(57)【要約】  本発明は、マンノ−スを含む炭水化物重合体を含む、免疫調節化合物を提供し、その炭水化物重合体は、少なくとも１つの免疫調節物質に結合される。本発明はまた、免疫調節組成物中での本化合物を、ワクチン接種および遺伝子療法の方法のために使用すること、ならびにその調製のためのプロセスを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンノ−スを含む炭水化物重合体を含み少なくとも１つの免疫調節物質に結合される、免疫調節化合物。
【請求項２】
１つを超える免疫調節物質が存在するとき、各免調節物質は、同じまたは異なり得る、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記炭水化物重合体が約１０００ｋＤａ超である、請求項１または請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記炭水化物重合体が酸化される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
前記炭水化物重合体が少なくとも１つの抗原またはそれをコ−ドする核酸に更に結合される、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記酸化された炭水化物重合体は、前記免疫調節物質および／または抗原もしくはそれをコ−ドする核酸への結合前に、少なくとも１５０個のアルデヒド基を有する、請求項４または請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、原虫抗原、真菌抗原、もしくは腫瘍抗原、自己抗原、またはアレルゲンである、請求項５または請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
前記酸化された炭水化物重合体は、前記少なくとも１つの抗原に共有結合により結合される、請求項５〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
前記酸化された炭水化物重合体は、ポリカチオンを介して前記少なくとも１つの核酸に結合される、請求項５〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
前記炭水化物重合体は、マンナンである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
前記マンナンは、酵母由来である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
前記免疫調節物質および／または抗原もしくはそれをコ−ドする核酸への結合前、かつアミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＮＴＳ）での標識後の、前記マンナンのサイズ分布は、タンパク質標準物に基づき約１５０〜約２５０ｋＤａであり、かつ／または炭水化物標準物に基づき約８００〜約３０００ｋＤａである、請求項１０または請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの免疫調節物質は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのＴＬＲアゴニストは、グアノシン類似体、デアザアデノシン類似体、イミダゾキノリン、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
前記ＴＬＲアゴニストは、ロキソリビン、イサトリビン、イミキモド、レシキモド、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１３または請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
各免疫調節物質は、リンカ−を介して前記炭水化物重合体に結合され、結合前に、各リンカ−は、前記免疫調節物質または前記炭水化物重合体への結合が可能な１つ以上の官能基を含み、前記官能基は任意に、好適な脱離基または保護基を含んでもよい、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
各官能基は、アルデヒド、ケトン、ホルミル、ヒドラジン、ヒドラジド、アミン、アミド、カルボン酸、アルキン、マレイミド、スルフヒドリル、およびハロゲンからなる群から選択される、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
前記アミンの好適な保護基は、ＢＯＣ基である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
前記ホルミルの好適な脱離基は、パラ−ニトロフェノキシ基である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２０】
各免疫調節物質は、
ｉ）炭水化物重合体に結合された官能基（タイプ（ｉ）基）と、
ｉｉ）免疫調節物質に結合された官能基（タイプ（ｉｉ）基）と、
ｉｉｉ）スペ−サ−と、
を含むリンカ−を介して、前記炭水化物重合体に結合され、各リンカ−は、同じであっても、相互に異なってもよい、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２１】
前記タイプ（ｉ）基は、ヒドラゾンである、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
前記タイプ（ｉｉ）基は、カルバメ−ト基である、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２３】
前記スペ−サ−は、１つ以上の異なるタイプの結合単位を含む、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２４】
各結合単位は、エチレングリコ−ルおよび／またはプロピレングリコ−ルの重合体、ポリアリ−ル、アミノ酸残基またはその誘導体、アルキルまたはアルケニル鎖、フェニル含有部分、ならびに糖類からなる群から独立して選択される、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
前記スペ−サ−は、１〜１００単位のエチレングリコ−ルおよび／またはプロピレングリコ−ルを含む重合体を含む、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２６】
前記スペ−サ−は、１〜１０単位のエチレングリコ−ルおよび／またはプロピレングリコ−ルを含む重合体、１〜５アミノ酸残基またはそれらの誘導体、ならびにフェニル含有部分を含む、請求項２４または請求項２５に記載の化合物。
【請求項２７】
結合後、前記リンカ−は、切断可能である、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２８】
前記切断可能なリンカ−は、エステル、カルバメ−ト、ヒドラゾン、アミド、およびアセタ−ルからなる群から選択される切断可能な基を含む、請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
前記酸化された炭水化物重合体および前記免疫調節物質は、式Ｉ：
【化１】
2014532799.tif 000095
の式を有し、式中、
Ａは、保護基であり、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
Ｂは、アミノ酸残基またはその誘導体であり、
ｎは、１〜１０の間の整数であり、
ｐは、１〜５の間の整数であり、
ＬＧは、脱離基である、
リンカ−との反応により連結される、請求項４〜２８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３０】
前記脱離基は、パラ−ニトロフェノキシ基である、請求項２９に記載の免疫調節化合物。
【請求項３１】
前記酸化された炭水化物重合体および前記免疫調節物質は、式ＩＩ：
【化２】
2014532799.tif 000096
の式を有し、式中、
Ａは、保護基であり、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
Ｂは、アミノ酸残基またはその誘導体であり、
ｎは、１〜１０の間の整数であり、
ｐは、１〜５の間の整数である、
リンカ−との反応により連結される、請求項４〜２８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３２】
前記保護基は、ＢＯＣである、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３３】
リンカ−を介して少なくとも１つの免疫調節物質に結合される、酸化されたマンナンを含む：
【化３】
2014532799.tif 000097
式中、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
Ｂは、アミノ酸残基またはその誘導体であり、
ｎは、１〜１０の間の整数であり、
ｐは、１〜５の間の整数であり、
Ｘは、結合または−ＭｅＮ（ＣＨ２）２ＮＭｅＣ（Ｏ）−である、
式ＩＩＩの化合物。
【請求項３４】
ｉ）免疫調節物質は、ロキソリビンまたはその誘導体であり、
ｉｉ）Ｘは、−ＭｅＮ（ＣＨ２）２ＮＭｅＣ（Ｏ）−であり、
ｉｉｉ）前記免疫調節物質は、その第一級または第二級ヒドロキシル基を通じてＸに結合される、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３５】
ｉ）免疫調節物質は、レシキモドまたはその誘導体であり、
ｉｉ）Ｘは、−ＭｅＮ（ＣＨ２）２ＮＭｅＣ（Ｏ）−であり、
ｉｉｉ）前記免疫調節物質は、前記免疫調節物質上の遊離ヒドロキシル基を通じてＸに結合される、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３６】
前記遊離ヒドロキシル基は、第三級ヒドロキシル基である、請求項３５に記載の化合物。
【請求項３７】
ｉ）免疫調節物質は、ロキソリビンもしくはレシキモドまたはその誘導体であり、
ｉｉ）Ｘは、結合であり、
ｉｉｉ）前記免疫調節物質は、前記免疫調節物質上の遊離アミノ基を通じてＸに結合される、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３８】
ｉ）−（ＥＧおよび／またはＰＧ）ｎ−は、エチレングリコ−ル（ＥＧ）単位のみであるか、
ｉｉ）−（ＥＧおよび／またはＰＧ）ｎ−は、プロピレングリコ−ル（ＰＧ）単位のみであるか、あるいは
ｉｉｉ）−（ＥＧおよび／またはＰＧ）ｎ−は、エチレングリコ−ル（ＥＧ）およびプロピレングリコ−ル（ＰＧ）単位の混合物である、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３９】
ｎは、８であり、かつ／またはｐは、１〜３である、請求項２９〜３８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４０】
ｐは、２である、請求項３９に記載の化合物。
【請求項４１】
ｐが１よりも大きいとき、各アミノ酸残基は、同じであるか、または異なる、請求項２９〜４０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４２】
各アミノ酸残基は、バリンおよびリジンからなる群から独立して選択される、請求項２９〜４１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４３】
【化４】
2014532799.tif 000098
式中、
Ｒ１およびＲ２は各々、水素およびＡからなる群から独立して選択され、
Ａは、保護基であるか、
あるいはＲ１およびＲ２は、一緒になって、カルボニル炭素を介して別の部分に連結する二重結合を形成し、
Ｙは、−ＣＨ２−および−Ｏ−から選択され、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
Ｂは、アミノ酸残基またはその誘導体であり、
ｎは、０〜１０の間の整数であり、
ｐは、１〜５の間の整数であり、
ｑは、０および１から選択される整数であり、
Ｘは、免疫調節物質の１個以上のヒドロキシル基または免疫調節物質の遊離アミノ基に結合することが可能な連結基である、
式ＩＶの化合物。
【請求項４４】
Ｒ１およびＲ２は、一緒になって、カルボニル炭素を介して炭水化物重合体に連結する二重結合を形成する、請求項４３に記載の化合物。
【請求項４５】
前記炭水化物重合体は、酸化されたマンナンである、請求項４４に記載の化合物。
【請求項４６】
リンカ−を介して少なくとも１つの免疫調節物質に結合される、酸化されたマンナンを含む：
【化５】
2014532799.tif 000099
式中、
Ｙは、−ＣＨ２−および−Ｏ−から選択され、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
Ｂは、アミノ酸残基またはその誘導体であり、
ｎは、０〜１０の間の整数であり、
ｐは、１〜５の間の整数であり、
ｑは、０および１から選択される整数であり、
Ｘは、免疫調節物質の１個以上のヒドロキシル基または免疫調節物質の遊離アミノ基に結合することが可能な連結基である、
式Ｖの化合物。
【請求項４７】
ｐは、１〜３の間の整数である、請求項４３〜４６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４８】
ｐは、２である、請求項４７に記載の化合物。
【請求項４９】
ｐが１よりも大きいとき、各アミノ酸残基は、同じであるか、または異なる、請求項４３〜４８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５０】
各アミノ酸残基は、バリンおよびリジンからなる群から独立して選択される、請求項４９に記載の化合物。
【請求項５１】
ｎは、０である、請求項４３〜５０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５２】
ｑは、０である、請求項４３〜５１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５３】
Ｘは、前記免疫調節物質の少なくとも１つのヒドロキシル基または遊離アミノ基を介して前記免疫調節物質に連結される、−Ｒ３Ｎ（ＣＨ２）２ＮＲ４Ｃ（Ｏ）−であり、
式中、Ｒ３およびＲ４は各々、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立して選択される、請求項４３〜５２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５４】
Ｘは、前記免疫調節物質の２個のヒドロキシル基によるアセタ−ルの形成を通じて前記免疫調節物質に連結される、請求項４３〜５２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５５】
Ｘ−免疫調節物質は、次の官能基：
【化６】
2014532799.tif 000100
を含み、式中、２個の酸素および点線の結合は、前記免疫調節物質分子の一部である、請求項５４に記載の化合物。
【請求項５６】
Ｘ−免疫調節物質は、
【化７】
2014532799.tif 000101
からなる群から選択される基を含み、式中、Ｒ３およびＲ４は各々、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立して選択され、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ｍは、０〜１０の間の整数である、請求項５４または請求項５５に記載の化合物。
【請求項５７】
【化８Ａ】
2014532799.tif 000102
【化８Ｂ】
2014532799.tif 000103
【化８Ｃ】
2014532799.tif 000104
からなる群から選択される化合物である、式ＩＶの化合物。
【請求項５８】
【化９】
2014532799.tif 000105
式中、Ｒ５およびＲ６は各々、水素およびＡからなる群から独立して選択され、
Ａは、保護基であるか、
あるいはＲ５およびＲ６は、一緒になって、カルボニル炭素を介して別の部分に連結する二重結合を形成し、
Ｗは、芳香族環またはヘテロ芳香族環を含む連結基であり、
ヘテロ原子環は、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を含み、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ｎは、０〜１０の間の整数であり、
ａは、０および１から選択される整数であり、
Ｘは、前記免疫調節物質の１個以上のヒドロキシル基または前記免疫調節物質の遊離アミノ基に結合することが可能な連結基である、
式ＶＩの化合物。
【請求項５９】
Ｒ１およびＲ２は、一緒になって、カルボニル炭素を介して炭水化物重合体に連結する二重結合を形成する、請求項５８に記載の化合物。
【請求項６０】
前記炭水化物重合体は、酸化されたマンナンである、請求項５９に記載の化合物。
【請求項６１】
リンカ−を介して少なくとも１つの免疫調節物質に結合される、酸化されたマンナンを含む：
【化１０】
2014532799.tif 000106
式中、
Ｗは、芳香族環またはヘテロ芳香族環を含む連結基であり、
ヘテロ原子環は、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を含み、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ｎは、０〜１０の間の整数であり、
ａは、０および１から選択される整数であり、
Ｘは、前記免疫調節物質の１個以上のヒドロキシル基または前記免疫調節物質の遊離アミノ基に結合することが可能な連結基である、式ＶＩＩの化合物。
【請求項６２】
Ｘは、前記免疫調節物質の２個のヒドロキシル基によるアセタ−ルの形成を通じて、前記免疫調節物質に連結される、請求項５８〜６１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６３】
Ｘ−免疫調節物質は、次の官能基：
【化１１】
2014532799.tif 000107
を含み、式中、前記２個の酸素および点線の結合は、前記免疫調節物質分子の一部である、請求項６２に記載の化合物。
【請求項６４】
Ｘ−免疫調節物質官能基は、
【化１２】
2014532799.tif 000108
を含む、請求項６２または請求項６３に記載の化合物。
【請求項６５】
Ｘは、結合および−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択される、請求項５８〜６１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６６】
Ｗは、ヘテロ芳香族環である、請求項５８〜６５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６７】
前記ヘテロ芳香族環中に、ピリジン環がある、請求項６６に記載の化合物。
【請求項６８】
Ｗは、
【化１３】
2014532799.tif 000109
である、請求項６６または請求項６７に記載の化合物。
【請求項６９】
Ｗは、芳香族環である、請求項５８〜６５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７０】
前記芳香族環中に、ベンゼン環がある、請求項６９に記載の化合物。
【請求項７１】
Ｗは、
【化１４】
2014532799.tif 000110
である、請求項６９または請求項７０に記載の化合物。
【請求項７２】
ａは、１である、請求項５８〜７１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７３】
−（Ｃ（Ｏ））ａ−Ｗは、
【化１５】
2014532799.tif 000111
である、請求項６９〜７２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７４】
【化１６】
2014532799.tif 000112
からなる群から選択される、式ＶＩの化合物。
【請求項７５】
前記酸化されたマンナンは、少なくとも１つの抗原またはそれをコ−ドする核酸に結合される、請求項３３〜４２、４６〜５６、または６１〜７３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７６】
請求項１〜４２、４６〜５６、６１〜７３、および７５のいずれか１項に記載の化合物を含む、免疫調節組成物。
【請求項７７】
ｉ）請求項５〜４２のいずれか１項に記載の化合物と、
ｉｉ）請求項１〜４２のいずれか１項に記載の化合物と、少なくとも１つの抗原またはそれをコ−ドする核酸と、
を含み、前記少なくとも１つの抗原またはそれをコ−ドする核酸は、前記炭水化物重合体に結合されない、ワクチン組成物。
【請求項７８】
前記炭水化物重合体の少なくとも７５％は、約１０００ｋＤａ超である、請求項７６または請求項７７に記載の組成物。
【請求項７９】
前記炭水化物重合体の少なくとも７５％は、前記免疫調節物質および／または抗原もしくはそれをコ−ドする核酸への結合前に、酸化され、少なくとも１５０個のアルデヒド基を有する、請求項７６〜７８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８０】
粘膜、局所、皮内、筋肉内、皮下、または静脈内投与のために製剤化される、請求項７６〜７９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８１】
少なくとも１つの許容される担体を更に含む、請求項７６〜８０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８２】
対象に、請求項７６〜８１のいずれか１項に記載の第１の組成物を投与することを含む、対象において免疫応答を誘導するおよび／または増強するもしくは抑制するもしくは寛容化するための方法。
【請求項８３】
前記第１の組成物が、少なくとも１つの抗原またはそれをコ−ドする核酸を含まない場合、前記方法は、少なくとも１つの抗原またはそれをコ−ドする核酸を含む、第２の組成物を投与することを更に含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記第１および第２の組成物は、順次にまたは同時に投与される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記対象を病原体に対して免疫する、請求項８２〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
癌治療において使用するための、請求項８２〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記組成物は、粘膜に、局所に、皮内に、筋肉内に、皮下に、または静脈内に投与される、請求項８２〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記対象は、トリまたは哺乳動物である、請求項８２〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記哺乳動物は、ヒトである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
対象において免疫応答を誘導するおよび／または増強するもしくは抑制するもしくは寛容化するための医薬の製造のための、請求項１〜４２、４６〜５６、６１〜７３、および７５のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項９１】
対象において免疫応答を誘導するおよび／または増強するもしくは抑制するもしくは寛容化するための、請求項１〜４２、４６〜５６、６１〜７３、および７５のいずれか１項に記載の化合物、または請求項７６〜８１のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項９２】
対象における免疫応答の誘導および／または増強もしくは抑制もしくは寛容化のための、請求項１〜４２、４６〜５６、６１〜７３、および７５のいずれか１項に記載の化合物、または請求項７６〜８１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９３】
細胞を、請求項１〜４２、４６〜５６、６１〜７３、および７５のいずれか１項に記載の化合物、または請求項７６〜８１のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを含む、インビトロまたはエクスビボで、マクロファ−ジ、樹状細胞、および／またはＣＴＬを活性化するための方法。
【請求項９４】
【化１７】
2014532799.tif 000113
式中、
Ｒ１およびＲ２は各々、水素およびＡからなる群から独立して選択され、
Ａは、保護基であり、
Ｙは、−ＣＨ２−および−Ｏ−から選択され、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
Ｂは、アミノ酸残基またはその誘導体であり、
ｎは、０〜１０の間の整数であり、
ｐは、１〜５の間の整数であり、
ｑは、０および１から選択される整数であり、
Ｘは、１個以上のヒドロキシル基または遊離アミノ基に結合することが可能な連結基である式ＶＩＩＩのリンカ−。
【請求項９５】
ｐは、１〜３の間の整数である、請求項９４に記載のリンカ−。
【請求項９６】
ｐは、２である、請求項９５に記載のリンカ−。
【請求項９７】
ｐが１よりも大きいとき、各アミノ酸残基は、同じであるか、または異なる、請求項９４〜９６のいずれか１項に記載のリンカ−。
【請求項９８】
各アミノ酸残基は、バリンおよびリジンからなる群から独立して選択される、請求項９７に記載のリンカ−。
【請求項９９】
ｎは、０である、請求項９４〜９８のいずれか１項に記載のリンカ−。
【請求項１００】
ｑは、０である、請求項９４〜９９のいずれか１項に記載のリンカ−。
【請求項１０１】
Ｘは、−Ｒ３Ｎ（ＣＨ２）２ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｈであり、
式中、Ｒ３およびＲ４は各々、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立して選択される、請求項９４〜１００のいずれか１項に記載のリンカ−。
【請求項１０２】
Ｘは、
【化１８】
2014532799.tif 000114
からなる群から選択される基を含み、式中、Ｒ３およびＲ４は各々、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立して選択され、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ｍは、０〜１０の間の整数である、請求項９４〜１００のいずれか１項に記載のリンカ−。
【請求項１０３】
【化１９】
2014532799.tif 000115
式中、
Ｙは、−ＣＨ２−および−Ｏ−から選択され、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
Ｂは、アミノ酸残基またはその誘導体であり、
ｎは、０〜１０の間の整数であり、
ｐは、１〜５の間の整数であり、
ｑは、０および１から選択される整数であり、
Ｘは、Ｊの１個以上のヒドロキシル基またはＪの遊離アミノ基に結合することが可能な連結基であり、
Ｊは、１個以上のヒドロキシル基および／または遊離アミノ基を含む部分であり、
Ｋは、カルボニル炭素を介して連結される部分である、式ＩＸの化合物。
【請求項１０４】
ｐは、１〜３の間の整数である、請求項１０３に記載の化合物。
【請求項１０５】
ｐは、２である、請求項１０４に記載の化合物。
【請求項１０６】
ｐが１よりも大きいとき、各アミノ酸残基は、同じであるか、または異なる、請求項１０３〜１０５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０７】
各アミノ酸残基は、バリンおよびリジンからなる群から独立して選択される、請求項１０６に記載の化合物。
【請求項１０８】
ｎは、０である、請求項１０３〜１０７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０９】
ｑは、０である、請求項１０３〜１０８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１０】
Ｘは、Ｊの少なくとも１つのヒドロキシル基または遊離アミノ基を介してＪに連結される、−Ｒ３Ｎ（ＣＨ２）２ＮＲ４Ｃ（Ｏ）−であり、
式中、Ｒ３およびＲ４は各々、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立して選択される、請求項１０３〜１０９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１１】
Ｘは、前記Ｊの２個のヒドロキシル基によるアセタ−ルの形成を通じて前記Ｊに連結される、請求項１０３〜１０９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１２】
Ｘ−Ｊは、次の官能基：
【化２０】
2014532799.tif 000116
を含み、式中、前記２個の酸素および点線の結合は、前記免疫調節物質分子の一部である、請求項１１１に記載の化合物。
【請求項１１３】
Ｘ−Ｊは、
【化２１】
2014532799.tif 000117
からなる群から選択される基を含み、式中、Ｒ３およびＲ４は各々、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立して選択され、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ｍは、０〜１０の間の整数である、請求項１１１または請求項１１２に記載の化合物。
【請求項１１４】
【化２２】
2014532799.tif 000118
のリンカ−であって、式中、Ｒ５およびＲ６は各々、水素およびＡからなる群から独立して選択され、
Ａは、保護基であり、
Ｗは、芳香族環またはヘテロ芳香族環を含む連結基であり、
ヘテロ原子環は、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を含み、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ｎは、０〜１０の間の整数であり、
ａは、０および１から選択される整数であり、
Ｘは、１個以上のヒドロキシル基または遊離アミノ基に結合することが可能な連結基である、式Ｘのリンカ−。
【請求項１１５】
Ｘは、脱離基および−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｈからなる群から選択される、請求項１１４に記載のリンカ−。
【請求項１１６】
Ｗは、ヘテロ芳香族環である、請求項１１４または請求項１１５に記載のリンカ−。
【請求項１１７】
前記ヘテロ芳香族環中に、ピリジン環がある、請求項１１６に記載のリンカ−。
【請求項１１８】
Ｗは、
【化２３】
2014532799.tif 000119
である、請求項１１６または請求項１１７に記載のリンカ−。
【請求項１１９】
Ｗは、芳香族環である、請求項１１４または請求項１１５に記載のリンカ−。
【請求項１２０】
前記芳香族環中に、ベンゼン環がある、請求項１１９に記載のリンカ−。
【請求項１２１】
Ｗは、
【化２４】
2014532799.tif 000120
である、請求項１１９または請求項１２０に記載のリンカ−。
【請求項１２２】
ａは、１である、請求項１１４〜１２１のいずれか１項に記載のリンカ−。
【請求項１２３】
−（Ｃ（Ｏ））ａ−Ｗは、
【化２５】
2014532799.tif 000121
である、請求項１１９〜１２２のいずれか１項に記載のリンカ−。
【請求項１２４】
【化２６】
2014532799.tif 000122
式中、
Ｗは、芳香族環またはヘテロ芳香族環を含む連結基であり、
ヘテロ原子環は、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を含み、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ｎは、０〜１０の間の整数であり、
ａは、０および１から選択される整数であり、
Ｘは、Ｊの１個以上のヒドロキシル基またはＪの遊離アミノ基に結合することが可能な連結基であり、
Ｋは、カルボニル炭素を介して連結される部分である、式ＸＩの化合物。
【請求項１２５】
Ｘは、Ｊの２個のヒドロキシル基によるアセタ−ルの形成を通じてＪに連結される、請求項１２４に記載の化合物。
【請求項１２６】
Ｘ−Ｊは、次の官能基：
【化２７】
2014532799.tif 000123
を含み、式中、前記２個の酸素および点線の結合は、前記免疫調節物質分子の一部である、請求項１２５に記載の化合物。
【請求項１２７】
前記Ｘ−Ｊ官能基は、
【化２８】
2014532799.tif 000124
を含む、請求項１２４〜１２６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２８】
Ｘは、結合および−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択される、請求項１２４〜１２７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２９】
Ｗは、ヘテロ芳香族環である、請求項１２４〜１２８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３０】
前記ヘテロ芳香族環中に、ピリジン環がある、請求項１２９に記載の化合物。
【請求項１３１】
Ｗは、
【化２９】
2014532799.tif 000125
である、請求項１２９または請求項１３０に記載の化合物。
【請求項１３２】
Ｗは、芳香族環である、請求項１２４〜１２８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３３】
前記芳香族環中に、ベンゼン環がある、請求項１３２に記載の化合物。
【請求項１３４】
Ｗは、
【化３０】
2014532799.tif 000126
である、請求項１３２または請求項１３３に記載の化合物。
【請求項１３５】
ａは、１である、請求項１２４〜１３４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３６】
−（Ｃ（Ｏ））ａ−Ｗは、
【化３１】
2014532799.tif 000127
である、請求項１３２〜１３５のいずれか１項に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの免疫調節物質に結合されるマンノ−スを含む炭水化物重合体、免疫調節組成物およびワクチン組成物中でのそれらの調製および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年において、免疫系のある特定の重要な側面を刺激することにより、ならびにある特定の他の側面を抑制することにより作用する、新たな医薬化合物を発見するため大きな努力が払われてきた。本明細書で免疫調節物質と称される、これらの化合物は、多種多様な疾患および病態を治療するために有用であり得る。例えば、ある特定の免疫調節物質は、ウイルス疾患（例えば、ヒトパピロ−マウイルス、肝炎、ヘルペス）、新生物（例えば、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、日光角化症、黒色腫）、およびＴｈ２媒介性疾患（例えば、喘息、アレルギ−性鼻炎、アトピ−性皮膚炎、多発性硬化症）を治療するために有用であり得、また、ワクチンアジュバントとしても有用である。
【０００３】
マンノ−スの複数の多糖類（炭水化物重合体）（例えば、マンナン）、β（１，３）ブドウ糖（例えば、グルカン）、β（１，４）アセチル化マンノ−ス（エ−スマンナン）、β（１，４）Ｎ−アセチル−グルコサミン（キチン）、およびラムノガラクツロナン（ペクチン）等のヘテロ多糖類は、免疫系を刺激することが示されている。
【０００４】
Ｃ型レクチン受容体への多糖類の結合は、食作用における増加、増殖応答、サイトカインの放出、および免疫系の他の活性によって示されるように、免疫賦活を誘導する。この免疫賦活活性のために、これらの多糖類が、ワクチン組成物において使用するために提案されてきた。特に興味深いのは、マンナンである。
【０００５】
マンナンは、マンノ−ス受容体（ＣＤ２０６）およびＤＣ−ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）等のＣ型レクチン受容体によって認識されるポリマンノ−スである。それらが抗原提示細胞上に存在するので、これらの受容体は、マンノ−ス、フコ−ス、またはブドウ糖含有化合物のそれらの取り込みで特徴付けられている。実例として、マンノ−ス受容体へのマンナンの結合は、エンドサイト−シス、続いてエンドソ−ム経路中へのその送達を誘導する。マンノシル化された（ｍａｎｎｎｏｓｙｌａｔｅｄ）抗原についての早期の研究は、抗原上のマンノ−ス残基の存在が、樹状細胞（ＤＣ）による抗原取り込みおよび主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ拘束性抗原提示を大幅に増強することを示した。少なくとも１つの抗原へのマンナンの結合もまた、その取り込みおよび提示を増強する。
【０００６】
疾患の治療または予防において使用するための更なる免疫調節組成物およびワクチン組成物、ならびにその調製のための信頼性のある方法に対する必要性が存在する。更に、免疫調節物質についての大きな治療的可能性、およびすでに行われてきた取り組みを考慮して、それらの使用および治療上の便益を拡大する実質的な継続的必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、免疫応答を刺激するための新たな化合物を開発してきた。
【０００８】
第１の態様において、本発明は、マンノ−スを含む炭水化物重合体を含む、免疫調節化合物を提供し、その炭水化物重合体は、少なくとも１つの免疫調節物質に結合される。
