(57)【要約】本発明は下記（ａ）と（ｂ）の段階を含む、血漿の初期溶液または免疫グロブリンを濃縮した血漿画分から多価免疫グロブリンの濃縮物を治療用途のために調製する方法に関する：（ａ）カプリル酸によってタンパク汚染菌を沈殿で除去してプロテアーゼを含まない溶液を得る段階、（ｂ）上記のプロテアーゼを含まない溶液を流動床でクロマトグラフィ分離する段階。本発明方法によってヒト多価免疫グロブリンの濃縮物を、使用した血漿１リットル当たり４．５ｇ以上の免疫グロブリンの収率で得ることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血漿の初期溶液または免疫グロブリンを濃縮した血漿画分からヒト多価免疫グロブリンの濃縮物を製造する方法であって、下記（ａ）と（ｂ）、：
（ａ）カプリル酸によってタンパク汚染菌を除去してプロテアーゼを含まない溶液を得る段階と、
（ｂ）その後に上記のプロテアーゼを含まない溶液を流動床クロマトグラフィする段階と、
を含み、ヒト多価免疫グロブリンの濃縮物を、使用した血漿１リットル当たり４．５ｇ以上の免疫グロブリンの収率で得ることができることを特徴とする方法。
【請求項２】
用いるカプリル酸の濃度が０．５〜１．５％、好ましくは０．８〜１．２％、特に０．９〜１．１％である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
カプリル酸によってタンパク汚染菌を除去する段階（ａ）を４．３〜４．９、好ましくは４．６〜４．８のｐＨで行う請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
カプリル酸によってタンパク汚染菌を除去する段階（ａ）と流動床クロマトグラフィする段階（ｂ）との間に、酸性ｐＨでの清澄段階、好ましくは深層濾過段階を含む請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
プロテアーゼを含まない溶液を得るための流動床クロマトグラフィ段階（ｂ）を、イオン交換タイプ、アフィニティタイプ、「偽アフィニティタイプ」または「混合モード」タイプのクロマトグラフィ担体を用いて行う請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
「混合モード」タイプの流動床クロマトグラフィ段階が下記（１）〜（４）の段階を含む請求項５に記載の方法：
（１）予めｐＨ４．５〜８の緩衝液で平衡化したクロマトグラフィカラムに、深層濾過によって清澄段階を実施した、予め同じｐＨに調整された溶液を供給し、
（２）カラムに吸着されなかった全てのタンパクが除去されるまでカラムを緩衝液で洗浄し、
（３）カラムに吸着された多価免疫グロブリンをｐＨ８〜１０に調整した溶出緩衝液で溶出し、
（４）ヒト多価免疫グロブリンを濃縮した溶液を回収する。
【請求項７】
（ｂ）段階の後に下記（ｉ）〜（ｖｉ）の一つまたは複数の段階をさらに有する請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法：
（ｉ）ウイルスの不活化段階、
（ｉｉ）上記段階の最後に得られる溶液を陰イオン交換クロマトグラフィする段階、
（ｉｉｉ）上記段階の最後に得られる溶液から抗Ａ抗体と抗Ｂ抗体とを除去する段階、
（ｉｖ）孔径が１００から１５ｎｍまで下がるナノメートルフィルターに通す濾過段階、
（ｖ）上記段階の溶液を限外濾過によって濃縮し、配合処理する段階、
（ｖｉ）次いでおこなう通常の滅菌濾過段階。
【請求項８】
初期溶液が、エタノール分画またはクロマトグラフィ分離によって免疫グロブリンを濃縮した血漿画分である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
上記の初期溶液が、エタノール分画された血漿から得られる「I＋II＋III」沈殿物または「II＋III」沈殿物を溶液にしたものである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記の「I＋II＋III」沈殿物または「II＋III」沈殿物を注射用精製水中またはイオンを含む溶液中の溶液にする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
上記のイオンを含む溶液が、NaClを２０ｍM以下、好ましくは５〜１５ｍM、より好ましくは１０ｍＭの濃度で含む溶液である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
上記の「I＋II＋III」沈殿物または「II＋III」沈殿物を、濃度が２０ｍM以下、好ましくは５〜１５ｍMのCaCl2溶液で処理し、好ましく１０ｍＭの CaCl2溶液で処理する請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
下記（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の段階を含む請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法：
（ｉ）カプリル酸によってタンパク汚染菌を除去する段階、
（ｉｉ）深層濾過による清澄段階、
（ｉｉｉ）「混合モード」タイプの流動床クロマトグラフィ段階、
（ｉｖ）溶剤／洗剤処理によるウイルス不活化段階、
（ｖ）陰イオン交換クロマトグラフィ段階、
（ｖｉ）抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体を除去する段階、
（ｖｉｉ）孔径が１００から１５ｎｍまで下がるナノメートルフィルターに通す濾過段階、
（ｖｉｉｉ）前段階の溶液を限外濾過によって濃縮し、配合処理し、その後、通常の滅菌濾過する段階。
【請求項１４】
下記（ａ）と（ｂ）の段階をさらに含む請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法：
（ａ）請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法で得られるヒト多価免疫グロブリンの濃縮物に、一種または複数の医薬上許容可能な安定剤を添加する段階、
（ｂ）必要に応じて行なう、上記段階で得られた医薬品を凍結または凍結乾燥して、医薬品を液体、凍結または凍結乾燥した形態にする段階。
【請求項１５】
上記濃縮物が３０％以下の抗補体活性を有することを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法で得られるヒト多価免疫グロブリンの濃縮物。
【請求項１６】
液体または凍結または凍結乾燥したヒト多価免疫グロブリンの医薬組成物の下記の群に含まれる症状を治療するための薬剤の製造での使用：脱髄性多発性神経障害、多発性硬化症、ランバート−イートン（Lambert-Eaton）筋無力症候群、皮膚筋炎、先天性無ガンマグロブリン血症および先天性低ガンマグロブリン血症のような原発性免疫不全、分類不能原発性免疫不全、重症複合免疫不全、ウィスコット・アルドリッチ症候群、骨髄腫または重症続発性低ガンマグロブリン血症および再発性感染を有する慢性リンパ性白血病、HIV感染小児の再発性感染での代替治療、低ガンマグロブリン血症または体液性免疫の機能障害を有する原発性免疫不全の治療、体液性免疫の続発性免疫不全、特に低ガンマグロブリン血症を有し且つ再発性感染を伴う慢性リンパ性白血病または骨髄腫の治療、感染を伴う低ガンマグロブリン血症を有する造血幹細胞の同種移植、激しい出血の危険がある場合または医療手術または外科手術の前に行う成人および小児の特発性血小板減少性紫斑病（ITP）の免疫調節治療、バードショット（Birdshot）脈絡網膜炎、ギラン・バレー症候群、多巣性運動ニューロパチー（MMN）、慢性炎症性脱髄性多発性神経障（CIDP）および川崎病の免疫調節。
