(57)【要約】  本発明は、ＥＲＢＢ２遺伝子のメチル化状態に基づいて癌療法に対する応答を予測する方法を提供する。本発明の１つの態様は、ＥＲＢＢ２遺伝子のメチル化状態に基づくＥＧＦＲ阻害剤療法に対する応答を予測する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料腫瘍細胞中のＥＲＢＢ２遺伝子のメチル化状態を検出することを含み、ＥＲＢＢ２遺伝子の低メチル化が、腫瘍細胞増殖がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対して感受性であることを示す、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を判定する方法。
【請求項２】
患者の癌の試料のＥＲＢＢ２遺伝子のメチル化状態を検出することを含み、ＥＲＢＢ２遺伝子のメチル化状態が低メチル化であると検出された場合に、患者がＥＧＦＲ阻害剤による治療から恩恵を受ける可能性がある者と特定される、ＥＧＦＲ阻害剤による治療から恩恵を受ける可能性がある癌患者を特定する方法。
【請求項３】
前記メチル化状態がＥＲＢＢ２遺伝子の一部において検出される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＥＲＢＢ２遺伝子の一部がエンハンサーである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＥＲＢＢ２遺伝子の一部がエンハンサーおよびプロモーターである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ＥＲＢＢ２遺伝子の一部が６ＣｐＧ反復領域を含む、請求項３ないし５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＥＲＢＢ２遺伝子の一部が配列番号１の核酸配列を含む、請求項３ないし６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＥＲＢＢ２遺伝子の一部が配列番号２の核酸配列からなる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
低メチル化がＥＲＢＢ２遺伝子の約５０％未満のメチル化によって示される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
低メチル化がＥＲＢＢ２遺伝子の約２０％未満のメチル化によって示される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
低メチル化がＥＲＢＢ２遺伝子の一部の約５０％未満のメチル化によって示される、請求項３ないし８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
低メチル化がＥＲＢＢ２遺伝子の一部の約２０％未満のメチル化によって示される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
患者がＥＧＦＲ阻害剤による治療から恩恵を受ける可能性がある患者と特定される場合、患者に治療上有効量のＥＧＦＲ阻害剤を投与することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
治療上有効量のＥＧＦＲ阻害剤を患者に投与することを含み、患者が、ＥＧＦＲ阻害剤の投与前に、ＥＲＢＢ２遺伝子の低メチル化を示す癌を有すると診断され、ＥＲＢＢ２遺伝子の低メチル化がＥＧＦＲ阻害剤に対する対象による治療応答性の徴候である、患者における癌を治療する方法。
【請求項１５】
ａ．患者の癌の試料のＥＲＢＢ２遺伝子のメチル化状態を検出すること、および
ｂ．ＥＲＢＢ２遺伝子が低メチル化されていることが検出された場合に、治療のためにＥＧＦＲ阻害剤を選択すること
を含む、癌患者に対する療法を選択する方法。
【請求項１６】
治療上有効量のＥＧＦＲ阻害剤を患者に投与することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＥＧＦＲ阻害剤が、エルロチニブ、セツキシマブまたはパニツムマブである、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞におけるＥＲＢＢ２遺伝子のメチル化状態を検出することを含み、ＥＲＢＢ２遺伝子の低メチル化が細胞におけるＥＲＢＢ２の過剰発現を示す、細胞におけるＥＲＢＢ２遺伝子の過剰発現を判定する方法。
【請求項１９】
メチル化状態がＥＲＢＢ２遺伝子の一部に検出される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＥＲＢＢ２遺伝子の一部がエンハンサーである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＥＲＢＢ２遺伝子の一部がエンハンサーおよびプロモーターである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ＥＲＢＢ２遺伝子の一部が６ＣｐＧ反復領域を含む、請求項１８ないし２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ＥＲＢＢ２遺伝子の一部が配列番号１の核酸配列を含む、請求項１８ないし２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＥＲＢＢ２遺伝子の一部が配列番号２の核酸配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
低メチル化がＥＲＢＢ２遺伝子の約５０％未満のメチル化によって示される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
低メチル化がＥＲＢＢ２遺伝子の約２０％未満のメチル化によって示される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
低メチル化がＥＲＢＢ２遺伝子の一部の約５０％未満のメチル化によって示される、請求項１９ないし２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
低メチル化がＥＲＢＢ２遺伝子の一部の約２０％未満のメチル化によって示される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
治療上有効量のＨＥＲ２阻害剤を患者に投与することを含み、患者が、ＨＥＲ２阻害剤の投与前に、ＥＲＢＢ２遺伝子の低メチル化を示す癌を有すると診断され、ＥＲＢＢ２遺伝子の低メチル化がＨＥＲ２阻害剤に対する対象による治療応答性の徴候である、患者における癌を治療する方法。
【請求項３０】
ａ．患者の癌の試料のＥＲＢＢ２遺伝子のメチル化状態を検出すること、および
ｂ．ＥＲＢＢ２遺伝子が低メチル化されていることが検出された場合に、治療のためにＨＥＲ２阻害剤を選択すること
を含む、癌患者に対する療法を選択する方法。
【請求項３１】
治療上有効量のＨＥＲ２阻害剤を患者に投与することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＨＥＲ２阻害剤がトラスツズマブまたはトラスツズマブ−ＤＭ１である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
メチル化状態がピロシークエンス法により検出される、請求項１ないし３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ＥＲＢＢ２遺伝子が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織または新鮮凍結組織からのものである、請求項１ないし３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
組織試料から単離されたＥＲＢＢ２遺伝子をピロシークエンスの前に前増幅する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
腫瘍細胞がＮＳＣＬＣ腫瘍細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
癌がＮＳＣＬＣである、請求項２、１４または１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年８月３１日に出願した米国特許仮出願第６１／５２９，９１７号の利益を主張するものであり、その開示はその全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、遺伝子メチル化状態に基づいて癌療法に対する応答を予測する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、癌患者を診断し、治療する方法を対象とする。特に、本発明は、いずれの患者が表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）キナーゼ阻害剤による治療から最も恩恵を受けるかを判定する方法を対象とする。
【０００４】
癌は、無制限な増殖、分化の欠如、および局所組織に浸潤し転移する能力によって特徴付けられる、広範囲の細胞悪性腫瘍の一般名である。これらの悪性新生物は、様々な程度の罹患率で身体のあらゆる組織および臓器を侵す。
【０００５】
各種の癌の治療用の多数の治療薬が過去数十年にわたり開発されてきた。最も一般的に用いられる種類の抗癌薬としては、ＤＮＡアルキル化薬（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド）、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキセート、葉酸拮抗薬および５−フルオロウラシル、ピリミジン拮抗薬）、微小管破壊剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、パクリタキセル）、ＤＮＡインターカレーター（例えば、ドキソルビシン、ダウノマイシン、シスプラチン）およびホルモン療法（例えば、タモキシフェン、フルタミド）などがある。
【０００６】
表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーは、分化および増殖などの細胞応答に関与する４種の密接に関連した受容体（ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）、ＨＥＲ３（ＥＲＢＢ２３）およびＨＥＲ４（ＥＲＢＢ４））を含む。ＥＧＦＲキナーゼまたはその配位子ＴＧＦアルファの過剰発現は、乳癌、肺癌、大腸直腸癌、卵巣癌、腎細胞癌、膀胱癌、頭頸部癌、神経膠芽腫および星状細胞腫を含む多くの癌をしばしば随伴し、また、これらの腫瘍の悪性増殖に寄与すると考えられる。ＥＧＦＲ遺伝子（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）における特定の欠失突然変異も細胞腫瘍形成性を増大させることが見いだされた。ＥＧＦＲ刺激性シグナル伝達経路の活性化は、潜在的に癌促進性である多数の過程、例えば、増殖、血管新生、細胞運動性および浸潤、アポトーシスの低減ならびに薬剤耐性の誘導を促進する。ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ発現の増大は、進行疾患、転移および予後不良にしばしば関連する。例えば、ＮＳＣＬＣおよび胃癌において、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ発現の増大は、高い転移率、不十分な腫瘍分化および腫瘍増殖の増大と相関することが示された。
【０００７】
ＥＲＢＢ２の過剰発現は、特に腋窩リンパ節に関係する原発性疾患を有する患者における予後不良の予測因子と一般的にみなされており（Slamonら、Science、235巻、177〜182頁(1987年)、Slamonら、Science、244巻、707〜712頁(1989年)、RavdinおよびChamness、Gene、159巻、19〜27頁(1995年)ならびにHynesおよびStem、Biochim Biophys Acta、1198巻、165〜184頁(1994年)）、ホルモン療法ならびにＣＭＦ（シクロホスファミド、メトトレキセートおよびフルオロウラシル）およびアントラサイクリンを含む化学療法計画に対する感受性および／または抵抗性に関連付けられた（Baselgaら、Oncology、11巻(3 Suppl 2)、43〜48頁(1997年)）。ＨＥＲ２抗体トラスツズマブによる治療を受ける患者は、ＨＥＲ２過剰発現／増幅に基づいて療法に選択される。例えば、ＷＯ９９／３１１４０、ＵＳ２００３／０１７０２３４、ＷＯ０１／８９５６６を参照のこと。
【０００８】
受容体の内在性タンパク質チロシンキナーゼ活性を活性化し、および／または下流シグナル伝達を増大させる突然変異が、ＮＳＣＬＣおよび神経膠芽腫に観測された。しかし、ＥＧＦ受容体阻害剤、例えば、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））またはゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（商標））に対する感受性の付与の原理的メカニズムとしての突然変異の役割は、議論の的となっていた。最近、全長ＥＧＦ受容体の突然変異体が、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤ゲフィチニブに対する応答性を予測するものであることが報告された（Paez, J. G.ら(2004年)、Science、304巻、1497〜1500頁、Lynch, T. J.ら(2004年)、N. Engl. J. Med.、350巻、2129〜2139頁）。細胞培養試験で、ＥＧＦ受容体の突然変異体を発現する細胞株（すなわち、Ｈ３２５５）がＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤ゲフィチニブによる増殖抑制に対してより感受性が高く、野生型ＥＧＦ受容体を発現する腫瘍細胞株を抑制するのにはるかにより高い濃度のゲフィチニブが必要であったことが示された。これらの所見は、ＥＧＦ受容体の特定の突然変異体は、ＥＧＦ受容体阻害剤に対するより高い感受性を反映し得るが、完全に非応答性の表現型を同定するものでないことを示唆するものである。
【０００９】
ＥＧＦＲのキナーゼ活性を直接阻害する化合物ならびにＥＧＦＲの活性化を遮断することによりＥＧＦＲキナーゼ活性を低下させる抗体の抗腫瘍薬として使用するための開発は、集中的な研究努力の分野である（de Bono J. S.およびRowinsky, E.K.(2002年)、Trends in Mol. Medicine、8巻、S19〜S26頁、Dancey, J.およびSausville, E. A.(2003年)、Nature Rev. Drug Discovery、2巻、92〜213頁）。いくつかの試験で、いくつかのＥＧＦＲキナーゼ阻害剤が、他の特定の抗癌もしくは化学療法薬または治療法と併用した場合に腫瘍細胞または新形成の殺滅を改善する可能性があることが示され、開示され、または示唆された（例えば、Herbst, R. S.ら(2001年)、Expert Opin. Biol. Ther.、1巻、719〜732頁、Solomon, B.ら(2003年)、Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys.、55巻、713〜723頁、Krishman, S.ら(2003年)、Frontiers in Bioscience、8巻、e1〜13頁、Grunwald, V.およびHidalgo, M.(2003年)、J. Nat. Cancer Inst.、95巻、851〜867頁、Seymour L. (2003年)、Current Opin. Investig. Drugs、4巻(6号)、658〜666頁、Khalil, M. Y.ら(2003年)、Expert Rev. Anticancer Ther.、3巻、367〜380頁、Bulgaru, A. M.ら(2003年)、Expert Rev. Anticancer Ther.、3巻、269〜279頁、Dancey, J.およびSausville, E.A. (2003年)、Nature Rev. Drug Discovery、2巻、92〜313頁、Ciardiello, F. ら(2000年)、Clin. Cancer Res.、6巻、2053〜2063頁ならびに特許出願公開ＵＳ２００３／０１５７１０４）。
【００１０】
エルロチニブ（例えば、エルロチニブＨＣｌ、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）またはＯＳＩ−７７４としても公知）は、ＥＧＦＲキナーゼの経口で使用できる阻害剤である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、エルロチニブは、大腸直腸および乳癌を含む多くのヒト腫瘍細胞株におけるＥＧＦＲキナーゼに対する実質的な阻害活性を示し（Moyer J. D.ら(1997年)、Cancer Res.、57巻、4838頁）、前臨床評価で、多くのＥＧＦＲ発現ヒト腫瘍異種移植片に対する活性を示した（Pollack, V. A.ら(1999年)、J. Pharmacol. Exp. Ther.、291巻、739頁）。つい最近、エルロチニブは、頭頸部癌（Soulieres, D.ら(2004年)、J. Clin. Oncol.、22巻、77頁）、ＮＳＣＬＣ（Perez-Soler R.ら(2001年)、Proc. Am. Soc. Clin. Oncol.、20巻、310a頁、要約1235）、ＣＲＣ（Oza, M.ら(2003年)、Proc. Am. Soc. Clin. Oncol.、22巻、196a頁、要約785）およびＭＢＣ（Winer, E.ら(2002年)、Breast Cancer Res. Treat.、76巻、5115a頁、要約445）を含む多くの適応症における第ＩおよびＩＩ相試験において有望な活性を示した。第ＩＩＩ相試験において、エルロチニブ単独療法は、難治性進行ＮＳＣＬＣを有する患者における生存期間を著しく延長させ、疾患の進行を遅延させ、肺癌に関連する症状の悪化を遅延させた（Shepherd, F.ら(2004年)、J. Clin. Oncology、22巻、14S頁(7月15日追補)、要約7022）。エルロチニブの臨床試験データの多くがＮＳＣＬＣにおけるその使用に関連するが、第Ｉ／ＩＩ相試験からの予備的結果は、ＣＲＣ（Oza, M.ら(2003年)、Proc. Am. Soc. Clin. Oncol.、22巻、196a頁、要約785）およびＭＢＣ（Jones, R. J.ら(2003年)、Proc. Am. Soc. Clin. Oncol.、22巻、45a頁、要約180）を含む、広範囲のヒト充実性腫瘍型を有する患者におけるエルロチニブおよびカペシタビン／エルロチニブ併用療法の有望な活性を示すものであった。２００４年１１月に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、少なくとも１つの以前の化学療法計画の失敗の後の局所的に進行または転移した非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者の治療用のエルロチニブを承認した。エルロチニブは、第ＩＩＩ相臨床試験において進行ＮＳＣＬＣ患者の生存率の増加を示す表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）クラスにおける唯一の薬物である。
【００１１】
抗腫瘍薬は、理想的には癌細胞を選択的に殺滅し、非悪性細胞に対するその毒性と比べて広い治療指数を有するものである。抗腫瘍薬はまた、当薬物への長期の曝露の後でさえ、悪性細胞に対するその有効性を保持する。残念ながら、現在の化学療法のどれもそのような理想的なプロファイルを有さない。それどころか、大部分が非常に狭い治療指数を有する。さらに、わずかに亜致死濃度の化学療法薬に曝露した癌性細胞は、そのような薬物に対する耐性を非常にしばしば、またいくつかの他の抗腫瘍薬に対してもかなりしばしば交差耐性を発現する。さらに、所定の癌型について、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤などのより新規な遺伝子標的療法を用いても、いずれの患者が特定の療法に応答する可能性があるかをしばしば予測することができず、したがって、最も有効な療法を見いだすために、患者へのかなりの危険および不快をしばしば冒して、かなりの試行錯誤が必要となる。
【００１２】
したがって、新形成および他の増殖性障害に対するより有効な療法、ならびにいずれの腫瘍がいずれの療法に応答するかを判断するより有効な手段の必要がある。既存の薬物の治療有効性を増大させるための戦略は、それらの投与計画の変更、および他の抗癌または生化学的調節薬とのそれらの併用も必要とした。併用療法は、治療上適切な用量の各薬剤単独の使用と比べて大きい有効性と副作用の減弱をもたらし得る方法として周知である。ある場合には、薬物の併用の有効性が相加的である（併用の有効性が各薬物単独の効果の和にほぼ等しい）が、別の場合には、効果が相乗的である（併用の有効性が単独投与した各薬物の効果の和より大きい）。
