(57)【要約】  本発明は、血液凝固の分野に関する。詳細には、本発明は、異物表面との接触による血液凝固過程の人為的活性化の特定の阻害剤に関する。
2014531413.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液凝固阻害活性を有する少なくとも１種のカルシウムキレート物質を含み、血液凝固系の接触活性化を阻害する最大で４２アミノ酸の熱安定性ペプチドをさらに含む組成物であって、前記ペプチドが、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含む、組成物。
【請求項２】
血液凝固阻害活性を有する少なくとも１種のカルシウムキレート物質を含み、血液凝固系の接触活性化を阻害する最大で４２アミノ酸の熱安定性ペプチドをさらに含む、試料採取用デバイスであって、前記ペプチドが、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含む、デバイス。
【請求項３】
血液凝固阻害活性を有する少なくとも１種のカルシウムキレート物質を含み、血液凝固系の接触活性化を阻害する最大で４２アミノ酸の熱安定性ペプチドをさらに含む、試料採取用デバイスであって、前記ペプチドが、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含む、デバイスと、
血液凝固活性を、好ましくは時間の関数としてのトロンビン活性の発達を判定するための試薬と
を含むキットオブパーツ。
【請求項４】
異物表面との接触による血液凝固系の活性化を阻害するための、血液凝固系の接触活性化を阻害する最大で４２アミノ酸の熱安定性ペプチドの使用であって、前記ペプチドが、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも４個のシステインと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含む、使用。
【請求項５】
医薬として使用するための、血液凝固系の接触活性化を阻害する最大で４２アミノ酸の熱安定性ペプチドであって、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含む、ペプチド。
【請求項６】
血液凝固活性を判定する方法において使用するための、血液凝固系の接触活性化を阻害する最大で４２アミノ酸の熱安定性ペプチドであって、前記ペプチドが、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含み、前記方法が、
個体から血液試料を採取するステップであり、前記ペプチドを前記血液試料と接触させるステップと、
前記試料における血液凝固活性を、好ましくはトロンビン活性を、より好ましくはトロンビン活性を測定するための蛍光アッセイを用いてトロンビン活性を測定するステップと、
好ましくは、診断に血液凝固活性値を使用するステップと
を含む、ペプチド。
【請求項７】
血液の凝固を阻害する方法であって、血液凝固系の接触活性化を阻害する最大で４２アミノ酸の熱安定性ペプチドであり、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含むペプチドを、凝固を阻害するのに十分な量で、血液、血漿又は任意の他の生体液と接触させるステップを含む、方法。
【請求項８】
個体からの試料の採取及び調製のための方法であって、
試料採取用デバイスを提供するステップであり、前記デバイスが、血液凝固阻害活性を有する少なくとも１種のカルシウムキレート物質を含み、血液凝固系の接触活性化を阻害する最大で４２アミノ酸の熱安定性ペプチドをさらに含み、前記ペプチドが、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含む、ステップ、
前記デバイスに試料を採取するステップ、及び
試料、血液凝固阻害活性を有するカルシウムキレート物質及びペプチドを混合するステップ
を含む、方法。
【請求項９】
血液試料における血液凝固活性を判定する方法であって、血液凝固阻害活性を有する少なくとも１種のカルシウムキレート物質を含み、血液凝固系の接触活性化を阻害する最大で４２アミノ酸の熱安定性ペプチドをさらに含む血液試料、血漿試料又は任意の他の生体液において、血液凝固活性、好ましくはトロンビン活性を、より好ましくはトロンビン活性を測定するための蛍光アッセイを用いて測定するステップを含み、前記ペプチドが、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含む、方法。
【請求項１０】
血液凝固系の接触活性化を阻害する最大で４２アミノ酸の熱安定性ペプチドであって、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含むペプチド。
【請求項１１】
血液凝固系の接触活性化を阻害する熱安定性ペプチドが、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含む、請求項１に記載の組成物、請求項２に記載のデバイス、請求項３に記載のキット、請求項４に記載の使用、請求項５若しくは６に記載の医学的使用のためのペプチド、請求項７〜９のいずれかに記載の方法、又は請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
血液凝固系の接触活性化を阻害する熱安定性ペプチドが、コンセンサスアミノ酸配列：XXCXXXXXXCXXXXXCXXXCXCXXXXXCX（配列番号９）（位置５のＸはＲ又はＲのアナログであり、位置９のＸはＥ又はＫ、好ましくはＫであり、位置２１のＸはＩ又はＶ、好ましくはＶである）、又はより好ましくは：XILMXCKKDSDCLAECX（配列番号６）（位置１のＸは、Ｋ又はＲ若しくはＲのアナログ、好ましくはＲ又はＲのアナログであり、位置５のＸはＥ又はＫ、好ましくはＫであり、位置１７のＸはＩ又はＶ、好ましくはＶである）、又はより好ましくは：RVCPXILMXCKKDSDCLAECXCLEHGYCG（配列番号７）（位置５のＸは、Ｋ又はＲ若しくはＲのアナログ、好ましくはＲ又はＲのアナログであり、位置９のＸはＥ又はＫ、好ましくはＫであり、位置２１のＸはＩ又はＶ、好ましくはＶである）を含む、請求項１に記載の組成物、請求項２に記載のデバイス、請求項３に記載のキット、請求項４に記載の使用、請求項５若しくは６に記載の医学的使用のためのペプチド、請求項７〜９のいずれかに記載の方法、又は請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１３】
血液凝固系の接触活性化を阻害する熱安定性ペプチドが、
配列番号１に示された配列を有するペプチド、
配列番号２に示された配列を有するペプチド、
配列番号３に示された配列を有するペプチド、
配列番号４に示された配列を有するペプチド、及び
配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４に示された配列と少なくとも７０％配列同一性を有するペプチド
からなる群から選択されるペプチドを含む、請求項１に記載の組成物、請求項２に記載のデバイス、請求項３に記載のキット、請求項４に記載の使用、請求項５若しくは６に記載の医学的使用のためのペプチド、請求項７〜９のいずれかに記載の方法、又は請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１４】
血液凝固系の接触活性化を阻害する熱安定性ペプチドが、
配列番号１に示された配列を有するペプチド、
配列番号２に示された配列を有するペプチド、
配列番号３に示された配列を有するペプチド、
配列番号４に示された配列を有するペプチド、及び
配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４に示されたペプチドと少なくとも７０％配列同一性を有するペプチド
からなる群から選択されるペプチドである、請求項１に記載の組成物、請求項２に記載のデバイス、請求項３に記載のキット、請求項４に記載の使用、請求項５若しくは６に記載の医学的使用のためのペプチド、請求項７〜９のいずれかに記載の方法、又は請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１５】
請求項１０〜１４のいずれかに記載の熱安定性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液凝固の分野に関する。詳細には、本発明は、異物表面との接触による血液凝固過程の人為的活性化の特定の阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液の凝固系は止血に不可欠であるが、血栓の発生にも関与する。多くの人が癌と同様に出血又は血栓で死亡している。それ故に、凝固系の過活性（血栓を促進する）又は低活性（出血傾向を引き起こす）を検出できることが、医学的に最も重要である。このような機能検査は、針を介して血管からバイアルに採取された血液で行われなければならない生体外検査法である。これは必然的に、血液が「異物」表面、すなわち血管の通常の内側以外の表面と接触することを意味する。
【０００３】
血液がこのような表面と接触するとすぐ、凝固過程が動き始める。血液凝固因子XII（ＦXII）又はハーゲマン因子が異物表面に吸着し、これにより活性酵素となり、他の血漿タンパク質（高分子量キニノゲン及びプレカリクレイン）の助けを借りて因子XIを活性化し、これが今度は因子IXを活性化する。遊離Ｃａ２＋イオンを結合する物質（例えばクエン酸ナトリウム又はＥＤＴＡ）を含有する溶液に血液を入れるように注意すれば、さらなる反応は起こらない。ＦIXａは、このようなイオンが利用可能である場合にのみこの過程を持続することができる。
【０００４】
それ故に、凝固系の試験のために血液が採取される場合、クエン酸に血液を入れることは標準的な手順である。とは言うものの、このような血液において因子XII、XI及びIXは、多かれ少なかれ既に活性化されている可能性が高い。
【０００５】
トロンビン生成過程の、ＦIXの活性化に至るまでの部分は、接触活性化系と呼ばれている。接触活性化過程自体は天然のトロンビン生成系の一部ではないが、ＦXI及びＦIXは、この天然系において役割を果たしており、この機能を正確に調べようとするなら、ＦXI及びＦIXは活性化されないままである必要がある。事前の意図しない活性化は、天然のトロンビン生成能力の評価を妨げ、並びに因子XI及びIXが役割を果たしている、又は反対にこのような役割が除外されるべき血液凝固系の任意の他のタイプの測定を妨げる。
【０００６】
それ故に、接触活性化系を阻害することが必要である。接触活性化過程は、血液が患者から採取され、異物表面（針の内側、しかし特に採血管の内側など）に触れるとすぐに開始するためである。これが、阻害剤が好ましくは、血液が採取される管において混合物に添加されなければならない理由である。このような混合物は、クエン酸又は別のＣａ２＋キレート物質及び必要とされ得る任意の他の添加物を含有するであろう。
【０００７】
接触活性化のこのような阻害剤を添加することにより、血液は天然状態のままとなり、天然のトロンビン生成（ＴＧ，thrombin generation）過程及びこの機序又はこの関連部分が、カルシウム再沈着後に次いで試験され得る。
【０００８】
検査されるには、トロンビン生成過程全体が、創傷又は血栓における自然環境下と同じように、すなわち組織因子により最もよく誘発される。Ｃａ２＋キレート物質を含む試料中のトロンビン活性を測定する場合、血液凝固カスケードを可能にするために十分なＣａ２＋が添加されなければならない。
【０００９】
組織因子は、血管壁が損傷された場合にのみ血液に曝露される血管周囲細胞で発生する膜タンパク質である。組織因子はまた、特定の白血球において不活性型（「暗号化型」）でも発生する。これらの細胞が、汚染細菌由来のリポ多糖又は他の産物への曝露などの、通常は細菌感染中に生じる過程により活性化されると、組織因子は「解読」され得る。この理由のため、並びにまた一般的医療衛生及び病院衛生のため、血液が採取される管は、臨床凝固検査の結果に重大な影響を与える上述の過程を回避するために無菌であることが必要である。それ故に、接触活性化系の阻害剤は、採血に使用される容器の滅菌中も依然として活性であるべきである。
【００１０】
トロンビン生成は、極めて複雑に入り組んだ酵素反応である。この骨格は、各酵素前駆体が活性化されると次の酵素前駆体を活性化する、一連の酵素前駆体−酵素反応である（「凝固カスケード」）。
【００１１】
接触活性化系は、自然カスケードの一部ではないが、接触活性化系の必要な阻害は、通常のトロンビン生成ネットワーク、すなわち組織因子により誘発されるトロンビン生成の多段反応のいずれかを、副作用として阻害するべきではない。
【００１２】
