(57)【要約】本発明は、ヒト化された低親和性FcgR遺伝子座を含む非ヒト動物に関する。また本明細書において、抗体のインビボ有効性を決定するための該非ヒト動物の使用、および、抗体のインビボ有効性を決定するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト化された低親和性FcgR遺伝子座を含む、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２】
内因性の低親和性FcgR遺伝子が、ヒト低親和性FcgR遺伝子と完全に置換されている、請求項1記載の非ヒト動物。
【請求項３】
哺乳動物である、請求項1または2記載の非ヒト動物。
【請求項４】
げっ歯類である、請求項3記載の非ヒト動物。
【請求項５】
マウスである、請求項4記載の非ヒト動物。
【請求項６】
同じ遺伝子型または別の遺伝子型の動物を用いて繁殖させることにより得られた、請求項1〜5のいずれか一項記載の非ヒト動物の子孫。 
【請求項７】
請求項1〜5のいずれか一項記載の非ヒト動物に由来するかまたは請求項6記載の子孫に由来する、細胞株または初代細胞培養物。
【請求項８】
請求項1〜5のいずれか一項記載の非ヒト動物に由来するかまたは請求項6記載の子孫に由来する、組織もしくは器官の外植片またはそれらの培養物。
【請求項９】
抗体の有効性を決定するための、請求項1〜5のいずれか一項記載の非ヒト動物、請求項6記載の子孫、請求項7記載の細胞株もしくは初代細胞培養物、または請求項8記載の組織もしくは器官の外植片の使用。
【請求項１０】
請求項1〜5のいずれか一項記載の非ヒト動物にまたは請求項6記載の子孫に腫瘍細胞または腫瘍を接種する工程、および、該非ヒト動物にまたはその子孫に抗体を投与する工程を含む、該抗体の有効性を決定するための方法。
【請求項１１】
請求項1〜5のいずれか一項記載の非ヒト動物にまたは請求項6記載の子孫に治療用抗体を投与する工程、および、急性輸注反応が少しでも生じたかどうかを判定する工程を含む、治療用抗体の潜在的な安全性リスクを評価するための方法。 
【請求項１２】
本質的に本明細書に記載されている、非ヒト動物、使用、および方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、内因性の低親和性FcgR遺伝子がヒト低親和性FcgR遺伝子で置換されたトランスジェニック非ヒト動物、四つの機能的ヒト低親和性FcgR遺伝子を発現可能な非ヒト動物、および内因性の低親和性FcgR遺伝子を発現しない非ヒト動物が含まれる、ヒト化された低親和性Fc-γ受容体（FcgR）遺伝子座を含むトランスジェニック非ヒト動物である。
【背景技術】
【０００２】
治療用抗体（TherAb）は、腫瘍性疾患または自己免疫炎症性疾患等のヒト疾患の治療のために非常に効果的であることが証明されている。TherAbの治療的作用は、これらの抗体剤のエフェクター機能特性が極めて重要な課題となっているように、腫瘍細胞の細胞障害除去に基づいていることが多い。マウス起源のTherAbは、治療される患者の免疫反応を生じることが多い（抗薬物抗体（ADA）反応）。純粋なヒトTherAbは、ADA反応の問題を実質的に緩和することが期待されている一方で、ヒト治療に入る前におけるそれらの生物学的有効性の予測可能性がほとんど未解決のままである。新規TherAbの開発に伴う莫大なコストのために、その過程の早い段階でそれらの有効性を予測するためのツールが必要とされている。抗腫瘍抗体薬物のインビボにおける能力は、一般的に、異種移植アッセイ法において試験される。この場合、免疫不全マウスに、典型的にはScidまたはRAG変異体に標的ヒト腫瘍をまず接種し、成長させた後、TherAbを注射する。TherAbの有効性は、ヒト腫瘍を取り除く能力によって決定される。このシステムにおいて、接種される癌細胞の破壊は、導入された（ヒト）TherAbによる、天然の免疫系の（マウス）細胞に対するエフェクター機能の活性化に大きく依存する。 
