(57)【要約】  本発明は、血栓形成剤を軽減させた免疫グロブリン組成物及びその調製のための方法に関する。１つの方法は、３．８超〜５．３以下の範囲のｐＨで、免疫グロブリン含有溶液をネガティブ陽イオン交換体クロマトグラフィーに供する工程を含む。当該溶液はまた、７〜８．２の範囲のｐＨで、ネガティブ陰イオン交換体クロマトグラフィーに供する工程を含み得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリン含有溶液から血栓形成剤を除去するための方法であって、３．８超〜５．３以下の範囲のｐＨの前記免疫グロブリン含有溶液を提供する工程と、固定化された負荷電基を含む支持体を提供する工程と、前記溶液を前記支持体と接触させる工程と、非結合画分Ｉを回収する工程と、を含む、方法。
【請求項２】
前記溶液が、３．８超〜５．０以下の範囲のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶液が、４．０以上〜５．０以下の範囲のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記溶液が、３．８超〜４．７以下の範囲のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記溶液が、約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、又は４．７のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記溶液が、３．８超〜４．３以下の範囲のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記溶液が、４．０以上〜４．３以下の範囲のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記溶液が、４．１以上〜４．３以下の範囲のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記非結合画分Ｉが、同一ｐＨ下で、前記固定化された負荷電基を含む前記支持体と更に接触させられ、非結合画分ＩＩが回収される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記支持体が、クロマトグラフィー材料又はクロマトグラフィー膜の形態である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記支持体材料又は膜が、親水性であり、アガロース、セファロース、アクリルビーズ、セルロース、制御された細孔ガラス、シリカゲル、及びデキストランからなる群から選択されるか、疎水性であり、樹脂類からなる群から選択されるか、又はポリアクリルアミド若しくはポリスチレン系の材料若しくは膜からなる群から選択される有機合成ポリマーである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記負荷電基が、前記支持体と前記負荷電基との間に存在するリンカーを介して前記支持体に固定化される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記リンカーが、タンパク質、アミノ酸、及びペプチドからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記支持体が、化学修飾される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記支持体が、弱又は強陽イオン交換体である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記固定化された負荷電基が、スルホン酸及び他の硫黄含有酸、ギ酸及び他のカルボン酸、リン酸及び他のリン含有酸、硝酸及び他の窒素含有酸の誘導体、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記固定化された負荷電基が、硫黄含有酸である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記硫黄含有酸が、スルホプロピルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記固定化された負荷電基が、カルボン酸である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記カルボン酸が、カルボキシメチルである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
７〜８．２の範囲のｐＨに、前記非結合画分Ｉ又は前記非結合画分ＩＩを調節する工程と、７〜８．２の範囲のｐＨで、前記非結合画分Ｉ又は前記非結合画分ＩＩを固定化された正荷電基を含む支持体と接触させる工程と、非結合画分を回収する工程と、を更に含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
固定化された負荷電基を含む前記支持体と接触させる工程の前に、前記溶液を調節し、それを、７〜８．２の範囲のｐＨで、固定化された正荷電基を含む支持体と接触させる工程と、非結合画分を回収する工程と、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記固定化された正荷電基が、アンモニウム、アルキルアンモニウム、ジアルキルアンモニウム、トリアキルアンモニウム、四級アンモニウム、アルキル基、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、アミノ官能基、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記固定化された正荷電基が、四級アンモニウムである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記四級アンモニウムが、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
７〜８．２の範囲のｐＨで、前記溶液を前記固定化された正荷電基を含む前記支持体と接触させる工程と、前記非結合画分を回収する工程と、３．８超〜５．３以下の範囲のｐＨに、前記非結合画分の前記ｐＨを調節する工程と、３．８超〜５．３以下の範囲のｐＨで、前記非結合画分を前記固定化された負荷電基を含む前記支持体と接触させる工程と、前記非結合画分Ｉを回収する工程と、を含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記非結合画分を調節し、それを前記固定化された負荷電基を含む前記支持体と接触させる工程が、３．８超〜５．０以下の範囲のｐＨで実施される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記非結合画分を調節し、それを前記固定化された負荷電基を含む前記支持体と接触させる工程が、４．０以上〜５．０以下の範囲のｐＨで実施される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記非結合画分を調節し、それを前記固定化された負荷電基を含む前記支持体と接触させる工程が、３．８超〜４．７以下の範囲のｐＨで実施される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記非結合画分を調節し、それを前記固定化された負荷電基を含む前記支持体と接触させる工程が、約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、又は４．７のｐＨで実施される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記非結合画分を調節し、それを前記固定化された負荷電基を含む前記支持体と接触させる工程が、３．８超〜４．３以下の範囲のｐＨで実施される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記非結合画分を調節し、それを前記固定化された負荷電基を含む前記支持体と接触させる工程が、４．０以上〜４．３以下の範囲のｐＨで実施される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記非結合画分を調節し、それを前記固定化された負荷電基を含む前記支持体と接触させる工程が、４．１以上〜４．３以下の範囲のｐＨで実施される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記溶液を前記正荷電基を含む前記支持体と接触させる工程が、１〜２ｍＬ／分／ｃｍ２の範囲の線速度で実施され、前記免疫グロブリン含有溶液が、２〜２２℃の範囲の温度を有する、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項３５】
固定化された負荷電基を含む前記支持体と接触させる工程の前に、前記溶液を、三次元架橋疎水性アクリルポリマーを含むクロマトグラフィー材料と接触させる工程と、非結合画分ＩＩＩを回収する工程と、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記非結合画分、非結合画分Ｉ、又は非結合画分ＩＩを、三次元架橋疎水性アクリルポリマーを含むクロマトグラフィー材料と接触させる工程と、非結合画分ＩＩＩを回収する工程と、を更に含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項３７】
固定化された正荷電基を含む前記支持体が、弱又は強陰イオン交換体である、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項３８】
免疫グロブリン組成物を調製するための方法であって、免疫グロブリン含有溶液を、ネガティブクロマトグラフィーの少なくとも２つの工程：７〜８．２の範囲のｐＨでの陰イオン交換体クロマトグラフィーと、３．８超〜５．３以下の範囲のｐＨでの陽イオン交換体クロマトグラフィーと、に供する工程を含む、方法。
【請求項３９】
前記陽イオン交換体クロマトグラフィーが、２回実施される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記陽イオン交換体クロマトグラフィーが、３．８超〜５．０以下の範囲のｐＨで実施される、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記陽イオン交換体クロマトグラフィーが、４．０以上〜５．０以下の範囲のｐＨで実施される、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記陽イオン交換体クロマトグラフィーが、３．８超〜４．７以下の範囲のｐＨで実施される、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記陽イオン交換体クロマトグラフィーが、約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、又は４．７のｐＨで実施される、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記陽イオン交換体クロマトグラフィーが、３．８超〜４．３以下の範囲のｐＨで実施される、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記陽イオン交換体クロマトグラフィーが、４．０以上〜４．３以下の範囲のｐＨで実施される、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記陽イオン交換体クロマトグラフィーが、４．１以上〜４．３以下の範囲のｐＨで実施される、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４７】
三次元架橋疎水性アクリルポリマーを含むクロマトグラフィー材料を用いた、ネガティブクロマトグラフィーを更に含む、請求項３８〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記陽イオン交換体が、膜の形態である、請求項３８〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記陽イオン交換体が、スルホン酸官能基を含む、請求項３８〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
４％〜１０％のタンパク質を含み、請求項３８〜４９のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、血液又は血液画分由来の免疫グロブリン組成物。
【請求項５１】
請求項５０に記載の前記免疫グロブリン組成物を含有する、収容体。
【請求項５２】
免疫不全、炎症性疾患、自己免疫疾患、又は急性感染病を患っている被検者を治療するための方法であって、前記被検者に、有効量の請求項５０に記載の免疫グロブリン組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項５３】
免疫不全、炎症性疾患、自己免疫疾患、又は急性感染病で用いる、請求項５０に記載の免疫グロブリン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低濃度の血栓形成剤を含む免疫グロブリン調製物に関する。
【背景技術】
【０００２】
静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）調製物は、皮膚筋炎、特発性血小板減少性紫斑病、川崎病、及びギランバレー症候群を含む、様々な免疫不全及び自己免疫疾患の治療のためにますます使用されている。少数の血栓塞栓有害事象は、ＩＶＩＧ調製物の使用と関連している（Ｂｒａｎｎａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １９９６；４７：６７４〜６７７、Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ  ＪＴ．Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  １９９７；４０：１７３２〜１７３３、及びＤａｌａｋａｓ  ＭＣ．Ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ：ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ  ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｃ  ｅｖｅｎｔｓ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １９９４；４４：２２３〜２２６）。
【０００３】
深部静脈血栓症及び心筋梗塞を含むこれらの事象は、主に、高投与量のＩＶＩＧを受けている患者において観察されており、血液粘性度の増加によるものである（Ｄａｌａｋａｓ  ＭＣ．１９９４、及びＲｅｉｎｈａｒｔ  ＷＨ，Ｂｅｒｃｈｔｏｌｄ  ＰＥ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｎ  ｂｌｏｏｄ  ｒｈｅｏｌｏｇｙ．Ｌａｎｃｅｔ  １９９２；３３９：６６２〜６６４）。
【０００４】
血液凝固の接触系の構成要素は、すでに、ヒト免疫グロブリン調製物において特定されている（Ａｌｖｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｔａｃｔ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ：ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｎｄ  ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ  １９８０；９６：３３４〜３４６）。免疫血清グロブリンの市販調製物が、広く様々な濃度のプレカリクレイン活性剤（ＰＫＡ）及びカリクレイン活性を含有することが示された。これらの活性は、血管透過性を増加させることができる生物活性ペプチドを生成するそれらの潜在能力のため所望であった。これらのタンパク質の血管作動性フラグメントの存在は、免疫グロブリン調製物の投与時の偶発的な有害反応に関連すると考えられた。これらの著者はまた、免疫グロブリン調製物中の第ＸＩ因子（ＦＸＩ）も見出した（Ａｌｖｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９８０）。
【０００５】
Ａｌｖｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）において、２５個のロットの免疫血清グロブリン（ＩＳＧ）が、受容体におけるキニンの生成を通じてそのような反応を媒介し得る、接触活性化系の構成要素であるＰＫＡ及びカリクレインについて分析された。カリクレイン活性は、検出不能なレベルから正常血漿中のすべての潜在的なカリクレイン活性の＞６０％に及んだ。ＰＫＡは、低血圧症を引き起こした参照血漿タンパク質画分中の活性の５％から３９５０％に及んだ。５個のロットを除いてすべて、モルモットにおいて血管透過性を増加した。増加を生じなかった５個のロットはまた、ＰＫＡ及びカリクレイン活性が最小であった。免疫グロブリン調製物をゲルクロマトグラフィーに供して、酵素混入物を免疫グロブリンＧから分離したとき、ＰＫＡ及び／又はカリクレインを含有する画分のみが、血管透過性を増加した。ＩＶＩＧの幾つかのロットは、正常血漿の非活性化部分トロンボプラスチン時間を２３６秒から３８秒から５５秒に短縮した。ゲルクロマトグラフィー中、凝集活性は、１５０，０００の分子量に対応する位置で溶出され、これはヒト第ＸＩ因子に対して抗体によって阻害された。これらのデータは、第Ｘｌａ因子が観察された凝血促進活性に関与し、ＰＫＡ及び／又はカリクレインがＩＶＩＧ調節物に対して血管作動反応の潜在的な緩衝液であることを示す。
【０００６】
免疫グロブリンはまた、第ＸＩ因子調製物を混入することも見出された。第ＸＩ因子及び免疫グロブリンは、逐次的なイオン交換カラムを通じて共精製され、第ＸＩ因子から痕跡量のＩｇＧ混入物を除去するために、特異的なコンカナバリンＡ親和性クロマトグラフィーカラムの付加を必要とする（Ｂｏｎｎｏ  ＢＮ，Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＪＨ．Ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９７７；２５２：６４３２〜６４３７）。
【０００７】
Ｗｏｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  Ｉｓ  ａ  Ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ  ｉｎ  Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｅｍ  ２０００；６５：３０〜３４）は、活性化因子ＸＩとして特定される凝血促進剤が、ＩｇＧ調製物中に存在することを示した。本研究では、８つの異なる製造業者からの２９個の静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）のサンプルが、凝血促進活性についてアッセイされた。これらのサンプルのうちの２６個のサンプルは、第ＸＩ因子欠乏症の血漿の凝固時間を短縮した。これらのうち、１４個のサンプルは、正常なプール血漿の０．００１Ｕ／ｍＬを超える第ＸＩ因子活性を有した。残りのサンプルは、正常な血漿活性の０．００１Ｕ／ｍＬ未満を有した。これらのサンプル中の凝血促進活性は、抗第ＸＩ因子ポリクローナル抗体によって阻害され得、これは、凝血促進活性が第ＸＩ因子であったことを示唆した。凝血促進活性は、４℃で４週間保存した後、第ＸＩａ因子の自己活性化の結果として、２つのサンプル中で増加した。更に、幾つかのＩＶＩＧサンプルの活性は、第ＸＩ因子を直接活性化することができ、これは、活性化された第ＸＩ因子がこれらのサンプル中に存在することを示した。
