(57)【要約】  本発明は、一価ノロウイルスウイルス様粒子の混合物を含む単回投与の非経口ワクチン組成物に関する。このような組成物を投与することによって、ヒト対象にノロウイルス感染に対する防御免疫を与える方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにノロウイルスに対する防御免疫を誘発する方法であって、
ワクチン組成物をヒトに非経口で単回投与することを含み、前記組成物がジェノグループＩノロウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含み、前記組成物が、前記組成物の投与前の前記ヒトにおけるノロウイルス特異的血清抗体価と比較して少なくとも３倍増加した前記抗体価を誘導し、前記ジェノグループＩノロウイルスＶＬＰが、ジェノグループＩウイルス株由来のカプシドタンパク質を含む、方法。
【請求項２】
前記組成物が、１５０μｇ以下の前記ジェノグループＩノロウイルスＶＬＰを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が、５０μｇ以下の前記ジェノグループＩノロウイルスＶＬＰを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が、２５μｇ以下の前記ジェノグループＩノロウイルスＶＬＰを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が、１５μｇ以下の前記ジェノグループＩノロウイルスＶＬＰを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物が、前記組成物の投与前の前記ヒトにおけるノロウイルス特異的血清抗体価と比較して、少なくとも６倍増加した前記抗体価を誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ノロウイルスＶＬＰが、一価ＶＬＰ又は多価ＶＬＰである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が、ジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰを更に含み、前記ジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰがジェノグループＩＩウイルス株由来のカプシドタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が、１５０μｇ以下のジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が、５０μｇ以下のジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が、２５μｇ以下のジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が、１５μｇ以下のジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記ジェノグループＩノロウイルスＶＬＰが、ノーウォークウイルスＶＬＰであり、前記ジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰが、ジェノグループＩＩノロウイルスのコンセンサス配列の発現により生成されたＶＬＰである、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
ヒトにノロウイルスに対する防御免疫を誘発する方法であって、
ワクチン組成物をヒトに非経口で単回投与することを含み、前記組成物がジェノグループＩＩノロウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含み、前記組成物が、前記組成物の投与前の前記ヒトにおけるノロウイルス特異的血清抗体価と比較して少なくとも３倍増加した前記抗体価を誘導し、前記ジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰが、ジェノグループＩＩウイルス株由来のカプシドタンパク質を含む、方法。
【請求項１５】
前記組成物が、１５０μｇ以下の前記ジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が、５０μｇ以下の前記ジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が、２５μｇ以下の前記ジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が、１５μｇ以下の前記ジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰが、ジェノグループＩＩ遺伝子型４ウイルス株由来のカプシドタンパク質を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物が、前記組成物の投与前の前記ヒトにおけるノロウイルス特異的血清抗体価と比較して、少なくとも６倍増加した前記抗体価を誘導する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記ノロウイルスＶＬＰが、一価ＶＬＰ又は多価ＶＬＰである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物が、ジェノグループＩノロウイルスＶＬＰを更に含み、前記ジェノグループＩノロウイルスＶＬＰがジェノグループＩウイルス株由来のカプシドタンパク質を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物が、１５０μｇ以下の前記ジェノグループＩノロウイルスＶＬＰを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物が、５０μｇ以下の前記ジェノグループＩノロウイルスＶＬＰを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物が、２５μｇ以下の前記ジェノグループＩノロウイルスＶＬＰを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物が、１５μｇ以下の前記ジェノグループＩノロウイルスＶＬＰを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記ジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰが、ジェノグループＩＩノロウイルスのコンセンサス配列の発現から生成されるＶＬＰである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物が、少なくとも１つのアジュバントを更に含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つのアジュバントが、ｔｏｌｌ様受容体アゴニストである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物が、２つのアジュバントを更に含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記２つのアジュバントが、モノホスホリルリピドＡ及び水酸化アルミニウムである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記組成物が、緩衝剤を更に含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記緩衝剤が、Ｌ−ヒスチジン、イミダゾール、コハク酸、トリス、及びクエン酸からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ワクチン組成物が、静脈内、皮下、皮内、又は筋肉内投与経路によって前記ヒトに投与される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ワクチン組成物が、筋肉内投与経路によって前記ヒトに投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ワクチン組成物が、液体として配合される、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ノロウイルス特異的抗体価の増加が、前記単回投与の前記組成物の投与から７日以内に誘導される、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ワクチン組成物が、ノロウイルス感染の１つ又は複数の症状からの防御を与える、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
[0001]  本出願は、２０１１年７月１１日出願の米国仮特許出願第６１／５０６，４４７号に対する優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
[0002]  本発明はワクチンの分野に関し、特にノロウイルスのワクチンの分野に関する。また、本発明は、ワクチン組成物を調製する方法、及びヒトのノロウイルスに対する防御免疫応答を誘導し、評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  ノロウイルスは、非細菌性胃腸炎を集団発生させる唯一かつ最も重要な原因であることが明らかになった、培養不可能なヒトカリシウイルスである（Glass他、２０００；Hardy他、１９９９）。ノロウイルスの臨床的重大性は、感度が高い分子診断アッセイが発達する前は過小評価されていた。プロトタイプのジェノグループ（genogroup）Ｉノーウォークウイルス（ＮＶ）のゲノムをクローン化し、組み換えバキュロウイルス発現系からウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生したことで、ノロウイルス感染が広まったことを明らかにするアッセイが発達した（Jiang他、１９９０；１９９２）。
【０００４】
[0004]  ノロウイルスは、非セグメント化ＲＮＡゲノムを含む１本鎖のプラス鎖ＲＮＡウイルスである。ウイルスのゲノムは３つのオープンリーディングフレームをコードし、そのうち後者の２つはそれぞれ大きなカプシドタンパク質及びわずかな構造タンパク質の産生を規定する（Glass他、２０００）。真核生物発現系で、高レベルに発現すると、ＮＶのカプシドタンパク質、及び特定の他のノロウイルスは自己組織化して、天然のノロウイルスビリオンを構造的に模倣するＶＬＰになる。透過電子顕微鏡で見ると、ＶＬＰは、ヒトの糞便サンプルから分離した感染性ビリオンと、形態学的に識別不能である。
【０００５】
[0005]  ノロウイルスに対する免疫応答は複雑であり、防御の相関関係はまさに現在解明中である。天然のウイルスで実施したヒトボランティアの調査は、粘膜由来の記憶免疫応答が感染からの短期の防御を提供することを実証し、ワクチン媒介性の防御が実行可能であることを示唆した（Lindesmith他、２００３；Parrino他、１９７７；Wyatt他、１９７４）。
【０００６】
[0006]  ノロウイルスは、ＶＬＰの入手可能性及びその大量産生能のために、in vitroで培養することができないが、ノロウイルスカプシドの抗原性及び構造的形態を規定することに多大な進歩があった。ＶＬＰでは、感染性遺伝物質は欠如しているが、ウイルスカプシドタンパク質の真正確認（authentic confirmation）は保存されている。その結果、ＶＬＰはウイルスと細胞受容体との機能的相互作用を模倣し、それにより感染を再現又は引き起こす能力が欠如しながら、適切な宿主の免疫応答を誘発する。ＮＩＨと協力して、ベイラー医科大学は、研究者主導の学究的な第Ｉ相臨床試験でヒトのボランティアのＮＶ  ＶＬＰに対する体液、粘液及び細胞の免疫応答を調査した。経口投与したＶＬＰは健康な成人には安全で、免疫原性であった（Ball他、１９９９；Tacket他、２００３）。しかし、免疫応答を観察するために、比較的高用量のＶＬＰの複数回投与が必要であった。他の学術的センターでは、動物モデルの臨床前実験で、細菌外毒素アジュバントで鼻腔内投与した場合に、ＶＬＰに対する免疫応答が向上したことを実証した（Guerrero他、２００１；Nicollier-Jamot他、２００４；Periwal他、２００３；Souza他（２００７）、Vaccine, Vol. 25(50): 8448-59）。しかし、ノロウイルスに対するヒトの防御免疫は謎のままである。何故なら、ヒトの防御免疫応答の指標がまだ明白に識別されていないからである（Herbst-Kralovetz他（２０１０）、Expert Rev. Vaccines 9(3), 299-307）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
[0007]  本発明は、単回投与のノロウイルスワクチンは、非経口投与した場合にノロウイルスに対するヒトの迅速で頑強な防御免疫応答を誘導するという発見に、ある程度基づいている。したがって、本発明は、ヒトのノロウイルスに対する防御免疫を誘発する方法であって、単回投与以内のワクチン組成物をヒトに非経口投与することを含む方法を提供し、上記組成物はジェノグループＩ及び／又はジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰを含み、上記組成物は、組成物投与前のヒトの抗体価と比較して、ノロウイルスに特異的な血清抗体の少なくとも３倍の増加を誘導する。特定の実施形態では、ノロウイルス特異的な抗体価の増加は、単回投与の組成物の投与から７日以内に誘導される。幾つかの実施形態では、ワクチン組成物は、静脈内、皮下、皮内、又は筋肉内の投与経路を介してヒトに投与される。一実施形態では、ワクチン組成物は、筋肉内投与経路によりヒトに投与される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
[0008]  単回投与のワクチン組成物は、約５μｇ〜約１５０μｇのジェノグループＩノロウイルスＶＬＰ、又はジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰ、あるいはその両方を含むことができる。単回投与のワクチン組成物がジェノグループＩ及びジェノグループＩＩのノロウイルスＶＬＰを両方含む実施形態では、各ＶＬＰの用量が同じか、又は異なっていてもよい。一実施形態では、組成物は５０μｇ以下のジェノグループＩノロウイルスＶＬＰを含む。別の実施形態では、組成物は２５μｇ以下のジェノグループＩノロウイルスＶＬＰを含む。更に別の実施形態では、組成物は１５０μｇ以下のジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰを含む。更に別の実施形態では、組成物は５０μｇ以下のジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰを含む。ノロウイルスＶＬＰは一価ＶＬＰ又は多価ＶＬＰとすることができる。
【０００９】
[0009]  本発明の幾つかの態様では、ワクチン組成物中のジェノグループＩノロウイルスＶＬＰは、ジェノグループＩウイルス株由来のカプシドタンパク質を含む。一実施形態では、ジェノグループＩノロウイルスＶＬＰはジェノグループＩ遺伝子型Ｉノロウイルスからのカプシドタンパク質を含む。別の実施形態では、ジェノグループＩノロウイルスＶＬＰはノーウォークウイルスからのカプシドタンパク質を含む。本発明の他の態様では、ワクチン組成物中のジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰは、ジェノグループＩＩウイルス株由来のカプシドタンパク質を含む。幾つかの実施形態では、ジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰは、ジェノグループＩＩ遺伝子型４ノロウイルスからのカプシドタンパク質を含む。特定の実施形態では、ジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰは、ジェノグループＩＩノロウイルスの共通塩基配列の発現から生成されたＶＬＰである。１つの特定の実施形態では、ジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰは配列番号：１の配列を有するカプシドタンパク質を含む。
