(57)【要約】本発明は、（ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する細菌Ｉｇ様ドメインタンパク質断片（ｏｒｆ４０５Ｂ）またはそれに対して少なくとも８０％の類似性を有するタンパク質と、（ｉｉ）配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する推定リポタンパク質（ｏｒｆ３５２６）またはそれに対して少なくとも８０％類似性を有するタンパク質の組み合わせを含む免疫原性組成物を提供する。ある実施形態において、免疫原性組成物は、（ｉｉｉ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するｕｐｅｃ１２３２またはそれに対して少なくとも８０％類似性を有するタンパク質をさらに含む。
2014531442.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する細菌Ｉｇ様ドメインタンパク質断片（ｏｒｆ４０５Ｂ）またはそれに対して少なくとも８０％の類似性を有するタンパク質と、（ｉｉ）配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する推定リポタンパク質（ｏｒｆ３５２６）またはそれに対して少なくとも８０％類似性を有するタンパク質の組み合わせを含む免疫原性組成物。
【請求項２】
（ｉｉｉ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するｕｐｅｃ１２３２またはそれに対して少なくとも８０％類似性を有するタンパク質をさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
（ｉｖ）配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有するｇｓｐＫ（ｏｒｆ３５１５）またはそれに対して少なくとも８０％の類似性を有するタンパク質をさらに含む、請求項１または請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
少なくとも１種の細菌毒素をさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記細菌毒素が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ毒素である、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記細菌毒素が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＬＴＫ６３）の修飾された熱不安定性毒素である、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記推定リポタンパク質（ｏｒｆ３５２６）が、配列番号８に関して位置１３０４、１３０５、１３０６、１３０７および／または１３０８の少なくとも１個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されており、変異体ｏｒｆ３５２６タンパク質の亜鉛結合活性が、野生型ｏｒｆ３５２６に対して少なくとも５０％低下している変異体タンパク質である、請求項１から６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記変異体ｏｒｆ３５２６タンパク質が、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
１種または複数の薬学的に許容される担体、希釈剤および／またはアジュバントを含む、前記の請求項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
ワクチン組成物である、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
医薬において使用するための、請求項１から１０のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
Ｅ．ｃｏｌｉによる感染の処置または予防において使用するための、請求項１から１０のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
哺乳動物においてＥ．ｃｏｌｉ感染を処置または予防するための方法であって、前記哺乳動物に、有効量の請求項１から１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１４】
Ｅ．ｃｏｌｉによる前記感染が、腸外病原性Ｅ．ｃｏｌｉおよび腸内病原性Ｅ．ｃｏｌｉの両方による感染を含む、請求項１３に記載の方法または請求項１２に記載の使用のための請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記免疫原性組成物が、粘膜表面に投与される、請求項１３もしくは１４に記載の方法または請求項１２もしくは１４に記載の使用のための請求項１２もしくは１４に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記粘膜表面が、鼻上皮を含む、請求項１５に記載の方法または請求項１５に記載の使用のための請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記粘膜表面が、口腔粘膜を含む、請求項１５に記載の方法または請求項１５に記載の使用のための請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記粘膜表面が、胃、小腸、大腸および直腸からなる群より選択される胃腸器官の管腔表面を含む、請求項１５に記載の方法または請求項１５に記載の使用のための請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記免疫原性組成物が、非経口投与によって投与される、請求項１３もしくは１４に記載の方法または請求項１２もしくは１４に記載の使用のための請求項１２もしくは１４に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
（ｉ）配列番号３１のアミノ酸配列または（ｉｉ）アミノ酸位置１３０４、１３０５および１３０８を含む配列番号３１の免疫原性断片を含むポリペプチド。
【請求項２１】
抗体に結合するポリペプチドであって、前記抗体は、
（ｉ）１７分あたりで溶出するか、またはアイソフォームＡの後および／もしくはアイソフォームＣの前に溶出する画分の組換え３５２６ポリペプチド（複数可）を含む組成物から、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ＣａｐｔｏＱおよび／またはブチルセファロースクロマトグラフィー）を使用する精製によって取得可能な３５２６ポリペプチドのアイソフォームＢと結合するが、前記抗体が、
（ｉｉ）１６分あたりで溶出する画分の、またはアイソフォームＢの前および／もしくはアイソフォームＣの前に溶出する画分の組換え３５２６ポリペプチド（複数可）を含む組成物から、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ＣａｐｔｏＱおよび／またはブチルセファロースクロマトグラフィー）を使用する精製によって取得可能な３５２６ポリペプチドのアイソフォームＡと結合せず、
１９分あたりで溶出するか、またはアイソフォームＡの後および／もしくはアイソフォームの後に溶出する画分の組換え３５２６ポリペプチド（複数可）を含む組成物から、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ＣａｐｔｏＱおよび／またはブチルセファロースクロマトグラフィー）を使用する精製によって取得可能な３５２６ポリペプチドのアイソフォームＣとも結合しない、
ポリペプチド。
【請求項２２】
前記推定リポタンパク質（ｏｒｆ３５２６）が、請求項２１に記載のポリペプチドである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、Ｅ．ｃｏｌｉに対する免疫化およびＥ．ｃｏｌｉワクチンの分野に関する。より詳しくは、本発明は、病原性Ｅ．ｃｏｌｉ病原型に対する免疫化において使用するための予防用および治療用ワクチンの組み合わせの調製において有用であるポリペプチドの組み合わせに関する。特に、ヒトを幅広いＥ．ｃｏｌｉ株から防御するのに有用なワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明が関連する技術分野の最先端をより十分に説明するために、いくつかの刊行物および特許文書が本願において参照されている。これらの刊行物の各々の開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉは、ヒト消化管の一般的な生着菌であり、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、大部分は共生生物と見なされているが、いくつかの単離株は、疾患を引き起こす可能性を有する。Ｅ．ｃｏｌｉの２つの別個の病原性カテゴリーは、それらが腸内または腸外の感染を引き起こすかどうかに応じて認識されている。腸外病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥｘＰＥＣ）群は、尿路感染症（ＵＰＥＣ）、新生児髄膜炎（ＮＭＥＣ）および敗血症を引き起こすヒト病原性株を含む。その他のＥｘＰＥＣ株として、鳥類種にとって代わりに病原性であるものがある（ＡＰＥＣ）。腸内病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＩｎＰＥＣ）群は、すべてヒト腸管に対して感染を引き起こす、腸毒素産生性（ＥＴＥＣ）、腸管病原性（ＥＰＥＣ）、腸管出血性（ＥＨＥＣ）、腸管侵入性、接着侵入性およびびまん接着性Ｅ．ｃｏｌｉなどの多数の病原型を含む。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのこれらの病原性株は、細菌感染の最もよく見られる原因であり、毎年世界で２００万人を超える人の命を奪う再発性の世界的な脅威を提示する。
【０００４】
ワクチン接種が、病原性Ｅ．ｃｏｌｉ株による罹病および死亡に対する最も費用効率の高い予防的手段であろうことは疑う余地もない。しかし、初期研究は、個々の病原性カテゴリーに対して、例えば、ＵＰＥＣ単独またはＮＭＥＣ単独に対して防御なワクチンにおいて使用するための候補の同定に焦点を当ててきた。比較ゲノム解析に基づき、３種のＥｘＰＥＣ株（ＩＨＥ３０３４、ＣＦＴ０７３および５３６）の完全ゲノム配列を使用する以前の刊行物では、発明者らは、敗血症からの防御を与えることができる９種の可能性あるワクチン候補を同定した（非特許文献１）。
【０００５】
個々の疾患または疾病に対して使用するためのワクチンは有用であるが、Ｅ．ｃｏｌｉによって引き起こされる感染症のすべて、または多数の感染症に対して、動物、特に、ヒトにおいて防御免疫を提供する広域スペクトルワクチンを提供することが望ましい。例えば、個体は、ワクチン接種されると、Ｅ．ｃｏｌｉが引き起こし得る種々の疾患のうちすべてまたは高いパーセンテージに対して守られ得るか、または防御され得る。広く防御的なワクチンは、病院および地域全体における抗生物質耐性菌（ＣＴＸ−Ｍ  β−ラクタマーゼおよびカルバペネマーゼ（ｃａｒｂｅｐｅｎｅｍａｓｅｓ））の蔓延のためにさらに有効であろう。しかし、このような「ユニバーサル」または「汎Ｅ．ｃｏｌｉ」ワクチンの開発は、普通は共生生物菌叢の一部ではないＥ．ｃｏｌｉ株のサブタイプを選択的に防ぐことが必要であるために難しいものである。したがって、粗細胞溶解物から離れて、より良好に規定された分子に変わる必要を含めて、改善されたＥ．ｃｏｌｉワクチンが必要であり、「ユニバーサル」ワクチンに含めるのに適している抗原、特に、臨床的に関連する株の間で広まっており、また、共生生物株においては見られない抗原を同定する必要がある。
【０００６】
さらに、ニードルを含まないワクチンか、または粘膜投与されるワクチンは、患者のコンプライアンスを向上させ、ワクチン接種の安全性を高めながらの、患者の快適さの改善および投与の容易性ならびに汚染およびその他の有害作用のリスクの低減という理由のために好ましい。
【０００７】
本発明者らは、病原性Ｅ．ｃｏｌｉに対する広域スペクトルワクチンの調製において使用するのに適した抗原の組み合わせを発見した。驚くべきことに、ワクチンの組み合わせは、ＥｘＰＥＣおよびＩｎＰＥＣ群両方に由来するＥ．ｃｏｌｉの病原性株によって引き起こされる疾患／疾病に対する防御を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ＰＮＡＳ（２０１０年）１０７巻：２０号  ９０７２〜９０７７頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の態様において、本発明は、（ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する細菌Ｉｇ様ドメインタンパク質断片（ｏｒｆ４０５Ｂ）またはそれに対して少なくとも８０％の類似性を有するタンパク質と、（ｉｉ）配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する推定リポタンパク質（ｏｒｆ３５２６）またはそれに対して少なくとも８０％類似性を有するタンパク質の組み合わせを含む免疫原性組成物を提供する。
【００１０】
ある実施形態において、免疫原性組成物は、（ｉｉｉ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するｕｐｅｃ１２３２またはそれに対して少なくとも８０％類似性を有するタンパク質をさらに含む。
【００１１】
さらなる実施形態では、免疫原性組成物は、（ｉｖ）配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有するｇｓｐＫ（ｏｒｆ３５１５）またはそれに対して少なくとも８０％の類似性を有するタンパク質をさらに含む。
【００１２】
その他の実施形態では、免疫原性組成物は、少なくとも１種の細菌毒素をさらに含む。特に、細菌毒素は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ毒素である。より詳しくは、細菌毒素は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＬＴＫ６３）の修飾された熱不安定性毒素、より詳しくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＬＴＫ６３）の解毒された熱不安定性毒素である。
【００１３】
本発明の組成物のタンパク質成分は、本明細書で言及されたタンパク質またはアミノ酸配列の断片であり得る。
【００１４】
ある実施形態において、免疫原性組成物において利用される推定リポタンパク質（ｏｒｆ３５２６）は、配列番号８に関して位置１３０４、１３０５、１３０６、１３０７および／または１３０８の少なくとも１個のアミノ酸（例えば、１、２、３、４または５個のアミノ酸）が、別のアミノ酸によって置換されている変異体タンパク質である。ある実施形態において、推定リポタンパク質（ｏｒｆ３５２６）は、亜鉛結合活性が、野生型ｏｒｆ３５２６に対して少なくとも５０％低下している変異体ｏｒｆ３５２６タンパク質である。ある実施形態において、変異体は、等量の野生型ｏｒｆ３５２６の含量よりも少なくとも５０％少ない亜鉛含量を有する。変異体ポリペプチドは、例えば、Ｎ末端システインで脂質付加され得る。ｏｒｆ３５２６ポリペプチドまたはその断片のその他の改変体に対して、例えば、野生型ｏｒｆ３５２６ポリペプチドに対して、亜鉛イオン含量が低下したか、または亜鉛イオンを実質的に含まない変異体ポリペプチドが調製され得る。このような低下した亜鉛結合活性を有する変異体ｏｒｆ３５２６タンパク質は、位置１３０４、１３０５、１３０６、１３０７および／または１３０８の前記のアミノ酸置換のうち１または複数（例えば、２、３、４または５）を有し得る。特定の変異体ｏｒｆ３５２６タンパク質は、配列番号３１のアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含み、それらは位置１３０４、１３０５および１３０８に変異を含む。１種のこのような断片は、位置１３０４、１３０５および１３０８に変異を含み、配列番号３１のアミノ酸残基２４〜１５２０または残基３４〜１５２０を含む。ｏｒｆ３５２６ポリペプチドまたはその断片のその他の改変体に対して、例えば、野生型ｏｒｆ３５２６ポリペプチドに対して、亜鉛イオン含量が低下したか、または亜鉛イオンを実質的に含まない変異体ポリペプチドまたはその免疫原性断片が調製され得る。
【００１５】
ある実施形態において、ｏｒｆ３５２６のアイソフォームＢ（図９ａ中のピークＢに対応する）またはその免疫原性断片が好ましい。１つのこのような例示的免疫原性断片として、位置１３０４、１３０５および１３０８に変異を含み、配列番号３１のアミノ酸残基２４〜１５２０または残基３４〜１５２０を含むポリペプチドのアイソフォームＢがある。
【００１６】
その他の実施形態では、ｏｒｆ３５２６のアイソフォームＡ（図９ａ中のピークＡに対応する）またはその免疫原性断片が好ましい。１つのこのような例示的免疫原性断片として、位置１３０４、１３０５および１３０８に変異を含み、配列番号３１のアミノ酸残基２４〜１５２０または残基３４〜１５２０を含むポリペプチドのアイソフォームＡがある。
【００１７】
その他の実施形態では、ｏｒｆ３５２６のアイソフォームＣ（図９ａ中のピークＣに対応する）またはその免疫原性断片が好ましい。
【００１８】
