(57)【要約】  本発明は、マイクロ環境において規定された温度を確立するための装置の温度制御の分析に適した方法に関し、以下のステップを含む第１の光学的温度検証手順を備える。ａ）それぞれが特定の発現温度を有する、１つ以上のサーモクロミック液晶をマイクロ環境に準備するステップ。ｂ）１つ以上の温度依存発光団をマイクロ環境に準備するステップ。ｃ）このマイクロ環境の温度を変化させ、これにに光を照射するステップ。ｄ）１つ以上のサーモクロミック液晶の発現温度に、マイクロ環境の温度が達した時に、温度依存発光団の発光を記録するステップ。  また、当該方法は、好ましくは以下のステップを含む第２の光学的温度検証手順を備える。ａ）第１の光学的温度検証手順で用いられた１つ以上の温度依存発光団をマイクロ環境に設けるステップ。ｂ）マイクロ環境の温度を変化させ、これにに光を照射するステップ。ｃ）放出される発光をモニターするステップ。【選択図】  図３
2014532854.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ環境において規定された温度を確立するための装置の温度制御の分析に適した方法であって、
前記方法は、
ａ）それぞれのサーモクロミック液晶が特定の発現温度（event temperature）を有する、１つ以上のサーモクロミック液晶をマイクロ環境に準備するステップと、
ｂ）マイクロ環境に１つ以上の温度依存発光団を準備するステップ。
ｃ）このマイクロ環境における温度を変化させ、かつこのマイクロ環境に光を照射するステップと、
ｄ）前記マイクロ環境において、前記１つ以上のサーモクロミック液晶の発現温度に達した時に、前記１つ以上の温度依存発光団の発光を記録するステップ、
とを有する第１の光学的温度検証手段を備えることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
前記ステップｄ）において、マイクロ環境における温度依存発光団の特定の発光強度が、前記マイクロ環境内の特定の実温度と関係づけられ、前記マイクロ環境における前記実温度は、ＴＬＣの光学的変化によって示されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法において、
前記１つ以上のサーモクロミック結晶と、異なる実温度での発光を測定するために用いられる前記1つ以上の温度依存発光団とが異なるマイクロ環境に設けられ、好ましくは異なる反応容器に設けられることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項1乃至３のいずれか１項に記載の方法において、
前記方法は、
ａ）前記第１の光学的温度検証手順で用いられた１つ以上の温度依存発光団をマイクロ環境に設けるステップと、
ｂ）前記マイクロ環境の温度を変化させ、かつ前記マイクロ環境に光を照射するステップと、
ｃ）放出される発光をモニターするステップと、
を有する第２の光学的温度検証手順を備えることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法において、
前記第１の光学的温度検証手順の前記ステップａ）において、
（ｉ）少なくとも１つのサーモクロミック液晶の発現温度は、前記所望の校正温度に対応することと、
（ｉｉ）少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つの異なるサーモクロミック液晶が用いられ、当該サーモクロミック液晶の少なくとも１つは、当該サーモクロミック液晶の少なくとも他の１つの発現温度と異なる特定の発現温度を有することと、
（ｉｉｉ）少なくとも３つのサーモクロミック液晶が用いられ、第１のサーモクロミック液晶は、４５℃〜５５℃の範囲にある発現温度を有し、第２のサーモクロミック液晶は、７０℃〜８０℃の範囲にある発現温度を有し、第３のサーモクロミック液晶は、８５℃〜９５℃の範囲にある発現温度を有することと、および／または、
（ｉｖ）それぞれの異なるサーモクロミック液晶が、２つ以上の同じサーモクロミック液晶を含むセットに用いられていることと、
の特徴（（ｉ）〜（ｉｖ））の内１つ以上の特徴を有することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法において、
前記第１の光学的温度検証手順の前記ステップｂ）において、それぞれ温度依存性の異なる、２つの異なる温度依存発光団が準備されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法において、
前記第１の温度依存発光団は、前記第２の温度依存発光団より高い温度感受性を有することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、前記第１の温度依存発光団の発光強度を、同一の発現温度で測定された前記第２の温度依存発光団の発光強度で除算して、割合が生成されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項6乃至8のいずれか１項に記載の方法において、
（ｉ）実質的に同一の光学的特性を有する、２つの異なる温度依存発光団が用いられることと、
（ｉｉ）検出器のドリフトを除去するために、２つの異なる温度依存発光団が用いられることと、
（ｉｉｉ）前記温度依存発光団の蛍光の温度依存性を確定するためのモデルであって、前記第１の温度依存発光団の場合には経験的な関数関係
2014532854.tif 000009
であり、前記第２の温度依存発光団の場合には、アレニウスの式
2014532854.tif 000010
であり、ここでＦＩ（Ｔ）は、ケルビンで与えられる温度Ｔであり、ＦI (Ｔｒｅｆ)は、ケルビンで与えられる基準温度Ｔｒｅｆでの蛍光強度であり、ｃ＝Ｅｎｒ／Ｒであり、Ｅｎｒは無放射過程の活性化エネルギー、Ｒは気体定数であるモデルを用いることと、および／または、
（ｉｖ）ピロニンＹおよびＡｔｔｏ５３２が、２つの異なる温度依存発光団として用いられることと、
の特徴（（ｉ）〜（ｉｖ））の内１つ以上の特徴を有することを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法において、
前記第１の光学的温度検証手順のステップｃ）において、開始ポイントと終了ポイントとを有する温度プロファイルを用いて温度が変化され、前記開始ポイントと前記終了ポイントの間の加熱の刻み幅は１℃より小さく設定され、好ましくは約０．１℃〜０．２℃に設定され、各刻み幅での保持時間は１０秒より大きく設定され、好ましくは当該保持時間は約３０秒に設定されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項４乃至１０のいずれか１項に記載の方法において、
前記第２の光学的温度検証手順のステップｂ）においては、動的な温度プロファイルが実行され、当該温度プロファイルは、数個の異なる温度段階を含み、当該温度段階の少なくとも１つは、少なくとも１つのサーモクロミック液晶の発現温度と異なっていることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の方法において、
他の測定された蛍光強度に対して、同様な測定を含むように、および／または％で与えられる閾置を超えるような測定を無視するようにして、マイクロ環境の測定を平均することによって、蛍光強度の誤った測定の影響が低減されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の方法において、
前記サーモクロミック液晶は、１つのマイクロ環境において発光団と組み合わせて用いられ、好ましくは、前記１つ以上のサーモクロミック液晶が、光学システムの光路に関して、少なくとも部分的に発光団の前または後に位置されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の方法において、
（ｉ）前記方法がマイクロ環境における温度測定の検証および／または校正に用いられることと、
（ｉｉ）前記マイクロ環境を含む温度制御環境の温度が、前記第１の光学的温度検証手順および／または前記第２の光学的温度検証手順で記録されることと、
（ｉｉｉ）前記１つ以上の異なるサーモクロミック液晶および前記１つ以上の異なる温度依存発光団が、別々のマイクロ環境に設けられることと、
（ｉｖ）前記温度依存発光団が蛍光色素であることと、
（ｖ）マイクロ環境の温度特性および／または光学的特性に実質的に影響する特性に関して、前記装置によってそれぞれのマイクロ環境において実施される反応条件に対応した、マイクロ環境の設定において、前記１つ以上の温度依存発光団が設けられることと、
（ｖｉ）前記１つ以上の温度依存発光団が、水溶液で準備されることと、
（ｖｉｉ）前記第２の光学的温度検証手順を実行する前に、前記１つ以上のサーモクロミック液晶が除去されることと、
（ｖｉｉｉ）前記マイクロ環境が反応容器であることと、および／または、
（ｉｘ）前記装置がサーマルサイクラーであることと、
の特徴（（ｉ）〜（ｉｘ））の内、１つ以上の特徴を有することを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の方法において、
前記装置は、
（ｉ）反応容器を収容するためのレセプタクルを有する金属ブロックを備えたサーマルサイクラーか、または、
（ｉｉ）加熱された環境に配置された反応容器を収容するための回転部材を備えることを特徴とする方法。
【請求項１６】
マイクロ環境用のレセプタクルを含むローターを備えたサーマルエアサイクラの温度制御の検証および校正用のシステムであって、
当該システムは、マイクロ環境に、
ａ）各サーモクロミック液晶が異なる発現温度を有する、２つ以上の異なるサーモクロミック液晶と、
ｂ）１つ以上の温度依存発光団と、
を含むことを特徴とするシステム。
【請求項１７】
請求項１６に記載のシステムにおいて、
前記異なるサーモクロミック液晶および前記１つ以上の温度依存発光団は、異なるマイクロ環境に設けられ、好ましくは異なる反応容器に設けられることを特徴とするシステム。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載のシステムにおいて、
前記サーモクロミック液晶を含むマイクロ環境は、前記１つ以上の温度依存発光団を含むマイクロ環境から分離されていることを特徴とするシステム。
【請求項１９】
請求項１６乃至１８のいずれか１項に記載のシステムにおいて、
前記マイクロ環境は反応容器であり、当該マイクロ環境の各々は前記ローターの異なるレセプタクルに設けられることを特徴とするシステム。
【請求項２０】
請求項１６乃至１９のいずれか１項に記載のシステムにおいて、
（ｉ）前記異なるサーモクロミック液晶および前記１つ以上の温度依存発光団が、異なるマイクロ環境に設けられていることと、
（ｉｉ）その温度依存性が異なる２つの温度依存発光団を備え、第１の温度依存発光団は、第２の温度依存発光団より高い温度感度を有し、前記２つの温度依存発光団は、実質的に同じ光学的特性を有することと、
