(57)【要約】本発明は歯科疾患を治療するための試薬および方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたアメロゲニン由来のポリペプチドであって、
（ａ）（ＷＰ（Ａ／Ｓ）ＴＤＫＴＫＲＥＥＶＤ）１‐１０（配列番号１）（ＡＤＰ３）；
（ｂ）（ＰＧＹＩＮ（Ｌ／Ｆ）ＳＹ（Ｅ／Ａ）（Ｋ／Ｎ／Ａ）ＳＨＳＱＡＩＮ（Ｔ／Ｖ）（Ｄ／Ａ）（Ｒ／Ａ）ＴＡ）１‐１０（配列番号２）（ＡＤＰ５）；
（ｃ）（ＬＰＰＬＦＳＭＰＬＳＰＩＬＰＥＬＰＬＥＡＷＰＡＴ）１‐１０（ＡＤＰ６）（配列番号３）；および
（ｄ）（ＨＰＰ（Ｓ／Ｔ）ＨＴＬＱＰＨＨＨ（Ｌ／Ｉ）ＰＶＶＰＡＱＱＰＶ（Ａ／Ｉ）ＰＱＱＰＭＭＰＶＰＧ（Ｈ／Ｑ）ＨＳＭＴＰ（Ｔ／Ｉ）ＱＨ）１‐１０（配列番号４）（ＡＤＰ７）のうち１２〜４３個の連続したアミノ酸
からなる群またはこれらの機能的等価物
から選択されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
ポリペプチドは、アミノ酸配列（ＰＧＹＩＮ（Ｌ／Ｆ）ＳＹ（Ｅ／Ａ）（Ｋ／Ｎ／Ａ）ＳＨＳＱＡＩＮ（Ｔ／Ｖ）（Ｄ／Ａ）（Ｒ／Ａ）ＴＡ）１‐１０（配列番号４）（ＡＤＰ５）またはその機能的等価物からなる、請求項１に記載の単離されたアメロゲニン由来のポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドは、アミノ酸配列（ＰＧＹＩＮＦＳＹＥＮＳＨＳＱＡＩＮＶＤＲＴＡ）１−１０（配列番号６）（ＡＤＰ５Ｈ）またはその機能的等価物からなる、請求項１に記載の単離されたアメロゲニン由来のポリペプチド。
【請求項４】
ポリペプチドは、（ＨＰＰ（Ｓ／Ｔ）ＨＴＬＱＰＨＨＨ（Ｌ／Ｉ）ＰＶＶＰＡＱＱＰＶ（Ａ／Ｉ）ＰＱＱＰＭＭＰＶＰＧ（Ｈ／Ｑ）ＨＳＭＴＰ（Ｔ／Ｉ）ＱＨ）１‐１０（配列番号４）（ＡＤＰ７）のうち１２〜４３個の連続したアミノ酸またはその機能的等価物からなる、請求項１に記載の単離されたアメロゲニン由来のポリペプチド。
【請求項５】
ポリペプチドは、
（ｉ）（ＨＴＬＱＰＨＨＨ（Ｌ／Ｉ）ＰＶＶ）１−１０（配列番号１２）（ＡＤＰ１）；
（ｉｉ）（ＶＰＧ（Ｈ／Ｑ）ＨＳＭＴＰ（Ｔ／Ｉ）ＱＨ）１−１０（配列番号１３）（ＡＤＰ２）
（ｉｉｉ）（ＨＰＰ（Ｓ／Ｔ）ＨＴＬＱＰＨＨＨ（Ｌ／Ｉ）ＰＶＶ）１−１０（配列番号１４）（ＡＤＰ４）；
（ｉｖ）（ＰＡＱＱＰＶ（Ａ−Ｉ）ＰＱＱＰＭＭＰ）１−１０（配列番号１５）（ＡＤＰ８）；
（ｖ）（ＨＰＰ（Ｓ／Ｔ）ＨＴＬＱＰＨＨＨ（Ｌ／Ｉ）ＰＶＶＰＡＱＱＰＶ（Ａ／Ｉ）ＰＱＱＰＭＭＰＶＰＧ（Ｈ／Ｑ）ＨＳＭＴＰ（Ｔ／Ｉ）ＱＨ）１‐１０（配列番号４）（ＡＤＰ７）；
（ｖｉ）（ＨＴＬＱＰＨＨＨＬＰＶＶ）１−１０（配列番号１６）（ＡＤＰ１Ｍ）；
（ｖｉｉ）（ＨＴＬＱＰＨＨＨＩＰＶＶ）１−１０（配列番号１７）（ＡＤＰ１Ｈ）；
（ｖｉｉｉ）（ＶＰＧＨＨＳＭＴＰＴＱＨ）１−１０（配列番号１８）（ＡＤＰ２Ｍ）
（ｉｘ）（ＶＰＧＱＨＳＭＴＰＩＱＨ）１−１０（配列番号１９）（ＡＤＰ２Ｈ）
（ｘ）（ＨＰＰＳＨＴＬＱＰＨＨＨＬＰＶＶ）１−１０（配列番号２０）（ＡＤＰ４Ｍ）；
（ｘｉ）（ＨＰＰＴＨＴＬＱＰＨＨＨＩＰＶＶ）１−１０（配列番号２１）（ＡＤＰ４Ｈ）；
（ｘｉｉ）（ＨＰＰＳＨＴＬＱＰＨＨＨＬＰＶＶＰＡＱＱＰＶＡＰＱＱＰＭＭＰＶＰＧＨＨＳＭＴＰＴＱＨ）１−１０（配列番号８）（ＡＤＰ７Ｍ）；
（ｘｉｉｉ）（ＨＰＰＴＨＴＬＱＰＨＨＨＩＰＶＶＰＡＱＱＰＶＩＰＱＱＰＭＭＰＶＰＧＱＨＳＭＴＰＩＱＨ）１−１０（配列番号９）（ＡＤＰ７Ｈ）；
（ｘｉｖ）（ＰＡＱＱＰＶＡＰＱＱＰＭＭＰ）１−１０（配列番号２２）（ＡＤＰ８Ｍ）；および
（ｘｖ）（ＰＡＱＱＰＶＩＰＱＱＰＭＭＰ）１−１０（配列番号２３）（ＡＤＰ８Ｈ）
からなる群またはこれらの機能的等価物
から選択される、請求項４に記載の単離されたアメロゲニン由来のポリペプチド。
【請求項６】
ポリペプチドは、
（ｉ）（ＷＰＡＴＤＫＴＫＲＥＥＶＤ）１−１０（配列番号１０）（ＡＤＰ３Ｍ）；および
（ｉｉ）（ＷＰＳＴＤＫＴＫＲＥＥＶＤ）１−１０（配列番号１１）（ＡＤＰ３Ｈ）
からなる群またはこれらの機能的等価物
から選択される、請求項１に記載の単離されたアメロゲニン由来のポリペプチド。
【請求項７】
（ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載のアメロゲニン由来のポリペプチド；および
（ｂ）異種ポリペプチド
を含む組換え融合ポリペプチド。
【請求項８】
異種ポリペプチドは、検出可能なポリペプチド、ポリペプチドアフィニティータグ、ペプチドマーカー、ＦＬＡＧタグ、抗微生物ポリペプチド、バイオミネラリゼーション促進ポリペプチド、無機物結合ポリペプチド、三次元スカフォールド形成ポリペプチド、コラーゲン、キトサン、両親媒性ペプチド、タンパク質結合ポリペプチド、エナメリン由来ポリペプチド、タフテリン由来ペプチド、スタテリン由来ポリペプチド、象牙質由来ポリペプチド、骨シアロタンパク質由来ポリペプチド、オステオカルシン由来ポリペプチド、オステオポンチン由来ポリペプチド、齲歯阻害活性を備えたタンパク質、カゼイン、および骨形成由来ポリペプチドからなる群から選択される、請求項７に記載の組換え融合ポリペプチド。
【請求項９】
（ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載のアメロゲニン由来のポリペプチド；および
（ｂ）前記アメロゲニン由来ポリペプチドに連結された非ペプチド部分
を含む組成物。
【請求項１０】
非ペプチド部分は、ラジオアイソトープ、非ペプチドのアフィニティータグ、同位体コードアフィニティータグ、発蛍光団、有機（ミセル、リポソーム、デンドリマー）または無機（金属、半導体および誘電性）ナノ構造体であってナノチューブ、ナノワイヤ、ナノ粒子、原子クラスター、量子ドット、単層もしくは多層の原子材料を含むナノ構造体、無機イオンもしくはイオンクラスター、有機‐無機ハイブリッドナノ構造体、魚粉、アミノ酸、および非ペプチドポリマーからなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
（ａ）請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド、組換え融合タンパク質、または組成物と、
（ｂ）薬学的に許容される担体と
を含む医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド、組換え融合タンパク質、または組成物を含む口腔ケア製品。
【請求項１３】
デンタルケア製品は、練り歯磨き、磨歯剤、口内洗浄液、デンタルフロス、液体歯磨剤、歯垢検出剤、局所用ゲル剤、トローチ、チューインガム、歯科用パスタ剤、歯肉マッサージクリーム剤、含嗽用錠剤、口内錠、および食物製品からなる群から選択される、請求項１２に記載の口腔ケア製品。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは組換え融合タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の単離核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項１７】
歯科疾患を治療するための方法であって、治療を必要とする対象者に、前記歯科疾患を治療するのに有効な量の、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド、組換え融合タンパク質、もしくは組成物、請求項１１または１２に記載の医薬組成物、あるいは請求項１２または１３に記載の口腔ケア製品を投与することを含む方法。
【請求項１８】
歯科疾患は、歯根膜炎、歯牙侵蝕症、過敏症、歯垢、歯牙フッ素中毒、齲蝕症、齲歯、歯牙吸収、および歯肉後退からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
単離ポリペプチドであって、
ＡＤＰ５（Ｖ１）：（ＰＧＹＩＮ（Ｌ／Ｆ）ＳＹＡ（Ｋ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮ（Ｔ／Ｖ）ＡＲＴＡ）１−１０（配列番号２５）；
ＡＤＰ５（Ｖ２）：（ＰＧＹＩＮ（Ｌ／Ｆ）ＳＹＥ（Ａ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮ（Ｔ／Ｖ）ＤＡＴＡ）１−１０（配列番号２６）；および
ＡＤＰ５（Ｖ３）：（ＰＧＹＩＮ（Ｌ／Ｆ）ＳＹＡ（Ａ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮ（Ｔ／Ｖ）ＡＡＴＡ）１−１０（配列番号２７）
からなる群から選択された１つ以上のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２０】
ＡＤＰ５（Ｖ１）：ＰＧＹＩＮ（Ｌ／Ｆ）ＳＹＡ（Ｋ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮ（Ｔ／Ｖ）ＡＲＴＡ（配列番号２５）；
ＡＤＰ５（Ｖ２）：ＰＧＹＩＮ（Ｌ／Ｆ）ＳＹＥ（Ａ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮ（Ｔ／Ｖ）ＤＡＴＡ（配列番号２６）；
ＡＤＰ５（Ｖ３）：ＰＧＹＩＮ（Ｌ／Ｆ）ＳＹＡ（Ａ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮ（Ｔ／Ｖ）ＡＡＴＡ（配列番号２７）；
ＰＧＹＩＮＬＳＹＡ（Ｋ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮＴＡＲＴＡ（配列番号３２）；
ＰＧＹＩＮＬＳＹＥ（Ａ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮＴＤＡＴＡ（配列番号３３）；
ＰＧＹＩＮＬＳＹＡ（Ａ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮＴＡＡＴＡ（配列番号３４）；
ＰＧＹＩＮＦＳＹＡ（Ｋ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮＶＡＲＴＡ（配列番号３５）；
ＰＧＹＩＮＦＳＹＥ（Ａ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮＶＤＡＴＡ（配列番号３６）；
ＰＧＹＩＮＦＳＹＡ（Ａ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮＶＡＡＴＡ（配列番号３７）；
ＰＧＹＩＮＬＳＹＡＫＳＨＳＱＡＩＮＴＡＲＴＡ（配列番号３８）；
ＰＧＹＩＮＬＳＹＥＡＳＨＳＱＡＩＮＴＤＡＴＡ（配列番号３９）；
ＰＧＹＩＮＬＳＹＡＡＳＨＳＱＡＩＮＴＡＡＴＡ（配列番号４０）；
ＰＧＹＩＮＦＳＹＡＮＳＨＳＱＡＩＮＶＡＲＴＡ（配列番号４１）；
ＰＧＹＩＮＦＳＹＥＡＳＨＳＱＡＩＮＶＤＡＴＡ（配列番号４２）；および
ＰＧＹＩＮＦＳＹＡＡＳＨＳＱＡＩＮＶＡＡＴＡ（配列番号４３）
からなる群から選択された１つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２１】
（ａ）請求項１９または２０に記載の単離ポリペプチド；および
（ｂ）異種ポリペプチド
を含む組換え融合ポリペプチド。
【請求項２２】
（ａ）請求項１９または２０に記載の単離ポリペプチド；および
（ｂ）前記ポリペプチドに連結された非ペプチド部分
を含む組成物。
【請求項２３】
（ａ）請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のポリペプチド、組換え融合タンパク質、または組成物と、
（ｂ）薬学的に許容される担体と
を含む医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１９〜２３のいずれか１項に記載のポリペプチド、組換え融合タンパク質、または組成物を含む口腔ケア製品。
【請求項２５】
デンタルケア製品は、練り歯磨き、磨歯剤、口内洗浄液、デンタルフロス、液体歯磨剤、歯垢検出剤、局所用ゲル剤、トローチ、チューインガム、歯科用パスタ剤、歯肉マッサージクリーム剤、含嗽用錠剤、口内錠、および食物製品からなる群から選択される、請求項２４に記載の口腔ケア製品。
【請求項２６】
請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは組換え融合タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項２７】
請求項２６に記載の単離核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項２８】
請求項２７に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項２９】
歯科疾患を治療するための方法であって、治療を必要とする対象者に、前記歯科疾患を治療するのに有効な量の、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のポリペプチド、組換え融合タンパク質、もしくは組成物、請求項２３に記載の医薬組成物、あるいは請求項２４または２５に記載の口腔ケア製品を投与することを含む方法。
【請求項３０】
歯科疾患は、歯根膜炎、歯牙侵蝕症、過敏症、歯垢、歯牙フッ素中毒、齲蝕症、齲歯、歯牙吸収、頭蓋顎顔面骨疾患、および歯肉後退からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、歯科疾患を治療するための試薬および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
国庫補助の明示
本発明は、米国国立科学財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）−ＭＲＳＥＣ交付番号ＤＭＲ＃０５２０５６７の下で、また米国国立歯科・頭蓋顔面研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｄｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）交付番号ＤＥ１３０４５およびＤＥ１５１０９の下で、国庫補助を得て行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
背景
脱灰（歯牙表面上におけるミネラル分の損失）はほとんどの歯科疾患の主要原因である。ミネラルの損失は、酸性の食物、口腔乾燥、歯牙の漂白、摩耗および歯垢形成によって引き起こされる可能性がある。治療せずに放置すると、脱灰は、疼痛および過敏性から全身感染症（例えば心疾患）および歯牙喪失に至るまで様々な問題をもたらす可能性がある。ミネラル損失の程度に応じて、このプロセスの阻止および逆行のうち少なくともいずれかをなし、かつ審美的な材料を用いて歯牙を適切な機能に回復させるために、いくつかの治療選択肢が存在する。従来の修復的治療では、齲蝕部分は物理的に除去され、失われた硬組織は無機接着剤を使用して金属材料または樹脂材料に置き換えられる。しかしながら、これらの材料は通常は寿命が短く、また毒性産物または二次感染を引き起こす場合がある。
【０００４】
初期病変の再石灰化は現在使用される修復的治療の代替法である。フッ化物イオンは、フッ化物が適用される場所において適切なレベルのカルシウムイオンおよびリン酸イオンが利用可能であれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｓｉｔｕにおいて、それまでに脱灰したエナメル質の再石灰化を促進することが示されている。しかしながら、フッ素添加水への長期曝露は、重篤な歯牙フッ素症、骨フッ素症、および骨の脆弱化を引き起こす可能性があること、ならびにフッ化物の不適正な施用はさらに急性フッ化物中毒をも引き起こす可能性があることが示されている。
【発明の概要】
【０００５】
第１の態様では、本発明は、単離されたアメロゲニン由来のポリペプチド（ＡＤＰ）であって、
（ａ）（ＷＰ（Ａ／Ｓ）ＴＤＫＴＫＲＥＥＶＤ）１‐１０（配列番号１）（ＡＤＰ３）；
（ｂ）（ＰＧＹＩＮ（Ｌ／Ｆ）ＳＹ（Ｅ／Ａ）（Ｋ／Ｎ／Ａ）ＳＨＳＱＡＩＮ（Ｔ／Ｖ）（Ｄ／Ａ）（Ｒ／Ａ）ＴＡ）１‐１０（配列番号２）（ＡＤＰ５）；
（ｃ）（ＬＰＰＬＦＳＭＰＬＳＰＩＬＰＥＬＰＬＥＡＷＰＡＴ）１‐１０（配列番号３）（ＡＤＰ６）；および
（ｄ）（ＨＰＰ（Ｓ／Ｔ）ＨＴＬＱＰＨＨＨ（Ｌ／Ｉ）ＰＶＶＰＡＱＱＰＶ（Ａ／Ｉ）ＰＱＱＰＭＭＰＶＰＧ（Ｈ／Ｑ）ＨＳＭＴＰ（Ｔ／Ｉ）ＱＨ）１‐１０（配列番号４）（ＡＤＰ７）のうち１２〜４３個の連続したアミノ酸；
もしくはこれらの機能的等価物
を含むか、または前記（ａ）〜（ｄ）もしくはその機能的等価物からなるポリペプチドを提供する。
【０００６】
本発明者らは、本明細書中で議論されるように、本発明のこの態様のアメロゲニン由来のポリペプチドは、例えば、歯牙の石灰化を進めるため、かつ歯科疾患を治療するために使用可能であることを発見した。
【０００７】
第２の態様では、本発明は、組換え融合ポリペプチドであって、
（ａ）本発明の第１の態様の任意の実施形態もしくは実施形態の組み合わせのＡＤＰ；および
（ｂ）異種ポリペプチド、
を含むポリペプチドを提供する。
【０００８】
第３の態様では、本発明は、組成物であって、
（ａ）本発明の第１の態様の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのＡＤＰ；および
（ｂ）該アメロゲニン由来ポリペプチドに連結された非ペプチド部分、
を含む組成物を提供する。
【０００９】
第４の態様では、本発明は、医薬組成物であって、本発明の１つ以上のポリペプチド、組換え融合タンパク質、または組成物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００１０】
第５の態様では、本発明は、口腔ケア製品であって、本発明のポリペプチド、組換え融合タンパク質、および組成物のうち少なくともいずれかの任意の実施形態または実施形態の組み合わせを含む口腔ケア製品を提供する。
【００１１】
第６の態様では、本発明は、本発明のＡＤＰまたは融合ポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。第７の態様では、本発明は、適切な制御配列に作動可能に連結された本発明の任意の態様の単離核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。第８の態様では、本発明は、本明細書中に開示された組換え発現ベクターでトランスフェクションされた宿主細胞を提供し、該宿主細胞は原核細胞であってもよいし真核細胞であってもよい。