このネットワークにおける反応の多くは、リン脂質−溶質（血漿）界面で生じる。通常は細胞の内側にあるリン脂質のみが、この目的に適うことができる。血液の凝固過程の一部として、特定の細胞（血小板）は、トロンビン形成を促進するために膜を裏返しにする。細菌汚染は、血小板及び白血球を凝固促進性リン脂質に曝露させる可能性があり得、自然凝固過程を妨げる別の方法である。それ故にこれが、接触活性化系の阻害剤が、滅菌中も依然として活性であるべき第二の理由である。
【００１３】
天然源由来のトウモロコシトリプシン阻害剤（ＣＴＩ，corn trypsin inhibitor）は、血液の接触活性化阻害の目的で知られている（米国特許第６，４０３，３８１号明細書）。ＣＴＩは熱不安定性であり、それ故に有効期間が短く、特別な条件下で保管されなければならない。より重要であるのは、ＣＴＩは失活することなく滅菌できないことである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第６，４０３，３８１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
故に、接触活性化を阻害し、かつ耐熱性である物質が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
驚くべきことに、特定の熱安定性ペプチドが、血液の接触活性化を阻害する一方で、トロンボプラスチン誘導トロンビン生成を阻害しない、すなわち通常の凝固過程を妨げないことが今や示された。
【００１７】
したがって、第１の態様において本発明は、血液凝固阻害活性を有する少なくとも１種のカルシウムキレート物質を含み、血液凝固系の接触活性化を阻害する熱安定性ペプチドをさらに含む組成物であって、前記ペプチドが、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも２個又は少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含む、組成物を提供する。
【００１８】
血液凝固系は当業者に知られている。要するに血液凝固系は、大部分が接触面（interface）で生じ、正及び負のフィードバック反応により制御される、一連の酵素前駆体−酵素変換である。血液凝固系は、本出願の序論に簡潔に、及び“The blood coagulation cascade” by Schenone M, Furie BC and Furie B. Current Opinion in Haematology 2004, Vol 11(4) pages 272-277により詳細に記載されている。
【００１９】
本発明による熱安定性ペプチドは、血液凝固過程の接触活性化を阻害するため、血液凝固系の接触活性化が生じ得る血液を含む体液を含む任意の生体液において、好都合に使用することができる。したがって、血液が明示されている本発明の全ての実施形態において、脳脊髄液漏出液及び滲出液を含む他の体液、並びに血液凝固が生じ得る、血漿を含む全ての血液製剤が同様に意図され、本発明の一部として解釈されるべきである。血液は採血したての血液であってもよいが、同様に、保管されている血液又は血漿などの血液製剤であってもよい。
【００２０】
「血液凝固阻害活性を有するカルシウムキレート物質」は、血液凝固阻害活性を有する一方で、遊離Ｃａ２＋イオンを結合する任意の物質として本明細書に定義される。因子IXは、遊離Ｃａ２＋イオンの非存在下では活性化することができないため、遊離Ｃａ２＋の結合により血液凝固カスケードは遮断される。血液凝固活性を有するカルシウムキレート物質は、当技術分野でよく知られており、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ，ethylene-diamine-tetraacetic-acid）、クエン酸又はクエン酸ナトリウムを含むクエン酸の塩を含む。好ましくは、血液凝固阻害活性を有するカルシウムキレート物質は、トロンビン活性の測定に適合性であり、好ましい物質はクエン酸ナトリウムである。
【００２１】
「ペプチド」は、化学結合、好ましくはペプチド結合により連接されたアミノ酸のポリマーとして本明細書に定義される。原則としてアミノ酸は、任意の自然発生若しくは非天然若しくは非コードアミノ酸、又はこれらの混合物であってもよい。２アミノ酸からなるジペプチドは、可能性のある最小のペプチドである。ペプチドは、２〜数千アミノ酸、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、８００、１００、１２００、１５００、２０００等のアミノ酸を含んでもよい。
【００２２】
「阻害」は、活性の低下として本明細書に定義される。低下は任意の低下、例えば１倍、１０分の１、１００分の１、１０００分の１の低下であってもよい。
【００２３】
「接触活性化」は、静脈の内面などの自然環境以外の任意の表面との血液の接触による、血液凝固過程の活性化として本明細書に定義される。このような異物表面は、例えば採血デバイス又は中空針であってもよい。血液凝固過程は、本明細書で前に説明されている。要するに「接触活性化の阻害」は、接触活性化が低下したときということになる。
【００２４】
「約４０アミノ酸」は、約４０アミノ酸、すなわち３８、３９、４０、４１、又は４２アミノ酸、好ましくは４０アミノ酸として本明細書に定義される。
【００２５】
「配列番号１におけるアミノ酸位置５に対応する位置」は、配列番号５の位置５のアミノ酸アルギニン（Ｒ）の位置に対応する、配列番号１と整列された場合の本発明によるペプチドにおける位置として本明細書に定義される。
【００２６】
「配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号に示されたペプチドと少なくとも７０％配列同一性を有するペプチド」との表現における同一性は、当技術分野で知られているように、配列の比較による２個以上のアミノ酸（ペプチド）配列間の関係として定義される。当技術分野において、「同一性」のパーセンテージは、このような配列鎖間の一致により判定されたアミノ酸間の配列関連性の程度を示す。好ましくは、同一性のパーセンテージは、本明細書に特定されているような配列番号全体を比較して判定される。しかし、このような配列の部分も使用されてもよい。この文脈において、「部分」は、配列の長さの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％を意味する。好ましくは１００％が使用される。
【００２７】
ポリペプチドが保存アミノ酸置換のみが異なる場合、２つのアミノ酸配列は「類似している」と見なされる。アミノ酸類似度の判定において、当業者は、「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れる。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有するアミノ酸の交換を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。本明細書に開示されたアミノ酸配列の置換バリアントは、開示された配列中の少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がこの場所に挿入されているものである。好ましくは、アミノ酸変化は保存的である。各自然発生アミノ酸に対する好ましい保存的置換は以下の通りである：Ａｌａとｓｅｒ；Ａｓｎとｇｌｎ又はｈｉｓ；Ａｓｐとｇｌｕ；Ｃｙｓとｓｅｒ又はａｌａ；Ｇｌｎとａｓｎ；Ｇｌｕとａｓｐ；Ｇｌｙとｐｒｏ；Ｈｉｓとａｓｎ又はｇｌｎ；Ｉｌｅとｌｅｕ又はｖａｌ；Ｌｅｕとｉｌｅ又はｖａｌ；Ｌｙｓとａｒｇ；Ａｓｎとｇｌｎ又はｇｌｕ；Ｍｅｔとｌｅｕ又はｉｌｅ；Ｐｈｅとｍｅｔ、ｌｅｕ又はｔｙｒ；Ｓｅｒとｔｈｒ；Ｔｈｒとｓｅｒ；Ｔｒｐとｔｙｒ；Ｔｙｒとｔｒｐ又はｐｈｅ；及びＶａｌとｉｌｅ又はｌｅｕ。それ故に、Ａｒｇの場合、好ましい保存的置換及びアナログは後で本明細書に定義される。
【００２８】
「同一性」及び「類似性」は、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987；Sequence Analysis Primer Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991；及びCarillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073（1988）に記載されているものを含むがこれらに限定されない公知の方法により容易に計算することができる。
【００２９】
同一性を判定するための好ましい方法は、テストされる配列間で最大の一致を示すように設計される。同一性及び類似性を判定する方法は、公的に利用可能なコンピュータープログラムにおいて成文化されている。２つの配列間の同一性及び類似性を判定するための好ましいコンピュータープログラム方法には、例えばＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12（1）:387（1984））、ＢｅｓｔＦｉｔ及びＦＡＳＴＡ（Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410（1990）が含まれる。データベース類似性検索に使用することができるプログラムのＢＬＡＳＴ  ２．０ファミリーには、タンパク質データベース配列に対するタンパク質クエリ配列のためのＢＬＡＳＴＰが含まれる。よく知られたSmith Watermanアルゴリズムも、同一性を判定するのに使用することができる。
【００３０】
ポリペプチド配列比較に好ましいパラメータには、以下が含まれる：Algorithm: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453（1970）；Comparison matrix: BLOSSUM62 from Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919（1992）；Gap Penalty: 12；及びGap Length Penalty: 4。これらのパラメータによる有用なプログラムは、Genetics Computer Group社（マジソン、WI所在）から「Ｏｇａｐ」プログラムとして公的に利用可能である。上述のパラメータは、アミノ酸比較のためのデフォルトパラメータである（末端ギャップに対するペナルティがないことに加えて）。
【００３１】
配列同一性及び類似性を判定するための別の好ましい方法は、アルゴリズムNeedleman-Wunsch（Needleman, S. B. and Wunsch, C. D.（1970）J. Mol. Biol. 48, 443-453, Kruskal, J. B.（1983）An overview of sequence comparison In D. Sankoff and J. B. Kruskal,（ed.）, Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley）を用いることによる。以下のウェブサイトが使用され得る：http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/index.html。このアルゴリズムにおいて使用されるパラメータの定義は、以下のウェブサイトで見出される：http://emboss.sourceforge.net/docs/themes/AlignFormats.html#id。好ましくは、このアルゴリズムを用いると、ギャップペナルティは１０．０、及び伸長ペナルティは０．５である。
【００３２】
「アミノ酸Ａｒｇ」は、アミノ酸アルギニン（Ｒ）又はアミノ酸アルギニンのアナログとして本明細書に定義され、好ましくはアミノ酸アルギニン（Ｒ）である。「Ａｒｇのアナログ」は、当業者に公知の、天然、非天然及び／又は合成かにかかわらずアミノ酸アルギニン（Ｒ）のいずれかのアナログとして本明細書に定義される。好ましいアルギニンアナログは、モノメチルアルギニン、対称性及び非対称性ジメチルアルギニン、カナリン、δ−グアニジノα−アミノ酪酸、ホモアルギニン、カナバニン、シトルリン、アルギニンの立体配座固定アナログ、アルギニンのアミノボロン酸アナログ、及び他の塩基性アミノ酸又はこの誘導体からなる群から選択される。好ましくは、アルギニンアナログは、リジン又はこの誘導体ではない。この定義が当てはまる好ましい位置は、配列番号１におけるアミノ酸位置５に対応する位置のアルギニンである。
【００３３】
