(57)【要約】  本発明は、サンプル中の活性酵素を検出するためのアッセイデバイス（１）を開示する。該アッセイデバイス（１）は以下の構成要素：（ａ）その上にサンプルを置くことができる配置領域（１０）；（ｂ）サンプルが該配置領域（１０）上に存在する（例えば置かれた）とき、上記マトリックス（２０）に沿って移動できるように、上記配置領域（１０）と動作可能に連結された、マトリックス（２０）；（ｃ）上記マトリックス（２０）上の少なくとも１つの個別捕捉位置（３０）であって、それぞれの個別捕捉位置（３０）は配置領域（１０）から遠くに引き離され、そしてサンプルがその個別捕捉位置（３０）を横切って移動でき；（ｄ）それぞれの個別捕捉位置（３０）に存在する又はそれらを画成する捕捉手段（４０）であって、該捕捉手段（４０）は、上記酵素の上記サンプルの少なくとも一部分を少なくとも１つの個別捕捉位置（３０）に保持するように上記酵素に結合できる；及び（ｅ）上記捕捉手段（４０）に結合した活性酵素の存在の選択的表示を提供するための、選択的表示手段（５０）又は少なくともその構成要素；を含む。
2014525032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の活性酵素を検出するためのアッセイデバイス（１）であって、該デバイスが：
（ａ）上にサンプルを置くことができる配置領域（１０）；
（ｂ）サンプルが、該配置領域（１０）上に存在する（例えば置かれた）とき、マトリックス（２０）に沿って移動できるように、該配置領域（１０）と動作可能に連結された、該マトリックス（２０）；
（ｃ）該マトリックス（２０）上の少なくとも１つの個別捕捉位置（３０）であって、それぞれの個別捕捉位置（３０）は配置領域（１０）から遠くに引き離され、そしてサンプルが該個別捕捉位置（３０）を横切って移動でき；
（ｄ）それぞれの個別捕捉位置（３０）に存在する又はそれらを画成する捕捉手段（４０）であって、捕捉手段（４０）は、該酵素の該サンプルの少なくとも一部分を少なくとも１つの個別捕捉位置（３０）に保持するように該酵素に結合できる；及び
（ｅ）該捕捉手段（４０）に結合した活性酵素の存在の選択的表示を提供するための、選択的表示手段（５０）又は少なくともその構成要素；
を含んでなる、上記アッセイデバイス。
【請求項２】
前記配置領域（１０）が吸収パッドである、請求項１に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項３】
前記配置領域（１０）が前記マトリックス（２０）の１つの端にある、請求項１又は２に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項４】
該デバイスが複数の個別捕捉位置（３０）を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項５】
前記デバイスが２つよりも多い個別捕捉位置（３０）を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項６】
前記デバイスが３つの個別捕捉位置（３０）を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項７】
それぞれの個別捕捉位置における捕捉手段（４０）の量が、異なっている又は同一である、請求項５又は６に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項８】
それぞれの個別捕捉位置（３０）における捕捉手段（４０）の量は、その位置が配置領域（１０）から離れれば離れるほどさらに増加又は減少する、請求項７に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項９】
前記デバイスがブロッキング試薬を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアッセイデバイス。
【請求項１０】
前記ブロッキング試薬が前記デバイスに直接結合する、請求項９に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項１１】
前記ブロッキング試薬が界面活性剤である又は界面活性剤を含む、請求項９又は１０に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項１２】
前記ブロッキング試薬が界面活性剤である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項１３】
前記ブロッキング試薬がトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）である、請求項１１又は１２に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項１４】
マトリックス（２０）が吸収性材料である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項１５】
マトリックス（２０）がニトロセルロースである又はニトロセルロースを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項１６】
前記選択的表示手段（５０）が沈殿反応を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項１７】
前記選択的表示手段（５０）が可視の色変化を含む又は可視の色変化をもたらす、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項１８】
前記色変化は酵素の基質の反応によって起こり、反応種と反応する部分を形成する、請求項１７に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項１９】
前記基質が前記マトリックス（２０）に結合する、請求項１８に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項２０】
前記基質がリン酸供与体を用いる／有するホスファターゼ基質である、請求項１８又は１９に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項２１】
前記ホスファターゼ基質が２−ホスホ−Ｌ−アスコルビン酸三ナトリウム（ＡｓＡｐ）である、請求項２０に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項２２】
前記反応種がテトラゾリウム化合物である、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項２３】
前記反応種がニトロブルーテトラゾリウム化合物である、請求項２２に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項２４】
前記反応種が塩化ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）である、請求項２３に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項２５】
前記反応種がハロニトロブルーテトラゾリウム化合物である、請求項２２に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項２６】
前記反応種がヨードニトロブルーテトラゾリウム化合物である、請求項２５に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項２７】
前記反応種が塩化ヨードニトロブルーテトラゾリウム（ＩＮＴ）である、請求項２６に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項２８】
前記ホスファターゼ基質が反応促進剤の存在下で前記反応種と反応する、請求項１８〜２７のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項２９】
該反応促進剤が第２のマトリックスに結合する、請求項２８に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項３０】
前記反応促進剤がフェナジン化合物である、請求項２８又は２９に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項３１】
前記反応促進剤がメトスルファート化合物である、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項３２】
請求項２８〜３１のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）であって、前記反応促進剤がフェナジンメトスルファート（ＰＭＳ）である、上記アッセイデバイス。
【請求項３３】
前記捕捉手段（４０）が同一である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）であって、上記アッセイデバイス。
【請求項３４】
捕捉手段（４０）が抗体である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項３５】
前記抗体が前記酵素に対して又はその構成要素（例えば、そのフラグメント及び／又はそのエピトープ）に対して産生された抗体である、請求項３４に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項３６】
該抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項３４又は３５に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項３７】
前記サンプルが水性サンプルである、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項３８】
前記サンプルが飼料又は飼料添加物由来である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項３９】
前記サンプルが飼料又は飼料添加物からの抽出物である、請求項１〜３８のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項４０】
前記サンプルが飼料ペレットからの抽出物である、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項４１】
前記酵素が酸性ホスファターゼである、請求項１〜４０のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項４２】
前記酵素がフィターゼである、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項４３】
前記フィターゼがフィターゼＢＰ１７のような６−フィターゼである、請求項４２に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項４４】
前記酵素がキシラナーゼである、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項４５】
該移動が縦方向である、請求項１〜４４のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項４６】
該捕捉位置（３０）がサンプルの移動の流れに対して直角である、請求項１〜４５のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）。
【請求項４７】
前記デバイスがストリップ又はスティックである、請求項１〜４６のいずれか１項に記載のアッセイデバイス。
【請求項４８】
前記デバイスがカバーを含む、請求項１〜４７のいずれか１項に記載のアッセイデバイス。
【請求項４９】
該カバーが２つのセクションを画成するデバイス中の折り目によって形成される、請求項４８に記載のアッセイデバイス。
【請求項５０】
デバイス構成要素（ａ）から（ｅ）のいくつか又は全部が１つのセクションに存在し、そしてデバイス構成要素（ａ）から（ｅ）のいくつか又は全部がもう一方のセクションに存在する、請求項４９に記載のアッセイデバイス。
【請求項５１】
選択的表示手段（ｅ）、又は少なくともその構成要素が１つのセクションに存在し、そしてデバイス構成要素（ａ）から（ｄ）のいくつか又は全部が同じ又はもう一方のセクションに存在する、請求項４９又は５０に記載のアッセイデバイス。
【請求項５２】
選択的表示手段（ｅ）、又は少なくともその構成要素が１つのセクションに存在し、そしてデバイス構成要素（ａ）から（ｄ）が同じ又はもう一方のセクションに存在する、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載のアッセイデバイス。
【請求項５３】
選択的表示手段（ｅ）、又は少なくともその構成要素がカバー内又はカバー上に存在する、請求項４８〜５２のいずれか１項に記載のアッセイデバイス。
【請求項５４】
飼料又は飼料添加物中の活性フィターゼのレベルを少なくとも半定量的に評価するためのアッセイデバイス（１）。
【請求項５５】
飼料又は飼料添加物中の活性キシラナーゼのレベルを少なくとも半定量的に評価するためのアッセイデバイス（１）。
【請求項５６】
サンプルを、請求項１〜５５のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）の配置領域（１０）に置き、そして該デバイスの選択的表示手段（５０）が、活性酵素が存在するかどうかを表示する、サンプル中の活性酵素の存在を決定する方法。
【請求項５７】
サンプルを、請求項１〜５５のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）の配置領域（１０）に置き、そして該デバイスの選択的表示手段（５０）が、存在する活性酵素の量を半定量的に表示する、サンプル中の活性酵素のレベルを決定する方法。
【請求項５８】
サンプルが食品又は飼料から得られる、請求項５６又は５７に記載の方法。
【請求項５９】
検出しようとする活性酵素がフィターゼである、請求項５６〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
検出しようとする活性酵素がキシラナーゼである、請求項５６〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
方法が、食品又は飼料に追加の酵素を添加する必要があるかどうかを決定するために使用される、請求項５６〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
方法が、食品又は飼料に追加のフィターゼを添加する必要があるかどうかを決定するために使用される、請求項５６〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記方法が品質管理の形態として使用される、請求項５６〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
請求項１〜５５のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）を含んでなる又は形成できるキット。
【請求項６５】
液体又は水性サンプルの添加によって再構成される乾燥試薬を含んでなる、請求項６４に記載のキット。
【請求項６６】
さらに、オペレータによって添加される予定の少なくとも１つの液体試薬を含む、請求項６４又は６５に記載のキット。
【請求項６７】
液体試薬がテトラゾリウム溶液である、請求項６６に記載のキット。
【請求項６８】
サンプル中の活性酵素の存在を決定する方法であって、その方法は以下：
ａ）サンプルの少なくとも一部を捕捉手段と接触させ、それによって酵素が該捕捉手段によって捕捉されるステップ；
ｂ）基質が該捕捉された酵素と反応して酵素産物を生じる、捕捉された酵素用の好適な該基質を供給するステップ；
ｃ）反応種が該酵素産物と反応して不溶性の生成物を生じる、酵素産物と反応できる該反応種を供給するステップ；及び
ｄ）検出が前記サンプル中の活性酵素の存在及び／又は量と相関する、ステップｃ）で得られた不溶性の生成物を検出するステップ；
を含む、上記方法。
【請求項６９】
前記酵素が請求項１〜６７のいずれか１項に定義されたような酵素である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記サンプルが請求項１〜６７のいずれか１項に定義されたようなサンプルである、請求項６８又は６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記捕捉手段が請求項１〜６７のいずれか１項に定義されたような捕捉手段である、請求項６８〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記反応種が請求項１〜６７のいずれか１項に定義されたような反応種である、請求項６８〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記方法が請求項１〜６７のいずれか１項に定義されたようなデバイスを使用する、請求項６８〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
アッセイデバイス（１）又はそれを用いた方法又はその使用であって、該アッセイデバイスはサンプル中の活性フィターゼを検出するためにあり、該デバイスが：
（ａ）その上にサンプルを置くことができる配置領域（１０）；
（ｂ）サンプルが、該配置領域（１０）上に存在する（例えば置かれたような）とき、マトリックス（２０）に沿って移動できるように、該配置領域（１０）と動作可能に連結された、該マトリックス（２０）；
（ｃ）該マトリックス（２０）上の少なくとも１つの個別捕捉位置（３０）であって、それぞれの個別捕捉位置（３０）は配置領域（１０）から遠くに引き離され、そしてサンプルは該個別捕捉位置（３０）を横切って移動でき；
（ｄ）それぞれの個別捕捉位置（３０）に存在する又はそれらを画成する捕捉手段（４０）であって、該捕捉手段（４０）は、上記フィターゼの該サンプルの少なくとも一部分を、少なくとも１つの個別捕捉位置（３０）に保持するように、該フィターゼに結合でき；及び
（ｅ）該捕捉手段（４０）に結合した活性フィターゼの存在の選択的表示を提供するための、選択的表示手段（５０）、又は少なくともその構成要素；
を含んでなる、上記アッセイデバイス（１）又はそれを用いた方法又はその使用。
【請求項７５】
アッセイデバイス（１）又はそれを用いた方法又はその使用であって、該アッセイデバイスはサンプル中の活性フィターゼを検出するためにあり、該デバイスが：
（ａ）その上にサンプルを置くことができる配置領域（１０）；
（ｂ）サンプルが、該配置領域（１０）上に存在する（例えば置かれたような）とき、マトリックス（２０）に沿って移動できるように、該配置領域（１０）と動作可能に連結された、該マトリックス（２０）；
（ｃ）該マトリックス（２０）上の少なくとも１つの個別捕捉位置（３０）であって、それぞれの個別捕捉位置（３０）は配置領域（１０）から遠くに引き離され、そしてサンプルは該個別捕捉位置（３０）を横切って移動でき；
（ｄ）それぞれの個別捕捉位置（３０）に存在する又はそれらを画成する捕捉手段（４０）であって、捕捉手段（４０）は、上記フィターゼの該サンプルの少なくとも一部分を、少なくとも１つの個別捕捉位置（３０）に保持するように該フィターゼに結合することができ、該捕捉手段は抗体を含み；及び
（ｅ）該捕捉手段（４０）に結合した活性フィターゼの存在の選択的表示を提供するための、選択的表示手段（５０）、又は少なくともその構成要素；
を含んでなる、上記アッセイデバイス（１）又はそれを用いた方法又はその使用。
【請求項７６】