【０００９】
ある実施形態において、１つを超える免疫調節物質が存在し、各免疫調節物質は、同じであるか、または異なる。例えば、炭水化物重合体は、免疫調節物質に直接結合され得るか、またはリンカ−を介して結合され得る、１つを超える官能基を含む。代替的にまたは加えて、炭水化物重合体は、分岐状リンカ−を介して１つを超える免疫調節物質に結合される。
【００１０】
ある実施形態において、炭水化物重合体は、約１０００ｋＤａ超である。
【００１１】
ある実施形態において、炭水化物重合体は、酸化される。酸化された炭水化物重合体は、免疫調節物質への結合前に、少なくとも１５０個のアルデヒド基を有してもよい。
【００１２】
ある実施形態において、酸化された炭水化物重合体は、少なくとも１つの抗原またはそれをコ−ドする核酸に更に結合される。抗原は、ウイルス、細菌、原虫、真菌、腫瘍抗原、自己抗原、またはアレルゲン（ａｌｌｅｇｅｎ）等の任意の源由来であり得る。抗原は、例えば、全生物、タンパク質、または抗原性ペプチであってもよい。抗原は、酸化された（ｏｘｉｚｉｄｅｄ）マンナンに、任意にリンカ−を介して、直接結合されても、または酸化されたマンナンに、免疫調節物質への結合によって、任意にリンカ−を介して、間接的に結合されてもよい。同様に、核酸は、酸化されたマンナンに、直接または間接的に（例えば、ＩＲＭを介して）結合されてもよい。
【００１３】
ある実施形態において、酸化された炭水化物重合体は、少なくとも１つの抗原に共有結合により結合される。
【００１４】
ある実施形態において、酸化された炭水化物重合体は、少なくとも１つの核酸にポリカチオンを介して結合される。
【００１５】
ある実施形態において、炭水化物重合体は、マンナンである。マンナンは、真菌等の、任意の源、より好ましくは酵母由来であり得る。
【００１６】
ある実施形態において、免疫調節物質および／または抗原もしくはそれをコ−ドする核酸への結合前、かつアミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＮＴＳ）での標識後の、マンナンのサイズ分布は、タンパク質標準物に基づき約１５０〜約２５０ｋＤａであり、かつ／または炭水化物標準物に基づき約８００〜約３０００ｋＤａである。
【００１７】
ある実施形態において、免疫調節物質は、例えば、グアノシン類似体、デアザアデノシン類似体、イミダゾキノリン、またはそれらの誘導体等の、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストである。好ましい実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、ロキソリビン、イサトリビン、イミキモド、レシキモド、またはそれらの誘導体である。
【００１８】
ある実施形態において、各免疫調節物質は、リンカ−を介して炭水化物重合体に結合され、結合前に、各リンカ−は、免疫調節物質または炭水化物重合体への結合が可能な１つ以上の官能基を含み、官能基は任意に、好適な脱離基または保護基を含んでもよい。
【００１９】
ある実施形態において、各官能基は、アルデヒド、ケトン、ホルミル、ヒドラジン、ヒドラジド、アミン、アミド、カルボン酸、アルキン、マレイミド、スルフヒドリル、およびハロゲンからなる群から選択される。
【００２０】
ある実施形態において、アミンの保護基は、ＢＯＣ基である。
【００２１】
ある実施形態において、ホルミルの脱離基は、パラ−ニトロフェノキシ基である。
【００２２】
ある実施形態において、各免疫調節物質は、
ｉ）炭水化物重合体に結合された官能基（タイプ（ｉ）基）と、
ｉｉ）免疫調節物質に結合された官能基（タイプ（ｉｉ）基）と、
ｉｉｉ）スペ−サ−と、
を含む、リンカ−を介して炭水化物重合体に結合され、各リンカ−は、同じであっても、相互に異なってもよい。
【００２３】
ある実施形態において、タイプ（ｉ）基は、ヒドラゾンである。
【００２４】
ある実施形態において、タイプ（ｉｉ）基は、カルバメ−ト基である。
【００２５】
ある実施形態において、スペ−サ−は、１つ以上の異なるタイプの結合単位を含む。ある実施形態において、各結合単位は、エチレングリコ−ルおよび／またはプロピレングリコ−ルの重合体、ポリアリ−ル、アミノ酸残基またはその誘導体、アルキルまたはアルケニル鎖、フェニル含有部分、ならびに糖類からなる群から独立して選択されてもよい。
【００２６】
ある実施形態において、スペ−サ−は、１〜１００単位のエチレングリコ−ルおよび／またはプロピレングリコ−ルを含む重合体を含む。例えば、スペ−サ−は、１〜１０単位のエチレングリコ−ルおよび／またはプロピレングリコ−ルを含む重合体、１〜５アミノ酸残基またはそれらの誘導体、およびフェニル含有部分を含んでもよい。
【００２７】
ある実施形態において、リンカ−は、結合後に切断可能である。例えば、リンカ−は、エステル、カルバメ−ト、ヒドラゾン、アミド、およびアセタ−ルからなる群から選択される切断可能な基を含む。
【００２８】
好ましい実施形態において、炭水化物重合体および免疫調節物質は、式Ｉ：
【００２９】
【化１】
2014532799.tif 000002
【００３０】
の式を有し、式中、
Ａは、保護基であり、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
Ｂは、アミノ酸残基またはその誘導体であり、
ｎは、１〜１０の間の整数であり、
ｐは、１〜５の間の整数であり、
ＬＧは、脱離基である、リンカ−との反応により連結される。
【００３１】
ある実施形態において、脱離基は、パラ−ニトロフェノキシ基である。
【００３２】
ある実施形態において、保護基は、ＢＯＣである。
【００３３】
ある実施形態において：
ｉ）−（ＥＧおよび／またはＰＧ）ｎ−は、エチレングリコ−ル（ＥＧ）単位のみであるか、
ｉｉ）−（ＥＧおよび／またはＰＧ）ｎ−は、プロピレングリコ−ル（ＰＧ）単位のみであるか、あるいは
ｉｉｉ）−（ＥＧおよび／またはＰＧ）ｎ−は、エチレングリコ−ル（ＥＧ）およびプロピレングリコ−ル（ＰＧ）単位の混合物である。
【００３４】
代替的な好ましい実施形態において、炭水化物重合体および免疫調節物質は、式ＩＩ：
【００３５】
【化２】
2014532799.tif 000003
【００３６】
の式を有し、式中、
Ａは、保護基であり、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
Ｂは、アミノ酸残基またはその誘導体であり、
ｎは、１〜１０の間の整数であり、
ｐは、１〜５の間の整数である、リンカ−との反応により連結される。
ある実施形態において、保護基は、ＢＯＣである。
別の態様において、本発明は、リンカ−を介して少なくとも１つの免疫調節物質に結合される、酸化されたマンナンを含む、式ＩＩＩ：
【００３７】
【化３】
2014532799.tif 000004
【００３８】
の化合物を提供し、式中、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
Ｂは、アミノ酸残基またはその誘導体であり、
ｎは、１〜１０の間の整数であり、
ｐは、１〜５の間の整数であり、
Ｘは、結合または−ＭｅＮ（ＣＨ２）２ＮＭｅＣ（Ｏ）−である。
【００３９】
ある実施形態において：
ｉ）−（ＥＧおよび／またはＰＧ）ｎ−は、エチレングリコ−ル（ＥＧ）単位のみであるか、
ｉｉ）−（ＥＧおよび／またはＰＧ）ｎ−は、プロピレングリコ−ル（ＰＧ）単位のみであるか、あるいは
ｉｉｉ）−（ＥＧおよび／またはＰＧ）ｎ−は、エチレングリコ−ル（ＥＧ）およびプロピレングリコ−ル（ＰＧ）単位の混合物である。
【００４０】
ある実施形態において、ｎは、８であり、かつ／またはｐは、１〜３である。好ましい実施形態において、ｐは、２である。
【００４１】
ある実施形態において、ｐは、１よりも大きく、各アミノ酸残基は、同じであるか、または異なる。各アミノ酸残基は、バリンおよびリジンからなる群から独立して選択されてもよい。
【００４２】
更なる実施形態において、酸化されたマンナンは、少なくとも１つの抗原またはそれをコ−ドする核酸に結合される。
【００４３】
更なる実施形態において、
ｉ）免疫調節物質は、ロキソリビンまたはその誘導体であり、
ｉｉ）Ｘは、−ＭｅＮ（ＣＨ２）２ＮＭｅＣ（Ｏ）−であり、
ｉｉｉ）免疫調節物質は、その第一級または第二級ヒドロキシル基を通じてＸに結合される。
【００４４】
代替的な実施形態において、
ｉ）免疫調節物質は、レシキモドまたはその誘導体であり、
ｉｉ）Ｘは、−ＭｅＮ（ＣＨ２）２ＮＭｅＣ（Ｏ）−であり、
ｉｉｉ）免疫調節物質は、免疫調節物質上の遊離ヒドロキシル基を通じてＸに結合される。
【００４５】
ある実施形態において、遊離ヒドロキシル基は、第三級ヒドロキシル基である。
代替的な実施形態において、
ｉ）免疫調節物質は、ロキソリビンもしくはレシキモドまたはその誘導体であり、
ｉｉ）Ｘは、結合であり、
ｉｉｉ）免疫調節物質は、免疫調節物質上の遊離アミノ基を通じてＸに結合される。
【００４６】
別の態様において、式ＩＶ：
【００４７】
【化４】
2014532799.tif 000005
【００４８】
の化合物が提供され、式中、
Ｒ１およびＲ２は各々、水素およびＡからなる群から独立して選択され、
Ａは、保護基であるか、
あるいはＲ１およびＲ２は、一緒になって、カルボニル炭素を介して別の部分に連結する二重結合を形成し、
Ｙは、−ＣＨ２−および−Ｏ−から選択され、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
Ｂは、アミノ酸残基またはその誘導体であり、
ｎは、０〜１０の間の整数であり、
ｐは、１〜５の間の整数であり、
ｑは、０および１から選択される整数であり、
Ｘは、免疫調節物質の１個以上のヒドロキシル基または免疫調節物質の遊離アミノ基に結合することが可能な連結基である。
【００４９】
好ましい実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、一緒になって、カルボニル炭素を介して炭水化物重合体に連結する二重結合を形成する。更により好ましくは、炭水化物重合体は、酸化されたマンナンである。
【００５０】
別の態様において、本発明は、リンカ−を介して少なくとも１つの免疫調節物質に結合される、酸化されたマンナンを含む、式Ｖ：
【００５１】
【化５】
2014532799.tif 000006
【００５２】
の化合物を提供し、式中、
Ｙは、−ＣＨ２−および−Ｏ−から選択され、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
Ｂは、アミノ酸残基またはその誘導体であり、
ｎは、０〜１０の間の整数であり、
ｐは、１〜５の間の整数であり、
ｑは、０および１から選択される整数であり、
Ｘは、免疫調節物質の１個以上のヒドロキシル基または免疫調節物質の遊離アミノ基に結合することが可能な連結基である。
【００５３】
一実施形態において、ｐは、１〜３の間の整数である。好ましい実施形態において、ｐは、２である。
【００５４】
ある実施形態において、ｐが１よりも大きいとき、各アミノ酸残基は、同じであるか、または異なる。好ましい実施形態において、各アミノ酸残基は、バリンおよびリジンからなる群から独立して選択される。
【００５５】
一実施形態において、ｎは、０である。
【００５６】
別の実施形態において、ｑは、０である。
【００５７】
一実施形態において、Ｘは、結合である。
【００５８】
一実施形態において、Ｘは、免疫調節物質の少なくとも１つのヒドロキシル基または遊離アミノ基を介して免疫調節物質に連結される、−Ｒ３Ｎ（ＣＨ２）２ＮＲ４Ｃ（Ｏ）−であり、
式中、Ｒ３およびＲ４は各々、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立して選択される。
【００５９】
一実施形態において、Ｘは、免疫調節物質の２個のヒドロキシル基によるアセタ−ルの形成を通じて、免疫調節物質に連結される。
【００６０】
好ましくは、Ｘ−免疫調節物質は、次の官能基：
【００６１】
【化６】
2014532799.tif 000007
【００６２】
を含み、式中、２個の酸素および点線の結合は、免疫調節物質分子の一部である。
【００６３】
更により好ましくは、Ｘ−免疫調節物質は、
【００６４】
【化７】
2014532799.tif 000008
【００６５】
からなる群から選択される基を含み、式中、Ｒ３およびＲ４は各々、ＨおよびＣ１−４アルキルからなる群から独立して選択され、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ｍは、０〜１０の間の整数である。
【００６６】
ある特定の実施形態において、式ＩＶの化合物は、
【００６７】
【化８Ａ】
2014532799.tif 000009
【化８Ｂ】
2014532799.tif 000010
からなる群から選択される化合物である。
【００６８】
好ましくは、ある特定の実施形態において、式ＩＶの化合物は、
【００６９】
【化９Ａ】
2014532799.tif 000011
【化９Ｂ】
2014532799.tif 000012
【００７０】
からなる群から選択される化合物である
【００７１】
別の態様において、本発明は、式ＶＩ：
【００７２】
【化１０】
2014532799.tif 000013
【００７３】
の化合物を提供し、式中、Ｒ５およびＲ６は各々、水素およびＡからなる群から独立して選択され、
Ａは、保護基であるか、
あるいはＲ５およびＲ６は、一緒になって、カルボニル炭素を介して別の部分に連結する二重結合を形成し、
Ｗは、芳香族環またはヘテロ芳香族環を含む連結基であり、
ヘテロ原子環は、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を含み、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ｎは、０〜１０の間の整数であり、
ａは、０および１から選択される整数であり、
Ｘは、免疫調節物質の１個以上のヒドロキシル基または免疫調節物質の遊離アミノ基に結合することが可能な連結基である。
【００７４】
好ましい実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、一緒になって、カルボニル炭素を介して炭水化物重合体に連結する二重結合を形成する。更により好ましくは、炭水化物重合体は、酸化されたマンナンである。
【００７５】
別の態様において、本発明は、リンカ−を介して少なくとも１つの免疫調節物質に結合される、酸化されたマンナンを含む、式ＶＩＩ：
【００７６】
【化１１】
2014532799.tif 000014
【００７７】
の化合物を提供し、式中、
Ｗは、芳香族環またはヘテロ芳香族環を含む連結基であり、
ヘテロ原子環は、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を含み、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ｎは、０〜１０の間の整数であり、
ａは、０および１から選択される整数であり、
Ｘは、免疫調節物質の１個以上のヒドロキシル基または免疫調節物質の遊離アミノ基に結合することが可能な連結基である。
【００７８】
一実施形態において、Ｘは、免疫調節物質の２個のヒドロキシル基によるアセタ−ルの形成を通じて、免疫調節物質に連結される。
【００７９】
一実施形態において、Ｘ−免疫調節物質は、次の官能基：
【００８０】
【化１２】
2014532799.tif 000015
【００８１】
を含み、式中、２個の酸素および点線の結合は、免疫調節物質分子の一部である。
【００８２】
好ましくは、Ｘ−免疫調節物質官能基は、
【００８３】
【化１３】
2014532799.tif 000016
【００８４】
別の実施形態において、Ｘは、結合および−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択される。
【００８５】
一実施形態において、Ｗは、ヘテロ芳香族環、好ましくはピリジン環である。
更により好ましくは、Ｗは、
【００８６】
【化１４】
2014532799.tif 000017
【００８７】
別の実施形態において、Ｗは、芳香族環、好ましくはベンゼン環である。更により好ましくは、Ｗは、
【００８８】
【化１５】
2014532799.tif 000018
【００８９】
一実施形態において、ａは、１である。
【００９０】
一実施形態において、−（Ｃ（Ｏ））ａ−Ｗは、
【００９１】
【化１６】
2014532799.tif 000019
【００９２】
ある特定の実施形態において、式ＶＩの化合物は、
【００９３】
【化１７】
2014532799.tif 000020
【００９４】
からなる群から選択される。
【００９５】
別の態様において、本発明は、本発明の化合物を含む免疫調節組成物を提供する。
【００９６】
別の態様において、本発明は、次のものを含む、ワクチン組成物を提供する：
ｉ）本発明の化合物および少なくとも１つの抗原またはそれをコ−ドする核酸（その少なくとも１つの抗原またはそれをコ−ドする核酸は、炭水化物重合体に結合される）、あるいは
ｉｉ）本発明の化合物および少なくとも１つの抗原またはそれをコ−ドする核酸（その少なくとも１つの抗原またはそれをコ−ドする核酸は、炭水化物重合体に結合されない）。
【００９７】
ある実施形態において、組成物中の炭水化物重合体の少なくとも７５％は、約１０００ｋＤａ超である。
【００９８】
ある実施形態において、組成物中の炭水化物重合体の少なくとも７５％は、酸化され、免疫調節物質および／または抗原もしくはそれをコ−ドする核酸への結合前に、少なくとも１５０個のアルデヒド基を有する。
【００９９】
ある実施形態において、組成物は、粘膜、局所、皮内、筋肉内、皮下、または静脈内投与のために製剤化される。
【０１００】
ある実施形態において、組成物は、少なくとも１つの許容される担体を更に含む。
【０１０１】
本発明の別の態様において、本発明は、対象において免疫応答を誘導するおよび／または増強するもしくは抑制するもしくは寛容化するための方法を提供し、本方法は、対象に、本発明による第１の組成物を投与することを含む。
【０１０２】
ある実施形態において、第１の組成物は、少なくとも１つの抗原またはそれをコ−ドする核酸を含まず、本方法は、少なくとも１つの抗原またはそれをコ−ドする核酸を含む、第２の組成物を投与することを更に含む。
【０１０３】
ある実施形態において、第１および第２の組成物は、順次にまたは同時に投与される。
【０１０４】
ある実施形態において、抗原が感染因子由来であるか、またはその突然変異体／誘導体であるとき、本方法は、対象を病原体（感染因子）に対して免疫する。別の実施形態において、抗原が癌細胞由来であるか、またはその突然変異体／誘導体であるとき、本方法は、癌治療のためのものである。
【０１０５】
また、対象において免疫応答を誘導するおよび／または増強するもしくは抑制するもしくは寛容化するための医薬の製造のための、本発明の化合物の使用も提供される。
【０１０６】
更に、対象において免疫応答を誘導するおよび／または増強するもしくは抑制するもしくは寛容化するための、本発明の化合物の使用が提供される。
【０１０７】
別の態様において、本発明は、インビトロまたはエクスビボで、マクロファ−ジ、ＤＣ、および／または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を活性化するための方法を提供し、本方法は、細胞を、本発明の化合物または組成物と接触させることを含む。
【０１０８】
別の態様において、本発明は、式ＶＩＩＩ
【０１０９】
【化１８】
2014532799.tif 000021
【０１１０】
のリンカ−を提供し、式中、
Ｒ１およびＲ２は各々、水素およびＡからなる群から独立して選択され、
Ａは、保護基であり、
Ｙは、−ＣＨ２−および−Ｏ−から選択され、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
Ｂは、アミノ酸残基またはその誘導体であり、
ｎは、０〜１０の間の整数であり、
ｐは、１〜５の間の整数であり、
ｑは、０および１から選択される整数であり、
Ｘは、１個以上のヒドロキシル基または遊離アミノ基に結合することが可能な連結基である。
【０１１１】
別の態様において、本発明は、式ＩＸ：
【０１１２】
【化１９】
2014532799.tif 000022
【０１１３】
の化合物を提供し、式中、
Ｙは、−ＣＨ２−および−Ｏ−から選択され、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
Ｂは、アミノ酸残基またはその誘導体であり、
ｎは、０〜１０の間の整数であり、
ｐは、１〜５の間の整数であり、
ｑは、０および１から選択される整数であり、
Ｘは、Ｊの１個以上のヒドロキシル基またはＪの遊離アミノ基に結合することが可能な連結基であり、
Ｊは、１個以上のヒドロキシル基および／または遊離アミノ基を含む部分であり、
Ｋは、カルボニル炭素を介して連結される部分である。
【０１１４】
別の態様において、本発明は、式Ｘ：
【０１１５】
【化２０】
2014532799.tif 000023
【０１１６】
のリンカ−を提供し、式中、Ｒ５およびＲ６は各々、水素およびＡからなる群から独立して選択され、
Ａは、保護基であり、
Ｗは、芳香族環またはヘテロ芳香族環を含む連結基であり、
ヘテロ原子環は、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を含み、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ｎは、０〜１０の間の整数であり、
ａは、０および１から選択される整数であり、
Ｘは、１個以上のヒドロキシル基または遊離アミノ基に結合することが可能な連結基である。
【０１１７】
別の態様において、本発明は、式ＸＩ：
【０１１８】
【化２１】
2014532799.tif 000024
【０１１９】
の化合物を提供し、式中、
Ｗは、芳香族環またはヘテロ芳香族環を含む連結基であり、
ヘテロ原子環は、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を含み、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ｎは、０〜１０の間の整数であり、
ａは、０および１から選択される整数であり、
Ｘは、Ｊの１個以上のヒドロキシル基またはＪの遊離アミノ基に結合することが可能な連結基であり、
Ｋは、カルボニル炭素を介して連結される部分である。
【０１２０】
別途具体的定めのない限り、本明細書におけるいずれの実施形態も、任意の他の実施形態に対して準用するように受け取られるものとする。
【０１２１】
本発明は、例証の目的のために意図されるにすぎない、本明細書に記載される具体的な実施形態によって、範囲を限定されるものではない。機能的に均等な生成物、組成物、および方法は明確に、本明細書に記載される本発明の範囲内にある。
【０１２２】
明らかとなろうが、本発明の一態様の好ましい特徴および性質は、本発明の多くの他の態様に適用可能である。
【０１２３】
本明細書全体を通じて、別途具体的定めのない限り、または文脈上そうでないとする要求がない限り、単一のステップ、組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍａｔｔｅｒ）、ステップの群または組成物の群への言及は、１つおよび複数の（すなわち１つ以上の）それらのステップ、組成物、ステップの群または組成物の群を包含するように受け取られるものとする。
【０１２４】
本発明は、これ以降、次の非限定的な実施例を用いて、および添付の図を参照して記載される。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ濃縮器を使用した分画プロセス。
【図２】酸化されたマンナン中のアルデヒド残基を定量化するための方法を図示する略図。
【図３】ＡＮＴＳによる酸化されたマンナンの修飾を図示する略図。
【図４】酸化されたマンナンへのタンパク質の結合を図示する略図。
【図５】マンナンを、フルオレセインイソチオシアネ−ト（ＦＩＴＣ）で標識し、種々の濃度でのｈｕｈ７ヒト肝癌細胞への結合を、フロ−サイトメトリ−によって測定した。
【図６Ａ】全マンナンおよびマンナン画分によるＢＭＤＣの成熟。共刺激分子ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の上方制御を、フロ−サイトメトリ−によって、６（図６Ａ）、２４（図６Ｂ）、および４８（図６Ｃ）時間時点で測定した。試料を種々の用量で分析した。
【図６Ｂ】同上。
【図６Ｃ】同上。
【図７Ａ】全マンナン、１０００ｋＤａ超のマンナン画分、および３００ｋＤａ超のマンナン画分によるＢＭＤＣの成熟。共刺激分子ＣＤ４０（図７Ａ）およびＣＤ８６（図７Ｂ）の上方制御を、フロ−サイトメトリ−によって測定した。試料を種々の用量で、かつ４８時間時点で分析した。
【図７Ｂ】同上。
【図８】マンナン画分の異なるマンノ−ス含量を示す、レゾルシノ−ルアッセイについての吸光度対濃度曲線。
【図９】ネイティブＰＡＧＥゲル上でのＡＮＴＳ標識マンナン画分の分析。
【図１０】ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でのＡＮＴＳ標識マンナン画分の分析。
【図１１Ａ】注釈されるＲｆ（図１１Ａ）および分子量（図１１Ｂ）を有する、ＡＮＴＳ標識マンナン画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの走査。
【図１１Ｂ】同上。
【図１２】Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅソフトウェアによって生成された標準曲線。
【図１３】タンパク質標準物に基づく相対分子量。
【図１４】炭水化物標準物に基づく相対分子量。
【図１５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での、ＭＵＣ１−ＦＰに結合された全マンナンおよびマンナンの画分の分析。星印は、全マンナン−ＭＵＣ１−ＦＰ結合体におけるものと同じ比率のＭＵＣ１−ＦＰ：マンナンを組み込んでいる結合体を表す。
【図１６】０、１０、１７日目に、１０μｇのＭＵＣ１−ＦＰ、ＭＦＰ、または１０００超ＭＦＰで免疫されたマウスの脾細胞中における、ＭＵＣ１特異的ＩＦＮ−γ応答。
【図１７】０、１０、１７日目に、１０μｇのＭＵＣ１−ＦＰ、ＭＦＰ、または１０００超ＭＦＰで免疫されたマウスにおける、総抗ＭＵＣ１血清ＩｇＧ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａ。
【図１８】供給業者からのマンナン仕様書。
【図１９Ａ】レゾルシノ−ルアッセイを使用したマンナンのバッチの分析。
【図１９Ｂ】レゾルシノ−ルアッセイを使用して得られたマンノ−スについての標準曲線。
【図２０】過ヨウ素酸塩酸化後のアルデヒド残基を定量化することによる、Ｓｉｇｍａからのマンナンの種々のバッチの比較。
【図２１】ＡＮＴＳと反応させられたマンナンの種々のバッチについての蛍光対濃度曲線。
【図２２】ポリエチレングリコ−ルリンカ−の合成。
【図２３】レシキモド（Ｒ−８４８）の合成。
【図２４】官能化誘導体の合成。
【図２５】官能化誘導体の合成。
【図２６】官能化誘導体の合成。
【図２７】官能化誘導体の合成。
【図２８】官能化誘導体の合成。
【図２９】免疫調節物質−炭水化物重合体結合体の包括的合成。
【図３０Ａ】官能化誘導体１−５。
【図３０Ｂ】同上。
【図３１】レシキモド（Ｒ−８４８）の代替的な合成。
【図３２】ＰＥＧ−Ａの合成。
【図３３】Ｌ−１およびリンカ−−１の代替的な合成。
【図３４】ロキソリビンの合成。
【図３５】誘導体４−３の合成。
【図３６】誘導体５−２および５−３の合成。
【図３７】官能化レシキモド誘導体Ｒｄ１〜Ｒｄ３。
【図３８Ａ】官能化ロキソリビン誘導体Ｌｄ１〜Ｌｄ１０。
【図３８Ｂ】同上。
【図３９】Ｌｄ１の合成。
【図４０Ａ】Ｌｄ２の合成。
【図４０Ｂ】同上。
【図４０Ｃ】同上。
【図４１】ＩＭ２の合成。
【図４２】ＩＭ３の合成。
【図４３】Ｒｄ１の合成。
【図４４】Ｌｄ６／Ｌｄ１０の合成。
【図４５】１０００ｋＤａ超の酸化されたマンナンへのＦＰの結合。分子量標準物、ＦＰ、および１０００超ＭＦＰを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４〜２０％）上で泳動させ、クマシ−ブル−で染色した。
【図４６】ＭＵＣ１特異的Ｔ細胞応答のリコ−ル。同種異系ＤＣ（ＢＣ１６）を、１０および２０μｇ／ｍＬの１０００超ＭＦＰまたはＦＰでパルスし、ＭＵＣ１特異的Ｔ細胞株中におけるＣＤ８（図４６Ａ）およびＣＤ４（図４６Ｂ）細胞内ＩＦＮγ応答をリコ−ルするために使用した。
【図４７】１０００ｋＤａ超の酸化されたマンナンへのｐＴｒｃ（ＭＵＣ１−ＶＮＴＲ）の結合。分子量標準物、ｐＴｒｃ、および１０００ｋＤａ超のｐＴｒｃを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４〜２０％）上で泳動させ、クマシ−ブル−で染色した。
【図４８】ＭＵＣ１特異的Ｔ細胞応答のリコ−ル。同種異系ＤＣ（ＢＣ１７Ａ）を、２０および４０μｇ／ｍＬの１０００ｋＤａ超のｐＴｒｃまたはｐＴｒｃでパルスし、ドナ−ＢＣ１３由来のｐＴｒｃ（ＭＵＣ１）特異的Ｔ細胞株中におけるＣＤ８細胞内ＩＦＮγ応答をリコ−ルするために使用した。
【図４９】ＭＵＣ１特異的Ｔ細胞応答のリコ−ル。自家ＤＣを、２０μｇ／ｍＬの１０００ｋＤａ超の酸化されたマンナン−ｐＴｒｃまたはｐＴｒｃでパルスし、ドナ−ＢＣ１７Ｋ由来のＭＦＰ特異的Ｔ細胞株中におけるＣＤ８細胞内ＩＦＮγ応答をリコ−ルするために使用した。
【図５０】１０００ｋＤａ超の酸化されたマンナンへのＭＡＲＴ−１の結合。分子量標準物、ＭＡＲＴ−１、１０００超のマンナン−ＭＡＲＴ−１を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４−２０％）上で泳動させ、クマシ−ブル−で染色した。
【図５１】ＭＡＲＴ−１特異的応答のプライミング（１刺激）。実施例１に記載されるように、ドナ−ＢＣ２８由来のＰＢＭＣを、ＭＡＲＴ−１タンパク質またはＭＡＲＴ−１    １０００ｋＤａ超酸化マンナン結合体でプライミングした。ＭＡＲＴ−１類似体および類似体ペプチドでパルスされたＴ２細胞による、ＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８細胞内ＩＦＮγ応答のリコ−ルが示される。
【図５２】ＭＡＲＴ−１特異的応答のプライミング（２刺激）。実施例１に記載されるように、ドナ−ＢＣ２８およびＢＣ２９由来のＰＢＭＣを、ＭＡＲＴ−１タンパク質またはＭＡＲＴ−１  １０００ｋＤａ超酸化マンナン結合体でプライミングした。ＭＡＲＴ−１タンパク質および１０００ｋＤａ超酸化マンナン結合体による、ＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８細胞内ＩＦＮγ応答のリコ−ルが示される。
【図５３】Ｈ１Ｎ１、およびＨ１Ｎ１＋１０００ｋＤａ超のマンナンの混合物へのＨ１Ｎ１特異的抗体応答。マウスを、０および１４日目に、１μｇのＨ１Ｎ１単独で、または１０００ｋＤａ超のマンナンと混合してのいずれかで、鼻腔内免疫した。最後の免疫化の１０日後、血清試料および肺洗浄試料を採取し、ＥＬＩＳＡアッセイによって抗Ｈ１Ｎ１  ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＡ活性について試験した。
【０１２６】
配列表の解読
配列番号１：Ｍｅｌａｎ／ＭＡＲＴ−１（天然）に特異的なＨＬＡ−Ａ２エピト−プペプチド。
配列番号２：Ｍｅｌａｎ／ＭＡＲＴ−１（類似体）に特異的なＨＬＡ−Ａ２エピト−プペプチド。
【発明を実施するための形態】
【０１２７】
一般的技法および定義
別途具体的に規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当該技術分野の（例えば、細胞培養、分子遺伝学、ワクチン技術、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、および生化学における）専門家によって一般に理解されるものと同じ意味を有するように受け取られるものとする。
【０１２８】
別途指定されない限り、本発明で利用される組換えタンパク質、細胞培養、および免疫学的技法は、当業者に周知の標準手順である。かかる技法は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８２）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編集者），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １  ａｎｄ  ２，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編集者），ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５  ａｎｄ  １９９６）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（編集者），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までの全てのアップデ−トを含む），Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（編集者），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、およびＪ．ＥＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（編集者），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９１、現在までの全てのアップデ−トを含む）等の出典における文献全体を通じて記載および説明される。
【０１２９】
本明細書で使用されるとき、「約」または「およそ」は、概して、所与の値または範囲の２０％以内、より好ましくは１０％以内、および更により好ましくは５％以内を意味するものとする。
【０１３０】
「および／または」という用語、例えば、「Ｘおよび／またはＹ」は、「ＸおよびＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味するように理解されるものとし、両方の意味またはいずれかの意味に対する明示的な支持を提供するように受け取られるものとする。
【０１３１】
「対象」は、本発明の化合物または組成物での投与時に、免疫応答が誘導されるかつ／または増強される、任意の生物であり得る。好ましい実施形態において、対象は、動物、より好ましくは哺乳動物またはトリである。特に好ましい実施形態において、対象は、ヒトである。他の好ましい実施形態は、ネコおよびイヌ等の伴侶／飼育動物、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、およびヤギ、家禽等の家畜動物、または野生の動物を含む。
【０１３２】
免疫調節物質
本発明の化合物は、マンノ−スを含む炭水化物重合体に結合された、免疫調節物質を含む。
【０１３３】
本明細書で使用される「免疫調節物質」という用語は、対象の免疫系を調節する物質を意味する。免疫調節物質は、免疫強化、免疫抑制、または免疫寛容の誘導におけるように、免疫応答を所望のレベルに調整し得る。本発明の化合物において使用するための免疫調節物質には、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体断片、小分子、サイトカイン、ホルモン、酵素、核酸、ｓｉＲＮＡ等のアンチセンスオリゴヌクレオチド、毒素、抗血管新生剤、細胞傷害性薬剤、アポト−シス促進剤、および他の既知の治療剤が含まれるが、これらに限定されない。好ましい免疫調節物質には、小分子（例えば、Ｒ８４８、ロキソリビン、Ｓｔａｔ−３阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、ラパマイシン／ＦＫ５０６）、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＴＧＦβ）、抗体断片（例えば、ＣＴＬＡ−４アゴニストｓｃＦｖ）、核酸（例えば、ＣｐＧ、ｓｉＲＮＡ）が含まれる。
【０１３４】
免疫調節物質は、サイトカインおよび／またはケモカイン生合成を調節し得る。例えば、免疫調節物質は、例えば、Ｉ型インタ−フェロン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β）、ＩＩ型インタ−フェロン（ＩＦＮ−γ）、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、および／もしくはＩＬ−１２、および／もしくはケモカイン、ＩＬ−８、ＭＩＰ−Ｉ、ＭＣＰ−Ｉ、ならびに／またはＲＡＮＴＥＳ等のサイトカインの産生および／または分泌を誘導し得る。代替的に、免疫調節物質は、例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−５、および／またはＩＬ−１３等のサイトカインの産生および／または分泌を阻害し得る。
【０１３５】
免疫調節物質は、天然および／または適応免疫を調節し得る。
【０１３６】
免疫調節物質は、体液性、細胞性のＴｈ１もしくはＴｈ２応答、またはそれらの組み合わせを誘導し得る。
【０１３７】
免疫調節物質は、アジュバントとして作用し得る。強力なＣＴＬ応答を活性化する免疫調節物質化合物は、ワクチンアジュバントとして、とりわけ治療的ウイルスおよび／または癌ワクチンのために特に望ましいことがあり、それはこれらの設定における治療効果が、典型的に細胞性免疫の活性化に依存するためである。
【０１３８】
免疫調節物質は、粘膜性および／または全身性免疫を調節し得る。
【０１３９】
好ましい実施形態において、免疫調節物質は、少なくとも１つのｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のアゴニストである。
【０１４０】
