(57)【要約】  試料中の検体の活性濃度を決定する方法であって、（ａ）検体と特異的に結合し得るリガンドを支持しかつそれぞれに異なるリガンド密度を有する複数の固相表面又は表面領域に、試料の層流を接触させる段階、（ｂ）各々のリガンド支持表面又は表面領域におけるリガンドへの検体の初期結合速度（ｄＲ／ｄｔ）を決定する段階、及び（ｃ）決定された初期結合速度から、表面又は表面領域における輸送制限相互作用に対応する初期結合速度を決定する段階、及び（ｄ）段階（ｃ）で決定された初期結合速度から活性検体濃度を決定する段階を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の検体の活性濃度を決定する方法であって、
（ａ）検体と特異的に結合し得るリガンドを支持しかつそれぞれに異なるリガンド密度を有する複数の固相表面又は表面領域に、試料の層流を接触させる段階、
（ｂ）各々のリガンド支持表面又は表面領域におけるリガンドへの検体の初期結合速度（ｄＲ／ｄｔ）を決定する段階、
（ｃ）決定された初期結合速度から、表面又は表面領域における輸送制限相互作用に対応する初期結合速度を決定する段階、及び
（ｄ）段階（ｃ）で決定された初期結合速度から活性検体濃度を決定する段階
を含む方法。
【請求項２】
結合速度が４以上の異なるリガンド密度で決定される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
輸送制限相互作用に対応する初期結合速度が最大初期結合速度である、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
２以上の異なる流量が使用される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
２つの異なる流量について初期結合速度を決定する段階、異なるリガンド密度における初期結合速度から、初期結合速度が流量の立方根に比例する最低のリガンド密度を決定する段階、及びこの初期結合速度から活性検体濃度を決定する段階を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
さらに、異なる流量における結合速度の固定化レベルに対するプロットを用いて物質輸送基準の正当性を立証する段階を含む、請求項４又は請求項５記載の方法。
【請求項７】
さらに、異なる流量における結合速度の固定化レベルに対するプロットを用いて濃度分析に含めるべきデータを選択する段階を含む、請求項４乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
流量を単一の接触サイクル中に変化させる、請求項４乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
さらに、結合データを輸送係数が一定である速度論的モデルに当てはめる、部分的又は完全な輸送制限下での異なる流量における速度論的分析によって活性濃度決定からのデータを同時評価する段階を含む、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
液体試料の複数の希釈度が使用され、結合データのグローバルフィット中に含まれる、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
相互作用分析センサー、好ましくはバイオセンサーが使用される、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
相互作用分析センサーが質量検知、好ましくはエバネッセント波検知、特に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づいている、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
コンピューターで実行される、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法段階をコンピューターに実施させるための命令を含むコンピュータープログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質のような生物検体の濃度の決定に関し、さらに詳しくは生物検体の活性濃度の決定に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質及び他の生体分子の濃度を決定するためには数多くの方法が存在しているが、かかる方法の大部分は試料と標準調製物との比較を必要とする。しかし、多くの場合、標準品が入手できないか、或いは標準品の活性が不確実である。
【０００３】
多くの機会に、機能的に不活性な分子を含むことがある総濃度ではなく、生物検体の活性濃度を知ることも重要となる。これは、例えば、バイオ治療薬の開発及び生産の場合に言える。しかし、タンパク質濃度を測定するための確立された方法の多くは、活性分子と不活性分子とを区別しない。
【０００４】
このように、例えばタンパク質の総濃度は通例、活性分子と不活性分子とを区別しないＵＶ又はＮＩＲ吸収分光分析によって測定される一方、生体分子の活性濃度はバイオセンサー技術によって簡便に測定できる。それによれば、生体分子を含む試料を特異的なリガンドが固定化されたセンサー表面に接触させ、その表面における会合／解離プロセスをモニターする。この場合、測定される活性を定義するのはリガンドの選択である。
【０００５】
通常、活性濃度は校正曲線を用いて測定される。しかし、バイオセンサー技術を用いて活性濃度の決定を実施する際には、検体の拡散性と検体濃度との関係を使用することで、校正標準への参照なしに検体濃度を決定することができる。したがって、検体の拡散係数を知れば検体濃度を計算できる。検討中の検体に対して満足すべき校正物質が入手できない場合に有用であり得るこのタイプの濃度測定は、通常は校正不要濃度分（ＣＦＣＡ）といわれ、観察される結合速度がセンサー表面への検体分子の輸送によって部分的又は完全に制限される（即ち、拡散によって部分的又は完全に制御される）条件下において様々な流量で検体結合を測定することに基づいている。
