(57)【要約】  本発明は、全般的には、真核発現系において製造されたＦｃ−融合タンパク質の精製方法に関する。より詳しくは、本発明は、最適化プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー工程および２つのイオン交換クロマトグラフィー工程（それらは共に結合および溶出様態で実施される）を含む、ヒト投与用のＴＮＦＲ：Ｆｃの製造における使用に適した頑強（ロバスト）かつ大規模化できる下流精製方法を提供する。【選択図】図２
2014520814.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）真核発現系において産生されたＦｃ融合タンパク質を含むサンプルを準備し、
ｂ）サンプル中に存在するＦｃ融合タンパク質をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィー樹脂に結合させ、
ｃ）プロテインＡ樹脂からＦｃ融合タンパク質を溶出し、ここで、溶出産物から第２サンプル（プロテインＡ産物（ＰＡＰ）と称されうる）を得、
ｄ）ＰＡＰをカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー樹脂に結合させ、
ｅ）ＣＥＸ樹脂から第２サンプルを溶出し、ここで、溶出産物から第３サンプル（ＣＥＸ産物（ＣＥＸＰ）と称されうる）を得、
ｆ）ＣＥＸＰをアニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー樹脂に結合させ、そして、
ｇ）ＡＥＸ樹脂から第３サンプルを溶出し、ここで、溶出産物から精製Ｆｃ融合タンパク質組成物を得る、
工程を含む、サンプル中に存在する１以上の不純物からＦｃ融合タンパク質を精製する方法。
【請求項２】
Ｆｃ融合タンパク質がｐ７５  ＴＮＦＲ：Ｆｃである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
５０ｍＭ  シトラート（ｐＨ５．０）〜１００ｍＭ  シトラート（ｐＨ４．０）の勾配を用いて工程ｃ）における溶出を行う、請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程ｂ）が、
ｂ’）３〜７の範囲のｐＨおよび１０ｍｓ／ｃｍ〜５０ｍｓ／ｃｍの範囲の伝導度を有するバッファーで結合Ｆｃ融合タンパク質を洗浄することを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
工程ｅ）における溶出を、直線イオン強度勾配として、２５ｍＭ  アルギニンを含む２５ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）を使用して行う、請求項１記載の方法。
【請求項６】
工程ｄ）が、
ｄ’）３〜７の範囲のｐＨおよび１０ｍｓ／ｃｍ〜５０ｍｓ／ｃｍの範囲の伝導度を有するバッファーで結合Ｆｃ融合タンパク質を洗浄することを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
工程ｇ）における溶出を、直線イオン強度勾配として、１２．５ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）を使用して行う、請求項１記載の方法。
【請求項８】
工程ｄ）が、
ｄ’）３〜７の範囲のｐＨおよび１０ｍｓ／ｃｍ〜５０ｍｓ／ｃｍの範囲の伝導度を有するバッファーで結合Ｆｃ融合タンパク質を洗浄することを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
プロテインＡクロマトグラフィー樹脂がＰＯＲＯＳ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
ＣＥＸクロマトグラフィー工程を、Ｐｏｒｏｓ  ＨＳ、Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＢＢ、Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ、ＴＳＫＧｅｌ  ＳＰ−５ＰＷ−ＨＲ２０およびＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ  ６５０から選択される強カチオン交換樹脂上で行い、ＡＥＸクロマトグラフィー工程を、Ｐｏｒｏｓ  ＨＱ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｑ−Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｑ．ＵＮＯ  Ｑから選択される強アニオン交換樹脂上で行う、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
ＣＥＸクロマトグラフィー樹脂がＰｏｒｏｓ  ＨＳ強カチオン交換樹脂であり、ＡＥＸクロマトグラフィー樹脂がＰｏｒｏｓ  ＨＱ強カチオン交換樹脂である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
Ｆｃ融合タンパク質を含むサンプルが哺乳類細胞培養ブロスまたは酵母発酵ブロスである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
Ｆｃ融合タンパク質を含むサンプルが酵母発酵ブロスであり、工程ａ）が、
ａ’）Ｆｃ融合タンパク質を含むサンプルのｐＨを８〜９のｐＨに調節し、サンプルをリフォールディング剤および解離剤と接触させることを更に含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
リフォールディング剤が、アルギニン、グリセロール、ＥＤＴＡ、ＴＭＡＯ、ＰＥＧ−３５００または酸化還元試薬から選択され、解離剤が、尿素または塩酸グアニジンから選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
Ｆｃ融合タンパク質を含むサンプルのｐＨを８．６に調節する、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
工程ｇ）において得られた精製Ｆｃ融合タンパク質組成物が、＞９９％の純度を有する産物を与える、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
工程ｇ）において得られた精製Ｆｃ融合タンパク質組成物が＞１８ｍＭｏｌのＴＳＡレベルにより特徴づけられる、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
請求項１記載の方法により得られる精製されたＦｃ含有融合タンパク質。
【請求項１９】
請求項１記載の方法により得られる精製されたＴＮＦＲ：Ｆｃタンパク質。
【請求項２０】
ＣＨＯ細胞培養発現系において製造され、請求項１記載の方法により精製された、＞９９％の純度および＞１８ｍＭｏｌのＴＳＡレベルを有する高度に精製されたＴＮＦＲ：Ｆｃタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に、真核発現系において製造されるＦｃ融合タンパク質の精製方法に関する。より詳しくは、本発明は、ヒト投与用のＴＮＦＲ：Ｆｃの製造における使用に適した頑強（ロバスト）かつ大規模化できる下流精製方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
生物医薬品の安全性を確保するために、規制機関は、ヒトへの投与が意図されるタンパク質に関して厳格な精製基準および品質特性（同一性、強度および純度）を課している。基準は、タンパク質に基づく治療用製品が、凝集物、断片（フラグメント）および組換えタンパク質の変異体のような製品関連汚染物ならびに浸出クロマトグラフィー樹脂、培地成分、ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、ウイルス汚染物および内毒素のようなプロセス関連汚染物を含む不純物を実質的に含有しないことを要求している。
【０００３】
臨床治験のための適当な量の生物医薬候補の製造においては、しばしば、プロセス開発が律速段階となりうる。再現性のある臨床成果を保証するためには、組換え生物医薬の製造者は、一貫した品質特性を有する製品を送り届ける必要がある。臨床開発を支持するための高純度の生物医薬の製造は、通常、２以上の工程の精製プロセスを要する。生物医薬の開発における最も大きな課題は、十分な純度および生物活性の製品を再現可能に製造しうる効率的かつ費用効果的な製造プロセスの確立である。
【０００４】
典型的には、組換えタンパク質の下流処理は、２〜５個のクロマトグラフィー単位操作を伴うプロセスクロマトグラフィーに大きく依存する。下流処理は全ての製造コストの５０〜８０％に相当するため、生物医薬業界はバイオプロセス開発を製品開発の必須要素および競合上の利点の源とみなしている。したがって、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の大規模製造に関わる企業は、大量の医薬等級のｍＡｂを一貫して製造しうることが保証されるように、上流および下流バイオプロセスプラットホームを確立するために多大な投資をしている。
【０００５】
商業的規模の精製プロセスは、典型的には、少なくとも以下の工程を含む：細胞内タンパク質を回収するための細胞溶解、または分泌性タンパク質の場合には培地からのタンパク質の回収；関心のあるタンパク質を含有する清澄化サンプルを得るための、分画遠心分離または濾過を用いる細胞残渣の除去；関心のあるタンパク質をサンプル中の種々の不純物から分離するための、多工程プロセスにおける種々のクロマトグラフィー媒体の使用。下流プロセス開発における主要考慮点は薬物純度である。また、プロセスは、頑強で信頼しうるものであり、大規模化可能でなければならない（Ｓｈｕｋｌａ，Ａら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ，８４８：２８（２００７））。
【０００６】
確立された精製プラットホームを有するという、認識されている利点にもかかわらず、個々のｍＡｂの生化学的特性および精製挙動における相違は、下流処理が、あらゆる生物医薬に一般的に適用可能な単一の定型化プロセスに強いられ得ないという認識につながっている。結果として、下流精製プロセスは、製品特異的プロセスの開発における使用に適した共通の枠組を得るために用いられる一定の操作パラメータおよび単位操作群に向かって進化している。操作パラメータは、個々の単位操作の性能予測を確立し、そして許容される操作条件を一括して扱い、それにより、タンパク質特異的精製スキームの開発に必要な実験の量を限定するのに役立つ。実際には、ｍＡｂの下流処理のために最初に開発された単位操作は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質を含む、代替型の生物医薬の製造における使用に適したプロセスの開発における使用のために修飾されうる。
【０００７】
ヒトへの投与に適し最終製品の大規模製造に適した、Ｆｃ融合タンパク質の効率的かつ頑強（ロバスト）な精製方法に対する、達成されていない要求が尚も存在する。
【０００８】
本出願において引用されている参考文献は、特許請求している発明に対する先行技術であると認められるものではない。
【発明の概要】
【０００９】
発明の概括
ミスフォールドＦｃ融合タンパク質が５％未満（４．５％〜０．２％の範囲）に全体的に減少し、凝集物が５％未満（５％〜０．５％の範囲）に減少し、断片（遊離Ｆｃレベルを含む）が５％未満（４．５％〜０％の範囲）に減少した高度に精製されたＴＮＦＲ：Ｆｃを与える、ＴＮＦＲ：Ｆｃのための下流プロセスが本発明において開発された。また、本明細書に開示されているプロセスは、シアル酸化ＴＮＦＲ：Ｆｃの全体的収量を改善する。
【００１０】
本発明は、部分的には、プロテインＡ捕捉工程および２つのイオン交換クロマトグラフィー工程（それらは共に、結合および溶出様態で行われる）を含む３つの最適化クロマトグラフィー単位操作と組合された最適化回収前コンディショニングプロトコールを含む精製方法の開発に基づく。本発明の方法は、図１および２に示されている流れ図において大まかに記載されている。本発明の精製プロセスは、真核発現系から得られた起源培地内に存在しうる不完全Ｆｃ含有タンパク質断片、凝集物および宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のような不純物の量および度合を有意に減少させ、ヒトへの投与に適した生物学的に活性な純粋なタンパク質の高い収率を与える。
【００１１】
一実施形態において、本発明は、ａ）真核発現系において産生されたＦｃ融合タンパク質を含むサンプルを準備し、ｂ）サンプル中に存在するＦｃ融合タンパク質をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィー樹脂に結合させ、ｃ）プロテインＡ樹脂からＦｃ融合タンパク質を溶出し、ここで、溶出産物から第２サンプル（プロテインＡ産物（ＰＡＰ）と称されうる）を得、ｄ）ＰＡＰをカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー樹脂に結合させ、ｅ）ＣＥＸ樹脂から第２サンプルを溶出し、ここで、溶出産物から第３サンプル（ＣＥＸ産物（ＣＥＸＰ）と称されうる）を得、ｆ）ＣＥＸＰをアニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー樹脂に結合させ、そして、ｇ）ＡＥＸ樹脂から第３サンプルを溶出し、ここで、溶出産物から精製Ｆｃ融合タンパク質組成物を得る工程を含む、サンプル中に存在する１以上の不純物からＦｃ融合タンパク質を精製する方法を提供する。
【００１２】
特定の実施形態においては、下流精製プロセスは、いずれかの糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母発現系において産生された二量体組換え糖タンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）を精製するために用いられる。もう１つの実施形態においては、プロセスは、哺乳類（ＣＨＯ細胞）発現系において産生されたＦｃ融合タンパク質を精製するために用いられる。より詳しくは、本明細書に記載されている実施例は、ヒトＩｇＧ１の定常領域（Ｆｃ）に連結されたヒト７５キロダルトンヒト腫瘍壊死因子受容体の細胞外リガンド結合部分からなるｐ７５  ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質を精製するための開示されている下流プロセスを用いることにより、本発明の方法を例示している。しかし、実施例におけるこの特定のＦｃ融合タンパク質の使用は本発明の範囲を限定するものではなく、本発明は、任意のＦｃ融合タンパク質の下流精製のためにより広く有用である。
【００１３】
本明細書に示されているとおり、本発明の最適化下流精製プロセスは、ＣＨＯ細胞培養発現系から単離され精製されている高精製ＴＮＦＲ：Ｆｃタンパク質を製造するために用いられ、ここで、精製タンパク質は＞９９％の純度および＞１８ｍＭｏｌのＴＳＡレベルを有する。本明細書に開示されている方法によれば、クエン酸ナトリウムバッファー（５０ｍＭ〜１００ｍＭ  シトラート）の溶出強度およびｐＨ５．０から３．５までの範囲で減少するｐＨ勾配を含む直線擬似勾配を用いて、ＴＮＦＲ：Ｆｃタンパク質をプロテインＡから溶出する。本明細書に示されているとおり、より高いｐＨおよびより低いバッファー強度から開始する擬似溶出勾配の使用は、浅いｐＨ転移曲線ゆえに、プロテインＡ溶出中の凝集形成の作用を軽減する。
【００１４】
本明細書に示されているとおり、本明細書に開示されている最適化操作パラメータは、後続のクロマトグラフィー工程に対する負荷を減少させるように機能する。本明細書に開示されている最適化プロテインＡ工程は、第１捕捉工程後に８０％超までプロテインＡ産物の純度を改善する。開示されているプロテインＡクロマトグラフィー工程は、下流精製工程の負荷を減少させる効果を有し、産物関連（製品関連）不純物（ミスフォールドした関心のあるタンパク質、凝集物、断片および不適切にシアル酸化した種）の除去のために最適化されている。
【００１５】
本発明のイオン交換クロマトグラフィー工程の両方は、結合および溶出様態で行われる。カチオン交換クロマトグラフィーは、好ましくは、ｐＨ４．０でのＮａＣｌ溶出勾配で行われる。もう１つの実施形態においては、凝集物およびＨＣＰの溶出を妨げる伝導度およびｐＨのバッファーで、イソクラティック溶出が行われうる。好ましくは、Ｆｃ含有タンパク質は、約３．５〜約６．０のｐＨで約１０〜約５０ｍＳ／ｃｍの範囲の伝導度の段階勾配で、カチオン交換樹脂から溶出される。プロセスのＣＥＸ工程は、高いＴＳＡレベルを有するＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質を保持しながら宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡおよび浸出プロテインＡリガンドを効率的に除去するように最適化されている。開示されている方法のＣＥＸ工程は、Ｆｃ含有タンパク質に関する中間精製工程をもたらす。
【００１６】
本発明においては、カチオン交換工程からの溶出物を、次いで、産物純化工程として結合および溶出様態で行われるアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）に付す。ＡＥＸはｐＨ８．０で行い、この場合、０〜０．３Ｍ  ＮａＣｌの２０ＣＶの直線イオン強度勾配による溶出を行い、１ＣＶの画分を集めた。開示している発明の最適化ＡＥＸ単位操作は、更に、凝集物を１〜２倍、そして宿主タンパク質を１〜５倍減少させる。本明細書に開示されている最適化操作条件を用いて、アニオン交換クロマトグラフィー工程は更に、ＴＳＡレベルを富化させ、残存プロセス残渣を除去した。
【００１７】
２つの最適化イオン交換純化クロマトグラフィー工程（それらは共に、結合および溶出様態で行われる）と連続的に行われる最適化プロテインＡ捕捉工程の使用は更に、最終精製タンパク質の全シアル酸（ＴＳＡ）含量を付随的制御しながら、Ｆｃ融合タンパク質調製物の純度を＞９０％まで増加させる。実際には、開示している精製プロセスは、＞９９％の純度でＦｃ融合タンパク質産物を精製するために用いられうる。一実施形態において、本発明の下流精製プロセスは、＞９９％の純度および＞１８ｍＭｏｌのＴＳＡレベルを有する、ＣＨＯ細胞培養発現系から得られた高度に精製されたＴＮＦ：Ｆｃタンパク質を製造するために用いられる。
【００１８】
「含む」のような非限定（オープン・エンド）用語は、追加的な要素または工程を許容する。時には、追加的な要素または工程の可能性を強調するために、「１以上」のような語が、非限定用語を伴って又は伴わないで使用される。
【００１９】
明示的に示されていない限り、”ａ”又は”ａｎ”のような用語は、１つに限定されない。例えば、「細胞」（ａ  ｃｅｌｌ）は、「複数の細胞」を除外しない。時には、複数の存在の可能性を強調するために、１以上のような語が用いられる。
