(57)【要約】本発明は、シュウ酸を代謝することができるヒト腸起源の乳酸菌およびビフィズス菌の株の選択に関する。さらに、本発明は、該細菌株を含む、食品組成物または栄養補助食品または医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
種・ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei) またはラクトバチルス・ガッセリ(Lactobacillus gasseri) に属し、かつ、60％を超える量で、シュウ酸および/またはその塩を分解することができる、細菌株。
【請求項２】
該株が、70％を超える量で、シュウ酸および/またはその塩を分解することができる、請求項1に記載の株。
【請求項３】
種・ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei) に属する該株が、ラクトバチルス・パラカゼイ種パラカゼイ(L. paracasei spp. paracasei ) LPC 09 DSM 24243である、請求項 1または2に記載の株。
【請求項４】
種・ラクトバチルス・ガッセリ(Lactobacillus gasseri) に属する該株が、株・ラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 01 DSM 18299および株・ラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 02 DSM 18300を含む群から選択される、請求項 1または2に記載の株。
【請求項５】
種・ラクトバチルス・ガッセリ(Lactobacillus gasseri) に属する該株が、株・ラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 01 DSM 18299 および株・ラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 02 DSM 18300からなる群から選択される、請求項 1または2に記載の株。
【請求項６】
高シュウ酸尿症、尿石症、腎不全、心臓病、腎臓結石、憩室症および憩室炎の予防的および/または治療的処置において使用するための、細菌組成物を含む、食品組成物または栄養補助食品または医療機器または医薬組成物であって、該細菌組成物が、請求項1-5に記載の少なくとも一つの細菌株を含む、食品組成物または栄養補助食品または医療機器または医薬組成物。
【請求項７】
該細菌組成物が、株・ラクトバチルス・パラカゼイ種パラカゼイ(L. paracasei spp. paracasei ) LPC 09 DSM 24243を含む、請求項 6に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
該細菌組成物が、株・ラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 01 DSM 18299および株・ラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 02 DSM 18300を含む、請求項6または7 に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
該細菌組成物がさらに、株・ラクトバチルス・ アシドフィラス(L. acidophilus) LA02 DSM 21717および株・ラクトバチルス・ アシドフィラス(L. acidophilus) LA 07 DSM 24303を含む、請求項6-8のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
該細菌組成物が、ラクトバチルス・パラカゼイ種パラカゼイ(L. paracasei spp. paracasei ) LPC 09 DSM 24243、ラクトバチルス・ アシドフィラス(L. acidophilus) LA02 DSM 21717およびラクトバチルス・ アシドフィラス(L. acidophilus) LA 07 DSM 24303からなる、請求項6-9のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
該組成物がさらに、フラクトオリゴ糖およびイヌリンを含む、請求項6-10のいずれかに記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シュウ酸(oxalic acid)および/またはその塩(シュウ酸 (oxalates))を代謝することができる、ヒト腸起源の乳酸菌株およびビフィズス菌の選択に関する。さらに、本発明は、該細菌株を含む、食品組成物または栄養補助食品または医療機器(medical device)または医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
シュウ酸(oxalate)(シュウ酸(oxalic acid)の塩)は、植物界において至るところに存在する化合物であり、すべてのヒトの食物において広く存在する。1日摂取量は70から920 mg (平均 495 mg 〜 5.6 mM)の範囲であるが、これらの値は菜食主義者の食事においては容易に上回る。 
【０００３】
シュウ酸(oxalic acid) (ジカルボン酸)は、もっとも高度に酸化された有機化合物の一つであり、したがって、カチオン、特に、Ca2+イオンのための強力なキレート剤として作用する。この性質のために、シュウ酸(oxalic acid)の塩 (シュウ酸(oxalates))は、分解産物反応およびエネルギー産生においては非常にわずかの有用性しかない。さらに、シュウ酸(oxalic acid)は、生物の大多数にとって、特に哺乳類にとって毒性である。