【００１２】
第９の態様では、本発明は、歯科疾患を治療するための方法であって、治療を必要とする対象者に、該歯科疾患を治療するのに有効な量の、本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのポリペプチド、組換え融合タンパク質、組成物、医薬組成物または口腔ケア製品を投与することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】アメロゲニン由来ペプチド（ＡＤＰ）の同定について示す図。パネルａ：ＡＤＰを同定するための設計ステップを示すフローチャート。パネルｂ：ｒＭ１８０および２つの実験的に選択されたＨＡＢＰセットの間の高類似性および低類似性アミノ酸領域。各バーは１つのアミノ酸を表し、基準線より上方のアミノ酸ドメインは高類似性を表す一方、下方のアミノ酸ドメインは低類似性領域を表す。重ね合わされたプロットは潜在的なカルシウムイオン結合ドメインを示す。最も潜在性の高いドメインの大多数が高類似性領域と一致することに留意されたい（矢印）。パネルｃ：ｒＭ１８０アメロゲニンについてコンピュータ計算で決定された分子構造であり、ｒＭ１８０の中の（折りたたまれた）ＡＤＰ７の位置を示している。パネルｄ：ｒＭ１８０上のイオン結合ドメインの位置。パネルｅ：ｒＭ１８０に沿ったＡＤＰの所在位置。
【図２】ＡＤＰのミネラル生成物の結合、石灰化および構造に関する特徴解析について示す図。パネルａ：ＱＣＭによって決定されたＡＤＰの結合定数ＫＤ。パネルｂ：ＡＤＰ５、７およびｒＭ１８０の存在下における石灰化のカルシウム消費率。パネルｃ：ＡＤＰの存在下で溶液中に形成されたリン酸カルシウムミネラル。パネルｄ：ＡＤＰ７のミネラル生成物はｒＭ１８０の存在下で形成されたミネラル生成物に類似しており、これらの針状微結晶はＨＡｐの形態と一致する。パネルｅ：ＡＤＰによって形成されたミネラルのＸ線回折（ＸＲＤ）スペクトル。ＡＤＰ７およびアメロゲニンによって形成された物質はＨＡｐ結晶構造に属する特徴的ピークを示す一方、他のＡＤＰによって形成されたミネラルはいずれも非晶質と一致する弱い回析ピークを示すか、またはパネルｃに示される緩い結晶という結果しか示さない。
【図３】ヒト歯根表面上でのＡＤＰ５によるセメント類似（ｃｅｍｅｎｔｏｍｉｍｅｔｉｃ）層のｉｎ  ｖｉｔｒｏ無細胞合成のための手順を示す図。抜去されたヒトの歯牙からあらゆる夾雑物を取り除き、円筒状の小片をセメントエナメル境のすぐ下方で切り出す。石灰化を進めるペプチドであるＡＤＰ５の水溶液を、脱灰した歯根表面上に適用する。該試験片を、カルシウムおよびリン酸を含有する石灰化溶液中に浸漬する。再石灰化した歯根表面上において細胞の接着および増殖を調査する。
【図４】ＡＤＰ５によってヒト歯根上に形成されたセメント類似層の構造的および機能的特徴を示す図。パネルａおよびｂ：脱灰した層（ａ）および（ｂ）ＡＤＰ５で形成されたセメント類似層のＳＥＭ像であって、ＥＤＸ（エネルギー分散型Ｘ線）スペクトルから得られたＣａ／Ｐ比が１．６７の均一なナノ結晶（挿入図）を示している。パネルｃ：新たに形成されたセメント類似ミネラル層の断面におけるＴＥＭ像および電子回折像であって、ＨＡｐ微結晶を示している。パネルｄ：機械的に分離されたセメント類似ミネラル層のＳＥＭ像であって、均一な厚さのＨＡｐ微結晶を示している。パネルｅ：対照層上およびセメント類似ミネラル層上におけるｈＰＤＬ細胞の付着。パネルｆ：対照のコーティングされていない歯根材料上におけるｈＰＤＬ細胞の増殖をＡＤＰ誘導性のセメント類似ミネラル層と比較して示す図。パネルｇおよびｈ：Ｆ‐アクチンを示す蛍光顕微鏡像。対照表面上における組織的なアクチンネットワークの形成を伴わない細胞接着（ｇ）が、良好に組織化されたアクチン細胞骨格および葉状仮足を示すＡＤＰ誘導性のセメント類似ミネラル層上における細胞接着（ｈ）と比較されている。
【図５】アメロゲニン由来ペプチドを設計するための手順を示す図。
【図６】最初の９０分間におけるＡＤＰのＣａ＋２消費率を示す図。
【図７】ペプチドを用いずに（ａ）、およびｆ‐ＡＤＰ５を用いて（ｂ）、コーティングされた歯根表面の蛍光顕微鏡像を示す図。
【図８】ナノインデンテーション特徴解析が実施された試料の概略図。２０回のインデンテーションを、石灰化した象牙質、脱灰した象牙質（約２０μｍ）、およびセメント類似層（約１０μｍ）の各領域において行った。象牙質におけるインデンテーションは、厳密に管間象牙質上において行われた。
【図９】定性的な機械的分析後のセメント類似層のＳＥＭ顕微鏡写真および対応するＥＤＸＳスペクトルを示す図。ａ）超音波処理およびｂ）ブラッシング。（挿入図：実験装置）
【図１０】最初の３．５時間におけるＡＤＰ５変異体のＣａ＋２消費率を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
引用された参照文献はすべて参照により全体が本願に援用される。本願においては、別途記載のない限り、利用される技法は、いくつかの良く知られた参照文献、例えば：サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング：実験の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、「遺伝子発現技術（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」（Ｄ．ゴッデル（Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ）編、「酵素学実験法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１９９１年、第１８５巻、米国カリフォルニア州サンディエゴ、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ））、「タンパク質精製のガイド（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」（Ｍ．Ｐ．ドイツァー（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ）編、「酵素学実験法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１９９０年、アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．））；イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら、「ＰＣＲプロトコール：方法および応用のガイド（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９０年、米国カリフォルニア州サンディエゴ、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｒ．Ｉ．フレシュニー（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）、「動物細胞の培養：基本技法の手引き（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」第２版、１９８７年、米国ニューヨーク州ニューヨーク、Ｌｉｓｓ社（Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｅ．Ｊ．マレー編、「遺伝子導入および発現のプロトコール（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、ｐ．１０９−１２８、米国ニュージャージー州クリフトン、ヒューマナ出版社（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．）、ならびに、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）１９９８年カタログ、米国テキサス州オースティン、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、のうちいずれかに見出すことができる。
【００１５】
本明細書中で使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうでないことを述べていない限り、複数の指示物を含む。本明細書中で使用される「および、ならびに（ａｎｄ）」は、明示的にそうでないことが定められた場合を除き、「または、もしくは（ｏｒ）」と互換的に使用される。
【００１６】
本発明の任意の態様のすべての実施形態は、文脈が明らかにそうでないことを述べていない限り、組み合わせて使用されうる。
第１の態様では、本発明は、単離されたアメロゲニン由来ポリペプチド（ＡＤＰ）であって、
（ａ）（ＷＰ（Ａ／Ｓ）ＴＤＫＴＫＲＥＥＶＤ）１−１０（配列番号１）（ＡＤＰ３）；
（ｂ）（ＰＧＹＩＮ（Ｌ／Ｆ）ＳＹ（Ｅ／Ａ）（Ｋ／Ｎ／Ａ）ＳＨＳＱＡＩＮ（Ｔ／Ｖ）（Ｄ／Ａ）（Ｒ／Ａ）ＴＡ）１−１０（配列番号２）（ＡＤＰ５）；
（ｃ）（ＬＰＰＬＦＳＭＰＬＳＰＩＬＰＥＬＰＬＥＡＷＰＡＴ）１−１０（配列番号３）（ＡＤＰ６）；および
（ｄ）（ＨＰＰ（Ｓ／Ｔ）ＨＴＬＱＰＨＨＨ（Ｌ／Ｉ）ＰＶＶＰＡＱＱＰＶ（Ａ／Ｉ）ＰＱＱＰＭＭＰＶＰＧ（Ｈ／Ｑ）ＨＳＭＴＰ（Ｔ／Ｉ）ＱＨ）１−１０（配列番号４）（ＡＤＰ７）のうち１２〜４３個の連続したアミノ酸；
もしくはこれらの機能的等価物
を含むか、または前記（ａ）〜（ｄ）もしくはその機能的等価物からなるポリペプチドを提供する。
【００１７】
本発明者らは、本明細書中で議論されるように、本発明のこの態様のアメロゲニン由来ポリペプチドが、例えば、歯牙の石灰化を進め、かつ歯科疾患を治療するために使用されうることを発見した。
【００１８】
本明細書中で使用されるように、ポリペプチドの「機能的等価物」とは、歯科疾患の治療における該ポリペプチドの生物学的活性を保持し、かつ１または複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入を含んだポリペプチドである。様々な実施形態において、機能的等価物はその挙げられたポリペプチドと少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、またはそれ以上同一である。
【００１９】
本願全体にわたって使用されるように、用語「ポリペプチド」は、天然に存在するものであれ合成起源のものであれ、サブユニットであるアミノ酸の配列物を指すための該用語の最も広い意味で使用される。本発明のポリペプチドは、Ｌ‐アミノ酸、Ｄ‐アミノ酸（ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＬ‐アミノ酸特異的プロテアーゼに耐性を有する）、またはＤ‐アミノ酸とＬ‐アミノ酸との組み合わせを含むことができる。本明細書中に記載されるポリペプチドは化学合成されてもよいし組換え発現されてもよい。ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期延長を促進するために、ＰＥＧ化、ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）、またはグリコシル化などによって他の化合物に連結されてもよい。そのような連結は、当業者には理解されているように、共有結合であっても非共有結合であってもよい。
【００２０】
様々な実施形態において、挙げられたポリペプチドは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０コピーとして存在することができるが、好ましくは１コピーとして存在する。複数コピーで存在する場合、該コピーは互いに連続している。例えば、２コピーのＡＤＰ５は：
ＰＧＹＩＮ（Ｌ／Ｆ）ＳＹＥ（Ｋ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮ（Ｔ／Ｖ）ＤＲＴＡＰＧＹＩＮ（Ｌ／Ｆ）ＳＹＥ（Ｋ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮ（Ｔ／Ｖ）ＤＲＴＡ（配列番号５）となろう。さらなる実施例は、本明細書中の教示に基づけば当業者には容易に明白となろう。
【００２１】
１つの実施形態では、単離ＡＤＰは、アミノ酸配列（ＰＧＹＩＮ（Ｌ／Ｆ）ＳＹ（Ｅ／Ａ）（Ｋ／Ｎ／Ａ）ＳＨＳＱＡＩＮ（Ｔ／Ｖ）（Ｄ／Ａ）（Ｒ／Ａ）ＴＡ）１−１０（配列番号２）（ＡＤＰ５）またはその機能的等価物を含むか、あるいは該配列またはその機能的等価物からなる。さらなる実施形態では、ＡＤＰは、（ＰＧＹＩＮ（Ｌ／Ｆ）ＳＹＥ（Ｋ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮ（Ｔ／Ｖ）ＤＲＴＡ）１−１０（配列番号２４）（ＡＤＰ５）またはその機能的等価物を含むか、あるいは該配列またはその機能的等価物からなる。好ましい実施形態では、ＡＤＰ５は、（ＰＧＹＩＮＦＳＹＥＮＳＨＳＱＡＩＮＶＤＲＴＡ）１−１０（配列番号６）（ＡＤＰ５Ｈ）、（ＰＧＹＩＮＬＳＹＥＫＳＨＳＱＡＩＮＴＤＲＴＡ）１−１０（配列番号７）（ＡＤＰ５Ｍ）またはそれらの機能的等価物を含むか、あるいは該配列またはそれらの機能的等価物からなり、ここで「ＡＤＰ５Ｈ」はヒトのアメロゲニン由来のＡＤＰ５を指し、「ＡＤＰ５Ｍ」はマウスのアメロゲニン由来のＡＤＰ５を指す。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、
ＡＤＰ５（Ｖ１）：（ＰＧＹＩＮ（Ｌ／Ｆ）ＳＹＡ（Ｋ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮ（Ｔ／Ｖ）ＡＲＴＡ）１−１０（配列番号２５）；
ＡＤＰ５（Ｖ２）：（ＰＧＹＩＮ（Ｌ／Ｆ）ＳＹＥ（Ａ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮ（Ｔ／Ｖ）ＤＡＴＡ）１−１０（配列番号２６）；
ＡＤＰ５（Ｖ３）：（ＰＧＹＩＮ（Ｌ／Ｆ）ＳＹＡ（Ａ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮ（Ｔ／Ｖ）ＡＡＴＡ）１−１０（配列番号２７）；
もしくはこれらの機能的等価物（「Ｖ」は「異型体（ｖａｒｉａｎｔ）」を表す）からなる群から選択されたＡＤＰ５変異体を含むか、または該変異体からなる。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、
（ＰＧＹＩＮＬＳＹＡ（Ｋ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮＴＡＲＴＡ）１−１０（配列番号３２）；
（ＰＧＹＩＮＬＳＹＥ（Ａ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮＴＤＡＴＡ）１−１０（配列番号３３）；
（ＰＧＹＩＮＬＳＹＡ（Ａ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮＴＡＡＴＡ）１−１０（配列番号３４）；
（ＰＧＹＩＮＦＳＹＡ（Ｋ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮＶＡＲＴＡ）１−１０（配列番号３５）；
（ＰＧＹＩＮＦＳＹＥ（Ａ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮＶＤＡＴＡ）１−１０（配列番号３６）；
（ＰＧＹＩＮＦＳＹＡ（Ａ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮＶＡＡＴＡ）１−１０（配列番号３７）；
（ＰＧＹＩＮＬＳＹＡＫＳＨＳＱＡＩＮＴＡＲＴＡ）１−１０（配列番号３８）；
（ＰＧＹＩＮＬＳＹＥＡＳＨＳＱＡＩＮＴＤＡＴＡ）１−１０（配列番号３９）；
（ＰＧＹＩＮＬＳＹＡＡＳＨＳＱＡＩＮＴＡＡＴＡ）１−１０（配列番号４０）；
（ＰＧＹＩＮＦＳＹＡＮＳＨＳＱＡＩＮＶＡＲＴＡ）１−１０（配列番号４１）；
（ＰＧＹＩＮＦＳＹＥＡＳＨＳＱＡＩＮＶＤＡＴＡ）１−１０（配列番号４２）；および
（ＰＧＹＩＮＦＳＹＡＡＳＨＳＱＡＩＮＶＡＡＴＡ）１−１０（配列番号４３）
を含むか、または前記配列からなる。
【００２２】
様々な実施形態において、ＡＤＰ５、ＡＤＰ５Ｍ、ＡＤＰ５Ｈまたはこれらの任意の異型体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０コピーとして存在する。好ましい実施形態では、ＡＤＰ５、ＡＤＰ５Ｍ、ＡＤＰ５Ｈまたはこれらの任意の異型体は１コピーとして存在する。ＡＤＰ５は、以降の実施例において、ヒト歯牙上の象牙質など所与の固体表面上における野生型アメロゲニンタンパク質の石灰化促進作用を迅速に模倣することが示されており、よって本明細書中に開示された方法のうちいずれにおいても使用することができる。最も好ましい実施形態では、ＡＤＰ５は、好ましくは１コピーの、ＡＤＰ５Ｈもしくはその任意の異型体を含むか、またはＡＤＰ５Ｈもしくはその任意の異型体からなる。
【００２３】
別の実施形態では、単離ＡＤＰは、アミノ酸配列（ＨＰＰ（Ｓ／Ｔ）ＨＴＬＱＰＨＨＨ（Ｌ／Ｉ）ＰＶＶＰＡＱＱＰＶ（Ａ／Ｉ）ＰＱＱＰＭＭＰＶＰＧ（Ｈ／Ｑ）ＨＳＭＴＰ（Ｔ／Ｉ）ＱＨ）１−１０（配列番号４）（ＡＤＰ７）またはその機能的等価物を含むか、あるいは該配列またはその機能的等価物からなる。好ましい実施形態では、ＡＤＰ７は、
（ＨＰＰＳＨＴＬＱＰＨＨＨＬＰＶＶＰＡＱＱＰＶＡＰＱＱＰＭＭＰＶＰＧＨＨＳＭＴＰＴＱＨ）１−１０（配列番号８）（ＡＤＰ７Ｍ）；
（ＨＰＰＴＨＴＬＱＰＨＨＨＩＰＶＶＰＡＱＱＰＶＩＰＱＱＰＭＭＰＶＰＧＱＨＳＭＴＰＩＱＨ）１−１０（配列番号９）（ＡＤＰ７Ｈ）、