【００２０】
本発明の他の特徴および利点は、種々の実施例を含む本明細書に記載されている追加的な説明から明らかである。記載されている実施例は、本発明の実施に有用な種々の成分および方法論を例示するものである。実施例は、特許請求している発明を限定しない。本開示に基づいて、当業者は、本発明の実施に有用な他の成分および方法論を特定し使用することが可能である。
【００２１】
発明の詳細な説明
定義
本明細書中で用いる「上流プロセス」なる語は、宿主細胞の培養および増殖による組換えタンパク質の製造に関連したプロセス（処理）工程を意味する。上流プロセスの考慮対象はクローン選択方法、培地選択、フェッドバッチ培養実施条件、培養供給法を含む。
【００２２】
本明細書中で用いる「下流プロセス」なる語は、組換えタンパク質の精製および不純物の除去に関連したプロセス工程を意味する。
【００２３】
本明細書中で用いる「頑強（ロバスト）なプロセス」なる語は、操作パラメータにおいて、一定の質、純度および収率の物質を一貫して得るプロセスを意味する。
【００２４】
「クロマトグラフィー」なる語は、関心のあるアナライト（例えば、ＩｇＧ融合タンパク質のようなＦｃ領域含有タンパク質）を、混合物中に存在する他の分子から分離する任意の種類の技術を意味する。通常、移動相の影響下で混合物の個々の分子が固定媒体中を移動する速度の相違の結果としてまたは結合および溶出プロセスにおいて、関心のあるアナライトが他の分子から分離される。
【００２５】
「精製」、「分離」または「単離」なる語は本明細書において互換的に用いられ、目的のポリペプチドおよび１以上の不純物または汚染物を含む組成物またはサンプルから、関心のあるポリペプチドもしくはタンパク質または標的タンパク質の純度を増加させることを意味する。典型的には、標的タンパク質の純度は、少なくとも１つの不純物を組成物から（完全または部分的に）除去することにより増加される。
【００２６】
「精製工程」または「単位操作」は、「均一」な組成物またはサンプルを与える全体的な精製プロセスの一部であり、これは、本明細書においては、関心のあるタンパク質を含む組成物中に１０００ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または９００ｐｐｍ未満、８００ｐｐｍ未満、７００ｐｐｍ未満、６００ｐｐｍ未満、５００ｐｐｍ未満のＨＣＰを含む組成物またはサンプルを意味する。
【００２７】
「汚染物」、「不純物」および「残渣」なる語は本明細書において互換的に用いられ、本発明のプロセスを用いて外来性の又は目的に反する分子の１以上から分離されるＦｃ含有標的タンパク質を含有するサンプル中に存在しうる生物学的巨大分子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、１以上の宿主タンパク質、内毒素、脂質および１以上の添加物を含む、いずれかの外来性の又は目的に反する分子を意味する。また、そのような汚染物には、精製プロセスの前に行われうる工程において使用されるいずれかの試薬が含まれうる。
【００２８】
「チャイニーズハムスター卵巣細胞タンパク質」および「ＣＨＯＰ」なる語は互換的に用いられ、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞培養に由来する宿主細胞タンパク質（「ＨＣＰ」）の混合物を意味する。ＨＣＰまたはＣＨＯＰは、一般に、細胞培養培地またはライセート［例えば、ＣＨＯ細胞内で発現される融合タンパク質のような、関心のあるタンパク質を含む回収細胞培養流体（「ＨＣＣＦ」）］中に不純物として存在する。関心のあるタンパク質を含む混合物中に存在するＣＨＯＰの量は、関心のあるタンパク質の純度の尺度となる。ＨＣＰまたはＣＨＯＰは、宿主細胞、例えばＣＨＯ宿主細胞により発現される関心のあるタンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。典型的には、タンパク質混合物中のＣＨＯＰの量は、混合物中の関心のあるタンパク質の量に対するピーピーエム単位で表される。宿主細胞が別の細胞型、例えば、ＣＨＯ以外の真核細胞、昆虫細胞または植物細胞、酵母細胞である場合、ＨＣＰは、宿主細胞のライセート中で見出される、標的タンパク質以外のタンパク質を意味すると理解される。
【００２９】
本明細書中で用いる「回収前コンディショニング」なる語は、回収前または回収細胞培養流体の入手前またはいずれかの形態の精製の前の細胞含有発酵ブロスの処理または調節を意味する。これは温度調節、安定化賦形剤の添加、酸化剤および還元剤の添加、タンパク質濃度を減少させるための発酵ブロスの希釈、界面活性剤の添加、塩の添加、ならびに有機溶媒の添加を含むが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
本明細書中で用いる「アフィニティ分離」または「アフィニティ精製」なる語は、標的アナライト（例えば、Ｆｃ領域含有タンパク質）を含有するサンプルを、標的アナライトに結合することが知られているアフィニティ媒体（例えば、アナライトに結合することが知られているアフィニティリガンド、例えばプロテインＡまたはその変異体を保持する固体支持体）と接触させることを含むいずれかの精製またはアッセイ技術を意味する。
【００３１】
「アフィニティクロマトグラフィー」および「タンパク質アフィニティクロマトグラフィー」なる語は本明細書において互換的に用いられ、標的タンパク質（例えば、関心のあるＦｃ領域含有タンパク質または抗体）を、標的タンパク質に特異的なリガンドに特異的に結合させるタンパク質分離技術を意味する。そのようなリガンドは、一般に生物特異的リガンドと称される。幾つかの実施形態においては、生物特異的リガンド（例えば、プロテインＡまたはその機能的変異体）はクロマトグラフィー固相物質に共有結合されており、溶液がクロマトグラフィー固相物質に接触すると、リガンドは溶液中の標的タンパク質にアクセス可能である。標的タンパク質は、一般に、クロマトグラフィー工程中に生物特異的リガンドに対するその特異的結合アフィニティを保有し、一方、混合物中の他の溶質および／またはタンパク質は、リガンドに明白または特異的には結合しない。
【００３２】
標的タンパク質の固定化リガンドへの結合は、標的タンパク質が固相物質上の固定化リガンドに特異的に結合したまま、汚染タンパク質またはタンパク質不純物がクロマトグラフィー媒体を通過するのを可能にする。特異的に結合した標的タンパク質は、次いで適当な条件（例えば、低いｐＨ、高いｐＨ、高い塩、競合リガンドなど）下、固定化リガンドから活性形態で除去され、先にカラムを通過した汚染タンパク質またはタンパク質不純物を含有しない状態で、溶出バッファーと共にクロマトグラフィーカラムを通過する。本発明の種々の方法においては、Ｆｃ領域含有標的タンパク質に対するリガンドとして、プロテインＡが使用される。
【００３３】
本明細書中で用いる「フェッドバッチ培養」なる語は、成長限定性栄養素を培養に供給することに基づく製造プロセスを意味する。これは、培養が製造バイオリアクターにおいて高い細胞密度を得ることを可能にし、副産物の産生を避けるために細胞の代謝制御を促進する。
【００３４】
本明細書中で用いる「細胞培養上清」なる語は、細胞が培養され、適当な細胞シグナル（いわゆる、シグナルペプチド）を含有するタンパク質が分泌される培地を意味する。Ｆｃ融合タンパク質発現細胞は、無血清培養条件下で培養されるのが好ましい。したがって、好ましくは、細胞培養上清は動物血清由来成分を欠いている。最も好ましくは、細胞培養培地は化学的に定義された培地である。
【００３５】
本明細書中で用いる「凝集物」なる語は、タンパク質凝集物を意味すると意図される。それは、精製されるべきＦｃ融合タンパク質の多量体（例えば、二量体、四量体またはより高次の凝集物）を含み、高分子量凝集物を生成しうる。
【００３６】
本明細書中で用いる「ミスフォールドＦｃ融合タンパク質」なる語は、不正確または不適当にフォールドしていて三次元構造を改変するＦｃ融合タンパク質を意味する。ミスフォールドは「凝集物」なる語をも含みうる。しかし、凝集物は、必ずしもミスフォールドしている必要はない。
【００３７】
「リフォールディング剤」なる語は、不適切なフォールディング、アンフォールディングまたは変性をするタンパク質の適切なフォールディングプロセスを補助する化合物または化合物および／または条件の組合せを意味する。そのような化合物は、タンパク質の天然コンホメーションを安定化させることにより（すなわち、アルギニン、グリセロール）、キレーターとして作用することにより（すなわち、ＥＤＴＡ）、または凝集を防ぐことにより（すなわち、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）、ＰＥＧ−３５００）、酸化還元剤（すなわち、グルタチオン、システイン）により、機能しうる。
【００３８】
「解離剤」なる語は、タンパク質凝集（例えば、二量体、四量体またはより高次の凝集物）のプロセスを逆転させるプロセスを補助する化合物または化合物および／または条件の組合せを意味する。そのような化合物は、穏和な変性剤（すなわち、尿素、塩酸グアニジン）、タンパク質の天然コンホメーションの安定剤（すなわち、アルギニン、グリセロール）およびキレーター（すなわち、ＥＤＴＡ）として作用することにより機能しうる。
【００３９】
「酸性変異体」なる語は、（例えば、カチオン交換クロマトグラフィーにより判定される）標的タンパク質より酸性である標的タンパク質の変異体である。酸性変異体の一例は、脱アミド化変異体である。
【００４０】
本明細書中で用いる「捕捉工程」なる語は、回収培地から関心のある産物（ＰＯＩ）を捕捉し、産物を濃縮し、不純物（例えば、細胞、細胞残渣、ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質）からＰＯＩの第１分離を達成する第１下流処理工程を意味する。
【００４１】
本明細書中で用いる「純化（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）工程」なる語は、産物流中に存在するより少量の不純物であって、捕捉工程中に除去される不純物よりも産物に対して高い類似性を典型的に有するもの（例えば、産物の凝集形態、構造変異体、例えば、ミスフォールド産物および修飾産物）を除去することを意図した、初期捕捉工程後に行われる下流処理工程を意味する。
【００４２】
「標的タンパク質」および「関心のあるタンパク質」なる語は本明細書において互換的に用いられ、タンパク質および場合によっては他の物質、例えば細胞残渣、ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、培地成分などの混合物から本発明の方法により精製されるべきＦｃ融合タンパク質（これらに限定されるものではない）を包含するタンパク質またはポリペプチドを意味する。
【００４３】
分子をクロマトグラフィー樹脂に「結合させる」とは、適当な条件（ｐＨ／伝導度）下、分子をクロマトグラフィー樹脂にさらして、分子をリガンド−タンパク質相互作用によりクロマトグラフィーの内部または表面上に可逆的に固定化することを意味する。非限定的な例には、分子とイオン交換材の荷電基との間のイオン相互作用、およびプロテインＡと免疫グロブリンとの間の生物特異的相互作用が含まれる。
【００４４】
本明細書中で、例えば、標的タンパク質（例えばＦｃ領域含有タンパク質）と、固体支持体に結合したリガンド（例えば固相マトリックスまたは樹脂に結合したプロテインＡ）との間の相互作用を示すために用いる「特異的結合」なる語は、結合部位における静電力、水素結合、疎水性力および／またはファンデルワールス力と共役した結合部位におけるタンパク質およびリガンド構造の空間的相補性の組合せ効果による、関心のあるタンパク質のリガンドへの、一般には可逆的な結合を意味する。一般に、空間的相補性が大きくなればなるほど、そして結合部位におけるその他の力が強くなればなるほど、タンパク質のそのそれぞれのリガンドに対する結合特異性は大きくなる。特異的結合の非限定的な例には、抗体−抗原結合、酵素−基質結合、酵素−補因子結合、金属イオンキレート化、ＤＮＡ結合タンパク質−ＤＮＡ結合、調節タンパク質−タンパク質相互作用などが含まれる。
【００４５】
本明細書中で、例えば、関心のある分子（例えば、本明細書に記載されている標的タンパク質）と、固体支持体に結合したリガンドまたは他の化合物（例えば、固相マトリックスまたは樹脂に結合したプロテインＡ）との間の相互作用を示すために用いる「非特異的結合」なる語は、相互作用部位における静電力、水素結合、疎水性力および／またはファンデルワールス力によるものであり、非構造的力の効果を増強する構造的相補性を欠く固体支持体上のリガンドまたは化合物への関心のあるタンパク質の結合を意味する。非特異的相互作用の例には、静電的、疎水性およびワンデルワールス力ならびに水素結合が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
クロマトグラフィー媒体を「洗浄する」とは、媒体の内部および表面上に適当なバッファーを通過させることを意味する。
【００４７】
「フロースループロセス」、「フロースルー様態」および「フロースルークロマトグラフィー」なる語は本明細書中で互換的に用いられ、少なくとも１つの潜在的汚染物または不純物がクロマトグラフィー樹脂または媒体に結合している状態で、１以上の汚染物と共にサンプル中に含有される少なくとも１つの産物（例えばＦｃ領域含有タンパク質）がクロマトグラフィー樹脂または媒体内を流動することを意図する、産物の分離技術を意味する。「フロースルー様態」は、一般にイソクラティック操作（すなわち移動相の組成が変化しないクロマトグラフィー法）である。
【００４８】
本明細書中で用いる「バッファー交換工程」なる語はインライン溶液条件調節を意味し、これは、典型的には、多数の通常のプロセスにおいて、保持タンクの使用に代わる代替手段である。典型的なバッファー交換工程においては、管または混合容器、濾過器または装置内での溶液混合を用いて転移中に２つの溶液が混合または滴定されうる。例えば、溶液をより低い伝導度の別の溶液と混合することにより伝導度を低下させるために、溶液を希釈する必要がありうる。バッファー交換は、例えば透析濾過、限外濾過などのような濾過装置の補助により達成されうる。
【００４９】
分子（例えば、関心のあるポリペプチドまたは不純物）をクロマトグラフィー樹脂から「溶出する」は、関心のある分子とバッファーがクロマトグラフィー樹脂上のリガンド部位に関して競合するように溶液条件を変化させることにより、それから分子を取り出すことを意味する。非限定的な一例は、イオン交換材上の荷電部位に関してバッファーが分子と競合するようにイオン交換材の周囲のバッファーのイオン強度を変化させることにより、イオン交換樹脂から分子を溶出させることである。
【００５０】
「イソクラティック溶出」なる語は、溶出プロセスの全体にわたって移動相の組成が不変である条件を意味するものとして本明細書において用いられる。
【００５１】
「勾配溶出」なる語は、一般に、移動相の塩強度が、溶出中に比較的低いイオン強度の溶媒から出発して増加する条件を意味するものとして本明細書において用いられる。
【００５２】
「溶出前工程」なる語は、溶出前の最後から２番目のクロマトグラフィー工程を意味し、この場合、標的分子はカラムに結合したままであるが、次のカラム上へのローディング中のバッファー混合は標的の収率または標的純度に悪影響を及ぼさない。非限定的な例は、カチオン交換カラムローディングに適したバッファー（例えば、ｐＨ５．４の酢酸ナトリウムまたはｐＨ５．０のクエン酸ナトリウム）中でＦｃ含有タンパク質がローディングされたプロテインＡカラムを平衡化し、ついでカラムをｐＨ３の酢酸ナトリウムでカチオン交換カラム上へ溶出することを含む。
【００５３】
「結合および溶出様態」および「結合および溶出プロセス」なる語は本明細書において互換的に用いられ、サンプル中に含有される少なくとも１つの産物（例えば、Ｆｃ領域含有タンパク質）がクロマトグラフィー樹脂または媒体に結合し、ついで溶出される、産物の分離技術を意味する。
【００５４】
「プール化法」および「プール化基準」なる語は本明細書において互換的に用いられ、標的不純物の消失を達成し所望の産物品質特性を向上させるためにクロマトグラフィープロセス溶出画分を合わせそして除去するアプローチを示すために用いられる。
【００５５】
「クロマトグラフィー樹脂」または「クロマトグラフィー媒体」なる語は本明細書において互換的に用いられ、関心のあるアナライト（例えば、Ｆｃ領域含有タンパク質、例えば、免疫グロブリン）を、混合物中に存在する他の分子から分離する任意の種類の固相を意味する。通常、関心のあるアナライトは、移動相の影響下または結合および溶出プロセスにおいて混合物の個々の分子が静止した固相を移動する速度における相違の結果として、他の分子から分離される。非限定的な例には、カチオン交換樹脂、アフィニティ樹脂、アニオン交換樹脂、アニオン交換膜、疎水性相互作用樹脂およびイオン交換モノリスが含まれる。樹脂の体積、使用されるカラムの長さおよび直径ならびに動的容積および流量は、処理される流体の体積、本発明のプロセスに付される流体中のタンパク質の濃度などのような幾つかのパラメータに左右される。各工程に関するこれらのパラメータの決定は、当業者の平均的な技量の範囲内に十分に含まれるものである。
【００５６】
「ＰＯＲＯＳクロマトグラフィー媒体」なる語は、非常に大きなスルーポア（ｔｈｒｏｕｇｈｐｏｒｅ）およびより小さな拡散孔を有することにより特徴づけられるクロマトグラフィー樹脂を意味する。それらの２つのものの相対バランスは、表面積および従って容積を最適化するために製造において操作される。表面コーティングおよび官能基の導入は、独立して、容積および制御選択性を増大させる。選択性を微調整するために、官能基の型、リガンド密度およびコーティング構造の制御が用いられる。
【００５７】
「プロテインＡ」、「プロＡ」および「ＰｒＡ」なる語は本明細書において互換的に用いられ、その天然源から回収されたプロテインＡ、合成的に（例えば、ペプチド合成または組換え技術により）製造されたプロテインＡ、およびＦｃ領域のようなＣＨ２／ＣＨ３領域を有するタンパク質に結合する能力を保有するそれらの変異体を包含する。プロテインＡは一般に固相支持体上に固定化される。「プロＡ」なる語はまた、プロテインＡが共有結合しているクロマトグラフィー固体支持体マトリックスを含有するアフィニティクロマトグラフィー樹脂またはカラムを意味する。
【００５８】
本発明の方法において使用されるプロテインＡの機能的誘導体、断片または変異体は、マウスＩｇＧ２ａまたはヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に対する少なくともＫ＝ＩＯ”８Ｍ、好ましくはＫ＝ＩＯ”９Ｍの結合定数により特徴づけられうる。結合定数に関するそのような値に従う相互作用は、この文脈において「高アフィニティ結合」と称される。好ましくは、プロテインＡのそのような機能的誘導体または変異体は、天然ドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＩｇＧ結合機能を保有するそれらの操作突然変異体から選択される野生型プロテインＡの機能的ＩｇＧ結合ドメインの少なくとも一部を含む。
