(57)【要約】本発明は、特にアンチセンス反応においてＬ−ＲＮＡに結合することができ、さらにＬ−ＲＮＡの標的配列の範囲内でＬ−ＲＮＡを任意で切断することができる、Ｌ−ＲＮＡを含む治療用分子の投与に起因する望ましくない生理学的副反応を治療するための医薬組成物を製造するためのＬ−ＤＮＡの使用に関する。あるいはまた、Ｌ−ＤＮＡは、内因性標的ＲＮＡまたはＤＮＡを切断するのに用いることもできる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬組成物を製造するためのＬ−ＤＮＡの使用。
【請求項２】
前記Ｌ−ＤＮＡが、特にアンチセンス反応においてＬ−ＲＮＡまたはＤ−ＲＮＡに結合することができ、さらに前記Ｌ−ＲＮＡまたはＤ−ＲＮＡの標的配列の範囲内で前記Ｌ−ＲＮＡまたはＤ−ＲＮＡを任意で切断することができる請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｌ−ＤＮＡが、特にアンチセンス反応においてＬ−ＲＮＡまたはＤ−ＲＮＡに結合することができ、さらに前記Ｌ−ＲＮＡまたはＤ−ＲＮＡの標的配列の範囲内で前記Ｌ−ＲＮＡまたはＤ−ＲＮＡを任意で切断することができる、前記Ｌ−ＲＮＡまたはＤ−ＲＮＡを含む治療用分子の投与に基づく望ましくない生理学的副反応を治療するための医薬組成物を製造するためのＬ−ＤＮＡの使用。
【請求項４】
Ｌ−ＤＮＡが、特にアンチセンス反応において遺伝子をコード化する内因性標的Ｄ−ＤＮＡまたは標的Ｄ−ＲＮＡに結合することができ、さらに遺伝子をコード化する内因性標的Ｄ−ＤＮＡまたは標的Ｄ−ＲＮＡの標的配列を任意で切断することができる、少なくとも１つの内因性遺伝子の過剰発現を伴う疾患の治療または予防のための医薬組成物を製造するためのＬ−ＤＮＡの使用。
【請求項５】
前記治療用分子が、前記Ｌ−ＲＮＡ、特に二本鎖Ｌ−ＲＮＡ、例えばシュピーゲルマーからなる請求項３に記載の使用。
【請求項６】
前記治療用分子が、前記Ｌ−ＲＮＡと共有結合されたアプタマーまたは前記Ｌ−ＲＮＡと共有結合された抗体を含有する請求項３に記載の使用。
【請求項７】
前記医薬組成物が、少なくとも前記Ｌ−ＲＮＡの投与量に相当する投与量、好ましくは前記Ｌ−ＲＮＡの投与量の２〜１００倍、好ましくは２〜２０倍に相当する投与量で前記Ｌ−ＤＮＡを含有する請求項３、５、または６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記医薬組成物が、さらに、標的配列の範囲内で二本鎖Ｄ−ＲＮＡまたはＬ−ＲＮＡを溶解することができる核酸、特に５〜１００ｍｅｒを含有する請求項３から７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
Ｌ−ＲＮＡまたはＤ−ＲＮＡを含む治療用分子の投与に基づく望ましくない生理学的副反応を治療するための、Ｌ−ＤＮＡを含む医薬組成物。
【請求項１０】
Ｌ−ＤＮＡが、特にアンチセンス反応において遺伝子をコード化する内因性標的Ｄ−ＲＮＡまたは標的Ｄ−ＤＮＡに結合することができ、さらに遺伝子をコード化する内因性標的Ｄ−ＲＮＡまたは標的Ｄ−ＤＮＡの標的配列を任意で切断することができる、少なくとも１つの内因性遺伝子の過剰発現を伴う疾患を治療または予防するためのＬ−ＤＮＡを含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１０または１１に記載の医薬組成物を製造するための方法であって、Ｌ−デオキシリボヌクレオチドからなる配列が生成されて合成され、Ｌ−リボヌクレオチドからなる所定の配列またはＤ−リボヌクレオチドもしくはＤ−デオキシリボヌクレオチドからなる所定の配列に結合することができ、さらに前述の所定の配列を任意で切断することができ、ならびにそのようにして得た前記Ｌ−ＤＮＡが薬理学的に有効な量で投与のために製剤化される方法。
【請求項１２】
前記Ｌ−ＤＮＡが、製剤の補形薬および／または賦形剤と混合される請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−ＤＮＡを含む医薬組成物、医薬組成物を製造するためのＬ−ＤＮＡの使用、およびこのような医薬組成物を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アプタマーは、抗原／抗体反応と同様に任意の１つの標的分子に特異的に結合する、大抵は二本鎖のＤ−核酸である（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．他，Ｎａｔｕｒｅ ３４６：８１８−８２２（１９９０））（非特許文献１）。所定の標的分子に対して特異的なアプタマーは、例えばＳＥＬＥＸ法によって核酸ライブラリーから単離される（Ｔｕｅｒｋ，Ｃ．他，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５−５１０（１９９０））（非特許文献２）。
【０００３】
治療の分野において、アプタマーはとりわけ望ましくない代謝産物に結合し、それによりその代謝産物を抑制するという目的を有する。一例にすぎないが、このような代謝産物として腫瘍遺伝子産物が挙げられる。治療分野でのアプタマーの使用における欠点は、アプタマーが不利な薬物動態を有すること、すなわち例えば内因性ヌクレアーゼによって非常に速く分解されることである。これとは無関係に、アプタマーは、いずれにせよ比較的小さい分子であり、したがって腎臓を通って比較的速やかに排泄される。
【０００４】
シュピーゲルマー（Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）は本質的にはアプタマーであり、しかしＬ−ヌクレオチドから形成されている点が異なる。シュピーゲルマーは一本鎖または二本鎖であることがある。Ｌ−ヌクレオチドの使用により内因性ヌクレアーゼによる分解が妨げられ、それにより薬物動態が大幅に改良され、すなわち血清中での滞留時間が長くなる。したがって、非機能的なシュピーゲルマーが代謝性であり、また２時間にわたって完全に安定であることが、Ｂｏｉｓｇａｒｄ，Ｒ他，Ｅｕｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ３２：４７０−４７７（２００５）（非特許文献３）の文献に記載されている。この文献には、診断分野でのシュピーゲルマーの使用も記載されており、シュピーゲルマーを例えば放射性レポーター物質と結合させる。
【０００５】
所定の標的分子に対して特異的なシュピーゲルマーの同定は、例えば、Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ，Ｓ．他，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：１１１２−１１１５（１９９６）（非特許文献４）に記載されているように行うことができる。シュピーゲルマーおよび治療分野でのその使用可能性については、Ｖａｔｅｒ，Ａ．他，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ ６：２５３−２６１（２００３）（非特許文献５）の文献も参照のこと。
【０００６】