【００１３】
エルロチニブなどの標的特異的治療アプローチは、一般的に従来の細胞毒性薬と比較して低い毒性を伴い、したがって、併用療法における使用に役立つ。有望な結果がベバシズマブ（Mininberg, E. D.ら(2003年)、Proc. Am. Soc. Clin. Oncol.、22巻、627a頁、要約2521）およびゲムシタビン（Dragovich, T.(2003年)、Proc. Am. Soc. Clin. Oncol.、22巻、223a頁、要約895）と併用したエルロチニブの第Ｉ／ＩＩ相試験で認められた。ＮＳＣＬＣ第ＩＩＩ相試験における最近のデータは、標準化学療法と併用した第一選択のエルロチニブまたはゲフィチヌブが生存率を改善しなかったことを示した（Gatzemeier, U.(2004年)、Proc. Am. Soc. Clin. Oncol.、23巻、617頁(要約7010)、Herbst, R. S.(2004年)、Proc. Am. Soc. Clin. Oncol.、23巻、617頁(要約7011)、Giaccone G.ら(2004年)、J. Clin. Oncol.、22巻、777頁、Herbst, R.ら(2004年)、J. Clin. Oncol.、22巻、785頁）。しかし、膵臓癌第ＩＩＩ相試験ではゲムシタビンと併用した第一選択のエルロチニブが生存率を改善したことが示された。
【００１４】
いくつかのグループがＥＧＦＲ阻害剤に対する患者の応答を予測するための潜在的バイオマーカーを検討した（例えば、ＷＯ２００４／０６３７０９、ＷＯ２００５／０１７４９３、ＷＯ２００４／１１１２７３、ＷＯ２００４／０７１５７２、ＵＳ２００５／００１９７８５およびＵＳ２００４／０１３２０９７を参照）。１つのそのようなバイオマーカーは、上皮および間葉表現型である。大部分の癌転移中に、上皮間葉転換（ＥＭＴ）として公知の重要な変化が腫瘍細胞において起こる（Thiery, J. P.(2002年)、Nat. Rev. Cancer、2巻、442〜454頁、Savagner, P.(2001年)、Bioassays、23巻、912〜923頁、Kang Y.およびMassague, J.(2204年)、Cell、118巻、277〜279頁、Julien-Grille, S.ら、Cancer Research、63巻、2172〜2178頁、Bates, R. C.ら(2003年)、Current Biology、13巻、1721〜1727頁、Lu Z.ら(2003年)、Cancer Cell.、4巻(6号)、499〜515頁）。ともに強固に結合し、極性を示す上皮細胞は、ともにより緩やかに結合し、極性の喪失を示し、移動する能力を有する間葉細胞を生じる。これらの間葉細胞は、最初の腫瘍の周囲の組織内に広がり、血管およびリンパ管に浸潤し、新たな場所に移動し、そこで分裂し、さらなる腫瘍を形成する。ＥＭＴは、胚形成時を除いて、健常細胞においては起こらない。正常な状況下では、ＴＧＦ−βは、増殖抑制剤として作用するが、癌の転移時には、ＴＧＦ−βは、ＥＭＴを促進し始める。
【００１５】
上皮および間葉表現型は、特定の遺伝子発現パターンと関連付けられた。例えば、上皮表現型は、ＷＯ２００６１０１９２５においてＥ−カドヘリン、Ｂｒｋ、γ−カテニン、α−カテニン、ケラチン８、ケラチン１８、コネキシン３１、プラコフィリン３、ストラタフィン１、ラミニンアルファ−５およびＳＴ１４の高い発現レベルと関連することが示されたが、間葉表現型は、ビメンチン、フィブロネクチン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、コラーゲンアルファ−２（ＩＶ）、コラーゲンアルファ−２（Ｖ）、ＬＯＸＬ１、ニドゲン、Ｃ１１ｏｒｆ９、テナシン、Ｎ−カドヘリン、胚ＥＤＢ＋フィブロネクチン、チューブリンアルファ−３およびエピモルフィンの高い発現レベルと関連していた。
【００１６】
後成的遺伝学は、基礎をなすＤＮＡ配列の変化以外のメカニズムにより引き起こされる遺伝子発現または細胞表現型の遺伝性変化の研究であり、したがって、名称は、後成的（ｅｐｉ）（ギリシャ語；の上、より上、外側）遺伝学である。そのような変化の例としては、両方が関連遺伝子の配列を変化させずに遺伝子発現を調節する役割を果たす、ＤＮＡメチル化およびヒストン修飾などがある。これらの変化は、生物の残りの生涯にわたり細胞分裂により体細胞において遺伝性であり得るものであり、生物の次世代に伝播する可能性もある。しかし、生物の基礎をなすＤＮＡ配列の変化はなく、その代りに、非遺伝要因により、生物の遺伝子が異なる挙動または発現を示す。
【００１７】
ＤＮＡのメチル化は、高等生物における正常な生物の発生および細胞分化の非常に重要な部分である。ＤＮＡのメチル化は、細胞が「それらが存在した場所を思い出す」ことができるように細胞における遺伝子発現パターンを安定に変化させる。例えば、胚発生時に膵島であるようにプログラムされた細胞は、それらが島のままである必要があることを細胞に告げる継続的なシグナルなしに生物の生涯を通して膵島のままである。さらに、ＤＮＡのメチル化は、長期にわたり宿主のゲノムに組み込まれたウイルス遺伝子および他の有害なエレメントの発現を抑制する。ＤＮＡのメチル化はまた、細胞がＤＮＡの単一不変配列から多細胞生命に必要な多彩な特性を生ずることを可能にする、クロマチン構造の基礎を構成する。ＤＮＡのメチル化はまた、ほぼすべての型の癌の発生に非常に重要な役割を果たす。シトシンの５位におけるＤＮＡのメチル化は、遺伝子発現を低下させるという特異的な効果を有し、検討したすべての脊椎動物に見いだされた。成体体細胞組織において、ＤＮＡメチル化は、一般的にＣｐＧジヌクレオチドの状況で起こるが、非ＣｐＧメチル化は、胚幹細胞で優勢である。
【００１８】
「ＣｐＧ」は、「−Ｃ−リン酸−Ｇ−」の略記である。すなわち、シトシンとグアニンが１つのリン酸のみによって分離されている。リン酸はＤＮＡにおける任意の２つのヌクレオチドを結合させる。「ＣｐＧ」表記は、この線状配列をシトシンとグアニンのＣＧ塩基対合と区別するために用いられる。ＣｐＧジヌクレオチドにおけるシトシンは、メチル化して、５−メチルシトシン（５−ｍＣ）を形成することができる。哺乳動物において、遺伝子内のシトシンのメチル化により、遺伝子を働かなくすることができる。メチル基をＤＮＡに付加する酵素は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼと呼ばれる。哺乳動物において、ＣｐＧシトシンの７０％〜８０％がメチル化される。ＣｐＧアイランドとして公知である、より高い濃度のＣｐＧ部位を有するゲノムの領域が存在する。これらの「ＣｐＧアイランド」は、予想されるより高いＧＣ含量（すなわち、＞５０％）も有する。哺乳類ゲノムにおける多くの遺伝子は、遺伝子の開始に関連するＣｐＧアイランドを有する。このため、ＣｐＧアイランドの存在は、遺伝子の予測およびアノテーションの助けとするために用いられる。ＣｐＧアイランドは、メチル化に対して不応性であり、これが開いたクロマチン構造を維持する助けとなり得る。さらに、これは、塩基転位型突然変異に対する脆弱性の低減をもたらす可能性があり、結果として、ＣｐＧのより高い平衡密度が存続する。遺伝子のプロモーター内のＣｐＧ部位のメチル化は、多くのヒト癌に見いだされる特徴である、それらのサイレンシングにつながり得る（例えば、腫瘍サプレッサー遺伝子のサイレンシング）。対照的に、ＣｐＧ部位の低メチル化は、癌細胞内の癌遺伝子の過剰発現に関連付けられた。
【発明の概要】
【００１９】
本発明の１つの態様は、試料腫瘍細胞中のＥＲＢＢ２遺伝子のメチル化状態を検出することを含み、ＥＲＢＢ２遺伝子の低メチル化が、腫瘍細胞増殖がＥＧＦＲ阻害剤による阻害に対して感受性であることを示す、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を判定する方法を提供する。本発明の別の態様は、患者の癌の試料のＥＲＢＢ２遺伝子のメチル化状態を検出することを含み、ＥＲＢＢ２遺伝子のメチル化状態が低メチル化であると検出された場合、患者がＥＧＦＲ阻害剤による治療から恩恵を受ける可能性がある患者と特定される、ＥＧＦＲ阻害剤による治療から恩恵を受ける可能性がある癌患者を特定する方法を提供する。１つの実施形態において、患者がＥＧＦＲ阻害剤による治療から恩恵を受ける可能性がある患者と特定される場合、患者に治療上有効量のＥＧＦＲ阻害剤を投与する。
【００２０】
本発明の別の態様は、治療上有効量のＥＧＦＲ阻害剤を患者に投与することを含み、患者が、ＥＧＦＲ阻害剤の投与前に、ＥＲＢＢ２遺伝子の低メチル化を示す癌を有すると診断され、ＥＲＢＢ２遺伝子の低メチル化がＥＧＦＲ阻害剤に対する対象による治療応答性の徴候である、患者における癌を治療する方法を提供する。
【００２１】
本発明の別の態様は、患者の癌の試料のＥＲＢＢ２遺伝子のメチル化状態を検出し、ＥＲＢＢ２遺伝子が低メチル化されていることが検出された場合に治療のためにＥＧＦＲ阻害剤を選択するステップを含む、癌患者に対する療法を選択する方法を提供する。１つの実施形態において、患者に治療上有効量の、例えば、エルロチニブ、セツキシマブまたはパニツムマブなどのＥＧＦＲ阻害剤を投与する。
【００２２】
本発明の別の態様は、細胞におけるＥＲＢＢ２遺伝子のメチル化状態を検出することを含み、ＥＲＢＢ２遺伝子の低メチル化が細胞におけるＥＲＢＢ２遺伝子の過剰発現を示す、細胞におけるＥＲＢＢ２遺伝子の過剰発現を判定する方法を提供する。
【００２３】
本発明の別の態様は、治療上有効量のＨＥＲ２阻害剤を患者に投与することを含み、患者が、ＨＥＲ２阻害剤の投与前に、ＥＲＢＢ２遺伝子の低メチル化を示す癌を有すると診断され、ＥＲＢＢ２遺伝子の低メチル化がＨＥＲ２阻害剤に対する対象による治療応答性の徴候である、患者における癌を治療する方法を提供する。
【００２４】
本発明の別の態様は、患者の癌の試料のＥＲＢＢ２遺伝子のメチル化状態を検出し、ＥＲＢＢ２遺伝子が低メチル化されていることが検出された場合に治療のためにＨＥＲ２阻害剤を選択するステップを含む、癌患者に対する療法を選択する方法を提供する。１つの実施形態において、患者に治療上有効量のトラスツズマブまたはＴ−ＤＭ１などのＨＥＲ２阻害剤を投与する。
【００２５】
上記の方法の特定の実施形態において、メチル化状態をＥＲＢＢ２遺伝子の一部において検出する。メチル化状態を検出するために用いる遺伝子の一部は、例えば、エンハンサー領域、またはエンハンサー領域およびプロモーター領域である。１つの実施形態において、メチル化状態を検出するために用いる遺伝子の一部は、配列番号１の核酸配列を含む。１つの実施形態において、メチル化状態を検出するために用いる遺伝子の一部は、配列番号１の核酸配列からなる。１つの実施形態において、メチル化状態を検出するために用いる遺伝子の一部は、６ＣｐＧ反復領域を含む。１つの実施形態において、メチル化状態を検出するために用いる遺伝子の一部は、配列番号２の核酸配列を含む。１つの実施形態において、メチル化状態を検出するために用いる遺伝子の一部は、配列番号２の核酸配列からなる。
【００２６】
方法の特定の実施形態において、ＥＲＢＢ２遺伝子またはその一部が約５０％未満または約２０％未満メチル化されている場合、ＥＲＢＢ２遺伝子のメチル化状態は、低メチル化状態であると考えられる。
【００２７】
上記の方法の特定の実施形態において、メチル化状態をピロシークエンス法により検出する。上記の方法の特定の実施形態において、ＥＲＢＢ２遺伝子は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織または新鮮凍結組織からのものである。上記の方法の特定の実施形態において、組織試料から単離されたＥＲＢＢ２遺伝子をピロシークエンスの前に前増幅する。
【００２８】
上記の方法の特定の実施形態において、腫瘍細胞は、ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞であり、癌は、ＮＳＣＬＣである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】２８ＣｐＧメチル化部位（配列番号１）を含有するＥＲＢＢ２エンハンサー領域の核酸配列（配列番号１）を示す図である。
【図２】ＮＳＣＬＣ外科的切除原発腫瘍および対応正常組織におけるＥＲＢＢ２メチル化状態のピロシークエンス解析の結果を示すグラフである。
【図３】上皮様および間葉様ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＥＲＢＢ２メチル化状態の定量的ピロシークエンス解析の結果を示すグラフである。
【図４】Ｆｌｕｄｉｇｍ遺伝子発現解析に基づくＴａｑＭａｎを用いたＮＳＣＬＣ細胞におけるＥＲＢＢ２  ｍＲＮＡの相対的発現を示すグラフである。
【図５】細胞株におけるＥＲＢＢ２エンハンサーＣｐＧ部位のメチル化の百分率を示すグラフである。細胞株は、エルロチニブ処理に対する感受性により順序づけて示す。
【図６】ＮＳＣＬＣ外科的切除原発腫瘍および対応正常組織における６つの個別ＣｐＧ部位のそれぞれにおけるメチル化の百分率を示すピロシークエンス解析の結果を示すグラフである。
【図７】高および低ＥＲＢＢ２発現腫瘍細胞におけるＥＲＢＢ２エンハンサー領域のメチル化の百分率を示すグラフである。
【図８】保管ＦＦＰＥスライド標本から得られた４７のＮＳＣＬＣ原発腫瘍試料におけるＥＲＢＢ２および上皮／間葉状態のメチル化のピロシークエンス解析を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
Ｉ．定義
別途定義しない限り、本明細書で用いたすべての専門用語、注釈および他の科学用語は、本発明が属する技術分野の技術者により一般的に理解されている意味を有するものとする。場合によって、一般的に理解されている意味を有する用語を、明瞭さを期し、かつ／または敏速な参照に供するために本明細書で定義するが、そのような定義を本明細書に含めることは、当技術分野で一般的に理解されていることを越える実質的な相違を意味するものと必ずしも解釈すべきではない。本明細書で述べるまたは参照する手法および手順は、一般的に十分に理解されており、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition (1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.に記載されている広く用いられている分子クローニングの方法論などの従来の方法論を用いて当業者により一般的に用いられている。必要に応じて、市販のキットおよび試薬の使用を必要とする処置は、特に示さない限り、製造業者が規定するプロトコールおよび／またはパラメーターに従って一般的に行われる。
【００３１】
したがって、本方法、キットおよび使用を述べる前に、本発明が特定の方法論、プロトコール、細胞株、動物種または属、構築物に限定されず、それとして述べる試薬が当然変化し得ることを理解すべきである。本明細書で用いた用語は、特定の実施形態のみを記述する目的のためのものであって、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも理解すべきである。
【００３２】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いているように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が他の状態を明確に決定づけるものでない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。
【００３３】
本明細書および特許請求の範囲を通して、「含む」という語、または「含む（単数形）」もしくは「を含むこと」などの変化形は、表示された整数または整数の群の包含を意味するが、他の整数または整数の群の除外は意味しないことを理解されたい。
【００３４】
動物における「癌」という用語は、無秩序な増殖、不死性、転移能、急速な成長および増殖速度ならびにある種の特有の形態学的特徴などの発癌性細胞に特有な特徴を有する細胞の存在を意味する。しばしば、癌細胞は、腫瘍の形態であるが、そのような細胞は、動物の体内に単独で存在することがあるか、または白血病細胞のような独立した細胞として血流中で循環することがある。
【００３５】
「異常な細胞増殖」は、本明細書で用いているように、特に示さない限り、正常な調節メカニズムと無関係（例えば、接触阻止の喪失）である細胞増殖を意味する。これは、（１）突然変異チロシンキナーゼを発現することまたは受容体チロシンキナーゼの過剰発現により増殖する腫瘍細胞（腫瘍）、（２）異常なチロシンキナーゼの活性化が起こる他の増殖性疾患の良性および悪性細胞、（４）受容体チロシンキナーゼにより増殖する任意の腫瘍、（５）異常なセリン／トレオニンキナーゼの活性化により増殖する任意の腫瘍、ならびに（６）異常なセリン／トレオニンキナーゼの活性化が起こる他の増殖性疾患の良性および悪性細胞の異常な成長を含む。
【００３６】
「治療する」という用語は、本明細書で用いているように、特に示さない限り、患者における腫瘍、腫瘍転移巣または他の発癌性もしくは腫瘍性細胞の成長を部分的または完全に、逆転させること、軽減すること、その進行を抑制すること、または予防することを意味する。
【００３７】
「治療」という用語は、本明細書で用いているように、特に示さない限り、治療する行為を意味する。
【００３８】
「治療する方法」という語句またはその相当語句は、例えば、癌に適用するとき、動物における癌細胞の数を低減もしくは除去するように、または癌の症状を軽減させるように計画されている行為の手順または過程を意味する。
【００３９】
癌または別の増殖性障害を「治療する方法」は、癌細胞もしくは他の障害が実際に取り除かれること、細胞の数もしくは障害が実際に低減されること、または癌もしくは他の障害の症状が実際に軽減されることを必ずしも意味しない。
【００４０】
「治療上有効な薬剤（agent）」という用語は、研究者、獣医、医師または他の臨床医が追求している組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する組成物を意味する。
【００４１】
「治療上有効量」または「有効量」という用語は、研究者、獣医、医師または他の臨床医が追求している組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する対象化合物または配合物の量を意味する。
【００４２】
「ＥｒｂＢ１」、「ＨＥＲ１」、「表皮成長因子受容体」および「ＥＧＦＲ」ならびに「ＥＧＦＲキナーゼ」という用語は、本明細書で同義で用い、その天然に存在する突然変異体（例えば、Humphreyら、PNAS(USA)、87巻、4207〜4211頁(1990年)におけるような欠失突然変異体ＥＧＦＲ）を含む、例えば、Carpenterら、Ann. Rev. Biochem.、56巻、881〜914頁(1987年)に開示されているようなＥＧＦＲを意味する。ｅｒｂＢ１は、ＥＧＦＲタンパク質産物をコードする遺伝子を意味する。
【００４３】
本明細書で用いているように、「ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤」および「ＥＧＦＲ阻害剤」という用語は、当技術分野で現在公知であり、または将来同定され、患者への投与により、その天然配位子のＥＧＦＲへの結合に別に起因する下流の生物学的効果のいずれかを含む、患者におけるＥＧＦ受容体の活性化に関連する生物学的活性の阻害をもたらす化学物質を含む任意のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を意味する。そのようなＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、患者における癌の治療に関連するＥＧＦＲの活性化またはＥＧＦＲの活性化の下流の生物学的効果のいずれかを遮断することができる任意の薬剤を含む。そのような阻害剤は、受容体の細胞内ドメインに直接結合し、そのキナーゼ活性を阻害することによって作用することができる。あるいは、そのような阻害剤は、ＥＧＦ受容体の配位子結合部位またはその一部を占有し、それにより、その正常な生物学的活性が妨げられるまたは低下するように受容体がその天然配位子にアクセスすることができなくすることによって作用することができる。あるいは、そのような阻害剤は、ＥＧＦＲポリペプチドの二量体化もしくはＥＧＦＲポリペプチドと他のタンパク質との相互作用を調節することによって作用する、またはＥＧＦＲのユビキチン化およびエンドサイトーシスによる分解を増大させることができる。ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、低分子量阻害剤、抗体または抗体断片、アンチセンス構築物、小抑制性ＲＮＡｓ（すなわち、ｄｓＲＮＡによるＲＮＡ干渉；ＲＮＡｉ）およびリボザイムを含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、小有機分子またはヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体である。
【００４４】
