(57)【要約】  本発明は、免疫原性組成物の撹拌誘導凝集を緩和する新規な製剤、特に、多糖−タンパク質コンジュゲートを有するものを提供する。具体的には、前記新規な製剤は、ポリソルベート８０を含めた従前に使用された界面活性剤よりも有意な利点を提供する１１００〜１７，４００の分子量範囲内のポロキサマーを含む。１つの実施形態において、本発明は、１５の区別される多糖−タンパク質コンジュゲートおよびポロキサマーを有する多価免疫原性組成物を提供する。各コンジュゲートは、担体タンパク質、好ましくはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの異なる血清型（１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆまたは３３Ｆ）から調製された被膜多糖からなる。【選択図】図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）５．０〜８．０の範囲のｐＨを有するｐＨ緩衝化生理食塩水、（ｉｉ）１１００〜１７，４００の範囲の分子量を有するポロキサマーおよび（ｉｉｉ）１以上の多糖−タンパク質コンジュゲートを含む、製剤。
【請求項２】
７，５００〜１５，０００の範囲の分子量を有する、請求項１に記載のポロキサマー。
【請求項３】
７，５００〜１０，０００の範囲の分子量を有する、請求項１に記載のポロキサマー。
【請求項４】
前記ポロキサマーがポロキサマー１８８又はポロキサマー２３７である、請求項１に記載の製剤。
【請求項５】
製剤中のポロキサマーの最終濃度が製剤の０．００１重量／容量％〜５重量／容量％である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６】
製剤中のポロキサマーの最終濃度が製剤の０．０２５重量／容量％〜１重量／容量％である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項７】
製剤中のポロキサマー１８８の最終濃度が製剤の０．０５重量／容量％〜１．０重量／容量％であるか、または製剤中のポロキサマー２３７の最終濃度が製剤の０．１重量／容量％〜１．０重量／容量％である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項８】
ｐＨ緩衝化生理食塩水が５．２〜８．０の範囲のｐＨを有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項９】
前記緩衝液がＴｒｉｓ、リン酸塩、コハク酸塩、ヒスチジン、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、酢酸塩またはクエン酸塩からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１０】
前記緩衝液が５ｍＭ〜５０ｍＭの最終濃度のヒスチジンであるか、または１ｍＭ〜２０ｍＭの最終濃度のコハク酸塩である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１１】
前記生理食塩水が２０ｎＭ〜１７０ｎＭの濃度で存在する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１２】
前記タンパク質が担体タンパク質ＣＲＭ１９７である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１３】
前記多糖−タンパク質コンジュゲートが１以上の肺炎球菌多糖を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１４】
前記多糖−タンパク質コンジュゲート製剤が、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型４多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型５多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ａ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ｂ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型７Ｆ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型９Ｖ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１４多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１８Ｃ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ａ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ｆ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２２Ｆ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２３Ｆ多糖、およびＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３３Ｆ多糖を含む１５価肺炎球菌コンジュゲート（１５ｖＰｎＣ）製剤である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１５】
前記製剤がさらにアジュバントを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１６】
前記アジュバントがアルミニウムベースのアジュバントである、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記アジュバントがリン酸アルミニウムである、請求項１６に記載の製剤。
【請求項１８】
０．１１２〜０．１３０ｍｇのアルミニウム元素、１４０〜１６０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１８〜２２ｍＭのＬ−ヒスチジン緩衝液を含む、請求項１７に記載の製剤。
【請求項１９】
３．６〜４．４μｇの６Ｂを除いて１．８〜２．２μｇの各糖；約３２μｇのＣＲＭ１９７担体タンパク質；０．１２５ｍｇのアルミニウム元素（０．５ｍｇリン酸アルミニウム）アジュバント；約１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび約２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン緩衝液を含有するように処方された単一の０．５ｍＬ用量である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項２０】
前記製剤が、さらに、ｍ−クレゾール、フェノール、２−フェノキシエタノール、クロロブタノール、ベンジルアルコール、またはチメロサールである保存剤を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の製剤を含む、バイアルまたはプレフィルシリンジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖−タンパク質コンジュゲートを有する免疫原性組成物の撹拌誘導凝集を緩和する新規な製剤を提供する。具体的には、新規な製剤は、ポリソルベート８０を含めた従前に使用された界面活性剤よりも優れた有意な利点を提供する１１００〜１７，４００の分子量範囲内のポロキサマー界面活性剤を含む。
【背景技術】
【０００２】
ワクチン製剤は、一般に、安定でなければならず、かつ長い寿命に対する要望および多数用量容器の使用を受け入れるための均一なコンシステンシーのものでなければならない。多糖−タンパク質コンジュゲートを含めたタンパク質に基づくワクチンは、沈殿したタンパク質生成物の非利用可能性のためワクチンの有効なより低い全濃度をもたらしかねないタンパク質の凝集および沈殿を受けやすい。多糖−タンパク質コンジュゲートワクチンは、特に、担体タンパク質単独よりも凝集するより強い傾向を有するように見える。Ｂｅｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ８６：３−９参照。
【０００３】
多糖−タンパク質コンジュゲートワクチンのための製剤の選択は、タンパク質の凝集に大いに影響し得る。Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：７１６−７２５参照。例えば、ソルビトールは水分誘導凝集を低下させることが判明しており（Ｓｃｈｗｅｎｄｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：１１２３４−１１２３８参照）、およびポリソルベート８０および硫酸アルミニウムの双方は、多糖−タンパク質コンジュゲートの沈殿を阻害することが示された（米国特許出願公開第２００７／０２５３９８４Ａ１号参照）。
【０００４】
多糖−タンパク質コンジュゲートを有する免疫原性組成物の安定性を増強させ、かつその凝集／沈殿を阻害するさらなるワクチン製剤に対する継続した要望が当分野にある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００７／０２５３９８４Ａ１号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｅｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ８６：３−９
【非特許文献２】Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：７１６−７２５
【非特許文献３】Ｓｃｈｗｅｎｄｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：１１２３４−１１２３８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、１以上の多糖−タンパク質コンジュゲートを有する免疫原性組成物の撹拌−誘導凝集を阻害する新規な製剤に関する。本発明の製剤は、シリコーン油相互作用、剪断力、出荷撹拌、熱安定性等のような因子に対して免疫原性組成物を安定化させる。
【０００８】
従って、本発明は、（ｉ）５．０〜８．０の範囲のｐＨを有するｐＨ緩衝化生理食塩水、（ｉｉ）１１００〜１７，４００の範囲の分子量を有するポロキサマーおよび（ｉｉｉ）１以上の多糖−タンパク質コンジュゲートを含む製剤に向けられる。
【０００９】
ある実施形態において、ポロキサマーは７，５００〜１５，０００または７，５００〜１０，０００の範囲の分子量を有する。ある実施形態において、該製剤のポロキサマーはポロキサマー１２４、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２３７、ポロキサマー３３８およびポロキサマー４０７からなる群から選択される。１つの特別な実施形態において、ポロキサマーはポロキサマー１８８またはポロキサマー２３７である。もう１つの実施形態において、該製剤中のポロキサマーの最終濃度は製剤の０．００１重量／容量％〜５重量／容量％である。もう１つの実施形態において、製剤中のポロキサマーの最終濃度は製剤の０．０２５重量／容量％〜４重量／容量％、０．０２５重量／容量％〜１重量／容量％、０．０２５重量／容量％〜０．５重量／容量％、または０．０２５重量／容量％〜０．１５重量／容量％である。もう１つの実施形態において、製剤中のポロキサマーの最終濃度は製剤の０．０５重量／容量％〜４重量／容量％、０．０５重量／容量％〜１重量／容量％、０．０５重量／容量％〜０．５重量／容量％、または０．０５重量／容量％〜０．１５重量／容量％である。他の実施形態において、製剤中のポロキサマーの最終濃度は製剤の０．０１重量／容量％、０．０５重量／容量％、０．１重量／容量％、０．５重量／容量％、１．０重量／容量％または５．０重量／容量％である。なおもう１つの実施形態において、製剤中のポロキサマー１８８の最終濃度は製剤の０．０５重量／容量％〜１．０重量／容量％であり、または製剤中のポロキサマー２３７の最終濃度は製剤の０．１重量／容量％〜１．０重量／容量％である。
【００１０】
ある実施形態において、本発明の製剤のｐＨ緩衝化生理食塩水は、５．２〜８．０、５．２〜７．５、または５．８〜７．０のｐＨを有する緩衝液を含む。ある実施形態において、緩衝液はリン酸塩、コハク酸塩、ヒスチジン、酢酸塩、クエン酸塩、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＲＩＳまたはＨＥＰＥＳである。ある実施形態において、緩衝液は１ｍＭ〜５０ｍＭの濃度で存在する。ある実施形態において、緩衝液は５ｍＭ〜５０ｍＭの最終濃度のヒスチジンである。１つの特別な実施形態において、ヒスチジン緩衝液の最終濃度は２０ｍＭである。
【００１１】
ある実施形態において、ｐＨ緩衝化生理食塩水中の塩は塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたはその組合せを含む。１つの特別な実施形態において、ｐＨ緩衝化生理食塩水中の塩は塩化ナトリウムである。１つの実施形態において、塩は２０ｍＭ〜１７０ｍＭの濃度で存在する。
【００１２】
ある実施形態において、多糖−タンパク質コンジュゲート製剤のタンパク質はＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、コレラトキソイド、百日咳トキソイド、Ｅ．ｃｏｌｉの熱不安定性トキソイド（ＬＴ）、ニューモリシントキソイド、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌接着タンパク質Ａ（ＰｓａＡ）、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓからのＣ５ａペプチダーゼ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタンパク質Ｄ、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびツベルクリンの精製されたタンパク質誘導体（ＰＰＤ）からなる群から選択される。
【００１３】
