(57)【要約】  本発明は、キムチ乳酸菌で発酵した米糖化液を有効成分として含有する抗菌及び抗ウイルス効果を有する米発酵食品組成物に関し、米糖化液を主材とし、これにキムチ乳酸菌を接種して発酵させることによって製造したものであって、アトピー皮膚炎及び鳥インフルエンザウイルスなどに対する抗菌及び抗ウイルス効果を有する米乳酸菌発酵食品組成物及びこれを含有する健康機能食品を提供する。【選択図】  図１
2014516524.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キムチから抽出した乳酸菌であるラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）またはこの培養したものを含み、鳥インフルエンザウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ）に対する抗ウイルス効果を有する抗ウイルス組成物。
【請求項２】
米糖化液に、キムチから抽出した乳酸菌であるラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）を添加して発酵させることによって製造され、
米乳酸菌発酵液を含み、アトピー皮膚炎に対する抗菌効果を有する
ことを特徴とする米乳酸菌発酵食品組成物。
【請求項３】
米糖化液に、キムチから抽出した乳酸菌であるラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）を添加して発酵させることによって製造され、
米乳酸菌発酵液を含み、鳥インフルエンザウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ）に対する抗ウイルス効果を有する
ことを特徴とする米乳酸菌発酵食品組成物。
【請求項４】
前記米糖化液は米を計量して精製水に浸漬し、ブレンディングした後、
１００℃で２０分ないし４０分間糊化、または６０℃で２０分ないし４０分間予備糊化した後、再び１００℃で２０分ないし４０分間本糊化して糊化液を製造する、糊化ステップと；
その糊化液に、α―アミラーゼを添加して８０℃ないし１００℃で４０分ないし２時間にわたって１次糖化した後、グルコアミラーゼを添加して６０℃ないし７５℃で４０分ないし２時間にわたって２次糖化し、
次いで、ろ過することによって得た米糖化液米糖化液を製造する米糖化ステップと；
を含み、製造することを特徴とする米乳酸菌発酵食品組成物。
【請求項５】
米を計量して精製水に浸漬し、ブレンディングした後、
１００℃で２０分ないし４０分間糊化、または６０℃で２０分ないし４０分間予備糊化した後、再び１００℃で２０分ないし４０分間本糊化して糊化液を製造する糊化ステップと、
その糊化液に、α―アミラーゼを添加して８０℃ないし１００℃で４０分ないし２時間にわたって１次糖化した後、グルコアミラーゼを添加して６０℃ないし７５℃で４０分ないし２時間にわたって２次糖化し、
次いで、ろ過することによって得た米糖化液を製造する米糖化ステップと；
米糖化ステップで製造した米糖化液に、全脂粉乳、牛乳、脱脂大豆タンパク質、オリゴ糖、ｐＨ調節剤、緩衝剤、糖質、甘味料、各種果汁、各種ビタミン類、香味料、アミノ酸、核酸及びそれらの塩類、植物繊維、各種ミネラルから選ばれる１種以上の添加剤を添加した後、１００℃で２０分間殺菌する混合殺菌ステップと；
熟成されたキムチの汁を希釈してＢＣＰ固体培地に塗抹し、３７℃で４８時間培養した後、球菌と桿菌を選抜し、これをＭＲＳ培地に移して培養した後、零下８０℃で保存した後、ラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）菌株を分離し、そのラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）菌株をＭＲＳ培地で３７℃の条件で培養してラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）を製造するラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）乳酸菌製造ステップと；
混合殺菌ステップで製造した混合殺菌米糖化液に、乳酸菌製造ステップで製造したラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）乳酸菌を米糖化液の重量に対して０.１重量％ないし５重量％添加し、３７℃で最終ｐＨが約４.１になるように１２時間にわたって発酵させる乳酸菌発酵ステップと；
を含み、請求項１または請求項２の米乳酸菌発酵食品組成物を製造する
ことを特徴とする方法。
【請求項６】
ラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）乳酸菌製造ステップにおいて、ラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）菌株の培養及び乳酸菌の製造は、
ラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）菌株をＭＲＳ培養培地（グルコース２％、ペプトン２％、酵母エキス０．５％、酢酸ナトリウム０．５％、リン酸カリウム二塩基性０．２％、硫酸アンモニウム０．２％、硫酸マグネシウム０．１％、硫酸マンガン０．００５％、Ｔｗｅｅｎ８０  ０．１％）で３７℃で１２時間培養した後、培養液を１３，０００ｒｐｍで３時間にわたって遠心分離し、遠心分離で得た菌体と同量の加水分解脱脂粉乳を混合して均質化した後、−４０℃で予備凍結を行った後、−４０℃から−２０℃まで７時間、−２０℃で５時間を維持し、−２０℃から−５℃まで９時間、−５℃で１０時間を維持し、−５℃から１０℃まで１０時間、１０℃で１０時間を維持し、１０℃で８時間にわたって２０℃まで温度を上げ、最終的に２０℃で凍結乾燥を完了し、凍結乾燥された菌体を粉砕してラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）を製造する
ことを特徴とする米乳酸菌発酵食品組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キムチ乳酸菌で発酵した米糖化液を有効成分として含有する抗菌及び抗ウイルス効果を有する米発酵食品組成物に関し、詳細には、米糖化液を主材とし、これにキムチ乳酸菌を接種して発酵させることによって製造したものであって、アトピー皮膚炎及び鳥インフルエンザウイルスなどに対する抗菌及び抗ウイルス効果を有する米乳酸菌発酵食品組成物及びこれを含有する健康機能食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
韓国人は、乳酸菌を食品に用いた長い歴史を有していて、最も代表的な食品としてキムチを挙げることができる。韓国の伝統複合発酵食品であるキムチの優秀性が世界的に知られるにつれて、２００１年７月５日の第２４次国際食品規格委員会（Ｃｏｄｅｘ  Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）総会で韓国の食品としては始めてキムチの国際規格（Ｃｏｄｅｘ  ｓｔａｎｄａｒｄ）が採択された。