ＥＧＦ受容体機能の阻害剤は、臨床的有用性を示し、治療から恩恵を受ける可能性が最も高い患者サブセットを記述する重要なＥＧＦ受容体シグナル伝達経路の定義は、重要な研究分野となった。受容体の内在性タンパク質チロシンキナーゼ活性を活性化し、かつ／または下流シグナル伝達を増大させる突然変異がＮＳＣＬＣおよび神経膠芽腫に認められた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび臨床試験で、ＥＧＦ受容体阻害に対するそれらの細胞応答のｗｔ  ＥＧＦ受容体細胞株および腫瘍の間のかなりの変動が示され、これは、抗アポトーシス性セリン−トレオニンキナーゼＡｋｔの持続的リン酸化につながる、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ経路のＥＧＦ受容体非依存的活性化により生ずることが一部示された。ＰＩ３−キナーゼ活性化の代替経路および結果として生ずるＥＦＧ受容体阻害剤非感受性の分子的決定要因は、活発な研究分野である。例えば、ＰＩ３−キナーゼ経路を強力に活性化するインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１受容体）は、ＥＧＦ阻害剤に対する細胞抵抗性に関連付けられた。選択的ＥＧＦ受容体阻害に対する非感受性の媒介においてＰＩ３−キナーゼ経路を経て生存シグナルも出すことができる、細胞間および細胞接着ネットワークの役割は、さほど明らかでなく、ＥＧＦ受容体遮断に対する細胞感受性に影響を及ぼすと想定されよう。細胞外マトリックスへの接着または細胞間接触が存在しない場合に成長および生存シグナルを維持する腫瘍細胞の能力は、細胞移動および転移の状況においてだけでなく、細胞外マトリックスがリモデリングされ、細胞接触阻止が減退している創傷様腫瘍環境において細胞増殖および生存を維持するうえでも重要である。
我々は、以前にエルロチニブに対するＮＳＣＬＣ細胞株のｉｎ  ｖｉｔｒｏ感受性と相関するＥＭＴ遺伝子発現署名を定義した（Yauchら、2005年、Clin Cancer Res、11巻、8686〜8698頁）。
【００４５】
「ＥｒｂＢ２」および「ＨＥＲ２」という表現は、本明細書で同義で用い、例えば、Sembaら、PNAS(USA)、82巻、6497〜6501頁(1985年)およびYamamotoら、Nature、319巻、230〜234頁(1986年)に記載されているヒトＨＥＲ２タンパク質（Ｇｅｎｅｂａｎｋ寄託番号Ｘ０３３６３）を指す。「ｅｒｂＢ２」という用語は、ヒトＥｒｂＢ２をコードする遺伝子を意味し、「ｎｅｕ」は、ラットｐ１８５ｎｅｕをコードする遺伝子を意味する。
【００４６】
「ＥｒｂＢ３」および「ＨＥＲ３」は、例えば、米国特許第５，１８３，８８４号および米国特許第５，４８０，９６８号ならびにKrausら、PNAS(USA)、86巻、9193〜9197頁(1989年)に開示されている受容体ポリペプチドを指す。
【００４７】
本明細書では「ＥｒｂＢ４」および「ＨＥＲ４」という用語は、例えば、１９９９年４月２２日に公開されたＷＯ９９／１９４８８に開示されているそのイソ型を含む、例えば、欧州特許出願公開第５９９，２７４号、Plowmanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90巻、1746〜1750頁(1993年)およびPlowmanら、Nature、366巻、473〜475頁(1993年)に開示されている受容体ポリペプチドを指す。
【００４８】
「低メチル化」とは、メチル化される可能性があるＣｐＧ部位の大部分がメチル化されていないことを意味する。特定の実施形態において、低メチル化は、ＥＲＢＢ２遺伝子の一部における可能なメチル化部位の５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満または１％未満がメチル化されていることを意味する。１つの実施形態において、ＥＢＢ２遺伝子の一部は、ＥＲＢＢ２のエンハンサー領域を含む。１つの実施形態において、ＥＢＢ２遺伝子の一部は、２８ＣｐＧメチル化部位を含有する、配列番号１のＥＲＢＢ２エンハンサー領域を含む。さらに別の実施形態において、低メチル化は、例えば、非腫瘍細胞において正常なレベルで発現するＥＲＢＢ２遺伝子と比較して少数の可能なメチル化部位がメチル化されていることを意味する。別の実施形態において、低メチル化は、ＥＲＢＢ２遺伝子のエンハンサー領域におけるＣｐＧ部位のいずれもメチル化されていないことを意味する。
【００４９】
ＩＩ．方法および組成物
本発明は、一部、ＥＲＢＢ２遺伝子の低メチル化が、ＥＲＢＢ２の高い発現およびＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による治療に対する癌の感受性と相関するという発見に関する。したがって、本発明は、腫瘍の試料を採取し、腫瘍試料を分析して、ＥＲＢＢ２のメチル化状態を検出することを含み、ＥＲＢＢ２の低メチル化状態の検出が、腫瘍細胞増殖がＥＧＦＲ阻害剤治療による抑制に対して感受性があることを示す、癌患者におけるＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による細胞増殖抑制に対する腫瘍の感受性を判定する方法を提供する。
【００５０】
したがって、１つの実施形態において、試料腫瘍細胞におけるＥＲＢＢ２遺伝子のメチル化状態を検出することを含み、ＥＲＢＢ２遺伝子の低メチル化が、腫瘍細胞増殖がＥＧＦＲ阻害剤による抑制に対して感受性があることを示す、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による抑制に対する腫瘍細胞増殖の感受性を判定する方法を提供する。
【００５１】
本発明の別の態様は、癌性腫瘍の試料などの患者の癌の試料のＥＲＢＢ２遺伝子のメチル化状態を検出することを含み、ＥＲＢＢ２遺伝子が低メチル化されていることが検出される場合に患者がＥＧＦＲ阻害剤による治療から恩恵を受ける可能性があると特定される、ＥＧＦＲ阻害剤による治療から恩恵を受ける可能性がある癌患者を特定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、低メチル化状態に基づいて治療上有効量のＥＧＦＲ阻害剤を患者に投与する。
【００５２】
さらに、ＥＧＦＲ阻害剤による治療の恩恵を示す可能性が高い患者を特定する方法であって、ＥＲＢＢ２遺伝子の一部における低メチル化を検出することを含み、ＥＲＢＢ２遺伝子配列の分析した部分の約５０％未満、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２％または１％のメチル化が、患者が治療から恩恵を受ける可能性が高いことを示す、上記方法を本明細書で提供する。
【００５３】
本発明の別の態様は、癌性腫瘍の試料などの患者の癌から採取した試料におけるＥＲＢＢ２遺伝子のメチル化状態に基づいて癌患者に対する療法を選択する方法を提供する。１つの実施形態において、療法を選択する方法は、患者の癌の試料のＥＲＢＢ２遺伝子のメチル化状態を検出し、ＥＲＢＢ２遺伝子が低メチル化されていることが検出される（メチル化状態が低メチル化状態であると判断される）場合に、療法のためにＥＧＦＲ阻害剤を選択するステップを含む。患者にこの選択方法に基づいて治療上有効量のＥＧＦＲ阻害剤を投与する。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブ、セツキシマブまたはパニツムマブである。
【００５４】
本発明の別の態様は、患者がＥＲＢＢ２の低メチル化によって特徴付けられる癌に罹患している場合にＥＧＦＲ阻害剤により患者を治療する方法を提供する。
【００５５】
本発明のさらに別の態様は、細胞中のＥＲＢＢ２遺伝子のメチル化状態を検出することを含み、ＥＲＢＢ２遺伝子が低メチル化されているという判定が細胞中のＥＲＢＢ２の過剰発現を示す、ＥＲＢＢ２遺伝子が癌細胞などの細胞中で過剰発現しているかどうかを判定する方法を提供する。
【００５６】
ＥＲＢＢ２遺伝子の過剰発現は、以前にトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）およびＴ−ＤＭ１などのＨＥＲ２阻害剤に対する応答と相関付けられた。例えば、ＷＯ９９／３１１４０、ＵＳ２００３／０１７０２３４、ＷＯ０１／８９５６６を参照のこと。それとして、本発明の別の態様は、患者がＥＲＢＢ２の低メチル化によって特徴付けられる癌に罹患している場合にＨＥＲ２阻害剤により患者を治療する方法を提供する。したがって、ＨＥＲ２阻害剤を含む療法による恩恵を示す可能性が高い個人を特定する方法であって、ＥＲＢＢ２遺伝子の一部における低メチル化を検出することを含み、ＥＲＢＢ２配列の約５０％未満、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２％または１％のメチル化が、個人が治療から恩恵を受ける可能性が高いことを示す、上記方法を本明細書で提供する。
【００５７】
１つの実施形態において、本発明は、治療上有効量のＨＥＲ２阻害剤を患者に投与することを含み、患者がＨＥＲ２阻害剤の投与前にＥＲＢＢ２の低メチル化によって特徴付けられる癌と診断され、ＥＲＢＢ２の低メチル化がＨＥＲ２阻害剤に対する患者による治療応答性の徴候である、対象における癌を治療する方法を提供する。１つの実施形態において、ＨＥＲ２阻害剤は、小分子または抗体である。１つの実施形態において、ＨＥＲ２阻害剤は、トラスツズマブまたはＴ−ＤＭ１などの抗体である。
【００５８】
本発明の別の態様は、患者の癌の試料のＥＲＢＢ２遺伝子のメチル化状態を検出し、ＥＲＢＢ２遺伝子が低メチル化されていることが検出される場合に治療のためにＨＥＲ２阻害剤を選択するステップを含む、癌患者に対する療法を選択する方法を提供する。
【００５９】
ＥＲＢＢ２遺伝子のメチル化状態を検出する上述の方法のいくつかの実施形態において、メチル化状態について解析するＥＲＢＢ２遺伝子の一部は、エンハンサー領域を含む。いくつかの実施形態において、ＥＲＢＢ２遺伝子の一部は、エンハンサー領域およびプロモーター領域を含む。いくつかの実施形態において、ＥＲＢＢ２遺伝子の一部は、ｃｈｒ１７：３７，８６１，１００〜３７，８６３，６５０の染色体位置（ＮＣＢＩ  ｂｕｉｌｄ  ３７／ｈｇ１９）におけるまたはそれを含む遺伝子の部分である。いくつかの実施形態において、ＥＲＢＢ２遺伝子の一部は、配列番号１によって表される配列である。いくつかの実施形態において、ＥＲＢＢ２遺伝子の一部は、配列番号１の６ＣｐＧ反復領域を含む。１つの実施形態において、ＥＲＢＢ２遺伝子の一部は、配列番号２の６ＣｐＧ反復領域を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態において、ＥＲＢＢ２遺伝子の一部は、定量的メチル化特異的ＰＣＲの前に前増幅する。
【００６１】
上述の方法の特定の実施形態において、ＥＲＢＢ２遺伝子または該遺伝子の特定の部分のメチル化状態は、ＥＲＢＢ２遺伝子配列の分析した部分の約５０％未満、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２％または１％のメチル化が検出される場合に低メチル化されていると判断される。
【００６２】
試料中の種々のバイオマーカーの存在および／またはレベル／量は、多くの方法論により分析することができ、それらの多くは、当技術分野で公知であり、当業者により理解されており、例えば、免疫組織化学（「ＩＨＣ」）、ウエスタンブロット分析、免疫沈降、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡ、蛍光活性化細胞選別（「ＦＡＣＳ」）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ、プロテオミクス、定量的血液ベースのアッセイ（例えば、血清ＥＬＩＳＡのような）、生化学的酵素活性アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、サザン分析、ノーザン分析、全ゲノム配列決定、定量的実時間ＰＣＲ（「ｑＲＴ−ＰＣＲ」）および例えば、分岐ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡ等などの他の増幅型検出法を含むポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、ＦＩＳＨ、マイクロアレイ分析、遺伝子発現プロファイリングおよび／または遺伝子発現の逐次分析（「ＳＡＧＥ」）、ならびにタンパク質、遺伝子および／または組織アレイ分析により実施することができる多種多様なアッセイのいずれか１つを含むが、これらに限定されない。遺伝子および遺伝子産物の状態を評価するための一般的なプロトコールは、例えば、Ausubelら編、1995年、Current Protocols In Molecular Biology、Units 2(ノーザンブロッティング)、4(サザンブロッティング)、15(免疫ブロッティング)および18(ＰＣＲ分析)に見いだされる。Ｒｕｌｅｓ  Ｂａｓｅｄ  ＭｅｄｉｃｉｎｅまたはＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（「ＭＳＤ」）から利用できるような多重免疫検定も用いることができる。
【００６３】
ＤＮＡメチル化の評価の方法は、周知である。例えば、Laird(2010年)、Nature Reviews Genetics、11巻、191〜203頁は、ＤＮＡメチル化解析のレビューを記載している。いくつかの実施形態において、メチル化を評価する方法は、ゲノムＤＮＡをランダムにせん断するまたはランダムに断片化すること、メチル化依存性またはメチル化感受性制限酵素によりＤＮＡを切断し、その後、切断または非切断ＤＮＡを選択的に同定し、かつ／または分析することを含む。選択的同定は、例えば、切断および非切断ＤＮＡを分離し（例えば、サイズにより）、切断された、あるいは切断されなかった対象の配列を定量することを含み得る。例えば、米国特許第７，１８６，５１２号を参照のこと。いくつかの実施形態において、方法は、制限酵素消化後の完全ＤＮＡを増幅し、それにより、増幅された部分における制限酵素により切断されなかったＤＮＡを増幅することのみを包含し得る。例えば、米国特許出願第１０／９７１，９８６号、第１１／０７１，０１３号および第１０／９７１，３３９号を参照のこと。いくつかの実施形態において、増幅は、遺伝子特異的であるプライマーを用いて実施することができる。あるいは、アダプターをランダムに断片化されたＤＮＡの末端に付加することができ、ＤＮＡをメチル化依存性またはメチル化感受性制限酵素により消化することができ、完全ＤＮＡを、アダプター配列とハイブリダイズするプライマーを用いて増幅することができる。いくつかの実施形態において、第２のステップは、ＤＮＡの増幅プールにおける特定の遺伝子の存在、非存在または量を決定するために実施することができる。いくつかの実施形態において、実時間定量的ＰＣＲを用いてＤＮＡを増幅する。
【００６４】
いくつかの実施形態において、該方法は、ゲノムＤＮＡの母集団内の標的配列における平均メチル化密度を定量化することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、遺伝子座における可能な制限酵素切断部位の少なくともいくつかのコピーが非切断のままであることを可能にする条件下で、ゲノムＤＮＡをメチル化依存性制限酵素またはメチル化感受性制限酵素と接触させること、遺伝子座の完全なコピーを定量化すること、および増幅生成物の量を対照ＤＮＡのメチル化の量を表す対照値と比較し、それにより、対照ＤＮＡのメチル化密度と比較して遺伝子座における平均メチル化密度を定量化することを含む。
【００６５】
ＤＮＡの遺伝子座のメチル化の量は、該遺伝子座を含むゲノムＤＮＡの試料を用意し、メチル化感受性またはメチル化依存性である制限酵素でＤＮＡを切断し、次いで、対象のＤＮＡ遺伝子座における完全ＤＮＡの量を定量化するまたは切断ＤＮＡの量を定量化することにより決定することができる。完全または切断ＤＮＡの量は、該遺伝子座を含有するゲノムＤＮＡの初期の量、該遺伝子座におけるメチル化の量およびゲノムＤＮＡにおけるメチル化されている遺伝子座におけるヌクレオチドの数（すなわち、断片）に依存する。ＤＮＡ遺伝子座におけるメチル化の量は、完全ＤＮＡまたは切断ＤＮＡの量を同様に処理したＤＮＡ試料中の完全ＤＮＡまたは切断ＤＮＡの量を表す対照値と比較することにより決定することができる。対照値は、メチル化ヌクレオチドの既知または予測数を表し得る。あるいは、対照値は、他の（例えば、正常、非異常）細胞における同じ遺伝子座または第２の遺伝子座の完全または切断ＤＮＡの量を表し得る。
【００６６】
遺伝子座における可能な制限酵素切断部位の少なくともいくつかのコピーが非切断のままであり、その後に残存する完全なコピーを定量化し、量を対照と比較することを可能にする条件下でメチル化感受性またはメチル化依存性制限酵素を用いることにより、遺伝子座の平均メチル化密度を測定することができる。遺伝子座における可能な制限酵素切断部位の少なくともいくつかのコピーが非切断のままであることを可能にする条件下でメチル化感受性制限酵素をＤＮＡ遺伝子座のコピーと接触させる場合、残存する完全ＤＮＡは、メチル化密度に正比例し、したがって、対照と比較して、試料中の遺伝子座の相対メチル化密度を決定することができる。同様に、遺伝子座における可能な制限酵素切断部位の少なくともいくつかのコピーが非切断のままであることを可能にする条件下でメチル化依存性制限酵素をＤＮＡ遺伝子座のコピーと接触させる場合、残存する完全ＤＮＡは、メチル化密度に反比例し、したがって、対照と比較して、試料中の遺伝子座の相対メチル化密度を決定することができる。そのようなアッセイは、例えば、米国特許出願第１０／９７１，９８６号に開示されている。
【００６７】
いくつかの実施形態において、定量的増幅法（例えば、定量的ＰＣＲまたは定量的線形増幅）を用いて、制限消化後の増幅プライマーにより両側に隣接される遺伝子座内の完全ＤＮＡの量を定量化することができる。定量的増幅の方法は、例えば、米国特許第６，１８０，３４９号、第６，０３３，８５４号および第５，９７２，６０２号、ならびに、例えば、Gibsonら、Genome Research、6巻、995〜1001頁(1996年)、DeGravesら、Biotechniques、34巻(1号)、106〜10頁、112〜5頁(2003年)、Deiman Bら、Mol Biotechnol.、20巻(2号)、163〜79頁(2002年)に開示されている。
【００６８】
ＤＮＡメチル化を検出するさらなる方法は、重亜硫酸塩によるＤＮＡの処理の前後のゲノム配列決定を含み得る。例えば、Frommerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89巻、1827〜1831頁(1992年)を参照のこと。重亜硫酸ナトリウムをＤＮＡと接触させる場合、非メチル化シトシンは、ウラシルに変換されるが、メチル化シトシンは、修飾されない。
【００６９】
いくつかの実施形態において、重亜硫酸塩変換ＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の制限酵素消化を用いて、ＤＮＡメチル化を検出する。例えば、SadriおよびHornsby、Nucl. Acids Res.、24巻、5058〜5059頁(1996年)、XiongおよびLaird、Nucleic Acids Res.、25巻、2532〜2534頁(1997年)を参照のこと。
【００７０】
いくつかの実施形態において、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを単独でまたは他の方法と組み合わせて用いて、ＤＮＡメチル化を検出する（Eadsら、Cancer Res.、59巻、2302〜2306頁(1999年)を参照）。手短に述べると、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ法において、ゲノムＤＮＡを重亜硫酸ナトリウム反応で変換する（重亜硫酸法は、非メチル化シトシン残基をウラシルに変換する）。次いで、ＣｐＧジヌクレオチドとハイブリダイズするＰＣＲプライマーを用いて対象のＤＮＡ配列の増幅を行う。非メチル化ＤＮＡの重亜硫酸塩変換により生ずる配列と（または別法として、変換されないメチル化配列と）のみハイブリダイズするプライマーを用いることにより、増幅は、プライマーがハイブリダイズする配列のメチル化状態を示し得る。同様に、増幅生成物は、非メチル化（またはメチル化）ＤＮＡの重亜硫酸塩処理により生ずる配列と特異的に結合するプローブを用いて検出することができる。所望の場合、プライマーとプローブの両方を用いて、メチル化状態を検出することができる。したがって、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔとともに用いるキットは、重亜硫酸ナトリウムならびに重亜硫酸塩で処理したメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとを区別するプライマーまたは検出可能に標識化されたプローブ（Ｔａｑｍａｎまたは分子ビーコンプローブを含むが、これらに限定されない）を含み得る。他のキット構成要素は、例えば、ＰＣＲ緩衝液、デオキシヌクレオチドおよび熱安定性ポリメラーゼを含むが、これらに限定されないＤＮＡの増幅に必要な試薬を含み得る。
【００７１】