アッセイデバイス（１）又はそれを用いた方法又はその使用であって、該アッセイデバイスはサンプル中の活性フィターゼを検出するためにあり、該デバイスが：
（ａ）その上にサンプルを置くことができる配置領域（１０）；
（ｂ）サンプルが、該配置領域（１０）上に存在する（例えば置かれた）とき、マトリックス（２０）に沿って移動できるように、該配置領域（１０）と動作可能に連結された、該マトリックス（２０）；
（ｃ）該マトリックス（２０）上の少なくとも１つの個別捕捉位置（３０）であって、それぞれの個別捕捉位置（３０）は配置領域（１０）から遠くに引き離され、そしてサンプルは該個別捕捉位置（３０）を横切って移動でき；
（ｄ）それぞれの個別捕捉位置（３０）に存在する又はそれらを画成する捕捉手段（４０）であって、捕捉手段（４０）は、上記フィターゼの該サンプルの少なくとも一部分を、少なくとも１つの個別捕捉位置（３０）に保持するように該フィターゼに結合することができ、該捕捉手段は抗体を含み；及び
（ｅ）該捕捉手段（４０）に結合した活性フィターゼの存在の選択的表示を提供するための、選択的表示手段（５０）、又は少なくともその構成要素；
を含んでなる、上記アッセイデバイス（１）又はそれを用いた方法若しくはその使用。
【請求項７７】
アッセイデバイス（１）又はそれを用いた方法又はその使用であって、
アッセイデバイスはサンプル中の活性キシラナーゼを検出するためにあり、該デバイスが：
（ａ）その上にサンプルを置くことができる配置領域；
（ｂ）サンプルが、該配置領域上に存在する（例えば置かれた）とき、マトリックスに沿って移動できるように、該配置領域に動作可能に連結された、該マトリックス；
（ｃ）該マトリックス上の少なくとも１つの個別捕捉位置であって、それぞれの個別捕捉位置は配置領域から遠くに引き離され、そしてサンプルは上記個別捕捉位置を横切って移動でき；
（ｄ）それぞれの個別捕捉位置に存在する又はそれらを画成する捕捉手段であって、捕捉手段は、上記キシリターゼの該サンプルの少なくとも一部分を少なくとも１つの個別捕捉位置に保持するように該キシラナーゼに結合でき；及び
（ｅ）該捕捉手段に結合した活性キシラナーゼの存在の選択的表示を提供するための、選択的表示手段又は少なくともその構成要素；
を含んでなる、上記アッセイデバイス又はそれを用いた方法又はその使用。
【請求項７８】
アッセイデバイス（１）又はそれを用いた方法又はその使用であって、該アッセイデバイスはサンプル中の活性キシラナーゼを検出するためにあり、該デバイスが：
（ａ）その上にサンプルを置くことができる配置領域；
（ｂ）サンプルが、該配置領域に存在する（例えば置かれた）とき、マトリックスに沿って移動できるように、該配置領域と動作可能に連結された、該マトリックス；
（ｃ）該マトリックス上の少なくとも１つの個別捕捉位置であって、それぞれの個別捕捉位置は配置領域から遠くに引き離され、そしてサンプルは該個別捕捉位置を横切って移動でき；
（ｄ）それぞれの個別捕捉位置に存在する又はそれらを画成する捕捉手段であって、捕捉手段は、上記キシリターゼの該サンプルの少なくとも一部分を少なくとも１つの個別捕捉位置に保持するように該キシラナーゼに結合でき；及び
（ｅ）該捕捉手段に結合した活性キシラナーゼの存在の選択的表示を提供するための、選択的表示手段又は少なくともその構成要素；
を含んでなる、上記アッセイデバイス又はそれを用いた方法又はその使用。
【請求項７９】
前記選択的表示手段は、アッセイデバイスが使用されたときアッセイデバイスの上及び／又は中に構成される、請求項１〜７８のいずれか１項に記載のアッセイデバイス又はそれを用いた方法又はその使用。
【請求項８０】
選択的表示手段（５０）がキットに加えられる、請求項１〜７９のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）を含む又は形成できるキット。
【請求項８１】
選択的表示手段（５０）の少なくとも１つの構成要素がキットに加えられる、請求項１〜８０のいずれか１項に記載のアッセイデバイス（１）を含む又は形成できるキット。
【請求項８２】
スコアカード又は参照カードが供給される、請求項１〜８１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８３】
実質的に本明細書に及び図面を参照して記述されたようなアッセイデバイス（１）。
【請求項８４】
実質的に本明細書に及び図面を参照して記述されたような方法。
【請求項８５】
実質的に本明細書に及び図面を参照して記述されたような使用。
【請求項８６】
実質的に本明細書に及び図面を参照して記述されたようなキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素アッセイの分野に関する。
【０００２】
特に、本発明は、酵素活性のストリップ・アッセイに関する。
【０００３】
より具体的には、本発明は、それを用いた及びそれを使用するアッセイデバイス及び方法に関する。アッセイデバイス及びアッセイは、活性酵素を検出できる。活性酵素は、フィターゼ又は酸性ホスファターゼなどのホスファターゼ、又はキシラナーゼ、β−グルカナーゼ、若しくはアミラーゼなどのグリコシドヒドロラーゼであり得る。より好ましい態様では、活性酵素はフィターゼである。
【０００４】
本発明は、例えばバイオ燃料製造、洗剤組成物における活性酵素の検出、及び食品並びに動物飼料中の活性酵素の検出のようなさまざまな工業的用途での利用に有用である。
【背景技術】
【０００５】
被検体、特に酵素の有無の決定は、実験室において、そして食品及び動物飼料、バイオ燃料製造ならびに洗濯石鹸及び粉石鹸のような多様な分野においてしばしば必要である。一般に、イムノアッセイのようなアッセイがこの目的のために使用される。
【０００６】
酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、サンプル中の抗体又は抗原の存在を検出するために使用できる。そのような方法では、抗体は表面に固定された抗原に結合する、又はその逆である。この抗体は、検出可能な、通常は色変化であるシグナルを引き起こす酵素と連結される。
【０００７】
アッセイ又はイムノアッセイの別の一般的なタイプは、側方流動アッセイである。そのようなアッセイでは、被検体の存在は、固体支持体に沿って流れるサンプルで検出される。被検体、又は被検体に結合する抗体のような試薬は、次に抗原又は抗体で処理されている支持体上の列又は位置に結合する。
【０００８】
ＥＬＩＳＡ及び側方流動アッセイの両者は、サンドイッチ・アッセイでもあり得る。これは、サンプルは最初に、検出しようとする抗原に結合する捕捉抗体に接触することを意味する。抗原は次に、側方流動アッセイの場合の固定された試験線のようなさらなる抗体に結合する。抗原は、このようにして少なくとも２つの抗体の間にサンドイッチされる。第２の抗体は、検出可能なシグナルに関連する。
【０００９】
多くの上記したタイプのアッセイ又はイムノアッセイは、特定の酵素の存在を決定する。
【００１０】
しかしながら、いくつかのサンプルでは、酵素は存在するが例えば熱又は化学的不活化によって不活性化されている。そのような場合、既存のアッセイは、それでもやはりその酵素の存在を検出する。
【００１１】
例えば、特許文献１は、側方流動システムではなくカラムを使用するアッセイを記載している。サンプルは、被検体吸収剤で被覆されたビーズの複数の帯域を通って流れる。被検体結合が起こる複数の帯域は、被検体量の尺度を提示する。別のカラムアッセイは特許文献２に記載されており、ここでは液体中の被検体の定量が流路に沿った間隔のある複数の帯域を使って行われる。
【００１２】
例えば特許文献３に記載されているような側方流動デバイスは、一般に、サンプル投入、被検体の捕捉又は固定化、及び捕捉された被検体又は被検体複合体の検出用の異なる複数の帯域を有する。そのようなデバイスは、もし被検体が酵素なら被検体の定量又は活性の確認は行わない。
【００１３】
特許文献４に開示された側方流動アッセイは、標識された抗被検体抗体を捕捉して検出可能なシグナルを提供するための複数の捕捉位置又はバンドを使用する。そのバンドは、単調な用量反応曲線を創るために数学的に組み合わせられたとき、サンプル中の被検体の濃度を示すシグナルの独特なパターンを提示する。
【００１４】
特許文献５は、サンプル中の被検体の量を半定量化するために、複数の捕捉位置を使用する側方流動アッセイを記載している。
【００１５】
巨大分子（例えば、＞３０００ダルトン）は、特許文献６の側方流動デバイスを用いて検出できる。実施態様によれば、捕捉部位の線数の色強度が被検体の量の指標となる。
【００１６】
特許文献７は、反応物質が乾燥された側方流動法を開示している。液体サンプルを添加して乾燥した反応物質を再構成する。この方法は、色変化の強さに基づいて被検体を定量する。特異的酵素Ｇ６ＰＤの活性は、Ｇ６ＰＤがいかに迅速にその基質と反応するかの尺度である色変化が起きるのに要する時間長によって決定される。しかし、特許文献７の方法は特にＧ６ＰＤに限定され、酵素は個別の捕捉位置には保持されない。
【００１７】
特許文献８は、フィターゼ、キシラナーゼ及びアミラーゼなどの酵素を検出するための標準的な側方流動・サンドイッチ・イムノアッセイの使用を記載している。酵素の量は、生じる色変化の強さによって少なくとも部分的に決定できる。特許文献９は、大腸菌フィターゼを検出するために特異的に使用されるコロイド金サンドイッチ・アッセイを記載している。このコロイド金サンドイッチ・アッセイは、フィターゼを免疫学的に認識する第１のモノクローナル抗体及び検出手段と共役した第２の抗体を含む。
【００１８】
従って、従来使用されたアッセイの幾つかは、サンプル中の酵素の定量を提供することだけはできるが、酵素の活性を決定すること又は活性酵素を特異的に識別することは出来ない。他のアッセイは、被検体濃度を決定するために捕捉バンドの複雑な数学的解析を必要とする。
【００１９】
従って、酵素の活性型だけを検出するアッセイの必要性がある。もしその様なアッセイが少なくともある程度の半定量的情報をもたらすことができれば、有利にもなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許第４４２５４３８号
【特許文献２】米国特許第５０７３４８４号
【特許文献３】米国特許第５４５１５０４号
【特許文献４】米国特許第６１８３９７２号
【特許文献５】米国特許第５２２９０７３号
【特許文献６】米国特許第６３５８５４８号
【特許文献７】米国特許第７４２５３０２号
【特許文献８】国際公開公報第２００５／０１４８４７号
【特許文献９】国際公開公報第２００７／００１８９５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、先行技術のデバイス及び方法の問題点の幾つかを克服しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明を今から説明する。参照を容易にするために、我々は本発明の要素を１つ又はそれ以上の見出しの下に記述した。なお、見出しのそれぞれの下の教示はまた、他の見出しの下の教示にも当てはまる。例えば、本発明のデバイスに関して述べられたそれぞれの好ましい構成要素及び態様は、同等に、本発明の方法又は本発明の使用に関する好ましい構成要素及び態様である。同様に、本発明の方法又は使用に関して述べられたそれぞれの好ましい構成要素及び態様は、同等に、本発明のデバイスの好ましい構成要素及び態様である。
【００２３】
要約した態様
広義の態様では、本発明は、酵素アッセイ及びサンプル中の活性酵素を検出するデバイス、並びにサンプル中の活性酵素の存在を決定する方法に関する。
【００２４】
特に、本発明は、その様なアッセイを行うためのデバイス及びキット、具体的には側方流動アッセイ並びに側方流動アッセイ及びイムノアッセイを行うためのデバイスに関する。
【００２５】
全般的な実施態様
一つの実施態様では、本発明は、サンプル中の活性酵素を検出するためのアッセイデバイスを提供する。
【００２６】
デバイスは以下を含む：（ａ）サンプルを置くことができる配置領域；（ｂ）該配置領域と動作可能に連結されたマトリックスであって、サンプルが、該配置領域に存在する（例えば置かれた）とき、上記マトリックスに沿って移動できる、上記マトリックス；（ｃ）上記マトリックス上の少なくとも１つの個別捕捉位置であって、それぞれの個別捕捉位置は配置領域から離れて、そしてサンプルはその個別捕捉位置を横切って移動できる、上記個別捕捉位置；（ｄ）それぞれの個別捕捉位置に存在する又は個別捕捉位置を定義する捕捉手段であって、該捕捉手段は、上記酵素の上記サンプルの少なくとも一部分が少なくとも１つの個別捕捉位置に保持されるように上記酵素に結合できる、上記捕捉手段；及び（ｅ）上記捕捉手段に結合した活性酵素の存在の選択的表示を提供するための、選択的表示手段又は少なくともその構成要素。
【００２７】
別の実施態様では、本発明は、サンプル中の活性酵素の存在を決定する方法を提供し、ここでサンプルは本発明のアッセイデバイスの配置領域に置かれ、そしてデバイスの選択的表示手段は活性酵素が存在するかどうかを表示する。
【００２８】
別の実施態様では、本発明は、サンプル中の活性酵素濃度を決定する方法を提供し、ここでサンプルは本発明のアッセイデバイスの配置領域に置かれ、そしてデバイスの選択的表示手段が存在する活性酵素の量を半定量的に表示する。
【００２９】
別の実施態様では、本発明は、本発明のアッセイデバイスを含む又は形成できるキットを提供する。
【００３０】
別の実施態様では、本発明は、サンプル中の活性酵素の存在を決定する方法を提供し、ここでその方法は以下のステップ：
ａ）サンプルの少なくとも一部を捕捉手段と接触させ、それによって酵素が該捕捉手段によって捕捉される；
ｂ）捕捉された酵素用の好適な基質を供給するが、ここで該基質は該捕捉された酵素と反応して酵素産物を生じる；
ｃ）酵素産物と反応し得る反応種を供給するが、ここで該反応種は該酵素産物と反応して不溶性の生成物をもたらす；及び
ｄ）ステップｃ）で得られた不溶性の生成物を検出するが、ここで該検出はサンプル中の活性酵素の存在及び／又は量と相関する；
を含む。
【発明の効果】
【００３１】
いくつかの利点
本発明の利点は、それを用いたデバイス及び方法によって、オペレータがサンプル中の活性酵素を識別できることである。
【００３２】
本発明のさらなる利点は、それを用いたデバイス及び方法によって、オペレータがサンプル中の活性酵素を簡単な方法で、ある場合には少なくとも半定量的な方法で、識別できることである。
【００３３】
本明細書で用いられる用語の「半定量的」とは、相対量、適切な量又は既知範囲内の量を意味する。
【００３４】
好ましくは、用語の「半定量的」は、活性酵素のレベルの概算、即ち活性酵素の「低」、「許容可能」又は「高」レベルを意味する。しかし、単位の正確な定量を除外するものではない。これは、例えば、捕捉領域のさらに個別の捕捉位置によって、又は発色の強度を測定若しくは観察することによって、又は色変化を測定若しくは観察することによって得られてもよい。
【００３５】
本発明のさらなる利点は、本明細書に記述される。
【００３６】
全般的な態様
一つの態様では、アッセイデバイスは、サンプルを置くことができる配置領域を含む。好ましくは、サンプルは液体サンプルである。好ましくは、サンプルは、食品若しくは飼料サンプル、又は食品若しくは飼料成分を含むサンプルである。マトリックスは、サンプルが配置領域からマトリックスに沿って移動できるように、配置領域と動作可能に連結される。好ましくは、マトリックスはニトロセルロースのような材料である。
【００３７】
本出願のアッセイデバイスのマトリックスは、配置領域から距離を置いた少なくとも１つの異なる捕捉位置を含む。サンプルは、その捕捉位置を横切って移動できる。好ましくは、少なくとも２つの捕捉位置が用いられる。好ましくは、少なくとも３つの捕捉位置が用いられる。好ましくは、３つの捕捉位置が用いられる。
【００３８】
本発明のアッセイデバイスのそれぞれの捕捉位置には、捕捉手段が存在する。捕捉手段は、アッセイデバイスによって検出される酵素に結合できる。少なくとも酵素のサンプルは、少なくとも１つの捕捉位置に保持される。捕捉手段は好ましくは抗体であり、そして最も好ましくは捕捉手段が酵素に結合する抗体である。抗体は、酵素それ自体に対して、又はその構成要素（例えば、そのフラグメント及び／又はそのエピトープ）に対して産生された（raised）ものであればよい。
【００３９】
選択的表示手段は、捕捉手段に結合した活性酵素の存在を選択的に表示するために、本発明のアッセイデバイスで用いられる。好ましくは、選択的表示手段は、沈殿反応を含む及び／又は生成物形成に際して起こる測定可能な可視又はＵＶ波長の変化をもたらす。色変化は、基質と酵素の反応によって起こればよい。基質との反応は、酵素が活性であること、そして単に不活性又は変性した形態だけで存在しないことを示す。
【００４０】
好ましくは、可視部の色変化は、裸眼で又は機械的読み取り機で及び／又は電気的読み取り機で観察できる色変化を意味する。
【００４１】
選択的表示手段の全部又は少なくとも幾つかの構成要素は、アッセイデバイスに存在する。幾つかの実施態様に対して、選択的表示手段の全てはアッセイデバイスの中及び／又は上に存在する。別の実施態様では、アッセイデバイスは、選択的表示手段の構成要素の少なくとも１つを含み、そしてデバイスは、選択的表示手段の他の一つ又は複数の構成要素で（例えばキットとして）供給される。このようにして、使用に際して、ユーザーは、活性酵素をアッセイするデバイスを使用するために必要な全ての選択的表示手段の構成要素を有する。
【００４２】
本発明は、活性酵素を検出するために用いることができる新規で簡単なアッセイを提供するので、有利である。これは、バイオエタノール、洗剤並びに食品及び飼料工業において特に有用であり、そこでは酵素は、現在利用可能なアッセイを用いて存在する通りに検出されればよいが、例えば熱又は化学処理による不活性化の故に利用できない可能性がある。さらにまた、本発明のアッセイ及び方法は、飼料又は食品成分の活性酵素がさらに必要かどうかを決定するのに有用であればよい。そのような方法はまた、食品又は飼料などの製品の品質管理にも使用し得よう。
【００４３】
本発明の別の態様は、サンプル中の活性酵素の量を半定量的に決定する方法を提供する。好ましくは、この半定量的な方法は、結合した酵素の存在を示す捕捉領域の数に関連する。
【００４４】
本発明のさらなる態様は、食品又は飼料中の活性酵素のレベルを決定する方法、及びさらなる酵素又は飼料若しくは食品添加物が必要かどうかを決定する方法を提供する。そのような方法はまた、食品又は飼料などの製品の品質管理にも使用し得るであろう。
【００４５】
本発明は、キットの形態で提示されてもよい。そのようなキットは、オペレータが、好ましくは実験室の外でのアッセイの実施を可能にしよう。キットは、アッセイを実施するために必要な全ての試薬を提供すればよい。そのような試薬の全て又は幾つかは、乾燥形態であってもよい。
【００４６】
好ましくは、本発明のアッセイ又はアッセイデバイスによって検出しようとする活性酵素は、ホスファターゼ又はグリコシドヒドロラーゼ、好ましくは酸性ホスファターゼ、フィターゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、又はβ−グルカナーゼである。
【００４７】
より好ましい態様では、本発明のアッセイ又はアッセイデバイスによって検出しようとする活性酵素は、ホスファターゼであり、好ましくは酸性ホスファターゼであり、より好ましくはフィターゼである。
【００４８】
用語の「フィターゼ」は、フィチン酸塩／フィチン酸を含むリン酸エステル類の加水分解を触媒し、無機リン酸塩を放出できるタンパク質又はポリペプチドを意味する。幾つかのフィターゼは、フィチン酸塩に加えて少なくともリン酸化が中間程度のイノシトール−リン酸エステルの幾つかを加水分解できる。
【００４９】