（ｉｖ）前記温度依存発光団が蛍光色素であることと、
（ｖ）マイクロ環境の温度特性および／または光学的特性に実質的に影響する特性に関して、前記装置によってそれぞれのマイクロ環境において実施される反応条件に対応した、マイクロ環境の設定において、前記１つ以上の温度依存発光団が設けられることと、
（ｖｉ）前記１つ以上の温度依存発光団が、水溶液で準備されることと、
（ｖｉ）温度依存発光団としてピロニンＹおよびＡｔｔｏ５３２を含むことと、
（ｖｉｉ）前記異なるサーモクロミック液晶の発現温度が、少なくとも１０℃異なり、好ましくは１５℃異なっていることと、
の特徴の内、１つ以上の特徴を有することを特徴とするシステム。
【請求項２１】
請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の方法における、請求項１６乃至２０のいずれか１項に記載のシステムの使用。
【請求項２２】
マイクロ環境において設定される温度を確実にするための装置の温度制御の分析のための方法であって、
その温度依存性が異なる、少なくとも２つの異なる温度依存発光団が、光学システムの光学ドリフトを補償するために、および同じ温度における第１の温度依存発光団の蛍光強度と第２の温度依存発光団の蛍光強度の割合を測定するために用いられることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は特定の温度が要求される化学プロセス、生物学プロセスおよびバイオ技術プロセスの分野に関する。本発明はとりわけ、マイクロ環境における温度の測定の検証または校正の方法に関し、マイクロ環境における温度測定の検証または構成システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くのプロセスは、このプロセスあるいはこのプロセスの特定のステップの有効性が特定の温度でのプロセス／ステップの実行に依存するように、この特定の温度を必要としている。このプロセス／ステップの環境の温度をモニターすることは、必要に応じて環境が加熱あるいは冷却されて所望の温度に維持されることができるために必要である。環境温度の連続的モニターは、必要に応じて加熱または冷却によって、温度が所望のレベルに維持されるために必要である。プロセスにおけるさらなるステップに異なった温度が要求される場合にも、同様の留意点が適用される。
【０００３】
特定の温度を必要とするプロセスの例として、複数のサイクルを含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）がある。このＰＣＲは、分子生物学における科学的技術であり、サイクルが完了する毎にポリヌクレオチド配列を増幅する。このＰＣＲの技術は、良く知られており、非特許文献１〜３を含む多くの本に記載されている。ＰＣＲは、特許文献１〜１１を含む多数の米国特許にも記載されている。
【０００４】
各ＰＣＲサイクルは、通常３つの別々の温度ステップ、変性ステップ、アニーリングステップ、伸張ステップを備える。ＤＮＡの変性は通常９０〜９５℃付近で起こり、変性されたＤＮＡのプライマーのアニーリングは通常４０〜６０付近で行われ、アニーリングされたプライマーをポリメラーゼを用いて伸張するステップは通常７０〜７５℃で行われる。したがって、ＰＣＲサイクル中に反応混合物の温度は変更されなければならず、多重サイクルＰＣＲの実験中では多数回変更される。各ステップの有効性は、それぞれのステップが実行される時の温度に強く依存する。このＰＣＲ技術は、非常に様々な生物学的アプリケーションを有しており、たとえば、ＤＮＡ配列解析、試料生成、核酸配列のクローニング、部位特異的突然変異、遺伝子変異の検出、ウィルス感染の診断、分子指紋、および生体液体他のソースにおける汚染微生物のモニタリングを含む。ＰＣＲは通常、サーマルサイクラーまたはＰＣＲサイクラーと呼ばれる実験室の装置の中で行われる。
【０００５】
ＰＣＲに加えて、特許文献１２に開示されているようなリガーゼ連鎖反応を含むインビトロ増幅処理が知られており、また従来技術で有利に用いられている。さらに一般的には、核酸ハイブリッド化および核酸シークエンシングのような生物学分野で知られた幾つかの重要な方法は、制御されたやりかたで、試料分子を含む溶液の温度の変化に依存している。従来の技術は、異なる温度ゾーンを循環する個々のウェルまたはチューブの使用に基づいている。たとえば、ＤＮＡ増幅およびＤＮＡシークエンシングに用いられる多数のサーマルサイクラーが従来技術で公知であり、これらにおいては、温度制御されたエレメントまたは「ブロック」は、反応混合物を保持し、ここでこのブロックの温度は時間と共に変化される。これらの装置の利点は、比較的多数個のサンプルが同時に処理できることであり、たとえば９６個のウェルプレートが一般的に用いられている。
【０００６】
このようなサーマルサイクラーの様々な構造が知られている。たとえば、一般的にＤＮＡの増幅用に、多数個のサンプルのサーマルサイクリング用の装置が入手可能である。このような装置の共通なフォーマットは、熱伝導性材料のブロックを含んでおり、反応チューブまたはプレートのような容器を収容するための、所望の反応が行われる複数のチャンネルまたはキャビティを有している。温度プローブがこのブロックに取り付けられているので、このような装置での温度のモニタリングは比較的容易である。
【０００７】
しかしながら、このようなブロック装置には様々な欠点があり、たとえばこれらは反応混合物をサイクリングが比較的低速であることであり、これらは動作させるのにエネルギーを大量に消費することであり、そして反応混合物のその場（in situ）検出が難しいことである。これらのいくつかの欠点を避けるための対策として、他のサーマルサイクラーが開発され、反応混合物を収容する複数の容器がチャンバ内で回転可能なカルーセルに回転可能に取り付けられ、加熱および冷却されるようになっている。
【０００８】
反応混合物のサーマルサイクリング用の装置が知られており、この装置ではローターを含む隔離されたチャンバ（「ロータージーン」、“ＲＯＴＯＲ-ＧＥＮＥ”(登録商標）として知られている。）のような温度制御された環境で、反応容器がローターに保持されて回転される。熱サイクリングは、環境の加熱および冷却によって達成される。このカルーセルすなわちローターは、この容器、バイアルまたはチューブに用いられる開口部、レセプタクルまたはスロットを有する。ローターについては、バイアルまたはチューブの数に対応した６０個または７２個のレセプタクルを有するものが知られている。このような装置は、たとえば特許文献１３に開示されている。特許文献１３では、反応混合物は回転されるので、反応混合物の温度を正確に測定することは難しい。ローターの環境の温度がどの程度良好に制御されているかに関わらず、反応混合物と環境との間に温度差があり得ることは自明である。
正確な温度制御は、大部分のサーマルサイクリングに対して極めて重要であり、反応混合物すなわち反応チューブの液体の実際の温度を知ることが重要である。これから環境温度管理プログラムで補償し、実際の反応チューブにおける所望の温度を設定することができる。しかしながら回転装置内の多量の水溶液の熱的挙動をモニターするのは容易ではない。ケーブルを有するセンサを用いると、追加の熱容量を持ち込むことになる。さらにこれらのケーブルは、追加の熱橋（thermal bridge）を形成し、これも温度の測定に影響を与える。このため、プロセスの全体的な環境の温度をモニターすることは容易であるが、プロセスのマイクロ環境の温度をモニターすることは常に容易というわけではない。
【０００９】
したがってそれぞれのサーマルサイクラーの動作の重要な点は、反応容器の内容物の温度の正確な制御である。これは反応容器の周りの空気の温度をどれだけ正確に制御するかということと等価である。しかしながら、チャンバ温度は、この装置で補償される筈であるので、容器内の温度はロータージーンの温度制御装置によって検出されるチャンバ温度と必ずしも同じである必要はない。
【００１０】
特許文献１４には、容器内の反応の温度を光学的に補償するシステムおよび方法が開示されている。検出可能なチャンバ温度と反応容器における温度との関係は、校正処理で得られる。校正では、サーモクロミック液晶（ＴＬＣ）の上または下に層状とされた、発光団を含む成分を有する透明なバイアルが用いられる。発光団を含む成分およびＴＬＣ成分を備えたシステムが光源を用いて照射され、この発光団を含む成分によって放出された発光が、上記の環境の温度を記録している間に、検出器によって検出される。得られたデータは、反応バイアル温度に対するチャンバ温度での温度校正曲線を提供するために用いられる。これにより、それぞれの装置の温度制御が正確に動作していることが管理／検証することができる。このため、発光団およびＴＬＣの組み合わせがマイクロ環境（反応バイアル）に提供され、またたとえば、マイクロ環境で異なる別々の温度が確定されなければならない過程でＰＣＲのプロファイルが実行される。ＴＬＣ／発光団の組み合わせの発光における遷移が記録される。マイクロ環境で生じた実際の温度は、上記の組み合わせの想定遷移温度に基づいて推定／決定され、温度制御が適切に動作したかどうか、達成された筈の温度と比較される。もし差があったならば、このＴＬＣ／発光団の組み合わせによって測定されたマイクロ環境の実際の温度が、期待される温度と充分に一致するまで、装置の温度制御で適切な調整が行われる。
【００１１】
上述の方法およびシステムの精度には改善される余地がある。さらに、温度を測定するための光学的測定を用いると、光学的なドリフトが生じ得るので、これが測定に影響を与える。たとえば、照射光源の光束が時間と共に変化する場合は、光学検出器が検出した強度が変化する。さらに、照射光源、すなわち光束は、この照射光源の温度によって影響される可能性があり、この光学的ドリフトは、そのままずれた温度測定となる。これは、特に光学系のドリフトを補償するための基準チャネルを有しないサーマルサイクラーを用いた場合に問題となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第４６８３１９５号
【特許文献２】米国特許第４６８３２０２号
【特許文献３】米国特許第４８００１５９号
【特許文献４】米国特許第４９６５１８８号
【特許文献５】米国特許第４８８９８１８号
【特許文献６】米国特許第５０７５２１６号
【特許文献７】米国特許第５０７９３５２号
【特許文献８】米国特許第５１０４７９２号
【特許文献９】米国特許第５０２３１７１号
【特許文献１０】米国特許第５０９１３１０号
【特許文献１１】米国特許第５０６６５８４号
【特許文献１２】米国特許第４９８８６１７号
【特許文献１３】国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ９８／００２７７号（国際特許出願公開ＷＯ９８／４９３４０号））
【特許文献１４】国際特許出願公開ＷＯ０３／１０２５２２号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】ＰＣＲについて： A Practical Approach M. J. McPherson, et al., IRL Press (1991)