またはそれらの機能的等価物を含むか、あるいは該配列またはそれらの機能的等価物からなり、ここで「ＡＤＰ７Ｈ」はヒトのアメロゲニン由来のＡＤＰ７を指し、「ＡＤＰ７Ｍ」はマウスのアメロゲニン由来のＡＤＰ７を指す。様々な実施形態において、ＡＤＰ７、ＡＤＰ７Ｍ、またはＡＤＰ７Ｈは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０コピーとして存在する。好ましい実施形態では、ＡＤＰ７、ＡＤＰ７Ｍ、またはＡＤＰＨ７は１コピーとして存在する。ＡＤＰ７は、以降の実施例において、溶液相中でハイドロキシアパタイト（ＨＡ）の結晶学的状態および形態学的状態を制御することが示されており、よって本明細書中に開示された方法のいずれにおいても使用されうる。ＡＤＰ７はさらに、例えば、対象とする生物活性分子（治療薬、標識分子、その他の対象ポリペプチドなど）を標的としてそれを歯牙上のＨＡ表面に固定化するためにも使用されうる。最も好ましい実施形態では、ＡＤＰ７は、好ましくは１コピーのＡＤＰ７Ｈを含むかまたは１コピーのＡＤＰ７Ｈからなる。
【００２４】
１つの実施形態では、単離ＡＤＰは、アミノ酸配列（ＷＰ（Ａ／Ｓ）ＴＤＫＴＫＲＥＥＶＤ）１−１０（配列番号１）（ＡＤＰ３）またはその機能的等価物を含むか、あるいは該配列またはその機能的等価物からなる。好ましい実施形態では、ＡＤＰ５は、（（ＷＰＡＴＤＫＴＫＲＥＥＶＤ）１−１０（配列番号１０）（ＡＤＰ３Ｍ）もしくは（ＷＰＳＴＤＫＴＫＲＥＥＶＤ）１−１０（配列番号１１）（ＡＤＰ３Ｈ）またはそれらの機能的等価物を含むか、あるいは該配列またはそれらの機能的等価物からなり、ここで「ＡＤＰ３Ｈ」はヒトのアメロゲニン由来のＡＤＰ３を指し、「ＡＤＰ３Ｍ」はマウスのアメロゲニン由来のＡＤＰ３を指す。様々な実施形態において、ＡＤＰ３、ＡＤＰ３Ｍ、またはＡＤＰ３Ｈは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０コピーとして存在する。好ましい実施形態では、ＡＤＰ３、ＡＤＰ３Ｍ、またはＡＤＰ３Ｈは１コピーとして存在する。ＡＤＰ３は低類似性ＨＡ結合剤であり、よって本発明の方法のいずれにおいても使用されうる。ＡＤＰ３はさらに、例えば、対象とする生物活性分子（治療薬、標識分子、その他の対象ポリペプチドなど）を標的としてそれを歯牙上のＨＡ表面に固定化するためにも使用されうる。最も好ましい実施形態では、ＡＤＰ３は、好ましくは１コピーのＡＤＰ３Ｈを含むかまたは１コピーのＡＤＰ３Ｈからなる。
【００２５】
様々な他の好ましい実施形態では、単離ポリペプチドは、
（ｉ）（ＨＴＬＱＰＨＨＨ（Ｌ／Ｉ）ＰＶＶ）１−１０（配列番号１２）（ＡＤＰ１）；
（ｉｉ）（ＶＰＧ（Ｈ／Ｑ）ＨＳＭＴＰ（Ｔ／Ｉ）ＱＨ）１−１０（配列番号１３）（ＡＤＰ２）
（ｉｉｉ）（ＨＰＰ（Ｓ／Ｔ）ＨＴＬＱＰＨＨＨ（Ｌ／Ｉ）ＰＶＶ）１−１０（配列番号１４）（ＡＤＰ４）；
（ｉｖ）（ＰＡＱＱＰＶ（Ａ−Ｉ）ＰＱＱＰＭＭＰ）１−１０（配列番号１５）（ＡＤＰ８）；
（ｖ）（ＨＴＬＱＰＨＨＨＬＰＶＶ）１−１０（配列番号１６）（ＡＤＰ１Ｍ）；
（ｖｉ）（ＨＴＬＱＰＨＨＨＩＰＶＶ）１−１０（配列番号１７）（ＡＤＰ１Ｈ）；
（ｖｉｉ）（ＶＰＧＨＨＳＭＴＰＴＱＨ）１−１０（配列番号１８）（ＡＤＰ２Ｍ）
（ｖｉｉ）（ＶＰＧＱＨＳＭＴＰＩＱＨ）１−１０（配列番号１９）（ＡＤＰ２Ｈ）
（ｉｘ）（ＨＰＰＳＨＴＬＱＰＨＨＨＬＰＶＶ）１−１０（配列番号２０）（ＡＤＰ４Ｍ）；
（ｘ）（ＨＰＰＴＨＴＬＱＰＨＨＨＩＰＶＶ）１−１０（配列番号２１）（ＡＤＰ４Ｈ）；
（ｘｉ）（ＰＡＱＱＰＶＡＰＱＱＰＭＭＰ）１−１０（配列番号２２）（ＡＤＰ８Ｍ）；および
（ｘｉｉ）（ＰＡＱＱＰＶＩＰＱＱＰＭＭＰ）１−１０（配列番号２３）（ＡＤＰ８Ｈ）
からなる群またはそれらの機能的等価物
から選択されたポリペプチドを含むか、あるいは該ポリペプチドからなる。
【００２６】
様々な実施形態において、上述したポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０コピーとして、好ましくは１コピーとして存在しうる。これらのポリペプチドはそれぞれＨＡに結合し、したがって、該ポリペプチドの石灰化作用以外にも、該ポリペプチドは対象とする生物活性分子（治療薬、標識分子、その他の対象ポリペプチドなど）を標的としてそれを歯牙上のＨＡ表面に固定化するために使用することができる。更に、ＡＤＰ７はＡＤＰ４＋ＡＤＰ８＋ＡＤＰ２の組み合わせであり、ＡＤＰ１はＡＤＰ４の中に完全に含まれている。したがって、これらのポリペプチドもそれぞれ、例えばＡＤＰ７を合成により調製する際に使用されうる。
【００２７】
これらの実施形態はすべて、文脈が明らかにそうでないことを述べていない限り、任意の他の実施形態と組み合わせてもよい。
第２の態様では、本発明は、組換え融合ポリペプチドであって、
（ａ）本発明の第１の態様の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのＡＤＰ；および
（ｂ）異種ポリペプチド
を含むポリペプチドを提供する。
【００２８】
本明細書中で使用されるように、「異種ポリペプチド」とは、（ａ）アメロゲニン由来ではないか、または（ｂ）該組換え融合ポリペプチドの構成要素（ａ）において挙げられたＡＤＰとは異なるＡＤＰである任意のポリペプチドである。組換え融合ポリペプチドは野生型アメロゲニンを含まない。したがって、例えば、組換え融合ポリペプチドは、該融合ポリペプチドがアメロゲニンでない限りは、ＡＤＰ５とＡＤＰ７との融合体を含むことも、ＡＤＰ５とＡＤＰ７との融合体からなることも可能である。
【００２９】
本発明の組換え融合ポリペプチドは、例えば、歯科疾患を治療するために使用されうる。したがって、ＡＤＰを融合ポリペプチドとして提供することは、そのような治療を実行する場合に高い機能性を提供するために、またはその他任意の適切な用途のために、有用な戦略である。
【００３０】
１つの実施形態では、異種ポリペプチドは、例えば歯科疾患を治療するための投与の際に該組換え融合体の検出を可能にする、検出可能なポリペプチドである。別の実施形態では、異種ポリペプチドは、例えば該ポリペプチドの単離の助けとなるように使用可能な任意の種類のアフィニティータグ（限定するものではないがＦＬＡＧタグ、ヘキサヒスチジンタグ、およびｍｙｃタグなど）である。
【００３１】
様々な他の実施形態では、異種ポリペプチドは、例えば融合ポリペプチドが歯科疾患を治療するために使用される場合、付加的機能性を提供する。そのような異種ポリペプチドの実例には、限定するものではないが、抗微生物ポリペプチド（細菌感染を抑制）、バイオミネラリゼーション促進ポリペプチド（すなわち、バイオミネラリゼーションを制御または促進するのに有用な任意のポリペプチド）、無機物結合ポリペプチド、三次元スカフォールド形成ポリペプチド、コラーゲン、キトサン、両親媒性ペプチド、タンパク質結合ポリペプチド、エナメリン由来ポリペプチド、タフテリン由来ペプチド、スタテリン由来ポリペプチド、象牙質由来ポリペプチド、骨シアロタンパク質由来ポリペプチド、オステオカルシン由来ポリペプチド、オステオポンチン由来ポリペプチド、齲歯阻害活性を備えたタンパク質、カゼイン、および骨形成由来ポリペプチドが挙げられる。当業者には当然のことであるが、上述した異種ポリペプチドは、完全長タンパク質もしくは該タンパク質に由来する機能性ポリペプチドを含むこともできるし、該タンパク質もしくはポリペプチドからなるものであってもよい。そのような異種ポリペプチドは当業者に周知である。様々な非限定的な実施形態において、そのような異種ポリペプチドには、限定するものではないが、象牙質もしくは象牙質に由来するポリペプチド；セメント質もしくはセメント質に由来するポリペプチド；または他のアメロゲニン由来ペプチドであって、例えば、限定するものではないが、
ＭＰＬＰＰＨＰＧＳＰＧＹＩＮＬＳＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＳＭＩＲＱＰＰＬＳＰＩＬＰＥＬＰＬＥＡＷＰＡＴＤＫＴＫＲＥＥＶＤ（配列番号２８）
ＭＰＬＰＰＨＰＧＳＰＧＹＩＮＬＳＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＳＭＩＲＱＰＹＰＳＹＧＹＥＰＭＧＧＷ（配列番号２９）；
ＬＰＰＨＰＧＳＰＧＹＩＮＬＳＹＥＶＬＴＰＬＫＷＹＱＳＭＩＲＱＰＹＰＳＹＧＹＥ（配列番号３０）；および
ＳＰＩＬＰＥＬＰＬＥＡＷＰＡＴＤＫ（配列番号３１）
が挙げられる。
【００３２】
第３の態様では、本発明は、
（ａ）本発明の第１の態様の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのＡＤＰ；および
（ｂ）該アメロゲニン由来ポリペプチドに連結された非ペプチド部分
を含む組成物を提供する。
【００３３】
本明細書中で使用されるように、「非ペプチド部分」とは、天然に存在するものであれ合成物であれ、本発明のＡＤＰに付加的機能性を提供する任意の非ペプチド部分である。例えば、非ペプチド部分は任意の有機もしくは無機のナノ構造体、またはこれらのハイブリッドであってよい。組成物は、例えば歯科疾患を治療するために使用されうる。したがって、ＡＤＰを上述した組成物として提供することは、そのような治療を実行する場合に高い機能性を提供するため、またはその他任意の適切な用途のために、有用な戦略である。
【００３４】
１つの実施形態では、非ペプチド部分は、例えば歯科疾患を治療するための投与の際に組成物の検出を可能にする検出可能な非ペプチド部分、例えば、限定するものではないが、ラジオアイソトープ、非ペプチドのアフィニティータグ、同位体コードアフィニティータグ、および発蛍光団であってよい。
【００３５】
他の実施形態では、非ペプチド部分は、有機ナノ構造体（例えばミセル、リポソームおよびデンドリマー）または無機ナノ構造体（例えば金属ナノ構造体、半導体ナノ構造体および誘電性ナノ構造体）、例えば、限定するものではないが、ナノチューブ、ナノワイヤ、ナノ粒子、原子クラスター、量子ドット、単層もしくは多層の原子材料、無機イオンもしくはイオンクラスター、および有機‐無機ハイブリッドナノ構造体、ならびに非ペプチドポリマーを含むことができる。これらの実施形態は、例えば、組成物の所与の適用のために、対象となる構造的特徴を提供するために使用することができる。
【００３６】
他の実施形態では、非ペプチド部分は、治療を受ける対象者に付加的な治療上の利益を提供する非ペプチド物質、例えば、限定するものではないが、魚粉、アミノ酸（例えば、限定するものではないがグリシン）、および非ペプチドポリマーを含むことができる。
【００３７】
第２および第３の実施形態それぞれにおいて、異種ポリペプチドまたは非ペプチド部分は、共有結合、例えば、限定するものではないがジスルフィド結合、水素結合、静電結合、組換え融合および立体配座による結合を通じてＡＤＰに連結されうる。別例として、異種ポリペプチドまたは非ペプチド部分は、１つ以上の連結化合物によってＡＤＰに連結されてもよい。ポリペプチドに構成部分をコンジュゲートするための技法は当業者には良く知られている。
【００３８】
任意の適切な検出可能なポリペプチドまたは検出可能な非ペプチド部分、例えば、限定するものではないが酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、ポジトロン放出金属、および非放射性の常磁性金属イオンが、本発明の第２および第３の態様においてＡＤＰに連結されうる。使用されるタグは、その特定の検出技法および使用される方法に応じて変わることになろう。ポリペプチドの視覚化を可能にするために該ポリペプチドに一般的にコンジュゲートされる酵素は良く知られており、例えば、限定するものではないがアセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、β‐ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびウレアーゼが挙げられる。さらに、視覚的に検出可能な生成物の産生および沈積のための一般的な基質も当業者に良く知られている。ＡＤＰはコロイド金を使用して標識されてもよいし、または放射性同位元素、例えば３３Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈおよび１２５Ｉなどを用いて標識されてもよい。本発明のＡＤＰは、当分野でよく知られた方法によって放射性核種に直接またはキレート剤を介して間接的に付着されてもよい。
【００３９】
第４の態様では、本発明は、本発明の１つ以上のポリペプチド、組換え融合タンパク質、または組成物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、例えば、下記に記載された本発明の方法において使用されうる。医薬組成物は、本発明のポリペプチドに加えて、（ａ）リオプロテクタント；（ｂ）界面活性剤；（ｃ）増量剤；（ｄ）等張化剤；（ｅ）安定化剤；（ｆ）防腐剤、および（ｇ）バッファーのうち少なくともいずれかを含むことができる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、医薬組成物中のバッファーは、トリスバッファー、ヒスチジンバッファー、リン酸バッファー、クエン酸バッファーまたは酢酸バッファーである。医薬組成物は、リオプロテクタント、例えばスクロース、ソルビトールまたはトレハロースを含むこともできる。ある実施形態では、医薬組成物は、防腐剤、例えば塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロルヘキシジン、フェノール、ｍ‐クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ｏ‐クレゾール、ｐ‐クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、安息香酸、およびこれらの様々な混合物を含む。他の実施形態では、医薬組成物はグリシンのような増量剤を含む。さらに他の実施形態では、医薬組成物は、界面活性剤、例えばポリソルベート‐２０、ポリソルベート‐４０、ポリソルベート‐６０、ポリソルベート‐６５、ポリソルベート‐８０  ポリソルベート‐８５、ポロキサマー‐１８８、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミタート、ソルビタンモノステアラート、ソルビタンモノオレアート、ソルビタントリラウレート、ソルビタントリステアラート、ソルビタントリオレアート、またはこれらの組み合わせを含む。医薬組成物はさらに、等張化剤、例えば調合物をヒト血液とほぼ等張または等浸透圧にする化合物も含むことができる。典型的な等張化剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、メチオニン、マンニトール、デキストロース、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニンおよび塩酸アルギニンが挙げられる。他の実施形態では、医薬組成物はさらに、安定化剤、例えば、対象とするタンパク質と組み合わされたときに、凍結乾燥形態または液体形態における該対象タンパク質の化学的かつ／または物理的不安定性を実質的に防止または低減する分子を含む。典型的な安定化剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニンおよび塩酸アルギニンが挙げられる。
【００４１】
本発明のポリペプチドは医薬組成物中の唯一の活性作用薬であってもよいし、該組成物が、用途に適した１つ以上の他の活性作用薬、例えば、限定するものではないが抗微生物性のポリペプチド（細菌感染を抑制）、バイオミネラリゼーション促進ポリペプチド（すなわち、バイオミネラリゼーションを制御または促進するのに有用な任意のポリペプチド）、無機物結合ポリペプチド、三次元スカフォールド形成ポリペプチド、コラーゲン、キトサン、両親媒性ペプチド、タンパク質結合ポリペプチド、エナメリン由来ポリペプチド、タフテリン由来ペプチド、スタテリン由来ポリペプチド、象牙質由来ポリペプチド、骨シアロタンパク質由来ポリペプチド、オステオカルシン由来ポリペプチド、オステオポンチン由来ポリペプチド、齲歯阻害活性を備えたタンパク質、カゼイン、および骨形成由来ポリペプチドをさらに含むこともできる。
【００４２】
本明細書中に記載される医薬組成物は一般に、本明細書中に記載された化合物と、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤との組み合わせを含む。そのような組成物は、薬学的に許容されない成分を実質的に含まない、すなわち、本願の出願時点において米国の規制上の要件により法的に認められているよりも低い量の薬学的に許容されない成分しか含有していない。この態様のいくつかの実施形態では、化合物が水中に溶解または懸濁される場合、組成物はさらに任意選択で追加の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む。他の実施形態では、本明細書中に記載される医薬組成物は固体の医薬組成物（例えば錠剤、カプセル剤など）である。
【００４３】
これらの組成物は製薬分野において良く知られた方式で調製可能であり、かつ任意の適切な経路によって投与されうる。好ましい実施形態では、医薬組成物および製剤は局所投与のために設計され、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、パスタ剤、ゲル剤、点滴剤、噴霧剤、液剤および散剤が挙げられる。従来の製薬用の担体、水性、粉末もしくは油性の基材、増粘剤などが必要であるかまたは望ましい場合もある。
【００４４】
医薬組成物は、任意の適切な形態、例えば、限定するものではないが錠剤、丸剤、散剤、口内錠、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、溶液、シロップ剤、エアロゾル剤（固体として、または液体媒体に含めて）、軟膏剤であって例えば重量比で最大１０％の活性化合物を含有するもの、軟ゼラチンカプセルおよび硬ゼラチンカプセル、無菌注射用溶液、ならびに無菌包装された散剤であってよい。
【００４５】
好ましい実施形態では、医薬組成物は、デンタルケア製品の形態、例えば、限定するものではないが練り歯磨き、磨歯剤、口内洗浄液、デンタルフロス、液体歯磨剤、歯垢検出剤、局所用ゲル剤、トローチ、チューインガム、歯科用パスタ剤、歯肉マッサージクリーム剤、含嗽用錠剤、口内錠、および食物製品であってよい。よって、第５の態様では、本発明は、口腔ケア製品であって、本発明のポリペプチド、組換え融合タンパク質、および組成物のうち少なくともいずれかの任意の実施形態または実施形態の組み合わせを含む口腔ケア製品を提供する。そのような口腔ケア製品は、例えば歯科疾患を治療するために使用されうる。
【００４６】