本明細書で使用されるとき、「アゴニスト」は、少なくとも１つのＴＬＲに結合し、ＴＬＲシグナル伝達を増加させることが可能である薬剤を指す。この点において、ＴＬＲシグナル伝達のレベルは、シグナル伝達の既存のレベルを超えて増強されてもよく、またはそれは、シグナル伝達のバックグラウンドレベルを超えて誘導されてもよい。ＴＬＲシグナル伝達は、免疫応答を媒介し得る。
【０１４１】
本明細書で使用されるとき、「ＴＬＲシグナル伝達」という用語は、ＴＬＲを通じるシグナル伝達に関連する細胞内シグナル伝達のいずれの態様も指す。例となるＴＬＲアゴニストが、表１に示される。
【０１４２】
本発明の目的のために、免疫調節物質が特定のＴＬＲのためのアゴニストと見なされるかどうかを決定する１つの方法は、それが、標的種由来のそのＴＬＲを通じるＮＦｋＢ／ルシフェラ−ゼレポ−タ−構築物を、例えば、ＨＥＫ２９３またはＮａｍａｌｗａ細胞等のＴＬＲトランスフェクトされた宿主細胞中で、対照トランスフェクタントと比べて、約１．５倍よりも大きく、および通常少なくとも約２倍、活性化するかどうかである。ＴＬＲ活性化に関する情報については、例えば、米国第７，３７５，１８０号、米国第７，４８５，４３２号、米国第２００４００１４７７９号、米国第２００４０１３２０７９号、米国第２００４０１９７８６５号、および国際公開第０３／０４３５８８号を参照されたい。
【０１４３】
好適なＴＬＲアゴニストには、グアノシン類似体（例えば、ロキソリビンおよびイサトリビン）、デアザアデノシン類似体（例えば、Ｓｕｍｉｔｏｍｏ化合物）、およびイミダゾキノリン（例えば、イミキモド、レシキモド、３Ｍ−００１、３Ｍ−００２、３Ｍ−００３）を含む、天然ＴＬＲリガンドおよび複数のクラスの小分子が含まれる。
【０１４４】
ＴＬＲ７、８、および／または９から選択されるＴＬＲのためのアゴニストである免疫調節物質化合物は、ある特定の適用に特に有用であり得る。
【０１４５】
ＴＬＲ７媒介性免疫応答は、概して、ＥＰ−１０およびＩ−ＴＡＣ等のＩＦＮ−αサイトカインおよびＩＦＮ誘導サイトカインの誘導によって特徴付けられる。ＴＬＲ７媒介性免疫応答において誘導されるサイトカインＩＬ−１α／β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α／β、およびＭＩＰ−３α／βのレベルは、典型的に、ＴＬＲ８媒介性免疫応答において誘導されるレベル未満である。
【０１４６】
ＴＬＲ８媒介性免疫応答は、概して、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ４０／７０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−ｌα／β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α／β、およびＭＩＰ−３α／β等の炎症促進性サイトカインの誘導によって特徴付けられる。
【０１４７】
ＴＬＲ９媒介性免疫応答は、概して、典型的に、ＴＬＲ８媒介性免疫応答を介して達成されるレベル未満ではあるが、少なくともＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２の産生および／または分泌によって特徴付けられる。
【０１４８】
【表１Ａ】
2014532799.tif 000025
【表１Ｂ】
2014532799.tif 000026
【０１４９】
ＴＬＲ８アゴニストである免疫調節物質化合物は、治療的癌ワクチンとの使用に特に望ましいことがあり、それはＴＬＲ８を発現する抗原提示細胞が、ＴＬＲ８を通じた刺激時にＩＬ−１２を産生することが示されているためである。ＩＬ−１２は、治療的有効性を媒介するために重要であるＣＴＬの活性化において、重要な役割を果たすと考えられる。
【０１５０】
ＴＬＲ７アゴニストおよび／またはＴＬＲ９アゴニストである免疫調節物質化合物は、予防的ワクチンとの使用に特に望ましいことがあり、それはこれらのＴＬＲを通じた刺激によって誘導されるＩ型インタ−フェロンが、中和Ｔｈｌ様体液性および細胞性応答の形成に寄与すると考えられるためである。
【０１５１】
ＴＬＲ７アゴニストかつＴＬＲ８アゴニストである免疫調節物質化合物は、治療的ウイルスワクチンおよび／または癌ワクチンとの使用に特に望ましいことがあり、それはＴＬＲ７刺激が、Ｉ型インタ−フェロンの産生ならびにマクロファ−ジおよびナチュラルキラ−（ＮＫ）細胞等の生得的な細胞の活性化を誘導すると考えられ、またＴＬＲ８刺激が、抗原提示細胞を活性化して、上述の細胞性適応免疫を開始すると考えられるためである。これらの細胞型は、ウイルス排除および／または新生物に対する治療的成長阻害効果を媒介することが可能である。
【０１５２】
ＴＬＲ７アゴニストでなく、実質的な量のＩＦＮαを誘導しない、免疫調節物質化合物は、細菌ワクチン等のある特定のワクチンとの使用に望ましい場合があり、それはＴＬＲ７が、マクロファ−ジおよびＤＣ由来のＩＬ−１２の産生を下方制御する、Ｉ型インタ−フェロン産生を誘導するためである。ＩＬ−１２は、マクロファ−ジ、ＮＫ細胞、およびＣＴＬのその後の活性化に寄与し、それらの全てが抗菌免疫性に寄与する。したがって、幾つかの種類の細菌に対する抗菌免疫の誘導は、ＩＦＮαの不在下で増強され得る。
【０１５３】
ＴＬＲ７アゴニストには、例えば、Ｃ８置換グアノシン等のグアノシン類似体、ＧおよびＵから本質的になるリボヌクレオシド、グアノシンリボヌクレオチド、およびＲＮＡまたはＲＮＡ様分子の混合物（国際公開第２００３／０８６２８０号）、ならびにアデノシンベ−スの化合物（例えば、６−アミノ−９−ベンジル−２−（３−ヒドロキシ−プロポキシ）−９Ｈ−プリン−８−オ−ル（ＣＬ−０２９、Ｓｕｍｉｔｏｍｏ）、６−アミノ−９−ベンジル−２−ブトキシ−９Ｈ−プリン−８−オ−ル、および米国第６，３１０，０７０号に記載されるもの等の他の関連する化合物）が含まれる。ＴＬＲ７アゴニストはまた、Ｇｏｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）（例えば、３Ｍ−００１、Ｎ−［４−（４−アミノ−２−エチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）ブチル−］メタンスルホンアミド、Ｃ１７Ｈ２３Ｎ５Ｏ２Ｓ、分子量３６１）に開示される。
【０１５４】
ＴＬＲ８アゴニストには、例えば、ＧおよびＵから本質的になるリボヌクレオシド、グアノシンリボヌクレオチド、ならびにＲＮＡまたはＲＮＡ様分子の混合物（国際公開第２００３／０８６２８０号）が含まれる。追加のＴＬＲ８アゴニストはまた、Ｇｏｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）（例えば、３Ｍ−００２、２−プロピルチアゾロ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン、Ｃ１３Ｈ１３Ｎ３Ｓ、分子量２４３）に開示される。
【０１５５】
ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の両方のアゴニストには、例えば、イミダゾキノリン、ＧおよびＵから本質的になるリボヌクレオシド、グアノシンリボヌクレオチド、ならびにＲＮＡまたはＲＮＡ様分子の混合物（国際公開第２００３／０８６２８０号）が含まれる。追加のＴＬＲ７／８アゴニストはまた、Ｇｏｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）（例えば、３Ｍ−００３、４−アミノ−２−（エトキシメチル）−α，α−ジメチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−ｌ−エタノ−ル水和物、Ｃ１７Ｈ２６Ｎ４Ｏ２、分子量３１８）に開示される。
【０１５６】
ＴＬＲ９アゴニストには、例えば、免疫調節核酸、および特に、ＣｐＧ免疫調節核酸が含まれる。
【０１５７】
グアノシン類似体
本明細書で使用されるとき、「グアノシン類似体」という用語は、グアニン塩基を伴う化学修飾を有するグアノシン様ヌクレオシド（グアノシンを除く）、グアノシンヌクレオシド糖、またはグアニン塩基およびグアノシンヌクレオシド糖の両方を指す。一例において、グアノシン類似体は、７−デアザ−グアノシンである。
【０１５８】
別の例において、グアノシン類似体は、Ｃ８置換グアノシンである。Ｃ８置換グアノシンの例としては、７−アリル−７，８−ジヒドロ−８−オキソ−グアノシン（ロキソリビン）、７−チア−８−オキソグアノシン（イムノシン、イサトリビン、ＡＮＡ２４５、７−チア−８−オキソ−７，８−ジヒドログアノシン、５−アミノ−３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−３Ｈ，６Ｈ−チアゾ−ル［４，５−ｄ］ピリミジン−２，７−ジオン）、８−メルカプトグアノシン、８−ブロモグアノシン、８−メチルグアノシン、８−オキソ−７，８−ジヒドログアノシン、Ｃ８−アリ−ルアミノ−２’−デオキシグアノシン、Ｃ８−プロピニル−グアノシン、Ｃ８置換およびＮ７置換グアニンリボヌクレオシド、７−メチル−８−オキソグアノシン、８−アミノグアノシン、８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン、７−デアザ−８−置換グアノシン、ならびに８−ヒドロキシグアノシンが挙げられる。
【０１５９】
アデノシン類似体
本明細書で使用されるとき、「アデノシン類似体」という用語は、アデニン塩基を伴う化学修飾を有するアデノシン様ヌクレオシド（アデノシンを除く）、アデノシンヌクレオシド糖、またはアデニン塩基およびアデノシンヌクレオシド糖の両方を指す。アデノシンベ−スの化合物には、例えば、６−アミノ−９−ベンジル−２−（３−ヒドロキシ−プロポキシ）−９Ｈ−プリン−８−オ−ルおよび６−アミノ−９−ベンジル−２−ブトキシ−９Ｈ−プリン−８−オ−ルが含まれる。
【０１６０】
５員の窒素含有複素環に縮合された２−アミノピリジン
５員の窒素含有複素環に縮合された２−アミノピリジンを有する化合物は、例えば、アミド置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミド置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンアミン、アリ−ルエ−テル置換イミダゾキノリンアミン、複素エ−テル置換イミダゾキノリンアミン、アミドエ−テル置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミドエ−テル置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンエ−テル、チオエ−テル置換イミダゾキノリンアミン、ヒドロキシルアミン置換イミダゾキノリンアミン、オキシム置換イミダゾキノリンアミン、６−、７−、８−、もしくは９−アリ−ル、ヘテロアリ−ル、アリ−ルオキシ、もしくはアリ−ルアルキレンオキシ置換イミダゾキノリンアミン、およびイミダゾキノリンジアミン等の置換イミダゾキノリンアミンを含むが、これらに限定されない、イミダゾキノリンアミン；アミド置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、スルホンアミド置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、尿素置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、アリ−ルエ−テル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、複素エ−テル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、アミドエ−テル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、スルホンアミドエ−テル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、尿素置換テトラヒドロイミダゾキノリンエ−テル、チオエ−テル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、ヒドロキシルアミン置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、オキシム置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、およびテトラヒドロイミダゾキノリンジアミンを含むが、これらに限定されない、テトラヒドロイミダゾキノリンアミン；アミド置換イミダゾピリジンアミン、スルホンアミド置換イミダゾピリジンアミン、尿素置換イミダゾピリジンアミン、アリ−ルエ−テル置換イミダゾピリジンアミン、複素エ−テル置換イミダゾピリジンアミン、アミドエ−テル置換イミダゾピリジンアミン、スルホンアミドエ−テル置換イミダゾピリジンアミン、尿素置換イミダゾピリジンエ−テル、およびチオエ−テル置換イミダゾピリジンアミンを含むが、これらに限定されない、イミダゾピリジンアミン；１，２−架橋イミダゾキノリンアミン；６，７−縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン；イミダゾナフチリジンアミン；テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン；オキサゾロキノリンアミン；チアゾロキノリンアミン；オキサゾロピリジンアミン；チアゾロピリジンアミン；オキサゾロナフチリジンアミン；チアゾロナフチリジンアミン；ピラゾロピリジンアミン；ピラゾロキノリンアミン；テトラヒドロピラゾロキノリンアミン；ピラゾロナフチリジンアミン；テトラヒドロピラゾロナフチリジンアミン；ならびにピリジンアミン、キノリンアミン、テトラヒドロキノリンアミン、ナフチリジンアミン、またはテトラヒドロナフチリジンアミンに縮合された１Ｈ−イミダゾ二量体、例えば、米国第４，６８９，３３８号、米国第４，９２９，６２４号、米国第４，９８８，８１５号、米国第５，０３７，９８６号、米国第５，１７５，２９６号、米国第５，２３８，９４４号、米国第５，２６６，５７５号、米国第５，２６８，３７６号、米国第５，３４６，９０５号、米国第５，３５２，７８４号、米国第５，３６７，０７６号、米国第５，３８９，６４０号、米国第５，３９５，９３７号、米国第５，４４６，１５３号、米国第５，４８２，９３６号、米国第５，６９３，８１１号、米国第５，７４１，９０８号、米国第５，７５６，７４７号、米国第５，９３９，０９０号、米国第６，０３９，９６９号、米国第６，０８３，５０５号、米国第６，１１０，９２９号、米国第６，１９４，４２５号、米国第６，２４５，７７６号、米国第６，３３１，５３９号、米国第６，３７６，６６９号、米国第６，４５１，８１０号、米国第６，５２５，０６４号、米国第６，５４５，０１６号、米国第６，５４５，０１７号、米国第６，５５８，９５１号、米国第６，５７３，２７３号、米国第６，６５６，９３８号、米国第６，６６０，７３５号、米国第６，６６０，７４７号、米国第６，６６４，２６０号、米国第６，６６４，２６４号、米国第６，６６４，２６５号、米国第６，６６７，３１２号、米国第６，６７０，３７２号、米国第６，６７７，３４７号、米国第６，６７７，３４８号、米国第６，６７７，３４９号、米国第６，６８３，０８８号、米国第６，８９４，０６０号、欧州特許第０  ３９４  ０２６号、米国第２００２００５５５１７号、米国第２００２０１１０８４０号、米国第２００３０１３３９１３号、米国第２００３０１９９５３８号、米国第２００４００１４７７９号、国際公開第０２／１０２３７７号、および国際公開第０３／１０３５８４号に開示されるもの等であってもよい。
【０１６１】
他の免疫調節物質
好適な免疫調節物質化合物にはまた、プリン誘導体（米国第６，３７６，５０１号および米国第６，０２８，０７６号に開示されるもの等）、イミダゾキノリンアミド誘導体米国第６，０６９，１４９号に開示されるもの等）、ベンズイミダゾ−ル誘導体（米国第６，３８７，９３８号に開示されるもの等）、アデニン誘導体（米国第６，３７６，５０１号、米国第６，０２８，０７６号、米国第６，３２９，３８１号、および国際公開第２００２／０８９０５号に開示されるもの等）、アミノアルキルグルコサミニドホスフェ−ト（米国第６，１１３，９１８号、米国第６，３０３，３４７号、米国第６，５２５，０２８号、および米国第６，６４９，１７２号に開示されるもの等）、小分子免疫増強物質化合物（米国第２００５／０１３６０６５号に開示されるもの等）、およびシトシン−グアニン（ＣｐＧ）含有オリゴヌクレオチド配列（米国第６，１９４，３８８号、米国第６，２０７，６４６号、米国第６，２３９，１１６号、米国第６，３３９，０６８号、および米国第６，４０６，７０５号に開示されるもの等）が含まれる。幾つかのＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、合成免疫調節構造モチ−フ（米国第６，４２６，３３４号および米国第６，４７６，０００号に開示されるもの等）を含む。
【０１６２】
マンノ−スを含む炭水化物重合体
本明細書で使用されるとき、「マンノ−スを含む炭水化物重合体」は、マンノ−スサブユニット（すなわち、マンノ−ス単量体単位）またはそれらの変異体を含む、より好ましくはそれからなる、いずれのマルチサブユニット化合物も含む。例としては、マンナン、ガラクトマンナン、およびエ−スマンナンが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、炭水化物重合体は、アルデヒド基を含む。
【０１６３】
好ましい実施形態において、炭水化物重合体は、酸化されて、ポリ−アルデヒドをもたらす。更に好ましい実施形態において、炭水化物重合体は、１つの免疫調節物質および／または少なくとも１つの抗原もしくはそれをコ−ドする核酸に結合される前に、１５０個のアルデヒド基を含む。少なくとも１つの免疫調節物質および／または少なくとも１つの抗原もしくはそれをコ−ドする核酸に結合される対象の炭水化物重合体を含む組成物中で、組成物中の炭水化物重合体の好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％、および更により好ましくは全てが、各々、少なくとも１５０個のアルデヒド基を有する。
【０１６４】
一実施形態において、マンノ−スを含む炭水化物重合体は、少なくとも１つの免疫調節物質および／または少なくとも１つの抗原もしくはそれをコ−ドする核酸に結合される前に、約１０００ｋＤａ超の分子量を有する。少なくとも１つの免疫調節物質および／または少なくとも１つの抗原もしくはそれをコ−ドする核酸に結合される対象の炭水化物重合体を含む組成物中で、組成物中の炭水化物重合体の好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％、および更により好ましくは全てが、約１０００ｋＤａ超である。
【０１６５】
本明細書で使用されるとき「マンナン」は、マンノ−スで排他的に形成される線状または分岐状多糖類を指し、修飾された、例えば、アセチル化マンノ−ス（エ−スマンナン）、またはマンノ−ス主鎖を有するが、非マンノ−ス側鎖基である置換マンナン（例えば、ガラクト−ス側鎖基を有するマンノ−ス主鎖からなるガラクトマンナン）の多糖類は指さない。
【０１６６】
本発明の化合物において有用なマンナンは、例えば、真菌、より好ましくは酵母中に見出される。出芽酵母（パン酵母）由来の分岐状マンナンにおいて、マンナンは、Ｏ−２原子上で、α−Ｄ−マンノピラノシル、α−Ｄ−マンノピラノシル−α−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル、およびα−Ｄ−マンノピラノシルα−（１→３）−α−Ｄ−マンノピラノシル−α−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシルの側鎖によって置換された、α−（１→６）結合マンノピラノシル主鎖構造からなる。加えて、出芽酵母マンナンはまた、リン酸化され得る（Ｂａｒｒｅｔｏ−Ｂｅｒｇｔｅｒ  ａｎｄ  Ｇｏｒｉｎ，１９８３、Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【０１６７】
マンナンは、好ましくは、真菌、より好ましくは酵母の細胞壁から単離される。ある実施形態において、マンナンは、高分子量マンナン、好ましくは１０００ｋＤａ超のマンナンを優先的に発現するように操作された、遺伝子改変酵母から単離されてもよい。
【０１６８】
アルデヒド基を含むマンナンは、例えば、酵母から得られた、マンナンの酸化によって産生することができる。アルデヒドを炭水化物重合体中に導入するための最も一般的な方法は、ビシナルジオ−ルの過ヨウ素酸塩媒介性（ＮａＩＯ４）酸化によるものである（図２の略図を参照されたい）。他の酸化方法については、概して、Ｍ．Ｌ．Ｗｏｌｆｒｏｍ（編集者），Ｐｅｒｉｏｄａｔｅ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １１，ｐａｇｅｓ  １−４０（１９５６）を参照されたい。
【０１６９】
好ましい実施形態において、マンナンは、ＮａＩＯ４を使用して酸化されて、ポリアルデヒドを産生し、それが次いで、少なくとも１つの免疫調節物質および／または少なくとも１つの抗原もしくはそれをコ−ドする核酸に結合される。
【０１７０】
ある実施形態において、高分子量マンナン（すなわち、約１０００ｋＤａ超）は、例えば、出芽酵母等の酵母から抽出された、全マンナンのサイズ分画によって得られる。この例において、全マンナンは、培養細胞または噴霧乾燥細胞の熱水抽出法および溶媒抽出法を含む、当該技術分野で既知の方法によって、出芽酵母からもたらされてもよい。出芽酵母に由来するマンナンは、供給業者、例えば、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得られてもよく、ある実施形態においては、その後分画されて、高分子量マンナン組成物をもたらしてもよい。ある実施形態において、高分子量マンナン組成物は、リボ−ス、核酸、リボ核酸、タンパク質、および／または他の炭水化物が実質的にない。
【０１７１】
マンノ−スを含む炭水化物重合体の調製
炭水化物および糖の分離ための方法は、当該技術分野で周知である（概して、Ｚ．Ｅｌ  Ｒａｓｓｉ（編集者），Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｍｏｄｅｒｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｖｏｌｕｍｅ  ６６，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）を参照されたい）。
【０１７２】
サイズ分画
ある実施形態において、マンノ−スを含む炭水化物重合体を含む組成物、より好ましくは、マンナンを含む組成物のサイズ分画は、十字流濾過（ＣＦＦ）とも呼ばれる、タンジェント流濾過（ＴＦＦ）によって行われる。ＴＦＦは、生成物流（供給流）が膜の表面に沿って接線方向に導かれ、その溶液のほとんどが供給タンクに還流させられる、プロセスである。膜をわたる供給流溶液の急流は、表面を「掃引する」ように作用して、濃度分極（膜表面での生成物濃度）を低減する。それはまた、膜表面の細孔を詰まらせる可能性のある汚れの蓄積を防止する。急速な十字流は、圧力降下を作り出し、それが供給流溶液の一部および膜における細孔よりも小さい溶質分子を、膜フィルタに押し通す。膜を通過する溶液は、濾液または透過水と称される。膜細孔よりも大きい分子または粒子は、供給流溶液中に保持され、事実上濃縮される。
【０１７３】
膜濾過は、「精密濾過」または「限外濾過」プロセスとして分類され得る。典型的に０．１ミクロン〜１ミクロンの間の孔径を有する精密濾過膜は概して、微粒子の清澄化、滅菌、および除去、または細胞採取に使用される。０．００１〜０．１ミクロンの間のはるかにより小さい孔径を有する限外濾過膜は、溶質分子（タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物および他の生体分子）の濃縮および脱塩、緩衝液の交換、分画、ならびに水精製に使用される。限外濾過膜は、典型的に、孔径ではなく、分画分子量（ＭＷＣＯ）によって分類される。
【０１７４】
別の実施形態において、マンノ−スを含む炭水化物重合体を含む組成物のサイズ分画は、サイズ排除クロマトグラフィ−によって行われる。
【０１７５】
サイズ排除クロマトグラフィ−の基本的な原則は、当該技術分野で周知であり、Ｇｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅに説明される。例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００  ＨＲ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００  ＨＲ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ＨＲ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００  ＨＲ、およびＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００  ＨＲ、またはそれらの均等物等の、特定の範囲を分画するために適切なカラムは、上の画分を分解するために容易に選択し、効果的に使用することができる。類似した様式で、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ媒体またはそれらの均等物、例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂ、４Ｂ、２Ｂが使用され得る。ある実施形態において、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００  ＨＲが、マンノ−スを含む炭水化物重合体を含む組成物を分画するために使用される。
【０１７６】
なおも別の実施形態において、マンノ−スを含む炭水化物重合体を含む組成物のサイズ分画は、限外濾過によって行われる。
【０１７７】
試料の限外濾過は、適切な分画分子量を有する分子膜を使用して行われ得る。分画を達成するために使用される具体的な膜および手順は、当業者に慣用である。
【０１７８】
当業者であれば、マンノ−スを含む炭水化物重合体を含む組成物のサイズ分画がまた、密度勾配遠心分離によって行われもよいことを理解するであろう。
【０１７９】
好ましい実施形態において、試料は、例えば、リボ−ス、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸、タンパク質、および／またはマンノ−スを含まない炭水化物等の、汚染物質を除去するために、分画前に少なくとも部分的に精製される。精製は、親和性、イオン交換、および疏水的相互作用クロマトグラフィ−を含む、他のクロマトグラフィ−技法と組み合わせて達成され得る。組成物の純度は、下に記載されるように、そのマンノ−ス含量を測定することによって決定され得る。
【０１８０】
非炭水化物構成成分の１つの除去方法は、非炭水化物構成成分を切断するための消化酵素、続いて切断された生成物を除去するためのサイズ分画の使用である。プロナ−ゼ、リボヌクレア−ゼ、ＤＮａｓｅ、およびプロテア−ゼを含む、消化酵素は、当該技術分野で周知であり、種々の教本に記載され、その一例が、上記のＭａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）である。タンパク質の消化に有用なプロテア−ゼには、エンドペプチダ−ゼおよびエキソペプチダ−ゼ、プロナ−ゼ、トリプシン、キモトリプシン、およびスブチリシン等のセリンプロテア−ゼ、パパイン等のチオ−ルプロテア−ゼ、ならびにサ−モリシン等のカルシウム依存性プロテア−ゼが含まれる。
【０１８１】
代替的に、非炭水化物構成成分は、親和性クロマトグラフィ−によって、例えば、ＤＮＡ結合またはＲＮＡ結合マトリクスの使用によって（上記のＭａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２、）除去されてもよい。別の選択肢は、レクチン等の多糖類結合マトリクスの使用によって、汚染構成成分から炭水化物重合体を取り出して精製することである。
【０１８２】
本発明のプロセスにより、選択された画分における、マンノ−スを含む炭水化物重合体のサイズ分布、アルデヒドおよび／またはマンノ−ス含量を決定することができる。この検証は、ヒトにおいて使用するために規制当局の認可を獲得する際に重要であり得る。
【０１８３】
サイズ分布
分画前および／または後の試料のサイズ分布を決定することができる。分画前に行われるとき、この分析は、分画のための炭水化物重合体の出発組成物の選択を補助する。例えば、出発組成物中の重合体の分子量種の大部分が１０００ｋＤａを下回る場合、組成物は破棄され得、炭水化物重合体の高分子量種の分布がより高い別のバッチが分画のために選択される。対照的に、回収された画分のサイズ分布の分析は、分画プロセスを確認または検証するように作用する。これは、これらの炭水化物重合体をヒトにおいて使用するために規制当局の認可を獲得するときに重要となろう。
【０１８４】
組成物の炭水化物重合体のサイズ分布は、酸化された試料をＡＮＴＳと反応させ（図３の略図を参照されたい）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＡＮＴＳ標識試料を分解することによって決定されてもよい。分解されたＡＮＴＳ標識試料を、タンパク質および／または炭水化物標準物に対して比較することは、該試料のサイズ分布が決定されることを可能にするであろう。
【０１８５】
本明細書で使用されるとき、「タンパク質および／または炭水化物標準物」は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分子量標準として使用するための種々の分子量の、既知のタンパク質または炭水化物の組成物を指す。組成物は、試料ゲルの隣接レ−ンで電気泳動させられる試料の分子量を推定するためのマ−カ−としての役目を果たす、鋭角の、十分に分離したバンドをもたらすように設計される。標準物は、予め染色されても（電気泳動中に分子量範囲の容易な可視化を可能にするために）、または染色されなくてもよい。多様な標準物が電気泳動用途のために利用可能であり、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎまたはＢｉｏ−ｒａｄから購入することができる。典型的に、標準物は、使用準備済みの形式で供給され、負荷する染料を濃縮、予混合、または追加する必要性を排除している。これらの標準物は、ロット間で一貫しており、一貫したバンド移動および強度を確実にするために、適切なゲルについて厳格に品質管理される。
【０１８６】
アルデヒド含量
試料のアルデヒド含量もまた、バッチ選択および／または画分検証を補助するために、分画の前および／または後に決定されてもよい。
【０１８７】
ある実施形態において、試料のアルデヒド含量は、ＮａＩＯ４での酸化後に、試料中のアルデヒド残基の数を定量化することによって決定される。例えば、マンナンを含む組成物は、マンナンが各々およそ９０〜２００個のアルデヒド残基を含む場合、分画のために選択されてもよい。
【０１８８】
方法は、例えば、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中、１００μＬ中１．４ｍｇの試料を、０．０１Ｍ  ＮａＩＯ４と、暗所で、氷上で１時間反応させることによって、試料を最初に酸化することを伴う。反応物を次いで、１０μＬエタンジオ−ルで反応停止処理し、更に１／２時間反応させた後、０．１  Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）で予備平衡化したＰＤ１０カラム上に負荷して、過剰なＮａＩＯ４を除去する。
【０１８９】
アルデヒド基の数は、その後、分光測光法によって、ＰＤＰＨで処理されたときのピリジン−２−チオンの放出を測定することによって測定することができる。
【０１９０】
当業者によって理解されるように、複数の他の方法がアルデヒドの定量化のために使用されてもよい。例えば、オキシム、ヒドラジド、セミカルバジド、およびカルボヒドラジドは、アルデヒドと容易に反応し、炭水化物重合体におけるアルデヒド基の定量化のために、レポ−タ−分子（例えば、蛍光化合物）に結合することができる。使用することができる蛍光化合物の選択は、ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−Ｐｒｏｂｅｓ−Ｔｈｅ−Ｈａｎｄｂｏｏｋ／Ｒｅａｇｅｎｔｓ−ｆｏｒ−Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ−Ｇｒｏｕｐｓ−Ｏｔｈｅｒ−Ｔｈａｎ−Ｔｈｉｏｌｓ−ｏｒ−Ａｍｉｎｅｓ／Ｈｙｄｒａｚｉｎｅｓ−Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅｓ−ａｎｄ−Ａｒｏｍａｔｉｃ−Ａｍｉｎｅｓ−ｆｏｒ−Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ−Ａｌｄｅｈｙｄｅｓ−ａｎｄ−Ｋｅｔｏｎｅｓ．ｈｔｍｌに詳述される。例としては、フルオレセイン−５−チオセミカルバジド、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄが挙げられる。
【０１９１】
加えて、２，４−ジニトロフェニルヒドラジンは、アルデヒドと反応して、赤色ヒドラゾンを形成し、それもまた、吸光分光測光法（Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）によって、炭水化物重合体におけるアルデヒド基の数を定量化するために使用することができる。
【０１９２】
マンノ−ス含量
ある実施形態において、組成物のマンノ−ス含量は、中性糖が水和物硫酸溶液の存在下でレゾルシノ−ルと反応する、中性糖についての比色アッセイによって決定される。
【０１９３】
例えば、２００μＬの６ｍｇ／ｍＬレゾルシノ−ルおよび１ｍＬの７５％硫酸を、２００μＬの容量中５〜１００ｎｍｏｌの中性糖を有する試料（０．０１Ｍ酢酸中に溶解させた）を含有する、アッセイ管に添加する。溶液を次いで、ボルテックスし、温度制御された水浴中、９０℃で３０分間加熱し、その後、暗所で冷水浴中に３０分間配置する。混合物の光学密度を次いで、４３０または４８０ｎｍで決定する。同じアッセイを、上に示される容量の半分を使用して行い、同様の結果を得ることができる。
【０１９４】
代替的に、アッセイは、マイクロプレ−ト形式で行うことができる。この実施形態において、２０μＬの６ｍｇ／ｍＬレゾルシノ−ルおよび１００μＬの７５％硫酸および５０μＬプリスチン（ｐｒｉｓｔｉｎｅ）を、２０μＬの容量中１〜１００ｎｍｏｌの中性糖を有する試料（０．０１Ｍ酢酸中に溶解させた）を含有する、９６ウェルのマイクロタイタ−プレ−トのＵ字形ウェルに添加する。溶液を次いで、ボルテックス装置でプレ−トを振盪することによって混合し、インキュベ−タ−中、９０℃で３０分間加熱し、その後、暗所で、室温で３０分間維持する。混合物の光学密度を次いで、マイクロタイタ−プレ−トリ−ダ−を使用して、４３０または４８０ｎｍで決定する。定量目的のために、ブランク、中性糖標準物、および試料を二重、より好ましくは三重、より好ましくは四重でアッセイする。
【０１９５】
マンノ−ス含量はまた、炭水化物重合体の酵素的加水分解または酸加水分解によって、続いてＨＰＬＣ、質量分析、キャピラリ−電気泳動、または薄層クロマトグラフィ−による分析によって決定することができる（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ａｎｕｍｕｌａ，１９９４、Ｒ．Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃ．Ｈｏｒｖａｔｈ  ａｎｄ  Ｌ．Ｓ．Ｅｔｔｒｅ（編集者），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９３）ｐｐ．８６−１０１）。
【０１９６】
免疫調節物質−炭水化物重合体結合体およびそれらの調製
本発明は、免疫調節物質−炭水化物重合体結合体、および該免疫調節物質−炭水化物重合体結合体を作製するために使用される方法に関する。
【０１９７】
一実施形態において、免疫調節物質は、リンカ−を介して炭水化物重合体に結合される。炭水化物重合体は、炭水化物重合体の生物活性の少なくとも一部分を保存しながら、リンカ−との共有結合を形成することができる、官能基を有してもよい。代替的に、かかる官能基は、場合によっては、例えば、炭水化物重合体を酸化してポリアルデヒドを得る、または炭水化物重合体を、官能基、例えば、マロニルもしくはスルホニルを有する部分に連結する等の化学反応によって、容易に生成または付加されてもよい。
【０１９８】
一実施形態において、第１の官能基を有するリンカ−は、免疫調節物質の免疫調節活性の少なくとも一部分を保存するように選択される免疫調節物質上の部位で、免疫調節活性を有する免疫調節物質に共有結合により連結されて、それによって免疫調節物質−リンカ−を形成する。免疫調節物質−リンカ−を次いで、炭水化物重合体と反応させて、リンカ−の第２の官能基が炭水化物重合体上の部位で共有結合することを可能にし、それによって、炭水化物重合体の免疫調節活性および生物活性を有する、免疫調節物質−炭水化物重合体結合体を形成する。代替的に、リンカ−を炭水化物重合体に最初に結合し、結果として生じる結合体をその後、免疫調節物質と反応させてもよい。依然として更に、免疫調節物質および炭水化物重合体の両方を各々、リンカ−に最初に結合し、結果として生じる結合体をその後反応させてもよい。
【０１９９】
本発明の結合体の調製のための好適な方法は、米国第２００９／００３５３２３号に記載される。米国第２００９／００３５３２３号は、第２の活性部分への免疫調節物質の結合を教示する。しかしながら、米国第２００９／００３５３２３号は、マンノ−スを含む炭水化物重合体、例えば、マンナン（ｍａｎｎｎａｎ）への、免疫調節物質の結合を教示していない。更に、米国第２００９／００３５３２３号は、高分子量炭水化物重合体への、免疫調節物質の結合を教示または示唆していない。
【０２００】