【非特許文献２】ＰＣＲプロトコルについて： A Guide to Methods and Applications by Innis, et al., Academic Press (1990)
【非特許文献３】ＰＣＲ技術について： Principals and Applications for DNA Amplification H. A. Erlich, Stockton Press (1989)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、上記の従来技術の少なくとも１つの欠点を改善し、有用な代替手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、とりわけサーマルサイクラーのような装置の、特に温度制御の確度の性能を分析することを可能とする方法に関する。上述のように、このような装置は、たとえばＰＣＲ反応のようなマイクロ環境において行われる温度依存反応の正確さを保証するため、たとえば反応バイアルのようなマイクロ環境内の特定の温度を達成し、かつ維持しなければならない。そのため、この装置の温度制御が適切に動作していることを保証すること、したがってこれを検証すること、またしたがってマイクロ環境で達成される実際の温度が、このマイクロ環境で達成される筈の温度に対応していることが重要である。もし差が検出されたならば、実際の温度が目的の温度と対応するように温度制御の適切な調整が行われてよい。たとえばＰＣＲサイクルの間にこの装置の温度制御の確度を検証するため、マイクロ環境での実際の温度を測定するために、このマイクロ環境に含まれる、温度依存の発光団、好ましくは蛍光色素が用いられる。好ましくは、この発行団は、液体中に含まれる。放出された発光は、マイクロ環境で達成されている実際の温度と相関している。測定されたそれぞれの温度を温度制御によって達成される筈の目的の温度と比較することによって、この温度制御の確度の分析、およびもし必要であればこの温度制御の調整を行うことが可能である。
【００１６】
そこで本発明は、もしこのマイクロ環境において生じる実温度で温度依存発光団の発光強度が測定され、これがマイクロ環境で生じている特定の実温度にマッピングされると、この温度依存発光団に基づいたマイクロ環境の温度測定、とりわけ液体中での温度測定の確度を改善することができるという見地に基づいたものである。さらに、装置が使用されているとき、すなわちマイクロ環境においてＰＣＲ反応のような反応を実行するときに、マイクロ環境内に行き渡っている条件下での発光強度を測定することは有利である。
【００１７】
以上より、本発明の第１の態様によれば、マイクロ環境において設定される温度を確実にするのに好適な装置の温度制御の分析に適した方法が提供され、この方法は、以下のステップを有する第１の光学的温度検証手順を備える。
ａ）それぞれのサーモクロミック液晶が特定の発現温度（event temperature）を有する、１つ以上のサーモクロミック液晶をマイクロ環境に準備するステップ。
ｂ）マイクロ環境に１つ以上の温度依存発光団を準備するステップ。
ｃ）このマイクロ環境の温度を変化させ、かつこのマイクロ環境に光を照射するステップ。
ｄ）このサーモクロミック液晶を含むマイクロ環境において、これらの１つ以上のサーモクロミック液晶の発現温度に達した時に、これらの１つ以上の温度依存発光団の発光を記録するステップ。
【００１８】
本発明の第２の態様によれば、サーマルエアサイクラの温度制御の検証および校正用のシステムを提供することであり、このシステムは、マイクロ環境用のレセプタクルを含むローターを備え、このローターはマイクロ環境に以下のものを含む。
ａ）各サーモクロミック液晶が異なる発現温度を有する、２つ以上の異なるサーモクロミック液晶。
ｂ）１つ以上の温度依存発光団。
【００１９】
本発明の第３の態様によれば、本発明は、マイクロ環境において設定される温度を確実にするための装置の温度制御の分析の際の温度依存発光団の使用に関し、ここで温度依存性が異なる、少なくとも２つの異なる温度依存発光団が、光学システムの光学ドリフトを補償するために、また同じ温度における第１の温度依存発光団の蛍光強度と第２の温度依存発光団の蛍光強度の割合を測定するために用いられる。この第２の温度依存発光団は、第１の温度依存発光団より温度依存性が小さい。
【００２０】
その他の本発明の目的、特徴、利点、および態様は、以下の説明およびこれに付随する請求項に基づき当業者であれば明白であろう。なお、しかしながら、以下の説明、付随する請求項およびそれぞれの例は、本発明の好ましい実施形態として説明されていたとしても、単なる例示である。以下の記載から、様々な変更および変形が、開示された本発明の主旨および範囲にあることが当業者にとっては明白であろう。
【００２１】
本発明の第１の態様によれば、１つの環境内にあるマイクロ環境において設定される温度を確実にするのに好適な装置の温度制御の分析に適した方法が提供され、この方法は、以下のステップを有する第１の光学的温度検証手順を備える。
【００２２】
ａ）それぞれのサーモクロミック液晶（ＴＬＣ）が特定の発現温度（event temperature）を有する、１つ以上のサーモクロミック液晶をマイクロ環境に準備するステップであって、好ましくは特定の発現温度を有する各ＴＬＣは、別々のマイクロ環境に含まれる。
ｂ）１つ以上の温度依存発光団をマイクロ環境に準備するステップであって、好ましくは別々のマイクロ環境においては異なる発光団が設けられる。
ｃ）このマイクロ環境の温度を変化させ、かつこのマイクロ環境に光を照射するステップ。
ｄ）これらの１つ以上のサーモクロミック液晶の発現温度に、それぞれのサーモクロミック液晶を含むマイクロ環境の温度が達した時に、これらの１つ以上の温度依存発光団を発光を記録するステップ。
【００２３】
ここで用いられる「環境」なる用語は、好ましくは装置、たとえばある装置のチャンバ内で達成されるあらゆる温度制御環境を意味する。たとえば上記の環境における温度は、１つのプロセスまたは１つのプロセス中のステップが特定の温度で実行されるために制御されてよい。この用語は、好ましくは加熱可能な反応チャンバ、とくにサーマルサイクラーの反応チャンバ、とりわけ温度制御された環境において回転されるロータに反応容器が含まれるサーマルサイクラーに対して用いられるものである。温度サイクリングは、各々のサーマルサイクラーにおいて、環境（ここでは断熱されたチャンバ）を加熱および冷却することによって行われる。１つの実施形態によれば、これは加熱された少なくとも１つの反応容器を保持するためのキャビティを有するブロックに対して用いられる。さらにこの用語は、必要に応じてその環境を加熱または冷却することによって温度が制御されるような環境も含む。
【００２４】
ここで用いられる「マイクロ環境」なる用語は、好ましくは、温度制御された環境内か、またはこの温度制御された環境の部分に含まれる環境を意味する。したがってこの用語は、とりわけ反応容器に対して用いられ、またさらに好ましくは温度制御された環境内に含まれる反応容器の内部に対して用いられる。この温度制御された環境は、たとえば加熱可能な反応チャンバまたはサーマルサイクラーの加熱ブロックである。とりわけこのマイクロ環境なる用語は、各々の温度制御された環境内に含まれる反応容器に含まれる液体を包含しており、またこれに対して用いられるものである。好ましくは、このマイクロ環境の温度は、マイクロ環境を含む環境の温度によって制御される。本発明では、校正方法が提案され、ここで環境中に設置されたマイクロ環境の温度が光学的に測定され、この際このマイクロ環境は好ましくは反応容器内の液体である。
【００２５】
ここで用いられる「サーモクロミック液晶」（ＴＬＣ）なる用語は、とりわけ「クリアリングポイント」タイプのＴＬＣまたは「温度感受性」タイプのＴＬＣを意味する。
「クリアリングポイント」タイプＴＬＣとは、遷移温度すなわちクリアリングポイント温度と呼ばれる所定の温度で、組成が不透明なものから透明なものに変化するものである。
したがって、この遷移温度では、光学的特性が突然変化する。このようなＴＬＣは、多様な遷移温度のものが市販で入手可能である。「温度感受性」タイプのＴＬＣとは、「レッドスタート（Red Start）」温度と呼ばれる所定の温度より低いところで、このＴＬＣが大部分透明であるものである。クリアリングポイント温度である、第２のこれより高い温度で、このＴＬＣは大部分が透明となる。これらの２つの温度の間で、このＴＬＣは可視光を選択的に反射する。レッドスタート温度においては、このＴＬＣは赤色光を強く反射する状態に変化する。ブルースタート（Blue Start）温度においては、このＴＬＣは青色光を強く反射する状態に変化する。ＴＬＣが保持されている環境の温度が上昇するにつれて、このＴＬＣが最も強く反射する光の色は、赤からオレンジ、黄色、緑、青、そして紫と、波長的に減少する。ＴＬＣを有するマイクロ環境を照射したときに、この光学システムの出力をモニターすることにより、すなわち光検出器を用いることにより、このマイクロ環境およびその内容物が、光学的特性が突然変化する温度にあるか、上にあるか、または下にあるか決定することができる。そのためここでは、この光学的特性が突然変化する時の上記の温度が、ＴＬＣの「発現温度」とも呼ばれている。クリアリングポイントタイプのＴＬＣの場合、この「発現温度」の例は、このＴＬＣの遷移温度である。温度感受性のＴＬＣの場合、このような発現温度の例は、このＴＬＣが特定の光の波長を容器の光源から最も強く反射あるいは方向を変える時の温度である。
【００２６】
ここで用いられる「発光団」なる用語は、とりわけ発光性を有する化合物を意味する。発光の元となるものは、通常は、この化合物の成分である、原子あるいは原子団等である。この発光団は、特定の波長のエネルギーを吸収し、異なる特定の波長のエネルギーで再放出する。この再放出されたエネルギーは、光検出器で検出することができる。発光団は、液体、気体および固体を含むさ様々な形態で存在すしてよい。好ましくは、この発光団は、水溶液または有機溶液にそれぞれ存在してよい。固体の形態では、発光団は、マイクロ環境の内側または外側の被覆または塗装として設けられてよい。この発光団なる用語は、蛍光および燐光を含む。好ましくは、この用語は蛍光を意味する。蛍光はその崩壊寿命が非常に短いという利点を有する。好ましくは、この用語は蛍光色素を意味し、これより蛍光団を含む任意の色素を意味する。温度依存の発光団においては、この光学的特性は発光団の温度に依存する。したがって、特定のマイクロ環境に存在する温度依存の発光団の発光を分析することによって、このマイクロ環境の温度を推測することができる。好ましくは蛍光色素である、この温度依存の発光団は、好ましくは本発明の装置でその後に実施され得る反応に用いられる設定に適合した設定で提供される。たとえば、サーマルサイクラーにおいては、マイクロ環境は通常、チューブ、バイアルまたはウェルのような反応容器で準備され、これらは別々の量の液体、とりわけ水溶液を含んでいる。この設定は、反応が正確に行われることを可能とするために、別々の温度を有するようなマイクロ環境を提供する。したがって、好ましくは蛍光色素である発光団を準備することが好ましく、また、この装置を使用している場合のマイクロ環境に存在する状態をしっかりと反映するように、液体とりわけ水溶液で、同じ形式の反応容器で、かつ好ましくはこの反応で通常用いられる同一の標準量で提供されることが好ましい。これにより校正処理を大幅に改善することができる。
