(57)【要約】  ＩＧＦ−１阻害を必要とする対象（例えば、がん、アテローム性動脈硬化、糖尿病性網膜症、または他の疾患に罹患する対象）においてインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）による細胞の活性化を阻害する方法であって、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合を阻害するアンタゴニストを、ＩＧＦ−１による細胞の活性化を阻害するのに有効な量で、対象に投与するステップを含む方法。また、このような方法を実行するための化合物および組成物についても記載される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩＡＰタンパク質のアミノ酸７１〜８０内のエピトープに特異的に結合し、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合に対するアンタゴニストである、モノクローナル抗体。
【請求項２】
検出可能な基へとカップリングされた、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
治療基へとカップリングされた、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
ＩＡＰのβ３タンパク質への結合を破壊しない、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
請求項１に記載の抗体を薬学的に許容される担体中に含む医薬製剤。
【請求項６】
（ａ）ハイブリドーマＮＰＧ−１により産生されるモノクローナル抗体と、（ｂ）前記ハイブリドーマＮＰＧ−１により産生されるモノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープへの結合について競合するモノクローナル抗体とからなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
検出可能な基へとカップリングされた、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
治療基へとカップリングされた、請求項６に記載の抗体。
【請求項９】
請求項６に記載の抗体を薬学的に許容される担体中に含む医薬製剤。
【請求項１０】
ＩＧＦ−１阻害を必要とする対象においてＩＧＦ−１作用を阻害する方法であって、請求項１に記載の抗体を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１１】
ＩＧＦ−１阻害を必要とする対象においてＩＧＦ−１作用を阻害する方法であって、請求項６に記載の抗体を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１２】
対象における網膜症を処置する方法であって、有効量の、請求項１または請求項６に記載の抗体を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１３】
対象におけるアテローム性動脈硬化を処置する方法であって、有効量の、請求項１または請求項６に記載の抗体を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１４】
対象における腎症を処置する方法であって、有効量の、請求項１または請求項６に記載の抗体を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１５】
対象における冠状動脈疾患を処置する方法であって、有効量の、請求項１または請求項６に記載の抗体を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１６】
対象におけるがんを処置する方法であって、有効量の、請求項１または請求項６に記載の抗体を前記対象に投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜優先権の言明＞
本出願は、２０１１年８月２６日に出願され、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１３／２１９，２７６号に対する優先権を主張する。
【０００２】
＜政府援助の言明＞
本発明は、米国国立保健研究所による助成金番号第ＡＧ０２３３１号の下で、政府援助によりなされた。米国連邦政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
＜発明の分野＞
本発明は、がん、アテローム性動脈硬化、腎症、および／または網膜症に罹患する対象など、それを必要とする対象におけるＩＧＦ−１活性を阻害するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
インスリン様成長因子Ｉは、一般的な体細胞増殖に必要である。すなわち、小児期を通じて生じる正常な成長および発生は、ＩＧＦ−１を必要とする。ＩＧＦ−１遺伝子をマウスから欠失させれば、そのマウスは、正常なサイズの半分で生まれ、生誕後の成長も思わしくなく、正常な成体サイズの約３０％にしか到達しない。したがって、この成長因子は、全ての既知の細胞型に重要なマイトジェンである。
【０００５】
ＩＧＦ−１濃度の上昇はがんの発症と関連しており、一方、ＩＧＦ−１濃度の低下はがんを保護するようであると示されているため、細胞におけるＩＧＦ−１による有糸分裂誘発の活性化を阻害することに関心が払われている。例えば、Ｂａｓｅｒｇａらによる米国特許第６，３４０，６７４号は、ＩＧＦ−１受容体ＲＮＡの領域と実質的に相補的であり、ＩＧＦ−１受容体のＲＮＡと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとがん細胞を接触させることにより、がん細胞の増殖を阻害するアンチセンス法について記載している。
【０００６】
加えて、ＩＧＦ−１は、細胞修復の異常を伴う複数の疾患の局所的な微小環境においても合成される。この種の重要な疾患は、米国における主要な死亡原因である、アテローム性動脈硬化である。アテローム性動脈硬化性病変中の細胞は、ＩＧＦ−１の合成が過剰であり、したがって、ＩＧＦ−１による過剰なシグナル伝達により、病変の拡大がもたらされる。複数の研究が、このＩＧＦ−１の影響が阻害されれば、病変の進行が遅延することを示している。したがって、平滑筋細胞などの血管壁細胞型におけるＩＧＦ−１の作用を阻害することに著しく関心が払われている。
【発明の概要】
【０００７】
ＩＧＦ−１受容体へのリガンドの結合の遮断など、ＩＧＦ−１を阻害する従来の手法は、２つの理由で不成功に終わっている。第１に、結合部位が極めて大きく、したがって、結合を効果的に阻害する化合物をデザインすることが困難である；第２に、ＩＧＦ−１受容体とインスリン受容体との間には大きな構造的重複が存在し、受容体の活性を遮断することによりＩＧＦ−１の受容体活性を変化させようと試みた手法は決まって、インスリン受容体の共阻害に起因する毒性を引き起こしている。アンチセンス法には、活性薬剤を標的細胞の内部へと送達するという課題が存在する。したがって、このような処置を必要とする対象の細胞におけるＩＧＦ−１の活性または産生を阻害する新たな方法が必要とされている。
【０００８】
本発明は、細胞の活性化阻害を必要とする対象（例えば、がん、腫瘍、アテローム性動脈硬化、腎症（例えば、糖尿病性腎症）、および／または網膜症（例えば、糖尿病性網膜症）を有するかまたはこれらを有する危険性が高い対象）における、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）による細胞の活性化を阻害する方法を提供する。方法は、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合を阻害するアンタゴニストを、ＩＧＦ−１による細胞の活性化を阻害するのに有効な量（例えば、状態もしくは障害を処置するのに有効な量または処置有効量）で、対象に投与するステップを含む。
