(57)【要約】本開示は、心欠陥のリスクおよび／または発症を特定し、および／または治療する方法を定義する。本明細書に示されるように、ミクロビオームは心欠陥の危険因子に再現可能および検出可能な程度に関連し、ミクロビオームに対する変化により、心欠陥のリスクが直接的に変化し得る。本開示は、微生物の特性を使用して、心欠陥のリスクまたは発症の変化に関連するミクロビオームの要素を特徴づけ、心欠陥のリスクまたは重症度を減少させるための治療を決定できることを示す。
2014525266.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心欠陥の発症および／またはリスクを特定しおよび／または特徴づける方法であって、
心欠陥の範囲または程度に相関する参照の微生物の特性を提供すること、および
心欠陥の発症および／またはリスクが特定される、または特徴づけられるべき個体からの微生物叢の試料に存在する微生物の特性を決定すること
を含む方法。
【請求項２】
心欠陥の発症および／またはリスクが特定される、または特徴づけられるべき個体からの微生物叢の試料に存在する微生物の特性を参照の微生物の特性と比較することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
微生物叢の試料が個体の特定の臓器または組織に認められる１種類以上の微生物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
微生物叢の試料が個体の特定の臓器または組織に認められる実質的に全種類の微生物のセットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
個体の特定の臓器または組織が個体の消化管である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
微生物叢の試料が糞便の試料である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
個体がヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項８】
個体が動物である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
微生物の特性が微生物叢の試料に存在する１種類以上の微生物または要素または産生物のレベルまたはレベルのセットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
微生物の特性が、微生物叢の試料に存在する実質的に全種類の微生物または要素または産生物のセットのレベルのセットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
微生物の特性が、微生物叢の試料に存在する１つ以上の１６Ｓ  ＲＮＡ遺伝子配列のレベルのまたはレベルのセットを含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
微生物の特性が、微生物叢の試料に存在する１つ以上の微生物代謝産物のレベルまたはレベルのセットを含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１３】
心臓の処置を受ける予定がある、または受けたことのある患者をモニターする方法であって、
心欠陥の範囲または程度に相関する参照の微生物の特性を提供し、および
心欠陥の発症および／またはリスクが特定される、または特徴づけられるべき患者からの微生物叢の試料に存在する微生物の特性を決定することを含む方法。
【請求項１４】
心欠陥の発症および／またはリスクが特定される、または特徴づけられるべき個体からの微生物叢の試料に存在する微生物の特性を、参照の微生物の特性と比較することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
微生物叢の試料が個体の特定の臓器または組織に認められる１種類以上の微生物を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
微生物叢の試料が個体の特定の臓器または組織に認められる実質的に全種類の微生物のセットを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
個体の特定の臓器または組織が個体の消化管である、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
微生物叢の試料が糞便の試料である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
個体がヒトである請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
個体が動物である請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
微生物の特性が、微生物叢の試料に存在する１種類以上の微生物または要素または産生物のレベルまたはレベルのセットを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
微生物の特性が、微生物叢の試料に存在する実質的に全種類の微生物または要素または産生物のセットのレベルのセットを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
微生物の特性が、微生物叢の試料に存在する１つ以上の１６Ｓ  ＲＮＡ遺伝子配列のレベルまたはレベルのセットを含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
微生物の特性が、微生物叢の試料に存在する１つ以上の微生物代謝産物のレベルまたはレベルのセットを含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２５】
心欠陥の発症および／またはリスクに相関する微生物の特性を特定する、および／または特徴づける方法であって、
微生物叢の試料の第１の収集物中の１種類以上の微生物または要素または産生物のレベルの第１のセットを決定することであって、ここで、微生物叢の試料の第１の収集物の各試料は、心欠陥の発症および／またはリスクの共通の特徴を共有する、決定することと、
微生物叢の試料の第２の収集物中の１種類以上の微生物または要素または産生物のレベルの第２のセットを決定することであって、微生物叢の試料の第２の収集物は、心欠陥の発症および／またはリスクの共通の特徴を共有しないが、それ以外では微生物叢の試料の第１のセットと同等である、決定することと、
心欠陥の発症および／またはリスクの共通の特徴の存在または非存在に相関する第１または第２のセットにおけるレベルを含んでいる微生物の特性を特定すること
を含む方法。
【請求項２６】
微生物叢の試料は、微生物叢の試料が収集される決定の臓器または組織に認められる１種類以上の微生物の試料を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
微生物叢の試料が収集される特定の臓器または組織に認められる実質的に全種類の微生物の試料を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
特定の臓器または組織が消化管である請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
微生物叢の試料が糞便の試料である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
１種類以上の微生物または要素または産生物のレベルまたはレベルのセットが、微生物叢の試料に存在する１つ以上の１６Ｓ  ＲＮＡ遺伝子配列のレベルまたはレベルのセットを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
１種類以上の微生物または要素または産生物のレベルまたはレベルのセットが、微生物叢の試料に存在する１つ以上の微生物代謝産物のレベルまたはレベルのセットを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
微生物叢の試料は宿主生物から得られ、心欠陥の発症および／またはリスクの共通の特徴は宿主生物における冠動脈性心疾患の発症を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
微生物叢の試料は宿主生物から得られ、心欠陥の発症および／またはリスクの共通の特徴は宿主生物における心筋梗塞の前病歴を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
微生物叢の試料は宿主生物から得られ、心欠陥の発症および／またはリスクの共通の特徴は、宿主生物における虚血／再灌流傷害への感受性の増加を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
心欠陥の発症および／またはリスクの共通の特徴は、心欠陥に相関することが知られているミクロビオームを変化させる作用因子に曝露することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
ミクロビオームを変化させる作用因子は１つ以上の抗生物質を含む請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
抗生物質は非吸収性の抗生物質を含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
非吸収性の抗生物質はバンコマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン、バシトラシン、および／またはポリミキシンＢまたはその組み合わせを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
ミクロビオームを変化させる作用因子は微生物を含む請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
微生物はラクトバチルス・プランタルムおよび／またはビフィドバクテリウム・ラクティスを含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
個体のミクロビオームを変化させることによって、個体の心欠陥を治療し、またはそのリスクを軽減する方法であって、
心欠陥の重症度またはリスクが変化することに相関するように、個体のミクロビオームを変化させるように、心欠陥を罹患しているまたは感受性のある個体に、ミクロビオームを変化させる作用因子を投与するステップを含む方法。
【請求項４２】
ミクロビオームを変化させる作用因子は１つ以上の抗生物質を含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
抗生物質は非吸収性の抗生物質を含む請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
非吸収性の抗生物質はバンコマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン、バシトラシン、および／またはポリミキシンＢ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ミクロビオームを変化させる作用因子は１種類以上の微生物を含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
微生物はラクトバチルス・プランタルムおよび／またはビフィドバクテリウム・ラクティスを含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
心欠陥の重症度またはリスクの変化は、レプチンのレベルの減少を含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
心欠陥の重症度またはリスクの変化は、１つ以上の微生物代謝産物のレベルの変化を含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
１つ以上の微生物代謝産物のレベルの変化は、キヌレニン、インドール酢酸、インドールプロピオン酸、３−インドキシル硫酸、フェニル乳酸、フェニルアセチルグリシン、フェニル酢酸塩、３−フェニルプロピオン酸、桂皮酸エステル、ｐ−クレゾール硫酸塩、フェノール硫酸塩、３−（４−ヒドロキシフェニル）乳酸塩、および／または４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、またはその組み合わせの減少を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
個体に投与されたときに、心欠陥の重症度またはリスクが変化することに相関するように、個体のミクロビオームを変化させるミクロビオームを変化させる作用因子を含む組成物。
【請求項５１】
薬剤的に許容可能な担体をさらに含む請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
食品製品、機能性食品または栄養補助食品中に、または、食品製品として提供される請求項５０に記載の組成物。
【請求項５３】
心欠陥の重症度またはリスクの減少を達成することに相関する投与計画に沿った投与のための単位用量が単位剤形で含まれる、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５４】
ミクロビオームを変化させる作用因子は微生物細胞である、または、それを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５５】
食品製品、機能性食品または栄養補助食品中に、または、食品製品として提供される請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
ミクロビオームを変化させる作用因子は少なくとも１，０００個の微生物細胞である、または、それを含む、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５７】
ミクロビオームを変化させる作用因子は抗生物質である、または、それを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５８】
ミクロビオームを変化させる作用因子は抗生物質をさらに含む請求項５４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の援助
米国政府は本発明の開発に利用する補助金援助をしている。具体的には、米国国立衛生研究所番号ＡＩ０８０３６３およびＨＬ５４０７５が、本発明の開発を援助している。米国政府はこの発明に一定の権利を有し得る。
【０００２】
関連出願
本出願は、２０１１年８月２６に提出された米国特許仮出願第６１／５２７，７３８号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
【背景技術】
【０００３】
冠動脈心疾患は米国および世界中で大きな健康問題であり、心筋梗塞（ＭＩ）としても知られる心臓発作に寄与する主要な疾患であり、世界中で主な死因になっている。冠動脈心疾患が検出される時点では、根底の原因が極めて進行していることが多い。冠動脈心疾患の重症度を医療および生活様式の修正を用いることによって管理できることは、共通して理解されている。さらに、心血管疾患、障害および病態は、一般的に医療産業において最も重大な課題のいくつかを表している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ミクロビオーム組成および／または活性の再現可能および検出可能な変化が、心欠陥の発症および／またはリスクに関連するという認識を含む。本発明は、このような変化を反映している微生物の特性の確認および／または特徴づけを可能にし、この微生物の特性を使用することについて、例えば、心欠陥の発症および／またはリスクを評価するための系も提供する。
【０００５】
いくつかの実施形態では、微生物の特性は、１つ以上の微生物またはその産生物のレベルまたは複数のレベルを含み、心欠陥の発症および／またはリスクを有する個体の特徴づけられるべきミクロビオームを、心欠陥の発症および／またはリスク、または既知の心欠陥の発症および／またはリスクのない個体のミクロビオームと比較して、区別しまたは特徴づけるのに十分である。例えば、いくつかの実施形態では、心欠陥のリスクが増加している個体の消化管のミクロビオームから得られる微生物の特性は、心欠陥のリスクが増加していない個体の消化管のミクロビオームの微生物の特性と比較して、リスクが増加しているとして個体を診断するのに十分である。
【０００６】
本発明に従い、適切な参照の微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）の試料に関連して、特定の微生物叢の試料について、微生物の特性を定義する。いくつかの実施形態では、特定の微生物叢の試料は、参照の微生物叢の試料によっては共有されない心欠陥の発症および／リスクの共通の特徴を共有する。いくつかの実施形態では、特定の微生物叢の試料は、供給源が異なる試料である点で、参照の微生物叢の試料と異なる。いくつかの実施形態では、特定の微生物叢の試料は、微生物叢の参照試料が、同じまたは異なる供給源の歴史的な微生物叢の試料である点で、参照の微生物叢の試料と異なる。
【０００７】
ある特定の実施形態では、本開示は心欠陥の発症および／またはリスクを確認しおよび／または特徴づける方法を提供し、心欠陥の範囲および／程度に相関する参照の微生物の特性を提供し、心欠陥の発症および／またはリスクが特定される、または特徴づけられるべき個体からの微生物叢の試料に存在する微生物の特性を決定することを含む。いくつかの実施形態では、微生物叢の試料は、対象の消化管に認められる１種類以上の微生物の試料を含む。いくつかの実施形態では、微生物の特性は、１種類以上の微生物の１つ以上の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列のレベルまたはレベルのセットを含む。いくつかの実施形態では、微生物の特性は、１種類以上の微生物の１つ以上の代謝産物のレベルまたはレベルのセットを含む。
【０００８】
ある特定の実施形態では、本開示は、心臓の処置を受ける予定がある、または受けた患者をモニターする方法を提供し、その方法は、心欠陥の範囲および／程度に相関する参照の微生物の特性を提供し、心欠陥の発症および／またはリスクが特定される、または特徴づけられるべき患者からの微生物叢の試料に存在する微生物の特性を決定することを含む。いくつかの実施形態では、微生物叢の試料は、対象の消化管に認められる１種類以上の微生物の試料を含む。いくつかの実施形態では、微生物の特性は、１種類以上の微生物の１つ以上の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列のレベルまたはレベルのセットを含む。いくつかの実施形態では、微生物の特性は、１種類以上の微生物の１つ以上の代謝産物のレベルまたはレベルのセットを含む。
【０００９】
ある特定の実施形態では、本開示は心欠陥の発症および／またはリスクに相関する微生物の特性を特定しおよび／または特徴づける方法を提供し、その方法は、微生物叢の試料の第１の収集物の１種類以上の微生物または要素または産生物のレベルの第１のセットを決定し、微生物叢の試料の第１の収集物の各試料は、心欠陥の発症および／またはリスクの共通の特徴を共有し、微生物叢の試料の第２の収集物の１種類以上の微生物または要素または産生物のレベルの第２のセットを決定し、微生物叢の試料の第２の収集物の各試料は、心欠陥の発症および／またはリスクの共通の特徴を共有しないが、それ以外は微生物叢の試料の第１のセットと同等であり、心欠陥の発症および／またはリスクの共通の特徴の存在または非存在に相関する第１または第２のセット内のレベルを含む微生物の特性を特定することを含む。いくつかの実施形態では、微生物叢の試料は宿主生物から得られ、心欠陥の発症および／またはリスクの共通の特徴は、宿主生物の冠動脈性心疾患の発症を含む。いくつかの実施形態では、微生物叢の試料は宿主生物から得られ、心欠陥の発症および／またはリスクの共通の特徴は、宿主生物の心筋梗塞の前病歴を含む。いくつかの実施形態では、心欠陥の発症および／またはリスクの共通の特徴は、心欠陥に相関することが知られているミクロビオームを変化させる作用因子への曝露を含む。いくつかの実施形態では、１種類以上の微生物または構成要素またはその産生物のレベルまたはレベルのセットは、微生物叢の試料に存在する１つ以上の微生物代謝産物のレベルまたはレベルのセットを含む。
【００１０】
ある特定の実施形態では、本開示は、個体のミクロビオームを変化させることによって、個体の心欠陥を治療またはそのリスクを低減させる方法を提供し、その方法は、心欠陥の重症度またはリスクの変化に相関する様式で、個体のミクロビオームが変化するように、心欠陥を罹患しているまたはそれに感受性のある個体に、ミクロビオームを変化させる作用因子を投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、ミクロビオームを変化させる作用因子は１つ以上の抗生物質を含む。いくつかの実施形態では、ミクロビオームを変化させる作用因子は１種類以上の微生物を含む。
【００１１】
ある特定の実施形態では、本開示は、個体に投与すると、低減した心欠陥の重症度またはリスクに相関する様式で、個体のミクロビオームを変化させるミクロビオームを変化させる作用因子を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は薬剤的に許容可能な担体をさらに含む。ある特定の実施形態では、組成物は食品製品、機能性食品または栄養補助食品中に、または、それらとして提供される。いくつかの実施形態では、組成物は単位剤形であり、低減した心欠陥の重症度またはリスクを達成することに相関する投与計画に沿った投与のための単位用量を含む。ある特定の実施形態では、ミクロビオームを変化させる作用因子は細菌細胞であり、または、それを含む。いくつかの実施形態では、ミクロビオームを変化させる作用因子は抗生物質を含む、またはそれをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】腸内に存在する微生物叢と心筋梗塞の状態で宿主の循環に輸送される微生物代謝産物との間の相互作用に関係するように使用されるシステムバイオロジーアプローチを説明する流れ図を示す。
【図２−１】特定の微生物の門、綱、属、および種（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉおよびＬ．プランタルム）の１６Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡに特異的なプライマーのセットを、定量的ＰＣＲ反応温度とともに描写するチャートを表す。
【図２−２】特定の微生物の門、綱、属、および種（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉおよびＬ．プランタルム）の１６Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡに特異的なプライマーのセットを、定量的ＰＣＲ反応温度とともに描写するチャートを表す。
【図２−３】特定の微生物の門、綱、属、および種（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉおよびＬ．プランタルム）の１６Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡに特異的なプライマーのセットを、定量的ＰＣＲ反応温度とともに描写するチャートを表す。
【図２−４】特定の微生物の門、綱、属、および種（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉおよびＬ．プランタルム）の１６Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡに特異的なプライマーのセットを、定量的ＰＣＲ反応温度とともに描写するチャートを表す。
【図２−５】特定の微生物の門、綱、属、および種（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉおよびＬ．プランタルム）の１６Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡに特異的なプライマーのセットを、定量的ＰＣＲ反応温度とともに描写するチャートを表す。