【００５９】
また、単点結合を可能にするように操作されたプロテインＡ誘導体または変異体も、特許請求している方法におけるアフィニティクロマトグラフィー工程において使用されうる。単点結合は、一般に、タンパク質部分がプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーのクロマトグラフィー支持体に共有単結合により結合していることを意味する。そのような単点結合は、露出したアミノ酸位置（すなわち、ループ内、ＮもしくはＣ末端の近傍、またはタンパク質フォールドの外周上の他の部位）に配置された適当な反応性残基の利用によっても生じうる。適当な反応性基としては、例えばスルフヒドリルまたはアミノ基が挙げられる。
【００６０】
本明細書中で用いる「汚染プロテインＡ」なる語は、結合抗体をプロテインＡアフィニテイクロマトグラフィーカラムから溶出した際に得られる、プロテインＡまたは前記の機能的誘導体の、いずれかの型の機能的なＩｇＧ結合性派生物である。そのような汚染プロテインＡ種は、例えば、特に工業的製造における酵素作用により生じる可能性が非常に高いペプチド結合の加水分解から生じうる。例えば、細胞培養ブロス内の死にかけている細胞または初期遠心分離もしくは濾過工程において破壊された細胞は、プロテインＡ樹脂を分解しうるプロテアーゼを遊離している可能性がある。粗精製された新鮮な産物溶液が相当なプロテアーゼ活性を尚も含有する場合、プロテインＡクロマトグラフィーは下流処理における早期の工程として適用されるため、これは特にありうることである。
【００６１】
本明細書中で用いる「イオン交換」および「イオン交換クロマトグラフィー」なる語は、混合物中の関心のある溶質またはアナライト（例えば、Ｆｃ領域含有標的タンパク質）が、固相イオン交換材に（例えば、共有結合により）連結された荷電化合物と相互作用して、関心のある溶質またはアナライトが、混合物中の溶質不純物または汚染物より高く又は低く、荷電化合物と非特異的に相互作用するクロマトグラフィープロセスを意味するものとして用いられる。混合物中の汚染溶質は、イオン交換材のカラムから、関心のある溶質より早く又は遅く溶出し、あるいは関心のある溶質に相応して、樹脂に結合し、または樹脂から除去される。「イオン交換クロマトグラフィー」は特に、カチオン交換、アニオン交換および混合様態イオン交換クロマトグラフィーを含む。
【００６２】
ポリペプチドの「ｐＩ」または「等電点」は、ポリペプチドの正電荷がその負電荷と釣り合っているｐＨを意味し、ｐｉは、ポリペプチドの結合炭水化物のアミノ酸残基またはシアル酸残基の実効電荷から計算されることが可能であり、あるいは等電点電気泳動により決定されることが可能である。
【００６３】
「イオン交換材」なる語は、負に荷電した（すなわち、カチオン交換樹脂）または正に荷電した（すなわち、アニオン交換樹脂）固相を意味する。電荷は、例えば共有結合により１以上の荷電リガンドを固相に結合させることにより付与されうる。その代わりまたはそれに加えて、電荷は固相の固有特性でありうる（例えば、全体的な負電荷を有するシリカの場合）。
【００６４】
「カチオン交換樹脂」なる語は、負に荷電し、したがって固相の内部または表面上を通過する水溶液中のカチオンとの交換のための遊離カチオンを有する固相を意味する。カチオン交換樹脂を形成するように固相に結合している負荷電リガンドは、例えばカルボキシラートまたはスルホナートでありうる。商業的に入手可能なカチオン交換樹脂には、カルボキシ−メチル−セルロース、アガロース上に固定化されたスルホプロピル（ＳＰ）（例えば、ＰｈａｒｍａｃｉａのＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷ（商標）またはＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＨＩＧＨ  ＰＥＲＦＯＲＭＡＮＣＥ（商標））、およびアガロース上に固定化されたスルホニル（例えば、ＰｈａｒｍａｃｉａのＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷ（商標））が含まれる。例えば、カチオン交換クロマトグラフィーは、樹脂が標的分子（例えば、Ｆｃ領域含有標的タンパク質）に結合し次いで溶出に付される条件下で行われうる（カチオン交換結合および溶出クロマトグラフィーまたは「ＣＩＥＸ」）。あるいは、ＣＥＸは、それが主に不純物に結合する一方で、標的分子がカラムを「フロースルー（流動通過）」する形態で実施されうる（カチオン交換フロースルークロマトグラフィーＦＴ−ＣＩＥＸ）。本明細書に開示されている精製方法は、結合および溶出様態で行われるカチオン交換クロマトグラフィー工程を用いる。
【００６５】
「アニオン交換樹脂」なる語は、正に荷電した（例えば、それに結合している第四級アミノ基のような１以上の正荷電リガンドを有する）固相を意味するものとして本明細書において用いられる。商業的に入手可能なアニオン交換樹脂には、ＤＥＡＥセルロース、ＱＡＥ  ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）およびＦＡＳＴ  Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。アニオン交換クロマトグラフィーは標的分子（例えば、Ｆｃ領域含有標的タンパク質）に結合し、ついで溶出に付されることが可能であり、あるいは主に不純物に結合する一方で、標的分子がカラムを「フロースルー（流動通過）」しうる。本明細書に開示されている精製方法は、結合および溶出様態で行われるアニオン交換クロマトグラフィー工程を用いる。
【００６６】
本明細書中で用いる「バッファー」なる語は、その酸−塩基共役成分の作用によりｐＨの変化に抗する溶液を意味する。例えばバッファーの所望のｐＨに応じて使用されうる種々のバッファーは、Ｂｕｆｆｅｒｓ．Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｂｕｆｆｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｕｅｆｆｒｏｙ，Ｄ．編，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１９７５）に記載されている。
【００６７】
「塩」は、酸と塩基との相互作用により形成される化合物である。本明細書に記載されているバッファーにおいて使用されうる種々の塩には、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、クエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム）、塩化物塩（例えば、塩化ナトリウム）、硫酸塩（例えば、硫酸ナトリウム）またはカリウム塩が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６８】
「カチオン交換バッファー」なる語は、標的分子（例えば、免疫グロブリン）がカチオン交換材に結合するようなｐＨおよび伝導度を有する平衡化バッファーを意味する。
【００６９】
本明細書中で用いる「ローディングバッファー」なる語は、関心のある標的分子（例えば、Ｆｃ領域含有標的タンパク質）および１以上の不純物を含むサンプルまたは組成物をクロマトグラフィーカラム（例えば、アフィニティカラムまたはイオン交換カラム）上にローディングするために使用されるバッファーを意味する。ローディングバッファーは、関心のある分子（および一般には１以上の不純物）がクロマトグラフィー樹脂に結合するような又は関心のあるタンパク質がカラムをフロースルーする一方で不純物が樹脂に結合するような伝導度および／またはｐＨを有する。
【００７０】
「中間バッファー」は、関心のあるポリペプチド分子を溶出する前にクロマトグラフィー樹脂から１以上の不純物を溶出するために使用される。中間バッファーの伝導度および／またはｐＨは、１以上の不純物がイオン交換樹脂から溶出するが、関心のあるポリペプチドの有意な量が溶出しないようなものである。
【００７１】
「洗浄バッファー」または「平衡化バッファー」なる語は本明細書において互換的に用いられ、関心のあるポリペプチド分子を溶出する前にクロマトグラフィー樹脂を洗浄または再平衡化するために使用されるバッファーを意味する。幾つかの場合には、洗浄バッファーとローディングバッファーとは同一でありうる。
【００７２】
「溶出バッファー」は、標的タンパク質を固相から溶出するために使用される。溶出バッファーの伝導度および／またはｐＨは、通常、標的分子がクロマトグラフィー樹脂から溶出されるようなものである。「イソクラティック溶出」なる語は、溶出プロセス全体において移動相の組成が不変である溶出条件を意味するものとして用いられる。
【００７３】
「勾配溶出」および「直線勾配溶出」なる語は、移動相における溶媒強度または溶出イオン濃度が、比較的低い溶媒強度の溶媒から出発して溶出中に増加する条件を意味するものとして本明細書において互換的に用いられる。
【００７４】
「擬似勾配溶出」なる語は、勾配溶出中に２以上の条件が変化している条件を意味するものとして用いられる。擬似勾配法の一例は、イソクラティック溶出または１つの移動相条件を変化させる勾配を行う場合より高いレベルの純度を得るために、プロテインＡクロマトグラフィーの溶出相中に、移動相の溶媒強度を増加させる一方で、移動相のｐＨを同時に減少させることを含み、これに限定されるものではない。イオン交換溶出中にｐＨおよび塩濃度を同時に変化させる組合せ効果は擬似勾配溶出のもう１つの例である。
【００７５】
「ウイルス不活化」、「ウイルス消失」または「ウイルス減少」なる語は本明細書において互換的に用いられ、物理化学的手段によりウイルスが細胞に感染できなくなるようにしうる又はウイルス機能を抑制しうるいずれかの過程を意味する。典型的なウイルス不活化法には、低ｐＨ処理（例えば、ｐＨ４．５未満、４．０未満または３．８未満）、熱処理、界面活性剤および放射線での処理（例えば、紫外線曝露）が含まれ、これらに限定されるものではない。幾つかの実施形態においては、ウイルス不活化法はレトロウイルスに対するものである。特定の実施形態においては、低ｐＨ条件がウイルス不活化に用いられ、そのような条件は、典型的に、ウイルス脂質エンベロープを破壊し、それによりウイルスを不活化する。
【００７６】
本明細書中で用いる「Ｆｃ領域」および「Ｆｃ領域含有タンパク質」は、タンパク質が、免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖定常領域またはドメイン（既に定義されているとおりのＣＨおよびＣＬ領域）を含有することを意味する。「Ｆｃ領域」を含有するタンパク質は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を有しうる。ＣＨ２／ＣＨ３領域のような「Ｆｃ領域」は、プロテインＡまたはその機能的変異体のようなアフィニティリガンドに選択的に結合しうる。幾つかの実施形態においては、Ｆｃ領域含有タンパク質はプロテインＡまたはその機能的誘導体、変異体または断片に特異的に結合する。
【００７７】
本明細書中で用いる「Ｆｃ融合タンパク質」なる語は、本明細書中で「Ｆｃ部分」と称される免疫グロブリン由来部分と、疾患の治療が意図されるか否かに無関係に本明細書中で「治療用部分」と称される第２の非免疫グロブリンタンパク質に由来する部分とを含むタンパク質、特に治療用タンパク質を包含すると意図される。別の実施形態においては、Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２もしくはＴＮＦスーパーファミリーメンバーの細胞外ドメインまたはＴＮＦ結合性断片および所望によりその抑制性断片、から選択される治療用部分を含む。ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーの特徴は、例えばＮａｉｓｍｉｔｈ  Ｊ．Ｈ．およびＳｐｒａｎｇ  Ｓ．Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２３，７４−７９（１９９８）に記載されているとおり、細胞外ドメインにおけるシステインに富む擬似反復の存在である。２つのＴＮＦ受容体であるｐ５５（ＴＮＦＲ１）およびｐ７５  ＴＮＦＲ（ＴＮＦＲ２）は、ＴＮＦＲスーパーファミリーのそのようなメンバーの例である。特定の実施形態においては、Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトｐ７５  ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）の可溶性部分を含有するＦｃ融合タンパク質であるエタネルセプト（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）である（例えば、ＷＯ９１／０３５５３，ＷＯ  ９４／０６４７６）。エタネルセプトは本明細書において「ＴＮＦＲ：Ｆｃ」とも称される。
【００７８】
本明細書中で用いる「参照品」は、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ）を意味するものとして用いられる。ＥＮＢＲＥＬロット番号１００９１６４、１０１１１４７、１０１１８０３、１０１１８５８および１００８８８５が、比較目的に本発明で用いられる。
【００７９】
Ｆｃ融合タンパク質
エタネルセプト（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））は、ヒトＩｇＧ１の定常領域（Ｆｃ）に連結されたヒト７５キロダルトン（ｐ．７５，ＴＮＦＲＩＩ，ＷＯ９１／０３５５３，ＷＯ  ９４／０６４７６）ヒト腫瘍壊死因子受容体の細胞外リガンド結合性部分からなる、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）哺乳類細胞発現系において産生される二量体組換え治療用糖タンパク質である。エタネルセプトは、少なくとも慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、乾癬および強直性脊椎炎症の治療のために販売されている。エタネルセプトは、炎症性サイトカインＴＮＦαに結合しその作用を中和することにより、これらの慢性炎症疾患において、その有益な効果をもたらす。
【００８０】
細胞培養上清内に遊離される可溶性分泌性Ｆｃ融合タンパク質を製造するためには、Ｆｃ融合タンパク質の治療用部分の天然シグナルペプチドが使用され、あるいは好ましくは、異種シグナルペプチド、すなわち、使用される個々の発現系において効率的である別の分泌性タンパク質に由来するシグナルペプチドが使用される。精製されるべきＦｃ融合タンパク質がそれを分泌する哺乳類細胞により発現される場合、本発明の精製プロセスの出発物質は、回収物または粗回収物とも称される細胞培養上清である。動物血清を含有する培地内で細胞が培養される場合には、細胞培養上清はまた、不純物として血清タンパク質を含有する。
【００８１】
本発明においては、組換えＦｃ融合タンパク質は、グリコシル化Ｆｃ融合タンパク質を与える糖操作酵母細胞および哺乳類細胞を含む真核発現系において製造されうる。好ましくは、Ｆｃ融合タンパク質を発現し分泌する細胞は、無血清条件下で培養される。Ｆｃ融合タンパク質は化学的に定義された培地内でも製造されうる。典型的には、本発明の精製プロセスの出発物質は、不純物として宿主細胞タンパク質を主に含む無血清細胞培養上清である。
【００８２】
グリコシル化／ＴＳＡ
ＴＮＦＲ：Ｆｃ（エタネルセプト）は、ヒトＩｇＧ１の定常領域（Ｆｃ領域）に連結されたヒト７５ｋＤａ（本明細書においてはｐ７５、ＴＮＦＲ２またはＴＮＦＲＩＩと称される）ヒトＴＮＦα受容体の細胞外リガンド結合性部分を含む治療用組換え融合タンパク質である。治療上重要なタンパク質の大多数と同様に、エタネルセプトは、生物活性のためにはＮ−グリコシル化を要する。哺乳類細胞および酵母細胞は、天然ヒトタンパク質上で見出される翻訳後修飾を組込むそれらの能力において異なることがよく知られている。哺乳類細胞のみが、分泌中にタンパク質のＮ結合グリコシル化を行う固有の能力を有する。
【００８３】
グリコシル化タンパク質は複合分子であり、十分に制御された産物でさえ同じアミノ酸配列上に種々のグリカン組成を有する数百個以上のグリコフォーム（糖形態）からなることがある。グリコシル化タンパク質のインビボ生物活性は、利用可能なシアル酸化部位、Ｎ−グリカンの分岐およびシアル酸化の完全性の結果である、１分子当たりのシアル酸単位の数に左右されることが公知である（Ｓｈｉｅｓｔｌ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９（４）：３１０（２０１１））。
【００８４】
酵母はもう１つのタンパク質発現系を提供するが、野生型酵母において産生される糖タンパク質は、潜在的に免疫原性の高マンノース型Ｎ−グリカンを含有する。哺乳類細胞と酵母との間のグリコシル化パターンにおける相違は、モノクローナル抗体および他の治療用タンパク質（ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質を含む）の製造のための酵母発現系の使用を制限する。高い忠実度で特異的ヒト化Ｎ−グリコシル化反応を行う宿主細胞を得るために、ヒトグリコシル化経路が酵母ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）内に操作されている。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）の糖操作細胞系を使用して、ヒト化Ｎ−グリカン構造を有する組換えモノクローナル抗体（Ｊｉａｎｇ，Ｙ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，（７６）７（２０１１））およびＦｃ融合タンパク質が成功裏に製造されている。
【００８５】
エタネルセプトは、Ｏ結合およびＮ結合のグリカンの両方を示す。Ｎ結合炭水化物構造は、ヒトタンパク質において天然に存在するグリカンに特徴的な多数の特徴を示す。例えば、その大部分の二分岐の構造は、末端シアル酸残基によりキャップ化された主に二糖Ｇａｌ  １，４  ＧｌｃＮＡｃからなる複合型分岐を有するように産生される。しかし、ＣＨＯ細胞におけるこれらの構造の不完全な合成は、しばしば、ある範囲の構造不均一性をタンパク質に付与して、バッチ間のばらつきを招く。エタネルセプト上で見出されるＯ結合グリカンは、いわゆるムチン型のものである。エタネルセプトの薬物動態学的特性は複合Ｎ結合炭水化物の構造およびＯ結合グリカンをキャップ化するシアル酸の度合に大きく左右されるため、不十分な又は一貫しないシアル酸化およびガラクトシル化は、今度はアシアロ糖タンパク質またはマンノース／ＧｌｃＮＡｃ受容体媒介性経路を介した可変的クリアランスをもたらし、薬物の適切な再現性のある投薬に関する重大な問題を潜在的に引き起こしうる。
【００８６】
