(57)【要約】  本発明は、単離された抗ヒトＨＥＲ３抗体又はそのフラグメントを提供する。特に、本発明は、ＨＥＲ-３の細胞外ドメインに特異的に結合し、ＣＮＣＭ?Ｉ?４４８６として寄託されたハイブリドーマから産生され得られる抗体とヒトＨＥＲ-３の細胞外ドメインへの結合に対して競合する、単離されたモノクローナル抗体を提供する。本発明に記述される抗体は、癌の治療に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＥＲ-３の細胞外ドメインに特異的に結合し、ＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６として寄託されたハイブリドーマから産生され得られる抗体とヒトＨＥＲ-３の細胞外ドメインへの結合に対して競合する、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２】
抗体が、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体を含む群から選択される、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項３】
ＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６として寄託されたハイブリドーマから産生され得られる抗体の可変軽鎖（ＶＬ）のＣＤＲを含むＶＬ鎖及びＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６として寄託されたハイブリドーマから産生され得られる抗体の可変重鎖（ＶＨ）のＣＤＲを含むＶＨ鎖から成る、請求項１又は２に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項４】
ＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６として寄託されたハイブリドーマから産生され得られる抗体のＶＬ鎖及びＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６として寄託されたハイブリドーマから産生され得られる抗体のＶＨ鎖から成る、請求項３に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項５】
ＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６として寄託されたハイブリドーマから産生され得られる抗体の可変ドメインを含むキメラ抗体である、請求項４に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項６】
ＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６として寄託されたハイブリドーマから産生され得られる抗体のＣＤＲを含むモノクローナルヒト化抗体である、請求項３に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項７】
ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ-４４８６に基づいて入手可能なハイブリドーマから得られるマウスモノクローナル抗体（１６Ｄ３-Ｃ１）である、請求項３に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項８】
Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２及び二重特異性抗体を含む群から選択される、請求項１から７の何れかに記載の単離されたモノクローナル抗体の抗体断片。
【請求項９】
請求項１から８の何れかに記載の単離されたモノクローナル抗体のＶＨドメイン又は請求項１から８の何れかに記載の本発明の抗体のＶＬドメインをコードする核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載の核酸又は請求項１０に記載のベクターによって遺伝子導入、感染又は形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１から８の何れかに記載の単離されたモノクローナル抗体を含む医薬組成物。
【請求項１３】
癌の治療に使用される、請求項１から８の何れかに記載の単離されたモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ヒトＨＥＲ３抗体及び診断及び治療法におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
受容体チロシンキナーゼであるヒト上皮増殖因子受容体ＥｒｂＢ／ＨＥＲファミリーは、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ｃ-Ｎｅｕ、ＨＥＲ２）、ＨＥＲ３（ＨＥＲ３）及びＨＥＲ４（ＨＥＲ４）の４つのメンバーを含む。そのＨＥＲ受容体は、１から４の４つの構造ドメインから成る細胞外の糖化付加ドメイン、膜貫通ドメイン及びシグナル伝達経路につなぐためのキナーゼドメインを含む細胞内Ｃ末端部分から成る。ＨＥＲ３を除いて、細胞内領域は、チロシンキナーゼ活性を持っている。シグナル伝達は、リガンドによって誘導される受容体の二量体化及び細胞質のシグナル伝達の活性化につながるリン酸化によって仲介される。ＨＥＲ２は、もともと「活性」構造をとっているため、特異的なリガンドを持たない。その他のＨＥＲ受容体は、二量体化を防ぐように折りたたまれた分子を含む不活性な単量体として存在する。ドメイン１及び３へのリガンドの結合は、最終的に受容体のドメイン２の二量体化ループを露出させる大きな構造変化を誘導する。この二量体化ループの露出によって、受容体の二量体化が可能になる。
【０００３】
１９９０年に最初に記述されたＨＥＲ３受容体は、細胞内キナーゼ活性を欠損する唯一のＨＥＲファミリーメンバーの受容体であり、下流のシグナル伝達はヘテロ二量体化によって達成される。従って、単量体としてのＨＥＲ３受容体は、「非自己」と呼ばれ、ホモ二量体を形成することができない。リガンドであるヘレグリン（ＨＲＧ）がＨＥＲ３受容体へ結合することによって、ＨＥＲ３の他のＨＥＲファミリー受容体（ＨＥＲ２選択的）とのヘテロ二量体化が誘導される。ヘテロ二量体のうち、ＨＥＲ３のキナーゼドメインは、そのＨＥＲファミリーのパートナーのアロステリック活性化因子として機能する。
【０００４】
ＨＥＲ３は、乳癌や卵巣癌を含む様々な癌の発生に関わる（Ｌｅｅ-Ｈｏｅｆｌｉｃｈ  ＳＴ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８；ＭｃＩｎｔｙｒｅ  Ｅ、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ．２０１０；Ｔａｎｎｅｒ  Ｂ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００６）。ＨＥＲ３の発現は、悪性の黒色腫における腫瘍進行、患者生存の減少及び転移と相関し、卵巣癌における生存の減少と関連がある。重要なことに、乳癌においては、ＨＥＲ２の発現が低くハーセプチン治療の条件を満たさない腫瘍は、多くの場合、ＨＥＲ３を強く発現するように「プログラム」されており（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ．Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２００４）、長期治療後にハーセプチン耐性となったＨＥＲ２＋＋＋の腫瘍は、ＨＥＲ３を強く発現するように「再プログラム」される（Ｎａｒａｙａｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９）。肺癌（Ｗｈｅｅｌｅｒ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００８）及び結腸直腸癌（Ｌｕ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７）におけるセツキシマブ耐性もまた、ＥＧＦＲの内在化／分解と共にＨＥＲ３の過剰発現と関連があった。また最近、ＨＥＲ３の過剰発現は、結腸直腸癌における無転移生存の不良と有意に関連があることが示された（Ｈｏ-Ｐｕｎ-Ｃｈｅｕｎｇ、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１０）。このように、ＨＥＲ３の過剰発現とＰＩ３キナーゼ／ＡＫＴ経路の活性化を介した代償シグナルは、ＨＥＲを標的とした治療（抗体及びＴＫＩ）に対する耐性発現に関わっており（Ｗｈｅｅｅｌｅｒ  ２００８、Ｌｕ  ２００７、Ｎａｒａｙａｎ、２００９、Ｓｅｒｇｉｎａ、２００７）、ＩＧＦＲを標的とした治療（Ｄｅｓｂｏｉｓ-Ｍｏｕｔｈｏｎ、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９）及び化学療法薬（Ｋｒｕｓｅｒ、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２０１０）に対する耐性にも関与している。
【０００５】
これら全ての発見から、ＨＥＲ３を標的とした薬剤、特に抗体が、癌におけるＨＥＲ３のシグナル伝達の役割をさらに理解するのに有用であり、特に、有効な免疫治療薬として使用される可能性が示唆される。
【０００６】
現在のところ、腫瘍治療学分野の科学文献がＨＥＲ３を標的とする利益を強く強調しているが、治療用の抗ＨＥＲ３抗体は商業化されていない。現在、メリマック・ファーマシューティカルズ／サノフィ・アベンティス（ＭＭ-１２１抗体；ＰＣＴ  ＷＯ２００８／１００６２４）及びウー３・ファルマ・ゲー・エム・ベー・ハー／第一三共／アムジェン（Ｕ３-１２８７又はＡＭＧ-８８８；ＰＣＴ  ＷＯ２００７／０７７０２８）によって、２つのヒト抗体が開発中である。ＭＭ-１２１抗体については、ＮＳＣＬＣにおいて第１相臨床試験、ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２-乳癌において第１／２相臨床試験が行われている。Ｕ３-１２８７抗体については、エルロチニブと共にＮＳＣＬＣにおける第１相臨床試験が行われている。１つのＥＧＦＲ／ＨＥＲ３二重特異性抗体ＤＬ１１ｆ（ジェネンテック；ＰＣＴ  ＷＯ２０１０／１０８１２７）は、いまだ研究開発段階である。ＨＥＲ２／ＨＥＲ３二重特異性抗体であるＭＭ-１１１（メリマック・ファーマシューティカルズ；ＰＣＴ  ＷＯ２００５／１１７９７３、ＷＯ２００６／０９１２０９）については、ＨＥＲ２が増幅された乳癌において、単独又は、トラスツズマブ又はラパチニブとの併用で第１／２相臨床試験が行われている。
【０００７】
上述した全ての抗体は、ＨＥＲ３受容体のヘレグリン結合部位を阻害するため、リガンド依存性の腫瘍に対するこれらの抗体治療に限られる。ＨＥＲ３のヘレグリン結合部位を対象としない抗体を用いてＨＥＲ３を標的とすることによって、ＨＥＲ２が増幅された乳癌における標的療法又は化学療法に対する耐性を回避すること、現在対象となっていないＨＥＲ２の発現が低い乳癌に対する標的療法の応用分野を拡大すること、又はＨＥＲ３を発現しまだ標的療法が利用できない３重陰性の乳癌を治療することが可能になるであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、単離された抗ヒトＨＥＲ３抗体又はそのフラグメントを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の態様は、ＨＥＲ-３の細胞外ドメインに特異的に結合し、ＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６として寄託されたハイブリドーマから産生され得られる抗体とヒトＨＥＲ-３の細胞外ドメインへの結合に対して競合する、単離されたモノクローナル抗体を提供する。
【００１０】
本発明の更なる態様は、ＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体の可変軽鎖（ＶＬ）のＣＤＲを含むＶＬ鎖及びＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体の可変重鎖（ＶＨ）のＣＤＲを含むＶＨ鎖を有するモノクローナル抗体に関する。
【００１１】
本発明の更に別の態様は、ＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体のＶＬ鎖及びＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体のＶＨ鎖を有するモノクローナル抗体に関する。
【００１２】
本発明の更に別の態様は、ＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体の可変ドメインを有するモノクローナルキメラ抗体に関する。
【００１３】
本発明の更に別の態様は、ＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体のＣＤＲを有するモノクローナルヒト化抗体に関する。
【００１４】
本発明の更に別の態様は、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ-４４８６に基づいて入手可能なハイブリドーマから得られるマウスモノクローナル抗体（１６Ｄ３-Ｃ１）に関する。
【００１５】
本発明は、更に、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２及び二重特異性抗体を含むがこれに限定されない、前記抗体の抗体断片も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１Ａは、選択されたモノクローナル抗体のＨＥＲ２及びＦｃに対するＨＥＲ３の結合性を示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ａｂ６抗体と比較して、本発明の精製されたマウスＩｇＧ抗体のマウスＨＥＲ３に対する反応性を示している。
【図２Ａ】図２Ａは、ＨＥＲ３抗原に対する精製されたモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ結合曲線を示している。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＨＥＲ３抗原に対する精製されたモノクローナル抗体の産生量（Ｂ）を示している。
【図３】図３は、精製されたマウスＩｇＧである４Ｈ９-Ｄ１１、９Ｂ４-Ｄ６、９Ｆ７-Ｆ１１、１１Ｇ１０-Ｄ２、１２Ｈ８-Ｂ１１、１４Ｈ１-Ｈ８、１５Ｄ４-Ｆ２及び１６Ｄ３-Ｃ１の野生型、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３及びＥＧＦＲ／ＨＥＲ４遺伝子を導入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞への特異的結合特性（幾何平均）のフローサイトメトリー分析を示している。Ｐｘ抗体は、負の対照である。Ａｂ６及びＵ１-５９は、競合抗体である。
【図４】図４は、ｍＡｂである１６Ｄ３-Ｃ１、９Ｆ７-Ｆ１１及び１２Ｈ８-Ｂ１１のＢＩＡＣＯＲＥ結合キネティクスを示している。表６は、Ａｂ６抗体と比較して、本発明の精製されたマウス抗体である９Ｆ７-Ｆ１１、１１Ｇ１０-Ｄ２、１２Ｈ８-Ｂ１１、１４Ｈ１-Ｈ８、１５Ｄ４-Ｆ２及び１６Ｄ３-Ｃ１の結合親和性を示している。
【図５】図５は、ＳＫＢＲ３細胞におけるＨＥＲ３特異抗体である１６Ｄ３-Ｃ１、９Ｆ７-Ｆ１１及び１２Ｈ８-Ｂ１１とヘレグリンのＦＡＣＳ競合実験を示している。Ａ、Ｂ及びＣは、ＨＥＲ３特異的な正の対照抗体である。
【図６】図６は、ＥＬＩＳＡによって測定された、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３を遺伝子導入され抗ＨＥＲ３マウスｍＡｂを処理されたＮＩＨ３Ｔ３細胞の全体のＨＥＲ２のリン酸化を示している。
【図７】図７は、ＥＬＩＳＡによって測定された、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３を遺伝子導入され抗ＨＥＲ３マウスｍＡｂを処理されたＮＩＨ３Ｔ３細胞の全体のＨＥＲ３のリン酸化を示している。
【図８Ａ】図８Ａは、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３を遺伝子導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞における抗ＨＥＲ３ｍＡｂによるＹ１２８９  ＨＥＲ３／Ｙ１１９６  ＨＥＲ２のリン酸化の阻害を示している。ＧＡＰＤＨは、ウエスタンブロットにおける対照として使用された。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３を遺伝子導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞における抗ＨＥＲ３ｍＡｂによるＹ１２６２  ＨＥＲ３／Ｙ１１１２  ＨＥＲ２（Ｂ）のリン酸化の阻害を示している。ＧＡＰＤＨは、ウエスタンブロットにおける対照として使用された。