第６の態様では、本発明は、本発明のＡＤＰまたは融合ポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。該単離核酸配列はＲＮＡまたはＤＮＡを含むことができる。本明細書中で使用されるように、「単離核酸」とは、ゲノム配列中またはｃＤＮＡ配列中において正常時にその周囲にある核酸配列から取り出されている核酸である。そのような単離核酸配列は、コードされたタンパク質の発現および精製のうち少なくともいずれか一方を容易にするのに有用な追加の配列、例えば、限定するものではないが、ｐｏｌｙＡ配列、修飾コザック配列、ならびに、エピトープタグ、移出シグナル、および分泌シグナル、核局在シグナル、および原形質膜局在シグナルをコードする配列を含むことができる。本明細書中の教示に基づけば、どの核酸配列が本発明のポリペプチドをコードすることになるかは当業者には明白であろう。
【００４７】
第７の態様では、本発明は、適切な制御配列に作動可能に連結された本発明の任意の態様の単離核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。「組換え発現ベクター」には、核酸コード領域または遺伝子を該遺伝子産物の発現を達成することができる任意の制御配列に作動可能に連結するベクターが含まれる。本発明の核酸配列に作動可能に連結される「制御配列」は、核酸分子の発現を達成することができる核酸配列である。制御配列は、該制御配列が核酸配列の発現を導くように機能する限り、該核酸配列に隣接している必要はない。したがって、例えば、翻訳されないが転写される介在配列がプロモータ配列と核酸配列との間に存在することが可能であり、その場合も該プロモータ配列はコード配列に「作動可能に連結された」とみなすことができる。他のそのような制御配列には、限定するものではないが、ポリアデニル化シグナル、終結シグナル、およびリボソーム結合部位が挙げられる。そのような発現ベクターは当分野において既知の任意の種類のものであってよく、例えば、限定するものではないが、プラスミドおよびウイルス系の発現ベクターが挙げられる。開示された核酸配列の発現を哺乳類の系において駆動するために使用される制御配列は、構成的（様々なプロモータのうち任意のもの、例えば、限定するものではないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦプロモータによって駆動される）であってもよいし、誘導型（いくつかの誘導プロモータのうち任意のもの、例えば、限定するものではないが、テトラサイクリン、エクジソン、ステロイド応答性のプロモータによって駆動される）であってもよい。原核細胞のトランスフェクションに使用される発現ベクターの構築は当分野においてよく知られており、よって標準的技法により達成可能である。（例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、「分子クローニング、実験の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｅ．Ｊ．マレー（Ｍｕｒｒａｙ）編、「遺伝子導入および発現のプロトコール（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、ｐ．１０９−１２８、米国ニュージャージー州クリフトン、ヒューマナ出版社（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．）、ならびに、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）１９９８年カタログ、米国テキサス州オースティン、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）を参照されたい）。発現ベクターは、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡへの組込みにより、宿主生物体内において複製可能でなければならない。好ましい実施形態では、発現ベクターはプラスミドを含む。しかしながら、本発明は、ウイルスベクターのような同等の機能を果たす他の発現ベクターを含むことも意図されている。
【００４８】
第８の態様では、本発明は、本明細書中に開示された組換え発現ベクターでトランスフェクションされた宿主細胞を提供し、該宿主細胞は原核細胞であってもよいし真核細胞であってもよい。細胞は、一過性にトランスフェクションされることも、安定的にトランスフェクションされることも可能である。原核細胞および真核細胞への発現ベクターのそのようなトランスフェクションは、当分野で既知の任意の技術、例えば、限定するものではないが、標準的な細菌形質転換、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション、またはリポソーム介在型、ＤＥＡＥデキストラン介在型、ポリカチオン介在型、もしくはウイルス介在型のトランスフェクションによって行うことができる。（例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング、実験の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｒ．Ｉ．フレシュニー（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）、「動物細胞の培養：基本技法の手引き（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」第２版、１９８７年、米国ニューヨーク州ニューヨーク、Ｌｉｓｓ社（Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照されたい）。本発明のポリペプチドを生産する方法は本発明の補足部分である。該方法は、（ａ）本発明のこの態様の宿主を該ポリペプチドの発現の助けになる条件下で培養するステップと、（ｂ）任意選択で、発現されたポリペプチドを回収するステップとを含む。発現されたポリペプチドは、無細胞抽出物から回収可能であるが、培地から回収されることが好ましい。無細胞抽出物または培地からポリペプチドを回収する方法は、当業者によく知られている。
【００４９】
第９の態様では、本発明は、歯科疾患を治療するための方法であって、治療を必要とする対象者に、該歯科疾患を治療するのに有効な量の、本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのポリペプチド、組換え融合タンパク質、組成物、医薬組成物または口腔ケア製品を投与することを含む方法を提供する。
【００５０】
本明細書中に示されるように、発明者らは様々な歯科疾患を治療するために本発明のポリペプチドが使用されうることを見出した。特定の作用機序に束縛されるものではないが、本発明者らは、本発明のポリペプチドが歯性病変部の石灰化を導いて、歯の過敏症および細菌の浸入を低減する役割も果たす「歯によく似た（ｄｅｎｔｏ−ｍｉｍｅｔｉｃ）」ミネラル層を形成するものと考えている。さらに、該ポリペプチドの中には、歯の上のハイドロキシアパタイト（ＨＡ）表面への結合を介して、再石灰化を速度論的に促進するという該ポリペプチドの活性を発揮して、刺激物が象牙細管に到達するのを防止／制限するために該細管を閉塞させること、および、失われたミネラルを再構築して細菌に対する物理的バリアを作出すること、のうち少なくともいずれかをなすものもあると考えられる。したがって、本発明の方法は、歯科疾患を治療するための先行技術の方法に勝る多大な改良点を提供する。
【００５１】
対象者は、歯科疾患に罹患しうる任意の対象者、例えば、限定するものではないが哺乳動物であってよい。様々な実施形態において、哺乳動物は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、またはその他の愛玩動物もしくは食用動物／酪農動物である。好ましい実施形態では、対象者はヒトである。
【００５２】
本明細書中で使用されるように、歯科疾患は、歯、歯肉または口内のその他の組織であって脱灰（すなわち歯牙表面上のミネラル分の損失）に（直接または間接に）関与するものに対して影響を及ぼす任意の疾患または症状である。健康な人では、歯は、歯牙表面と周囲の唾液との間のイオンの交換により、脱灰および再石灰化を循環している。脱灰の速度が再石灰化の速度を上回ると、歯科疾患が引き起こされる。脱灰はほとんどの歯科疾患の主要原因である。ミネラルの損失は、あらゆる原因、例えば、限定するものではないが酸性の食物、口腔乾燥、歯牙の漂白、摩耗および歯垢形成によって引き起こされうる。
【００５３】
そのような歯科疾患には、限定するものではないが、歯根膜炎、歯牙侵蝕症、過敏症、齲歯（齲蝕症／齲窩としても知られている）、歯牙フッ素中毒、歯牙吸収、頭蓋顎顔面骨疾患、および歯肉後退が挙げられる。
【００５４】
本明細書中で使用されるように、「歯根膜炎」は、歯周組織すなわち歯牙を取り囲んで支持している組織を侵す一連の炎症性疾患である。歯根膜炎は、歯牙の周りの歯槽骨の進行性の喪失に関与し、仮に治療せずに放置されると歯牙の弛緩およびその後の喪失をもたらす可能性がある。歯根膜炎は、歯牙表面に付着して増殖する微生物、加えてこれらの微生物に対する過度に攻撃的な免疫応答によって、引き起こされる。
【００５５】
本明細書中で使用されるように、「歯牙脱灰」または「歯牙侵蝕症」は歯牙エナメル質の侵蝕である。この侵蝕は、様々な要因、例えば細菌感染、歯ぎしり、摩耗、侵蝕、およびアブフラクションなどが原因で引き起こされうる。
【００５６】
本明細書中で使用されるように、「過敏症」は、歯牙の象牙質内部の神経の環境への露出増大が原因で神経応答の増大が引き起こされるものであり、軽症の場合もあれば重症の場合もあり得る。過敏性は、様々な要因、例えば、限定するものではないが摩滅、齲蝕症または歯根の露出などが原因で引き起こされうる。
【００５７】
本明細書中で使用されるように、「齲歯」とは、硬組織（エナメル、象牙質およびセメント質）の脱灰ならびに歯牙の有機物の破壊の原因となる、通常は細菌を原因とする感染症である。齲窩の最も一般的な原因である細菌はストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）および乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）である。仮に治療せずに放置されると、齲歯は疼痛、歯牙の喪失および全身感染をもたらす可能性がある。
【００５８】
本明細書中で使用されるように、「歯牙フッ素中毒」とは、歯牙の発生の間に高濃度のフッ素化合物に過度に曝露されることによって引き起こされたエナメル質の発育障害である。フッ素化合物への過剰曝露のリスクは生後３か月〜８年の間が最も大きい。軽症のものでは、フッ素症は、歯牙のエナメル質における目立たない小さな白い条痕または斑点として現れる場合が多い。最も重症なものでは、歯牙の外観が変色または褐色の痕跡によって損なわれる。該エナメル質は小窩を有し、粗面であり、かつ清潔にすることが困難な場合がある。フッ素症によって残された染みおよび変色は恒久的であり、時間がたつにつれて黒くなる場合もある。
【００５９】
本明細書中で使用されるように、「歯牙吸収」とは歯牙構造体のすべてまたは一部が失われるプロセスである。「外部性吸収（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）」では、歯根表面が失われるが、これは、例えば慢性炎症、嚢腫、腫瘍、外傷、歯牙の再移植、または未知の原因によって引き起こされる可能性がある。「内部性呼吸（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）」は根管内の中央における象牙質壁および髄側壁の吸収を伴い、原因は、時に歯牙の外傷に起因することもあるが、多くの場合、原因不明である。
【００６０】
本明細書中で使用されるように、「歯肉後退」とは、歯肉線縁が歯冠から後退する結果として環境に露出している歯根（セメント質）である。セメント質は、歯周靭帯によって下顎骨または上顎骨への歯牙の付着を支援する石灰化組織である。露出したセメント質は、セメント質の吸収およびその下にある象牙質の露出、したがって過敏症および疼痛をもたらす可能性がある。
【００６１】
１つの実施形態では、「頭蓋顎顔面骨疾患」とは、歯骨構造体の疾患を指す。
本明細書中で使用されるように、「歯科疾患を治療する（こと）」とは、下記すなわち：（ａ）歯科疾患の重症度を低下させること；（ｂ）治療されている歯科疾患に特徴的な症状の発生を制限または防止すること；（ｃ）治療されている歯科疾患に特徴的な症状の悪化を抑制すること；（ｄ）以前にその疾患を有していた患者において該歯科疾患の再発を制限または防止すること；（ｅ）以前にその歯科疾患の症状を示した患者において症状の再発を制限または防止すること；および（ｆ）歯科疾患を発症するリスクを有しているか、または歯科疾患の臨床作用を未だ示していない対象者において歯科疾患の発現を制限すること、のうち１つ以上を遂行することを意味する。
【００６２】
本明細書中で使用されるように、「有効な量」とは歯科疾患の治療および制限のうち少なくともいずれかを行うのに有効なポリペプチドの量を指す。ポリペプチドは、典型的には上記に開示されたもののような医薬組成物として製剤化され、かつ、従来の薬学的に許容される担体、アジュバント、およびビヒクルを含有する投与量単位製剤に含めて任意の適切な経路で、例えば経口的に、ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ、吸入噴霧により、または局所的に、投与可能である。好ましい実施形態では、医薬組成物および製剤は、例えば軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、パスタ剤、ゲル剤、点滴剤、噴霧剤、液剤および散剤の形態で局所投与される。従来の製薬用の担体、水性、粉末もしくは油性の基材、増粘剤などが必要であるかまたは望ましい場合もある。
【００６３】
投与レジメンは最適な所望の応答（例えば治療的または予防的応答）を提供するために調節可能である。適切な用量域は、例えば体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１００ｍｇとなりうるが；別例として、適切な用量域は体重１ｋｇあたり０．５μｇ〜５０ｍｇ；１μｇ〜２５ｍｇ、または５μｇ〜１０ｍｇであってもよい。ポリペプチドは単回ボーラス投与で送達されることも可能であるし、主治医の決定により２回以上（例えば２、３、４、５回またはそれ以上）投与されてもよい。
【００６４】
これらの実施形態それぞれにおいて、または実施形態の組み合わせにおいて、ポリペプチドは本発明の第１、第２、または第３の態様の任意の実施形態または実施形態の組み合わせであってよい。したがって、１つの実施形態では、ＡＤＰは、
（ａ）（ＷＰ（Ａ／Ｓ）ＴＤＫＴＫＲＥＥＶＤ）１−１０（配列番号１）（ＡＤＰ３）；
（ｂ）（ＰＧＹＩＮ（Ｌ／Ｆ）ＳＹ（Ｅ／Ａ）（Ｋ／Ｎ／Ａ）ＳＨＳＱＡＩＮ（Ｔ／Ｖ）（Ｄ／Ａ）（Ｒ／Ａ）ＴＡ）１−１０（配列番号２）（ＡＤＰ５）；
（ｃ）（ＬＰＰＬＦＳＭＰＬＳＰＩＬＰＥＬＰＬＥＡＷＰＡＴ）１−１０（配列番号３）（ＡＤＰ６）；および
（ｄ）（ＨＰＰ（Ｓ／Ｔ）ＨＴＬＱＰＨＨＨ（Ｌ／Ｉ）ＰＶＶＰＡＱＱＰＶ（Ａ／Ｉ）ＰＱＱＰＭＭＰＶＰＧ（Ｈ／Ｑ）ＨＳＭＴＰ（Ｔ／Ｉ）ＱＨ）１−１０（配列番号４）（ＡＤＰ７）のうち１２〜４３個の連続したアミノ酸；
もしくはこれらの機能的等価物
を含むか、または前記（ａ）〜（ｄ）もしくはその機能的等価物からなる。様々な実施形態において、上述したポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０コピーとして、好ましくは１コピーとして存在しうる。
【００６５】
１つの好ましい実施形態では、方法は、アミノ酸配列（ＰＧＹＩＮ（Ｌ／Ｆ）ＳＹ（Ｅ／Ａ）（Ｋ／Ｎ／Ａ）ＳＨＳＱＡＩＮ（Ｔ／Ｖ）（Ｄ／Ａ）（Ｒ／Ａ）ＴＡ）１−１０（配列番号２）（ＡＤＰ５）またはその機能的等価物を含むか、あるいは該配列またはその機能的等価物からなるポリペプチドを投与することを含む。さらなる実施形態では、投与されるＡＤＰは、（ＰＧＹＩＮ（Ｌ／Ｆ）ＳＹＥ（Ｋ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮ（Ｔ／Ｖ）ＤＲＴＡ）１−１０（配列番号２４）（ＡＤＰ５）またはその機能的等価物を含むか、あるいは該配列またはその機能的等価物からなる。好ましい実施形態では、投与されるＡＤＰ５は、（ＰＧＹＩＮＦＳＹＥＮＳＨＳＱＡＩＮＶＤＲＴＡ）１−１０（配列番号６）（ＡＤＰ５Ｈ）、（ＰＧＹＩＮＬＳＹＥＫＳＨＳＱＡＩＮＴＤＲＴＡ）１−１０（配列番号７）（ＡＤＰ５Ｍ）またはそれらの機能的等価物を含むか、あるいは該配列またはそれらの機能的等価物からなる。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、
ＡＤＰ５（Ｖ１）：（ＰＧＹＩＮ（Ｌ／Ｆ）ＳＹＡ（Ｋ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮ（Ｔ／Ｖ）ＡＲＴＡ）１−１０（配列番号２５）；
ＡＤＰ５（Ｖ２）：（ＰＧＹＩＮ（Ｌ／Ｆ）ＳＹＥ（Ａ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮ（Ｔ／Ｖ）ＤＡＴＡ）１−１０（配列番号２６）；
ＡＤＰ５（Ｖ３）：（ＰＧＹＩＮ（Ｌ／Ｆ）ＳＹＡ（Ａ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮ（Ｔ／Ｖ）ＡＡＴＡ）１−１０（配列番号２７）；
もしくはこれらの機能的等価物（「Ｖ」は「異型体（ｖａｒｉａｎｔ）」を表す）からなる群から選択されたＡＤＰ５変異体を含むか、または該変異体からなる。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、
（ＰＧＹＩＮＬＳＹＡ（Ｋ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮＴＡＲＴＡ）１−１０（配列番号３２）；
（ＰＧＹＩＮＬＳＹＥ（Ａ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮＴＤＡＴＡ）１−１０（配列番号３３）；
（ＰＧＹＩＮＬＳＹＡ（Ａ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮＴＡＡＴＡ）１−１０（配列番号３４）；