【００１０】
[0010]  特定の実施形態では、ワクチン組成物は少なくとも１つのアジュバントを更に含む。アジュバントは細菌外毒素アジュバントではないことが好ましい。一実施形態では、アジュバントは、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、フラジェリン、又はＣｐＧなどのｔｏｌｌ様受容体アゴニストである。別の実施形態では、アジュバントは水酸化アルミニウム（例えばミョウバン）である。特定の実施形態では、ワクチン組成物はＭＰＬ及び水酸化アルミニウムなどの２つのアジュバントを含む。幾つかの実施形態では、ワクチン組成物はＬ−ヒスチジン、イミダゾール、コハク酸、トリス、及びクエン酸などの緩衝剤を更に含むことができる。ワクチン組成物は、乾燥粉末又は液体として配合することができる。一実施形態では、ワクチン組成物を液体（例えば水性製剤）として配合する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】[0011]プラセボ（生理食塩水）、又はジェノグループＩ．１ノロウイルスＶＬＰ及びジェノグループＩＩ．４ノロウイルスＶＬＰをそれぞれ５、１５、５０、又は１５０μｇ含有するワクチン製剤で筋肉内免疫したヒトボランティアからの混合血清ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭレベルを測定したｐａｎＥＬＩＳＡアッセイの結果。第一免疫から７日及び２１日後、及び第二免疫から７日及び２８日後における各用量レベルについて、抗ＧＩ．１（Ａ）及び抗ＧＩＩ．４（Ｂ）抗体の幾何平均抗体価を示す。ボランティアは調査の０日及び２８日目に免疫処置を受けた。
【図２】[0012]プラセボ（生理食塩水）、又はジェノグループＩ．１ノロウイルスＶＬＰ及びジェノグループＩＩ．４ノロウイルスＶＬＰをそれぞれ５、１５、５０、又は１５０μｇ含有するワクチン製剤で筋肉内免疫したヒトボランティアからの混合血清ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭレベルを測定したｐａｎＥＬＩＳＡアッセイの結果。第一免疫から７日及び２１日後、及び第二免疫から７日及び２８日後における各用量レベルについて、抗ＧＩ．１（Ａ）及び抗ＧＩＩ．４（Ｂ）抗体の幾何平均上昇倍数を示す。ボランティアは調査の０日及び２８日目に免疫処置を受けた。
【図３】[0013]プラセボ（生理食塩水）、又はジェノグループＩ．１ノロウイルスＶＬＰ及びジェノグループＩＩ．４ノロウイルスＶＬＰをそれぞれ５、１５、５０、又は１５０μｇ含有するワクチン製剤で筋肉内免疫したヒトボランティアからの混合血清ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭレベルを測定したｐａｎＥＬＩＳＡアッセイの結果。第一免疫から７日及び２１日後、及び第二免疫から７日及び２８日後における各用量レベルについて、抗ＧＩ．１（Ａ）及び抗ＧＩＩ．４（Ｂ）抗体の血清応答割合（すなわち、免疫前の抗体価と比較して抗体価の４倍の増加）を示す。ボランティアは調査の０日及び２８日目に免疫処置を受けた。
【図４】[0014]プラセボ（生理食塩水）、又はジェノグループＩ．１ノロウイルスＶＬＰ及びジェノグループＩＩ．４ノロウイルスＶＬＰをそれぞれ５、１５、又は５０μｇ含有するワクチン製剤で筋肉内免疫したヒトボランティアからの血清ＩｇＡを測定したＥＬＩＳＡアッセイの結果。第一免疫から７日及び２１日後、及び第二免疫から７日及び２８日後における各用量レベルについて、抗ＧＩ．１（Ａ）及び抗ＧＩＩ．４（Ｂ）抗体の幾何平均抗体価を示す。ボランティアは調査の０日及び２８日目に免疫処置を受けた。
【図５】[0015]プラセボ（生理食塩水）、又はジェノグループＩ．１ノロウイルスＶＬＰ及びジェノグループＩＩ．４ノロウイルスＶＬＰをそれぞれ５、１５、又は５０μｇ含有するワクチン製剤で筋肉内免疫したヒトボランティアからの血清ＩｇＡを測定したＥＬＩＳＡアッセイの結果。第一免疫から７日及び２１日後、及び第二免疫から７日及び２８日後における各用量レベルについて、抗ＧＩ．１（Ａ）及び抗ＧＩＩ．４（Ｂ）抗体の幾何平均上昇倍数を示す。ボランティアは調査の０日及び２８日目に免疫処置を受けた。
【図６】[0016]プラセボ（生理食塩水）、又はジェノグループＩ．１ノロウイルスＶＬＰ及びジェノグループＩＩ．４ノロウイルスＶＬＰをそれぞれ５、１５、又は５０μｇ含有するワクチン製剤で筋肉内免疫したヒトボランティアからの血清ＩｇＡを測定したＥＬＩＳＡアッセイの結果。第一免疫から７日及び２１日後、及び第二免疫から７日及び２８日後における各用量レベルについて、抗ＧＩ．１（Ａ）及び抗ＧＩＩ．４（Ｂ）抗体の血清応答割合（すなわち、免疫前の抗体価と比較して抗体価の４倍の増加）を示す。ボランティアは調査の０日及び２８日目に免疫処置を受けた。
【図７】[0017]プラセボ（生理食塩水）、又はジェノグループＩ．１ノロウイルスＶＬＰ及びジェノグループＩＩ．４ノロウイルスＶＬＰをそれぞれ５、１５、又は５０μｇ含有するワクチン製剤で筋肉内免疫したヒトボランティアからの血清ＩｇＧを測定したＥＬＩＳＡアッセイの結果。第一免疫から７日及び２１日後、及び第二免疫から７日及び２８日後における各用量レベルについて、抗ＧＩ．１（Ａ）及び抗ＧＩＩ．４（Ｂ）抗体の幾何平均抗体価を示す。ボランティアは調査の０日及び２８日目に免疫処置を受けた。
【図８】[0018]プラセボ（生理食塩水）、又はジェノグループＩ．１ノロウイルスＶＬＰ及びジェノグループＩＩ．４ノロウイルスＶＬＰをそれぞれ５、１５、又は５０μｇ含有するワクチン製剤で筋肉内免疫したヒトボランティアからの血清ＩｇＧを測定したＥＬＩＳＡアッセイの結果。第一免疫から７日及び２１日後、及び第二免疫から７日及び２８日後における各用量レベルについて、抗ＧＩ．１（Ａ）及び抗ＧＩＩ．４（Ｂ）抗体の幾何平均上昇倍数を示す。ボランティアは調査の０日及び２８日目に免疫処置を受けた。
【図９】[0019]プラセボ（生理食塩水）、又はジェノグループＩ．１ノロウイルスＶＬＰ及びジェノグループＩＩ．４ノロウイルスＶＬＰをそれぞれ５、１５、又は５０μｇ含有するワクチン製剤で筋肉内免疫したヒトボランティアからの血清ＩｇＧを測定したＥＬＩＳＡアッセイの結果。第一免疫から７日及び２１日後、及び第二免疫から７日及び２８日後における各用量レベルについて、抗ＧＩ．１（Ａ）及び抗ＧＩＩ．４（Ｂ）抗体の血清応答割合（すなわち、免疫前の抗体価と比較して抗体価の４倍の増加）を示す。ボランティアは調査の０日及び２８日目に免疫処置を受けた。
【図１０】[0020]El Kamary他（２０１０）がJ Infect Dis, Vol.202(11): 1649-1658で述べたようなノロウイルス鼻腔内一価ワクチン（ＬＶ０１−１０３群）、又は実施例１で述べたようなノロウイルス筋肉内二価ワクチン（ＬＶ０３−１０４群）で指示された時点にて免疫したヒトボランティアからの混合血清ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭレベルを測定したｐａｎＥＬＩＳＡアッセイの結果。ヒトボランティアは、プラセボ、又は筋肉内又は鼻腔内ワクチン製剤の２用量を受けた。筋肉内二価ノロウイルスワクチンは、ジェノグループＩ．１ノロウイルスＶＬＰ及びジェノグループＩＩ．４ノロウイルスＶＬＰをそれぞれ５μｇ含有していた。鼻腔内一価ワクチンはジェノグループＩ．１ノロウイルスを１００μｇ含有していた。鼻腔内ワクチン又はプラセボを投与されたボランティアは、第二免疫の後に生ノロウイルスを感染させた。
【図１１】[0021]５μｇ用量のノロウイルス筋肉内二価ワクチン（Ａ）又はプラセボ（Ｂ）で免疫する前の０日目、及び免疫後７日目にヒトボランティアから採取した末梢血単核細胞のＦＡＣＳ分析。アルファ４／ベータ７回帰受容体及びケモカインＣＣＲ１０受容体の発現で明示されるように、ＣＤ１９＋ＰＢＭＣが粘膜攻撃される。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
[0022]  本発明は、対象のノロウイルス感染に対して防御免疫を誘発する方法に関する。特に、本発明はノロウイルスＶＬＰ及び任意選択で少なくとも１つのアジュバントを含む単回投与以内のワクチンをヒトに非経口投与することにより、ヒトのノロウイルスに対する防御免疫を誘発する方法を提供し、ワクチンはノロウイルス感染の少なくとも１つの症状に対する防御、又はその回復を与える。本発明者は、意外なことに、ノロウイルスＶＬＰを含むワクチン組成物を単回投与でヒトに筋肉内投与すると、ノロウイルス感染及び疾患に対する防御免疫応答を示す血清抗体陽転（すなわち、抗原特異的血清抗体価がワクチン接種前のレベルより少なくとも３倍増加する）を迅速に（すなわち、免疫から７日以内に）誘導することを見出した。この単回投与のワクチン組成物によって誘導された免疫応答は、ヒト誘発試験で生ウイルスを投与することによって自然感染で観察されるものと同様の高い抗体価で横ばいになる。興味深いことに、追加のワクチン用量を更に投与しても免疫応答は増大しないので、ワクチンの追加投与は必要ない。
【００１３】
[0023]  本発明は、１つ又は複数のノロウイルス抗原を含むワクチン組成物を提供する。本明細書では、「ノロウイルス」(Norovirus)、「ノロウイルス（ＮＯＲ）」（Norovirus (NOR)）、「ノロウイルス」(norovirus)及びその文法的同義語は、カリシウイルス科のノロウイルス属の一つを意味する。幾つかの実施形態では、ノロウイルスは、ヒト又は非ヒト哺乳類に感染可能である関連した１本鎖のプラス鎖ＲＮＡ非エンベロープイルスのグループを含むことができる。幾つかの実施形態では、ノロウイルスはヒトに急性胃腸炎を引き起こすことがある。ノロウイルスは、電子顕微鏡で見ると画定された表面構造又は凸凹の縁部を有する小型球形構造ウイルス（ＳＲＳＶ）と呼ぶこともできる。
【００１４】
[0024]  ノロウイルスには少なくとも５つのジェノグループ（ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＩＩ、ＧＩＶ、及びＧＶ）が含まれる。ＧＩ、ＧＩＩ、及びＧＩＶノロウイルスはヒト感染性であり、ＧＩＩＩノロウイルスは主にウシ科に感染する。ＧＶは最近、マウスから分離されている（Zheng他（2006) Virology, Vol. 346: 312-323）。代表的なＧＩＩＩはJena及びNewbury株であり、Alphatron、Fort Lauderdale、及びSaint Cloud株はＧＩＶの代表である。ＧＩ及びＧＩＩ群は、遺伝子分類に基づいて遺伝子クラスタ又は遺伝子型に更に分離することができる（Ando他（2000) J. Infectious Diseases, Vol. 181(Supp2): S336-S348；Lindell他（2005) J. Clin. Microbiol., Vol. 43(3): 1086-1092）。本明細書で使用する遺伝子クラスタという用語は、遺伝子型という用語と区別なく使用される。ジェノグループＩ内には、今日までに８つのＧＩクラスタが（プロトタイプウイルスの株名で）知られている。すなわち、ＧＩ．１（ノーウォーク（ＮＶ−ＵＳＡ９３））、ＧＩ．２（サウサンプトン（ＳＯＶ−ＧＢＲ９３））；ＧＩ．３（デザートシールド（ＤＳＶ−ＵＳＡ９３））；ＧＩ．４（クルーズシップウイルス／チバ（Ｃｈｉｂａ−ＪＰＮ００））；ＧＩ．５（３１８／マズグローブ（Ｍｕｓｇｒｏｖ−ＧＢＲ００））；ＧＩ．６（ヘッセ（Ｈｅｓｓｅ−ＤＥＵ９８））；ＧＩ．７（Ｗｎｃｈｅｓｔ−ＧＢＲ００）；及びＧＩ．８（Ｂｏｘｅｒ−ＵＳＡ０２）である。ジェノグループＩＩ内には、今日までに１９のＧＩＩクラスタが（プロトタイプウイルスの株名で）知られている。すなわち、ＧＩＩ．１（ハワイ（Ｈａｗａｉｉ−ＵＳＡ９４））；Ｇ１１．２（スノウマウンテン／メルクシャム（Ｍｓｈａｍ−ＧＢＲ９５））；ＧＩＩ．３  （トロント（Ｔｏｒｏｎｔｏ−ＣＡＮ９３））；ＧＩＩ．４  （ブリストル／ローズデール（Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＧＢＲ９３））；ＧＩＩ．５  （２９０／ヒリンドン（Ｈｉｌｉｎｇｄ−ＧＢＲ００））；ＧＩＩ．６  （２６９／シークロフト（Ｓｅａｃｒｏｆ−ＧＢＲ００））；ＧＩＩ．７（２７３／リーズ（Ｌｅｅｄｓ−ＧＢＲ００））；ＧＩＩ．８（５３９／アムステルダム（Ａｍｓｔｄａｍ−ＮＬＤ９９））；ＧＩＩ．９  （３７８（ＶＡＢｅａｃｈ−ＵＳＡ０１））、ＧＩＩ．１０（Ｅｒｆｕｒｔ−ＤＥＵ０１）；ＧＩＩ．１１（ＳＷ９１８０ＪＰＮ０１）；ＧＩＩ．１２（Ｗｏｒｔｌｅｙ−ＧＢＲ００）；ＧＩＩ．１３（Ｆａｙｔｖｉｌ−ＵＳＡ０２）；ＧＩＩ．１４（Ｍ７−ＵＳＡ０３）；ＧＩＩ．１５（Ｊ２３−ＵＳＡ０２）；ＧＩＩ．１６（Ｔｉｆｆｉｎ−ＵＳＡ０３）；ＧＩＩ．１７（ＣＳＥ１−ＵＳＡ０３）；ＧＩＩ．１８（ＱＷ１０１／２００３／ＵＳ）及びＧＩＩ．１９（ＱＷ１７０／２００３／ＵＳ）である。
【００１５】
[0025]  本明細書では「ノロウイルス」には組み換えノロウイルスのウイルス様粒子（ｒＮＯＲ  ＶＬＰ）も意味する。幾つかの実施形態では、少なくとも、例えばＳｆ９細胞中のバキュロウイルスベクターなどから細胞中のＯＲＦ２によってコードされたノロウイルスカプシドタンパク質が組み換え型により発現すると、その結果、カプシドタンパク質がＶＬＰへと自然に自己組織化することがある。幾つかの実施形態では、少なくとも、例えばＳｆ９細胞中のバキュロウイルスベクターなどから細胞中のＯＲＦ１及びＯＲＦ２によってコード化されたノロウイルスタンパク質が組み換え型により発現すると、その結果、カプシドタンパク質がＶＬＰへと自然に自己組織化することがある。ＶＬＰは構造的にノロウイルスに類似しているが、ウイルス性ＲＮＡゲノムが欠如し、したがって感染性ではない。したがって、「ノロウイルス」は欠損粒子を含む感染性又は非感染性粒子となり得るビリオンを含む。
【００１６】