さらなる実施形態では、ｏｒｆ３５２６のアイソフォームＡ、ＢおよびＣまたはその免疫原性断片のうち少なくとも２種の組み合わせが好ましい。特に、ｏｒｆ３５２６のアイソフォームＡおよびＢまたはその免疫原性断片の組み合わせが好ましい。例えば、位置１３０４、１３０５および１３０８に変異を含み、配列番号３１のアミノ酸残基２４〜１５２０または残基３４〜１５２０を含むポリペプチドのアイソフォームＡおよびＢの組み合わせが好ましい。
【００１９】
本発明の免疫原性組成物は、１種または複数の薬学的に許容される担体、希釈剤および／またはアジュバントを含み得る。本発明の免疫原性組成物は、プロパン−１，２，３−トリオール（グリセロール）を含み得る。本発明の免疫原性組成物は、ワクチンまたはワクチン組成物であり得る。
【００２０】
その他の態様では、哺乳動物においてＥ．ｃｏｌｉ感染を処置または予防するための方法であって、哺乳動物に、有効量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含む方法が提供される。ある実施形態において、免疫原性組成物は、鼻上皮、口腔粘膜または胃、小腸、大腸および直腸からなる群より選択される胃腸器官の管腔表面などの粘膜表面に投与される。好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、非経口投与によって投与される。
【００２１】
その他の態様では、例えば、哺乳動物におけるＥ．ｃｏｌｉ感染を処置または予防するための、特に、病原性Ｅ．ｃｏｌｉ、例えば、腸外または腸内病原性Ｅ．ｃｏｌｉに対する広い防御を提供するための、特に、２種以上のＥ．ｃｏｌｉ病原型による感染、例えば、腸外および腸内病原性Ｅ．ｃｏｌｉの両方、すなわち、ＥｘＰＥＣおよびＩｎＰＥＣ病原型の両方、例えば、ＮＭＥＣ、ＡＰＥＣ、ＵＰＥＣ、ＥＨＥＣ、ＡＩＥＣ、ＥＰＥＣ、ＥＡＥＣ、ＥＩＥＣ、ＥＴＥＣおよびＤＡＥＣ病原型による感染を処置または予防するための医薬における本発明の免疫原性組成物の使用が提供される。したがって、被験体は、それらに限定されないが、腹膜炎、腎盂腎炎、膀胱炎、心内膜炎、前立腺炎、尿路感染症（ＵＴＩ）、髄膜炎（特に、新生児髄膜炎）、敗血症（またはＳＩＲＳ）、脱水症、肺炎、下痢（乳児、旅行者、急性、持続性など）、細菌性赤痢、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、心膜炎、細菌尿症などを含む疾患に対して防御され得る。したがって、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉ感染、例えば、腸外または腸内病原性Ｅ．ｃｏｌｉ、特に、２種以上のＥ．ｃｏｌｉ病原型による感染、例えば、腸外および腸内病原性Ｅ．ｃｏｌｉの両方、すなわち、ＥｘＰＥＣおよびＩｎＰＥＣ病原型の両方、例えばＮＭＥＣ、ＡＰＥＣ、ＵＰＥＣ、ＥＨＥＣ、ＡＩＥＣ、ＥＰＥＣ、ＥＡＥＣ、ＥＩＥＣ、ＥＴＥＣおよびＤＡＥＣ病原型による感染、または前記の疾患のいずれかを処置または予防するための薬物の製造のための、本発明の免疫原性組成物の使用を提供する。
【００２２】
本発明はまた、位置１３０４、１３０５、１３０６、１３０７および／または１３０８（配列番号８に関して番号付けされた）の少なくとも１個のアミノ酸（例えば、１、２、３、４または５個のアミノ酸）が、別のアミノ酸によって置換されているｏｒｆ３５２６変異体ポリペプチドも提供する。ある実施形態において、変異体は、等量の野生型ｏｒｆ３５２６の含量より少なくとも５０％少ない亜鉛含量を有する。特定の変異体ｏｒｆ３５２６ポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列または前記アミノ酸位置１３０４、１３０５および１３０８を含むその免疫原性断片を含む。１種のこのような断片は、配列番号３１のアミノ酸残基２４〜１５２０または残基３４〜１５２０を含む。変異体ポリペプチドは、例えば、Ｎ末端システインで脂質付加され得る。ｏｒｆ３５２６ポリペプチドのその他の改変体またはその断片に対して、例えば、野生型ｏｒｆ３５２６ポリペプチドに対して、亜鉛イオン含量が低下したか、または亜鉛イオンを実質的に含まない変異体ポリペプチドが、調製され得る。
【００２３】
本発明はまた、１７分あたりで溶出するか、またはアイソフォームＡの後および／もしくはアイソフォームＣの前に溶出する画分の組換え３５２６ポリペプチド（複数可）を含む組成物から、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ＣａｐｔｏＱおよび／またはブチルセファロースクロマトグラフィー）を使用する精製によって取得可能な３５２６ポリペプチドのアイソフォームＢ（図９ａ中のピークＢに対応する）またはその免疫原性断片を提供する。さらなる実施形態では、アイソフォームＢは、位置１３０４、１３０５および１３０８に変異を含み、場合により、配列番号３１のアミノ酸残基１〜２３または残基１〜３３を欠く、３５２６ポリペプチドのものである。
【００２４】
本発明はまた、１６分あたりで溶出する画分の、またはアイソフォームＢの前および／もしくはアイソフォームＣの前に溶出する画分の組換え３５２６ポリペプチド（複数可）を含む組成物から、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ＣａｐｔｏＱおよび／またはブチルセファロースクロマトグラフィー）を使用する精製によって取得可能な３５２６ポリペプチドのアイソフォームＡ（図９ａ中のピークＡに相当する）またはその免疫原性断片を提供する。さらなる実施形態では、アイソフォームＡは、位置１３０４、１３０５および１３０８に変異を含み、場合により、配列番号３１のアミノ酸残基１〜２３または残基１〜３３を欠く、３５２６ポリペプチドのものである。
【００２５】
本発明はまた、１９分あたりで溶出するか、またはアイソフォームＡの後および／もしくはアイソフォームＢの後に溶出する画分の組換え３５２６ポリペプチド（複数可）を含む組成物から、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ＣａｐｔｏＱおよび／またはブチルセファロースクロマトグラフィー）を使用する精製によって得られる３５２６ポリペプチドのアイソフォームＣ（図９ａ中のピークＣに対応する）またはその免疫原性断片を提供する。さらなる実施形態では、アイソフォームＣは、位置１３０４、１３０５および１３０８に変異を含み、場合により、配列番号３１のアミノ酸残基１〜２３または残基１〜３３を欠く３５２６ポリペプチドのものである。
【００２６】
さらなる実施形態では、本発明は、アイソフォームＡについては１６分あたりで、アイソフォームＢについては１７分あたりで、アイソフォームＣについては１９分あたりで溶出する画分の、またはアイソフォームＡについてはアイソフォームＢの前および／もしくはアイソフォームＣの前に溶出する、またはアイソフォームＢについてはアイソフォームＡの後および／もしくはアイソフォームＣの前に溶出する、またはアイソフォームＣについてはアイソフォームＡの後および／またはアイソフォームＢの後に溶出する画分の組換え３５２６ポリペプチド（複数可）を含む組成物から、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ＣａｐｔｏＱおよび／またはブチルセファロースクロマトグラフィー）を使用する精製によって取得可能なｏｒｆ３５２６のアイソフォームＡ、ＢおよびＣのうち少なくとも２種またはその免疫原性断片の組み合わせを提供する。例えば、位置１３０４、１３０５および１３０８に変異を含み、配列番号３１のアミノ酸残基２４〜１５２０または残基３４〜１５２０を含むポリペプチドのアイソフォームＡおよびＢの組み合わせなどの、ｏｒｆ３５２６のアイソフォームＡおよびＢまたはその免疫原性断片の組み合わせ。
【００２７】
「アイソフォームＣ」は、「断片Ｃ」の同義語として使用される。
【００２８】
本発明はまた、１７分あたりで溶出するか、またはアイソフォームＡの後および／もしくはアイソフォームＣの前に溶出する画分の組換え３５２６ポリペプチド（複数可）を含む組成物から、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ＣａｐｔｏＱおよび／またはブチルセファロースクロマトグラフィー）を使用する精製によって取得可能な３５２６ポリペプチドのアイソフォームＢと結合するが、１６分あたりで溶出する画分の、またはアイソフォームＢの前および／もしくはアイソフォームＣの前に溶出する画分の組換え３５２６ポリペプチド（複数可）を含む組成物から、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ＣａｐｔｏＱおよび／またはブチルセファロースクロマトグラフィー）を使用する精製によって取得可能な３５２６ポリペプチドのアイソフォームＡと結合せず、１９分あたりで溶出するか、またはアイソフォームＡの後および／もしくはアイソフォームＢの後に溶出する画分の組換え３５２６ポリペプチド（複数可）を含む組成物から、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ＣａｐｔｏＱおよび／またはブチルセファロースクロマトグラフィー）を使用する精製によって取得可能な３５２６ポリペプチドのアイソフォームＣとも結合しない抗体と結合するタンパク質を提供する。さらなる実施形態では、アイソフォームＢは、位置１３０４、１３０５および１３０８に変異を含み、場合により、配列番号３１のアミノ酸残基１〜２３または残基１〜３３を欠く３５２６ポリペプチドのものである。
【００２９】
本発明はまた、１６分あたりで溶出する画分の、またはアイソフォームＢの前および／もしくはアイソフォームＣの前に溶出する画分の組換え３５２６ポリペプチド（複数可）を含む組成物から、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ＣａｐｔｏＱおよび／またはブチルセファロースクロマトグラフィー）を使用する精製によって取得可能な３５２６ポリペプチドのアイソフォームＡと結合するが、１７分あたりで溶出するか、またはアイソフォームＡの後および／もしくはアイソフォームＣの前に溶出する画分の組換え３５２６ポリペプチド（複数可）を含む組成物から、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ＣａｐｔｏＱおよび／またはブチルセファロースクロマトグラフィー）を使用する精製によって取得可能な３５２６ポリペプチドのアイソフォームＢと結合せず、１９分あたりで溶出するか、またはアイソフォームＡの後および／もしくはアイソフォームＢの後に溶出する画分の組換え３５２６ポリペプチド（複数可）を含む組成物からサイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ＣａｐｔｏＱおよび／またはブチルセファロースクロマトグラフィー）を使用する精製によって取得可能な３５２６ポリペプチドのアイソフォームＣとも結合しない抗体と結合するタンパク質も提供する。さらなる実施形態では、アイソフォームＢは、位置１３０４、１３０５および１３０８に変異を含み、場合により、配列番号３１のアミノ酸残基１〜２３または残基１〜３３を欠く３５２６ポリペプチドのものである。
【００３０】
本発明はまた、１９分あたりで溶出するか、またはアイソフォームＡの後および／またはアイソフォームＢの後に溶出する画分の組換え３５２６ポリペプチド（複数可）を含む組成物から、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ＣａｐｔｏＱおよび／またはブチルセファロースクロマトグラフィー）を使用する精製によって取得可能な３５２６ポリペプチドのアイソフォームＣと結合するが、１６分あたりで溶出する画分の、またはアイソフォームＢの前および／またはアイソフォームＣの前に溶出する画分の組換え３５２６ポリペプチド（複数可）を含む組成物から、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ＣａｐｔｏＱおよび／またはブチルセファロースクロマトグラフィー）を使用する精製によって取得可能な３５２６ポリペプチドのアイソフォームＡと結合せず、１７分あたりで溶出するか、またはアイソフォームＡの後および／もしくはアイソフォームＣの前に溶出する画分の組換え３５２６ポリペプチド（複数可）を含む組成物から、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ＣａｐｔｏＱおよび／またはブチルセファロースクロマトグラフィー）を使用する精製によって取得可能なものとも結合しない抗体と結合するタンパク質も提供する。さらなる実施形態では、アイソフォームＢは、位置１３０４、１３０５および１３０８に変異を含み、場合により、配列番号３１のアミノ酸残基１〜２３または残基１〜３３を欠く３５２６ポリペプチドのものである。
【００３１】
このような抗体は、当技術分野で公知のスクリーニング法によって調製され得る（例えば、陽性および陰性選択のためにアイソフォームを使用するクロマトグラフィー；ファージディスプレイ）。
【００３２】
本発明はまた、これらのアイソフォームのうち１種または複数を含む免疫原性組成物および例えば、哺乳動物においてＥ．ｃｏｌｉ感染を処置または予防するための方法におけるそれらの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１（Ａ）は、本発明の組成物において利用される抗原の各々の存在が、ほとんどの病原性株、具体的には、ＮＭＥＣ、ＡＰＥＣ、ＵＰＥＣ、ＥＨＥＣ、ＥＡＥＣ、ＥＩＥＣ、ＥＰＥＣ、ＥＴＥＣおよびＡＩＥＣにおいて決定されたことを示す図であり；図１（Ｂ）は、防御的候補の遺伝子の存在を、配列決定されたゲノムにおいて（＞８５％の配列相同性に基づいて）、および臨床単離株において（ＰＣＲ増幅によって）評価したことを示す図である。
【図２】図２は、遺伝子分布解析−ＰＣＲ増幅および配列決定されたゲノムでのＢＬＡＳＴ検索によって、６０３種のＥ．ｃｏｌｉ株において最良の防御的候補の遺伝子の存在を評価したことを示す。ＥｘＰＥＣ：ＡＰＥＣ＝鳥類、ＵＰＥＣ＝尿路病原性、ＮＭＥＣ＝新生児髄膜炎性、ＳＥＰＥＣ＝敗血症、病原性Ｅ．ｃｏｌｉ。ＥＰＥＣ＝腸管病原性Ｅ．ｃｏｌｉ。ＥＴＥＣ＝腸毒素産生性Ｅ．ｃｏｌｉ。ＥＨＥＣ＝腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ。糞便Ｅ．ｃｏｌｉおよびその他の病原型＝実験室株、ＳＴＥＣ＝毒素産生性Ｅ．ｃｏｌｉ、ＥＩＥＣ＝腸管侵入性ｅ．ｃｏｌｉ、ＡＩＥＣ＝接着侵入性Ｅ．ｃｏｌｉ、ＥＡＥＣ＝腸管凝集性（ｅｎｔｅｒｏａｇｒｅｇａｔｉｖｅ）Ｅ．ｃｏｌｉ。ＡＲＥＣ＝アンピシリン耐性Ｅ．ｃｏｌｉ。ｏｒｆ３５２６（ＥＣＯＫ１＿３３８５）発現は、ポリクローナルウサギ血清を使用して上清画分での免疫ブロット法解析によって評価した。
【図３】図３は、ｏｒｆ３５２６の分子の多様性の研究を示す図である。ｏｒｆ３５２６タンパク質の２１７種の配列の配列アラインメント解析は、８６％から１００％の範囲の配列同一性を示した。導かれた系統樹は、６種の主要な改変体の存在を示した。系統樹は、ＭＥＧＡ５パッケージにおいて実行される最尤法（Ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用して推測した。
【図４】図４は、抗原ｏｒｆ３５２６に対する抗体が、敗血症の鳥類（ニワトリ）モデルにおける受動免疫において防御するとわかったことを示す図である。
【図５】図５は、抗原ｏｒｆ３５２６（ＥＣＯＫ１＿３３８５）を用いる鼻腔内免疫化が、ＥＴＥＣ株ＧＬ５３を用いるチャレンジ後に回腸管におけるコロニー形成を低減させたことを示す図である。
【図６】図６は、抗原４０５Ｂ（ＥＣＯＫ１＿０２９０）が、感染のＵＴＩモデルにおいて腎臓コロニー形成を防ぐことを示す図である。
【図７】図７は、抗原ｕｐｅｃ１２３２（ｃ１２７５）が、感染のＵＴＩモデルにおいて腎臓コロニー形成を防ぐことを示す図である。
【図８】図８は、ｏｒｆ３５２６配列の解析が、いくつかの保存されたモチーフを示したことを示す図である。
【図９】図９（ａ）は、ＤＧ３５２６ＴＬのアイソフォームが、Ｔｏｓｏｈ  Ｇ３０００ＳＷｘｌカラムでのＳＥ−ＨＰＬＣによって分離されたことを示す図である。ブチルセファロースと結合する画分は、ＳＥＣにおいて、あまり緻密ではないようであり、ピークＡを形成するが、ブチルセファロースと結合する形態は、ピークＢを形成する。ピークＣは、Ｎ末端切断型に対応している。図９（ｂ）は、ＤＧ３５２６ＴＬおよび天然３５２６の間のあり得る機能的相違を評価するために、後者を、ＥｘＰＥＣ  ＩＨＥ３０３４の培養上清から精製したことを示す図である。ＤＧ３５２６ＴＬのアイソフォームとともに３５２６を実施することによって、天然型が、ピークＢとともに共溶出することが示され、これは、天然３５２６が、ｉ）緻密な、ｉｉ）モノマーであることを示唆する。
【図１０】図１０は、利用されたｏｒｆ３５２６の７種の変異体／改変体を例示する図である。
【図１１】図１１は、種々のｏｒｆ３５２６誘導体の亜鉛含量が、原子吸光分析法によって決定されたことを示す図である。結果は、タンパク質分子あたり単一の亜鉛イオンの存在を示唆する。実際に亜鉛結合モチーフを含有する３５２６Ｂ  ｈｉｓの予期しない低い亜鉛含量は、末端切断型誘導体のミスフォールディングによって説明できるが、Ｅ１３０５変異体における単一のアミノ酸交換は、亜鉛結合を完全に無効にするのに十分ではないようである（赤色の四角）。対照的に、ＴＬ３Ｍ三重変異体では、亜鉛親和性は、完全に失われている。
【図１２】図１２は、ｏｒｆ３５２６  ７５％コンセンサス配列を示す図である。コンセンサス配列を作製するために使用されたｏｒｆ３５２６配列の少なくとも７５％において、各特定された残基が、その位置に見られる。Ｘは、任意のアミノ酸を表す。ＭＯ６０様ドメインが、強調されている。