ある実施形態において、製剤の多糖−タンパク質コンジュゲートは１以上の肺炎球菌多糖を含む。ある実施形態において、該１以上の肺炎球菌多糖はＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型４多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型５多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ａ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ｂ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型７Ｆ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型８多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型９Ｎ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型９Ｖ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１０Ａ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１１Ａ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１２Ｆ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１４多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１５Ｂ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１７Ｆ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１８Ｃ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ａ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ｆ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２０多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２２Ｆ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２３Ｆ多糖、およびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３３Ｆ多糖からなる群から選択される。１つの実施形態において、多糖−タンパク質コンジュゲート製剤は、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型４多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型５多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ａ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ｂ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型７Ｆ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型９Ｖ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１４多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１８Ｃ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ａ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ｆ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２２Ｆ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２３Ｆ多糖、およびＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３３Ｆ多糖を含む１５価肺炎球菌コンジュゲート（１５ｖＰｎＣ）製剤である。
【００１４】
ある実施形態において、製剤はさらにアジュバントを含む。１つの実施形態において、アジュバントはアルミニウムベースのアジュバント、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは硫酸アルミニウムである。１つの特別な実施形態において、アルミニウムアジュバントはリン酸アルミニウムである。ある実施形態において、製剤は０．００１ｍｇ〜０．２５０ｍｇのアルミニウム元素を含む。
【００１５】
ある実施形態において、製剤は０．００１ｍｇ〜０．２５０ｍｇのアルミニウム元素、好ましくは、０．１１２ｍｇ〜０．１３０ｍｇのアルミニウム元素、１４０〜１６０ｍＭの塩化ナトリウムおよび１８〜２２ｍＭのＬ−ヒスチジン緩衝液を含む。例示的な実施形態において、製剤は：３．６〜４．４μｇの６Ｂを除いて１．８〜２．２μｇの各糖；約３２μｇのＣＲＭ１９７担体タンパク質；０．１２５ｍｇのアルミニウム元素（０．５ｍｇのリン酸アルミニウム）アジュバント；１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン緩衝液を含有するように処方された単一の０．５ｍＬの用量である。
【００１６】
ある実施形態において、製剤は、さらに、ｍ−クレゾール、フェノール、２−フェノキシエタノール、クロロブタノール、ベンジルアルコール、またはチメロサールを含む。
【００１７】
ある実施形態において、製剤は、バイアル、バイアルストッパー、バイアルクロージャー、ガラスクロージャー、ゴムクロージャー、プラスチッククロージャー、プレフィルシリンジ、シリンジストッパー、シリンジプランジャーを含めたシリンジ、フラスコ、ビーカー、メスシリンダー、ファーメンター、バイオリアクター、チューブ、パイプ、バッグ、ジャー、アンプル、カートリッジおよびディスポーザブルペンからなる群から選択される容器手段内に含有される。ある実施形態において、容器手段はシリコン処理されており、好ましくは焼き付かれている。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｂは、４℃（Ａ）および３７℃（Ｂ）での撹拌の有りおよび無しでのｐＨ５．８製剤についてのサイズ分布である。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｂは、４℃（Ａ）および３７℃（Ｂ）での撹拌の有りおよび無しでのｐＨ５．８製剤についてのサイズ分布である。
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｂは、４℃（Ａ）および３７℃（Ｂ）での撹拌の有りおよび無しでの０．１％（ｗ／ｖ）ポロキサマー１８８製剤に関するｐＨ５．８でのサイズ分布である。
【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｂは、４℃（Ａ）および３７℃（Ｂ）での撹拌の有りおよび無しでの０．１％（ｗ／ｖ）ポロキサマー１８８製剤に関するｐＨ５．８でのサイズ分布である。
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｂは、４℃（Ａ）および（Ｂ）での撹拌の有りおよび無しでの０．１％（ｗ／ｖ）ポロキサマー１８８製剤に関するｐＨ７．０でのサイズ分布である。
【図３Ｂ】図３Ａ〜Ｂは、４℃（Ａ）および（Ｂ）での撹拌の有りおよび無しでの０．１％（ｗ／ｖ）ポロキサマー１８８製剤に関するｐＨ７．０でのサイズ分布である。
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｂは、４℃（Ａ）および３７℃（Ｂ）での撹拌の有りおよび無しでの０．１％（ｗ／ｖ）ポロキサマー１８８、６％（ｗ／ｖ）スクロースおよび５０ｍＭ  ＮａＣｌ製剤に関するｐＨ７．０でのサイズ分布である。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｂは、４℃（Ａ）および３７℃（Ｂ）での撹拌の有りおよび無しでの０．１％（ｗ／ｖ）ポロキサマー１８８、６％（ｗ／ｖ）スクロースおよび５０ｍＭ  ＮａＣｌ製剤に関するｐＨ７．０でのサイズ分布である。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｄは、ＩＳＴＡ標準出荷実験、（Ａ）ｐＨ５．８製剤からの実行１、（Ｂ）ｐＨ５．８製剤からの実行２、（Ｃ）０．１％ポロキサマー１８８でのｐＨ５．８製剤からの実行１、（Ｄ）０．１％ポロキサマー１８８からの実行２に従った、０．１％ポロキサマー１８８の有りおよび無しでのｐＨ５．８製剤についてのサイズ分布である。
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｄは、ＩＳＴＡ標準出荷実験、（Ａ）ｐＨ５．８製剤からの実行１、（Ｂ）ｐＨ５．８製剤からの実行２、（Ｃ）０．１％ポロキサマー１８８でのｐＨ５．８製剤からの実行１、（Ｄ）０．１％ポロキサマー１８８からの実行２に従った、０．１％ポロキサマー１８８の有りおよび無しでのｐＨ５．８製剤についてのサイズ分布である。
【図５Ｃ】図５Ａ〜Ｄは、ＩＳＴＡ標準出荷実験、（Ａ）ｐＨ５．８製剤からの実行１、（Ｂ）ｐＨ５．８製剤からの実行２、（Ｃ）０．１％ポロキサマー１８８でのｐＨ５．８製剤からの実行１、（Ｄ）０．１％ポロキサマー１８８からの実行２に従った、０．１％ポロキサマー１８８の有りおよび無しでのｐＨ５．８製剤についてのサイズ分布である。
【図５Ｄ】図５Ａ〜Ｄは、ＩＳＴＡ標準出荷実験、（Ａ）ｐＨ５．８製剤からの実行１、（Ｂ）ｐＨ５．８製剤からの実行２、（Ｃ）０．１％ポロキサマー１８８でのｐＨ５．８製剤からの実行１、（Ｄ）０．１％ポロキサマー１８８からの実行２に従った、０．１％ポロキサマー１８８の有りおよび無しでのｐＨ５．８製剤についてのサイズ分布である。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｃは、以下の条件：０．１％（ｗ／ｖ）ポロキサマー１８８（Ａ）の不存在下でのｍ−クレゾール、０．１％（ｗ／ｖ）ポロキサマー１８８の存在下でのｍ−クレゾール、および０．１％（ｗ／ｖ）ポロキサマー１８８（Ｃ）の存在下でのフェノール下での撹拌の有りおよび無しでのｐＨ５．８、３７℃におけるサイズ分布である。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｃは、以下の条件：０．１％（ｗ／ｖ）ポロキサマー１８８（Ａ）の不存在下でのｍ−クレゾール、０．１％（ｗ／ｖ）ポロキサマー１８８の存在下でのｍ−クレゾール、および０．１％（ｗ／ｖ）ポロキサマー１８８（Ｃ）の存在下でのフェノール下での撹拌の有りおよび無しでのｐＨ５．８、３７℃におけるサイズ分布である。
【図６Ｃ】図６Ａ〜Ｃは、以下の条件：０．１％（ｗ／ｖ）ポロキサマー１８８（Ａ）の不存在下でのｍ−クレゾール、０．１％（ｗ／ｖ）ポロキサマー１８８の存在下でのｍ−クレゾール、および０．１％（ｗ／ｖ）ポロキサマー１８８（Ｃ）の存在下でのフェノール下での撹拌の有りおよび無しでのｐＨ５．８、３７℃におけるサイズ分布である。
【図７】図７は、３７℃での撹拌の有りおよび無しでの０．１％（ｗ／ｖ）ポロキサマー２３７製剤に関するｐＨ５．８でのサイズ分布である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、部分的には、多糖−タンパク質コンジュゲートを含有する製剤中での界面活性剤としてのポロキサマーの使用が、撹拌誘導凝集を緩和し、かつ予期せぬことに、ポリソルベートのような他の界面活性剤よりも優れた特性を提供するという発見に基づく。本発明は、多糖−タンパク質コンジュゲートのような免疫原性組成物の安定性を改良し、および免疫原性組成物の微粒子形成（例えば、凝集、沈殿）を阻害する当分野における継続した要望に取り込むものである。
【００２０】
実施例に記載されたように、初期の研究は、０．１％（ｗ／ｖ）の濃度のポロキサマー１８８のワクチン製剤への添加が熱的、機械的応力等に際して凝集体の形成を緩和し得るか否かを調べるものであった。多数の振盪研究ならびにシミュレートされた出荷研究（ＩＳＴＡ標準テスト）は、現行のＩＳＴＡ標準方法を用いる回転振盪およびシミュレートされた出荷実験に続いて凝集を緩和するポロキサマー１８８の能力を示した。
【００２１】
従って、本発明は、多糖−タンパク質コンジュゲートを有する製剤を安定化させる製剤に向けられ、該製剤はｐＨ緩衝化生理食塩水、ここに、当該緩衝液は５．０〜８．０のｐＨを有し、１１００〜１７，４００の分子量を有するポロキサマー、および１以上の多糖−タンパク質コンジュゲートを含む。ある実施形態において、多糖−タンパク質コンジュゲート製剤は容器手段に含まれる。
【００２２】
本明細書中で定義されるように、用語「ＣｐＧ含有ヌクレオチド」、「ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド」、「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」、および同様な用語が、非メチル化ＣｐＧ部位を含有する長さが６〜５０ヌクレオチドのヌクレオチド分子をいう。例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：４２９７参照。
【００２３】
本明細書中で定義されるように、用語「多糖」は、限定されるものではないが、「糖」、「オリゴ糖」、「多糖」、「リポ多糖」「リポ−オリゴ糖（ＬＯＳ）」、「リポ多糖（ＬＰＳ）」、「グリコシレート」、「グリココンジュゲート」等を含めた、免疫学的および細菌ワクチン分野で通常使用されるいずれの抗原性糖エレメント（または抗原性ユニット）も含めることを意図する。
【００２４】
本明細書中で定義されるように、「多糖−タンパク質コンジュゲート」、「肺炎球菌コンジュゲート」、「７価肺炎球菌コンジュゲート（７ｖＰｎＣ）」、「１３価肺炎球菌コンジュゲート（１３ｖＰｎＣ）」、および「１５価肺炎球菌コンジュゲート（１５ｖＰｎＣ）」は、液状製剤、凍結液状製剤および固体（例えば、凍結−乾燥または凍結乾燥）製剤を含む。用語「ＰＣＶ１５」とは１５価肺炎球菌コンジュゲートもいい、かつ用語１５ｖＰｎＣと相互交換可能に用いられる。
【００２５】
本明細書中で定義されるように、用語「析出」、「沈殿」、「微粒子製剤」、「混濁」および「凝集」は相互交換可能に用いることができ、多糖−タンパク質コンジュゲートの「凝集」をもたらすいずれの物理的相互作用または化学的反応もいうことを意図する。凝集（例えば、タンパク質凝集）のプロセスは、しばしば、熱、圧力、ｐＨ、撹拌、剪断力、凍結−解凍、脱水、重金属、フェノール性化合物、シリコンオイル、変性剤等を含めた多数の物理化学的応力によって影響される。
