(57)【要約】  シスプラチン、パクリタキセル、ゲムシタビン、マイコバクテリウムｗ又はこれらの組み合わせで処理されたがん細胞は、変更されたタンパク質プロフィールを示す。このように変更されたタンパク質プロフィールは、少なくとも１つの共通して発現又は過剰発現しているタンパク質を有する。共通して発現又は過剰発現しているタンパク質は、起源組織／臓器のがん細胞（相同性及び異種性）に特異的な免疫応答を誘発する。共通して発現／過剰発現している抗原の投与により生成された免疫応答は、正常な細胞及び異なる起原組織／臓器に対して反応性がない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
作用物質で処理されたときにがん細胞により発現されるタンパク質であって、作用物質がマイコバクテリウムｗ、シスプラチン、パクリタキセル、ゲンタマイシン及びこれらの組み合わせから選択される、タンパク質。
【請求項２】
がん抗原である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
起源組織／臓器の相同並びに異質のがん細胞に対しても免疫応答を誘発する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
誘発された免疫応答が細胞仲介性免疫応答である、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
誘発された免疫応答が体液性免疫応答である、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項６】
請求項１に記載のタンパク質と、薬学的に許容される賦形剤及び場合によりアジュバントとを含む、医薬組成物。
【請求項７】
場合によりアジュバントと共に薬学的に許容される組成物で哺乳動物に投与されたとき腫瘍量を退縮する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項８】
がんの治療のためである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項９】
がんの治療のための請求項７に記載のタンパク質の投与。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの管理に使用される、起源組織／臓器に特異的ながんに対して免疫原性を有するがんワクチンの抗原に関する。本発明はその製造方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
がんは急速に分裂する細胞により引き起こされる。がんが罹患率及び死亡率の主な原因である。がんは組織／臓器から生じる。単一の組織／臓器から生じるという事実にもかかわらず、細胞は同一（相同）ではない。がんは、外科的除去、放射線療法及び／又は化学療法により治療される。抗体の形態による受動免疫療法も有用であることが見出されている。単一組織／臓器から生じるがんにおける異質細胞の存在は、外科療法以外のがん療法に対する不十分な応答の原因であることが知られている。これらは、免疫療法を使用するがんの治療にとってより重要である。
能動免疫療法は、がんの管理のためにワクチンの形態で試みられている。能動免疫療法は、治療されるがんに特異的な抗原の使用を必要とする。がん特異的抗原の幾つかには、マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター、上皮増殖因子、ガストリン、全がん細胞、ヒートショックプロテインなどが含まれる。
【０００３】
幾つかの方法が、全細胞を使用する免疫原性がんワクチンの生産において提案されてきた。がんワクチンにより生成される免疫応答は、多くの場合に自己免疫又は毒性を引き起こす（Ｂｌｏｏｄ−２０１１−０１−３２５−２６６）。
【０００４】
従って、がん抗原に対して免役応答を誘発するが、正常細胞（自己免疫）に対して誘発しないがん抗原を有する必要性が存在する。
がん細胞は、抗原として使用されるとき、免疫原性を欠いているか、又は不十分な免疫応答を生成する。アントラサイクリン及びオキシリプラチン（Oxliplatin）は、臨床がん研究（Clin Cancer Res）、２０１０年、１６（１２）：３１００〜４においてＬａｕｒｅｎｃｅ  Ｚｉｔｖｏｇｅｌらにより報告されているように、がん細胞の免疫原性を改善することが知られている。「幾つかの化学療法剤（例えば、アントラサイクリン及びオキサリプラチン）並びにイオン化放照射に対する応答において、腫瘍細胞は免疫原性アポトーシスを受け、このことは、免疫応答性（イムノコンピテント）マウスにアジュバントの不在下で皮下注射されたとき、これらが保護免疫反応の引き金を引くことを意味する（実験医学ジャーナル（J Exp Med）２００５年；２０２：１６９１〜７０１；ネイチャー医学（Nat Med）２００７年；１３：５４〜６１;免疫学論評（Immunol Rev）２００７年；２２０：２２〜３４；ネイチャー医学２００７年；１３：１０５０〜９；ネイチャー医学２００９年；１５：１１７０〜８；細胞分子免疫学（Cell Mol Immunol）２００９年；６：４６９〜７５；がん免疫学免疫療法（Cancer Immunol Immunother）２０１０年；５９：７６９〜７７）。対照的に、他の抗がん薬（例えば、アルキル化剤及びシスプラチン）に応答して屈服する細胞は、そのような免疫反応の引き金を引かない（実験医学ジャーナル（J Exp Med）２００５年；２０２：１６９１〜７０１）。」
【０００５】
正常な細胞及び異なる起源組織／臓器のがん細胞に対して反応性がなく、がん細胞に対して特異的な免疫応答を生成することは難問である。
【０００６】
したがって、正常細胞に対して反応性がなく、同じ組織／臓器から生じる細胞の異種集団に対して免疫原性を有するがんワクチンを提供するという、未解決な必要性が存在する。
【発明の目的】
【０００７】