本発明の結合体は、次の反応スキ−ムに例示される一般方法を使用して、調製され得る：
【０２０１】
【化２２】
2014532799.tif 000027
【０２０２】
上の反応スキ−ムにおいて、炭水化物（ＣＨＯ）重合体および免疫調節物質は、上述の通りである一方で、ＦＧＡ、ＦＧＢ、リンカ−Ａ、Ｂ、およびＣは、米国第２００９／００３５３２３号に定義される通りである。当業者であれば、ｐが炭水化物重合体の長さに応じて変動することを理解するであろう。一実施形態において、ｐは、１〜１００の整数である。
【０２０３】
上の反応スキ−ムのステップ（１）において、免疫調節物質は、式ＸＩＩの官能化免疫調節物質を提供するように修飾される。式ＸＩＩの官能化免疫調節物質化合物は、ヘテロ二官能性リンカ−を使用して調製することができる。本明細書で使用されるとき、「ヘテロ二官能性リンカ−」は、両端における２つの異なる反応性官能基と、種々の長さおよび組成のスペ−サ−とを含む。ヘテロ二官能性リンカ−によって修飾され得る、免疫調節物質上の有用な官能基には、アミン、チオ−ル（−ＳＨ）、ケトン、ヒドラジド（−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２）、ヒドラジン（−ＮＨＮＨ２）、ヒドロキシルアミン（−ＮＨＯＨ）、およびＯ−アルキルヒドロキシルアミン（−Ｏ−ＮＨ２）が含まれるが、これらに限定されない。式ＸＩＩの官能化免疫調節物質化合物は、ヘテロ二官能性リンカ−を用いること以外の手段によって合成されてもよい。
【０２０４】
幾つかの実施形態において、免疫調節物質は、リンカ−Ａを組み込むことなく使用されてもよい。例えば、官能基ＦＧＡを含有する免疫調節物質を、式ＸＩＩＩの官能化部分と反応させて、式ＸＩＶの免疫調節物質−炭水化物結合体を形成することができる。免疫調節物質における好ましい官能基ＦＧＡには、アミン、チオ−ル（−ＳＨ）、ケトン、ヒドラジド（−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２）、ヒドラジン（−ＮＨＮＨ２）、ヒドロキシルアミン（−ＮＨＯＨ）、およびＯ−アルキルヒドロキシルアミン（−Ｏ−ＮＨ２）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０５】
上の反応スキ−ムのステップ（２）において、炭水化物重合体は、式ＸＩＩＩの官能化部分を提供するように修飾される。式ＸＩＩＩの官能化部分は、上のステップ（１）に記載されるものと同様の戦略を用いることによって、ヘテロ二官能性リンカ−を使用して調製することができる。炭水化物重合体上の有用な官能基ＦＧＢには、アミン（−ＮＨ２）、チオ−ル（−ＳＨ）、およびアルデヒド（−ＣＨＯ）が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実例において、有用な官能基ＦＧＢは、炭水化物重合体上で容易に生成され得る。例えば、重合体上の炭水化物残基を、過ヨウ素酸ナトリウムを使用して酸化させて、反応性アルデヒドを形成することができる。式ＸＩＩＩの官能化部分は、ヘテロ二官能性リンカ−を用いること以外の手段によって合成されてもよい。
【０２０６】
好ましい実施形態において、炭水化物重合体は、リンカ−Ｂを組み込むことなく使用されてもよい。例えば、官能基ＦＧＢを含有する炭水化物重合体を、式ＸＩＩの官能化免疫調節物質と反応させて、式ＸＩＶの免疫調節物質−炭水化物重合体結合体を形成することができる。炭水化物重合体上の有用な官能基ＦＧＢには、アミン（−ＮＨ２）、チオ−ル（−ＳＨ）、およびアルデヒド（−ＣＨＯ）が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実例において、有用な官能基ＦＧＢは、炭水化物重合体上で容易に生成され得る。例えば、重合体上の炭水化物残基を、過ヨウ素酸ナトリウムを使用して酸化させて、反応性アルデヒドを形成することができる。
【０２０７】
反応は、式ＸＩＩの官能化免疫調節物質の、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等の好適な溶媒中の溶液を、式ＸＩＩＩの官能化部分の、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）等の好適な緩衝液中の溶液に添加することによって行うことができる。反応は、周囲温度で行うことができる。結果として生じる結合体は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィ−等の、従来の方法を使用して精製することができる。
【０２０８】
式ＸＩＩの官能化免疫調節物質および式ＸＩＩＩの官能化部分は、官能基ＦＧＡおよびＦＧＢが相互に反応して、式ＸＩＶの免疫調節物質−炭水化物重合体結合体において新たな共有結合を形成するように選択される。
【０２０９】
幾つかの実施形態において、炭水化物重合体上の適切な官能基と反応することが意図される、免疫調節物質上の官能基ＦＧＡＦＧＢは、免疫調節物質における特定の官能基、例えば、アミノ基またはヒドロキシル基と適合性でない場合がある。
【０２１０】
これらの場合において、保護基またはプロドラッグ基（ｐｒｏｄｒｕｇ  ｇｒｏｕｐ）を使用して、例えば、アミノまたはヒドロキシル基の反応性を一時的に遮蔽することが必要であり得る。保護基は次いで、合成経路における適切なステップで除去され得る。
【０２１１】
好適なアミノ保護基は、米国第２００９／００３５３２３号に記載され、アセチル、トリフルオロアセチル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル、および９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）を含む。好適なヒドロキシ保護基は、米国第２００９／００３５３２３号に記載され、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基等の、アセチル基およびシリル基を含む。
【０２１２】
本発明の幾つかの実施形態において、免疫調節物質のプロドラッグを使用することができる。「プロドラッグ」という用語は、インビボで形質転換されて免疫応答修飾化合物をもたらす、化合物を意味する。プロドラッグ自体が、免疫応答修飾化合物であってもよい。形質転換は、化学的生体内変換（例えば、血液中での、例えば、加溶媒分解または加水分解）または酵素的生体内変換を通じて等の、種々の機構によって生じ得る。好適なプロドラッグは、米国第２００９／００３５３２３号に記載される。
【０２１３】
リンカ−
一実施形態において、リンカ−は、次のものを含む：
ｉ）炭水化物重合体に結合され得る第１の官能基（タイプ（ｉ）基）、
ｉｉ）免疫調節物質に結合され得る第２の官能基（タイプ（ｉｉ）基）、および
ｉｉｉ）スペ−サ−。
第１および第２の基は任意に、好適な脱離基または保護基を含んでもよい。
第１の基は、例えば、アルデヒド、ケトン、ホルミル、ヒドラジン、ヒドラジド、アミン、アミド、カルボン酸、アルキン、またはハロゲンであってもよい。
【０２１４】
第２の基は、例えば、アルデヒド、ケトン、ホルミル、ヒドラジン、ヒドラジド、アミン、アミド、カルボン酸、アルキン、またはハロゲンであってもよい。
【０２１５】
リンカ−は、複数の免疫調節物質化合物がリンカ−に共有結合し得るように、分岐状であってもよい。複数の免疫調節物質化合物がリンカ−に結合するとき、免疫調節物質化合物は、同じ化合物であっても、異なる化合物であってもよい。
【０２１６】
複数の免疫調節物質化合物が炭水化物重合体に結合され得るように、１つを超えるリンカ−が炭水化物重合体に共有結合してもよい。複数のリンカ−が炭水化物重合体に結合するとき、リンカ−は、同じであっても、異なってもよい。更に、各リンカ−に結合する免疫調節物質化合物は、同じ化合物であっても、異なる化合物であってもよい。
【０２１７】
一実施形態において、リンカ−は、ヘテロ二官能性であり、式Ｉ：
【化２３】
2014532799.tif 000028
【０２１８】
の式を有し、式中、
Ａは、保護基であり、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
Ｂは、アミノ酸残基またはその誘導体であり、
ｎは、１〜１０の間の整数であり、
ｐは、１〜５の間の整数であり、
ＬＧは、脱離基である。
【０２１９】
別の実施形態において、リンカ−は、ヘテロ二官能性であり、式ＩＩ：
【０２２０】
【化２４】
2014532799.tif 000029
【０２２１】
の式を有し、式中、
Ａは、保護基であり、
ＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
ＰＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であり、
Ｂは、アミノ酸残基またはその誘導体であり、
ｎは、１〜１０の間の整数であり、
ｐは、１〜５の間の整数である。
リンカ−の長さ、強剛性、または可撓性、および疎水性もしくは親水性は、各免疫調節物質−炭水化物重合体結合体のために最適化することができる。更に、リンカ−は、複数の免疫調節物質化合物が単一のリンカ−に結合し得るように、分岐点を含むように設計および合成することができる。
【０２２２】
最後に、リンカ−は、免疫調節物質がインビボで免疫調節物質−炭水化物重合体結合体から放出されるように、設計および合成することができる。例えば、リンカ−は、ジスルフィド結合、ヒドラゾン部分、または文献（Ｔｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｊｅｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、国際公開第２００５／０８２０２３号）に記載されるもの等の、自己犠牲（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）スペ−サ−と共にもしくはそれなしで使用されるペプチド単位のアミド結合が含まれるが、これらに限定されない、不安定な連鎖を含有してもよい。
【０２２３】
不安定な結合は、インビボで容易に切断される。切断は、化学的（例えば、生理的ｐＨでの加水分解、またはある特定の腫瘍内で見出されるより低いｐＨ環境での加水分解）または酵素的（例えば、エステラ−ゼとの反応）生体内変換を通じて等の、種々の機構によって生じ得る。
【０２２４】
かかる結合体は、免疫応答を誘導するおよび／または増強するもしくは抑制するもしくは寛容化する前に、投与される結合体が標的組織に到達することを可能にするのに有用であり得る。これは、より高度に局在化された免疫応答を提供することによって、治療上の便益を提供し得る。免疫調節物質部分は、結合体が、免疫療法が必要とされる標的とされる組織に到達するまで、不活性に維持されて、それによって全身免疫応答を低減、または更に予防してもよい。
【０２２５】
免疫調節化合物および組成物
本明細書で使用されるとき、「免疫調節化合物」という用語は、免疫応答を誘導するおよび／または増強するもしくは抑制もしくは寛容化する、化合物の能力を指す。
【０２２６】
同様に、本明細書で使用される、「免疫調節組成物」という用語は、免疫応答を誘導するおよび／または増強するもしくは抑制もしくは寛容化する、組成物の能力を指す。
【０２２７】
「免疫応答」という用語は、当該技術分野におけるその通常の意味を有し、体液性免疫および細胞性免疫の両方を含む。免疫応答は、抗抗原抗体の発達、抗原特異的Ｔ細胞の増大、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）における増加；抗腫瘍または抗腫瘍抗原遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答の発達、病原体の除去、病原体および／または腫瘍成長および／または拡散の抑制、腫瘍低減、転移の低減または排除、再発までの時間増加、病原体または腫瘍のない生存期間の増加、ならびに生存期間の増加のうちの１つ以上として現れ得る。免疫応答は、Ｂ細胞活性化、Ｔ細胞活性化、ナチュラルキラ−細胞活性化、抗原提示細胞（例えば、Ｂ細胞、ＤＣ、単球、および／またはマクロファ−ジ）の活性化、サイトカイン産生、ケモカイン産生、特異的細胞表面マ−カ−発現、特に、共刺激分子の発現のうちの１つ以上によって媒介されてもよい。免疫応答は、体液性、細胞性のＴｈ１もしくはＴｈ２応答、またはそれらの組み合わせによって特徴付けられてもよい。
【０２２８】
体液性応答
ある実施形態において、本発明の化合物、組成物、またはワクチンの投与は、体液性応答をもたらし、ここでＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、および任意にＩｇＥ抗体産生のうちの１つ以上が刺激される。
【０２２９】
免疫グロブリンは、抗体の各クラス内のサブクラスのうちの１つ以上、例えば、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１を含んでもよい。
【０２３０】
一実施形態において、ＩｇＧ１および／またはＩｇＡ産生が刺激される。
【０２３１】
幾つかの実例において、例えば、寄生虫感染に対して免疫するために、ＩｇＥ産生の刺激が有益な場合がある。
【０２３２】
他の実例において、例えば、Ｉ型過敏症またはアトピ−、例えば、花粉症、喘息発作、または食物アレルギ−および他のアレルギ−を予防するまたは低減するために、総ＩｇＥ産生における低減、または他の抗体クラスと比べたＩｇＥのレベルにおける低減が有益であり得る。ＩｇＥのその受容体への結合およびその後のアレルゲンとの架橋は、まん延する健康問題である、アトピ−性喘息を含む喘息、アレルギ−性鼻炎、およびアトピ−性皮膚炎等の病態の根底にある免疫応答の触発に関与する。故に、ある実施形態において、免疫応答は、ＩｇＥ産生が低減されるようなものである。
【０２３３】
別の実施形態において、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭのうちの１つ以上、またはこれらのサブクラスと比べたＩｇＥ価が低減される。ＩｇＥ産生が変化しないままで、他の抗体のうちの１つ以上の産生が組成物での免役化時に増加させられてもよい。
【０２３４】
ある実施形態において、免役化は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのうちの１つ以上の、ＩｇＥを上回る産生を選択的に刺激する。
【０２３５】
ある実施形態において、ＩｇＡ産生が刺激され、１つ以上の粘膜領域での、および／または血清中でのＩｇＡの力価が増加される。
【０２３６】
ある実施形態において、免役化時のＩｇＡ産生は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＥの産生と比較したとき、より高い。
【０２３７】
別の実施形態において、免役化は、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ２ａ産生における増加と比べて、ＩｇＡのより高い産生をもたらす。
【０２３８】
なおも別の実施形態において、ＩｇＧ産生が刺激され、１つ以上の全身領域でのおよび／または血清中でのＩｇＧの力価が増加される。
【０２３９】
ある実施形態において、免役化時のＩｇＧ産生は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥの産生と比較したとき、より高い。
【０２４０】
別の実施形態において、免役化は、ＩｇＡにおける増加と比べて、ＩｇＧのより高い産生をもたらす。
【０２４１】
ある実施形態において、免役化は、免役化は、ＩｇＧ１における増加と比べて、ＩｇＧ２ａのより高い産生をもたらす。
【０２４２】
細胞性免疫応答
ある実施形態において、本発明の化合物、組成物、またはワクチンの投与は、細胞性応答をもたらし、ここで１つ以上の抗原提示細胞が活性化される。
【０２４３】
ある実施形態において、マクロファ−ジおよび／またはＤＣが活性化される。
【０２４４】
ＤＣの活性化は、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、および８６を含む、共刺激分子の亢進された表面発現、ならびに／または炎症促進性サイトカイン、例えば、ＩＬ−１２および／もしくはＩＬ−４における増加、ならびに／またはＭＨＣクラスＩおよび／もしくはＩＩ分子における増加をもたらし得る。
【０２４５】
更なる実施形態において、免役化は、ＣＤ８および／またはＣＤ４  Ｔ細胞応答をもたらす。
【０２４６】
更なる実施形態において、免役化は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の産生をもたらす。
【０２４７】
ある実施形態において、ＤＣは、ナイ−ブＴ細胞を活性化する。樹状細胞は、ワクチン抗原の免疫系をプライミングすることにおいて、少なくとも次の３つの明確に異なる役割を果たすと考えられる：
１）エンドサイト−シス後に外因性経路においてプロセスされる、ワクチン抗原のＭＨＣクラスＩＩ拘束性提示、
２）ＤＣの、例えば、抗原をコ−ドするプラスミドＤＮＡでの直接トランスフェクション後の、ワクチン抗原のＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ拘束性提示、
３）ワクチン抗原のＭＨＣクラス−Ｉ拘束性「交差」提示。
Ｔｈ１／Ｔｈ２
【０２４８】
ある実施形態において、本発明の化合物、組成物、またはワクチンの投与は、体液性および／または細胞性免疫のメディエ−タ−を刺激する。
【０２４９】
ある実施形態において、本発明の化合物、組成物、またはワクチンの投与は、細胞媒介性のＴｈ１型応答をもたらす。
【０２５０】
別の実施形態において、本発明の化合物、組成物、またはワクチンの投与は、抗体媒介性のＴｈ２型応答をもたらす。
【０２５１】
ある実施形態において、本発明の化合物、組成物、またはワクチンの投与は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＩＦＮ−γ等の、Ｔｈ１誘導サイトカインの産生をもたらす。これらのサイトカインは、典型的に、細胞媒介性免疫性を促進する。  
【０２５２】
別の実施形態において、本発明の化合物、組成物、またはワクチンの投与は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１０等の、Ｔｈ２誘導サイトカインの産生をもたらす。これらのサイトカインは、典型的に、体液性免疫性を促進する。
【０２５３】
ある実施形態において、マクロファ−ジの活性化は、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−１８の産生をもたらす。これが今度は、ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γδ産生を活性化して、細胞性媒介性免疫性および／または補体結合抗体の産生を支持する、Ｔｈ１媒介性免疫応答の分化を誘導し得る。
【０２５４】
ワクチン
「ワクチン組成物」という用語は、レシピエント対象において防御免疫性を引き出すために使用され得る、組成物を指す。有効であるためには、本発明のワクチンは、集団の一部分において免疫性を引き出すことができるが、個体によっては、強固な免疫応答もしくは防御免疫応答が開始できないか、または場合によっては、ワクチンに対するいずれの免疫応答も開始できない場合があることに留意すべきである。この能力欠如は、個体の遺伝的背景に起因するか、または免疫不全状態（後天性または先天性のいずれか）もしくは免疫抑制（例えば、臓器拒否反応を予防するまたは自己免疫病態を抑制するための免疫抑制薬での治療）のためであり得る。有効性は、動物モデルにおいて確立することができる。
【０２５５】
ワクチンは、「単価」（一価とも呼ばれる）または「多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）」（多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）とも呼ばれる）であり得る。単価ワクチンは、単一の抗原を含む。多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）または多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）ワクチンは、例えば、同じ病原体の２つ以上の株に対して、または２つ以上の病原体に対して免疫し得る、２つ以上の抗原を含む。
【０２５６】
組成物またはワクチンは、対象を、例えば、病原体または腫瘍に対して免疫する、寛容化する、治療する、または防御するために使用することができる。
【０２５７】
「免疫する」という用語は、本明細書で、対象において防御免役応答を生成して、対象に特定の病原体または疾患に対する耐性を提供することを意味するように使用される。
【０２５８】
「寛容化する」という用語は、本明細書で、対象において免疫寛容を誘導することを意味するように使用される。対象を寛容化することは、対象において特定の免疫応答の回避または抑制を誘導することである。免疫寛容は、例えば、移植拒絶反応、自己免疫性、またはアレルギ−反応を予防するまたは寛解させるために使用することができる。
【０２５９】
「治療する」という用語は、本明細書で、対象内において病原体感染細胞または腫瘍細胞を部分的または全体的に破壊しながら、好ましくは非感染細胞への破壊効果が最小であることを意味するように使用される。本発明の組成物の治療的投与は、病原体によって感染したまたは癌を有するレシピエント対象を治療することができる。代替的な実施形態において、抗原提示細胞、例えば、マクロファ−ジおよびＤＣは、インビトロまたはエクスビボで本発明の組成物と接触させられ、次いで対象に投与される。当業者は承知しているであろうが、インビトロで行われる手順は、生存生物においてではく、制御環境において行われる。かかるインビトロ手順は、生物に由来する組織（複数可）または細胞中またはその上で行われてもよく、典型的にエクスビボ手順と称される。
【０２６０】
「防御する」という用語は、本明細書で、病原体による感染もしくは腫瘍成長の開始を予防する（すなわち、癌の発症を予防する）、または腫瘍成長の発症を遅延させることを意味するように使用される。本発明の組成物の予防的投与は、レシピエント対象を該感染または腫瘍成長から防御することができる。
【０２６１】
抗原
本発明は、ワクチン組成物中で少なくとも１つの抗原と組み合わせた、免疫調節物質−炭水化物重合体結合体の使用を提供する。免疫調節物質−炭水化物重合体結合体を、少なくとも１つの抗原と混合して、またはそれに結合して、防御免役応答次のワクチン接種を得ることができる。
【０２６２】
「少なくとも１つの抗原」とは、１つ以上の抗原型または抗原性決定基を意味する。更に、１つを超える抗原分子が免疫調節物質−炭水化物重合体結合体に結合され得る（すなわち、結果として生じる結合体は、炭水化物重合体に結合される単一よりも多い抗原分子を含んでもよく、かつ１つ以上の抗原型または抗原性決定基を含んでもよい）ことが当業者によって理解されるであろう。
【０２６３】
免疫調節物質および抗原の送達のために、酸化されたマンナンを使用して、複数の戦略が利用され得る。免疫調節物質および抗原は、同時にまたは順次に（任意の順序で）、酸化されたマンナンに結合され得るか、または代替的に、免疫調節物質−抗原複合体が最初に生成され、次いでその後、酸化されたマンナンに結合され得る。一例において、酸化されたマンナンのアルデヒド基は、抗原のアミノ基と直接反応してシッフ塩基連鎖を形成することができる。別の例において、免疫調節物質は、抗原上のスルフヒドリル基（システイン）またはアミノ基（リジン）と反応することができる、マレイミド、ハロアセチルまたは、活性化エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド）を含有するリンカ−基で修飾された、ＴＬＲアゴニストである。ＴＬＲアゴニストはまた、アルデヒドまたはアセチレン基で官能化された抗原と反応することができる、ヒドラジドまたはアジド基を含有するリンカ−で修飾され得る。ＴＬＲ−抗原結合体は次いで、酸化されたマンナンと反応させられ得る。
【０２６４】
ワクチンは、疾患を有する、または疾患に感染しやすいもしくはその危険性がある対象に投与され得る。疾患は、病原体感染に関連し得る。この実施形態において、ワクチン投与は、病原体による感染の影響を予防するまたは寛解させ得る。
【０２６５】
本明細書で使用されるとき、「抗原」は、特定の免疫応答を誘導する能力を有する物質を意味する。抗原は、生活環段階のうちのいずれかにある全生物、不活性化された全生物、全生物から単離された断片または構成成分、生物のライセ−トまたは腫瘍ライセ−ト、当該技術分野で既知の方法を通じて遺伝子操作または合成操作された特異的抗原であってもよい。加えて、選択される抗原は、成熟した全生物またはスポロゾイト（オ−シスト）のいずれかまたは両方に由来してもよい。
【０２６６】
本発明の化合物、組成物、および方法において使用するための抗原はまた、全細胞またはその亜細胞画分からなり得る。かかる細胞またはその亜細胞画分は、例えば、腫瘍または感染した組織に由来してもよい。
【０２６７】
好ましい選択される抗原には、例えば、次のもの由来の抗原が含まれる：
花粉、
アレルゲン、とりわけ喘息を誘導するもの、
インフルエンザ、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、狂犬病、麻疹、Ｂ型肝炎、手足口病、パピロ−マウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、Ａ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２等の、ウイルス、
炭疽、ハンセン病、結核、ジフテリア、ライム病、梅毒、腸チフス、および淋病の病原体等の、細菌
ウシバベシア、熱帯熱マラリア原虫、リ−シュマニア菌種等の、原虫、トキソプラズマ・ゴンディ、およびトリパノソ−マ・クル−ジ、
アスペルギルス菌種、カンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、およびヒストプラズマ・カプスラ−ツム等の、真菌、
蠕虫類等の寄生虫、ならびに
ムチン−１（ＭＵＣ−１）、癌胎児性抗原、前立腺特異的膜抗原、前立腺特異抗原特異的抗原、タンパク質ＭＺ２−Ｅ、多形性上皮ムチン（ＰＥＭ）、葉酸結合タンパク質ＬＫ２６、切端上皮成長因子受容体（ＥＧＲＦ）、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ（Ｔ）抗原、テロメラ−ゼ、サバイビン、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ＷＴ１、ＬＭＰ２、ヒトパピロ−マウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６  Ｅ７、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ）、イディオタイプ、黒色腫関連抗原３（ＭＡＧＥ−３）、ｐ５３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、前立腺酸ホスファタ−ゼ（ＰＡＰ）、癌精巣抗原、５Ｔ４、ならびにＧＭ−２およびＧＤ−２ガングリオシド等の、腫瘍抗原。
【０２６８】
抗原は、タンパク質、ペプチド、多糖類もしくはオリゴ糖類（遊離またはに結合されタンパク質担体）、またはそれらの混合物であり得る。タンパク質およびペプチドは、天然源から精製された、固相合成の手段によって合成された、抽出物もしくはライセ−トの一部であってもよく、または組換え遺伝子の手段によって得られてもよい。多糖類およびオリゴ糖類は、天然源から単離されてもよく、または酵素的手順および／もしくは有機合成アプロ−チを使用して合成されてもよい。
【０２６９】
抗原は、組換え宿主細胞中での融合タンパク質の産生に対して発現および精製を容易にするために、融合タンパク質の一部を形成してもよい。融合タンパク質の非抗原部分は、概して、融合ポリペプチドのＮ末端領域に相当し、カルボキシ末端配列が抗原配列を含む。融合タンパク質は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ、β−ガラクトシダ−ゼ、または任意の他のタンパク質またはその一部、特に、タンパク質の結合または他の親和性性質を利用する親和性精製により、結果として生じる融合タンパク質を精製可能にするものから選択されてもよい。タンパク質はまた、担体タンパク質のＣ末端またはＮ末端に縮合されてもよい。融合タンパク質の性質は、融合タンパク質がもたらされるベクタ−系に依存するであろう。細菌発現ベクタ−の例は、ｐＧＥＸであり、目的の遺伝子がこのベクタ−中にサブクロ−ニングされると、目的のタンパク質を有するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラ−ゼからなる融合タンパク質をもたらす。目的のタンパク質を有する融合タンパク質を生じさせる他のベクタ−系の例は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）に記載される。
【０２７０】
代替的に、任意にタンパク質担体にカップリングされた、合成ペプチドまたはポリペプチドが、本発明において使用されてもよい。合成ペプチドまたはポリペプチドは、標準方法に従ってもたらされてもよい。
【０２７１】
有用なペプチドまたはポリペプチドは、ポリペプチドが動物に投与されるときに抗体および／または抗原特異的ＣＴＬ応答を引き出すことが知られる、ポリペプチドのエピト−プ担持部分を含んでもよい。このポリペプチド部分のエピト−プは、ポリペプチドの免疫原性または抗原性エピト−プである。
【０２７２】
「免疫原性エピト−プ」は、全タンパク質が免疫原であるとき、抗体および／または抗原特異的ＣＴＬ応答を引き出すタンパク質の一部として定義される。他方で、抗体またはＭＨＣ分子が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピト−プ」として定義される。タンパク質の免疫原性エピト−プの数は概して、抗原性エピト−プの数より少ない。
【０２７３】
ペプチドまたはポリペプチド担持抗原性エピト−プの選択に関して、タンパク質配列の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドが通例、部分的に模倣されるタンパク質と反応する抗血清を引き出すことは、当該技術分野で周知である（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３を参照されたい）。タンパク質反応性血清を引き出すことが可能なペプチドは、タンパク質の一次配列において頻繁に表され、一連の単純な化学規則によって特徴付けることができ、無傷のタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピト−プ）にも、アミノまたはカルボキシル末端にも制限されない。
【０２７４】
本発明の抗原性エピト−プ担持ペプチドおよびポリペプチドは、特定のポリペプチドのアミノ酸配列内に含有される、好ましくは、少なくとも７、より好ましくは少なくとも９、および最も好ましくは約１５〜３０アミノ酸の配列を含有する。
【０２７５】
ＣＴＬ上のＴ細胞受容体によって認識されるエピト−プは、抗体によって認識されるものとは異なってもよい。通常、ＣＴＬは、ＭＨＣクラスＩ分子に結合し、細胞表面上に曝露される、ペプチド（サイトゾル区画において酵素的に分解されるタンパク質に由来する）を認識する。これらのＣＴＬにより認識されるペプチドは、ＭＨＣ対立遺伝子特異的配列モチ−フに従って、ＭＨＣクラスＩ分子に選択的に結合する。これらのペプチドは、発現クロ−ニング（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１を参照されたい）によって特定し、種々のクラスＩおよびクラスＩＩ結合ペプチドアルゴリズム（Ｐｉｅｔｅｒｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）を使用して予測することができる。
【０２７６】
代替的に、ＣＴＬにより認識されるペプチドは、免役化に使用されるタンパク質抗原に由来するペプチドでのインビトロまたはエクスビボ刺激によるＣＴＬの誘導によって、特定することができる。本発明の特定のＣＴＬにより認識されるエピト−プ担持ペプチドおよびポリペプチドは、好ましくは少なくとも６アミノ酸、およびより好ましくは約７〜２０アミノ酸の配列である。
【０２７７】
エピト−プ担持ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来の手段によってもたらされてもよい。
【０２７８】
細菌性抗原
抗原は、ヘリコバクタ−・ピロリ、クラミジア・ニュ−モニエ、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリチカム、マイコプラズマ・ニュ−モニエ、ブドウ球菌種、黄色ブドウ球、レンサ球菌種、化膿レンサ球菌、肺炎レンサ球菌、緑色レンサ球菌、エンテロコッカス・フェカリス、髄膜炎菌、淋菌、炭疽菌、サルモネラ菌種、チフス菌、コレラ菌、ペスト菌、緑膿菌、カンピロバクタ−菌種、カンピロバクタ−・ジェジュニ、クロストリジウム菌種、クロストリジウム・ディフィシル、マイコバクテリウム菌種、結核菌、トレポネ−マ菌種、ボレリア菌種、ボレリア・ブルグドルフェリ、レプトスピラ菌種、軟性下疳菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌（ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、大腸菌、赤痢菌種、エ−リキア（Ｅｒｌｉｃｈｉａ）菌種、およびリケッチア菌種を含むが、これらに限定されない細菌に由来し得る。
【０２７９】
細菌抗原は、天然、組換え、または合成であり得る。かかる細菌抗原には、細胞表面上に存在する炭水化物決定基に結合する細菌由来のセレクチンまたはレクチン、ならびにフィブロネクチン、ラミニン、およびコラ−ゲン等のタンパク質のための細菌受容体が含まれるが、これらに限定されない。
【０２８０】
ウイルス抗原
抗原は、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、アデノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、エプスタイン・バ−ルウイルス、ライノ−ウイルス、ポリオウイルス、コクサッキ−ウイルス、エコ−ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、水痘・帯状疱疹（Ｖａｒｉｃｅｌｌ−ｚｏｓｔｅｒ）ウイルス、ヘルペスウイルス（ヒトおよび動物）、単純ヘルペスウイルス、パルボウイルス（ヒトおよび動物）、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルス、ヒトパピロ−マウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、ブニヤウイルス、狂犬病ウイルス、アレナウイルス、フィロウイルス、ＨＩＶ  １、ＨＩＶ  ２、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＦｅＬＶ、ウシＬＶ、ＦｅＩＶ、犬ジステンパ−ウイルス、イヌ伝染性肝炎ウイルス、ネコカリチウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、ＴＧＥウイルス（ブタ）、および口蹄疫を含むが、これらに限定されないウイルスに由来し得る。
【０２８１】
ウイルス抗原は、天然、組換え、または合成であり得る。かかるウイルス抗原には、（ｉ）レトロウイルス（ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＦｅＬＶ、およびその他）およびヘルペスウイルスの外被糖タンパク質、ならびに（ｉｉ）インフルエンザウイルスのノイラミニダ−ゼ（ｎｅｕｒａｍｉｄａｓｅ）等の、細胞表面受容体に結合して感染プロセスを開始することに関与するウイルスタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【０２８２】
腫瘍抗原
本発明のある実施形態において、対象は、癌を有するか、または癌を発症する増加した危険性がある。
【０２８３】
「癌」とは、周囲の組織に浸潤するおよび／または新たな定着部位に転移する能力を有する細胞の増殖によって特徴付けられる、種々の悪性新生物のうちのいずれかを意味する。癌は、例えば、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、膵臓癌、膀胱癌、または肺癌であってもよい。好ましい実施形態において、癌は、乳癌である。
【０２８４】
癌に対する多くの「危険因子」は、癌の家族歴、癌の個人歴、異型増殖症等の増殖疾患の以前の生検検出等、十分に確立されている。特定の遺伝的危険因子もまた知られており、乳癌についての例として、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＡＴＭ、ＣＨＥＫ−２、およびｐ５３突然変異が挙げられる。生活様式関連の危険因子もまた、考慮され得る。女性における乳癌についての生活様式関連の危険因子には、３０歳を過ぎるまで遅延された出産、およびホルモン置換療法の長期使用が含まれる。専門医師は、これらのおよび他の危険因子を評価して、対象が本発明のワクチン組成物の予防的使用から便益を得るかどうかを決定することができる。
【０２８５】
