(57)【要約】本発明は、少なくとも2つのfabフラグメントを含み、Fcドメインを欠いている二重特異性抗体であって、第一のFabフラグメントが、第一の抗原に特異的な少なくとも1つの抗原結合部位を含み、かつ第二のFabフラグメントが、第二の抗原に特異的な少なくとも1つの抗原結合部位を含み、第二のFab重鎖の可変領域と第二のFab軽鎖の可変領域とが交換されているかまたは第二のFab重鎖の定常領域と第二のFab軽鎖の定常領域とが交換されているかのいずれかである二重特異性抗体、その産生方法、該抗体を含む薬学的組成物、ならびにそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも2つのfabフラグメントを含み、Fcドメインを欠いている二重特異性抗体であって、
第一のfabフラグメントが、第一の抗原に特異的な少なくとも1つの抗原結合部位を含み、かつ
第二のfabフラグメントが、第二の抗原に特異的な少なくとも1つの抗原結合部位を含み、第二のFab重鎖の可変領域と第二のFab軽鎖の可変領域とが交換されているかまたは第二のFab重鎖の定常領域と第二のFab軽鎖の定常領域とが交換されているかのいずれかである、
二重特異性抗体。
【請求項２】
第三のfabフラグメントをさらに含む、請求項1記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
第三のfabフラグメントが、第一または第二の抗原に特異的な少なくとも1つの抗原結合部位を含む、請求項2記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
第三のfabフラグメントが、第一の抗原に特異的な少なくとも1つの抗原結合部位を含む、請求項2記載の二重特異性抗体。
【請求項５】
第三のfabフラグメントが、第一のfabフラグメントに接続されている、請求項2〜4のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
【請求項６】
第三のFabフラグメントのC末端が、第一のFabフラグメントのN末端に接続されている、請求項5記載の二重特異性抗体。
【請求項７】
第三のFabフラグメントが、第二のFabフラグメントに接続されている、請求項2〜4のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
【請求項８】
第三のFabフラグメントのN末端が、第一のFabフラグメントのC末端に接続されている、請求項7記載の二重特異性抗体。
【請求項９】
fabフラグメントが、ペプチドリンカーを介して接続されている、請求項1〜8のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
【請求項１０】
ペプチドリンカーが(G4S)2リンカーである、請求項9記載の二重特異性抗体。
【請求項１１】
請求項1〜10のいずれか一項記載の二重特異性抗体を含む、薬学的組成物。
【請求項１２】
請求項1〜10のいずれか一項記載の二重特異性抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターを含む、原核宿主細胞または真核宿主細胞。
【請求項１３】
抗体が産生されるように請求項12記載の宿主細胞を培養する工程を含む、抗体の産生方法。
【請求項１４】
請求項1〜10のいずれか一項記載の抗体と細胞毒性剤とを含む、イムノコンジュゲート。
【請求項１５】
特に実施例を参照して本明細書に記載される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、少なくとも2つのfabフラグメントを含み、Fcドメインを欠いている二重特異性抗体であって、第一のFabフラグメントが、第一の抗原に特異的な少なくとも1つの抗原結合部位を含み；かつ第二のFabフラグメントが、第二の抗原に特異的な少なくとも1つの抗原結合部位を含み、第二のFab重鎖の可変領域と第二のFab軽鎖の可変領域とが交換されているかまたは第二のFab重鎖の定常領域と第二のFab軽鎖の定常領域とが交換されているかのいずれかである二重特異性抗体、その産生方法、該抗体を含む薬学的組成物、ならびにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
モノクローナル抗体(mAb)は、ますます重要になっている部類の治療剤である。完全体形態のIgGで構成されるmAb産物以外では、多種多様な多重特異性組換え抗体形式、例えば、IgG抗体形式と一本鎖ドメインとの融合により得られる四価二重特異性抗体(例えばColoma, M.J.ら, Nature Biotech 15(1997)159-163(非特許文献1)；WO 2001/077342(特許文献1)；およびMorrison, S.L., Nature Biotech 25(2007)1233-1234(非特許文献2)を参照)が開発されている。
【０００３】
抗体コア構造(IgA、IgD、IgE、IgGまたはIgM)がもはや保持されていないその他のいくつかの新しい形式、例えば、2つ以上の抗原に結合可能なダイアボディ(diabody)、トリアボディ(triabody)、テトラボディ(tetrabody)、ミニボディ(minibody)、いくつかの一本鎖形式(scFv、ビス-scFv)等が開発されてきた(Holliger, P.ら, Nature Biotech 23(2005)1126-1136(非特許文献3)；Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74(2007)3-14(非特許文献4)；Shen, J.ら, Journal of Immunological Methods 318(2007)65-74(非特許文献5)；Wu, C.ら, Nature Biotech. 25(2007)1290-1297(非特許文献6))。
【０００４】
そのような形式は全て、抗体コア(IgA、IgD、IgE、IgGまたはIgM)を別の結合タンパク質(例えば、scFv)と融合させるために、または例えば2つのFabフラグメントもしくはscFvを融合させるために、リンカーを使用する(Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74(2007)3-14(非特許文献4))。タンデムscFVは、追加のペプチドリンカーにより連結された2つのscFvフラグメントであり、(scFv)2とも称される。可変ドメインの間のペプチドリンカーの長さを短くすることで、ダイアボディが生成される。2つのポリペプチドの間に追加のペプチドリンカーを加えることで、いわゆる一本鎖ダイアボディが産出される。US 2007/0274985(特許文献2)は、一本鎖Fab(scFab)フラグメントを含む抗体に関する。抗体フラグメントは、完全体モノクローナル抗体と比べて治療薬として賛否両論ある：一つの利点は、それらがより小さく、組織および腫瘍により速く浸透することである。さらに、フラグメントの大きさが小さいことで、完全体のモノクローナル抗体に到達できないエピトープへの結合が可能であることが示唆されている。不都合な点としては、フラグメントは、おそらく腎臓の浄化作用により、ヒトにおける循環半減期が短い。半減期が短いと、標的部位における治療が十分に蓄積するのが阻まれ得る。フラグメントは凝集体を形成し易く、完全体モノクローナル抗体よりも安定性が低くなり得るため、抗体フラグメントの産生は簡単ではない。さらに、同族でない重鎖および軽鎖の望ましくない対合によって、不活性な抗原結合部位および/またはその他の望ましくない非機能性副産物が形成され、これは、抗体フラグメントの臨床規模での製造および治療的応用において大きな問題となる。特に、1つのコネクターを介して2つ以上のFabが互いに融合したタンデムFab構築物は、2本の軽鎖がランダムに会合して望ましくない不活性な副産物を生じるために実現不可能である。今回、これらの欠点が、本発明の新規抗体形式により克服できた。誤対合による副産物の量が減少し、当該分野で公知の二重特異性抗体フラグメントよりも凝集が少ないために、高い収率で簡単に産生できる新規の二重特異性抗体形式を提供する。クロスオーバーアプローチを使用することで、共通の軽鎖を生成する必要無しに、正しいLC会合を強化することができる。共通の軽鎖のアプローチは、既存の抗体には不可能である。さらに、新規の二重特異性抗体形式は、多くの従来の二重特異性抗体フラグメントと比べて分子量がより大きいため、腎臓の過剰な浄化作用が抑えられて、インビボでの半減期が改善される。新規の二重特異性抗体形式は完全に機能し、対応する従来の二重特異性抗体に匹敵するか、またはそれ以上に改善された結合性および活性を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO 2001/077342
【特許文献２】US 2007/0274985
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Coloma, M.J.ら, Nature Biotech 15(1997)159-163
【非特許文献２】Morrison, S.L., Nature Biotech 25(2007)1233-1234
【非特許文献３】Holliger, P.ら, Nature Biotech 23(2005)1126-1136
【非特許文献４】Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74(2007)3-14
【非特許文献５】Shen, J.ら, Journal of Immunological Methods 318(2007)65-74
【非特許文献６】Wu, C.ら, Nature Biotech. 25(2007)1290-1297
【発明の概要】
【０００７】
概要
本発明は、少なくとも2つのFabフラグメントを含み、Fcドメインを欠いている二重特異性抗体であって、第一のFabフラグメントが、第一の抗原に特異的な少なくとも1つの抗原結合部位を含み；かつ第二のFabフラグメントが、第二の抗原に特異的な少なくとも1つの抗原結合部位を含み、第二のFab重鎖の可変領域と第二のFab軽鎖の可変領域とが交換されているかまたは第二のFab重鎖の定常領域と第二のFab軽鎖の定常領域とが交換されているかのいずれかである二重特異性抗体に関する。一つの態様では、前記第一および第二のFabフラグメントがペプチドリンカーを介して連結されている。前記ペプチドリンカーは(G4S)2リンカーであることが好ましい。
【０００８】
一つの態様では、前記抗体は第三のFabフラグメントをさらに含む。別の態様では、前記第三のFabフラグメントは、第一または第二の抗原、好ましくは第一の抗原に特異的な少なくとも1つの抗原結合部位を含む。
【０００９】
一つの態様では、第三のFabフラグメントが、第一のFabフラグメントの軽鎖または重鎖に接続されている。別の態様では、第三のFabフラグメントが、第二のFabフラグメントの軽鎖または重鎖のN末端またはC末端に接続されている。一つの態様では、第三のFabフラグメントが、ペプチドリンカーを介して前記第一または第二のFabフラグメントに接続されている。前記ペプチドリンカーは(G4S)2リンカーであることが好ましい。
【００１０】
本発明による二重特異性抗体は、少なくとも二価であり、三価または多価(例えば、四価)であり得る。一つの態様では、前記二重特異性抗体は、1つの結合部位がそれぞれ第一の抗原および第二の抗原のそれぞれを標的とする二価(1+1形式)である。別の態様では、前記二重特異性抗体は、以下の節で詳細に説明するように、2つの結合部位がそれぞれ第一の抗原を標的とし、1つの結合部位が第二の抗原を標的とする三価(2+1形式)である。
【００１１】
第二の目的において、本発明は、本発明の二重特異性抗体を含む薬学的組成物に関する。
【００１２】
第三の目的において、本発明は、癌を処置するための本発明の二重特異性抗体に関する。別の態様では、薬剤としての二重特異性抗体の使用を提供する。前記使用は、癌の処置のためのものであることが好ましい。
【００１３】
さらなる目的において、本発明は、本発明の二重特異性抗体の重鎖をコードする配列を含む核酸配列、本発明の二重特異性抗体の軽鎖をコードする配列を含む核酸配列、本発明の核酸配列を含む発現ベクター、および本発明のベクターを含む原核宿主細胞または真核宿主細胞に関する。さらに、抗体が産生されるように前記宿主細胞を培養する工程を含む、抗体の産生方法を提供する。
【００１４】
さらなる態様では、本発明の二重特異性抗体と細胞毒性剤とを含むイムノコンジュゲートを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の例示的な二重特異性抗体形式の概略図。a)Fab-Crossfab分子C末端、b)Fab-Crossfab分子N末端、c)(Fab)2-Crossfab分子C末端、d)(Fab)2-Crossfab分子N末端、e)Fab-Crossfab-Fab分子。
【図２】hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)の産生および精製の分析：SDS-Page：4〜12％Bis/Tris(NuPage [invitrogen]；クーマシー染色されたもの)：a)1 - Mark 12(invitrogen)、2 - hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)、非還元型；b)1 - Mark 12(invitrogen)、2 - hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)、還元型。
【図３】Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)の産生および精製の分析。分析用サイズ排除クロマトグラフィー、クロマトグラムA280(Superdex 200 10/300 GL[GE Healthcare]；2mM MOPS pH 7.3、150mM NaCl、0.02％(w/v)NaCl；50μgサンプルを注入した)。
【図４】hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)の産生および精製の分析：SDS-Page：4〜12％Bis/Tris(NuPage [invitrogen]；クーマシー染色されたもの)：a)1 - Mark 12(invitrogen)、2 - hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)、非還元型；b)1 - Mark 12(invitrogen)、2 - hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)、還元型。
【図５】hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)の産生および精製の分析。分析用サイズ排除クロマトグラフィー、クロマトグラムA280(Superdex 200 10/300 GL[GE Healthcare]；2mM MOPS pH 7.3、150mM NaCl、0.02％(w/v)NaCl；50μgサンプルを注入した)。
【図６】hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)の産生および精製の分析。SDS-Page：4〜12％Bis/Tris(NuPage [invitrogen]；クーマシー染色されたもの)：a)1 - Mark 12(invitrogen)、2 - hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)、非還元型；b)1 - Mark 12(invitrogen)、2 - hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)、還元型。
【図７】hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)の産生および精製の分析。分析用サイズ排除クロマトグラフィー、クロマトグラムA280(Superdex 200 10/300 GL[GE Healthcare]；2mM MOPS pH 7.3、150mM NaCl、0.02％(w/v)NaCl；50μgサンプルを注入した)。
【図８】マウスCrossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)の産生および精製の分析。SDS-Page：4〜12％Bis/Tris(NuPage [invitrogen]；クーマシー染色されたもの)：a)1 - Mark 12(invitrogen)、2 - マウスCrossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)、非還元型；b)1 - Mark 12(invitrogen)、2 - マウスCrossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)、還元型。
【図９】マウスCrossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)の産生および精製の分析。分析用サイズ排除クロマトグラフィー、クロマトグラムA280(Superdex 200 10/300 GL[GE Healthcare]；2mM MOPS pH 7.3、150mM NaCl、0.02％(w/v)NaCl；50μgサンプルを注入した)。
【図１０】ヒト汎T細胞と共培養(E：T比＝5：1)し、かつ異なる濃度のhu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)(＝「Fab-Crossfab」)、hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)(＝「Fab-Crossfab-Fab」)、hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)(＝「(Fab)2-Crossfab」)、および(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)(＝「(scFv)2」)二重特異性分子によって20時間活性化したときのMDA-MB-435腫瘍細胞の死滅(LDH放出により測定)。二価MCSP標的指向性を伴う構築物は、「(scFv)2」構築物に匹敵する細胞毒性活性を示す一方で、一価MCSP結合を伴う「Fab-Crossfab」構築物は明らかに作用が弱かった。
【図１１】ヒト汎T細胞と共培養(E/T比＝5：1)し、かつ異なる濃度の二重特異性構築物および対応するIgGによって21時間活性化したときの、hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)(＝「(Fab)2-Crossfab」)と (scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)(＝「(scFv)2」)構築物との比較。MDA-MB-435腫瘍細胞からのLDH放出を示している。「(Fab)2-Crossfab」 は、標的細胞において、(scFv)2分子と少なくとも同じ程度に良好にアポトーシスを誘導する。
【図１２】hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)(＝「(Fab)2-Crossfab」)と(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)(＝「(scFv)2」)構築物との比較。ヒトPBMCと共培養(E/T比＝10：1)し、かつ異なる濃度の二重特異性構築物および対応するIgGによって26時間活性化したときの、MV-3ヒト黒色腫腫瘍細胞からのLDH放出を示している。「(Fab)2-Crossfab」は、標的細胞において、(scFv)2分子と少なくとも同じ程度に良好にアポトーシスを誘導する。
【図１３】ヒトMCSPおよびマウスCD3を標的とするマウスCrossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)構築物(＝(Fab)2-CrossFab)での初代マウスT細胞の活性化により誘導される、B16/F10-huMCSP Fluc2、クローン48腫瘍細胞からのLDH放出。エフェクター 対 標的細胞比は5：1であった。37℃、5％C02での23.5時間のインキュベーションの後にアッセイを分析した。構築物は、ヒトMCSP発現標的細胞の濃度依存的なT細胞媒介性アポトーシスを誘導する。
【図１４】ヒトMCSPおよびマウスCD3を標的とする50nMのマウスCrossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)構築物(＝(Fab)2-CrossFab)での初代マウスT細胞の活性化によって誘導される、B16/F10-huMCSP Fluc2、クローン48腫瘍細胞からのLDH放出。エフェクター 対 標的細胞比は5：1であった。37℃、5％C02での23.5時間のインキュベーションの後にアッセイを分析した。構築物は、ヒトMCSP発現標的細胞のT細胞媒介性アポトーシスを誘導する。この濃度の構築物ではT細胞の弱い過活性化しか得られない。
【図１５】Colo-38腫瘍細胞の存在下(A、B)もしくは非存在下(C、D)にて、1nMの異なるCD3-MCSP二重特異性構築物(hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)(＝「(Fab)2-Crossfab」)、および(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)(＝「(scFv)2」))で24時間処理した後の、全血の上清中で測定した異なるサイトカインレベル。記載のとおり、96ウェルプレートの1ウェルにつき280μlの全血をプレーティングし、30 000個のColo-38細胞を添加した。Colo-38腫瘍細胞の存在下でT細胞を活性化させたときに分泌された主要なサイトカインは、IL-6で、その次がIFNγである。さらに、グランザイムBのレベルも、標的細胞の存在下でT細胞を活性化させたときに極端に増加した。全般的に、「(scFv)2」構築物は、標的細胞の存在下(AおよびB)で、TNFおよびIFNγ、ならびにグランザイムBのレベルを、他方の二重特異性構築物と比べてわずかに多く上昇させた。標的細胞の存在下(または非存在下)において、二重特異性構築物によってT細胞を活性化させたときに、Th2サイトカイン(IL-10およびIL-4)の有意な分泌はなかった。このアッセイで、標的細胞の非存在下において「(Fab)2-Crossfab」構築物により誘導されるIFNγの弱い分泌も見られた。
【図１６】脾細胞から単離されたマウス汎T細胞上での後期活性化マーカーCD25の表面発現レベル。マウス汎T細胞を、記載のとおり、B16/F10-huMCSP Fluc2クローン48腫瘍標的細胞の存在下または非存在下において(E：T比は10：1)、50nMのマウスCrossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)構築物(＝(Fab)2-CrossFab)二重特異性構築物(マウスCD3およびヒトMCSPを標的とする)とインキュベートした。70時間後の、CD8+T細胞上での後期活性化マーカーCD25の発現レベルを示している。(Fab)2-CrossFab構築物によるCD8+T細胞上のCD25のアップレギュレーションは、標的細胞の存在下においてのみ生じる。同じモル濃度に調整されて使用された参照IgGは、CD25をアップレギュレートできなかった。
【図１７】Fab(CD33)-CrossFab(CD3)の産生および精製の分析。SDS-Page：a)3〜8％ Tris/酢酸(NuPage [invitrogen]；クーマシー染色されたもの)：a)1 - HiMark(invitrogen)、2 - Fab(CD33)-CrossFab(CD3)、非還元型；b)4〜12％Bis/Tris(NuPage[invitrogen]：1 - Mark 12(invitrogen)、2 - Fab(CD33)-CrossFab(CD3)、還元型。
【図１８】Fab(CD33)-CrossFab(CD3)の産生および精製の分析。分析用サイズ排除クロマトグラフィー、クロマトグラムA280(Superdex 200 10/300 GL[GE Healthcare]；2mM MOPS pH 7.3、150mM NaCl、0.02％(w/v)NaCl；50μgサンプルを注入した)。
【図１９】ヒトPBMCと共培養(E：T比＝10：1)し、かつ異なる濃度のCD3-MCSP二重特異性構築物(hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)(「1+1, Fc無し」と称する)および(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)(＝「(scFv)2」)参照分子) によって24時間活性化したときのMV-3腫瘍細胞の死滅(LDH放出により測定)。MV-3標的細胞において、「(scFv)2」参照分子についての計算上のEC50が57pMである一方で、「1+1, Fc無し」構築物は、25.4pMの計算上のEC50でアポトーシスを誘導し、EC50の点で「1+1, Fc無し」分子の能力がわずかに優れていることが示された。
【図２０】ヒトPBMCと共培養(E：T比＝10：1)し、CD3-MCSP二重特異性構築物(それぞれ、hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)(「1+1, Fc無し」と称する)および(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)(＝「(scFv)2」)参照分子)で約24時間処理したときの、huMCSP陽性MV-3腫瘍細胞の存在下でのCD69のアップレギュレーション(A)、CD69陽性細胞のそれぞれの増加(B)により測定される、CD4+またはCD8+T細胞の活性化。全般的に、CD69中央値は、CD4+T細胞と比べてCD8+T細胞でより高い。両方の構築物についてのCD69中央値およびCD69陽性細胞のパーセンテージの両方に明らかな濃度依存的な増加がみとめられる。
【図２１】(scFv)2参照分子の図。
【図２２】(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)の産生および精製の分析。SDS-Page：4〜12％Bis/Tris(NuPage [invitrogen]；クーマシー染色されたもの)：1 - Mark 12(invitrogen)、2 - (scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)、還元型；3 - (scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)、非還元型。
【図２３】(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)の産生および精製の分析。分析用サイズ排除クロマトグラフィー、クロマトグラムA280(Superdex 75 10/300 GL[GE Healthcare]；2mM MOPS pH 7.3、150mM NaCl、0.02％(w/v)NaCl；50μgサンプル((scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e))を注入した)。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の態様の詳細な説明
I. 定義
「フレームワーク」または「FR」とは、超可変領域(HVR)残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのFRは、一般的に、4つのFRドメイン(FR1、FR2、FR3、およびFR4)で構成される。したがって、HVRおよびFR配列は、一般的に、VH(またはVL)において以下の並びで見とめられる：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