本発明の主な目的は、がんワクチンのための抗原を提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、起源組織／臓器のがん細胞（相同のみならず異質のがん細胞）に対して免疫応答を誘発するがんワクチンのための抗原を提供することである。
【０００９】
さらに別の目的は、起源組織／臓器のがん細胞（相同のみならず異質のがん細胞）に対して細胞仲介性免疫応答を刺激する悪性腫瘍のためのがん抗原を提供することである。
【００１０】
さらに別の目的は、起源組織／臓器のがん細胞（相同のみならず異質のがん細胞）に対して体液性免疫応答を刺激する悪性腫瘍のためのがんワクチンを提供することである。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、悪性腫瘍の治療に使用されるがんワクチンのための抗原を提供することである。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、がんワクチンのための抗原を調製する方法を提供することである。
【発明の概要】
【００１３】
発明の目的のために、がん細胞を腫瘍組織から単離することができる。市販の樹立した細胞株又は患者から得た新たな初代がん細胞から生じる任意のがん細胞を、本発明の目的に使用することができる。
【００１４】
驚くべきことに、シスプラチン、パクリタキセル、ゲムシタビン、マイコバクテリウムｗ又はこれらの組み合わせで処理されたがん細胞は、変更されたタンパク質プロフィールを示す。更に驚くべきことに、処理された細胞のタンパク質プロフィールは、処理に使用された作用物質、例えばマイコバクテリウムｗ、シスプラチン、パクリタキセル、ゲムシタビンにかかわらず、少なくとも１つの共通する（共通して発現／過剰発現している）タンパク質を有することが見出される。この驚くべき知見は、それぞれ異なる活性を有するという事実にかかわらずなされている。このタンパク質は、本発明の上記処理後に異なって発現されたタンパク質であることが見出されている。
【００１５】
本発明による共通して発現しているタンパク質は、免疫原性であることが見出されており、それが誘導されるがん細胞（相同）、並びに同じ組織／臓器であるが、異なる細胞特性のがん細胞（異種）に対して反応する免疫応答を誘発する。
【００１６】
本発明によると、上記に記述された作用物質のいずれかにより処理された膵がん細胞株が、起原が同じ組織／臓器である限り、同じ（相同）細胞のみならず異なる（異種）細胞に対しても免疫応答を誘発するタンパク質の発現をもたらすとき、例えば、Ｍｉａ−ｐａ−ｃａ−２細胞株で処理された後に発現したタンパク質は、Ｍｉａ−ｐａ  ｃａ−２細胞（相同）のみならずＰａｎｃ−１、ＡｓＰｃ−１、ＳＷ１９９０など（異種）に対しても免役応答を誘発する。生成された免疫応答は、細胞仲介性であるばかりでなく体液性でもある。
【００１７】
そのように生成された免疫応答は、膵がんに対して予防のみならず治療効果も提供することができる。
【００１８】
膵がん細胞株を使用して生成された免疫応答は、他のがんに対して免疫応答を生成することができない。タンパク質の投与は、哺乳動物にとって安全であることが見出されている。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】共通して発現／過剰発現している癌抗原による細胞仲介性免疫応答の誘発
【図２】共通して発現／過剰発現している癌抗原による体液性免疫応答の誘発
【図３】処理なし群とワクチン処理群の比較
【図４】共通して発現／過剰発現しているタンパク質により生成された免疫応答は癌性起原組織／臓器に特異的である
【詳細な説明】
【００２０】
がん細胞がマイコバクテリウムｗ（Ｍｗ）で処理されたとき、がん細胞のタンパク質プロフィールが変化することが観察されている。タンパク質プロフィールの変化は、ＳＤＳ  ｐａｇｅ分析により観察されるように、単一タンパク質バンドの存在度と関連する。
【００２１】
驚くべきことに、細胞がシスプラチン、パクリタキセル、ゲムンシタビン（gemncitabine）で処理されたとき、同じタンパク質が発現することが見出されている。そのように発現したタンパク質は、共通して発現／過剰発現しているタンパク質と定義される。
【００２２】
そのように発現したタンパク質を、Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎらによりタンパク質科学カレントプロトコール（Current Protocols in Protein Science）に記載されている既知の方法の使用により単離することができる。
【００２３】
驚くべきことに、このタンパク質は、起源組織／臓器に特異的な相同のみならず異質のがん細胞に対しても免疫応答を生成することが見出されている。タンパク質は、哺乳動物に投与されたとき、正常な細胞／組織に対して免疫応答を生成しない。
【００２４】
驚くべきことに、シスプラチン、パクリタキセル及びゲムシタビンのような化合物でがん細胞を処理することは、細胞がマイコバクテリウムｗで処理されたときに発現するタンパク質の発現ももたらすことも観察されている。
【００２５】
したがって、本発明によると、Ｍｗ、シスプラチン、パクリタキセル及びゲムシタビン又はこれらの組み合わせによるがん細胞の処理により共通して発現／過剰発現しているタンパク質は、起源組織／臓器に特異的な相同のみならず異種のがん細胞に対しても免疫応答を生成する。
【００２６】
免疫応答を誘発する共通して発現／過剰発現しているタンパク質は、がん細胞から単離される。本発明の目的のため、がん細胞の死を誘発する多様な作用物質による処理の必要はない。細胞は、共通して発現しているタンパク質からの単離のために生きている必要はない。
【００２７】
本発明の共通タンパク質は、組織／臓器に特異的な異質のがん細胞に特異的な免疫応答も誘発する。
【００２８】