【０００９】
本発明の一態様は、対象（例えば、処置を必要とする対象）における腫瘍を処置する方法であって、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合に対するアンタゴニスト（例えば、本発明の抗体）を、腫瘍を処置するのに有効な量（例えば、ＩＧＦ−１の腫瘍に対する影響を阻害するのに有効な量）で対象に投与するステップを含む方法である。本明細書にはまた、対象（例えば、処置を必要とする対象）におけるがんを処置する方法であって、有効量の、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合に対するアンタゴニスト（例えば、本発明の抗体）を対象に投与するステップを含む方法も包含される。本発明の方法に従い処置されうるがんの非限定的な例には、乳がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、膀胱がん、平滑筋肉腫、卵巣がん、神経膠芽腫、および肝細胞がんが含まれる。処置される腫瘍には、上記で列挙したがんのほか、ＩＧＦ−１受容体を発現させる任意の腫瘍のうちのいずれかと関連する腫瘍が含まれる。
【００１０】
本発明の別の態様は、処置有効量の抗新生物性化合物（すなわち、化学療法剤）および／または放射線療法を対象に投与することによる、処置を必要とする対象における腫瘍を処置する方法の改善であって、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合に対するアンタゴニストを、ＩＧＦ−１を媒介する腫瘍細胞のレスキューを阻害する（すなわち、ＩＧＦ−１の腫瘍細胞に対する抗アポトーシス効果を阻害する）のに有効な量で対象に投与するステップを含む改善である。
【００１１】
本発明のさらなる態様は、処置を必要とする対象におけるアテローム性動脈硬化を処置する方法であって、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合に対するアンタゴニストを、アテローム性動脈硬化を処置するのに有効な量で対象に投与するステップを含む方法である。冠動脈アテローム性動脈硬化、頸動脈アテローム性動脈硬化、および／または大腿動脈アテローム性動脈硬化など、任意の種類のアテローム性動脈硬化性病変を処置することができる。一般に、処置されるアテローム性動脈硬化性病変は、病変細胞がＩＧＦ−１受容体を発現させるアテローム性動脈硬化性病変である。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、処置を必要とする対象における糖尿病性腎症（例えば、糖尿病性腎症）を処置する方法であって、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合に対するアンタゴニストを、腎症を処置するのに有効な量で対象に投与するステップを含む方法である。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、処置を必要とする対象における網膜症（例えば、糖尿病性網膜症）を処置する方法であって、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合に対するアンタゴニストを、網膜症を処置するのに有効な量で対象に投与するステップを含む方法である。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、処置を必要とする対象における冠状動脈疾患を処置する方法であって、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合に対するアンタゴニストを、冠状動脈疾患を処置するのに有効な量で対象に投与するステップを含む方法である。
【００１５】
本明細書では、本明細書で記載される方法を実行するのに用いられうるアンタゴニストを、活性薬剤と称する場合があるが、これらは、抗体またはそれらの抗原結合断片などのタンパク質またはペプチドを含めた任意の適切な種類でありうる。本発明を実行するのに用いられうる特定のアンタゴニストの例には、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合をアンタゴナイズする抗体、ＩＡＰ結合ドメインを含むか、これからなるか、もしくはこれから本質的になるＳＨＰＳ−１断片、ＳＨＰＳ−１結合ドメインを含むか、これからなるか、もしくはこれから本質的になるＩＡＰ断片、これらの類似体、および／または非ペプチド性模倣体もしくは非ペプチド性類似体が含まれるがこれらに限定されない。本発明の一実施形態では、抗体が、モノクローナル抗体のＢ６Ｈ１２でありうる。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、活性薬剤（例えば、本明細書で記載される抗体またはそれらの抗原結合断片）を、薬学的に許容される担体中に含む医薬製剤である。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、本明細書で記載される活性薬剤の、本明細書で記載される処置法を実行するための医薬の製造のための使用である。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、インビトロにおいて、化合物を、（ｉ）インスリン様成長因子Ｉによる細胞の活性化の阻害（例えば、ＩＧＦ−１による細胞の成長の阻害）、（ｉｉ）がんもしくは腫瘍の処置（上で記載）、および／または（ｉｉｉ）アテローム性動脈硬化の処置（上で記載）における活性についてスクリーニングする方法であって、（ａ）被験化合物を、ＳＨＰＳ−１タンパク質およびＩＡＰタンパク質を含むインビトロ系へと添加するかまたはこれと接触させるステップと、次いで、（ｂ）被験化合物が、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合に対するアンタゴニストであるかどうかを決定するステップと、次いで、（ｃ）被験化合物が、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合に対するアンタゴニストである場合、被験化合物を、（ｉ）インスリン様成長因子１による細胞の活性化の阻害、（ｉｉ）がんもしくは腫瘍の処置、および／または（ｉｉｉ）アテローム性動脈硬化の処置において活性であるかもしくは潜在的に活性な化合物として同定するステップとを含む方法である。
【００１９】
本発明はまた、ヒトＩＡＰタンパク質のアミノ酸７１〜８０（アミノ酸の番号付けは、配列番号７のアミノ酸配列に基づく）（すなわち、ペプチドＡＬＮＫＳＴＶＰＴＤ、配列番号６）内のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合に対するアンタゴニストであるモノクローナル抗体も提供する。抗体のさらなる特徴は、それが、ＩＡＰのβ３タンパク質への結合を破壊しないことである。ヒトＩＡＰのアミノ酸の番号付けは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース受託番号第ＮＰ＿９４２０８８号（参照により本明細書に組み込まれる）の基準アミノ酸配列に基づき、１と番号付けされた最初のアミノ酸および３０５と番号付けされた最後のアミノ酸を伴う以下の通りである。以下の配列では、アミノ酸残基７１〜８０が太字で示される。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
