(57)【要約】  本発明は、Ｔｉｅ２に結合する抗体およびその使用方法を提供する。本発明の特定の実施形態によれば、抗体は、ヒトＴｉｅ２に結合しＴｉｅ２と１つまたはそれ以上のＴｉｅ２リガンド（アンジオポエチン（angtopoietin）１（Ａｎｇ１）、アンジオポエチン（angtopoietin）２（Ａｎｇ２）、アンジオポエチン３（Ａｎｇ３）および／またはアンジオポエチン（angtopoietin）４（Ａｎｇ４）等）との間の相互作用を遮断する完全ヒト抗体である。本発明の抗体は、Ｔｉｅ２の１種またはそれ以上の血管新生を含む生物学的活性と関連したｄおよび障害の治療に特に有用である。
2014525934.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴｉｅ２に特異的に結合し、Ｔｉｅ２とＴｉｅ２リガンドとの間の相互作用を遮断する単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
Ｔｉｅ２リガンドは、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３およびＡｎｇ４からなる群から選択される、請求項１に記載の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項３】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｔｉｅ２と、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３およびＡｎｇ４の４つ全てとの間の相互作用を遮断する、請求項１に記載の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項４】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＴｉｅ２のＩｇ１−Ｉｇ２−ＥＧＦドメイン（配列番号７）からなるポリペプチドまたはヒトＴｉｅ２のＩｇ２−ＥＧＦドメイン（配列番号８）からなるポリペプチドに特異的に結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項５】
抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号７のアミノ酸９６〜１０６、配列番号７のアミノ酸１３９〜１５２および配列番号７のアミノ酸１６６〜１７５からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸セグメント内に位置する１個またはそれ以上のアミノ酸と相互作用する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項６】
抗体または抗原結合フラグメントは、水素／重水素交換法で特定して、配列番号７のアミノ酸９６〜１０６、配列番号７のアミノ酸１３９〜１５２および配列番号７のアミノ酸１６６〜１７５と相互作用する、請求項５に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項７】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、げっ歯類のＴｉｅ２およびヒトＴｉｅ２と特異的に結合する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項８】
げっ歯類のＴｉｅ２は、マウスＴｉｅ２またはラットＴｉｅ２である、請求項７に記載の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項９】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト、マウスおよびラットＴｉｅ２と特異的に結合する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、受託番号ＰＴＡ−１２２９５またはＰＴＡ−１２２９６でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託された細胞株から生産される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
受託番号ＰＴＡ−１２２９５またはＰＴＡ−１２２９６でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託された細胞株から生産される抗体とヒトＴｉｅ２上の同じエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
ヒトＴｉｅ２への結合に関して、受託番号ＰＴＡ−１２２９５またはＰＴＡ−１２２９６でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託された細胞株から生産される抗体と競合する単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１４】
ヒトＴｉｅ２に特異的に結合しＴｉｅ２とＴｉｅ２リガンドとの間の相互作用を遮断する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、患者の腫瘍の増殖阻害に用いられる医薬組成物。
【請求項１５】
Ｔｉｅ２リガンドは、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３およびＡｎｇ４からなる群から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｔｉｅ２と、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３およびＡｎｇ４の４つ全てとの間の相互作用を遮断する、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、受託番号ＰＴＡ−１２２９５またはＰＴＡ−１２２９６でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託された細胞株から生産される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、受託番号ＰＴＡ−１２２９５またはＰＴＡ−１２２９６でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託された細胞株から生産される抗体とヒトＴｉｅ２上の同じエピトープに結合する、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＴｉｅ２への結合に関して、受託番号ＰＴＡ−１２２９５またはＰＴＡ−１２２９６でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託された細胞株から生産される抗体と競合する、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ヒトＴｉｅ２に特異的に結合しＴｉｅ２とＴｉｅ２リガンドとの間の相互作用を遮断する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を患者に投与することを含む、患者の腫瘍の増殖阻害方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＴｉｅ２に特異的である抗体およびその抗原結合フラグメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は生物学的プロセスであり、それにより新しい血管が形成される。血管新生の異常は、例えば増殖網膜症、関節リウマチおよび乾癬等の様々な病状に関連している。更に、血管新生は腫瘍の増殖および維持に重要であることが確立している。Ｔｉｅ２は、血管を形成する内皮細胞に局在化しており血管新生に関与することが示されている一回膜貫通チロシン・キナーゼ受容体である。Ｔｉｅ２リガンドとしてアンジオポエチン（例えばＡｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３およびＡｎｇ４）が挙げられる。Ｔｉｅ２と１つまたはそれ以上のＴｉｅ２リガンドとの間の相互作用を遮断することは、血管新生を制限または遮断することが好都合である環境において、有益な治療効果を有すると予想される。
【０００３】
Ｔｉｅ２に対する抗体は、例えば特許文献１および特許文献２で言及されている。それでもなお、Ｔｉｅ２に結合することができる新規分子、特にＴｉｅ２とＡｎｇ２等の１種またはそれ以上のＴｉｅ２リガンドとの相互作用を遮断することができる抗Ｔｉｅ２抗体が、当技術分野では依然として要求されている。そのような分子は様々な治療目的および診断目的にとって有用であろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第６，３６５，１５４号
【特許文献２】米国特許第６，３７６，６５３号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ヒトＴｉｅ２に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、Ｔｉｅ２介在シグナル伝達の阻害、ならびにＴｉｅ２活性および／またはシグナル伝達によって発症するまたは関連する疾患ならびに障害の治療のために特に有用である。特定の実施形態によれば、本発明の抗体は、Ｔｉｅ２と、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３および／またはＡｎｇ４等の１種またはそれ以上のＴｉｅ２リガンドとの間の相互作用を遮断する。
【０００６】
本発明の抗体は完全長（例えばＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ４抗体）であり得、または抗原結合部分（例えばＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントまたはｓｃＦｖフラグメント）のみを含んでいてもよく、例えば残留するエフェクタ機能を除去するために機能性に影響を及ぼすように本発明の抗体を改変してもよい（Ｒｅｄｄｙ他、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５〜１９３３ページ）。
【０００７】
本発明は、本明細書で説明した例示的な抗Ｔｉｅ２抗体のいずれかと同じ結合特性を実質的に有する抗Ｔｉｅ２抗体を提供する。本発明は、本明細書で説明した抗Ｔｉｅ２抗体を生産する細胞株を含む。非限定的な例として、例示的な抗体Ｈ１Ｍ２０５５ＮおよびＨ２ａＭ２７６０Ｎを生産する細胞株がブダペスト条約に従った条件で２０１１年１２月２日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９に寄託された。寄託された細胞株には以下の受託番号：ＰＴＡ−１２２９５（Ｈ１Ｍ２０５５Ｎ）およびＰＴＡ−１２２９６（Ｈ２ａＭ２７６０Ｎ）が付与されている。
【０００８】
本発明は、本明細書で説明した例示的な抗Ｔｉｅ２抗体をコードする核酸分子を提供する。本発明の核酸を含む組み換え発現ベクター、およびそのようなベクターが導入されている宿主細胞も本発明に包含されており、抗体の生産を可能にする条件下での宿主細胞の培養による抗体の生産および生産した抗体の回収の方法も本発明に包含される。
【０００９】
本発明は、寄託された細胞株ＰＴＡ−１２２９５およびＰＴＡ−１２２９６により生産される抗体を含む、本明細書で説明した例示的な抗Ｔｉｅ２抗体のいずれかで見られる重鎖および軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。本発明はまた、寄託された細胞株ＰＴＡ−１２２９５およびＰＴＡ−１２２９６により生産される抗体を含む、本明細書で説明した例示的な抗Ｔｉｅ２抗体のいずれかで見られる、重鎖および軽鎖の可変ドメイン・アミノ酸配列（ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ）を含む抗体およびその抗原結合フラグメントも含む。
【００１０】
本発明は、改変グリコシル化パターンを有する、本明細書で説明した例示的な抗Ｔｉｅ２抗体のいずれかを含む。いくつかの用途において、望ましくないグリコシル化部位を除去する改変が有用であり得、またはオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分が欠けている抗体が例えば抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）機能を増加させるのに有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ他（２００２）ＪＢＣ２７７：２６７３３参照）。別の用途において、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を改変するために、ガラクトシル化の改変を行なってもよい。
【００１１】
別の態様において、本発明は、本明細書で説明した抗Ｔｉｅ２抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。関連する一態様において、本発明は、抗Ｔｉｅ２抗体と第２の治療薬との組み合わせを含む組成物を特色とする。抗Ｔｉｅ２抗体と有利に組み合わせることができる例示的な薬剤として、抗Ｔｉｅ２活性を阻害する別の薬剤（例えば別の抗体またはその抗原結合フラグメント、ペプチド阻害剤、小分子アンタゴニスト等）および／またはＴｉｅ２の上流もしくは下流のシグナル伝達を妨げる薬剤が挙げられるが、それらに限定されない。
【００１２】
