変異の種類を特定するべきである。
【００７５】
前述のアッセイに使用するＰＲＲＴ２エキソン特異的プローブは、（１）各エキソンに隣接するイントロン特異的プライマーを使用する、ＰＲＲＴ２遺伝子の各エキソンのＰＣＲ増幅物、（２）各エキソンに対して特異的なｃＤＮＡプローブ、又は（３）調査中のエキソンに集団的に相当する一連のオリゴヌクレオチドに由来し得る。ＰＲＲＴ２遺伝子のゲノム構造を図２（コーディングエキソンに関しては、エキソン２〜４）に示し、ＰＲＲＴ２の各エキソン及びイントロンのヌクレオチド配列を図３及び配列番号１１に示す。
【００７６】
さらなる実施形態では、ヘテロ二本鎖形成を分析するためのアッセイを用いることができる。変性させた野生型ＰＲＲＴ２  ＤＮＡを対象由来のＤＮＡ試料と混合することによって、２つの試料の間のＰＲＲＴ２配列のいかなる変化も、ヘテロ二本鎖とホモ二本鎖の混合集団をＤＮＡの再アニーリング中に形成させる。この混合集団の分析は、部分的変性温度下で実施する、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ, high performance liquid chromatography）のような技法の使用によって達成することができる。この方式では、ヘテロ二本鎖は、その低下した融解温度のために、ホモ二本鎖より早くＨＰＬＣカラムから溶出する。
【００７７】
さらなる実施形態では、患者の核酸試料は、電気泳動ベースのアッセイにかけることができる。例えば、ＰＲＲＴ２フラグメントの長さの違いを測定する電気泳動アッセイを用いることができる。被検対象由来のゲノムＤＮＡフラグメントを、ＰＲＲＴ２遺伝子のイントロン特異的プライマーで増幅する。したがって、遺伝子の増幅領域は、所望のエキソン、エキソン／イントロン境界のスプライス部位接合部、及び増幅産物の両端にある短いイントロン部分を含む。増幅産物は電気泳動のサイズ分離ゲルで泳動することができ、野生型遺伝子由来の既知の及び期待される標準長と増幅フラグメントの長さを比較して、挿入又は欠失変異が患者の試料に見出されるかどうかを判定する。この手順は、有利には「多重化」型式で使用することができ、この場合、複数のエキソンに対するプライマーを同時に増幅し、単一の電気泳動ゲルで同時に評価する。これは、各エキソンに対するプライマーを慎重に選択することによって可能になる。各エキソンにわたる増幅フラグメントは、異なるサイズになるように設計されるので、電気泳動／サイズ分離ゲルで識別可能である。本技法の使用は、ヘテロ接合個体において正常アレル及びミュータントアレルの両方を検出するという利点を有する。
【００７８】
さらなる電気泳動アッセイを用いることができる。これらには、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ, single-stranded conformational polymorphism）法（Orita et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2766-70）が含まれ得る。前述のように、遺伝子の個々のエキソンが増幅され、個々に分析できるように、対象のゲノムＤＮＡフラグメントをＰＲＲＴ２遺伝子のイントロン特異的プライマーでＰＣＲ増幅する。次いで、ＤＮＡフラグメントが、その配列組成によって決まるコンフォメーションに基づいてゲルを通って移動するように、エキソン特異的なＰＣＲ産物を非変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかける。野生型配列と配列が異なるエキソン特異的なフラグメントは、異なる二次構造コンフォメーションを有するので、別々にゲルを通って移動する。異常に移動する、患者の試料のＰＣＲ産物は、エキソン中の変化を指し示しており、ＤＮＡシーケンシングなどのアッセイでさらに分析して、変化の種類を特定するべきである。
【００７９】
用いることができるさらなる電気泳動アッセイには、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（Finkelstein et al., 1990, Genomics 7: 167-172; Kinszler et al., 1991, Science 251: 1366-1370）及び変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ, denaturing gradient gel electrophoresis）（Wartell et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 2699-2705; Sheffield et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 232-236）が含まれる。ＲＮａｓｅプロテクションは、ミュータントポリヌクレオチドを２つ以上のより小さいフラグメントに切断することを含み、一方ＤＧＧＥは、変性グラジエントゲルを使用して、野生型配列と比較した際のミュータント配列の移動速度の違いを検出する。
【００８０】
ＲＮａｓｅプロテクションアッセイでは、野生型ＰＲＲＴ２遺伝子のコーディング配列と相補的な標識リボプローブを患者から単離されたｍＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかとハイブリダイズさせ、続いて、二本鎖ＲＮＡ構造中のある種のミスマッチを検出することができるＲＮａｓｅＡ酵素で消化する。ミスマッチがＲＮａｓｅＡによって検出される場合、ＲＮａｓｅＡはそのミスマッチ部位で切断する。したがって、ＲＮａｓｅＡによってミスマッチが検出され切断される場合、アニーリングしたＲＮＡ調製物が電気泳動ゲルマトリックスで分離される時に、リボプローブ及びｍＲＮＡ又はＤＮＡについて、完全長二本鎖ＲＮＡよりも小さいＲＮＡ産物が認められることになる。リボプローブは調査中のｍＲＮＡ又は遺伝子の完全長である必要はなく、いずれかのセグメントでもよい。リボプローブがｍＲＮＡ又は遺伝子のセグメントのみを含む場合は、幾つかのこうしたプローブを使用して、ｍＲＮＡ配列全体をミスマッチについてスクリーニングすることが望ましい。
【００８１】
さらなる実施形態では、酵素ベースのアッセイを本発明の方法で使用することができる。そうしたアッセイには、Ｓ１ヌクレアーゼ、ＲＮＡ分解酵素、Ｔ４エンドヌクレアーゼVII、ＭｕｔＳ（Modrich, 1991, Ann. Rev. Genet. 25: 229-253）、Cleavase及びＭｕｔＹの使用が含まれる。ＭｕｔＳアッセイでは、このタンパク質は、ミュータント配列と野生型配列の間のヘテロ二本鎖中にヌクレオチドミスマッチを含有する配列のみに結合する。
【００８２】
発作又は運動障害がＰＲＲＴ２遺伝子の異常な発現と関連する場合は、代替のアッセイが必要になる。第一に、ＰＲＲＴ２発現についての正常な又は標準のプロファイルを確立する。これは、ハイブリダイゼーション又は増幅に適した条件下で、正常な対象から採取した体液又は細胞抽出物を、ＰＲＲＴ２遺伝子をコードする配列又はそのフラグメントと混ぜ合わせることによって達成することができる。標準ハイブリダイゼーションは、正常な対象から得た値を、実質的に精製された既知の量のポリヌクレオチドが使用される実験由来の値と比較することによって定量化することができる。発現に対する正常な又は標準のプロファイルを特定するための別の方法は、定量ＲＴ−ＰＣＲ試験による。正常な対象の体細胞から単離したＲＮＡを逆転写し、ＰＲＲＴ２に対して特異的なオリゴヌクレオチドを使用するリアルタイムＰＣＲを行い、遺伝子の正常な発現レベルを定める。これら両方の例から得られる標準値を、障害の徴候を示す患者由来の試料から得た値と比較することができる。標準値からの偏差を使用して、障害の存在を確証する。
【００８３】
遺伝子の発現レベルを測定する方法は、一般に、当技術分野で既知である。技法には、これらに限定されないが、ノーザンブロット法、ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ, reverse-transcriptase PCR）、リアルタイム（定量）ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ又はＳＡＧＥ（遺伝子発現の逐次分析、serial analysis of gene expression）などの「タグベースの」技術が含まれ得る。マイクロアレイ及びＳＡＧＥを使用して、１つより多くの遺伝子の発現を同時に定量化することができる。プライマー又はプローブは、ＰＲＲＴ２遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。Paik et al., 2004（NEJM 351(27): 2817-2826）又はAnderson et al., 2010（J. Mol. Diagnostics 12(5): 566-575）に開示されているものに類似している方法論を使用して、ＰＲＲＴ２遺伝子の発現を測定することができる。多くの方法が、Sambrook et al.（Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000）などの標準的な分子生物学の教科書にも開示されている。
【００８４】
ＲＴ−ＰＣＲに関しては、第一ステップは典型的には、調査中の対象から得た試料から全ＲＮＡを単離することである。続いて、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ, messenger RNA）を全ＲＮＡ試料から精製することができる。次いで適切な逆転写酵素を使用して、全ＲＮＡ試料（又は精製されたｍＲＮＡ）をｃＤＮＡに逆転写する。逆転写ステップは典型的には、ＲＮＡ鋳型に応じて、オリゴｄＴプライマー、ランダムヘキサマー又はＰＲＲＴ２遺伝子に対して特異的なプライマーを使用してプライムする。次いで、逆転写反応に由来するｃＤＮＡを、典型的なＰＣＲ反応の鋳型として供する。その際、ＰＲＲＴ２遺伝子に対して特異的な２つのオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲ産物を生成する。他の２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するように設計された第三のオリゴヌクレオチド又はプローブもＰＣＲ反応に使用する。プローブは、ＰＣＲ反応で使用するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素よって伸長することができず、且つレポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素で標識される。２つの色素がプローブ上にあるので、それらが近くに位置する時に、レポーター色素からのいかなるレーザー誘起放射もクエンチング色素によってクエンチされる。ＰＣＲ増幅反応中に、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、鋳型依存的様式でプローブを切断する。得られたプローブフラグメントは溶液中で解離し、遊離レポーター色素からのシグナルは、第二のフルオロフォアのクエンチング作用から免れている。レポーター色素の一方の分子は、合成される新しい各分子から遊離しており、クエンチされていないレポーター色素の検出によって、データの定量的な解釈に対する根拠がもたらされる。
【００８５】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲでは、ＰＣＲ反応で形成される産物の量及び産物が形成されるタイミングは、出発鋳型の量に相関する。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、標準又は「正常な」試料と比較してｍＲＮＡレベルが高い試料においてより急速に蓄積する。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＰＣＲ合成産物中にSybr Greenなどの色素をインターカレートしているＤＮＡの蛍光を測定するか、又は二重標識された蛍光発生プローブ（すなわちTaqManプローブ）を通してＰＣＲ産物の蓄積を測定することができる。ＲＴ−ＰＣＲ反応の進行は、産物の蓄積をリアルタイムに測定するＰＣＲ装置、例えばApplied Biosystems社のPrism 7000又はRoche社のLightCyclerなどを使用してモニターすることができる。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、定量的競合ＰＣＲ及び定量的比較ＰＣＲの両方に対応する。前者は、各標的配列に対する内部コンペティターを標準化のために使用し、一方後者は、試料内に含有される標準化遺伝子又はＲＴ−ＰＣＲ用のハウスキーピング遺伝子を使用する。