【０００６】
表面プラズモン共鳴検出を用いて、ＣＦＣＡは最初にＫａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １６６（１）：７５−８によって記載され、さらにＳｉｇｍｕｎｄｓｓｏｎ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１（２６）：８２６３−７６によって記載された。この方法論は、（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（ウプサラ、スウェーデン）から市販されている）商業的なＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムにおいて実行されてきた。
【０００７】
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器では、試料はマイクロフローシステムに注入され、層流によってセンサー表面に輸送される。分子は拡散制御輸送プロセスによってバルク溶液からセンサー表面に到達する。輸送速度に影響する要因としては、検体分子の濃度に加えて、拡散係数、フローセル寸法及び流量がある。輸送速度と結合速度とのバランスにより、観察される結合が輸送制限されるか又は反応制限されるかが決定される。ＣＦＣＡの成功のためには、観察される結合速度は上述のように少なくとも部分的には輸送によって制限されなければならない。
【０００８】
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムにおける技術の現行の実施では、検体を固定化リガンドに結合させる２つの結合実験が必要とされる。１つの実験は低い流量（多くは５又は１０μｌ／分）で行われ、１つの実験は高い流量（多くは１００μｌ／分）で行われる。分析に際しては、応答を輸送（拡散）制限挙動についてチェックし、輸送係数が一定である速度論的モデルに応答を当てはめて検体の濃度を当てはめる。（詳細に関しては、２８−９７６８−７８８Ａ Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ、スウェーデン）を参照されたい。）
このアプローチは、多くの場合に効率的であるものの、すくつかの制約を有している。第一に、輸送制限の程度が固定化レベルに大きく依存する。低すぎる固定化レベルは輸送制限が小さすぎるデータをもたらし、高すぎる固定化レベルはフック効果（即ち、一定の固定化レベルを超えると応答が低下すること）を引き起こすことがある。第二に、ダイナミックレンジ（即ち、アッセイが有用である濃度範囲）が制限される。さらに、この方法は２つのサイクル／試料濃度を必要とするので時間がかかる。また、データ分析はもっぱら速度論的アルゴリズムに基づいている。
【０００９】
部分的又は完全な輸送制限下でのＣＦＣＡ測定の信頼性を向上させるための新規アプローチを提供することが本発明の目的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
国際公開第２０１１／０４９５３０号パンフレット
【発明の概要】
【００１１】
上述の目的並びに他の目的及び利点は、（少なくとも）様々なリガンド密度を有する複数の表面又は表面領域（即ち、異なるリガンド密度のアレイ）に沿った単一のフローパス又は注入、並びに最大初期結合速度及びそれによって活性濃度を決定するための曲線当てはめアルゴリズムを用いて活性濃度を決定する方法によって達成される。本方法は直接的なものであって、標準曲線を必要としない。
【００１２】
したがって一態様では、本発明は、試料中の検体の活性濃度を決定する方法であって、
（ａ）検体と特異的に結合し得るリガンドを支持しかつそれぞれに異なるリガンド密度を有する複数の固相表面又は表面領域に、試料の層流を接触させる段階、
（ｂ）各々のリガンド支持表面又は表面領域におけるリガンドへの検体の初期結合速度（ｄＲ／ｄｔ）を決定する段階、
（ｃ）段階（ｂ）で決定された初期結合速度から、固相表面又は表面領域における輸送制限相互作用に対応する初期結合速度を決定する段階、及び
（ｄ）段階（ｃ）で決定された初期結合速度から活性検体濃度を決定する段階
を含む方法を提供する。
【００１３】
段階（ｃ）で決定された初期結合速度は、通例は最大結合速度である。
【００１４】
しかし、好ましい実施形態では、本方法は、２つの異なる流量について初期結合速度を決定する段階、異なるリガンド密度における２つの流量についての初期結合速度から、初期結合速度が流量の立方根に比例する最低のリガンド密度を決定する段階、及びこの初期結合速度から活性検体濃度を決定する段階を含んでいる。
【００１５】
上記の好ましい実施形態の変形例では、流量を単一の接触（例えば、注入）サイクル中に変化させる。
【００１６】
別の好ましい実施形態では、本方法はさらに、結合データを輸送係数が一定である速度論的モデルに当てはめる、部分的又は完全な輸送制限下での異なる流量における速度論的分析によって活性濃度決定からのデータを同時評価する段階を含んでいる。好ましくは、液体試料の複数の希釈度が使用され、結合データのグローバルフィット中に含まれる。
【００１７】
他の好ましい実施形態は従属請求項に記載されている。
【００１８】
本発明の方法は、コンピューターのような電気的データ処理装置上で動作するソフトウェアによって簡便に実行できる。かかるソフトウェアは、記録媒体、読出し専用メモリ、或いは電気ケーブル若しくは光ケーブルを介して又は無線通信若しくは他の手段によって伝送し得る電気信号又は光学信号を含む任意適宜のコンピューター読取り可能な媒体に載せてコンピューターに提供できる。
【００１９】
したがって、本発明の別の態様は、上述した方法変形例のいずれか１つの方法段階をコンピューターに実施させるための命令を含むコンピュータープログラムに関する。
【００２０】