更に別の態様において、本発明は、本発明の抗Ｔｉｅ２抗体または抗体の抗原結合部分を用いてＴｉｅ２活性を阻害する方法であって、本発明の抗体または抗体の抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む治療方法を提供する。治療される障害は、Ｔｉｅ２活性の除去、阻害または低減によって好転する、改善される、阻害されるまたは予防される任意の疾患または症状である。本発明の抗Ｔｉｅ２抗体または抗体フラグメントは、Ｔｉｅ２とＴｉｅ２結合パートナー（例えばＡｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３および／またはＡｎｇ４）との間の相互作用を遮断、またはＴｉｅ２のシグナル伝達活性を別の方法で阻害するように機能し得る。
【００１３】
本発明はまた、患者においてＴｉｅ２活性に関連する、またはＴｉｅ２活性によって発症する疾患もしくは障害を治療するための薬剤の製造における、本発明の抗Ｔｉｅ２抗体または抗体の抗原結合部分の使用も含む。
【００１４】
別の実施形態は、以下の詳細な説明のレビューから明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の抗Ｔｉｅ２抗体のエピトープをマッピングするために用いる完全長ヒトＴｉｅ２および様々な欠失構築物を直線状に描写した図である。構築物上の数字は、完全長Ｔｉｅ２分子（配列番号１）に対する構築物のアミノ酸境界を示す。
【図２】抗Ｔｉｅ２抗体Ｈ４Ｈ２０５５ＮまたはコントロールＩで前処理したｈＴｉｅ２被覆センサー先端部へのアンジオポエチン（ｈＡｎｇ１、ｈＡｎｇ２、ｍＡｎｇ３またはｈＡｎｇ４）の結合の程度を示すヒストグラムである。
【図３】アンジオポエチン（ｈＡｎｇ１、ｈＡｎｇ２、ｍＡｎｇ３またはｈＡｎｇ４）１００ｎＭで前処理したｈＴｉｅ２被覆センサー先端部への抗Ｔｉｅ２抗体（Ｈ４Ｈ２０５５ＮまたはコントロールＩ）の結合の程度を示すヒストグラムである。
【図４】パネルＡは、抗Ｔｉｅ２抗体Ｈ２Ｍ２０５５Ｎ（■）またはＦｃコントロール（●）の投与後のマウスにおけるＨ２９腫瘍増殖曲線を示すグラフである。下向きの矢印は処理開始日を示す。パネルＢは、抗Ｔｉｅ２抗体Ｈ２Ｍ２０５５ＮまたはＦｃコントロールで処理したマウスにおける処理開始からの腫瘍の増殖を示すグラフである。アスタリスク（*）は、ｐ＜０．０５であるＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙノンパラメトリック両側ｔ検定を示す。
【図５】抗Ｔｉｅ２抗体Ｈ２Ｍ２０５５ＮまたはＦｃコントロールで処理したマウスにおける実験終了時に測定したＨ２９腫瘍の血管密度を示すグラフである。アスタリスク（*）は、ｐ＜０．０５であるＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙノンパラメトリック両側ｔ検定を示す。
【図６】パネルＡは、抗Ｔｉｅ２抗体Ｈ２Ｍ２０５５Ｎ（■）またはＦｃコントロール（●）の投与後のマウスにおけるＣｏｌｏ３０５腫瘍増殖曲線を示すグラフである。下向きの矢印は処理開始日を示す。パネルＢは、抗Ｔｉｅ２抗体Ｈ２Ｍ２０５５ＮまたはＦｃコントロールで処理したマウスにおける処理開始からの腫瘍の増殖を示すグラフである。アスタリスク（*）は、ｐ＜０．０５であるＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙノンパラメトリック両側ｔ検定を示す。
【図７】抗Ｔｉｅ２抗体Ｈ２Ｍ２０５５ＮまたはＦｃコントロールで処理したマウスにおける実験終了時に測定したＣｏｌｏ２０５腫瘍の血管密度を示すグラフである。アスタリスク（*）は、ｐ＜０．０５であるＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙノンパラメトリック両側ｔ検定を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明を説明する前に、説明された特定の方法および実験条件に本発明は限定されず、従って方法および条件は変更し得ることを理解すべきである。本発明の範囲は添付した特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で用いられる専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないことも理解すべきである。
【００１７】
別段の定義がない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。用語「約」は本明細書で用いられる場合、特定の列挙した数値に関して用いられる場合に値が列挙した数値から１％以下で変動し得ることを意味する。例えば、語句「約１００」は本明細書で用いられる場合、９９および１０１ならびにその間にある全ての値（例えば９９．１、９９．２、９９．３、９９．４等）を含む。
【００１８】
本明細書で説明したものと同様の、または同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験で用いることができるが、好ましい方法および材料をこれから説明する。
【００１９】
定義
語句「Ｔｉｅ２」および「Ｔｉｅ２フラグメント」は本明細書で用いられる場合、ヒト以外の種由来であること（例えば「マウスＴｉｅ２」、「マウスＴｉｅ２フラグメント」、「サルＴｉｅ２」、「サルＴｉｅ２フラグメント」等）が明記されない限りヒトＴｉｅ２タンパク質またはフラグメントを指す。「Ｔｉｅ２フラグメント」は完全長Ｔｉｅ２分子よりも少ないアミノ酸を有するＴｉｅ２の任意の部分であり、Ｔｉｅ２リガンドに結合することができる。ヒトＴｉｅ２は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有する。ヒト以外の種（例えばマウス、サル、ウサギ、イヌ、ブタ等）由来のＴｉｅ２分子のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公的な供給源から入手可能である（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３８７１８．２（マウス）；ＮＰ＿００１０９９２０７．１（ラット）等）。
【００２０】
用語「Ｔｉｅ２リガンド」は本明細書で用いられる場合、インビボでＴｉｅ２タンパク質と相互作用して生物学的シグナルを伝達するタンパク質を意味する。用語「Ｔｉｅ２リガンド」は、例えばＡｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３および／またはＡｎｇ４等の任意のアンジオポエチンを含む。用語「Ａｎｇ１」は本明細書で用いられる場合、配列番号１５のアミノ酸配列を含むタンパク質、またはＴｉｅ２と相互作用することができる、前記タンパク質の部分を意味する。用語「Ａｎｇ２」は本明細書で用いられる場合、配列番号１６のアミノ酸配列を含むタンパク質、またはＴｉｅ２と相互作用することができる、前記タンパク質の部分を意味する。用語「Ａｎｇ３」は本明細書で用いられる場合、配列番号１７のアミノ酸配列を含むタンパク質、またはＴｉｅ２と相互作用することができる、前記タンパク質の部分を意味する。用語「Ａｎｇ４」は本明細書で用いられる場合、配列番号１８に記載されたアミノ酸配列を含むタンパク質、またはＴｉｅ２と相互作用することができる、前記タンパク質の部分を意味する。
【００２１】
用語「抗体」は本明細書で用いられる場合、ジスルフィド結合により相互に接続された４つのポリペプチド鎖、即ち２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにその多量体（例えばＩｇＭ）を指すことを意図する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲまたはＶHと省略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は３つのドメイン、即ちＣH１、ＣH２およびＣH３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲまたはＶLと省略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣL１）を含む。ＶHおよびＶL領域を、より保存された領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と称される）が散在している超可変性の領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される）に更に細分化することができる。各ＶHおよびＶLは、以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配列された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成されている。本発明の様々な実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲはヒト生殖系列配列と同一であることができ、または前記ＦＲを天然にもしくは人工的に改変することができる。２つまたはそれ以上のＣＤＲの並行分析（side-by-side analysis）に基づいてアミノ酸コンセンサス配列を定義することができる。
【００２２】
用語「抗体」は本明細書で用いられる場合、完全な抗体分子の抗原結合フラグメントも含む。抗体の用語「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」等は、本明細書で用いられる場合、任意の天然に存在する、酵素的に得ることができる、合成された、または遺伝子工学的に改変されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含み、ポリペプチドまたは糖タンパク質は抗原と特異的に結合して複合体を形成する。タンパク質分解、または抗体可変ドメインおよび場合により定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を含む組み換え遺伝子工学技術等の任意の適切な標準的技術を用いて、例えば完全な抗体分子から抗体の抗原結合フラグメントを得ることができる。そのようなＤＮＡは公知であり、および／またはそのようなＤＮＡを例えば商業的供給源、ＤＮＡライブラリ（例えばファージ抗体ライブラリ等）から容易に入手することができ、もしくは合成することができる。例えば１つまたはそれ以上の可変ドメインおよび／または定常ドメインを適切な配置に配列するために、またはコドンを導入するために、システイン残基を作成するために、アミノ酸を改変する、付加するもしくは欠失させる等のために、ＤＮＡをシーケンスし、化学的にまたは分子生物学的技術を用いて操作することができる。
【００２３】
抗原結合フラグメントの非限定的な例として、（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基（例えばＣＤＲ３ペプチド等の単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））または拘束されたＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば一価ナノボディ、二価ナノボディ等）、小モジュール免疫薬（ＳＭＩＰ）およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメイン等の別の改変分子も本明細書で用いられる語句「抗原結合フラグメント」に包含される。
【００２４】
抗体の抗原結合フラグメントは少なくとも１つの可変ドメインを典型的には含むであろう。可変ドメインは、任意の大きさのアミノ酸組成物であり得、１つまたはそれ以上のフレームワーク配列と隣接するまたはフレームワーク配列とインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを一般的に含むであろう。ＶLドメインと会合したＶHドメインを有する抗原結合フラグメントにおいて、ＶHドメインおよびＶLドメインは任意の適切な配置で、互いに関して位置し得る。例えば、可変領域は二量体であり得、ＶH−ＶH二量体、ＶH−ＶL二量体またはＶL−ＶL二量体を含んでもよい。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体のＶHドメインまたはＶLドメインを含んでもよい。
【００２５】
特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合的に連結された少なくとも１つの可変ドメインを含んでもよい。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内で見出すことができる可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的かつ例示的な配置として、（ｉ）ＶH−ＣH１；（ｉｉ）ＶH−ＣH２；（ｉｉｉ）ＶH−ＣH３；（ｉｖ）ＶH−ＣH１−ＣH２；（ｖ）ＶH−ＣH１−ＣH２−ＣH３；（ｖｉ）ＶH−ＣH２−ＣH３；（ｖｉｉ）ＶH−ＣL；（ｖｉｉｉ）ＶL−ＣH１；（ｉｘ）ＶL−ＣH２；（ｘ）ＶL−ＣH３；（ｘｉ）ＶL−ＣH１−ＣH２；（ｘｉｉ）ＶL−ＣH１−ＣH２−ＣH３；（ｘｉｉｉ）ＶL−ＣH２−ＣH３；および（ｘｉｖ）ＶL−ＣLが挙げられる。前記に列挙した例示的な配置のいずれか等の可変ドメインおよび定常ドメインの任意の配置において、可変ドメインおよび定常ドメインを互いに直接連結していてもよく、または完全なもしくは部分的なヒンジ領域またはリンカー領域により連結していてもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接した可変ドメインおよび／または定常ドメインの間の柔軟なまたは半柔軟な連結をもたらす少なくとも２個（例えば５個、１０個、１５個、２０個、４０個、６０個またはより多く）のアミノ酸からなっていてもよい。更に、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、互いに非共有結合的に会合した、および／または１つもしくはそれ以上の単量体ＶHドメインまたはＶLドメインと（例えばジスルフィド結合（単数または複数）により）非共有結合的に会合した、前記に列挙した可変ドメインおよび定常ドメインの配置のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または別の多量体）を含んでいてもよい。