【００１７】
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、以下に定義するような、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン(VL)フレームワークまたは重鎖可変ドメイン(VH)フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、それと同じアミノ酸配列を含むか、またはアミノ酸配列に変化を含み得る。一部の態様では、アミノ酸変化の数は、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、または2以下である。一部の態様では、VLアクセプターヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列に対して配列が同一である。
【００１８】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンVLまたはVHフレームワーク配列の選択において最もよく見出されるアミノ酸残基を表すフレームワークである。概して、ヒト免疫グロブリンVLまたはVH配列は、可変ドメイン配列のサブグループから選択される。概して、配列のサブグループとは、Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition、NIH Publication 91-3242, Bethesda MD(1991), vols.1-3で言うようなサブグループである。一つの態様では、VLについてのサブグループは、Kabatら(前掲)で言うサブグループκIである。一つの態様では、VHについてのサブグループは、Kabatら(前掲)で言うサブグループIIIである。
【００１９】
本明細書で用いる「超可変領域」または「HVR」という用語は、配列が超可変性であり、および/または形状構造的に定義されたループ(「超可変ループ」)を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然の四本鎖抗体は、6つのHVR(VHにおいて3つ(H1、H2、H3)、およびVLにおいて3つ(L1、L2、L3))を含む。HVRは、一般的に、超可変ループおよび/または「相補性決定領域」(CDR)由来のアミノ酸残基を含み、後者は、配列変化が最も多く、および/または抗原認識に関与する。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、91〜96(L3)、26〜32(H1)、53〜55(H2)、および96〜101(H3)に見出される。(ChothiaおよびLesk, J. Mol. Biol. 196：901-917(1987))。例示的なCDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)は、L1のアミノ酸残基24〜34、L2の50〜56、L3の89〜97、H1の31〜35B、H2の50〜65、およびH3の95〜102に見出される。(Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991))。超可変領域(HVR)および相補性決定領域(CDR)という用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して、本明細書において互いに代替的に使用される。この特定の領域は、Kabatら, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest"(1983)、およびChothiaら, J. Mol. Biol. 196：901-917(1987)に記載されており、これらの定義は、互いに比較した場合にアミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。いずれにせよ、抗体またはその改変体のCDRを指すためにいずれの定義を適用しても、本明細書において定義および使用される用語の範囲内にあることが意図される。上記引用文献のそれぞれで定義されるCDRを構成する適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表1に示す。特定のCDRを構成する正確な残基の数は、CDRの配列および大きさに依存して変化する。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のCDRを構成するかを慣行的に決定できる。
【００２０】
（表１）CDR定義1
2014532037.tif 000002
1表1における全てのCDR定義のナンバリングは、Kabatら(以下を参照)に記載されたナンバリングの規則に従っている。
2表1において使用する小文字「b」の入った「AbM」は、Oxford Molecularの「AbM」抗体モデル化ソフトウェアによって定義されたCDRを指す。
【００２１】
Kabatらはまた、あらゆる抗体に適用可能な、可変領域配列のナンバリング体系も定義している。当業者は、配列自体以外の実験的データに依存することなく、この「Kabatナンバリング」の体系をあらゆる可変領域配列に迷いなくあてがうことができる。本明細書で使用する「Kabatナンバリング」とは、Kabatら, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)に記載のナンバリング体系を指す。特に明記しない限り、抗体可変領域中の特定のアミノ酸残基位置のナンバリングについては、Kabatナンバリング体系に準じたものである。
【００２２】
VH中のCDR1を除いて、CDRは、一般的に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。CDRは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」または「SDR」も含む。SDRは、短縮(abbreviated)-CDR、または a-CDRと呼ばれるCDRの領域内に含まれる。例示的なa-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、およびa-CDR-H3)は、L1のアミノ酸残基31〜34、L2の50〜55、L3の89〜96、H1の31〜35B、H2の50〜58、およびH3の95〜102に見出される。(AlmagroおよびFransson, Front. Biosci. 13：1619-1633(2008)を参照)。特に記載しない限り、可変ドメイン中のHVR残基および他の残基(例えば、FR残基)は、本明細書においてKabatら(前掲)に準じてナンバリングしている。
【００２３】
本明細書でいう「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、多種多様な抗体構造を包含し、これらとしては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、および抗体フラグメントが挙げられるが、所望の抗原結合活性を示す限りこれらに限定されない。特に、「抗体」という用語には、少なくとも2つのfabフラグメントを含むがFcドメインは含まない本発明の二重特異性抗体も含まれる。
【００２４】
「ヒト抗体」とは、ヒトもしくはヒト細胞により産生される抗体のアミノ酸配列に由来する抗体のアミノ酸配列に対応する、またはヒト抗体レパートリーもしくはその他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を所有するものである。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。 
【００２５】
本明細書で使用する「組換えヒト抗体」という用語は、NS0もしくはCHO細胞等の宿主細胞から、またはヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニック動物(例えば、マウス)から単離された抗体、あるいは宿主細胞にトランスフェクトした組換え発現ベクターを使用して発現させた抗体等、組換え手段により調製、発現、作出または単離された全てのヒト抗体を含むことを意図する。このような組換えヒト抗体は、再構成された形態の可変および定常領域を有する。本発明による組換えヒト抗体は、インビボ体細胞超変異に供されている。したがって、組換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列VHおよびVL配列に由来および関係する一方で、インビボではヒト抗体生殖細胞系列レパートリーに自然に存在しない可能性のある配列である。
【００２６】
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVR由来アミノ酸残基およびヒトFR由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の態様では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、全てまたは実質的に全てのHVR(例えば、CDR)が非ヒト抗体のものに対応し、全てまたは実質的に全てのFRがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体の「ヒト化形態」(例えば、非ヒト抗体)とは、ヒト化を経た抗体を指す。本発明に包含される「ヒト化抗体」のその他の形態としては、本発明による性質(特に、C1q結合および/またはFc受容体(FcR)結合に関する性質)を生成するために、定常領域が元の抗体のものからさらに改変または変更されたものがある。
【００２７】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖および/または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来する一方で、該重鎖および/または軽鎖の残りが、異なる供給源または種に由来する抗体(通常、組換えDNA技術により調製される)を指す。マウス可変領域およびヒト定常領域を含むキメラ抗体が好ましい。本発明が包含するその他の好ましい形態の「キメラ抗体」としては、本発明による性質(特に、C1q結合および/またはFc受容体(FcR)結合に関する性質)を生成するために、定常領域が元の抗体のものから改変または変更されたものがある。このようなキメラ抗体は「クラススイッチ抗体」とも称される。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするDNAセグメントと、免疫グロブリン定常領域をコードするDNAセグメントとを含む免疫グロブリン遺伝子の発現産物である。キメラ抗体の産生方法は従来の組換えDNAを伴い、遺伝子トランスフェクション技術は当該分野で周知である。例えば、Morrison, S.L.ら, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 81(1984)6851-6855；米国特許第5,202,238号および同第5,204,244号を参照のこと。
【００２８】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、例えば自然発生的な突然変異を含むかもしくはモノクローナル抗体調製物の産生の間に生じる可能性のある改変型抗体(このような改変体は一般的に少量で存在している)は別として、同一であるか、および/または同じエピトープに結合する。異なる決定基(エピトープ)を指向する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物のモノクローナル抗体はそれぞれ、抗原上の単一の決定基を指向する。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得たのに等しい抗体であるという特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、多種多様な技術によって作ることができ、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージ提示法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法が挙げられるが、これらに限定されない。このような方法および他の例示的なモノクローナル抗体産生方法は、本明細書に記載している。
【００２９】
「抗体フラグメント」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例としては、Fv、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2;ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子(例えば、scFv)；および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられるがこれらに限定されない。scFv抗体は、例えば、Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203(1991)46-96)に記載されている。さらに抗体フラグメントは、VHドメインの特徴(つまりVLドメインと共に機能的抗原結合部位へと会合可能)またはVLドメインの特徴(つまりVHドメインと共に機能的抗原結合部位へと会合可能)を有する一本鎖ポリペプチドを含み、それによって、完全長抗体の抗原結合性質を提供する。
【００３０】
本明細書で使用する「Fabフラグメント」とは、軽鎖のVLドメインおよび定常ドメイン(CL)を含む軽鎖フラグメント、ならびに重鎖のVHドメインおよび第一の定常ドメイン(CH1)を含む抗体フラグメントを指す。本発明の二重特異性抗体は、少なくとも2つのFabフラグメントを含み、第二のFabフラグメントの重鎖の可変領域と第二のFabフラグメントの軽鎖の可変領域とが交換されているかまたは第二のFabフラグメントの重鎖の定常領域と第二のFabフラグメントの軽鎖の定常領域とが交換されているかのいずれかである。可変領域または定常領域のいずれかの交換により、該第二のFabフラグメントは、「CrossFabフラグメント」または「xFabフラグメント」または「クロスオーバーFabフラグメント」とも称される。クロスオーバーFab分子においては2つの異なる鎖組成が存在でき、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方では、Fab重鎖の可変領域とFab軽鎖の可変領域とが交換されており、すなわち、クロスオーバーFab分子は、軽鎖可変領域(VL)および重鎖定常領域(CH1)で構成されるペプチド鎖と、重鎖可変領域(VH)および軽鎖定常領域(CL)で構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーFab分子は、CrossFab(VLVH)とも称される。他方で、Fab重鎖の定常領域とFab軽鎖の定常領域とが交換されている場合には、クロスオーバーFab分子は、重鎖可変領域(VH)および軽鎖定常領域(CL)で構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変領域(VL)および重鎖定常領域(CH1)で構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーFab分子は、CrossFab(CLCH1)とも称される。
【００３１】
一つの態様では、前記Fabフラグメントが、ペプチドリンカーを介して接続されている。「接続されている」とは、Fabフラグメントが、直接または1つもしくは複数のペプチドリンカーを介したペプチド結合によって連結されていることを意味する。
【００３２】
本発明で用いる「ペプチドリンカー」という用語は、好ましくは合成起源のものであるアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。本発明によるこれらのペプチドリンカーは、一方のFabフラグメントを、他方のFabフラグメントのC末端またはN末端に接続して、本発明による多重特異性抗体を形成するために使用される。該ペプチドリンカーは、少なくとも5アミノ酸の長さ、好ましくは5〜100アミノ酸の長さ、より好ましくは10〜50アミノ酸の長さのアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。一つの態様では、該ペプチドリンカーは(GxS)nまたは(GxS)nGmであり、式中、G＝グリシン、S＝セリン、ならびに(x＝3、n＝3、4、5もしくは6、およびm＝0、1、2もしくは3)または(x＝4、n＝2、3、4もしくは5、およびm＝0、1、2もしくは3)、好ましくはx＝4およびn＝2または3、より好ましくはx＝4、n＝2である。さらに、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域(の一部)を含み得る。一つの態様では、該ペプチドリンカーは(G4S)2(SEQ ID NO：28)である。Fabフラグメントを接続するのに適した他のペプチドリンカーは、例えば、
2014532037.tif 000003
である。
【００３３】
「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原の一部または全てに特異的に結合し、かつそれに対して相補的な領域を含む抗原結合分子の部分を指す。抗原が大きい場合には、抗原結合分子は、抗原の特定部分にしか結合しないこともあり、この部分はエピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、例えば、1つまたは複数の抗体可変ドメイン(抗体可変領域とも呼ばれる)によって提供され得る。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域(VL)および抗体重鎖可変領域(VH)を含むことが好ましい。
【００３４】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン(それぞれ、VHおよびVL)は一般的に同様の構造を有し、それぞれのドメインは4つの保存フレームワーク領域(FR)および3つの超可変領域(HVR)を含む。(例えば、Kindtら Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91頁(2007)を参照)。抗原結合特異性を与えるには、単一のVHまたはVLドメインで十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、該抗原に結合する抗体に由来するVHまたはVLドメインを使用して、相補的なVLまたはVHドメインのライブラリーをそれぞれスクリーニングして単離してもよい。例えば、Portolanoら, J. Immunol.150：880-887(1993)；Clarksonら, Nature 352：624-628(1991)を参照のこと。
【００３５】
本明細書で使用する「抗体の抗原結合部位」という用語は、抗原結合に関与する、抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」または「CDR」に由来するアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」または「FR」領域は、本明細書で定義する超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインは、N末端からC末端の方向に、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4を含む。特に、重鎖のCDR3は、抗原結合に最も寄与し、抗体の性質を決める領域である。CDRおよびFR領域は、Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)の標準規定に従って決定されるか、および/または「超可変ループ」に由来する残基である。
【００３６】
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合可能なあらゆるポリペプチド決定基を含む。特定の態様では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニル等の化学活性表面でグループ分けされた分子を含み、特定の態様では、特定の三次元構造特徴、および/または特定の電荷特徴を有し得る。エピトープは、抗体が結合する、抗原の領域である。
【００３７】
本明細書の「Fcドメイン」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のC末端領域を規定するために使用される。例えば、天然抗体において、Fcドメインは、IgG、IgAおよびIgDアイソタイプの抗体の2つの重鎖の第二および第三の定常ドメインに由来する2つの同一のタンパク質フラグメントからなる；IgMおよびIgE Fcドメインは、各ポリペプチド鎖に3つの重鎖定常ドメイン(CHドメイン2〜4)を含む。本発明の二重特異性抗体は、Fcドメインを欠く。本明細書で用いる「Fcドメインを欠く」とは、本発明の二重特異性抗体がCH2、CH3またはCH4ドメインを含まない、つまり、定常重鎖が1つ以上のCH1ドメインのみからなることを意味する。
【００３８】
「親和性」とは、分子(例えば、抗体)の単一の結合部位と、その結合相手(例えば、抗原)との間の非共有結合性相互作用の合計強度を指す。特に記載しない限り、本明細書で使用する「結合親和性」とは、結合対のメンバー(例えば、抗体および抗原)間の1：1相互作用を反映する固有結合親和性を指す。分子Xのその相手Yに対する親和性は、一般的に、解離定数(KD)で表すことができる。親和性は、本明細書に記載するものを含めて当該分野で公知のよくある方法によって測定できる。結合親和性を測定するための特定の説明的および例示的な態様は以下に記載する。
【００３９】
本明細書で使用する「結合」または「特異的に結合」という用語は、結合が抗原に対して選択的であることを意味し、望ましくないまたは非特異的な相互作用と区別できる。特定の抗原決定基に結合するという抗原結合部分の能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、または当業者によく知られている他の技術(例えば、表面プラズモン共鳴(SPR)技術(BIAcore機器で分析)(Liljebladら, Glyco J 17, 323-329(2000))、および従来の結合アッセイ(Heeley, Endocr Res 28, 217-229(2002)))のいずれかによって測定できる。一つの態様では、無関係なタンパク質への抗原結合部分の結合の程度は、例えばSPRによって測定された場合に、抗原への抗原結合部分の結合の約10％未満である。特定の態様では、抗原に結合する抗原結合部分、またはその抗原結合部分を含む抗原結合分子は、≦1μΜ、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、または≦0.001nM(例えば、10-8M以下、例えば、10-8M〜10-13M、例えば、10-9M〜10-13M)の解離定数(KD)を有する。
【００４０】
「親和性成熟」抗体とは、1つまたは複数の超可変領域(HVR)において1つまたは複数の変化を有する抗体を指し、このような変化は、そのような変化を持たない親抗体と比べて抗原に対する抗体の親和性を改善する。
【００４１】
一つの態様では、第一の抗原および第二の抗原に特異的に結合する二重特異性抗体が、無関係なタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)またはフローサイトメトリー(FACS)によって測定された場合に、第一または第二の抗原への抗体の結合の約10％未満である。特定の態様では、第一の抗原および第二の抗原に特異的に結合する二重特異性抗体は、≦1μΜ、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、または≦0.001nM(例えば、10-8M以下、例えば、10-8〜10-13M、例えば、10-9M〜10-13M)の解離定数(KD)を有する。特定の態様では、第一の抗原および第二の抗原に特異的に結合する二重特異性抗体は、異なる種に由来する第一の抗原間または第二の抗原間で保存された、第一の抗原または第二の抗原のエピトープに結合する。
【００４２】
抗体特異性とは、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を指す。例えば、天然抗体は、単一特異的である。本発明による「二重特異性抗体」は、2つの異なる抗原結合特異性を有する抗体である。本発明の抗体は、2つの異なる抗原(すなわち、第一の抗原および第二の抗原)に対して特異的である。
【００４３】
本明細書で使用する「単一特異性」抗体という用語は、同じ抗原の同じエピトープにそれぞれ結合する1つまたは複数の結合部位を有する抗体を意味する。
【００４４】
本明細書で使用する「二重特異性」抗体という用語は、同じ抗原の異なるエピトープまたは異なる抗原にそれぞれ結合する少なくとも2つの結合部位を有する抗体を意味する。
【００４５】
本明細書で提供する抗体は、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。本明細書で提供するのは、第一の抗原および第二の抗原に対して結合特異性を有する二重特異性抗体である。特定の態様では、二重特異性抗体は、第一の抗原または第二の抗原の2つの異なるエピトープに結合し得る。
【００４６】
二重特異性抗体は、第一の抗原または第二の抗原を発現する細胞に細胞毒性剤を局在させるためにも使用され得る。 
【００４７】
本出願において使用する「価」という用語は、抗体分子において特定の数の結合部位が存在することを意味する。したがって、「二価」、「四価」、および「六価」という用語はそれぞれ、抗体分子において、2つの結合部位、4つの結合部位、および6つの結合部位が存在することを意味する。本発明による二重特異性抗体は、少なくとも「二価」であり、「三価」または「多価」(例えば、「四価」もしくは「六価」)であってもよい。
【００４８】
本発明の抗体は、2つ以上の結合部位を有し、二重特異性である。つまり、抗体は2つを超える結合部位がある(つまり、抗体が三価または多価である)場合でも、二重特異性であり得る。
【００４９】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて参照抗体がその抗原に結合するのを、50％以上ブロックする抗体を指し、逆に言えば、競合アッセイにおいてその抗体がその抗原に結合するのを参照抗体は50％以上ブロックする。例示的な競合アッセイは、本明細書において提供する。
【００５０】
「実質的な交差反応無し」とは、分子(例えば、抗体)が、特に標的抗原と比べた場合に、該分子の実際の標的抗原とは異なる抗原(例えば、標的抗原に密接に関連する抗原)を認識、または特異的に結合しないことを意味する。例えば、抗体は、実際の標的抗原とは異なる抗原に約10％未満〜約5％未満で結合し得るか、または実際の標的抗原とは異なる抗原に、実際の標的抗原とは異なる抗原の約10％、9％、8％ 7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％もしくは0.1％未満、好ましくは、約2％、1％もしくは0.5％未満、最も好ましくは約0.2％もしくは0.1％未満からなる群より選択される量で、結合し得る。
【００５１】