【０００３】
キムチを構成する乳酸菌は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）の３属であり、代表的な乳酸菌の種類として、ラクトバチルス・サケイ亜種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ｓａｋｅｉ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ワイセラ・コリエンシス（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ  ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）が明らかになった。
【０００４】
これら種の構成はキムチの内外的環境によって変更可能であるので、キムチごとに異なる種類の乳酸菌が出現し得る。したがって、キムチの味も、キムチ乳酸菌の物質代謝による発酵副産物によって大きく左右され得る。発酵過程を経ながらキムチ内の好気性有害菌は死滅する一方、嫌気性有益菌が繁殖していて、乳酸の生成が増加し、酸度が低くなることによって、漸次より多くの乳酸菌が増殖するようになる。このようなキムチ乳酸菌は、生体内の免疫機能を強化することはもちろん、バクテリオシンと有機酸などを生産することによって有害菌を抑制する抗菌活性を保有していて、正常な腸内菌叢（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ）の形成及び維持に寄与する。その他にも、キムチ乳酸菌は、血中コレステロール低下と坑癌効果を有すると知られている。
【０００５】
キムチから分離した乳酸菌のうちラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）は、有機酸を生成する乳酸菌（Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ、ＬＡＢ）グループに属し、一般に肉類で生息するものと知られていて、植物発酵産物と発酵された魚類でも発見される。この菌は、商業的に重要な菌の一つであって、発酵させたソーセージ商品を作るためのスターター（ｓｔａｒｔｅｒ）として使用されたり、または肉類と魚類商品のバイオプリザバティブ・カルチャー（ｂｉｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ）として使用されている。ラクトバチルス・サケイは、一次代謝産物として有機酸を生産するが、これがスターターとプリザバティブ・カルチャーとして重要な作用をし、有機酸による酸性化により食物を保存し、商品の質を向上させるのに寄与する。また、バクテリオシンの生成による抗菌活性があるが、これは、魚類病原性細菌に対する抗菌活性であって、魚類の細菌性疾病予防を促進し、肉類の発酵時にリステリア菌を抑制する。
【０００６】
これによって、本発明者は、キムチに多量分布していて、ソーセージの発酵や肉類の発酵に多く使用される乳酸菌であるラクトバチルス・サケイのうちアレルギー予防効能に優れた菌株を見出すのに成功し、ラクトバチルス・サケイの一つの亜種として、耐酸性、耐膽汁性、抗菌性及び抗生剤耐性を有するラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５をキムチから分離するのに成功した。
【０００７】
すなわち、開発された菌株は、キムチの汁を段階的に希釈した後、乳酸菌選別培地で培養して乳酸菌のみを単離し、単離された各菌株を選別してＭＲＳ培地で培養した後、アトピー皮膚炎の悪化因子であるスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の増殖をよく抑制する微生物を最終的に選別したものであって、ラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）と命名し、特許文献１で特許を受けたことがある。
【０００８】
前記のキムチ由来の乳酸菌であるラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５は、アトピー性皮膚炎の疾病悪化因子として知られたスタフィロコッカス・アウレウスの生育抑制機能に優れるだけでなく、多様な病原性細菌に対する抗菌活性を保有していて、ＩｇＥ生成抑制及び免疫体系活性能力に優れる。また、ラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５は、耐酸性及び耐膽汁酸性に優れるので、効率的に腸に到逹し、抗菌物質の分泌による有害細菌の生育抑制及び腸内菌叢の正常化に寄与する。
【０００９】
一方、前記のようなアトピー皮膚炎は、激しい掻痒感と特徴的な湿疹性皮膚病変を示す炎症性皮膚疾患であって、主に幼小児期に発病し、慢性的に特に冬季によく再発するアトピー疾患の一つである。このように一度発病されたアトピー皮膚炎は、後で気管支喘息やアレルギー性鼻炎などに発展する場合が多く、大人になっても再発する場合が多い。アトピー皮膚炎の患者に表れる激しい掻痒感は、環境適応能力、活動力及び作業能率の減少、不眠症及び情緒障害などをもたらし得る。また、色素沈着を伴う湿疹性皮膚病変は、皮膚醜形を誘発するので、正常な対人関係や社会活動に支障を与えるおそれがある。また、乾燥し且つ刺激に敏感な皮膚は、よく刺激性接触皮膚炎を起こすので、職業の選択において制限要因にもなり得る。
【００１０】
最近になって、アトピー皮膚炎は全世界的に増加の趨勢を示していて、韓国でもアレルギー疾患の急増と共に増加している状況である。アレルギー及び呼吸器学会で全国の小学生と中学生４３，０４５人を対象にして実施した２０００年度のアンケート調査結果によると、小学生の２４．９％、中学生の１２．８％がアトピー皮膚炎の診断を受けていた。１０年間における韓国のアトピー皮膚炎の増加は５０％であり、その増加趨勢は、年齢が高くなるほど高い数値を示す。すなわち、アトピー皮膚炎の発病率は、大人まで約１７％の高い数値を示している。
【００１１】
アトピー皮膚炎を誘発する原因には、遺伝的な要因、免疫学的な要因及び環境的な要因が関与すると知られている。遺伝的な要因としては、アトピーと関連する各遺伝子が存在していて、これらのほとんどは免疫学的な遺伝子で占められている。今まで明らかになったアトピーと関連する遺伝子としては、人体白血球抗原系（ＨＬＡ）と染色体６ｐ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と染色体７ｐ、ＩｇＥ高親和性受容体（ＦｃεＲＩ―β）と染色体１１ｑ、及びＩＬ―４と染色体５ｑなどがある。環境的な要因としては、家中のダニ、家の埃、真菌、家の建築時に使用した材料やペイントから流出して空気中に露出するホルマリン、メチルベンゼンなどの有害物質、または食品に添加された化学物質や食品自体があり得る。
【００１２】