【００２６】
完全な抗体分子と同様に、抗原結合フラグメントは単一特異的であり得、または多重特異的（例えば二重特異的）であり得る。抗体の多重特異的な抗原結合フラグメントは少なくとも２つの異なる可変ドメインを典型的には含み、各可変ドメインは別々の抗原または同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合し得るであろう。当技術分野において利用可能である日常的な技術を用いて、本明細書に開示した例示的な二重特異的抗体フォーマット等の任意の多重特異的な抗体フォーマットを、本発明の抗体の抗原結合フラグメントに関連して用いるのに適応させてもよい。
【００２７】
本発明の抗体は、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞介在障害（ＡＤＣＣ）を通じて機能し得る。「補体依存性細胞障害」（ＣＤＣ）は、補体の存在下における本発明の抗体による抗原発現細胞の溶解を指す。「抗体依存性細胞介在障害」（ＡＤＣＣ）は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）を発現する非特異的な細胞障害性細胞が標的細胞に結合した抗体を認識し、それにより標的細胞を溶解させる細胞媒介性反応を指す。当技術分野で公知であるとともに利用可能なアッセイを用いて、ＣＤＣおよびＡＤＣＣを測定することができる（例えば米国特許第５，５００，３６２号および米国特許第５，８２１，３３７号ならびにＣｌｙｎｅｓ他（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６５２〜６５６ページ参照）。抗体の定常領域は、補体を固定して細胞依存性細胞障害を媒介する抗体の能力において重要である。従って、細胞障害を媒介することが抗体にとって望ましいかどうかに基づいて、抗体のアイソタイプを選択することができる。
【００２８】
用語「ヒト抗体」は本明細書で用いられる場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列でコードされていないアミノ酸残基（例えばインビトロでのランダムもしくは部位特異的な変異誘発により、またはインビボでの体細胞変異により導入された変異）を例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３中に含んでもよい。しかしながら、用語「ヒト抗体」は本明細書で用いられる場合、マウス等の別の哺乳類の種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むことを意図しない。
【００２９】
用語「組み換えヒト抗体」は本明細書で用いられる場合、組み換え手段により調製した、発現させた、作成したまたは単離した全てのヒト抗体、例えば宿主細胞（下記に更に説明する）中に遺伝子導入した組み換え発現ベクターを用いて発現させた抗体、組み換え組み合わせヒト抗体ライブラリ（下記に更に説明する）から単離した抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子の遺伝子導入動物（例えばマウス）から単離した抗体（例えばＴａｙｌｏｒ他（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７〜６２９５ページ参照）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の別のＤＮＡ配列へのスプライシング等の任意の別の手段により調製した、発現させた、作成したもしくは単離した抗体を含むことを意図する。そのような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかしながら、特定の実施形態において、そのような組み換えヒト抗体はインビトロでの変異誘発（またはヒトＩｇ配列の遺伝子導入動物が用いられる場合、インビボでの体細胞変異誘発）を受けており、従って、組み換え抗体のＶH領域およびＶL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶH配列およびＶL配列に由来および関連するが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しない可能性がある配列である。
【００３０】
ヒト抗体は、ヒンジ異質性と関連した２種の形態で存在することができる。一形態において、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合により結合している約１５０〜１６０ｋＤａの安定した４つの鎖構築物を含む。第２の形態において、二量体は鎖間ジスルフィド結合を介して連結されておらず、供給結合的にカップリングした軽鎖および重鎖で構成された約７５〜８０ｋＤａの分子（半抗体）が形成されている。これらの形態は、親和性精製後でも分離することが極めて困難である。
【００３１】
様々なインタクトなＩｇＧアイソタイプにおける第２の形態の出現頻度は抗体のヒンジ領域のアイソタイプと関連した構造的差異に起因するが、それに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一アミノ酸置換により、一般にヒトＩｇＧ１ヒンジを用いて観察されるレベルまで第２の形態の出現を著しく低減し得る（Ａｎｇａｌ他（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３０：１０５ページ）。本発明は、所望の抗体の形態の収率を高めるために、例えば生産において望ましい可能性があるヒンジ、ＣH２領域またはＣH３領域中に１つまたはそれ以上の変異を有する抗体を包含する。
【００３２】
「単離抗体」は本明細書で用いられる場合、その天然環境の少なくとも１つの成分から同定して分離したおよび／または回収した抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１つの成分から、または抗体が天然に存在するもしくは天然に生産される組織もしくは細胞から分離されたまたは取り出された抗体は、本発明の目的のための「単離抗体」である。単離抗体はまた、組み換え細胞内でのインサイチュの抗体も含む。単離抗体は、少なくとも１つの精製工程または単離工程に供される抗体である。特定の実施形態によれば、単離抗体は、別の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００３３】
用語「特異的結合」等は、抗体またはその抗原結合フラグメントが生理学的条件下で比較的安定である抗原との複合体を形成することを意味する。抗体が抗原に特異的に結合するかどうかを判断する方法は当技術分野において公知であり、例えば平衡透析、表面プラズモン共鳴等が挙げられる。例えば、ヒトＴｉｅ２に「特異的に結合する」抗体として本発明に関連して用いられる場合には、表面プラズモン共鳴アッセイでの測定で約１０００ｎＭ未満、約５００ｎＭ未満、約３００ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約９０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満または約０．５ｎＭ未満のＫDでヒトＴｉｅ２またはその一部に結合する抗体が挙げられる（例えば本明細書の実施例２参照）。しかしながら、ヒトＴｉｅ２に特異的に結合する単離抗体は、別の（ヒト以外の）種に由来するＴｉｅ２分子等の別の抗原に対する交差反応を有してもよい。
【００３４】
「中和」抗体または「遮断」抗体は本明細書で用いられる場合、Ｔｉｅ２への抗体の結合が（ｉ）Ｔｉｅ２またはＴｉｅ２フラグメントとＴｉｅ２リガンド（例えばアンジオポエチン）との間の相互作用を妨害し、および／または（ｉｉ）Ｔｉｅ２の少なくとも１種の生物学的機能の阻害をもたらす抗体を指すことを意図する。Ｔｉｅ２中和抗体またはＴｉｅ２遮断抗体に起因する阻害は、適切なアッセイを用いて検出可能である限り完全である必要はない。Ｔｉｅ２阻害を検出する例示的なアッセイは本明細書で説明されている。
【００３５】
本明細書に開示した抗Ｔｉｅ２抗体は、抗体が得られた対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖の可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域において１個またはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入および／または欠失を含んでもよい。本明細書に開示したアミノ酸配列と例えば公的な抗体配列データベースから入手可能である生殖系列配列とを比較することにより、そのような変異を容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示したアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体およびその抗原結合フラグメントを含み、１つまたはそれ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１個またはそれ以上のアミノ酸が、抗体が得られた生殖系列配列の対応する残基（単数または複数）に、もしくは別のヒト生殖系列配列の対応する残基（単数または複数）に変異しており、または対応する生殖系列残基（単数または複数）に保存的アミノ酸置換変異している（そのような配列の変化を本明細書においてまとめて「生殖系列変異」と称する）。当業者は、本明細書に開示した重鎖および軽鎖の可変領域の配列から、１つまたはそれ以上の個々の生殖系列変異またはそれらの組み合わせを含む多数の抗体および抗原結合フラグメントを容易に生産することができる。特定の実施形態において、ＶHドメインおよび／またはＶLドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基の全ては、抗体が得られたオリジナルの生殖系列配列中に見られる残基に復帰変異されている。別の実施形態において、特定の残基のみ、例えばＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内にもしくはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に見られる変異残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内に見られる変異残基のみがオリジナルの生殖系列配列に復帰変異されている。別の実施形態において、１つまたはそれ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基（単数または複数）は、異なる生殖系列配列（即ち、抗体がもともと得られていた生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基（単数または複数）に変異されている。更に、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つまたはそれ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含むことができ、例えば、オリジナルの生殖系列配列とは異なる特定の別の残基が維持されているか、または異なる生殖系列配列の対応する残基に変異されているが、特定の個々の残基は特定の生殖系列配列の対応する残基に変異されている。ひとたび得られれば、向上した結合特異性、増加した結合親和性、向上したまたは増大したアンタゴニスト生物学的特性またはアゴニスト生物学的特性（場合により）、低下した免疫原性等の１種またはそれ以上の所望の特性に関して、１つまたはそれ以上の生殖系列変異を含む抗体および抗原結合フラグメントを容易に試験することができる。この一般的な方法で得られる抗体および抗原結合フラグメントは本発明に包含される。
【００３６】
本発明はまた、本明細書に開示した例示的な抗Ｔｉｅ２抗体内に見られるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲのアミノ酸配列と比較して１つまたはそれ以上の保存的置換を有する変異体を含む抗Ｔｉｅ２抗体も含む。例えば、本発明は、本明細書に開示した抗Ｔｉｅ２抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲのアミノ酸配列のいずれかと比較して例えば１０個以下、８個以下、６個以下、４個以下等の保存的アミノ酸置換を備えるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲのアミノ酸配列を有する抗Ｔｉｅ２抗体を含む。
【００３７】
用語「表面プラズモン共鳴」は本明細書で用いられる場合、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（商標）システム（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）を用いてバイオセンサー・マトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによる、実時間での相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。
【００３８】
用語「ＫD」は本明細書で用いられる場合、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指すことを意図する。
【００３９】