本発明の共通タンパク質の投与は、細胞仲介性免疫応答を誘発する。細胞仲介性免疫応答の測定に用いられる一般的な方法は、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＰＯＴ及びエフェクター機能などである。
【００２９】
本発明の共通タンパク質の投与は、体液性免疫応答を誘発する。この目的に用いられる一般的な方法は、ＦＡＣＳ、ウエスタンブロット、Ｅｌｉｓａなどである。
【００３０】
がん抗原の効力は、起源組織／臓器に特異的な相同のみならず異種のがん細胞に対しても免疫応答を誘発する能力によって決定される。
【００３１】
免疫応答を誘発するがんワクチンの効力は、ＥＬＩＳＰＯＴにより、抗原に応答してインターフェロンガンマを産生する細胞の数の増加の測定として細胞仲介性免疫応答を測定することによって研究した。
【００３２】
免疫応答を誘発するがんワクチンの効力は、抗原を発現／過剰発現している細胞で免疫化したマウス及び抗原に反応性の特異的な抗体の存在により抗原のみで免疫化したマウスの血清からの体液性免疫応答を測定することにより研究した。
【００３３】
同様に、組織／臓器に特異的な異質のがん細胞に対して誘発された免疫応答を決定した。異質の応答は、インターフェロンガンマＥＬＩＳＰＯＴを使用する細胞仲介性応答及びウエスタンブロットを使用する体液性反応の両方について評価した。
【００３４】
本発明の目的の細胞株は、米国のアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection, USA）；オーストラリアの細胞バンク（Cell bank Australia, Australia）；米国ニュージャージー州のコリエル細胞貯蔵所（Coriell Cell Repositories, New Jersey USA）；英国の欧州細胞カルチャーコレクション（European Collection of Cell Cultures (ECACC), UK）；ドイツの微生物及び細胞カルチャーコレクション（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Germany）；日本の医薬基礎研究所（Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB), Japan）；ドイツの微生物及び細胞カルチャーコレクション（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Germany)；韓国の細胞バンク（Korean Cell bank, Korea）；日本の理研バイオソースセンター（RIKEN Biresource Centre, Japan）；米国のヒト遺伝資源センター（Human Genetics Resource Center, USA）；インドの国立細胞科学センター（National Centre for Cell Science, India）；ＭＭＲＲＣ：米国の変異マウス地域リソースセンター（Mutant Mouse Regional Resource Centers, USA）；米国の国立ヒト神経幹細胞リソース（National Human Neural Stem Cell Resource, USA）；英国の幹細胞バンク（UK Stem Cell Bank, UK）及びインドのＮＣＣＳのような多様な貯蔵所から調達することができる。
【００３５】
がん細胞を採取及び保存する又は増殖させる方法は、良く知られている。これらの方法を、自己（autologus）細胞のみならず同種異系細胞にも使用することができる。これらの又は新たな細胞株又は特定のがん細胞をＥｔｏｎ  Ｏらにより記載されたとおりに単離することができる（臨床がん研究（Clinical cancer research）、１９９８年３月、第４巻、６１９〜６２７）。新たな腫瘍を、手術時に凍結切片研究室から収集し、薄切りにより断片化した。ワクチン調製用に生存腫瘍細胞の収量を最大にするため、大量の腫瘍を、コラゲナーゼ１型（２ｍｇ／ｍｌ）及びＩＶ型ＤＮアーゼ（０．４ｍｇ／ｍｌ）Ｓｉｇｍａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ  Ｌｏｉｕｓ，ＭＯ；参照番号２５を使用して解離した。これらの酵素は、得られる細胞調製物の免疫原性を変更することができる。解離された細胞をＨＢＳＳ及びゲンタマイシンで洗浄し、ＨＢＳＳ及び冷却１０％ＤＭＳＯ＋４％ヒト血清アルブミンの等量に再懸濁した。１．５〜２×１０７個の生存腫瘍細胞を含有するアリコートを、液体窒素下で保存した。
【００３６】
以下のプロセスは、本発明による共通して発現しているタンパク質を得るプロセスを記載する。
１．がん細胞を、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ハンクスＦ１２などのような適切な細胞培養培地に懸濁する。
２．これらに、次のシスプラチン、パクリタキセル、ゲムシタビン及びマイコバクテリウムｗのような作用物質のいずれかを加える。
３．全ての作用物質は、がん細胞を死滅させることが知られているが、共通して発現しているタンパク質を得る本発明の目的では、全ての又はいずれかの作用物質による処理でがん細胞を死滅させる必要はない。同様に、細胞を死滅させることは、目的の「共通タンパク質」を発現するがん細胞の特性の損失をもたらさず、その免疫特性を変えることもない。
４．以下の表は、使用される多様な作用物質の好ましい量を提供する。
【００３７】
【表１】
2014521599.tif 000002
【００３８】
５．細胞を、上記処理の後で採取する。
６．採取された細胞のタンパク質プロフィールを、電気泳動、ＨＰＬＣなどの既知の方法を使用して生成する。
７．「共通して発現しているタンパク質を、上記の多様な作用物質を使用した処理により得たタンパク質プロフィールを重ね合せることによって同定する。
８．同定されたタンパク質を、タンパク質精製の方法の使用により大規模で得ることができる。