上記のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマＮＰＧ−１により産生されるモノクローナル抗体の場合もあり、ハイブリドーマＮＰＧ−１により産生されるモノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープへの結合について競合するモノクローナル抗体の場合もある。ハイブリドーマＮＰＧ−１は、２０１２年８月１７日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）へと寄託され、受託番号第＿＿＿号を割り当てられた。
【００２２】
加えて、本明細書では、ＩＧＦ−１阻害を必要とする対象におけるＩＧＦ−１作用を阻害する方法であって、本発明の抗体またはそれらの抗原結合断片を対象に投与するステップを含む方法も提供される。
【００２３】
さらに、対象（例えば、処置を必要とする対象）における糖尿病性網膜症、糖尿病性アテローム性動脈硬化、糖尿病性腎症、および／または冠状動脈疾患を処置する方法であって、有効量の、本発明の抗体またはそれらの抗原結合断片を対象に投与するステップを含む方法も提供される。一部の実施形態におけるこのような方法では、抗体を、皮下注射および／または静脈内注入により投与しうる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ−１Ｃ】ＩＡＰのＳＨＰＳ−１との共沈殿および抗ＩＡＰ抗体であるＢ６Ｈ１２による破壊を示す図である。Ａ．細胞溶解物を抗ＩＡＰ抗体で免疫沈降させ、抗ＳＨＰＳ−１抗血清で免疫ブロットすることによりＳＨＰＳ−１の共沈殿を決定するか、または細胞溶解物をＳＨＰＳ−１で免疫沈降させ、抗ＩＡＰ抗体で免疫ブロットすることによりＩＡＰの共沈殿を決定した。また、対照としては細胞溶解物を、非関与のポリクローナル抗体（ＩｇＧ）で免疫沈降させ、抗ＩＡＰ抗体でも免疫ブロットした。Ｂ．休眠ｐＳＭＣを、抗ＩＡＰモノクローナル抗体であるＢ６Ｈ１２、または非関与の対照モノクローナル抗体（いずれも４μｇ／ｍｌで）の添加を伴うかまたは伴わずに、２時間にわたりインキュベートした。次いで、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１との共沈殿を、ＳＨＰＳ−１抗体で免疫沈降させ、抗ＩＡＰ抗体で免疫ブロットすることにより決定した。各レーンにおけるＳＨＰＳ−１タンパク質の量を、下パネルに示す。Ｃ．ＦＬＡＧで標識されたＩＡＰの発現およびＳＨＰＳ−１との会合。上パネル：ＦＬＡＧで標識されたＩＡＰの発現を、ＩＡＰのｃＤＮＡ構築物の各々でトランスフェクトされた細胞に由来する全細胞溶解物を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫ブロットすることにより決定した。走査単位としての結果は、レーン１：３８０１８、レーン２：３９２７４、レーン３：４６７７９である。下パネル：細胞溶解物を、抗ＳＨＰＳ−１抗体で免疫沈降させ、次いで、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫ブロットすることによりＦＬＡＧで標識されたＩＡＰの共沈殿を決定した。各レーン内の免疫沈降したＳＨＰＳ−１の量を、下パネルに示す。
【図２Ａ】抗ＩＡＰ抗体であるＢ６Ｈ１２によりＩＡＰとＳＨＰＳ−１との会合を破壊した後における、ＩＧＦ−１に応答したＳＨＰＳ−１のリン酸化およびＳＨＰ−２のＳＨＰＳ−１への動員を示す図である。休眠細胞を、Ｂ６Ｈ１２抗体または非関与の対照モノクローナル抗体（いずれも４μｇ／ｍｌで）を伴うかまたは伴わずに、２時間にわたりインキュベートし、次いで、表示される通りにＩＧＦ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）へと曝露した。細胞溶解物を、抗ＳＨＰＳ−１抗体によって免疫沈降させ、次いで、抗ホスホチロシン抗体（ｐ−Ｔｙｒ）によって免疫ブロットすることによりＳＨＰＳ−１のリン酸化を決定した。ＳＨＰ−２のＳＨＰＳ−１との会合は、抗ＳＨＰ−２抗体を用いる免疫ブロット法で視覚化した。各レーンにおけるＳＨＰＳ−１タンパク質の量を、下パネルに示す。３回の個別の実験に由来するウェスタン免疫ブロットについての走査密度測定解析により決定される、ＩＧＦ−１による刺激の後におけるＳＨＰＳ−１のリン酸化およびＳＨＰ−２の動員の増大を示す。＊＊Ｂ６Ｈ１２と共にプレインキュベートされた細胞を、ＳＦＭ単独中でプレインキュベートされた細胞と比較した場合のｐ＜０．０５。
【図２Ｂ】ＩＡＰの突然変異形態を発現させる細胞における、ＩＡＰとＳＨＰＳ−１との会合を破壊した後における、ＩＧＦ−１に応答したＳＨＰＳ−１のリン酸化およびＳＨＰ−２の動員。細胞は、多様な期間にわたりＩＧＦ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）へと曝露した。細胞溶解物を、抗ＳＨＰＳ−１抗体で免疫沈降させ、抗ホスホチロシン抗体（ｐＴｙｒ）で免疫ブロットすることによりＳＨＰＳ−１のリン酸化を決定した。ＳＨＰ−２の会合は、抗ＳＨＰ−２抗体を用いる免疫ブロット法で視覚化した。各レーンにおけるＳＨＰＳ−１タンパク質の量を、下パネルに示す。３回の個別の実験に由来するウェスタン免疫ブロットについての走査密度測定解析により決定される、ＩＧＦ−１による刺激の後におけるＳＨＰＳ−１のリン酸化およびＳＨＰ−２の動員の増大を示す。＊＊ＩＡＰの突然変異体形態を発現させる細胞を、ＩＡＰ  ｆｌを発現させる細胞と比較する場合のｐ＜０．０５。
【図２Ｃ】ＰＤＧＦに応答したＳＨＰＳ−１のリン酸化。細胞は、５分間にわたりＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）へと曝露した。抗ホスホチロシン抗体（ｐＴｙｒ）で免疫ブロットすることにより、抗ＳＨＰＳ−１抗体による細胞の溶解および免疫沈降の後におけるＳＨＰＳ−１のリン酸化を決定した。
【図３Ａ．３Ｂ】ＩＡＰとＳＨＰＳ−１との相互作用を破壊した後における、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化の時間経過およびＳＨＰ−２の動員を示す図である。Ａ．休眠細胞を、抗ＩＡＰ抗体であるＢ６Ｈ１２（４μｇ／ｍｌ）を伴うかまたは伴わずにインキュベートし、次いで、多様な長さの時間にわたりＩＧＦ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）へと曝露した。抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体による溶解および免疫沈降の後における受容体のリン酸化を、抗ホスホチロシン抗体（ｐＴｙｒ）で免疫ブロットすることにより決定した。ＳＨＰ−２の会合は、抗ＳＨＰ−２抗体で免疫ブロットすることにより決定した。各レーン内のＩＧＦ−１Ｒタンパク質の量を、下パネルに示す。ＩＧＦ−１Ｒのチロシンリン酸化のレベルを、３回の個別の実験に由来するウェスタン免疫ブロットについての走査密度測定解析により決定される、最大のリン酸化の百分率として示す。また、３回の個別の実験に由来するウェスタン免疫ブロットについての走査密度測定解析により決定される、ＩＧＦ−１により刺激した後におけるＳＨＰ−２の動員の増大も示す。＊＊Ｂ６Ｈ１２と共にプレインキュベートされた細胞を、ＳＦＭ単独中でプレインキュベートされた細胞と比較した場合のｐ＜０．０５。Ｂ．細胞を、多様な時間にわたりＩＧＦ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。抗ホスホチロシン抗体（ｐＴｙｒ）で免疫ブロットすることにより、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体による溶解および免疫沈降の後における受容体のリン酸化を決定した。ＳＨＰ−２の会合は、抗ＳＨＰ−２抗体で免疫ブロットすることにより決定した。各レーン内のＩＧＦ−１Ｒタンパク質の量を、下パネルに示す。３回の個別の実験に由来するウェスタン免疫ブロットについての走査密度測定解析により決定される、ＩＧＦ−１により刺激した後における、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化およびＳＨＰ−２の動員の変化を示す。＊＊ＩＡＰｃ−ｓを発現させる細胞を、ＩＡＰ−ｆｌを発現させる細胞と比較した場合のｐ＜０．０５。