【０００８】
ここ３世紀の間に、静脈内免疫グロブリンの精製のための多くの方法が、ＩＶＩＧに対する高まる需要を満たすために開発されている。製造プロセスの大部分は、専用の樹脂、通常、イオン交換樹脂上に免疫グロブリンを捕捉するための様々な技術を含む（Ｊｅｒｒｙ  Ｓｉｅｇｅｌ．Ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ：Ａｌｌ  Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  Ａｒｅ  Ｎｏｔ  Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｖｏｌｕｍｅ  ２５，Ｉｓｓｕｅ  １１  Ｐａｒｔ  ２，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００５）。樹脂上での免疫グロブリンの捕捉は、非常に高価であり、大量の樹脂を必要とするため、時間を消費する。平均して、１リットリ当たりイオン交換樹脂は、約３０〜５０ｇの免疫グロブリンを捕捉する。したがって、約１００Ｌの樹脂の容積を用いた従来の大カラムを使用するとき、３〜５Ｋｇの免疫グロブリンが捕捉され得る。小カラムによって免疫グロブリン溶液中に存在する薬剤を捕捉することは、経済的利益を有する。
【０００９】
米国特許第５２５２２１７号は、濾過吸着工程に寒冷沈降した血漿上清を適用すること、及び陽イオン交換樹脂上でのクロマトグラフィーの単一の工程によって調製された、ヒト第ＸＩ因子濃縮物を開示する。得られた濃縮物は、好ましくは、第ＸＩ因子欠乏症の場合、代償療法での治療的使用に適している。陽イオン交換樹脂は、５．５〜６．５のｐＨ、好ましくは、６のｐＨで、緩衝液を用いて平衡化される。
【００１０】
米国特許第４２７２５２１号は、７．２以上のｐＨで、イオン交換材料を用いて、免疫血清グロブリン（ＩＳＧ）溶液からのプレカリクレイン活性化因子（ＰＫＡ）及びＰＫＡに対してカリクレイン活性化可能な前駆体（第ＸＩＩ因子）の両方の除去のための方法を開示する。
【００１１】
米国特許第５１６４４８７号は、凝集体、血管刺激物質、及びタンパク質分解酵素のない静脈内で耐容可能な免疫グロブリンＧ調製物を製造する方法を開示する。出発材料は、０．４〜１．５容量％のオクタン酸で処理し、次いで、特に、イオン若しくは陽イオン交換体、又は疎水性マトリックス上でクロマトグラフ化される。
【００１２】
米国特許公開第２０１０／０３１１９５２号は、免疫グロブリンを精製するための方法を開示し、本方法は、単量体及び凝集形態の免疫グロブリンを含む水性緩衝液を、単量体形態の免疫グロブリンが陽イオン交換材料に結合しない条件下で、陽イオン交換材料に適用する工程と、陽イオン交換材料との接触後、この溶液から単量体形態の免疫グロブリンを回収する工程と、を含む。
【００１３】
ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／０７２３８１号は、免疫グロブリンを精製するための方法を開示し、本方法は、単量体形態、凝集形態、及び断片化形態の免疫グロブリンを含む水性緩衝液を、単量体形態の免疫グロブリンが陰イオン交換材料に結合しない条件下で、陰イオン交換体クロマトグラフィー材料に適用する工程と、陰イオン交換体クロマトグラフィー材料からフロースルー中に単量体形態の免疫グロブリンを回収する工程と、を含み、それによって、緩衝水溶液は、８．０〜８．５のｐＨ値を有する。一実施形態では、陰イオン交換体クロマトグラフィー材料は、膜陰イオン交換体クロマトグラフィー材料である。
【００１４】
Ｊｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）は、静脈内免疫グロブリンの産生中の低温殺菌が、凝固酵素等の幾つかの血栓形成剤を不活性化することを開示する。しかしながら、この方法は、凝固酵素を選択的に不活性化せず、それ故に、免疫グロブリン溶液の活性を変化させ得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、免疫グロブリンに作用することなく、免疫グロブリン溶液から血栓形成剤を選択的に除去する方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、具体的には、免疫グロブリン調製物からＰＫＡ、カリクレイン、及び／又はＦＸＩ（ａ）を除去するための方法に関する。一実施形態では、免疫グロブリン調製物は、血液又は血液画分から由来する。
【００１７】
一態様では、本発明は、免疫グロブリン含有溶液から血栓形成剤を除去するための方法を提供し、本方法は、３．８超〜５．３以下の範囲のｐＨの免疫グロブリン含有溶液を提供する工程と、固定化された負荷電基を含む支持体を提供する工程と、当該溶液を当該支持体と接触させる工程と、非結合画分Ｉを回収する工程と、を含む。
【００１８】
本発明の一実施形態では、溶液は、３．８超〜５．０以下の範囲のｐＨを有する。
【００１９】
本発明の別の実施形態では、溶液は、４．０以上〜５．０以下の範囲のｐＨを有する。
【００２０】
本発明の別の更なる実施形態では、溶液は、３．８超〜４．７以下の範囲のｐＨを有する。
【００２１】
更に、本発明の別の実施形態では、溶液は、約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、又は４．７のｐＨを有する。
【００２２】
更に、本発明の別の実施形態では、溶液は、３．８超〜４．３以下の範囲のｐＨを有する。
【００２３】
本発明の別の実施形態では、溶液は、４．０以上〜４．３以下の範囲のｐＨを有する。
【００２４】
本発明の別の更なる実施形態では、溶液は、４．１以上〜４．３以下の範囲のｐＨを有する。
【００２５】
本発明の一実施形態では、非結合画分Ｉは、同一ｐＨ下で、固定化された負荷電基を含む支持体と更に接触させられ、非結合画分ＩＩが回収される。
【００２６】
本発明の別の実施形態では、支持体は、クロマトグラフィー材料又はクロマトグラフィー膜の形態である。
【００２７】
本発明の別の実施形態では、支持体材料又は膜は、親水性であり、アガロース、セファロース、アクリルビーズ、セルロース、制御された細孔ガラス、シリカゲル、及びデキストランからなる群から選択されるか、疎水性であり、樹脂類からなる群から選択されるか、又はポリアクリルアミド若しくはポリスチレン系の材料若しくは膜からなる群から選択される有機合成ポリマーである。
【００２８】
本発明の一実施形態では、負荷電基は、支持体と負荷電基との間に存在するリンカーを介して支持体に固定化される。
【００２９】
本発明の一実施形態では、リンカーは、タンパク質、アミノ酸、及びペプチドからなる群から選択される。
【００３０】
本発明の一実施形態では、支持体は、化学修飾される。
【００３１】
本発明の一実施形態では、支持体は、弱又は強陽イオン交換体である。
【００３２】
本発明の一実施形態では、固定化された負荷電基は、スルホン酸及び他の硫黄含有酸、ギ酸及び他のカルボン酸、リン酸及び他のリン含有酸、硝酸及び他の窒素含有酸の誘導体、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００３３】
本発明の一実施形態では、固定化された負荷電基は、スルホプロピル等の硫黄含有酸である。
【００３４】
本発明の一実施形態では、固定化された負荷電基は、カルボキシメチル等のカルボン酸である。
【００３５】
本発明の一実施形態では、本方法は、７〜８．２の範囲のｐＨに、非結合画分Ｉ又は非結合画分ＩＩを調節する工程と、７〜８．２の範囲のｐＨで、非結合画分Ｉ又は非結合画分ＩＩを固定化された正荷電基を含む支持体と接触させる工程と、非結合画分を回収する工程と、を更に含む。
【００３６】
本発明の一実施形態では、本方法は、固定化された負荷電基を含む支持体と接触させる工程の前に、当該溶液を調節し、その溶液を、７〜８．２の範囲のｐＨで、固定化された正荷電基を含む支持体と接触させる工程と、非結合画分を回収する工程と、を更に含む。
【００３７】
本発明の一実施形態では、固定化された正荷電基は、アンモニウム、アルキルアンモニウム、ジアルキルアンモニウム、トリアキルアンモニウム、四級アンモニウム、アルキル基、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、アミノ官能基、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００３８】
本発明の一実施形態では、固定化された正荷電基は、四級アンモニウムである。四級アンモニウムは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）である。
【００３９】
更に、本発明の別の実施形態では、本方法は、７〜８．２の範囲のｐＨで、溶液を固定化された正荷電基を含む支持体と接触させる工程と、非結合画分を回収する工程と、３．８超〜５．３以下の範囲のｐＨに、非結合画分のｐＨを調節する工程と、３．８超〜５．３以下の範囲のｐＨで、非結合画分を固定化された負荷電基を含む支持体と接触させる工程と、非結合画分Ｉを回収する工程と、を含む。
【００４０】
更に、本発明の別の実施形態では、非結合画分を調節し、それを固定化された負荷電基を含む支持体と接触させる工程が、３．８超〜５．０以下の範囲のｐＨで実施される。
【００４１】
本発明の一実施形態では、非結合画分を調節し、それを固定化された負荷電基を含む支持体と接触させる工程が、４．０以上〜５．０以下の範囲のｐＨで実施される。
【００４２】
本発明の一実施形態では、非結合画分を調節し、それを固定化された負荷電基を含む支持体と接触させる工程が、３．８超〜４．７以下の範囲のｐＨで実施される。
【００４３】
本発明の一実施形態では、非結合画分を調節し、それを固定化された負荷電基を含む支持体と接触させる工程が、約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、又は４．７のｐＨで実施される。
【００４４】
本発明の一実施形態では、非結合画分を調節し、それを固定化された負荷電基を含む支持体と接触させる工程が、３．８超〜４．３以下の範囲のｐＨで実施される。
【００４５】
本発明の一実施形態では、非結合画分を調節し、それを固定化された負荷電基を含む支持体と接触させる工程が、４．０以上〜４．３以下の範囲のｐＨで実施される。
【００４６】
本発明の一実施形態では、非結合画分を調節し、それを固定化された負荷電基を含む支持体と接触させる工程が、４．１以上〜４．３以下の範囲のｐＨで実施される。
【００４７】
本発明の別の実施形態では、溶液を正荷電基を含む支持体と接触させる工程が、１〜２ｍＬ／分／ｃｍ２の範囲の線速度で実施され、免疫グロブリン含有溶液は、８〜３７℃の範囲の温度を有する。
【００４８】
本発明の一実施形態では、本方法は、固定化された負荷電基を含む支持体と接触させる工程の前に、溶液を三次元架橋疎水性アクリルポリマーを含むクロマトグラフィー材料と接触させる工程と、非結合画分ＩＩＩを回収する工程と、を更に含む。
【００４９】
本発明の一実施形態では、本方法は、非結合画分、非結合画分Ｉ、又は非結合画分ＩＩを三次元架橋疎水性アクリルポリマーを含むクロマトグラフィー材料と接触させる工程と、非結合画分ＩＩＩを回収する工程と、を更に含む。
【００５０】
本発明の一実施形態では、固定化された正荷電基を含む支持体は、弱又は強陰イオン交換体である。
【００５１】
本発明の別の態様は、免疫グロブリン組成物を調製するための方法に関し、本方法は、免疫グロブリン含有溶液を、ネガティブクロマトグラフィーの少なくとも２つの工程：７〜８．２の範囲のｐＨでの陰イオン交換体クロマトグラフィー、続いて、３．８超〜５．３以下の範囲のｐＨでの陽イオン交換体クロマトグラフィーに供する工程を含む。
【００５２】
本発明の一実施形態では、陽イオン交換体クロマトグラフィーは、２回実施される。一実施形態では、２つの陽イオン交換体クロマトグラフィーは、相前後して実施される。
【００５３】
本発明の一実施形態では、陽イオン交換体クロマトグラフィーは、３．８超〜５．０以下の範囲のｐＨで実施される。
【００５４】
本発明の別の実施形態では、陽イオン交換体クロマトグラフィーは、４．０以上〜５．０以下の範囲のｐＨで実施される。
【００５５】
本発明の別の更なる実施形態では、陽イオン交換体クロマトグラフィーは、３．８超〜４．７以下の範囲のｐＨで実施される。
【００５６】
更に、本発明の別の実施形態では、陽イオン交換体クロマトグラフィーは、約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、又は４．７のｐＨで実施される。
【００５７】
更に、本発明の別の実施形態では、陽イオン交換体クロマトグラフィーは、３．８超〜４．３以下の範囲のｐＨで実施される。
【００５８】
更に、本発明の別の実施形態では、陽イオン交換体クロマトグラフィーは、４．０以上〜４．３以下の範囲のｐＨで実施される。
【００５９】
更に、本発明の別の更なる実施形態では、陽イオン交換体クロマトグラフィーは、４．１以上〜４．３以下の範囲のｐＨで実施される。
【００６０】
本発明の一実施形態では、本方法は、三次元架橋疎水性アクリルポリマーを含むクロマトグラフィー材料を用いた、ネガティブクロマトグラフィーを更に含む。
【００６１】
本発明の一実施形態では、陽イオン交換体は、膜の形態である。
【００６２】
本発明の一実施形態では、陽イオン交換体は、スルホン酸官能基を含む。
【００６３】
別の態様では、本発明は、血液又は血液画分から由来する免疫グロブリン組成物に監視、４％〜１０％のタンパク質を含み、本発明の方法によって得ることができる。
【００６４】
本発明はまた、本発明によって免疫グロブリン組成物を含有する収容体も提供する。
【００６５】
別の態様では、本発明は、免疫不全、炎症性疾患、自己免疫疾患、又は急性感染病を患っている被検者を治療するための方法を提供し、被検者に有効量の本発明による免疫グロブリン組成物を投与する工程を含む。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
本発明は、血栓形成剤を免疫グロブリン調製物から除去するための方法に関する。本発明の一実施形態では、免疫グロブリン調製物は、血液又は血液画分に由来する。別の実施形態では、血液又は血液画分は、１人を超えるドナー又は複数のドナーからのものである。
【００６７】
６未満のｐＨ値で、免疫グロブリン溶液を陽イオン交換体クロマトグラフィーに供することによって、ＦＸＩ及び又はその活性型ＦＸＩａは、免疫グロブリン含有溶液から効果的に除去され得ることが本発明により見出された。最適の結果が、３．８超〜５．３以下のｐＨ範囲で得られた。このｐＨ範囲は、ＦＸＩａを効果的に除去し、同時に、実質的には、免疫グロブリン（ＩｇＧ）値を維持することが見出された。
【００６８】
免疫グロブリン（６〜８の等電点を有する、米国特許第６５９２９０５号及び同第４２９６０２７号）が、６未満のｐＨ値で、正の正味電荷を有し、したがって、陽イオン交換体に結合することが見込まれ、その上、溶液中に残留する低免疫グロブリン値（米国特許第６５９２９０５号）が得られることから考えると、これらの所見は、驚くべきことである。
【００６９】
機序によって束縛されることなく、６未満のｐＨで、ＦＸＩａ及び免疫グロブリンは、陽イオン交換体上で負荷電基を競い合い、ＦＸＩａの結合は、更に有益であると思われる。
【００７０】
また、驚くべきことに、免疫グロブリン含有溶液からのより高い効率のＦＸＩａ除去が、４．０〜４．３のｐＨ範囲で、陽イオン交換体に免疫グロブリン溶液を供することによって達成され得ることも本発明により見出された。また、これらの所見は、広いｐＨ範囲及び最大約ｐＨ  ９の正の正味電荷を有するという事実から、驚くべきことである（その等電点は、８．９〜９．１である、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃａｔａｌｏｇ）。驚くべきことに、これらの結果は、弱陽イオン交換体又は強陽イオン交換体のいずれかを用いて得られた。
【００７１】
また、カリクレイン（８．６〜９．５の等電点を有する）が、実質的には、ＩｇＧ値を維持しながら、４．１〜４．３のｐＨ値で、溶液を陽イオン交換体クロマトグラフィーに供することによって、免疫グロブリン含有溶液から効果的に除去され得ることも、本発明により見出された。免疫グロブリンが、このｐＨ範囲で正の正味電荷を有し、それ故に、陽イオン交換体に結合することが見込まれ、その上、溶液中に残存する低免疫グロブリン値が得られることを考慮に入れると、これらの所見は、驚くべきことである。
【００７２】
これらの結果は、溶液中の免疫グロブリンの不変の値を維持しながら、非常に狭いｐＨ範囲下で、溶液を陽イオン交換体に供することによって、ＩｇＧ含有溶液からの血栓形成剤の最大の除去を示す。
【００７３】
これらの所見は、溶液内に免疫グロブリンの大部分を保持しながら、及び／又はＩｇＧサブクラスの分布（例えば、ＩｇＧ１−約６５％、ＩｇＧ２−約３０％、ＩｇＧ３−約６％、及びＩｇＧ４−約１％）を変化させることなく、免疫グロブリン含有溶液から血栓形成剤を除去するための方法の発展への道を開いた。「溶液内に免疫グロブリンの大部分を保持する」とは、本方法が、本発明によって溶液を支持体と接触させる前に、初期免疫グロブリン含有量と比較して、免疫グロブリンの７５％以上の回収を可能にすることを意味する。一実施形態では、本方法は、本発明によって溶液を支持体と接触させる工程の前に、初期免疫グロブリン含有量と比較して、免疫グロブリンの８０％、８５％、９０％、９５％、及び９９％の回収を可能にする。
【００７４】
本発明は、血栓形成剤を免疫グロブリン含有溶液から除去するための方法を提供し、本方法は、３．８超〜５．３以下の範囲のｐＨの免疫グロブリン溶液を提供する工程と、固定化された負荷電基を含む支持体を提供する工程と、溶液を支持体と接触させる工程と、非結合画分を回収する工程と、を含む。本発明の一実施形態では、溶液は、３．８超〜５．０以下の範囲のｐＨを有する。本発明の別の実施形態では、この範囲は、４．０以上〜５．０以下である。更なる実施形態では、この範囲は、３．８超〜４．７以下、例えば、約４．０、４．１、４，２、４．３、４．４、４．５、４．６、又は４．７のｐＨである。更に、更なる実施形態では、この範囲は、３．８超〜４．３以下である。更に、更なる実施形態では、この範囲は、４．０以上〜５．３以下である。別の実施形態では、４．０以上〜４．３以下又は約４．１〜約４．３の範囲は、非常に狭く、具体的には、ＦＸＩａ及びカリクレインの除去を可能にする。
【００７５】
用語「血栓形成剤」は、フィブリン凝塊形成を誘発する潜在性を有する薬剤を指す。用語「血栓形成剤」は、止血剤、血栓剤、及び前凝血剤の用語と互換的に本明細書で使用される。血栓形成剤は、例えば、カリクレイン、ＦＸＩ、ＦＸＩａ、第ＸＩＩ因子、トロンビン、及びＰＫＡであり得る。用語「血栓形成剤」は、凝固カスケード中の血栓形成因子を活性化する薬剤等の血栓形成を誘発させる薬剤及び「血栓を生成させる薬剤」を含む。
【００７６】
本明細書で使用される、用語「支持体」は、担体、又は負荷電基を付着、固定化、担持、若しくは安定化させるために使用される任意のマトリックスを含む。支持体は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎらの固定化親和性リガンド技術（Immobilized Affinity Ligand Techniques）（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．１９９２）に記載されるように、当該技術分野において周知である。本発明の方法を行うための支持体は、負荷電基を含む分子を結合することができる任意の材料から作製され得る。固体支持体としては、マトリックス、カラム、カバースリップ、クロマトグラフィー材料、フィルタ、顕微鏡スライド、試験管、バイアル、瓶、ＥＬＩＳＡ支持体、ガラス若しくはプラスチック表面、クロマトグラフィー膜、シート、粒子、電磁ビーズを含むビーズ、ゲル、粉末、繊維等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