不均一性はクローンによって大きく異なることがあり、培養条件および製造様態に左右される。したがって、特異的グリコフォームを富化しうることが非常に望ましく、ＧｌｙｃｏＦｉのピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母発現プラットホームは、同一ではないもののより均一なヒト化グリコシル化パターンを有する治療用タンパク質の製造をもたらす。生物学的類似体とみなされるためには、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）産生タンパク質のＮ結合複合グリカンの末端単糖がシアル酸により占有されるべきである。しかし、不十分な又は一貫しないシアル酸化は、プロセスの一貫性を達成する際に重大な障害をもたらしうる。シアル酸化のレベルの変動から生じる精製の難題は、適当な単位操作を定めること、および各クロマトグラフィー工程のための条件（例えば、樹脂選択、操作方式、バッファー、溶出条件）を最適化することにより、本明細書に開示されている下流処理（下流プロセス）において対処される。
【００８７】
グリコシル化パターン及び末端シアル酸化の制御は、ほとんどの糖タンパク質の半減期および治療効力ゆえに、ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質の精製中に注意深くモニターされ、末端シアル酸の存在に左右される。ヒトグリコシル化の最終段階であるシアル酸化は、酵母において達成するのが特に困難である。なぜなら、野生型酵母は、β−１，４−ガラクトースで終結するＮ−グリコシル化前駆体を産生する能力、糖ヌクレオチド前駆体シチジン一リン酸（ＣＭＰ）−シアル酸［特に、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮＡＮＡ）］を産生する生合成能、ＣＭＰ−シアル酸をゴルジ内に往復させる輸送体、およびシアル酸を新生糖タンパク質の末端ガラクトースに転移するシアリルトランスフェラーゼの全てを欠くからである。シアル酸の頻度の低下は糖タンパク質の溶解度の減少および循環半減期の減少を招く。結果として、精製および治療的有効性は、シアル酸含量に左右される（Ｂｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｄ．Ｔ．およびＳｌｉｗｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．Ｂ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３，６９２−６９８（１９９５））。Ｓｈａｎｔｈａ  Ｒａｊｕ，Ｔ．Ｓ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０，８８６８−８８７６（２００１）は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内で発現されるＴＮＦＲ−Ｆｃ分子における末端シアル酸化のレベルの増加が血清半減期を増加させることを示した。
【００８８】
治療用タンパク質のシアル酸含量は、以下の方法を用いて決定される。簡潔に説明すると、１０〜２０μｇのタンパク質サンプルを４００μＬの０．１Ｍ  塩酸と混合する。ついでこれを８０℃で１時間加熱する。生じた混合物をＳｐｅｅｄＶａｃ内で１時間乾燥させる。ついで産物を５００μＬのＨＰＬＣ水で再構成させ、Ｄｉｏｎｅｘ  ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ系上でクロマトグラフィー分析を行う。曲線下面積を用いてシアル酸の量をｐｍｏｌ単位で計算し、ついでタンパク質に対するシアル酸のモル比を計算した。参照品は１００％ＴＳＡとして計算され、ＰＯＩにおける％ＴＳＡが参照品に対して表される。
【００８９】
溶出流中のＴＳＡレベルの改善に寄与するパラメータが、３つ全てのクロマトグラフィー工程に存在する。プロテインＡ工程に関しては、用いられる擬似勾配は、主に産物溶出の出発においてＴＳＡレベルを選択的に富化する。擬似勾配はｐＨおよびバッファー強度の両方を同時に用い、高レベルのＴＳＡを示す特有かつ高選択的な産物プロファイルを可能にする。プロテインＡ工程に使用されたプール化法はまた、糖操作ピチア宿主細胞およびＣＨＯ細胞系の両方において産生されるＴＮＦＲ：ＦｃのＴＳＡ含量の一貫した富化を示している。改善されたＴＳＡプロファイルは、ＣＥＸクロマトグラフィーの間にも明らかである。複数のＣＨＯ細胞系および糖操作ピチアに存在する不均一性にもかかわらず、ＣＥＸクロマトグラフィーの産物プールにおけるシアル酸含量の一貫した改善が認められる。これは、ＣＥＸクロマトグラフィーが実施された様態（結合および溶出）および単位操作の最後に用いられたプール化法によるものだと考えられうる。ＡＥＸが実施されるこの方式（結合および溶出）は、産物プールにおいて示されるＴＳＡレベルの増加に対する寄与因子である。ＡＥＸは、典型的には、フロースルー（Ｆ／Ｔ）様態において実施されるが、ＡＥＸ  Ｆ／Ｔ単位操作の使用はＦ／Ｔ産物におけるＴＳＡレベルの最低限の改善をもたらすに過ぎないことが認められている。
【００９０】
リフォールディング／ミスフォールディング
ＴＮＦＲ：Ｆｃは、タンパク質のＦｃ領域内に７個のジスルフィド結合、及びＴＮＦ受容体領域内に２２個のジスルフィド結合を含む。したがって、下流処理法中のジスルフィド攪乱の高い可能性が存在する。ピチア宿主細胞の発酵から生じたＴＮＦＲ：Ｆｃは、２０％未満の適切にフォールドした関心のある産物（ＰＯＩ）を有しており、残りは、下流精製作業の重大な課題となる凝集またはミスフォールドを伴っていた。ＷＯ２００２／０６８４５５に記載されている発明は、ＣＨＯにおけるＴＮＦＲ：Ｆｃ（エタネルセプトとしても公知のｐ７５ＴＮＦＲＩＩ：Ｆｃ融合タンパク質）の発現が、適切にフォールドしたＴＮＦＲ：Ｆｃ、断片ならびにミスフォールドおよび／または凝集タンパク質産物の混合物を含む調製物を与えるという観察を前提としている。この開示は、組換えタンパク質の幾つかの領域またはドメインは適切にフォールドされうるが、他の領域またはドメインは望ましくないコンホメーションを有しうることを示している。疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）の画分＃３はサンプルの２０〜６０％を含む可能性があり、ＨＩＣカラム溶出物の画分＃２におけるタンパク質収集物と比較して低いＴＮＦ結合活性および生物活性を示しており、画分＃３に特に関心が持たれたことを示している。
【００９１】
ＷＯ２００２／０６８４５５は、哺乳類細胞により産生された組換えタンパク質（すなわち、ｐ７５  ＴＮＦＲ：Ｆｃ）の調製物を還元／酸化カップリング試薬と約７〜約１１のｐＨで接触させ、そして、所望のコンホメーションを有する組換えタンパク質の調製物の画分を単離する方法を提供している。ＷＯ２００２／０６８４５５において公開されている実験的研究の全ては、プロテインＡまたはＨＩＣカラムのいずれかから溶出したＣＨＯ細胞により産生された物質から得られた部分精製ＴＮＦＲ：Ｆｃタンパク質混合物を使用した。
【００９２】
先行技術の精製方法
ＷＯ０３／０５９９３５は、プロテインＡ上のアフィニティクロマトグラフィーとヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーとの組合せを用いる、ｐ７５  ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質の精製プロセスを開示している。開示されている精製方法は、Ｆｃ融合タンパク質はヒドロキシアパタイトに結合しないがその他のタンパク質は結合するようなフロースルー様態でヒドロキシアパタイト樹脂を使用して、少なくとも１つの定常抗体免疫グロブリンドメインを含むタンパク質を分離することをもたらす。本明細書に開示されている方法はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いない。これに加えて、ｐ７５  ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質の精製のためのイオン交換クロマトグラフィーの使用は記載されていない。
【００９３】
ＵＳ７，４２７，６５９は、細胞培養内で産生された組換えＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質を含む標的タンパク質を、標的タンパク質と汚染物（例えば、ＨＣＰ）とを含有する混合物から分離するための精製方法を開示しており、これは、混合物を、分枝炭化水素官能基を含む疎水性吸収材（例えば、ＨＩＣ樹脂）と水性塩溶液中で接触させ、標的タンパク質を含有する未結合フロースルー画分を集めることによるものである。フロースルーにおけるＨＩＣの使用は驚くほどに効率的であり、標的タンパク質の有意に高い回収を単工程でもたらし、それにより、タンパク質精製法の効率およびコストを単純化し改善すると記載されている。本明細書に開示されている方法はＨＩＣクロマトグラフィーを使用しない。
【００９４】
ＵＳ６，８７０，０３４は、抗体およびイムノアドヘシンのようなＣＨ２／ＣＨ３領域含有タンパク質をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーにより精製するための方法を開示している。開示は、プロテインＡカラムに結合した固定化された関心のあるタンパク質ではなく汚染物を除去するためのプロテインＡクロマトグラフィーにおける使用のための、ＴＭＡＣまたはＴＥＡＣ（これらは共に米国特許第６，１２７，５２６号および第６，３３３，３９８号に開示されている）以外の中間洗浄バッファーの使用を記載している。開示されている中間バッファーの１つは界面活性剤および塩を含み、もう１つは溶媒および塩を含み、３番目の洗浄バッファーは、重合体および塩を含む。開示において例示されているＣＨ２／ＣＨ３領域含有タンパク質は抗体である。
【００９５】
ＵＳ６，８７０，０３４に記載されている洗浄バッファーとは対照的に、本明細書に開示されているプロテインＡ精製工程において使用される洗浄バッファーは、非産物関連不純物を標的とし、ｐＨ５．５〜５．８のｐＨにおける塩による水性（ホスファート）系バッファーである。また、溶出中に用いられる擬似勾配は、非産物関連不純物、断片、凝集物およびミスフォールドを除去する。開示されている最適化プロテインＡ条件の使用は、タンパク質の所望のシアル酸化パターンの向上（すなわちＴＳＡ含量の改善）をももたらす。
【００９６】
ＥＰ１５６１７５６は、プロテインＡまたはＧに基づくクロマトグラフィーが単独ではタンパク質からのＤＮＡ汚染物の分離に十分ではない可能性があること、およびタンパク質を精製するためには、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはそれらの組合せのような更なる工程が用いられうることを開示している。これらのクロマトグラフィー工程に関しては、特定の順序は何ら提示されていない。また、ＥＰ１５６１７５６が言及しているタンパク質は、造血因子、サイトカインおよび抗体である。Ｆｃ融合タンパク質はＥＰ１５６１７５６に記載されていない。
【００９７】
ＥＰ１６１４６９３は、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーに基づく、抗体の精製のための方法を記載している。この文書においては、抗体はアニオン交換およびカチオン交換のその順序のクロマトグラフィーにより、あるいはカチオン交換クロマトグラフィーおよびそれに続く疎水性クロマトグラフィーにより精製されることが特定されている。疎水性クロマトグラフィーの代わりに、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含むいずれかの他のタイプのクロマトグラフィーが用いられうる。Ｆｃ融合タンパク質はＥＰ１６１４６９３に記載されていない。
【００９８】
ＵＳ２０１０／０２６７９３２は、プロテインＡまたはＧアフィニティクロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、６．９〜９．５のｐＩを有するＦｃ融合タンパク質の精製のための方法を開示している。精製に用いられる精製工程の順列または順序は、ＵＳ２０１０／０２６７９３２において用いられているものとは異なる。本明細書に開示されている下流処理は、１つ少ないクロマトグラフィー工程を含み、ＵＳ２０１０／０２６７９３２に記載されているフロースルー様態とは反対の結合および溶出様態で実施されるＡＥＸ精製工程を用いる。
【００９９】
したがって、ヒトへの投与に適した純度をもたらすＦｃ融合タンパク質の効率的な精製方法に対する、達成されていない要求が尚も存在する。
【０１００】
本発明
本発明は、部分的には、Ｆｃ含有タンパク質の流体または組成物中に存在しうる不完全なＦｃ含有タンパク質断片、凝集物および宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のような不純物の量または度合を有意に減少させうる、プロテインＡ捕捉工程および２つのイオン交換クロマトグラフィー工程を含む３つの最適化クロマトグラフィー単位操作と組合された最適化回収前コンディショニング法に基づく精製方法の開発に基づく。
【０１０１】
本明細書に開示されている下流処理は、生産性を改善するために回収工程に組込まれた新規ｐＨシフトリフォールディング法を含み、ハイスループット法を用いてアフィニティプロテインＡクロマトグラフィー工程を迅速に最適化し、それにより一次捕捉工程後にＰＯＩの純度を＞８０％へと高めた。結合および溶出様態で実施される２つの新たに開発されたイオン交換純化クロマトグラフィー工程とこれらの工程の統合は、純度を＞９０％へと更に増加させ、それに伴い、最終薬物の全シアル酸含量の制御をもたらした。下流処理は最初にピチア発現ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質に関して開発され、後にＣＨＯ発現ＴＮＦＲ：Ｆｃの精製に適合化された。
【０１０２】
ＣＨＯ発現ＴＮＦ−Ｒ融合タンパク質
本明細書に開示されている方法においては、ＴＮＦＲ：Ｆｃの製造は、組換え二量体ＴＮＦＲ  ＤＮＡ構築物を発現するように操作された糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の大規模培養により達成される。組換えタンパク質は、遺伝子工学の方法により製造されたタンパク質である。「遺伝子工学」なる語は、高いレベル、低いレベルの遺伝子および／または遺伝子の突然変異体を発現する宿主細胞を作製するために用いられるいずれかの組換えＤＮＡまたはＲＮＡ法を意味する。言い換えると、細胞は組換えポリヌクレオチド分子でトランスフェクト、形質転換または形質導入されていて、それにより所望のタンパク質の発現を細胞に改変させるように改変されている。関心のあるタンパク質を発現させるために遺伝子操作された細胞および／または細胞系のための方法およびベクターは、当業者によく知られている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８および季刊更新）およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に種々の技術が例示されている。
【０１０３】
本発明の下流処理法から得られた精製されたＦｃ融合タンパク質は、好ましくは、高度に精製された（高精製）Ｆｃ融合タンパク質である。高精製Ｆｃ融合タンパク質は、例えば、銀染色非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける単一バンドの存在により判定される。精製Ｆｃ融合タンパク質はまた、ＨＰＬＣにおいて単一ピークとして溶出することとして定められうる。
【０１０４】
本発明の精製プロセスから得られるＦｃ融合タンパク質調製物は、２０％未満の不純物、好ましくは１０％未満、５％未満、３％未満、２％未満または１％未満の不純物を含有することが可能であり、あるいはそれは均一状態（すなわち、後記のとおり例えば銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＨＰＬＣにより判定された場合に検出可能なタンパク質性汚染物を全く含有しない状態）まで精製されうる。
【０１０５】
精製Ｆｃ融合タンパク質は、治療用途、特にヒト患者への投与を意図したものでありうる。精製Ｆｃ融合タンパク質が患者に投与される場合、それは、好ましくは全身投与され、好ましくは皮下または筋肉内または局所的（すなわち局部的）に投与される。この目的には、本発明の精製Ｆｃ融合タンパク質は、医薬組成物に、すなわち医薬上許容される担体、賦形剤などと共に製剤化されうる。
【０１０６】
クロマトグラフィー工程
一般的に言えば、タンパク質の電荷、疎水性の度合またはサイズに基づいて、関心のあるタンパク質を混合物中に存在する他のタンパク質および汚染物から分離するために、クロマトグラフィー単位操作が用いられる。幾つかの異なるクロマトグラフィー樹脂がこれらの技術のそれぞれに利用可能であり、関連した個々のタンパク質に精製方式を厳密に適合化させることが可能である。これらの分離方法のそれぞれの本質は、タンパク質が異なる速度で長いカラムを移動して、それがカラムを通過するにつれて増進する物理的分離を達成し、または分離媒体に選択的に付着し、ついで、異なる溶媒により異なる様態で溶出されうることである。
【０１０７】
典型的には、モノクローナル抗体に関して開発された下流処理プラットホームは、捕捉工程としてプロテインＡアフィニティ精製工程を用い、ついで産物の純度および下流処理の頑強な操作を保証するのに十分な過剰を有する２以上の純化クロマトグラフィー工程を用いる。通常、純化工程の１以上はフロースルー様態（この場合、ＰＯＩは、不純物を保持するカラムに結合しない）で実施される。モノクローナル抗体の場合、ハドロキシアパタイト相互作用クロマトグラフィー工程（ＨＩＣ）およびアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）工程は、通常、フロースルー様態で実施され、高い等電点を有する傾向にある。
【０１０８】
プロテインＡ捕捉工程
プロテインＡは、細菌スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）により産生される４３，０００ダルトンのタンパク質であり、ＩｇＧのＦｃ領域への４つの結合部位を含有する。プロテインＧはＧ群連鎖球菌により産生され、ＩｇＧ  Ｆｃ領域への２つの結合部位を有する。どちらのタンパク質も、種々のタイプの免疫グロブリンに対するアフィニティに関して詳細に特徴づけられている。プロテインＡおよびプロテインＧへの結合部位は免疫グロブリンのＦｃ領域内に存在し、プロテインＡおよびプロテインＧアフィニティクロマトグラフィーは、いわゆるＦｃ融合タンパク質の精製を可能にする。
【０１０９】