[0026]  ノロウイルスの非制限的な例に含まれるものにはジェノグループ１株Ｈｕ／ＮｏＶ／ウェストチェスタ／２００１／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１６；Ｃｈｉｂａウイルス（ＣＨＶ、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ０４２８０８）；ノロウイルスジェノグループ２株Ｈｕ／ＮｏＶ／ブラドックハイツ／１９９９／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１５；ノロウイルスジェノグループ２株Ｈｕ／ＮｏＶ／フェーエット／１９９９／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１４；ノロウイルスジェノグループ２株Ｈｕ／ＮｏＶ／フェアフィールド／１９９９／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１３；ノロウイルスジェノグループ２株Ｈｕ／ＮｏＶ／サンダスキー／１９９９／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１２；ノロウイルスジェノグループ２株Ｈｕ／ＮｏＶ／カントン／１９９９／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１１；ノロウイルスジェノグループ２株Ｈｕ／ＮｏＶ／ティフィン／１９９９／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１０；ノロウイルスジェノグループ２株Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ−Ｅ１／２００２／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２００；ノロウイルスジェノグループ１株Ｈｕ／ＮｏＶ／ウィスコンシン／２００１／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２００８；ノロウイルスジェノグループ１株Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ−８４１／２００１／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２００７；ノロウイルスジェノグループ２株Ｈｕ／ＮｏＶ／ハイラム／２０００／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２００６；ノロウイルスジェノグループ２株Ｈｕ／ＮｏＶ／トントガニ／１９９９／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２００５；ノーウォークウイルス、完全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ．ｓｕｂ．−−００１９５９；ノロウイルスＨｕ／ＧＩ／オトフケ／１９７９／日本ゲノムＲＮＡ、完全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ１８７５１４；ノロウイルスＨｕ／ホッカイドウ／１３３／２００３／日本、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ２１２３０６；ノロウイルスシドニー２２１２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８１３２；ノーウォークウイルス株ＳＮ２０００ＪＡ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ１９０４５７；ローズデールウイルス、完全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ８６５５７；ノーウォーク様ウイルスゲノムＲＮＡ、ギフ’９６、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０４５６０３；ノーウォークウイルス株ベトナム０２６、完全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５０４６７１；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ．４／２００４／Ｎ／Ｌ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ８８３０９６；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ／ホクシン／０３／日本、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ１９５２２７；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ／カモ／０３／日本、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ１９５２２８；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ／シンシロ／９７／日本、ＧｅｎＢａｎｋアクセッショ��番号ＡＢ１９５２２６；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ／イナ／０２／日本、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ１９５２２５；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／ＧＩＩ／ネウストレリッツ２６０／２０００／デンマーク、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ７７２７３０；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／ドレスデン１７４／ｐＵＳ−ＮｏｒＩＩ／１９９７／ドイツ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ７４１８１１；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／オックスフォード／Ｂ２ＳＩ６／２００２／英国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８７９８９；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／オックスフォード／Ｂ４Ｓ７／２００２／英国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８７９８９；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／ウィットニー／Ｂ７Ｓ２／２００３／英国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０３０；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／バンベリー／Ｂ９Ｓ２３／２００３／英国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２９；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／チッピングノートン／２００３／英国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２８；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／ジドコット／Ｂ９Ｓ２／２００３／英国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２７；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／オックスフォード／Ｂ８Ｓ５／２００２／英国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２６；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／オックスフォード／Ｂ６Ｓ４／２００３／英国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２５；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／オックスフォード／Ｂ６Ｓ５／２００３／英国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２４；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／オックスフォード／Ｂ５Ｓ２３／２００３／英国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２３；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／オックスフォード／Ｂ６Ｓ２／２００３／英国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２２；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／オックスフォード／Ｂ６Ｓ６／２００３／英国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５８８０２１；ノーウォーク様ウイルス分離Ｂｏ／サースク１０／００／英国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１２６４６８；ノーウォーク様ウイルス分離Ｂｏ／ペンリス５５／００／英国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１２６４７６；ノーウォーク様ウイルス分離Ｂｏ／アベリストウィス２４／００／英国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１２６４７５；ノーウォーク様ウイルス分離Ｂｏ／ダムフリース／９４／英国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１２６４７４；ノロウイルスＮＬＶ／ＩＦ２０３６／２００３／イラク、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ６７５５５５；ノロウイルスＮＬＶ／ＩＦ１９９８／２００３／イラク、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ６７５５５４；ノロウイルスＮＬＶ／ＢＵＤＳ／２００２／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ６６０５６８；ノロウイルスＮＬＶ／パリス島／２００３／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ６５２９７９；スノーマウンテンウイルス、完全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１３４７４８；ノー��ォーク様ウイルスＮＬＶ／フォートローダーデール／５６０／１９９８／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４２６；Ｈｕ／ノロウイルス／ヒロシマ／１９９９／日本（９９１２−０２Ｆ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０４４３６６；ノーウォーク様ウイルス株１１ＭＳＵ−ＭＷ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ２７４８２０；ノーウォークウイルス株Ｂ−ＩＳＶＤ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ２７４８１９；ノロウイルスジェノグループ２株Ｈｕ／ＮｏＶ／ファーミントンヒルズ／２００２／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０２３；ノロウイルスジェノグループ２株Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ−Ｇ４／２００２／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０２２；ノロウイルスジェノグループ２株Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ−Ｇ２／２００２／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０２１；ノロウイルスジェノグループ２株Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ−Ｇ１２００２／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０２０；ノロウイルスジェノグループ２株Ｈｕ／ＮｏＶ／アンカレッジ／２００２／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１９；ノロウイルスジェノグループ２株Ｈｕ／Ｎｏｖ／ＣＳ−Ｄ１／２００２／カナダ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１８；ノロウイルスジェノグループ２株Ｈｕ／ＮｏＶ／ジャーマントン／２００２／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５０２０１７；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／ＧＩＩ／ランゲン１０６１／２００２／デンマーク、完全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ４８５６４２；マウスノロウイルス１ポリプロテイン、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ２２８２３５；ノーウォークウイルス、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０６７５３６；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／Ｍｅｘ７０７６／１９９９、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５４２０９０；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／オーバーハウゼン４５５／０１／デンマーク、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５３９４４０；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／ヘルツバーグ３８５／０１／デンマーク、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５３９４３９；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／ボクサ／２００１／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５３８６７９；ノーウォーク様ウイルスゲノムＲＮＡ、完全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０８１７２３；ノーウォーク様ウイルスゲノムＲＮＡ、完全ゲノム、分離：サイタマＵ２０１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３９７８２；ノーウォーク様ウイルスゲノムＲＮＡ、完全ゲノム、分離：サイタマＵ１８、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３９７８１；ノーウォーク様ウイルスゲノムＲＮＡ、完全ゲノム、分離：サイタマＵ２５、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３９７８０；ノーウォークウイルス株：Ｕ２５ＧＩＩ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０６７５４３；ノーウォークウイルス株：Ｕ２０１  ＧＩＩ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０６７５４２；ノーウォーク様ウイルス株４１６／９７００３１５６／１９９６／ルイジアナ州、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８０５５９；ノーウォーク様ウイルス株４０８／９７００３０１２／１９９６／フロリダ州、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８０５５８；ノーウォーク様ウイルスＮＬＶ／バーウォッシュランディング／３３１／１９９５／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４２５；ノーウォーク様ウイルスＮＬＶ／マイアミビーチ／３２６／１９９５／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４２４；ノーウォーク様ウイルスＮＬＶ／ホワイトリバー／２９０／１９９４／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４２３；ノーウォーク様ウイルスＮＬＶ／ニューオリンズ／３０６／１９９４／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４２２；ノーウォーク様ウイルスＮＬＶ／ポートカナベラル／３０１／１９９４／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４２１；ノーウォーク様ウイルスＮＬＶ／ホノルル／３１４／１９９４／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４２０；ノーウォーク様ウイルスＮＬＶ／リッチモンド／２８３／１９９４／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４１９；ノーウォーク様ウイルスＮＬＶ／ウェストオーバー／３０２／１９９４／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４１８；ノーウォーク様ウイルスＮＬＶ／ＵＫ３−１７／１２７００／１９９２／英国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４１７；ノーウォーク様ウイルスＮＬＶ／マイアミ／８１／１９８６／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４１６；スノウマウンテン株、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ７００５９；デザートシールドウイルスＤＳＶ３９５、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０４４６９；ノーウォークウイルス、完全ゲノム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０９３７９７；ハワイカリシウイルス、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０７６１１；サウサンプトンウイルス、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ０７４１８；ノーウォークウイルス（ＳＲＳＶ−ＫＹ−８９／８９／日本）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２３８２８；ノーウォークウイルス（ＳＲＳＶ−ＳＭＡ／７６／米国）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２３８３１；キャンバーウェルウイルス、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ４６５００；ヒトカリシウイルス株メルクシ