本発明による組成物において、血液凝固阻害活性を有するカルシウムキレート物質及び血液凝固系の接触活性化を阻害する熱安定性ペプチドは、血液、血漿又は本明細書で前に記載された他の生体液中の最終濃度の場合に、組成物が両方の化合物の活性を依然として保持している限り、任意の濃度及び比で組成物中に存在していてよい。好ましくは、クエン酸ナトリウムなどの血液凝固阻害活性を有するカルシウムキレート物質は、最終濃度約１１ｍＭ〜１３ｍＭ、より好ましくは１１ｍＭになるような濃度で存在する。血液凝固系の接触活性化を阻害する本発明による熱安定性ペプチドは、約５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの血中最終濃度になるような濃度で好ましくは存在する。好ましくは、採取容器中に存在する場合、クエン酸ナトリウムなどの血液凝固阻害活性を有するカルシウムキレート物質は、約１１ｍＭ〜１３ｍＭ、より好ましくは１１ｍＭの血中最終濃度になる、採取容器中３．２又は３．８％の貯蔵液中に存在する。好ましくは、血液凝固系の接触活性化を阻害する本発明による熱安定性ペプチドは、約１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの血中最終濃度になる採取管中の貯蔵液中に存在する。貯蔵液は、好ましい最終濃度の５、１０、２０倍を含む任意の貯蔵濃度を有してよい。好ましくは、貯蔵液は、最終濃度の１０倍を有する。当業者は、全血が採取される場合、全血液量のおよそ５０％である赤血球により取られる容積に応じて、本発明によるカルシウムキレート物質及び熱安定性ペプチドの最終濃度は、血漿中のこれらの濃度の約２倍になることを理解するであろう。本発明の全ての実施形態において、血液凝固系の接触活性化を阻害する本発明による熱安定性ペプチドの最終濃度は、ペプチドが阻害活性を依然として保持している限り任意の濃度であってよく、好ましくは最終濃度は約５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである。
【００３４】
本発明の全ての実施形態において、血液凝固系の接触活性化を阻害する本発明による熱安定性ペプチドは、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも２個又は少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含む任意のペプチドであってよい。少なくとも２個又は少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含む、最大で約４０アミノ酸の連続配列は、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２アミノ酸、好ましくは約２５〜３５アミノ酸、より好ましくは約２７〜３２アミノ酸、及び最も好ましくは約２９アミノ酸であってもよい。少なくとも２個又は少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含む、最大で約４０アミノ酸の連続配列は、生理学的環境下でジスルフィド架橋を形成することができる一対のシステイン（すなわち合計２個のシステイン）を好ましくは含む。少なくとも２個又は少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含む、最大で約４０アミノ酸の連続配列は、２個を超えるシステイン、例えば４個、６個、８個、１０個、１２個以上のシステイン、好ましくは６個のシステインを含み、システインは、好ましくはジスルフィド架橋として存在する。しかし、３個、５個、７個、９個、１１個、１３個以上のシステインがあり得ることは除外されない。本発明によるペプチド中のシステインは、配列番号１による対応するシステインとして好ましくは対になり、すなわちＣ３はＣ２０と対になり、Ｃ１０はＣ２２と対になり、及びＣ１６はＣ２８と対になる。血液凝固系の接触活性化を阻害する本発明による熱安定性ペプチドは、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも２個又は少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは、任意の長さであってよい少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含む任意のペプチドであってよい。好ましくは、本発明によるペプチドは、最大で４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０アミノ酸、より好ましくは約２５〜３５の間のアミノ酸、より好ましくは約２７〜３２アミノ酸、及び最も好ましくは約２９アミノ酸を含む。
【００３５】
本発明によるペプチドが、最も好ましい２９アミノ酸より長い又は短い場合、本発明によるペプチドの正味電荷は、同一条件下、好ましくは生理学的条件下で測定された場合の配列番号１の正味電荷と好ましくは実質的に同一である。この文脈における実質的に同一は、ペプチドの正味電荷が、同一条件下、好ましくは生理学的条件下で測定された場合の配列番号１の正味電荷の好ましくは＋０．５及び−０．５の範囲内、より好ましくは＋０．４及び−０．４の範囲内、＋０．３及び−０．３の範囲内、＋０．２及び−０．２の範囲内、＋０．１及び−０．１の範囲内であることを意味する。最も好ましくは、本発明によるペプチドの正味電荷は、同一条件下、好ましくは生理学的条件下で測定された場合の配列番号１の正味電荷と同一である。好ましくは、本発明によるペプチドのｐＩは、配列番号１のｐＩと実質的に同一である。実質的に同一なｐＩは、本発明によるペプチドのｐＩが、配列番号１のｐＩの好ましくは＋０．５及び−０．５の範囲内、より好ましくは＋０．４及び−０．４の範囲内、＋０．３及び−０．３の範囲内、＋０．２及び−０．２の範囲内、＋０．１及び−０．１の範囲内であることを意味する。
【００３６】
接触活性化の阻害は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）の延長により最もよく測定される。ａＰＴＴは、カオリン又はエラグ酸などの接触系を活性化する物質の存在下で、クエン酸血漿のカルシウム再沈着により開始される血漿の凝固時間として当業者に知られている。ａＰＴＴは、L.Poller in "Laboratory techniques in thrombosis" Edited by J.Jespersen, RM.Bertina and F.Haverkate, ISBN 0-7923-5317-X (1999) p.37-44により詳細に記載されている。或いは、国際公開第２００３０９３８３１号パンフレットによるトロンビン生成実験の遅延時間の延長が判定されてもよい。接触活性化因子阻害剤の１つの機能単位は、トロンビン生成曲線の遅延時間のａＰＴＴを２倍にする量として定義される。
【００３７】
接触活性化の阻害の最小限の所望程度は、ＴＧ曲線又はａＰＴＴ測定の遅延時間を３倍にするものである。
【００３８】
好ましくは、本発明による熱安定性ペプチドに関する熱安定性は、密閉バイアル中の本発明による熱安定性ペプチドの０．１ｍＭ溶液を用いて測定されたとき、血液凝固系の接触活性化の阻害の活性が、加熱滅菌の条件下、すなわち１２０℃、２０分間で失われないようなものである。しかし、一般に活性の５０％喪失は、滅菌後に阻害の最小限の程度が依然として達成される限り許容され得る。本発明の全ての実施形態において、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも２個又は少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含む、血液凝固系の接触活性化を阻害する本発明による熱安定性ペプチドは、本明細書に上述された条件下で加熱滅菌後、少なくとも１０、より好ましくは２０、３０、４０、５０、６０、８０、９０、９５及び最も好ましくは９９％阻害活性を好ましくは保持する。
【００３９】
本発明の全ての実施形態において、血液凝固系の接触活性化を阻害する本発明による熱安定性ペプチドは単一ペプチドであってもよいが、本発明による異なるペプチドが存在してもよく、すなわち本発明による全ての実施形態において本発明によるペプチドは、混合物に混合され得及び適用され得ることが想定される。
【００４０】
本発明による組成物は、Ｃａ２＋の活性化（凝固反応シーケンスの生理学的部分ではない、すなわち接触系）を阻害するのに、採血に好都合には使用できることが明らかとなろう。したがって、第２の態様において本発明は、血液凝固阻害活性を有する少なくとも１種のカルシウムキレート物質を含み、血液凝固系の接触活性化を阻害する熱安定性ペプチドをさらに含む試料採取用デバイスであって、前記ペプチドが、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも２個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含む、デバイスを提供する。前記デバイスは、試料の採取又は保管に適した任意のデバイスであってもよい。好ましくは、試料は血液又は血漿である。試料が血液である場合、デバイスは好ましくは、管などの採血用の容器であり、対象からの採血を容易にするために真空下であってもよい。デバイスはまた、採血用のバッグであってもよい。採血用の管（Becton Dickinsonバキュテナーガラス、Sarstedt管；Terumo Venosafe、Becton Dickinsonバキュテナープラスチック、Haemtech SCAT、Greiner真空管など）及びバッグは、当業者に知られている。
【００４１】
好ましくは、本発明によるデバイスにおいて、血液凝固阻害活性を有するカルシウムキレート物質及び血液凝固系の接触活性化を阻害する本発明による熱安定性ペプチドは、本発明の第１の態様に記載された濃度及び比で存在する。
【００４２】
本発明による組成物及びデバイスは、血液中の血液凝固活性を判定する場合に、血液の接触活性化凝固を防止するのに好都合には使用することができる。接触活性化は、経時的なトロンビン活性（トロンビン生成）を測定して血液凝固活性を判定する間は特に、判定及び調査にバイアスをかけることになる。したがって、第３の態様において本発明は、
血液凝固阻害活性を有する少なくとも１種のカルシウムキレート物質を含み、血液凝固系の接触活性化を阻害する熱安定性ペプチドをさらに含む試料採取用デバイスであって、前記ペプチドが、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも２個又は少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含む、デバイス、及び
血液凝固活性を、好ましくは時間の関数としてのトロンビン活性の発達を判定するための試薬
を含むキットオブパーツ（kit of parts）を提供する。
【００４３】
好ましくは、本発明によるキットにおいて、試料採取用デバイスは、任意のデバイスであってもよいが、好ましくは管などの採血用の容器であり、対象からの採血を容易にするために真空下であってもよい。
【００４４】
本発明によるキットにおいて、血液凝固阻害活性を有するカルシウムキレート物質及び血液凝固系の接触活性化を阻害する本発明による熱安定性ペプチドは、本発明の第１の態様に記載された濃度及び比で存在する。
【００４５】
キットは、血液凝固活性の判定に有用な任意の他の試薬又はデバイスを含むことができる。血液凝固活性を判定するための試薬は、当業者にこの目的で公知の任意の試薬であってもよい。トロンビン活性が測定される場合、試薬は好ましくは、蛍光発生トロンビン基質、好ましくは蛍光発生基に連結されたオリゴペプチドである。このようなペプチドの一般式は、Ｅ−（ＡＡ）ｎ−（Ａｒｇ又はＬｙｓ）−Ｆｌｕｏであり、式中、Ｅは末端基であり、ＡＡはアミノ酸であり、Ｆｌｕｏは好ましくはアミノメチルクマリン又はローダミン−１１０である。
【００４６】
本明細書で前に記載されているように、本発明による熱安定性ペプチドは、血液凝固系の接触活性化を阻害するのに好都合に使用することができる。したがって、第４の態様において本発明は、異物表面との接触による血液凝固系の活性化を阻害するための、血液凝固系の接触活性化を阻害する熱安定性ペプチドの使用であって、前記ペプチドが、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも２個又は少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含む、使用を提供する。
【００４７】