【０００３】
異なる免疫細胞の表面上の補体（C）またはFc受容体（FcR）への抗原抗体複合体の結合は、抗体依存性細胞障害（ADCC）を引き起こし、これによって免疫系のエフェクター細胞は、標的（腫瘍）細胞を積極的に溶解する。補体依存性細胞障害（CDC）、つまりナチュラルキラー細胞（NK）または顆粒球によって誘導されるマクロファージ仲介型食作用または細胞溶解が、癌細胞の破壊に寄与する。
【０００４】
しかし、これらのメカニズムの効率は、異なる種によって、かつ同じ種の異なる個体によってさえも変化する。特に、マウスが二つの活性化低親和性FcR遺伝子（Fcgr3およびFcgr4）しか有さない一方で、ヒトは四つの活性化低親和性FcR遺伝子（FCGR2A、FCGR2C、FCGR3A、FCGR3B）を有している。さらに、主要な機能的ヒトFcRであるFcγRIIIa（FCGR3A遺伝子によりコードされる）は、NK細胞およびマクロファージで見いだされ、そのマウス相同体であるFcγR4は、顆粒球およびマクロファージで見いだされるがNK細胞では見いだされない。ヒト顆粒球は、マウスにおいて対応する部分がないFcRであるFCGR3Bを発現する。最後に、低親和性マウスFcg3は、マクロファージ、NK細胞、および顆粒球において発現され、そのヒト相同体であるFcgR2aはマクロファージおよび顆粒球でのみ見いだされ、ヒト変異体FcgR2cは、NK細胞のみで発現するが集合の約20％でしか発現しない。従って、マウスにおけるおよびヒトエフェクター細胞におけるFcgRの完全に異なる発現によって、マウス異種移植システムにおけるヒト治療用抗体の生物学的有効性の評価は的中率が低い。マウスおよびヒトのエフェクター細胞およびメカニズム間における本質的な違いのため、異種移植アッセイ法で得られたデータは、ヒトよりもマウスにおけるTherAbの有効性の方が予測され易い。
【０００５】
今日まで、ヒトエフェクター細胞およびメカニズムにより近似した様々なインビボモデルが開発されてきた。例えば、個々のヒトFcgR遺伝子を発現するトランスジェニックマウスが作製されてきた。しかし、このマウスモデルは、細胞分布および発現レベルの両方の点において、ヒトのものと部分的にしか類似しない。低親和性FcgR遺伝子の高度に保存された遺伝子座（ヒトとマウスの両方において染色体1に位置する）が遺伝子内領域において個別のFcgR遺伝子の正確な発現のために必要な調節エレメントを含み、該遺伝子座を局所的な遺伝学的状況から引き離すことができないようである。
【０００６】
従って、別のアプローチでは、最長で200 kbのゲノムヒトDNAを持っているトランスジェニック細菌人工染色体（BAC）を使用して、トランスジェニックマウスにおいてヒト発現パターンを再現した。しかし、BACトランスジェニックマウスにおいては、ヒトFcgRおよび内因性マウスFcgRが発現され、FcgRの全レベルを異常に高めた。さらに、得られた細胞分布はマウスおよびヒトの発現パターンを合わせたものである。
【０００７】
従って、非ヒト動物においてヒトFcgR遺伝子の発現を再現して、異種移植アッセイ法の予測可能性を向上させるインビボモデルがいまだに必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ヒト化された低親和性FcgR遺伝子座を有する新規トランスジェニック非ヒト動物に関する。非ヒト動物は、任意の非ヒト動物であり得る。非ヒト動物は哺乳動物であることが好ましく、ラットまたはマウス等のげっ歯類であることがより好ましく、非ヒト動物はマウスであることが最も好ましい。好ましい態様では、該非ヒト動物はマウスである。
【０００９】