【請求項１７】
使用する多価免疫グロブリンの医薬組成物が請求項１４に記載の方法に従って得られる組成物である請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療で使用するための多価免疫グロブリン濃縮物の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリン(Ig)は、血漿、血管外液および分泌物中に分布しているBリンパ球およびプラズマ細胞によって合成される。この免疫グロブリン(Ig)はそのタンパク構造に基づいて５つのカテゴリー、アイソタイプまたはクラスすなわちIgG, IgA, IgM, IgEおよび IgDに分類される。ヒト体内での自然の分布はIgG: 75%, IgA: 20%, IgM: 5%で、IgEおよび IgDは<1%である。通常は血漿１リットル当たり８〜１５ｇのIgGが存在する。血漿中でのクラスIgGの血中免疫グロブリンの半減期は約２１日で、IgA, IgM, IgD, IgEの半減期が７日以下である。
【０００３】
医薬で用いられるヒト起源の多価免疫グロブリンは９７％のIgGからなり、これは種々の感染性病原体に対する非常に多様な抗体の存在に対応する。
【０００４】
種々の先天性感染または欠損の治療で多価免疫グロブリンを濃縮したヒト血漿画分を使用した時の治療効果は良く知られている。原発性免疫不全および特定の続発性欠損（白血病、骨髄腫または反復性感染）を治すためにも多価または通常免疫グロブリンが投与される。これらは特定の抗体(抗Rhまたは抗D細胞傷害性抗体)とは無関係と考えられる。この多価または通常免疫グロブリンは、特定の疾患の進行を遅らせるために非常に高い投与量、2g/kg／日で処方できる（その生理病理学は分かっていない）が、免疫タイプの一つの成分を含む。特発性血小板減少性紫斑病ともよばれる免疫起源の血小板減少症の治療では多価免疫グロブリンの投与は少なくとも一過性の効果を示す。多価免疫グロブリンはギランバレー症候群、脱髄性多発性神経障害、多発性硬化症、Lambert-Eaton筋無力症候群、皮膚筋炎の治療でも薬効を有する。
【０００５】
多価免疫グロブリンは種々の分子を含むため、その作用機序は複雑であるが、それが複数のレベルで介在することによって患者の免疫系のバランスを変え、薬効を発揮する。
【０００６】
多価免疫グロブリンの濃縮物を調製する方法は当業者にいくつか知られている。最もよく知られている調製方法はエタノールを用いた沈殿を複数段階有する（非特許文献１）。
【０００７】
特許文献１（欧州特許第０７０３ ９２２号公報）には、ヒト血漿または凍結沈殿血漿上清から免疫グロブリンGの濃縮物を調製する方法が記載されている。この方法はエタノール沈殿を含まず、一連のクロマトグラフィ段階と、溶剤／洗剤によるウイルス不活化段階とを含む。この方法では一連のクロマトグラフィ段階を有するため収率はかなり低い。実際には２つの陰イオンおよび陽イオン交換サイクルを直列に備え、また２つの限外濾過段階を含む。
【０００８】
特許文献２（欧州特許第1 385 886号公報）には、脂質およびタンパク汚染菌の沈殿による予備精製段階と、陰イオン交換体でアルカリ性ｐＨを用いて行う単一のクロマトグラフィ段階とを含むヒト免疫グロブリン濃縮物の調製方法が記載されている。この方法を用いると初期処理した血漿１リットル当たり最大で４ｇの免疫グロブリンを得ることができる。
【０００９】
非特許文献２（Tanaka K. et al）には、３つのタイプのゲルすなわち２つのイオン交換ゲル(Q-セファロース FF および CM-セファロース FF)と濾過ゲル(セファクリルS-300 HR)でのクロマトグラフィ分離によるコーン法（Cohn's method）に従って得られたォI+II+IIサおよびォII+IIIサ画分から免疫グロブリンGを精製する方法が記載されている。この方法を用いると血漿１リットル当たり最大で4.3ア 0.2 gの免疫グロブリンＧを得ることができる。
【００１０】
しかし、免疫グロブリンを用いた治療の指示は増加しており、免疫グロブリンの生産収率を高くし、しかも最終産物が高純度で、ウイルス汚染菌を確実に含まないようにする、という大きなニーズがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】欧州特許第０７０３ ９２２号(ラボラトワール  フランセ  デュ  フラクショヌマン  エ  デ  ビオテクノロジ "Concentre d'immunoglobulines G a usage therapeutique et procede de production dudit concentre" (治療用途での免疫グロブリン G 濃縮物およびこの濃縮物の製造方法))
【特許文献２】欧州特許第1 385 886号(ラボラトワール  フランセ  デュ  フラクショヌマン  エ  デ  ビオテクノロジ, "Procede de preparation de concentres d'immunoglobulines humaines a usage therapeutique" (治療用途でのヒト免疫グロブリン濃縮物の調製方法))
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Cohn et al. 1946, J. Am. Chem. Soc. 68, 459
【非特許文献２】Tanaka K. et al., 2000 (「液体クロマトグラフィによってコーン画分から精製した高品質のヒト免疫グロブリンG」 Braz J Med Bio Res 2000, 33(1): 27-30)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、ヒト多価免疫グロブリンの濃縮物を当業者に公知の方法より高い収率で製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の対象は、下記（ａ）と（ｂ）の段階を含む、血漿の初期溶液または免疫グロブリンを濃縮した血漿画分からヒト多価免疫グロブリンの濃縮物を製造する方法にある：
（ａ）、カプリル酸によってタンパク汚染菌を除去してプロテアーゼを含まない溶液を得る段階
（ｂ）その後の上記のプロテアーゼを含まない溶液の流動床でのクロマトグラフィ段階、
本発明のこの方法によってヒト多価免疫グロブリンの濃縮物を、血漿の初期溶液または免疫グロブリンを濃縮した血漿画分１リットル当たり４．５ｇ以上の免疫グロブリンの収率で得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明方法のカプリル酸によってタンパク汚染菌を除去する（ａ）段階の最後に得られた溶液は非特許文献３に従ったプロテアーゼ濃度を有する。このプロテアーゼ濃度は、30 g/Lの免疫グロブリンを含む被検製剤の希釈に対して計算して最大で35 IU/mLである。
【非特許文献３】ヨーロッパ薬局方、第7.5版（01/2012:0918）規格2.6.15
【００１６】
本発明は、カプリル酸によってタンパク汚染菌を除去する段階と、流動床クロマトグラフィ段階とを組み合わせることによって、免疫グロブリンの生産収率を驚くほど高めることができるという観察に基づいている。
【００１７】