（ＰＧＹＩＮＦＳＹＡ（Ｋ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮＶＡＲＴＡ）１−１０（配列番号３５）；
（ＰＧＹＩＮＦＳＹＥ（Ａ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮＶＤＡＴＡ）１−１０（配列番号３６）；
（ＰＧＹＩＮＦＳＹＡ（Ａ／Ｎ）ＳＨＳＱＡＩＮＶＡＡＴＡ）１−１０（配列番号３７）；
（ＰＧＹＩＮＬＳＹＡＫＳＨＳＱＡＩＮＴＡＲＴＡ）１−１０（配列番号３８）；
（ＰＧＹＩＮＬＳＹＥＡＳＨＳＱＡＩＮＴＤＡＴＡ）１−１０（配列番号３９）；
（ＰＧＹＩＮＬＳＹＡＡＳＨＳＱＡＩＮＴＡＡＴＡ）１−１０（配列番号４０）；
（ＰＧＹＩＮＦＳＹＡＮＳＨＳＱＡＩＮＶＡＲＴＡ）１−１０（配列番号４１）；
（ＰＧＹＩＮＦＳＹＥＡＳＨＳＱＡＩＮＶＤＡＴＡ）１−１０（配列番号４２）；および
（ＰＧＹＩＮＦＳＹＡＡＳＨＳＱＡＩＮＶＡＡＴＡ）１−１０（配列番号４３）
を含むか、または前記配列からなる。
【００６６】
様々な実施形態において、ＡＤＰ５、ＡＤＰ５Ｍ、ＡＤＰ５Ｈ、またはこれらの任意の異型体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０コピーとして存在する。好ましい実施形態では、ＡＤＰ５、ＡＤＰ５Ｍ、ＡＤＰ５Ｈまたはこれらの任意の異型体は１コピーとして存在する。ＡＤＰ５は、以降の実施例において、ヒトの歯牙上の象牙質など所与の固体表面上における野生型アメロゲニンタンパク質の石灰化促進作用を迅速に模倣することが示されており、よって本明細書中に開示された方法のうちいずれにおいても使用することができる。最も好ましい実施形態では、ＡＤＰ５は、好ましくは１コピーのＡＤＰ５Ｈもしくはその任意の異型体を含むか、または１コピーのＡＤＰ５Ｈもしくはその任意の異型体からなる。
【００６７】
別の好ましい実施形態では、方法は、アミノ酸配列（ＨＰＰ（Ｓ／Ｔ）ＨＴＬＱＰＨＨＨ（Ｌ／Ｉ）ＰＶＶＰＡＱＱＰＶ（Ａ／Ｉ）ＰＱＱＰＭＭＰＶＰＧ（Ｈ／Ｑ）ＨＳＭＴＰ（Ｔ／Ｉ）ＱＨ）１−１０（配列番号４）（ＡＤＰ７）またはその機能的等価物を含むか、あるいは該配列またはその機能的等価物からなるポリペプチドを投与することを含む。好ましい実施形態では、ＡＤＰ７は、
（ＨＰＰＳＨＴＬＱＰＨＨＨＬＰＶＶＰＡＱＱＰＶＡＰＱＱＰＭＭＰＶＰＧＨＨＳＭＴＰＴＱＨ）１−１０（配列番号８）（ＡＤＰ７Ｍ）；
（ＨＰＰＴＨＴＬＱＰＨＨＨＩＰＶＶＰＡＱＱＰＶＩＰＱＱＰＭＭＰＶＰＧＱＨＳＭＴＰＩＱＨ）１−１０（配列番号９）（ＡＤＰ７Ｈ）、またはそれらの機能的等価物を含むか、あるいは該配列またはそれらの機能的等価物からなる。様々な実施形態において、ＡＤＰ７、ＡＤＰ７Ｍ、またはＡＤＰ７Ｈは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０コピーとして存在する。好ましい実施形態では、ＡＤＰ７、ＡＤＰ７Ｍ、またはＡＤＰＨ７は１コピーとして存在する。最も好ましい実施形態では、ＡＤＰ７は、好ましくは１コピーのＡＤＰ７Ｈを含むかまたは１コピーのＡＤＰ７Ｈからなる。
【００６８】
さらなる実施形態では、該方法で使用されるポリペプチドは、アミノ酸配列ＷＰ（Ａ／Ｓ）ＴＤＫＴＫＲＥＥＶＤ）１−１０（配列番号１）（ＡＤＰ３）またはその機能的等価物を含むか、あるいは該配列またはその機能的等価物からなる。好ましい実施形態では、ＡＤＰ３は、（ＷＰＡＴＤＫＴＫＲＥＥＶＤ）１−１０（配列番号１０）（ＡＤＰ３Ｍ）もしくは（ＷＰＳＴＤＫＴＫＲＥＥＶＤ）１−１０（配列番号１１）（ＡＤＰ３Ｈ）またはそれらの機能的等価物を含むか、あるいは該配列またはそれらの機能的等価物からなる。様々な実施形態において、ＡＤＰ３、ＡＤＰ３Ｍ、またはＡＤＰ３Ｈは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０コピーとして存在する。好ましい実施形態では、ＡＤＰ３、ＡＤＰ３Ｍ、またはＡＤＰ３Ｈは１コピーとして存在する。最も好ましい実施形態では、ＡＤＰ３は、好ましくは１コピーのＡＤＰ３Ｈを含むかまたは１コピーのＡＤＰ３Ｈからなる。
【００６９】
様々なさらなる実施形態において、該方法で使用されるポリペプチドは、
（ｉ）（ＨＴＬＱＰＨＨＨ（Ｌ／Ｉ）ＰＶＶ）１−１０（配列番号１２）（ＡＤＰ１）；
（ｉｉ）（ＶＰＧ（Ｈ／Ｑ）ＨＳＭＴＰ（Ｔ／Ｉ）ＱＨ）１−１０（配列番号１３）（ＡＤＰ２）
（ｉｉｉ）（ＨＰＰ（Ｓ／Ｔ）ＨＴＬＱＰＨＨＨ（Ｌ／Ｉ）ＰＶＶ）１−１０（配列番号１４）（ＡＤＰ４）；
（ｉｖ）（ＰＡＱＱＰＶ（Ａ−Ｉ）ＰＱＱＰＭＭＰ）１−１０（配列番号１５）（ＡＤＰ８）；
（ｖ）（ＨＴＬＱＰＨＨＨＬＰＶＶ）１−１０（配列番号１６）（ＡＤＰ１Ｍ）；
（ｖｉ）（ＨＴＬＱＰＨＨＨＩＰＶＶ）１−１０（配列番号１７）（ＡＤＰ１Ｈ）；
（ｖｉｉ）（ＶＰＧＨＨＳＭＴＰＴＱＨ）１−１０（配列番号１８）（ＡＤＰ２Ｍ）
（ｖｉｉ）（ＶＰＧＱＨＳＭＴＰＩＱＨ）１−１０（配列番号１９）（ＡＤＰ２Ｈ）
（ｉｘ）（ＨＰＰＳＨＴＬＱＰＨＨＨＬＰＶＶ）１−１０（配列番号２０）（ＡＤＰ４Ｍ）；
（ｘ）（ＨＰＰＴＨＴＬＱＰＨＨＨＩＰＶＶ）１−１０（配列番号２１）（ＡＤＰ４Ｈ）；
（ｘｉ）（ＰＡＱＱＰＶＡＰＱＱＰＭＭＰ）１−１０（配列番号２２）（ＡＤＰ８Ｍ）；および
（ｘｉｉ）（ＰＡＱＱＰＶＩＰＱＱＰＭＭＰ）１−１０（配列番号２３）（ＡＤＰ８Ｈ）
からなる群またはそれらの機能的等価物
から選択されたポリペプチドを含むか、または該ポリペプチドからなる。
【００７０】
様々な実施形態において、上述したポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０コピーとして、好ましくは１コピーとして存在しうる。
本明細書中で開示されたこれらの態様／実施形態はすべて、文脈が明らかにそうでないことを述べていない限り、任意の他の態様／実施形態と組み合わされることが可能である。
【００７１】
実施例１
要約
セメント質は、歯根上の外部組織であり石灰化組織である。セメント質は、歯牙を骨に固定する歯周組織のシステムの一部である。歯周病は、歯根に付着している感染性バイオフィルムによって誘発された宿主の破壊的挙動に起因し、治療せずに放置されると歯牙の喪失をもたらす場合がある。歯牙の損傷した石灰化組織を修復するための組織特異的な細胞外マトリックスタンパク質は、治療への適用にはこれまで限界があった。ここで、ハイドロキシアパタイトのバイオミネラリゼーションの制御に関連する天然タンパク質由来のペプチド配列を同定するための新規なプロトコールについて述べる。事例研究としてアメロゲニンおよびバイオインフォマティクスのスコアリングマトリックスを使用して、本発明者らは、予めファージディスプレイによって選択された一連のハイドロキシアパタイト結合ペプチドを用いて、アメロゲニンについて類似性領域を同定した。アメロゲニン由来ペプチドとも呼ばれるこれらの領域の中で、２２アミノ酸長のペプチド（ＡＤＰ５）は、脱灰したヒト歯根象牙質上におけるセメント質様のハイドロキシアパタイトミネラル層の無細胞性の形成を促進し、該ミネラル層がひいてはｉｎ  ｖｉｔｒｏで歯周靭帯細胞の付着を支援することが示された。本発明者らの知見は、バイオミネラリゼーション事象を模倣するペプチド支援のミネラル形成においていくつかの意義を有する。これらのシステムで形成されるバイオミネラルに対するタンパク質制御のメカニズムをさらに詳細に詰めることにより、本発明者らは、タンパク質‐ミネラル相互作用の進化に対する新たな見解を提供する。天然タンパク質の小さなペプチドドメインを活用することにより、バイオミネラリゼーションタンパク質の構造と機能との関係についての理解を広げることが可能であり、かつこれらのペプチドをミネラル形成の工学的操作に利用することが可能である。最後に、ＡＤＰは、歯周組織の再生を促進し、かつそれにより歯の喪失に関連する病的状態を低減するための、例えば齲歯および歯周病によって引き起こされた病変歯根表面の修復を通じた、歯科疾患を治療する臨床適用を有している。
【００７２】
序論
歯科用バイオセラミック系硬組織（例えばエナメル質、セメント質、および象牙質）の優れた特徴は、形成されるハイドロキシアパタイト（ＨＡｐ）微結晶の量、該微結晶の寸法構造上の特徴および該微結晶の全体構造により達成される。これらの特徴は、各組織の発生の際に該組織中に見出され（１〜５）、かつ核形成および生体アパタイトの成長の調整剤として作用する（１、２、６）、組織特異的細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質に由来する。歯周病は歯牙表面に付着する細菌バイオフィルムに対する宿主の炎症反応によって引き起こされ（７）、歯周組織の破壊をもたらす。歯周病は人類の最もよく見られる感染症のうちの１つであり、放置されると歯牙および周囲組織、例えば硬骨の損失をもたらすことになる（７、８）。そのような疾患によって引き起こされた損傷を修復する治療薬としての歯牙ＥＣＭタンパク質の使用は、これらのタンパク質の同定、抽出および精製における技術的かつ財政的限界からこれまで制限されてきた。本発明者らは以前、エナメル質タンパク質であるアメロゲニンを使用して、本発明者らが実験的に選択した一連のＨＡｐ結合ペプチド（ＨＡＢＰ）を用いて類似性領域すなわち類似アミノ酸配列を同定した（２３）。アメロゲニンは歯牙エナメル質形成の間に発現され、組み立てられたタンパク質基質内に形成されるＨＡｐ結晶の寸法および指向性の制御を行うことにより人体で最も硬くかつ最も高度に石灰化される組織に寄与する（１７〜１９）。アメロゲニンアミノ酸配列のある領域はリン酸カルシウムミネラルと相互作用することが提唱されているが、推定上の結晶相互作用ドメインまたはミネラル核形成ドメインの広範囲マッピングは未だ存在しない（２０、２１）。ここで本発明者らは、知識ベースとしてファージディスプレイで選択されたペプチドを使用し、かつバイオインフォマティクスにより次世代ペプチドを同定して、機能性ペプチドがアメロゲニンから誘導可能であることを示す。次いで本発明者らは、これらのペプチドが、セメントに類似した（例えば、セメント質状の）物質を生じる歯根の無細胞性の再石灰化を導くように機能することが可能であり、よって細胞に基づいた歯周組織の再生に寄与することができることを示す。
【００７３】
材料および方法
（ペプチドのコンビナトリアル選択）
ファージディスプレイおよびＨＡｐ結合によるペプチドの選択ならびに石灰化特徴解析は、以前に記載されているようにして（２２）行われた（補足情報を参照のこと）。
【００７４】
（類似性解析）
コンビナトリアル方式で選択されたペプチドから得られたアミノ酸配列は、本発明者らの知識ベース設計のためのデータソースとして使用された。かつてオレン（Ｏｒｅｎ）らによって記載された方法（２３）を使用して、２つのスコアリングマトリックスＨＡｐ１２ＩおよびＨＡｐＣ７ＣＩが、それぞれ１２ファージライブラリーおよびｃ７ｃファージライブラリー（米国のニューイングランドバイオラボ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．））から選択されたペプチドについて導き出された。選択されたペプチドに特化した新たなマトリックスを最適化するためのシードマトリックスとして、ＰＡＭ２５０（Ｐｏｉｎｔ  Ａｃｃｅｐｔｅｄ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ２５０）が選択された。ＰＡＭマトリックスは、１００アミノ酸ごとにある特定数の点突然変異を生じる、配列の置換確率を与える。したがってＰＡＭ２５０は、１００アミノ酸ごとに２５０個の点突然変異についての確率を表す。ＰＡＭ２５０は、ＨＡｐ結合ペプチド（ＨＡＢＰ）を選択するために使用されるライブラリー内のアミノ酸の相対存在量、およびファージを増幅するために使用される宿主生物（大腸菌Ｋ１２  ＥＲ２７３８）のコドン選択性を補償するために改変された。選択されたペプチドと組換えマウス（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｏｕｓｅ）の１８０アミノ酸長（１８０  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｌｏｎｇ）のアメロゲニン（ｒＭ１８０）との間の配列類似性を同定するために、本発明者らは該ｒＭ１８０アミノ酸配列をファージライブラリーと同じ長さ（すなわち７アミノ酸または１２アミノ酸）のセグメントに分割した。繰り返しごとにその次のアミノ酸から始まるセグメントが生成され、したがってＭ１８０配列全体についてあらゆる可能な７アミノ酸または１２アミノ酸長のセグメントが作出された。次いで、セグメントはそれぞれ各ＨＡＢＰと比較され、類似性スコアが与えられた。ＨＡＢＰおよびアメロゲニンセグメントのすべての組み合わせを比較したら、両ライブラリーに対して高い類似性スコアを示した領域を重ね合わせた。これら一致している高類似性の領域は、推定上の強固な結合領域として選出された（補足情報を参照のこと）。同じ方法で、一致している低類似性の領域は、推定上の微弱な結合領域として選出された。次に、これらの領域は、タンパク質構造予測、Ｃａ＋２イオン結合ドメイン予測およびメタ機能的シグニチャー・アナリシス（ｍｅｔａ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ａｎａｌｙｓｅｓ）によって絞り込まれた（補足情報を参照のこと）。設計過程の概略的説明は図１ａに示されている。
【００７５】
（ペプチド合成）
モラディアン‐オルダック（Ｍｏｒａｄｉａｎ−Ｏｌｄａｋ）らによって以前に記載されたようにして（２４）、ｒＭ１８０アメロゲニンを作出した。ＡＤＰは、標準的な固相ペプチド合成技法によってワング樹脂上でＦ‐ｍｏｃ化学反応およびＨＢＴＵ活性化を使用して合成した。ＣＳＢｉｏ  ３３６ｓ型（米国のシーエスバイオ（ＣＳＢｉｏ））自動ペプチド合成機を合成に使用した。生じた樹脂結合型ペプチドは、試薬Ｋ（トリフルオロ酢酸／チオアニソール／Ｈ２Ｏ／フェノール／エタンジチオール（８７．５：５：５：２．５））を用いて切り出しおよび側鎖の脱保護を行い、冷エーテルによって沈殿させた。得られた粗製ペプチドを、逆相高速液体クロマトグラフィーにより最大で純度９８％超まで精製した（Ｇｅｍｉｎｉ（登録商標）１０μ  Ｃ１８  １１０Ａカラム）。精製ペプチドの質量はＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析計（米国のブルカー・ダルトニクス（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ））を用いた質量分析によって確認した。
【００７６】
（ＱＣＭによる結合解析）
リン酸カルシウムでコーティングされたＱＣＭ電極は市販のものから購入した（スウェーデン国のキュー・センス（Ｑ−Ｓｅｎｓｅ））。水晶発振子および電極の直径はそれぞれ８．８ｍｍおよび５．０ｍｍであった。発振電子回路は、緩衝増幅器を備えた典型的なコルピッツ型発振器であった。１２ＶのＤＣ電流が該発振回路に流されて水晶発振子が駆動され、周波数は、ヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）５３１３１Ａ型周波数カウンタを用いて２２５Ｈｚでサンプリングして測定された（アジレント・テクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のユニバーサルカウンタ）。水晶発振子をセルに取り付けた後、該水晶発振子を清浄化して高純度窒素ガスで乾燥させ、直ちに使用した。安定なベースラインを確立するため、ペプチドの添加前に十分な量の緩衝液をセル内に導入した。純粋な緩衝液中における水晶発振子の周波数変化を３０〜６０分間記録した。この後、所望量のＡＤＰをセル内に導入し、周波数変化を連続的に記録した。
【００７７】
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける溶液のバイオミネラリゼーション）
ペプチドの石灰化反応を調査するために、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）を用いる石灰化モデルが以前に記載されたようにして使用された（２２）（詳細に関しては補足情報を参照のこと）。
【００７８】
（ｅｘ  ｖｉｖｏにおける歯根の再石灰化）
セメント質‐歯根材料のブロックは、ワシントン大学歯学部クリニック（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｃｌｉｎｉｃ）で収集された単根の成人抜去歯牙から調製した。個体識別子は使用せず、そのような材料の使用については施設内倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）のガイドラインに準拠した。歯牙は試験片の調製まで７０％エタノール溶液中で４℃に維持された。直径４ｍｍの円筒状のブロックが、トレフィンバーを使用してセメントエナメル境に近い無細胞セメント質から切削された。歯牙は、摩擦による熱損傷を防止するために切削の間は７０％エタノール‐リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中での浸漬状態に保たれた。切削された円筒状ブロックは、ＰＢＳを用いて夾雑物を取り除き、３５％リン酸ゲルで１０秒間脱灰処理した。該試験片は使用時まで、７０％エタノール‐ＰＢＳ溶液中に４℃で保存された。
【００７９】
試験片をペプチドでコーティングする前に、予め切断された円筒状ブロックは再水和されて２４ｍＭトリス‐ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）の中で２時間平衡化された。凍結乾燥状態のＡＤＰは、２４ｍＭトリス‐ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）中に終濃度０．４ｍＭとなるように溶解した。ＡＤＰ溶液の５０μｌ小滴を試験片の上に滴下し、蒸発を防ぐために水で飽和させたチャンバ内にて室温で１０分間、その試験片上に放置した。対照の試験片は、単にバッファーのみを５０μｌ滴下することにより、同じように調製した。１０分後、試料を脱イオン水で２度すすいだ。蛍光顕微鏡分析はイソチオシアン酸フルオレセインで標識したＡＤＰ（ｆＡＤＰ）を用いて行った。
【００８０】