【図２−６】特定の微生物の門、綱、属、および種（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉおよびＬ．プランタルム）の１６Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡに特異的なプライマーのセットを、定量的ＰＣＲ反応温度とともに描写するチャートを表す。
【図２−７】特定の微生物の門、綱、属、および種（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉおよびＬ．プランタルム）の１６Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡに特異的なプライマーのセットを、定量的ＰＣＲ反応温度とともに描写するチャートを表す。
【図２−８】特定の微生物の門、綱、属、および種（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉおよびＬ．プランタルム）の１６Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡに特異的なプライマーのセットを、定量的ＰＣＲ反応温度とともに描写するチャートを表す。
【図３】バンコマイシン処置を受けたラットの糞便の微生物集団を示す棒グラフを示す。糞便あたりのＬｏｇ１０微生物数を、微生物の種類の関数として、グラフにする。飲料水に加えることによって経口投与（６０ｍｇ／ｋｇ／日）されるバンコマイシンは、糞便中の微生物種の存在量を変化させ、微生物の総数を減少させた。ｘ軸のラベルは３つの微生物分類群、細菌、真菌を表し、古細菌Ｌ．プランタルムは細菌のバチルス綱の一部である。ＮＤは検出されなかったことを示す。データは平均値±標準偏差であり、ｎ＝６／群である。＊は、０日目に対するＰ＜０．０１を示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、バンコマイシンの投与がラットの心筋梗塞に及ぼす効果を説明する棒グラフを示す。抗生物質による処置の関数として、梗塞サイズをグラフ化する。４Ａ）飲料水に加えたバンコマイシン（６０ｍｇ／ｋｇ／日）は、インビボで梗塞サイズ（ＩＳ）を減少させた。４Ｂ）単離された心臓の冠動脈循環に直接加えたバンコマイシンは、インビトロでＩＳを減少させなかった。４Ｃ）飲料水に加えられ（６０ｍｇ／ｋｇ／日）、その後、単離された心臓の冠動脈循環から除外されたバンコマイシンはＩＳを減少させた。データは平均値±標準偏差であり、ｎ＝６／群である。ＬＶは左心室を示す。ＩＳの減少は、インビトロおよびインビボの試験（Ａ、Ｃ）について類似していた。＊は、対照に対するＰ＜０．０１を示す。
【図５】バンコマイシン処置がラットの心臓保護を４８時間以内に与え、その効果は処置停止後７２時間で失われることを示す棒グラフを表す。バンコマイシン処置の関数として、経時的梗塞サイズをグラフ化する。虚血／再灌流試験のために心臓を切除する前に、バンコマイシンを飲料水に加えた（６０ｍｇ／ｋｇ／日）。食べ物と（バンコマイシン）水は全ラットに自由に与えた。データは平均値±標準偏差であり、ｎ＝４である。＊は、対照に対するＰ＜０．０５を示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、ラットにおいて腸の微生物叢がレプチンを介して心臓保護を媒介することを示す棒グラフを表す。６Ａ）２３のサイトカインのうち１１の定量的な変化。バンコマイシン処置の関数として、サイトカインのレベルをｐｇ／ｍｌでグラフ化する。６Ｂ）レプチンの再構成はバンコマイシンによる心臓保護を逆転させた。心筋の虚血／再灌流の２４時間前および１２時間前に、レプチンでラットを処置した（静脈内０．１２ｇ／ｋｇ）。梗塞サイズ（ＩＳ）および回復最大左心室圧（ＬＶＤＰ）を、レプチンおよびバンコマイシン処置の関数としてグラフ化する。データは平均値±標準偏差であり、ｎ＝６／群である。＊は、対照に対するＰ＜０．０５を示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、プロバイオティクスジュースがレプチンを減少させ、ラットの心筋梗塞に対して保護したことを説明するグラフを示す。血中レプチンレベルの分析および心筋の虚血／再灌流の前に、１４日間、Ｄａｈｌ  Ｓラットをプロバイオティクスジュースで処置した（１５ｍｌ／ラット／日）。図７Ａは、レプチンおよびプロバイオティクスジュースの処置の関数として、ＩＳおよび回復最大左心室圧（ＬＶＤＰ）をグラフ化する棒グラフを示す。プロバイオティクスジュースはレプチンの再構成によって逆転された心筋梗塞を減少させた（虚血の２４時間前および１２時間前に０．１２ｇ／ｋｇ）。図７Ｂは、レプチンおよびプロバイオティクスジュースの処置の関数として、血中レプチンレベル（ｐｇ／ｍｌ）をグラフ化する棒グラフを示す。血中のレプチンレベルはプロバイオティクスジュースの処置の後に減少した。図７Ｃは、レプチンおよびプロバイオティクスジュースの処置び関数として、ラットの糞便グラムあたりのＬｏｇ１０のＬ．プランタルムをプロットする散布図を示す。１６Ｓ  ｒＲＮＡの定量的ＰＣＲを使用すると、プロバイオティクスジュースで処置されたラットの糞便中のＬ．プランタルムのレベルが増加した。Ｌ．プランタルムの検知の限界値は、３ｌｏｇ１０／ｇの糞便である。データは平均値±標準偏差であり、ｎ＝６／群である。＊は、対照に対するＰ＜０．０１を示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｂは、レプチンおよびプロバイオティクスジュースの処置の関数として、ＩＳ（８Ａ）または血中のレプチンレベル（ｐｇ／ｍｌ）（８Ｂ）の棒グラフを表す。プロバイオティクスジュースの処置は心筋梗塞に対して保護し、ラットのレプチンレベルを減少させた。Ｄａｈｌ  Ｓラットを、プロバイオティクスジュース（１５ｍｌ／ラット／日、約１．５ｘ１０９のＬ．プランタルム／ラット／日）、照射された（３５ｋＧｙ）プロバイオティクスジュース、またはビヒクル（水、９２．８ｍｇ／ｍｌのグルコース、４２．２μｇ／ｍｌのＮａＣｌ、４６４μｇ／ｍｌのＫＣｌ、および４ｍｇのアルブミン）のいずれかで１４日間処置を受けるか、若しくは虚血／再灌流試験のために心臓を切除する前の２４時間および１２時間、またはその両方に、０．１２μｇ／ｋｇのレプチンを注射された。８Ａ）処置を受けたラットの心臓のＩＳ。８Ｂ）虚血／再灌流の前に８Ａのラットの血中の血漿を直ちに回収し、レプチンレベルを分析した。データは平均値±標準偏差であり、ｎ＝６／群である。＊は、対照に対するＰ＜０．０２を示し、＋は、対照に対するＰ＜０．０１を示す。
【図９】図９Ａ〜９Ｅは、ラットにおいて、微生物代謝産物によって活性化される、受容体、細胞内生存経路およびＡＴＰ依存性カリウムチャンネルを説明する。バンコマイシンおよび細胞内シグナル伝達阻害剤による処置の関数として、ＩＳまたは回復ＬＶＤＰを棒グラプにプロットする。対照およびバンコマイシンで処置を受けたラットから単離された心臓を、虚血／再灌流の前に、（９Ａ）ＪＡＫ−２、（９Ｂ）Ａｋｔ、（９Ｃ）ｐ４２／４４  ＭＡＰＫ、（９Ｄ）ｐ３８  ＭＡＰＫおよび（９Ｅ）ＫＡＴＰチャンネルの薬理学的阻害剤で灌流適用した。結果は、再灌流後の梗塞サイズおよび機械的機能の回復として表した。データは平均値±標準偏差であり、ｎ＝６／群である。＊は、対照に対するＰ＜０．０５を示す。
【図１０】バンコマイシンおよびトロンボポイエチンによるラットの梗塞サイズの減少は相加的なものであることを説明する棒グラフを示す。バンコマイシンおよびトロンボポイエチンの処置の関数として、梗塞サイズ（ＩＳ）をプロットする。ラットは、処置なし、バンコマイシン単独で処置（１５ｍｇ／ｋｇ／日を虚血前７２時間）、トロンボポイエチン（Ｔｐｏ）単独（静脈内０．０２５ｐｇ／ｋｇを虚血前１５分間）、または心筋の虚血／再灌流の前のバンコマイシン＋トロンボポイエチンで処置を受けた。データは平均値±標準偏差であり、ｎ＝９／群である。＊は、対照に対するＰ＜０．０５を示す。
【図１１】バンコマイシンで処置を受けたラットの糞便中の微生物集団のラットの系統ごとの差を説明する棒グラフを示す。バンコマイシン処置、微生物の種類、およびラットの系統の関数として、微生物の存在量をプロットする。経口投与されたバンコマイシンは微生物の種類を変化させ、微生物の総数を減少させた。この効果は、ラットの系統に依存する。ＷＡＧはＷＡＧ／ＲｉｊＣｍｃｒラットを示す。ＳＤはＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを示す。ＤＳＳはＤａｈｌ  Ｓラットを示す。データは平均値±標準偏差であり、ｎ＝９／群である。＊は、第０日目に対するＰ＜０．０５を示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃは、抗生物質の処置を受けた心筋梗塞のラットの系統ごとの差を説明する棒グラフを表す。ＷＡＧ／ＲｉｊＣｍｃｒ（１２Ａ）、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（１２Ｂ）およびＤａｈｌ  Ｓ（１２Ｃ）ラットについての、抗生物質の処置の関数として、梗塞サイズ（ＩＳ）をプロットする。抗生物質を飲料水に加えた。ラットは、処置なし、バンコマイシンで処置（６０ｍｇ／ｋｇ／日）、またはストレプトマイシン（１２０ｍｇ／ｋｇ／日）、ネオマイシン（６０ｍｇ／ｋｇ／日）、バシトラシン（１２０ｍｇ／ｋｇ／日）、およびポリミキシンＢ（６０ｍｇ／ｋｇ／日）の併用での処置を受けた。データは平均値±標準偏差であり、ｎ＝６／群である。＊は、対照に対するＰ＜０．０５を示す。ＬＶは左心室を示す。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｂは、抗生物質が梗塞サイズおよび微生物の存在量に及ぼす効果を説明する。以下の濃度で、Ｄａｈｌ  Ｓラットの飲料水に抗生物質を加えた：１２０ｍｇ／ｋｇ／日のストレプトマイシン、６０ｍｇ／ｋｇ／日のポリミキシンＢ、１２０ｍｇ／ｋｇ／日のバシトラシン、６０ｍｇ／ｋｇ／日のネオマイシン、または６０ｍｇ／ｋｇ／日のバンコマイシン。図１３Ａは、梗塞サイズ（ＩＳ）を抗生物質の処置の関数としてプロットする棒グラフを示す。図１３Ｂは、抗生物質が誘発する微生物の分類群の変化を説明し、これらの変化が心臓保護に対する変化と相関する図表を示す。
【図１４】抗生物質の処置を受けたラットの糞便中の微生物集団を説明する棒グラフを表す。微生物の分類群の関数として、糞便グラムあたりの微生物をプロットする。経口投与されたストレプトマイシン、ネオマイシン、ポリミキシンＢ、およびバシトラシンの混合物は、糞便中に存在する微生物種の存在量を変化させ、微生物の総数を減少させる。Ｘ軸のラベルは、細菌、真菌、および古細菌によってグループ化される微生物の分類群を示す。ＮＤは検出されなかったことを示す。データは平均値±標準偏差であり、ｎ＝６／群である。＊は、第０日目に対するＰ＜０．０５を示す。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｃは、抗生物質の混合物の投与が心筋梗塞に及ぼす効果を説明する棒グラフを示す。抗生物質の処置の関数として、梗塞サイズ（ＩＳ）をプロットする。１５Ａ）飲料水に加えられた抗生物質は、インビボでの梗塞サイズを減少させた。１５Ｂ）単離された心臓の冠状動脈循環に直接加えられた抗生物質は、インビトロでの梗塞サイズを減少させなかった。１５Ｃ）飲料水に加え、その後、冠状動脈の潅流液から除外された抗生物質は、梗塞サイズを減少させた。データは平均値±標準偏差であり、ｎ＝６／群である。＊は、対照に対するＰ＜０．０１を示す。ＡＡＲはリスク領域を示す。ＬＶは左心室を示す。
【図１６】抗生物質が、トリプトファンの腸の微生物叢の代謝産物に及ぼす効果を説明する箱ひげ図を表す。抗生物質の処置の関数として、各代謝産物の量をプロットする。平均値を＋サインで表す。中央値を水平バーで表す。上部および下部の箱は、上限および下限の四分位を表す。ひげは最大値および最小値を表す。白丸は極値のデータポイントを表す。データは平均値±標準偏差であり、ｎ＝８／群であり、＊は、第０日目に対するＰ＜０．０５を示し、ＮＳは有意性がないことを示す。
【図１７】抗生物質が、フェニルアラニンの腸の微生物叢の代謝産物に及ぼす効果を説明する箱ひげ図を表す。抗生物質の処置の関数として、各代謝産物の量をプロットする。平均値を＋サインで表す。中央値を水平バーで表す。上部および下部の箱は、上限および下限の四分位を表す。ひげは最大値および最小値を表す。白丸は極値のデータポイントを表す。データは平均値±標準偏差であり、ｎ＝８／群であり、＊は、第０日目に対するＰ＜０．０５を示し、ＮＳは有意性がないことを示す。
【図１８】抗生物質が、チロシンの腸の微生物叢の代謝産物に及ぼす効果を説明する箱ひげ図を表す。抗生物質の処置の関数として、各代謝産物の量をプロットする。平均値を＋サインで表す。中央値を水平バーで表す。上部および下部の箱は、上限および下限の四分位を表す。ひげは最大値および最小値を表す。白丸は極値のデータポイントを表す。データは平均値±標準偏差であり、ｎ＝８／群であり、＊は、第０日目に対するＰ＜０．０５を示し、ＮＳは有意性がないことを示す。
【図１９】腸の微生物代謝産物がラットの梗塞サイズに及ぼす効果を説明する棒グラフを表す。腸の微生物代謝産物の処置の関数として、梗塞サイズをプロットする。以下の３つのアミノ酸の全てまたはそれぞれ個別の代謝産物の前処置によって、バンコマイシンでの梗塞サイズの減少が無効にされた：フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン。バンコマイシンで処置を受けたラットに、フェニルアラニン（Ｆ）、（トランス桂皮酸＋フェニル酢酸塩＋３−フェニルプロピオン酸）、トリプトファン（Ｗ）、（インドール−３−アセテート＋３−インドキシル硫酸＋Ｌ−キヌレニン＋３−インドールプロピオン酸）、またはチロシン（Ｙ）、（４−ヒドロキシフェニルピルビン酸＋ｐ−ヒドロキシフェニル乳酸塩）の代謝産物を、虚血／再灌流の試験の前に、静脈内または経口で投与した。データは平均値±標準偏差であり、ｎ＝６／群であり、＊は、対照に対するＰ＜０．０５を示す。ｉｖは静脈内を示す。ｏは経口を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
抗生剤：本明細書で使用される場合、「抗生剤」という用語は、天然源から単離、または天然源から単離された抗生剤に由来し、細菌および他の微生物の増殖を阻害する、またはそれを駆除する能力を有し、感染症の治療に主に使用される、あらゆるグループの化学物質を意味する。抗生剤の例としては、限定はされないが、アミカシン；アモキシシリン；アンピシリン；アジスロマイシン；アズロシリン；アズトレオナム；アズトレオナム；カルベニシリン；セファクロル；セフェピム；セフェタメト；セフメタゾール（Ｃｅｆｉｎｅｔａｚｏｌｅ）；セフィキシム；セフォニシド；セフォペラゾン；セフォタキシム；セフォテタン；セフォキシチン；セフポドキシム；セフプロジル；セフスロジン；セフタジジム；セフチゾキシム；セフトリアキソン；セフロキシム；セファレキシン；セファロチン；セスロマイシン；クロラムフェニコール；シノキサシン；シプロフロキサシン；クラリスロマイシン；クリンダマイシン；クロキサシリン；コ−アモキシクラブアネート（Ｃｏ−ａｍｏｘｉｃｌａｖｕａｎａｔｅ）；ダルババシン；ダプトマイシン；ジクロキサシリン；ドキシサイクリン；エノキサシン；エリスロマイシンエストレート；エチルコハク酸エリスロマイシン；グルコヘプタン酸エリスロマイシン；ラクトビオン酸エリスロマイシン；ステアリン酸エリスロマイシン；エリスロマイシン；フィダキソマイシン；フレロキサシン；ゲンタマイシン；イミペネム；カナマイシン；ロメフロキサシン；ロラカルベフ；メチシリン；メトロニダゾール；メズロシリン；ミノサイクリン；ムピロシン；ナフシリン；ナリジクス酸；ネチルマイシン；ニトロフラントイン；ノルフロキサシン；オフロキサシン；オキサシリン；ペニシリンＧ；ピペラシリン；レタパムリン；リファキシミン（Ｒｉｆａｘａｍｉｎ）、リファンピン；ロキシスロマイシン；ストレプトマイシン；スルファメトキサゾール；テイコプラニン；テトラサイクリン；チカルシリン；チゲサイクリン；トブラマイシン；トリメトプリム；バンコマイシン；ピペラシリンおよびタゾバクタムの組み合わせ；並びにそれらの種々の塩、酸、塩基、並びに他の誘導体が挙げられる。抗菌性抗生剤の例としては、限定はされないが、アミノグリコシド系抗生剤、カルバセフェム系抗生剤、カルバペネム系抗生剤、セファロスポリン系抗生剤、セファマイシン系抗生剤、フルオロキノロン系抗生剤、糖ペプチド抗生剤、リンコマイシン系抗生剤、マクロライド系抗生剤、モノバクタム系抗生剤、ペニシリン系抗生剤、キノロン系抗生剤、スルホンアミド系抗生剤、およびテトラサイクリン系抗生剤が挙げられる。
【００１４】
抗菌剤には抗菌性ペプチドも含まれる。例としては、限定はされないが、アバエシン（ａｂａｅｃｉｎ）；アンドロピン（ａｎｄｒｏｐｉｎ）；アピダエシン類（ａｐｉｄａｅｃｉｎｓ）；ボンビニン；ブレビニン類；ブフォリンＩＩ；ＣＡＰ１８；セクロピン類；セラトトキシン（ｃｅｒａｔｏｔｏｘｉｎ）；デフェンシン類；デルマセプチン；ダームシジン；ドロソマイシン（ｄｒｏｓｏｍｙｃｉｎ）；エスクレチン類（ｅｓｃｕｌｅｎｔｉｎｓ）；インドリシジン；ＬＬ３７；マガイニン；マキシマムＨ５（ｍａｘｉｍｕｍ  Ｈ５）；メリチン；モリシン（ｍｏｒｉｃｉｎ）；プロフェニン（ｐｒｏｐｈｅｎｉｎ）；プロテグリン；および／またはタキプレシン類が挙げられる。
【００１５】
心欠陥（ｃａｒｄｉａｃ  ｄｅｆｅｃｔ）：本明細書に記載される場合、「心欠陥」は、心臓および／または血管に影響を与えるあらゆる疾患、障害、状態、または事象である。いくつかの実施形態において、心欠陥は、心臓および／または血管に影響を与えるあらゆる疾患、障害、状態、または事象のリスクの増大を含む。いくつかの実施形態において、心欠陥は、心臓および血管の正常作動からのいかなる逸脱をも含む。いくつかの実施形態において、心欠陥を有する個体は、心臓および／または血管に影響を与えるあらゆる疾患、障害、状態、または事象に罹患しているかまたはそれに感受性がある。いくつかの実施形態において、心欠陥は、心発作もしくは心筋梗塞またはそれに起因する傷害であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、心欠陥は、脳卒中またはそれに起因する傷害であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、心欠陥は、虚血事象（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｅｖｅｎｔ）またはそれに起因する傷害であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、心欠陥は、冠動脈疾患またはそれに起因する傷害であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、心欠陥は、アテローム性動脈硬化またはそれに起因する傷害であるか、またはそれを含む。
【００１６】
担体：本明細書で使用される場合、「担体」という用語は、医薬製剤の調製に有用な、薬剤的に許容できる（例えば、ヒトへの投与に安全で無毒な）担体または希釈用物質（ｄｉｌｕｔｉｎｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）を指す。希釈剤の例としては、滅菌水、静菌性注射用蒸留水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えばリン酸塩−緩衝食塩水）、無菌食塩水、リンゲル液またはデキストロース溶液が挙げられる。
【００１７】
併用療法：「併用療法」という用語は、本明細書で使用される場合、対象が両薬剤に同時に暴露されるような重なり合う投与計画において、２つ以上の異なる医薬品が投与されている状況を指す。
【００１８】
同等の、比較できる（ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ）：比較を可能にするのに充分に類似しているが、少なくとも１つの特徴において異なることである。
【００１９】
相関する（ｃｏｒｒｅｌａｔｅ）：「相関する」という用語は、本明細書で使用される場合、「〜と相関性を示す」というその通常の意味を有する。２つの特徴、項目（ｉｔｅｍ）または値が同時に出現するおよび／または同時に変化する傾向を示す場合に、それらが互いに相関性を示すことは、当業者に理解されるであろう。いくつかの実施形態において、相関性はそのｐ値が０．０５未満である場合に統計的に有意であり；いくつかの実施形態においては、相関性はそのｐ値が０．０１未満である場合に統計的に有意である。いくつかの実施形態において、相関性は回帰分析によって評価される。いくつかの実施形態において、相関性は相関係数である。
【００２０】
識別する（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ）：「識別する」という用語は、本明細書で使用される場合、他の実体（例えば、同等の実体）からの定義付けまたは区別を表す。いくつかの実施形態において、識別は、供給源および／または試料中に一緒に存在する他の種類からの区別を意味する。
【００２１】
投与計画：「投与計画（ｄｏｓｉｎｇ  ｒｅｇｉｍｅｎ）」（または「治療薬投与計画（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｒｅｇｉｍｅｎ）」）は、その用語が本明細書で使用される場合、対象に別々に、典型的にはある期間だけ隔てられて、投与される、一連の単位用量（典型的には２つ以上）である。いくつかの実施形態において、所与の治療薬は推奨の投与計画を有し、その投与計画は一つまたは複数の用量を含み得る。いくつかの実施形態において、投与計画は、同じ長さの期間だけ互いに各々隔てられた複数の用量を含み；いくつかの実施形態においては、投与計画は、複数の用量および個々の用量を隔てる少なくとも２つの異なる期間を含む。いくつかの実施形態において、本治療薬は所定の期間に亘り連続的に投与される。いくつかの実施形態において、本治療薬は１日１回（ＱＤ）または１日２回（ＢＩＤ）投与される。
【００２２】
発症：文脈から理解される通り、疾患、障害、もしくは状態および／または望ましくない心臓事象の「発症」は（心欠陥の「発症」も共に）、疾患、障害、もしくは状態、または事象（心欠陥）に罹患している、および／またはそれに以前罹患していた、個体を含む。
【００２３】
梗塞：「梗塞」という用語は、典型的には、血液供給障害に起因する酸素の局所的欠乏によってもたらされる組織病変および／または組織死の領域を指すために、当該技術分野においては使用される。
【００２４】
虚血：「虚血」という用語は、典型的には、組織への血流の制限を指すために、当該技術分野においては使用される。虚血によって、組織は、血液中で運搬される必要な酸素および栄養分を受け取ることを妨げられる。いくつかの実施形態において、虚血は動脈における血液供給の減少である。いくつかの実施形態において、虚血は冠動脈における血液供給の減少である。いくつかの実施形態において、虚血は血管における血液供給の減少である。いくつかの実施形態において、血液供給の減少は、減少していない血液供給の０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０％またはそれより多い、血液供給の減少である。いくつかの実施形態において、血液供給の減少は血液供給の完全な欠乏である。
【００２５】
代謝産物：「代謝産物」という用語は、本明細書で使用される場合、あらゆる代謝過程による、あらゆる化学物質の、インビボでの生体内変換によって形成される、いかなる化合物をも指す。いくつかの実施形態において、代謝産物は酸化によって生成される。いくつかの実施形態において、代謝産物は還元によって生成される。いくつかの実施形態において、代謝産物は加水分解によって生成される。いくつかの実施形態において、代謝産物は複合体化によって生成されるか複合体化である。いくつかの実施形態において、代謝産物はポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、代謝産物は炭水化物を含む。いくつかの実施形態において、代謝産物は小分子を含む。いくつかの実施形態において、代謝産物は多細胞生物の細胞によって産生される。いくつかの実施形態において、代謝産物は単細胞生物によって産生される。いくつかの実施形態において、代謝産物は微生物細胞によって産生される。
【００２６】