本発明の一実施例では、本発明はタンパク汚染菌を酸性ｐＨでカプリル酸によって除去する段階と、その後の、カプリル酸を用いた処理段階の最後に得られる上清の酸性ｐＨでの清澄化との組み合わせを含み、それによって免疫グロブリンを流動床カラムで使用するクロマトグラフィゲル（陰イオン交換体タイプおよび／またはアフィニティタイプおよび／または「偽アフィニティ」タイプ、好ましくは「混合モード」タイプのゲル）とを組み合わせることができ、それによって多価免疫グロブリンの生産収率を上げることができる。クロマトグラフィゲルから多価免疫グロブリンを溶出する条件が、透析または限外濾過タイプの技術による配合処理段階を全く実施せずにプロセスの次の段階に直接適したものにすることができる場合には、生産性を上げることができ好ましい。特に、本発明方法は生産性を血漿１リットル当たり0.25%の多価免疫グロブリンに増加させることができ、得られる最終産物は高純度（９９％）にすることができる。
【００１８】
特定の実施例では、本発明方法はカプリル酸によってタンパク汚染菌を除去する段階（ａ）と流動床クロマトグラフィ段階（ｂ）との間に、酸性ｐＨでの清澄段階、好ましくは深層濾過段階を含む。
溶出段階はＧタイプの免疫グロブリン（IgG）を選択的に抽出するように定義するのが有利である。
【００１９】
本発明の他の対象は下記（ａ）〜（ｄ）の段階を含む、血漿の初期溶液または免疫グロブリンを濃縮した血漿画分からヒト多価免疫グロブリンの濃縮物を調製する方法にある：
（ａ）酸性ｐＨでカプリル酸によってタンパク汚染菌を除去してプロテアーゼを含まない溶液を得る段階、
（ｂ）酸性ｐＨでの清澄段階、
（ｃ）上記のプロテアーゼを含まない溶液の流動床でのクロマトグラフィ段階、
（ｄ）緩衝液で溶出し免疫グロブリンを溶出する段階。
【００２０】
特に、酸性ｐＨでの清澄段階（ｂ）は、できるだけ大きな孔径で、しかも、清澄化上清を流動床カラムに通すことができる孔径をベースにした深層濾過で行う。
【００２１】
本発明方法のカプリル酸によってタンパク汚染菌を除去する（ａ）段階の最後に得られる溶液は非特許文献３の規格2.6.15に従ったプロテアーゼ濃度を有する。このプロテアーゼ濃度は、30 g/Lの免疫グロブリンを含む被検製剤の希釈に対して計算して最大で35 IU/mLである。
【００２２】
本発明のさらに他の対象は、上記方法と、酸性ｐＨでの清澄段階（ｂ）の後のｐＨを上げる段階とを一体化することにある。このｐＨを上げる段階は多価免疫グロブリンのコンディショニングに対応し、このコンディショニングによって後者が流動モードで使用されるクロマトグラフィゲルに合せることができる。
【００２３】
驚くべきことに、本発明方法の最後に得られるヒト多価免疫グロブリンの濃縮物は３０％以下の抗補体活性を有する。この抗補体活性は非特許文献４のパラグラフ2.6.17に記載の方法を参照して求める。
【非特許文献４】ヨーロッパ薬局方の第7.5版（01/2012:0918）
【００２４】
「多価免疫グロブリン」とは、本発明では、産生プロセス中に得られる免疫グロブリンの全体または免疫グロブリンの断片、例えばF(ab')2またはF(ab) および任意の中間画分を意味する。
【００２５】
「血漿画分」とは、自然ヒト血漿、特に多価免疫グロブリンの濃縮物の調製プロセス中に得られる任意の中間画分を分離または分画できる処理で得られる任意の血液溶液を意味する。
【００２６】
「免疫グロブリンを濃縮した血漿画分」とは、自然ヒト血漿中に含まれるレベルを超える免疫グロブリンを含む血漿画分を意味する。
【００２７】
「I＋II＋III」沈殿物または「II＋III」沈殿物とは、コーン法（非特許文献１（Cohn et al. 1946, J. Am. Chem. Soc. 68, 459））または非特許文献５（キストラーおよびニッチマン法（the method of Kistler and Nitschmann） (1962, Vox Sang. 7, 14)）に従ってエタノールで分画した血漿から得られる沈殿物を意味する。
【非特許文献５】キストラーおよびニッチマン法（the method of Kistler and Nitschmann） (1962, Vox Sang. 7, 14)）
【００２８】
「タンパク汚染菌」とは、例えばＧタイプの免疫グロブリン、およびＡ、ＥまたはＭタイプの免疫グロブリン（これらに限定されるものではない）、およびその他の血漿タンパク、例えば下記のもの（これらに限定されるものではない）以外の全てのタンパクを意味する：
（１）アルブミン、トランスフェリン、α\och2-マクログロブリン、プラスミノーゲン、フィブリノゲン等、
（２）凝固因子、例えばFX, FXI,またはFXII（これらに限定されるものではない）
（３）プロテアーゼ、例えばカリクレイン、プレカリクレインまたはプレカリクレインのアクチベーター（これらに限定されるものではない）、
（４）抗Aおよび抗B 赤血球凝集素。
【００２９】
「流動床クロマトグラフィ（chromatographie en lit fluidise）」とは、高密度のクロマトグラフィビーズに重力と逆の方向に流れを与えることによって、ビーズ間に空間を作ることができ、それによって、溶液流を全く詰まらせることなく、わずかに清澄化した溶液をクロマトグラフィカラムに通すことができる技術を意味する。流動床クロマトグラフィはイオン交換タイプ、アフィニティタイプ、「偽アフィニティタイプ」または「混合モード」タイプ（すなわちイオン交換と偽アフィニティの両方）のクロマトグラフィにすることができる。
【００３０】
特に、流動床クロマトグラフィは「混合モード」タイプのUpFront IVIG ゲルを用いて達成され、このゲルでは免疫グロブリンに固有の偽アフィニティを与える静電荷と疎水基とを結合する化学リガンドがビーズ上に存在する。
【００３１】
本発明方法で用いるカプリル酸の濃縮には注意する。すなわち、汚染菌の沈殿を達成するために溶液中の他の成分の沈殿中に多価免疫グロブリンが捕捉されないようにカプリル酸の最終濃度を十分に低い状態にする。カプリル酸の濃度は０．５〜１．５％、好ましくは０．８〜１．２％、特に０．９〜１．１％、特に１％であるのが有利である（カプリル酸の百分比は処理すべき溶液の量に対するカプリル酸のグラム数に対応する）。
【００３２】
本発明の一実施例では、カプリル酸によってタンパク汚染菌を除去する段階を４．３〜４．９、好ましくは４．６〜４．８のｐＨで行う。
【００３３】
本出願人は、驚くべきことに、本発明の多価免疫グロブリンの濃縮物の調製方法で適用されるカプリル酸の濃度は、この方法が後の清澄段階を含むときにこの方法の収率に直接的な影響を及ぼすということに気づいた。カプリル酸濃度が過度に低い場合には完全に沈殿せず、（特に溶液中に脂質の大部分が残る）、従って、任意段階である清澄段階を適用するのが極めて困難になる。一方、カプリル酸濃度が過度に高い場合には多価免疫グロブリンが生成沈殿物の形で捕捉され、もはや清澄段階後に上清中で利用できない。
【００３４】
本発明の一実施例では、酸性ｐＨでの清澄段階をカプリル酸によってタンパク汚染菌を除去する段階と流動床クロマトグラフィ段階との間に追加する。酸性ｐＨでのこの清澄は4.3〜4.9,好ましくは4.4〜4.8のｐＨ値、好ましくは4.6〜4.8のpHで行う。
【００３５】
本発明の特定の実施例では、酸性ｐＨでの清澄段階は深層濾過による清澄段階である。この清澄段階は流動床の運転に害を与える大きい粒子のみを保持するように行う。
【００３６】