９．６ｍＭのＣａＣｌ２溶液、および５．６ｍＭの（ＰＯ４）−３すなわちＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２ＯとＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２０との混合物の溶液を、２４ｍＭトリス‐ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）を溶媒として調製した。ペプチドでコーティングされた試験片およびコーティングされていない対照試験片を３００μｌのＣａ＋２溶液中に入れ、等容積の（ＰＯ４）−３溶液を添加して４．８ｍＭのＣａ＋２および２．８ｍＭの（ＰＯ４）−３の終濃度とした。試験片を該石灰化溶液中、水飽和雰囲気中にて３７℃で２時間インキュベートし、石灰化溶液から取り出し、２４ｍＭトリス‐ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）ですすいだ。該試験片は特徴解析時まで７０％エタノール溶液中で４℃に維持された。ｅｘ  ｖｉｖｏでの再石灰化の概略的な説明は図３に示されている。
【００８１】
（セメント類似層の機械的性質）
セメント類似層の機械的性質は、ナノインデンテーション試験および定性的な機械的摩耗試験によって評価した。試料は、最初に室温硬化エポキシ（米国のアライドハイテク社（Ａｌｌｉｅｄ  Ｈｉｇｈ  Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．））をセメント類似層の上から浸透させてインデンテーション特徴解析のための連続量を提供することにより調製した。エポキシが硬化した後、試料を試験片の断面において内部を露出させるために研磨し、次に、ナノインデンテーションのための平滑面を達成するためにウルトラミクロトームで処理した。それぞれ２０回のナノインデンテーションが、石灰化した象牙質領域（インデンテーションは管間象牙質上に作られた）、脱灰した象牙質領域（セメント類似層に隣接している）およびセメント類似層に対して行われた（補足情報、図８を参照のこと）。
【００８２】
定性的な機械的分析法は超音波処理および機械的摩耗によって行われた。超音波処理については、試験片を走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）用の試料台に載置し、ガラスバイアルに入った７０％エタノール中に入れた。プローブを試験片の３ｃｍ上方に設置し、超音波エネルギーを１５秒間適用して合計１０Ｊを生じた。機械的摩耗は、家庭用の電動歯ブラシ（Ｏｒａｌ  Ｂ（登録商標）、４０００シリーズ）を使用して同じ試験片に対して適用された。試験片と歯ブラシとを、ブラシの毛が試験片と接触する配置状態で１分間固定し、その後該試料を７０％エタノールですすいでＳＥＭで分析した。
【００８３】
（細胞接着および細胞増殖のアッセイ）
細胞接着実験は、培養ヒト歯周靭帯（ｈＰＤＬ）線維芽細胞を用いて行った。細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（米国のギブコ（Ｇｉｂｃｏ））に１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２ｍＭのグルタミンが補足されたもの（ＰＳＧ）で維持した。細胞は継代７代目〜９代目で使用した。細胞接着アッセイを開始する前に、石灰化した試験片を７０％エタノール溶液から取り出し、血清を含まないＤＭＥＭ中で２時間平衡化させた。コンフルエント状態のｈＰＤＬ細胞は０．０５％トリプシン‐ＥＤＴＡを用いて懸濁し、血球計を用いて計数した。平衡化した歯牙試験片は、１ウェルあたり試験片４個として三連で、２４ウェルプレート中に配置した。懸濁状態のｈＰＤＬ細胞を、血清を含まないＤＭＥＭ中で調製し、１ウェルあたり３×１０４個の細胞を試験片の上面に播種した。該試験片を細胞とともに３７℃かつ５％ＣＯ２の雰囲気で２時間インキュベートした。２時間後、試験片を培地ですすぎ、表面上に残っている細胞を０．０５％トリプシン‐ＥＤＴＡを用いて試験片の表面から回収した。こうして得られた該細胞を、ＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）細胞増殖アッセイキット（米国のインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して計数した。
【００８４】
ＰＢＳ中の２％グルタルアルデヒドで１０分間の固定の後、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘを用いて細胞を２分間透過化処理し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３０分間ブロッキングし、蛍光顕微鏡検査法で観察するためにファロイジン‐Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８（登録商標）（米国のインビトロジェン）で染色した。細胞は、適切な波長およびゲート制御フィルタにてＴＥ  ３００  Ｌ型顕微鏡（ニコン（日本国））を使用して観察および記録した。
【００８５】
増殖アッセイについては、ｈＰＤＬ細胞を細胞接着アッセイについて上述されたのと同じ方法で調製した。試験片を培地中で平衡化し、２４ウェルプレート内に１ウェルあたり４個の試験片を入れ、三連で実施した。懸濁状態のｈＰＤＬ細胞を、血清を含まないＤＭＥＭ中で調製し、１ウェルあたり３×１０４個の細胞を試験片の上面に播種した。２４時間後、試験片をすすぎ、プレートの底で増殖する細胞の混入を防ぐために新しいプレート内に移した。細胞は、水ジャケットインキュベータ内で３７℃、５％ＣＯ２中にてＨ２Ｏ飽和状態に維持され、培地を２％ＦＢＳが補足されたＤＭＥＭで４８時間ごとに交換した。三連の試料は２日間、６日間、１０日間および１５日間の期間後に終了した。各時点の終わりに、試験片をウェルから取り出し、血清を含まないＤＭＥＭ、次いでＰＢＳですすがれた。細胞は０．０５％トリプシン‐ＥＤＴＡを用いて試験片表面から回収され、ＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）細胞増殖アッセイキット（米国のインビトロジェン）を使用して計数した。
【００８６】
（結果）
新たに生じたセメント類似ミネラル構築物中の１つの構成要素は、ミネラルを合成する機能を有し、かつ融合性のナノ構造体化したＨＡｐ層の沈積を制御するＨＡｐ形成ペプチドである。これらのペプチドを設計するための手順は図１に概略的に説明されている。ファージディスプレイ法を使用して、本発明者らは７アミノ酸および１２アミノ酸ファージペプチドライブラリーから１００個を超えるＨＡＢＰをコンビナトリアルに選択し、ほぼ生理学的な条件下でＨＡｐミネラルへの該ＨＡＢＰの結合親和性を特徴解析した（２２）。選択されたペプチドの全てがＨＡｐに対して同じ親和性を有するとは限らないので、本発明者らは次に該ペプチドを、強く結合するもの、中程度に結合するもの、および弱く結合するものの３クラスに分類した。バイオインフォマティクス分類プロトコール（２３）を使用して、本発明者らは、選択されたセプタペプチドおよびドデカペプチドの両セットについて類似性スコアリングマトリックスを導き出した。これらのマトリックスは、類似性領域、すなわち実験的に選択されたＨＡＢＰとｒＭ１８０との間の類似アミノ酸配列のドメインを系統的に比較しかつ同定するために使用された。この比較から、アメロゲニンに沿って高類似性および低類似性領域が得られた（図１ｂ）。両ライブラリー由来の高類似性領域を重ね合わせることによって、推定上の結晶結合配列を同定し、これらをアメロゲニン由来ペプチド（ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）ＡＤＰと称する（図１ｂ、ｅ）。類似性解析は、他のコンピュータ計算ツール、すなわち構造予測、メタ機能的シグニチャー・アナリシスおよびイオン結合ドメイン解析（図１ｃ、ｄ）（補足情報を参照のこと）によって精密化および支援された。多くの短いアミノ酸配列はこの手順によって生成可能であり、各々が、ＨＡｐの形成および成長に対する制御を必要とする特定の用途に使用される潜在性を有する。最も高い類似性を有する、アメロゲニンの推定上のＨＡｐ相互作用領域（すなわちＡＤＰ１、ＡＤＰ２、ＡＤＰ４）が化学合成された（補足情報を参照のこと）。比較のため、本発明者らはさらに、Ｃ末端付近のかつて提唱された推定上のミネラル結合領域（２５〜２８）に相当するアメロゲニン由来ペプチド（ＡＤＰ３、ＡＤＰ６）、ミネラルとは相互作用しない（例えば低い類似性スコアの）領域（ＡＤＰ５、ＡＤＰ８）ならびに最終的にはＡＤＰ１、ＡＤＰ２およびＡＤＰ８を含むペプチドであるＡＤＰ７を合成した（図１ｅおよび表１）。これらのペプチドのＨＡｐ結合親和性は水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）によって検査し、該ペプチドのリン酸カルシウム形成の制御傾向は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの溶液石灰化アッセイおよびｅｘ  ｖｉｖｏでの歯牙再石灰化実験によって行った。
【００８７】
【表１】
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（ＱＣＭによる結合解析）
ペプチドの解離定数（ＫＤ）を測定した。ＫＤとは、５０％の表面カバー率を達成するのに必要な濃度を表す平衡定数である。実験的結合アッセイから、ＡＤＰ１、ＡＤＰ２、ＡＤＰ４およびＡＤＰ７は類似性解析によって予測されたように１μＭオーダーのＫＤ値でＨＡｐへの強い親和性を示すことが実証された（図２ａ、表１）。同様に、ＡＤＰ３、ＡＤＰ６、ＡＤＰ５およびＡＤＰ８の結合親和性は予測されたように低く、ＡＤＰ５については顕著に低いＫＤ（５０ｍＭ）を有していた（図２ａ、表１）。
【００８８】
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける溶液のバイオミネラリゼーション）
本発明者らは、試験されたＡＤＰの中で３つの異なる石灰化傾向があることに気付いた。大多数のペプチド（ＡＤＰ１、ＡＤＰ２、ＡＤＰ３、ＡＤＰ４、ＡＤＰ６およびＡＤＰ８）は、ペプチドの存在しない陰性対照と同様の動態を示した。ファージディスプレイで選択されたＨＡＢＰ１および本研究で同定されたＡＤＰ７はゆっくりとした石灰化傾向を示した（図２ｂ）。興味深いことに、完全長ｒＭ１８０およびＡＤＰ５は、利用可能な遊離Ｃａ２＋の半分以上が９０分後に消費されるという急速な石灰化傾向を示した（図２ｂ）（すべてのＡＤＰの石灰化傾向については補足情報図６を参照のこと）。
【００８９】
ＳＥＭ、透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）およびＸ線回折（ＸＲＤ）による合成ミネラルの微細構造解析および結晶学的解析から、ミネラル結合性と石灰化活性との関係に関する別の興味深い結果が明らかになった。石灰化動態と同様に、ミネラルの形態学的状態についても３つの異なる傾向が観察された。大多数のペプチド（ＡＤＰ１、ＡＤＰ２、ＡＤＰ３、ＡＤＰ４、ＡＤＰ６、ＡＤＰ８およびＨＡＢＰ１）は、球状の非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）の形成および結晶質相への転移（２９〜３１）と整合する球顆状の粒子を生じた。該球顆から生じる放射状結晶質のブレード状粒子の量は、ＡＤＰ１、ＡＤＰ２、ＡＤＰ４およびＨＡＢＰ１（強力な結合剤）ではＡＤＰ３、ＡＤＰ６、ＡＤＰ８（微弱な結合剤）およびペプチドなしの対照と比較してわずかに多く、この順に非晶質から結晶質への転移速度がわずかに異なっていた（図２ｃ）。しかしながらｒＭ１８０およびＡＤＰ７の場合には、完全に異なる形態学的状態が観察された。針状ナノ結晶は、ｒＭ１８０およびＡＤＰ７について観察された束状アセンブリへと組織化された（図２ｄ）。束状アセンブリはｒＭ１８０の場合に一層よく組織化されるようであり、このことは、アメロゲニンの自己アセンブリ特性および組換えアメロゲニンのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける石灰化挙動と一致している（２４、３２〜３４）。
【００９０】
ＡＤＰ５の存在下で形成された粒子は、電子密度のあまり高くないコアと、より小さな放射状結晶とを備えた、はるかに小さい球顆であった（図２ｃ）。ＡＤＰ５の存在下で粒子の大きさが小さいということは、石灰化動態について説明するデータから示唆されるように、ＡＤＰ５の核形成優位の状況に起因する可能性がある。
【００９１】
ＸＲＤ分光法による結晶学的解析からも、観察された形態学的な違いが異なる結晶構造に起因することが確認された。ｒＭ１８０とＡＤＰ７を除くすべての事例において、ミネラルはおよそ２θ  ２５〜３０°に幅広いピークを生じ、結晶相に乏しいことを示した（図２ｅ）。しかしながらｒＭ１８０およびＡＤＰ７の存在下では、ＸＲＤパターンは結晶質ＨＡｐを示す多数の鋭いピークで構成されていた。主要なピークは、それぞれＨＡｐの（２１１）面および（３００）面に相当する２θ＝３１．８°（ｄ＝２．８１Å）および３２．１°（ｄ＝２．７８Å）に観察された。
【００９２】
（ｅｘ  ｖｉｖｏにおける歯根の再石灰化）
ヒトのセメント質ディスクは、「材料および方法」に記載されるように、また図３に図示されるようにして調製された。フルオレセインで標識されたＡＤＰ５（ｆＡＤＰ５）を用いた蛍光顕微鏡分析から、ＡＤＰ５はヒトの歯根材料セメント質の脱灰表面に容易に吸着し、徹底的に洗浄した後も該表面上に残存することが示された。顕微鏡は対照試料の発光に対して較正されたので、バックグラウンドの発光はいずれの試料においても除去された。清浄化およびエッチング後のヒト試料は、直径約１μｍの、象牙エナメル境の予想通りの象牙細管の特徴が、ｆ‐ＡＤＰ５でコーティングされた試料の上で明瞭に視認可能であることを示している（補足情報、図７を参照のこと）。
【００９３】
ＡＤＰ５は、ＳＥＭおよびエネルギー分散型Ｘ線分光法（ｅｎｅｒｇｙ−ｄｉｓｐｅｒｓｉｖｅ  ｘ−ｒａｙ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＥＤＸＳ）による解析によって観察されるように、ヒトの歯根材料セメント質表面の再石灰化の分析結果における大きな差異をもたらした。２時間後、ペプチドコーティングされていない対照試料では実質的な再石灰化は生じなかった（図４ａ）。他方、試験片の表面全体を覆う連続ミネラル層が、ＡＤＰ５でコーティングされた試験片上で観察された（図４ｂ）。新たに形成されたミネラルの形態学的状態は、下層にある象牙質の表面から成長しているプレート状の結晶であった。ＥＤＳによる元素組成分析では、ペプチドを含んでいない対照試料からの観察可能なＣａまたはＰのピークは示されず、対照的に、ＡＤＰ５でコーティングされた試料からはかなりのＣａおよびＰピークが観察された（それぞれ図４ａ、ｂの挿入図）。ＳＥＭおよびＴＥＭいずれの断面解析も、ＡＤＰ５が下層にある象牙質と良好に一体化されているように見える厚さ１０〜１５μｍのミネラル層を生じることを示した（図４ｃ、ｄ）。さらに、この無細胞バイオミメティックセメント質層の厚さは、天然のヒト無細胞セメント質の厚さに十分に匹敵する。
【００９４】
（セメント類似層の機械的性質）
表２に示されるように、セメント類似ミネラル層は天然のヒトセメント質に匹敵しうる弾性モジュールおよび硬さを示した（３５）。セメント類似層について観察された大きな標準偏差が示されているが、恐らくは、天然の石灰化した象牙質またはセメント質について観察されるよりもミネラル分布の均一性に劣ることに起因すると思われた。
【００９５】
【表２】
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本発明者らはさらに、新たに形成されたミネラル層が超音波処理および機械的摩耗（ブラッシング）によって生じた機械的ストレスに耐えうるどうかについても試験した。ＳＥＭによる観察は、ミネラルのプレート状の形態学的状態が超音波処理およびブラッシングの後では多少歪曲することを示した。しかしながら、ＥＤＸＳで確認されるように、ミネラルはなおもその下にある象牙質に付着していた（補足情報、図９を参照のこと）。
【００９６】
（細胞接着アッセイおよび増殖アッセイ）
細胞付着性アッセイは、ｈＰＤＬ細胞が、石灰化されていない対照表面と比較して石灰化された表面に対してより有効に付着することを示した。２時間の付着時間の後に回収された細胞の定量から、２時間のインキュベーション後、２３．２％の細胞が石灰化されていない対照表面上に付着していた一方、６０．６％の細胞がバイオミメティックな石灰化表面に付着したことが示された（図４ｅ）。
【００９７】
増殖アッセイからは、ｈＰＤＬ細胞が、石灰化されていない対照表面と比較して、バイオミメティックな石灰化表面上においてより有効に増殖することが示された。１５日後、ｈＰＤＬ細胞は、バイオミメティックな石灰化表面上において、対照表面と比較して２倍を超える数の細胞に到達した（図４ｆ）。このデータは、セメント類似ミネラル層が、ｈＰＤＬ細胞の付着および増殖のいずれにとっても好ましい環境を提供することを示唆している。蛍光画像は、初期の接着の後、該細胞がミネラル層上において、同じ細胞が対照表面上で増殖する（図４ｇ）よりも良好に細胞骨格を組織化する（図４ｈ）ことを示した。
【００９８】
（考察）
ＡＤＰによって産生されたミネラルの定量的な回折解析および顕微鏡解析から、設計されたペプチドの中では、類似性領域の最も長いＡＤＰ７および天然のｒＭ１８０だけが針状の結晶性ＨＡｐ粒子を産生し、その他は結晶性の球顆粒子を形成することが明らかとなった（図２ｃ〜ｅ）。興味深いことに、ＨＡｐに対する結合親和性を示さなかったＮ末端のＡＤＰ５は、完全長ｒＭ１８０アメロゲニンタンパク質と同様のレベルでリン酸カルシウム核形成を速度論的に制御した（図２ｂ）。ＡＤＰ５はＨＡｐに対して高親和性を示さなかったという事実は、核形成に対する制御が前駆体イオンとの相互作用によって支配されていることを示している。
【００９９】