治療分野でのシュピーゲルマーの使用においては、従来、シュピーゲルマーが免疫原性でないことが前提とされていた（Ｗｌｏｔｚｋａ他，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：８８９８−８９０２（２００２））（非特許文献６）。しかしながら、本明細書に挙げる研究は、有機体中のＬ−核酸に絶対に副作用がないとは必ずしも言えないことを示している。したがって、シュピーゲルマーを使用するとき、患者への投与の際に、望ましくない生理学的副反応、例えば内因性ＲＮＡ（調節ＲＮＡを含む）との免疫反応および／または望ましくない酵素反応、または内因性核酸のアンチセンス阻害（ワトソン・クリック反応）の危険も決して無視できない。特に、第１相試験で起きたモノクローナル抗体ＴＧＮ１４１２の治験事故に鑑み、また上述した関係に基づいてシュピーゲルマーの滞留時間が比較的非常に長いという背景があることから、シュピーゲルマーの投与時には使用するシュピーゲルマーに対する解毒剤を用意しておき、望ましくない生理学的副反応が発生した際にはすぐに解毒剤を投与し、それにより血清中の（生物活性）シュピーゲルマー濃度を短時間で下げることができるようにしておくことが望ましい。
【０００７】
他の関係、すなわちリボザイム−触媒立体選択的ディールス・アルダー反応から、Ｌ−リボザイムが知られており、これに関しては、Ｓｅｅｌｉｇ，Ｂ．他，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．，３９：４５７６−４５７９（２０００）（非特許文献７）およびＳｅｅｌｉｇ，Ｂ．他，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１１２：４７６４−４７６８（２０００）（非特許文献８）の文献を参照のこと。
【０００８】
その他に、内因性核酸、例えばｍＲＮＡまたはその他の非コード核酸を阻害する様々な手法が知られている。これには、例えばアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、アプタマーなどが含まれるがこれに限定されない。このような内因性核酸を阻害することにより、代謝過程を制御、抑制、または切り替えることができ、これは例えば腫瘍関連ＲＮＡ分子との関連で、またはその他の医療分野においても重要である。腫瘍関連遺伝子の一例として、例えばＨ１９遺伝子が挙げられる。非腫瘍関連遺伝子の一例として、心不全の関連で重要な役割を果たすホスホランバンコード遺伝子が挙げられる。
【０００９】
ＷＯ２０１０／０８８８９９Ａ２（特許文献１）の文献から、シュピーゲルザイム（Ｓｐｉｅｇｅｌｚｙｍｅ）（解毒剤として）および／または内因性ＲＮＡ分子を切断するためにＬ−リボザイムを使用することが知られている。
【００１０】
Ｌ−ＤＮＡは、それ自体、例えばこのような核酸が分子標識として述べられている文献、Ｇ．Ｈａｙａｓｈｉ他，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ ４９（１）：２６１−２６２（２００５）（非特許文献９）から知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／０８８８９９Ａ２
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．他，Ｎａｔｕｒｅ ３４６：８１８−８２２（１９９０）
【非特許文献２】Ｔｕｅｒｋ，Ｃ．他，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５−５１０（１９９０）
【非特許文献３】Ｂｏｉｓｇａｒｄ，Ｒ他，Ｅｕｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ３２：４７０−４７７（２００５）
【非特許文献４】Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ，Ｓ．他，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：１１１２−１１１５（１９９６）
【非特許文献５】Ｖａｔｅｒ，Ａ．他，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ ６：２５３−２６１（２００３）
【非特許文献６】Ｗｌｏｔｚｋａ他，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：８８９８−８９０２（２００２）
【非特許文献７】Ｓｅｅｌｉｇ，Ｂ．他，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．，３９：４５７６−４５７９（２０００）
【非特許文献８】Ｓｅｅｌｉｇ，Ｂ．他，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１１２：４７６４−４７６８（２０００）
【非特許文献９】Ｇ．Ｈａｙａｓｈｉ他，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ ４９（１）：２６１−２６２（２００５）
【非特許文献１０】Ｌｕ，Ｙ．，他，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：５８０−５８８（２００６）
【非特許文献１１】Ｊｉａｎｇ，Ｄ．，他，ＦＥＢＳ ２７７（１１）：２５４３−２５４９（２０１０）
【非特許文献１２】Ｓｅｅｍａｎ，Ｎ．Ｃ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．１０（６）：１９７１−１９７８（２０１０）
【非特許文献１３】Ｓｉｇｈ，Ｗ．，Ｎａｔｕｒｅ ４７８（７３６８）：２２５−２２８（２０１１）
【非特許文献１４】Ｓｉｇｈ，Ｗ．Ｓｙｎａｐｓｅ ６５（１２）：１２８９−９７（２０１１）
【非特許文献１５】Ｚｈａｏ，Ｗ．他，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（４９）：４９０２０１（２０１１）
【非特許文献１６】Ｈｉｌｔ，Ｊ．Ｚ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ．５６（１１）：１５３３−１５３６（２００４）
【非特許文献１７】Ｌｉｎ，Ｃ，他，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８（８）：１６６３−１６７４（２００７）
【非特許文献１８】Ｚａｂｏｒｏｗｓｋａ，Ｚ．，他，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７７（４３）：４０６１７−４０６２２（２００２）
【非特許文献１９】Ｋｉｍ，Ｋ．，他，Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒｅａｎ Ｃｈｅｍ．Ｓｃｏ．２７（５）：６５７ｆｆ （２００６）
【非特許文献２０】Ｈｅｒｔｅｌ，Ｋ．Ｊ．，他，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０（１２）：３２５２ｆｆ（１９９２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の技術的な課題は、シュピーゲルマーおよび内因性核酸を切断するための改良された手法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この技術的課題を解決するために、本発明は、Ｌ−ＤＮＡが好ましくはＬ−ＲＮＡに結合、特にアンチセンス反応（ワトソン・クリック反応を阻害）することができ、さらにＬ−ＲＮＡの標的配列の範囲内でＬ−ＲＮＡを任意で切断することができる、医薬組成物を製造するためのＬ−ＤＮＡの使用を教示し、さらに詳しくは、特に、Ｌ−ＲＮＡを含む治療用分子の投与に基づいた、望ましくない生理学的副反応、特にＬ−ＲＮＡの内因性ＲＮＡ（調節ＲＮＡを含む）との免疫反応および／または望ましくない酵素反応またはアンチセンス反応を治療するための医薬組成物を製造するためのＬ−ＤＮＡの使用を教示する。さらに、例えばアンチセンス反応において、Ｌ−ＤＮＡが遺伝子をコード化する内因性標的Ｄ−ＤＮＡまたは標的Ｄ−ＲＮＡの標的配列に結合することができ、さらに上記標的配列を任意で切断することができる、少なくとも1つの内因性遺伝子の過剰発現に伴う疾患の治療または予防のための医薬組成物を製造するためのＬ−ＤＮＡの使用を教示する。