【００２６】
本明細書中で定義されるように、本発明の「界面活性剤」は、免疫原性組成物製剤の表面張力を低下させるいずれの分子または化合物でもある。
【００２７】
ポロキサマーは、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキサイド））の２つの親水性鎖によって両側から挟まれたポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキサイド））のある種の疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロックコポリマーである。ポロキサマーは商品名プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標）によっても知られている。ポリマーブロックの長さは慣用化することができるゆえに、わずかに異なる特性を有する多くの異なるポロキサマーが存在する。上位概念的用語「ポロキサマー」では、これらのコポリマーは（ポロキサマーについては）文字「Ｐ」、続いての、３桁の数字で慣用的に命名され、最初の２桁の数字×１００はポリオキシプロピレンコアの近似的な分子質量を与え、および最後の桁の数字×１０はパーセンテージのポリオキシエチレン含有量を与える（例えば、Ｐ４０７＝４，０００ｇ／モルのポリオキシプロピレン分子質量および７０％ポリオキシエチレン含有量を有するポロキサマー）。プルロニック商品名では、これらのコポリマーの暗号は室温でのその物理的形態を定義するための文字（Ｌ＝液体、Ｐ＝ペースト、Ｆ＝フレーク（固体））で開始し、続いて２または３桁の数字が伴う。数字の表示における最初の桁（３桁の数字における２つの数字）に３００を掛けたものは、疎水性物の近似的な分子量を示し；および最後の数字×１０はパーセンテージのポリオキシエチレン含有量を与える（例えば、Ｌ６１＝１，８００ｇ／モルのポリオキシプロピレン分子質量および１０％ポリオキシエチレン含有量を有するプルロニック（登録商標））。例えば、米国特許第３７４０４２１号参照。
【００２８】
ポロキサマーの例は一般式：ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨを有し、ここに、ａおよびｂのブロックは以下の値を有する：
【００２９】
【表１】
2014502595.tif 000003
本明細書中で用いるように、分子量の単位はダルトン（Ｄａ）またはｇ／モルである。
【００３０】
ある実施形態において、製剤中のポロキサマーの最終濃度は製剤の０．００１重量／容量％〜５重量／容量％である。もう１つの実施形態において、製剤中のポロキサマーの最終濃度は製剤の０．０２５重量／容量％〜４重量／容量％、０．０２５重量／容量％〜１重量／容量％、０．０２５重量／容量％〜０．５重量／容量％、または０．０２５重量／容量％〜０．１５重量／容量％である。もう１つの実施形態において、製剤中のポロキサマーの最終濃度は製剤の０．０５重量／容量％〜４重量／容量％、０．０５重量／容量％〜１重量／容量％、０．０５重量／容量％〜０．５重量／容量％、または０．０５重量／容量％〜０．１５重量／容量％である。他の実施形態において、製剤中のポロキサマーの最終濃度は製剤の０．０１重量／容量％、０．０５重量／容量％、０．１重量／容量％、０．５重量／容量％、１．０重量／容量％または５．０重量／容量％である。もう１つの実施形態において、製剤中のポロキサマー１８８の最終濃度は製剤の０．０５重量／容量％〜１．０重量／容量％であって、製剤中のポロキサマー２３７の最終濃度は製剤の０．１重量／容量％〜１．０重量／容量％である。
【００３１】
界面活性剤は、好ましくは、担体タンパク質にコンジュゲートされない。
【００３２】
製剤はｐＨ緩衝化生理食塩水も含有する。緩衝液は、例えば、ＴＲＩＳ、酢酸塩、グルタミン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、グリシン酸塩、ヒスチジン、グリシン、コハク酸塩、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）およびトリエタノールアミン緩衝液からなる群から選択することができる。緩衝液は４〜１０、５．２〜７．５、または５．８〜７．０の範囲のｐＨに溶液を緩衝化することができる。緩衝液は、さらに、例えば、特に、医薬製剤が非経口使用である場合、非経口使用のためのＵＳＰ適合性緩衝液から選択することができる。緩衝液の濃度は１ｍＭ〜５０ｍＭまたは５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲となる。
【００３３】
生理食塩水（すなわち、ＮａＣｌを含有する溶液）が好ましいが、製剤に適した他の塩は、限定されるものではないが、ＣａＣｌ２、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ２を含む。限定されるものではないが、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールを含めた非イオン性等張剤を塩の代わりに用いてもよい。適当な塩の範囲は、限定されるものではないが、２５ｍＭ〜５００ｍＭまたは４０ｍＭ〜１７０ｍＭを含む。
【００３４】
好ましい実施形態において、ワクチン組成物は塩化ナトリウムとでＬ−ヒスチジン緩衝液中に処方される。
【００３５】
本発明の製剤はさらなる界面活性剤を含有してもよい。好ましい界面活性剤は、限定されるものではないが：（通常は、Ｔｗｅｅｎといわれる）ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤、特に、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０；線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーのような、ＤＯＷＦＡＸ（商標）商品名下で販売される、エチレンオキサイド（ＥＯ）、プロピレンオキサイド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキサイド（ＢＯ）のコポリマー；反復するエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変化し得るオクトキシノール、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に注目される；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）のようなリン脂質；Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズのようなノニルフェノールエトキシレート；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）のような、（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られた）ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル；およびソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５）、およびソルビタンモノラウレートのような（通常、ＳＰＡＮとして知られた）ソルビタンエステルを含む。
【００３６】
本発明のある実施形態において、本発明の製剤はさらにアジュバントで処方される。アジュバントは、免疫原または抗原と共に投与された場合に免疫応答を増強させる物質である。免疫アジュバントは、例えば、抗体力価または細胞媒介免疫応答を誘導しないこと、または弱い誘導、抗原に対する抗体力価を増加させること、および／または個体において免疫応答を達成するのに効果的な抗原の量を低下させることを含めた、単独で投与した場合に弱く免疫原性である抗原への免疫応答を増強させることができる。従って、アジュバントは、しばしば、免疫応答をブーストするために与えられ、これは当業者によく知られている。組成物の有効性を高めるための適当なアジュバントは、限定されるものではないが：
（１）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等のようなアルミニウム塩（ミョウバン）；
（２）例えば、（ａ）モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）のようなマイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に処方される（ＭＴＰ−ＰＥの種々の量を含有してもよい）５％スクワレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５を含有するＭＦ５９（国際特許出願公開第ＷＯ９０／１４８３７号）、（ｂ）より大きな粒子サイズのエマルジョンを生じさせるためにサブミクロンエマルジョンにミクロ流体化された、または渦巻かせた、１０％スクワレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、（ｃ）２％スクワレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、および米国特許第４，９１２，０９４号に記載された３−Ｏ−デアシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（商標））、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群からの１以上の細菌細胞壁成分を含有するＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）；および（ｄ）Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡのような、（（限定されるものではないが、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）等を含めた）ムラミルペプチド、または細菌細胞壁成分のような他の特異的免疫刺激剤の有りまたは無しでの）水中油型エマルジョン処方；
（３）用いてもよいＱｕｉｌ  ＡまたはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号参照）のようなサポニンアジュバント、またはＩＳＣＯＭ（コレステロール、サポニン、リン脂質、および両親媒性タンパク質の組合せによって形成された免疫刺激複合体）および米国特許第５，２５４，３３９号に記載された（タンパク質を含まない以外はＩＳＣＯＭと実質的に同一の構造を有する（ＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ））Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘ（登録商標）のようなそれから生じた粒子；
（４）Ｃｏｒｉｘａ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）から入手可能であって、米国特許第６，１１３，９１８号に記載された、アミノアルキルグルコサミンリン酸塩化合物（ＡＧＰ）、またはその誘導体またはアナログのような細菌リポ多糖、合成リピドＡ；１つのそのようなＡＧＰは、水性形態として、または安定なエマルジョンとして処方される、（以前はＲＣ５２９として知られていた）５２９としても知られた２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドである；
（５）いずれかの合成ヌクレオチド間結合を用いて修飾されたオリゴヌクレオチド、修飾された塩基および／または修飾された糖を有するものを含めた、ＣｐＧモチーフ（米国特許第６，２０７，６４６号）を含有するオリゴヌクレオチドのような合成ポリヌクレオチド（例えば、Ｓｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６２８４−９３；Ｖｅｒｔｈｅｌｙｉ，２００６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．１２７：１３９−５８；およびＹａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．２３：８９−１１０参照）；
（６）インターロイキン（その突然変異体形態を含めた、例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８等；米国特許第５，７２３，１２７号）、インターフェロン（例えば、α、βおよびγインターフェロン）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、共刺激性分子Ｂ７−１およびＢ７−２等、およびＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＲＡＮＴＥＳのようなケモカインのようなサイトカインおよびリンホカイン；および
（７）補体成分Ｃ３ｄのトリマーのような補体；
を含む。
【００３７】
他のアジュバントはＡｍｐｈｉｇｅｎ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ、Ｌ１２１／スクワレン、Ｄ−ラクチド−ポリラクチド／グリコシド、プルロニックポリオール、ムラミルジペプチド、欧州特許第１，２９６，７１３号および第１，３２６，６３４号に記載された殺されたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ＩＣ−３１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ  ＡＧ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）、百日咳トキシン（ＰＴ）、またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性トキシン（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９を含む；例えば、国際特許公開番号ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５参照。
【００３８】
もう１つの実施形態において、アジュバントは前記アジュバントの２、３またはそれ以上の混合物、例えば、ＳＢＡＳ２（３−デアシル化モノホスホリルリピドＡおよびＱＳ２１も含有する水中油型エマルジョン）である。
【００３９】