参照ポリペプチド配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を位置合わせし、必要であればギャップを導入して最大パーセント配列同一性を得た後で、どの保存的置換も配列同一性の一部であると全く考慮しない場合の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中アミノ酸残基のパーセンテージと定義する。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のための位置合わせは、当該分野の技術範囲内の様々な手法で、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalign(DNASTAR)ソフトウェア等の公に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、達成され得る。当業者は、比較する配列の完全長にわたり最大限の位置合わせを達成するのに必要なあらゆるアルゴリズムを含めて、配列を位置合わせするのに適したパラメータを決定できる。ただし、本明細書における目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値を、配列比較コンピュータープログラムALIGN-2を用いて生成する。ALIGN-2配列比較コンピュータープログラムは、Genentech, Inc.により作成され、ソースコードがユーザー文書と共に米国著作権局(Washington D.C., 20559)に提出され、米国著作権登録第TXU510087号として登録されている。 ALIGN-2プログラムは、Genentech、Inc., South San Francisco, Californiaから公に利用可能であるか、またはソースコードから作成され得る。ALIGN-2プログラムは、digital UNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティングシステム上で使用するためには作成されなければならない。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムにより設定され、変化しない。
【００５２】
アミノ酸配列比較のためにALIGN-2が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Aの所与のアミノ酸配列Bに対する％アミノ酸配列同一性(あるいはまた、所与のアミノ酸配列Bに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有する所与のアミノ酸配列Aと言い換えることができる)は、以下のように計算する。
100×分数X/Y
式中、Xは、配列位置合わせプログラムALIGN-2が、該プログラムによりAおよびBを位置合わせした際に同一性の一致と記録されたアミノ酸残基の数であり、YはB中のアミノ酸残基の合計数である。アミノ酸配列Aの長さとアミノ酸配列Bの長さが等しくない場合、A対Bの％アミノ酸配列同一性はB対Aの％アミノ酸配列同一性に等しくならないことが理解されよう。特に特記しない限り、本明細書で使用する全ての％アミノ酸配列同一性の値は、直前の段落に記載したようにALIGN-2コンピュータープログラムを用いて得たものである。
【００５３】
「単離された」抗体とは、その天然環境での構成要素から分離されたものである。一部の態様では、抗体は、例えば、電気泳動(例えば、SDS-PAGE、等電点電気泳動法(IEF)、キャピラリー電気泳動法)で、またはクロマトグラフィー(例えば、イオン交換もしくは逆相HPLC)で決定された際に95％または99％を上回る純度まで精製される。抗体純度を評価する方法の概説については、例えば、Flatmanら, J. Chromatogr. B 848：79-87(2007)を参照のこと。
【００５４】
「単離された」核酸とは、その天然環境での構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、その核酸分子を通常含む細胞に含まれている核酸分子を含むが、染色体外、またはその天然での染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子を含む。
【００５５】
「本発明の二重特異性抗体をコードする単離された核酸」とは、抗体重鎖および軽鎖(またはそれらのフラグメント)をコードする1つまたは複数の核酸分子を指し、単一のベクターまたは別個のベクターに入っている核酸分子、および宿主細胞の1つまたは複数の位置に存在する核酸分子が挙げられる。
【００５６】
本出願で使用する「アミノ酸」という用語は、アラニン(三文字表記：ala、一文字表記：A)、アルギニン(arg、R)、アスパラギン(asn、N)、アスパラギン酸(asp、D)、システイン(cys、C)、グルタミン(gln、Q)、グルタミン酸(glu、E)、グリシン(gly、G)、ヒスチジン(his、H)、イソロイシン(ile、I)、ロイシン(leu、L)、リジン(lys、K)、メチオニン(met、M)、フェニルアラニン(phe、F)、プロリン(pro、P)、セリン(ser、S)、トレオニン(thr、T)、トリプトファン(trp、W)、チロシン(tyr、Y)、およびバリン(val、V)を含む、天然に存在するカルボキシαアミノ酸の群を意味する。
【００５７】
本明細書で使用する「ベクター」という用語は、それと連結している別の核酸を増殖可能な核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、および導入される宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターを含む。特定のベクターは、それと機能的に連結している核酸の発現を指示することが可能である。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。
【００５８】
本明細書で使用する「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」という表現は互いに代替的に使用され、このような指定の全てにおいて子孫が含まれる。したがって、「トランスフェクタント」および「トランスフェクトされた細胞」という言葉には、最初の対象細胞およびトランスファーの回数を問わずそれに由来する培養物が含まれる。意図的または不慮の突然変異のために、全ての子孫のDNAの内容が正確に同一でなくてもよいことも理解されよう。当初導入された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異型子孫が含まれる。
【００５９】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」という用語は互いに代替的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫も含まれる。宿主細胞には「形質転換体」および「形質転換された細胞」が含まれ、これには、最初の形質転換された細胞および継代の数を問わずそれに由来する子孫が含まれる。子孫の核酸の内容は、親細胞と完全に同一でなくてもよく、突然変異を含み得る。当初形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異型子孫が、本明細書に含まれる。
【００６０】
「裸抗体」とは、異種部分(例えば、細胞毒性部分)または放射性標識とコンジュゲートしていない抗体を指す。裸抗体は薬学的製剤中に存在し得る。
【００６１】
「イムノコンジュゲート」は、細胞毒性剤等の(ただしこれに限定されない)1つまたは複数の異種分子とコンジュゲートした抗体である。 
【００６２】
本明細書において使用する「細胞毒性剤」という用語は、細胞機能を阻害もしくは抑制する、および/または細胞死もしくは破壊をもたらす物質を指す。細胞毒性剤としては、放射性同位体(例えば、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212およびLuの放射性同位体)；化学療法剤または薬物(例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシン、またはその他の挿入剤)；成長阻害剤；核酸分解酵素等の酵素およびそれらのフラグメント；抗生物質；小分子毒素、または細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素活性毒素(それらのフラグメントおよび/または変異体を含む)等の毒素；ならびに以下に開示する様々な抗腫瘍剤または抗癌剤が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６３】
「N末端」という用語はN末端の最後のアミノ酸を意味し、「C末端」という用語はC末端の最後のアミノ酸を意味する。
【００６４】
「薬学的製剤」という用語は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性が有効になるような形態をとり、該製剤が投与される対象に対して許容できないほど毒性である追加成分は含まない調製物を指す。
【００６５】
「薬学的に許容される担体」とは、活性成分以外の、対象に対して無毒の、薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または保存剤が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６６】
本明細書で使用する「処置」(および「処置する」または「処置すること」等のその文法上の変化形)は、処置されている個体の自然経過を変えようとするための臨床的介入を指し、予防のために行うことも、または臨床病理の過程において行うこともできる。処置の望ましい効果としては、疾患の発生または再発を防ぐこと、症状を緩和すること、疾患のあらゆる直接的または間接的な病理的帰結を軽減すること、転移を防ぐこと、疾患の進行の速度を低下させること、病態を改善または緩和すること、および寛解または改善された予後が挙げられるがこれらに限定されない。一部の態様では、疾患の発症を遅らせるために、または疾患の進行を減速させるために、本発明の抗体を使用する。
【００６７】
「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ)、霊長類(例えば、ヒト、およびサル等の非ヒト霊長類)、ウサギ、ならびに齧歯類(例えば、マウスおよびラット) が挙げられるがこれらに限定されない。特定の態様では、個体または対象はヒトである。 
【００６８】
剤(例えば、薬学的製剤)の「有効量」とは、所望の治療的または予防的結果を達成するための、必要な投薬および期間における、有効な量を指す。
【００６９】
本明細書で使用する「癌」という用語は、リンパ腫、リンパ性白血病、肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、細気管支肺胞細胞肺癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭頸部の癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸部の癌、膣の癌、外陰の癌、ホジキン病、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟部組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、膀胱の癌、腎臓もしくは尿管の癌、腎細胞癌、腎盂の癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系(CNS)の新生物、脊髄軸腫瘍(spinal axis tumor)、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、およびユーイング肉腫等の増殖性疾患を指し、上記癌のいずれかの難治性の型、または上記癌の1つもしくは複数の組み合わせも含まれる。
【００７０】
「添付文書」という用語は、治療製品の使用するにあたっての適応症、使用、投薬量、投与、併用療法、禁忌症および/または警告についての情報を含む、治療製品の商業用パッケージに通例含まれる取扱説明書を指すために使用される。
【００７１】
II. 組成物および方法
A. 例示的な二重特異性抗体
本発明は、少なくとも2つのFabフラグメントを含み、Fcドメインを欠いている二重特異性抗体であって、第一のFabフラグメントが、第一の抗原に特異的な少なくとも1つの抗原結合部位を含み；かつ第二のFabフラグメントが、第二の抗原に特異的な少なくとも1つの抗原結合部位を含み、第二のFabフラグメントの重鎖の可変領域と第二のFabフラグメントの軽鎖の可変領域とが交換されているかまたは第二のFabフラグメントの重鎖の定常領域と第二のFabフラグメントの軽鎖の定常領域とが交換されているかのいずれかである二重特異性抗体に関する。一つの態様では、第一および第二のFabフラグメントはペプチドリンカーを介して接続されている。該ペプチドリンカーは、少なくとも5アミノ酸の長さ、好ましくは5〜100アミノ酸の長さ、より好ましくは10〜50アミノ酸の長さを有するアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。一つの態様では、該ペプチドリンカーは、(GxS)nまたは(GxS)nGm(式中、G＝グリシン、S＝セリン、ならびに(x＝3、n＝3、4、5もしくは6、およびm＝0、1、2もしくは3)または(x＝4、n＝2、3、4もしくは5、およびm＝0、1、2もしくは3)、好ましくはx＝4およびn＝2または3、より好ましくはx＝4、n＝2)である。一つの態様では、該ペプチドリンカーは(G4S)2である。ペプチドリンカーを使用して、第一および第二のFabフラグメントを接続する。一つの態様では、前記第一のFabフラグメントが前記第二のFabフラグメントのC末端またはN末端に接続されている。
【００７２】
一つの態様では、第一のFabフラグメントが、第二のFabフラグメントのN末端に接続されている。第一のFabフラグメントが第二のFabフラグメントのN末端に接続された場合に、第二のFabフラグメントの重鎖の可変ドメインと第二のFabフラグメントの軽鎖の可変ドメインとが交換されているかまたは第二のFabフラグメントの重鎖の定常ドメインと第二のFabフラグメントの軽鎖の定常ドメインとが交換されているかによって、異なる二重特異性抗体分子が存在しうる。
【００７３】
一つの態様では、第二のFabフラグメントの可変ドメインが交換されており(すなわち、第二のFabフラグメントはCrossFab(VHVL)であり)、第一のFabフラグメントの重鎖または軽鎖のC末端が、第二のFabフラグメントのVLCH1鎖のN末端に接続されている。第一のFabフラグメントのC末端重鎖が、第二のFabフラグメントのVLCH1鎖のN末端に接続されていることが好ましい。したがって、一つの態様では、二重特異性抗体は、3つの鎖を含む：第一のFabフラグメントの軽鎖(VLCL)、第二のFabフラグメントのVLCH1鎖にペプチドリンカーを介して接続された第一のFabフラグメントの重鎖(VHCH1-リンカー-VLCH1)、および第二のFabフラグメントのVHCL鎖。
【００７４】
別の態様では、第二のFabフラグメントの定常ドメインが交換されており(すなわち、第二のFabフラグメントはCrossFab(CLCH1)であり)、第一のFabフラグメントの重鎖または軽鎖のC末端が、第二のFabフラグメントのVHCL鎖のN末端に接続されている。第一のFabフラグメントの重鎖のC末端が、第二のFabフラグメントのVHCL鎖のN末端に接続されていることが好ましい。したがって、一つの態様では、二重特異性抗体は、3つの鎖を含む：第一のFabフラグメントの軽鎖(VLCL)、第二のFabフラグメントのVHCL鎖にペプチドリンカーを介して接続された第一のFabフラグメントの重鎖(VHCH1-リンカー-VHCL)、および第二のFabフラグメントのVLCH1鎖。
【００７５】
一つの態様では、第一のFabフラグメントが、第二のFabフラグメントのC末端に接続されている。第一のFabフラグメントが第二のFabフラグメントのC末端に接続された場合に、第二のFabフラグメントの重鎖の可変ドメインと第二のFabフラグメントの軽鎖の可変ドメインとが交換されているかまたは第二のFabフラグメントの重鎖の定常ドメインと第二のFabフラグメントの軽鎖の定常ドメインとが交換されているかによって、異なる二重特異性抗体分子が存在しうる。
【００７６】
一つの態様では、第二のFabフラグメントの可変ドメインが交換されており(すなわち、第二のFabフラグメントはCrossFab(VHVL)であり)、第二のFabフラグメントのCH1ドメインが第一のFabフラグメントの重鎖または軽鎖のN末端に接続されている。第二のFabフラグメントのCH1ドメインが、第一のFabフラグメントの重鎖のN末端に接続されていることが好ましい。したがって、一つの態様では、二重特異性抗体は、3つの鎖を含む：第一のFabフラグメントの軽鎖(VLCL)、第一のFabフラグメントの重鎖にペプチドリンカーを介して接続された第二のFabフラグメントのVLCH1鎖(VLCH1-リンカー-VHCH1)、および第二のFabフラグメントのVHCL鎖。
【００７７】
別の態様では、第二のFabフラグメントの定常ドメインが交換されており(すなわち、第二のFabフラグメントはCrossFab(CLCH1)であり)、第二のFabフラグメントのCLドメインが第一のFabフラグメントの重鎖または軽鎖のN末端に接続されている。第二のFabフラグメントのCLドメインが、第一のFabフラグメントの重鎖のN末端に接続されていることが好ましい。したがって、一つの態様では、二重特異性抗体は、3つの鎖を含む：第一のFabフラグメントの軽鎖(VLCL)、第一のFabフラグメントの重鎖にペプチドリンカーを介して接続された第二のFabフラグメントのVHCL鎖(VLCH1-リンカー-VHCH1)、および第二のFabフラグメントのVLCH1鎖。
【００７８】
本発明による二重特異性抗体は、少なくとも二価であり、三価または多価(例えば、四価)であってもよい。一つの態様では、該二重特異性抗体は、1つの結合部位がそれぞれ第一の抗原および第二の抗原を標的とする二価(1+1形式)である。別の態様では、二重特異性抗体は、以下の節に詳細に記載するように、2つの結合部位がそれぞれ第一の抗原を標的とし、1つの結合部位が第二の抗原を標的とする三価(2+1形式)である。
【００７９】
一つの態様では、前記抗体は、第三のFabフラグメントをさらに含む。別の態様では、前記第三のFabフラグメントは、第一または第二の抗原、好ましくは第一の抗原に特異的な少なくとも1つの抗原結合部位を含む。
【００８０】
一つの態様では、第三のFabフラグメントは、第一のFabフラグメントのN末端またはC末端に接続されている。一つの態様では、第三のFabフラグメントが第一のFabフラグメントにペプチドリンカーを介して接続されている。前記ペプチドリンカーは、(G4S)2リンカーであることが好ましい。
【００８１】
一つの態様では、第三のFabフラグメントは、第一のFabフラグメントの軽鎖または重鎖のN末端またはC末端に接続されている。(上で詳細に記載したように)第一のFabフラグメントのどちらの末端が第二のFabフラグメントに接続されているかによって、第三のFabフラグメントが第一のフラグメントの反対(遊離)側にある末端に接続される。
【００８２】
一つの態様では、本発明の二重特異性抗体は、3つのFabフラグメントを含み、該FabフラグメントとリンカーとがN末端からC末端の方向に以下の順序で接続されている：Fabフラグメント3-リンカー-Fabフラグメント1-リンカー-Fabフラグメント2(ここで、第二のFabフラグメントの重鎖の可変領域と第二のFabフラグメントの軽鎖の可変領域とが交換されているかまたは第二のFabフラグメントの重鎖の定常領域と第二のFabフラグメントの軽鎖の定常領域とが交換されているかのいずれかである)。この態様では、第三のFabフラグメントのC末端が、第一のFabフラグメントのN末端に接続されている。上で詳細に記載したように、Fabフラグメントは、重鎖または軽鎖を介して互いに接続され得る。一つの態様では、第三のFabフラグメントの重鎖のC末端が、ペプチドリンカーを介して第一のFabフラグメントの重鎖のN末端に接続されており；第一のFabフラグメントのC末端が、第二のFabフラグメントのN末端に接続されている(ここで、第二のFabフラグメントの重鎖の可変領域と第二のFabフラグメントの軽鎖の可変領域とが交換されているかまたは第二のFabフラグメントの重鎖の定常領域と第二のFabフラグメントの軽鎖の定常領域とが交換されているかのいずれかである)。第二のFabフラグメントの重鎖の可変ドメインと第二のFabフラグメントの軽鎖の可変ドメインとが交換されているかまたは第二のFabフラグメントの重鎖の定常ドメインと第二のFabフラグメントの軽鎖の定常ドメインとが交換されているかによって、異なる二重特異性抗体分子が存在しうる。
【００８３】
一つの態様では、第二のFabフラグメントの可変ドメインが交換されており(すなわち、第二のFabフラグメントはCrossFab(VHVL)であり)、3つのFabフラグメントの鎖がN末端からC末端の方向に以下の順序で接続されている：VHCH1-リンカー-VHCH1-リンカー-VLCH1。一つの態様では、二重特異性抗体は4つの鎖を含む：第三のFabフラグメントの軽鎖(VLCL)、第一のFabフラグメントの軽鎖(VLCL)、第二のFabフラグメントのVLCH1鎖にペプチドリンカーを介してそれ自体接続されている第一のFabフラグメントの重鎖に接続された第三のフラグメントの重鎖(VHCH1-リンカー-VHCH1-リンカー-VLCH1)、および第二のFabフラグメントのVHCL鎖。
【００８４】
一つの態様では、第二のFabフラグメントの定常ドメインが交換されており(すなわち、第二のFabフラグメントはCrossFab(CLCH1)であり)、3つのFabフラグメントの鎖がN末端からC末端の方向に以下の順序で接続されている：VHCH1-リンカー-VHCH1-リンカー-VHCL。一つの態様では、二重特異性抗体は4つの鎖を含む：第三のFabフラグメントの軽鎖(VLCL)、第一のFabフラグメントの軽鎖(VLCL)、第二のFabフラグメントのVHCL鎖にペプチドリンカーを介してそれ自体接続されている第一のFabフラグメントの重鎖に接続された第三のフラグメントの重鎖(VHCH1-リンカー-VHCH1-リンカー-VHCL)、および第二のFabフラグメントのVLCH1鎖。
【００８５】
一つの態様では、本発明の二重特異性抗体は、3つのFabフラグメントを含み、該FabフラグメントとリンカーとがN末端からC末端の方向に以下の順序で接続されている：Fabフラグメント2-リンカー-Fabフラグメント1-リンカー-Fabフラグメント3(ここで、第二のFabフラグメントの重鎖の可変領域と第二のFabフラグメントの軽鎖の可変領域とが交換されているかまたは第二のFabフラグメントの重鎖の定常領域と第二のFabフラグメントの軽鎖の定常領域とが交換されているかのいずれかである)。この態様では、第三のFabフラグメントのN末端が、第一のFabフラグメントのC末端に接続されている。上で詳細に記載したように、Fabフラグメントは、重鎖または軽鎖を介して互いに接続され得る。一つの態様では、第三のFabフラグメントの重鎖のN末端が、第一のFabフラグメントの重鎖のC末端にペプチドリンカーを介して接続されており；第一のFabフラグメントのN末端が、第二のFabフラグメントのC末端に接続されている(ここで、第二のFabフラグメントの重鎖の可変領域と第二のFabフラグメントの軽鎖の可変領域とが交換されているかまたは第二のFabフラグメントの重鎖の定常領域と第二のFabフラグメントの軽鎖の定常領域とが交換されているかのいずれかである)。第二のFabフラグメントの重鎖の可変ドメインと第二のFabフラグメントの軽鎖の可変ドメインとが交換されているかまたは第二のFabフラグメントの重鎖の定常ドメインと第二のFabフラグメントの軽鎖の定常ドメインとが交換されているかによって、異なる二重特異性抗体分子が存在しうる。
【００８６】
一つの態様では、第二のFabフラグメントの可変ドメインが交換されており(すなわち、第二のFabフラグメントはCrossFab(VHVL)であり)、3つのFabフラグメントの鎖がN末端からC末端の方向に以下の順序で接続されている：VLCH1-リンカー-VHCH1-リンカー-VHCH1。一つの態様では、二重特異性抗体は4つの鎖を含む：第三のFabフラグメントの軽鎖(VLCL)、第一のFabフラグメントの軽鎖(VLCL)、第一のFabフラグメントの重鎖にペプチドリンカーを介してそれ自体接続されている第一のフラグメントの重鎖に接続された第二のFabフラグメントのVLCH1鎖(VLCH1-リンカー-VHCH1-リンカー-VHCH1)、および第二のFabフラグメントのVHCL鎖。
【００８７】
一つの態様では、第二のFabフラグメントの定常ドメインが交換されており(すなわち、第二のFabフラグメントはCrossFab(CLCH1)であり)、3つのFabフラグメントの鎖がN末端からC末端の方向に以下の順序で接続されている：VHCL-リンカー-VHCH1-リンカー-VHCH1。一つの態様では、二重特異性抗体は4つの鎖を含む：第三のFabフラグメントの軽鎖(VLCL)、第一のFabフラグメントの軽鎖(VLCL)、第一のFabフラグメントの重鎖にペプチドリンカーを介してそれ自体接続されている第一のフラグメントの重鎖に接続された第二のFabフラグメントのVHCL鎖(VHCL-リンカー-VHCH1-リンカー-VHCH1)、および第二のFabフラグメントのVLCH1鎖。
【００８８】
別の態様では、第三のFabフラグメントが、第二のFabフラグメントの軽鎖または重鎖のN末端またはC末端に接続されている。一つの態様では、第三のFabフラグメントが、第二のFabフラグメントにペプチドリンカーを介して接続されている。該ペプチドリンカーは(G4S)2リンカーであることが好ましい。上に詳細に記載したように、Fabフラグメントは、重鎖または軽鎖を介して互いに接続され得る。
【００８９】
一つの態様では、本発明の二重特異性抗体は、3つのFabフラグメントを含み、該FabフラグメントとリンカーとがN末端からC末端の方向に以下の順序で接続されている：Fabフラグメント1-リンカー-Fabフラグメント2-リンカー-Fabフラグメント3(ここで、第二のFabフラグメントの重鎖の可変領域と第二のFabフラグメントの軽鎖の可変領域とが交換されているかまたは第二のFabフラグメントの重鎖の定常領域と第二のFabフラグメントの軽鎖の定常領域とが交換されているかのいずれかである)。一つの態様では、第三のFabフラグメントのN末端が、第二のFabフラグメントのC末端に接続されている。
【００９０】
別の態様では、第三のFabフラグメントの重鎖のC末端が、第二のFabフラグメントのN末端にペプチドリンカーを介して接続されており；第一のFabフラグメントのN末端が、第二のFabフラグメントのC末端に接続されており、第二のFabフラグメントの重鎖の可変領域と第二のFabフラグメントの軽鎖の可変領域とが交換されているかまたは第二のFabフラグメントの重鎖の定常領域と第二のFabフラグメントの軽鎖の定常領域とが交換されているかのいずれかである。
【００９１】
第二のFabフラグメントの重鎖の可変領域と第二のFabフラグメントの軽鎖の可変領域とが交換されているかまたは第二のFabフラグメントの重鎖の定常領域と第二のFabフラグメントの軽鎖の定常領域とが交換されているかによって、異なる二重特異性抗体分子が存在しうる。
【００９２】
一つの態様では、第二のFabフラグメントの可変ドメインが交換されており(すなわち、第二のFabフラグメントはCrossFab(VHVL)であり)、3つのFabフラグメントの鎖がN末端からC末端の方向に以下の順序で接続されている：VHCH1-リンカー-VLCH1-リンカー-VHCH1。一つの態様では、二重特異性抗体は4つの鎖を含む：第三のFabフラグメントの軽鎖(VLCL)、第一のFabフラグメントの軽鎖(VLCL)、第三のフラグメントの重鎖が第二のFabフラグメントのVLCH1鎖のN末端に接続され、該VLCH1鎖のC末端が第一のFabフラグメントの重鎖のN末端にペプチドリンカーを介して接続されたもの (VHCH1-リンカー-VLCH1-リンカー-VHCH1)、および第二のFabフラグメントのVHCL鎖。