本発明による使用において、血液凝固系の接触活性化を阻害する本発明による熱安定性ペプチドは、当業者に利用可能なあらゆる方法で、血液又は本明細書で前に記載された任意の他の生体液若しくは血漿などの血液製剤と接触され得る。血液は、好ましくは生体外の血液又は血漿であり、すなわち血液の採取が既に行われており、血液又は血漿は保管されていてもよい。本発明による使用において、血液凝固系の接触活性化を阻害する本発明による熱安定性ペプチドは、異物表面との血液の最初の接触時又は血液との接触後できるだけすぐに、本発明の第１の態様に記載された濃度及び比で好ましくは存在する。好ましくは、本発明による熱安定性ペプチドは、血液凝固阻害活性を有するカルシウムキレート物質と一緒に存在し、血液凝固阻害活性を有するカルシウムキレート物質及び血液凝固系の接触活性化を阻害する本発明による熱安定性ペプチドは、本発明の第１の態様に記載された濃度及び比で好ましくは存在する。好ましくは、本発明による熱安定性ペプチド及び血液凝固阻害活性を有するカルシウムキレート物質は、血液凝固系の接触活性化を阻害するために血液の採取後直ちに血液と混合される。これは、本発明による熱安定性ペプチド及び血液凝固阻害活性を有するカルシウムキレート物質を、血液が採取される容器に入れることにより好都合には達成することができる。そのため、血液は、血液試料が抜き取られた直後に混合され得る。容器は好ましくは、本発明の第２の態様に記載されたデバイスである。
【００４８】
本発明による熱安定性ペプチドは、血液凝固系の接触活性化を阻害するために血液試料の採取中に好都合に使用することができ、凝固はさもなければ、試料の採取中に既に開始する可能性がある。したがって、第５の態様において本発明は、本発明による熱安定性ペプチドの医学的使用を提供する。すなわち、医薬として使用するための、血液凝固系の接触活性化を阻害する熱安定性ペプチドであって、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも２個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含む、ペプチド。
【００４９】
本発明のこの態様は、血液凝固活性を判定するための、血液凝固系の接触活性化を阻害する熱安定性ペプチドであって、前記ペプチドが、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも２個又は少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含み、前記方法が、
個体から血液試料を採取するステップであり、前記ペプチドを血液試料と接触させるステップと、
前記試料における血液凝固活性を、好ましくはトロンビン活性を、より好ましくはトロンビン活性を測定するための蛍光アッセイを用いてトロンビン活性を測定するステップと、好ましくは、
診断に血液凝固活性値を使用するステップと
を含む、ペプチドをさらに提供する。
【００５０】
試料は、本明細書で前に記載された任意の生体液、好ましくは血液又は血漿であってもよい。試料は、測定前に処理することができる。そのため、試料は実際は、最初の試料の一部分であってもよい。前記部分は、試料の一部のみが使用され、残りの試料は将来の使用のために保管されるということであり得る。前記部分は、例えば測定が、血漿など試料の上清で行われることも意味し得る。試料は、採取と測定の間で保管することもできる。そのため、測定は、−８０℃で保管されていた血漿で例えば行ってもよい。
【００５１】
血液凝固活性は、当業者に利用可能な任意のアッセイにより測定することができる。好ましくは、血液凝固活性は、経時的なトロンビン活性（トロンビン生成）を測定して判定される。トロンビン活性は、当業者に公知の任意の手段により測定することができる。好ましいアッセイは、蛍光発生トロンビン基質、好ましくは蛍光発生基に連結されたオリゴペプチドを使用する。このようなペプチドの一般式は、Ｅ−（ＡＡ）ｎ−（Ａｒｇ又はＬｙｓ）−Ｆｌｕｏであり、式中、Ｅは末端基であり、ＡＡはアミノ酸であり、Ｆｌｕｏは好ましくは、トロンビン活性を測定するためのアミノメチルクマリン又はローダミン−１１０である。このようなアッセイは、血漿に関しては国際公開第２００３／０９３８３１号パンフレット、全血に関しては国際公開第２００６／１１７２４６号パンフレットに記載されている。典型的なアッセイでは、血漿又は血液の２つの部分が、少なくともＣａ２＋、上記の蛍光発生基質、及びトロンビン生成を開始するための組織因子を含有する溶液の１つの部分と混合される。
【００５２】
血液凝固活性の値は好ましくは、先天性若しくは後天性血栓形成傾向、先天性若しくは後天性血友病、消費性凝固障害、又は抗血栓薬（ヘパリン、ビタミンＫアンタゴニスト、直接トロンビン阻害剤など）若しくは凝固促進薬（因子VIII又はIXの濃縮製剤など）の作用などの幾つかの凝固促進状態及び抗凝固状態の診断に使用される。実施例１に例示されているような当技術分野に公知の方法により検査される場合、内因性トロンビン産生能の正常値、すなわちトロンビン生成曲線下の面積は、１６００±２５０ｎＭ．ｍｉｎである。４００ｎＭ．ｍｉｎより低い値は確実な出血傾向を、１８５０ｎＭ．ｍｉｎより上の値は血栓傾向を示す。
【００５３】
本発明による医学的使用において、血液凝固系の接触活性化を阻害する本発明による熱安定性ペプチドを、血液又は本明細書で前に記載された他の生体液と接触させる。本発明による熱安定性ペプチドは、当業者に利用可能なあらゆる方法で、血液又は本明細書で前に記載された他の生体液と接触され得る。血液、血漿又は本明細書で前に記載された他の生体液との接触後、血液凝固系の接触活性化を阻害する本発明による熱安定性ペプチドは、本発明の第１の態様に記載された濃度及び比で好ましくは存在する。好ましくは、本発明による熱安定性ペプチドは、血液凝固阻害活性を有するカルシウムキレート物質と一緒に存在し、血液凝固阻害活性を有するカルシウムキレート物質及び血液凝固系の接触活性化を阻害する本発明による熱安定性ペプチドは、本発明の第１の態様に記載された濃度及び比で好ましくは存在する。好ましくは、本発明による熱安定性ペプチド及び（もし使用されるならば）血液凝固阻害活性を有するカルシウムキレート物質は、血液凝固系の接触活性化を阻害するために血液の採取中に血液と混合される。これは、本発明による熱安定性ペプチド及び血液凝固阻害活性を有するカルシウムキレート物質を、血液が採取される容器に入れることにより好都合には達成することができる。そのため、血液は、血液試料が抜き取られた直後に混合され得る。容器は好ましくは、本発明の第２の態様に記載されたデバイスである。
【００５４】
本明細書で前に記載されているように、本発明による熱安定性ペプチドは、血液凝固系の接触活性化を阻害するのに好都合には使用することができる。したがって、第６の態様において本発明は、血液の凝固を阻害する方法であって、血液凝固系の接触活性化を阻害する熱安定性ペプチドであり、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも２個又は少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含むペプチドを、凝固を阻害するのに十分な量で、血液、血漿又は本明細書で前に記載された任意の他の生体液と接触させるステップを含む、方法を提供する。
【００５５】
本発明による血液の凝固を阻害する方法において、血液凝固系の接触活性化を阻害する本発明による熱安定性ペプチドを、血液又は本明細書で前に記載された他の生体液と接触させる。本発明による熱安定性ペプチドは、当業者に利用可能なあらゆる方法で血液と接触され得る。血液との接触後、血液凝固系の接触活性化を阻害する本発明によるペプチドは、凝固を阻害するのに十分な量で好ましくは存在し、好ましくは本発明による熱安定性ペプチドは、本発明の第１の態様に記載された濃度及び比で存在する。好ましくは、本発明による熱安定性ペプチドは、血液凝固阻害活性を有するカルシウムキレート物質と一緒に存在し、血液凝固阻害活性を有するカルシウムキレート物質及び血液凝固系の接触活性化を阻害する本発明による熱安定性ペプチドは、本発明の第１の態様に記載された濃度及び比で好ましくは存在する。本発明による熱安定性ペプチドは、血液又は本明細書で前に記載された他の生体液といつでも接触され得る。これは、試料を採取するとすぐに行うことができるが、試料の保管後を含む後ほど、例えば凝固活性などのパラメータの測定前に行うこともできる。
【００５６】
本明細書で前に記載されているように、本発明による熱安定性ペプチドは、血液凝固系の接触活性化を阻害するのに好都合に使用することができる。それ故に、前記ペプチドは、前記試料における血液凝固系の接触活性化を阻害する一方で、試料を採取及び調製するのに好都合には使用することができる。したがって、第７の態様において本発明は、個体からの試料の採取及び調製のための方法であって、
試料採取用デバイスを提供するステップであり、前記デバイスが、血液凝固阻害活性を有する少なくとも１種のカルシウムキレート物質を含み、血液凝固系の接触活性化を阻害する熱安定性ペプチドをさらに含み、前記ペプチドが、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも２個又は少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含む、ステップ、
デバイスに試料を採取するステップ、及び
試料、血液凝固阻害活性を有するカルシウム結合物質及びペプチドを混合するステップ
を含む、方法を提供する。
【００５７】
デバイスは、当業者に公知の及び試料の採取の目的に適したデバイスであってもよい。好ましくは、デバイスは、本発明の第２の態様に記載されたデバイスである。試料は、本明細書で前に記載された生体液などの任意の生物学的試料であってもよく、好ましくは試料は血液又は血漿である。デバイスにおいて、血液凝固阻害活性を有するカルシウムキレート物質及び血液凝固系の接触活性化を阻害する本発明によるペプチドは、本発明の第１の態様に記載された濃度及び比で好ましくは存在する。
【００５８】
試料、好ましくは血液は、当業者に公知の任意の手段により採取することができ、例えば血液は、デバイスに接続することができる中空針を通じて個体から採取することができる。
【００５９】
採取後、又は採取中でも、試料、好ましくは血液は、血液凝固阻害活性を有するカルシウムキレート物質及び本発明による熱安定性ペプチドと混合される。混合は、当業者に公知の任意の手段により行うことができる。デバイスは、１又は２回以上手で傾けることができる。デバイスはまた、混合目的で機械又はツールに入れることもできる。
【００６０】
本明細書で前に記載されているように、本発明による熱安定性ペプチドは、血液の接触活性化を阻害する一方で、トロンボプラスチン誘導トロンビン生成を阻害しない、すなわち通常の凝固過程を妨げない。それ故に、本発明による熱安定性ペプチドは、血液凝固活性が判定されるアッセイにおいて好都合には使用することができる。したがって、第８の態様において、本発明は、血液若しくは血漿試料、又は本明細書で前に記載された任意の他の生体液における血液凝固活性を判定する方法であって、血液凝固阻害活性を有する少なくとも１種のカルシウムキレート物質を含み、血液凝固系の接触活性化を阻害する熱安定性ペプチドをさらに含む前記試料において、血液凝固活性を、好ましくはトロンビン活性を、より好ましくはトロンビン活性を測定するための蛍光アッセイを用いてトロンビン活性を測定するステップを含み、前記ペプチドが、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも２個又は少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含む、方法を提供する。凝固活性を分析される血液試料中に、本発明による熱安定性ペプチドは既に存在していてもよく、又は分析前の適切な時間に添加されてもよい。一実施形態において、血液試料は、本発明の第２の態様によるデバイスに採取されている。このようなデバイスにおいて本発明による熱安定性ペプチドは、血液試料が採取されたとき既に存在している。そのため、血液は、本発明による熱安定性ペプチドと直ちに混合され、故に血液凝固系の接触活性化が阻害される。好ましくは、血液又は血漿試料、又は本明細書で前に記載された任意の他の生体液は、本発明による熱安定性ペプチド及び血液凝固阻害活性を有するカルシウムキレート物質の両方を含み、血液凝固阻害活性を有するカルシウムキレート物質及び血液凝固系の接触活性化を阻害する本発明による熱安定性ペプチドは、本発明の第１の態様に記載された濃度及び比で好ましくは存在する。
【００６１】
血液凝固活性は、当業者に利用可能な任意のアッセイにより測定することができる。好ましくは、血液凝固活性は、経時的なトロンビン活性（トロンビン生成）を測定して判定される。トロンビン活性は、当業者に公知の任意の手段により測定することができる。好ましいアッセイは、蛍光発生トロンビン基質、好ましくはトロンビン活性を測定するためのアミノメチルクマリンを使用する。このようなアッセイは、血漿に関しては国際公開第２００３／０９３８３１号パンフレット、血液に関しては国際公開第２００６／１１７２４６号パンフレットに記載されている。例えば本明細書の実施例１を参照のこと。