【００３９】
上記にようにして得られたがん細胞を、１：１０〜１：１０００の範囲の比、好ましくは１：１００のＭｗ細胞で処理した。処理は、適切な培地、好ましくは無血清増殖支持培地において実施した。処理は、２０〜４０℃の範囲の温度、好ましくは３７℃で実施した。処理された細胞を当該技術に既知の方法の１つにより溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、プロテオミクスプロフィールを得た。このようにして得たプロフィールを、未処理細胞タンパク質プロフィールと比較した。異なって発現したタンパク質のバンドパターンを注目した。
【００４０】
がん細胞を、シスプラチンにより０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは５μｇ／ｍｌで処理した。処理は、適切な培地、好ましくは無血清増殖支持培地において実施した。処理は、２０〜４０℃の範囲の温度、好ましくは３７℃で実施した。処理された細胞を当該技術に既知の方法の１つにより溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、プロテオミクスプロフィールを得た。このようにして得たプロフィールを、未処理細胞タンパク質プロフィールと比較した。異なって発現したタンパク質のバンドパターンが注目された。
【００４１】
がん細胞を、パクリタキセルにより５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは５μｇ／ｍｌで処理した。処理は、適切な培地、好ましくは無血清増殖支持培地において実施した。処理は、２０〜４０℃の範囲の温度、好ましくは３７℃で実施した。処理された細胞を当該技術に既知の方法の１つにより溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、プロテオミクスプロフィールを得た。このようにして得たプロフィールを、未処理細胞タンパク質プロフィールと比較した。異なって発現したタンパク質のバンドパターンが注目された。
【００４２】
がん細胞を、ゲムシタビンにより１０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲の濃度、好ましくは８００で処理した。処理は、適切な培地、好ましくは無血清増殖支持培地において実施した。処理は、２０〜４０℃の範囲の温度、好ましくは３７℃で実施した。処理された細胞を当該技術に既知の方法の１つにより溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、プロテオミクスプロフィールを得た。このようにして得たプロフィールを、未処理細胞タンパク質プロフィールと比較した。異なって発現したタンパク質のバンドパターンが注目された。
【００４３】
上記の処理のそれぞれにより得られた変更されたタンパク質プロフィールは、互いに整合した。共通して発現／過剰発現しているタンパク質は、Ｍｉａ−ｐａ−ｃａ−２がん細胞では４０〜５０ＫＤａで示された／同定された。
【００４４】
処理及び未処理がん細胞を、ＰＢＳにｐＨ６．５〜７．５で再懸濁した。細胞を、５〜１５秒間オン及び５〜１５秒間オフにプログラムして５００〜１５００秒間超音波処理し、好ましくは９秒間のオン及び１０秒間のオフにプログラムして９００秒間超音波処理した。ローリータンパク質推定法による総タンパク質推定を溶解産物で実施した。総タンパク質を計算し、２０マクログラムのタンパク質／レーンをゲルに装填した。５〜２０％アクリルアミドゲルをタンパク質の単離に使用し、好ましくは、ＳＤＳであるがこれに限定されない界面活性剤を有する１０％アクリルアミドゲルを使用した。ゲルを１００〜３００Ｖ、好ましくは２００Ｖの定電圧で３０〜９０分間、好ましくは６０分間泳動させた。ゲルをクーマシーブルーＲ２５０染色溶液で１５〜６０分間染色し、脱染溶液（４０％メタノール＋１０％酢酸＋５０％水）により、背景が清澄になり、バンドがゲル上に見えるようになるまで脱染した。得られたタンパク質プロフィールはバンド毎に整合し、Ｍｗ、シスプラチン、パクリタキセル及びゲムシタビンでの処理により共通して発現／過剰発現しているタンパク質が示された。
【００４５】
同定した後、目的のバンドを有するゲルを切片に切断し、次に溶出緩衝液（２０ｍＭのトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．７、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２％のＳＤＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ）で溶出し、撹拌のために振とう器に室温で最低６〜８時間又は一晩保持した。上澄みを収集し、氷冷アセトン（１：４のタンパク質：アセトン）を加え、沈殿のために−２０℃で１〜１２時間保持した。沈殿物を１５０００×ｇにより４℃で４５分間遠心分離した。得られたペレットをアセトン（アセトン：水の４：１）で洗浄し、所望の量のＰＢＳに再懸濁した。総タンパク質をローリーアッセイで推定し、その特異性を、目的のタンパク質に対する抗体を含有する社内マウス血清の使用により分析した。２Ｄゲル電気泳動を実施して、この異なって発現したタンパク質を同定した。タンパク質は、同じゲルで泳動した基準タンパク質分子量マーカーと比較したとき、４５ｋＤａのサイズの大型スポットとしてゲルに現れた。
【００４６】
共通して発現しているタンパク質をマウスに注射した。がん細胞に反応性のある特異的な免疫応答がマウスに生成された。体液性免疫応答は、共通して発現／過剰発現しているタンパク質に特異的な抗体を検出することにより測定した。分析は、ウエスタンブロット、ドットブロット及びＥＬＩＳＡの標準的な技術を使用して実施した。