【００９３】
一つの態様では、第二のFabフラグメントの定常ドメインが交換されており(すなわち、第二のFabフラグメントはCrossFab(CLCH1)であり)、3つのFabフラグメントの鎖がN末端からC末端の方向に以下の順序で接続されている：VHCH1-リンカー-VHCL-リンカー-VHCH1。一つの態様では、二重特異性抗体は4つの鎖を含む：第三のFabフラグメントの軽鎖(VLCL)、第一のFabフラグメントの軽鎖(VLCL)、第三のフラグメントの重鎖が第二のFabフラグメントのVHCL鎖のN末端に接続され、該VHCL鎖のC末端が第一のFabフラグメントの重鎖のN末端にペプチドリンカーを介して接続されたもの(VHCH1-リンカー-VHCL-リンカー-VHCH1)、および第二のFabフラグメントのVLCH1鎖。
【００９４】
本発明の一つの態様では、二重特異性抗体は、以下に詳細に記載するようなヒト化抗体である。
【００９５】
本発明の別の態様では、二重特異性抗体は、以下に詳細に記載するようなヒト抗体である。
【００９６】
第二の目的において、本発明は、本発明の二重特異性抗体を含む薬学的組成物に関する。
【００９７】
第三の目的において、本発明は、癌の処置のための本発明の二重特異性抗体に関する。別の態様では、薬剤としての二重特異性抗体の使用を提供する。この使用は、癌の処置のためのものであることが好ましい。
【００９８】
さらなる目的において、本発明は、本発明の二重特異性抗体の重鎖をコードする配列を含む核酸配列、本発明の二重特異性抗体の軽鎖をコードする配列を含む核酸配列、本発明の核酸配列を含む発現ベクター、および本発明のベクターを含む原核宿主細胞または真核宿主細胞に関する。さらに、抗体が産生されるように宿主細胞を培養する工程を含む、抗体の産生方法を提供する。
【００９９】
さらなる態様では、本発明の二重特異性抗体と細胞毒性剤とを含むイムノコンジュゲートを提供する。
【０１００】
さらなる態様では、上記態様のいずれかによる二重特異性抗体は、以下の節1〜5に記載するように、いずれの特徴も単独でまたは組み合わせて組み入れることができる。
【０１０１】
1. 抗体親和性
本明細書で提供する二重特異性抗体の標的抗原に対する親和性は、実施例に記載する方法に従って、表面プラズモン共鳴(SPR)により、BIAcore機器(GE Healthcare)等の標準的な計装、および組換え発現によって得られる受容体または標的タンパク質を用いて決定できる。あるいはまた、異なる受容体または標的抗原に対する二重特異性抗体の結合は、特定の受容体または標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えば、フローサイトメトリー(FACS)によって評価され得る。
【０１０２】
特定の態様では、本明細書で提供する二重特異性抗体は、≦1μΜ、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、または≦0.001nM(例えば、10-8M以下、例えば、10-8M〜10-13M、例えば、10-9M〜10-13M)の解離定数(KD)を有する。
【０１０３】
一つの態様によれば、KDは、BIACORE(商標登録)-2000またはBIACORE(商標登録)-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を25℃にて、約10の反応単位(RU)の固定化抗原CM5チップと共に用いる表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIACORE, Inc.)を、供給元の取扱説明書に従って、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(EDC)およびN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化する。抗原を10mM酢酸ナトリウム(pH 4.8)で5μg/ml(約0.2μΜ)まで希釈した後に、5μl/分の流速で注入して、およそ10反応単位(RU)の結合したタンパク質を得る。抗原注入後、1Mエタノールアミンを注入して未反応基をブロックする。反応速度測定のために、二倍連続希釈のFab(0.78nM〜500nM)を、0.05％ポリソルベート20(TWEEN-20(商標))界面活性剤(PBST)を有するPBSに、25℃にて、およそ25μl/minの流速で注入する。会合速度(kaまたはKon)および解離速度(kdまたはkoff)は、単純な1対1ラングミュア結合モデル(BIACORE(商標登録)評価ソフトウェア、バージョン3.2)を用いて、会合および解離センサーグラムを同時に適合させることによって計算する。平衡解離定数(KD)は、koff/kon比として計算される。例えば、Chenら, J.Mol.Biol.293：865-881(1999)を参照のこと。上記表面プラズモン共鳴アッセイによってオン速度が106 M-1S-1を超える場合、オン速度は、漸増濃度の抗原の存在下にて、25℃で20nMの抗抗原抗体(Fab形態)含有PBS(pH 7.2)における蛍光発光強度(励起＝295nm；発光＝340nm、16nmバンドパス)の増減を測定する蛍光消光技術を用いて、ストップフロー(stop-flow)を備えた分光光度計(Aviv Instruments)、または攪拌キュベットを有する8000シリーズSLM-AMINCO(商標)分光光度計(Thermo Spectronic)等の分光計で測定することによって決定できる。
【０１０４】
2. キメラおよびヒト化抗体
特定の態様では、本明細書で提供する二重特異性抗体はキメラ抗体である。特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第4,816,567号；およびMorrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81：6851-6855(1984)に記載されている。一例を挙げると、キメラ抗体は非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサル等の非ヒト霊長類に由来する可変領域)およびヒト定常領域を含む。別の例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変化している「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、それらの抗原結合フラグメントを含む。
【０１０５】
特定の態様では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的に、非ヒト抗体はヒト化されることで、非ヒト親抗体の特異性および親和性は保持したまま、ヒトに対する免疫原性が低減される。一般的に、ヒト化抗体は、HVR、例えば、CDR(またはその一部)が非ヒト抗体に由来し、FR(またはその一部)がヒト抗体配列に由来する1つまたは複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部も含む。一部の態様では、ヒト化抗体中の一部のFR残基は、非ヒト抗体(例えば、HVR残基が由来する抗体)に由来する対応残基と置換されて、例えば、抗体特異性または親和性を回復または改善する。
【０１０６】
ヒト化抗体およびその産生方法は、例えば、AlmagroおよびFransson, Front. Biosci. 13：1619-1633(2008)において概説されており、例えば、Riechmannら, Nature 332：323-329(1988)；Queenら, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86：10029-10033(1989)；米国特許第5,821,337号、同第7,527,791号、同第6,982,321号および同第7,087,409号；Kashmiriら, Methods 36：25-34(2005)(SDR(a-CDR)グラフティングを記載)；Padlan, Mol.Immunol.28：489-498(1991)( 「リサーフェシング(resurfacing)」を記載)；Dall'Acquaら, Methods 36：43-60(2005)(「FRシャッフリング(shuffling)」を記載)；ならびにOsbournら, Methods 36：61-68(2005)およびKlimkaら, Br. J. Cancer, 83：252-260(2000)( FRシャッフリングに対する「誘導選択(guided selection)」アプローチを記載)にさらに記載されている。
【０１０７】
ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域としては、「ベストフィット」法を用いて選択されたフレームワーク領域(例えば、Simsら J. Immunol. 151：2296(1993)を参照)；特定のサブグループの軽鎖または重鎖可変領域のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域(例えば、Carterら Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89：4285(1992)；およびPrestaら J. Immunol, 151：2623(1993)を参照)；ヒト成熟(体細胞変異した)フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系列フレームワーク領域(例えば、AlmagroおよびFransson、Front. Biosci. 13：1619-1633(2008)を参照)；ならびにFRライブラリーをスクリーニングすることによって誘導されるフレームワーク領域(例えば、Bacaら, J. Biol. Chem. 272：10678-10684(1997)、およびRosokら, J. Biol. Chem. 271：22611-22618(1996)を参照)が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０８】
3. ヒト抗体
特定の態様では、本明細書で提供する二重特異性抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当該分野で公知の様々な技術を用いて産生できる。ヒト抗体は、van Dijkおよびvan de Winkel、Curr. Opin. Pharmacol. 5：368-74(2001)、ならびにLonberg、Curr. Opin. Immunol. 20：450-459(2008)に全般的に記載されている。
【０１０９】
ヒト抗体は、抗原接種に反応してヒト可変領域を有するインタクトなヒト抗体またはインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することで調製してもよい。このような動物は、典型的に、内因性免疫グロブリン遺伝子座に取って代わるか、または染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含む。このようなトランスジェニックマウスにおいては、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、概して不活化されてきた。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の概説については、Lonberg, Nat. Biotech. 23：1117-1125(2005)を参照のこと。例えば、XENOMOUSE(商標)技術を記載する米国特許第6,075,181号および同第6,150,584号；HUMAB(商標登録)技術を記載する米国特許第5,770,429号；K-M MOUSE(商標登録)技術を記載する米国特許第7,041,870号、ならびにVELOCIMOUSE(商標登録)技術を記載する米国特許出願公報第US 2007/0061900号も参照のこと。このような動物によって生成されるインタクトな抗体に由来するヒト可変領域を、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせて、さらに改変してもよい。
【０１１０】
ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によっても作ることができる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒトミエローマおよびマウス-ヒトヘテロミエローマ(heteromyeloma)細胞株が記載されている。(例えば、Kozbor J. Immunol, 133：3001(1984)；Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63(Marcel Dekker, Inc., New York,1987)；およびBoernerら, J. Immunol., 147：86(1991)を参照)。ヒトB-cell ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体も、Liら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,103：3557-3562(2006)に記載されている。さらなる方法としては、例えば、米国特許第7,189,826号(ハイブリドーマ細胞株由来のモノクローナルヒトIgM抗体の産生を記載)、およびNi, Xiandai Mianyixue, 26(4)：265-268(2006)(ヒト-ヒトハイブリドーマを記載)に記載されているものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術(トリオーマ技術)も、VollmersおよびBrandlein, Histology and Histopathology, 20(3)：927-937(2005)、ならびにVollmersおよびBrandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3)：185-91(2005)に記載されている。
【０１１１】
ヒト抗体は、ヒト由来ファージ提示ライブラリーから選択されたFvクローン可変ドメイン配列を単離することによっても生成され得る。その後、このような可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択する技術を以下に記載する。
【０１１２】
4. ライブラリー由来抗体
本発明の二重特異性抗体は、コンビナトリアルライブラリーを所望の活性を有する抗体についてスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージ提示ライブラリーを生成し、このようなライブラリーを、所望の結合特徴を所有する抗体についてスクリーニングするために、多種多様な方法が当該分野において公知である。このような方法は、例えば、Hoogenboomら, Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brienら編、Human Press、Totowa、NJ、2001)において概説されており、例えば、McCaffertyら, Nature 348：552-554；Clacksonら, Nature 352：624-628(1991)；Marksら, J. Mol. Biol. 222：581-597(1992)；MarksおよびBradbury, Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo編、Human Press, Totowa, NJ, 2003)；Sidhuら, J. Mol. Biol. 338(2)：299-310(2004)；Leeら, J. Mol. Biol. 340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34)：12467-12472(2004)；ならびにLeeら, J. Immunol. Methods 284(1-2)：119-132(2004)に記載されている。
【０１１３】
特定のファージ提示法では、VHおよびVL遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により別々にクローニングされ、ファージライブラリーにおいてランダムに組み換えられ、これを、その後、Winterら, Ann. Rev. Immunol., 12：433-455(1994)に記載されているように抗原結合ファージについてスクリーニングできる。ファージは、典型的に、抗体フラグメントを、一本鎖Fv(scFv)フラグメントまたはFabフラグメントのいずれかとして提示する。免疫された供給源に由来するライブラリーは、ハイブリドーマを構築することを必要とせずに、免疫原に対して親和性の高い抗体を提供する。あるいはまた、Griffithsら, EMBO J 12：725-734(1993)に記載されるように、ナイーブレパートリーを(例えば、ヒトから)クローニングして、どのような免疫付与も無しに、単一供給源の抗体から広範囲の非自己抗原および自己抗原まで提供できる。最後に、HoogenboomおよびWinter, J. Mol. Biol, 227：381-388(1992)に記載されるように、ナイーブライブラリーは、幹細胞由来の再構成されていないV遺伝子セグメントをクローニングして、高度可変CDR3領域をコードしかつインビトロでの再構成を達成するランダム配列を含むPCRプライマーを使用することによって合成的に作ることもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載している特許文献としては、例えば、米国特許第5,750,373号、ならびに米国特許公報第2005/0079574号、同第2005/0119455号、同第2005/0266000号、同第2007/0117126号、同第2007/0160598号、同第2007/0237764号、同第2007/0292936号、および同第2009/0002360号が挙げられる。
【０１１４】
本明細書において、ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体フラグメントは、ヒト抗体またはヒト抗体フラグメントとみなす。
【０１１５】
5. 抗体改変体
特定の態様において、本明細書において提供する二重特異性抗体のアミノ酸配列改変体を検討する。例えば、二重特異性抗体の結合親和性および/または他の生物学的性質を改善することが望ましいことがある。二重特異性抗体のアミノ酸配列改変体は、二重特異性抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入するか、またはペプチド合成よって調製され得る。このような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内における残基の欠失、および/または挿入、および/または置換が挙げられる。最終構築物が所望の特徴(例えば、抗原結合)を所有するのであれば、最終構築物にたどり着くために、欠失、挿入および置換のいずれの組合せも行うことができる。
【０１１６】
a) 置換、挿入、および欠失改変体
特定の態様では、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体改変体を提供する。置換型突然変異誘発のための目的の部位として、HVRおよびFRが挙げられる。保存的置換を、表1の「保存的置換」という見出しの下に示す。より実質的な変化は、表1の「例示的な置換」という見出しの下に示し、アミノ酸側鎖クラスに関連して以下にさらに記載する。アミノ酸置換を目的の抗体に導入し、産物を所望の活性(例えば、保持/改善された抗原結合、または低減した免疫原性)についてスクリーニングすることができる。
【０１１７】
（表１）
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【０１１８】
アミノ酸は、側鎖の共通する性質によってグループ分けできる。
(1)疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)塩基性：His、Lys、Arg；
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
【０１１９】
非保存的置換は、上記クラスのうちの1つに属するメンバーを別のクラスのものと交換することを伴う。
【０１２０】
置換型改変体の1つのタイプは、親抗体(例えば、ヒト化またはヒト抗体)の1つまたは複数の超可変領域残基を置換することを伴う。概して、結果的に得られ、以後の研究のために選択される改変体は、親抗体に関連した特定の生物学的性質(例えば、増加した親和性、低減した免疫原性)が改変(例えば、改善)されているか、および/または親抗体の特定の生物学的性質が実質的に保持されている。例示的な置換型改変体としては、例えば、本明細書に記載するようなファージ提示に基づく親和性成熟技術を使用して都合よく生成され得る親和性成熟抗体がある。簡単に言うと、1つまたは複数のHVR残基を突然変異させ、ファージ上で改変型抗体を提示させ、特定の生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングする。
【０１２１】
変更(例えば、置換)は、例えば、抗体親和性を改善するために、HVRにおいて行ってもよい。このような変更は、HVR「ホットスポット」(すなわち、体細胞成熟過程の間に高頻度に突然変異を生じるコドンにコードされる残基)(例えば、Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207：179-196(2008)を参照)、および/またはSDR(a-CDR)において行ってもよく、得られた改変型VHもしくはVLを結合親和性についてテストする。二次ライブラリーを構築し、そこから再選択する親和性成熟は、例えば、Hoogenboomら Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brienら編、Human Press, Totowa, NJ,(2001))に記載されている。親和性成熟の一部の態様では、多種多様な方法(例えば、エラープローンPCR、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発)のいずれかによって、成熟のために選択された可変遺伝子に多様性を導入する。次に、二次ライブラリーを作製する。その後、ライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を有するあらゆる抗体改変体を同定する。多様性を導入する別の方法は、数個のHVR残基(例えば、一度に4〜6残基)がランダム化されるHVR特異的なアプローチを伴う。抗原結合に関与するHVR残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発またはモデル化を用いて特異的に同定され得る。特に、CDR-H3およびCDR-L3は標的とされることが多い。
【０１２２】
特定の態様では、置換、挿入または欠失は、そのような変更によって抗体が抗原に結合する能力が実質的に低減されない限り、1つまたは複数のHVR内で生じてもよい。例えば、結合親和性を実質的に低減しない保存的変更(例えば、本明細書で提供する保存的置換)をHVRで行ってもよい。このような変更は、HVR「ホットスポット」またはSDR以外であってもよい。上で提供した改変型VHおよびVL配列の特定の態様では、各HVRは変更されていないか、1つ以下、2つ以下または3つ以下のアミノ酸置換しか含まない。
【０１２３】
突然変異誘発のために標的とされ得る抗体の残基または領域を同定するための有用な方法は、CunninghamおよびWells(1989)Science, 244：1081-1085に記載されるように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基または標的残基グループ(例えば、arg、asp、his、lysおよびglu等の荷電残基)が同定され、中性または負電荷を持つアミノ酸(例えば、アラニンまたはポリアラニン)によって置換され、抗体と抗原との相互作用に影響があるか否かを決定する。最初の置換に対して機能的感度を示したアミノ酸位置においてさらなる置換を導入してもよい。あるいはまた、またはさらに、抗原-抗体複合体の結晶構造によって、抗体と抗原との間の接触点を同定する。このような接触残基および隣接する残基は、置換の候補として標的とされるかまたは排除される。改変体をスクリーニングして、所望の性質を含むか否かを決定できる。
【０１２４】
アミノ酸配列挿入としては、1残基から100以上の残基を含むポリペプチドの長さにわたるアミノ末端および/またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または多数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、N末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入型改変体としては、抗体のN末端またはC末端の、抗体の血清半減期を延ばす酵素(例えば、ADEPT用)またはポリペプチドへの融合が挙げられる。
【０１２５】
b) システインによって操作された抗体改変体
特定の態様では、システインによって操作された二重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体の1つまたは複数の残基がシステイン残基で置換された「thioMAb」を作ることが望ましいことがある。特定の態様では、置換残基は、二重特異性抗体の接触可能な部位に生じる。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が、抗体の接触可能な部位に配置され、本明細書にさらに記載するように、抗体を他の部分(薬物部分またはリンカー-薬物部分等)とコンジュゲートさせてイムノコンジュゲートを作るために使用され得る。特定の態様では、以下の残基のいずれか1つまたは複数がシステインで置換され得る：軽鎖のV205(Kabatナンバリング)、および重鎖のA118(EUナンバリング)。システインによって操作された抗体は、例えば、米国特許第7,521,541号に記載のように生成され得る。
【０１２６】
c) 抗体誘導体
特定の態様では、本明細書で提供する二重特異性抗体をさらに改変して、当該分野で公知かつ利用可能な追加の非タンパク質性部分を含むようにしてもよい。二重特異性抗体の誘導体化に適した部分としては、水溶性ポリマーが挙げられるがこれに限定されない。水溶性ポリマーの限定しない例としては、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたはランダム共重合体のいずれか)、デキストランまたはポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレン(propropylene)グリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド(prolypropylene oxide)/エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性ゆえに製造において有利である可能性がある。ポリマーは、あらゆる分子量のものであり得、分岐していてもまたは分岐していなくてもよい。抗体に付着させるポリマーの数は異なることもあり、1つを上回るポリマーが付着している場合、それらは同じ分子であってもまたは異なる分子であってもよい。全般的に、誘導体化に使用するポリマーの数および/または種類は、改善する抗体の特定の性質または機能、抗体誘導体が規定された条件下で治療に使用されるか否か、等を含む(ただし、これらに限定されない)考慮に基づいて決定することができる。
【０１２７】