【図９】図９は、ＢｘＰＣ３膵癌細胞における抗ＨＥＲ３マウスｍＡｂである１６Ｄ３-Ｃ１及び９Ｆ７-Ｆ１１の使用によるＨＥＲ２／ＨＥＲ３受容体のリン酸化及び下流のＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナルの阻害を示している。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ウエスタンブロットによってＢｘＰＣ３膵癌細胞における抗体誘導性のＨＥＲ３内在化の阻害を示している。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ウエスタンブロットによってＢｘＰＣ３膵癌細胞における抗体誘導性のＨＥＲ３内在化の定量化（Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）を示している。
【図１１】図１１は、ＭＴＳ試験によって測定される、マウスＨＥＲ３特異抗体によるＨＥＲ２／ＨＥＲ３を遺伝子導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞及び様々な癌細胞株の増殖抑制を示している。
【図１２】図１２は、ＴＲ-ＦＲＥＴ解析によって測定される、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３を遺伝子導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞における抗ＨＥＲ３ｍＡｂによるＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体化の阻害を示している。
【図１３】図１３は、１６Ｄ３-Ｃ１ｍＡｂによって認識されるエピトープを同定する。（Ａ）抗ＨＥＲ３抗体１６Ｄ３-Ｃ１によって認識される領域のスポット解析、（Ｂ）１６Ｄ３-Ｃ１モノクローナル抗体によって認識される領域のアラスキャン解析、及び（Ｃ）ＨＥＲ３ペプチドに対する１６Ｄ３-Ｃ１の結合のピクセル定量化（Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）。
【図１４】図１４は、９Ｆ７-Ｆ１１ｍＡｂによって認識されるエピトープを同定する。（Ａ）抗ＨＥＲ３抗体９Ｆ７-Ｆ１１によって認識される領域のスポット解析、（Ｂ）９Ｆ７-Ｆ１１ｍＡｂによって認識される領域のアラスキャン解析、及び（Ｃ）ＨＥＲ３ペプチドに対する９Ｆ７-Ｆ１１の結合のピクセル定量化（Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）。
【図１５】図１５は、リガンド非結合のＨＥＲ３受容体の結晶構造（ｐｄｂ１Ｍ６Ｂ）における、ｍＡｂである１６Ｄ３-Ｃ１及び９Ｆ７-Ｆ１１によって認識されるスポット寄与残基の位置決定（左側）、及びペルツズマブに結合したＨＥＲ２受容体の結晶構造上のエピトープの重ね合わせ（ｐｄｂ１Ｓ７８）（右側）を示している。
【図１６】図１６は、ＨＲＧ依存性、ＨＥＲ２非増幅／ＰＩＫ３ＣＡ-ｗｔ／ｐ５-ｍｕｔ扁平上皮癌Ａ４３１細胞を異種移植されたヌードマウスにおけるｍＡｂである１６Ｄ３-Ｃ１及び９Ｆ７-Ｆ１１による腫瘍進行の抑制（Ａ）、及び対応するカプランマイヤー曲線（Ｂ）を示している。
【図１７】図１７は、ＨＥＲ２非増幅／ＰＩＫ３ＣＡ-ｗｔ／ｐ５３-ｍｕｔ膵癌ＢｘＰＣ３細胞を異種移植されたヌードマウスにおけるｍＡｂである９Ｆ７-Ｆ１１及び１６Ｄ３-Ｃ１による腫瘍進行の抑制（Ａ）及び対応するカプランマイヤー曲線（Ｂ）を示している。
【図１８】図１８は、媒体又は１６Ｄ３-Ｃ１を処理されたマウスから摘出されたＢｘＰＣ３異種移植片におけるＹ１２８９-ＨＥＲ３のリン酸化レベル及び全体のＨＥＲ３発現を示している。
【図１９】図１９は、ＨＲＧ依存性、ＨＥＲ２ｌｏｗ扁平上皮癌Ａ４３１細胞（Ａ）及び肺癌Ａ５４９細胞（Ｂ）におけるＨＥＲ３特異ｍＡｂである１６Ｄ３-Ｃ１単独使用又はトラスツズマブとの併用による腫瘍進行の抑制を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明者は、マウスの抗ヒトＨＥＲ３抗体の特徴を明らかにした。特に、発明者は、２０１１年５月１７日にブダペスト条約の条項に従って、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５、Ｆｒａｎｃｅ）にマウスの抗ヒト抗体（１６Ｄ３-Ｃ１）を産生するハイブリドーマを寄託した。寄託されたハイブリドーマのＣＮＣＭ寄託番号は、Ｉ-４４８６である。発明者は、特に、この抗体がヘテロ二量体であるＨＥＲ２-ＨＥＲ３複合体形成の強力な阻害剤であり、その阻害がリガンドであるヘレグリンに依存しないことを示した。
【００１８】
（定義）
「ＨＥＲ３」という用語は、Ｐｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：４９０５-４９０９（１９９０）；Ｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４：１５８４２-８５７（２００５）、Ｃｈｏ  ａｎｄ  Ｌｅａｈｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１３３０-１３３３（２００２）も参照）に記述されたように、ヒトＨＥＲ３受容体を示す。ＨＥＲ３は、「ＨＥＲ３」としても知られている。
【００１９】
「抗ヒトＨＥＲ３抗体」という用語は、ヒトＨＥＲ３に対して誘導された抗体を示す。
【００２０】
本発明によれば、「抗体」又は「免疫グロブリン」は同じ意味を持ち、本発明においては同等に使用される。「抗体」は、ここでは、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含む分子など、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な成分を示す用語として使用される。前記のように、抗体という用語は、抗体分子全体だけでなく、抗体及び抗体断片のバリアント（誘導体を含む）と同様に抗体断片も包含する。自然抗体においては、２つの重鎖は、互いにジスルフィド結合によって連結しており、それぞれの重鎖は、ジスルフィド結合によって１つの軽鎖と連結している。軽鎖には、ラムダ（ｌ）及びカッパ（ｋ）の２つの型が存在する。重鎖には、抗体分子の機能活性を決定する５つの主な種類（又はアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥが存在する。それぞれの鎖は、独特の配列ドメインを有する。軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）と定常ドメイン（ＣＬ）の２つのドメインを含む。重鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）と３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３、まとめてＣＨと呼ばれる。）の４つのドメインを含む。軽鎖と重鎖両方の可変領域（ＶＬ、ＶＨ）が、抗原に対する結合認識と特異性を決定する。軽鎖と重鎖の定常領域（ＣＬ、ＣＨ）は、抗体鎖の連結、分泌、胎盤通過性、相補的な結合及びＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合といった生物学的特性をもたらす。Ｆｖ断片は、免疫グロブリンのＦａｂ断片のＮ末端部分で、１つの軽鎖と１つの重鎖の可変部から成る。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基の間の構造的相補性に依存する。抗体結合部位は、主に超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基で構成されている。時には、非超可変領域又はフレームワーク領域（ＦＲ）由来の残基が、全体のドメイン構造と結合部位に影響することもある。相補性決定領域又はＣＤＲは、結合親和性と天然の免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の特異性を共に決定する、アミノ酸配列を示す。免疫グロブリンの軽鎖と重鎖は、それぞれ３つのＬ-ＣＤＲ１、Ｌ-ＣＤＲ２、Ｌ-ＣＤＲ３及びＨ-ＣＤＲ１、Ｈ-ＣＤＲ２、Ｈ-ＣＤＲ３と名付けられたＣＤＲを持っている。従って、抗原結合部位は、軽鎖と重鎖それぞれのＶ領域由来のＣＤＲ１組を有する６つのＣＤＲｓを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に介在するアミノ酸配列を示す。
【００２１】
「キメラ抗体」という用語は、１６Ｄ３-Ｃ１抗体由来のＶＨドメイン及びＶＬドメインとヒト抗体のＣＨドメイン及びＣＬドメインから成る抗体を示す。
【００２２】
発明によれば、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体由来の可変フレームワーク領域及び定常領域を持ち、１６Ｄ３-Ｃ１抗体のＣＤＲを保持している抗体を示す。
【００２３】
「Ｆａｂ」という用語は、プロテアーゼとパパインでＩｇＧを処理することによって得られた断片のうちＨ鎖のＮ末端側の半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合を介して連結した、分子量約５００００で抗原結合活性を持つ抗体断片を示す。
【００２４】
「Ｆ（ａｂ’）２」という用語は、プロテアーゼとペプシンでＩｇＧを処理することによって得られた断片のうちヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合した、Ｆａｂよりわずかに大きい分子量約１０００００で抗原結合活性を持つ抗体断片を示す。
【００２５】
「Ｆａｂ’」という用語は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られた、分子量約５００００で抗原結合活性を持つ抗体断片を示す。
【００２６】
一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、ペプチドをコードするリンカーによって連結したＶＨ及びＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合によって通常発現する、共有結合したＶＨ：：ＶＬへテロ二量体である。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合によって安定化されたＶＨ：：ＶＬへテロ二量体である。二価及び多価の抗体断片は、一価のｓｃＦｖの会合によって自然発生的に形成するか、又は二価のｓｃ（Ｆｖ）２のようなペプチドリンカーによって単価のｓｃＦｖを連結することで生成し得る。
【００２７】
「二重特異性抗体」という用語は、同一のポリペプチド鎖（ＶＨ-ＶＬ）中の軽鎖可変領域（ＶＬ）に連結された重鎖可変領域（ＶＨ）を含む小さな抗体断片を示す。同一鎖の２つのドメインを対合させるには短過ぎるリンカーを使用することによって、そのドメインは、別の鎖の相補性ドメインと対合せざるを得なくなり、２つの抗原結合部位を創造する。
【００２８】
本発明の抗体又はヌクレオチド配列を示すとき、「精製」及び「単離」によって、同種の別の生物学的高分子を相当量欠如し、表示された分子が存在することを意味する。「精製」という用語は、ここでは好ましくは同種の生物学的高分子の少なくとも重量７５％、より好ましくは少なくとも重量８５％、さらに好ましくは少なくとも重量９５％、及び最も好ましくは少なくとも重量９８％存在することとして使用される。「単離」された特定のポリペプチドをコードする核酸分子は、ポリペプチドをコードしない別の核酸分子を実質的に含んでいない核酸分子を示す。；しかしながら、その分子は、組成物の塩基特性に悪影響を及ぼさない幾つかの付加的な塩基を含む可能性がある。
【００２９】
（本発明の抗体）
本発明は、単離された抗ヒトＨＥＲ３抗体又はそのフラグメントを提供する。特に、発明者は、２０１１年５月１７日にブダペスト条約の条項に従ってＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５、Ｆｒａｎｃｅ）にマウスの抗ヒト抗体（１６Ｄ３-Ｃ１）を産生するハイブリドーマを寄託した。寄託されたハイブリドーマのＣＮＣＭ寄託番号は、Ｉ-４４８６である。
【００３０】
本発明の態様は、ＨＥＲ-３の細胞外ドメインに特異的に結合し、ＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６として寄託されたハイブリドーマから産生され得られる抗体とヒトＨＥＲ-３の細胞外領域への結合に対して競合する、単離されたモノクローナル抗体を提供する。
【００３１】
特定の実施態様において、前記抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から成る集団から選択される。
【００３２】
本発明の更なる態様は、ＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体の可変軽鎖（ＶＬ）のＣＤＲを含むＶＬ鎖及びＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体の可変重鎖（ＶＨ）のＣＤＲを含むＶＨ鎖を有するモノクローナル抗体に関する。
【００３３】
本発明の更に別の態様は、ＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体のＶＬ鎖及びＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体のＶＨ鎖を有するモノクローナル抗体に関する。
【００３４】
本発明の更に別の態様は、ＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体の可変ドメインを有するモノクローナルキメラ抗体に関する。
【００３５】
本発明の更に別の態様は、ＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体のＣＤＲを有するモノクローナルヒト化抗体に関する。
【００３６】
本発明の更に別の態様は、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ-４４８６に基づいて入手可能なハイブリドーマから得られるマウスモノクローナル抗体（１６Ｄ３-Ｃ１）に関する。
【００３７】
本発明は、更に、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２を及び二重特異性抗体含むがこれに限定されない、前記抗体の抗体断片も提供する。
【００３８】
（競合的結合試験）
前述のように、本発明は、ＨＥＲ-３の細胞外ドメインに特異的に結合し、ＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６として寄託されたハイブリドーマから産生され得られる抗体とヒトＨＥＲ-３の細胞外領域への結合に対して競合する、全ての単離されたモノクローナル抗体に関する。
【００３９】
エピトープビニングは、請求項に係る発明の範囲内の抗体を同定するために利用可能である。エピトープビニングは、同時にＨＥＲ３に結合できる又はできない抗体の組み合わせ、すなわちＨＥＲ３の同じ又は重複するエピトープに結合する抗体の組み合わせを同定するための競合的結合試験を示す。エピトープビニング実験は、抗原的に異なるエピトープが存在する証拠を提供する。結合の競合は、いかなる抗体又はフラグメントの組み合わせに対しても評価される。例えば、適切な検出試薬を使用することで、いかなる起源の抗体又は結合フラグメントの結合特異性でも、ここで開示されるモノクローナル抗体の結合特異性と比較できる。エピトープビニングは、「単離された抗体」又は細胞培養上清を用いて実施可能である。しばしば、ビニングは、さらに開発すべきクローンの選択を支援するために最初のクローンの上清を用いて実施する。比較する抗体の抗原結合ドメインは、実質的に同種であるべきである。「二重特異性」又は「二官能性」抗体の場合は、２つの異なる結合部位の結合特異性をそれぞれ評価又はビニング処理する必要がある。
【００４０】
本発明の抗体は、当技術分野で周知のいかなる方法によっても特異的な結合を試験可能である。多くの異なる競合的結合試験形式は、エピトープビニングに使用可能である。使用し得る免疫測定法は、ウエスタンブロット、放射免疫測定、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫沈降法、沈降素法、ゲル内沈降法、免疫放射定量測定法、蛍光免疫測定法、プロテインＡ免疫法、補体結合試験といった技術を使用する競合法を含むが、これに限定されるものではない。前記の試験は、当技術分野でよく知られた所定の試験である（例えば、  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，１９９４  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）は、モノクローナル抗体のエピトープパネルが通常使用される様々な表面プラズモン共鳴の試験法の１つである。さらに、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ及びＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，１９８８に記述されるような所定の交差遮断試験が実施可能である。
【００４１】
（本発明の抗体の産生法）
本発明の抗ヒトＨＥＲ３抗体は、化学的、生物学的、遺伝学的又は酵素技術の単独あるいは併用といった当分野で周知の技術によって産生可能であるが、これらの技術に限定されるものではない。
