(57)【要約】  本発明は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）構造生物学およびシグナル伝達の分野に関する。特に、本発明はＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に対して作製されたおよび／または特異的に結合する結合ドメインに関する。そのような結合ドメインをコードする核酸配列およびそのような結合ドメインを発現するまたは発現することができる細胞も提供される。本発明の結合ドメインは、下流のヘテロ三量体Ｇタンパク質と複合体を形成し、種々の天然または合成リガンドに結合しているＧタンパク質共役受容体の構造的および機能的特徴付けのため、Ｇタンパク質活性化の動的特徴を調べるためならびにＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体を利用するスクリーニングおよび創薬努力のための汎用ツールとして用いられ得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含む複合体に対して作製されたおよび／または特異的に結合する結合ドメイン。
【請求項２】
ヘテロ三量体Ｇタンパク質単独および／またはＧＰＣＲ単独それぞれに結合するのと比べてより高い親和性で複合体に結合する、請求項１に記載の結合ドメイン。
【請求項３】
Ｇタンパク質に特異的に結合し、ＧＰＣＲには結合しない、請求項１に記載の結合ドメイン。
【請求項４】
複合体が、受容体リガンドをさらに含む、請求項１に記載の結合ドメイン。
【請求項５】
複合体が、ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質および受容体リガンドからなる、請求項４に記載の結合ドメイン。
【請求項６】
前記受容体リガンドが、アゴニストである、請求項４または５のいずれかに記載の結合ドメイン。
【請求項７】
Ｇタンパク質が、無ヌクレオチド形態である、請求項１から６のいずれかに記載の結合ドメイン。
【請求項８】
前記Ｇタンパク質のアルファとベータサブユニット間の界面で立体構造エピトープに特異的に結合する、請求項１から７のいずれかに記載の結合ドメイン。
【請求項９】
ａ）ヌクレオチドの存在下で複合体の解離を防ぐもしくは阻害する、または
ｂ）Ｇタンパク質へのヌクレオチドの結合を防ぐもしくは阻害する、または
ｃ）Ｇタンパク質からヌクレオチドを置換することができる、
請求項１から８のいずれかに記載の結合ドメイン。
【請求項１０】
前記ヌクレオチドがＧＤＰもしくはＧＴＰなどのグアニンヌクレオチドまたはＧＴＰγＳなどのそのアナログである、請求項７から９のいずれかに記載の結合ドメイン。
【請求項１１】
ＧＰＣＲが、活性立体構造である、請求項１から１０のいずれかに記載の結合ドメイン。
【請求項１２】
Ｇタンパク質が、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｏ、Ｇｔ、Ｇｇｕｓｔ、Ｇｚ、Ｇｏｌｆ、Ｇｑ、Ｇ１２、Ｇ１３からなる群から選択される、請求項１から１１のいずれかに記載の結合ドメイン。
【請求項１３】
ＧＰＣＲが、Ｇｓ共役受容体、Ｇｉ共役受容体、Ｇｏ共役受容体、Ｇｔ共役受容体、Ｇｇｕｓｔ共役受容体、Ｇｏｌｆ共役受容体、Ｇｑ共役受容体、Ｇ１２共役受容体、Ｇ１３共役受容体からなる群から選択される、請求項１から１１のいずれかに記載の結合ドメイン。
【請求項１４】
前記ＧＰＣＲが、ヒトタンパク質である、請求項１から１３のいずれかに記載の結合ドメイン。
【請求項１５】
前記結合ドメインが、以下の式（１）：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（１）
に従って、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含むアミノ酸配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインである、請求項１から１４のいずれかに記載の結合ドメイン。
【請求項１６】
免疫グロブリン単一可変ドメインが、以下の式（１）：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（１）
に従って、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含むアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ１は
ａ）配列番号１３−１８、
ｂ）配列番号１３−１８と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
ｃ）配列番号１３−１８と３つ、２つまたは１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド
からなる群から選択され、ＣＤＲ２は
ａ）配列番号２５−３０、
ｂ）配列番号２５−３０と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
ｃ）配列番号２５−３０と３つ、２つまたは１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド
からなる群から選択され、ＣＤＲ３は
ａ）配列番号３７−４２、
ｂ）配列番号３７−４２と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
ｃ）配列番号３７−４２と３つ、２つまたは１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド
からなる群から選択される、請求項１５に記載の結合ドメイン。
【請求項１７】
免疫グロブリン単一可変ドメインが、ナノボディ（ＶＨＨ）である、請求項１５に記載の結合ドメイン。
【請求項１８】
ナノボディが、配列番号１から６またはそれらのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１７に記載の結合ドメイン。
【請求項１９】
前記結合ドメインが、ポリペプチドに含まれる、請求項１から１８のいずれかに記載の結合ドメイン。
【請求項２０】
前記結合ドメインが、固体支持体上に固定化される、請求項１から１９のいずれかに記載の結合ドメイン。
【請求項２１】
請求項１から２０のいずれかに記載の結合ドメインを含む複合体。
【請求項２２】
ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質および場合によって受容体リガンドをさらに含む、請求項２１に記載の複合体。
【請求項２３】
結晶である、請求項２１から２２のいずれかに記載の複合体。
【請求項２４】
請求項１から２０のいずれかに記載の結合ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸配列。
【請求項２５】
請求項２４に記載の核酸配列を含む組換えベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載の組換えベクターまたは請求項２４に記載の核酸配列を含む細胞。
【請求項２７】
ＧＰＣＲおよび／またはＧタンパク質を発現しているまたは発現することができる、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
請求項２６から２７のいずれかに記載の細胞の細胞培養物。
【請求項２９】
請求項２６から２７のいずれかに記載の細胞のまたは請求項２８に記載の細胞培養物の膜調製物。
【請求項３０】
ＧＰＣＲおよびＧタンパク質ならびに場合によって受容体リガンドを含む複合体を機能的立体構造状態で安定化するための、請求項１から２０のいずれかに記載の結合ドメインの使用。
【請求項３１】
ヌクレオチド、特にグアニンヌクレオチドまたはＧＴＰγＳなどのそのアナログの存在下で複合体の解離を防ぐための、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
ＧＰＣＲおよびＧタンパク質ならびに場合によって受容体リガンドを含む複合体を結晶化するおよび／またはその構造を解明するための、請求項１から２０のいずれかに記載の結合ドメインの使用。
【請求項３３】
ＧＰＣＲのシグナル伝達活性を調節する化合物についてスクリーニングするための、請求項１から２０のいずれかに記載の結合ドメインまたは請求項２６から２７のいずれかに記載の細胞または請求項２９に記載の膜調製物の使用。
【請求項３４】
ＧＰＣＲが、活性立体構造である、請求項３０から３３のいずれかに記載の使用。
【請求項３５】
１つ以上の相互作用タンパク質を捕捉するための、請求項１から２０のいずれかに記載の結合ドメインの使用。
【請求項３６】
ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含む複合体を捕捉および／または精製する方法であって、
ａ）請求項１から２０のいずれかに記載の結合ドメインを用意する段階、
ｂ）結合ドメインをＧＰＣＲおよびＧタンパク質ならびに場合によって受容体リガンドを含む複合体に結合させる段階、ならびに
ｃ）場合によって、段階ｂ）において形成される複合体を単離する段階
を含む方法。
【請求項３７】
ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含む複合体の結晶構造を決定する方法であって、
ａ）請求項１から２０のいずれかに記載の結合ドメインを用意する段階、
ｂ）結合ドメインをＧＰＣＲおよびＧタンパク質ならびに場合によって受容体リガンドを含む複合体に結合させる段階、ならびに
ｃ）段階ｂ）において形成される複合体を結晶化する段階
を含む方法。
【請求項３８】
ＧＰＣＲ受容体シグナル伝達、特にＧタンパク質媒介ＧＰＣＲ受容体シグナル伝達を調節するための、請求項１から２０のいずれかに記載の結合ドメインの使用。
【請求項３９】
ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含む複合体に対して作製されたおよび／または特異的に結合する結合ドメインを産生する方法であって、
ａ）適切な細胞発現系において請求項２４に記載の核酸を発現させる段階、ならびに場合によって
ｂ）結合ドメインを単離および／または精製する段階
を含む方法。
【請求項４０】
ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含む複合体に対して作製されたおよび／または特異的に結合する結合ドメインについてスクリーニングする方法であって、
ａ）複数の結合ドメインを用意する段階、ならびに
ｂ）ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含む複合体に結合する結合ドメインについて前記複数の結合ドメインをスクリーニングする段階、ならびに
ｃ）複合体に結合する結合ドメインを単離する段階
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）構造生物学およびシグナル伝達の分野に関する。特に、本発明はＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に対して作製されたおよび／または特異的に結合する結合ドメインに関する。そのような結合ドメインをコードする核酸配列およびそのような結合ドメインを発現するまたは発現することができる細胞も提供される。本発明の結合ドメインは、下流のＧタンパク質と複合体を形成し、種々の天然または合成リガンドに結合しているＧタンパク質共役受容体の構造的および機能的特徴付けのため、Ｇタンパク質活性化の動的特徴を調べるためならびにＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体を利用するスクリーニングおよび創薬努力のための汎用ツールとして用いられ得る。
【背景技術】
【０００２】
７回膜貫通受容体（７ＴＭＲ）は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）とも呼ばれているが、ヒトゲノムにおいて最大クラスの受容体であり、医薬治療法のためのもっとも広く標的にされるタンパク質クラスである。薬理学からインビボでの機能的特徴付けまで多様なＧＰＣＲの理解はこの３０年でかなり前進してきた。最近の高分解能構造研究は、ＧＰＣＲ活性化および構成的活性についての分子機構を明らかにしてきた（たとえば、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら２０１１年）。しかし、ＧＰＣＲがその下流標的の活性とどのように相互作用し調節しているのかについての分子詳細はいまだに不足している。その下流タンパク質と複合体を形成したＧＰＣＲの構造は、これらの相互作用が薬理学的に関連しているからというだけではなく、分子間相互作用の原子的理解が、機能的選択性の秘密、すなわち、異なるアゴニストが一種類の受容体から別個の下流効果を達成させる能力を解き明かすので、非常に興味深い。最近の構造データによれば、ＧＰＣＲは、そのサイズは小さいけれども、複数のシグナル伝達出力を有する精巧なアロステリック機械であるというアイデアが支持されている。
【０００３】
ＧＰＣＲは、活性化されると、ヘテロ三量体Ｇタンパク質またはＧαβγとして知られる３つのタンパク質の複合体を介してＧＴＰ依存的な形態でそのシグナルを伝達する。細胞外リガンドがＧＰＣＲに結合すると、ＧαβγにおいてＧＤＰ−ＧＴＰ交換を触媒するその能力を調節し、それによって二次メッセンジャーの細胞内レベルを調節する。不活性Ｇαβγヘテロ三量体は２つの主要なエレメント、Ｇα−ＧＤＰおよびＧβγヘテロ二量体で構成されている。ＧβγはＧα上のスイッチＩＩエレメントを隔離し、その結果、スイッチＩＩエレメントはｃＡＭＰ、ジアシルグリセロールおよびカルシウムを伴う系などの二次メッセージ系と相互作用することができない。活性化されたＧＰＣＲはＧＤＰのＧαからの放出を触媒し、ＧＴＰが結合して活性化されたＧα−ＧＴＰサブユニットを遊離させることが可能になる。この状態では、スイッチＩＩはＧＴＰのγ−リン酸により安定化されるヘリックスを形成し、前記へリックスがアデニリルシクラーゼなどのエフェクターと相互作用することが可能になる。Ｇαサブユニットがどのようにしてその下流標的と相互作用しその活性を調節するかについての理解は大いに前進したが、活性化されたＧＰＣＲがＧαβγ上でのヌクレオチド交換を触媒することによりどのようにしてこのプロセスを開始するのかははっきりしていない。
【０００４】
創薬の努力は一般的には、出発点として標的の静的モデルを使用して、特定の触媒または活性部位に競合的に結合する小分子リガンドに焦点を合わせる。この方法により、今日使用されている多数の活性部位治療法が同定され検証されてきた。しかし、新薬剤化合物の高い失敗率（第１相臨床治療法のうち最終的に食品医薬品局の承認を得るのはおよそ８％のみと推算されており、薬剤あたり８億ドルの保存費が掛かっている）に反映されるように、多くの努力がうまくいかず、多くの場合、標的は新薬の開発につながらないと見なされると破棄される（ＬｅｅおよびＣｒａｉｋ、２００９年）。これらの失敗のうちの相当な部分が、問題の標的のもっとも突き出した立体構造が、薬剤が治療的徴候にとって効果的であるためには結合しなければならない新薬の開発につながる立体構造と一致していないという事実に起因する。たとえば、アゴニスト結合活性状態ＧＰＣＲ構造を得るための努力により、Ｇタンパク質の非存在下でのこの状態の固有の不安定性のせいで困難を伴うことが判明している。最近では、Ｇタンパク質を模倣しオルソステリック部位でアゴニストに対する親和性を増加する立体構造選択的な安定化に寄与するナノボディまたはグザペロン（Ｘａｐｅｒｏｎｅ）（登録商標）を利用してＧＰＣＲの活性状態の構造を得ることが可能になった（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら  ２０１１年）。これにより、治療的関連立体構造においてもっとも難解な薬剤標的の構造をロックするＸａｐｅｒｏｎｅｓ（登録商標）の威力（ＳｔｅｙａｅｒｔおよびＫｏｂｉｌｋａ、２０１１年）および特定の標的に対するより高い感受性および選択性を有する潜在的薬剤について特異的にスクリーニングすることができる指向性創薬のためのその有用性（ＷＯ２０１２００７５９３）が実証されている。この技術的アプローチの１つの限界は、ＧＰＣＲ標的ごとに特異的な安定化に寄与するナノボディを同定する必要があることであり、そのために時間がかかり高価であるだけでなく、中でも免疫化および選択目的のための生体物質のような異なるツールの利用能も暗に意味している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１２／００７５９３号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２０１１年，ＮＡＴＵＲＥ  ４６９，１７５−１８０
【非特許文献２】ＬｅｅおよびＣｒａｉｋ、２００９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｐｒ１０;３２４（５９２４）：２１３−５
【非特許文献３】ＳｔｅｙａｅｒｔおよびＫｏｂｉｌｋａ、２０１１年、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．  Ａｕｇ；２１（４）：５６７−７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ＧＰＣＲ薬剤標的の構造および薬理学的解析のための新しい直接的なツールの開発が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
その下流ヘテロ三量体Ｇタンパク質と複合体を形成し、様々な天然および合成リガンドに結合しているＧＰＣＲの構造的および機能的特徴を解明することは、ＧＰＣＲシグナル伝達の機構を理解するためにも、ならびに創薬の努力のためにも価値がある。たとえば、アゴニスト、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質で構成されている活性状態三元複合体の構造を得ることは今までのところ成功していないが、その生物学の理解が不十分なためにシグナル伝達の構造生物学において大いに望まれていた。この複合体の結晶生成は、１つのパートナー（受容体）が可溶化されるためには界面活性剤を必要とし、Ｇタンパク質は界面活性剤中では不安定であるために、極めて困難であることが判明していた。その上、複合体の形成に必要なヌクレオチドは過渡過程の複合体を解離させもする。
【０００９】
したがって、全く予想外に、本発明者らはＧＰＣＲとＧタンパク質の複合体を安定化するツールであって、そのような複合体を捕捉し精製し、最終的にそのような複合体を結晶化することを可能にするツールを同定した。これにより、たとえば、構造ベースのバーチャルスクリーニングもしくは設計、ハイスループットスクリーニングまたは断片ベースの創薬によりリガンドまたは薬剤化合物の同定が促進されることになる（たとえば、実施例１０参照）。さらに具体的には、本発明者らは、アゴニスト、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質で構成されている活性状態複合体の構造的および機能的解析に適した結合ドメイン、特に免疫グロブリン単一可変ドメインを同定した（たとえば、実施例４−７参照）。興味深いことに、これらのＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体選択的結合ドメインの一部はＧタンパク質に対して特異的に作製されており、ＧＰＣＲに対してではないことが実証された。たとえば、ベータアドレナリン受容体に接触することなくＧαｓとＧβγの界面でＧｓに結合する結合ドメインが同定され（たとえば、実施例３参照）、したがって、アルギニンバソプレシン受容体２（Ｖ２Ｒ）について実証されたように、他のＧｓ共役受容体を捕捉し安定化するのに有用であることになる（たとえば、実施例９参照）。したがって、結合ドメインがＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体のＧタンパク質に対して作製されているのは、そのような結合ドメインはその特定のＧタンパク質と相互作用するＧＰＣＲの範囲の活性状態複合体を安定化し捕捉する一般的ツールとして使用することができるので、特に有利な点である。
【００１０】
したがって、第一の態様によると、本発明は、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含む複合体に対して作製されたおよび／または特異的に結合する結合ドメインに関する。さらに具体的には、本明細書に記載される結合ドメインは、それぞれＧタンパク質単独および／またはＧＰＣＲ単独に結合することと比べた場合、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体により高い親和性で結合する。その上、本明細書に記載される結合ドメインは、ＧＰＣＲに対するＧタンパク質の親和性を増強する。したがって、本発明は、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含む複合体の立体構造エピトープに対して作製されたおよび／または特異的に結合する結合ドメインを提供し、前記複合体を特定の立体構造状態、さらに具体的には活性な立体構造状態で安定化するもしくはロックする。
【００１１】
一般には、本明細書に記載される結合ドメインは、ＧＰＣＲとＧタンパク質の複合体により利用可能または接近可能になるどんな立体構造エピトープにも結合し得る。これらの立体構造エピトープは、前記複合体中に含まれる個々のタンパク質により表されてもよいおよび／または複合体を形成した際にのみ表されてもよい。さらに、これらの立体構造エピトープは、個々のタンパク質単独により表されても表されなくてもよい。一特定の実施形態によれば、本明細書に記載される結合ドメインは、前記複合体中に含まれるＧタンパク質に特異的に結合するが、ＧＰＣＲには結合しない。
【００１２】
典型的には、本来、Ｇタンパク質はヌクレオチド結合型である。さらに具体的には、Ｇタンパク質（または、少なくともαサブユニット）は、本明細書においてさらに記載されるように、特定のＧＰＣＲの活性化状態に応じて、ＧＴＰまたはＧＤＰのどちらかに結合している。アゴニストがＧＰＣＲに結合すると、ＧＤＰが結合したＧαβγヘテロ三量体との相互作用が促進され、ＧＤＰとＧα上のＧＴＰが交換されて、Ｇタンパク質は追加の細胞内シグナル伝達のために必要とされるＧα−ＧＴＰとＧβγサブユニットに機能的に解離する。特定の実施形態では、本明細書に記載される結合ドメインは、ヌクレオチドの非存在下ではＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に特異的に結合して前記複合体を安定化し、さらに具体的には、前記結合ドメインは、Ｇタンパク質が無ヌクレオチド形態であるＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に結合して前記複合体を安定化する。特定の実施形態では、本明細書に記載される結合ドメインは、前記Ｇタンパク質のアルファとベータ−ガンマサブユニット間の界面で立体構造エピトープに特異的に結合することになり、したがってＧＤＰ／ＧＴＰ結合部位を遮断し、ＧＤＰ／ＧＴＰ結合に干渉する。したがって、驚くべきことに、本明細書に記載される結合ドメインは、ヌクレオチド、特にグアニンヌクレオチドまたはＧＴＰγＳなどのそのアナログの存在下でＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の解離を妨げるまたは阻害する。その上、本明細書に記載される結合ドメインは、ヌクレオチドのＧタンパク質への結合を防ぐまたは阻害する。
【００１３】
好ましくは、本明細書に記載される結合ドメインは、ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質および１つ以上の受容体リガンドを含む複合体に対して作製されているおよび／または特異的に結合する。典型的には、前記受容体リガンドは、アゴニストもしくはポジティブアロステリックモジュレーターまたはそれらの組合せになる。
【００１４】
別の好ましい実施形態によると、本明細書に記載される結合ドメインは、Ｇｓタンパク質共役受容体およびＧｓタンパク質を含む複合体に、またはＧｉタンパク質共役受容体およびＧｉタンパク質を含む複合体に、またはＧｔタンパク質共役受容体およびＧｔタンパク質を含む複合体に、またはＧｇｕｓｔタンパク質共役受容体およびＧｇｕｓｔタンパク質を含む複合体に、またはＧｚタンパク質共役受容体およびＧｚタンパク質を含む複合体に、またはＧｏｌｆタンパク質共役受容体およびＧｏｌｆタンパク質を含む複合体に、またはＧｑタンパク質共役受容体およびＧｑタンパク質を含む複合体に、またはＧ１２タンパク質共役受容体およびＧ１２タンパク質を含む複合体に、またはＧ１３共役受容体およびＧ１３タンパク質を含む複合体に対して作製されているおよび／または特異的に結合する。前記複合体に含まれるＧＰＣＲおよび／またはＧタンパク質は、同じまたは異なる種由来、特に哺乳類種由来でもよい。好ましくは、ＧＰＣＲはヒトタンパク質である。
【００１５】
一般に、本発明の結合ドメインは、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に特異的に結合することができるいかなる天然に存在しない分子またはその部分であっても可能である。特に、本明細書に記載される結合ドメインは、以下の式（１）：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（１）
に従って、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含むアミノ酸配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインである。
【００１６】
好ましくは、本明細書に記載される結合ドメインは、ラクダ科の種由来の免疫グロブリン単一可変ドメインであり、特にナノボディまたはＶＨＨである。
【００１７】
特定の実施形態によると、本明細書に記載される結合ドメインは、以下の式（１）：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（１）
に従って、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含むアミノ酸配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインであり、ＣＤＲ１は
ａ）配列番号１３−１８、
ｂ）配列番号１３−１８と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
ｃ）配列番号１３−１８と３つ、２つまたは１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド
からなる群から選択され、ＣＤＲ２は
ａ）配列番号２５−３０、
ｂ）配列番号２５−３０と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
ｃ）配列番号２５−３０と３つ、２つまたは１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド
からなる群から選択され、ＣＤＲ３は
ａ）配列番号３７−４２、
ｂ）配列番号３７−４２と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
ｃ）配列番号３７−４２と３つ、２つまたは１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド
からなる群から選択される。
【００１８】
特に好ましい実施形態では、本発明は、以下の式（１）：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（１）
に従って、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲ１は配列番号１３、ＣＤＲ２は配列番号２５、ＣＤＲ３は配列番号３７であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【００１９】
極めて特定の実施形態によると、結合ドメイン、特に免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号１から６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００２０】
さらに、本明細書に記載される結合ドメインはポリペプチドに含まれていてもよい。その上、前記結合ドメインは固体支持体上に固定化されていてもよい。
【００２１】
一特定の態様では、本発明はＧタンパク質に対して作製されたおよび／または特異的に結合する結合ドメインに関する。
【００２２】
本発明の別の態様は、本明細書に記載される結合ドメインを含む複合体を想定している。特に、前記複合体は、ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質および場合によって受容体リガンドを含む。ある種の適用では、本明細書に記載される前記複合体は結晶である。
【００２３】
さらに、本発明は、核酸配列、特に本明細書に記載される結合ドメインのうちのいずれかの任意のアミノ酸配列をコードする核酸配列、ならびに本明細書に記載される核酸配列のうちのいずれかを含む組換えベクターを提供する。本発明の特に好ましい態様は、本明細書に記載されるベクターまたは核酸のいずれかを含み、したがってＧＰＣＲおよび／またはＧタンパク質を発現することがあるまたは発現することができる細胞である。本発明に従った細胞の細胞培養物ならびにそれに由来する膜調製物も本発明の範囲内である。
【００２４】
本明細書に記載される結合ドメイン、複合体および細胞は、種々の文脈および適用において有用であり得る。このように、したがって、本発明の一態様は、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質、ならびに場合によって受容体リガンドを含む複合体を、機能的な立体構造状態で、さらに具体的には活性な立体構造状態で安定化するための本明細書に記載される結合ドメインの使用に関する。一特定の実施形態では、本明細書に記載される結合ドメインを使用して、ヌクレオチド、特にグアニンヌクレオチドまたはＧＴＰγＳなどのそのアナログの存在下で前記複合体の解離を防ぐことができる。したがって、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体を安定化し、ＧＰＣＲを機能的な立体構造状態、好ましくは活性な立体構造状態で遮断するためのツールとしての結合ドメインは、今後概要を述べるように、一定範囲の適用に非常に有用である。
【００２５】
ＧＰＣＲおよびＧタンパク質、ならびに場合によって受容体リガンドを含む複合体を結晶化するおよび／または前記複合体の構造を解明することが、本明細書に記載される結合ドメインの使用に対する本発明の目的である。
【００２６】
本明細書に記載される結合ドメインまたは本明細書に記載される細胞もしくはそれに由来する膜調製物を使用して、ＧＰＣＲのシグナル伝達活性を調節する化合物についてスクリーニングすることも本発明の範囲内で想定されている。
【００２７】
さらに、本明細書に記載される結合ドメインを使用して、１つ以上の相互作用をするタンパク質、特にＧタンパク質とおよび／またはＧＰＣＲと相互作用するタンパク質を捕捉し得る。
【００２８】
特定の実施形態によると、本発明はＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含む複合体を捕捉および／または精製する方法であって、
ａ）本明細書に記載される結合ドメインを用意する段階、
ｂ）前記結合ドメインをＧＰＣＲおよびＧタンパク質ならびに場合によって受容体リガンドを含む複合体に結合させる段階、ならびに
ｃ）場合によって、段階ｂ）において形成される複合体を単離する段階
を含む方法を提供する。
【００２９】
別の特定の実施形態では、本発明は、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含む複合体の結晶構造を決定する方法であって、
ａ）本明細書に記載される結合ドメインを用意する段階、
ｂ）前記結合ドメインをＧＰＣＲおよびＧタンパク質ならびに場合によって受容体リガンドを含む複合体に結合させる段階、ならびに
ｃ）段階ｂ）において形成される複合体を結晶化する段階
を含む方法に関する。
【００３０】
本明細書に記載される結合ドメインの一部は治療上の有用性を有し得る。したがって、本明細書に記載される結合ドメインを使用してＧＰＣＲ受容体シグナル伝達、特にＧタンパク質媒介ＧＰＣＲ受容体シグナル伝達を調節することも本発明の目的である。
【００３１】
本発明は、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含む複合体に対して作製されたおよび／または特異的に結合する結合ドメインを産生する方法であって、
ａ）適切な細胞発現系において本明細書に記載される核酸を発現させる段階、ならびに場合によって
ｂ）前記結合ドメインを単離および／または精製する段階
を含む方法をさらに包含する。
【００３２】
本発明の別の態様は、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含む複合体に対して作製されたおよび／または特異的に結合する結合ドメインについてスクリーニングする方法であって、
ａ）複数の結合ドメインを用意する段階、
ｂ）ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含む複合体に結合する結合ドメインについて前記複数の結合ドメインをスクリーニングする段階、ならびに
ｃ）前記複合体に結合する結合ドメインを単離する段階
を含む方法に関する。
【００３３】
本発明の他の目的は、本明細書における記載からさらに明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ａ）β２ＡＲ：Ｇｓ複合体に対するＧタンパク質サイクルを示す図である。細胞外アゴニストがβ２ＡＲに結合すると、膜貫通セグメントの細胞質末端が立体構造的に再配置され、Ｇｓヘテロ三量体（α、βおよびγ）が受容体（Ｒ、Ｒ＊）に結合できるようになる。ＧＤＰは、Ｒ：Ｇ複合体が形成されるとαサブユニットから放出される。ＧＴＰは無ヌクレオチドαサブユニットに結合して、αおよびβγサブユニットが受容体から解離する。前記サブユニットはそのそれぞれのエフェクタータンパク質のアデニリルサイクラーゼ（ＡＣ）およびＣａ２＋チャネルを調節する。Ｇｓヘテロ三量体は、αサブユニットにおけるＧＴＰのＧＤＰへの加水分解に続いてαおよびβγサブユニットから再構成される。ｂ）β２ＡＲ：Ｇｓ複合体に対するＧタンパク質サイクルを示す図である。精製された無ヌクレオチドβ２ＡＲ：Ｇｓタンパク質複合体は界面活性剤ミセル中に維持される。Ｇｓαサブユニットは２つのドメイン、Ｒａｓドメイン（αＲａｓ）とαヘリックスドメイン（αＡＨ）からなる。両方ともヌクレオチド結合に関与している。無ヌクレオチド状態では、αＡＨドメインはαＲａｓドメインに対して様々な位置を有する。
【図２】安定なβ２ＡＲ：Ｇｓ複合体の形成を示す図である。安定なβ２ＡＲ：Ｇｓ複合体は、１）高親和性アゴニストを受容体に極めて遅い解離速度で結合させる（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２０１１年に記載される）；２）放出されたＧＤＰを加水分解するアピラーゼの存在下で無ヌクレオチド複合体を形成し、ＧＤＰが再結合してＲ：Ｇ相互作用の安定性が低下するのを防ぐ；および３）ＤＤＭをＭＮＧ−３に界面活性剤交換して前記複合体を安定化する、の併用効果により達成された。
【図３−１】ａ）β２ＡＲ：Ｇｓ複合体の安定性に対するヌクレオチドアナログ、ｐＨおよびナノボディの効果を示す図である。分析的ゲル濾過は、ヌクレオチドＧＤＰおよびＧＴＰγＳ（０．１ｍＭ）がβ２ＡＲ−３６５：Ｇｓ複合体の解離を引き起こすことを示している。ｂ）β２ＡＲ：Ｇｓ複合体の安定性に対するヌクレオチドアナログ、ｐＨおよびナノボディの効果を示す図である。リン酸のピロリン酸およびホスカルネット（５ｍＭで使用）がヌクレオチドリン酸基に類似していることは複合体の崩壊を引き起こさなかった。リン酸のピロリン酸およびホスカルネットは、Ｔ４Ｌ−β２ＡＲ：Ｇｓ複合体（ナノボディなし）、Ｔ４Ｌ−β２ＡＲ：Ｇｓ：Ｎｂ３７およびＴ４Ｌ−β２ＡＲ：Ｇｓ：Ｎｂ３５の両方の結晶成長を改善したので添加物としての役割を果たした。
【図３−２】ｃ）β２ＡＲ：Ｇｓ複合体の安定性に対するヌクレオチドアナログ、ｐＨおよびナノボディの効果を示す図である。結晶化スクリーンの調製を導くためにｐＨ限界が決定された。同じ目的で、イオン強度の効果（データは示されず）は、ＮａＣｌを様々な濃度で使用して決定された。前記複合体は２０、１００および５００ｍＭでは安定であるが、２．５Ｍ  ＮａＣｌでは解離する。
【図３−３】ｄ）β２ＡＲ：Ｇｓ複合体の安定性に対するヌクレオチドアナログ、ｐＨおよびナノボディの効果を示す図である。ナノボディ３５（Ｎｂ３５、赤破線）はＴ４Ｌ−β２ＡＲ：Ｇｓ：Ｂｌ１６７１０７三元複合体（青実線）に結合して、処理されたＲ：Ｇ複合体（緑破線）とは対照的に、ＧＴＰγＳ処理（緑実線）に非感受性であるＲ：Ｇ：Ｎｂ３５複合体（赤実線）を形成する。Ｎｂ３５およびＮｂ３７はＧｓヘテロ三量体上の別々のエピトープに結合してＲ：Ｇ：Ｎｂ３５：Ｎｂ３７複合体（紫実線）を形成する。
【図３−４】ｅ）β２ＡＲ：Ｇｓ複合体の安定性に対するヌクレオチドアナログ、ｐＨおよびナノボディの効果を示す図である。ナノボディ３６（Ｎｂ３６、赤破線）はＲ：Ｇ複合体（黒実線）に結合して、ＧＴＰγＳ処理（緑実線）に感受性が低いＲ：Ｇ：Ｎｂ３６複合体（赤実線）を形成する。Ｎｂ３６およびＮｂ３７はＧｓヘテロ三量体上の別々のエピトープに結合して、Ｒ：Ｇ：Ｎｂ３６：Ｎｂ３７複合体（紫実線）を形成する。
【図３−５】ｆ）β２ＡＲ：Ｇｓ複合体の安定性に対するヌクレオチドアナログ、ｐＨおよびナノボディの効果を示す図である。ナノボディ３７（Ｎｂ３７、緑線）はＲ：Ｇ複合体（黒実線）に結合してＲ：Ｇ：Ｎｂ３７複合体（赤実線）を形成する。ｇ）β２ＡＲ：Ｇｓ複合体の安定性に対するヌクレオチドアナログ、ｐＨおよびナノボディの効果を示す図である。Ｒ：Ｇ：Ｎｂ３７複合体は、処理されたＲ：Ｇ複合体（青破線）とは対照的にＧＴＰγＳ処理（青実線）に非感受性である。