細胞応答（細胞仲介性免疫応答＝ＣＭＩ）を、インターフェロンガンマ及び／若しくはグランザイム産生細胞の計数、並びに／又は標的細胞（がん細胞）の死滅％により測定した。
【００４７】
本発明に従って調製されたワクチンは、腫瘍を有する動物（マウス、哺乳動物）に投与されたとき、ワクチン及び腫瘍が同じ起源組織を有する場合には腫瘍退縮をもたらす。
【００４８】
以下の実施例は、本発明を説明するが、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４９】
実施例１：共通して発現しているタンパク質を同定する方法
１．膵がん
Ｍｉａ−Ｐａ−Ｃａ−２細胞を、１：５００の比のＭｗ細胞、５μｇ／ｍｌのシスプラチン、１５０μｇ／ｍｌのパクリタキセル及び８００ｎｍのゲンタマイシンで処理した。処理は無血清培地において３７℃で実施した。細胞を溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、プロテオミクスプロフィールを得た。このようにして得たプロフィールを、未処理細胞タンパク質プロフィールと重ね合わせた。タンパク質プロフィールがそれぞれの処理において注目された。異なって発現したタンパク質を４５ＫＤａで同定した。
４５ＫＤａのタンパク質は、膵がん細胞がＭｗ、シスプラチン、パクリタキセル、ゲンタマイシン又はこれらの組み合わせで処理されるとき、共通して過剰発現しているタンパク質である。
【００５０】
２．黒色腫（皮膚がん）
Ｂ１６黒色腫細胞を、５μｇ／ｍｌのシスプラチン、１５０μｇ／ｍｌのパクリタキセル及び８００ｎｍのゲンタマイシンで処理した。処理は無血清培地において３７℃で実施した。細胞を溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、プロテオミクスプロフィールを得た。このようにして得たプロフィールを、未処理細胞タンパク質プロフィールと重ね合わせた。タンパク質プロフィールがそれぞれの処理において注目された。異なって発現したタンパク質を３６ＫＤａで同定した。
３６ＫＤａのタンパク質は、黒色腫細胞がシスプラチン、パクリタキセル、ゲンタマイシン又はこれらの組み合わせで処理されるとき、共通して発現しているタンパク質である。
【００５１】
３．肺がん
異なる肺がん細胞株（Ａ５４９及びＬ１３２）を１：１００の比のＭｗ／細胞で処理した。それぞれの処理群は、４×１０Ｅ６個の細胞を含有した。Ｍｗで処理した細胞を、３７℃で４時間インキュベートした。処理した後、細胞をペレット化し、上澄みを廃棄した。次に細胞をＤＰＢＳ（４００μｌ）に再懸濁した。次に細胞を、１０秒間のオン及び２０秒間のオフのパルスで１５分間超音波処理した。得られた溶解産物を、ＢＣＡタンパク質アッセイの使用によりタンパク質含有量について推定し、タンパク質をそれぞれのウエルに３０μｇタンパク質を装填するように規準化した。この後に１２％還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットを行い、タンパク質プロフィール及び体液性応答を得た。このようにして得たプロフィールを、未処理細胞タンパク質プロフィールと比較した。両方の細胞株は４３ＫＤａで共通タンパク質を示した。
【００５２】
４．皮膚黒色腫
異なる皮膚黒色腫がん細胞株（Ａ３７５、Ｂ１６Ｆ１及びＢ１６Ｆ１０）を１：１００の比でＭｗ／細胞で処理した。それぞれの処理群は、４×１０Ｅ６個の細胞を含有した。Ｍｗで処理した細胞を、３７℃で４時間インキュベートした。処理した後、細胞をペレット化し、上澄みを廃棄した。次に細胞をＤＰＢＳ（４００μｌ）に再懸濁した。次に細胞を、１０秒間のオン及び２０秒間のオフのパルスで１５分間超音波処理した。得られた溶解産物を、ＢＣＡタンパク質アッセイの使用によりタンパク質含有量について推定し、タンパク質をそれぞれのウエルに３０μｇタンパク質を装填するように規準化した。この後に１２％還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットが続いて、タンパク質プロフィール及び体液性応答を得た。このようにして得たプロフィールを、未処理細胞タンパク質プロフィールと比較した。
ゲルは、２つのタンパク質を、１つ目は３６ＫＤａに、２つ目は１７０ＫＤａに示した。興味深いことに、両方のタンパク質は、処理されたＢ１６細胞から生じた抗体でブロットしたとき、Ａ３７５、Ｂ１６Ｆ１及びＢ１６Ｆ１０の間で交差反応を有し、一方、処理されたＡ３７５細胞から生じた抗体でブロットしたときは、３６ＫＤａのタンパク質のみが反応性であった。
【００５３】
５．結腸がん
異なる結腸がん細胞株（ＨＣＴ１５及びＣｏｌｏ２０５）を１：１００の比でＭｗ／細胞で処理した。それぞれの処理群は、４×１０Ｅ６個の細胞を含有した。Ｍｗで処理した細胞を、３７℃で４時間インキュベートした。処理した後、細胞をペレット化し、上澄みを廃棄した。次に細胞をＤＰＢＳ（４００μｌ）に再懸濁した。次に細胞を、１０秒間のオン及び２０秒間のオフのパルスで１５分間超音波処理した。得られた溶解産物を、ＢＣＡタンパク質アッセイの使用によりタンパク質含有量について推定し、タンパク質をそれぞれのウエルに３０μｇタンパク質を装填するように規準化した。この後に１２％還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットを行い、タンパク質プロフィール及び体液性応答を得た。このようにして得たプロフィールを、未処理細胞タンパク質プロフィールと比較した。両方の細胞株は、１０〜１５ＫＤａ及び２６ＫＤａに共通タンパク質を示した。
【００５４】
実施例２：共通して発現／過剰発現しているタンパク質（がん抗原）の単離方法：