【００４２】
望ましいアミノ酸配列を知ることで、当業者は、ポリペプチドの産生に関する標準的な技術によって容易に前記抗体を産生することができる。例えば、それらの抗体は、好ましくは商業的に利用可能なペプチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア州、によって作られた物など）及び以下の使用説明のような、周知の固相法を利用することで合成可能である。別の方法として、本発明の抗体は、当技術分野で周知の組み換えＤＮＡ技術によって合成可能である。例えば、抗体は、発現ベクターに抗体をコードするＤＮＡ配列を組み込み、そのようなベクターを、望ましい抗体を発現し後に周知の技術を使用して単離できる適切な真核又は原核の宿主に導入することで取得可能である。
【００４３】
従って、本発明の更なる目的は、本発明に準じた抗体をコードする核酸配列に関する。
【００４４】
特定の実施態様においては、本発明の抗体（例えば、ＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６  として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体（１６Ｄ３-Ｃ１））のＶＨドメイン又は本発明の抗体（例えば、ＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体（１６Ｄ３-Ｃ１））のＶＬドメインをコードする核酸配列に関する。
【００４５】
一般的に、前記核酸は、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ又はウイルスベクターといった、いかなる適切なベクターにも含むことができるＤＮＡ又はＲＮＡ分子のことである。
【００４６】
「ベクター」、「クローニングベクター」及び「発現ベクター」は、宿主細胞にＤＮＡ又はＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を導入するための媒体を意味し、宿主を形質転換させ導入された配列の発現（例えば、転写及び翻訳）を亢進する。
【００４７】
従って、本発明の更なる目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。
【００４８】
前記のベクターは、対象への投与により前記抗体の発現を引き起こす又は誘導するためのプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどといった調節エレメントを包含可能である。動物細胞用の発現ベクターに使用されるプロモーター及びエンハンサーの例としては、ＳＶ４０の早期プロモーター及びエンハンサー（Ｍｉｚｕｋａｍｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．１９８７）、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーター及びエンハンサー（Ｋｕｗａｎａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．１９８７）、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Ｍａｓｏｎ  ＪＯ  ｅｔ  ａｌ．１９８５）及びエンハンサー（Ｇｉｌｌｉｅｓ  ＳＤ  ｅｔ  ａｌ．１９８３）などが含まれる。
【００４９】
いかなる動物細胞用の発現ベクターでも、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を挿入及び発現可能でさえあれば使用できる。適切なベクターの例としては、ｐＡＧＥ１０７（Ｍｉｙａｊｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）、ｐＡＧＥ１０３（Ｍｉｚｕｋａｍｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．１９８７）、ｐＨＳＧ２７４（Ｂｒａｄｙ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．１９８４）、ｐＫＣＲ（Ｏ’Ｈａｒｅ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  １９８１）、ｐＳＧ１  ｂｅｔａ  ｄ２-４-（Ｍｉｙａｊｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）などが含まれる。
【００５０】
プラスミドの別の例としては、複製起点を含む複製型プラスミド又はｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどといった統合的プラスミドが含まれる。
【００５１】
ウイルスベクターの別の例としては、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス及びＡＡＶベクターがある。前記の組み換えウイルスは、パッケージング細胞への遺伝子導入、又はヘルパープラスミド又はウイルスを用いた一過性の遺伝子導入といった当分野で周知の技術によって産生可能である。ウイルスパッケージング細胞の標準的な例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが含まれる。前記の複製欠損組み換えウイルスの詳細な作製方法は、例えば、ＷＯ  ９５／１４７８５、ＷＯ  ９６／２２３７８、ＵＳ  ５，８８２，８７７、ＵＳ  ６，０１３，５１６、ＵＳ  ４，８６１，７１９、ＵＳ  ５，２７８，０５６及びＷＯ  ９４／１９４７８で参照可能である。
【００５２】
本発明の更なる目的は、本発明による核酸及び／又はベクターによって遺伝子導入した、感染した又は形質転換した宿主細胞に関する。
【００５３】
「形質転換」という用語は、「外来」（すなわち、外因性の又は細胞外の）遺伝子、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を宿主細胞に導入し、宿主細胞が、一般的に導入された遺伝子又は配列によってコードされたタンパク質又は酵素といった望ましい物質を産生するために、導入された遺伝子又は配列を発現することを意味する。導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受け取り発現する宿主細胞は、「形質転換している」。
【００５４】
本発明の核酸は、適切な発現系で本発明の抗体を産生するために使用可能である。「発現系」という用語は、宿主細胞及び、例えば、ベクターによって運ばれ宿主に導入される外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現用といった、適切な条件下で適合するベクターを意味する。
【００５５】
一般的な発現系は、大腸菌の宿主細胞及びプラスミドベクター、昆虫の宿主細胞及びバキュロウイルスベクター、及び哺乳類の宿主細胞及びベクターを含む。別の宿主細胞の例としては、原核細胞（細菌など）及び真核細胞（酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が含まれるが、これらに限定されるものではない。具体例としては、大腸菌、クルイベロミセス又はサッカロミケス、哺乳類細胞株（例えば、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）及び、プライマリー又は確立された哺乳類細胞株（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞等から産生されたもの）が含まれる。例としてはまた、マウスＳＰ２／０-Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３-Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ここでは以下、「ＤＨＦＲ遺伝子」と称す）を欠損したＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ；１９８０）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２、ここでは以下、「ＹＢ２／０細胞」と称す）なども含まれる。
【００５６】
本発明は、本発明に従った抗体を発現する組み換え宿主細胞を産生する方法に関するが、その方法は以下の手順を含む：（ｉ）前述のような組み換え核酸又はベクターの試験管内又は生体外でのコンピテント宿主細胞への導入、（ｉｉ）獲得した組み換え宿主細胞の試験管内又は生体外での培養、及び（ｉｉｉ）任意に、前記抗体を発現及び／又は分泌する細胞の選択。前記の組み換え宿主細胞は、本発明の抗体の産生に使用可能である。
【００５７】
別の特定の実施態様では、以下の手順を含む：（ｉ）１６Ｄ３-Ｃ１抗体の発現に適切な条件下でのＣＮＣＭ-Ｉ-４４８６として寄託されたハイブリドーマの培養、及び（ｉｉ）発現した抗体の回収。
【００５８】
本発明の抗体は、例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーといった、標準的な免疫グロブリン精製法によって培地から適切に分離される。
【００５９】
特定の実施態様では、本発明のヒトキメラ抗体は、前述のようにＶＬ及びＶＨドメインをコードする核酸配列を獲得することによって産生可能である。具体的には、その核酸配列をヒト抗体のＣＨ及びヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を持つ動物細胞用の発現ベクターに挿入することでヒトキメラ抗体発現ベクターを構築し、その発現ベクターを動物細胞に導入することによってコード配列を発現する。
【００６０】
ヒトキメラ抗体のＣＨドメインとしては、ヒト免疫グロブリンに属するいかなる領域でもあり得るが、ＩｇＧクラスの領域が適切であり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４といったＩｇＧクラスに属するいかなるサブクラスも使用可能である。また、ヒトキメラ抗体のＣＬドメインとしては、Ｉｇに属するいかなる領域でもあり得るが、κクラス又はλクラスの領域が使用可能である。
【００６１】
キメラ抗体を産生する方法は、当該分野では周知の標準的な組み換えＤＮＡ及び遺伝子導入技術を含む（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）及び特許文献ＵＳ５，２０２，２３８及びＵＳ５，２０４，２４４を参照）。
【００６２】
本発明のヒト化抗体は、前述のように、ＣＤＲドメインをコードする核酸配列を獲得することによって産生可能である。具体的には、その核酸配列を（ｉ）ヒト抗体と同一の重鎖定常領域及び（ｉｉ）ヒト抗体と同一の軽鎖定常領域をコードする遺伝子を持つ動物細胞用の発現ベクターに挿入することでヒト化抗体発現ベクターを構築し、その発現ベクターを動物細胞に導入することによって遺伝子を発現する。
【００６３】
ヒト化抗体発現ベクターは、別個のベクター上に抗体重鎖をコードする遺伝子及び抗体軽鎖をコードする遺伝子が存在するタイプか、同一のベクター上に両方の遺伝子が存在するタイプ（タンデム型）のどちらかであり得る。ヒト化抗体発現ベクター構築の容易さに関しては、動物細胞への導入の容易さ、及び動物細胞における抗体のＨ及びＬ鎖の発現レベルのバランスが重要であり、タンデム型のヒト化抗体発現ベクターが望ましい（Ｓｈｉｔａｒａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）。タンデム型のヒト化抗体発現ベクターの例としては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８などが含まれる。
【００６４】
標準的な組み換えＤＮＡと遺伝子導入技術に基づいてヒト化抗体を産生する方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．１９８８；  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ＭＳ．ｅｔ  ａｌ．１９８５を参照）。抗体は、例えば、ＣＤＲ移植（ＥＰ２３９，４００；国際公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許ＵＳ５，２２５，５３９；５，５３０，１０１；５，５８５，０８９）、ベニヤリング又はリサーフェイシング（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ  ＥＡ（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ＧＭ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）；  Ｒｏｇｕｓｋａ  ＭＡ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４））、及び鎖シャッフリング（米国特許ＵＳ５，５６５，３３２）を含む当技術分野で周知の様々な技術を用いてヒト化可能である。前記抗体の調製のための一般的な組み換えＤＮＡ技術もよく知られている（欧州特許出願ＥＰ１２５０２３及び国際公開ＷＯ９６／０２５７６を参照）。
【００６５】
本発明のＦａｂは、ヒトＨＥＲ３と特異的に反応する抗体をプロテアーゼであるパパインで処理することによって獲得可能である。また、Ｆａｂは、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物の発現系、又は真核生物の発現系用のベクターに挿入し、Ｆａｂを発現させるための原核生物又は真核生物（適切なもの）にベクターを導入することによって産生可能である。
【００６６】
本発明のＦ（ａｂ’）２は、ヒトＨＥＲ３と特異的に反応する抗体をプロテアーゼであるペプシンで処理することによって獲得可能である。また、Ｆ（ａｂ’）２は、チオエーテル結合又はジスルフィド結合を介して下記のようにＦａｂ’に結合することによって産生可能である。
【００６７】
本発明のＦａｂ’は、ヒトＨＥＲ３と特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を還元剤であるジチオトレイトールで処理することによって獲得可能である。また、Ｆａｂ’は、抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物、又は真核生物用の発現ベクターに挿入し、それを発現させるための原核生物又は真核生物（適切なもの）にベクターを導入することによって産生可能である。
【００６８】
本発明のｓｃＦｖは、前述のようにＶＨ及びＶＬドメインをコードするｃＤＮＡを獲得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築、そのＤＮＡを原核生物、又は真核生物用の発現ベクターに挿入し、ｓｃＦｖを発現させるための原核生物又は真核生物（適切なもの）に発現ベクターを導入することによって産生可能である。ヒト化ｓｃＦｖ断片を作製するために、ＣＤＲ移植と呼ばれる周知の技術が使用可能であるが、それは、ドナーのｓｃＦＶ断片由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を選択し、それらを既知の３次元構造を持つヒトｓｃＦｖ断片に移植することに関する（例えば、Ｗ０９８／４５３２２；ＷＯ８７／０２６７１；ＵＳ５，８５９，２０５；ＵＳ５，５８５，０８９；ＵＳ４，８１６，５６７；ＥＰ０１７３４９４を参照）。
【００６９】
ここで記述される抗体のアミノ酸配列の修飾が、企図されている。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい可能性がある。単に非ヒト動物由来抗体のＶＨ及びＶＬ中のＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植すると、非ヒト動物由来の元の抗体と比較して抗原結合活性が低下することが知られている。ＣＤＲだけでなくＦＲにおいても、非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬの幾つかのアミノ酸残基は、直接的又は間接的に抗原結合活性と関連すると考えられている。従って、これらのアミノ酸残基をヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲ由来の異なるアミノ酸残基で置換すると、結合活性が低下することになる。この問題を解決するために、ヒトＣＤＲを移植された抗体においては、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、抗体との結合に直接関連する、又はＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用する、又は抗体の３次元構造を維持する及び抗原との結合に直接関連するアミノ酸残基を同定する試みが必要である。低下した抗原結合活性は、同定されたアミノ酸を非ヒト動物由来の元の抗体のアミノ酸残基で置換することで、亢進可能である。
【００７０】
本発明の抗体の構造及びそれらをコードするＤＮＡ配列の修飾及び改変が実施可能であり、さらに望ましい特性を持つ抗体をコードする機能分子を獲得することができる。
【００７１】