本発明の一実施形態では、支持体は、クロマトグラフィー材料の形態である。本発明の別の実施形態では、支持体は、クロマトグラフィー膜の形態である。支持体は、アガロース、セファロース、アクリルビーズ、セルロース、制御された細孔ガラス、シリカゲル、及びデキストラン等の親水性材料、樹脂類等の疎水性材料、又はポリアクリルアミド若しくはポリスチレン系の材料等の有機人工／合成ポリマーからなり得る。一般的な材料／ポリマーは、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｕｌｔｒａｇｅｌ（登録商標）（Ｂｉｏｓｅｐａｒａ，Ｆｒａｎｃｅ）ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）（Ｔｏｓｏ  Ｃｏｒｐ．，Ｊａｐａｎ）、ＨＥＭＡ（Ａｌｌｔｅｃｈ  Ａｓｓ．（Ｄｅｅｒ−ｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌ．，ＵＳＡ）、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標）（Ｒｏｈｍ  Ｐｈａｒｍａ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の商標名下で市販されている。また、アズラクトン系材料（３Ｍ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎ．，ＵＳＡ）。特に好ましいのは、Ａｇａｒｏｓｅ（登録商標）又はＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）である。これらの材料は、例えば、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓから市販されている。クロマトグラフィー材料は、適切な媒体中に懸濁され得、得られたスラリーは、例えば、クロマトグラフィーカラム中で使用され得る。しかしながら、本発明の方法はまた、例えば、試験管又は回分反応器を使用することによって、回分式でも行われ得る。本発明の一実施形態では、支持体は、ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（登録商標）ＥＭＤ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）、又はＴＳＫ−ＧＥＬ（登録商標）ポリマーマトリックスである。
【００７８】
カラムクロマトグラフィーは、当該技術分野において既知であり（Ｋｅｎｎｅｙ及びＦｏｗｅｌｌによって編集された実用的なタンパク質クロマトグラフィー、１１巻Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９２）、概して、溶液（移動相）が、カラムを流下することが可能であり、個々の構成要素は、例えば、クロマトグラフィー材料によって固定相によって吸着させる技術を指す。用語「負荷電基」は、スルホン酸及び他の硫黄含有酸（例えば、ＳＯ４２−及びＳＯ３−）、ギ酸及び他のカルボン酸（例えば、ＣＯＯ−）、並びにリン酸及び他のリン含有酸（例えば、ＰＯ４３−）、硝酸及び他の窒素含有酸（例えば、ＮＯ２）の誘導体のような負電荷を持つ化学基、並びにそれらの組み合わせを含む分子を指す。本発明の一実施形態では、負荷電基は、硫黄含有酸である。本発明の別の実施形態では、負荷電基は、スルホプロピル（ＳＰ）である。本発明の別の更なる実施形態では、負荷電基は、カルボン酸である。本発明の別の実施形態では、負荷電基は、カルボキシメチル（ＣＭ）である。
【００７９】
支持体は、疎水性／親水性の共有結合性相互作用によって負荷電基の一部に結合する疎水性又は親水性表面を有し得る。支持体の疎水性／親水性表面はまた、疎水性／親水性基がポリスチレン、ポリスチレン、又はポリビニル等に結合する、プラスチック等のポリマー、又は任意の他のポリマーであり得る。あるいは、負荷電基は、支持体と負荷電基との間のリンカー架橋によって支持体に共有結合され得る。上で使用される、用語「リンカー」は、支持体と負荷電基との間の中間接続体として使用される数十から１００万ダルトンの分子量を有するスペーサーアーム又は鎖を指す。例えば、リンカーは、タンパク質、ペプチド、及び／又はアミノ酸であり得る。支持体が負荷電基（リンカーを持たない）を含む分子に直接結合する場合、ヒドロキシル基、エステル若しくはアミノ基、又はカルボキシ基等の負荷電基を含む分子内の反応基は、共有結合を生成するために、支持体上に存在する反応基に接合させるために使用され得る。支持体はまた、荷電表面を有し得るか、又は負荷電基と相互作用する荷電基を持つように修飾され得る。支持体は、例えば、臭化シアン活性化マトリックス、エポキシ活性化マトリックス等の負荷電基に付着させるために、化学的に活性化され得る他の反応基を有し得る。支持体はまた、酸化ケイ素材料、例えば、シリカゲル等の無機担体を含んでもよく、これに、荷電基が共有結合され得る。別の実施形態では、荷電基は、膜表面に付着されるか、又は膜に組み込まれる。膜への荷電基の付着は、上述と同一の様式で行われ得る。
【００８０】
本発明によって使用される陽イオン交換体は、上に定義されるように、膜の形態又はクロマトグラフィー材料の形態であり得る。
【００８１】
固定化された負荷電基を含む支持体は、概して、陽イオン交換体と称される。「陽イオン交換体」は、陽イオン又は正荷電を持つ粒子を付着させる又は結合させるそれらの能力に対して命名される。一般的に、支持体系は、負に荷電され、分子は、分子の正味電荷を正の状態にするｐＨ下で結合させるであろう。膜の形態の市販の陽イオン交換体の例は、スルホン官能基を含む、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ膜及びＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓカプセルである。
【００８２】
支持体として膜（例えば、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ膜、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓカプセル）を使用する場合、免疫グロブリン溶液は、２〜４．３膜容量（ＭＶ）／分の範囲の流体流速で膜と接触され得る。用語「流体流速」は、通常、支持体を介する溶液の流れを指す。
【００８３】
用語「等電点」は、分子が正味電荷を持たない場合のｐＨを指す。等電点を下回る分子は、正味正電荷を持ち、それを上回る分子は、正味負電荷を持つ。
【００８４】
負荷電基を含む支持体は、弱陽イオン交換体（例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）カラム）又は強陽イオン交換体（例えば、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ膜）であり得る。弱陽イオン交換体は、概して、ｐＨが低下するにつれて、その電荷を徐々に失う弱酸からなる交換体を指し、一方、強陽イオン交換体は、概して、広いｐＨ範囲にわたってその電荷を持続することができる強酸からなる交換体を指す。
【００８５】
用語「接触させる」は、支持体と、より具体的には、結合相互作用が荷電基と任意の結合パートナー、例えば、溶液／画分中に存在する血栓形成剤との間で生じる様式で、支持体の荷電基と、溶液又は画分を十分に密接に接触させる、いずれかのタイプの結合作用を指す。溶液／画分は、荷電基と血栓形成剤を結合させることができる十分な時間、支持体で培養させることができる。溶液／画分は、支持体を接触させながら７℃〜３７℃の範囲の温度であり得る。
【００８６】
第２の陽イオン交換体クロマトグラフィー工程を行うことは、単一の陽イオン交換体クロマトグラフィー工程を行うことと比較して、免疫グロブリン含有溶液からのＦＸＩａ除去の増加をもたらすことが本発明により見出された。この第２の陽イオン交換体クロマトグラフィー工程は、実質的には、ＩｇＧ値を維持しながら実施された。したがって、溶液は、数回、支持体と接触させることができる。あるいは、支持体がフィルタであるとき、１個を超えるフィルタが、単一の機能単位に組み合わせられ得る。本発明の一実施形態では、第１の濾過工程が、上で明記された同一ｐＨ範囲下で、固定化された負荷電基を含む支持体と接触させる非結合画分Ｉをもたらし、第２の非結合画分ＩＩが回収される。
【００８７】
支持体は、溶液／画分を緩衝液と接触させる前に、例えば、免疫グロブリン含有溶液の緩衝液で支持体を洗浄することによって、平衡化され得る。
【００８８】
用語「平衡化」は、概して、カラム又は支持体が、特定のｐＨ値及び／又はイオン強度等の特定の緩衝液条件に達するようにすることを指す。
【００８９】
用語「非結合画分」は、一般的に、免疫グロブリン含有溶液を荷電基を含む支持体と接触させた後に得られる又は回収されるフロースルー材料、又は免疫グロブリン含有溶液／画分をクロマトグラフィー支持体と接触させた後に得られる又は回収されるフロースルー材料を指す。
【００９０】
一実施形態では、荷電基は、負に荷電される。別の実施形態では、得られたフロースルー材料は、「非結合画分Ｉ」と称される。別の実施形態では、「非結合画分Ｉ」は、負荷電基を含む支持体に供され、フロースルー材料は、「非結合画分ＩＩ」と称される。
【００９１】
クロマトグラフィーカラムは、乾燥したクロマトグラフィー材料又は予め膨潤した材料をカラムに充填させることによって調製され得る。乾燥したクロマトグラフィー材料は、２容量の０．５ＮのＨＣｌ（負荷電基を含む支持体を得るために）中又は０．５ＮのＮａＯＨ（正荷電基を含む支持体を得るために）中で材料を撹拌することによって前処理され得る。次いで、材料は、例えば、約３０分間、沈殿させ得る。上清は、デカントされ得、材料は、ｐＨ値がそれぞれ４又は８に達するまで、Ｈ２Ｏで洗浄することができる。次いで、材料は、２容量の０．５ＮのＮａＯＨ（負荷電基を含む支持体のため）中又は０．５ＮのＨＣｌ（正荷電基を含む支持体のため）中に懸濁され得、上清は、３０分後、デカントされ得る。第２の懸濁工程は、繰り返すことができ、次いで、カラムは、濾液が中和するまで、Ｈ２Ｏで洗浄することができる。
【００９２】
予め膨潤した材料（及び上の段落で記載されるように処理された乾燥材料）は、６ｍＬの緩衝液／グラムの予め膨潤した材料（又は３０ｍＬの緩衝液／グラムの乾燥材料）の比率で、免疫グロブリン含有溶液を装填するために使用される緩衝液で、例えば５分間、材料を撹拌することによって前処理され得る。次いで、ｐＨは、本発明に従って調節され得、材料は、約３０分間、沈殿させて、上清が、デカントされる。次いで、スラリーは、平衡緩衝液（上述通りの比率）中に再分散される。カラム充填のために、材料は、沈殿させる。
【００９３】
あるいは、市販の前充填された使用準備済みのカラムは、前処理することなく使用することができる。
【００９４】
その後、カラム（乾燥材料、予め膨潤した材料から調製された、又は前充填された使用準備済みのカラム）が充填され、所望のｐＨ条件に平衡化される（例えば、平衡緩衝液を使用することによって）。
【００９５】
カラム平衡化後、所望のｐＨを有する免疫グロブリン溶液を装填し、カラムは、すべての非結合材料を洗い落とすために、約５床容量の平衡緩衝液で洗浄することができる。カラムは、２回目の使用のために洗浄され得る。
【００９６】
クロマトグラフィー材料の調製及び前処理、カラム充填、カラム平衡化、免疫グロブリン含有溶液の装填、非結合材料の回収、及び２回目の使用のためのカラム洗浄は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｋａｓｔｎｅｒ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂ．Ｖ．２０００，ｐａｇｅｓ  ４５〜４９を参照されたい。
【００９７】
免疫グロブリン含有溶液は、溶液中の凝集体を減少させるために、クロマトグラフィー前の濾過工程に供され得る。濾過は、例えば、１．２μｍの深さフィルタ又は０．２μｍのフィルタを介して行うことができる。本発明の一実施形態では、陰イオン交換体クロマトグラフィーを行う前に、溶液は、０．２μｍの正に荷電された深さフィルタに供される。有利には、正に荷電された深さフィルタは、リン脂質、脂質等の負電荷材料を除去するために使用される。陰イオン交換体クロマトグラフィーは、７．５Ｌの樹脂、例えば、直径３５ｃｍ及び床高さ１５ｃｍを有するカラム中に充填された、例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）樹脂を用いて行うことができる。充填されたカラムは、１００〜１２０Ｌ／時の流体流速で、例えば、１１０Ｌ／時の流体流速で、少なくとも４８カラム容量の精製水（ＰｕＷ）又は注射用蒸留水（ＷＦＩ）を用いて平衡化され得る。平衡化した後、１８カラム容量の免疫グロブリン含有溶液が、カラムに装填され得る。免疫グロブリン含有溶液の装填は、５０〜７０Ｌ／時の流体流速で、例えば、６０Ｌ／時の流体流速で行われ得る。溶液は、２〜１０℃、例えば、８〜１０℃の温度であり得る。クロマトグラフィーは、室温（２２±２℃）で行われ得る。
【００９８】
陽イオン交換体クロマトグラフィーは、１５６０ｍＬの膜容量を有する陽イオン交換フィルタ膜を用いて行われ得る。様々な膜サイズの組み合わせが、最終膜容量の１５６０ｍＬを得るために使用することができる、例えば、７８０ｍＬの容量を有する２つのフィルタ膜を直列に接続して、１５６０ｍＬの総膜容量を形成することができる。
【００９９】
陽イオン交換体は、１．６〜２．３Ｌ／分の流体流速で、少なくとも３８膜容量の１ＮのＮａＯＨ、続いて、少なくとも６４膜容量の１ＮのＮａＣｌを用いて前処理することができる。用語「前処理する」は、概して、支持体又は膜の表面上に存在し得る望ましくない物質を除去するために、使用前に、支持体又は膜を洗浄することを指す。その後、フィルタ膜は、所望のｐＨに達するまで、１．６〜２．３Ｌ／分の流体流速で、少なくとも６４膜容量の２０ｍＭの酢酸ナトリウム（所望のｐＨに調節された）を用いて平衡化され得る。平衡化した後、少なくとも５０〜１４０膜容量の免疫グロブリン含有溶液は、フィルタ膜を介して濾過され得る。クロマトグラフィーは、１．６〜２．３Ｌ／分の流体流速で、室温（２２±２℃）で行われ得る。装填溶液の温度は、６〜１０℃であり得る。
【０１００】
免疫グロブリン含有溶液中のタンパク質濃度は、陽イオン又は陰イオン交換体への装填中、４０〜７５ｍｇ／ｍＬの範囲、例えば、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度であり得る。
【０１０１】
カラムクロマトグラフィーの場合、非結合画分は、平衡化のために使用される同一の緩衝液及び／又はカラムへの免疫グロブリン含有溶液の装填のために使用される緩衝液（しばしば、「結合緩衝液」と称される）を用いて装填されたカラムの洗浄後に得られ得る。
【０１０２】
また、ベンズアミジンセファロース（この親和性は、ＦＸＩａ等のセリンプロテアーゼと結合する）親和性クロマトグラフィーは、免疫グロブリン含有溶液からＦＸＩａを除去するのには適さなかったことが本発明によって見出された。しかしながら、驚くべきことには、ＦＸＩａは、低ｐＨ値（例えば、５．３のｐＨ値）で、免疫グロブリン溶液をへパリン親和性クロマトグラフィーに供することによって、免疫グロブリン溶液から効果的に除去することができることが見出された。
【０１０３】
機序によって束縛されることなく、低ｐＨ値のへパリン親和性クロマトグラフィーは、陽イオン交換体（ＣＯＯＨ及びＨ２ＳＯ４等の酸性基を有する）として作用し、それ故に、有利には、本発明に従って免疫グロブリン含有溶液からＦＸＩａを効果的に除去するために使用することができる。
【０１０４】
「親和性クロマトグラフィー」は、概して、抗原と抗体、酵素と基質、又は受容体とリガンドとの間のもの等の高度に特異的な生物相互作用に基づいている。
【０１０５】
本発明の一実施形態では、初期ＦＸＩａ含有量（溶液又は画分を本発明によって固定化された負荷電基を含む支持体と接触させる前）と比較して、免疫グロブリン含有溶液又は画分からの７５％を超える、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、及び９９％のＦＸＩａの除去は、十分であると考えられる。
【０１０６】
本発明の一実施形態では、初期カリクレイン含有量（溶液又は画分を本発明によって固定化された負荷電基を含む支持体と接触させる前）と比較して、免疫グロブリン含有溶液又は画分からの７５％を超える、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、及び９９％のカリクレインの除去は、十分であると考えられる。
【０１０７】
ＰＫＡは、７〜８．２の範囲のｐＨ値でゼロ正味電荷を有し（ＰＫＡの等電点は、約８である、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）、したがって、正荷電基と結合することは見込まれない。それにもかかわらず、７〜８．２の範囲のｐＨ値で、陰イオン交換体に免疫グロブリン溶液を供することは、有効なＰＫＡの除去をもたらしたことが本発明によって見出された。これらの結果はまた、陰イオン交換体クロマトグラフィーにおいて７〜８．２の範囲のｐＨ値を使用することはまた、非結合画分においてＩｇＧの高回収率をもたらしたことを示す。７〜８．２のｐＨは、ＩｇＧがゼロ又は負の正味電荷を有する値であり、それ故に、その一部が陰イオン交換体と結合するために失われ得ることが見込まれた。驚くべきことには、７〜８．２の範囲のｐＨ値で、陰イオン交換体に免疫グロブリン含有溶液を供することは、ＰＫＡの最大の除去をもたらし、実質的には、ＩｇＧの損失がなかったことが見出された。
【０１０８】
したがって、ＰＫＡを除去し、同時に、高回収率で免疫グロブリンを得るために、本発明による方法は、７〜８．２の範囲のｐＨ値で、免疫グロブリン含有溶液／画分を固定化された正荷電基を含む支持体と接触させる工程と、非結合画分を回収する工程と、を更に含むことができる。したがって、免疫グロブリン含有溶液は、７〜８．２の範囲のｐＨ値で、陰イオン交換体に供される。
【０１０９】
一実施形態では、本方法は、まず、本発明の陰イオン交換工程を使用し、続いて、陽イオン交換工程を使用する。別の実施形態では、本方法は、まず、陽イオン交換工程を使用し、続いて、陰イオン交換工程を使用する。
【０１１０】
一実施形態では、免疫グロブリン含有溶液のｐＨは、７〜８．２の範囲のｐＨに、酸性又は塩基性溶液を用いて調節され、この溶液は、溶液と同一ｐＨを有する緩衝液又はＰｕＷで前平衡化された正荷電基と接触させられ、非結合画分が回収される。制御された画分のｐＨは、３．８超〜５．３以下の範囲のｐＨに、酸性溶液を用いて調節することができ、この画分は、画分と同一ｐＨを有する緩衝液で前平衡化された負荷電基と接触させることができ、非結合画分が回収される。
【０１１１】
別の実施形態では、免疫グロブリン含有溶液のｐＨは、３．８超〜５．３以下の範囲のｐＨに、酸性又は塩基性溶液を用いて調節され、溶液と同一ｐＨを有する緩衝液で前平衡化された負荷電基と接触させられ、非結合画分が回収される。回収された画分のｐＨは、７〜８．２の範囲のｐＨに、塩基性溶液を用いて調節され、画分と同一ｐＨを有する緩衝液又はＰｕＷで前平衡化された正荷電基と接触させられ、非結合画分が回収される。
【０１１２】