【図１３】図１３は、ｏｒｆ３５２６  １００％コンセンサス配列を示す図である。コンセンサス配列を作製するために使用されたｏｒｆ３５２６配列のすべてにおいて、各特定された残基が、その位置に見られる。Ｘは、任意のアミノ酸を表す。ＭＯ６０様ドメインが、強調されている。
【図１４】図１４は、アジュバント単独と比較して、３５２６＋ミョウバンを用いる免疫化後に、または３５２６＋ＭＦ５９を用いる免疫化後に、細菌力価が大幅に低下したことを示す図である。結果は、マウスが０日および２１日のみで免疫化された実験において確認される（図１４（ｂ））。
【図１５】図１５は、４０５Ｂ＋３５２６＋ＬＴＫ６３および３５２６＋１２３２＋ＬＴＫ６３が、ＬＴＫ６３単独と比較して、盲腸におけるＧＬ５３による腸のコロニー形成を有意に減少させたことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、免疫原性成分が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する細菌Ｉｇ様ドメインタンパク質断片（ｏｒｆ４０５Ｂ）またはそれに対して少なくとも８０％の類似性を有するタンパク質、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するｕｐｅｃ１２３２またはそれに対して少なくとも８０％の類似性を有するタンパク質、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する推定リポタンパク質（ｏｒｆ３５２６）またはそれに対して少なくとも８０％の類似性を有するタンパク質および配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有するｇｓｐＫ（ｏｒｆ３５１５）またはそれに対して少なくとも８０％の類似性を有するタンパク質からなる群より選択される、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの免疫原性成分を含む免疫原性組成物を提供する。本発明の組成物は、例えば、前記の成分のうち１、２、３または４種、例えば
ｏｒｆ４０５Ｂおよびｕｐｅｃ１２３２；ｏｒｆ４０５Ｂおよびｏｒｆ３５２６；ｏｒｆ４０５Ｂおよびｏｒｆ３５１５；
ｕｐｅｃ１２３２およびｏｒｆ３５２６；ｕｐｅｃ１２３２およびｏｒｆ３５１５；
ｏｒｆ３５２６およびｏｒｆ３５１５；
ｏｒｆ４０５Ｂ、ｕｐｅｃ１２３２およびｏｒｆ３５２６；ｏｒｆ４０５Ｂ、ｏｒｆ３５２６およびｏｒｆ３５１５；またはｕｐｅｃ１２３２、ｏｒｆ３５２６ｓおよびｏｒｆ３５１５；
またはそれらのいずれかに対して少なくとも８０％の類似性を有するタンパク質を含み得る。
【００３５】
本発明の免疫原性組成物は、ｏｒｆ４０５Ｂ、ｕｐｅｃ１２３２、ｏｒｆ３５２６またはそれらのいずれかに対して少なくとも８０％の類似性を有するタンパク質から選択される１、２または３種の成分を含むことが好ましい。例えば、本発明の免疫原性組成物は、３種の成分ｏｒｆ４０５Ｂ、ｕｐｅｃ１２３２およびｏｒｆ３５２６またはそれらのいずれかに対して少なくとも８０％の類似性を有するタンパク質を含み得る。より好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、ｏｒｆ４０５Ｂおよびｏｒｆ３５２６またはそれらのいずれかに対して少なくとも８０％の類似性を有するタンパク質から選択される１種または２種の成分を含む。例えば、本発明の免疫原性組成物は、２種の成分ｏｒｆ４０５Ｂおよびｏｒｆ３５２６またはそれらのいずれかに対して少なくとも８０％の類似性を有するタンパク質を含み得る。あるいは、本発明の免疫原性組成物は、ｏｒｆ４０５Ｂ、ｕｐｅｃ１２３２、ｏｒｆ３５２６およびｏｒｆ３５１５またはそれらのいずれかに対して少なくとも８０％の類似性を有するタンパク質を含み得る。
【００３６】
本発明の組成物の成分は、単離または精製され得る。
【００３７】
本明細書において使用される場合、用語「免疫原性」とは、例えば、ポリペプチド（複数可）、組成物などが、体液性または細胞性免疫応答、好ましくは、それらの両方を惹起できることを意味する。例えば、用語「免疫原性組成物」とは、ひとたび、動物、例えば、ヒトなどの被験体に投与されると、Ｅ．ｃｏｌｉに対する免疫応答を誘導または刺激できる任意の組成物を指す。
【００３８】
免疫原性ポリペプチドはまた、抗原性である。分子は、免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体などの免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用できる場合に「抗原性」である。抗原性ポリペプチドは、少なくとも約５個、特に、少なくとも約１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個または少なくとも５０個のアミノ酸のエピトープを含有する。エピトープとも呼ばれるポリペプチドの抗原性部分は、抗体またはＴ細胞受容体認識について免疫優性である部分であり得るか、または免疫化のために担体ポリペプチドに抗原性部分を結合体化することによって分子に対する抗体を作製するために使用される部分であり得る。当業者ならば、抗原性である分子は、それ自体が免疫原性である必要はなく、例えば、いくつかの抗原は、それらを免疫応答を惹起できるようにするためのアジュバントまたは担体の存在を必要とするということは認識するであろう。
【００３９】
用語「抗原」とは、それに対して、被験体が、体液性および／または細胞性免疫応答を開始し得る分子を指す。組成物またはワクチンに対する「免疫学的応答」は、目的の組成物またはワクチンに対する細胞性および／または抗体媒介性免疫応答の宿主における発生である。通常、「免疫学的応答」は、それらに限定されないが、以下の効果：抗原または目的の組成物もしくはワクチン中に含まれる抗原に特異的に向けられる、抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞の産生のうち１種または複数を含む。好ましくは、被験体は、新規感染に対する抵抗性が増強される、および／または、疾患の臨床重篤度が低下するような治療的または防御的免疫学的応答のいずれかを示す。このような防御は、感染した被験体によって通常示される症状の低減もしくは欠如、感染した宿主におけるより迅速な回復時間および／またはウイルス力価の低下のいずれかによって実証される。本明細書において、用語「免疫原性」タンパク質またはポリペプチドとはまた、上記のように免疫学的応答を惹起するアミノ酸配列を指す。
【００４０】
前記免疫原性組成物が、動物から疾患を防ぐ、寛解させる、緩和するまたは排除する場合に、免疫原性組成物は、場合により、ワクチンと呼ばれることもある。
【００４１】
本明細書において、用語「ワクチン」とは、疾患を引き起こす生物の不在下で、精製抗原決定基、精製抗原決定基またはその断片をコードする核酸のいずれかを含むワクチン組成物を指す。このようなワクチンはまた、「サブユニットワクチン」と呼ばれることもある。この用語は、「全細胞ワクチン」、例えば、死滅させた全細菌細胞に由来するもの、複合体および特性決定されていない組成物の一部として精製されていない形態で抗原決定基を含有し得るものを包含しないものとする。
【００４２】
本明細書において、用語「多価」とは、ワクチンが、少なくとも２種の株または単離株に由来する構造的に同様または「関連する」抗原決定基を含有し、抗原決定基が、そのアミノ酸配列間にわずかな相違しか有さない相同体であることを意味する。
【００４３】
ポリペプチドまたは抗原に関して、用語「改変体」、「相同体」、「誘導体」または「断片」とは、配列から、または配列への１個の（または複数の）アミノ酸またはヌクレオチドの任意の置換、改変、修飾、置き換え、欠失または付加を含む。文脈からそうではないと認められない限り、特定の抗原への言及は、このような改変体、相同体、誘導体および断片への言及を含む。
【００４４】
抗原の好ましい改変体は、その抗原と結合する抗体を惹起し得る。特に、抗体は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中に存在するような野生型抗原と結合する。
【００４５】
特に、用語「相同体」は、抗原活性または免疫原性活性を有する結果として得られるアミノ酸配列を提供する構造および／または機能に関する同一性を網羅する。配列同一性（すなわち、類似性）に関して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％の配列同一性があり得る。例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％または９４％の配列同一性があり得る。また、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の配列同一性があり得る。これらの用語はまた、核酸またはアミノ酸配列（複数可）の対立遺伝子変異であるアミノ酸に由来するポリペプチドを包含する。配列Ａおよび配列Ｂ間のパーセンテージ配列同一性および類似性は、（ｘ／ｙ）＊１００（式中、ｘは、ＡおよびＢの間で同一であるアミノ酸数であり、ｙは、ＡおよびＢから選択される最長配列のアミノ酸数である）として算出される。例えば、５０個のアミノ酸からなる第１の配列Ａと２００個のアミノ酸からなる第２の配列Ｂの間の１０個の同一残基の場合には、２つの配列の間の配列同一性は、５％である。
【００４６】
ポリペプチドの「活性」または「生物活性」が言及される場合には、これらの用語は、ポリペプチドの抗原活性および免疫原性活性を指すものとする。このような活性の例およびこれらの活性をアッセイし、定量する方法は、当技術分野で公知であり、本明細書において明細書中の別の場所に詳細に記載されている。
【００４７】
本明細書において、「欠失」とは、それぞれ、１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が存在しない、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列いずれかにおける変化と定義される。本明細書において、「挿入」または「付加」とは、天然に存在する物質と比較して、それぞれ、１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の付加をもたらした、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列における変化である。本明細書において、「置換」とは、それぞれ、１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の、異なるヌクレオチドまたはアミノ酸による置き換えに起因する。
【００４８】
用語「抗原」および「アミノ酸配列」は、本明細書において使用されるように、上記の配列の各々への、ならびにその断片、相同体、誘導体および改変体への言及を含むととられなければならない。
【００４９】
用語「断片」とは、本明細書において、本発明の部分ヌクレオチドまたはアミノ酸配列を指す。ある実施形態において、アミノ酸配列またはポリペプチド断片は、列挙された配列識別子から導かれた少なくとも「ｎ」個の連続するアミノ酸のアミノ酸配列、例えば、上記アミノ酸配列のうちの少なくとも５個のアミノ酸残基、少なくとも１０個のアミノ酸残基、少なくとも１５個のアミノ酸残基、少なくとも２０個のアミノ酸残基、少なくとも２５個のアミノ酸残基、少なくとも３０個のアミノ酸残基、少なくとも３５個のアミノ酸残基、少なくとも４０個のアミノ酸残基、少なくとも４５個のアミノ酸残基、少なくとも５０個のアミノ酸残基、少なくとも６０個のアミノ残基、少なくとも７０個のアミノ酸残基、少なくとも８０個のアミノ酸残基、少なくとも９０個のアミノ酸残基、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個または少なくとも２５０個のアミノ酸残基を含むポリペプチドを含み得る。ある実施形態において、アミノ酸断片は、５０個以下、６０個以下、７５個以下、１００個以下、１５０個以下、２００個以下、２５０個以下、３００個以下、３５０個以下、４００個以下のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み得る。好ましい断片は、エピトープを含むか、または免疫原性断片である。好ましい断片は、配列番号８または配列番号３１の残基１〜２３または残基１〜３３または本発明のその他のｏｒｆ３５２６ポリペプチド中の対応する残基などの本発明のポリペプチドのアミノ末端部分を欠く。断片およびより長い配列間の配列同一性および類似性は、上記と同一の方法に従って、すなわち、最長配列に対する同一残基に基づいて算出される。
【００５０】
本明細書において、用語「精製された」または「精製するために」とは、試料からの混入物の除去を指す。例えば、抗原は、混入するタンパク質の除去によって精製される。混入物の除去は、試料中の抗原（例えば、本発明の抗原）のパーセントの増大をもたらす。
【００５１】
「単離された」および「精製された」とは、本明細書において、ある分子、タンパク質、多糖、脂質、抗原などを説明し、分子、タンパク質、多糖、脂質または抗原が、細胞中で天然に存在するものを超えた状態を指す。特に、この用語は、本明細書において、その天然に存在する環境、例えば、細胞などから取り出されたことを意味する。好ましい実施形態では、単離された分子、タンパク質、多糖、脂質、抗原などは、分子、タンパク質、多糖、脂質、抗原などが、細胞において天然には通常関連しているタンパク質および／または脂質の２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％超から分離される。単離された分子、タンパク質、多糖、脂質、抗原などが合成される場合には、それらに、脂質抗原を合成するために使用された化学的前駆体または合成試薬のうち５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％または０．１％未満が混入している。好ましい実施形態では、分子、タンパク質、多糖、脂質または抗原は、少なくとも１％純粋、５％純粋、１０％純粋、２０％純粋、３０％純粋、４０％純粋、５０％純粋、６０％純粋、７０％純粋、８０％純粋、９０％純粋、９５％純粋、９９％純粋または１００％純粋である。本明細書において、用語「純粋％」は、重量による、目的の分子で構成されている組成物のパーセンテージを示す。したがって、５０グラムの目的の分子を含有する１００グラムの組成物は、目的の分子に関して５０％純粋である。
【００５２】
用語「処置すること」は、治療処置および防護または予防処置の両方を含み、その目的は、感染を防ぐか、または減らすことである。例えば、処置することは、例えば、感染と関連している症状に直接的に影響を及ぼすことまたは治癒、抑制、阻害、予防すること、その重篤度を低減すること、その発症を遅延すること、低減すること、またはそれらの組み合わせを含み得る。「予防すること」とは、とりわけ、症状の発症を遅延すること、疾患の再発を予防することなどを指し得る。処置することはまた、感染または疾病を「抑制すること」または「阻害すること」、例えば、重篤度、数、発生数または症状の潜伏期を低減すること、症状を寛解させること、二次的症状を低減すること、二次感染を低減すること、患者の生存を延長すること、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【００５３】
本発明において使用されるポリペプチドは、多数の方法で、例えば、化学合成によって（全体でまたは部分で）、プロテアーゼを使用してより長いポリペプチドを消化することによって、ＲＮＡからの翻訳によって、細胞培養物からの（例えば、組換え発現からの）精製によって、生物自体から（例えば、細菌の培養後の、もしくは患者から直接）などによって調製され得る。４０アミノ酸長より短いペプチドの製造のための好ましい方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ化学合成を含む［１，２］。ｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ［３］化学に基づく方法などの固相ペプチド合成は、特に好ましい。酵素合成［４］もまた、部分的に、または全部で使用され得る。化学合成の代替として、生物学的合成は、使用され得、例えば、ポリペプチドは、翻訳によって製造され得る。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施され得る。生物学的方法は、一般に、Ｌ−アミノ酸に基づいたポリペプチドの製造に制限されるが、翻訳機構の（例えば、アミノアシルｔＲＮＡ分子の）操作を使用して、Ｄ−アミノ酸（またはヨードチロシンまたはメチルフェニルアラニン、アジドホモアラニンなどといったその他の非天然アミノ酸）の導入を可能にすることができる［５］。しかし、Ｄ−アミノ酸が含まれる場合には、化学合成を使用することが好ましい。ポリペプチドは、Ｃ末端および／またはＮ末端に共有結合性修飾を有し得る。
【００５４】
ポリペプチドは、種々の形態をとることができる。（例えば、天然、融合、グリコシル化、非グリコシル化、脂質付加、非脂質付加、リン酸化、非リン酸化、ミリストイル化、非ミリストイル化、モノマー、マルチマー、粒子状、変性など）。
【００５５】
ポリペプチドは、精製または実質的に精製された形態で提供されることが好ましい。ポリペプチドは、固相支持体と結合していてもよい。ポリペプチドは、検出可能な標識（例えば、放射性または蛍光標識またはビオチン標識）を含み得る。
【００５６】