本発明のより完全な理解、並びにそのさらなる特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び添付の図面を参照することによって得られよう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】図１Ａは、初期結合速度のシミュレーションにおいて得られたグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、初期結合速度のシミュレーションにおいて得られたグラフである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、初期結合速度のシミュレーションにおいて得られたグラフである。
【図１Ｄ】図１Ｄは、初期結合速度のシミュレーションにおいて得られたグラフである。
【図２】図２は、８つの異なる結合レベルで当てはめた結合データのプロットである。
【図３】図３は、固定化レベルに対する初期結合速度のプロットである。
【図４】図４は、注入中に流量を変化させた、２つの異なる固定化レベルにおける結合対時間のプロットである。
【図５】図５は、分析のために作成した、図４のプロットに対応するプロットである。
【図６】図６は、通常のＣＦＣＡにおいて２つの異なる流量について当てはめた結合対時間データのプロットである。
【図７】図７は、同時に分析された複数の濃度においてグローバルに当てはめた結合対時間データのプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。また、単数形は特に断らない限り複数の場合も含めて意味する。
【００２３】
上述の通り、本発明は、流体試料中の検体（通例は生物検体）の活性濃度の決定に関する。簡単に述べれば、本方法は、検体結合リガンドの異なる密度又は固定化レベルを有する固体支持表面又は領域において検体結合相互作用を測定し、初期結合速度データから完全な輸送制限（即ち、相互作用が拡散制御される条件）下での初期結合速度を決定することに基づいており、それから活性検体濃度を決定できる。
【００２４】
好ましくは、活性濃度決定に際して相互作用分析センサー（通例はバイオセンサー）が使用される。
【００２５】
本発明を一層詳しく説明する前に、バイオセンサーの概念及び相互作用速度論の検出を簡単に説明しよう。
【００２６】
バイオセンサーは通例標識を使わない技術に基づき、固定化された層の質量、屈折率又は厚さのようなセンサー表面の性質の変化を検出する。本発明の目的のための典型的なバイオセンサーはセンサー表面における質量検出に基づいており、特に光学的方法及び圧電又は音波方法を含んでいる。光学的検出方法に基づく代表的なセンサーには、質量表面濃度を検出するもの、例えば反射光学的方法に基づくセンサー、例えば、エバネッセント波に基づくセンサー（例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサー）、フラストレーテッド全反射（ＦＴＲ）センサー及び導波管センサー（例えば、反射干渉分光法（ＲＩｆＳ）センサー）がある。圧電及び音波センサーには、表面音波（ＳＡＷ）及び水晶マイクロバランス（ＱＣＭ）センサーがある。
【００２７】
ＳＰＲ及びその他の検出技法に基づくバイオセンサーシステムは商業的に入手可能である。例示的なかかるＳＰＲバイオセンサーには、フロースルーセルに基づくＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ、スウェーデン）及びＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州）があり、これらは試料中の分子と検知表面に固定化された分子構造との相互作用を検出するために表面プラズモン共鳴を使用している。試料がセンサー表面を通過する際、結合の進行は相互作用が起こる速度を直接反映する。通常、試料の注入後に緩衝液流が続き、その間には検出器の応答は表面上の複合体の解離速度を反映する。システムからの典型的な出力は、会合相部分と解離相部分を含む分子相互作用の経時的進行を記述するグラフ又は曲線である。通常、コンピュータースクリーン上に表示されるこの結合曲線は「センサーグラム」といわれることが多い。
【００２８】
したがって、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムを用いれば、標識化を使用せずに、また多くの場合に関連する物質を精製することなく、試料中の特定の分子又は検体の存在及び濃度ばかりでなく、分子相互作用における会合（結合）と解離の速度論的速度定数及び表面相互作用に対する親和性を含む追加の相互作用パラメーターもリアルタイムで決定することが可能である。
【００２９】
以下、限定ではなく例示のみのため、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム型のＳＰＲセンサーに関して本発明を詳細に説明する。
【００３０】
上述の通り、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム並びに類似のセンサーシステムは、検体の総濃度と区別して活性検体濃度を測定する。測定される活性の種類を定義するのはセンサー表面上のリガンドの選択である。
【００３１】
例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム型の層流システムに、検体をセンサー表面に接触するようにして注入した場合、それは結合イベントを引き起こす。検体／リガンド相互作用の速度は、相互作用速度論及びフローシステムの輸送効率によって決定される。
【００３２】
生化学的相互作用に関しては、相互作用が進行する速度は順方向（会合）プロセスと逆方向（解離）プロセスとの差によって与えられる。検体Ａと表面結合（固定化）捕獲分子又はリガンドＢとの間の可逆的１：１相互作用に関しては、それは拡散又は物質移動によって制限されない。
【００３３】
【数１】
2014521063.tif 000002
式中、ｋa及びｋdはそれぞれ会合及び解離に関する速度定数である。