好ましくは、規格保持率が15〜100 μm、好ましくは25〜70 μmまたは15〜40 μmのフィルターを用いる。本発明の一実施例では、この段階では規格保持率が25〜70 μm のSEITZ T5500タイプの清澄フィルターを用い、特に、規格保持率が15〜40μmのフィルターT2600を用いる。同等の清澄を可能にする荷電または非荷電の任意のタイプのフィルターを使用することもできる。清澄は、濾過土の存在下で行うのが有利である。それによって、使用する濾過表面を減らすことができる。濾過される溶液の流動性を高めるために、清澄を４〜３０℃、特に１０〜２５℃、例えば２０〜２５℃で行うのが有利である。本発明の清澄段階で用いるフィルターは容量が１m2当たり少なくとも４０リットル、すなわち１m2当たり８ｋｇの沈殿物、特に１m2当たり５５リットル、すなわち１m2当たり１１ｋｇの沈殿物であるのが有利である。
【００３７】
深層濾過の最後に、濾過上清のｐＨおよびオスモル濃度を、透析または限外濾過段階無しに、本発明方法の次の段階のニーズに応じて調整するのが有利である。
【００３８】
本発明の特定実施例では、流動床クロマトグラフィ段階は下記（１）〜（４）の段階を含む「混合モード」タイプのクロマトグラフィ段階にすることができる：
（１）予めｐＨ4.5〜8, 特に 4.5〜7.5; 4.5 〜7.0; 4.5〜 6.8; 4.5 〜 6.5; 5.0〜7.0; 5.0〜6.5; 5.5〜6.3;または5.7 〜 6.3の緩衝液で平衡化したクロマトグラフィカラムに、深層濾過による清澄段階が実施された、予め同じｐＨ、すなわちｐＨ4.5〜8, 特に 4.5〜7.5; 4.5 〜7.0; 4.5〜 6.8; 4.5 〜 6.5; 5.0〜7.0; 5.0〜6.5; 5.5〜6.3;または5.7 〜 6.3に調整された溶液を供給し、
（２）カラムで全ての非吸着タンパクが除去されるまでカラムを緩衝液で洗浄し、
（３）カラム上に吸着された多価免疫グロブリンを、ｐＨ8〜10, 好ましくは8〜9.8; 8.3〜9.8; 8.5 〜 9.8; 8.8 〜 9.8; 9.0〜 9.8; 9.5 〜 9.8に調整した溶出緩衝液で溶出し、
（４）ヒト多価免疫グロブリンを濃縮した溶液を回収する。
【００３９】
本発明で使用する流動床の「混合モード」のクロマトグラフィでは種々のサイズのビーズを使用するのが好ましく、それによって、クロマトグラフィ床を安定化できる。本発明の流動床の「混合モード」タイプのクロマトグラフィで使用するビーズは平均密度が2.5〜3.5kg/L、直径が20〜400 μmで、本発明の条件下で多価免疫グロブリン結合能を有し、この結合能が70 g/Lを超えるのが有利である。
【００４０】
流動床クロマトグラフィで使用する溶出は、次の段階をｐＨと伝導率の簡単な調整後に直接行なえるようにするために、例えば塩基性ｐＨで且つイオン力が低い溶出である。本発明で使用可能な溶出緩衝液は例えばｐＨが７〜１０、特に９〜１０、特に９．５〜１０、より好ましくは９．５〜９．８の 5〜500 mM、特に20mMのグリシンと、5〜500 mM、特に20 mMのNaCl下記を含むことができる。
【００４１】
流動床クロマトグラフィの後に続く段階が高イオン力条件に合わない場合すなわち流動床クロマトグラフィ段階の最後に得られる溶出液を予め希釈または透析する必要である場合には、高ｐＨで且つ低イオン力の溶出緩衝液を使用できる。本発明で使用可能な溶出緩衝液は例えばｐＨが9.5〜10.5、特に9.8〜10.5、より好ましくは9.8〜10.2の 5〜20 mM、特に10mMのグリシンを含むことができる。
【００４２】
本発明の特定実施例では、本発明方法は流動床クロマトグラフィ段階の後に下記（ｉ）〜（ｖｉ）の段階の一つまたは複数の段階をさらに含む：
（ｉ）ウイルス不活化段階、
（ｉｉ）ウイルス不活化段階で用いられる化学成分の除去と、IgAおよびIgM 汚染菌の減少を目的とした、前段階の最後に得られる溶液の陰イオン交換クロマトグラフィ段階、
（ｉｉｉ）前段階の最後に得られる溶液から抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体を除去する段階、
（ｉｖ）孔径が１００から１５ｎｍまでのナノメートルフィルタに通す濾過段階、
（ｖ）前段階からの溶液を限外濾過によって濃縮し、配合処理する段階、
（ｖｉ）通常の滅菌濾過段階。
【００４３】
本発明方法で得られる多価免疫グロブリンの濃縮物には一般に少なくとも一回の感染性病原体を除去または不活化する段階を実施する。感染性病原体としてはウイルスおよびNCTA (非在来型伝染性物質)、例えばプリオンが挙げられる。ウイルス不活化は化学物質、例えば溶剤および／または洗剤および／または熱、例えばUVC、ガンマ線照射および／または低温殺菌による処理を含むことが多い。ナノ濾過も、感染性物質、特にウイルスの除去に役立つ。本発明方法は溶剤および洗剤による少なくとも一つの処理とナノ濾過とを含むのが好ましい。溶剤および／または洗剤による処理（一般に、溶剤／洗剤処理とよばれる）としては特にトリ-n-ブチルホスフェート(TnBP)および／またはTriton X-100, Tween (好ましくは Tween 80), コール酸ナトリウムおよび2-[4-(2,4,4-トリメチルペンタン-2-イル)フェノキシ]エタノール (オクトキシノール)から選択される洗剤による処理が挙げられる。ナノ濾過は一般に多価免疫グロブリンの濃縮物を孔径が８０ｎｍ以下のフィルターに通す濾過を意味する。入手可能なフィルターは例えばBioEx, Planova（登録商標）75 nm, Planova（登録商標）35 nm, Planova（登録商標）20 nm or Planova（登録商標）15 nm (Asahi corporation), Ultipor DV 50またはDV 20 (Pall corporation), Virosart CPV (Sartorius), Viresolve NFRまたはNFP (Millipore)フィルター。ナノ濾過は配合処理段階と限外濾過とを組み合わせせた多価免疫グロブリンを濃縮する段階（ｖ）の前に行うのが好ましい。本発明の特定実施例では多価免疫グロブリンの精製した濃縮物を、孔径が１５〜５０ｎｍ、例えば２０または３５ｎｍの一連のフィルターで濾過する。
【００４４】
本発明方法で使用する陰イオン交換クロマトグラフィはアルカリ性ｐＨかつ低イオン力で行い、多価免疫グロブリンを固定させる。この段階は例えば特許文献２に記載の方法に従って行う。樹脂はpHが8.5〜9.5の低濃度で緩衝能を有する任意の緩衝液、例えばトリス緩衝液、特にグリシン緩衝液で平衡化する。グリシン濃度は5〜50 mM, 例えば5 〜20 mM 、特に8 〜 10 mMにすることができる。ｐＨは8.5〜9.5、特に8.9〜9.1に調整する。
【００４５】
流動床クロマトグラフィからの溶出液は、多価免疫グロブリンを陰イオン交換クロマトグラフィ担体に固定できるように希釈し、ｐＨ調整するのが有利である。この希釈は水で行い、伝導率が1,500 μS/cm以下、好ましくは1,100μS/cm以下になるようにする。カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、多価免疫グロブリンをpHが6.2の20 mM Na/Na2 PO4 緩衝液で溶出させる。さらに、カラムを150 mM NaCl 溶液で洗浄する。
【００４６】
陰イオン交換クロマトグラフィから得られる溶液中の抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体の除去は、特許文献３（国際特許出願第WO 2007/077365号）に記載の方法に従って実施できる。前段階で得られた溶液に、抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体の除去の段階を実施する。この除去は、マトリックスにＡおよびＢの血液型に抗原的に似たオリゴ糖型がグラフトされている担体混合物上に上記多価免疫グロブリンの濃縮物をパーコレーションする免疫アフィニティクロマトグラフィで行う。