本発明の一実施形態では、陰イオン交換工程及び陽イオン交換工程は、交互に迅速に実施される。本発明の別の実施形態では、本発明の陰イオン交換工程と陽イオン交換工程との間に更なる工程がある。
【０１１３】
陰イオン又は陽イオン交換の工程は、精製を増加させるために数回実施され得る。
【０１１４】
本明細書で使用される、用語「正荷電基」は、アンモニウム、アルキルアンモニウム、ジアルキルアンモニウム、トリアキルアンモニウム、四級アンモニウム［例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ジメチルアミノエチル、又はトリメチルアミノエチル］、アルキル基、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、アミノ官能基（例えば、ＮＲ２Ｈ＋）等の正電荷を持つ化学基、及びそれらの組み合わせを含む分子を指す。
【０１１５】
本発明の一実施形態では、正荷電基は、四級アンモニウム（Ｑ）である。本発明の別の実施形態では、正荷電基は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）である。
【０１１６】
本発明の一実施形態では、免疫グロブリン含有溶液が、まず、７〜８．２の範囲のｐＨで、固定化された正荷電基を含む支持体と接触させられ、非結合画分が回収され、次いで、非結合画分が、固定化された負荷電基を含む支持体と接触させられ、非結合画分Ｉが回収される。あるいは、免疫グロブリン含有溶液が、まず、固定化された負荷電基を含む支持体と接触させられ得、「非結合画分Ｉ」が回収され、次いで、非結合画分Ｉが、固定化された正荷電基を含む支持体と接触させられ、「非結合画分Ｉ」が回収される。
【０１１７】
正荷電基を含む支持体は、上で定義された通りに正電荷を持つ化学基を含む分子と結合することができる任意の材料からなり得る。
【０１１８】
固定化された正荷電基を含む支持体は、概して、陰イオン交換体として称される。「陰イオン交換体」は、陰イオン又は負に荷電された粒子を付着させる又は結合させるそれらの能力に対して命名される。陰イオン交換体は、当該技術分野において周知である（Ｋｅｎｎｅｙ及びＦｏｗｅｌｌによって編集された実用的なタンパク質クロマトグラフィー、１１巻Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９２）。陰イオン交換体では、支持体系は、正に荷電され、分子は、緩衝ｐＨがタンパク質の固有の等電点を超える場合、結合する。
【０１１９】
固定化された正荷電基を含む支持体は、弱又は強陰イオン交換体であり得る。弱陰イオン交換体は、概して、ｐＨが低下するにつれて、その電荷を徐々に失う弱酸からなる交換体を指し、一方、強陽イオン交換体は、概して、広いｐＨ範囲にわたってその電荷を持続することができる強酸からなる交換体を指す。
【０１２０】
溶液／画分は、支持体を接触させながら、８℃〜３７℃の範囲の温度であり得る。
【０１２１】
免疫グロブリン含有溶液／画分は、数回、支持体と接触させることができる、及び／又は単一の機能単位に組み合わせた２個以上のフィルタを使用することができる。
【０１２２】
支持体は、溶液／画分を支持体と接触させる前に、例えば、免疫グロブリン含有溶液／画分の緩衝液で支持体を洗浄することによって、平衡化され得る。
【０１２３】
より具体的には、溶液を固定化された正荷電基を含む支持体と接触させた後、非結合画分が回収される（免疫グロブリン溶液を支持体と接触させた後に得られたフロースルー材料）。カラムクロマトグラフィーの場合、非結合画分は、平衡化のために使用される同一の緩衝液及び／又はカラムへの免疫グロブリン含有溶液／画分の装填のために使用される緩衝液を用いて装填されたカラムの洗浄後に得られ得る。
【０１２４】
支持体と正荷電基との間の代替的な固定化の可能性は、支持体と負荷電基との間の固定化の可能性について上で詳述される。
【０１２５】
正荷電基を含む支持体としてカラムを使用する場合、免疫グロブリン含有溶液は、１〜２ｍＬ／分／ｃｍ２の線速度で、カラムと接触させられ得る。用語「濾過線速度」は、カラムを流れる溶液の速度を指す。
【０１２６】
本発明はまた、免疫グロブリン含有溶液から血栓形成剤を除去するための方法も提供し、７〜８．２の範囲のｐＨの免疫グロブリン含有溶液を提供する工程と、固定化された正荷電基を含む支持体を提供する工程と、固定化された負荷電基を含む支持体を提供する工程と、溶液を固定化された正荷電基を含む支持体と接触させる工程と、３．８超〜５．３以下の範囲のｐＨに、画分のｐＨを調節する工程と、非結合画分を固定化された負荷電基を含む支持体と接触させる工程と、非結合画分Ｉを回収する工程と、を含む。
【０１２７】
本発明の一実施形態では、検出可能な量の血栓形成剤（例えば、ＰＫＡ、カリクレイン、及び／又はＦＸＩａ）は、免疫グロブリン含有溶液から除去される。
【０１２８】
用語「検出可能な」は、例えば、材料及び方法の項に下述される分析の方法を用いて検出される値を指す。
【０１２９】
本発明の一実施形態では、初期ＰＫＡ含有量（本発明によって溶液又は画分を固定化された正荷電基を含む支持体と接触させる前）と比較して、免疫グロブリン含有溶液又は画分から８０％を超える、例えば、８３％、８５％、９０％、９５％、及び９９％のＰＫＡの除去は、十分であると考えられる。本発明による所見はまた、三次元架橋疎水性アクリルポリマーから作製されるＳＤＲカラムを使用することは、残留量のＦＸＩａの除去をもたらすことも示す。ＳＤＲカラムは、サンプルが、比較的高い移動相の塩濃度で、疎水性固定相と相互作用するクロマトグラフィー技術である。
【０１３０】
したがって、免疫グロブリン含有溶液はまた、三次元架橋疎水性アクリルポリマーを含むクロマトグラフィー材料と接触させられ得、非結合画分（例えば、「非結合画分ＩＩＩ」）が回収される。あるいは、三次元架橋疎水性アクリルポリマーを含むクロマトグラフィー材料との接触は、固定化された負荷電基を含む支持体と接触させた後、又は固定化された正荷電基を含む支持体と接触させた後、行われ得る、即ち、「非結合画分」、「非結合画分Ｉ」、又は「非結合画分ＩＩ」が、三次元架橋疎水性アクリルポリマーを含むクロマトグラフィー材料と接触させられ、非結合画分ＩＩＩが回収される。かかる三次元架橋疎水性アクリルポリマーの例は、Ｂｉｏｓｅｐｒａによって供給されるＨｙｐｅｒＤ樹脂である。ＨｙｐｅｒＤクロマトグラフィーは、疎水性相互作用の混合モード吸着及び分子排除を含む［Ｇｕｅｒｒｉｅｒ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．「Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｏｒｂｅｎｔ  ｔｏ  ｒｅｍｏｖｅ  ｓｏｌｖｅｎｔ−ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｆｒｏｍ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄｓ」．Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｐｐｌ．１９９５  Ｆｅｂ  ３；６６４（１）：１１９〜１２５］。
【０１３１】
本発明によってカリクレイン、ＰＫＡ、及び／又はＦＸＩａの除去に供される免疫グロブリン組成物が、血栓症を誘発する活性の減少を示したことが観察された（Ｗｅｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ａ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９５９；１４：９４３〜９４６に記載されるＷｅｓｓｌｅｒ動物モデルを用いて）。
【０１３２】
一実施形態では、本発明は、血栓形成剤から免疫グロブリン含有溶液を精製するための方法を提供し、該方法は、溶液を、ネガティブイオンクロマトグラフィーの少なくとも２つの工程：７〜８．２の範囲のｐＨでの陰イオン交換体クロマトグラフィー、続いて、３．８超〜５．３以下の範囲のｐＨでの陽イオン交換体クロマトグラフィーに供する工程を含む。本方法は、三次元架橋疎水性アクリルポリマーを含むクロマトグラフィー材料を用いて、溶液をネガティブ疎水性クロマトグラフィーに供する工程を更に含むことができる。
【０１３３】
本発明はまた、免疫グロブリン組成物を調製するための方法も提供し、該方法は、免疫グロブリン含有溶液を、ネガティブイオンクロマトグラフィーの少なくとも２つの工程：７〜８．２の範囲のｐＨでの陰イオン交換体クロマトグラフィー、続いて、３．８超〜５．３以下の範囲のｐＨでの陽イオン交換体クロマトグラフィーに供する工程を含む。
【０１３４】
陽イオン交換体クロマトグラフィーは、３．８超〜５．０以下のｐＨ値で、４．０以上〜５．０以下のｐＨ値で、３．８超〜４．７以下のｐＨ値で、３．８超〜４．３以下のｐＨ値で、又は４．０以上〜４．３以下のｐＨ値で、実施され得る。
【０１３５】
本発明の方法は、三次元架橋疎水性アクリルポリマーを含むクロマトグラフィー材料を用いるネガティブ疎水性クロマトグラフィーを更に含むことができる。
【０１３６】
ある実施形態では、本発明による陽イオン交換体からのフロースルー材料は、非結合画分Ｉと命名され、本発明による陰イオン交換体からのフロースルー材料は、非結合画分と命名され、本発明による陽イオン交換体の第２工程からのフロースルー材料は、非結合画分ＩＩと命名され、本発明による三次元架橋疎水性アクリルポリマーを含むクロマトグラフィー材料からのフロースルーは、非結合画分ＩＩＩと命名される。これらの画分のそれぞれは、血栓形成剤を除去し、フロースルー画分を含有する免疫グロブリンを回収するために、異なる順序で、本発明によるクロマトグラフィー工程及び条件のうちの１つ以上において装填され得る。
【０１３７】
本発明の一実施形態では、免疫グロブリン含有溶液は、米国特許第６，４６８，７３３号に記載される三次元架橋疎水性アクリルポリマーに装填される。得られた非結合画分ＩＩＩが回収され、非結合画分ＩＩＩのｐＨが７〜８．２に平衡化され、画分ＩＩＩは、同様のｐＨ条件下で、陰イオン交換体に供される。非結合画分が回収され、非結合画分のｐＨが、本発明による陽イオン交換体に装填される前に、本発明によって平衡化され、非結合画分Ｉが回収される。この最後の工程は、繰り返すことができる。
【０１３８】
用語「ネガティブクロマトグラフィー」は、比較的小さい比率（例えば、２５％未満）のみ又は精製されたタンパク質（即ち、免疫グロブリン）のいずれもクロマトグラフィー支持体と結合せず、クロマトグラフィー分離において、支持体を通過するように選ばれた条件を指す。それ故に、タンパク質の優勢な部分は、フロースルー材料中に存在する。
【０１３９】
用語「ポジティブクロマトグラフィー」は、精製されたタンパク質（即ち、免疫グロブリン）の大部分がクロマトグラフィー支持体と結合し、したがって、非等張条件下で溶出の工程がタンパク質を回収するために必要とされるように、得らばれた条件を指す。
【０１４０】
結果は、血栓形成剤の十分な除去が、陽イオン及び陰イオン交換体クロマトグラフィーのスケールアッププロセスにおいても得られたことを示す。
【０１４１】
本発明はまた、低濃度の血栓形成剤を含む免疫グロブリン組成物も提供する。免疫グロブリンは、液体又は固体形態で、例えば、凍結乾燥された粉末として提供され得る。
【０１４２】
本発明の一実施形態では、免疫グロブリン含有溶液は、まず、固定化された正荷電基を含む支持体（陰イオン交換体）と接触させられ、得られた非結合画分が回収され、固定化された負荷電基を含む支持体（陽イオン交換体）と接触させられ、低い血栓形成剤を有する免疫グロブリン組成物を含む得られた非結合画分Ｉが回収される。本発明の一実施形態では、免疫グロブリン含有溶液はまた、三次元架橋疎水性アクリルポリマー（疎水性クロマトグラフィー−ＨＩＣ）を含むクロマトグラフィー材料と接触させられる。
【０１４３】
低濃度の血栓形成剤を含む免疫グロブリン組成物は、例えば、６ＩＵ／ｍＬ未満のＰＫＡを有する組成物、例えば、下述のトロンビン生成アッセイを行うことによって、免疫グロブリン組成物においてトロンビンの形成を決定するとき、約１００ｎＭ未満のトロンビン生成を示す組成物、０．８ｎｇ／ｍＬ未満のＦＸＩａ、及び／又は２００ｎｇ／ｍＬ未満のカリクレイン（例えば、１２６ｎｇ／ｍＬ未満）を指す。ＰＫＡ、カリクレイン、及びＦＸＩａ値は、材料及び方法の項に下述されるアッセイを行うことによって決定され得る。
【０１４４】
別の態様では、本発明は、本発明の方法によって得ることができる、免疫グロブリン組成物に関する。免疫グロブリン組成物は、収容体中に提供され得る。バイアル又はプレフィルドシリンジは、異なる容積の組成物を含有し得、例えば、本組成物は、０．５ｍＬ、２ｍＬ、１０ｍＬ、３０ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ、５００ｍＬ、１リットル、２リットル、及び３リットルの容積を有し得る。
【０１４５】
用語「収容体」は、免疫グロブリン組成物を保持するために設計された任意の容器を指す。
【０１４６】
免疫グロブリン組成物は、２〜２０ｗ／ｖ％、又は５〜１０％の範囲のタンパク質濃縮物を指す。本発明の一実施形態では、組成物は、４．５〜５．５ｗ／ｖ％の範囲のタンパク質濃縮物を有する。本発明の別の実施形態では、組成物は、約５ｗ／ｖ％のタンパク質濃縮物を有する。別の実施形態では、組成物は、約１０ｗ／ｖ％のタンパク質濃縮物を有する。一実施形態では、タンパク質濃縮物は、約５０ｍｇ／ｍＬである。総タンパク質含有量中の免疫グロブリンの割合（％）は、９０％を超え得る。本発明の一実施形態では、総タンパク質含有量中の免疫グロブリンの割合（％）は、９５％である。
【０１４７】
本発明の別の実施形態では、免疫グロブリン組成物は、低い割合のタンパク質凝集物、例えば、３％未満のタンパク質凝集物を含む。
【０１４８】
用語「凝集物」は、タンパク質凝集物等の固体を含有する材料の塊を指す。凝集物は、ＨＰＬＣによって測定され得る。
【０１４９】
本発明の一実施形態では、組成物は、５０ｍＬの容積中に提供され、２．５ｇのタンパク質含有量を有する。本発明の別の実施形態では、組成物は、１００ｍＬの容積中に提供され、５．０ｇのタンパク質含有量を有する。本発明の別の実施形態では、組成物は、２００ｍＬの容積中に提供され、１０．０ｇのタンパク質含有量を有する。
【０１５０】
本組成物を含むバイアルは、２５℃を下回る温度、例えば、０℃又は２℃〜８℃の温度で保存され、使用するまで光から保護され得る。
【０１５１】
免疫グロブリン組成物はまた、賦形剤を含むこともできる。本明細書で使用するとき、用語「賦形剤」は、薬学的組成物に加えられる不活性物質を指す。賦形剤は、例えば、貯蔵中に活性物質がその化学安定性及び生物活性を維持するのを確実にするために、製造プロセスを支援するために、及び／又は審美的理由で（例えば、色）添加され得る。賦形剤の例としては、マルトース又はＤ−ソルビトール等の様々な糖類；グリシン；ＰＥＧ等の重合賦形剤、又はアルブミン等の血清タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
免疫グロブリン組成物は、活性成分として少なくとも９５％のヒト正常免疫グロブリンＧ、１０％のマルトース、及び注射用蒸留水を含むことができる。免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）含有量は、０．１５ｍｇ／ｍＬ以下であり得る。
【０１５３】
本発明の更に別の目的は、免疫不全、例えば、原発性及び続発性免疫不全、炎症性疾患、自己免疫疾患、急性感染症を患っている被験者を治療するための方法を提供することによって達成され、これは、被験者に有効量の本発明による免疫グロブリン組成物を投与する工程を含む。
【０１５４】
用語「被験者」は、ヒトを含む哺乳類起源の動物を含む。一実施形態では、被験者は患者である。
【０１５５】
用語「有効量」は、疾病、疾患、又は病状を予防する又は治療する（ある症状又はすべての症状を緩和する）のに必要な用量を指す。有効量は、組成物の投与に応答した、疾病の経過中の任意の変化に基づいて判断され得る。有効用量は、被験体の年齢及び体重、疾患及びその重症度（例えば、早期か末期か）、並びに当業者によって認識され得る他の要因に応じて変えることができる。
【０１５６】
免疫グロブリン組成物は、原発性免疫不全（無ガンマグロブリン血症若しくは低ガンマグロブリン血症等の原発性不完全抗体合成を患っている患者）；重度二次性低ガンマグロブリン血症及び予防的抗生物質が効かない反復性感染を伴う慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；肺炎球菌の予防接種に応答しない低ガンマグロブリン血症及び反復性細菌感染を伴うプラトー相中の骨髄腫；同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後のＩ型低ガンマグロブリン血症患者；先天性ＡＩＤＳ及び反復性感染を伴う子供；並びに同種骨髄移植；並びに慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）等の免疫修飾；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；ギランバレー症候群；並びに川崎病のような代償療法に対して使用され得る。
【０１５７】
投与量及び薬物投与法は、意図される使用によって異なる。代償療法では、投薬は、薬物動態及び臨床応答に応じて、各患者に合わせて個別に行われる必要があり得る。
【０１５８】
低濃度の血栓形成剤を有する本発明によって調製される免疫グロブリン組成物は、体内吸収をもたらす経路によって投与され得る。投与経路の非限定例としては、静脈内、皮下、腹内、及び筋肉内が挙げられるが、これらに限定されない。有利には、患者は、低濃度の血栓形成剤を有する本発明によって調製される高用量の免疫グロブリン溶液を受容し得る。投与は、初めに高用量、例えば、０．４〜０．８ｇ／ｋｇ、続いて、間隔を置いて、同一又は低用量で行われ得る。高用量は、患者の免疫グロブリン濃度を有効な標的濃度まで迅速に増加させることを目的とし得る。
【０１５９】
用語「静脈内」は、被験者の静脈への組成物の投与を指す。投与は、間欠的であるか、又は持続点滴注入によるものであり得る。用語「間欠的」は、用語「静脈内ボーラス」又は「静注」と同義である。
【０１６０】
用語「皮下」は、被験者の皮膚下への注射による組成物の導入を指す。注射は、ポケットを形成することによって、例えば、皮膚をつまんだり、又は皮膚を上に引き上げて下層組織から離すこと等によって行われ得る。任意に、注入は、被験者の皮膚下に埋め込まれた薬物送達ポンプの皮下移植によって行われ得る。ポンプは、所定の時間、所定の速度で、所定量の免疫グロブリンを送達することができる。
【０１６１】
「筋肉内」とは、筋肉への直接的な免疫グロブリン組成物の導入を意味する。注射は、三角筋、外側広筋、腹側殿筋、及び背側殿筋が挙げられるが、これらに限定されない、任意の筋肉に投与され得る。投与は、複数の位置で行われ得る。「腹腔内注射」とは、腹膜への免疫グロブリンの注射を指す。
【０１６２】
本発明の免疫グロブリン組成物は、健常なドナーによって献血された血液又は血液画分から調製され得る。免疫グロブリンは、１０００人以上のドナーから得られたプールした血液又は血液画分から調製され得る。免疫グロブリンは、高力価の抗体を有するスクリーニングされたドナーから調製され得る。そのような技術の例は、第ＷＯ−２００７／０１７８５９号に開示されており、その内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。用語「血液画分」は、血漿又は血清等の免疫グロブリンを含む全血の画分を指す。免疫グロブリン組成物は、血漿画分、例えば、Ｃｏｈｎ画分及び／又はＫｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ（ＫＮ）画分法によって、ペーストＩＩを再懸濁することによって得られ得る。