【００３４】
会合速度はｋa[Ａ][Ｂ]によって与えられ、解離速度はｋd[ＡＢ]によって与えられる。したがって、正味結合速度（即ち、生成複合体Ｂの表面濃度の変化）は次のようになる。
【００３５】
【数２】
2014521063.tif 000003
時間ｔの後、表面における非結合リガンドＢの濃度は[ＢT]−[ＡＢ]である。ここで、[ＢT]はリガンドＢの総濃度又は最大濃度である。上記式（２）に挿入すれば、次の式が得られる。
【００３６】
【数３】
2014521063.tif 000004
検出器の応答単位（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムでは、複合体の生成は共鳴単位（ＲＵ）で測定される応答の増加として観察される。）を用いれば、これは次のように表すことができる。
【００３７】
【数４】
2014521063.tif 000005
式中、Ｒは応答単位で表された応答であり、Ｃは試料中の検体の濃度であり、Ｒmaxは検体（Ａ）が表面上の全てのリガンド（Ｂ）に結合した場合に得られる応答（即ち、最大検体結合容量）である。
【００３８】
速度論的速度定数ｋa及びｋdは、通例、好ましくは複数の異なる検体濃度及びやはり好ましくはセンサー表面における１以上の他のリガンド密度に関する応答データを上記式（４）又は次のようなその積分形式に当てはめることによって計算される。
【００３９】
【数５】
2014521063.tif 000006
速度論的データ及び親和性データの分析のためのソフトウェアは商業的に入手可能である。したがって、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器によって生成された速度論的データ及び親和性データの評価は、通常、（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（ウプサラ、スウェーデン）から供給される）専用のＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアにより、数値積分を用いて微分速度方程式を計算すると共に、非線形回帰を用いて、平方残差の和を最小に減少させる最も密接な当てはめを与える変数の値を見出すことによって速度論的パラメーター及び親和性パラメーターを当てはめることで実施される。「残差」とは各点における計算曲線と実験曲線との差であり、実験曲線の上方又は下方に偏差を等しく重み付けするために平方残差が使用される。平方残差の和は次の式によって表される。
【００４０】
【数６】
2014521063.tif 000007
式中、Ｓは平方残差の和であり、ｒfは所定の点における当てはめ値であり、ｒxは同じ点における実験値である。例えば、上記の分子相互作用に関しては、かかるソフトウェア支援データ分析が、バックグラウンドノイズの減算後に、上記の式（４）又は（５）によって表されるような上述の単純な１：１結合モデルを測定データに当てはめる試みを行うことで実施される。
【００４１】
通常、結合モデルは、異なる検体濃度Ｃを用いて（及び／又は異なるレベルの表面誘導体化Ｒmaxを用いて）得られた複数の結合曲線に同時に当てはめられる。これは「グローバルフィッティング」といわれ、センサーグラムデータに基づき、かかるグローバルフィ
ッティングは単一のグローバルｋa又はｋdが全てのデータに良好な当てはめを提供するか否かを確認する。
【００４２】
しかし、上記のことは、拡散又は物質移動によって制限されない反応についてのみ有効である。
【００４３】
したがって、センサー表面に結合すべき検体については、分子をバルク溶液からセンサー表面に輸送しなければならないが、これは拡散制限プロセスである。Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）及び類似のバイオセンサーシステムに適用される層流条件下では、輸送速度はバルク溶液中の検体の濃度に比例する。
【００４４】
所定の分析状況では、任意の時点で観察される結合速度は、正味の生化学的相互作用速度及び物質輸送速度の相対的大きさによって決定される。相互作用が輸送よりずっと速ければ、観察される結合はもっぱら輸送プロセスによって制限される。このことはまた、検体が解離中に表面から十分に速く拡散せずに再結合を引き起こす場合にも言える。逆に、輸送が速くて相互作用が遅ければ、観察される結合は相互作用速度論のみを表す。２つのプロセスの速度が同程度の大きさである場合、結合は２つの速度特性の組合せによって決定される。
【００４５】
全体的な相互作用プロセスは、次のスキームによって表すことができる。
【００４６】
【数７】
2014521063.tif 000008
バルク溶液から表面への物質輸送速度は次の式によって与えられる。
【００４７】
【数８】
2014521063.tif 000009
式中、Ａsurfaceはセンサー表面における検体濃度であり、Ａbulkはバルク溶液中の検体濃度であり、ｋmは物質輸送係数である。
【００４８】
したがって、結合相互作用を記述する微分方程式は、上記式（８）に対応した、表面への検体の物質移動に関する項を含んでいる。フローセルに関しては、１組の対になった常微分方程式からなりかつ例えばＭｙｓｚｋａ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７５，５８３−５９４に記載されている「２コンパートメント」モデルが、データが物質輸送によって影響される場合に結合速度論の合理的な説明を与えるものと考えられる。このモデルでは、フローセルは２つのコンパートメントに分けられると仮定され、一方では検体の濃度が一定であり、センサー表面に近い第２のものでは検体濃度が物質輸送速度、リガンドの表面密度及び反応速度定数に依存する。
【００４９】
固定化一価リガンドＢと反応する一価検体Ａの上記に例示された相互作用に関しては、このモデルは、上記式（３）に代えて以下の２つの微分方程式で表すことができる。
【００５０】
【数９】