本明細書において、ヒト低親和性FcgR遺伝子による内因性の低親和性FcgR遺伝子の置換を含み、四つの機能的ヒト低親和性FcgR遺伝子を発現できる非ヒト動物を含み、かつ、内因性の低親和性FcgR遺伝子を発現しない非ヒト動物を含む、トランスジェニック非ヒト動物を提供する。一態様では、この四つのヒト機能的低親和性FcgR遺伝子はFCGR2A、FCGR3A、FCGR2C、およびFCGR3Bである。
【００１０】
この新規トランスジェニック非ヒト動物では、低親和性FcgR遺伝子全体がヒトの対応部分で置換されている。例えば、一態様では、非ヒト動物はマウスであり、二つのマウス低親和性受容体遺伝子（Fcgr4、Fcgr3）を含む遺伝子座が四つのヒト遺伝子（FCGR2A、FCGR3A、FCGR2C、FCGR3B）で置換されている。つまり、マウス遺伝子の代わりにヒト低親和性FcgRのセットを、ヒト発現によく似たレベルおよび細胞特異性で発現できるマウス系統が樹立されている。このようなFcgRヒト化マウス系統は、マウスFcgRの蓄積発現および細胞分布の混合を回避する一方で、ヒトFcgR発現レベルおよび細胞特異性の正確な再現が組み合わせられるため、治療用ヒト抗体の有効性予測のための理想的なツールになる。
【００１１】
一態様では、非ヒト動物は、ヘテロ接合とホモ接合の標的化マウスの両方において、マクロファージ上および顆粒球上でヒトFCGR2Aを、NK細胞上およびマクロファージ上でヒトFCGR3Aを、顆粒球上でヒトFCGR3Bを発現する。別の態様では、該非ヒト動物は、内因性マウス低親和性Fcgr4およびFcgr3遺伝子を発現しない。
【００１２】
本発明による非ヒト動物は、内因性遺伝子の代わりにヒト低親和性FcgRのセットをヒト発現に類似した細胞特性パターンで発現するため、抗体ADCC有効性を決定するためのインビボモデルとして有用である。それゆえに、本発明の第二の目的においては、非ヒト試験動物をインビボモデルとして使用して、抗体有効性を決定する。
【００１３】
一態様では、本発明による、ヒト化された低親和性FcgR遺伝子座を有する非ヒト動物に、判定される抗体を投与する工程を含む抗体の有効性を決定するための方法を提供する。一態様では、該方法は、（a）ヒト化された低親和性FcgR遺伝子座を有する非ヒト動物を供給する工程、（b）標的腫瘍を該非ヒト動物に接種して成長させる工程、（c）判定される抗体を投与する工程を含む。抗体の有効性は、腫瘍を除外する能力、または腫瘍の成長を遅らせる能力によって決定される。この腫瘍はヒト腫瘍であることが好ましい。一つの好ましい態様において、該抗体は、腫瘍細胞表面抗原を標的化するヒト抗体またはヒト化抗体である。
【００１４】
「置換」という用語は、非ヒト動物のゲノム内の配列をヒト配列と置換されるように、非ヒト動物の細胞のゲノムにDNA配列を配置することを含む。
【００１５】
「FcgR」という用語は、Fcのための、例えば、IgG免疫グロブリンのFc部分のための受容体を含む。FcgR遺伝子は、細胞の表面上で発現され、リガンド結合ドメインとして機能するα鎖を含み、FcRγ鎖のホモ二量体、または、FcRγ鎖およびα鎖のヘテロ二量体のいずれかと会合する。いくつかの異なるFcgR遺伝子が存在し、これらは免疫複合体中のIgGへの優先的な結合に応じて低親和性タイプおよび高親和性タイプに分類できる。ヒトの低親和性FcgR遺伝子はFCGR2A、FCGR3A、FCGR2C、FCGR3B、およびFCGR2Bを含み、これらの遺伝子のほとんどにおいて、自己免疫疾患を有するヒト対象における自然発生的な遺伝的差異、すなわち多型が説明されている。
【００１６】
本明細書で使用する「ヒト化された低親和性FcgR遺伝子座」という用語は、ヒトFCGR2A、FCGR3A、FCGR2C、およびFCGR3B遺伝子をコードする配列と、ならびに隣接する非コード領域と置換された低親和性内因性FcgR遺伝子をコードする非ヒト動物のゲノムの部分に関する。
【００１７】
