(57)【要約】本発明は、ダビガトランのプロドラッグ誘導体、疾患、とくに血栓性疾患、発作、心筋梗塞および／または心房細動および心不整脈ならびにあらゆる病因の腫瘍性疾患の処置および／または予防におけるそれらの使用に関する。
2014521619.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
2014521619.tif 000018
式中、
Ｒ１は、−Ｈ、分枝状または非分枝状の、飽和または不飽和の、置換されたまたは非置換の、１〜１２の鎖長を有する炭化水素鎖を表し、および
ｎは、１〜１０を表す、
で表される化合物またはその薬学的に許容し得る誘導体。
【請求項２】
ｎが２を表す、請求項１に記載の化合物．
【請求項３】
Ｒ１がエチルを表す、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物の塩、溶媒和物または塩の溶媒和物。
【請求項５】
疾患の処置および／または予防のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
血栓性疾患の処置および／または予防における使用のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
血栓性事象、とくに静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）の処置および／または予防における使用のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
発作、心筋梗塞および／または心房細動および心不整脈の処置および／または予防における使用のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
あらゆる病因の腫瘍性疾患の処置および／または予防における使用のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
トロンビン時間への持続延長効果、トロンビン阻害効果および／または関連するセリンプロテアーゼへの阻害効果を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１種の化合物を含む薬物。
【請求項１１】
１または２以上の不活性の、非毒性の、薬学的に適した賦形剤と組み合わせた、請求項１〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１種の化合物を含む薬物。
【請求項１２】
１または２以上のさらなる活性剤と組み合わせた、請求項１〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１種の化合物を含む薬物。
【請求項１３】
経口または非経口投与のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１種の化合物を含む薬物。
【請求項１４】
薬物が腸溶性処方物であることを特徴とする、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の薬物。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１種の化合物または請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の薬物を使用した、ヒトまたは動物における血栓性疾患、発作、心筋梗塞および／または心房細動および心不整脈の処置および／または予防のための方法。
【請求項１６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の少なくとも１種の化合物または請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の薬物を使用した、ヒトまたは動物における腫瘍性疾患の処置および／または予防のための方法。
【請求項１７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物の製造方法であって、式（Ａ）
【化２】
2014521619.tif 000019
式中、
Ｒ１は、−Ｈ、分枝状または非分枝状の、飽和または不飽和の、置換されたまたは非置換の、１〜１２の鎖長を有する炭化水素鎖を表す、
で表されるニトリルを、式（Ｂ）
【化３】
2014521619.tif 000020
で表されるアミドキシムに変換し、そうして得られるアミドキシムを、式（Ｃ）
【化４】
2014521619.tif 000021
式中、ｎは、１〜１０を表す、
で表されるジカルボン酸無水物と反応させることにより、式
【化５】
2014521619.tif 000022
で表される化合物に変換することを特徴とする、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ダビガトランのプロドラッグ誘導体、疾患、とくに血栓性疾患、発作、心筋梗塞および／または心房細動および心不整脈ならびにあらゆる病因の腫瘍性疾患の処置および／または予防のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ここ数年、ダビガトランエテキシラート（Pradaxa（登録商標））は、股関節および膝の代替手術後の血栓症防止において、確立されている。１さらに、この活性剤は、さらなる兆候（心房細動、心臓発作後の発作防止および二次防止、急性冠症候群）の分野に認められた。２、３長期的には、さらなる有望な兆候の分野もまた、とくに癌治療のために心血管分野においても考えられる。市場投入の成功にもかかわらず、ダビガトランエテキシラートはまた、その広範の使用を限定し得る好ましくない物質特性を有する。