本発明の癌ワクチンは、１つ以上の腫瘍関連抗原を含んでもよい。腫瘍関連抗原は、天然、組換え、または合成であり得る。かかる腫瘍関連抗原には、ＭＵＣ−１およびそのペプチド断片、タンパク質ＭＺ２−Ｅ、多形性上皮ムチン、葉酸結合タンパク質ＬＫ２６、ＭＡＧＥ−１またはＭＡＧＥ−３およびそのペプチド断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）およびそのペプチド断片、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびそのペプチド断片、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）およびそのペプチド断片、膵癌胎児抗原およびそのペプチド断片、ＣＡ  １２５、１５−３、１９−９、５４９、１９５およびそのペプチド断片、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびそのペプチド断片、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）およびそのペプチド断片、扁平上皮細胞癌抗原（ＳＣＣＡ）およびそのペプチド断片、卵巣癌抗原（ＯＣＡ）およびそのペプチド断片、膵臓癌関連抗原（ＰａＡ）およびそのペプチド断片、Ｈｅｒ１／ｎｅｕおよびそのペプチド断片、ｇｐ−１００およびそのペプチド断片、突然変異体Ｋ−ｒａｓタンパク質およびそのペプチド断片、突然変異体ｐ５３およびそのペプチド断片、非突然変異体ｐ５３およびそのペプチド断片、切端上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、キメラタンパク質ｐ２１０ＢＣＲ−ＡＢＬ、テロメラ−ゼおよびそのペプチド断片、サバイビンおよびそのペプチド断片、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１タンパク質およびそのペプチド断片、ＷＴ１タンパク質およびペプチド断片、ＬＭＰ２タンパク質およびペプチド断片、ＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７タンパク質およびペプチド断片、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質およびペプチド断片、イディオタイプタンパク質およびペプチド断片、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質およびペプチド断片、ＰＡＰタンパク質およびペプチド断片、癌精巣タンパク質およびペプチド断片、ならびに５Ｔ４タンパク質およびペプチド断片が含まれるが、これらに限定されない。他の例となる腫瘍抗原は、Ｃｈｅｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９に記載される。
【０２８６】
ムチン
好ましい実施形態において、抗原は、ムチンまたはその抗原性断片もしくは免疫原性突然変異体／誘導体である。多くの癌には、ヒトムチンの過剰産生が伴う。ムチンは、多くの上皮細胞および腫瘍によって産生される重グリコシル化タンパク質（約１００ｋＤａ超）である。癌細胞上で見出されるムチンは、幾つかのムチンが、それらの炭水化物コ−トにおける不全を有することによりタンパク質コアが曝露されたままであるということにおいて、正常な上皮細胞上のそれらとは幾つかの点で異なる。ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４、ＭＵＣ−５  ＭＵＣ−６、およびＭＵＣ−７等と表記される、既知のヒトムチンの２１の型が存在する。ＭＵＣ−１が最も普遍的である。種々のムチンは全て、非常に類似した特性を有し、つまりそれらは、膜貫通糖タンパク質であり、全てが、高含量のセリン、スレオニン、およびプロリンを有する、可変数の反復アミノ酸配列を有する。異常にグリコシル化されたムチン（グリコシル化されないまたはグリコシル化における不全のいずれか）の過剰産生は、乳、卵巣、膵臓、結腸、肺、前立腺の腫瘍、および分泌組織の他の腫瘍に特有である。ヒトムチンＭＵＣ−１〜ＭＵＣ−２１のそれぞれのタンパク質コアのｃＤＮＡ配列がクロ−ニングされ、特徴付けられており、特定のアミノ酸モチ−フの様々な数の反復（ＶＮＴＲとして知られる）である高度反復中心部分を含有することが見出されている。例として、ＭＵＣ−１は、２０アミノ酸モチ−フの４０〜８０の直列に配列されたコピ−または反復を含有する高度反復中心部分だけ離れた、固有のアミノ末端配列およびカルボキシル末端配列からなる。
【０２８７】
ある実施形態において、腫瘍関連抗原は、ヒトムチンＭＵＣ−１〜ＭＵＣ−２１のうちのいずれか１つ以上であり、上述のように、全てが、セリン、スレオニン、およびプロリンが豊富である反復アミノ酸配列の高度反復中心部分を含む。特に、本発明のワクチンは、ヒトムチンポリペプチド（正常な対立遺伝子変異に関連する可変数の反復を含有する）を含み得、または、ヒトムチンの反復配列のうちの１つ以上、好ましくはヒトムチンの２〜８０、より好ましくは２〜２０、および更により好ましくは２〜１０の反復サブユニットを含み得る。ヒトムチンおよびそのサブユニットは、炭水化物コ−トにおける不全を有することによりタンパク質コアが曝露されたままである、癌細胞上で見出されるムチンへの免疫応答を誘発するために、好ましくはグリコシル化されていないか、または異常にグリコシル化されている。ヒトムチンＭＵＣ−１の使用が特に好ましいが、本発明が、任意の抗原の使用、およびとりわけヒトムチンＭＵＣ−１〜ＭＵＣ−２１の使用にも及ぶことは明確に理解されるものとする。
【０２８８】
ＭＵＣ−１抗原は、例えば、国際公開第９５／１０８１４５号、米国第６，０５４，４３８号、米国第６，２２２，０２０号、国際公開第９８／５０５２７号、国際公開第０１／１８０３５号、国際公開第００／６３３６３号、国際公開第９５／０３８２５号、国際公開第００／０６７２３号、および国際公開第０４／０１６６４３号に記載される通りであり得る。国際公開第２００８／０１１６７２号に開示されるＭＵＣ−１  Ｔ細胞エピト−プ由来ペプチドまたはペプチド類似体の使用もまた、企図される。
【０２８９】
免疫調節物質−炭水化物重合体結合体＋抗原（複数可）
少なくとも１つの抗原の、例えば、マクロファ−ジおよびＤＣへの送達は、少なくとも１つの抗原が免疫調節物質−炭水化物重合体に結合されるとき、増加され得る。理論に制限されることを望むものではないが、これは、マクロファ−ジおよびＤＣが、抗原提示に関与する２つのプロセスである、炭水化物部分（典型的に微生物由来の）を認識し、食作用、ならびに飲作用において媒介する、細胞表面受容体を有するためである可能性が最も高い。したがって、本発明の免疫調節物質−炭水化物重合体−抗原結合体は、ＡＰＣ標的化のための有効な機構を提供する。
【０２９０】
好ましい実施形態において、炭水化物重合体は、少なくとも１つの抗原への結合前に、例えば、ＮａＩＯ４で酸化される。ある実施形態において、炭水化物重合体は、マンナンであり、マンナンの多糖類鎖は、少なくとも１つの抗原への結合前に酸化される。少なくとも１つの抗原は、国際公開第９５／１８１４５号に記載されるものと同様の様態で、酸化されたマンナンに結合されてもよい。還元されたマンナンがまた使用されてもよく、これを含有する組成物は、水素化ホウ素ナトリウムまたはシアノ水素化ホウ素ナトリウムを、酸化されたマンナン−抗原結合体に添加することによって調製されてもよい。
【０２９１】
代替的な実施形態において、炭水化物重合体は、臭化シアンで最初に活性化されてもよく、活性化された炭水化物重合体は次いで、ジアミンと反応させられ、続いて少なくとも１つの抗原に結合して、結合体を形成し、それは次いで任意に酸化される。
【０２９２】
炭水化物重合体および少なくとも１つの抗原は、炭水化物重合体と少なくとも１つの抗原とを架橋するために、二官能性薬剤で誘導体化されてもよい。一般的に使用される架橋剤には、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３′−ジチオビス（スクシンイミジル−プロピオン酸塩）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン等の二官能性マレイミドが含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジド−フェニル）ジチオ］プロピオイミデ−ト（ｐｒｏｐｉｏｉｍｉｄａｔｅ）等の誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することが可能である、光励起性中間体を産出する。酸化された炭水化物重合体を、抗原のヒドラジン誘導体と反応させて、結合体をもたらしてもよい。代替的に、炭水化物重合体を、最初にカルボニルジイミダゾ−ル等の試薬と反応させ、次いで抗原と反応させ、酸化させて、結合体をもたらしてもよい。
【０２９３】
少なくとも１つの抗原の炭水化物重合体へのカップリングは、炭水化物上の官能基を、抗原上の官能基と反応させることを伴う。炭水化物重合体は、ヒドロキシル基で充実している。これらの基は、標準的な化学手順に従って活性化されてもよい。例えば、ヒドロキシル基を、ヨウ化水素、臭化水素、および塩化水素等のハロゲン化水素と反応させて、官能化ハロゲン化多糖類を得てもよい。ヒドロキシ基を、三塩化リン、活性金属（ナトリウムエトキシド、アルミニウムイソプロポキシド、およびカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド等）で活性化するか、またはエステル化して（塩化トシルまたは酢酸等の基で）、官能基を形成してもよく、それを次いで、ポリペプチド上の官能基と反応させて、１つ以上の結合を形成してもよい。
【０２９４】
抗原をコ−ドする核酸
ある実施形態において、ワクチン組成物は、抗原をコ−ドする核酸を含む。複数の核酸をワクチン中に組み込んで、多価抗原ワクチンをもたらすことができる。ある実施形態において、ワクチンは、ＤＮＡワクチンである。
【０２９５】
少なくとも１つの核酸が、例えば、ポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミン、またはＰＡＭＡＭデンドリマ−等のポリカチオンを介して、炭水化物重合体に結合され得る。ある実施形態において、酸化されたマンナン−ポリカチオンの正電荷は、負電荷性のＤＮＡと相互作用し、トランスフェクションに使用され得るポリプレックスを形成する（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０２９６】
ＤＮＡワクチン接種は、典型的に、対象の細胞による抗原の発現のために、抗原をコ−ドするＤＮＡの、例えば、対象の筋肉または皮膚中への直接のインビボ導入を伴う。一旦、ＤＮＡコ−ド抗原が、トランスフェクトされた細胞によってプロセスされ、提示されると、細胞性および／または体液性免疫応答が誘発され得る。ＤＮＡワクチンは、米国第５，９３９，４００号、米国第６，１１０，８９８号、国際公開第９５／２０６６０号、および国際公開第９３／１９１８３号に記載される。
【０２９７】
現在まで、哺乳類系におけるほとんどのＤＮＡワクチンは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するウイルスプロモ−タ−に依存してきた。これらは、幾つかの哺乳類種における筋肉接種および皮膚接種の両方において良好な効率を有してきた。ＤＮＡ免役化によって引き出される免疫応答に影響を及ぼすことが知られる因子は、ＤＮＡ送達の方法であり、例えば、非経口経路は、低い率の遺伝子導入を生み出し、遺伝子発現のかなりのばらつきをもたらし得る。遺伝子銃を使用した、プラスミドの高速度接種は、マウスの免疫応答を増強したが、これは恐らくは、ＤＮＡトランスフェクションのより高い効率性、およびＤＣによるより有効な抗原提示のためである。本発明の核酸ベ−スのワクチンを含有するベクタ−がまた、当該技術分野で既知の他の方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレ−ション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソ−ム融合）、またはＤＮＡベクタ−輸送体によって、所望の宿主中に導入されてもよい。ＤＮＡワクチンの投与の機構は、下により詳細に記載される。
【０２９８】
他の構成成分
本発明の組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含んでもよい。「薬学的に許容される担体」という用語は、対象、特に哺乳動物、より特にはヒトに投与されるときにアレルギ−反応、有毒反応、あるいは有害反応を生み出さない、分子実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体は、固体または液体であってもよい。薬学的に許容される担体の有用な例としては、本発明の活性剤の活性に影響を及ぼさない、希釈剤、賦形剤、溶媒、界面活性剤、懸濁化剤、緩衝剤、滑沢剤、ビヒクル、乳化剤、吸収剤、分散媒体、コ−ティング剤、安定剤、保護コロイド、接着剤、増粘剤、チキソトロ−プ剤、浸透剤、金属イオン封鎖剤、等張および吸収遅延剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９９】
担体は、慣習的に使用されるもののうちのいずれかであり得、溶解度および活性剤との反応性の欠如等の化学物理的考慮によって、ならびに投与経路によってのみ、限定される。本発明のために好適な担体には、慣習的に使用されるもの、例えば、水、食塩水、水性デキストロ−ス、乳糖、リンゲル液，緩衝液、ヒアルロナン、グリコ−ル、デンプン、セルロ−ス、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョ−ク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロ−ル、塩化ナトリウム、グリセロ−ル、プロピレングリコ−ル、水、エタノ−ル等が含まれる。リポソ−ムがまた、担体として使用されてもよい。
【０３００】
本発明の化合物および組成物の免疫原性または有効性を更に増強し得る化合物がまた、投与されてもよい。これらの化合物は、本発明の組成物中に含まれても、または本発明の化合物もしくは組成物と共投与されてもよい。例えば、組成物は、１つ以上の油（例えば、フロイント完全および不完全）、サポニン、改変サポニン、リポソ−ム、鉱物塩（例えば、ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）、シリカ、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）３、Ｃａ３（ＰＯ４）２、カオリン、および炭素）、ポリヌクレオチド（例えば、ポリＩＣおよびポリＡＵ酸）、ならびにある特定の天然物質（例えば、リピドＡ、結核菌由来のワックスＤ、ならびにコリネバクテリウム・パルバム、百日咳菌、およびブルセラ属の員に見出される物質）、ウシ血清アルブミン、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、エデスチン、キ−ホ−ルリンペットヘモシニアン、シュ−ドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｌ）トキシンＡ、コレラジェノイド、コレラ毒素、百日咳毒素、ウイルスタンパク質、およびインタ−フェロン、インタ−ロイキン等の真核性タンパク質、または腫瘍壊死因子を含んでもよい。かかるタンパク質は、当業者に既知の方法に従って、天然または組換え源から得られてもよい。他の既知の免疫原性マクロ分子には、多糖類、ｔＲＮＡ、ポリビニルアミン、ポリメタクリル酸、ポリビニルピロリドン等の非代謝性合成重合体、４′，４−ジアミノジフェニル−メタン−３，３′−ジカルボン酸および４−ニトロ−２−アミノ安息香酸または糖脂質、脂質、もしくは炭水化物の混合重縮合体（比較的高分子量を有する）が含まれる。
【０３０１】
投与
本発明の化合物、組成物、またはワクチンは、適切な経路によって、単独でまたは第２の化合物と組み合わせてのいずれかで、対象に投与され得る。
【０３０２】
ある実施形態において、第２の化合物は、抗原またはそれをコ−ドする核酸である。ある実施形態において、免疫調節物質−炭水化物重合体結合体および抗原またはそれをコ−ドする核酸は、異なる組成物中で順次にまたは同時に投与される。好ましい実施形態において、それらは、同じ組成物中で投与される。
【０３０３】
免疫調節物質−炭水化物重合体結合体は、抗原またはそれをコ−ドする核酸と混和して投与されてもよく、あるいは代替的に、免疫調節物質−炭水化物重合体結合体は、抗原にまたはそれをコ−ドする核酸に結合され得る。
【０３０４】
多様な投与経路が可能であり、経口、食餌、局所、非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、血管内、または皮下注射）、および吸入（例えば、気管支内、鼻腔内または経口吸入、点鼻）投与経路を含むが、これらに限定されない。
【０３０５】
一実施形態において、本発明の化合物、組成物、またはワクチンは、粘膜部位に投与される。粘膜部位の例としては、鼻部（例えば、鼻）、気管、気管支、および肺等の気道、口腔（例えば、口および歯肉）および中咽頭腔を含む頬または口腔組織、扁桃腺を含む咽喉、眼の結膜、胃腸管（例えば、食道、胃、十二指腸、小腸および大腸、結腸および直腸）、生殖器系／組織（膀胱、尿管、尿道および関連組織、陰茎、外陰部／膣および頚膣部組織、ならびに子宮および卵管を含むが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０６】
投与対象の組成物またはワクチンの製剤は、選択される投与経路（例えば、溶液、乳濁液、カプセル）により異なるであろう。
【０３０７】
例えば、免疫調節物質−炭水化物重合体結合体は、約０．０００１％〜約２０％製剤中で（別途指定されない限り、本明細書に提供される全ての百分率は、総製剤に対する重量／重量である）、対象に投与され得る。一実施形態において、免疫調節物質−炭水化物重合体結合体は、対象に、約０．０１％〜約１％の結合体を含む製剤、例えば、約０．１％〜約０．５％の結合体を含む製剤中で投与される。
【０３０８】
本発明の化合物は、生理的に許容される担体中で調製され得る。溶液または乳濁液について、好適な担体には、食塩水および緩衝媒体を含む、水性またはアルコ−ル性／水溶液、乳濁液または懸濁液が含まれる。非経口担体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロ−ス、デキストロ−スおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル油または固定油が含まれる。静脈内担体には、種々の添加剤、防腐剤、または流体、栄養補充液もしくは電解質補給液等が含まれる（概して、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９８５を参照されたい）。吸入について、可溶性組成物またはワクチンが、投与に好適なディスペンサ−（例えば、気化器、噴霧器、または加圧エアロゾルディスペンサ−）中に負荷され得る。
【０３０９】
核酸は、レトロウイルス、アデノウイルス、もしくは他の好適なベクタ−、または種々の他のタンパク質ベ−スのまたは脂質ベ−スの遺伝子送達複合体中への組み込みによって、ならびに「裸」ポリヌクレオチドの送達を容易にする技法の使用を通じて（エレクトロポレ−ションまたは「遺伝子銃」送達等）、細胞に直接送達され得る。代替的に、核酸は、送達のためのタンパク質を発現することが可能な宿主細胞中に導入され得る。これらのトランスフェクトまたは形質転換された細胞は次いで、治療上有効量で抗原を発現するために有効な量で、移植（単独でまたはバリアデバイス中で）、注射、あるいは導入される。
【０３１０】
代替的な実施形態において、抗原提示細胞、例えば、マクロファ−ジおよび／またはＤＣは、インビトロまたはエクスビボで、本発明の化合物または組成物と接触させられて、抗原での負荷を達成し、次いで対象に投与され得る。一実施形態において、抗原提示細胞は、対象または自家ドナ−に由来し、エクスビボで抗原を負荷される。例えば、血液は、対象または自家ドナ−から採取され、密度勾配遠心分離によって末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のために富化され、続いてプラスチック表面に接着させて単球を富化してもよい。接着細胞を次いで、サイトカインミックスで培養させて、例えば、未成熟ＤＣへと分化を誘導することができ、結果として生じる未成熟ＤＣをワクチン抗原および免疫調節物質−炭水化物重合体と接触させるか、または代替的に、該抗原をコ−ドする核酸でトランスフェクトすることができる。結果として生じる成熟／活性化ＤＣ調製物のアリコ−ト（例えば、凍結保管されたアリコ−ト）（すなわち、上方制御された共刺激分子ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６を有する）は次いで、対象に、例えば、皮内注射（複数可）によって、プロトコル規定のスケジュ−ルで投与され得る。
【０３１１】
本発明の化合物、組成物、またはワクチンの投与は、単一もしくは複数の事象であってもよく、またはプライムブ−ストプロトコルの一部、これらの組み合わせ、あるいはこれらの各々と、他の従来の投与／ワクチン接種方法との組み合わせであってもよい。例えば、プライムブ−ストプロトコルは、例えば、筋肉内、皮内、血管内、皮下、または静脈内投与によるプライム（ｐｒｉｍｉｎｇ）、および例えば、鼻腔内、筋肉内、皮内、血管内  皮下、または静脈内投与によるブ−スト（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）を含んでもよい。プライム組成物およびブ−スト組成物の一方または両方が、抗原またはそれをコ−ドする核酸および免疫調節物質−炭水化物重合体結合体を含んでもよい。プライム組成物およびブ−スト組成物の一方は、免疫調節物質−炭水化物重合体結合体を省略してもよい。
【０３１２】
特定の適用に有効な投与免疫調節物質−炭水化物重合体結合体の量および頻度は、免疫調節物質−炭水化物重合体結合体（例えば、免疫調節物質部分および／または炭水化物重合体）の物理的および化学的性質、担体の性質、意図される投薬レジメン、対象の免疫系の状態（例えば、抑制されている、低下している、刺激されている）、免疫調節物質結合体を投与する方法、ならびに製剤が投与されている種を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の要因により異なるであろう。したがって、全ての可能性のある適用に有効な免疫調節物質結合体の量を概して記載することは、実用的でない。量および頻度は、担当医師または獣医によって決定されてもよい。
【０３１３】
組成物の有効量が投与される。「有効量」は、投与条件下で所望の免疫調節効果を達成するのに十分な量である。
【０３１４】
例として、約１００ｎｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの免疫調節物質が、対象に投与されてもよく、好ましくは約１０μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１００μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇである。
【０３１５】
例として、約１００ｎｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの炭水化物重合体が、対象に投与されてもよく、好ましくは約１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。更により好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｋ／ｋｇの炭水化物重合体の用量が、特にヒトのために企図される。
【０３１６】
例として、約１μｇ／ｋｇ〜約１０，０００μｇ／ｋｇ抗原が、対象に投与されてもよく、好ましくは約５μｇ／ｋｇ〜約５０００μｇ／ｋｇ、より好ましくは約８μｇ／ｋｇ〜約１０００μｇ／ｋｇ、および最も好ましくは、約４００μｇ／ｋｇ〜約６００μｇ／ｋｇである。更により好ましくは、約１００μｇ／ｋｇ〜約２００μｇ／ｋｇの抗原の用量が、特にヒトのために企図される。
【０３１７】
代替的に、用量は、治療ク−ルの開始直前に得られた実際の体重を使用して、算出されてもよい。このようにして算出された投薬量、体表面積（ｍ２）は、治療ク−ルの開始前に、次のデュボア法を使用して算出される：ｍ２＝（体重ｋｇ０．４２５×身長ｃｍ０．７２５）×０．００７１８４。一実施形態において、免疫調節物質は、対象に、例えば、約０．０１ｍｇ／ｍ２〜約１０ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【０３１８】
本発明の化合物、組成物、およびワクチンはまた、対象に、他の免疫応答修飾物質、例えば、サイトカイン、ＨＬＡクラスＩＩタンパク質結合ヘルパ−分子、ＣＤ４０アゴニスト、チェックポイント受容体（例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、Ｓｔａｔ３）のアンタゴニスト、Ｂ７共刺激分子、ＦＬｔ３アゴニスト、およびＣＤ４０Ｌアゴニストと併せて投与されてもよい。
【０３１９】
ＨＬＡクラスＩＩタンパク質結合ヘルパ−分子の存在は、ヘルパ−（ＣＤ４＋）Ｔ細胞を刺激する際に有効である。ＨＬＡクラスＩＩタンパク質結合ヘルパ−分子は、例えば、キ−ホ−ルリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド、またはＰＡＤＲＥペプチド等のより小さいＴ細胞ヘルパ−エピト−プ、およびそれらの組み合わせを含む、当業者に周知のもののいずれかであってもよい。
【０３２０】
本発明の化合物または組成物の免疫原性または有効性を更に増強し得る化合物がまた、投与されてもよい。
【０３２１】
本発明の化合物および組成物はまた、他の免疫療法戦略、例えば、対象が癌を有し、ワクチンが癌ワクチンである場合に、化学療法と組み合わせて使用され得る。
【０３２２】
免疫調節物質−炭水化物重合体結合体を投与することによって治療され得る病態には、次のものが含まれるが、これらに限定されない：
（ａ）例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ−Ｉ、ＨＳＶ−ＩＩ、ＣＭＶ、またはＶＺＶ）、ポックスウイルス（例えば、痘瘡もしくは牛痘等のオルソポックスウイルス、または伝染性軟属腫）、ピコルナウイルス（例えば、ライノ−ウイルスまたはエンテロウイルス）、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、および呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ））、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ）、パポ−バウイルス（例えば、性器疣贅、尋常性疣贅、または足底疣贅を引き起こすもの等のパピロ−マウイルス）、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、フラビウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルスまたはデングウイルス）、またはレトロウイルス（例えば、ＨＩＶ等のレンチウイルス）による感染からもたらされる疾患等の、ウイルス疾患、
（ｂ）例えば、例えば、エシェリキア属、エンテロバクタ−属、サルモネラ属、ブドウ球菌属、赤痢菌属、リステリア属、アエロバクタ−属、ヘリコバクタ−属、クレブシエラ属、プロテウス属、シュ−ドモナス属、レンサ球菌属、クラミジア属、マイコプラズマ属、肺炎球菌属、ナイセリア属、クロストリジウム属、バチルス属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、カンピロバクタ−属、ビブリオ属、セラチア属、プロビデンシア属、クロモバクテリウム属、ブルセラ属、エルシニア属、ヘモフィラス属、またはボルデテラ属の細菌による感染からもたらされる疾患等の、細菌疾患、
（ｃ）クラミジア等の他の感染性疾患、カンジダ症、アスペルギルス症、ヒストプラスマ症、クリプトコッカス髄膜炎を含むが、これらに限定されない、真菌性疾患、またはマラリア、ニュ−モシスチス・カリニ肺炎、リ−シュマニア症、クリプトスポリジウム症、トキソプラスマ症、およびトリパノソ−マ感染を含むが、これらに限定されない、寄生虫性疾患、
（ｄ）上皮内新生物、子宮頚部異形成、日光角化症、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、腎細胞癌、カポジ肉腫、黒色腫等の、新生物疾患、骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、および有毛細胞白血病を含むが、これらに限定されない、白血病、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、および他の癌、
（ｅ）Ｔｈ２媒介性、アトピ−性皮膚炎または湿疹等のアトピ−性疾患、好酸球増加、喘息、アレルギ−、アレルギ−性鼻炎、およびオ−メンズ症候群、
（ｆ）全身性紅斑性狼瘡、本態性血小板血症（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｈａｅｍｉａ）、多発性硬化症、円板状狼瘡、円形脱毛症等の、ある特定の自己免疫疾患、ならびに
（ｇ）例えば、ケロイド形成および他のタイプの瘢痕化の阻害（例えば、慢性創傷を含む、創傷治癒を増強すること）等の、創傷修復に関連する疾患。
免疫調節物質−炭水化物重合体結合体はまた、低下した免疫機能を有する個体に有用あり得る。例えば、ある特定の結合体は、例えば、移植患者、癌患者、およびＨＩＶ患者において細胞媒介性免疫性の抑制後に生じる、日和見感染および腫瘍を治療するために使用されてもよい。
【０３２３】
核酸の細胞への送達
ある実施形態において、本発明は、核酸を細胞に送達するための化合物または組成物に関する。少なくとも１つの核酸は、ポリカチオンを介して炭水化物重合体に結合されてもよい。
【０３２４】
ある実施形態において、核酸は、抗原をコ−ドする。
【０３２５】
「核酸」という用語は、全ての形態のＤＮＡ、ＲＮＡ、およびポリヌクレオチド、すなわち、１本鎖および２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等と同義である。
【０３２６】
核酸の対象への送達手段は、核酸の直接送達、および核酸でトランスフェクトされたまたは形質転換された細胞の送達を含む。細胞または核酸は、所望の臓器または腫瘍に、例えば、注射、カテ−テル法、または内視鏡によって、直接送達することができる。それらはまた、静脈内に、気管支内に、腫瘍内に、髄腔内、筋肉内に、眼内に、局所に、皮下に、経皮的に、または経口投与で送達することもできる。
【０３２７】
核酸送達ビヒクルの例としては、リポソ−ム、天然重合体および合成重合体を含む生体適合性重合体、リポタンパク質、ポリペプチド、多糖類、リポ多糖類、人口ウイルス外被、金属粒子、および細菌、バキュロウイルス、アデノウイルス、およびレトロウイルス等のウイルス、バクテリオファ−ジ、コスミド、プラスミド、真菌ベクタ−、ならびに多様な真核性および原核性宿主における発現について記載されており、遺伝子療法、遺伝子ワクチン接種（例えば、ＤＮＡワクチン接種）に、ならびに単純なタンパク質発現のために使用され得る、当該技術分野で典型的に使用される他の組換えビヒクルが挙げられる。
【０３２８】
本明細書で使用されるとき、「ベクタ−」は、非相同核酸を細胞中に、それらの発現または複製のいずれかのために導入するために使用される、個別的な要素を指す。例えば、ベクタ−は、人口染色体、プラスミド、コスミド、バクテリオファ−ジ、もしくはウイルスであってもよく、宿主細胞ゲノム中への安定な組み込みが可能であってもよく、またはそれは、独立した遺伝子要素（例えば、エピソ−ム、プラスミド）として存在してもよい。ベクタ−は、単一のポリヌクレオチドとして、または２つ以上の分離したポリヌクレオチドとして存在してもよい。ベクタ−は、宿主細胞中に存在するとき、単一コピ−ベクタ−または多コピ−ベクタ−であってもよい。本発明において使用するために好ましいベクタ−は、宿主細胞中で１つ以上のタンパク質の発現を導くために、１つ以上の機能的遺伝子が、発現調節要素に対して適切な向きおよび近接性でベクタ−中に挿入され得る、発現ベクタ−である。
【０３２９】
「調節要素」という用語は、特定の宿主細胞中における作動可能に連結されたヌクレオチドコ−ド配列の発現のために必要な、核酸配列を指す。原核生物中における発現のために好適な調節配列は、例えば、複製起源、プロモ−タ−、リボソ−ム結合部位、および転写終結部位を含む。真核生物中における発現のために好適な調節配列は、例えば、例えば、複製起源、プロモ−タ−、リボソ−ム結合部位、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサ−を含む。
【０３３０】
「プロモ−タ−」は、核酸の転写を導く。本明細書で使用されるとき、「プロモ−タ−」は、ポリメラ−ゼＩＩタイププロモ−タ−の場合においては、ＴＡＴＡ要素等の、転写の開始部位の近くで必要な核酸配列を含む。
【０３３１】
プロモ−タ−はまた、任意に、転写の開始部位から数千塩基対と同程度の距離に位置する、遠位「エンハンサ−またはリプレッサ−要素」を含む。プロモ−タ−は、相同または非相同のいずれでもあり得る。「構成的」プロモ−タ−は、ほとんどの環境および発達条件下で、選択される生物中において活性であるプロモ−タ−である。「誘導性」プロモ−タ−は、選択される生物中において環境および発達制御下にあるプロモ−タ−である。
【０３３２】
ベクタ−は、アデノウイルスベクタ−、アデノ関連ウイルスベクタ−、レトロウイルスベクタ−、レンチウイルスベクタ−、およびプラスミドベクタ−を含む、ウイルスベクタ−または非ウイルスベクタ−であってもよい。例となるタイプのウイルスには、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、アデノウイルス、ＡＡＶ（アデノ関連ウイルス）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＢＩＶ（ウシ免疫不全ウイルス）、およびＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）が含まれる。核酸は、ウイルス粒子中、リポソ−ム中、ナノ粒子中、および重合体への複合体化を含む、十分に効率的な送達レベルを提供する任意の所望の形式で投与され得る。本明細書で使用される、遺伝子送達、遺伝子導入等は、導入に使用される方法に関わらず、核酸（ときに「導入遺伝子」と称される）の宿主細胞中への導入を指す用語である。かかる方法は、ベクタ−媒介性遺伝子導入（例えば、ウイルス感染／トランスフェクション、または種々の他のタンパク質ベ−スのもしくは脂質ベ−スの遺伝子送達複合体による）、ならびに「裸」ポリヌクレオチドの送達を容易にする技法（エレクトロポレ−ション、「遺伝子銃」送達、および核酸の導入に使用される種々の他の技法等）等の、多様な周知の技法を含む。導入されるポリヌクレオチドは、宿主細胞中で安定にまたは一過性で維持されてもよい。安定した維持は、典型的に、導入されるポリヌクレオチドが、宿主細胞と適合性の複製起源を含有するか、あるいは染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）または核もしくはミトコンドリア染色体等の、宿主細胞のレプリコン中へと組み込むかのいずれかであることを必要とする。当該技術分野で既知であり、また本明細書に記載されるように、複数のベクタ−が、哺乳類細胞への遺伝子の導入を媒介可能であることで知られている。
【実施例】
【０３３３】
実施例１：材料および方法
培地および化学物質
完全ＲＰＭＩ−１６４０培地を、２％のＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノ−ル、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン、および１０ｖ／ｖ％のウシ胎仔血清を補充することによって調製した。ＤＣの培養に用いた組換えＧＭ−ＣＳＦをＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）から購入し、ＰＢＳ中で再構成した。リポ多糖類（ＬＰＳ）（Ｌ３１３７、Ｓｉｇｍａ，Ｃａｓｔｌｅ  Ｈｉｌｌ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を滅菌蒸留水中で再構成した。抗ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣをＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。抗ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６抗体を室内で調製した。マンナン、ＮａＩＯ４、ＡＮＴＳ、エタン−１，２−ジオ−ルをＳｉｇｍａから購入した。
【０３３４】
これらの研究に用いたマンナンは、パン酵母（出芽酵母）由来である。マンナンは、非常に不均一であり、５０〜１，０００ｋＤａ超の範囲の種々の分子量を有するマンノ−ス豊富な多糖類を組み込む。
【０３３５】
分画方法
再蒸留水（ＤＤＷ）中２０ｍｇ／ｍＬのマンナン（Ｓｉｇｍａ）を２０ｍＬの３００ｋＤａ  ＭＷＣＯ  Ｖｉｖａ回転濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）に添加し、２５００ｒｐｍで１５〜２０分間遠心分離し、１〜２ｍＬに濃縮した（図１）。全試料を添加するまで濃縮器を補充した。数回の回転を必要とした。濾液を収集し、ＤＤＷで２回洗浄したが、これを廃棄した。濃縮画分（残留物）は、３００ｋＤａ超の画分である。その後、濾液を１５ｍＬの１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎ回転濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に加え、先に詳述されたように実行した。次に、マンナンを、２×１５ｍＬの５０ｋＤａ  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎ回転濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、続いて２×１５ｍＬの３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎ回転濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて順に分画した。これは、３００ｋＤａ超、１００〜３００ｋＤａ、５０〜１００ｋＤａ、３０〜５０ｋＤａ、および３０ｋＤａ未満の画分をもたらした。残留物画分および最終濾液を凍結乾燥させると白色のふわふわした粉末になったが、３０ｋＤａ未満の画分のみゴム状になり、これは使用しなかった。試料を秤量し、回収率を記録した。