本明細書で使用する「内因性の低親和性FcgR遺伝子」という用語は、非ヒト動物のゲノムにおいて自然発生する低親和性FcgR遺伝子に関する。例えば、マウスの内因性の低親和性FcgR遺伝子はFcgR3およびFcgR4である。
【００１８】
本明細書で使用する「野生型」という用語は、内因性の低親和性FcgR遺伝子を有し、かつ、ヒト化された低親和性FcgR遺伝子座を有さない、非ヒト動物を指す。
【００１９】
本明細書で使用する「抗体の有効性」という用語は、細胞中の抗体依存性細胞障害（ADCC）の程度に関する。ADCCは、免疫系のエフェクター細胞による標的細胞の溶解を媒介する。従って、抗体の有効性は、標的細胞を除外する能力によって、または標的細胞の成長を遅らせる能力によって決定できる。この標的細胞は腫瘍細胞であることが好ましい。
【００２０】
判定される抗体は、腫瘍細胞のエピトープを標的化する抗体を含むがこれに限定されない。
【００２１】
判定される抗体を投与する方法は、経口投与および非経口投与（例えば、静脈内投与、腹腔内投与、および鼻腔内投与）を含むがこれらに限定されない。判定される抗体は、薬学的に許容できる従来の賦形剤（担体および希釈剤等）または添加物と組み合わせて投与され得る。治療用抗体の投与は、皮膚発疹、嘔吐、アナフィラキシー様反応、およびサイトカイン放出症候群等の急性輸注反応を伴うことが多い。これらの有害反応のほとんどにおいて、マクロファージ、NK細胞、および好中球等のエフェクター細胞に対する、注入される抗体とFcgRとの相互作用が関与している。従って、本明細書で提供される非ヒト動物は、ヒトに最初に抗体を注入することで誘発される急性有害反応を評価するためのインビボモデルとして有用である。
【００２２】
本発明はまた、同じ伝子型または別の遺伝子型を用いて繁殖させることにより得られた、本発明によって提供されるヒト化された低親和性FcgR遺伝子座を有する非ヒト動物の子孫にも関する。子孫は、同じ遺伝子型を用いて繁殖することにより得ることが好ましい。本発明のさらなる目的は、該子孫を、抗体の有効性を決定するためのインビボモデルとして使用することである。本発明のさらなる目的は、このマウスを、治療用抗体の最初の注入によって生じ、異なるエフェクター細胞上のFcgRに媒介される急性輸注反応を評価するためのインビボモデルとして使用することである。一態様では、本発明の非ヒト動物またはその子孫に治療用抗体を投与する工程、および、急性輸注反応が生じたかどうかを判定する工程を含む、治療用抗体の潜在的な安全性リスクを評価するための方法を提供する。急性輸注反応は、アナフィラキシー様反応、またはサイトカイン放出症候群を評価することにより測定され得る。
【００２３】
さらに、本発明は、上述のヒト化された低親和性FcgR遺伝子座を有する非ヒト動物に由来するまたはその子孫に由来する細胞株または初代細胞培養物に関する。
【００２４】
加えて、本発明はまた、上述のヒト化された低親和性FcgR遺伝子座を有する非ヒト動物に由来するもしくはその子孫に由来する組織もしくは器官の外植片、またはそれらの培養物を提供する。
【００２５】
本発明はまた、上述のヒト化された低親和性FcgR遺伝子座を有する非ヒト動物に由来するまたはその子孫に由来する組織または細胞抽出物も提供する。
【００２６】
本発明の別の態様では、上述の細胞株または初代細胞培養物、組織もしくは器官の外植片またはそれらの培養物、ヒト化された低親和性FcgR遺伝子座を有する非ヒト動物に由来するまたはその子孫に由来する組織または細胞抽出物を、抗体の有効性を決定するためのインビボモデルとして使用する。
【００２７】