また、アトピー皮膚炎の悪化要因としてスタフィロコッカス・アウレウスがある。アトピー皮膚炎患者たちの湿疹性病変の８０％ないし１００％においてスタフィロコッカス・アウレウスの集落が発見される。これは、健康な皮膚で５％ないし３０％程度が発見されることに比べると遥かに高い数値である。スタフィロコッカス・アウレウスは、膿痂疹を増加させることによって皮膚炎部位を悪化させ、他の人たちに伝播されてアトピー皮膚炎に感染されやすくする。アトピー皮膚炎の悪化に対しては、スタフィロコッカス・アウレウスが生産する外毒素の超抗原的な役割に対する証拠が提示されているが、外毒素の種類としては、ＳＥＡ―Ｄ（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌｅｎｔ  ｅｒｏｔｏｘｉｎｓ  Ａ―Ｄ）とＴＳＳＴ―１（ｔｏｘｉｃ  ｓｈｏｃｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｔｏｘｉｎ―１）があり、これらはＩｇＥの生成量を８倍以上増加させる。
【００１３】
アトピー皮膚炎患者たちに多く使用される治療療法としては、抗生剤療法、抗ヒスタミン剤療法、ステロイド剤療法及び免疫療法などがある。抗生剤療法は、上述したスタフィロコッカス・アウレウスなどの２次的微生物による感染を遮断するために使用されているが、抗生剤を不適切に投与する場合が多く、また、最近、抗生剤耐性スタフィロコッカス・アウレウスが増加している趨勢であるため問題が多い。全世界的に主要な抗生剤耐性菌株としては、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ―ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、ＭＲＳＡ）、メチシリン耐性凝固酵素陰性ブドウ球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ―ｒｅｓｉｓｔａｎｔ―ｃｏａｇｕｌａｓｅ―ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、ＭＲＣＮＳ）などがある。
【００１４】
したがって、抗生剤の誤濫用、副作用、耐性菌の発生を防止し、アトピー皮膚炎の根本的な原因防止または治療のための代替物質の必要性が切実に要求されている。
【００１５】
他の側面において、１９８３年にベルギー、フランスなどのヨーロッパで発生して以来、現在まで世界各国で問題となっている鳥インフルエンザは、鳥類に感染する急性ウイルス性伝染病であって、主に鶏、七面鳥などの家擒類に多くの害を与えるが、鳥インフルエンザが発生すると、世界のほとんどの国家では家擒類を全量屠殺処分し、鳥インフルエンザ発生国家では養鶏産物を輸出できなくなる。
【００１６】
感染は、主に鳥類の分泌物に直接接触するときに発生し、飛沫、水、人の足、飼料運搬車両、器具、装備、卵の殻に付いた糞便などによっても伝播される。症状は、感染したウイルスの病原性によって多様であるが、概して呼吸器症状、下痢、急激な産卵率の減少が表れる。場合に応じて鶏冠などの頭部位に青色症が表れ、顔面浮腫が生じたり、羽毛が１ヶ所に集まる現象が表れることもあり、斃死率も病原性によって０％ないし１００％と多様である。
【００１７】
一般に鳥インフルエンザウイルスは、人に直接伝染されず、中間宿主として豚を経て人に伝染されると知られているが、病原性によって高病原性、弱病原性及び非病原性の３つの種類に区分され、このうち高病原性は人間にも感染される。
【００１８】
最近問題となっているＨ５Ｎ１高病原性鳥インフルエンザ（ｈｉｇｈｌｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ；ＨＰＡＩ）ウイルスの人体感染事例で提示されたインフルエンザウイルス人体感染の病理機転は、ＨＡＰＩウイルス感染時におけるＴ細胞の著しい減少とインターフェロンガンマの減少によってウイルスの体内増殖が早期に抑制されないので、ウイルス感染が全身に転移し、その結果、器官、肺などの呼吸器臓器以外の血液と直腸でウイルスが増殖されることが確認された。また、これらウイルス増殖部位での細胞自殺（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）による細胞の死滅と、炎症性サイトカインの大量放出による非化膿性肺炎及び多発性臓器機能不全（ｍｕｌｔｉ―ｏｒｇａｎ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）の誘発によって死亡に至るようになると報告されている。
【００１９】
このように、ベトナム、タイなどの東南アジア地域で鳥インフルエンザによる死亡者が発生するなど、鳥インフルエンザに対する人体感染の被害が漸次深刻になっている。そのため、このような被害を減少させるために鳥インフルエンザワクチンと治療剤を開発する多くの努力がなされているが、完璧な予防と治療がなされていない状態で一部の開発結果が報告されている。特許文献２では、魚腥草抽出物を用いた漢薬材組成物を抗鳥インフルエンザウイルス剤として提案し、特許文献３では、酵母の水溶性グルカンオリゴマーを含有する組成物を、細胞内のＮＯとＴＮＦ―αの生成を増加させることによって間接的に鳥インフルエンザを予防及び治療する薬剤として提案している。
【００２０】
一方、米は、韓国を始めとする全世界人口の半分以上が主食としている穀食である。韓国の米生産は、品種改良と営農技術の発展に伴って急激に増加したが、西欧式食文化の影響により毎年急速に減少した。このような米消費の減少は、食品消費パターンの多様化、ウェルビーング文化の拡散、食習慣の変化などに起因するが、未だに米を用いた多様な製品開発が不十分であることにも大きな原因がある。すなわち、米は、ほとんどが１次加工して摂取したり、製菓、製パンなどに少量使用する実情にあり、国民所得の向上に伴う食習慣の変遷と加工食品の不足により消費が減少し、在庫が増加している趨勢である。
【００２１】
また、米は、視力を良好にするカロチン、骨を丈夫にするカルシウム及び鉄分、コレステ  ロール生合成を阻害するモナスカス成分を含有しているだけでなく、韓国人の体質によく合い、特に、これを牛乳と混合する場合に米で不足なアミノ酸であるライシンを補充することによって、発酵乳の食品及び栄養学的価値を大きく高めることができ、現在減少している米の消費を促進させることにも役立つという側面がある。
【００２２】
現在まで米を主材とする食品としては、特許文献４に"白米及び玄米を別途に加工する工程を採択し、白米加工時には、炒め工程を省略し、タフィー類製造工程の温度、時間及び酵素含量を調節して熱安定性を強化させ、玄米加工時には、炒め工程は実施し、粉砕及びタフィー類製造工程を省略することによって、十分な微生物殺菌のためにレトルト殺菌をしながらも熱による褐変を防止し、その結果、白米固有の白色を維持し、栄養素破壊を最小化できる風味に優れる米飲料組成物及びその製造方法"が開示されている。また、特許文献５には、"炒めた玄米と白米を酵素分解させた後、清い液を得て米飲料を製造する方法に関するもので、玄米と白米の栄養成分を最大限生かすことによって味がよく調和され、微酸性飲料でありながらも低温殺菌とＰＥＴ容器への充填が可能な米飲料の製造方法"が開示されている。
【００２３】