【図４】ａ）Ｒ：Ｇ複合体に対するＭＮＧ−３の安定化効果を示す図である。４℃での４８時間のインキュベーションに続いて、ＤＤＭ（黒）、ＭＮＧ−３（青）または２つのＭＮＧ−３アナログ（赤および緑）において精製されたβ２ＡＲ−３６５：Ｇｓ複合体の分析的ゲル濾過。ＤＤＭとは対照的に、Ｒ：Ｇ複合体はＭＮＧ界面活性剤中では安定している。ｂ）Ｒ：Ｇ複合体に対するＭＮＧ−３の安定化効果を示す図である。３Ｈ−ジヒドロアルプレノロール（３Ｈ−ＤＨＡ）飽和結合によりアッセイされた場合の、界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）より下でのＤＤＭまたはＭＮＧ−３におけるリガンド非結合精製β２ＡＲを希釈する効果。ＤＤＭにおいて維持されるβ２ＡＲをＣＭＣの１０００分の１未満に希釈すると２０秒後に３Ｈ−ＤＨＡ結合（黒データ点）が失われる。これとは対照的にＣＭＣの１０００分の１未満に希釈されたＭＮＧ−３におけるβ２ＡＲは２４時間後、放射性リガンドに結合する全能力を維持した。
【図５】Ｒ：Ｇ複合体の精製および均一性を示す図である。ａ）Ｔ４Ｌ−β２ＡＲ：Ｇｓ精製の種々の段階で得られる試料の分析的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシーブルー染色。過剰量のＧｓヘテロ三量体中でのＢｌ１６７１０７アゴニスト結合、脱リン酸化および脱グリコシル化受容体は、Ｇタンパク質の機能的部分との最適結合効率のために使用される。Ｇｓの機能的精製は、非機能的／非結合Ｇｓは洗い流される一方でＭ１樹脂上に固定化された受容体とのその相互作用を通じて実現される。ｂ）４つの連続調製用ゲル濾過のうちの１つの代表的溶出プロファイル、分画は赤で示されている。Ｒ：Ｇ複合体を含有する画分は指示された破線内にプールされ、スピン濃縮され、ｃ）におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシーブルー（ａ、右側から２番目のレーン）、ゲル濾過によりおよびｄ）における陰イオン交換クロマトグラフィーにより純度および均一性について解析された。上パネルは、脱リン酸化されず不均一な調製物を生じる複合体（下パネル）と比べて、複合体形成に先立ってλＰＰａｓｅで処理されたβ２ＡＲ−３６５：Ｇｓ複合体の分析的ＩＥＣからの溶出プロファイルを示す。ｂ）における指示された破線外の画分内の均一性が低い材料は、様々な化学物質の存在下でのＲ：Ｇ複合体の分析的ゲル濾過実験のために使用された（図１の例）。
【図６】Ｎｂ３５を用いてＲ：Ｇ複合体を調製するための精製手順のフローチャートを示す図である。
【図７】ａ）Ｎｂ３５の精製およびＲ：Ｇ：Ｎｂ混合率の決定を示す図である。ナノボディ３５（Ｎｂ３５）のニッケル親和性クロマトグラフィー精製に続く分取イオン交換クロマトグラフィー。ナノボディは２つの集団（赤で示す）中に小ピークおよび大均一ピークとして溶出され、収集され、スピン濃縮され、（ｂ）に示されるＲ：Ｇ複合体を用いた適切な混合率の決定に続く結晶学のために使用された。ｂ）Ｎｂ３５の精製およびＲ：Ｇ：Ｎｂ混合率の決定を示す図である。アゴニスト結合Ｔ４Ｌ−β２ＡＲ：Ｇｓ複合体は、そのタンパク質濃度に基づいてわずかに過剰のＮｂ３５（１から１．２のモル比のＲ：Ｇ複合体対Ｎｂ３５）と混合され、分析的ゲル濾過により確かめられた。
【図８】スポンジ様中間相におけるＴ４Ｌ−β２ＡＲ：Ｇｓ：Ｎｂ３５複合体の結晶を示す図である。
【図９−１】ａ）β２ＡＲ：Ｇｓ複合体の全体構造を示す図である。複合体の格子パッキングは、結晶内の受容体とＧタンパク質の交互層を示している。大量の接触は水層内のタンパク質間で形成されている。ｂ）β２ＡＲ：Ｇｓ複合体の全体構造を示す図である。非対称ユニット内容物の全体構造は、β２ＡＲ（緑）がアゴニスト（黄球体）に結合し、Ｇｓα（橙）との広範な相互作用に関与していることを示している。ＧαｓはＧβ（青緑）およびＧγ（紫）と一緒にヘテロ三量体Ｇタンパク質Ｇｓを構成している。Ｇｓ結合ナノボディ（Ｎｂ３５、赤）はαとβサブユニット間のＧタンパク質に結合している。ナノボディ（Ｎｂ３５）は、β２ＡＲのアミノ末端に融合されたＴ４リゾチーム（紫紅色）と同様に、結晶化を促進する。
【図９−２】ｃ）β２ＡＲ：Ｇｓ複合体の全体構造を示す図である。生物学的複合体が結晶化を省くことは助けとなり、細胞膜内でのその位置および配向を示す。
【図１０】ａ）Ｂｌ−１６７１０７結合Ｔ４Ｌ−β２ＡＲ：Ｇｓ：Ｎｂ３５複合体内でのＮｂ３５とＧｓの相互作用を示す図である。Ｎｂ３５（赤）のＣＤＲ１（空間充填表示）とＧβ（空間充填、青緑）の相互作用についての２つの代表的表示。ｂ）Ｂｌ−１６７１０７結合Ｔ４Ｌ−β２ＡＲ：Ｇｓ：Ｎｂ３５複合体内でのＮｂ３５とＧｓの相互作用を示す図である。Ｎｂ３５（赤）のＣＤＲ３（空間充填表示）とＧαＳ（空間充填、橙）およびＧβ（空間充填、青緑）の相互作用についての２つの代表的表示。ＧαＳおよびＧβとの相互作用により、Ｎｂ３５は複合体の立体構造柔軟性を減少することがある。ｃ）Ｂｌ−１６７１０７結合Ｔ４Ｌ−β２ＡＲ：Ｇｓ：Ｎｂ３５複合体内でのＮｂ３５とＧｓの相互作用を示す図である。Ｎｂ３５（空間充填表示、赤）のフレームワーク領域とＧαＳ（橙）の相互作用についての２つの代表的表示。
【図１１】ａ）隣接する複合体のＮｂ３５とＧαＳサブユニット間の結晶接触を示す図である。−ｘ，ｙ−１／２，−ｚ＋１対称関連複合体のＮｂ３５（赤、空間充填表示）およびＧαＳ（橙）を伴う結晶接触。ｂ）隣接する複合体のＮｂ３５とＧαＳサブユニット間の結晶接触を示す図である。ｘ，ｙ−１，ｚ対称関連複合体のＮｂ３５（赤、空間充填表示）およびＧαＳ（橙）を伴う結晶接触。
【図１２−１】ａ）活性および不活性β２ＡＲ構造の比較を示す図である。不活性カラゾロール結合β２ＡＲ構造（青、Ｒｏｓｅｎｂａｕｍら、２００７年）と比べたβ２ＡＲ：Ｇｓ構造（緑）の側面図および細胞質図。ＴＭ５およびＴＭ６の細胞内ドメインについては著しい構造変化が見られる。ＴＭ５は２つの螺旋回転により拡張しており、ＴＭ６は、２つの構造においてＧｌｕ２６８（黄色矢印）のα炭素で測定した場合１４Å外側に移動している。ｂ）活性および不活性β２ＡＲ構造の比較を示す図である。ナノボディ安定化している活性状態β２ＡＲ：Ｎｂ８０構造（橙、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２０１１年）と比べたβ２ＡＲ：Ｇｓ。
【図１２−２】ｃ）活性および不活性β２ＡＲ構造の比較を示す図である。細胞質側から見たＥ／ＤＲＹおよびＮＰｘｘＹモチーフにおける残基ならびにβ２ＡＲ：Ｇｓおよびβ２ＡＲ：Ｎｂ８０構造の他のキーとなる残基の位置。β２ＡＲ：Ｎｂ８０構造中でナノボディと相互作用するＡｒｇ１３１を除いて、すべての残基が極めて類似する位置を占めている。
【図１３−１】ａ）Ｒ：Ｇ界面における残基の電子密度の図である。ＴＭ３の細胞質末端のＤ／ＥＲＹモチーフ。電子密度マップは１シグマで輪郭を描いた２Ｆｏ−Ｆｃマップである。ｂ）Ｒ：Ｇ界面における残基の電子密度の図である。Ｅ／ＤＲＹモチーフのＡｒｇ１３１とＣ末端ＧαＳのＴｙｒ３９１間のパッキング相互作用。電子密度マップは１シグマで輪郭を描いた２Ｆｏ−Ｆｃマップである。ｃ）Ｒ：Ｇ界面における残基の電子密度の図である。ＴＭ７の細胞質末端のＮＰｘｘＹ。電子密度マップは１シグマで輪郭を描いた２Ｆｏ−Ｆｃマップである。
【図１３−２】ｄ）Ｒ：Ｇ界面における残基の電子密度の図である。Ｔｈｒ６８およびＴｙｒ１４１のＥ／ＤＲＹモチーフのＡｓｐ１３０との相互作用。ＩＬ２のＰｈｅ１３９はＧαＳ中の疎水性ポケットに埋もれている。電子密度マップは１シグマで輪郭を描いた２Ｆｏ−Ｆｃマップである。ｅ）Ｒ：Ｇ界面における残基の電子密度の図である。ヌクレオチド結合に関与しているＧαＳのβ１−α１ループ（Ｐ−ループ）。電子密度マップは１シグマで輪郭を描いた２Ｆｏ−Ｆｃマップである。
【図１４】ａ）受容体：Ｇタンパク質相互作用を示す図である。ＧαＳのα５ヘリックスは、膜貫通型へリックス５および６の開口により受容体の細胞内側上に形成された空洞に入り込む。膜貫通コア内では、相互作用は主に非極性である。例外は、ＴＭ３における保存されたＤＲＹ配列のＡｒｇ１３１に対するα５ヘリックスのＴｙｒ３９１のパッキングを含む（図１３も参照）。Ａｒｇ１３１も、ＴＭ７における保存されたＮＰｘｘＹ配列のＴｙｒに対して詰め込まれる。ｂ）受容体：Ｇタンパク質相互作用を示す図である。ＧαＳのα５ヘリックスは、膜貫通型へリックス５および６の開口により受容体の細胞内側上に形成された空洞に入り込む。α５ヘリックスは、受容体から抜けると、ＴＭ５およびＴＭ３との極性相互作用のネットワークを形成する。ｃ）受容体：Ｇタンパク質相互作用を示す図である。受容体残基のＴｈｒ６８およびＡｓｐ１３０はＴｙｒ１４１を介してβ２ＡＲのＩＬ２ヘリックスと相互作用し、受容体のＰｈｅ１３９がＧタンパク質表面上の疎水性ポケットに入り込み、それによって受容体−Ｇタンパク質相互作用をβ２ＡＲの高度に保存されたＤＲＹモチーフに構造的に連結するように、前記ヘリックスを配置する。
【図１５】ａ）ＧαＳの立体構造変化を示す図である。β２ＡＲ：Ｇｓ複合体中のＧαＳ（橙）のＧＴＰγＳ結合ＧαＳ（灰色）との比較（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＡＺＴ；Ｓｕｎａｈａｒａら、１９９７年）。ＧＴＰγＳは球体として示されている。Ｇαｓのヘリックスドメイン（ＧαｓＡＨ）は、ＧＴＰγＳ結合状態でのその位置と比べて劇的な移動を示している。ｂ）ＧαＳの立体構造変化を示す図である。Ｇαｓのα５−ヘリックスは回転され、β２ＡＲの方に移動され、そうでなければＧＴＰγＳ結合ポケットの一部を形成するβ６−α５ループを撹乱している。ｃ）ＧαＳの立体構造変化を示す図である。Ｇαｓのβ１−α１ループ（Ｐ−ループ）およびβ６−α５ループは、ＧＴＰγＳ−Ｇαｓ構造中のＧＴＰγＳのそれぞれリン酸およびプリン環と相互作用する。ｄ）ＧαＳの立体構造変化を示す図である。β１−α１およびβ６−α５ループは無ヌクレオチドβ２ＡＲ：Ｇｓ構造に再配置される。
【図１６】Ｎｂ３７がＧＴＰγＳのＧαｓへの結合を阻害することを示す図である。ボディパイ−ＧＴＰγＳ（１００ｎＭ）は１μＭの精製されたＧαｓと一緒にインキュベートされ、蛍光増加は漸増する濃度のＮｂ３７の存在下、リアルタイムで測定された。
【図１７】Ｎｂ３５はＧＴＰγＳのＧαｓへの結合に影響を与えないことを示す図である。ボディパイ−ＧＴＰγＳ（１００ｎＭ）は１μＭの精製されたＧαｓと一緒にインキュベートされ、蛍光増加は漸増する濃度のＮｂ３５の存在下、リアルタイムで測定された。
【図１８】Ｎｂ３５がＧＴＰγＳのＧｓαβγヘテロ三量体への結合を阻害することを示す図である。ボディパイ−ＧＴＰγＳ（１００ｎＭ）は１μＭの精製されたＧｓαβγヘテロ三量体と一緒にインキュベートされ、蛍光増加は漸増する濃度のＮｂ３５の存在下、リアルタイムで測定された。
【図１９】ａ）安定なＡＶＰ：ＮＴ４ＬＶ２Ｒ：Ｇｓ複合体の精製を示す図である。Ｎｉ−ＮＴＡ続いてＦＬＡＧ−タグ親和性精製を使用するＡＶＰ：ＮＴ４ＬＶ２Ｒ：Ｇｓ複合体の精製の略図。ｂ）安定なＡＶＰ：ＮＴ４ＬＶ２Ｒ：Ｇｓ複合体の精製を示す図である。親和性精製されたＡＶＰ：ＮＴ４ＬＶ２Ｒ：ＧｓのＳＥＣクロマトグラム。ｃ）安定なＡＶＰ：ＮＴ４ＬＶ２Ｒ：Ｇｓ複合体の精製を示す図である。精製スキームをモニターするＳＤＳ−ｐａｇｅ。レーン１：ＦＬＡＧ−タグ親和性カラムのフロースルー；レーン２：精製に先立つＡＶＰ、ＮＴ４ＬＶ２ＲおよびＧｓの混合物；レーン３：分子マーカー；レーン４：ＳＥＣから溶出したＡＶＰ：ＮＴ４ＬＶ２Ｒ：Ｇｓ複合体；レーン５：Ｎｉ−ＮＴＡ続いてＦＬＡＧ−タグ親和性精製後のＡＶＰ：ＮＴ４ＬＶ２Ｒ：Ｇｓ複合体。
【図２０】ＳＥＣによりモニターされるＡＶＰ：ＮＴ４ＬＶ２Ｒ：Ｇｓ複合体の安定性を示す図である。破線：氷上２４時間インキュベーション後のＡＶＰ：ＮＴ４ＬＶ２Ｒ：Ｇｓ複合体のＳＥＣクロマトグラム。青線：氷上４８時間インキュベーション後のＡＶＰ：ＮＴ４ＬＶ２Ｒ：Ｇｓ複合体のＳＥＣクロマトグラム。赤線：１０μＭのアンタゴニストＳＲ１２１４６３と一緒の前記複合体のインキュベーション後のＡＶＰ：ＮＴ４ＬＶ２Ｒ：ＧｓのＳＥＣクロマトグラム。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
定義
特定の実施形態に関して、特定の図面を参照しつつ本発明を説明するが、本発明は、これらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定されるものである。特許請求の範囲におけるいかなる引用符号も、範囲を限定するものとして解釈するべきではない。記載されている図面は模式的なものでしかなく、非限定的である。図面において、ある要素のサイズは誇張されている可能性があり、例証目的のスケールで描かれてはいない。本明細書および特許請求の範囲において、用語「含む」が用いられている場合、この用語は、他の要素または段階を除外しない。単数名詞について言及する際に不定冠詞または定冠詞（たとえば、「ａ」または「ａｎ」、「ｔｈｅ」）が用いられている場合、特に他の事柄の記載がない限り、これは該名詞の複数を包含する。その上、本明細書および特許請求の範囲における、第１、第２、第３等の用語は、類似の要素間を区別するために用いられており、必ずしも連続的または経時的な順を説明するために用いられていない。このように用いられる用語は、適切な状況下において互換的であり、本明細書に記載されている本発明の実施形態は、本明細書において記載または説明されている以外の順序で実施できることを理解されたい。
【００３６】
本明細書において他に定義がなされていなければ、本発明に関連して用いられている科学および技術用語および語句は、当業者によって一般に理解されている意味を持つ。一般に、本明細書に記載されている、分子および細胞生物学、遺伝学、タンパク質、核酸化学およびハイブリダイゼーションに関連して用いられている命名法ならびにその技法は、本技術分野において周知のものであり、一般に用いられている。本発明の方法および技法は、一般に、他に断りがなければ、本技術分野において周知の、本明細書を通じて引用、記述されている様々な一般的な参考文献およびより具体的な参考文献に記載されている従来の方法に従って実施される。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２、および２００２の別冊号）を参照されたい。
【００３７】
用語「結合ドメイン」または「タンパク質結合ドメイン」は、特異的分子間相互作用を用いてタンパク質またはペプチドと結合することができる、任意の非天然起源の分子またはその部分を一般に意味する。タンパク質性分子（タンパク質、ペプチド、タンパク質様またはタンパク質含有）、核酸分子（核酸、核酸様、核酸含有）および炭水化物分子（炭水化物、炭水化物様、炭水化物含有）等が挙げられるが、これらに限定されない様々な分子が、タンパク質結合ドメインとして機能し得る。本明細書においてより詳細な説明をさらに見出すことができる。
【００３８】
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、「ペプチド」は、本明細書において互換的に用いられており、コードされたおよびコードされていないアミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸および修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドを包含し得る、任意の長さのアミノ酸のポリマー型を意味する。
【００３９】
本明細書において、用語「タンパク質複合体」または単に「複合体」は、２以上の会合したポリペプチド鎖の群を意味する。タンパク質複合体におけるタンパク質は、非共有結合性タンパク質−タンパク質相互作用により連結されている。「四次構造」は、タンパク質複合体における会合し折り畳まれたタンパク質の構造的配置である。前記複合体は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれよりも多いポリペプチドを含む多量体複合体でもよいことは理解される。その上、前記複合体は非タンパク質性分子をさらに含んでいてもよい。
【００４０】
本明細書において、用語「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」、「ポリ核酸」、「核酸」は、互換的に用いられ、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかまたはそれらのアナログである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー型を意味する。ポリヌクレオチドは、いかなる三次元構造であってもよく、公知または未知のいかなる機能を果たし得る。ポリヌクレオチドの非限定的な例として、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、調節領域、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーが挙げられる。核酸分子は、直鎖状であっても環状であってもよい。
【００４１】
本明細書において、用語「リガンド」または「受容体リガンド」は、細胞内または細胞外のいずれかにおいてＧＰＣＲと特異的に結合する分子を指す。リガンドは、タンパク質、（ポリ）ペプチド、脂質、小分子、タンパク質スキャフォールド、抗体、抗体断片、核酸、炭水化物でよいが、これらに制限する目的はない。リガンドは、合成であっても天然起源であってもよい。用語「リガンド」は、自然のＧＰＣＲに対する内在性の天然リガンドである、「自然のリガンド」を包含する。ほとんどの場合、リガンドは、細胞において発現されたＧＰＣＲと接触、たとえば、結合したときに、細胞内応答を増加または減少させる「修飾因子」である。修飾因子であるリガンドの例は、アゴニスト、部分アゴニスト、インバースアゴニストおよびアンタゴニストを包含するが、これらは、本明細書においてより詳細な説明をさらに見出すことができる。
【００４２】
タンパク質の用語「立体構造」または「立体構造状態」は、タンパク質が、任意の瞬間において形をとり得る構造の範囲を一般に意味する。当業者であれば、立体構造または立体構造状態の決定因子が、タンパク質のアミノ酸配列（修飾アミノ酸を包含する）に反映されるタンパク質の一次構造およびタンパク質を取り巻く環境を包含することを認識する。タンパク質の立体構造または立体構造状態は、タンパク質二次構造（たとえば、とりわけα−ヘリックス、β−シート）、三次構造（たとえば、ポリペプチド鎖の三次元フォールディング）および四次構造（たとえば、ポリペプチド鎖と他のタンパク質サブユニットとの相互作用）等の構造的特色にも関する。とりわけリガンド結合、リン酸化、硫酸化、糖鎖付加または疎水性基の付着等、ポリペプチド鎖に対する翻訳後および他の修飾は、タンパク質の立体構造に影響し得る。その上、とりわけ周囲の溶液のｐＨ、塩濃度、イオン強度および浸透圧ならびに他のタンパク質および補助因子との相互作用等の環境要因が、タンパク質立体構造に影響を及ぼし得る。タンパク質の立体構造状態は、活性もしくは別の分子との結合の機能アッセイまたは他の方法の中でもＸ線結晶構造解析、ＮＭＲもしくはスピン標識等の物理的方法のいずれかによって決定され得る。タンパク質立体構造および立体構造状態の総合的な考察のため、Ｃａｎｔｏｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第Ｉ部：Ｔｈｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８０およびＣｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９３を参照されたい。「特異的立体構造」または「特異的立体構造状態」は、タンパク質が形をとり得る立体構造または立体構造状態の範囲の任意のサブセットである。
【００４３】
本明細書における「機能的立体構造」または「機能的立体構造状態」は、タンパク質が、ダイナミックレンジ、特に活性なしから最大活性にわたる活性を有する様々な立体構造状態を保有するとの事実を意味する。機能的立体構造状態の例には、活性立体構造および不活性立体構造が含まれる。「機能的立体構造状態」とは、活性がないことを含むいかなる活性でも有するＧＰＣＲの任意の立体構造状態を含めることを意図されており、タンパク質の変性状態を含めることは意図されていないのは明らかであるはずである。ここで想定されている特定のクラスの機能的立体構造とは「新薬の開発につながる立体構造」であり、一般には、標的タンパク質の独自の治療関連立体構造状態のことである。実例として、β２アドレナリン受容体の活性立体構造は、喘息の治療のためのこの受容体の新薬の開発につながる立体構造に対応する。したがって、新薬の開発につながることは、治療徴候に応じて特定の立体構造に限定されることは理解される。
【００４４】
ＧＰＣＲの機能的立体構造（本明細書において定義されている）に関する表現「ロックする」または「トラップする」または「固定する」または「凍結する」とは、本明細書で使用される場合、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体と本発明に従った結合ドメインとの相互作用の効果のため、他に仮定され得る可能な立体構造のサブセットにおけるＧＰＣＲの保持または維持である。したがって、「立体構造的にトラップされた」または「立体構造的に固定された」または「立体構造的にロックされた」いるまたは「立体構造的に凍結された」タンパク質は、本明細書で使用される場合、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体と本発明に従った結合ドメインとの相互作用の効果のせいで、他に仮定され得る可能な立体構造のサブセットにおいて維持されたタンパク質である。この文脈内では、タンパク質の特定の立体構造または立体構造状態に特異的にまたは選択的に結合する結合ドメインとは、前記タンパク質に仮定し得る他の立体構造または立体構造状態よりも高い親和性で立体構造または立体構造状態のサブセットにおけるタンパク質と結合する結合ドメインのことである。当業者であれば、タンパク質の特定の立体構造または立体構造状態に特異的にまたは選択的に結合する結合ドメインはこの特定の立体構造または立体構造状態を安定化することになることは認識される。
【００４５】
本明細書において、抗体の文脈における用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、Ｈ（重）またはＬ（軽）鎖（それぞれＶＨおよびＶＬとも略される）いずれかの可変領域を意味し、抗原標的と特異的に結合することができるアミノ酸配列を含有する。これらのＣＤＲ領域は、抗体の特定の抗原決定基構造に対する基礎特異性の原因となる。このような領域は、「高頻度可変領域」とも称される。ＣＤＲは、可変領域内のアミノ酸の非近接なストレッチを表すが、生物種にかかわらず、可変重および軽鎖領域内のこれらの重大な意味を持つアミノ酸配列の位置的配置は、可変鎖のアミノ酸配列内において同様の配置を有することが判明した。あらゆる標準的抗体の可変重および軽鎖はそれぞれ、個々の軽（Ｌ）および重（Ｈ）鎖毎に、それぞれ互いに非近接である３個のＣＤＲ領域（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３と称する）を有する。特に、ナノボディ（本明細書でさらに定義される）などの免疫グロブリン単一可変ドメインは、一般に４つの「フレームワーク配列もしくは領域」またはＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と呼ばれる）および３つの「相補性決定領域」またはＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれる）を含み、それぞれその他とは隣接していない単一アミノ酸鎖を含む。ＣＤＲ配列の描写（したがってまたＦＲ配列の描写）は、Ｖ−ドメインおよびＶ様ドメインのＩＭＧＴ独自の番号方式に基づく（Ｌｅｆｒａｎｃら、２００３）。
【００４６】
本明細書における「エピトープ」は、ポリペプチドの抗原決定基を意味する。エピトープは、該エピトープ独特の空間的立体構造における３個のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも４、５、６、７個のこのようなアミノ酸からなり、さらに通常は、少なくとも８、９、１０個のこのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的立体構造を決定する方法は、本技術分野において公知のものであり、たとえば、Ｘ線結晶構造解析および多次元核磁気共鳴を包含する。
【００４７】
本明細書における「立体構造エピトープ」は、ポリペプチドの折り畳まれた三次元立体構造に独特である、空間的な立体構造におけるアミノ酸を含むエピトープを意味する。一般に、立体構造エピトープは、タンパク質の折り畳まれた構造において一体となる、直鎖状配列において非連続的なアミノ酸からなる。しかし、立体構造エピトープはまた、ポリペプチドの折り畳まれた三次元立体構造に独特の立体構造の形をとる（変性状態には存在しない）アミノ酸の直鎖状配列からなる。タンパク質複合体において、立体構造エピトープは、異なる折り畳まれたポリペプチドのフォールディングおよび独自の四次構造におけるそれらの会合により一体となる、１つまたは複数のポリペプチドの直鎖状配列における非連続的なアミノ酸からなる。ここで同様に、立体構造エピトープはまた、一体となって四次構造に独特の立体構造の形をとる、１つまたは複数のポリペプチドのアミノ酸の直鎖状配列からなる可能性がある。
【００４８】
用語「特異性」とは、本明細書で使用される場合、結合ドメイン、特に抗体などの免疫グロブリンまたはナノボディなどの免疫グロブリン断片が異なる抗原に対比して１つの抗原に優先的に結合する能力のことであり、必ずしも高親和性（本明細書でさらに定義される）を意味しない。特定の抗原または抗原決定基（たとえば、エピトープ）に特異的に結合することができるおよび／またはこれらに対する親和性を有する結合ドメイン、特に抗体などの免疫グロブリンまたはナノボディなどの免疫グロブリン断片は、前記抗原または抗原決定基に「対する」または「対して作製されている」と言われる。本発明に従った結合ドメインは、それがこれら両方の異なる抗原または抗原決定基に対して特異的である場合には、２つの異なる抗原または抗原決定基に「交差反応的」であると言われる。
【００４９】
本明細書における用語「親和性」は、抗原および結合ドメインの平衡状態をその結合によって形成される複合体の存在に向かってシフトさせるような、結合ドメイン、特に抗体等の免疫グロブリンまたはナノボディ等の免疫グロブリン断片が抗原と結合する程度を意味する。よって、たとえば、相対的に等濃度の抗原および抗体（断片）が組み合わされる場合、高親和性の抗体（断片）は、利用できる抗原と結合して、その結果生じる高濃度の複合体に向けて平衡状態をシフトさせる。解離定数は、タンパク質結合ドメインおよび抗原標的の間の親和性を説明するよう一般に用いられる。通例、解離定数（Ｋｄ）は、１０−５Ｍよりも低い。好ましくは、解離定数は、１０−６Ｍよりも低く、より好ましくは、１０−７Ｍよりも低い。もっとも好ましくは、解離定数は、１０−８Ｍよりも低い。
【００５０】
本明細書における用語「特異的に結合」および「特異的結合」は、結合ドメイン、特に、抗体等の免疫グロブリンまたはナノボディ等の免疫グロブリン断片の、異なる抗原の均一な混合物に存在する特定の抗原と優先的に結合する能力を一般に意味する。ある特定の実施形態において、特異的結合相互作用は、試料における望ましいおよび望ましくない抗原の間を識別し、一部の実施形態において、約１０倍超から１００倍以上（たとえば、約１０００または１０，０００倍超）で識別する。
【００５１】
用語「特異的に結合」、「選択的に結合」、「優先的に結合」およびそれらの文法的な均等語は、本明細書において互換的に用いられる。用語「立体構造特異的」または「立体構造選択的」も、本明細書において互換的に用いられる。
【００５２】
「欠失」は、それぞれ１つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオチド残基が、親ポリペプチドまたは核酸のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して存在しない、アミノ酸またはヌクレオチド配列のいずれかにおける変化として本明細書において定義されている。タンパク質またはその断片の文脈において、欠失は、約２、約５、約１０、最大約２０、最大約３０または最大約５０以上のアミノ酸の欠失に関与し得る。タンパク質またはその断片は、２以上の欠失を含有し得る。ＧＰＣＲの文脈において、欠失は、特にループ欠失であっても、Ｎおよび／またはＣ末端欠失であってもよい。
【００５３】
「挿入」または「付加」は、親タンパク質のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較した、それぞれ１つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオチド残基の付加をもたらした、アミノ酸またはヌクレオチド配列における変化である。「挿入」は、ポリペプチドのアミノ酸配列内部への１つまたは複数のアミノ酸残基への付加を一般に意味するが、一方、「付加」は、挿入となることができる、またはＮもしくはＣ末端または両末端に付加されたアミノ酸残基を意味し得る。タンパク質またはその断片の文脈において、挿入または付加は、通常、約１、約３、約５、約１０、最大約２０、最大約３０または最大約５０以上のアミノ酸の挿入または付加である。タンパク質またはその断片は、２以上の挿入を含有し得る。
【００５４】
本明細書における「置換」は、親タンパク質またはその断片のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較した、それぞれ異なるアミノ酸またはヌクレオチドによる１つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオチドの置き換えに起因する。タンパク質またはその断片が、タンパク質の活性における効果が実質的にない保存的アミノ酸置換を有し得ることが理解される。保存的置換は、ｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ；ｃｙｓ、ｍｅｔ；およびｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ等、所望の組合せによるものである。
【００５５】
本明細書で使用される用語「配列同一性」とは、配列が比較の窓にわたりヌクレオチド対ヌクレオチドベースでまたはアミノ酸対アミノ酸ベースで同一である程度のことである。したがって、「配列同一性の百分率」は、比較の窓にわたり２つの最適に整列された配列を比較し、同一の核酸塩基（たとえば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（たとえば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が両方の配列に存在する位置の数を決定して適合する位置の数を得、適合する位置の数を比較の窓における全位置数（すなわち、窓サイズ）で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることにより計算される。配列同一性の百分率を決定することは手動で、または当技術分野で利用可能であるコンピュータプログラムを利用して行うことが可能である。
【００５６】
本明細書における「結晶」または「結晶構造」は、その構成原子、分子またはイオンが３つの空間的次元すべてに広がって整然と反復したパターンに配置された固体材料を意味する。液体または液体に溶解された材料から結晶構造を形成するプロセスは、多くの場合、「結晶化」または「結晶生成」と称される。タンパク質結晶は、ほとんどの場合、溶液において成長する。もっとも一般的なアプローチは、その構成分子の溶解性を徐々に低くすることである。溶液における結晶成長は、２段階によって特徴付けられる。すなわち、顕微鏡レベルの結晶子（恐らく１００分子しかない）の核形成と、続く、該結晶子の理想的には回折品質の結晶への成長。
【００５７】
本明細書における「Ｘ線結晶構造解析」は、Ｘ線ビームを結晶に当て、多くの特異的な方向に回折させる、結晶内の原子の配置を決定する方法である。この回折したビームの角度および強度から、結晶学者は、結晶内電子の密度の三次元像を作成することができる。当業者に公知であるように、この電子密度から、結晶における原子の平均的な位置ならびにその化学結合、その無秩序（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）および様々な他の情報が決定され得る。
【００５８】
本明細書における用語「原子座標」は、分子構造内の原子の三次元座標のセットを意味する。一実施形態において、原子座標は、生物物理学分野の当業者にとって周知の方法に従ったＸ線結晶構造解析を用いて得られる。簡単に説明すると、Ｘ線回折パターンは、結晶からのＸ線を回折することによって得ることができる。回折データは、結晶を含む単位格子の電子密度マップの計算に用いられる。前記マップは、単位格子内の原子の位置（すなわち、原子座標）の確立に用いられる。当業者であれば、Ｘ線結晶構造解析によって決定された構造座標のセットが、標準誤差を含有することを理解する。他の実施形態において、原子座標は、電子回折（電子結晶構造解析としても知られる）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）方法を包含し得る他の実験生物物理学的構造決定方法を用いて得ることができる。さらに他の実施形態において、原子座標は、アブイニシオなタンパク質フォールディングアルゴリズム、エネルギー最小化および相同性に基づくモデリングのうち１つまたは複数に基づき得られる分子モデリングツールを用いて得ることができる。これらの技法は、生物物理学および生物情報学分野における当業者にとって周知のものである。
【００５９】
本明細書における「構造を解明すること」は、タンパク質の原子の配置または原子座標の決定を意味し、多くの場合、Ｘ線結晶構造解析等の生物物理学的方法によってなされる。
【００６０】
本明細書における用語「化合物」または「試験化合物」または「候補化合物」または「薬物候補化合物」は、スクリーニングアッセイまたは創薬アッセイ等、アッセイにおいて検査される天然起源または合成いずれかの任意の分子を説明する。そのようなものとして、これらの化合物は、有機および無機化合物を含む。化合物は、低分子量によって特徴付けられたポリヌクレオチド、脂質またはホルモンアナログを包含する。他のバイオポリマー有機試験化合物は、抗体、抗体断片または抗体コンジュゲート等、約２から約４０アミノ酸を含む小分子ペプチドまたはペプチド様分子（ペプチド模倣物）および約４０から約５００アミノ酸を含むより高分子のポリペプチドを包含する。試験化合物は、タンパク質スキャフォールドでもよい。ハイスループットな目的のため、十分な範囲の多様性をもたらすコンビナトリアルまたはランダム化ライブラリー等の試験化合物ライブラリーを用いることができる。例として、天然化合物ライブラリー、アロステリック化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体断片ライブラリー、合成化合物ライブラリー、断片ベースのライブラリー、ファージディスプレイライブラリー等が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書においてより詳細な説明をさらに見出すことができる。
【００６１】
本明細書において、用語「決定する」、「測定する」、「評価する」、「モニターする」および「アッセイする」は、互換的に用いられ、定量的および定性的決定の両方を包含する。
【００６２】
ＧＰＣＲに関して用語「生物活性のある」は、天然起源のＧＰＣＲの生化学的機能（たとえば、結合機能、シグナル伝達機能またはリガンド結合の結果立体構造を変化させる能力）を有するＧＰＣＲを意味する。
【００６３】
本明細書における用語「治療上有効量」、「治療上有効用量」および「有効量」は、所望の結果（単数または複数）の達成に必要とされる量を指す。
【００６４】
本明細書における用語「薬学的に許容される」は、生物学その他の観点から望ましくないことのない材料を指し、すなわち、材料が、望ましくない生物学的効果を決して生じないまたはそれを含有する医薬組成物の他の成分のいずれとも有害な様式で相互作用しない化合物と共に個体に投与され得ることを指す。
詳細な説明
ＧＰＣＲを活性化し得るリガンドは極めて多様であるが、リガンドは比較的少数の細胞内タンパク質と相互作用して顕著な生理的変化を誘導する。ヘテロ三量体Ｇタンパク質、βアレスチンおよびＧＰＣＲキナーゼは、ＧＰＣＲをその活性状態で特異的に認識する能力で周知であるが、構造的ならびに機能的観点の両方からは十分に理解されていない。したがって、驚くべきことにおよび有利なことに、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に特異的に結合し、前記複合体を機能的立体構造状態で、特に活性な立体構造状態で安定化するまたはロックすることができる結合ドメインが同定された。さらに、前記結合ドメインは一般に好まれるＧＰＣＲを、ＧＰＣＲの活性状態（本明細書において定義されている）を表すと一般に仮定されているそのＧタンパク質結合状態で安定化および捕捉するための一般的ツールである。
【００６５】
したがって、本発明の第１の態様は、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含む複合体に向けられているおよび／または特異的に結合する結合ドメインに関する。
【００６６】
本発明の結合ドメインは、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含む複合体と特異的に結合することができる任意の非天然起源の分子またはその部分（上文に定義されている）であり得る。好ましい一実施形態に従えば、本明細書に記載されている結合ドメインは、タンパク質スキャフォールドである。用語「タンパク質スキャフォールド」は、別の分子、たとえばタンパク質との結合のためのフレームワークを含む構造、特にタンパク質またはペプチド構造を形成するフォールディング単位を一般に意味する（概説として、たとえば、Ｓｋｅｒｒａ（２０００）を参照されたい）。結合ドメインは、天然起源の分子、たとえば、自然または獲得免疫系の成分に由来し得るまたは全く人工的に設計され得る。結合ドメインは、免疫グロブリンに基づいてもよくまたは微生物タンパク質、プロテアーゼ阻害剤、毒素、フィブロネクチン、リポカリン、単鎖アンチパラレルコイルド大腸菌タンパク質（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ  ｃｏｉｌｅｄ  ｃｏｉｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）もしくは反復モチーフタンパク質等が挙げられるが、これらに限定されないタンパク質に存在するドメインに基づいてもよい。本技術分野における公知の結合ドメインの例として、抗体、重鎖抗体（ｈｃＡｂ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ミニボディ、ラクダ科動物重鎖抗体に由来する可変領域（ＶＨＨまたはナノボディ）、サメ抗体に由来する新規抗原受容体の可変領域（ＶＮＡＲ）、アルファボディ、プロテインＡ、プロテインＧ、設計アンキリンリピートドメイン（ＤＡＲＰｉｎｓ）、フィブロネクチンＩＩＩ型リピート、アンチカリン、ノッチン、操作されたＣＨ２ドメイン（ナノ抗体）、ペプチドおよびタンパク質、リポペプチド（たとえば、ペプデューシン（ｐｅｐｄｕｃｉｎ））、ＤＮＡならびにＲＮＡ（たとえば、Ｇｅｂａｕｅｒ＆Ｓｋｅｒｒａ、２００９；Ｓｋｅｒｒａ、２０００；Ｓｔａｒｏｖａｓｎｉｋら、１９９７；Ｂｉｎｚら、２００４；Ｋｏｉｄｅら、１９９８；Ｄｉｍｉｔｒｏｖ、２００９；Ｎｙｇｒｅｎら、２００８；ＷＯ２０１００６６７４０を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。多くの場合、選択方法を用いて特定の種類の結合ドメインを作製する際、ランダム化された相互作用残基候補を含有するコンセンサスまたはフレームワーク配列を含むコンビナトリアルライブラリーが、タンパク質等の対象の分子への結合に関するスクリーニングに用いられる。