ャム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ８１８７９；ヒトカリシウイルス株ＭＸ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ２２４９８；ミニレオウイルスＴＶ２４、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０２０３０；及びノーウォーク様ウイルスＮＬＶ／グウィネズ／２７３／１９９４／米国、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４４０９があり、これらの配列はすべて（本出願の出願日に登録した状態で）参照により本明細書に組み込むものとする。追加のノロウイルス配列は、以下の特許公報、すなわち、ＷＯ２００５／０３０８０６号、ＷＯ２０００／７９２８０号、ＪＰ２００２０２０３９９号、ＵＳ２００３１２９５８８号、米国特許第６，５７２，８６２号、ＷＯ１９９４／０５７００号、及びＷＯ  ０５／０３２４５７号に開示され、これはすべて参照により全体を本明細書に組み込むものとする。また、配列の比較、及びノロウイルスの遺伝子の多様性及び系統学的分析の検討については、Green他（２０００）のJ. Infect. Dis., Vol. 181 (Suppl. 2): S322-330；Wang他（１９９４）のJ. Virol., Vol. 68: 5982-5990；Chen他（２００４）のJ. Virol., Vol. 78: 6469-6479；Chakravarty他（２００５）のJ. Virol., Vol. 79: 554-568；Hansman他（２００６）のJ. Gen. Virol., Vol. 87: 909-919；Bull他（２００６）のJ. Clin. Micro., Vol. 44(2): 327-333；Siebenga他（２００７）のJ. Virol., Vol. 81(18): 9932-9941；及びFankhauser他（１９９８）のJ. Infect. Dis., Vol. 178: 1571-1578を参照されたい。それぞれの核酸及び対応するアミノ酸の配列はすべて、参照により全体を本明細書に組み込むものとする。幾つかの実施形態では、識別
目的に暗号を使用することができ、系統立てられている。すなわち、ウイルスを分離した元の宿主の種／属の略語／科の略語／株名／発生年／発生国である（Green他、Human Caliciviruses, in Fields Virology Vol. 1 841-874（Knipe及びHowley、主任編集者、第４版、Lippincott Williams & Wilkins 2001））。幾つかの実施形態では、ジェノグループＩＩ、遺伝子型４（ＧＩＩ．４）ウイルス株（例えばヒューストン、ミネルバ（デンハーグとしても知られる）、及びローレンス（イェルセケとしても知られる）株）が好ましい。新しい株が識別され、その遺伝子配列が使用可能になるにつれ、当業者は、組成物のこれら最近の株、及び本発明の方法を使用し、通常の技術でＶＬＰを採用することができる。したがって、本発明は本明細書で述べる組成物及び方法で使用するために適切な抗原として、このような株から作成したＶＬＰを想定する。
【００１７】
[0027]  ノロウイルス抗原は、ペプチド、タンパク質、又はウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形態であり得る。好ましい実施形態では、ノロウイルス抗原はＶＬＰを含む。本明細書で使用する「ウイルス様粒子又はＶＬＰ」は、ノロウイルスのカプシドタンパク質コード化配列から産生され、感染性ノロウイルス粒子と同様の抗原特徴を含むウイルス様粒子、フラグメント、集合体、又はその一部を指す。ノロウイルス抗原は、カプシド単量体、カプシド多量体、ＶＬＰのタンパク質又はペプチドフラグメント、又はその集合体又は混合物の形態であり得る。ノロウイルス抗原タンパク質又はペプチドは、当技術分野で知られている方法を使用して産生した変性形態でもあり得る。
【００１８】
[0028]  本発明のＶＬＰは、ＶＰ１及び／又はＶＰ２タンパク質などの完全長ノロウイルスカプシドタンパク質、又は特定のＶＰ１又はＶＰ２誘導体から当技術分野の標準的方法を使用して形成することができる。あるいは、ＶＬＰの形成に使用されるカプシドタンパク質は、切断されたカプシドタンパク質である。幾つかの実施形態では、例えばＶＬＰの少なくとも１つが切断したＶＰ１タンパク質を含む。他の実施形態では、ＶＬＰはすべて切断されたＶＰ１タンパク質を含む。切断は、Ｎ又はＣ末端切断でもよい。切断されたカプシドタンパク質は、適切機能性カプシドタンパク質誘導体である。機能性カプシドタンパク質誘導体は（必要に応じて、適切にアジュバントを与えると）完全長カプシドタンパク質で構成されたＶＬＰによって生じる免疫応答と同じ方法で免疫応答を生じさせることができる。
【００１９】
[0029]  ＶＬＰは多量ＶＰ１タンパク質及び／又は微量ＶＰ２タンパク質を含有することができる。幾つかの実施形態では、各ＶＬＰは一価ＶＬＰを生じるノロウイルスジェノグループ１つのみからのＶＰ１及び／又はＶＰ２タンパク質を含有する。本明細書で使用する「一価」という用語は、抗原タンパク質が単一のノロウイルスジェノグループから誘導されることを意味する。例えば、ＶＬＰはジェノグループＩのウイルス株からのＰＶ１及び／又はＶＰ２（例えばノーウォークウイルスからのＶＰ１及びＶＰ２）を含有する。ＶＬＰは大部分がＶＰ１タンパク質で構成されていることが好ましい。本発明の一実施形態では、抗原は一価ＶＬＰの混合物であり、組成物は、単一のノロウイルスジェノグループからのＶＰ１及びＶＰ２が、複数のウイルス株から得られた異なるノロウイルスジェノグループからのＶＰ１及びＶＰ２（例えばノーウォークウイルス及びヒューストンウイルス）で構成されたＶＬＰと混合されたＶＬＰを含む。純粋に例示により、組成物はノロウイルスジェノグループＩの１つ又は複数の株からの一価ＶＬＰを、ノロウイルスジェノグループＩＩの１つ又は複数の株からの一価ＶＬＰと一緒に含有することができる。株は、所与の時間におけるその循環優位性に基づいて選択することができる。特定の実施形態では、ノロウイルスＶＬＰ混合物はＧＩ．１及びＧＩＩ．４ウイルス株で構成される。ノロウイルスＶＬＰ混合物は、ノーウォークの株、及びジェノグループＩＩノロウイルス由来のコンセンサスカプシド配列で構成することが、更に好ましい。循環するノロウイルス配列由来のコンセンサスカプシド配列、及びこのような配列で作成されるＶＬＰについては、ＷＯ２０１０／０１７５４２号で説明され、これは参照により全体を本明細書に組み込むものとする。例えば、一実施形態では、ジェノグループＩＩ遺伝子型４（ＧＩＩ．４）ウイルス株由来のコンセンサスカプシド配列は、配列番号：１の配列を含む。したがって、幾つかの実施形態では、ワクチン組成物は一価ＶＬＰの混合物を含み、１つの一価ＶＬＰはジェノグループＩノロウイルス（例えばノーウォーク）からのカプシドタンパク質を含み、他の一価ＶＬＰは配列番号：１の配列を含むコンセンサスカプシドタンパク質を含む。
【化１】
2014520852.tif 000002
【００２０】
[0030]  しかし、本発明の代替実施形態では、ＶＬＰは、例えば１つのノロウイルスジェノグループからのＶＰ１及び／又はＶＰ２タンパク質が第二ノロウイルスジェノグループからのＶＰ１及び／又はＶＰ２タンパク質と混合したものと含む多価ＶＬＰとすることができ、異なるＶＰ１及びＶＰ２タンパク質はキメラＶＰ１及びＶＰ２タンパク質ではなく、同じカプシド構造内で会合して免疫原性ＶＬＰを形成する。本明細書で使用する「多価」という用語は、抗原タンパク質が２つ以上のノロウイルスジェノグループ又は株由来であることを意味する。多価ＶＬＰは、２つ以上のウイルス株から採取したＶＬＰ抗原を含有することができる。純粋に例示により、組成物は、ノロウイルスジェノグループＩＩの１つ又は複数の株（例えばヒューストンウイルス）からのカプシド単量体又は多量体とともにノロウイルスジェノグループＩの１つ又は複数の株（例えばノーウォークウイルス）からのカプシド単量体又は多量体で構成された多価ＶＬＰを単有することができる。多価ＶＬＰは、ノーウォーク及びヒューストンノロウイルスの株、又は所与の時間において優性に循環している他の株からのカプシドタンパク質を含有することが好ましい。
【００２１】
[0031]  組成物中の一価又は多価ＶＬＰの組み合わせは、各ＶＬＰ型の免疫原性を低下させないことが好ましい。特に、本発明の組み合わせＶＬＰ組成物が、ワクチン中に提示された各ノロウイルス遺伝子型によって感染に対する免疫を誘発できるように、本発明の組み合わせのノロウイルスＶＬＰ間に干渉がないことが好ましい。組み合わせ中の所与のＶＬＰ型に対する免疫応答は、個々に測定した場合に同じＶＬＰ型の免疫応答の少なくとも５０％、好ましくは１００％、又はほぼ１００％であることが適切である。免疫応答は、例えば本明細書の例で例証したような抗体応答によって適切に測定することができる。
【００２２】
[0032]  本明細書で使用する「ジェノグループＩノロウイルスＶＬＰ」は、１つ又は複数のジェノグループＩノロウイルス株由来のカプシドタンパク質を含む一価又は多価ＶＬＰを指す。幾つかの実施形態では、ジェノグループＩノロウイルスＶＬＰはジェノグループＩノロウイルス（例えばノーウォークウイルス）からの完全長カプシドタンパク質を含む。他の実施形態では、ジェノグループＩノロウイルスＶＬＰは、様々なジェノグループＩ株由来のコンセンサスカプシドタンパク質を含む。コンセンサスカプシド配列が誘導される元のジェノグループＩ株は、同じ遺伝子型又は遺伝子クラスタ内にあるか、又は異なる遺伝子型又は遺伝子クラスタからのものでよい。同様に、本明細書で使用する「ジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰ」は、１つ又は複数のジェノグループＩＩノロウイルス株由来のカプシドタンパク質を含む一価又は多価ＶＬＰを指す。幾つかの実施形態では、ジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰはジェノグループＩＩノロウイルス（例えばローレンス又はミネルバウイルス）からの完全長カプシドタンパク質を含む。他の実施形態では、ジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰは様々なジェノグループＩＩ株由来のコンセンサスカプシドタンパク質を含む。コンセンサスカプシド配列が誘導される元のジェノグループＩＩ株は、同じ遺伝子型又は遺伝子クラスタ内にあるか、又は異なる遺伝子型又は遺伝子クラスタからのものでよい。一実施形態では、ジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰはジェノグループＩＩ遺伝子型４（ＧＩＩ．４）ノロウイルスのカプシドコンセンサス配列を含む。したがって、幾つかの実施形態では、ジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰは配列番号：１のカプシド配列を含む。
【００２３】
[0033]  多価ＶＬＰは、個々のカプシドタンパク質が別個に発現し、その後に組み合わせてＶＬＰを形成することによって産生することができる。あるいは、複数のカプシドタンパク質が同じ細胞内で１つ又は複数のＤＮＡ構築物から発現することができる。例えば、複数のＤＮＡ構築物は、形質転換するか、又は宿主細胞に導入することができ、各ベクターが異なるカプシドタンパク質をコードする。あるいは、複数のカプシド遺伝子を有し、共有プロモータ又は複数の個々のプロモータに制御された単一のベクターを使用することができる。適宜、ＩＲＥＳエレメントをベクターに組み込むこともできる。このような発現戦略を使用し、同時発現したカプシドタンパク質を、その後のＶＬＰ形成のために同時精製するか、又は多価ＶＬＰを自然形成させ、次にそれを精製することができる。
【００２４】
[0034]  好ましい多価ＶＬＰ産生プロセスは、様々なノロウイルス遺伝子型からＶＰ１タンパク質などのＶＬＰカプシドタンパク質又は誘導体を調製することと、タンパク質を混合することと、多価ＶＬＰを産生するためにタンパク質を集合させることとを含む。ＶＰ１タンパク質は、粗抽出物の形態であるか、部分的に精製されているか、又は混合前に精製することができる。様々なジェノグループの集合した一価ＶＬＰは、分解し、一緒に混合して、多価ＶＬＰへと再集合させることができる。タンパク質又はＶＬＰは、組み合わせる前に少なくとも部分的に精製することが好ましい。任意選択で、集合後に多価ＶＬＰのさらなる精製を実行することができる。
【００２５】
[0035]  本発明のＶＬＰは、均質で純粋なＶＬＰを提供するために、ＶＬＰを分解し、最集合させることによって作製することが適切である。一実施形態では、２つ以上のＶＬＰを分解し、その後に再集合前の任意の適切な時点で分解したＶＬＰ成分を組み合わせることによって、多価ＶＬＰを作成することができる。この方法は、例えば幾つかのイースト株で生じるように、発現したＶＰ１タンパク質からＶＬＰが自然形成する場合に適切である。ＶＰ１タンパク質が発現してもＶＬＰが自然形成されない場合、集合してＶＬＰにする前にＶＰ１タンパク質又はカプソメアの試料を組み合わせることができる。
【００２６】
[0036]  多価ＶＬＰを使用する場合、ＶＬＰの成分を最終的な混合ＶＬＰに所望の比率で混合することが好ましい。例えば、ノーウォーク及びヒューストンウイルス（又は他のノロウイルス株）からの部分的に精製したＶＰ１タンパク質を同量混合すると、各タンパク質がほぼ同量である多価ＶＬＰが提供される。
【００２７】
[0037]  多価ＶＬＰを含む組成物は、参照により本明細書に組み込まれたＷＯ９８／４４９４４号、ＷＯ００／４５８４１号など、当技術分野で知られる解決法で安定させることができる。
【００２８】
[0038]  本発明の組成物は、ノロウイルスＶＰ１及びＶＰ２タンパク質又は誘導体に加えて、他のタンパク質又はタンパク質フラグメントを含むことができる。他のタンパク質又はペプチドも、本発明の組成物と同時投与することができる。任意選択で、組成物は非ノロウイルス抗原を配合するか、それと同時投与することもできる。これらの抗原は、他の疾病に対する防御を提供できることが適切である。
【００２９】