【００２７】
本発明は、もしこのマイクロ環境において生じる実温度で温度依存発光団の発光強度が測定され、これがマイクロ環境で生じている特定の実温度にマッピングされると、この温度依存発光団に基づいたマイクロ環境の光学的温度測定を改善することができるという見地に基づいたものである。それぞれのマッピングを行うために、本発明による方法における第１の光学的温度検証手順が実行される。ここで、少なくとも１つの、特定の発現温度を有するサーモクロミック液晶（ＴＬＣ）を用いて、実温度測定が行われる。このＴＬＣは、それぞれのマイクロ環境に含まれており、したがってこのマイクロ環境内で起こる温度変化に対して（のみ）反応する。次にステップｃ）で、好ましくはこのマイクロ環境が置かれた環境における温度を変更することによって、これらのマイクロ環境の温度が変更される。
【００２８】
環境の温度は、好ましくはステップｃ）で同時に記録される。もしこのマイクロ環境で発現温度に達した場合、ＴＬＣはその光学的特性を変化させ、これによってこの用いられたＴＬＣの発現温度に対応したマイクロ環境の温度の到達したことの信号を生成する。この発現温度において観測されるサーモクロミック液晶の光学的特性の変化は、マイクロ環境における実温度測定を可能とする。好ましくは同時または殆ど同時に、温度依存の発光団の蛍光が測定される。このようにして、ＴＬＣの光学的特性の変化が起った後においても、発光団の発光を測定することが可能である。しかしながら、ここで、この発光団を含むマイクロ環境内の温度が、まだＴＬＣの光学的特性が生じた時と同じ温度であることを保証するために、測定が直ちに行われることが保証されなければならない。ここではマイクロ環境における特定の実温度に到達した時に発生する、使用されている温度依存発光団の特定の発光強度、すなわちＴＬＣの発現温度を測定し記録することが可能である。このようにして、本発明による方法においては、マイクロ環境における温度依存発光団の特定の発光強度が、このマイクロ環境内の特定の実温度と関係づけられ、マイクロ環境におけるこの実温度は、ＴＬＣの光学的特性における変化によって示される。好ましくは、温度依存発光団の発光は、ここでは校正温度とも称される、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも３つの、別々の実温度で測定される。この実温度は、発現温度がほぼ校正温度である異なるＴＬＣを用いた装置の動作中に測定され、これらの校正温度は、好ましくはこの装置が使用中のマイクロ環境で確定されなければならない反応温度か、またはこれに近い温度である。好ましくは、発現温度で測定された温度依存発光団の発光強度は、この発現温度とともに記憶される。２つ以上の別々のポイントでの実際の実温度を用い、またこれに対応した温度依存発光団の発光を用いることにより、実温度に対する温度依存発光団の相対的な発光をマッピングすることができる。このようにして１つの実施形態によれば、本発明による方法は、１つ以上のサーモクロミック液晶の発現温度において測定された１つ以上の温度依存発光団の相対的な発光をこれに対応した実温度に対してマッピングするステップを備える。このため、温度依存発光団の発光の蛍光強度を、温度に関連して前以て測定しておくことが可能であり、これらのデータはたとえばテーブルとしてまたはモデル化されて記憶されてよい。
【００２９】
例示されているように、１つの好ましい実施形態では、（複数の）温度依存発光団および（複数の）サーモクロミック液晶は、たとえば別々の反応容器における、別々のマイクロ環境に設けられる。異なるマイクロ環境に（複数の）温度依存発光団および（複数の）サーモクロミック液晶を設けることにより、マイクロ環境における実温度を測定するために用いられるサーモクロミック液晶を妨害することなく、この温度依存発光団の発光を測定することができる。この温度依存発光団は、サーモサイクラーのレセプタクルに配置された反応容器内に設置されてよく、サーモクロミック液晶は、この装置のさらなる、異なったレセプタクルに配置された異なる反応容器内に設置されてよい。もし１つ以上の温度依存発光団が用いられている場合、それぞれの温度依存発光団は、異なる反応容器内に設置される。さらに、それぞれの反応容器は、このサーモサイクラーの異なるレセプタクルに設置される。それぞれの反応容器は、したがってこのサーモサイクラーの別々のレセプタクルに設置される。好適な配置を例として示す。
【００３０】
この第１の光学的温度検証手順で用いられた少なくとも１つの温度依存発光団は、次にこの装置、たとえばサーマルサイクラーの温度制御を検証するために用いることができ、これはマイクロ環境における温度を変化させ、このマイクロ環境において達成された実際の温度がこの装置の温度制御によって達成される筈の所望の温度と合致するかどうかを分析することによって行われる。この検証は、温度依存発光団が放出した発光を用いて行われる。第１の光学的温度検証手順で得られたデータにより、温度依存発光団を含むマイクロ環境において達成された温度をさらに正確に測定することができる。このため、本発明による方法を用いた場合、さらに正確な温度制御の調整が可能である。これは、温度測定の確度が改善されることから、このマイクロ環境において実行されるべきプロセスの有効性に対して良い影響を与える。この確度は、マイクロ環境が環境内で回転していても達成される。
【００３１】
さらに、この第１の光学的温度検証手順で得られたデータは、たとえば環境内に備えられた温度センサによって測定された環境温度を、たとえば達成される筈の所望のマイクロ環境温度およびＴＬＣによって示されるマイクロ環境の温度と比較するのに用いることができる。この第１の光学的温度検証手順で得られた情報は、既に温度制御の分析に有用であり、したがってマイクロ環境における温度測定の検証または校正に有用である。とりわけ、温度センサの確度およびマイクロ環境で確定される温度の確度を分析することができ、たとえば検証あるいは校正することができる。このように、本発明の方法は、とりわけサーマルサイクラーにおける温度測定を検証または校正するのに有用である。たとえば、マイクロ環境における実際の温度と達成される筈の温度とで差が見られた場合、適切な調整を行うことができる。
【００３２】
好ましい実施形態によれば、本発明による方法は、以下のステップを含む第２の光学的温度検証手順を備える。
ａ）第１の光学的温度検証手順で用いられた１つ以上の温度依存発光団をマイクロ環境に設けるステップ。
ｂ）このマイクロ環境の温度を変化させ、かつこのマイクロ環境に光を照射するステップ。
ｃ）放出される発光をモニターするステップ。
【００３３】
この第２の光学的温度検証手順では、たとえばＰＣＲサイクルの温度プロファイルが検査される。この（複数の）マイクロ環境が置かれた環境における温度を変更することによって、これらのマイクロ環境の温度が変更される。装置の通常の使用時に行われる温度の変更のような動的な設定における装置の温度制御の検査は、温度制御の確度を検査するために重要であり、したがって実際の設定におけるマイクロ環境において達成される温度の確度を検査するために重要である。温度依存発光団により放出される発光を用いて、このような設定で装置の温度制御が正確に機能しているかどうかを分析することが可能であり、マイクロ環境内で所望の温度を正確に達成することが可能である。マイクロ環境で達成される筈の所望の温度は、次に、温度依存発光団により放出される発光に基づいた、このマイクロ環境で達成される実際の温度と比較される。第１の光学的温度検証手順で得られたデータのおかげで、とりわけ実温度に対する発光団の相対的発光のマッピングにおいて、第２の光学的温度検証手順の間にマイクロ環境で達成される実温度をさらに正確に測定することができる。
【００３４】
環境の温度は、たとえばこの環境に備えられた温度センサによって、好ましくは同時に記録される。このマイクロ環境の温度は通常、マイクロ環境を含む環境の温度を変更することによって変更される。得られたデータは、測定された環境温度を、所望のマイクロ環境温度および／または少なくとも１つの温度依存発光団の発光により測定される実際のマイクロ路環境の温度と比較するのに再び用いられる。
【００３５】
この第２の光学的温度検証手順から得られた情報は、所望の温度がマイクロ環境において正確に得られるように、必要に応じて装置の温度制御の適切な補償を行うのに用いられる。
【００３６】
本発明による方法のさらなる特徴および好ましい実施形態を以下にさらに詳細に説明する。
【００３７】
１つの実施形態によれば、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つの異なるサーモクロミック液晶が第１の光学的温度検証手順で用いられ、当該サーモクロミック液晶の少なくとも１つは、当該サーモクロミック液晶の少なくとも他の１つの発現温度と異なる特定の発現温度を有する。好ましくは、これらの異なるＴＬＣは、別々のマイクロ環境に設けられており、ただしここでこれらのマイクロ環境は同じ特性を有している。好ましくは、異なるサーモクロミック液晶の光学的特性は測定されている。異なるサーモクロミック液晶の数は、マイクロ環境における反応混合物の反応のためにこのマイクロ環境が制御される温度の数であってよい。これらの異なるサーモクロミック液晶の発現温度は、所望の校正温度に対応してよい。
【００３８】
好ましくは、３つの異なるサーモクロミック液晶が用いられ、それぞれのサーモクロミック液晶の光学的特性は、温度依存発光団の発光、好ましくは蛍光強度が、好ましくは同一の平衡状態で測定される。この異なるサーモクロミック液晶の数は、「マッピング」の確度を向上し、したがって、第２の光学的温度検証手順におけるこの温度依存発光団の発光に基づいたマイクロ環境の温度の測定の確度を向上する。１つの実施形態によれば、これらの用いられたＴＬＣの発現温度は、少なくとも１０℃異なり、好ましくは少なくとも１５℃異なる。
【００３９】
１つの好ましい実施形態においては、少なくとも３つのサーモクロミック液晶が用いられ、第１のサーモクロミック液晶は、４０℃〜６０℃の範囲、好ましくは４５℃〜５５℃の範囲にある発現温度を有し、第２のサーモクロミック液晶は、６５℃〜９０℃の範囲、好ましくは７０℃〜８０℃の範囲にある発現温度を有し、第３のサーモクロミック液晶は、８５℃〜９５℃の範囲にある発現温度を有する。好ましくは、３つのサーモクロミック液晶が用いられ、それぞれ約５０℃、約７０℃または７５℃、および約９０℃の発現温度を有する。１つ以上の同じタイプのＴＬＣが第１の光学的温度検証手順で用いられてよい。
１つ以上の同じタイプのＴＬＣの使用は、確度をさらに向上することができる。
【００４０】