【００６７】
本発明の結合ドメインは、一般に好まれる任意のＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に対して作製されおよび／または特異的に結合してもよい。好ましい標的複合体は、天然に存在するＧＰＣＲとＧタンパク質の複合体、または、代わりに、たとえば、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質の天然には存在しないバリアント（本明細書でさらに説明される）の場合は、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質が適切な生理的条件下で会合することになる複合体である。ＧＰＣＲとＧタンパク質間の構造的関係が、特定のＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体が形成され得るかどうかを決定することは当業者であれば理解され、これはＧタンパク質ファミリーのメンバーおよびＧＰＣＲファミリーのメンバーについてさらに下で詳細に論じられることになる。
【００６８】
「Ｇタンパク質」は、化学シグナルを細胞の外に伝達し細胞の内部で変化を引き起こすことに関与するグアニンヌクレオチド結合タンパク質のファミリーを意味する。Ｇタンパク質は、リガンドがＧＰＣＲの細胞外ドメインに結合することに続く細胞内シグナル伝達におけるキーとなる分子成分である。Ｇタンパク質は「ヘテロ三量体Ｇタンパク質」または「大Ｇタンパク質」とも呼ばれる。Ｇタンパク質は、３つのサブユニット、アルファ（α）、ベータ（β）およびガンマ（γ）からなり、その分類はその特徴的αサブユニットの独自性およびその後の伝達事象の性質に大いに基づいている。Ｇタンパク質の追加の分類は、ｃＤＮＡ配列相同性解析から生まれた。Ｇタンパク質は、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）またはグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）のどちらかに結合し、高度に相同的なグアニンヌクレオチド結合ドメインならびに受容体およびエフェクターとの相互作用のための特徴的ドメインを有する。とりわけ、Ｇαｓ、Ｇαｉ、ＧαｑおよびＧα１２などのＧαタンパク質の異なるサブクラスは、ｃＡＭＰ、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール、細胞内Ｃａ２＋およびＲｈｏＡ  ＧＴＰアーゼなどの二次メッセンジャー分子を伴う特徴的経路を通じてシグナルを送る。このことをさらに説明すれば、αサブユニット（３９−４６ｋＤａ）はグアニンヌクレオチド結合部位を含有しており、ＧＴＰアーゼ活性を有し、β（３７ｋＤａ）およびγ（８ｋＤａ）サブユニットは緊密に会合しておりβγヘテロ二量体として機能する。２３種類（いくつかのスプライシングアイソフォームを含む）のαサブユニット、６種類のβサブユニットおよび１１種類のγサブユニットが現在記載されている。Ｇタンパク質のクラスおよびサブユニットは添字が付けられており、したがって、たとえば、Ｇｓタンパク質のαサブユニット（アデニル酸シクラーゼを活性化する）はＧｓα、他のＧタンパク質には、Ｇｓとは構造的に異なり（異なる種類のαサブユニット）、アデニル酸シクラーゼを阻害するＧｉが含まれる。追加の例は表１に提供されている。
【００６９】
典型的には、本来、Ｇタンパク質はヌクレオチド結合型である。さらに具体的には、Ｇタンパク質（または少なくともαサブユニット）は、特定のＧＰＣＲの活性化状態に応じてＧＴＰまたはＧＤＰのどちらかに結合している。アゴニストがＧＰＣＲに結合すると、ＧＤＰ結合Ｇαβγヘテロ三量体との相互作用を促進し、Ｇα上でＧＤＰはＧＴＰに交換され、Ｇタンパク質はＧα−ＧＴＰおよびＧβγサブユニットに機能的に解離する。別個のＧα−ＧＴＰおよびＧβγサブユニットは、下流細胞エフェクター（チャネル、キナーゼまたは他の酵素、表１を参照）を独立してまたは平行して調節することができる。Ｇγの内因性ＧＴＰアーゼ活性は、ＧＴＰをＧＤＰに加水分解し、Ｇα−ＧＤＰとＧβγサブユニットは再会合して、シグナル伝達は終了する。このように、Ｇタンパク質は、αおよびβγサブユニット効果を通じて分岐シグナルを誘発することができる調節された分子スイッチとしての役割を果たす。前記スイッチは受容体によりオンになり、シグナル伝達をかなり増幅するのに十分な時間である数秒以内にオフになる。
【００７０】
本明細書における「Ｇタンパク質共役受容体」または「ＧＰＣＲ」は、それぞれ膜を貫通する７個のアルファヘリックスを形成する、２２から２４個の間の疎水性アミノ酸の７領域を備える共通構造的モチーフを共有するポリペプチドである。各貫通領域は、番号により同定され、すなわち、膜貫通−１（ＴＭ１）、膜貫通−２（ＴＭ２）等とする。膜貫通ヘリックスは、それぞれ「細胞外」領域１、２および３（ＥＣ１、ＥＣ２およびＥＣ３）と称される、細胞膜の外部または「細胞外」側における膜貫通−２と膜貫通−３との間、膜貫通−４と膜貫通−５との間および膜貫通−６と膜貫通−７との間のアミノ酸の領域によって連結されている。膜貫通ヘリックスは、それぞれ「細胞内」領域１、２および３（ＩＣ１、ＩＣ２およびＩＣ３）と称される、細胞膜の内部または「細胞内」側における膜貫通−１と膜貫通−２との間、膜貫通−３と膜貫通−４との間および膜貫通−５と膜貫通−６との間のアミノ酸の領域によっても連結されている。受容体の「カルボキシ」（「Ｃ」）末端は、細胞の内側にある細胞内空間に位置し、受容体の「アミノ」（「Ｎ」）末端は、細胞の外側にある細胞外空間に位置する。これらの領域のいずれも、ＧＰＣＲの一次アミノ酸配列の解析により容易に同定可能である。
【００７１】
ＧＰＣＲ構造および分類は、一般に本技術分野において周知のものであり、ＧＰＣＲに関するさらなる考察は、Ｐｒｏｂｓｔら、１９９２；Ｍａｒｃｈｅｓｅら、１９９４；Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ＆Ｓｃｈｉｏｔｈ、２００８；Ｒｏｓｅｎｂａｕｍら、２００９ならびに次の書籍、Ｊｕｒｇｅｎ  Ｗｅｓｓ（編）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ発行（第１版；１９９９年１０月１５日）；Ｋｅｖｉｎ  Ｒ．Ｌｙｎｃｈ（編）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ発行（１９９８年３月）；Ｔａｔｓｕｙａ  Ｈａｇａ（編）、Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ発行（１９９９年９月２４日）およびＳｔｅｖｅ  Ｗａｔｓｏｎ（編）Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ発行（第１版；１９９４年）に見出すことができる。ＧＰＣＲは、配列相同性に基づいて、数種の別々のファミリーにグループ分けすることができる。あらゆるＧＰＣＲは、７個の膜貫通α−ヘリックスの類似の構造を有するが、この受容体クラス内の異なるファミリーは、互いに配列相同性を示さず、よって、これらの膜貫通ドメイン構造の類似性が、共通の機能的要件を定義し得ることを示唆する。ヒトゲノムの最初のドラフト配列が利用できるようになったとき、ＧＰＣＲレパートリーの包括的見解が可能となった。Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎおよび同僚らは、系統発生学的判断基準に基づいて８０２種のヒトＧＰＣＲをファミリー分けした。その結果は、ヒトＧＰＣＲの多くが、ロドプシン、接着、セクレチン、グルタミン酸、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／Ｔａｓｔｅ２と称される５種の主要ファミリーに存在することを示した（Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎら、２００３）。
【００７２】
ロドプシンファミリー（クラスＡ（Ｋｏｌａｋｏｗｓｋｉ、１９９４）またはクラス１（Ｆｏｏｒｄら、（２００５）、古い分類システムにおける）に相当）のメンバーは、小型の細胞外ループしか持たず、リガンドの相互作用は、膜貫通間隙内の残基との間で行われる。これは、圧倒的最大の群（ＧＰＣＲの＞９０％）であり、匂い分子、カテコールアミンおよびアミン等の小分子、（神経）ペプチドおよび糖タンパク質ホルモンの受容体を含有する。このファミリーの代表であるロドプシンは、構造が解明された最初のＧＰＣＲである（Ｐａｌｃｚｅｗｓｋｉら、２０００）。構造が解明された拡散性リガンドと相互作用する最初の受容体であるβ２ＡＲ（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍら、２００７）も、このファミリーに属す。系統発生解析に基づき、クラスＢ  ＧＰＣＲまたはクラス２（Ｆｏｏｒｄら、２００５）受容体は、近年、接着およびセクレチン（Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎら、２００３）の２ファミリーに細分化された。接着およびセクレチン受容体は、リガンド結合に関与する相対的に長いアミノ末端細胞外ドメインによって特徴付けられる。膜貫通ドメインの配向性に関してほとんど分かっていないが、恐らく、ロドプシンの配向性とは全く異なる。これらのＧＰＣＲのリガンドは、グルカゴン、セクレチン、性腺刺激ホルモン放出ホルモンおよび副甲状腺ホルモン等のホルモンである。グルタミン酸ファミリー受容体（クラスＣまたはクラス３受容体）も大型の細胞外ドメインを有し、このドメインは、内側に結合したアゴニストにより開閉できることから「ハエジゴク（Ｖｅｎｕｓ  ｆｌｙ  ｔｒａｐ）」の様に機能する。ファミリーメンバーは、代謝型グルタミン酸、Ｃａ２＋感知およびγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）−Ｂ受容体である。
【００７３】
ＧＰＣＲは、セロトニン嗅覚受容体、糖タンパク質ホルモン受容体、ケモカイン受容体、アデノシン受容体、生体アミン受容体、メラノコルチン受容体、神経ペプチド受容体、走化性受容体、ソマトスタチン受容体、オピオイド受容体、メラトニン受容体、カルシトニン受容体、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体、グルカゴン受容体、セクレチン受容体、ラトロトキシン受容体、代謝型グルタミン酸受容体、カルシウム受容体、ＧＡＢＡ−Ｂ受容体、フェロモン受容体、プロテアーゼ活性化型受容体、ロドプシンおよび他のＧタンパク質共役型７回膜貫通セグメント受容体を限定することなく包含する。ＧＰＣＲは、ホモマーもしくはヘテロマーのダイマーまたはより高次のオリゴマーとして互いに会合したＧＰＣＲ受容体も包含する。ＧＰＣＲのアミノ酸配列（およびこれをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列）は、たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ）を参照することにより容易に入手できる。
【００７４】
したがって、特定の実施形態によると、本発明は、Ｇタンパク質がＧｓ、Ｇｉ、Ｇｏ、Ｇｔ、Ｇｇｕｓｔ、Ｇｚ、Ｇｏｌｆ、Ｇｑ、Ｇ１２およびＧ１３からなる群から選択されるＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に対して作製されたおよび／または特異的に結合する結合ドメインを提供する。一好ましい実施形態では、Ｇタンパク質はＧｓである。別の好ましい実施形態では、Ｇタンパク質はＧｉである。さらに別の好ましい実施形態では、Ｇタンパク質はＧｔ、さらに具体的にはトランスデューシンである。それに対応して、前記複合体内に含まれるＧＰＣＲは、Ｇｓ共役受容体、Ｇｉ共役受容体、Ｇｏ共役受容体、Ｇｔ共役受容体、Ｇｇｕｓｔ共役受容体、Ｇｏｌｆ共役受容体、Ｇｑ共役受容体、Ｇ１２共役受容体およびＧ１３共役受容体からなる群から選択される。一好ましい実施形態では、ＧＰＣＲはＧｓ共役受容体である。別の好ましい実施形態では、ＧＰＣＲはＧｉ共役受容体である。さらに別の好ましい実施形態では、ＧＰＣＲはＧｔ共役受容体、さらに具体的にはロドプシンである。特定の非限定的例は表１に与えられている。
【００７５】
【表１】
2014525735.tif 000002
2014525735.tif 000003
【００７６】
一般に、本発明の結合ドメインは、当業者には明らかになるように、生物学的および／または治療的観点からもっとも関連のある種類のＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に少なくとも結合することになる。したがって、目的と適用に応じて、標的複合体に含まれるＧＰＣＲおよびＧタンパク質は天然に存在していてもまたは天然に存在していなくても（すなわち、ヒトにより変更されていても）よい。用語「天然に存在する」は、本明細書で使用される場合、天然に産生されるＧＰＣＲまたはＧタンパク質を意味する。特に、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質の野生型多形バリアントおよびアイソフォーム、ならびに異なる種にわたるオルソログは、天然に存在するタンパク質の例であり、たとえば、制限なしに、とりわけ、哺乳動物に、さらに具体的にはヒトに、またはウイルスにまたは植物に、または昆虫に見出される。したがって、そのようなＧＰＣＲまたはＧタンパク質は天然に見出される。用語「天然に存在しない」は、本明細書で使用される場合、天然には存在しないＧＰＣＲまたはＧタンパク質を意味する。ある種の状況では、前記複合体に含まれるＧＰＣＲおよび／またはＧタンパク質は天然には存在しないタンパク質であることが有利な場合もある。たとえばおよび説明のみを目的に、本発明の結合ドメインにより安定化されたＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の結晶を得る可能性を高めるために、リガンド結合親和性に影響を与えずにまたは最小限度の影響を与えるだけであるタンパク質操作を実施するのは望ましいことがある。あるいは、代わりにまたはさらに、ＧＰＣＲおよび／もしくはＧタンパク質の細胞発現レベルを増加するために、または安定性を高めるために、対象のＧＰＣＲおよび／またはＧタンパク質にある種の変異を導入することを検討してもよい。天然に存在しないＧＰＣＲの非限定的例には、制限なく、変異を通じて構成的に活性になっているＧＰＣＲ、ループ欠失のあるＧＰＣＲ、Ｎ−および／またはＣ−末端欠失のあるＧＰＣＲ、置換、挿入もしくは付加のあるＧＰＣＲ、またはそのアミノ酸もしくはヌクレオチド配列に関するそれらの任意の組合せ、または天然に存在するＧＰＣＲの他のバリアントが含まれる。同様に、天然に存在しないＧタンパク質の非限定的例には、制限なく、Ｎ−および／またはＣ−末端欠失のあるＧタンパク質、置換、挿入もしくは付加のあるＧタンパク質、またはそのアミノ酸もしくはヌクレオチド配列に関するそれらの任意の組合せ、または天然に存在するＧタンパク質の他のバリアントが含まれる。本発明の範囲内には、キメラもしくはハイブリッドＧＰＣＲ、たとえば、１つのＧＰＣＲ由来のＮ−および／もしくはＣ−末端と第二のＧＰＣＲのループを有するキメラＧＰＣＲを含む、またはＴ４リゾチームなどの部分に融合しているＧＰＣＲを含む標的ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体も含まれる（実施例のセクションも参照）。
【００７７】
本発明の範囲内における特定の実施形態に従えば、非天然起源のＧＰＣＲまたはＧタンパク質は、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に含まれるように、天然起源のＧＰＣＲまたはＧタンパク質に対して少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有し得る。これをさらに説明するために、およびβ２−アドレナリン受容体を本発明の範囲内におけるＧＰＣＲの特定の非限定的な例とすると、上の記述から、ヒトβ２アドレナリン受容体（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００００１５に記載の配列）に加えて、マウスβ２アドレナリン受容体（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ００７４２０に記載）または他の哺乳動物β２アドレナリン受容体が網羅されてよいことは明らかである。特定の生物種のβ２アドレナリン受容体の野生型多型変種および特定の他の活性変種も想定される。たとえば、「ヒトβ２アドレナリン受容体」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００００１５の天然起源の「ヒトβ２アドレナリン受容体」に対して少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する。同様に、Ｇαｓ、ＧαｉおよびＧαｔを本発明の範囲内のＧタンパク質のサブユニットの特定の非限定的例とすると、ヒトＧαｓもしくはＧαｉもしくはＧαｔに加えて、マウスＧαｓもしくはＧαｉもしくはＧαｔタンパク質または他の哺乳動物ＧαｓもしくはＧαｉもしくはＧαｔタンパク質が包含されることは上記から明らかになるはずである。特定の種由来のＧαｓもしくはＧαｉもしくはＧαｔの野生型多形バリアントおよびある種の他の活性バリアントも想定されている。たとえば、「ヒトＧαｓ」または「ヒトＧαｉ」または「ヒトＧαｔ」は、それぞれジェンバンク受託番号Ｐ６３０９２、Ｐ６３０９６およびＰ１１４８８の天然に存在する「ヒトＧαｓ」または「ヒトＧαｉ」または「ヒトＧαｔ」に少なくとも８０％同一の、少なくとも９０％同一の、少なくとも９５％同一の、少なくとも９７％同一のまたは少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する。さらに、たとえば、ＧｓおよびＧｉタンパク質のアイソフォーム（ＨＧＮＣヒト遺伝子標準命名法によると、Ｇαｓ：ＧＮＡＳ；Ｇα０：ＧＮＡＯ１；Ｇαｉ：ＧＮＡｌ１またはＧＮＡｌ２またはＧＮＡｌ３；Ｇβ：ＧＮＢ１またはＧＮＢ２またはＧＮＢ３またはＧＮＢ４またはＧＮＢ５またはＧＮＢ１ＬまたはＧＮＢ２Ｌ；Ｇγ：ＧＮＧＴ１またはＧＮＧＴ２またはＧＮＧ２またはＧＮＧ３またはＧＮＧ４またはＧＮＧ５またはＧＮＧ７またはＧＮＧ８またはＧＮＧ１０またはＧＮＧ１１またはＧＮＧ１２またはＧＮＧ１３；異なる生物由来の異なるアイソフォームの受託番号はｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇより入手可能である）を含むＧタンパク質サブユニットの多くのアイソフォームが存在する。Ｇタンパク質サブユニットのアイソフォームのいくつかの特定の例は表５に与えられている。当業者であれば、異なるＧタンパク質サブユニットのアミノ酸配列は種および生物間で１００％ではないにしてもほぼ１００％保存されていることを認識する。とりわけ、Ｇタンパク質のヒト、ウシ、ラットおよびマウスβサブユニットのアミノ酸配列の配列アライメントにより、これらの生物間のアミノ酸配列は１００％保存されていることが明らかになっている。同様に、Ｇタンパク質のヒト、マウスおよびウシγサブユニットのアミノ酸配列は１００％同一である。ラットおよびマウスＧαｓアミノ酸配列も１００％同一であり、ヒトおよびウシＧαｓはそれぞれ１または２アミノ酸が異なるだけである。したがって、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に対して作製されたおよび／または特異的に結合する、特に前記複合体に含まれるＧタンパク質に結合する結合ドメインは交差反応性であると予想される。標的複合体に含まれるＧＰＣＲおよびＧタンパク質は同一種由来でも異なる種由来でもよいことも明らかになる。好ましくは、ＧＰＣＲおよび／またはＧタンパク質は哺乳動物タンパク質、または植物タンパク質、または微生物タンパク質、またはウイルスタンパク質、または昆虫タンパク質である。さらに好ましくは、ＧＰＣＲはヒトタンパク質である。
【００７８】
本発明の結合ドメインは一般に、前記複合体中に含まれる特定のＧＰＣＲおよび／またはＧタンパク質のすべての天然に存在するまたは合成のアナログ、バリアント、変異体、アレル、部分、断片およびアイソフォームを含むＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に、または少なくとも前記複合体中に含まれる特定のＧＰＣＲおよび／またはＧタンパク質のアナログ、バリアント、変異体、アレル、部分、断片およびアイソフォームであって、本発明の結合ドメインが前記複合体中に含まれる特定のＧＰＣＲおよび／またはＧタンパク質に結合する抗原決定基（複数可）またはエピトープ（複数可）と基本的に同じである１つ以上の抗原決定基またはエピトープを含有する上記アナログ、バリアント、変異体、アレル、部分、断片およびアイソフォームに結合することができるとも予想される。
【００７９】
たとえば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴法、ファージディスプレイ等を含めた様々な方法が、結合ドメインおよび標的ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の間の特異的結合（上文に定義されている）の決定に用いることができ、これらの方法は、本技術分野において慣行的であり、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーに記されており、実施例の節でさらに説明される。この目的のため、多くの場合、本明細書にさらに記載されているペプチド標識、核酸標識、化学標識、蛍光標識または高周波タグ等の独特の標識またはタグが用いられることが認識される。
【００８０】
特定の実施形態によると、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に対する結合ドメインは、Ｇタンパク質単独および／またはＧＰＣＲ単独それぞれに結合する場合と比べて高い親和性で前記複合体に結合する。一実施形態では、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に対する結合ドメインは、前記複合体に含まれるＧＰＣＲに特異的に結合し、Ｇタンパク質には結合しない。好ましくは、別の実施形態では、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に対する結合ドメインは、前記複合体に含まれるＧタンパク質に特異的に結合し、ＧＰＣＲには結合しない。さらに具体的には、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に対する結合ドメインは、Ｇｓ共役受容体およびＧｓタンパク質の複合体に含まれるＧｓタンパク質であるＧタンパク質に特異的に結合する。
【００８１】
ＧＰＣＲが、天然および合成リガンドに応じて機能的挙動のスペクトルを示す立体構造的複合体膜タンパク質であることは周知である。本来、リガンド結合ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質と会合して、特定の機能的立体構造状態、さらに具体的には活性立体構造状態となり、特定の生物活性を生じることになる複合体となり得る。本発明は、本明細書に記載される結合ドメインが、Ｇタンパク質と複合体を形成し様々な天然のまたは合成のリガンドに結合しているＧＰＣＲのこれらの種々の活性立体構造を安定化することができるという特定の利点を提供する。当業者であれば、リガンド：ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に特異的に結合する結合ドメインが、前記複合体に含まれるＧＰＣＲの特定の立体構造を安定化することを認識する。好ましい実施形態では、前記結合ドメインは、好ましくはＧＰＣＲが活性立体構造状態にある、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の特定の機能的立体構造状態を安定化する、または別の方法で、その安定性を増加することができる。一般に、前記ＧＰＣＲの機能的立体構造状態は基本的な立体構造状態である、または活性立体構造状態であるまたは不活性立体構造状態であることが可能である。好ましくは、本発明の結合ドメインは、受容体リガンドの存在下であれ非存在下であれ、ＧＰＣＲをその活性立体構造状態で安定化することができるおよび／またはＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に結合するとＧＰＣＲを活性立体構造状態でロックすることができる。
【００８２】
本発明の特に好ましい実施形態では、前記結合ドメインはＧＰＣＲ、Ｇタンパク質および受容体リガンド（本明細書に定義されている）を含む複合体に対して作製されているおよび／または特異的に結合することが想定されている。さらに好ましくは、前記結合ドメインはＧＰＣＲ、Ｇタンパク質および受容体リガンドからなる複合体に対して作製されているおよび／または特異的に結合する。受容体リガンドは、結合すると応答を始動させる小化合物、ペプチド、抗体、または抗体断片などでもよい。本明細書における受容体リガンドまたは単にリガンドは、受容体の活性部位と結合し、その有効性またはすなわち、特異的経路を通した受容体シグナル伝達におけるその効果に従って分類されるオルソステリックリガンド（天然および合成の両方）でよい。本明細書において、「アゴニスト」は、受容体と結合することにより、受容体のシグナル伝達活性を増加させるリガンドを意味する。完全アゴニストは、最大受容体刺激ができる。部分アゴニストは、飽和濃度であっても完全活性を誘発できない。部分アゴニストは、より強いアゴニストの結合を抑制することにより、「遮断薬」としても機能し得る。「アンタゴニスト」は、いかなる活性も刺激することなく受容体と結合するリガンドを意味する。「アンタゴニスト」は、他のリガンドの結合を抑制するその能力、したがって遮断アゴニスト誘導活性のため、「遮断薬」としても知られる。さらに、「インバースアゴニスト」は、アゴニスト効果の遮断に加えて、受容体の基礎または構成的活性をリガンド非結合の受容体の活性よりも低下させるアンタゴニストを意味する。好ましくは、本発明の結合ドメインは、ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質および受容体リガンドを含み、前記受容体リガンドがアゴニストである複合体に対して作製されているおよび／または特異的に結合する。さらに具体的には、前記アゴニストはオルソステリック部位で受容体に結合する。
【００８３】
ＧＰＣＲのシグナル伝達活性（したがって、その立体構造挙動）は、アロステリック調節因子として公知の別種のリガンドの結合によっても影響され得る。「アロステリック調節因子」あるいは「アロステリック修飾因子」または「エフェクター分子」は、ＧＰＣＲのアロステリック部位（すなわち、物理的にタンパク質の活性部位と異なる調節性部位）において結合する。オルソステリックリガンドと対照的に、アロステリック修飾因子は、内在性リガンドも結合しているとしても、異なる部位で受容体と結合して受容体機能を修飾するため、非競合的である。このため、アロステリック修飾因子は、多くの薬物がそうであるように、単に受容体をオンにしたりオフにしたりすることに限定されない。その代わりに、これは、むしろ減光スイッチのように作用し、その（内因性）リガンドの受容体の親和性を変更することによって、本体に受容体活性化の惹起に関するその天然の制御を保持させつつ、活性化または非活性化の強度に関する制御をもたらす。タンパク質の活性を増強するアロステリック調節因子は、本明細書において、「アロステリック活性化因子」または「正のアロステリック修飾因子」と称され、一方、タンパク質の活性を減少させるアロステリック調節因子は、本明細書において、「アロステリック阻害剤」あるいは「負のアロステリック修飾因子」と称される。したがって、一特定の実施形態では、本発明の結合ドメインは、ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質および受容体リガンドを含み、前記受容体リガンドがアロステリックモジュレーター、好ましくはポジティブアロステリックモジュレーターである複合体に対して作製されているおよび／または特異的に結合する。さらに具体的には、前記ポジティブアロステリックモジュレーターはアロステリック部位で受容体に結合する。
【００８４】
説明されたように、ＧＰＣＲが細胞生理をどのように調節しているのかの標準的見方は、リガンド（たとえば、ホルモン、神経伝達物質または感覚刺激）の結合は受容体の活性立体構造状態を安定化させ、それによってヘテロ三量体Ｇタンパク質との相互作用を可能にするというものである。Ｇタンパク質との相互作用に加えて、アゴニスト結合ＧＰＣＲはＧＰＣＲキナーゼ（ＧＲＫ）と会合し、受容体をリン酸化する。ＧＲＫによりＧＰＣＲがリン酸化される結果、一般的には、ＧＰＣＲのＧタンパク質との相互作用が減少し、ＧＰＣＲのアレスチンとの相互作用が増加し、Ｇタンパク質のさらなるシグナル伝達が立体的に阻害され、受容体脱感作をもたらす。βアレスチンはＧタンパク質のシグナルを打ち消すため、ＭＡＰＫ経路などの第二のパラレルなセットのシグナルカスケードを同時に開始することができる。ＧＰＣＲは、一般的なＧＰＣＲ相互作用タンパク質（Ｇタンパク質、ＧＲＫ、アレスチンおよび他の受容体）のファミリーの他に様々なタンパク質とも会合する。これらのＧＰＣＲ選択性パートナーは、ＧＰＣＲシグナル伝達を媒介し、Ｇタンパク質を通じてＧＰＣＲシグナル伝達を組織化し、ＧＰＣＲ輸送を指示し、ＧＰＣＲを特定の細胞内領域に固定しおよび／またはＧＰＣＲ薬理に影響を及ぼすことができる（ＲｉｔｔｅｒおよびＨａｌｌ、２００９年）。この点に関して、本明細書で使用されるリガンドは、サブセットの受容体シグナル伝達活動、たとえば、Ｇタンパク質またはβアレスチン機能の選択的活性化を選択的に刺激する能力を有する「バイアスリガンド」であってもよい。そのようなリガンドは、「バイアスリガンド」、「バイアスアゴニスト」または「機能的選択性アゴニスト」として知られる。さらに詳細には、リガンドバイアスは、リガンドが複数の受容体活動を異なるシグナルに対して異なる相対的有効性で刺激すること（非絶対的選択性）を特徴とする不完全バイアスであることが可能であり、またはリガンドが１つの受容体活動を刺激して別の既知の受容体活動を全く刺激しないことを特徴とする完全バイアスであることが可能である。したがって、一特定の実施形態では、本発明の結合ドメインは、ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質および受容体リガンドを含み、前記受容体リガンドがバイアスリガンドである複合体に対して作製されているおよび／または特異的に結合する。
【００８５】
さらに、本発明の好ましい実施形態によると、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に対して作製されたおよび／または特異的に結合する本発明の結合ドメインは、上文に記載されているように、自然または適応免疫系由来であることが特に想定されている。好ましくは、前記結合ドメインは免疫グロブリンに由来する。好ましくは、本発明による結合ドメインは、抗体または抗体断片である。用語「抗体」（Ａｂ）は、抗原を特異的に結合および認識する、免疫グロブリン遺伝子によってコードされたポリペプチドまたはその機能的断片を一般に意味し、当業者にとって公知のものである。従来の免疫グロブリン（抗体）構造的単位は、テトラマーを含む。各テトラマーは、各対が１本の「軽」（約２５ｋＤａ）および１本の「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を有する同一の２対のポリペプチド鎖によって構成されている。各鎖のＮ末端は、主として抗原認識に関与する約１００から１１０以上のアミノ酸の可変領域を画定する。用語、可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）はそれぞれ、これらの軽および重鎖を意味する。用語「抗体」は、単鎖全抗体および抗原結合断片を含めた全抗体を包含するよう企図されている。一部の実施形態において、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）およびＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むまたはそれからなる断片ならびに標的抗原と結合することができる免疫グロブリンペプチドのこれらまたは任意の他の機能的部分の任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない抗原結合抗体断片でよい。用語「抗体」は、本明細書においてさらに定義されている単一ドメイン抗体、より具体的にはＶＨＨまたはナノボディ等の免疫グロブリン単一可変ドメインの、重鎖抗体またはその機能的断片も包含するよう企図されている。
【００８６】
好ましくは、本発明の結合ドメインは免疫グロブリン単一可変ドメインである。さらに好ましくは、前記結合ドメインは、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含むアミノ酸配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインであり、好ましくは以下の式（１）に従う：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（１）
またはその任意の適切な断片（よって通常、相補性決定領域のうち少なくとも１個を形成するアミノ酸残基の少なくとも一部を含有する）。
【００８７】
４個のＦＲおよび３個のＣＤＲを含む結合ドメインは、当業者にとって公知のものであり、非限定的な例として、Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉら（２００９、Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８：１５７）に記載されている。免疫グロブリン単一可変ドメインの典型的であるが非限定的な例には、通常は従来の４本鎖抗体に由来する軽鎖可変ドメイン配列（たとえば、ＶＬドメイン配列）または重鎖可変ドメイン配列（たとえば、ＶＨドメイン配列）が含まれる。好ましくは、免疫グロブリン単一可変ドメインはラクダ科動物抗体由来、好ましくは軽鎖が欠けている重鎖ラクダ科動物抗体由来であり、ＶＨＨドメイン配列またはナノボディとして知られる（本明細書においてさらに記載される）。
【００８８】
本明細書における用語「ナノボディ」（Ｎｂ）は、天然起源の重鎖抗体に由来する最小の抗原結合断片または単一可変ドメイン（ＶＨＨ）を意味し、当業者にとって公知のものである。これは、ラクダ科動物に見られる重鎖のみの抗体に由来する（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、１９９３；Ｄｅｓｍｙｔｅｒら、１９９６）。「ラクダ科動物」のファミリーにおいて、軽ポリペプチド鎖を欠く免疫グロブリンが見出される。「ラクダ科動物」は、旧世界ラクダ科動物（カメルス・バクトリアヌス（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）およびカメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ））ならびに新世界ラクダ科動物（たとえば、ラマ・パコス（Ｌａｍａ  ｐａｃｃｏｓ）、ラマ・グラマ（Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ）、ラマ・グアニコエ（Ｌａｍａ  ｇｕａｎｉｃｏｅ）およびラマ・ビクニャ（Ｌａｍａ  ｖｉｃｕｇｎａ））を含む。前記単一可変ドメイン重鎖抗体は、本明細書において、ＮａｎｏｂｏｄｙまたはＶＨＨ抗体と命名される。Ｎａｎｏｂｏｄｙ（ナノボディ）（商標）およびＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（商標）は、Ａｂｌｙｎｘ  ＮＶ（ベルギー）の商標である。Ｎｂの小サイズおよび独特の生物物理学的特性は、稀少なまたは隠れたエピトープの認識およびタンパク質標的の空洞または活性部位への結合に関して従来の抗体断片よりも優れている。さらに、Ｎｂは、多重特異性および／または多価抗体として設計され得るまたはレポーター分子と付着され得る（Ｃｏｎｒａｔｈら、２００１）。Ｎｂは、容易に製造されて胃腸管系に残存し得る安定的で強固な単一ドメインタンパク質である。したがって、Ｎｂは、創薬および治療等、多くの用途において用いられ得る（Ｓａｅｒｅｎｓら、２００８）が、タンパク質の精製、機能研究および結晶化のための多用途および有用なツールとしても用いられ得る（Ｃｏｎｒａｔｈら、２００９）。天然の標的の立体構造エピトープに結合する結晶化シャペロンとして機能する特定クラスのナノボディは、グザペロンと呼ばれ、ここでは特に想定されている。グザペロンは構造生物学における独自のツールである。グザペロン（商標）はＶＩＢおよびＶＵＢの商標である（Ｂｅｌｇｉｕｍ）。結晶化補助としてラクダ科動物抗体断片を使用する大きな利点は、グザペロンは（１）隠れたエピトープに結合しタンパク質を独自の天然立体構造にロックする、（２）可溶性タンパク質および可溶化膜タンパク質の安定性を増加する、（３）可溶性タンパク質および可溶化膜タンパク質の立体構造複雑性を減少する、（４）回折結晶の成長を可能にする極性表面を増加し、（５）集合性または重合性表面を隔離する、（６）活性タンパク質を親和性トラップすることを可能にすることである。
【００８９】
したがって、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、特に本発明のナノボディは一般に、典型的には式（１）