微生物：「微生物」という用語は、典型的には、細菌、真菌、原生動物、またはウイルス等の、顕微鏡レベルに小さな生物を指すために、当該技術分野においては使用される。いくつかの実施形態において、微生物は細菌、古細菌、単細胞菌類（例えば、酵母）、藻類、または原生動物（例えば、マラリア病原体であるマラリア原虫）である。いくつかの実施形態において、微生物はそれらの界に基づいて特徴づけされる。いくつかの実施形態において、微生物はそれらの門に基づいて特徴づけされる。いくつかの実施形態において、微生物はそれらの綱に基づいて特徴づけされる。いくつかの実施形態において、微生物はそれらの科に基づいて特徴づけされる。いくつかの実施形態において、微生物はそれらの属に基づいて特徴づけされる。いくつかの実施形態において、微生物はそれらの種に基づいて特徴づけされる。いくつかの実施形態において、微生物はそれらの亜種に基づいて特徴づけされる。いくつかの実施形態において、微生物はそれらの系統に基づいて特徴づけされる。亜種に含まれる微生物（例えば細菌）を区別するために、追加の分類学によるクラス（例えば、血液型亜型または血清型）が使用されることがある。血液型亜型および血清型は、微生物のタイプの異なる細胞膜結合挙動によって区別される。いくつかの実施形態において、微生物（例えば、試料中の）を特定および／または特徴づけするために、属および種が使用される。いくつかの実施形態において、微生物（例えば、試料中の）を特定および／または特徴づけするために、亜種、血清型および／または系統が使用される。あるいは、または、さらに、いくつかの実施形態では、病原性（すなわち、特定の病気を引き起こす能力）、または一つもしくは複数の抗生剤への耐性、代謝プロフィール、形態等のような一つまたは複数の識別特徴を使用して、微生物（例えば、試料中の）は特定および／または特徴づけされる。
【００２７】
微生物種：文脈から理解される通り、「微生物種」または「微生物の種類」という用語は、共通の特徴を有する微生物の分類を指すために、本明細書では使用される。いくつかの実施形態において、微生物種は、共通の検出可能な特徴を共有する微生物のグループである。いくつかの実施形態において、共通の検出可能な特徴は、特定のＤＮＡ配列の存在または量であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、共通の検出可能な特徴は、特定のＲＮＡ転写物の存在または量であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、共通の検出可能な特徴は、ポリペプチド（例えば、微生物により産生されたポリペプチド）の存在または量であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、共通の検出可能な特徴は、代謝産物（例えば、微生物により産生された代謝産物）の存在または量であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、共通の検出可能な特徴は、酵素活性（例えば、微生物酵素の活性）の存在またはレベルであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、一般的な種類の微生物は、標準的な分類法に基づく、特定の分類における微生物である。「微生物種」という用語が、本明細書で使用される場合に、特定の解像度に限定されるものではなく；様々なレベルの解像度を達成する技術を用いることで、様々な特徴が検出可能であることは、当業者には理解される。いくつかの実施形態において、共通の種類の微生物は、同じ微生物界の微生物である。いくつかの実施形態において、共通の種類の微生物は、同じ微生物門の微生物である。いくつかの実施形態において、共通の種類の微生物は、同じ微生物綱の微生物である。いくつかの実施形態において、共通の種類の微生物は、同じ微生物科の微生物である。いくつかの実施形態において、共通の種類の微生物は、同じ微生物属の微生物である。いくつかの実施形態において、共通の種類の微生物は、同じ微生物種の微生物である。いくつかの実施形態において、共通の種類の微生物は、同じ微生物亜種の微生物である。いくつかの実施形態において、共通の種類の微生物は、同じ微生物血液型亜型の微生物である。いくつかの実施形態において、共通の種類の微生物は、同じ微生物血清種類の微生物である。いくつかの実施形態において、共通の種類の微生物は、同じ系統の微生物である。
【００２８】
ミクロビオームを変化させる作用因子（ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ａｌｔｅｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）：本明細書で使用される場合、「ミクロビオームを変化させる作用因子」という用語は、個体内のミクロビオームを（例えば、ミクロビオーム中に存在する一つまたは複数の微生物の絶対的または相対的なレベルおよび／または活性を変化させることにより）変化させる作用因子を指す。いくつかの実施形態において、ミクロビオームを変化させる作用因子は、ミクロビオームにおける一つまたは複数の微生物種の相対レベルを増加させる薬剤を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームを変化させる作用因子は、ミクロビオームにおける一つまたは複数の微生物種の相対レベルを減少させる薬剤を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームを変化させる作用因子は、ミクロビオームにおける一つまたは複数の微生物種絶対レベルを（例えば、一つまたは複数の微生物種を追加することによって）増加させる薬剤を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームを変化させる作用因子は、ミクロビオームにおける一つまたは複数の微生物種の絶対レベルを減少（例えば、一つまたは複数の微生物種を実質的に排除する（例えば、死滅させることにより）ことによって）させる薬剤を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームを変化させる作用因子は、ミクロビオームにおける微生物の総数を増加させる薬剤を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームを変化させる作用因子は、ミクロビオームにおける微生物の総数を減少させる薬剤を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームを変化させる作用因子は化学物質を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームを変化させる作用因子は抗菌剤を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームを変化させる作用因子は抗生剤を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームを変化させる作用因子は非吸収性抗生剤を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームを変化させる作用因子はバシトラシン、ネオマイシン、ポリミキシンＢ、ストレプトマイシン、および／もしくはバンコマイシン、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームを変化させる作用因子は微生物を含む。いくつかのそのような実施形態において、ミクロビオームを変化させる作用因子は細菌を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームを変化させる作用因子はプロバイオティクス細菌を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームを変化させる作用因子はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームを変化させる作用因子はビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームを変化させる作用因子は抗菌ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームを変化させる作用因子は抗真菌剤を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームを変化させる作用因子はバクテリオファージを含む。
【００２９】
ポリペプチド：「ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、ペプチド結合を介して連結しているアミノ酸が連続してできた鎖を指す。前記用語はいかなる長さのアミノ酸鎖を指すのにも使用されるが、前記用語が長い鎖に限定はされず、ペプチド結合を介して連結している２つのアミノ酸を含んでなる最短の鎖を指し得ることは、当業者には理解される。当業者に既知である通り、ポリペプチドはプロセシングおよび／または修飾されていてもよい。
【００３０】
プロバイオティクス（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）：本明細書に記載される場合、「プロバイオティクス」は、宿主生物における健康上の利益、並びに／または宿主生物における疾患、障害、状態、もしくは事象のリスクおよび／もしくは症状の低減と関連する、あらゆる微生物種である。いくつかの実施形態において、プロバイオティクスは、食品、機能性食品または栄養補助食品中に配合される。いくつかの実施形態において、プロバイオティクスは細菌の一種である。細菌性プロバイオティクスの例としては、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アニマリスＤＮ  １７３  ０１０（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  ＤＮ  １７３  ０１０）、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスＢｂ−１２（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ  Ｂｂ−１２）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ・ヤクルト（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ  Ｙａｋｕｌｔ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス３５６２４（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ  ３５６２４）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ラクティスＨＮ０１９（ＤＲ１０）（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ  ＨＮ０１９  （ＤＲ１０））、ビフィドバクテリウム・ロングムＢＢ５３６（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＢＢ５３６）、腸球菌ＬＡＢ  ＳＦ  ６８（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ＬＡＢ  ＳＦ  ６８）、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７）、好酸性乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、好酸性乳酸桿菌ＬＡ−５（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＬＡ−５）、好酸性乳酸桿菌ＮＣＦＭ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＦＭ）、ラクトバチルス・カゼイＤＮ−１１４  ００１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ＤＮ−１１４  ００１）、ラクトバチルス・カゼイＣＲＬ４３１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ＣＲＬ４３１）、ラクトバチルス・カゼイＦ１９（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  Ｆ１９）、ラクトバチルス・カゼイ・シロタ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  Ｓｈｉｒｏｔａ）、ラクトバチルスＧＧ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ＧＧ）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニーＬａ１（Ｌｊ１）（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  Ｌａ１  （Ｌｊ１））、ラクトバチルス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティスＬ１Ａ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  Ｌ１Ａ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）���ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・プランタルム２９９Ｖ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９Ｖ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＴＣ５５７３０（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＡＴＴＣ  ５５７３０）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ラムノサスＡＴＣＣ５３０１３（ＬＧＧ）（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＡＴＣＣ  ５３０１３  （ＬＧＧ））、ラクトバチルス・ラムノサスＬＢ２１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＬＢ２１）および／またはラクトバチルス・サリヴァリゥスＵＣＣ１１８（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ＵＣＣ１１８）が挙げられる。いくつかの実施形態において、プロバイオティクスは真菌の一種である。真菌性プロバイオティクスの例としては、サッカロマイセス・セレビシエ  （ブラウディ）リオ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  （ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）  ｌｙｏ）が挙げられる。
【００３１】
タンパク質：「タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、独立した単位として機能する一つまたは複数のポリペプチドを指す。単一ポリペプチドが独立した機能単位であり、その独立した機能単位を形成するために他のポリペプチドとの物理的結合を永続的にも一時的にも必要としない場合、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は同義的に使用することができる。その独立した機能単位が互いに物理的に結合している２つ以上のポリペプチドから成っている場合、「タンパク質」という用語は、物理的に結合している、独立した単位として一緒に機能する、複数のポリペプチドを指す。
【００３２】
参照：文脈から理解される通り、参照試料または参照個体は、適切な比較を可能にするのに、目的の特定の試料または個体に充分に類似している試料または個体である。いくつかの実施形態において、参照試料に関する情報は、特定の試料に関する情報と同時に得られる。いくつかの実施形態において、参照試料に関する情報は過去（ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ）の情報である。いくつかの実施形態において、参照試料に関する情報は、例えば、コンピューター可読媒体に記憶される。いくつかの実施形態において、目的の特定の試料と参照試料との比較により、参照試料に対する目的の特定の試料の同一性、類似性、または差異が確立される。
【００３３】
リスク：文脈から理解される通り、疾患、障害、状態、または事象（心欠陥）の「リスク」は、特定の個体が疾患、障害、または状態を発症する、および／または望ましくない心臓事象に罹患する可能性（その個体が心欠陥に罹患する可能性も含む）を含む。いくつかの実施形態において、リスクはパーセンテージとして表される。いくつかの実施形態において、リスクは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０％〜最大１００％である。いくつかの実施形態において、リスクは、参照試料または参照試料群と関連したリスクと比較したリスクとして表される。いくつかの実施形態において、参照試料または参照試料群は、疾患、障害、状態および／または事象（心欠陥）の既知のリスクを有する。いくつかの実施形態において、参照試料または参照試料群は、特定の個体と同等の個体から得られる。いくつかの実施形態において、相対リスクは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより大きい。
【００３４】
試料：本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、本明細書に記載される場合、目的の供給源から得られた、またはそれに由来する生物試料を指す。いくつかの実施形態において、目的の供給源は動物またはヒト等の生物を含む。いくつかの実施形態において、生物試料は生物組織または生体液を含む。いくつかの実施形態において、生物試料は、骨髄；血液；血液細胞；腹水；組織もしくは細針生検試料；細胞含有体液；浮動性核酸（ｆｒｅｅ  ｆｌｏａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）；痰；唾液；尿；脳脊髄液、腹水；胸膜液；糞便；リンパ液；婦人科学的体液（ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄ）；皮膚スワブ；膣スワブ；口腔スワブ；鼻腔スワブ；管洗浄液（ｄｕｃｔａｌ  ｌａｖａｇｅ）もしくは気管支肺胞洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｅｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ）等の洗浄液（ｗａｓｈｉｎｇｓ  ｏｒ  ｌａｖａｇｅｓ）；吸引液；擦過標本；骨髄検体；組織生検検体；外科検体；糞便、他の体液、分泌物、および／もしくは排出物；並びに／またはそれらから得られる細胞等であってもよいか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態において、生物試料は、個体から得られる細胞であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、得られる細胞は、その試料が採取される個体から得られる細胞であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、得られる細胞は、個体のミクロビオームの微生物細胞であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、試料は、あらゆる適切な手段で目的の供給源から直接得られる「一次試料」である。例えば、いくつかの実施形態において、一次生物試料は、生検（例えば、細針吸引生検または組織生検）、外科手術、体液（例えば、血液、リンパ液、糞便等）採取等からなる群から選択される方法によって得られる。いくつかの実施形態において、文脈から明らかなように、「試料」という用語は、一次試料を処理することにより（例えば、一次試料の一つまたは複数の成分を除去することにより、および／または一次試料に一つまたは複数の薬剤を添加することにより）、得られる調製物を指す。例えば、半透膜を用いるフィルタリングである。そのような「処理された試料」は、試料から抽出された、または、ｍＲＮＡの増幅もしくは逆転写、特定の成分の単離および／もしくは精製等の手法に一次試料を曝すことにより得られる、例えば核酸またはタンパク質を含み得る。
【００３５】
実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、完全なまたはほぼ完全な範囲または程度で目的の特徴または性質を示している、質的な状態を指す。生物学的および化学的現象が完結するまで進み、且つ／または完全に向かいまたは絶対的結果を達成もしくは回避することはあるにしても極めてまれであることは、生物学分野における当業者には明らかである。従って、本明細書において「実質的に」という用語が使用されることにより、多くの生物学的現象および化学的現象に内在する潜在的な完全性の欠如が捕えられる。
【００３６】
〜に感受性のある（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ  ｔｏ）：疾患、障害、もしくは状態および／または望ましくない心臓事象に「感受性のある」個体（一括して個体が心欠陥に「感受性のある」）は、疾患、障害、状態、または事象の症状に目下罹患していない、および／またはそれを示さない場合がある。いくつかの実施形態において、疾患、障害、状態、または事象（例えば、心欠陥）に罹患している個体は、以下のうちの一つまたは複数により特徴づけることができる：（１）疾患、障害、状態、および／または事象の発症に関連する遺伝子変異；（２）疾患、障害、状態、および／または事象の発症に関連する遺伝子多型；（３）疾患、障害、状態、および／または事象に関連するタンパク質の発現および／または活性の増加および／または減少；（４）疾患、障害、状態、および／または事象の発症に関連する習性および／または生活習慣；（５）疾患、障害、状態、および／または事象の家族歴；（６）特定の微生物への応答；（７）特定の化学物質への暴露。いくつかの実施形態において、疾患、障害、状態、または事象に感受性のある個体は、その疾患、障害、状態、および／または事象を発症する。いくつかの実施形態において、疾患、障害、状態、または事象に感受性のある個体は、その疾患、障害、状態、および／または事象を発症しない。
【００３７】
〜に罹患している（ｓｕｆｆｅｒｉｎｇ  ｆｒｏｍ）：疾患、障害、もしくは状態に「罹患している」、および／または望ましくない心臓事象（個体が心欠陥に「感受性のある」心臓事象も含める）に「罹患している」個体は、その疾患、障害、状態、または事象の一つまたは複数の症状を有すると目下診断されている、および／またはそれを目下示している。
【００３８】
治療有効量：本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、いかなる内科療法にも適用可能な適切なリスク・利益比で治療対象に治療効果を与える、ミクロビオームを変化させる作用因子の量を指す。治療効果は、客観的（すなわち、いくつかの試験またはマーカーにより測定可能）であっても主観的（すなわち、対象が効果の徴候を示す、またはそれを感じる）であってもよい。具体的には、「治療有効量」は、例えば、疾患に伴う症状の回復によって、疾患発症の予防もしくは遅延によって、および／または疾患症状の重症度もしくは頻度の軽減によっても、目的の疾患もしくは状態を治療、改善、もしくは予防する、または検出可能な治療効果もしくは予防効果を示すのに有効な治療薬の量を指す。治療有効量は、複数の単位用量を含み得る投与計画において通常投与される。いかなる特定の治療薬においても、治療有効量（および／または有効な投与計画内の適切な単位用量）は、例えば、投与経路に応じて、他の薬剤との組み合わせに応じて、変化し得る。また、いかなる特定の患者においても、特定の治療有効量（および／または単位用量）は、種々の要素、例えば、治療されている障害は何か；障害の重症度；使用される特定の薬剤の活性；使用される特定の組成物；患者の年齢、体重、全体的な健康、性別および食事；投与時期、投与経路；治療期間；等、並びに医療分野において周知の要素にも依存し得る。
【００３９】