【特許文献３】国際特許出願第WO 2007/077365号(ラボラトワール  フランセ  デュ  フラクショヌマン  エ  デ  ビオテクノロジ「抗Aおよび抗B抗体の、および、多反応性IgGが枯渇した免疫グロブリンG (IgG) 濃縮物」)
【００４７】
本発明の特定実施例では、初期溶液は当業者に公知の方法、特にエタノール分画および／またはクロマトグラフィ分離で免疫グロブリンを濃縮した血漿または血漿画分である。
【００４８】
本発明の特定の実施例では、初期溶液はコーン法または非特許文献５に従ってエタノール分画された血漿から得られる「I＋II＋III」沈殿物または「II＋III」沈殿物を溶液にしたものである。「I＋II＋III」沈殿物または「II＋III」沈殿物は、本発明では注射用精製水（wfi）またはイオンを含む溶液の溶液にするのが有利である。本発明で用いるイオン含有溶液はNaClを２０ｍM以下、好ましくは５〜１５ｍM、より好ましくは１０ｍＭの濃度で含む溶液にすることができる。
【００４９】
本発明の別の実施例では、「I＋II＋III」沈殿物または「II＋III」沈殿物の溶液化を汚染フィブリノゲンの沈殿を可能にする条件下で行う。この場合、汚染フィブリノゲンの沈殿は「I＋II＋III」沈殿物または「II＋III」沈殿物をフィブリノゲンの特定の沈殿溶液、例えば濃度が２０ｍM以下、好ましくは５〜１５ｍMのCaCl2溶液、好ましくは１０ｍＭの塩の溶液で処理することで達成できる。この実施例ではフィブリノゲンが沈殿した形態で残り、多価免疫グロブリンは再可溶化される。
【００５０】
本発明の特定実施例の対象は下記（ｉ）〜(viii)を含むヒト多価免疫グロブリンの濃縮物の調製方法にある： 
（ｉ）カプリル酸によってタンパク汚染菌を除去する段階、
（ｉｉ）深層濾過による清澄段階、
（ｉｉｉ）「混合モード」タイプの流動床クロマトグラフィ段階、
（ｉｖ）溶剤／洗剤処理によるウイルス不活化段階、
（ｖ）陰イオン交換クロマトグラフィ段階、
（ｖｉ）抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体を除去する段階、
（ｖｉｉ）孔径が１００から１５ｎｍのナノメートルフィルターに通す濾過段階、
（ｖｉｉｉ）前段階からの溶液を限外濾過で濃縮し、配合処理する濃縮段階と、それに続く通常の滅菌濾過段階。
【００５１】
本発明のさらに特定実施例では、本発明の対象は、下記（ｉ）〜(xi)段階を含むヒト多価免疫グロブリンの濃縮物の調製方法にある：
（ｉ）初期溶液またはエタノール分画によって免疫グロブリンを濃縮した血漿または血漿画分を処理し、コーン法（非特許文献１）または非特許文献５（キストラーおよびニッチマン法（the method of Kistler and Nitschmann） (1962, Vox Sang. 7, 414)）に従って「I＋II＋III」沈殿物または「II＋III」沈殿物を得る段階、
（ｉｉ）「I＋II＋III」沈殿物または「II＋III」沈殿物を、撹拌下に、２０℃（好ましくは４〜１５℃）でWFI（注射用水）水を用いて溶液にする段階。沈殿した多価免疫グロブリンを溶液化を容易にするために、種々のイオン、例えば陽イオン例えばNa+、陰イオン例えばCl-、例えばNaClを供給できる。塩の濃度は２０ｍM以下、好ましくは５〜１５ｍM、より好ましくは１０ｍＭであり、例えばモル濃度が１０ｍＭのNaClである。
【００５２】
（ｉｉｉ）溶液化した「I＋II＋III」沈殿物または「II＋III」沈殿物から、濃度が０．５〜１．５％、特に０．８〜１．２％、特に０．９〜１．１％のカプリル酸によってタンパク汚染菌を沈殿させ、プロテアーゼを含まない血漿溶液を得た後、ｐＨを４．３〜４．９、好ましくは４．４〜４．８、さらに好ましくは４．６〜４．８に調整する段階。本発明の一実施例ではｐＨの調整をＨＣｌで行う。
（ｉｖ） (iii)段階から生じるプロテアーゼを含まない血漿溶液を深層フィルターによって酸性pHで濾過する段階。深層フィルターは流動床モードで使用するクロマトグラフィカラムに濾液を注入できるだけの大きな孔径を有する。
【００５３】
（ｖ）（ｉｖ）段階で生じる溶液のｐＨおよびオスモル濃度を調整する段階、
（ｖｉ）前段階の最後に得られる溶液を流動床クロマトグラフィに通してヒト多価免疫グロブリンを濃縮した血液溶液を得る段階。このクロマトグラフィは本発明方法の次の段階に必要な緩衝液に近い緩衝液中で多価免疫グロブリンを溶出でき、それによって、透析、限外濾過段階または溶液の再配合処理に必要な任意段階に起因する多価免疫グロブリンの減少を少なくするのが有利である。
【００５４】
（ｖｉｉ）溶剤／洗剤処理、特に、トリ-n-ブチルホスフェート(TnBP)および／またはTriton X-100, Tween (好ましくは Tween 80), コール酸ナトリウムおよび2-[4-(2,4,4-トリメチルペンタン-2-イル)フェノキシ]エタノール (オクトキシノール)から選択される洗剤による処理によって前段階の最後に得られる溶液中でウイルスを不活化する段階。
（ｖｉｉｉ）前段階の最後に得られる溶液をTMAE基をグラフトした、架橋多糖類またはビニルポリマーゲルを用いた陰イオン交換クロマトグラフィによって、前段階で用いた溶剤および洗剤を除去し且つIgAおよびIgMタイプの汚染菌を除去する段階。
【００５５】
（ｉｘ）特許文献３に記載のアフィニティクロマトグラフィによって、前段階の最後に得られる溶液から抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体を除去する段階。
（ｘ）孔径が５０ｎｍ（例えばPALL DV20フィルター）または孔径が３５ｎｍ（例えばPLANOVA 35 Nフィルター）の前置フィルター、その後に続く、孔径が２０ｎｍ（例えばPLANOVA 20 Nフィルター）または孔径が１５ｎｍ（例えばPLANOVA 20 NまたはBIOEXフィルター）のフィルターを用いて、前段階の最後に得られる溶液をナノ濾過し、(ix)段階の処理に耐性を示すプリオンまたはウイルスを除去する段階。
（ｘｉ）前段階の最後に得られる溶液を濃縮または透析濾過して、少なくとも50 g/Lの多価免疫グロブリンを含む溶液を得る段階。
【００５６】
本発明方法のカプリル酸によって汚染菌を除去する段階(iii)の最後に得られる溶液は非特許文献６の規格2.6.15に従ったプロテアーゼ濃度を有する。このプロテアーゼ濃度は、30 g/Lの免疫グロブリンを含む被検製剤の希釈に対して計算して最大で35 IU/mLである。
【非特許文献６】ヨーロッパ薬局方の第6.7版（01/2012:0918）
【００５７】
本発明のさらに他の対象は、濃縮物が３０％以下の抗補体活性を有する本発明法で得られるヒト多価免疫グロブリンの濃縮物にある。
【００５８】
本発明のさらに他の対象は、下記（ａ）と（ｂ）を特徴とする液体の、凍結または凍結乾燥したヒト多価免疫グロブリンの医薬組成物の調製方法にある：
（ａ）本発明方法で得られるヒト多価免疫グロブリンの濃縮物に、一種または複数の医薬上許容可能な安定剤を添加する段階、
（ｂ）必要に応じて行なう、前段階で得られる医薬品を凍結または凍結乾燥して、医薬品を液体、凍結または凍結乾燥した形態にする段階。
【００５９】
本発明で用いられる医薬上許容可能な安定剤は例えば特許文献４、特許文献５および特許文献６に記載されている。
【特許文献４】フランス国特許出願第2 853 551号公報
【特許文献５】フランス国特許出願第2 961 107号公報