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（１）
に従って、４つの「フレームワーク配列」またはＦＲおよび３つの「相補性決定領域」またはＣＤＲを含む単一アミノ酸鎖を含む。
【００９０】
用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とは、免疫グロブリン単一可変ドメインにおける可変領域のことであり、抗原標的に特異的に結合することができるアミノ酸配列を含有する。これらのＣＤＲ領域は、特定の抗原決定構造に対するナノボディの基本的特異性を説明する。そのような領域は「超可変領域」とも呼ばれる。免疫グロブリン単一可変ドメインは、３つのＣＤＲ領域を有し、それぞれのＣＤＲがその他のＣＤＲとは隣接していない（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれる）。免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域も、その抗原の結合に寄与し得ることは明らかである（Ｄｅｓｍｙｔｅｒら、２００２；Ｋｏｒｏｔｋｏｖら、２００９）。本発明のそのような免疫グロブリン単一可変ドメインならびにＦＲとＣＤＲの特定の組合せの非限定的例は、本明細書に記載される通りである（表２−３を参照）。ＣＤＲ配列（したがって、ＦＲ配列も）の描写は、ＶドメインおよびＶ様ドメインのＩＭＧＴ独自の付番方式に基づいている（Ｌｅｆｒａｎｃら、２００３年）。代わりに、ＦＲおよびＣＤＲ配列の描写は、ＲｉｅｃｈｍａｎｎおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓの論文（２０００年）でラクダ科動物由来のＶＨＨドメインに適用されるＫａｂａｔ付番方式を使用することにより行うことが可能である。当業者であれば知ることになるように、免疫グロブリン単一可変ドメイン、特にナノボディは、たとえば、参照により本明細書に組み込むＷＯ０８／０２００７９、７５頁、表Ａ−３に記載されているように、フレームワーク配列のうちの１つ以上における１つ以上のラクダ科ホールマーク残基（Ｋａｂａｔ付番に従って）の存在を特に特徴とすることができる。
【００９１】
好ましい実施形態では、本発明は、基本的に４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなるアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列のＣＤＲ配列が配列番号１−６、好ましくは配列番号１および／または４の免疫グロブリン単一可変ドメインのうちの少なくとも１つのＣＤＲ配列（表３を参照）と少なくとも７０％アミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％アミノ酸同一性、さらに好ましくは少なくとも９０％アミノ酸同一性、たとえば少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％アミノ酸同一性さえ有する上記アミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。免疫グロブリン単一可変ドメインの１つ以上の配列のＣＤＲのアミノ酸配列のアミノ酸同一性の程度を決定するためには、フレームワーク領域を形成するアミノ酸残基は無視されることは理解される。本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインのいくつかの好ましいが非限定的例は、配列番号１から６、好ましくは配列番号１および／または配列番号４に与えられる（表２を参照）。
【００９２】
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、特にナノボディは、そのもっとも広い意義において、特定の生物学的ソースまたは特定の調製方法に限定されないことに留意されたい。たとえば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、特にナノボディは、一般に、（１）天然起源の重鎖抗体のＶＨＨドメインを単離することにより、（２）天然起源のＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列の発現により、（３）天然起源のＶＨＨドメインの「ヒト化」によりまたはこのようなヒト化ＶＨＨドメインをコードする核酸の発現により、（４）任意の動物種、特にヒト等の哺乳動物種から得られた天然起源のＶＨドメインの「ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚａｔｉｏｎ）」によりまたはこのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現により、（５）本技術分野において説明されている「ドメイン抗体」または「Ｄａｂ」の「ラクダ化」によりまたはこのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現により、（６）それ自体は公知のタンパク質、ポリペプチドまたは他のアミノ酸配列を調製するための合成または半合成技法を用いることにより、（７）それ自体は公知の核酸合成技法を用いてナノボディをコードする核酸を調製し、次に、このようにして得られた核酸を発現することにより、および／または（８）前述の１つまたは複数の任意の組合せにより得ることができる。
【００９３】
免疫グロブリン単一可変ドメインの好ましい１クラスは、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質の標的複合体に対して作製された天然起源の重鎖抗体のＶＨＨドメインに相当する。免疫グロブリン単一可変ドメインのナイーブまたは合成ライブラリーは、標的複合体に対する立体構造結合剤を含有し得るが、本発明の好ましい一実施形態は、標的複合体によりラクダ科を免疫化して、複合体独特の立体構造エピトープに、この動物の免疫系を曝露することを包含する。動物は相互作用する単量体の混合物で免疫することが可能である。場合によって、前記複合体は、化学架橋によりまたは前記複合体を安定化する協調的／アロステリックリガンド／代謝物（オルソステリックアゴニスト、アロステリック活性化物質、Ｃａ＋＋、ＡＴＰ、等）を付加することにより安定化することが可能である。前記複合体は、前記複合体のメンバー（のうちの１つ）の共有結合性修飾（リン酸化、等）により安定化することも可能である。別の実施形態では、ＧＰＣＲおよび／またはＧタンパク質単独で、したがって互いと複合体を形成せずに用いてラクダ科を免疫してもよい。場合によって、ＧＰＣＲおよび／またはＧタンパク質を、たとえば、ＧＰＣＲおよび／またはＧタンパク質を安定化する協調的／アロステリックリガンド／代謝物（とりわけ、オルソステリックアゴニスト、アロステリック活性化物質、Ｃａ＋＋、ＡＴＰ）を付加することにより安定化してもよい。
【００９４】
したがって、そのようなＶＨＨ配列は一般に、ラクダ科動物の一種をＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含む標的複合体でまたはその構成メンバータンパク質のうちの１つもしくは両方のどちらかで適切に免疫することにより（すなわち、標的複合体に対して作製された免疫応答および／または重鎖抗体を産生するために）、前記ラクダ科動物から適切な生体試料（たとえば、血液試料またはＢ細胞の任意の試料）を得ることにより、ならびに、それ自体が公知である任意の適切な技法を使用して前記試料から開始して標的複合体に対して作製されたＶＨＨ配列を産生することにより作製されるまたは得ることができる。そのような技法は当業者には明らかである。代わりに、そのような天然に存在するＶＨＨドメインは、たとえば、それ自体公知の１つ以上のスクリーニング技法を使用して、標的複合体またはその少なくとも一部分、断片、抗原決定基もしくはエピトープを使用してそのようなライブラリーをスクリーニングすることによりラクダ科動物ＶＨＨ配列のナイーブライブラリーから得ることが可能である。そのようなライブラリーおよび技法は、たとえば、ＷＯ９９３７６８１、ＷＯ０１９０１９０、ＷＯ０３０２５０２０およびＷＯ０３０３５６９４に記載されている。代わりに、たとえば、ＷＯ００４３５０７に記載されているランダム変異誘発および／またはＣＤＲシャフリングなどの技法によりナイーブＶＨＨライブラリーから得られるＶＨＨライブラリーなどの、ナイーブＶＨＨライブラリーに由来する改良された合成または半合成ライブラリーを使用してもよい。標的に向けられたＶＨＨ配列を得るためのさらに別の技法は、重鎖抗体を発現することのできるトランスジェニック哺乳動物を適切に免疫化し（すなわち、標的に対して作製された免疫応答および／または重鎖抗体を産生できるよう）、前記トランスジェニック哺乳動物から適切な生物試料（血液試料または任意のＢ細胞試料等）を得て、次に、それ自体は公知の任意の適切な技法を用いて前記試料から出発して標的に対して作製されたＶＨＨ配列を産生することに関与する。たとえば、この目的のため、ＷＯ０２０８５９４５およびＷＯ０４０４９７９４に記載されている重鎖抗体発現マウスならびにさらなる方法および技法を用いることができる。
【００９５】
本発明の特に好ましいクラスの免疫グロブリン単一可変ドメイン、特に本発明のナノボディは、天然に存在するＶＨＨドメインのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列であって、しかし、すなわち、前記天然に存在するＶＨＨ配列のアミノ酸配列（特に、フレームワーク配列内）における１つ以上のアミノ酸残基をヒト由来の従来の４鎖抗体由来のＶＨドメインにおける対応する位置（複数可）に存在するアミノ酸残基のうちの１つ以上で置き換えることにより「ヒト化」されているアミノ酸配列を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。これは、たとえば、当業者であれば本明細書におけるさらなる説明および本明細書で参照するヒト化に関する先行技術に基づき明らかとなる、それ自体は公知の様式で行われ得る。一方、本発明のこのようなヒト化免疫グロブリン単一可変ドメインが、それ自体は公知の任意の適切な様式で（すなわち、上記のポイント（１）−（８）に表示）得られ、よって、出発材料として天然起源のＶＨＨドメインを含むポリペプチドを用いて得られたポリペプチドに厳密に限定されないことに留意されたい。ヒト化免疫グロブリン単一可変ドメイン、特にナノボディは、対応する天然起源のＶＨＨドメインと比較した免疫原性の低下等、いくつかの利点を有し得る。このようなヒト化では、一般に、天然起源のＶＨＨの配列における１つまたは複数のアミノ酸残基を、ヒトＶＨ３ドメイン等のヒトＶＨドメインにおける同一位置に存在するアミノ酸残基に置き換える。ヒト化置換は、得られたヒト化免疫グロブリン単一可変ドメインが、本明細書において定義されている免疫グロブリン単一可変ドメインの有利な特性を保持し続けるように選ばれるべきである。当業者であれば、一方ではヒト化置換によってもたらされる有利な特性と、他方では天然起源のＶＨＨドメインの有利な特性との間の所望のまたは適切なバランスを最適化または達成するヒト化置換またはヒト化置換の適切な組合せを選択することができる。
【００９６】
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、特に本発明のナノボディの別の特に好ましいクラスは、天然起源のＶＨドメインのアミノ酸配列に相当するが、「ラクダ化」された、すなわち、従来の４鎖抗体から得られた天然起源のＶＨドメインのアミノ酸配列における１つまたは複数のアミノ酸残基を、重鎖抗体のＶＨＨドメインにおける対応する位置（複数可）に存在するアミノ酸残基の１つまたは複数に置き換えることにより「ラクダ化」されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。本明細書において定義されている通り、このような「ラクダ化」置換は、好ましくは、ＶＨ−ＶＬの連結部を形成するおよび／またはそこに存在するアミノ酸位置におよび／またはいわゆるラクダ科に特徴的な残基に挿入される（たとえば、ＷＯ９４０４６７８を参照）。好ましくは、ラクダ化ナノボディを産生または設計するための出発材料または出発点として用いられるＶＨ配列は、好ましくは、哺乳動物由来のＶＨ配列、より好ましくは、ＶＨ３配列等のヒトのＶＨ配列である。しかし、本発明のこのようなラクダ化免疫グロブリン単一可変ドメインが、それ自体は公知の任意の適切な様式（すなわち、上記のポイント（１）−（８）に表示）で得られ、よって、出発材料として天然起源のＶＨドメインを含むポリペプチドを用いて得られたポリペプチドに厳密に限定されないことに留意されたい。
【００９７】
たとえば、「ヒト化」および「ラクダ化」は両者ともに、それぞれ天然起源のＶＨＨドメインまたはＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列を用意し、次に、新たなヌクレオチド配列が、それぞれ本発明の「ヒト化」または「ラクダ化」免疫グロブリン単一可変ドメインをコードするような仕方で、前記ヌクレオチド配列における１つまたは複数のコドンをそれ自体は公知の様式で変化させることによって行われ得る。次に、この核酸は、本発明の所望の免疫グロブリン単一可変ドメインを生じるようそれ自体は公知の様式で発現され得る。あるいは、それぞれ天然起源のＶＨＨドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸配列に基づき、それぞれ本発明の所望のヒト化またはラクダ化免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列が設計され、続いてそれ自体は公知のペプチド合成のための技法を用いて新規合成され得る。また、それぞれ天然起源のＶＨＨドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に基づき、それぞれ本発明の所望のヒト化またはラクダ化免疫グロブリン単一可変ドメインをコードするヌクレオチド配列が設計され、続いてそれ自体は公知の核酸合成のための技法を用いて新規合成され、その後、このようにして得られた核酸が、本発明の所望の免疫グロブリン単一可変ドメインを生じるようそれ自体は公知の様式で発現され得る。天然起源のＶＨ配列または好ましくはＶＨＨ配列から出発して、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／またはこれをコードする核酸を得るための他の適切な方法および技法は、当業者にとって明らかであり、たとえば、１つまたは複数の天然起源のＶＨ配列のうち１つまたは複数の部分（１つまたは複数のＦＲ配列および／またはＣＤＲ配列等）、１つまたは複数の天然起源のＶＨＨ配列のうち１つまたは複数の部分（１つまたは複数のＦＲ配列またはＣＤＲ配列等）および／または１つまたは複数の合成または半合成配列を、本発明のナノボディまたはこれをコードするヌクレオチド配列もしくは核酸を生じるよう適切な様式で組み合わせる段階を含むことができる。
【００９８】
本明細書で定義される免疫グロブリン単一可変ドメイン、特に本発明のナノボディの天然または合成のアナログ、変異体、変種、対立遺伝子、部分または断片（本明細書においてまとめて「バリアント」と称される）、特に、配列番号１−６（表２−３を参照）の免疫グロブリン単一可変ドメインのバリアントも、本発明の範囲内に収まるものである。よって、本発明の一実施形態によると、そのもっとも広い意義における用語「本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン」または「本発明のナノボディ」もこのようなバリアントを網羅する。一般に、このようなバリアントにおいて、１つまたは複数のアミノ酸残基は、本明細書において定義されている本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインと比較して置換、欠失および／または付加されていてよい。このような置換、挿入または欠失は、ＦＲのうち１つもしくは複数および／またはＣＤＲの１つもしくは複数において、特に、配列番号１−６の免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲおよびＣＤＲ（表２−３を参照）に相当する）のバリアントにおいてなされ得る。バリアントは、本明細書で使用される場合、それぞれのまたは任意のフレームワーク領域およびそれぞれのまたは任意の相補性決定領域が、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴ（５０、５１）などのアルゴリズムを利用することにより電子工学的に測定することが可能な場合、基準配列の対応する領域に少なくとも８０％同一性、好ましくは少なくとも８５％同一性、さらに好ましくは９０％同一性、さらにより好ましくは９５％同一性、またはいっそうさらに好ましくは９９％同一性を示す（すなわち、ＦＲ１＿バリアント対ＦＲ１＿基準、ＣＤＲ１＿バリアント対ＣＤＲ１＿基準、ＦＲ２＿バリアント対ＦＲ２＿基準、ＣＤＲ２＿バリアント対ＣＤＲ２＿基準、ＦＲ３＿バリアント対ＦＲ３＿基準、ＣＤＲ３＿バリアント対ＣＤＲ３＿基準、ＦＲ４＿バリアント対ＦＲ４＿基準）。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは国立バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に利用可能である。免疫グロブリン単一可変ドメインの１つ以上の配列のＣＤＲのアミノ酸配列のアミノ酸同一性の程度を決定するためには、フレームワーク領域を形成するアミノ酸残基は無視されることは理解される。同様に、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの１つ以上の配列のＦＲのアミノ酸配列のアミノ酸同一性の程度を決定するためには、相補性領域を形成するアミノ酸残基は無視される。免疫グロブリン単一可変ドメインのそのようなバリアントは、改良された効力／親和性を有し得るので特に有利になることがある。
【００９９】
非限定的な例によると、置換は、たとえば、保存的置換（本明細書に記載されている）であり得るおよび／またはアミノ酸残基は、別のＶＨＨドメインにおける同一位置における天然起源の別のアミノ酸残基に置き換えることができる。よって、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの特性を改善するまたは本発明のナノボディの所望の特性もしくはバランスもしくは所望の特性の組合せを少なくとも過度に損なう（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインがもはや目的の用途に適さなくなる程度まで）ことのない任意の１つまたは複数の置換、欠失もしくは挿入またはそれらの任意の組合せは、本発明の範囲内に包含されている。当業者は、一般に、本明細書における開示に基づき、場合によって、たとえば限られた数の可能な置換を導入し、このようにして得られた免疫グロブリン単一可変ドメインの特性におけるその影響の決定に関与し得る限られた程度のルーチン実験後に、適切な置換、欠失または挿入またはそれらの適切な組合せを決定および選択することができる。
【０１００】
特に好ましい実施形態によると、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインのバリアント、特にナノボディは、ＣＤＲのうちの１つ、２つまたは３つのいずれかにおいて１つ、２つまたは３つのアミノ酸の置換、欠失または挿入、さらに具体的には、（ｉ）ＣＤＲ１またはＣＤＲ２またはＣＤＲ３において、（ｉｉ）ＣＤＲ１およびＣＤＲ２において、またはＣＤＲ１およびＣＤＲ３において、またはＣＤＲ２およびＣＤＲ３において、（ｉｉｉ）ＣＤＲ１およびＣＤＲ２およびＣＤＲ３において１つ、２つまたは３つのアミノ酸の置換、欠失または挿入を有していてもよく、そのＣＤＲのアミノ酸配列は表３に収載されている通りである。さらに好ましくは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインのバリアント、特にナノボディは、ＣＤＲのうちの１つ、２つまたは３つのいずれかにおいて、さらに具体的には、表３に収載されている通りである、（ｉ）ＣＤＲ１またはＣＤＲ２またはＣＤＲ３において、（ｉｉ）ＣＤＲ１およびＣＤＲ２において、またはＣＤＲ１およびＣＤＲ３において、またはＣＤＲ２およびＣＤＲ３において、（ｉｉｉ）ＣＤＲ１およびＣＤＲ２およびＣＤＲ３において１つ、２つまたは３つのアミノ酸の保存的置換（本明細書において定義される）を有していてもよい。
【０１０１】
特定の実施形態によると、本発明は、以下の式（１）
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（１）
に従って、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含むアミノ酸配列であって、ＣＤＲ１は
ａ）配列番号１３−１８、
ｂ）配列番号１３−１８と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
ｃ）配列番号１３−１８と３つ、２つまたは１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド
からなる群から選択され、ＣＤＲ２は
ａ）配列番号２５−３０、
ｂ）配列番号２５−３０と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
ｃ）配列番号２５−３０と３つ、２つまたは１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド
からなる群から選択され、ＣＤＲ３は
ａ）配列番号３７−４２、
ｂ）配列番号３７−４２と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
ｃ）配列番号３７−４２と３つ、２つまたは１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【０１０２】
特に好ましい実施形態では、本発明は、以下の式（１）
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（１）
に従って、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含むアミノ酸配列であって、ＣＤＲ１は配列番号１３であり、ＣＤＲ２は配列番号２５であり、およびＣＤＲ３は配列番号３７であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【０１０３】
さらに、また、結合ドメイン、特に本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの発現に用いた宿主生物に応じて、欠失および／または置換は、当業者の能力の範囲内にある、１つまたは複数の翻訳後修飾のための部位（１つまたは複数の糖鎖付加部位等）が除去されるような仕方で設計され得る。あるいは、置換または挿入は、官能基（本明細書に記載されている）付着のための１つまたは複数の部位を導入するよう、たとえば、部位特異的ペグ化を可能にするよう設計され得る。
【０１０４】
修飾と、修飾され得る（すなわち、タンパク質骨格か、好ましくは側鎖のいずれかにおける）結合ドメイン、特に本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン内におけるアミノ酸残基、このような修飾の導入に用いられ得る方法および技法ならびにこのような修飾の潜在的な用途および利点の例は、当業者にとって明らかである。たとえば、そのような改変は、１つ以上の官能基、残基または部分を、特に本発明の結合ドメインに１つ以上の望ましい特性または機能性を与える１つ以上の官能基、残基または部分を結合ドメイン、特に本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン中にまたは上に導入すること（たとえば、共有結合によりまたは別の適切な方法で）を含んでいてもよい。このような官能基およびこれを導入するための技法の例は、当業者にとって明らかであり、当技術分野において言及されているあらゆる官能基および技法ならびに医薬品タンパク質の修飾のため、特に抗体または抗体断片（ＳｃＦｖおよび単一ドメイン抗体等）の修飾のためのそれ自体は公知の官能基および技法を一般に含むことができ、これに関し、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、ペンシルベニア州イーストン（１９８０）について記す。同様に当業者にとって明らかな通り、このような官能基は、たとえば、結合ドメイン、特に本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインに直接的に（たとえば共有結合により）連結されても、場合によって、適切なリンカーまたはスペーサーを介して連結されてもよい。半減期を増加および／または医薬品タンパク質の免疫原性を低下させるためにもっとも広く用いられている技法の一法は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはその誘導体（メトキシポリ（エチレングリコール）もしくはｍＰＥＧ等）等、適切な薬理学的に許容されるポリマーの付着を含む。一般に、本技術分野において抗体および抗体断片（（単一）ドメイン抗体およびＳｃＦｖ等が挙げられるが、これらに限定されない）に用いられるペグ化等、任意の適切な形態のペグ化が用いられ得る。たとえば、Ｃｈａｐｍａｎ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５４、５３１−５４５（２００２）；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ著、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４、４５３−４５６（２００３）、Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｓｓ著、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．、２、（２００３）およびＷＯ０４０６０９６５について記す。タンパク質のペグ化のための様々な試薬は、たとえば、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、米国から市販もされている。好ましくは、特にシステイン残基を介した部位特異的ペグ化が用いられる（たとえば、Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１６、１０、７６１−７７０（２００３）を参照）。たとえば、この目的のため、ＰＥＧが、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインにおける天然起源のシステイン残基に付着されていても、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインが、ＰＥＧの付着のための１つもしくは複数のシステイン残基を適切に導入するよう修飾されていてもまたはＰＥＧの付着のための１つもしくは複数��システイン残基を含むアミノ酸配列が、本発明のナノボディのＮおよび／またはＣ末端と融合されていてもよく、これらはすべて当業者にとってそれ自体は公知のタンパク質工学の技法を用いる。好ましくは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインのため、分子量が１０，０００を超える等、５０００を超え、１００，０００未満等、２００，０００未満である、たとえば、２０，０００−８０，０００範囲のＰＥＧが用いられる。また、通常、より好ましくない修飾として、通常、同時翻訳および／または翻訳後修飾の一部としての、結合ドメイン、特に本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの発現に用いた宿主細胞に応じたＮ結合型またはＯ結合型糖鎖付加が挙げられる。結合ドメインの半減期を増加させるための別の技法は、二官能性結合ドメイン（たとえば、一方の免疫グロブリン単一可変ドメインは標的ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に対し、もう一方はアルブミン等の血清タンパク質に対する）またはペプチド（たとえば、アルブミン等の血清タンパク質に対するペプチド）と結合ドメイン、特に免疫グロブリン単一可変ドメインの融合体への操作を含み得る。
【０１０５】
さらに別の修飾は、標識結合ドメインの目的の用途に応じて、１つもしくは複数の検出可能な標識または他のシグナル発生基もしくは部分の導入を含み得る。適切な標識ならびにこれを付着、使用および検出するための技法は、当業者にとって明らかであり、たとえば、インビボ、インビトロまたはインサイチュ診断および画像処理における使用に特に適した蛍光標識（フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレサミンならびにＥｕまたはランタニド系列由来の他の金属等の蛍光金属等）、リン光標識、化学発光標識または生物発光標識（ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ  ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ジオキセタンまたはＧＦＰおよびそのアナログ等）、放射性同位元素、金属、金属キレートもしくは金属陽イオンまたは他の金属もしくは金属陽イオンならびに発色団および酵素（リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイド異性化酵素、酵母アルコール脱水素酵素、アルファ−グリセロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸異性化酵素、ビオチンアビジンペルオキシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース酸化酵素、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−ＶＩ−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ等）が挙げられるが、これらに限定されない。他の適切な標識は、当業者にとって明らかであり、たとえば、ＮＭＲまたはＥＳＲ分光測定を用いて検出され得る部分を包含する。このような本発明の標識結合ドメインは、たとえば、特異的標識の選択に応じて、インビトロ、インビボまたはインサイチュアッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡおよび他の「サンドイッチアッセイ」等、それ自体は公知のイムノアッセイ等）ならびにインビボ診断および画像処理目的に用いられ得る。当業者にとって明らかな通り、たとえば、上に記す金属または金属陽イオンの１つをキレート化するための別の修飾が、キレート化基の導入に関与し得る。適切なキレート化基として、たとえば、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が限定されることなく挙げられる。さらに別の修飾は、ビオチン−（ストレプト）アビジン結合ペア等、特異的結合ペアの一部分である官能基の導入を含み得る。このような官能基は、結合ペアのもう半分と結合している別のタンパク質、ポリペプチドまたは化学物質と本発明の結合ドメインとの、すなわち結合ペアの形成による連結に用いられ得る。たとえば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、ビオチンとコンジュゲートされて、アビジンまたはストレプトアビジンとコンジュゲートした別のタンパク質、ポリペプチド、化合物または担体と連結され得る。たとえば、このようなコンジュゲートされた免疫グロブリン単一可変ドメインは、たとえば、検出可能シグナル発生薬剤が、アビジンまたはストレプトアビジンとコンジュゲートされた��断システムにおけるレポーターとして用いられ得る。このような結合ペアは、たとえば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインと製薬目的に適した担体等の担体との結合にも用いられ得る。非限定的な一例は、Ｃａｏ  ａｎｄ  Ｓｕｒｅｓｈ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ、８、４、２５７（２０００）によって記載されたリポソーム製剤である。このような結合ペアは、治療上有効な薬剤と本発明の結合ドメインとの連結に用いることもできる。
【０１０６】
「多価」形態であり、２つ以上の一価免疫グロブリン単一可変ドメインを化学的にまたは組換えＤＮＡ技法により一緒に結合させることによって形成される本発明の結合ドメイン、特に免疫グロブリン単一可変ドメインも本発明の範囲内に包含される。多価構築物の非限定的例には、「二価」構築物、「三価」構築物、「四価」構築物などが含まれる。多価構築物内に含まれる免疫グロブリン単一可変ドメインは同一でも異なっていてもよい。別の特定の実施形態では、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは「多重特異的」形態であり、その少なくとも１つが異なる特異性を有する２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを一緒に結合することにより形成される。多重特異的構築物の非限定的例には、「二重特異的」構築物、「三重特異的」構築物、「四重特異的」構築物などが含まれる。これをさらに説明するならば、本発明の任意の多価または多重特異的（本明細書において定義されている）免疫グロブリン単一可変ドメインは、同じ抗原上の２つ以上の異なるエピトープに、たとえば、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に含まれるＧタンパク質の２つ以上の異なる部分に適切に対して作製されていてもよいし、または２つ以上の異なる抗原に、たとえば、ＧＰＣＲのエピトープとＧタンパク質のエピトープに対して作製されていてもよい。特に、本発明の一価免疫グロブリン単一可変ドメインは、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、さらに好ましくは５００ｐＭ未満などの１０ｎＭ未満の親和性で標的ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体（本明細書に記載される）に結合することになるようなドメインである。本発明の多価または多重特異性免疫グロブリン単一可変ドメインは、所望のＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に対して、および／またはそのような多価もしくは多重特異性免疫グロブリン単一可変ドメインの使用により得られる任意の他の所望の特性もしくは所望の特性の組合せに対して増加した結合活性および／または改善した選択性を有していても（または、それらのために操作されるおよび／もしくは選択されても）よい。
【０１０７】
さらに、本発明の結合ドメイン、特に本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含む複合体が表すまたは前記複合体上で接近可能であるまたは前記複合体の一部である任意の立体構造エピトープに対して一般に作製しまたは特異的に結合することができる。「三次元」エピトープまたは「立体構造」エピトープに特異的に結合する結合ドメインは、折り畳まれたタンパク質またはタンパク質複合体の三次または四次構造に特異的に結合する結合ドメインである。そのような結合ドメインは、線形（すなわち、折り畳まれていない、変性）ポリペプチド鎖にはずっと減少した（すなわち、少なくとも２、５、１０、５０または１００倍低い）親和性で結合する。そのような結合ドメインが結合する構造は通常、タンパク質（複合体）の線形配列において非連続的であるアミノ酸を含有する。言い換えると、そのような結合ドメインのポリペプチドへの結合は、前記ポリペプチドが特定の三次元立体構造に折り畳まれていることに依存している。本発明の結合ドメインにより選択的に認識される立体構造エピトープは、ＧＰＣＲ特異的エピトープ、またはＧタンパク質特異的エピトープ、またはそうでなければＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体特異的エピトープになることがあり、これらのエピトープは構成しているタンパク質が会合して、したがって前記ＧＰＣＲと前記Ｇタンパク質のアミノ酸残基を結合することによって初めて形成されることは明らかなはずである。一実施形態では、本発明の結合ドメイン、特に免疫グロブリン単一可変ドメインは、任意の所望のＧタンパク質またはその部分のどんな立体構造エピトープにでも特異的に結合する。別の実施形態では、前記立体構造エピトープは任意の所望のＧＰＣＲの細胞内もしくは細胞外領域の一部、または膜内領域、またはドメインもしくはループ構造になることがある。これらの立体構造エピトープの一部は非会合形態のＧＰＣＲおよび／またはＧタンパク質において接近可能になり、他の立体構造エピトープは複合体が形成された後においてのみ接近可能になることは明らかである。一特定の実施形態によると、本発明の結合ドメイン、特に免疫グロブリン単一可変ドメインは、本明細書においてさらに非限定的例として特定されるように、Ｇタンパク質のαとβサブユニット間の界面で立体構造エピトープに特異的に結合する（実施例のセクションを参照）。
【０１０８】
他の特定の実施形態によると、前記結合ドメインは、Ｇタンパク質がその無ヌクレオチド形態であるＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に結合する。追加の特定の実施形態によると、本発明の結合ドメイン、特に免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヌクレオチド、特にＧＤＰもしくはＧＴＰなどのグアニンヌクレオチド、またはＧＴＰγＳなどの非加水分解性ＧＴＰアナログ、もしくはフッ化アルミニウムもしくはフッ化ベリリウム種と組み合わされたＧＤＰ、もしくはピロリン酸もしくはホスカルネットなどの最小ヌクレオチドアナログなどのそれらのアナログの存在下でのＧＰＣＲ：Ｇタンパク質の解離を阻害するまたは防ぐ。本発明の結合ドメインの非存在下では、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の解離はこれらのヌクレオチドの存在下で普通に起こる。
【０１０９】