アミノ酸配列の改変においては、アミノ酸のハイドロパシーインデックスを考慮する可能性がある。タンパク質の相互の生物学的機能をもたらすアミノ酸のハイドロパシー指標の重要性は、当技術分野で一般的に理解されている。アミノ酸の相対的なハイドロパシー特性は、結果として得られるタンパク質の２次構造に寄与するが、その２次構造によって、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原など、他のタンパク質との相互作用が決まる。それぞれのアミノ酸は、疎水性及び電荷特性に基づいてハイドロパシーインデックスに割り当てられている。電荷特性：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（-０．４）；スレオニン（-０．７）；セリン（-０．８）；トリプトファン（-０．９）；チロシン（-１．３）；プロリン（-１．６）；ヒスチジン（-３．２）；グルタミン酸（-３．５）；グルタミン（-３．５）；アスパラギン酸（-３．５）；アスパラギン（３．５）；リジン（-３．９）；及びアルギニン（-４．５）。
【００７２】
本発明の更なる目的は、本発明の抗体の機能保存されたバリアントも含む。
【００７３】
「機能保存されたバリアント」は、類似の特性（例えば、両極生、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、疎水性、芳香性など）を持つアミノ酸の置換を含むがこれらに限定されないポリペプチドの機能及び全体の立体配座の改変を行わずに、タンパク質又は酵素中の既存のアミノ酸残基が改変されたものである。保存されたと示されたもの以外のアミノ酸は、タンパク質中で異なる可能性があるため、類似の機能を持ついかなる２つのタンパク質間でも、そのタンパク質又はアミノ酸配列の類似性は多様である可能性があり、例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づいたクラスター法などによって、アライメント配置に従って決定される７７％から９９％という値になり得る。また、「機能保存されたバリアント」は、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定される少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらにいっそう好ましくは少なくとも９０％、さらによりいっそう好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸相同性を持ち、天然又は比較対象に対して親タンパク質として同じ又は実質的に類似の性質を持つポリペプチドも含む。
【００７４】
２つのアミノ酸配列は、より短い配列の全長を超えて、８０％、好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％より多くのアミノ酸が相同である時、又は約９０％、好ましくは９５％より多くのアミノ酸が類似（機能的に相同）である時、「実質的に相同」又は「実質的に類似」である。好ましくは、類似又は相同な配列は、例えば、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）ｐｉｌｅｕｐ  ｐｒｏｇｒａｍ、又はＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列比較アルゴリズムを用いてアライメントによって同定される。  
【００７５】
例えば、あるアミノ酸は、さほど活性が低下することなくタンパク質構造中の他のアミノ酸によって置換可能である。タンパク質の相互に作用する能力及び性質がタンパク質の生物学的機能活性を決定するため、同様の特性を持つタンパク質を獲得するにも関わらず、タンパク質の配列、及び、当然、そのＤＮＡコード配列中で、あるアミノ酸の置換を行うことができる。従って、本発明の抗体の配列、又は前記抗体をコードするＤＮＡ配列中で、それらの生物学的活性を低下することなく様々な改変を検討することができる。
【００７６】
当技術分野においては、あるアミノ酸を類似のハイドロパシーインデックス又はスコアを持つ他のアミノ酸によって置換し、結果として類似の生物学的活性、すなわち生物学的機能が同等なタンパク質を獲得可能であることが知られている。
【００７７】
上記のように、アミノ酸置換は、一般的に、例えば、疎水性、親水性、電荷、大きさなどのアミノ酸側鎖の置換基の相対的類似性に基づいている。当技術分野においては、様々な前述の特徴を考慮した典型的な置換がよく知られており、以下のものを含む：アルギニン及びリジン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；セリン及びスレオニン；グルタミン及びアルギニン；及び、バリン、ロイシン及びイソロイシン。
【００７８】
本発明の抗体の別の種類のアミノ酸修飾は、抗体の元の糖鎖付加パターンを改変するのに役立つ可能性がある。
【００７９】
「改変」は、抗体中に見られる１つ又はより多くの糖質部分を削除すること、及び／又は抗体中に存在しない１つ又はより多くの糖化部位を付加することを意味する。
【００８０】
抗体の糖鎖付加は、典型的なＮ-結合型である。「Ｎ-結合型」は、アスパラギン残基の側鎖に糖質部分を付加することを示す。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニンのトリペプチド配列は、Ｘはプロリンを除くいかなるアミノ酸でもあり得るが、アスパラギン側鎖への糖質部分の酵素的付加のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にどちらかのトリペプチド配列が存在すると、潜在的な糖化部位が形成される。抗体への糖化部位の付加は、１つ又はより多くの前述されたトリペプチド配列（Ｎ-結合型糖化部位のための）を含むアミノ酸配列を改変することによって通常達成される。
【００８１】
別の種類の共有結合修飾は、配糖体を化学的又は酵素的に抗体に連結させることに関する。これらの処置は、Ｎ-又はＯ-結合型糖鎖付加のための糖化能を持つ宿主細胞における抗体産生を必要としないという点で都合が良い。カップリングモードを利用することによって、糖は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインの一部のような遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン、又はヒドロキシプロリンの一部のような遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファンの一部のような芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に付加することができる。例えば、そのような方法は、ＷＯ８７／０５３３０に記述されている。
【００８２】
抗体に存在するいかなる糖質部分でも、化学的又は酵素的に除去可能である。化学的な脱グリコシル化には、トリフルオロメタンスルホン酸、又は相当の化合物に抗体を暴露する必要がある。この処置は、抗体に損傷なく連結糖（Ｎ-アセチルグルコサミン又はＮ-アセチルガラクトサミン）を除くほとんど又は全ての糖を切断する。化学的な脱グリコシル化は、Ｓｏｊａｈｒ  Ｈ．ら（１９８７）及びＥｄｇｅ、ＡＳ．ら（１９８１）によって記述されている。抗体の糖質部分は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ、ＮＲ．ら（１９８７）によって記述されるように、様々なエンド-及びエキソ-グリコシダーゼの使用によっての酵素的に切断可能である。
【００８３】
抗体の別の種類の共有結合修飾は、米国特許ＵＳ４，６４０，８３５；４，４９６，６８９；４，３０１，１４４；４，６７０，４１７；４，７９１，１９２又は４，１７９，３３７に記述されているように、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンといった様々な非タンパク性ポリマーの１つに抗体を連結することを含む。
【００８４】
また、例えば、抗体の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を高めるように、エフェクター機能に関して本発明の抗体を修飾することが望ましいこともある。これは、抗体のＦｃ領域における１つ又はより多くのアミノ酸置換を導入することで達成可能である。その代わり又は付加的に、システイン残基をＦｃ領域に導入することで、この領域における鎖間でのジスルフィド結合が形成可能になる。従って、生成されたホモ二量体型抗体は、内在化能が改善及び／又は補体を介した細胞死滅及び／又は抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）が増加する可能性がある（Ｃａｒｏｎ  ＰＣ．ｅｔ  ａｌ．１９９２；及びＳｈｏｐｅｓ  Ｂ．１９９２）。
【００８５】
（免疫抱合体）
本発明の抗体は、抗ＨＥＲ３免疫抱合体を形成するための検出可能なラベルで抱合可能である。適切な検出ラベルは、例えば、放射性同位体、蛍光ラベル、化学発光ラベル、酵素ラベル、生物発光ラベル又はコロイド金を含む。検出できるように標識された免疫抱合体を作成及び検出する方法は、当技術分野では通常の技術としてよく知られており、以下に詳細を記述する。
【００８６】
検出ラベルは、オートラジオグラフィーで検出される放射性同位体であり得る。本発明の目的において特に有用な同位体は、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ及び１４Ｃである。
【００８７】
抗ＨＥＲ３免疫抱合体は、蛍光化合物でも標識可能である。蛍光標識された抗体の存在は、免疫抱合体を適切な波長の光に露光し、その結果起こる蛍光を検出することで特定される。蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、オルトフタルアルデヒド及びフルオレスカミンを含む。
【００８８】
また、抗ＨＥＲ３免疫抱合体は、化学発光化合物に抗体を連結することで検出できるように標識可能である。化学発光標識された免疫抱合体の存在は、化学反応過程で起こる蛍光の存在を検出することで特定される。化学発光標識化合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルが含まれる。
【００８９】
同様に、生物発光化合物は、本発明の抗ＨＥＲ３免疫抱合体を標識するために使用可能である。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を上げる生物系で発見された化学発光の一種である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することで特定される。標識に有用な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンを含む。
【００９０】
あるいは、抗ＨＥＲ３免疫抱合体は、抗ＨＥＲ３モノクローナル抗体を酵素と連結することで検出できるように標識可能である。抗ＨＥＲ３酵素抱合体を適切な基質存在下でインキュベートすると、酵素部分が基質と反応し、例えば、分光測光、蛍光分析又は目で見える手段で検出可能な化学的部分を生成する。多特異性免疫抱合体を検出できるように標識するのに使用可能な酵素の例としては、β-ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びアルカリフォスファターゼが含まれる。
【００９１】
当業者は、本発明に基づいて使用可能な別の適切なラベルを知るところとなるだろう。当技術分野で知られている標準的な技術を使用して、抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体に標識部分を結合することができる。これに関する典型的な方法は、Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ７０：１、１９７６；Ｓｃｈｕｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ８１：１、１９７７；Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ'ｌ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：１１０１、１９９０；Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１３３０、１９９０；及びＣｏｌｉｇａｎ、ｓｕｐｒａに記述されている。
【００９２】
さらに、免疫化学的検出の利便性及び汎用性は、アビジン、ストレプトアビジン、及びビオチンで抱合された抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体を使用することによって高まる可能性がある（例えば、Ｗｉｌｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）、“Ａｖｉｄｉｎ-Ｂｉｏｔｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｖｏｌ．１８４）（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９０）；Ｂａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ａｖｉｄｉｎ-Ｂｉｏｔｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏｌ．１０）１４９-１６２（Ｍａｎｓｏｎ、ｅｄ．，Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）を参照。）。
【００９３】
免疫測定を行う方法は、確立されている。（例えば、Ｃｏｏｋ  ａｎｄ  Ｓｅｌｆ、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  １８０-２０８（Ｒｉｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｌａｄｙｍａｎ、ｅｄｓ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；Ｐｅｒｒｙ、“Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １０７-１２０（Ｂｉｒｃｈ  ａｎｄ  Ｌｅｎｎｏｘ、ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ-Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）；Ｄｉａｍａｎｄｉｓ、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９６）を参照。）
別の態様では、本発明は、抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体薬物抱合体を提供する。ここで用いられる「抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体薬物抱合体」は、治療薬と抱合された本発明の抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体を示す。前記の抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体薬物抱合体は、対象者に投与されるとき、例えば、一般的には、単独だけでなく他の治療薬と併用されることで、ＨＥＲ３発現癌に対して臨床的に有益な効果をもたらす。
【００９４】
典型的な実施態様では、抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体は、細胞毒性薬と抱合されるため、結果的に得られる抗体医薬抱合体は、細胞に取り込まれる又は吸収されるときに、ＨＥＲ３発現細胞（例えば、ＨＥＲ３発現癌細胞）に対して細胞毒性又は細胞増殖抑制効果を発揮する。抗体への抱合において特に適切な成分は、化学療法剤、プロドラッグ変換酵素、放射性同位体、又は毒素である。例えば、抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体は、化学療法剤又は毒素といった細胞毒性薬と抱合可能である（例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、ジフテリア毒素といった細胞増殖抑制薬又は殺細胞薬）。
【００９５】
細胞毒性薬の有益な分類は、例えば、抗チューブリン薬、オーリスタチン、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、単核（白金）、二核（白金）、三核白金錯体及びカルボプラチンといった白金錯体）、アントラサイクリン、抗生物質、葉酸拮抗薬、代謝拮抗薬、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、発生前化合物、プリン代謝拮抗剤、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、又は同種のものを含む。
【００９６】