用語「エピトープ」は、パラトープとして知られている抗体分子の可変領域中における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は複数のエピトープを有することができる。従って、異なる抗体は抗原の異なる領域に結合することができ、異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは立体構造であってもよく、または線状であってもよい。立体構造エピトープは、線状のポリペプチド鎖の異なるセグメントからの、空間的に並列したアミノ酸によって形成される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって形成されるエピトープである。特定の状況において、エピトープは抗原上の糖、ホスホリル基またはスルホニル基の部分を含んでもよい。
【００４０】
用語「実質的な同一性」または「実質的に同一」は核酸またはそのフラグメントを指す場合、ヌクレオチドを適切に挿入または欠失しつつ別の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列させた場合に、下記に述べるように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐ等の任意の公知の配列同一性のアルゴリズムによって評価した場合、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％でヌクレオチド配列の同一性があることを示す。参照核酸分子に対して実質的な同一性を有する核酸分子は、参照核酸分子でコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを場合によってはコードしていてもよい。
【００４１】
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的な類似性」または「実質的に類似」は、２つのペプチド配列を、デフォルトのギャップウェイトを用いるプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより等で最適に整列させた場合に、それらのペプチド配列が少なくとも９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」では、アミノ酸残基が、類似した化学的特性（例えば電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基に置換される。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないであろう。２つまたはそれ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合には、配列同一性の割合または類似性の程度を上方に調整して置換の保存的性質を補正することができる。この調整を行なう手段は当業者に公知である。例えばＰｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７〜３３１ページ参照。類似した化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸群の例として、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；（２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リシン、アルギニンおよびヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩、ならびに（７）システインおよびメチオニンである硫黄含有側鎖が挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸塩−アスパラギン酸塩およびアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔ他（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：１４４３〜１４４５ページに開示されたＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負ではない値を有する任意の変化である。
【００４２】
ポリペプチドに関する配列類似性は配列同一性とも称されており、配列解析ソフトウェアを用いて典型的には評価される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換等の様々な置換、欠失および別の改変に割り当てられる類似性の尺度を用いて、類似する配列を整合させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアはＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔ等のプログラムを含み、このプログラムをデフォルトのパラメータとともに用いて、異なる種の生物に由来する相同なポリペプチド等の密接に関連するポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその変異タンパク質との間の配列相同性または配列同一性を評価することができる。例えばＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１参照。ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１中のプログラムである、デフォルトのまたは推奨されるパラメータを用いるＦＡＳＴＡを用いて、複数のポリペプチド配列を比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えばＦＡＳＴＡ２およびＦＳＡＴＡ３）はアラインメント、およびクエリと検索配列との間で最も重なる領域の配列同一性の割合を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）前記を参照）。本発明の配列を異なる生物に由来する多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトのパラメータを用いるコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＢＬＡＳＴＮである。例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０ページおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜４０２ページ参照。
【００４３】
抗体の生物学的特性
本発明は、Ｔｉｅ２とＴｉｅ２リガンドとの間の相互作用を遮断する抗体を含む。語句「Ｔｉｅ２とＴｉｅ２リガンドとの間の相互作用を遮断する」は、本明細書で用いられる場合、Ｔｉｅ２とＴｉｅ２リガンドとの間の物理的相互作用を検出および／または定量することができるアッセイにおいて、本発明の抗体を添加することによりＴｉｅ２とＴｉｅ２リガンド（例えばＡｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３および／またはＡｎｇ４）との間の相互作用が少なくとも５０％低減することを意味する。抗体がヒトＴｉｅ２とＴｉｅ２リガンドとの間の相互作用を遮断するかどうかを判断するために用いることができる非限定的かつ例示的なアッセイを本明細書の実施例５に示す。このアッセイ・フォーマットの例示的な一実施形態では、抗体をＴｉｅ２タンパク質と混合し、次いでＴｉｅ２リガンド（この場合にはＡｎｇ２タンパク質）で被覆した表面に抗体／Ｔｉｅ２混合物を接触させる。結合していない分子を洗い流した後、Ａｎｇ２被覆表面に結合したＴｉｅ２の量を測定する。このアッセイ・フォーマットにおいて様々な量の抗体を用いることにより、Ａｎｇ２に結合するＴｉｅ２の５０％を遮断するのに必要な抗体の量を算出することができ、ＩＣ50の値として表すことができる。表面をＴｉｅ２で被覆し、Ｔｉｅ２被覆表面に抗体を添加し、結合していない抗体を洗い流し、次いで抗体処理したＴｉｅ２表面にＴｉｅ２リガンドを添加するように、このアッセイのフォーマットを置き換えることができる。本発明は、実施例５に示すＴｉｅ２／Ｔｉｅ２リガンド結合アッセイまたは実質的に同じアッセイで試験する場合に約１００ｎＭ未満のＩＣ50を示す抗Ｔｉｅ２抗体を含む。例えば、本発明は、実施例５に示すＴｉｅ２／Ｔｉｅ２リガンド結合アッセイまたは実質的に同じアッセイで試験する場合に約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、０．４、０．３または０．２ｎＭ未満のＩＣ50を示す抗Ｔｉｅ２抗体を含む。
【００４４】
抗体がヒトＴｉｅ２とＴｉｅ２リガンドとの間の相互作用を遮断するかどうかを判断するのに用いることができる、別のアッセイ・フォーマットを本明細書の実施例６に示す。このアッセイ・フォーマットでは、細胞株の表面上でヒトＴｉｅ２が発現するように改変されているとともに、Ｔｉｅ２がＴｉｅ２リガンドと相互作用する際に検出可能なシグナルを発現させるレポーター構築物も含む細胞株が用いられる。改変細胞を抗Ｔｉｅ２抗体およびＴｉｅ２リガンドで処理し、レポーター・シグナルを測定する。このアッセイ・フォーマットにおいて様々な量の抗体を用いることにより、抗体がない場合に観察されるレポーター・シグナルの５０％を阻害するのに必要な抗体の量を算出することができ、ＩＣ50の値として表すことができる。本発明は、実施例６に示すＴｉｅ２／Ｔｉｅ２リガンド結合アッセイまたは実質的に同じアッセイで試験する場合に約２０ｎＭ未満のＩＣ50を示す抗Ｔｉｅ２抗体を含む。例えば、本発明は、実施例６で説明するＴｉｅ２／Ｔｉｅ２リガンド結合アッセイまたは実質的に同じアッセイで試験する場合に約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、０．４、０．３、０．２または０．１ｎＭ未満のＩＣ50を示す抗Ｔｉｅ２抗体を含む。
【００４５】
エピトープマッピングおよび関連する技術
ヒトＴｉｅ２タンパク質は以下のドメイン：Ｉｇ１ドメイン、Ｉｇ２ドメイン、ＥＧＦ繰り返しドメイン、Ｉｇ３ドメインおよびフィブロネクチン繰り返し（ＦＮ）ドメイン（ＦＮ１、ＦＮ２およびＦＮ３等）を含有する。これらのドメインを図１に図示する。本発明は、１つまたはそれ以上の以下の領域：（ａ）Ｉｇ１−Ｉｇ２−ＥＧＦドメイン（配列番号７）；（ｂ）Ｉｇ２−ＥＧＦドメイン（配列番号８）；（ｃ）ＥＧＦドメイン（配列番号９）；（ｄ）Ｉｇ３−ＦＮドメイン（配列番号１０）；および／または（ｅ）ＦＮドメイン（配列番号１１）内のエピトープに特異的に結合する抗Ｔｉｅ２抗体を含む（実施例３および４参照）。
【００４６】
特定の実施形態によれば、本発明は、Ｔｉｅ２のＩｇ１ドメインおよび／またはＩｇ２ドメイン内に見られる１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する抗Ｔｉｅ２抗体を提供する。エピトープ（単数または複数）は、Ｔｉｅ２のＩｇ１ドメインおよび／またはＩｇ２ドメイン内に位置する３個またはそれ以上（例えば３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはそれ以上）のアミノ酸の１個またはそれ以上の連続的な配列からなっていてもよい。あるいは、エピトープは、Ｔｉｅ２のＩｇ１ドメインおよび／またはＩｇ２ドメイン内に位置する複数の非連続的なアミノ酸（またはアミノ酸配列）からなっていてもよい。本発明の特定の実施形態によれば、配列番号７のアミノ酸９６〜１０６；配列番号７のアミノ酸１３９〜１５２；および配列番号７のアミノ酸１６６〜１７５からなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸セグメント内に位置する１個またはそれ以上のアミノ酸と相互作用する抗Ｔｉｅ２抗体が提供される。例えば、本発明は、前述した各セグメント（即ち配列番号７の各アミノ酸９６〜１０６、１３９〜１５２および１６６〜１７５内）内の少なくとも１個のアミノ酸と相互作用する抗Ｔｉｅ２抗体を含む。本発明の特定の実施形態によれば、配列番号７のアミノ酸１３９〜１５２および／または１６６〜１７５と相互作用する抗体は、Ｔｉｅ２と１つまたはそれ以上のＴｉｅ２リガンド（例えばＡｎｇ２等）との間の相互作用を遮断することができる（本明細書の実施例４〜６参照）。
【００４７】
当業者に公知の様々な技術を用いて、抗体がポリペプチドまたはタンパク質内の「１個またはそれ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを判断することができる。例示的な技術として、例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．、ニューヨーク州）で説明されているもの等の日常的な交差遮断アッセイ、アラニン・スキャニング変異分析、ペプチド・ブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ、２００４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２４８：４４３〜４６３ページ）およびペプチド切断分析が挙げられる。加えて、抗原のエピトープ切除、エピトープ抽出および化学修飾等の方法を用いることができる（Ｔｏｍｅｒ、２０００、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ９：４８７〜４９６ページ）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を特定するために用いることができる別の方法は、質量分析により検出される水素／重水素交換である（例えば本明細書の実施例４参照）。大まかに言えば、水素／重水素交換法は、検査対象であるタンパク質を重水素標識すること、続いて重水素標識したタンパク質に抗体を結合させることを含む。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移し、抗体で保護されている残基（重水素標識のままである）を除く全ての残基で水素−重水素交換させる。抗体が解離した後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断および質量分析に供し、それにより抗体が相互作用する特異的アミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えばＥｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６７（２）：２５２〜２５９ページ；ＥｎｇｅｎおよびＳｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ〜２６５Ａページ参照。