【０００３】
したがって、ダビガトランエテキシラート、すなわち実際の活性物質であるダビガトランのプロドラッグは、非常に難溶性であり、例えば、薬用製品の利用ならびに調製の両方においていくつかの欠点をもたらす。化合物の溶解度を改善するために、薬用物質を、酒石酸を含有するペレット上に適用するが、この生薬形態を調製するための多額の技術的費用により非常にコストが大きい。５〜７さらに、バイオアベイラビリティには、化合物の難溶性が悪影響を及ぼすので、２個のカプセルからなる薬剤は、今度は患者のコンプライアンスに負の影響を及ぼす。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の目標は、十分な経口バイオアベイラビリティの他に、例えば、改善された溶解度などの改善された物質特性も有する、ダビガトランのプロドラッグを開発することであった。様々なダビガトラン誘導体が、この目的のために合成された。ダビガトランのアミジン官能基のＮ−水酸化により、ダビガトランは、ダビガトランアミドキシム（２）に変換され、消化管からの塩基度の低減および吸収の増強がもたらされた。８さらに、我々の研究の範囲内である特許出願［WO2009095499、DE102008007381］に記載の「アミドキシムのジカルボン酸への共役」プロドラッグ原理について言及する。９このプロドラッグ原理は、ダビガトランに転用され、得られる化合物は、詳細に特徴づけられ、それらのバイオアベイラビリティに関して試験された。
【０００５】
活性剤ダビガトランは、経口で使用できない極めて強力なトロンビン阻害剤である。この理由により、化合物は現在、エテキシラートプロドラッグ（ダビガトランエテキシラート、Pradaxa（登録商標））として使用される。化合物は、経口で使用でき、良好な作用があるにもかかわらず、該化合物は、プロドラッグ原理の適用により、相当な負の特性を有する。非常に難溶性であることは、薬用製品の利用ならびに調製の両方において、いくつかの難点を引き起こす。化合物の溶解度を改善するために、薬用物質を、酒石酸を含有するペレット上に適用するが、この生薬形態を調製するための多額の技術的費用により非常にコストが大きい。５、７、１２さらに、バイオアベイラビリティには、化合物の難溶性が悪影響を及ぼすので、２個のカプセルからなる薬剤は、今度は患者のコンプライアンスに負の影響を及ぼす。上記を踏まえて、本発明は、ダビガトランの既知の医薬品形態と比較して改善された特性を示すダビガトランプロドラッグを提供する課題に基づくものであった。
【０００６】
前記課題は、本発明によると、式（Ｉ）
【化１】
2014521619.tif 000003
式中、
Ｒ１は、−Ｈ、分枝状または非分枝状の、飽和または不飽和の、置換されたまたは非置換の、１〜１２の鎖長を有する炭化水素鎖を表し、および
ｎは、１〜１０を表す、
で表される化合物ならびにその薬学的に許容し得る誘導体により解決される。
【０００７】
好ましい態様において、式（Ｉ）において、ｎは、２を表す。
別の好ましい態様において、式（Ｉ）において、Ｒ１は、エチルを表す。
とくに好ましい態様において、本発明による化合物は、ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）である。他のダビガトランプロドラッグとの比較研究において、ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）は、有利なダビガトランプロドラッグであることを証明した。化合物は、優れた溶解度、適当な安定性および良好な経口バイオアベイラビリティを有する。さらに、プロドラッグは、活性型ダビガトランに容易に変換される。活性化は、エステラーゼならびにモリブデン含有酵素系（ｍＡＲＣ）により続いて行われ、よって、相互作用の危険性を伴うであろうシトクロムＰ４５０酵素から独立している。８、１０、１１
【０００８】
本発明はさらに、前述の式（Ｉ）化合物の塩、溶媒和物または塩の溶媒和物に関する。
本発明はさらに、疾患の処置および／または予防のための、前述の式（Ｉ）化合物に関する。
【０００９】
好ましい態様において、本発明は、血栓性疾患の処置および／または予防における使用のための、前述の化合物に関する。
さらに好ましい態様において、本発明は、血栓性事象、例えば静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）の処置および／または予防における使用のための、前述の式（Ｉ）化合物に関する。
【００１０】
さらに好ましい態様において、本発明は、発作、心筋梗塞および／または心房細動および心不整脈の処置および／または予防における使用のための、前述の式（Ｉ）化合物に関する。
さらに好ましい態様において、本発明は、あらゆる病因の腫瘍性疾患の処置および／または予防における使用のための、前述の式（Ｉ）化合物に関する。
【００１１】
本発明はまた、トロンビン時間への持続延長効果、トロンビン阻害効果および／または関連するセリンプロテアーゼへの阻害効果を有する前述の式（Ｉ）化合物の少なくとも１種を含む薬物に関する。