ある実施形態において、アジュバントはアルミニウム塩である。アルミニウム塩アジュバントはミョウバン沈殿ワクチンまたはミョウバン吸着ワクチンであってよい。アルミニウム−塩アジュバントは当分野でよく知られており、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（１９８８；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）およびＮｉｃｋｌａｓ，Ｗ．（１９９２；Ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｓａｌｔｓ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４３：４８９−４９３）に記載されている。アルミニウム塩は、限定されるものではないが、水和アルミナ、アルミナ水和物、アルミナ三水和物（ＡＴＨ）、アルミニウム水和物、アルミニウム三水和物、アルハイドロゲル（ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）、スーパーフォス（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ）、アムフォゲル（Ａｍｐｈｏｇｅｌ）、水酸化アルミニウム（ＩＩＩ）、ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム（リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ））、アモルファスアルミナ、三水和アルミナ、またはトリヒドロキシアルミニウムを含む。
【００４０】
ＡＰＡはヒドロキシリン酸アルミニウムの水性懸濁液である。ＡＰＡは塩化アルミニウムおよびリン酸ナトリウムを１：１容量比率でブレンドして、ヒドロキシリン酸アルミニウムを沈殿させることによって製造される。ブレンディングプロセスの後、該材料を高剪断ミキサーでサイズを低下させて、２〜８μｍの範囲の標的凝集体粒子サイズを達成する。次いで、生成物を生理食塩水に対して透析濾過し、および蒸気滅菌する。
【００４１】
ある実施形態において、商業的に入手可能なＡｌ（ＯＨ）３（例えば、デンマーク国／Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹのアルハイドロゲルまたはスーパーフォス）を用いて、５０〜２００ｇタンパク質／ｍｇ水酸化アルミニウムの比率でタンパク質を吸着させる。タンパク質の吸着は、もう１つの実施形態においては、タンパク質のｐＩ（等電点ｐＨ）および培地のｐＨに依存する。より低いｐＩを有するタンパク質は、より高いｐＩを有するタンパク質よりも強く正に荷電したアルミニウムイオンに吸着される。アルミニウム塩は２〜３週間にわたってゆっくりと放出されるＡｇの貯蔵所を確立し、マクロファージの非特異的活性化および補体の活性化に関与でき、および／または（恐らくは尿酸の刺激を通じた）先天性免疫メカニズムを刺激することができる。例えば、Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：２３参照。
【００４２】
本発明の多糖−タンパク質コンジュゲート形成はいずれの公知の多糖および担体タンパク質も含むことができる。多糖の例は肺炎球菌多糖、ナイセリア多糖、および連鎖球菌多糖を含む。
【００４３】
ある実施形態において、１以上の肺炎球菌多糖はＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型４多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型５多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ａ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ｂ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型７Ｆ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型８多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型９Ｎ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型９Ｖ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１０Ａ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１１Ａ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１２Ｆ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１４多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１５Ｂ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１７Ｆ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１８Ｃ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ａ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ｆ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２０多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２２Ｆ多糖、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２３Ｆ多糖、およびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３３Ｆ多糖からなる群から選択される。
【００４４】
本発明は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの多数の血清型から得られる多糖を含有する多価肺炎球菌多糖−タンパク質コンジュゲートワクチンに特に適している。７価肺炎球菌コンジュゲートワクチンＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）は血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆからの多糖を含有する。米国特許出願公開第Ｕ．Ｓ．２００６／０２２８３８０Ａ１号は、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆを含めた１３価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを記載する。中国特許出願公開第ＣＮ１０１５９０２２４Ａ号は、血清型１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆ含めた１４価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを記載する。米国仮特許出願第６１／３０２７２６号は血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆを含めた１５価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを記載する。
【００４５】
ある実施形態においては、多糖−タンパク質コンジュゲート製剤は、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型４多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ｂ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型９Ｖ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１４多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１８Ｃ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ｆ多糖およびＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２３Ｆ多糖を含む７価肺炎球菌コンジュゲート（７ｖＰｎＣ）製剤である。
【００４６】
ある他の実施形態においては、多糖−タンパク質コンジュゲー製剤は、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型４多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ｂ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型９Ｖ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１４多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１８Ｃ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ｆ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２３Ｆ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型５多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ａ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型７Ｆ多糖およびＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ａ多糖を含む１３価肺炎球菌コンジュゲート（１３ｖＰｎＣ）製剤である。
【００４７】
１つの実施形態おいて、多糖−タンパク質コンジュゲー製剤は、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型４多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型５多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ａ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ｂ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型７Ｆ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型９Ｖ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１４多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１８Ｃ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ａ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ｆ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２２Ｆ多糖、ＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２３Ｆ多糖、およびＣＲＭ１９７ポリペプチドにコンジュゲートしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３３Ｆ多糖を含む１５価肺炎球菌コンジュゲート（１５ｖＰｎＣ）製剤である。
【００４８】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの被膜多糖は当業者に公知の標準的技術によって調製することができる。例えば、多糖は細菌から単離することができ、公知の方法（例えば、欧州特許第ＥＰ４９７５２４号および第ＥＰ４９７５２５号参照）によって、好ましくはミクロ流体化によって、ある程度のサイズとすることができる。多糖は、多糖試料における粘度を低下させる、および／またはコンジュートされた生成物の濾過性を改良するようなサイズとすることができる。
【００４９】
１つの実施形態において、各肺炎球菌多糖血清型は大豆ベースの媒体中で成長させる。次いで、個々の多糖は遠心、沈殿、および限外濾過を含めた標準的な工程を通じて精製される。例えば、米国特許出願公開第２００８／０２８６８３８号および米国特許第５，８４７，１１２号参照。
【００５０】
担体タンパク質は、好ましくは、非毒性かつ非反応原性であって、十分な量および純度で得ることができるタンパク質である。担体タンパク質はＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ多糖とコンジュゲートまたは接合させて、多糖の免疫原性を増強させることができる。担体タンパク質は標準的なコンジュゲーション手法を受けることができるはずである。本発明の特別な実施形態において、ＣＲＭ１９７は担体タンパク質として使用される。１つの実施形態において、各被膜多糖は同一の担体タンパク質にコンジュゲートされる（各被膜多糖分子は単一の担体タンパク質にコンジュゲートされる）。もう１つの実施形態において、被膜多糖は２以上の担体タンパク質にコンジュゲートされる（各被膜多糖分子は単一の担体タンパク質にコンジュゲートされる）。そのような実施形態において、同一血清型の各被膜多糖は、典型的には、同一担体タンパク質にコンジュゲートされる。
【００５１】
ＣＲＭ１９７はジフテリアトキシンの非毒性変種（すなわち、トキソイド）である。１つの実施形態において、それは、カザミノ酸および酵素エキスベースの培地中で成長させたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ株Ｃ７（β１９７）の培養から単離される。もう１つの実施形態において、ＣＲＭ１９７は、米国特許第５，６１４，３８２号に記載された方法に従って組換えによって調製される。典型的には、ＣＲＭ１９７は限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィーの組合せを通じて精製される。いくつかの実施形態において、ＣＲＭ１９７は、Ｐｆｅｎｅｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）（Ｐｆｅｎｅｘ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓにおいて調製される。
【００５２】