【００１５】
まず本発明は、従来の推測とは異なり、シュピーゲルマーに必ずしも副反応がないわけではなく、むしろ自然に有機体中に生じる核酸を切断し、それによって予想不能な副作用が発生する可能性があり得るという認識に基づく。同様に、結合したシュピーゲルマーの酵素反応とは無関係に、望ましくないアンチセンス反応、すなわちシュピーゲルマーと内因性核酸のワトソン・クリック型塩基結合による内因性核酸の阻害の可能性がある。
【００１６】
本発明は、驚くべきことにＬ−ＤＮＡが内因性Ｄ−核酸、つまりＤＮＡもＲＮＡも切断またはこれに結合することができるというさらなる認識に基づく。これは自動的に予測できるものではない。加えて、Ｌ−ＤＮＡは酵素分解に対して特に安定しているので、（大抵は大量の）保護基が分子に結合される必要がなく、これにより、有利な薬物動態特性を有する一方で、細胞への取り込みが促進される。
【００１７】
Ｌ−ＲＮＡと比べてのＬ−ＤＮＡの意外な利点は、細胞内においてＬ−ＲＮＡよりもＬ−ＤＮＡの活性が高いことであり、これについては実施例を参照のこと。
【００１８】
本発明は、この認識に基づき、投与されるシュピーゲルマーを特異的に切断、または抑制してこれに結合し、それにより特に望ましくない副反応に関してシュピーゲルマーの生理学的作用をなくすＬ−ＤＮＡ、つまりＬ−ＤＮＡザイムを利用できるようにするという技術的な教示を基礎とする。シュピーゲルマーの例としては以下のものがある：シュピーゲルマー、ＮＯＸＣ８９、ＮＯＸＡ４２、ＮＯＸＡ５０、ＮＯＸＢ１１、ＮＯＸＡ１２、ＮＯＸＥ３６、ＮＯＸＦ３７（すべてＮＯＸＸＯＮ ＡＧ）、シュピーゲルマー（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏ．）、ＮＵ１７２（ＡＲＣＡ ｂｉｏｐｈａｒｍ Ｉｎｃ．）、ＡＲＣＨＥＭＩＸ、ＡＲＣ１９０５、ＡＲＣ１７７９、ＡＲＣ１８３、ＡＲＣ１８４、Ｅ１００３０、ＮＵ１７２、ＲＥＧ２、ＲＥＧ１（すべてＡｒｃｈｅｍｉｘ Ｃｏｒｐ．）、ＡＳ１４１１、ＡＳ１４０５（ともにＡｎｔｉｓｏｍａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌｔｄ．）、ＤｓｉＲＮＡ（Ｄｉｃｅｒｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、ＲＮＡアプタマーＢＥＸＣＯＲＥ（ＢｅｘＣｏｒｅ Ｉｎｃ．）、ＥＬＡＮ（Ｅｌａｎ Ｃｏｒｐ Ｐｌｃ．）、またはＭａｃｕｇｅｎ。したがって、シュピーゲルマーの投与時に望ましくない副反応を観察する過程でこのようなＬ−ＤＮＡを投与することにより、望ましくない副反応の原因を代謝から迅速に、効果的に、高い選択性で取り除くことができ、しかもまたさらに、Ｌ−ＤＮＡ投与の副作用の危険が非常に低い。副作用の危険が低いのは、Ｌ−ＤＮＡがＬ−デオキシリボヌクレオチドで構成されていることに基づくだけでなく、さらに、Ｌ−ＤＮＡの高い選択性、すなわちシュピーゲルマーの標的配列に対する高い選択性に基づくものでもある。その結果、治療分野で使用されるシュピーゲルマーに対する有効性と選択性がともに高い解毒剤が得られ、シュピーゲルマーの望ましくない副反応に対して効果的に、迅速に、副作用なしに対処することができる。
【００１９】
基本的には、アプタマーを含め、Ｄ−ヌクレオチドまたはＬ−ヌクレオチドのいずれから構成されたものであれ、各ＲＮＡ分子に対して特異的なＬ−ＤＮＡを形成することができ、このＬ−ＤＮＡはＲＮＡ分子の標的配列を切断することでＲＮＡを切断するか（リボザイムとしての作用）、または抑制してこれに結合する（アンチセンス反応）。つまり、このようなＬ−ＤＮＡの重要な特性は、標的配列への配列特異的結合である。しかしこれはまた、各任意の標的配列について、例えば切断箇所を含むＬ−ＤＮＡの部分配列が標的配列とハイブリダイゼーションすることによって、Ｌ−ＤＮＡの部分配列を生成することができることを意味する。したがって、本発明の範囲において、特定の標的配列に関して特定のＬ−ＤＮＡ部分配列のみの構造を示すことは妥当でない。したがって、実施例に示す標的配列およびＬ−ＤＮＡ部分配列は例にすぎず、当業者は、シュピーゲルマーの各所定の標的配列に関して適切な、すなわちハイブリダイゼーションするＬ−ＤＮＡ部分配列を容易に決定し、Ｌ−ＤＮＡ部分配列に関する情報に基づいて、当技術分野で一般的な手段を用いてＬ−ＤＮＡを合成することができる。
【００２０】
基本的には、治療用分子がシュピーゲルマーであるか、またはＬ−ＲＮＡがアプタマーと共有結合していてよい。しかし、治療用分子は、（例えばアプタマーの他に）Ｌ−ＤＮＡを含むか、またはＬ−ＤＮＡで構成されていてもよい。シュピーゲルマー／アプタマーの組合せは、例えばアプタマーがヌクレアーゼに対して安定化している場合に可能である。ここで、治療分野での本発明の利点は、Ｌ−ＲＮＡまたはＬ−ＤＮＡを切断することによってヌクレアーゼに対するアプタマーが得られることであり、またこれにより最終的に、副作用を引き起こす可能性のあるアプタマーも血清から比較的短時間で除去することができる。
【００２１】
しかしまた、Ｌ−ＤＮＡをアプタマー、抗体またはペプチドもしくはタンパク質と共有結合させることも可能である。この場合、例えば、アプタマーまたは抗体と細胞表面との相互作用によりＬ−ＤＮＡとアプタマーまたは抗体からなる構造全体が細胞内に導入されるようにアプタマーまたは抗体を選択することができる。
【００２２】
適切なＬ−ＤＮＡは、基質配列における保存切断箇所に合わせること、および、図１、特に図１ａに示すように、保存ヌクレオチド自体を含むことができる。この具体的な例については、同じく図１ｃに示す。
【００２３】
この医薬組成物は、少なくともＬ−ＲＮＡの投与量に相当する投与量、好ましくは分子数またはモルに関してＬ−ＲＮＡの投与量の２〜１０倍に相当する投与量でＬ−ＤＮＡを含有する。除去すべきＬ−ＲＮＡすべてを反応により確実に排除するために、Ｌ−ＲＮＡの投与量と比べて過剰投与が推奨される。ここで、本発明に従って定められる絶対投与量は、提示される相対量比で、所定のＬ−ＲＮＡ投与量に厳密に合わせられ、したがってＬ−ＲＮＡの所定の投与量を知っていれば当業者が容易に決定して調節することができる。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、医薬組成物が、さらに、二本鎖Ｌ−ＲＮＡをその標的配列の範囲内で溶解することができる核酸、特に５〜１００−ｍｅｒ、好ましくは５〜２５−ｍｅｒを含有する。これは、標的配列に隣接する部分配列とハイブリダイゼーションする配列である。それにより、Ｌ−ＲＮＡの三次構造に基づき、通常は空間配置上の理由から到達することができないＬ−ＲＮＡの切断領域にＬ−ＤＮＡが到達することができるようになる。これに加えさらに、隣接するその他の配列との相応する二重項または三重項ではなく、希望の切断箇所を極めて特異的に切断することができる。