転写物：本明細書で使用される場合、「転写物」という用語は、転写された、あるいはスプライシング等の一つまたは複数のステップでプロセシングされた、分子を指す。
【００４０】
単位用量：「単位用量」という用語は、本明細書で使用される場合、典型的には投与計画と関連して、医薬品の独立した投与を指す。
【００４１】
［ある特定の実施形態の詳細な説明］
心欠陥
心欠陥は世界的に病気および死亡の主な原因である。本明細書に記載される場合、心欠陥は、心臓および／または血管に関与する疾患、障害、状態、および／または望ましくない事象から生じ得る。多くの実施形態において、心欠陥は、心臓および／または冠動脈の生理機能における変化に関係する、および／またはそれに起因する。いくつかの実施形態において、心欠陥は、狭心症、アテローム性動脈硬化、心不整脈、心筋症、うっ血性心不全、冠動脈心疾患、心内膜炎、高血圧性心疾患、虚血性心疾患、虚血、虚血／再灌流障害、左室肥大、心筋梗塞、心筋炎、再灌流障害、脳卒中、および／または心臓突然死等の、心臓の疾患または事象から生じる、および／またはそれに関連する。いくつかの実施形態において、心疾患は自然発生的なものである。いくつかの実施形態において、心疾患は人為的に誘発されたものである。
【００４２】
アテローム性動脈硬化および冠動脈心疾患
心欠陥の多くの形態は、アテローム性動脈硬化に起因するか、またはそれから生じる。アテローム性動脈硬化は、コレステロール等の脂肪質の蓄積の結果として動脈壁が肥厚している状態である。動脈壁上への脂肪質の沈着は持続性の免疫応答を誘発し、その結果プラーク形成および狭窄がもたらされる。この免疫応答は、コレステロール蓄積領域への血小板および単球の誘引によって特徴づけられる。その後、単球は泡沫細胞へと分化し、泡沫細胞は高含量の内部脂質小胞を有する。泡沫細胞が死ぬと、免疫応答がさらに誘発され、より多くの免疫細胞が動員され、その結果、死んだ、高含量の脂質を有する免疫細胞が蓄積された領域、すなわちプラークが生じる。狭窄、すなわち動脈の狭小化は、プラークの破綻と修復の繰り返しによって生じ得る。
【００４３】
冠動脈心疾患は、心臓および冠動脈における重度のアテローム性動脈硬化を述べている。冠動脈心疾患では、アテローム性動脈硬化により引き起こされたプラークの発達が、心臓領域への血流の減少をもたらす。
【００４４】
冠動脈心疾患の症状としては、限定はされないが、狭心症、息切れ、心拍増加、脱力感もしくは眩暈感、発汗および／または悪心、並びにそれらのあらゆる組み合わせが挙げられる。アテローム性動脈硬化および冠動脈心疾患に付随する動脈の状態が、個体を種々の心臓状態（例えば心筋梗塞）に罹患させることは、当該技術分野において一般に理解される。
【００４５】
冠動脈心疾患を診断するための現在の方法としては、理学的検査、血液検査、足関節・上腕血圧指数、ＣＴスキャン、血管造影、心電図検査、ストレステスト、および／または心エコーが挙げられる。
【００４６】
理学的検査において、聴診器を使用することで、プラークの蓄積による血流不足を示す異常な心音を検出することができる。脈拍の弱さまたは脈拍がないことは、動脈が遮断されている徴候であり得る。
【００４７】
冠動脈疾患のための血液検査としては、限定はされないが、Ｃ反応性タンパク質、フィブリノーゲン、ホモシステイン、コレステロール、リポ蛋白（ａ）、および／もしくはナトリウム利尿ペプチドまたはそれらの組み合わせの検査が挙げられる。
【００４８】
足関節・上腕血圧指数は、血液がどれだけ良く流れているかを検査するため、患者の足首における血圧および腕における血圧を比較する。
【００４９】
コンピューターで作成される画像によって、ＣＴスキャンは大動脈の硬化および狭小化を示すことができる。
【００５０】
血管造影では、色素およびＸ線を使用することで、動脈内のプラークが可視化される。
【００５１】
心電図検査は心臓の電気的活動を記録する。心電図検査は、患者の心臓がいかに速く鼓動しているか、およびそのリズム（一様か不規則か）を示す。心拍動の不規則性または上昇は、動脈の狭小化を示し得る。
【００５２】
ストレステストは、例えば、ストレス下の心機能を検査するための心電図検査等の検査を行いつつ、患者をトレッドミル上で歩かせるかまたは走らせることにより、患者の心臓に対しストレスを誘導することを含む。
【００５３】
心エコーでは、音波を使用することで、心臓の大きさおよび形に関する情報を与える動画が作成され、さらに、心室および心臓弁がどれだけ良く作動しているか、並びに血流が不足している領域が示される。
【００５４】
アテローム性動脈硬化および冠動脈心疾患の危険因子としては、限定はされないが、高脂血症、Ｃ反応性タンパク質のレベル上昇、ビタミンＢ６欠乏症、真性糖尿病、食事、不活動状態、肥満、ストレス、高血圧症、喫煙、性別（例えば、男性）、年齢、家族歴、および／または薬物使用が挙げられる。
【００５５】
アテローム性動脈硬化および冠動脈心疾患の治療としては、限定はされないが、生活習慣の変化が挙げられる。生活習慣の変化としては、限定はされないが、身体活動性の向上、禁煙、飲酒量の制限、健康体重の維持、および飽和脂肪の少ない食事の消費が挙げられる。また、アテローム性動脈硬化および冠動脈心疾患の治療としては、限定はされないが、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、抗不整脈薬、抗血小板薬、アスピリン、β遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、ジゴキシン、利尿薬、スタチン系薬剤、血栓溶解薬、および／もしくは血管拡張薬（例えばニトログリセリン）を含む薬物、またはそれらの組み合わせによる治療も挙げられる。重症の冠動脈心疾患における治療には、限定はされないが、外科的処置も含まれる。外科的処置としては、限定はされないが、血管形成術、ステントの挿入、冠動脈バイパス、および／もしくは心臓移植、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００５６】
高脂血症を有する患者において、高脂血症に対して患者を治療することにより、アテローム性動脈硬化および冠動脈心疾患をさらに治療することができる。高脂血症の治療としては、本開示に記載される生活習慣の変化、およびスタチン系薬剤を含むがこれに限定はされない薬物療法が挙げられる。
【００５７】
真性糖尿病を有する患者において、真性糖尿病に対して患者を治療することにより、アテローム性動脈硬化および冠動脈心疾患をさらに治療することができる。真性糖尿病の治療としては、本開示に記載される生活習慣の変化、並びにαグルコシダーゼ阻害剤、ビグアナイド類、ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤、もしくは麦角アルカロイド類、インスリン、メグリチニド類、スルホニル尿素類、および／もしくはチアゾリジンジオン類、またはそれらの組み合わせを含むがこれに限定はされない薬物療法が挙げられる。
【００５８】
高血圧症を有する患者において、高血圧症に対して患者を治療することにより、アテローム性動脈硬化および冠動脈心疾患をさらに治療することができる。高血圧症の治療としては、本開示に記載される生活習慣の変化、並びにα遮断薬、α−β遮断薬、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、β遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、中枢作用薬（ｃｅｎｔｒａｌ−ａｃｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、レニン阻害薬、チアジド系利尿薬、および／もしくは血管拡張薬またはこれらの組み合わせを含むがこれに限定はされない薬物療法が挙げられる。
【００５９】
心筋梗塞
心筋梗塞（ＭＩ）は、米国において、および世界的に大部分の先進国においても、主な死因となっている。心筋梗塞は、心血流が減少および／または遮断され、その結果、心筋細胞が傷害および／または死滅した場合に生じる（心筋梗塞）。当該技術分野においては一般的に理解されることであるが、心筋梗塞は、しばしばアテローム性動脈硬化および／または冠動脈心疾患によって引き起こされるが、しばしばアテローム性動脈硬化および／または冠動脈心疾患の最初の自覚症状（ｎｏｔｉｃｅｄ  ｓｙｍｐｔｏｍ）にもなる。アテローム性動脈硬化および／または冠動脈心疾患によるプラークが破裂すると、プラークは血流を遮断し得る血餅を形成し得る。心血流が逆流すると、再灌流障害が引き起こされ得る。動物モデルにおける研究では、再灌流障害は心筋梗塞の最終的な大きさの最大５０％を占めることが示されている。
【００６０】
解剖学的に、心筋梗塞は２つのタイプ、すなわち壁内心筋梗塞および非貫壁性心筋梗塞のうちの１つとして現れる。壁内心筋梗塞は、患部心筋の全層および／または心内膜から虚血心筋を介して心外膜まで広がる区域の虚血性壊死によって特徴づけられる。非貫壁性心筋梗塞は、心筋壁区域（複数可）の全層までは及ばない、虚血性壊死の領域と定義される。非貫壁性心筋梗塞において、虚血性壊死の領域は、心内膜に、または心内膜および虚血心筋に限定される。
【００６１】
心筋梗塞はまた、虚血の特徴に応じて６つのタイプのうちの１つに分類される。１型は、原発性冠動脈イベント（例えば、プラーク破綻、血栓性閉塞）による虚血に関連する自発性心筋梗塞である。２型は需要と供給のミスマッチによる虚血に続発する。３型は心臓突然死をもたらす心筋梗塞である。４ａ型は経皮的冠動脈形成術に伴う心筋梗塞である。４ｂ型はステント内血栓症に伴う。５型は冠動脈バイパス外科手術に伴う心筋梗塞である。
【００６２】
心筋梗塞の症状としては、限定はされないが、胸部の圧迫感（ｃｈｅｓｔ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｈｅａｖｉｎｅｓｓ）および／または疼痛、左腕および／または右腕の疼痛、下顎の疼痛、頸部の疼痛、背痛、上胃部の疼痛、レビン徴候（Ｌｅｖｉｎｅ’ｓ  ｓｉｇｎ）、胸やけのような感覚、発汗、悪心、嘔吐、眩暈感、意識朦朧、脱力感、疲労、睡眠障害、不安、息切れ、心臓動悸が挙げられる。心筋梗塞のおよそ４分の１が症状無しで現れる。
【００６３】
心筋梗塞を診断するための現在の方法としては、限定はされないが、心電図検査、血液検査および／または心エコーが挙げられる。
【００６４】
通常は心筋梗塞に伴って電気的活動における異常が生じるため、心電図検査によって、酸欠状態である心筋領域および／または死んだ心筋領域を特定することができる。心電図検査の１つの利点は、迅速な診断手段であることである。しかし、患者が非定型的兆候を示す、または異常な電気的パターンを有する場合、心電図検査による診断は困難となり得る。
【００６５】
心筋梗塞診断のための血液検査は、心筋酵素の存在についてアッセイする。心筋梗塞の間、死滅する心筋により心筋酵素が血流中に放出される。アッセイされる酵素としては、限定はされないが、クレアチンキナーゼ、トロポニンＩ、トロポニンＴ、および／もしくはミオグロビンまたはそれらの組み合わせが挙げられる。これらの酵素は、典型的に、心筋梗塞後に数時間増加する。
【００６６】
心エコーは心筋の傷害領域を検出することができる。しかし、心エコーは最近の事象と過去の事象を区別することができず、異常は心筋梗塞以外の状態も示し得る。
【００６７】
心筋梗塞の危険因子はアテローム性動脈硬化および冠動脈心疾患の危険因子と類似している。危険因子としては、限定はされないが、アテローム性動脈硬化、冠動脈心疾患、高脂血症、真性糖尿病、食事、不活動状態、肥満、ストレス、高血圧症、喫煙、性別（例えば、男性）、高齢、家族歴、および／または薬物使用が挙げられる。
【００６８】
心筋梗塞のリスクを低減するための現在の方法には、心筋梗塞の原因および／または心筋梗塞の危険因子の治療が含まれる。いくつかの実施形態において、心筋梗塞の原因および／または心筋梗塞の危険因子の治療は、本開示に記載される生活習慣の変化を含む。いくつかの実施形態において、心筋梗塞の原因および／または心筋梗塞の危険因子の治療は、本開示に記載されるアテローム性動脈硬化、および／または冠動脈心疾患の治療を含む。いくつかの実施形態において、心筋梗塞の原因および／または心筋梗塞の危険因子の治療は、本開示に記載される高脂血症の治療を含む。いくつかの実施形態において、心筋梗塞の原因および／または心筋梗塞の危険因子の治療は、本開示に記載される真性糖尿病の治療を含む。いくつかの実施形態において、心筋梗塞の原因および／または心筋梗塞の危険因子の治療は、本開示に記載される高血圧症の治療を含む。
【００６９】
心筋梗塞を治療するための現在の方法としては、血小板凝集抑制剤の投与による血餅部位での血小板蓄積の防止、酸素療法による損傷組織への酸素運搬の増加、および／または硝酸塩の投与が挙げられる。硝酸塩は血管拡張薬（ｖａｓｏｄｉａｌａｔｏｒ）として作用する。
【００７０】
心筋梗塞による長期的影響は、心筋梗塞の重症度および損傷した心臓組織の大きさに依存する。長期的影響には、限定はされないが、動脈瘤のリスク増加、心外膜炎、狭心症のリスク増加、うっ血性心不全、浮腫、うつ病、性的欲求消失および／もしくは勃起不全のリスク増加、後の心筋梗塞事象および／もしくは肥大心のリスク増加、またはそれらの組み合わせが含まれ得る。
【００７１】
心筋梗塞の動物モデル
動物モデルにおいて心筋梗塞を研究する１つの方法は、虚血／再灌流を心筋梗塞時に生じるように人為的に引き起こし、次に、生じた梗塞を測定し、さらに、心筋梗塞の重症度の指標である、虚血前の最大左心室圧（ＬＶＤＰ）と比較したＬＶＤＰとして、機械的機能の回復を測定することによるものである。虚血／再灌流を引き起こす技術は、インビボでは、例えば、“Ｋ（ＡＴＰ）  ｏｐｅｎｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｅｌａｙｅｄ  ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ：  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｋ（ＡＴＰ）  ｃｈａｎｎｅｌｓ，  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌｓ  ａｎｄ  ＭＥＫ１／２”（Ｇｒｏｓｓ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ３５，  ９８５−９９２，  ２００３）に記載されているように、当該技術分野においては周知である。虚血／再灌流を引き起こす技術は、インビトロでは、例えば、“Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｉｎ  ｆｉｖｅ  ｒａｔ  ｓｔｒａｉｎｓ：  ｉｓ  ｔｈｅｒｅ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ？”（Ｂａｋｅｒ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ２０００）に記載されているように、当該技術分野において周知である。
【００７２】
脳卒中
最も一般的な脳卒中の２つは、虚血性脳卒中および出血性卒中である。虚血性脳卒中では、脳への酸素流量の不足によって脳組織のアポトーシスおよび壊死がもたらされ、それが梗塞を引き起こし得る。心血管虚血（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）と同様に、脳虚血は、血餅、血栓症、塞栓症、動脈硬化巣による閉塞、または脈管構造における他の閉塞等の種々の要因によって引き起こされ得る。特に、高コレステロール血症、高血圧症、糖尿病、および肥満は、虚血性脳卒中の危険因子とされている。虚血性脳卒中は世界的に見てヒトの主な死因である。
【００７３】
出血性卒中は、全脳卒中の約１０〜２０％を占め、典型的には脳内の血管破裂によって引き起こされる。破裂によって脳に出血が起こり、その場所で、蓄積した血液が周囲の神経組織に傷害を与え得る。
【００７４】
脳卒中エピソードは、その原因にかかわらず、特に閉塞または出血の場所で神経細胞死をもたらす。さらに、脈管構造内の脳卒中エピソードの後に起こる生化学反応は、浮腫、出血性変化、および神経組織におけるさらなる損傷（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）をもたらし得る。脳卒中によりもたらされる神経学的損傷およびニューロン細胞死は、個体を肉体的にも精神的にも消耗させるものであり得る。特に、脳卒中は感情制御、認識、感覚認識、発声、聴覚（ｈｅａｒｉｎｇ）、視覚（ｖｉｓｉｏｎ）、認知、動作および運動性の問題をもたらし、麻痺を引き起こし得る。
【００７５】
ミクロビオーム
人体は典型的に、人体が有するヒト細胞よりも１０倍多い微生物細胞（特に細菌細胞）を含有する。そのような微生物の多くまたはほとんどは、それらのヒト宿主に対して無害であるか、または有益でさえある。研究により、そのような微生物がヒトの健康の維持および／または促進において重要な役割を担っていることが次第に明らかにされている。胃腸細菌は充分に研究された一例である。これらの細菌は、種々の重要な機能、例えば、限定はされないが、炭水化物消化の補助、腸細胞の成長制御、病原性微生物の増殖抑制、腸管粘膜免疫の発達促進、発癌物質の代謝、並びにアレルギーおよび炎症性腸疾患の防止を提供すると考えられている。
【００７６】
特定の環境におけるあらゆるタイプのおよび大量の微生物が、ミクロビオームを構成する。微生物ほぼ至る所に存在するため、ミクロビオームはほとんどの場所に存在する。いくつかの実施形態において、ミクロビオームは、あらゆる定義済みの場所（ｄｅｆｉｎｅｄ  ｌｏｃａｔｉｏｎ）に関連する微生物を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームは、生体、または特定の部位、器官、組織、またはその成分に関連する微生物を含む。いくつかの実施形態において、そのような生物は非ヒト多細胞生物である。いくつかの実施形態において、そのような生物は動物である。いくつかの実施形態において、動物はマウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、雌ウシ、ヤギ、ヒツジ、カエル、魚および／またはブタである。いくつかの実施形態において、動物は非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態において、生物はヒトである。
【００７７】
ミクロビオームの含有量（例えば、存在する微生物のタイプおよび／または存在量）および／または挙動（例えば、一つまたは複数のマーカーの産生、呼吸および／または増殖の速度、移住の程度等）は局所環境によって形作られ得；いくつかの実施形態においては；単一の生物が、例えばそれらの身体内の様々な場所またはそれらの身体の様々な部位で、複数の異なるミクロビオームを含む。ヒトミクロビオームプロジェクト（ｈｕｍａｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ｐｒｏｊｅｃｔ）（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｍｍｏｎｆｕｎｄ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｈｍｐ／）は、人体の様々な異なる部位（例えば、鼻腔、口腔、皮膚、胃腸管、および尿生殖路）に存在する微生物群の特徴づけを行っている。いくつかの実施形態において、本発明に従って使用されるミクロビオームは、生物の身体の特定の部位または場所（例えば、組織または器官）に関連するミクロビオームである。いくつかの実施形態において、ミクロビオームは皮膚に関連する微生物を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームは歯に関連する微生物を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームは口腔粘膜に関連する微生物を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームは鼻腔に関連する微生物を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームは泌尿生殖器系に関連する微生物を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームは胃腸管に関連する微生物を含む。
【００７８】
いくつかの実施形態において、ミクロビオームは単一の微生物を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームは１〜１兆以上の個々の微生物を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームは１種の微生物を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームは１〜１００万種以上の微生物を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームは５００〜５，０００種の微生物を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームは１０００〜２，０００種の微生物を含む。腸内に存在する微生物の種類は一般的に、門、綱、目および科のレベルで記述される。いくつかの実施形態において、１０００〜１５００種の細菌が胃腸管ミクロビオームに存在する。
【００７９】
ミクロビオーム変化
本発明により、ミクロビオームの組成および／または活動が、より具体的にはミクロビオームの組成および／または活動における変化が、特定の環境条件に関する、特に宿主生物の健康状態に関する、情報源となり得ることが教示される。本明細書において提供される本発明には、ミクロビオームの組成および／または活動が、心欠陥のリスクおよび／または心欠陥の特定の影響のリスクと相関関係にある、検出可能で且つ再現性のある様式で変化し得るという発見も包含される。
【００８０】
いくつかの実施形態において、ミクロビオームの組成および／または活動における変化は、ミクロビオームにおける一種もしくは複数種の微生物の、並びに／またはそれらにより産生される１つもしくは複数の成分の、存在量および／または種類におけるいかなる変化をも含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームの組成および／または活動における変化は、ミクロビオームにおける一種もしくは複数種の微生物の、またはそれらにより産生される１つもしくは複数の成分の、存在量における増加を含む。あるいはまたはさらに、いくつかの実施形態において、ミクロビオームの組成および／または活動における変化は、ミクロビオームにおける一種もしくは複数種の微生物の、および／またはそれらにより産生される１つもしくは複数の成分の、存在量における減少を含む。いくつかの実施形態において、ミクロビオームの組成および／または活動における変化は、一種もしくは複数種の微生物の、および／またはそれらから産生される成分の、存在量における増加を含み、並びに、ミクロビオームにおける一種もしくは複数種の微生物の、および／またはそれらから産生される成分の、存在量における減少も含む。
【００８１】
本発明に従って、心欠陥の範囲および／または程度と相関するミクロビオーム変化が、特定、特徴づけ、および／または検出される。いくつかの実施形態において、そのような変化の分析は、ミクロビオームの組成および／または活動における一つまたは複数の他の変化の影響を、調整および／または減ずることを含む。
【００８２】
ミクロビオームの組成および／または活動は、宿主生物の外側または内側の事象によって、検出可能な程度に変化させることができる。例えば、個体による抗生剤の経口摂取は、それらの胃腸内ミクロビオームの組成および／または活動を劇的に変化させ得る。
【００８３】
いくつかの実施形態において、ミクロビオームの組成および／または活動における変化は、宿主生物における疾患に応答して生じる。いくつかの実施形態において、ミクロビオームの組成および／または活動における変化は、病原菌の宿主生物への感染に応答して生じる。いくつかの実施形態において、ミクロビオームの組成および／または活動における変化は、宿主生物の食事の変化に応答して生じる。いくつかの実施形態において、ミクロビオームの組成および／または活動における変化は、宿主生物の水の供給源における変化に応答して生じる。いくつかの実施形態において、ミクロビオームの組成および／または活動における変化は、宿主生物の環境における変化（例えばヒトは新しい都市または国に移る場合がある）に応答して生じる。いくつかの実施形態において、ミクロビオームの組成および／または活動における変化は、宿主生物の個人衛生習慣における変化に応答して生じる。いくつかの実施形態において、ミクロビオームの組成および／または活動における変化は、宿主生物の体重における変化に応答して生じる。いくつかの実施形態において、ミクロビオームの組成および／または活動における変化は、宿主生物の年齢の変化に応答して生じる。いくつかの実施形態において、ミクロビオームの組成および／または活動における変化は、宿主生物の化学物質への暴露における変化に応答して生じる。