Ｍｉａ−ｐａ  ｃａ−２細胞ペレットを採取し、滅菌ＤＰＢＳを用いて２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により洗浄した。細胞を実施例１及び２のとおりに処理した。処理された細胞ペレットをＤＰＢＳに再懸濁し、１５分間超音波処理した。溶解産物の総タンパク質含有量を、フォリン・ローリー法により推定した。２０μｇの溶解産物を１０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥの各レーンに装填し、２００Ｖで４５分間泳動した。ゲルをクーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色した。４５ＫＤａのバンドが分子量タンパク質マーカーに対して観察され、薄く切って取り出した。薄く切られた切片を細かく切り刻み、溶解緩衝液（２０ｍＭのトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．７、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２％のＳＤＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ）において、室温で一晩振とうしながらインキュベートした。タンパク質は、溶解産物を１５０００×ｇにより４℃で４５分間遠心分離することによって、ゲルから溶出させた。上澄みを冷アセトンと１：４の比で混合し、−２０℃で約１時間インキュベートした。得られた沈殿物を、１５０００＊ｇにより４℃で４５分間遠心分離して分離した。ペレットを、３：２のアセトン：水溶液で洗浄し、１５０００＊ｇにより４℃で４５分間遠心分離した。得られたペレットをＤＰＢＳに再懸濁し、フォリン・ローリー法によりタンパク質含有量について推定した。およそ９０％の精製タンパク質を得た。
【００５５】
実施例３：医薬製剤
膵がん及び黒色腫がんに共通して発現／過剰発現しているタンパク質の医薬製剤を下記のように調製する。
１．膵がん細胞の４５ＫＤａタンパク質−１０μｇ
リン酸緩衝液        ５０ｍＭ
ＮａＣｌ          １５０ｍＭ
賦形剤                  十分量
２．膵がん細胞の４５ＫＤａタンパク質−５０μｇ
リン酸緩衝液        ５０ｍＭ
ＮａＣｌ          １５０ｍＭ
賦形剤                十分量
３．膵がん細胞の４５ＫＤａタンパク質−１００μｇ
リン酸緩衝液        ５０ｍＭ
ＮａＣｌ          １５０ｍＭ
賦形剤                十分量
４．膵がん細胞の４５ＫＤａタンパク質−１０μｇ
酢酸緩衝液          ５０ｍＭ
ＮａＣｌ          １５０ｍＭ
賦形剤                十分量
５．膵がん細胞の４５ＫＤａタンパク質−５０μｇ
酢酸緩衝液          ５０ｍＭ
ＮａＣｌ          １５０ｍＭ
賦形剤                十分量
６．膵がん細胞の４５ＫＤａタンパク質−１００μｇ
酢酸緩衝液          ５０ｍＭ
ＮａＣｌ          １５０ｍＭ
賦形剤                十分量
７．膵がん細胞の４５ＫＤａタンパク質−１００μｇ
リン酸緩衝液        １０ｍＭ
ＮａＣｌ          ３００ｍＭ
賦形剤                十分量
８．膵がん細胞の４５ＫＤａタンパク質−１μｇ
リン酸緩衝液        １０ｍＭ
ＮａＣｌ          ３００ｍＭ
賦形剤                十分量
９．黒色腫がん細胞の３６ＫＤａタンパク質−１０μｇ
リン酸緩衝液        ５０ｍＭ
ＮａＣｌ          １５０ｍＭ
賦形剤                十分量
１０．黒色腫がん細胞の３６ＫＤａタンパク質−１００μｇ
リン酸緩衝液        ５０ｍＭ
ＮａＣｌ          １５０ｍＭ
賦形剤                十分量
１１．黒色腫がん細胞の３６ＫＤａタンパク質−５００μｇ
リン酸緩衝液        ５０ｍＭ
ＮａＣｌ          １５０ｍＭ
賦形剤                十分量
１２．黒色腫がん細胞の３６ＫＤａタンパク質−１μｇ
酢酸緩衝液          ５０ｍＭ
ＮａＣｌ          １５０ｍＭ
賦形剤                十分量
１３．黒色腫がん細胞の３６ＫＤａタンパク質−５００μｇ
酢酸緩衝液          ５０ｍＭ
ＮａＣｌ          １５０ｍＭ
賦形剤                十分量
１４．黒色腫がん細胞の３６ＫＤａタンパク質−５０μｇ
リン酸緩衝液        １０ｍＭ
ＮａＣｌ          ３００ｍＭ
賦形剤                十分量
１５．膵がん細胞の４５ＫＤａタンパク質−５００μｇ
トリス緩衝液        ５０ｍＭ
賦形剤                十分量
１６．黒色腫がん細胞の３６ＫＤａタンパク質−５００μｇ
トリス緩衝液        ５０ｍＭ
賦形剤                十分量
【００５６】
上記の製剤を単独で又は場合によりアジュバントと組み合わせて使用し、適切な投与により所望の免疫応答を誘発させる。
【００５７】
実施例４：共通して発現／過剰発現しているがん抗原による細胞仲介性免疫応答の誘発：がん抗原の免疫原性
４５ＫＤａのタンパク質（共通して発現／過剰発現している）に対する免疫原性応答は、マウスを、実施例３の製剤１により１０ｕｇの４５ＫＤａタンパク質で０及び２１日目に皮内で免疫化することによって評価した。対照マウスはＰＢＳを受けた。マウスの個体からの脾細胞懸濁液（１０７個の細胞／ｍＬ）を研究の２８日目に調製して、ＥＬＩＳＰＯＴによりＩＦＮ−ｇ分泌細胞を推定した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、対照及び試験の両方の群の脾細胞で実施した。
プレートの画像をＣＴＬスポット読取機で捕捉した。それぞれのウエルのスポットを自動計数した。プレートＱＣを、感受性及びバックグラウンドパラメーターを使用して実施し、結果を分析した。２倍高いＩＦＮ−ｇ放出が、図１に示されているように、４５ＫＤａタンパク質の免疫化に応答して見出された。