個々の細胞毒性薬は、例えば、アンドロゲン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、アスパラギナーゼ、５-アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ＣＣ-１０６５（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４２：９９９-１００４、１９８２）、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、サイトカラシンＢ、ダカルバジン、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ダウノルビシン、デカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エストロゲン、５-フルオロデオキシウリジン、エトポシドホスフェート（ＶＰ-１６）、５-フルオロウラシル、グラミシジンＤ、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン、メルファラン、６-メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルビジン、ストレプトゾトシン、テノポシド（ＶＭ-２６）、６-チオグアニン、チオＴＥＰＡ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びビノレルビンを含む。
【００９７】
特に適切な細胞毒性薬は、例えば、ドラスタチン（例えば、オーリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ）、ＤＮＡ副溝結合剤（例えば、エネジイン及びレキシトロプシン）、デュオカルマイシン、タキサン（例えば、パクリタキセル及びドセタキセル）、ピューロマイシン、ビンカアルカロイド、ＣＣ-１０６５、ＳＮ-３８（７-エチル-１０-ヒドロキシ-カンプトテシン）、トポテカン、モルホリノドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノドキソルビシン、エキノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エポチロールＡ及びＢ、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、メイタンシノイド、ディスコダーモライド、エルーテロビン、及びミトキサントロンを含む。
【００９８】
特定の実施態様において、細胞毒性薬は、例えば、ドキソルビシン、パクリタキセル、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキサート、マイトマイシンＣ又はエトポシドといった標準の化学療法薬である。さらに、ＣＣ-１０６５アナログ、カリケアミシン、メイタンシン、ドラスタチン１０のアナログ、リゾキシン及びパリトキシンといった強力な薬は、抗ＨＥＲ３発現抗体に連結可能である。
【００９９】
特異的変異において、細胞毒性薬又は細胞増殖抑制薬は、オーリスタチンＥ（当技術分野でドラスタチン-１０としても知られる）又はその誘導体である。一般的に、オーリスタチンＥ誘導体は、例えば、オーリスタチンＥ及びケト酸の間にエステルが形成されたものである。例えば、オーリスタチンＥをパラアセチル安息香酸又はベンゾイル吉草酸と反応させ、それぞれＡＥＢ及びＡＥＶＢを生成可能である。別の典型的なオーリスタチン誘導体は、ＡＦＰ（ジメチルバリン-バリン-ドライソロイシン-ドラプロリン-フェニルアラニン-パラ-フェニレンジアミン）、ＭＭＡＦ（ドバリン-バリン-ドライソロイシン-ドラプロリン-フェニルアラニン）、及びＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥ）を含む。オーリスタチンＥ及びその誘導体の合成及び構造は、米国特許公開ＵＳ２００３００８３２６３；国際特許公開ＷＯ２００２／０８８１７２及びＷＯ２００４／０１０９５７；及び米国特許ＵＳ６，８８４，８６９；６，３２３，３１５；６，２３９，１０４；６，０３４，０６５；５，７８０，５８８；５，６６５，８６０；５，６６３，１４９；５，６３５，４８３；５，５９９，９０２；５，５５４，７２５；５，５３０，０９７；５，５２１，２８４；５，５０４，１９１；５，４１０，０２４；５，１３８，０３６；５，０７６，９７３；４，９８６，９８８；４，９７８，７４４；４，８７９，２７８；４，８１６，４４４；及び４，４８６，４１４に記述されている。
【０１００】
別の変異においては、細胞毒性薬は、ＤＮＡ副溝結合剤である（例えば、ＵＳ６，１３０，２３７を参照。）。例えば、特定の実施態様において、副溝結合剤は、ＣＢＩ化合物である。別の実施態様においては、副溝結合剤は、エネジイン（例えば、カリケアミシン）である。
【０１０１】
特定の実施態様において、抗体医薬抱合体は、抗チューブリン剤を含む。抗チューブリン剤の例としては、例えば、タキサン（例えば、タキソール；登録商標（パクリタキセル）、タキソテール；登録商標（ドセタキセル））、Ｔ６７（ツラリク）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、及びビノレルビン）、及びドラスタチン（例えば、オーリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ）がある。その他の抗チューブリン剤には、例えば、バッカチン誘導体、タキサンアナログ（例えば、エポチロールＡ及びＢ）、ノコダゾール、コルヒチン及びコルシミド、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、ディスコダーモライド、及びエルーテロビンが含まれる。いくつかの実施態様においては、細胞毒性薬は、別の抗チューブリン剤群であるメイタンシノイドである。例えば、具体的な実施態様において、メイタンシノイドは、メイタンシン又はＤＭ-１である（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃ．；Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１２７-１３１、１９９２も参照）。
【０１０２】
別の実施態様においては、細胞毒性薬は、代謝拮抗薬である。代謝拮抗薬は、例えば、プリンアンタゴニスト（例えば、アザチオプリン又はミコフェノール酸モフェチル）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤（例えば、メトトレキサート）、アシクロビル、ガンシクロビル、ジドブジン、ビダラビン、リバビリン、アジドチミジン、シチジンアラビノシド、アマンタジン、ジデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、ポスカーネット、又はトリフルリジンであり得る。
【０１０３】
別の実施態様においては、抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体は、プロドラッグ変換酵素と抱合される。プロドラッグ変換酵素は、既知の方法を利用して、抗体に組換え技術によって融合又は化学的に抱合される。典型的なプロドラッグ変換酵素は、カルボキシペプチダーゼＧ２、β-グルクロニダーゼ、ペニシリン-Ｖ-アミダーゼ、ペニシリン-Ｇ-アミダーゼ、β-ラクタマーゼ、β-グルコシダーゼ、ニトロレダクターゼ及びカルボキシペプチダーゼＡである。
【０１０４】
治療薬をタンパク質、特に抗体に結合する技術は、よく知られている（例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８５）；  Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、”ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  （Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｉｋｅｒ、Ｉｎｃ．、２ｎｄ  ｅｄ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ、”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  '８４：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．、１９８５）；“Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｒｅｓｕｌｔｓ、ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８５）；Ｔｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９-５８．；及び国際特許公開ＷＯ８９／１２６２４を参照）。
【０１０５】
（診断用途）
本発明の更なる目的は、ＨＥＲ３発現を伴う癌の診断及び／又は観測のための本発明の抗ヒトＨＥＲ３抗体に関する。ＨＥＲ３発現を伴う癌は、一般的に、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵癌、グリア芽腫及び神経線維腫症といったグリア細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、黒色腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌及び様々な種類の頭頸部癌を含むが、これらに限定されるものではない。特定の実施態様において、本発明の方法を利用して診断された癌は、乳癌又は卵巣癌である。好ましい実施態様において、本発明の抗体は、乳癌及び卵巣癌を診断するのに有用である。
【０１０６】
好ましい実施態様において、本発明の抗体は、前述したように当技術分野で周知の蛍光分子、放射性分子又は別のいかなるラベルといった、検出可能分子又は物質で標識可能である。例えば、本発明の抗体は、当技術分野で知られるいかなる方法によっても放射性分子で標識可能である。例えば、放射性分子は、Ｉ１２３、Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８といったシンチグラフ検査用の放射性原子を含むが、これらに限定されるものではない。本発明の抗体は、ヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-Ｉｌｌ、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄といった、核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージングのためのスピンラベルでも標識可能である。抗体投与後に、抗体の分布が患者の体内で検出されるのである。いかなる特異的なラベルの分布を検出する方法も、当業者にとって既知であり、いかなる適切な方法も使用可能である。いくつかの例として、コンピューテッドトモグラフィー（ＣＴ）、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）、核磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、蛍光、化学発光及び超音波検査が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１０７】
本発明の抗体は、ＨＥＲ３発現を伴う癌の病期診断（例えば、放射性イメージング）に有用である可能性がある。例えば、本発明の抗体は、乳癌又は卵巣癌の病期診断に有用であり得る。本発明の抗体は、単独又はＨＥＲ２、ＣＡＩ２５、ＨＥＲ４及びメソテリンを含むがこれらに限定されない別の乳癌又は卵巣癌のマーカーとの併用で使用可能である。
【０１０８】
一般的に、前記診断方法は、患者から得た生体サンプルの使用に関する。ここで使用するように、「生体サンプル」という用語は、被験者から得た様々な種類のサンプルを含み、診断又は測定試験で利用可能である。生体サンプルは、血液及び別の生物由来の液体サンプル、生検標本又は組織培養又はそれら由来の細胞といった固形組織サンプル、及びその産物を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、生体サンプルは、ＨＥＲ３発現を伴う癌を持つ疑いがある個人から採取された組織サンプル、及び好ましい実施態様において乳房又は卵巣由来の細胞を含む。従って、生体サンプルは、臨床サンプル、培養細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生体液、及び組織サンプルを含む。
【０１０９】
特定の実施態様において、本発明は、本発明の抗体を使用して被験者由来の細胞上のＨＥＲ３を検出することによって、被験者のＨＥＲ３発現を伴う癌を診断する方法である。特に、前記診断方法は、以下の手順を含み得る。
【０１１０】
（ａ）本発明の抗体が、ＨＥＲ３を発現する生体サンプルの細胞と複合体を形成するのに十分な条件下で、ＨＥＲ３発現を伴う癌を患っている可能性がある被験者の生体サンプルと抗体を接触させる；
（ｂ）前記複合体を検出及び／又は定量化することによって、前記複合体の検出が、ＨＥＲ３発現を伴う癌の指標となる。
【０１１１】
癌を観測するために、本発明に準じた診断方法は、異なる時間間隔で繰り返され、抗体のサンプルへの結合が増加又は減少するか測定することによって癌が進行又は退行したかどうか判定される。
【０１１２】
（治療用途）
本発明の抗体、フラグメント又は免疫抱合体は、いかなるＨＥＲ３発現癌の治療においても有用である可能性がある。本発明の抗体は、単独又はいかなる適切な薬剤との併用でも使用可能である。
【０１１３】
ＨＥＲ３発現癌の例としては、上皮性悪性腫瘍、芽細胞種、非上皮性悪性腫瘍、及び白血病が含まれる。前記癌の更に特定の例としては、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵癌、グリア芽腫及び神経線維腫症といったグリア細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、黒色腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌及び様々な種類の頭頸部癌が含まれる。特定の実施態様において、本発明の方法を使用して治療される癌は、乳癌又は卵巣癌である。
【０１１４】
従って、本発明の目的は、本発明の抗体、フラグメント又は免疫抱合体を必要とする被験者への治療有効量の投与を含む、ＨＥＲ３発現を伴う癌の治療方法に関する。
【０１１５】
本発明の内容において、「処理」又は「治療」という用語は、ここで使用するように、疾患、又は前記用語が適用される状態、又は１つ又はより多くの前記疾患又は状態の症状の進行の反転、軽減、抑制、又はそれらの予防を意味する。
【０１１６】
本発明によれば、「患者」又は「それを必要とする患者」という用語は、ヒトＨＥＲ３の発現を伴う癌に冒された又は冒された可能性があるヒト又は非ヒト動物を対象としている。
【０１１７】
本発明の抗体の「治療有効量」は、いかなる薬物治療にも適用できる合理的なリスク対効果比で、前記癌を治療する抗体の十分量を意味する。しかし、当然のことながら、本発明の抗体及び成分の総１日投与量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されるであろう。いかなる特定の患者にも治療効果のある服用レベルは、治療されている疾患及び疾患感受性；使用される特異的な抗体の活性；使用される固有の成分、年齢、体重、総体的な健康、性別及び患者の食事；投与時間、投与経路、及び使用される特異的な抗体の排泄率；治療期間；使用される特異的な抗体と併用又は偶然同時に使用される薬物などの医療技術でよく知られる様々な要因に依存するであろう。当技術分野では、望ましい治療効果を達成するのに必要な量よりも低いレベルで化合物の投与を始め、望ましい効果が達成されるまで徐々に投与量を増加することがよく知られている。
【０１１８】
いくつかの実施態様において、抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体又は抗体医薬抱合体は、疾患又は障害の治療のための第２の薬物と併用される。癌の治療に使用される際、本発明の抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体又は抗体医薬抱合体は、例えば、外科手術、放射線治療、化学療法、又はそれらの組み合わせといった標準的な癌治療と併用される可能性がある。特定の態様においては、本発明に基づいた抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体又は抗体医薬抱合体との併用癌療法に有用な別の治療薬は、抗血管新生薬を含む。いくつかの態様において、本発明に基づいた抗体又は抗体医薬抱合体は、サイトカイン（例えば、抗腫瘍免疫反応を刺激するサイトカイン）と同時投与される。
【０１１９】
いくつかの別の態様において、併用療法に有用な別の治療薬は、例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、又はＨＥＲ４といった腫瘍増殖関与する特定因子のアンタゴニストを含む。
【０１２０】
好ましい実施態様において、本発明の抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体又は抗体医薬抱合体は、トラスツズマブ又はペルツズマブといった抗ヒトＨＥＲ２モノクローナル抗体と併用される。
【０１２１】