【００８６】
ＰＲＲＴ２遺伝子の発現レベルを測定するためのマイクロアレイの製品及びアプリケーションを使用することができ、これらは当技術分野で周知である。一般にマイクロアレイでは、ＰＲＲＴ２遺伝子の一部又は全てに相当するヌクレオチド配列（例えば、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）が、基盤上の既知の位置を占有する。次いで、所望の対象から得た核酸標的試料（例えば全ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）をマイクロアレイにハイブリダイズし、アレイ上の各プローブにハイブリダイズした標的核酸の量を定量化し、標準又は「正常な」試料に対して起こるハイブリダイゼーションと比較する。１つの例示的な定量化方法は、共焦点顕微鏡及び蛍光標識を使用することである。Affymetrix GeneChip（商標）アレイシステム（Affymetrix社、Santa Clara、Calif.）及びAtlas（商標）ヒトｃＤＮＡ発現アレイシステムは、ハイブリダイゼーションを定量化するのに特に適する。しかし、いかなる類似のシステム又は他の事実上同等の検出方法も使用できることは、当業者には明らかであろう。蛍光標識されたｃＤＮＡプローブは、核酸標的試料にも相当し得る。そうしたプローブは、被検対象の試料から抽出した全ＲＮＡ又はｍＲＮＡの逆転写中に、蛍光性ヌクレオチドの取り込みを通して生成することができる。マイクロアレイに適用する標識ｃＤＮＡプローブは、アレイ上の対応するＤＮＡスポットと特異性をもってハイブリダイズする。配列された各エレメントのハイブリダイゼーションを定量化することによって、標準又は「正常な」試料で観察された存在量と比較して、対応するｍＲＮＡの試料中の存在量を評価することが可能になる。二色蛍光を使用して、２つのＲＮＡ供給源から生成された別々に標識されたｃＤＮＡプローブをペアでアレイにハイブリダイズする。したがって、２つの供給源由来の、ＰＲＲＴ２遺伝子に対応する転写産物の相対的存在量を同時に測定する。そうした方法は、発現レベルの少なくともほぼ２倍の差を検出するのに必要な感度を有することが示されている。
【００８７】
ＰＲＲＴ２遺伝子中の変化を特定するのに使用することができる別のアッセイは、多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ, Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification）アッセイである。ＭＬＰＡは、単一のプライマーペアのみで多数の標的の増幅を可能にする多重ポリメラーゼ連鎖反応の変形である。このアッセイに使用する各プローブは、ＰＲＲＴ２  ＤＮＡ上の隣接する標的部位を認識する２つのオリゴヌクレオチドからなる。プローブオリゴヌクレオチドが標的配列に正確にハイブリダイズする時に、これらは熱安定性のリガーゼによってライゲーションさせられ、完全なプローブを形成する。プローブを２つの領域に分割する利点は、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドだけがＰＣＲ反応中に増幅され、未結合プローブオリゴヌクレオチドは増幅されないことである。それぞれの完全なプローブは長さが特有であり、その結果、その生成アンプリコンは分離することができ、キャピラリー電気泳動によって特定することができる。これによって、多重ＰＣＲの分解能の限界が回避される。プローブオリゴヌクレオチドのうちの一方が蛍光色素で標識されるならば、各アンプリコンは、キャピラリーシーケンサーによって検出することができる蛍光ピークを発生する。所与の試料について得られたピークパターンが参照試料（例えば野生型ＰＲＲＴ２遺伝子由来の試料）に関して得られたピークパターンと違うことは、完全なプローブ中の変化の存在（すなわちＰＲＲＴ２遺伝子中の変化）を示す。
【００８８】
ＰＲＲＴ２遺伝子中の変化の存在を特定するための、及び／又は変異の種類を特定するための最も決定的なアッセイは、ＤＮＡシーケンシングである。野生型ＰＲＲＴ２のヌクレオチド配列と被検対象由来のＰＲＲＴ２ヌクレオチド配列との比較は、高い特異性及び高い感度の両方を提供する。用いる一般的方法論は、上記のように、ＰＲＲＴ２遺伝子のＤＮＡフラグメントを（例えばＰＣＲを使用して）対象のＤＮＡから増幅することと、増幅したＤＮＡを、増幅プライマーと同一でもよいし異なってもよいシーケンシングプライマーと混ぜ合わせることと、正常なヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴ）及び一旦組み込まれるとプライマーのさらなる伸長を妨げる読み終りヌクレオチド、例えばジデオキシヌクレオチドなどの存在下でシーケンシングプライマーを伸長させることと、得られた伸長フラグメントの長さについて産物を分析することとを含む。Sanger et al., 1977（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467）によって開示された最初のジデオキシシーケンシング法に基づくそうした方法は、本発明で有用ではあるが、最終的なアッセイは、そうした方法に限定されない。例えば、ＰＲＲＴ２遺伝子の配列を決定するための他の方法も用いることができる。代替方法には、Maxam and Gilbert, 1977（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560-564）によって述べられている方法、及びジデオキシ法の変形、並びに参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４，９７１，９０３号明細書に開示される方法などの読み終りヌクレオチドに全く依拠しない方法が含まれる。他の代替方法には、ピロシーケンシング（Pyrosequencing社、 Westborough、Mass.）が含まれ、そのプロトコルはAlderborn et al., 2000（Genome Res. 10: 1249-1265）に見出すことができる。ジデオキシチェーンターミネーション法によるシーケンシングは、Thermo Sequenase（Amersham Pharmacia社、Piscataway、NJ）、US Biochemicals社のSequenase試薬、又はSequathermシーケンシングキット（Epicenter Technologies社、Madison、Wis.）を使用して実施することができる。シーケンシングは、PE Applied Biosystems社（製品番号403044、Weiterstadt、ドイツ）の「RR dRhodamineターミネーターサイクルシーケンシングキット」、Taq DyeDeoxy（商標）ターミネーターサイクルシーケンシングキット及び方法（Perkin-Elmer社／Applied Biosystems社）によって、Applied Biosystems社のModel 373 A DNAを使用して、又はダイターミネーターCEQ（商標）ダイターミネーターサイクルシーケンシングキット（Beckman社608000）の存在下で、二方向で行うこともできる。野生型配列のものと比較した時の被検対象のエキソンにおける（良性の多型以外の）いかなる配列の違いも、潜在的な病因性変異を示す。
【００８９】
一実施形態では、用いるアッセイ系は、野生型ＰＲＲＴ２ポリペプチドと比較する、対象のタンパク質試料から得たＰＲＲＴ２ポリペプチドの分析でもよい。例えば、野生型ＰＲＲＴ２と比較した場合の、ミュータントＰＲＲＴ２ポリペプチドの電気泳動移動度のいかなる違いも、変異したＰＲＲＴ２ポリペプチドを同定する根拠として活用することができる。そうした手法は、電荷置換が存在するミュータント、又は挿入、欠失、トランケーション若しくは置換によって生じたタンパク質の電気泳動的移動が有意に変化したミュータントを同定する際に特に有用である。抗体（又はそのフラグメント）も、特に抗体（又はそのフラグメント）がミュータントＰＲＲＴ２ポリペプチドに特異的にハイブリダイズすることができ、野生型ＰＲＲＴ２ポリペプチドにはハイブリダイズしないならば、ミュータントＰＲＲＴ２ポリペプチドを同定する際に有用であり得る。或いは、トランケートされたＰＲＲＴ２ポリペプチドの存在を検出する抗体（又はそのフラグメント）は、トランケートされた領域に結合し、その結果、事実上野生型ＰＲＲＴ２ポリペプチドのみを認識し、野生型ＰＲＲＴ２ポリペプチドのみに結合する抗体であり得る。他の実施形態では、正常ＰＲＲＴ２ポリペプチドとミュータントＰＲＲＴ２ポリペプチドのタンパク質分解的切断パターンの違いを測定することができ、又は種々のアミノ酸残基のモル比の違いを測定することができる。アミノ酸配列の決定も、対象試料から得たＰＲＲＴ２ポリペプチドと野生型ＰＲＲＴ２ポリペプチドを比較するのに使用することができる。
【００９０】
前述のように本発明者らは、発作障害及び運動障害（ＢＦＩＥ及びＩＣＣＡ）の原因となる特異的な５つの変異をＰＲＲＴ２遺伝子中に特定した。これらは、エキソン２での２つのフレームシフト変異（ｃ．６２９−６３０ｉｎｓＣ及びｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣ）、２つのスプライス部位変異（ＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ｔ及びＩＶＳ２＋５Ｇ＞Ａ）、及び１つのミスセンス変異（ｃ．９５０Ｇ＞Ａ）を含む。したがって、本発明の第一及び第二の態様の一実施形態では、これらの特異的な変異は、対象にこれらの変異のみが存在することについて検査するアッセイの根拠になり得る。例えば、ｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣ変異は、異なる家族からの多数の罹患者に存在することが発見されており、こうした個体は血縁であることは疑われない。したがって、ｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣ変異は、より広範な集団において又は被検対象における主要な初回通過変異スクリーニングとして検査された、ＰＲＲＴ２変異の一例であり得る。
【００９１】
上記で言及したアッセイは、対象におけるこれら５つの変異の存在について検査するのに使用することができる。しかし、変異の種類が既知ならば、さらなるアッセイを用いることもできる。既知のＰＲＲＴ２変異に基づくアッセイには、アレル特異的なプライマー及びプローブを利用するアッセイ、例えば、検査されるＰＲＲＴ２変異に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲベースの手法が含まれる。標的配列中の単一ヌクレオチドのバリエーションを検出するそうしたオリゴヌクレオチドは、「アレル特異的なプローブ」又は「アレル特異的なプライマー」のような用語で言及され得る。既知の配列のバリエーションを検出するためのアレル特異的なプローブ（今回はＰＲＲＴ２中）の設計及び使用は、例えば、Mutation Detection A Practical Approach, ed. Cotton et al. Oxford University Press, 1998; Saiki et al., 1986（Nature, 324: 163-166）、欧州特許第２３５７２６号明細書、及び国際公開第８９／１１５４８号パンフレットに記載されている。一例を挙げると、プローブ又はプライマーは、ＰＲＲＴ２標的ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズし、その結果、ＰＲＲＴ２中の変異部位がプローブ又はプライマーの５’最末端又は３’最末端のいずれかと整列するように設計することができる。ある種のアッセイでは、増幅は標識プライマーを含むことができ、それによって、そのプライマーの増幅産物を検出できるようになる。一例を挙げると、増幅は、多様な標識プライマーを含むことができ、典型的には、そうしたプライマーは識別可能に標識され、多数の増幅産物を同時に検出できるようになる。