別の態様では、放射線照射により選択的に加熱され得る、二重特異性抗体と非タンパク質性部分とのコンジュゲートを提供する。一つの態様では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである(Kamら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102：11600-11605(2005))。放射線は、あらゆる波長のものでもあり得、通常の細胞には害を加えず、抗体-非タンパク質性部分の近位にある細胞が死滅する温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２８】
B. 組換え方法および組成物
本発明の二重特異性抗体は、例えば、固体状ペプチド合成(例えば、メリフィールド固相合成)または組換え産生によって得ることができる。組換え産生には、例えば、上述したような二重特異性抗体(フラグメント)をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを単離し、1つまたは複数のベクターに挿入して、宿主細胞中でさらにクローニングおよび/または発現させる。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を用いて簡単に単離および配列決定され得る。一つの態様では、本発明のポリヌクレオチドを1つまたは複数含むベクター(好ましくは発現ベクター)を提供する。当業者に周知の方法を使用して、二重特異性抗体(フラグメント)のコード配列を、適切な転写/翻訳制御シグナルと共に含む発現ベクターを構築できる。これらの方法としては、インビトロ組換えDNA技術、合成技術、およびインビボ組換え/遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Maniatisら, MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.(1989)；およびAusubelら, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y(1989)に記載の技術を参照のこと。発現ベクターは、プラスミドの一部、ウイルスの一部であり得るか、または核酸フラグメントであり得る。発現ベクターは、二重特異性抗体(フラグメント)をコードするポリヌクレオチド(すなわち、コード領域)が、プロモーターおよび/または他の転写もしくは翻訳制御エレメントと機能的に会合するようにクローニングされる発現カセットを含む。本明細書で使用する「コード領域」とは、アミノ酸に翻訳されるコドンで構成される核酸の部分である。「終止コドン」(TAG、TGAまたはTAA)はアミノ酸に翻訳されないが、存在すればそれもコード領域の一部であるとみなされ得る。ただし、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、5'および3'非翻訳領域等の隣接配列は、コード領域の一部ではない。単一のポリヌクレオチド構築物(例えば、単一のベクター上)、または別々のポリヌクレオチド構築物(例えば、別々の(異なる)ベクター上)に、2つ以上のコード領域が存在し得る。さらに、任意のベクターが、単一のコード領域を含んでいてもよいし、または2つ以上のコード領域を含んでいてもよい(例えば、本発明のベクターは、1つまたは複数のポリペプチドをコードしてもよく、これらは翻訳後にまたは翻訳と同時に、タンパク質分解切断により最終タンパク質に分離される。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、本発明の二重特異性抗体(フラグメント)、その改変体、またはその誘導体をコードするポリヌクレオチドと融合されているか融合されていない異種コード領域をコードし得る。異種コード領域は、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメイン等の特化したエレメントまたはモチーフを含み得るがこれらに限定されない。機能的な会合とは、遺伝子産物(例えば、ポリペプチド)の発現が調節配列の影響または制御下におかれるように、遺伝子産物のコード領域が1つまたは複数の調節配列と会合した場合のことを言う。2つのDNAフラグメント(ポリペプチドコード領域およびそれと会合したプロモーター)が「機能的に会合」しているとは、プロモーター機能を誘導することにより、所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写��生じ、かつ2つのDNAフラグメントの連結の性質によって遺伝子産物の発現を指示する発現調節配列の能力が妨げられないか、またはDNA鋳型の転写される能力が妨げられない場合を言う。したがって、プロモーター領域がポリペプチドをコードする核酸と機能的に会合しているとは、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことが可能である場合に言える。プロモーターは、所定の細胞においてのみDNAの実質的な転写を指示する細胞特異性プロモーターであり得る。プロモーター以外の転写制御エレメント(例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終止シグナル)がポリヌクレオチドと機能的に会合して細胞特異的転写を指示してもよい。適切なプロモーターおよびその他の転写制御領域は本明細書において開示する。多種多様な転写制御領域が当業者に公知である。これらとしては、サイトメガロウイルス由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメント(例えば、イントロンAと連結した前初期プロモーター)、サルウイルス40(例えば、初期プロモーター)、ならびにレトロウイルス(例えば、ラウス肉腫ウイルス等)等(ただしこれらに限定されない)の脊椎動物細胞で機能する転写制御領域が挙げられるがこれらに限定されない。その他の転写制御領域としては、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、およびウサギa-グロビン等の脊椎動物遺伝子由来のもの、ならびに真核細胞における遺伝子発現を制御可能なその他の配列が挙げられる。さらなる適切な転写制御領域としては、組織特異性プロモーターおよびエンハンサー、ならびに誘導性プロモーター(例えば、テトラサイクリンを誘導可能なプロモーター)が挙げられる。同様に、多種多様な翻訳制御エレメントが当業者に公知である。これらとしては、リボソーム結合部位、翻訳開始および終止コドン、ならびにウイルスシステムに由来するエレメント(特に、内部リボソーム侵入部位、またはIRES、CITE配列とも称される)が挙げられるが、これらに限定されない。発現カセットは、複製起点、および/またはレトロウイルス長鎖末端反復配列(LTR)、もしくはアデノ随伴ウイルス(AAV)逆位末端反復配列(ITR)等の染色体組み込みエレメント等の他の特徴も含み得る。
【０１２９】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドの分泌を指示する分泌またはシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と会合しうる。例えば、二重特異性抗原結合分子の分泌が望ましい場合、シグナル配列をコードするDNAが、本発明の二重特異性抗体またはそのフラグメントをコードする核酸の上流に配置され得る。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、伸長中のタンパク質鎖の輸送が粗面小胞体にわたって開始されると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドにおいて、一般的に、シグナルペプチドがポリペプチドのN末端に融合していること、それが、翻訳されたポリペプチドから切断されて、ポリペプチドの分泌形態または「成熟」形態を産生することを承知している。特定の態様では、天然シグナルペプチド(例えば、免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖のシグナルペプチド)を使用するか、またはそれと機能的に会合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持しているこの配列の機能的誘導体が使用される。あるいはまた、異種哺乳動物シグナルペプチド、またはその機能的誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子(TPA)またはマウスβ-グルクロニダーゼのリーダー配列で置換することができる。
【０１３０】
その後の精製を容易にする(例えば、ヒスチジンタグ)ため、または二重特異性抗体の標識化を手助けするために使用され得る短いタンパク質配列をコードするDNAが、ポリヌクレオチドをコードする二重特異性抗体(フラグメント)内またはその端部において含まれ得る。
【０１３１】
さらなる態様では、本発明の1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。特定の態様では、本発明の1つまたは複数のベクターを含む宿主細胞を提供する。ポリヌクレオチドおよびベクターには、ポリヌクレオチドおよびベクターのそれぞれに関連して本明細書に記載するあらゆる特徴を単独でまたは組み合わせて組み込むことができる。このような態様の一つでは、宿主細胞が、本発明の二重特異性抗体(の一部)をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む(例えば、該ベクターで形質転換またはトランスフェクトされている)。本明細書で使用する「宿主細胞」という用語は、本発明の二重特異性抗体またはそのフラグメントを生成するように操作できるあらゆる種類の細胞システムを指す。二重特異性抗体を複製およびその発現を支持するのに適した宿主細胞は当該分野で周知である。このような細胞は、特定の発現ベクターで適切にトランスフェクトまたは形質導入され得、大規模発酵槽に播種するために大量のベクター含有細胞を増殖させて、臨床応用のために十分な量の二重特異性抗体を得ることができる。適切な宿主細胞としては、大腸菌(E. coli)等の原核微生物、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、昆虫細胞等の様々な真核細胞が挙げられる。例えば、特にグリコシル化が必要でない場合には、ポリペプチドは細菌において産生され得る。発現後、ポリペプチドは、細菌細胞ペーストから可溶性画分に単離してさらに精製できる。原核生物に加えて、糸状菌または酵母等の真核微生物は、ポリペプチドコードベクターに適したクローニングまたは発現宿主であり、グリコシル化経路の「ヒト化」によって部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドを産生する真菌および酵母株が挙げられる。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414(2004)、およびLiら, Nat Biotech 24, 210-215(2006)を参照のこと。(グリコシル化)ポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物(無脊椎動物および脊椎動物)にも由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞と共に、特にヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞のトランスフェクションのために、使用できる多数のバキュロウイルス株が同定されている。植物細胞培養物も宿主として利用できる。例えば、米国特許第5,959,177号、同第6,040,498号、同第6,420,548号、同第7,125,978号、および同第6,417,429号(トランスジェニック植物で抗体を産生するためのPLANTIBODY(商標)技術を記載)を参照のこと。脊椎動物細胞も宿主として使用できる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株のその他の例として、SV40で形質転換されたサル腎臓CV1系統(COS-7)；ヒト胎児腎臓系統(例えば、Grahamら, J Gen Virol 36、59(1977)に記載の293または293T細胞)、ベビーハムスター腎臓細胞(BHK)、マウスセルトリ細胞(例えば、Mather, Biol Reprod 23, 243-251(1980)に記載のTM4細胞)、サル腎臓細胞(CV1)、アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76)、ヒト子宮頸癌細胞(HELA)、イヌ腎臓細胞(MDCK)、バッファローラット肝細胞(BRL3A)、ヒト肺細胞(W138)、ヒト肝細胞(Hep G2)、マウス乳腺腫瘍細胞(MMT 060562)、TRI細胞(例えば、Matherら, Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68(1982)に記載)、MRC 5細胞、およびFS4細胞がある。その他の有用な哺乳動物宿主���胞株としては、dhfr-CHO細胞(Urlaubら, Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216(1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞；およびYO、NS0、P3X63およびSp2/0等のミエローマ細胞株が挙げられる。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株についての概説としては、例えば、YazakiおよびWu、Methods in Molecular Biology, Vol. 248(B.K.C. Lo編、Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268(2003)を参照のこと。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、ほんの一部として、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞および植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、または培養植物もしくは動物組織中に含まれる細胞も挙げられる。一つの態様では、宿主細胞は、真核細胞、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胎児腎臓(HEK)細胞またはリンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)等の哺乳動物細胞である。これらのシステムにおいて外来遺伝子を発現させる標準的技術は当該分野で公知である。抗体等の抗原結合ドメインの重鎖または軽鎖のいずれかを含むポリペプチドを発現する細胞を操作して、他方の抗体鎖も発現させるよう、発現産物が重鎖および軽鎖の両方を有する抗体となるようにしてもよい。一つの態様では、本発明による二重特異性抗体を産生する方法が提供され、該方法は、本明細書で提供するような二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程、および該宿主細胞(または宿主細胞培養培地)から二重特異性抗体を回収する工程を含む。
【０１３２】
二重特異性抗体のコンポーネントは、互いに遺伝子的に融合される。二重特異性抗体は、コンポーネントが互いに直接的にまたはリンカー配列を介して間接的に融合されるように設計され得る。リンカーの組成および長さは当該分野で周知の方法によって決定でき、その効力についてテストされてもよい。二重特異性抗体の異なるコンポーネント間のリンカー配列の例は、本明細書で提供する配列において見つけることができる。所望であれば、さらなる配列を含むことで切断部位を組み込んで、個別の融合コンポーネント(例えば、エンドペプチダーゼ認識配列)を分離してもよい。
【０１３３】
特定の態様では、二重特異性抗体の1つまたは複数の抗原結合部分が、抗原決定基に結合可能な少なくとも1つの抗体可変領域を含む。可変領域は、天然または非天然抗体およびそのフラグメントの一部を形成し、それらに由来し得る。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生方法は、当該分野で周知である(例えば、HarlowおよびLane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照)。非天然抗体は、固相-ペプチド合成を使用して構築してもよく、組換えによって産生してもよく(例えば、米国特許第4,186,567号に記載のように)、または例えば、可変重鎖および可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得てもよい(例えば、McCaffertyに発行された米国特許第5,969,108号を参照)。
【０１３４】
本発明の二重特異性抗体において、あらゆる動物種の抗体、抗体フラグメント、抗原結合ドメインまたは可変領域が使用できる。本発明において有用な、限定されない抗体、抗体フラグメント、抗原結合ドメイン、または可変領域は、マウス、霊長類、またはヒト起源のものであり得る。抗体がヒトへの適用を意図する場合、抗体の定常領域がヒト由来のものであるキメラ形態の抗体が使用され得る。ヒト化または完全にヒト形態の抗体も、当該分野で周知の方法により調製され得る(例えば、Winterに発行された米国特許第5,565,332号を参照)。ヒト化は、以下を含む(ただし、これらに限定されない)様々な方法によって達成され得る：(a)非ヒト(例えば、ドナー抗体)CDRをヒト(例えば、レシピエント抗体)フレームワークおよび定常領域に、決定的なフレームワーク残基(例えば、良好な抗原結合親和性もしくは抗体機能を保持するのに重要となるもの)を保持するかもしくは保持しないで、グラフティングする、(b)非ヒト特異性決定領域(SDRもしくはa-CDR；抗体-抗原相互作用にとって決定的な残基)のみをヒトフレームワークおよび定常領域にグラフティングする、または(c)非ヒト可変ドメイン全体をグラフティングするが、表面残基の置換によりヒト様セクションで「覆う(cloaking)」。ヒト化抗体およびその産生方法は、例えば、AlmagroおよびFransson, Front Biosci 13, 1619-1633(2008)で概説されており、例えば、さらに、Riechmannら, Nature 332, 323-329(1988)；Queenら, Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033(1989)；米国特許第5,821,337号、同第7,527,791号、同第6,982,321号、および同第7,087,409号；Jonesら, Nature 321, 522-525(1986)；Morrisonら, Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855(1984)；MorrisonおよびOi、Adv Immunol 44, 65-92(1988)；Verhoeyenら, Science 239, 1534-1536(1988)；Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217(1994)；Kashmiriら, Methods 36, 25-34(2005)(SDR(a-CDR)グラフティングを記載)；Padlan, Mol Immunol 28, 489-498(1991)(「リサーフェシング」を記載)；Dall'Acquaら, Methods 36, 43-60(2005)(「FRシャッフリング」を記載)；ならびにOsbournら, Methods 36, 61-68(2005)およびKlimkaら, Br J Cancer 83, 252-260(2000)( FRシャッフリングに対する「誘導選択」アプローチを記載)に記載されている。ヒト抗体およびヒト可変領域は、当該分野で公知の様々な技術を用いて産生できる。ヒト抗体は、全般的に、van Dijkおよびvan de Winkel、Curr Opin Pharmacol 5, 368-74(2001)、ならびにLonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459(2008)に記載さている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法で産生されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成し、そこから誘導され得る(例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照)。ヒト抗体およびヒト可変領域は、抗原接種に反応してヒト可変領域を有するインタクトなヒト抗体またはインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することでも調製され得る(例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125(2005)を参照)。ヒト抗体およびヒト可変領域は、ヒト由来ファージ提示ライブラリーから選択されるFvクローン可変領域配列を単離することによっても精製され得る(例えば、Hoogenboomら, Methods in Molecular Biology 178, 1-37(O'Brienら編、Human Press, Totowa, NJ, 2001)；およびMcCaffertyら, Nature 348, 552-554；Clacksonら, Nature 352, 624-628(1991)を参照)。ファージは、典型的に、抗体フラグメントを、一本鎖Fv(scFv)フラグメントま��はFabフラグメントのいずれかとして提示する。
【０１３５】
特定の態様では、例えば、米国特許出願公報第2004/0132066号(参照によりその内容全体が本明細書に組み入れられる)に開示されている方法に従って、本発明の二重特異性抗体が操作されて、結合親和性を向上させる。本発明の二重特異性抗体が特異的な抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ(EL1SA)または当業者にとってなじみのある他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴技術(BIACORE T100システム上で分析)(Liljebladら, Glyco J 17, 323-329(2000))、および従来の結合アッセイ(Heeley, Endocr Res 28, 217-229(2002))のいずれかによって測定できる。競合アッセイを使用して、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する、抗体(例えば、CD3への結合についてV9抗体と競合する抗体)、抗体フラグメント、抗原結合ドメイン、または可変ドメインを同定できる。特定の態様では、このような競合抗体は、参照抗体が結合するのと同じエピトープ(例えば、線状または立体構造エピトープ)に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングする例示的な方法の詳細は、Morris(1996) "Epitope Mapping Protocols", Methods in Molecular Biology vol. 66(Humana Press, Totowa, NJ)に示されている。例示的な競合アッセイでは、固定化抗原(例えば、CD3)を、抗原に結合する第一の標識化抗体(例えば、V9抗体)、および抗原への結合について第一の抗体と競合する能力がテストされる第二の非標識化抗体を含む溶液中でインキュベートする。第二の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在し得る。対照として、固定化抗原を、第一の標識化抗体を含むが、第二の非標識化抗体は含まない溶液中でインキュベートする。第一の抗体が抗原へ結合可能な条件下でのインキュベーションの後、過剰量の未結合抗体を除去し、固定化抗原と会合した標識の量を測定する。テストサンプル中の固定化抗原と会合した標識の量が対照サンプルと比べて実質的に低減した場合には、抗原への結合について第二の抗体が第一の抗体と競合していることを示す。HarlowおよびLane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照のこと。
【０１３６】
本明細書に記載するように調製した二重特異性抗体を、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等の当該分野で公知の技術により精製してもよい。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、正味電荷、疎水性、親水性等の因子に一部依存して決まり、当業者には明らかである。抗体のアフィニティークロマトグラフィー精製のためには、二重特異性抗体が結合するリガンド、受容体、または抗原が使用できる。例えば、本発明の二重特異性抗体のアフィニティークロマトグラフィー精製のために、プロテインAまたはプロテインGを有するマトリックスが使用され得る。連続的なプロテインAまたはGアフィニティークロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、本質的に実施例に記載のように、二重特異性抗体を単離できる。二重特異性抗体の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー等を含む多種多様な周知分析法のいずれかにより決定され得る。
【０１３７】
C. アッセイ
本明細書で示す二重特異性抗体は、それらの物理的/化学的性質、および/または生物学的活性について、当該分野で公知の様々なアッセイにより、同定、スクリーニング、または特徴付けされ得る。
【０１３８】
1. 結合アッセイおよびその他のアッセイ
一局面では、本発明の二重特異性抗体を、例えば、EL1SA、ウェスタンブロット等の公知方法によって、抗原結合活性についてテストする。
【０１３９】
別の局面では、競合アッセイを使用して、第一または第二の抗原への結合について、特定の抗体と競合する抗体を同定してもよい。特定の態様では、このような競合抗体は、特定の抗体が結合するのと同じエピトープ(例えば、線状または立体構造エピトープ)に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングする例示的な方法の詳細は、Methods in Molecular Biology vol. 66(Humana Press, Totowa, NJ)掲載のMorris(1996) "Epitope Mapping Protocols"に示されている。
【０１４０】
2. 活性アッセイ
一局面では、生物学的活性を有する二重特異性抗体を同定するためのアッセイを提供する。生物学的活性としては、例えば、標的細胞の溶解、またはアポトーシスの誘導が挙げられる。インビボおよび/またはインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体も提供する。
【０１４１】
特定の態様では、本発明の二重特異性抗体を、そのような生物学的活性についてテストする。細胞溶解の検出(例えば、LDH放出の測定による)、またはアポトーシスの検出(例えば、TUNELアッセイを使用する)のためのアッセイは、当該分野で周知である。
【０１４２】
D. イムノコンジュゲート
本発明は、化学療法剤もしくは薬物、成長阻害剤、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはそれらのフラグメント)、あるいは放射性同位体等の1つまたは複数の細胞毒性剤とコンジュゲートしている本発明の二重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートも提供する。