2014521063.tif 000010
【００５１】
【数１０】
2014521063.tif 000011
式中、ｋmは（コンパートメント間の検体の拡散的移動を記述する）物質輸送係数であり、ＢTは総リガンド濃度であり、Ａsurfaceはセンサー表面における遊離検体の濃度であり、Ａbulkは注入（即ち、初期）検体濃度であり、ＡＢは複合体ＡＢの濃度（＝結合検体の表面密度）であり、ｋa及びｋdはそれぞれ会合速度定数及び解離速度定数である。
【００５２】
下記に一層詳しく説明されるように、物質輸送係数ｋmは計算することができ、応答データを式（９）及び（１０）に当てはめることで速度論的速度定数ｋa及びｋdが得られる。
【００５３】
上記に略述した速度論的特性決定は、従来、各試料濃度を独立のサイクルで流し、各サイクル間には表面の再生によって検体を除去する十分に確立された方法を用いて実施されてきた。しかし、「単一サイクル分析」といわれる最近開発されたアプローチでは、検体が単一のサイクルにおいて増加する濃度（又は他のやり方で変化する濃度）で注入され、表面は注入間に再生されない。かかる単一サイクル分析の一層詳しい説明については、Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４９：１３６−１４７（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）を参照されたい。
【００５４】
上述した物質輸送係数ｋmに関しては、次の式が適用される。
【００５５】
【数１１】
2014521063.tif 000012
式中、Ｄは検体の拡散係数（ｍ2／ｓ）であり、Ｆはフローセルを通る液体の体積流量（ｍ3／ｓ）であり、ｈ、Ｗ及びｌはフローセルの寸法（高さ、幅及び長さ（ｍ））である。
【００５６】
拡散係数Ｄは、分子の大きさ及び形状並びに当該溶媒の粘度によって与えられる摩擦抵抗の関数である。球状分子の場合、拡散係数は半径に反比例し、したがって分子量の立方根に比例する。しかし、タンパク質のような非常に大きい溶質分子の場合、拡散係数は分子量に対して比較的鈍感である。
【００５７】
拡散係数に関して文献値が存在しなければ、例えば分析超遠心又は光散乱によってそれを実験的に決定できる。別法として、拡散係数は次の式に従って分子量及び形状係数又は摩擦速度から推定できる。
【００５８】
【数１２】
2014521063.tif 000013
式中、Ｄは拡散係数（ｍ2／ｓ）であり、Ｍは分子量（ダルトン）であり、ｆは摩擦比であり、ηrelは２０℃の水と比較した溶媒の粘度である。
【００５９】
したがって、式（９）及び（１０）から、物質輸送係数ｋmを計算できる。
【００６０】
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムに関しては、検体の分子量について調整し、（ＲＵで）測定された応答を濃度単位に変換することで、Ｂｉａｃｏｒｅ固有の物質移動定数ｋtを求めることができる。
【００６１】
【数１３】
2014521063.tif 000014
ここで、Ｍは分子量（Ｍｗ）であり、変換定数１０9は近似値であって、タンパク質検体及び特定のセンサー表面Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ、スウェーデン）についてのみ有効である。他の検体／センサー表面に関しては、ＲＵ変換係数によるシステムの校正が必要となる（１ＲＵは×ｎｇ／ｍｍ2に等しい）。
【００６２】
検体の拡散性との関係を部分的な拡散制御条件下での結合速度の分析と共に用いて校正不要濃度測定結果を評価するためには、拡散係数から物質輸送係数を計算し、次いで物質輸送定数ｋtに変換し、これを用いて実験データを拡散制御相互作用モデルに当てはめ、それによって試料の検体濃度を求めることができる。
【００６３】
通例、（ＳＰＲ検出技術を用いるＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムの場合）、試料検体（例えばタンパク質）を２つの流量（例えば、５及び１００μｌ／分）で固定化リガンドに沿って流し、各試行の初期結合速度（ｄＲ／ｄｔ）を決定する。次いで、（通例は専用のソフトウェアにより）、当てはめるべきパラメーターとしての検体濃度及び既知定数としてのｋmをＭｗと共に設定することで検体濃度Ｃを評価する。
【００６４】
一般に、結合速度は試料注入の開始から直ぐに測定すべきである。これは、結合が定常状態に近づくに従って速度はゼロに近づくからである。
【００６５】
本発明
システムの輸送効率によって完全に制限される反応については、次の式が適用される。
【００６６】
【数１４】
2014521063.tif 000015
式中、Ｒは検出器応答であり、ｋmは物質輸送係数であり、Ｃは試料の検体濃度である。即ち、センサー表面における応答増加ｄＲ／ｄｔ又は結合速度は物質輸送係数及び検体の活性濃度な比例する。
【００６７】
上記の式（１４）から、完全な輸送制限時の（初期）結合速度ｄＲ／ｄｔ及びｋmを知れば、ｄＲ／ｄｔをｋmで割ることで検体濃度Ｃを計算できることがわかる。
【００６８】
しかし、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムのような質量検知システムに関しては、応答信号は質量依存性であり（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムの場合にはＲＵ）、信号は上記の式（１３）に従って質量に関係しているはずである。したがって、Ｃを得るためには、ｄＲ／ｄｔを（ｋmではなく）ｋtで割る。
【００６９】
本発明は、完全な輸送制限時の初期結合速度を決定し、それによって活性濃度の決定を可能にするためのアプローチを提供する。これは、１以上のセンサー表面上で複数の異なるリガンド密度を用ることで得られる複数の異なる部分的制限条件下で初期結合速度を測定することによって達成される。
【００７０】