【００９２】
あるタイプのＰＣＲベースアッセイでは、アレル特異的なプライマーは、変異部位（例えばｃ．６２９−６３０ｉｎｓＣ、ｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣ、ＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ｔ、ＩＶＳ２＋５Ｇ＞Ａ及びｃ．９５０Ｇ＞Ａ）とオーバーラップする、標的ＰＲＲＴ２核酸分子上の領域にハイブリダイズし、完全な相補性を示す対立遺伝子型の増幅のみをプライムする（Gibbs, 1989, Nucleic Acid Res. 17:2427-2448）。典型的には、プライマーの最も３’側のヌクレオチドは標的核酸分子の変異部位と整列し、且つその変異部位と相補的である。このプライマーは、遠位部位でハイブリダイズする第二のプライマーと併せて使用される。増幅はこれら２つのプライマーから進み、対立遺伝子型が被検試料中に存在することを示す検出可能な産物を生成する。コントロールは、第二のプライマーペアを使用して通常実施され、プライマーペアの一方は変異部位で一塩基ミスマッチを示し、他方は遠位部位に完全な相補性を示す。一塩基ミスマッチは、増幅を妨げるか実質的に増幅効率を低下させ、その結果、検出可能な産物が形成されないか、検出可能な産物がより少ない量又はより遅いペースで形成される。この方法は一般に、ミスマッチがオリゴヌクレオチドの最も３’側の位置にある（すなわちオリゴヌクレオチドの最も３’側の位置が標的変異位置と整列する）時に、最も効率的に機能する。なぜならば、この位置は、プライマーからの伸長に対して最も不安定であるからである（例えば、国際公開第９３／２２４５６号パンフレットを参照されたい）。上記で言及したｃ．６２９−６３０ｉｎｓＣ、ｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣ、ＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ｔ、ＩＶＳ２＋５Ｇ＞Ａ及びｃ．９５０Ｇ＞ＡのＰＲＲＴ２変異、又は将来的に特定される任意の他のＰＲＲＴ２変異を検出するためのアレル特異的なプライマー配列は、当業者なら容易に設計できるであろう。
【００９３】
一例を挙げると、プライマーが、プライマーの３’最末端にある３つのヌクレオチド位置のうちの１つにミスマッチヌクレオチドを有し、その結果、ミスマッチヌクレオチドが変異部位で特定のアレルと塩基対を作らないことを除いて、プライマーは、変異を含有する標的核酸分子のセグメントに実質的に相補的な配列を含有する。プライマー中のミスマッチヌクレオチドは、プライマーの最も３’側の位置の最後のヌクレオチドから一番目、二番目又は三番目のヌクレオチドであり得る。幾つかの例では、プライマー及び／又はプローブは検出可能な標識で標識される。
【００９４】
代替の手法では、ＰＲＲＴ２中の既知の変異を検出するのに、タグされたアレル特異的プライマーペアを使用することができる（Strom et al., 2005, Genet. Med. 7:633-63）。一例を挙げると、２つのタグされたアレル特異的なプライマーは標的ＤＮＡ中の変異部位にオーバーラップするが、正確にハイブリダイズしたプライマー（複数可）のみが伸長して、標識産物（複数可）を生成する。非相補的プライマーは、３’側のミスマッチ塩基が原因で伸長しないか標識されない。標識された伸長産物は、検出可能な標識に基づいて検出することができる。タグされた伸長プライマーは、抗タグ配列に連結された、ビーズなどの固体支持体上で捕獲することもできる。固定化された伸長プライマー産物は、Luminex 100 LabMAP（商標）（Luminex Corporation社、Austin TX）などの市販品として入手可能な手段によって検出することができる。
【００９５】
本明細書に収載されるものを含めた以前に特定されたＰＲＲＴ２ポリペプチド変異を検出するアッセイも、当技術分野で既知である。例えば、対象の試料から得たタンパク質集団におけるミュータントＰＲＲＴ２ポリペプチドの検出は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ, SDS polyacrylamide gel electrophoresis）によるタンパク質の分離、それに続く適切な染色剤、例えば、クマシーブルーによるタンパク質染色によってできる。変異を有するＰＲＲＴ２ポリペプチド及び変異を有さないＰＲＲＴ２ポリペプチドは、その分子量及びＳＤＳ  ＰＡＧＥでの移動に基づいて、互いに及び他のタンパク質からも区別することができる。
【００９６】
ＰＲＲＴ２ポリペプチド中における既知の変異の存在の検出は、例えば、抗体、アプタマー、リガンド／基質、他のタンパク質若しくはタンパク質フラグメント、他のタンパク質結合剤、又はフラグメントの質量分析によっても達成することができる。好ましくは、タンパク質検出剤は変異ＰＲＲＴ２ポリペプチドに対して特異的であり、したがって、変異タンパク質と野生型タンパク質又は別のバリアント型とを判別することができる。一般にこれは、例えば、バリアントと野生型タンパク質で異なるタンパク質領域に結合する検出剤を選択又は設計することによって達成することができる。
【００９７】
変異ＰＲＲＴ２ポリペプチドを検出するための好ましい薬剤の１つは、変異ＰＲＲＴ２ポリペプチドに特異的に結合することができる抗体である。野生型と変異ＰＲＲＴ２ポリペプチドを区別できる抗体は、当技術分野で既知の任意の適切な方法によって作製することができる（以下を参照されたい）。抗体は、モノクローナル若しくはポリクローナル抗体、単鎖若しくは二本鎖のキメラ若しくはヒト化の抗体、又は前記抗体のフラグメント（すなわち、ＰＲＲＴ２の抗原結合領域を含有する免疫グロブリン分子の一部）でもよい。
【００９８】
本発明者らによって同定されたトランケートされたＰＲＲＴ２ポリペプチド（すなわち、ｐ．Ｐ２１０ｆｓＸ２２４又はｐ．Ｒ２１７ｆｓＸ２２４）の存在を検出するのに有用な抗体又はそのフラグメントは、欠失させられたポリペプチド領域（すなわち、ＰＲＲＴ２のアミノ酸２１７〜３４０）を認識し且つその領域に結合し、その結果、事実上野生型ＰＲＲＴ２ポリペプチドのみを認識し且つそのポリペプチドのみに結合する、抗体又はそのフラグメントでもよい。
【００９９】
既知のＰＲＲＴ２ポリペプチド変異を検出するためのインビトロでの方法には、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ, enzyme linked immunosorbent assay）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ, radioimmunoassay）、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、免疫蛍光法及びプロテインアレイ／チップ法（例えば、抗体又はアプタマーのアレイ）も含まれる。イムノアッセイ法及び関連するタンパク質検出法に関するさらなる情報については、Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, N.Y;及びHage, 1999, Anal. Chem. 15; 71(12): 294R-304Rを参照されたい。アミノ酸バリアントを検出するさらなる方法には、これらに限定されないが、電気泳動移動度の変化（例えば二次元電気泳動）、トリプシンペプチド消化の変化、細胞ベースアッセイ又は細胞フリーアッセイでのＨＥＸＡ活性の変化、リガンド又は抗体結合パターンの変化及び等電点の変化が含まれる。
【０１００】
ウェスタンブロット分析によって、変異を有するＰＲＲＴ２ポリペプチド及び変異を有さないＰＲＲＴ２ポリペプチドを互いに及び他のタンパク質から区別することができる。ウェスタンブロットの方法は当技術分野で周知であり、例えば、Burnette, 1981（Anal. Biochem.112 (2): 195-203）に記載されている。簡単に述べると、標準的な技法を用いて対象から得た試料からタンパク質を抽出し、次いでＳＤＳ  ＰＡＧＥにかける。このタンパク質試料はＰＲＲＴ２ポリペプチドを含むはずである。ゲル電気泳動後に、タンパク質試料中のタンパク質を、ニトロセルロース又はフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ, polyvinylidene fluoride）膜にトランスファーする。この膜を適切なブロッキング剤でブロッキングして、後に抗体が非特異的に膜へ結合するのを防止する。適切なブロッキング剤には、ウシ血清アルブミン及び脱脂粉乳が含まれる。ブロッキングし、適切なバッファーで何回か洗浄した後に、検査されるＰＲＲＴ２変異に特異的に結合する抗体、欠失させられたＰＲＲＴ２ポリペプチド領域を認識し且つその領域に結合する抗体、及び／又は野生型ＰＲＲＴ２に特異的に結合する抗体は、膜へトランスファーされた所望のタンパク質試料に結合することができる。一次抗体が膜に結合した後に、過剰な抗体を適切なバッファーで洗い流す。次いで、一次抗体に結合することができる、検出可能な程度に標識された適切な二次抗体を加える。次いで、過剰な二次抗体を適切なバッファーで洗い流し、二次抗体の検出可能な標識を検出する。二次抗体の検出可能な標識の検出は、所望のミュータント又は野生型のタンパク質の存在を示す。特定のミュータントＰＲＲＴ２ポリペプチドに対して特異的な一次抗体を使用するならば、その時は、ミュータントポリペプチドが同定される。
【０１０１】
ミュータントＰＲＲＴ２ポリペプチドの存在を測定するためのさらなる種々のアッセイも使用することができる。そうしたアッセイには、解離促進ランタニド蛍光免疫アッセイ（ＤＥＬＦＩＡ, dissociation-enhanced lanthanide fluoro immuno assay））、プロテオミクス法、表面プラスモン共鳴法、化学発光法、蛍光偏光法、燐光法、免疫組織化学法、国際公開第２００９／００４５７６号パンフレットに記載されているようなマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ, matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry）（表面エンハンス型レーザー脱離イオン化質量分析法（ＳＥＬＤＩ−ＭＳ, surface enhanced laser desorption/ionization mass spectrometry）、特に、表面エンハンス型親和性捕獲法（ＳＥＡＣ, surface-enhanced affinity capture）、表面エンハンス型ニードデソープション（ＳＥＮＤ, surface-enhanced need desorption）又は表面エンハンス型光標識アタッチメントアンドリリース（ＳＥＰＡＲ, surface-enhanced photo label attachment and release）を含める）、マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ, matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight）質量分析法、マイクロサイトメトリー、マイクロアレイ、顕微鏡観察、蛍光標識細胞分取法（ＦＡＣＳ, fluorescence activated cell sorting）及びフローサイトメトリーが含まれる。
【０１０２】
ＰＲＲＴ２中の変異を検査するのに利用可能な様々なアッセイに基づいて、さらなる実施形態では、ＰＲＲＴ２遺伝子中における発作又は運動障害に関連する変異、例えばＢＦＩＥ又はＩＣＣＡに関連する変異について対象を検査する方法であって、
（１）増幅される各エキソンに隣接するイントロン領域に相補的なプライマーを使用して、ＰＲＲＴ２遺伝子の少なくとも１つのエキソンを前記対象から得た試料から定量的に増幅するステップと、
（２）増幅される各エキソンに関する増幅産物の長さを、同一のプライマーを使用して野生型ＰＲＲＴ２遺伝子を増幅する時に得られる増幅産物の長さと比較するステップと
を含み、
試料の増幅エキソンと対応する野生型の増幅エキソンとの長さの違いが、試料のＰＲＲＴ２遺伝子中におけるトランケート変異の出現を示す方法が提供される。