【００８４】
いくつかの実施形態において、ミクロビオームの組成および／または活動における変化は、ミクロビオームを変化させる作用因子への暴露に応答して生じる。
【００８５】
微生物の特性
本発明は、微生物の特性が、ミクロビオームの組成および／または活動の代用物として信頼して用い得るという認識を包含する。微生物の特性は、ミクロビオームの組成および／または活動を示すデータポイントを含む。従って、本発明によれば、ミクロビオームにおける変化は、微生物の特性の一つまたは複数の特徴の検出を通じて、検出および／または分析することができる。
【００８６】
いくつかの実施形態において、微生物の特性には、一種もしくは複数種の微生物および／またはそれらの産生物の絶対量に関する情報が含まれる。いくつかの実施形態において、微生物の特性には、一種もしくは複数種の微生物および／またはそれらの産生物の相対量に関する情報が含まれる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、微生物の特性には、少なくとも一種の微生物の存在、レベル、および／または活性に関する情報が含まれる。いくつかの実施形態において、微生物の特性には、１〜１０種の微生物の存在、レベル、および／または活性に関する情報が含まれる。いくつかの実施形態において、微生物の特性には、１〜１００種の微生物の存在、レベル、および／または活性に関する情報が含まれる。いくつかの実施形態において、微生物の特性には、１〜１０００種以上の微生物存在、レベル、および／または活性に関する情報が含まれる。いくつかの実施形態において、微生物の特性には、ミクロビオーム内の実質的に全種の微生物の存在、レベル、および／または活性に関する情報が含まれる。
【００８８】
いくつかの実施形態において、微生物の特性は、あるレベルの、またはある一連のレベルの、一種もしくは複数種の微生物もしくは構成要素またはそれらの産生物を含む。いくつかの実施形態において、微生物の特性は、あるレベルの、またはある一連のレベルの、一つまたは複数のＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態において、微生物の特性は、あるレベルの、またはある一連のレベルの、一つまたは複数の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態において、微生物の特性は、あるレベルの、またはある一連のレベルの、一つまたは複数の１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態において、微生物の特性は、あるレベルの、またはある一連のレベルの、一つまたは複数のＲＮＡ転写物を含む。いくつかの実施形態において、微生物の特性は、あるレベルの、またはある一連のレベルの、一つまたは複数のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、微生物の特性は、あるレベルの、またはある一連のレベルの、一つまたは複数の微生物の代謝産物を含む。
【００８９】
１６Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列は、それぞれ原核生物リボソームおよび真核生物リボソームの小サブユニット成分をコードする。ｒＲＮＡ遺伝子は微生物の種類を区別するのに特に有用であるが、それは、これらの遺伝子の配列は微生物の種によって異なるが、これらの遺伝子がプライマー結合に関する高度に保存された領域を有するからである。この保存されたプライマー結合領域間の特異性により、様々な微生物種のｒＲＮＡ遺伝子を１対のプライマーを用いて増幅させ、その後、増幅された配列により区別することが可能となる。
【００９０】
本発明による方法において、微生物の特性は微生物叢試料を用いて入手および／または決定される。微生物叢試料は、ミクロビオームから得られた、微生物および／もしくは構成要素またはそれらの産生物の試料を含む。
【００９１】
いくつかの実施形態において、微生物叢試料は、ミクロビオームの微生物もしくは構成要素またはそれらの産生物の回収を可能とし、適切なミクロビオーム源に適合するいかなる手段によっても、採取することができる。例えば、胃腸管の微生物叢試料が得られる場所は、糞便試料からである。
【００９２】
微生物レベルの定量
本発明に従う方法において、微生物の特性は、微生物レベルを定量することにより、入手および／または決定することができる。様々な微生物種のレベルを定量する方法は、本明細書に記載される。
【００９３】
いくつかの実施形態において、一種もしくは複数種の微生物もしくは構成要素またはそれらの産生物のレベルまたは一連のレベルの決定は、一つまたは複数のＤＮＡ配列のレベルまたは一連のレベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、一つまたは複数のＤＮＡ配列は、様々な微生物種を区別するために使用することができるいかなるＤＮＡ配列をも含む。ある特定の実施形態において、一つまたは複数のＤＮＡ配列は１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を含む。ある特定の実施形態において、一つまたは複数のＤＮＡ配列は１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態において、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１，０００、５，０００またはそれより多い配列が増幅される。
【００９４】
いくつかの実施形態において、微生物叢試料は、一つまたは複数のＤＮＡ配列のレベルまたは一連のレベルについて直接的にアッセイされる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡが微生物叢試料から単離され、単離されたＤＮＡが一つまたは複数のＤＮＡ配列のレベルまたは一連のレベルについてアッセイされる。微生物ＤＮＡの単離法は当該技術分野において周知である。例としては、限定はされないが、フェノール−クロロホルム抽出および種々様々な市販キット（例えばＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社、カリフォルニア州バレンシア））が挙げられる。
【００９５】
いくつかの実施形態において、一つまたは複数のＤＮＡ配列のレベルまたは一連のレベルは、ＰＣＲ（例えば、標準的なＰＣＲ、半定量的ＰＣＲ、または定量的ＰＣＲ）を用いてＤＮＡ配列を増幅することにより決定される。いくつかの実施形態において、一つまたは複数のＤＮＡ配列のレベルまたは一連のレベルは、定量的ＰＣＲを用いてＤＮＡ配列を増幅することにより決定される。これらおよび他の基本的なＤＮＡ増幅法は、当業者に周知であり、Ａｕｓｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ，  Ｂｒｅｎｔ  Ｒ，  Ｋｉｎｇｓｔｏｎ  ＲＥ，  Ｍｏｏｒｅ  ＤＤ，  Ｓｅｉｄｍａｎ  ＪＧ，  Ｓｍｉｔｈ  ＪＡ，  Ｓｔｒｕｈｌ  Ｋ  （ｅｄｓ）．  １９９８．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｗｉｌｅｙ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されている。
【００９６】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ配列は、個々の微生物種を他の異なる微生物種と識別する、一つまたは複数の配列に特異的なプライマーを用いて増幅される。いくつかの実施形態において、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列またはそれらの断片は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に特異的なプライマーを用いて増幅される。いくつかの実施形態において、１８Ｓ  ＤＮＡ配列は、１８Ｓ  ＤＮＡ配列に特異的なプライマーを用いて増幅される。いくつかの実施形態において、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列は、図２に示されるプライマー配列を用いて増幅される。
【００９７】
いくつかの実施形態において、一つまたは複数の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列のレベルまたは一連のレベルは、フィロチップ（ｐｈｙｌｏｃｈｉｐ）技術を用いて決定される。フィロチップ（ｐｈｙｌｏｃｈｉｐ）の使用は当該技術分野において周知であり、Ｈａｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （“Ｄｅｅｐ−ｓｅａ  ｏｉｌ  ｐｌｕｍｅ  ｅｎｒｉｃｈｅｓ  ｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓ  ｏｉｌ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ．”  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３３０，  ２０４−２０８，  ２０１０）（その全体が参照によって組み込まれる）に記載されている。簡潔に説明すると、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列が、微生物叢試料から抽出されたＤＮＡから増幅および標識される。増幅されたＤＮＡは次に、微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対するプローブを含有するアレイとハイブリッド形成される。各プローブへの結合レベルが次に定量化され、プローブされた１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に対応する微生物種の試料レベルが得られる。いくつかの実施形態において、フィロチップ（ｐｈｙｌｏｃｈｉｐ）解析は商業ベンダー（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｖｅｎｄｏｒ）によって行われる。例としては、限定はされないが、セカンドゲノム社（Ｓｅｃｏｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州サンフランシスコ）が挙げられる。
【００９８】
いくつかの実施形態において、一種もしくは複数種の微生物もしくは構成要素またはそれらの産生物のレベルまたは一連のレベルの決定は、一つまたは複数の微生物ＲＮＡ分子（例えば、転写物）のレベルまたは一連のレベルの決定を含む。ＲＮＡ転写物レベルの定量法は当該技術分野において周知であり、例えば、限定はされないが、ノーザン解析、半定量的逆転写酵素ＰＣＲ、定量的逆転写酵素ＰＣＲ、およびマイクロアレイ解析が挙げられる。これらおよび他の基本的なＲＮＡ転写物検出法は、Ａｕｓｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌに記載されている。
【００９９】
いくつかの実施形態において、一種もしくは複数種の微生物もしくは構成要素またはそれらの産生物のレベルまたは一連のレベルの決定は、一つまたは複数の微生物ポリペプチドのレベルまたは一連のレベルの決定を含む。ポリペプチドレベルの定量法は当該技術分野において周知であり、例えば、限定はされないが、ウエスタン解析および質量分析が挙げられる。これらおよび他の基本的ポリペプチド検出法は、Ａｕｓｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌに記載されている。
【０１００】
いくつかの実施形態において、一種もしくは複数種の微生物もしくは構成要素またはそれらの産生物のレベルまたは一連のレベルの決定は、一つまたは複数の微生物の代謝産物のレベルまたは一連のレベルの決定を含む。いくつかの実施形態において、代謝産物のレベルは質量分析によって決定される。いくつかの実施形態において、代謝産物のレベルは核磁気共鳴分光法によって決定される。いくつかの実施形態において、代謝産物のレベルは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定される。いくつかの実施形態において、代謝産物のレベルは比色分析によって決定される。いくつかの実施形態において、代謝産物のレベルは分光光度法によって決定される。
【０１０１】
心欠陥と相関する微生物の特性
本発明は、微生物の特性における変化が、ミクロビオームの組成および／または活動における変化の代用として、信頼して使用し得るという認識を包含する。従って、検出および／または解析されるミクロビオームにおける特定の変化は、微生物の特性の特徴を生み出す一因となる。ある特定の実施形態において、本発明は、心欠陥により影響を受けるミクロビオームの構成要素を特定することにより、心欠陥のリスクおよび／または心欠陥の特定の影響のリスクを示す微生物の特性を定義づけるための方法に関する。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、心欠陥の発症および／またはリスクの特徴と相関する微生物の特性の定義付けは、心欠陥に罹患しているもしくは罹患していない、もしくは心欠陥に罹患していたもしくは罹患したことがない個体のミクロビオーム間で異なる、または心欠陥に罹患しているもしくは罹患していた個体のミクロビオームを定義付けもしくは分類する、微生物もしくは構成要素またはそれらの産生物の種類を特定することを可能にするいかなる方法をも含む。いくつかの実施形態において、心欠陥の発症および／またはリスクの特徴と相関する微生物の特性の定義付けは、以下を含む：第一の微生物叢試料集合における一種もしくは複数種の微生物もしくは構成要素またはそれらの産生物の第一のレベルセットを決定すること、ここで第一の微生物叢試料集合における各微生物叢試料は心欠陥の発症および／またはリスクの共通の特徴を共有している；第二の微生物叢試料集合における一種もしくは複数種の微生物もしくは構成要素またはそれらの産生物の第二のレベルセットを決定すること、ここで、第二の微生物叢試料集合は心欠陥の発症および／またはリスクの共通の特徴を共有していないが、それ以外では第一セットの微生物叢試料と同等である；並びに、心欠陥の発症および／またはリスクの共通の特徴の存在または不在と相関する、第一または第二のセットに含まれるレベルを含む微生物の特性を特定すること。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、微生物叢試料の集合は、少なくとも１つの微生物叢試料を含む。いくつかの実施形態において、微生物叢試料は、１、２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、もしくは１，０００またはそれより多い試料を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、第一および第二の微生物叢試料集合は、心欠陥の発症および／またはリスクの特徴において異なっているが、それ以外では同等である、あらゆる２つの微生物叢試料集合である。いくつかの実施形態において、第一および第二の微生物叢試料集合は、異なる宿主生物から得られる。いくつかの実施形態において、第一および第二の微生物叢試料集合は、異なる時点での同一の宿主集合から得られる。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、心欠陥の発症および／またはリスクの特徴は、本明細書に記載の方法により、その特徴を共有する宿主生物から得られた微生物叢試料を、その特徴を共有しない宿主生物から得られた微生物叢試料と区別することを可能にする、心欠陥の発症および／またはリスクのいかなる特徴をも含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、心欠陥の発症および／またはリスクの特徴は、試料が採取される宿主生物における心欠陥の発症を含む。いくつかの実施形態において、心欠陥の発症は、いかなる心欠陥の発症をも含む。いくつかの実施形態において、心欠陥の発症は、アテローム性動脈硬化を含む。いくつかの実施形態において、心欠陥の発症は、冠動脈心疾患に罹患することを含む。いくつかの実施形態において、心欠陥の発症は、心筋梗塞に罹患したことを含む。いくつかの実施形態において、心欠陥の発症は、心筋梗塞事象に単回罹患したことを含む。いくつかの実施形態において、心欠陥の発症は、心筋梗塞事象に２、３、４、５、６、７、８、９、１０回またはそれより多く罹患したことを含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、心欠陥の発症および／またはリスクの特徴は、試料が採取される宿主生物における心筋梗塞の発症の特徴を含む。いくつかの実施形態において、心筋梗塞の発症の特徴は、心筋梗塞によりもたらされる医学的状態を含む。いくつかの実施形態において、心筋梗塞の発症の特徴は、動脈瘤を含む。いくつかの実施形態において、心筋梗塞の発症の特徴は心外膜炎を含む。いくつかの実施形態において、心筋梗塞の発症の特徴は、うっ血性心不全を含む。いくつかの実施形態において、心筋梗塞の発症の特徴は、狭心症を含む。いくつかの実施形態において、心筋梗塞の発症の特徴は、浮腫を含む。いくつかの実施形態において、心筋梗塞の発症の特徴は、うつ病を含む。いくつかの実施形態において、心筋梗塞の発症の特徴は、性的欲求の喪失または勃起不全を含む。いくつかの実施形態において、心筋梗塞の発症の特徴は、肥大心を含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、心欠陥の発症および／またはリスクの特徴は、試料が採取される宿主生物における心欠陥のリスクの特徴を含む。いくつかの実施形態において、心欠陥のリスクの特徴は、本明細書に記載の方法により、その特徴を共有する宿主生物から得られた微生物叢試料を、その特徴を共有しない宿主生物から得られた微生物叢試料と区別することを可能にする、心欠陥のリスクのいかなる特徴をも含む。いくつかの実施形態において、心欠陥のリスクの特徴は、心欠陥の危険因子を含む。いくつかの実施形態において、心欠陥のリスクの特徴は、アテローム性動脈硬化および／または冠動脈心疾患の危険因子を含む。いくつかの実施形態において、心欠陥のリスクの特徴は、心筋梗塞の危険因子を含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、心欠陥のリスクの特徴は、第二の微生物叢試料セットが採取される宿主生物と比較した場合の、第一の微生物叢試料セットが採取される宿主生物における虚血／再灌流障害への罹病性の変化を含む。いくつかの実施形態において、虚血／再灌流障害への罹病性の変化は、虚血／再灌流障害への罹病性に影響を与えることが知られている遺伝子変異または遺伝的背景を含む。いくつかの実施形態において、虚血／再灌流障害への罹病性に影響を与えることが知られている遺伝的背景は、シトクロムｐ４５０における変異を含む。いくつかの実施形態において、虚血／再灌流障害への罹病性の変化は、虚血／再灌流障害への罹病性に影響を与えることが知られているミクロビオームを変化させる作用因子への暴露を含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、虚血／再灌流障害への罹病性の変化は、第二の微生物叢試料セットが採取される宿主生物における梗塞サイズと比較した場合の、第一の微生物叢試料セットが採取される宿主生物における心筋梗塞のサイズの変化を含む。いくつかの実施形態において、心筋梗塞のサイズの変化は、０〜１０００％の心筋梗塞サイズにおける増加を含む。いくつかの実施形態において、心筋梗塞のサイズの変化は、１〜１００％の心筋梗塞サイズにおける増加を含む。いくつかの実施形態において、心筋梗塞のサイズの変化は、１０〜５０％の心筋梗塞サイズにおける増加を含む。いくつかの実施形態において、心筋梗塞のサイズの変化は、０〜１０００％の心筋梗塞サイズにおける減少を含む。いくつかの実施形態において、心筋梗塞のサイズの変化は、１〜１００％の心筋梗塞サイズにおける減少を含む。いくつかの実施形態において、心筋梗塞のサイズの変化は、１０〜５０％の心筋梗塞サイズにおける減少を含む。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、虚血／再灌流障害への罹病性の変化は、第二の微生物叢試料セットが採取される宿主生物における心拍出量と比較した場合の、第一の微生物叢試料セットが採取される宿主生物における心拍出量の変化を含む。いくつかの実施形態において、心拍出量の変化はＬＶＤＰの変化を含む。いくつかの実施形態において、ＬＶＤＰの変化は、ＬＶＤＰにおける０〜１０００％の増加を含む。いくつかの実施形態において、ＬＶＤＰの変化は、ＬＶＤＰにおける１〜１００％の増加を含む。いくつかの実施形態において、ＬＶＤＰの変化は、ＬＶＤＰにおける１０〜５０％の増加を含む。いくつかの実施形態において、ＬＶＤＰの変化は、ＬＶＤＰにおける０〜１０００％の減少を含む。いくつかの実施形態において、ＬＶＤＰの変化は、ＬＶＤＰにおける１〜１００％の減少を含む。いくつかの実施形態において、ＬＶＤＰの変化は、ＬＶＤＰにおける１０〜５０％の減少を含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、微生物の特性の特定は、心欠陥の特徴に関連するサインを特定することを可能にするいかなる手段をも含む。いくつかの実施形態において、微生物の特性の特定は、第二の微生物叢試料集合の第二のレベルセットと比較した場合に増加および／または減少している、第一の微生物叢試料集合における第一のレベルセットにおける一つまたは複数のレベルを特定することを含む。
【０１１３】
用途
心欠陥の発症および／またはリスクの評価