用語「ポリペプチド」とは、任意の長さのアミノ酸ポリマーを指す。ポリマーは、直鎖であっても、分岐していてもよく、修飾されたアミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸によって割り込まれていてもよい。この用語はまた、天然に、または介入によって、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化または標識成分との結合体化などの任意のその他の操作または修飾によって修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。また、この定義内に、例えば、１個または複数のアミノ酸の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含めた）、ならびに当技術分野で公知のその他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。ポリペプチドは、単一鎖または会合している鎖として生じ得る。ポリペプチドは、天然に、または非天然にグリコシル化され得る（すなわち、ポリペプチドは、対応する天然に存在するポリペプチドにおいて見られるグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する）。
【００５７】
本発明において使用されるポリペプチドは、ポリペプチド発現を誘導する条件下で宿主細胞を培養することによって産生され得る。ポリペプチドの発現は、発現のための異種宿主において起こり得る。異種宿主は、原核生物（例えば、細菌）または真核生物であり得る。適した宿主として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、マイコバクテリア（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、酵母などが挙げられる。
【００５８】
本発明の組み合わせにおいて使用される特定のポリペプチドは、各々、本明細書においてより十分に記載される、細菌Ｉｇ様ドメイン（群１）タンパク質断片（ｏｒｆ４０５Ｂ）、ｇｓｐＫ（ｏｒｆ３５１５）、ｕｐｅｃ−１２３２および推定リポタンパク質（ｏｒｆ３５２６）に由来するアミノ酸配列を含み得る。
【００５９】
細菌Ｉｇ様ドメインタンパク質断片「ｏｒｆ４０５Ｂ」
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＭＥＣに由来する細菌Ｉｇ様ドメイン（群１）タンパク質は、ＷＯ２００６／０８９２６４（配列番号８０９および８１０）に開示されており、それでは、「ｏｒｆ４０５」と呼ばれており、このタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＭＥＣ株ＩＨＥ３０３４由来の「ｏｒｆ２８４」、ＣＦＴ０７３由来の「ｃ０４１５」および５３６由来の「ｅｃｐ＿０３６７」とも呼ばれる。このｏｒｆ４０５タンパク質の断片は、最初に、ＷＯ２０１１／００４２６３において開示された（例えば、配列番号６４１および６４２中）。本発明の組成物は、細菌Ｉｇ様ドメインタンパク質断片「ｏｒｆ４０５Ｂ」を含むことが好ましい。本明細書において、配列番号１および２と呼ばれるこのタンパク質断片のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は以下のとおりである：
【００６０】
【化１】
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【００６１】
ｏｒｆ４０５Ｂタンパク質は、本発明に従って使用される場合には、種々の形態をとり得る。特定のｏｒｆ４０５Ｂ配列は、配列番号１および／または２に対して８０％またはそれを超える同一性（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える）を有する。これは、改変体（例えば、対立遺伝子改変体、相同体、オルソログ、パラログ、変異体など）を含む。
【００６２】
Ｕｐｅｃ１２３２タンパク質
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＵＰＥＣに由来する「Ｕｐｅｃ１２３２」タンパク質は、ＷＯ２００６／０９１５１７に開示されており（配列番号１３８）、ＣＦＴ０７３由来の「ｃ１２７５」としても知られている。ｕｐｅｃ１２３２タンパク質は、本発明に従って使用される場合、種々の形態をとり得る。好ましいｕｐｅｃ１２３２配列は、配列番号３、４、５または６に対して８０％またはそれを超える同一性（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える）を有する。これは、改変体（例えば、対立遺伝子改変体、相同体、オルソログ、パラログ、変異体など）を含む。
【００６３】
【化２】
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【００６４】
推定リポタンパク質ｏｒｆ３５２６
補助的なコロニー形成因子Ｄ（ＡｃｆＤ）前駆体は、「ＥＣＯＫ１＿３３８５」としても知られ、「推定リポタンパク質ｏｒｆ３５２６」としても知られ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＭＥＣ株ＩＨＥ３０３４由来の「ｏｒｆ３５２６」タンパク質とも呼ばれ、ＷＯ２００６／０８９２６４に開示されている。ｏｒｆ３５２６タンパク質は、本発明に従って使用される場合に、種々の形態をとり得る。好ましいｏｒｆ３５２６配列は、配列番号７〜２８に対して８０％またはそれを超える同一性（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える）を有する。これは、改変体（例えば、対立遺伝子改変体、相同体、オルソログ、パラログ、変異体など）を含む。
【００６５】
【化３】
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【００６６】
【化４】
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【００６７】
【化５】
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【００６８】
【化６】
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【００６９】
【化７】
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【００７０】
【化８】
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【００７１】
【化９】
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【００７２】
【化１０】
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【００７３】
【化１１】
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【００７４】
【化１２】
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【００７５】
【化１３】
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【００７６】
【化１４】
2014531442.tif 000016
【００７７】
【化１５】
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【００７８】
【化１６】
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【００７９】
【化１７】
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【００８０】
【化１８】
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【００８１】
【化１９】
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【００８２】
【化２０】
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【００８３】
【化２１】
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【００８４】
本発明の好ましいｏｒｆ３５２６配列は、配列番号５４に列挙されるようなコンセンサス配列と一致するか、またはその免疫原性断片である。本発明のその他の好ましいｏｒｆ３５２６配列は、配列番号５５に列挙されるようなコンセンサス配列と一致するか、またはその免疫原性断片である。Ｘは、任意のアミノ酸を表す。その他の好ましいｏｒｆ３５２６配列は、配列番号８の位置１３０４〜１３０８に対応する位置に、ＸＥＶＧＨ、ＸＸＶＧＨ、ＸＥＶＧＸ、ＨＸＶＧＸおよびＸＸＶＧＸから選択される配列モチーフをさらに含有し、任意のこのような配列モチーフでは、Ｘは、ＨもしくはＥではない、またはＸは、Ｈ、ＥもしくはＤではない、またはＸは、Ｈ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、ＱもしくはＣではない、Ｘは、非極性アミノ酸である、またはＸは、ＡもしくはＧから選択される、またはＸは、好ましくは、Ａである。さらなる実施形態では、配列番号５４または配列番号５５の残基１〜２３または１〜３３が欠失している。
【００８５】
【化２２】
2014531442.tif 000024
【００８６】
ｇｓｐＫ（ｏｒｆ３５１５）
ｇｓｐＫ一般的分泌経路タンパク質は、本明細書では、「ｏｒｆ３５１５」と呼ばれる。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＭＥＣに由来する「ｏｒｆ３５１５」タンパク質は、ＷＯ２００６／０８９２６４に開示されており（配列番号７０２９＆７０３０）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＭＥＣ株ＩＨＥ３０３４由来の「ｏｒｆ３３３２」、ＣＦＴ０７３由来の「ｃ３７０２」および５３６由来のｅｃｐ＿３０３９としても知られている。
【００８７】
ｏｒｆ３５１５タンパク質は、本発明に従って使用される場合には、種々の形態をとり得る。好ましいｏｒｆ３５１５配列は、配列番号２９および３０に対して８０％またはそれを超える同一性（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える）を有する。これは、改変体（例えば、対立遺伝子改変体、相同体、オルソログ、パラログ、変異体など）を含む。
【００８８】
【化２３】
2014531442.tif 000025
【００８９】
本発明の特定の組成物は、（ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する細菌Ｉｇ様ドメインタンパク質（ｏｒｆ４０５Ｂ）またはそれに対して少なくとも８０％の類似性を有するタンパク質および（ｉｉ）配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する推定リポタンパク質（ｏｒｆ３５２６）またはそれに対して少なくとも８０％の類似性を有するタンパク質の組み合わせを含む。
【００９０】
本発明のその他の特定の組成物は、（ｉｉｉ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するｕｐｅｃ１２３２またはそれに対して少なくとも８０％の類似性を有するタンパク質をさらに含む。
【００９１】
より詳しくは、本発明の組成物の免疫原性成分は、（ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する細菌Ｉｇ様ドメインタンパク質（ｏｒｆ４０５Ｂ）またはそれに対して少なくとも８０％の類似性を有するタンパク質および（ｉｉ）配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する推定リポタンパク質（ｏｒｆ３５２６）またはそれに対して少なくとも８０％の類似性を有するタンパク質から本質的になる。組成物は、さらに、非免疫原性成分を含み得る。
【００９２】
本発明の組成物のその他の特定の免疫原性成分は、（ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する細菌Ｉｇ様ドメインタンパク質（ｏｒｆ４０５Ｂ）またはそれに対して少なくとも８０％の類似性を有するタンパク質、および（ｉｉ）配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する推定リポタンパク質（ｏｒｆ３５２６）またはそれに対して少なくとも８０％の類似性を有するタンパク質、および（ｉｉｉ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するｕｐｅｃ１２３２またはそれに対して少なくとも８０％の類似性を有するタンパク質から本質的になる。組成物は、非免疫原性成分をさらに含み得る。
【００９３】
特に、本発明の組成物は、少なくとも１種の細菌毒素をさらに含み得る。特に、毒素は、Ｅ．ｃｏｌｉ（すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）または百日咳（「ＰＴ」）に由来する。
【００９４】
粘膜アジュバントとしての解毒されたＡＤＰ−リボシル化毒素の使用がＷＯ９５／１７２１１に、非経口アジュバントとしての使用がＷＯ９８／４２３７５に記載されている。
【００９５】
特定の解毒されたＬＴ変異体として、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２およびＬＴＲ１９２Ｇが挙げられる。好ましくは、細菌毒素は、変異体または修飾された細菌毒素となる。好ましい実施形態では、細菌毒素は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの修飾された熱不安定性毒素（ＬＴＫ６３）である。
【００９６】
アジュバントとしての、ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体、特に、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２の使用は、以下の参考文献において見出すことができる：それらの各々が、参照によってその全文が本明細書に具体的に組み込まれる、Ｂｅｉｇｎｏｎら、「Ｔｈｅ  ＬＴＲ７２  Ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ  Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｅｎａｈｎｃｅｓ  ｔｈｅ  Ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｔｏ  Ｅｌｉｃｉｔ  ＣＤ４  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｅ  Ｇａｍｍａ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｆｔｅｒ  Ｃｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎｔｏ  Ｂａｒｅ  Ｓｋｉｎ」、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００２年）７０巻（６号）：３０１２〜３０１９頁；  Ｐｉｚｚａら、「Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ：  ｎｏｎ  ｔｏｘｉｃ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ＬＴ  ａｎｄ  ＣＴ  ａｓ  ｍｕｃｏｓａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１年）１９巻：２５３４〜２５４１頁；Ｐｉｚｚａら、「ＬＴＫ６３  ａｎｄ  ＬＴＲ７２，  ｔｗｏ  ｍｕｃｏｓａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｒｅａｄｙ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ」  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０００年）２９０巻（４〜５号）：４５５〜４６１頁；Ｓｃｈａｒｔｏｎ−Ｋｅｒｓｔｅｎら、「Ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＡＤＰ−Ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｎｇ  Ｅｘｏｔｏｘｉｎｓ，  Ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ａｎｄ  Ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０００年）６８巻（９号）：５３０６〜５３１３頁；Ｒｙａｎら、「Ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ  Ｔｏｘｉｎ  Ａｃｔ  ａｓ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｎａｓａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎ  Ａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  Ｖａｃｃｉｎｅ：  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｏｎｔｏｘｉｃ  ＡＢ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｎ  Ｔｈ１  ａｎｄ  Ｔｈ２  Ｃｅｌｌｓ」  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９９年）６７巻（１２号）：６２７０〜６２８０頁；  Ｐａｒｔｉｄｏｓら、「Ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｎｔ  ＬＴＫ６３  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ  ｃｏ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．（１９９９年）６７巻（３号）：２０９〜２１６頁；  Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉら、「Ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ａｓ  ｓａｆｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｏｎｇ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２００３年）２巻（２号）：２８５〜２９３頁；およびＰｉｎｅら、（２００２年）「Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｄ  ａ  ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｌａｂｉｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  （ＬＴＫ６３）」Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ（２００２年）８５巻（１〜３号）：２６３〜２７０頁。アミノ酸置換の数的参照は、参照によりその全文が本明細書において具体的に組み込まれる、Ｄｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉら、Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９５年）１５巻（６号）：１１６５〜１１６７頁に示されるＡＤＰ−リボシル化毒素のＡおよびＢサブユニットのアラインメントに基づいていることが好ましい。