小麦やオオムギなどの幾つかの穀類の非デンプン性多糖類（ＮＳＰ）は腸で粘性が増加し、それは栄養物の拡散を抑える。この栄養阻害作用は、キシラナーゼ及び／又はβ−グルカナーゼの添加によって軽減することができ、それはヘミセルロースポリマーを寸断し、それぞれキシラン及びβ−グルカンにする。
【００５０】
他の栄養補助食品の中で、α−アミラーゼは、飼料のデンプン利用率を改善するために飼料に添加される。
【００５１】
例えばブチオウキセラ種（Buttiauxella sp.）由来の６−フィターゼＢＰ１７のようなフィターゼ酵素は、リン酸利用性を高める、従って製品の栄養的価値を高めるために動物飼料に添加される。例えば、熱及び高圧下での飼料の処理は、フィターゼを変性させることができ、そしてその活性を低下させる。本発明は、処理後の飼料中に存在するフィターゼ活性のレベルを特異的に示すことができる半定量試験を提供する。
【００５２】
非常に好ましい態様では、本発明によって検出しようとする活性酵素は、フィターゼ、より具体的には６−フィターゼである。
【００５３】
非常に好ましい態様では、検出しようとする活性酵素は、ＢＰ１７である。ＢＰ１７は、ブチオウキセラ種フィターゼの変異体酵素である。ＢＰ１７の配列（シグナルペプチドを除く）は以下の通りである：
ＮＤＴＰＡＳＧＹＱＶＥＫＶＶＩＬＳＲＨＧＶＲＡＰＴＫＭＴＱＴＭＲＤＶＴＰＮＴＷＰＥＷＰＶＫＬＧＹＩＴＰＲＧＥＨＬＩＳＬＭＧＧＦＹＲＱＫＦＱＱＱＧＩＬＳＱＧＳＣＰＴＰＮＳＩＹＶＷＴＤＶＡＱＲＴＬＫＴＧＥＡＦＬＡＧＬＡＰＱＣＧＬＴＩＨＨＱＱＮＬＥＫＡＤＰＬＦＨＰＶＫＡＧＩＣＳＭＤＫＴＱＶＱＱＡＶＥＫＥＡＱＴＰＩＤＮＬＮＱＨＹＩＰＳＬＡＬＭＮＴＴＬＮＦＳＫＳＰＷＣＱＫＨＳＡＤＫＳＣＤＬＧＬＳＭＰＳＫＬＳＩＫＤＮＧＮＥＶＳＬＤＧＡＩＧＬＳＳＴＬＡＥＩＦＬＬＥＹＡＱＧＭＰＱＡＡＷＧＮＩＨＳＥＱＥＷＡＬＬＬＫＬＨＮＶＹＦＤＬＭＥＲＴＰＹＩＡＲＨＫＧＴＰＬＬＱＡＩＳＮＡＬＮＰＮＡＴＥＳＫＬＰＤＩＳＰＤＮＫＩＬＦＩＡＧＨＤＴＮＩＡＮＩＡＧＭＬＮＭＲＷＴＬＰＧＱＰＤＮＴＰＰＧＧＡＬＶＦＥＲＬＡＤＫＳＧＫＱＹＶＳＶＳＭＶＹＱＴＬＥＱＬＲＳＱＴＰＬＳＬＮＱＰＡＧＳＶＱＬＫＩＰＧＣＮＤＱＴＡＥＧＹＣＰＬＳＴＦＴＲＶＶＳＱＳＶＥＰＧＣＱＬＱ。
【００５４】
別の実施態様では、検出しようとする活性酵素は、ＢＰ１１である。ＢＰ１１は、ブチオウキセラ種フィターゼの変異体酵素である。ＢＰ１１は、バイオエタノール製造に用いられる。ＢＰ１１の配列（シグナルペプチドを除く）は以下の通りである：
ＮＤＴＰＡＳＧＹＱＶＥＫＶＶＩＬＳＲＨＧＶＲＡＰＴＫＭＴＱＴＭＲＤＶＴＰＮＴＷＰＥＷＰＶＫＬＧＹＩＴＰＲＧＥＨＬＩＳＬＭＧＧＦＹＲＱＫＦＱＱＱＧＩＬＳＱＧＳＣＰＴＰＮＳＩＹＶＷＴＤＶＤＱＲＴＬＫＴＧＥＡＦＬＡＧＬＡＰＱＣＧＬＴＩＨＨＱＱＮＬＥＫＡＤＰＬＦＨＰＶＫＡＧＩＣＳＭＤＫＴＱＶＱＱＡＶＥＫＥＡＱＴＰＩＤＮＬＮＱＨＹＩＰＳＬＡＬＭＮＴＴＬＮＦＳＫＳＰＷＣＱＫＨＳＡＤＫＳＣＤＬＧＬＳＭＰＳＫＬＳＩＫＤＮＧＮＥＶＳＬＤＧＡＩＧＬＳＳＴＬＡＥＩＦＬＬＥＹＡＱＧＭＰＱＡＡＷＧＮＩＨＳＥＱＥＷＡＬＬＬＫＬＨＮＶＹＦＤＬＭＥＲＴＰＹＩＡＲＨＫＧＴＰＬＬＱＡＩＳＮＡＬＮＰＮＡＴＥＳＫＬＰＤＩＳＰＤＮＫＩＬＦＩＡＧＨＤＴＮＩＡＮＩＡＧＭＬＮＭＲＷＴＬＰＧＱＰＤＮＴＰＰＧＧＡＬＶＦＥＲＬＡＤＫＳＧＫＱＹＶＳＶＳＭＶＹＱＴＬＥＱＬＲＳＱＴＰＬＳＬＮＱＰＡＧＳＶＱＬＫＩＰＧＣＮＤＱＴＡＥＧＹＣＰＬＳＴＦＴＲＶＶＳＱＳＶＥＰＧＣＱＬＱ。
【００５５】
別の実施態様では、検出しようとする活性酵素は、ＢＰ１１１である。ＢＰ１１１は、ブチオウキセラ種フィターゼの変異体酵素である。ＢＰ１１１は、バイオエタノール製造に用いられる。ＢＰ１１１の配列（シグナルペプチドを除く）は以下の通りである：
ＮＤＴＰＡＳＧＹＱＶＥＫＶＶＩＬＳＲＨＧＶＲＡＰＴＫＭＴＱＴＭＲＤＶＴＰＹＴＷＰＥＷＰＶＫＬＧＹＩＴＰＲＧＥＨＬＩＳＬＭＧＧＦＹＲＱＫＦＱＱＱＧＩＬＰＲＧＳＣＰＴＰＮＳＩＹＶＷＴＤＶＡＱＲＴＬＫＴＧＥＡＦＬＡＧＬＡＰＱＣＧＬＴＩＨＨＱＱＮＬＥＫＡＤＰＬＦＨＰＶＫＡＧＩＣＳＭＤＫＴＱＶＱＱＡＶＥＫＥＡＱＴＰＩＤＮＬＮＱＲＹＩＰＥＬＡＬＭＮＴＩＬＮＦＳＫＳＰＷＣＱＫＨＳＡＤＫＰＣＤＬＡＬＳＭＰＳＫＬＳＩＫＤＮＧＮＥＶＳＬＤＧＡＩＧＬＳＳＴＬＡＥＩＦＬＬＥＹＡＱＧＭＰＱＶＡＷＧＮＩＨＳＥＱＥＷＡＬＬＬＫＬＨＮＶＹＦＤＬＭＥＲＴＰＹＩＡＲＨＫＧＴＰＬＬＱＡＩＳＮＡＬＮＰＮＡＴＥＳＫＬＰＤＩＳＰＤＮＫＩＬＦＩＡＧＨＤＴＮＩＡＮＩＡＧＭＬＮＭＲＷＴＬＰＧＱＰＤＮＴＰＰＧＧＡＬＶＦＥＲＬＡＤＫＳＧＫＱＹＶＳＶＳＭＶＹＱＴＬＥＱＬＲＳＱＴＰＬＳＬＮＱＰＰＧＳＶＱＬＫＩＰＧＣＮＤＱＴＡＥＧＹＣＰＬＳＴＦＴＲＶＶＳＱＳＶＥＰＧＣＱＬＱ。
【００５６】
本発明は、以下の図を参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】２つのダイアグラムを示す。
【図２】ダイアグラム（フォーマット１：酵素捕捉及び沈殿性基質アッセイ）を示す。
【図３】一連の写真（半乾燥フォーマットに関するステップ）を示す。
【図４】写真（半乾燥フォーマットを用いたフィターゼＢＰ１７希釈シリーズの結果）を示す。
【図５】ダイアグラム（フォーマット２：金共役抗体サンドイッチアッセイ）を示す。
【図６】一連の写真（乾燥フォーマット試験の例）を示す。
【図７】一連の写真（酢酸緩衝液、ミリＱ水及び水道水で調製したサンプルの結果）を示す。
【図８】一連の写真（異なる時間の間隔でサンプル採取）を示す。
【図９】一連の写真（飼料サンプル及び精製フィターゼＢＰ１７のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット）を示す。
【図１０】一連の写真（フィターゼＢＰ１７の特異的阻害剤ＭＩＨＳを用いた金サンドイッチフォーマットと沈殿性基質酵素活性フォーマットの比較）を示す。
【図１１】ダイアグラムと写真（フロースルーフォーマットの概略図）を示す。
【図１２】ダイアグラム（フロースルーフォーマットのディップスティックの概略図）を示す。
【図１３】写真（ディップスティックフォーマットの試験結果）を示す。
【図１４】ダイアグラム（ウィッキング・スティック・フォーマットの概略図）を示す。
【図１５】一連の写真（ウィッキング・スティック・フォーマットの試験結果）を示す。
【図１６】一連の写真（異なるブロッキング剤を用いたウィッキング・スティック・フォーマットの試験結果）を示す。
【図１７】一連の写真（試験の半定量性を調節するための試験列濃度の変更。ウィッキング・スティック・フォーマット）を示す。
【図１８】一連の写真（ウィッキング・スティック・フォーマットを用いたＮＢＴとＩＮＴ間の比較）を示す。
【図１９】一連の写真（最も適切な決定をするために広範なニトロセルロース種類の試験）を示す。
【図２０】写真（界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ−２０）の存在下でブロッキング剤のカゼイン濃度を低下させる試験）を示す。
【図２１】一連の写真（満足な結果が得られるかどうかを試験するために、試験ニトロセルロース上に直接ブロッキング剤を添加）を示す。
【図２２】一連の写真（この方法の感度を試験するため、ＩＮＴ及びＮＢＴ基質の両者を用い、界面活性剤のみでブロックしたニトロセルロースマトリックス（ＮＣ）を用いて試験したフィターゼＢＰ１７濃度の希釈系列）を示す。
【図２３】一連の写真（一緒に混合した各種基質成分の乾燥及び保存試験）を示す。
【図２４】一連の写真（半乾燥フォーマットと全溶液フォーマットの比較）を示す。
【図２５】一連の写真（溶液の活性の定期的試験は、テトラゾリウム溶液が優れた安定性を有することを示唆する）を示す。
【図２６】溶液のキシラナーゼ活性を試験する写真を示す。
【図２７】溶液のキシラナーゼ活性を試験する写真を示す。
【図２８】活性キシラナーゼ活性を試験するための概略図を示す。
【図２９】一連の概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本発明は、活性酵素を検出するためのデバイスを提供する。そのデバイスは、さまざまな分野の実験室及び実験室外でも使用できる。
【００５９】
本発明は、サンプル中の活性酵素を検出するためのアッセイデバイス（１）を提供する。アッセイデバイス（１）は、次の構成要素を含む：（ａ）上にサンプルを置くことができる配置領域（１０）；（ｂ）該配置領域（１０）と動作可能に連結されたマトリックス（２０）であって、サンプルが、上記配置領域（１０）に存在する（例えば置かれた）とき、該マトリックス（２０）に沿って移動できる上記マトリックス（２０）；（ｃ）上記マトリックス上の少なくとも１つの個別捕捉位置（３０）であって、それぞれの個別捕捉位置（３０）は配置領域（１０）から離れて、そしてここでサンプルはその個別捕捉位置（３０）を横切って移動できる上記個別捕捉位置（３０）；（ｄ）それぞれの個別捕捉位置（３０）に存在する又はそれらを定義する捕捉手段（４０）であって、該捕捉手段（４０）は、上記酵素の上記サンプルの少なくとも一部分が少なくとも１つの個別捕捉位置（３０）に保持されるように上記酵素に結合できる、上記捕捉手段（４０）；及び（ｅ）上記捕捉手段（４０）に結合した活性酵素の存在の選択的表示を提供するための、選択的表示手段（５０）又は少なくともその構成要素。
【００６０】
活性酵素の存在及びそのような酵素の量を検出することは、食品及び飼料の分野では極めて重要である。活性酵素の不足は、食品又は飼料を摂取するヒト及び動物に栄養素及びミネラル欠乏症を潜在的にもたらしてもよい。酵素の存在を検出する能力は、既存の方法を用いて活性酵素の存在を検出する能力と同一視しなければよい。
【００６１】
特定の例として、フィチン酸エステルは、穀草類及びマメ科植物の主要なリンの貯蔵形態である。しかし、豚、家禽及び魚などの単胃動物は、フィチン酸エステル（又はフィチン酸）を代謝又は吸収することができず、従って、それは排泄され、集中的な家畜生産地方にリン公害をもたらす。さらにまた、フィチン酸は、カルシウム、銅及び亜鉛などのキレート金属物質によって、単胃動物では栄養阻害剤としても作用する。
【００６２】
フィターゼの作用を介して、一般に、フィチン酸エステルは加水分解されて低級イノシトールリン酸と無機リン酸塩を与える。フィターゼ類は、動物飼料への添加物として有用であり、そこでそれらは動物の有機リン利用性を改善し、そして環境のリン酸塩公害を低下させる（Wodzinski RJ, Ullah AH. Adv Appl Microbiol.  42, 263-302 (1996)）。しかし、飼料に含まれるフィターゼが不活性であるなら、これはフィターゼの加水分解作用を有しないだろうし、動物に栄養失調症をもたらしかねない。それ故、本発明は、動物飼育者、農夫、獣医、動物園の飼育係、飼料成分製造者、飼料製造者、科学者又は動物飼料を試験する一般人などのオペレータが、それが例えばフィターゼのような活性酵素を含むかどうかを知ること、及びフィターゼのような活性酵素の量を知ることを可能にする。
【００６３】
本発明は、飼料若しくは食品の製造、バイオ燃料製造、又はホスファターゼ若しくはグリコシドヒドロラーゼ、好ましくは酸性ホスファターゼ、フィターゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、若しくはβ−グルカナーゼなどの酵素が添加されている洗剤組成物における品質管理の方法に用いられてもよい。
【００６４】
アッセイ及びデバイス
本明細書で用いられる用語の「アッセイデバイス」は、器具、器具の集合体又は装置を意味する。
【００６５】
上記（ａ）〜（ｄ）に記載された特徴を含むアッセイデバイス又は器具は、図１に示される。
【００６６】
図１を参照して、本発明のアッセイデバイス（１）は、図１（ａ）（実施態様１）及び図１（ｂ）（実施態様２）に示される２つの実施態様として示される。
【００６７】
両者の実施態様において、アッセイデバイス（１）は、マトリックス（２０）と動作可能に連結された前記配置領域（１０）を含む。少なくとも１つの個別捕捉位置（３０）は、マトリックス（２０）上に存在する。捕捉手段（４０）は、それぞれの個別捕捉位置（３０）に存在する又はそれらを画成する。使用に当たって、オペレータはサンプルを該配置領域（１０）に置き、そしてサンプルは矢印で示した方向にマトリックス（２０）に沿って移動する。実施態様１では、選択的表示手段（５０）（示されてない）、又は少なくともその構成要素（示されてない）は捕捉位置（３０）に添加される又はそれを構成する。一つの態様では、選択的表示手段は、活性酵素が基質と反応したとき観察可能な色変化を発生させることができる試薬（反応種）を含む。その態様では、試薬は使用時に液体の形態でデバイスに供給されてもよい。
【００６８】
アッセイデバイス（１）の実施態様２は、実施態様１と同じように機能する。しかし、この場合、アッセイデバイス（１）は、折り畳みセクション又は折り目（７０）で接合される２つの相対する半分（２）及び（３）から成る。動作可能にマトリックス（２０）に連結された配置領域（１０）は、デバイスの片方半分（２）に設置される。捕捉位置（３０）及び捕捉手段（４０）は、マトリックス（２０）上に設置される。デバイスの同じ又は反対の半分（３）は、選択的表示手段又は少なくともその構成要素を含み、そして場合により、反対の半分（３）は、過剰のサンプルを吸収するための吸収パッド（６０）を含む。
【００６９】
実施態様２の選択的表示手段（５０）、又は少なくともその構成要素は、オペレータが折り目（７０）を折り畳んだとき、マトリックス（２０）及び捕捉手段（４０）と接触する。オペレータは、選択的表示手段（５０）又は選択的表示手段（５０）の幾つかの構成要素を液体の形態でデバイスに添加する必要があってもよい。或いは、選択的表示手段又は選択的表示手段の少なくとも幾つかの構成要素は、位置（９０）に乾燥形態で存在してもよい。
【００７０】
場合により好ましくは、実施態様２は、デバイスの２つの半分（２）及び（３）が閉じられた時点でオペレータがアッセイデバイスの結果を見る（言い換えると、捕捉位置を見る）ことができる視界窓（８０）を含む。視界窓（８０）は、プラスチック製であってもよく、又はそれは開放した開口部であってもよい。
【００７１】
実施態様２では、２つの半分（２、３）の１つ又はそれぞれは、支持体を提供するのに十分硬いプラスチック又はボール紙材料で作られればよい。
【００７２】
前述のように、アッセイデバイス（１）は、サンプルを置くことができる配置領域を含む。好ましくは、サンプルは液体サンプルである。マトリックス（２０）は、サンプルが配置領域（１０）からマトリックス（２０）に沿って移動できるように配置領域（１０）に動作可能に連結される。好ましくは、マトリックス（２０）は、例えばニトロセルロースのようなサンプルの移動を可能にする素材である。本出願のアッセイデバイス（１）のマトリックス（２０）は、配置領域（１０）から離れている少なくとも１つの個別捕捉位置（３０）を含む。サンプルは捕捉位置（３０）を横切って移動できる。好ましくは、３つの捕捉位置（３０）が使用される。本発明のアッセイデバイス（１）内のそれぞれの捕捉位置（３０）に捕捉手段（４０）が存在する。捕捉手段（４０）は、アッセイデバイス（１）によって検出される酵素に結合できる。少なくとも酵素のサンプルは、少なくとも１つの捕捉位置（３０）で保持される。捕捉手段（４０）は、好ましくは抗体であり、そして最も好ましくは、捕捉手段（４０）は酵素に結合する抗体である。抗体は、酵素それ自体に対して又はその構成要素（例えば、そのフラグメント及び／又はそのエピトープ）に対して産生されたものであればよい。
【００７３】
選択的表示手段（５０）は、本発明のアッセイデバイス（１）において、捕捉手段（４０）に結合した活性酵素の存在の選択的表示をもたらすために使用される。好ましくは、選択的表示手段又は少なくともその構成要素は、マトリックス（２０）と比べてアッセイデバイス（１）の相対する半分の位置（９０）にある。好ましくは、選択的表示手段（５０）は、沈殿反応を含む及び／又は目視可能な色変化を与える。その色変化は酵素と基質の反応によってもたらされればよい。基質との反応は、酵素が活性であり、単に不活性又は変性した形態で存在するのではないことを示す。
【００７４】
好ましい態様では、活性酵素の量（被検体量）は、もし活性酵素が存在するとき選択的表示手段が色変化を起こすなら、デバイスの色変化を表示する捕捉位置（３０）の数によって及び／又は捕捉位置での色変化の強さによって示されるという意味において、半定量的である。
【００７５】
本発明のアッセイデバイス（１）は、好ましくは、動作可能に連結された数個の領域を含む。それらの領域は、好ましくは配置領域（１０）を包含する。最も好ましくは、本発明のアッセイデバイス（１）は、側方流動デバイスである。
【００７６】
本発明のアッセイデバイス（１）は場合により、アッセイデバイスが正しく機能したかどうかを示す表示域又は表示線（９１）を含んでもよい。好ましくは、その表示域又は線は、アッセイが機能したことを色又は色変化を介して表示する。任意の表示域又は線は、抗体を含んでもよい。これらの抗体は、酵素それ自体に対して又はその構成要素（例えば、そのフラグメント及び／又はそのエピトープ）に対して産生されたものであればよく、ここで上記酵素は、検出すべき活性酵素とは無関係である。さらに又は或いは、表示線は、少なくとも基質構成要素の幾つかと反応できる関連する又は無関係の酵素を含んでもよい。本発明の一つの実施態様では、デバイス及びアッセイは、活性フィターゼ酵素を検出するために使用される。そのような場合、表示線にある関連する又は無関係の酵素は、ホスファターゼ活性を有する酵素であってもよい。一例として、表示線は、関連する酵素又は検出される酵素と同じ酵素を含んでもよく、例えば、表示線は、ＢＰ１７フィターゼを検出するためのアッセイにおいてＢＰ１７フィターゼを含んでもよい。さらなる例として、表示線は、酵素及び抗体を含んでもよく、ここで抗体は、表示線の酵素又は別の酵素に特異的であればよい。
【００７７】
「アッセイ」とは、物質の化学成分又は強度を分析することである。これは、混合物中の特定の成分の検出を包含できる。アッセイデバイス（１）は、活性酵素を検出する本発明のアッセイを実施するために使われる。
【００７８】
用語の「イムノアッセイ」及び「アッセイ」は、本出願では互換可能に用いられ、ここで用語の「アッセイ」は、「イムノアッセイ」を包含できる。イムノアッセイは、アッセイの特定の形態であり、それはサンプル中の物質を識別するために抗原とその抗体の間の特異的な結合を利用する。
【００７９】
アッセイデバイスは、好ましくはブロッキング試薬を含めばよい、又はブロッキング試薬がデバイスに添加されればよい。
【００８０】
用語の「ブロッキング試薬」は、検出しようとする活性酵素（即ち、被検体）と捕捉手段との相互作用を調節する作用物質を意味し、ここで好ましくは、捕捉手段は抗体を含む。ブロッキング試薬は、全部のサンプルが第１の捕捉手段によってブロックされないように、デバイスのマトリックスに沿ったサンプルの移動を可能にする。ブロッキング試薬は、界面活性剤である又はそれを含めばよい。好適なブロッキング試薬又はブロッキング試薬の成分の例としては、カゼイン及びDehquart CC6が挙げられる。
【００８１】
マトリックス（２０）は、ブロッキング試薬を含んでもよい。或いは、ブロッキング試薬又はその成分がデバイスに添加されてもよい。ブロッキング試薬は、アッセイデバイスの構成要素（３０）に、又はその近傍に、さらにそれから離れて添加されてもよい。ブロッキング試薬は、マトリックス（２０）に結合させても又はパッド上でマトリックス（２０）に適用されてもよい。ブロッキング剤は、乾燥形態及び／又は脱水形態であればよい。
【００８２】
酵素
本明細書で用いる用語の「酵素」とは、反応の完了時にそれ自身は分解又は変化すること無しに、別の物質の化学反応を触媒するタンパク質を指す。
【００８３】