【図４Ａ】ＩＧＦ−１に応答したＭＡＰＫのリン酸化を示す図である。細胞を播種し、成長させてから、抗ＩＡＰ抗体であるＢ６Ｈ１２または非関与の対照モノクローナル抗体（いずれも４μｇ／ｍｌ）を伴うかまたは伴わずに、２時間にわたりインキュベートし、次いで、ＩＧＦ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）で１０分間にわたり処理した。ホスホ特異的ＭＡＰＫ抗体で免疫ブロットすることにより、ｐ４２／４４  ＭＡＰＫのリン酸化レベルを決定した。各試料中のＭＡＰＫの総量は、ＭＡＰＫ抗体で免疫ブロットすることにより決定した。
【図４Ｂ】細胞を播種し、成長させてから、Ｂ６Ｈ１２または非関与の対照モノクローナル抗体（いずれも４μｇ／ｍｌの濃度）を伴うかまたは伴わずに、２時間にわたりインキュベートし、次いで、ＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ）で４８時間にわたり処理した。次いで、各ウェル内の細胞数を決定した。各データ点は、３回の独立の実験の平均を表す。＊＊Ｂ６Ｈ１２の存在下においてインキュベートされた培養物中の細胞数を、抗体の非存在下においてインキュベートされた培養物中の細胞数と比較する場合のｐ≦０．０５。
【図５】全長ＩＡＰを発現させる細胞およびＩＡＰＣ−Ｓを発現させる細胞において、ＩＧＦ−１により刺激された細胞の遊走を示す図である。コンフルエントの細胞を損傷させ、次いで、ＩＧＦ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）を伴うかまたは伴わずに、４８時間にわたりインキュベートした。少なくとも５つのあらかじめ選択された領域において損傷エッジを越えて遊走する細胞の数をカウントした。各データ点は、３回の独立の実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。＊＊ＩＧＦ−１の存在下における遊走を、ＳＦＭ単独中のインキュベーションと比較する場合のｐ＜０．０５。
【図６Ａ−６Ｄ】ヒト内皮細胞を抗ＩＡＰ抗体へと曝露し、溶解物を、抗ＳＨＰＳ−１により免疫沈降させ、次いで、ＩＡＰまたはＳｈｃについて免疫ブロットさせた結果を示す図である。Ａ．モノクローナル抗体ＮＰＧ−１により、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合が破壊されうる。細胞を、ＮＰＧ−１と共にプレインキュベートし、次いで、ＳＨＰＳ−１を免疫沈降させ、免疫沈降物をＩＡＰについて免疫ブロットした。Ｂ．細胞をＮＰＧ−１抗体と共にプレインキュベートすると、内皮細胞内で活性化するにはＳＨＰＳ−１に結合しなければならないＳｈｃが正常に結合しない。Ｃ．ＮＰＧ−１抗体が、ＩＡＰのβ３への結合を破壊することなく、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合が特異的に破壊する。Ｄ．対照ラット（Ｃｏｎ）、糖尿病性ラット（Ｄ）、および抗ＩＡＰ抗体（Ｒ５６９）で処理した糖尿病性ラット（Ｄ＋ＡＢ）に由来する大動脈ホモジネート中で、ＳＨＰＳ−１のＩＡＰとの会合を決定した。
【図７Ａ．７Ｂ】毛細血管の形成についてのインビトロアッセイを示す図である。Ａ．インビトロにおいてデキストランブルーの透過に基づき測定される細胞透過性。ＩＧＦ−１により透過が刺激され、これがＮＰＧ−１抗体（ＩＡＰａｂ）の存在下で阻害される。Ｂ．内皮細胞が透過性に対する障壁を形成することを可能とする密着結合タンパク質オクルディンが、ＩＧＦ−１の存在下で破壊され、その結果として、正常に形成された密着結合複合体から離脱し、細胞内に拡散する。ＮＰＧ−１抗体の存在下では、このＩＧＦ−１の影響が完全に阻害される。
【図７Ｃ】毛細血管の形成についてのインビトロアッセイを示す図である。Ｃ．内皮細胞における管形成についての顕微鏡写真。ＩＧＦ−１で処理された細胞では、毛細血管細胞が互いに毛細血管と合体している管形成を見ることができる（上右パネル）。下側の２つのパネルおよび１ｃｍ２当たりの管の数を示す棒グラフにおいて示される通り、ＮＰＧ−１抗体の存在下では、これが完全に破壊される。
【図８Ａ．８Ｂ】ラットの内皮細胞を、２５ｍＭのグルコース中で培養した結果を示す図である。ＳＦＭ中で一晩培養した後、細胞を、ラットＩＡＰ配列のアミノ酸７１〜８０（番号付けは、ＮＣＢＩ基準配列受託番号第ＮＰ＿０６２０６８号
【表２】
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のアミノ酸配列に基づく）であるラットＩＡＰ配列ＮＫＮＳＴＴＲＥＱＮ（配列番号８）を用いて調製した抗ＩＡＰ抗体（Ｒ５６９）を伴う（ＡＢ）かまたは伴わずに（Ｃｏｎ）インキュベートした。抗体を作製するために、既知の方法に従い、この配列を免疫原としてのＫＬＨと連結した。Ａ．対照抗体が、ＩＡＰ／ＳＨＰＳ−１間の会合に対して効果を及ぼさなかったのに対し、抗ラットＩＡＰ抗体は、この会合を完全に破壊した。Ｂ．ＩＧＦ−１による刺激の後で、ＳＨＰＳ−１のチロシンがリン酸化され、ＡＫＴおよびＭＡＰＫの活性化が刺激される。これらが抗ラットＩＡＰ抗体の存在下で阻害される。
【図９】血管透過性を示す図である。非糖尿病性ラットを対照として示す（Ｎ＝５）。糖尿病性ラットを、対照のＩｇＧ（Ｎ＝１２）または本明細書で記載される抗ラットＩＡＰ抗体を含有する抗血清からプロテインＡセファロースクロマトグラフィーにより精製されたＩｇＧ（Ｎ＝１４）で処理した。３週間後、動物に麻酔をかけ、次いで、血管透過性を測定した。抗ラットＩＡＰ−ＩｇＧにより、糖尿病性網膜症で生じる最初の変化のうちの１つである、網膜静脈における血管透過性が著しく阻害された。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下では、本発明をより詳細に説明する。本記載は、本発明を実装しうる全ての異なる様式または本発明へと付加されうる全ての特色の詳細な列挙であることを意図するものではない。例えば、１つの実施形態に関して例示されている特色を、他の実施形態へと組み込むこともでき、特定の実施形態に関して例示されている特色を、この実施形態から削除することもできる。加えて、当業者には、本開示に照らして、本明細書で示唆される多様な実施形態に対する多数の変化および付加であって、本発明から逸脱しない変化および付加が明らかとなろう。よって、以下の明細書は、本発明の一部の特定の実施形態について例示することを意図するものであり、それらの全ての順列、組合せ、および変化を網羅的に指定することを意図するものではない。
【００２６】
本発明により処置されうる対象には、医療を目的とするヒト対象と、獣医療ならびに薬物のスクリーニングおよび開発を目的とする動物対象との両方が含まれる。他の適切な動物対象は一般に、ヒト、霊長動物、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ目動物、齧歯動物（例えば、ラットおよびマウス）などの哺乳動物対象である。ヒト対象が最も好ましい。ヒト対象には、胎児対象、新生児対象、乳児対象、若年者対象、および成人対象が含まれる。
【００２７】
本明細書で用いられる「ＩＧＦ−１」とは、インスリン様成長因子１を意味する。
【００２８】
本明細書で用いられる「ＩＧＦ−１Ｒ」とは、ＩＧＦ−１受容体を意味する。