本発明は、微生物の特性における変化が、心欠陥の発症および／またはリスクを特定および特徴づけするための診断ツールとして、信頼して使用できるものであるという認識を包含する。本明細書に記載の通り、世界的にみて、心欠陥は病的状態および死亡の主な原因である。従って、心欠陥のリスクおよび／または心欠陥の特定の影響のリスクを評価するためのより正確な検査が常に必要とされている。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、本発明は、心欠陥の範囲または程度と相関する参照微生物の特性を与え、心欠陥の発症および／またはリスクが特定される、または特徴づけらるべき個体から得られる微生物叢試料中に存在する微生物の特性を決定することを含む、心欠陥の発症および／またはリスクを特定および／または特徴づけする方法を提供する。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、個体は、心欠陥に罹患しているか、その危険性があるいかなる個体をも含む。いくつかの実施形態において、本発明は、心臓手術を受ける予定になっている、または心臓手術を受けた患者をモニターする方法を提供し、個体には患者が含まれる。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、参照の微生物の特性は、心欠陥の発症および／またはリスクの既知の特徴と相関しているいかなる値をも含む。いくつかの実施形態において、参照の微生物の特性は、心欠陥に罹患しておらず、且つ罹患たこともない個体から得られる微生物の特性を含む。いくつかの実施形態において、参照の微生物の特性は、既知の範囲または程度の心欠陥に罹患したことがある個体から得られる微生物の特性を含む。いくつかの実施形態において、参照の微生物の特性は、心筋梗塞に一回または複数回罹患したことがある個体から得られる微生物の特性を含む。いくつかの実施形態において、参照の微生物の特性は、母集団と比較して心欠陥のリスクが低い個体から得られる微生物の特性を含む。いくつかの実施形態において、参照の微生物の特性は、心欠陥の危険因子を有していない個体から得られる微生物の特性を含む。いくつかの実施形態において、参照の微生物の特性は、一つまたは複数の既知の心欠陥の危険因子を有する個体から得られる微生物の特性を含む。いくつかの実施形態において、参照の微生物の特性は、心欠陥の発症および／またはリスクが特定または特徴づけされる個体と同等の個体から得られる微生物の特性を含む。いくつかの実施形態において、参照の微生物の特性は、異なる時点で心欠陥の発症および／またはリスクが得られる個体から得られる微生物の特性を含む。いくつかの実施形態において、異なる時点は心欠陥の発生前に生じた。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、参照の微生物の特性は、心欠陥の発症および／またはリスクが特定されるべき個体の微生物叢試料から得られる。いくつかの実施形態において、参照の微生物の特性は、心欠陥の発症および／またはリスクに応じて実質的に変化しない、一種または複数種の微生物のレベルおよび／または活性を含む。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、本発明は、心欠陥の発症および／またはリスクを特定および／または特徴づけする方法を提供し、それらの方法は、心欠陥の範囲または程度と相関する参照の微生物の特性を提供し、心欠陥の発症および／またはリスクが特定される、または特徴づけられるべき個体から得られる微生物叢試料中に存在する微生物の特性を決定し、さらに、心欠陥の発症および／またはリスクが特定される、または特徴づけらるべき個体から得られる微生物叢試料中に存在する微生物の特性を参照の微生物の特性と比較すること、を含む。いくつかの実施形態において、心欠陥の発症および／またはリスクが特定される、または特徴づけられるべき個体から得られる微生物叢試料中の微生物の特性と参照の微生物の特性との比較は、２つの別々の個体から得られた微生物の特性の比較を含む。いくつかの実施形態において、微生物の特性の比較は、別々の時点で同一個体から得られた微生物の特性の比較を含む。いくつかの実施形態において、微生物の特性の比較は、同一微生物試料の微生物の特性の比較を含む。いくつかの実施形態において、微生物の特性の比較は、２つ以上の微生物の相対的なレベルおよび／または活性の比較を含む。いくつかの実施形態において、微生物の特性の比較は、少なくとも１つの第一の微生物（すなわち、少なくとも１つの第一の微生物のレベルおよび／または活性）が実質的に一定のままである、２つ以上の微生物の相対的なレベルおよび／または活性の比較を含む。いくつかのそのような実施形態において、微生物の特性の比較は、少なくとも１つの第二の微生物が変化する、２つ以上の微生物の相対的なレベルおよび／または活性の比較を含む。
【０１１９】
治療
宿主のミクロビオームが宿主の健康において重要な役割を果たしており、宿主のミクロビオームへの変化が宿主の健康状態を変化させ得ることはよく知られている。本発明は、個体の心欠陥の発症および／またはリスクに影響を与える方法で、個体のミクロビオームが変化され得るという認識を包含する。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、本発明は、心欠陥に罹患しているまたは感受性のある個体に対して、心欠陥の重症度またはリスクの変化と相関する様式でその個体のミクロビオームが改変されるように、組成物を投与するステップを含む、個体のミクロビオームを変化させることにより個体における心欠陥のリスクを治療または低減する方法を提供する。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、投与は、有効な（例えば、治療効果のある）あるいは望ましい量の組成物を個体に投与する、いかなる手段をも含む。いくつかの実施形態において、組成物の投与は、例えば非経口経路および非−非経口（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）経路の投与を含む、いかなる経路での投与をも含む。非経口経路としては、例えば、動脈内、脳室内、頭蓋内、筋肉内、腹腔内、胸膜内、門脈内、脊髄内、くも膜下腔内、静脈内、皮下、または他の経路の注射が挙げられる。非−非経口経路としては、例えば、頬側、経鼻、経眼（ｏｃｕｌａｒ）、経口、肺内、直腸内、経皮、または膣内経路が挙げられる。投与は、持続点滴、局所投与、インプラント（ゲル、メンブレン等）からの持続放出、および／または静脈内注射によるものであってもよい。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、心欠陥の重症度またはリスクの変化は、心欠陥の重症度またはリスクにおけるいかなる変化をも含む。いくつかの実施形態において、心欠陥の重症度またはリスクの変化は、心欠陥の重症度またはリスクに影響を与えることが知られている作用因子のレベルにおける変化を含む。いくつかの実施形態において、心欠陥の重症度またはリスクに影響を与えることが知られている作用因子は、レプチンを含む。いくつかの実施形態において、心欠陥の重症度またはリスクに影響を与えることが知られている作用因子は、微生物の代謝産物を含む。いくつかの実施形態において、微生物の代謝産物は、３−（４−ヒドロキシフェニル）乳酸、３−インドキシル硫酸、３−フェニルプロピオン酸、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、桂皮酸、インドール酢酸、インドールプロピオン酸、キヌレニン、ｐ−クレゾール硫酸、フェノール硫酸、フェニル酢酸、フェニルアセチルグリシン、フェニル乳酸、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、本発明に従う組成物は、心欠陥の重症度またはリスクと相関する様式で、個体のミクロビオームを改変する組成物である。いくつかの実施形態において、本発明に従う組成物は、投与された場合に、心欠陥の重症度もしくはリスクの低減と相関する様式で、および／または心欠陥の重症度もしくはリスクの低減と相関している状態もしくは特性に対して、個体のミクロビオームを改変する組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は、上記のようなミクロビオームを変化させる作用因子を含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、組成物は、特定の所望の結果（例えば、目的の結果と相関する、ミクロビオームの構成および／または特性における特定の変化）と相関する、量でおよび／または投与計画に従って、投与される。いくつかの実施形態において、所望の結果は、上記のような、心欠陥の重症度またはリスクにおける変化（例えば、低減）である。
【０１２５】
本発明に従って投与される特定の用量または量は、例えば、所望の結果の性質および／もしくは範囲、投与の経路および／もしくはタイミングの詳細、並びに／または一つもしくは複数の特徴（例えば、体重、年齢、個人歴、遺伝的特徴、生活習慣パラメータ、心欠陥の重症度および／もしくは心欠陥のリスクのレベル等、またはそれらの組み合わせ）に応じて、変化してもよい。当業者はそのような用量または量を決定することができる。いくつかの実施形態において、適切な用量または量は標準的な臨床技術に従って決定される。あるいはまたはさらに、いくつかの実施形態において、適切な用量または量は、投与される望ましいまたは最適な用量域または量を特定するのに役立つ、一つまたは複数のインビトロまたはインビボアッセイの使用によって、決定される。
【０１２６】
いくつかの特定の実施形態において、投与される適切な用量または量は、インビトロ試験系または動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から推定することができる。特定の個体への有効な投与用量または投与量は、その個体の必要に応じて経時的に変化（例えば、増加または減少）し得る。いくつかの実施形態において、細菌が投与される場合、適切な用量は、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個またはそれより多い細菌細胞を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、約１０００以上（例えば、約１５００、２０００、２５００、３０００、３５０００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３またはそれより多い細菌）をさらに超える多数の細菌細胞を与えることにより、より大きな利益を達成することができるという認識を包含する。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、提供される組成物は、本明細書に記載のミクロビオームを変化させる作用因子および一つまたは複数の担体を含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、一つまたは複数の薬剤的に許容できる担体を含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、一つまたは複数の食用成分を含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は食用である。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、食品、機能性食品または栄養補助食品中でミクロビオームを変化させる作用因子を含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、食品、機能性食品または栄養補助食品は、酪農製品であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、酪農製品は、ヨーグルト製品であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、酪農製品は、ミルク製品であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、酪農製品は、チーズ製品であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、食品、機能性食品または栄養補助食品は、ジュースまたは果実から得られる他の製品であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、食品、機能性食品または栄養補助食品は、野菜から得られる製品であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、食品、機能性食品または栄養補助食品は、穀物製品（例えば、限定はされないが、シリアル、クラッカー、パン、および／またはオートミール）であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、食品、機能性食品または栄養補助食品は、米製品であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、食品、機能性食品または栄養補助食品は、肉製品であるか、またはそれを含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、提供される組成物は医薬製剤として提供される。いくつかの実施形態において、医薬製剤は、心欠陥の重症度またはリスクの低減の達成と関連付けられた投与計画に従って投与するための単位用量であるか、またはそれを含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、医薬製剤は、カプセル剤（例えば、ゼラチンカプセル）または錠剤（例えば、圧縮錠剤）を含む。いくつかの実施形態において、医薬製剤は、液体であるか、またはそれを含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、提供される組成物（医薬製剤として提供される組成物も含む）は、液体担体（例えば、限定はされないが、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、血清含有溶液、ハンクス液、他の生理的平衡水溶液、油、エステルおよびグリコール）を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、単位用量は、心欠陥の重症度またはリスクの低減の達成と関連付けられた投与計画に従って投与される。いくつかの実施形態において、投与計画は、単回単位用量としての投与を含む。いくつかの実施形態において、投与計画は、時間間隔によって互いに隔てられた複数回の単位用量の投与を含む。「間隔」をおいた投与は、本明細書で使用される場合、単位用量が定期的に投与されることを示す（１回用量と区別）。いくつかの実施形態では、単位用量を隔てる時間間隔は同じであり；いくつかの実施形態では、単位用量を隔てる時間間隔は異なっている。いくつかの実施形態において、単位用量は、例えば、隔月、毎月、月２回、毎３週間、隔週、毎週、週２回、週３回、毎日、１日２回、または毎６時間、投与される。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「隔月に」という用語は、１回／２ヵ月（すなわち、毎２ヵ月に１回）の投与を意味し；「毎月」という用語は、１回／月の投与を意味し；「毎３週間」という用語は、１回／３週間（すなわち、３週間毎に１回）の投与を意味し；「隔週」という用語は、１回／２週間（すなわち、２週間毎に１回）の投与を意味し；「毎週」という用語は、１回／週の投与を意味し；「毎日」という用語は、１回／日の投与を意味する。
【０１３４】
併用療法
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、個体の生理機能および／または個体のミクロビオームの一つまたは複数の態様に影響を与えるまたは改変する、一つまたは複数の他の薬剤または因子と組み合わせて投与される。例えば、いくつかの実施形態において、提供される組成物は、一つまたは複数の抗増殖剤（例えば、抗生剤）、抗炎症剤、鎮痛剤等と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、提供される組成物は一つまたは複数の既知の治療薬と組み合わせて投与され、その既知の治療薬は、その標準的なまたは認可された投与計画および／またはスケジュールに従って投与される。いくつかの実施形態において、提供される組成物は一つまたは複数の既知の治療薬と組み合わせて投与され、その既知の治療薬は、その標準的なまたは認可された投与計画および／またはスケジュールと比較して変更されている投与計画に従って投与される。いくつかの実施形態において、そのような変更された投与計画は、一つもしくは複数の単位用量が量において変更（例えば、減少または増加）されている点、および／または投薬が頻度において変更（例えば、単位用量間の一つまたは複数の間隔が延長された結果低頻度に、または前記間隔が減少された結果高頻度に）されている点において、標準的なまたは認可された投与計画と異なる。
【実施例】
【０１３５】
実施例１：ラットの取り扱いおよび抗生物質による処置方法
以下の実施例では、ラットを取り扱いおよび抗生物質で処置する方法を記述する。ラットの取り扱いおよびプトロコルの使用は、ウィスコンシン医科大学の動物管理使用委員会によって承認された。抗生物質で処置する前に１週間、雄Ｄａｈｌ  Ｓラット（２００−２２０ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社、ウィルミントン、マサチューセッツ州）にオートクレーブで処理できる実験齧歯動物用食５０１０（ＬａｂＤｉｅｔ社、セントルイス、ミズーリ州）および水を自由に与えた。消化管の微生物叢を変化させることで知られる抗生物質のバンコマイシン（Ｃｒｏｓｗｅｌｌ、Ａ．ら“Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ｏｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｅｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｅｎｔｅｒｉｃ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．”Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７７、２７４１−２７５３、２００９）を飲料水に加えた（０．５ｇ／Ｌ）。
【０１３６】
ペントバルビタール（ネンブタール；５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射することによって、ラットに麻酔をかけ、気胸が起こる腹腔内ペントバルビタールを過剰投与することで安楽死させた。安楽死の最中、足反射および呼吸数を評価することによって、ラットの安楽死の深さをモニターした。足反射がなくなるまで外科手術の手順は継続しなかった。さらに、この手順の間に１５〜３０分毎に足反射が観察され、検出された場合は、追加のペントバルビタールナトリウムをラットに投与した。
【０１３７】
実施例２：ラットの糞便中の微生物叢の存在量の分析
以下の実施例では、ラットの糞便中の微生物叢の存在量を定量化する方法を記述する。処置前（第０日目）、処置後の第６〜７日目に、各ラットから新鮮なラットの糞便のペレットを得た。ペレットを１ｍｌのＰＢＳで均質化した。ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、カリフォルニア州）を使用して、２００μｌのホモジネートを微生物のＤＮＡ単離に使用した。微生物群を数え上げるために、ｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を使用して、単離されたＤＮＡ試料を定量的ＰＣＲに供した。ＰＣＲ反応混合物は、５０％のｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）、０．４μＭのフォーワードおよびリバースプライマー、並びにＲＮａｓｅ／Ｄｎａｓｅの遊離水中の３．８％のテンプレート溶液から構成されていた。２０の反応温度とともに、特定の微生物の門、綱、属、および種（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉおよびＬ．プランタルム）の１６ｓおよび１８ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に特異的なプライマーセットおよび参照株を図２および表１に詳細に示す。
【表１−１】
2014525266.tif 000003
【表１−２】
2014525266.tif 000004
【表１−３】
2014525266.tif 000005
【表１−４】
2014525266.tif 000006
【０１３８】
実施例３：ラットの心筋梗塞の定量化
以下の実施例では、虚血／再灌流試験によって特定されるラットのインビトロおよびインビボの心筋梗塞を分析する方法を記述する。
【０１３９】
インビボの虚血／再灌流試験について、  “Ｋ（ＡＴＰ）ｏｐｅｎｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｅｌａｙｅｄ  ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ：  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｋ（ＡＴＰ）ｃｈａｎｎｅｌｓ、ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌｓ  ａｎｄ  ＭＥＫ１／２”（Ｇｒｏｓｓ、Ｅ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．３５、９８５−９９２、２００３）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の一般的な外科手術プロトコルおよび梗塞サイズ（ＩＳ）の測定を使用して、麻酔をかけられたラットモデルを使用した。簡潔に述べると、麻酔の後、血圧および心拍数を測定するためにカニューレ処置された左総頚動脈で、人工呼吸のための気管切開術を行った。５番目の肋間腔に開胸を行い、心膜を切除し、左前下行枝を含む左心室の胸骨部分に及ぶ左心耳の遠位に絹糸結紮を配置した。結紮の終端をポリプロピレン管に通して配置し、止血鉗子で心外膜の表面に対してスネアを固定することによって、リスク領域（ＡＡＲ）と記述される領域の遮閉を作製した。３０分後、止血鉗子を緩め、ＡＡＲを再潅流した。２時間の再潅流の後に、結紮を再度遮閉し、ＡＡＲをパテントブルーネガティブ染色によって特定した。その後、心臓を切除し、４〜５個のスライスに断片としし、正常な領域とＡＡＲとに分離した。切片を、１％の２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド中でインキュベートし、ＩＳを測定した。その後、心臓を１０％のホルムアルデヒド中で一晩インキュベートし、梗塞された組織をＡＡＲから切り離した。ＩＳをＡＡＲに対する割合（％）として表した（ＩＳ／ＡＡＲ）。レプチン（０．１２μｇ／ｋｇ）を、虚血の２４および１２時間前に、ボーラスとして静脈内に投与した。アミノ酸を、虚血の２４および１２時間前にボーラスとして静脈内に投与するか、飲料水に溶解し虚血の４８時間前に与えた。
【０１４０】
インビトロの虚血／再灌流試験のために、Ｂａｋｅｒ、Ｊ．ら（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２０００）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に以前に記述されたように、心臓に逆行性に灌流適用した。簡潔に述べると、９５％のＯ２と５％のＣＯ２で泡立てられた、修正されたＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液（１２０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３、４．７ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．２０ｍＭのＭｇＳＯ４、１１ｍＭのグルコース、および１．８ｍＭのＣａＣｌ２）で、４０分の整定時間、心臓に灌流適用し、２５分間の全体的な非流動虚血、次に１８０分の再灌流に供した。全灌流液は使用前に、孔径が５．０μｍのアセチルセルロース膜で濾過し、粒子状物質を除去した。温度管理されたチャンバーに心臓を保管し心筋の温度を３７℃に保った。圧力トランスデューサーに接続されたバルーンを左心室に挿入し、心機能をモニターした。いくつかの実験のために、心臓を２５分間安定させ、その後、虚血／再灌流前の１５分間、バンコマイシンまたは抗生物質の混合物で灌流適用した。最初の４０分間の再灌流の最中、機械的機能の回復を定常状態下の最大左心室圧（ＬＶＤＰ）として測定し、虚血前のＬＶＤＰに対する割合（％）として表した。３時間の再灌流期間の終わりに、ＩＳ測定のために、心臓を処理し、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド染色で染色した。
【０１４１】
実施例４：バンコマイシンおよびプロバイオティクスが腸の微生物叢および心筋梗塞に及ぼす影響
以下の実施例では、バンコマイシンおよびプロバイオティクスによるラットの処置が腸の微生物叢および心筋梗塞に及ぼす効果を評価する。本実施例は、発明者による発行物、題名“Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ”（ＦＡＳＥＢ、印刷中、２０１２年にオンライン発行）に記述される（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。吸収性が最小の抗生物質であるバンコマイシンを、実施例１に記述されるように、Ｄａｈｌ  Ｓラットの腸の微生物叢の組成を変化させる手段として飲料水に加えた。抗生物質を補充した飲料水を最大７日間、ラットに与えた。実施例２に記述されるように、糞便に存在する微生物群を１６Ｓ／１８Ｓ  ｒＲＮＡ定量的ＰＣＲによってモニターした。使用したプライマーは、真正細菌および古細菌タクソンそれぞれの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子および各菌類タクソンに固有の１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を独自に標的とした。本明細書に示される結果は、バンコマイシンが微生物の総数を減少させたが、微生物組成に及ぼす影響は種特定的に異なることを示した（図３）。
【０１４２】