【０３３６】
後の分画泳動において、２×２０ｍＬの１０００ｋＤａ  ＭＷＣＯ  Ｖｉｖａ回転濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を第１の分画ステップとして使用し、続いて上述の一連の他の濃縮器を使用した。これは、１０００ｋＤａ超、３００〜１０００ｋＤａ、１００〜３００ｋＤａ、５０〜１００ｋＤａ、３０〜５０ｋＤａ、および３０ｋＤａ未満の画分をもたらす。
【０３３７】
前回と同様に、残留物画分および最終濾液を凍結乾燥させると白色のふわふわした粉末になり、３０ｋＤａ未満の画分は使用しなかった。試料を秤量し、回収率を記録した。幾つかの泳動において、３００〜１０００ｋＤａの画分に粉末が存在しなかったため、それらの泳動においてこの特定の画分を分析に用いなかった。
【０３３８】
ＰＤＰＨ定量化方法を用いたマンナン中のアルデヒド残基の定量化
酸化されたマンナン中のアルデヒド基の数を定量化するための方法が図２に略図的に示される。同一のモル濃度のＮａＩＯ４を酸化の程度がマンナンの分子量に依存するように使用する。マンナンおよびマンナン画分（０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中１．４ｍｇ／０．１ｍＬ）を０．０１ＭのＮａＩＯ４で酸化し、暗所で、氷上で１時間反応させた。反応物を１０μＬのエタン−１，２−ジオ−ルで反応停止処理し、更に３０分間反応させた後、０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）を用いてＰＤ１０カラムに通した。
【０３３９】
２ｍＬの酸化されたマンナン（０．７ｍｇ／ｍＬ）の１ｍＬを、室温で一晩回転させながら０．１ｍｇのＰＤＰＨと反応させた後、ＤＤＷを用いてＰＤ１０に通した。０．０１ＭのＤＴＴと１５分間反応させ、かつＯＤ３４３ｎｍで吸光度を読み取ることによって、アルデヒド基の数を決定することができる。これは、アルデヒド基を示す２−ピリジンを放出する（図２）。
アルデヒド残基の数
＝２−ピリジンチオン（Ｍ）の濃度／マンナン（Ｍ）の濃度
＝［ＯＤ３４３／８０８０］／［マンナン（ｍｇ／ｍＬ）の濃度／マンナンの分子量］
【０３４０】
種々の画分に用いた平均分子量使用は以下の通りである：全マンナン＝５００ｋＤａ、１，０００超＝１０００ｋＤａ、３００超＝６５０ｋＤａ、１００−３００＝２００ｋＤａ、５０−１００＝７５ｋＤａ、３０−５０＝４０ｋＤａ。
【０３４１】
ＡＮＴＳでのマンナンの化学修飾および定量化
ＡＮＴＳによる酸化されたマンナンの化学修飾が、図３に略図的に示される。マンナンおよびマンナン画分（０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中１．４ｍｇ／０．１ｍＬ）を０．０１ＭのＮａＩＯ４で酸化し、暗所の氷上で１時間反応させた。反応物をエタン−１，２−ジオ−ルで反応停止処理し、更に３０分間反応させた後、０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）を用いてＰＤ１０カラムに通した。
【０３４２】
０．７ｍｇ／ｍＬの酸化されたマンナンの１ｍＬ、３００ｋＤａ超、１００−３００ｋＤａ、５０−１００ｋＤａ、および３０−５０ｋＤａの画分を、３：１７の酢酸：ＤＤＷで、それぞれ、０．２８８、０．１８４、０．５９８、１．５９、および２．９９ｍｇのＡＮＴＳ（４００倍過剰）と反応させた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（５０μＬ、１Ｍ、Ｓｉｇｍａ）を添加し、反応物を室温で一晩回転させたまま放置した後、ＤＤＷを用いてＰＤ１０に通した。ＡＮＴＳ結合体の蛍光を、４０５ｎｍの励起および５２０ｎｍの発光でＡＮＴＳ標準物に対して読み取った。
【０３４３】
マンノ−ス残基の定量化のためのレゾルシノ−ルアッセイ
マンナンおよびマンナン画分を、レゾルシノ−ルアッセイ（Ｍｏｎｓｉｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）を用いて定量化した。マンノ−スを標準物として用いた。プレ−トを、ＯＤ４５０ｎｍ（４３０ｎｍも４８０ｎｍも存在しないため）の吸光度で読み取った。
【０３４４】
マンナンへの抗原の結合
酸化されたマンナンへのタンパク質の結合が、図４に略図的に示される。マンナンおよび画分（０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中１４ｍｇ／ｍＬの１０００ｋＤａ超、３００〜１０００ｋＤａ（または先の泳動においては３００超）、１００〜３００ｋＤａ、５０〜１００ｋＤａ、３０〜５０ｋＤａ（１４ｍｇ／０．５ｍＬであった３０〜５０画分を除いて））を、０．１ＭのＮａＩＯ４（それぞれ、１００、７７、２５０、６００μＬ、および１．２５ｍＬ）を添加して酸化し、１．６ｍＬの最終容量にした。
【０３４５】
混合物を暗所の氷上で１時間静置し、エタン−１，２−ジオ−ルで反応停止処理し、前回と同様に３０分間更に反応させた。結合体を、０．０５Ｍの重炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）で予備平衡化したＰＤ１０カラム（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分離し、未反応の物質および副生成物を除去した。これは、１．６ｍＬの試料、その後、０．９ｍＬの緩衝液のカラム通過および廃棄を伴った。次の２ｍＬを収集し、１ｍＬの酸化されたマンナンまたは画分を、それぞれ、計算された量の０．３５、０．３、０．４９５、０．７３５、および０．５９ｍｇのＦＰおよびＯＶＡと反応させた。結合体を室温で一晩インキュベ−トし、４〜１２または４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離して、結合の成功を確認した。良好な結合は、塗抹およびはっきりと異なるタンパク質バンドの欠如によって示される。
【０３４６】
インビボ研究で使用した１０００超の最終ＭＦＰ結合体の場合、０．７ｍｇのＦＰ（５．４５ｍｇ／ｍＬ、１２８μＬ）を２ｍＬの酸化されたマンナンと反応させた。同様に、１０００超のＭａｎＲＳＶｇ結合体の場合、０．２５ｍｇのＲＳＶｇ（０．３７ｍｇ／ｍＬ、３６７μＬ）を２ｍＬの酸化されたマンナンと反応させた。
【０３４７】
１０００超のＭＦＰ中のマンナンのモル濃度がＭＦＰ中のモル濃度の半分であったため、１０μｇのＦＰをインビボ免疫原性研究に用いた。
【０３４８】
天然および変性ゲル電気泳動
マンナンおよび画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは天然ゲル上で可視化した。４−１２％または４−２０％のプレキャスト（ＰＡＧＥゲル）ＳＤＳ勾配ゲル（ＰＡＧＥゲル）を１×ＭＯＰＳ  ＳＤＳ泳動緩衝液中で泳動させた。あるいは、０．０６３ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）中で作製された５％のスタッキングゲルおよびＴＢＥ中で作製された分離ゲルからなる１２％の天然ゲル（塩基性条件）を用いた。ＴＢＥに加えて０．１９Ｍのグリシン中で電気泳動を行った（Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【０３４９】
クマシ−染色およびＰＡＳ染色（それぞれ、タンパク質および糖）を用いてゲルを染色した。
【０３５０】
密度測定によるマンナン画分の分子量決定
マンナン画分を上述のようにＮａＩＯ４で酸化し、ＡＮＴＳで標識した。ＡＮＴＳ標識マンナンの試料をＰＡＳ染色後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。乾燥したゲルを走査し、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ソフトウェアを用いた密度測定によって分析した。
【０３５１】
骨髄由来樹状細胞の生成
マウスＤＣを以前に説明されたように（Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）生成した。手短に言うと、骨髄細胞を大腿および脛骨の内腔から抽出した。その後、骨髄細胞を、滅菌の０．７３（ｗ／ｖ）％ＮＨ４Ｃｌで３７℃で１０分間処理して、赤血球を溶解させた。細胞を洗浄し、１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦを補充した完全培地（２×１０６個の細胞／３ｍＬ）中に再懸濁した。これらの細胞を２４ウェルプレ−ト（１ｍＬ／ウェル）中で４日間培養した。細胞を、培養培地を緩徐にピペットで吸い上げることによって採取した。ＧＭ−ＣＳＦで培養した骨髄細胞は、強力な混合リンパ球反応（ＭＬＲ）刺激細胞であるＤＣを発現する多数のＭＨＣクラスＩＩを産生する。
【０３５２】
インビトロ樹状細胞成熟研究
Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＤＣを成熟研究に用いた。樹状細胞を培養プレ−トから除去し、１×１０５個のＤＣを１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦを補充した１５０μＬの完全ＲＰＭＩ中に再懸濁し、４８ウェルプレ−トに播種した。最終濃度８００、４００、および２００μｇ／ｍＬをウェルに添加するようにマンナンおよび種々のマンナン画分を添加した。ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を陽性対照として使用し、同様にそれぞれのウェルに添加し、３７℃で１８時間インキュベ−トした。細胞を採取し、フルオレセインイソチオシアネ−ト（ＦＩＴＣ）と結合させた抗ＣＤ８６、抗ＣＤ４０、または抗ＣＤ８０とともに抗ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣで染色した。ＣＤ１１ｃ高細胞をゲ−トし、ＦＩＴＣの強度をヒストグラム分析によって決定して、ＤＣ成熟状態を決定した。
【０３５３】
インビボマウス免疫原性研究
マウスおよび免役化
ＨＬＡ−Ａ２／ＫｂマウスをＡｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ（Ｐｅｒｔｈ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入した。ＭＦＰによって誘導されたエフェクタ−免疫応答を決定するために、１０００超のＭＦＰおよび非結合ＦＰ、ＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂマウスを、尾の基部に１００μＬの容量を０日目、１０日目、および１７日目に皮内注入することによって免疫し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて免疫応答を１０〜１４日後に評価した。２回目および３回目の注入後にマウスを出血させ、ＭＵＣ１特異的総Ｉｇ、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＧ１がＥＬＩＳＡアッセイによって検出された。
【０３５４】
インビボでの抗原特異的Ｔ細胞応答
免疫したＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂマウス由来の脾臓細胞を単離し、抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌についてＥＬＩＳｐｏｔによって評価した。混合酢酸プレ−ト（ＭＡＩＰ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を抗マウスＩＦＮ−γ（ＡＮ１８、５μｇ／ｍＬ、Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で一晩コ−ティングした。５×１０５個の脾臓細胞／ウェルを添加し、ＭＵＣ−ＦＰ（２０μｇ／ｍＬ）の存在下で、１０％  ＦＣＳ  ＲＰＭＩ  １６４０培地中で１８時間インキュベ−トした。ＣｏｎＡ（１μｇ／ｍＬ）または細胞のみを、それぞれ、陽性対照および陰性対照として用いた。細胞を廃棄し、洗浄後（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳ）、抗マウス  ＩＦＮ−γ抗体−ビオチン（Ｒ４−６Ａ２、Ｍａｂｔｅｃｈ，ＣＡ，ＵＳＡ）を２時間添加し、その後、０．１μｇ／ｍＬのＥｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ−アルカリ性ホスファタ−ゼ（ＡＰ）（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）を室温で２時間添加した。活性スポットを比色ＡＰキット（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて検出した。サイトカインスポットをＡＩＤ  ＥＬＩＳｐｏｔリ−ダ−システム（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で計数した。デ−タは、０．５×１０６個の細胞当たりの平均のスポット形成単位（ＳＦＵ）＋／−平均の標準偏差（ＳＤ）で示される。
【０３５５】
１０００ｋＤａ超の酸化されたマンナンに結合したタンパク質抗原のインビトロヒト免疫原性研究
タンパク質／ペプチド抗原
ＭＡＲＴ−１タンパク質をＢｉｏｖｉｓｉｏｎ（ＵＳＡ）から購入した。ＧＳＴ−ＭＵＣ１−ＶＮＴＲ（ＦＰ）をＡｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）に記載されるように調製した。Ｈｉｓでタグ付けしたＭＵＣ１−ＶＮＴＲ（ｐＴｒｃ）を、ｐＴｒｃＢ  ベクタ−（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において室内で調製した（Ｌｏｖｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１［ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（天然）（配列番号１）、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（類似体）（配列番号２）］に特異的なＨＬＡ−Ａ２エピト−プペプチドは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（ＵＳＡ）によって合成された。
【０３５６】
１０００ｋＤａ超の酸化されたマンナンへのＧＳＴ−ＭＵＣ１−ＶＮＴＲ（ＦＰ）、ＭＵＣ１−ＶＮＴＲ（ｐＴｒｃ）、およびＭＡＲＴ−１の結合
１０００ｋＤａ超の過ヨウ素酸塩で酸化されたマンナンへの抗原の結合を上述のように実行した。１０００ｋＤａ超のマンナンと抗原の比率は４０：１であった。
【０３５７】
ペプチド特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の生成
ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて密度勾配遠心分離によってバフィ−コ−トから分離した。ＨＬＡ−Ａ２の状態を、フロ−サイトメトリ−によって評価した。ＰＢＭＣを、完全ＡＢ培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＡＢ血清、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、ＨＥＰＥＳ、Ｌ−ＧＬＵＴ、ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２−メルカプトエタノ−ル）中に５×１０６／ｍＬで再懸濁し、２４ウェルプレ−ト中で１０μｇ／ｍＬのＭＡＲＴ−１類似体ペプチド（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）（配列番号２）および３μｇ／ｍＬのＲ８４８（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）で刺激した。３日後、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５、および２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充した別の１ｍＬの完全ＡＢ培地を添加した。最初のプライミングから７〜１０日後、細胞を、２μｇ／ｍＬのＦＭＰまたは１０μｇ／ｍＬのＭＡＲＴ１類似体ペプチド（ＥＬＡ）でパルスした照射自家ＰＢＭＣ（１：１００）で再刺激した。翌日、１ｍＬの上清を２５Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含有する新鮮な完全ＡＢ培地と交換した。これを３〜４日毎に繰り返した。
【０３５８】
ＭＡＲＴ−１特異的Ｔ細胞クロ−ンをＦＡＣＳ選別によって生成した。ペプチドでパルスした照射（６０００ｃＧｙ）Ｔ２細胞と４時間インキュベ−トした後、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶペプチド（配列番号２）に特異的なＩＦＮγ分泌細胞をＦＡＣＳ  Ａｒｉａを用いて選別した。製造業者のプロトコルに従って行われるＩＦＮγ分泌および検出アッセイ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてＩＦＮγ分泌細胞を特定した。
【０３５９】
タンパク質抗原特異的Ｔ細胞応答のプライミング
単球を、ＣＤ１４マイクロビ−ズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いたＡｕｔｏＭＡＣＳ分離によってＰＢＭＣから精製した。単球由来の樹状細胞（ＭｏＤＣ）を、Ｔ７５フラスコ中の５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦおよび２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する完全ＦＣＳ培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％  ＦＣＳ＋Ｌ−ＧＬＵＴ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、ＨＥＰＥＳ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノ−ル）中で単球（５×１０５／ｍＬ）を５〜６日間培養することによって生成した。
【０３６０】
完全ＡＢ培地中の２×１０５／ｍＬ（１：２０のＭｏＤＣ：Ｔ細胞の場合）のＭｏＤＣを２４ウェルプレ−ト（１試験条件当たり１ｍＬ）に添加し、その後、タンパク質または１０００ｋＤａ超の酸化されたマンナン結合体（１０−２０μｇ／ｍＬ）を添加した。４時間後、４×１０６のＣＤ１４枯渇ＰＢＭＣを１ｍＬの完全ＡＢ培地中でウェルに添加した。３日後、２５Ｕ／ｍＬのＩＬ−２、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７、および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５を添加した。７−１０日後、Ｔ細胞を、抗原を装填した１ｘ１０５  ＭｏＤＣで再刺激した。再刺激から２４時間後、培養物に２５Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を補充し、３〜４日後に再補充した。Ｔ細胞培養物を、典型的には、１回目の再刺激または２回目の再刺激後に分析した。
【０３６１】
抗原特異的Ｔ細胞応答の分析
Ｔ細胞エピト−プペプチドの場合、複数のペプチド負荷Ｔ２細胞（２×１０５／ウェル）を無関係のペプチド（例えば、ＣＡＰ−１  １０μｇ／ｍＬまたはペプチドなし）でパルスすることによって調製し、１つのペプチド負荷Ｔ２細胞を、１．２５μｇ／ｍＬのβ２−ミクログロブリンを有する無血清培地中で１時間、目的とするペプチド（５μｇ／ｍＬ）でパルスすることによって調製した。Ｔ２細胞を１００μＬ中約１：５比（４×１０４／ウェル）で複製Ｔ細胞ウェルに添加し、５％ＣＯ２と３７℃で１時間インキュベ−トした。Ｇｏｌｇｉ−Ｓｔｏｐ（２００μＬのＴ細胞当たり０．１μＬ／ＭｏＤＣ共培養物）を含有する５０μＬの培地を添加し、細胞を５％ＣＯ２と３７℃で更に３〜４時間インキュベ−トした。
【０３６２】
タンパク質抗原および結合体の場合、抗原または１０００ｋＤａ超のマンナン結合体（２０μｇ／ｍＬ）を、７５〜１００μＬの完全培地中２×１０４  ＭｏＤＣ／ウェル（自家またはＡ２一致）を含有するＶ底９６ウェルクラスタ−プレ−トに添加し、２時間インキュベ−トした。７５〜１００μＬの完全培地中の２×１０５刺激Ｔ細胞を各ウェルに添加し、細胞を５％ＣＯ２と３７℃で１５−１６時間インキュベ−トした。Ｇｏｌｇｉ−Ｓｔｏｐ（２００μＬのＴ細胞当たり０．１μＬ／ＭｏＤＣ共培養物）を含有する５０μＬ培地を添加し、細胞を５％ＣＯ２と３７℃で更に４〜５時間インキュベ−トした。
【０３６３】
細胞内インタ−フェロンγ（ＩＦＮγ）応答の分析
細胞を表面マ−カ−ＣＤ８およびＣＤ４で染色し、固定し、透過させ、その後、細胞内ＩＦＮγの蓄積をＣｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏＰｅｒｍキット（ＢＤ）を用いてＣＤ４  ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＣＤ８  ＦＩＴＣ、およびＩＦＮγ  ＰＥ−Ｃｙ７（ＢＤ）で染色した。抗原特異的Ｔ細胞を、フロ−サイトメトリ−によって特定し、目的とするペプチド／タンパク質の存在下でのＩＦＮγ＋ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞を無関係のペプチド／タンパク質対照と比較した。
【０３６４】
新鮮な血液由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離
新鮮な血液を健常な志願者から収集し、ヘパリンナトリウム管に保管した。その後、１５ｍＬの血液を５０ｍＬの遠心分離管に移し、等容量のＤＰＢＳと緩徐に混合した。１０ｍＬのＦｉｃｏｌｌを、ピペットを用いてゆっくりとその下に置いた。管を室温で３０分間絶え間なく、８００ｇで遠心分離した。バフィ−コ−ト（ＰＢＭＣ含有）を血清とＦｉｃｏｌｌとの間の界面に吸引した。ＰＢＭＣを十分なＤＰＢＳで洗浄し、９００ｇで遠心分離してＦｉｃｏｌｌを除去した。ＲＰＭＩ−１６４０培地を収集したＰＢＭＣに添加し、ＰＢＭＣの数を計数することによって決定した。１ｍＬの血液は、典型的には、少なくとも１００万個のＰＢＭＣを産生する。
【０３６５】
ＩＬ−６の測定のためのサイトカイン放出アッセイ
ＰＢＭＣを計数し、細胞密度を調製した。１００μＬの細胞を、ＩＬ−６アッセイのための細胞密度が５，０００／ウェルになるように必要数のウェルに添加した。スクリ−ニング用のＬＤ１で酸化されたマンナン結合体をＤＭＳＯ中に連続希釈した。ＬＤ１溶液を各ウェルに添加した（アッセイにおけるＤＭＳＯの最終濃度は０．０３％以下であった）。プレ−トをＣＯ２インキュベ−タ−中で３７℃でインキュベ−トし、上清を６時間および２４時間時点で収集した。各収集時点で、プレ−トを９００ｒｐｍで４分間遠心分離し、上清を別の９６ウェルプレ−トに移した。これらをラベル付けし、−８０℃で保管した。放出されるサイトカインを定量化するためにＩＬ−６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥＬＩＳＡキットを用いた。製造業者の指示に記載されるようにＥＬＩＳＡを行った。吸光度をＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３で測定した。デ−タを分析するために各サイトカインの標準曲線を毎回読み出した。
【０３６６】
実施例２：マンナンの分画
最初に、マンナンを、材料および方法に記載されるように順に膜に通して、３００ｋＤａ超、１００〜３００ｋＤａ、５０〜１００ｋＤａ、３０〜５０ｋＤａ、４〜３０ｋＤａのマンナン画分を単離した。その後、１，０００ｋＤａ超、１００〜３００ｋＤａ、５０〜１００ｋＤａ、および３０〜５０ｋＤａのマンナン画分を単離した。４〜３０ｋＤａの画分はゴム様の残留物のようであったため、その後の研究に含まなかった。
【０３６７】
３００ｋＤａ、１００ｋＤａ、５０ｋＤａ、３０ｋＤａの膜を通る既知の容量のマンナンを既知の濃度で順に分画することによって分離を行った（図１）。通過物およびそれぞれからの洗浄物を次の膜に通した。全ての分離を水中で行い、最後に、全ての試料を凍結乾燥させ、白色の粉末の重量を記録した（表２）。
【０３６８】
【表２】
2014532799.tif 000030
【０３６９】
種々の画分を、方法を説明する箇所に記載されるように０．０１ＭのＮａＩＯ４との反応後に生成されたアルデヒド残基について分析した。表２に示されるように、全マンナン、３００ｋＤａ超、１００〜３００ｋＤａ、５０〜１００ｋＤａ、および３０〜５０ｋＤａの画分は、それぞれ、７３個、８２個、３５個、１９個、および９個のアルデヒド残基を産生する（例えば、泳動７）。
【０３７０】
実施例３：種々のマンナン画分のマンノ−ス受容体への結合
ｈｕｈ−７細胞は、マンノ−ス受容体を発現するヒト肝細胞癌細胞である。マンノ−ス−ＢＳＡは、マンノ−ス受容体に結合することで知られており、陽性対照としてこれらの研究に含まれた。全マンナンおよび種々の画分をＦＩＴＣで標識し、ｈｕｈ−７細胞への結合をフロ−サイトメトリ−で観察した（図５）。
【０３７１】
全マンナンおよび全ての画分は、用量依存的な様式でｈｕｈ−７細胞に結合した。したがって、大きさにかかわらず、全てのマンナン画分は、マンノ−ス受容体または他のマンノ−ス結合レクチンに結合する。
【０３７２】
実施例４：マンナンおよびマンナンの種々の画分によるＢＭＤＣの活性化
マンナンの種々の画分がＢＭＤＣを活性化し、かついずれかの画分が全マンナンよりも優れているかを確かめるために、画分をＤＣと共に、異なる用量で異なる時間インキュベ−トし、成熟マ−カ−ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６をフロ−サイトメトリ−で監視した（図６）。図６に示されるように、全ての画分が用量および時間依存的な様式でＤＣを活性化した。３００ｋＤａ超の画分が全マンナンよりも優れていた。
【０３７３】
実施例５：１０００ｋＤａ超のマンナン画分の単離
マンナンの３００ｋＤａ超の画分が全マンナンよりも効果的にＢＭＤＣを活性化したため、より高い分子量の画分を分析用に単離した。更により高い分子量の画分を単離するために、全マンナンを１，０００ｋＤａのカットオフ膜を有するＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ濃縮器に通した。種々の画分の収率が表３に示される。興味深いことに、３００〜１，０００ｋＤａの画分が大幅に減少し、１，０００ｋＤａ超のマンナンが先に単離された３００ｋＤａ超のマンナン画分よりも優位であることを示す。
【０３７４】
実施例６：１０００ｋＤａ超のマンナン画分の活性と全マンナンおよび３００ｋＤａ超のマンナン画分の活性の比較
種々の用量の１０００ｋＤａ超の画分のＢＭＤＣを刺激する能力を、フロ−サイトメトリ−で４８時間後にＣＤ４０およびＣＤ８６の上方制御を観察することによって測定した（それぞれ、図７Ａおよび７Ｂ）。１０００ｋＤａ超の画分を３００ｋＤａ超の画分および全マンナンと比較し、１０００ｋＤａ超の画分が全マンナンよりも優れており、３００ｋＤａ超の画分でも同様であったことが明らかであった。
【０３７５】
【表３】
2014532799.tif 000031
【０３７６】
実施例７：マンナン画分の分子量の分析
上記の通り、マンナンの種々の画分は、ＢＭＤＣを活性化し、マンノ−ス受容体に結合することができ、１０００ｋＤａ超のマンナン画分は、最も生物学的に活性な画分である。しかしながら、一組の仕様が設定され得るように画分の生化学的性質を分析する能力も画分の相対分子量を得る能力も重要である。本発明者は、種々のマンナンがＮａＩＯ４で酸化されるときに異なる数のアルデヒド基を生成することをすでに示している（表２および３）。
【０３７７】
マンナンのマンノ−ス含量を測定するレゾルシノ−ルアッセイもマンナンの異なる画分を特定する手段として使用され得る（図８）。
【０３７８】
マンナンは、電荷を有しない炭水化物であり、高親水性であり、結果として、タンパク質分析で用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を移動しない。高い頻度で、炭水化物は、分析のために電荷および疎水性を組み込むように化学修飾される。これらの性質を組み込むために、酸化されたマンナンをＡＮＴＳと反応させた。ネイティブＰＡＧＥゲル上でのＡＮＴＳで標識したマンナン画分の分析（図９）は、それらの相対分子量に基づいてはマンナンを分解しなかった。
【０３７９】
しかしながら、ＡＮＴＳ標識画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したとき、それらは分画した分子量と同様のパタ−ンで移動した（膜カットオフ）（図１０）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを走査し、密度測定分析に用いた（図１１）。通常のタンパク質標準物も用いた。これは、分子量範囲が異なる様式で定義されたタンパク質が拡散するバンド（広域バンド）に割り当てられることを可能にする。複数の分画泳動物由来のマンナンを分析してこの分析を実証した。標準曲線を既知の分子量（タンパク質またはマンナン画分）および相対移動度（Ｒｆ）から生成した。Ｒｆは、特異的バンドによって移動した距離で割った移動した総距離と定義される（図１２）。標準曲線に基づいて、種々のマンナン画分の相対分子量を計算した（図１３および１４）。
【０３８０】
実施例８：マンナンへのＭＵＣ１−ＦＰの結合
マンナンの種々の画分を、方法を説明する箇所に記載されるようにＭＵＣ１−ＦＰに結合した。生成されるアルデヒド基の分子量および数が画分と比較して全マンナンで異なるため、使用したＦＰの量をＭＵＣ１−ＦＰとアルデヒドのモル比として標準化した。加えて、様々な量のＭＵＣ１−ＦＰを結合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図１５）。
【０３８１】
実施例９：マウスにおける１０００超のＭＦＰおよびＭＦＰのインビボ活性
全マンナンおよび１０００ｋＤａ超のマンナンを上述のように調製し、インビボ免疫原性研究で使用した。
【０３８２】
全マンナンに結合したＭＵＣ１の免疫原性を確認するために、１０００ｋＤａ超のマンナン、結合体、またはＭＵＣ１−ＦＰを、０日目、１０日目、１７日目、および１４日目に１０μｇの用量でマウスに皮内注入した。マウスを安楽死させて、ＥＬＩＳｐｏｔ分析によって細胞性応答を分析した（図１６）。種々の用量のＭＵＣ１−ＦＰに対する抗原特異的ＩＦＮ−γ応答を、免疫したマウス由来の脾細胞培養物において測定した。図１６に示されるように、ＭＵＣ１−ＦＰ、ＭＦＰ、および１０００超のＭＦＰで免疫したマウスの間で細胞性応答に大きな差はなかった。免疫したマウス由来の血清を、抗ＭＵＣ１特異的総ＩｇＧ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａ抗体について試験した（図１７）。興味深いことに、１０００超のＭＦＰで免疫したマウスは、他の群と比較して、約１０倍高い抗ＭＵＣ１特異的ＩｇＧ２ａ力価を有した。同様のＩｇＧ２ａ偏向が２回の免役化後のマウス由来の血清において実証された（デ−タ示されず）。
【０３８３】
実施例１０：マンナンの特徴付けおよび可能な品質管理アッセイ
マンナンは、現在、Ｓｉｇｍａから供給されている。これは、製造品質管理基準（ＧＭＰ）水準のものではなく、与えられた情報のみが図１８に示される。酵母マンナンを製造業者から購入する場合、これが特定の水準を満たすことを確認することが重要である。ＰＤＰＨアッセイを用いてアルデヒドを測定し、レゾルシノ−ルアッセイを用いてマンノ−ス含量を測定し、ＡＮＴＳアッセイを用いてマンナンの種々のバッチを特徴付けることができる。
【０３８４】
Ｓｉｇｍａからのマンナンの５つのバッチをレゾルシノ−ルアッセイを用いて分析した。図１９Ａに示されるように、全てのバッチは同一の吸光度対濃度曲線を示し、マンナン中に同一のマンノ−ス含量が存在することを示す。図１９Ｂは、レゾルシノ−ルアッセイにおいてマンノ−スを用いた標準曲線を示す。同様に、５つのバッチ全てを、ＮａＩＯ４で酸化した後、アルデヒド残基について分析した（図２０）。
【０３８５】
３つの独立した測定結果から、アルデヒド残基の数が９０−１５５残基と異なることが分かる。したがって、マンナンの仕様は、生成されたアルデヒド残基が１２５±２０％である場合、合格であると設定され得る。同様の様式で、酸化されたマンナンを、蛍光測定のためにＰＤＰＨの代わりにＡＮＴＳと反応させてもよい（図２１）。興味深いことに、このアッセイにおける全てのバッチの変動も約±２０％である。
【０３８６】
実施例１１：炭水化物重合体−免疫調節物質結合体の合成
本発明の結合体は、図２２〜４４に例示される一般方法を使用して調整することができる。
【０３８７】
一実施形態において、免疫調節物質は、レシキモド（Ｒｅｓｑｕｉｍｏｄ）である。代替的な実施形態において、免疫調節物質は、ロキソリビンである。
【０３８８】
免疫調節物質は、酸化されたマンナン上の官能基と反応することが可能な第１の官能基および免疫調節物質上の官能基と反応することが可能な第２の官能基を有するリンカ−を介して、酸化されたマンナンに結合することができる。
【０３８９】
免疫調節物質は、リンカ−１またはリンカ−２を使用して、酸化されたマンナンに結合することができる。リンカ−１および２は、図２２または図３３に例示される方法を使用して調製することができる。
【０３９０】
レシキモドは、その遊離アミノ基または遊離ヒドロキシル基を通じて、リンカ−に結合することができる。リンカ−１およびリンカ−２は、それぞれ、レシキモドの遊離アミノ基およびレシキモドのヒドロキシル活性化誘導体との反応のために使用することができる（図２４および２５を参照されたい）。かかる誘導体は、レシキモド上の保護されたヒドラジド基を組み込んでもよく、それは脱保護し、酸化されたマンナンのアルデヒド基と反応させることができる。
【０３９１】
例えば、レシキモドで酸化されたマンナン結合体は、次のことによって調製することができる：
ｉ）マンナンを、先に詳述されたように、０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ６．０）緩衝液中、０．０１Ｍ  ＮａＩＯ４で酸化すること、
ｉｉ）酢酸緩衝液（ｐＨ４．５〜６．５）で平衡化したゲル濾過カラム（例えば、ＰＤ１０カラム）に通過させて、所望されない副生成物（ｂｉ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を除去すること、
ｉｉｉ）好適な溶媒中のヒドラジド官能化レシキモドを、酸化されたマンナンに滴加すること、
ｉｖ）（ステップｉｉｉ）の２〜１６時間後）リン酸緩衝食塩水で平衡化したゲル濾過カラムに通過させて、未反応のレシキモドを除去すること。
【０３９２】
酸化されたマンナンと反応させられたレシキモド分子の数は、分光測光法によって定量化することができる。レシキモドで酸化されたマンナン結合体は次いで、生物学的アッセイ、または処理方法において使用してもよい。
【０３９３】
ロキソリビン（Ｌｏｘｒｉｂｉｎｅ）は、そのアミノ基またはその第一級もしくは第二級ヒドロキシル基を通じて、リンカ−に結合することができる。ヒドロキシル基は、好適に活性化することができる。しかしながら、他のヒドロキシル基を反応から好適に保護することは必要でない。リンカ−１およびリンカ−２は、それぞれ、ロキソリビン（Ｌｏｘｒｉｂｉｎｅ）の遊離アミノ基およびロキソリビン（Ｌｏｘｒｉｂｉｎｅ）のヒドロキシル活性化誘導体との反応のために使用することができる。（図２６〜２８を参照されたい）。一旦、ヒドラジド誘導体が得られると、レシキモドについて上述されるように、それらは、酸化されたマンナンに結合させるために使用することができる。
【０３９４】
Ｒ−８４８の合成
Ｒ−８４８は、図３１に例示される方法を使用してに例示される方法を使用して、また下に記載されるように、調製することができる。調製することができる。
【０３９５】
【化２５】
2014532799.tif 000032
【０３９６】
回転子を充填した丸底フラスコに、ＮＨ４ＯＨ（６０ｍＬ）、イソブチレンオキシド（１０．０ｇ、１３８．６ｍｍｏｌ）、およびＭｅＯＨ（１２５ｇ）を添加した。混合物を室温で１２時間攪拌し、次いでそれを、６０℃まで緩徐に加熱し、２〜３時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を、大気圧下で蒸留して、所望の生成物（３．０ｇ、３３％）を得た。
【０３９７】
【化２６】
2014532799.tif 000033
【０３９８】
化合物２−１（８０ｇ、０．５ｍｏｌ）のＨＮＯ３（１３０ｍＬ）およびＨＯＡｃ（５００ｍＬ）中の混合物を、１０５℃で１時間攪拌した。次いでそれを室温まで冷却し、反応物を、水の添加によって反応停止処理した。固体を沈殿させ、濾過して、黄色の生成物２−２（６０ｇ、５８％）を得た。
【０３９９】
【化２７】
2014532799.tif 000034
【０４００】
２−２（１０ｇ、４８．５ｍｍｏｌ）のＰＯＣｌ３（８０ｍＬ）中の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（４．８５ｇ、４８．５ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を１２０℃まで加熱し、３時間攪拌し、次いで溶媒を真空下で除去した。残基を氷水中に注ぎ、ＤＣＭで抽出した。有機相をＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過した。濾液を濃縮し、所望の生成物を得た（３０ｇ、６８％）。