【００２５】
さらに本発明は、Ｌ−ＲＮＡを含む治療用分子の投与に起因する望ましくない生理学的副反応、特に免疫反応を治療するための、Ｌ−ＤＮＡを含む医薬組成物に関する。
【００２６】
しかし、本発明によるＬ−ＤＮＡは、本発明に従って（内因性または外因性の、例えば感染の過程でウイルス源または細菌源に由来する）核酸の切断にも、基本的にＲＮＡであるがＤＮＡにおいても用いることができ、または内因性核酸におけるアンチセンス反応によるこの核酸の阻害にも用いることができる。ＤＮＡの切断に関して、補足的に、Ｌｕ，Ｙ．，他，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：５８０−５８８（２００６）（非特許文献１０）、またはＪｉａｎｇ，Ｄ．，他，ＦＥＢＳ ２７７（１１）：２５４３−２５４９（２０１０）（非特許文献１１）の文献を参照のこと。特にこれにより、特定のＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはそれによりコード化された発現産物の過剰発現に伴う疾患を治療することができる。したがって、Ｌ−ＤＮＡはこの発現産物に関して、すなわちそれに関するコード化ＲＮＡもしくはＤＮＡの切断により、またはこれのアンチセンス結合により発現を阻止するもしくは減少させることによって、阻害剤として機能する。このとき、特定の（つまり切断または結合されるべきＲＮＡまたはＤＮＡの）標的配列は、任意の標的を抑制することができるという点で、本発明の範囲において重要ではない。ただ、Ｌ−ＤＮＡまたはその配列を、選択した切断箇所の領域において、上述した方法で標的配列の配列に合わせる必要がある。これにより、治療すべき疾患が原因として当該標的配列に関係している場合には、基本的に任意の適応症を見つけることができる。以下に例を挙げるが、これは本発明の実施形態を単に示すものであり、決してその適用性を限定するものではない。
【００２７】
この医薬組成物に関して、前述および後述の実施形態すべてが同様に当てはまる。
【００２８】
最後に、本発明は、このような医薬組成物を製造するための方法であって、Ｌ−デオキシリボヌクレオチドからなる配列が生成されて合成され、その配列が、Ｌ−リボヌクレオチドからなる所定の配列またはＤ−リボヌクレオチドもしくはＤ−デオキシリボヌクレオチドからなる所定の配列に結合、特にアンチセンス反応すること、および前記の配列を任意で切断することができ、このようにして得られたＬ−ＤＮＡが薬理学的に有効な量で投与のために製剤化される。このとき、Ｌ−ＤＮＡは、典型的には調剤の補形薬および／または賦形剤と混合される。製剤化の過程で、（Ｌ−ＤＮＡの）エンドサイトーシスを促進する当技術分野で一般的な物質を、Ｌ−ＤＮＡと共有結合させるか、または組成物に別途添加することが可能である。
【００２９】
基本的には、１つまたは複数の生理学的に許容される補形薬および／または賦形剤をＬ−ＤＮＡと混合し、混合物は、調剤として、局所または全身投与、特に経口投与、非経口投与、標的臓器への点滴もしくは注入、注射（例えば、静脈内、筋肉内、嚢内、または腰椎内）、歯周ポケット（歯根と歯肉の間の空間）への投与および／または吸入のために製剤化することができる。添加剤および／または補形薬は、選択される投与形態に応じて選択する。このとき、本発明に従った医薬組成物の調剤製剤化は、当技術分野で一般的な方法で行うことができる。
【００３０】
イオン結合のための対イオンとして、例えばＭｇ＋＋、Ｐｂ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｃａ＋＋、ＣａＣｌ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋もしくはシクロヘキシルアンモニウム、またはＣｌ−、Ｂｒ−、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、プトレシン、カダベリン、スペルミジン、スペルミンなどがある。適切な固形または液体の調剤の調合形態には、例えば、顆粒、粉末、糖衣錠、錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、ジュース、懸濁液、乳剤、滴剤、または注射溶液（静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下）、または霧状（エアロゾル）、乾燥粉末吸入用の調剤、経皮システム、および徐放性製剤があり、その製造においては、一般的な補形薬、例えば賦形剤、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨張剤、滑沢剤、潤滑剤、調味料、甘味料、溶解補助剤が使用される。また、例えば吸入剤として製剤化するために、有効成分を、好ましくは生分解性ナノカプセルとしてカプセル化するか、または多孔性ナノ粒子の孔に生分解可能に、もしくは安定的に入れ込むこともできる。しかしまた、例えばシュピーゲルザイムおよびシュピーゲルマーまたはアプタマーの細胞標的のために、Ｄ−核酸およびＬ−核酸から成るナノ粒子を用いることもできる。（Ｓｅｅｍａｎ，Ｎ．Ｃ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．１０（６）：１９７１−１９７８（２０１０）；Ｓｉｇｈ，Ｗ．，Ｎａｔｕｒｅ ４７８（７３６８）：２２５−２２８（２０１１）；Ｓｉｇｈ，Ｗ．Ｓｙｎａｐｓｅ ６５（１２）：１２８９−９７（２０１１）；Ｚｈａｏ，Ｗ．他，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（４９）：４９０２０１（２０１１）；Ｈｉｌｔ，Ｊ．Ｚ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ．５６（１１）：１５３３−１５３６（２００４）；Ｌｉｎ，Ｃ，他，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８（８）：１６６３−１６７４（２００７））。補形薬としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、重炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよびその他の糖、シクロデキストリン、タルク、乳タンパク質、ゼラチン、澱粉、セルロースおよびその誘導体、肝油、ヒマワリ油、落花生油、またはゴマ油などの動物油および植物油、ポリエチレングリコールおよび滅菌水などの溶剤、および１価または２価アルコール、例えばグリセリンが挙げられる。本発明に従った医薬組成物は、本発明に従って使用される少なくとも１つの物質の組合せを、既定の投与量で、薬剤的に適切であり生理学的に許容される賦形剤と、および場合によってはさらに既定の投与量の適切な有効成分、添加剤、または補形薬と混合し、望ましい剤形にすることによって製造可能である。希釈剤としては、ポリグリコール、水、ジメチルスルホキシド（例えば皮膚疾患またはリウマチの治療用製剤）および緩衝液が挙げられる。適切な緩衝物質は、例えばＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、Ｎ−ベンジルフェンエチルアミン、ジエチルアミン、リン酸塩、重炭酸ナトリウム、または炭酸ナトリウムである。しかしまた、希釈剤なしで製造することも可能である。生理学的に許容される���は、例えば乳酸、塩酸、硫酸、酢酸、クエン酸、ｐ−トルオールスルホン酸などの無機酸もしくは有機酸の塩、または例えばＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）２、ジエタノールアミン、エチレンジアミンなどの無機塩基もしくは有機塩基の塩、またはアルギニン、リジン、グルタミン酸などのアミノ酸の塩、またはＣａＣｌ２、ＮａＣｌなどの無機塩もしくは例えばＣａ２＋、Ｎａ＋、Ｐｂ＋＋、Ｃｌ−、ＳＯ４２−などのその遊離イオンの塩、またはそれらに相当する塩およびＭｇ＋＋もしくはＭｎ＋＋の遊離イオン、またはこれらの組合せである。これらは標準的な方法に従って製造される。好ましくは、ｐＨ値が５〜９の範囲、特に６〜８の範囲に調整される。