[0039]  ＶＰ１タンパク質又は機能性タンパク質誘導体は、ＶＬＰを形成できることが適切であり、ＶＬＰの形成は、例えばサイズ排除クロマトグラフィ、電子顕微鏡及び動的レーザ光散乱などの標準的技術で評価することができる。
【００３０】
[0040]  本発明の抗原分子は、これが自然に発生する生体から分離して精製することによって調製することができるか、又は組み換え技術によって調製してもよい。ノロウイルスＶＬＰ抗原は、Ｓｆ９又はＨ５細胞などの昆虫の細胞から調製することが好ましいが、大腸菌などの任意の適切な細胞、又は例えば酵母、Ｓ．ポンベ、ピチア・パストリ又は他のピチア発現系などのイースト細胞、ＣＨＯ又はＨＥＫ系などの哺乳類細胞発現も使用することができる。組み換え法又は合成によって調製する場合、ペプチドを構成するアミノ酸の１つ又は複数の挿入、削除、反転又は置換を実行することができる。上記抗原はそれぞれ、実質的に純粋な状態で使用することが好ましい。
【００３１】
[0041]  昆虫細胞の培養でノロウイルスＶＬＰを産生する手順は、参照により全体を本明細書に組み込むものとする米国特許第６，９４２，８６５号で以前に開示されている。簡潔に言うと、ウイルスカプシド遺伝子（ＯＲＦ２）及び微量構造遺伝子（ＯＲＦ３）を含有するゲノムの３’末端からのｃＤＮＡをクローン化する。ウイルスカプシド遺伝子を有する組み換えバキュロウイルスは、クローン化されたｃＤＮＡから構築される。ノロウイルスＶＬＰは、Ｓｆ９又はＨ５昆虫細胞培養で産生される。
【００３２】
[0042]  幾つかの実施形態では、ワクチン組成物はノロウイルス抗原と組み合わせた１つ又は複数のアジュバントを含む。大部分のアジュバントは、水酸化アルミニウム又は鉱物油などの急速な代謝から、及び百日咳菌又は結核菌由来のタンパク質などの免疫応答の刺激物質から抗原を防除するように設計された物質を含有する。適切なアジュバントは例えばFreund's Incomplete Adjuvant及びComplete Adjuvant（Pifco Laboratories、ミシガン州デトロイト）；Merck Adjuvant 65（Merck and Company, Inc.、ニュージャージー州ローウェイ）；水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）又はリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム、鉄又は亜鉛の塩；アシル化チロシンアシル化糖の不溶性懸濁液；カチオン又はアニオン誘導の多糖類；ポリホスファゼン；生分解性微小球；及びクイルＡなどとして市販されている。
【００３３】
[0043]  適切なアジュバントには、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、特にｔｏｌｌ様受容体タイプ４（ＴＬＲ−４）アゴニスト（例えばモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、合成リピドＡ、リピドＡ模倣品又は類似物質）、アルミニウム塩、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖類（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルジョン、ビロゾーム、渦巻形、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマ粒子、微粒子、リポソーム、水中油型乳剤、ＭＦ５９、及びスクアレンも含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、アジュバントは細菌由来の外毒素ではない。好ましいアジュバントには、３ＤＭＰＬ又はＱＳ２１などのＴｈ１型応答を刺激するアジュバントが含まれる。
【００３４】
[0044]  モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、すなわち、サルモネラからのリピドＡの非毒性誘導体は、ワクチンアジュバントとして開発されてきた強力ＴＬＲ−４アゴニストである（Evans他、２００３）。マウスの臨床前試験では、鼻腔内ＭＰＬが分泌、更に体液の全身応答を向上させることが示されている（Baldridge他、２０００；Yang他、２００２）。１２０，０００人を超える患者の臨床試験で、ワクチンアジュバントとして安全で有効であることも証明されている（Baldrick他、２００２；Baldridge他、２００４）。ＭＰＬはＴＬＲ−４受容体を通して先天性免疫の誘導を刺激し、したがってグラム陰性菌及びグラム陽性菌の両方、ウイルス、及び寄生生物などの広範囲の感染性病原体に対する非特異的免疫応答を誘発することができる（Baldridge他、２００４；Persing他、２００２）。ワクチン配合にＭＰＬを含めると、ワクチンの抗原成分によって生じた特異的応答を向上させながら、先天性応答を迅速に誘導し、ウイルス攻撃から非特異的免疫応答を誘発するはずである。
【００３５】
[0045]  一実施形態では、本発明は適応免疫及び先天性免疫のエンハンサとしてモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）又は３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）を含む組成物を提供する。化学的に、３Ｄ−ＭＰＬは３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと４、５又は６個のアシル鎖との混合物である。３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい形態が、参照により本明細書に組み込むものとする欧州特許第０６８９４５４Ｂ１号（SmithKline Beecham Biologicals SA）に開示されている。別の実施形態では、本発明は合成リピドＡ、リピドＡ模倣品又は類似体、例えばBioMiraのＰＥＴリピドＡ、又はＴＬＲ−４アゴニストのように機能すべく設計された合成誘導体を含む組成物を提供する。
【００３６】
[0046]  特定の実施形態では、ワクチン組成物は２つのアジュバントを含む。アジュバントの組み合わせは上記から選択することができる。１つの特定の実施形態では、２つのアジュバントはＭＰＬ及び水酸化アルミニウム（例えばミョウバン）である。別の特定の実施形態では、２つのアジュバントはＭＰＬ及び油である。
【００３７】
[0047]  「有効アジュバント量」又は「アジュバントの有効量」という用語は、当業者には十分理解されており、鼻洗浄のＩｇＡ、血清ＩｇＧ又はＩｇＭレベル、又はＢ及びＴ細胞増殖に関して測定した場合の、投与された抗原に対する免疫応答を刺激することができる１つ又は複数のアジュバントの量、すなわち投与された抗原組成物の免疫応答を増大させる量を含む。免疫グロブリンレベルの適切に効果的な増加は、アジュバントが全くない同じ抗原組成物と比較して、５％超、好ましくは２５％超、特に５０％超を含む。
【００３８】
[0048]  一実施形態では、本発明は非経口投与用に配合されたワクチン組成物を提供し、組成物は水酸化アルミニウム及び緩衝剤と組み合わせた少なくとも２タイプのノロウイルスＶＬＰを含む。緩衝剤は、Ｌ−ヒスチジン、イミダゾール、コハク酸、トリス、クエン酸、ビストリス、ｐｉｐｅｓ、ｍｅｓ、ｈｅｐｅｓ、グリシンアミド、及びトリシンからなる群から選択することができる。一実施形態では、緩衝剤はＬ−ヒスチジン又はイミダゾールである。好ましくは、緩衝剤は約１５ｍＭ〜約５０ｍＭ、更に好ましくは約１８ｍＭ〜約４０ｍＭ、又は最も好ましくは約２０ｍＭ〜約２５ｍＭの濃度で存在する。幾つかの実施形態では、抗原又はワクチン組成物のｐＨは約６．０〜約７．０、又は約６．２〜約６．８、又は約６．５である。ワクチン組成物は水性配合とすることができる。幾つかの実施形態では、ワクチン組成物は凍結乾燥粉末であり、水性製剤に再構成される。
【００３９】
[0049]  特定の実施形態では、ワクチン組成物は２つ以上のタイプのノロウイルスＶＬＰ、水酸化アルミニウム、及び緩衝剤に加えて、少なくとも１つのアジュバントを更に含む。例えば、アジュバントはＭＰＬ、フラジェリン、ＣｐＧオリゴ、合成リピドＡ、又はリピドＡ模倣品又は類似物質などのｔｏｌｌ様受容体アゴニストでよい。１つの特定の実施形態では、アジュバントはＭＰＬである。
【００４０】
[0050]  本発明のワクチン組成物に含まれるノロウイルスＶＬＰは、本明細書で述べるＶＬＰのいずれでもよい。一実施形態では、２タイプのノロウイルスＶＬＰはそれぞれ、異なるジェノグループ（例えばジェノグループＩ及びジェノグループＩＩ）からのカプシドタンパク質を含む。例えば、一方のタイプのノロウイルスＶＬＰは、ジェノグループＩのノロウイルス由来のカプシドタンパク質を含み、他方のタイプのノロウイルスＶＬＰは、ジェノグループＩＩのノロウイルス由来のカプシドタンパク質を含む。一実施形態では、一方のタイプのノロウイルスＶＬＰは、ノーウォークウイルスからのカプシドタンパク質を含み、他方のタイプのノロウイルスＶＬＰは、ジェノグループＩＩ遺伝子型４ノロウイルス由来のコンセンサスカプシドタンパク質（例えば配列番号：１の配列を含むカプシドタンパク質）を含む。ワクチン組成物は、約５μｇ〜約２００μｇの各ノロウイルスＶＬＰ、更に好ましくは約１５μｇ〜約５０μｇの各ノロウイルスＶＬＰを含むことができる。幾つかの実施形態では、一方のタイプのノロウイルスＶＬＰの用量は、他方のタイプのノロウイルスＶＬＰの用量とは異なる。例えば、特定の実施形態では、ワクチン組成物は約５μｇ〜約１５μｇのジェノグループＩのＶＬＰ、及び約１５μｇ〜約５０μｇのジェノグループＩＩのＶＬＰを含む。他の実施形態では、ワクチン組成物は約１５μｇ〜約５０μｇのジェノグループＩのＶＬＰ、及び約５０μｇ〜約１５０μｇのジェノグループＩＩのＶＬＰを含む。
【００４１】
[0051]  幾つかの実施形態では、ワクチン組成物は更に、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、及びクエン酸ナトリウムを含むが、これらに限定されない薬学的に許容可能な塩を含む。一実施形態では、薬学的に許容可能な塩は塩化ナトリウムである。薬学的に許容可能な塩の濃度は、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭでよく、約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭの範囲の濃度が好ましい。本発明のワクチン組成物は、２ｍＭ未満の遊離リン酸塩を含有することが好ましい。幾つかの実施形態では、ワクチン組成物は１ｍＭ未満の遊離リン酸塩を含む。ワクチン組成物は更に、糖（例えば蔗糖、トレハロース、マンニトール）及び界面活性剤などの薬学的に許容可能な他の賦形剤も含むことができる。
【００４２】
[0052]  本明細書で検討するように、本発明の組成物はワクチン製剤として投与するように配合することができる。本明細書で使用する「ワクチン」という用語は、ノロウイルスＶＬＰ又は上述したような本発明の他のノロウイルス抗原を含有する製剤を指し、これは脊椎動物、特にヒトに投与することができる形態であり、ノロウイルス感染又はノロウイルスに誘導された疾患を防御及び／又は改善する、及び／又はノロウイルス感染又は疾患の少なくとも１つの症状を軽減するための免疫を誘導するのに十分な防御免疫応答を誘導する。
【００４３】
[0053]  本明細書で使用する「免疫応答」という用語は、体液性免疫応答と細胞媒介性免疫応答との両方を指す。体液性免疫応答は、例えば感染因子を中和する、感染因子の細胞進入を阻害する、上記感染因子の複製を阻害する、及び／又は宿主細胞を感染及び破壊から防御するようなＢリンパ球によって、抗体の産生を刺激することを含む。細胞媒介性免疫応答は、感染因子に対してＴリンパ球及び／又はマクロファージなどの他の細胞によって仲介され、脊椎動物（例えばヒト）によって提示され、感染を防止又は改善するか、その少なくとも１つの症状を軽減する免疫応答を指す。特に、「防御免疫」又は「防御免疫応答」は、感染因子に対する免疫又は免疫応答の誘発を指し、これは脊椎動物（例えばヒト）によって提示され、感染を防止又は改善するか、又はその少なくとも１つの症状を軽減する。具体的には、ワクチンの投与による防御免疫応答の誘導は、急性胃腸炎の１つ又は複数の症状の存在が消失するか減少する、又はこのような症状の持続時間又は重症度が低下することによって明白である。ノロウイルスによる胃腸炎の臨床的症状には悪心、下痢、軟便、嘔吐、発熱、及び全身の倦怠感が含まれる。疾病の症状を軽減又は消失させる防御免疫応答は、集団におけるノロウイルス大発生の蔓延を低下又は停止させる。ワクチンの調製については、ワクチン設計に概略説明されている（「The subunit and adjuvant approach」（編集者Powell M. F.及びNewman M. J.）（１９９５）、Plenum Press New York）。本発明の組成物は、例えば口腔、胃腸、及び呼吸器（例えば鼻腔）の粘膜のうち１つ又は複数に送達するように配合することができる。本発明の組成物は、非経口注射（例えば静脈内、皮下、皮内、又は筋肉内注射）などの注射によって送達するように配合することができる。
【００４４】
[0054]  組成物を呼吸器（例えば鼻腔）粘膜に送達するように意図されている場合、通常は、エアロゾル又は点鼻液として投与するために水溶液として、あるいは例えば鼻腔路内に迅速に付着させるために乾燥粉末として配合される。点鼻液として投与する組成物は、このような組成物に通常含まれるタイプの１つ又は複数の賦形剤、例えば保存剤、粘度調整剤、等張化剤、緩衝剤などを含有することがある。粘度調整剤は微結晶質セルロース、キトサン、デンプン、多糖類などとすることができる。乾燥粉末として投与する組成物は、このような組成物に通常含まれる１つ又は複数の賦形剤、例えば粘膜付着剤、増量剤、及び適切な粉末流及びサイズ特性を与える薬剤も含有することがある。増量剤及び粉末流動及びサイズの薬剤は、マンニトール、蔗糖、トレハロース、及びキシリトールを含むことがある。
【００４５】
[0055]  組成物が、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、皮内、又は筋肉内（ｉ．ｍ．）注射などの非経口注射を意図している場合、これは通常、少なくとも１タイプのノロウイルスＶＬＰ及び任意選択で少なくとも１つのアジュバントで構成される懸濁液（すなわち、水性製剤）として配合される。一実施形態では、アジュバントはＭＰＬとすることができる。別の実施形態では、非経口投与用に配合された液体ワクチンは、複数のアジュバントを有することができる。好ましい実施形態では、非経口配合（例えば、ｉ．ｍ．、ｉ．ｖ．、又はｓ．ｃ．配合）液体ワクチンは、ノロウイルスジェノグループＩ及び／又はジェノグループＩＩのＶＬＰを、アジュバントとしての水酸化アルミニウム（例えばミョウバン）及びモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）とともに含む。一実施形態では、非経口投与用液体製剤は、本明細書で述べるような１つ又は複数タイプのノロウイルスＶＬＰなどのノロウイルスジェノグループ抗原、ＭＰＬ、水酸化アルミニウム、及び緩衝剤を含む。別の実施形態では、非経口投与用液体製剤はノロウイルスジェノグループ抗原、ＭＰＬ、油、及び緩衝剤を含む。特定の実施形態では、非経口ワクチン製剤中の緩衝剤はＬ−ヒスチジン又はイミダゾールである。液体ワクチンの非経口投与は、当技術分野で周知であるように針又はシリンジによって実行することができる。
【００４６】