【００４８】
本発明は、本明細書で説明した特定の例示的抗体（例えば寄託された細胞株ＰＴＡ−１２２９５およびＰＴＡ−１２２９６からそれぞれ生産される抗体Ｈ１Ｍ２０５５ＮおよびＨ２ａＭ２７６０Ｎ）のいずれかと同じエピトープに結合する抗Ｔｉｅ２抗体を含む。同様に、本発明はまた、Ｔｉｅ２またはＴｉｅ２フラグメントへの結合に関して、本明細書で説明した特定の例示的抗体（例えば寄託された細胞株ＰＴＡ−１２２９５およびＰＴＡ１２２９６からそれぞれ生産される抗体Ｈ１Ｍ２０５５ＮおよびＨ２ａＭ２７６０Ｎ）のいずれかと競合する抗Ｔｉｅ２抗体も含む。
【００４９】
当技術分野で公知の日常的な方法を用いることにより、抗体が参照抗Ｔｉｅ２抗体と同じエピトープに結合するか、または結合に関して参照抗Ｔｉｅ２抗体と競合するかどうかを容易に判断することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗Ｔｉｅ２抗体と同じエピトープに結合するかどうかを判断するために、飽和条件下で参照抗体をＴｉｅ２タンパク質またはペプチドに結合させる。次に、Ｔｉｅ２分子に結合する試験抗体の能力を評価する。参照抗Ｔｉｅ２抗体との飽和結合後に試験抗体がＴｉｅ２に結合することができる場合、試験抗体は参照抗Ｔｉｅ２抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。一方、参照抗Ｔｉｅ２抗体との飽和結合後に試験抗体がＴｉｅ２分子に結合することができない場合、そのときには試験抗体は本発明の参照抗Ｔｉｅ２抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する可能性がある。次いで、観察された試験抗体の結合の欠如が、実際に参照抗体と同じエピトープへの結合に起因するかどうか、または立体遮断（または別の現象）が、観察された結合の欠如の原因であるかどうかを、追加の日常的な実験（例えばペプチド変異および結合分析）を行なって確認することができる。ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フロー・サイトメトリーまたは当技術分野で利用可能である任意の別の定量的なまたは定性的な抗体結合アッセイを用いてこの種の実験を実施することができる。本発明の特定の実施形態によれば、例えば１倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍過剰である一方の抗体が、競合的結合アッセイでの測定で少なくとも５０％であるが好ましくは７５％、９０％またはさらには９９％で他方の結合を阻害する場合、２つの抗体は同じ（または重複する）エピトープに結合する（例えばＪｕｎｇｈａｎｓ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９０：５０：１４９５〜１５０２ページ参照）。あるいは、一方の抗体の結合を低減するまたは排除する抗原中の本質的に全てのアミノ酸変異が他方の結合を低減するまたは排除する場合、２つの抗体は同じエピトープに結合すると考えられる。一方の抗体の結合を低減するまたは排除するアミノ酸変異の一部のみが他方の結合を低減するまたは排除する場合、２つの抗体は「重複するエピトープ」を有すると考えられる。
【００５０】
結合に関して抗体が参照抗Ｔｉｅ２抗体と競合するかどうかを判断するために、前述した結合方法論が２つの方向で実施される：第１の方向では、飽和条件下で参照抗体をＴｉｅ２分子に結合させ、続いてＴｉｅ２分子への試験抗体の結合を評価する。第２の方向では、飽和条件下で試験抗体をＴｉｅ２分子に結合させ、続いてＴｉｅ２分子への参照抗体の結合を評価する。両方向において第１の（飽和）抗体のみがＴｉｅ２分子に結合することができる場合、そのときはＴｉｅ２への結合に関して試験抗体と参照抗体とが競合すると結論付けられる。当業者に十分理解されるように、参照抗体との結合が競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同じエピトープに結合しなくてもよいが、重複または隣接するエピトープに結合することにより参照抗体の結合を立体的に遮断することができる。
【００５１】
ヒト抗体の調製
完全ヒトモノクローナル抗体等のモノクローナル抗体の作成方法は当技術分野で公知である。そのような公知の任意の方法を本発明と関連して用いてヒトＴｉｅ２に特異的に結合するヒト抗体を作ることができる。
【００５２】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術またはモノクローナル抗体を作成する任意の別の公知の方法を用いて、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する、Ｔｉｅ２に対する高親和性キメラ抗体が最初に単離される。下記の実験セクションのように、親和性、選択性、エピトープ等を含む望ましい特徴に関して抗体が特徴付けられて選択される。マウス定常領域が所望のヒトの定常領域と置き換えられて本発明の完全ヒト抗体、例えば野生型または改変したＩｇＧ１またはＩｇＧ４が作成される。選択された定常領域を特定の用途に従って変更することができるが、高親和性抗原結合および標的特異度特性は可変領域中に存在する。
【００５３】
生物学的同等物
本発明の抗Ｔｉｅ２抗体および抗体フラグメントは、説明した抗体の配列とは異なるがヒトＴｉｅ２に結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。そのような変異抗体および抗体フラグメントは、親配列と比較した場合にアミノ酸の１個またはそれ以上の付加、欠失または置換を含むが、説明した抗体の生物化学的活性と本質的に同等である生物学的活性を示す。同様に、本発明の抗Ｔｉｅ２抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示した配列と比較した場合にヌクレオチドの１個またはそれ以上の付加、欠失または置換を含むが本発明の抗Ｔｉｅ２抗体または抗体フラグメントと本質的に生物学的に同等である抗Ｔｉｅ２抗体または抗体フラグメントをコードする配列を包含する。
【００５４】
２つの抗原結合タンパク質または抗体は、例えば同じ実験条件下において同じモル用量で単回投与または複数回投与される際に、その吸収速度および量が顕著な差異を示さない医薬同等物または医薬代替物である場合に、生物学的に同等であるとみなされる。いくつかの抗体は、それらの吸収量は同等であるが吸収速度は同等ではなく、それにも関わらず、吸収速度におけるそのような差異が計画的であり、ラベリングに反映されており、有効な体内薬物濃度の達成に、例えば慢性使用において不可欠ではなく、そして研究された特定の医薬品にとって医学的に重要ではないと判断されるためになお生物学的に同等であると判断し得る場合、それらの抗体は同等物または医薬代替物と判断されるであろう。
【００５５】
一実施形態において、２つの抗原結合タンパク質は、それらの安全性、純度および力価において臨床的に有意な差異がない場合には、生物学的に同等である。
【００５６】
一実施形態において、２つの抗原結合タンパク質は、参照製品と生物学的製品とを１回またはそれ以上切り替えられずに継続される治療と比較して、免疫原性における臨床的に有意な変化等の予期される副作用リスクの増加がなく、または有効性の減少がなく、患者が参照製品と生物学的製品とを１回またはそれ以上切り替えることができる場合には、生物学的に同等である。
【００５７】
一実施形態において、２つの抗原結合タンパク質は、それらが使用条件（単数または複数）に関して作用の共通の機序（単数または複数）によって両方ともそのような機序が公知である程度まで作用する場合には生物学的に同等である。
【００５８】
生物学的同等性をインビボおよびインビトロの方法によって実証することができる。生物学的同等性の測定として、例えば（ａ）血液、血漿、血清または別の体液における抗体またはその代謝産物の濃度を時間の関数として測定する、ヒトまたは別の哺乳類におけるインビボ試験；（ｂ）ヒト・インビボ生物学的利用能のデータと相関させ、前記データを合理的に予測するインビトロ試験；（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理効果を時間の関数として測定する、ヒトまたは別の哺乳類におけるインビボ試験；および（ｄ）抗体の安全性、有効性または生物学的利用能もしくは生物学的同等性を確立する、十分に管理された臨床試験が挙げられる。
【００５９】
例えば残基もしくは配列の様々な置換を行なうこと、または生物学的活性に必要ではない末端のもしくは内部の残基もしくは配列を欠失させることにより、本発明の抗Ｔｉｅ２抗体の生物学的に同等な変異体を構築することができる。例えば、生物学的活性に必須ではないシステイン残基を欠失させることにより、または別のアミノ酸と置き換えることにより、再生時の不必要なまたは不適当な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止することができる。別の状況において、生物学的に同等な抗体は、抗体のグリコシル化特性を改変するアミノ酸変化、例えばグリコシル化を排除するまたは除去する変異を含む抗Ｔｉｅ２抗体の変異体を含むことができる。
【００６０】
種選択性および種交差反応性
本発明の特定の実施形態によれば、抗Ｔｉｅ２抗体はヒトＴｉｅ２に結合するが、別の種に由来するＴｉｅ２には結合しない。本発明はまた、ヒトＴｉｅ２および１種またはそれ以上のヒト以外の種に由来するＴｉｅ２に結合する抗Ｔｉｅ２抗体も含む。例えば、本発明の抗Ｔｉｅ２抗体は、ヒトＴｉｅ２およびげっ歯類のＴｉｅ２（例えばマウスまたはラットに由来するＴｉｅ２）に特異的に結合することができる。抗体がマウスＴｉｅ２に特異的に結合するかどうかを判断するために用いることができる例示的な構築物は、配列番号６のアミノ酸配列を有する構築物であり、抗体がラットＴｉｅ２に特異的に結合するかどうかを判断するために用いることができる例示的な構築物は、配列番号５のアミノ酸配列を有する構築物である。これらの構築物を用いた抗Ｔｉｅ２抗体の結合の評価を本明細書の実施例２に示す。
【００６１】
免疫結合体
本発明は、細胞毒素、化学療法薬、免疫抑制剤または放射性同位体等の治療部分に結合した抗Ｔｉｅ２モノクローナル抗体（「免疫結合体」）を包含する。細胞毒性剤として、細胞に有害である任意の薬剤が挙げられる。免疫結合体の形成に適した細胞毒性剤および化学療法剤の例は当技術分野で公知である（例えばＷＯ０５／１０３０８１参照）。
【００６２】
多重特異性抗体
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性または多重特異性であり得る。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であってもよく、または１超の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有してもよい。例えばＴｕｔｔ他、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０〜６９ページ；Ｋｕｆｅｒ他、２００４、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８〜２４４ページ参照。本発明の抗Ｔｉｅ２抗体を別の機能性分子（例えば別のペプチドまたはタンパク質）に連結させることができ、または機能性分子と共発現させることができる。例えば、抗体またはそのフラグメントを別の抗体または抗体フラグメント等の１つまたはそれ以上の別の分子的実在物に（例えば化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合または別の方法によって）機能的に連結させることにより、第２の結合特異性を備えた二重特異性抗体または多重特異性抗体を生産することができる。例えば、本発明はトリプシン阻害剤等の、免疫グロブリンの一方のアームがヒトＴｉｅ２またはそのフラグメントに特異的であり、免疫グロブリンの他方のアームが第２の治療標的に特異的であるかまたは治療部分に結合されている二重特異性抗体を含む。
【００６３】
本発明との関連で用いることができる例示的な二重特異性抗体フォーマットは第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣH３ドメインおよび第２のＩｇＣH３ドメインを用いることを含み、第１のおよび第２のＩｇＣH３ドメインは少なくとも１個のアミノ酸が互いに異なっており、少なくとも１個のアミノ酸の差異は、アミノ酸の差異を欠く二重特異性抗体と比較してプロテインＡへの二重特異性抗体の結合を弱める。一実施形態において、第１のＩｇＣH３ドメインはプロテインＡに結合し、第２のＩｇＣH３ドメインは、Ｈ９５Ｒ改変（ＩＭＧＴエクソン・ナンバリングによる；ＥＵナンバリングによるＨ４３５Ｒ）等のプロテインＡ結合を弱めるまたは消失させる変異を含有する。第２のＣH３は、Ｙ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）を更に含んでもよい。第２のＣH３内に見られる更なる改変として、ＩｇＧ１抗体の場合にはＤ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７ＭおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７ＭおよびＶ４２２Ｉ）が挙げられ；ＩｇＧ２抗体の場合にはＮ４４Ｓ、Ｋ５２ＮおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２ＮおよびＶ４２２Ｉ）が挙げられ；ならびにＩｇＧ４抗体の場合にはＱ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９ＱおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９ＱおよびＶ４２２Ｉ）が挙げられる。前述した二重特異性抗体フォーマットでの多様性は本発明の範囲内で考慮される。