プロテインＡは、哺乳類細胞培養内で発現されるモノクローナル抗体の製造のために開発された下流処理において広範に使用される。典型的には、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーは、中性ｐＨでｍＡｂ産物を直接的に捕捉するための第１精製工程として用いられ、通常、プロセス残渣（例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、宿主細胞ＤＮＡおよび培地成分）を除去するように意図された条件下で実施される。低ｐＨでプロテインＡカラムから溶出される産物は、通常、プロセスおよび産物関連不純物（凝集物、変異体およびミスフォールド産物を含む）を含有し、このため、後続のクロマトグラフィー工程が必要となる。
【０１１０】
アフィニティクロマトグラフィーに使用されるプロテインＡは組換え体でありうる。また、その特性（例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから商業的に入手可能なＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅと称される樹脂の場合）を改善するために、それを修飾することも可能である。一実施形態において、捕捉工程は、ＰＯＲＯＳ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ潅流クロマトグラフィー媒体を使用して行なわれる。ＰＯＲＯＳ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ媒体は、ｍＡｂの分取精製を意図した高分子媒体である。該媒体は、非常に迅速な物質移動のために最適化された細孔構造を有する強固な架橋ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）フロースルー粒子からなる。粒子表面はポリヒドロキシ化重合体でコーティングされており、これは組換えプロテインＡの共有結合固定化により更に誘導体化されている。
【０１１１】
本明細書に開示されている精製方法は、哺乳類宿主細胞および糖操作酵母株を含む真核発現系において産生されたＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質を結合させるための捕捉工程としてプロテインＡアフィニティクロマトグラフィー工程を用いる。実際、プロテインＡ単位操作は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を除去するように、Ｆｃ融合タンパク質流を濃縮するように、そしてＦｃ融合タンパク質凝集物を除去するように機能する。プロテインＡ捕捉工程のもう１つの目的は、ＰＯＩの全シアル酸（ＴＳＡ）の富化である。本明細書に示されているとおり、最適化実施パラメータを用いて、開示している下流処理法のプロテインＡ捕捉工程は、Ｆｃ融合タンパク質凝集レベルを０．５％〜３％の範囲の最終凝集レベルに減少させうる。宿主細胞タンパク質値も１０００ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの範囲に減少した。
【０１１２】
本明細書に開示されている方法においては、洗浄バッファーとしては６ｍＭ  リン酸ナトリウム  ５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）が好ましい。しかし、４００ｍＭ〜１Ｍの塩濃度および／または５．３〜ｐＨ７．０の範囲のｐＨの組合せも用いられうる。２ｍＭ〜３５ｍＭ  リン酸ナトリウムの範囲のリン酸ナトリウムバッファー強度も用いられうる。非産物関連不純物、例えば宿主細胞タンパク質、ＤＮＡおよび他の媒体関連添加物を除去するために、洗浄バッファーが使用される。
【０１１３】
本明細書に開示されている方法においては、クエン酸ナトリウムバッファーの５０ｍＭ〜１００ｍＭシトラートの溶出強度を組み込んだ直線勾配およびｐＨ５．０〜３．５の範囲の次第に減少するｐＨ勾配を用いて、ＰＯＩをプロテインＡから溶出する。プロテインＡ溶出工程は、酢酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムから選択されるバッファー中で行われうる。適当なバッファー濃度は、例えば５０ｍＭまたは１００ｍＭまたは１５０ｍＭまたは２００ｍＭから選択される。プロテインＡ溶出に要求される低ｐＨ条件は、しばしば、これらの産物の凝集の問題を引き起こしうる（Ｓｈｕｋｌａ，Ａ．Ａ．ら，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ．（２００７））。より高いｐＨおよびより低いバッファー強度から開始する勾配であるプロテインＡ擬似溶出は、浅いｐＨ転移曲線ゆえにプロテインＡ溶出中の凝集形成の作用を軽減する。また、より低いｐＨの溶出でのプロテインＡ産物流においては、より高いレベルの浸出プロテインＡリガンドが認められる。擬似勾配溶出は、産物流における高レベルの浸出プロテインＡリガンドの作用を抑制する。
【０１１４】
実際、免疫原性でありうるプロテインＡ残渣が溶出物中に浸出しうることを含む、プロテインＡ樹脂の使用に関連した幾つかの重大な欠点が存在し、これは、プロテインＡ残渣を除去するための追加的なクロマトグラフィー工程の使用を要する考慮すべき点である。他の欠点は、商業的規模の精製プロセスに使用される原料の全コストの３０％以上に相当しうる樹脂のコスト、および樹脂が水酸化ナトリウムのような衛生化溶液により容易に変性するため、樹脂の衛生化が困難であることを含む。
【０１１５】
イオン交換クロマトグラフィー
主に電荷の相違に基づくタンパク質の分離には、イオン交換クロマトグラフィー系が使用される。イオン交換クロマトグラフィーにおいては、周囲のバッファーのイオン強度が低ければ、溶質の表面上の荷電部分は、クロマトグラフィーマトリックスに結合した反対電荷により誘引される。ＩＥＸ樹脂上のタンパク質保持は主に静電的相互作用の働きによるものであるが、タンパク質と荷電表面との相互作用メカニズムは多形態であり、疎水性相互作用、水素結合およびファンデルワールス相互作用を包含する非静電的相互作用を含むことが公知である。
【０１１６】
溶出は、一般に、イオン交換マトリックスの荷電部位において溶質と競合するバッファーのイオン強度（すなわち、伝導度）を増加させることにより達成される。ｐＨを変化させそれにより溶質の電荷を変化させることは、溶質の溶出を達成するためのもう１つの方法である。伝導度またはｐＨの変化は漸進的（勾配溶出）または段階的（段階溶出）でありうる。
【０１１７】
タンパク質の「等電点」または「ｐＩ」は、タンパク質が、ゼロに等しい総実効電荷を有するときのｐＨ、すなわち、タンパク質が同数の正電荷および負電荷を有するときのｐＨである。いずれかの与えられたタンパク質のｐＩの決定は、十分に確立された技術に従い、例えば等電点電気泳動により行われうる。本発明の方法は、６．９〜９．５の範囲のｐＩを有するＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質を精製するために用いられる。
【０１１８】
ＩＥＸプロセスの最適化は、実施様態（結合および溶出またはフロースルー）、カラムの寸法、ローディングバッファー（種類、濃度、ｐＨ）、溶出様態（勾配、段階的、イソクラティック）、溶出勾配の傾き、および実施流速を含む多数の相互関連パラメータの考慮を要する。実際には、最も重要な因子は実施様態およびローディングｐＨである。
【０１１９】
ＣＥＸ
カチオン交換体は、弱または強カチオン交換体のいずれかとしても分類されうる。強カチオン交換体は、ｐＨ１〜１４で荷電したままである強酸（例えば、スルホプロピル基）を含有し、一方、弱カチオン交換体は、ｐＨが４または５未満に減少するにつれてその荷電を次第に喪失する弱酸（例えば、カルボキシメチル基）を含有する。カルボキシメチル（ＣＭ）およびスルホプロピル（ＳＰ）は対イオンとして例えばナトリウムを有する。
【０１２０】
本発明においては、プロテインＡクロマトグラフィー単位操作からの溶出液は、カチオン交換クロマトグラフィーに付される。カチオン交換クロマトグラフィーは、いずれかの適当なカチオン交換樹脂（例えば、弱または強カチオン交換体）上で行われうる。本発明の一実施形態において、結合および溶出様態で行われるＰＯＲＯＳ  ＨＳ強カチオン交換樹脂を使用して、ＣＥＸ精製工程が行われる。ＰＯＲＯＳ  ＨＳは潅流クロマトグラフィー様態でのペプチド、タンパク質および他の生体分子のカチオン交換クロマトグラフィーのための高分子充填物である。それは、非常に迅速な物質輸送のためのバイモーダル細孔径分布を有する架橋ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）フロースルー粒子からなる。粒子は、スルホプロピルで官能基化されたポリヒドロキシ化重合体で表面コーティングされている。ＰＯＲＯＳ  ＨＳは、１〜１４のｐＨ範囲にわたって完全な表面イオン化を有する強カチオン交換体である。ＰＯＲＯＳ  ＨＳは最高結合能を有し、大規模化につながる適用に推奨される。考慮されうる他の樹脂には、ソース（ｓｏｕｒｃｅ）３０Ｓ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰおよびＳＰセファロースが含まれる。
【０１２１】
Ｊｉａｎｇらは、糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において発現された組換え抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体を精製するための、ｐＨ４．５〜６．０でＮａＣｌ溶出勾配を用いるカチオン交換クロマトグラフィーの使用を開示している（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ７６：７  ２０１１））。
【０１２２】
開示している方法のカチオン交換クロマトグラフィーＣＥＸ工程は、好ましくは、結合および溶出様態で実施される。カチオン交換クロマトグラフィーは、好ましくは、ｐＨ４．０でＮａＣｌ溶出勾配を用いて行われる。このバッファーはまた、より低いｐＨでの実施の成功を可能にする安定化賦形剤（アルギニン）を含有する。本明細書に示されているとおり、ＣＥＸは、高いＴＳＡレベルを有するＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質を保持しながら、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡおよび浸出プロテインＡリガンドを効率的に除去することが判明している。開示している方法のＣＥＸ工程は、Ｆｃ含有タンパク質の中間精製工程を提供する。該工程は、宿主細胞タンパク質、Ｆｃ含有タンパク質凝集物およびＦｃ含有タンパク質の不完全な断片を低減し、減少させ又は除去し、そしてＦｃ含有タンパク質調製物を濃縮することを意図したものである。
【０１２３】
好ましくは、プロテインＡ溶出物（ＰＡＰ）は、カチオン交換カラム上に直接的にローディングされる。ローディングは、精製されるべきＦｃ融合タンパク質のｐＩより少なくとも１単位低いｐＨで行われることが好ましい。Ｆｃ含有タンパク質を含む流体をカチオン交換樹脂上にローディングする前に、プロテインＡ溶出物は、５未満、好ましくは約４のｐＨに調節され、あるいは代替手段として、ｐＨ約７で約４ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度まで水で希釈される。約４へのｐＨの調節が好ましい。なぜなら、それは、ロード容量を有意に増加させることなく濃酢酸の添加により容易に行われるからである。これは、カチオン交換樹脂へのＦｃ含有タンパク質の結合を可能にするのに不可欠である。
【０１２４】
ローディング後、ＣＥＸカラムを、好ましくはｐＨ４．０でアルギニンを含有する２０ｍＭ〜５０ｍＭ  リン酸系バッファーで洗浄する。工程中、タンパク質安定化賦形剤（すなわち、アルギニン、尿素）の存在下、および／またはより低い温度で、３．５〜６．０のｐＨ範囲（すなわち、ｐＨ３．８）が用いられうる。リン酸系バッファーの代わりに、酢酸系バッファー（２０〜５０ｍＭ）も使用されうる。ＣＥＸ洗浄では、平衡化条件の場合より高いが溶出伝導度より低い中間的な伝導度（すなわち、８ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ、１２ｍＳ／ｃｍ）を用いうる。
【０１２５】
本発明のＣＥＸ工程においては、Ｆｃ含有タンパク質は、次第に増加する塩勾配を用いて、Ｆｃ含有タンパク質の等電点より約１単位低いｐＨでカチオン交換樹脂から溶出される。Ｆｃ含有タンパク質の溶出は、いずれかの適当な塩（例えば、ＮａＣｌまたはＫＣｌ）を使用して行われうる。一実施形態において、本発明の方法における次第に増加する塩勾配は、好ましくは、浅いＮａＣｌ勾配である。好ましくは、Ｆｃ含有タンパク質は、約１０〜約５０ｍＳ／ｃｍの伝導度で約３．５〜約６．０のｐＨで、次第に増加するＮａＣｌ勾配でカチオン交換樹脂から溶出される。約１０〜約６０ｍＳ／ｃｍの範囲の伝導度勾配は、０ｍＭ〜約４００ｍＭまたは６００ｍＭまたは８００ｍＭまたは１０００ｍＭまたは１２００ｍＭまで塩化ナトリウム濃度を増加させることにより得られうる。ｐＨは勾配中に一定に維持され、３．５〜６．０でありうる。
【０１２６】
あるいは、凝集物およびＨＣＰの溶出を妨げる伝導度およびｐＨのバッファーでイソクラティック溶出が行われうる。好ましくは、Ｆｃ含有タンパク質は、約１０〜約５０ｍＳ／ｃｍの範囲の伝導度で約３．５〜約６．０のｐＨで段階勾配によりカチオン交換樹脂から溶出される。約１０〜約６０ｍＳ／ｃｍの伝導度のイソクラティック溶出は、塩化ナトリウム濃度を約４００ｍＭまたは６００ｍＭまたは８００ｍＭまたは１０００ｍＭまたは１２００ｍＭから進めることにより得られうる。結合中に用いられたものより高いｐＨへの増加も溶出工程として用いられうる。
【０１２７】
アルギニンは、タンパク質凝集を抑制するのに有効であることがよく知られており、カラムクロマトグラフィー中にそれを適度な濃度で加えることが一般的な慣行である（Ａｒａｋａｗａ，Ｔら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ５４：１１０（２００７））。ＣＥＸ洗浄および溶出バッファーは、より低いｐＨでの実施の成功を可能にする安定化賦形剤（例えばアルギニン）をも含有する。ＴＮＦＲ−ＦＣ含有溶液中の５ｍＭ〜４００ｍＭの賦形剤（例えば、アルギニン、グアニジン）の存在は、タンパク質が凝集および／または断片化する傾向を低下させ、幾つかの場合には、作用、凝集またはミスフォールドを逆転させうる。安定化賦形剤の非存在下、許容されないレベルの凝集がＣＥＸ工程中に生じうる。
【０１２８】
本発明においては、カチオン交換クロマトグラフィーは、好ましくは、２〜５倍の範囲の汚染プロテインＡの除去または減少のために用いられうる。
【０１２９】
また、開示している本発明の方法の最適化ＣＥＸ単位操作は、Ｆｃ融合タンパク質調製物からの宿主細胞タンパク質の濃度をも例えば２〜５倍の範囲で減少させ、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の消失に有意に寄与する。
【０１３０】
Ｆｃ含有タンパク質の溶出は２８０ｎｍでの吸光度によりモニターされ、吸光度のピークの減少期に画分が集められる。ついで、溶出のピークの尾部において凝集物およびＨＣＰを回避しＴＳＡレベルを富化させるように、画分がプールされ、これは本明細書においては「尾部の除外」と称される。溶出のピークの尾部は特徴的な肩部を示しうるが、これは、好ましくは、主要ピークから除去されうる。
【０１３１】
ＡＥＸ
アニオン交換体は弱または強アニオン交換体のいずれかとして分類されうる。弱アニオン交換体上の荷電基は弱塩基であり、これは高いｐＨでは脱プロトン化され、したがってその電荷を失う。ＤＥＡＥ−セファロースは弱アニオン交換体の一例であり、この場合、アミノ基はｐＨ９未満では正に荷電することが可能であり、より高いｐＨ値では徐々にその電荷を失う。ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）またはジエチル−（２−ヒドロキシ−プロピル）アミノエチル（ＱＡＥ）は、例えば塩化物イオンを対イオンとして有する。逆に、強アニオン交換体は強塩基を含有し、これは、イオン交換クロマトグラフィーに通常用いられるｐＨ範囲（ｐＨ１〜１４）の全体において正に荷電したままである。Ｑ−セファロース（Ｑは第四級アンモニウムを表す）は強アニオン交換体の一例である。
【０１３２】
本発明においては、カチオン交換工程からの溶出物を、次いで本発明における産物純化工程として利用されるアニオン交換クロマトグラフィーに付す。本発明においては、カチオン交換工程からの溶出物をアニオン交換クロマトグラフィーに付す。アニオン交換クロマトグラフィーは弱または強アニオン交換体のようないずれかの適当なアニオン交換樹脂上で行われうる。ＰＯＲＯＳ  ＨＱなる名称で商業的に入手可能なカラムは、本方法のＡＥＸ単位操作に特に適したアニオン交換樹脂の一例である。
【０１３３】
ＰＯＲＯＳ  ＨＱは、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドおよび他の生体分子のアニオン交換クロマトグラフィー用に設計された高分子充填樹脂である。それは、非常に迅速な物質輸送のための特許権化されたバイモーダルな細孔径分布を有する架橋ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）フロースルー粒子からなる。ＰＯＲＯＳ  ＨＱ媒体は、完全に第四級化されたポリエチレンイミンで表面コーティングされている。それは、１〜１４のｐＨ範囲にわたって完全な表面イオン化を有する強アニオン交換体である。
【０１３４】
典型的には、ＣＥＸカラム溶出物を適当なローディングバッファー中に希釈または透析した後、アニオン交換カラム上にそれをローディングする。アニオン交換カラムは、ローディングバッファーで平衡化される。ローディングバッファーの好ましいｐＨはｐＩより１単位高い。適当なｐＨ値は６．０〜８．５の範囲である。ローディングバッファーの好ましい伝導度は、２．０〜４．６ｍＳ／ｃｍの範囲である。開示している精製プロセスにおいて使用される適当な平衡化／ローディングバッファーは、５〜３５、好ましくは２０〜３０ｍＭの範囲の濃度のリン酸ナトリウムである。溶出バッファーの好ましいｐＨは、ｐＩより１単位高い。適当なｐＨ値は６．０〜８．５の範囲である。溶出バッファーの好ましい伝導度は、７〜２０ｍＳ／ｃｍの範囲である。適当な溶出バッファーは、例えば、５〜３５、好ましくは７０〜２００ｍＭの範囲の濃度のリン酸ナトリウムでありうる。
【０１３５】
開示している本発明の下流処理法の最適化ＡＥＸ単位操作は、更に、凝集物を１〜２倍、及び宿主細胞タンパク質を１〜５倍減少させる。ＡＥＸクロマトグラフィーは、更に、ＴＳＡレベルを富化させ、残存プロセス残渣を除去する。好ましくは、Ｆｃ含有タンパク質の溶出を伴う０ｍＭ〜１００ｍＭのＮａＣｌ勾配溶出は、２８０ｎｍでの吸光度によりモニターされ、吸光度のピークの減少期に画分が集められる。ついで、凝集物およびＨＣＰを回避するように画分がプールされる。ピークの尾部は富化ＴＳＡレベルを含む。
【０１３６】
限外濾過