【００６２】
第９の態様において、本発明は、血液凝固系の接触活性化を阻害する熱安定性ペプチドであって、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも２個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含むペプチドを提供する。
【００６３】
本発明により、本発明の第１の態様による組成物、本発明の第２の態様によるデバイス、本発明の第３の態様によるキット、本発明の第４の態様による使用、本発明の第５の態様による医学的使用のためのペプチド、本発明の第６、第７及び第８の態様のいずれか１つによる方法、又は本発明の第９の態様によるペプチドにおいて、血液凝固系の接触活性化を阻害する熱安定性ペプチドは、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも２個又は少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを好ましくは含む。
【００６４】
本発明により、本発明の第１の態様による組成物、本発明の第２の態様によるデバイス、本発明の第３の態様によるキット、本発明の第４の態様による使用、本発明の第５の態様による医学的使用のためのペプチド、本発明の第６、第７及び第８の態様のいずれか１つによる方法、又は本発明の第９の態様によるペプチドにおいて、血液凝固系の接触活性化を阻害する熱安定性ペプチドは、コンセンサスアミノ酸配列：XXCXXXXXXCXXXXXCXXXCXCXXXXXCX（配列番号９）（位置５のＸはＲ又はＲのアナログであり、位置９のＸはＥ又はＫ、好ましくはＫであり、位置２１のＸはＩ又はＶ、好ましくはＶである）、又はより好ましくは：XILMXCKKDSDCLAECX（配列番号６）（位置１のＸは、Ｋ又はＲ若しくはＲのアナログ、好ましくはＲ又はＲのアナログであり、位置５のＸはＥ又はＫ、好ましくはＫであり、位置１７のＸはＩ又はＶ、好ましくはＶである）、又はより好ましくは：RVCPXILMXCKKDSDCLAECXCLEHGYCG（配列番号７）（位置５のＸは、Ｋ又はＲ若しくはＲのアナログ、好ましくはＲ又はＲのアナログであり、位置９のＸはＥ又はＫ、好ましくはＫであり、位置２１のＸはＩ又はＶ、好ましくはＶである）を好ましくは含む。配列番号９を定義する上記の実施形態において、配列番号９は、配列番号１と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有することがさらに好ましい。
【００６５】
一実施形態において、コンセンサスアミノ酸配列配列番号９は、コンセンサスアミノ酸配列：XXCXXXXXXCXXXXXCXXXCXCXXXXXCX
（位置５のＸは、Ｒ若しくはＲのアナログであり、
位置１のＸは、Ｒ若しくはＲのアナログであり、
位置２のＸは、Ｖ若しくはＶのアナログであり、
位置９のＸは、Ｅ若しくはＫ、好ましくはＫであり、
位置２１のＸは、Ｉ若しくはＶ、好ましくはＶであり、及び／又は
位置４のＸは、Ｐ若しくはＰのアナログであり、並びに好ましくは
前記配列番号９が、配列番号１と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有する）を含む、又は、からなる、又は、である。
【００６６】
この実施形態において、コンセンサスアミノ酸配列は、
2014531413.tif 000003
（配列番号１０〜２５の各々において、
位置９のＸは、Ｅ又はＫ、好ましくはＫであり、位置２１のＸは、Ｉ又はＶ、好ましくはＶであり、
及び好ましくは配列番号１０〜２５の各々は、配列番号１と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有する）を含み得、又は、からなり得る。この段落では、配列番号１０〜２５において特定されたＲ、Ｖ又はＰは、配列番号９においてと同じ意味を有し、ＲはＲ又はＲのアナログであり得、ＶはＶ又はＶのアナログであり得、ＰはＰ又はＰのアナログであり得ると理解されるべきである。
【００６７】
当業者は、アミノ酸の保存的置換は、前記ペプチドの機能的特徴を変更することなく行えることを理解するであろう。このような保存的置換は、ペプチドが血液凝固系の接触活性化を阻害する熱安定性ペプチドのままである限り、本発明の範囲内である。熱安定性は、好ましくは本明細書で前に定義されている通りである。
【００６８】
本発明により、本発明の第１の態様による組成物、本発明の第２の態様によるデバイス、本発明の第３の態様によるキット、本発明の第４の態様による使用、本発明の第５の態様による医学的使用のためのペプチド、本発明の第６、第７及び第８の態様のいずれか１つによる方法、又は本発明の第９の態様によるペプチドにおいて、血液凝固系の接触活性化を阻害する熱安定性ペプチドは、
配列番号１に示された配列を有するペプチド、
配列番号２に示された配列を有するペプチド、
配列番号３に示された配列を有するペプチド、
配列番号４に示された配列を有するペプチド、及び
配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４に示されたペプチドと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有するペプチド
からなる群から選択されるペプチドを好ましくは含む。
【００６９】
より好ましくは、ペプチドは、配列番号１又は配列番号２に示された配列を有するペプチドを含む。さらにより好ましくは、ペプチドは、配列番号１に示された配列を有するペプチドを含む。
【００７０】
本発明により、本発明の第１の態様による組成物、本発明の第２の態様によるデバイス、本発明の第３の態様によるキット、本発明の第４の態様による使用、本発明の第５の態様による医学的使用のためのペプチド、本発明の第６、第７及び第８の態様のいずれか１つによる方法、又は本発明の第９の態様によるペプチドにおいて、血液凝固系の接触活性化を阻害する熱安定性ペプチドは、好ましくは、
配列番号１に示された配列を有するペプチド、
配列番号２に示された配列を有するペプチド、
配列番号３に示された配列を有するペプチド、
配列番号４に示された配列を有するペプチド、及び
配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４に示されたペプチドと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有するペプチド
からなる群から選択されるペプチドである。
【００７１】
より好ましくは、ペプチドは、配列番号１又は配列番号２に示された配列を有するペプチドである。さらにより好ましくは、ペプチドは、配列番号１に示された配列を有するペプチドである。
【００７２】
本発明は、本発明による熱安定性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをさらに提供する。
【００７３】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、血液凝固系の接触活性化を阻害する熱安定性ペプチドであって、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも２個又は少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含むペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【００７４】
より好ましくは、ポリヌクレオチドは、最大で約４０アミノ酸の連続配列内に、少なくとも２個又は少なくとも４個のシステインと、配列番号１のアミノ酸位置５に対応する位置におけるアミノ酸Ａｒｇ又はＡｒｇのアナログと、好ましくは少なくとも連続アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔとを含む熱安定性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【００７５】
さらにより好ましくは、ポリヌクレオチドは、コンセンサスアミノ酸配列：XXCXXXXXXCXXXXXCXXXCXCXXXXXCX（配列番号９）（位置５のＸはＲ又はＲのアナログ、好ましくはＲ又はＲのアナログであり、位置９のＸはＥ又はＫ、好ましくはＫであり、位置２１のＸはＩ又はＶ、好ましくはＶである）、又はより好ましくは：XILMXCKKDSDCLAECX（配列番号６）（位置１のＸはＫ又はＲ、好ましくはＲであり、位置５のＸはＥ又はＫ、好ましくはＫであり、位置１７のＸはＩ又はＶ、好ましくはＶである）、又はより好ましくは：RVCPXILMXCKKDSDCLAECXCLEHGYCG（配列番号７）（位置５のＸはＫ又はＲ、好ましくはＲであり、位置９のＸはＥ又はＫ、好ましくはＫであり、位置２１のＸはＩ又はＶ、好ましくはＶである）を含むペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドであって、配列番号９をコードする前記ポリヌクレオチドを定義する上記の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号９をコードし、又は配列番号１と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有するペプチドをコードすることがさらに好ましい。
【００７６】
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、コンセンサスアミノ酸配列配列番号９であって、コンセンサスアミノ酸配列：XXCXXXXXXCXXXXXCXXXCXCXXXXXCX
（位置５のＸは、Ｒ若しくはＲのアナログであり、
位置１のＸは、Ｒ若しくはＲのアナログであり、
位置２のＸは、Ｖ若しくはＶのアナログであり、
位置９のＸは、Ｅ若しくはＫ、好ましくはＫであり、
位置２１のＸは、Ｉ若しくはＶ、好ましくはＶであり、及び／又は
位置４のＸは、Ｐ又はＶのアナログであり、並びに好ましくは
前記配列番号９が、配列番号１と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有する）を含む又はそれらからなる又はそれらである前記配列番号９をコードする。
【００７７】
一実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、
2014531413.tif 000004
（配列番号１０〜２５の各々において、
位置９のＸは、Ｅ又はＫ、好ましくはＫであり、及び位置２１のＸは、Ｉ又はＶ、好ましくはＶであり、
並びに好ましくは、配列番号１０〜２５の各々は、配列番号１と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有する）を含む又はそれらからなるコンセンサスアミノ酸配列をコードすることが好ましい。この段落では、配列番号１０〜２５において特定されたＲ、Ｖ又はＰは、配列番号９においてと同じ意味を有し、ＲはＲ又はＲのアナログであり得、ＶはＶ又はＶのアナログであり得、ＰはＰ又はＰのアナログであり得ると理解されるべきである。
【００７８】
当業者は、アミノ酸の保存的置換は、前記ペプチドの機能的特徴を変更することなく行えることを理解するであろう。このような保存的置換は、ペプチドが血液凝固系の接触活性化を阻害する熱安定性ペプチドのままである限り、本発明の範囲内である。熱安定性は、好ましくは本明細書で前に定義されている通りである。
【００７９】
さらにより好ましくは、ポリヌクレオチドは、
配列番号１に示された配列を有するペプチド、
配列番号２に示された配列を有するペプチド、
配列番号３に示された配列を有するペプチド、
配列番号４に示された配列を有するペプチド、及び
配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４に示されたペプチドと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有するペプチド
からなる群から選択されるペプチドを含む熱安定性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。より好ましくは、ペプチドは、配列番号１又は配列番号２に示された配列を有するペプチドを含む。さらにより好ましくは、ペプチドは、配列番号１に示された配列を有するペプチドを含む。
【００８０】
さらにより好ましくは、ポリヌクレオチドは、
配列番号１に示された配列を有するペプチド、
配列番号２に示された配列を有するペプチド、
配列番号３に示された配列を有するペプチド、
配列番号４に示された配列を有するペプチド、及び