【００９７】
したがって、本発明の文脈で、語句「毒素」は、もはやヒトに対して毒性ではないように解毒されている毒素またはヒトにおいて毒性活性を実質的に欠く毒素サブユニットまたはその断片を意味するものとする。
【００９８】
その他の解毒された毒素として、Ｅ．ｃｏｌｉ不安定性毒素（ＬＴ）由来のＢサブユニット、炭疽菌致死因子（ＬＦ）のアミノ末端ドメイン、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ、Ｂ．Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来のアデニレートシクラーゼＡ、ＡＢ５ファミリーのファミリーである毒素、例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ  Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素（ＰＴ）ならびに最近同定されたサブチラーゼ（ｓｕｂｔｉｌａｓｅ）細胞毒（Ｐａｔｏｎら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００４年、２００巻３５〜４６頁）に由来するものまたはその変異体が挙げられる。
【００９９】
Ｅ．ｃｏｌｉの不安定性毒素（ＬＴ）は、２つのサブユニット、五量体Ｂサブユニットおよび単量体Ａサブユニットからなる。Ａサブユニットは、毒性に関与しており、一方で、Ｂサブユニットは、細胞中への輸送に関与している。ＬＴは、Ｇ  Ｍ１ガングリオシド受容体と結合する。
【０１００】
９０％以上の相同性を有するＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素の誘導体は、アミノ酸レベルで９０％超の相同性を有する。別の実施形態では、タンパク質は、９５％以上の相同性、例えば、９６、９７、９８または９９％を有する。例えば、機能に影響を及ぼさないアミノ酸欠失が行われ得る。さらなる実施形態では、誘導体は、Ｇ  Ｍ１ガングリオシド受容体と依然として結合できる。
【０１０１】
したがって、本発明の特定の組成物は、ｏｒｆ４０５Ｂ、ｕｐｅｃ１２３２、ｏｒｆ３５２６、ｏｒｆ３５１５およびＬＴＫ６３からなる群より選択される、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４または５種のＥ．ｃｏｌｉ抗原の組み合わせを含む。本発明の特定の組成物は、ｏｒｆ４０５Ｂ、ｕｐｅｃ１２３２、ｏｒｆ３５２６、ｏｒｆ３５１５およびＬＴＫ６３からなる群より選択される２種以下、３種以下、４種以下または５種以下の抗原を含む。さらにより詳しくは、本発明の組成物は、ｏｒｆ４０５Ｂ、ｕｐｅｃ１２３２、ｏｒｆ３５２６、ｏｒｆ３５１５およびＬＴＫ６３からなる群より選択される２、３、４または５種の抗原の組み合わせからなる、またはそれから本質的になる。特定の組み合わせは、以下のＥ．ｃｏｌｉ抗原（複数可）／免疫原性成分を含む：
【０１０２】
【化２４】
2014531442.tif 000026
【０１０３】
抗原ｏｒｆ３５２６は、配列番号８に関して位置１３０４〜１３０８に、アミノ酸を包含する亜鉛結合モチーフを含む（配列番号８中の下線を引いたＨＥＶＧＨ）。この亜鉛結合モチーフは、毒性と関連している可能性があるので、亜鉛結合活性を欠くか、または低下したｏｒｆ３５２６ポリペプチドは、本発明の組み合わせにおいて特に有用である。好ましくは、変異体ｏｒｆ３５２６タンパク質の亜鉛結合活性は、野生型ｏｒｆ３５２６に対して、またはそれと比較して、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、少なくとも１５％、少なくとも１０％または少なくとも５％だけ、または少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、少なくとも１５％、少なくとも１０％または少なくとも５％に低下しているのいずれかである。亜鉛結合は、原子吸光によって決定でき、その他のアッセイは、当業者に公知であろう。したがって、亜鉛結合モチーフにおける変異は、亜鉛結合および関連する毒性の低減において有用である。例えば、野生型ＨＥＶＧＨからＡＥＶＧＨへの亜鉛結合モチーフにおける変異は、亜鉛結合を約４３％に低減し得、またはより詳しくは、野生型からＡＡＶＧＡへの変異は、亜鉛結合をおよそ５％に低減し得る。驚くべきことに、ＡＡＶＧＡ配列を含むｏｒｆ３５２６変異体は、天然ｏｒｆ３５２６と共溶出し、２種のみのアイソフォーム（モノマーおよび末端切断型）で存在するという追加の利点を有し、これは、精製の効率が簡素化され、試験されるその他の変異体と比較して大幅に改善されることを意味する。本発明の組成物は、ＸＥＶＧＨ、ＸＸＶＧＨ、ＸＥＶＧＸ、ＨＸＶＧＸまたはＸＸＶＧＸから選択される配列モチーフを含むｏｒｆ３５２６変異体を含み得、任意のこのような配列モチーフでは、Ｘは、ＨもしくはＥではない、またはＸは、Ｈ、ＥもしくはＤではない、またはＸは、Ｈ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、ＱもしくはＣではない、Ｘは、非極性アミノ酸である、またはＸは、ＡもしくはＧから選択される、またはＸは、好ましくは、Ａである。
【０１０４】
有利なことに、本発明のワクチン組み合わせは、新生児髄膜炎のほとんどの症例を防止するためにＢ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓワクチンと組み合わせて使用してもよい。したがって、ある実施形態において、本発明の組み合わせは、（ｉ）Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）タンパク質に対する抗体反応を惹起する１種または複数のさらなる非Ｅ．ｃｏｌｉ、ポリペプチド、（ｉｉ）Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに由来する莢膜糖および／または（ｉｉｉ）非ＧＢＳ生物上のエピトープを認識する抗体反応を惹起する１種または複数のさらなる免疫原を含み得る。その他の実施形態では、本発明の免疫原性組み合わせは、ＧＢＳワクチンと実質的に同時に別個に投与される。
【０１０５】
特定のＧＢＳポリペプチドとして、「ＧＢＳ８０」（ＳＡＧ０６４５）細胞壁表面アンカーファミリータンパク質（ＧＩ：２２５３３６６０参照のこと）；「ＧＢＳ１５２３」（ＳＡＮ１５１８；ＳｐｂＩ）、細胞壁表面アンカーファミリータンパク質（ＧＩ：７７４０８６５１参照のこと）；「ＧＢＳ１０４」（ＳＡＧ０６４９）（ＧＩ：２２５３３６６４参照のこと）；「ＧＢＳ６７」（ＳＡＧ１４０８）、細胞壁表面アンカーファミリータンパク質（ＧＩ：２２５３４４３７参照のこと）；「ＧＢＳ５９」、病原性遺伝子塊（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｉｓｌａｎｄ）２ａ（ＢＰ−２ａ）によってコードされる線毛骨格タンパク質；「ＧＢＳ３」（ＳＡＧ２６０３；ＢｉｂＡ）、病原性タンパク質（ＧＩ：２２５３５１０９参照のこと）；「ＳＡＮ１４８５」、細胞壁表面アンカーファミリータンパク質」（ＧＩ：７７４０８２３３参照のこと）；「ＧＢＳ１４７」（ＳＡＧ０４１６）、推定プロテアーゼ（ＧＩ：ＧＩ：２２５３３４３５参照のこと）；「ＧＢＳ３２８」（ＳＡＧ１３３３）５’−ヌクレオチダーゼファミリータンパク質」（ＧＩ：２２５３４３５９参照のこと）が挙げられる。
【０１０６】
免疫原性組成物および医薬品
上記のポリペプチドは、本発明の免疫原性組成物中の活性成分（免疫原）として有用であり、そのような組成物は、ワクチンとして有用であり得る。免疫原性組成物は、よって、薬学的に許容される。これらは、通常、抗原に加えて成分を含み、例えば、これらは、典型的には、１または複数の薬学的キャリア、賦形剤および／またはアジュバントを含む。ワクチンアジュバントの詳細な考察は、参考文献６および７で入手可能である。
【０１０７】
組成物は、一般的に、哺乳動物に水性形態で投与される。しかし、投与の前に、組成物は非水性形態であってよい。例えば、いくつかのワクチンは水性形態で製造され、次いで充填および配布され、同じく水性形態で投与されるが、その他のワクチンは製造中に凍結乾燥され、使用時に水性形態に再構成される。よって、本発明の組成物は、凍結乾燥処方物のように乾燥され得る。
【０１０８】
組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールのような防腐剤を含んでよい。しかし、好ましくは、ワクチンは、水銀性物質を実質的に含まない（すなわち５μｇ／ｍｌ未満）、例えばチオメルサールを含まないようにすべきである。水銀を含まないワクチンがより好ましい。防腐剤を含まないワクチンが特に好ましい。
【０１０９】
熱安定性を改善するために、組成物は、温度保護剤を含んでよい。
【０１１０】
張度を制御するために、ナトリウム塩のような生理的な塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは、１〜２０ｍｇ／ｍｌ、例えば約１０±２ｍｇ／ｍｌ  ＮａＣｌで存在してよい。存在し得るその他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物（ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどを含む。
【０１１１】
組成物は、一般的に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの質量オスモル濃度を有し、より好ましくは、２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内にある。
【０１１２】
組成物は、１または複数の緩衝剤を含んでよい。典型的な緩衝剤は、リン酸塩緩衝剤、Ｔｒｉｓ緩衝剤、ホウ酸塩緩衝剤、コハク酸塩緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤（特に水酸化アルミニウムアジュバントとともに）またはクエン酸塩緩衝剤を含む。緩衝剤は、典型的には、５〜２０ｍＭの範囲で含まれる。
【０１１３】
組成物のｐＨは、一般的に、５．０〜８．１であり、より典型的には６．０〜８．０、例えば６．５および７．５、または７．０〜７．８である。
【０１１４】
組成物は、好ましくは滅菌されている。組成物は、好ましくは非発熱性であり、例えば用量あたり＜１ＥＵ（内毒素単位、標準的な尺度）、好ましくは用量あたり＜０．１ＥＵを含有する。組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。
【０１１５】
組成物は、単回の免疫化のための物質を含んでも、複数回の免疫化（すなわち「複数回用量（ｍｕｌｔｉｄｏｓｅ）」キット）のための物質を含んでもよい。複数回用量の構成（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）において、防腐剤を含むことが好ましい。複数回用量組成物に防腐剤を含める代わり（またはそれに加えて）に、組成物を、物質を取り出すための無菌アダプタを有する容器中に入れてよい。
【０１１６】
ヒトワクチンは、典型的には、約０．５ｍｌの投与容積で投与されるが、小児には半分の用量（すなわち約０．２５ｍｌ）を投与してよい。
【０１１７】
ある実施形態において、ワクチン組成物は、１種または複数の薬学的に許容される担体、希釈剤および／またはアジュバントを含む。本発明の組成物において使用され得るアジュバントとして、それらに限定されないが、以下が挙げられる。
【０１１８】
・無機塩、例えば、水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）および硫酸塩などを含めたアルミニウム塩およびカルシウム塩［例えば、参考文献８の８＆９章を参照のこと］、
・水中油型エマルジョン、例えば、ＭＦ５９（マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に処方された、５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ  ８０および０．５％Ｓｐａｎ  ８５）を含めたスクアレン−水エマルジョン［参考文献６の１０章、参考文献９〜１２、参考文献１３の１０章および参考文献１４の１２章も参照のこと］、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、
・サポニン処方物［参考文献６の２２章］、例えば、ＱＳ２１［１５］およびＩＳＣＯＭ［参考文献６の２３章］、
・ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）［１６〜２２］、
・細菌または微生物誘導体、例えば、腸内細菌リポ多糖類（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、脂質Ａ誘導体［２３、２４］、ＩＣ−３１（商標）［３１］（２６マーの配列５’−（ＩＣ）１３−３’（配列番号５６）を含むデオキシヌクレオチドおよび１１マーのアミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号５７）を含むポリカチオンポリマーペプチド）などの免疫賦活性オリゴヌクレオチド［２５〜３０］、ならびにＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体［３２〜４１］、
・インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［４２、４３］、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子および腫瘍壊死因子などのサイトカインを含めたヒト免疫調節物質、
・生体付着性物質および粘膜付着性物質、例えばキトサンおよびその誘導体、エステル化ヒアルロン酸マイクロスフェア［４４］または粘膜付着性物質、例えば、ポリ（アクリル酸）の架橋された誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロース［４５］、
・生分解性で、非毒性である材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成される微小粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは、直径約２００ｎｍ〜約３０μｍおよび最も好ましくは、直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）、
・リポソーム［参考文献６の１３＆１４章、参考文献４６〜４８］、
・ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル［４９］、
・ＰＣＰＰ処方物［５０および５１］、
・Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）を含めたムラミルペプチド、および
・イミクアモド（Ｉｍｉｑｕａｍｏｄ）およびその相同体（例えば、「レシキモド３Ｍ」）を含めたイミダゾキノロン化合物［５２および５３］。
【０１１９】