しかし、従来の米を素材とする食品においては、主に米糖化液を獲得し、これに補助添加物などを単純に混合して製造する方法のみを開示しているだけで、人体に各種の有益な成分を提供する乳酸菌による発酵食品は報告されていないので、米を乳酸菌で発酵させた発酵食品が開発された。
【００２４】
前記の米を用いた乳酸菌発酵食品は、肥満及び成人病の予防効果と難消化性炭水化物を栄養源とする場内微生物の増殖を促進し、血中コレステロールを低下させる機能を有するので、成人病の予防に寄与する因子として作用する。また、米には、持久力増進剤であるオクタコサノール（ｏｃｔａｃｏｓａｎｏｌ）とアトピーの改善に役立つセラミド（ｃｅｒａｍｉｄｅ）などが含有されているので、その加工食品の開発が活発になされている。
【００２５】
特許文献６には、水６８重量部ないし７６重量部にアルファ米粉５重量部ないし１８重量部、脱脂粉乳１０重量部ないし１５重量部、ブドウ糖２重量部、蔗糖２重量部を混合・均質化し、熱処理後に冷却した試料に混合乳酸菌種菌を接種し、定置・培養した発酵原液に糖液を混合・均質化した液状の米ヨーグルトの製造方法が開示されている。
【００２６】
また、特許文献７には、米糖化液を主材とし、これにビフィズス菌、乳酸菌をそれぞれ添加して発酵させたり、または、ビフィズス菌と乳酸菌の混合物を添加して発酵させることによって製造される米発酵液を含む米発酵食品組成物が開示されている。
【００２７】
また、特許文献８には、（１）米成分の含量を増大させ、嗜好性を増進させるために米を１次酵素処理を通して液化させ、２次酵素処理して糖化させた後、米濃縮液の糖度が５０ないし７５゜Ｂｘになるように濃縮して米濃縮液を製造する第１の工程；（２）米の臭いをマスキングして嗜好性を向上させるために、米濃縮液に糖類、食物繊維及び添加物を混合して米シロップを製造する第２の工程；（３）原乳または還元乳に脱脂粉乳を溶解し、凍結乾燥した混合粉末乳酸菌を接種して発酵させた後、適正酸度が０．７５％に到逹すると冷却させ、乳酸菌発酵が完了した乳酸菌発酵液を製造する第３の工程；（４）前記第２の工程の米シロップと第３の工程の乳酸菌発酵液とを混合して均質化し、甘味と酸味が調和されるように混合する第４の工程；及び（５）自動充填包装機を用いてプラスチック瓶に前記混合液を充填及び包装する第５の工程；を含む製造方法で製造される米ヨーグルトが開示されている。
【００２８】
しかし、免疫機能強化、有害菌抑制、場内菌形成及び維持、血中コレステロール減少及び坑癌効果などの乳酸菌の一般的な効果の他に、キムチ乳酸菌の発酵による米発酵食品組成物において、アトピー皮膚炎及びインフルエンザウイルス感染の抑制、特に鳥インフルエンザウイルスの増殖抑制に関する効能検証に対する試験結果は見出し難い実情にある。そこで、本発明者らは、韓国の主食である米に、本発明者らが開発したキムチから抽出した乳酸菌であるラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）を接種・発酵させることによって製造した米乳酸菌発酵食品組成物がアトピー皮膚炎及び鳥インフルエンザウイルスなどに対する抗菌及び抗ウイルス効果を有することを発見し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２９】
【特許文献１】韓国特許登録１０―０４７９７１９
【特許文献２】大韓民国公開特許１０―２００７―００３５２０３
【特許文献３】大韓民国登録特許１０―０４８５０５６
【特許文献４】韓国特許公開公報２００２―００１６１０９
【特許文献５】韓国特許公開公報２０００―０００６６０１
【特許文献６】韓国特許公開公報１９９８―０７５０７９
【特許文献７】韓国登録特許１０―０５２７４１９
【特許文献８】韓国特許公開公報１０―２０１０―００７４３８９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
本発明は、米糖化液を主材とし、これにキムチ乳酸菌を接種して発酵させることによって製造したものであって、アトピー皮膚炎及び鳥インフルエンザウイルスなどに対する抗菌及び抗ウイルス効果を有し、安全性に問題がなく、日常的に摂取可能な米乳酸菌発酵食品組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
前記課題を解決するために、本発明は、キムチから抽出した乳酸菌であるラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）またはその培養物を含む鳥インフルエンザウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ）に対する抗ウイルス効果を有する抗ウイルス組成物を提供する。
【００３２】
また、本発明は、米糖化液に、キムチから抽出した乳酸菌であるラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）を添加して発酵させることによって製造される米乳酸菌発酵液を含む、アトピー皮膚炎に対する抗菌効果を有することを特徴とする米乳酸菌発酵食品組成物を提供する。
【００３３】
また、本発明は、米糖化液に、キムチから抽出した乳酸菌であるラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）を添加して発酵させることによって製造される米乳酸菌発酵液を含む、鳥インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス効果を有することを特徴とする米乳酸菌発酵食品組成物を提供する。
【発明の効果】
【００３４】
本発明に係る米乳酸菌発酵食品組成物は、韓国の主食である米にラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）を接種・発酵させることによって製造されたものであって、免疫機能が強化された高付加価値の米発酵食品を製造することができ、過剰に生産されている米の利用度を増進させ得るだけでなく、前記米発酵食品組成物を日常的に摂取することによって、アトピー皮膚炎及び鳥インフルエンザウイルスなどに対する抗菌及び抗ウイルス効果を示すという画期的な効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明に係る米乳酸菌発酵食品組成物の製造工程図
【図２】本発明に係る細胞株実験を通した抗ウイルス活性の確認写真
【図３】本発明に係る種卵培養及び抗ウイルス活性の確認写真
【図４】本発明に係る抗菌活性の確認写真
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、キムチから抽出した乳酸菌であるラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）またはその培養物を含む鳥インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス効果を有する抗ウイルス組成物を提供することを技術構成の特徴とする。
【００３７】
また、本発明は、米糖化液に、キムチから抽出した乳酸菌であるラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）を添加して発酵させることによって製造される米乳酸菌発酵液を含む、アトピー皮膚炎に対する抗菌効果を有することを特徴とする米乳酸菌発酵食品組成物を提供することを技術構成の特徴とする。