本明細書に記載する「非ヒト動物」とはヒトではないあらゆる動物を指す。非ヒト動物は、哺乳動物であることが好ましく、ラットまたはマウス等のげっ歯類であることがより好ましく、非ヒト動物はマウスであることが最も好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】BAC標的化構築物に配置された四つのヒト低親和性FcgR遺伝子であるFCGR2A、FCGR3A、FCGR2C、およびFCGR3B（中央行）による二つのマウス低親和性FcgR遺伝子であるFcgr4およびFcgr3（上行）の置換をもたらす、RMGRプロセスの模式図。Cre媒介組換えにより生じる突然変異した「ヒト化された」対立遺伝子を下行に示す。
【図２】（A）表示したLoxPおよびLox511エレメント（色付き三角）におけるCre支援型組換えを介した、ヒト低親和性FcR遺伝子の全セットを含む160 kbのヒトDNAによる54 kb長の領域の置換による、マウス低親和性Fcgr遺伝子座の模式図。検出PCRアッセイ法において使用するオリゴヌクレオチドの位置を、それらの対応する配向を指す短い矢印によって示す。（B）1％アガロースゲル上での分離による、表示のPCRアッセイ法において個々のマウス生検から増幅されたDNA断片（5'末端：約5 kb；3'末端：1.2 kb）を示す。Tmは変異型マウスを示し、wtは野生型マウス；MはマーカーDNAを示す。
【図３】（A）略称を用いているが図2と同様の、個々のヒトFCGR遺伝子のPCR増幅に使用するプライマーの位置を示すためにFCGRヒト化遺伝子座を模式的に示す。FCGR2A、FCGR3A、FCGR2C、およびFCGR3Bをコードする遺伝子を、プライマー対1＋2、3＋4、5＋6および7＋8でそれぞれ増幅した。SalI制限切断の位置を垂直の矢印で示す。（B）アガロースゲルは、置換突然変異についてヘテロ接合であるマウスから採取した生検DNAから増幅したDNA断片を示す。特異的なプライマーを使用して、ヒト遺伝子FCGR2A（2A：12.9 kb）、FCGR3A（3A：9.6 kb）、FCGR2C（2C：18.5 kb）、およびFCGR3B（3B：9.6 kb）を増幅した。XおよびIVは、使用したDNA分子量マーカー（kb）を示す（Roche Diagnostics）。（C）3Aおよび3BのPCRに特異的なプライマーで増幅された二つの9.6 PCR断片の特異性を、SalI消化により試験した。3A断片はSalIで8 kbおよび1.65 kbの断片に切断される一方、FCGR3B遺伝子（3B）から増幅させた9.6 kbのPCR断片はSalI消化に耐性であるため、増幅された断片が二つの異なる遺伝子に対応することが実証された。
【図４Ａ】遺伝子標的化ヒトであるヒトFCGR2A/3A/2C/3Bのヘテロ接合マウスの末梢血細胞、および野生型マウスの末梢血細胞におけるヒトFCGR3A（CD16）の発現を、表示の抗体で染色した後に、FACS Canto装置を用いたFACS解析によりモニタリングした。発現は、F4/80＋単球、NK1.1＋ナチュラルキラー細胞（両方ともリンパ系ゲート内）、および骨髄系ゲート内で検出されたGr-1＋顆粒球においてはっきりと検出された。
【図４Ｂ】図4Aと同様の、遺伝子標的化「ヒトFCGR2A/3A/2C/3B」ヘテロ接合マウスおよび野生型マウスの末梢血細胞におけるヒトFCGR2A（CD32）の発現：発現は、ヒトCD32について予想されたように、F4/80＋単球およびGr-1＋顆粒球においてはっきりと見られたが、 NK1.1＋ナチュラルキラー細胞においてはなかった。
【図５Ａ】遺伝子標的化ヒトであるヒトFCGR2A/3A/2C/3Bのホモ接合マウスの末梢血細胞、および野生型マウスの末梢血細胞におけるヒトFCGR3A（CD16）の発現を、表示の抗体で染色した後に、FACS Canto装置を用いたFACS解析によりモニタリングした。発現は、F4/80＋単球、NK1.1＋ナチュラルキラー細胞（両方ともリンパ系ゲート内）、および骨髄系ゲート内で検出されたGr-1＋顆粒球においてはっきりと検出された。