【０４０１】
【化２８】
2014532799.tif 000035
【０４０２】
２−３（１０ｇ、４１ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（５ｇ、４９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ中の溶液に、２−ａ（３ｇ、３４ｍｍｏｌ）を滴加した。混合物を、４０℃で１２時間攪拌した。溶液を室温まで冷却し、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過した。濾液を濃縮し、粗生成物を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィ−（ＰＥ：ＥＡ＝１：１）による更なる精製により、６．０ｇの所望の生成物（収率５０％）を得た。
【０４０３】
【化２９】
2014532799.tif 000036
【０４０４】
化合物２−４（６ｇ、２０ｍｍｏｌ）、Ｐｔ／Ｃ（８００ｍｇ）のＥＡ中の混合物を、室温で４時間水素化した。次いで混合物を濾過し、濾液を濃縮して、所望の生成物２−５（５．７ｇ）を得た。
【０４０５】
【化３０】
2014532799.tif 000037
【０４０６】
２−５（５．７ｇ、２１．５ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（４ｇ、４０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１００ｍＬ）中の溶液に、化合物２−エトキシアセチルクロリド（３ｇ）を添加した。混合物を３時間攪拌し、次いでそれを飽和ブラインで洗浄した。有機層を濃縮し、残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ−（ＥＡ：ＰＥ＝１：２）によって精製した。所望の生成物を得た（３．７ｇ、５０％）。
【０４０７】
【化３１】
2014532799.tif 000038
【０４０８】
化合物２−６（１．８７ｇ、５．３ｍｍｏｌ）のＮＨ３／ＭｅＯＨ中の混合物を、オ−トクレ−ブ中に密閉し、１６０℃で８時間攪拌した。次いで溶媒を除去し、残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ−（ＥＡ／ＴＥＡ  ９５：５）によって精製した。所望の生成物Ｒ−８４８（１．５ｇ）を得た。
【０４０９】
ＰＥＧ−Ａの合成
ＰＥＧ−Ａは、図３２に例示される方法を使用して、また下に記載されるように、調製することができる。
【０４１０】
【化３２】
2014532799.tif 000039
【０４１１】
ＰＥＧ−Ａ−１（３０ｇ、９３ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ（３６．５２ｇ、１３８ｍｍｏｌ）の、攪拌したＤＣＭ中の０℃の溶液に、ＨＯＳｕ（１２．７２ｇ、１１１．７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、氷浴中で３０分間攪拌した。次いで溶液を室温まで暖めさせ、１５時間攪拌した。混合物をＨ２Ｏ、１Ｎ水性ＨＣｌおよび飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を蒸発させて、３６．５ｇの粗ＰＥＧ−Ａ−２を得た。
【０４１２】
【化３３】
2014532799.tif 000040
２．ＰＥＧ−Ａ−３の調製
【０４１３】
ＳＭ−１（２４．７１ｇ、１００．３２ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ３（８．４３ｇ、１００．３２ｍｍｏｌ）の５０ｍＬＨ２Ｏ中の溶液に、ＰＥＧ−Ａ−２（８３．６ｇ、３６．５ｍｍｏｌ）を添加し、それを、５０ｍＬＤＭＥ中に溶解させた。混合物を室温１５時間で攪拌し、真空下で蒸発させた。残基を１００ｍＬ  ＥＡ中に溶解させ、１Ｎ水性ＨＣｌの添加によってｐＨを２〜３に調整し、反応混合物をＨ２Ｏで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で蒸発させ、ＰＥ／ＥＡ＝１：１で溶出するカラムクロマトグラフィ−によって精製して、薄黄色の固体ＰＥＧ−Ａ−３（１５．２ｇ、７０％）を得た。
【０４１４】
【化３４】
2014532799.tif 000041
【０４１５】
１Ｌ丸底フラスコに、ＰＥＧ−Ａ−３（９．５ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）、ＳＭ−２（４．０４ｇ、３３．４ｍｍｏｌ）、ＥＥＤＱ（８．２６ｇ、３３．４ｍｍｏｌ）、ＤＣＭ（３００ｍＬ）、およびＭｅＯＨ（１００ｍＬ）を充填した。混合物を室温で一晩攪拌し、１Ｎ水性ＨＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、カラムクロマトグラフィ−によって精製して、薄黄色の固体ＰＥＧ−Ａ−４（４ｇ、４０％）を得た。
【０４１６】
【化３５】
2014532799.tif 000042
【０４１７】
１Ｌ丸底フラスコ（ｆｌａｎｋ）に、ＰＥＧ−Ａ−４（４．５ｇ、６．６８ｍｍｏｌ）、ジエチルアミン（７．３３ｇ、１００．２ｍｍｏｌ）、ＤＣＭ（２００ｍＬ）、ＭｅＣＮ（２００ｍＬ）を充填した。混合物を、０℃で２時間攪拌し、次いで室温で１５時間攪拌した。ＴＬＣにより、出発物質が微量であることが示され、混合物を１Ｎ水性ＨＣｌ、Ｈ２Ｏで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィ−によって精製して、ＰＥＧ−Ａ（１．５ｇ、６５％）を得た。
【０４１８】
【化３６】
2014532799.tif 000043
【０４１９】
手順は、ＰＥＧ−Ａ−４と同じであった。
【０４２０】
【化３７】
2014532799.tif 000044
【０４２１】
手順は、ＰＥＧ−Ａと同じであった。
【０４２２】
Ｌ−１およびリンカ−−１の合成
【０４２３】
Ｌ−１およびリンカ−−１は、図３３に例示される方法を使用して、また下に記載されるように、調製することができる。
【０４２４】
【化３８】
2014532799.tif 000045
【０４２５】
ＰＥＧ−Ｂ−１（１１ｇ、３０ｍｍｏｌ）、固体ＫＯＨ（６．７２ｇ、１２０ｍｍｏｌ）、およびｎ−Ｂｕ４ＮＨＳＯ４（１．３ｇ、３．６ｍｍｏｌ）のトルエン（１６０ｍＬ）中の溶液に、ブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（１８ｍＬ、１２０ｍｍｏｌ）を０℃で滴加した。反応混合物を、０℃で１時間、次いで室温で４時間攪拌し、濾過し、水、飽和ＮＨ４Ｃｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、飽和ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて、ＰＥＧ−Ｂ−２（１２ｇ、収率７０％）を得た。
【０４２６】
【化３９】
2014532799.tif 000046
【０４２７】
ＰＥＧ−Ｂ−２（６ｇ、１０ｍｍｏｌ）のＴＦＡ／ＤＣＭ（５ｍＬ／５ｍＬ）中の混合物を、室温で２時間攪拌した。ＴＬＣにより、反応が終了したことが示された。蒸発させて、定量的にＰＥＧ−Ｂ−３を得、次のステップのために直接使用した。
【０４２８】
【化４０】
2014532799.tif 000047
【０４２９】
ＰＥＧ−Ｂ−３（１．２ｇ、２．４ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．８ｇ、２．１ｍｍｏｌ）の１０ｍＬ  ＴＨＦ中の溶液に、ＰＥＧ−Ａ（０．９ｇ、２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．４７ｇ、３．６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で２時間攪拌し、真空下で蒸発させ、残渣を１００ｍＬ  ＥＡ中に溶解させた。溶液を、飽和ＮＨ４Ｃｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、飽和ＮａＣｌで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４、上で乾燥させ、減圧下で蒸発させて、粗Ｌ−２を得、それを次のステップのために直接使用した。
【０４３０】
【化４１】
2014532799.tif 000048
【０４３１】
Ｌ−２ａの調製は、Ｌ−２と同じである。
【０４３２】
【化４２】
2014532799.tif 000049
【０４３３】
Ｌ−２（４．６ｇ、５ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（２．３ｇ、６ｍｍｏｌ）の２０ｍＬ  ＤＭＦ中の溶液に、ＢｏｃＮＨＮＨ２（１．３２ｇ、１０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．７７ｇ、６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で２時間攪拌した。混合物を真空下で蒸発させ、残渣を１００ｍＬ  ＥＡ中に溶解させた。混合物を、飽和ＮＨ４Ｃｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、飽和ＮａＣｌで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で蒸発させて、粗Ｌ−１を得、それを次のステップのために直接使用した。
【０４３４】
【化４３】
2014532799.tif 000050
【０４３５】
Ｌ−１ａの調製は、Ｌ−１と同じである。
【０４３６】
Ｌ−１ａ〜Ｌ−１手順：
Ｌ−１ａ（４ｇ粗、１ｍｍｏｌ）の２０ｍＬ  ＤＣＭ中の溶液に、ＴＢＡＦ（２．２ｇ、８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、室温で２４時間攪拌し、次いでそれを飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させ、カラムクロマトグラフィ−によって精製して、Ｌ−１（１．１ｇ）を得た。
【０４３７】
【化４４】
2014532799.tif 000051
【０４３８】
Ｌ−１（３１０ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）、ピリジン（２３７ｍｇ、３ｍｍｏｌ）の０℃の２ｍＬ  ＤＣＭ中の溶液に、ＰＮＰ−Ｃｌ（４８５ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）の２ｍＬ  ＤＣＭ中の溶液を滴加した。混合物を室温で２０時間攪拌した。溶液をブラインで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させ、カラムクロマトグラフィ−（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝２５：１）によって精製して、リンカ−−１（１００ｍｇ）を得た。
【０４３９】
ロキソリビンの合成
ロキソリビンＡは、図３４に例示される方法を使用して、また下に記載されるように、調製することができる。
【０４４０】
１．ロキソリビンの調製
【０４４１】
ＮａＨ（４．２ｇ、１７６ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（３００ｍＬ）中の溶液に、プロプ−２−エン−１−オ−ル（３０ｍＬ）および８−ブロモグアノシン（１５ｇ、４１．４ｍｍｏｌ）を一度に添加した。混合物を６５℃で３時間攪拌し、冷却させ、次いでＥＡ（１０００ｍＬ）を添加し、濾過した。固体を収集し、ＥＡで洗浄し、次いでＨ２ＯおよびＡｃＯＨ（５：１、９０ｍＬ）中に氷浴で溶解させた。混合物を３０分間攪拌し、濾過し、固体（３−０）を、精製することなく次のステップのために使用した。
【０４４２】
上の固体（３−０）をＨ２ＯおよびＭｅＯＨ（１：１、３００ｍＬ）中に溶解させた。混合物を５時間還流させ、次いで蒸発させて、粗ロキソリビン（１０．７ｇ、２ステップで収率７６％）を得た。
【０４４３】
ｄ４−３の合成
誘導体４−３は、図３５に例示される方法を使用して、また下に記載されるように、調製することができる。
【０４４４】
【化４５】
2014532799.tif 000052
【０４４５】
ロキソリビン（２ｇ、６ｍｍｏｌ）およびイミダゾ−ル（８２０ｍｇ、１２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍＬ、乾燥）中の溶液に、ＴＩＰＤＳ−Ｃｌ（２ｍＬ）を滴加した。次いで混合物を室温で４時間攪拌した。ＥＡを添加し、有機相を、飽和ＮａＨＣＯ３、飽和ブラインで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させ、カラムクロマトグラフィ−（ＰＥ：ＥＡ＝１：１）によって精製して、ｄ４−１（９００ｍｇ）を得た。
【０４４６】
【化４６】
2014532799.tif 000053
【０４４７】
ｄ４−１（８７０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）およびピリジン（１．２ｇ、１５ｍｍｏｌ）の０℃の１５ｍＬ  ＤＣＭ中の溶液に、ＰＮＰ−Ｃｌ（３ｇ、１５ｍｍｏｌ）の５ｍＬ  ＤＣＭ中の溶液を滴加した。混合物を室温で１０時間攪拌し、飽和ＮａＣｌで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させて、所望の粗生成物を得、それを次のステップのために直接使用した。
【０４４８】
【化４７】
2014532799.tif 000054
【０４４９】
ｄ４−２（３８０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）およびピリジン（４００ｍｇ、５ｍｍｏｌ）の５ｍＬ  ＤＣＭ中の溶液に、ＳＭ−４（５３０ｍｇ、６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で４時間攪拌し、Ｈ２Ｏ、飽和ブラインで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させ、カラムクロマトグラフィ−（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝５：１）によって精製して、ｄ４−３（１００ｍｇ）を得た。
【０４５０】
ｄ４−３とリンカ−１との反応、および脱保護により、誘導体４が得られる。
【０４５１】
ｄ５−２およびｄ５−３の合成
誘導体５−２  ５−３は、図３６に例示される方法を使用して、また下に記載されるように、調製することができる。
【０４５２】
【化４８】
2014532799.tif 000055
【０４５３】
ロキソリビン（２．５ｇ、７．４ｍｍｏｌ）、２，２−ジメトキシプロパン（１４．１ｇ、１３４．７ｍｍｏｌ）、およびＣＳＡ（１．８９ｇ、８．２ｍｍｏｌ）の５０ｍＬアセトン中の混合物を、３５℃で５時間攪拌し、蒸発させ、カラムクロマトグラフィ−（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１）によって精製して、ｄ５−１（１．５ｇ、収率５５％）を得た。
【０４５４】
【化４９】
2014532799.tif 000056
【０４５５】
ｄ５−１（８６０ｍｇ、２．２７ｍｍｏｌ）およびピリジン（１．８ｇ、２２．７ｍｍｏｌ）の０℃の２５ｍＬ  ＤＣＭ中の溶液に、ＰＮＰ−Ｃｌ（２．８３ｇ、１４ｍｍｏｌ）の１５ｍＬ  ＤＣＭ中の溶液を滴加した。混合物を室温で１０時間攪拌した。溶液をブラインで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させ、カラムクロマトグラフィ−（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝３００：１〜１００：１）によって精製して、ｄ５−２（６２０ｍｇ、収率５０％）を得た。
【０４５６】
【化５０】
2014532799.tif 000057
【０４５７】
ｄ５−２（６４０ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ）の１５ｍＬ  ＤＣＭ中の溶液に、ＳＭ−４（２１０ｍｇ、２．３６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１時間攪拌した。溶液をＨ２Ｏ、ブラインで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させ、カラムクロマトグラフィ−（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝５：１）によって精製して、ｄ５−３（３００ｍｇ）を得た。
【０４５８】
ｄ５−３とリンカ−１との反応、および脱保護により、誘導体５が得られる。
【０４５９】
実施例１２：炭水化物重合体−免疫調節物質結合体の合成
更なるレシキモド（Ｒｅｓｑｕｉｍｏｄ）誘導体（Ｒｄ１−Ｒｄ３と称される）およびロキソリビン誘導体（ｄｅｒｉｖｉｔａｉｖｅｓ）（Ｌｄ１−Ｌｄ１０と称される）は、それぞれ、図３７および３８に例示される。
【０４６０】
Ｌｄ１の合成
Ｌｄ１は、図３９に例示される方法を使用して、また下に記載されるように、調製することができる。
【０４６１】
【化５１】
2014532799.tif 000058
【０４６２】
６−クロロニコチン酸（５ｇ、３２ｍｍｏｌ））のＥｔＯＨ（５０ｍＬ）中の溶液に、ヒドラジン水和物（３．７ｍＬ、８０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、攪拌しながら４８時間加熱還流させた。混合物を、室温まで冷却させて、灰色の沈殿物を得、それを濾過によって収集し、次いでＥｔＯＨおよび石油エ−テル／ＥｔＯＡｃ（２：１）で洗浄して、２ｇの固体（４０％）を得た。
【０４６３】
ＬＣ−ＭＳ：ＣＰ−０００７０２３−００１：（ＥＳ、ｍ／ｚ）：１５４［Ｍ＋Ｈ］＋
【０４６４】
【化５２】
2014532799.tif 000059
【０４６５】
６−ヒドラジニルニコチン酸（３ｇ、１９．６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２０ｍＬ）の懸濁液に、ＴＥＡ（２．９７ｇ、２９．４ｍｍｏｌ）およびＢｏｃ２Ｏ（４．７ｇ、２１．６ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を、攪拌しながら６５℃まで１５時間加熱した。懸濁液を水（２０ｍＬ）中に注ぎ、ＨＣｌ（１Ｍ）でｐＨを６に調整し、次いで逆相バイオタ−ジによって精製して、１．２ｇの固体（２４％）を得た。
【０４６６】
ＬＣ−ＭＳ：ＣＰ−０００７０２３−００８：（ＥＳ、ｍ／ｚ）：２５４［Ｍ＋Ｈ］＋
【０４６７】
【化５３】
2014532799.tif 000060
【０４６８】
７−アリル−２−アミノ−９−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−１Ｈ−プリン−６，８（７Ｈ，９Ｈ）−ジオン（１．１ｇ、３．２４ｍｍｏｌ）および２，２−ジメトキシプロパン（６．７５ｇ、６４．９ｍｍｏｌ）のアセトン（４０ｍＬ）中の懸濁液に、（＋／−）−カンファ−−１０−スルホン酸（３０１ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を、攪拌しながら３５℃まで２時間加熱した。混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフィ−（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２＝２０：１）によって精製して、白色の固体生成物（７１０ｍｇ、５８％）を得た。
【０４６９】
ＬＣ−ＭＳ：ＣＰ−０００７０２３−０４５：（ＥＳ、ｍ／ｚ）：３８０［Ｍ＋Ｈ］＋
【０４７０】
【化５４】
2014532799.tif 000061
【０４７１】
６−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラジニル）ニコチン酸（６６８ｍｇ、２．６３ｍｍｏｌ）のトルエン（１０ｍＬ、無水）中の懸濁液に、２，４，６−トリクロロベンゾイルクロリド（９５９ｍｇ、３．９５ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６７９ｍｇ、５．６２ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を１０分間攪拌し、次いで７−アリル−２−アミノ−９−（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（ヒドロキシメチル）−２，２−ジメチル−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソ−ル−４−イル）−１Ｈ−プリン−６，８（７Ｈ，９Ｈ）−ジオン（５００ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（３２１ｍｇ、２．６３ｍｍｏｌ）のトルエン（１０ｍＬ、無水）中の懸濁液を添加した。懸濁液を１５時間攪拌し、次いでブラインで反応停止処理した。水性相をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ×３）で抽出した。有機相を組み合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残基を逆相バイオタ−ジによって精製して、白色の固体生成物（３９０ｍｇ、４８％）を得た。
【０４７２】
ＬＣ−ＭＳ：ＣＰ−０００７０２３−０７０：（ＥＳ、ｍ／ｚ）：６１５［Ｍ＋Ｈ］＋
【０４７３】
【化５５】
2014532799.tif 000062
【０４７４】
（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（７−アリル−２−アミノ−６，８−ジオキソ−１，６，７，８−テトラヒドロプリン−９−イル）−２，２−ジメチル−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソ−ル−４−イル）メチル６−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラジニル）ニコチン酸塩（２２０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を、過塩素酸（６．６ｍＬ、１０％）およびＴＨＦ（１３．２ｍＬ）の混合物に添加した。混合物を、マイクロ波によって４０℃で１時間反応させた。混合物を水（１０ｍＬ）中に注ぎ、ＮａＨＣＯ３（水溶液）でｐＨを８に調整し、ＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ×３）で抽出した。有機相を組み合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残基を逆相バイオタ−ジによって精製して、白色の固体生成物（５６ｍｇ、２７％）を得た。
【０４７５】
ＬＣ−ＭＳ：ＣＰ−０００７０２３−１０９：（ＥＳ、ｍ／ｚ）：５７５［Ｍ＋Ｈ］＋
【０４７６】
【化５６】
2014532799.tif 000063
【０４７７】
（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（７−アリル−２−アミノ−６，８−ジオキソ−１，６，７，８−テトラヒドロプリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシ−テトラヒドロフラン−２−イル）メチル６−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラジニル）ニコチン酸塩（２５０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）およびＴＥＳ（１２．５ｍＬ）のＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）中の溶液に、ＴＦＡ（１０ｍＬ）を０℃で滴加した。混合物を、０℃で２．５時間攪拌し、次いで減圧下で濃縮した。残基を逆相バイオタ−ジによって精製して、白色の固体生成物（４０ｍｇ、１７％）を得た。
【０４７８】
ＬＣ−ＭＳ：ＣＰ−０００７０２３−１１７：（ＥＳ、ｍ／ｚ）：４７５［Ｍ＋Ｈ］＋
【０４７９】
１Ｈ  ＮＭＲ：ＣＰ−０００７０２３−１１７：１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、５００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）１０．９５３（ｓ、１Ｈ）、８．５８５−８．５８１（ｄ、Ｊ＝２Ｈｚ、１Ｈ）、８．４０８（ｓ、１Ｈ）、７．８９５−７．８７４（ｄｄ、Ｊ＝２、９Ｈｚ、１Ｈ）、６．７２１−６．７０７（ｄ、Ｊ＝７Ｈｚ、１Ｈ）、６．５８７（ｓ、２Ｈ）、５．９２３−５．８５７（ｍ、１Ｈ）、５．６２７−５．６１９（ｄ、Ｊ＝４Ｈｚ、１Ｈ）、５．３７９−５．３６８（ｄ、Ｊ＝５．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．１３５−５．０１６（ｍ、３Ｈ）、４．８１１−４．８７２（ｍ、１Ｈ）、４．４２９−４．３５５（ｍ、６Ｈ）、４．２９５−４．２５９（ｍ、１Ｈ）、４．０２０−３．９８８（ｍ、１Ｈ）。
【０４８０】
Ｌｄ２の合成
Ｌｄ２は、図４０に例示される方法を使用して、また下に記載されるように、調製することができる。
【０４８１】
【化５７】
2014532799.tif 000064
【０４８２】
（Ｓ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−３−メチルブタン酸（５ｇ、１５ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシピロリジン−２，５−ジオン（１．８ｇ、１７ｍｍｏｌ））を、乾燥ＴＨＦ（４０ｍＬ）中に溶解させた。乾燥ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のＤＣＣ（３．４ｇ、１７ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、懸濁液を０℃で４時間攪拌した。固体を濾去し、濾液を、カラムクロマトグラフィ−（ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝３：１）によって精製して、２．５６ｇの固体（４０％）を得た。
【０４８３】
ＬＣ−ＭＳ：ＣＰ−０００７３４９−０１１：（ＥＳ、ｍ／ｚ）：４５９［Ｍ＋Ｎａ］＋
【０４８４】
【化５８】
2014532799.tif 000065
【０４８５】
（Ｓ）−２−アミノ−６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸（５２４ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ））のアセトン（１０ｍＬ）およびＮａＨＣＯ３（Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ）中６１６ｍｇ、７．３４ｍｍｏｌ）中の懸濁液に、（Ｓ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−３−メチルブタノエ−ト（８００ｍｇ、１．８３ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を１８時間攪拌し、次いでＥｔ２Ｏ（１０ｍＬ）で洗浄した。ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）を混合物に添加し、ＨＣｌ（１Ｍ）でｐＨを５に調整した。有機相を収集し、水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、８２０ｍｇの固体（７８％）を得た。
【０４８６】
ＬＣ−ＭＳ：ＣＰ−０００７０２３−１０４：（ＥＳ、ｍ／ｚ）：５６８［Ｍ＋Ｈ］＋
【０４８７】
【化５９】
2014532799.tif 000066
【０４８８】
（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸（１ｇ、１．７６ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１．１４ｇ、８．８２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２０ｍＬ）中の溶液に、ＢｎＢｒ（８９９ｍｇ、５．２９ｍｍｏｌ）を０℃で滴加した。混合物を室温で３時間攪拌した。混合物を水（１５０ｍＬ）中に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ×３）で抽出した。有機相を組み合わせ、水（５０ｍＬ）で洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残基を、カラムクロマトグラフィ−（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２＝１：９９）によって精製して、白色の固体生成物（９８０ｍｇ、８４％）を得た。
【０４８９】
ＬＣ−ＭＳ：ＣＰ−０００７３４９−０６２：（ＥＳ、ｍ／ｚ）：６５８［Ｍ＋Ｈ］＋
【０４９０】
【化６０】
2014532799.tif 000067
４．（Ｓ）−ベンジル２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサノエ−トの合成
【０４９１】
（Ｓ）−ベンジル２−（（Ｓ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサノエ−ト（９５０ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）中の溶液に、ピペリジン（１．２３ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を３時間攪拌し、次いで減圧下で濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィ−によって精製して、白色の固体生成物（３３０ｍｇ、５２％）を得た。
【０４９２】
ＬＣ−ＭＳ：ＣＰ−０００７３４９−０６７：（ＥＳ、ｍ／ｚ）：４３６［Ｍ＋Ｈ］＋
【０４９３】
【化６１】
2014532799.tif 000068
【０４９４】
ジヒドロ−３Ｈ−ピラン−２，６−ジオン（２５０ｍｇ、２．１９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中の溶液に、ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジンカルボキシレ−ト（２９０ｍｇ、２．１９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）の溶液を滴加した。混合物を２時間攪拌し、次いで減圧下で濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィ−によって精製して、油生成物（１９０ｍｇ、３５％）を得た。
【０４９５】
１Ｈ−ＮＭＲ−ＣＰ−０００７０２３−１６９：１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、５００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）１２．０５２（ｓ、１Ｈ）、９．４８０（ｓ、１Ｈ）、８．６５４（ｓ、１Ｈ）、２．２４９−２．２１８（ｔ、Ｊ＝７．５、１５．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．１０５−２．００７（ｔ、Ｊ＝７、１４Ｈｚ、２Ｈ）、１．７４１−１．６８２（ｍ、２Ｈ）、１．３９１（ｓ、９Ｈ）。
【０４９６】
【化６２】
2014532799.tif 000069
【０４９７】
５−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラジニル）−５−オキソペンタン酸（３３９ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（８ｍＬ）中の溶液に、ＤＩＰＥＡ（１．３３ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（３９７ｍｇ、２．０７ｍｍｏｌ）、およびＨＯＢｔ（１８６ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１．５時間攪拌し、次いで（Ｓ）−ベンジル２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサノエ−ト（３００ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１６８ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１６時間攪拌した。混合物を水（１００ｍＬ）中に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ×３）で抽出した。有機相を組み合わせ、水（１５ｍＬ）で洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮し、カラムクロマトグラフィ−（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２＝３：９７）によって精製して、白色の固体生成物（１５０ｍｇ、３３％）を得た。
【０４９８】
ＬＣ−ＭＳ：ＣＰ−０００７３４９−０６９：（ＥＳ、ｍ／ｚ）：６６４［Ｍ＋Ｈ］＋
【０４９９】
【化６３】
2014532799.tif 000070
【０５００】
１１（１４０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）中の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（４０ｍｇ、１０％）を添加した。懸濁液を、Ｈ２大気下で、攪拌しながら３時間かき混ぜた。触媒を濾過によって除去し、濾液を減圧下で濃縮して、白色の固体生成物（９６ｍｇ、８０％）を得た。
【０５０１】
ＬＣ−ＭＳ：ＣＰ−０００７３４９−０６９：（ＥＳ、ｍ／ｚ）：５７４［Ｍ＋Ｈ］＋
【０５０２】
【化６４】
2014532799.tif 000071
【０５０３】
２−ブロモエタンアミン臭化水素酸塩（１０ｇ、４８．８ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１９０ｍＬ）中の懸濁液に、ＴＥＡ（１２．３４ｇ、１２１．９５ｍｍｏｌ）およびＢｏｃ２Ｏ（１１．７２ｇ、５３．７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１６時間攪拌し、水およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、８．７ｇの油を得た（精製することなく次のステップのために使用した）。
【０５０４】
【化６５】
2014532799.tif 000072
【０５０５】
ｔｅｒｔ−ブチル２−ブロモエチルカルバメ−ト（９ｇ、４０．３ｍｍｏｌ）およびメチルアミン（４１．７ｇ、４０３ｍｍｏｌ、ＥｔＯＨ中３０％）のＥｔＯＨ（８０ｍＬ）中の溶液に、ＫＩ（１４０ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、攪拌しながら５０℃まで５時間加熱し、次いで減圧下で濃縮し、残基を水中に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（３×８０ｍＬ）で抽出した。有機相を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒の除去により、４．３ｇの油を得た（精製することなく次のステップのために使用した）。
【０５０６】
ＬＣ−ＭＳ：ＣＰ−０００７０２３−１２８：（ＥＳ、ｍ／ｚ）：１７５［Ｍ＋Ｈ］＋
【化６６】
2014532799.tif 000073
【０５０７】
ｔｅｒｔ−ブチル２−（メチルアミノ）エチルカルバメ−ト（４．３ｇ、０．４４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（６０ｍＬ）中の溶液に、ＴＥＡ（５．４９ｇ、５４．３ｍｍｏｌ）およびＣｂｚＣｌ（４．６２ｇ、２７．１ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を、０℃で４時間攪拌し、次いで水（１００ｍＬ）中に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（３×８０ｍＬ）で抽出した。有機相を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、残渣を逆相バイオタ−ジによって精製して、油生成物（２．５ｇ、３３％）を得た。
【０５０８】
ＬＣ−ＭＳ：ＣＰ−０００７０２３−１３０：（ＥＳ、ｍ／ｚ）：３３１［Ｍ＋Ｎａ］＋
【０５０９】
【化６７】
2014532799.tif 000074
【０５１０】
化合物１６（１．３ｇ、４．２２ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（３０ｍＬ）中の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（１５０ｍｇ、１０％）を添加した。懸濁液を、Ｈ２大気下で、攪拌しながら２時間かき混ぜた。触媒を、濾過によって除去し、濾液を減圧下で濃縮して、油生成物（７２０ｍｇ、９８％）を得た。
【０５１１】