さらに、本発明はまた、適当な場合、不活性の、非毒性の、薬学的に適した賦形剤と組み合わせた前述の式（Ｉ）化合物の少なくとも１種を含む薬物に関する。
【００１２】
本発明はさらにまた、さらなる活性剤と組み合わせた前述の式（Ｉ）化合物の少なくとも１種を含む薬物に関する。
本発明はさらにまた、経口または非経口投与のための薬物に関する。
【００１３】
本発明はまたさらに、腸溶性処方物である上記の薬物に関する。さらに、本発明は、前述の式（Ｉ）化合物の少なくとも１種または前述の薬物の１種を使用した、ヒトまたは動物における血栓性疾患、発作、心筋梗塞および／または心房細動および心不整脈の処置および／または予防のための方法に関する。
さらに、本発明は、前述の式（Ｉ）化合物の少なくとも１種または前述の薬物の１種を使用した、ヒトまたは動物における腫瘍性疾患の処置および／または予防のための方法に関する。
【００１４】
本発明はまた、請求項１〜４のいずれか一項に記載の本願化合物の製造方法であって、式（Ａ）
【化２】
2014521619.tif 000004
式中、
Ｒ１は、−Ｈ、分枝状または非分枝状の、飽和または不飽和の、置換されたまたは非置換の、１〜１２の鎖長を有する炭化水素鎖を表す、
で表されるニトリルを、式（Ｂ）
【化３】
2014521619.tif 000005
で表されるアミドキシムに変換し、そうして得られるアミドキシムを、式（Ｃ）
【化４】
2014521619.tif 000006
式中、ｎは、１〜１０を表す、
で表されるジカルボン酸無水物と反応させることにより、式
【化５】
2014521619.tif 000007
で表される化合物に変換することを特徴とする、前記方法に関する。
【００１５】
本発明は、ダビガトランエテキシラートと比較して改善された特性を有する新規のダビガトランプロドラッグの開発に関与する。我々の系統的開発および続く特性評価内で、新規のプロドラッグであるダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）は、極めて適したプロドラッグであることを証明した。プロドラッグは、ダビガトランエテキシラートに匹敵する良好な溶解度、迅速な活性化および経口バイオアベイラビリティなどの優れた特性を特徴とする。このプロドラッグの決定的な利点は、それらの改善された物質特性にある。大幅に増加した溶解度のため、Pradaxa（登録商標）が必要な複雑な医薬処方物を調剤し得、何よりも相当な製造コストの削減をもたらす。さらに、別の生薬処方物は、１つの錠剤またはカプセルで経口投与されるダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）の必要とされる活性用量を可能にし、患者コンプライアンスにおける相当な改善をもたらすことができる。さらに、化合物の非経口適用（注射、点滴など）も、プロドラッグの良好な溶解度により考えられ、これらは、Pradaxa（登録商標）を使用するときは不可能である。
【００１６】
本明細書中に記載のプロドラッグにより改善することができるさらなる面は、ダビガトランエテキシラートが示す副作用、とくに消化管出血の発生の低減である。
【００１７】
要約すると、ダビガトランのプロドラッグが、一般的なプロドラッグ原理［WO2009095499、DE102008007381］を適用することにより得られ得、従来の既知の薬用物質であるダビガトランエテキシラートからの相当な改善を示す。ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）を使用するとき、一方で、製造コストを大きく削減することができ、他方で臨床応用を決定的に最適化することができる。
【００１８】
合成
ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）を、図１に従い、ダビガトランニトリル（３）から出発し、ダビガトランアミドキシム（２）を経由して、調製した。ダビガトランアミドキシム（２）を、乾燥ＭｅＣＮ中に懸濁し、対応する酸無水物（コハク酸無水物など）と反応させる。物質を、続いてジエチルエーテルを添加し、直接ろ去することにより、単離することができた。
【００１９】
安定性
安定性分析は、ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）が酸性媒体（＜ｐＨ６）中でむしろ不安定であったことを示した（図２）。スクシニルエステル結合は、完全に切断され、ダビガトランアミドキシム（２）を形成する。化合物は、中性または弱アルカリ性のｐＨ範囲において明らかにより安定している。３６０分の試験期間において、約２５％のスクシニルエステル切断が９．０のｐＨ値で、約４０％が７．４のｐＨ値で決定された。このデータから、化合物は、変わることなく胃の通過に耐え、よって上部腸管領域において完全に吸収されることができるよう、薬用物質としての後の使用のために経腸的に処方すべきであるということになる。
【００２０】
予想通り、ヒトおよびマウス血漿におけるインキュベーションは、エステル結合の顕著な加水分解を示した（図３）。プロドラッグの活性化、よってダビガトラン活性剤の放出をもたらすことから、血漿におけるこの加水分解は望ましい。それは、血漿に偏在的に存在するエステラーゼにより触媒される。
【００２１】
溶解度
ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）は、分析した６．３〜９．０のｐＨ範囲において非常に良好な溶解度を有する（表１参照）。酸性媒体（ｐＨ２．０）における溶解度は、上記の加水分解により正確に特徴づけることができなかった。しかしながら、予備的テストランは、ここでも良好な溶解度を示した。
【００２２】
表１は、他のダビガトランプロドラッグと比較したダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）の溶解度を示す。ここで、ダビガトランエテキシラートとの比較は、とくに重視されるべきである。得られたデータは、新たに開発したダビガトランプロドラッグ（１）の溶解度が大きく改善されたことを明らかにした。したがって、エテキシラートプロドラッグと比較して、溶解度は、薬用製品におけるその使用に都合がよいｐＨ値に依存して１０００および１００，０００倍の間、改善された。さらに、ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）の良好な溶解度はまた、例えば、注射および点滴などの投与の非経口形態の想起を可能にする。
【００２３】
タンパク質結合
血漿タンパク質結合の分析は、化合物（１）が、約２２％の血漿タンパク質結合にて、非常に低レベルのタンパク質結合を示すことを示した。約９０％の値からのみが、それらの相互作用の潜在性に関し、重大であると分類されるタンパク質結合である。１３したがって、ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）は、この点に関し重大ではないと分類することができる。
【００２４】
プロドラッグ概念
プロドラッグ概念自体は、他の例示態様により特許［WO2009095499、DE102008007381］に記載されていた。概念は、この研究においてダビガトランに転用された。この新たに開発したダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）は、in vitroおよびin vivo研究両方における高度な性質決定の後、薬用製品を開発するための非常に好適なダビガトランプロドラッグであることを今や証明した。プロドラッグは、エステラーゼおよびｍＡＲＣ酵素系によって活性化され、よってシトクロムＰ４５０酵素から独立している。８、１０、１１Ｐ４５０酵素の関与は常に、我々が選択した活性化機構において評されない相互作用の危険性を伴う。
【００２５】
In vitro活性化
行われたin vitro活性化研究は、ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）活性化の優れた範囲を示した（表２）。
ヒトおよびマウス血漿におけるインキュベーションは既に、プロドラッグを活性化するのに必要な非常に際立ったエステル切断を示した（図３）。
【００２６】
続くダビガトランへの還元もまた、細胞内酵素調製物を用いたインキュベーション内で検出することができた（表２）。ブタ酵素源を用いたインキュベーションにおいて特定された変換率は、ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）は、活性型に見事に変換されることを示した。予想通り、アミドキシムからアミジンへの還元は、９０００ｘｇ画分中よりもミクロソームおよびミトコンドリア調製物中の方がより迅速に続いて行われた。
要約すると、ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）が、ダビガトランの非常に好適なプロドラッグであることを述べることができる。エステル切断および還元の両方により、ダビガトランの治療的に活性な血漿レベルを発生させる範囲へと進む。
【００２７】
経口バイオアベイラビリティ
ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）の経口バイオアベイラビリティを、行った動物実験において実証することができた。プロドラッグを経口投与した後、ダビガトラン血漿レベルを、４８０分間かけて測ることができ、これは、ダビガトランエテキシラートの経口投与後のものに匹敵する（図７、表３）。プロドラッグの急速および完全な活性化を示すダビガトラン活性型以外、さらなる代謝産物を、検出することができなかった。ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）の経口バイオアベイラビリティは、５．５％±１．７％であると検出された。最大血漿濃度は、１．８〜３．７μＭの範囲内であり、経口投与後３０〜６０分間に得られた。決定したダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）のバイオアベイラビリティは、ダビガトランエテキシラートの経口投与後に得られる結果と有意な差異がない。したがって、ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）の開発は、バイオアベイラビリティに関してダビガトランエテキシラートに匹敵するプロドラッグの開発において成功した。
【００２８】
器官試料（腎臓および肝臓）の分析は、少量のダビガトランを、ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）の経口投与後肝臓および腎臓の両方において検出することができることを示した（図８および９）。
【００２９】