【００２９】
本明細書で用いられる「ＩＡＰ」とは、インテグリン関連タンパク質を意味する。ＩＡＰは、任意の種類でありうるが、哺乳動物ＩＡＰ（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サル、ブタなどのＩＡＰ）であることが好ましく、ヒトＩＡＰであることが最も好ましい。ＩＡＰ（また、ＣＤ４７と称する場合もある）は、知られており、例えば、Ｅ．Ｂｒｏｗｎら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１１１：２７８５〜９４（１９９０）；Ｃ．Ｒｏｓａｌｅｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４９：２７５９〜６４（１９９２）；Ｄ．Ｃｏｏｐｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、ＵＳＡ、９２：３９７８〜８２（１９９５）；Ｐ．Ｊｉａｎｇら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７４：５５９〜６２（１９９９）；Ｐ．Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８８：２０５１〜４（２０００）；Ｍ．Ｓｅｉｆｆｅｒｔら、Ｂｌｏｏｄ、９４：３６３３〜４３（１９９９）；Ｅ．Ｖｅｒｎｏｎ−Ｗｉｌｓｏｎら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、３０：２１３０〜２１３７（２０００）；Ｈ．Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６８：３２１３〜２０（２００２）；およびＩ．Ｂａｂｉｃら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６４：３６５２〜８（２０００）において記載されている。
【００３０】
本明細書で用いられる「ＳＨＰＳ−１」とは、ＳＨ２（ｓｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ２）ドメインを含有するタンパク質チロシンホスファターゼ基質１を意味する。ＳＨＰＳ−１は、任意の種類でありうるが、哺乳動物ＳＨＰＳ−１（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サル、ブタなどのＳＨＰＳ−１）であることが好ましく、ヒトＳＨＰＳ−１であることが最も好ましい。ＳＨＰＳ−１（また、Ｐ８４と称する場合もある）は、知られており、例えば、Ｔ．Ｎｏｇｕｃｈｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７１、２７６５２〜８（１９９６）；Ｙ．Ｆｕｊｉｏｋａら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１６、６８８７〜９９（１９９６）；Ａ．Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖら、Ｎａｔｕｒｅ、３８６、１８１〜６（１９９７）；Ｍ．Ｓｔｏｆｅｇａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７３、７１１２〜７（１９９８）；およびＴ．Ｔａｋａｄａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７３、９２３４〜４２（１９９８）において記載されている。
【００３１】
本明細書で用いられる「ＳＨＰ−２」とは、ＳＨ２（ｓｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ２）を含有するタンパク質チロシンホスファターゼ２を意味する。
【００３２】
本明細書で用いられる「〜を処置する」、「〜を処置すること」、または「処置」は、対象の状態の改善（例えば、１以上の症状の改善）、疾患の進行の遅延、症状の発症の遅延、および／または症状の進行の緩徐化などを含め、疾患もしくは障害を有するか、または疾患もしくは障害を発症する危険性がある対象に利益を付与する任意の種類の作用を指す。一部の実施形態では、「処置」という用語自体に、症状の発症を防止するための対象の予防的処置が含まれうる。本明細書で用いられる「〜を処置する」または「処置」という用語は、必ずしも治癒または症状の完全な消失を含意することを意図するものではない。
【００３３】
本明細書で用いられる「処置有効量」、「〜を処置するのに有効な量」、「有効量」などは、がん、腫瘍、アテローム性動脈硬化、網膜症、腎症、またはＩＧＦ−１により異常な細胞の成長が誘導されている他の所望されない医療状態を有する対象に、所望の効果および／または有益な効果をもたらすのに十分なアンタゴニスト（例えば、抗体またはそれらの抗原結合断片）の量を意味する。これには、疾患の進行の遅延など、患者の状態の改善（例えば、１以上の症状における）が含まれる。
【００３４】
本明細書で用いられる「薬学的に許容される」とは、化合物または組成物が、本明細書で記載される有益な転帰および／または処置有効な転帰を達成するための対象への投与に適し、疾患または障害の重症度および処置の必要性に照らして過度に有害な副作用を伴わないことを意味する。
【００３５】
本出願者らは、とりわけ、本明細書で引用される全ての特許、特許公開、国際特許公開、および特許以外の参考文献が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれることを意図する。
【００３６】
Ａ．抗体。
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含めた全ての種類の免疫グロブリンを指す。「免疫グロブリン」という用語は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４など、これらの免疫グロブリンのサブタイプを包含する。これらの免疫グロブリンの中では、ＩｇＭおよびＩｇＧが好ましく、ＩｇＧが特に好ましい。抗体は、（例えば）マウス、ラット、ウサギ、ウマ、またはヒトを含めたいずれの種に由来することも可能であり、キメラ抗体であることも可能である。例えば、Ｍ．Ｗａｌｋｅｒら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２６、４０３〜１１（１９８９）を参照されたい。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体の場合もあり、モノクローナル抗体の場合もある。このような抗体は、既知の技法に従い作製される。本明細書で用いられる「抗体」という用語はまた、標的抗原への結合能を保持する抗体断片（例えば、それらの抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびＦｖ断片）およびＩｇＧ以外の抗体から得られる対応する断片も包含する。このような断片もまた、既知の技法により作製される。
【００３７】
本発明の範囲内に包含される抗体断片には、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ドメイン抗体、ダイアボディー；ワクシボディー、直鎖状抗体；単鎖抗体分子；および抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。このような断片は、既知の技法により作製することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体分子のペプシン消化により作製することができる。Ｆａｂ断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより作製することができる。代替的に、Ｆａｂの発現ライブラリーを構築して、所望の特異性を伴うモノクローナルのＦａｂ断片の迅速かつ容易な同定を可能とすることができる（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４：１２７５（１９８９））。