【００５８】
実施例５：共通して発現／過剰発現しているがん抗原による体液性免疫応答の誘発：がん抗原の免疫原性
ａ．がん抗原に対する体液性免疫の生成を評価した。マウスを２群に無作為化した。第１群のマウスを実施例３の製剤１５により０及び２１日目に皮内で免疫化し、一方、第２群、すなわち対照群をＰＢＳでの免疫化のままにした。全てのマウスの血清試料を研究の２８日目に単離して、ワクチンに対する抗体の生成を検出した。ＭｉａＰａＣａ−２溶解産物のウエスタンブロットは、４５Ｋｄａのタンパク質を発現する処理済ＭｉａＰａＣａ−２がん細胞で免疫化したマウス及びＰＢＳで免疫化したマウス（対照）の血清で実施した。溶解産物タンパク質に結合した一次抗体の検出には、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を、着色剤としてのＤＡＢ（ジアミノベンジジン）と共に使用した。ウエスタンブロット分析では、ＭｉａＰａＣａ−２がんワクチン免疫化は、がん抗原に対して抗体応答を生成することが見出される（図２）。
【００５９】
ｂ．ウサギに高い抗体力価を生成するために、実施例３の黒色腫がん製剤１０（３６ｋＤａ）の抗原を、０、７及び１４日目にフロイントアジュバントと同時投与した。免疫化したウサギを２１日目に出血させ、抗体力価を、抗原をニトロセルロース膜に被覆し、免疫化ウサギ血清を一次抗体として使用するドットブロットアッセイにより測定した。ブロットを、二次抗体−ＨＲＰＯ結合体により展開した。力価は、抗黒色腫抗原では１００００を超えることが見出された。
【００６０】
ｃ．抗膵がん抗原抗体を生成するため、ウサギを、フロイント完全アジュバントを用い、１５日目にはフロイント不完全アジュバントを用いて、実施例３の膵がん抗原製剤８（約４５Ｋｄａのタンパク質）で免疫化した。免疫化したウサギを３０日目に出血させ、抗体力価を、抗原をニトロセルロース膜に被覆し、免疫化ウサギ血清を一次抗体として使用するドットブロットアッセイにより測定した。ブロットを、二次抗体−ＨＲＰＯ結合体により展開した。力価は、抗膵がん抗原では５００００を超えることが見出された。
【００６１】
実施例６：免疫化マウスの異種及び相同のがん細胞脾細胞のインビトロでの死滅：エフェクター機能アッセイ
Ａ．相同がん細胞に対する免疫応答
数が２０匹の雄Ｂａｌｂ／Ｃマウス（６〜８週齢）を研究に使用した。動物を、体重に基づいて無作為化し、それぞれ動物が１０匹の２群に分けた。マウスの第１群を、実施例３のがん抗原製剤７の１００μｇ／マウス／用量（実施例１に記載された処理済Ｍｉａ−ｐａ−ｃａ−２細胞から単離された４５ＫＤａの共通して発現／過剰発現しているタンパク質）により０及び２１日目に皮内で免疫化し、一方、第２群、すなわち対照マウスをＰＢＳでの免疫化のままにした。
それぞれの群の免疫化動物の脾細胞を、標的としてＭｉａＰａＣａ−２細胞を含有するポリプロピレンチューブに分配した。脾細胞エフェクターを加えて、エフェクターと標的の比の５：１及び１：１をそれぞれ得た。チューブを３７℃及び６％のＣＯ２で４時間インキュベートした。４時間後、細胞を３００×ｇで１０分間遠心分離してペレット化した。上澄みを廃棄し、ペレットを１％（ｗ／ｖ）ｐ−ホルムアルデヒド溶液で固定し、次にＤＰＢＳを用いて遠心分離により２回洗浄した。７０％の氷冷エタノールを加え、細胞を氷上に３０分間放置した。細胞を、更なる分析まで−２０℃で保存した。
Ｔ細胞の細胞溶解活性を、ＢＤ  ＡＰＯ  ＢｒｄＵキットプロトコールの使用により、エフェクター細胞による標的細胞死を決定することによって評価した。ＡＰＯ−ＢＲＤＵキットは、ＤＮＡ切断及び総細胞ＤＮＡを標識して、フローサイトメトリーによりアポトーシス細胞を検出する２色染色法である。がん抗原（共通して発現している４５ＫＤａのタンパク質）免疫化マウスは、５：１（エフェクター：標的）の比で、対照群と比較して有意に高い相同性標的（Ｍｉａ−ｐａ−ｃａ−２がん細胞）細胞の溶解を示す。
【００６２】
Ｂ．異質性（Heterogenous）（異種性（Hetrologus））がん細胞に対する免疫応答
数が２０匹の雄Ｂａｌｂ／Ｃマウス（６〜８週齢）を研究に使用した。動物を、体重に基づいて無作為化し、それぞれ動物が１０匹の２群に分けた。マウスの第１群を、実施例３のがん抗原製剤５の５０μｇ／マウス／用量（実施例１に記載された処理済Ｍｉａ−ｐａ−ｃａ−２細胞から単離された共通して発現している４５ＫＤａのタンパク質）により０及び２１日目に皮内で免疫化し、一方、第２群、すなわち対照マウスをＰＢＳでの免疫化のままにした。
それぞれの群の免疫化動物の脾細胞を、標的としてＰａｎｃ−１、ＡｓＰＣ−１又はＳＷ１９９０細胞を含有するポリプロピレンチューブに分配した。脾細胞エフェクターを加えて、エフェクターと標的の比の５：１及び１：１をそれぞれ得た。チューブを３７℃及び６％のＣＯ２で４時間インキュベートした。４時間後、細胞を３００×ｇで１０分間遠心分離してペレット化した。上澄みを廃棄し、ペレットを１％（ｗ／ｖ）ｐ−ホルムアルデヒド溶液で固定し、次にＤＰＢＳを用いて遠心分離により２回洗浄した。７０％の氷冷エタノールを加え、細胞を氷上に３０分間放置した。細胞を、更なる分析まで−２０℃で保存した。
Ｔ細胞の細胞溶解活性を、ＢＤ  ＡＰＯ  ＢｒｄＵキットプロトコールの使用により、エフェクター細胞による標的細胞死を測定することによって評価した。ＡＰＯ−ＢＲＤＵキットは、ＤＮＡ切断及び総細胞ＤＮＡを標識して、フローサイトメトリーによりアポトーシス細胞を検出する２色染色法である。がん抗原（共通して発現している４５ＫＤａのタンパク質）免疫化マウスは、５：１（エフェクター：標的）の比で、対照群と比較して有意に高い異種性標的膵がん細胞（Ｐａｎｃ−１、ＡｓＰＣ−１又はＳＷ１９９０）細胞の溶解を示す。
【００６３】
実施例７：マウス機能性アッセイによるインビボでの腫瘍退縮