新たに開発したプロドラッグは、ダビガトランの経口投与可能なプロドラッグである。ダビガトランの本発明によるプロドラッグへの変換により、重要な物質特性を、大幅に最適化することができた。特記すべきは、ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）の大きく改善された溶解度であり、薬用物質の製造および投与において様々な利点をもたらす。したがって、改善された溶解度は、複雑な生薬およびコストが大きい処方物を用いて調剤することを可能にする。現在、ダビガトランエテキシラートは、酒石酸含有ペレットを含むカプセル（Pradaxa（登録商標））として市販されている。６ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）の使用は、かかる技術的に要求が多い方法を用いた調剤を可能にする。さらに、１カプセル／錠剤のみを、現在通常２カプセルの代わりに飲み込まなければいけないことにより、投与、よって患者コンプライアンスを、最適化をすることができる。
【００３０】
酸性ｐＨ範囲以外は、化合物は、良好な化学的安定性を有する。酸性媒体における際立った加水分解から、プロドラッグを経口投与したときに胃内での早期の加水分解が起きないようにするために、腸溶性処方物として投与されるべきである。
In vitro生体内活性化アッセイは、プロドラッグのダビガトランへの急速および幅広い活性化を証拠立てた。活性化は、シトクロムＰ４５０酵素から独立して進み、よって相互作用の危険性を伴わない。１０、１１
【００３１】
良好な経口バイオアベイラビリティもまた、続いて行った動物実験において、実験的に証明することができた。この場合の５．５％±１．７％の経口バイオアベイラビリティは、ダビガトランエテキシラート参照化合物と有意な差異はない。
要約すると、ダビガトランアミドキシムジカルボン酸誘導体は、優れた生理化学的パラメータを有し、良好な経口バイオアベイラビリティを有する優れたプロドラッグである。分析された特性のすべてを比較すると、本発明によるダビガトランプロドラッグは、ダビガトランエテキシラートより明らかに優れている。
記載の発明は、添付の図により詳細に明確にする。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、本発明によるダビガトランプロドラッグの合成の概略図である。
【図２】図２は、様々なｐＨ値でのダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）の安定性を示す図である。
【図３】図３は、マウスおよびヒト血漿におけるダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）の安定性を示す図である。
【図４】図４は、ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）の経口投与（５０ｍｇ／ｋｇ）後のダビガトランの血漿レベルを示す図である。すべてのテストしたラット（ｎ＝１０）における血漿濃度を示す。
【図５】図５は、ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）の経口投与（５０ｍｇ／ｋｇ）後のダビガトランの血漿レベルを示す図である。すべてのテストしたラット（ｎ＝１０）におけるダビガトランの平均血漿濃度の値を示す。
【図６】図６は、ダビガトランの静脈内投与（１０ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝２０）および経口投与（５０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝３）後ならびに様々なダビガトランプロドラッグの経口投与（５０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１０）後の血漿レベルを示す図である。すべてのテストしたラットにおけるダビガトランの平均血漿濃度の値を示す。
【図７】図７は、様々なダビガトランプロドラッグの経口投与（５０ｍｇ／ｋｇ）後のダビガトランの血漿レベルの概要を示す図である。平均血漿濃度値を示す。
【図８】図８は、様々なプロドラッグの経口投与（５０ｍｇ／ｋｇ）後の腎臓におけるダビガトランの濃度［ｎｇ／ｇ］の概要を示す図である。テストしたラットのすべての腎臓の濃度を示す。
【図９】図９は、様々なプロドラッグの経口投与（５０ｍｇ／ｋｇ）後の肝臓におけるダビガトランの濃度［ｎｇ／ｇ］の概要を示す図である。テストしたラットのすべての肝臓の濃度を示す。
【００３３】
材料および方法：例示態様
合成
【化６】
2014521619.tif 000008
【００３４】
エチル−３−（｛２−［（４−（Ｎ’−（３−カルボキシプロパノイルオキシ）アミジノ）フェニルアミノ）メチル］−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボニル｝ピリジン−２−イル）プロピオナート（１）。
ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）
ダビガトランアミドキシム２（１００ｍｇ、０．１９４ｍｍｏｌｅ）をアルゴン雰囲気下で約８ｍｌの乾燥ＭｅＣＮ中に懸濁した。コハク酸無水物（２０．３８ｍｇ、０．２０４ｍｍｏｌｅ）を添加し、混合物を約７０℃（油浴を８０℃に調節）で４時間攪拌した。フラスコを続いて氷で冷却し、約１０ｍｌのジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ）を添加した。沈殿物をろ過し、Ｅｔ２Ｏで徹底的にすすいだ。