【０１６３】
血液成分由来の免疫グロブリン組成物は、典型的には、感染性粒子から精製される。ウイルス不活化は、濾過、ナノ濾過、溶媒／洗剤処理、例えば、低温殺菌、ガンマ線又はＵＶＣ（＜２８０ｎｍ）照射等であるが、これらに限定されない熱処理、又は当該技術分野において既知である任意の他の方法により実行することができる。
【０１６４】
本発明の一実施形態では、免疫グロブリン組成物は、ＴｎＢＰ／Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を用いる溶媒−洗剤法によって、及びｐＨ  ４でのナノ濾過によって精製される。
【０１６５】
用語「感染性粒子」は、微生物又はプリオン等であるが、これらに限定されない、微細粒子を指し、これらは生物有機体の細胞に感染する又は伝搬し得る。感染性粒子はウイルス粒子であってもよい。
【０１６６】
感染性粒子の不活性化手順は、精製手順前、及び／又はその間に、不活性化分子を組成物に添加することによって行われ得る。添加した分子及びその生成物は、重力、カラムクロマトグラフィー、又は当該技術分野において既知である任意の他の方法により除去できる。感染性粒子の除去は、ナノ濾過により、又はアフィニティ、イオン交換、若しくは疎水性クロマトグラフィーのような選択的吸収法により実行できる。多段階ウイルス不活化手順を実行してもよい。例えば、免疫グロブリン含有溶液は、溶媒／洗剤処理、熱処理、選択的クロマトグラフィー、及びナノ濾過に供することができる。
【０１６７】
用語「ウイルス不活性化」は、ウイルスは溶液中に維持されるが、（例えば、それらの脂質コーティングを溶解することによって）生育不能にする状況、及び／又は、（例えば、サイズ排除技術によって）ウイルスが溶液から物理的に除去される状況を指す。
【０１６８】
「溶媒洗剤（Ｓ／Ｄ）処理」は、典型的には、それらの脂質エンベロープを破壊することによって、エンベロープ被覆されたウイルスを不活性化するプロセスを指す。処理は、洗剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、又はＴｗｅｅｎ  ８０等）及び溶媒［トリ−（ｎ−ブチル）リン酸塩（ＴｎＢＰ）、ジ−又はトリアルキルリン酸塩等］の添加によって行われ得る。脂質被覆されたウイルスを非活性化するために用いられる溶媒−洗剤の組み合わせは、例えば、ＴｎＢＰとＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の組み合わせ、Ｔｗｅｅｎ  ８０とコール酸ナトリウムの組み合わせ等、当該技術分野において周知である任意の溶媒−洗剤の組み合わせであり得る。溶媒洗剤の濃度は、例えば、＞０．１％のＴｎＢＰ及び＞０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のような、当該技術分野において一般的に使用されるものであり得る。典型的には、溶媒−洗剤がウイルスを不活性化する条件は、５〜８のｐＨ値で１０〜１００ｍｇ／ｍＬの溶媒洗剤、及び２〜３７℃の温度にて３０分間〜２４時間からなる。しかしながら、溶媒／洗剤の他の組み合わせ、及び他の好適な条件が、当業者には明らかであろう。Ｓ／Ｄ処理において使用される溶媒−洗剤のバルクは、例えば、クロマトグラフィーカラム等の疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（ＨＩＣ）、例えば、Ｃ−１８シリカ充填材料及びＳＤＲ（溶媒−洗剤除去）ＨｙｐｅｒＤ、イオン交換マトリックス、親和性マトリックス等のタンパク質吸着マトリックス、及び／又はサイズ排除マトリックスを使用することによって除去することができる。Ｓ／Ｄ除去は、油抽出工程を更に含み得る。
【０１６９】
「ナノ濾過」は、典型的には、Ｐｌａｎｏｖａ（商標）２０Ｎ、３５Ｎ、及び７５Ｎ、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ／７０（商標）、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ／１８０（商標）等の特殊なナノメートルスケールのフィルタを使用することによって、脂質エンベロープ及び非エンベロープウイルスを溶液から除外するプロセスを指すフィルタは、７０ｎｍ未満、好ましくは１５〜５０ｎｍの孔径を有し得る。しかしながら、溶液からウイルスを低減又は排除するのに十分な孔径を有する任意の膜を、ナノ濾過で採用することができる。ナノ濾過によって除去されるウイルスは、エンベロープ［例えばＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス］、及び非エンベロープ（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオウイルス）であり得る。
【０１７０】
免疫グロブリン精製技術の例は、米国特許第６，４６８，７３３号、欧州特許第１，１６１，９５８号、及び国際公開第ＷＯ９９／１８１３０号に開示され、これらの内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、Ｃｏｈｎ画分ＩＩ等の原料溶液からの免疫グロブリンの精製方法は、（ａ）４．０〜４．５のｐＨを有する酸性溶液を用いて陽イオン交換樹脂を前処理する工程と、（ｂ）原料溶液を陽イオン交換樹脂と接触させる工程と、（ｃ）陽イオン交換樹脂と結合する免疫グロブリンを溶出する工程と、を含み得る。陽イオン交換樹脂と接触させる前に、原料溶液は、有機溶媒及び洗剤で処理され得る。
【０１７１】
免疫グロブリンの精製のための別の方法は、（ａ）脂質被覆されたウイルスを不活性化するのに十分な濃度及び条件下で、溶液を溶媒−洗剤の組み合わせで処理する工程と、（ｂ）細孔容積が三次元架橋疎水性アクリルポリマーで充填されるシリカビーズからなるクロマトグラフィー充填剤において（ａ）で得られた溶液を通過させることによって、溶媒−洗剤の組み合わせを溶液から除去する工程と、（ｃ）米国特許第６，４６８，７３３号に記載されるように、約１５ｎｍ〜約７０ｎｍの孔径を有するフィルタを通じて、工程（ｂ）の溶液を通過させる工程と、を含み得る。
【０１７２】
免疫グロブリン組成物は、限外濾過プロセスによって濃縮され得る。緩衝液を交換するために、限外濾過に続いて、透析濾過され得る。限外濾過及び透析濾過による濃縮及び透析はそれぞれ、１つの工程において又は２つの別々の工程として実行され得る。透析濾過は、ヒト投与に適している任意の溶液に対して行われ得る。そのような溶液の非限定例としては、０．３％のＮａＣｌ、及び約１．６〜約２．６％、例えば約２．２５％のグリシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【０１７３】
材料と方法。
免疫グロブリン溶液
ａ）ペーストＩＩの再懸濁
Ｃｏｈｎ画分法（Ｃｏｈｎ，Ｅ．Ｊ．Ｔｈｅ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ．Ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｌｉｔａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｎｄｒｕｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｄｓ．Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ  ＆  Ｃｏ，１９４８）によって血漿から調製されたペーストＩＩ（４５Ｋｇ）を、クラッシャータンクに移し、これに、低温（４℃）の注射用蒸留水（ＷＦＩ）（ペーストＩＩの重量の３倍）を添加して、最終重量の１８０Ｋｇを得た。再懸濁したペーストは、まず、４〜６℃で５時間撹拌し、次いで、約３７時間撹拌せずに４〜６℃でデカントし、主要タンパク質の凝集物の沈殿が認められた。沈殿後、上清を沈殿物から分離し、以下の工程に使用した。
【０１７４】
ｂ）ＣＵＮＯ濾過
前の工程で得られた上清は、凝集物を除去するために、平行対のＣＵＮＯ  ０．２μｍの正に荷電した深さフィルタ（Ｃｕｎｏ  Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ，Ｃｕｎｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．ＣＴ  ＵＳＡ）を通じて濾過した。濾過圧力は、濾過工程中、０．１ＭＰａ（１．０バール）を超えなかった。濾過中、流体流速は、６０Ｌ／時であり、温度は、７．２℃であった。
【０１７５】
ｃ）陰イオン交換体クロマトグラフィー−ジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥ）カラム
次の工程では、工程ｂ）から得られた溶液を陰イオン交換体に供した（実施例７〜１１を参照）。
【０１７６】
別途記載のない限り、ＤＥＡＥカラムは、２．８ｍＬ／分の流体流速で、７カラム値（ＣＶ、即ち、７７ｍＬ）の純水（又はＷＦＩ）で平衡化された。平衡化後、工程ｂ）から得られた免疫グロブリン溶液をカラムに装填した。カラム圧力は、０．１ＭＰａ（１．０バール）を超えなかった。
【０１７７】
更なる処理の場合、工程ｃ）は、別途記載のない限り、以下の条件（スケールアップ条件）を用いて実行された：ＤＥＡＥカラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＤＥＡＥ−６５０Ｍ、ＴＯＳＯＨＡＡＳ）は、陰イオン交換体［７．５Ｌ樹脂。カラムの直径は、３５ｃｍであり、１５ｃｍの床高さであった］として使用された。カラムは、１１０Ｌ／時の流体流速で、３６０ＬのＷＦＩで洗浄した。装填は、６０Ｌ／時の流体流速で、８〜１０℃（材料温度）で、ＣＵＮＯ濾過への継続として実行された。免疫グロブリン溶液の装填容量は、１８カラム容量であり、供された溶液のｐＨは、７〜７．６であった。クロマトグラフィーは、室温（２２±２℃）で実施された。
【０１７８】
ｄ）ｐＨ調節
溶液のｐＨは、継続撹拌下で、０．５Ｍ  ＨＣｌを添加することにより、４．５９に調節された。温度は、８±２℃で維持された。凝集物を除去するために、溶液は、清浄な容器内に０．４５μｍ〜０．６５μｍのフィルタ（Ｓａｒｔｏｂｒａｎ）を通じて濾過された。
【０１７９】
ｅ）９０ｇ／Ｌまで濃縮及び透析濾過
ｄ）から得られた溶液は、排除限界３０，０００Ｄの膜を含有する限外濾過カセット（Ｆｉｌｔｒｏｎ  Ｍａｘｉｓｅｔｔｅ、３０ＫＤ）を使用することによって、限外濾過された。カセットは、５００ＫｇのＷＦＩを用いて洗浄することによって調製された。限外濾過中、タンパク質溶液（２００Ｋｇ）は、９０ｇ／Ｌ（１４１Ｋｇの最終重量）まで濃縮された。この工程に続いて、残留エタノールを除去し、＜３０ｍＯｓｍ／Ｋｇまで浸透圧を低下させるために、一定容量で、７０５ＫｇのＷＦＩに対して透析濾過された。次いで、タンパク質濃度が、ＷＦＩを用いて７３ｇ／Ｌに調節され、最終容量が１７３Ｋｇに達した。温度は、この工程を通して８±２℃で維持された。
【０１８０】
陽イオン交換体クロマトグラフィー［Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ膜、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓカプセル、ＳＰカラム、又はＣＭカラム（特定の条件については、実施例２〜４、実施例５、実施例実施例１、及び実施例１をそれぞれ参照のこと）を使用することによって］は、工程ｃ）ＳＰカラムを使用後又は工程ｅ）Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ膜又はＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓカプセルを使用後、実施された。
【０１８１】
陽イオン交換体クロマトグラフィーは、工程ｃ）約５０〜６０ｍｇ／ｍＬのタンパク質がクロマトグラフィーに供された後、実施された。陽イオン交換体クロマトグラフィーは、工程ｅ）約７０ｍｇ／ｍＬのタンパク質がクロマトグラフィーに供された後、実施された。
【０１８２】
凝集物を除去するために、免疫グロブリン溶液を陽イオン交換体に供する前に、溶液は、フィルタ［Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓａｒｔｏｐｕｒｅから得られた１．２μｍの深さフィルタ（ＳＰカラム前）又はＣｏｒｎｉｎｇから得られた０．２μｍのＣＡフィルタ（Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ膜若しくはＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）カプセル前）］を通じて濾過された。
【０１８３】
ＳＰカラムについては、カラムは、免疫グロブリン溶液を装填する前に、免疫グロブリン溶液が装填されるときに、適合するｐＨ値を有する、２０ｍＬの２０ｍＭ緩衝酢酸溶液を用いて平衡化された。
【０１８４】
Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ膜については、フィルタ膜は、免疫グロブリン溶液を装填する前に、免疫グロブリン溶液が装填されるときに、適合するｐＨ値を有する、２０ｍＬの２０ｍＭ緩衝酢酸溶液を用いて平衡化された。
【０１８５】
Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓカプセルについては、カプセルは、製造業者の取扱説明書に従って平衡化前に、前処理された。別途記載のない限り、次の工程では、カプセルは、４．２のｐＨレベルを有する２０ｍＭの緩衝酢酸溶液の６００ｍＬで平衡化された。
【０１８６】
溶媒／洗剤（Ｓ／Ｄ）処理
免疫グロブリン溶液は、５．３のｐＨに平衡化され、次の通りに、（不活性化脂質エンベロープを有するウイルスに対して）Ｓ／Ｄ処理に供した：１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び０．３％のトリ（ｎ−ブチル）リン酸塩（ＴｎＢＰ）（ｖ／ｖ）を共に混合し、次いで、溶液を急速撹拌（２０Ｈｚ）しながら、溶液中にゆっくりと添加した。次いで、溶液は、一定の穏やかな撹拌下で、６．９℃で約４．５時間培養した。培養期間の終了時、１〜１．５時間の期間にわたって、（２０Ｈｚの速度で）撹拌下で、温度は、２３℃まで上昇させた。次の工程では、ＳＤ処理した溶液は、連続的に、（その後の工程のＳ／Ｄ除去の前に、肉眼的微粒子破片を除去するために）３μの深さフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、続いて、０．４５〜０．６５μｍの膜フィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通じて濾過された。
【０１８７】
ＳＤＲカラムによるＳ／Ｄ除去
Ｓ／Ｄ除去は、専用カラムのＨｙｐｅｒＤ溶媒−洗剤除去のクロマトグラフィー樹脂（ＢｉｏｓｅｐｒａによるＳＤＲ−ＨｙｐｅｒＤ）によって行われた。ＳＤで処理された免疫グロブリン溶液を装填する前に、カラムは、４５０ＫｇのＷＦＩ（０．０８ＭＰａ（０．８バール）の最大圧力で）を用いて、８０Ｌ／時の流速で調製された。カラム長さは５４ｃｍであり、直径は２８ｃｍであり、樹脂の容量は、３０〜３２Ｌであった。流速は７８Ｌ／時であり、サンプルを装填した後、３７ＫｇのＷＦＩを用いてカラムを洗浄して、ベースラインを得た。回収された総フロースルー容量は、１７６．７Ｋｇであった。
【０１８８】
プレカリクレイン活性剤濃度の測定
内因性凝固カスケードの第１の酵素原であるプレカリクレイン活性剤（ＰＫＡ）は、プレカリクレインをカリクレインに活性化する。このアッセイでは、プレカリクレイン（試験サンプルに添加される）は、試験サンプル中に見出されたＰＫＡによってカリクレインに活性化される。次いで、形成されたカリクレインは、定速で、色素基質（Ｈ−Ｄ−Ｂｕｔ−ＣＨＡ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）を有色のｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）に切断する（以下の反応を参照のこと）。この反応は、４０５ｎｍで、分光光度法で測定され得る。
【０１８９】
得られた色は、試験サンプル中に存在するＰＫＡの量に比例する。
【０１９０】
【化１】
2014516031.tif 000002
【０１９１】
必要とされる試薬はすべて、プレカリクレイン活性剤アッセイキット（Ｐａｔｈｗａｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃｏｄｅ：ＰＷ３０１００）からものである。アッセイは、３７℃で行われた。
【０１９２】
より具体的には、アッセイは、以下の通りに行われた：
ｉ）ブランク調製物のための工程Ａ：２５μＬの各ＰＫＡ標準希釈物（０、３．１２５、６．２５、１２．５、及び１８．７５ＩＵ／ｍＬ。様々なＰＫＡ濃度は、緩衝液キットで希釈されたＰＫＡ溶液から調製された）、陽性対照［１０ＩＵ／ｍＬのＰＫＡを含有したＰＫＡについては、ＦＤＡ国際規格］又は希釈された試験サンプル（緩衝液キットを用いて１：２に希釈）を９６ウェルのマイクロプレートにピペット分注した。
ｉｉ）ＰＫＡの標準的な陽性対照及び試験サンプルのための工程：２５μＬの各ＰＫＡ標準希釈物又は希釈された試験サンプル（上で調製されたものと同一の希釈物）をエッペンドルフチューブにピペット分注した。次いで、５０μＬのヒトプレカリクレイン溶液を各エッペンドルフチューブに添加した。チューブにふたをかぶせ、混合し、各エッペンドルフチューブから２５μＬをマイクロプレートウェルに（複製して）移した。
ｉｉｉ）次の工程では、プレートを３７℃で３０分間培養した。
ｉｖ）ブランク調製物のための工程Ｂ：３０分間の培養後、５０μＬの予熱した（３７℃）ヒトプレカリクレイン溶液をすべてのブランクに添加し（工程ｉの調製を参照のこと）、ウェルの内容物をピペットを用いて混合した。次いで、２５μＬのこれらのウェルの各々の内容物を対応するマイクロプレートウェル中に（複製して）直ちに移した。マイクロプレートは、更に約１５分間（合計４５分間の培養時間）、３７℃で培養した。
ｖ）すべての調製物のための工程：１００μＬの予め温めた（３７℃で）カリクレイン基質作用液（色素基質を含む溶液）をすべてのウェル（工程ｉｉ及びｉｖのウェル）に添加した。
ｖｉ）マイクロプレートは、ＥＬＩＳＡリーダー中に置かれ（３７℃で）、光学密度（ＯＤ）は、２分間後（ＯＤ２分間）、４０５ｎｍで測定され、もう一度、１２〜１７分間の培養後（ＯＤＸ分間）、４０５ｎｍで測定された。
【０１９３】
ブランクに対して得られたＯＤは、対応する試験サンプルに対して得られたＯＤから減じられた。
【０１９４】
ＰＫＡ含有量は、関連した希釈因子を考慮に入れた標準較正曲線から補間される通りに、ΔＯＤ（ｘ−２）（それぞれの読み取りからブランクを減じた後）を用いて計算された。結果は、国際単位／ｍＬで示される。
【０１９５】
ＦＸＩ／ＦＸＩａ除去の評価のためのトロンビン生成アッセイ
トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）は、時間と共に生成され、そして分解されるトロンビンの量を測定する国際的な止血法である。このアッセイは、凝固カスケードが誘発されるとき（内因性トリガー又は外因性トリガーのいずれかによって）、トロンビンを生成するための任意の所与のサンプルの能力（又は潜在性）を推定する。ＴＧは、定義されたトロンビン活性標準に対してサンプルのトロンビン生成の蛍光トロンビン基質及び較正の変換によって観察される。
【０１９６】
アッセイは、透明な丸底（Ｕ底）９６ウェルプレート及び３９０／４６０ナノメートルフィルタセット及びディスペンサーを備えたＴｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（「Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  ＦＬ」）において行われた。