【００３８】
また、本発明は、米糖化液に、キムチから抽出した乳酸菌であるラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）を添加して発酵させることによって製造される米乳酸菌発酵液を含む、鳥インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス効果を有することを特徴とする米乳酸菌発酵食品組成物を提供することを技術構成の特徴とする。
【００３９】
以下では、本発明を、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できるように本発明の実施例を通して詳細に説明する。しかし、本発明は、多様な異なる形態に具現することができ、ここで説明する実施例に限定されない。
【００４０】
まず、図１に示したように、米糖化液の製造時には、米を計量して精製水に浸漬し、ブレンディングした後で糊化させるが、糊化過程は、約１００℃で約２０分ないし４０分間一度に行うこともでき、または、約６０℃で約２０分ないし４０分間予備糊化した後、再び約１００℃で約２０分ないし４０分間糊化する２段階の過程を経て行うこともできる。
【００４１】
次に、糊化過程を経た糊化液にα―アミラーゼを添加し、約８０℃ないし１００℃で約４０分ないし２時間にわたって１次糖化し、１次糖化が完了した後、グルコアミラーゼを添加して約６０℃ないし７５℃で約４０分ないし２時間にわたって２次糖化過程を行い、ろ過することによって米糖化液を製造する。
【００４２】
一方、家庭で製造したキムチの汁を希釈してＢＣＰ固体培地に塗抹し、３７℃で４８時間培養し、一定時間の経過後に表れるコロニーを顕微鏡で観察した後、球菌と桿菌を４８０個選抜し、これらをＭＲＳ培地に移して培養した後、零下８０℃で保存した後、アトピー疾患の悪化因子であるスタフィロコッカス・アウレウスＫＣＴＣ１６２１の増殖を抑制する微生物を確認し、ラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）菌株を分離した後、前記の分離されたＰｒｏＢｉｏ６５菌株をＭＲＳ培地で３７℃の条件で培養してラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）を製造する。
【００４３】
すなわち、前記ＰｒｏＢｉｏ―６５菌株の培養時には、ＭＲＳ培養培地（グルコース２％、ペプトン２％、酵母エキス０．５％、酢酸ナトリウム０．５％、リン酸カリウム二塩基性０．２％、硫酸アンモニウム０．２％、硫酸マグネシウム０．１％、硫酸マンガン０．００５％、Ｔｗｅｅｎ８０  ０．１％）で３７℃で１２時間培養した後、培養液を１３，０００ｒｐｍで３時間にわたって遠心分離し、前記の遠心分離して得た菌体と同量の加水分解脱脂粉乳を混合して均質化した後、−４０℃で予備凍結を行った後、−４０℃から−２０℃まで７時間、−２０℃で５時間を維持し、−２０℃から−５℃まで９時間、−５℃で１０時間を維持し、−５℃から１０℃まで１０時間、１０℃で１０時間を維持し、１０℃で８時間にわたって２０℃まで温度を上げ、最終的に２０℃で凍結乾燥を完了し、凍結乾燥された菌体を粉砕してラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）を製造する。
【００４４】
次に、前記のろ過された米糖化液を１００℃で２０分間殺菌した後、前記の準備したラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）１．５重量％を添加し、３７℃で最終ｐＨが約４．１になるように１２時間にわたって発酵させた後、水飴を５重量％添加して米乳酸菌発酵食品組成物を製造する。
【００４５】
前記ラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５乳酸菌を前記の製造された米糖化液に発酵スターターとして添加するにおいて、その添加量は、米糖化液の重量に対して０．１重量％ないし５重量％であることが望ましく、前記米糖化液には、全脂粉乳、牛乳、脱脂大豆タンパク質から選ばれた少なくとも一つ以上をさらに含ませることができ、各種オリゴ糖、ｐＨ調節剤及び緩衝剤、各種糖質、甘味料、及びその他添加剤などを添加することができる。
【００４６】
前記の適合したオリゴ糖の例としては、イソマルトオリゴ糖類、ガラクトオリゴ糖類、マルトオリゴ糖類、シクロデキストリン類、オリゴフルクトース類、ラクトスクロース、グリコシルスクロース、ゲンティオオリゴ糖類、パラチノースオリゴ糖類、大豆オリゴ糖類及びキシロオリゴ糖類などがある。
【００４７】
ｐＨ調節剤及び緩衝剤は、通常、液状製品に要求されるものであって、ｐＨ４．０ないし６．５程度に調節することができる。前記ｐＨ調節剤及び緩衝剤の例としては、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、乳酸、炭酸などの弱酸及びそれらの塩類、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸アンモニウム、酒石酸ナトリウム、リンゴ酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、乳酸カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどを例示することができる。リン酸水素ナトリウムも、前記ｐＨ調節剤及び緩衝剤として使用することができる。これらの酸及びその塩類は、単独で使用しても良く、２種以上を併用しても良い。これらの配合割合は、収得する飲料が前記適当なｐＨ範囲を維持する範囲で適宜決定されるが、通常、組成物重量の約２重量％以下、望ましくは約０．０５重量％ないし０．３重量％である。
【００４８】
また、前記飲料などの食品形態の本発明の組成物中には、一般的な飲料などと同様に、各種の糖質及び甘味料などを添加して配合することができる。糖質としては、グルコース、フルクトースなどの単糖類；マルトース、スクロースなどの２糖類；デキストリン、シクロデキストリンなどの多糖類；キシリトール、エリトリトール、ソルビトールなどの糖アルコール類；シュガーエステルなどを例示することができる。甘味料としては、天然甘味料（レバウディオサイド（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ）Ａ）などのステビア抽出物、ソーマチン（ｓｏｒｍａｔｉｎ）、グリチルリチン（ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ）など）、合成甘味料（サッカリン、アスパタムなど）などを例示することができる。これら糖質及び甘味料の配合割合は、通常収得する飲料の約１５重量％以下、望ましくは約１３重量％以下である。
【００４９】