【００３１】
Ｌ−ＤＮＡが遺伝子をコード化する内因性標的Ｄ−ＲＮＡまたは標的Ｄ−ＤＮＡの標的配列に結合、特にアンチセンス反応することができ、さらに上記標的配列を任意で切断することができる、少なくとも1つの内因性遺伝子の過剰発現に伴う疾患の治療または予防のための医薬組成物を製造するためのＬ−ＤＮＡの使用を含む、すでに前述した本発明の変形形態は、独自の意義をもつ。該当するウイルスまたは細菌の標的配列に結合するようにＬ−ＤＮＡを調整すれば、ウイルスまたは細菌感染の治療または予防が可能である。それ以外は、上記の実施形態が同様に当てはまる。これに関係して、Ｌ−ＤＮＡが微生物の遺伝子をコード化する標的Ｄ−ＲＮＡまたは標的Ｄ−ＤＮＡの標的配列を切断（または特にアンチセンス反応でこれに結合）することができる、哺乳動物の微生物感染を伴う疾患の治療または予防のための医薬組成物を製造するためのＬ−ＤＮＡの使用を含む本発明の上述の態様のさらなる変形形態が重要である。対象となる微生物として、とりわけウイルス、細菌、および菌類を挙げることができる。基本的にＬ−ＤＮＡは、少なくとも一部が既知の遺伝子配列を有する任意の微生物の核酸に結合またはこれを切断するために使用することができ、このとき、例えば微生物の活性および／またはその複製能力を弱化または抑制、および／または細胞表面への結合を弱化または抑制する切断を目的として、遺伝子配列の領域を選択する。
【００３２】
この変形形態では、Ｄ−ＲＮＡ、特にｍＲＮＡもしくは調節ＲＮＡ、限定しない例としては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなどとのアンチセンス反応による阻害、またはこれらの切断にも、またさらにＤ−ＤＮＡの切断またはこれとの結合にもＬ−ＤＮＡを使用できることが活用される。これによって、遺伝子もしくはそれによりコード化されたタンパク質またはコードＲＮＡもしくは非コードＲＮＡを抑制することができる。これは、罹患していない有機体の発現を伴う場合と比べて、特定の遺伝子の過剰発現を伴うすべての疾患に関して治療上有用である。
【００３３】
この変形形態は、一方では、標的配列の切断またはそれとの結合が非常に高い特異性で行われ、したがってまた調節系とのそれ以外の干渉が生じないという利点を有する。さらに、例えばｓｉＲＮＡなど阻害Ｄ−核酸の使用に伴う副作用が確実に回避される。Ｌ−ＲＮＡリボザイムおよびＬ−ＤＮＡザイムは、ｓｉＲＮＡ（危険因子など）とは異なり、望ましくない副反応を大幅に減少させるヘルパー分子を必要としない。
【００３４】
最終的に、２つのＬ−ＤＮＡまたはＬ−ＤＮＡザイムを組み合わせて使用することができ、このとき、この配列は二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡも切断することができるという条件で選択される。
【００３５】
本発明に従った、医薬組成物を製造するためのＬ−ＤＮＡの使用において、さらなる変形形態が可能である。
【００３６】
まず第一に、Ｌ−ＤＮＡは別の１つの核酸への結合だけでなく、基本的にＤ−核酸から成るアプタマーの既知の使用分野に類似して使用することができる。これは、本発明に従ったＬ−ＤＮＡを用いて、原則的に有機体中でどの標的分子にも結合し、またそれによってこれを抑制できることを意味している。当業者には既知のアプタマーの技術すべてが、相応にＬ−ＤＮＡアプタマーに転用できる。
【００３７】
所定の標的に結合しているＬ−ＤＮＡは、以下の方法で入手することができる。選択した標的分子は、スクリーニングアッセイの固定した相（または固相、例えば電磁ビーズも）に結合される。スクリーニングアッセイには、不動相の他に、不動相と接触しているか、または不動相と接触する移動相（大抵は液中の核酸および標的分子が安定して結合可能である水溶液）を含む。移動相はＬ−ＤＮＡライブラリー、すなわちポリヌクレオチドを含み、一般に長さが１０〜５００ヌクレオチドで、その配列は多様で、通常は無作為化されている。このようなＬ−ＤＮＡライブラリーは、Ｄ−ＤＮＡライブラリーの生成から知られている一般的な合成法を用いて製造することができる。接触により、このようなＬ−ＤＮＡ分子が標的分子に結合し、その配列に基づいて、標的分子と安定したファンデルワールス結合することが可能である。このとき結合力は、一般に１００ｎｍｏｌ未満、より望ましくは１００ｐｍｏｌ未満、またしばしば１ｐｍｏｌ未満の値の解離定数にさえなる。これに続いて、例えば１つまたは複数の洗浄手順を用いて、（核酸が結合していない、または核酸の結合が弱い）移動相を不動相から分離する。この後で、標的分子に結合したＬ−ＤＮＡ分子を含む不動相をＤ−ＤＮＡライブラリーと接触させる。標的分子に結合したＬ−ＤＮＡとハイブリダイゼーションするＤ−ＤＮＡがＬ−ＤＮＡに結合し、これにより、標的分子／Ｌ−ＤＮＡ／Ｄ−ＤＮＡの複合体が生じる。結合していないＤ−ＤＮＡは移動相とともに再び除去される。その後で、このようにして得た複合体から、再び当技術分野で一般的な方法でＤ−ＤＮＡを溶出、すなわち移動相に移動する。このようにして得たＤ−ＤＮＡ分子は、この段階で、必要に応じて（例えばＰＣＲを用いて）増幅させ、いずれにせよ配列を決定することができる。そうすると、このようにして得たＤ−ＤＮＡの配列から相補的Ｌ−ＤＮＡを確認し、合成することができる。あるいは、Ｌ−ＤＮＡを標的分子から溶出し、本明細書の別の箇所に記載した塩基配列決定方法で配列を決定することができる。この段落で述べる方法は、基本的に不動相なしでも実行することができ、その場合、標的分子は不動相の代わりにマーカー分子に結合する。標的／結合Ｌ−ＤＮＡの複合体からの、結合していないＬ−ＤＮＡの分離は、一般的な方法を用いて、マーカー分子との結合およびこのマーカー分子を持たない分子の分離によって行う。それ以外の点で、この代替方法は、上述の記載とまったく同じように機能する。
【００３８】
その結果、標的分子と高親和性で結合するＬ−ＤＮＡ分子種またはこのような種の混合物が得られる。これはさらに、本発明に従った医薬組成物の範囲内で、任意の適応をもって使用することができる。その場合適応は、どの標的分子が疾患と因果関係があると認識されており、その疾患の治療または予防のためにそれを抑制する必要があるかに依存する。
【００３９】
相応する方法で、標的と結合しているＬ−ＲＮＡを単離または決定することもできる。この場合、Ｌ−ＤＮＡライブラリーの箇所でＬ−ＲＮＡライブラリーを使用する。
【００４０】