【０１９７】
ＦＸＩ／ＦＸＩａ値を測定するために、ＦＸＩ欠損血漿（Ｓｔａｇｏから得られる、カタログ番号００７２３）を使用し、凝固カスケードは、１ｐＭの組織因子（外因性凝固経路の活性化をもたらす）及び４μＭのリン脂質（内因性凝固経路の活性化をもたらす）によって誘発された（組織因子及びリン脂質は、一緒に混合し、１つの試薬−ＰＰＰ−Ｒｅａｇｅｎｔ  ｌｏｗに提供される、Ｓｔａｇｏ、カタログ番号ＴＳ  ３１．００）。
【０１９８】
測定は、以下の修正を伴って、「Ｔｈｅ  Ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｍ  Ｇｕｉｄｅ」（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ＢＶ）：ｏｕｔｌｉｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｍ」に従って行われた。
【０１９９】
測定については、２０μＬの試験サンプル（ＦＸＩａの潜在源としての機能を果たす）を、ウェル中で６０μＬのＦＸＩ欠損血漿及び２０μＬのＰＰＰ−Ｒｅａｇｅｎｔ  ｌｏｗと混合した。
【０２００】
試験されたそれぞれの個々のサンプルは、対応する較正物質サンプル（既知量のトロンビンを含む）及び試験サンプルを必要とする。トロンビン較正物質サンプル測定のために、２０μＬの試験サンプル、６０μＬのＦＸＩ欠損血漿、及び２０μＬのトロンビン較正物質（Ｓｔａｇｏ、カタログ番号ＴＳ  ２０．００）を混合した。
【０２０１】
トロンビン生成反応（３７℃で）は、蛍光基質及びＣａ２＋を含有する２０μＬの添加により開始された［蛍光基質及びＣａ２＋はＦｌｕｃａキット（Ｓｔａｇｏ、カタログ番号ＴＳ  ５０．００）に提供され、製造業者の取扱説明書に従って一緒に混合する］。蛍光基質及びＣａ２＋の添加は、「Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  ＦＬ」によって自動的に行われる。
【０２０２】
次いで、生成されたトロンビンの量（ｎＭで）は、計器ソフトウェアＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ＢＶ（「Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  ＦＬ」が提供される）を用いて計算された。試験サンプル中の最終トロンビン量は、試験サンプルの値とトロンビン較正物質の値の両方からバックグラウンド値を減じ、トロンビン較正物質の値からサンプル中のトロンビン量を外挿することによって計算された。バックグラウンド値は、２０ｍＭの緩衝酢酸溶液を含有する２０μＬの緩衝液が追加された６０μＬのＦＸＩ欠損血漿を用いて得られる。
【０２０３】
第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）値の測定（蛍光発生法）
第ＸＩａ因子値は、蛍光発生法によって測定された。本方法では、ＦＸＩａは、カルシウムの存在下で、特定の蛍光基質を切断する。切断反応において、基質（トリペプチド配列に結合する蛍光レポーター基６−アミノ−１−ナフタレン−スルホンアミド（ＡＮＳＮ）からなる）は、トリペプチド配列とＡＮＳＮ基との間で加水分解される。一旦ペプチド部分から切断されると、ＡＮＳＮ基は、相対的蛍光量の約１０００倍の増加を示す。この活性は、サンプル中の第ＸＩａ因子の量と直接関連する。発生した蛍光は、３５０ｎｍで励起及び４７０ｎｍで発光の波長を有するＥＬＩＳＡリーダーを使用することによって測定される。より具体的には、測定は、以下の通りに行われた。
【０２０４】
第１段階（１回目の９６ウェルプレート調製）−試験サンプルは、不希釈（免疫グロブリン溶液を陽イオン交換体に供する工程の後にサンプルが試験される場合、又は希釈（免疫グロブリン溶液を陽イオン交換体に供する前にサンプルが試験される場合、１：１０）のいずれかで試験された。希釈は、緩衝液Ｂ［４０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３００ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＣａＣｌ２、及び０．２％のポリスチレングリコール（ＰＥＧ）２０Ｋ溶液］中で行われた。上述のサンプルから５０μＬを、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３７９７）のウェルに四重に添加した。
【０２０５】
標準曲線は、１４０、１００、７０、５０、及び２５ｎｇ／ｍＬの濃度に、緩衝液Ａ［２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液、０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ］中で希釈されたＦＸＩａ（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、カタログ番号ＨＣＸＩＡ−０１６０）を用いて調製された。５０μＬのそれぞれの濃縮物をウェルに四重に添加した。陽性対照（約１２０ｎｇ／ｍＬのＦＸＩａを含有した免疫グロブリン調製物）及びブランクサンプル（緩衝液Ａ）をそれぞれのプレートに四重に添加した（陽性及びブランクサンプルをそれぞれ５０μＬ）。
【０２０６】
第２段階（２回目の９６ウェルプレート調製）−運動性反応のために、９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに、緩衝液Ｂ）中に１：１００で希釈した２５μＬのＦＸＩａ基質溶液（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，カタログ番号ＳＮ−１３ａ）を添加することにより第２の９６ウェルプレートが調製された（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３６９５）。次に、２５μＬの１回目の９６ウェルプレートにおいて調製されたすべてのサンプル（試験サンプル、標準曲線調製のためのサンプル、陽性対照、及びブランクサンプル）を、第２のプレート中の並列ウェルに移し、第２のプレートをＥＬＩＳＡリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）に直ちに移した。以下のパラメーター：３０秒おきに１５分間の記録、励起：３５０ｎｍ、発光：４７０ｎｍ、カットオフ：４５５ｎｍ、温度：３７℃が、読み取りに使用された。振とう器は、第１の読み取りの１５秒前に活性化され、Ｖ最大速度［相対的蛍光単位（ＦＲＵ）／分］が０〜９００秒間測定された。
【０２０７】
運動性反応のＶ最大は、線形曲線フィットを用いた反応の計算である。クリーピング反復法は、Ｖ最大点を用いて行われ、最急線分の勾配は、ＲＦＵ（相対的蛍光単位）のＶ最大速度として報告される。
【０２０８】
試験サンプル中のＦＸＩａ濃度（ｎｇ／ｍＬ）は、サンプル希釈を考慮して、ＦＸＩａ（上述）を用いて生成された標準曲線からソフトウェアによって外挿された（ブランクは自動的に差し引かれた）。
【０２０９】
タンパク質含有量は、製造業者の取扱説明書に従って総タンパク質試薬（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＩＮＣ．，カタログ番号５４１−２）を用いたビューレット法（Ｂｉｕｒｅｔ法）によって測定された。
【０２１０】
ＩｇＧサブクラス分布は、製造業者の取扱説明書に従ってヒトＩｇＧサブクラスコンビキット（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｌｔｄ．、カタログ番号ＲＫ０２１）のためのＢＩＮＤ  Ａ  ＲＩＤキットを用いて測定された。
【０２１１】
抗ジフテリア抗体力価は、製造業者の取扱説明書に従ってジフテリアキット（ＶＩＴＲＯＴＥＣＨ）によって測定された。
【０２１２】
Ｂ型肝炎表面抗原（抗ＨＢｓＡｇ）抗体は、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号：ＬＢＸＨＢＳから入手されるキットによって測定された。
【０２１３】
カリクレイン値の測定（色素法）。
カリクレイン値は、色素法によって測定された。本方法では、カリクレインは、特定の色素基質を切断する。切断反応では、カリクレイン基質（カリクレイン基質のオリゴペプチド配列に結合する色素レポーター基パラ−ニトロアニリン（ｐＮａ）からなる）は、オリゴペプチド配列とｐＮａ基との間で加水分解される。一旦ペプチド部分から切断されると、ｐ−Ｎａは、４０５ｎｍで高吸光度を示す。この活性は、サンプル中のカリクレインの量と直接関連する。観察された吸光度は、４０５ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーを使用することによって測定される。より具体的には、測定は、以下の通りに行われる。
【０２１４】
第１段階（１回目の９６ウェルプレート調製）−試験サンプルは、１：５で希釈（免疫グロブリン溶液を陽イオン交換体に供する工程の後にサンプルが試験される場合、又は１：３０で希釈（免疫グロブリン溶液を陽イオン交換体に供する前にサンプルが試験される場合）のいずれかで試験された。希釈は、緩衝液Ａ［２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｗ／ｖ％のＢＳＡ］中で行われた。上述のサンプルから５０μＬを、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３７９７）のウェルに四重に添加した。
【０２１５】
標準曲線は、４００、２００、１００、５０、２５、及び１２．５ｎｇ／ｍＬの濃度に、緩衝液Ａ中で希釈されたカリクレイン（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＨＰＫａ−１３０３）を用いて調製された。５０μＬのそれぞれの濃縮物をウェルに四重に添加した。２つの陽性対照（約７０及び１５ｎｇ／ｍＬのカリクレインを含有した免疫グロブリン調製物）及びブランクサンプル（緩衝液Ａ）をそれぞれのプレートに四重に添加した（陽性及びブランクサンプルをそれぞれ５０μＬ）。
【０２１６】
第２段階（２回目の９６ウェルプレート調製）−運動性反応のために、９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに、２５μＬのカリクレイン基質溶液｛Ｂｉｏｐｈｅｎ  ＳＣ３１（０２）（ＨＹＰＨＥＮ  ＢｉｏＭｅｄ，カタログ番号２２９０３１−５ｍＬの精製水中で再構成され、次いで、緩衝液Ａ中に１：７で希釈した｝を添加することにより第２の９６ウェルプレートが調製された（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３６９５）。次に、２５μＬの１回目の９６ウェルプレートにおいて調製されたすべてのサンプル（試験サンプル、標準曲線調製のためのサンプル、陽性対照、及びブランクサンプル）を、第２のプレート中の並列ウェルに移し、第２のプレートをＥＬＩＳＡリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）に直ちに移した。以下のパラメーター：３４秒おきに１５分間の記録、吸光度：４０５ｎｍ、温度：３７℃が、読み取りに使用された。振とう器は、第１の読み取りの１５秒前に活性化され、Ｖ最大速度［ＯＤ／分］が０〜９００秒間測定された。
【０２１７】
運動性反応のＶ最大は、線形曲線フィットを用いた反応の計算である。クリーピング反復法は、Ｖ最大点を用いて行われ、最急線分の勾配は、吸光度単位／分のＶ最大速度として報告される。
【０２１８】
試験サンプル中のカリクレイン濃度（ｎｇ／ｍＬ）は、サンプル希釈を考慮して、カリクレイン（上述）を用いて生成された標準曲線からソフトウェアによって外挿された（ブランクは自動的に差し引かれた）。
【０２１９】
実施例１：ＦＸＩａを溶液から除去するための陽イオン交換体クロマトグラフィーの有効性における免疫グロブリン溶液のｐＨ値の効果
以下の実験は、陽イオン交換体による溶液からのＦＸＩａ除去における免疫グロブリン溶液のｐＨ値の効果を決定することを目的とした。
【０２２０】
ＦＸＩａの等電点は、約９である（Ｂｏｎｎｏ  ＢＮ，Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＪＨ．Ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９７７；２５２：６４３２〜６４３７）。陽イオン交換体が使用されるため、等電点（ＦＸＩａは正味正電荷を有する）を下回るｐＨ値が使用され得る。この実験では、４〜７の範囲のｐＨ値の効果が評価された。
【０２２１】
この目的のために、免疫グロブリン溶液は、材料及び方法の項に記載される工程ａ〜ｃに従って調製された。次の工程では、溶液のｐＨは、０．５ＮのＮａＣｌ又は０．１ＮのＮａＯＨのいずれかを用いて、所望の試験ｐＨ（４〜７のｐＨ範囲、溶液のｐＨ値は、電子ｐＨモニタ装置を用いて測定された）に調節され、１００ｍＬの得られた免疫グロブリン溶液はそれぞれ、陽イオン交換体カラムに供された。
【０２２２】
スルホプロピルカラム（ＳＰカラム）が、陽イオン交換体として使用された。カラムの調製：４ｍＬのＳＰ樹脂（ＴＯＳＯＨＡＡＳ、カタログ番号Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ，ＳＰ−６５０Ｍ）は、直径１ｃｍのカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）内部に実装され、床高さは６ｃｍに達した。クロマトグラフィーは、２ｍＬ／分の流速で、室温（２２±２℃）で行われた。装填溶液の温度は、２２±２℃であった。
【０２２３】
ＦＸＩａ除去を評価するために、ＦＸＩａ値が装填材料（「装填」）において測定され、その後、カラムから溶液を回収した（「非結合」）。測定は、材料及び方法の項に記載されるように、ＴＧアッセイによって行われた。この実験では、装填材料におけるトロンビン生成値は、２４６〜２７１ｎＭの範囲であった。
【０２２４】
非結合画分におけるＩｇＧ回収率を見積もるために、総タンパク質回収率（％）が測定された（ＩｇＧは、総タンパク質の約９５％からなる）。結果を次の表１に示す。
【０２２５】
ＩｇＧの等電点は、６〜８である。したがって、６を下回るｐＨ値のＩｇＧ（正の正味電荷を有する）は、（ＦＸＩａに加えて）陽イオン交換体にも結合し、それによって、低いＩｇＧ回収率をもたらし得る。
【０２２６】
【表１】
2014516031.tif 000003
＊  評価は、溶液をカラムに供する前（「装填」）及び後（「非結合」）のタンパク質含有量を（ビューレット法を用いて）比較することによって行われた。
【０２２７】
結果は、６超のｐＨ値が免疫グロブリン溶液からの不良なＦＸＩａ除去（高ＴＧ値）をもたらし、約６を下回るｐＨ値がＦＸＩａの高い除去（低ＴＧ値）をもたらし、同時に、高いＩｇＧ回収率を有する（総タンパク質回収率によって測定されるとき）ことを示す。これらの結果は、６を下回る、ＩｇＧ（６〜８の等電点を有する）が正の正味電荷を有するため、陽イオン交換体カラムの負荷電基と結合することが見込まれ、それ故に、低いＩｇＧ回収率が見込まれたことは驚くべきことである。
【０２２８】
別の組の実験は、カルボキシメチル（ＣＭ）カラム（ＴＯＳＯＨＡＡＳ、カタログ番号Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ，ＣＭ−６５０Ｍから得られる弱陽イオン交換体）を用いて行われた。実験は、ＳＰカラムと同一条件で行われた。ＣＭカラムのみを用いて、４〜５．５の低ｐＨ範囲が試験された。結果は、試験されたｐＨ（４〜５．５）で、ＦＸＩａの高い除去が得られ、同時に、高いＩｇＧ回収率が得られたことを示すＳＰカラムを用いて得られた結果と同程度であった。樹脂の容量は８ｍＬであり、カラムの直径は１ｃｍであり、底高さは１０ｃｍであった。
【０２２９】
実施例２：溶液からＦＸＩａを除去するためのＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ膜（陽イオン交換体）の有効性における免疫グロブリン溶液のｐＨ値の効果
以下の実験は、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ膜陽イオン交換体［コインフィルタ、膜の床高さ（ＭＶ）＝０．３５ｍＬ、Ｐａｌｌ、カタログ番号ＮＰ８ＭＳＴＧＳＰ１）］を使用することによって、溶液からのＦＸＩａ除去における低ｐＨ値のＩＶＩＧ溶液の効果を試験することを目的とした。この実験では、ＦＸＩａ除去における免疫グロブリン溶液の３．８〜５．３の範囲のｐＨ値の効果が評価された。
【０２３０】
この目的のために、免疫グロブリン溶液は、材料及び方法の項に上述される工程（ａ）〜（ｅ）に従って調製された。次の工程では、透析濾過された溶液のｐＨは、０．５ＮのＮａＣｌ又は０．１ＮのＮａＯＨを用いて所望の試験されたｐＨ（３．８〜５．３のｐＨ範囲）に調節し、３０ｍＬのそれぞれの得られた免疫グロブリン溶液をＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ膜に供した。クロマトグラフィーは、１．５ｍＬ／分の流速で室温（２２±２℃）で実施された。装填溶液の温度は、２２±２℃であった。
【０２３１】
ＦＸＩａ値は、溶液を陽イオン交換体に供する前（「装填」）及び後（「非結合」）に、免疫グロブリン溶液中で測定された。評価は、材料及び方法の項の「ＦＸＩａ値の測定」の項目において記載される蛍光発生法によって行われた。結果を次の表２に示す。
【０２３２】
【表２】
2014516031.tif 000004
＊  溶液をカラムに供する前（「装填」）及び後（「非結合」）のＦＸＩａ値を比較することによって計算された
【０２３３】
得られた結果は、３．８超のｐＨ値が、免疫グロブリン溶液からのＦＸＩａの有効な除去をもたらし、最適ｐＨ値が４．０〜５．０の範囲を有する（ＦＸＩａ除去の最高の割合が観察されたｐＨ）ことを示す。
【０２３４】
別の組の実験では、最高ｐＨ値の効果が、評価された（最大７．４）。実験は、２０ｍＬの免疫グロブリン溶液が陽イオン交換体（Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ膜）に装填されたことを除いては前述の実験と同一の様式で行われ、濾過が、２．５ｍＬ／分のより高流速で行われた。
【０２３５】
ＦＸＩａ値は、装填材料（「装填」）及び非結合画分１０（２ｍＬの１０画分が回収され、この測定は画分１０において行われた）中で測定された。測定は、蛍光発生法によって上述の通りに行われた。結果を次の表３に示す。
【０２３６】
【表３】
2014516031.tif 000005
＊  溶液をカラムに供する前（「装填」）及び後（「非結合」）のＦＸＩａ値を比較することによって計算された
【０２３７】
驚くべきことには、得られた結果は、ＦＸＩａが約９を下回るｐＨで正の正味電荷を有する（その等電点は８．９〜９．１である）が、効率の悪いＦＸＩａ除去が６以上のｐＨで得られたことを示す。
【０２３８】
実施例３：陽イオン交換体クロマトグラフィーによる免疫グロブリン溶液からのＦＸＩａ除去における流体流速の効果
以下の実験は、陽イオン交換体クロマトグラフィーによる免疫グロブリン溶液からのＦＸＩａ除去における流体流速の効果を試験する。０．７、１、１．５、２．５ｍＬ／分の流速が評価された。使用された出発免疫グロブリン溶液は実施例２と同様のものであり、同一のＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ膜が陽イオン交換体として使用された。
【０２３９】