他の適当な担体タンパク質は、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）、ＴＴ（破傷風トキソイド）またはＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００４／０８３２５１号に記載された）コレラトキソイド、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＴ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＴ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからのエキソトキシンＡのようなさらなる不活化細菌トキシンを含む。外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポリン、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌表面プロテインＡ（ＰｓｐＡ；国際特許出願公開第ＷＯ０２／０９１９９８号参照）、肺炎球菌接着タンパク質（ＰｓａＡ）、Ａ群またはＢ群連鎖球菌（例えば、米国特許第６，９５１，６５３号、米国特許第６，３５５，２５５号および米国特許第６，２７０，７７５号に記載された１以上のＳＣＰ変種のような酵素的に不活性な連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ））、またはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅプロテインＤ、なんらかの方法で解毒されたｐｌｙ、例えば、ｄＰＬＹ−ＧＭＢＳ（国際特許出願公開第ＷＯ０４／０８１５１５号参照）またはｄＰＬＹ−フォーマル（ｆｏｒｍｏｌ）を含めた肺炎球菌ニューモリシン（Ｋｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６３；２７０６−１３）、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、およびＰｈｔタンパク質の融合、例えば、ＰｈｔＤＥ融合、ＰｈｔＢＥ融合（国際特許出願公開第ＷＯ０１／９８３３４号および第ＷＯ０３／５４００７号参照）を含めたＰｈｔＸのような細菌外膜タンパク質を用いることもできる。オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはツベルクリンの精製されたタンパク質誘導体（ＰＰＤ）、（Ｎ．ｍｅｎｉｎｉｇｉｔｉｄｉｓからの）ＰｏｒＢ、ＰＤ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅプロテインＤ；例えば、欧州特許第ＥＰ０５９４６１０Ｂ号）、またはその免疫学的機能同等体、合成ペプチド（欧州特許第ＥＰ０３７８８８１号および第ＥＰ０４２７３４７号参照）、熱ショックタンパク質（国際特許出願公開第ＷＯ９３／１７７１２号および第ＷＯ９４／０３２０８号参照）、百日咳タンパク質（国際特許出願公開第ＷＯ９８／５８６６８号および欧州特許第ＥＰ０４７１１７７号参照）、サイトカイン、リンホカイン、成長因子もしくはホルモン（国際特許出願公開第ＷＯ９１／０１１４６号参照）、Ｎ１９タンパク質（Ｂａｒａｌｄｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７２：４８８４−７参照）のような種々の病原体由来抗原からの多数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（Ｆａｌｕｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１：３８１６−３８２４参照）、鉄摂取タンパク質（国際特許出願公開第ＷＯ０１／７２３３７号参照）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのトキシンＡまたはＢ（国際特許出願公開第ＷＯ００／６１７６１号参照）、およびフラゲリン（Ｂｅｎ−Ｙｅｄｉｄｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ６４：９参照）のような他のタンパク質も担体タンパク質として用いることもできる。
【００５３】
ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５（Ｕｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２１８：３８３８−３８４４）；ＣＲＭ９、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３およびＣＲＭ１０７、およびＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔｏｘｉｎｓ，Ｅｄ：Ｆｒａｎｋｅｌ，Ｍａｅｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ，１９９２においてＮｉｃｈｏｌｌｓおよびＹｏｕｌｅによって記載された他の突然変異；Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＳｅｒに対するＧｌｕ−１４８および／またはＧｌｙに対するＡｌａ１５８の欠失または突然変異、および米国特許第４，７０９，０１７号または米国特許第４，９５０，７４０号に開示された他の突然変異；少なくとも１以上の残基Ｌｙｓ５１６、Ｌｙｓ５２６、Ｐｈｅ５３０および／またはＬｙｓ５３４の突然変異、および米国特許第５，９１７，０１７号または米国特許第６，４５５，６７３号に開示された他の突然変異；または米国特許第５，８４３，７１１号に開示された断片のような他のＤＴ突然変異体を用いることもできる。
【００５４】
次いで、（例えば、還元的なアミノ化を介して）精製された多糖を化学的に活性化して、担体タンパク質と反応できる多糖を作成する。一旦活性化されたなら、各被膜多糖を公知のカップリング技術によって別々に担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）にコンジュゲートして、糖コンジュゲートを形成し（または、別法として、各被膜多糖を同一担体タンパク質にコンジュゲートする）、および単一の投与製剤に処方する。
【００５５】
１つの実施形態において、多糖の化学的活性化および担体タンパク質への引き続いてのコンジュゲーションは米国特許第４，３６５，１７０号、第４，６７３，５７４号および第４，９０２，５０６号に記載された手段によって達成される。簡単に述べれば、その化学は、（過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム、または過ヨウ素酸を含めた）過ヨウ素酸塩のような、末端ヒドロキシル基をアルデヒドに酸化するいずれかの酸化剤との反応による肺炎球菌多糖の活性化を含む。該反応は、反応性アルデヒド基の形成を伴う、炭水化物の近接ヒドロキシル基のランダム酸化的開裂に至る。
【００５６】
１つの実施形態において、タンパク質担体（例えば、ＣＲＭ１９７）へのカップリングは、直接的アミノ化を介するタンパク質のリシル基への還元的アミノ化によるものであり得る。例えば、コンジュゲーションは、活性化された多糖および担体タンパク質の混合物をシアノホウ水素化ナトリウムのごとき還元剤と反応させることによって行われる。次いで、未反応アルデヒドを、ホウ水素化ナトリウムのような強力な還元剤の添加でキャップする。
【００５７】
もう１つの実施形態において、コンジュゲーション方法は、糖をテトラフルオロホウ酸１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウム（ＣＤＡＰ）で活性化してシアネートエステルを形成することに依拠することができる。従って、活性化された多糖は、担体タンパク質上のアミノ基に、直接的に、またはスペーサー（リンカー）を介してカップリングさせることができる。例えば、スペーサーは、（例えば、ＧＭＢＳを用いる）マレイミド活性化担体タンパク質または（例えば、ヨードアセチミド［例えば、エチルヨードアセチミドＨＣｌ］またはブロモ酢酸Ｎ−スクシンイミジルまたはＳＩＡＢ、またはＳＩＡ、またはＳＢＡＰを用いる）ハロアセチル化担体タンパク質との反応の後に得られたチオエーテル結合を介して担体にカップリングすることができるチオレート化多糖を与えるための、シスタミンまたはステアミンであり得る。好ましくは、（ＣＤＡＰ化学によって作成されてもよい）シアネートエステルをヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とカップリングさせ、およびアミノ誘導体化多糖を、タンパク質担体上のカルボキシル基を介してカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学を用いて担体タンパク質にコンジュゲートする。そのようなコンジュゲートは国際特許出願公開第ＷＯ９３／１５７６０号、第ＷＯ９５／０８３４８号および第ＷＯ９６／２９０９４号；およびＣｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４０：２４５−２５６に記載されている。
【００５８】
他の適当な技術はカルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを用いる。国際特許出願公開第ＷＯ９８／４２７２１号に多くが記載されている。コンジュゲーションは、カルバメート結合を形成するための、多糖の遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応（Ｂｅｔｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：２５７２−４；Ｈｅａｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２１８：５０９−１８参照）、続いてのタンパク質との反応によって形成できるカルボニルリンカーを含むことができる。これは、第一級ヒドロキシル基へのアノマー末端の還元、第一級ヒドロキシル基の任意の保護／脱保護、ＣＤＩカルバメート中間体を形成するための第一級ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応、およびＣＤＩカルバメート中間体とタンパク質上のアミノ基とのカップリングを含むことができる。
【００５９】
１つの実施形態において、処方に先立ち、各肺炎球菌被膜多糖抗原をＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから個々に精製し、活性化して、反応性アルデヒドを形成し、次いで、還元的アミノ化を用いて共有結合により担体タンパク質ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせる。
【００６０】
被膜多糖の担体タンパク質へのコンジュゲーションの後、多糖−タンパク質コンジョゲートを種々の技術の１以上によって精製する（多糖−タンパク質コンジョゲートの量に対して豊富化させる）。これらの技術の例は当業者によく知られており、濃縮／透析濾過操作、限外濾過、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィー、および深部濾過を含む。例えば、米国特許第６，１４６，９０２号参照。
【００６１】
個々の糖コンジュゲートを精製した後、それらを配合して、本発明の免疫原性組成物を処方する。これらの肺炎球菌コンジュゲートを別々のプロセスによって調製し、単一投与製剤に原体処方する。本発明の多糖−タンパク質コンジュゲートの処方は当分野で認められた方法を用いて達成される。例えば、１５の個々の肺炎球菌コンジュゲートを、生理学的に許容されるビヒクルで処方して、組成物を調製することができる。そのようなビヒクルの例は、限定されるものではないが、水、緩衝化生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、脂質ポリエチレングリコール）およびデキストロース溶液を含む。
【００６２】
各ワクチン用量中のコンジュゲートの量は有意な有害効果なくして免疫保護応答を誘導する量として選択される。そのような量は肺炎球菌血清型に依存して変化させることができる。一般に、各用量は０．１〜１００μｇの各多糖、特に０．１〜１０μｇ、より特別には１〜５μｇを含むことになる。例えば、各用量は１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、または７５０ｎｇ、または１、１．５、２、３、４、５、６、７、７．５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００μｇを含むことができる。
【００６３】
１つの実施形態において、アルミニウム塩の用量は１０、１５、２０、２５、３０、５０、７０、１００、１２５、１５０、２００、３００、５００または７００μｇ、または１、１．２、１．５、２、３、５ｍｇ以上である。なおもう１つの実施形態において、前記したミョウバン塩の用量は組換えタンパク質のμｇ当たりである。
【００６４】
特別なワクチンについての成分の最適量は対象における適切な免疫応答の観察を含む標準的な実験によって確認することができる。例えば、もう１つの実態態様においては、ヒトワクチン接種のための用量は動物実験からのヒトデータへの外挿によって決定される。もう１つの実施形態において、用量は経験的に決定される。
【００６５】
本発明の特別な実施形態において、ＰＣＶ−１５ワクチンは、個々にＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆの肺炎球菌被膜多糖の滅菌液体製剤である。各０．５ｍＬの用量を処方して、：４μｇの６Ｂを除いて、２μｇの各多糖；約３２μｇのＣＲＭ１９７担体タンパク質（例えば、３２μｇ±５μｇ、±３μｇ、±２μｇ、または±１μｇ）；０．１２５ｍｇのアルミニウム元素（０．５ｍｇのリン酸アルミニウム）アジュバント；および塩化ナトリウムおよびＬ−ヒスチジン緩衝液を含有させる。塩化ナトリウム濃度は約１５０ｍＭ（例えば、１５０ｍＭ±２５ｍＭ、±２０ｍＭ、±１５ｍＭ、±１０ｍＭ、または±５ｍＭ）および約２０ｍＭ（例えば、２０ｍＭ±５ｍＭ、±２．５ｍＭ、±２ｍＭ、±１ｍＭ、または±０．５ｍＭ）Ｌ−ヒスチジン緩衝液である。
【００６６】
多糖−タンパク質コンジュゲートは、典型的には、ｐＨ緩衝化生理食塩水中の多数の血清型のブレンドに合わせ、次いで、（生理食塩水中であってよい）アジュバントと合わせる。ポロキサマーはプロセスにおいていずれの段階で加えてもよい。
【００６７】
１つの実施形態において、該プロセスは１５の血清型のブレンドをヒスチジン、生理食塩水、およびポロキサマー中に合わせ、次いで、このブレンドされた材料をＡＰＡおよび生理食塩水と合わせることからなる。