【特許文献６】フランス国特許出願第2 962 650号公報
【００６０】
特許文献４には、アルコール糖、例えばマンニトール、グリシンおよび非イオン洗剤を含む安定化配合物が記載されている。マンニトール濃度は30 g/L〜50 g/Lであるのが有利であり、グリシン濃度は7 g/L〜10 g/Lであり、非イオン洗剤の濃度は20 and 50 ppmである。
【００６１】
特許文献５には、グリシンおよびｐＨが４．８以下の非イオン洗剤を含む安定化配合物が記載されている。グリシン濃度は少なくとも200 mM、好ましくは250 mM ± 50 mMであり、非イオン洗剤の濃度は20〜100 mg/L、好ましくは35 mg/L ± 15 mg/L、さらに好ましくは50 mg/ Lである。特許文献６には、ヒト免疫グロブリンＧの製剤に、アミノ酸、糖類、糖類の誘導体、塩および表面活性剤から選択される賦形剤を添加することが記載されている。この界面活性剤はこの界面活性剤の臨界ミセル濃度より低い濃度で添加される。
【００６２】
本発明のさらに他の対象は、ヒト多価免疫グロブリンの液体、凍結または凍結乾燥した医薬組成物、特に本発明方法で得られたヒト多価免疫グロブリンの液体、凍結または凍結乾燥した医薬組成物の下記での使用にある：脱髄性多発性神経障害、多発性硬化症、ランバート−イートン（Lambert-Eaton）筋無力症候群、皮膚筋炎等の症状の治療、原発性免疫不全の症例、例えば先天性無ガンマグロブリン血症および先天性低ガンマグロブリン血症、分類不能原発性免疫不全、重症複合免疫不全、ウィスコット・アルドリッチ症候群、骨髄腫または重症続発性低ガンマグロブリン血症および再発性感染を有する慢性リンパ性白血病、HIV感染小児の再発性感染での代替治療、低ガンマグロブリン血症または体液性免疫の機能障害を有する原発性免疫不全の治療。本発明のさらに他の対象は本発明のヒト多価免疫グロブリンの液体、凍結または凍結乾燥した医薬組成物の下記での使用にある：体液性免疫の続発性免疫不全、特に低ガンマグロブリン血症を有し且つ再発性感染を伴う慢性リンパ性白血病または骨髄腫の治療、感染を伴う低ガンマグロブリン血症を有する造血幹細胞の同種移植、激しい出血の危険がある場合または血小板値を補正するための医療手術または外科手術の前に行う成人および小児の特発性血小板減少性紫斑病（ITP）の免疫調節治療、バードショット（Birdshot）脈絡網膜炎、ギラン・バレー症候群、多巣性運動ニューロパチー（MMN）、慢性炎症性脱髄性多発性神経障（CIDP）および川崎病の免疫調節治療。
【００６３】
以下、本発明方法の実施例を説明する。下記実施例は本発明の対象を明確にし、有利な実施例を説明することを目的とするもので、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００６４】
実施例１
1.1  「I＋II＋III」沈殿物を溶液化
出発材料としてはコーン法または非特許文献５に従ってエタノール分画された血漿から得られる「I＋II＋III」沈殿物を用いる。この沈殿物を、228 mLの脱塩水に対して56.7 gの量または同等の比率で溶液化する。混合物を15ーC ア 5ーCで２０分間撹拌した後、温度を22ーC ア 2ーCに上げ、カプリル酸(1重量％／容量)を、溶液化した「I＋II＋III」沈殿物に徐々に添加する。カプリル酸を添加して得られた溶液のｐＨを４．８に調整し、溶液を撹拌下に６０分間維持する。
【００６５】
1.2  深層濾過
得られた溶液をSEITZ(登録商標)T 2600 フィルター(Pall Corporation)の深層濾過によって清澄化する。この濾過は「I＋II＋III」沈殿物中に存在する濾過アジュバントと、カプリル酸の添加によって生じたタンパク沈殿物の両方を保持する。
濾過収率を最適化するためにサンプルのｐＨを調べることも有利である。
タンパク溶液のｐＨは濾過した後にだけ6.0に調整する。すなわち、ｐＨを4.8から6.0に調整すると、フィルターに保持されたわずかな沈殿物（不溶性の多価免疫グロブリン）が生じ、従って、多価免疫グロブリンの濾過収率が低下する。
フィルターのリンス容量（無熱性精製水）は最終収率を最適化するために初期サンプルの容量と同じにする。
【００６６】
1.3  「混合モード」タイプの流動床クロマトグラフィ
運転条件は以下の通り：
・平衡化および洗浄緩衝液: 20 mM Na/Na2PO4、pH 6
・溶出緩衝液 20 mM グリシン/20 mM NaCl、pH 9.8
Gly/NaCl緩衝液のｐＨ作用による溶出を選択することで単なる希釈（伝導率およびｐＨの調整）によってイオン交換カラム(TMAE Fractogel)に直ちに注入できる状態のサンプルを得ることができる。
【００６７】
1.4  溶剤／洗剤処理
実施例１．３による「混合モード」タイプの流動床クロマトグラフィからの溶出液に、NeurathおよびHorowitzの特許文献７（米国特許第4,764,369号明細書）に記載のような溶剤／洗剤によるウイルス不活化処理を実施する。
１０倍濃縮した溶剤／洗剤混合物は３％のTnBP (トリ(n-ブチル) ホスフェート) および10%のオクトキシノールを含む。溶出液中の最終濃度は0.3%のTnBP および 1% のオクトキシノールである。
１時間の不活化後、溶出液をｐＨ９．０に調整し、水に希釈して1,100 μS/cm 以下の伝導率を得る。
【００６８】
1.5  イオン交換クロマトグラフィ
使用するイオン交換ゲルはTMAE-Fractogel(登録商標)（Merck）である。
・予備平衡化緩衝液: グリシン 80 mM / NaCl 80 mM、pH 9
・平衡化緩衝液: グリシン 9 mM / NaCl 9 mM、pH 9。
サンプルを入れた後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、20 mM Na/Na2 PO4 緩衝液、pH 6.2中で溶出する。
【００６９】
1.6  アフィニティクロマトグラフィ
使用するアフィニティゲルはIso A/Iso B Hypercel（Pall Corporation）である。
TMAEクロマトグラフィの溶出液に、このアフィニティクロマトグラフィを実施し、抗Ａ抗および抗Ｂ抗体を除去する。目的の多価免疫グロブリンは保持されずにカラムを通過する。
・脱塩水によるゲルの平衡化
・カラム洗浄を用いない非吸着画分の回収。
【００７０】
1.7  濾過
アフィニティクロマトグラフィからのタンパク溶液を深層フィルター90LA CUNO、3M、次いで、0.2 μmフィルターで濾過する。これらのフィルターを水洗し、リンス溶液は濾液と混合する。
【００７１】
1.8  ナノ濾過
前段階の濾液をｐＨ4.5に調整し、Fluorodyne IIフィルター0.1 μm（Pall Corporation）でオンラインで前置濾過し、DV50フィルター（Pall Corporation）、次いで、Planova 20N フィルター（Asahi）でナノ濾過する。
【００７２】
1.9  配合
カットオフ閾値が30 kDaのカセットで限外濾過によって、産物を約80 g/Lに予備濃縮し、次いで、伝導率が<600 μS/cmになるまで定容で透析濾過する。産物を次いで配合し、50 g/Lのタンパクに調整する。
【００７３】
実施例２
本発明方法をパイロット規模で用いて多価免疫グロブリン濃縮物を得る
2.1  「I＋II＋III」沈殿物の溶液化