【００６４】
治療用製剤および投与
本発明は、本発明の抗Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、適切な担体、賦形剤および移送、送達、耐性等を改善する別の薬剤とともに製剤化される。全ての薬剤師に公知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ中に多数の適切な製剤を見出すことができる。これらの製剤として、例えば粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）等）、ＤＮＡ接合体、無水吸収ペースト、水中油型のおよび油中水型のエマルション、エマルション・カーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲルならびにカーボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌ他、「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」ＰＤＡ（１９９８）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２：２３８〜３１１ページも参照。
【００６５】
患者に投与される抗体の用量を患者の年齢および大きさ、標的とする疾患、症状、投与経路等に応じて変更することができる。好ましい用量は、体重または体表面積に従って典型的には算出される。成人の患者においてＴｉｅ２活性と関連した症状または疾患を治療するために本発明の抗体が用いられる場合、通常は約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０２〜約７、約０．０３〜約５または約０．０５〜約３ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量で本発明の抗体を静脈内投与することが好都合であり得る。症状の重症度に応じて治療の頻度および継続期間を調整することができる。Ｔｉｅ２抗体の投与に効果的な投薬量およびスケジュールを経験的に決定することができ、例えば患者の経過を周期的な評価でモニタリングし、モニタリングに基づいて用量を調整することができる。更に、当技術分野で公知の方法を用いて種間での投薬量のスケーリングを実施することができる（例えばＭｏｒｄｅｎｔｉ他、１９９１，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１ページ）。
【００６６】
様々な送達系、例えばリポソーム、微粒子、マイクロカプセルへの封入、変異ウイルスを発現できる組み換え細胞、受容体介在エンドサイトーシスが知られており、本発明の医薬組成物の投与に用いることができる（例えばＷｕ他、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９〜４４３２ページ参照）。導入法として皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。任意の好都合な経路により、例えば点滴またはボーラス注入により、上皮もしくは粘膜皮膚の内膜（例えば口腔粘膜、直腸および腸の粘膜等）を介した吸収により組成物を投与することができ、および別の生物学的活性剤とともに組成物を投与することができる。全身にまたは局所的に投与することができる。
【００６７】
標準的な針およびシリンジにより、皮下にまたは静脈内に本発明の医薬組成物を送達することができる。加えて、皮下送達に関して、本発明の医薬組成物の送達にペン型送達デバイスが容易に適用される。そのようなペン型送達デバイスは再使用可能であり、または使い捨てであってもよい。再使用可能なペン型送達デバイスは、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジを一般的には利用する。カートリッジ内の全ての医薬組成物が投与されてカートリッジが空になると、空のカートリッジを容易に廃棄し、医薬組成物を含有する新しいカートリッジと交換することができる。その後、ペン型送達デバイスを再使用することができる。使い捨てペン型送達デバイスでは交換可能なカートリッジがない。正確に言えば、使い捨てペン型送達デバイスは、デバイス内のリザーバ中に収容される医薬組成物が予め充填されている。リザーバの医薬組成物が空になると、デバイス全体が廃棄される。
【００６８】
本発明の医薬組成物の皮下送達に多数の再使用可能なペン型および自己注射型送達デバイスが適用される。ほんの数例を挙げると、例としてＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、イギリス）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｒｇｄｏｒｆ、スイス）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、インディアナ州）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、デンマーク）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、デンマーク）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ニュージャージー州）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）およびＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、ドイツ）が挙げられるが、これらに限定されない。ほんの数例を挙げると、本発明の医薬組成物の皮下送達に適用される使い捨てペン型送達デバイスの例として、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）自己注射器（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、カリフォルニア州）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、ドイツ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）ならびにＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ  イリノイ州）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
特定の状況では、制御された放出系において医薬組成物を送達することができる。一実施形態において、ポンプを用いてもよい（Ｌａｎｇｅｒ、前記参照；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１ページ参照）。別の実施形態において、ポリマー材料を用いてもよい；Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）、１９７４、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ参照。更に別の実施形態において、制御された放出系を組成物の標的の近くに設置することができ、結果として全身用量のごく一部が必要となる（例えばＧｏｏｄｓｏｎ、１９８４、ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、前記の第２巻、１１５〜１３８ページ参照）。別の制御された放出系は、Ｌａｎｇｅｒによる総説、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７〜１５３３ページで述べられている。
【００７０】
注射可能な調製物は、静脈内、皮下、皮内および筋肉内注射、点滴等のための剤形を含むことができる。これらの注射可能な調製物を公知の方法で調製することができる。例えば、前述の抗体またはその塩を、注射用に従来用いられていた無菌の水性媒体または油性媒体に溶解すること、懸濁すること、または前記媒体で乳化すること等により注射可能な調製物を調製することができる。注射用の水性媒体として、例えば生理食塩水、グルコースおよび別の助剤等を含有する等張液が挙げられ、水性媒体をアルコール（例えばエタノール）、多価アルコール（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えばポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）添加物）］等の適切な可溶化剤と組み合わせて用いることができる。油性媒体として、例えばゴマ油、大豆油等が用いられ、油性媒体を、安息香酸ベンジル、ベンジル・アルコール等の可溶化剤と組み合わせて用いてもよい。このように調製された注射剤は、適切なアンプル中に好ましくは充填される。
【００７１】
好都合なことに、前述の経口用途または非経口用途の医薬組成物は、活性成分の用量に合うように適合された単位用量で剤形に調製される。そのような単位用量の剤形として、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル剤）、坐剤等が挙げられる。含有される前述の抗体の量は、一般的に単位用量の剤形当たり約５〜約５００ｍｇであり；特に注射剤の形態では、前述の抗体は約５〜約１００ｍｇで含有され、別の剤形では約１０〜約２５０ｍｇで含有されることが好ましい。
【００７２】
抗体の治療での使用
本発明の抗体は、血管新生と関連した疾患または障害等のＴｉｅ２活性と関連した任意の疾患または障害の治療、予防および／または改善に特に有用である。例えば脳および髄膜、中咽頭、肺および気管支樹、消化管、男性のおよび女性の生殖器官、筋肉、骨、皮膚および付属器、結合組織、脾臓、免疫系、造血細胞および骨髄、肝臓および尿路、ならびに眼等の特別な感覚器官に生じる原発性のおよび／または転移性の腫瘍の治療に本発明の抗体および抗原結合フラグメントを用いることができる。特定の実施形態において、以下の癌の内の１種またはそれ以上の治療に本発明の抗体および抗原結合フラグメントが用いられる：腎細胞癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸癌、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、滑膜肉腫、甲状腺癌または黒色腫。
【００７３】
併用療法
本発明は、本発明の抗Ｔｉｅ２抗体を少なくとも１種の追加の治療活性成分と組み合わせて投与することを含む治療的投与レジメンを含む。そのような追加の治療活性成分の非限定的な例として、例えば別のＴｉｅ２アンタゴニスト（例えば抗Ｔｉｅ２抗体）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）のアンタゴニスト（例えば抗ＥＧＦＲ抗体［例えばセツキシマブまたはパニツムマブ］またはＥＧＦＲ活性の小分子阻害剤［例えばゲフィチニブまたはエルロチニブ］）、Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４等の別のＥＧＦＲファミリ・メンバのアンタゴニスト（例えば抗ＥｒｂＢ２、抗ＥｒｂＢ３もしくは抗ＥｒｂＢ４抗体またはＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３もしくはＥｒｂＢ４活性の小分子阻害剤）、ＥＧＦＲｖＩＩＩのアンタゴニスト（例えばＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体）、ｃＭＥＴアンタゴニスト（例えば抗ｃＭＥＴ抗体）、ＩＧＦ１Ｒアンタゴニスト（例えば抗ＩＧＦ１Ｒ抗体）、Ｂ−ｒａｆ阻害剤（例えばベムラフェニブ、ソラフェニブ、ＧＤＣ−０８７９、ＰＬＸ−４７２０）、ＰＤＧＦＲ−α阻害剤（例えば抗ＰＤＧＦＲ−α抗体）、ＰＤＧＦＲ−β阻害剤（例えば抗ＰＤＧＦＲ−β抗体）、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えばＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、例えば米国特許第７，０８７，４１１参照（本明細書において「ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質」とも称する））、抗ＶＥＧＦ抗体（例えばベバシズマブ）、ＶＥＧＦ受容体の小分子キナーゼ阻害剤（例えばスニチニブ、ソラフェニブまたはパゾパニブ）、ＤＬＬ４アンタゴニスト（例えばＲＥＧＮ４２１等の米国特許出願公開第２００９／０１４２３５４号に開示された抗ＤＬＬ４抗体）、Ａｎｇ２アンタゴニスト（例えばＨ１Ｈ６８５Ｐ等の米国特許出願公開第２０１１／００２７２８６号に開示された抗Ａｎｇ２抗体）等が挙げられる。本発明の抗Ｔｉｅ２抗体と組み合わせて有利に投与することができる別の薬剤として、小分子サイトカイン阻害剤等のサイトカイン阻害剤と、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８等のサイトカインまたはそれぞれの受容体に結合する抗体とが挙げられる。
【００７４】