本発明によって検出される酵素は、天然に存在する酵素である野生型、又は変異体であり得る。「変異体」は、変異体が誘導される野生型酵素又はさらに変種酵素などの親配列と比較して１つ又は数個の挿入部、欠失部及び／又は置換部を有するアミノ酸配列を有する酵素であり、そしてそれは、酵素の機能的特性を保持する及び／又は特性を強化する、例えば活性が高められる。本明細書で用いる用語の「アミノ酸配列」は、用語の「ポリペプチド」及び／又は用語の「タンパク質」と同義である。
【００８４】
本明細書で用いる用語の「活性酵素」とは、酵素の触媒機能を保持した酵素を言う。例えば、フィターゼは、リン酸のエステルの加水分解を触媒できる。
【００８５】
用語の「不活性な酵素」とは、サンプル中に存在するが酵素の触媒機能を果たすことができない酵素を言う。不活性化は、酵素の変性によって、熱処理によって又は化学的処理若しくはプロテアーゼによるタンパク質分解又はグリコシダーゼによる脱グリコシル化のような別の酵素による処理または加工によって起こってもよい。不活性化は、化学的阻害剤に起因してもよい。酵素が例えばフィターゼＢＰ１７のようなフィターゼの場合、使用し得る阻害剤はミオイノシトール・ヘキサスルファート（ＭＩＨＳ）である。
【００８６】
本発明によって検出される酵素の例としては、ホスファターゼ及びグリコシドヒドロラーゼが挙げられる。
【００８７】
ホスファターゼ即ちリン酸モノエステルヒドロラーゼ（EC 3.1.3）は、その基質からリン酸基を放出できる酵素である。有用なホスファターゼとしては、アルカリホスファターゼ（EC 3.1.3.1）、酸性／酸ホスファターゼ（EC 3.1.3.2）、３−フィターゼ（EC 3.1.3.8）又は６−フィターゼ（EC 3.1.3.26）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明のアッセイデバイスによって検出される酵素は、フィターゼである。好ましくは、その酵素は６−フィターゼであり、そして最も好ましくは、その酵素はブチオウキセラ種由来の６−フィターゼ（ＢＰ１７）である。
【００８８】
６−フィターゼはまた、「４−フィターゼ」又は「フィチン酸６−ホスファターゼ」とも呼ばれる。さらにフィターゼは、ヒスチジン酸性フィターゼ（ＨＡＰ）を含み、それは原核生物に見出されるメンバー（例えば、Escherichia coli由来のａｐｐＡフィターゼ）及び真核生物に見出されるメンバー（Aspergillus sp.由来のｐｈｙＡ及びＢ、酵母及び植物由来のＨＡＰフィターゼ）を含むグループである。複数のＨＡＰフィターゼは、それらのＤＮＡ配列のＮ−末端に共通の活性部位モチーフＲＨＧＸＲＸＰを、そしてＣ−末端にＨＤモチーフを共有する。これは、リン酸モノエステルの加水分解において２段階メカニズムを可能にする。A. niger（アスペルギルス・ニガー）由来のｐｈｙＡ及びｐｈｙＢ並びにE. coli（大腸菌）由来のａｐｐＡは、最も特徴付けられた代表である。
【００８９】
好ましい態様では、酵素はフィターゼであり、そして活性酵素の活性は−テトラゾリウム塩のような−反応種を還元し、色付きでもよい視覚的に観察可能な沈殿などの視覚的に観察可能な効果を生み出すことによって決定される。デバイスは半定量的であり、被検体量は、沈殿のために色変化を表示する捕捉位置（３０）の数によって示される。色を生み出すテトラゾリウム還元は、実質的にそれ独自の基質に対するホスファターゼ酵素作用の間接的な手段である。これに関して、還元作用物又は反応性部分が生成され、それが次にテトラゾリウムに作用してホルマザン色素を生成する。
【００９０】
一つの実施態様では、本発明によって検出される酵素は、例えば、Buttiauxella sp.、Trichoderma reesei、E. coli、Aspergillus niger、Citrobacter braakii、Citrobacter
freundii、Peniphora lycii又はPenicillium funiculosum由来の６−フィターゼである。
【００９１】
一つの実施態様では、そのフィターゼは、例えば、国際公開公報第２００６／０３８０６２号（参照によって本明細書に組み込まれる）及び国際公開公報第２００６／０３８１２８号（参照によって本明細書に組み込まれる）に開示されるようなCitrobacter freundii、好ましくはC. freundii NCIMB 41247 及びそれらの変異株；国際公開公報第２００４／０８５６３８号に開示されるようなCitrobacter braakii YH-15；国際公開公報第２００６／０３７３２８号（参照によって本明細書に組み込まれる）に開示されるようなCitrobacter braakii ATCC 51113、並びに国際公開公報第２００７／１１２７３９号（参照によって本明細書に組み込まれる）及び国際公開公報第２０１１／１１７３９６号（参照によって本明細書に組み込まれる）に開示されるようなその変異株；国際公開公報第２００６０３７３２７号（参照によって本明細書に組み込まれる）に開示されるようなCitrobacter amalonaticus、好ましくはCitrobacter amalonaticus ATCC 25405又はCitrobacter amalonaticus ATCC 25407；国際公開公報第２００６０３７３２７号（参照によって本明細書に組み込まれる）に開示されるようなCitrobacter gillenii、好ましくはCitrobacter gillenii DSM 13694；又はCitrobacter intermedius；Citrobacter koseri；Citrobacter murliniae；Citrobacter rodentium；Citrobacter sedlakii；Citrobacter werkmanii；Citrobacter youngae；Citrobacter 種ポリペプチド又はそれらの変異体由来のCitrobacterフィターゼである。
【００９２】
一つの実施態様では、フィターゼは、国際公開公報第２００６／０３８１２８号、その文献は参照によって本明細書に組み込まれる、で教示されたフィターゼ酵素のような、Citrobacter由来の、例えば、Citrobacter freundii 由来のフィターゼであればよい。
【００９３】
幾つかの実施態様では、フィターゼは、DuPont Nutrition Biosciences ApSよりPhyzyme XP（商標）の名のもとに市販されているE. coliフィターゼである。
【００９４】
或いは、フィターゼは、Buttiauxellaフィターゼ、例えば、Buttiauxella agrestisフィターゼ、例えば、国際公開公報第２００６／０４３１７８号、国際公開公報第２００８／０９７６１９号、国際公開公報第０９／１２９４８９号、国際公開公報第２００８／０９２９０１号、又は国際公開公報第１０／１２２５３２号、そしてその全部が参照によって本明細書に組み込まれる、で教示されたフィターゼ酵素であればよい。
【００９５】
一つの実施態様では、フィターゼは、米国特許第２００８２６３６８８号、その文献は参照によって本明細書に組み込まれる、で教示されたフィターゼ酵素のような、Hafnia由来の、例えば、Hafnia alvei由来のフィターゼであればよい。
【００９６】
一つの実施態様では、フィターゼは、Aspergillus由来の、例えば、Apergillus orzyae由来のフィターゼであればよい。
【００９７】
一つの実施態様では、フィターゼは、Penicillium由来の、例えば、Penicillium funiculosum由来のフィターゼであればよい。
【００９８】
本明細書に用いられる１ＦＴＵ（１フィターゼ単位）は、ＩＳＯ２００９フィターゼアッセイ−フィターゼ活性決定のための標準アッセイに規定された反応条件のもとで、１分間に基質から１μｍｏｌの無機オルトリン酸塩を放出するために必要な酵素の量として定義され、１ＦＴＵは、International Standard ISO/DIS 30024: 1-17, 2009で知ることができるものと理解される。
【００９９】
或いは、本明細書に用いられるフィターゼの１単位（ＦＴＵ）は、ｐＨ５．５、３７℃で、０．０００１５ｍｏｌ／Ｌのフィチン酸ナトリウムから、１マイクロモルの無機リン／分を放出する酵素の量として定義される（Denbow, L. M., V. Ravindran, E. T. Kornegay, Z. Yi, and R. M. Hulet. 1995. Improving phosphorus availability in soybean meal for broilers by supplemental phytase. Poult. Sci.74:1831-1842）。
【０１００】
一つの実施態様では、好適には、酵素は上記のＥＣ分類を用いて分類され、そしてＥＣ分類は、本明細書で教示されたアッセイで１ＦＴＵを試験したときその活性を有する酵素を指定する。
【０１０１】
本発明のアッセイデバイス及び方法によって検出され得る酵素の別のグループは、グルコシドヒドロラーゼ（EC 3.2.1）、即ち、Ｏ−及びＳ−グリコシル化合物を加水分解する酵素、のグループである。このグループの酵素のさらなる共通の特性は、それらが例えば還元末端基を有する（アルデヒド基を含む）フラグメント又は産物を放出することである。このグループの例としては、エンド−１，４−β−キシラナーゼ（EC 3.2.1.8）及びキシランエンド−１，３−β−キシロシダーゼ（EC 3.2.1.32）、好ましくはキシランエンド−１，４−β−キシロシダーゼ（EC 3.2.1.37）などのキシラナーゼ；α−アミラーゼ（EC 3.2.1.1）；β−アミラーゼ（EC 3.2.1.2）；オリゴ−１，６−グルコシダーゼ（EC 3.2.1.10）；グルカン１，４−α−グルコシダーゼ（EC 3.2.1.3）；プルラナーゼ（EC 3.2.1.41）；セルラーゼ（EC 3.2.1.4）；エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ（EC 3.2.1.6）；又はグルカンエンド−１，３−β−Ｄ−グルコシダーゼ（EC 3.2.1.39）が挙げられる。
【０１０２】
キシラナーゼは、線状多糖類のβ−１，４−キシランをキシロースに分解する、従って、植物細胞壁の主要成分の１つであるヘミセルロースを破壊する酵素の種類に付けられた名称である。
【０１０３】
本発明で用いるためのキシラナーゼは、どのような市販のキシラナーゼでもよい。
【０１０４】
好適には、キシラナーゼは、エンド−１，４−β−キシラナーゼ（E.C. 3.2.1.8として分類される）又は１，４−β−キシロシダーゼ（E.C. 3.2.1.37として分類される）であればよい。
【０１０５】
一つの実施態様では、好ましくは、キシラナーゼはエンドキシラナーゼ、例えば、エンド−１，４−β−ｄ−キシラナーゼである。エンド−１，４−β−ｄ−キシラナーゼの分類は、E.C. 3.2.1.8である。
【０１０６】
アミラーゼもまた、本発明のアッセイデバイス及び方法によって検出されてもよい。
【０１０７】
アミラーゼは、デンプンをマルトースのような短鎖のオリゴ糖に加水分解できる酵素の種類に付けられた名称である。その後グルコース部分は、最初のデンプン分子からよりも、マルトースからの方がより容易にモノグリセリド又はグリコシルモノグリセリドに変換させることができる。
【０１０８】
用語のアミラーゼは、α−アミラーゼ（E.C. 3.2.1.1）、Ｇ４−形成アミラーゼ（E.C.
3.2.1.60）、β−アミラーゼ（E.C. 3.2.1.2）及びγ−アミラーゼ（E.C. 3.2.1.3）を包含する。
【０１０９】
一つの実施態様では、好ましくは、アミラーゼはα−アミラーゼである。α−アミラーゼは（E.C. 3.2.1.1）として分類される。
【０１１０】
好ましくは、基質はホスファターゼ基質であり、そして最も好ましくは、ホスファターゼ基質は２ホスホ−Ｌ−アスコルビン酸三ナトリウム塩（ＡｓＡＰ）である。
【０１１１】
サンプル
本明細書で用いる用語の「サンプル」とは、活性酵素が存在するかどうかを決定するための分析用に採集した標本又は物質若しくは組成物を意味する。
【０１１２】
サンプルは、好ましくは液体である。サンプルは、好ましくは、分析する物質又は組成物を水などの溶媒に入れ、溶解し、液化又は磨り潰すことによって得られる。好ましくは、サンプルは水性のサンプルである。水道水又はミリＱのような精製脱イオン水若しくは他の好適な水性溶液を用いればよい。サンプルを調製するためには、分析する物質又は組成物を溶媒に混合、崩壊及び／又は溶解を可能にするために、抽出の或る形態が必要であってもよいことが想定される。例えば、撹拌が用いられてもよい。
【０１１３】
キットが製造されるだろうことが予想され、ここでオペレータは、サンプル抽出容器（例えば、チューブ、プラスチックバッグ又はキャニスタ）に所定のレベル（容器に線でマークをつけた）まで食品、又は飼料、又はバイオ燃料、又は洗剤組成物を満たし、そして次にチューブを第２の線まで水道水、精製脱イオン水などで満たす。次に、好ましくは、抽出容器を振盪する。これは、オペレータが統一した様式でサンプル作成することを可能にする。
【０１１４】
本発明のサンプルは、食品若しくは飼料から、または食品若しくは飼料組成物から、又は洗剤から若しくは洗剤組成物から、又はエタノールから若しくはバイオ燃料製品から誘導、抽出又は取得されればよい。ここで、用語の「食品」は、広義に用いられ、ヒト用の食物並びに動物用の食物（即ち、飼料）の範囲にわたる。好ましい態様では、食品はヒトの摂取用である。別の好ましい態様では、食品は非ヒト動物飼料である。
【０１１５】
食品又は飼料は、使用及び／又は適用の方法及び／又は投与方法によって、溶液、又はスラリー、又はペレットのような固体としての形態であってもよい。
【０１１６】
用語の「食品」及び「飼料」はまた、食品成分を指してもよい。本発明のサンプルは、食品成分から誘導、抽出又は取得されればよい。
【０１１７】
本明細書で用いられる用語の「食品又は飼料成分」は、栄養補助剤及び／又は繊維質補助剤として機能性食品又は食料品に添加する又はできる製剤を包含する。本明細書で用いられる用語の「食品又は飼料成分」はまた、所望される特別の飼料又は食料品に対して、これらに限定されないが、ゲル化、質感化、安定化、乳化、懸濁化、フィルム化及び構造化、ジューシーさの保持及び粘性を付与しないで口当たりの改善を含む、関連する有益な機能的効果を追加するために低濃度で多種多様の製品に使用できる製剤も意味する。
【０１１８】
さらなる実施態様では、「食品又は飼料成分」は、パン改良剤組成物又はベーキング前のパン生地などの食品中間体を含む。製パン用途の領域では、通常は酵素がベーキング前のパン生地組成物に添加され、そして好ましい実施態様では、ベーキング工程中の酵素の変性がさらなる酵素活動を終結させる。従って、本発明の酵素アッセイは、ベーキングする前のパン生地又はパン生地添加物組成物で行われなければならない。さらなる実施態様では、本発明は、穀物添加物、好ましくはオートムギ、ライムギ、米、コムギ、コムギふすま、又はこれらの加工誘導体を含む日常の食品組成物で使用できる。好ましくは、上記日常の食品組成物は、ヨーグルト、チーズ、又は培養飲料である。
【０１１９】
食品成分は、使用及び／又は適用の方法及び／又は投与方法によって、溶液、又はスラリー、又はペレットのような固体としての形態であってもよい。
【０１２０】
用語の「食品」及び「飼料」はまた、食品添加物を指してもよい。本発明のサンプルは、食品添加物から誘導、抽出又は取得されればよい。
【０１２１】
本明細書で用いられる用語の「食品又は飼料添加物」は、食品及び動物飼料内の消化力を強化する製剤を包含する。特に、「食品又は飼料添加物」は、食品及び動物飼料内のリン酸塩の消化を強化するために用いることができるフィターゼに関連する。
【０１２２】
食品添加物は、使用及び／又は適用の方法及び／又は投与方法によって、溶液、又はスラリー、又はペレットのような固体としての形態であってもよい。
【０１２３】
飼料組成物、及び／又は飼料添加物は、ａ）穀物、例えば、小穀物（例えば、コムギ、オオムギ、ライムギ、オートムギ及びそれらの組み合わせ）及び／又は大穀物、例えばトウモロコシ又はモロコシなど；ｂ）穀物由来の副産物、例えば、トウモロコシグルテン粗挽き粉、乾燥蒸留粕（ＤＤＧＳ）（特に、トウモロコシを基にした乾燥蒸留粕（ｃＤＤＧＳ））、コムギふすま、コムギミドリング粉、コムギショートニング、米ふすま、もみ殻、オートムギ殻、オイルヤシ種子、及び柑橘パルプ；ｃ）大豆、ひまわり、ピーナッツ、ウチワマメ、エンドウマメ、ソラマメ、綿花、カノーラ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉及び骨粉、ジャガイモタンパク質、コプラ、ゴマ、を原料としたタンパク質；ｄ）植物及び動物源由来のオイル及び脂肪；ｅ）ミネラル及びビタミン類、を含むグループから選択される１つ又はそれ以上の飼料材料を含んでもよい。
【０１２４】
本発明は、バイオエタノール製造のようなバイオ燃料製造における活性酵素の検出のために有用である。
【０１２５】
アッセイデバイスの構造
本発明のアッセイデバイス（１）は、配置領域（１０）を含む。本明細書で用いる用語の「配置領域」は、その上にサンプルを置くことができるアッセイデバイス（１）の領域を指す。好ましくは、配置領域（１０）は、吸収パッドである。配置領域（１０）は、動作可能にマトリックス（２０）に連結される。配置領域（１０）は、マトリックス（２０）と接触又は連続していればよい。配置領域（１０）は、マトリックス（２０）の一体領域であり得る。好ましくは、配置領域（１０）は、マトリックス（２０）の一端にある。場合により、過剰のサンプルを吸収するためのさらなる吸収パッド（６０）が存在する。
【０１２６】
本明細書との関連で、「動作可能に連結した」とは、デバイスを操作する間接合した、一緒に固定された又は接触していることを意味する。
【０１２７】
好ましくは、マトリックス（２０）は、吸収性材料である又はそれを含む。より好ましくは、マトリックス（２０）は、ニトロセルロースである又はそれを含む。例えば、マトリックス（２０）は、タイプ MDI 90 CNPH、MDI SS12 12μ又はSS12 15μのニトロセルロースであればよい、又はそれらを含んでもよい。
【０１２８】
サンプル領域（１０）に存在する又は置かれたとき、サンプルはマトリックス（２０）に沿って移動できる。好ましくは、その移動は毛管現象のような液体移動である。好ましくは、移動は縦方向であり、最も好ましくは、アッセイデバイス（１）がストリップ又はスティックである場合にこれが起こることである。好ましくは、スティック又はストリップは、ハウジングに入っている。
【０１２９】
ブロッキング試薬がアッセイデバイスに添加されてもよい。マトリックス（２０）は、ブロッキング試薬を含んでもよい。ブロッキング試薬はマトリックス（２０）に結合されもよく、ブロッキング試薬は乾燥した又は脱水された形態でもよい。ここで、「結合された」は、連結した又は取り付けられた、を包含する。ブロッキング試薬は直接又は間接的にマトリックスに結合されればよい。ブロッキング試薬は、いかなる好適なブロッキング試薬でもよい。ブロッキング試薬の例は、カゼインである。ブロッキング試薬は、界面活性剤であっても又はそれを含んでもよい。ブロッキング試薬は、好ましくは界面活性剤を含む。ブロッキング試薬は、好ましくは非イオン性界面活性剤及び／又は両性イオン性界面活性剤である。例えば、界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ−２０又はＤｅｈｑｕａｒｔ  ＣＣ６であればよい。
【０１３０】
本発明のアッセイデバイス（１）は、マトリックス（２０）上に少なくとも１つの個別捕捉位置（３０）を含む。それぞれの捕捉位置（３０）は、配置領域（１０）から離れて、そしてサンプルは特異な個別捕捉位置（３０）を横切って移動できる。これに関して本明細書で用いる「個別」とは、他の捕捉位置（３０）から分離していることを意味する。
【０１３１】
本発明のアッセイデバイス（１）は、複数の個別捕捉位置（３０）を含んでもよく；好ましくは２つよりも多い個別捕捉位置（３０）、そして最も好ましくは、デバイスは３つの個別捕捉位置（３０）を含む。