さらに詳しくは、複数（好ましくは４以上）の異なるリガンド密度レベル（即ち、固定化レベル）で初期結合速度を測定する。各固定化レベルについて、１以上の固定流量を用いて応答を記録する。初期結合速度を固定化レベル又は最大結合容量Ｒmaxに対してプロットし、通例はそれが可能なアルゴリズムを用いてデータを外挿することで、ｄＲ／ｄｔがその最大値に達した結合速度を決定する。この最大結合速度は物質輸送制限時の結合速度に対応し、これは上記の式（１４）が適用され、したがってｄＲ／ｄｔをｋtで割ることで活性濃度Ｃを計算できることを意味する。
【００７１】
外挿は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムで通常使用される４パラメーター回帰式にデータを当てはめることで実施できる。
【００７２】
【数１５】
2014521063.tif 000016
式中、Ｒhigh及びＲlowはそれぞれ最大及び最小応答レベルに対応する当てはめパラメーターであり、Ａ1及びＡ2は追加の当てはめパラメーターであり、ｙはｄＲ／ｄｔであり、ｘはＲmax又はリガンド密度である。
【００７３】
最大値を確定し得る他のアルゴリズムも適用できる。
【００７４】
上記の式（１１）に従えば、物質輸送係数ｋmは(流量)1/3に比例する。したがって、完全な輸送制限反応については、結合速度ｄＲ／ｄｔも式（１４）に従えば(流量)1/3に比例する。
【００７５】
本方法の現時点で好ましい変形例では、検体応答は２つの異なる流量を用いて測定される。データ分析では下記に記載するように検体に関する組合せデータを使用することができ、さらに固定化レベルに対する結合比のプロットを用いて物質輸送基準の正当性を立証することができる。
【００７６】
結合速度比のプロットはまた、（希釈率及び予測可能なＲhighと無関係にグラフを重ね合わせる）予想挙動からの偏差がこのプロットの特徴であるので、濃度分析中に含めるべきデータを選択するためにも使用できる。
【００７７】
固定化レベルのより広い範囲にわたって結合データを収集する場合、当てはめアルゴリズムは、結合データが流量の立方根に比例するという基準を満たす最低の固定化レベルを確定するように構成される。したがって、この点では、物質輸送係数で割った初期結合速度として活性濃度を導くことができる。
【００７８】
例えば、流量がそれぞれ１０μｌ／分及び８０μｌ／分であると仮定すれば、完全に速度論的に制御された反応については、結合速度は流量によって影響されず、したがって結合速度比は１であることが容易にわかる。それとは対照的に、反応が完全に輸送制限される場合、この例示的な場合における結合比は２［(８０／１０)1/3］である。したがって、結合速度比が２である固定化レベル（リガンド密度）を決定し、その固定化レベルにおける結合速度のいずれかから検体濃度を計算できる。
【００７９】
２つの流量を用いる後者の方法変形例では、１回の試料注入中に流量を変化させる上述の単一サイクルアプローチが使用できる。例えば、試料を１０μｌ／分で注入し、５〜２０秒後に流量を１００μｌ／分に増加させることができる。データ分析に際しては、これは使用する評価アルゴリズム中に実際の流量を入力することによって処理される。
【００８０】
任意には、本方法は液体試料の２以上の異なる希釈度を用いて実施される。
【００８１】
式（１３）に関連して上述したようにして、センサーチップＣＭ５についてのＲＵ変換係数が得られる。濃度がＣＭ５表面上で決定されているならば、異なる表面についても、例えば測定表面からの距離に応じて異なる変換係数を用いて同じ濃度が得られるはずである。ＣＭ５表面上でグローバル分析を実施することで、他の表面に関する物質輸送定数ｋｔを計算でき、かくして使用範囲を他のタイプの表面に拡大できる。
【００８２】
異なるリガンド密度を有する表面又は表面領域への試料の接触は、単一のセンサー表面を有する分析機器において、順次の試料注入及び注入間でのリガンド密度の変化によって実施できる。しかし好ましくは、本方法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００、Ｔ２００又は４０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウブサラ、スウェーデン）或いはＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州）のようなマルチフローチャンネル機器を用いて、好ましくは並行試料注入によって実施される。
【００８３】
任意には、異なる固定化レベル及び異なる流量で結合データを収集する場合、本発明の方法は上述したような「通常の」校正不要濃度分析（ＣＦＣＡ）と組み合わせることができる。即ち、かかる組合せ分析は、（本発明の方法におけるような）完全な輸送制限への外挿及び（「通常の」ＣＦＣＡにおけるような）部分的な輸送制限下での分析の両方を考慮しており、したがってより頑強になる可能性を有する。
【００８４】
組合せ分析は、共通パラメーターをグローバルに当てはめることによって可能となる。通常のＣＦＣＡでは、Ｃを直接に当てはめる。上記の式（１５）に基づく４パラメーター当てはめでは、Ｒｈｉｇｈを決定し、上述のように対応する結合速度ｄＲ／ｄｔをｋtで割ることで検体濃度Ｃを得る。ここでは、濃度Ｃを代わりに修正４パラメーター方程式中に当てはめパラメーターとして設定することもできる。これは、速度論に基づく実験及び初期結合速度実験がグローバルパラメーターを共有する結果、実験を同時評価できることを意味する。
【００８５】
組合せ分析では、「通常の」ＣＦＣＡは好ましくは、液体試料の複数の異なる希釈度が使用され、少なくともいくつかの希釈度が濃度データのグローバルフィット中に含まれ、いくつかの希釈度に同じ当てはめ基準が適用されるような後者の改良法によって置き換えられる。かくして、分析はより頑強になると共に、分析のダイナミックレンジは拡大する。かかる改良ＣＦＣＡは、本願と同日に提出された、“Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ａｃｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ ａｎａｌｙｓｉｓ”と称する我々の同時係属特許出願（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）中に記載されている。