いくつかの実施態様において、抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体又は抗体医薬抱合体は、ここで記述されるように、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）と併用される。ＢＡＹ  ４３-９００６（ソラフェニブ、ネクサバール；登録商標）及びＳＵ１１２４８（スニチニブ、スーテント；登録商標）の２剤は、承認された前記ＴＫＩである。別のＴＫＩは、イマチニブメシル酸塩（グリベック；登録商標、ノバルティス）；ゲフィチニブ（イレッサ；登録商標、アストラゼネカ）；エルロチニブ塩酸塩（タルセバ；登録商標、ジェネンテック）；バンデタニブ（ザクティマ；登録商標、アストラゼネカ）、ティピファニブ（ザーネストラ；登録商標、ヤンセン・シラグ）；ダサチニブ（スプリセル；登録商標、ブリストルマイヤーズスクイブ）；ロナファニブ（サラサール；登録商標、シェリングプラウ）；  バタラニブコハク酸塩（ノバルティス、シェーリングアーゲー）；ラパチニブ（タイカーブ；登録商標、グラクソスミスクライン）；ニロチニブ（ノバルティス）；レスタウルチニブ（セファロン）；パゾパニブ塩酸塩（グラクソスミスクライン）；アキシチニブ（ファイザー）；カネルチニブ二塩酸塩（ファイザー）；ペリチニブ（国立がん研究所、ワイス）；タンヅチニブ（ミレニアム）；ボスチニブ（ワイス）；セマキサニブ（スーゲン、大鵬）；ＡＺＤ-２１７１（アストラゼネカ）；ＶＸ-６８０（メルク、バーテックス）；ＥＸＥＬ-０９９９（エグゼリキス）；ＡＲＲＹ-１４２８８６（アレイバイオファーマ、アストラゼネカ）；ＰＤ-０３２５９０１（ファイザー）；ＡＭＧ-７０６（アムジェン）；ＢＩＢＦ-１１２０（ベーリンガーインゲルハイム）；ＳＵ-６６６８（大鵬）；ＣＰ-５４７６３２（ＯＳＩ）；（ＡＥＥ-７８８（ノバルティス）；ＢＭＳ-５８２６６４（ブリストルマイヤーズスクイブ）；ＪＮＫ-４０１（セルジーン）；Ｒ-７８８（ライジェル）；ＡＺＤ-１１５２  ＨＱＰＡ（アストラゼネカ）；ＮＭ-３（ジェンザイムオンコロジー）；ＣＰ-８６８５９６（ファイザー）；ＢＭＳ-５９９６２６（ブリストルマイヤーズスクイブ）；ＰＴＣ-２９９（ＰＴＣセラピューティクス）；ＡＢＴ-８６９  （アボット）；ＥＸＥＬ-２８８０（エグゼリキス）；ＡＧ-０２４３２２（ファイザー）；ＸＬ-８２０（エグゼリキス）；ＯＳＩ-９３０（ＯＳＩ）；ＸＬ-１８４（エグゼリキス）；ＫＲＮ-９５１（キリンビール）；ＣＰ-７２４７１４（ＯＳＩ）；Ｅ-７０８０（エーザイ）；ＨＫＩ-２７２（ワイス）；ＣＨＩＲ-２５８（カイロン）；ＺＫ-３０４７０９（シェーリングアーゲー）；ＥＸＥＬ-７６４７（エグゼリキス）；ＢＡＹ-５７-９３５２（バイエル）；ＢＩＢＷ-２９９２（ベーリンガーインゲルハイム）；ＡＶ-４１２（ＡＶＥＯ）；ＹＮ-９６８Ｄ１（アドヴェンチェンラボラトリーズ）；ミドスタウリン（ノバルティス）；ペリフォシン（エテルナゼンタリス、ケリックス、国立がん研究所）；ＡＧ-０２４３２２（ファイザー）；ＡＺＤ-１１５２（アストラゼネカ）；ＯＮ-０１９１０Ｎａ（オンコノバ）；及びＡＺＤ-０５３０（アストラゼネカ）を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２２】
（医薬組成物）
投与を目的として、抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体又は抗体医薬抱合体は、医薬組成物として調製される。抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体又は抗体医薬抱合体を含む医薬組成物は、薬学的に有用な配合を調製するための既知の方法に従って調製可能であるため、治療用分子は、薬学的に許容可能な担体と混合される。ある組成物は、その投与を受容する患者によって許容される場合、「薬学的に許容可能な担体」と言われている。無菌のリン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に許容可能な担体の１つの例である。別の適切な担体は、当業者にとって周知のものである（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９ｔｈ  ｅｄ．１９９５）を参照。）。製剤設計は、更に、１つ又はより多くの賦形剤、防腐剤、可溶化剤、緩衝剤、薬瓶表面のタンパク質の損失を防ぐためのアルブミンなどを含む可能性がある。
【０１２３】
医薬組成物の剤形、投与経路、投与量及び投与計画は、当然ながら、患者の治療される状態、疾患重症度、年齢、体重、及び性別などに依存する。
【０１２４】
本発明の医薬組成物は、局所、経口、経鼻、静脈内、筋肉内、皮下又は眼内投与などを目的として製剤設計可能である。
【０１２５】
好ましくは、本発明の医薬組成物は、注入可能な製剤設計のための薬学的に許容可能な媒体を含む。これらは、特に、等浸透圧、無菌の食塩水（リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナトリウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム又は塩化マグネシウムなど又は前記塩の混合物）であり得るが、場合によっては、滅菌水又は生理食塩水の乾燥した、特に凍結乾燥した組成物を加えることによって、注射剤の組成が可能になる。
【０１２６】
投与量は、様々なパラメーター、特に投与方法、関連のある病態、又は望ましい投与期間に応じて調整可能である。
【０１２７】
医薬組成物を調製するために、有効量の抗体は、薬学的に許容可能な担体又は水媒体に溶解又は分散可能である。
【０１２８】
注射に用いる適切な医薬品形態は、無菌の水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油又は含水プロピレングリコールを含む製剤；及び無菌の注射剤又は分散剤の即時調製のための無菌粉末剤を含む。いかなる場合でも、形態は、無菌でなければならず、容易に注入できる程度に流動的でなければならない。また、製造及び保管状態において安定でなければならず、細菌及び菌類といった微生物の汚染から保護されなければならない。
【０１２９】
遊離塩基のような活性化合物の溶液又は薬学的に許容可能な塩は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と共に水中で適切に調製可能である。また、分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びその混合物及び油中で調製可能である。通常の保管及び使用条件下において、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含む。
【０１３０】
本発明の抗体は、中性又は塩形態で組成物内に配合可能である。薬学的に許容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）及び例えば、塩酸又はリン酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などといった無機酸で形成されるものを含む。また、遊離カルボキシル基で形成された塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化鉄といった無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどといった有機塩基由来であり得る。
【０１３１】
また、担体も、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールなど）、それらの安定的な混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散液であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散液の場合には所要の粒径の維持及び界面活性剤の使用によって維持できる。微生物の活動は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどといった様々な抗菌剤及び抗真菌剤によって防止される。多くの場合、例えば、砂糖又は塩化ナトリウムといった等張剤を含むことが望ましいであろう。注入可能な成分は、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンといった吸収を遅らせる薬剤の配合によって持続的に吸収できるようになる。
【０１３２】
無菌の注射剤は、所要量の活性化合物を、必要に応じて前述された様々な他の成分と共に適切な溶媒に含有させ、フィルター滅菌を行うことによって調製される。一般的に、分散液は、様々な無菌の活性成分を基礎の分散媒及び前述された所要の他の成分を含む無菌の媒体に含有させることによって調製される。無菌の注射剤を調製するための無菌の粉末剤の場合、好ましい調製方法は、事前にフィルター滅菌された溶液から、活性成分に加えてさらなる必要な成分の粉末も産出する真空乾燥及び凍結乾燥技術である。
【０１３３】
また、直接投与用のより多くの、又はより高濃度の溶液の調製も企図されるが、溶媒としてＤＭＳＯを使用することによって、高濃度の活性薬剤が小さな腫瘍領域に急速に浸透し、送達できるようになると予想される。
【０１３４】
製剤設計においては、溶液は、適合可能な剤形及び治療効果のある前記の投与量にて投与されるであろう。また、製剤は、前述の注射剤タイプといった様々な剤形で容易に投与されるが、薬剤放出カプセルなども使用可能である。
【０１３５】
水溶液の非経口投与のためには、例えば、その溶液は、必要であれば適切に緩衝すべきであり、希釈液は、まず十分な食塩水又はグルコースを用いて溶解すべきである。これらの特定の水溶液は、特に静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与及び腹腔内投与に適している。この関連において、使用可能な無菌の水溶液は、本開示を考慮する当業者にとって既知であろう。例えば、一回投与量は、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解可能であり、１０００ｍｌの皮下点滴液に加えられるか又は計画された点滴部位に注入される（例えば、"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１０３５-１０３８ページ及び１５７０-１５８０ページを参照）。多少の投与量の変動は、治療される被験者の状態に依存して必然的に起こるであろう。投与担当者は、いかなる場合でも、個々の被験者に対して適切な投与量を決定するであろう。
【０１３６】
本発明の抗体は、治療用混合物内に一回投与量あたり約０．０００１から１．０ミリグラム、又は約０．００１から０．１ミリグラム又は約０．１から１．０又は約１０ミリグラムを含むように調合される可能性がある。また、複数回投与も実施可能である。
【０１３７】
静脈内投与又は筋肉内投与といった非経口投与用に製剤設計された化合物に加えて、他の薬学的に許容可能な剤形は、錠剤又は他の経口用固形剤、徐放性カプセル、及び現在使用されているいかなる別の剤形も含む。
【０１３８】
特定の実施態様において、リポソーム及び／又はナノ粒子の使用が、抗体の宿主細胞への導入のために企図されている。リポソーム及び／又はナノ粒子の製剤及び使用は、当業者にとって既知である。
【０１３９】
ナノカプセルは、一般的に、化合物を安定的かつ再現可能な方法で補足可能である。細胞内の重合負荷による副作用を回避するために、前記の超微粒子（約０．１μｍの大きさ）は、一般的に、生体内で分解可能なポリマーを使用して設計される。これらの必要条件を満たす生分解性のポリアルキルシアノアクリル酸ナノ粒子は、本発明における使用が企図されており、前記粒子は容易に製造可能である。
【０１４０】
リポソームは、水媒体で分散されるリン脂質から形成され、自然に多重ラメラ同心状二層小胞（多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）とも称される）を形成する。ＭＬＶは、一般的に、直径２５ｎｍから４μｍである。ＭＬＶの超音波処理によって、直径２００から５００Aの範囲内で中核に水溶液を含む小単ラメラ小胞（ＳＵＶ）が形成される。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度及び二価陽イオンの存在に依存する。
【０１４１】
（キット）
最後に、本発明は、少なくとも１つの本発明の抗体を含むキットを提供する。本発明の抗体を含むキットによって、ＨＥＲ３の検出、又は治療的又は診断的試験における利用法が見出される。本発明のキットは、例えば、組織培養皿又はビーズ（例えば、セファロースビーズ）といった固形の担体に結合した抗体を含み得る。例えば、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロッティングといったＨＥＲ３の検出及び定量化のための抗体を含むキットが提供され得る。検出に有用な前記抗体は、蛍光又は放射性ラベルといった標識と共に提供される可能性がある。
【０１４２】
本発明は、添付の図面及び実施例によってより詳細に説明される。しかしながら、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでない。
【０１４３】
＜実施例１＞
−免疫によるマウスモノクローナル抗体の産生−
（Ｂａｌｂ／ｃの免疫及びハイブリドーマの作製）
ＨＥＲ３に対するモノクローナル抗体は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの連続免疫によって開発した。ＨＥＲ３-Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を抗原として使用した。第１群５匹のＢａｌｂ／ｃマウスに、第０日、１４日及び２８日に完全又は不完全フロイントアジュバント存在下で１０μｇの可溶性ＨＥＲ３-Ｆｃを皮下注射した。第２群５匹のＢａｌｂ／ｃマウスには、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３を遺伝子導入し、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体形成を促進するために事前にヘレグリン（ＨＲＧ）で刺激したＮＩＨ３Ｔ３細胞株（約２×１０６細胞）を腹腔内注射した。抗体反応を測定するために、抗体力価をＥＬＩＳＡ又はフローサイトメトリーによって測定した。既述のプロトコル（Ｓａｌｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２００４）に従って、免疫したマウス由来の脾臓細胞をミエローマＰＸ６３Ａｇ８．６５３と融合した。ハイブリドーマ選択用のＨＡＴ培地を用いて、プレート１ウェルあたり１０５個の融合細胞を培養した。融合して１２日後に、抗原としてＨＥＲ３-Ｆｃタンパク質を使用してＥＬＩＳＡによってハイブリドーマ培養上清のスクリーニングを行った。対照では、ＨＥＲ２-Ｆｃ及びＦｃフラグメントの抗原を区別して同時にスクリーニングが実施されるであろう。
【０１４４】
図１Ａに示すように、１３のＨＥＲ３特異モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を選択した。それらの抗体は、可溶性ＨＥＲ３-Ｆｃに特異的であるが、Ｆｃ部分は認識しない。４つの抗ＨＥＲ３抗体は、ＨＥＲ３-Ｆｃで免疫したＢａｌｂ／ｃマウスから選択し、９つの抗ＨＥＲ３抗体は、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３を遺伝子導入しヘレグリンで刺激したＮＩＨ３Ｔ３細胞株で免疫したＢａｌｂ／ｃマウスから選択した。ＨＥＲ２-Ｆｃ抗原への結合は、観測されなかった。
【０１４５】
選択した抗ＨＥＲ３抗体を他の２つの抗ＨＥＲ３抗体Ａｂ６（メリマック・ファーマシューティカルズ）及びＵ１-５９（アムジェン／ユースリーファーマ-第一三共）と比較した。Ｕ１-５９及びＡｂ６は、それぞれＵＳ２００８／０１２４３４５Ａ１及びＵＳ２００９／０２９１０８５Ａ１の特許における配列情報の開示に基づいて作製した。
【０１４６】
マウスＨＥＲ３受容体との交差反応性は、２５０ｎｇ／ｍｌで固定化したヒトＨＥＲ３-Ｆｃ及びマウスＨＥＲ３-Ｆｃ（組み換えマウス細胞外ドメインＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３  Ｆｃキメラ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＥＬＩＳＡによって比較検討した。殆どの本発明のクローンは、１μｇ／ｍｌの濃度では、マウスＨＥＲ３と交差反応しなかった（図１Ｂ）が、Ａｂ６抗体は、マウス及びヒトＨＥＲ３どちらも認識した。９Ｆ７-Ｆ１１及び１６Ｄ３-Ｃ１クローンが、最も良く結合した。無関連対照抗体Ｐｘは、ヒト及びマウスＨＥＲ３受容体のどちらにも結合しなかった。
【０１４７】
（ＨＥＲ３結合ＥＬＩＳＡ）