さらなる代替方法において、（任意の）標的、例えば標的分子、ウイルス、細菌、菌類またはその他の細胞（またはその断片）に結合するＬ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡを単離または決定および製造することができる。これについてＬ−核酸ライブラリーを用意し、このとき、核酸に任意で結合分子またはマーカー分子が、例えば５’末端にビオチンが結合している。標的分子は固相、例えば電磁ビーズに結合する。そうすると、固相は核酸ライブラリーと接触する。このとき、先のＬ−核酸は標的分子に結合し、高い結合親和性を示す。固相には、１つまたは複数の洗浄手順を実施し、結合していないＬ−核酸を除去する。それからＬ−核酸を再び溶出することで、当技術分野で一般的な方法で標的分子から分離する。そうして最終的に、本明細書の別の箇所に記載するように、そうして得たＬ−核酸の塩基配列を決定する。
【００４１】
Ｌ−ＤＮＡは、本発明に従った使用の範囲内で、Ｌ−ＤＮＡの潜在的副作用を試験するためにも用いることができる。このような試験方法においては、有効成分候補として選択されているＬ−ＤＮＡ（または同一のＬ−ＤＮＡ分子の大部分）を、例えば治療すべき有機体の細胞抽出物と接触させ、一般的な手段で、その細胞抽出物において標的分子のみがＬ−ＤＮＡと結合するか、または他の分子とも結合するかどうかを判定する。標的分子のみと結合する場合、その有効成分候補は、標的分子以外の細胞成分と結合したりこれを抑制したりしないという意味において、高い確率で副作用がないであろう。他の分子とも結合する場合には、副作用が予想されるであろう。
【００４２】
Ｌ−核酸の塩基配列決定は、本発明のその他の態様とは無関係に、さまざまな方法で実施することができる。Ｌ−ＲＮＡまたはＬ−ＤＮＡの塩基配列を決定する最初の方法では、Ｌ−核酸は固相に結合する。これは例えば（上述のように）核酸が結合分子またはビオチンなどのマーカー分子を含むことによって実行できる。その場合、固相が、結合分子に対して相補的であり、かつこれを結合する分子、例えばアビジンまたはストレプトアビジンを有する。このように固相に結合したＬ−核酸は、その後、Ｄ−ＤＮＡライブラリーと接触させる。このとき、ライブラリーのこのようなＤ−ＤＮＡ分子は、相補的配列を有するか、または相補的配列から成るＬ−核酸とハイブリダイゼーションする。それから、固相を１つまたは複数の洗浄手順で洗浄し、結合していないＤ−ＤＮＡを除去する。次いで、Ｌ−核酸から結合したＤ−ＤＮＡを分離する。それに続いて、例えばＰＣＲを用いて増幅を行うことができる。次いで、Ｄ−ＤＮＡの配列を決定する。そうして得たＤ−ＤＮＡ配列から、Ｌ−核酸の相補的配列を決定することができる。
【００４３】
あるいは、Ｌ−核酸、特にＬ−ＲＮＡは、塩基配列決定方法で、次のように配列を決定することができる。このとき、末端、例えば（上述のように）５’末端の核酸が、結合分子またはマーカー分子、例えばビオチンと結合している。その後、核酸は「はしご」状に分離される。すなわち、加水分解方式でさまざまな長さ、理想的には１塩基から核酸の完全な塩基数までの核酸断片を得る。Ｌ−ＲＮＡの場合、これはｐＨが一般に＞８、大抵の場合８．５〜１０のアルカリで行うことができる。これには、ＫＯＨまたは炭酸水素ナトリウムを含む市販の加水分解緩衝溶液を使用することができる。そうして得た、なおも結合分子を有する断片は、その後で固相に結合する。この固相は、さらに結合分子に対して相補的であり、かつこれを結合する分子、例えばアビジンまたはストレプトアビジンを有する。それから、固相を１つまたは複数の洗浄手順で洗浄し、結合分子を有していない核酸断片を除去する。その結果、マーキングした核酸断片の「はしご」が残る。これはその後、固相から溶出して質量分析を行い、それから検出された質量とその分布に基づいてＬ−核酸の元の配列を確認することができる。Ｌ−ＤＮＡの場合、相応の方法を用いるが、このとき、「はしご」はｐＨ＜６、より望ましくは＜５の酸加水分解によって得られる。
【００４４】
Ｌ−ＤＮＡまたはシュピーゲルザイムは、到達可能なｍＲＮＡ配列を決定するためにも用いることができる。というのも、このようなｍＲＮＡ配列の決定は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、またシュピーゲルザイムについても、コンピューター技術を用いた二次構造予測が非常に不確実であるため、極めて難しいからである。まず、ＲＮＡ分子が三次元的に折りたたまれる規則についてはほとんどわかっていないため、コンピュータープログラムが不十分ということがある。さらに、細胞中のｍＲＮＡは、溶液中で遊離しているときとは違った構造で折りたたまれているという前提に立つことができる。そのため、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡおよびシュピーゲルザイムの使用を最適化する必要が大いにある。これは、例えば、原核生物または真核生物のｉｎ ｖｉｔｒｏ系（例えばＲｉＮＡ ＧｍｂＨ（ドイツ）で入手可能）において特定（所定）のｍＲＮＡが翻訳され、さまざまなシュピーゲルザイム（有効成分候補）を用いてタンパク質合成を試験するという、ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質生合成で確認することができよう。先行技術の分子バサミ、例えばリボザイム、ｓｉＲＮＡなどは、安定性の理由から、またはこれらのハサミにはヘルパー分子が必要とされるという事情から、適していない。
【００４５】
ここに述べる関連や説明する独自の発明とは無関係に、Ｌ−ＤＮＡは製剤目的でなくても用いることができる。適用範囲は、人の安全および／または認証および／または識別を目的としてＬ−ＤＮＡで物または人にマーキングすることである。この場合、Ｌ−ＤＮＡを物または人に塗布し、その存在および／またはその配列を適切な方法で調べる。
【００４６】
物としては、原則的に、それが本物であることを調べる必要のあるすべての物が対象となり、それに盗難防止目的でマーキングする必要があるか、または所有者への帰属を示すことが望ましい物である。第一のグループには、例えば旅券、身分証明書、運転免許証、自動車の登録証明書、ビザ、その他の身元確認書および／または、アクセスカード、会員証、紙幣、チケット、収入印紙、郵便切手、クレジットカードなどのアクセス文書、または粘着ラベル（例えば製品安全用）など、いわゆる保安文書および／または有価証券がある。第二のグループには、例えば装飾品、時計、その他の貴重品、技術的装置、車両など、物的価値があり盗難を防ぐ必要のある物がある。Ｌ−ＤＮＡを使用することで、すなわち、ある物に、その物のためにその物だけに特徴的な配列を有するＬ−ＤＮＡでマーキングすることによって、その物を個別化することも可能である。人または所有者にこのような配列を割り当てると、物に塗布したＬ−ＤＮＡの配列を決定することによって、その物を人または所有者に帰属させることもできる。医薬製品またはその包装または博物館の展示品またはこのようなもののマーキングも好ましい適用分野である。
【００４７】
人のマーキングは、例えば襲撃の場合に望ましいかもしれない。その場合、襲撃を受けた人が、襲撃者に例えばＬ−ＤＮＡ含有スプレーを噴射し、それによって襲撃者または襲撃者の衣服に付着したＬ−ＤＮＡを証拠として人物を特定することができる。また、自動噴霧装置を、例えば権限のない空間に立ち入った人またはそうした空間から出た人にマーキングするために設計することもできる。この場合、警報装置の警報状態にある警報装置のセンサーが噴霧装置の噴霧範囲内に人の存在を検出するとすぐに、警報装置と接続された噴霧装置を作動させる。そうすると、噴霧装置に入っている、同様にＬ−ＤＮＡを含有する溶液がその人に噴霧され、前述のように特定することができる。