本発明はまた、上記で同定されたアジュバントのうち１種または複数の組み合わせも含み得る。例えば、本発明において以下のアジュバント組成物が使用され得る：（１）サポニンおよび水中油型エマルジョン［５４］、（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）［５５］、（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール、（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（場合により、＋ステロール）［５６］、（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組み合わせ［５７］、（６）より大きな粒径のエマルジョンを作製するために、サブミクロンエマルジョンにマイクロフルイダイズされたか、またはボルテックス処理された、１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ  ８０（商標）、５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、（７）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ  ８０およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ジミコール酸トレハロース（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群から１種または複数の細菌の細胞壁成分を含有するＲｉｂｉ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）および（８）１種または複数の無機塩（アルミニウム塩など）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（３ｄＭＰＬなど）。
【０１２０】
免疫刺激物質として作用するその他の物質は、参考文献６の７章に開示されている。
【０１２１】
水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムアジュバントの使用は、特に、小児において有用であり、抗原は、一般に、これらの塩に吸着される。水中スクアレンエマルジョンもまた、特に高齢者において好ましい。有用なアジュバント組み合わせは、ＣｐＧ＆ミョウバンまたはレシキモド＆ミョウバンなどのＴｈ１およびＴｈ２アジュバントの組み合わせが挙げられる。リン酸アルミニウムおよび３ｄＭＰＬの組み合わせを使用してもよい。
【０１２２】
本発明の組成物は、細胞媒介免疫応答ならびに体液性免疫応答の両方を惹起し得る。
【０１２３】
２つの型のＴ細胞、すなわちＣＤ４およびＣＤ８細胞は、一般的に、細胞媒介性免疫および体液性免疫を開始および／または増進するために必要であると考えられている。ＣＤ８  Ｔ細胞は、ＣＤ８共受容体を発現でき、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と一般に呼ばれる。ＣＤ８  Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子上に提示される抗原を認識でき、またはそれと相互作用できる。
【０１２４】
ＣＤ４  Ｔ細胞は、ＣＤ４共受容体を発現でき、Ｔヘルパー細胞と一般に呼ばれる。ＣＤ４  Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合した抗原性ペプチドを認識できる。ＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用の際に、ＣＤ４細胞は、サイトカインのような因子を分泌できる。これらの分泌されたサイトカインは、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージおよび免疫応答に参加するその他の細胞を活性化できる。ヘルパーＴ細胞またはＣＤ４＋細胞は、２つの機能的に異なるサブセット、すなわちそれらのサイトカインおよびエフェクター機能が異なるＴＨ１表現型およびＴＨ２表現型にさらに分けることができる。
【０１２５】
活性化ＴＨ１細胞は、細胞性免疫を増進し（抗原特異的ＣＴＬの生成の増加を含む）、よって、細胞内感染に対する応答において特に価値がある。活性化ＴＨ１細胞は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−βの１または複数を分泌し得る。ＴＨ１免疫応答は、マクロファージ、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化することにより局所的炎症反応をもたらし得る。ＴＨ１免疫応答は、ＢおよびＴ細胞の増殖を、ＩＬ−１２を用いて刺激することにより免疫応答を拡大するように作用することもある。ＴＨ１刺激Ｂ細胞は、ＩｇＧ２ａを分泌し得る。
【０１２６】
活性化ＴＨ２細胞は、抗体生成を増進し、よって、細胞外感染に対する応答において価値がある。活性化ＴＨ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０の１または複数を分泌し得る。ＴＨ２免疫応答は、ＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび将来の防御のためのメモリーＢ細胞の生成をもたらし得る。
【０１２７】
免疫応答の増進は、ＴＨ１免疫応答の増進およびＴＨ２免疫応答の増進の１または複数を含み得る。
【０１２８】
ＴＨ１免疫応答は、ＣＴＬの増加、ＴＨ１免疫応答と関連するサイトカインの１もしくは複数（例えばＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−β）の増加、活性化マクロファージの増加、ＮＫ活性の増加、またはＩｇＧ２ａの生成の増加の１または複数を含み得る。好ましくは、ＴＨ１免疫応答の増進は、ＩｇＧ２ａ生成の増加を含む。
【０１２９】
ＴＨ１免疫応答は、ＴＨ１アジュバントを用いて惹起し得る。ＴＨ１アジュバントは、一般的に、アジュバントなしの抗原での免疫化と比べて、増加したレベルのＩｇＧ２ａ生成を惹起する。本発明で用いるために適切なＴＨ１アジュバントは、例えばサポニン処方物、ビロソームおよびウイルス様粒子、腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチドを含んでよい。ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドのような免疫刺激オリゴヌクレオチドは、本発明で用いるために好ましいＴＨ１アジュバントである。
【０１３０】
ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２免疫応答と関連するサイトカインの１もしくは複数（例えばＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）の増加、またはＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびメモリーＢ細胞の生成の増加の１または複数を含み得る。好ましくは、ＴＨ２免疫応答の増進は、ＩｇＧ１生成の増加を含む。
【０１３１】
ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２アジュバントを用いて惹起し得る。ＴＨ２アジュバントは、一般的に、アジュバントなしの抗原での免疫化と比べて、増加したレベルのＩｇＧ１生成を惹起する。本発明で用いるために適切なＴＨ２アジュバントは、例えば無機質含有組成物、油性エマルジョンならびにＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒化誘導体を含む。アルミニウム塩のような無機質含有組成物は、本発明で用いるために好ましいＴＨ２アジュバントである。
【０１３２】
組成物は、ＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントとの組み合わせを含み得る。好ましくは、このような組成物は、増進されたＴＨ１応答および増進されたＴＨ２応答を惹起し、すなわちアジュバントなしでの免疫化と比べて、ＩｇＧ１生成およびＩｇＧ２ａ生成の両方の生成の増加を惹起する。さらにより好ましくは、ＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントとの組み合わせを含む組成物は、単一アジュバントを用いる免疫化と比べて（すなわち、ＴＨ１アジュバントのみでの免疫化またはＴＨ２アジュバントのみでの免疫化と比べて）、ＴＨ１免疫応答の増加および／またはＴＨ２免疫応答の増加を惹起する。
【０１３３】
免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２応答の一方または両方であってよい。好ましくは、免疫応答は、ＴＨ１応答の増進およびＴＨ２応答の増進の一方または両方をもたらす。
【０１３４】
免疫応答の増進は、全身免疫応答および粘膜免疫応答の一方または両方であり得る。好ましくは、免疫応答は、全身免疫応答の増進および粘膜免疫応答の増進の一方または両方をもたらす。好ましくは、粘膜免疫応答は、ＴＨ２免疫応答である。好ましくは、粘膜免疫応答は、ＩｇＡの生成の増加を含む。
【０１３５】
感染は、身体の種々の領域を侵し得、そのため本発明の組成物は、種々の形態で調製してよい。例えば、組成物は、液体溶液または懸濁物のいずれかとしての注射剤（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ）として非経口投与のために調製してよい。注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するために適切な固体の形態も調製できる（例えば凍結乾燥組成物または噴霧凍結乾燥組成物）。組成物は、表面投与（ｔｏｐｉｃａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）用に、例えば軟膏剤、クリームまたは散剤として調製してよい。上記組成物は、「ワクチンパッチ」または硬膏剤を使用する投与のために処方されてもよい。組成物は、経口投与用に、例えば錠剤もしくはカプセル剤として、噴霧剤として、またはシロップ剤（所望により矯味矯臭して）として調製してよい。組成物は、肺投与用に、例えば微細粉末または噴霧剤を用いる吸入器として調製してよい。組成物は、坐剤または膣坐剤として調製してよい。組成物は、鼻、耳または眼の投与用に、例えば滴剤として調製してよい。組成物は、組み合わせ組成物が、患者への投与の直前に再構成されるように設計されたキットの形態であってよい。このようなキットは、液体の形態の１または複数の抗原と、凍結乾燥された１または複数の抗原とを含んでよい。
【０１３６】
組成物が使用前に即席で調製され（例えば成分が凍結乾燥された形態である場合）、かつキットとして提示される場合、キットは２つのバイアルを含んでも、１つの充填済み（ｒｅａｄｙ−ｆｉｌｌｅｄ）シリンジと１つのバイアルとを含んでもよく、シリンジの内容物は、注射前にバイアルの内容物を再活性化するために用いられる。
【０１３７】
非経口注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内または間質性注射）および直腸、経口（例えば、錠剤、スプレー）、膣内、局所、経皮を含めた送達方法は、ＷＯ９９／２７９６１に開示されており、ＷＯ０２／０７４２４４およびＷＯ０２／０６４１６２には経皮的方法、ＷＯ０３／０２８７６０には鼻腔内が開示されている。その他の投与経路として、眼内、耳および肺またはその他の粘膜投与が挙げられる。
【０１３８】
特に、本発明の組成物は、全身経路または粘膜経路または経皮経路によって投与され得るか、特定の組織に直接投与され得る。本明細書において、用語「経皮送達」は、皮内（例えば、真皮または表皮中に）および経皮（例えば、「経皮的」）すなわち、少なくとも皮膚の最上層中またはそれを通る薬剤の通過による送達を含む。本明細書において、用語「全身投与」は、それらに限定されないが、任意の非経口投与経路が挙げられる。特に、非経口投与は、それらに限定されないが、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内、筋肉内または胸骨内注射、静脈内、動脈内または腎臓透析注入技術を含む。一般に、全身性、非経口投与は、筋肉内注射である。本明細書において、用語「粘膜投与」は、それらに限定されないが、経口、鼻腔内、膣内、直腸内、気管内、腸および眼投与を含む。新規直接送達形態はまた、食物におけるポリペプチドの組み合わせのトランスジェニック発現、例えば、ジャガイモにおけるトランスジェニック発現も含み得る。
【０１３９】
ワクチンとして用いられる免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原（複数可）と、必要に応じて任意のその他の成分とを含む。「免疫学的有効量」により、単回用量または一連のものの一部のいずれかとしてその量を個体に投与することが、処置または予防のために有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康および身体の状態、年齢、処置される個体の分類群（例えば非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方、医学的状態についての処置医師の評価、およびその他の関連する要因に依存して変動する。この量は、日常的な試験により決定できる比較的広い範囲内にあると予測される。
【０１４０】
薬学的に許容される担体
本発明の組成物は、通常、上記の成分に加えて、１種または複数の「薬学的に許容される担体」を含む。これらは、それ自体が、組成物を受け取る個体にとって有害な抗体の製造を誘導しない任意の担体を含む。適した担体は、通常、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび脂質凝集体（油滴またはリポソームなど）などの大きな、ゆっくり代謝される巨大分子である。このような担体は、当業者に周知である。組成物はまた、水、食塩水、グリセロールなどの希釈剤を含有し得る。さらに、湿潤剤または乳化剤などの補助物質、ｐＨ緩衝物質などが存在し得る。薬学的に許容される成分の徹底的な考察が、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００年）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．  ２０版、ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２において利用可能である。本発明の組成物は、当技術分野で公知のように、種々の形態（例えば、液体形態、凍結乾燥した形態）で調製され得る。
【０１４１】
処置方法および本発明の免疫原性組成物またはワクチン組成物の投与
本発明はまた、有効量の本発明の組成物を投与するステップを含む、被験体、特に、哺乳動物において免疫応答を引き起こすための方法を提供する。免疫応答は、好ましくは、防御的であり、好ましくは、抗体および／または細胞性免疫を含む。方法は、追加免疫応答を引き起こし得る。
【０１４２】
本発明はまた、例えば、哺乳動物などの被験体において免疫応答を引き起こすことにおいて使用するための医薬として使用するための免疫原性組み合わせまたは組成物を提供する。
【０１４３】
本発明はまた、哺乳動物などの被験体において免疫応答を引き起こすための医薬の製造における、本発明のポリペプチドまたは組成物の組み合わせの使用を提供する。
【０１４４】
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物で予め充填された送達デバイスを提供する。
【０１４５】
これらの使用および方法によって、被験体において免疫応答を引き起こすことによって、被験体、例えば、哺乳動物は、Ｅ．ｃｏｌｉ感染、例えば、ＥｘＰＥＣおよび非ＥｘＰＥＣ株を含めた２種以上のＥ．ｃｏｌｉ病原型に対して防御され得る。本発明は、ＥＰＥＣ、ＥＡＥＣ、ＥＩＥＣ、ＥＴＥＣおよびＤＡＥＣ（びまん付着性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）病原型などの腸病原型を含めた病原性ＥｘＰＥＣ  Ｅ．ｃｏｌｉに対する広い防御を提供するために特に有用である。したがって、被験体は、それらに限定されないが、腹膜炎、腎盂腎炎、膀胱炎、心内膜炎、前立腺炎、尿路感染症（ＵＴＩ）、髄膜炎（特に、新生児髄膜炎）、敗血症（またはＳＩＲＳ）、脱水症、肺炎、下痢（乳児、旅行者、急性、持続性など）、細菌性赤痢、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、心膜炎、細菌尿症などを含む疾患に対して防御され得る。
【０１４６】
被験体は、好ましくは、哺乳動物、特に、ヒトであるが、限定されない例として、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ネコまたはイヌであってもよいが、これは、Ｅ．ｃｏｌｉ疾患はまた、これらの種においても問題があるからである。ある実施形態において、被験体は、例えば、ニワトリ、ガチョウ、シチメンチョウなどといった鳥類被験体であり得る。
【０１４７】
ワクチンが予防用使用のためのものである場合、ヒトは、特に、小児（例えば、よちよち歩きの幼児（ｔｏｄｄｌｅｒ）または乳児）またはティーンエイジャーであり、ワクチンが治療用使用のためのものである場合には、ヒトは、特にティーンエイジャーまたは成人である。小児のために意図されたワクチンはまた、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために、成人に投与され得る。
【０１４８】