１６０ｍＭ、ｐＨ７．２のＰＢＳに２５０ｎｇ／ｍｌの濃度で希釈したＨＥＲ３-Ｆｃ抗原を用いて９６ウェル酵素免疫測定プレート（Ｎｕｎｃ、ペイズリー、ＵＫ）をコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む１６０ｍＭ、ｐＨ７．２のＰＢＳ（ＰＢＳ-Ｔ）を用いて４回洗浄した後、プレートをＰＢＳ-Ｔ緩衝液に１％で希釈したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて３７℃で６０分間浸した。ＰＢＳ-Ｔを用いて４回洗浄した後、２倍段階希釈した精製ＨＥＲ-３特異ｍＡｂを加え、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳ-Ｔを用いて４回洗浄した後、ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）１００ｕｌをそれぞれのウェルに加えた。その複合体は、ＰＢＳ-Ｔ-１％ＢＳＡに１：２０００で希釈して使用した。プレートを３７℃で６０分間インキュベートした後、ＰＢＳ-Ｔで４回洗浄した。最後に、オルト-フェニレンジアミン溶液（Ｓｉｇｍａ）を加えて室温暗所で３０分間インキュベートした後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。抗ＨＥＲ３ｍＡｂは、濃度依存的に、ＨＥＲ３抗原と特異的に反応した。１６Ｄ３-Ｃ１、９Ｆ７-Ｆ１１、１５Ｄ４-Ｆ２及び２３Ｈ２-Ｂ３抗体が、最も反応性が高かった（図２Ａ）。対照的に、Ａｂ６及びＵ１-５９抗体は、ＨＥＲ３受容体との結合反応性が最も低かった。５０％の吸光度を得た抗体濃度は、１６Ｄ３-Ｃ１、９Ｆ７-Ｆ１１、１５Ｄ４-Ｆ２及び２３Ｈ２-Ｂ３抗体では１-１０ｎｇ／ｍｌ以下であったのに対し、Ａｂ６及びＵ１-５９抗体は、約２００ｎｇ／ｍｌで５０％のシグナルを示した。全てのＨＥＲ３特異抗体は、腹水で産生され、プロテインＡ免疫アフィニティーによって精製した（図２Ｂ）。
【０１４８】
（ＨＥＲ３陽性細胞のフローサイトメトリー解析）
ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３及びＥＧＦＲ／ＨＥＲ４を遺伝子導入したＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞（１０６細胞）をＰＢＳ-０．１％ＢＳＡ中で抗ＨＥＲ３ｍＡｂと共に４℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ-０．１％ＢＳＡで３回洗浄した後、細胞をフルオレセイン結合抗マウスＩｇＧ（１：５０）（Ｓｉｇｍａ）と共に４℃、暗所で４５分間インキュベートした。細胞を３回洗浄した後、ＥＰＩＣＳフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ-Ｃｏｕｌｔｅｒ、フラートン、カリフォルニア州）を用いた解析のためにＰＢＳに懸濁した。図３に示すように、全てのＨＥＲ３特異ｍＡｂは、ＨＥＲ３及びＨＥＲ２／ＨＥＲ３を遺伝子導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞に結合したが、野生型、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、及びＥＧＦＲ／ＨＥＲ４を遺伝子導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞には結合しなかった。ＨＥＲ２／ＨＥＲ３を遺伝子導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞への結合性（幾何平均）は、Ａｂ６及びＵ１-５９抗体よりも９Ｂ４-Ｄ６、１２Ｈ８-Ｂ１１、１５Ｄ４-Ｆ２及び１６Ｄ３-Ｃ１抗体が高かった。
【０１４９】
（ＢＩＡＣＯＲＥによる親和性測定）
選択した抗体のＨＥＲ３結合性は、ＢＩＡＣＯＲＥ解析によって確認した（図４）。ＢＩＡＣＯＲＥ解析は、モンペリエのがん研究機関（ＰＰ２Ｉプラットフォーム、Ｍ．Ｐｕｇｎｉｅｒｅ）にある相互作用分析施設を利用して実施した。選択した抗体へのＨＥＲ３受容体の結合反応動力学定数は、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）を用いた表面プラズモン共鳴解析によって、２５℃で測定した。ＨＥＲ３特異抗体は、ラビット抗マウスポリクローナル補足抗体（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてＣＭ５センサーチップ表面に固定した。補足抗体は、使用説明書に従って固定した。１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ＨＥＲ３受容体を含むＨＢＳ-ＥＰ緩衝液及び０．００５％非イオン性界面活性剤Ｐ２０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を５０μｇ／ｍｌの濃度でフローセルに注入し、相分離と１０ｍＭ塩酸水溶液を用いた再生手順を行った（図４）。流速は、５０μｌ／ｍｉｎとした。全てのセンサーグラムは、対照のフローセルシグナルを差し引くことで補正した。データは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１．１ソフトウェアを用いて、全体的にｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎａｌｙｔｅモデルとして適用した（図４）。選択した抗体の結合定数（Ｋａ）は、Ａｂ６抗体の解離定数と極めて類似した約１ｘ１０５  Ｍ-１ｓ-１に分布した（表１）。対照的に、それぞれの抗体の解離定数は、顕著に異なるＫＤ値を説明できる変数であった。１６Ｄ３-Ｃ１、１２Ｈ８-Ｂ１１及び９Ｆ７-Ｆ１１抗体は、Ａｂ６抗体の測定値と同様に、１-５ｎＭの範囲で最も良い親和性を示した。
【０１５０】
【表１】
2014516960.tif 000002
【０１５１】
（ヘレグリンとの競合）
ＳＫＢＲ３細胞に基づく試験において、ＨＥＲ３と抗体の結合に対するＨＲＧの阻害能を定量化するためにサイトメトリー競合実験を実施した。この目的を達成するために、１０５個のＳＫＢＲ３細胞を様々な濃度の競合するＨＲＧリガンドと共に氷上で１．５時間プレインキュベートした。ＰＢＳ-１％ＢＳＡを用いて１回洗浄した後、抗ＨＥＲ３ｍＡｂを最大値の５０％の結合を示す濃度でそれぞれのウェルに加え、氷上で１時間インキュベートした。いくつかの態様においては、ＨＲＧリガンド及び抗ＨＥＲ３抗体を氷上で２時間共にインキュベートした。細胞を洗浄した後、更に１：６０で希釈した適切なＦＩＴＣ結合２次抗体（Ｓｉｇｍａ）と共に氷上で４５分間インキュベートし、Ｑｕａｎｔａ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ-Ｃｏｕｌｔｅｒ）によってサイトメトリー解析を行った。ＦＡＣＳによる競合実験により、９Ｆ７-Ｆ１１抗体は、ヘレグリンと競合しないことが証明され、従って、この抗体は、ＨＲＧ結合部位に結合しないことが示唆された（図５）。９Ｆ７-Ｆ１１抗体の結合性は、ＨＲＧを加えることによってさらに亢進したのに対し、陽性対照抗体Ａの結合性は、ＨＲＧとのインキュベーションによって改善しなかった。対照的に、１２Ｈ８-Ｂ１１及び１６Ｄ３-Ｃ１抗体は、陽性対照抗体Ｂ及びＣと同様に、ＨＥＲ３受容体に対してＨＲＧ依存性の結合減少を示したため、これらの抗体によって認識されるエピトープは、ＨＲＧ結合部位に位置するか又は近接している、又はＨＲＧが活性ＨＥＲ３受容体の二量体化への構造変化を誘導する際に抗体結合に対する立体障害が起こり得ることが証明された（図５）。結合の５０％阻害濃度は、１２Ｈ８-Ｂ１１及び１６Ｄ３-Ｃ１抗体に対してＨＲＧリガンド約２．５ｎＭである。同様の結果が、抗体とＨＲＧを連続又は同時にインキュベートすることによって得られた。
【０１５２】
＜実施例２＞
−本発明の抗ＨＥＲ３抗体によるＨＥＲ２及びＨＥＲ３のリン酸化の抑制−
（遺伝子導入したＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞のＨＲＧ刺激）
総計８×１０４個のＨＥＲ２／ＨＥＲ３を遺伝子導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞をＲＰＭＩ-５％ＦＣＳ中で７２時間、ＲＰＭＩ-１％ＦＣＳ中で更に２４時間６ウェルプレートで培養した。その後、細胞をＲＰＭＩ-１％ＦＣＳ中に２０μｇ／ｍｌの濃度で希釈したＨＥＲ３特異マウスｍＡｂと共に３７℃で１時間インキュベートした。抗体を除去した後、抗体を処理した細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＨＲＧ溶液と共に３７℃で１０分間インキュベートすることによってリガンド刺激を実施した。冷却したＤｕｌｂｅｃｃｏ-ＰＢＳ（Ｄ-ＰＢＳ）で洗浄した後、細胞を０．５ｍｌの冷却したＤ-ＰＢＳ中でラバーポリスマンを用いてプラスチックディッシュから２回掻き取った。１１０００ｇで１分間遠心分離した後、細胞ペレットを５０μｌの２０ｍＭトリス  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％トリトンＸ-１００  （ｖ／ｖ）、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）、１００ｍＭフッ化ナトリウム、０．１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、及び全てのプロテアーゼ阻害剤混合錠剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、メイラン、フランス）を含む細胞溶解緩衝液に溶解した。３０分間インキュベートした後、遠心分離によってサンプルから不溶画分を除去し、細胞溶解液中のタンパク質濃度をブラッドフォード比色反応によって測定した。
【０１５３】
（ＨＥＲ２／ＨＥＲ３を遺伝子導入したＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞におけるＨＥＲ２及びＨＥＲ３の全体のリン酸化のＥＬＩＳＡ測定）
細胞溶解液中のチロシンリン酸化されたＨＥＲ２及びＨＥＲ３は、製造業者によって記述されたように、ＤｕｏＳｅｔ（登録商標）サンドイッチＥＬＩＳＡ（ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）を用いて定量化した。図６及び図７に示すように、１６Ｄ３-Ｃ１及び９Ｂ４-Ｄ６ｍＡｂは、対照のトラスツズマブと同様に、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３の全体のリン酸化を抑制した。９Ｆ７-Ｆ１１及び２４Ｅ３-Ｃ１０ｍＡｂは、ＨＥＲ２のリン酸化を阻害した。
【０１５４】
（ＨＥＲ２／ＨＥＲ３を遺伝子導入したＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞におけるＨＥＲ３のＹ１２６２及びＹ１２８９リン酸化に対するＨＥＲ２のＹ１１１２及びＹ１１９６リン酸化のＰＡＧＥ-ＳＤＳ及びウエスタンブロット解析）
還元性条件下で７％ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって電気泳動を行った後、細胞溶解物を二フッ化ポリビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、モルスアイム、フランス）に転写し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び５％脱脂粉乳を含む２５ｍＭ  トリスｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液（ＴＮＴ）に室温で１時間浸した。その後、ＴＮＴ-５％ＢＳＡに希釈したＨＥＲ２のリン酸化Ｙ１１１２に対する抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）又はＹ１１９６に対する抗体（ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、及びＨＥＲ３のリン酸化Ｙ１２６２に対する抗体（ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）又はＹ１２８９に対する抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の１μｇ／ｍｌ溶液に４℃で１８時間浸した。ＴＮＴ中で５回洗浄後、化学発光基質（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｐｌｕｓ-ＥＣＬ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いてブロットを可視化した。図８Ａ及び８Ｂのウエスタンブロットに示すように、１６Ｄ３-Ｃ１及び９Ｂ４-Ｄ６ｍＡｂは、対照のトラスツズマブと同様に、ＨＥＲ２のＹ１１９６及びＹ１１１２リン酸化及びＨＥＲ３のＹ１２６２及びＹ１２８９リン酸化を阻害した。
【０１５５】
（ＢｘＰＣ３膵癌細胞におけるＨＥＲ３受容体のリン酸化及び内在化の阻害）
５００及び１０００個のＢｘＰＣ３腫瘍細胞を６ウェル培養プレートに加え、３７℃で２４時間培養した。１％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ完全培地中で１６時間血清飢餓状態にし、更に洗浄した後、細胞を５０μｇ／ｍｌの１６Ｄ３-Ｃ１及び９Ｆ７-Ｆ１１抗体、又は陰性対照抗体と３７℃で１５分間プレインキュベートし、洗浄後に１００ｎｇ／ｍｌに希釈したヘレグリン有り又は無しの条件下で刺激した。その後、細胞を洗浄し、２０ｍＭ  トリス塩酸  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％トリトン、１０％グリセロール、１００ｍＭ  フッ化ナトリウム、０．１ｍＭ  フッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭ  オルトバナジウム酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び全てのプロテアーゼ阻害剤混合錠剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、インディアナポリス、インディアナ州）を含む緩衝液を用いて細胞を掻き取り溶解した。３０分間のインキュベーション後、遠心分離によってサンプルから不溶画分を除去し、細胞溶解液中のタンパク質濃度をブラッドフォード試験によって測定した。これらのタンパク質溶解液をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液と直接混合し（標的及び細胞株によって１-２０μｇの総タンパク量）、９５℃で５分間加熱した。還元性条件下で７％ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって電気泳動を行った後、タンパク質を二フッ化ポリビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写し、５％脱脂粉乳を含むＴＮＴ緩衝液（トリス  ２５ｍＭ  ｐＨ７．４、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ０．１％）に２５℃で１時間浸した。その後、受容体キナーゼ又はシグナル伝達キナーゼ、及びそれらのリン酸化型に対する１次抗体をＴＮＴ-５％ＢＳＡ緩衝液中にて４℃で１８時間インキュベートした。ＴＮＴ緩衝液中で５回洗浄後、ペルオキシダーゼ結合ラビット、ヒツジ又はマウスポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）を必要に応じて５％脱脂粉乳を含むＴＮＴ緩衝液に加え、２５℃で１時間浸した。ＴＮＴ緩衝液中で５回洗浄後、化学発光基質（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｐｌｕｓ-ＥＣＬ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いてブロットを可視化した。
【０１５６】
著しく、１６Ｄ３-Ｃ１及び９Ｆ７-Ｆ１１抗体は、リガンド誘導性のＨＥＲ３のＹ１２８９及びＹ１２６２残基のリン酸化を阻害した（図９）；９Ｆ７-Ｆ１１抗体が最も効果的な抗体である。それに付随して、ＢｘＰＣ３細胞におけるＡｋｔのＳｅｒ４７３及びＴｈｒ３０８のリン酸化も１６Ｄ３-Ｃ１及び９Ｆ７-Ｆ１１抗体の１５分の短時間処理によって抑制されることが示された。また、例えば、タンパク質の合成を減少させるＳ６リボソームタンパク質のリン酸化の抑制、アポトーシス及び細胞周期停止を誘導する遺伝子の核転写を促進するＦｏｘＯ１ａのリン酸化の抑制、ｐ５３の分解を阻害するリン酸化ＭＤＭ２の減少、及び細胞周期を阻害しアポトーシスを促進するリン酸化ＧＳＫ３α／βの抑制といったＡＫＴのリン酸化によって誘導される下流のシグナルも選択した抗体によって影響を受けた（図９）。
【０１５７】
ＢｘＰＣ３細胞に９Ｆ７-Ｆ１１及び１６Ｄ３-Ｃ１抗体を異なる時間と温度で暴露した後、ＨＥＲ３受容体の細胞膜上の発現を解析した。図１０Ａに示すように、ＢｘＰＣ３細胞と抗体を３７℃で２時間インキュベートすると、ＨＥＲ３の細胞膜上の発現は、単調減少した。前記抗体誘導性のＨＥＲ３のダウンレギュレーションは、細胞に４℃で処理した際には起こらなかったため、ＨＥＲ３特異抗体９Ｆ７-Ｆ１１及び１６Ｄ３-Ｃ１は、ＨＥＲ３の内在化を誘導することが証明された。対照的に、ＢｘＰＣ３細胞をＡｂ６抗体で処理した際には、ＨＥＲ３の内在化は、低下した（図１０Ａ）。ＨＥＲ３の内在化を定量化することによって、１６Ｄ３-Ｃ１及び９Ｆ７-Ｆ１１抗体は、Ａｂ６抗体よりも効率良くＨＥＲ３の内在化を誘導することが確認された（図１０Ｂ）。抗体の２時間処理によって、１６Ｄ３-Ｃ１及び９Ｆ７-Ｆ１１抗体は、それぞれ７３％及び７８％のＨＥＲ３内在化を誘導したが、Ａｂ６抗体は、４２％しか内在化を誘導しなかった（図１０Ｂ）。