【００６８】
特定の実施形態において、製剤は２５０ｕｇ／ｍＬのＡＰＡ（リン酸アルミニウムアジュバント）と共に、ｐＨ５．８のヒスチジン（２０ｍＭ）、生理食塩水（１５０ｍＭ）およびポロキサマー１８８（０．１％ｗ／ｖ）からなる。現在の努力は、５．８〜７．０のｐＨ範囲を調べ、リストされた製剤が撹拌誘導凝集を緩和することを示した。ポロキサマー１８８についての範囲の知見は、現在、０．０２５〜０．１５％の範囲を調べている途中である。
【００６９】
本発明の組成物はＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの１以上のタンパク質を含むこともできる。含ませるのに適したＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質の例は国際特許出願公開第ＷＯ０２／０８３８５５号および第ＷＯ０２／０５３７６１号で確認されるものを含む。
【００７０】
前記した製剤は１以上のさらなる医薬上許容される希釈剤、賦形剤または医薬上許容される担体を含むこともできる。本明細書中で用いるように、用語「医薬上許容される担体」は、ヒトまたは他の脊椎動物宿主への投与に適合する、いずれかのおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸着遅延剤等を含める意図である。適当な担体は当業者に明らかであり、かなり、投与の経路に依存する。
【００７１】
液状製剤のための医薬上許容される担体は水性または非水性溶液、懸濁液、エマルジョンまたは油である。非水性溶媒の例はプロピングリコール、ポリエチレングリコール、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。水性担体は（水に加えて）アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含む。油の例は動物、植物、または合成起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、もう１つの魚油、または乳または卵からの脂質である。
【００７２】
免疫原性組成物製剤に存在させることができる賦形剤は、限定されるものではないが、保存剤、化学的安定化剤および懸濁化もしくは分散剤を含む。典型的には、安定化剤、保存剤等は、標的化受容者（例えば、ヒト対象）における効能についての最良の処方を決定するために最適化される。保存剤の例はｍ−クレゾール、２−フェノキシエタノール、ベンジルアルコール、チメロサール、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールを含む。安定化成分の例はカザミノ酸、スクロース、ゼラチン、フェノールレッド、Ｎ−Ｚアミン、二リン酸一カリウム、ラクトース、ラクトアルブミン加水分解物、および粉乳を含む。
【００７３】
ある実施形態において、免疫原性組成物製剤は、例えば、液体、粉末、エアロゾル、錠剤、カプセル剤、腸溶被覆錠剤もしくはカプセル剤、または坐薬の形態でのヒト対象への投与のために調製される。従って、免疫原性組成物製剤は、限定されるものではないが、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、エマルジョン、ペースト、およびインプラント可能な除放もしくは生分解性製剤を含むこともできる。
【００７４】
もう１つの実施形態において、本発明の製剤は、経口投与され、従って、経口投与に適した形態に、すなわち、固体または液状製剤として処方される。固体経口製剤は錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、ペレット等を含む。液状経口製剤は溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、油等を含む。
【００７５】
ある実施形態において、製剤は単一用量バイアル、多用量バイアルまたはプレフィルシリンジである。
【００７６】
本発明の免疫原性組成物は、溶媒、緩衝液、アジュバント、または前記したタイプの医薬製剤で有用な他の成分のような慣用的な生理学的に許容される担体、希釈剤および賦形剤の選択によって制限されない。適当なｐＨ、等張性、安定性および他の慣用的な特徴を有する前記成分からのこれらの医薬上許容される組成物の調製は当分野の技量内のものである。
【００７７】
ある実施形態において、本発明は容器手段に含まれた免疫原性組成物の製剤に向けられる。本明細書中に規定されるように、本発明の「容器手段」は、研究、加工、開発、処方、製造、貯蔵および／または投与の間に免疫原性組成物を「含有する」、「保持する」、「混合する」、「ブレンドする」、「分注する」、「注射する」、「導入する」、「霧化する」等するのに用いられるいずれの組成物も含む。例えば、本発明の容器手段は、限定されるものではないが、一般的な実験室ガラス器具、フラスコ、ビーカー、メスシリンダー、ファーメンター、バイオリアクター、チューブ、パイプ、バッグ、ジャー、バイアル、バイアルクロージャー（例えば、ゴムストッパー、スクリュー・オン・キャップ）、アンプル、シリンジ、シリンジストッパー、シリンジプランジャー、ゴムクロージャー、プラスチッククロージャー、ガラスクロージャー等を含む。本発明の容器手段は、製造の材料によって制限されず、ガラス、金属（例えば、スチール、ステンレススチール、アルミニウム等）およびポリマー（例えば、熱可塑性樹脂、エラストマー、熱可塑性樹脂−エラストマー）のような材料を含む。
【００７８】
当業者であれば、前記した容器手段は限定的なリストでは断じてなく、組成物の研究、加工、開発、処方、製造、貯蔵および／または投与の間に、免疫原または免疫原性組成物を含有し、保持し、混合し、ブレンドし、分注し、注射し、導入し、霧化するなどを行うために用いられる種々の容器手段に関して当業者へのガイドラインとして役立つに過ぎないことを認識するである。本発明での使用が考えられるさらなる容器手段は、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｃｏｒｐ．（Ｌｉｍａ，Ｏｈｉｏ）、ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，Ｐａ．）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．（Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｎ．Ｈ．）およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）のような研究室器具の販売業者および製造業者からの公表されたカタログ中に見出すことができる。
【００７９】
従って、本発明の新規な製剤は、それらが、組成物の研究、加工、開発、処方、製造、貯蔵および／または投与の種々の段階を通じて容器手段に含まれた免疫原性製剤を安定化し、およびその沈殿を阻害する点で特に有利である。本発明の新規な製剤は物理的／熱的ストレス（例えば、温度、湿度、剪断力等）に対して免疫原性組成物を安定化させるのみならず、免疫原性組成物と容器／クロージャーシステム（例えば、シリコン処理された容器手段）との不適合性のような負の因子または影響に対して免疫原性組成物の安定化を増強させ、およびその沈殿を阻害する。
【００８０】
本発明の免疫原性組成物の安定性は、当業者によく知られており、かつ当業者にとってルーチン的である標準的な技術を用いて容易に決定される。例えば、免疫原性組成物は、限定されるものではないが、光散乱、光学密度、沈降速度遠心、沈降平衡遠心、円二色性（ＣＤ）、ローリー（Ｌｏｗｒｙ）アッセイ、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ、抗体結合等を含めた方法によって、安定性、凝集、免疫原性、微粒子形成、タンパク質（濃度）喪失等についてアッセイされる。
【００８１】
添付の記載および図面を参照して本発明の種々の実施形態を記載してきたが、本発明はそれらの正確な実施形態に限定されず、および添付の特許請求の範囲に定義された本発明の範囲または精神に逸脱することなく当業者によって種々の変形および修飾をそこでなすことができるのは理解されるべきである。
【００８２】
以下の実施例は本発明を説明するが、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００８３】
実施例１：Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ被膜多糖の調製
肺炎球菌を培養する方法は当分野でよく知られている。例えば、Ｃｈａｓｅ，１９６７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １：５２参照。肺炎球菌被膜多糖を調製する方法はやはり当分野でよく知られている。例えば、欧州特許第ＥＰ０４９７５２４号参照。肺炎球菌血清サブタイプの単離体はＡＴＣＣから入手可能である。
【００８４】
細菌は、血液−寒天上でアルファ溶血性である被包非運動性グラム陽性のランセット形状の双球菌として同定される。サブタイプは特定の抗血清を用いるＱｕｅｌｌｉｎｇ反応に基づいて区別される。例えば、米国特許第５，８４７，１１２号参照。
細胞バンク
ＰＣＶ−１５に存在するＳ．ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ血清型の各々を表す細胞バンクは、凍結したバイアル中にてＭｅｒｃｋ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ）から得た。
接種
解凍された種培養を、適当な予め滅菌された成長培地を含有するシードファーメンターに移した。
シード発酵
培養を温度およびｐＨを制御してシードファーメンター中で成長させた。シードファーメンターの全用量を、予め滅菌した成長培地を含有する生産ファーメンターに移した。
生産発酵
生産発酵は当該プロセスの最後の細胞培養段階であった。温度、ｐＨおよび撹拌速度を制御した
不活化
発酵プロセスは不活化剤の添加を介して終了させた。不活化の後、バッチを不活化タンクに移動させ、そこで、それを制御された温度および撹拌に維持した。
精製
細胞デブリスを、遠心および濾過の組合せを用いて除去した。バッチを限外濾過し、および透析濾過した。次いで、バッチを、不純物を除去し、および多糖を回収する溶媒ベースの分画に付した。
【００８５】
実施例２：肺炎球菌多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの調製
活性化プロセス
異なる血清型糖を、通常のプロセスフローを用いて精製されたＣＲＭ１９７担体タンパク質に個々にコンジュゲートする。このプロセスにおいて、糖を溶解させ、目標分子質量のサイズとし、化学的に活性化し、および限外濾過によって緩衝液交換する。次いで、精製されたＣＲＭ１９７を活性化された糖とコンジュゲートさせ、および得られたコンジュゲートを最終０．２μｍ膜濾過に先立って限外濾過によって精製する。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各工程内のいくつかのプロセスパラメーターは、本実施例に記載されているように血清型特異的である。
工程１：溶解
精製された多糖を２〜３ｍｇ／ｍＬの濃度まで水に溶解させた。溶解した多糖を、０〜１０００バールに予め設定した圧力で機械的ホモゲナイザーを通過させた。サイズ低下に続いて、糖を濃縮し、および１０ｋＤａ  ＭＷＣＯウルトラフィルター上で滅菌水にて透析濾過した。透過物を捨て、および保持物を酢酸ナトリウム緩衝液、５０ｍＭ最終濃度で４．１のｐＨに調整した。血清型４および５について、ｐＨ５．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウムを用いた。血清型４については、溶液を５０°±２℃でインキュベートした。加水分解は、２０〜２４℃まで冷却することによって停止させた。
工程２：過ヨウ素酸塩反応
肺炎球菌糖活性化について必要な過ヨウ素酸ナトリウムのモル等量は、全糖含有量を用いて決定した。徹底的に混合しつつ、温度を２〜６℃とした５、７Ｆおよび１９Ｆを除いて、全ての血清型について２０〜２４℃にて酸化を３〜２０時間の間進行させた。
工程３：限外濾過
酸化された糖を濃縮し、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯウルトラフィルター上の１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４（血清型５については１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．３）で透析濾過した。透過物を捨て、および保持物を３Ｍリン酸カリウム緩衝液の添加によって６．３〜８．４のｐＨに調整した。
コンジュゲーションプロセス
工程１：コンジュゲーション反応
濃縮された糖を、０．２−２対〜１の充填比率にてＣＲＭ１９７担体タンパク質と混合した。ブレンドされた糖−ＣＲＭ１９７混合物を０．２μｍフィルターを通して濾過した。
【００８６】
コンジュゲーション反応を、シアノホウ水素化ナトリウム溶液を加えることによって開始して、糖のモル当たり１．８〜２．０モルのシアノホウ水素化ナトリウムを達成した。反応混合物を２０〜２４℃（血清型３、５、６Ａ、７Ｆ、１９Ａ、および１９Ｆについては８〜１２℃）にて４８〜１２０時間インキュベートした。
【００８７】
工程２：ホウ水素化物反応
コンジュゲーションインキュベーションの最後に、反応混合物を、１．２Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液、または３Ｍリン酸カリウム緩衝液（血清型５を除く）いずれかで４〜８℃、および８〜１０のｐＨに調整した。コンジュゲーション反応は、ホウ水素化ナトリウム溶液を加えて、糖のモル当たり０．６〜１．０モルのホウ水素化ナトリウム（血清型５については０モルのホウ水素化物を添加）を達成することによって停止させた。反応混合物を４５〜６０分の間インキュベートした。
【００８８】
工程３：限外濾過工程
反応混合物を、最小の２０容量の１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨの８．４緩衝液で１００ｋＤａ  ＭＷＣＯウルトラフィルターにて透析濾過した。１００ｋＤａウルトラフィルターからの保持物を、２０〜２４℃にて、最小の２０の二容量の１５０ｍＭ塩化ナトリウムで３００ｋＤａ  ＭＷＣＯウルトラフィルターにて透析濾過した。透過物は捨てた。
【００８９】
工程４：滅菌濾過