【００３８】
モノクローナル抗体は、例えば、Ｒｅａｄｉｎｇ、米国特許第４，４７４，８９３号、またはＣａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号において開示される方法に従い作製される組換えモノクローナル抗体でありうる。抗体はまた、Ｓｅｇｅｌら、米国特許第４，６７６，９８０号において開示される方法に従い作製される特異的抗体により化学的に構築することもできる。
【００３９】
モノクローナルのＦａｂ断片は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて、当業者に知られた組換え法により作製することができる。例えば、Ｗ．Ｈｕｓｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５〜８１（１９８９）を参照されたい。
【００４０】
本発明において用いられる抗体は、それらの標的に、比較的高い結合アフィニティーで、例えば、約１０−６または１０−８、最大で１０−１２または１０−１３の解離定数で特異的に結合する。
【００４１】
ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合に対するアンタゴニストであるヒト化モノクローナル抗体が、本発明のさらなる態様である。本発明のヒト化抗体は、任意の適切な技法により、例えば、それらの全てが参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、ＥＰＯ公開第０２３９４００号、ならびに米国特許第６，４０７，２１３号；同第６，１８０，３７０号；および同第５，６９３，７６２号において開示される従来の相補性決定領域（ＣＤＲ）移植法を用いて、本明細書で記載される抗体から作製することができる。代替的に、ヒト化抗体は、抗体の可変領域を修飾することにより、異種の分子種に対するその免疫原性を低減しながら、ドメインの抗原に対する天然のアフィニティーを減少することなく、直接的に産生することもできる（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７６６，８８６号を参照されたい）。
【００４２】
ＣＤＲ移植法を用いる場合、ヒト化抗体は一般に、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を、所定の抗原に結合することが可能な非ヒト（通常、マウスまたはラットの）免疫グロブリンに由来する１または複数のＣＤＲと組み合わせることにより産生される。
【００４３】
ヒト化抗体は、少なくとも１つであり、典型的には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ）であって、その中のＣＤＲの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のＦＲである、可変ドメインの実質的に全てを含むことが典型的である。ヒト化抗体はまた、場合によって、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的に、ヒト免疫グロブリンＦｃの少なくとも一部も含む。通常、抗体は、軽鎖ならびに重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含有する。抗体はまた、重鎖のＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、およびＣＨ４領域も包含しうる。
【００４４】
ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥを含めた、免疫グロブリンの任意のクラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および、ＩｇＧ４を含めた、任意のアイソタイプから選択することができる。通常、定常ドメインは、補体結合性の定常ドメインであって、ヒト化抗体が細胞傷害活性を呈示することが所望され、クラスが典型的にＩｇＧ１である定常ドメインである。このような細胞傷害活性が所望でない場合、定常ドメインは、ＩｇＧ２クラスである。ヒト化抗体は、複数のクラスまたはアイソタイプに由来する配列を含むことが可能であり、特定の定常ドメインを選択して、所望の影響または機能を最適化することは、当技術分野の通常の技術の範囲内にある。
【００４５】
ヒト化抗体のＦＲおよびＣＤＲは、親配列に正確に対応する必要はない。ヒト化抗体残基のうちの少なくとも約７５％は、親ＦＲおよびＣＤＲ配列の残基に対応することが可能であり、一部の実施形態では約９０％であり、一部の実施形態では約９５％を超える。
【００４６】
本発明の抗体は、抗体が作製される種以外の種との適合性のために、改変するかまたは突然変異させることができる。例えば、抗体は、ヒト化することもでき、ラクダ化することもできる。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または他の抗原に結合する抗体の部分配列など）である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特異性、アフィニティー、および効力を有するマウス、ラット、またはウサギなど、非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基で置きかえられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を包含する。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基を、対応する非ヒト残基で置きかえる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲ配列またはフレームワーク配列にも見出されない残基も含みうる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つであり、典型的には２つの可変ドメインであって、その中のＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、フレームワーク（ＦＲ）領域（すなわち、ＣＤＲ領域の間の配列）の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のＦＲ領域である可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、場合によって、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的に、ヒト免疫グロブリンＦｃの少なくとも一部も含む（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３（１９９２））。
【００４７】