配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４に示されたペプチドと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％配列同一性を有するペプチド
からなる群から選択されるペプチドである熱安定性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。より好ましくは、ペプチドは、配列番号１又は配列番号２に示された配列を有するペプチドである。さらにより好ましくは、ペプチドは、配列番号１に示された配列を有するペプチドである。
【００８１】
本発明によるポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ等を含む、任意のタイプのポリヌクレオチドであってもよい。ポリヌクレオチドは、本発明によるポリヌクレオチドの発現を誘導することができる制御配列を含む追加のポリヌクレオチドを含むことができる核酸構築物又はベクターに含まれてもよい。
【００８２】
本文書及びこの特許請求の範囲において、動詞「含む（to comprise）」及びこの活用は、該単語の次にくる項目が含まれるが、具体的に言及されない項目は除外されないことを意味する非限定的意味において使用される。さらに、不定冠詞「１つの（a）」又は「１つの（an）」による要素への言及は、唯一の要素があることを文脈が明白に求めない限り、１つを超える要素が存在する可能性を除外しない。不定冠詞「１つの（a）」又は「１つの（an）」は、故に通常は「少なくとも１つの」を意味する。数値（例えば約１０）との関連において使用される場合、単語「約（about）」又は「約（approximately）」は、この値の０．１％多い又は少ない任意の値（１０の）であり得ることを好ましくは意味する。
【００８３】
本明細書に提供された配列情報は、誤って特定されたアミノ酸の包含を要求するほど狭義に解釈されるべきではない。当業者は、このように誤って特定されたアミノ酸を識別することができ、このような誤りの修正の方法を知っている。
【００８４】
本明細書に引用された全ての特許及び文献参照は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】組織因子及び接触活性化により誘発されるトロンビン生成に対する天然のＴＩＣＡ−１の効果を示す図である。描線：ＴＩＣＡ１なし、点線：７．５μｇ／ｍｌ  ＴＩＣＡ１。左から右に：組織因子誘発トロンビン生成（２つの重複するピーク）、接触活性化トロンビン生成（ＴＩＣＡ１なし）、接触活性化トロンビン（ＴＩＣＡ１有り）。
【図２】ＣＴＩ及びＴＩＣＡ１による接触活性化トロンビン生成、阻害を示す図である。描線はＴＩＣＡ−１を示す。濃度（左から右に）：なし、１、２、３及び５μＭ。点線はＣＴＩ０．７５μＭを示す。
【図３】因子XIIａに対する阻害効果の定量化を示す図である。円はデータポイントを表し、線は最良適合を表す。３ａ：ｈ−ＦXIIａによるＳ２３０２の加水分解に対するＴＩＣＡ１（ＰＴ１）の効果、ＦXIIａ＝５ｎＭ、Ｋｃａｌ＝２５ｓ−１、Ｋｍ＝１８０μＭ、Ｋｉ＝２５１ｎＭ。３ｂ：ｈ−ＦXIIａによるＳ２３０２の加水分解に対するＣＴＩの効果、ＦXIIａ＝４．２１ｎＭ、Ｋｃａｔ＝２５ｓ−１、Ｋｍ＝１８０μＭ、Ｋｉ＝２．９０ｎＭ
【図４】ＴＩＣＡ−１の酸化的フォールディングを示す図である。４ａ：タンパク質フォールディングの結果としての保持時間の典型的な減少を示す、還元（太線）及び酸化（細線）ＴＩＣＡ−１のＨＰＬＣ。４ｂ：フォールディングされたＴＩＣＡ−１、４ｃ：フォールディングされていないＴＩＣＡ−１。ＴＩＣＡ−１のフォールディングは、３個のジスルフィド結合の形成による６個のプロトン（protons）の喪失に相当する、約６Ｄａの質量減少をもたらす。
【図５】凝固活性化の熱安定性阻害剤（ＴＩＣＡ１）：ジスルフィド依存性を示す図である。３個のジスルフィド（Ｃ３−Ｃ２０、Ｃ１０−Ｃ２２、Ｃ１６−Ｃ２８）：１００％活性；０．２〜６．８％活性の２個のジスルフィド：（Ｃ３−Ｃ２０、Ｃ１０−Ｃ２２）：０．２％活性、（Ｃ１０−Ｃ２２、Ｃ１６−Ｃ２８）：０．３％活性、（Ｃ３−Ｃ２０、Ｃ１６−Ｃ２８）：６．８％活性；０．００３〜０．００６％活性の１個のジスルフィド：（Ｃ１０−Ｃ２２）：０．００３％活性、（Ｃ３−Ｃ２０）：０．００３％活性、（Ｃ１６−Ｃ２８）：０．００６％活性；ジスルフィドなし、Ｃなし：０活性
【図６】ＴＩＣＡ１：インタクトなジスルフィド結合によるアラニンスキャンを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
配列
【００８７】
【表１】
2014531413.tif 000005
【００８８】
配列番号６において、位置１のＸはＫ又はＲ、好ましくはＲであり、位置５のＸはＥ又はＫ、好ましくはＫであり、位置１７のＸはＩ又はＶ、好ましくはＶである。
配列番号７において、位置５のＸはＫ又はＲ、好ましくはＲであり、位置９のＸはＥ又はＫ、好ましくはＫであり、位置２１のＸはＩ又はＶ、好ましくはＶである。
配列番号９において、位置５のＸは、Ｒ又はＲのアナログであり、位置９のＸは、Ｅ又はＫ、好ましくはＫであり、位置２１のＸは、Ｉ又はＶ、好ましくはＶである。
【００８９】
本発明は、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない以下の例によりさらに記載される。
【００９０】
特に記載がない限り、本発明の実践は、分子生物学、ウイルス学、微生物学又は生化学の標準的従来方法を使用する。このような技法は例えば、Sambrook et al.（1989） Molecular Cloning, A Laboratory Manual（2nd edition）, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrook and Russell（2001） Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY；Volumes 1 and 2 of Ausubel et al.（1994） Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA；及びVolumes I and II of Brown（1998） Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press（UK）；“Laboratory techniques in thrombosis” Edited by J.Jespersen, R.M.Bertina and F.Haverkate, ISBN 0-7923-5317-X (1999)；“Haemostasis and thrombosis: Basic principles and clinical practice” Eds: Colman, Hirsh, Marder, Clowes, George Lippincott Williams and Wilkins. (2010)に記載されている。
［実施例］
【００９１】
要約
本発明者らは、トリプシンカラムでの親和性クロマトグラフィー及び当技術分野に公知のさらなる精製手順により、多数の種子からトリプシン阻害剤（セルピン）、特にセイヨウカボチャ（Cucurbita Maxima）種子由来のセルピン、すなわちスカッシュ型トリプシン阻害剤（ＳＴＩ，squash trypsin inhibitor）を単離した（実施例２を参照のこと）。
【００９２】
本発明者らは、セルピンが因子XIIａの阻害剤であることを確認した（実施例３を参照のこと）。本発明者らは、セルピンが、接触活性化により開始されるトロンビン生成を有効に阻害するが、天然のトリガー組織因子により開始されたＴＧは阻害しないことを観察した（図１を参照のこと）。ここで注意されるべきは、接触活性化の阻害は、トロンビン生成の遅延時間の延長としてトロンビン生成曲線に見られることである。この理由は、接触活性化は因子IXａを生じさせ、トロンビン生成を開始するのに特定の臨界量の因子IXａが必要とされるためである。
【００９３】
組織因子誘発トロンビン生成が阻害されないということは、ＳＴＩが自然凝固過程は阻害しないが、接触活性化のみを阻害することを示している。実際にＳＴＩは、接触活性化を非常によく阻害したため、クエン酸ナトリウム又はＣａ２＋イオンを結合する別の物質を含有しないが、ＳＴＩ（１０μｇ／ｍｌ）のみを含有する溶液に採取された血液は、ＳＴＩの非存在下ならば５分未満で凝固する条件下で、４５分間以上にわたり液体のままであった。ＳＴＩを含有する管が、沸騰水中で１時間加熱して滅菌された場合でも、ＳＴＩは驚くべきことに阻害活性を喪失しなかった。すなわち、血液は、依然として４５分超後にのみ凝固するであろう。類似の環境下でＣＴＩ（１０μｇ／ｍｌ）は、１５分未満の凝固時間が観察されたことから活性の多くを喪失した。
【００９４】
天然生成物はさらに分析され、２つの活性ポリペプチドを含有することが見出され、このポリペプチドは均質にまで精製された（実施例２）。
【００９５】
これらの２つの天然ペプチド（ＴＩＣＡ１及びＴＩＣＡ２）は、トリプシン分解（trypsinolysis）により得られた断片のペプチド質量フィンガープリント（ＰＭＦ，peptide mass fingerprinting）と併用したタンデムマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ，Matrix-assisted Laser Desorption Ionisation Time-of-flight）質量分析を用いて、１次構造を判定するためにさらに分析された。ＰＭＦ陽性断片は、衝突誘起断片化（ＣＩＤ，collision-induced fragmentation）及びアミノ酸配列決定により確認された。見出された１次構造は、表１に示されている。
【００９６】
【表２】
2014531413.tif 000006
【００９７】
ＴＩＣＡ１及び２は、次いで、幾つかの同類物（表１、ＴＩＣＡ３、４及び５）と一緒に固相ペプチド合成を用いて合成された（実施例４を参照のこと）。
【００９８】
本発明者らは、天然材料に対して行ったのと同じ方法で合成材料の阻害作用を判定し、ＴＩＣＡ１が最も活性を有することを見出した（表２及び実施例３を参照のこと）。
【００９９】
【表３】
2014531413.tif 000007
【０１００】
本発明者らは、次いで、接触活性化の阻害剤としてのＴＩＣＡ１の作用を判定した。これは、ＳＴＩと同じように、接触活性化により誘発されたトロンビン生成の遅延時間を延長するようである（図１を参照のこと）。
【０１０１】
ＴＩＣＡ１は、ＣＴＩ配列を反応性結合、ＰＣＴＩの周辺に挿入してさらに修飾された（配列番号８）。得られたＰＣＴＩペプチドは不活性であり、新たに見出された阻害剤が、ＣＴＩと共通する構造機能相関を持たないことを示している。カオリンとのインキュベーションにより誘発されたＰＰＰの接触活性化に対するＴＩＣＡ１の効果が、ＣＴＩの効果と比較された。表３及び図２に見ることができるように、ＰＰＰがさまざまな濃度のＴＩＣＡ１（０．９４〜４．６μＭ）とインキュベートされる場合、接触活性化の用量依存的阻害がある。モルベースでは、ペプチドＢはＣＴＩより約２．５倍効力が低い。重量ベースでは、これは等効力である。
【０１０２】
【表４】
2014531413.tif 000008
【０１０３】
ＴＩＣＡ１はＭＷ＝３２６８Ｄａを有し、合成、フォールディング及び精製が容易である。ＴＩＣＡ１は、活性を喪失することなく室温で数週間放置することができる。密閉アンプル中の０．１ｍＭ溶液を沸騰水で６０分間加熱することは生物学的活性に影響を及ぼさないのに対し、ＣＴＩは著しく不活化される（実施例７）。これは、ＣＴＩとは異なり、ＴＩＣＡ１は臨床条件下で滅菌及び使用され得るクエン酸管に添加できることを意味する。１０ｍｌの血液を採取するように意図された真空管１本当たり、約０．１０ｍｇのＴＩＣＡ１が必要とされる。
【０１０４】
本発明者らは故に、血液凝固の接触活性化系の特異的阻害剤であり、それ故に、この系が、以前に特許取得されたトウモロコシトリプシン阻害剤と同じように、血液試料におけるトロンビン生成の機能分析を妨げるのを防ぐのに有利には使用することができ、熱安定性と、故に日常的な医療診断業務におけるこの使用を大幅に高める滅菌の可能性という追加の利点を有するポリペプチドのクラス、接触活性化の熱安定性阻害剤（ＴＩＣＡ，Thermostable Inhibitors of Contact Activation）を提供した。
【実施例１】
【０１０５】
さまざまなポリペプチドの存在下でのトロンビン生成