１Ｈ  ＮＭＲ：ＣＰ−０００７０２３−１１７：１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、５００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）６．７０７（ｓ、１Ｈ）、２．９９９−２．９６２（ｑ、Ｊ＝６．５、１２．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．４８８−２．４６１（ｔ、Ｊ＝７、１３．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．２４７（ｓ、３Ｈ）、１．３６９（ｓ、９Ｈ）。
【０５１２】
【化６８】
2014532799.tif 000075
【０５１３】
７−アリル−２−アミノ−９−（（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ，６ａＳ）−６−（ヒドロキシメチル）−２，２−ジメチル−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソ−ル−４−イル）−１Ｈ−プリン−６，８（７Ｈ，９Ｈ）−ジオン（１．４ｇ、３．７ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（３６ｍＬ）中の懸濁液に、ピリジン（２．９２ｇ、３７ｍｍｏｌ）を添加し、懸濁液を０．５時間攪拌し、次いで４−ニトロフェニルカルボノクロリデ−ト（４．４８ｇ、２２．２ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（２４ｍＬ）中の溶液を０℃で滴加した。混合物を室温で５時間攪拌し、次いで減圧下で濃縮した。残基をＣＨ２Ｃｌ２（７０ｍＬ）中に溶解させ、ブライン（飽和）で洗浄し、有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残基を逆相バイオタ−ジによって精製して、黄色の固体生成物（１．２ｇ、５５％）を得た。
【０５１４】
ＬＣ−ＭＳ：ＣＰ−０００７０２３−１７２：（ＥＳ、ｍ／ｚ）：５４５［Ｍ＋Ｈ］＋
【０５１５】
【化６９】
2014532799.tif 000076
【０５１６】
（（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ，６ａＳ）−６−（７−アリル−２−アミノ−６，８−ジオキソ−１，６，７，８−テトラヒドロプリン−９−イル）−２，２−ジメチル−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソ−ル−４−イル）メチル４−ニトロフェニル炭酸塩（１．１ｇ、２ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中の溶液に、ｔｅｒｔ−ブチル２−（メチルアミノ）エチルカルバメ−ト（７０４ｍｇ、４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で２時間攪拌し、次いでブライン（飽和）で洗浄した。有機相を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、逆相バイオタ−ジによって精製して、黄色の固体生成物（９１０ｍｇ、７８％）を得た。
【０５１７】
ＬＣ−ＭＳ：ＣＰ−０００７０２３−１７５：ＥＳ、ｍ／ｚ）：５８０［Ｍ＋Ｈ］＋
【０５１８】
【化７０】
2014532799.tif 000077
【０５１９】
２１（１ｇ、１．７３ｍｍｏｌ）およびＴＥＳ（３．４ｍＬ）のＣＨ２Ｃｌ２（１６．５ｍＬ）中の溶液に、ＴＦＡ（３．４ｍＬ）を０℃で滴加した。混合物を０℃で２時間攪拌し、次いで減圧下で濃縮した。残基をＥｔ２Ｏで洗浄して、白色の固体生成物（９２０ｍｇ、９０％）を得た。
【０５２０】
ＬＣ−ＭＳ：ＣＰ−０００７０２３−１７９：（ＥＳ、ｍ／ｚ）：４８０［Ｍ＋Ｈ］＋
【０５２１】
【化７１】
2014532799.tif 000078
【０５２２】
（１３Ｓ，１６Ｓ）−１３−イソプロピル−２，２，２４，２４−テトラメチル−４，７，１１，１４，２２−ペンタオキソ−３，２３−ジオキサ−５，６，１２，１５，２１−ペンタアザペンタコサン−１６−カルボン酸（１９７ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍＬ）中の溶液に、ＤＩＰＥＡ（２９６ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（１３２ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）、およびＨＯＢｔ（６２ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１．５時間攪拌し、次いで（（３ａＳ，４Ｓ，６Ｓ，６ａＳ）−６−（７−アリル−２−アミノ−６，８−ジオキソ−１，６，７，８−テトラヒドロプリン−９−イル）−２，２−ジメチル−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソ−ル−４−イル）メチル２−アミノエチル（メチル）カルバメ−ト（１１０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（５６ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１６時間攪拌した。混合物を水（５０ｍＬ）中に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ×３）で抽出した。有機相を組み合わせ、水（１５ｍＬ）で洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残基を、分取ＨＰＬＣによって精製して、白色の固体生成物（４３ｍｇ、２３％）を得た。
【０５２３】
ＬＣ−ＭＳ：ＣＰ−０００７３４９−０６９：（ＥＳ、ｍ／ｚ）：１０３５［Ｍ＋Ｈ］＋
【０５２４】
【化７２】
2014532799.tif 000079
【０５２５】
化合物２３（３０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）およびＴＥＳ（０．５ｍＬ）のＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）中の溶液に、ＴＦＡ（０．５ｍＬ）を０℃で滴加した。混合物を、攪拌しながら室温まで４時間加温し、次いで減圧下で濃縮した。残基を、分取ＨＰＬＣによって精製して、白色の固体生成物（４ｍｇ、１７％）を得た。
【０５２６】
ＬＣ−ＭＳ：ＣＰ−０００７０２３−１１７：（ＥＳ、ｍ／ｚ）：７９５［Ｍ＋Ｈ］＋
【０５２７】
Ｌｄ３の合成
Ｌｄ３は、下に示されるように、本明細書に記載されるものと同様の方法を使用して、ロキソルビシン（Ｌｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）の誘導体をリンカ−と反応させることによって調製することができる。
【０５２８】
【化７３】
2014532799.tif 000080
【０５２９】
Ｌｄ４の合成
Ｌｄ４は、図２８に例示されるものと同様の方法を使用して、より短いＰＥＧ鎖を使用して調製することができる。
【０５３０】
Ｌｄ５の合成
Ｌｄ５は、図２７に例示されるものと同様の方法を使用して、より短いＰＥＧ鎖を使用して調製することができる。
【０５３１】
Ｌｄ６の合成
Ｌｄ６は、図４４に例示される方法を使用して調製することができる。
【０５３２】
ＬＤ７の合成
Ｌｄ７は、カルボヒドラジド安息香酸の代わりにヒドラジンニコチン酸を組み、Ｌｄ６を調製するために使用されるのと同じ方法を使用して調製することができる。
【０５３３】
Ｌｄ８の合成
ＰＥＧベ−スのリンカ−を合成するために使用されるのと同様の戦略を使用して、Ｌｄ８のためにアセタ−ル基との必要とされるＰＥＧリンカ−を合成することができる。このリンカ−を、下に示されるようにロキソリビン（Ｌｏｘｏｒｕｂｉｎｅ）と縮合して、環状アセタ−ルを組み込むＬｄ８を形成することができる。
【０５３４】
【化７４】
2014532799.tif 000081
【０５３５】
Ｌｄ９の合成
ＰＥＧベ−スのリンカ−を合成するために使用されるのと同様の戦略を使用して、Ｌｄ９のために必要とされるＰＥＧリンカ−を合成することができる。このリンカ−を、下に示されるようにロキソリビン（Ｌｏｘｏｒｕｂｉｎｅ）のアセタ−ルと縮合して、Ｌｄ９を形成することができる。
【０５３６】
【化７５】
2014532799.tif 000082
【０５３７】
Ｌｄ１０の合成
Ｌｄ１０は、図４４に例示される方法を使用して調製することができる。
【０５３８】
ＩＭ２の合成
ＩＭ２（Ｌｄ１０の合成における中間体化合物）は、図４１に例示される方法を使用して、また下に記載されるように、調製することができる。
【０５３９】
【化７６】
2014532799.tif 000083
【０５４０】
７−アリル−２−アミノ−９−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−１Ｈ−プリン−６，８（７Ｈ，９Ｈ）−ジオン（５００ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）および３−ヒドロキシベンズアルデヒド（１．８ｇ、１４．７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４０ｍＬ、無水）中の懸濁液に、ＺｎＣｌ２（Ｅｔ２Ｏ中７．３７ｍＬ、７．３７ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を、攪拌しながら４８時間加熱還流させた。懸濁液を、室温まで冷却させ、Ｅｔ２Ｏ（３００ｍＬ）中に注いで、灰色の沈殿物を得、次いで分取ＴＬＣによって精製して、灰色の固体生成物（４５ｍｇ、７％）を得た。
【０５４１】
ＬＣ−ＭＳ：ＣＰ−０００７０２３−０４０：（ＥＳ、ｍ／ｚ）：４４４［Ｍ＋Ｈ］＋
【０５４２】
１Ｈ−ＮＭＲ−ＣＰ−０００６７０８−０４０：１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、５００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）１１．０６（ｓ，１Ｈ）、９．５９７（ｓ，１Ｈ）、７．２３９−７．２０７（ｔ、Ｊ＝８、１６  Ｈｚ，１Ｈ）、６．９４３−６．９０７（ｍ、２Ｈ）、６．８３１−６．８１１（ｄｄ、Ｊ＝２、８Ｈｚ、１Ｈ）、６．６７７（ｓ、２Ｈ）、５．９４６−５．８７０（ｍ、３Ｈ）、５．４３６−５．４２０（ｄｄ、Ｊ＝１、７Ｈｚ、１Ｈ）、５．１２４−５．１００（ｄｄ、Ｊ＝１．５、１０．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．０５８−５．０２０（ｍ、２Ｈ）、４．８９０−４．８６６（ｔ、Ｊ＝６、２４Ｈｚ、１Ｈ）、４．４１１−４．４００（ｄ、Ｊ＝５．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．１５７−４．１２５（ｍ、１Ｈ）、３．６１９−３．５７１（ｍ、１Ｈ）、３．５０４−３．４５７（ｍ、１Ｈ）。
【０５４３】
ＩＭ３の合成
ＩＭ３（Ｌｄ１０の合成における中間体化合物類似体）は、図４２に例示される方法を使用して、また下に記載されるように、調製することができる。
【０５４４】
【化７７】
2014532799.tif 000084
【０５４５】
プロプ−２−エン−１−オ−ル（１２０ｍＬ）のＤＭＳＯ（１６０ｍＬ、無水）中の溶液に、水素化ナトリウム（１１ｇ、２７６ｍｍｏｌ）を０ｏＣで少量ずつ添加した。混合物を、攪拌しながら２５℃まで１時間昇温させ、次いでｏ２−アミノ−８−ブロモ−９−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−１Ｈ−プリン−６（９Ｈ）−オンを添加した。混合物を０．５時間攪拌し、次いで攪拌しながら６０℃まで４時間加熱した。混合物を室温まで冷却させ、次いでジエチルエ−テル（２．５Ｌ）に添加して、灰色の沈殿物を得、逆相バイオタ−ジによって精製して、白色の固体生成物（４．８ｇ、５１％）を得た。
【０５４６】
ＬＣ−ＭＳ：ＣＰ−０００７０２３−０２０：（ＥＳ、ｍ／ｚ）：３４０［Ｍ＋Ｈ］＋
【０５４７】
【化７８】
2014532799.tif 000085
【０５４８】
８−（アリルオキシ）−２−アミノ−９−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−１Ｈ−プリン−６（９Ｈ）−オン（２．６ｇ、７．７ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（２５ｍＬ）および水（２５ｍＬ）中に懸濁した。懸濁液を、攪拌しながら２０時間加熱還流させた（混合物は清澄となった）。有機溶媒を除去し、水溶液を、凍結乾燥させて、白色の固体生成物（２．６ｇ、１００％）を得た。
【０５４９】
ＬＣ−ＭＳ：ＣＰ−０００７０２３−０３１：（ＥＳ、ｍ／ｚ）：３４０［Ｍ＋Ｈ］＋
【０５５０】
【化７９】
2014532799.tif 000086
【０５５１】
７−アリル−２−アミノ−９−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イル）−１Ｈ−プリン−６，８（７Ｈ，９Ｈ）−ジオン（４００ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ）および４−ホルミルフェニル酢酸塩（１．９３ｇ、１１．８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３０ｍＬ、無水）中の懸濁液に、ＺｎＣｌ２（Ｅｔ２Ｏ中５．９ｍＬ、５．９ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を、攪拌しながら４８時間加熱還流させた。懸濁液を室温まで冷却させ、Ｅｔ２Ｏ（３００ｍＬ）中に注いで、灰色の沈殿物を得、次いで分取ＴＬＣによって精製して、灰色の固体生成物（４５ｍｇ、８％）を得た。
【０５５２】
ＬＣ−ＭＳ：ＣＰ−０００７０２３−０３４：（ＥＳ、ｍ／ｚ）：４８６［Ｍ＋Ｈ］＋
【０５５３】
１Ｈ−ＮＭＲ−ＣＰ−０００６７０８−０３４：１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、５００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）１１．００（ｓ、１Ｈ）、７−５７５−７．５５８（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．２２１−７．２０４（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）、６．６８４（ｓ、２Ｈ）、５．９８８（ｓ、１Ｈ）、５．９４５−５．８７９（ｍ、２Ｈ）、５．４６６−５．４５０（ｄｄ、Ｊ＝１、７Ｈｚ、１Ｈ）、５．１１９−５．０１８（ｍ、３Ｈ）、４．８９０−４．８６７（ｔ、Ｊ＝６、１１．５Ｈｚ，１Ｈ）、４．４０８−４．３９７（ｄ、Ｊ＝５．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．１７９−４．１４７（ｍ、１Ｈ）、３．６１６−３．５６８（ｍ、１Ｈ）、３．５０２−３．４５５（ｍ、１Ｈ）、２．２８７（ｓ、３Ｈ）。
【０５５４】
Ｒｄ１の合成
Ｒｄ１は、図４３に例示される方法を使用して調製することができる。
【０５５５】
Ｒｄ２の合成
Ｒｄ２は、図２５に例示されるものと同様の方法を使用して、Ｌｄ２およびＬｄ３のために使用したものと同様の非ＰＥＧリンカ−を使用して調製することができる。
【０５５６】
Ｒｄ３の合成。
Ｒｄ３は、Ｌｄ４およびＬｄ５中に存在するＰＥＧリンカ−を組み込み、同様の戦略を使用して調製することができる。
【０５５７】
酸化されたマンナンへのＬＤ１の結合
マンナンの酸化
１．マンナン２８ｍｇを、２ｍＬの０．１Ｍ  ＰＢ（ｐＨ６．０）中に溶解させた。
２．過ヨウ素酸ナトリウム０．２１３ｇを、１０ｍＬのｄｄＨ２Ｏ（０．１Ｍ）中に溶解させた。
３．反応：過ヨウ素酸塩を最後に添加した。２つの反応を準備した。
１０００ｋＤａ超のマンナン１．０ｍＬ（１４ｍｇ）
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）５５０μＬ
０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム５０μＬ
総計１．６ｍＬ
４．混合物を、暗所で、氷上で１時間インキュベ−トした。
５．反応物を、１０μＬエタンジオ−ルで反応停止処理した。
６．混合物を、暗所で、氷上で更に０．５時間インキュベ−トした。
７．ＰＤ−１０カラムを、５０ｍＬの０．２Ｍ  ＮａＯＨ、続いて５０
ｍＬ  ＤＤＷで洗浄した。
８．試料を、０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で予備平衡化したＰＤ１０（Ｇ２５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、８．３ｍＬ）カラムに通した。１．６ｍＬ試料を負荷し、送液した。更なる０．９ｍＬ酢酸緩衝液を添加し、収集することなく通過させた。
９．２ｍＬ酢酸緩衝液を添加し、画分を収集した。酸化されたマンナンは、回収率が１００％であることを想定すると、酢酸緩衝液中約７ｍｇ／ｍＬであった。
１０．ステップ７〜９を反復して、残りの試料を脱塩させた。
【０５５８】
ＬＤ１との結合
１．５．３ｍｇ  ＬＤ１（分子量４７４、９０％純粋）を、０．８３ｍＬＤＭＳＯ（１０ｍＭ）中に溶解させた。
２．結合を、表４に従って開始した。
【０５５９】
【表４】
2014532799.tif 000087
【０５６０】
３．ＰＤ−１０カラムを、５０ｍＬの０．２Ｍ  ＮａＯＨ、続いて５０
ｍＬ  ＤＤＷで洗浄した。
４．室温で４時間のインキュベ−ション後、試料を、ＰＤ１０カラムに通した。１．２ｍＬ試料を負荷し、送液した。１．３ｍＬ  ＤＤＷを添加し、収集することなく通過させた。
５．２ｍＬ  ＤＤＷを添加し、試料を収集した。
６．試料を４℃で保管した。濃度をＯＤ３００によって決定した。
【０５６１】
内毒素の除去
１．試料を、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１１４と共に、４℃で１時間インキュベ−トした。
２．１ｍＬ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムを充填した。
３．Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを１０ｍＬの１．０Ｍ  ＮａＯＨ、続いて１０ｍＬＨ２Ｏで洗浄した。
４．試料を、カラム上に負荷し、１０ｍＬの１％  Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１１４で洗浄した。
５．カラムを１０ｍＬ水で洗浄した。
６．試料を２ｍＬの０．５Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。
７．１００μＬ画分を収集し、ＯＤ３００を決定した。
８．結合体を含有する画分をプ−ルした。
【０５６２】
内毒素決定
試料の内毒素レベルをＬＡＬアッセイによって決定した。
【０５６３】
濃度
１．試料をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（０．５ｍＬ、３０ｋＤａカットオフ）によって濃縮した。Ａｍｉｃｏｎウルトラ管を、０．１Ｍ  ＮａＯＨで処理した後に使用した。
２．緩衝液を交換するために、試料を、濃縮中に水で１０回希釈した。
３．試料を−８０℃で保管した。
【０５６４】
定量化
マンナンおよびその酸化形態の両方は、可視光下で吸収度を有しないため、結合体の定量化は、ＬＤ１の濃度を確認することによって容易に単純化することができる。ＬＤ１は、３００ｎｍ周囲で最大吸収を有し、ＯＤ３００は、ＬＤ１濃度と線形であることが判明している。
【０５６５】
結合体の濃度を決定するために、ＬＤ１についての標準曲線を連続希釈によって得た。結合体についてのＯＤ３００を測定し、次いでその濃度を標準曲線に従って算出した。
【０５６６】
【表５】
2014532799.tif 000088
【０５６７】
酸化されたマンナンへのＬＤ２の結合
マンナンの酸化
１．過ヨウ素酸ナトリウム０．２１３ｇを、１０ｍＬ  ｄｄＨ２Ｏ（０．１Ｍ）中に溶解させた。
２．２８ｍｇマンナンを、２ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中に溶解させた。
３．反応：過ヨウ素酸塩を最後に添加した。
１０００ｋＤａ超のマンナン２．０ｍＬ（２８ｍｇ）
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１．１ｍＬ
０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム１００μＬ
総計３．２ｍＬ
４．混合物を、暗所で、氷上で１時間インキュベ−トした。
５．反応物を、１０μＬエタンジオ−ルで反応停止処理した。
６．混合物を、暗所で、氷上で更に０．５時間インキュベ−トした。
７．ＰＤ−１０カラムを５０ｍＬの０．２Ｍ  ＮａＯＨ、続いて５０ｍＬ  ＤＤＷで洗浄した。
８．試料を、０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で予備平衡化したＰＤ１０（Ｇ２５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、８．３ｍＬ）カラムに通した。１．６  ｍｌ試料を負荷し、送液した。０．９ｍＬ酢酸緩衝液を添加し、収集することなく通過させた。
９．２ｍＬｌ酢酸緩衝液を、添加し、画分を収集した。
１０．ステップ８−９を反復して、残りの試料を脱塩させた。
１１．酸化されたマンナンは、酢酸緩衝液中約７ｍｇ／ｍＬであった。回収率は１００％と想定した。内毒素レベルをＬＡＬ法によって決定した。
【０５６８】
ＬＤ２との結合
１．４ｍｇ  ＬＤ２−＃１９５または＃１９７（分子量７９４）を、０．５ｍＬＤＭＳＯ（１０ｍＭ）中に溶解させた。
２．結合を表６に従って準備した。
【０５６９】
【表６】
2014532799.tif 000089
【０５７０】
３．ＰＤ−１０カラムを５０ｍＬの０．２Ｍ  ＮａＯＨ、続いて５０ｍＬ  ＤＤＷで洗浄した。
４．室温で４時間のインキュベ−ション後、試料を、ＰＤ１０カラムに通した。試料を負荷し、送液した。２．５ｍＬ  ＤＤＷを添加し、収集することなく通過させた。
５．カラムを３．５ｍＬ  ＤＤＷで洗浄し、試料を収集した。内毒素レベルをＬＡＬ法によって決定した。
６．試料を４℃で保管した。濃度をＯＤ３００によって決定した。
【０５７１】
内毒素除去
１．１ｍＬ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムを充填した。
２．Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを１０ｍＬの１．０Ｍ  ＮａＯＨ、続いて１０ｍＬＨ２Ｏで洗浄した。
３．試料を、カラム上に負荷し、２．５ｍＬ水（通過画分を収集）、続いて１０ｍＬの１％  Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１１４で洗浄した。
４．カラムを１０ｍＬ水で洗浄した。
５．試料を５ｍＬの０．５Ｍ  ＮａＣｌで溶出し、１００μＬ画分を収集した。
６．各画分についてのＯＤ３００を決定し、結合体を含有する画分をプ−ルした。
ＯＭ−ＬＤ２−＃１９５については、約１／３の結合体が通過画分中にあり、新鮮な樹脂を有する第２のＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを使用したことに留意されたい。
【０５７２】
内毒素決定
試料の内毒素レベルをＬＡＬアッセイによって決定した。
【０５７３】
濃度
１．試料をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（０．５ｍＬ、３ｋＤａカットオフ）によって濃縮した。Ａｍｉｃｏｎウルトラ管を、０．１Ｍ  ＮａＯＨで処理した後に使用した。
２．緩衝液を交換するために、試料を、濃縮中に水で１０回希釈した。
３．試料を−８０℃で保管した。
【０５７４】
定量化
ＬＤ２の濃度および残基の数を、ＬＤ１について記載されるように、ＬＤ２の標準曲線および３００ｎｍでの光学密度を使用して決定した。
【０５７５】
【表７】
2014532799.tif 000090
【０５７６】
実施例１３：ロキソリビン（Ｌｏｘｏｒｕｂｉｎｅ）（ＬＯＸ）酸化マンナン結合体によるＰＢＭＣからのサイトカイン（ＩＬ−６）放出の刺激
ロキソリビン（Ｌｏｘｏｒｕｂｉｎｅ）（ＬＯＸ）誘導体であるＬＤ１を合成し、上述の酸化されたマンナン（ＬＤ１−ＯＭ）に結合した。ＬＯＸ誘導体であるＬＤ１は、酸化されたマンナンのアルデヒド残基への結合のためのヒドラジド結合およびリンカ−とＬＯＸとの間のエステル結合を組み込む。ＬＤ１で酸化されたマンナン結合体を用いてヒトドナ−から単離されたＰＢＭＣを刺激し、ＩＬ−６サイトカイン放出をＥＬＩＳＡで測定した。
【０５７７】
ＬＤ１で酸化されたマンナン結合体を用いてヒトドナ−から単離されたＰＢＭＣを刺激し、ＩＬ−６サイトカイン放出をＥＬＩＳＡで測定した。表８に示されるように、ＬＯＸは、５００μＭの用量でＩＬ−６放出を刺激することができた。
【０５７８】
表８に示されるように、ＬＯＸは、５００μＭの用量でＩＬ−６放出を刺激すること
ができた。
【０５７９】
【表８】
2014532799.tif 000091
【０５８０】
２つの異なる薬物装填量（ＬＤ１−ＯＭ６０およびＬＤ１−ＯＭ１２０）を有するＬＤ１で酸化されたマンナン結合体を、６時間および２４時間時点でＰＢＭＣによるＩＬ−６放出について試験した。ＬＤ１で酸化されたマンナン結合体は、６時間および２４時間時点の両方でＰＢＭＣによるＩＬ−６放出の刺激に成功した（表９）。
【０５８１】
【表９】
2014532799.tif 000092
【０５８２】
遊離ＬＯＸがＥＣ５０値に達しなかったため、遊離ＬＯＸによるＩＬ−６の刺激を、ＩＬ−６標準曲線から計算した誘導されたＩＬ−６の量（ｐｇ／ｍＬ）を用いて結合体と比較した。非結合ＬＤ１は、ＩＬ−６を刺激しなかった。２４時間時点で、５００μＭ用量のＬＯＸがＰＢＭＣ由来の１０ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６を刺激した一方で、６０残基および１２０残基を有するＬＤ１で酸化されたマンナン結合体は、それぞれ、９１ｐｇ／ｍＬおよび１１１ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６を刺激した。同様に、６時間時点で、ＬＤ１結合体が８６ｐｇ／ｍＬ（６０残基）および１０５ｐｇ／ｍＬ（１２０残基）のＩＬ−６を誘導した一方で、遊離ＬＯＸは、ヒトＰＢＭＣ由来のＩＬ−６の誘導に失敗した。
【０５８３】
インビトロデ−タは、ＬＤ１で酸化されたマンナン結合体が、ＰＢＭＣによるＩＬ−６分泌の誘導において、遊離ＬＯＸよりも効果的であることを明確に示している。明らかに、ＬＯＸ誘導体であるＬＤ１のエステル結合を介した酸化されたマンナンへの結合は、ＰＢＭＣ由来のＩＬ−６のより効率的な刺激につながり得る。
【０５８４】
実施例１４：ＧＳＴ−ＭＵＣ１−ＶＮＴＲ（ＦＰ）
結合
ＦＰを、上述のように１０００ｋＤａ超の酸化されたマンナン（１０００超ＭＦＰ）に結合した（図４５）。
【０５８５】
１０００ｋＤａ超の酸化されたマンナンに結合されたＦＰの免疫原性
ＭＵＣ１特異的Ｔ細胞株を、酸化されたマンナン−ｐＴｒｃを繰り返し刺激し、その後、ＭＵＣ１特異的Ｔ細胞を選別および増殖することによって生成した。ＭＵＣ１特異的Ｔ細胞株に対してＭＵＣ１を提示するマンナン結合体でパルスされた同種異系ＤＣ（ＢＣ１６）の能力を研究した。１０００超のＭＦＰは、図４６に示されるようにＭＵＣ１特異的Ｔ細胞株を刺激することができた。１０００超のＭＦＰは、１０μｇ／ｍＬおよび２０μｇ／ｍＬ用量で、Ｔ細胞の刺激において非結合ＦＰよりも効果的であった。
【０５８６】
実施例１５：ＭＵＣ１−ＶＮＴＲ（ｐＴｒｃ）
結合
ＭＵＣ１−ＶＮＴＲ（ｐＴｒｃ）を１０００ｋＤａ超の酸化されたマンナンに結合した（図４７）。種々の量のｐＴｒｃを１０００ｋＤａ超の酸化されたマンナンと反応させて、最適比を確認した。１：４０の抗原：マンナン比（１／２倍、レ−ン５）を有する結合体を免疫原性研究に用いた。
【０５８７】
１０００ｋＤａ超の酸化されたマンナンに結合されたＭＵＣ１−ＶＮＴＲの免疫原性
１０００ｋＤａ超の酸化されたマンナンに結合したｐＴｒｃのインビトロ免疫原性を、凍結ＭｏＤＣ（凍結、ＢＣ１７Ｋ）でリコ−ルしたｐＴｒｃ（ＭＵＣ１）Ｔ細胞株（ドナ−ＢＣ１３由来）を用いて確認した（図４８）。示されるように、ｐＴｒｃは効果的に処理されず、ＭＵＣ１特異的Ｔ細胞に提示されなかった。しかしながら、１０００ｋＤａ超の結合体は、非結合ｐＴｒｃよりも効果的にＭＵＣ１特異的Ｔ細胞を刺激した。２０μｇ／ｍＬのｐＴｒｃ、１０００ｋＤａ超のｐＴｒｃ結合体でパルスした自家ＭｏＤＣを用いて、健常なドナ−ＢＣ１７Ｋに由来したＭＵＣ１特異的Ｔ細胞株からのＭＵＣ１特異的ＣＤ８応答をリコ−ルした（図４９）。１０００ｋＤａ超の酸化されたマンナン結合体は、非結合抗原と比較して、ＣＤ８  Ｔ細胞における細胞内ＩＦＮγ分泌を効率的に刺激した。
【０５８８】
実施例１６：ＭＡＲＴ−１
結合
組換えＭＡＲＴ−１タンパク質も上述のように１０００ｋＤａ超の酸化されたマンナンに結合した（図５０）。２種類の結合体をＭＡＲＴ−１タンパク質（通常のタンパク質および還元タンパク質）で作製した。ＭＡＲＴ−１タンパク質は複数のシステインを有するため、空気酸化および凝集の傾向がある。結合を促進するために、ＭＡＲＴ−１を最初にＤＴＴで還元し、その後、結合で使用した。
【０５８９】
ＭＡＲＴ−１および１０００ｋＤａ超の酸化されたマンナンの結合体の免疫原性
ペプチドでのＴ細胞プライミングおよびリコ−ル
２つのドナ−（ＢＣ２８およびＢＣ２９）由来のＰＢＭＣおよびＭｏＤＣを、実施例１に記載されるように、ＭＡＲＴ−１および１０００ｋＤａ超の酸化されたマンナンの結合体（２０μｇ／ｍＬ）でのプライミングに用いた。１回目の刺激後、類似体および天然ＭＡＲＴ−１ペプチド特異的Ｔ細胞応答を、パルスされたＴ２細胞を用いて測定した（図５１）。１０００ｋＤａ超の酸化されたマンナン−ＭＡＲＴ−１でプライミングしたＢＣ２８ドナ−Ｔ細胞は、Ｔ２細胞によって提示された類似体または天然ＭＡＲＴ−１ペプチドに効率的に応答した（図５１）。ＢＣ２８およびＢＣ２９培養物をそれぞれのタンパク質および結合体で再刺激し、抗原提示細胞としてパルスされた自家ＭｏＤＣを用いてＭＡＲＴ−１タンパク質特異的Ｔ細胞応答について試験した（図５２）。パルスされたＭｏＤＣは、１０００ｋＤａ超の酸化されたマンナン結合体でプライミングしたＢＣ２８およびＢＣ２９ドナ−Ｔ細胞において、ＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答をリコ−ルすることができた。ＭＡＲＴ−１および１０００ｋＤａ超の酸化されたマンナンでのプライミングは、プライミングにおいて、非結合タンパク質よりも効率的であった。
【０５９０】
実施例１７：不活性化インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）および１０００ｋＤａ超のマンナンの混合物を用いたインビボ免疫原性研究
インフルエンザウイルスおよびマウス
卵から成長したＨ１Ｎ１（Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９）ウイルスをショ糖勾配によって精製し、濃縮し、β−プロピオラクトンで不活性化して、インフルエンザゾ−ンプ−ル（ＩＺＰ）調製物を作成し、これは、ＷＨＯ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（Ｎｏｒｔｈ  Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の副部長であるＤｒ  Ｉａｎ  Ｂａｒｒから快く提供されたものであった。全てのマウスは、ＷＥＨＩ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から供給された雌ＢＡＬＢ／ｃであり、第１の免役化時点で８−１０週齢であった。
【０５９１】
Ｈ１Ｎ１／１０００ｋＤａ超のマンナン混合物の生成
Ｈ１Ｎ１／１０００ｋＤａ超のマンナン混合物を、それぞれの所望の用量が５０μＬに含まれるように、Ｈ１Ｎ１ストック（２．７ｍｇ／ｍＬ）および１０００ｋＤａ超のマンナンストック（１４ｍｇ／ｍＬ）を滅菌ＰＢＳ中に希釈することによって生成した。１０００ｋＤａ超のマンナンを上述のように単離した。
【０５９２】
免疫物
全ての免疫物を鼻腔内投与した。完全に麻酔し（メトキシフルラン吸入によって）、直立状態で保持しながら、およそ５μＬの液滴を緩徐に各鼻孔に交互にピペット注入した。
【０５９３】
血清およびＢＡＬ（気管支肺胞洗浄／肺洗浄）収集
血清を、記載されるように、眼窩後出血によって収集した。ＢＡＬを収集する前に、ケタミンおよびキシラジルの混合物を用いてマウスを安楽死させた。組織を除去して上部気管を曝露し、その中に小切開を行った。１ｍＬのシリンジに取り付けられた鈍針を用いて１ｍＬのＰＢＳを緩徐に肺に流して引き出した。
【０５９４】
抗体力価のＥＬＩＳＡ決定
ＨＲＰ／ＴＭＢシステムを用いてＥＬＩＳＡを行った。プレ−トを１μｇ／ｍＬの濃度の全不活性化Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９）でコ−ティングした。プレ−トを１μｇ／ｍＬの濃度の全不活性化Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９）でコ−ティングした。最終力価を、対応する対照値を超えた状態を維持するように滴定における最終値として測定し、対照を、各滴定点でのナイ−ブマウス血清（３−５匹のマウス）の平均ＯＤ値＋２標準偏差として計算した。
【０５９５】
４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、０日目および１４日目に、Ｈ１Ｎ１（１μｇ）または１０００ｋＤａ超のマンナン（１００μｇ）を混合したＨ１Ｎ１で鼻腔内免疫した。最後の免役の１０〜１４日後、マウス血清および肺分泌物を、Ｈ１Ｎ１特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＡ抗体について分析した。図５３に見られるように、１０００ｋＤａ超のマンナンは、血清ＩｇＧ１応答を増強した。さらに重要なことには、１０００ｋＤａ超のマンナンは、血清および肺Ｈ１Ｎ１特異的ＩｇＡの増強に効果的であった。
【０５９６】
当業者であれば、広範に説明される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変形および／または修正が特定の実施形態に示されるように本発明に加えられてもよいことを理解する。したがって、本実施形態は、あらゆる点で説明するものであり、限定するものと見なされるべきではない。
【０５９７】
本明細書で論じられ、かつ／または参照される全ての出版物は、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０５９８】
本明細書に包含される文献、行為、材料、デバイス、品物等のいずれの考察も、単に本発明に前後関係を提供するためである。本出願のそれぞれの特許請求の主張の優先日前に存在したため、これらの事柄のいずれかもしくは全てが先行技術の基礎の一部を形成するか、または本発明の関連分野で共通の一般的知識であったと承認するもと見なされるべきではない。
【０５９９】
本出願は、２０１１年１１月９日出願の豪州第２０１１９０４６５６号の優先権を主張するものであり、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０６００】
[参考文献]
2014532799.tif 000093
2014532799.tif 000094
【図１】
2014532799.tif 000128
【図２】
2014532799.tif 000129
【図３】
2014532799.tif 000130
【図４】
2014532799.tif 000131
【図５】
2014532799.tif 000132
【図６Ａ】
2014532799.tif 000133
【図６Ｂ】
2014532799.tif 000134
【図６Ｃ】
2014532799.tif 000135
【図７Ａ】
2014532799.tif 000136
【図７Ｂ】
2014532799.tif 000137
【図８】
2014532799.tif 000138
【図９】
2014532799.tif 000139
【図１０】
2014532799.tif 000140
【図１１Ａ】
2014532799.tif 000141
【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
2014532799.tif 000151
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2014532799.tif 000154
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
2014532799.tif 000168
【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
2014532799.tif 000171
【図３８Ｂ】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
2014532799.tif 000189
【配列表】
2014532799000001.app
【国際調査報告】
2014532799.tif 000190
2014532799.tif 000191
2014532799.tif 000192
2014532799.tif 000193
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