一特定の態様によると、本発明は、Ｇタンパク質（すなわち、Ｇタンパク質単独、したがってＧＰＣＲと複合体を形成していない）に対して作製されまたは特異的に結合する結合ドメインも提供する。特定の実施形態では、本明細書に記載される結合ドメインは、Ｇタンパク質に対して作製されるおよび／または特異的に結合する。この態様の特定の実施形態によると、本発明の結合ドメインは、ヌクレオチド、特にグアニンヌクレオチドまたはアナログ（上文に記載されている）のＧタンパク質への結合を防ぐまたは阻害する。または、本発明の結合ドメインは、Ｇタンパク質からグアニンヌクレオチドまたはアナログを置換することもできる。グアニンヌクレオチドのタンパク質への結合または置換の阻害の程度を決定するアッセイの非限定的例は、実施例のセクション、たとえば、実施例３および８に与えられている。さらに、本発明の結合ドメインに関連する特定の実施形態はすべて、上文に記載されるように、本発明のこの特定の態様についても当てはまることは理解される。
【０１１０】
ＧＰＣＲの機能的多用途性は、広範な立体構造を生じるこれらのタンパク質の柔軟性と固有に連動している。立体構造エネルギー景観は、結合リガンド（エフェクター分子、アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニスト等）の存在、脂質環境または相互作用タンパク質の結合などの要因と内因的に連動している。したがって、一実施形態では、本発明の結合ドメイン、特に免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含む複合体の安定性を、前記結合ドメインが結合すると増加する。さらに追加の実施形態では、本発明の結合ドメインが、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体を含む複合体が表すまたは前記複合体上で接近可能であるまたは前記複合体の一部であるいずれかの立体構造エピトープに結合すると、ＧＰＣＲの機能的立体構造状態、特に前記ＧＰＣＲの活性立体構造状態の形成が誘導される。さらに具体的には、本発明の結合ドメインは、受容体に対するＧタンパク質の親和性を増加することにより、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に含まれるＧＰＣＲの活性状態を安定化することができる。同様に、本発明の結合ドメインは、アゴニスト結合ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体を安定化することができるおよび／またはＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に対するアゴニストの親和性を増強する。好ましくは、結合ドメインはＧＰＣＲに対するＧタンパク質の親和性および／またはＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に対するアゴニストの親和性を、Ｋｄの減少により測定した場合、少なくとも２倍、少なくとも５倍、さらに好ましくは少なくとも１０倍増加することができる。代わりに、結合ドメインは、この結合ドメインが非存在である条件と比べて複合体安定化結合ドメインの存在下での受容体とＧタンパク質の相互作用強度を比較する任意のアッセイ装置または当業者に公知の親和性もしくは効力の他のいかなる基準においても、ＥＣ５０またはＩＣ５０の変化を少なくとも２倍、少なくとも５倍、さらに好ましくは少なくとも１０倍誘導することができる。
【０１１１】
用語「機能的立体構造状態」とは、本明細書で使用される場合、タンパク質、特にＧＰＣＲなどの膜タンパク質が、特に活性なしから最大活性までに及ぶ動的活動範囲を有する多くの異なる立体構造状態を有するという事実のことである（ＫｏｂｉｌｋａおよびＤｅｕｐｉ、２００７年により概説されている）。「機能的立体構造状態」は、タンパク質の変性状態を網羅するようには意図されていないことは明らかであるはずである。たとえば、基本的立体構造状態は、リガンドの非存在下での受容体の低エネルギー状態として定義することができる。タンパク質が別の立体構造状態への遷移を受ける確率は、２つの状態間のエネルギー差と２つの状態間のエネルギー障壁の高さの関数である。ＧＰＣＲなどの受容体タンパク質の場合、リガンド結合のエネルギーは、２つの状態間のエネルギー障壁を変えるため、もしくは２つのエネルギー間の相対的エネルギーレベルを変えるために、またはその両方のために使用することができる。エネルギー障壁を変えれば、２つの状態間の遷移速度に影響を与えると考えられ、エネルギーレベルを変えれば２つの状態における受容体の平衡分布に影響を与えると考えられる。アゴニストまたは部分的アゴニストが結合すれば、エネルギー障壁を下げるおよび／または不活性立体構造状態と比べてより活性の高い立体構造状態のエネルギーを減少させると考えられる。インバースアゴニストであれば、エネルギー障壁を増加させるおよび／または活性立体構造と比べて不活性状態立体構造のエネルギーを減少させると考えられる。受容体とそのＧタンパク質の共役はエネルギー景観をさらに変化させ得る。リガンド結合アッセイにおいて観察されるβ２ＡＲとＧｓの協調的相互作用によりＧＰＣＲ活性化の三元複合体モデルの基礎が形成された（Ｄｅｌｅａｎら、１９８０年）。アゴニスト、受容体およびＧタンパク質からなる三元複合体では、アゴニストに対する受容体の親和性が増強され、グアニンヌクレオチドに対するＧタンパク質の特異性はＧＤＰよりもＧＴＰの方に有利に変化する。
【０１１２】
ＧＰＣＲを含む膜内在性タンパク質の活動は、膜内で前記タンパク質を取り囲む脂質分子の構造によっても影響を与えられることは注目すべきである。膜タンパク質は固い実体ではなく、変形して周囲を取り囲む脂質二重層に対する良好な疎水性適合を確保する。１つの重要なパラメータは、脂質脂肪アシル鎖の長さにより定義される脂質二重層の疎水性の厚みである。脂質頭部領域の構造も、膜タンパク質のうちの脂質頭部領域に位置する部分の構造を定義するのに重要である可能性がある。他の脂質の中で、パルミトイル化およびＧＰＣＲへのコレステロールの結合は単量体受容体内部で構造的役割も果たし、受容体オリゴマーの形成／安定化に寄与している可能性がある（Ｌｅｅ  ２００４年；ＣｈｉｎｉおよびＰａｒｅｎｔｉ  ２００９年）。
【０１１３】
本発明の追加の態様は、本発明の結合ドメインを含む複合体に関する。さらに具体的には、本発明の結合ドメイン、ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質、および場合によって受容体リガンドを含む複合体が提供される。非限定的例として、たとえば、ナノボディ、ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質および受容体リガンドを含有する四元複合体について実行されたように、安定な複合体はゲル濾過により精製し得る（実施例のセクションを参照）。特定の実施形態では、前記複合体は結晶であり得る。したがって、前記複合体の結晶、ならびに前記結晶を作製する方法も提供され、さらに本明細書においてさらに詳細に説明される。
【０１１４】
別の態様では、本発明の結合ドメイン、特に免疫グロブリン単一可変ドメインのいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸配列も本発明の一部であり、非限定的例が表４に与えられている。好ましい実施形態によると、本発明は、本発明の結合ドメイン、特に免疫グロブリン単一可変ドメインの核酸配列であって、配列番号４９−５４の結合ドメインの核酸配列（表４を参照）のうちの少なくとも１つの配列に８０％を超える、好ましくは９０％を超える、さらに好ましくは９９％以上などの９５％を超える配列同一性（本明細書において定義されている）を有する核酸配列に関する。割合配列同一性の計算では、タグ（たとえば、ＨｉｓタグまたはＥＰＥＡタグ）の核酸配列は無視されるべきである。その上、本明細書に記載される核酸配列が核酸配列に含まれることもある。
【０１１５】
さらに、本発明は、本発明の結合ドメイン、特に免疫グロブリン単一可変ドメインのいずれかをコードする核酸配列を含む発現ベクター、ならびにそのような発現ベクターを発現する宿主細胞も想定している。適切な発現系には、細菌もしくは酵母における構成的誘導性発現系、バキュロウイルス、セムリキ森林ウイルスおよびレンチウイルスなどのウイルス発現系、または昆虫もしくは哺乳動物細胞における一過性トランスフェクションが含まれる。本発明の結合ドメイン、特に免疫グロブリン単一可変ドメインのクローニング、発現および／または精製は、当業者に公知の技法に従って実行することが可能である。
【０１１６】
したがって、本発明は、ＧＰＣＲとＧタンパク質を含む複合体に対して作製されたおよび／または特異的に結合することができる本発明の結合ドメイン、特に免疫グロブリン単一可変ドメインを発現する細胞または細胞の培養物を包含する。本発明に従った細胞は、原核または真核生物のいずれでも可能である。好ましくは、対象のＧＰＣＲおよび／またはＧタンパク質を内因的にまたは組換え的に発現する真核細胞、たとえば、酵母細胞もしくは昆虫細胞、または培養細胞株、たとえば、哺乳動物細胞株、好ましくはヒト細胞株である。使用される細胞の性質は典型的には、天然タンパク質（複数可）を産生する容易さおよび経費、所望のグリコシル化特性、標的タンパク質の起源、意図される適用、またはそれらの任意の組合せに依存することになる。タンパク質産生のための真核細胞または改変されたグリコシル化経路を有する細胞株を含む細胞株は当技術分野では周知であり、非限定的例はこの後与えられることになる。
【０１１７】
それに続く単離および／または精製のためにタンパク質を宿す、発現および産生するのに適した動物または哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＤＧ４４（Ｃｈａｓｉｎら、１９８６年、Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．、１２：５５５−５５６；およびＫｏｌｋｅｋａｒら、１９９７年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６：１０９０１−１０９０９）、ＣＨＯ−Ｋ１  Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＥＣＡＣＣ  ８５０５０３０２と命名されたＣＨＯ（ＣＡＭＲ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ）、ＣＨＯクローン１３（ＧＥＩＭＧ、Ｇｅｎｏｖａ、ＩＴ）、ＣＨＯクローンＢ（ＧＥＩＭＧ、Ｇｅｎｏｖａ、ＩＴ）、ＥＣＡＣＣ  ９３０６１６０７と命名されたＣＨＯ−Ｋ１／ＳＦ（ＣＡＭＲ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ）、ＥＣＡＣＣ  ９２０５２１２９と命名されたＲＲ−ＣＨＯＫ１（ＣＡＭＲ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ陰性ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／−ＤＨＦＲ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、１９８０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６）およびｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（米国特許第５，７２１，１２１号）などのチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）；ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１）；ヒト胎児由来腎臓細胞（たとえば、２９３細胞、または２９３Ｔ細胞、または懸濁培養における増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、１９７７年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９、またはＧｎＴＩ  ＫＯ  ＨＥＫ２９３Ｓ細胞、Ｒｅｅｖｅｓら  ２００２年、ＰＮＡＳ、９９：１３４１９）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７；ＶＥＲＯ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、１９８０年、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３−２５１）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７５）；ヒト肝癌細胞（ＨＥＰ−Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−５１）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４４２）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ、１９８２年、Ａｎｎａｌｓ  ＮＹＡｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３：４４−６８）；ＭＣＲ  ５細胞；ＦＳ４細胞が含まれる。特定の実施形態によると、細胞はＨｅｋ２９３細胞またはＣＯＳ細胞から選択される哺乳動物細胞である。
【０１１８】
例となる非哺乳動物細胞株には、Ｓｆ９細胞、バキュロウイルス昆虫細胞系（たとえば、総説Ｊａｒｖｉｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３１０巻、１号、２００３年５月２５日、１−７頁）、タバコ細胞、トマト細胞、トウモロコシ細胞、藻類細胞などの植物細胞、またはサッカロマイセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、シゾサッカロマイセス属種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、ハンゼヌラ属種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、ヤロウイア属種（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）もしくはピキア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）などの酵母が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態によると、真核細胞は、サッカロマイセス属種（たとえば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、シゾサッカロマイセス属種（たとえば、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ））、ハンゼヌラ属種（たとえば、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））、ヤロウイア属種（たとえば、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））、クルイベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）（たとえば、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ））、ピキア属種（たとえば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））、またはコマガタエラ属種（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）（たとえば、コマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））由来の酵母細胞である。特定の実施形態によると、真核細胞はピキア細胞であり、非常に特定の実施形態では、ピキア・パストリス細胞である。
【０１１９】
標的細胞（たとえば、哺乳動物細胞）のトランスフェクションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、３巻、第１６章、第１６．１−１６．５４節）によって概要を述べられた原理に従って行われ得る。さらに、ウイルス形質導入は、アデノウイルスベクター等の試薬を用いても行われ得る。適切なウイルスベクター系、調節領域および宿主細胞の選択は、当業者の技能範囲レベル内の周知の知識である。得られたトランスフェクト細胞は、一般慣例に従って培養において維持されるまたは後に用いるために凍結される。
【０１２０】
したがって、本発明の別の態様は、本発明に従って結合ドメインを産生するための方法であって、少なくとも
ａ）適切な細胞発現系（上文に定義されている）において本発明に従った核酸を発現させる段階、および場合によって
ｂ）前記結合ドメインを単離および／または精製する段階
を含む方法に関する。
【０１２１】
本明細書に記載される結合ドメイン、複合体、細胞または細胞株は、種々の状況および適用において、たとえば、制限なしに、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体を捕捉および／または精製するために、ならびにＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の結晶化研究および高分解能構造解析において使用することが可能である。したがって、本発明に従った結合ドメイン、特にナノボディなどの免疫グロブリン単一可変ドメインをＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体を安定化させるツールとして使用する、さらにこれらの結合ドメインをＧタンパク質と複合体を形成したＧＰＣＲの共結晶化補助として、または言い換えると、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の結晶生成を促進するために使用することが本発明の目的の１つである。さらにおよび／または代わりに、本明細書に記載される結合ドメイン、好ましくは結合ドメインを発現する細胞系は、リガンドスクリーニング、創薬、免疫化などの他の適用に有用であることが可能であり、これらの適用はすべて下においてさらに詳細に説明されることになる。
【０１２２】
ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の安定化およびＧＰＣＲをＧタンパク質結合状態にロックする
したがって、一態様によると、本発明は、ＧＰＣＲとＧタンパク質を含む複合体を安定化するための上文に記載される結合ドメインの使用に関する。好ましい実施形態によると、安定化される複合体は、受容体リガンド、さらに具体的にはアゴニストをさらに含む。用語「安定化する（ｓｔａｂｉｌｉｚｅ）」、「安定化する（ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ）」または「安定性を増す（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）」とは、本明細書で使用される場合、前記複合体の構成タンパク質、特にＧＰＣＲおよび／またはＧタンパク質のうちの１つまたは両方の構造（立体構造状態）および／または特定の生物活性（細胞内シグナル伝達活性）に関してＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の安定性を増加することである。一特に好ましい実施形態では、本発明の結合ドメインを使用して、ＧＰＣＲが活性またはＧタンパク質結合状態にロックされるまたは固定されるように、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体を安定化することができる。そのような活性またはＧタンパク質結合状態をとるＧＰＣＲは事実上その生物活性を発揮することになる。ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の（増加した）安定性を決定する方法は、上文に記載されており、実施例のセクションでさらに説明される。
【０１２３】
ＧＰＣＲの構造および／または特定の生物活性に関して増加した安定性を有することは、熱、界面活性剤、カオトロピック剤および極端なｐＨを含む他の変性剤または変性条件に対する安定性を含むことは認識される。したがって、追加の実施形態では、本発明に従った結合ドメインは、とりわけ、希釈、濃縮、バッファー組成、加熱、冷却、凍結、界面活性剤、カオトロピック剤、ｐＨにより誘発される非生理的条件下でＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の安定性を増加することができる。したがって、用語「熱安定化する（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｚｅ）」、「熱安定化する（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ）」、「の熱安定性を増加する（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ）」とは、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の熱力学的特性というよりむしろ機能的特性のことであり、加熱、冷却、凍結、化学変性剤、ｐＨ、界面活性剤、塩、添加剤、プロテアーゼまたは温度を含むがこれらに限定されない熱的および／または化学的アプローチにより誘発される不可逆的変性に対する構成タンパク質の抵抗性のことである。不可逆的変性により、タンパク質の機能的立体構造は不可逆的にアンフォールディングされ、変性されたタンパク質は生物活性を失い凝集する。用語「（熱）安定化する（（ｔｈｅｒｍｏ）ｓｔａｂｉｌｉｚｅ）」、「（熱）安定化する（（ｔｈｅｒｍｏ）ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ）」、「の（熱）安定性を増加する（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  （ｔｈｅｒｍｏ）ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ）」とは、本明細書で使用される場合、脂質粒子または脂質層（たとえば、脂質単層、脂質二重層など）に包埋しているＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に、および界面活性剤中に可溶化されているＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に当てはまる。
【０１２４】
熱に対する増加した安定性に関して、これは、リガンド結合を測定することによりまたは漸増する温度でのアンフォールディングに感受性である蛍光、ＣＤまたは光散乱などの分光法を使用することにより容易に決定することができる。結合ドメインは、少なくとも２℃、少なくとも５℃、少なくとも８℃、さらに好ましくは少なくとも１０℃または１５℃または２０℃でのＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の熱安定性の増加により測定される安定性を増加することができることが好ましい。別の好ましい実施形態によると、結合ドメインは、受容体リガンド、さらに具体的にはＧＰＣＲ依存性シグナル伝達経路のアゴニストまたは陽性アロステリックモジュレーターを有するＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の熱安定性を増加することができる。別の好ましい実施形態によると、本発明に従った結合ドメインは、界面活性剤またはカオトロープの存在下でＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の安定性を増加することができる。好ましくは、結合ドメインは熱的または化学的アプローチによる誘発される変性に対するＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の安定性を増加することができる。熱、界面活性剤またはカオトロープに対する増加した安定性に関して、典型的にはＧＰＣＲ：Ｇタンパク質は、試験界面活性剤または試験カオトロピック剤の存在下で規定された時間インキュベートされ、その安定性は、たとえば、上で考察されたように、場合によって漸増する温度でリガンド結合または分光法を使用して決定される。さらに別の好ましい実施形態によると、本発明に従った結合ドメインは、極端なｐＨに対するＧＰＣＲの機能的立体構造状態の安定性を増加することができる。好ましくは、結合ドメインは極端なｐＨに対するＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の安定性を増加することができる。極端なｐＨに関して、典型的なｐＨ試験は、たとえば、６から８の範囲、５．５から８．５の範囲、５から９の範囲、４．５から９．５の範囲で、さらに具体的には、４．５から５．５の範囲で（低ｐＨ）または８．５から９．５の範囲で（高ｐＨ）選択されることになる。
【０１２５】
特に好ましい実施形態では、本発明に従った結合ドメインを使用して、ヌクレオチド、特にグアニンヌクレオチドまたはそのアナログの存在下での前記複合体の解離を防ぐことができる。さらに具体的には、グアニンヌクレオチドには、ＧＤＰおよびＧＴＰが含まれ、グアニンヌクレオチドのアナログには、限定的ではなく、ＧＴＰγＳまたはフッ化アルミニウムもしくはフッ化ベリリウム種と組み合わせたＧＤＰまたはピロリン酸もしくはホスカルネットなどのヌクレオチド断片が含まれる。
【０１２６】
ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体を捕捉および／または精製する
したがって、安定なＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体を形成する能力はＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体を捕捉および／または精製するのに特に有用であり、これにより、とりわけ、それに続く結晶化、リガンド特徴付けおよび化合物スクリーニング、免疫化が可能になることは理解される。さらに、本発明の結合ドメインが、広範囲のＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に適用可能であり得る有用な一般的ツールになることができるのは特に有利である。
【０１２７】
したがって、本発明は、ＧＰＣＲとＧタンパク質を含む複合体を捕捉および／または精製する方法であって、
ａ）本発明に従った結合ドメインを用意する段階、
ｂ）結合ドメインをＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含む複合体に結合させる段階、ならびに
ｃ）場合によって、段階ｂ）で形成された複合体を単離する段階
を含む方法も想定している。
【０１２８】
特定の実施形態では、本発明はＧＰＣＲとＧタンパク質を含む複合体を捕捉する方法であって、
ａ）複数のＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含有する溶液を、本発明に従った固定化された結合ドメインを有する固体支持体に適用する段階、
ｂ）結合ドメイン、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質の複合体を形成する段階、ならびに
ｃ）弱く結合しているまたは非結合の分子を取り除く段階
を含む方法を提供する。
【０１２９】
本発明は、ＧＰＣＲとＧタンパク質を含む複合体を精製する方法であって、
ａ）ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含有する溶液を、本発明に従った結合ドメインに接触させる段階、
ｂ）結合ドメイン、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含む複合体を形成する段階、ならびに
ｃ）段階ｂ）の複合体を単離する段階
を含み、ＧＰＣＲとＧタンパク質の複合体が基本的に精製されている、
方法も想定している。
【０１３０】
特定の実施形態によると、本明細書に記載される結合ドメインを使用して、受容体リガンドおよび／または１つ以上の他の相互作用タンパク質をさらに含む標的ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体を捕捉することもできる。
【０１３１】
標的ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体を捕捉する／精製するための上記方法には、制限なしに、とりわけ、親和性クロマトグラフィー、親和性精製などの親和性ベースの方法、免疫沈降、タンパク質検出、免疫化学、表面ディスプレイが含まれ、すべてが当技術分野では周知である。
【０１３２】
ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の結晶化およびこの構造の解明
ＧＰＣＲを含む膜タンパク質の結晶化は依然として手強い課題である。ミリグラム量の生成を可能にする発現および精製法が現れてきているが、これらの分子の安定性を達成するのはおそらく克服するのがもっとも困難な障害物である。
【０１３３】
第一に、本発明による結合ドメインは、界面活性剤で可溶化したＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の安定性を増大させ、この受容体をタンパク質分解および／または凝集から保護し、正しく折り畳まれたタンパク質の均一な試料の精製および濃縮を促進することができる。当業者であれば、そのような試料は回折結晶の生成のための好まれる出発点であることを認識する。
【０１３４】
結晶化は、Ｘ線結晶学による巨大分子構造決定のプロセスにおけるもう１つの大きな障害である。結晶化の成功には、核の形成およびこれに続く適切な大きさの結晶へのその成長が必要である。結晶成長は一般に、同種の核形成の結果として過飽和溶液中で自然に起こる。タンパク質は典型的な低密度マトリックススクリーニング実験において結晶化することができ、この実験において沈殿剤、添加剤およびタンパク質濃度が広範にサンプリングされ、核形成と結晶成長に適した過飽和条件を特定のタンパク質について同定することが可能である。たとえば、タンパク質に結合するリガンドを添加することによりまたは優先的に標的タンパク質の表面残基において異なる変異体を作製することによりまたは標的タンパク質の異なる種のオルソログの結晶化を試みることにより、タンパク質それ自体において構造変異を生み出すことは低密度マトリックススクリーニングアプローチに関係している（Ｃｈａｎｇ  １９９８）。本発明の１つの思いがけない発見は、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に特異的に結合して、複合体の全体的フォールドは保存しつつ結合にある程度の構造変異を導入する、結合ドメインの有用性である。
【０１３５】
結晶化は、結晶格子に組み立てられる分子における立体構造エントロピーの好ましくない喪失を伴うために、まだ溶液のまま標的の立体構造エントロピーを減少させる方法は、格子形成の正味のエントロピーペナルティを低下させることにより結晶化の尤度を増強するはずである。「表面エントロピー減少」アプローチは極めて効果的であることが判明している（Ｄｅｒｅｗｅｎｄａ  ２００４）。同様に、イオン、小分子リガンドおよびペプチド等の結合パートナーは、タンパク質の立体構造状態のサブセットに結合して安定化させることにより立体構造不均一性を減少させることができる。そのような結合パートナーは効果的ではあるが、すべてのタンパク質が既知の結合パートナーを有しているわけではなく、結合パートナーが既知の場合でも、その親和性、溶解性および化学的安定性は結晶化の試みと両立しないこともある。したがって、驚くべきことに、本発明の結合ドメインは、Ｇタンパク質の具体的な立体構造に結合することにより標的ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体における立体構造不均一性を最小限に抑えることによって秩序だった結晶を得る可能性を増加させるツールとして使用することが可能であることが見出された。
【０１３６】
高分解能構造研究のためのＧＰＣＲの結晶化は、これらの膜タンパク質の両親媒性表面のせいで特に困難である。膜二重層に埋め込まれているので、リン脂質のアシル鎖とのタンパク質の接触部位は疎水性であり、極曲面は脂質の極性頭部および水相に曝露されている。秩序だった三次元結晶、つまり高分解能でのＸ線構造解析の必要条件を得るために、ＧＰＣＲは界面活性剤の助けを借りて可溶化され、タンパク質−界面活性剤複合体として精製される。界面活性剤ミセルは膜タンパク質の疎水性表面を帯状の様式で覆う（Ｈｕｎｔｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈｅｌ  ２００２；Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら、１９９５）。ＧＰＣＲ−界面活性剤複合体は、隣接するタンパク質分子間の接触が界面活性剤ミセルから突出しているタンパク質の極曲面により作られる三次元結晶を形成する（Ｄａｙら、２００７）。明らかに、界面活性剤ミセルには結晶格子における空間が必要である。ミセル間の引力相互作用は結晶パッキングを安定化する可能性はあるが（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２００７；Ｄｕｎｎら、１９９７）、これらの相互作用は強固な結晶接触をもたらさない。ＧＰＣＲを含む多くの膜タンパク質が比較的小さなまたは高度に柔軟な親水性ドメインを含有しているので、秩序だった結晶を得る可能性を増加させるための戦略は、タンパク質の極曲面を拡大するおよび／またはその柔軟性を減少させることである。もっとも生理的なアプローチは、Ｇタンパク質またはアレスチンなどの天然のシグナル伝達パートナーを使用することである。不運なことに、ＧＰＣＲとＧタンパク質またはアレスチンとの相互作用は高度に脂質依存性であり、結晶学のための十分安定な複合体を形成することは困難であった。したがって、本発明の結合ドメインを使用すれば、Ｇタンパク質との結合によってＧＰＣＲの極曲面を拡大し、Ｇタンパク質およびナノボディの極曲面によって結晶格子中の分子間の一次接触を促進することができるタンパク質表面の量を補うことが可能である。本発明の結合ドメインは、その細胞外領域の柔軟性を減少させて秩序だった結晶を成長させることも可能である。ナノボディを含む免疫グロブリン単一可変ドメインは、立体構造エピトープに結合しており、単一の強固な球状ドメインで構成されており、従来の抗体またはＦａｂ’等の断片由来とは違って柔軟なリンカー領域を欠くために、この目的には特に適している。
【０１３７】
したがって、好ましい実施形態によると、本発明は、ＧＰＣＲとＧタンパク質を含む複合体を結晶化し、最終的にはその構造を解明するためのツールとして有用な結合ドメインを提供する。さらに好ましくは、本発明の結合ドメインを利用することにより結晶化される複合体は、受容体リガンド、さらに具体的には、アゴニストをさらに含む。特に好ましい実施形態では、複合体に含まれるＧＰＣＲは活性状態または立体構造である。
【０１３８】
したがって、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体および場合によって受容体リガンドと複合体を形成している結合ドメインは、膜タンパク質のための種々の特殊化した結晶化法のいずれを使用して結晶化してもよく、前記方法の多くはＣａｆｆｒｅｙ（２００３＆２００９）に概説されている。一般的には、前記方法は結晶化に先立って脂質を複合体に添加することを含む脂質ベースの方法である。そのような方法は、他の膜タンパク質を結晶化するために既に使用されてきた。脂質立方相結晶化法およびバイセル（ｂｉｃｅｌｌｅ）結晶化法を含む、これらの方法の多くが脂質と界面活性剤の自然な自己組織化特性を小胞（小胞融合法）、円盤状ミセル（バイセル法）および液体結晶または中間相（中間または立方相法）として利用する。脂質立方相結晶化法は、たとえば、Ｌａｎｄａｕら、１９９６；Ｇｏｕａｕｘ  １９９８；Ｒｕｍｍｅｌら、１９９８；Ｎｏｌｌｅｒｔら、２００４、Ｒａｍｕｓｓｅｎら、２０１１に記載されており、これら出版物はそれらの方法の開示について参照により組み込まれる。バイセル結晶化法は、たとえば、Ｆａｈａｍら、２００５；Ｆａｈａｍら、２００２に記載されており、これら出版物はそれらの方法の開示について参照により組み込まれる。
【０１３９】
別の実施形態によると、本発明は、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含み、場合によってさらに受容体リガンドを含む標的複合体の構造を解明するために本明細書に記載されている結合ドメインの使用に関する。本明細書で使用される「構造を解明する」とは、タンパク質の原子の配置または原子座標を決定することであり、Ｘ線結晶学等の生物物理学的方法により行われることが多い。
【０１４０】
Ｘ線結晶学において、正しく組み立てられた場合の回折データは、単位胞における分子の電子密度の３Ｄフーリエ変換の振幅を与える。位相が分かっている場合、電子密度はフーリエ合成により簡単に得ることができる。タンパク質複合体において、構造が既知のタンパク質（探索モデル）の割合が低い（アミノ酸含有量の５０％未満）場合および／または結晶が限定された回折特質を示す場合には、分子置換（ＭＲ）のみから位相情報を導き出すことが成功するかは疑わしい。多重同形置換（ＭＩＲ）とＭＲ位相合わせを組み合わせるとタンパク質複合体では首尾よくいくことが判明しているが（たとえば、Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら、１９９５；Ｌｉら、１９９７；Ｈｕｎｔｅら、２０００）、良好な重原子誘導体を作製する必要があることがほとんどの場合に問題となる。この１０年にわたり、古典的ＭＩＲアプローチは一般には、主にセレノメチオニン（ＳｅＭｅｔ）取り込みを使用する異常分散データの使用（ＭＡＤまたはＳＡＤ）に取って代わられた（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  １９９１）。実際、Ｓｅエッジエネルギーを使用する異常実験データは一般に、ＭＩＲまたはモデルベースのＭＲ位相合わせデータと比べて優れたバイアスの少ない位相情報を提供する。したがって、一特定の実施形態は、ＭＲまたはＭＡＤによるＧＰＣＲ：Ｇ複合体の位相合わせのための本発明に従った結合ドメインの使用に関する。特に、ナノボディを含む免疫グロブリン単一可変ドメインは一般に、強固に発現し、ＳｅＭｅｔ取り込みに適している。これをさらに説明すると、制限されることなく、すべてのＳｅＭｅｔ部位をナノボディ単独に導入することによりＧＰＣＲ、Ｇタンパク質およびナノボディを含む複合体の位相合わせにより、ＳｅＭｅｔ部位をＧＰＣＲまたはＧタンパク質に組み込ませる必要性は回避される。