【０００４】
この理由のため、ヒトにおけるシュウ酸(oxalic acid)およびシュウ酸(oxalates)の蓄積は、一連の病状を引き起こし、悪化させることができ、なかでも言及すべきは、高シュウ酸尿症、尿石症、腎不全、心筋症(cardiomyopathies)およびその他の心疾患である。特に、シュウ酸(oxalic acid)はカルシウムと一緒になって、対応するシュウ酸カルシウムを形成し、シュウ酸カルシウムは、診断された腎臓結石の70％を超えるものの原因である不溶性の塩である。さらに、シュウ酸(oxalic acid)は、腸粘膜に影響を及ぼす強力な炎症性物質である。それゆえ、内腔におけるこの酸の過剰の存在は、上皮の天然のバリア機能を、その透過性を変化させることにより損ない得、その結果として、シュウ酸(oxalate)の吸収の増加を誘発する。特に、結腸は、シュウ酸(oxalate)の吸収の主な部位であり、正常な生理的条件において3-5％の吸入をする。腸管腔におけるシュウ酸(oxalate)を低下させることは、それゆえ吸収を低下させることに貢献しうる。これはしたがって、血漿および尿におけるシュウ酸(oxalates)の濃度の低下を導き得、したがってその有害性を軽減する。 
【０００５】
さらに、血液における高レベルのシュウ酸(oxalates)は、憩室症または憩室炎を導きうる。「憩室疾患(diverticular disease)」としても知られる憩室症は、結腸における憩室によって特徴付けられる病状であり;これらは結腸の壁における筋層の相対的に弱い領域を介する結腸の粘膜および粘膜下層の外転(eversion)である。憩室は、明らかにS状結腸においてより一般的であり、S状結腸は、より大きい圧力によって特徴付けられる腸の部分であり、かかる圧力は憩室の形成を促進する因子である。憩室炎は一以上の憩室の炎症によって特徴付けられる、消化管の病状である。憩室炎の症例の大多数は、結腸(特に、下行結腸およびS状結腸)において集中して局在する。
【０００６】
それゆえ、シュウ酸(oxalates)の高い値に関連する合併症、例えば、高シュウ酸尿症、尿石症、腎不全、心筋症およびその他の心疾患、腎臓結石、憩室症および憩室炎などを回避するように、腸管腔、血漿および尿におけるシュウ酸(oxalates)の量を低下させることを可能にすることが重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特に、二つのタイプの対象の尿におけるシュウ酸(oxalate)のレベルを低下させることを可能にすることが望ましい:
・高シュウ酸(oxalate) 含量の食物を好まない傾向にある高シュウ酸尿(Hyperoxaluric) 対象。
・高シュウ酸(oxalate)含量の食物を好む傾向にある正常シュウ酸尿(Normooxaluric) 対象。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
出願人は、集中した研究活動の後に上記の必要性に対する回答を提供し、研究活動の最後には、非常に膨大なセットの株から、属・ラクトバチルス(Lactobacillus)およびビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) に属する細菌株の選択を同定した; 該株は、シュウ酸(oxalates)を定量的に分解する顕著な能力を示す。選択された株は、シュウ酸(oxalate)をエネルギー源として利用する能力を示し、該シュウ酸(oxalate)が本来みられるべき環境からそれを除去する。それゆえ、選択された株は、シュウ酸(oxalates)を分解することができる。
【０００９】
本発明の対象は、添付の独立請求項において開示されるように、属・ラクトバチルス(Lactobacillus)およびビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) に属し、かつ、シュウ酸(oxalates)を分解する能力を有する細菌株に関する。
【００１０】
本発明の対象はまた、添付の独立請求項において開示されるように、該細菌株を含有する、食品組成物または栄養補助食品または医療機器または医薬組成物にも関する。
【００１１】
本発明の好ましい態様は、以下の詳細な説明において例示されるであろう。 
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図 1は、SPE 精製の前(A)および後(B)の、5 mMのシュウ酸(oxalate)を含む培地についてのクロマトグラムの間の比較を示す。
【図２】図 2は、5 mMのシュウ酸(oxalate)を含む培地についてのクロマトグラム(陽性参照(positive reference))を示す。
【図３】図 3は、細菌株・ビフィドバクテリウム・ブレベ(B. breve) BR03 DSM 16604についてのクロマトグラムを示す。
【図４】図 4は、細菌株・ラクトバチルス・パラカゼイ種パラカゼイ(L. paracasei spp. paracasei ) LPC09 DSM 24243についてのクロマトグラムを示す。
【図５】図 5は、株・ラクトバチルス・パラカゼイ種パラカゼイ(L. paracasei spp. paracasei ) LPC 09 DSM 24243が、その他の炭素源 (繊維(fibres)) がそれぞれ添加された、無糖 MRS 培地 (炭素源)において培養された場合の、時間 (T= 0、3、6、8 および10 時間)の関数として得た酸性化曲線(acidification curves) (pH 値)を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