本発明の精製プロセスは、１以上の限外濾過工程を含む。限外濾過は、これまでのクロマトグラフィー工程から得られた溶出液中の小さな有機分子および塩の除去、下流精製プロセスの次工程に必要なバッファー中へのＦｃ融合タンパク質の平衡化、または所望の濃度へのＦｃ融合タンパク質の濃縮に有用である。そのような限外濾過は、５、１０、１５、２０、２５、３０ｋＤａ未満またはそれ以上の分子量を有する成分の除去を可能にする細孔径を有する限外濾過膜上で行われうる。
【０１３７】
本発明の方法により精製されるタンパク質がヒトへの投与を意図したものである場合、ウイルス除去の１以上の工程をプロセス中に含めることが有利である。実際、最終クロマトグラフィー工程の後、バルク産物の製剤化の前に、ウイルス除去濾過工程が行われる。
【０１３８】
本発明の種々の特徴を更に例示するために、以下に実施例を記載する。実施例は、本発明を実施するための有用な方法をも例示する。これらの実施例は、特許請求している本発明を限定するものではない。
【０１３９】
略語の解説
アニオン交換クロマトグラフィー：ＡＥＸ
アニオン交換産物：ＡＥＸＰ
カチオン交換クロマトグラフィー：ＣＥＸ
カチオン交換産物：ＣＥＸＰ
キャピラリー等電点電気泳動：ｃＩＥＦ
細胞培養上清：ＣＣＳ
チャイニーズハムスター卵巣：ＣＨＯ
カラム体積：ＣＶ
宿主細胞タンパク質：ＨＣＰ
精密濾過：ＭＦ
精密濾過産物：ＭＦＰ
クエンチ化プロテインＡ産物：ＱＰＡＰ
プロテインＡクロマトグラフィー：ＰｒＡ
プロテインＡ産物：ＰＡＰ
限外濾過２：ＵＦ２
限外濾過２産物：ＵＦ２Ｐ
限外濾過４：ＵＦ４
限外濾過４産物：ＵＦ４Ｐ
ＴＳＡ：全シアル酸
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】図１は、糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において産生されたＴＮＦＲ：Ｆｃに関する精製スキームを示す。
【図２】図２は、ＣＨＯ細胞において産生されたＴＮＦＲ：Ｆｃに関する精製スキームを示す。
【図３】分析ＨＩＣクロマトグラム上のＭａｂＳｅｌｅｃｔおよびＰｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ  ＱＰＡＰ流の比較。
【図４Ａ】プロテインＡ溶出条件の開発。本発明者らは、プール化プロテインＡ産物におけるミスフォールドおよび凝集物の減少と共に、ＴＳＡレベルの富化を観察した。
【図４Ｂ】プロテインＡ溶出条件の開発。本発明者らは、プール化プロテインＡ産物におけるミスフォールドおよび凝集物の減少と共に、ＴＳＡレベルの富化を観察した。
【図５】遠心分離の経過に対する供給速度および上清濁度。灰色の実線は、４７００ｒｐｍで２０分間のバッチ遠心分離から得られた上清濁度を示す。
【図６】ローディングの関数としてのフラックス（流束）および濁度により決定されたＭＦの性能。
【図７】溶出プロファイルおよび対応ＴＳＡ値のＣＥＸの再生。ＴＳＡ値は参照化合物に対するものとして示されている。点線は、最終産物に関して特定された最小ＴＳＡ比率（％）を表す。
【図８】イオン勾配溶出にわたるＣＥＸ画分のｃＩＥＦ電気泳動図。
【図９】カラム伝導度の関数としてのＡＥＸ  ＴＳＡプロファイル。ＴＳＡ値は参照化合物に対するものとして示されている。点線は、最終産物に関して特定された最小ＴＳＡ比率（％）を表す。
【図１０】イオン勾配溶出にわたるＡＥＸ画分のｃＩＥＦ電気泳動図。
【図１１】Ｍ００１０６８１精製の経過における不純物の消失。
【図１２】最終製剤化バルクのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析。
【図１３Ａ】プロテインＡクロマトグラフィー中のＣＨＯ細胞系における２つのクローンの溶出産物プロファイル。
【図１３Ｂ】プロテインＡクロマトグラフィー中のＣＨＯ細胞系における２つのクローンの溶出産物プロファイル。
【図１４】収率の関数としてのプール化プロテインＡ画分のＴＳＡレベル。ＴＳＡ値は参照化合物に対するものとして示されている。
【図１５Ａ】参照化合物と比較された、ＣＨＯ細胞系クローン１８Ｇ１０からのプロテインＡ溶出画分に関するｃＩＥＦプロファイル。
【図１５Ｂ】参照化合物と比較された、ＣＨＯ細胞系クローン１８Ｇ１０からのプロテインＡ溶出画分に関するｃＩＥＦプロファイル。
【図１６】参照化合物と比較された、ＣＨＯ細胞系クローン２３Ｄ８からのプロテインＡ溶出画分に関するｃＩＥＦプロファイル。
【図１７Ａ】ＣＥＸクロマトグラフィー中のＣＨＯ細胞系における２つのクローンの溶出産物プロファイル。
【図１７Ｂ】ＣＥＸクロマトグラフィー中のＣＨＯ細胞系における２つのクローンの溶出産物プロファイル。
【図１８】収率の関数としてのプール化ＣＥＸ画分のＴＳＡレベル。ＴＳＡ値は参照化合物に対するものとして示されている。
【図１９Ａ】参照化合物と比較された、ＣＨＯ細胞系クローン２３Ｄ８からのＣＥＸ溶出画分に関するｃＩＥＦプロファイル。
【図１９Ｂ】参照化合物と比較された、ＣＨＯ細胞系クローン２３Ｄ８からのＣＥＸ溶出画分に関するｃＩＥＦプロファイル。
【図２０】参照化合物と比較された、ＣＨＯ細胞系クローン１８Ｇ１０からのＣＥＸ溶出画分に関するｃＩＥＦプロファイル。
【図２１Ａ】ＡＥＸクロマトグラフィー中のＣＨＯ細胞系における２つのクローンの溶出産物プロファイル。
【図２１Ｂ】ＡＥＸクロマトグラフィー中のＣＨＯ細胞系における２つのクローンの溶出産物プロファイル。
【図２２】収率の関数としてのプール化ＡＥＸ画分のＴＳＡレベル。ＴＳＡ値は参照化合物に対するものとして示されている。
【図２３Ａ】参照化合物と比較された、ＣＨＯ細胞系クローン２３Ｄ８からのＡＥＸ溶出画分に関するｃＩＥＦプロファイル。
【図２３Ｂ】参照化合物と比較された、ＣＨＯ細胞系クローン２３Ｄ８からのＡＥＸ溶出画分に関するｃＩＥＦプロファイル。
【図２４】参照化合物と比較された、ＣＨＯ細胞系クローン１８Ｇ１０からのＡＥＸ溶出画分に関するｃＩＥＦプロファイル。
【０１４１】
実施例
実施例１：クロマトグラフィー単位操作の最適化
方法および材料
ヒトＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質を含有するピチア（Ｐｉｃｈｉａ）培養発酵ブロスから集めた遠心分離液を、更に精密濾過により清澄化し滅菌濾過した。濾液を４℃で保存し、全ての実験のための供給物として使用した。
【０１４２】
クロマトグラフィー工程の全ては、ＵＮＩＣＯＲＮソフトウェアを備えたＡＫＴＡエクスプローラー（ｅｘｐｌｏｒｅｒ）を使用して実験的規模のカラム上で行った。遠心分離液をカラム上に供給し、ついでカラムを洗浄した。ついで、結合産物を有するプロテインＡ樹脂を再懸濁させ、生じたスラリーを９６ウェルフィルタープレートのウェル内に分注した。液体操作アーム、ロボット操作アーム、真空濾過、磁気撹拌装置およびマイクロプレートリーダー（ＭＡＧＥＬＬＡＮソフトウェアを伴う）を備えたＴＥＣＡＮ装置上でＧＥＮＥＳＩＳソフトウェアを使用するハイスループット法を用いて、代替的洗浄／溶出条件を評価した。
【０１４３】
分析用ＨＩＣブチルカラムを使用して、完全な、凝集した、およびミスフォールドした産物が検出された。マイクロタイタープレート上で４１０ｎｍでのＵＶを用いてＨＣＰを検出し、３ｍｌのサイズ排除カラムを使用して単量体含量を評価した。分析用プロテインＡカラムを使用して、正確な力価計算を行った。
【０１４４】
樹脂およびバッファー
本発明の下流精製プロセスを最適化するために、３つのクロマトグラフィー工程のそれぞれを個別に最適化した。表２８は、最適化プロセス中に評価された樹脂を特定しており、本プロセスを開発するために用いたハイスループット最適化スクリーニングにおいて評価されたバッファーの全ての概要を示す。
【表１】
2014520814.tif 000003
【０１４５】
2014520814.tif 000004
【０１４６】
処理サンプルにおける残存ＤＮＡの定量のための方法は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）のＱｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡキットを使用する。Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ試薬は、二本鎖ＤＮＡに選択的に結合する蛍光色素である。提供されたλＤＮＡ標準物から標準曲線を作成し、サンプルを希釈し、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）試薬を加え、励起４８５ｎｍ、発光５３５ｎｍにおける蛍光を測定する。アッセイ全体はＴｅｃａｎワークステーション上で自動化されている。
【０１４７】
治療用タンパク質処理中間体および最終産物における残存宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および残存プロテインＡ（クロマトグラフィーカラムから浸出したもの）を定量するための方法。該方法は、９６ウェルマイクロプレート内で行われる酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。マイクロプレートを抗ＨＣＰまたは抗プロテインＡポリクローナル抗体でコーティングし、ついで、１％  ＢＳＡおよび０．０５％  ポリソルベート−２０を含有するアッセイ希釈剤でブロッキングする。ついで校正曲線およびサンプルを調製し、プレートに加える。捕捉工程後、ビオチン化抗ＨＣＰまたは抗プロテインＡポリクローナル抗体をプレートに加えて、免疫複合体を形成させる。この複合体は、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲートおよび蛍光性基質４−メチルウンベリフェリルホスファート（４−ＭＵＰ）の添加により検出される。濃度の対数に対して蛍光強度をプロットすることにより、標準曲線を作成する。曲線を４パラメータロジスティック式にフィットさせ、曲線からの内挿により未知サンプル濃度を決定する。このアッセイはＴｅｃａｎワークステーション上で完全に自動化される。
【０１４８】
酵素活性（ＥＣ５０）はμｍｏｌ／分として絶対値で示されうる。したがって、１単位の酵素活性は、１分間当たりに１／μｍｏｌの基質の変換を触媒する酵素の量である。この量は、１または１００％の絶対値を有する参照体に対して測定される（Ｒｏｅ，Ｓ．編，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２ｎｄ  ｅｄ．３６−３８（２００１））。
【０１４９】
プロテインＡクロマトグラフィーの最適化
下流処理方式の一次捕捉工程は、最適収率で不純物を除去するパラメータを用いて実施された場合、後続のクロマトグラフィー工程に対する負担を有意に減少させうる。したがって、適切にフォールドした産物を富化し、ＴＳＡを増加させ、凝集物のレベルを最小にし、ＰＡＰ中に存在する宿主細胞タンパク質の量を減少させる能力について、代替的プロテインＡ樹脂を評価するために、ハイスループットスクリーニング法（ＨＴＰＳ）を用いた。
【０１５０】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕｒｅおよびＰｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ａ潅流媒体を、２０ｍｌカラムを使用して評価した。樹脂スクリーニング法は５ＣＶの２５ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）を平衡化バッファーとして使用し、ついでカラムを同じバッファーで洗浄した（洗浄１、２ＣＶ）。結合タンパク質を有する再懸濁された樹脂をフィルタープレート内に分注し、洗浄２（３ＣＶの平衡化バッファー）のためのスラリー法、および５０〜１００ｍＭ  クエン酸バッファー（ｐＨ３．４〜４．５）を使用する溶出（溶出５ＣＶ  ５０〜１００ｍＭ  シトラート  ｐＨ３．４〜４．５，５ＣＶ  １００ｍＭ  シトラート  ｐＨ３．５）を実行するように、ＴＥＣＡＮをプログラムする。全ての３つの樹脂に関して同等の物質収支が得られた。
【０１５１】
濾過を各カラム上にローディングし、前記樹脂スクリーニング法を用いて精製した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ｓｕｒｅカラムはｐＨ４で低い収率を示し、更なる考慮から除外された。全ての３つの樹脂に関して同等の物質収支が得られた。Ｐｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａは、適切にフォールドした産物の溶出において、ＭａｂＳｅｌｅｃｔと比較して２倍より高い選択性をもたらして、クエンチ化プロテインＡ産物（ＱＰＡＰ）のより高い純度を与えることが観察された。
【０１５２】
分析用ＨＩＣクロマトグラムは、適切にフォールドした産物に関するＰｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａの選択性の増加を示した。ＴＮＦＲ：Ｆｃは、画分＃１（ＴＮＦＲ：Ｆｃ断片を含む）、画分＃２（適切にフォールドしたＴＮＦＲ：Ｆｃを含む）および画分＃３（ミスフォールドしたジスルフィド混合性ＴＮＦＲ：Ｆｃ変異体および凝集タンパク質産物）と称される３つの異なるピークとして、疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）から溶出する（図１を参照されたい）。タンパク質凝集はバイオプロセシングにおける一般的な問題であり、発現、精製または貯蔵中に生じうる。凝集は、高レベルの高分子量種を含有するＦｃ融合調製物の精製を意図した下流処理における特別な課題であり、タンパク質のアミノ酸配列、タンパク質の複雑さ、温度、ｐＨ、ならびにバッファー中に存在するイオンのタイプおよびバッファーのイオン強度のような実験的変数に左右される。
【０１５３】
画分＃２が所望の画分である。図１のクロマトグラムに示されているデータは、Ｐｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ樹脂から得られたＱＰＡＰが、僅か約１５％の適切にフォールドした産物を含むに過ぎないＭａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂より有意に多量（すなわち、約４０％の所望の産物）の完全に適切にフォールドした産物を含むことを示している。
【０１５４】
プロテインＡ捕捉工程の性能を更に最適化するために、前記と同じ試薬および工程を用いる追加的なＨＴＰＳ実験を行って、Ｆｃ融合タンパク質源として供給される天然およびリフォールド培地を使用するＰｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａの選択性を評価した。結果は、Ｐｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ樹脂が、完全に適切にフォールドした産物（すなわち、ＨＩＣクロマトグラフのピーク＃２に存在するタンパク質）に対する高い選択性を示し続け、そしてＱＰＡＰの純度および収率が供給されたリフォールド培地を使用した場合にほぼ２倍増加したことを示した。
【０１５５】
ＨＣＰおよびＤＮＡの消失の関数としての洗浄条件の効率を種々のｐＨ値における種々の塩濃度において評価した。結果は、ＨＣＰ除去が疎水性条件および静電的条件の両方によりもたらされることを示している。一般に、より良好なＨＣＰ消失はより低いｐＨにおいて観察され、より良好なＤＮＡ消失はより高い洗浄ｐＨにおいて観察された。したがって、ＨＣＰおよびＤＮＡの両方のレベルを減少させるための最適な洗浄条件が選択された。データは、最適な洗浄条件が、調査範囲に基づくより低いｐＨおよび中等度ないし低いイオン強度を要することを示唆した。
【０１５６】
クエン酸バッファー強度（５０ｍＭまたは１００ｍＭ）およびｐＨ（３．５〜４．５の範囲）の関数としての、産物の収率および純度ならびに溶出画分中に存在するＴＳＡ含量を調べることにより、溶出条件も最適化した。ＴＮＦＲ：Ｆｃを、ｐＨ勾配を用いてプロテインＡカラムから溶出した。凝集物およびミスフォールド体の分離のための選択性を更に増加させるために、直線勾配を用いた。画分を集め、分析した後、プール化した。図４Ａに示されているデータは、調査ｐＨ範囲にわたる回収に基づけば、５０ｍＭ  クエン酸バッファーが低い収率を有することが観察されたことを示している。１００ｍＭ  クエン酸バッファーの場合、純度（例えば、ピーク２含量）は調査ｐＨ範囲にわたって比較的高かったが、収率は、ｐＨ範囲の低末端において顕著により低く、ｐＨ約４において最適であるようであった。ｐＨがｐＨ３．８未満に減少するにつれて、溶出液中のピーク＃３の物質の量が次第に増加することにより、より低い純度となった。許容されうる画分における凝集物またはミスフォールドのレベルは１％未満（すなわち、０．５％〜３．０％）であった。
【０１５７】
ＴＳＡレベルに関しては、より早く溶出した画分が最高ＴＳＡレベルを示した。高いＴＳＡを有する種は、一般に、より低いｐＩ値を有することが観察された（図４Ｂ）。したがって、正しくフォールドしたＴＮＦＲ：Ｆｃの純度および収率を最大にするためには、中間的なｐＨでより高いクエン酸濃度でプロテインＡ溶出を行うべきであると結論づけられた。プロテインＡ溶出液のＴＳＡレベルは、エタネルセプト参照品に関して計算されたレベルに類似していると判定された。
【０１５８】
ＣＥＸの最適化
カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を第１純化工程（プロテインＡの後）として用いた。２０ｍＬカラムを使用して、ＣＥＸ工程を最適化した。ＣＥＸ工程に供給されるプロテインＡ産物をｐＨ４．０に滴定し、ついでカラムにローディングした。ついで、カラムを、２５ｍＭ  リン酸ナトリウム、２５ｍＭ  アルギニン（ｐＨ４．０）で洗浄し、異なる直線勾配の傾き（４つの異なる勾配の傾き、すなわち、１０ＣＶ、２０ＣＶ、３０ＣＶ、４０ＣＶおよび５０ＣＶで、１００％  ２５ｍＭ  リン酸ナトリウム、２５ｍＭ  アルギニン（ｐＨ４．０）から１００％  ２５ｍＭ  リン酸ナトリウム、２５ｍＭ  アルギニン、＋１  ＮａＣｌ（ｐＨ４．０）へ）で溶出を行った。画分を集め、ついで分析した。結果は、断片、凝集物およびミスフォールド体の分離ならびに付随的なＴＳＡレベルの増加のための最適な選択性が４０ＣＶの勾配の傾きで達成可能であったことを示している。
【０１５９】
ＡＥＸの最適化
アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）を最終純化工程として用いた。２０ｍＬカラムを使用して、ＡＥＸ工程を最適化した。ＡＥＸ工程に供給されるＣＥＸ産物を、調製において、３０ｋＤａの２．５ｍ２  再生酢酸セルロース膜を使用して１２．５ｍＭ  リン酸Ｎａ（ｐＨ６．３）中にバッファー交換し、ついで供給物をカラム上にローディングした。ついでカラムを２５ｍＭ  リン酸ナトリウム、２５ｍＭ  アルギニン（ｐＨ４．０）で洗浄し、異なる直線勾配の傾き（４つの異なる勾配の傾き、すなわち、１０ＣＶ、２０ＣＶ、３０ＣＶ、４０ＣＶおよび５０ＣＶで、１００％  ２５ｍＭ  リン酸ナトリウム、２５ｍＭ  アルギニン（ｐＨ４．０）から１００％  ２５ｍＭ  リン酸ナトリウム、２５ｍＭ  アルギニン、＋１  ＮａＣｌ（ｐＨ４．０）へ）で溶出を行った。画分を集め、ついで分析した。