また、食品形態の本発明の組成物には、必要に応じて、例えば、下記の添加剤の１種または２種以上を添加して配合することもできる。前記添加剤には、例えば、グレープフルーツ、リンゴ、オレンジ、レモン、パイナップル、バナナ、梨などの各種果汁（濃縮果汁、粉末果汁などであってもよい）；ビタミン類及びプロビタミン類（パルミチン酸レチノール、ビスベンチアミン（ｂｉｓｂｅｎｔｉａｍｉｎｅ）、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、シアノコバラミン（ｃｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎｅ）、アスコルビン酸ナトリウム、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、葉酸、ビオチン、コレカルシフェロール（ｃｈｏｌｅｃａｌｃｉｆｅｒｏｌ）、重酒石酸コリン、トコフェロール、β―カロテンなどの水溶性及び脂溶性ビタミン類）；香味料（レモンフレーバー、オレンジフレーバー、グレープフルーツフレーバー、バニラエッセンスなど）；アミノ酸、核酸及びそれらの塩類（グルタミン酸、グルタミン酸ナトリウム、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン酸ナトリウム、イノシン酸など）；植物繊維（ポリデキストロース、ペクチン、キサンタンガム、アラビアガム、アルギン酸など）；ミネラル及び微量元素（塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、炭酸マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、グリセロリン酸カルシウム、クエン酸第一鉄ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、ヨウ化ナトリウム、ソルビン酸カリウム、亜鉛、マンガン、銅、ヨード、コバルトなど）などを含ませることができる。
【００５０】
その他にも、穀類（玄米、黒米、餅米、｛もちごめ｝糯粟、蜀黍、麦、緑豆、黍、鳩麦、アルファーコーン、トウモロコシ、小麦、小豆、胡麻など）、豆類（黒豆、ピーナッツ、黄豆、豌豆、隠元豆など）、堅果類（松の実、胡桃、ピスタチオ、アーモンド、ヒマワリの種、ペカン、栗、ブドウなど）、果物類（リンゴ、柚子、木瓜、柿、桃、バナナ、イチゴ、レモンなど）、野菜類（カボチャ、大根、蕪、キャベツ、ニンジン、牛蒡、蓮根、新鮮草、松葉、パセリ、明日葉、セリ、ホウレンソウなど）、球根類（ジャガイモ、ヤーコン、ニンジン、蔓人参、牛蒡、大根、蓮根、長芋、ケール、桔梗など）、葉菜類（ケール、新鮮草、ブロッコリーなど）、茸類（樺孔茸、霊芝茸、桑黄茸、山伏茸、アガリクス、椎茸、瓦茸、洋松たけ、平茸、岩茸、榎茸、冬虫夏草など）、微生物流（酵母、乳酸菌、バチルス菌、紅麹など）、微細鳥類（クロレラ、スピルリナなど）、海藻類（若布、昆布、海苔、青海苔、鹿尾菜など）、植物性薬材類（緑茶、ハーブ、甘草、黄漆、五加皮、高麗人参、紅参、枸杞子、アロエなど）、動物性薬材類（鹿茸、蚕など）などを含ませることができる。
【００５１】
＜実施例１＞米乳酸菌発酵食品組成物の製造
【００５２】
米を計量して精製水に浸漬し、ブレンディングした後、６０℃で４０分間予備糊化し、１００℃で４０分間糊化して糊化液を製造した。前記糊化液にα―アミラーゼを添加して１００℃で４０分間１次糖化し、１次糖化が完了した後、グルコアミラーゼを添加して７５℃で４０分間２次糖化過程を行って糖化液を製造し、これをろ過することによって米糖化液を製造した。
【００５３】
米糖化液とは別途に、熟成されたキムチの汁を希釈してＢＣＰ固体培地（日本の栄研化学社製）に塗抹し、３７℃で４８時間培養し、一定時間の経過後に表れるコロニーを顕微鏡で観察した後、球菌と桿菌を４８０個選抜し、これらをＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に移して培養した後、零下８０℃で保存した後、アトピー疾患の悪化因子であるスタフィロコッカス・アウレウスＫＣＴＣ１６２１の増殖を抑制する微生物を確認し、ラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）菌株を分離した後、前記の分離されたＰｒｏＢｉｏ―６５菌株をＭＲＳ培養培地で３７℃で１２時間培養した後、培養液を１３，０００ｒｐｍで３時間にわたって遠心分離し、前記の遠心分離して得た菌体と同量の加水分解脱脂粉乳を混合して均質化した後、−４０℃で予備凍結を行い、−４０℃から−２０℃まで７時間、−２０℃で５時間を維持し、−２０℃から−５℃まで９時間、−５℃で１０時間を維持し、−５℃から１０℃まで１０時間、１０℃で１０時間を維持し、１０℃で８時間にわたって２０℃まで温度を上げ、最終的に２０℃で凍結乾燥を完了し、凍結乾燥された菌体を粉砕してラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５菌を製造した。
【００５４】
前記米糖化液に全脂粉乳を米糖化液に対して６重量％添加し、温度を１００℃に上げて２０分間殺菌した。これに、前記の製造したラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）１．５重量％を添加し、３７℃で最終ｐＨが約４．１になるように１２時間にわたって発酵させた後、水飴を５重量％添加して最終的な米乳酸菌発酵食品組成物を製造した。
【００５５】
＜実施例２＞米乳酸菌発酵食品組成物のアトピー皮膚炎ＳＣＯＲＡＤ測定実験
【００５６】
軽症アレルギー及びアトピー患者５４人を対象にして、人体試験を通して本発明の米乳酸菌発酵食品組成物と対照食品を１２週間投与した後、アトピー皮膚炎の重症度（ＳＣＯＲＡＤ）指標を分析し、その結果を次の表１に示した。
【００５７】
【表１】
2014516524.tif 000003
【００５８】
表１に示したように、米乳酸菌発酵食品組成物投与群と対照食品群のいずれにおいても、アトピー性皮膚炎の臨床指標であるＳＣＯＲＡＤ（ＳＣＯＲｉｎｇ  ｏｆ  Ａｔｏｐｉｃ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）が減少したが、米乳酸菌発酵食品組成物投与群のＳＣＯＲＡＤ変化量が対照食品群よりも大きいことが分かり、特に、米乳酸菌発酵食品組成物投与群は、ＳＣＯＲＡＤの数値が２０％以上減少し、症状が好転した被験者の数が対照食品群２９．６％に比べて７０％と２倍以上高かった。
【００５９】
＜実施例３＞米乳酸菌発酵食品組成物のＣＣＬ１７、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ１８変化実験
【００６０】
実施例２と共に、ＣＣＬ１７（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ｃ―ｃ  ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ  １７）、ＣＣＬ２７（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ｃ―ｃ  ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ  ２７）、ＣＣＬ１８（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ｃ―ｃ  ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ  １８）は、アトピー皮膚炎でＴリンパ球を炎症部位に動員する機転に関与するものであるので、アトピー性皮膚炎の免疫学的且つ客観的な指標（バイオマーカー）としてＣＣＬ１７、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ１８の濃度を測定し、これを表２に示した。