出願人は、属・ラクトバチルス(Lactobacillus)およびビフィドバクテリウム(Bifidobacterium) に属する株の培養物のシュウ酸(oxalate)分解能力を同定および定量することができる方法を開発した。
【００１４】
出願人は、以下の細菌株が、エネルギー源としてシュウ酸(oxalates)を使用する確かな能力を有することを見出した: 
(i)受託番号DSM 24243にて23.11.2010に、Probiotical SpA of Novara社 (イタリア) によって寄託されたラクトバチルス・パラカゼイ種パラカゼイ(L. paracasei spp. paracasei ) LPC 09。
(ii) 受託番号DSM 18299にて24.05.2006に、Probiotical SpA of Novara社 (イタリア) によって寄託されたラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 01。
(iii) 受託番号DSM 18300にて24.05.2006に、Probiotical SpA of Novara社 (イタリア) によって寄託されたラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 02。
(iv) 受託番号DSM 24303にて23.11.2010に、Probiotical SpA of Novara社 (イタリア) によって寄託されたラクトバチルス・ アシドフィラス(L. acidophilus) LA 07。
(v) 受託番号DSM 21717にて06.08.2008に、Probiotical SpA of Novara社 (イタリア) によって寄託されたラクトバチルス・ アシドフィラス(L. acidophilus) LA 02。
(vi) 受託番号LMG-P-21021にて16.10.2001に、寄託機関 BCCM-LMG (ベルギー)に、Mofin Srl of Novara社 (イタリア) によって寄託されたラクトバチルス・プランタラム(L. plantarum) LP 01。
(vii) 受託番号DSM 23879にて05.08.2010に、 Probiotical SpA of Novara社 (イタリア) によって寄託されたラクトバチルス・ロイテリ(L. reuteri) LRE 03。
(viii) 受託番号DSM 23878にて05.08.2010に、Probiotical SpA of Novara社 (イタリア) によって寄託されたラクトバチルス・ロイテリ(L. reuteri) LRE 02。
(ix) 受託番号DSM 16604にて16.07.2004に、Probiotical SpA of Novara社 (イタリア) によって寄託されたビフィドバクテリウム・ブレベ(B. breve) BR 03。
(x) 受託番号DSM 16603にて20.07.2004に、Probiotical SpA of Novara社 (イタリア) によって寄託された ビフィドバクテリウム・ロンガム(B. longum) BL 03。
(xi) ATCC パブリック・コレクション(public collection)にて入手可能な、ラクトバチルス・ラムノサス(L. rhamnosus) GG、ATCC 53103。
(xii) 受託番号DSM 23880にて05.08.2010に、Probiotical SpA of Novara社 (イタリア) によって寄託されたラクトバチルス・ロイテリ(L. reuteri) LRE 04。
(xiii) 受託番号DSM 21981にて14.11.2008に、Probiotical SpA of Novara社 (イタリア) によって寄託されたラクトバチルス・ラムノサス(L. rhamnosus) LR 06。
(xiv) 受託番号DSM 18352にて15.06.2006に、Probiotical SpA of Novara社 (イタリア) によって寄託されたビフィドバクテリウム・ラクティス(B. lactis) BA 05。
(xv) 受託番号DSM 16605にて20.07.2004に、Probiotical SpA of Novara社 (イタリア) によって寄託された ラクトバチルス・ カゼイ種・ラムノーサス(L. casei spp. rhamnosus) LR 04。
【００１５】
好ましい態様において、組成物は、(i)から(xv)によって上記に示されるもののなかから選択される少なくとも一つの株を含むか、あるいは、(i)から(xv)によって上記に示されるもののなかから選択される少なくとも一つの株からなる; 好ましくは、株は、(i)から(viii) によって上記に示されるもののなかから選択される。
【００１６】
本発明の文脈において、「細菌株」は、生細胞および/または死細胞および/またはそれらの器官(parts)、成分/誘導体および/または酵素を意味する。
【００１７】
選択された細菌株は、属・ラクトバチルス(Lactobacillus)に属し、かつ、50％を超える量でシュウ酸(oxalate)を分解し、エネルギー源として利用する能力を有する。有利なことには、該能力は60％を超える。有利なことには、該能力は70％を超える。
【００１８】
選択された細菌株は、種・ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)に属する。好ましい株は、ラクトバチルス・パラカゼイ種パラカゼイ(L. paracasei spp. paracasei ) LPC 09 DSM 24243である。