【００８６】
校正不要方式で活性濃度を決定する有利な方法では、複数の異なる試料希釈度に関し、部分的又は完全な輸送制限時に異なる固定化レベル及び異なる流量で（初期）結合速度データを収集する。次いで、複数の代替手段に従って得られた結合速度データを評価する選択の自由がある。即ち、かかる代替手段としては、（ｉ）完全な輸送制限への外挿、（ii）好ましくは試料の複数の希釈度に関するデータのグローバルフィッティングを用いる改良ＣＦＣＡによる、部分的な輸送制限下での分析、又は（iii）（ｉ）と（ii）との組合せがある。
【００８７】
複数のリガンド密度（固定化レベル）及び異なる流量について結合データが生成され、かつ当てはめのために一定の物質輸送定数ｋｔが使用される場合には、同一の実験からのデータを用いて濃度及び速度論を同時に当てはめることが可能である。
【００８８】
濃度分析及び速度論的分析は、様々なやり方で組み合わせることができる。例えば、捕獲実験では、先ず抗体を表面上に捕獲してその濃度をＣＦＣＡで決定した後、抗体の注入による「通常の」速度論的分析を用いて実験を続ける。次いで、単一の実験によって抗体濃度及び抗体速度論の両方が得られる。
【実施例】
【００８９】
次に、以下の非限定的な実施例によって本発明をさらに例示する。
【００９０】
実施例１
例えば一部変更したＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００システムを用いる本発明の方法によって活性濃度を決定するための手順は、次のようにして実施できる。
【００９１】
（この記載はＣＦＣＡ実験そのものに焦点を合わせたものであり、固定化方法、緩衝液条件及び再生条件のような他のアッセイ開発段階は既に実施済みであることに注意されたい。）
１）適当な固定化技法（アミンカップリング、チオールカップリング、ビオチニル化、ストレプトアビジン上への捕獲、或いは他のタグ又はドメイン特異的捕獲試薬の固定化）を用いてセンサー表面上の個別のスポット／チャンネルにリガンドを固定化する。固定化レベルを記録する。
【００９２】
２）参照のため、１つのスポットは固定化リガンドを持たないままにする。
【００９３】
３）試料の連続希釈液（通例は２〜５段階）を調製する。
【００９４】
４）Ｍｅｔｈｏｄ Ｂｕｉｌｄｅｒソフトウェアを用いて、次のようなアッセイ段階を有するアッセイを構成する。
ａ）システムのコンディショニングのために使用される始動サイクル。始動サイクルは通例は試料サイクルの模倣であるが、。データ分析では無視される。
ｂ）実際の分析のための試料サイクル。
【００９５】
各サイクルでは、ソフトウェアに関連する入力を与えて試料の注入のための条件（流量、注入中に到達すべきスポット、接触時間、解離時間及び注入特性）を確定する。可逆的な捕獲固定化を使用する場合には、興味あるリガンドを捕獲するために追加の注入が使用される（例えば、ヒスチジン標識タンパク質は固定化された抗ヒスチジン抗体上に捕獲することができる。）大抵の場合、再生溶液もプログラムされる。
【００９６】
試料に関する典型的なプログラム入力は次の通りである。高速注入、流路１，２、接触時間３６秒、解離時間５秒、流量５又は１００μｌ／分。試料名及び希釈率も与えられる。好ましくは、濃度ゼロの試料の１回以上の注入をプログラムすべきである。
（市販のソフトウェアを使用した場合、注入中の流量変化は可能でないことに注意されたい。）
５）高いデータ収集速度（通例１０Ｈｚ）を選択する。
【００９７】
６）アッセイを実行する。
【００９８】
７）４以上の異なるリガンド密度を用いてアッセイを繰り返す。
【００９９】
８）適当な評価プログラム、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００評価ソフトウェア又はＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア４．１においてデータを開く。
【０１００】
９）適切なブランク注入（濃度ゼロの試料）を選択する。
【０１０１】
１０）試料注入からブランク注入を差し引く。
【０１０２】
１１）オーバーレイプロット中にデータを表示する。
【０１０３】
１２）残留する参照又はブランク減算アーティファクトによる影響を受けない結合曲線の最も早期の部分を確認する。５μｌ／分の流量では、これは通常注入開始から数秒であり、１００μｌ／分では、これは通例注入開始から１秒付近である。
【０１０４】
さらなる分析は複数の部分に分けられる。
【０１０５】
パート１
初期結合速度を用いる濃度の決定
１）初期結合速度を決定するため、最も早期の妨害されないデータのウィンドウを選択する。典型的なデータウィンドウは５〜１０秒であるが、それより短くても長くてもよい。
【０１０６】
２）データを線形方程式ｙ＝ａ＊ｘ＋ｂ（式中、ｘは初期結合速度に対応している。）に当てはめる。
【０１０７】
３）注入中に流量を変化させる場合には、流量の変化からできるだけ早く第２の流量に関するデータを選択し、第２の流量に関する初期結合速度を決定する。
【０１０８】
４）異なる流量で得られた結合速度の比を計算する。
【０１０９】
５）各試料希釈度に関し、初期結合速度及びポイント４で記載した結合速度の比を固定化リガンドのレベルに対してプロットしたグラフを作成する。
【０１１０】
６）上記の式（１５）を用いて結合速度データを当てはめる。かかる当てはめは、各試料希釈度について最大の結合速度を返すように直接に行うか（全ての当てはめパラメーターはローカルである）、或いは好ましくは試料希釈度及び流量の変化を説明するパラメーターでＲhighを置換した修正バージョンに対して行う。例えば、Ｒhighの代わりに、Ｒhigh＊((Ｆｌｒａｔｅ／Ｌｆｒａｔｅ)＾(１／３))／Ｄｉｌを使用できる。式中、Ｆｌｒａｔｅは結合速度が決定される実際の流量であり、Ｌｆｒａｔｅは実験で使用される最低の流量であり、Ｄｉｌは試料に関する希釈率である。