収率：９５ｍｇ（８０％）
【００３５】
【化７】
2014521619.tif 000009
【００３６】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：
計算されたＣ３１Ｈ３３Ｎ７Ｏ７［Ｍ＋Ｈ］＋：６１６．２５１４２；見出されたもの６１６．２５１９３
元素分析Ｃ３１Ｈ３３Ｎ７Ｏ７（分子量６１５．６５）：
計算されたもの：Ｃ６０．４８、Ｈ５．４０、Ｎ１５．９３；見出されたもの：Ｃ６０．１６、Ｈ５．２４、Ｎ１５．８７
【００３７】
ダビガトランプロドラッグの性質決定
ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）の安定性分析
安定性分析のために、０．２ｍＭ溶液のダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）を５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液中に調製した。試験は、２．０、４．０、６．３、７．４および９．０のｐＨ値で行った。１つの試料は３６０分間かけて３０分毎に採取し、ＨＰＬＣにより直ちに分析した。
【００３８】
さらなる分析は、ヒトおよびマウス血漿を用いて実施した。９００μｌの血漿を１００μｌの２ｍＭ溶液のダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）と混合した。これにより、ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）の最終濃度は０．２ｍＭであった。試料を振とう水浴中３７℃でインキュベートし、試料を０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０および１５０分後に採取した。この目的のために、各場合において１００μｌを抜き出し、１００μｌのアセトニトリルと混合した。試料を振とうし、５分間遠心分離し、上清をＨＰＬＣにより測定した。結果を、図２および３において図示する。
【００３９】
ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）の溶解度
１５０μｌ中に不溶である量のダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）を５０ｍＭのリン酸緩衝液（それぞれｐＨ６．３、ｐＨ７．４、ｐＨ９．０）に懸濁させ、１０分間振とうした。酸性ｐＨ値でのスクシニルエステルの急速な加水分解のため、溶解度は４．０および２．０ｐＨ値で決定されなかった。３ＮＨＣｌおよび１０％ＫＯＨそれぞれをｐＨ値を調節するために使用した。１０分後、溶解しなかった部分を遠心分離（１３，０００ＲＰＭ、１０分）により除去し、試料を直ちにＨＰＬＣにより測った。溶解度の評価は、ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）の較正を介して続いて行われた（表１）。
【００４０】
前述の誘導体と比較して溶解度をよりよく判定することができるように、ダビガトランエテキシラートおよびダビガトランアミドキシム（２）を比較することによって調べた。溶解度は、化合物（１）について記載の方法と同様にして決定した。
【００４１】
【表１】
2014521619.tif 000010
【００４２】
ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）のタンパク結合の決定
血漿タンパク結合は、３種の異なる濃度（１０、２０および５０μＭ）で決定した。４％アルブミン溶液はタンパク質溶液として使用した。各場合において、５０μｌの１０倍に濃縮した物質溶液を４５０μｌのタンパク質溶液にピペットで取った。インキュベーションは、３７℃で振とう水浴中、１５分にわたって続いて行われた。続いて、試料を限外ろ過ユニット（ビバスピン５００、１０ｋＤａカットオフ）に移し、１０，０００ＲＰＭで１５分間遠心分離した。ろ液をＨＰＬＣにより分析した。 さらに、タンパク質と混合されず、遠心分離もされなかったコントロールは、各濃度について行った。タンパク質を添加しなかったが、しかしながら遠心分離したさらなるコントロールは、方法論を検証するために役立った。
【００４３】
試料の分析により、ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）について２１．８±５．３％のタンパク結合が特定された。同様の分析により、ダビガトランアミドキシム（２）について３１．２±１．３％の値が得られた。
【００４４】
ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）の生体内活性化分析
様々な細胞内酵素系を使用したプロドラッグ活性化の確認
プロドラッグの活性化は、細胞内酵素調製物を用いてin vitroで決定した。９０００ｘｇの上清、ブタの肝臓および腎臓組織のミクロソームおよびミトコンドリアを、酵素調製物として使用した。インキュベーションバッチは、５００ｍＭプロドラッグ、１ｍＭＮＡＤＨ、１Ｕエステラーゼおよび２５０μｌの１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．３中に溶解された０．３ｍｇの酵素調製物から構成された。インキュベーションは、３７℃で振とう水浴中で３０分にわたって行った。インキュベーションは、２５０μｌのメタノールを添加することにより停止させた。続いて、試料を２０分間振とうし、沈殿したタンパク質を１５分間、１０，０００ＲＰＭで遠心分離することによって除去した。上清をＨＰＬＣにより測定した。特定された変換率を表２に示す。