【０１０３】
一実施形態では、方法は、トランケート変異の核酸配列を決定することをさらに含む。
【０１０４】
さらなる実施形態では、ＰＲＲＴ２遺伝子中における発作又は運動障害に関連する変異、例えばＢＦＩＥ又はＩＣＣＡに関連する変異などについて対象を検査する方法であって、
（１）増幅される各エキソンに隣接するイントロン領域に相補的なプライマーを使用して、ＰＲＲＴ２遺伝子の少なくとも１つのエキソンを前記対象から得た試料から定量的に増幅するステップと、
（２）（１）由来のフラグメントを、野生型ＰＲＲＴ２遺伝子の同一エキソンの増幅によって生成したフラグメントとハイブリダイズさせるステップと
を含み、
対応する野生型のフラグメントにハイブリダイズしないか、それとミスマッチヘテロ二本鎖を形成する、前記対象から増幅したエキソンが、増幅したエキソン中おける変異の出現を示す方法が提供される。
【０１０５】
一実施形態では、方法は、変異エキソンの核酸配列を決定することをさらに含む。
【０１０６】
前述のように、本発明者らは、ＰＲＲＴ２遺伝子中の変異の特定を通して、ＰＲＲＴ２遺伝子は、ＢＦＩＥ及びＩＣＣＡを含めた発作障害及び運動障害に関連すると判断した。
【０１０７】
したがって第三の態様では、本発明は、ＰＲＲＴ２遺伝子中に変化を含む単離核酸分子であって、前記変化が発作及び／又は運動障害の表現型をもたらす単離核酸分子を提供する。幾つかの実施形態では、変化は、フレームシフト変異、スプライス部位変異又はミスセンス変異である。例えば幾つかの実施形態では、変異は、上で詳述されているｃ．６２９−６３０ｉｎｓＣ、ｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣ、ＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ｔ、ＩＶＳ２＋５Ｇ＞Ａ及びｃ．９５０Ｇ＞Ａのうちの１つでもよい。その際、核酸分子は、配列番号１、３、５、６及び７のうちの１つに記述される配列を含む。
【０１０８】
本発明は、配列番号１、３、５、６及び７の核酸フラグメントも意図する。但し、フラグメントが関連する変異を含むことを条件とする。核酸フラグメントは、配列番号１、３、５、６及び７のうちの１つに対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％のヌクレオチド配列同一性を含むことができ、且つ関連する変異を含有する。核酸フラグメントは、配列番号１、３、５、６及び７のうちの１つの少なくとも約２０個連続するヌクレオチドを含むことを条件として、いかなる長さでもよい。
【０１０９】
したがって第四の態様では、本発明は、ＰＲＲＴ２遺伝子のフラグメントを含む単離核酸分子であって、前記核酸分子がＰＲＲＴ２中に変異を含み、前記変異がｃ．６２９−６３０ｉｎｓＣ、ｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣ、ＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ｔ、ＩＶＳ２＋５Ｇ＞Ａ及びｃ．９５０Ｇ＞Ａからなる群から選択される単離核酸分子を提供する。
【０１１０】
幾つかの実施形態では、核酸分子は、（１）配列番号１の少なくとも約２０個連続するヌクレオチドと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列であり、且つｃ．６２９−６３０ｉｎｓＣ変異を含む配列、（２）配列番号３の少なくとも約２０個連続するヌクレオチドと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列であり、且つｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣ変異を含む配列、（３）配列番号５の少なくとも約２０個連続するヌクレオチドと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列であり、且つＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ｔ変異を含む配列、（４）配列番号６の少なくとも約２０個連続するヌクレオチドと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列であり、且つＩＶＳ２＋５Ｇ＞Ａ変異を含む配列、又は（５）配列番号７の少なくとも約２０個連続するヌクレオチドと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列であり、且つｃ．９５０Ｇ＞Ａ変異を含む配列を含む。
【０１１１】
これらのＰＲＲＴ２フラグメントの任意の１又は２以上を、調査中の対象のＰＲＲＴ２遺伝子中に変化が存在することについて検査するための前述のアッセイで使用することができる。
【０１１２】
第五の態様では、本発明は、ポリペプチドが、変化を含むＰＲＲＴ２ポリペプチドであり、前記変化が発作及び／又は運動障害の表現型をもたらす、単離ポリペプチドを提供する。幾つかの実施形態では、変化は、トランケーション変異又はアミノ酸置換変異である。例えば幾つかの実施形態では、変異は、上で詳述されているｐ．Ｐ２１０ｆｓＸ２２４、ｐ．Ｒ２１７ｆｓＸ２２４及びｐ．Ｓ３１７Ｎのうちの１つでもよい。その際ポリペプチドは、配列番号２、４及び８のうちの１つに記述される配列を含む。
【０１１３】
本発明は、配列番号２、４及び８のポリペプチドフラグメントも意図する。但し、フラグメントが関連する変異を含むことを条件とする。ポリペプチドフラグメントは、配列番号２、４及び８のうちの１つに対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を含むことができ、且つ関連する変異を含有する。前記ポリペプチドフラグメントは、配列番号２、４及び８のうちの１つの少なくとも約２０個連続するアミノ酸残基を含むことを条件として、いかなる長さでもよい。
【０１１４】
したがって、第六の態様では、本発明は、ＰＲＲＴ２ポリペプチドのフラグメントを含む単離ポリペプチドであって、ＰＲＲＴ２中に変異を含み、前記変異が、ＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ｔ変異（ｐ．Ｐ２１０ｆｓＸ２２４）によってコードされるトランケートされたＰＲＲＴ２ポリペプチド、ＩＶＳ２＋５Ｇ＞Ａ変異（ｐ．Ｒ２１７ｆｓＸ２２４）によってコードされるトランケートされたＰＲＲＴ２ポリペプチド及びＳ３１７Ｎからなる群から選択される、単離ポリペプチドを提供する。
【０１１５】
幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、（１）配列番号８の少なくとも約２０個連続するアミノ酸と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列であり、且つＳ３１７Ｎ変異を含む配列、及び（２）配列番号２又は配列番号４と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するトランケートされたＰＲＲＴ２ポリペプチドを含む。
【０１１６】
本発明はまた、本発明の核酸分子を含む、遺伝子改変（ノックアウト、ノックイン及び遺伝子組換え）非ヒト動物モデルの作製を提供する。したがって第七の態様では、本発明は、本発明の第三又は第四の態様による核酸分子を含む遺伝子改変非ヒト動物を提供する。
【０１１７】
遺伝子改変動物は、ＰＲＲＴ２遺伝子機能の研究に、本発明のＰＲＲＴ２変異が発作障害及び運動障害を引き起こす機構の研究に、組織発生におけるＰＲＲＴ２変異の影響の研究に、医薬化合物の候補のスクリーニングに、ミュータントを発現する外植された哺乳類細胞培養物の作製に、及び可能性のある治療介入の評価に有用である。
【０１１８】
本発明の動物モデルに使用するのに適する動物種には、これらに限定されないが、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ並びにサル及びチンパンジーなどの非ヒト霊長類が含まれる。初期の研究のためには、遺伝子改変されたマウス及びラットが、ノックイン、ノックアウト又は遺伝子組換え体を作製するのが比較的容易であり、管理が容易であり、寿命が短いため、非常に望ましい。特定の研究のためには、遺伝子組換えの酵母又は無脊椎動物が適切且つ好ましい場合がある。なぜならば、これらは、迅速なスクリーニングを可能にし、取扱いがより容易になるからである。より長期間の研究のためには、非ヒト霊長類が、ヒトとのその類似性のために所望される場合がある。
【０１１９】
本発明のミュータントＰＰＲＴ２遺伝子の動物モデルを作製するために、幾つかの方法を用いることができる。これらには、限定はされないが、相同な動物遺伝子での特定のＰＰＲＴ２変異の作製、ミュータントヒトＰＲＲＴ２遺伝子及び／若しくはヒト化動物ＰＲＲＴ２遺伝子の相同組換えによる挿入、野生型、ミュータント若しくは人工のプロモーターエレメントを使用する、ゲノム若しくはミニ遺伝子のｃＤＮＡ構築物としてのミュータントヒトＰＰＲＴ２遺伝子の挿入、又は内在性遺伝子の人工的に改変されたフラグメントの相同組換えによる挿入が含まれる。改変には、ミュータント終止コドンの挿入、ＤＮＡ配列の欠失、又はＣｒｅリコンビナーゼなどの酵素によって認識される組換えエレメント（ｌｏｘ  ｐ部位）の包有が含まれる。
【０１２０】
インビボで遺伝子機能獲得型研究を行う目的で遺伝子組換えマウスを作製するためには、本発明のいかなるミュータントも、卵母細胞マイクロインジェクションなどの標準的な技法を使用してマウスの生殖系列に挿入することができる。遺伝子機能獲得は、遺伝子及びそのタンパク質産物の過剰発現、又は調査遺伝子の変異の遺伝的相補を意味し得る。卵母細胞注入のためには、１又は２コピー以上のミュータント遺伝子を、受精直後のマウス卵母細胞の前核へ挿入することができる。次いで、この卵母細胞を偽妊娠の里親に再移植する。次いで、生きて生まれたマウスを、関連するヒト遺伝子配列の存在について尾のＤＮＡを分析することによって、組み込み体についてスクリーニングすることができる。導入遺伝子は、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ若しくは他の染色体ＤＮＡフラグメントとして注入された完全なゲノム配列、天然プロモーター若しくは異種プロモーターのいずれかを有するｃＤＮＡ、又はコーディング領域全体及び最適な発現に必要であることが分かっている他のエレメントを含有するミニ遺伝子のいずれかであり得る。
【０１２１】
ノックアウトマウス又はノックインマウスを作製するためには、マウス胚性幹（ＥＳ, embryonic stem）細胞での相同組換えによる遺伝子ターゲティングを適用することができる。ノックアウトマウスは、インビボで遺伝子機能の喪失を研究するために（例えばトランケート変異の影響を研究するために）作製される。一方で、ノックインマウスは、機能獲得の研究又は特定の遺伝子変異の影響の研究を可能にする。ノックインマウスは、遺伝子組換えマウスと類似しているが、前者では、組み込み部位及びコピー数が確定される。
【０１２２】
ノックアウトマウスの作製に関しては、マウスゲノム中のＰＲＲＴ２遺伝子のタンパク質コーディング配列を破壊する（ノックアウトする）ように、遺伝子ターゲティングベクターを設計することができる。この破壊は、典型的にはマウスの胚性幹細胞で相同組換え（Joyner, 2000, Gene Targeting: A Practical Approach, Oxford University Press）を介するか、関連する遺伝子を標的にするｓｉＲＮＡベクター（Kunath et al., 2003, Nature Biotechnol. 21: 559-561）などの他の技術を介することができる。ノックアウト動物は、遺伝子が生物学的に活性な産物を発現しないような、ＰＲＲＴ２遺伝子の機能的破壊を含むはずである。遺伝子によってコードされる少なくとも１つの機能活性が実質的に欠ける可能性がある。遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現は、実質的にない（すなわち基本的に検出不可能な量が作られる）可能性があり、又は遺伝子産物の一部のみが産生される場合など、活性が欠けている場合がある。それとは対照的に、ノックインマウスは、ミュータントＰＲＲＴ２遺伝子を含有する遺伝子ターゲティングベクターをマウスゲノム中の決められた遺伝子座に組み込まれ得ることによって作製することができる。両方の適用に関して、相同組換えは、相同なＤＮＡ配列を認識し、二重交差によって交換する特異的なＤＮＡ修復酵素によって触媒される。