温度が段階的に変化され、それぞれの段階で平衡状態が得られた時には、環境の空気の温度とマイクロ環境の液体の温度とは同じ値であると想定される。しかしながら温度制御が適切に動作するよう制御することは必須のことである。サーモクロミック液晶は、その光学的特性が突然変化する少なくとも１つの発現温度を備え、この変化は光学システムによって検出される。特定の発現温度を有する、適合したサーモクロミック液晶を選択した場合、この発現温度でのマイクロ環境内の温度依存発光団の発光、好ましくは蛍光強度を測定することが可能となる。１つの利点は、たとえば動的な温度プロファイル（たとえばＰＣＲプロファイル）が実施される第２の光学的温度検証手順において続けて用いられるのと同じマイクロ環境の設定／条件（たとえば用いられる反応容器、発光団を受容するために用いられる液体のタイプ、用いられる量、用いられる発光団の濃度等）で、この蛍光強度が測定できることである。さらに、この同じ設定は、好ましくはサーマルサイクラである装置で実施される実際の分析／反応で続いて用いられる、マイクロ環境での温度を測定するのに好適に用いられる。これに関しこの同じ設定／条件とは、光学的特性に大きな影響を与える条件および／またはパラメータであり、反応容器、好ましくは水溶液である用いられる液体、用いられる量等である。これにより、たとえば実温度と相関する温度依存蛍光色素の蛍光強度を測定することができ、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、さらに好ましくは少なくとも３つの実温度に対して蛍光強度の「マッピング」を行うことにより、これはさらに各々のマイクロ環境における正確な温度を温度制御が確定できるかどうかを分析するために用いることができる。このため、マイクロ環境の実際の温度は、このマイクロ環境がチャンバ内で回転されている場合であっても、非常に正確に測定することができる。この温度の測定の確度の改善は、１０％〜１５％と見積もられている。
【００４１】
好ましくは、この装置によって適合したマイクロ環境で普段処理される反応混合物の熱的特性を模倣する（emulates）、マイクロ環境における発光団のための設定が選択される。たとえば増幅反応を行う場合は、液体（通常は水溶液）がマイクロ環境で処理される。このため、それぞれの装置のために、液体あるいはたとえば水溶液で発光団を準備することが好ましい。この発光団、好ましくは蛍光団を含む液体サンプルは、このため温度の変化に伴う検出可能な変化を起こす特性を有する。好ましくは、温度に従って蛍光の連続的変化を起こす温度依存発光団として蛍光団が用いられ、これによってこの液体の蛍光に基づいて液体の温度を測定することができる。好適な例では、ピロニンＹのような蛍光色素を含む。マイクロ環境として、好ましくは装置が使用される時に普段用いられるのと同じ反応容器が用いられるが、これらの容器は同じ光学的または熱的特性を有している。さらに、好ましくは、温度依存発光団を含む液体の量は、普段マイクロ環境に設けられる反応混合物の量と等しく設定される。約１０μｌ〜約１００μｌが好ましく、１０μｌ〜５０μｌがさらに好ましい。反応混合物の量が異なる場合は、正確な結果が得られるようにするために、好ましくは別の検証が行われる。
【００４２】
温度依存発光団の蛍光強度およびサーモクロミック液晶の光学的特性は同じランにおいて、すなわち実質的に同時に、同じ条件および高い確度の「マッピング」を得るために、環境において同じ温度を維持しつつ測定される。１つの実施形態によれば、ＴＬＣの発現温度は、マイクロ環境における混合物の反応が行われる時の温度か、または温度の１つであり、あるいは少なくとも上記の温度に近い（たとえばもし発現温度が正確に反応温度と一致するＴＬＣが得られなかった場合、たとえば５℃〜１０℃の範囲内である。）。
【００４３】
好ましくは、発現温度で測定された蛍光強度が、今後の使用のため、この発現温度とともに記憶される。上述したように、この記憶された蛍光強度の値は、温度依存発光団の蛍光強度の温度に対する関数またはマップを計算するために用いられてよい。測定されて記憶された蛍光強度の値は、これらの値を参照することを可能とし、この蛍光強度の挙動を測定された値に合わせることを可能とする。
【００４４】
（複数の）サーモクロミック液晶の（複数の）発現温度、すなわち（複数の）実温度への蛍光強度のマッピングは、実温度に基づいた発光団の温度挙動を確定することを可能とする。こうして特定の実温度、すなわち発現温度において、具体的なマイクロ環境においてこの温度依存発光団がどのように振舞うかを正確に確定することができる。さらなるランにおいて、要求されている温度プロファイルの校正および検証が行われてよい。ここで、装置の温度制御が適切に動作しているかどうかが分析されてよい。たとえば、要求されているサーマルサイクル／プロファイルは、マイクロ環境における温度を制御するための装置で使用される環境において、通常の温度センサを用いて実行される。加えて、マイクロ環境において実際に達成される温度が、温度依存発光団を用いて確定され、この結果はたとえばディスプレイに表示されてよい。もしマイクロ環境における実際の温度が所望の温度（または小さな変動が許容されるのであれば、その温度範囲）に対応しない場合、適宜調整が行われてよい。たとえば、サーマルサイクル／プロファイルにおいて発光団を用いることによって確定される実際の温度は、表示されるだけでなく、マイクロ環境における（複数の）温度の最適化を達成するための環境において、温度センサによって設定されたプロファイルを変更するためにも用いられてよい。第２の光学的温度検証手順は、所望の正確な温度制御が達成されるまで繰り返されてよい。
【００４５】
好ましくは、互いに異なる温度依存性を有する２つの温度依存発光団の蛍光強度が測定され、ここでこれらの２つの温度依存発光団は別々のマイクロ環境に充填されている。これらのマイクロ環境は好ましくは同じ特性を有する。これらの２つの異なる温度依存発光団は、その温度依存性が異なっており、第１の温度依存発光団は、第２の温度依存発光団より高い温度感度を有する。
【００４６】
２つの異なる温度依存発光団を用いることで、温度の測定の確度が改善され、これよりチャンバのマイクロ環境において実行されるプロセスの有効性が改善される。１つの好ましい実施形態では、２つの発光団の１つは大きな温度変化特性を有するので温度変化に対して感度が高く、これに対しこの２つの発光団の他の１つは小さな温度変化特性を有するので温度変化に対して感度が低い。温度変化に対してより感度が高い発光団の蛍光強度は、アレニウスの式によって好適にモデル化されるのに対し、温度変化に対して感度の低い発光団の蛍光強度は、経験的な関係式でモデル化することができる。
【００４７】
こうして、１つの実施形態によれば、温度依存発光団の蛍光依存性を確定するために１つのモデルが用いられ、これは第１の温度依存発光団の場合には経験的な関係式
2014532854.tif 000003
であり、第２の温度依存発光団の場合にはアレニウスの式
2014532854.tif 000004
である。ここでＦＩ（Ｔ）はケルビンで与えられる温度Ｔであり、ＦＩ（Ｔｒｅｆ）はケルビンで与えられる基準温度Ｔｒｅｆにおける蛍光強度である。ｃ＝Ｅｎｒ／Ｒであり、ここでＥｎｒは無放射過程の活性化エネルギーであり、Ｒは気体定数である。
【００４８】
発光団の蛍光の温度依存性をモデル化するための適切な式を用いることにより、本方法はさらに改善される。
【００４９】
本方法の第１の手順において、２つ以上の発光団が用いられる場合には、異なる発光団のそれぞれの蛍光強度が、対象となる温度範囲の中央領域における温度に対して実質的に同じ値となるように、対象となる温度範囲の中央領域における温度での発光団の濃度が選択されることが好ましい。これは、高い信号対ノイズ比を得ることによって、蛍光の測定を改善し、したがって温度測定の確度を改善する。
【００５０】
１つの好ましい実施形態では、同じ温度での２つの異なる温度依存発光団の測定された蛍光強度の割合（高感度温度依存発光団／低感度温度依存発光団）が確定され、これは正確に再現可能な温度測定に関して改善をもたらすものであり、また照射および蛍光の検出に用いられる光学システムの変化に、すなわち光源および／または光電増倍管の温度に依存しない。したがって、本発明により示唆されたように、２つの異なる温度依存発光団の使用は検出システムのドリフトを除去することができる。光学的ドリフトは、温度測定での累積的な誤差となるので、これは極めて重要な利点である。このように、好ましくは蛍光色素である第２の発光団は、数学的手法を用いて、この光学システムのドリフトを補償することができる。たとえば、光学システムのドリフトを補償するための基準チャネルを備えていないサーマルサイクラーのような装置を使用した場合に、これはとりわけ有利である。
【００５１】
上述したように、好ましくは、（複数の）ＴＬＣの３つのセットの融点の同時測定が実行され、ここでそれぞれのＴＬＣは、異なる発現温度を有し、使用された少なくとも２つの温度感受性蛍光色素の蛍光強度がモニターされる。第２の光学的温度検証手順における実際のＰＣＲプロファイルの温度検証が開始される前に、上述した静的な第１の光学的温度検証手順が、サーモクロミック液晶を用いて行われる。３つの別々のポイントにおける実際の実温度があると、これに対応した色素の蛍光があれば、実温度に対するこれらの色素の相対的な蛍光の（最小二乗法的な観点での）マッピングを行うことができる。基準温度Ｔｒｅｆ．は、好ましくは６５℃と８０℃の間の温度の範囲の中央で選択され、好ましくは７０℃と８０℃の間であり、最も好ましくは約７５℃である。
【００５２】
好ましくは、実質的に同じ光学的特性を有する２つの異なる温度依存発光団が用いられて、温度測定の確度が改善される。「光学的特性」なる用語は、実質的に同じ発光スペクトル並びに吸収スペクトルを有するものとして理解されべきであり、これより特定のウィンドウを有するフィルターが、２つの異なる発光団の両方に適合して使用することができる。
好ましくは、両方の発光団の発光／吸収スペクトルにおけるピークの波長は、５０ｎｍの範囲内にあり、好ましくは２５ｎｍの範囲内にあり、最も好ましくは１５ｎｍの範囲内にある。したがって、これら２つの発光団の励起スペクトルおよび発光スペクトル、また同様にフィルターで決まるウィンドウ内のこれらの相対的な位置は、できる限り一致しなければならない。
【００５３】
特に発光団の温度係数は、その温度感受性を示している。他の発光団より高い温度感受性を有する発光団の温度係数の絶対値は、他の発光団の温度係数の絶対値より大きい。高い温度感受性を有する発光団の温度係数の絶対値は、少なくとも２．５％／℃であってよく、少なくとも３％／℃であってよく、少なくとも４％／℃であってよく、少なくとも４．５％／℃であってよく、または少なくとも５％／℃であってよい。高い温度感受性を有する発光団の温度係数の絶対値は、２．５％／℃、好ましくは４．５％／℃から７．５％／℃であってよく、さらに大きな温度係数であっても好適である。低い温度感受性を有する発光団は、好ましくは２．５％℃以下であり、２％／℃以下であり、１．５％／℃以下であり、または１％／℃以下の絶対値の温度係数を備えることが好ましい。低い温度感受性を有する発光団の温度係数の絶対値は、０．３％／℃から２．５％／℃の範囲であってよく、これよりさらに小さな値であってもよいが、蛍光強度の変化は検出限界より大きくなければならない。さらに好ましくは、２つの発光団の温度感受性は、それぞれの発光団の温度係数の比に関係している。高い温度感受性を有する発光団の温度係数と低い温度感受性を有する発光団の温度係数との比は、１つの実施形態によれば、少なくとも１．５であり、好ましくは少なくとも２．０であり、さらに好ましくは少なくとも２．５であり、最も好ましくは少なくとも３．０である。