治療処置の有効性を調べる１つの方法は、本発明の組成物の投与後にＥ．ｃｏｌｉ感染をモニタリングすることを含む。予防処置の有効性を調べる１つの方法は、組成物の投与後の、本発明の組成物中の抗原に対する免疫応答を、全身的に（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ生成のレベルをモニタリングすることなど）および／または粘膜的に（ＩｇＡ生成のレベルをモニタリングすることなど）モニタリングすることを含む。通常、抗原特異的血清抗体反応は、免疫化後であるが、チャレンジ前に決定されるが、抗原特異的粘膜抗体反応は、免疫化後およびチャレンジ後に決定される。
【０１４９】
本発明の組成物の免疫原性を評価する別の方法は、イムノブロットおよび／またはマイクロアレイによって患者血清または粘膜分泌物をスクリーニングするために組換えによってタンパク質を発現させることである。タンパク質と患者試料の間の陽性の反応は、患者が、問題のタンパク質に対する免疫応答を開始したことを示す。この方法はまた、免疫優性抗原および／または抗原内のエピトープを同定するために用いてもよい。
【０１５０】
本発明の組成物の有効性はまた、Ｅ．ｃｏｌｉ感染の動物モデル、例えば、モルモットまたはマウスを、ワクチン組成物を用いてチャレンジすることによってｉｎ  ｖｉｖｏで決定することもできる。ＥｘＰＥＣおよび致死性敗血症のマウスモデルは、参考文献５８に記載されている。コットンラットモデルは、参考文献５９に開示されている。
【０１５１】
投薬処置は、単回用量スケジュールであっても、複数回用量スケジュールであってもよい。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、抗生物質処置レジメンと組み合わせて投与される。一実施形態では、抗生物質は、本発明の組成物の投与に先立って投与される。別の実施形態では、抗生物質は、本発明の組成物の投与に続いて投与される。
【０１５２】
複数回用量は、一次免疫スケジュールにおいて、および／または追加免疫スケジュールにおいて使用され得る。複数回用量スケジュールでは、種々の用量を、同一または異なる経路、例えば、非経口初回刺激（ｐｒｉｍｅ）および粘膜追加刺激（ｂｏｏｓｔ）、粘膜初回刺激および非経口追加刺激などによって与えてもよい。複数回用量は、通常、少なくとも１週間隔てて（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）投与される。
【０１５３】
本発明のワクチンは、小児および成人の両方を処置するために用いてよい。したがって、ヒト患者は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳または少なくとも５５歳であってよい。ワクチンを受ける特定の患者群は、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、好ましくは、≧６５歳）、年少者（例えば、≦５歳）、入院患者、医療従事者、軍隊および軍人、旅行者、妊娠中の女性、慢性の病人または免疫不全患者である。しかし、ワクチンは、これらの群に対してのみ適しているわけではなく、より一般的には、集団において使用され得る。
【０１５４】
本発明のワクチンは、外科手術を控えている患者またはその他の入院患者にとって特に有用である。それらはまた、カテーテル処置される患者において有用である。それらはまた、青年期女性（例えば、１１〜１８歳）において、また慢性尿路感染症を有する患者において有用である。
【０１５５】
本発明のワクチンは、その他のワクチンと実質的に同時に（例えば、医療専門家またはワクチン接種センターへの同一の医療相談または訪問中に）または組み合わせて、例えば、麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、テタヌスワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合体化Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型ワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合体ワクチン（四価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチンなど）、呼吸器合胞体ウイルスワクチン、Ａ群連鎖球菌ワクチンまたはＢ群連鎖球菌ワクチンなどといった連鎖球菌ワクチンと実質的に同時に患者に投与してよい。
【０１５６】
一般
本発明の実施は、特に断りのない限り、当業者の技術の範囲内の化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を使用する。このような技術は、文献において完全に説明されている。例えば、参考文献６０〜６１などを参照のこと。
【０１５７】
いくつかの実施では、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、列挙されたポリペプチドなどの示された活性物質を含むことならびにその他の活性物質および製薬業界において公知であるような、薬学的に許容される担体、賦形剤、皮膚軟化薬、安定化剤などを含むことを指す。いくつかの実施では、用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、その唯一の有効成分が、示された有効成分（複数可）である組成物を指すが、製剤の安定化、保存のためなどのものであるが、示された有効成分の治療用効果には直接的に関与しないその他の化合物が含まれ得る。移行句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」の使用は、特許請求の範囲は、特許請求の範囲において列挙される特定の材料またはステップおよび特許請求される発明の基本的および新規特徴（複数可）に物質的に影響を及ぼさないものを包含するよう解釈されなければならないということを意味する。Ｉｎ  ｒｅ  Ｈｅｒｚ、５３７  Ｆ．２ｄ  ５４９巻、５５１〜５２頁、１９０  ＵＳＰＱ  ４６１、４６３  （ＣＣＰＡ  １９７６）（原本では強調）を参照のこと；ＭＰＥＰ  §  ２１１１．０３も参照のこと。したがって、用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、本発明の特許請求の範囲において使用される場合には、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等であると解釈されないものとする。
【０１５８】
数値ｘに関して用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１５９】
本明細書では、「ＧＩ」番号付けが使用されている。ＧＩ番号または「ＧｅｎＩｎｆｏ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ」は、配列がそのデータベースに加えられる時点で、ＮＣＢＩによって処理された各配列記録に逐次的に割り当てられている一連の数字である。ＧＩ番号は、配列記録の受託番号に対して類似点はない。配列が更新されると（例えば、訂正のために、またはより多くのアノテーションもしくは情報を加えるために）、新規ＧＩ番号を受け取る。したがって、所与のＧＩ番号と関連している配列は、決して変更されない。
【０１６０】
２種のアミノ酸配列間の配列同一性パーセンテージへの言及は、アラインされた場合に、アミノ酸のパーセンテージが、配列のうち最長のものに対する２種の配列の比較において同じである（すなわち、同一である）ことを意味する。このアラインメントおよび相同性または配列同一性パーセントは、当技術分野で公知のソフトウェアプログラムを使用して決定できる。好ましいアラインメントは、１２のギャップオープンペナルティおよび２のギャップ伸長ペナルティ、６２のＢＬＯＳＵＭマトリックスを用いるアフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。
【０１６１】
本発明のある実施形態が記載され、上記に具体的に例示されているが、本発明がこのような実施形態に限定されることを意図するものではない。以下の特許請求の範囲に示されるような本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、それに種々の改変を行うことができる。
【実施例】
【０１６２】
本発明の実施するための様式
（実施例１）
各々、本明細書においてより十分に記載される、細菌Ｉｇ様ドメイン（群１）タンパク質（ｏｒｆ４０５）、ｇｓｐＫ（ｏｒｆ３５１５）、ｕｐｅｃ−１２３２およびｏｒｆ３５２６を発現させ、配列決定し、精製した。配列は、種々のその他のＥ．ｃｏｌｉ株においてオルソログのために入手した。各候補抗原の分布は、ほとんどの病原性株、具体的には、ＮＭＥＣ、ＡＰＥＣ、ＵＰＥＣ、ＥＨＥＣ、ＥＡＥＣ、ＥＩＥＣ、ＥＰＥＣ、ＥＴＥＣおよびＡＩＥＣにおいて決定した。各抗原の存在が、図１ＡおよびＢに示されている。
【０１６３】
（実施例２）
抗原を、ゲノムＤＮＡ鋳型からＰＣＲ増幅し、ｐＥＴ−２１ｂ  ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にクローニングし、増幅のための化学的にコンピテントな細胞ＤＨ５α−Ｔ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）化学的にコンピテントな細胞を使用した。すべての候補は、クローニングし、シグナル配列を伴わずに、Ｈｉｓ−タグ融合タンパク質として発現させた。候補は、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【０１６４】
【化２５】
2014531442.tif 000027
【０１６５】
（実施例３）
防御は、敗血症動物モデルにおいて評価した。Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｉｔａｌｉａ製のＣＤ１非近交系雌マウス（５週齢）を、フロイントのアジュバント中の２０μｇの組換えタンパク質を用いて、１日目、２１日目および３５日目の皮下注射によって免疫化した。陽性対照は、０．１５ｍｌのフロイントのアジュバント（Ｓｉｇｍａ）中の生理学的溶液中の１０８個の熱不活化細菌（６５℃、３０分間）を用いて免疫化したのに対し、陰性対照は、フロイントのアジュバント中の生理学的溶液を用いて免疫化した。チャレンジは、４９日目に、１０７個の新鮮な細菌の培養物／マウス（ＬＤ８０）の用量を用いて腹膜内（株ＩＨＥ３０３４およびＣＦＴ０７３のために）または静脈内（株５３６のために）注射によって行った。ヘパリン処理した血液試料を、チャレンジ後２４時間で生存マウスから採取して、細菌レベルを調べ、チャレンジ後４日間死亡率を観察した。
【０１６６】
【化２６】
2014531442.tif 000028
【０１６７】
（実施例３Ａ）
防御は、敗血症動物モデルにおいて評価した。ＣＤ１マウスをフロイントの完全アジュバントまたはミョウバン中の２０μｇの組換えタンパク質を用いる、０、２１および３５日目の皮下注射によって免疫化した。陽性対照は、フロイントの完全アジュバントまたはミョウバン中の０．１５ｍｌの生理学的溶液中の１０８個の熱不活化細菌（６５℃、３０分間）を用いて免疫化したのに対し、陰性対照は、フロイントの完全アジュバントまたはミョウバン中の生理学的溶液を用いて免疫化した。チャレンジは、４９日目に、１０７個の新鮮な細菌の培養物／マウス（ＬＤ８０）の用量を用いて腹膜内（株ＩＨＥ３０３４およびＣＦＴ０７３のために）または静脈内（株５３６のために）注射によって行った。ヘパリン処理した血液試料を、チャレンジ後２４時間で生存マウスから採取して、細菌レベルを調べ、チャレンジ後４日間死亡率を観察した。
【０１６８】
【化２７】
2014531442.tif 000029
【０１６９】
【化２８】
2014531442.tif 000030
【０１７０】
【化２９】
2014531442.tif 000031
【０１７１】
防御率＝（（死滅対照％−死滅免疫化％）／（死滅対照％））×１００
（実施例３Ｃ）
交差防御は、能動免疫化または受動免疫化によって敗血症動物モデルにおいて評価した。マウスは、チャレンジ（能動免疫化）の前にミョウバン中の抗原３５２６−ｈｉｓを用いて免疫化するか、またはチャレンジ（受動免疫化）後に抗３５２６−ｈｉｓ抗体を投与した。３５２６−ｈｉｓの配列は、ＮＭＥＣ株ＩＨＥ３０３４から得た天然３５２６タンパク質の配列に基づいている。マウスは、株ＩＨＥ３０３４、Ｂ６１６、ＩＮ１Ｓまたは９８５５／９３を用いてチャレンジした。ＰＥ％（防御有効性）は、１−（死亡ワクチン接種％／死亡対照％）×１００として算出した。
【０１７２】
【化３０】
2014531442.tif 000032
【０１７３】
結果は、ＥｘＰＥＣ−ＮＭＥＣ株ＩＨＥ３０３４に由来する３５２６が、少なくとも３種のさらなるＥｘＰＥＣ株（１種のＮＭＥＣおよび２種のＳＥＰＥＣ）に対して能動免疫化されたマウスにおいて防御を付与することを示す。受動免疫化実験によって、少なくとも１種のさらなるＥｘＰＥＣ株（ＳＥＰＥＣ）に対する交差防御が確認される。
【０１７４】
（実施例４）
防御は、以下のスケジュールに従って敗血症動物モデルにおいて評価した：
【０１７５】
【化３１】
2014531442.tif 000033
【０１７６】
・２４時間で血液を尾から採取して、菌血症を評価する。
・感染後４日間死亡率をモニタリングする。
防御率は、＝（死亡対照％−死亡免疫化％）／死亡対照％
×１００として算出する。
【０１７７】
【化３２】
2014531442.tif 000034
【０１７８】
（実施例５）
抗原ｏｒｆ３５２６の遺伝子分布、遺伝的変動およびタンパク質発現を研究するために、ならびに有効ワクチン適用範囲（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）を評価するために、本発明者らは、異なる病原性（ＥｘＰＥＣ、ＥＴＥＣ、ＥＰＥＣ）および糞便株を含めたヒトおよび動物単離株の３種の異なる収集物を研究した。手短に述べると、細菌を３７℃、ＬＢ（Ｄｉｆｃｏ）中５％ＣＯ２とともに加湿した雰囲気中で一晩培養することによってゲノムＤＮＡを調製した。染色体ＤＮＡを、ＧｅｎＥｌｕｔｅ細菌ゲノムＤＮＡキット（Ｓｉｇｍａ）を製造業者の使用説明書に従って使用して１．５ｍＬの培養物から調製した。ＤＮＡ濃度は、２６０ｎｍでの光学濃度決定によって算出した。約１００ｎｇの染色体ＤＮＡを、抗原ｏｒｆ３５２６の増幅のための鋳型として使用した。使用した増幅酵素は、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）とした。すべての遺伝子を、コーディング領域の外側のプライマーを使用して増幅した。プライマーは、保存されたＤＮＡ領域において設計し、配列は表１に報告されている。抗原ｏｒｆ３５２６を、プライマーＥＣＯＫ１＿３３８５＿１およびＥＣＯＫ１＿３３８５＿２２を使用して増幅した。ＰＣＲ条件は以下のとおりとした：９８℃で１０秒の変性、５５℃で２０秒間のアニーリングおよび７２℃で３分間の伸長の３５サイクル。ＰＣＲ産物は、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）プロトコール（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて精製し、キャピラリーシークエンサーＡＢＩ３７３０ｘｌ  ＤＮＡ分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で配列決定した。配列は、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ４．８（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ）を用いてアセンブルし、アラインし、ベクターＮＴＩスーツ１０を使用して解析した。
【０１７９】
【表１】
2014531442.tif 000035
【０１８０】
Ｅｌｉｓａアッセイ
上清（ＳＮ）中のｏｒｆ３５２６抗原検出および相対定量化を、ウサギ抗ｏｒｆ３５２６抗原ポリクローナル抗体を用いてｏｒｆ３５２６抗原をターゲッティングする抗体−サンドイッチＥＬＩＳＡによって実施し、アルカリホスファターゼ結合体化抗ウサギ抗体によって示した。手短に述べると、マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ、Ｍａｘｉ  Ｓｏｒｐ）のウェルを、０．２２μｍ濾過細菌上清を用いて４℃で一晩コーティングした。結合していないＳＮを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）（ＰＢＳ−Ｔ）の溶液を用いて２回洗い流し、非特異的結合部位を、ＰＢＳＴ−ＢＳＡ（１％）溶液を用いて３７℃で１時間ブロッキングした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いてさらに３回さらに洗浄し、その後、２連のウェルに、ウサギ抗ｏｒｆ３５２６ポリクローナル抗体段階希釈剤を３７℃で１時間３７分添加した。ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄した後、アルカリホスファターゼ結合体化抗ウサギポリクローナル抗体を添加した。続いて、マイクロプレートを３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴを用いて３回洗浄し、その後、酵素基質を添加することによって顕色させた。暗所、室温にて、３０分インキュベートした後、５０μｌのＮａＯＨ溶液（３Ｎ）を添加することによって反応を停止させた。プレートを、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）において４０５ｎｍで読み取った。