Ｄａｈｌ  Ｓラットは、心筋虚血／再灌流からの傷害に対する増加した感受性の確立されたモデルである（Ｂａｋｅｒ、Ｊ．ら“Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｉｎ  ｆｉｖｅ  ｒａｔ  ｓｔｒａｉｎｓ：  ｉｓ  ｔｈｅｒｅ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ？”Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７８、Ｈ１３９５−Ｈ１４００、２０００、Ｓｈｉ、Ｙ．ら“Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙ  ｖｓ．  Ｄａｈｌ  Ｓ  ｒａｔ：  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ａｎｄ  Ｈｓｐ９０．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．３８（４）：６２５−６３５、２００５）。実施例１に記述されるように、７日間のバンコマイシンを加えた飲料水では、実施例３に記述されるように局所性の心筋虚血／再灌流のインビボのモデルにおける心臓の障害の感受性が減少し、それは心筋のＩＳが約２７％減少することによって示された（図４Ａ）。バンコマイシンによる４８時間は、ＩＳが減少するのに必要とされる最小の処置時間である。バンコマイシンの中断から７２時間で、心筋のＩＳが対照値に戻ることが観察された（図５）。このＩＳの減少が冠状血管系に存在する抗生物質の直接的な影響なのかどうかを確かめるために、バンコマイシンの血中濃度を測定した。血液中のバンコマイシンの濃度は、使用される分析の検出限界値以下であった（１μＭ）。実施例３に記述されるように、ラットの心筋虚血／再灌流のインビトロのモデルにおいて、冠状動脈の灌流液にバンコマイシンを１μＭの濃度で直接加えたとき、ＩＳは減少しなかった（図４Ｂ）。ＩＳの減少が間接的なものであるかどうかを確かめるために、実施例３に記述されるように、バンコマイシンを飲料水に加え、その後、心筋梗塞のインビトロのモデルを使用して、虚血／再灌流の前に冠状動脈の灌流液から除外した。バンコマイシンはＩＳを２９％減少させた（図４Ｃ）。本明細書の結果は、虚血／再灌流時に冠状動脈の灌流液に抗生物質が存在しないにも関わらず、バンコマイシンがＤａｈｌ  ＳラットのＩＳを減少させることを説明している。これらのデータは、心臓に及ぼす抗生物質の直接的な影響は、ＩＳの減少の原因にならないことを示唆する。心筋虚血／再灌流のインビボおよびインビトロのモデルに使用しているＩＳの減少の範囲を比較することができる（図４Ａ、Ｃ）。
【０１４３】
バンコマイシンで処置されたラットの血液中のサイトカインの濃度を定量化し、抗生物質が誘発する変化を確認した。サイトカイン分析のために、抗生物質での処置前（第０日目）および抗生物質での処置から第６日目に、血液試料を得た。血液試料を氷上に３０分間置き、その後、４℃において１０分間１，０００ｇで遠心分離にかけ、血漿を得た。その後、血漿試料を分析し、２３のサイトカインの濃度を測定した（Ｅｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カルガリー、アルバータ州、カナダ）。実施例１に記述されるように、抗生物質を飲料水に連続して加えた。測定した２３のサイトカインのうち、１１が信頼性をもって定量化された。これらのうち、レプチンだけが対照群と処置群とに有意な差があった（図６Ａ）。バンコマイシンが循環しているレプチンを３８±４％減少させた。減少したレプチンレベルが、ＩＳの減少に関連しているかどうかを確認するために、実施例３に記述されるように、インビトロの虚血／再灌流の２４時間と１２時間前に、バンコマイシンで処置したラットにレプチン（静脈内０．１２μｇ／ｋｇ）を投与した。この用量は、循環中のレプチン濃度を再構築するために選択された。レプチンは、バンコマイシンによる処置によって与えられるＩＳの減少およびＬＶＤＰの回復の増加を無効にした（図６Ｂ）。バンコマイシン前処置がない状態でのレプチンによる処置は、何の影響も及ぼさなかった。したがって、本開示は、バンコマイシンの投与に見られるＩＳの減少およびＬＶＤＰの回復の増加は、レプチンの投与によって相殺される可能性があることが示される。
【０１４４】
プロバイオティックスであるＬ．プランタルムは、喫煙者のレプチンのレベルを３７％低下させ（Ｎａｒｕｓｚｅｗｉｃｚ、Ｍ．ら“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖ  ｏｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｓｍｏｋｅｒｓ．”Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．７６、１２４９−１２５５、２００２）、高脂肪食を与えられたマウスのレプチンのレベルを３８％低下させた（Ｔａｋｅｍｕｒａ、Ｎ．，ら“Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ｓｔｒａｉｎ  Ｎｏ．１４  ｒｅｄｕｃｅｓ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｓｉｚｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｆｅｄ  ｈｉｇｈ−ｆａｔ  ｄｉｅｔ．”Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２３５、８４９−８５６、２０１０）。２つのプロバイオティクス微生物、Ｌ．プランタルム（Ｌｐ２９９ｖ）およびビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉ−０７）を含んでいるプロバイオティクスジュースが、レプチンのレベルおよび心筋梗塞の重症度を減少させることができるかどうかを確認するために、Ｌ．プランタルム（Ｌｐ２９９ｖ）およびビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉ−０７）を含んでいるプロバイオティクスジュースを、ラットに１４日間与えた（以降、「プロバイオティクスジュース」として言及する）。飲料水に加えて、プロバイオティクスジュースを１日１回与えた。各リッターボトルは、ラットに与える（１５ｍｌ／ラット／日）まで、４℃で保管した。４５ミリリットルのプロバイオティクスジュースまたはビヒクルを、なめて飲む飲み口を有する小さいボトルに分け、３個体のラットの各ゲージに利用できるようにした。ラットはプロバイオティクスジュースを１５分以内に容易に飲み干し、モニターし、どのラットも飲むことから除外されることがないことを確認した。プロバイオティクスジュースの処置についての負の対照は、照射されたプロバイオティクスジュース（３５ｋＧｙ；Ｓｔｅｒｉｇｅｎｉｃｓ社、ガーニー、イリノイ州、米国）、および砂糖水（水、９２．８ｍｇ／ｍｌのグルコース、４２．２μｇ／ｍｌのＮａＣｌ、４６４μｇ／ｍｌのＫＣｌ、および４ｍｇ／ｍｌアルブミン）を含み、プロバイオティクスジュースの砂糖、塩、およびタンパク質の内容量を調節した。プロバイオティクスジュースと同じ量のこれらの負の対照をラットに与えた。実施例３に記述されるように、虚血／再灌流を行った。プロバイオティクスジュースが与えられたラットにおいて、ＩＳが２９％減少したことを観察した（図７Ａ）。虚血／再灌流の２４時間および１２時間前にレプチンを投与（０．１２μｇ／ｋｇ静脈内）すると、プロバイオティクスジュースが誘発する心臓保護を無効にした（図７Ａ）。γ照射された（３５ｋＧｙ）プロバイオティクスジュース、照射されたプロバイオティクスジュース＋レプチン、ビヒクルと同量のプロバイオティクスジュース、およびビヒクル＋レプチンはＩＳに何の影響も及ぼさなかった（図８Ａ）。プロバイオティクスジュースの処置は、血中のレプチンを４１％減少させもした（図７Ｂ）。γ照射された（３５ｋＧｙ）プロバイオティクスジュース、照射されたプロバイオティクスジュース＋レプチン、ビヒクルと同量のプロバイオティクスジュース、およびビヒクル＋レプチンは、レプチンのレベルに何の影響も及ぼさなかった（図８Ｂ）。対照、ビヒクル、およびプロバイオティクスジュースを与えられたラットの糞便からＬ．プランタルムを検出しなかったが、プロバイオティクスジュースで処置されたラットの糞便には５．８ｌｏｇ１０／ｇ存在した（図７）。ここで示される結果は、Ｌ．プランタルム（Ｌｐ２９９ｖ）およびビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉ−０７）を含むプロバイオティクスジュースでの処置が、ＩＳおよびレプチンのレベルを減少させることを示す。
【０１４５】
本開示の結果は、および腸の微生物叢の変化と心筋梗塞との間に、概念証明および機械論的なつながりがあることを含む。心筋梗塞の重症度を予測することにおける腸の微生物叢の役割を示すために、広範囲の抗生物質バンコマイシンでラットを経口的に処置を行い、微生物叢の総数を効果的に減少させ、腸の微生物叢の個別群の存在量を変化させた。バンコマイシンの心臓保護効果は、この抗生物質が循環に最小量で吸収され、冠動脈循環に直接的に投与されたとき、心筋梗塞の重症度に何の影響も及ぼさなかったので、間接的である。バンコマイシンを飲料水に加え、心臓を循環系から単離したとき、それでもＩＳの減少が観察された。したがって、保護が、バンコマイシン処置によって心筋内に確立され、虚血／再灌流前に、循環中に抗生物質が存在しないにもかかわらず、現れた。心臓保護は処置から２日以内に確立され、処置が３日間止められた後に消えた。心筋のＩＳを媒介する可能性のあるシグナル伝達分子を特定するために、バンコマイシン処置を受けたラットの血漿中のサイトカインのレベルを分析した。バンコマイシン処置によってレプチンのレベルが３８％減少した。Ｌ．プランタルム（Ｌｐ２９９ｖ）およびＢ．ラクティス（Ｂｉ−０７）の両方を含むプロバイオティクスジュースも、バンコマイシンと同様に、循環しているレプチンのレベルを減少させ、バンコマイシンと同じ程度に心筋のＩＳを減少させた。どちらの場合も、レプチンによる前処置が、バンコマイシンと  プロバイオティクスジュースの双方による心臓保護を無効にした。
【０１４６】
当該技術分野の現在の状態では、宿主の心血管機能に影響する宿主−ミクロビオームの相互関係について、ほとんど理解されていない。本開示に示される結果は、腸の微生物叢の混乱が、心筋梗塞の重症度に影響することができる宿主の全体的な代謝表現型そのものに顕現されることを説明する概念証明を含む。ミクロビオームによって合成される代謝産物は、積極的に宿主の生物作用に影響し、当該仮想臓器内のいかなる腸内菌共生バランス失調も、宿主の健康に対して意味を有する。微生物の微生物分類学綱の一員であるＬ．プランタルムは、循環内のレプチンのレベルを調節する他に、心血管疾患バイオマーカーであるフィブリノーゲンおよびＬＤＬコレステロールを減少させることが知られている（Ｎａｒｕｓｚｅｗｉｃｚ、Ｍ．ら“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖ  ｏｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｓｍｏｋｅｒｓ．”Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．７６、１２４９−１２５５、２００２）。本開示は、虚血／再灌流前のバンコマイシンおよびプロバイオティクスジュースによる処置から、血液レプチン濃度が減少することが、心臓保護になることを説明する。
【０１４７】
レプチンは、白色脂肪細胞によって主に合成され、循環内に分泌される１６−ｋＤａ、１６７−ａａポリペプチドである。心臓はレプチンの産生および活動の部位でもある（Ｐｕｒｄｈａｍ、Ｄ．Ｍ．ら“Ｒａｔ  ｈｅａｒｔ  ｉｓ  ａ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｌｅｐｔｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｏｎ．”Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８７、Ｈ２８７７−Ｈ２８８４、２００４）。レプチンは、その受容体に結合して、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＭＡＰＫ、Ａｋｔ、およびラパマイシンという哺乳動物の標的を含むいくつかの細胞内経路を活性化する。レプチンによる処置はＪＡＫ／ＳＴＡＴおよびＡｋｔシグナル伝達を活性化することによって、心臓保護を誘発する（Ｓｍｉｔｈ、Ｃ．Ｃ．ら“Ｌｅｐｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ＪＡＫ／ＳＴＡＴ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｈａｔ  ｍａｙ  ｂｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｐｏｒｅ．”Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９９、Ｈ１２６５−Ｈ１２７０，２０１０）。
【０１４８】
本開示は心筋のレプチン抵抗のモデルを支持し、循環中の一貫して高いレベルのレプチンが、心筋のレプチンシグナル伝達に対する感度を減じることを示している（Ｒｅｎ、Ｊ．ら“Ｈｉｇｈ−ｆａｔ  ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｌｅｐｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．”Ｏｂｅｓｉｔｙ  １６、２４１７−２４２３、２００８）。逆に、循環中のレプチンレベルの一貫した減少は、心筋のレプチンに対する感受性を促進する。まとめると、これらの結果は、プロバイオティクスが、循環中のレプチンレベルを減少させることによって、心筋の二相保護に影響を及ぼすことができ得ることを示唆する。本明細書の結果によって示されるように、循環中のレプチンレベルの減少は、虚血／再灌流からの急性傷害に対する心筋の感受性を減少させる一方で、他の研究では、レプチン受容体の遮断によるレプチンのシグナル伝達の低下が、慢性心肥大を減少させることになることを示している（Ｐｕｒｄｈａｍ、Ｄ．Ｍ．ら、“Ａ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｌｅｐｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｔｉｇａｔｅｓ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  ａｎｄ  ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｏｓｔｉｎｆａｒｃｔｅｄ  ｒａｔ  ｈｅａｒｔ．”Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．ＨｅａｒｔＣｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９５、Ｈ４４１−Ｈ４４６、２００８）。本開示はしたがって、循環中のレプチンレベルを減少させるためにプロバイオティクスで腸の微生物叢を変化させることが、心肥大および心筋梗塞後の心臓のリモデリングを緩和し、または治療することができることを示す。
【０１４９】
本明細書に記載の結果は、心筋梗塞を予防または治療するための新しいアプローチ、すなわち食事を補うプロバイオティクスの使用を示唆する。循環中のレプチンを制御することのできる追加の微生物種を特定し、投与することが、治療上便益があり、広範囲の抗生物質より腸の微生物叢を撹乱しないと思われる。バンコマイシンおよびプロバイオティクスジュースでの心臓保護の大きさは、エリトロポエチン（ＩＳが３９％減少；Ｂａｋｅｒ、Ｊ．Ｅ．ら“Ｄａｒｂｅｐｏｅｔｉｎ  ａｌｆａ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｈｅａｒｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：  ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ、ｐｈａｓｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ、ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．”Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４９、３３７−３４５、２００７）およびトロンボポイエチン（ＩＳが３４％減少；Ｂａｋｅｒ、Ｊ．Ｅ．ら“Ｈｕｍａｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔ  ｓｉｚｅ、ａｐｏｐｔｏｓｉｓ、ａｎｄ  ｓｔｕｎｎｉｎｇ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｓｃｈａｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ．”Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．７７、４４−５３、２００８）での薬理学的なプレコンディショニングのそれと同等である。薬理学的なプレコンディショニングは、持続性の虚血後の再灌流の前、最中または開始のいずれかに薬理学的剤を投与することを含み、心臓保護をもたらす。
【０１５０】
米国では、推定１４０万人が、毎年、新規または再発の急性心筋梗塞になり、多くの生存者が長い病的状態、心不全の進行、および死を経験している（Ｒｏｇｅｒ、Ｖ．Ｌ．ら“Ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｏｋｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ−２０１１  ｕｐｄａｔｅ：ａ  ｒｅｐｏｒｔ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．”Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２３、ｅ１８−ｅ２０９、２０１１）。本開示は、心筋梗塞および心肥大を治療および予防するための新しい診断検査（心筋梗塞に対する感受性のバイオマーカーとして、糞便および／または血液中の糞便微生物叢および／または微生物代謝産物）と治療手段（プロバイオティクス、非吸収性の抗菌薬、および／または微生物代謝産物）の両方に機会を提供する、腸の微生物叢に由来する代謝産物と心筋梗塞との間の概念証明の関係を説明する。
【０１５１】
実施例５：バンコマイシンが誘発する心臓保護のメディエータ
以下の実施例では、細胞内シグナル伝達経路を遮断することが、バンコマイシンが誘発する心臓保護に及ぼす影響を記述する。生存促進性のキナーゼＪＡＫ−２、Ａｋｔ、ｐ４２／４４、ＭＡＰＫおよびｐ３８  ＭＡＰＫの受容体結合および活性化、並びにＡＴＰ依存性カリウム（ＫＡＴＰ）チャンネルの活性化は、心臓保護の古典的なメディエータである。これらのメディエータは、心筋梗塞の重症度を定める心筋の、相互に交わり、相互に依存するシグナル伝達経路の要素である。バンコマイシンが誘発する心臓保護のこれらのメディエータの役割を評価した。
【０１５２】
ＪＡＫ−２
本開示は、バンコマイシンによって影響を受ける微生物代謝産物が、受容体に結合し、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）を活性化するかどうかを検討する。心臓をバンコマイシンで処置されたラットから単離し、実施例３に記載されるように、インビトロの虚血／再灌流の前に、ＪＡＫ−２阻害剤ＡＧ−４９０（１μＭ）で灌流適用した。ＡＧ−４９０は部分的に、バンコマイシンの、虚血／再灌流後の心筋壊死を減少させる能力、および心室の機能を向上させる能力を無効にした。ＡＧ−４９０単独では心臓保護に何の影響も及ぼさなかった（図９Ａ）。本明細書に表される結果は、ＪＡＫ−２シグナル伝達が、バンコマイシンが媒介する心臓保護に寄与することを示唆する。
【０１５３】
Ａｋｔ
本開示はバンコマイシンが誘発する心臓保護がＡｋｔによって媒介されるかどうかを検討する。実施例３に記載されるように、インビトロの虚血／再灌流の前に、単離された心臓をＡｋｔ／ＰＩ３キナーゼ阻害剤であるワートマニンで灌流適用した。ワートマニン（１００ｎＭ）は、バンコマイシンの、虚血／再灌流後の心筋壊死を減少させる能力、および心室の機能を向上させる能力を無効にした。ワートマニン単独では心臓保護に何の影響も及ぼさなかった（図９Ｂ）。本明細書に表される結果は、Ａｋｔシグナル伝達が、バンコマイシンが媒介する心臓保護に寄与することを示唆する。
【０１５４】
ｐ４２／４４  ＭＡＰＫ
本開示はバンコマイシンが誘発する心臓保護がｐ４２／４４  ＭＡＰＫによって媒介されるかどうかを検討する。心臓を実施例３に記載されるように、インビトロの虚血／再灌流の前に、ｐ４２／４４  ＭＡＰＫ阻害剤であるＰＤ９８０５９で灌流適用した。ＰＤ９８０５９（１０μＭ）は、バンコマイシンの、虚血／再灌流後の心筋壊死を減少させる能力、および心室の機能を向上させる能力を抑制した。ＰＤ９８０５９単独では心臓保護に何の影響も及ぼさなかった（図９Ｃ）。本明細書に表される結果は、ｐ４２／４４  ＭＡＰＫシグナル伝達が、バンコマイシンが媒介する心臓保護に寄与することを示唆する。
【０１５５】
ｐ３８  ＭＡＰＫ
本開示はバンコマイシンが誘発する心臓保護がｐ３８  ＭＡＰＫによって媒介されるかどうかを検討する。心臓を実施例３に記載されるように、インビトロの虚血／再灌流の前に、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤であるＳＢ  ２０３５８０で灌流適用した。ＳＢ  ２０３５８０（１５μＭ）は、バンコマイシンの、虚血／再灌流後の心筋壊死を減少させる能力、および心室の機能を向上させる能力を無効にした。ＳＢ  ２０３５８０単独では心臓保護に何の影響も及ぼさなかった（図９Ｄ）。本明細書に表される結果は、ｐ３８  ＭＡＰＫシグナル伝達が、バンコマイシンが媒介する心臓保護に寄与することを示唆する。
【０１５６】
ＫＡＴＰチャンネル
本開示はバンコマイシンが誘発する心臓保護がＫＡＴＰチャンネルによって媒介されるかどうかを検討する。実施例３に記載されるように、心臓をインビトロの虚血／再灌流の前に、非選択的ＫＡＴＰチャンネル遮断薬であるグリベンクラミドで灌流適用した。グリベンクラミド（３μＭ）は、バンコマイシンの、虚血／再灌流後の心筋壊死を減少させる能力、および心室の機能を向上させる能力を無効にした。グリベンクラミド単独では心臓保護に何の影響も及ぼさなかった（図９Ｅ）。本明細書に表される結果は、ＫＡＴＰチャンネルを経由するシグナル伝達が、バンコマイシンが媒介する心臓保護に寄与することを示唆する。
【０１５７】
実施例６：バンコマイシンが誘発する心臓保護にＴＰＯが及ぼす影響
以下の実施例は、トロンボポイエチン等の剤で古典的な薬理学的プレコンディショニング（Ｂａｋｅｒ  Ｊ．Ｅ．ら“Ｈｕｍａｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔ  ｓｉｚｅ、ａｐｏｐｔｏｓｉｓ、ａｎｄ  ｓｔｕｎｎｉｎｇ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｓｃｈａｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ．”Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ７７（１）：４４−５３、２００８）とは異なる機序によって、バンコマイシンが心臓保護を与えるかどうかを検討する。トロンボポイエチンは、ＪＡＫ−２、ｐ４２／４４  ＭＡＰＫの活性および開いたＫＡＴＰ  チャンネルによって、薬理学的プレコンディショニングを与える（Ｂａｋｅｒら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ７７（１）：４４−５３、２００８）。実施例３に記載されるように、虚血／再灌流の前に、トロンボポイエチンをバンコマイシンで処置されたラットにインビボで静脈内に投与した。バンコマイシン単独およびトロンボポイエチン単独はそれぞれ、梗塞サイズを２８％と２５％減少させた。バンコマイシンおよびトロンボポイエチンを併用した処置では、梗塞サイズを３８％減少させた（図１０）。本開示はバンコマイシンおよびトロンボポイエチンの併用が、バンコマイシンおよびトロンボポイエチン単独より、梗塞サイズを大きく減少させることを示し、バンコマイシンの心臓保護の機序は、トロンボポイエチンの心臓保護的な機序とは少なくとも部分的に異なることを示唆する。