１．数が３０匹の雄Ｂａｌｂ／Ｃマウス（６〜８週齢）を研究に使用した。動物を体重に基づいて無作為化した。腫瘍誘発は、１×１０５個のＢ１６−Ｆ１細胞をマウスの後肢に皮下注射して実施した。マウスには平均腫瘍サイズの約１００〜１５０ｍｍ３を発達させ、腫瘍サイズに基づいてそれぞれ１０匹の２群に無作為化した。第１群のマウスを、実施例３の黒色腫ワクチン製剤１３の５００μｇ／マウス／用量（共通して発現している３６ＫＤａのタンパク質）により無作為化後の０及び１０日目に皮内で免疫化し、一方、第２群、すなわち対照マウスは非免疫化のままであった。腫瘍サイズ増殖を、腫瘍サイズが動物の体重の１０％に達するまで、週に２回記録した。
処理群の腫瘍容積は、未処理群と比較して上昇しなかった（図３）。処理群は、実際には腫瘍サイズの低減を示し、疾患状態の消散を示唆している。全体的には生存率が改善され、マウスにおける腫瘍サイズは処置群で低減された。
【００６４】
２．数が２０匹の雄Ｃ５７マウス（６〜８週齢）を研究に使用した。動物を体重に基づいて無作為化した。腫瘍誘発は、１×１０５個のＰａｎ０２（膵がん細胞株）細胞をマウスの後肢に皮下注射して実施した。マウスには平均腫瘍サイズの約２００ｍｍ３を発達させ、腫瘍サイズに基づいてそれぞれ１０匹の２群に無作為化した。第１群のマウスを、実施例３の膵がんワクチン製剤４の１０μｇ／マウス／用量（共通して発現している４５ＫＤａのタンパク質）により無作為化後の０及び１０日目に皮内で免疫化し、一方、第２群、すなわち対照マウスは非免疫化（処理なし）のままであった。腫瘍サイズを、腫瘍サイズが動物の体重の１０％に達するまで、週に２回記録した。
処理群の腫瘍容積は、未処理群と比較して上昇しなかった。全体的には生存率が改善され、マウスにおける腫瘍サイズは処置群で低減された。処理群は、処理なしの動物と比較して腫瘍体積の遅延した進行を示した。
【００６５】
３．数が１０匹の雄Ｃ５７マウス（６〜８週齢）を研究に使用した。動物を体重に基づいて無作為化した。第１群のマウスを、実施例３の膵がんワクチン製剤１５の５００μｇ／マウス／用量（共通して発現している４５ＫＤａのタンパク質）により無作為化後の０及び１０日目に皮内で免疫化し、一方、第２群、すなわち対照マウスは非免疫化のままであった（処理なし）。腫瘍誘発は、１×１０５個のＰａｎ０２（膵がん細胞株）細胞を、膵がんワクチンの最初の注射の１０日後にマウスの後肢に皮下注射して実施した。腫瘍サイズを、腫瘍サイズが動物の体重の１０％に達するまで、週に２回記録した。
処理群の腫瘍容積は、未処理群と比較して上昇しなかった。全体的には、生存率は処理群の方が高かった。処理群は、処理なしの動物と比較して腫瘍の遅延した発達を示した。
【００６６】
実施例８：共通して発現／過剰発現しているタンパク質により生成された免疫応答はがん性起原組織／臓器に特異的である
マウスを、実施例３のがん抗原製剤５により５０μｇ／マウス／用量（共通して発現している４５ＫＤａのタンパク質）で０及び２１日目に皮内により免疫化した。マウスの血清試料を研究の２８日目に単離した。ＭｉａＰａＣａ−２、ＡｓＰＣ−１、ＳＷ−１９９０の溶解産物及びＨＥＫ−２９３（腎臓）、ＰＣ−３（前立腺）、ＭＣＦ−７（乳房）、Ａ５４９（肺）、ＰＡ−１（卵巣）のような異なる起源のがんによるウエスタンブロットを、治療がんワクチンに対してマウスにおいて生成された一次抗体で実施した。溶解産物抗原に結合した一次抗体の検出には、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を、着色／検出剤としてのＤＡＢ（ジアミノベンジジン）と共に使用した。ウエスタンブロット分析は、（共通して発現している４５ＫＤａのタンパク質）の免疫化により生成された抗体が膵臓起源のがん細胞溶解産物（異質）に対して異質反応性を有するが、異なる組織／臓器のがん細胞溶解産物に対して無反応性であることを示す（図４）。図４のゲル１において、レーン２〜４は、がん抗原（共通して発現現している４５ＫＤａのタンパク質）免疫化マウスの血清に反応性を示す異なる種類の膵がん細胞によるものであり、起原組織／臓器のがん細胞に異質反応性を示す。一方、ゲル２において、レーン１〜５は、異なる組織／臓器、すなわち、前立腺、乳房、肺、卵巣及び皮膚のがん細胞と反応性を示さず、がん抗原（共通して発現しているタンパク質）を含有するワクチンの安全性を例示している。
【００６７】
まとめ
本発明は、驚くべきことに、シスプラチン、パクリタキセル、ゲムシタビン、マイコバクテリウムｗ又はこれらの組み合わせで処理されたがん細胞が、変更されたタンパク質プロフィールを示すことを見出した。更に、処理された細胞のタンパク質プロフィールは、処理に使用された作用物質、例えばマイコバクテリウムｗ、シスプラチン、パクリタキセル、ゲムシタビンにかかわらず、少なくとも１つの共通する（共通して発現／過剰発現している）タンパク質を有することが見出される。タンパク質（共通して発現／過剰発現している）は、異なる臓器／組織から生じるがん細胞によって異なる。
【００６８】
上記の実施例に記載されている通り、１μｇを超える量で処方された共通して発現しているタンパク質は、免疫原性であることが見出されており、それが誘導されるがん細胞（相同性）、並びに同じ組織／臓器であるが、異なる細胞特性のがん細胞（異種性）に対して免疫応答を誘発する。膵がん細胞株を使用して生成された免疫応答は、他のがんに対して免疫応答を生成することができない。タンパク質の投与は、哺乳動物にとって安全であることが見出されている。場合により、さらに改善された免疫応答を得るために、これらのタンパク質を、哺乳動物への投与の前にアジュバントと組み合わせることができる。
【００６９】
そのように生成された免疫応答は、膵がんに対して予防のみならず治療効果も提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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