総合すると、これらのデータは、ペプチドによる該ペプチドのミネラル基材への強い結合親和性が、必ずしも常に石灰化指向活性につながるとは限らないことを示している。ＡＤＰ５がＨＡｐに対する有意な結合親和性は示さなかったがより速い反応速度をもたらしたという事実は、ＡＤＰ５がミネラル表面ではなく可溶性前駆体イオンと相互作用している可能性もあることを示唆している。ＡＤＰ５の９〜１０位および１９〜２０位における２つの隣接した反対に荷電した残基対は、可溶性のＣａ２＋およびＰＯ４−３を引きつけて局所的な過飽和を増大させ、その結果として核形成障壁を低減する役割を果たしているのかもしれない。対照的に、ＡＤＰ７とミネラル表面との間の強い相互作用は、ミネラル‐溶液界面エネルギーの変化が、観察された石灰化挙動に関与していることを示している。クエン酸塩のような生体分子は、反応速度論的に好ましい準安定なリン酸カルシウム相の界面エネルギーを変化させて熱力学的に好ましいＨＡｐへの相転移を引き起こすことができることが報告されている（４１、４２）。ミネラル表面に対してＡＤＰ７の親和性が比較的高いことから、類似の作用が関与している可能性もある。結晶表面上へのペプチドの結合は、結合境界面におけるペプチドの立体配座（側鎖の利用可能性）および結晶の原子配位の両方によって決定される（４３〜４５）。本発明者らは、ＡＤＰ７存在下における、ＡＣＰ、ＯＣＰまたはＴＣＰのような他の準安定なＣａＰ相に代わるＨＡｐの形成は、結合エネルギーを最大限にし、ひいては相転移を克服するのに必要な界面エネルギー障壁を低減する、ペプチドの特定の立体配座ならびに結晶表面上のＣａ部位およびＰ部位の配置構成に起因すると推測している。
【０１００】
まとめると、ＡＤＰ５、ＡＤＰ７およびｒＭ１８０の結合およびバイオミネラリゼーション反応は、エナメル質形成中のアメロゲニン介在型の石灰化に関する興味深いメカニズムを示唆している。２つの異なるアメロゲニン由来ペプチドが元のタンパク質の異なる性状を模倣するという事実は、これらのペプチドがアメロゲニン内の異なる機能的領域であるかもしれないという疑問をもたらす。すなわち、ＡＤＰ５は、局所的な過飽和を増大させることによる石灰化反応速度上昇を担う領域である可能性があり、ＡＤＰ７は、界面エネルギーを変化させることによるＨＡｐへの相転移を促進する原因となる領域である可能性がある。しかしながら、これらの疑問に対する答えは進行中の別の研究の焦点である。
【０１０１】
これら個々のＡＤＰによって示された特徴の幅広さは、ミネラル相の特異的な制御機構が望まれる硬組織の修復および置換に関与する工学的かつ生物医学的な適用について検討するための、潜在的な分子試薬を表している。歯牙組織異常のペプチド支援の再石灰化は、臨床用途のための重要な可能性を提示している。この目的に向けて、本発明者らは、バイオミメティックなセメント質状のミネラル層がｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞の挙動に好ましい効果を有するかどうかを問うた。培養されたヒト歯周靭帯細胞（ｈＰＤＬ）は、該細胞がｉｎ  ｖｉｖｏにおいて歯根表面に接触する主な種類の細胞であること、さらに、これらの細胞は適切に誘発されると歯周組織の修復および再生において重要な機能を果たすことができることから（４６〜５０）、検査用に選択された。細胞接着および細胞増殖のアッセイは、ＡＤＰ５介在型のセメント質状の歯牙材料の表面上で血清由来因子の非存在下で実施され、ナノ構造化されたミネラル層が歯周組織由来の細胞の接着および増殖をいずれも促進することを示した（図４ｅ、ｆ）。
【０１０２】
結論として、ここで説明された研究は、ペプチド支援のバイオミネラリゼーションにおいていくつかの重要な意味合いを有する。第１に、本発明者らは、ＨＡｐを含有する組織がバイオミネラリゼーションを制御するために極めて重要な、該組織に関連する天然タンパク質中に由来するペプチド配列を同定するための、新しいプロトコールについて述べる。単細胞生物（例えば走磁性細菌）、無脊椎動物（海綿動物、軟体動物）および脊椎動物によって形成されるバイオミネラルに関連する細胞外マトリックスタンパク質の同様の解析は、ミネラル形成および該生物の様々な無機化合物（磁鉄鉱、シリカおよび炭酸カルシウム）各々の成長を調節する他の特有のアミノ酸ドメインを明らかにすることができる（５１）。バイオミネラリゼーションは多くの生物にとって必須であり、沈積されるミネラルの範囲は周期表の元素を反映する。これらの系で形成されたバイオミネラルに対するタンパク質制御のメカニズムを詳述することにより、ミネラル相互作用へのタンパク質の進化に対する新しい洞察が得られるであろう（５２）。エナメル質の場合、アメロゲニンは本質的に無秩序なタンパク質の部類に属している（５３）。構造解析を、ＡＤＰ５によって定義されるような大型タンパク質のごく小さなドメインに限定することにより、構造機能相関についての我々の理解が拡がり、これがペプチドと化学沈積物との関係を判読する可能性を示し、次いでそのような情報を、材料形成技術（例えばバイオマニュファクチャリング）を計画実行するための実用に用いることが可能である。第２に、本研究で実証されるように、無機固体へのペプチドの強い結合親和性は必ずしも該ペプチドのミネラル形成能力の現れではない。第３に、ＡＤＰ５によって形成されたセメント類似層は、齲歯および歯周病によって引き起こされたいずれの病変歯根表面をも修復し、かつ歯周組織の再生を促進して歯牙の喪失に関連する病的状態を低減するための、臨床適用の可能性を有する。
【０１０３】
実施例１の参照文献
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【０１０４】
実施例１の補足資料
（ペプチドのコンビナトリアル選択）
市販のＰｈ．Ｄ．（商標）ファージディスプレイペプチドライブラリーキット（ｃ７ｃおよび１２）をバイオコンビナトリアルライブラリーとして使用し（米国のニューイングランドバイオラボ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．））、合成ＨＡ粉末を標的基材として使用した（ウクライナ国のイヴァン・トランセヴィカ研究所（Ｉｖａｎ  Ｔｒａｎｓｅｖｉｃａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）物質科学科（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）からの寄贈）。ペプチド‐ファージライブラリーに接触させる前に、ＨＡ粉末は１／１のメタノール／アセトン混合物中での超音波処理と、続くイソプロパノール中での超音波処理によって清浄化された。清浄化されたＨＡ粉末を、ファージ‐ペプチドライブラリーとともに、０．１％の界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０およびＴｗｅｅｎ８０、米国のメルク（Ｍｅｒｃｋ））を含有するリン酸カリウム／炭酸ナトリウム（ＰＣ）バッファー（ｐＨ７．４）中で室温にて絶えず回転させながら一晩インキュベートした。界面活性剤は、ファージ粒子間の非特異的相互作用を防ぎ、個々のファージ粒子と粉末表面との相互作用が生じることを可能にする。ＨＡｐ粉末基材をファージライブラリーとともにインキュベートした後、該粉末を、非特異的にまたは弱く結合したファージ粒子をＨＡ表面から除去するために０．１％の界面活性剤を含有するＰＣバッファーで数回洗浄した。その後、ＨＡ表面上に残存しているファージを０．２ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．２）溶液とその後の超音波処理によって溶出させた。溶出したファージを、対数増殖早期の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７３８培養物に移し、４時間増幅させた。増幅したファージをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈澱反応によって単離させる。３回目のパニングの後、各選択回から得られたファージは、単一のファージプラークを得るために、系列希釈物として、５‐ブロモ‐４‐クロロ‐３‐インドリル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシド（Ｘｇａｌ）およびイソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含有するＬＢ寒天平板培地に播種する。ＥＲ２７３８株はｌａｃＺα遺伝子を欠いているので、ｌａｃＺα遺伝子を担持しているＭ１３ｍｐ１９バクテリオファージに感染した細胞だけがβ‐ガラクトシダーゼを産生してＸｇａｌへの曝露時に発色性の変色をなすことができる。したがって、感染細胞はＸ‐Ｇａｌを加水分解して青色のファージプラークを形成することができる。ＬＢ寒天平板上でファージを増殖させた後、クローンの増殖ファージ粒子を含有する単一の青色プラークを採取し、増幅させて、対応するポリペプチドセグメントのアミノ酸配列をＤＮＡ塩基配列決定法によって同定した。
【０１０５】
（ＨＡ結合の半定量的解析）
各クローンの結合親和性は、免疫蛍光顕微鏡検査および酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）によって評価した。蛍光顕微鏡検査については、清浄化されたＨＡｐ粉末を、０．１％の界面活性剤を含有するＰＣバッファー中で１０１１ＰＦＵ／ｍＬの濃度の選択されたモノクローナルファージとともに、室温にて絶えず回転させながら一晩インキュベートした。ｐＩＩＩタンパク質上にランダムペプチドが提示されていない野生型Ｍ１３ｍｐ１９バクテリオファージを陰性対照として使用した。インキュベーション後、該粉末を同じバッファーで３回洗浄した。洗浄後、表面に結合したままのファージをマウス抗Ｍ１３  ＩｇＧ（米国のアマシャムバイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８‐抗マウスＩｇＧ２ａコンジュゲート（米国のインビトロジェン・コーポレイション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））で標識する。標識後、粉末懸濁液を顕微鏡用スライドガラスに移し、ＴＥ  ３００Ｌ型顕微鏡（日本国のニコン）を使用して観察した。ファージ粒子のおよその表面カバー率は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標）画像化システムＶｅｒ．６．２（英国の英国フォトメトリクス社（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  ＵＫ  Ｌｔｄ．）、以前の米国のユニバーサル・イメージング社（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏ．））を使用して、明視野像中の粉末のおよその表面積を蛍光画像中のおよそのファージカバー率と比較することにより計算した。
【０１０６】
ＥＬＩＳＡ解析については、清浄化されたＨＡｐ粉末を、１０１１ＰＦＵ／ｍｌの濃度の選択されたモノクローナルファージとともに、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳバッファー中で室温にて絶えず回転させながら一晩インキュベートした。ｐ（ＩＩＩ）タンパク質上にペプチドを提示していない野生型Ｍ１３ｍｐ１９バクテリオファージを陰性対照として使用した。粉末を、０．０５％の界面活性剤を含有するＰＢＳバッファーで３回洗浄した。洗浄後、表面上に結合したファージを、２％ＢＳＡを含有するＰＢＳバッファー中でホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）‐抗Ｍ１３  ＩｇＧコンジュゲート（米国のアマシャムバイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））とともに３０分間絶えず回転させながら標識処理し、ＰＢＳバッファーで４回洗浄した。ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｄｙ（商標）ＨＲＰ基質３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）‐ＥＬＩＳＡ（米国のピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ））を溶液中に添加した。ＨＲＰによるＴＭＢの酸化により、ＴＭＢのジイミン体が生じる。該反応は２分後に１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することにより停止され、その結果４５０ｎｍに最大吸収を有する黄色が生じる。反応溶液の光学密度（ＯＤ）は、マイクロプレートリーダ（スイス国のテカン・トレーディング・アーゲー（Ｔｅｃａｎ  Ｔｒａｄｉｎｇ  ＡＧ））を使用して波長４５０ｎｍにて測定した。
【０１０７】
【表３】
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（タンパク質構造予測）
最新のタンパク質構造予測方法は、構築物アセンブリのための様々な長さの鋳型として既知構造を使用する。本発明者らは、３Ｄ‐Ｊｕｒｙ（ウェブサイト／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｐｌ／ｍｅｔａ）（１）を使用してメタ予測の形で不完全な構造アラインメントの初期セットを作り、これらを、Ｐｒｏｔｉｎｆｏタンパク質構造予測プロトコール（ウェブサイトｐｒｏｔｉｎｆｏ．ｃｏｍｐｂｉｏ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｒｏｔｉｎｆｏ＿ａｂｃｍｆｒ）（２）（ＲＡＭＰ：タンパク質の構造および機能のモデリングを支援するプログラム一式（ウェブサイトｃｏｍｐｂｉｏ．−ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｒａｍｐ／）（３）を使用して多数の完全長モデルを作るための鋳型として組込んだ。さらに本発明者らは、Ｉ‐ＴＡＳＳＥＲサーバ（ウェブサイトｚｈａｎｇ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｋｕ．ｅｄｕ／Ｉ−ＴＡＳＳＥＲ）（４）から完全長モデルを検索した。次に、本発明者らは全原子条件的確率識別関数（ａｌｌ−ａｔｏｍ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）ＲＡＰＤＦ（５）を使用して最良のモデルを選択した。これらのモデルは、ＲＡＭＰ一式（３）に含まれる、鋳型ベース、幾何学ベース、および物理学ベースの方法を使用して、反復的に精密化された。
【０１０８】
本発明者らは、ＲＡＰＤＦを使用して完全長のＭ１８０アメロゲニンについて作出されたデコイ全ての中で最良の５つのモデルを選択した。次いで本発明者らは、最適化された立体配座モデル（６）の作出において、グラフ理論によるクリーク発見手法を使用して、上記の上位５つのモデルから領域の最良の組み合わせを選定した。
【０１０９】
（Ｃａ２＋イオン結合ドメイン予測）
本発明者らは、３Ｄ構造内のすべての溶媒露出部位にイオンを配置する、グリッドを用いる網羅的探索を実施した。該部位は、グリッドを用いる網羅的サンプリングアルゴリズムを用いてスコアリングされ、教師なし階層クラスタリングアルゴリズムの変法を使用してクラスター化され、モンテカルロ法による最小化で精密化された。スコアリング関数は、ＰＤＢ（７）によって公的に利用可能な多数の結晶学的構造において見出される低分子有機物を配位している単一原子の無機イオンについて観察された幾何学的パラメータから開発された。このスコアリング関数は、タンパク質とイオンとの間の結合親和性を正確にランク付けし、タンパク質の天然に存在するイオン結合部位を予測し、タンパク質‐基質結合の天然立体配座を回復させることにより確認された（ウェブサイトｐｒｏｔｉｎｆｏ．ｃｏｍｐｂｉｏ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｓｏａｋ）（８）。
【０１１０】
（メタ機能的シグニチャー）
メタ機能的シグニチャー（Ｍｅｔａ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）（ＭＦＳ）法は５つのサブスコアを含む。これらのスコアのコンピレーションは、単純なロジットモデル（ウェブサイトｐｒｏｔｉｎｆｏ．ｃｏｍｐｂｉｏ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｍｆｓ）を使用して機能的に重要な残基の２つのデータベース（９）についてトレーニングされた（１０〜１２）。ＭＦＳ法はさらに、機能にとって重要であることが知られているアミノ酸の極めて正確な同定を行うために、配列情報、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）、Ｓｔａｔｅ−ｔｏ−Ｓｔｅｐ  Ｒａｔｉｏ（ＳＳＲ）、およびアミノ酸の種類（ＡＡ＿ｔｙｐｅ）に基づいたスコアのみを使用して、構造解析を伴わずに適用されてもよい（１０）。
【０１１１】
ＳＳＲ  −  ある領域についての進化的背景（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｏｎｔｅｘｔ）は、ＰＳＩ‐ＢＬＡＳＴ結果の多重配列アラインメントを使用して（１３）、タンパク質中の各アミノ酸を取り囲む配列に関する進化系統樹の作出によりモデル化される。該系統樹の根は理論上の祖先配列を表し、系統樹の葉はそれぞれＰＳＩ‐ＢＬＡＳＴ結果の配列を表す。本発明者らは、系統樹を通じて各アミノ酸の進化的分岐を該アミノ酸の進化的背景から定量化する。ＳＳＲは、多重配列アラインメント中のある部位に現れる異なるアミノ酸の数と、系統樹内における入力タンパク質とベース配列との間の変更点の総数との比を表す。（１０）
ＨＭＭ  −  本発明者らは、ＨＭＭＥＲパッケージ（１４）を使用して、上述の多重配列アラインメントからＨＭＭをコンパイルした。次に本発明者らは、各アミノ酸部位についてのＨＭＭ相対エントロピースコアを得るために、ＨＭＭモデルからのエミッション頻度推定値（ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｅｓｔｉｍａｔｅ）を、ＢＬＡＳＴプログラムパッケージ（１３）のｋａｒｌｉｎ．ｃにより与えられたアミノ酸のバックグラウンド頻度と比較した（１５）。
【０１１２】
ＡＡ＿ｔｙｐｅ  −  本発明者らは、２つの大型データベースにおいて活性部位内に現れる各種類のアミノ酸の頻度から生じた単純なスコアを、各種類のアミノ酸に割り当てた。