【０１５８】
実施例７：遺伝的背景が微生物組成物に及ぼす影響
本実施例は、遺伝的背景がラットのミクロビオーム組成物に及ぼす影響を検討する。健康な人間の腸の微生物叢の組成物は、宿主の遺伝型によって影響を受け、本明細書に表される実施例は、有機製剤（特に抗生物質）がミクロビオーム組成物および宿主の表現型を調節することができることを示唆する。宿主の遺伝的性質は、様々な動物種の種構成が広く異なることによって証明されるように、広い腸のミクロビオーム構造に影響する。宿主のゲノムが腸の微生物叢および心筋梗塞に対する感受性に及ぼす影響については、ほとんど理解されていない。実施例１のプロトコルに従い、同じ食事を与えられたバンコマイシンで処置されたラットの図１１に表されるデータは、遺伝的背景が抗生物質の処置に対する反応に寄与することを示唆する。さらに、環境の影響を最小にすると、バンコマイシン処置またはストレプトマイシン、ネオマイシン、バシトラシンおよびポリミキシンＢの抗生物質の混合物での処置によって、実施例３のプロトコルに従いアッセイされた心筋の虚血／再灌流からの傷害に対する感受性が、Ｄａｈｌ  ＳラットではＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットと比較して減少したが、ＷＡＧ／ＲｉｊＣｍｃｒラットは何の影響も受けなかった（図１２）。Ｉｎｂｒｅｄ  Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラット、Ｆａｗｎ  Ｈｏｏｄｅｄラット、およびＴ２ＤＮラットに追加で試験をすることができる。これらの所見は、抗生物質に対する反応に差をもたらす根本的な遺伝的な基盤を示唆する。バンコマイシンに対して、ＷＡＧ／ＲｉｊＣｍｃｒラットは抵抗性であり、Ｄａｈｌ  Ｓラットは感受性があり、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットは中程度の反応性がある。この考えを支持して、ｉｎｂｒｅｄラットの系統が心筋梗塞からの傷害に対して異なる感受性を表すことを示している（Ｂａｋｅｒ、Ｊ．ら、２０００）。
【０１５９】
実施例８：抗生物質が微生物叢に及ぼす影響
この実施例では、バンコマイシン以外の抗生物質が心筋の梗塞サイズに及ぼす影響を検討する。２つの他の非吸収性の抗生物質であるネオマイシンおよびストレプトマイシンが、実施例３の手技を用いてアッセイすると、梗塞サイズを減少させる。他の非吸収性の抗生物質であるポリミキシンＢおよびバシトラシンは、Ｄａｈｌ  Ｓラットにおいて保護を誘発しなかった（図１３Ａ）。実施例２に記述されるように、１６Ｓ  ｒＲＮＡに基づくＰＣＲを使用して、抗生物質の抗微生物活性も特徴づけられた。一般的に、抗生物質の処置は１つ以上の微生物分類群の存在量を減少させるのに十分である（図１３Ｂ）。これらの結果は、抗生物質が微生物叢の存在量および多様性に異なる影響を有し、これらの差が心筋保護の存在または非存在に寄与することを示す。まれな場合に、抗生物質の処置は特定の分類群の存在量を増加させた。例えば、バンコマイシンは同時に微生物の全体数を減少させ、プロテオバクテリアおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓの存在量を増加させることができる。なぜなら、これらの分類群の存在量は微生物集団のたった０．０１および１パーセントしか占めないためである。心臓保護と観察される任意の微生物分類群の減少または増加との間に、明白な相関性は認められなかった。数十から数百の微生物種を検出するプライマーの広い反応性質に起因して、心臓保護に寄与する微生物種の存在量の変化がデータによって隠されていると思われる。
【０１６０】
実施例９：代謝産物をモニターする方法
この実施例では、質量分析を使用して代謝産物のレベルを分析する方法を記述する。受け取った各サンプルはメタボロンＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩＭＳ）に寄託され、ＬＩＭＳによって固有の識別子を割り付けられ、その識別子は原試料の識別子にのみ関連づけられた。この識別子を使用して、全サンプルの扱い、タスク、結果等を追跡した。試料（およびそこから由来する全アリコット）にバーコードを付し、ＬＩＭＳシステムによって追跡した。いかなる試料の部分も、新しいタスクが作られると、ＬＩＭＳによって固有の識別子が自動的に割り付けられ、これらの試料の関係も追跡された。すべての試料は加工されるまで−８０℃で保存された。
【０１６１】
試料の調製
試料の調製過程は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製の自動ＭｉｃｒｏＬａｂ  ＳＴＡＲ（登録商標）システムを使用して実施した。品質管理（ＱＣ）のために抽出過程の最初のステップの前に、リカバリースタンダードを加えた。試料の調製は、専売の一連の有機および水性の抽出物を使用して実施され、小分子を最大限に回復しながら、タンパク質分画を除去した。得られた抽出物を２つの分画に分け、１つはＬＣによる分析に、もう１つはＧＣによる分析を行った。試料を短時間ＴｕｒｂｏＶａｐ（登録商標）（Ｚｙｍａｒｋ社）に配置し、有機溶媒を除去した。各試料を凍結し、真空下で乾燥させた。その後、試料を適切な機器、ＬＣ／ＭＳまたはＧＣ／ＭＳのいずれかのために調製した。
【０１６２】
品質保証（ＱＡ）／ＱＣ：（ＱＡ）／ＱＣのために、いくつかの追加の試料が各日の分析に含まれる。さらに、試験中のものを含めて、ＱＣ化合物の選択を全ての試料に加える。内因性の化合物の測定を妨害しないように、これらの化合物を注意深く選ぶ。表２および３はＱＣ試料および化合物を記述する。これらのＱＣ試料は主に、各試験のプロセスコントロールを評価し、並びにデータのキューレーションにおいて援助するために使用される。
【表２】
2014525266.tif 000007
【表３】
2014525266.tif 000008
【０１６３】
液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ２）
プラットホームのＬＣ／ＭＳ部分は、Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣおよびＴｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＴＱ質量分析計に基づいており、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源および線形イオントラップ（ＬＩＴ）質量分析計から成った。試料の抽出物を２つのアリコットに分離し、乾燥させ、その後、酸性または塩基性のＬＣ互換性の溶媒に再構成し、それぞれ、一定の濃度で１１またはそれ以上の注入標準を含んだ。別々の専用のカラムを使用した２つの独立した注入液に、１つのアリコットは酸性の陽イオン最適化条件で分析し、もう１つは塩基性の陰イオン最適化条件を使用して分析した。酸性条件に再構成された抽出物を、０．１％の蟻酸を含む水とメタノールの両方を使用して溶出勾配し、一方、塩基性の抽出物も、水／メタノールを使用し、６．５ｍＭの炭酸水素アンモニウムを含んだ。ＭＳ分析は、動的な除外を使用して、ＭＳとデータ依存性ＭＳ２スキャンとの間で交互に繰り返した。
【０１６４】
ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）
ＧＣ／ＭＳ分析を予定された試料を、最小時間で２４時間、真空乾燥下で再乾燥し、ビストリメチル−シリル−トリフロウロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）を使用して、乾燥窒素下で誘導体化した。ＧＣカラムは５％のフェニルであり、温度上昇は１６分間で４０℃から３００℃である。電子衝突イオン化を使用して、試料をＴｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｔｒａｃｅ  ＤＳＱ高速走査型単四極子質量分析計で分析した。機器は、毎日、質量分解および質量の正確性のために合わせ、較正した。生データファイルからの情報出力は、以下に検討するように、自動的に抽出した。
【０１６５】
正確な質量の測定およびＭＳ／ＭＳ細分化（ＬＣ／ＭＳ）、（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）
プラットホームのＬＣ／ＭＳ部分はＷａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣおよびＴｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＴＱ−ＦＴ質量分析計に基づき、線形イオントラップ（ＬＩＴ）の前端およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ）質量分析計の後端を有した。数が２百万超のイオンについて、正確な質量測定を行うことができた。正確な質量測定は、親イオンと断片に行うことができた。典型的な質量のエラーは５ｐｐｍ未満であった。数が２百万未満のイオンは、特徴づけにもっと多くの労力を必要とする。フラグメンテーションスペクトル（ＭＳ／ＭＳ）が、典型的にはデータ依存様式で生成されたが、必要であれば、もっと低いレベルの信号の場合等に、標的ＭＳ／ＭＳを使用することができた。
【０１６６】
バイオインフォマティクス
インフォマティクス系は、４つの主要な要素、すなわち実験室情報管理システム（ＬＩＭＳ）、データの抽出およびピークの確認のソフトウェア、ＱＣおよび化合物の特定のためのデータプロセッシングツール、並びにデータ解析者によって使用される情報解析および視覚化ツールの集まりから成る。これらのインフォマティクス要素についてのハードウェアおよびソフトウェアの基盤は、ＬＡＮのバックボーンであり、オラクル１０．２．０．１エンタープライズエディションが稼働するデータベースサーバーであった。
【０１６７】
ＬＩＭＳ
メタボロンＬＩＭＳシステムの目的は、安全で、使い易い、高度に専門化されたシステムによって、全体的に編集可能な実験の自動化を可能にすることである。メタボロンＬＩＭＳシステムの使用範囲は、試料へのアクセス、試料の調製、および機器による分析ならびに報告および高度なデータ解析を含む。続くソフトウェアはすべて、ＬＩＭＳデータ構造に基礎として用いられる。それは、自家の情報抽出およびデータ視覚化システム、ならびに第三者の計装化およびデータ解析ソフトウェアを利用し、それらとインターフェースで接続されるように改変されている。
【０１６８】
データ抽出および品質保証
生の質量スペクトルデータファイルの抽出は、リレーショナルデータベースに蓄えられ、ＢＬＯＢ操作に頼らなくとも操作することのでき得る情報を生み出した。データベースに格納されると、情報は検査され、適切なＱＣ限界値が課された。ピーク値は、メタボロンの著作権保護されたピーク統合ソフトウェアを用いて確認され、構成部分を、別個の特別に設計された複合データ構造に保存した。
【０１６９】
化合物の特定
純化された標準または回帰性の未知の属性のライブラリーのエントリーと比較することによって、化合物を特定した。既知の化学的実体の特定は、純化された標準のメタボロミックなライブラリーのエントリーとの比較に基づいた。クロマトグラフィーの特性および質量スペクトルの組み合わせが、特定の化合物または等圧の実体に一致するものへの指標を与えた。追加の実体をそれらの回帰性の性質（クロマトグラフィーと質量スペクトルの両方）によって特定することができ得る。これらの化合物には、一致している純化された標準の将来の獲得または古典的な構造解析によって特定される可能性がある。
【０１７０】
キューレーション
様々なキューレーションの過程が実施され、高品質なデータセットが統計的分析およびデータ解釈に使用可能であることを確実なものにした。真の化学的実体を正確で一貫して確認することを確実にし、表しているシステムの人為的結果、誤配置、およびバックグラウンドノイズを取り除くために、ＱＣおよびキューレーションの過程が設計された。
【０１７１】
メタボロンのデータ解析は、様々な試料のピークの確認の一貫性を確認するために、著作権保護された視覚化および解釈ソフトウェアを使用する。各化合物のライブラリーの一致を各試料についてチェックを行い、必要であれば訂正した。
【０１７２】
正規化
複数日にわたる試験について、データを正規化するステップを実施し、機器から生じる日の間のチューニングの差から得られる変差を訂正した。本質的に、中央値を値（１．００）と等しくするように登録することによって、および、各データポイントを比例して正規化する（「部分補正」と呼ばれる）ことによって、稼働日のブロック内で、各化合物を訂正した。１日を超える解析を必要としなかった試験について、データの視覚化の目的以外に、正規化は重要でない。
【０１７３】
統計計算
多くの試験では、２種類の統計解析すなわち（１）有意性試験および（２）分類分析を通常実施する。（１）対比較については、Ｗｅｌｃｈのｔ検定および／またはＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を典型的に行う。その他の統計設計については、様々な分散分析の手順を実施してもよい（例えば、反復計測分散分析）。（２）分類については、ランダムフォレスト分析を主に使用する。ランダムフォレストは、２つの集団についての未知の平均値に差があるかないかを試験するｔ検定とは対照的に、新しいデータの中で、個体をいかにうまく各群に分類することができるかの推定を与える。ランダムフォレストは、実験単位および化合物の連続的なサンプリングに基づいて一組の分類木を作る。その後、全分類木から多数決に基づいて、各観察結果を分類する。統計学的分析はプログラム「Ｒ」（ｈｔｔｐ：／／ｃｒａｎ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）で実施される。
【０１７４】
実施例１０：心筋梗塞における微生物代謝産物の役割
腸の微生物叢の組成を変えるために、ストレプトマイシン（１２０ｍｇ／ｋｇ／日）、ネオマイシン（６０ｍｇ／ｋｇ／日）、バシトラシン（１２０ｍｇ／ｋｇ／日），およびポリミキシンＢ（６０ｍｇ／ｋｇ／日）の組み合わせを飲料水に加えた。実施例１および２に記載の方法を使用して、糞便に存在する微生物集団を１６Ｓ／１８Ｓ  ｒＲＮＡ定量的ＲＴ−ＰＣＲによってモニターした。抗生物質の組み合わせは微生物の総数を減少させ、特定の微生物種の存在量を変化させた（図１４）。この処置によって、実施例４に示されるように、バンコマイシンと比較して、微生物の様々な分類群を同様に減少させた。例外として、バンコマイシン処置に反応して２倍に増加したが、細菌の桿菌群は抗生物質の混合物に反応して５倍に減少し、プロテオバクテリアはバンコマイシン処置に反応して、１２０倍に増加したが、抗生物質の混合物に反応して変化することはなかった。細菌の密度はｌｏｇ１０に変換され、対応の両側ｔ検定を使用して、任意の差の有意性を定めた。報告されるデータは平均値＋標準偏差である。統計分析は、対応の両側ｔ検定を使用して行われた。有意性をＰ＜０．０５に設定した。
【０１７５】
実施例３に記載の方法を使用して、抗生物質の混合物で処置をしたラットの梗塞サイズを測定した。抗生物質の混合物は梗塞サイズを２９％減少させた（図１５Ａ）。梗塞サイズの減少が冠状血管系に存在する抗生物質の直接的な影響なのかどうかを確認するために、ストレプトマイシン、ネオマイシン、バシトラシンおよびポリミキシンＢの血中レベルを測定した。血中のこれらの抗生物質のレベルは、使用したアッセイの検出限界値（１μＭ）未満であった。実施例３に記載されるように、心筋の虚血／再灌流のインビトロのモデルに、１μＭの濃度でこれらの抗生物質を冠状潅水に直接加えると、梗塞サイズは減少しなかった（図１５Ｂ）。梗塞サイズの減少が間接的なものかどうかを確認するために、抗生物質を飲料水に加え、その後、虚血／再灌流のインビトロのモデルの冠状潅水から除外した。抗生物質の組み合わせは梗塞サイズを２９％減少させた（図１５Ｃ）。本開示はしたがって、虚血／再灌流時に冠状潅水中に抗生物質が存在しないにもかかわらず、梗塞サイズが減少することを示す。
【０１７６】
メタボロミックな方法を使用して、実施例１に記載されるように、バンコマイシンまたはストレプトマイシン（１２０ｍｇ／ｋｇ／日）、ネオマイシン（６０ｍｇ／ｋｇ／日）、バシトラシン（１２０ｍｇ／ｋｇ／日）、およびポリミキシンＢ（６０ｍｇ／ｋｇ／日）の併用で７日間処置したラットの血中の代謝産物を確かめた。質量スペクトル分析は、バンコマイシン単独または抗生物質の混合物が、腸の微生物叢によって修正されることが知られている代謝産物を減少させ、必須芳香族アミノ酸トリプトファン（キヌレニン、インドール酢酸、インドールプロピオン酸、および３−インドキシル硫酸）（図１６）；フェニルアラニン（フェニル乳酸、フェニルアセチルグリシン、フェニル酢酸塩、３−フェニルプロピオン酸，および桂皮酸エステル）（図１７）；並びにチロシン（ｐ−クレゾール硫酸塩、フェノール硫酸塩、３−（４−ヒドロキシフェニル）乳酸塩、および４−ヒドロキシフェニルピルビン酸）（図１８）の複数の分解物が挙げられる。トリプトファン代謝産物３−インドキシル硫酸（図１６）およびチロシン代謝ｐ−クレゾール硫酸塩およびフェノール硫酸塩（図１８）のスルホン化産物は、肝臓から形成され、両方の抗生物質処置の後に減少した（図１８）。
【０１７７】
循環しているアミノ酸代謝産物のレベルの減少が、心筋の梗塞サイズの減少に関連しているかどうかを確認するために、処置なし、およびバンコマイシンで処置を受けたラットに、フェニルアラニン（トランス−桂皮酸エステル［４．５０μｇ／ｋｇ］、フェニル酢酸塩［４．０８μｇ／ｋｇ］、および３−フェニルプロピオン酸［３．０６μｇ／ｋｇ］酸類）、トリプトファン（インドール−３−酢酸塩［０．２６μｇ／ｋｇ］、３−インドキシル硫酸［１２４．５０μｇ／ｋｇ］、Ｌ−キヌレニン［３４．９９μｇ／ｋｇ］および３−インドールプロピオン酸［２．７３μｇ／ｋｇ］）、並びにチロシン（４−ヒドロキシフェニルピルビン酸［２．０４μｇ／ｋｇ］、並びにｐ−ヒドロキシフェニル乳酸塩［３．５４μｇ／ｋｇ］）の代謝産物を、実施例３に記載のインビトロの虚血／再灌流試験の２４時間および１２時間前に、静脈内に投与した。これらの用量は、循環中の代謝産物を再構成するように選択した。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンの代謝産物は、バンコマイシン処置によって与えられる梗塞サイズの減少を無効にした（図１９）。バンコマイシン前処置がない状態で、静脈内のアミノ酸代謝産物の処置は梗塞サイズに何の影響も及ぼさなかった（図１９）。
【０１７８】
代謝産物の食事の再構成が、バンコマイシンが誘発する梗塞サイズの減少を無効にするのに十分であるかどうかをさらに確認するために、芳香族アミノ酸フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンの全３つまたは個別の代謝産物を、上述と同じ用量で、バンコマイシン処置のラットの飲料水に加えた。個別のアミノ酸またはそれらを組み合わせた代謝産物の経口栄養補助剤は、梗塞サイズの減少を無効にした（図１９）。
【０１７９】
本開示は、腸の微生物叢に由来するアミノ酸の代謝産物と、宿主の心筋梗塞の重症度との間の、概念証明および機械論的なつながりを実証する。抗生物質を、ラットの腸内の特定の微生物群の存在量を一時的に減少または増加させる道具として使用し、質量分析計を、血液の血漿内の微生物叢によって産生される代謝産物の存在量の変化を描き出すために使用した。抗生物質は、腸の微生物叢の一般的な存在量、並びにフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンの微生物発酵に関連する代謝産物を減少させた。循環中のこれらの代謝産物の減少は、心筋梗塞の重症度の減少に関連した。使用される抗生物質が循環中に吸収されないため、心臓保護の影響は間接的であり、全身に投与されると、心筋梗塞に何の影響も及ぼさない。静脈内の送達または経口栄養のいずれによっても、全身の代謝産物レベルを再構成することは、心臓保護の表現型を無効にした。これらの結果は、腸の微生物叢によって産生される代謝産物の影響範囲が、腸の局所的な環境をはるかに越えて、心臓等の遠隔の臓器に拡張することができることを示す。
【０１８０】
微生物叢によって産生される代謝産物が、宿主の生理学的機能に影響を及ぼす分子的機序についてはほとんど理解されていない。本明細書に示されるデータは、心筋の芳香族アミノ酸に由来する代謝産物の直接的な影響を示唆する。可能な説明の１つは、対照動物の代謝産物のレベルの増加が、心筋のミトコンドリアへの酸化ストレスを増加させることによって、心筋を梗塞に感作することである。この考えを支持して、両方ともフェニルアラニンの代謝産物であるフェニルプロピオン酸およびフェニル酢酸塩が、ＮＡＤ依存性酸化を妨害することによってミトコンドリアの機能不全を増加させ、活性酸素種の産生を増加させ、ミトコンドリアの孔の開口を誘発する（Ｆｅｄｏｔｃｈｅｖａ、Ｎ．Ｉ．ら  Ｔｏｘｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．”Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．１８０（３）：１８２−１８８、２００８）。しかしながら、芳香族アミノ酸代謝産物、レプチンシグナル伝達を含む様々な臓器、肝臓、および心臓との間の多くの代謝およびシグナル伝達経路がすべて相互に関係し、心臓保護の表現型に影響する可能性があることも予想される。
【０１８１】
本開示は、バンコマイシンおよびラクトバチルス・プランタルムが心臓保護を誘発する能力に固有のものではないことも説明する。ストレプトマイシン、ネオマイシン、バシトラシン、およびポリミキシンＢの組み合わせも同じレベルの心臓保護を誘発する（Ｌａｍら）。微生物集団の定量化によって、抗生物質の組み合わせが、バンコマイシン処置を受けたラットに観察される増加とは対照的に、桿菌およびプロテオバクテリアの存在量を減少させたことを示した（Ｌａｍら）。本明細書に示される結果は、ラクトバチルス・プランタルム等の桿菌細菌の存在量の増加が、抗生物質の併用で処置を受けたラットの心臓保護の原因にはならないように思われることを示唆する。抗生物質の併用とバンコマイシン処置の両方で観察される芳香族アミノ酸代謝産物の同じような減少は、桿菌およびプロテオバクテリア分類群での微生物種以外の微生物種が、心臓保護に寄与することを示唆する。処置間で異なった唯一の代謝産物は、バンコマイシン処置に反応して増加したフェニル乳酸であった。フェニル乳酸は、ラクトバチルス・プランタルム等のラクトバチルス細菌によって産生されることが知られている抗菌および抗真菌であり（Ｊｉａ、Ｊ．ら“Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅ  ｔｏ  ｐｈｅｎｙｌｌａｃｔａｔｅ：  ｇｅｎｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ、ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ａｎｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄ−  ａｎｄ  Ｌ１−ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＳＫ００２．”Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６２（１）：２４２−２５１、２０１０）、その増加は相関し、観察される桿菌細菌の増殖を支える（Ｌａｍら）。
【０１８２】
等価物
当業者は、日常的なものを超えない実験作業を使用して、本明細書に記載される発明の特定の実施形態と等価のものを多く認識し、または確かめることができる。本発明の範囲は、上述に限定されることを意図せず、むしろ以下の請求項に記載される。
【図１】
2014525266.tif 000009
【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2014525266.tif 000028
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2014525266.tif 000036
2014525266.tif 000037
2014525266.tif 000038
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