いくつかの実施形態において、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ（メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長）反応を単独でまたは他の方法と組み合わせて用いて、ＤＮＡメチル化を検出する（GonzalgoおよびJones、Nucleic Acids Res.、25巻、2529〜2531頁(1997年)を参照）。Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ法は、ＤＮＡの重亜硫酸塩処理とそれに続く単一ヌクレオチドプライマー伸長に基づき特定のＣｐＧ部位におけるメチル化の差異を評価するための定量的方法である。手短に述べると、ゲノムＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムと反応させて、非メチル化シトシンをウラシルに変換するが、５−メチルシトシンは未変化のままとする。次いで、所望の標的配列の増幅を、重亜硫酸塩変換ＤＮＡに特異的なＰＣＲプライマーを用いて行い、得られた生成物を単離し、対象のＣｐＧ部位（単数または複数）におけるメチル化解析のための鋳型として用いる。
【００７２】
いくつかの実施形態において、メチル化特異的ＰＣＲ（「ＭＳＰ」）反応を単独でまたは他の方法と組み合わせて用いて、ＤＮＡメチル化を検出する。ＭＳＰアッセイは、すべての非メチル化シトシンをウラシルに変換するが、メチル化シトシンは変換しない、重亜硫酸ナトリウムによるＤＮＡの最初の修飾、およびメチル化対非メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーによるその後の増幅を伴う。Hermanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93巻、9821〜9826頁(1996年)、米国特許第５，７８６，１４６号を参照のこと。いくつかの実施形態において、ＤＮＡメチル化を、ＱＩＡＧＥＮ  ＰｙｒｏＭａｒｋ  ＣｐＧ  Ａｓｓａｙ予備デザイン（predesigned）ピロシークエンスＤＮＡメチル化アッセイにより検出する。
【００７３】
いくつかの実施形態において、細胞メチル化状態を高処理ＤＮＡメチル化解析を用いて判定して、ＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性を判断する。簡潔に述べると、当技術分野における標準的アッセイを用いてゲノムＤＮＡを細胞または組織試料（例えば、腫瘍試料または血液試料）から単離し、重亜硫酸ナトリウム反応で変換する（重亜硫酸塩法は、非メチル化シトシン残基をウラシルに変換する）。当技術分野における標準的アッセイを用いて重亜硫酸塩変換ＤＮＡ産物を増幅し、断片化し、ゲノムにおけるＣｐＧ部位を含有するアレイとハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの後、アレイを撮像し、当技術分野における標準的アッセイを用いてＤＮＡメチル化状態の解析のために処理する。いくつかの実施形態において、組織試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織である。いくつかの実施形態において、組織試料は、新鮮な凍結組織である。いくつかの実施形態において、組織試料から単離したＤＮＡを重亜硫酸塩変換の前に前増幅する。いくつかの実施形態において、組織試料から単離したＤＮＡを重亜硫酸塩変換の前に、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑを用いるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ１ステップＲＴ−ＰＣＲシステムを用いて前増幅する。いくつかの実施形態において、組織試料から単離したＤＮＡを重亜硫酸塩変換の前にＴａｑｍａｎベースのアッセイを用いて前増幅する。いくつかの実施形態において、重亜硫酸ナトリウム反応をＺｙｍｏ  ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎキットを用いて行わせる。いくつかの実施形態において、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０  Ｂｅａｄｃｈｉｐキットを用いて重亜硫酸塩変換ＤＮＡを増幅し、アレイとハイブリダイズさせる。いくつかの実施形態において、アレイをＩｌｌｕｍｉｎａ  ｉＳｃａｎ  Ｒｅａｄｅｒで撮像する。いくつかの実施形態において、画像をＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏソフトウエアメチル化モジュールを用いて処理する。いくつかの実施形態において、メチル化データをＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｌｕｍｉソフトウエアパッケージを用いて解析する。Duら、Bioinformatics、24巻(13号)、1547〜1548頁(2008年)を参照のこと。
【００７４】
いくつかの実施形態において、ＥＲＢＢ２  ＤＮＡメチル化部位を重亜硫酸塩配列決定ＰＣＲ（ＢＳＰ）を用いて同定して、ＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性を判断する。手短に述べると、当技術分野における標準的アッセイを用いてゲノムＤＮＡを細胞または組織試料（例えば、腫瘍試料または血液試料）から単離し、重亜硫酸ナトリウム反応で変換する（重亜硫酸塩法は、非メチル化シトシン残基をウラシルに変換する）。重亜硫酸塩変換ＤＮＡ産物を重亜硫酸塩変換ＤＮＡに特異的であるようにデザインされたプライマー（例えば、重亜硫酸塩特異的プライマー）を用いて増幅し、当技術分野における標準的アッセイを用いて宿主細胞内へのトランスフォーメーションのためのベクターにライゲーションする。対象のＰＣＲ増幅重亜硫酸塩変換ＤＮＡ産物を含有する宿主細胞の選択の後、ＤＮＡ産物を単離し、当技術分野における標準的アッセイを用いて配列決定を行って、メチル化の部位を決定する。いくつかの実施形態において、組織試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織である。いくつかの実施形態において、組織試料は、例えば、ＥＲＢＢ２発現についての、ＩＨＣ解析のために処理したＦＦＰＥ組織である。いくつかの実施形態において、組織試料は、ＩＨＣによりほとんどまたは全くＥＲＢＢ２発現を示さなかったＦＦＰＥ組織である。いくつかの実施形態において、組織試料は、新鮮な凍結組織である。いくつかの実施形態において、組織試料から単離したＤＮＡを重亜硫酸塩変換の前に前増幅する。いくつかの実施形態において、組織試料から単離したＤＮＡを重亜硫酸塩変換の前に、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑを用いるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ１ステップＲＴ−ＰＣＲシステムを用いて前増幅する。いくつかの実施形態において、組織試料から単離したＤＮＡを重亜硫酸塩変換の前にＴａｑｍａｎベースのアッセイを用いて前増幅する。いくつかの実施形態において、重亜硫酸ナトリウム反応をＺｙｍｏ  ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄキットを用いて行う。いくつかの実施形態において、重亜硫酸塩変換ＤＮＡに特異的であるようにデザインされたプライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｅｔｈｙｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウエアを用いてデザインされている。いくつかの実施形態において、重亜硫酸塩変換ＤＮＡ産物をＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑを用いるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ１ステップＲＴ−ＰＣＲシステムを用いてＰＣＲ増幅する。さらなる実施形態において、ＰＣＲ増幅重亜硫酸塩変換ＤＮＡ産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキットを用いてベクターにライゲーションする。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、細菌である。いくつかの実施形態において、対象の単離ＰＣＲ増幅重亜硫酸塩変換ＤＮＡ産物をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０ｘ１  ＤＮＡアナライザーを用いて配列決定する。いくつかの実施形態において、重亜硫酸塩変換ＤＮＡに特異的であるようにデザインされたプライマーは、Ｑｉａｇｅｎ  ＰｙｒｏＭａｒｋ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎソフトウエアを用いてデザインされている。いくつかの実���形態において、重亜硫酸塩変換ＤＮＡ産物をＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑを用いるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ１ステップＲＴ−ＰＣＲシステムを用いてＰＣＲ増幅する。さらなる実施形態において、ＰＣＲ増幅重亜硫酸塩変換ＤＮＡ産物をＱｉａｇｅｎ  Ｐｙｒｏｍａｒｋ  Ｑ２４を用いて配列決定し、Ｑｉａｇｅｎ  ＰｙｒｏＭａｒｋソフトウエアを用いて解析する。
【００７５】
いくつかの実施形態において、ＥＲＢＢ２  ＤＮＡメチル化部位を定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ＱＭＳＰ）を用いて同定して、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２阻害剤に対する感受性を判断する。手短に述べると、当技術分野における標準的アッセイを用いてゲノムＤＮＡを細胞または組織試料から単離し、重亜硫酸ナトリウム反応で変換する（重亜硫酸塩法は、非メチル化シトシン残基をウラシルに変換する）。いくつかの実施形態において、組織試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織である。いくつかの実施形態において、組織試料は、例えば、ＥＲＢＢ２発現についての、ＩＨＣ解析のために処理したＦＦＰＥ組織である。いくつかの実施形態において、組織試料は、ＩＨＣによりほとんどまたは全くＥＲＢＢ２発現を示さなかったＦＦＰＥ組織である。いくつかの実施形態において、組織試料は、新鮮な凍結組織である。重亜硫酸塩変換ＤＮＡ産物を重亜硫酸塩変換ＤＮＡに特異的であるようにデザインされたプライマー（例えば、定量的メチル化特異的ＰＣＲプライマー）を用いて増幅する。重亜硫酸塩変換ＤＮＡ産物を定量的メチル化特異的ＰＣＲプライマーを用いて増幅し、当技術分野における標準的アッセイを用いてメチル化について解析する。いくつかの実施形態において、組織試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織である。いくつかの実施形態において、組織試料は、新鮮な凍結組織である。いくつかの実施形態において、組織試料から単離したＤＮＡを重亜硫酸塩変換の前にＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑを用いるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ１ステップＲＴ−ＰＣＲシステムを用いて前増幅する。いくつかの実施形態において、組織試料から単離したＤＮＡを重亜硫酸塩変換の前に前増幅する。いくつかの実施形態において、組織試料から単離したＤＮＡを重亜硫酸塩変換の前にＴａｑｍａｎベースのアッセイを用いて前増幅する。いくつかの実施形態において、重亜硫酸ナトリウム反応を市販のキットを用いて行わせる。いくつかの実施形態において、重亜硫酸ナトリウム反応をＺｙｍｏ  ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄキットを用いて行わせる。いくつかの実施形態において、重亜硫酸塩変換ＤＮＡに特異的であるようにデザインされたプライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｅｔｈｙｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウエアを用いてデザインされている。いくつかの実施形態において、重亜硫酸塩変換ＤＮＡをＴａｑｍａｎベースのアッセイを用いて増幅する。いくつかの実施形態において、重亜硫酸塩変換ＤＮＡをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴで増幅し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＤＳソフトウエアを用いて解析する。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本発明は、１）腫瘍試料のＩＨＣ解析と、それに続く２）ステップ１のＩＨＣ解析に用いた腫瘍組織から抽出したＤＮＡの定量的メチル化特異的ＰＣＲによりＥＲＢＢ２のメチル化を判定する方法を提供する。手短に述べると、ＩＨＣスライド標本のカバーガラスを２つの方法のうちの１つにより除去する。すなわち、スライド標本を冷凍庫に少なくとも１５分間入れ、次いでかみそりの刃を用いてカバーガラスを顕微鏡スライド標本から取り外す。次いで、スライド標本をキシレン中で室温でインキュベートして、封入剤を溶解する。別法として、スライド標本をカバーガラスが離れ落ちるまでキシレン中に浸漬する。これは、最長で数日間を必要とし得る。すべてのスライド標本を５分間のキシレン（ｘ３）および５分間の１００％エタノール（ｘ２）の脱パラフィン化処置を経て取り出す。組織をかみそりの刃を用いてスライドからかき落とし、プロテイナーゼＫを含有する組織溶解緩衝液に入れ、５６℃で一夜インキュベートする。インキュベーションの後に組織が依然として存在する場合、余分の１０μｌのプロテイナーゼＫを加えてもよく、組織をさらに３０分間インキュベートする。ＤＮＡ抽出は、例えば、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥ  Ｔｉｓｓｕｅキットを用いることにより継続した。ＩＨＣスライド標本から直接抽出されたＤＮＡを上述のＱＭＳＰ３プライマーおよびプローブを用いたＱＭＳＰ解析にかけた。
【００７７】
いくつかの実施形態において、重亜硫酸塩変換ＤＮＡを大規模シークエンス法により配列決定する。大規模シークエンス法は、配列が複数回読まれる、直接ピロシークエンス法のような方法である。大規模シークエンス法は、まれな突然変異のようなまれな事象を検出するために用いることができる。限られた数の遺伝子座の超大規模シークエンス法は、ＰＣＲ産物の直接ピロシークエンス法により、および単一ランにおける１００を超えるＰＣＲ産物の配列決定により達成することができた。重亜硫酸塩変換ＤＮＡの配列決定における課題は、シトシン残基のチミン（ウラシル）残基への重亜硫酸塩変換後のその低い配列の複雑さから生じる。ＤＮＡ断片のサイズ分画により配列決定のためのゲノムの一部の領域のみを選択することによって配列冗長性を減少させるために重亜硫酸塩処理による配列決定部位の制限（Reduced representation bisulphite sequencing）（ＲＲＢＳ）を導入することができる（Laird, PW、Nature Reviews、11巻、195〜203頁(2010年)）。ターゲティングは、配列決定の前のアレイ捕捉またはパッドロック捕捉により達成することができる。例えば、固定アレイ上または溶液ハイブリッド選択による標的化捕捉は、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドのライブラリにより標的とされる配列について濃縮することができ、亜硫酸塩変換の前または後に実施することができる。あるいは、パッドロック捕捉は、２つのテザードプローブのアニーリング特異性の増大を合わせることによる濃縮効率の改善をもたらし、ユニバーサルプライマーによるその後の増幅により、遺伝子座特異的プライマーによる増幅よりも均一な再現が可能となる。
【００７８】
さらなるメチル化の検出方法は、メチル化ＣｐＧアイランド増幅（Toyotaら、Cancer Res.、59巻、2307〜12頁(1999年)を参照）ならびに例えば、米国特許出願公開第２００５／００６９８７９号、Reinら、Nucleic Acids Res.、26巻(10号)、2255〜64頁(1998年)、Olekら、Nat Genet.、17巻(3号)、275〜6頁(1997年)、Laird, PW、Nature Reviews、11巻、195〜203頁(2010年)およびＰＣＴ公開番号ＷＯ００／７００９０に記載されているものを含むが、これらに限定されない。
【００７９】
いくつかの実施形態において、細胞におけるＥＲＢＢ２の発現は、細胞におけるＥＲＢＢ２  ｍＲＮＡを評価することにより確認される。細胞におけるｍＲＮＡｓの評価の方法は、周知であり、例えば、相補的ＤＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーションアッセイ（１つまたは複数の遺伝子に対して特異的な標識リボプローブを用いるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロットおよび関連技術など）および様々な核酸増幅アッセイ（１つまたは複数の遺伝子に対して特異的な相補的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲおよび例えば、分岐ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡ等などの他の増幅型検出法など）を含む。いくつかの実施形態において、試験試料中のＥＲＢＢ２の発現を参照試料と比較する。例えば、試験試料は、腫瘍組織試料であり得、参照試料は、正常組織またはＰＢＭＣｓなどの細胞であり得る。
【００８０】
哺乳動物からの試料は、ノーザン、ドットブロットまたはＰＣＲ分析を用いてｍＲＮＡｓについて好都合にアッセイすることができる。さらに、そのような方法は、生物学的試料中の標的ｍＲＮＡのレベルを決定する（例えば、アクチンファミリーメンバーなどの「ハウスキーピング」遺伝子の比較対照ｍＲＮＡ配列のレベルを同時に検査することにより）ことを可能にする１つまたは複数のステップを含み得る。場合によって、増幅標的ｃＤＮＡの配列を決定することができる。
【００８１】
本発明の任意選択の方法は、マイクロアレイ技術により組織または細胞試料中の標的ｍＲＮＡｓなどのｍＲＮＡｓを検査または検出するプロトコールを含む。核酸マイクロアレイを用いて、試験および対照組織試料から得られる試験および対照ｍＲＮＡ試料を逆転写し、標識して、ｃＤＮＡプローブを作製する。次いで、プローブを、固体担体上に固定化した核酸のアレイとハイブリダイズさせる。アレイは、アレイの各メンバーの配列および位置が既知であるように構成されている。例えば、それらの発現が抗血管新生療法の臨床的恩恵の増大または低減と相関する遺伝子の選択を固体担体上に配置することができる。標識プローブと特定のアレイメンバーとのハイブリダイゼーションは、プローブが得られた試料が当該遺伝子を発現することを示している。
【００８２】
いくつかの実施形態によれば、存在および／またはレベル／量は、前述の遺伝子のタンパク質発現レベルを観測することにより測定される。特定の実施形態において、該方法は、バイオマーカーの結合を可能にする条件下で生物学的試料を本明細書で述べるバイオマーカーに対する抗体と接触させること、および抗体とバイオマーカーとの間に複合体が形成されているかどうかを検出することを含む。
【００８３】
特定の実施形態において、試料中のバイオマーカータンパク質の存在および／またはレベル／量は、ＩＨＣおよび染色プロトコールを用いて検査する。組織切片のＩＨＣ染色は、試料中のタンパク質を測定するまたはその存在を検出する信頼できる方法であることが示された。１つの態様において、バイオマーカーのレベルは、（ａ）抗体を用いて試料（対象癌試料など）のＩＨＣ解析を行うこと、および（ｂ）試料中のバイオマーカーのレベルを測定することを含む方法を用いて測定する。いくつかの実施形態において、ＩＨＣ染色強度は、参照値を基準として決定する。
【００８４】
ＩＨＣは、形態学的染色および／または蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの追加の技術と組み合わせて実施することができる。ＩＨＣの２つの一般的方法、すなわち、直接および間接アッセイが利用可能である。第１のアッセイによれば、標的抗原への抗体の結合が直接的に測定される。この直接アッセイでは、さらなる抗体相互作用なしに視覚化することができる蛍光タグまたは酵素標識一次抗体などの標識試薬を用いる。一般的な間接アッセイでは、非コンジュゲート一次抗体が抗原に結合し、次に標識二次抗体が一次抗体に結合する。二次抗体を酵素標識にコンジュゲートさせる場合、抗原の視覚化をもたらすために発色または蛍光発生基質を加える。いくつかの二次抗体が一次抗体上の異なるエピトープと反応し得るので、シグナル増幅が起こる。