【００１９】
選択された細菌株は、種・ラクトバチルス・ガッセリ(Lactobacillus gasseri)に属する。いくつかの好ましい株は、ラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 01 DSM 18299 およびラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 02 DSM 18300を含む群から選択されるか、あるいは、ラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 01 DSM 18299 およびラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 02 DSM 18300からなる群から選択される。
【００２０】
選択された細菌株は、種・ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)に属する。いくつかの好ましい株は、ラクトバチルス・ アシドフィラス(L. acidophilus) LA02 DSM 21717およびラクトバチルス・ アシドフィラス(L. acidophilus) LA 07 DSM 24303を含む群から選択されるか、あるいはラクトバチルス・ アシドフィラス(L. acidophilus) LA02 DSM 21717およびラクトバチルス・ アシドフィラス(L. acidophilus) LA 07 DSM 24303からなる群から選択される。
【００２１】
本発明による組成物は、高シュウ酸尿症、尿石症、腎不全、心臓病(cardiopathies)、腎臓結石、憩室症および憩室炎の処置における使用のための、少なくとも一つの細菌株を含む。
【００２２】
組成物は、食品組成物または栄養補助食品または医療機器または医薬組成物でありうる。
【００２３】
高シュウ酸尿症、尿石症、腎不全、心臓病、腎臓結石、憩室症および憩室炎の処置における使用のための組成物は、(i)から(xv)によって上記に示されるもののなかから選択される少なくとも二つの株を含むか、あるいはそれらからなり、好ましくは、株は、(i)から(viii)によって上記に示されるもののなかから選択される。
【００２４】
高シュウ酸尿症、尿石症、腎不全、心臓病、腎臓結石、憩室症および憩室炎の処置における使用のための組成物は、(i)から(v) によって上記に示されるもののなかから選択される少なくとも二つの株を含むか、あるいはそれらからなる。
【００２５】
高シュウ酸尿症、尿石症、腎不全、心臓病、腎臓結石、憩室症および憩室炎の処置における使用のための組成物は、以下を含むか、あるいは、以下からなる:
(a)ラクトバチルス・パラカゼイ種パラカゼイ(L. paracasei spp. paracasei ) LPC 09 -DSM 24243;または、
(b)ラクトバチルス・パラカゼイ種パラカゼイ(L. paracasei spp. paracasei ) LPC 09 -DSM 24243およびラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 01 -DSM 18299; または、
(c)ラクトバチルス・パラカゼイ種パラカゼイ(L. paracasei spp. paracasei ) LPC 09 -DSM 24243およびラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 02 -DSM 18300; または、
(d)ラクトバチルス・パラカゼイ種パラカゼイ(L. paracasei spp. paracasei ) LPC 09 -DSM 24243、ラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 01 -DSM 18299およびラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 02 -DSM 18300; または、
(e)ラクトバチルス・パラカゼイ種パラカゼイ(L. paracasei spp. paracasei ) LPC 09 -DSM 24243、ラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 01 -DSM 18299、ラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 02 -DSM 18300およびラクトバチルス・ アシドフィラス(L. acidophilus) LA 07 -DSM 24303; または、
(f)ラクトバチルス・パラカゼイ種パラカゼイ(L. paracasei spp. paracasei ) LPC 09 -DSM 24243、ラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 01 -DSM 18299、ラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 02 -DSM 18300およびラクトバチルス・ アシドフィラス(L. acidophilus) LA 02 -DSM 21717; または、
(g)ラクトバチルス・パラカゼイ種パラカゼイ(L. paracasei spp. paracasei ) LPC 09 -DSM 24243、ラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 01 -DSM 18299、ラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 02 -DSM 18300、ラクトバチルス・ アシドフィラス(L. acidophilus) LA 07 -DSM 24303およびラクトバチルス・ アシドフィラス(L. acidophilus) LA 02 -DSM 21717。