【０１２３】
遺伝子ターゲティングベクターは、通常、エレクトロポレーションを使用してＥＳ細胞に導入する。次いで、ＥＳ細胞の組み込み体をターゲティングベクター上に存在する抗生物質耐性遺伝子を介して単離し、続いてジェノタイピングして、調査中の遺伝子が所望の座位に組み込まれているＥＳ細胞クローンを同定する。次いで適切なＥＳ細胞を生殖系列を通して伝えて、新規なマウス系統を作製する。
【０１２４】
遺伝子削除が早期の胚性致死をもたらす場合は、条件的遺伝子ターゲティングを用いることができる。これは、時間的及び空間的な制御様式で遺伝子を欠失させることができる。上記のように、適切なＥＳ細胞を生殖系列を通して伝えて新規なマウス系統を作製するが、実際の遺伝子欠失は、成体マウスにおいて、組織特異的な又は時間制御的な様式で実施される。条件的遺伝子ターゲティングは、ｃｒｅ／ｌｏｘシステムの使用によって最も一般的に達成される。ｃｒｅ酵素は、３４塩基対のｌｏｘＰ配列を認識することができ、その結果、ｃｒｅによってｌｏｘＰに隣接する（又はｌｏｘＰが導入された）ＤＮＡが認識され、切り取られる。遺伝子組換えマウスでの組織特異的なｃｒｅの発現によって、遺伝子ターゲティングされたｌｏｘＰが導入されたマウスをｃｒｅ遺伝子組換えマウスと交配することによる組織特異的なノックアウトマウスの作製が可能になる。ノックアウトは、「欠失」マウスを使用して、若しくは誘導性ｃｒｅ遺伝子を有する遺伝子組換えマウス（テトラサイクリン誘導性ｃｒｅ遺伝子を有するものなど）を使用して、あらゆる組織で行うことができ（Schwenk et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23: 5080-5081）、又はノックアウトは、例えばＣＤ１９−ｃｒｅマウスの使用による組織特異的でもよい（Rickert et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 1317-1318）。
【０１２５】
一旦ノックイン動物が作製されると、続いて、それらは、疾患の程度及び機構を研究するのに使用することができ、並びに遺伝的背景の変化が有する、動物の表現型に対する影響を検査するのに使用することができる。これは、例えば、本発明のノックインマウスを異なる遺伝的背景を含むマウス、例えばＤＢＡ／２Ｊ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ又はＦｒｉｎｇｓ系統のマウスとかけ合わせることによって、マウスで達成することができる。
【０１２６】
当技術分野で周知の方法を使用して、ミュータントポリペプチドに対して特異的な抗体を産生するために、又はミュータントポリペプチドに結合する医薬品を同定するための医薬品ライブラリーをスクリーニングするために、本発明のミュータントＰＲＲＴ２ポリペプチドを使用することができる。さらに、本発明のミュータントＰＲＲＴ２ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、アンタゴニスト若しくはモジュレーターとして直接的に、又はミュータントポリペプチドを発現する細胞若しくは組織に医薬品を運ぶためのターゲティング若しくは送達機構として間接的に使用することができる。
【０１２７】
したがって第八の態様では、本発明は、本発明の第五又は第六の態様によるポリペプチドに特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを提供する。
【０１２８】
さらに第九の態様では、本発明は、本発明の第五又は第六の態様によるポリペプチドを検出する抗体又はそのフラグメントであって、前記ポリペプチドがトランケーション変異を含み、前記ポリペプチドのトランケートされた領域に結合する、抗体又はそのフラグメントを提供する。
【０１２９】
本発明の本態様で意図されるそうした抗体には、これらに限定されないが、当業者なら理解するように、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体及び単鎖抗体が含まれ得る。抗体の産生のためには、ウサギ、ラット、ヤギ、マウス、ヒトなどを含めた種々の宿主を、記載のミュータントポリペプチド又は免疫原性の特性を有するそれらの任意のフラグメント若しくはオリゴペプチドの注射によって、免疫化することができる。種々のアジュバントは、免疫学的応答を増大させるのに使用することができ、アジュバントには、これらに限定されないが、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、及びリゾレシチンなどの表面活性物質が含まれる。ヒトで使用するアジュバントには、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌（bacilli Calmette-Guerin））及びコリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）が含まれる。
【０１３０】
本発明のミュータントＰＲＲＴ２ポリペプチドに対する抗体を誘導するのに使用するＰＲＲＴ２のオリゴペプチド、ペプチド又はフラグメントは、少なくとも５アミノ酸、より好ましくは少なくとも１０アミノ酸からなるアミノ酸配列を有することが好ましい。こうしたオリゴペプチド、ペプチド又はフラグメントは、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり、且つ天然に存在する小分子のアミノ酸配列全体を含有することも好ましい。本発明のポリペプチド由来のアミノ酸の短いストレッチをＫＬＨなどの別のタンパク質の短いストレッチと融合することができ、そのキメラ分子に対する抗体を産生することができる。
【０１３１】
本発明のミュータントＰＲＲＴ２ポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、培養における連続細胞株によって抗体分子を産生する任意の技法を使用して調製することができる。これらには、限定はされないが、ハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（例えば、Kohler et al., 1975, Nature 256: 495-497; Kozbor et al., 1985, J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030;及びCole et al., 1984, Mol. Cell Biochem. 62: 109-120を参照されたい）が含まれる。
【０１３２】
抗体は、リンパ球集団でのインビボ産生を誘導することによって、又は免疫グロブリンライブラリー若しくは文献（例えば、Orlandi et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837;及びWinter and Milstein, 1991, Nature 349: 293-299を参照されたい）に開示されているような非常に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって産生することもできる。
【０１３３】
本発明のミュータントＰＲＲＴ２ポリペプチドに対する特異的結合部位を含有する抗体フラグメントを作製することもできる。例えば、そうしたフラグメントには、抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ’）２フラグメント、及びＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって作製されるＦａｂフラグメントが含まれる。或いは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速且つ容易な同定を可能するために、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築することができる（例えば、Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281を参照されたい）。
【０１３４】
所望の特異性を有する抗体を同定するためのスクリーニング目的で、種々のイムノアッセイを使用することができる。特異性が確証されたポリクローナル又はモノクローナル抗体のいずれかを使用する競合的結合アッセイ又は免疫放射線アッセイに関する多数のプロトコルが当技術分野で周知である。そうしたイムノアッセイは、典型的には、タンパク質とその特異的抗体の間での複合体形成を測定することを含む。２つの非干渉性エピトープに対して反応性の抗体を利用する、モノクローナルベースの二部位イムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイも用いることができる。
【０１３５】
ＰＲＲＴ２遺伝子と発作障害及び運動障害との関連が確証されたので、本発明によって、そうした障害のための治療的適用が可能になる。例えば、本発明者らによって同定されたＰＲＲＴ２ポリペプチドミュータントを含めたミュータントＰＲＲＴ２ポリペプチドを、（上記のように）ミュータントポリペプチドに対して特異的な抗体を産生するのに、又はミュータントポリペプチドに結合する医薬品を同定するために医薬品ライブラリーをスクリーニングするのに（以下を参照されたい）、使用することができる。
【０１３６】
一実施形態では、本発明のミュータントに特異的に結合する抗体は、アンタゴニスト若しくはモジュレーターとして直接的に、又はミュータントポリペプチドを発現する細胞若しくは組織に医薬品を運ぶためのターゲティング若しくは送達機構として間接的に使用することができる。
【０１３７】
発作障害及び／又は運動障害に関与する遺伝子としてＰＲＲＴ２を同定することによって、ＢＦＩＥ又はＩＣＣＡを含めたそうした障害を治療する方法が可能になる。機能的なＰＲＲＴ２遺伝子発現又は機能的なＰＲＲＴ２ポリペプチドの回復は、治療上有効であり得る。したがって本発明のさらなる態様は、機能的なＰＲＲＴ２遺伝子及び／又はタンパク質の発現及び／又は活性を回復させることに関する。遺伝子及びタンパク質の発現及び活性を回復させるための多数の方法が存在する。例えば、野生型ＰＲＲＴ２核酸を発現させるベクターを、そうした治療を必要としている対象に投与することができる。細胞又は組織中にベクターを導入するための多くの方法が利用可能であり、それぞれインビボ、インビトロ及びエクスビボでの使用に同様に適する。エクスビボでの療法に関しては、患者から採取した幹細胞にベクターを導入し、クローン的に増殖させて、それを同一患者へ戻す自家移植をすることができる。トランスフェクション、リポソーム注入又はポリカチオン性アミノポリマーによる送達は、当技術分野で周知の方法を使用して達成することができる。
【０１３８】
本発明のさらなる態様は、罹患対象においてミュータントＰＲＲＴ２遺伝子をサイレンシングすることによる、ＢＦＩＥ又はＩＣＣＡを含めた発作及び／又は運動障害の治療に関する。一手法は、本発明者らによって同定されたＰＲＲＴ２核酸ミュータントのうちのいずれか１つの相補体を含めた、ミュータントＰＲＲＴ２核酸の相補体（アンチセンス）であるＤＮＡ分子、及びミュータントＰＲＲＴ２によってコードされるｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡ分子である、又はそのＲＮＡ分子をコードする分子を、そうした治療を必要としている対象に投与することを含む。
【０１３９】
典型的には、ミュータントＰＲＲＴ２核酸の相補体（アンチセンス）を発現させるベクターを、そうした治療を必要としている対象に投与することができる。細胞又は組織中にベクターを導入する方法を上に記載する。
【０１４０】