【０１４１】
多くの場合に、回折特質結晶を得ることは、この原子分解能構造を解明することに対する主要な障害となっている。したがって、特定の実施形態に従って、本明細書に記載されている結合ドメインを使用すれば、標的複合体の結晶構造を解明することができるように結晶の回折特質を改善することが可能である。
【０１４２】
さらに、たとえば、ＧＰＣＲ創薬を導く一助とするためにＧＰＣＲ標的の構造情報を得ることが極めて望ましい。より多くのＧＰＣＲの結晶化以外に、とりわけアゴニスト、アンタゴニスト、アロステリック調節因子および／またはＧタンパク質を含む異なる種類のリガンドに結合している受容体の構造を得るための方法が必要とされている。本発明は、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の結晶を得るための一般的ツールを特に提供する。特に、アゴニスト結合ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体結晶はＧＰＣＲの活性状態の三次元表示を提供し得る。これらの構造は、リガンド結合とＧタンパク質相互作用部位を連結する立体構造変化を明らかにし、より正確な機構的仮説および最終的には新しい治療学をもたらすのに役立つ。リガンド活性化されたＧＰＣＲに固有の立体構造的柔軟性およびアゴニスト結合受容体により示されるより大きな不均一性を考慮すると、そのような状態を安定化させるのは容易ではない。したがって、そのような努力は、そのような複合体に特異的な結合ドメインを付加することによりそのヘテロ三量体Ｇタンパク質に結合しているアゴニスト結合受容体立体構造の複合体の安定化から利益を得ることが可能である。そのような複合体の一部を形成するＧタンパク質に結合する結合ドメインは特に適している。なぜならば、これらの結合ドメインは同じＧタンパク質を通じてシグナル伝達するすべてのＧＰＣＲを安定化するための一般的ツールとして使用することができるからである（たとえば、Ｇｓ共役受容体、Ｇｉ共役受容体、等）。
【０１４３】
別の実施形態によると、本発明は、ＧＰＣＲとＧタンパク質を含む複合体の結晶構造を決定する方法であって、
ａ）本発明に従った結合ドメインを用意する段階、
ｂ）前記結合ドメインをＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含む複合体に結合させる段階、ならびに
ｃ）段階ｂ）で形成される複合体を結晶化する段階
を含む方法を包含している。
【０１４４】
結晶構造を決定する上記方法の特定の実施形態では、ＧＰＣＲとＧタンパク質を含む標的複合体は、前記ＧＰＣＲに結合している受容体リガンド、さらに具体的にはアゴニストをさらに含む。
【０１４５】
結晶構造の前記決定はＸ線結晶学等の生物物理学的方法により行うことができる。前記方法は、結晶の原子座標（上文に定義されている）を得る段階をさらに含むことができる。
【０１４６】
ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体を標的にする化合物の同定
化合物スクリーニング、創薬およびリード最適化の過程において、様々な化合物特徴および様々な細胞経路に対するそれらの効果（すなわち、有効性、特異性、毒性および薬剤代謝）に関する同時情報を提供するより迅速でより効果的で経費が少なく特に情報が豊富なスクリーニングアッセイの必要性が存在する。したがって、潜在的な新しい薬剤候補であり得る対象のＧＰＣＲの新しい特異的リガンド、好ましくは立体構造特異的リガンドを同定するために多数の化合物を迅速に安価にスクリーニングする必要性が存在する。本発明は、その後種々の状況においてスクリーニングするための免疫原または選択試薬として使用することができる、機能的立体構造状態のＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体を安定化する結合ドメインを提供することにより、この問題を解決する。本発明による結合ドメインの大きな利点は、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に含まれるＧＰＣＲを安定化された機能的立体構造、特に活性状態の立体構造に保つことができる点である。たとえば、受容体のこの活性立体構造に選択的に結合するライブラリー化合物は、ＧＰＣＲの活性立体構造のオルソステリックまたはアロステリック安定化が生物学的応答を誘発するために、アゴニストとして振る舞うより高い傾向を有する。別の利点は、結合ドメインが複合体に含まれるＧＰＣＲの活性立体構造の熱安定性を増大させ、したがって、安定性が増大する変異ＧＰＣＲに頼る必要なしで、化合物スクリーニングおよび創薬に使用される非自然条件により誘導される不可逆的または熱変性に対してＧＰＣＲを保護する点である。本発明による立体構造選択性結合ドメインの別の大きな利点は、前記ドメインが受容体アゴニスト、インバースアゴニスト、アンタゴニストおよび／またはモジュレーターならびにＧＰＣＲおよびＧＰＣＲ依存性経路の阻害剤について迅速に確実にスクリーニングし区別することを可能にし、したがって望ましい薬理特性のあるリガンドを同定する尤度を増加する点である。
【０１４７】
このことをさらに説明すると、大半のＧＰＣＲがＧタンパク質と複合体化されると、さらに高いアゴニスト結合親和性を示すことは確立した概念である。これは、アゴニスト占有受容体とＧタンパク質間の協調的相互作用に起因すると考えられる。したがって、ＧＰＣＲとＧタンパク質の複合体の解離を阻害する本発明の結合ドメインは、Ｒ：Ｇタンパク質複合体の活性立体構造状態を安定化し、このようにしてアゴニストに対するＧＰＣＲの親和性を増加させインバースアゴニストに対する親和性を減少することになる。Ｒ：Ｇ複合体の活性機能的立体構造を認識する結合ドメインは、たとえば、インバースアゴニストと比べてアゴニストに対する受容体の親和性を増加するので、アゴニストについてスクリーニングするためのハイスループットスクリーニングアッセイにおいて使用することが可能であるということになる。Ｇ：Ｒ複合体の活性機能的立体構造を認識する結合ドメインも、サブセットの受容体シグナル伝達活性、たとえば、βアレスチン機能と比べてＧタンパク質の選択的活性化を選択的に刺激する能力のあるバイアスアゴニストについてスクリーニングするためのハイスループットスクリーニングアッセイにおいて使用することが可能である。特定の実施形態によると、ＧＰＣＲと複合体を形成しているＧタンパク質に特異的に結合する結合ドメイン（たとえば、表２−３）は、複数のＧＰＣＲを標的にするスクリーニングプログラムのための普遍的ツールとして使用することができる。なぜならば、特定のＧタンパク質（たとえば、Ｇｓ）は複数のＧＰＣＲと複合体（たとえば、５−ＨＴ受容体型５−ＨＴ４および５−ＨＴ７を含むＧｓ共役受容体、ＡＣＴＨ受容体、アデノシン受容体型Ａ２ａおよびＡ２ｂ、アルギニンバソプレシン受容体２、βアドレナリン受容体型β１、β２およびβ３、カルシトニン受容体、カルシトニン遺伝子関連ペプチド受容体、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体、ドーパミン受容体Ｄ１様ファミリー（Ｄ１およびＤ５）、ＦＳＨ受容体、胃抑制ポリペプチド受容体、グルカゴン受容体、ヒスタミンＨ２受容体、黄体形成ホルモン／絨毛性ゴナドトロピン受容体、メラノコルチン受容体、副甲状腺ホルモン受容体１、プロスタグランジン受容体型Ｄ２およびＩ２、セクレチン受容体、甲状腺刺激ホルモン受容体、等；表１も参照）を形成することになるからである。
【０１４８】
したがって、本発明の別の態様は、最終的には潜在的な新薬候補をもたらす可能性のある、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の立体構造特異的結合パートナーについてのスクリーニングおよび／または同定プログラムにおける、上文においてすべて記載されている結合ドメインの使用、または結合ドメインを含む複合体、細胞、膜調製物の使用を包含している。
【０１４９】
一実施形態に従って、本発明は、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体と選択的に結合することができる化合物を同定する方法であって、
（ｉ）ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含む複合体を用意する段階、
（ｉｉ）前記複合体を前記複合体に対して作製されたおよび／または特異的に結合する結合ドメインに接触させ、前記結合ドメインを前記複合体に結合させる段階、
（ｉｉｉ）試験化合物を用意する段階、
（ｉｖ）試験化合物が複合体と結合するかどうかを評価する段階ならびに
（ｖ）複合体と選択的に結合する化合物を選択する段階
を含む方法を想定している。
【０１５０】
上記方法のいずれかにおいて使用される結合ドメインは、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の機能的立体構造状態を安定化することができ、複合体の解離を防ぐことは明らかになる。好ましくは、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体は活性立体構造状態（上文で定義されている）である。上記スクリーニング法の特に好ましい実施形態によると、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体は受容体リガンドをさらに含む。
【０１５１】
結合ドメインの特に好ましい実施形態は、本発明の前の態様に関して上文に記載されている通りであることは注目すべきである。
【０１５２】
したがって、本発明の結合ドメインはスクリーニングアッセイにおいて有用になることができる。創薬のためのスクリーニングアッセイは固相または液相アッセイ、たとえば、放射性リガンド結合アッセイなどの結合アッセイであることが可能である。いくつかの例において、試験化合物のハイスループットスクリーニングが好まれ、上記の方法は当業者には周知である用語「ライブラリースクリーニング」法として使用し得ることが認識される。したがって、試験化合物は試験化合物のライブラリーでもよい。特に、アゴニスト、アンタゴニストもしくはインバースアゴニストおよび／またはモジュレーター等の治療化合物についてのハイスループットスクリーニングアッセイは本発明の一部を形成する。ハイスループット目的で、アロステリック化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体ライブラリー、断片ベースのライブラリー、合成化合物ライブラリー、天然化合物ライブラリー、ファージディスプレイライブラリー等の化合物ライブラリーを使用し得る。そのようなライブラリーを調製しスクリーニングするための方法論は当技術分野において公知である。好ましい一実施形態において、ハイスループットスクリーニング法は、多数の潜在的治療リガンドを含有するコンビナトリアル化学的またはペプチドライブラリーを提供することを含む。次に、そのような「コンビナトリアルライブラリー」または「化合物ライブラリー」は、本明細書に記載されるように１つまたは複数のアッセイにおいてスクリーニングされて、所望の特徴的活性を示すライブラリーメンバー（特定の化学種またはサブクラス）を同定する。「化合物ライブラリー」は、通常は最終的にハイスループットスクリーニングにおいて使用される保存された化学物質のコレクションである。「コンビナトリアルライブラリー」は、試薬等のいくつかの化学的「構成要素」を組み合わせることによって、化学的合成または生物学的合成により生み出される多様な化学化合物のコレクションである。コンビナトリアルライブラリーの調製およびスクリーニングは当業者には周知である。このようにして同定された化合物は従来の「リード化合物」としての役割を果たすことができる、またはそれ自体が潜在的なもしくは実際の治療薬として使用することができる。したがって、一追加の実施形態において、本明細書に上で記載されるスクリーニング法は、立体構造的に活性なＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に結合することが明らかにされている試験化合物を改変し、前記改変された試験化合物が特定の立体構造に属するときにＧＰＣＲに結合するかどうかを決定することをさらに含む。
【０１５３】
立体構造特異的結合パートナーについての標的ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体のハイスループットスクリーニングが好まれる場合、これは本発明に従った結合ドメイン、または結合ドメインにより安定化されたＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体を、整列させるまたは他の方法で多重化することができる適切な固体支持体上に固定化することにより促進される。適切な固体支持体の非限定的例には、ビーズ、カラム、スライド、チップまたはプレートが含まれる。さらに具体的には、固体支持体は、粒状（たとえば、一般に抽出カラムで使用されるビーズまたは顆粒）または平坦、ひだ状、もしくは中空繊維もしくはチューブであることが可能なシート形態（たとえば、膜またはフィルター、ガラスまたはプラスチックスライド、マイクロタイターアッセイプレート、ディップスティック、キャピラリーフィルデバイス、等）でもよい。以下のマトリックスが例として与えられており、網羅的ではなく、そのような例には、シリカ（多孔質アモルファスシリカ）、すなわち、Ｂｉｏｔａｇｅ（Ｄｙａｘ  Ｃｏｒｐ．の一部門）により供給される６０Ａ不定形シリカ（３２−６３μｍまたは３５−７０μｍ）を含有するＦＬＡＳＨシリーズのカートリッジ、アガロースまたはポリアクリルアミド支持体、たとえば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈにより供給されるＳｅｐｈａｒｏｓｅレンジの製品またはＢｉｏ−Ｒａｄにより供給されるＡｆｆｉ−Ｇｅｌ支持体が含まれ得る。さらに、Ｂｉｏ−Ｒａｄにより供給される圧力安定性Ａｆｆｉ−Ｐｒｅｐ支持体などのマクロ多孔質ポリマーがある。利用できる他の支持体には、デキストラン、コラーゲン、ポリスチレン、メタクリレート、アルギン酸カルシウム、コントロールドポアガラス、アルミニウム、チタニウムおよび多孔質セラミックスが含まれる。代わりに、固体表面は質量依存センサー、たとえば、表面プラズモン共鳴検出器の一部を備えていてもよい。市販されている支持体の追加の例は、たとえば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ、Ｒ．Ｆ．Ｔａｙｌｏｒ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９９１年）で考察されている。
【０１５４】
固定化は非共有結合的でも共有結合的でもよい。特に、固体表面上への本発明に従った結合ドメインまたは結合ドメインにより安定化されたＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の非共有結合固定化または吸着は、当業者には公知の標準技法（たとえば、ビオチンタグ、ヒスチジンタグ、等）に従って、結合ドメインまたはＧＰＣＲに結合している分子タグを認識する、抗体、またはストレプトアビジンもしくはアビジンまたは金属イオンのいずれかを用いた表面被覆を介して起こり得る。代わりに、本発明に従った結合ドメインまたは結合ドメインにより安定化されたＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体は、従来のカップリング化学を使用する共有架橋結合により固体表面に結合されてもよい。固体表面は、共有結合に適した架橋結合可能な残基を天然に含んでいてもよいし、または当技術分野で周知の方法に従って適切な架橋結合可能な基を導入するよう被覆されているもしくは誘導体化されてもよい。一特定の実施形態では、固定化されたタンパク質の十分な機能性は、化学的スペーサーアームを含有しない反応性部分を介して所望のマトリックスに直接共有結合するのに続いて保持される。固体支持体上への抗体（断片）の固定化法に関するさらなる例および詳細な情報はＪｕｎｇら（２００８年）で考察されており、同様に、膜受容体固定化法はＣｏｏｐｅｒ（２００４年）で概説されている。前記両文献は参照により本明細書に組み込む。特に、特定のアミノ酸（既知のまたは推測される構造を有するタンパク質中の）がリジンまたはシステイン（または他の所望のアミノ酸）に変異すれば、たとえば、共有結合のための特定の部位を提供することができる。特定のタンパク質を再設計して、化学結合に関与する表面で利用可能なアミノ酸の分布を変え（Ｋａｌｌｗａｓｓら、１９９３年）、事実上、結合したタンパク質の配向を制御することも可能である。類似するアプローチを、本発明に従った結合ドメインに、ならびに立体構造的に安定したＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に適用することができ、したがって天然のまたは非天然のアミノ酸のどちらかを含有する他のペプチドテールまたはドメインを付加することなく指向性固定化の手段を提供する。ナノボディなどの抗体または抗体断片の場合、抗体（断片）の抗原結合活性の破壊を最小限に抑えるフレームワーク領域への変異の導入が好ましい。
【０１５５】
都合がよいことに、固定化されたタンパク質は、免疫アッセイ、たとえば、ＥＬＩＳＡなどの免疫吸着プロセス、または当技術分野では従来の標準法に従って本発明に従った固定化されたタンパク質を試験試料（すなわち、とりわけ試験化合物を含む）に接触させることによる免疫親和性精製プロセスにおいて使用し得る。代わりに特にハイスループット目的で、固定化されたタンパク質は整列させるまたは他の方法で多重化させることが可能である。好ましくは、本発明に従った固定化されたタンパク質は、特にＧＰＣＲが活性立体構造状態にある立体構造的に安定化されたＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に特異的に結合する化合物のスクリーニングおよび選択のために使用される。
【０１５６】
結合ドメイン、または（立体構造的に安定化された）ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体、またはその構成タンパク質のいずれかを、適用の種類または実行する必要のあるスクリーニングの種類に応じて固定化してもよいことは認識される。その上、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質安定化結合ドメイン（ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の特定の立体構造エピトープを標的にする）の選択はタンパク質の配向、したがって、化合物同定の所望の結果、たとえば、前記立体構造的に安定化されたＧＰＣＲの細胞外部分、膜内部分もしくは細胞内部分に特異的に結合する化合物または前記立体構造的に安定化されたＧタンパク質に特異的に結合する化合物を決定することになる。
【０１５７】
代わりに、試験化合物（または試験化合物のライブラリー）は、チップ表面などの固体表面に固定化してもよく、結合ドメインおよびＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体は、たとえば、界面活性剤溶液でまたは膜様調製物で提供される（下参照）。
【０１５８】
もっとも好ましくは、たとえば、溶液でのファージディスプレイ選択プロトコールまたは放射性リガンド結合アッセイの場合のように、結合ドメインもＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体も、またはその構成タンパク質も試験化合物も固定化されない。好ましい実施形態では、上記スクリーニング法のいずれかで使用される結合ドメイン、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体（または別に、構成タンパク質）は、それぞれのタンパク質の十分な機能性が保持されるように、細胞全体もしくは膜抽出物もしくはそれらの部分などの細胞（細胞小器官）抽出物として提供される、または脂質層もしくはベシクル（天然および／または合成脂質を含む）、高密度リポ粒子もしくはナノディスクなどの任意のナノ粒子に組み込んでもよく、またはＶＬＰとして提供される。膜断片または膜−界面活性剤抽出物から形成されるＧＰＣＲの調製物はＣｏｏｐｅｒ（２００４年）に詳細に概説されており、前記文献は参照により本明細書に組み込む。代わりに、結合ドメイン、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体または構成タンパク質は、界面活性剤中に可溶化してもよい。可溶化された受容体調製物の非限定的例は実施例のセクションにおいてさらに提供されている。
【０１５９】
たとえば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴アッセイ、チップベースのアッセイ、免疫細胞蛍光法、酵母ツーハイブリッド技術およびファージディスプレイを含む様々な方法を使用して安定化されたＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体と試験化合物間の結合を決定し得、これらの方法は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら．（２００１年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹにおいて当技術分野では一般的方法となっている。試験化合物とＧＰＣＲ間の結合を検出する他の方法には、イオンスプレー質量分析／ＨＰＬＣ法を用いる限外濾過または他の（生物）物理学的および分析的方法が含まれる。たとえば、当業者には周知である蛍光エネルギー共鳴転移（ＦＲＥＴ）法も使用し得る。本明細書においてさらに記載されているように、結合した試験化合物は、ペプチド標識、核酸標識、化学標識、蛍光標識または高周波タグなどの化合物と会合している独自の標識またはタグを使用して検出することが可能であることは認識される。
【０１６０】
化合物および／またはそれを含む組成物の有効性は、関連する特定の疾患または障害に応じて、任意の適切なインビトロアッセイ、細胞ベースのアッセイ、インビボアッセイおよび／またはそれ自体が公知の動物モデルまたはそれらの任意の組合せを使用して試験することが可能である。
【０１６１】
一特定の実施形態において、前記化合物が受容体リガンド（上で定義される）へのＧＰＣＲの結合を変化させるかどうかが決定される。ＧＰＣＲのこのリガンドへの結合は、本明細書に記載される当技術分野で公知の標準リガンド結合法を使用してアッセイすることが可能である。たとえば、リガンドは放射標識されても蛍光的に標識されてもよい。前記アッセイは、ホールセルでまたは細胞もしくは界面活性剤を用いて水性の可溶化された受容体から得られた膜で実施し得る。前記化合物は、標識されたリガンドの結合を変化させるその能力により特徴付けられる（実施例の節も参照）。前記化合物は、たとえば、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍の因数で、ＧＰＣＲとそのリガンド間の結合を減少させ得るし、またはＧＰＣＲとそのリガンド間の結合を増加させ得る。したがって、さらに具体的な実施形態によると、上記スクリーニング法のいずれでも使用される複合体は、受容体リガンドをさらに含む。好ましくは、受容体リガンドは、小分子、ポリペプチド、抗体またはこれらに由来する任意の断片、天然物等を含む群から選択される。さらに好ましくは、受容体リガンドは、上文に記載されるように、完全アゴニストまたは部分アゴニストまたはインバースアゴニストまたはアンタゴニストである。
【０１６２】
機能的立体構造状態の標的ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に結合することを確立することに加えて、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に対する、特にＧＰＣＲおよび下流相互作用パートナーの生物活性に対する化合物の機能的効果を決定することも望ましい。特に、本発明に従った結合ドメインを使用して、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体またはその構成成分であるＧＰＣＲもしくはＧタンパク質の生物活性を調節する（増加するまたは減少する）化合物についてスクリーニングすることができる。生物活性の所望の調節は一般に好まれるＧＰＣＲに依存することになる。化合物は、標的ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に、特にその構成成分のうちの１つまたは両方に結合して、下流受容体シグナル伝達を調節し得る（活性化するまたは阻害する）。ＧＰＣＲシグナル伝達のこの調節はオルソステリック的にまたはアロステリック的に起こることが可能である。化合物は、Ｇタンパク質に結合しているＧＰＣＲを含む標的複合体もしくはその構成成分に結合して、受容体シグナル伝達を活性化するもしくは増加する、または代わりに受容体シグナル伝達を減少するもしくは阻害し得る。化合物は、ＧＰＣＲの構成的活性を遮断するように標的複合体に結合することもある。化合物は、アロステリック調節を媒介する（たとえば、ＧＰＣＲまたはＧタンパク質にアロステリック部位で結合する）ように標的複合体に結合することもある。このように、化合物は、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体中の異なる領域に（たとえば、アロステリック部位に）結合することにより受容体機能を調節し得る。たとえば、Ｇｅｏｒｇｅら．（２００２年）、Ｋｅｎａｋｉｎ（２００２年）およびＲｉｏｓら．（２００１年）を参照されたい。本発明の化合物は、ＧＰＣＲ媒介シグナル伝達の持続時間を延長する、または受容体−リガンド親和性を増加することにより受容体シグナル伝達を増強するように標的複合体に結合することもある。さらに、化合物は、ＧＰＣＲ機能的ホモマーまたはヘテロマーの組立てを阻害するまたは増強するように標的複合体に結合することもある。
【０１６３】
細胞ベースのアッセイは、新しい生物学的標的の作用機構および化学化合物の生物学的活性を評価するためにも極めて重要である。ＧＰＣＲのための現在の細胞ベースのアッセイには、経路活性化の基準（Ｃａ２＋放出、ｃＡＭＰ生成または転写活性）；ＧＰＣＲおよび下流エレメントにＧＦＰのタグを付けることによるタンパク質輸送の測定；ならびにフォルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）または酵母ツーハイブリッドアプローチを使用するタンパク質間の相互作用の直接基準が含まれる。当技術分野で周知であり一般的に使用されている任意の手段により、本発明の結合ドメインを細胞内部の関連する細胞の区画に（細胞内にまたは細胞外に）導入すれば、新しいまたは改良された細胞ベースのアッセイがもたらされ得る。
【０１６４】
特に、天然の活性化リガンドが同定されていないＧＰＣＲを「脱オーファン化する」必要性が存在する。本発明による結合ドメインを使用して機能的立体構造状態のＧＰＣＲを安定化すれば、天然のリガンドが未知である「オーファン」ＧＰＣＲのリガンドを同定するのに使用し得るスクリーニングアプローチが可能になる。たとえば、既知のリガンドのファミリーに対するアレイスクリーニングを含む、「脱オーファン化」への種々のアプローチが採用されてきた。オーファンＧＰＣＲのリガンドは生体試料から同定し得る。したがって、特定の実施形態では、試験化合物は生体試料として提供される。特に、試料は個人から採取される任意の適切な試料であることが可能である。たとえば、試料は、血液、血清、血漿、髄液などの体液試料でもよい。代わりに、試料は組織または細胞抽出物である。
【０１６５】
上記スクリーニング法のいずれかで使用される試験化合物は、上文で定義される、ポリペプチド、ペプチド、小分子、天然物、ペプチド模倣物、核酸、脂質、リポペプチド、炭水化物、抗体またはそれに由来する任意の断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）およびＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、重鎖抗体（ｈｃＡｂ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ミニボディ、ラクダ科動物重鎖抗体に由来する可変ドメイン（ＶＨＨまたはナノボディ）、サメ抗体に由来する新規抗原受容体の可変ドメイン（ＶＮＡＲ）、アルファボディを包含するタンパク質スキャフォールド、プロテインＡ、プロテインＧ、設計アンキリンリピートドメイン（ＤＡＲＰｉｎ）、フィブロネクチンＩＩＩ型リピート、アンチカリン、ノッチン、操作されたＣＨ２ドメイン（ナノ抗体）等）を含む群から選択されうる。
【０１６６】
前記試験化合物は、場合によって、検出可能な標識に共有結合的にまたは非共有結合的に連結してもよい。適切な検出可能標識およびこれを付着させる、使用する、検出するための技法は当業者には明白であり、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能ないかなる組成物も含むが、これらに限定されない。有用な標識には、磁気ビーズ（たとえば、ダイナビーズ）、蛍光色素（たとえば、すべてのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質等）、放射性標識（たとえば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）、酵素（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、およびコロイド金または色ガラスまたはプラスティック（たとえば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）ビーズ等の比色標識が含まれる。そのような標識を検出する手段は当業者には周知である。したがって、たとえば、放射性標識は写真フィルムまたはシンチレーション計数器を使用して検出することができ、蛍光マーカーは放射されたイルミネーションを検出する光検知器を使用して検出し得る。酵素標識は典型的には、酵素に基質を与え酵素の基質に対する作用により生じる反応生成物を検出することにより検出され、比色標識は着色標識を視覚化するだけで検出される。他の適切な検出可能標識は、結合ドメインに関する本発明の第１の態様の文脈内で前に記載された。
【０１６７】
具体的に好ましい実施形態に従って、試験化合物は、抗体またはナノボディを含む上記のそれに由来する任意の断片である。たとえば、限定する目的ではなく、試験化合物は、本発明による結合ドメインによって安定化されたＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に対して産生された抗体（本明細書ではそのもっとも広い意味で定義されている）でもよい。抗体をインビボで産生するための方法は当技術分野において公知である。好ましくは、動物の免疫化は、本明細書において前に記載される類似する方法で行われる。本発明は、細菌、酵母、繊維状ファージ、リボソームもしくはリボソームサブユニットまたは前記ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体上の他のディスプレイシステムで発現される、発現ライブラリーコード免疫グロブリン遺伝子またはこの部分のスクリーニングを含む、立体構造的に安定したＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体に特異的に結合する抗体を選択するための方法にも関する。
【０１６８】
本発明の特定の態様は、本発明に従った結合ドメインが固定化される固体支持体に関する。したがって、そのような固体支持体（上文に記載されている）は、上記のスクリーニング法のうちのいずれにおいても使用し得る。
【０１６９】
ＧＰＣＲ受容体シグナル伝達を調節する
本発明の結合ドメインを使用して、ＧＰＣＲシグナル伝達、特にＧタンパク質媒介ＧＰＣＲシグナル伝達を無効にすることを含むＧタンパク質媒介ＧＰＣＲシグナル伝達を調節することもできる。用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」、「調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」、「調節された（ｍｏｄｕｌａｔｅｄ）」は、タンパク質またはタンパク質複合体、特にＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の活性の増加または減少を意味する。特に、本発明の結合ドメインはアロステリックモジュレーターまたはアロステリック阻害剤であることが可能である。本発明との関連での用語「アロステリックモジュレーター」または「アロステリック阻害剤」とは非競合的モジュレーターまたは阻害剤のことであり、これらは受容体の活性部位以外の部位に結合することによりその効果を発揮し、受容体の活性を調節するまたは受容体をシグナル伝達の点で無効にする。「ポジティブアロステリックモジュレーター（ＰＡＭ）」はシグナル伝達を増加させ、「ネガティブアロステリックモジュレーター（ＮＡＭ）」はシグナル伝達を減少する。特に、アロステリック阻害剤はシグナル伝達を無効にすることもある。本発明の結合ドメインによるＧＰＣＲシグナル伝達における調節を評価するためのアッセイは上文に記載されている通りである。
【０１７０】
それに関して、特定の実施形態によると、本発明の結合ドメイン、特に免疫グロブリン単一可変ドメインは、ペプチド模倣物のリード同定および設計にも有用であることが可能である。リード同定のための出発点として生物学的に関連するペプチドまたはタンパク質構造を使用することは、現代的創薬におけるもっとも強力なアプローチの１つを表す。ペプチド模倣物は、その必須要素（ファルマコフォア）が天然のペプチドまたはタンパク質を３Ｄ空間で模倣し、生物学的標的と相互作用して同じ生物学的効果を生じる能力を保持する化合物である。ペプチド模倣物は、天然のペプチドに伴う問題のいくつか、たとえば、タンパク質分解に対する安定性（活性の持続）および乏しい生物学的利用能を回避するように設計される。受容体選択性または効力などのある種の他の特性はかなり改善することができることが多い。
【０１７１】
治療的および診断的適用
上記の結合ドメインのうちのいくらかは、治療的有用性を有し得、病状を有する対象に、対象の前記病状を治療するために投与することができる。結合ドメインの治療的有用性は、そのＧＰＣＲを介したシグナル伝達が前記病状と連鎖している点で、結合ドメインが結合する標的ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体により決定される。ある種の場合、ＧＰＣＲはリガンドに結合することによりその病状において活性化され得る。他の実施形態では、ＧＰＣＲは変異を受けて、たとえば、構成的に活性になることもある。本結合ドメインは、総合失調症、片頭痛、逆流、喘息、気管支痙攣、前立腺肥大、潰瘍、癲癇、狭心症、アレルギー、鼻炎、癌、たとえば、前立腺癌、緑内障および脳卒中などのＧＰＣＲ媒介病状の治療のために用い得る。Ｏｎ−ｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ  ｄａｔａｂａｓｅでの追加の例となるＧＰＣＲ関連状態は、ＮＣＢＩのワールドワイドウェブサイトに見出される。したがって、本発明の特定の実施形態は、ＧＰＣＲ関連疾患または障害の治療において使用するための本発明の結合ドメインまたは前記結合ドメインを含む医薬組成物も想定している。治療的有用性は、結合ドメインがそれに対して作製されているＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の特定の立体構造エピトープにも依存することは理解される。
【０１７２】
本結合ドメインは、所定の医薬組成物中で別の原薬と混合してもよいし、残りの原薬の前に、と同時にまたは後で別々に投与してもよい。一般論として、これらのプロトコールは、ＧＰＣＲ関連疾患または障害に罹っている個体に、宿主におけるＧＰＣＲのシグナル伝達活性を調節し個体の障害を治療する有効量の結合ドメインを投与することを含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、ある種のＧＰＣＲの活性の減少が望まれる場合には、ＧＰＣＲの活性を減少する１つ以上の化合物が投与されてもよく、ある種のＧＰＣＲの活性の増加が望まれる場合には、ＧＰＣＲ活動の活性を増加する１つ以上の化合物が投与されてもよい。
【０１７４】
本方法に従って種々の個体が治療可能である。一般に、そのような個体は哺乳動物または哺乳類であり、これらの用語は、肉食動物目（たとえば、イヌおよびネコ）、齧歯目（たとえば、マウス、モルモットおよびラット）および霊長目（たとえば、ヒト、チンパンジーおよびサル）を含む哺乳動物綱内の生物を記述するのに広く使用されている。多くの実施形態では、個体はヒトである。本治療法は典型的には、そのような障害を有する個人またはそのような障害を避けたいと考えている個人に実施される。
【０１７５】
別の態様では、本発明は、治療的有効量の本発明の結合ドメインおよび少なくとも１つの医薬として許容される担体、アジュバントまたは希釈剤を含む医薬組成物に関する。
【０１７６】
「担体」または「アジュバント」、特に「医薬として許容される担体」または「医薬として許容されるアジュバント」は、それ自体が組成物を受ける個人に有害な抗体の産生を誘導しないし防御を誘発しない任意の適切な賦形剤、希釈剤、担体および／またはアジュバントのことである。したがって、医薬として許容される担体は本質的に無毒性および非治療的であり、当業者には公知である。適切な担体またはアジュバントは典型的には、以下の非網羅的リスト：タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子などの大きなゆっくり代謝される巨大分子に含まれる化合物のうちの１つ以上を含む。担体またはアジュバントは、非限定的例として、リンゲル液、ブドウ糖溶液またはハンクス液でもよい。不揮発性油およびオレイン酸エチルなどの非水溶液も使用し得る。好ましい賦形剤は生理食塩水中５％ブドウ糖である。賦形剤は、バッファーおよび保存剤を含む、等張性および化学的安定性を増強する物質などの少量の添加剤を含有してもよい。
【０１７７】