【０１３２】
アッセイデバイス（１）は、２つ又はそれ以上の捕捉位置領域を有してもよく、それぞれの領域は１つ又はそれ以上の分離した捕捉位置（３０）を含む。例えば、３つの分離した捕捉位置領域を有する場合、１つのサンプルの１回の測定で、例えばフィターゼ、キシラナーゼ及びアミラーゼのような、少なくとも３つの異なる種類の酵素を捕捉することが可能であってもよい。
【０１３３】
それぞれの捕捉位置（３０）には、捕捉手段（４０）がある。それぞれの捕捉位置（３０）の捕捉手段（４０）は、異なってもよいし又は同じものであってもよい。捕捉手段（４０）は、アッセイデバイス（１）によって検出される酵素に結合できる。これは、少なくとも１つの個別捕捉位置（３０）で保持される少なくとも酵素のサンプル又はサンプルの一部をもたらす。捕捉手段（４０）と酵素の間の結合は、好ましくは、抗体／抗原結合の結果である。捕捉手段（４０）だけで捕捉位置（３０）を定義してもよい。
【０１３４】
アッセイデバイス（１）のそれぞれの個別捕捉位置（３０）における捕捉手段（４０）の量は、異なっても又は同じでもよい。それぞれの個別捕捉位置（３０）における捕捉手段（４０）の量は、その位置が配置領域（１０）から離れれば離れるほどさらに増加してもよい。それぞれの個別捕捉位置（３０）における捕捉手段（４０）の量は、位置が配置領域（１０）から離れれば離れるほどさらに減少してもよい。
【０１３５】
幾つかの実施態様では、アッセイデバイス（１）のそれぞれの個別捕捉位置（３０）における捕捉手段（４０）の量は、実質的に同じである。
【０１３６】
本発明のアッセイデバイス（１）は場合により、アッセイデバイスが正しく機能したかどうかを示す表示域又は表示線（９１）を含んでもよい。好ましくは、その表示域又は線は、アッセイが機能したことを、色変化を介して表示する。任意の表示域又は線は、抗体を含んでもよい。これらの抗体は、酵素それ自体に対して又はその構成要素（例えば、そのフラグメント及び／又はそのエピトープ）に対して産生されたものであればよく、ここで上記酵素は、検出すべき活性酵素とは無関係である。さらに又は或いは、表示線は、少なくとも基質構成要素の幾つかと反応できる無関係の酵素を含んでもよい。
【０１３７】
抗体
本発明の捕捉手段（４０）は、好ましくはアッセイデバイス（１）によって検出しようとする活性酵素に結合する抗体である。抗体は、酵素それ自体に対して又はその構成要素（例えば、そのフラグメント及び／又はそのエピトープ）に対して産生されたものであればよい。
【０１３８】
本発明のアッセイデバイス（１）の任意の表示域又は線は、抗体を含んでもよい。
【０１３９】
最も好ましくは、捕捉手段（４０）は、フィターゼＢＰ１７、ＢＰ１１又はＢＰ１１１のようなフィターゼ又はその構成要素（例えば、そのフラグメント及び／又はそのエピトープ）に対して産生された抗体である。
【０１４０】
抗体は、例えば興味ある酵素、その混合物、精製されたサンプル若しくはフラグメントとして免疫することによって、又はファージ提示ライブラリーを用いるなどの、標準的な方法によって生産されればよい。
【０１４１】
本発明の目的で、用語の「抗体」は、異なる指定がない限り、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーで産生されたフラグメント、並びにそれらの模倣体を包含する。そのようなフラグメントとしては、標的物質に対する結合活性を保持した完全抗体のフラグメント、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）2フラグメント、並びに一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、抗体の抗原結合部位を含むフュージョンタンパク質及び他の合成タンパク質が挙げられる。さらにまた、抗体及びそのフラグメントは、ヒト化抗体であればよい。
【０１４２】
中和抗体（即ち、ポリペプチド物質の生物活性を阻害するもので、一般に治療に使用される）は、本発明のデバイス又はアッセイに好ましくない。
【０１４３】
もしポリクローナル抗体を望むなら、選択した動物（例えば、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリなど）を検出する酵素（又はその免疫学的エピトープを含むポリペプチドフラグメント）で免疫する。宿主の種によって、免疫反応を高めるためにさまざまなアジュバントが使われてもよい。
【０１４４】
免疫された動物由来の血清を採集し、既知の方法に従って処理する。もし、本発明のアッセイデバイスによって検出される酵素及び／又はその酵素のアミノ酸配列（又はその免疫学的エピトープを含む配列）に対するポリクローナル抗体を含む血清が、他の抗原に対する抗体を含むなら、ポリクローナル抗体はイムノアフィニティクロマトクロマトによって精製できる。ポリクローナル抗血清を生産及び処理するための技術は、業界に良く知られている（例えば、Harboe N, Ingild A. Immunization, isolation of immunoglobulins, Estimation of antibody titre. Scand J Immunol Suppl. 1973, 1:161-4）。実施例の項で、フィターゼＢＰ１７に対する抗体を生産するためにHarboe（同上）の方法論を用いた。しかし、好適な抗体を生み出すために、他の技術が使われてもよかった及び／又は他の酵素が使われてもよかったかもしれない。
【０１４５】
本発明のアッセイデバイス（１）によって検出される酵素、及び／又はその酵素のアミノ酸配列（又は、その免疫学的エピトープを含む配列）に対するモノクローナル抗体もまた、当業者によって容易に生産することができ、そしてハイブリドーマ技術（Koehler and Milstein, 1975 Nature 256:495-497）、ヒトＢ-細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor et al., (1983) Immunol Today 4:72；Cote et al., (1983) Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030）、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Rickman Liss Inc, pp 77-96）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４６】
また、「キメラ抗体」を生産するために開発された、適切な抗原特異性及び生物学的活性を持つ分子を得るためにマウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子と継ぎ合せる技術が使われてもよい（Morrison et al., (1984) Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855；Neuberger et al., (1984) Nature 312:604-608；Takeda et al., (1985) Nature 314:452-454）。
【０１４７】
或いは、一本鎖抗体の生成について開示された技術（米国特許第４９４６７７９号）は、物質特異的一本鎖抗体を製造するために適応させることができる。
【０１４８】
物質に対する特異的な結合部位を含む抗体フラグメントが、生成されてもよい。例えば、その様なフラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化によって生産できるＦ（ａｂ’）2フラグメント及びＦ（ａｂ’）2フラグメントのジスルフィド結合を還元することによって生成させることができるＦａｂフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。或いは、Ｆａｂ発現ライブラリーは、望ましい特異性を持つモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な識別を可能にするために構築されてもよい（Huse WD et al., (1989) Science 256:1275-128 1）。
【０１４９】
幾つかの実施態様では、好ましくは、抗体はポリクローナル抗体である。
【０１５０】
抗体は、さらに優れたデバイス又はアッセイに適合するように変更−例えば、誘導体化−されてもよい。例えば、抗体は、マトリックスへの特異的な付着／結合を可能にする１つ又はそれ以上の誘導体化プラスチックのような化学部分に連結されてもよい。
【０１５１】
選択的表示手段
本発明のアッセイデバイスは、捕捉手段（４０）に結合した活性酵素の存在を選択的に表示するための選択的表示手段（５０）又は少なくともその構成要素を含む。選択的表示手段（５０）は、沈殿反応を含んでもよい。
【０１５２】
一つの態様では、アッセイデバイスは、選択的表示手段の全部又は実質的に全部を含む。
【０１５３】
別の態様では、アッセイデバイスは、選択的表示手段の少なくとも１つの構成要素が備えられる。その場合、アッセイデバイスは、選択的表示手段のもう一方の構成要素が提供される。一つの態様では、アッセイデバイスが使用されているとき、選択的表示手段はアッセイデバイスの上及び／又は中に構成される。用語の「構成される」は、選択的表示手段を作り出すために構成要素の混合又は接触を包含する。
【０１５４】
別の態様では、本発明のアッセイデバイスとして使用できるデバイスが提供されるキットが提供され、ここでそのキットは選択的表示手段を備える。使用に際して、本発明のアッセイデバイスを形成するために、選択的表示手段の構成要素の全部又は幾つかがデバイスに添加される。
【０１５５】
本明細書で用いる用語の「提供する／される／された」は、システム自体で又はシステムの一部として表示を送達できることを指す。或いは、「提供する／される／された」又は「備えた」は、識別された構成構成要素を含有する又は含むキット又はデバイスを意味する。
【０１５６】
選択的表示手段（５０）は、目に見える色変化を含む又は提供すればよい。色変化は、好ましくは、酵素の基質の反応によって反応種と反応する部分を形成することによって起こる。基質は、マトリックス（２０）に結合されればよい。
【０１５７】
酵素が作用する物質は、その「基質」と呼ばれる。好ましくは、酵素の基質は、アッセイデバイス（１）に結合される。ここで、「結合される」は、連結した又は取り付けられた、を包含する。基質は、デバイスに直接又は間接的に結合されればよい。最も好ましくは、基質は、アッセイデバイス（１）のマトリックス（２０）に結合される、又はそれはデバイスの反対側半分（３）上の位置（５０）に存在すればよい。基質は、好ましくは乾燥形態である。
【０１５８】
好ましくは、酵素がその基質に作用して反応性部分を生じさせる。該反応性部分は、次に反応種に作用して機能的な効果を、好ましくは、色変化のような視覚的に観察可能な効果を生み出す。
【０１５９】
前記の反応性部分はまた、本明細書では部分、還元部分、還元種又は還元作用物とも呼ばれる。
【０１６０】
基質は、ホスファターゼ基質又はリン酸供与基を持つ化合物であればよい。好ましくは、基質は、酸性ホスファターゼ基質である。幾つかの態様について、リン酸供与基の除去は、還元作用物又は反応性部分をもたらす。好ましくは、ホスファターゼ基質は、２−ホスホ−Ｌ−アスコルビン酸三ナトリウム（ＡｓＡｐ）である。他の例としては、替りの２−リン酸アスコルビル塩（例えば、マグネシウム、亜鉛、カルシウム）又は３−Ｏ−リン酸誘導体などの類似体が挙げられる。他の可能性のある例としては、リン酸アスコルビルのエステル化バージョン（ホスホアスコルビルパルミテート）が挙げられる。
【０１６１】
選択的表示手段（５０）が、酵素の基質の反応が反応種と反応する部分を形成することによって起こる色変化を含む場合、その反応種はテトラゾリウム化合物であればよい。これに関して、色変化は、酵素反応の結果としてのホルマザン色素の形成によって起こる。
【０１６２】
テトラゾリウム塩は、酸化還元反応の色変化を妨害する恐れのある物質を取り除くために業界で使用されている。例えば、米国特許第５，１９６，３１４号を参照されたい。また、テトラゾリウム塩の色変化は、米国特許第５，３６０，５９５号において被検体の存在の指標として使用されている。
【０１６３】
本発明では、反応種は、ニトロブルーテトラゾリウム化合物であればよい。反応種は、塩化ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）であればよい。反応種は、或いは、ハロニトロテトラゾリウム化合物であればよい。反応種は、好ましくは、ヨードニトロテトラゾリウム化合物であればよい。好ましくは、反応種は塩化ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）である。
【０１６４】
選択的表示手段に対して、そして最も好ましくは反応種に対して、沈殿物の拡散を低減する又は抑えることができる実体を添加すればよい。これは、結果の質を改善する、そして最も好ましくは、視覚的な沈殿物の線を改善する。最も好ましくは、この実体はポリエチレングリコールであり、そして最も好ましくはこれがテトラゾリウム塩に添加される。
【０１６５】
従って、好ましい態様では、サンプル中の活性酵素を検出する側方流動アッセイデバイス（１）が記述される。好ましくは、酵素は酸性ホスファターゼであり、そして酵素活性は、テトラゾリウム塩を還元して着色した沈殿物を形成することによって決定される。デバイスは、半定量的であり、被検体量は沈殿物による色変化を表示するデバイスの捕捉位置（３０）の数によって示される。
【０１６６】
選択的表示手段（５０）が上記のようにホスファターゼ基質を含む場合、ホスファターゼ基質は、反応促進剤の存在下で、上記のように反応種と反応してもよい。反応促進剤は、第２のマトリックスに結合してもよい。その反応促進剤は、フェナジン化合物であればよい。
【０１６７】
好ましくは、反応促進剤は、メトスルファート化合物である。最も好ましくは、反応促進剤は、フェナジンメトスルファート（ＰＭＳ）である。
【０１６８】
好ましい実施態様では、検出される酵素は基質に作用して、観察可能な効果を生む実体に作用する反応性部分又は還元作用物を生成する。
【０１６９】
好ましい実施態様では、酵素はフィターゼであり、基質はホスファターゼ基質又はリン酸供与基を持つ化合物である。
【０１７０】
別の好ましい実施態様では、酵素はキシラナーゼであり、基質はキシランでありそして反応性部分はキシロースである。
【０１７１】
別の好ましい実施態様では、酵素はアミラーゼであり、基質はデンプンでありそして反応性部分はグルコースである。
【０１７２】
好ましい実施態様では、実体はテトラゾリウム塩でありそして観察可能な効果は目に見える効果であり、最も好ましくは色変化である。
【０１７３】
好ましい実施態様
本発明のアッセイデバイス（１）の２つの好ましい実施態様を、図１ａ及び図１ｂに示す。
【０１７４】
好ましくは、アッセイデバイス（１）は、ストリップ又はスティックである。このストリップ又はスティックに沿って、液体サンプルは、図１に矢印で示される方向に縦に流れることができる。ストリップ又はスティック本体は、マトリックス（２０）を含む。デバイスの実施態様１（図１ａ）におけるように、配置領域（１０）は、好ましくは、ストリップ又はスティックの１つの端にある。捕捉位置（３０）は好ましくはストリップ又はスティックの配置領域（１０）と反対の端にある。
【０１７５】
選択的表示手段（５０）又はその構成要素は、使用時にアッセイデバイスに添加されればよい。好ましくは、これらの表示手段又は少なくともそれらの構成要素は、液体の形態である。好ましくは、選択的表示手段（５０）又は選択的表示手段（５０）の幾つかの構成要素を除いて、全ての試薬は乾燥されている。或いは、全ての試薬は乾燥又は脱水した形態であればよい。
【０１７６】
アッセイデバイス（１）の好ましい実施態様２は、図１ｂに示される。この場合、アッセイデバイス（１）は、折り畳みセクション又は折り目（７０）で接合された２つの相対する半分から成る。動作可能にマトリックス（２０）に連結された配置領域（１０）は、デバイスの片方半分（２）に設置される。捕捉位置（３０）及び捕捉手段（４０）は、マトリックス（２０）上に設置される。デバイスの同じもの（２）又は反対の半分（３）は、選択的表示手段又は少なくともその構成要素を含み、そして場合により、反対の半分（３）は、過剰のサンプルを吸収するための吸収パッド（６０）を含む。
【０１７７】
実施態様２を使用するとき、オペレータはサンプルを該配置領域（１０）に置く。彼／彼女は次にサンプルを少なくとも所要の位置まで流す。次に、彼／彼女は折り畳みセクション（７０）に沿ってデバイスを閉じる。これは、選択的表示手段（５０）、又は少なくともその構成要素をマトリックス（２０）及び捕捉手段（４０）に接触させる。オペレータは、選択的表示手段（５０）又は選択的表示手段（５０）の幾つかの構成要素を液体の形態でデバイスに添加する必要があればよい。
【０１７８】
幾つかの実施態様について、選択的表示手段又は選択的表示手段の幾つかの構成要素は、位置（９０）に乾燥形態で存在すればよい。好ましくは、全ての試薬は乾燥している。幾つかの実施態様では、ＩＮＴ又はＮＢＴのいずれかのテトラゾリウム溶液が、オペレータによって位置（５０）又は（３０）に添加されればよい。
【０１７９】
場合によって好ましくは、実施態様２は、デバイスの２つの半分（２）及び（３）が閉じられた時点でオペレータがアッセイデバイスの結果を見る（言い換えると、捕捉位置を見る）ことができる視界窓（８０）を含む。
【０１８０】
本発明のアッセイデバイス（１）は、アッセイデバイスが正しく機能したかどうかを示す表示域又は表示線（９１）を場合により含んでもよい。好ましくは、その表示域又は線は、アッセイが機能したことを、色変化を介して表示する。任意の表示域又は線は、抗体を含んでもよい。これらの抗体は、酵素それ自体に対して又はその構成要素（例えば、そのフラグメント及び／又はそのエピトープ）に対して産生されたものであればよく、ここで上記酵素は、検出すべき活性酵素とは無関係である。さらに又は或いは、表示線は、少なくとも基質構成要素の幾つかと反応できる無関係の酵素を含んでもよい。
【０１８１】
さらに又は別の方法では、表示域は、酸性ホスファターゼ又は検出しようとするフィターゼとは無関係なフィターゼを含んでもよい。
【０１８２】
一つの実施態様では、本発明は、サンプル中の活性酵素を検出するためのアッセイデバイスを提供し；ここでデバイスは以下を含む：（ａ）サンプルを置くことができる配置領域；（ｂ）該配置領域と動作可能に連結されたマトリックスであって、サンプルが、該配置領域に存在する（例えば置かれた）とき、上記マトリックスに沿って移動できる、上記マトリックス；（ｃ）上記マトリックス上の少なくとも１つの個別捕捉位置であって、それぞれの個別捕捉位置は配置領域から離れて、そしてサンプルはその個別捕捉位置を横切って移動できる、上記個別捕捉位置；（ｄ）それぞれの個別捕捉位置に存在する又は個別捕捉位置を定義する捕捉手段であって、該捕捉手段は、上記酵素の上記サンプルの少なくとも一部分が少なくとも１つの個別捕捉位置に保持されるように上記酵素に結合できる、上記捕捉手段；及び（ｅ）上記捕捉手段に結合した活性酵素の存在の選択的表示を提供するための、選択的表示手段又は少なくともその構成要素。
【０１８３】
好ましくは、酵素はフィターゼである。
【０１８４】