【００２６】
上記の組成物のすべては、そして特に上記列挙の組成物(a)から(g)は、さらにフラクトオリゴ糖(FOS) および/またはイヌリンを含んでいてもよい。フラクトオリゴ糖(FOS) および/またはイヌリンは、組成物の重量に対して1から30重量％、好ましくは3から15重量％、さらにより好ましくは5から10重量％から構成される量にて含まれる。
【００２７】
本発明の対象は、種・ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)またはラクトバチルス・ガッセリ(Lactobacillus gasseri)に属し、かつ、シュウ酸(oxalic acid)および/またはその塩を60％を超える量で分解することができる細菌株に関する。該株は、シュウ酸(oxalic acid)および/またはその塩を70％を超える量で分解することができる。種・ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei) に属する該株は、ラクトバチルス・パラカゼイ種パラカゼイ(L. paracasei spp. paracasei ) LPC 09 DSM 24243である。種・ラクトバチルス・ガッセリ(Lactobacillus gasseri) に属する該株は、株・ラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 01 DSM 18299および株・ラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 02 DSM 18300を含む群から選択される。種・ラクトバチルス・ガッセリ(Lactobacillus gasseri) に属する該株は、株・ラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 01 DSM 18299 および株・ラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 02 DSM 18300からなる群から選択される。
【００２８】
本発明の対象は、細菌組成物を含む、食品組成物または栄養補助食品または医療機器または医薬組成物に関する; 該細菌組成物は、高シュウ酸尿症、尿石症、腎不全、心臓病、腎臓結石、憩室症および憩室炎の予防的および治療的処置において使用するための、上記の少なくとも一つの細菌株を含む。該細菌組成物は、株・ラクトバチルス・パラカゼイ種パラカゼイ(L. paracasei spp. paracasei ) LPC 09 DSM 24243を含む。該細菌組成物は、株・ラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 01 DSM 18299および株・ラクトバチルス・ガッセリ( L. gasseri) LGS 02 DSM 18300を含む。該細菌組成物はさらに、株・ラクトバチルス・ アシドフィラス(L. acidophilus) LA02 DSM 21717 および株・ラクトバチルス・ アシドフィラス(L. acidophilus) LA 07 DSM 24303を含む。該細菌組成物は、ラクトバチルス・パラカゼイ種パラカゼイ(L. paracasei spp. paracasei ) LPC 09 DSM 24243、ラクトバチルス・ アシドフィラス(L. acidophilus) LA02 DSM 21717 および/またはラクトバチルス・ アシドフィラス(L. acidophilus) LA 07 DSM 24303からなる。該組成物はさらに、フラクトオリゴ糖および/またはイヌリンを含む。
【実施例】
【００２９】
実験部分
1. 分析した細菌株
属・ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)およびラクトバチルス(Lactobacillus) に属する約 70 株を研究した;それらは、Probiotical SpA of Novara社の内部株コレクションおよび国際コレクション、例えば、DSMZ -ドイツから得られたか、または文献においてみられたものであった。選択された株を表1に示し、これは、試験した細菌株によるシュウ酸(oxalate) 分解のパーセンテージを示す。実験は、5 mM シュウ酸アンモニウムを含有する培地を用いて行った。
【００３０】
表1
【表１−１】
2014513977.tif 000002
【００３１】
【表１−２】
2014513977.tif 000003
【００３２】
表1にて列挙される、細菌株 (i)から(v)、(vii)から(x) および(xii)から(xv) は、Probiotical SpA of Novara社 (イタリア)によって寄託された。株 (vi)は、Mofin Srl of Novara社 (イタリア)によって寄託された。株 (xi)は、ATCC コレクションから入手可能である。すべての株は、ブダペスト条約によって確立された条件下で入手可能であり、一般に公開されている。
【００３３】
2.採用された培養条件 
分析に供される株の調製物は、適切な増殖に到達するまで37℃でインキュベートされたMRS 培養液 (+1％ cys-HCl、嫌気生活、ビフィッド(bifids)のため)における一連の三連続の継代培養にあった。この培養戦略は株の完全な活性化を可能とする。株を次いで、具体的には、5mM シュウ酸アンモニウム (シュウ酸(oxalic acid)の平均 1日摂取量に等しい量)を補充した、乳酸菌およびビフィズス菌の最大増殖を保証すると考えられる実験培地において、同一のパーセンテージの接種材料 (2％)にて接種した。このようにして調製した培養物を24 時間37℃でインキュベートした。