さらなるアンチセンス又は遺伝子ターゲティング性のサイレンシングストラテジーには、これらに限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用、アンチセンスＲＮＡの注入、アンチセンスＲＮＡ発現ベクターのトランスフェクション、及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ, RNA interference）又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ, short interfering RNA）の使用が含まれ得る。またさらに、遺伝子サイレンシングのために、ＤＮＡザイム及びリボザイムなどの触媒性核酸分子を使用することができる。これらの分子は、従来のアンチセンス手法のように単に標的ｍＲＮＡ分子に結合するのではなく、その標的ｍＲＮＡ分子を切断することによって機能する。
【０１４１】
本発明のさらに別の態様によれば、本発明者らによって特定された特定のＰＲＲＴ２核酸及びポリペプチドの変異、並びにこれらを発現する細胞を含めた、ミュータントＰＲＲＴ２核酸又はポリペプチドは、医薬品候補、特にＢＦＩＥ及びＩＣＣＡなどの発作又は運動障害を治療するための医薬品候補をスクリーニングするのに有用である。
【０１４２】
本発明に従ってスクリーニングすることができる薬剤には、これらに限定されないが、ペプチド（可溶性ペプチドなど）、リンペプチド及び小さな有機分子又は無機分子（天然物又は合成化合物ライブラリー及びペプチドミメティックなど）が含まれる。
【０１４３】
一実施形態では、スクリーニングアッセイは、競合的結合アッセイにおいて、ミュータントＰＲＲＴ２ポリペプチドを発現させる組換え分子で安定的に形質転換された真核性又は原核性の宿主細胞を利用する細胞ベースアッセイを含むことができる。結合アッセイ（例えばＥＬＩＳＡベースのアッセイ又は競合ベースのアッセイ）は、特定のミュータントＰＲＲＴ２ポリペプチドと被検薬の間の複合体形成を測定するか、被検薬が特定のミュータントＰＲＲＴ２ポリペプチドとその相互作用物質又はリガンドの間の複合体形成を阻害する又は回復させる程度を測定する。好ましくは（例えばマイクロプレートリーダーによる又はフローサイトメーターの使用による）検出ステップの自動化又は部分的自動化を提供する、分光光度的、蛍光定量的、熱量測定的又は化学発光的手段を含めた標準的な方法を使用することによって、活性の変化をこうしたアッセイで観察することができる。
【０１４４】
非細胞ベースアッセイも、本発明者らによって同定されたミュータントを含めたミュータントＰＲＲＴ２ポリペプチドと相互作用物質の間の結合を阻害する又は回復させることができる薬剤を同定するのに使用することができる。そうしたアッセイは当技術分野で既知であり、例えば、AlphaScreen technology（PerkinElmer Life Sciences社、MA、USA）が含まれる。この適用は、各相互作用パートナーが離れたビーズに抗体を介して結合しているようなビーズの使用に依拠する。各パートナーの相互作用によってビーズが接近し、その結果レーザー励起によって、光シグナルを放射するフルオロフォアを最終的に導く幾つかの化学反応が惹起される。ミュータントとその相互作用物質の結合を阻害する候補薬剤は光放射の喪失をもたらし、一方で、ミュータントと相互作用物質の結合を回復させる候補薬剤は、陽性の光放射をもたらす。これらのアッセイによって、候補薬剤の同定及び単離が最終的に可能になる。
【０１４５】
ハイスループット薬物スクリーニング法は、国際公開第８４／０３５６４号パンフレット及びPirogova et al., 2011（Curr. Pharm. Biotechnol. 12: 1117-1127）などに記載されている方法を用いることもできる。例えば、コンビナトリアルケミストリー、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ, highthroughput screening）、バーチャルスクリーニング、デノボ設計及び構造ベースの薬物設計などの効率的な技術は、治療法の候補を同定するための効率的な手段を提供することができるので、本発明に関連する。より具体的な例としては、固体基盤上で合成された低分子ペプチド被検薬を、ミュータントポリペプチドの結合についてアッセイすることができる。次いで、結合したミュータントＰＲＲＴ２ポリペプチドを、当技術分野で周知の方法によって検出する。本技法の変形では、精製されたミュータントＰＲＲＴ２ポリペプチドをプレート上に直接コーティングして、相互作用する被検薬を同定することができる。
【０１４６】
本発明は、ミュータントＰＲＲＴ２ポリペプチドと特異的に結合することができる中和抗体が、そのポリペプチドとの結合について被検薬と競合する、競合薬物スクリーニングアッセイの使用も意図する。この方式では、抗体を使用して、ミュータントの１又は２以上の抗原決定基を共に有するいかなるペプチドの存在も検出することができる。
【０１４７】
本発明者らによって同定されたミュータントを含めたミュータントＰＲＲＴ２ポリペプチドは、コンビナトリアルライブラリー法の結果として開発された薬剤をスクリーニングするのにも使用することができる。これは、ポリペプチドの活性をモジュレートする能力について、多数の異なる物質を検査する方法を提供する。ポリペプチド機能のモジュレーターとして同定された薬剤は、実際はペプチドでも非ペプチドでもよい。非ペプチドの「小分子」が、多くのインビボでの医薬的適用に関して好ましいことが多い。加えて、その物質のミミック又はミメティックを、医薬的使用のために設計することができる。医薬として活性な既知の化合物（「リード」化合物）に基づくミメティックの設計は、新規の医薬品を開発するための一般的な手法である。これは、最初の活性な薬剤が合成困難であるか合成に費用がかかる場合、又はその最初の活性な薬剤が不適切な投与方法をもたらす場合に、望ましいことが多い。ミメティックの設計では、標的の性質を決定する際に重要な、最初の活性な薬剤の特定の部分を特定する。薬剤の活性領域を構成するこうした部分又は残基は、ファルマコフォアとして知られる。ファルマコフォア構造は、一旦発見されれば、Ｘ線回折データ及びＮＭＲを含めた様々な供給源からのデータを使用して、その物理的特性に従ってモデル化される。次いで、ファルマコフォアをミミックする化学基を付加できる鋳型分子を選択する。選択は、ミメティックが合成しやすく、薬理学的に許容される可能性が高く、インビボで分解せず、且つリード化合物の生物活性を保持するように行うことができる。インビボ又は臨床の検査に有用な１又は２以上の最終的なミメティックを選択するために、さらなる最適化又は改変を行うことができる。
【０１４８】
薬物スクリーニングのための別の代替方法は、構造ベースの合理的薬物設計に依拠する。本発明者らによって同定されたミュータントを含めた、ミュータントＰＲＲＴ２ポリペプチドの三次元構造の決定によって、生物学的に活性なリード化合物を同定するための、構造ベースの薬物設計が可能になる。
【０１４９】
三次元構造モデルは、幾つかのアプリケーションによって作成することができ（それらの幾つかはＸ線結晶解析及びＮＭＲなどの実験的モデルを含む）、及び／又はタンパク質データバンク（ＰＤＢ, Protein Databank）などの構造データベースのインシリコ研究から作成することができる。加えて三次元構造モデルは、ポリペプチドの一次配列に基づく幾つかの既知のタンパク質構造予想法（例えばSYBYL、Tripos Associated社、St. Louis、MO）、デノボタンパク質構造設計プログラム（例えばMODELER、MSI Inc.社、San Diego、CA、又はMOE、Chemical Computing Group社、Montreal、カナダ）又はアブイニシオ法（例えば米国特許第５３３１５７３号明細書及び第５５７９２５０号明細書を参照されたい）を使用して決定することができる。
【０１５０】
ポリペプチドの三次元構造が一旦決定されれば、こうした三次元構造に基づいて生物学的に活性な薬剤を設計するために、構造ベースの創薬法を用いることができる。そうした技法は、当技術分野で既知であり、それにはDOCK（University of California、San Francisco）又はAUTODOCK（Scripps Research Institute、La Jolla、California）などの例が含まれる。コンピューターによるドッキングプロトコルは、活性部位又は予測タンパク質モデルに基づいてタンパク質の活性に重要であると見なされる部位を特定する。次いで、タンパク質モデルを補完する分子について、市販化学薬品一覧（ＡＣＤ, Available Chemicals Directory）などの分子データベースをスクリーニングする。
【０１５１】
これらの方法などの方法を使用して、可能性のある臨床的薬物候補を同定することができ、典型的な「ウェットラボ」の薬物スクリーニング法に付き物の時間及び費用を軽減するために、コンピューターによってランク付けすることができる。上記で言及したスクリーニング法に関するコントロール反応には、被検薬への暴露がない前記細胞又は動物において検出されるベースライン応答が含まれ得、又は、代わりに、コントロール反応は、正常若しくは野生型の完全なＰＲＲＴ２コード配列を含む細胞若しくは動物における被検薬への暴露後の反応でもよい。被検薬又は薬物候補は、既知の及び新規の化合物、複合体並びに他の物質から選択することができ、これらは、例えば、私的又は公的に利用できる薬剤ライブラリー（例えば、Queensland Compound Library（Griffith University、Nathan、QLD、オーストラリア）及びMolecular Libraries Small Molecule Repository（NIH Molecular Libraries、Bethesda、MD、USA）から供給され得る。したがって被検薬は、タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド（例えば組換えにより発現させられたＰＲＲＴ２遺伝子、タンパク質若しくはポリペプチド又はそれらの機能的フラグメント若しくは機能的バリアント）、又はそれらのミメティック（いわゆる合成核酸ミミック、ペプトイド及びレトロインベルソペプチドを含める）を含むことができるが、より好ましくは、有機小分子、特に「薬らしさ」に関するリピンスキーのルールオブファイブ（Lipinski, CA et al., 2001, Adv. Drug. Del. Rev. 46: 3-26）に従うか実質的に従う有機小分子を含む。被検薬はまた、既知の若しくは新規の化合物の構造的な分析に基づいて選択することができ、又は別の方法では、ＰＲＲＴ２結合部位のさらなる構造的な分析に続いて設計することができる。
【０１５２】
上記のスクリーニング手順を通して同定された薬剤及び本発明者らによって同定されたミュータントを含めた、ミュータントＰＲＲＴ２核酸分子又はポリペプチドの使用に基づく薬剤は、これら及び薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物がそうであるように本発明の一部を形成する。
【０１５３】
本発明はまた、本発明の第一又は第二の態様の方法を実施するために使用することができるキットを提供する。例えばキットは、少なくとも１アッセイに十分な量で、野生型及びミュータントＰＲＲＴ２核酸又はＰＲＲＴ２ポリペプチドに対して特異的な、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅プライマー及び／又は抗体を含有することができる。これらの構成要素は、上で詳述されている。典型的には、キットは、被検試料中のミュータントＰＲＲＴ２核酸又はミュータントＰＲＲＴ２ポリペプチドの存在を判定するための検出アッセイにおいてパッケージ化されたプローブ、プライマー及び／又は抗体を使用するための、（例えば、紙又は電子媒体上に含有される）有形形態で記録された説明書も含む。
【０１５４】
したがって第十の態様では、本発明は、対象において発作及び／若しくは運動障害を診断若しくは予測するための、又は発作及び／若しくは運動障害になりやすい子孫をもつ可能性が増大している対象を特定するためのキットであって、前記対象においてＰＲＲＴ２遺伝子中の変化の存在について検査するための１又は２以上の構成要素を含むキットを提供する。
【０１５５】
一実施形態では、１又は２以上の構成要素は、以下からなる群から選択される：（ｉ）本発明の第五又は第六の態様によるポリペプチドに特異的に結合する抗体又はそのフラグメント、（ii）本発明の第五又は第六の態様によるポリペプチドを検出し、前記ポリペプチドがトランケート変異を含み、前記ポリペプチドのトランケートされた領域に結合する、抗体又はそのフラグメント、及び（iii）本発明の第三又は第四の態様による核酸分子に特異的にハイブリダイズする核酸分子。