【０１８１】
全体に、ＥＣＯＫ１＿３３８５遺伝子が存在し、分析された４１７株のうち８０％超において発現され、アミノ酸配列同一性は、決して８６％を下回らなかった。結論として、本明細書において提示された結果は、抗原ｏｒｆ３５２６は、病原性および糞便単離株にわたり良好に表され、保存され、発現されることを示し、これは、この標的がＥ．ｃｏｌｉに対して広く防御的なワクチンの有用な候補であり得ることを示す（図２（ａ）、２（ｂ）および２（ｃ））。
【０１８２】
系統発生的再構築
ｏｒｆ３５２６抗原の２１７種のアミノ酸配列の系統樹を、最大複合尤度法（Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ）（参考文献Ｔａｍｕｒａ  Ｋ、Ｎｅｉ  Ｍ、Ｋｕｍａｒ  Ｓ（２００４年）Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｉｎｆｅｒｒｉｎｇ  ｖｅｒｙ  ｌａｒｇｅ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｅｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０１巻：１１０３０〜１１０３５頁）を使用してコンピュータで計算したタンパク質配列間の距離行列から、近隣結合（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｊｏｉｎｉｎｇ）アルゴリズムを使用するＭＥＧＡ  ｖ．４（参考文献Ｔａｍｕｒａ  Ｋ、Ｄｕｄｌｅｙ  Ｊ、Ｎｅｉ  Ｍ、Ｋｕｍａｒ  Ｓ（２００７年）ＭＥＧＡ４：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  （ＭＥＧＡ）  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  ２４巻：１５９６〜１５９９頁）を使用してコンピュータで計算した（図３）。
【０１８３】
（実施例６）
ｏｒｆ３５２６は、鳥類モデルにおいて防御性である。
【０１８４】
３日齢のニワトリ（Ｂａｒ−Ｏｎ）に、５×１０６個のＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ２株１７７２を用い、３時間隔てた各０．２ｍｌの２回の注射でｉ．ｐ．チャレンジした。抗体（抗ｏｒｆ３５２６）、第１の注射の２０分後に０．１５ｍｌをｓ．ｃ．適用した（頸部）。敗血症のニワトリモデルにおける受動免疫化において、抗原ｏｒｆ３５２６に対する抗体が防御することがわかった（図４）。
【０１８５】
（実施例７）
この実験の目的は、腸病原性Ｋ８８  Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）によって引き起こされた仔ブタにおける下痢性疾患に対する、ＬＴＫ６３を用いた場合および用いない場合の保存された抗原ｏｒｆ３５２６の防御能力を評価することであった。
【０１８６】
２つの研究を実施した：
１．  １１ＮＡＨＬＷ１０１９ｖ：過剰免疫化によるタンパク質ｏｒｆ３５２６抗血清の生成（Ｉ相）、仔ブタにおける抗血清経口投与予備チャレンジ（ＩＩ相）
２．  １１ＮＡＨＬＷ１０２０ｖ：ＥｘＰＥＣ抗血清投与およびｏｒｆ３５２６タンパク質のチャレンジ評価  。
【０１８７】
第１の実験は、ＣＤ／ＣＤブタにおいてＬＴＫ６３を用いた場合および用いない場合のｏｒｆ３５２６タンパク質の抗血清を作製し、続いて、免疫学的にナイーブな仔ブタに最小および最大用量ならびに対照を用いてパイロット投与を行い、チャレンジモデルにおける抗血清型生成物の予備的有効性を評価するように設計した。
【０１８８】
第２の実験は、免疫学的にナイーブな仔ブタに抗血清の形態で投与されたｏｒｆ３５２６タンパク質とそれに続く、経口Ｋ８８  Ｅ．ｃｏｌｉチャレンジを評価するように設計された無作為化盲検である。
【０１８９】
以下の材料が利用された：
−精製組換えｏｒｆ３５２６タンパク質
−精製組換えｏｒｆ３５２６タンパク質＋ＬＴＫ６３
−安定性試験のためのｏｒｆ３５２６に対するモノクローナル抗体  。
【０１９０】
チャレンジ
Ｋ８８チャレンジ培養物（ロット番号ＴＢＤ）を、室温（約２３℃）で解凍し、一緒にプールし、滅菌ペプトンバッファー、２．０ｍｌを用いて１：２希釈し、３ｍｌのクライオバイアル中に再度分注し、＜−６０℃で凍結した。ＳＯ  ６．００１に従って凍結後生存度カウントを実施して、投与される抗原の量を確立した。
【０１９１】
分娩時に、各仔ブタに、分娩／チャレンジ形式で記録された分娩の日付および時間をつけた。誕生の時間および日付の記録において仔ブタの同定番号が必要であるために、仔ブタに耳標を付け、その後、処理した。仔ブタに自由に乳を飲ませた。誕生の６時間内（＋／−２時間）に、仔ブタを計量した。処理の直後に、組込み後除去／離脱（Ｐｏｓｔ−ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  Ｒｅｍｏｖａｌ／Ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）基準に合致する仔ブタを、チャレンジ研究に利用した。
【０１９２】
希釈し、再度分注したＫ８８チャレンジ培養物（ロット番号ＴＢＤ）を、室温（約２３℃）で解凍し、各仔ブタに２．０ｍｌを経口投与した。チャレンジ後、仔ブタを雌ブタに戻した。
【０１９３】
Ｉ相の処置結果を、過剰免疫化ブタから採取した血清におけるタンパク質ｏｒｆ３５２６に対する抗体力価によって評価した。ＩＩ相の処置結果は、臨床観察および剖検結果から集められた死亡率／罹病率情報によって決定される、どの群が、予備チャレンジの経口による２用量の抗血清から最大防御を有するかによって評価した。
【０１９４】
（実施例８）
ＥＴＥＣ株ＧＬ５３−Ｋ８８による胃内感染による腸管コロニー形成のマウスモデルにおけるｏｒｆ３５２６防御
マウスに、感染の４８〜２４時間前に、飲用水（６、７％フルクトースで補強した）中のストレプトマイシン（５ｇ／リットル）を投与して、正常な常在細菌叢を根絶した。この後、４００μｌの最終容量中、１０９ＣＦＵのＧＬ５３株の懸濁液を用いる経口洗浄によってマウスに感染させた。細菌生物に対する胃酸度の効果を低下させるために、細菌接種の１５分前に胃内に重炭酸塩を投与した。感染の２４時間後、マウスを安楽死させ、回腸のセグメント（２ｃｍ）を採取し、ホモジナイズした。ＧＬ５３（カナマイシン耐性）の段階希釈物を、抗生物質を用いて強化したＬＢ寒天プレート上で平板培養する。回収された細菌が接種株であったことを確認するために、細菌コロニーを、ＬＴホロ毒素をコードするプライマーを使用するＰＣＲによって調べる。抗原ｏｒｆ３５２６の防御効果を調べるために、１、７、２１および３５日目に、単独または粘膜アジュバントとしてＬＴＲ７２と組み合わせて（比１：１０）使用した抗原（２０μｇ）を用いて、マウスを鼻腔内免疫化した。４９日目に、１０９  ＣＦＵのＧＬ５３株を用いる経口洗浄によってマウスに感染させた。
【０１９５】
図５に示されるように、抗原ｏｒｆ３５２６を用いる鼻腔内免疫化は、ＥＴＥＣ株ＧＬ５３を用いるチャレンジ後の回腸管におけるコロニー形成を低減した。したがって、ｏｒｆ３５２６は、ＵＴＩマウスモデルにおけるＵＰＥＣ株５３６を用いるチャレンジに対して防御できる。
【０１９６】
（実施例９）
抗原ｏｒｆ３５２６は、ＦＣＡ、ＩＣ３１、ミョウバン、ＭＦ５９と組み合わせて、または単独で、または組み合わせで、これまでに記載されたように調製し、投与した。抗原ｏｒｆ３５２６は、種々のアジュバントとともに投与された場合に防御性のままであった。
【０１９７】
【化３３】
2014531442.tif 000036
【０１９８】
（実施例１０）
抗原４０５Ｂおよびｕｐｅｃ１２３２の防御効果を、マウスにおける感染のＵＴＩモデルを使用して調べた：
マウスに感染させるために使用した細菌を、フィルター滅菌したヒト尿において増殖させ、３回継代した。細菌を３７℃でインキュベートし、２００回転／分で一晩振盪し、６，５００×ｇで１０分間遠心分離した。次いで、ペレットを、およそ１０１０ＣＦＵ／ｍｌの濃度にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した。
【０１９９】
０．０８ｍｌの、５：１．５の割合のＨｙｐｎｏｒｍ（クエン酸フェンタニル、０．３１５ｍｇ／ｍｌ；フルアニソン、１０ｍｇ／ｍｌ）およびＳｔｅｓｏｌｉｄ（ジアゼパム、５ｍｇ／ｍｌ）の混合物の腹膜内投与によってマウスに麻酔した。麻酔したマウスに、プラスチックカテーテルの使用によって細菌懸濁液（Ｅ．ｃｏｌｉ  ５３６）を用いて経尿道的に播種した。０．０５ｍｌの細菌懸濁液を、膀胱尿管逆流を避けるために５秒かけて膀胱中に注入した（１２、１８）。播種の直後にカテーテルを除去した。腹部をやさしく圧迫することによって、各マウスからの尿をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に採取し、頸椎脱臼によってマウスを屠殺した。器官を無菌的に取り出し、膀胱を尿道の近くで切除し、出血を避けるために腎臓をブラントジセクションによって取り出した。器官を、７５０μｌのコラゲナーゼ（５００Ｕ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ  Ｃ９８９１）の懸濁液を含有するクライオチューブ（Ｎｕｎｃ  ３６３４５２）中に入れ、−８０℃で保存した。ホモジナイゼーションに先立って、感染した器官を室温で１．５時間インキュベートし、次いで、播種ループおよび回転ミキサーを用いて手作業でホモジナイズした。播種材料から得た細菌、尿試料から回収した細菌および膀胱または腎臓の一方のいずれかから得た細菌を測定した。それぞれ、図６および７に例示された結果は、抗原４０５Ｂおよびｕｐｅｃ１２３２が、感染のＵＴＩモデルにおいて腎臓コロニー形成を防ぐということを実証する。
【０２００】
（実施例１１）
ｏｒｆ３５２６の変異体／改変体
ｏｒｆ３５２６のｈｉｓタグのついた改変体を発現する３種の構築物各々のうち１種を有する細菌を、３０ｍｌの培地中で培養し、２５℃でｏｒｆ３５２６変異体（リーダーペプチドを含まないｏｒｆ３５２６（３５２６）、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域を介してＮ末端が除去されたｏｒｆ３５２６（ΔＧ３５２６）およびプロリンリッチ領域を介してＮ末端が除去されたｏｒｆ３５２６（ΔＧ３５２６））を発現するよう誘導した。細菌を回収し、超音波処理によって溶解した。可溶性画分を単離し、ＩＭＡＣカラム上にロードした。カラムを、２０ｍＭイミダゾールバッファーを用いて３回洗浄した。次いで、５００ｍＭのイミダゾールバッファーの３回の洗浄を用いてｏｒｆ３５２６改変体を溶出した。ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域を介したｏｒｆ３５２６のＮ末端の除去は、精製タンパク質の溶解度および収量を大幅に高めた。得られた収量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによって、以下のとおりであると推定した：３５２６の０．１８ｍｇおよびΔＧ３５２６の２．３４ｍｇ。
【０２０１】
（実施例１２）
ｏｒｆ３５２６の変異体／改変体
ｏｒｆ３５２６の機能は未知であるが、ｏｒｆ３５２６配列の解析によって、いくつかの保存されたモチーフ、中でも注目すべきは、亜鉛結合モチーフ、おそらくはメタロプロテアーゼ機能の一部および不完全なＧＴＰ結合モチーフが示された（図８）。天然ｏｒｆ３５２６は、潜在的リポタンパク質であり、培養上清中にも分泌される。配列アラインメント研究は、タンパク質が、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａに由来するＡｃｆＤ（補助的なコロニー形成因子）に対して相同性を有するということを示す。天然ｏｒｆ３５２６は、構成的に発現され、２型分泌システム（Ｔ２ＳＳ）によって分泌される。図１０に例示されるように、ｏｒｆ３５２６の７種の変異体／改変体を調製した。
【０２０２】
種々のｏｒｆ３５２６誘導体の亜鉛含量を、原子吸光分光法によって調べた。図１１に例示される結果は、タンパク質分子あたり単一の亜鉛イオンの存在を示唆する。亜鉛結合モチーフを実際に含有する３５２６  Ｂ  ｈｉｓの予期しない低い亜鉛含量は、この末端切断型誘導体のミスフォールディングによって説明できるが、Ｅ１３０５変異体における単一のアミノ酸交換は、亜鉛結合を完全に無効にするのに十分ではないようである（赤色の四角）。
【０２０３】
配列番号８の位置Ｈ１３０４、Ｅ１３０５およびＨ１３０８のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換された（具体的には、Ｈ１３０４Ａ、Ｅ１３０５ＡおよびＨ１３０８Ａ）精製された三重変異体ｏｒｆ３５２６（ＤＧ３５２６ＴＬ）タンパク質を調製した。驚くべきことに、アミノ酸配列  ＨＥＶＧＨからＡＡＶＧＡへ、配列番号８のアミノ酸１３０４、１３０５および１３０８で亜鉛結合モチーフ中に変異を含んでいたＤＧ３５２６ＴＬ三重変異体では、亜鉛親和性はほとんど完全に失われている。
【０２０４】
機能的および構造的特徴づけを可能にするために、可溶性のタグのない組換えタンパク質ＤＧ３５２６ＴＬ（１６４ＫＤａ）を、ＣａｐｔｏＱおよびブチルセファロースクロマトグラフィーによって精製した。ＳＥ−ＨＰＬＣ／ＭＡＬＬＳ解析によって、ＤＧ３５２６ＴＬは、２種のアイソフォーム（図９ａ中のピークＡおよびＢ）および１種の末端切断型（図９ａ中のピークＣ）中に存在するということが示された。アイソフォームは、ブチルセファロースで分離され得る。しかし、グリセロールによる安定化を行わない場合には、ある形態から他のものへの変換が時間をわたって観察された（図９（ａ）および９（ｂ））。したがって、三重変異体アイソフォームは、精製の点でさらに有利である。
【０２０５】
三重変異体ＴＬ３Ｍのアミノ酸配列は以下のとおりである：
【０２０６】
【化３４】
2014531442.tif 000037
【０２０７】
（実施例１３）
抗原組み合わせ
Ｈｉｓタグをつけた抗原をミョウバンと組み合わせ、投与した。防御率を算出した：
【０２０８】
【化３５】
2014531442.tif 000038
【０２０９】
（実施例１４）
抗原組み合わせ
抗原を、ミョウバンと組み合わせ、投与した。ＩＨＥ３０３４（ＮＭＥＣ）または９８５５／９３（ＳＥＰＥＣ）ＥｘＰＥＣ株のいずれかを用いるチャレンジ後の生存および防御率を算出した。
【０２１０】
【化３６】
2014531442.tif 000039
【０２１１】
（実施例１５）
腸のコロニー形成モデルにおける３６２５の防御有効性
０、２１および３５日目に、ミョウバンまたはＭＦ５９とともに３５２６抗原を用い、筋肉内経路によってマウスを免疫化した。４８日目に、ＧＬ５３（ＥＴＥＣ）を用いてマウスにチャレンジし、盲腸における細菌力価を評価した。図１４（ａ）は、アジュバント単独と比較して、３５２６＋ミョウバンを用いる免疫化後または３５２６＋ＭＦ５９を用いる免疫化後に、細菌力価が大幅に低下したことを示す。結果は、マウスが０および２１日目だけで免疫化された実験において確認される（図１４（ｂ））。
【０２１２】
（実施例１６）
腸のコロニー形成モデルにおける抗原組み合わせの防御的有効性
１、２１および３５日目に、ＬＴＫ６３を用いるか、用いない抗原４０５Ｂ、１２３２および３５２６の種々の組み合わせを用いてマウスを免疫化した（図１５）。ＧＬ５３（ＥＴＥＣ）を用いてマウスにチャレンジし、盲腸における細菌力価を評価した。結果は、４０５Ｂ＋３５２６＋ＬＴＫ６３および３５２６＋１２３２＋ＬＴＫ６３が、ＬＴＫ６３単独と比較して、盲腸におけるＧＬ５３による腸のコロニー形成を大幅に低下させることを示す。
【０２１３】
（実施例１７）
３５２６のアイソフォームＡ、ＢおよびＣの防御的有効性
アイソフォームＡ単独、アイソフォームＢ単独またはアイソフォームＡ、ＢおよびＣの組み合わせを用いて、マウスを免疫化した。ＩＨＥ３０３４を用いて、マウスにチャレンジし、細菌力価を評価した。結果は、単独またはアイソフォームＡおよびＣと組み合わせたアイソフォームＢが、最大の防御的有効性を付与することを示す。
【０２１４】
【化３７】
2014531442.tif 000040
【０２１５】
さらなる参考文献
【０２１６】
【化３８】
2014531442.tif 000041
【０２１７】
【化３９】
2014531442.tif 000042
【図３】
2014531442.tif 000043
【図１】
2014531442.tif 000044
【図２】
2014531442.tif 000045
【図４】
2014531442.tif 000046
【図５】
2014531442.tif 000047
【図６】
2014531442.tif 000048
【図７】
2014531442.tif 000049
【図８】
2014531442.tif 000050
【図９】
2014531442.tif 000051
【図１０】
2014531442.tif 000052
【図１１】
2014531442.tif 000053
【図１２】
2014531442.tif 000054
【図１３】
2014531442.tif 000055
【図１４】
2014531442.tif 000056
【図１５】
2014531442.tif 000057
【配列表】
2014531442000001.app
【国際調査報告】
2014531442.tif 000058
2014531442.tif 000059
2014531442.tif 000060
2014531442.tif 000061
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