【００５４】
非常に感受性のある温度依存発光団として、好ましくは、ピロニンＹが用いられる。ピロニンＹは、約−５．５％／℃の温度係数を有する。感受性の低い温度依存発光団として、好ましくはＡｔｔｏ５３２が用いられる。Ａｔｔｏ５３２は、約−１．４％／℃の温度係数を有する。しかしながら、他の温度依存発光団を用いてもよく、好ましくは温度依存蛍光色素が用いられてよい。たとえば、ＨＥＸ（6-carboxy-2',4,4'5',7,7'-hexachlorofluorescein）が、感受性の低い温度依存蛍光色素として用いられてよい。これは約−０．５％／℃より小さい温度係数を有する。それぞれの色素は、たとえばLiuとSullivanの著書“Temperature Sensitive Paints”，２００４（ＩＳＢＮ−１０：３５４０２２２４１３）に記載されている。
【００５５】
１つの実施形態によれば、上記のサーモクロミック液晶は、１つのマイクロ環境において発光団と組み合わせて用いられる。１つの好ましい実施形態においては、サーモクロミック液晶は、光学システムの光路に関して、少なくとも部分的に上記の発光団の前または後に位置される。それぞれのサーモクロミック液晶／発光団の組合せの使用は、サーモクロミック液晶／発光団の組合せの発光が鋭く変化することで、いつマイクロ環境内でサーモクロミック液晶の発現温度に到達したか感度良く示すために用いられる。それぞれのサーモクロミック液晶／発光団の組合せは、たとえばＷＯ０３／１０２５２２に記載されている。本発明においては、このような組合せは、１つ以上の温度依存発光団と組み合わせて用いられる。上述したように、この１つ以上の温度依存発光団は、好ましくは放出された発光（これは温度に依存する）に基づいてマイクロ環境における温度を測定するためにも用いられ、以下に説明するように、別々のマイクロ環境、とりわけ別々の反応容器に設けられる。この構成を用いて、同じ光学部品、すなわち特にフィルターが、温度依存発光団の蛍光強度を測定する時に用いられてよい。このような構成を用いると、光学システムの他のチャネルに切り替える必要が無い。好ましくは、サーモクロミック液晶は、マイクロ環境としてバイアルまたはチューブのような反応容器に収容され、この反応容器は発光団でコーティングされる。この発光団は、使用された温度依存発光団の１つと同一のものである必要は無い。この使用される発光団は、さらに温度依存である必要も無い。しかしながら、簡単のため、蛍光強度を測定するために用いられるのと同じ温度依存発光団が用いられてよい。チューブまたはバイアルは、外側または内側から発光団でコーティングされてよい。この発光団は、通常プラスチックで出来ている容器またはバイアルの製造の際に、射出成型によってバイアルまたはチューブの壁に取り込まれていてもよい。もう１つの実施形態によれば、ストークスシフトを生成するインサートを含まないＴＬＣ用に、透明な反応容器またはバイアルが用いられる。ここでたとえば赤色ＬＥＤ（６２５ｎｍ）および６１０ｈｐフィルタのような長波長側に広い通過ウィンドウを有するフィルタを用いることが好ましい。それぞれの設定は、たとえば蛍光色素ピロニンＹ、およびＡｔｔｏ５３２または同様な励起および放出特性を有する温度依存蛍光色素と共に用いられたものであってよい。
【００５６】
好ましくは、第１の光学的温度検証手順のステップｃ）において、開始ポイントと終了ポイントとを有する温度プロファイルを用いて温度が変化され、開始ポイントと終了ポイントの間の加熱の刻み幅は１℃より小さく設定され、好ましくは約０．１℃〜０．２℃に設定され、各刻み幅での保持時間は１０秒より大きく設定される。好ましくは、この保持時間は、約２０秒に設定され、最も好ましくは約３０秒に設定される。１つの実施形態によれば、ステップｃ）における温度変化は、約０．１℃の増加で行われる。開始ポイントおよび終了ポイントは、好ましくはＴＬＣの公称融点の約±２．５℃、好ましくは±１．５℃に設定される。この校正中の「穏やかな」温度プロファイルは、ほぼ定常状態あるいは平衡状態の測定をもたらし、これはさらに校正処理および温度測定を改善する。
【００５７】
１つの実施形態によれば、第２の光学的温度検証手順のステップｂ）においては、動的な温度プロファイルが実行され、この温度プロファイルは、数個の異なる温度段階を含み、これらの温度段階の少なくとも１つは、少なくとも１つのサーモクロミック液晶の発現温度と異なっている。以上で説明したように、それぞれの動的温度プロファイルは、ＰＣＲプロファイルに対応してよい。
【００５８】
１つの実施形態によれば、他の測定された蛍光強度に対して、同様な測定を含むように、および／または％で与えられる閾置を超えるような測定を無視するようにして、マイクロ環境の測定を平均することによって、蛍光強度の誤った測定の影響が低減される。
【００５９】
１つの好ましい実施形態によれば、１つ以上の異なるサーモクロミック液晶および１つ以上の異なる温度依存発光団が、別々のマイクロ環境に設けられる。このように、それぞれの異なる化合物／部材が、別々のマイクロ環境に含まれる。それぞれの（複数の）温度依存発光団および異なる（複数の）ＴＬＣを複数のセットで設けることが好ましい。これはまた確度を改善する。好ましくは、加熱装置のロータに配設される場合は、（複数の）ＴＬＣはグループにまとめられて、（複数の）温度依存発光団と、交互に設定される。
【００６０】
好ましくは、第１の光学的温度検証手順が実行された後で、第２の光学的温度検証手順が実行される前に、（複数の）サーモクロミック液晶が除去される。上述したように、第１の光学的温度検証手順は、穏やかな温度プロファイルを用いて実行される。しかしながら、第２の光学的温度検証手順においては、たとえばＰＣＲプロファイルのような、それぞれの装置に対して実際的な温度プロファイルが用いられる。これはＴＬＣの寿命の大幅な低下をもたらし得る。このため、好ましくは、ＴＬＣは第１の光学的温度検証手順でのみ用いられ、用いられた温度依存発光団（好ましくは上述のように２つの発光団が用いられ、割合が規定される）の発光が、このＴＬＣによって示される実温度に対してマッピングされる。この後、第２の光学的温度検証手順において、これらは取り外されて、たとえば水によって置き換えられる。
【００６１】
上述したように、好ましくはマイクロ環境は、反応容器であり、それぞれ上述したように反応容器内に収容された液体に対応している。
【００６２】
本発明の装置は好ましくはサーマルサイクラーである。以上より、本装置はとりわけ核酸増幅のためのサーマルサイクラーに向けた装置であることが分かる。ここで反応容器は、チャンバ内に回転可能に取り付けられた、回転可能な円形カルーセルに支持されている。この装置で使用される、とりわけ好ましいサーマルサイクラーはキアゲン  ゲーエムベーハー（Ｑｉａｇｅｎ  ＧＭＢＨ、www.qiagen.com）で製造販売されているＲＯＴＯＲ-ＧＥＮＥ(登録商標）製品群であり、最も好ましくは、ＲＯＴＯＲ-ＧＥＮＥ  Ｑである。他の類似の装置は、国際出願公開ＷＯ９２／２０７７８およびＷＯ９８／４９３４０に開示されている。しかしながら、他の市販のサーマルサイクラーも変更されて上述のように動作することが理解されるであろう。
【００６３】
サーマルサイクラー内に既に設けられている光学システムは、温度依存発光団の蛍光強度、および少なくとも１つのサーモクロミック液晶の光学的特性を正確に測定するのに用いられる。したがって、本発明による方法を実行するために用いられる光学システムは、この装置（好ましくはサーマルサイクラー）に設けられた光学システムであり、マイクロ環境に収容される反応混合物における指示薬の色に基づいて反応の状態を識別するためのものである。この光学システムは、ＬＥＤのような照明光源を含んでよく、また、反射された照射光を検出するための光電増倍管のような、適合した光学検出器を含んでよい。
【００６４】
本発明の第２の態様によれば、本発明は、サーマルエアサイクラの温度制御の検証および校正用のシステムを提供し、このシステムは、マイクロ環境用のレセプタクルを含むローターを備え、このローターはマイクロ環境に以下のものを含む。
ａ）それぞれのサーモクロミック液晶が異なる発現温度を有する、２つ以上の異なるサーモクロミック液晶。
ｂ）１つ以上の温度依存発光団。
【００６５】
それぞれのシステムの詳細、とりわけマイクロ環境、ＴＬＣ、温度依存発光団については、上記に詳述されているが、それぞれの開示内容はここでも適用される。したがって、以下では幾つかの特別な点のみについて説明する。好ましくは、異なる実温度で発光を測定するために使用される、異なるサーモクロミック液晶および１つ以上の温度依存発光団は、異なるマイクロ環境、すなわち別々のマイクロ環境に設けられる。上述したように、これらはしかしながら、それぞれ１サイクルで測定される。たとえば使用されたそれぞれのサーモクロミック液晶および異なったそれぞれの温度依存発光団は、ローターの別々のレセプタクルに設置された別々の反応容器に設置される。実施形態を例として示す。好ましくは、本発明のシステムは、その温度依存性が異なった、２つの異なる温度依存発光団を備える。第１の温度依存発光団は、第２の温度依存発光団より高い温度感受性を有する。これらの２つの異なる温度依存発光団は、好ましくは、特にその励起および放出の特性に関し、実質的に同じ光学的特性を有する。好ましくは、発光団としてピロニンＹが含まれている。異なるサーモクロミック液晶の発現温度は、好ましくは少なくとも１０℃異なっており、好ましくは少なくとも１５℃異なっている。上述したように、好ましくは３つの異なったＴＬＣが用いられる。これらの特性は上述の通りである。それぞれのシステムは、第１の態様による方法で使用することができる。
【００６６】
本発明の第３の態様によれば、本発明は、マイクロ環境において設定される温度を確実にするための装置の温度制御の分析のための光学的方法に関し、ここでその温度依存性が異なる、少なくとも２つの異なる温度依存発光団が、光学システムの光学ドリフトを補償するために、また同じ温度における第１の温度依存発光団の蛍光強度と第２の温度依存発光団の蛍光強度の割合を測定するために用いられる。第１の温度依存発光団は、第２の温度依存発光団より高い温度感受性を有する。上述したように、これらの２つの異なる温度依存発光団は、好ましくは、特にその励起および放出の特性に関し、実質的に同じ光学的特性を有する。その温度依存性の異なる２つの温度依存発光団の測定の詳細は、上記に詳述されているが、それぞれの開示内容はここでも適用される。
【００６７】