【００４５】
【表２】
2014521619.tif 000011
【００４６】
ＨＰＬＣ分析論：
以下のＨＰＬＣ分析論を、評価において使用した。
【表３】
2014521619.tif 000012
【００４７】
【表４】
2014521619.tif 000013
【００４８】
経口バイオアベイラビリティ（動物実験）
ダビガトランは、１０ｍｇ／ｋｇの濃度で２０匹のラットに静脈内投与した。ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）、ダビガトランアミドキシム（２）およびダビガトランエテキシラートは、アラビアゴム（１０％ｍ／Ｖ）との懸濁液として、経管栄養あたり５０ｍｇ／ｋｇの濃度で１０匹のラットそれぞれに投与した。胃の酸性環境におけるスクシニルエステルの早期の切断を防止するために、懸濁液の調製に際し、１００ｍＭのｐＨ９．０のリン酸カリウム緩衝液をダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）と共に用いた。３匹のラットに、活性型自体の経口バイオアベイラビリティを決定するために、経管栄養あたり５０ｍｇ／ｋｇの用量でダビガトランを与えた。
【００４９】
静脈内投与後、血漿試料を、５、１０、２５、５０、１００、２００および４００分後に、経口投与後それぞれ３０、６０、９０、１２０、２４０、３６０および４８０分後に採取した。この目的のために、３００μｌの全血を、インスリン注射器を用いて抜き取り、ＥＤＴＡコーティングされたCB 300 microvettes (Sarstedt、Nuembrecht)に移した。それぞれの採血後、試料を０．９％生理食塩水１００μｌで、それぞれ６０分間隔でヘパリン溶液（２５０Ｉ．Ｅ．／ｍｌ）ですすいだ。血液試料を短時間振とうし、遠心分離まで氷上に置いた（４℃；１４，０００ＲＰＭ；１０分間）。試料は−８０℃で更に保存した。
【００５０】
屠殺は薬物投与後８時間、ギロチン断頭によって続いて行われた。続いて器官を除去した。全ての器官を洗浄し、ドライアイス中で冷却された２−メチルブタン中に凍結させた。肝臓、腎臓、肺、脾臓、心臓および脳を取り出した。
【００５１】
試料調製
１．血漿試料：
血漿試料を室温で解凍した。各場合において５μｌの１ＮＨＣｌを調製し、５５μｌの血漿試料をピペットにより添加した。続いて、既存のグルクロニドを切断するために、試料を４５分間振とうした。そして、血漿タンパク質を５５μｌのメタノールで沈殿させ、さらに３０分間振とうした。試料を、１５分間１０，０００ＲＰＭで遠心分離し、上清をＨＰＬＣバイアルに移した。各場合において、１０μｌをＨＰＣＬ決定のために使用した。
ダビガトランの回収のための校正および分析は、定量的に血漿試料を評価するために、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液においておよびマウス血漿においてそれぞれ行った。
【００５２】
２．器官試料
器官を室温で解凍し、秤量した。それぞれの器官に応じて、異なる量の組織を調製した。肝臓試料の場合には約１０００ｍｇ；腎臓試料の場合には約５００ｍｇを使用した。肝臓および腎臓は、両方の器官がプロドラッグの活性化に関与し、よって同じくダビガトランの濃度の増加も生じ得ることから、調べられた。他の器官は、生体内活性化に無関係であり、したがって調べられなかった。
【００５３】
器官試料（肝臓および腎臓）はポッター（ｐｏｔｔｅｒ）によって細かくした。この目的のために、秤量した各組織は、５分間、１ｍｌの再蒸留水で細かくした。ポッター容器は、続いて、各場合において、１ｍｌの再蒸留水ですすいだ。試料は、反応容器に移し、同量のアセトニトリルを、タンパク質を沈殿させるために添加した。試料を４５分間振とうし、続いて１５分間１２，０００ＲＰＭで遠心分離した。上清をガラス瓶に移し、圧縮空気下で濃縮した。残渣を５００μｌのアセトニトリルで洗浄し、再度遠心分離し、上清を残りの試料に添加した。残渣は廃棄した。圧縮空気下で濃縮した後、サンプルを一晩凍結乾燥した。
【００５４】
試料の可溶化は、４００μｌのメタノール／再蒸留水（５０／５０）の混合物で続いて行った。試料を、室温で、１．５時間振とうし、続いて、残渣は、遠心分離（１５，０００ＲＰＭ、１５分間）により除去した。ダビガトランの濃度をＨＰＬＣによって上清から決定した。
【００５５】
ダビガトランの活性型の投与のみがバイオアベイラビリティの決定において利用可能であることから、活性剤の経口投与後の器官試料の調製物を、調剤した。
【００５６】
動物実験の結果
ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）の経口投与後の血漿試料の分析は、４８０分の全テスト期間にわたる血漿レベルを検出可能にした。得られた血漿レベルを、図４および５において図示する。
【００５７】