【００４８】
このような目的のためのＤ−核酸の使用は知られてはいるものの、権限のない人によって、例えばヌクレアーゼで分解される可能性があるという欠点がある。これは特に、物を盗難から守る必要がある場合、または人にマーキングしてある場合には、ヌクレアーゼを用いることでマーキングが破壊して取り除かれるので、妨げとなる。さらに、Ｌ−核酸は（Ｄ−核酸とは異なり）人間のゲノムに組み込まれ得ないないため、Ｌ−核酸の使用には、疾患が誘発、特に腫瘍が発生する可能性の危険がないという大きな長所がある。
【００４９】
ここに述べる本発明は、その限りにおいて、物または人をマーキングする方法であって、物または人またはその衣服にＬ−ＤＮＡが付与され、Ｌ−ＤＮＡがこの物の上もしくは中、人またはその衣服に固着する方法に関する。本発明はさらに、その上もしくは中に固着したＬ−ＤＮＡを有する物に関する。本発明はさらに、物または人を特定する方法であって、Ｌ−ＤＮＡの存在について物または人またはその衣服を分析する、さらに任意でその塩基配列決定を行う方法に関する。
【００５０】
ここで、マーキングの概念は、それ以前にその物または人になかった特徴をこの物または人に付けることによる、ある物または人の特徴付けを表す。いかなる場合にも、この特徴は、所定の構造を有し、かつ物または人への（意図的な）マーキング以外の状況で生じ得ない特徴である。
【００５１】
固着は、Ｄ−核酸を用いたマーキングとの関連で既知の技術すべてを用いて行うことができる。最も簡単な場合には、Ｌ−ＤＮＡを含有する溶液、特に水溶液を物または人またはその衣服に塗布し、乾かす。しかし、追加的に溶解または分散させた結合剤を含む調合剤にＬ−ＤＮＡが含まれているのが好ましい。基本調合剤としては、基本的にまだ硬化していない液状またはペースト状のラッカー結合調合剤、接着調合剤またはこのようなものすべてが、そのｐＨが９より小さく、より望ましくは８より小さい場合には、適している。溶剤としては、水の他にラッカー技術または接着技術において一般的なあらゆる溶剤も考慮される。これは使用可能な結合剤および当技術分野で一般的な添加剤にも当てはまる。この調合剤は、マーキングされるべき物またはマーキングされるべき人に塗布される。塗布されるべき溶液または調合剤は、１ｍｌ当たり、好ましくはＬ−ＤＮＡ分子を１または１０＾１から１０＾１６の間、例えば１０＾３から１０＾１２の間、特に１０＾３から１０＾９の間含む。好ましくはＬ−ＤＮＡ分子の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも５０％が同一のヌクレオチド配列を有する。
【００５２】
本発明の好ましい変形形態は、Ｌ−ＤＮＡが５’または３’末端に共有結合した光輝性レポーター分子群を有しており、これがさらに好ましくは、紫外線放射による刺激に基づいて発光、特に蛍光が行われるという条件で選択されている。レポーター分子群としては、生化学分野で一般的なあらゆる光輝性分子群を使用することができる。本発明に従ってマーキングされた物またはマーキングされた人に紫外線を当てると、紫外線によって刺激された発光により、マーキングが目で見てわかるか、または器具で確認できる。Ｌ−ＤＮＡは、対置する末端に共有結合したマーカー群、例えばビオチンを有していてもよい。そうすると、Ｌ−ＤＮＡを含むマーキングを検出した後に、上述した方法の１つに従って、これの分離および塩基配列決定を行うことができる。その後、この配列とともに、必要に応じて測定された配列で登録された人または事業部門への帰属を行うことができる。
【００５３】
Ｌ−ＤＮＡは、本発明のさらなる形態において、少なくとも１つの不変配列ブロックおよび／または１つの可変配列ブロックを有することができる。その場合、この不変配列ブロックはＬ−ＤＮＡを含むマーキングのグループのすべてまたは少なくとも１つについて同じである、すなわちすべてのマーキングが、配列ブロックの配列を持つ部分配列を含む。そしてこの可変配列ブロックは個別化されていてよい。これは、例えば紫外線の照射による証明が、さらに前述の配列ブロックを持つＬ−ＤＮＡの存在に依存することになっている場合、目的に適っている。これにより、本発明に従ったＬ−ＤＮＡの存在とは無関係に、任意の発光物質から生じ得る照明効果と区別される。
【００５４】
このさらなる形態において、本発明に従って用いられたＬ−ＤＮＡが分子指標の構造を有する場合、さらに有利である。これはヘアピン構造またはステムループ構造を有する一本鎖の核酸であり、ステムを形成している末端が、一方に発光分子を、そしてその向かい側にクエンチャー、例えばＤａｂｃｙｌを有している。末端の少なくとも１つは（一般に５〜２０塩基対の長さの）不変配列（配列ブロック）である。Ｌ−ＤＮＡをハイブリダイゼーションしていない状態では、蛍光は蛍光共鳴エネルギー移動によってクエンチャー上に抑制され、紫外線で照射しても照明効果が見られない。その場合、Ｌ−ＲＮＡの証明は、マーキングされた領域に、まずこのＬ−ＤＮＡの不変配列ブロックに相補的な核酸、特にＬ−ＤＮＡの溶液を噴霧することによって行う。これが不変配列ブロックとハイブリダイゼーションし、それにより発光分子とクエンチャーが互いに離れる。ここでマーキングを紫外線で照射すると、蛍光を観察または器具で確認することができる。その後、可変配列ブロックがある場合には、その溶出および塩基配列決定は上述した通りに行う。
【００５５】
上述の好ましい実施形態の変形形態において、マーキングのＬ−ＤＮＡは一本鎖として存在するのではなく、（より長い）一本鎖の末端（末端については、常に３または５’のいずれかを意味する）に発光分子を有している。この末端は、所定数の塩基の不変配列ブロックを形成している。これに相補的Ｌ−ＤＮＡがハイブリダイゼーションするが、このＬ−ＤＮＡの末端にはクエンチャーを、しかも、発光を抑制するためにクエンチャーが発光分子に十分近いところに配置されているという条件で有している。この相補的Ｌ−ＤＮＡの長さは、不変配列ブロックの長さより、少なくとも２、より望ましくは少なくとも５塩基短い。ここで、Ｌ−ＤＮＡを含有する溶液が、不変配列ブロックに相補的で、その長さがクエンチャーを有するＬ−ＤＮＡより少なくとも２、より望ましくは少なくとも５塩基長い場合、これがクエンチャーを有するＬ−ＤＮＡを排除し、不変配列ブロックとハイブリダイゼーションする。紫外線を照射すると、発光分子が光り、マーキングが目に見えるか、または器具で確認できる。それに続いて、上述のように、可変配列があればそれを確認するために、再び溶出および配列決定することができる。
【００５６】
したがって、本発明はデータバンクを含む登録システムも含み、このデータバンクにはさまざまなＬ−ＤＮＡマーキングの可変配列ブロックが登録され、人、会社、または官公庁に割り当てられている。この登録システムを用いれば、マーキングから確認できる可変配列ブロックを容易に割り当てられている官公庁、博物館、会社または人に割り振ることができる。
【００５７】
基本的に上述のＬ−ＤＮＡの使用は、Ｌ−ＲＮＡを用いた場合と同様に容易に実施できることがわかる。
【００５８】