【０１１１】
７）Ｒhighをｋm値で割ることで試料の濃度を求める。グローバルフィットを使用する場合には、割るために使用するｋt値は最低の流量に対応したものであることに注意されたい。
【０１１２】
パート２
単一サイクルＣＦＣＡ
このアプローチでは、流量を注入中に変化させる。時間区分をそれぞれの流量とリンクさせることで、このデータは容易に分析できる。
【０１１３】
パート３
通常のＣＦＣＡデータのグローバル分析
この手順には、複数の濃度のグローバル分析を可能にするためのＣＦＣＡアルゴリズムの修正が組み込まれる。これは、希釈率を通して局所濃度を導き出し、グローバルフィットを実施することによって行われる。
【０１１４】
実施例２
初期結合速度のシミュレーション
以下の実施例では、初期結合速度のシミュレーションからのデータを、図１Ａ乃至１Ｄを参照しながら説明する。
【０１１５】
図１Ａはシミュレートしたデータのオーバーレイプロットを示している。左のパネルでは、濃度は３ｎＭ（希釈率１０）である。５０、１００、３００、５００及び１０００ＲＵの結合容量を与えるリガンドレベル、ｋａ １ｅ６、ｋｄ １ｅ−３、ｋｔ １ｅ９（赤）又は２ｅ９（青）。右のパネルでは、濃度は１０ｎＭ（希釈率３）である。他のパラメーターは全て、左のパネルの通りである。
【０１１６】
図１Ｂは、注入開始から１〜４秒における３秒のウィンドウを用いた結合データの直線当てはめを示している。
【０１１７】
図１Ｃは、修正４パラメーター方程式を用いたグローバルフィットを示している。両方の流量における各濃度についての結合速度をリガンド密度（Ｒｍａｘ）に対してプロットする。分析によって返されたデータは、Ｒｈｉ ３０２、Ｃｈｉ＾２ ６２Ｅ−０６、非希釈試料の濃度３０ｎＭである。
【０１１８】
図１Ｄは、リガンド密度（Ｒｍａｘ）に対してプロットした結合速度比を示している。データが重なり合っていることに注意されたい。当てはめたＲｈｉは１．０８であって、ｋｔの２倍の変化に対して一致している。
【０１１９】
実施例３
抗β−２−ミクログロブリン抗体及びβ−２−ミクログロブリンを用いて得られた結合データの分析
この実施例では、（４３５〜１３３００ＲＵの範囲内にある）８つの異なる結合レベルで抗体を固定化し、１つの濃度のβ−２−ミクログロブリンを５μｌ／分の流量で注入した。結合データ及び５秒のウィンドウを用いたデータへの直線当てはめを図２に示す。
【０１２０】
初期結合速度（ｄＲ／ｄｔ）を固定化レベル（Ｉｍｍ）に対してプロットし、式（１５）を用いたデータの当てはめを図３に示す。
【０１２１】
Ｒｈｉ（この場合には４．８１ＲＵ／ｓ）を関連するｋｔ値４．９ｅ８ＲＵ／(Ｍ＊ｓ)で割って９．９ｎＭの活性濃度を得ることにより、β−２−ミクログロブリンの濃度を決定した。
【０１２２】
固定化レベル４２００ＲＵ及び１０４００ＲＵで得られたデータを、図４に示すように２つの流量で分析した。この実験では、流量は最初５μｌ／分であり、注入開始から１５秒後に１００μｌ／分に変化させた。数ＲＵの信号オフセットが切り取られた。流量の増加には結合速度の増加が伴っている。
【０１２３】
図示されたこのデータを、図５に示すように、参照及びブランク減算なしに直接分析した。
【０１２４】
この手順によって決定された濃度は１０．７ｎＭであり、当てはめに際して使用し及び当てはめ中に得られた追加のパラメーターは下記の表１中に示す。
【０１２５】
【表１】
2014521063.tif 000017
当てはめたＲｍａｘ値は固定化レベルに対応している一方、他のパラメーターは定数として使用した。ｋｔ１及びｋｔ２は、それぞれ５及び１００μｌ／分における輸送係数である。
【０１２６】
実施例４
ＣＦＣＡデータのグローバルフィット
ここに記載する実験では、抗体を結合し得る固定化プロテインＡ誘導体に対する抗体結合が実証される。通常のＣＦＣＡ分析を図６に示す。
【０１２７】
検体を別々のサイクルにおいて様々な流量で注入した。この場合、検体は原液濃度に対して４００倍に希釈した。ＣＦＣＡ分析は１９．１ｎＭの局所抗体濃度を与え、したがって原液は７．６μＭである。
【０１２８】
しかし、多くの場合、試料の複数の希釈度を試験するのが有用であり、分析は長々しくなる。データのグローバルフィットに頼ることで、図７に示すように複数の濃度が同時に分析される。
【０１２９】
このグラフは、抗体希釈度１：４００、１：１２００、１：３６００及び１：１０８００のグローバルフィットを示している。各希釈液が２つの流量で注入され、原液についてグローバルに決定された濃度は７．６μＭである。これは直ちに、濃度分析が希釈度に依存せず、分析を簡略化することを証明している。
【０１３０】
本発明は上記の好ましい実施形態に限定されない。様々な代替例、修正例及び同等物を使用し得る。したがって、上記実施形態は添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の技術範囲を限定するものと解すべきない。
【図１Ａ】
2014521063.tif 000018
【図１Ｂ】
2014521063.tif 000019
【図１Ｃ】
2014521063.tif 000020
【図１Ｄ】
2014521063.tif 000021
【図２】
2014521063.tif 000022
【図３】
2014521063.tif 000023
【図４】
2014521063.tif 000024
【図５】
2014521063.tif 000025
【図６】
2014521063.tif 000026
【図７】
2014521063.tif 000027
【国際調査報告】
2014521063.tif 000028
2014521063.tif 000029
2014521063.tif 000030
2014521063.tif 000031
2014521063.tif 000032
2014521063.tif 000033