【００６１】
【表２】
2014516524.tif 000004
【００６２】
表２に示したように、米乳酸菌発酵食品組成物投与群でのＣＣＬ１７、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ１８の血中濃度は、統計学的に有意に減少することが分かるが、このような結果は、本発明の米乳酸菌発酵食品組成物がアトピー性皮膚炎の症状改善に有効であることを臨床的に確認した結果である。
【００６３】
＜実施例４＞ラクトバチルス・サケイＰｒｏｂｉｏ―６５（ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）抗ウイルス活性実験
【００６４】
［細胞株培養］
ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ―Ｄａｒｂｙ  ｃａｎｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ；韓国細胞株銀行、ＫＣＬＢ  Ｎｏ．１００３４）細胞を牛血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）と抗生剤（１００Ｕ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  １００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が含まれたＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）で４８時間ないし７２時間にわたって３５℃で培養した。
【００６５】
［ウイルス培養］
Ｈ９Ｎ２ウイルス（Ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｈ９Ｎ２  ｖｉｒｕｓ；国立獣医科学検疫院）は、ＭＤＣＫ細胞株で４８時間ないし７２時間にわたって３５℃で培養した。ＭＤＣＫ単層細胞をリン酸緩衝溶液で２回洗浄した後、ウイルスを接種し、約３０分間ウイルスを細胞に吸着させた後、牛血清（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を含まない最小培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）を添加して３７℃の培養器で培養しながら細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ、ＣＰＥ）を観察した。単層細胞に細胞変性効果が約７０％観察されるとき、ＭＥＭ培地を含む感染細胞を−７０℃で繰り返して３回冷凍及び解凍した後で遠心分離し、細胞成分を除去した上層液を−７０℃で保管しながらウイルスを確保した。
【００６６】
［ラクトバチルス・サケイＰｒｏｂｉｏ―６５（ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）培養］
実施例１のラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）製造過程中に脱脂粉乳を混合し、凍結乾燥する前の段階で培養液を遠心分離し、上澄液を確保して実験に用いた。
【００６７】
［抗ウイルス活性確認］
９６ウェル（９６―ｗｅｌｌ）細胞培養プレートにＭＤＣＫ単層細胞を準備し、これをリン酸緩衝溶液で２回洗浄した後、−７０℃で保管中のウイルスを１０倍階段希釈法で希釈し、各希釈段階別に１０個のウェルに接種し、７２時間にわたって５％のＣＯ２を含む３７℃の細胞培養器内で培養しながら細胞変性効果を観察した。前記結果に基づいて、培養液内に存在するウイルスの含量を定量した。
【００６８】
抗ウイルス活性試験は、ウイルス培養液に牛血清が添加されていない最小培地を希釈し、ウイルス力価を１．０  ＴＣＩＤ  ５０／０．１ｍｌ、１０．０  ＴＣＩＤ  ５０／０．１ｍｌ、１００  ＴＣＩＤ  ５０／０．１ｍｌ及び１０００  ＴＣＩＤ  ５０／０．１ｍｌにした。９６ウェル細胞培養プレートにＭＤＣＫ単層細胞を準備し、これをリン酸緩衝溶液で２回洗浄した後、ラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５培養液１サンプル当たり４個のウェルを使用し、１番目、２番目、３番目及び４番目のウェルにそれぞれ９０μｌの１．０  ＴＣＩＤ  ５０／０．１ｍｌ、１０．０  ＴＣＩＤ  ５０／０．１ｍｌ、１００  ＴＣＩＤ  ５０／０．１ｍｌ及び１０００  ＴＣＩＤ  ５０／０．１ｍｌを添加し、直ちに１０μｌ（１０％）のラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５培養液を各ウェルに添加した後、５％のＣＯ２が含まれた３７℃の細胞培養器内で培養しながら、試験後２４時間、４８時間及び７２時間で細胞変性効果を観察し、細胞変性効果が観察される場合、培養液に抗ウイルス活性がないと判定したが、図２に示したように、ラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５培養液処理群では、細胞変性効果が観察されないので、抗ウイルス活性を有することが確認された。
【００６９】
［種卵培養及び抗ウイルス活性確認］
種卵を９日ないし１１日間３７℃の培養器で培養した。卵の殻の接種部位を確認し、血管のない部位にウイルスとラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５とを混合して０．２ｍｌ接種した。ウイルスと乳酸菌の接種後４日ないし５日間培養し、血管有無、種卵敗死などを観察した。種卵から尿膜腔液（ａｌｌａｎｔｏｎｉｃ  ｆｌｕｉｄ）を回収して血球凝集反応を実施し、ウイルスの増殖有無を確認した。血球凝集反応は、９６ウェル細胞培養プレートに尿膜腔液とリン酸緩衝溶液を２５μｌずつ分注し、２倍階段希釈法で希釈した。希釈された９６ウェル細胞培養プレートに鶏から採取した赤血球（１％のＲｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌ）をそれぞれ２５μｌずつ分注し、室温で４０分間反応させて血球凝集を観察した。種卵実験で血球凝集が表れてウェル細胞培養プレートに沈む場合、培養液に抗ウイルス活性がないと判定したが、図３に示したように、ラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５培養液処理群においては、血球凝集がウェル細胞培養プレートに沈まないので、抗ウイルス活性を有することが確認された。