活性型のみ、ダビガトランは、血漿試料の分析において検出することができた。プロドラッグ自体は、プロドラッグの非常に良好な活性化を示す血漿において特定することができなかった。ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）の経口投与後、１．８および３．７μＭの間の最大血漿濃度を決定することができ、それは、経口投与後３０〜６０分に到達した。
ダビガトランの静脈内投与後の血漿試料の分析は、４００分間の期間にわたる血漿レベルを検出可能にし（図６）、それは、経口バイオアベイラビリティを計算するために使用される。
【００５８】
２種類の参照プロドラッグ（ダビガトランアミドキシム（２）およびダビガトランエテキシラート）の投与後、同様に、４８０分間のテスト期間にわたり検出することができた。得られた血漿レベルを、図６において図示する。血漿試料の分析において、活性型のみ、ダビガトランは、各場合に検出することができた。プロドラッグ自体は、血漿において特定することができなかった。ダビガトランエテキシラートの経口投与後、２．３および４．５μＭの間の最大血漿濃度を決定することができ、それは、経口投与後３０〜９０分に到達した。ダビガトランアミドキシム（２）の経口投与後、１．７および５．５μＭの間の最大血漿濃度を決定することができ、それは、経口投与後３０〜６０分に到達した。
【００５９】
３種類のダビガトランプロドラッグの概要および比較（図７）：
異なるプロドラッグ（ダビガトランアミドキシム（２）、ダビガトランエテキシラートおよびダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１））について行ったin vivo研究の結果の比較は、最高血漿濃度が、ダビガトランエテキシラート（７．２％±２．０％）、続いてダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）およびダビガトランアミドキシム（２）の適用後決定することができたことを示した。よって、我々が行ったin vivo研究においてダビガトランエテキシラートについて確認されたバイオアベイラビリティは、文献に記載されているエテキシラートデータ（５〜８％）と一致した。６ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）のバイオアベイラビリティは、５．５％±１．７％と決定され（表３）、ダビガトランエテキシラートの経口投与後に得られる結果と有意な差異がない。したがって、ダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）の開発は、バイオアベイラビリティに関してダビガトランエテキシラートに匹敵するプロドラッグの開発において成功した。
【００６０】
ダビガトラン誘導体のバイオアベイラビリティ：
異なるダビガトランプロドラッグのバイオアベイラビリティを、血漿濃度を使用してPK Solutions 2.0TMプログラムの平均により計算した．さらに、血漿半減期ｔ１／２、最大血漿レベルの時間ｔｍａｘ、ならびに最大血漿濃度ｃｍａｘを、計算した。得られたデータを、表３に例証する。
【００６１】
【表５】
2014521619.tif 000014
【００６２】
器官試料の評価：
調製した器官試料の分析は、肝臓ならびに調べた腎臓両方におけるダビガトランの検出可能な濃度をもたらした。同等の濃度のダビガトランが、エテキシラート、アミドキシム（２）およびスクシニルエステル（１）が、経口投与後の肝臓組織において確認された。スクシニルエステルの投与後、濃度は、全ての調べた肝臓試料において明らかに低かった（図９参照）。肝臓において検出された総量は、分析された全てのプロドラッグについて平均約１３μｇであった。肝臓において確認された濃度と比較して、腎臓における濃度は、明らかに低かった（図８参照）。しかしながら、バイオアベイラビリティは、分析された血漿濃度からもっぱら計算されるから、組織において検出されたダビガトラン濃度は、決定するバイオアベイラビリティと無関係である。肝臓および腎臓ダビガトラン濃度は単に、新たに開発したプロドラッグを効果的に特徴づけることができる追加の情報としての役割を果たすのみである。
【００６３】
ＨＰＬＣ分析論
以下のＨＰＬＣ分析論を、ダビガトランの静脈内投与後の器官および血漿試料を分析するために使用した：
【表６】
2014521619.tif 000015
【００６４】
以下のＨＰＬＣ分析論を、ダビガトランエテキシラート、ダビガトランアミドキシム（２）およびダビガトランアミドキシムコハク酸エステル（１）の経口投与後の器官および血漿試料を分析するために使用した：
【００６５】
【表７】
2014521619.tif 000016
【００６６】
参考文献リスト：
【表８】
2014521619.tif 000017
【図１】
2014521619.tif 000023
【図２】
2014521619.tif 000024
【図３】
2014521619.tif 000025
【図４】
2014521619.tif 000026
【図５】
2014521619.tif 000027
【図６】
2014521619.tif 000028
【図７】
2014521619.tif 000029
【図８】
2014521619.tif 000030
【図９】
2014521619.tif 000031
【国際調査報告】
2014521619.tif 000032
2014521619.tif 000033
2014521619.tif 000034
2014521619.tif 000035