【００８５】
ＩＨＣに用いられる一次および／または二次抗体は、一般的に検出可能な部分により標識される。一般的に以下のカテゴリーに分類することができる多数の標識が利用可能である：（ａ）３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈおよび１３１Ｉなどの放射性同位体、（ｂ）コロイド状金粒子、（ｃ）希土類キレート（ユウロピウムキレート）、テキサスレッド、ローダミン、フルオレセイン、ダンシル、リサミン、ウンベリフェロン、フィコクリセリン、フィコシアニンもしくはＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＯＲＡＮＧＥ７およびＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＧＲＥＥＮ７のような市販の蛍光プローブおよび／または上記のいずれか１つもしくは複数の誘導体を含むが、これらに限定されない蛍光標識、（ｄ）様々な酵素−基質の標識が入手でき、米国特許第４，２７５，１４９号は、これらの一部のレビューを記載している。酵素標識の例は、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなど）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどを含む。
【００８６】
酵素−基質の組合せの例は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と基質としての水素ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と発色基質としてのパラ−ニトロフェニルリン酸、およびβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）と発色基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光発生基質（例えば、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）を含む。これらの一般的なレビューについては、米国特許第４，２７５，１４９号および第４，３１８，９８０号を参照のこと。
【００８７】
そのようにして調製した試料をマウントし、カバーガラスをのせる。次いで、スライド標本の評価を、例えば、顕微鏡を用いて行い、当技術分野で常用されている染色強度基準を用いることができる。いくつかの実施形態において、約１＋以上の染色パターンスコアは、徴候および／または前兆を示す。特定の実施形態において、ＩＨＣアッセイにおける約２＋以上の染色パターンスコアは、徴候および／または前兆を示す。他の実施形態において、約３＋以上の染色パターンスコアは、徴候および／または前兆を示す。１つの実施形態において、腫瘍または結腸腺腫からの細胞および／または組織をＩＨＣを用いて検査する場合、腫瘍細胞および／または組織（試料に存在し得る間質または周囲組織と対立するものとして）における染色を一般的に測定または評価することが理解される。
【００８８】
代替法において、抗体−バイオマーカー複合体が形成するのに十分な条件下で試料をバイオマーカーに対して特異的な抗体と接触させ、次いで、複合体を検出することができる。バイオマーカーの存在は、血漿および血清を含む多種多様な組織および試料をアッセイするための例えば、ウエスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡ法などの多くの方法で検出することができる。そのようなアッセイ法を用いる広範囲の免疫検定法が利用できる。例えば、米国特許第４，０１６，０４３号、第４，４２４，２７９号および第４，０１８，６５３号を参照のこと。これらは、非競合的タイプのならびに伝統的な競合結合アッセイにおける単一部位および２部位または「サンドイッチ」アッセイの両方を含む。これらのアッセイは、標的バイオマーカーへの標識抗体の直接結合も含む。
【００８９】
組織または細胞試料中の選択されるバイオマーカーの存在および／またはレベル／量は、機能または活性ベースのアッセイによっても検査することができる。例えば、バイオマーカーが酵素である場合、組織または細胞試料中の所定の酵素活性を測定またはその存在を検出するための当技術分野で公知のアッセイを行うことができる。
【００９０】
特定の実施形態において、試料は、アッセイしたバイオマーカーの量および用いた試料の品質の変動性における差ならびにアッセイラン間の変動について標準化する。そのような標準化は、ＡＣＴＢなどの周知のハウスキーピング遺伝子を含む特定の標準化バイオマーカーを検出し、そのレベルを組み込むことによって達成することができる。あるいは、標準化は、アッセイした遺伝子またはその大サブセットのすべてのシグナルの平均値または中央値に基づくものであり得る（包括的標準化アプローチ）。遺伝子ごとに、対象腫瘍ｍＲＮＡまたはタンパク質の測定された標準化量を参照セットに見いだされる量と比較する。対象ごとの試験した腫瘍当たりの各ｍＲＮＡまたはタンパク質の標準化発現レベルは、参照セットにおける測定された発現レベルの百分率として表すことができる。分析すべき特定の対象試料中の測定された存在および／または発現レベル／量は、当技術分野で周知の方法により測定することができる、この範囲内のある百分位数となる。
【００９１】
特定の実施形態において、遺伝子の相対発現レベルは、以下のように求められる。
【００９２】
相対発現遺伝子１試料１＝２ｅｘｐ（Ｃｔハウスキーピング遺伝子−Ｃｔ遺伝子１）（試料中の測定されたＣｔを用いた）
【００９３】
相対発現遺伝子１参照ＲＮＡ＝２ｅｘｐ（Ｃｔハウスキーピング遺伝子−Ｃｔ遺伝子１）（参照試料中の測定されたＣｔを用いた）
【００９４】
標準化相対発現遺伝子１試料１＝（相対発現遺伝子１試料１／相対発現遺伝子１参照ＲＮＡ）ｘ１００
【００９５】
Ｃｔは、閾値サイクルである。Ｃｔは、反応において発生した蛍光が閾値線と交差するサイクル数である。
【００９６】
すべての実験は、様々な組織源からのＲＮＡの包括的な混合物である参照ＲＮＡ（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡからの参照ＲＮＡ＃６３６５３８）に対して標準化する。同一参照ＲＮＡは、異なる実験ランの間の結果の比較を可能にする各ｑＲＴ−ＰＣＲランに含まれる。
【００９７】
１つの実施形態において、試料は、臨床試料である。別の実施形態において、試料を診断アッセイに用いる。いくつかの実施形態において、試料は、原発または転移性腫瘍から得られる。組織生検は、腫瘍組織の代表的な断片を得るためにしばしば用いられる。あるいは、腫瘍細胞は、対象の腫瘍細胞を含有することが公知または含有すると考えられる組織または体液の形で間接的に得ることができる。例えば、肺癌病巣の試料は、切除、気管支鏡法、微細針吸引、気管支擦過により、または痰、胸水もしくは血液から得ることができる。いくつかの実施形態において、試料は、循環腫瘍細胞、例えば、血液、尿または痰中の循環癌細胞を含む。遺伝子または遺伝子産物は、癌もしくは腫瘍組織からまたは尿、痰、血清もしくは血漿などの他の身体試料から検出することができる。癌性試料中の標的遺伝子または遺伝子産物の検出のための上述の同じ技術を他の身体試料に適用することができる。癌細胞は、癌病巣から脱落し、そのような身体試料中に出現する可能性がある。そのような身体試料をスクリーニングすることにより、これらの癌について簡単な早期の診断を達成することができる。さらに、標的遺伝子または遺伝子産物についてそのような身体試料を試験することによってより容易に治療の経過をモニターすることができる。
【００９８】
特定の実施形態において、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞または対照組織は、試験試料が得られる時点の他の１つまたは複数の異なる時点に得られる同じ対象または個人からの単一試料またはすべてを含めた複数試料である。例えば、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞または対照組織は、試験試料が得られる時点より早い時点に同じ対象または個体から得られる。そのような参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞または対照組織は、参照試料が癌の最初の診断時に得られ、試験試料が癌が転移性になる後期に得られる場合に有用であり得る。
【００９９】
特定の実施形態において、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞または対照組織は、該対象または個人でない１人または複数人の健常人からのすべてを含めた複数試料である。特定の実施形態において、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞または対照組織は、該対象または個人でない疾患または障害（例えば、癌）を有する１人または複数人の個人からのすべてを含めた複数試料である。特定の実施形態において、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞または対照組織は、該対象または個人でない１人または複数人の個人からの正常組織からのプールされたＲＮＡ試料またはプールされた血漿もしくは血清試料である。特定の実施形態において、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞または対照組織は、該対象または個人でない疾患または障害（例えば、癌）を有する１人または複数人の個人からの腫瘍組織からのプールされたＲＮＡ試料またはプールされた血漿もしくは血清試料である。
【０１００】
本発明の方法において、組織試料は、血液、尿、唾液、便、胸水、リンパ液、痰、腹水、前立腺液、脳脊髄液（ＣＳＦ）などの体液もしくは排泄物、または他の体分泌物もしくはその派生物であり得る。血液とは、全血、血漿、血清または血液の派生物を含むことを意味する。そのような体液または排泄物中の腫瘍上皮または間葉バイオマーカーの評価は、侵襲的な試料採取法が不適切または不都合である状況において時には好ましいことがあり得る。
【０１０１】
本発明の方法において、腫瘍細胞は、肺癌腫瘍細胞（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、膵臓癌腫瘍細胞、乳癌腫瘍細胞、頭頸部癌腫瘍細胞、胃癌腫瘍細胞、結腸癌腫瘍細胞、卵巣癌腫瘍細胞または下文で述べるような様々な他の癌のいずれかの腫瘍細胞であり得る。腫瘍細胞は、好ましくは、充実性腫瘍のすべての腫瘍細胞と同様に、ＥＧＦＲを発現することが公知または予想される型のものである。ＥＧＦＲキナーゼは、野生型または変異体であり得る。
【０１０２】
本発明の方法において、腫瘍は、肺癌腫瘍（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、膵臓癌腫瘍、乳癌腫瘍、頭頸部癌腫瘍、胃癌腫瘍、結腸癌腫瘍、卵巣癌腫瘍または下文で述べるような様々な他の癌のいずれかの腫瘍であり得る。腫瘍は、好ましくは、その細胞がすべての充実性腫瘍と同様に、ＥＧＦＲを発現することが公知または予想される型のものである。ＥＧＦＲは、野生型または変異体であり得る。
【０１０３】
阻害剤および医薬組成物
本発明に使用するのに適する具体例としてのＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、例えば、以下の特許公開に記載されているようなキナゾリンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ピリド−ピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ピリミド−ピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ピロロ−ピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ピラゾロ−ピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、フェニルアミノ−ピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、オキシンドールＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、インドロカルバゾールＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、フタラジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、イソフラボンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、キナロンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤およびチルホスチンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤ならびにＥＧＦＲキナーゼ阻害剤のすべての薬学的に許容される塩および溶媒和物を含む：国際特許公開番号ＷＯ９６／３３９８０、ＷＯ９６／３０３４７、ＷＯ９７／３００３４、ＷＯ９７／３００４４、ＷＯ９７／３８９９４、ＷＯ９７／４９６８８、ＷＯ９８／０２４３４、ＷＯ９７／３８９８３、ＷＯ９５／１９７７４、ＷＯ９５／１９９７０、ＷＯ９７／１３７７１、ＷＯ９８／０２４３７、ＷＯ９８／０２４３８、ＷＯ９７／３２８８１、ＷＯ９８／３３７９８、ＷＯ９７／３２８８０、ＷＯ９７／３２８８、ＷＯ９７／０２２６６、ＷＯ９７／２７１９９、ＷＯ９８／０７７２６、ＷＯ９７／３４８９５、ＷＯ９６／３１５１０、ＷＯ９８／１４４４９、ＷＯ９８／１４４５０、ＷＯ９８／１４４５１、ＷＯ９５／０９８４７、ＷＯ９７／１９０６５、ＷＯ９８／１７６６２、ＷＯ９９／３５１４６、ＷＯ９９／３５１３２、ＷＯ９９／０７７０１およびＷＯ９２／２０６４２、欧州特許出願番号ＥＰ５２０７２２、ＥＰ５６６２２６、ＥＰ７８７７７２、ＥＰ８３７０６３およびＥＰ６８２０２７、米国特許第５，７４７，４９８号、第５，７８９，４２７号、第５，６５０，４１５号および第５，６５６，６４３号ならびにドイツ特許出願番号ＤＥ１９６２９６５２。低分子量ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤のさらなる非限定的な例は、Taxler, P.、1998年、Exp. Opin. Ther. Patents、8巻(12号)、1599〜1625頁に記載されているＥＧＦＲキナーゼ阻害剤のいずれかを含む。
【０１０４】
本発明により用いることができる低分子量ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の特定の好ましい例は、［６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリン−４−イル］−（３−エチニルフェニル）アミン（ＯＳＩ−７７４、エルロチニブまたはＴＡＲＣＥＶＡ（商標）（エルロチニブＨＣｌ）；ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅとしても公知である）（米国特許第５，７４７，４９８号、国際特許公開番号ＷＯ０１／３４５７４およびMoyer, J.D.ら(1997年)、Cancer Res.、57巻、4838〜4848頁）、ＣＩ−１０３３（以前はＰＤ１８３８０５として公知、Ｐｆｉｚｅｒ）（Sherwoodら、1999年、Proc. Am. Assoc. Cancer Res.、40巻、723頁）、ＰＤ−１５８７８０（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＡＧ−１４７８（カリフォルニア大学）、ＣＧＰ−５９３２６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＰＫＩ−１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＥＫＢ−５６９（Ｗｙｅｔｈ）、ＧＷ−２０１６（ＧＷ−５７２０１６またはラパチニブジトシル酸塩；ＧＳＫとしても公知）およびゲフィチニブ（ＺＤ１８３９またはＩＲＥＳＳＡ（商標）；Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａとしても公知）（Woodburnら、1997年、Proc. Am. Assoc. Cancer Res.、38巻、633頁）を含む。本発明により用いることができる特に好ましい低分子量ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、［６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリン−４−イル］−（３−エチニルフェニル）アミン（すなわち、エルロチニブ）、その塩酸塩（すなわち、エルロチニブＨＣｌ、ＴＡＲＣＥＶＡ（商標））または他の塩形態（例えば、エルロチニブメシル酸塩）である。
【０１０５】
抗体ベースのＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、その天然配位子によるＥＧＦＲの活性化を部分的または完全に遮断することができる任意の抗ＥＧＦＲ抗体または抗体断片を含む。抗体ベースのＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の非限定的な例は、Modjtahedi, H.ら、1993年、Br. J. Cancer、67巻、247〜253頁、Teramoto, T.ら、1996年、Cancer、77巻、639〜645頁、Goldsteinら、1995年、Clin. Cancer Res.、1巻、1311〜1318頁、Huang, S. M.ら、1999年、Cancer Res.、15:59巻(8号)、1935〜40頁およびYang, X.ら、1999年、Cancer Res.、59巻、1236〜1243頁に記載されているものを含む。したがって、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、モノクローナル抗体Ｍａｂ  Ｅ７．６．３（Yang, X. D.ら(1999年)、Cancer Res.、59巻、1236〜43頁）またはＭａｂ  Ｃ２２５（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−８５０８）またはその結合特異性を有する抗体もしくは抗体断片であり得る。適切なモノクローナル抗体ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、ＩＭＣ−Ｃ２２５（セツキシマブまたはＥＲＢＩＴＵＸ（商標）；Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓとしても公知）、ＡＢＸ−ＥＧＦ（Ａｂｇｅｎｉｘ）、ＥＭＤ７２０００（Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）、ＲＨ３（Ｙｏｒｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）およびＭＤＸ−４４７（Ｍｅｄａｒｅｘ／Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ）を含むが、これらに限定されない。
【０１０６】
様々なＨＥＲ２阻害剤が当技術分野で公知である。これらの阻害剤は、抗ＨＥＲ２抗体を含む。そのような抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。それらは、いわゆるキメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体のいずれかであり得る。ヒト化抗ＨＥＲ２抗体の例は、ＩＮＮ名トラスツズマブおよびペルツズマブのもとに公知である。トラスツズマブは、商品名ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）のもとにＧｅｎｅｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．およびＦ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｌｔｄにより販売されている。トラスツズマブは、マウス４Ｄ５抗体（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１０４６３、１９９０年５月２４日のブダペスト条約に基づいてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．２０８５２により寄託された）のまたはそれに由来する抗原結合残基を有する抗体である。具体例としてのヒト化４Ｄ５抗体は、ＵＳ５８２１３３７におけるようなｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７およびｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））を含む。
【０１０７】