【０１１３】
構造安定性スコア  −  仮想突然変異  −  本発明者らは、１９種の代替アミノ酸への一連の仮想突然変異導入を実施し、三次構造において誘発された変化をモデル化し、各残基の突然変異セットについてシミュレートされたエネルギー関数スコアを比較することにより（ＲＡＰＤＦ；（５））、該タンパク質の構造安定性に対する各残基の重要性を評価した。ＲＡＰＤＦ＿ｓｐｒｅａｄ（その残基についての可能な突然変異全体を通じたＲＡＰＤＦスコアの変動）は、その部位の構造上の変動性を示し、したがって該部位の安定性への寄与を示す。ＲＡＰＤＦ＿ｄｉｆ構造安定性スコアは、入力された構造と１９個の代替物すべてとの間のＲＡＰＤＦスコアの単純な差の合計を表しており、これはその天然アミノ酸のアイデンティティーが構造安定性に及ぼす影響について示している（１１）。
【０１１４】
構造安定性スコアは、ＭＦＳにおいても実施され、かつ、別途、機能には寄与しないようであるが特定の立体配座が広がる領域の機能にとって重要なその立体配座を作出する可能性のある、折りたたみを担っている領域を同定するためにも使用された。
【０１１５】
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける溶液のバイオミネラリゼーション）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのリン酸カルシウム核形成に対するペプチドの影響を調査するために、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）を用いる石灰化モデルが使用された（１６）。このモデルは生体のマトリックス小胞を介した石灰化を模倣するものであり、無機リン酸塩がＡＰにより有機リン酸塩化合物から開裂されて、マトリックス小胞内部のカルシウムと反応するものである。石灰化実験に先立ち、ペプチドの存在下においてＡＰの活性を測定し、該酵素活性に対する各ペプチドの影響を評価した。１４．４ｍＭのβ‐グリセロリン酸（β‐ＧＰ）溶液であってペプチドを含有しないものおよび０．４ｍＭのペプチドを含有するものを、２５ｍＭトリス‐ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）を溶媒として調製した。反応は、該溶液に１．４×１０−６ｇ／ｍＬの細菌性ＡＰ（米国のインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を添加することにより開始した。反応は３７℃で実施され、試料を０．２５時間、１時間、３時間、１６時間および２４時間の時点で収集した。各溶液中に放出されたリン酸塩はＰｉＰｅｒ（商標）リン酸アッセイキット（米国のインビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．））を使用して測定され、時間に対してプロットされた。
【０１１６】
石灰化実験については、２４ｍＭのＣａ２＋および１４．４ｍＭのβ‐ＧＰならびに０．４ｍＭのペプチドを含有する石灰化溶液を、２５ｍＭトリス‐ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）を溶媒として調製した。ペプチドを含まない石灰化溶液を陰性対照として調製した。石灰化反応は、該溶液に細菌性ＡＰを終濃度１．４×１０−６ｇ／ｍＬとなるように添加することにより開始した。その後のミネラル形成反応速度は、テカンＳａｆｉｒｅ（商標）マイクロプレートリーダ（スイス国のテカン・トレーディング・アーゲー（Ｔｅｃａｎ  Ｔｒａｄｉｎｇ  ＡＧ））を使用して波長８２０ｎｍでの吸光度を連続測定することにより、また反応全体にわたるカルシウムイオンの定期的なアッセイによって、モニタリングした。カルシウムおよびリン酸の定期的アッセイについては、１０μＬの反応溶液を０．２５時間、０．５時間、１時間および１．５時間の時点で収集した。該溶液中のカルシウム濃度は、ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍｅ（商標）カルシウムアッセイキット（米国のバイオアッセイ（Ｂｉｏａｓｓａｙｓ））を使用して測定した。石灰化反応はすべて３７℃で行われた。電子顕微鏡法による解析のための試料は、カーボンコーティングされたＴＥＭグリッド上に反応溶液由来の１０μＬアリコートを配置することにより調製した。１分後、ＴＥＭグリッド上の液体を注意深く除き、該グリッドを５分間減圧乾燥させた。乾燥したグリッドは解析時まで乾燥容器内に保存した。ＳＥＭ撮像は、ＪＳＭ  ７０００Ｆ型（日本国のＪＥＯＬ）ＳＥＭを使用して二次電子撮像モードにて１０ｋＶで行った。ＴＥＭ撮像および電子回折解析は、１２０ｋＶで操作されるＥＭＳ  ４２０Ｔ型ＴＥＭ（米国のＦＥＩ社（ＦＥＩ，Ｉｎｃ．）；以前はオランダ国のフィリップス（Ｐｈｉｌｉｐｓ））を使用して実施した。
【０１１７】
本発明者らは、試験されたＡＤＰの中で３つの異なる石灰化傾向があることに気づいた。（図２）大多数のペプチド（ＡＤＰ１、ＡＤＰ２、ＡＤＰ３、ＡＤＰ４、ＡＤＰ６およびＡＤＰ８）は、ペプチドが存在しない陰性対照と同様の反応速度を示した。ファージディスプレイで選択されたＨＡＢＰ１およびＡＤＰ７はゆっくりとした石灰化傾向を示した。興味深いことに、完全長のｒＭ１８０およびＡＤＰ５は、利用可能な遊離Ｃａ２＋の半分以上が９０分後には消費される迅速な石灰化傾向を示した（図６）。ＳＥＭ、ＴＥＭおよびＸＲＤによる合成されたミネラルの微細構造解析および結晶学的解析から、ミネラル結合と石灰化活性との関係に関する別の興味深い結果が明らかとなった。石灰化反応速度と同様に、ミネラルの形態学的状態の３つの異なる傾向が観察された。大多数のペプチド（ＡＤＰ１、ＡＤＰ２、ＡＤＰ３、ＡＤＰ４、ＡＤＰ６、ＡＤＰ８およびＨＡＢＰ１）は、球状の非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）の形成および結晶質相への転移と整合する球顆状の粒子を生じた。（１７〜１９）該球顆に由来する放射状結晶質のブレード状粒子の量は、ＡＤＰ１、ＡＤＰ２、ＡＤＰ４およびＨＡＢＰ１（強い結合剤）ではＡＤＰ３、ＡＤＰ６、ＡＤＰ８（弱い結合剤）およびペプチドなしの場合と比較してわずかに高く、この順で非晶質から結晶質への転移速度がわずかに異なっていた。しかしながらｒＭ１８０およびＡＤＰ７の場合には、完全に異なる形態学的状態が観察された。針状ナノ結晶は、ｒＭ１８０およびＡＤＰ７について観察された束状アセンブリへと組織化された。束状アセンブリはｒＭ１８０の場合に一層よく組織化されるようであり、このことは、アメロゲニンの自己アセンブリ特性および組換えアメロゲニンのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける石灰化挙動と一致している（２０〜２２）。ＡＤＰ５の存在下で形成された粒子は、電子密度があまり高くないコアおよびより小さな放射状結晶を備えた、はるかに小さい球顆であった。ＡＤＰ５存在下で粒子の大きさが小さいのは、石灰化反応速度について説明するデータにおいて観察されるように、ＡＤＰ５の核形成優位の状況に起因するのかもしれない。ＸＲＤ分光法による結晶学的解析からも、この形態学的相違が異なる結晶構造に起因することが確認された。ｒＭ１８０とＡＤＰ７を除くすべての事例において、ミネラルはおよそ２θ  ２５〜３０°に幅広いピークを生じ、結晶相に乏しいことを示した。しかしながらｒＭ１８０およびＡＤＰ７の存在下では、ＸＲＤパターンは結晶質ＨＡｐを示す多数の鋭いピークで構成されていた。主要なピークは、それぞれＨＡｐの（２１１）面および（３００）面に相当する２θ＝３１．８°（ｄ＝２．８１Å）および３２．１°（ｄ＝２．７８Å）に観察された（図２ｄ）。
【０１１８】
実施例１の補足資料に関する参照文献
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【０１１９】
実施例２
リン酸カルシウムミネラルの固有の抗細菌性（ティンウー（Ｔｉｎ−Ｏｏ）ら、アーカイブス・オブ・オロフェイシャル・サイエンシズ（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｏｒｏｆａｃｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、２００７年、第２巻：ｐ．４１−４４；イングラム（Ｉｎｇｒａｍ）ら、プラスチック・アンド・リコンストラクティブ・サージェリー（Ｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ）、１９９６年、第９８巻、第６号：ｐ．１１１９−１１１９；オワダリー（Ｏｗａｄａｌｌｙ）、エンドドンティクス・アンド・デンタル・トラウマトロジー（Ｅｎｄｏｄｏｎｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｔｒａｕｍａｔｏｌｏｇｙ）、１９９４年、第１０巻、第５号：ｐ．２２８−２３２）はさらに、細菌のコロニー形成にとってはあまり生存しやすくない環境を築き、かつ細菌コロニー形成の低減をもたらす可能性もある。これを試験するために、強力なバイオフィルムを形成する細菌である表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を用いて、ペプチドにより形成されたミネラル層の上で予備実験を行った。細菌生存率のアッセイは、ミネラル層が殺菌作用を示すことを明白に示している（データは示さない）。実施された生存／死滅アッセイでは、生存細菌は緑色に染色される一方、死滅細菌は、赤色染料が損傷した細胞壁だけに浸透することができることから赤色に染色された。ミネラル層上の死滅細菌の割合（％）は露出した象牙質上よりもはるかに高かった。露出した象牙質およびペプチドにより形成されたミネラルの上での全体的な細菌カバー率はそれぞれ４１％および５８％であった。全体的な細菌カバー率はミネラル層上においてより高かったが、細菌の４０％は死滅しており、露出した象牙質上では細菌の約６％しか死滅していなかった。観察された作用は、露出した象牙細管のさらなる浸潤の防止、および歯牙吸収の阻止において、重要な意味合いを有する。この抗菌作用にもかかわらず、上記に示されるように、ペプチドにより形成されたミネラル層はＰＤＬ線維芽細胞およびセメント芽細胞のような真核細胞に対しては逆の作用を示す。
【０１２０】
実施例２の方法
（細菌生存率のアッセイ）
表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）培養物を光学密度１．０（細胞がおよそ１×１０８個／ｍｌ）に調整し、該細胞懸濁液を、予め調製した石灰化試験片および石灰化されていない対照試験片とともにすべてのウェルに入れた。該細菌を３７℃で２．５時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳで３回穏やかにすすぐことにより、弱く付着した細菌を除去した。付着した細菌を、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  ＢａｃＬｉｇｈｔ（商標）細菌生存率染色キット（米国のインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して製造業者のプロトコールに従って染色した。過剰量の液体を表面から吸引し、細胞を、オプトロニクスＭａｇｎａＦｉｒｅ（商標）デジタルカメラシステム（米国カリフォルニア州ゴレタのオプトロニクス（Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ））、１００×油浸系対物レンズ、および適切なフィルタが装備された落射蛍光顕微鏡（ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）のＡｘｉｏｓｋｏｐ  ２、ドイツ連邦共和国イェーナ）を用いて観察した。ウェルごとに５つのランダムな視野を選択し、ＭａｇｎａＦｉｒｅ（商標）ソフトウェアプログラムを使用して画像化した。細菌カバー率はＩｍａｇｅＪ（商標）ソフトウェアを用いて定量化した。
【０１２１】
実施例３
（ＡＤＰ５変異体：）
ＡＤＰ５における２つの隣接する反対に荷電した残基対（Ｅ９〜Ｋ１０およびＤ１９〜Ｒ２０）は、可溶性のＣａ＋２およびＰＯ４−３の誘因ならびにポリペプチド付近における局所的な高過飽和の発生に関与している可能性がある。この仮説をさらに試験しかつポリペプチドの機能性を評価するために、本発明者らは、正に荷電した残基のみ、負に荷電した残基のみ、および全ての荷電残基がアラニン（Ａ）に置き換えられた３種の変異体を使用して、石灰化に対する荷電残基排除の影響について試験した。生成された変異体ペプチドのアミノ酸配列は表４に列挙されている。
【０１２２】
【表４】
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変異型ＡＤＰ５ペプチドを用いた本明細書中に記載の標準化された石灰化アッセイの応用は、反対に荷電した隣接する残基がバイオミネラリゼーションプロセスの際の核形成の促進において確かに役割を果たすことを示した。正および負に荷電した両方の残基の欠失は、カルシウム枯渇アッセイによって観察されるような機能の完全喪失をもたらした。他方、正または負に荷電した残基のみの欠失は、機能の部分的喪失をもたらした。核形成の促進は、正に荷電した残基を欠失させて負に荷電した残基が保持された場合は阻害の程度が小さかった（図１０）。
【０１２３】
これらの相互作用の結果、本発明者らはバイオミネラリゼーションプロセス、特に反応の速度を制御することができた。ここで本発明者らは、迅速な石灰化を提供するため核形成の促進が必要な場合にＡＤＰ５が臨床的な潜在能力を有するペプチドとして際立っていることを見出している。更に、ここで各変異体はバイオミネラリゼーションの速度について異なる影響を有している。これは、例えばバイオミネラリゼーションされる物質の形状をつくるために上記速度を制御したい場合に有用となりうる。
【０１２４】
（ＡＤＰ７のフラグメント：）
ＡＤＰ７の場合、該ポリペプチドとミネラルとの間の強い相互作用は、ミネラル‐溶液界面エネルギーの変化がＯＣＰよりもＨＡの形成において重要であることを示している。ＨＡの形成はやや複雑なプロセスであり、様々なルートを介して生じうる。ｐＨ９以上では、ＡＣＰは直接ＨＡへと転移する。［１］高ｐＨで形成されるＡＣＰは、構造上はあまり明確ではないが低ｐＨにおける形態と比較するとＨＡにより類似しており、よって、エネルギー的にはＨＡに転移するのにより有利であると考えられる。［１、２］しかしながらｐＨ９未満では、転移はより複雑であり、ＡＣＰからＯＣＰへの転移がＯＣＰからＨＡへの転移に先行する。ｐＨ９未満で生ずるＡＣＰ粒子は、水和されたＯＣＰ状構造に似ているランダムに配置された秩序クラスター（ｒａｎｄｏｍｌｙ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｅｄ  ｏｒｄｅｒｅｄ  ｃｌｕｓｔｅｒ）を備えたより明確な構造を有する。［１］したがって、ＡＣＰからＯＣＰへの転移はｐＨ９未満ではより有利である。その後、ＯＣＰからＨＡへの転移は、主としてＯＣＰの加水分解により適切な条件下で生じうる。［３］
上述のように、ポリペプチドとミネラルとの間の強い相互作用は、ミネラル‐溶液界面エネルギーの変化がＡＤＰ７を用いて観察される石灰化反応に関与していることを示している。しかしながら、ＨＡ沈澱反応がＡＤＰ７においてのみ観察され、その他の強い結合剤、すなわちＡＤＰ１、ＡＤＰ２およびＡＤＰ４のいずれにおいても観察されないという事実は、結合だけが観察された作用を担っているわけではないことを示している。観察された作用についての１つの可能な説明は、ＡＤＰ７がＨＡのための異成分核形成部位として働き、その結果、恐らくは分子認識を通じて他の相よりもＨＡの沈澱反応を促進しているかもしれないということである。ＡＤＰ７は、強い結合剤であるＡＤＰ１およびＡＤＰ２、ならびにその間に弱い結合領域のＡＤＰ８を備えて構成されている。ＡＤＰ７全体と、これに対してＡＤＰ１、ＡＤＰ２およびＡＤＰ８の影響を比較するために行われた石灰化実験は、ＡＤＰ７が溶液中に単一ポリペプチドとして存在する場合に限りＨＡ形成が生じることを個別に示している（図２ａ、ｂ）。これは、表面の結合時に誘導される可能性のある構造上の特徴が、観察された機能にとって不可欠であることを示唆している。ＡＤＰ７の興味深い１つの特徴は、ミネラル結合領域内に塩基性のヒスチジン（Ｈ）残基が豊富であること（ＡＤＰ１およびＡＤＰ２）、ならびに非結合性の中間領域には存在しないこと（ＡＤＰ８）である。ヒスチジンは、カルシウム結合タンパク質に共通して見出されるアミノ酸であり［４、５、および６］、ＡＤＰ７の機能においても同様に役割を果たしている可能性がある。さらに、ＲＡＭＰソフトウェアを用いて行われた分子構造予測は、ＡＤＰ７が完全なタンパク質上においても単一ポリペプチドとしてもループ状構造を形成する傾向を有することを示している。この立体配座はヒスチジン残基どうしを接近させ、このことはヒスチジン残基の重要性を一層示唆している。
【０１２５】
本発明者らはＡＤＰ７がＯＣＰよりもＨＡの沈澱反応を促進することを認識しているが、しかし、ＡＤＰ５およびＡＤＰ７の結合反応およびバイオミネラリゼーション反応は、エナメル質形成時のアメロゲニンを介した石灰化に関する興味深いメカニズムを示唆している。２つの異なるアメロゲニン由来ポリペプチドが親タンパク質の異なる性状を模倣するという事実は、これらのポリペプチドが元のアメロゲニン配列内の異なる機能領域であるということを提示している。すなわち、ＡＤＰ５は、局所的な過飽和を高めることによる石灰化反応速度の上昇に関与する領域である可能性があり、ＡＤＰ７は、界面エネルギーの変更によるＨＡへの相転移の優先に関与する領域である可能性がある。
【０１２６】
実施例３の参照文献
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【図９ａ）】
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【図９ｂ）】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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