一つの態様では、本発明はサンプル中の活性酵素を検出するためのアッセイデバイスを提供し；ここで使用時のデバイスは以下を含む：（ａ）サンプルを置くことができる配置領域；（ｂ）該配置領域と動作可能に連結されたマトリックスであって、サンプルが、上記配置領域に存在する（例えば置かれた）とき、該マトリックスに沿って移動できる、上記マトリックス；（ｃ）上記マトリックス上の少なくとも１つの個別捕捉位置であって、それぞれの個別捕捉位置は配置領域から離れて、そしてサンプルはその個別捕捉位置を横切って移動できる、該個別捕捉位置；（ｄ）それぞれの個別捕捉位置に存在する又は個別捕捉位置を定義する捕捉手段であって、上記捕捉手段は、上記酵素の上記サンプルの少なくとも一部分が少なくとも１つの個別捕捉位置に保持されるように上記酵素に結合できる、上記捕捉手段；及び（ｅ）上記捕捉手段に結合した活性酵素の存在の選択的表示を提供するための選択的表示手段。
【０１８５】
好ましくは、酵素はフィターゼである。
【０１８６】
一つの実施態様では、サンプル中の活性酵素を検出するためのアッセイデバイスを提供し；ここでデバイスは以下を含む：（ａ）サンプルを置くことができる配置領域；（ｂ）該配置領域と動作可能に連結されたマトリックスであって、サンプルが、上記配置領域に存在する（例えば置かれた）とき、該マトリックスに沿って移動できる、上記マトリックス；（ｃ）上記マトリックス上の少なくとも１つの個別捕捉位置であって、それぞれの個別捕捉位置は配置領域から離れて、そしてサンプルはその個別捕捉位置を横切って移動できる、上記個別捕捉位置；（ｄ）それぞれの個別捕捉位置に存在する又は個別捕捉位置を定義する捕捉手段であって、該捕捉手段は、上記酵素の上記サンプルの少なくとも一部分が少なくとも１つの個別捕捉位置に保持されるように上記酵素に結合できる、上記捕捉手段；及び（ｅ）上記捕捉手段に結合した活性酵素の存在の選択的表示を提供するための、選択的表示手段又は少なくともその構成要素；そしてここで、酵素はフィターゼであり、そしてここで選択的表示手段は酸性ホスファターゼを含む。
【０１８７】
半定量的
本発明のアッセイデバイス（１）は、サンプル中の活性酵素の量の少なくとも半定量的測定を提供してもよい。
【０１８８】
好ましくは、量は、結合した酵素の存在を示す捕捉位置（３０）の数と相対的である。或いは、半定量的測定は、捕捉位置（３０）の色変化の強さを用いて行うことができる。
【０１８９】
色変化の強さは、スコアカード又は参照カードを用いて評価することができ、好ましくは、ここでオペレータは、マトリックス（２０）上の着色反応の強さをスコアカードと比較する。さらに、又は代りに、ユーザーは、色変化を読み取りその分析結果をユーザーに報告できる電子機器を使用してもよい。例として、その電子機器は、好適な「アプリケーション」を含む携帯電話であってもよい。
【０１９０】
半定量的測定は、活性酵素の量が一定の量又は濃度より上か又は下か、例えば３００ＦＴＵ／ｇの上か又は下かを決定してもよい。
【０１９１】
本発明の方法及び使用
上記のように、本発明は、サンプル中に活性酵素が存在するかどうかを測定するための方法及び使用（例えば、本発明のデバイスを用いる）を提供する。好ましくは、この方法は半定量的である。方法は、サンプルと共に本明細書に記載されるアッセイデバイス（１）を用いること、及び結果を他のサンプルと比較することに関連する。
【０１９２】
より多くの活性酵素を含むサンプルは、結合した活性酵素の存在を表示するより多くの捕捉位置（３０）をもたらす。
【０１９３】
或いは又はさらに、捕捉位置により強い（例えば、より濃い）色変化を引き起こすサンプルは、より多くの活性酵素を含む。
【０１９４】
好ましくは、その方法は、活性ホスファターゼ即ちリン酸モノエステルヒドロラーゼ（EC 3.1.3）及びグリコシドヒドロラーゼ（EC 3.2.1）を測定するために使用され、アルカリホスファターゼ（EC 3.1.3.1）、酸性／酸ホスファターゼ（EC 3.1.3.2）、３−フィターゼ（EC 3.1.3.8）、６−フィターゼ（EC 3.1.3.26）、エンド−１，４−β−キシラナーゼ（EC 3.2.1.8）及びキシランエンド−１，３−β−キシロシダーゼ（EC 3.2.1.32）、好ましくはキシラン１，４−β−キシロシダーゼ（EC 3.2.1.37）、α−アミラーゼ（EC 3.2.1.1）、β−アミラーゼ（EC 3.2.1.2）、オリゴ−１，６−グルコシダーゼ（EC 3.2.1.10）、グルカン１，４−α−グルコシダーゼ（EC 3.2.1.3）、プルラナーゼ（EC 3.2.1.41）、セルラーゼ（EC 3.2.1.4）、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ（EC 3.2.1.6）、及びグルカンエンド−１，３−β−Ｄ−グルコシダーゼ（EC 3.2.1.39）が挙げられる。より好ましくは、フィターゼＢＰ１７のような活性６−フィターゼのレベルが決定される。
【０１９５】
本発明のさらなる態様は、それが食品又は飼料又はバイオ燃料又は洗剤組成物中の活性酵素のレベルを決定する方法を提供することである。この方法は、食品又は飼料又はバイオ燃料又は洗剤組成物のサンプル、好ましくは水性サンプルを調製することを含む。次に、サンプルを本発明のアッセイデバイス（１）の配置領域（１０）上に置き、サンプル中の活性酵素の量を半定量的に決定するためにアッセイデバイス（１）が使用される。数個のサンプル中の活性酵素の量は、互いに比較する及び／又は対照サンプルと比較できる。最も好ましくは、この方法は、食品又は飼料中の活性フィターゼレベル、好ましくは活性フィターゼＢＰ１７レベルを決定するために用いられる。
【０１９６】
本発明はさらに、追加の酵素又は食品若しくは飼料添加物が必要かどうかを測定する方法を提供する。もし、上記の方法を用いて規定の量又は相対量よりも少ない活性酵素が検出されるなら、それは、追加の酵素を添加すべきであることを示している。最も好ましくは、この方法は、追加のフィターゼ、好ましくは活性フィターゼＢＰ１７が食品又は飼料に添加されるべきかどうかを決定するために用いられる。
【０１９７】
上記の方法は、品質管理のために用いることができる。そのような方法は、サンプル中の活性酵素レベルを決定するために本発明のアッセイデバイス（１）を使用し、そして次にこれらの酵素が、酵素の品質管理レベルに適合するかどうかを決定することを含む。好ましくは、そのような方法は、飼料又は使用添加物中のフィターゼレベルを決定するため、そして次にその飼料又は飼料添加物を使用すべきかどうかを決定するために使用されてもよい。
【０１９８】
本発明はさらに、サンプル中の活性酵素の存在を決定する方法を提供し、ここでその方法は以下のステップ：
ａ）サンプルの少なくとも一部を捕捉手段と接触させ、それによって酵素が該捕捉手段によって捕捉される；
ｂ）捕捉された酵素用の好適な基質を供給し、ここで該基質は該捕捉された酵素と反応して酵素産物を生じる；
ｃ）酵素産物と反応し得る反応種を供給し、ここで該反応種は該酵素産物と反応して不溶性の生成物を生じる；及び
ｄ）ステップｃ）で得られた不溶性の生成物を検出し、ここで該検出はサンプル中の活性酵素の存在及び／又は量と相関する；
を含む。
【０１９９】
好ましくは、サンプルは、食品若しくは飼料サンプル又は食品若しくは飼料成分サンプル又はバイオ燃料若しくは洗剤組成物サンプルである。好ましくは、サンプルは乾燥した、再水和した又は水性のサンプルである。最も好ましくは、サンプルは液体サンプルである。
【０２００】
好ましくは、本方法によって検出しようとする活性酵素は、ホスファターゼ又はグリコシドヒドロラーゼ、最も好ましくは、酸性ホスファターゼ、フィターゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、又はβ−グルカナーゼである。
【０２０１】
好ましくは、本方法で用いられる捕捉手段は、アッセイデバイス（１）によって検出しようとする活性酵素に結合する抗体である。抗体は、酵素自体に対して又はその構成要素（例えば、そのフラグメント及び／又はそのエピトープ）に対して産生されたものであればよい。
【０２０２】
好ましくは、捕捉された酵素用の基質は、ホスファターゼ基質又はリン酸供与基を持つ化合物であればよい。好ましくは、基質は、酸性ホスファターゼ基質であり、そして最も好ましくは、ホスファターゼ基質は、２−ホスホ−Ｌ−アスコルビン酸三ナトリウム（ＡｓＡｐ）である。
【０２０３】
好ましくは、本方法で使用される反応種は、テトラゾリウム化合物であればよい。最も好ましくは、反応種は、ニトロブルーテトラゾリウム化合物であればよい。反応種は、塩化ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）であればよい。反応種は、或いは、ハロニトロテトラゾリウム化合物であればよい。反応種は、好ましくは、ヨードニトロテトラゾリウム化合物であればよい。好ましくは、反応種は塩化ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）である。
【０２０４】
不溶性の生成物は、好ましくは沈殿物、最も好ましくは視覚的に検出又は観察可能な沈殿物、好ましくは着色した沈殿物である。
【０２０５】
不溶性の生成物は、好ましくは視覚的に又は電子的に検出又は観察される。最も好ましくは、それは色変化によって検出可能である。
【０２０６】
キット
本発明は、キットの形態で提示されてもよい。そのようなキットは、オペレータが好ましくは実験室の外でのアッセイを実施することを可能にする。キットは、アッセイを実施するために必要な１つ又はそれ以上の又は全ての試薬を提供すればよい。そのような試薬は、乾燥した又は脱水した形態であればよい。乾燥試薬は、溶媒に溶けたサンプル、好ましくは水性のサンプルで再構成されればよい。好ましくは、選択的表示手段（５０）又は選択的表示手段（５０）のいくつかの構成要素を除く全ての試薬は乾燥される。そのようなキットは、「半乾燥フォーマット」として知られ得る。好ましくは、反応種を除いて、全ての試薬は乾燥される。最も好ましくは、ＩＮＴ又はＮＢＴのいずれかのテトラゾリウム溶液以外の全ての試薬は乾燥される。オペレータは、アッセイを実施するために、乾燥した試薬に液体を添加する。
【０２０７】
好ましくは、アッセイデバイス（１）は、スティック又は最も好ましくはストリップの形態で供給される。最も好ましくは、乾燥した試薬は、提供されるストリップ又はスティックに結合されている。本発明のキットはまた、１つ又はそれ以上のバッグ（例えば、プラスチックバッグ）、ピペット、シリンジ、チューブ又は試験管も含み得る。好ましくは、ストリップ又はスティックは、ハウジング、例えば、プラスチック、カード紙又はボール紙製ハウジングに収容される。
【０２０８】
本発明のアッセイデバイス（１）は、図１の実施例１又は図１の実施例２に示されるようにキットで提供され得る。
【０２０９】
本発明のキットは、アッセイデバイスを含む又は形成できればよく、そしてアッセイデバイスの全ての構成要素には以下が含まれる：
（ａ）上にサンプルを置くことができる配置領域（１０）；
（ｂ）該配置領域（１０）と動作可能に連結されたマトリックス（２０）であって、サンプルが、上記配置領域（１０）に存在する（例えば置かれた）とき、該マトリックス（２０）に沿って移動できる上記マトリックス（２０）；
（ｃ）上記マトリックス上の少なくとも１つの個別捕捉位置（３０）であって、それぞれの個別捕捉位置（３０）は配置領域（１０）から離れて、そしてここでサンプルはその個別捕捉位置（３０）を横切って移動できる上記個別捕捉位置（３０）；
（ｄ）それぞれの個別捕捉位置（３０）に存在する又はそれらを定義する捕捉手段（４０）であって、該捕捉手段（４０）は、前記酵素の上記サンプルの少なくとも一部分が少なくとも１つの個別捕捉位置（３０）に保持されるように前記酵素に結合できる、上記捕捉手段（４０）；及び
（ｅ）上記捕捉手段（４０）に結合した活性酵素の存在の選択的表示を提供するための、選択的表示手段（５０）又は少なくともその構成要素。
【０２１０】
本発明のキットは、アッセイデバイスの構成要素（ａ）〜（ｄ）の全部又は実質的に全部を含み得て、そこに、使用に際してデバイスに添加される選択的表示手段（５０）が備えられる。
【０２１１】
本発明のキットは、アッセイデバイスの構成要素（ａ）〜（ｄ）の全部及び少なくとも前述の選択的表示手段の構成要素を含み得て、そしてここでキットはさらに、使用時にデバイスに添加される選択的表示手段（５０）の他の構成要素を含む。
【０２１２】
本発明のキットは、アッセイデバイスの構成要素（ａ）〜（ｅ）の全部を含み得る。
【０２１３】
水−又は他の好適な水溶液−などの溶媒は、本発明のキット又はデバイスに付属又は追加され得る。キット構成要素の同じもの又は如何なるものも、水、精製水又は脱イオン水などの溶媒に分散、溶解又は再水和され得る。
【０２１４】
本発明のキットは、スコアカード又は参照カードと共に供給されればよい。色変化の強さは、スコアカード又は参照カードを用いて評価されればよく、好ましくはここでオペレータは、マトリックス（２０）上の色変化の強さをスコアカードと比較する。半定量的測定はスコアカードを用いて行われればよく、例えばここで、活性酵素の量がある量又は濃度より上か又は下か、例えば３００ＦＴＵ／ｇの上か又は下かを、スコアカードを用いて決定してもよい。
【０２１５】
スコアカード又は参照カードは、紙、カード紙又は他の物理的素材で作られていてもよい。或いは、スコアカード又は参照カードは、例えば、電話、スマートフォン、コンピュータ又は他のコンピュータによる機器などで電子的に見てもよい。スコアカードは電子的参照と比較される及び／又はスコアカードは電子的に読み取られ得る。
【実施例】
【０２１６】
本発明は、次の図が参照される実施例のみによって記述される。
【０２１７】
実施例の項の第１部は、サンプル中の活性フィターゼの存在を決定するための、本発明のアッセイデバイス及び方法について詳細を提供する。
【０２１８】
実施例の項の第２部は、サンプル中の活性キシラナーゼの存在を決定するための、本発明のアッセイデバイス及び方法のために用いられてもよい方法論について詳細を提供する。
【０２１９】
本発明のアッセイデバイス及び方法のための抗体の作成
本発明のアッセイデバイス及び方法に用いるための抗体は、Harboe N、Ingild Aの方法論を用いることによって作成できる（Immunization, isolation of immunoglobulins, Estimation of antibody titre. Scand J Immunol Suppl. 1973, 1:161-4）。
【０２２０】
実施例の項の第１部では、本発明のアッセイデバイス及び方法に用いるためのフィターゼＢＰ１７に対する抗体は、以下のHarboe N（１９７３）（同書）の方法論によって作成された。ＢＰ１７の配列（シグナルペプチドを除く）は上記に示される。
【０２２１】
第１部
本発明に導きそして本発明をもたらした研究では、２つの異なる研究方針が取られた。
【０２２２】
１つのアプローチは、本発明によるデバイス（図１に包括的に示される）及びそれを用いた方法及びそれを含むキットをもたらした。このアプローチの方向を我々はフォーマット１と呼んだ。このデバイス等は、実施例１などで詳細に検討される。
【０２２３】
我々はまた、金共役抗体サンドイッチ側方流動アッセイについても検討した。このアプローチの方向を我々はフォーマット２と呼んだ。本明細書に説明した理由により、このアプローチの方向は、好適でないと見なされた。図５及び関連する解説などのフォーマット２（即ち、金共役抗体サンドイッチ側方流動アッセイ）に関する情報は、比較のために付け加えた（比較例の項を参照）。
【０２２４】
また、比較例の項では、我々は、実験の１つの態様についてフォーマット１とフォーマット２の直接比較を行った。
【０２２５】
実施例１〜９
フォーマット１：本発明のアッセイデバイス及び方法
【０２２６】
〔実施例１〕
本発明のアッセイ及びデバイスは、沈殿性基質を使った抗体捕捉試験に関する（例えば、図１及び図２及び図３）。
【０２２７】
この点に関して、沈殿性基質を使った抗体捕捉試験が特徴付けられた。テトラゾリウム塩を還元して着色した沈殿を生むという主要特徴を持つ好的な酸性ホスファターゼ基質が確認され、そして次に側方流動型アッセイにおいて用量依存的シグナル応答で機能することが認められた。
【０２２８】
沈殿性基質を使った抗体捕捉試験の開発では、基質の複雑さ及び試験流動による沈殿物の移動など幾つかの障害が認められた。しかし、この試験は、単に酵素の抗体に対する結合に頼らずに直接酵素活性を測定するので、金共役サンドイッチアッセイ（図５）よりも好適である。
【０２２９】
沈殿性基質アッセイでの抗体捕捉（図２）が、広範囲に開発された。多数のフォーマットが研究され、その試験は、初期の多成分基質やサンプル添加後の試験スティック操作の複雑なデザインから、最少のユーザー処理ステップを持つ簡単な構成に絞り込まれた。
【０２３０】
試験の半定量的な態様は、３本線の試験領域によって決定され、３本線の結果は高レベルの活性酵素（合格）を表し、２本線は中間レベル（境界線）を表しそして１本線又はゼロは低酵素レベル（不合格）を表す。
【０２３１】
このアッセイの展開は、非常に有用なフォーマット、即ち、我々が呼ぶ「半乾燥フォーマット」の開発をもたらした。図３は、本発明の半乾燥フォーマットに関するステップを示す。
【０２３２】
これに関して、そして図３に図示した様に、半乾燥フォーマットでは、オペレータは試験スティックに適用する試験サンプルの水溶液を作る必要がある。基質複合体中の１つの成分の溶液は、「瓶からそのまま」（オペレータによる調製の必要なく）、基質複合体の他の乾燥した成分を含有するパッドでカバーされた試験スティックマトリックス（この例ではニトロセルロース）に直接適用される。次に試験を展開させ、結果は２０〜３０分後に読み取った（図４）。ここで、図４は、図３の半乾燥フォーマットを用いて６−フィターゼ（ＢＰ１７と呼ばれる）の希釈系列からの結果を提示している。６−フィターゼは、上記したように、Buttiauxella sp.由来である。
【０２３３】
「乾燥フォーマット」も研究され、この場合、オペレータはサンプルを適用する必要があるだけになるように、全ての成分が試験の中に乾燥される（図６）。ここに、オペレータは単にサンプルを添加し、試験を明らかにする。最終的な試験はカセット化され、そして図６に描かれる釣合い重りの必要はなくなるだろう。図示された例では、リン酸供与体の２ホスホ−Ｌ−アスコルビン酸三ナトリウム塩（ＡｓＡＰ）及び反応促進剤のフェナジンメトスルファート（ＰＭＳ）は試験ニトロセルロースマトリックス（ＮＣ）中で乾燥され、テトラゾリウム基質の塩化ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）のナイロンパッドは最上部にしっかり設置される。液体サンプルは通常通りに添加され、そして基質成分を再水和するのはサンプル溶液それ自身である。
【０２３４】
従って、図６（即ち、乾燥フォーマット試験の例）では、オペレータは単にサンプルを添加しそして試験を明らかにする。この図において、２ホスホ−Ｌ−アスコルビン酸三ナトリウム塩＝ＡｓＡＰ；反応促進剤のフェナジンメトスルファート＝ＰＭＳ；ニトロセルロースマトリックス＝ＮＣ；そしてテトラゾリウム基質の塩化ヨードニトロテトラゾリウム＝ＩＮＴである。
【０２３５】
〔実施例２〕−サンプル調製
溶媒
サンプル調製法は、水で行った。連続性を目的とするために、ミリＱ水を使用した。ミリＱとは、浄水システムで高度に精製及び脱イオン化された水を言う。
【０２３６】
図７は、１グラムの飼料ペレットを０．２５Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０、ミリＱ水又は水道水のいずれかで３０分間抽出し、フロースルーフォーマットで３重に実施したときに得られた結果を示す（図１１も参照）。それぞれの場合、底部の線は試験線そして最上部線はコントロール線である。試験は、基質適用後１０分及び３０分に撮影した。
【０２３７】
実験から、水道水の使用も同様に半乾燥フォーマットで満足できる結果を生むことが示された。水道水は、試験した他の２つの溶媒と比べて、僅かに増加した視覚シグナルを生じさせた。
【０２３８】
撹拌時間