出発材料としては非特許文献５に従ってエタノールで分画した血漿から得られる「I＋II＋III」沈殿物を用いる。この沈殿物を、12Lの脱塩水に対して3kgの量で溶液化する。混合物を少なくとも10ーC ± 3ーCで２０分間撹拌する。次いで、温度を22ーC ± 2ーCに上げ、溶液に戻した「I＋II＋III」沈殿物にカプリル酸(1重量％／容量)を徐々に添加する。カプリル酸を添加して得られた溶液のｐＨを４．８に調整し、溶液を撹拌下に６０分間維持する。
【００７４】
2.2  深層濾過
得られた溶液をSEITZ(登録商標)T 2600 フィルター(Pall Corporation)での深層濾過で清澄化する。この濾過は「I＋II＋III」沈殿物中に存在する濾過アジュバントと、カプリル酸の添加によって生じるタンパク沈殿物の両方を保持する。このテストで用いた表面積は１ｍ2の濾過媒体当たり８．７ｋｇの沈殿物である。
フィルターのリンス容量（無熱性精製水）は初期サンプルの容量、すなわち１５Lと同じである。
【００７５】
2.3  「混合モード」タイプの流動床クロマトグラフィ
使用するクロマトグラフィゲルはRhobust IGIVゲル（Upfront）である。
直径10cmのカラム中に4.3 Lのゲル。
運転条件は以下の通り：
・平衡化および洗浄緩衝液: 20 mM Na/Na2PO4、pH 6
・溶出緩衝液 20 mM グリシン/20 mM NaCl、pH 9.8
【００７６】
2.4  溶剤／洗剤処理
「混合モード」タイプの流動床クロマトグラフィからの溶出液に、NeurathおよびHorowitzの特許文献７に記載のような溶剤／洗剤によるウイルス不活化処理を実施する。
１０倍濃縮した溶剤／洗剤混合物は３％のTnBP (トリ(n-ブチル) ホスフェート) および10%のオクトキシノールを含む。溶出液中の最終濃度は0.3%のTnBP および 1% のオクトキシノールである。
少なくとも１時間の不活化の後、溶出液をｐＨ９．０に調整し、水に希釈して1,100 オS/cm 以下の伝導率を得る。
【００７７】
2.5  イオン交換クロマトグラフィ
適用するイオン交換ゲルはEMD-TMAE-Fractogel(登録商標)（Merck）である。
直径12.7cmのカラム中に4 Lのゲル。
・予備平衡化緩衝液: グリシン 80 mM / NaCl 80 mM、pH 9
・平衡化緩衝液: グリシン 9 mM / NaCl 9 mM、pH 9。
サンプルを入れた後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、20 mM Na/Na2 PO4 緩衝液、pH 6.2中で溶出する。
【００７８】
2.6  アフィニティクロマトグラフィ
使用するアフィニティゲルはIso A/Iso B Hypercel（Pall Corporation）である。直径７cmのカラム中の154mLのゲル。
TMAEクロマトグラフィからの溶出液に、このアフィニティクロマトグラフィを実施し、抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体を除去する。目的の多価免疫グロブリンは保持されずにカラムを通過する。
・脱塩水によるゲルの平衡化
・カラム洗浄を用いない非吸着画分の回収。
【００７９】
2.7  濾過
Iso A／Iso B Hypercelアフィニティクロマトグラフィからのタンパク溶液を深層フィルター90LA CUNO、3M、次いで、0.2 μmフィルターで濾過する。これらのフィルターを水洗したリンス溶液は濾液に合せる。
【００８０】
2.8  ナノ濾過
ｐＨ4.5に調整された前段階の濾液を、Fluorodyne IIフィルター0.1 オm（Pall Corporation）でオンラインで前置濾過し、DV50フィルター（Pall Corporation）、次いで、Planova 20N フィルター（Asahi）でナノ濾過する。
【００８１】
2.9  配合（formulation）処理
カットオフ閾値が30 kDaのカセットで限外濾過して、産物を約80 g/Lに予備濃縮し、次いで、伝導率が<600 オS/cm以下になるまで定容で透析濾過する。産物を次いで配合し、50 g/Lのタンパクに調整する。
【００８２】
実施例３
本発明方法の収率
実施例１および実施例３に記載の本発明方法に従って３つの異なる「I＋II＋III」沈殿物を用いて３つのバッチ（ロット）を作った。１％のカプリル酸を用いてプロテアーゼを除去した。濾過はSEITZ T 2600 プレートフィルタープレスで行う。
対照ロットは特許文献２（欧州特許出願第1 385 886号公報）に記載の参照方法に従って処理した。
本発明の新規な方法の収率結果を［表１］に示す：
【００８３】
【表１】
2014520829.tif 000002
【００８４】
本発明方法を用いることで参照方法（特許文献２の方法〕に比べて処理血漿１リットル当たりの多価免疫グロブリンの収率（ｇ）を増加させることができる。
上記実施例におけるゲインは、本発明のバッチと同じ沈殿物から作られた対照バッチとの間で、0.26 gIgG/血漿である。
【００８５】
実施例４
抗補体活性
３つの異なる「I＋II＋III」沈殿物から本発明方法に従って３つの試験的バッチをパイロット規模で作った。これらのバッチを同じ規模（パイロットサイズ）であるが特許文献２（欧州特許出願第1 385 886号公報）に記載の静脈注射によって免疫グロブリンを産生する工業的方法に従って作ったバッチと、同じ沈殿物から作られた特許文献２（欧州特許出願第1 385 886号公報）に記載の方法に従って調製された３つの工業的バッチと比較した。
パイロットサイズで作られたバッチは、工業的バッチの少なくとも１０％のサイズを有するバッチに対応する。
本発明のバッチは、非特許文献４（ヨーロッパ薬局方の第7.5版（01/2012:0918）のパラグラフ2.6. 17）のテストに従って測定した抗補体活性（ACA）が、特許文献２（欧州特許出願第1 385 886号公報）に記載の方法で作られたバッチの抗補体活性より常に低い。さらに、この基準で１８カ月以内に観察される進行率は本発明で作られたバッチの方が低い。
抗補体活性（ACA）の結果は［表２］に示してある：
【００８６】
【表２】
2014520829.tif 000003
【００８７】
従って、本発明の方法を用いることにによって抗補体活性が３０％以下である多価免疫グロブリンの濃縮物を得ることができる。
【００８８】
実施例５
本発明方法で生産した免疫グロブリンの純度
実施例２に記載のパイロットバッチに関する純度分析データを［表３］にまとめた。
【表３】
2014520829.tif 000004
【非特許文献７】Pressac M, Later R. "Dosages seriques d'IgG, IgA, IgM, transferrine et haptoglobine. II Precision analytique et comparaison des resultats fournis par differents analyseurs"（ IgG, IgA, IgM, トランスフェリンおよびハプトグロビンの連続投与。II種々の分析器によって提供される結果の分析精度および比較） Ann Biol Clin 1995; 53: 273-81
【非特許文献８】R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne et J. Kuby,「酵素免疫吸着法」in Immunology, 5e edition, pages 148-150, W. H. Freeman, New York, 2003
【００８９】
「モノマー」＋「ダイマー」の合計、下位クラスの分布、汚染菌および抗補体活性レベルは、本発明方法の免疫グロブリンまたは特許文献２（欧州特許出願第1 385 886号）に記載の参照方法の免疫グロブリンで同じである。これらの特徴はヨーロッパ薬局方の規格を満たす。