【０１４３】
一つの態様では、イムノコンジュゲートとは、抗体が、以下に挙げる(ただし、これらに限定されない)1つまたは複数の薬物とコンジュゲートした抗体-薬物コンジュゲート(ADC)である：メイタンシノイド(米国特許第5,208,020号、同第5,416,064号、および欧州特許第EP0 425 235 B1号を参照)；モノメチルアウリスタチン薬物部分DEおよびDF(MMAEおよびMMAF)等(米国特許第5,635,483号、同第5,780,588号、および同第7,498,298号を参照)のアウリスタチン；ドラスタチン；カリケアミシンまたはその誘導体(米国特許第5,712,374号、同第5,714,586号、同第5,739,116号、同第5,767,285号、同第5,770,701号、同第5,770,710号、同第5,773,001号および同第5,877,296号；Hinmanら, Cancer Res. 53：3336-3342(1993)；ならびにLodeら, Cancer Res. 58：2925-2928(1998)を参照)；ダウノマイシンまたはドキソルビシン等のアントラサイクリン(Kratzら, Current Med. Chem. 13：477-523(2006)；Jeffreyら, Bioorganic & Med. Chem. Letters 16：358-362(2006)；Torgovら, Bioconj. Chem. 16：717-721(2005)；Nagyら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97：829-834(2000)；Dubowchikら, Bioorg. & Med. Chem. Letters 12：1529-1532(2002)；Kingら, J. Med. Chem. 45：4336-4343(2002)；および米国特許第6,630,579号を参照)；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセルおよびオルタタキセル等のタキサン；トリコテセン；ならびにCC1065。
【０１４４】
別の態様では、イムノコンジュゲートは、以下に挙げる(ただし、これらに限定されない)酵素活性毒素またはその断片とコンジュゲートした、本明細書に記載の二重特異性抗体を含む：ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素A鎖(緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデッシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギリ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチンタンパク質、アメリカヤマゴボウ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、およびPAP-S)、ニガウリ(momordica charantia)阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ(sapaonaria officinalis)阻害剤、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセン(tricothecene)。
【０１４５】
別の態様では、イムノコンジュゲートは、本明細書に記載の、放射性原子とコンジュゲートして放射性コンジュゲートを形成する二重特異性抗体を含む。多種多様な放射性同位体が放射性コンジュゲートの作製ために利用可能である。例としては、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212およびLuの放射性同位体が挙げられる。放射性コンジュゲートを検出に使用する場合には、シンチグラフィー検査のための放射性原子(例えば、tc99mもしくはI123)、または同じくヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガンもしくは鉄等の核磁気共鳴(NMR)画像化(磁気共鳴画像化、mriとしても知られている)のためのスピン標識を含み得る。 
【０１４６】
二重特異性抗体と細胞毒性剤とのコンジュゲートは、 N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-l-カルボキシレート(SMCC)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(アジピミド酸ジメチルHCl等)、活性エステル(スベリン酸ジスクシンイミジル等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トルエン2,6-ジイソシアネート等)、およびビス-活性フッ素化合物(1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン等)等の多種多様な二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製され得る。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら, Science 238：1098(1987)に記載のように調製できる。炭素-14標識化1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸(MX-DTPA)は、放射性ヌクレオチドを抗体にコンジュゲーションさせるための例示的なキレート剤である。W094/11026を参照のこと。リンカーは、細胞中で細胞毒性薬物を放出し易くする「切断可能リンカー」であり得る。例えば、酸分解リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光分解リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー(Chariら, Cancer Res. 52：127-131(1992)；米国特許第5,208,020号)が使用され得る。
【０１４７】
本明細書でいうイムノコンジュゲートまたはADCとは、(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aから)市販されているBMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、およびスルホ-SMPB、ならびにSVSB(スクシンイミジル-(4-ビニルスルホン)ベンゾエート)を含む(ただし、これらに限定されない)架橋剤試薬を用いて調製されるコンジュゲートを明示している(ただし、これらに限定されない)。
【０１４８】
E. 診断および検出のための方法および組成物
特定の態様では、本明細書で提供する二重特異性抗体のいずれもが、生物学的サンプル中の第一および/または第二の抗原の存在を検出するのに有用である。本明細書で言う「検出する」という用語は、定量的または定性的検出を包含する。特定の態様では、生物学的サンプルは、細胞または組織を含む。
【０１４９】
一つの態様では、診断または検出方法において使用する二重特異性抗体を提供する。さらなる局面では、生物学的サンプル中の第一および/または第二の抗原の存在を検出する方法を提供する。特定の態様では、本方法は、二重特異性抗体が第一および/または第二の抗原に結合することが可能な条件下で、生物学的サンプルを、本明細書に記載する二重特異性抗体と接触させる工程、ならびに二重特異性抗体と第一および/または第二の抗原との間で複合体が形成されているか否かを検出する工程を含む。このような方法は、インビトロ法またはインビボ法であり得る。一つの態様では、二重特異性抗体を使用して、二重特異性抗体での療法にふさわしい対象を選択する(例えば、第一および/または第二の抗原は患者を選択するためのバイオマーカーである)。
【０１５０】
本発明の抗体を使用して診断し得る例示的な障害としては、癌が挙げられる。
【０１５１】
特定の態様では、標識化二重特異性抗体を提供する。標識としては、直接検出される標識または部分(蛍光、発色、高密度電子、化学発光および放射性標識等)、ならびに、例えば、酵素反応または分子相互作用を介して間接的に検出される、酵素またはリガンド等の部分が挙げられるがこれらに限定されない。例示的な標識としては、放射性同位体32P、14C、125I、3Hおよび131I、希土類キレート、またはフルオレセインおよびその誘導体等のフルオロフォア、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ(例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ(米国特許第4,737,456号))、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖酸化酵素(例えば、グルコース酸化酵素、ガラクトース酸化酵素、およびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ)、HRP、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼ等の染料前駆体を酸化するために過酸化水素を用いる酵素と結合させる、ウリカーゼおよびキサンチン酸化酵素等の複素環酸化酵素、ビオチン/アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカル等が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５２】
F. 薬学的製剤
本明細書に記載する二重特異性抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するこのような二重特異性抗体と、1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A編(1980))とを、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、一般的に、用いられる投薬量および濃度においてはレシピエントに対して無毒であり、以下が挙げられるがこれらに限定されない：リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸等の緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤(オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；およびm-クレゾール等)；低分子量(約10残基未満の)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジン等のアミノ酸；単糖、二糖、およびグルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む他の炭水化物；EDTA等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成(salt-forming)対イオン；金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体)；ならびに/またはポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤。本明細書の薬学的に許容される例示的な担体としては、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)等の間質(insterstitial)薬物分散剤、例えば、rHuPH20(HYLENEX(商標登録)、Baxter International、Inc.)等のヒト可溶性PH-20 ヒアルロニダーゼ糖タンパク質がさらに挙げられる。rHuPH20を含むsHASEGPおよびその使用方法の特定の例は、米国特許公報第2005/0260186号および同第2006/0104968号に記載されている。一局面では、sHASEGPを、コンドロイチナーゼ等の1つまたは複数の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わせる。
【０１５３】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第6,267,958号に記載されている。水性抗体製剤としては、米国特許第6,171,586号およびWO2006/044908に記載のものが挙げられ、後者の製剤はヒスチジン-酢酸緩衝剤を含む。
【０１５４】
本明細書の製剤は、必要に応じて、処置される特定の兆候に対して1つを上回る活性成分(好ましくは、互いに悪影響のない相補的な活性を有するもの)も含み得る。このような活性成分は、意図する目的に有効な量で組み合わせられて適切に存在する。
【０１５５】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術または界面重合化によって調製したマイクロカプセル(例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース、またはゼラチン-マイクロカプセル、およびポリ-(メチルメタクリレート(methylmethacylate))マイクロカプセル)の中に、コロイド薬物送達システム(例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル)の中に、またはマクロエマルジョンの中に封入され得る。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition、Osol、A.編(1980)に開示されている。
【０１５６】
徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の適切な例としては、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスであって、該マトリックスは成形品(例えば、フィルムまたはマイクロカプセル)の形をしている。
【０１５７】
インビボ投与に使用される製剤は、概して、滅菌されている。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜に通す濾過によって簡単に達成できる。
【０１５８】
G. 治療方法および組成物
本明細書で提供する二重特異性抗体のいずれもが治療方法において使用され得る。
【０１５９】
一局面では、薬剤として使用する二重特異性抗体を提供する。さらなる局面では、癌を処置するために使用される二重特異性抗体を提供する。特定の態様では、処置の方法において使用する二重特異性抗体を提供する。特定の態様では、本発明は、癌を患っている個体を処置する方法であって、該個体に有効量の二重特異性抗体を投与する工程を含む方法において使用する二重特異性抗体を提供する。このような態様の一つでは、該方法は、例えば、以下に記載するように、少なくとも1つの追加の治療剤を有効量で個体に投与する工程をさらに含む。上記した全ての態様における「個体」とは、ヒトであることが好ましい。
【０１６０】
さらなる局面では、本発明は、薬剤の製造または調製における二重特異性抗体の使用を提供する。一つの態様では、薬剤は癌を処置するためのものである。さらなる態様では、薬剤は、癌を処置する方法であって、癌を患っている個体に有効量の薬剤を投与する工程を含む方法において使用するためのものである。このような態様の一つでは、該方法は、例えば、以下に記載するように、少なくとも1つの追加の治療剤を有効量で個体に投与する工程をさらに含む。上記した全ての態様における「個体」とは、ヒトであることが好ましい。
【０１６１】
さらなる局面では、本発明は、癌を処置する方法を提供する。一つの態様では、該方法は、有効量の二重特異性抗体を、癌を患っている個体に投与する工程を含む。このような態様の一つでは、該方法は、例えば、以下に記載するように、少なくとも1つの追加の治療剤を有効量で個体に投与する工程をさらに含む。上記した全ての態様における「個体」とは、ヒトであることが好ましい。
【０１６２】
さらなる局面では、本発明は、例えば、上記のいずれかの治療方法において使用するための、本明細書で提供するいずれかの二重特異性抗体を含む薬学的製剤を提供する。一つの態様では、薬学的製剤は、本明細書で提供するいずれかの二重特異性抗体、および薬学的に許容される担体を含む。別の態様では、薬学的製剤は、本明細書で提供するいずれかの二重特異性抗体、および例えば、以下に記載するような、少なくとも1つの追加の治療剤を含む。
【０１６３】
本発明の二重特異性抗体は、治療において、単独で、または他の剤と組み合わせて使用できる。例えば、本発明の二重特異性抗体は、少なくとも1つの追加の治療剤と同時投与され得る。
【０１６４】
上記したこのような併用療法は、組合せ投与(2つ以上の治療剤が同じまたは別個の製剤に含まれる)、および別個投与(この場合、本発明の抗体の投与は、追加の治療剤および/またはアジュバントを投与する前、それと同時、および/またはその後に行われ得る)を包含する。本発明の二重特異性抗体は、放射線療法とも併用できる。
【０１６５】
本発明の二重特異性抗体(およびあらゆる追加の治療剤)は、非経口投与、肺内投与、鼻腔内投与、そして局部処置のために所望であれば病巣内投与を含む任意の適切な手段で投与され得る。非経口注入としては、筋内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が挙げられる。投薬は、投与が短期であるかまたは長期であるかに一部依存して、例えば、静脈内または皮下注射等の注射等、任意の適切な経路によって行われ得る。単回投与、または様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を行うことを含む(ただし、これらに限定されない)様々な投薬スケジュールが、本明細書で検討されている。
【０１６６】
本発明の二重特異性抗体は、適正な医療行為にふさわしい様式で、製剤化、投薬、および投与され得る。この点で考慮するファクターとしては、処置される具体的な障害、処置される具体的な哺乳動物、個体患者の臨床症状、障害の原因、剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および医師に知られている他のファクターが挙げられる。二重特異性抗体は、その必要はないが、任意に、問題となる障害を予防または処置するために現在使用されている1つまたは複数の剤と製剤化される。このような他の剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害または処置の種類、および上記で論じた他のファクターに依存する。これらは、概して、本明細書に記載するのと同じ投薬量および投与経路で使用するか、または本明細書に記載する投薬量の約1〜99％で使用するか、または経験的/臨床的に適切であると決定された任意の投薬量および任意の経路で使用する。
【０１６７】
疾患の予防または処置のために、本発明の二重特異性抗体の適切な投薬量(単独で、または1つ以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合)は、処置される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度および経過、二重特異性抗体が予防的目的のために投与されるのかまたは治療的目的のために投与されるのか、薬歴、患者の病歴、二重特異性抗体に対する反応、および担当医の裁量に依存する。抗体は、一度に、または一連の処置にわたり患者に適切に投与される。疾患の種類および重症度によって、約1μg/kg〜15mg/kg(例えば、0.1mg/kg〜10mg/kg)の二重特異性抗体が、例えば1回または複数回の個別投与、または連続注入のいずれかにより、患者へ投与する初期候補投薬量となり得る。典型的な一日投薬量の一つは、上記ファクターに応じて、約1μg/kg〜100mg/kg以上にわたり得る。数日間以上にわたる繰り返し投与については、処置は、症状に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで概して続けられる。二重特異性抗体の例示的な投薬量は、約0.05mg/kg〜約10mg/kgの範囲にある。したがって、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kgもしくは10mg/kgの用量(またはそれらの任意の組合せ)が1回または複数回、患者に投与され得る。このような用量は、断続的に、例えば、毎週または三週毎で(例えば、患者が約2〜約20回、または例えば約6回用量の二重特異性抗体を受けるように)投与され得る。初回はより高い負荷用量、その後は1回または複数回の低用量が投与され得る。しかし、その他の投薬レジメンも有用であり得る。この療法の成り行きは、従来の技術およびアッセイにより簡単にモニタリングできる。
【０１６８】
上記いずれの製剤または治療方法も、本発明の二重特異性抗体の代わりに、またはそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを使用して実行され得ることが理解されよう。
【０１６９】
H. 製造品
本発明の別の局面では、上記障害の処置、予防および/または診断に有用な材料を含む製造品を提供する。製造品は、容器、および容器上にまたは容器に添付されるラベルまたは添付文書を含む。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグ等が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチック等の多種多様な材料から形成され得る。容器は、単独であるか、または症状を処置、予防および/もしくは診断するのに有効な別の組成物と組み合わせられた組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る(例えば、容器は、皮下注射針により刺し貫くことができるストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る)。組成物中の少なくとも1つの活性剤が本発明の二重特異性抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択された症状を処置するために使用されるものであることを示す。さらに、製造品は、(a)本発明の二重特異性抗体を含む組成物が中に入った第一の容器；および(b)さらに細胞毒性剤またはそうでなければ治療剤を含む組成物が中に入った第二の容器を含み得る。本発明のこの態様における製造品は、組成物が特別な症状を処置するために使用され得ることを示す添付文書をさらに含み得る。あるいはまた、またはさらに、製造品は、注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液等の薬学的に許容される緩衝剤を含む第二(または第三)の容器をさらに含み得る。容器はさらに、その他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業およびユーザーの観点から望ましいその他の材料を含み得る。
【０１７０】
上記製造品のいずれもが、本発明の二重特異性抗体の代わりに、またはそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含み得ることが理解されよう。
【実施例】
【０１７１】
III. 実施例
以下は、本発明の方法および組成物の実施例である。上記概要に基づいて、その他様々な態様が実施され得ることが理解されよう。
【０１７２】
上記発明は、理解を明確にするために説明および実施例によっていくらか詳細に記載してきたが、説明および実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるものではない。本明細書において引用する全ての特許および科学的文献の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書にはっきりと組み入れられる。
【０１７３】
実施例1：Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)の調製
結果として得られた重鎖および軽鎖DNA配列の可変領域を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入された重鎖定常または軽鎖定常のいずれかとインフレームでサブクローニングした。抗体発現は、MPSVプロモーターで駆動し、CDSの3'末端に合成ポリAシグナル配列を担持する。さらに、各ベクターは、EBV OriP配列を含む。
【０１７４】
分子は、リン酸カルシウムトランスフェクションを使用して、哺乳動物発現ベクターをHEK293-EBNA細胞に共トランスフェクトすることによって産生される。指数関数的に増殖するHEK293-EBNA細胞は、リン酸カルシウム方法によってトランスフェクトされる。あるいはまた、浮遊状態で増殖しているHEK293-EBNA細胞は、ポリエチレンイミンによってトランスフェクトされる。1：1：1の比率の対応する発現ベクター(「ベクターCH1-VH-CK-VH」：「ベクター軽鎖」：「ベクター軽鎖CH1-VL」)を細胞にトランスフェクトする。
【０１７５】
リン酸カルシウムを使用するトランスフェクションについては、10％(v/v)FCSを補充したDMEM培養培地を用いたTフラスコ内で細胞を接着性単層培養物として増殖させ、それらが50〜80％の間でコンフルエントになったときにトランスフェクションを行う。T150フラスコのトランスフェクションについては、トランスフェクションの24時間前に、FCSを補充された25ml DMEM培養培地(10％v/v最終)に1,500万個の細胞を播種し、細胞を、5％C02雰囲気のインキュベーター内に37℃にて一晩入れる。トランスフェクションを行う各T150フラスコにつき、対応する比率で分配された94μgの合計プラスミドベクターDNA、最終容量が469μlの水、および469μlの1M CaC12溶液を混合して、DNA、CaC12および水の溶液を調製する。この溶液に、938μlの50mM HEPES、280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4溶液(pH 7.05)を添加し、すぐに10秒間混合し、室温にて20秒間静置させる。2％(v/v)FCSを補充した10mlのDMEMで懸濁液を希釈し、既に入っている培地に代えてそれをT150に添加する。次に、さらに13mlのトランスフェクション培地を添加する。細胞を37℃、5％C02にて、約17〜20時間インキュベートした後、培地を25ml DMEM、10％FCSで置き換える。210×gで15分間の遠心分離によって、培地交換のおよそ7日後に馴化培養培地を収集し、溶液を滅菌濾過し(0.22μmフィルター)、最終濃度0.01％(w/v)のアジ化ナトリウムを添加し、4℃にて保つ。
【０１７６】
ポリエチレンイミンを使用するトランスフェクションについては、HEK293 EBNA細胞を、無血清CD CHO培養培地において浮遊状態で培養する。500ml振とうフラスコ中での産生については、40,000万個のHEK293 EBNA細胞を、トランスフェクションの24時間前に播種する。トランスフェクションのために、細胞を210×gで5分間遠心分離し、上清を予め温められた20ml CD CHO培地で置き換える。発現ベクターを、20ml CD CHO培地に、200μg DNAの最終量まで混合する。540μl PEIを添加した後、溶液を15秒間攪拌し、その後、室温にて10分間インキュベートする。その後、細胞をDNA/PEI溶液と混合し、500ml振とうフラスコに移し、5％C02雰囲気のインキュベーター中で37℃にて3時間インキュベートする。インキュベーション時間の後、160ml F17培地を添加し、細胞を24時間培養する。トランスフェクションの翌日、1mMバルプロ酸(valporic acid)および7％Feed 1(Lonza)を添加する。7日間の培養の後、上清を回収して、210×gで15分間の遠心分離により精製し、溶液を滅菌濾過し(0.22μmフィルター)、最終濃度0.01％w/vのアジ化ナトリウムを添加し、4 ℃で保つ。