本発明は、ここで開示された方法および内容に限定されない。数値範囲は、この範囲を規定する数値を含むものである。ここで示す表題は、本発明の実施形態の様々な態様を限定するものでなく、明細書全体に対する参考として理解されるものである。１つの実施形態によれば、ここで記載された対象物は、方法の場合においては所定のステップを備えたものであり、あるいはこれらのそれぞれのステップからなるものに用いられる所定の部品を備えたものであり、あるいは部品である。ここに記載された好ましい実施形態を選択および組み合わせることが好ましく、好ましい実施形態のそれぞれの組み合わせからなる特定の対象物もまた本願発明の開示内容に属するものである。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
本発明の実施例を、これに付随する以下の図を参照して説明する。
【図１】マイクロ環境の温度を検出し、また適宜制御するための装置の概略図を示す。
【図２】温度依存発光団の、温度に対する蛍光強度を概略的にプロットした図を示す。
【図３】互いに異なる温度依存性を有する２つの温度依存発光団の、温度に対する蛍光強度を概略的にプロットした図を示す。
【図４】第１の温度依存発光団の蛍光強度を第２の温度依存発光団の蛍光強度で除算したものを、温度に対して概略的にプロットした図を示す。
【図５】マイクロ環境に収容されるサーモクロミック液晶の概略図を示す。このマイクロ環境は、発現温度の検出を容易にするために蛍光色素が塗布されている。
【図６】それぞれのマイクロ環境の内容を概略的に示すロータ配置のテーブルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
図１は、サーマルサイクリング処理の際のバイアルまたはチューブに収容された液体の温度を検出し、また適宜制御するための装置１の概略図を示す。この装置１はＰＣＲサイクラーまたはサーマルサイクラーの一部であってよい。
【００７０】
この装置１は、環境を確立し、反応混合物のような液体４を収容できるマイクロ環境３としての少なくとも１つの反応チャンバを含む、チャンバ２を有する。この装置１は、通常、コントローラ５を有する。このコントローラは、たとえば加熱器６および冷却器７が接続された処理装置である。加熱器６は、通常対流ヒータあるいはこれと同様なものであり、チャンバ２内の空気を加熱するように構成されている。チャンバ２の加熱／冷却は、マイクロ環境３の温度に影響を与え、したがって液体４の温度に影響を与える。冷却器７はファンであってよい。チャンバ２内には、コントローラ５に接続された温度センサ８が配設されている。この温度センサ８を用いて、チャンバ２の内側の空気の温度をコントローラ５によって感知することができる。さらに、このコントローラ５は、加熱器６および冷却器７が動作するように接続されている。
【００７１】
稼働中は、コントローラ５は通常この装置が制御されるような命令を実行する。ここで、通常、ユーザは必要とする温度プロファイルを含む、所望のサーマルサイクリング処理を選択する。これによりコントローラ５は、命令を取得し、装置１を制御することによって、装置１が選択されたサーマルサイクリング処理を実行することができる。
【００７２】
マイクロ環境３は、回転可能なロータ９のレセプタクルに配設されたチューブまたはバイアルによって形成され、このロータ９は、６０個または７２個のそれぞれの数のチューブまたはバイアル、すなわちマイクロ環境３を収容するレセプタクルを備える。
【００７３】
ロータ９は、ロータ９のレセプタクルに収容されている幾つかのマイクロ環境３の交換を速やかにかつ容易に行うセグメントを備える。モータ１０が設けられており、これによってロータ９を回転することができる。
【００７４】
コントローラ５は、テーブルが格納されたメモリにアクセス、すなわち読み書きし、コントローラはこのテーブルに基づいてロータ９のレセプタクルに収容されたマイクロ環境３の内容物を確認することができる。
【００７５】
検査のためにそれぞれのマイクロ環境３は、このマイクロ環境３およびその内容物が光源１１によって照射され得るような位置でロータ９を回転して設置される。この光源は好ましくはチャンバ２の外側に配設されたＬＥＤである。この光源１１から放出された光は、チャンバ２内の光路にあるフィルタ１２を通過する。光強度を波長の関数として検出するために、光検出器１３がチャンバ２の外側に設けられている。この検出器１３は、フィルタおよび光電子増倍管を備えてよい。この検出器１３は、測定された蛍光強度を受信するため、および検出器１３のゲインを設定するために、コントローラに接続されて作動する。
【００７６】
特に所定の濃度の水溶液の形態での温度依存発光団をマイクロ環境３が含む場合、コントローラ５がロータ９を回転させると、それぞれの位置で、マイクロ環境３内の温度依存発光団を光源１１によって照射することができる。マイクロ環境３内の温度依存発光団を照射すると、放出された蛍光強度を検出器１３によって検出することができる。
【００７７】
温度センサ８の信号を用いて、チャンバ２内の温度センサ８によって感知された温度を、マイクロ環境３の蛍光強度が測定されるのと同時に得ることができる。こうしてチャンバ２の温度に対するマイクロ環境３内の温度の相関が測定される。
【００７８】
さらに、この蛍光強度は、特定の温度依存発光団の温度の関数として、コントローラ５がアクセス可能なメモリ内のテーブル（またはモデルまたは関数）に格納され、検出器１３での蛍光強度の測定の際に、このコントローラ５がアクセス可能な温度依存発光団の格納されたテーブルまたはモデルに基づいて、マイクロ環境３内の温度を確定することができる。
【００７９】
図２には、温度依存発光団の、温度に対する蛍光強度をプロットした例が示されている。蛍光強度は、この蛍光強度が測定された時の温度を明瞭に示すことが分かる。このようにして、検出器１３を用いて、発光団によって放出される蛍光強度を測定することにより、温度依存発光団の温度を確定することができる。
【００８０】
互いに異なる温度依存性を有する２つの温度依存発光団が、２つのそれぞれのマイクロ環境３、すなわち所定の濃度のそれぞれの発光団の水溶液で満たされた、ロータ９における少なくとも２つのバイアルまたはチューブにおいて用いられる場合、これら２つの温度依存発光団のそれぞれの蛍光強度を測定することができる。それぞれのマイクロ環境３の内容物を確認することができるテーブルに基づいて、これらの温度依存発光団の蛍光強度を得ることが可能となる。
【００８１】
互いに異なる温度依存性を有する２つの温度依存発光団を用いて、蛍光強度の差分を用いた際に光学システムのドリフトを補償することが可能となる。これは、互いに異なる温度依存性を有する２つの温度依存発光団の、温度に対する蛍光強度をプロットした図３に示されている。単独の発光団の絶対蛍光強度を用いるのでなく、２つの異なる温度依存発光団を用い、これら２つの温度依存発光団の蛍光強度の差分を用いることによって、マイクロ環境３の温度が確定される。蛍光強度の差分として、これら２つの異なる温度依存発光団の蛍光強度の割合が用いられてよい。
【００８２】
しかしながら、実際のＰＣＲプロファイル温度検証が開始される前に、サーモクロミック液晶を用いて、静的な光学的温度検証が行われてよい。これは実温度測定を可能とし、この温度測定の確度を改善することを可能とする。
【００８３】
光学的温度検証に用いられる、異なるサーモクロミック液晶の数は、蛍光強度がマッピングされ得る実温度の数を増加させる。３つの異なるサーモクロミック液晶が用いられる場合、これは３つの別々の温度での実温度測定を可能とする。
【００８４】
好ましくはこれらのサーモクロミック液晶は、これらの液晶の発現温度が、対象となる処理のプロセス／ステップに必要な特定の温度に等しいかまたは近いように選択され、この特定の温度がマイクロ環境３における処理のプロセス／ステップの間維持される。装置１がＰＣＲサイクラーである場合、約５０℃、約７５℃、および約９０℃の融点を有する、少なくとも２つの異なるサーモクロミック液晶が用いられてよい。
【００８５】
実際の実温度を得るために、サーモクロミック液晶の光学的特性が測定される。同時に温度依存発光団の蛍光強度がモニターされ、この実温度に対してマッピングされる。３つの別々のポイントにおける実際の実温度があって、これに対応して、マイクロ環境３の液体４における温度依存蛍光色素の蛍光強度があれば、実温度に対して、この温度依存蛍光色素３の相対蛍光強度の（最小二乗法的な観点での）マッピングを行うことができる。
【００８６】
液体４すなわちマイクロ環境３の液体４内の温度依存発光団の測定された蛍光強度は、以下のようなパラメータの関数として考察される。
ＦＩ（Ｔ，ｃｄｙｅ，ｃｉｏ，ｇ（ｔ））
ここでＴは発光団の水溶液を収容するマイクロ環境３の温度である。ｃｄｙｅは、この水溶液中の色素濃度であり、時間に対し不変であるとみなされる。ｃｉｏは、マイクロ環境３に関しては定数であり、光がマイクロ環境３にどの程度効率良くカップリングされ、またデカップリングされるかを表わす。この定数ｃｉｏは時間に対し不変であるとみなされる。ｇ（ｔ）は、時間の関数である、光源１１と検出器１３の光電増倍管とからなる検出システム全体の「ゲイン」である（実際のゲインは、主に光源１１の温度によって影響を受ける。しかしながら、光源１１および光電増倍管の実際の温度は取得できない。）。
【００８７】
２つの異なる温度依存発光団を用いた校正処理によって、測定に影響する時間依存の（検査期間に渡り変化する）、かつ時間依存の因子を分離することができる。時間依存の項は除算によって消去される。こうして、この校正処理で、時間に依存しない因子ｃｄｙｅおよびｃｉｏが、図４に概略的に示す曲線に対して正しくマッピングされる。図４は、温度感受性の高い色素（ピロニンＹ）の蛍光強度を温度感受性の低い発光団（Ａｔｔｏ５３２）の蛍光強度で除算した結果を概略的に示す。
【００８８】
異なる温度依存性を有する２つの温度依存発光団が用いられた場合の測定値の取得は、これらの異なる温度依存性を有する２つの温度依存発光団に対して測定された蛍光強度の比較が行えるように、これら２つの発光団のそれぞれに対して同じゲイン設定で行われなければならない。
【００８９】
ロータ９は、幾つかのレセプタクルを備えているので、温度依存発光団を収容したマイクロ環境３の１つのみで、その蛍光を測定するのでなく、同じ温度依存発光団を殆ど同じ濃度および量で収容する多数のマイクロ環境３を測定することが好ましい。特定の温度依存発光団を特定の濃度で含む多数のマイクロ環境３を平均することで、信号対ノイズ比が改善されることになる。
【００９０】
７２個のレセプタクル、およびこれより７２個のバイアル／チューブ／マイクロ環境３が用いられる場合、以下のようなロータ構成が用いられる。３０個のマイクロ環境３は、互いに異なる温度依存性を有する２つの温度依存発光団の内の第１の発光団を用いて充填され、他の３０個のマイクロ環境３は、互いに異なる温度依存性を有する２つの温度依存発光団の内の第２の発光団を用いて充填される。好ましくは、これらの発光団は、これらのマイクロ環境３において交互に充填される。同じ発光団を有する３０個のマイクロ環境３の測定は、信号対ノイズ比を