３００ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析濾過からの保持物を０．２μｍフィルターを通して濾過し、および放出テスト、インプロセス制御、および処方（血清型１９Ｆを除く）のために適当な容量にてホウ珪酸ガラス容器に充填した。血清型１９Ｆコンジュゲートを０．２μｍフィルターを通して保持タンクに入れ、および２０〜２４℃でインキュベートした。インキュベーションに続き、２０〜２４℃にて、最小の２０二容量の１５０ｍＭ塩化ナトリウムでの３００ｋＤａ  ＭＷＣＯウルトラフィルターにてコンジュゲートを透析濾過した。透過物を捨て、および保持物を０．２μｍフィルターを通して濾過し、および放出テスト、インプロセス制御、および処方のために適切な容量にてホウ珪酸ガラス容器に充填した。最終の原体濃縮物を２〜８℃で貯蔵した。
【００９０】
実施例３：１５価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの処方
原体濃縮物の必要な容量は、バッチ容量および原体糖濃度に基づいて計算した。塩化ナトリウム、Ｌ−ヒスチジン、ｐＨ５．８を含有する緩衝液を含む賦形剤（例えば、ポロキサマー）の添加によって、合わせた１５コンジュゲートを目標吸着濃度までさらに希釈した。十分な混合の後、ブレンドを０．２μｍの膜を通して滅菌濾過した。原体リン酸アルミニウムとのそのブレンディングの間およびその後、滅菌処方原体を穏和に混合した。処方されたワクチンを２〜８℃で貯蔵した。
【００９１】
実施例４：撹拌誘導凝集に対する賦形剤の効果
回転撹拌実験の後に、１５価肺炎球菌コンジュゲートワクチン−１５（ＰＣＶ−１５）の安定性を種々の賦形剤およびｐＨ条件で調べた。ＰＣＶ−１５は、０．２５ｍｇ／ｍＬリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）を含む２０ｍＭヒスチジンｐＨ５．８および１５０ｍＭ塩化ナトリウム中で調製した。６４μｇ／ｍＬのＣＲＭ１９７タンパク質は、６４μｇ／ｍＬの合計多糖濃度について、４μｇ／ｍＬの肺炎球菌多糖（ＰｎＰ）型１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ、および８μｇ／ｍＬの型６Ｂにコンジュゲートした。
【００９２】
回転撹拌実験では、ＰＣＶ−１５製剤骨格は、ｐＨ５．８、６．２、および７．０にて、界面活性剤およびオスモライト、およびオスモライトと組み合わせた界面活性剤の添加で調製した。塩化ナトリウム濃度は、オスモライトの濃度に依存して、１５０ｍＭから１００ｍＭまたは５０ｍＭいずれかまでに調整した。撹拌実験は、４℃での２４時間の回転直立および側面撹拌を用いて設計した。凝集は視覚的におよび静的光散乱で観察した。
【００９３】
処方材料：
ＰＣＶ−１５製剤材料は実施例１〜３に記載されたように調製した。処方された材料は、全ての撹拌実験が完了するまで２〜８℃で貯蔵した。以下の製剤を、０．２５ｍｇ／ｍＬリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）および６４μｇ／ｍＬ多糖：ＣＲＭコンジュゲート：
１．１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．８
２．１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０
３．１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．２
４．１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．６
５．１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．８
６．１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０
７．３％スクロース、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．８
８．３％スクロース、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ＰＳ−８０、ｐＨ５．８
９．６％スクロース、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．８
１０．６％スクロース、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ＰＳ８０、ｐＨ５．８
１１．３％スクロース、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．２
１２．３％スクロース、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ＰＳ−８０、ｐＨ６．２
１３．６％スクロース、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．２
１４．６％スクロース、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ＰＳ８０、ｐＨ６．２
１５．６％トレハロース、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ＰＳ−８０、ｐＨ６．２
１６．６％スクロース、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ポロキサマー１８８、ｐＨ６．２
１７．０．５％スクロース、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ＰＳ−８０、ｐＨ５．８
１８．０．５％スクロース、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ポロキサマー１８８、ｐＨ５．８
１９．０．５％スクロース、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ＰＳ−８０、ｐＨ５．８
２０．０．５％トレハロース、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ＰＳ−８０、ｐＨ５．８
２１．０．５％スクロース、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ＰＳ−２０、ｐＨ５．８
２２．０．５％トレハロース、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ＰＳ−２０、ｐＨ５．８
２３．０．５％スクロース、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．８
２４．０．５％トレハロース、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．８
２５．１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ＰＳ−８０、ｐＨ５．８
２６．１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ＰＳ−２０、ｐＨ５．８
２７．１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ＰＳ−８０、ｐＨ６．２
２８．１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ポロキサマー１８８、ｐＨ５．８
２９．１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ポロキサマー１８８、ｐＨ６．２
３０．１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０４％ＣＴＡＢ、ｐＨ５．８
３１．５０ｍＭ  ＮａＣｌ、６％スクロース、０．１％ポロキサマー１８８、ｐＨ７．０
３２．１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ポロキサマー１８８、ｐＨ７．０
を含む２０ｍＭヒスチジン中で調製した。
【００９４】
撹拌実験手法
撹拌実験の目的は、バイアルを撹拌条件に付し、次いで、これらの条件が凝集体形成に対して有する効果を決定することにある。該実験は親水性表面（非研磨）との相互作用および製剤の最終容器成分および空気界面への暴露を通じてのＰＣＶ−１５製剤の直接的撹拌を表す。ＰＣＶ−１５製剤を、１３ｍｍストッパーを備えた０．７５ｍＬの充填容量の非硫酸塩処理２ｍＬバイアルに充填した。
【００９５】
回転、振動、および転倒撹拌方法について、バイアルを４℃および２５℃にて２４時間直立および側面撹拌を行った。バイアルを、バイアルを７×７フリーザーボックスに最初に入れた直立回転撹拌を除いて直接的に撹拌機器に付着させた。最大スピードでの実験室スケールの多目的ローテーターを回転撹拌で用い、他方１，５００ｒｐｍにおけるデジタル渦巻を振動撹拌で用いた。最大スピードでのＲｏｔｏ−Ｓｈａｋｅ  Ｇｅｎｉｅを転倒撹拌で用いた。観察は回転撹拌方法では８時間まで、および振動および転倒撹拌方法では９時間までで１時間間隔で行い、最終の観察は全ての３つの撹拌方法について２４時間に記録した。バイアルを回転方法では二連で、および処方材料の限定された入手可能性のため振動および転倒方法では一連で撹拌した。全てのバイアルを対照としての非撹拌バイアルと比較した。
【００９６】
加えて、回転撹拌方法では、３％硫酸塩処理２ｍＬバイアルに０．７５ｍＬの製剤を充填した。バイアルを２４時間の間最大スピードで直立および側面撹拌し、および同一条件下で撹拌した非硫酸塩処理バイアルとの比較のために４℃にて１０−ｂｉ生成物カートンの有りおよび無しでパッケージした。１０−ｂｉ生成物カートンは、１０までのバイアルを保持することができ、かつ球状の１つの生成物を含有する最終の市販の生成物パッケージの１つのタイプである。
【００９７】
結果
ｐＨ５．８、６．０、６．２、６．６、６．８および７．０でのＰＣＶ−１５製剤１の撹拌の後、ｐＨの変化が、特に、側面撹拌後において凝集の形成を妨げるのに有意に十分ではなかった。界面活性剤ＰＳ−８０の添加は、個々に、およびオスモライトスクロースと組み合わせて、いくつかの撹拌実験においては、直立および側面撹拌誘導凝集を妨げたが、全ての撹拌の実験においてはそうというのではなかった。界面活性剤ＰＳ−２０を個々にＶ１１４製剤に加えることはまた、いくつかの撹拌実験においては、直立および側面撹拌誘導凝集を妨げたが、全ての撹拌実験でそうというのではなかった。しかしながら、ＰＳ−２０をｐＨ５．８にてオスモライトスクロースまたはトレハロースと共に加えると、直立および側面撹拌誘導凝集が妨げられた。最後に、界面活性剤ポロキサマー１８８は、ｐＨ５．８、６．２、および７．０にて、個々に、およびオスモライトスクロースと組み合わせて撹拌誘導凝集を妨げた。
【００９８】
結論
種々の界面活性剤、オスモライト、およびｐＨ条件を用いる撹拌実験の完了の後に、界面活性剤ＰＳ−２０は、ｐＨ５．８にて、オスモライトスクロースおよびトレハロースと組み合わせて撹拌誘導凝集を妨げることができた。しかしながら、界面活性剤ポロキサマー１８８は、ｐＨとは無関係に、個々に、およびオスモライトスクロースと組み合わせて、撹拌誘導凝集を妨げることができた。
【００９９】
実施例５：撹拌誘導凝集に対する温度、ｐＨ、塩濃度およびスクロースの効果
熱的ストレスに続いてのいくつかの製剤でのＰＣＶ−１５に対する回転撹拌損傷のインパクトを実験した。回転撹拌実験では、ｐＨ、塩濃度を変化させ、およびスクロースを加えることによって、ＰＣＶ−１５をいくつかの製剤処方にて調製した（表１）。次いで、これらの製剤を３つの群：４℃；一週間の間の３７℃ストレス、および４５日間の２５℃ストレスに分けた。４℃の群を直ちに撹拌に付し、他方、他の２つの群を前記条件に従ってインキュベートし、次いで、撹拌に付した。回転側面撹拌を用いる４℃での２４時間の撹拌実験を設計した。目視観察を全ての試料で用いて、微粒子を検出し、および４℃および３７℃の試料を静的光散乱でテストして、試料中の粒子サイズの分布を見た。
【０１００】
【表２】
2014502595.tif 000004
方法：
製剤の調製：
製剤は、１０ｍＭヒスチジン  ｐＨ７．０および生理食塩水中で貯蔵し、次いで、表１に規定されたように処方された前記多糖−タンパク質コンジュゲートからクラスＩＩ  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙキャビネット中で無菌的に調製した。
【０１０１】
回転撹拌：
この実験は、親水性表面（非研磨）との相互作用、および最終容器成分および空気／液体界面への製剤の暴露を通じてのＰＣＶ−１５製剤の直接的撹拌を表す。ＰＣＶ−１５製剤を、１３ｍｍストッパーを備えた０．７５ｍＬの充填容量の非硫酸塩処理２ｍＬバイアルに充填した。バイアルを、必要であれば、熱的ストレス条件に付し、次いで、４℃にて２４時間、側面で撹拌した。最大スピードでの実験室スケールの多目的ローテーターを回転撹拌で用いた。バイアルを側面撹拌用のローテーターに直接的に付着させた。観察は２４時間において行った。
【０１０２】
結果：
４℃における２４時間のバイアル中での回転撹拌に続いてのＰＣＶ−１５製剤（表１）の結果、ストレス条件にかかわらず、ポロキサマー１８８の不存在下で沈殿が形成された。ポロキサマー１８８の添加の結果、微粒子は観察されなかった（表２）。１５のバイアルを各条件で調べた。
【０１０３】
対照実験は、ＡＰＡの存在下または不存在下にて、２０ｍＭヒスチジン  ｐＨ５．８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌで４℃にて行った。結果は匹敵するものであり、ＡＰＡの存在は撹拌誘導凝集の阻害に寄与しないことを示す。
【０１０４】
【表３】
2014502595.tif 000005
静的光散乱も４℃および３７℃の試料に対して行って、サイズ分布を見た。ポロキサマー１８８無しの製剤においては、より大きな微粒子の集団が観察された。ポロキサマー１８８のみを含有する製剤は、非撹拌試料で見られた集団に匹敵する粒子の１つの集団を有した（図１Ａ〜４Ｂ）。
【０１０５】
結論：
０．１％の最終濃度におけるポロキサマー１８８は、撹拌に先立って製剤に熱ストレスを掛けた場合にさえバイアル中の撹拌誘導凝集を緩和できた。
実施例６：ＩＳＴＡ標準テストの間における撹拌誘導凝集の防止に対する界面活性剤のインパクト
導入：
ＩＳＴＡ標準３Ａ実験の目的は、バイアル製剤を、ルーチン的出荷の間に観察される振動ストレスおよび潜在的な降下ストレスに暴露することにある。実験では、ＰＣＶ１５をいくつかの製剤にて調製し、次いで、ＩＳＴＡ  ３Ａ手法に付した。国際安全輸送協会手法３Ａ（Ｅａｓｔ  Ｌａｎｓｉｎｇ，ＭＩ）参照。ＩＳＴＡ標準プロセスを利用し、結果は、先進国に出荷する場合に材料が経験する予測された条件により沿ったものである。次いで、試料を２〜８℃で貯蔵した。２〜８℃での貯蔵に続き、試料を微粒子の検出のために目視により精査し、次いで、加えて、粒子サイズ分布について静的光散乱（ＳＬＳ）によって分析した。