別の適切な抗ＨＥＲ２抗体は、抗体−薬物コンジュゲート（ＣＡＳ登録番号１３９５０４−５０−０）であるトラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１（Ｔ−ＤＭ１）であり、以下の構造を有する。
【０１０８】
2014525270.tif 000002
式中、Ｔｒは、リンカー部分ＭＣＣを介してメイタンシノイド薬物部分ＤＭＩ（ＵＳ５２０８０２０、ＵＳ６４４１１６３）に結合しているトラスツズマブである。薬物と抗体との比または薬物負荷は、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１の上記の構造においてｐにより表し、整数値の範囲は、１〜約８である。薬物負荷値ｐは、１〜８である。トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つおよび８つの薬物部分が抗体トラスツズマブに共有結合している様々に負荷され、結合した抗体−薬物コンジュゲートのすべての混合物を含む（ＵＳ７０９７８４０、ＵＳ２００５／０２７６８１２、ＵＳ２００５／０１６６９９３）。
【０１０９】
様々な特性を有する他のＨＥＲ２抗体は、Tagliabueら、Int. J. Cancer、47巻、933〜937頁(1991年)、McKenzieら、Oncogene、4巻、543〜548頁(1989年)、Cancer Res.、51巻、5361〜5369頁(1991年)、Bacusら、Molecular Carcinogenesis、3巻、350〜362頁(1990年)、Stancovskiら、PNAS(USA)、88巻、8691〜8695頁(1991年)、Bacusら、Cancer Research、52巻、2580〜2589頁(1992年)、Xuら、Int. J. Cancer、53巻、401〜408頁(1993年)、ＷＯ９４／００１３６、Kasprzykら、Cancer Research、52巻、2771〜2776頁(1992年)、Hancockら、Cancer Res.、51巻、4575〜4580頁(1991年)、Shawverら、Cancer Res.、54巻、1367〜1373頁(1994年)、Arteagaら、Cancer Res.、54巻、3758〜3765頁(1994年)、Harwerthら、J. Biol. Chem.、267巻、15160〜15167頁(1992年)、米国特許第５，７８３，１８６号およびKlapperら、Oncogene、14巻、2099〜2109頁(1997年)に記載された。ＨＥＲ２抗原およびそれに対して誘導される抗体に関するさらなる詳細は、多くの特許および非特許刊行物に記載されている（適切な概要については米国特許第５，８２１，３３７号およびＷＯ２００６／０４４９０８を参照）。
【０１１０】
本発明の方法は、ＥＧＦＲおよびさらなる標的を阻害する化合物に拡大することができる。これらの化合物は、本明細書で「二重特異性阻害剤」と呼ぶ。１つの実施形態において、二重特異性阻害剤は、二重特異性ＨＥＲ３／ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ４またはＥＧＦＲ  ｃ−Ｍｅｔ阻害剤である。１つの実施形態において、二重特異性阻害剤は、二重特異性抗体である。１つの実施形態において、二重特異性阻害剤は、ＥＧＦＲおよび第２の標的に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体である。１つの実施形態において、二重特異性阻害剤は、ＨＥＲ３およびＥＧＦＲに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体である。１つの実施形態において、二重特異性ＨＥＲ３／ＥＧＦＲ阻害剤は、２つの同じ抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体である。そのような抗体は、ＵＳ８，１９３，３２１、２００８００６９８２０、ＷＯ２０１０１０８１２７、ＵＳ２０１００２５５０１０およびSchaeferら、Cancer Cell、20巻、472〜486頁(2011年)に記載されている。１つの実施形態において、二重特異性ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ阻害剤は、ラパチニブ／ＧＷ５７２０１６である。
【０１１１】
さらなる抗体ベースの阻害剤は、例えば、とりわけブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジおよびマウスから選択される宿主動物に適切な抗原またはエピトープを投与することにより、公知の方法に従って生成することができる。当技術分野で公知の様々なアジュバントを用いて、抗体産生を促進することができる。
【０１１２】
本発明を実施するのに有用な抗体はポリクローナルであり得るが、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体は、培養継代細胞株による抗体分子の産生をもたらす任意の技術を用いて調製し、単離することができる。産生および単離の技術は、KohlerおよびMilstein（Nature、1975年、256巻、495〜497頁）により最初に記載されたハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kosborら、1983年、Immunology Today、4巻、72頁、Coteら、1983年、Proc. Nati. Acad. Sci. USA、80巻、2026〜2030頁）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Coleら、1985年、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss, Inc.、77〜96頁）を含むが、これらに限定されない。
【０１１３】
あるいは、単鎖抗体の産生のための記載された技術（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照）を所望の特異性を有する単鎖抗体を産生させるために適応させることができる。本発明を実施するのに有用な抗体ベースの阻害剤は、これらに限定されるものではないが、完全抗体分子のペプシン消化により得ることができるＦ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２断片、およびＦ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２断片のジスルフィド架橋を還元することにより得ることができるＦａｂ断片も含む。あるいは、所望の特異性を有する断片の迅速な同定ができるようにＦａｂおよび／またはｓｃＦｖ発現ライブラリを構築することができる（例えば、Huseら、1989年、Science、246巻、1275〜1281頁を参照）。
【０１１４】
モノクローナル抗体および抗体断片の産生および単離のための技術は、当技術分野で周知であり、HarlowおよびLane、1988年、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor LaboratoryならびにJ. W. Goding、1986年、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice、Academic Press、Londonに記載されている。ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体および抗体断片もVaughn, T. J.ら、1998年、Nature Biotech.、16巻、535〜539頁および当文献内で引用された参考文献に記載されているような公知の技術により調製することができ、そのような抗体またはその断片も本発明を実施するのに有用である。
【０１１５】
本発明に用いる阻害剤は、別法としてアンチセンスオリゴヌクレオチド構築物に基づくものであり得る。アンチセンスＲＮＡ分子およびアンチセンスＤＮＡ分子を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それに結合することにより標的ｍＲＮＡの翻訳を直接的に遮断し、ひいてはタンパク質翻訳を妨げまたはｍＲＮＡの分解を増大させ、それにより標的タンパク質のレベル、ひいては細胞中の活性を低下させる。例えば、少なくとも約１５塩基を有し、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２をコードするｍＲＮＡ転写配列の固有の領域と相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、従来のホスホジエステル技術により合成し、例えば、静脈内注射または注入により投与することができる。配列が公知である遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためのアンチセンス技術を用いる方法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号、第６，５６６，１３１号、第６，３６５，３５４号、第６，４１０，３２３号、第６，１０７，０９１号、第６，０４６，３２１号および第５，９８１，７３２号を参照）。
【０１１６】
小抑制性ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）も本発明に用いる阻害剤として機能し得る。標的遺伝子の発現が特異的に抑制される（すなわち、ＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉ）ように、腫瘍、対象または細胞を小二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または小二本鎖ＲＮＡの産生をもたらすベクターもしくは構築物と接触させることにより、標的遺伝子発現を低減させることができる。適切なｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択する方法は、配列が公知である遺伝子について当技術分野で周知である（例えば、Tuschi, T.ら(1999年)、Genes Dev.、13巻(24号)、3191〜3197頁、Elbashir, S. M.ら(2001年)、Nature、411巻、494〜498頁、Hannon, G. J.(2002年)、Nature、418巻、244〜251頁、McManus, M. T.およびSharp, P. A. (2002年)、Nature Reviews Genetics、3巻、737〜747頁、Bremmelkamp, T. R.ら(2002年)、Science、296巻、550〜553頁、米国特許第６，５７３，０９９号および第６，５０６，５５９号ならびに国際特許公開番号ＷＯ０１／３６６４６、ＷＯ９９／３２６１９およびＷＯ０１／６８８３６を参照）。
【０１１７】
リボザイムも本発明に用いる阻害剤として機能し得る。リボザイムは、ＲＮＡの特異的開裂を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機序は、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションとそれに続くエンドヌクレアーゼ的切断を含む。ｍＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ的切断を特異的かつ効率的に触媒する改変ヘアピンまたはハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、それによって本発明の範囲内で有用である。可能なＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム開裂部位は、最初に、一般的に次の配列、ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム開裂部位について標的分子をスキャンすることにより同定する。同定されたならば、開裂部位を含有する標的遺伝子の領域に対応する約１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、当該オリゴヌクレオチド配列を不適切にし得る、二次構造などの予測される構造上の特徴について評価することができる。候補標的の適切性についても、例えば、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへのそれらのアクセシビリティーを試験することによって評価することができる。
【０１１８】
阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの両方を公知の方法により調製することができる。これらは、例えば、固相ホスホルアミダイト（phosphoramadite）化学合成によるような化学合成の技術を含む。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ転写により得ることができる。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込んでいる多種多様なベクターに組み込むことができる。本発明のオリゴヌクレオチドの様々な修飾を細胞内安定性および半減期を高める手段として導入することができる。可能な修飾は、分子の５’および／または３’末端へのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加、あるいはオリゴヌクレオチド骨格内におけるホスホジエステラーゼ結合の代わりのホスホロチオエートまたは２’−Ｏ−メチルの使用を含むが、これらに限定されない。
【０１１９】
本発明の治療の方法に関連して、阻害剤（ＥＧＦＲ阻害剤またはＨＥＲ２阻害剤など）は、薬学的に許容される担体および非毒性の治療上有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤化合物（薬学的に許容されるその塩を含む）で構成されている組成物として用いる。
【０１２０】
「薬学的に許容される塩」という用語は、薬学的に許容される非毒性の塩基または酸から調製される塩を意味する。本発明の化合物が酸性である場合、その対応する塩は、無機塩基および有機塩基を含む薬学的に許容される非毒性塩基から好都合に調製することができる。そのような無機塩基に由来する塩は、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅（第二銅および第一銅）、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン（マンガン（ＩＩＩ）およびマンガン（ＩＩ））、カリウム、ナトリウム、亜鉛などの塩を含む。特に好ましいものは、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウムおよびナトリウム塩である。薬学的に許容される有機非毒性塩基に由来する塩は、第一級、第二級および第三級アミンならびに環状アミンならびに天然および合成置換アミンなどの置換アミンの塩を含む。塩を形成させることができる他の薬学的に許容される有機非毒性塩基は、例えば、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどのイオン交換樹脂を含む。
【０１２１】
本発明に用いる化合物が塩基性である場合、その対応する塩は、無機および有機酸を含む薬学的に許容される非毒性酸から好都合に調製することができる。そのような酸は、例えば、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、パモン酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸などを含む。特に好ましいものは、クエン酸、臭化水素酸、塩酸、マレイン酸、リン酸、硫酸および酒石酸である。
【０１２２】
阻害剤化合物（薬学的に許容されるその塩を含む）を有効成分として含む本発明に用いる医薬組成物は、薬学的に許容される担体および任意選択の他の治療用成分またはアジュバントを含み得る。他の治療薬は、それらの細胞毒性化学療法もしくは抗癌剤、または上で挙げたような、そのような薬剤の効果を増大させる薬剤を含み得る。所定の場合における最も適切な経路は、個々の宿主、ならびに有効成分が投与される状態の性質および重症度に依存するが、組成物は、経口、直腸、局所および非経口（皮下、筋肉内および静脈内を含む）投与に適する組成物を含む。医薬組成物は、単位剤形で好都合に提供することができ、薬学の技術分野で周知の任意の方法により調製することができる。
【０１２３】
実際には、本発明の阻害剤化合物（薬学的に許容されるその塩を含む）は、通常の医薬調合技術により有効成分として医薬担体と緊密な混合物に混ぜ合わせることができる。担体は、例えば、経口または非経口（静脈内を含む）での投与に望ましい製剤の形態に依存する多種多様な形態をとり得る。したがって、本発明の医薬組成物は、それぞれがあらかじめ定められた量の有効成分を含有するカプセル剤、カシェ剤または錠剤などの経口投与に適する個別の単位として提供することができる。さらに、組成物は、散剤として、顆粒剤として、液剤として、水性液体中懸濁剤として、非水性液体として、水中油型乳剤として、または油中水型液体乳剤として提供することができる。上述の一般的な剤形に加えて、阻害剤化合物（その各化合物の薬学的に許容される塩を含む）は、制御放出手段および／または送達デバイスによっても投与することができる。配合組成物は、薬学の方法のいずれかにより調製することができる。一般的に、そのような方法は、有効成分を１つまたは複数の必要な成分を構成する担体と結合させるステップを含む。一般的に、組成物は、有効成分を液体担体または微細な固体担体または両方と均一かつ緊密に混合することにより調製する。次に生成物を所望の形態に好都合に成形する。
【０１２４】
本発明に用いる阻害剤化合物（薬学的に許容されるその塩を含む）は、１つまたは複数の他の治療上有効な化合物と一緒に医薬組成物に含めることもできる。他の治療上有効な化合物は、細胞毒性、化学療法もしくは抗癌剤、または上で挙げたような、そのような薬剤の効果を増大させる薬剤を含み得る。
【０１２５】
したがって、本発明の１つの実施形態において、医薬組成物は、阻害剤化合物を抗癌剤と一緒に含むことがあり得、抗癌剤は、アルキル化薬、代謝拮抗剤、微小管阻害剤、ポドフィロトキシン、抗生物質、ニトロソ尿素、ホルモン療法剤、キナーゼ阻害剤、腫瘍細胞アポトーシスの活性剤および抗血管新生剤からなる群から選択されるメンバーである。
【０１２６】
用いられる医薬担体は、例えば、固体、液体または気体であり得る。固体担体の例は、ラクトース、白土、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸を含む。液体担体の例は、シュガーシロップ、ラッカセイ油、オリーブ油および水である。気体担体の例は、二酸化炭素および窒素を含む。
【０１２７】
経口剤用の組成物を調製するに際して、任意の好都合な医薬媒体を用いることができる。例えば、水、グリコール、油、アルコール、着香料、保存剤、着色剤などは、懸濁剤、エリキシル剤および液剤などの経口液体製剤を形成するために用いることができるが、一方、デンプン、糖、結晶セルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などは、散剤、カプセル剤および錠剤などの経口固体製剤を形成するために用いることができる。それらが投与し易いため、錠剤およびカプセル剤は、固体医薬担体を用いる、好ましい経口投与単位である。場合によって、錠剤は、標準的湿式または非湿式法により被覆することができる。
【０１２８】
本発明に用いる組成物を含有する錠剤は、１つもしくは複数の補助成分またはアジュバントを場合によって用いて、圧縮または成形により調製することができる。圧縮錠剤は、結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、界面活性または分散剤と場合によって混合された散剤または顆粒剤などの流動性の形態の有効成分を適切な機械で圧縮することによって調製することができる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を適切な機械で成形することによって調製することができる。各錠剤は、好ましくは約０．０５ｍｇ〜約５ｇの有効成分を含有し、各カシェ剤またはカプセル剤は、好ましくは約０．０５ｍｇ〜約５ｇの有効成分を含有する。
【０１２９】
例えば、ヒトへの経口投与を目的とする製剤は、全組成物の約５パーセントから約９５パーセントまで変化し得る適切かつ好都合な量の担体とともに配合された約０．５ｍｇ〜約５ｇの有効成分を含有し得る。単位剤形は、通常、約１ｍｇ〜約２ｇ、一般的に２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇまたは１０００ｍｇの有効成分を含有する。
【０１３０】
非経口投与に適する本発明に用いる医薬組成物は、水中活性化合物の溶液または懸濁液として調製することができる。例えば、ヒドロキシプロピルセルロースなどの適切な界面活性剤を含めることができる。油中グリセロール、液体プロピレングリコールおよびその混合物中分散体も調製することができる。さらに、微生物の有害な増殖を防ぐために保存剤を含めることができる。