【０１５６】
キットの種々の構成要素は、種々の形態で提供することができる。例えば、必要とされる酵素、ヌクレオチド三リン酸、プローブ、プライマー及び／又は抗体は、凍結乾燥試薬として提供することができる。こうした凍結乾燥試薬は、再構成時に、適切な比で各構成要素を含む、アッセイで直ぐに使える状態の完全な混合物を形成するように、前もって混合してから凍結乾燥することができる。加えて、キットは、キットの凍結乾燥試薬を再構成するための再構成試薬を含有することができる。
【０１５７】
一例を挙げると、キットは、ＰＲＲＴ２核酸の一部をＰＣＲ増幅するためのプライマーペア及び作製されたアンプリコンにハイブリダイズすることができる検出可能な程度に標識されたプローブを含めた、少なくとも３種の凍結乾燥オリゴヌクレオチドを含むことができる。ある種のキットでは、少なくとも３種の凍結乾燥オリゴヌクレオチドは、セミネステッドＰＣＲによってＰＲＲＴ２核酸の少なくとも一部を増幅するためのプライマーである。
【０１５８】
ある種のキットは、所望の核酸を固体支持体上に固着するための固体支持体をさらに含むことができる。標的核酸は、固体支持体に固着された捕捉プローブを通して直接的に又は間接的に固体支持体へ固着することができ、所望の核酸にハイブリダイズすることができる。そうした固体支持体の例としては、これらに限定はされないが、ビーズ、微粒子（例えば、金及び他のナノ粒子）、マイクロアレイ、マイクロウェル及びマルチウェルプレートが挙げられる。固体表面は、結合ペアの第一メンバーを含むことができ、捕捉プローブ又は標的核酸は、結合ペアの第二メンバーを含むことができる。結合ペアメンバーの結合は、捕捉プローブ又は標的核酸を固体表面に固着する。そうした結合ペアの例としては、これらに限定されないが、ビオチン／ストレプトアビジン、ホルモン／受容体、リガンド／受容体及び抗原／抗体が挙げられる。
【０１５９】
他のキットでは、ＰＲＲＴ２の野生型及びミュータントポリペプチドに対する凍結乾燥抗体を提供することができる。ある種のキットでは、一次／二次抗体ペアを提供することができる。ある種のキットは、ＰＲＲＴ２の野生型及びミュータントポリペプチドを固着するための固体支持体をさらに含むことができる。そうしたＰＲＲＴ２の野生型及びミュータントポリペプチドの固着は、上記のように、ビオチン／ストレプトアビジン及び抗原／抗体の相互作用を介することができる。
【０１６０】
典型的な包装材料には、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ及び／又は増幅プライマーを一定の範囲内に保持することができる、ガラス、プラスチック、紙、ホイル、微粒子などの固体マトリックスが含まれ得る。したがって、例えば、包装材料は、サブミリグラム（例えばピコグラム又はナノグラム）量の意図されるプローブ、プライマー若しくは抗体を含有するために使用されるガラスバイアルを含むことができ、又は包装材料は、プローブ、プライマー若しくは抗体が作動可能に付着させられた、すなわち増幅及び／若しくは検出方法に関与できるように連結されているマイクロタイタープレートウェルであり得る。
【０１６１】
キットは、試薬及び／又は試薬濃度及び少なくとも１つのアッセイ方法のパラメーター（例えば、試料量あたりに使用する試薬の相対量でもよい）を指示する説明書を含むことができる。加えて、管理、期間、温度及びバッファー条件のような詳細も含まれ得る。
【０１６２】
用語「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、「含む（comprised）」又は「含む（comprising）」を本明細書（特許請求の範囲を含める）で使用する場合は、それらは、記載した特色、整数、ステップ又は構成要素の存在を特定するものであり、１若しくは２以上の他の特色、整数、ステップ若しくは構成要素又はそれらの群の存在を排除するものではないと解釈すべきである。
【０１６３】
値の範囲を表す場合は、この範囲は、範囲の上限及び下限、並びにこれらの限界値の間の全ての値を包含することが明確に理解されることに留意されたい。
【０１６４】
さらに本明細書で使用する用語「約」は、ほぼ又はおおよそを意味し、本明細書に記述される数値又は範囲において、列挙される又は主張される数値又は範囲の、及びその数値又は範囲から＋／−１０％以下、＋／−５％以下、＋／−１％以下、又は＋／−０．１％以下の変動を包含することを意味する。
【０１６５】
本発明を、明確さ及び理解の目的である程度詳細に説明してきたが、本明細書で開示される本発明の概念の範囲を逸脱することなく、本明細書に記載の実施形態及び方法に対して種々の改変及び変更を行い得ることは当業者には明らかであろう。
【０１６６】
本発明を以下の実施例でさらに説明する。実施例は特定の実施形態のみを説明することを目的とし、上記の記載について制限することを意図するものではない。
【実施例１】
【０１６７】
発作障害及び運動障害の原因遺伝子の同定
以下の研究は、発作障害及び運動障害の原因となる遺伝子を同定するために行った。てんかん（良性家族性乳児てんかん）及び／又は発作障害（ＩＣＣＡ）を罹患する家族（及びその家族内の対象）が、研究の根拠となった。
【０１６８】
患者及びコントロール
本研究は、Austin Health and the Women's and Children's Hospitalのヒト研究倫理委員会によって承認された。有効な発作アンケートを使用して、個々について詳細なフェノタイピングを行った。入手可能な全ての以前の医療記録、ＥＥＧ及び神経画像データを取得した。オーストラリア人のコントロール試料は、匿名の血液ドナーとした。イスラエル人のコントロール試料は、てんかんの遺伝的原因に関する研究のために動員された罹患していない、血縁でない家族の一員とした。
【０１６９】
ジェノタイピング
ＢＦＩＥ連鎖領域でのマイクロサテライトマーカーを、変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動とそれに続くオートラジオグラフィー、GelScan 3000（Corbett Research社、Sydney、オーストラリア）を使用する変性ゲル電気泳動、又はGenescan 400D ROXで標識されたサイズ標準（Applied Biosystems社、Carlsbad、CA）を用いるABI 3100 Avant DNA analyserを使用するキャピラリー電気泳動のいずれかによってジェノタイピングした。後者の２つの方法については、各ペアのフォワードプライマーをHEX又はFAMのいずれかで標識した。マイクロサテライトマーカーに対するプライマー配列は、UniSTSからであった。ＬＯＤスコアは、FASTLINKプログラムを使用して計算した。
【０１７０】
連鎖
ＢＦＩＥ又はＩＣＣＡを罹患する家族１〜９、１１及び１２について連鎖分析を実施した（図１）。本分析によって、家族１、２及び５のそれぞれに関して、第１６染色体の３．２７、３．０及び２．７１座位について最大のＬＯＤスコアが得られた。家族３、４、６〜９、１１及び１２は、第１６染色体への連鎖と一致していた。第１染色体座位への連鎖は、家族１、３、５〜７、９及び１１について除外された。第１９染色体座位への連鎖は、家族１、３及び６〜９及び１１について除外された。良性家族性新生児−乳児発作の重複症候群に関する遺伝子であるＳＣＮ２Ａへの連鎖は、家族１、６〜９及び１１〜１３について除外された。これは、第１６染色体ｐ１１．２〜ｑ１２．１のＢＦＩＥ領域に属する、これらの家族における原因遺伝子と一致している。
【０１７１】
第１６染色体連鎖区間での遺伝子同定
Ｄ１６Ｓ３０９３とＤ１６Ｓ４１１の間の第１６染色体連鎖区間中のコーディング配列、ミニマルプロモーター配列及びマイクロＲＮＡを捕獲するために、シーケンスキャプチャーアレイを設計した。捕獲配列のシーケンスキャプチャー及び増幅は、Roche-Nimblegen社（Madison、WI）によって実施された。捕獲され増幅されたＤＮＡの超並列シーケンシング（ＭＰＳ, massively parallel sequencing）は、Illumina社のGenome Analyzer IIを使用してGeneWorks社（Adelaide、オーストラリア）によって実施された。リピートマスクバージョンのヒトゲノム（UCSCゲノムブラウザー、hg18）にMosaik 1.0.1388を使用して配列をマップした。１０リード以上のシーケンス深度に対するバリアントであって、参照配列と１５〜８５％の不一致である全てのバリアントを、Consed v19を使用して同定した。SeattleSeqを使用して、バリアントを機能的にアノテートした。
【０１７２】
超並列シーケンシング（ＭＰＳ）を、第１６染色体のＢＦＩＥ領域に連鎖を示した家族１及び５のそれぞれの１個体について実施した。本シーケンシングによって、脳で発現する遺伝子であるＡ２ＬＰ、ＡＲＭＣ５及びＢＣＫＤＫの特有のバリアントが家族５の個体で同定された。ＡＲＭＣ５及びＢＣＫＤＫのバリアントは、これらの家族で表現型とともに分離し、これらの遺伝子を、第１６染色体への連鎖と一致しているＢＦＩＥ家族のさらなる１０人の患者で、サンガーシーケンシング法によってスクリーニングした。さらなる特有のコーディングバリアントが１つだけしか同定されなかったので、これらの遺伝子のいずれもＢＦＩＥの原因遺伝子ではないと結論した。ＭＰＳは既定の判断基準を使用して病原性変異を特定できなかったことから、本技術を使用して捕獲及びシーケンシングするのが困難であると予測された配列に分析を移した。ＰＲＲＴ２の一部は、このカテゴリーに入る。
【０１７３】
ＰＲＲＴ２バリアントのシーケンシング及びスクリーニング
ＢＦＩＥ又はＩＣＣＡを罹患する２３家族の発端者を、ＰＲＲＴ２（ＮＭ＿１４５２３９．２）のコーディング領域についてダイレクトサンガーシーケンシング法によってシーケンシングした。２３家族のうちの１９家族（８３％）から変異を特定した。変異は、２つのフレームシフト（ｃ．６２９−６３０ｉｎｓＣ、ｐ．Ｐ２１０ｆｓＸ１５、及びｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣ、ｐ．Ｒ２１７ｆｓＸ８）及び２つのスプライス部位変異（ＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ｔ、ＩＶＳ２＋５Ｇ＞Ａ）を含んでおり、これらの変異はそれぞれ、タンパク質トランケーションを引き起こすことが予想される（図２）。第五の変異はミスセンス変異のｃ．９５０Ｇ＞Ａ、ｐ．Ｓ３１７Ｎであり、この変異は、ゼブラフィッシュからヒトまで進化的に保存されているＰＲＲＴ２膜貫通ドメインのアミノ酸残基を変化させ、ＰＲＲＴ２タンパク質は脊椎動物のみに見出される。このミスセンス変異の病原性は、PolyPhen-2によっておそらく損傷を与えると予想され、ソーティングトレラントフロムイントレラント（ＳＩＦＴ, Sorting Tolerant from Intolerant）アルゴリズム（http://sift.jcvi.org/）によってトレラントでないと予想される、ｐ．Ｓ３１７Ｎ置換によって支持される。
【０１７４】
家族員及びコントロールを、ｃ．６２９−６３０ｉｎｓＣ及びｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣ変異についてダイレクトシーケンシングによって分析した。ＩＶＳ２＋１及びＩＶＳ２＋５変異に関するコントロール及び家族員を、LightScanner（登録商標）（Idaho Technology社、Salt Lake City、Utah）を使用して、高解像度融解（ＨＲＭ, High-Resolution Melting）分析によってスクリーニングした。ｃ．９５０Ｇ＞Ａ変異に関するコントロールをLightScannerによってスクリーニングし、家族員を、サンガー法でシークエンシングした。ＰＲＲＴ２変異は、ＢＦＩＥ又はＩＣＣＡ（ＢＦＩＥ及びＰＫＣ）表現型とともに１９家族のそれぞれで分離し（図１、表２）、９２のコントロール又はｄｂＳＮＰ中には存在しなかった。サンガーシーケンシング及びスクリーニングに使用したプライマー配列及びＰＣＲ条件は、請求に応じて入手可能である。
【０１７５】
【表２】
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【０１７６】