前述の実施例を考慮して、免疫グロブリン溶液のｐＨは、免疫グロブリン溶液を陽イオン交換体に装填する前に、（０．７、１、及び２．５ｍＬ／分の流速で装填された免疫グロブリン溶液については）４．２又は（１．５ｍＬ／分の流速で装填された免疫グロブリン溶液については）４．３に調節された。クロマトグラフィーは、室温（２２±２℃）で実施され、陽イオン交換体に装填された溶液の温度は、２２±２℃であり、３０ｍＬの容量の免疫グロブリン溶液が陽イオン交換体に適用された。
【０２４０】
ＦＸＩａ値は、溶液を陽イオン交換体に供する前（「装填」）及び後（「非結合」）に、免疫グロブリン溶液中で測定された。測定は、蛍光発生法によって直接的に行われ、材料及び方法の上述される通りにＴＧアッセイによって間接的に行われた。この実験では、装填材料におけるトロンビン生成値は、１７９〜２９０ｎＭの範囲であった。
【０２４１】
結果を次の表４に示す。
【０２４２】
【表４】
2014516031.tif 000006
＊  ０．７、１、及び２．５ｍＬ／分の流速については、１５画分が回収され（それぞれ、２ｍＬを含有）、ＦＸＩａ値の評価については、非結合画分：２、５、７、１０、及び１３の混合が使用された。
１．５ｍＬ／分の流速については、全非結合画分が評価のために使用された。
＊＊  Ｍｕｓｔａｎｇの膜の底高さ（ＭＶ）は０．３５ｍＬであり、０．７ｍＬ／分＝２ＭＶ／分、１ｍＬ／分＝２．９ＭＶ／分、１．５ｍＬ／分＝４．３ＭＶ／分、及び２．５ｍＬ／分＝７．１ＭＶ／分である。
＊＊＊  溶液をカラムに供する前（「装填」）及び後（「非結合」）のＦＸＩａ値を比較することによって計算された
【０２４３】
蛍光発生法によれば、免疫グロブリン溶液からのＦＸＩａ除去のための最適流速は、０．７〜１．５ｍＬ／分の範囲であったことが観察された（最高のＦＸＩａ除去の割合がこの流速範囲で観察された）。また、ＴＧアッセイによれば、免疫グロブリン溶液からのＦＸＩａ除去のための最適流速（他の試験された流速と比較して、非結合画分において得られた最低トロンビン値）は、１．５ｍＬ／分であったことも観察された。
【０２４４】
これらの結果は、免疫グロブリン溶液からのＦＸＩａ除去を更に改善するために、０．７〜１．５ｍＬ／分（２〜４．３ＭＶ／分）の範囲の流速のような２．５ｍＬ／分より低い流速が、溶液を陽イオン交換体膜に供する間、使用することができることを示す。
【０２４５】
実施例４：陽イオン交換体クロマトグラフィーによるＦＸＩａ除去の有効性における免疫グロブリン溶液の温度値の効果
以下の実験は、陽イオン交換体クロマトグラフィーによるＦＸＩａ除去における免疫グロブリン溶液の温度値の効果を試験する。この目的のために、免疫グロブリン溶液は、７℃、室温（２２±２）、及び３７℃の温度に平衡化された。使用された出発免疫グロブリン溶液は、実施例２と同様のものであり、同一のＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ膜が陽イオン交換体として使用された。
【０２４６】
実施例２及び３で得られた結果によれば、溶液を陽イオン交換体に供する前に、免疫グロブリン溶液のｐＨを４．２に調節し、免疫グロブリン溶液は、１〜１．５ｍＬ／分の流速で陽イオン交換体に装填された。クロマトグラフィー自体は、室温（２２±２℃）で実施され、異なる温度に平衡化した３０ｍＬの容量の免疫グロブリン溶液が、陽イオン交換体に適用された。
【０２４７】
ＦＸＩａ値は、溶液を陽イオン交換体に供する前（「装填」）及び後（「非結合」）に、免疫グロブリン溶液中で測定された。実施例３と同様に、評価は、材料及び方法の項に記載されるように、蛍光発生法及びＴＧアッセイによって行われた。結果を次の表５に示す。この実験では、装填材料におけるトロンビン生成値は、２５１〜２９２ｎＭの範囲であった。
【０２４８】
【表５】
2014516031.tif 000007
＊  溶液をカラムに供する前（「装填」）及び後（「非結合」）のＦＸＩａ値を比較することによって計算された
【０２４９】
得られた結果は、すべての試験された温度値が免疫グロブリン溶液からのＦＸＩａ除去をもたらし（装填材料と比較して）、最適温度は室温（２２±２℃）から７℃まで下がったことを示す。
【０２５０】
実施例５：免疫グロブリン溶液からのＦＸＩａ除去における第２の陽イオン交換体クロマトグラフィー工程を行うことの効果
以下の実験は、第２の陽イオン交換体クロマトグラフィー工程を行うことが免疫グロブリン溶液からのＦＸＩａ除去を更に増加させるかどうかを試験する。
【０２５１】
使用された出発免疫グロブリン溶液は、実施例２と同様のものであった。以下の実験では、２６００ｍＬの容量の溶液が、１０ｍＬのＭＶを有するＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓカプセル（Ｐａｌｌ、カタログ番号ＣＬＭ０５ＭＳＴＧＳＰ１）に供され、装填溶液のｐＨは、４．２に調節され、濾過は３０ｍＬ／分（＝３ＭＶ／分）の流速で室温（２２±２℃）で行われた。装填溶液の温度は、２２±２℃であった。
【０２５２】
６つの濾液画分（１画分当たり４００ｍＬ）が回収され、ＦＸＩａ値が、材料及び方法の項に記載されるようにＴＧアッセイを用いて測定された。次の工程では、６つの濾液画分がすべて回収され、プールされ、新しいＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓカプセル（ＭＶ＝１０ｍＬ）を通じて第２の濾過工程に供された。再度、６つの濾液画分（１画分当たり４００ｍＬ）が回収され、ＦＸＩａ値が、ＴＧアッセイを用いて測定された。装填材料及びそれぞれの濾過工程におけるそれぞれの濾液画分（１〜６）が、次の表６中に要約される。また、ＩｇＧ回収率を見積もるために、総タンパク質回収率が、第２の陽イオン交換体クロマトグラフィー工程後に測定された。
【０２５３】
【表６】
2014516031.tif 000008
【０２５４】
第２の濾過工程を行うことは、単一の濾過工程を行うことと比較して、免疫グロブリン溶液からのＦＸＩａ除去の増加をもたらすことが観察された。また、第２の濾過が、高いＩｇＧ回収率を変化させなかった（総タンパク質回収率の９１．６％が第２の濾過工程後に得られた）ことも示す。
【０２５５】
これらの結果は、ＩｇＧ値を実質的には維持しつつ、免疫グロブリン溶液からのＦＸＩａの最大除去を得るために、溶液が２回以上陽イオン交換体に供され得ることを示す。
【０２５６】
実施例６：免疫グロブリン溶液からＦＸＩａを除去する場合の親和性カラムクロマトグラフィーの有効性
実施例１〜５では、陽イオン交換体クロマトグラフィーが、３．８〜６未満のｐＨ範囲で、免疫グロブリン溶液からＦＸＩａを除去するために有効な工程であったことを示した。以下の実施例では、ＦＸＩａ除去における親和性カラムクロマトグラフィーの有効性が試験された。ベンズアミジンセファロースカラム（ベンズアミジンセファロースは、ＦＸＩａ等のセリンプロテアーゼと結合する）が、親和性カラムとして使用された。
【０２５７】
この目的のために、免疫グロブリン溶液は、材料及び方法の項に記載される工程ａ〜ｃに従って調製された。次の工程では、溶液が、親和性カラムに供された。以下の条件が、親和性クロマトグラフィーにおいて採用された：１２０ｍＬの溶液がカラムに装填され、プロセスは室温（２２±２℃）で実施され、免疫グロブリン溶液のｐＨは７．４であり、１．３ｍＬ／分の流体流速が使用され、供された溶液の温度は２２±２℃であった。カラムは、製造業者の取扱説明書に従って調製され、５ｍＬのベンズアミジンセファロース（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのカタログ番号１７−５１２３−０１）が、直径１ｃｍのカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）内部に実装された。使用前に、カラムは、５ＣＶの精製水で洗浄され、７．４のｐＨを有する５ＣＶの緩衝液（５０ｍＭのクエン酸塩及び０．２ＭのＮａＣｌ）で平衡化された。
【０２５８】
３つの濾液サンプル（１画分当たり４０ｍＬ）が回収され、ＦＸＩａ値が、材料及び方法の項に上述される通りに蛍光発生法を用いて、装填材料及び濾液サンプル中で測定された。結果を次の表７に示す。
【０２５９】
【表７】
2014516031.tif 000009
【０２６０】
第１の非結合（ＵＢ）画分では、カラムがＦＸＩａと有効に結合することができたことが観察された。しかしながら、第２及び第３の非結合画分では、ＦＸＩａが、免疫グロブリン溶液中の高い量で検出された。
【０２６１】
これらの結果は、使用された条件下で、ベンズアミジンセファロース親和性クロマトグラフィーが、免疫グロブリン溶液からＦＸＩａを有効に除去するのに適していないことを示す。
【０２６２】
上述の実験では、試験された条件下で、ベンズアミジンセファロース親和性カラムは、ＦＸＩａを除去する場合に有効でなかったことが見出された。以下の組の実験では、ヘパリン親和性クロマトグラフィーが試験された（ヘパリンは、ＦＸＩ及びＦＸＩａと結合する能力のため試験された）。この実験では、免疫グロブリン溶液の異なるｐＨ値の効果が評価された（５．３〜８の範囲で）。
【０２６３】
この目的のために、免疫グロブリン溶液は、材料及び方法の項に上述される工程（ａ）〜（ｃ）に従って調製された。次の工程では、溶液のｐＨは、０．５ＮのＮａＣｌ又は０．１ＮのＮａＯＨのいずれかを用いて、所望の試験されたｐＨに調節され、１５０ｍＬの異なるｐＨを有する免疫グロブリン溶液のそれぞれが、ヘパリン親和性クロマトグラフィーに供された。
【０２６４】
カラムの調製：８ｍＬのＣａｐｔｏヘパリン樹脂（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、直径１ｃｍのカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）内部に実装され、床高さは１０ｃｍに達した。クロマトグラフィーは、２ｍＬ／分の流速で、室温（２２±２℃）で実施された。装填溶液の温度は、２２±２℃であった。カラムは、免疫グロブリン溶液を装填する前に、装填される免疫グロブリン溶液のｐＨ値に対応するｐＨ値（即ち、５．３、６．５、７．４、及び８のｐＨ値）を有する４０ｍＬの５０ｍＭのクエン酸塩緩衝液で平衡化された。
【０２６５】
４つの濾液画分（１画分当たりの４０ｍＬ）が回収され、ＦＸＩａ値は、装填材料及び上述される通りに蛍光発生法を用いた濾液画分において評価された。結果を次の表８に示す。
【０２６６】
【表８】
2014516031.tif 000010
＊  ｐＨ  ５．３では、以下の条件が使用された（残りのｐＨ値に対して特定された条件の代わりに）：８ｍＬのヘパリン−Ｈｙｐｅｒ  ＤＭ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）が使用され、装填容量は１２５ｍＬであった。装填前の平衡化は、２ｍＬ／分の流体流速で、４０ｍＬの緩衝液（ｐＨ  ７．４で５０ｍＭのクエン酸塩及び０．２ＭのＮａＣｌを含有する）を用いて行われた。
【０２６７】
概して、ヘパリン樹脂へのＦＸＩａの結合は、免疫グロブリン溶液のｐＨを減少させることによって改善されたことが観察された。最良の結果は、最低ｐＨ（５．３）の第１の３つの非結合画分において観察された。しかしながら、約１５カラム容量後、ＦＸＩａが濾液中で回収される（ｐＨ  ５．３の非結合画分４中で比較的高いＦＸＩａ量が観察された）。
【０２６８】
実施例７：溶液からＰＫＡを除去するための陰イオン交換体クロマトグラフィーの有効性における免疫グロブリン溶液のｐＨ値の効果
以下の実験は、陰イオン交換体による溶液からのＰＫＡ除去における免疫グロブリン溶液のｐＨ値の効果を決定することを目的とした。
【０２６９】
この実験では、６．４〜８．２の範囲のｐＨ値の効果が評価された。溶液のｐＨ値は電子ｐＨ監視デバイスを用いて測定された。
【０２７０】
ＤＥＡＥカラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＤＥＡＥ−６５０Ｍ、ＴＯＳＯＨＡＡＳ）は、陰イオン交換体として使用された。１１ｍＬの樹脂が使用された。カラムの直径は１ｃｍであり、１４ｃｍの床高さが使用された。
【０２７１】
この実験では、材料及び方法の項に記載の様式でペーストＩＩから調製され、ＣＵＮＯ濾液に供された免疫グロブリン溶液（工程ｂに従う免疫グロブリン溶液）が使用された。次の工程では、この溶液のｐＨ値を０．５ＮのＨＣｌ又は０．５ＮのＮａＯＨを用いて所望の試験されたｐＨ値（６．４〜８．２のｐＨ範囲）に調整し、得られた免疫グロブリン溶液２００ｍＬをそれぞれ、陰イオン交換体クロマトグラフィー（材料及び方法の項に記載の免疫グロブリン溶液調製の工程ｃ）に供した（すべての実験において、約７０ｍｇ／ｍＬのタンパク質を含有する２００ｍＬを陰イオン交換体クロマトグラフィーに供した）。クロマトグラフィー工程は８℃で実施され、装填した免疫グロブリン溶液の温度は８℃であり、１．６５ｍＬ／分／ｃｍ２の線形流体流速が使用された。
【０２７２】
実施例７〜１１では、同一の免疫グロブリン溶液が、装填材料（「装填」）として用い、即ち、装填材料のＰＫＡ値は、すべての実験において同一であった。
【０２７３】
総タンパク質回収率、ＩｇＧサブクラス分布、抗ＨＢｓＡｇ及び抗ジフテリア抗体の力価レベル等の免疫グロブリン溶液のＰＫＡ値及び他の特性が、「非結合」画分において評価された（溶液を陰イオン交換体に供する工程の後）。評価は、材料及び方法の項に記載されるように行われた。結果を表９にまとめて示す。
【０２７４】
【表９】
2014516031.tif 000011
＊  ＮＤ−決定されず、ＬＯＱ−定量限界−＜６の値
＊＊  溶液をカラムに供する前及び後のタンパク質含有量を（ビューレット法を用いて）比較することによって、総タンパク質回収率（％）が計算された。
【０２７５】
より高いｐＨ値と比較して、６．４の低いｐＨ値が、回収されたＩｇＧ溶液中でＰＫＡ含有量の増加をもたらしたことが観察された。また、７〜８．２の範囲のｐＨ値（ＰＫＡがゼロ正味電荷を有し、したがって、正荷電基と結合することが見込まれない範囲）が、ＰＫＡを除去する陰イオン交換体の能力の向上をもたらした（ＰＫＡ値は、定量限界を下回った）ことも観察された。結果は、７〜８．２の範囲のｐＨ値が、非結合画分（ＩｇＧが正味ゼロ又は負の電荷を有し、その一部が陰イオン交換体に結合されることが見込まれるｐＨ値）、変化していないＩｇＧサブクラス分布特性［典型的なＩｇＧサブクラス分布（ＩｇＧ１−約６５％、ＩｇＧ２−約３０％、ＩｇＧ３−約６％、及びＩｇＧ４−約１％）、典型的な抗ＨＢｓＡｇ力価（２０００〜５０００ｍＩＵ／ｍＬの範囲）、並びに抗ジフテリア抗体力価（約６ＩＵ／ｍＬ）］においても高いタンパク質回収率をもたらした（９５〜１００％の範囲のタンパク質回収率が得られた）ことも示す。
【０２７６】
これらの結果は、免疫グロブリン溶液が溶液からＰＫＡを効率的に除去するために陰イオン交換体に供される間、７〜８．２の範囲のｐＨ値を有するはずであることを示す。
【０２７７】
実施例８：陰イオン交換体クロマトグラフィーによる免疫グロブリン溶液からのＰＫＡ除去における温度値の効果
以下の実験は、陰イオン交換体による溶液からのＰＫＡ除去における免疫グロブリン溶液の温度値の効果を試験する。以下の温度に平衡化された免疫グロブリン溶液が評価された：２℃、８℃、１４℃、及び２０℃。使用された出発免疫グロブリン溶液（装填材料）及びＤＥＡＥカラムは、実施例７と同様のものが使用された。クロマトグラフィー工程自体は８℃で実施され、１．６５ｍＬ／分／ｃｍ２の線形流体流速及び７．５のｐＨ値が使用され、装填容量は２００ｍＬであった。
【０２７８】
免疫グロブリン溶液のＰＫＡ値及び他の特性（上述と同一のパラメータ）が、非結合画分において評価された。結果を表１０にまとめて示す。
【０２７９】
【表１０】
2014516031.tif 000012
＊  ＮＤ−決定されず、ＬＯＱ−定量限界−＜６の値
【０２８０】
２℃の低温を有する装填されたＩｇＧ溶液が、回収された非結合画分中でＰＫＡ含有量の増加をもたらしたことが見出された。８〜２０℃の範囲の温度は、ＤＥＡＥクロマトグラフィー工程の後にＩｇＧ含有量及びＩｇＧサブクラス分布特性を変化させず、典型的な抗ＨＢｓＡｇ力価及び抗ジフテリア抗体力価（上記の典型的な値を参照のこと）で、最適なＰＫＡ除去をもたらした（ＰＫＡ値は定量限界を下回った）。
【０２８１】
実施例９：ＰＫＡを除去するための陰イオン交換体クロマトグラフィーの有効性における免疫グロブリン溶液の装填容量の効果
以下の実験は、陰イオン交換体による溶液からのＰＫＡ除去における免疫グロブリン溶液の装填容量の効果を試験する。以下の量がカラムに装填された：１２カラム容量（ＣＶ）、２０ＣＶ、及び２５ＣＶ（樹脂の容量及びカラムのプレマスタは、実施例７と同様である）。「１２カラム容量」とは、樹脂の容量の１２倍を意味する（ここでは１１ｍＬであった）。
【０２８２】
使用された出発免疫グロブリン溶液（装填材料）は、実施例７と同様のものであり、ＤＥＡＥカラムは陰イオン交換体として使用された。クロマトグラフィー工程は８℃で実施され、先行実施例に従って、装填した免疫グロブリン溶液の温度は８℃であり、ｐＨは７．５であり、１．６５ｍＬ／分／ｃｍ２の線形流体流速が用いられた。
【０２８３】
免疫グロブリン溶液のＰＫＡ値及び他の特性（上述と同一のパラメータ）が、非結合画分において評価された。結果を表１１にまとめて示す。
【０２８４】
【表１１】
2014516031.tif 000013
＊  ＬＯＱ−定量限界−＜６の値
【０２８５】
結果は、すべての試験された装填容量において、タンパク質回収率（９３〜１００％の範囲の総タンパク質回収率が得られた）、ＩｇＧ特性（すべての値は、典型的な値又は抗ジフテリア力価及び抗ＨＢｓＡｇ力価（実施例７の典型的な値を参照のこと）と比較可能である）を低下させることなく、ＤＥＡＥカラムがＰＫＡを実質的には効率的に除去したことを示す。
【０２８６】
実施例１０：陰イオン交換体クロマトグラフィーに供する間のＰＫＡを除去するためのクロマトグラフィーの有効性における免疫グロブリン溶液の線速度の効果
以下の実施例は、ＰＫＡを除去するための陰イオン交換体クロマトグラフィーの有効性における装填中の溶液の線速度の効果を試験する。以下の線速度が評価された：１、２、３、及び４ｃｍ／分／ｍＬ。
【０２８７】
使用された装填材料及び使用されたＤＥＡＥカラムは、実施例７と同様のものであった。クロマトグラフィー工程が８℃で実施され、装填した免疫グロブリン溶液の温度は８℃であり、７．５のｐＨが使用され、装填容量は２００ｍＬであった。
【０２８８】
免疫グロブリン溶液のＰＫＡ値及び他の特性（上記と同一）が、非結合材料において評価された。結果を表１２にまとめる。
【０２８９】
【表１２】
2014516031.tif 000014
＊  ＮＤ−決定されず、ＬＯＱ−定量限界−＜６の値
【０２９０】
結果は、１〜２ｃｍ／分／ｍＬの線速度が、タンパク質回収又はＩｇＧ特性を低下させることなく、免疫グロブリン溶液からＰＫＡを効率的に除去したことを示す。より高い線速度（例えば、３〜４ｃｍ／分／ｍＬ）が、より低いＰＫＡ除去をもたらした。
【０２９１】
実施例１１：タンデムイオン交換体クロマトグラフィーを用いることによる免疫グロブリン溶液からの血栓形成剤の除去
免疫グロブリン溶液は、材料及び方法の項に記載の様式でペーストＩＩから調製され、ＣＵＮＯ濾液（工程ｂ後の免疫グロブリン溶液）に供された。次の工程では、この溶液は、以下の条件下で、ＤＥＡＥカラムに供された［（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＤＥＡＥ−６５０Ｍ、ＴＯＳＯＨＡＡＳ）（１１ｍＬの樹脂が使用され、カラムの直径は１ｃｍであり、１４ｃｍの床高が使用された）］：クロマトグラフィー工程が８℃で実施され、装填した免疫グロブリン溶液の温度は８℃であり、線形流体流速は１．６５ｍＬ／分／ｃｍ２であり、装填した免疫グロブリン溶液のｐＨ値は７．５に平衡化された。装填した溶液の容量は２００ｍＬであった。このカラムは、材料及び方法の項に記載されるように、溶液を装填する前に平衡化された。