トロンビン生成は、（ＷＯ２００３／０９３８３１）により実施した。インフォームドコンセントを得た後、健康な成人ボランティアから、静脈血を０．１０６ｍｏｌ／ｌクエン酸三ナトリウムを含有する管に採取した（１：９、ｖ：ｖ）。室温で１５分間、２５００×ｇで二重の遠心分離後、乏血小板血漿（ＰＰＰ）を血漿上清の上半分の容積から採取し、急速冷凍し、−８０℃で保管した。ＰＰＰ中の血小板及び白血球の非存在は、ADVIA 120カウンター（Bayer Diagnostics社、ＮＹ、ＵＳＡ）によりチェックした。
【０１０６】
トロンビン生成検査のための試薬
組換えヒト組織因子Innovin（登録商標）は、Dade Behring社（マールブルグ、ドイツ）から入手し、ＰＲＰ中０．５ｐＭ及びＰＰＰ試料中１又は５ｐＭの最終濃度で使用した。４μＭの最終濃度で使用されるリン脂質ベシクルは、Avanti Polar Lipids社（アラバスター、アラバマ州、ＵＳＡ）から入手し、２０ｍｏｌ％ホスファチジルセリン（ＰＳ）、２０ｍｏｌ％ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）及び６０ｍｏｌ％ホスファチジルコリン（ＰＣ）からなり、押出し法により調製した（９、１０）。カオリンライト（Kaolin light）（含水ケイ酸アルミニウム）は、Baker Harrison ltd.社（イルフォード、ＵＫ）から入手した。ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水は、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Sigma Aldrich社、l'Ile d'Abeau Chesnes、フランス）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ及び５ｍｇ／ｍＬ  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Euromedex社、ゾウフェルヴァイヤースハイム、フランス）、ｐＨ７．３５を含有した。この緩衝液を使用まで−２０℃で保管した。蛍光発生基質及びＣａＣｌ２の新鮮な混合物は、各実験前に調製した。蛍光発生基質、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣは、Bachem社（ブーベンドルフ、スイス）から入手した。蛍光発生基質２．５ｍＭ及びＣａＣｌ２  ０．１Ｍの混合物を、Ｈｅｐｅｓ  ２０ｍＭ及び６０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、ｐＨ７．３５を含有する緩衝液を用いて調製した。６００ｎＭヒトトロンビンの活性を有する校正器は、Thrombinoscope BV社（マーストリヒト、オランダ）から入手した。透明の丸底Greinerマイクロタイタープレート（Greiner社  ref 65204、ポアティエ、フランス）を使用した。
【０１０７】
トロンビン生成の校正された自動測定（ＣＡＴ，Calibrated Automated Measurement of Thrombin Generation）
トロンビン生成は、（ＷＯ２００３／０９３８３１）の方法論による校正された自動トロンボグラフィー（ＣＡＴ，Calibrated Automated Thrombography）及び３９０／４６０ｎｍフィルターセットを備えた９６ウェルプレート蛍光光度計（Fluoroscan Ascent Reader、Thermolab systems OY社、ヘルシンキ、フィンランド）を用いて測定した。簡単に述べると、８０μＬの血漿を、丸底９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに分注する。組織因子及びリン脂質を含有する２０μＬの混合物をＰＰＰ試料に添加する。或いは、接触活性化を得るために、クエン酸血漿を、１ｍｇ／ｍｌのカオリンライトと少なくとも１０分間プレインキュベートする。開始試薬（１ウェル当たり２０μＬ）は、蛍光発生基質及びＣａＣｌ２を含有する。専用ソフトウェアプログラム、Thrombinoscope（登録商標）（Thrombinoscope bv社、マーストリヒト、オランダ）は、校正器（Thrombinoscope bv社、マーストリヒト、オランダ）に対するトロンビン活性の計算を可能にし、時間と共にトロンビン活性を示した。ＣＡＴから導かれ得る最も重要なパラメータは、遅延時間、ＣＡＴ曲線下の面積に対応する内因性トロンビン産生能、トロンビンのピーク高さ及びピークまでの時間である。
【実施例２】
【０１０８】
セイヨウカボチャ（Curbita Maxima）種子由来のセルピンＳＴＩの精製
ＳＴＩは、３つのステップ手順：
１：０．１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．０による粉砕種子の抽出、及び
２：トリプシンセファロースカラムでの親和性クロマトグラフィー
３：逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣ−Ｃ１８カラム、水（０．１％トリフルオロ酢酸）中、直線勾配０〜６０％アセトニトリル
でセイヨウカボチャ種子から精製する。
【０１０９】
これは、アミノ酸配列が判定された（表１を参照のこと）２つの活性ペプチド（ＴＩＣＡ１及びＴＩＣＡ２）の分離を可能にする。
【実施例３】
【０１１０】
セルピンによる因子XIIａの阻害
材料
Ｓ２３０２  Chromogenic社製、ロット＃N0398718 SEQ0860、有効期限２０１２年０７月。水を２０１０年１０月７日に添加→３．７ｍＭ。２０１０年８月３日に３１６ｎｍのＯＤを測定した（０．２３６＋０．２３５）／２×２００＝４７．１。計算濃度は故に４７．１／１２．９＝３．７ｍＭである。ＦXIIａによるＳ２３０２加水分解速度は、Ｋｍ＝１８０μＭ及びｋｃａｔ＝２５ｓ−１であった。
ｈ−ＦXIIａ「Enzyme Research Laboratories」社製。製品コードＦXIIａ 1212A、ロット＃ＦXIIａ2520PL。０．５ｍｇを含むボトルを３７０μｌ純水で再構成した。タンパク質濃度：１．３５ｍｇ／ｍｌ、すなわち約８μＭ。緩衝液４ｍＭ  ＮａＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ５．３）。調製物を２０μｌ量に分け、−８０℃で冷凍した。
Ｈｅｐｅｓ７３５  １４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．０２％  ＮａＮ３（ｐＨ７．３５）。
ＢＳＡ５  Ｈｅｐｅｓ７３５＋５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ。
ＣＴＩ  ２００４年１２月１７日に調製、０．１４１ｍｇ／ｍｌ、すなわち０．１４１／１２０２８＝１１．７＊１０−６Ｍ（１１．７μＭ）。一部を解凍し、３つの部分に分けた。部分１は−８０℃で冷凍し、部分２は室温で維持し、部分３は９５℃で３０分インキュベートし、次いで室温で維持した。
【０１１１】
ｈ−ＦXIIａによるＳ２３０２の加水分解に対するＣＴＩ、ＳＴＩ及びＴＩＣＡ１の効果
貯蔵ＦXIIａはＢＳＡ５で７００×希釈した。阻害剤は示されているようにＢＳＡ５で希釈した。ウェルは、７０μｌ希釈ＦXIIａ（最終５ｎＭ）、７０μｌ阻害剤及び２０μｌ  Ｓ２３０２（最終４７５又は４６２．５μＭ）を含有した。反応は、Ｓ２３０２と共に加熱板で５分加熱した後に始まった。フィルター４０５ｎｍ及び４９０ｎｍ（参照）。見出されたｍΔＡ／分に２．１４を乗じて１ｃｍ経路に対する数値を得た。
【０１１２】
残留活性（Ｖ）を方程式によりＰＴＩ濃度に対して適合させた：
Ｖ＝（Ｅ＋（ｓｑｒｔ（Ｅ＾２＋２＊Ｅ＊（Ｋｉ−Ｉ）＋Ｉ＾２＋２＊Ｉ＊Ｋｉ＋Ｋｉ＾２）−Ｅ−Ｉ−Ｋｉ）／２）＊ｋｃａｔ＊Ｓ／（Ｋｍ＋Ｓ）
（式中、Ｅ＝［ＦXIIａ］、Ｋｉは解離定数であり、Ｉ＝［阻害剤（Inhibitor）］、ｋｃａｔ及びＫｍはミカエリス定数であり、Ｓ＝［Ｓ２３０２］）。図３は、これらの適合並びにＰＴＩ及びＣＴＩに対して得られた定数を示している。表４は、このように見出された定数をまとめている。
【０１１３】
【表５】
2014531413.tif 000009
【実施例４】
【０１１４】
ＴＩＣＡ１の化学合成
一般的：１．ＴＩＣＡ１を固相ペプチド合成により合成し、レジン（固相）から切断し及び同時に脱保護し、ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥させた。２．精製ＴＩＣＡ１を溶解し、酸化的フォールディングをしてジスルフィド結合された３次元活性構造を得た。最終生成物をＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥させた。
【０１１５】
詳細には：
１．合成：ＴＩＣＡ１ポリペプチド鎖を、以前に記載された（１０）Ｂｏｃ−／Ｂｚｌ−ペプチド合成のためのインサイチュ中和／活性化手順を用いて、ただし、カップリング試薬として２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ，2-（1H-benzotriazole-1-yl）-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate）の代わりにＨＣＴＵを用いて、０．２ｍｍｏｌスケールで手動固相ペプチド合成により合成した。グリシルＰＡＭレジン（０．７６ｍｅｑ／ｇ）を固体担体として使用した。ＴＩＣＡ１ペプチドを脱保護し、及び４ｖ％  ｐ−クレゾールをスカベンジャーとして用いて、０℃で１時間、無水ＨＦにより処理してレジンから切断した。切断後、ＴＩＣＡ１ポリペプチド鎖を氷冷ジエチルエーテルで沈殿させ、６Ｍ  Ｇｎ．ＨＣｌ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４）を含有する水性緩衝液に溶解し、セミ分取ＨＰＬＣにより精製した。所望の生成物を含有する画分をＥＳＩ−ＭＳにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【０１１６】
２．酸化的タンパク質フォールディング：ＴＩＣＡ１（Ｈ−Ａｒｇ１−Ｇｌｙ２９−ＯＨ）（１８ｍｇ、５．４９μｍｏｌｅ）を、８ｍＭシステイン及び１ｍＭシスチンを含有する５０ｍＬの１Ｍ  Ｇｎ．ＨＣｌ、０．１０Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。得られた溶液を４℃で２時間撹拌した。反応進行は、分析的ＨＰＬＣによりモニターした（図４）。セミ分取ＨＰＬＣ後、画分を含有する生成物をＥＳＩ−ＭＳにより同定し、プールし、凍結乾燥して１０．０５ｍｇの酸化ＴＩＣＡ１（３．０８μｍｏｌｅ、５６％）を得た。ＥＳＩ−ＭＳは、計算されたモノアイソトピック質量（３２６６．５０）と平均質量（フォールディングされたＴＩＣＡ１の３２６８．９９）の間で十分に適合する、３２６７．６８＋／−０．７９の質量を示した。フォールディングされていないＴＩＣＡ１とフォールディングされたＴＩＣＡ１の間の観察された質量差６．４Ｄａは、３個のジスルフィド結合の形成による６個のプロトンの喪失に起因する、予期された質量減少に相当する（図４）。
【実施例５】
【０１１７】
阻害生成物の熱安定性
以下の表は、加熱前及び加熱後の、低分子量色素産生ペプチドＳ２３０２、すなわちＨ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐ．ニトロアニリンに対する、幾つかのこれらの生成物の阻害活性、並びにカオリンとのプレインキュベーションにより最適に接触活性化される血漿の凝固時間を、４倍延長させる濃度を示している。
【０１１８】
【表６】
2014531413.tif 000010
【実施例６】
【０１１９】
室温及び３０分、９５℃でのＣＴＩ、ＰＴＩ、及びＴＩＣＡの安定性
貯蔵ＦXIIａはＢＳＡ５で７００×希釈した。阻害剤は示されているようにＢＳＡ５で希釈した。ウェルは、７０μｌ希釈ＦXIIａ（最終５ｎＭ）、７０μｌ阻害剤及び２０μｌ  Ｓ２３０２（最終４７５又は４６２．５μＭ）を含有した。反応は、Ｓ２３０２と共に加熱板で５分加熱した後に始まった。フィルター４０５ｎｍ及び４９０ｎｍ（参照）。見出されたΔｍＡ／分に２．１４を乗じて１ｃｍ経路に対する数値を得た。
【０１２０】
残留活性（Ｖ）を方程式により阻害剤濃度に対して適合させた：
Ｖ＝（Ｅ＋（ｓｑｒｔ（Ｅ＾２＋２＊Ｅ＊（Ｋｉ−Ｉ）＋Ｉ＾２＋２＊Ｉ＊Ｋｉ＋Ｋｉ＾２）−Ｅ−Ｉ−Ｋｉ）／２）＊ｋｃａｔ＊Ｓ／（Ｋｍ＋Ｓ）
（式中、Ｅ＝［ＦXIIａ］、Ｋｉは解離定数であり、Ｉ＝［阻害剤］、ｋｃａｔ及びＫｍはミカエリス定数であり、Ｓ＝［Ｓ２３０２］）。
【０１２１】
【表７】
2014531413.tif 000011
【０１２２】
９５°Ｃへの６０分間のＣＴＩ及びＴＩＣＡ１の曝露
Ｉの濃度を計算するために、方程式Ｉ＝ｘ・（ｘ−Ｅ−Ｋｉ）／（ｘ−Ｅ）を使用した。この方程式においてＩは計算された阻害剤濃度であり、ｘ＝ＦXIIａ（遊離ＦXIIａ）の残留活性、Ｅは合計ＦXIIａ濃度（＝９．３３ｎＭ）であり、Ｋｉは解離又は阻害剤定数である。