ＰＲＲＴ２変異が分離している１９家族で、合計で、変異を有するＢＦＩＥ又はＩＣＣＡを罹患する７７個体が存在した。加えて、見かけ上は罹患していない変異保因者が２３存在した（図１）。しかし、乳児発作の出現に関する正確な病歴が高齢の家族員から必ずしも得ることができたとは限らず、このことによって、正確な変異浸透レベルを測定するのが困難になった。乳児発作を罹患するわずか１個体（４−III−１）のみが家族性のＰＲＲＴ２変異を欠いていたため、この個体は表現型模写と考えられた。本発明者らは、コントロールでの２つの非同義ＰＲＲＴ２配列バリアント、すなわち６／１１５（５．２％）のオーストラリア人のコントロール及び１患者におけるｃ．６４７Ｃ＞Ｔ、Ｐ２１６Ｌ（ｒｓ７６３３５８２０）、並びに１／９７（１％）のセファルディ系ユダヤ人のコントロールにおけるｃ．６４４Ｃ＞Ｇ、Ｐ２１５Ｒも観察した。上記のように、第１６染色体連鎖区間のシーケンスキャプチャー及び超並列シーケンシングによって、いかなる他の潜在的に有害な変異も家族１及び５で特定されなかった。
【０１７７】
本発明者らの結果は、ＰＲＲＴ２中の変異がＢＦＩＥを引き起こすことを示す。本発明者らは、２つの異なる障害、ＢＦＩＥ及びＩＣＣＡは対立形質であること、すなわち、同一遺伝子中の変異によって引き起こされることも示した。ＢＦＩＥ家族の１４／１７（８２％）及びＩＣＣＡ家族の５／６（８３％）でのＰＲＲＴ２変異の検出は、この遺伝子の変異がこれらの特異なてんかん症候群の最も一般的な原因であることを示す。変異陽性１９家族のうちの１５家族（７９％）は、同一変異、ｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣを保有し、この変異はＢＦＩＥ１２家族及びＩＣＣＡ３家族で見られる。家族の多様な民族起源（オーストラレーシア人／西欧人（１２）、スウェーデン人（１）及びセファルディ系ユダヤ人のイスラエル人（２））を考えれば、この変異は、少なくとも幾つかの家族で独立に生じることが最も可能性が高い。さらに、家族５〜８（オーストラリア人）並びに１０及び１１（セファルディ系ユダヤ人の）におけるＰＲＲＴ２に密接に連鎖した３つのマイクロサテライトマーカーのジェノタイピングは、いかなる共通のハプロタイプも示さなかった。
【０１７８】
ｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣ変異に関しては、このフレームシフト変異は、それが起こる配列構成が原因である可能性が高い。シトシン塩基の挿入は、４つのグアニン（Ｇ）に隣接する９つのシトシン（Ｃ）塩基のホモポリマー中に起こる。このＤＮＡ配列は、ヘアピンループ構造を形成する可能性があり、これは、ＤＮＡ複製の間にＤＮＡポリメラーゼスリッページ及び余分なシトシンの挿入をおそらく導く。興味深いことに、この配列中に見られた２つの置換多型のうちの１つ、ｃ．６４７Ｃ＞Ｔ、Ｐ２１６Ｌは、患者よりもコントロールについてより高い割合で存在していた。この多型を保有するアレルは、この多型がポリシトシン域を変化させ、そのサイズを９から６塩基対に縮小させるので、挿入変異に対して保護されている可能性がある。
【０１７９】
家族１及び５での変異は、第１６染色体のＢＦＩＥ領域由来の配列の濃縮に使用したキャプチャーアレイ上でのＰＲＲＴ２のカバー度にもかかわらず、超並列シーケンシングによって検出されなかった。家族５における共通の挿入変異を含有するリードの割合は、変異呼び出しのために設定した閾値未満であった。さらに、ホモポリマー域に対するリードは様々な数のシトシンを示した。これは、ＭＰＳは、特にホモポリマー域又はＧ／Ｃリッチ領域などの「困難な」配列において、必ずしも変異検出の確固たる方法とは限らないことを説明する。
【０１８０】
ＢＦＩＥでのＰＲＲＴ２変異の発見は、ＰＲＲＴ２タンパク質がてんかんに関与することを明らかにする。３つの異なる変異がＩＣＣＡを罹患する家族で検出されたので、この症候群は共通の挿入変異に起因するだけではない。なぜ家族内において、１個体が、ＢＦＩＥ若しくはＰＫＣのいずれか又はこれらの表現型の両方を経験しなければならないのか不明のままである。発症年齢及び解剖学的基質の点から、その多面発現は注目すべきである。遺伝的背景又は単一変異の表現型発現を改変する第二のＰＲＲＴ２アレルの影響は、考えられる説明である。そうした可変性の発現度の根底にある機構は、まだ分かっていない。最近、血族のイラン人家族でのＰＲＲＴ２のホモ接合性フレームシフト変異が、知的障害（ＩＤ, intellectual disability）を有する個体において報告された。表現型異種性はてんかんに関与する遺伝子にとって珍しくないが、異なる神経回路網を係合するてんかん及び運動障害を考える場合、むしろ稀である。本発明者らは、てんかん及び認知機能障害は、発作に関連する脳領域でのＰＲＲＴ２の初期の発現及び運動に関連する領域での後期の発現から生じる可能性があると推測する。
【０１８１】
ＰＲＲＴ２変異を有する一部の個体で、乳児発作又はＰＫＣのいずれかは出現するが両方の障害は発現しないことは、表現型を現す発達段階のうちの１つでの不完全な変異浸透度に起因する可能性がある。てんかんと運動障害の遺伝的重複は、発作性の運動誘発性ジスキネジアとてんかんの両方が家族及び個体で同時に起こる１型グルコース輸送体欠損症候群で最近認識されている。ＰＲＲＴ２の同定によって、幼児期のてんかんについての分子基盤に関する本発明者らの知識が著しく拡大し、てんかんの発病における非イオンチャネル遺伝子の役割の重要性が拡大し続けている。この発見はまた、診断、治療及び予測を方向づけるための分子ベースの明確な分類フレームワークを完成させるのに役立つ。
【実施例２】
【０１８２】
ＰＲＲＴ２遺伝子のさらなる変異スクリーニング
実施例１に記載されているものと同一の変異検出法を使用して、さらなる対象及び家族をＰＲＲＴ２遺伝子中の変異についてスクリーニングした。本スクリーニングは、１０の散発性乳児発作症例、ＩＣＣＡ５家族、ＢＦＩＥ７家族、ＰＫＣ５家族及び所与の表現型を有さない３家族を含んでいた。１２家族のうちの１１家族の系図を図４に示す。
【０１８３】
変異スクリーニングによって、ＢＦＩＥ７家族のうちの５家族における対象、及びＩＣＣＡ５家族の全てがＰＲＲＴ２遺伝子中の変異を有していることが確証された。全てがｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣ変異を有していた。
【０１８４】
まとめると、現在までに実施した変異スクリーニングは、発作障害及び運動障害を罹患する個体において、ＰＲＲＴ２遺伝子中に５つの変異を特定した。最も共通する変異は、トランケートされたＰＲＲＴ２ポリペプチド（ｐ．Ｒ２１７ｆｓＸ２２４）を生じさせるｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣ変異であった。この変異は、遺伝子中に変異を保有する対象の８６％で特定されたので、この変異は、対象の発作若しくは運動障害を診断若しくは予測する、又は変異の保因者を特定するための決まりきったスクリーニングアッセイの根拠になり得る変異を意味する。
【実施例３】
【０１８５】
発作又は運動障害を罹患する個体を特定するための診断的アッセイ
前述のように、最も共通するＰＲＲＴ２遺伝子変異（ｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣ）の存在に関するスクリーニングは、てんかんなどの発作障害又はＰＫＤなどの運動障害を個体において診断するためのアッセイの根拠になり得る。一例を挙げると、ＰＲＲＴ２のｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣ変異は、オリゴヌクレオチドプライマーの5'-TCACTCACCACCCTCAAA-3'（配列番号１２）及び5'-CATTCGATCCTCCTCAAC-3'（配列番号１３）であって、プライマーのうちの１つがHEXなどの蛍光標識を保持するオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲ増幅、それに続く、ABI genetic analyser又は類似のものを使用するキャピラリー電気泳動によってスクリーニングすることができる。ＰＣＲ増幅は、ｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣ変異を保有しない個体で、８５塩基対の産物を生成する。８５塩基対の産物の配列を以下に示し、及び配列番号１４で表される。
5'-TCACTCACCACCCTCAAAAAAATCCCCCCCAGCCAATGGGGCC
CCCCCCCGAGTGCTGCAGCAGCTGGTTGAGGAGGATCGAATG-3'
【０１８６】
ＰＲＲＴ２遺伝子のこの領域のいかなる挿入又は欠失も、当技術分野で既知の決まりきった手順（キャピラリー電気泳動など）によって検出されるＰＣＲ産物長の変化として見られる。検出されたＰＣＲ産物長のいかなる変化も、変異の種類を特定するために、ＰＣＲ産物をシーケンシングすることによってさらに調査することができる。
【０１８７】
発作又は運動障害を罹患する個体についてスクリーニングするための診断的アッセイにおけるＰＲＲＴ２遺伝子の使用は、ｃ．６４９−６５０ｉｎｓＣ変異を含有するＰＲＲＴ２領域に焦点を合わせる必要はない。実施例１で示すように、本発明者らによってＰＲＲＴ２遺伝子中に４つの他の変異、すなわちｃ．６２９−６３０ｉｎｓＣ、ＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ｔ、ＩＶＳ２＋５Ｇ＞Ａ及びｃ．９５０Ｇ＞Ａが発見された。上記のようなＰＣＲベースアッセイを利用して、１又は２以上のこれらの変異を特異的に特定することもできる。
【０１８８】
診断目的で用いることができるさらなるアッセイは、上で詳述されている、多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）アッセイである。このアッセイを使用して、ＰＲＲＴ２遺伝子の特定の領域で、又はＰＲＲＴ２遺伝子全体にわたって欠失及び部分的な重複を検出することができる。例えば、表３に収載されるプローブを参照プローブ混合物（MRC-Holland社のSALSA MLPA probemix P300-A2 Human DNA Reference-2）と併せて使用して、ＰＲＲＴ２のいかなる領域にも影響を及ぼす大きな欠失及び重複を検出することができる。プローブ混合物及びＭＬＰＡの調製は、MRC-Holland社の「合成ＭＬＰＡプローブの設計」及び「多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ（登録商標））一般プロトコル」中に提供されるプロトコルに従って行うことができる。
【０１８９】
【表３】
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【実施例４】
【０１９０】
ＰＲＲＴ２変異の機能解析
タンパク質機能及び最終的には細胞機能に対して特定のＰＲＲＴ２変異が有する影響を測定するために、様々な方法を用いることができる。それらの方法のうちの１つは、分析される特定のＰＲＲＴ２変異を内部に有する、遺伝子改変マウスなどの遺伝子改変動物の作製を含む。遺伝子改変動物の作製方法は、上で詳述されている。
【０１９１】
本明細書に記載の本発明は、明確に記載されているもの以外は、変形及び修正を受けやすいことを当業者なら理解するであろう。本発明は、全てのそうした変形及び修正を含むことを理解されたい。本発明はまた、本明細書で個々に又はまとめて言及される又は示される全てのステップ、特色、組成物、及び化合物、並びに任意の２つ以上のステップ又は特色の全ての組合せを含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ−Ｄ】
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【図４Ｅ−Ｆ】
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【図４Ｇ−Ｈ】
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【図４Ｉ−Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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