2014532854.tif 000005
だけ改善する。
【００９１】
実質的に同じ内容物の温度依存発光団を有する少なくとも２つ以上のマイクロ環境３を用いることで、測定された蛍光強度を平均することができ、測定で生じる誤差が極小となる。実質的に同じ内容物の温度依存発光団を有する少なくとも３つ以上のマイクロ環境３を用いることで、他の測定のそれぞれの蛍光強度に対して％で与えられた所定の閾置を超える測定を除外することができ、誤差を極小とすることができる。
【００９２】
互いに異なる温度依存性を有する２つの異なる温度依存発光団として、ピロニンＹおよびＡｔｔｏ５３２が用いられる。２つの色素の励起および放出スペクトルはこれらの相対位置と共に、検出器１３内のフィルターあるいはフィルター１２のウィンドウに良く一致する。５３０±２ｎｍの中心波長および１０±２ｎｍの半値幅を有する励起フィルターを用いてよい。５５７±２ｎｍの中心波長および１０±２ｎｍの半値幅を有する放出フィルターを用いてよい。このため、装置１がＰＣＲサイクラーの場合、ＰＣＲサイクラーの黄色のチャネルを用いることができる。
【００９３】
光路内の（複数の）フィルターで与えられるウィンドウ内で「一致する」励起／放出スペクトルおよび相対位置を有する２つの異なる温度依存発光団を用いることにより、このフィルターを２つの異なる温度依存発光団の双方の測定に適合して用いることができるので、良好な信号対ノイズ比を得ることができる。
【００９４】
図５に概略的に示すマイクロ環境３が用いられた場合、ロータ９に収容された他のマイクロ環境３に含まれる温度依存発光団の蛍光強度を測定するために用いられる光学システムを用いて、ＴＬＣ１４の発現温度を正確に測定することができる。図５に示すマイクロ環境３は、５３０ｎｍ（緑色励起）から５５７ｎｍ（黄色検出）への周波数シフトを行うための、適合したそれぞれの発光団１５で塗布されている。図５に示すマイクロ環境３を照射し、チャンバ２を加熱した際に、検出器１３の出力をモニターすることにより、いつマイクロ環境３に含まれているＴＬＣ１４の光学的特性が発現温度で突然変化するかを確定することができる。
【００９５】
しかしながら、６２５ｎｍ付近の波長の光を放出する赤色ＬＥＤの光源１１および長い波長側へ広く開放されたフィルター（６１０ｈｐ）の関連で、透明なマイクロ環境３が用いられてよい。
【００９６】
これらのＴＬＣを含むマイクロ環境３は、温度依存発光団を含むマイクロ環境から分離されていなければならない。光学的温度検証は、「穏やかな」溶融温度プロファイルを用いて行われる。オーバーシュートを有する実際のＰＣＲプロファイルの使用は、これらのＴＬＣの寿命を大幅に低減する。したがって、これらのＴＬＣは、２つの温度依存発光団、すなわちピロニンＹおよびＡｔｔｏ５３２から測定された蛍光強度の、少なくとも１つの温度依存発光団を用いた実温度へのマッピングを行う最初にのみ使用される。マッピングの後で、これらのＴＬＣを有するマイクロ環境３は、空のマイクロ環境３／チューブ／バイアルから成るロータセグメントと交換されてよい。次に第２の光学的温度検証手順が、温度依存発光団のみを用いて行われる。
【００９７】
図６は、ロータ配置、すなわちマイクロ環境３用の７２個のレセプタクルを有するロータ９のマイクロ環境の内容物の例である。ＴＬＣ１は約５０℃で融解するＴＬＣを示し、ＴＬＣ２は約７５℃で融解するＴＬＣを示し、ＴＬＣ３は約９０℃で融解するＴＬＣを示し、ＦＤ１は第１の温度依存発光団を示し、ＦＤ２は第２の温度依存発光団を示す。１８番目から６９番目のマイクロ環境には温度依存発光団ＦＤ２とＦＤ１とが交互に設けられている。
【００９８】
３つの別々のポイントでの実際の実温度を用い、またこれに対応したこれらの温度依存発光団の蛍光を用いることにより、実温度に対するこれらの温度依存発光団の相対的な蛍光強度をマッピングすることができる。
【００９９】
この蛍光強度の温度依存性は、アレニウスの式によっても以下のようにモデル化することができる。
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ここでＦＩ（Ｔ）は、ケルビンで与えられた温度Ｔにおける蛍光強度であり、ＦＩ（Ｔｒｅｆ）はケルビンで与えられた（および対象範囲の温度に選択された）温度Ｔｒｅｆにおける蛍光強度である。ｃはＥｎｒ／Ｒであり、ここでＥｎｒは無放射過程の活性化エネルギーであり、Ｒは気体定数である。Ｔｒｅｆはケルビンで測定された基準温度であり、Ｔはケルビンで測定された温度である。ＰＣＲサイクラーが装置１である例においては、Ｔｒｅｆは好ましくは７５℃に設定される。このアレニウスの式はピロニンＹに対し最も良好に適合する。あるいは、この蛍光強度の温度依存性は、以下の近似を用いた単純なヒューリスティックな手法でモデル化することができる。
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ここでｆは多項式、指数関数、または他の関数である。Ａｔｔｏ５３２の量子収率は、ピロニンＹの１つよりも遥かに温度感受性が低く、このためＡｔｔｏ５３２は、単純なヒューリスティックな手法でモデル化される。
【０１００】
「光学的ドリフトが補償された」蛍光強度、すなわちＡｔｔｏ５３２の蛍光強度で除算したピロニンＹの蛍光強度（図４に概略的に示す）は以下の式でモデル化される。
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ここでＴｒｅｆ＝３４３．１５Ｋ，ａ＝０．９９５９，ｂ＝４５９７．７，ｃ＝３８５．１９０，およびｄ＝１４８７．８である。
【０１０１】
たとえばＬＥＤのような光源１１の温度の独立した測定ができない場合、たとえばＰＣＲサイクラーのような環境２が用いられた場合であっても、異なる温度感受性を有する２つの発光団の使用は、光学的／検出システムにおけるいかなるドリフトも補償することを可能とする。
【０１０２】
次に、ＰＣＲサイクラー、特にキアゲン  ゲーエムベーハー (Ｑｉａｇｅｎ  ＧＭＢＨ、www.qiagen.com)で製造販売されているＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ（登録商標）のＰＣＲサイクラー、最も好ましくはＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑにおける温度プロファイルの熱的検証（校正）の詳細な操作の説明を行う。
【０１０３】
１）３つのサーモクロミック液晶の公称融点が、ユーザによって入力されるか、またはコントローラ５で実行されるソフトウェアがローター９のシリアル番号（ユーザにより入力される）からこれらの公称融点を取得する。
【０１０４】
２）ユーザは発光団を含むロータ９のセグメントをロータ９に設置する。ピロニンＹおよびＡｔｔｏ５３２を用いた場合には、Ｐｙ−Ｙ−／Ａｔｔｏセグメントが用いられてよい。
【０１０５】
３）ユーザは、サーモクロミック液晶を備えたロータ９のセグメントをロータ９に設置する。
【０１０６】
４）ユーザは、マイクロ環境３においてどの温度がモニター／評価されるべきなのか選択するようプロンプトを受け取る。
【０１０７】
５）ユーザは以下のような校正処理（サーモクロミック液晶の融点で与えられる実温度に対する、測定された２つの発光団の相対的蛍光強度の初期マッピング）を開始する。
−ソフトウェアは、ピロニンＹを含むマイクロ環境３／チューブで選択されたプロファイルにおいて生じる最も低い温度で、黄色チャネルでの自動ゲイン校正を実行する。目標蛍光値（すべてのピロニンＹを含むマイクロ環境３の平均）は、任意単位で９０±５の蛍光強度であり、これに対応するゲインが記憶される。
−ソフトウェアは、標準の光学的温度検証（ＯＴＶ）処理の中温（約７５℃）における前処理を行う。
−ソフトウェアは、「ストークスシフトを用いない」赤色チャネル（すなわち６２５ｎｍのＬＥＤ／発光フィルタ６１０ｈｐ）で自動ゲイン校正を行う。約７５℃の融点を有するＴＬＣを備えたマイクロ環境３の目標蛍光値（対応するＴＬＣを含むマイクロ環境３の平均）は、任意単位で５０±５の蛍光強度である。これに対応するゲインが記憶される。
−ソフトウェアは、中温のサーモクロミック液晶の公称融点（約７５℃）付近（±１．５℃）の融解プロファイルを開始する。０．２℃の刻みで、保持時間はそれぞれ３０秒である。融解プロファイルは、黄色チャネルおよび赤色「非ストークスシフト」チャネルの２つのデータ取得を含む。
−ソフトウェアは、標準のＯＴＶ処理の最高温（約９０℃）における前処理を行う。
−ソフトウェアは、「ストークスシフトを用いない」赤色チャネル（すなわち６２５ｎｍのＬＥＤ／発光フィルタ６１０ｈｐ）で自動ゲイン校正を行う。約９０℃の融点を有するＴＬＣを備えたマイクロ環境３の目標蛍光値（対応するＴＬＣを含むマイクロ環境の平均）は、任意単位で５０±５の蛍光強度である。これに対応するゲインが記憶される。
−ソフトウェアは、高温サーモクロミック液晶の公称融点（約９０℃）付近（±１．５℃）の融解プロファイルを開始する。０．２℃の刻みで、保持時間はそれぞれ３０秒である。
融解プロファイルは、黄色チャネルおよび赤色「非ストークスシフト」チャネルの２つのデータ取得を含む。
−ソフトウェアは、標準の光学的温度検証（ＯＴＶ）処理の最低温（約５０℃）における前処理を行う。
−ソフトウェアは、「ストークスシフトを用いない」赤色チャネル（すなわち６２５ｎｍＬＥＤ／発光フィルタ６１０ｈｐ）で自動ゲイン校正を行う。約５０℃の融点を有するＴＬＣを備えたマイクロ環境３の目標蛍光値（対応するＴＬＣを含むマイクロ環境の平均）は、任意単位で５０±５の蛍光強度である。これに対応するゲインが記憶される。
−ソフトウェアは、中温のサーモクロミック液晶の公称融点（約５０℃）付近（±１．３℃）の融解プロファイルを開始する。０．２℃の刻みで保持時間はそれぞれ３０秒である。融解プロファイルは、黄色チャネルおよび赤色「非ストークスシフト」チャネルの２つのデータ取得を含む。
−これら３つのＴＬＣの融点が測定される。これに対応した、２つの発光団（ピロニンＹおよびＡｔｔｏ５３２）を有するマイクロ環境３の蛍光強度がこれらのＴＬＣの公称融点と共に用いられて、所定のモデルの挙動が現状のセットアップに合わせられる。
【０１０８】
６）ユーザは、これらのＴＬＣを有するマイクロ環境３を備えたロータ９のセグメントを水で満たされたマイクロ環境３または空のマイクロ環境３に交換するよう、プロンプトを受け取る。
【０１０９】
７）ユーザは要求されたユーザ動作を承認する。
【０１１０】
８）ソフトウェアは、連続的な黄色チャネルの測定を有するプロファイルの実行を開始する。このプロファイルで規定されている通常の測定は、延長された保持時間（４秒）に置き換えられている。
【０１１１】
９）黄色チャネルでの連続測定が実温度に対してマッピングされる。タイムスタンプと測定温度からなる列が記憶される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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