[0056]  特定の実施形態では、ヒトのノロウイルスに対して防御免疫応答を誘発する本発明のワクチン組成物は、１５０μｇ以下の容量のジェノグループＩ及び／又はジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰを含む。例えば、幾つかの実施形態では、ワクチン組成物は１５０μｇ以下、１００μｇ以下、５０μｇ以下、２５μｇ以下、１５μｇ以下、又は１０μｇ以下のジェノグループＩノロウイルスＶＬＰを含む。他の実施形態では、ワクチン組成物は１５０μｇ以下、１００μｇ以下、５０μｇ以下、２５μｇ以下、１５μｇ以下、又は１０μｇ以下のジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰを含む。特定の実施形態では、ワクチン組成物は１５０μｇ以下のジェノグループＩ及びジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰをそれぞれ含む。このような実施形態では、ジェノグループＩノロウイルスＶＬＰとジェノグループＩＩのＶＬＰの用量は同じか、又は異なっていてもよい。例えば、一実施形態では、ワクチン組成物は５０μｇ以下のジェノグループＩノロウイルスＶＬＰ、及び１５０μｇ以下のジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰを含むことができる。別の実施形態では、ワクチン組成物は２５μｇ以下のジェノグループＩノロウイルスＶＬＰ、及び５０μｇ以下のジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰを含むことができる。他の実施形態では、ワクチン組成物は１５μｇ以下のジェノグループＩノロウイルスＶＬＰ、及び５０μｇ以下のジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰを含むことができる。更に他の実施形態では、ワクチン組成物は２５μｇ以下のジェノグループＩノロウイルスＶＬＰ、及び１５０μｇ以下のジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰを含むことができる。
【００４７】
[0057]  ジェノグループＩ及びジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰは、本明細書で述べるノロウイルス株のいずれかから誘導することができる。一実施形態では、ジェノグループＩノロウイルスＶＬＰはジェノグループＩ遺伝子型Ｉ（ＧＩ．１）ＶＬＰである（すなわち、ＧＩ．１ノロウイルスからのカプシドタンパク質を含む）。別の実施形態では、ジェノグループＩノロウイルスＶＬＰはノーウォークＶＬＰである。別の実施形態では、ジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰはジェノグループＩＩ遺伝子型４（ＧＩＩ．４）ＶＬＰである。更に別の実施形態では、ジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰは、ジェノグループＩＩノロウイルスのコンセンサス配列の発現により生じたＶＬＰである。特定の実施形態では、ジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰは、配列番号：１の配列を有するカプシドタンパク質を含む。
【００４８】
[0058]  本明細書で上述したワクチン組成物は、使用準備が整うまで凍結乾燥して無水保存することができ、使用時点で希釈剤にて再構成する。あるいは、組成物の様々な成分をキット内で別個に保存する（いずれか、又はすべての成分を凍結乾燥する）ことができる。組成物は、乾燥製剤の場合は凍結乾燥形態のままにし、液体製剤の場合は再構成することができ、使用前に混合するか、患者に別個に投与する。幾つかの実施形態では、ワクチン組成物は液体製剤にてキット内で保存し、針を装備したシリンジなどの送達器具を添付することができる。他の実施形態では、液体ワクチン組成物はキットの送達器具内で保存することができる。例えば、キットは、本明細書で述べたワクチン組成物の液体製剤を収容した事前充填シリンジ、自動注入装置、又は注射ペン器具を含むことができる。
【００４９】
[0059]  ワクチンの凍結乾燥は当技術分野で周知されている。通常、液体抗原は、凍結乾燥プロセス中の抗原を保護し、望ましい粉末特性を有するケークを生成する薬剤が存在する状態で、凍結乾燥する。蔗糖、マンニトール、トレハロース、又は乳糖などの糖（１０〜２００ｍｇ／ｍＬの初期濃度で存在）は、一般的にタンパク質抗原の凍結防止のために使用され、望ましい粉末特性を有する凍結乾燥ケークを生成する。組成物を凍結乾燥した結果、理論的に組成物の安定性が向上する。
【００５０】
[0060]  各ワクチン組成物の抗原の量は、重大で有害な副作用がない状態で頑強な免疫応答を誘導する量で選択される。このような量は、採用する特定の抗原、投与経路、及び使用するアジュバントに応じて変化する。概して、本発明の状況では、患者への投与量はある期間にわたって患者の防御免疫応答をもたらす、又は抗原特異的抗体の産生を誘導するのに十分でなければならない。したがって、組成物は、特異的抗原に対する免疫応答を誘発する、及び／又は疾患又は感染からの症状及び／又は合併症を防止、緩和、軽減、又は治癒させ、したがって集団におけるノロウイルス大発生の蔓延を低下又は停止させるのに十分な量で患者に投与される。これを達成するために適切な量は、「治療有効用量」と規定される。
【００５１】
[0061]  本発明のワクチン組成物は、非粘膜又は粘膜経路を介して投与することができる。この投与には非経口注射（例えば静脈内、皮下、皮内、及び筋肉内）、又は他の伝統的な直接的経路、例えば頬側／舌下、直腸、口腔、鼻腔、局所（例えば経皮及び眼）、膣、肺、動脈内、腹膜内、眼内、又は鼻腔内経路を介する、又は特定の組織に直接的にin vivoで投与することが含まれる。他の適切な投与経路には経皮、皮下、及び座薬を介することが含まれる。一実施形態では、ワクチンは静脈内、皮下、皮内、又は筋肉内など、非経口投与経路によって投与される。特定の実施形態では、ワクチンは筋肉内投与経路によって投与される。投与は、針、カテーテル又は関連する器具（例えば事前充填したシリンジ又は自動注入装置）を使用し、単一の時点又は複数の時点で直接投与することにより、単純に遂行することができる。他の非経口製剤を、微量注射又は皮膚パッチ送達法により皮下又は皮内送達することができる。
【００５２】
[0062]  本発明は、対象にノロウイルスに対する防御免疫を誘発する方法であって、単回投与以内の本発明のワクチン組成物を対象に非経口投与することを含む方法を提供し、上記ワクチンは本明細書で述べるようなジェノグループＩ及び／又はジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰ、及び任意選択で少なくとも１つのアジュバントを含む。このような実施形態では、単回投与のワクチン組成物は、組成物を投与する前のヒトの抗体価と比較して、ノロウイルスに特異的な血清抗体価の少なくとも３倍の増加を誘導する。幾つかの実施形態では、単回投与のワクチン組成物は、組成物を投与する前のヒトの抗体価と比較して、ノロウイルスに特異的な血清抗体価の少なくとも６倍の増加を誘導する。他の実施形態では、単回投与のワクチン組成物は、自然感染で生のノロウイルスに曝露することによって誘導された抗体価と同等のノロウイルスに特異的な血清抗体価を、すなわち組成物を投与する前のヒトの抗体価と比較してノロウイルスに特異的な血清抗体の１０倍を超える増加を誘導する。特定の実施形態では、単回投与のワクチン組成物は、組成物を投与したから７日間以内にノロウイルスに特異的な血清抗体価の増加を誘導する。単回投与のワクチン組成物は、静脈内、皮下、又は筋肉内投与経路によって投与することが好ましい。特定の実施形態では、単回投与のワクチン組成物はヒトに筋肉内投与される。
【００５３】
[0063]  本明細書で述べるように、幾つかの実施形態では、上記方法で使用するのに適切な単回投与のワクチン組成物は、ジェノグループＩ及び／又はジェノグループＩＩノロウイルスをそれぞれ１５０μｇ以下含む。例えば、幾つかの実施形態では、ワクチン組成物は１５０μ以内、１００μｇ以下、５０μｇ以下、２５μｇ以下、１５μｇ以下、又は１０μｇ以下のジェノグループＩノロウイルスＶＬＰを含む。他の実施形態では、ワクチン組成物は１５０μｇ以下、１００μｇ以下、５０μｇ以下、２５μｇ以下、１５μｇ以下、又は１０μｇ以下のジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰを含む。特定の実施形態では、ワクチン組成物はジェノグループＩ及びジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰをそれぞれ５０μｇ以下含む。単回投与のワクチン組成物がジェノグループＩ及びジェノグループＩＩのノロウイルスＶＬＰを両方含む実施形態では、ジェノグループＩノロウイルスＶＬＰとジェノグループＩＩのＶＬＰとの用量は同じ、又は異なってよい。例えば、一実施形態では、ワクチン組成物は５０μｇ以下のジェノグループＩノロウイルスＶＬＰ、及び１５０μｇ以下のジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰを含むことができる。別の実施形態では、ワクチン組成物は２５μｇ以下のジェノグループＩノロウイルスＶＬＰ、及び５０μｇ以下のジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰを含むことができる。他の実施形態では、ワクチン組成物は１５μｇ以下のジェノグループＩノロウイルスＶＬＰ、及び５０μｇ以下のジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰを含むことができる。更に他の実施形態では、ワクチン組成物は２５μｇ以下のジェノグループＩノロウイルスＶＬＰ、及び１５０μｇ以下のジェノグループＩＩノロウイルスＶＬＰを含むことができる。
【００５４】
[0064]  上記方法の一実施形態では、対象はヒトであり、ワクチンはノロウイルス感染の１つ又は複数の症状からの防御を与える。ノロウイルス抗原で免疫応答を誘導する方法を報告している人もいるが（米国特許出願公開第ＵＳ２００７／０２０７５２６号参照）、ヒトのノロウイルスに対する防御免疫応答の指標はまだ明白に識別されていない（Herbst-Kralovetz他（２０１０）、Expert Rev. Vaccines 9(3), 299-307）。米国で現在特許を有し、ワクチンの有効性が血清抗体と相関する幾つかのワクチンとは異なり、試験は、ノーウォークウイルスに対する血清ＩｇＧ抗体の抗体価上昇などの免疫応答のマーカーは、ヒトの防御免疫に付随しないことを示している（Johnson他（１９９０）、J. Infectious Diseases 161: 18-21）。更に、ヒトのノーウォークウイルス感染を検査する別の試験は、ノーウォーク感染に対する感受性は多因子性であり、分泌状態及び記憶粘膜免疫応答などの因子を含むことを示した（Lindesmith他（２００３）、Nature Medicine 9: 548-553）。
【００５５】
[0065]  ノロウイルスはin vitroで培養することができないので、現在使用可能なウイルス中和測定法はない。中和測定法の代用の働きをする機能アッセイは、赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）アッセイである（実施例１参照）。ＨＡＩは、ノロウイルスワクチンに誘導された抗体が、ノロウイルスＶＬＰによる抗原被覆赤血球の凝集を抑制する能力を測定する。ノロウイルスＶＬＰが赤血球抗原（例えば組織−血液型抗原）に結合するからである。このアッセイは炭水化物阻害アッセイとしても知られる。赤血球上の血液型抗原炭水化物に対するウイルス又はＶＬＰの結合を阻害する抗体の機能的能力を示すからである。このアッセイでは、固定量のノロウイルスＶＬＰを、免疫処置した対象からの固定量の赤血球及び血清と混合する。血清サンプルが機能抗体を含有する場合、抗体はＶＬＰに結合し、それにより赤血球の凝集を抑制する。本明細書で使用する「機能抗体」は、ノロウイルス粒子と赤血球抗原との相互作用を抑制することができる抗体を指す。すなわち、機能抗体価は、組織−血液型抗原（ＨＢＧＡ）又は炭水化物阻害抗体価と同等である。ノロウイルス特異的機能抗体の血清抗体価は、上述したＨＡＩアッセイで測定することができる。ノロウイルス特異的機能抗体の血清抗体価は、炭水化物Ｈ抗原が微量定量ウェルに結合し、Ｈ抗原に結合したノロウイルスＶＬＰが血清の存在下で検出されるＥＬＩＳＡ系アッセイを使用して測定することもできる（実施例１及びReeck他（２０１０）、J Infect Dis, Vol. 202(8): 1212-1218を参照）。ノロウイルス特異的機能抗体のレベル上昇は、防御免疫応答の指標となり得る。したがって、一実施形態では、ワクチンの投与は、ワクチンを投与されていないヒトの血清抗体価と比較して、ノロウイルス特異的機能抗体の血清抗体価の上昇を含む防御免疫を誘発する。防御免疫応答を示すノロウイルス特異的機能抗体の血清抗体価は、幾何平均抗価がＨＡＩアッセイで測定して４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００より大きい、又は阻害価（ＢＴ）５０（ノロウイルスＶＬＰによるＨ抗原結合が５０％阻害）の幾何平均抗体価がＨ抗原結合アッセイで測定して１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００より大きいことが好ましい。一実施形態では、ノロウイルス特異的機能抗体の血清抗体価は、ＨＡＩアッセイで測定して幾何平均抗体価が４０より大きい。別の実施形態では、ノロウイルス特異的機能抗体の血清抗体価は、ＨＡＩアッセイで測定して幾何平均抗体価が１００より大きい。別の実施形態では、ノロウイルス特異的機能抗体の血清抗体価は、Ｈ抗原結合アッセイで測定してＢＴ５０の幾何平均抗体価が１００より大きい。更に別の実施形態では、ノロウイルス特異的機能抗体の血清抗体価は、Ｈ抗原結合アッセイで測定してＢＴ５０の幾何平均抗体価が２００より大きい。
【００５６】
[0066]  さらなる態様では、ワクチン投与は、１つ又は複数タイプのノロウイルス抗原、及び任意選択で少なくとも１つの有効アジュバントを含む単回投与以内の抗原又はワクチン組成物を対象に非経口（好ましくは筋肉内）投与することにより、ＩｇＡ粘膜免疫応答及びＩｇＧ全身免疫応答を含む防御免疫を誘発する。本発明者は、本明細書で述べるノロウイルスワクチン組成物の非経口投与が、強力なＩｇＧ応答に加えて頑強なＩｇＡ応答を誘導することを発見して意外であった。通常、強力なＩｇＡ応答は、ワクチンを粘液投与経路を通して投与した場合にのみ観察される。
【００５７】
[0067]  特定の実施形態では、ワクチン投与は、ワクチンを投与されていないヒトのレベルと比較して、血液中のＩｇＡノロウイルス特異的抗体分泌細胞のレベルが上昇することを含む防御免疫を誘発する。幾つかの実施形態では、ワクチン投与は、ワクチンを投与される前のヒトのレベルと比較して、血液中のＩｇＡノロウイルス特異的抗体分泌細胞のレベルが上昇することを含む防御免疫を誘発する。一実施形態では、ＩｇＡノロウイルス特異的抗体分泌細胞はＣＣＲ１０＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、及びα４β７＋である。このマーカーのプロフィールを有する抗体分泌細胞は、腸管中のパイエル板などの末梢リンパ組織と、腸管粘膜などの粘膜リンパ組織との両方を回帰させることができる。一実施形態では、ＣＣＲ１０＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、及びα４β７＋ＩｇＡ抗原分泌細胞の数は、末梢血液単球１×１０６個当たり約５００個、約７００個、約１，０００個、約１，５００個、又は約２，０００個を超える。別の実施形態では、ＩｇＡノロウイルス特異的抗体分泌細胞はＣＣＲ１０＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ６２Ｌ−、及びα４β７＋である。このマーカーのプロフィールを有する抗体分泌細胞は通常、粘膜部位への回帰のみを呈し、メモリＢ細胞応答を示すことができる。ワクチンを筋肉内投与する幾つかの実施形態では、ＣＣＲ１０＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ６２Ｌ−、及びα４β７＋ＩｇＡ抗原分泌細胞の数は、末梢血液単球１×１０６個当たり約５，０００個、約６，５００個、約７，０００個、約１０，０００個、約１３，０００個、約１５，０００個、又は約２０，０００個を超える。
【００５８】