【０１６０】
実施例２：糖操作ピチア・パストリス発酵からの組換えヒトＴＮＦＲ：ＦＣの精製
この実験の主要目的は、小規模精製実験およびハイスループットスクリーニング法を用いて最適化された前記単位操作を含む精製プロセスの大規模化を実証することであった。
【０１６１】
実際、プロテインＡクロマトグラフィーの目的は、産物における全シアル酸（ＴＳＡ）の富化ならびに凝集物およびミスフォールドの減少である。中間ＣＥＸクロマトグラフィー工程の目的は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡおよび浸出プロテインＡリガンドを消失させながら、高いＴＳＡレベルを有するＰＯＩを保持することを含む。ＴＳＡレベルを更に富化させ、残存プロセス残渣を除去するために、ＡＥＸ純化クロマトグラフィー工程を用いる。
【０１６２】
方法および材料
プロテインＡ樹脂−Ｐｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａは、結合および溶出様態で使用される。カチオン交換樹脂−ＰＯＲＯＳ  ＨＳ強カチオン交換吸着体は、結合および溶出様態で使用される。アニオン交換樹脂−ＰＯＲＯＳ  ＨＱ樹脂は、結合および溶出様態で使用される。全てのバッファーはＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標）Ｒａｐｉｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇから供給され、必要に応じて、塩および濃縮し調整した塩および／またはｐＨを調節した。分析用プロテインＡ  ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００系列クロマトグラフィー系と共に使用されるＰＯＲＯＳ  ５０Ａ）により、応答係数５６３０で、および１．２の吸光係数（ε）を用いるプロテインＡ精製後のＵＶ／ＶＩＳにより、インプロセス（ｉｎ−ｐｒｏｃｅｓｓ）タンパク質濃度を決定した。
【０１６３】
Ａ．発酵ブロスの回収前処理
ＴＮＦＲ：Ｆｃの発酵を５５時間のメタノール誘導の後に終結させ、遠心分離の開始前に、温度、システイン濃度およびｐＨに関して調節した。発酵ブロスを、発酵リアクターのジャケット付き冷却系を使用して、まず４〜１０℃に冷却した。１１Ｌの２５０ｍＭ  システイン塩酸塩一水和物（ｐＨ８．５）を発酵槽に加えて、発酵ブロス内の最終システイン濃度を５ｍＭにした。２９Ｌの１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍの添加により、６．５５の初期ｐＨから、８．６の標的ｐＨを得た。表１は細胞培養の回収前処理のためのプロセスパラメータを要約している。
【０１６４】
発酵ブロスから回収されたミスフォールドＰＯＩ産物に、正しくリフォールドする機会を与え、それにより、正しくフォールドしたＰＯＩの収率を増加させるために、ジスルフィド異性化を促進する条件を与えるように、発酵ブロスの回収前処理は設計される。表１は細胞培養の回収前処理のプロセスパラメータを要約している。
【０１６５】
回収前処理の最適な実施ｐＨはｐＨ８．６（８．０〜９．０の範囲）であることが確認された。一般に、低い温度は、室温での処理より有効であることが観察され、リフォールディング効率はタンパク質濃度に無関係であった。試験された有効なリフォールディング剤（塩化グアニジン、アルギニン、システインならびにシステインおよびシスチンを含む）は、システインとシスチンとの組合せであった。一般に、バイオリアクターｐＨ工程前処理工程は、糖操作ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）発酵から集められたＴＮＦＲ：Ｆｃの収率および純度の両方を改善した。
【表２】
2014520814.tif 000005
【０１６６】
Ｂ．遠心分離
初期一次回収工程は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞バイオマスの除去のために、ディスク・スタック遠心分離を用いて行った。処理細胞培養を、ＷＥＳＴＦＡＬＩＡ  ＣＳＣ−６連続ディスク・スタック遠心機を使用して、０．７３Ｌ／分および９４７０ＲＰＭで処理した。ＣＳＣ−６は２５０ｍＬの固体保持空間と共に６００ｍＬのボール体積を有する。蠕動ポンプを使用して、細胞培養をバイオリアクターの底出口から遠心機供給入口に送り出した。遠心分離上清を、精密濾過（ＭＦ）による処理のために冷却保持タンク内に送り出し、遠心分離放出物を分析および廃棄のためにドラム内に集めた。工程収率を最大にするために、細胞培養を遠心分離により処理した後、発酵槽に２５Ｌの６ｍＭ  リン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．６）を流した。
【０１６７】
遠心分離放出物中の固体を７０〜８０％に維持しながらディスク・スタック遠心分離上清の濁度をバッチ遠心分離上清のものに合致させるために、遠心分離の最初の３０分間に、遠心分離実施条件を最適化した。ついで最適化実施条件を、遠心分離工程の残りに一定に維持した。表２は遠心分離工程の実施条件および処理パラメータを要約している。
【表３】
2014520814.tif 000006
【０１６８】
図５は、遠心分離過程の経過にわたる、ディスク・スタック遠心分離上清の濁度、サンプルバッチ遠心分離上清の濁度、およびディスク・スタック遠心機内への供給速度を示す。上清サンプルを３０分ごとに採取し、氷中で３０分間冷却した後、濁度を測定した。遠心分離上清に関して観察された高い濁度（〜４００ＮＴＵ）に注目することが重要である。この濁度は、これまでに処理されたバッチ（通常、ｐＨ８．６で処理された場合、２５０〜３００ＮＴＵ）より有意に高かったが、それはバッチ遠心分離後の濁度（３８５ＮＴＵ）に良く合致した。また、濁度はバッチ全体にわたって比較的一定であったが、このことは、遠心分離単位操作中に細胞溶解が最小であったことを示唆している。ＭＦ膜上への１３５Ｌ／ｍ２を超える遠心分離上清のローディングの成功と関連して、データは、高い濁度測定値に関する考えられうる説明が、濁度アッセイを妨げた脂質またはコロイドの存在であることを示唆している。
【０１６９】
Ｃ．精密濾過および滅菌濾過
精密濾過を用いて、遠心分離上清を更に清澄化した。一定の浸透流束で行ったこの単位操作は、０．１μｍのカットオフおよび２．５ｍ２の面積を有するＰＡＬＬ  ＳＵＰＯＲ再生酢酸セルロース精密濾過膜を使用した。遠心分離上清を保持タンクから膜内に導くために、蠕動ポンプを使用した。ＭＦ浸透物（産物）を、生物負荷の軽減のために、０．２２μｍフィルターを介して送り出し、２００Ｌの無菌バッグ内で４℃で貯蔵し、一方、ＭＦ保持物を保持タンク内に再循環させた。約７５Ｌの遠心分離上清の蓄積の後、精密濾過を開始させた。約５０Ｌを保持タンク内に残存させて、一定容量の透析濾過を行い、３通過体積（１５０Ｌ）の６ｍＭ  リン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．６）の後で完了させた。追加的な遠心分離上清の蓄積を可能にするために、実施の８〜９時間の間、ＭＦを中断した。表３は、精密濾過（ＭＦ）および滅菌濾過工程に関するプロセスパラメータおよび結果を要約している。
【表４】
2014520814.tif 000007
【０１７０】
図６はＭＦの経過にわたるフラックス、貫膜圧（ＴＭＰ）および浸透濁度を示す。遠心分離上清の高い濁度にもかかわらず、透過フラックスおよび貫膜圧（ＴＭＰ）は、それぞれ、〜１３ＬＭＨおよび１ｐｓｉｇでほぼ一定であった。
【０１７１】
Ｄ．プロテインＡクロマトグラフィー
ＴＮＦＲ：Ｆｃの精製における初期捕捉工程として、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを用いた。ＵＮＩＣＯＲＮ（登録商標）バージョン５．２を備えたＧＥ  ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｓｋｉｄ  ｉｎ  ＦＰＰ  （ＣＣＳ−１４４４）をプロテインＡクロマトグラフィー工程に使用した。滅菌濾過ＭＦ産物を、ＢＰＧ（ＣＯＬ−５６−１１９０−３０）２０ｃｍ  ＩＤ×１９．５ｃｍ（ＢＰＧ  ２００／５００）において、充填された５．２Ｌのカラム上にローディングした。溶出は、クエン酸ナトリウムバッファーの溶出強度、およびｐＨ５．０〜３．５の範囲のｐＨ勾配を含む直線勾配に基づくものであり、主要産物ピークにわたる１ＣＶの画分を集めた。
【０１７２】
プロテインＡ産物収集のためのプール化法は、小規模実験により集められたこれまでのＴＳＡデータに基づくものである。予想どおり、プロテインＡに関する実施パラメータは、低レベルのミスフォールド体および関連凝集物と共に、ピークの前方に向かうＴＳＡに富む産物を与えた。表４はプロテインＡクロマトグラフィー工程に関する実施条件および結果を要約している。
【表５】
2014520814.tif 000008
【０１７３】
Ｅ．滴定１
プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー画分２〜５を、次のクロマトグラフィー工程上にローディングする前に、ｐＨ４．０に滴定した。滴定は、まず、０．５ｍ  酢酸を使用して行った。１０％ｖ／ｖの滴定液を加えた後、酸強度を増加させるために、それをＤＩ水中の５０％氷酢酸に変更した。滴定１に関するプロセス情報を表５に要約する。
【表６】
2014520814.tif 000009
【０１７４】
プロテインＡ産物（ＰＡＰ）は、４〜８℃の温度範囲で保存された場合に１６時間まで安定であることが観察された。ＰＡＰの滴定およびクエンチ化によりｐＨ変化の過程中に生じうる考えられうる凝集およびタンパク質劣化を避けるためには、ＰＡＰをクエンチしないで、その代わりに、それをｐＨ４．０でＣＥＸカラム上に直接的にローディングすることが可能である。
【０１７５】
Ｆ．カチオン交換クロマトグラフィー
第２クロマトグラフィー工程は、中間精製のためのカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用いた。ＣＥＸは、５．６５ＬのＰＯＲＯＳ  ＨＳ強カチオン交換吸着体が充填されたＢＰＧ（ＣＯＬ−５６−１１９０−３０）２０ｃｍ  ＩＤ×１９．５ｃｍ（ＢＰＧ  ２００／５００）カラムを使用するＣＣＳ−４４４クロマトグラフィー系ＦＰＰバイオプロセススキッド（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＦＰＰ  ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  ｓｋｉｄ）上で行った。滴定１の産物をＰＯＲＯＳ  ＨＳカラム上にローディングした。カラムを洗浄し、４０ＣＶの直線イオン強度勾配で溶出し、１ＣＶ間隔で画分を集めた。表６は、ＣＥＸクロマトグラフィー工程に関する実施条件および結果を要約している。
【表７】
2014520814.tif 000010
【０１７６】
ＣＥＸ収率は９１％であった。最適化プロテインＡ実施は、最適化ローディング、洗浄および溶出バッファーを用いなかった実施と比較して、産物の純度における有意な増加を示したため、この収率および純度の改善は、大部分は、最適化プロテインＡ実施によるものであると考えられるべきである。ＣＥＸ画分に関するｐＩ値は、イオン強度の増加に伴う有意な変動を示さないが、図７の電気泳動図は、より早いＣＥＸＰ画分が、より望ましいシアル酸パターンを有していたという前提を証明している。
【０１７７】
ＴＳＡレベルを図７および９に示す。結果は、産物の断片、凝集物およびミスフォールド体のレベルが低下しうること、ならびにＴＳＡに対する選択性を示している（図７）。個々のＣＥＸ産物画分を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基（ｐＨ８．０）で約２倍希釈し、ついで１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基でｐＨ６．３に滴定した。産物品質特性のプロセス決定の後、画分を２〜８℃で別々に保存し、プール化した。
【０１７８】
Ｇ．限外濾過２
限外濾過２（ＵＦ−２）十字流濾過工程の目的は、ＡＥＸ工程のための準備において、プール化ＣＥＸ産物を＜３ｇ／Ｌまで濃縮し、１２．５ｍＭ  リン酸Ｎａ（ｐＨ６．３）中にバッファー交換することである。ＲＹ８０５−２０８低温実験室において、３０ｋＤａの２．５ｍ２再生酢酸セルロース膜（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ２  Ｍａｘｉ  ３０ｋＤａ  ＰＬＣＴＫ−Ｃ）でＵＦを行った。フェッドバッチ様態で濃縮を実施し、ついで、４通過体積の１２．５ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．３）を使用して連続的に透析濾過を行った。複数の蠕動ポンプを使用することにより十字流速を維持し、隔膜弁により保持物質背圧を制御し、蠕動ポンプにより透過速度を制御した。透析濾過後、産物回収を最大にするために、膜にバッファーを流した。表７はＵＦ−２実施条件およびプロセス結果を要約している。
【表８】
2014520814.tif 000011
【０１７９】
Ｈ．滴定２
ＵＦ−２産物を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基（ｐＨ８．０）（１〜１．５％  ｖ：ｖ  ＵＦ−２産物）でｐＨ８．０および＜３ｍＳ／ｃｍの伝導度まで滴定した。表８は、ＡＥＸ注入前にＵＦ−２産物に対して行った滴定工程を要約している。
【表９】
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【０１８０】
Ｉ．アニオン交換クロマトグラフィー
最終クロマトグラフィー工程であるアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）を、産物純化工程として用いた。５ＬのＰＯＲＯＳ  ＨＱ樹脂が充填されたＢＰＧ（ＣＯＬ−５６−１１９０−３０）２０ｃｍ  ＩＤ×１９．５ｃｍ（ＢＰＧ  ２００／５００）カラムを使用して、ＣＣＳ−１４４４クロマトグラフィー系ＦＰＰバイオプロセススキッド（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＦＰＰ  ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  ｓｋｉｄ）上でＡＥＸを行った。ＵＦ−２産物をＰＯＲＯＳ  ＨＱカラム上にローディングした。カラムを洗浄し、３０ＣＶの直線イオン強度勾配およびそれに続く１０ＣＶのイソクラティック溶出で溶出し、１ＣＶの間隔で画分を集めた。表９はＡＥＸクロマトグラフィー工程に関するプロセスパラメータおよび結果を要約している。
【表１０】
2014520814.tif 000013
【０１８１】
図９は、ＡＥＸクロマトグラフィー工程における溶出中の伝導度とＴＳＡ含量との間の強い相関性を示している。予想どおり、この依存性は産物画分の等電点（ｐＩ）と伝導度との関係においても明らかである（図１０）。
【０１８２】
ＣＥＸと比較して、ＡＥＸは、ＴＳＡの富化において、より優れた能力を示した。ＡＥＸクロマトグラフィーの収率は、ＴＳＡ値に基づくプール化基準に基づけば８２％であった。ＴＳＡに加えて、凝集物およびミスフォールド体のレベルに関しても改善が実証された。
【０１８３】
Ｊ．製剤化および貯蔵
画分品質特性（ＴＳＡ、ミスフォールド、断片および凝集レベル）の生成、ならびに製剤化バッファーおよび画分プール化の最終決定を可能にするために、ＡＥＸ画分を１〜３週間の期間にわたって貯蔵した。この待機期間中の産物分解を最小にするために、ＡＥＸ画分をｐＨ６．３に滴定し、それに１０×製剤化バッファーを加え、それをバッグ内に滅菌濾過し、４℃で貯蔵した。
【０１８４】
Ｋ．限外濾過４および製剤化
貯蔵およびプール化ＡＥＸ画分を製剤化するために、限外濾過４（ＵＦ−４）を用いた。３ｇのＡＥＸＰを精製開発作業のために取っておいた。専有製剤化バッファー中の最終製剤化の経過中に産物品質をモニターするための小規模実験を行うために、その物質の一部を使用した。
【０１８５】
データは、産物品質が５６ｇ／Ｌの最終濃度まで維持されたことを示唆している。物質輸送および参照標準物を維持するために、最終ＵＦ中に１１．８ｇのプール化ＡＥＸ産物を処理した。ＵＦ−４は、３０ｋＤａの０．５ｍ２再生酢酸セルロース膜（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ２  Ｍａｘｉ  ３０ｋＤａ  ＰＬＣＴＫ−Ｃ）で行った。ＲＹ８０５−２０８低温実験室において濾過を行った。３ｇ／Ｌの中間標的濃度を得た後、物質を適当な製剤化バッファー中に透析濾過した。ついで、産物回収を最大にするために膜フラッシュを行い、一緒にした後、産物を５０ｇ／Ｌの最終濃度にした。０．０１％  ＰＳ−２０の最終濃度が得られるように、１％ＰＳ−２０を透析濾過産物内に加えた。生物負荷を軽減するために、最終的な０．２μｍの滅菌濾過を行う。表１２はＵＦ−４実施条件および結果を要約している。
【表１１】
2014520814.tif 000014
【０１８６】
要約
図１１に示されている三元プロットは、精製プロセスにわたる不純物の消失の経過を要約している。リフォールディングは、ミスフォールド（ピーク＃３）および凝集物を減少させる一方で適切なフォールド体（ピーク＃２）のレベルを増加させることにより、生産性を改善する。最適化プロテインＡ条件は純度の上昇を可能にし、したがって、この要件の後続のＣＥＸおよびＡＥＸクロマトグラフィーに対する負荷を軽減する。図１１はＣＥＸおよびＡＥＸ産物の間の純度のレベルにおけるほどほどの増加を示しているが、３つのクロマトグラフィー方式を含むプロセスはより大きなレベルのプロセス残渣消失をもたらし、したがって、全体的なプロセスの頑強性を向上させる。プロセス流および最終製剤化バルクの純度を要約している分析結果が表１１に要約されており、参照品と比較したＳＤＳ  ＰＡＧＥが図１２に示されている。
【０１８７】
精製を経た総収率は３３％であり、１８ｇの精製産物が得られた。工程収率および濃度を表１２に要約する。
【表１２】
2014520814.tif 000015
【０１８８】
実施例３：ＣＨＯ細胞培養上清（ＣＣＳ）からのＴＮＦＲ：Ｆｃの精製
材料および方法：
ここに記載されている実験に使用したＣＣＳは、２つの異なるＣＨＯ細胞系（２３Ｄ８および１８Ｇ１０）を使用して製造した。図２に大まかに示されている下流プロセス流動スキームに従い、ＴＮＦＲ：Ｆｃを各培養から別々に精製した。簡潔に説明すると、下流プロセスはプロテインＡ一次回収工程、ＣＥＸ中間精製工程、少なくとも１つの限外濾過工程、ＡＥＸ純化工程および最終製剤化工程を含む。
【０１８９】
Ａ．一次回収およびリフォールディング