当技術分野では、非ヒト抗体をヒト化するための方法がよく知られている。一般に、ヒト化抗体では、１または複数のアミノ酸残基が、非ヒトである供給源から導入される。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と称することが多く、「移入」可変ドメインから採取されることが典型的である。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒら（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４（１９８８））の方法に従い、齧歯動物のＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、対応するヒト抗体の配列で置換することにより実施することができる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、対応する非ヒト種に由来する配列で置換されたインタクトなヒト可変ドメインが実質的に１つ未満のキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際に、ヒト化抗体は、一部のＣＤＲ残基（例えば、ＣＤＲの全部またはその一部）が、齧歯動物抗体内の相似部位に由来する残基で置換され、おそらくは一部のＦＲ残基が、齧歯動物抗体内の相似部位に由来する残基で置換されたヒト抗体であることが典型的である。
【００４８】
ヒト抗体もまた、ファージディスプレイライブラリーを含め、当技術分野で知られた多様な技法を用いて作製することができる（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１（１９９１））。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技法もまた、ヒトモノクローナル抗体を調製するために利用可能である（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７ページ（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：８６（１９９１））。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されたトランスジェニック動物、例えば、マウスへと導入することによっても作製することができる。感作すると、遺伝子再配列、遺伝子アセンブリー、および抗体レパートリーを含めた全ての点で、ヒトにおいて見られる抗体に酷似するヒト抗体の産生が観察される。この手法は、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；５，５４５，８０６号；５，５６９，８２５号；５，６２５，１２６号；５，６３３，４２５号；５，６６１，０１６号、ならびに以下の学術刊行物：Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８１２（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４：８４５（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４：８２６（１９９６）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３：６５（１９９５）において記載されている。
【００４９】
本発明を実行するのに用いられるポリクローナル抗体は、適切な動物（例えば、ウサギ、ヤギなど）を、標的に対するモノクローナル抗体が結合する抗原で免疫化し、免疫血清を動物から回収し、知られた手順に従い、ポリクローナル抗体を免疫血清から分離することにより作製することができる。
【００５０】
本発明を実行するのに用いられるモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２６５：４９５（１９７５）の技法に従い、ハイブリドーマ細胞株内で作製することができる。例えば、適切な抗原を含有する溶液を、マウスへと注射し、十分な時間の後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を得た。次いで、脾臓細胞を、典型的にはポリエチレングリコールの存在下で、骨髄腫細胞またはリンパ腫細胞と融合させることにより、それらを不死化して、ハイブリドーマ細胞を作製する。次いで、ハイブリドーマ細胞を適切な培地中で成長させ、上清を、所望の特異性を有するモノクローナル抗体についてスクリーニングする。モノクローナルのＦａｂ断片は、当業者に知られた組換え法により、Ｅ．ｃｏｌｉ内で作製することができる。例えば、Ｈｕｓｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５（１９８９）を参照されたい。
【００５１】
標的のポリペプチドに特異的な抗体はまた、当技術分野で知られたファージディスプレイ法によっても得ることができる。
【００５２】
モノクローナル抗体は、既知の技法に従い作製されるキメラ抗体の場合もあり、「ヒト化」抗体の場合もある。例えば、キメラモノクローナル抗体は、既知の技法に従い作製される相補性決定領域を移植された抗体（または「ＣＤＲを移植された抗体」）でありうる。
【００５３】
本発明の抗体の例は、モノクローナル抗体Ｂ６Ｈ１２（例えば、ＡＴＣＣ受託番号第ＨＢ−９７７１号を割り当てられたＢ６Ｈ１２．２）である。
【００５４】
本発明はまた、ヒトＩＡＰタンパク質のアミノ酸７１〜８０（配列番号７のアミノ酸配列に基づく番号付け）内のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合に対するアンタゴニストであるモノクローナル抗体も提供する。例えば、抗体は、配列番号７のアミノ酸配列のうちのアミノ酸７１〜７３、７１〜７４、７１〜７５、７１〜７６、７１〜７７、７１〜７８、７１〜７９、７１〜８０、７２〜７４、７２〜７５、７２〜７６、７２〜７７、７２〜７８、７２〜７９、７２〜８０、７３〜７５、７３〜７６、７３〜７７、７３〜７８、７３〜７９、７３〜８０、７４〜７６、７４〜７７、７４〜７８、７４〜７９、７４〜８０、７５〜７７、７５〜７８、７５〜７９、７５〜８０、７６〜７８、７６〜７９、７６〜８０、７７〜７９、７７〜８０、または７８〜８０を含むエピトープに結合しうる。
【００５５】
本発明は、ハイブリドーマＮＰＧ−１により産生され、本明細書ではモノクローナル抗体ＮＰＧ−１と称するモノクローナル抗体もさらに提供する。このハイブリドーマは、当技術分野でよく知られたモノクローナル抗体を産生するための標準的なプロトコールに従い作製した。マウスへと投与される免疫原は、ペプチドＡＬＮＫＳＴＶＰＴＤＣ（配列番号１０）であり、これは、本明細書で提示されるヒトＩＡＰのアミノ酸配列のアミノ酸残基７１〜８０（配列番号７のアミノ酸配列に基づく番号付け）（すなわち、ＡＬＮＫＳＴＶＰＴＤ、配列番号６）であって、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）へと連結するのに用いたカルボキシ末端にシステイン残基を付加したアミノ酸残基を表す。したがって、実際の免疫原は、システインにより連結された活性ペプチドとＫＬＨとのコンジュゲートであった。マウスを免疫化し、次いで、骨髄腫細胞と融合させるために、脾臓を採取した。骨髄腫細胞の上清を、プレートをコーティングするためのＢＳＡへと連結された免疫原を用いて、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。次いで、陽性の上清を、個別に４回にわたり再クローニングしてから、高アフィニティーの抗体を産生する最終クローンを選択した。ヒトＩＡＰのアミノ酸の番号付けは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース受託番号第ＮＰ＿９４２０８８号（参照により本明細書に組み込まれる）の基準アミノ酸配列に基づき、１と番号付けされた最初のアミノ酸および３０５と番号付けされた最後のアミノ酸を伴う以下の通りである。以下の配列では、アミノ酸残基７１〜８０が太字で示される。
【００５６】
【表３】
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【００５７】