【０２９２】
免疫グロブリン溶液のＰＫＡ値及び他の特性（上記のもの）は、「非結合」画分において評価された（溶液を陰イオン交換体に供する工程の後）。材料及び方法の項に記載されるように測定は行われた。結果を表１３にまとめて示す。
【０２９３】
【表１３】
2014516031.tif 000015
ＬＯＱ−定量限界−＜６の値
【０２９４】
結果は、使用された条件下で、ＤＥＡＥカラムが、タンパク質回収率（１００の総タンパク質回収率が得られた）、ＩｇＧ特性（すべての値は、典型的な値と比較可能である）、抗ジフテリア力価及び抗ＨＢｓＡｇ力価（実施例７の典型的な値を参照のこと）を低下させることなく、ＰＫＡを実質的には効率的に除去したことを示す。
【０２９５】
免疫グロブリン溶液を陰イオン交換体と接触させた後、回収された非結合画分は、材料及び方法の項に記載されるように、免疫グロブリン調製物の工程ｄ）〜ｅ）に供される。次の工程では、この溶液は、以下の条件下で陽イオン交換体に供される：３．８〜６の範囲のｐＨ値、２．５ｍＬ／分より低い流速［例えば、０．７〜１．５ｍＬ／分（２〜４．３ＭＶ／分）の範囲の流速］、及び装填した免疫グロブリン組成物の温度は室温（２２±２℃）から７℃まで下がった範囲である。
【０２９６】
ＦＸＩａ除去は、装填材料（「装填」）において評価され、その後、溶液をカラム（「非結合」）から回収する。材料及び方法の項に記載されるように、ＴＧアッセイ及び／又は蛍光発生法によって測定が行われる。
【０２９７】
実施例１２：免疫グロブリン溶液からのＦＸＩａ除去におけるＳＤＲカラムの効果
以下の実験は、免疫グロブリン溶液からＦＸＩａを除去するためのＳＤＲカラムの能力を決定することを目的とした。
【０２９８】
この目的のために、免疫グロブリン溶液は、材料及び方法の項に記載の様式で、工程ａ）〜ｅ）に従ってペーストＩＩから調製された。次の工程では、この溶液は、以下のように（スケールアップ条件）Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓカプセルを用いて陽イオン交換体クロマトグラフィーに供された：
【０２９９】
免疫グロブリン溶液を陽イオン交換体に供する前に、溶液をＣｏｒｎｉｎｇから入手した０．２μｍのＣＡフィルタを通して濾過した（凝集物を減らすために）。直列に接続された２つのＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓフィルタを通してＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）濾過が行われた。Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）濾過の前に、２つのフィルタは、３０ｋｇの１ＮのＮａＯＨで、２．１Ｌ／分の流速で（両フィルタともに）別々に洗浄した。２回目の洗浄時、両フィルタは、５０ｋｇの１ＮのＮａＣｌで、１．８Ｌ／分の流速（第１のフィルタ）又は２．１Ｌ／分の流速（第２のフィルタ）で別々に洗浄した。最後に、これらのフィルタは、５０ｋｇの２０ｍＭ酢酸ナトリウム（４．２のｐＨ）で、１．８Ｌ／分の流速（第１のフィルタに対しては）又は１．９Ｌ／分の流速（第２のフィルタに対しては）で別々に洗浄した。上述の洗浄を実行して、４．２のｐＨ値を得た。すべての洗浄は０圧力で行われた。
【０３００】
Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）濾過：免疫グロブリン溶液は、これらの２つの洗浄されたＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓフィルタを通して１．６Ｌ／分の流速で濾過した。合計１６０ｋｇの免疫グロブリン溶液（非結合画分）が回収された。装填溶液の温度は７℃であり、一方、フィルタは室温であった。装填した免疫グロブリン溶液のｐＨは、４．２〜４．３であった。
【０３０１】
次の工程では、濾液（非結合画分）は、材料及び方法の項に記載されるように、溶媒／洗剤（Ｓ／Ｄ）処理及びＳＤＲカラムに供された。
【０３０２】
溶液をＭｕｓｔａｎｇ  Ｓ膜を通して濾過する前、溶液をＭｕｓｔａｎｇ  Ｓ膜を通して濾過した後、及び溶液をＳ／Ｄ処理及びＳＤＲカラムに供した後の、溶液（即ち、材料及び方法の項に記載されるように、工程ａ〜ｅに従って調製された免疫グロブリン溶液）中のＦＸＩａ値が測定された。
【０３０３】
評価は、材料及び方法の項に記載されるように、蛍光発生法によって行われた。結果を次の表１４に示す。
【０３０４】
【表１４】
2014516031.tif 000016
＊  ＬＯＤ−検出限界
【０３０５】
表１４に示されるように、ＳＤＲカラムによるＳ／Ｄ処理及びＳ／Ｄ除去工程の追加は、残存した量のＦＸＩａの除去をもたらす。
【０３０６】
実施例１３：Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓカプセル（陽イオン交換体）を用いることによる免疫グロブリン溶液からのカリクレインの除去
以下の実験は、免疫グロブリン溶液からカリクレインを除去するＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）カプセルの能力を決定することを目的とした。
【０３０７】
この目的のために、免疫グロブリン溶液は、材料及び方法の項に記載の様式で、工程（ａ）〜（ｅ）に従ってペーストＩＩから調製された。次の工程では、この溶液は、以下のように（スケールアップ条件）Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓカプセルに供された：
【０３０８】
Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）濾過の前に、それぞれのフィルタは、少なくとも３０ｋｇの１ＮのＮａＯＨで、１．６〜２．３Ｌ／分の流速で別々に予め洗浄した。２回目の洗浄時、それぞれのフィルタは、少なくとも５０ｋｇの１ＮのＮａＣｌで、１．６〜２．３Ｌ／分の流速で別々に洗浄した。最後に、それぞれのフィルタは、５０ｋｇの２０ｍＭ酢酸ナトリウム（４．２のｐＨ）で、１．６〜２．３Ｌ／分の流速で別々に平衡化された。上述の洗浄を実行して、４．２のｐＨ値を得た。すべての洗浄は、０．１ＭＰａ（１バール）以下の圧力で行われた。
【０３０９】
免疫グロブリン溶液を陽イオン交換体に供する前に、溶液は、０．２μｍのＤｕｒａｐｏｒｅフィルタ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過した（凝集物を減らすために）。得られた免疫グロブリン溶液は、直列に接続された（上に指定されるように、予め洗浄し、平衡化した）２つのＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓカプセルを通して濾過した。
【０３１０】
Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）濾過：免疫グロブリン溶液は、２つのカプセルを通して１．６〜２．３Ｌ／分の流速で濾過した［約１６０ｋｇ（約１６０Ｌ）の免疫グロブリン溶液が装填され、約７０ｍｇ／ｍＬのタンパク質］。合計約１６０ｋｇの免疫グロブリン溶液（約１６０Ｌ）（非結合画分）が回収された。
【０３１１】
装填溶液の温度は約７℃であり、一方、フィルタは室温であり、濾過が室温で行われ、装填した免疫グロブリン溶液のｐＨは４．１〜４．３であった。
【０３１２】
免疫グロブリン溶液中のカリクレイン除去の値は、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓカプセルを通して濾過する前（「濾過前」）、及び濾過した後（「濾過後」）に測定され、カリクレイン除去の割合が計算された。評価は、材料及び方法の項に記載される発色法によって行われた。
【０３１３】
濾過後のＩｇＧ回収率を見積もるために、総タンパク質回収率（％）が測定された。
【０３１４】
得られたカリクレイン除去は次の表１５に示され、得られた総タンパク質回収率（％）は表１６に示される。
【０３１５】
【表１５】
2014516031.tif 000017
【０３１６】
【表１６】
2014516031.tif 000018
【０３１７】
特定の条件下で免疫グロブリン溶液を陽イオン交換体に装填することにより、９７％のカリクレイン除去をもたらし、一方で、タンパク質（ＩｇＧ）の９７％が回収されたことが観察された。
【０３１８】
実施例１４：インビボモデルにおける本発明に従って調製された免疫グロブリン溶液の血栓症誘導活性の確認
以下の実験は、先行実施例において見られるように、カリクレイン、ＰＫＡ、及び／又はＦＸＩａ除去に供された免疫グロブリン溶液が、血栓症誘導活性の低下を呈するかどうかを試験することを目的とした。評価は、Ｗｅｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ａ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９５９；１４：９４３〜９４６）に記載のインビボモデルを用いて行われた。
【０３１９】
Ｗｅｓｓｌｅｒ動物モデルを用いて、本発明に従ってＰＫＡ及び／又はＦＸＩａ除去に供された免疫グロブリン溶液が血栓症誘導活性の低下を呈したことが観察された。
【０３２０】
〔実施の態様〕
（１）  免疫グロブリン含有溶液から血栓形成剤を除去するための方法であって、３．８超〜５．３以下の範囲のｐＨの前記免疫グロブリン含有溶液を提供する工程と、固定化された負荷電基を含む支持体を提供する工程と、前記溶液を前記支持体と接触させる工程と、非結合画分Ｉを回収する工程と、を含む、方法。
（２）  前記溶液が、３．８超〜５．０以下の範囲のｐＨを有する、実施態様１に記載の方法。
（３）  前記溶液が、４．０以上〜５．０以下の範囲のｐＨを有する、実施態様１に記載の方法。
（４）  前記溶液が、３．８超〜４．７以下の範囲のｐＨを有する、実施態様１に記載の方法。
（５）  前記溶液が、約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、又は４．７のｐＨを有する、実施態様１に記載の方法。
【０３２１】
（６）  前記溶液が、３．８超〜４．３以下の範囲のｐＨを有する、実施態様１に記載の方法。
（７）  前記溶液が、４．０以上〜４．３以下の範囲のｐＨを有する、実施態様１に記載の方法。
（８）  前記溶液が、４．１以上〜４．３以下の範囲のｐＨを有する、実施態様１に記載の方法。
（９）  前記非結合画分Ｉが、同一ｐＨ下で、前記固定化された負荷電基を含む前記支持体と更に接触させられ、非結合画分ＩＩが回収される、実施態様１〜８のいずれかに記載の方法。
（１０）  前記支持体が、クロマトグラフィー材料又はクロマトグラフィー膜の形態である、実施態様１〜９のいずれかに記載の方法。
【０３２２】
（１１）  前記支持体材料又は膜が、親水性であり、アガロース、セファロース、アクリルビーズ、セルロース、制御された細孔ガラス、シリカゲル、及びデキストランからなる群から選択されるか、疎水性であり、樹脂類からなる群から選択されるか、又はポリアクリルアミド若しくはポリスチレン系の材料若しくは膜からなる群から選択される有機合成ポリマーである、実施態様１０に記載の方法。
（１２）  前記負荷電基が、前記支持体と前記負荷電基との間に存在するリンカーを介して前記支持体に固定化される、実施態様１〜１１のいずれかに記載の方法。
（１３）  前記リンカーが、タンパク質、アミノ酸、及びペプチドからなる群から選択される、実施態様１２に記載の方法。
（１４）  前記支持体が、化学修飾される、実施態様１〜１３のいずれかに記載の方法。
（１５）  前記支持体が、弱又は強陽イオン交換体である、実施態様１〜１４のいずれかに記載の方法。
【０３２３】
（１６）  前記固定化された負荷電基が、スルホン酸及び他の硫黄含有酸、ギ酸及び他のカルボン酸、リン酸及び他のリン含有酸、硝酸及び他の窒素含有酸の誘導体、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様１〜１５のいずれかに記載の方法。
（１７）  前記固定化された負荷電基が、硫黄含有酸である、実施態様１６に記載の方法。
（１８）  前記硫黄含有酸が、スルホプロピルである、実施態様１７に記載の方法。
（１９）  前記固定化された負荷電基が、カルボン酸である、実施態様１６に記載の方法。
（２０）  前記カルボン酸が、カルボキシメチルである、実施態様１９に記載の方法。
【０３２４】
（２１）  ７〜８．２の範囲のｐＨに、前記非結合画分Ｉ又は前記非結合画分ＩＩを調節する工程と、７〜８．２の範囲のｐＨで、前記非結合画分Ｉ又は前記非結合画分ＩＩを固定化された正荷電基を含む支持体と接触させる工程と、非結合画分を回収する工程と、を更に含む、実施態様１〜２０のいずれかに記載の方法。
（２２）  固定化された負荷電基を含む前記支持体と接触させる工程の前に、前記溶液を調節し、それを、７〜８．２の範囲のｐＨで、固定化された正荷電基を含む支持体と接触させる工程と、非結合画分を回収する工程と、を更に含む、実施態様１に記載の方法。
（２３）  前記固定化された正荷電基が、アンモニウム、アルキルアンモニウム、ジアルキルアンモニウム、トリアキルアンモニウム、四級アンモニウム、アルキル基、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、アミノ官能基、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様２１又は２２に記載の方法。
（２４）  前記固定化された正荷電基が、四級アンモニウムである、実施態様２３に記載の方法。
（２５）  前記四級アンモニウムが、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）である、実施態様２４に記載の方法。
【０３２５】
（２６）  ７〜８．２の範囲のｐＨで、前記溶液を前記固定化された正荷電基を含む前記支持体と接触させる工程と、前記非結合画分を回収する工程と、３．８超〜５．３以下の範囲のｐＨに、前記非結合画分の前記ｐＨを調節する工程と、３．８超〜５．３以下の範囲のｐＨで、前記非結合画分を前記固定化された負荷電基を含む前記支持体と接触させる工程と、前記非結合画分Ｉを回収する工程と、を含む、実施態様２２〜２５のいずれかに記載の方法。
（２７）  前記非結合画分を調節し、それを前記固定化された負荷電基を含む前記支持体と接触させる工程が、３．８超〜５．０以下の範囲のｐＨで実施される、実施態様２６に記載の方法。
（２８）  前記非結合画分を調節し、それを前記固定化された負荷電基を含む前記支持体と接触させる工程が、４．０以上〜５．０以下の範囲のｐＨで実施される、実施態様２６に記載の方法。
（２９）  前記非結合画分を調節し、それを前記固定化された負荷電基を含む前記支持体と接触させる工程が、３．８超〜４．７以下の範囲のｐＨで実施される、実施態様２６に記載の方法。
（３０）  前記非結合画分を調節し、それを前記固定化された負荷電基を含む前記支持体と接触させる工程が、約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、又は４．７のｐＨで実施される、実施態様２６に記載の方法。
【０３２６】
（３１）  前記非結合画分を調節し、それを前記固定化された負荷電基を含む前記支持体と接触させる工程が、３．８超〜４．３以下の範囲のｐＨで実施される、実施態様２６に記載の方法。
（３２）  前記非結合画分を調節し、それを前記固定化された負荷電基を含む前記支持体と接触させる工程が、４．０以上〜４．３以下の範囲のｐＨで実施される、実施態様２６に記載の方法。
（３３）  前記非結合画分を調節し、それを前記固定化された負荷電基を含む前記支持体と接触させる工程が、４．１以上〜４．３以下の範囲のｐＨで実施される、実施態様２６に記載の方法。
（３４）  前記溶液を前記正荷電基を含む前記支持体と接触させる工程が、１〜２ｍＬ／分／ｃｍ２の範囲の線速度で実施され、前記免疫グロブリン含有溶液が、２〜２２℃の範囲の温度を有する、実施態様２１又は２２に記載の方法。
（３５）  固定化された負荷電基を含む前記支持体と接触させる工程の前に、前記溶液を、三次元架橋疎水性アクリルポリマーを含むクロマトグラフィー材料と接触させる工程と、非結合画分ＩＩＩを回収する工程と、を更に含む、実施態様１に記載の方法。
【０３２７】
（３６）  前記非結合画分、非結合画分Ｉ、又は非結合画分ＩＩを、三次元架橋疎水性アクリルポリマーを含むクロマトグラフィー材料と接触させる工程と、非結合画分ＩＩＩを回収する工程と、を更に含む、実施態様２１又は２２に記載の方法。
（３７）  固定化された正荷電基を含む前記支持体が、弱又は強陰イオン交換体である、実施態様２１又は２２に記載の方法。
（３８）  免疫グロブリン組成物を調製するための方法であって、免疫グロブリン含有溶液を、ネガティブクロマトグラフィーの少なくとも２つの工程：７〜８．２の範囲のｐＨでの陰イオン交換体クロマトグラフィーと、３．８超〜５．３以下の範囲のｐＨでの陽イオン交換体クロマトグラフィーと、に供する工程を含む、方法。
（３９）  前記陽イオン交換体クロマトグラフィーが、２回実施される、実施態様３８に記載の方法。
（４０）  前記陽イオン交換体クロマトグラフィーが、３．８超〜５．０以下の範囲のｐＨで実施される、実施態様３８又は３９に記載の方法。
【０３２８】
（４１）  前記陽イオン交換体クロマトグラフィーが、４．０以上〜５．０以下の範囲のｐＨで実施される、実施態様３８又は３９に記載の方法。
（４２）  前記陽イオン交換体クロマトグラフィーが、３．８超〜４．７以下の範囲のｐＨで実施される、実施態様３８又は３９に記載の方法。
（４３）  前記陽イオン交換体クロマトグラフィーが、約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、又は４．７のｐＨで実施される、実施態様３８又は３９に記載の方法。
（４４）  前記陽イオン交換体クロマトグラフィーが、３．８超〜４．３以下の範囲のｐＨで実施される、実施態様３８又は３９に記載の方法。
（４５）  前記陽イオン交換体クロマトグラフィーが、４．０以上〜４．３以下の範囲のｐＨで実施される、実施態様３８又は３９に記載の方法。
【０３２９】
（４６）  前記陽イオン交換体クロマトグラフィーが、４．１以上〜４．３以下の範囲のｐＨで実施される、実施態様３８又は３９に記載の方法。
（４７）  三次元架橋疎水性アクリルポリマーを含むクロマトグラフィー材料を用いた、ネガティブクロマトグラフィーを更に含む、実施態様３８〜４６のいずれかに記載の方法。
（４８）  前記陽イオン交換体が、膜の形態である、実施態様３８〜４７のいずれかに記載の方法。
（４９）  前記陽イオン交換体が、スルホン酸官能基（sulfonic functional group）を含む、実施態様３８〜４８のいずれかに記載の方法。
（５０）  ４％〜１０％のタンパク質を含み、実施態様３８〜４９のいずれかに記載の方法によって得ることができる、血液又は血液画分由来の免疫グロブリン組成物。
【０３３０】
（５１）  実施態様５０に記載の前記免疫グロブリン組成物を含有する、収容体（receptacle）。
（５２）  免疫不全、炎症性疾患、自己免疫疾患、又は急性感染病を患っている被検者を治療するための方法であって、前記被検者に、有効量の実施態様５０に記載の免疫グロブリン組成物を投与する工程を含む、方法。
（５３）  免疫不全、炎症性疾患、自己免疫疾患、又は急性感染病で用いる、実施態様５０に記載の免疫グロブリン組成物。
【国際調査報告】
2014516031.tif 000019
2014516031.tif 000020
2014516031.tif 000021
2014516031.tif 000022
2014516031.tif 000023
2014516031.tif 000024