ミスフォールド種および凝集種を、正しくフォールドした単量体に変換するために、ＣＣＳをリフォールディングさせた。用いたリフォールディング条件は、ピチア発現ＴＮＦＲ：Ｆｃに関して開発されたものであり、この場合、ブロスを＜１０℃に冷却し、５ｍＭの最終濃度となるようにシステインを加え、１．０Ｍ  トリズマ塩基＋０．５Ｍ  アルギニンを使用してｐＨを８．６に調節した。ｐＨに対する温度の効果を最小にするために、リフォールディングおよび滴定を＜１０℃で行った。運搬された細胞ブロスの容量および力価を表１３に要約する。
【表１３】
2014520814.tif 000016
【０１９０】
簡便さを考慮して、遠心分離およびデプス濾過ではなくＭＦにより清澄化を行った。後の大規模バッチにおいて、本発明者らは一次回収のためのディスク・スタック遠心機およびデプスフィルターの使用を調査したであろう。０．６５μｍの細孔径を有するＰａｌｌ  Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ  ＩＩ膜を使用して、ＭＦを行った。保持物質の供給体積をその出発体積の１／１０に減少させ、透析濾過を３回行った。０．２２μｍ滅菌フィルターの通過前に、透析物濁度は〜１０ＮＴＵであると測定され、リフォールディングのために４℃で＞１６時間維持された。
【０１９１】
天然および前処理上清から回収された正しくフォールドしたＴＮＦＲ：Ｆｃ（すなわち、ＱＰＡＰ  ＨＩＣ分析からのピーク＃２）の収率に対するリフォールディングおよびｐＨ滴定の効果を比較するために、ＣＣＳサンプルを分析した。分析は、表１４に大まかに記載されている方法に従い、Ｐｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａカラム供給物をローディングすることからなるものであった。
【０１９２】
クローン１８Ｇ１０に関して表１４に示されているデータ（これは、クローン２３Ｄ８に関して得られたデータの代表例である）は、ｐＨ滴定されリフォールドしたＣＣＳがプロテインＡにわたる若干高い収率およびクエンチ化プロテインＡ産物（ＱＰＡＰ）における有意に高いピーク２含量を有していたことを示している。表１４は、ＨＰ−ＨＩＣおよびＨＰ−ＳＥＣを用いてＱＰＡＰから得られたデータを示す。
【表１４】
2014520814.tif 000017
【０１９３】
Ｂ．プロテインＡクロマトグラフィー
ピチア発現ＴＮＦＲ：Ｆｃに関して前記で明らかにされた実施条件を用いて、ＣＨＯ発現ＴＮＦＲ：Ｆｃの精製における一次捕捉工程として、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを用いた。
【０１９４】
リフォールドＭＦＰをプロテインＡカラム上にローディングした。処理条件を表１５に要約する。各クローンに関して１回の注入を行い、ローディングは＜１０ｇ／Ｌカラム体積（ＣＶ）で行った。保持時間は５．３分であり、これは、系の流量限界ゆえに、可能な最低保持時間であった。ローディングのあと、３回の洗浄を行って、産物断片および不純物を除去した。洗浄液またはフロースルーにおいて、ＰＯＩの喪失は検出されなかった。
【０１９５】
５０ｍＭ  クエン酸Ｎａ（ｐＨ５．０）から１００ｍＭ  クエン酸Ｎａ（ｐＨ４．０）までの１０ＣＶにわたる勾配およびそれに続く１００ｍＭ  クエン酸Ｎａ（ｐＨ４．０）での５ＣＶの維持で溶出を行った。画分を未クエンチ状態で一晩放置した。なぜなら、ＰｒＡ産物はクエンチ無しに少なくとも１０日間安定であることをこれまでのデータが示していたからである。溶出中、１ＣＶの画分を集め、ＨＰ−ＰｒＡ、ＨＰ−ＨＩＣおよびＨＰ−ＳＥＣにより分析して、タンパク質濃度、ならびにピーク１〜３、凝集物およびクリップ（ｃｌｉｐ）の比率を決定した。
【表１５】
2014520814.tif 000018
【０１９６】
高いピーク＃２比率および単量体含量を有するＰｒＡ画分を、更なる処理のためにプール化した。ＣＨＯ細胞クローン１８Ｇ１０および２３Ｄ８に関する溶出プロファイルを図１３に示す。クローン２３Ｄ８は、溶出開始後に１０〜１５ＣＶの間に溶出した。高いピーク＃３含量を有する画分＃１５を除く全ての画分を、更なる処理のためにプールした。クローン１８Ｇ１０は２３Ｄ８より早く溶出し、溶出開始後に６〜１２ＣＶの間に溶出した。＃６および１２を除く全ての画分を、それらの低い産物含量および比較的高いピーク＃３含量ゆえに、更なる処理のためにプールした。
【０１９７】
収率および産物品質を表１６に要約する。
【０１９８】
クローン２３Ｄ８は、ＰｒＡの間に、クローン１８Ｇ１０より有意に高い収率を示した。
【表１６】
2014520814.tif 000019
【０１９９】
高いピーク２および単量体含量を有する画分を、更なる精製のためにプールした。また、サンプルを、ＴＳＡ含量、ｃＩＥＦプロファイル、ＥＣ５０および不純物に関して分析した。どちらのクローンに関しても、より早い溶出画分はＴＳＡに富んでいた（図１３）。より遅い画分をプールしたところ、収率が増加するにつれてＴＳＡは減少した（図１４）。ＴＳＡ値は、参照品ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）ロット１０１１８０３に対するＴＳＡ含量の百分率として表されている。クローン２３Ｄ８の場合、１８Ｇ１０の場合より良好な収率とＴＳＡとの間のバランスが達成されたようである。
【０２００】
どちらのクローンに関しても、より早い溶出ＰｒＡ画分は、より遅い画分と比較してより酸性であり、参照品と良く重なるｃＩＥＦプロファイルを有していた（図１５および図１６）。図１５Ａは、画分１０〜１４およびプール化サンプルのクローン１８Ｇ１０由来ＰＡＰ画分に関するｃＩＥＦプロファイルを比較している。図１５Ｂは、比較のための参照品（エタネルセプト）のサンプルに関するｃＩＥＦプロファイルの重ね合せを示す。図１６は、クローン２３Ｄ８からの単一ＰＡＰ画分を参照品（すなわち、ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）ロット１０１１８０３）のｃＩＥＦプロファイルと比較するｃＩＥＦプロファイルを示す。
【０２０１】
どちらのクローンに関しても、ＰＡＰ画分は、ＣＨＯ  ＨＣＰに関するＥＬＩＳＡアッセイおよびＤＮＡに関するピコグリーン（ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ）アッセイにより測定された場合、検出限界未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＤＮＡ不純物を含有していた。どちらも、リガンドに関するＥＬＩＳＡアッセイにより検出された場合、数百ｎｇ／ｍＬのオーダーの浸出ＰｒＡリガンドを含有していた（表１７）。クローン２３Ｄ８はより高いレベルの汚染ＰｒＡを有することが観察されたが、これは、おそらくそれをＰｒＡカラムから溶出するのに必要なより低いｐＨに起因すると考えられる。
【表１７】
2014520814.tif 000020
【０２０２】
表１８は、ＰＡＰ画分に関する標準化ＥＣ５０値を要約している。クローン２３Ｄ８に関するプール化ＰＡＰ画分の標準化ＥＣ５０の結果は１．０７であり、これは、０．９６であった１８Ｇ１０の場合より若干高かった。画分番号による傾向は明らかでなく、全ての画分が〜１の値を有していた。
【表１８】
2014520814.tif 000021
【０２０３】
Ｃ．カチオン交換クロマトグラフィー
ＴＳＡ、ピーク２および単量体の含量を更に富化し、残存不純物を消失させるために、プール化ＰｒＡ産物に対してＣＥＸを行った。処理条件を以下に要約する。
【表１９】
2014520814.tif 000022
【０２０４】
ローディングは＜１５ｇ／Ｌ  ＣＶであり、これは、ピチア供給物に関して一般に用いられるローディングであった。ローディング限界未満のままとなるように、２３Ｄ８供給のために１回の注入を行い、１８Ｇ１０供給のために２回の注入を行った。０．２５〜０．６５Ｍ  ＮａＣｌの２０ＣＶ直線勾配による溶出でｐＨ４．０でＣＥＸを行った。産物を１ＣＶ画分で集め、ついでそれらをＨＰ−ＰｒＡ、ＨＰ−ＨＩＣおよびＨＰ−ＳＥＣにより分析した。高いピーク２および単量体含量を有するものを、更なる処理のためにプールした。ついで画分をＴＳＡ、ｃＩＥＦプロファイル、ＥＣ５０および残存不純物に関しても分析した。
【０２０５】
それらの２つのクローンの溶出プロファイルを図１７に示す（２３Ｄ８  パネルＡ、１８Ｇ１０  パネルＢ）。クローン２３Ｄ８に関しては、溶出ピークの大部分は３５〜４０ｍＳ／ｃｍの間であった。溶出のまさに開始時に小さなピークも存在した。全ての産物画分は高いピーク２および単量体含量を有していたため、全てをプールした。クローン１８Ｇ１０の大部分は３７〜４５ｍＳ／ｃｍの間に溶出し、溶出のまさに開始時に小さなピークを伴っていた。３７〜４２ｍＳ／ｃｍの間に溶出した産物を更なる処理のためにプールした。１８Ｇ１０に関して行った２回の注入は同一プロファイルを有していたが、このことは、ＣＥＸの性能が再現性を有することを示している。表２０におけるデータは収率および産物品質を要約している。
【表２０】
2014520814.tif 000023
【０２０６】
どちらのクローンに関しても、溶出伝導度の増加と共にＴＳＡは減少した。図１８は、より遅い溶出画分がプールされた場合に、収率が増加するにつれてＴＳＡが減少することを示している。ＴＳＡは、参照品（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）ロット１０１１８０３）中に存在するシアル酸に対する比率として表されている。ＣＥＸ中、クローン２３Ｄ８の場合には、１８Ｇ１０の場合より高い収率およびＴＳＡ値が得られた。
【０２０７】
どちらのクローンに関しても、より早い溶出ＣＥＸＰ画分は、より遅い画分と比較してより酸性であり、イノベーター（ｉｎｎｏｖａｔｏｒ）と良く重なるｃＩＥＦプロファイルを有していた（図１９および図２０）。図１９Ａは、クローン２３Ｄ８  ＣＥＸＰ画分４〜７に関するｃＩＥＦプロファイルを示す。図１９Ｂは、比較のための参照品（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）Ｌｏｔ１０１１８０３）のサンプルに関するｃＩＥＦプロファイルの重ね合せを与えるｃＩＥＦプロファイルを示す。図２０は、クローン１８Ｇ１０からのＣＥＸＰ画分１、５、６、７、８およびＵＦ２Ｐに関するｃＩＥＦプロファイルを示す。
【０２０８】
どちらのクローンに関しても、ＣＥＸ供給物は検出限界未満のＨＣＰおよびＤＮＡレベルを示した。表２１は、ＣＥＸ画分にわたる浸出ｐｒＡリガンドの消失を要約しているデータを示す。データは、遅い溶出画分が高い不純物純度を有することを示す。
【表２１】
2014520814.tif 000024
【０２０９】
クローン２３Ｄ８に関するプール化ＣＥＸＰ画分の標準化ＥＣ５０の結果は１．０７であり、これは、１．０１であった１８Ｇ１０の場合に類似していた。画分番号による傾向は明らかでなかった（表２２）。
【表２２】
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【０２１０】
Ｄ．限外濾過
供給物の伝導度を減少させるために、ＡＥＸの前に、プール化ＣＥＸＰ画分を濃縮し、透析濾過に付した。プール化ＣＥＸＰを〜５倍濃縮し、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）再生セルロース膜ｗ／３０ｋＤ細孔径を使用する１２．５ｍＭ  ＮａＰｉ（ｐＨ６．３）中への５倍の透析濾過に付した。
【０２１１】
ＵＦ２にわたる収率は、クローン２３Ｄ８に関しては、予想より低く７７％であったが、これは恐らく膜の欠陥によるものであろう。浸透物は、１３％の物質を含む。クローン１８Ｇ１０に関する収率は９８％であった。
【０２１２】
Ｅ．アニオン交換クロマトグラフィー
ＴＳＡ、ピーク２および単量体の含量を更に富化させ、残存不純物を消失させるために、ＡＥＸを行った。ＡＥＸ供給物は、１Ｍ  Ｔｒｉｚｍａ塩基でｐＨ８．０に調節されたＵＦ２Ｐであった。その処理条件を表２３に要約する。ローディングは＜１０ｇ／Ｌ  ＣＶであった。ローディング限界未満のままとなるように、２３Ｄ８供給のために１回の注入を行い、１８Ｇ１０供給のために２回の注入を行った。１ＣＶ画分の収集を行いながら、０〜０．３Ｍ  ＮａＣｌの２０ＣＶ直線勾配による溶出により、ＡＥＸをｐＨ８．０で行った。最終的な製剤化のためにどの画分をプールするべきかを決定する前に、利用可能な分析アッセイ（ＨＰ−ＰｒＡ、ＨＰ−ＨＩＣ、ＨＰ−ＳＥＣ、ＴＳＡ、ｃＩＥＦ、ＥＣ５０および残存不純物）の全てからのデータを調べた。
【表２３】
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【０２１３】
それらの２つのクローンの溶出プロファイルを図２１に示す（２１Ａにおける２３Ｄ８および２１Ｂにおける１８Ｇ１０）。クローン２３Ｄ８および１８Ｇ１０は共に〜４〜２４ｍＳ／ｃｍの間で溶出した。１８Ｇ１０に関して行った２回の注入は同一プロファイルを有していたが（データ非表示）、このことは、ＡＥＸの性能が再現性を有することを示している。表２４はクローンのそれぞれに関する収率および産物品質を要約している。ＰＯＩの純度および品質を保証するために、より高いピーク３含量を含有することが観察された、より遅く溶出する画分はプールしなかった。クローン２３Ｄ８は、ＡＥＸの間、クローン１８Ｇ１０より有意に高い収率を示した。
【表２４】
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【０２１４】
一般に、より遅く溶出するＡＥＸＰ画分は、ＴＳＡに富むことが観察された。図２２は、ＡＥＸの間、クローン２３Ｄ８に関して、収率とＴＳＡとの間の有意に良好なバランスが得られたことを示している。どちらのクローンに関しても、より遅く溶出するＡＥＸＰ画分はより酸性である（図２３および図２４）。クローン２３Ｄ８に関しては、画分１１〜１４は、クローン１８Ｇ１０からの画分１１〜１３と同様に、許容しうる程度の、参照品タンパク質との重なりを有している。より早く溶出する画分は参照品に匹敵するものではないことが観察された。
【０２１５】
どちらのクローンに関しても、ＡＥＸ供給物は、検出限界未満のＨＣＰおよびＤＮＡレベルを有していた。表２５は浸出ＰｒＡリガンドの消失を要約している。
【表２５】
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【０２１６】
クローン２３Ｄ８に関するプール化ＡＥＸＰ画分の標準化ＥＣ５０の結果は０．９７であり、これは、０．９５であった１８Ｇ１０の場合に類似していた。表２６は、画分にわたる傾向が明らかでないことを示している。
【表２６】
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【０２１７】
クローン２３Ｄ８に関しては、１６〜２２ｍＳ／ｃｍの間に溶出した画分１１〜１４をプールした。それらの画分のＴＳＡ含量は、参照品の８５〜１１５％の間であった。ピーク２含量は＞９０％であり、凝集物は＜４％であった。プール化画分は、許容しうる程度の参照品との重なりを有するｃＩＥＦプロファイルを有していた。ＨＣＰおよびＤＮＡは検出限界未満であった。ＥＣ５０は全ての画分に関して０．９〜１．０８であった。
【０２１８】
クローン１８Ｇ１０に関しては、１９〜２２ｍＳ／ｃｍの間に溶出した画分１１〜１３をプールした。それらの画分のＴＳＡ含量は、イノベーターの８０〜１００％の間であった。ピーク２含量は＞９０％であり、凝集物は＜４％であった。プール化画分は、許容しうる程度の参照品との重なりを有するｃＩＥＦプロファイルを有していた。ＨＣＰおよびＤＮＡは検出限界未満であった。ＥＣ５０は全ての画分に関して０．９〜１．０８であった。
【０２１９】
Ｅ．限外濾過
プール化ＡＥＸＰ画分を濃縮し、製剤化バッファー中への透析濾過に付した。プール化ＡＥＸＰ画分を５０ｇ／Ｌに濃縮し、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）再生セルロース膜ｗ／３０ｋＤ細孔径を使用する２５ｍＭ  ＮａＰｉ、２５ｍＭ  Ａｒｇ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  スクロース（ｐＨ６．３）中への５倍の透析濾過に付した。
【０２２０】
ＵＦ４にわたる収率は、クローン２３Ｄ８および１８Ｇ１０に関して、それぞれ、９８％および８０％であり、物質収支は１０１％および８４％であった。ＵＦ４Ｐは、クローン２３Ｄ８では９００ｍｇを、そしてクローン１８Ｇ１０では６３０ｍｇを含有していた。
【０２２１】
全体的な生産性は、参照品ピーク２含量の＞８０％のＴＳＡ値を有するＡＥＸＰ画分をプールした場合、クローン２３Ｄ８および１８Ｇ１０に関して、それぞれ、９７．２および３２．５ｍｇ／Ｌであった。一方、ピチア発現物質の生産性は、＞５０％のＴＳＡ値を有する画分をプールした場合、４０ｍｇ／Ｌであった。
【０２２２】
要約
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）クローン２３Ｄ８および１８Ｇ１０からの細胞培養供給物を、ピチア発現ＴＮＦＲ：Ｆｃに関して開発されたものに類似したプロセスにより精製した。一次回収、プロテインＡクロマトグラフィー（ＰｒＡ）、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、限外濾過、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）および最終製剤化によりバッチを採取した（図２）。クロマトグラフィー工程のそれぞれの溶出中に画分を集めた。後続工程のためにどの画分をプールすべきかを決定するために、プロテインＡ産物（ＰＡＰ）およびＣＥＸ産物（ＣＥＸＰ）画分を、ＨＰ−ＨＩＣおよびＨＰ−ＳＥＣによるプロセスにおいて分析した。プール化画分は、単量体である正しくフォールドされた種（ピーク２）の高い含量を有していた。棄却された画分は断片（ピーク１）、ミスフォールド種（ピーク３）または凝集物のいずれかにおいて高かった。全シアル酸（ＴＳＡ）含量、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）、標準化ＥＣ５０および不純物に関してＡＥＸ産物（ＡＥＸＰ）画分を更に分析して、最終製剤化のためにどの画分をプールすべきかを決定した。両方の供給物に関する収率を表２７に要約する。
【表２７】
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【０２２３】
他の実施形態は以下の特許請求の範囲内である。幾つかの実施形態が本明細書に示され記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の変更が施されうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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