【０１７７】
プロテインAおよびプロテインGアフィニティークロマトグラフィー、その後にサイズ排除クロマトグラフィー工程を用いて、分泌されたタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製する。アフィニティークロマトグラフィーについては、HiTrapプロテインG HPカラム(CV＝5ml、GE Healthcare)に連結したHiTrapプロテインA HPカラム(CV＝5ml、GE Healthcare)(各カラムは30ml 20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム(pH 7.5)で平衡化)に上清を充填する。両方のカラムを6カラム容量の20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム(pH 7.5)で洗浄して、未結合タンパク質を除去する。その後は、少なくとも8カラム容量の20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム(pH 7.5)を用いて、HiTrapプロテインG HPカラムのみを洗浄する追加の洗浄工程が必要となる。7カラム容量の8.8mMギ酸(pH 3.0)での段階的な勾配を用いて、標的タンパク質をHiTrapプロテインG HPカラムから溶出させる。1/10の0.5Mリン酸ナトリウム(pH 8.0)を添加して、タンパク質溶液を中和する。25mMリン酸カリウム、125mM塩化ナトリウム、100mMグリシン溶液(pH 6.7)で平衡化したHiLoad Superdex 200カラム(GE Healthcare)に充填する前に、標的タンパク質を濃縮および濾過する。
【０１７８】
アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を用いて、280nmでの光学濃度(OD)を測定することで、精製タンパク質サンプルのタンパク質濃度を決定する。還元剤(5mM 1,4-ジチオトレイトール(dithiotreitol))の存在下および非存在下におけるSDS-PAGE、ならびにクーマシー(Invitrogen製のSimpleBlue(商標)SafeStain)での染色により、抗体の純度および分子量を分析する。NuPAGE(商標登録)プレキャストゲルシステム(Invitrogen、USA)を、製造元の取扱説明書に従って使用する(4〜12％Tris-酢酸ゲルまたは4〜12％Bis-Tris)。Superdex 200 10/300GL分析用サイズ排除カラム(GE Healthcare、Sweden)を用いて、2mM MOPS、150mM NaCl、0.02％(w/v)NaN3(pH 7.3)泳動緩衝液において、抗体サンプルの凝集体含有量を分析する。
【０１７９】
例示的なFab-Crossfab分子(3つの鎖で構成される：VHCH1(MCSP)-VLCH1(CD3V9)＝SEQ ID NO：25、VLCL(MCSP)＝SEQ ID NO：17、およびVHCL(CD3V9)＝SEQ ID NO：23；図1aに示すような配向を有する)の産生および精製の分析を、図2および3に示す。この分子は、さらに、Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)またはhu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)と称される。
【０１８０】
実施例2：Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)およびFab(MCSP)-CrossFab(CD3)-Fab(MCSP)の調製
結果として得られた重鎖および軽鎖DNA配列の可変領域を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入された重鎖定常または軽鎖定常のいずれかとインフレームでサブクローニングした。抗体発現は、MPSVプロモーターで駆動し、CDSの3'末端に合成ポリAシグナル配列を担持する。さらに、各ベクターは、EBV OriP配列を含む。
【０１８１】
分子は、リン酸カルシウムトランスフェクションを使用して、哺乳動物発現ベクターをHEK293-EBNA細胞に共トランスフェクトすることによって産生される。指数関数的に増殖するHEK293-EBNA細胞は、リン酸カルシウム方法によってトランスフェクトされる。あるいはまた、浮遊状態で増殖しているHEK293-EBNA細胞は、ポリエチレンイミンによってトランスフェクトされる。1：2：1の比率の対応する発現ベクター(「ベクターCH1-VH-CH1-VH-CK-VH」：「ベクター軽鎖」：「ベクター軽鎖CH1-VL」)を細胞にトランスフェクトする。
【０１８２】
リン酸カルシウムを使用するトランスフェクションについては、10％(v/v)FCSを補充したDMEM培養培地を用いたTフラスコ内で細胞を接着性単層培養物として増殖させ、それらが50〜80％の間でコンフルエントになったときにトランスフェクションを行う。T150フラスコのトランスフェクションについては、トランスフェクションの24時間前に、FCSを補充された25ml DMEM培養培地(10％v/v最終)に1,500万個の細胞を播種し、細胞を、5％C02雰囲気のインキュベーター内に37℃にて一晩入れる。トランスフェクションを行う各T150フラスコにつき、対応する比率で分配された94μgの合計プラスミドベクターDNA、最終容量が469μlの水、および469μlの1M CaC12溶液を混合して、DNA、CaC12および水の溶液を調製する。この溶液に、938μlの50mM HEPES、280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4溶液(pH 7.05)を添加し、すぐに10秒間混合し、室温にて20秒間静置させる。2％(v/v)FCSを補充した10mlのDMEMで懸濁液を希釈し、既に入っている培地に代えてそれをT150に添加する。次に、さらに13mlのトランスフェクション培地を添加する。細胞を37℃、5％C02にて、約17〜20時間インキュベートした後、培地を25ml DMEM、10％FCSで置き換える。210×gで15分間の遠心分離によって、培地交換のおよそ7日後に馴化培養培地を収集し、溶液を滅菌濾過し(0.22μmフィルター)、最終濃度0.01％(w/v)のアジ化ナトリウムを添加し、4℃にて保つ。ポリエチレンイミンを使用するトランスフェクションについては、HEK293 EBNA細胞を、無血清CD CHO培養培地において浮遊状態で培養する。500ml振とうフラスコ中での産生については、40,000万個のHEK293 EBNA細胞を、トランスフェクションの24時間前に播種する。トランスフェクションのために、細胞を210×gで5分間遠心分離し、上清を予め温められた20ml CD CHO培地で置き換える。発現ベクターを、20ml CD CHO培地に、200μg DNAの最終量まで混合する。540μl PEIを添加した後、溶液を15秒間攪拌し、その後、室温にて10分間インキュベートする。その後、細胞をDNA/PEI溶液と混合し、500ml振とうフラスコに移し、5％C02雰囲気のインキュベーター中で37℃にて3時間インキュベートする。インキュベーション時間の後、160ml F17培地を添加し、細胞を24時間培養する。トランスフェクションの翌日、1mMバルプロ酸および7％Feed 1(Lonza)を添加する。7日間の培養の後、上清を回収して、210×gで15分間の遠心分離により精製し、溶液を滅菌濾過し(0.22μmフィルター)、最終濃度0.01％w/vのアジ化ナトリウムを添加し、4 ℃で保つ。
【０１８３】
プロテインAおよびプロテインGアフィニティークロマトグラフィー、その後にサイズ排除クロマトグラフィー工程を用いて、分泌されたタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製する。
【０１８４】
アフィニティークロマトグラフィーについては、HiTrapプロテインG HPカラム(CV＝5ml、GE Healthcare)に連結したHiTrapプロテインA HPカラム(CV＝5ml、GE Healthcare)(各カラムは30ml 20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム(pH 7.5)で平衡化)に上清を充填する。両方のカラムを6カラム容量の20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム(pH 7.5)で洗浄して、未結合タンパク質を除去する。その後は、少なくとも8カラム容量の20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム(pH 7.5)を用いて、HiTrapプロテインG HPカラムのみを洗浄する追加の洗浄工程が必要となる。7カラム容量の8.8mMギ酸(pH 3.0)での段階的な勾配を用いて、標的タンパク質をHiTrapプロテインG HPカラムから溶出させる。1/10の0.5Mリン酸ナトリウム(pH 8.0)を添加して、タンパク質溶液を中和する。25mMリン酸カリウム、125mM塩化ナトリウム、100mMグリシン溶液(pH 6.7)で平衡化したHiLoad Superdex 200カラム(GE Healthcare)に充填する前に、標的タンパク質を濃縮および濾過する。
【０１８５】
アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を用いて、280nmでの光学濃度(OD)を測定することで、精製タンパク質サンプルのタンパク質濃度を決定する。還元剤(5mM 1,4-ジチオトレイトール)の存在下および非存在下におけるSDS-PAGE、ならびにクーマシー(Invitrogen製のSimpleBlue(商標)SafeStain)での染色により、抗体の純度および分子量を分析する。NuPAGE(商標登録)プレキャストゲルシステム(Invitrogen、USA)を、製造元の取扱説明書に従って使用する(4〜12％Tris-酢酸ゲルまたは4〜12％Bis-Tris)。Superdex 200 10/300GL分析用サイズ排除カラム(GE Healthcare、Sweden)を用いて、2mM MOPS、150mM NaCl、0.02％(w/v)NaN3(pH 7.3)泳動緩衝液において、抗体サンプルの凝集体含有量を分析し、従来技術の抗体フラグメント(scFv)2と比較する(結果については以下の表を参照)。
2014532037.tif 000005
HMW＝高分子量；LMW＝低分子量
【０１８６】
例示的なFab-Fab-Crossfab分子(4つの鎖で構成される：VHCH1(MCSP)-VHCH1(MCSP)-VLCH1(CD3V9)＝SEQ ID NO：26、2つのVLCL(MCSP)鎖＝SEQ ID NO：17、および1つのVHCL(CD3V9)鎖＝SEQ ID NO：23；図1cに示すような配向を有する))の産生および精製の分析を、図4および5に示す。この分子は、さらに、Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)またはhu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)と称される。
【０１８７】
例示的なFab-Crossfab-Fab分子(4つの鎖で構成される：VHCH1(MCSP)-VLCH1(CD3V9)-VHCH1(MCSP)＝SEQ ID NO：27、2つのVLCL(MCSP)鎖＝SEQ ID NO：17、および1つのVHCL(CD3V9)鎖＝SEQ ID NO：23；図1eに示すような配向を有する))の産生および精製の分析を、図6および7に示す。この分子は、さらに、Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)またはhu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)と称される。
【０１８８】
例示的なCrossfab-Fab-Fab分子(4つの鎖で構成される：VLCH1(CD32c11)-VHCH1(MCSP)-VHCH1(MCSP)＝SEQ ID NO：42、2つのVLCL(MCSP)鎖＝SEQ ID NO：17、および1つのVHCL(CD32c11)鎖＝SEQ ID NO：43；図1dに示すような配向を有する))の産生および精製の分析を、図8および9に示す。この分子は、さらに、マウスCrossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)と称される。
【０１８９】
実施例3：Fab(CD33)-CrossFab(CD3)の調製
結果として得られた重鎖および軽鎖DNA配列の可変領域を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入された重鎖定常または軽鎖定常のいずれかとインフレームでサブクローニングした。抗体発現は、MPSVプロモーターで駆動し、CDSの3'末端に合成ポリAシグナル配列を担持する。さらに、各ベクターは、EBV OriP配列を含む。
【０１９０】
分子は、リン酸カルシウムトランスフェクションを使用して、哺乳動物発現ベクターをHEK293-EBNA細胞に共トランスフェクトすることによって産生される。指数関数的に増殖するHEK293-EBNA細胞は、リン酸カルシウム方法によってトランスフェクトされる。あるいはまた、浮遊状態で増殖しているHEK293-EBNA細胞は、ポリエチレンイミンによってトランスフェクトされる。1：1：1の比率の対応する発現ベクター(「ベクターCH1-VH-CK-VH」：「ベクター軽鎖」：「ベクター軽鎖CH1-VL」)を細胞にトランスフェクトする。
【０１９１】
リン酸カルシウムを使用するトランスフェクションについては、10％(v/v)FCSを補充したDMEM培養培地を用いたTフラスコ内で細胞を接着性単層培養物として増殖させ、それらが50〜80％の間でコンフルエントになったときにトランスフェクションを行う。T150フラスコのトランスフェクションについては、トランスフェクションの24時間前に、FCSを補充された25ml DMEM培養培地(10％v/v最終)に1,500万個の細胞を播種し、細胞を、5％C02雰囲気のインキュベーター内に37℃にて一晩入れる。トランスフェクションを行う各T150フラスコにつき、対応する比率で分配された94μgの合計プラスミドベクターDNA、最終容量が469μlの水、および469μlの1M CaC12溶液を混合して、DNA、CaC12および水の溶液を調製する。この溶液に、938μlの50mM HEPES、280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4溶液(pH 7.05)を添加し、すぐに10秒間混合し、室温にて20秒間静置させる。2％(v/v)FCSを補充した10mlのDMEMで懸濁液を希釈し、既に入っている培地に代えてそれをT150に添加する。次に、さらに13mlのトランスフェクション培地を添加する。細胞を37℃、5％C02にて、約17〜20時間インキュベートした後、培地を25ml DMEM、10％FCSで置き換える。210×gで15分間の遠心分離によって、培地交換のおよそ7日後に馴化培養培地を収集し、溶液を滅菌濾過し(0.22μmフィルター)、最終濃度0.01％(w/v)のアジ化ナトリウムを添加し、4℃にて保つ。
【０１９２】
ポリエチレンイミンを使用するトランスフェクションについては、HEK293 EBNA細胞を、無血清CD CHO培養培地において浮遊状態で培養する。500ml振とうフラスコ中での産生については、40,000万個のHEK293 EBNA細胞を、トランスフェクションの24時間前に播種する。トランスフェクションのために、細胞を210×gで5分間遠心分離し、上清を予め温められた20ml CD CHO培地で置き換える。発現ベクターを、20ml CD CHO培地に、200μg DNAの最終量まで混合する。540μl PEIを添加した後、溶液を15秒間攪拌し、その後、室温にて10分間インキュベートする。その後、細胞をDNA/PEI溶液と混合し、500ml振とうフラスコに移し、5％C02雰囲気のインキュベーター中で37℃にて3時間インキュベートする。インキュベーション時間の後、160ml F17培地を添加し、細胞を24時間培養する。トランスフェクションの翌日、1mMバルプロ酸および7％Feed 1(LONZA)を添加する。
【０１９３】
7日間の培養の後、上清を回収して、210×gで15分間の遠心分離により精製し、溶液を滅菌濾過し(0.22μmフィルター)、最終濃度0.01％w/vのアジ化ナトリウムを添加し、4 ℃で保つ。
【０１９４】
プロテインAおよびプロテインGアフィニティークロマトグラフィー、その後にサイズ排除クロマトグラフィー工程を用いて、分泌されたタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製する。
【０１９５】
アフィニティークロマトグラフィーについては、HiTrapプロテインG HPカラム(CV＝5mL、GE Healthcare)に連結したHiTrapプロテインA HPカラム(CV＝5mL、GE Healthcare)(各カラムは30ml 20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム(pH 7.5)で平衡化)に上清を充填する。両方のカラムを6カラム容量の20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム(pH 7.5)で洗浄して、未結合タンパク質を除去する。その後は、少なくとも8カラム容量の20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム(pH 7.5)を用いて、HiTrapプロテインG HPカラムのみを洗浄する追加の洗浄工程が必要となる。7カラム容量の8.8mMギ酸(pH 3.0)での段階的な勾配を用いて、標的タンパク質をHiTrapプロテインG HPカラムから溶出させる。1/10の0.5Mリン酸ナトリウム(pH 8.0)を添加して、タンパク質溶液を中和する。25mMリン酸カリウム、125mM塩化ナトリウム、100mMグリシン溶液(pH 6.7)で平衡化したHiLoad Superdex 200カラム(GE Healthcare)に充填する前に、標的タンパク質を濃縮および濾過する。
【０１９６】
アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を用いて、280nmでの光学濃度(OD)を測定することで、精製タンパク質サンプルのタンパク質濃度を決定する。還元剤(5mM 1,4-ジチオトレイトール)の存在下および非存在下におけるSDS-PAGE、ならびにクーマシー(Invitrogen製のSimpleBlue(商標)SafeStain)での染色により、抗体の純度および分子量を分析する。NuPAGE(商標登録)プレキャストゲルシステム(Invitrogen、USA)を、製造元の取扱説明書に従って使用する(4〜12％Tris-酢酸ゲルまたは4〜12％Bis-Tris)。Superdex 200 10/300GL分析用サイズ排除カラム(GE Healthcare、Sweden)を用いて、2mM MOPS、150mM NaCl、0.02％(w/v)NaN3(pH 7.3)泳動緩衝液において、25℃で抗体サンプルの凝集体含有量を分析する。
【０１９７】
例示的なFab-Crossfab分子(3つの鎖で構成される：VHCH1(CD33)-VLCH1(CD3V9)＝SEQ ID NO：102、VLCL(CD33)＝SEQ ID NO：100、およびVHCL(CD3V9)＝SEQ ID NO：23またはSEQ ID NO：101；図1aに示すような配向を有する)の産生および精製の分析を、図17および18に示す。この分子は、さらに、Fab(CD33)-CrossFab(CD3)またはhu Fab(CD33)-CrossFab(CD3)と称される。
【０１９８】
実施例4：参照分子(scFv)2の調製
クローニングおよび産生
結果として得られた重鎖および軽鎖DNA配列の可変領域を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターにインフレームでサブクローニングした。抗体発現は、MPSVプロモーターで駆動し、CDSの3'末端に合成ポリAシグナル配列を担持する。さらに、各ベクターは、EBV OriP配列を含む。
【０１９９】
分子は、ポリエチレンイミンを使用して、哺乳動物発現ベクターをHEK293-EBNA細胞にトランスフェクトすることによって産生される。HEK293 EBNA細胞を、無血清CD CHO培養培地において浮遊状態で培養する。500ml振とうフラスコ中での産生については、40,000万個のHEK293 EBNA細胞を、トランスフェクションの24時間前に播種する。トランスフェクションのために、細胞を210×gで5分間遠心分離し、上清を予め温められた20ml CD CHO培地で置き換える。発現ベクターを、20ml CD CHO培地に、200μg DNAの最終量まで混合する。540μl PEIを添加した後、溶液を15秒間攪拌し、その後、室温にて10分間インキュベートする。その後、細胞をDNA/PEI溶液と混合し、500ml振とうフラスコに移し、5％C02雰囲気のインキュベーター中で37℃にて3時間インキュベートする。インキュベーション時間の後、160ml F17培地を添加し、細胞を24時間培養する。トランスフェクションの翌日、1mMバルプロ酸および7％Feed 1(LONZA)を添加する。7日間の培養の後、上清を回収して、210×gで15分間の遠心分離により精製し、溶液を滅菌濾過し(0.22μmフィルター)、最終濃度0.01％w/vのアジ化ナトリウムを添加し、4 ℃で保つ。
【０２００】
(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3)の精製
固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー(IMAC)、その後にサイズ排除クロマトグラフィー工程を用いて、分泌されたタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製する。
【０２０１】
最初の精製工程の前に、妨害するコンポーネントを、5.000MWCO膜(Sartoconスライスカセット、Hydrosart；Sartorius)を備えたタンジェンシャルフロー濾過システムSarcojet(Sartorius)を用いる透析濾過(diafiltration)によって、上清から除去する。上清を210mlまで濃縮した後、1lの20mMリン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム(pH 6.5)で希釈する。再度、タンパク質溶液を210mlまで再度濃縮する。このプロセスを2回繰り返して、完全な緩衝剤交換が確実に行われるようにする。
【０２０２】
アフィニティークロマトグラフィーについては、透析濾過プロセスの残余分を、25mlの20mMリン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、15mMイミダゾール(pH 6.5)で平衡化されたNiNTA Superflowカートリッジ(CV＝5mL、Qiagen)に充填する。少なくとも2カラム容量の20mMリン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、15mMイミダゾール(pH 6.5 )で洗浄した後、3カラム容量の20mMリン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、62.5mMイミダゾール(pH 6.5)を用いた追加の洗浄工程により、未結合タンパク質を除去する。2カラム容量の20mMリン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、125mMイミダゾール(pH 6.5)中で、標的タンパク質を溶出させる。その後、カラムを20mMリン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、250mMイミダゾール(pH 6.5)で洗浄する。
【０２０３】
25mM KH2P04、125mM NaCl、200mMアルギニン(pH 6.7)で平衡化されたHiLoad Superdex 75カラム(GE Healthcare)に充填する前に、標的タンパク質を濃縮する。
【０２０４】
収率、最初の精製工程後の凝集体含有量、および最終単量体含有量は、上記表に示している。最初の精製工程後の凝集体含有量の比較から、(scFv)2とは対照的にFab-Crossfab構築物の優れた安定性が示される。
【０２０５】
(scFv)2の特徴付け
アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を用いて、280nmでの光学濃度(OD)を測定することで、精製タンパク質サンプルのタンパク質濃度を決定する。還元剤(5mM 1,4-ジチオトレイトール)の存在下および非存在下におけるSDS-PAGE、ならびにクーマシー(Invitrogen製のSimpleBlue(商標)SafeStain)での染色により、抗体の純度および分子量を分析する。NuPAGE(商標登録)プレキャストゲルシステム(Invitrogen、USA)を、製造元の取扱説明書に従って使用する(4〜12％Tris-酢酸ゲルまたは4〜12％Bis-Tris)。Superdex 75 10/300GL分析用サイズ排除カラム(GE Healthcare、Sweden)を用いて、2mM MOPS、150mM NaCl、0.02％(w/v)NaN3(pH 7.3)泳動緩衝液において、25℃で抗体サンプルの凝集体含有量を分析する。
【０２０６】
(scFv)2分子の模式図を図21に示す。
【０２０７】
例示的な(scFv)2分子(抗MCSP/抗huCD3；2つの一本鎖Fvから構成される：VL-VH(MCSP)およびVH-VL(CD3V9)＝SEQ ID NO：149)の産生および精製の分析を、図22および23に示す。この分子は、さらに、(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)と称される。
【０２０８】
実施例5：PBMCからの初代ヒト汎T細胞の単離
地元の血液バンクまたは健康なヒトドナー由来の新鮮な血液から得た濃縮(enriched)リンパ球調製物(バフィーコート(buffy coats))から、Histopaque密度遠心分離により、末梢血単核細胞(PBMC)を調製した。
【０２０９】
汎T細胞単離キットII(Miltenyi Biotec #130-091-156)を、製造元の取扱説明書に従って用いて、PBMCからT細胞濃縮を行った。簡単に言うと、細胞ペレットを10個のMio細胞(Mio cell)につき40μlの冷たい緩衝剤に希釈し(0.5％BSA、2mM EDTAを含有するPBS-滅菌濾過済み)、10個のMio細胞につき10μlビオチン-抗体カクテルと4℃にて10分間インキュベートした。
【０２１０】
10個のMio細胞につき、30μlの冷たい緩衝剤、および20μlの抗-ビオチン磁気ビーズを添加し、混合液を4℃にてさらに15分間インキュベートした。
【０２１１】
10〜20×の標識容量を添加し、その後の300gで10分間の遠心分離によって、細胞を洗浄した。最大で100個のMio細胞が500μl緩衝剤に再懸濁された。
【０２１２】
LSカラム(Miltenyi Biotec #130-042-401)を製造元の取扱説明書に従って用いて、未標識ヒト汎T細胞の磁気分離を行った。得られたT細胞の集団を自動的に計数し(ViCell)、アッセイを開始するまで(24時間以内)、AIM-V培地に入れて、37℃、5％C02にてインキュベーターに保存した。 
【０２１３】
実施例6：脾細胞からのマウス汎T細胞の単離