【００３４】
3. サンプルのSPE (固相抽出) 精製 
インキュベーション期間の最後に、ブロス培養物(broth cultures)を遠心分離に供し、上清を0.22μm フィルターを介して濾過した。サンプルのHPLC 注入により、不明確なクロマトグラフィープロファイルが明らかになった。特に、シュウ酸(oxalic acid)のクロマトグラフィーピークは、サンプル中に存在するグルコースピークとオーバーラップするようであった。前記の問題を是正するために、サンプルを、有機酸に対して特異的なSPE (固相抽出) カラムを用いて精製した。
【００３５】
SPE カラムによる精製のためのプロトコールには、最高の最終収率を得るために最適化工程が必要であった。特に、カラム調整(conditioning) 工程および分析物の最終溶出に関して異なる試薬を用いた。この固相精製により、図 1 A-Bにおいてみることができるようにシュウ酸(oxalic acid)の顕著によりクリーンなクロマトグラフィーピークを得ることが可能となった。用いたプロトコールは以下の通りであった：
SPE カラムのタイプ: Phenomenex Strata-XA
活性化: 1 mlのメタノール
調整(conditioning): 2 mlのギ酸ナトリウム(sodium formiate) 20 mM
サンプルローディング: 1 ml サンプル
不純物の洗浄: 1 ml 酢酸アンモニウム 25 mM ＋ 1 ml メタノール
溶出: 2x500 μl HCl 1 M ＋ 2x500 μl HCl 3 M
【００３６】
4. HPLC 分析
各個々の株によって分解されたシュウ酸(oxalate)の量を HPLCによって分析し、T0 (発酵前)にて培地 (5 mM)に存在するシュウ酸(oxalate) 濃度と微生物の増殖後の残余濃度との間の相違を計算した。個々の株の結果は、T0におけるシュウ酸(oxalate) 濃度を100とみなしてパーセンテージとして表す。例えば、株・ラクトバチルス・パラカゼイ種パラカゼイ(L. paracasei spp. paracasei ) LPC 09 DSM 24243の結果は、およそ 70％に等しく、それがおよそ 3.5 mMのシュウ酸 (oxalate) (5 mMの70％)に等しいシュウ酸(oxalate) 量を利用することができることを示す。用いたHPLC プロトコールは以下の通りであった:
カラムのタイプ: Phenomenex Hydro-RP 250 x 4.6 mm
検出器のタイプ: 220 nm での読み取りのUV-Vis 
溶出流速: 0.7 ml/分
注入体積: 20 μl
カラム温度: 30℃
溶出のタイプ: 定組成(isocratic)
移動相: 20 mM リン酸カリウム pH 2.0
【００３７】
シュウ酸(oxalic acid)に対して高い分解活性を示した、属・ラクトバチルス(Lactobacillus) に属する細菌株は、 (i)から(v)によって上記に示されるものである。 
【００３８】
A.株・ラクトバチルス・パラカゼイ種パラカゼイ(L. paracasei spp. paracasei ) LPC 09 DSM 24243についての酸性化曲線の判定
株 LPC09を、実験に先立ってMRSにおける継代培養により再活性化し、好気生活下で37℃でインキュベートした。再活性化工程は、実験の前に三回繰り返し、一晩のインキュベーションを伴った。三回目の再活性化工程の最後に、細胞をペレットにし、滅菌水で洗浄し、繊維(fibre)を補充した培地への接種の前に再懸濁した。使用した培地は、それぞれ以下を補充した無糖 MRS (炭素源)に基づくものであった:
- グルコース (121℃で15秒間の加熱処理によって滅菌した溶液)、対照培地。
- フラクトオリゴ糖- FOS (0.20 μl フィルターでの濾過によって滅菌した溶液)。
- GOS-Gl、-グルコースの残余(residual)を伴うガラクト-オリゴ糖(0.20 μl フィルターでの濾過によって滅菌した溶液)。
- GOS-Gal、-ガラクトースの残余を伴うガラクト-オリゴ糖 (0.20 μl フィルターでの濾過によって滅菌した溶液)。
- XOS、- キシロ-オリゴ糖(0.20 μl フィルターでの濾過によって滅菌した溶液)。
- Larex、- カラマツ繊維(fibre) (121℃で15秒間の加熱処理によって滅菌した溶液)。 
- イヌリン (121℃で15秒間の加熱処理によって滅菌した溶液)。
【００３９】
すべての培地についての炭素源の最終濃度は、20 g/lであった。
【００４０】
このように調製した培地に次いで、株 LPC09を4％のパーセンテージにて接種し、37℃で好気生活下でインキュベートした。
【００４１】
時間 0および3、6、8および10 時間目に、図 5のグラフにおいて示される酸性化曲線を構築するためにpH 測定を行った。
【００４２】
表 2は、株・ラクトバチルス・パラカゼイ種パラカゼイ(L. paracasei spp. paracasei ) LPC 09 DSM 24243 を上記の培地中で培養した時の、時間 (T= 0、3、6、8および10 時間)の関数として得た酸性化曲線(pH 値)を示す。
【００４３】
表 2
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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