【００９０】
実施例６
本発明方法で生産した免疫グロブリンの安定性
実施例２に記載のパイロットバッチからの配合処理済み製品を４℃に維持し、また、同じ初期沈殿物で工業的バッチのアリコートを作り、同じ条件下に同じ段階で維持した。６カ月ごとに実施したサンプリングによって、下記の３つの基準で、本発明で得られたバッチ（パイロットバッチ１、２、３）と、工業的参照方法である特許文献２（欧州特許出願第1 385 886号公報）で得られるバッチ（工業的バッチ１、２、３）の間に差が認められた。
測定された３つの基準は以下の通り：
（１）非特許文献９（ヨーロッパ薬局方の第6.7版(Pharmeuropa, volume 21, number 2, April 2009), パラグラフ2.7.1）に記載の方法による免疫グロブリンG (IgG)の濃度の測定および抗Hb免疫グロブリンの濃度の測定、および、
（２）非特許文献１０（ヨーロッパ薬局方の第6.7版(Pharmeuropa, volume 21, number 2, April 2009), パラグラフ2.2.29）に記載の方法による分子の大きさ（ポリマー、ダイマー、モノマーおよび画分）の決定
【非特許文献９】ヨーロッパ薬局方の第6.7版(Pharmeuropa, volume 21, number 2, April 2009), パラグラフ 2.7.1
【非特許文献１０】ヨーロッパ薬局方の第6.7版(Pharmeuropa, volume 21, number 2, April 2009), パラグラフ 2.2.29
【００９１】
これらの差は［表４］に示してある：
【表４】
2014520829.tif 000005
【００９２】
データの分析から以下のことがわかる：
（１）７つのバッチの１８カ月にわたるIgG濃度の安定性および均一性、
（２）１８カ月にわたる抗Hb Igの濃度の安定性、各バッチはこの基準に固有のものである、
（３）各バッチに対して１８カ月にわたるヨーロッパ薬局方が要求する８５％以上の一定の「モノマー＋ダイマー」の合計。
【００９３】
実施例７
カプリル沈殿段階、清澄段階、「混合モード」タイプき流動床クロマトグラフィ段階を含む方法
カプリル酸による処理は、血漿から汚染タンパクの一部（溶液中に残る免疫グロブリン）、特にプロテアーゼを沈殿によって除去する目的がある。用いるカプリル酸の百分比と上清および沈殿物の分離方法に依存して程度の差はあるが免疫グロブリンのかなりの部分が失われる可能性がある。流動床クロマトグラフィと両立可能なできるだけ最も粗い清澄化を実施することで免疫グロブリンの減少が最小になるように、実験条件をテストした。そのために、第１段階ではカプリル沈殿なしで、孔径をだんだんに大きくした複数のフィルターを比較し、次いで、異なる濃度のカプリル酸処理で確認した。
【表５】
2014520829.tif 000006
【００９４】
これらの結果から、詰まりによるIgG減少を減らすためには約10〜20 オmの最小孔径を用いなければならないことがわかる。フィルターT5500に比べて小さい孔径で同等のIgG収率が得られるためフィルターT2600を選択した。
プロテアーゼの沈殿および溶液の濾過性に影響を与える添加カプリル酸の百分比（濾過アジュバントき添加なしのカプリル酸の範囲は0.5 〜1 %）を試験した。得られた結果を、単純な遠心分離による対照清澄化で得られた結果と比較する。
【００９５】
【表６】
2014520829.tif 000007
【００９６】
遠心分離による対照から、免疫グロブリンの一部が沈殿物中で失われることがわかる。沈殿物がリンスされない場合、この方法は維持されなかった。最も興味深い被試験条件は１％濃度のカプリル酸である。すなわち、プロテアーゼ汚染は低く、免疫グロブリンの減少は３０％以下である。従って、１％のカプリル酸の濃度は、濾過性と収率とプロテアーゼの除去との最良のバランスのように思われる。
収率を上げるために、より少ない量（210 mLの代わりに180 mL）を用い且つ［表７］に記載のリンス緩衝液で沈殿物の洗浄量を増やすことによって下記のテストを行った。
【００９７】
【表７】
2014520829.tif 000008
【００９８】
フィルターへの添加量を減らし且つ清澄化される産物の量（180 mL）と同じ洗浄量で沈殿物をリンスすることによって、詰まらないことが観察され、免疫グロブリン全体が回収された。免疫グロブリン全体を、次の精製法のアフィニティクロマトグラフィ段階に利用できる。
【００９９】
実施例８
IgG溶液化の改良
実施例２に記載の新規な方法に従ってパイロットサイズのバッチを作り、特許文献２（欧州特許出願第1 385 886号公報）に記載の方法に従って同じ規模（10AXTO1064015）で調製されたバッチと比較した。「I+II+III」沈殿物の溶液化を改良できることがわかる。すなわち、［表８］に示すように、この段階で少なくとも1 g/IgGの差が観察される（容量は同等である）。
【表８】
2014520829.tif 000009
【０１００】
相補的試験から、沈殿物中に存在する免疫グロブリンを、精製水ではなくイオンを含む溶液に有利に溶液化できることがわかった。特に、10 mM NaCl 溶液を用いることによって可能になることがわかった。
さらに、カプリル酸によるタンパク汚染菌の沈殿も4.8以下のpHで改良できる。特に、4.6のpHによってこの改良は可能になる。
これらの改良を考慮に入れてパイロットサイズのバッチ（「新規なバッチ」）を作り、本発明に従って予め作られた３つのバッチ（バッチ１、２、３）を用いた「ロバストクロマトグラフィ溶出液」段階と比較した。
【０１０１】
これらの差は［表９］によって説明される。
【表９】
2014520829.tif 000010
【０１０２】
カプリル酸で処理され且つｐＨが4.6に調整された10 mM NaCl 濃度の溶液に溶液化した新規なバッチは下記（１）および（２）を示す：
（１）使用した血漿１リットル当たりの免疫グロブリンの収率がより良い、
（２）免疫グロブリン／総タンパク比に関する純度がより良い。
【０１０３】
実施例９
「II+III」沈殿物への本発明の応用
「II+III」沈殿物はポリクローナルIgGの精製用原料源としての「I+II+III」沈殿物の代替物である。
ここでは本発明の２つのバッチを種々の「II+III」沈殿物から作った。これらの原料の両者から得られる第１の評価の結果を「流動床クロマトグラフィ溶出液」段階と比較した。
【０１０４】
これらの結果は［表１０］によって説明される。
【表１０】
2014520829.tif 000011
【０１０５】
これらの結果から、本発明方法の第１段階は両タイプの沈殿物を用いて同じ方法で行えることがわかる：
（１）抽出収率：清澄化段階およびロバストアフィニティクロマトグラフィ段階の累積収率は、例えバッチの一つが少し失敗しても、同程度である。しかし、「I+II+III」沈殿物と比較してエタノールによる追加の分画段階を実施した「II+III」沈殿物は、収率（IgGのグラム／L血漿）が「I+II+III」沈殿物で得られる収率より１５％少ない。この不足はエタノールによる追加の分画段階でのIgGの一部の損失に関連する。
（２）純度：溶液化し、カプリル酸で処理し且つｐＨを4.6に調整した「II+III」沈殿物で得られるIgG/総タンパク比は、溶液化し、カプリル酸処理し且つｐＨを4.8に調整した「I+II+III」沈殿物で得られた収率と同等である。
【国際調査報告】
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