C57BL/6マウスから脾臓を単離し、MACS緩衝剤(PBS＋0.5％BSA＋2mM EDTA)を含むGentleMACS Cチューブ(Miltenyi Biotech #130-093-237)に移し、製造元の取扱説明書に従って、GentleMACS解離装置で解離して、単一細胞懸濁液を得た。
【０２１４】
細胞懸濁液を分離前(pre-sepearation)フィルターに通して、残っている未解離組織粒子を取り除いた。400g、4℃にて、4分間の遠心分離の後、ACK溶解緩衝剤を添加して、赤血球を溶解した(室温にて5分間のインキュベーション)。残った細胞をMACS緩衝剤で二回洗浄し、計数し、マウス汎T細胞の単離のために使用した。Miltenyi Biotec製の汎T細胞単離キット(#130-090-861)を、製造元の取扱説明書に従って用いてネガティブ(磁気)選択を行った。得られたT細胞の集団を自動で計数し(ViCell)、さらなるアッセイのためにすぐに使用した。
【０２１５】
実施例7：T細胞上のCD3および腫瘍細胞上のMCSPを標的とする架橋二重特異性構築物により媒介される再指向型T細胞毒性(LDH放出アッセイ)
ヒトまたはマウスT細胞上のCD3および腫瘍細胞上のヒトを標的とする二重特異性構築物を、標的細胞のT細胞媒介性アポトーシスを誘導する可能性について、LDH放出アッセイにより分析した。 
【０２１６】
簡単に言うと、標的細胞(ヒトColo-38、ヒトMDA-MB-435、ヒト黒色腫MV-3、またはマウスB16/F10-huMCSP Fluc 2クローン48細胞、全てヒトMCSPを発現する)を、細胞解離緩衝剤(MCSPはトリプシン感受性)またはトリプシンで収集し(そして前日にプレーティング)、洗浄し、適切な細胞培養培地に再懸濁した(別図面の詳細な説明を参照)。1ウェルあたり20,000〜30,000個の細胞を、丸底96ウェルプレートにプレーティングし、それぞれの抗体希釈液を、表示の通りに添加した(三連)。エフェクター細胞を添加して、5：1(ヒト汎T細胞のため)、10：1(ヒトPBMCのため)の最終E：T比を得た。
【０２１７】
さらに、1〜10μg/ml PHA-M(Sigma #L8902)、インゲンマメ(Phaseolus vulgaris)から単離したイソレクチンの混合液を細胞分裂刺激物として使用して、ヒトまたはカニクイザル(cynomolgus)T細胞活性化を誘導した。マウスT細胞については、「ConAを含有するラットT-Stim」(BD #354115)の5％溶液を、T細胞活性化の陽性対照として用いた。
【０２１８】
正規化のために、標的細胞を最終濃度1％のTriton-X-100とインキュベートすることで、標的細胞の最大溶解(＝100％)を得た。最小溶解(＝0％)とは、いずれの構築物も抗体も非存在のまま、エフェクター細胞と共インキュベートされた標的細胞を指す。
【０２１９】
37℃、5％C02にて、少なくとも18時間の一晩のインキュベーションの後、LDH検出キット(Roche Applied Science、# 11 644 793 001)を、製造元の取扱説明書に従って用いて、上清へのアポトーシス/壊死標的細胞のLDH放出を測定した。
【０２２０】
Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)およびFab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)二重特異性構築物を用いたLDH放出アッセイ
精製されたFab(MCSP)-Crossfab(CD3)、Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)および(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)参照分子を、細胞上のそれぞれの抗原に対する標的指向部分の両方の結合を介して構築物が架橋された場合に腫瘍標的細胞においてT細胞媒介性アポトーシスを誘導する能力について分析した。簡単に言うと、huMCSPを発現するMDA-MB-435ヒト黒色腫標的細胞を、細胞解離緩衝剤で収集し、洗浄し、AIM-V 培地(Invitrogen # 12055-091)に再懸濁する。1ウェルあたり30,000個の細胞を、丸底96ウェルプレートにプレーティングし、それぞれの抗体希釈液を、表示の濃度で添加した。全ての構築物および対照は、同じモル濃度を有するように調節した。
【０２２１】
ヒト汎Tエフェクター細胞を添加して、5：1の最終E：T比を得た。ヒト汎T細胞の活性化の陽性対照として、1μg/ml PHA-M(Sigma #L8902)を使用した。正規化のために、標的細胞を最終濃度1％のTriton-X-100とインキュベートすることで、標的細胞の最大溶解(＝100％)を決定した。最小溶解(＝0％)とは、いずれの構築物も抗体も非存在のまま、エフェクター細胞と共インキュベートされた標的細胞を指す。
【０２２２】
37℃、5％C02にて、20時間の一晩のインキュベーションの後、LDH検出キット(Roche Applied Science、# 11 644 793 001)を、製造元の取扱説明書に従って用いて、上清へのアポトーシス/壊死標的細胞のLDH放出を測定した。
【０２２３】
図10に図示するように、二価MCSP標的指向性を伴う構築物は、(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)構築物と比べた際に匹敵する細胞毒性活性を示し、一価MCSP結合を伴うFab(MCSP)-Crossfab(CD3)構築物は明らかに作用が弱い。
【０２２４】
MDA-MB-435ヒト黒色腫標的細胞での、Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)二重特異性構築物を用いたLDH放出アッセイ
精製されたFab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)および(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)参照分子を、細胞上のそれぞれの抗原に対する標的指向部分の両方の結合を介して構築物が架橋された場合に腫瘍標的細胞においてT細胞媒介性アポトーシスを誘導する能力について分析した。
【０２２５】
簡単に言うと、huMCSPを発現するMDA-MB-435ヒト黒色腫標的細胞を、細胞解離緩衝剤で収集し、洗浄し、AIM-V 培地(Invitrogen # 12055-091)に再懸濁する。1ウェルあたり30,000個の細胞を、丸底96ウェルプレートにプレーティングし、それぞれの抗体希釈液を、表示の濃度にて添加した。全ての構築物および対照は、同じモル濃度を有するように調節した。
【０２２６】
ヒト汎Tエフェクター細胞を添加して、5：1の最終E：T比を得た。ヒト汎T細胞の活性化の陽性対照として、5μg/ml PHA-M(Sigma #L8902)を使用した。正規化のために、標的細胞を最終濃度1％のTriton-X-100とインキュベートすることで、標的細胞の最大溶解(＝100％)を決定した。最小溶解(＝0％)とは、いずれの構築物も抗体も非存在のまま、エフェクター細胞と共インキュベートされた標的細胞を指す。
【０２２７】
37℃、5％C02にて、21時間の一晩のインキュベーションの後、LDH検出キット(Roche Applied Science、# 11 644 793 001)を、製造元の取扱説明書に従って用いて、上清へのアポトーシス/壊死標的細胞のLDH放出を測定した。
【０２２８】
図11に図示するように、Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)は、標的細胞において、(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)分子と少なくとも同じ程度に良好にアポトーシスを誘導する。
【０２２９】
MV-3ヒト黒色腫標的細胞での、Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)二重特異性構築物を用いたLDH放出アッセイ
精製されたFab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)、および(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)分子を、細胞上のそれぞれの抗原に対する標的指向部分の両方の結合を介して構築物が架橋された場合に腫瘍標的細胞においてT細胞媒介性アポトーシスを誘導する能力について分析した。
【０２３０】
簡単に言うと、huMCSPを発現するMV-3ヒト黒色腫標的細胞を、LDH放出アッセイを開始する前日にトリプシンで収集する。細胞を洗浄し、適切な細胞培養培地に再懸濁した。1ウェルあたり30,000個の細胞を、丸底96ウェルプレートにプレーティングした。翌日、上清を捨て、100μl/ウェルのAIM-V培地(Invitrogen # 12055-091)、およびそれぞれの抗体希釈液を、表示の濃度にて添加した。全ての構築物および対照は、同じモル濃度を有するように調節した。
【０２３１】
ヒトPBMCエフェクター細胞を添加して、10：1の最終E：T比を得た。ヒト汎T細胞の活性化の陽性対照として、5μg/ml PHA-M(Sigma #L8902)を使用した。正規化のために、標的細胞を最終濃度1％のTriton-X-100とインキュベートすることで、標的細胞の最大溶解(＝100％)を決定した。最小溶解(＝0％)とは、いずれの構築物も抗体も非存在のまま、エフェクター細胞と共インキュベートされた標的細胞を指す。
【０２３２】
37℃、5％C02にて、26時間の一晩のインキュベーションの後、LDH検出キット(Roche Applied Science、# 11 644 793 001)を、製造元の取扱説明書に従って用いて、上清へのアポトーシス/壊死標的細胞のLDH放出を測定した。
【０２３３】
図12に図示するように、Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)は、標的細胞において、(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)分子と少なくとも同じ程度に良好にアポトーシスを誘導する。
【０２３４】
MV-3ヒト黒色腫標的細胞での、Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)二重特異性構築物を用いたLDH放出アッセイ
上記概説したように、LDH放出アッセイを行った。図19は、ヒトPBMC(E：T比＝10：1)と共培養し、Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)、(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)参照分子で約24時間処理したときのhuMCSP陽性MV-3腫瘍細胞の死滅を示す。
【０２３５】
マウスCrossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)二重特異性構築物を用いたLDH放出アッセイ
マウスCD3およびヒトMCSPを標的とする精製されたマウスCrossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)を、細胞上のそれぞれの抗原に対する標的指向部分の両方の結合を介して構築物が架橋された場合に腫瘍標的細胞においてT細胞媒介性アポトーシスを誘導する能力について分析した。
【０２３６】
簡単に言うと、huMCSPを発現するB16/F10-huMCSP Fluc2クローン48腫瘍標的細胞を、細胞解離緩衝剤で収集し、洗浄し、1×NEAA、10mM Hepes、50μm 2-b-ME、および1mMピルビン酸ナトリウムを含有するRPMI1640 培地に再懸濁する。
【０２３７】
1ウェルあたり20,000個の細胞を、丸底96ウェルプレートにプレーティングし、それぞれの抗体希釈液を、表示の濃度で添加した。二重特異性構築物、および異なるIgG対照は、同じモル濃度を有するように調節した。マウスT細胞の活性化についての追加の対照として、「ConAを含有するT細胞刺激物」(BD #354115)を使用し、アッセイ培地で1:160希釈した。
【０２３８】
脾細胞(C57BL/6マウス)から単離したマウス汎Tエフェクター細胞を添加して、10：1の最終E：T比を得た。正規化のために、標的細胞を最終濃度1％のTriton-X-100とインキュベートすることで、標的細胞の最大溶解(＝100％)を決定した。最小溶解(＝0％)とは、いずれの構築物も抗体も非存在のまま、エフェクター細胞と共インキュベートされた標的細胞を指す。
【０２３９】
37℃、5％C02にて、70時間のインキュベーションの後、LDH検出キット(Roche Applied Science、# 11 644 793 001)を、製造元の取扱説明書に従って用いて、上清へのアポトーシス/壊死標的細胞のLDH放出を測定した。
【０２４０】
図13に図示するように、二重特異性構築物は、「ConAを含有するT細胞刺激物」での陽性対照に匹敵する程度に、標的細胞からの濃度依存的LDH放出を誘導する。
【０２４１】
マウスCrossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)二重特異性構築物を用いたLDH放出アッセイ
マウスCD3およびヒトMCSPを標的とする精製されたマウスCrossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)を、細胞上のそれぞれの抗原に対する標的指向部分の両方の結合を介して構築物が架橋された場合に腫瘍標的細胞においてT細胞媒介性アポトーシスを誘導する能力について分析した。
【０２４２】
簡単に言うと、huMCSPを発現するB16/F10-huMCSP Fluc2クローン48腫瘍標的細胞を、細胞解離緩衝剤で収集し、洗浄し、1×NEAA、10mM Hepes、50μm 2-b-ME、および1mMピルビン酸ナトリウムを含有するRPMI1640培地に再懸濁する。
【０２４３】
1ウェルあたり20,000個の細胞を、丸底96ウェルプレートにプレーティングし、それぞれの抗体希釈液を添加して、50nMの最終濃度を得た。二重特異性構築物、および異なるIgG対照は、同じモル濃度を有するように調節した。
【０２４４】
脾細胞(C57BL/6マウス)から単離したマウス汎Tエフェクター細胞を添加して、10：1の最終E：T比を得た。標的細胞の非存在下でマウスT細胞の過活性化のレベルを評価するために、50nM二重特異性構築物およびT細胞を含む対照ウェルを相応にプレーティングした。
【０２４５】
正規化のために、標的細胞を最終濃度1％のTriton-X-100とインキュベートすることで、標的細胞の最大溶解(＝100％)を決定した。最小溶解(＝0％)とは、いずれの構築物も抗体も非存在のまま、エフェクター細胞と共インキュベートされた標的細胞を指す。
【０２４６】
37℃、5％C02にて、70時間のインキュベーションの後、LDH検出キット(Roche Applied Science、# 11 644 793 001)を、製造元の取扱説明書に従って用いて、上清へのアポトーシス/壊死標的細胞のLDH放出を測定した。
【０２４７】
図14に図示するように、二重特異性構築物は、標的細胞からの強いLDH放出を誘導する。標的細胞の非存在下では、標的細胞と共インキュベートされた未処理マウスT細胞と比較して、わずかなLDH増加しかみとめられない(T細胞の過活性化を反映)。対照IgGはどれも、標的細胞のLDH放出を誘導しない。
【０２４８】
実施例8：サイトカイン放出アッセイ(CBA分析)
標的細胞の存在下または非存在下においてCD3-二重特異性構築物によってT細胞を活性化させたときの、異なるサイトカインのde novo分泌を評価するために、ヒトPBMCをバフィーコートから単離し、Mio細胞を0.3個/ウェルで丸底96ウェルプレートにプレーティングした。あるいはまた、深底96ウェルプレートに、1ウェルにつき280μlの健康なドナー由来の全血をプレーティングした。
【０２４９】
腫瘍標的細胞(例えば、CD3-MCSP-二重特異性構築物についてはMDA-MB-435細胞)を添加して、10：1の最終E/T比を得た。二重特異性構築物および対照を、表示の通りに添加した。37℃、5％C02での最長24時間のインキュベーションの後、アッセイプレートを350gにて5分間遠心分離し、以降の分析のために上清を新しい深底96-ウェルプレートに移した。
【０２５０】
CBA分析を、FACS CantoIIの製造元の取扱説明書に従い、以下のCBAFlexセットの組合せを用いて行った：ヒトグランザイムB(BD 560304)、ヒトIFN-γFlex セット(BD 558269)、ヒトTNFFlexセット(BD 558273)、ヒトIL-10Flexセット(BD 558274)、ヒトIL-6Flexセット(BD 558276)、ヒトIL-4Flexセット(BD 558272)。
【０２５１】
MCSP-CD3二重特異性構築物を用いたサイトカイン放出アッセイ
ヒトMCSPおよびヒトCD3を標的とする以下の精製された二重特異性構築物を、腫瘍標的細胞の存在下(A、B) 対 非存在下(C、D)でサイトカインのT細胞媒介性de novo分泌を誘導する能力について分析した："Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)、および(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)参照分子。
【０２５２】
簡単に言うと、深底96ウェルプレートに、1ウェルにつき280μlの健康なドナー由来全血をプレーティングした。ヒトMCSPを発現する30,000個のColo-38腫瘍標的細胞、ならびに異なる二重特異性構築物、およびIgG対照を、1nMの最終濃度で添加した。細胞を37℃、5％C02 にて24時間インキュベートした後、350×gにて5分間遠心分離した。以降の分析のために上清を新しい深底96-ウェルプレートに移した。
【０２５３】
CBA分析を、FACS CantoIIの製造元の取扱説明書に従い、以下のCBAFlexセットの組合せを用いて行った：ヒトグランザイムB(BD 560304)、ヒトIFN-γFlex セット(BD 558269)、ヒトTNFFlexセット(BD 558273)、ヒトIL-10Flexセット(BD 558274)、ヒトIL-6Flexセット(BD 558276)、ヒトIL-4Flexセット(BD 558272)。
【０２５４】
図15は、Colo-38腫瘍細胞の存在下(A、B) 対 非存在下(C、D)で、1nMの異なるCD3-MCSP二重特異性構築物(Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)および(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e))で24時間処理した後の全血の上清において測定した異なるサイトカインレベルを図示する。表示のとおり、96ウェルプレートに、1ウェルにつき280μlの全血をプレーティングし、30,000個のColo-38細胞を添加した。
【０２５５】
Colo-38腫瘍細胞の存在下でT細胞を活性化させたときに分泌された主要なサイトカインは、IL-6であり、その次がIFNγである。さらに、グランザイムBのレベルも、標的細胞の存在下でT細胞を活性化させたときに極端に増加した。概して、(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)構築物は、他の二重特異性構築物と比べて、標的細胞の存在下(AおよびB)でTNFおよびIFNγ、ならびにグランザイムBのレベルをわずかに多く上昇させた。
【０２５６】
標的細胞の存在下(または非存在下)で二重特異性構築物によってT細胞を活性化させたときに、Th2サイトカイン(IL-10およびIL-4)の有意な分泌はみとめられなかった。 
【０２５７】
このアッセイでは、標的細胞の非存在下でFab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)構築物によって誘導されたIFNγの弱い分泌もあった。
【０２５８】
MCSP-マウスCD3二重特異性構築物を用いたサイトカイン放出アッセイ
マウスCrossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)として精製されたhuMCSP-muCD3標的指向性二重特異性分子を、ヒトMCSP発現腫瘍細胞の存在下でCD8+T細胞上の後期活性化マーカーCD25をアップレギュレートする能力についてフローサイトメトリーによりテストした。
【０２５９】
簡単に言うと、MCSP陽性B16/F10-huMCSP Fluc2クローン48腫瘍細胞を細胞解離緩衝剤で収集し、計数し、生存性について調べた。細胞を、RPMI1640 培地(1×NEAA、10mM Hepes、50μm 2-b-ME、1mMピルビン酸ナトリウムを含有)中で1mlあたり0.3×106個の(生存)細胞に調節し、100μlのこの細胞懸濁液を、丸底96ウェルプレートのウェルごとにピペットで取った(表示の通り)。50μlの(希釈された)二重特異性構築物を、細胞含有ウェルに添加して、50nMの最終濃度を得た。ヒトマウスTエフェクター細胞を脾細胞(C57BL/6マウス)から単離し、AIM-V培地中で1mlあたり3×106(生存)細胞となるように調節した。この細胞懸濁液の50μlを、アッセイプレートのウェルごとに添加して、10：1の最終E：T比を得た(上記参照)。二重特異性構築物が、huMCSPを発現する標的細胞の存在下においてのみT細胞を活性化できるのかどうかを分析するために、50nMのそれぞれの二重特異性分子、およびTエフェクターは含有するが、標的細胞は含有しないウェルを含めた。
【０２６０】
37℃、5％C02にて、70時間のインキュベーションの後、細胞を遠心分離し(5分間、350×g)、0.1％BSAを含有する150μl/ウェルPBSで二回洗浄した。
【０２６１】
CD8a(ラットIgG2a；クローン53-6.7；BioLegend #100712)およびCD25(ラットIgG2b；クローン3C7；BD #553075)についての表面染色を、供給元の提案に従って行った。細胞を0.1％BSAを含有する150μl/ウェルPBSで二回洗い、100μl/ウェル固定化緩衝剤(BD ##554655)を用いて4℃にて15分間固定させた。
【０２６２】
遠心分離の後、サンプルを、200μl/ウェルPBS、0.1％BSAに再懸濁させ、FACS CantoII装置(ソフトウェアFACS Diva)を用いて分析した。
【０２６３】
図16は、マウスCrossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)構築物が、標的細胞が存在する場合にのみCD25のアップレギュレーションを誘導することを示す。
【０２６４】
実施例9：二重特異性構築物が結合したときの、初代ヒトT細胞上での表面活性化マーカーの発現
CD3二重特異性構築物がもっぱら腫瘍標的細胞の存在下で結合したときの、T細胞の特異的な活性化を調べるために、初代ヒトPBMC(上述したように単離されたもの)を、腫瘍抗原陽性標的細胞の存在下または非存在下で、表示した濃度の二重特異性構築物と少なくとも24時間インキュベートした。 
【０２６５】
簡単に言うと、huMCSP陽性標的細胞(MV-3腫瘍細胞)または培地を含有する平底96ウェルプレートに、1ウェルあたり300,000個の初代ヒトPBMCをプレーティングした。最終エフェクター 対 標的細胞(E：T)比は10：1であった。細胞を、表示した濃度のCD3-MCSP二重特異性構築物(Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)(「1+1, Fc無し」と称する)および(scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)参照分子(「(scFv)2」と称する)と、37℃、5％C02にて、表示のインキュベーション時間の間、インキュベートした。エフェクター細胞をCD8、初期活性化マーカーCD69または後期活性化マーカーCD25について染色し、FACS CantoIIで分析した。
【０２６６】
図20は、この実験の結果を示す。
【０２６７】
本発明の現時点において好適な態様を示し、説明してきたが、本発明はこれらに限定されず、その他にも、添付の特許請求の範囲内で様々に具現化およびは実施され得ることがはっきりと理解されよう。
【０２６８】
配列
本発明の現時点において好適な態様を示し、説明してきたが、本発明はこれらに限定されず、その他にも、添付の特許請求の範囲内で様々に具現化およびは実施され得ることがはっきりと理解されよう。凡例：GA201＝EGFRバインダー、3F2＝FAPバインダー、CH1AlA＝CEA バインダー。
【０２６９】
タンパク質配列
2014532037.tif 000006
2014532037.tif 000007
2014532037.tif 000008
2014532037.tif 000009
2014532037.tif 000010
2014532037.tif 000011
2014532037.tif 000012
2014532037.tif 000013
【０２７０】
DNA配列
2014532037.tif 000014
2014532037.tif 000015
2014532037.tif 000016
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2014532037.tif 000030
2014532037.tif 000031
【０２７１】
本発明の現時点において好適な態様を示し、説明してきたが、本発明はこれらに限定されず、その他にも、以下の請求の範囲内で様々に具現化およびは実施され得ることがはっきりと理解されよう。
【図１ａ】
2014532037.tif 000032
【図１ｂ】
2014532037.tif 000033
【図１ｃ】
2014532037.tif 000034
【図１ｄ】
2014532037.tif 000035
【図１ｅ】
2014532037.tif 000036
【図２】
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【図３】
2014532037.tif 000038
【図４】
2014532037.tif 000039
【図５】
2014532037.tif 000040
【図６】
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【図７】
2014532037.tif 000042
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2014532037.tif 000047
【図１３】
2014532037.tif 000048
【図１４】
2014532037.tif 000049
【図１５ａ】
2014532037.tif 000050
【図１５ｂ】
2014532037.tif 000051
【図１５ｃ】
2014532037.tif 000052
【図１６】
2014532037.tif 000053
【図１７】
2014532037.tif 000054
【図１８】
2014532037.tif 000055
【図１９】
2014532037.tif 000056
【図２０ａ】
2014532037.tif 000057
【図２０ｂ】
2014532037.tif 000058
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
2014532037000001.app
【国際調査報告】
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2014532037.tif 000063
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