[0068]  ロタウイルスなど、他のウイルスのワクチンでも同様の所見が観察される。ロタウイルスのワクチンの場合は、血清抗体が防御に直接関係するか、単に最近の感染を反映しているのかに関して論争がある（Jiang、２００２；Franco、２００６）。防御のこのような相関を規定することは、ロタウイルス又はノロウイルスなどの下痢疾患の状況では特に困難である。この状況では、防御を考察する臨床前検査が、粘膜免疫（腸管ＩｇＡなど）、サイトカインの生産、及び細胞媒介性免疫の寄与により多面的なことがあるからである。臨床での開発中にこのような免疫応答を測定することが困難であり、血清抗体の測定値との相関がないことから、これらのタイプのウイルスに対するワクチンの有効性が、ヒトの臨床感染実験を通してのみ実証できることが必要である。
【００５９】
[0069]  上述したように、本発明のワクチン組成物の投与は、ノロウイルス感染の少なくとも１つの症状を防止及び／又は軽減する。ノロウイルス感染の症状は当技術分野で周知であり、悪心、吐き気、下痢、及び胃痙攣が含まれる。また、ノロウイルスに感染した患者は、軽度の発熱、頭痛、悪寒、筋肉痛、及び疲労を覚えることがある。本発明は、ノロウイルス感染に伴う少なくとも１つの症状を緩和及び／又は軽減するように、本発明のワクチン製剤を対象に投与することにより、ノロウイルス感染を経験している対象に防御免疫応答を誘導する方法も含む。症状の軽減は、主観的又は客観的に、例えば対象の自己評価、臨床医の評価により、又は適切なアッセイ又は測定（例えば体温）、例えばクォリティオブライフの評価、ノロウイルス感染又は追加的症状の進行遅延、ノロウイルス症状の重篤度軽減又は適切なアッセイ（例えば抗体価、ＲＴ−ＰＣＲ抗原検出、及び／又はＢ細胞又はＴ細胞活性化アッセイ）を実行することにより判定することができる。有効な応答は、腸管から放出されたウイルスの量を反映する糞便サンプル中のウイルス負荷を直接測定する（例えばＲＴ−ＰＣＲ）ことによっても判定することができる。客観的評価には動物及びヒトの評価の両方が含まれる。
【００６０】
[0070]  本発明は１つ又は複数のノロウイルス抗原に対する抗体を生成する方法も提供し、上記方法は、上述したような本発明のワクチン組成物を対象に投与することを含む。これらの抗体は、当技術分野の日常的方法で分離し、精製することができる。分離したノロウイルス抗原特異的抗体を、診断免疫学的アッセイの開発に使用することができる。これらのアッセイは、臨床サンプル中のノロウイルスを検出し、感染を引き起こす特定のウイルス（例えばノーウォーク、ヒューストン、スノウマウンテンなど）を識別するために採用することができる。あるいは、分離した抗体を、ノロウイルスに感染しやすい対象に投与し、受動性又は短期の免疫を与えることができる。
【００６１】
[0071]  次に、以下の実施例で述べる特定の実施形態を参照しながら、本発明を更に詳細に例証する。実施例は、純粋に本発明を例証するものであり、いかなる意味でもその範囲を限定するものではない。
【００６２】
実施例
実施例１．ヒトにおける筋肉内ノロウイルス二価ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンの用量増大、安全性及び免疫原性の検討（ＬＶ０３−１０４試験）、コホートＡ
[0072]  この実施例は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）及び水酸化アルミニウム（ＡｌＯＨ）のアジュバントを追加した筋肉内（ＩＭ）ノロウイルス二価ＶＬＰワクチンの４用量レベルの安全性及び免疫原性を成人対象でプラセボと比較した、ランダム化多部位用量増大試験のコホートＡについて説明する。１８歳〜４９歳の対象ほぼ４８名がコホートに登録した。対象には、２８日間隔で１．５インチ（３８ｍｍ）の針を使用し、筋肉内（ＩＭ）注射によって２用量のワクチン又はプラセボを投与した。
【００６３】
[0073]  ノロウイルス二価ＶＬＰワクチンは、抗原としてジェノグループＩ遺伝子型Ｉ（ＧＩ．１）及びジェノグループＩＩ遺伝子型ＩＶ（ＧＩＩ．４）のＶＬＰ、アジュバントとしてモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）及び水酸化アルミニウム（ＡｌＯＨ）、緩衝剤として塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及びＬ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓ）、注射用のエタノール及び水を含有していた。筋肉内ノロウイルス二価ＶＬＰワクチンの組成物が表１に要約されている。ＧＩＩ．４のＶＬＰは、３つのＧＩＩ．４株から誘導した配列番号：１のカプシド配列を含んでいた。
【表１】
2014520852.tif 000003
【００６４】
[0074]  プラセボは、注射用の無菌の通常生理食塩溶液（０．９％のＮａＣｌで保存剤なし）であった。ワクチンの用量増大は以下のように実施した。すなわち、良好な健康状態について適切にスクリーニングした後、コホートＡの対象を順次、それぞれ約１２名の４用量群（用量群Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４）にそれぞれ登録させた。用量群Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４は、ＧＩ．１及びＧＩＩ．４ノロウイルスのそれぞれ５／５μｇ、１５／１５μｇ、５０／５０μｇ、及び１５０／１５０μｇの二価抗原用量を表す。各用量群の対象は、ワクチン又はプラセボを投与するように５：１でランダム化した。用量群Ａ１の対象は、個々のランダム化した治療を受けた（１０名は５／５μｇのワクチン、２名はプラセボが投与された）。対象は、記憶補助に記憶された症状（０〜７日目）、及び７日目、２１日目、２８日目、３５日目、及び５６日目の訪問による暫定病歴を検討することにより、安全性評価のために追跡調査された。安全性データは、セントラルセイフティモニタ（ＣＳＭ）によって検討された。用量群Ａ１の対象から検討するために７日間の投与２後安全性データ（試験３５日）が使用可能になり、許容可能と見なされた後、用量群Ａ２の対象が初期用量の投与に適格となった。同じ規則がその後の用量グループの用量に適用された。すなわち、ある用量群から検討のために７日間の投与２後安全性データ（試験３５日目）が使用可能になった後、次の用量群が初期用量の投与に適格となった。
【００６５】
[0075]  コホートＡの登録の最後に、各用量群の約１０名がワクチンを投与され（ワクチン被接種者は合計４０名）、各群の２名が生理食塩水を投与された（生理食塩水の対照標準レシピエントは合計約８名）。
【００６６】
[0076]  対象は、ＩＭノロウイルス二価ＶＬＰワクチン又は対照標準を投与するごとにその後０日目〜７日目まで、疼痛、圧痛、発赤、及び腫脹などの４つの注射部位の局所反応、及び毎日の口腔体温、頭痛、疲労、筋肉痛、悪寒、関節痛、及び悪心、吐き気、下痢、腹部痙攣／痛などの１０の全身徴候又は症状を含む聴き取り症状について、毎日の記憶補助に記入した。注射部位における発赤及び腫脹を、各注射後７日間測定し、記録した。
【００６７】
[0077]  暫定病歴は、７＋３、２１＋３、２８＋３、３５＋３、５６＋７、１８０＋１４、及び３９３＋１４日目の追跡調査の訪問ごとに、及び２６５＋１４日目の追跡調査の電話にて入手した。対象に、暫定疾患、往診、及び重篤な有害事象（ＳＡＥ）、及び重大な新しい医学的状態があればその発症について照会した。対象は、ＷＢＣ鑑別及び血小板算定を伴うＣＢＣ、血清ＢＵＮ、クレアチニン、グルコース、ＡＳＴ、及びＡＬＴがスクリーニング時に評価され、２１日及び３５日目（各投与後約７日）にはそれぞれ継続的適格性及び安全性が評価された。
【００６８】
[0078]  ワクチン接種前の０日目、及び７＋３、２１＋３、２８＋３、３５＋３、５６＋７、１８０＋１４、及び３９３＋１４日目に対象の血液を採取し、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によりＩＭノロウイルス二価ＶＬＰワクチンに対する血清抗体を（ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭを別個に、及び組み合わせて）測定した。血清炭水化物阻害活性及び血清ＨＡＩ抗体も測定した。コホートＡの患者の場合、抗体分泌細胞（ＡＳＣ）、回復マーカー、メモリＢ細胞及び細胞免疫応答を検定した。
【００６９】
[0079]  以下の方法を使用して、免疫した個体又はプラセボを投与された個体から採取した血液サンプルを分析した。
【００７０】
ＥＬＩＳＡによる血清抗体測定
[0080]  コード化した試料をスクリーニングする標的抗原として精製した組み換えノロウイルスＶＬＰ（別個にＧＩ．１及びＧＩＩ．４）を使用して、ある対象でＥＬＩＳＡによるノロウイルスの抗体の測定を実施した。簡潔に言うと、炭水化物コーティング緩衝液ｐＨ９．６中のノロウイルスＶＬＰを使用して、マイクロタイタプレートをコーティングした。コーティングしたプレートを洗浄し、ブロッキングして、試験血清の段階的２倍希釈液でインキュベートし、その後に洗浄し、ヒト全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＭに特異的な酵素結合２次抗体試薬でインキュベートした。適切な基質溶液を添加し、色を発現させ、プレートを読み取り、各抗体クラスの基準標準曲線と比較して、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭエンドポイントタイタを判定した。各群の幾何平均抗体価（ＧＭＴ）、幾何平均上昇倍数（ＧＭＦＲ）及び血清応答割合を判定した。抗体応答は、免疫前の抗体価と比較して抗体価が４倍増加すると定義した。
【００７１】
ノロウイルス炭水化物組織−血液群抗原（ＨＢＧＡ）阻害活性
[0081]  上述したように、血清抗体がＨ１型又はＨ３型合成炭水化物に対するＮＶ  ＶＬＰの結合を阻止する能力を測定するために阻害アッセイを実施した（Reeck他（２０１０）、J Infect Dis, Vol. 202(8): 1212-1218）。簡潔に言うと、阻害アッセイのＮＶ  ＶＬＰを同等量の血清でインキュベートし、１：２５の開始希釈液から段階的に２倍希釈した。ニュートラアビジンでコーティングした９６ウェルのマイクロタイタプレートを洗浄し、２．５μｇ／ｍＬの合成多価Ｈ型１−ＰＡＡビオチン又は多価Ｈ型３−ＰＡＡビオチンでコーティングした。血清ＶＬＰ溶液を添加した。プレートを洗浄し、ＮＶ  ＶＬＰに特異的なウサギの多クローン血清を添加し、洗浄して、その後にホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ヒツジ抗ウサギＩｇＧでインキュベートした。色は、テトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ液体基質で発現させ、１Ｍリン酸で停止させた。光学密度は４５０で測定した。プラス及びマイナスの制御を実施した。５０％阻害価（ＢＴ５０）を判定し、これは（空白を除いた後の）ＯＤ読み取り値がプラスの対照標準の５０％である力価と定義される。ＢＴ５０が２５未満のサンプルに１２．５の値を割り当てた。各群の幾何平均抗体価（ＧＭＴ）、幾何平均上昇倍数（ＧＭＦＲ）及び血清応答割合を判定した。抗体応答は、免疫前の抗体価と比較して抗体価が増加したことと定義した。阻害対照標準血清サンプルを内部対照標準として使用した。以下を除いては阻害アッセイと同じプロトコルを使用して、阻害の特異性を確認するアッセイを実施した。すなわち、炭水化物でコーティングした後、血清は、最初にＶＬＰで事前にインキュベートせずに、プレート上で直接インキュベートした。洗浄後、ＶＬＰをプレート上でインキュベートし、阻害アッセイと同様に検出した。
【００７２】
ノロウイルス赤血球凝集抗体阻止（ＨＡＩ）アッセイ
[0082]  上述したように（El Kamary他（２０１０）、J Infect Dis, Vol. 202(11): 1649-58）、ワクチン誘導の抗体がノロウイルスＶＬＰによるヒトのＯ型ＲＢＣの赤血球凝集を阻止する能力があるか検査した。ＨＡＩ抗体価を、赤血球凝集を阻止した最高希釈の逆数としてコンパクトなマイナスＲＢＣパターンで計算し、ＧＭＴ、ＧＭＲＦ、及び４倍上昇以上として提示する。
【００７３】
[0083]  ノロウイルスＧＩ．１及びＧＩＩ．４のＶＬＰを別個に段階的に希釈し、９６ウェルのＶ字底プレートに入れた等量の０．５％ヒトＲＢＣ懸濁液でインキュベートした。４ＨＡ単位に対応するノロウイルスＶＬＰ抗原の量を判断し、逆滴定で確認した。試験血清を５６℃で３０分かけて熱失活し、新しく調製した２５％のカオリン懸濁液で処理した。血清阻止因子を除去するために、試験サンプルにＲＢＣを事前吸着させた。ＨＡＩアッセイは以下のように実施した。すなわち、前処理した血清（ｐＨ５．５のＲＢＳで２倍希釈）を９６ウェルのＶ字プレートに加え、４ＨＡ単位を含有する等量のノロウイルスＧＩ．１及びＧＩＩ．４のＶＬＰ抗原でそれぞれインキュベートした。０．５％ＲＢＣの懸濁液を各ウェルに添加し、４℃で更に９０分間プレートインキュベートした。血清がなくＲＢＳ又は抗原のみを含有するウェルが、それぞれマイナス及びプラスの対照標準の働きをした。各群の幾何平均抗体価（ＧＭＴ）、幾何平均上昇倍率（ＧＭＦＲ）及び血清応答割合を割り出した。抗体応答とは、抗体化前の抗体価と比較して抗体価が４倍上昇したことと定義された。
【００７４】
抗体分泌細胞（ＡＳＣ）アッセイ
[0084]  ＩＭノロウイルス二価ＶＬＰワクチン又はプラセボを投与した後０、７＋３、２８＋３、及び３５＋３日目に約６０ｍＬの抗凝固処理した血液からＰＢＭＣを分離した。新しいＰＢＭＣアッセイ用に約２５ｍＬの血液、ＰＢＭＣの凍結保存用に３５ｍＬの血液を入手した。ＡＳＣアッセイは、ノロウイルスＶＬＰに対する抗体を分泌する細胞を検出する（Tacket他（２０００）、J. Infect. Dis., Vol. 182: 302-305；Tacket他（２００３）、Clin. Immunol., Vol. 108: 241-247；El Kamary他（２０１０）、J. Infect Dis, Vol. 202(11): 1649-58）。対象のサブセットからのＡＳＣ頻度について新しいＰＢＭＣを評価し、回復マーカーを判定した。コホートＡに参加した対象からの凍結保存したＰＢＭＣのＡＳＣ頻度を評価した。群ごとに各時点におけるＰＢＭＣ１０６個当たりのＡＳＣの平均数及び応答割合を既述した。プラスの応答は、全対象、及び少なくとも８つのＡＳＣスポットで、でＰＢＭＣ１０６個当たりワクチン接種後のＡＳＣカウントが、（ログ計量で）ワクチン接種前の平均カウントより少なくとも３標準偏差（ＳＤ）高いことと定義され、これは同様のアッセイで判定された中程度刺激のマイナスの対照標準ウェル（２スポット）の平均に３ＳＤを加えた値に対応する。
【００７５】
ノロウイルスのウイルス特異的メモリＢ細胞の測定
[0085]  抗凝固血をコホートＡの対象からのみ（０、２８、５６及び１８０日目に約２５ｍＬ）採取し、in vitro抗原刺激が先行するＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して、ワクチン接種後０、２８、５６及び１８０日目にメモリＢ細胞を測定した（Crotty他（２００４）、J. Immunol. Methods, Vol. 286: 111-122.；Li 他（２００６）、J. Immunol. Methods, Vol. 313: 110-118）。末梢血単核細胞（細胞５×１０６個／ｍＬ、１ｍＬ／２４ウェルプレートのウェル）を、ノロウイルスＧＩ．１及びＧＩＩ．４のＶＬＰ抗原で４日間別個にインキュベートし、抗原特異的メモリＢ細胞がクローン増殖して、抗体分泌細胞に分化できるようにした。対照標準には、抗原及び／又は無関係の抗原でインキュベートした細胞を使用せずに同じ状態でインキュベートした細胞が含まれた。刺激後、細胞を洗浄し、カウントして、ノーウォークＶＬＰでコーティングしたＥＬＩＳｐｏｔプレートに移した。全Ｉｇ分泌Ｂリンパ球当たりのウイルス特異的メモリＢ細胞の頻度を判定するために、抗ヒトＩｇＧ及び抗ヒトＩｇＡ抗体でコーティングしたウェルにも、増殖したＢ細胞を加えた。適切な基質後のＨＲＰで標識された抗ヒトＩｇＧ又は抗ヒトＩｇＡで、結合抗体が明らかになった。顕著なエフェクタのメカニズム及び免疫初回刺激の位置と関連しているような抗原特異的サブクラス応答を判定するために、ＩｇＡ及びＩｇＧサブクラス（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２及びＩｇＧ１〜４）との共役も使用した。ＥＬＩＳｐｏｔ読み取り装置でスポットをカウントした。各対象の増殖細胞集団をフローサイトメトリで検査し、特にそのメモリＢ細胞のフェノタイプ、すなわちＣＤ１９＋、ＣＤ２７＋、ＩｇＧ＋、ＩｇＭ＋、ＣＤ３８＋、ＩｇＤを確認した（Crotty他（２００４）、J. Immunol. Methods, Vol. 286: 111-122.；Li他（２００６）、J. Immunol. Methods, Vol. 313: 110-118）。