本明細書に記載される結合ドメインまたは医薬として許容されるその塩の投与は、経口、吸入または非経口投与によってもよい。特定の実施形態では、ナノボディは、くも膜下腔内または脳室内投与を通じて送達される。活性化合物は単独で投与してもよいし、または好ましくは医薬組成物として処方される。結合ドメインにより認識される抗原を発現しているある種の疾患または障害を治療するのに有効な量は、治療を受けている障害の性質および重症度ならびに哺乳動物の体重などの通常の要因に依存する。しかし、単位用量は通例、結合ドメインまたはそれの医薬として許容される塩の０．０１から５０ｍｇ、たとえば、０．０１から１０ｍｇ、または０．０５から２ｍｇの範囲になる。単位用量は１日の全用量が通例０．０００１から１ｍｇ／ｋｇ；したがって７０ｋｇ成人では適切な１日全用量は０．０１から５０ｍｇ、たとえば０．０１から１０ｍｇまたはさらに通常では０．０５から１０ｍｇになるように、通例１日に１回または１回よりも多く、たとえば１日に２、３もしくは４回、さらに通常では、１日に１から３回、投与される。化合物またはその医薬として許容される塩が、単位用量経口、非経口または吸入組成物などの単位用量組成物の形態で投与されるのが極めて好ましい。そのような組成物は混合により調製され、経口、吸入または非経口投与のために適切に適合され、したがって、錠剤、カプセル、経口液体調製物、粉末、顆粒、トローチ、再構成可能粉末、注射可能なおよび注入可能な溶液または懸濁液または坐薬またはエアロゾルの形態でもよい。経口投与のための錠剤およびカプセルは通常、単位用量で提示され、結合剤、充填剤、希釈剤、成形剤、潤滑剤、崩壊剤、着色剤、香味料および湿潤剤などの従来の賦形剤を含有する。錠剤は当技術分野で周知の方法に従って被覆されてもよい。使用するのに適した充填剤には、セルロース、マンニトール、ラクトースおよび他の類似の薬剤が含まれる。適切な崩壊剤には、デンプン、ポリビニルピロリドンおよびデンプングリコール酸ナトリウムなどのデンプン誘導体が含まれる。適切な潤滑剤には、たとえば、ステアリン酸マグネシウムが含まれる。適切な医薬として許容される湿潤剤には、ラウリル硫酸ナトリウムが含まれる。これらの固形経口組成物は、調合、充填、成形などの従来の方法により調製し得る。繰り返し調合作業を使用して、活性薬剤を大量の充填剤を用いてこれらの組成物全体に分配してもよい。そのような作業は、当然のことながら、当技術分野では慣習的である。経口液体調製物は、たとえば、水性もしくは油性懸濁液、溶液、乳濁液、シロップもしくはエリキシル剤の形態でもよく、または使用前に水もしくは他の適切な溶媒を用いて再構成するための乾燥製品として提示されてもよい。そのような液体調製物は、懸濁剤、たとえば、ソルビトール、シロップ、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲルもしくは水素化食用脂肪、乳濁剤、たとえば、レシチン、ソルビタンモノオレエートまたはアカシア；非水溶媒（食用油を含み得る）、たとえば、アーモンド油、ヤシ油、グリセリン、プロピレングリコールもしくはエチルアルコールのエステルなどの油性エステル；保存剤、たとえば、メチルもしくはプロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸などの従来の添加剤、および必要に応じて従来の香味剤または着色剤を含有していてもよい。経口製剤には、腸溶コーティングを有する錠剤または顆粒などの従来の徐放製剤も含まれる。好ましくは、吸入のための組成物は、スナッフまたはネブライザー用のエアロゾルもしくは溶液としてまたは吹送のための超微粒粉末として、単独でまたはラクトースなどの不活性担体と組み合わせて気道に投与するために提示される。そのような場合、活性化合物の粒子は、５０ミクロン未満、好ましくは１０ミクロン未満、たとえば、２から５ミクロンなどの１から５ミクロンの直径を有するのが適切である。好適吸入用量は、０．０５から２ｍｇ、たとえば、０．０５から０．５ｍｇ、０．１から１ｍｇまたは０．５から２ｍｇの範囲になる。非経口投与では、本発明の化合物および無菌溶媒を含有する液体単位剤形が調製される。活性化合物は、溶媒および濃度に応じて、懸濁させるまたは溶解することが可能である。非経口溶液は通例、化合物を溶媒に溶解させ濾過殺菌してから、適切なバイアルまたはアンプルに充填して密封することにより調製される。有利なことに、局所麻酔薬、保存剤および緩衝剤などのアジュバントも溶媒に溶解させる。安定性を増強するために、組成物は、バイアルに充填し真空下で水を除去した後に凍結させることが可能である。非経口懸濁液は、溶解させる代わりに化合物を溶媒に懸濁させ、無菌溶媒に懸濁させる前にエチレンオキシドに曝露して殺菌すること以外は、実質的に同じ方法で調製される。有利なことに、界面活性剤または湿潤剤が組成物に含まれて、活性化合物の均一分布を促進する。必要に応じて、少量の気管支拡張剤、たとえば、イソプレナリン、イソエタリン、サルブタモール、フェニレフリンおよびエフェドリンなどの交感神経刺激アミン；テオフィリンおよびアミノフィリンなどのキサンチン誘導体ならびにプレドニゾロンなどの副腎皮質ステロイドならびにＡＣＴＨなどの副腎刺激剤を含んでいてもよい。一般的方法であるように、組成物は通常、関連する医学的処置において使用するための文書または印刷された説明書を伴う。
【０１７８】
結合ドメイン、特に免疫グロブリン単一可変ドメインの細胞内への送達は、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質について記載された通りに実施してもよい。抗原が細胞外であるまたは細胞外ドメインである場合、結合ドメインは、細胞内に送達する必要なしで、このドメインに結合することによりその機能を発揮し得る。本明細書に記載される本発明の結合ドメインは、対象のＧＰＣＲ：Ｇタンパク質の細胞内立体構造エピトープを標的にしてもよい。これらの結合ドメインを細胞内部で効果的で安全な治療薬として使用するために、細胞内送達は当技術分野で公知のタンパク質形質導入または送達システムにより増強し得る。タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）は、生体膜を通過して移動するその能力のために薬物送達分野ではかなりの関心を集めてきた。ＰＴＤはこのはっきりした移動活性を、それがコンジュゲートしている、複合体化しているまたは融合しているタンパク質および他の巨大分子カーゴに与える比較的短い（１１−３５アミノ酸）配列である（ＳａｗａｎｔおよびＴｏｒｃｈｉｌｉｎ、２０１０年）。たとえば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）は、小分子からタンパク質、ペプチド、医薬ナノ担体および造影剤の範囲までに及ぶ様々な薬剤の細胞内送達に広く使用されてきた。代わりに、受容体媒介エンドサイトーシス機構も細胞内薬物送達に使用することも可能である。たとえば、トランスフェリン受容体媒介内部移行経路は、薬物およびタンパク質の部位特異的送達のために開発されてきた効率的細胞取り込み経路である（Ｑｉａｎら  ２００２年）。これは、化学的にはトランスフェリンと治療薬もしくはタンパク質とのコンジュゲーションにより、または一般的には治療ペプチドもしくはタンパク質のトランスフェリンの構造内への注入により達成される。天然に存在するタンパク質（たとえば、鉄結合タンパク質トランスフェリン）は、これらのタンパク質が生分解性、無毒性および非免疫原性であるので薬物ターゲティングのこの分野では非常に有用である。さらに、前記タンパク質は、その受容体が細胞表面に大量に存在するために部位特異的ターゲティングを達成することが可能である。さらに他の送達システムには、限定するという目的なしに、ポリマーベースのおよびリポソームベースの送達システムが含まれる。
【０１７９】
本発明の結合ドメインのおよびそれを含む組成物の効力は、関係する特定の疾患または障害に応じて、任意の適切なインビトロアッセイ、細胞ベースのアッセイ、インビボアッセイおよび／もしくはそれ自体公知の動物モデルまたはそれらの任意の組合せを使用して試験することが可能である。
【０１８０】
結合ドメインのスクリーニング、選択、産生
さらに別の態様では、本発明は、ＧＰＣＲとＧタンパク質を含む複合体に対して作製されたおよび／または特異的に結合する結合ドメインについてのスクリーニングの方法であって、
ａ）複数の結合ドメインを用意する段階、ならびに
ｂ）ＧＰＣＲおよびＧタンパク質を含む複合体に結合する結合ドメインについて前記複数の結合ドメインをスクリーニングする段階、ならびに
ｃ）前記複合体に結合する結合ドメインを単離する段階
を含む方法も包含している。
【０１８１】
本発明のこの態様の好ましい実施形態では、結合ドメインが産生され、ＧＰＣＲとＧタンパク質および場合によって受容体リガンドを含む複合体へのその特異的結合についてスクリーニングされる。結合ドメインは産生されて、Ｇタンパク質へのその特異的結合についてスクリーニングされてもよい。本明細書に記載されるように、結合ドメインは多くの方法で産生することが可能である。ナノボディなどの免疫グロブリン単一可変ドメインの場合には、典型的には、動物の免疫化は、上文に記載されているように（たとえば、非限定的例としてＶＨＨ配列について）およびさらに本明細書で例示されるように、Ｇタンパク質に結合しているＧＰＣＲおよび受容体リガンドを含む標的複合体を用いて実行されることになる。
【０１８２】
標的複合体を用いた動物の免疫化では、標的複合体のタンパク質（すなわち、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質）は、組換え型の前記タンパク質を宿主細胞において発現し、前記タンパク質を親和性クロマトグラフィーおよび／または抗体ベースの方法を使用して精製することを用い得る従来法を使用して産生し精製し得る。特定の実施形態では、バキュロウイルス／Ｓｆ−９系を発現のために用い得るが、他の発現系（たとえば、細菌、酵母または哺乳類細胞系）も使用し得る。ＧＰＣＲを発現し精製するための例となる方法は、数ある中でも、たとえば、Ｋｏｂｉｌｋａ（１９９５年）、Ｅｒｏｇｌｕら（２００２年）、Ｃｈｅｌｉｋａｎｉら（２００６年）および書籍「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」（Ｋｅｖｉｎ  Ｒ．Ｌｙｎｃｈ（編）、１９９８年）に記載されている。機能的ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体は、β２−ＡＲ：ＧｓについてＷｈｏｒｔｏｎら（２００９年）にまたはＭＯＲ：ＧｉについてＫｕｓｚａｋら（２００９年）に記載されているように、化学量論的に過剰なＧタンパク質（ＧｓまたはＧｉ）を用いて組換えＨＤＬ粒子に再構成された精製された受容体（たとえば、β２−ＡＲまたはＭＯＲ）を使用することにより再構成してもよい。ＧＰＣＲは、リン脂質ベシクル中で化学量論的に過剰なＧタンパク質を負荷させて再構成してもよい。同様に、リン脂質ベシクル中で活性ＧＰＣＲを再構成するための方法は公知であり、とりわけ、Ｌｕｃａら（２００３年）、Ｍａｎｓｏｏｒら（２００６年）、Ｎｉｕら（２００５年）、Ｓｈｉｍａｄａら（２００２年）およびＥｒｏｇｌｕら（２００３年）に記載されている。ある種の場合には、ＧＰＣＲとリポ脂質は高密度で再構成されることがある（たとえば、１ｍｇのリン脂質あたり１ｍｇの受容体）。多くの場合、ＧＰＣＲはリポ脂質ベシクル内に両方の配向で存在することがある（正常な配向で、および細胞内ループがベシクルの外側にある「逆さまの」配向で）。ＧＰＣＲを用いた他の免疫化法には、制限なく、ＧＰＣＲおよび／もしくはＧタンパク質を発現する完全な細胞またはそれに由来する膜の使用が含まれる。
【０１８３】
特定の実施形態では、動物は二機能性クロスリンカーで架橋されている標的複合体を用いて免疫される（実施例のセクションも参照）。化学的架橋結合は、当業者には周知である標準技法を使用して実行することが可能である（たとえば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｇ．Ｔ．（２００８年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２ｎｄ  ｅｄ．、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｉｎｃ．、１２０２頁参照）。
【０１８４】
任意の適切な動物、たとえば、温血動物、特にウサギ、マウス、ラット、ラクダ、ヒツジ、ウシもしくはブタなどの哺乳動物、またはニワトリもしくはシチメンチョウなどのトリは、免疫応答を生じるのに適した当技術分野で周知の技法のいずれかを使用して免疫し得る。
【０１８５】
標的複合体の立体構造エピトープに特異的に結合する結合ドメインについてのスクリーニングは、たとえば、その表面上で結合ドメインを発現する細胞（たとえば、適切に免疫されたラクダ科動物から得られるＢ細胞）のセット、コレクションもしくはライブラリーをスクリーニングすることにより、結合ドメインの（ナイーブまたは免疫）ライブラリーのスクリーニングにより、または結合ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸配列の（ナイーブまたは免疫）ライブラリーのスクリーニングにより実施してもよく、これらのスクリーニングはすべてそれ自体公知の方法で実施することができ、その方法は場合によって、たとえばおよび制限なく、親和性成熟の段階、所望のアミノ酸配列を発現する段階、所望の抗原への結合および／もしくは所望の抗原に対する活性についてスクリーニングする段階、所望のアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列を決定する段階、１つ以上のヒト化置換を導入する段階、適切な多価および／もしくは多重特異性フォーマットでフォーマットする段階、所望の生物学的および／もしくは生理的特性についてスクリーニングする段階（すなわち、当技術分野で公知の適切なアッセイを使用して）、ならびに／またはそのような段階のうちの１つ以上の、任意の適切な順番での任意の組合せなどの１つ以上の他の適切な段階をさらに含んでいてもよい。
【０１８６】
本発明のさらに別の態様は、本発明に従った結合ドメインを含むキットに関する。キットは、バッファー、分子タグ、ベクター構築物、基準試料物質等の試薬の組合せならびに適切な固体支持体、細胞、核酸等をさらに含み得る。そのようなキットは、本明細書に記載される本発明の適用のいずれにおいても有用であり得る。たとえば、前記キットは、化合物スクリーニング適用に有用な試験化合物（のライブラリー）を含んでいてもよい。
【０１８７】
最後に、本発明の最後の態様は、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の立体構造エピトープへの特異的結合に関与するアミノ酸配列を単離し、前記アミノ酸配列に基づいて人為的な結合ドメインを構築するための本発明による任意の結合ドメインの使用である。本発明による結合ドメインにおいて、フレームワーク領域および相補性決定領域は公知であり、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体の同じ立体構造エピトープに結合する、結合ドメインの誘導体の研究により、前記立体構造エピトープへの結合に関与する不可欠なアミノ酸を推定することが可能であることが認識される。この知識を使用して最小結合ドメインを構築し、この誘導体を作製することができ、これは当業者に公知の技法により日常的に行うことが可能である。
【０１８８】
以下の実施例は本発明のさらなる理解を促進することが意図されている。本発明は説明される実施形態を参照して本明細書に記載されているが、本発明は本文書に限定されないことは理解されるべきである。当業者および本明細書の教示を利用することができる者は、その範囲内で追加の修正および実施形態を認識する。したがって、本発明は本明細書に添付される特許請求の範囲のみに限定される。
【実施例】
【０１８９】
［実施例１］：安定なアゴニスト−β２ＡＲ−Ｇｓ三元複合体の形成および精製
安定な複合体の形成（図２を参照）は、２ｍｌバッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＤＤＭ、１ｍＭのＥＤＴＡ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１０μＭのＢｌ−１６７１０７）中でＧｓヘテロ三量体をおよそ１００μＭの濃度で、モル過剰（およそ１３０μＭ）のＢｌ−１６７１０７結合Ｔ４Ｌ−β２ＡＲ（またはβ２ＡＲ−３６５）と混合し、室温で３時間インキュベートすることにより実現された。Ｂｌ−１６７１０７は、およそ５０の異なるβ２ＡＲアゴニストをスクリーニングし特徴付けることから同定されたが、およそ３０時間の解離半減期を有しており、イソプロテレノールなどの他の完全アゴニストよりも高度な安定性を活性Ｇタンパク質結合受容体に与える（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２０１１年）。複合体の高親和性無ヌクレオチド状態を維持するため、アピラーゼ（２５ｍＵ／ｍｌ、ＮＥＢ）は９０分後に添加されて、受容体に結合するとＧαｓから放出される残留ＧＤＰを加水分解した。アピラーゼによるＧＤＰの加水分解から生じるＧＭＰは複合体中のＧタンパク質に対し非常に乏しい親和性を有する。ＧＤＰの再結合はＲ：Ｇ複合体の解離を引き起こすことができる（図３ａ）。
【０１９０】
ＤＤＭ中のＲ：Ｇ複合体は、４℃で４８時間後、著しい解離を示す（図４ａ）。５０を超える両親媒性物質をスクリーニングし特徴付け（データは示されていない）、複合体を実質的に安定化する界面活性剤としてＭＮＧ−３（ＮＧ−３１０、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ−Ａｎａｔｒａｃｅ；Ｃｈａｅら、２０１１年）およびそれに密接に関連するアナログを同定した（図４ａ、ｂ）。複合体は、Ｒ：Ｇ混合物（２ｍｌ）を１％のＭＮＧ−３を含有する８ｍｌのバッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０μＭのＢｌ−１６７１０７）に室温で１時間添加することによりＭＮＧ−３に交換された。
【０１９１】
この段階では、前記混合物は、Ｒ：Ｇ複合体、非機能的Ｇｓおよび過剰なβ２ＡＲを含有している。機能的Ｒ：Ｇ複合体を非機能的Ｇｓから分離するため、および界面活性剤交換を完了するため、Ｒ：Ｇ複合体はＭ１フラッグ樹脂上に固定化され、０．２％のＭＮＧ−３を含有するバッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０μＭのＢｌ−１６７１０７および３ｍＭのＣａＣｌ２）中で洗浄された。Ｒ：Ｇ複合体のシステイン架橋媒介凝集を防ぐために、５０ｋＤａのＭＷＣＯ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮器を用いて濃縮することに先立って、１００μＭのＴＣＥＰが溶出タンパク質に添加された。過剰な遊離の受容体をＲ：Ｇ複合体から分離するための最終のサイズ排除クロマトグラフィー手順（図５ｂ）は、０．０２％のＭＮＧ−３、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０μＭのＢｌ−１６７１０７および１００μＭのＴＣＥＰを含有するバッファーで平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で実施された。ピーク画分はプールされ（図５ｂ）、１００ｋＤａのＭＷＣＯ  Ｖｉｖａ−ｓｐｉｎ濃縮器を用いておよそ９０ｍｇ  ｍｌ−１まで濃縮され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシーブリリアントブルー染色（図５ａ）およびゲル濾過（図５ｃ）により解析された。純粋で均質で脱リン酸化された調製物を確認するため、Ｒ：Ｇ複合体はイオン交換クロマトグラフィーにより日常的に解析された（図５ｄ）。
【０１９２】
［実施例２］：アゴニスト：β２ＡＲ：Ｇｓ三元複合体に結合しているナノボディの作製
ネガティブ染色ＥＭ撮像（データは示されていない）から、Ｇαｓのアルファへリックスドメインが柔軟であるであることが観察された。このドメインの標的安定化は、アゴニスト：β２ＡＲ：Ｇｓ三元複合体に結合するナノボディを作製することにより取り組まれた。ナノボディは単一ドメイン抗体であり、ラマ由来の重鎖のみ抗体由来である（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、２００１年）。（アゴニスト負荷）受容体共役Ｇｓタンパク質に結合するナノボディを同定するために、２頭のラマ（ラマ・グラマ（Ｌｌａｍａ  ｇｌａｍａ））をビス（スルホスクシンイミジル）グルタン酸（ＢＳ２Ｇ、Ｐｉｅｒｃｅ）架橋β２ＡＲ：Ｇｓ：Ｂｌ−１６７１０７三元複合体を用いて免疫した。両方の動物とも５０から１００μｇの隔週で４回の注射で免疫された。免疫化終了後、末梢血リンパ球は免疫化動物から単離され全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを調製した。全ＲＮＡは、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（１９８７年）により記載された通りに約１０７のリンパ球から単離された。第一鎖ｃＤＮＡ合成が、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の使用説明書に従ってｄＮ６プライマーおよびスーパースクリプトＲＴを使用して調製された。ＶＨＨ遺伝子をコードする断片は、以前記載された通りに（Ｃｏｎｒａｄら、２００１年）特異的プライマーを使用してＰＣＲによりこのｃＤＮＡから増幅された。ネステッドＰＣＲを使用して、Ｐｓｔ１およびＢｓｔＥＩＩはそれぞれＶＨＨオープンリーディングフレームの出発点および終点で操作された。ＶＨＨはＰｓｔ１−ＢｓｔＥＩＩ断片としてファージディスプレイベクターｐＭＥＳｙ４にクローニングされた。ラマごとに、遺伝子ＩＩＩ融合物としてそれぞれナノボディレパートリーを抱える別々のファージディスプレイライブラリーが構築された（Ｄｏｍａｎｓｋａら  ２０１１年）。Ｒ：Ｇ複合体特異的ナノボディは、ｉ）ＡｐｏＬビオチン化高密度リポタンパク質粒子に包埋されたβ２ＡＲ：Ｇｓ：Ｂｌ−１６７１０７三元複合体上での（ｒＨＤＬ、Ｗｈｏｒｔｏｎら  ２００７年）、またはｉｉ）ＢＳ２Ｇ架橋β２ＡＲ：Ｇｓ：Ｂｌ−１６７１０７三元複合体上での２ラウンドのバイオパニングにより濃縮された。第一のバイオパニング戦略では、β２ＡＲ：Ｇｓ：Ｂｌ−１６７１０７三元複合体を含有するビオチン化ｒＨＤＬ粒子は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００μＭのＴＣＥＰおよび１００ｎＭのＢｌ−１６７１０７中１μｇ／ウェルでニュートラアビジン被覆Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）上に固定化された。第二のバイオパニング戦略では、ＢＳ２Ｇ架橋β２ＡＲ：Ｇｓ：Ｂｌ−１６７１０７三元複合体は、１μｇ／ウェルでＭａｘｉｓｏｒｐプレート上に固相被覆された。バイオパニングのラウンドごとに、１０１１ファージは固定化された抗原に添加され、１から２時間インキュベートされた。次に、非結合ファージは抗原含有ウェルから取り除かれ、ウェルは２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８で１４回洗浄され、最後に２００μＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００μＭのＴＣＥＰおよび１００ｎＭのＢｌ−１��７１０７と一緒に１０分間インキュベートされ、非特定ファージを取り除いた。複雑な特定のファージを溶出するため、ウェルはトリプシンで処理され、ファージは回収され、これを使用して指数関数的に増殖するＴＧ１細胞（ＯＤ６００±０．５）に感染させた。それぞれの濃縮されたライブラリーから、４８のコロニーが無作為に選ばれ、アンピシリンおよびグルコースを含有する１ｍｌの２×ＴＹにおいて増殖された。培養物はＩＰＴＧで誘導されてナノボディの発現を誘導し、部分的に精製されたナノボディを含有する周辺質抽出物が調製された。これらの周辺質抽出物に含有されるナノボディは、アゴニスト：β２ＡＲ：Ｇｓ三元複合体への結合についてＥＬＩＳＡにより解析された。
【０１９３】
β２ＡＲ：Ｇｓ：Ｂｌ−１６７１０７三元複合体を含有するビオチン化ｒＨＤＬ粒子上で濃縮されたナノボディは、空のｒＨＤＬ粒子と対比したニュートラアビジン被覆Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート上に固定化された同じ複合体での比較ＥＬＩＳＡにより解析された。固相被覆ＢＳ２Ｇ架橋化β２ＡＲ：Ｇｓ：Ｂｌ−１６７１０７三元複合体上で濃縮されたナノボディは、非被覆ウェルと対比した同じ固相被覆複合体での比較ＥＬＩＳＡにより解析された。比較ＥＬＩＳＡにおいてプラスのスコアーを出したコロニーから、単一コロニーが調製され、ＤＮＡが抽出され、コードされたナノボディ遺伝子の配列が日常的方法を使用して解析された（表２−３に示されているアミノ酸配列）。Ｎｂ３５、Ｎｂ３６およびＮｂ３７では、β２ＡＲ：Ｇｓ：Ｂｌ−１６７１０７三元複合体への結合は、分析的ゲル濾過によりさらに確かめられた（図３ｄ、３ｅ、３ｆ、３ｇ）。
【０１９４】
［実施例３］：Ｎｂ３５、Ｎｂ３６およびＮｂ３７はＧｓに結合し、ＧＴＰγＳによる複合体の解離を防ぐ
β２ＡＲ：Ｇｓ：Ｂｌ−１６７１０７三元複合体に対して産生されたナノボディ（表２）が受容体にまたはＧｓに結合するかどうかを判定するため、次に精製された受容体単独上でのＥＬＩＳＡにおけるこれらナノボディの結合がモニターされた。表２のナノボディすべてが、高密度でリン脂質ベシクル内に再構成された固相被覆（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、Ｎｕｎｃ）アゴニスト結合β２ＡＲ−３５６においてマイナスのスコアーを出した（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２０１１年）。Ｎｂ８０、β２ＡＲ特異的ナノボディ（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２０１１年）はこのＥＬＩＳＡにおいてプラスのスコアーを出した。表２に記載されるβ２ＡＲ：Ｇｓ：Ｂｌ−１６７１０７結合剤はどれも再構成受容体単独には結合せず、これらの結合剤はＧｓ上のエピトープに結合することを示している。サイズ排除クロマトグラフィーによれば、Ｎｂ３５およびＮｂ３７はＧｓヘテロ三量体上の別々のエピトープに結合してＲ：Ｇ：Ｎｂ３５：Ｎｂ３７複合体を形成することが示される（図３ｄ）。同様に、Ｎｂ３６およびＮｂ３７はＧｓヘテロ三量体上の別々のエピトープに結合してＲ：Ｇ：Ｎｂ３６：Ｎｂ３７複合体を形成する（図３ｅ）。
【０１９５】
ＧＤＰ、ＧＴＰおよび非加水分解性ＧＴＰアナログはβ２ＡＲ：Ｇｓ複合体を破壊し（図３ａ）、ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体をインビトロでもインビボでも解離させる。アゴニスト：β２ＡＲ：Ｇｓ三元複合体の完全性に対するＮｂおよび非加水分解性ＧＴＰアナログであるＧＴＰγＳの相互効果は、ＧＴＰγＳの存在下でおよび非存在下で分析的サイズ排除クロマトグラフィーにより解析された。ナノボディの３５、３６および３７はβ２ＡＲ：Ｇｓ：Ｂｌ−１６７１０７複合体をＧＴＰγＳによる解離から保護することが見出された（図３ｄ、３ｅおよび３ｇ）。
【０１９６】
［実施例４］：β２ＡＲ−Ｇｓ複合体のナノボディ支援結晶化
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、ホルモンおよび神経伝達物質ならびに視覚、嗅覚および味覚の感覚に対する大多数の細胞応答の原因となる。ＧＰＣＲシグナル伝達のパラダイムは、アゴニストが占める受容体によるヘテロ三量体ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）の活性化である。ＧＰＣＲシグナル伝達の構造的基礎を理解する目的で、我々は、Ｘ線結晶学によりその構造を解明するためにβ２ＡＲ：Ｇｓ複合体を結晶化した。
【０１９７】
結晶生成のための１つの難問は、界面活性剤溶液中で安定なβ２ＡＲ：Ｇｓ複合体を調製することであった。β２ＡＲとＧｓは脂質二重層中では効率的に共役するが、これらのタンパク質を可溶化し精製するのに使用される界面活性剤中では結合しない（実施例１）。相対的に安定なβ２ＡＲ：Ｇｓ複合体は、ドデシルマルトシド溶液中で精製されたＧＤＰ−Ｇｓ（およそ１００μＭの最終濃度）を高親和性アゴニスト（Ｂｌ−１６７１０７；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら  ２０１１年）に結合しているモル過剰な精製されたβ２ＡＲと混合することにより調製することができることが見出されていた。非選択性プリンピロホスファターゼであるアピラーゼが添加されて、β２ＡＲとの複合体を形成するとＧｓから放出されたＧＤＰを加水分解した。それに続いて、複合体は連続的抗体親和性クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより精製された。複合体の安定性はドデシルマルトシドを最近開発されたマルトースネオペンチルグリコール界面活性剤（ＮＧ−３１０、Ａｎａｔｒａｃｅ）に交換することにより増強された（Ｃｈａｅら  ２０１０年）。この複合体は目立った分解もなく室温で２４時間インキュベートすることができたが、界面活性剤ミセル、バイセルおよび脂質立方相（ＬＣＰ）中でのスパースマトリックススクリーンを使用して複合体を結晶化する最初の試みは失敗した。
【０１９８】
複合体の性質をさらに評価するために、タンパク質は単粒子電子顕微鏡（ＥＭ）により解析された。その結果により、複合体が単分散であることが確かめられた（データは示されていない）が、上質の結晶の回折を得ることに対する他の考えられる障壁が明らかにされた。第一に、複合体を安定化するのに使用される界面活性剤が大きなミセルを形成し、結晶格子接触の形成のためのβ２ＡＲ：Ｇｓ複合体の細胞外側にほとんど極性表面を残さない。したがって、β２ＡＲの構造不定のアミノ末端をＴ４リゾチーム（Ｔ４Ｌ）で置き換えた。我々は以前Ｔ４Ｌを使用して、膜貫通セグメント（ＴＭ）５と６の細胞質末端の間にＴ４Ｌを挿入することにより不活性β２ＡＲの結晶生成を促進していた（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍら  ２００７年）。この融合タンパク質（Ｔ４Ｌ−β２ＡＲ）は正常なリガンド結合およびＧｓ共役特性を示した。結晶化の試みは、Ｔ４Ｌ−β２ＡＲ：Ｇｓ複合体の大きな親水性成分を収容するように設計された改変されたモノレイン（ｍｏｎｏｌｅｉｎ）（７．７ＭＡＧ、Ｍａｒｔｉｎ  Ｃａｆｆｒｅｙにより提供された）を使用してＬＣＰにおいて実施された（Ｍｉｓｑｕｉｔｔａら  ２００４）。我々は、７Åまで回折する小さな結晶を得ることができたが、添加物および他の改変物の使用を通じてその品質を改良することはできなかった。
【０１９９】
単粒子ＥＭ解析により明らかにされた結晶生成についての別の考えられる問題は、Ｇαｓサブユニットのαヘリックス成分の位置決めの変わりやすさが増大することであった。Ｇαｓは２つのドメイン、すなわち、β２ＡＲおよびＧβサブユニットと相互作用をするｒａｓ様ＧＴＰアーゼドメイン（ＧαｓＲａｓ）ならびにαヘリックスドメイン（ＧαｓＡＨ）からなる（Ｓｐｒａｎｇら  １９９７年）。２つのＧαｓサブドメインの界面はヌクレオチド結合ポケットを形成し（図１）、ＥＭ  ２Ｄアベレージおよび３Ｄ再構成から、グアニンヌクレオチドの非存在下では、ＧαｓＡＨはＴ４Ｌ−β２ＡＲ−ＧαｓＲａｓ−Ｇβγの複合体と比べて変わりやすい位置を有することが示唆される（図１ｂ）。
【０２００】
複合体の結晶生成をさらに促進する目的で、我々は複合体とナノボディ３５の共結晶化を試みた。Ｎｂ３５は複合体をＧＴＰγＳによる解離から保護し、安定化に寄与するＧｓ：Ｎｂ相互作用が示唆される（図３ａ）。Ｂｌ−１６７１０７結合Ｔ４Ｌ−β２ＡＲ：Ｇｓ複合体とＮｂ３５は１対１．２のモル比で混合された（図６および７を参照）。わずかにモル過剰なＮｂ３５は分析的ゲル濾過により確証された（図７ｂ）。混合物は、以前報告された２シリンジ混合法（Ｃａｆｆｒｅｙ  ２００９年）を使用して、１対１のタンパク質対脂質比（ｗ／ｗ）で１０％のコレステロール（Ｃ８６６７、Ｓｉｇｍａ）を含有する７．７ＭＡＧ（Ｍａｒｔｉｎ  Ｃａｆｆｒｅｙにより提供された）と混合するのに先立って、室温で１時間インキュベートされた。７．７ＭＡＧ中のＲ：Ｇ：Ｎｂ複合体の濃度はおよそ２５ｍｇ／ｍｌであった。タンパク質：脂質混合物は、ＬＣＰ分配ロボット（Ｇｒｙｐｈｏｎ、Ａｒｔ  Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を通して４０ｎｌ液滴で２４ウェルまたは９６ウェルガラスサンドイッチプレートのどちらかに送達され、ひとまとめにして０．８μｌの沈殿溶液で表面を覆われた。複数の結晶化リードは最初、ＳｔｏｃｋＯｐｔｉｏｎｓ  Ｓａｌｔキット（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）由来の試薬を部分的にベースにした自社製スクリーンを使用して同定された。データ収集のための結晶は、１８から２２％のＰＥＧ４００、１００ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ６．５（図１ｃ）、３５０から４５０ｍＭの硝酸カリウム、１０ｍＭのホスカルネット（図３ｂ）、１ｍＭのＴＣＥＰおよび１０μＭのＢｌ−１６７１０７中で成長させた。結晶は２０℃で３−４日以内にフルサイズに達し（図８）、スポンジ様中間相から選び取られ、液体窒素内での追加の凍結保護物質なしで瞬間冷凍された。
【０２０１】
［実施例５］：Ｎｂ３５はＲ：Ｇ複合体の結晶形成を促進する
Ｂｌ−１６７１０７結合Ｔ４Ｌ−β２ＡＲ：Ｇｓ：Ｎｂ３５複合体は、空間群ｐ２１において結晶化し、単一複合体はそれぞれの非対称性単位であった。図９ａは、結晶学的パッキング相互作用を示している。図９ｂは、Ｔ４ＬおよびＭｂ３５を含む完全複合体の構造を示しており、図９ｃはβ２ＡＲ：Ｇｓ複合体のみを示している。
【０２０２】
Ｂｌ−１６７１０７結合Ｔ４Ｌ−β２ＡＲ：Ｇｓ：Ｎｂ３５複合体は、交互になった水層と脂質層中で整列され、格子接触はほぼ複合体の可溶性成分間のみで形成され、受容体分子はＧタンパク質層間に浮遊し、膜の水平面で互いに広く分離したままであった。広範な格子接触がすべての可溶性タンパク質間で形成されており、おそらくＧタンパク質についての強い全回折および著しく明瞭な電子密度を説明する。
【０２０３】
Ｎｂ３５およびＴ４ＬはＢｌ−１６７１０７結合Ｔ４Ｌ−β２ＡＲ：Ｇｓ：Ｎｂ３５複合体の結晶形成を促進した。Ｎｂ３５はＧｓ上の立体構造エピトープに結合し、ＧβとＧαサブユニットの界面で詰め込まれ、相補性決定領域（ＣＤＲ、ＩＭＴＧ付番法に従って定義される；Ｌｅｆｒａｎｃ、２００３年）１は主にＧβと相互作用し（図１０ａ）、長ＣＤＲ３ループはＧβとＧαサブユニットの両方と相互作用する（図１０ｂ）。Ｎｂ３５の一部のフレームワーク領域も同じ複合体由来のＧαと相互作用する（図１０ｃ）。１つの複合体由来の他のフレームワーク領域は２つの隣接する複合体由来のＧαサブユニットと相互作用して（図１１）、結晶格子内の結晶接触にかなり寄与している。Ｔ４Ｌは受容体のアミノ末端との比較的希薄な相互作用を形成するが、１つの複合体のＧβサブユニットのアミノ末端、別の複合体のＧγサブユニットのカルボキシル末端およびさらに別の複合体のＧαサブユニットに対して詰め込まれる。
【０２０４】
［実施例６］：活性状態β２ＡＲの構造
β２ＡＲ：Ｇｓ構造は、ＧＰＣＲによる細胞膜を横切るシグナル伝達の機構および三元複合体の機能特性の構造的基礎についての最初の高分解能の洞察を与える。図１２ａはβ２ＡＲ：Ｇｓ複合体におけるアゴニスト結合受容体の構造と不活性カラゾロール結合β２ＡＲを比較する。不活性と活性構造間の最大の違いは、Ｅ２６８のＣα炭素で測定した場合、ＴＭ６の１４Å外側への移動である。ＴＭ５ヘリックスの細胞質末端は、７残基分もっと小さく外側へ移動し伸長している。第三の細胞内ループ（ＩＣＬ３）における２６アミノ酸のストレッチは乱れている。不活性と活性構造間の別の顕著な違いは、第二の細胞内ループ（ＩＣＬ２）であり、このループは不活性β２ＡＲ構造では伸長したループを、β２ＡＲ：Ｇｓ複合体ではαヘリックスを形成している。このヘリックスはβ２ＡＲ−Ｎｂ８０構造においても観察される（図１２ｂ）が、高度に類似するトリβ２ＡＲの不活性構造においても観察される（Ｗａｒｎｅら、２００８年）ために活性状態に特有の特徴ではない可能性がある。
【０２０５】
β２ＡＲについての電子密度地図の質はこのβ２ＡＲ−ＧαｓＲａｓ界面でもっとも高く、おそらく細胞外表面との結晶格子接触の欠如のせいで細胞外半分ではずっと弱い（図９ａ）。その結果、我々は自信を持ってリガンド結合ポケットにおける高親和性アゴニスト（Ｂｌ−１６７１０７）のモデルを作ることができない。しかし、Ｔ４Ｌ−β２ＡＲ：Ｇｓ複合体におけるβ２ＡＲの全構造は、Ｇタンパク質模倣ナノボディ（Ｎｂ８０）により安定化されるβ２ＡＲの我々の最近の活性状態構造に極めて類似している。これらの構造は、おそらくβ２ＡＲ−Ｎｂ８０構造においてＩＣＬ３に取って代わるＴ４Ｌの存在のせいで、主にＴＭ５および６の細胞質末端で逸脱している（図１２ｂ）。にもかかわらず、β２ＡＲ−Ｎｂ８０複合体は、アゴニストのイソプロテレノールに対するβ２ＡＲ：Ｇｓ複合体（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら  ２０１１年）と同じ高親和性を示しており、リガンド結合ポケット周辺の高い構造的類似性と一致している。β２ＡＲ−Ｎｂ８０結晶についての電子密度地図は、リガンド結合ポケット周辺およびリガンド結合ポケットとＧｓ共役界面間のアミノ酸の立体構造再配置についてさらに信頼性の高い見方を提供する（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら  ２０１１年）。
【０２０６】
図１２ｃは、β２ＡＲ−Ｎｂ８０複合体と比べた場合の、β２ＡＲ：Ｇｓ複合体中のＤ／ＥＲＹおよびＮＰｘｘＹを含む高度に保存された配列モチーフの位置を示している（図１３も参照）。これらの保存された配列は、受容体を活性化するまたは不活性状態に維持するために重要であると提唱されてきた（Ｈｏｆｍａｎｎら、２００９年）。これらのアミノ酸の位置は、これら２つの構造では基本的に同じであり、Ｎｂ８０が極めて良好なＧタンパク質代理であることを示している。これら２つの構造間では、Ａｒｇ１３１のみが異なる。β２ＡＲ−Ｎｂ８０構造では、Ａｒｇ１３１はＮｂ８０と相互作用をし、β２ＡＲ：Ｇｓ構造ではＡｒｇ１３１はＧαｓのＴｙｒ３９１に対して詰め込まれる（図１３）。
【０２０７】