図７で図解した例では、１グラムの飼料ペレットを１０ｍLのミリＱ水で抽出し、抽出は定速撹拌で１０分間継続した。しかし、さらなる実験から、５分間の単純な振盪の抽出が、フィターゼ１７の水層への完全な抽出を起こすことが示された（図８）。従って、試験サンプルの調製は迅速かつ簡単な手順であり、最低限の訓練を受けたオペレータによって動作可能である。
【０２３９】
図８は、異なる時間の間隔でサンプリングした結果を示す。１グラムの飼料ペレットを１０ｍLのミリＱ水に添加し、生じた溶液をゼロから６０分までのさまざまな時間間隔でサンプリングした。５分後、抽出は試験用に十分であるように見えた。
【０２４０】
一つの態様では、オペレータは、飼料ペレットをサンプル抽出チューブ又はバッグに所定の（チューブに線でマークを付けた）高さまで満たし、次にチューブを水道水で第２の線まで満たす。線は、飼料と水の比率が最適になるようにマークされる。１：１０の比率を一貫して使用してきたが、この比率は効果的な酵素濃度を変化させるために、必要に応じて変えることができた。
【０２４１】
本明細書に提示される実験では、ブランクの粉餌（フィターゼＢＰ１７が欠如）を使用して上記のように抽出し、これに精製したフィターゼＢＰ１７を添加して明確な酵素量にした。
【０２４２】
〔実施例３〕：抗体捕捉及び沈殿性基質試験の開発
沈殿性基質
活性のアッセイのために基質を特定した。この基質は一般的な酸性ホスファターゼ基質であり、リン酸供与体（２ホスホ−Ｌ−アスコルビン酸三ナトリウム塩、ＡｓＡＰ）、反応促進剤（フェナジンメトスルファート、ＰＭＳ）及び反応種（塩化ニトロブルーテトラゾリウム、ＮＢＴ）を用いる。これらの化学物質及び酸性ホスファターゼの存在で、可溶性のテトラゾリウム塩は還元されて不溶性沈殿（テトラゾリウム塩のホルマザン誘導体）の産生をもたらす。ニトロブルーテトラゾリウムの場合、これは青／紫色の沈殿の形成をもたらす。
【０２４３】
試験フォーマットの開発
プロジェクトの実現可能性検討段階の間に、幾つかのフォーマットを分析した。
【０２４４】
フロースルーフォーマット
このアプローチは、「フロースルー」方法論を利用する。標準の側方流動方法論と対照的に、フロースルー試験は、サンプルを専用のニトロセルロース（抗フィターゼＢＰ１７抗体で縞模様になった）の最上部へ直接適用することを含み、そしてサンプルは下層の吸収パッドによってニトロセルロースを通して引かれる。サンプルを適用後、同じ方法で基質を適用され、続いて試験は展開するのを可能にした（図１１）。
【０２４５】
図１１は、フロースルーフォーマットの配置図である。図１１のフォーマットは、非常に簡単で且つ鮮明な視覚的結果を与える。しかし、幾つかの態様にとって、さらに優れた半定量フォーマットを有することが望まれてもよい。したがって、オペレータがこの様式における結果の解釈を容易にできるように、試験完了後の可視の試験線の数がサンプル中に存在する酵素のレベルを示す多重線試験フォーマットを作ることが決められた。
【０２４６】
ディップスティックフォーマット
このフォーマットは、多重線アプローチを採用する。最初に、ニトロセルロースは増加する濃度の６本の線で縞模様にし、そして試験スティック全体を飼料抽出サンプルに沈めた（浸けた）。インキュベーションした後、スティックを水中ですすぎ、次に基質溶液を適用し、そして試験を展開させる（図１２）。
【０２４７】
図１２は、ディップスティックフォーマットの略図を示す。このフォーマットは実施するのが非常に容易であり、そして１つの利点は、試験スティック上にあった吸収パッドが無く、それはサンプル試験後のスティック処理の必要がないことを意味した。試験は機能したが、さらに優れた半定量的な結果を求められる場合がある。ここで、試験される酵素、フィターゼＢＰ１７が存在した場合、用量依存的な視覚強度ではあるものの、試験線の全部が目視可能であった。理想的には、低濃度抗フィターゼＢＰ１７の試験線は、低レベルのフィターゼＢＰ１７サンプルでチャレンジした場合は現れない筈であるが、これは事実と異なった（図１３）。
【０２４８】
図１３は、ディップスティックフォーマットの試験結果を示す。ここでは、ニトロセルロースに、４、２、１、０．５、０．２５及び０．１２５ｍｇ／ｍＬ抗フィターゼＢＰ１７抗体（写真の右から左に）で６本の試験線の縞を付けた。試験スティックを直接、飼料抽出チューブ（７ｍＬ、０〜１．０Ｕ／ｍＬフィターゼＢＰ１７）に加え、振盪しながら２０分間インキュベーションした。次にスティックを取り外し、ミリＱ水で簡単にすすぎ、基質をスティックに添加した。試験を３０分間展開させた後、撮影した。結果は、半定量的には見えなく、高いバックグラウンドがあるようにも見え、それはサンプル中のフィターゼＢＰ１７の量に比例していた。
【０２４９】
ウィッキング・スティック・フォーマット
ここでは、ディップスティックに類似するが試験走行が異なる様式の試験スティックを使用した。試験スティック全体を沈めるのではなく、ここではサンプルは毛管現象によって試験スティックに沿って移動させる。完了した時点で、基質を同じ方法で適用し、そして試験線の展開を進めた（図１４）。
【０２５０】
図１４は、ウィッキング・スティック・フォーマットの略図を示す。この試験フォーマットは、マイクロタイタープレートのウェル内のサンプルを垂直に走行させ、サンプルが走行し終わった時点でスティックをウェルから取り外し、基質の添加が可能なように水平に置いた。
【０２５１】
最初、抗フィターゼＢＰ１７のさまざまな量による多重線試験を使用しそしてサンプルが遭遇した線の順番が試験展開のために重要であることが示された。サンプル中のフィターゼＢＰ１７は最初の試験線に結合するが、もしそれでも未結合のフィターゼＢＰ１７が存在したなら、これは第２の線等々に進んだようにみえた。従って、最初の試験線が高レベルの抗フィターゼＢＰ１７抗体を含んでいた場合、そのときサンプルの大部分はその線に結合し、次の線に結合するものをほとんど残さなかった。一方、遭遇した最初の線が低レベルの抗体を含んでいた場合、そのとき、この線はすぐに飽和になり、大部分のフィターゼＢＰ１７は次の試験線に進み続けた（図１５）。これは、好ましくは最も低レベルの抗体が配置領域の最も近くに在るべきであることを示す。
【０２５２】
図１５は、ウィッキング・スティック・フォーマットの試験結果を示す。ここでは、ニトロセルロースは、４、１及び０．２５ｍｇ／ｍＬの抗フィターゼＢＰ１７で試験線の縞を付けた。サンプルは、水で希釈した０．２、０．０５、０．０１２、０．００６Ｕ／ｍＬのフィターゼＢＰ１７であった。サンプルは、末端を溶液に接触させそして毛管現象で溶液をスティックの上方に移動させることによって、ＮＣの上方に運ばれた。スティックの２つの方向性：４から０．２５ｍｇ／ｍＬ、及び０．２５から４ｍｇ／ｍＬを試験した。１０分後、スティックを基質溶液に触れさせ３０分間展開させた。試験線濃度の配向性は、試験を成功裏に実行することに極めて重要な影響を有する。
【０２５３】
試験システムを簡単にするために、抗フィターゼＢＰ１７の単一濃度の多重線を用いた実験を行った。最初は、サンプル中の大部分のフィターゼＢＰ１７は最初の線に結合しているように見えた。しかし、この予期される問題は、サンプルにブロッキング試薬を添加することによって回避され、ミルクタンパク質カゼインで最良の結果を示した（図１６）。
【０２５４】
図１６は、異なるブロッキング剤を用いたウィッキング・スティック・フォーマットの試験結果を示す。サンプルは、ブランクの粉餌抽出物中の０．４、０．２、０．１、０．０５、０．０２５Ｕ／ｍＬフィターゼＢＰ１７及びゼロコントロール（水又はカゼインのいずれか）に調製した。スティックを４０μＬのサンプルを含むマイクロタイタープレートのウェルに入れ、サンプルを１０分間スティックの上方に毛管作用で運ばせた。スティックをふき取って乾燥し、平らに横たえ、そして４０μＬの基質溶液をニトロセルロース上にピペットで加えた。スティックを３０分間展開させた後、写真撮影した（実施例６を参照）。
【０２５５】
図１７は、試験（ウィッキング・スティック・フォーマット）の半定量性を調節するために、試験線濃度を変化させることに関する結果を示す。結果は、試験線の抗体濃度が０．４〜０．６ｍｇ／ｍＬの濃度を有する試験の半定量性に影響を及ぼし求められる規格に最適であるように見えることを示し、従って、サンプルが捕捉手段を横断できることを示す。
【０２５６】
より詳細には、図１７は、ウィッキング・スティック・フォーマットを用いて、試験の半定量性を調節するために、試験線濃度を変えることによって生じた結果を示す。ニトロセルロースは、０．４、０，６、０．８又は１．０ｍｇ／ｍＬの抗フィターゼＢＰ１７のいずれかの同じ濃度の３本の試験線で縞を付けられた。ブランクの粉餌抽出物は、１ｇの粉餌を１０ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬカゼイン溶液に入れローラーミキサー上で１０分間インキュベーションして調製した。純粋なフィターゼＢＰ１７を、０．２、０．１、０．０５、０．０２５、０．０１２５、０．００６２５及び０．００３１２５Ｕ／ｍＬで粉餌抽出物に添加した。４０μＬのサンプルをマイクロタイタープレートのウェルにピペットで入れ、スティックを挿入し、サンプルを毛管現象でスティックの上方に１０分間移動させた。スティックを取り外し、ふき取り、そして４０μＬの基質溶液をピペットでスティック上に載せ３０分間展開させた。試験線の抗体濃度は、０．４〜０．６ｍｇ／ｍＬの濃度で試験の半定量性に影響を及ぼし、要求される規格に最適であるように見える。これらの結果は、適切なブロッキングと共に、試験線の濃度を変えることが、試験の半定量性を調節するために使用し得ることを示す。
【０２５７】
ディップスティックフォーマットと同様、ウィッキング・スティック・フォーマットの利点は、試験スティックに吸収パッドは無く、従ってオペレータは、サンプル添加後及び基質添加前に試験スティックを処理する必要がないことである。しかし、垂直フォーマットはある用途に対して、特に基質添加前にスティックを再配向しなければならない場合、非常に望ましくない可能性がある。
【０２５８】
これに対処するために、非常に類似した材料で、試験スティックのニトロセルロース部分の上流に吸収サンプルパッドを追加しただけの水平フォーマットを開発した。このアプローチは高品質な結果を与え、フォーマット２では不可能であったさらなる開発の可能性を開いた。ある場合には、ブロッキング剤の添加を必要としてもよい。ある場合には、サンプルパッドは、基質添加の前に除去する必要があってもよい。
【０２５９】
〔実施例４〕：テトラゾリウム基質
この実施例では、テトラゾリウム基質、塩化ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）を試験した。この基質は、試験線上に（ＮＢＴによる青／紫色よりもむしろ）赤色の沈殿をもたらした。
【０２６０】
図１８は、ウィッキング・スティック試験を用いてＮＢＴとＩＮＴの比較を示す。ブランクの粉餌抽出物は、１ｇの粉餌を１０ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬカゼイン溶液に入れローラーミキサー上で１０分間インキュベーションして調製した。純粋なフィターゼＢＰ１７を、０．２、０．１、０．０５、０．０２５、０．０１２５、０．００６２５及び０．００３１２５Ｕ／ｍＬで粉餌抽出物に添加した。４０μＬのサンプルをマイクロタイタープレートのウェルにピペットで入れ、スティックを挿入し、サンプルを毛管現象でスティックの上方に１０分間移動させた。ＩＮＴ溶液は、酢酸緩衝液で４．４５ｍｇ／ｍＬに作成したが、これはＮＢＴ溶液のモル濃度と同じになる。スティックを取り外し、ふき取り、そして４０μＬの基質溶液をピペットでスティック上に載せ１分間インキュベーションした。次に基質溶液を除き、スティックをふき取り、そして３０分間展開させた。
【０２６１】
図１８を見て分かるように、結果は、基質としてＩＮＴの使用はＮＢＴと同様の結果を与えることを示した。ＮＢＴとＩＮＴの両者はこの時点から先は、互換可能に使用した。
【０２６２】
〔実施例５〕：ニトロセルロースの種類
水平フォーマットは有望なフォーマットと見なされたので、このフォーマットに最も適切なニトロセルロースを決定するために広範なニトロセルロースの種類を試験する実験を行った（図１９）。
【０２６３】
図１９は、最も適切なニトロセルロースを決定するために広範なニトロセルロースの種類を試験した結果を示す。さまざまな種類のニトロセルロースに０．５ｍｇ／ｍＬ抗フィターゼＢＰ１７で３本の試験線の縞を付けた。フィターゼＢＰ１７サンプルは、精製酵素からブランクの粉餌抽出物（水１０ｍＬ中１ｇ）で希釈して０．２及び０．０４Ｕ／ｍＬフィターゼＢＰ１７（プラス飼料だけのゼロコントロール）とした。抽出物をピペットで試験スティックのサンプルパッドに取り、サンプルを毛管現象によってスティックに沿って移動させて終了した。サンプルパッドを取り除き、４０μＬの基質を適用した。試験を２０分間進行させ、その後写真撮影した。
【０２６４】
試験したニトロセルロースのうちの１つ、即ちＭＤＩ ９０ ＣＮＰＨは、最良の結果を示し（図１９を参照）、そして確かに前のフォーマットによる前回の実験から決定された最適なニトロセルロースであった。他の２つのニトロセルロースの種類（ＭＤＩ ＳＳ１２ １２μ及びＳＳ１２ １５μ）もまた、満足のいく結果をもたらした。試験した全ての膜は対応した。
【０２６５】
〔実施例６〕：ブロッキング試薬
この時点までに、ブロッキング試薬（例えば、カゼイン）は、抽出後のサンプルに添加されていた。これは、それが最終試験に提供されるのは溶液である必要があり且つオペレータはそれを飼料抽出物に添加することが求められるので、理想的ではないことが決定された。これに対処するために実験を行った。カゼインは水に溶解するのが難しい。しかし、カゼインのナトリウム塩は、これに関して優れていることが認められている。これは、明確な量のカゼインナトリウムを直接飼料抽出物に添加することを可能にした。このアプローチは、機能的であった。しかし、幾つかの態様にとって、サンプル抽出チューブに供給されるカゼインナトリウムは明確な量が要求され、そしてそれは輸送中に置き換えられたりチューブを開けたとき失ったりするので、このアプローチはなおさらに最適化されてもよい。それ故、ブロッキング試薬を試験スティック自体の中に供給する可能性を試験することにした。
【０２６６】
実験は、乾燥したブロッキング試薬をサンプルパッドと試験ニトロセルロースの間のパッドに設置するようにデザインした。
【０２６７】
図２０は、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ−２０）の存在下でブロッキング試薬カゼインの濃度を下げることを試験した結果を示す。ポリエステル接合パッドをさまざまな濃度のカゼイン溶液で飽和させ、３７℃で乾燥させた。次にパッドを試験スティックの「上流」に（追加のサンプルパッドと一緒に）設置した。ブランクの粉餌を水で（１ｇを１０ｍＬで）抽出し、そして精製酵素をその抽出物で希釈した。サンプルは、サンプルパッド上にピペットで取り、それは次にカゼイン含有パッドを通って試験スティック上に流れる。サンプルパッドと接合パッドを取り除き、４０μＬの基質を適用した。試験は２０分間進行させ、その後写真撮影した。驚くべき結果が見られ、界面活性剤単独の存在が、試験を満足に実施することを可能にするのに十分であった。従って、カゼイン無しのパッドは、カゼイン有りのパッドと同じ色強度を示した。
【０２６８】
この結果に励まされ、このアプローチが同様に満足な結果をもたらすかを究明するために、ブロッキング試薬を直接試験ニトロセルロースの上に加えるように実験をデザインした。
【０２６９】
図２１は、満足な結果が得られるかどうかを試験するために、ブロッキング試薬を直接試験ニトロセルロースの上に加えることによって得た結果を示す。
【０２７０】
より詳細には、図２１は、ブロッキング試薬を直接ニトロセルロースに加えるための実験結果を図解する。ニトロセルロースの全長をさまざまなカゼイン／Ｔｗｅｅｎ溶液に５分間インキュベーションし、その後５５℃で１０分間乾燥させた。ニトロセルロースを未処理のサンプルパッドの付いた（接合パッドは無い）裏当てのカード紙に重ね合せた。ブロックされないＮＣ及びカゼイン／Ｔｗｅｅｎ接合パッドが付いたセットもまた構築した。フィターゼＢＰ１７サンプルは、精製酵素からブランクの粉餌抽出物（水１０ｍＬ中１ｇ）で希釈し、０．２及び０．０４Ｕ／ｍＬフィターゼＢＰ１７（プラス飼料だけのゼロコントロール）とした。抽出物をピペットで試験スティックのサンプルパッドに取り、サンプルを毛管現象によってスティックに沿って移動させて終了した。サンプルパッドと接合パッドを取り除き、４０μＬの基質を適用した。試験を２０分間進行させ、その後写真撮影した。
【０２７１】
やはり、カゼインが存在しない界面活性剤だけの状態が優れた結果をもたらした（図２１）。
【０２７２】
この方法の感度を試験するために、界面活性剤だけでブロックしたＮＣを用い、ＩＮＴとＮＢＴ基質の両者を用いてフィターゼＢＰ１７濃度の希釈系列を試験した。
【０２７３】
図２２は、この方法の感度を試験するために、界面活性剤だけでブロックしたＮＣを用い、ＩＮＴとＮＢＴ基質の両者を用いてフィターゼＢＰ１７濃度の希釈系列を試験した結果を示す。縞を付けたニトロセルロースは、０．２５％Ｔｗｅｅｎ−２０溶液中で５分間インキュベーションしそして次に５５℃で１０分間乾燥させた。フィターゼＢＰ１７サンプルは、精製酵素からブランクの粉餌抽出物（水１０ｍＬ中１ｇ）で希釈し、０．４〜０．００１５Ｕ／ｍＬフィターゼＢＰ１７（プラス飼料だけのゼロコントロール）の希釈系列とした。
【０２７４】
より詳細には、図２２はこの実験の結果を示す。縞を付けたニトロセルロースは、０．２５％Ｔｗｅｅｎ−２０溶液中で５分間インキュベーションしそして次に５５℃で１０分間乾燥させた。フィターゼＢＰ１７サンプルは、精製酵素からブランクの粉餌抽出物（水１０ｍＬ中１ｇ）で希釈し、０．４〜０．００１５Ｕ／ｍＬフィターゼＢＰ１７（プラス飼料だけのゼロコントロール）の希釈系列とした。抽出物をピペットで試験スティックのサンプルパッド上に取り、サンプルを毛管現象によってスティックに沿って移動させて終了した。サンプルパッドと接合パッドを取り除き、４０μＬの基質（ＩＮＴ又はＮＢＴを基にした）を適用した。試験を２０分間進行させ、その後写真撮影した。その結果、両者の基質は、同じように機能し、方法の全般的な感度及び半定量性は優れているように見えた。
【０２７５】
界面活性剤で直接ニトロセルロースをブロックする方法の魅力は、それが試験スティック上に第２の「ブロッキングパッド」を含める必要性を取り除き、従って、試験組み立てに関する複雑性を排除することである。その上、試験それ自体にブロッキング試薬を封入することによって、オペレータはサンプル調製のために飼料と水を空のチューブに入れること以外は何もする必要が無くなる。
【０２７６】
生み出された試験スティックは、非常に簡単なデザインであり、ここでそれは、全て同じ濃度の抗フィターゼＢＰ１７抗体の３本の線で縞を付けられ、そして縞を付けられた後、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０の水溶液でブロックされ、ブランクの未処理のサンプルパッドに取り付けられた試験ニトロセルロースから成る。
【０２７７】
〔実施例７〕：基質送達実験
上に詳述した全ての実験では、基質溶液は、３つの成分（ＡｓＡＰ、ＰＭＳ及びテトラゾリウム、ＩＮＴ又はＮＢＴ）を使用直前に混合して添加した。これをオペレータにとって簡単にするために、最終の試験フォーマットの中にこれらの成分を乾燥させることを試みる実験を行った。これは、オペレータが、基質組成に対して責任は無く、そして液体の試験構成要素を供給する必要が無くなることを意味する。
【０２７８】
最初の実験は、さまざまな基質成分を一緒に混合し、吸収パッドを飽和させるために使用し、続いて乾燥させ、そして３７℃で貯蔵することを試験した。その結果を図２３に示す。
【０２７９】