【０１３１】
注射剤としての使用に適する本発明に用いる医薬組成物は、滅菌水性液剤または分散体を含む。さらに、組成物は、そのような滅菌注射用液剤または分散体の即時調製用の滅菌粉末の形態であり得る。すべての場合に、最終注射剤形は、滅菌されていなければならず、容易に注射器を使用可能なように効果的に流体でなければならない。医薬組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、したがって、好ましくは、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護すべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール）、植物油およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。
【０１３２】
本発明用の医薬組成物は、例えば、エアゾール剤、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、粉剤等などの局所使用に適する形態であり得る。さらに、組成物は、経皮デバイスに使用するのに適する形態であり得る。これらの製剤は、従来の処理方法により阻害剤化合物（薬学的に許容されるその塩を含む）を用いて調製することができる。例として、クリーム剤または軟膏剤は、親水性物質および水を約５重量％〜約１０重量％の化合物と一緒に混合して、所望の粘稠度を有するクリーム剤または軟膏剤を生成させることにより調製する。
【０１３３】
本発明用の医薬組成物は、担体が固体である、直腸投与に適する形態であり得る。混合物が単位投与坐剤を形成することが好ましい。適切な担体は、ココアバターおよび当技術分野で一般的に用いられる他の物質を含む。坐剤は、最初に組成物を軟化または溶融担体（単数または複数）と混合した後、冷却し、型で成形することによって好都合に形成することができる。
【０１３４】
上記の担体成分に加えて、上述の医薬製剤は、適宜、希釈剤、緩衝剤、着香料、結合剤、界面活性剤、粘稠化剤、滑沢剤、保存剤（抗酸化剤を含む）等などの１つまたは複数の追加の担体成分を含み得る。さらに、製剤を意図される受容者の血液と等張性にするための他のアジュバントを含めることができる。阻害剤化合物（薬学的に許容されるその塩を含む）を含有する組成物は、粉末または液体濃縮物の形態にも調製することができる。
【０１３５】
本発明を実施するために用いる化合物の用量レベルは、本明細書で述べるように、またはこれらの化合物について当技術分野で述べられているように、おおよそである。しかし、個々の患者に特有の用量レベルは、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時、投与経路、排泄速度、薬物の組合せおよび治療を受けている特定の疾患の重症度を含む様々な因子に依存することを理解されたい。
【０１３６】
例えば、本発明に関連する技術の分野で入手可能な多くの優れたマニュアルおよび教科書（例えば、Using Antibodies、A Laboratory Manual、Harlow, E.およびLane, D.編、1999年、Cold Spring Harbor Laboratory Press (例えば、ISBN 0-87969-544-7)；Roe B. A.ら、1996年、DNA Isolation and Sequencing (Essential Techniques Series)、John Wiley & Sons (例えば、ISBN 0-471-97324-0)；Methods in Enzymology: Chimeric Genes and Proteins、2000年、J. Abelson、M. Simon、S. Emr、J. Thorner編、Academic Press；Molecular Cloning: a Laboratory Manual、2001年、3rd Edition、Joseph SambrookおよびPeter MacCallum著(以前のManiatis Cloning manual) (例えば、ISBN 0-87969-577-3)；Current Protocols in Molecular Biology、Fred M. Ausubelら編、John Wiley & Sons (例えば、ISBN 0-471-50338-X)；Current Protocols in Protein Science、John E. Coligan編、John Wiley & Sons (例えば、ISBN 0-471-11184-8)ならびにMethods in Enzymology: Guide to protein Purification、1990年、182巻、Deutscher, M. P.編、Acedemic Press,Inc. (例えば、ISBN 0-12-213585-7)）に記載されているような、または分子生物学における実験方法を扱う多くの大学および商業的ウェブサイトに述べられているような、当技術分野で公知の多くの代替実験方法は、本発明の実施に際して本明細書で具体的に述べたものの代わりに成功裏に用いることができる。
【０１３７】
阻害剤に対する患者の起り得る応答性の診断の後の治療上有効量の本明細書で述べた阻害剤（例えば、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、二重特異性ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＨＥＲ２阻害剤）の患者への投与の的確な方法が主治医の裁量であることは、医療技術分野の技術者により十分に理解されよう。用量、他の抗がん剤との併用、投与の時期および頻度などを含む投与方法は、阻害剤に対する患者の起り得る応答性の診断ならびに患者の状態および病歴による影響を受ける可能性がある。したがって、典型的な阻害剤に対して比較的非感受性であると予測される腫瘍を有すると診断された患者でさえ、特に他の抗がん剤または阻害剤に対する腫瘍の感受性を変化させ得る薬剤と併用するそのような阻害剤による治療から恩恵を受ける可能性が依然としてある。
【０１３８】
本発明の目的のために、さらなる抗癌剤と阻害剤「の併用投与」および「を併用投与する」（両化合物を以後「２つの活性薬」と呼ぶ）は、２つの活性薬の別個または一緒の投与を意味し、２つの活性薬は、併用療法の恩恵を受けるように計画された適切な投与計画の一部として投与される。したがって、２つの活性薬は、同じ医薬組成物の一部として、または別個の医薬組成物で投与することができる。追加の薬剤は、阻害剤の投与の前に、と同時に、もしくはその後に、またはそのある配合で投与することができる。阻害剤を反復間隔で、例えば治療の標準的過程の間に患者に投与する場合、追加の薬剤は、阻害剤またはそのある組み合わせの毎回の投与の前に、それと同時にもしくはその後に投与することができ、あるいは、阻害剤治療とは異なる間隔で、または阻害剤による治療過程の前に、その期間中のある時点にもしくはその後に単回投与で、投与することができる。
【０１３９】
阻害剤は、一般的に当技術分野で公知のように、また例えば、国際特許公開番号ＷＯ０１／３４５７４に開示されているように、患者が治療を受けている癌の最も有効な治療（有効性および安全性の観点から）をもたらす投与計画で患者に投与する。本発明の治療方法を実施するに際して、阻害剤は、治療する癌の種類、用いられる阻害剤の種類（例えば、小分子、抗体、ＲＮＡｉ、リボザイムまたはアンチセンス構築物）、および例えば公表臨床試験の結果に基づく処方医師の医学的判断によって、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、皮下、鼻腔内、眼内、膣、直腸または皮内経路によるなどの当技術分野で公知の有効な方法で投与することができる。
【０１４０】
投与する阻害剤の量および阻害剤投与の時期は、治療を受ける患者の種類（種、性、年齢、体重等）および状態、治療を受ける疾患または状態の重症度に、ならびに投与経路に依存する。例えば、小分子阻害剤は、１回もしくは分割投与で、または持続注入により１日当たりまたは１週当たり０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で患者に投与することができる（例えば、国際特許公開番号ＷＯ０１／３４５７４を参照）。特に、エルロチニブＨＣｌは、１回もしくは分割投与で、または持続注入により１日当たり５〜２００ｍｇまたは１週当たり１００〜１６００ｍｇの範囲の用量で患者に投与することができる。好ましい用量は、１５０ｍｇ／日である。抗体ベースの阻害剤、またはアンチセンス、ＲＮＡｉもしくはリボザイム構築物は、１回もしくは分割投与で、または持続注入により１日当たりまたは１週当たり０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で患者に投与することができる。ある場合には、上述の範囲の下限より低い用量レベルが十分以上であり得るが、他の場合には、一日を通して投与するためにそのようなより大きい用量を最初にいくつかの小用量に分割するならば、有害な副作用を引き起こすことなく、さらにより大きい用量を用いることができる。
【０１４１】
阻害剤および他の追加の薬剤は、同じまたは異なる経路により、また多種多様な異なる剤形で別個にまたは一緒に投与することができる。例えば、阻害剤は、好ましくは経口的または非経口的に投与する。阻害剤がエルロチニブＨＣｌ（ＴＡＲＣＥＶＡ（商標））である場合、経口投与が好ましい。阻害剤および他の追加の薬剤の両方は、１回または複数回投与で投与することができる。
【０１４２】
阻害剤は、錠剤、カプセル剤、ローゼンジ剤、トローチ剤、硬キャンディー、散剤、噴霧剤、クリーム剤、軟膏、坐剤、ジェル剤、ゲル剤、ペースト剤、ローション剤、軟膏剤、エリキシル剤、シロップ剤などの形態で様々な薬学的に許容される不活性担体とともに投与することができる。そのような剤形の投与は、１回または複数回投与で行うことができる。担体は、固体希釈剤または充填剤、滅菌水性媒体および様々な非毒性有機溶媒等を含む。経口医薬組成物は、適切に甘味料添加および／または着香料添加を行うことができる。
【０１４３】
阻害剤は、噴霧剤、クリーム剤、軟膏、坐剤、ジェル剤、ゲル剤、ペースト剤、ローション剤、軟膏剤などの形態で様々な薬学的に許容される不活性担体と混ぜ合わせることができる。そのような剤形の投与は、１回または複数回投与で行うことができる。担体は、固体希釈剤または充填剤、滅菌水性媒体および様々な非毒性有機溶媒等を含む。
【０１４４】
タンパク質性阻害剤を含むすべての製剤は、阻害剤の変性および／または分解ならびに生物学的活性の喪失を避けるように選択すべきである。
【０１４５】
阻害剤を含む医薬組成物を調製する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、国際特許公開番号ＷＯ０１／３４５７４に記載されている。本発明の教示を考慮すると、阻害剤を含む医薬組成物を調製する方法は、上で引用した刊行物から、またRemington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、Pa.、18版(1990年)などの他の公知の参考文献から明らかであろう。
【０１４６】
阻害剤の経口投与の場合、活性薬の１つまたは両方を含有する錠剤は、例えば、結晶セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウムおよびグリシンなどの様々な賦形剤のいずれか、ならびにデンプン（好ましくはトウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン）、アルギン酸および特定の複雑ケイ酸塩などの様々な崩壊剤、ならびにポリビニルピロリドン、ショ糖、ゼラチンおよびアラビアゴムのような造粒結合剤と混ぜ合わされている。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなどの滑沢剤は、錠剤化の目的のためにしばしば非常に有用である。同様な種類の固体組成物は、ゼラチンカプセル剤における充填剤としても用いることができ、これに関連して好ましい物質は、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールも含む。水性懸濁剤および／またはエリキシル剤が経口投与に望ましい場合、阻害剤は、様々な甘味料または着香料、着色剤または色素と、ならびにそのように望ましいならば、乳化剤および／または懸濁化剤とも、ならびに水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンおよびそれらの様々な同様な組合せのような希釈剤と混ぜ合わせることができる。
【０１４７】
活性薬のいずれかまたは両方の非経口投与の場合、ゴマもしくはラッカセイ油中または水性プロピレングリコール中溶液ならびに活性薬またはその対応する水溶性塩を含む滅菌水溶液を用いることができる。そのような滅菌水溶液は、好ましくは適切に緩衝剤が添加され、また好ましくは、例えば、十分な生理食塩水またはグルコースにより等張性とされている。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内注射の目的のために特に適している。油性溶液は、関節内、筋肉内および皮下注射の目的のために適している。無菌条件下でのすべてのこれらの溶液の調製は、当業者に周知の標準製薬技術により容易に達成される。タンパク質性阻害剤の投与に選択される非経口製剤は、阻害剤の生物学的活性の変性および喪失を避けるように選択すべきである。
【０１４８】
さらに、標準薬務に従って、例えば、クリーム剤、ローション剤、ジェル剤、ゲル剤、ペースト剤、軟膏剤、軟膏などにより活性薬のいずれかまたは両方を局所投与することが可能である。例えば、約０．１（重量／容積）％〜約５（重量／容積）％の濃度で阻害剤を含む局所製剤を調製することができる。
【０１４９】
獣医の目的のために、活性薬は、上述の形のいずれかを用いて、経路のいずれかにより動物に別個または一緒に投与することができる。好ましい実施形態において、阻害剤は、注射によりまたはインプラントとして、カプセル剤、ボーラス、錠剤、液体ドレンチの形で投与する。代替として、阻害剤は、動物飼料とともに投与することができ、この目的のために、濃縮飼料添加物またはプレミックスを通常の動物飼料用に調製することができる。そのような製剤は、標準獣医業務に従った従来の方法で調製される。
【０１５０】
特に診断試験および治療薬による治療の適用に関連する、医療技術分野の技術者は、生物学的システムが変動を示す可能性があり、常に完全に予測できるとは限らず、したがって、多くの優れた診断試験または治療薬が時折無効であることを認識する。したがって、試験結果、患者の状態および病歴ならびに彼自身の経験に基づいて個々の患者に対する最も適切な治療のコースを決定することは、最終的に主治医の判断による。例えば、特に他の明らかな治療選択肢のすべてもしくはほとんどが失敗した場合、または別の療法とともに投与した場合にある程度の相乗効果が予想される場合に、診断試験のデータに基づきまたは他の基準から、腫瘍がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して特に感受性であると予測されない場合でさえも医師がＥＧＦＲ阻害剤により患者を治療することを選択する場合さえあり得る。薬物のクラスとしてのＥＧＦＲ阻害剤が、より伝統的な化学療法または細胞毒性薬などの癌の治療において用いられる多くの他の抗癌薬と比較して比較的に忍容性が良好であるという事実により、これがより実行可能な選択肢であることがわかる。
【０１５１】
広告の方法
本明細書における本発明は、ＥＲＢＢ２低メチル化によって特徴付けられる種類の癌を有する患者集団を治療するための阻害剤または薬学的に許容されるその組成物の使用を標的視聴者に宣伝することを含むＥＧＦＲもしくはＨＥＲ２阻害剤、または薬学的に許容されるその組成物を広告する方法も包含する。
【０１５２】
広告は、一般的に広告主が特定され、メッセージが管理される非個人的媒体を介する有料の情報伝達である。本明細書における目的のための広告は、公表、広報活動、商品配置、資金提供、引受業務および販売促進を含む。この用語は、本明細書における発明を購入、支持または承認する有利なパターンに向けての行動を説得し、知らせ、促進し、動機付けし、または別の方法で修正することを多くの視聴者に訴えるように計画された印刷情報伝達媒体のいずれかに出現するスポンサー付きの情報の公衆への公示も含む。
【０１５３】
本明細書における診断方法の広告および宣伝は、あらゆる手段によって達成することができる。これらのメッセージを伝えるために用いられる広告媒体の例は、放送媒体に出現するメッセージであるコマーシャルを含む、テレビジョン、ラジオ、映画、雑誌、新聞、インターネットおよび掲示板を含む。広告はまた、食料品店のカートのシート上、空港の通路の壁上およびバスの側面上のものまたは電話保留メッセージもしくは店内ＰＡシステムにおける聴取、または視覚もしくは可聴情報伝達を配置できるあらゆる場所を含む。
【０１５４】
宣伝および広告手段のより具体的な例は、テレビジョン、ラジオ、映画、ウェブ放送およびウェビナー、同時ユーザーに到達することを意図した双方向コンピュータネットワークなどのインターネット、固定もしくは電子掲示板および他の公開表示、ポスター、雑誌および新聞のような伝統的もしくは電子的文献、他の媒体アウトレット、例えば、ｅメール、電話、インスタントメッセージ、郵便、宅配、マス（mass）またはキャリアメール、実際の来訪等によるプレゼンテーションもしくは個人的な接触を含む。
【０１５５】
用いられる広告の種類は、多くの因子、例えば、到達すべき標的視聴者の性質、例えば、病院、保険会社、診療所、医師、看護師および患者、ならびに経費検討および関連する管轄区域の法律ならびに医薬品および診断の広告を規定している規則に依存する。広告は、サービス相互作用および／またはユーザーの人口統計学的特性および地理的位置などの他のデータにより定義されるユーザーの特性に基づいて個別化またはカスタマイズすることができる。
【０１５６】
本発明は、続く実施例からより十分に理解されよう。しかし、当業者は、述べる特定の方法および結果がその後に続く特許請求の範囲により十分に記述されている本発明の単に例示であり、それに限定されると考えるべきでないことを容易に理解するであろう。
【０１５７】
本明細書で開示したすべての特許、公開特許出願および他の参考文献は、それらの全体として参照により明確に本明細書によって組み込まれる。
【実施例】
【０１５８】
実施例１−材料および方法
細胞株：ＮＳＣＬＣ細胞株のすべては、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入したか、またはＵＴ  ＳｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎのＡｄｉ  ＧａｚｄａｒおよびＪｏｈｎ  Ｍｉｎｎａによって提供された。不死化気管支上皮（ｇＢＥＣｓ）および末梢気道（ｇＳＡＣｓ）細胞株は、選択マーカーとしてｃｄｋ４、ｈＴＥＲＴおよびＧ４１８を含有するトリシストロン性ベクターを用いてＧｅｎｅｎｔｅｃｈにおいて作製された。トリシストロン性ベクターは、ｈＴＥＲＴを含有するｐＱＣＸＩＮ骨格から設計した。不死化法は、若干の修正を加えた以前に公表されたプロトコール（Ramirezら、2004年、Cancer Res、64巻、9027頁、Satoら、2006年、Cancer Res、66巻、2116頁）に基づくものであった。ｇＢＥＣｓおよびｇＳＡＣｓは、二倍体核型を有し、非発癌性であった。
【０１５９】
腫瘍試料：ＤＮＡメチル化アッセイは、カルボプラチンおよびパクリタキセルの投与計画と併用して投与されたエルロチニブによる治療を受けた１０７９例のステージＩＩＩＢまたはステージＩＶのＮＳＣＬＣ患者（ｎ＝５３９）の生存率をカルボプラチンおよびパクリタキセルのみによる治療を受けた患者（ｎ＝５４０）と比較するためのＧｅｎｅｎｔｅｃｈにより後援された第ＩＩＩ相試験であるＴＲＩＢＵＴＥに登録された患者から得られたＦＦＰＥ生検材料から単離された腫瘍ＤＮＡについて実施した（Yauchら、2005年、Clin Cancer Res、11巻、8686頁）。ＤＮＡは３４３人のＴＲＩＢＵＴＥ患者および１１２人のＭｅｔＭＡｂ患者について利用可能であった。
【０１６０】
ゲノムＤＮＡの脱メチル化：メチル化アッセイにおける陰性対照に用いた細胞は、１０％ウシ胎児血清および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ１６４０中で増殖させた。細胞を０日目に４０００〜９０００細胞／ｃｍ２で播種し、１μＭ  ５−アザ−２’−デオキシシチジン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨカタログ番号Ａ３６５６）またはＤＭＳＯ対照（カタログ番号Ｄ２６５０）を１、３および５日目に投与した。６日目に細胞を冷リン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄し、トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５５９６０１８）中でこすり落とすことにより採取し、ＲＮＡを抽出するか、または後のＲＮＡ抽出のためにフラッシュ凍結した。