【００７０】
＜実施例５＞米乳酸菌発酵食品組成物の抗ウイルス活性実験
【００７１】
実施例１で製造した米乳酸菌発酵食品組成物を実施例４のラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）抗ウイルス活性実験と同じ方法で実験した結果、実施例４と同じ結果を示した。
【００７２】
＜実施例６＞米乳酸菌発酵食品組成物の抗菌活性実験
【００７３】
実施例１で製造した米乳酸菌発酵食品組成物を実施例３のラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）抗菌活性実験と同じ方法で実験した結果を測定すると、表２と同じ結果を示し、次の表３及び図４に示したように抗菌活性が確認された。
【００７４】
【表３】
2014516524.tif 000005
【００７５】
以上のように、本発明を望ましい実施例を参照して説明したが、該当の技術分野で通常の知識を有する者であれば、下記の特許請求の範囲に記載した本発明の思想及び領域から逸脱しない範囲内で本発明を多様に修正及び変更可能である。
【図１】
2014516524.tif 000006
【図２】
2014516524.tif 000007
【図３】
2014516524.tif 000008
【図４】
2014516524.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成25年11月22日(2013.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
米を計量して精製水に浸漬し、ブレンディングした後、
１００℃で２０分ないし４０分間糊化、または６０℃で２０分ないし４０分間予備糊化した後、再び１００℃で２０分ないし４０分間本糊化して糊化液を製造し、
その糊化液に、α―アミラーゼを添加して８０℃ないし１００℃で４０分ないし２時間にわたって１次糖化した後、グルコアミラーゼを添加して６０℃ないし７５℃で４０分ないし２時間にわたって２次糖化し、
次いで、ろ過することによって得た米糖化液に、キムチから抽出した乳酸菌であるラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）を添加して発酵させることによって製造され、
米乳酸菌発酵液を含み、アトピー皮膚炎に対する抗菌効果を有する
ことを特徴とする米乳酸菌発酵食品組成物。
【請求項２】
米を計量して精製水に浸漬し、ブレンディングした後、
１００℃で２０分ないし４０分間糊化、または６０℃で２０分ないし４０分間予備糊化した後、再び１００℃で２０分ないし４０分間本糊化して糊化液を製造し、
その糊化液に、α―アミラーゼを添加して８０℃ないし１００℃で４０分ないし２時間にわたって１次糖化した後、グルコアミラーゼを添加して６０℃ないし７５℃で４０分ないし２時間にわたって２次糖化し、
次いで、ろ過することによって得た米糖化液に、キムチから抽出した乳酸菌であるラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）を添加して発酵させることによって製造され、
米乳酸菌発酵液を含み、鳥インフルエンザウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ）に対する抗ウイルス効果を有する
ことを特徴とする米乳酸菌発酵食品組成物。
【請求項３】
米を計量して精製水に浸漬し、ブレンディングした後、
１００℃で２０分ないし４０分間糊化、または６０℃で２０分ないし４０分間予備糊化した後、再び１００℃で２０分ないし４０分間本糊化して糊化液を製造する糊化ステップと；
糊化ステップで製造した糊化液に、α―アミラーゼを添加して８０℃ないし１００℃で４０分ないし２時間にわたって１次糖化した後、グルコアミラーゼを添加して６０℃ないし７５℃で４０分ないし２時間にわたって２次糖化し、ろ過することによって米糖化液を製造する米糖化ステップと；
米糖化ステップで製造した米糖化液に、全脂粉乳、牛乳、脱脂大豆タンパク質、オリゴ糖、ｐＨ調節剤、緩衝剤、糖質、甘味料、各種果汁、各種ビタミン類、香味料、アミノ酸、核酸及びそれらの塩類、植物繊維、各種ミネラルから選ばれる１種以上の添加剤を添加した後、１００℃で２０分間殺菌する混合殺菌ステップと；
熟成されたキムチの汁を希釈してＢＣＰ固体培地に塗抹し、３７℃で４８時間培養した後、球菌と桿菌を選抜し、これをＭＲＳ培地に移して培養した後、零下８０℃で保存した後、ラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）菌株を分離し、そのラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）菌株をＭＲＳ培地で３７℃の条件で培養してラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）を製造するラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）乳酸菌製造ステップと；
混合殺菌ステップで製造した混合殺菌米糖化液に、乳酸菌製造ステップで製造したラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）乳酸菌を米糖化液の重量に対して０.１重量％ないし５重量％添加し、３７℃で最終ｐＨが約４.１になるように１２時間にわたって発酵させる乳酸菌発酵ステップと；
を含み、請求項１の米乳酸菌発酵食品組成物を製造する
ことを特徴とする方法。
【請求項４】
ラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）乳酸菌製造ステップにおいて、ラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）菌株の培養及び乳酸菌の製造は、
ラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）菌株をＭＲＳ培養培地（グルコース２％、ペプトン２％、酵母エキス０．５％、酢酸ナトリウム０．５％、リン酸カリウム二塩基性０．２％、硫酸アンモニウム０．２％、硫酸マグネシウム０．１％、硫酸マンガン０．００５％、Ｔｗｅｅｎ８０  ０．１％）で３７℃で１２時間培養した後、培養液を１３，０００ｒｐｍで３時間にわたって遠心分離し、遠心分離で得た菌体と同量の加水分解脱脂粉乳を混合して均質化した後、−４０℃で予備凍結を行った後、−４０℃から−２０℃まで７時間、−２０℃で５時間を維持し、−２０℃から−５℃まで９時間、−５℃で１０時間を維持し、−５℃から１０℃まで１０時間、１０℃で１０時間を維持し、１０℃で８時間にわたって２０℃まで温度を上げ、最終的に２０℃で凍結乾燥を完了し、凍結乾燥された菌体を粉砕してラクトバチルス・サケイＰｒｏＢｉｏ―６５（受託番号：ＫＣＴＣ  １０７５５ＢＰ）を製造する
請求項３に記載の米乳酸菌発酵食品組成物の製造方法。
【国際調査報告】
2014516524.tif 000010
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