【０１０６】
方法：
製剤の調製：
製剤は、１０ｍＭヒスチジンｐＨ７．０および生理食塩水中に保存し、次いで、表３に規定されたように処方された前記多糖−タンパク質コンジュゲートからクラスＩＩ  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙキャビネットにて無菌的に調製した。
【０１０７】
【表４】
2014502595.tif 000006
ＩＳＴＡ標準撹拌実験：
バイアルをＩＳＴＡ  ３Ａ手法に付した。
【０１０８】
用いた材料はＩＳＴＡ手法３Ａにおいて特定されたものであり、ゲルシッパーベース（拡大されたポリスチレン（ＥＰＳ）熱的シッパーに対するベース）；ＰｏｌａｒＰａｃｋゲル、２８オンス（製品の温度を維持するのに用いる冷蔵剤）；０℃の低温アラームおよび２５℃の高温アラームを備えたＰＣＳ  ５０９１３  ＴｅｍｐＴａｌｅモニター；ＰＣＳ５０９００波型パッド、スロット付き；各々、製品カートンおよびゲル荷送人シャットを保持するのに用いるＴａｐｅ  Ｓｃｏｔｃｈテープおよびパッキングテープ；１０×製品カートン（５列のうち２列を分離する円状製品を備えた５×２パターンの１０のストッパー付きのかつ襞付きバイアルを保持するために設計されたカートン）；およびＰＣＳ５０８３７ゲルシッパー蓋（ＥＰＳで作成された蓋）を含む。
【０１０９】
以下のカートンの調製を行った：
閉じた１側面にスコッチテープでテーピングすることによって１つの１０×製品カートンを組み立てた。
【０１１０】
黒色の永久的なマーカーを付けた全ての側面の１０×製品カートンの外観が損なわれた。
【０１１１】
ＰＣＶ１５製剤の１０バイアルを得た。
【０１１２】
Ｖ１１４ＤＰ製剤の全ての１０バイアルをＰｒｏＱｕａｄ  １０×製品カートンに入れた。
【０１１３】
閉じた１０×製品カートンの開放端部にテーピングした。
【０１１４】
包装された１０×製品カートンを４つの冷蔵されたＰｏｌａｒＰａｋゲル、２８オンスの間のゲルシッパー内部に、底部に２つのゲルおよび頂部に２つのゲルにて置いた。
【０１１５】
カートンの調製が完了した直後に、貯蔵／予備テストコンディショニングのためにＴｅｇｒａｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）に移した。テストが行われるまで、全ての材料を以下の温度条件に入れた：ＰｏｌａｒＰａｃｋゲル冷蔵剤、５℃±３℃で冷蔵、ＰＣＶ１５製剤のバイアル５℃±３℃；ＰｏｌａｒＰａｃｋゲル冷蔵剤、−２０℃±５℃で凍結、全ての他の温度は室温。全ての材料を２４時間にわたってこれらの温度貯蔵条件とした。
【０１１６】
以下の詰め込み（ｐａｃｋ  ｏｕｔ）をＴｅｇｒａｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎで行った：
ゲルシッパーベースを入手した。
【０１１７】
１つの冷蔵されたＰｏｌａｒＰａｃｋゲル、２８オンスをゲル荷送人底部に平坦においた。
【０１１８】
１つのＴｅｍｐＴａｌｅをゲル荷送人内壁のエッジに接触するＰｏｌａｒＰａｃｋゲルの頂部に置き、それをひっくり返した。
【０１１９】
スロット付きの１つの波型パッドを冷蔵されたＰｏｌａｒＰａｃｋゲルおよびＴｅｍｐＴａｌｅの頂部に置いた。
【０１２０】
ＰＣＶ１５製剤を充填した製品カートンを波型パッドの頂部に置いた。
【０１２１】
ＴｅｍｐＴａｌｅをＰＣＶ１５製剤を充填した製品カートンの頂部層中に置いた。
【０１２２】
スロット付きの１つの波型パッドを、ＰＣＶ１５製剤を充填した製品カートンの頂部に置いた。
【０１２３】
１つのＴｅｍｐＴａｌｅを底部としてのゲル荷送人壁の対向するエッジに接触する波型パッド中に置き、それをひっくり返した。
【０１２４】
１つの冷蔵されたＰｏｌａｒＰａｃｋゲル、２８オンスを波型パッドおよびＴｅｍｐＴａｌｅの頂部に平坦に置いた。
【０１２５】
２つの凍結されたＰｏｌａｒＰａｃｋゲル、２８オンスを、冷蔵されたＰｏｌａｒＰａｃｋゲルの頂部に置いた。
【０１２６】
ゲルシッパー蓋をゲルシッパーベース上に置いた。
【０１２７】
閉じたゲルシッパーを包装テープでテーピングした。
【０１２８】
ＩＳＴＡ  ３Ａテスト手法に従い、分布テストのために、詰め込まれたゲルシッパーをＭｉｄ−Ａｔｒａｎｔｉｃ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）に移した。
【０１２９】
ＩＳＴＡテストに加えて、バイアルのサブセットを先に記載した回転振盪条件にやはり暴露した。最大スピードの実験室スケールの多目的ローテーターを回転撹拌で用いた。側面撹拌のためにバイアルをローテーターに直接付着させた。２４時間において観察を行った。
【０１３０】
結果：
回転撹拌の結果：
４℃に置ける２４時間のバイアル中での回転撹拌に続いてのＰＣＶ１５製剤の結果、ポロキサマー１８８の不存在下で沈殿が形成された。界面活性剤ポロキサマー１８８の添加の結果、微粒子は観察されなかった（表４）。
【０１３１】
【表５】
2014502595.tif 000007
ＩＳＴＡ標準テスト結果：
ＩＳＴＡ標準３Ａ手法に続いてのＶ１１４製剤（表３）を凝集体につき目視で調べた。ポロキサマー１８８またはポリソルベート（ＰＳ）を含有する製剤は凝集体の出現を緩和した（表５）。
【０１３２】
【表６】
2014502595.tif 000008
目視精査に加えて、試料のサブセットに対して静的光散乱も行って、サイズ分布を調べた。界面活性剤無しの対照製剤は、増大した粒子サイズ、ならびにＩＳＴＡテストに続いての粒子のより広い分布の双方に導いた（図５Ａ〜Ｂ）。ポロキサマー１８８を含有する製剤は、ＩＳＴＡテストへの暴露の後に、より均一な製品を示した（図５Ｃ〜Ｄ）。
【０１３３】
結論：
多数の製剤を回転および振動ストレスの双方に暴露し、目視で、ならびに粒子サイズ分布のための静的光散乱を利用して観察した。結果は、界面活性剤（ポリソルベートまたはポロキサマー１８８）の添加は振動ストレスによって引き起こされた撹拌誘導凝集を緩和できることを示す（ＩＳＴＡ標準３Ａ結果）。しかしながら、ポロキサマー１８８のみは、Ｖ１１４製剤に関連した振動および回転ストレスの双方を緩和することができる。
【０１３４】
実施例７：ポロキサマーの範囲の知見
ＰＣＶ−１５を、０．２５ｍｇ／ｍＬリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）を含む２０ｍＭヒスチジンｐＨ５．８および１５０ｍＭ塩化ナトリウムでのバイアルイメージとして実施例１〜３に記載されたように調製した。回転撹拌実験では、ＰＣＶ−１５は、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）への界面活性剤の添加にて調製した。回転側面撹拌を用いる４℃での２４時間の撹拌実験を設計した。バイアルを通過する光のビームの経路（チンデル（Ｔｉｎｄｅｌ）効果）は、微粒子の検出を可能とした。
【０１３５】
方法：
製剤の調製：
クラスＩＩ  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙキャビネット中で、無菌的に、実施例１〜３に記載されたように製剤を調製した。撹拌実験の開始まで製剤を４℃で貯蔵した。
【０１３６】
【表７】
2014502595.tif 000009
回転撹拌：
撹拌実験の目的は、バイアルを撹拌条件に付し、次いで、それらの条件が凝集体形成に対して有する効果を決定することにある。ＰＣＶ−１５製剤を、１３ｍｍストッパーを備えた、０．７５ｍＬの充填容量の非硫酸塩処理２ｍＬバイアルに充填した。バイアルを４℃にて２４時間側面にて撹拌した。最大スピードでの実験室スケールの多目的ローテーターを回転撹拌で用いた。バイアルを側面撹拌のためのローテーターに直接的に付着させた。
【０１３７】
２４時間において観察を行った。
【０１３８】
結果：
４℃での２４時間のバイアル中での回転撹拌後のＰＣＶ１５製剤の結果、ポロキサマー１８８の不存在下における、またはＰＳ８０の存在下における沈殿の形成がもたらされた。０．０２５％および０．１５％の間の濃度における界面活性剤ポロキサマー１８８の添加の結果、微粒子は観察されなかった。しかしながら、より高い濃度０．１％および０．１５％においては、わずかなヘイズの外観（ファニング）が、空気／液体の界面が生じたバイアルの領域で観察された（表７）。
【０１３９】
【表８】
2014502595.tif 000010
結論：
界面活性剤ポロキサマー１８８は、０．０２５〜０．１５％（ｗ／ｖ）の間の濃度においてバイアル中の撹拌誘導凝集を妨げることができた。
【０１４０】
実施例８：撹拌誘導凝集に対する保存剤の効果
１５価肺炎球菌コンジュゲートワクチン−１５（ＰＣＶ−１５）の安定性を、回転撹拌実験の後に、単独で、または界面活性剤と組み合わせた種々の保存剤で実験した。ＰＣＶ−１５は、０．２５ｍｇ／ｍＬのリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）を含む２０ｍＭヒスチジン  ｐＨ５．８および１５０ｍＭ塩化ナトリウム中にて調製した。６４μｇ／ｍＬにおけるＣＲＭ１９７タンパク質は、６４μｇ／ｍＬの合計多糖濃度について、４μｇ／ｍＬの肺炎球菌多糖（ＰｎＰ）型１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ、および８μｇ／ｍＬの型６Ｂにコンジュゲートした。
【０１４１】
回転撹拌実験は実施例４に記載されたように行った。ＰＣＶ−１５製剤骨格は、単独で、またはポロキサマー１８８と組み合わせて、特定の濃度のフェノール、２−フェノキシエタノール、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、またはクロロブタノールで調製した。いくつかの保存剤を特定の溶媒に溶解させた。回転側面撹拌を用いる４℃での２４時間の撹拌実験を設計した。凝集を目視で観察し、いくつかの場合においては、静的光散乱で観察した。
【０１４２】
結果：
４℃における２４時間のバイアル中での回転撹拌後のＰＣＶ１５製剤は、一般に、ポロキサマー１８８の不存在下における沈殿の形成をもたらした。界面活性剤０．１％ポロキサマー１８８の添加の結果、テストした保存剤のいずれでも微粒子は観察されなかった。
【０１４３】
【表９】
2014502595.tif 000011
静的光散乱も代表的な試料に対して行って、サイズの分布を見た。ポロキサマー１８８無しの製剤では、より大きな微粒子の集団が観察された。ｍ−クレゾールまたはフェノールいずれかを含むポロキサマー１８８を含有する製剤は、非撹拌試料で見られた集団に匹敵する粒子の１つの集団を有した（図６Ａ〜Ｃ）。
【０１４４】
結論：
テストした種々の保存剤は、撹拌誘導凝集を阻害するポロキサマー１８８の能力に対して有害な効果を有しなかった。
【０１４５】
実施例９：撹拌誘導凝集に対するｐＨおよび緩衝液の効果
１５価肺炎球菌コンジュゲートワクチン−１５（ＰＣＶ−１５）の安定性を、回転撹拌実験後に種々の緩衝液およびｐＨ条件で実験した。ＰＣＶ−１５は、０．２５ｍｇ／ｍＬのリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）を含む２０ｍＭの特定の緩衝液および１５０ｍＭの塩化ナトリウム中で調製した。６４μｇ／ｍＬのＣＲＭ１９７タンパク質を、６４μｇ／ｍＬの合計多糖濃度について、４μｇ／ｍＬの肺炎球菌多糖（ＰｎＰ）型１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ、および８μｇ／ｍＬの型６Ｂにコンジュゲートさせた。
【０１４６】
回転撹拌実験では、ＰＣＶ−１５製剤骨格は、ｐＨ５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．６、６．８、７．０および８．０での、界面活性剤およびオスモライト、およびオスモライトと組み合わせた界面活性剤の添加にて調製した。回転側面撹拌を用いる４℃の２４時間の撹拌実験を設計した。凝集は目視で観察した。
【０１４７】
結果：
４℃での２４時間のバイアル中での回転撹拌後のＰＣＶ１５製剤の結果、テストした緩衝液およびｐＨ条件についてポロキサマー１８８の不存在下で沈殿の形成がもたらされた。界面活性剤０．１％ポロキサマー１８８の添加の結果、テストした緩衝液およびｐＨ条件のいずれでも微粒子は観察されなかった。
【０１４８】
【表１０】
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結論：
テストした種々の緩衝液およびｐＨ条件は、撹拌誘導凝集を阻害するポロキサマー１８８の能力に対する有害効果を有しなかった。
【０１４９】
実施例１０：撹拌誘導凝集に対する種々の分子量範囲のポロキサマーの効果
１５価肺炎球菌コンジュゲートワクチン−１５（ＰＣＶ−１５）の安定性を、回転撹拌実験後に種々の商業的に入手可能なポロキサマーで実験した。ＰＣＶ−１５は、０．２５ｍｇ／ｍＬのリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）を含む２０ｍＭヒスチジン  ｐＨ５．８および１５０ｍＭ塩化ナトリウム中で調製した。６４μｇ／ｍＬのＣＲＭ１９７タンパク質は、６４μｇ／ｍＬの合計多糖濃度について、４μｇ／ｍＬの肺炎球菌多糖（ＰｎＰ）型１、３，４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ、および８μｇ／ｍＬの型６Ｂにコンジュゲートした。
【０１５０】
回転撹拌実験では、ＰＣＶ−１５製剤骨格は、特定の濃度のポロキサマー２３７、ポロキサマー３３８、またはポロキサマー４０７の添加で調製した。回転側面撹拌を用いる４℃での２４時間の撹拌実験を設計した。凝集を目視で観察した。
【０１５１】
結果：
０．１％ポロキサマー２３７を含む４℃の２４時間でのバイアル中での回転撹拌後のＰＣＶ１５製剤の結果、微粒子は観察されなかった。テストした他の条件の結果、非常に小さな微粒子がもたらされたが、ポロキサマー無しの対照製剤よりも有意な改良であった。
【０１５２】
【表１１】
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静的光散乱を０．１％のポロキサマー２３７でも試料に対して行って、サイズ分布を見た。この製剤は、非撹拌試料で見られた集団と匹敵するものであった（図７）。
【０１５３】
結論：
変化させた分子量範囲のポロキサマーは、撹拌誘導凝集を阻害するそれらの能力において異なっていた。条件の最適化は完全な阻害を可能とするはずである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【国際調査報告】
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