以下、図面および実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、本発明に従った、Ｌ−ＤＮＡ（ａ）およびハンマーヘッド型リボザイム（ｂ）の一般的な構造であり、それぞれ記載された標的配列特異性および保存構造要素を有し、ならびに緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（ｂ）の同じ標的配列への結合後の具体的なＬ−ＤＮＡ（ｃ）および具体的なハンマーヘッド型リボザイム（ｄ）の結合の比較、二次構造のを示す図である（Ｚａｂｏｒｏｗｓｋａ，Ｚ．，他，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７７（４３）：４０６１７−４０６２２（２００２）（非特許文献１８）、Ｋｉｍ，Ｋ．，他，Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒｅａｎ Ｃｈｅｍ．Ｓｃｏ．２７（５）：６５７ｆｆ （２００６）（非特許文献１９）、およびＨｅｒｔｅｌ，Ｋ．Ｊ．，他，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０（１２）：３２５２ｆｆ（１９９２）（非特許文献２０）も参照）。
【図２】図２は、Ｌ−ＤＮＡザイムおよびＤ−ＤＮＡザイムおよびハンマーヘッド型リボザイムによるＬ−ＧＦＰ標的配列およびＤ−ＧＦＰ標的配列の切断の分析を示す図である。
【図３】図３は、Ｌ−ＤＮＡザイム（Ｌ−Ｄｚ）によるＤ−ＧＦＰ標的配列の切断およびＤ−ＤＮＡザイム（Ｄ−Ｄｚ）によるＬ−ＧＦＰ標的配列の切断のＭｇＣｌ２濃度依存の比較を示す図である。
【図４】図４は、切断箇所を特定したＬ−ＤＮＡザイム（Ｌ−Ｄｚ）によるＤ−ＧＦＰ標的配列の切断のＭｇＣｌ２濃度依存を示す図である。
【図５】図５は、さまざまな酵素濃度および２４時間培養におけるＧＦＰ−トランスフェクト細胞中のさまざまなＤＮＡザイムおよびＲＮＡザイムの活性の比較を示す図である。
【図６】図６は、蛍光強度を記載した、図５の結果の定量化を示す図である。
【図７】図７は、さまざまな酵素濃度および２４時間培養におけるＬ−ＤＮＡザイムおよびＬ−リボザイムの活性の直接比較を示す図である。
【図８】図８は、蛍光強度を記載した、図７の結果の定量化を示す図である。
【図９】図９は、図５の対象物の４８時間培養後を示す図である。
【図１０】図１０は、蛍光強度を記載した、図９の結果の定量化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
実施例１：切断アッセイ
Ｌ−リボザイムとＤ−リボザイムの活性を様々な条件下で測定した。基本条件は以下のようにした。０．２μＭの標的ＲＮＡまたはＤＮＡを、１０μｌの反応混合物とともに、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ７．５）中で２μＭのＤＮＡザイムまたはＲＮＡザイムの存在下で、２０℃で２時間培養した（ＤＮＡザイムまたはＲＮＡザイム／標的の比率は１０：１）。反応前に、標的ＲＮＡまたはＤＮＡおよびＤＮＡザイムまたはＲＮＡザイムを２分間７２℃で変性させて、加熱ブロック内でゆっくりと（１℃／分）２５℃に冷却した。０．１〜１０ｍＭの濃度でＭｇ２＋イオンの影響を調べた。切断生成物を、０．０９ＭのＴｒｉｓ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）中で７Ｍの尿素の存在下で、２０％のポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。蛍光の分析は、ホスホイメージャＦｕｊｉ Ｆｉｌｍ ＦＬＡ ５１００で行った。プログラムＦｕｊｉ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｇｒａｍを用いてデータを取得した。Ｅｘｃｅｌでグラフを作成した。
【００６１】
実施例２：標的配列およびリボザイムの生成
すべての標的配列は化学合成法で生成した。合成生成物は９０％超の純度を有していた。
【００６２】
ＤＮＡザイム配列またはＲＮＡザイム配列として、標的配列の条件に従って、切断箇所トリプレットの周りのＤＮＡザイムまたはＲＮＡザイムの変更可能な範囲を選択し、ＲＮＡザイム配列またはＤＮＡザイム配列を合成して生成した。合成生成物は８５％超の純度を有していた。
【００６３】
すべての合成生成物の５’末端にフルオレセインで標識した。
【００６４】
実施例３：細胞中の活性の測定
ＨｅＬａ細胞は、１μｇのＥＧＦＰプラスミドを用いて、指示に従って導入した。その後、使用するべきＤＮＡザイムまたはＲＮＡザイムの２５、５０または１００ｎＭ溶液を用いて培養した。細胞は、２４時間または４８時間後にライカ顕微鏡で分析したか、またはマルチモードマイクロプレートリーダーＳｙｎｅｒｇｙ ２を用いて指示に従って蛍光強度（ＲＦＵ）を測定した。
【００６５】
実施例４：さまざまなＤＮＡザイムと標的配列の相互作用の比較
図２（１０ｍＭ、ＭｇＣｌ２）において、Ｌ−ＤＮＡザイムがＬ−標的配列もＤ−標的配列も切断可能であることがわかる。図３は、これに対してＭｇＣｌ２濃度依存を示す。この図から、Ｌ−ＤＮＡザイムはＤ−標的を切断するが、Ｄ−ＤＮＡザイムはＬ−標的を切断しないことも読み取れる。図４に再び図３に相応する測定を示し、追加的に図１ａに従った標的における切断箇所が見て取れる。
【００６６】
実施例５：細胞中のさまざまなＤＮＡザイムとＲＮＡザイムの活性
図５では、ＨｅＬａ細胞はＥＧＦＰプラスミドを用いて導入され、つまりＤ−標的を有する。特に、Ｌ−ＤＮＡザイムが蛍光をＬ−ＲＮＡザイムより、または同様にＤ−ＲＮＡザイムまたはＤ−ＤＮＡザイムより強く抑制することがわかる。この結果は図６で有意に確認される。これにより、特に細胞中でＬ−ＲＮＡザイムと比べてＬ−ＤＮＡザイムの効果が優れていることが裏付けられる。図７および８では、この結果が２４時間培養についてもさらに裏付けられている。そして最後に図９および１０では、Ｌ−ＤＮＡザイムが４８時間培養でも他の酵素と比べて有意に良好な阻害を示していることが見て取れる。
【００６７】
実施例６：製剤適用の可能性
シュピーゲルマーを用いた治療における解毒剤としての適用の他に、本発明はその他の一般的な関連においても使用可能である。基本的に、遺伝子産物の望ましくない発現を伴う疾患が関連しているあらゆる適応症がこれに含まれる。
【００６８】
心不全または肥大が一例である。Ｌ．Ｓｕｃｋａｕ 他，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１９：１２４１−１２５２（２００９）から、これに対しては、ホスホランバンを抑制する治療が適していることが知られている。この文献では、これにＲＮＡｉが用いられる。相応するＬ−ＤＮＡザイムは、ヒトホスホランバンに関する既知の配列情報に基づいて容易に設計することができ、さらに酵素分解に対して、その点について既知の治療法よりも有効成分のＬ−ＤＮＡザイムの安定性がより優れているという長所と、同時にホスホランバンをコード化する標的ＲＮＡの阻害に関して優れた活性がもたらされる。
【００６９】
人体中のその他の標的に、例えば非コードＨ１９ＲＮＡがある。この遺伝子は、例えば癌細胞中に特異的に発現する。とりわけ、米国特許第２０１０／００８６５２６Ａ号明細書から、ｓｉＲＮＡでＨ１９ＲＮＡを抑制することが知られている。類似の方法で、本発明に従ったＬ−ＤＮＡザイム分子を選択することができ、この分子がＨ１９核酸の既知の、かつ適切な箇所を切断することによって、転写を減少または抑制させる。これにより、すでに上に説明したように長所がもたらされる。
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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