図２３は、一緒に混合したさまざまな基質成分を乾燥しそして貯蔵したときに得た結果を示す。１ｃｍ平方の吸収材を（プレミックス）基質のさまざまな組み合わせに５分間浸した。パッドをふき取って乾かし３７℃のインキュベータに置いた。３０分でパッドは乾燥したとみなし、これを「時間＝０」とした。パッドを規定時間の間隔で、特に紫に偏った（ＮＢＴ）又は赤に偏った（ＩＮＴ）の色変化を求めてモニターした。時間ゼロ及び一晩後を示す。
【０２８０】
この実験では、１ｃｍ平方の吸収剤を（プレミックス）基質のさまざまな組み合わせに５分間浸した。パッドをふき取って乾かし３７℃のインキュベータに置いた。３０分でパッドは乾燥したとみなし、これを「時間＝０」とした。パッドを規定時間の間隔で、特に紫に偏った（ＮＢＴ）又は赤に偏った（ＩＮＴ）の色変化を求めてモニターした。時間ゼロ及び一晩を図２３に示す。一晩の後、より使用に適した組み合わせは；ＮＢＴ又はＩＮＴそのまま；ＡｓＡＰ＋ＰＭＳ；ＰＭＳであり；ＡｓＡＰ＋ＩＮＴは中程度に安定に且つＡｓＡＰ＋ＮＢＴよりも安定に見える。
【０２８１】
この実験から、テトラゾリウム溶液、ＩＮＴ又はＮＢＴと試験の任意の他の成分との混合は、両者共時間が経てばテトラゾリウムの最終的な沈殿をもたらすことが明らかになった。
【０２８２】
ＡｓＡＰとＰＭＳの混合及び乾燥は、長時間安定であるように見えることもまた実証された。全てこれらの乾燥成分を利用する実験を、いくつかの基質成分は乾燥品であるが他は溶液で使用した実験と同じように、行った。アッセイの全ての成分が乾燥形態で提供されることは可能であるように見える。潜在的に、水性のサンプルの使用が、乾燥した成分を再構成してもよい。
【０２８３】
従って、図６（乾燥フォーマット試験の例）では、ユーザー（オペレータ）は、単にサンプルを添加し、試験を明らかにするだけである。この図において、２−ホスホ−Ｌ−アスコルビン酸三ナトリウム塩＝ＡｓＡＰ；反応促進剤のフェナジンメトスルファート＝ＰＭＳ；ニトロセルロースマトリックス＝ＮＣ；そしてテトラゾリウム基質の塩化ヨードニトロテトラゾリウム＝ＩＮＴである。
【０２８４】
〔実施例８〕：乾燥フォーマット
オペレータは単に抽出物を試験に添加する必要があり、そして次にさらなる添加又は操作すること無しに結果を読み取ることができるように、全ての試験成分を試験の中に乾燥して組み入れるための実験を行った。ここで、ドライダウンした全ての成分を備えたパッドは、試験システムのさまざまな部分に組み込まれる。前に示したように、全ての３つの成分を混合して１つのパッドに乾燥して組み入れることができず、そのため、さまざまな成分が別々になってもよい又は少なくとも安定な組み合わせを利用する試験システムは、試験内のそれらのさまざまな配置としてもまた、決定されなければならない。そのような試験がどのように想像されるかの例は、図６に見ることができる。
【０２８５】
図６の乾燥フォーマット試験では、オペレータは単にサンプルを添加し、そして試験を明らかにする。最終的な試験はカセット化されてもよく、そして図６に描かれるユニークな釣合い重りの必要はなくなる。図解された例では、ＰＭＳ／ＡｓＡＰは試験ニトロセルロースに乾燥して組み入れられ、ＩＮＴのナイロンパッドは最上部に確実に設置される。サンプルは通常通りに添加され、そして基質成分を再水和するのはサンプル溶液それ自身である。
【０２８６】
〔実施例９〕：半乾燥フォーマット
乾燥フォーマット（上記）に代わる方法として、いくつかの成分は乾燥形態で供給され、他は溶液のままの実験を行った。これは、半乾燥フォーマットと呼ばれる試験システムを生み出した。
【０２８７】
半乾燥フォーマットでは、サンプルは、前と同様に、水平のスティックに沿って運転され（run）、終了した時点でテトラゾリウム溶液が試験のニトロセルロース上に直接ピペットで置かれる。これは次に、乾燥したＡｓＡＰ／ＰＭＳを含有するニトロセルロースパッドでカバーされ、試験を展開させる。これは、図３（半乾燥フォーマットに関するステップ）に図解される。
【０２８８】
このフォーマットは幾つかの利点を有する。オペレータは、試験に先立って基質試薬を調製する必要は無く、そのフォーマットはテトラゾリウム溶液を用意する必要はあるけれども、それは単に「瓶から直接」それを添加する例に過ぎない。このフォーマットに認められる１つの利点は、吸収パッドを取り除く必要性が排除されることである。ＡｓＡＰ／ＰＭＳパッドの存在は沈殿物を定位置に固定し、そしてたとえサンプルパッドが存在しても生じた沈殿物は移動しない。
【０２８９】
半乾燥フォーマットと前の（全て溶液）フォーマットの比較を、図２４に示す。
【０２９０】
図２４は、半乾燥フォーマットと全溶液フォーマットの比較を示す。フィターゼＢＰ１７サンプルは、精製酵素からブランクの粉餌抽出物（水１０ｍＬ中１ｇ）で希釈し、０．４〜０．００１５Ｕ／ｍＬフィターゼＢＰ１７（プラス飼料だけのゼロコントロール）の希釈系列とした。抽出物をピペットで試験スティックのサンプルパッド上に取り、サンプルを毛管現象によってスティックに沿って移動させて終了した。全溶液フォーマットについては、サンプルパッドを取り除き、４０μＬの完全基質を適用した。半乾燥フォーマットについては、２０μＬのＩＮＴ溶液を試験ニトロセルロースに添加し、ＰＭＳ／ＡｓＡＰのパッドを最上部に置いた。試験を２０分間進行させ、その後写真撮影した。
【０２９１】
図２４の実験結果は、半乾燥法の感度は試験規格に関して許容可能であることを示す。
【０２９２】
この半乾燥フォーマットが許容可能であるためには、最終の試験の提唱された有効期限の間、テトラゾリウム溶液が安定性を保持することである。これに対処するために実験を開始した。そのような実験の結果を、図２５に示す。
【０２９３】
図２５の実験では、フィターゼＢＰ１７サンプルは、精製酵素からブランクの粉餌抽出物（水１０ｍＬ中１ｇ）で希釈し、０．２及び０．０４Ｕ／ｍＬＢＰ１７とした。ＩＮＴは、５０％メタノール、０．１２５Ｍ酢酸緩衝液で４０ｍｇ／ｍＬに調製し、溶解させるために６０℃で加熱した。この保存溶液を０．２５Ｍ酢酸緩衝液で１０ｍｇ／ｍＬに希釈した。一定分量を、−２０℃で冷凍、室温及び５５℃で保存した。４０μＬの各抽出物をピペットで試験スティックのサンプルパッド上に取り、サンプルを毛管現象によってスティックに沿って移動させて終了した。試験は、３通り行った。２０μＬのＩＮＴ溶液をピペットで試験ＮＣ上に取り、ＰＭＳ／ＡｓＡＰのＮＣストリップを最上部に置いた。試験を２０分間進行させ、写真撮影した。「時間＝ゼロ」試験は、基線シグナルを出すために新鮮に調製したＩＮＴ溶液を使って迅速に行った。１４日後、進行中のＩＮＴ溶液の安定性を比較するために、冷凍、室温及び５５℃を視覚的に比較した。１４日後、室温及び５５℃でのＩＮＴ溶液の劣化は見られなかった。−２０℃の試験は、シグナルが他の温度よりも少なく、これは保存及び解凍中の多少のＩＮＴ沈殿によると考えられた。
【０２９４】
２週間後に、全ての温度で活性の変化が認められなかったので、これは、テトラゾリウム溶液が長期間の優れた安定性を有することを示唆する（図２５）。
【０２９５】
〔実施例１０〕：キット
図２９は、本発明のデバイス／キット／アッセイの使用を図解する。
【０２９６】
図２９のパネル１では、回収バッグは指示された最初の線までサンプルで満たされ、次にバッグは指示された第２の線まで水で満たされる。
【０２９７】
パネル２では、バッグはシールされ、次にサンプルが崩壊するまで振盪される。
【０２９８】
パネル３では、ハウジング（図１に図解された、実施態様１のような）は本のように開かれる。
【０２９９】
パネル４では、バッグからサンプル抽出物の一部がピペットに満たされ、これはハウジング上の配置領域に適用される。
【０３００】
パネル５では、ユーザーは、液体がスティックの頂点に移動するまで待つ。これは色変化で表示されてもよい。
【０３０１】
パネル６では、選択的表示手段の１つ又はそれ以上の成分がデバイスに添加される。
【０３０２】
パネル７では、ハウジングが閉じられ、そして封止される。
【０３０３】
パネル８では、展開するためにハウジングは平らな表面に放置される。
【０３０４】
パネル９では、１、２及び３本の線の結果が示される。
【０３０５】
〔比較例〕
フォーマット２：金共役抗体サンドイッチ
図５に図解された金共役抗体サンドイッチは、高レベルと低レベルフィターゼＢＰ１７活性を含む飼料サンプルを区別した。この試験で発生されたシグナルの強度は、遊離の抗フィターゼＢＰ１７抗体の含有によって減衰されてもよく、その濃度は、試験の線形応答を所望のフィターゼＢＰ１７活性範囲にシフトさせることができることを示した。
【０３０６】
しかし、この方法論で、使用したポリクローナル抗フィターゼＢＰ１７ウサギ血清は、野生型及び変性酵素の両者と反応する。
【０３０７】
また、金サンドイッチ・アッセイ作業に対して、不活性なサンプルは、実際は酵素が枯渇していた疑い及び不活化法が単なる不活性化ではなく酵素を破壊していた疑いがあった。
【０３０８】
これに対処するために、サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットを行い、そしてこれは、この見解が正しかったことそして不活性なサンプルは確かに酵素が消費されていたことを示した（図９）。
【０３０９】
図９は、飼料サンプル及び精製フィターゼＢＰ１７のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットに関する。結果は、「試行５」のペレットは粉餌と比較して非常に少量の検出可能なフィターゼＢＰ１７を有し、そして不活性なフィターゼＢＰ１７は認識可能なフィターゼＢＰ１７のバンドを有しないことを示した（ウェスタンブロットで一般的な原料の汚れは見られるが）。精製フィターゼＢＰ１７及び活性フィターゼＢＰ１７（９及び１０列）は、タンパク質染色で１つの強いバンドをもたらしたが、ウェスタンブロットでは多数のバンドであり、おそらくフィターゼＢＰ１７多量体及び分解産物のバックグラウンドレベルによるものであり、加熱不活化サンプルではその何れも認められなかった（８列）。
【０３１０】
やや詳細には、図９は、飼料サンプルと精製フィターゼＢＰ１７のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットの結果を示す。活性及び不活性フィターゼＢＰ１７は、マイクロ濃縮器で３０倍に濃縮した。粉餌が高レベルのフィターゼＢＰ１７を有しそして加工ペレットがごく少量有することが示されているので、「試行５」由来のペレット及び粉餌を使用した。飼料ペレット及び粉餌は、ミリＱ水で１０分間抽出し、生じた抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で運転した。タンパク質はニトロセルロースメンブランに転送し、Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓで総タンパク質を染色した（左側パネル）。ブロットは、抗フィターゼＢＰ１７抗血清第１抗体、続いてビオチン化ヒツジ抗ウサギ第２抗体で実証し、そしてストレプトアビジン−Ｑｄｏｔ６２５（Invitrogen）で視覚化した。結果は、試行５のペレットは粉餌と比較して非常に少量の検出可能なフィターゼＢＰ１７を有し、そして不活性なフィターゼＢＰ１７は認識可能なフィターゼＢＰ１７のバンドを有さないことを示した（ウェスタンブロットで一般的な原料の汚れは見られるが）。精製フィターゼＢＰ１７及び活性フィターゼＢＰ１７（９及び１０列）は、タンパク質染色で１つの強いバンドを与えたが、ウェスタンブロットでは多数のバンドであり、おそらくフィターゼＢＰ１７多量体及び分解産物のバックグラウンドレベルによるものであり、不活性サンプルではその何れも認められなかった。
【０３１１】
この結果は、任意のサンプル中の活性酵素レベルを決定する金アッセイの有効性に疑問を持たせた。実験的に不活性化したフィターゼＢＰ１７と加工後の低フィターゼＢＰ１７活性を持つ飼料は機構的に同等である（即ち、両者の場合で、フィターゼＢＰ１７は破壊されている）ように見えるが、金に基づくアッセイでは、フィターゼＢＰ１７の不活性化が、分解よりもむしろ変性によって起こったという状況を検出することは出来なかっただろう。
【０３１２】
これを試験するため、酵素を破壊することなくフィターゼＢＰ１７活性を阻害するために特異的フィターゼＢＰ１７阻害剤のミオイノシトール・ヘキサスルファート（ＭＩＨＳ）を使用した。ここで、金アッセイは、阻害された酵素の存在でもやはり検出できたのに対し、活性アッセイは非常に低下したシグナルを示した（図１０）。
【０３１３】
図１０は、フィターゼＢＰ１７の特異的阻害剤ＭＩＨＳを用いた、金サンドイッチフォーマット（フォーマット２）と沈殿性基質酵素活性フォーマット（フォーマット１：即ち、本発明のアッセイ）の比較を示す。
【０３１４】
金サンドイッチ試験の結果は、図１０−最上部に示す。ここで、精製フィターゼＢＰ１７は、７５ｍＭグリシン・ＨＣｌ緩衝液ｐＨ２．５で、２．５ｍＭのＭＩＨＳの有り又は無しで、さまざまな濃度に調製し、試験する前に２０分間インキュベーションした。金試験は、１００μＬのサンプルに対して行った。
【０３１５】
比較のために、沈殿性基質試験もまた図１０−下部に示す。沈殿性基質試験は、４０μＬのさまざまな濃度のサンプルに対して行った。２．５ｍＭのＭＩＨＳを含む７５ｍＭグリシン緩衝液（又は緩衝液だけのコントロール）４０μＬを試験スティックに適用し、１５分間インキュベーションした。次に溶液を取り除き、基質溶液（ＡｓＡＰ、ＰＭＳ、塩化ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）を含む２％Ｔｗｅｅｎ−２０）を加えた。これを１分間インキュベーションし、取り除き、スティックを展開させた。２０分後に試験を写真撮影した。結果は、金試験は、阻害されたか否かを問わずフィターゼＢＰ１７を検出するのに対し、沈殿性基質試験は活性酵素だけを明らかに検出することを示した。
【０３１６】
フィターゼＢＰ１７特異的阻害剤のＭＩＨＳ（酵素を破壊することなくフィターゼＢＰ１７活性を阻害する）を用いた金サンドイッチフォーマットと沈殿性基質酵素活性フォーマットの比較である図１０から、金アッセイ（最上部）は阻害された酵素の存在でもやはり検出できたのに対し、活性アッセイ（下部）は非常に低下したシグナルを示したことが分かった。
【０３１７】
従って、金共役抗体サンドイッチフォーマット（図５）は、酵素の存在だけを検出し、その活性を検出しない。特異的な阻害剤によるフィターゼＢＰ１７の機能的不活化でもなお、このアッセイフォーマットで陽性の結果をもたらした。
【０３１８】
これらの結果は、単に酵素が未だ存在するという理由で酵素は活性であるという想定に頼らずに、フィターゼＢＰ１７のような酵素の活性を直接測定できるアッセイの必要性を明確に示した。本発明のアッセイデバイスはその必要性に適合する。
【０３１９】
国際公開公報第２００５／０１４８４７号及び国際公開公報第２００７／００１８９５号は、金試験と同じ原理に基づくアッセイを記載している。申し立てによると、そのアッセイは、記載されたＥＬＩＳＡキットで、加熱処理した飼料の測定で活性フィターゼＢＰ１７だけを検出する。フィターゼＢＰ１７は破壊されそしてサンプル調製において飼料マトリックスと一緒に除去されるので、これは正確でない可能性がある。そのキットは、従って、実際には、存在する活性フィターゼＢＰ１７と存在する非活性フィターゼＢＰ１７を区別できないかもしれない。
【０３２０】
第２部
これらの実験において、我々は、本発明のデバイス及び方法を用いてサンプル中の活性キシラナーゼを検出するための検出方法論について詳細を提供する。
【０３２１】
〔実施例ｉ〕
この実施例で使用する方法論は、還元糖方法論を基にした検出システムである。これに関して、我々はChong et al“Determination of reducing sugars in the nanomole range with tetrazolium blue”(Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 11 (1985) 109-115)に記載の方法論に合わせた。その方法論（それはプレートアッセイである）では、還元糖（キシロースなど）は、糖サンプルをＮａＯＨ中で塩化テトラゾリウムブルー及び酒石酸カリウムナトリウムと加熱（９５℃３分間又は５５℃１時間）することによって検出される。
【０３２２】
サンプル中の活性キシラナーゼを本発明のデバイス及び方法を用いて検出するための我々の方法論では、我々は還元糖（例えば、キシロース）の生成を、キシラン基質に対するキシラナーゼの酵素活性によって、室温でインキュベーションすることによって、塩化テトラゾリウムブルーを塩化ニトロブルーテトラゾリウムと置き換えることによって検出する。塩化ニトロブルーテトラゾリウムは、第１部（上記）で説明したフィターゼＢＰ１７方法論で使用されたのと同じ基質ファミリー由来である。
【０３２３】
データは図２６に示す。これに関して：
最上列（図２６の）左から右に：
純粋なキシロース（５μＬの１％溶液）その後倍加希釈（０．５〜０．０００１％キシロース）が続き、一番右側にゼロコントロール；
最下列（図２６の）左から右に：
最初のウェルに５μＬの１０Ｕ／ｍＬキシラナーゼ、その後酵素の倍加希釈（５〜０．００１Ｕ／ｍＬキシラナーゼ）が続き、一番右側にゼロコントロールを含むキシラナーゼアッセイ。各ウェルはまた、１％キシラン（基質）の入った酢酸緩衝液（０．２５Ｍ、ｐＨ４．５）を５μＬ含む。それぞれのウェルのキシラナーゼとキシランを混合した後、プレートを３７℃で６０分間インキュベーションし、酵素をその基質と反応させた。
【０３２４】
我々の方法論では、２００μＬの「展開液」をそれぞれのウェルに添加し、プレートを５５℃に1時間置き、写真撮影した。展開液は，１ｍｇ／ｍＬのテトラゾリウムブルー、０．５Ｍの酒石酸カリウムナトリウム及び０．０５ＭのＮａＯＨを含む。
【０３２５】
我々の還元糖方法論は、５μＬの０．０３１％キシロース（最上列、左側から６番目のウェル）を検出し、そして酵素アッセイで約５μＬの０．１Ｕ／ｍＬのキシラナーゼ（最下列、左側から７番目のウェル）を検出した。
【０３２６】
〔実施例ｉｉ〕
この実施例で用いた方法論もまた、還元糖方法論を基にした検出システムである。この実施例で用いた方法論は、テトラゾリウムブルーがニトロブルーテトラゾリウムと置き換えられたこと及び反応を室温で６０分間展開させたこと以外は、上記実施例ｉの最上列（キシロース１〜０．０００１％）のための方法論と同じものである。データは図２７に示す。
【０３２７】
〔実施例ｉｉｉ〕
実施例ｉ又は実施例ｉｉで説明した方法論は、サンプル中の活性キシラナーゼを検出するために本発明によるアッセイデバイス又は方法において使用されてもよい。これに関して、キシラナーゼ検出方法論は、第１部（上記）で記述したものに類似した迅速試験に組み込まれる。
【０３２８】
従って、上述したフィターゼＢＰ１７試験と同じ様式で、複雑な飼料抽出物由来のキシラナーゼは、望ましい又は好適なキシラナーゼに対して産生された抗体上に捕捉される。その方法論では、キシラナーゼ酵素をキシラン基質に触れさせ、生じたキシロース産物を、例えば、テトラゾリウム還元糖アッセイで検出する。図２８は、この方法論の概略図を示す。
【０３２９】
上記の明細書で述べられた全ての出版物は、参照することによって本明細書に組み込まれる。記載された本発明の方法及びシステムのさまざまな改良及び変更は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明白になるだろう。本発明は、具体的な好ましい実施態様に関連して記述されたが、請求される発明はそのような具体的な実施態様に不当に限定されないと理解するべきである。実際に、本発明を実施するための記載された形態のさまざまな変更は、生化学又は関連する分野の熟練者にとって明白であり、以下の請求項の範囲であることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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