本発明はまた、本明細書で述べた抗Ｔｉｅ２抗体のいずれかと、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ２、ＤＬＬ４、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｃＭｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、Ｂ−ｒａｆ、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−βまたは前記サイトカインのいずれかの内の１種もしくはそれ以上の阻害剤とを含む治療的組み合わせも含み、阻害剤はアプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ペプチボディ、ナノボディまたは抗体フラグメント（例えばＦａｂフラグメント；Ｆ（ａｂ’）2フラグメント；Ｆｄフラグメント；Ｆｖフラグメント；ｓｃＦｖ：ｄＡｂフラグメント；またはダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディおよび最小認識単位等の別の改変分子）である。抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛剤、副腎皮質ステロイドおよび／またはＮＳＡＩＤと組み合わせて本発明の抗Ｔｉｅ２抗体を投与することもできる。放射線治療および／または従来の化学治療も含む治療レジメンの一部として本発明の抗Ｔｉｅ２抗体を投与することもできる。
【００７５】
本発明の抗Ｔｉｅ２抗体の投与の直前に、同時に、または直後に追加の治療活性成分（単数または複数）を投与することができる（本開示の目的のために、そのような投与レジメンを追加の治療活性成分と「組み合わされた」抗Ｔｉｅ２抗体の投与とみなす）。本発明は、本発明の抗Ｔｉｅ２抗体が本明細書の別の箇所で説明した１種またはそれ以上の追加の治療活性成分（単数または複数）と共製剤化されている医薬組成物を含む。
【００７６】
抗体の診断での使用
例えば診断目的のために本発明の抗Ｔｉｅ２抗体を用いてサンプル中のＴｉｅ２を検出するおよび／または測定することもできる。例えば、抗Ｔｉｅ２抗体またはそのフラグメントを用いて、Ｔｉｅ２の異常な発現（例えば過剰発現、過小発現、発現の欠如等）により特徴付けられる症状または疾患を診断することができる。Ｔｉｅ２に関する例示的な診断アッセイは、例えば患者から得たサンプルを本発明の抗Ｔｉｅ２抗体と接触させることを含むことができ、抗Ｔｉｅ２抗体は検出可能な標識またはレポーター分子で標識されている。あるいは、それ自体が検出可能に標識されている二次抗体と組み合わせて、標識されていない抗Ｔｉｅ２抗体を診断用途で用いることができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓもしくは125Ｉ等の放射性同位体；フルオロセイン・イソチオシアネートもしくはローダミン等の蛍光部分もしくは化学発光部分；またはアルカリ・ホスファターゼ、ベータ−ガラクトシターゼ、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼもしくはルシフェラーゼ等の酵素であることができる。サンプル中のＴｉｅ２を検出するためにまたは測定するために用いることができる特定の例示的なアッセイとして、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【００７７】
本発明に係るＴｉｅ２診断アッセイで用いることができるサンプルとして、正常な状態下または病的状態下で患者から得ることができる、検出可能な量のＴｉｅ２タンパク質またはそのフラグメント等の任意の組織サンプルまたは液体サンプルが挙げられる。一般的に、健康な患者（例えば異常なＴｉｅ２レベルまたは活性と関連した疾患または症状を患っていない患者）から得られる特定のサンプル中のＴｉｅ２のレベルを測定することにより、ベースラインまたは基準であるＴｉｅ２のレベルを最初に確立することができるであろう。次に、このベースライン・レベルのＴｉｅ２を、Ｔｉｅ２に関連した疾患または状態を有する疑いがある個体から得たサンプルで測定したＴｉｅ２のレベルと比較することができる。
【実施例】
【００７８】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのようにして作るかおよび用いるかを当業者に完全に開示するとともに説明するために提示されており、発明者らが自らの発明とみなすものの範囲を限定することを意図していない。用いた数字（例えば量、温度等）に関して、正確性を確保する努力はしているが、多少の実験的誤差および偏差を考慮すべきである。特に指示がない場合、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
【００７９】
以下の実施例で用いたコントロール構築物
比較目的のために、以下に説明する様々な実験に例示的なコントロール構築物（抗Ｔｉｅ２抗体）を含めた。コントロールＩと称するす抗体は、米国特許第６，３７６，６５３号に記載の「１２Ｈ８」のドメインに対応するアミノ酸配列を有するマウスの重鎖および軽鎖の可変ドメイン備えるキメラ抗Ｔｉｅ２抗体であった。この抗体の定常ドメインはヒトＩｇＧ４であった。
【００８０】
〔実施例１〕
ヒトＴｉｅ２に対するヒト抗体の作成
標準的方法（例えば米国特許第６，５９６，５４１号参照）に従って、ヒトＴｉｅ２抗原を備えたＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを免疫化することにより、様々なヒト抗Ｔｉｅ２抗体を作成した。この技術を用いて、様々な抗Ｔｉｅ２抗体を得た；このようにして作成した例示的な抗体、およびこれらの対応する生物学的特性を以下の実施例で詳細に説明した。例示的な抗体は、Ｈ２ａＭ２７６０Ｎ、Ｈ２ａＭ２７６１Ｎ、Ｈ１Ｍ２０５５Ｎ、Ｈ１Ｈ２３０４Ｂ、Ｈ１Ｈ２３１７Ｂ、Ｈ１Ｈ２３２２Ｂ、Ｈ１Ｈ２３２４Ｂ、Ｈ１Ｈ２３３１Ｂ、Ｈ１Ｈ２３３２Ｂ、Ｈ１Ｈ２３３３Ｓ、Ｈ１Ｈ２３３７Ｂ、Ｈ１Ｈ２３３８Ｂ、Ｈ１Ｈ２３３９Ｂ、Ｈ１Ｈ２３４０ＢおよびＨ４Ｈ２０５５Ｎと命名した抗体を含でいた。本明細書で用いた抗体の命名に関するＨ１Ｍ、Ｈ２Ｍ、Ｈ１Ｈ等の接頭辞は、抗体の特定のＦｃ領域を示す。例えば、「Ｈ２Ｍ」抗体はマウスＩｇＧ２Ｆｃを有したが、「Ｈ１Ｈ」抗体はヒトＩｇＧ１Ｆｃを有した。当業者には分かるように、抗体のＦｃ領域を改変することができ、または異なるＦｃ領域と置き換えることができるが、可変ドメイン（ＣＤＲ等）には変化がないであろう。
【００８１】
抗Ｔｉｅ２抗体Ｈ１Ｍ２０５５ＮおよびＨ２ａＭ２７６０Ｎを生産するハイブリドーマを、ブダペスト条約に従った条件下で、受託番号ＰＴＡ−１２２９５（Ｈ１Ｍ２０５５Ｎ）およびＰＴＡ−１２２９６（Ｈ２ａＭ２７６０Ｎ）で２０１１年１２月２日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９に寄託した。
【００８２】
〔実施例２〕
ヒトモノクローナル抗Ｔｉｅ２抗体の結合親和性および動力学的定数を得た表面プラズモン共鳴
ヒトモノクローナル抗Ｔｉｅ２抗体の結合親和性および動力学的定数を表面プラズモン共鳴によって２５℃および３７℃で測定した（表１〜４）。Ｂｉａｃｏｒｅ２０００またはＴ２００機器上で測定を実施した。
【００８３】
マウス定常領域（Ｈ１ＭまたはＨ２Ｍと命名）を備えた抗体に関して、抗マウスＦｃセンサーの表面上に抗体を固定し、様々な濃度のヒト、マウスまたはラットＴｉｅ２構築物（ｈＴｉｅ２−Ｈｉｓ、ｍＴｉｅ２−ｈＦｃおよびｒＴｉｅ２−ｈＦｃ）を抗体捕捉表面全体に注入した。ヒトＩｇＧフォーマット（Ｈ１ＨまたはＨ４Ｈと命名）における抗体に関して、抗体捕捉表面に接触させたＴｉｅ２構築物に応じて抗ヒトＦｃセンサーの表面（ｈＴｉｅ２−ＨｉｓおよびｈＴｉｅ２−ｍＦｃ）または抗ヒトＦａｂセンサーの表面（ｍＴｉｅ２−ｈＦｃおよびｒＴｉｅ２−ｈＦｃ）を用いた。本実施例で用いた構築物のアミノ酸配列は以下の通りであった：ｈＴｉｅ２−Ｈｉｓ（配列番号２）；ｈＴｉｅ２−ｈＦｃ（配列番号３）；ｈＴｉｅ２−ｍＦｃ（配列番号４）；ｒＴｉｅ２−ｈＦｃ（配列番号５）；およびｍＴｉｅ２−ｈＦｃ（配列番号６）。
【００８４】
動力学的速度定数−Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０曲線適合ソフトウェアを用いて、物質移動限界を備える１：１結合モデルに実時間結合センサーグラムを適合させることにより、会合速度（Ｋａ）および解離速度（ｋｄ）を求めた。平衡解離定数（ＫD）および解離半減期（Ｔ１／２）を、ＫD（Ｍ）＝ｋｄ／Ｋａ；およびＴ１／２（分）＝（ｌｎ２／（６０*ｋｄ））として動力学的速度定数から算出した。表１〜２に示すように、試験した両方の温度で様々な抗体がｈＴｉｅ２への高い親和性結合を示した。更に、Ｈ１Ｍ２０５５Ｎ、Ｈ１Ｈ２３３２Ｂ、Ｈ１Ｈ２３３７Ｂ、Ｈ１Ｈ２３４０ＢおよびＨ４Ｈ２０５５Ｎは、マウスおよびラットＴｉｅ２への有意な結合を示した（表３〜４）。
【００８５】
【表１】
2014525934.tif 000003
【００８６】
【表２】
2014525934.tif 000004
【００８７】
【表３】
2014525934.tif 000005
【００８８】
【表４】
2014525934.tif 000006
【００８９】
〔実施例３〕
Ｌｕｍｉｎｅｘビーズを用いるＴＩｅ２ｍＡｂのエピトープマッピング
抗Ｔｉｅ２抗体に結合するドメインを決定するために、様々なｈＴｉｅ２受容体細胞外ドメイン欠失構築物をｌｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰビーズに共有結合的に連結させた（１０7個のビーズ当たり各タンパク質１０μｇ／ｍｌ）。構築物を図１に図示し、以下のように命名した：ｈＴｉｅ２（Ｉｇ１−Ｉｇ２−ＥＧＦ）（配列番号７）；ｈＴｉｅ２（Ｉｇ２−ＥＧＦ）（配列番号８）；ｈＴｉｅ２（ＥＧＦ）（配列番号９）；ｈＴｉｅ２（Ｉｇ３−ＦＮ）（配列番号１０）；およびｈＴｉｅ２（ＦＮ）（配列番号１１）。また、本実施例において、完全長ｈＴｉｅ２−ｍＦｃ（配列番号４）およびｈＴｉｅ１−ｈＦｃ（配列番号１２）の細胞外ドメイン構築物を試験した。
【００９０】
結合させるために、９６ウェルのフィルタ・プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中において、結合緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、０．０５％アジ化ナトリウム）中の前記作成したＬｕｍｉｎｅｘビーズ混合物７５μｌ（構築物当たり３×１０3個のビーズ）に抗Ｔｉｅ２抗体２５μｌ（２５μｇ／ｍｌ）を添加した。室温（ＲＴ）で９０分にわたってインキュベートし、または振とうしつつ４℃で終夜インキュベートした。ビーズを洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄してＰＥ（フィコエリトリン）標識抗ヒトカッパＦａｂ二次抗体またはＰＥ標識抗マウスＦａｂ二次抗体を含有する結合緩衝液１００μｌ中に再懸濁させ、振とうしつつ４５分にわたってＲＴでインキュベートした。サンプルを２回以上洗浄し、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｌ２００またはＦＬＥＸＭＡＰ３Ｄ機器を用いて各ビーズに関して結合シグナル（ＭＦＩ）を測定した。ヒトＴｉｅ２に連結したビーズをポジティブ・コントロールとして用い、ヒトＴｉｅ１に連結したビーズを用いてファミリー交差反応性を測定した。一般的に、５００単位より大きいＭＦＩシグナルは有意な結合を示す。結果を表５にまとめる。
【００９１】
【表５】
2014525934.tif 000007
【００９２】
前記結果から、Ｈ２ａＭ２７６０ＮおよびＨ１Ｍ２０５５ＮはＴｉｅ２のＩｇ１／Ｉｇ２ドメインに結合し；Ｈ２ａＭ２７６１ＮはＴｉｅ２のＥＧＦドメインおよびＩｇ３ドメインに結合し；Ｈ１Ｈ２３０４Ｂ、Ｈ１Ｈ２３１７Ｂ、Ｈ１Ｈ２３２２ＢおよびＨ１Ｈ２３２４ＢはＴｉｅ２のＥＧＦドメインに結合し；ならびにＨ１Ｈ２３３１Ｂ、Ｈ１Ｈ２３３２Ｂ、Ｈ１Ｈ２３３７Ｂ、Ｈ１Ｈ２３３９Ｂ、Ｈ１Ｈ２３４０ＢおよびコントロールＩはＴｉｅ２のＦＮドメインに結合すると結論付けることができる。
【００９３】
〔実施例４〕
Ｈ／Ｄ交換によるＴｉｅ２へのＨ４Ｈ２０５５Ｎ結合のエピトープマッピング
実験を行なうことにより、Ｈ４Ｈ２０５５Ｎが相互作用するＴｉｅ２のアミノ酸残基をより正確に限定した（Ｈ４Ｈ２０５５Ｎは、ハイブリドーマＰＴＡ−１２２９５から生産した抗体Ｈ１Ｍ２０５５Ｎの完全ヒトＩｇＧ４バージョンである）。この目的のために、Ｈ／Ｄ交換エピトープマッピングを行なった。Ｈ／Ｄ交換法の概要は例えばＥｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６７（２）：２５２〜２５９ページ；ならびにＥｎｇｅｎおよびＳｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ〜２６５Ａページに記載されている。
【００９４】
Ｈ／Ｄ交換を介してＴｉｅ２上の抗体Ｈ４Ｈ２０５５Ｎの結合エピトープ（単数または複数）をマッピングするために、ヒトＴｉ２のＩｇ１、Ｉｇ２およびＥＧＦの細胞外ドメインからなる組み換え構築物（ｈＴｉｅ２（Ｉｇ１−Ｉｇ２−ＥＧＦ）；配列番号７）を用いた。抗体Ｈ４Ｈ２０５５ＮをＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）アガロース・ビーズ（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）に共有結合的に結合した。
【００９５】