【００７６】
細胞免疫応答
[0086]  ノロウイルスＧＩ．１及びＧＩＩ．４のＶＬＰ抗原に対するＣＭＩ応答を将来評価する可能性があるので、そのためにコホートＡの対象からコード化した試料として抗凝固血を（０、２８、５６及び１８０日目に約２５ｍＬ）採取し、ＰＢＭＣを分離して、液体窒素中で凍結保存した。実施するアッセイには、確立された技術により特にインタフェロン（ＩＦＮ）−γ及びインタロイキン（ＩＬ）−４のレベルを測定することによる、ノロウイルスＧＩ．１及びＧＩＩ．４のＶＬＰ抗原に対するＰＢＭＣ増殖及びサイトカイン応答が含まれる（Samandari他（２０００）、J. Immunol., Vol. 164: 2221-2232；Tacket他（２００３）、Clin. Immunol., Vol. 108: 241-247）。Ｔ細胞応答も評価した。
【００７７】
結果
[0087]  安全性評価には、各投与後、７日間の聴き取り局所及び全身症状、及び２８日間の非聴き取り症状が含まれた。１２ヶ月間、重篤な有害事象をモニタする。ｐａｎＥＬＩＳＡ抗体（ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭ混合）、及びＩｇＧ及びＩｇＡ抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）についてＥｌｉｓｐｏｔを介してワクチン接種する度に、その前後で取得した血清で免疫原性を評価した。
【００７８】
[0088]  コホートＡには４つの投与量群が登録され、４つの投与量群全体（ワクチン被接種者合計４０名）から投与後２安全性データが入手可能であった。ワクチン被接種者４０名のうち、いずれかの投与後に報告された最も一般的な症状は疼痛及び圧痛であり、腫脹又は発赤は稀であった。重症の局所症状は報告されなかった。いずれかの投与後に頭痛、筋肉痛、又は倦怠感という全身症状を報告したのは、ワクチン被接種者の半分未満であった。発熱を報告したワクチン被接種者はいなかった。関連するＳＡＥは報告されなかった。
【００７９】
[0089]  図１〜図３に示すように、最低用量（５μｇのＧＩ．１＋５μｇのＧＩＩ．４  ＶＬＰ）を最初に投与して７日後に、両方のＶＬＰ抗原で頑強な既往ｐａｎＥＬＩＳＡ抗体応答（混合したＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭ）が観察された。２番目の投与は投与後の１応答を増大させなかった。別個に測定された抗原特異的血清ＩｇＧ及び血清ＩｇＡ応答で、同様の結果が観察された（図４〜図９）。両方の抗原に対する抗体応答で、投与量依存の応答が観察された（図１〜図９）。しかし、ＧＩ．１のＶＬＰに対する最大応答は、ＧＩＩ．４のＶＬＰに対するサイダ凹応答より低い用量（１５μｇ対５０μｇ）で達成されるようであった。興味深いことに、筋肉内投与された単回投与のノロウイルス二価ワクチンは、２０倍多いＶＬＰ用量を含み鼻腔内投与された２用量の一価ＶＬＰワクチンで誘導される抗価よりも驚くほど有意に大きい抗原特異的抗体価を誘導した（図１０；ＬＶ０３−１０４の５μｇ群をＬＶ０１−１０３の１００μｇ群と比較されたい）。更に、低用量（５μｇ）のＩＭ二価ノロウイルスワクチンは、生ノロウイルスに曝露したヒトに誘導されたものと同様のノロウイルス特異的抗体価を生じた（図１０）。
【００８０】
[0090]  両方のＶＬＰ抗原で、最低用量（５μｇ）の１回目投与から７日後に、頑強なＩｇＧ及びＩｇＡのＥｌｉｓｐｏｔ応答も観察された（表２）。特に、抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の応答はＩｇＡ対ＩｇＧに偏倚し、ＡＳＣはフローサイトメトリで評価すると粘膜回帰（アルファ４／ベータ７）及びケモカイン（ＣＣＲ１０）受容体のフェノタイプを呈した（図１１；表３）。表３に示すように、二重の粘膜／末梢回帰マーカー（ベータ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋）と比較して、粘膜回帰マーカー（ベータ７＋、ＣＤ６２Ｌ−）を発現するＡＳＣが多い。表４は、ＶＬＰ抗原に応答する末梢血単球１０６個当たりのメモリＢ細胞のパーセンテージを示す。二重粘膜／末梢又は末梢回帰マーカーと比較して、粘膜回帰マーカーを発現する抗原特異的メモリＢ細胞のパーセンテージも高くなる。１５μｇ及び５０μｇの用量を投与された受容者でも、同様の応答が観察された。
【表２】
2014520852.tif 000004
【表３】
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【表４】
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【００８１】
[0091]  ノロウイルスをin vitroで培養することができないので、使用可能な直接的ウイルス中和測定法がない状態で、ウイルス中和測定法の代用品の働きをする機能アッセイを実施し、ワクチン被接種者の機能抗体を測定した。
【００８２】
[0092]  上述した炭水化物Ｈ抗原阻害活性アッセイを使用し、ワクチン誘導の血清抗体によって仲介されたＨ抗原に対するＧＩ．１  ＶＬＰ結合の阻止を測定した。データは、表５では幾何平均上昇倍数（ＧＭＦＲ）及び抗体応答（４倍上昇）として、表６では幾何平均抗体価（ＧＭＴ）として表す。意外なことに、ワクチン製剤を１回筋肉注射しただけで、投与群で有意な炭水化物阻害活性が観察され、実際、ワクチンの第２用量を投与しても、投与１後のレベルと比較して阻害活性が有意に増加しなかった。結合活性の阻止は、試験期間を通して最大でも投与１後５６日間維持された。
【表５】
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【表６】
2014520852.tif 000008
【００８３】
[0093]  同様に、ＧＩＩ．４  ＶＬＰに対する血清抗体の炭水化物阻害活性を測定した。ＧＭＦＲ及び抗体応答（表７）、更にＧＭＴ（表８）で測定して、全投与群で有意な応答が観察された。上述したＧＩ．１結合の抗体媒介性阻害と同様に、１回投与しただけで、その後にＧＩＩ．４  ＶＬＰ炭水化物結合活性の頑強な阻害が検出され、２回目の投与では阻害活性が増大しないようであった。
【表７】
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【表８】
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【００８４】
[0094]  標的ノロウイルスＶＬＰ抗原に対するワクチン接種した対象の血清抗体の応答を試験するために、赤血球凝集阻止アッセイ（ＨＡＩ）も使用した。炭水化物Ｈ抗原結合試験と同様に、ＶＬＰワクチンを２回投与しただけで、ＧＭＦＲ（表９）、４倍上昇（表９）、及びＧＭＴ（表１０）で測定して全投与群で赤血球凝集を阻止する抗体が誘導された。赤血球凝集阻止レベルは試験した最終日（投与２後２８日、投与１後５６日）を通して維持されたが、ＶＬＰワクチンの２回目の投与ではワクチン誘導の赤血球凝集の抗体媒介性阻止が増大しないようであった。
【表９】
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【表１０】
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【００８５】
[0095]  標的ＶＬＰが不適正ウイルスであった場合にも、赤血球凝集の阻止が達成された。ワクチン誘導の血清抗体は、ＧＭＦＲ及び抗体応答（表１１）、更にＧＭＴ（表１２）で測定して、ヒューストンウイルス株ＶＬＰによって赤血球凝集を阻止した。この場合、ＶＬＰワクチン用量が高くなると、特に４倍上昇又はＧＭＴで測定した場合に応答が強力になった。投与１後ちょうど７日で測定して、標的ＶＬＰが２００３シンシナティウイルス株であった場合にＧＭＦＲ及び４倍上昇も有意に増加した。（表１３）
【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
2014520852.tif 000015
【００８６】
[0096]  この試験結果は、二価ＩＶノロウイルスＶＬＰワクチンは概ね良好な耐容性があったことを実証した。免疫原性データは、血清陽性の人の成人を防御するには、単一のワクチン用量で十分なことがあることを示唆した。炭水化物阻害活性及び赤血球凝集阻止アッセイの結果は、単一のワクチン用量が強力な抗ノロウイルス活性で血清抗体を誘導したという証拠を更に提供した。ヒトに１回非経口投与した後に観察された免疫応答の大きさ及び迅速性は、はるかに高いＶＬＰ用量での複数回の鼻腔ＶＬＰワクチン投与で報告された比較的初期の免疫応答と比較して、劇的であった（El Kamary他（２０１０）、J Infect Dis, Vol. 202(11): 1649-1658）。これらの応答は、経口投与したノロウイルスＶＬＰで誘導される応答（Tacket他（２００３）、Clin Immunol 108: 241-247; Ball et al. (1999, Gastroenterology 117: 40-48）、更に遺伝子導入植物が産生したノロウイルスＶＬＰによって誘導された応答（Tacket他（２０００）、J Infect Dis 182: 302-305）よりも優れていた。特に、この筋肉内ワクチン製剤は、免疫から７日以内に既往応答を生じ、１回の投与後に、重大なＩｇＡ応答及び機能炭水化物阻害活性及び赤血球凝集阻止活性などの最大の血清抗体応答が観察された。したがって、このノロウイルス価ワクチンは、現在使用可能ないかなるノロウイルスワクチンで誘導される免疫応答よりも優れた強力な防御免疫応答をヒトに誘導した。
【００８７】
実施例２．ヒトの筋肉内ノロウイルス二価ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンの用量増大、安全性及び免疫原性試験（ＬＶ０３−１０４試験）。
[0097]  以下の実施例は、実施例１で述べた臨床試験の残りの計画部分を提供し、ここでは１８歳以上の成人で、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）及び水酸化アルミニウム（ＡｌＯＨ）のアジュバントを加えた筋肉内（ＩＭ）ノロウイルス二価ＶＬＰワクチンの４用量レベルの安全性及び免疫原性をプラセボと比較して実施した。対象には、２８日間隔で１．５インチ（３８ｍｍ）の針を使用し、筋肉内（ＩＭ）注射によって２用量のワクチン又はプラセボを投与した。この実施例は、本発明の原理を更に例証するためのものである。
【００８８】
[0098]  コホートＡは、試験の登録を完了し、実施例１で上述されている。コホートＢは、５０〜６４歳の約２０名の対象を含む。コホートＣは６５〜８５歳の約３０名の対象を含む。全体として、約９８名が試験に登録している。
【００８９】
[0099]  コホートＢでは、５０〜６４歳の対象約２０名が登録し、１：１でワクチン（Ｎ＝１０）又はプラセボ（Ｎ＝１０）を投与するようにランダム化する。コホートＢの対象から検討用に７日間の投与２後安全データ（試験３５日目）が使用可能になった後、コホートＣの対象が初期用量の投与に適格となる。コホートＣでは、６５〜８５歳の対象約３０名が登録し、１：１：１でＭＰＬ及びＡｌＯＨのアジュバントを加えたワクチン（Ｎ＝１０）、又はＡｌＯＨのみのアジュバントを加えたワクチン、すなわちＭＰＬなし（Ｎ＝１０）、又はプラセボ（Ｎ＝１０）を投与するようにランダム化する。コホートＣでは、２つのワクチン製剤のノロウイルスＶＬＰ及びＡｌＯＨの抗原濃度は等しく、ＭＰＬの有無のみが異なる。
【００９０】
[00100]  ノロウイルス二価ＶＬＰワクチンは、抗原としてジェノグループＩ遺伝子型１（ＧＩ．１）及びジェノグループＩＩ遺伝子型ＩＶ（ＧＩＩ．４）ＶＬＰ、アジュバントとしてモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）及び水酸化アルミニウム（ＡｌＯＨ）、緩衝剤（ｐＨ６．３〜６．７）として塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及びＬ−ヒスチジン（Ｌ−Ｈｉｓ）、注射用のエタノール及び水を含有する。ＧＩＩ．４  ＶＬＰは、３つのＧＩＩ．４株から誘導した配列番号：１のカプシド配列を含んでいた。
【００９１】
[00101]  コホートＢ及びＣで更に評価するために選択された単回投与のワクチンは、コホートＡの最低用量であり、その結果、最も頑強で再現可能な免疫応答になり、これも概ね良好な耐容性がある。５６日目にコホートＡの対象からの安全性及び免疫原性データがＣＳＭ／ＳＭＣによって検討され、コホートＢ及びＣで評価するために二価用量が選択される。
【００９２】
[00102]  対象は、ＩＭノロウイルス二価ＶＬＰワクチン又は対照標準を投与するごとにその後０日目〜７日目まで、疼痛、圧痛、発赤、及び腫脹などの４つの注射部位の局所反応、及び毎日の口腔体温、頭痛、疲労、筋肉痛、悪寒、関節痛、及び悪心、吐き気、下痢、腹部痙攣／痛などの１０の全身徴候又は症状を含む聴き取り症状について、毎日の記憶補助に記入した。注射部位における発赤及び腫脹を、各注射後７日間測定し、記録した。
【００９３】
[00103]  暫定病歴は、７＋３、２１＋３、２８＋３、３５＋３、５６＋７、１８０＋１４、及び３９３＋１４日目の追跡調査の訪問ごとに、及び２６５＋１４日目の追跡調査の電話にて入手する。対象に、暫定疾患、往診、及び重篤な有害事象（ＳＡＥ）、及び重大な新しい医学的状態があればその発症について照会する。対象は、ＷＢＣ鑑別及び血小板算定を伴うＣＢＣ、血清ＢＵＮ、クレアチニン、グルコース、ＡＳＴ、及びＡＬＴがスクリーニング時に評価され、２１日及び３５日目（各投与後約７日）にはそれぞれ継続的適格性及び安全性が評価される。
【００９４】
[00104]  ワクチン接種前の０日目、及び７＋３、２１＋３、２８＋３、３５＋３、５６＋７、１８０＋１４、及び３９３＋１４日目に対象の血液を採取し、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によりＩＭノロウイルス二価ＶＬＰワクチンに対する血清抗体を（ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭを別個に、及び組み合わせて）測定する。血清炭水化物阻害活性及び血清ＨＡＩ抗体も測定する。
【００９５】
[00105]  コホートＡについて上記方法を使用して、免疫した個体又はプラ背部を投与した個体から採取した血液サンプルを分析する。試験結果は、本発明のワクチン製剤を投与するための臨床プロトコルの開発に採用される。
【００９６】
[00106]  本発明は、上記特定の実施形態に範囲が限定されるものではなく、実施形態は本発明の個々の態様の単一の例証として意図され、機能的に同等の方法及び成分は本発明の範囲に入る。実際、本明細書で図示し、述べたもの以外の本発明の様々な改善が、日常の経験以上のものを使用せずに、以上の既述及び添付図面から当業者には明白になる。このような改善及び同等物は、特許請求の範囲に入るものとする。
【００９７】
[00107]  本明細書で言及したすべての出版物、特許及び特許出願は、個々の出版物、特許、又は特許出願をそれぞれ具体的かつ個別的に参照により本明細書に組み込むものとすると示された場合と同じ程度まで参照により本明細書に組み込むものとする。
【００９８】
[00108]  本明細書の参照文献の引用又は検討は、それが本発明の先行技術であると承認したことにはならないと解釈されたい。
【００９９】
＜参照文献＞
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
2014520852.tif 000026
【図１１Ｂ】
2014520852.tif 000027
【配列表】
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【国際調査報告】
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