β２ＡＲの活性状態は（ＧαｓＲａｓ）との広範な相互作用により安定化される（図１４）。ＧβまたはＧγサブユニットとの直接の相互作用はない。β２ＡＲ−ＧαｓＲａｓ界面の全埋没表面は２５７６Å２（ＧαｓＲａｓでは１３００Å２およびβ２ＡＲでは１２７６Å２）である。この界面はβ２ＡＲのＩＣＬ２、ＴＭ５およびＴＭ６により、およびＧαｓＲａｓのα５ヘリックス、αＮ−β１接合部、β３鎖の先端およびα４ヘリックスにより形成されている（特定の相互作用については表６を参照）。この相互作用に関与しているβ２ＡＲ配列はＧタンパク質共役である役割を果たしていることが明らかにされたが、これらのセグメントを他のＧＰＣＲと整列させた場合、Ｇｓ共役特異性に対するはっきりした共通配列は存在しない。β２ＡＲがＧｉにも共役することおよび多くのＧＰＣＲが１つよりも多いＧタンパク質アイソフォームに共役することを考慮すると、おそらくこれは驚くに当たらない。したがって、Ｇタンパク質共役特異性の構造的基礎は、二次および三次構造のもっととらえがたい特徴を伴わなければならない。にもかかわらず、注目すべき相互作用はＰｈｅ１３９を伴い、これはＩＣＬ２ヘリックスの開始部に位置しており、β１鎖の開始部のＧαｓ  Ｈｉｓ４１、β３鎖の出発点のＶａｌ２１３ならびにα５ヘリックスのＰｈｅ３７６、Ａｒｇ３８０およびＩｌｅ３８３により形成される疎水性ポケットに位置している（図１４ｃ）。β２ＡＲ変異体Ｆ１３９ＡはＧｓへの共役の激しい低下を示している（Ｍｏｒｏら、１９９３年）。Ｐｈｅ１３９に対応する残基は、ほぼすべてのＧｓ共役受容体上のＰｈｅまたはＬｅｕであるが、他のＧタンパク質に共役することが分かっているＧＰＣＲでは可変性が高い。興味深いことに、ＩＣＬ２ヘリックスは、保存されたＤＲＹ配列のＡｓｐ１３０とＩＣＬ２ヘリックスの中間のＴｙｒ１４１間の相互作用により安定化される（図１４ｃ）。Ｔｙｒ１４１は、インスリン受容体チロシンキナーゼに対する基質であることが明らかにされている（Ｂａｌｔｅｎｓｐｅｒｇｅｒら、１９９６年）が、このリン酸化の機能的意義は現在分かっていない。
【０２０８】
［実施例７］：活性化されたＧｓの構造
β２ＡＲ：Ｇｓ複合体におけるもっとも驚くべき所見はＧαｓＲａｓと対比したＧαｓＡＨの大きな転置である（ドメイン間の接合部回りのおよそ１８０°の回転）（図１５ａ）。Ｇαｓの結晶構造では、ヌクレオチド結合ポケットは、ＧαｓＲａｓとＧαｓＡＨ間の界面により形成される。グアニンヌクレオチド結合は、これら２つのドメイン間の相互作用を安定化する。グアニンヌクレオチド結合のこの安定化効果の消失は、界面活性剤可溶化された複合体の単粒子ＥＭ解析においてＧαｓＡＨについて観察される高い柔軟性と一致している（データは示されていない）。この安定化効果の消失は、複合体が形成されるとこれら２つのドメイン間の界面での重水素交換の増加とも一致している（データは示されていない）。最近、Ｈａｍｍ、Ｈｕｂｂｅｌｌおよび同僚らは、電子電子二重共鳴（ＤＥＥＲ）分光法を使用して、光活性化ロドプシンと複合体を形成するとＧｉのＲａｓおよび（？）−ヘリックスドメインに位置する窒素酸化物プローブ間に距離の大きな（最大２０Å）変化が生じることを記述した（Ｖａｎ  Ｅｐｓ  ２０１１年）。したがって、ＧαｓＡＨがＧαｓＲａｓに対比して転置していることは驚きに当たらないが、この結晶構造中のその位置は、生理的立体構造よりはむしろ結晶充填相互作用の影響をおそらく反映している。
【０２０９】
β２ＡＲとヌクレオチド結合ポケット間の立体構造連結は、Ｇαｓのアミノおよびカルボキシル末端ヘリックスを主に含む（図１４）。図１５ｂは、Ｇｓ−β２ＡＲ複合体由来のＧαｓＲＡＳの構造をＧαｓ−ＧＴＰγＳ複合体由来のＧαｓＲＡＳの構造と比較した場合、最大の立体構造変化を受けるＧαｓＲＡＳの領域に焦点を合わせている（Ｓｕｎａｈａｒａら  １９９７年）。最大の違いはα５ヘリックスについて観察され、このヘリックスは受容体方向に６Å転置され、カルボキシル末端がβ２ＡＲの膜貫通コア内に突き出ているので回転している。この移動と関連して、β６−α５ループは、Ｇαｓ−ＧＴＰγＳ構造内でグアニン環と相互作用しているが、ヌクレオチド結合ポケットから離れて外側に転置されている（図１５ｂ−ｄ）。α５ヘリックスの移動は、このヘリックスとβ６シート、αＮ−β１ループおよびα１ヘリックス間の相互作用の変化にも関連している。β１鎖は、β２ＡＲとヌクレオチド結合ポケット間に別の連結を形成する。この鎖のＣ末端はＧｌｙ４７周囲の立体構造を変化させ、γリン酸をＧＴＰ結合型に配位させるβ１−α１ループ（Ｐ−ループ）においてさらに変化している（図１５ｂ−ｄ）。結晶構造における所見は重水素交換実験と一致しており、この実験では、無ヌクレオチドβ２ＡＲ：Ｇｓ複合体が形成されると、β１シートおよびα５ヘリックスのアミノ末端における重水素交換が増強される（データは示されていない）。
【０２１０】
Ｇｓヘテロ三量体の構造は決定されていないので、β２ＡＲ：Ｇｓ複合体の形成前と後でＧαｓ−Ｇβγ界面を直接比較することはできない。ＧＤＰ結合Ｇｉヘテロ三量体の構造に基づいて（Ｗａｌｌら  １９９５年）、我々はβ２ＡＲと複合体を形成するとＧαｓＲＡＳとＧβγ間の相互作用に大きな変化を観察していない。これは重水素交換研究とも一致している（データは示されていない）。Ｎｂ３５がＧαｓＲａｓとＧβ間の界面で結合することは注目すべきである（図２ｂ）。したがって、我々は、Ｎｂ３５が結晶構造内のＧαｓＲａｓ−Ｇβγ界面の相対的配向に影響を与え得る可能性を排除することはできない。しかし、単粒子ＥＭ研究により、Ｎｂ３５がＧαｓＡＨとＧαｓＲａｓ間の相互作用を破壊しない証拠が提供される（データは示されていない）。
【０２１１】
［実施例８］：Ｎｂ３５およびＮｂ３７はＧｓ上の異なるエピトープに結合しヌクレオチド結合を阻害する
Ｇｓのみへのナノボディ（Ｎｂ３５およびＮｂ３７）の効果を調べるため、最終容積２００μＬで２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴにおいて、ナノボディはボディパイ−ＧＴＰγＳ−ＦＬおよび種々のＧｓタンパク質調製物と一緒に添加された。ヘテロ三量体Ｇｓタンパク質を含有する試料は０．１％ＤＤＭも含んでいた。ボディパイ−ＧＴＰγＳ−ＦＬは、安定な蛍光性ＧＴＰアナログである（λｅｘ≒４７０ｎｍ、λｅｍ≒５１５ｎｍ）。その蛍光強度はＧタンパク質が結合すると増加し、したがってボディパイ−ＧＴＰγＳ−ＦＬは、Ｇタンパク質へのヌクレオチド結合のリアルタイム測定に使用することが可能である（ＭｃＥｗｅｎら  ２００１年）。蛍光はＭ５蛍光プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）上９６ウェルマイクロタイタープレートフォーマットにおいて測定された。
【０２１２】
最初の実験では（図１６）、漸増する量のＮｂ３７は１μＭの精製Ｇαｓおよび１００ｎＭのボディパイ−ＧＴＰγＳ−ＦＬと一緒にインキュベートされ、蛍光増加は加水分解生成物であるボディパイリン酸の蓄積を最小限に抑えるために短時間スケール（３００秒）で測定された（Ｊａｍｅｓｏｎら  ２００５年）。ヘテロ三量体Ｇｓタンパク質のＧαｓサブユニットは以前記載された通りに精製された（Ｓｕｎａｈａｒａら  １９９７年）。この実験から、Ｎｂ３７はＧｓα単独へのＧＴＰγＳの結合を用量依存的に遮断すると思われる。これらに結果により、Ｎｂ３７の結合エピトープはヘテロ三量体Ｇｓタンパク質のＧｓαサブユニットに限定されていることも示されている。類似の実験では（図１７）、漸増する量のＮｂ３５は１μＭの精製Ｇαｓおよび１００ｎＭのボディパイ−ＧＴＰγＳ−ＦＬと一緒にインキュベートされた。Ｎｂ３５はＧαｓＲＡＳおよびＧβの要素で構成されたエピトープに結合するという所見と一致して（実施例７を参照）、Ｎｂ３５はＧαｓサブユニット単独へのＧＴＰγＳの結合に何の効果もない。
【０２１３】
別の実験では（図１８）、漸増する量のＮｂ３５は１μＭの精製Ｇｓαβγヘテロ三量体および１００ｎＭのボディパイ−ＧＴＰγＳ−ＦＬと一緒にインキュベートされた。この実験により、Ｎｂ３５は遊離のＧｓαβγヘテロ三量体へのＧＴＰγＳの結合を用量依存的に遮断することが示されている。
【０２１４】
［実施例９］：Ｎｂ３５は他のアゴニスト−ＧＰＣＲ−Ｇｓ複合体を安定化する
Ｇｓアルファサブユニット（またはＧｓタンパク質）は、アデニル酸シクラーゼを活性化することによりｃＡＭＰ依存性経路を活性化するヘテロ三量体Ｇタンパク質サブユニットである。Ｇｓに共役するＧタンパク質共役受容体には、とりわけ、５−ＨＴ受容体型５−ＨＴ４および５−ＨＴ７、ＡＣＴＨ受容体、アデノシン受容体型Ａ２ａおよびＡ２ｂ、アルギニンバソプレシン受容体２、βアドレナリン受容体型β１、β２およびβ３、カルシトニン受容体、カルシトニン遺伝子関連ペプチド受容体、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体、ドーパミン受容体Ｄ１様ファミリー（Ｄ１およびＤ５）、ＦＳＨ受容体、胃抑制ポリペプチド受容体、グルカゴン受容体、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１−Ｒ）、ヒスタミンＨ２受容体、黄体形成ホルモン／絨毛性コナドトロピン受容体、メラノコルチン受容体、副甲状腺ホルモン受容体１、プロスタグランジン受容体型Ｄ２およびＩ２、セクレチン受容体、甲状腺刺激ホルモン受容体が含まれる。
【０２１５】
β２ＡＲ：Ｇｓ：Ｂｌ−１６７１０７内のＧｓに結合するナノボディが他のＧＰＣＲ：Ｇｓ：アゴニスト複合体も安定化するかどうかを判定するため、我々は、Ｇｓ、Ｎｂ３５およびアルギニンバソプレシンと複合体を形成したアルギニンバソプレシン受容体２（受託番号Ｐ３０５１８；Ｖ２Ｒ＿ＨＵＭＡＮ）の複合体（ＡＶＰ：ＮＴ４ＬＶ２Ｒ：Ｇｓ）を調製し、ＳＥＣにおけるこの複合体の安定性を実証した。アルギニンバソプレシン（ＡＶＰ）は、バソプレシン、アルギプレシンまたは抗利尿ホルモンとしても知られるが、アルギニンバソプレシン受容体２を活性化する天然リガンドである。
【０２１６】
安定な複合体の形成（図１９ａ）は、０．１ｍｌバッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＤＤＭ、１ｍＭのＥＤＴＡ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１０μＭのＡＶＰ）中で、およそ９０μＭ濃度のＨｉｓタグ付きＧｓヘテロ三量体をＡＶＰ結合ＮＴ４ＬＶ２Ｒ（９０μＭ）およびＮＢ３５（１００μＭ）と混合することにより実現され、室温で２時間インキュベートした。次に、ＡＶＰ：ＮＴ４ＬＶ２Ｒ：Ｇｓ複合体は２つの連続する親和性精製段階で精製された。精製はＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニターされた（図１９）。先ず、複合体は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌバッファー中１％のＭＮＧを３００μｌを反応混合物に添加した後Ｎｉ−ＮＴＡカラムに適用された。バッファーを用いた広範な洗浄に続いて、複合体は２００ｍＭのイミダゾールを用いて０．２％のＭＮＧ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、ＡＶＰ１０μＭ中に溶出された。次に、複合体はＦＬＡＧタグ親和性カラムに適用され、０．０１％のＭＮＧを含有する同じバッファー中で広範に洗浄され、ＦＬＡＧペプチドを用いて溶出された。この手順はＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニターされ（図１９ｂ）、ＮＴ４ＬＶ２Ｒ、Ｇαｓ、Ｇβ、ＧγおよびＮｂ３５を含有する複合体をそれに従って精製することが可能であることを示している。この複合体は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＭＮＧ、１ｍＭのＥＤＴＡ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１μＭのＡＶＰ中、ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上でＳＥＣによりさらに精製された。この手順はＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニターされ（図１９ｃ）、ＮＴ４ＬＶＴＲ、Ｇαｓ、Ｇβ、ＧγおよびＮｂ３５を含有する単分散複合体をそれに従って精製することが可能であることを示している。
【０２１７】
ＡＶＰ：ＮＴ４ＬＶ２Ｒ：Ｇｓ複合体の安定性を確認するため、精製された試料を氷上で２４時間インキュベートし、その単分散性およびそのＭＷを確認するために試料をＳＥＣに再適用した（図２０）。予想通り、過剰量のアンタゴニストＳＲ１２１４６３（１０μＭ）はＡＶＰ：ＮＴ４ＬＶ２Ｒ：Ｇｓ複合体を破壊する。
【０２１８】
［実施例１０］：ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質複合体を安定化するナノボディを使用するアゴニストまたはポジティブアロステリックモジュレーターについての改良されたスクリーニング
ＧＰＣＲの突き出ていない配座異性体を選択的に安定化するナノボディは、この特定の低量配座異性体と選択的に相互作用するリガンドについてのさらに効率的なスクリーニングを可能にする。その上、配座異性体選択性ナノボディを使用して、薬物スクリーニングのためのアロステリックもしくは隠れた新薬の開発につながる部位を曝露するまたは望まれない結合ポケットを逆にマスクすることもできる。特定の配座異性体が活性状態である場合には、同定されたリガンドはアゴニストとして振る舞う高い可能性があり、ＣｏｓｔａｎｚｉおよびＶｉｌａｒ（２０１１年）により記載されているインシリコドッキング実験により支持されている。実際、その結果によれば、活性化された構造はアンタゴニストよりもアゴニストの同定のほうに有利であり、不活性構造はアゴニストよりも受容体遮断剤の同定に有利である。
【０２１９】
Ｎｂ３５が、ＧαｓおよびＧβγサブユニットの界面に結合することにより活性化されたβ２ＡＲとＧタンパク質間の複合体を安定化するという証拠が提供される。β２ＡＲの低量の活性状態配座異性体と選択的に相互作用するリガンドを同定するスクリーニングアッセイの例は、β２ＡＲ集合をその活性状態の方により移動させるＮｂ３５を使用する放射性リガンドアッセイであり得る。そのような放射性リガンドアッセイは、少し改変を加えてＳｅｉｆｅｒｔおよび共同研究者（１９９８年）により記載されているアッセイとほぼ同じように実行することが可能である。我々は、一般的に好まれる標的としてβ２ＡＲを含み、β２ＡＲの代わりにＧαｓと相互作用をする他の任意のＧＰＣＲを使用するアッセイをここに記載し、その特定のＧＰＣＲに対するアゴニストリガンドを同定する類似のスクリーニング法を実行する。小分子（ＭＷが典型的には２５０から１０００Ｄａの化合物）または断片ベース（ＭＷが典型的には２５０Ｄａ未満の化合物）ライブラリーでさえスクリーニングして候補アゴニストを同定することが可能である。とりわけ断片ベースの薬物スクリーニングにおける最初の的中は典型的には効力／親和性が低いために、突き出ていない配座異性体の安定化は、断片ライブラリースクリーニングの性能をかなり増加させる。Ｎｂ３５は、選択性の新薬の開発につながる配座異性体に特異的である化合物の親和性を選択的に増加させ、したがって新規の断片の同定に強い効果を及ぼす。
【０２２０】
膜固定されたＧタンパク質サブユニットを含有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのヒトβ２ＡＲホモジナイズされた膜抽出物の適切な量（典型的には１０μｇ）は、インキュベーションバッファー（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、１ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌおよび０．５％  ｗ／ｖＢＳＡ）中、３０℃で１時間、Ｎｂ３５または非関連ナノボディ（活性ＧＰＣＲ立体構造を安定化しない）と並行してインキュベートされる。ナノボディはアドレナリン受容体と比べてモル大過剰に（たとえば、１μＭ以上）外因的に供給される。続いて、ナノボディ結合膜は、ライブラリー化合物および２ｎＭの３Ｈ−ジヒドロアルプレノロール（ＤＨＡ）アンタゴニスト放射性リガンドを含有する９６ウェルプレートに添加される。ウェルあたりの全容積はインキュベーションバッファーで１００μｌに調整され、反応混合物は３０℃でもう１時間インキュベートされる。続いて、膜結合放射性リガンドは、０．３％ポリエチレンイミン中に予浸されたＧＦ／Ｃグラスファイバー９６ウェルフィルタープレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して収穫される。フィルタープレートは氷冷洗浄バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４）で洗浄され、５０℃で３０分間乾燥される。２５μｌのシンチレーション液（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ（商標）−Ｏ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を添加後、放射活性（ｃｐｍ）はＷａｌｌａｃ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  ＴｒｉＬｕｘシンチレーションカウンターにおいて測定される。非関連ナノボディを使用せずにＮｂ３５の存在下でｃｐｍを著しく減少するライブラリー化合物はアゴニストリガンドと見なされる。一次ライブラリースクリーニングを介して同定される候補アゴニスト的中は用量応答的に再スクリーニングされる。Ｎｂ３５および非関連ナノボディの存在下での候補アゴニストごとの％放射性リガンド置換曲線のＩＣ５０値は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算される。同定された新規化合物の効果的受容体活性化作用を証明するため、細胞β２ＡＲシグナル伝達アッセイにおけるこれらの化合物の用量依存性効果が評価されることになる。そのようなアッセイの一例は、Ｇαｓ媒介シグナル伝達後のｃＡＭＰなどの二次メッセンジャー分子の検出に頼っている（たとえば、ＨｉｔＨｕｎｔｅｒ  ｃＡＭＰアッセイ技術、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）。膜抽出物および外因的に適用されるＮｂ３５を使用する代わりに、β２ＡＲ集団をその活性状態に移動させるために細胞内抗体（または由来膜）としてＮｂ３５で同時トランスフェクトされたβ２ＡＲ発現細胞株で、放射性リガンドアッセイを実施することができた。代わりに、組換えＧタンパク質およびβ２ＡＲを使用して、Ｎｂ３５を介してβ２ＡＲの活性状態を安定化することができる。
【０２２１】
実施例の材料および方法
β２ＡＲ、Ｇｓヘテロ三量体およびナノボディ３５の発現および精製
３６５位で切断されたＮ末端融合Ｔ４リゾチーム−β２ＡＲ構築物（Ｔ４Ｌ−β２ＡＲ、下に詳細に記載されている）は、以前記載された方法（Ｋｏｂｉｌｋａら１９９５年）に従って、組換えバキュロウイルスで感染されたＳｆ−９昆虫細胞培養物（ＢｅｓｔＢａｃ、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ）において発現され、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）中に可溶化された（精製全体像は図６を参照）。残基３６５の後で切断されたβ２ＡＲ構築物（β２ＡＲ−３６５；配列番号５５）は、大多数の分析実験のためにおよび重水素交換実験のために使用された。Ｍ１  ＦＬＡＧ親和性クロマトグラフィー（Ｓｉｇｍａ）は最初の精製段階としての役割を果たし、機能的受容体の選択のためのアルプレノロール−セファロースクロマトグラフィーが続いた。それに続くＭ１  ＦＬＡＧ親和性クロマトグラフィー段階を使用して、受容体結合アルプレノロールを高親和性アゴニストＢｌ−１６７１０７と交換した。アゴニスト結合受容体は溶出され、バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％ＤＤＭおよび１０μＭのＢｌ−１６７１０７）に対して透析され、ラムダホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理され、５０ｋＤａの分画分子量（ＭＷＣＯ）Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮器を用いておよそ５０ｍｇ  ｍｌ−１まで濃縮された。スピン濃縮に先立って、Ｔ４Ｌ−β２ＡＲではなくβ２ＡＲ−３６５構築物はＰＮＧアーゼＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理されてアミノ末端Ｎ連結グリコシル化を取り除いた。精製された受容体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシーブリリアントブルー染色により日常的に解析された（図５ａを参照）。
【０２２２】
ウシＧα５ショート、Ｈｉｓ６タグに融合したラットＧβ１およびラットＧγ２（表５を参照）は、Ｉｎｓｅｃｔ  Ｘｐｒｅｓｓ無血清培地（Ｌｏｎｚａ）において増殖されたＨｉｇｈ５昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において発現された。培養物は、１ｍｌあたり１５０万細胞の密度まで増殖され、次に３つの別々のオートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルスであって、それぞれがＧタンパク質サブユニットのうちの１つの遺伝子を含有するウイルスで１対１の感染多重度で感染された（ウイルスはＤｒ．Ａｌｆｒｅｄ  Ｇｉｌｍａｎより寄贈された）。４０−４８時間のインキュベーション後、感染細胞は遠心分離により収穫され、１リットルの培養物容積あたり７５ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、６５ｍＭのＮａＣｌ、１．１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、１×ＰＴＴ（３５μｇ／ｍｌのフッ化フェニルメタンスルホニル、３２μｇ／ｍｌのトシルフェニルアラニルクロロメチルケトン、３２μｇ／ｍｌのトシルリシルクロロメチルケトン）、１×ＬＳ（３．２μｇ／ｍｌのロイペプチンおよび３．２μｇ／ｍｌのダイズトリプシン阻害剤）、５ｍＭのβ―ＭＥおよび１０μＭのＧＤＰ）中に再懸濁された。懸濁液は窒素空洞化爆弾（Ｐａｒｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）において４０分間、６００ｐｓｉｇ  Ｎ２で加圧された。減圧後、ライセートは遠心分離されて核および非溶解細胞を取り除き、次に１８０，０００×ｇで４０分間、超遠心分離された。ペレット化された膜は、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを使用して１リットル培養物容積あたり３０ｍｌの洗浄バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、５０ｍＭのＮａＣｌ、１００μＭのＭｇＣｌ２、１×ＰＴＴ、１×ＬＳ、５ｍＭのβ−ＭＥ、１０μＭのＧＤＰ）中に再懸濁され、再び１８０，０００×ｇで４０分間、遠心分離された。洗浄されたペレットは最小容積の洗浄バッファーに再懸濁され、液体窒素を用いて急速冷凍された。
【０２２３】
凍結した膜は解凍され、新鮮な洗浄バッファーで全タンパク質濃度５ｍｇ／ｍｌまで希釈された。コール酸ナトリウム界面活性剤が最終濃度１．０％で懸濁液に添加され、ＭｇＣｌ２は最終濃度５ｍＭまで添加され、．０５ｍｇの精製されたタンパク質ホスファターゼ５（自社製）は１リットルの培養物容積あたりで添加された。試料は氷上で４０分間撹拌され、次に１８０，０００×ｇで４０分間、遠心分離されて不溶性デブリを取り除いた。上澄みはＮｉ−ＮＴＡロードバッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、３６３ｍＭのＮａＣｌ、１．２５ｍＭのＭｇＣｌ２、６．２５ｍＭのイミダゾール、０．２％のＡｎｚｅｒｇｅｎｔ３−１２、１×ＰＴＴ、１×ＬＳ、５ｍＭのβ−ＭＥ、１０μＭのＧＤＰ）で５倍に希釈され、コール酸濃度をその臨界ミセル濃度よりも下にあまりにも急速に下げるのを避けるために注意してバッファーをゆっくり添加した。１リットルの培養物容積あたり、Ｎｉ−ＮＴＡ洗浄バッファー１（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのイミダゾール、０．２％のコール酸、０．１５％のＡｎｚｅｒｇｅｎｔ３−１２、１×ＰＴＴ、１×ＬＳ、５ｍＭのβ−ＭＥ、１０μＭのＧＤＰ）中で予め平衡化された３ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）が添加され、試料は氷上で２０分間撹拌された。樹脂は重力カラムに収集され、Ｎｉ−ＮＴＡ洗浄バッファー１、Ｎｉ−ＮＴＡ洗浄バッファー２（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのイミダゾール、０．１５％のＡｎｚｅｒｇｅｎｔ３−１２、０．１％のＤＤＭ、１×ＰＴＴ、１×ＬＳ、５ｍＭのβ−ＭＥ、１０μＭのＧＤＰ）およびＮｉ−ＮＴＡ洗浄バッファー３（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのイミダゾール、０．１％のＤＤＭ、１×ＰＴＴ、１×ＬＳ、５ｍＭのβ−ＭＥ、１０μＭのＧＤＰ）の４×カラム容積を用いて洗浄された。タンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ溶出バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのイミダゾール、０．１％のＤＤＭ、１×ＰＴＴ、１×ＬＳ、５ｍＭのβ−ＭＥ、１０μＭのＧＤＰ）を用いて溶出された。タンパク質含有画分はプールされ、ＭｎＣＬ２は最終濃度１００μＭまで添加された。５０μｇの精製されたラムダタンパク質ホスファターゼ（自社製）は１リットルの培養物容積あたりで添加され、溶出液は氷上３０分間撹拌しながらインキュベートされた。溶出液は０．２２μｍフィルターを通して、ＭｏｎｏＱバッファーＡ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、５０ｍＭのＮａＣｌ、１００μＭのＭｇＣｌ２、０．１％のＤＤＭ、５ｍＭのβ−ＭＥ、１×ＰＴＴ）中で平衡化されたＭｏｎｏＱ  ＨＲ１６／１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に直接負荷された。カラムは１５０ｍｌのバッファーＡを用いて５ｍｌ／分で洗浄され、結合しているタンパク質は、直線勾配最大２８％のＭｏｎｏＱバッファーＢ（１ＭのＮａＣｌ以外バッファーＡと同じ）で３５０ｍｌ超溶出された。画分は、最終濃度１０μＭにするのに十分なＧＤＰをスポットされたチューブ内に収集された。Ｇｓ含���画分は、１０ｋＤａ  ＮＭＷＬ再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた撹拌限外濾過細胞を使用して２ｍｌまで濃縮された。濃縮された試料は、Ｓ２００バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、１．１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２％のＤＤＭ、１００μＭのＴＣＥＰ、２μＭのＧＤＰ）中で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｒｅｐグレードＸＫ  １６／７０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に流された。純粋なＧｓを含有する画分はプールされ、グリセロールは１０％の最終濃度まで添加され、次にタンパク質は、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ再生セルロースＡｍｉｃｏｎ遠心分離限外濾過装置を使用して少なくとも１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮された。次に、濃縮された試料はアリコートされ、急速冷凍され、−８０℃で保存された。８リットルの細胞培養物容積からの最終精製Ｇｓヘテロ三量体の典型的収量は６ｍｇであった。
【０２２４】
ナノボディ３５（Ｎｂ３５）（配列番号１）は、以前記載された方法（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら  ２０１１年）に従って、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＷＫ６の周辺質に発現され、抽出され、ニッケル親和性クロマトグラフィー、続いてＭｏｎｏ  Ｓ  １０／１００ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するイオン交換クロマトグラフィー（図７ａ）により精製された。選択されたＮｂ３５画分はバッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ）に対して透析され、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮器を用いておよそ６５ｍｇ  ｍｌ−１まで濃縮された。
【０２２５】
タンパク質操作
Ｒ：Ｇ複合体の結晶を得る可能性を高めるために、我々は２つの戦略を使用して受容体細胞外表面の極性表面積を増加することを試みた。アプローチは、柔軟でおそらく構造不定のＮ末端を、カラゾロール結合受容体を結晶化し解明するために以前使用された球状タンパク質Ｔ４リゾチーム（Ｔ４Ｌ）（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍら  ２００７年）で置き換えることであった。ここで使用される構築物（Ｔ４Ｌ−β２ＡＲ）は、切断可能なシグナル配列、続いてＭ１  Ｆｌａｇエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＡ；配列番号７０）、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列（ＥＮＬＹＦＱＧ；配列番号７１）、Ｃ５４ＴおよびＣ９７Ａ変異を含むＮ２からＹ１６１までのバクテリオファージＴ４リゾチーム、ならびにヒトβ２ＡＲ配列Ｄ２９からＧ３６５までに融合している２つの残基アラニンリンカーを含有していた（配列番号６９により定義されるＴ４Ｌ−β２ＡＲ融合構築物）。β２ＡＲのＮ１８７におけるＰＮＧアーゼＦ隔絶されたグリコシル化部位はＧｌｕに変異していた。第一の細胞外ループ内のＭ９６およびＭ９８は、それぞれＴｈｒで置き換えられて、Ｔ４Ｌ−β２ＡＲのそうでなければ低い発現レベルを増加した。スレオニン変異は３Ｈ−ジヒドロ−アルプレノロールに対するリガンド結合親和性に影響を与えなかったが、イソプロテレノールに対する親和性の小さなおよそ２倍の減少を引き起こした（データは示されていない）。ここで使用される野生型基準β２ＡＲは配列番号７２により定義されていることに留意されたい。
【０２２６】
マイクロ結晶学データ収集および処理
データ収集は先端放射光施設ビームライン２３  ＩＤ−Ｂで実施された。何百もの結晶がスクリーニングされ、最終データセットは、２０の強く回折している結晶から典型的には１０度の回折ウェッジを使用してまとめられた。データ整理はＨＫＬ２０００を使用して実施された（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉら  １９９７年）。多くの場合に３Åを超える回折が最初のフレームで見られたが、放射線障害および異方性回折のせいでより高い分解能シェルの完全性は低かった。ＵＣＬＡ回折異方性サーバーによる最終データセットの解析（Ｓｔｒｏｎｇら  ２００６年）により、ａ＊逆数軸に沿った回折は他の方向の回折よりも優れていることが示された。それぞれの逆格子空間軸に沿ったＦ／ｓｉｇＦカットオフの３に基づいて、反射は、精密化して使用するのに先立って、ａ＊、ｂ＊およびｃ＊に沿った分解限界２．９、３．２および３．２オングストロームを用いた異方性切り捨てにかけられた。高分解能シェルの完全性の低さのせいで、我々はわずか３．３Åの全分解能までのこの構造を報告するが、精密化および地図計算中に２．９Åまでの一部の回折データが含まれていたことに留意すべきである。
【０２２７】
構造解明および精密化
構造はＰｈａｓｅｒを使用する分子置換により解明された（ＭｃＣｏｙら  ２００７ａ，ｂ）。分子置換探索の順番は構造を解明するのに極めて重要であることが見出された。使用された順番に、探索モデルは、Ｇｉヘテロ三量体Ｇタンパク質の構造からのベータおよびガンマサブユニットの構造（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＧＰ２）、Ｇｓアルファｒａｓドメイン（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＡＺＴ）、活性状態ベータ２アドレナリン受容体（ＰＤＢ  ＩＤ：３Ｐ０Ｇ）、ベータ２結合ナノボディ（ＰＤＢ  ＩＤ：３Ｐ０Ｇ）、Ｔ４リゾチーム（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＲＨ１）、Ｇｓアルファへリックスドメイン（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＡＺＴ）であった。分子置換による初期構造の決定に続いて、剛体精密化およびシュミレートアニーリングが、Ｐｈｅｎｉｘ（Ａｆｏｎｉｎｅら  ２００５年）およびＢＵＳＴＥＲ（Ｂｌａｎｃら  ２００４年）において実施され、続いてＣｏｏｔにおいて拘束精密化（ｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）および手動再構築が実施された（Ｅｍｓｌｅｙら  ２００４年）。反復精密化および手動調整後、構造はＤＥＮ法を使用してＣＮＳにおいて精密化された。この構造の分解能はＤＥＮが典型的にもっとも有用である分解能を超えてはいるが、いくつかの分解能の低い領域の存在により、精密化を先導する追加の情報を組み込むことによりもっと良好な結果が得られることが示された。使用されたＤＥＮ基準モデルは分子置換探索モデルとして上で示されたモデルであり、例外はＮＢ３５で、これは秩序立っておりこれにはさらに高い分解能の構造は入手できない。図はＰｙＭＯＬを使用して調製された（ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｙｔｅｍ、Ｖｅｒｓｉｏｎ１．３、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ）。精密化統計は表７に与えられている。
【０２２８】
結合
β２ＡＲまたはβ２ＡＲ−Ｇｓペプチド融合物を発現する膜はバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞から調製され、３Ｈ−ジヒドロアルプレノロール（３Ｈ−ＤＨＡ）結合は以前記載された（Ｓｗａｍｉｎａｔｈら  ２００２年）通りに実施された。競合結合では、膜は３Ｈ−ＤＨＡ（最終１．１ｎＭ）および漸増する濃度の（−）−イソプロテレノール（ＩＳＯ）と一緒に１時間インキュベートされ、その後ＧＦ／Ｂフィルター上に収穫された。競合データは２部位結合モデルにフィットされ、ＩＳＯ高および低Ｋｉならびに画分はＧｒａｐｈＰａｄ  ｐｒｉｓｍを使用して計算された。
【０２２９】
ＮＴ４ＬＶ２Ｒの精製
Ｎ末端融合Ｔ４Ｌ  Ｖ２Ｒ構築物（ＮＴ４Ｌ−Ｖ２Ｒ；配列番号７３）はバキュロウイルス系（ＰｆａｓｔＢａｃ）を使用してＳｆ９細胞において発現された。細胞には１ｍｌあたり４×１０６細胞の密度で感染させ、培養フラスコは２７℃で４８時間振盪させた。収穫後、細胞は、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、１μＭのトルバプタン（Ｓｉｇｍａ）および反応性システインを遮断するための２ｍｇ  ｍｌ−１のヨードアセトアミドを含むバッファー中浸透圧ショックにより溶解させた。Ｓｆ９膜からのＮＴ４Ｌ−Ｖ２Ｒの抽出は、０．５％のドデシルマルトシド（ＤＤＭ）、０．３％のコール酸、０．０３％のコレステロールヘミコハク酸（ＣＨＳ）、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、０．５ＭのＮａＣｌ、３０％ｖ／ｖグリセロール、２ｍｇ  ｍｌ−１のヨードアセトアミドおよび１μＭのトルバプタンを含む可溶化バッファー中でＤｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いて実行された。遠心分離後、ニッケル−ＮＴＡアガロースが上澄みに添加され、２時間撹拌され、次に０．１％のＤＤＭ、０．０３％のコール酸、０．０１％のＣＨＳ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌの洗浄バッファーを用いて１００ｇスピンでそれぞれ５分間、バッチ内で洗浄された。樹脂はガラスカラムに注入され、結合している受容体は、３００ｍＭのイミダゾールを補充された洗浄バッファーに溶出された。我々は、抗Ｆｌａｇ  Ｍ１親和性樹脂を使用してＮＴ４Ｌ−Ｖ２Ｒをさらに精製し、リガンドをアゴニストＡＶＰと交換した。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂溶出液は抗Ｆｌａｇ  Ｍ１樹脂上に負荷され、１０μＭのＡＶＰの存在下で広範に洗浄された。次に、受容体は、１μＭのＡＶＰの存在下で、０．２ｍｇ  ｍｌ−１Ｆｌａｇペプチドおよび２ｍＭのＥＤＴＡを用いて抗Ｆｌａｇ  Ｍ１親和性樹脂から溶出させ、１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ濃縮器を使用して濃縮した。
【０２３０】
【表２】
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【０２３１】
【表３】
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【０２３２】
【表４】
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【０２３３】
【表５】
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【０２３４】
【表６】
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【０２３５】
【表７】
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【０２３６】
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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