【０１６１】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｆｉｎｉｕｍメチル化解析：９６ＮＳＣＬＣ細胞株のそれぞれからの１μｇのゲノムＤＮＡを重亜硫酸塩変換し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｆｉｎｉｕｍ４５０Ｋメチル化で解析した。メチル化データは、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｌｕｍｉソフトウエアパッケージを用いて処理した（Duら、2008年、Bioinformatics、24巻、1547頁）。Ｉｎｆｉｎｉｕｍ４５０Ｋプラットフォームは、同じアッセイにおけるＩｎｆｉｎｉｕｍ  ＩおよびＩＩアッセイを含む。Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  Ｉアッセイは、ＣｐＧ遺伝子座当たり２つのビードタイプを用い、メチル化状態は、ある場合には赤色色素により、他の場合には緑色色素により報告される（以前のＩｎｆｉｎｉｕｍ２７Ｋプラットフォームと同じ）。Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＩＩアッセイは、１つのビードタイプを用い、常に同じ色素によりメチル化状態を報告し、色素バイアスを問題にする。高いバックグラウンドシグナルを有する１つのアレイを捨てた後、２段階の標準化処置を残りのアレイに適用した。第１に、各アレイについて、平滑分位標準化法を用いてＩｎｆｉｎｉｕｍ  Ｉデータから色バイアス補正曲線を推定した。次いでこの補正曲線を当アレイからのすべてのデータに適用した。第２に、すべての色補正シグナルに標準分位標準化を適用することにより、アレイを互いに標準化した。
【０１６２】
前処理の後、メチル化Ｍ値（メチル化プローブ対非メチル化プローブのｌｏｇ２比）とβ値（ロジスティック変換によるＭ値の０および１範囲へのリスケール）の両方を各試料について計算した（Duら、2010年、BMC Bioinformatics、11巻、587頁）。視覚化のために、完全連結およびユークリッド距離を用いてβ値の凝集型階層的クラスタリングを行った。最初に各細胞株のＭ値の移動平均（呼び出し（interrogated）ＣｐＧ部位を中心とする５００ｂｐウインドウ）を計算することによってＤＭＲｓを特定し、次いで、ｔ検定を用いて、関連するウインドウスコアをランダムに選択した１０上皮様および１０間葉様株のトレイニングセットと対比させた。ＤＭＲ  ｐ値は、偽発見率を抑えるために調整し（BenjaminiおよびHochberg、1995年）、０．０１のカットオフと比較した。より生物学的に関連性のある現象を拡充するために、下流解析は、その平均ウインドウスコアが（ｉ）感受性株と耐性株との間が少なくとも２異なり、（ｉｉ）２セットの細胞株において反対符号を有していた、差別的にメチル化された領域のみを考慮した。最後にこれらの基準をすべて満たす近接ＤＭＲｓは、２ｋｂ未満離れていた場合には単一ＤＭＲに統合した。
【０１６３】
重亜硫酸塩配列決定および解析：候補遺伝子のＤＮＡメチル化状態を確認するために、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて２μｇのゲノムＤＮＡを重亜硫酸塩変換した。Ｍｅｔｈｙｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウエアｖ１．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、変換ＤＮＡに特異的なプライマーをデザインした。ＰＣＲ増幅は、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＰＣＲ  ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２５μｌの反応物中１μｌの重亜硫酸塩変換ＤＮＡを用いて実施した。ＰＣＲ温度サイクリング条件は次の通りであった：１０分間９５℃の初期変性サイクルを１回、その後、３０秒間９４℃、１分間６５℃およびサイクルごとに１℃低下、および１分間７２℃の１０サイクル、その後、３０秒間９４℃、１．５分間５５℃および１分間７２℃の３０サイクル、その後、１５分間７２℃における最終伸長。ＰＣＲ産物は、臭化エチジウムを含有する２％アガロースＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた電気泳動により分割し、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ  ８９００カメラ（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）を用いて視覚化した。
【０１６４】
ＰＣＲ産物は、製造業者の指示に従ってＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにライゲーションした。２μｌのライゲーション済みプラスミドＤＮＡをＴＯＰ１０コンピテント細菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換させ、１００μｌの形質転換細菌を５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン（Ｔｅｋｎｏｖａ）を含有するＬＢ−寒天プレート上で平板培養し、３７℃で一夜インキュベートした。各候補遺伝子座について細胞株当たり１２コロニーを５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有する１ｍｌのＬＢ中に接種し、振とうインキュベーター中で３７℃で一夜増殖させた。プラスミドＤＮＡを９６ウエル方式のＱｉａｐｒｅｐ  ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、３７３０ｘ１  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で配列決定を行った。配列決定データをＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ  ｖ４．５ソフトウエアおよびＢｉＱ  Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウエアを用いて解析した。重亜硫酸塩変換配列を最初に整列させ、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒを用いて各候補遺伝子座について参照配列にトリミングして、配列の質を評価し、重亜硫酸ナトリウム処理時のシトシンの変換を確認した。次いで、ＢｉＱ  Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウエアを用いて、トリミングした配列を個々のＣｐＧ部位におけるメチル化状態について評価した。
【０１６５】
ピロシークエンス法：重亜硫酸塩特異的ＰＣＲ（ＢＳＰ）プライマーは、Ｍｅｔｈｙｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウエアｖ１．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＰｙｒｏＭａｒｋ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎソフトウエアｖ２．０（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてデザインした。ストレプトアビジンセファロースビーズへのＰＣＲ産物の結合を促進するためにフォワードまたはリバースプライマー上に５’ビオチン標識を有するＰＣＲプライマーを合成した。シークエンシングプライマーは、ＰｙｒｏＭａｒｋ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎソフトウエアｖ２．０（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて５’−ビオチン標識ＰＣＲプライマーの逆方向にデザインした。１μｌ重亜硫酸塩修飾ＤＮＡをＰｌａｔｉｎｕｍ  ＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２５μｌの反応物中で増幅し、２０μｌのＰＣＲ産物をＰｙｒｏｍａｒｋ  Ｑ２４（Ｑｉａｇｅｎ）での配列決定に用いた。ＰＣＲ産物をストレプトアビジンセファロースビーズとともに１０分間インキュベートした後、７０％エタノール、Ｐｙｒｏｍａｒｋ変性溶液およびＰｙｒｏｍａｒｋ洗浄緩衝液で洗浄した。次いで、０．３μＭのシークエンシングプライマーを用いて変性ＰＣＲ産物を配列決定した。ピログラムを視覚化し、配列の質について評価し、個々のＣｐＧ部位におけるメチル化の百分率をＰｙｒｏＭａｒｋソフトウエアバージョン２．０．４（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて決定した。以下のプライマーは、ＥＲＢＢ２ピロシークエンシングアッセイに用いられる具体例としてのプライマーである。
ＥＲＢＢ２ピロシークエンスプライマー：
１フォワード：5'-GGTTTAAGTGGGTTAGGTGTG-3'（配列番号３）
１リバース、ビオチン：5'-CAATTATAAACATCTAAACCCAAACTACA-3'（配列番号４）
１シークエンシング：5'-AGTTTTATGTTTTATGGTTGA-3'（配列番号５）
ネストフォワード：5'-TAGTTTTATGTTTTATGGTTGATGGTT-3'（配列番号６）
ネストリバース、ビオチン：5'-CCAAAACCAACTAACAAAATATATACC-3'（配列番号７）
ネストシークエンシング：5'-TTGGGTAGGTATGTAGG-3'（配列番号８）
【０１６６】
プロモーターエンハンサー活性ルシフェラーゼリポーターアッセイ：ＥＲＢＢ２遺伝子の差別的メチル化領域（インフィニウムアレイプロファイリングにより同定される）のプロモーターエンハンサー活性は、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて評価した。ＥＲＢＢ２の第１のイントロン内の１７９１ｂｐ領域を製造業者の指示に従ってｐＧＬ４ルシフェラーゼリポーターベクターにクローニングした。細胞に対照プロモーター＋ＥＲＢＢ２推定エンハンサー領域をトランスフェクトし、トランスフェクションの後の２４、４８および７２時間の時点に標準ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
【０１６７】
定量的メチル化特異的ＰＣＲ：定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）アッセイは、エルロチニブ感受性および耐性ＮＳＣＬＣ細胞株において差別的にメチル化されていると我々の候補スクリーニングで同定された遺伝子座を用いてデザインした。１０分間９５℃、次に１５秒間９５℃および１分間６０℃の５０サイクルのサイクリング条件でＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３２４０１８）を用いて、最低限１０ｎｇの重亜硫酸ナトリウム変換ＤＮＡを様々な２０Ｘ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３３１３４８）で増幅した。増幅は、７９００ＨＴシステムで行い、ＳＤＳソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析した。ＤＮＡ含量は、ｍｅＲＮａｓｅＰ  Ｔａｑｍａｎアッセイを用いて標準化した。
【０１６８】
ＦＦＰＥ臨床試験材料の前増幅：ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から抽出したｐｇ量のＤＮＡのメチル化解析のための前増幅法を開発した。２μｌ（１０ｐｇ〜１ｎｇの相当量）の重亜硫酸塩変換ＤＮＡを最初に、０．１ＸｑＭＳＰプライマー−プローブ濃度を有する２０μｌの反応物中でＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３２４０１８）および９５℃１０分間、次に９５℃１５秒間および６０℃１分間の１４サイクルのサイクリング条件を用いて増幅した。１μｌの前増幅材料を次に９５℃１０分間、次に９５℃１５秒間および６０℃１分間の５０サイクルのサイクリング条件を用いた第２のＰＣＲ反応で増幅した。参照ｍｅＲＮａｓｅＰ  Ｔａｑｍａｎアッセイにより前増幅を用いてＤＮＡ含量を確認し、ｍｅＲＮａｓｅＰについて陽性であった試料のみをｑＭＳＰ反応のさらなる解析に含めた。すべての反応を２連で実施した。
【０１６９】
実施例２−ＥＲＢＢ２  ＤＭＲの低メチル化はＮＳＣＬＣ細胞株およびＮＳＣＬＣ原発腫瘍における上皮様表現型と相関する
ＥＲＢＢ２原型癌遺伝子のエクソン４の近くのＣｐＧ部位は、上皮および間葉様ＮＳＣＬＣ細胞株のメチル化プロファイリングに基づいて差別的にメチル化された領域（ＤＭＲ）と同定された。メチル化プロファイリングは、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓを用いて行い、メチル化状態の検証は、重亜硫酸ナトリウム変換ＤＮＡのクローン化断片の直接配列決定により検証した。
【０１７０】
ピロシークエンス法を用いて、ＮＳＣＬＣ原発腫瘍および対応正常組織におけるＤＭＲの定量的メチル化状態を判定した。定量的メチル化は、式メチル化％＝（Ｃピーク高ｘ１００／Ｃピーク高＋Ｔピーク高）を用いてＰｙｒｏｍａｒｋ解析ソフトウエアにより６連続ＣｐＧ部位において求めた、図２（６つの個々のＣｐＧ部位のメチル化の平均パーセントを示し、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いてｐ＜０．０６のＰ値が決定された）。図２に示すように、ＥＲＢＢ２のこの遺伝子内ＤＭＲは、正常隣接組織と比較して低メチル化しているようであった。
【０１７１】
ＵＣＳＣゲノムブラウザーを用いたこの領域のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析により、プローブｃｇ００４５９８１６（ＩＩ型Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ４５０Ｋメチル化アレイプローブ、染色体座標での単一ＣｐＧ部位を表す：ＮＣＢＩ  ｂｕｉｌｄ  ３６／ｈｇ１８ｃｈｒ１７：３５１１５６３９（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））に対応する差別的にメチル化されたＣｐＧ部位が潜在的調節エレメントと重複していたことが示唆された。この領域がＣｐＧアイランド内でなく、特にＣＧリッチでなかったため、この領域をフランキングするピロシークエンシングプライマーは、上皮様および間葉様細胞株のパネルにおけるメチル化状態を判定するようにデザインした。間葉様株（２１間葉様株のうちの２０において平均メチル化≧７０％、Ｐ＜０．００１）と比べて１６上皮様株のうちの１３における低メチル化（６ＣｐＧ部位の平均メチル化≦２０％）のパターンが認められた。図３にこの解析の結果を示す。データは、配列決定領域における６連続ＣｐＧ部位におけるメチル化の平均値＋／−ＳＤパーセントとして表す。
【０１７２】
１つの間葉様株Ｈ１４３５のみがこの遺伝子座において低メチル化された。ＥＭＴ発現解析により、Ｈ１４３５が間葉様株と同定されたという我々の以前の所見を考慮すると、この例外は驚くべきことでなかった。
【０１７３】
実施例３−ＥＲＢＢ２  ＤＭＲの低メチル化はＥＲＢＢ２の発現と相関する
ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＥＲＢＢ２  ｍＲＮＡの相対的発現レベルは、ＴａｑＭａｎベースのＦｌｕｉｄｉｇｍ遺伝子発現解析を用いて測定した。図４に示すように、上皮様株は、間葉様株よりも有意に高いレベルのＥＲＢＢ２の発現を示した（Ｐ＜０．００１）。ＥＲＢＢ２遺伝子座の低メチル化が細胞株におけるＨＥＲ２のより高い発現と上皮表現型との両方と高度に相関するという所見は、この領域の差別的メチル化がＥＧＦＲまたはＨＥＲ２シグナル伝達の阻害の予測バイオマーカーとしての役割を果たし得ることを示すものである。
【０１７４】
実施例４−ＥＲＢＢ２  ＤＭＲの低メチル化はエルロチニブ感受性と相関する
ＥＲＢＢ２低メチル化は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのエルロチニブ感受性と強く相関しており、エルロチニブ応答の予測臨床バイオマーカーとしての可能性があることが示された。図５にＥＲＢＢ２低メチル化とエルロチニブ感受性との間のこの相関を示しているＮＳＣＬＣ細胞株のＥＲＢＢ２ピロシーンス解析の結果を示す。この図５におけるデータは、エルロチニブ感受性に対して６ＣｐＧ部位のメチル化の平均値＋／−ＳＤとしてプロットしている。エルロチニブのＩＣ５０の決定のために、細胞を、０．５％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ（アッセイ培地）中で３８４ウエルプレートにおける１ウエル当たり３ｘ１０２細胞で４連で平板培養し、一夜インキュベートした。２４時間後に、細胞を、３ｎＭ  ＴＧＦαおよび１０μＭ〜１ｐＭの最終濃度の用量範囲のエルロチニブを含有するアッセイ培地で処理した。７２時間後に、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞生存率を測定した。細胞生存率の５０％の阻害をもたらすエルロチニブの濃度を４パラメーター曲線解析から計算し、最小限２回の実験から決定した。
【０１７５】
実施例５−ＥＲＢＢ２  ＤＭＲの低メチル化は上皮様表現型ＦＦＰＥ組織試料と相関する
新鮮凍結試料は、一般的にＮＳＣＬＣｓの診断時または肺癌臨床試験の一部として得られない。したがって、臨床適用に適するものであるためには、ピロシークエンスアッセイは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から限定され、分解したＤＮＡ（一般的に＜１５０ｂｐ）を増幅することができなければならない。２２８ｂｐピロシークエンスアッセイを用いたＥＲＢＢ２  ＤＭＲ内の６つの隣接するＣｐＧ部位のメチル化状態の間に高い一致がある（図６）ため、アッセイは、２ＣｐＧ部位だけを検討するように再デザインした。このアッセイにおいて、ピロシークエンス法を用いて、ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＤＭＲの定量的メチル化状態を判定した。定量的メチル化は、式メチル化％＝（Ｃピーク高ｘ１００／Ｃピーク高＋Ｔピーク高）を用いてＰｙｒｏｍａｒｋ解析ソフトウエアにより６連続ＣｐＧ部位において決定した。図６に６つの個々のＣｐＧ部位の平均メチル化パーセントを示し、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いてｐ＜０．０６のＰ値が決定された。上皮または間葉としての細胞株の指定は、２０遺伝子Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎパネルを用いて以前に決定した。
【０１７６】
実施例６−ＥＲＢＢ２  ＤＭＲの低メチル化はＮＳＣＬＣ原発腫瘍における上皮様表現型と相関する
次にＥＲＢＢ２のメチル化状態を、遺伝子発現データも得られた４２の末期（ステージＩＩＩｂ／ＩＶ）ＦＦＰＥ  ＮＳＣＬＣ腫瘍において評価した。ＥＲＢＢ２エンハンサーの低メチル化は、細胞株に認められたパターン（図７）を再現する、後にフロントライン化学療法を継続できなかった患者から得られた生検検体中のＨＥＲ２の発現と強く相関していた（Ｐ＜０．０１１）。低メチル化は、ピロシークエンス法およびＴａｑＭａｎベースのＦｌｕｉｄｉｇｍ遺伝子発現解析を用いて判定した。メチル化の百分率は、２ＣｐＧ部位の平均値として示す。中央値カットオフポイントは、ＥＲＢＢ２高およびＥＲＢＢ２低腫瘍を二分するために用いた。Ｐ値は、片側Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定を用いて決定した。
【０１７７】
保管ＦＦＰＥスライド標本から得られた４７のＮＳＣＬＣ原発腫瘍試料におけるＥＲＢＢ２のメチル化および上皮／間葉の状態の解析を実施した。ＥＲＢＢ２のメチル化状態は、ピロシークエンス解析を用いて判定した。上皮様と分類された腫瘍は、間葉様と分類された腫瘍と比べてＥＲＢＢ２エンハンサーにおいて低メチル化されており（Ｐ＜０．０４６）、ＥＲＢＢ２のメチル化状態と全遺伝子発現表現型との間に強い関連性があることがわかる、図８（データは、２つのＣｐＧ部位の平均値として示す。上皮様／間葉様状態は、ＴａｑＭａｎベースのＦｌｕｉｄｉｇｍ遺伝子発現解析から得られたスコアを用いて判定した。中央値カットオフポイントを用いて、上皮様／間葉様発現スコアを二分した。Ｐ値は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて決定した）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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