【図５Ｂ】図5Ａと同様の、遺伝子標的化「ヒトFCGR2A/3A/2C/3B」ホモ接合マウスおよび野生型マウスの末梢血細胞におけるヒトFCGR2A（CD32）の発現：発現は、ヒトCD32について予想されたように、F4/80＋単球およびGr-1＋顆粒球においてはっきりと見られたが、 NK1.1＋ナチュラルキラー細胞においてはなかった。
【図６】（A）遺伝子標的化ヒトであるヒトFCGR2A/3A/2C/3Bのホモ接合マウスの末梢血中の表示した細胞集合における、表面ヒトFcγRIIIまたはFcγRIIを持っている細胞の量を示す。ヒストグラムは、野生型マウス（グレー線）と比較した場合の、ホモ接合遺伝子標的化マウス（黒線）における、F4/80＋単球、NK1.1＋ナチュラルキラー細胞（両方ともリンパ系ゲート内）、およびGr-1＋顆粒球（骨髄系ゲート内）において検出されたヒトFcγRについて陽性な細胞の量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
【表１】
2014532399.tif 000002
【００３０】
表は、ヒトFCGR2A/3A/2C/3Bのヘテロ接合（Het）またはホモ接合（Hom）マウスのF4/80＋単球、NK1.1＋ナチュラルキラー細胞、またはGr-1＋顆粒球の選択された集合内における、表面ヒトFcγRIII（CD16）またはFcγRII（CD32）を発現する末梢血細胞のパーセンテージをまとめたものである。
【実施例】
【００３１】
二つのマウス低親和性受容体遺伝子（Fcgr4、Fcgr3）を含む遺伝子座全体を、リコンビナーゼ媒介遺伝子置換（RMGR）により、四つのヒト遺伝子（FCGR2A、FCGR3A、FCGR2C、FCGR3B）と置換した。この技術を用いて、Fcgr4、Fcgr3、および隣接する非コードDNA領域を含む54 kbのマウスゲノムを、まず、マウスES細胞における連続相同遺伝子ターゲティングにより二つの不適合性のLoxエレメント（LoxPおよびLox511）で挟む。同時に、同じくLoxPおよびLox511で挟まれた、遺伝子FCGR2A、FCGR3A、FCGR2C、FCGR3B、および隣接する非コード領域を含む160 kbのヒトゲノムDNAを含むBAC構築物を調製する。後者のDNA構築物を用いて、マウス領域をヒトDNAでCre-リコンビナーゼ媒介交換によって、マウスゲノムの本来の位置において、四つのヒト低親和性FcgR遺伝子をそれらの二つのマウス対応部分の代わりに有している変異型ES細胞が生成される（図1〜3を参照）。レシピエントマウス胚盤胞に変異型ES細胞をマイクロインジェクションすることにより、キメラマウスが作製される。突然変異を次世代に伝達することにより、ヒト低親和性FcgRを二つのマウス対応部分の代わりに活性化するセットを、ヒト細胞のものを模倣する細胞特異性パターンで発現可能なマウス系統が樹立されている（図4〜6および表1）. このようなFcgR「ヒト化」マウス系統は、マウスFcgRの蓄積発現および細胞分布の混合を回避する一方で、ヒトFcgR発現レベルおよび細胞特異性の正確な再現が組み合わせられるため、ヒト治療用抗体の有効性予測のための理想的なツールになる。
【００３２】
本発明は、典型的なヒト細胞特異性に従ってヒトFcgR遺伝子を発現している、RMGRを介したFcgRヒト化マウスの作製を記載する。以下ヒトFCGR2A/3A/2C/3Bと称するこれらのマウスは、治療用抗体のインビボADCC潜在能力の予測を示すのに適しており、従って、一連の治療候補の中から早期の機能的選択を行うのに適している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2014532399.tif 000012
2014532399.tif 000013
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