【０１２３】
【表８】
2014531413.tif 000012
【実施例７】
【０１２４】
ジスルフィド結合の量（０−１−２−３）に関連したＴＩＣＡ１の安定性
３個のジスルフィド結合を有するＴＩＣＡ１の化学合成は、実施例４に記載されている。
ジスルフィド結合がより少ないＴＩＣＡ１を合成するには、合成及び酸化的タンパク質フォールディングが異なる。
【０１２５】
２個のジスルフィド結合を有するＴＩＣＡ１
詳細には：
１．合成：２個のジスルフィド結合を有するＴＩＣＡ１は、システイン残基を除いて実施例４の通りに手動固相ペプチド合成により合成した。ジスルフィド結合に関与する２個のシステイン残基を、アラニンにより置換した。ジスルフィド結合に関与する２個の他のシステイン残基は、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）基で保護されたシステインにより置換した。ジスルフィド結合に関与する第３システイン残基は、変更しなかった。ペプチドを脱保護し、実施例４に記載されているように切断した。ＨＦ切断後、２個のシステインは保護せず、他の２個はアセトアミドメチル（Ａｃｍ）基で保護されたままにした。ＴＩＣＡ１ポリペプチド鎖を氷冷ジエチルエーテルで沈殿させ、５０％アセトニトリル及び０．１％  ＴＦＡを含有する水性緩衝液に溶解し、ＨＰＬＣにより分析し、凍結乾燥した。
【０１２６】
２．酸化的タンパク質フォールディング：第１のジスルフィド結合を生成するために、ＴＩＣＡ１を１Ｍ  Ｇｎ．ＨＣｌ、０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）（０．５ｍｇ／ｍｌ）に溶解した。得られた溶液を４℃で４８時間撹拌した。次いで、第２のジスルフィド結合を形成するために、溶液を１０％  ＡｃＯＨに調整し、窒素でパージし、及びＡｃｍ基を２当量のヨウ素（メタノール中０．１２Ｍ）の添加により除去した。反応進行は、分析的ＨＰＬＣ及びＥＳＩ−ＭＳによりモニターし、フォールディングされたペプチドの計算されたモノアイソトピック質量と平均質量の間で十分に適合する質量を示した。セミ分取ＨＰＬＣ後、画分を含有する生成物をＥＳＩ−ＭＳにより同定し、プールし、凍結乾燥した。観察された質量差−１４４．２Ｄａは、２個のジスルフィド結合の形成による２個のプロトン及び２個のＡｃｍ基の喪失に起因する、予期された質量減少に相当する。
【０１２７】
１個のジスルフィド結合を有するＴＩＣＡ１
詳細には：
１．合成：２個のジスルフィド結合を有するＴＩＣＡ１は、システイン残基を除いて実施例４の通りに手動固相ペプチド合成により合成した。２個のジスルフィド結合に関与する４個のシステイン残基を、アラニンにより置換した。ペプチドを脱保護し、実施例４に記載されているように切断した。切断後、ＴＩＣＡ１ポリペプチド鎖を氷冷ジエチルエーテルで沈殿させ、６Ｍ  Ｇｎ．ＨＣｌ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４）を含有する水性緩衝液に溶解し、セミ分取ＨＰＬＣにより精製した。所望の生成物を含有する画分をＥＳＩ−ＭＳにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【０１２８】
２．酸化的タンパク質フォールディング：酸化的タンパク質フォールディング：ＴＩＣＡ１を１Ｍ  Ｇｎ．ＨＣｌ、０．１０Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。得られた溶液を４℃で２４時間撹拌した。反応進行は、分析的ＨＰＬＣによりモニターした（図４）。セミ分取ＨＰＬＣ後、画分を含有する生成物をＥＳＩ−ＭＳにより同定し、プールし、凍結乾燥した。ＥＳＩ−ＭＳは、フォールディングされていないＴＩＣＡ１とフォールディングされたＴＩＣＡ１の間の観察された質量差２Ｄａが、１個のジスルフィド結合の形成による２個のプロトンの喪失に起因する、予期された質量減少に相当することを示した（図４）。
【０１２９】
ジスルフィド結合がないＴＩＣＡ１
詳細には：
１．合成：ＴＩＣＡ１は、実施例４の通りに手動固相ペプチド合成により合成した。ペプチドを脱保護し、実施例４に記載されているように切断した。切断後、還元ＴＩＣＡ１ポリペプチド鎖を氷冷ジエチルエーテルで沈殿させ、６Ｍ  Ｇｎ．ＨＣｌ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４）を含有する水性緩衝液に溶解し、セミ分取ＨＰＬＣにより精製した。所望の生成物を含有する画分をＥＳＩ−ＭＳにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【０１３０】
２．システインのブロッキング（実施例７の「Ａｃ」）：還元ＴＩＣＡ１を５０ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ７．８（１ｍｇ／ｍｌ）に溶解した。４０ｍＭヨードアセトアミド（７．４ｍｇ／ｍｌ）を添加した。反応は暗所で１時間起こった。反応進行は、分析的ＨＰＬＣによりモニターした。セミ分取ＨＰＬＣ後、画分を含有する生成物をＥＳＩ−ＭＳにより同定し、プールし、凍結乾燥した。ＥＳＩ−ＭＳは、ブロックされていないシステインとブロックされたシステインの間の観察された質量差３４２Ｄａが、システインへの６個のアセトアミドの付加に起因する、予期された質量増加に相当することを示した。
【実施例８】
【０１３１】
インタクトなジスルフィドによるアラニンスキャン
ＴＩＣＡ１の活性に対するアミノ酸ごとの寄与を判定した。単一アミノ酸ごとに、システインを除いてアラニンにより置換した。ＴＩＣＡ１におけるシステインの影響は、実施例７で既に記載した。全てのＴＩＣＡ１アナログを、実施例４に記載されているように合成し、フォールディングした。図６も参照のこと。
【０１３２】
配列  アラニンスキャン  活性対ＴＩＣＡ１
2014531413.tif 000013
【実施例９】
【０１３３】
採血管へのＴＩＣＡ添加の効果及びＣＡＴアッセイ
１２名のドナーにおいて血液を、採血管（drawing tube）にＴＩＣＡ１を添加した及び添加しない、７つの異なる採血管により抜き取った（合計１４管；７８ｍｌ）。これらの管からＰＰＰを調製した後、MP試薬及びpplow試薬を用いてＣＡＴ測定を行った。ドナー１名を１つのプレートで測定した（pplow複製；MP複製；校正器（４倍））。合計容積は、合計８８ウェル／ドナーにおいて３２０μｌ試料/測定である。
【０１３４】
１２名のドナーにおいて血液を、以下の市販の採血管で採取する：
（全ての採血管から、ＴＩＣＡ有りの１本の管及びＴＩＣＡなしの１本の管が採血に使用される）
１本のｅｄｔａ管を用いて採血を開始する。
１Ａ：BDバキュテナー（ガラス）９ＮＣ；０．５ｍｌ  ０．１０５Ｍクエン酸、合計容積５ｍｌ。
１Ｃ：１本の真空管に添加する：１００μｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ  ＴＩＣＡ
合計管：２本→ＴＩＣＡ有りの１本の管及びＴＩＣＡなしの１本の管。
２Ａ：Sarstedt管；S−monovette、９ＮＣ；０．５ｍｌ  ０．１０６Ｍクエン酸、合計容積５ｍｌ。
２Ｃ：１本の真空管に添加する：１００μｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ  ＴＩＣＡ
合計管：２本→ＴＩＣＡ有りの１本の管及びＴＩＣＡなしの１本の管。
３Ａ：Terumo Venosafe  ４ｍｌ。９ＮＣ；０．４ｍｌ  ０．１０９Ｍクエン酸、合計容積４ｍｌ。
ppg内部コーティング/シリコンストッパーコーティング
３Ｃ：１本の真空管に添加する：８０μｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ  ＴＩＣＡ。
合計管：２本→ＴＩＣＡ有りの１本の管及びＴＩＣＡなしの１本の管。
４Ａ：BDバキュテナー（プラスチック）９ＮＣ；０．３ｍｌ  ０．１０９Ｍクエン酸、合計容積３ｍｌ。
４Ｃ：１本の真空管に添加する：６０μｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ  ＴＩＣＡ。
合計管: ２本→ＴＩＣＡ有りの１本の管及びＴＩＣＡなしの１本の管。
５Ａ：Haemtech SCAT 113−4.5/5 AA0809  ３．２％クエン酸（ＣＴＩなしの対照管）、合計容積５ｍｌ。
５Ｃ：１本の真空管に添加する：１００μｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ  ＴＩＣＡ。
合計管：２本→ＴＩＣＡ有りの１本の管及びＴＩＣＡなしの１本の管。
６Ａ：Greiner真空管９ｍｌ＋１ｍｌ（９ＮＣ、３．２％クエン酸）
６Ｃ：１本の真空管に添加する：２００μｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ  ＴＩＣＡ。
合計管：２本→ＴＩＣＡ有りの１本の管及びＴＩＣＡなしの１本の管。
ＴＩＣＡを添加したあらゆる管における採血後の最終ＴＩＣＡ濃度は、３０μｇ／全血ｍｌである。
ＰＰＰを調製後の血漿中最終ＴＩＣＡ濃度は、６０μｇ／ｍｌである（ヘマトクリット５０％と仮定して）。
【０１３５】
ＴＩＣＡ調製：
９ｍｇ  ＴＩＣＡを６ｍｌ滅菌注射用水に溶解する。この溶液は、採血管へのＴＩＣＡの注入に使用する。採血管にＴＩＣＡ溶液を注入した後、この管は８時間以内に使用しなければならない。
【０１３６】
ＣＡＴ
管に添加したＴＩＣＡなし及び管に添加したＴＩＣＡの測定：
MP試薬及びpplow試薬によるＣＡＴ測定が行われるであろう。ドナー１名を１つのプレートで測定する。PPLow複製；MP複製；校正器（４倍）。
合計容量は、合計８８ウェル／ドナーにおいて３２０μｌ試料/測定である。ＮＰ２０１２も４倍での測定に含める。
遅延時間、内因性トロンビン産生能、及びピーク高さを記録した。トロンビン生成の現状について、ピーク高さが結果を解釈するのに好ましいパラメータである。
【０１３７】
ＣＡＴアッセイに添加したＴＩＣＡの測定：
ＴＩＣＡを添加した血漿：血漿中濃度：６０μｇ／ｍｌ
貯蔵ＴＩＣＡ：１．５ｍｇ／ｍｌ→１５００μｇ／ｍｌ
２０μｌ  ＴＩＣＡ（貯蔵：１５００μｇ／ｍｌ）を４８０μｌ血漿に添加する。
【０１３８】
【表９】
2014531413.tif 000014
【０１３９】
（参考文献）
1. 米国特許第６，４０３，３８１号
2. 国際公開第２０１０／０１６７６２号パンフレット
3. 国際公開第２００３／０９３８３１号パンフレット
4. 国際公開第２００６／１１７２４６号パンフレット
5. “The blood coagulation cascade” by Schenone M, Furie BC and Furie B. Current Opinion in Haematology 2004, Vol 11(4) pages 272-277.
6. L.Poller in “Laboratory techniques in thrombosis” Edited by J.Jespersen, R.M.Bertina and F.Haverkate, ISBN 0-7923-5317-X (1999) p.37-44.
7. “Laboratory techniques in thrombosis” Edited by J.Jespersen, R.M.Bertina and F.Haverkate, ISBN 0-7923-5317-X (1999); 
8. “Haemostasis and thrombosis: Basic principles and clinical practice”Eds: Colman, Hirsh, Marder, Clowes, George Lippincott Williams and Wilkins. (2010).
【図１】
2014531413.tif 000015
【図２】
2014531413.tif 000016
【図３ａ】
2014531413.tif 000017
【図３ｂ】
2014531413.tif 000018
【図４ａ】
2014531413.tif 000019
【図４ｂ】
2014531413.tif 000020
【図４ｃ】
2014531413.tif 000021
【図５】
2014531413.tif 000022
【図６】
2014531413.tif 000023
【配列表】
2014531413000001.app
【国際調査報告】
2014531413.tif 000024
2014531413.tif 000025
2014531413.tif 000026
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