「オン−溶液／オフ−ビーズ」（溶液中でのオン−交換後にビーズ上でのオフ−交換）実験において、リガンド（ｈＴｉｅ２  Ｉｇ１−Ｉｇ２−ＥＧＦ）をＤ2Ｏで調製したＰＢＳ緩衝液中で５分また１０分にわたって重水素化し、次いで２分にわたってインキュベートしてＨ４Ｈ２０５５Ｎビーズに結合させた。Ｔｉｅ２結合ビーズをＰＢＳ水性緩衝液（Ｈ2Ｏで調製）で洗浄し、ＰＢＳ緩衝液中でオン−交換時間の半分にわたってインキュベートした。オフ−交換後、氷冷した低ｐＨのＴＦＡ溶液により、結合したＴｉｅ２をビーズから溶出させた。次いで、溶出したＴｉｅ２を、固定したペプシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により５分にわたって消化した。得られたペプチドをＺｉｐＴｉｐ（登録商標）クロマトグラフィー・ピペット・チップを用いて脱塩し、ＵｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析（ＭＳ）により速やかに分析した。
【００９６】
「オン−ビーズ／オフ−ビーズ」（ビーズ上でのオン−交換後にビーズ上でのオフ−交換）実験において、最初にＴｉｅ２をＨ４Ｈ２０５５Ｎビーズに結合させ、次いでオン−交換するためにＤ2Ｏ中で５分または１０分にわたってインキュベートした。その後の工程（オフ−交換、ペプシン消化およびＭＳ分析）を「オン−溶液／オフ−ビーズ」の手順に関して記載されているように行なった。検出したペプチド全ての重心値または平均質量対電荷比（ｍ／ｚ）を算出し、これら２組の実験の間で比較した。
【００９７】
Ｈ／Ｄ交換およびペプシン消化手順後の液体クロマトグラフィー−マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＬＣ−ＭＡＬＤＩ）ＭＳにより特定した検出ペプチド全てに関して重心ｍ／ｚ値の比較を示す表６に結果をまとめる。おそらくジスルフィド結合に起因して、単一のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルから検出されたＴｉｅ２配列包括度は比較的低い。それにも関わらず、検出したペプシン消化ペプチドの過半数は、オン−溶液／オフ−ビーズ・プロトコルおよびオン−ビーズ／オフ−ビーズ・プロトコルの両方に関して同様の重心値を示す。残基８８〜１０６、１３９〜１５２および１６６〜１７５に対応する３つのセグメントは、両方の実験において０．２０ｍ／ｚ以上のデルタ重心値を有していた。本実施例の目的のために、両方の実験における少なくとも０．２０ｍ／ｚの正の差（Δ）は、抗体の結合により保護されたアミノ酸を示す。表６において、この基準に合うセグメントを太字のテキストおよびアスタリスク（*）で示す。
【００９８】
【表６】
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【００９９】
残基８８〜９５に対応するペプチド・フラグメント（１０４９．４のｍ／ｚ）はオフ−交換後に重陽子の保持を示さなかった（Δ＝０）ことから、第１の保護セグメント（８８〜１０６）を縮小して残基９６〜１０６のみを含ませることができる。従って、配列番号７の３つの領域９６〜１０６、１３９〜１５２および１６６〜１７５は、オン−交換後にＴｉｅ２に結合するＨ４Ｈ２０５５Ｎにより完全オフ−交換から保護される。
【０１００】
Ｔｉｅ２のＩｇ１ドメインは配列番号７のアミノ酸１〜９７から成り；Ｔｉｅ２のＩｇ２ドメインは配列番号７のアミノ酸９８〜１８６から成り；およびＥＧＦ繰り返しドメインは配列番号７のアミノ酸１８７〜３２１からなる。従って、第１の結合領域（配列番号７のアミノ酸９６〜１０６）は、Ｉｇ１ドメインの最後の２個のアミノ酸およびＩｇ２ドメインの最初の９個のアミノ酸を含む。第２および第３の結合領域（配列番号７のアミノ酸１３９〜１５２および１６６〜１７５）の全体がＩｇ２ドメイン内に位置する。
【０１０１】
Ｂａｒｔｏｎ他（２００６、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ１３（６）５２４〜５３２ページ）による共結晶構造に基づいて、第２および第３の結合領域（配列番号７のアミノ酸１３９〜１５２および１６６〜１７５）は、同種のリガンドであるアンジオポエチン２に直接接触するＴｉｅ２のアミノ酸領域内に位置することにも留意すべきである。従って、本実施例は、抗体Ｈ４Ｈ２０５５Ｎが、主に（Ｉｇ１ドメインのＣ末端部内での１個または２個の潜在的アミノ酸接触を有する）ヒトＴｉｅ２のＩｇ２ドメイン内の不連続エピトープに結合し、本明細書の実施例５および６に示すように、これらの領域への結合は、Ｔｉｅ２とＡｎｇ２との間の相互作用を遮断するＨ４Ｈ２０５５Ｎの能力と関連することを示す。
【０１０２】
〔実施例５〕
Ｔｉｅ２とアンジオポエチンとの間の相互作用を遮断する抗Ｔｉｅ２抗体の能力の評価
Ｔｉｅ２がアンジオポエチン（Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３およびＡｎｇ４）と相互作用することが知られている。従って、Ａｎｇ２に結合するＴｉｅ２を遮断する抗Ｔｉｅ２抗体の能力を評価するために、最初の組の実験を行なった。この最初の組の実験では定量的遮断免疫アッセイを利用した。簡潔に言えば、６ｘＨｉｓ（配列番号２）に融合した０．８ｎＭのビオチン化ｅｃｔｏ−Ｔｉｅ２溶液を段階希釈により約５０ｎＭ〜０ｎＭの範囲で抗Ｔｉｅ２抗体と前混合した。室温で１時間にわたりインキュベートした後、プレート被覆Ｂｏｗ−Ａｎｇ２に結合したＴｉｅ２ーＨｉｓの量をサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。Ｂｏｗ−Ａｎｇ２（配列番号１３）、即ち両末端でＡｎｇ２の１つのＦＤドメインに挟まれたｈＩｇＧ１のＦｃドメインを含むＡｎｇ２構築物を９６ウェルのマイクロタイター・プレート上において２μｇ／ｍｌで被覆し、ＢＳＡで遮断した。ＨＲＰが接合したストレプトアビジンを用いて、プレートに結合したビオチン−Ｔｉｅ２−Ｈｉｓを検出し、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）を用いて現像した。ＯＤ450ｎｍのシグナルを記録し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いてデータを分析することによりＩＣ50の値を算出した。結果を表７にまとめる。ＩＣ50を、プレートに結合したＢｏｗ−Ａｎｇ２リガンドで検出可能なビオチン−Ｔｉｅ２−Ｈｉｓを５０％低減するのに必要な抗体の量として定義した。表７において、抗体の添加により、抗体がないコントロールと比較してＢｏｗ−Ａｎｇ２被覆表面に結合したＴｉｅ２−Ｈｉｓの量が増加する場合、抗体を「増強剤」と命名した。
【０１０３】
【表７】
2014525934.tif 000009
【０１０４】
最初の組の実験では、抗Ｔｉｅ２抗体Ｈ１Ｈ２３３９Ｂ、Ｈ１Ｈ２３４０ＢおよびＨ４Ｈ２０５５ＮがＥＬＩＳＡフォーマットにおいてＡｎｇ２とＴｉｅ２との間の相互作用を遮断することができることが示された。
【０１０５】
Ｔｉｅ２のＡｎｇ２およびアンジオポエチン・ファミリの別のメンバー（Ａｎｇ１、Ａｎｇ３およびＡｎｇ４）への結合を遮断するＨ４Ｈ２０５５Ｎの能力を評価するために、更なる組の実験を実施した。この組の実験では、２つの実験フォーマットを用いるＯｃｔｅｔ  Ｒｅｄバイオセンサーを用いた。最初のフォーマットでは、ｈＴｉｅ２．ｍＦｃ（配列番号４；１０μｇ／ｍｌ）またはネガティブ・コントロールを抗ｍＦｃ  Ｏｃｔｅｔセンサー先端部で５分にわたって捕捉した。次いで、各モノクローナル抗体３００ｎＭを含有するウェル中に１０分にわたって浸すことにより、捕捉したセンサー先端部の表面をＨ４Ｈ２０５５ＮまたはコントロールＩの抗体で飽和した。最後に、ｈＡｎｇ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州、Ｃａｔ９２３−ＡＮ／ＣＦ；受託番号Ｑ５ＨＹＡ０）、ｈＡｎｇ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州Ｎ、Ｃａｔ６２３−ＡＮ／ＣＦ；受託番号Ｏ１５１２３）、ｍＡｎｇ３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州、Ｃａｔ７３８−ＡＮ／ＣＦ；受託番号Ｑ９ＷＶＨ６）またはｈＡｎｇ４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州、Ｃａｔ９６４−ＡＮ／ＣＦ；受託Ｑ９Ｙ２６４）を１００ｎＭ含有するウェル中に５分にわたってセンサー先端部を配置した。実験の各工程での結合反応性をモニタリングし、モノクローナル抗体飽和受容体表面への様々なアンジオポエチンの結合をプロットした（図２）。図２に示すように、Ｈ４Ｈ２０５５Ｎは、４種全てのアンジオポエチンのｈＴｉｅ２．ｍＦｃ表面への結合を遮断した。コントロールＩの抗体は、アンジオポエチンのＴｉｅ２被覆表面へのいずれの結合も遮断しなかった。
【０１０６】
第２のアッセイ・フォーマットでは、ｈＴｉｅ２．ｍＦｃ（１０μｇ／ｍｌ）またはネガティブ・コントロールを抗ｍＦｃ被覆Ｏｃｔｅｔセンサー先端部に捕捉した（５分）後、アンジオポエチン（ｈＡｎｇ１、ｈＡｎｇ２、ｍＡｎｇ３またはｈＡｎｇ４）を１００ｎＭ含有する様々なウェル中に１０分にわたって先端を配置した。最後に、Ｈ４Ｈ２０５５ＮまたはコントロールＩを３００ｎＭ含有するウェル中にセンサー先端部を配置した（５分）。フォーマット１のように、各工程での結合反応性をモニタリングし、結合反応性をプロットした（図３）。本フォーマットでは、コントロールＩとは異なり、Ｔｉｅ２被覆表面上の既に結合したアンジオポエチンによりＨ４Ｈ２０５５Ｎの結合が低下したことが示された。従って、Ｔｉｅ２への結合に関して、Ｈ４Ｈ２０５５Ｎはアンジオポエチン（Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３およびＡｎｇ４）と競合した。
【０１０７】
〔実施例６〕
アンジオポエチン介在Ｔｉｅ２シグナル伝達を遮断する抗Ｔｉｅ２抗体の能力の評価
本発明の抗ｈＴｉｅ２ｍＡｂを更に特徴付けるために、Ｔｉｅ２誘導ルシフェラーゼ活性を遮断する抗体の能力を調べた。簡潔に言えば、ＨＥＫ２９３細胞にｈＴｉｅ２を安定的に遺伝子導入し、Ｔｉｅ２を発現する細胞の上位１０％をＦＡＣＳにより単離した。次いで、これらの細胞に血清応答要素（ＳＲＥ）依存型ルシフェラーゼ・レポーター・レンチウイルス（ＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を形質導入し、アンジオポエチン−１（Ｂｏｗ−Ａｎｇ１、配列番号１４）およびアンジオポエチン−２（Ｂｏｗ−Ａｎｇ２、配列番号１３）の四量体に対する強い反応性を有するクローナル個体群（２９３−ＴＩＥ２／ＳＲＥ−Ｌｕｃ）を単離した。
【０１０８】
分析するために、処理の１日前に、２９３−Ｔｉｅ２／ＳＲＥ−Ｌｕｃ細胞を９６ウェルのプレート中に播種した（ウェル当たり３０，０００個の細胞）。ルシフェラーゼ活性の測定前に４時間にわたって細胞と共にインキュベートしたＢｏｗ−Ａｎｇ１（ＢＡ１）またはＢｏｗ−Ａｎｇ２（ＢＡ２）の段階希釈により用量−反応曲線を作成した。Ｔｉｅ２の阻害に関して、ＢＡ１またはＢＡ２の１ｎＭ一定用量の存在下で４時間にわたり、段階希釈したＴｉｅ２ｍＡｂで細胞を処理した。Ｏｎｅ−Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬によるインキュベート後にＶｉｃｔｏｒ照度計でルシフェラーゼ活性を測定した。３種類の抗体を観察した：抗体の添加時にＴｉｅ２依存型ルシフェラーゼ活性が低下すると定義される遮断剤；抗体の添加時にＴｉｅ２依存型ルシフェラーゼ活性が高まると定義される活性剤；および抗体の添加時にシグナルの有意な変化がないと定義される不活性。「不活性な」抗体に関してはＥＣ50またはＩＣ50の値を算出しなかった。結果を表８にまとめる。
【０１０９】
【表８】
2014525934.tif 000010
【０１１０】
本実験系において、抗Ｔｉｅ２抗体Ｈ２ａＭ２７６０Ｎ、Ｈ２ａＭ２７６１ＮおよびＨ４Ｈ２０５５Ｎを遮断剤と特定した。
【０１１１】
〔実施例７〕
インビボでの抗Ｔｉｅ２の抗腫瘍活性の評価
免疫不全マウスにおけるヒト腫瘍の異種移植片の増殖を阻害する例示的な抗Ｔｉｅ２抗体（Ｈ２Ｍ２０５５Ｎ）の能力に関して、Ｔｉｅ２抗体を試験した。簡潔に言えば、ＳＣＩＤマウスにおいてヒト結腸直腸のＨＴ２９またはＣｏｌｏ２０５腫瘍を増殖させた。腫瘍が触知できた場合（ＨＴ２９に関しては１００ｍｍ3およびＣｏｌｏ２０５に関しては４００ｍｍ3）、Ｆｃタンパク質（１０ｍｇ／ｋｇ）または抗Ｔｉｅ２抗体（Ｈ１Ｍ２０５５Ｎ；１０ｍｇ／ｋｇ）により隔週で動物を処理した。処理の終了時（ＨＴ２９に関しては３１日およびＣｏｌｏ２０５に関しては１４日）に、腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）を求め（表９）、腫瘍組織を摘出して血管密度の分析に利用した。ＣＤ３１免疫組織化学により、３０μｍ厚のＯＣＴ腫瘍部における血管密度を評価した。ＮＩＨ画像ソフトウェアを利用して腫瘍組織部における血管密度の％面積を求めた。結果を図４〜７に図示する。
【０１１２】
【表９】
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【０１１３】
本実施例で示すように、抗Ｔｉｅ２ＡｂであるＨ１Ｍ２０５５Ｎは、腫瘍の増殖を低下させた（表９）だけでなく、ＨＴ２９（２５％、図５）異種移植モデルおよびＣｏｌｏ２０５（４０％、図７）異種移植モデルの両方において血管密度を有意に低下させた。
【０１１４】
本発明は、本明細書で説明した特定の実施形態による範囲に限定されない。実際に、本明細書で説明されているものに加えて本発明の様々な変更が前述の説明および添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような変更は、添付した特許請求の範囲に含まれるように意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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