【０１５８】
＜実施例３＞
−細胞増殖の抑制−
総計１０４個のＨＥＲ２／ＨＥＲ３を遺伝子導入したＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を９６ウェルプレート中で、ＤＭＥＭ完全培地を用いて２４時間培養した。その後、細胞を最終濃度１００μｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ３抗体と３７℃で５日間インキュベートした。増殖は、テトラゾリウム化合物ＭＴＳ［３-（４、５-ジメチルチアゾール-２-イル）-５-（３-カルボキシメトキシフェニル）-２-（４-スルホフェニル）-２Ｈ-テトラゾリウム］及び電子結合試薬ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）を含む溶液を４０μｌ／ウェルで加えることによって測定した。ＭＴＳは、細胞によって組織培養培地に可溶性のホルマザン産物に還元される。ホルマザンの４９０ｎｍにおける吸光度は、分光光度計を用いて測定可能である。図１１に示すように、１６Ｄ３-Ｃ１及び９Ｆ７-Ｆ１１ｍＡｂは、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３を遺伝子導入したＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞の増殖をそれぞれ２３．７％及び３２．０％抑制した。他のＨＥＲ３特異抗体では、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３を遺伝子導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞の有意な増殖抑制は、観察されなかった。さらに、１６Ｄ３-Ｃ１及び９Ｆ７-Ｆ１１は、Ａ４３１扁平上皮癌、乳癌細胞株ＭＣＦ７及びＭＤＡ-ＭＢ３６１、初期の腹水１（クローンＡ５）及び２（クローンＣ９）由来の上皮性卵巣腫瘍、転移癌２８１５、及びＯＶＣＡＲ３及びＳＫＯＶ３細胞株の増殖を抑制した。乳癌細胞株Ｔ４７Ｄ、及びＡ５４９肺癌の増殖は、９Ｆ７-Ｆ１１ｍＡｂ単独で抑制された。
【０１５９】
＜実施例４＞
−時間分解-蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ-ＦＲＥＴ）による抗体誘導性のＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体化抑制の測定−
試験は、それぞれＬｕｍｉ４-テルビウムクリプタート及びＤ２アクセプター染料（Ｃｉｓｂｉｏ  Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）で標識された抗ＨＥＲ２（ＦＲＰ５）及び抗ＨＥＲ３（１５Ｄ４-Ｆ２）を用いて接着細胞上で実施した。これらのｍＡｂは、熟慮の上、興味のあるｍＡｂと異なるエピトープを標的とするために選択した。ＨＥＲ２／ＨＥＲ３を遺伝子導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞を、滅菌した９６ウェル黒色マイクロプレートに１ウェルあたり３ｘ１０５個で播種し、１０％ウシ胎仔血清を補完したＤＭＥＭ培地（フェノールレッド無し）中で２４時間培養した。それらの細胞に、様々な濃度のＨＥＲ３特異マウスｍＡｂを３７℃で３０分間処理した。ＫＲＥＢＳ緩衝液で洗浄した後、細胞を１０％ホルマリン（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）で２分間固定し、ＫＲＥＢＳで一回洗浄した。ＫＲＥＢＳに希釈した標識抗体（それぞれ５ｎＭ）と共に３７℃で６時間インキュベーション後、ＫＲＥＢＳ緩衝液で細胞を４回洗浄した。Ｌｕｍｉ４-テルビウム及びＤ２の蛍光は、Ｐｈｅｒａｓｔａｒ  ＦＳ装置を用いて３３７ｎｍで励起し、それぞれ６２０及び６６５ｎｍ（６０μｓディレイ、４００μｓインテグレーション）で測定した。ＫＲＥＢＳ中のＬｕｍｉ４-テルビウム標識抗体の段階希釈液を同じマイクロタイタープレート上で同時に測定し、６２０ｎｍの蛍光に対する６６５ｎｍの蛍光をプロットした。結果として得られた曲線は、サンプルの６２０ｎｍの蛍光（Ｅ６２０）を用いてテルビウム（Ｅ６６５Ｔｂ）から６６５ｎｍの寄与を計算するのに使用した。ＴＲ-ＦＲＥＴのシグナルは、Δ６６５（％）＝Δ６６５／６６５Ｔｂ、また、Δ６６５＝Ｅ６６５ｃ  -Ｅ６６５Ｔｂとして示した；サンプル由来の６６５ｎｍ及び６２０ｎｍ蛍光は、Ｅ６６５ｃ＝Ｅ６６５ｓａｍｐｌｅ-Ｅ６６５ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ及びＥ６２０ｃ＝Ｅ６２０ｓａｍｐｌｅ-Ｅ６２０ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄのように、バックグラウンドから補正した。Ｅ６６５ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ及びＥ６２０ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄは、読み込み緩衝液のみが入ったブランクで測定した。ＴＲ-ＦＲＥＴのシグナルは、Δ６６５（％）がＨＥＲ２／ＨＥＲ３二量体の量を示すように表現した。６２０ｎｍの時間分解蛍光放射は、ＨＥＲ２の量と相関する。同時に、ＨＥＲ３受容体を定量化するために、Ｄ２の急速な蛍光を６２０ｎｍで励起して６７０ｎｍで測定した。それぞれのサンプルにおいて、未処理の細胞又は無関連の抗体、トラスツズマブ及びペルツズマブを処理した細胞を用いて同じ実験を実施することによって対照を得た。図１２に示すように、１６Ｄ３-Ｃ１、２４Ｅ３-Ｃ１０及び９Ｆ７-Ｆ１１ｍＡｂは、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体化を濃度依存的に抑制したのに対し、他の抗体（特に１２Ｈ８-Ｂ１１）は抑制しなかった。無関連の抗体による阻害は、観察されなかった。トラスツズマブと同様に、ペルツズマブは、二量体阻害を強く誘導した。
【０１６０】
＜実施例５＞
−抗ＨＥＲ３抗体のエピトープマッピング−
メンブレンは、アビメド社（ランゲンフェルト、ドイツ）から入手した。また、Ｆｏｍｃアミノ酸及びＮ-ヒドロキシベンゾトリアゾールはノバビオケム社（レウフェルフィンゲン、スイス）から入手した。ＡＳＰ２２２ロボット（Ａｂｉｍｅｄ）をカップリング段階で使用した。ＨＥＲ３受容体の細胞外ドメインに相当する、１残基ずつフレームシフトした２１３の重複するドデカペプチドをセルロースメンブレン上で合成した。全てのペプチドは、Ｎ末端でアセチル化した。ペプチド配列を構築した後、トリフルオロ酢酸処理によって側鎖保護基を除去した。ＴＢＳ緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、  ５０ｍＭ  トリス）中で３回洗浄後、メンブレンを２％セミスキムミルク及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ緩衝液（ＴＢＳ-Ｔ）に４℃で１８時間浸した。ＴＢＳ-Ｔで１回洗浄した後、１μｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ３ｍＡｂである１６Ｄ３-Ｃ１及び９Ｆ７-Ｆ１１溶液をメンブレンに加えて、３７℃で１時間３０分インキュベートした。結合した抗体は、ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、米国）の１：２０００希釈溶液中に３７℃で１時間メンブレンをインキュベートし、電気化学発光暴露することによって検出した。１６Ｄ３-Ｃ１ｍＡｂが１１１-１２９領域を認識した（図１３Ａ）のに対し、９Ｆ７-Ｆ１１ｍＡｂは、３５-５３領域に結合した（図１４Ａ）；これらの２つの領域は、ＨＥＲ３受容体のＤ１ドメインに位置している。
【０１６１】
これらの抗体によって認識されるエピトープを正確に同定するために、スポットアラニンスキャニングを実施した。図１３Ａ及び１３Ｂで同定した抗体の免疫活性アミノ酸配列に対応する１２のペンタデカペプチド、及びそれぞれのペプチドの１５のアラニンアナログをスポット法によって合成した。セルロース結合ペプチドの抗体反応性は、前述したものと同様に測定した。スポットの反応性は、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  １．４４（http://rsbweb.nih.gov/ij）を用いたメンブレンのスキャニング及びスポットの明暗度の測定によって評価した。１６Ｄ３-Ｃ１及び９Ｆ７-Ｆ１１ｍＡｂによって認識されるＨＥＲ３エピトープに含まれるスポット寄与残基（ＳＣＲ）は、非修飾ペプチド配列の抗体結合能の２０％と同等又はそれを超えて低下した抗体結合能に基づいて同定した。ＨＥＲ３／Ｄ１ドメイン由来の１１１ＡＬＲＱＬＲＬＴＱＬＴＥＩＬＳ１２５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、１１２ＬＲＱＬＲＬＴＱＬＴＥＩＬＳＧ１２６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、１１３ＲＱＬＲＬＴＱＬＴＥＩＬＳＧＧ１２７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、１１４ＱＬＲＬＴＱＬＴＥＩＬＳＧＧＶ１２８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）及び１１５ＬＲＬＴＱＬＴＥＩＬＳＧＧＶＹ１２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）５つのペンタデカペプチド（図１３Ｂ）の研究により、１６Ｄ３-Ｃ１ｍＡｂの結合モチーフとして１１２Ｌ―ＬＴ―ＬＴＥＩＬＳ１２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を同定し、Ｌｅｕ１２０、Ｇｌｕ１２２、Ｉｌｅ１２３及びＬｅｕ１２４が主要なＳＣＲであると同定した（図１３Ｃ）。抗ＨＥＲ３抗体９Ｆ７-Ｆ１１は、ＨＥＲ３／Ｄ１ドメインのモチーフ４４ＬＥＩＶＬ４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）を認識し、その中のＬｅｕ４４、Ｉｌｅ４６及びＬｅｕ４８がＳＣＲとして同定された（図１４Ｃ）。
【０１６２】
リガンド非結合のＨＥＲ３受容体の結晶構造（ｐｄｂ  １Ｍ６Ｂ）を基に、１６Ｄ３-Ｃ１及び９Ｆ７-Ｆ１１抗体の結合モチーフ由来のＳＣＲのポジショニングを実施した（図１５、左）。９Ｆ７-Ｆ１１のエピトープである４４ＬＥＩＶＬ４８は、ドメイン３に６０Åの距離で面し、Ｄ２ドメインに覆いかぶさって、ドメイン１の開始点の突出したβストランドの１つに重なっていた。１６Ｄ３-Ｃ１結合モチーフは、Ｄ１ドメインのβストランド構造の内側により深く位置していた。配列相同性によって、ＨＥＲ３特異抗体１６Ｄ３-Ｃ１及び９Ｆ７-Ｆ１１によって認識されるエピトープを、ペルツズマブに結合したＨＥＲ２受容体の結晶構造（ｐｄｂ  １Ｓ７８）と重ね合わせた（図１５、右）。
【０１６３】
＜実施例６＞
−異種移植腫瘍研究−
胸腺を欠損した、６から８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃヌードマウスは、ジャンヴィエ及びチャールズリバーラボラトリーズから購入した。ＨＥＲ２-非増幅／ＰＩＫ３ＣＡ-ｗｔ／ｐ５３-ｍｕｔ  Ａ４３１扁平上皮癌細胞（１ｘ１０６）、ＨＥＲ２-非増幅／ＰＩＫ３ＣＡ-ｗｔ／ｐ５３-ｗｔ  ＢｘＰＣ３膵臓癌細胞（３．５ｘ１０６）及びＨＥＲ２-非増幅／ＰＩＫ３ＣＡ-ｗｔ／ｐ５３-ｗｔ  Ａ５４９肺癌細胞（５ｘ１０６）を胸腺欠損ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右脇腹に皮下注射した。それらはいずれも低レベルでＨＥＲ３受容体を発現していた（１００００から２００００受容体／細胞）。加えて、Ａ４３１及びＡ５４９癌細胞は、ＨＲＧ３リガンドであるＨＲＧを分泌し、ＨＲＧ依存性である（Ｙｏｎｅｓａｋａ、２０１１、Ｚｈｏｕ  ２００６）。
【０１６４】
全てのｉｎ  ｖｉｖｏ実験は、フランス実験動物研究ガイドラインに従って実施した（Ａｇｒｅｅｍｅｎｔ  ｎｏ．Ｂ３４-１７２-２７）。
【０１６５】
腫瘍が約１００ｍｍ３に達した時に、担癌マウスを異なる治療群に無作為に分けた。そのマウスに、担体（ＰＢＳ）に対して、ＨＥＲ３特異抗体１６Ｄ３-Ｃ１又は９Ｆ７-Ｆ１１を腹腔内注射によって処理した。抗体の注入量は、３００μｇ／注射で、週３回（Ｑ２ｄ、１５ｍｇ／ｋｇ）、６週間投与とした。腫瘍の寸法は、測径器を用いて週２回測定し、Ｄ１ｘＤ２ｘＤ３／２の算出式によって計算した。腫瘍進行は、［（最終体積）-（初期体積）］／（初期体積）の算出式を用いて計算した。結果は、腫瘍が規定の最終体積２０００ｍｍ３に達するのに要した時間を用いて、カプランマイヤー曲線によっても示した。平均遅延時間は、５０％のマウスの腫瘍が規定体積に達した時間と定義した。
【０１６６】
Ａ４３１癌細胞は、ＨＥＲ３リガンドであるＨＧＲを分泌し（Ｙｏｎｅｓａｋａ、２０１１）、細胞あたり１７０００個のＨＥＲ３受容体を発現した。移植後３１日目（治療開始後２０日に相当）に、抗ＨＥＲ３ｍＡｂは、担体対照群に比べて、Ａ４３１癌細胞を移植されたマウスの約５３±６％の腫瘍増殖を有意に抑制した（図１６Ａ；ｐ＜０．００１）。実験の最終日（１２０日）において、１６Ｄ３-Ｃ１及び９Ｆ７-Ｆ１１ｍＡｂによって治療されたそれぞれの群のマウス８匹のうち１匹が治癒し、２１日間の５０％平均生存期間が遅延した（図１６Ｂ）。
【０１６７】
図１７Ａに示すように、担体を用いて治療したマウスで測定した腫瘍の大きさと比較して、腫瘍移植後５６日目（抗体治療開始後２６日に相当）に抗体治療を実施したマウスにおいてＢｘＰＣ３膵臓腫瘍増殖の６８±４％の有意な減少を観察した（ｐ＜０．００１）。実験の最終日（１３５日）において、カプランマイヤー解析により、抗ＨＥＲ３ｍＡｂである９Ｆ７-Ｆ１１を用いて治療したＢｘＰＣ３膵臓腫瘍移植マウスの５０％平均生存期間が１８日間遅延したことが明らかとなった（図１７Ｂ）。さらに、ＨＥＲ３特異ｍＡｂである１６Ｄ３-Ｃ１では、ＨＥＲ２-非増幅／ＰＩＫ３ＣＡ-ｗｔＢｘＰＣ３膵臓腫瘍細胞を移植したマウスの生存期間がより長期の２４日間遅延し、８匹中１匹は完治した。この場合（図１８）、１６Ｄ３-Ｃ１処理マウスから摘出した腫瘍においては、担体処理マウスから摘出した腫瘍と比較して、ＨＥＲ３のＹ１２８９リン酸化及びＨＥＲ３受容体の発現が抑制されていることが示された。まとめると、これらの結果により、ｍＡｂである１６Ｄ３-Ｃ１及び９Ｆ７-Ｆ１１は、ＨＲＧ又はｐ５３変異状態非依存性の腫瘍において有効であることが示された。
【０１６８】
当所は、以前、治療抗体トラスツズマブとＨＥＲ２発現が低い癌において相乗効果が示された他の標的療法の併用を実施した（Ｌａｒｂｏｕｒｅｔ、２００７、２０１０）。ＨＥＲ２発現が低い癌における抗ＨＥＲ２トラスツズマブ（Ｔｚ）との二重薬としての抗ＨＥＲ３特異抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を確認するために、ＨＲＧを分泌し（Ｙｏｎｅｓａｋａ、２０１１；Ｚｈｏｕ、２００６）、トラスツズマブ治療の効果がそれぞれ全くない（Ｆａｒｈａｎ、２００６）又はわずかな（Ｎａｋａｍｕｒａ、２００５）ＨＥＲ２ｌｏｗ扁平上皮Ａ４３１及び肺Ａ５４９癌細胞をマウスに移植した。潜在的な相乗効果を判別するために、トラスツズマブと併用した抗ＨＥＲ３ｍＡｂである１６Ｄ３-Ｃ１が副次効果を示す量である１０ｍｇ／ｋｇのみを３日毎に４週間投与した（Ｑ３ｄ-４Ｗ）。
図１９Ａに示すように、１６Ｄ３-Ｃ１を処理したマウスの腫瘍の大きさが２５％退行し、トラスツズマブ単独又は担体を処理した移植マウスでは効果が全く観察されなかったのと比較して、１６Ｄ３-Ｃ１及びＴｚの併用治療を実施したマウスでは、Ａ４３１腫瘍の増殖が、腫瘍移植後３５日目に有意に６０％退行したことを観察した（ｐ＜０．００１）。同様に、抗体単独処理したＡ５４９移植マウスで観察された腫瘍退行（５０％）と比較して、１６Ｄ３-Ｃ１＋Ｔｚの併用治療を実施したマウスでは、有意な７５％以上の腫瘍退行を測定した（ｐ＜０．００１）。まとめると、これらの結果により、トラスツズマブ治療が適切でないＨＥＲ２ｌｏｗ癌において、抗ＨＥＲ３特異抗体及び抗ＨＥＲ２抗体の併用が有効であることが示された。
【０１６９】
（参考資料）
本出願を通して、様々な参考資料が、本発明が関連する最先端技術を記述している。これらの参考資料の開示は、本開示に参考資料として組み込まれる。
【図１Ａ】
2014516960.tif 000003
【図１Ｂ】
2014516960.tif 000004
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2014516960.tif 000011
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
2014516960000001.app
【国際調査報告】
2014516960.tif 000026
2014516960.tif 000027
2014516960.tif 000028