一部の実施形態では、抗体が、（ａ）ハイブリドーマＮＰＧ−１により産生されるモノクローナル抗体、または（ｂ）ハイブリドーマＮＰＧ−１により産生されるモノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープへの結合について競合するモノクローナル抗体（すなわち、ハイブリドーマＮＰＧ−１により産生されるモノクローナル抗体が結合するエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体）である。
【００５８】
ハイブリドーマＮＰＧ−１は、２０１２年８月１７日にＭａｎａｓｓａｓ、ＶｉｒｇｉｎｉａのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号＿＿＿を割り当てられた。このハイブリドーマは、本明細書で記載される本発明の抗体を産生する。
【００５９】
モノクローナル抗体ＮＰＧ−１は、ヒトＩＡＰタンパク質に結合し、ＩＡＰのβ３タンパク質への結合を破壊することなく、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合を破壊する。β３インテグリンサブユニットは、αｖβ３インテグリンの構成要素である。β３インテグリンサブユニットは、血管内皮細胞の表面において多量に発現する。αｖβ３インテグリンの機能を破壊する薬剤は、内皮細胞機能の変化のほか、内皮細胞の成長の阻害をもたらすことが示されている。さらに、このインテグリンサブユニットは、血小板上でも発現するので、血小板におけるその機能を阻害することが示されている薬剤は、血小板の凝集を刺激し、これにより、血栓をもたらしうることが示されている。これは、このモノクローナル抗体の重要な際立った特色である。ヒトＩＡＰと反応する多くの抗体はまた、αｖβ３インテグリンにも結合する。ＩＡＰのβ３への結合を破壊すれば、このような抗体の治療的使用を所望されないものとする副作用がもたらされうるであろう。ＮＰＧ−１抗体は、ヒトＩＡＰに結合し、ＩＡＰのβ３への結合を破壊することなく、そのＳＨＰＳ−１との会合を破壊する予測外の利益を有する。
【００６０】
本明細書では、ヒト化モノクローナル抗体ＮＰＧ−１がさらに提供される。抗体のヒト化形態は、インビトロにおける突然変異誘発を用いて調製することができる。これらの領域で単一のアミノ酸を変化させて、免疫原性を回避または最小化することが必要でない限り、相補性決定領域（ＣＤＲ）はインタクトのまま放置する。同様に、フレームワーク領域を、免疫原性を付与しうる領域について走査し、適切なマウスアミノ酸残基を、ヒトアミノ酸残基へと変化させる。次いで、抗体全体の免疫原性を、２０のＨＬＡハプロタイプの各々に由来するヒトＨＬＡドナーから調製されるリンパ球を用いて決定する。
【００６１】
多様なイムノアッセイを、本発明のポリペプチドに対して所望の特異性を有する抗体をスクリーニングして同定するために用いることができる。当技術分野では、特異性が確立されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いる競合的結合アッセイまたは免疫放射定量測定法のための多数のプロトコールがよく知られている。このようなイムノアッセイは、抗原とその特異的抗体との複合体の形成（例えば、抗原／抗体複合体の形成）の測定を伴うことが典型的である。本発明のポリペプチドまたはペプチド上の２つの非干渉的エピトープに対するモノクローナル抗体の反応性を使用する、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイのほか、競合的結合アッセイも用いることができる。
【００６２】
抗体は、既知の技法に従い、固体支持体（例えば、ラテックスまたはポリスチレンなどの材料から形成されるビーズ、プレート、スライド、またはウェル）へとコンジュゲートすることができる。抗体はまた、既知の技法に従い、放射性標識（例えば、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、および蛍光標識（例えば、フルオレセイン）などの検出可能な基へもコンジュゲートすることができる。本発明の方法における抗体／抗原複合体の形成の決定は、例えば、当技術分野でよく知られた沈殿、凝集、軟凝集、放射能、発色または色彩の変化、蛍光、発光などの検出によって行うことができる。
【００６３】
多様な実施形態では、本発明の抗体が、ＩＡＰに特異的に結合する抗体またはその断片（例えば、モノクローナル抗体）である。一部の実施形態では、本発明の抗体が、ＳＨＰＳ−１に特異的に結合する抗体またはその断片（例えば、モノクローナル抗体）である。
【００６４】
一実施形態では、抗体が、ハイブリドーマ細胞株ＮＰＧ−１（ＡＴＣＣ受託番号：＿＿＿；２０１２年８月１７日に寄託された）により産生されるモノクローナル抗体である。さらなる実施形態では、抗体が、ハイブリドーマ細胞株ＮＰＧ−１（ＡＴＣＣ受託番号：＿＿＿；２０１２年８月１７日に寄託された）により産生されるモノクローナル抗体が特異的に結合する同じエピトープへの結合について競合するモノクローナル抗体またはその断片である。別の実施形態では、抗体が、ハイブリドーマ細胞株ＮＰＧ−１（ＡＴＣＣ受託番号：＿＿＿；２０１２年８月１７日に寄託された）により産生されるモノクローナル抗体が特異的に結合する同じエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその断片である。特定の実施形態では、モノクローナル抗体またはその断片が、キメラ抗体またはヒト化抗体である。付加的な実施形態では、キメラまたはヒト化抗体が、ＮＰＧ−１（ＡＴＣＣ受託番号：＿＿＿；２０１２年８月１７日に寄託された）の少なくとも一部を含む。本明細書で用いられる、ＣＤＲの「一部」とは、ＣＤＲを構成する軽鎖および重鎖の各々に由来する（例えば、ＣＤＲの１〜６に由来する）３つのループのうちの１もしくは複数、またはループの１もしくは複数の部分であって、少なくとも３つの連続アミノ酸を含むか、これらから本質的になるか、もしくはこれらからなる部分と定義される。例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体は、１、２、３、４、５、もしくは６つのＣＤＲループ、１、２、３、４、５、もしくは６つのＣＤＲループの部分、またはこれらの混合物を含みうる。
【００６５】
Ｂ．タンパク質／ペプチドによるアンタゴニストおよび他のアンタゴニスト
ＩＡＰのアミノ末端のＩｇドメインおよびＳＨＰＳ−１の細胞外Ｉｇ可変ドメインは、それらの物理的相互作用に十分であり、これらの領域を、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合に対する、タンパク質またはペプチドによるアンタゴニストとして用いることができる。したがって、本発明のさらなる態様は、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１結合ドメイン（例えば、ＩＡＰ断片；ＩＡＰのアミノ末端のＩｇドメイン）を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるタンパク質またはペプチドである活性薬剤である。具体例には、マウスＩＡＰのアミノ酸１〜１４０からなるポリペプチド；マウスＩＡＰのアミノ酸１〜１３５からなるポリペプチド；マウスＩＡＰのアミノ酸５〜１３５からなるポリペプチド；マウスＩＡＰのアミノ酸５〜９５からなるポリペプチド；マウスＩＡＰのアミノ酸１９〜９５からなるポリペプチド；マウスＩＡＰのアミノ酸１〜１４０からなるポリペプチド；ラットＩＡＰのアミノ酸１〜１３５からなるポリペプチド；ラットＩＡＰのアミノ酸５〜１３５からなるポリペプチド；ラットＩＡＰのアミノ酸５〜９５からなるペプチド；ラットＩＡＰのアミノ酸１９〜９５からなるポリペプチド；ヒトＩＡＰのアミノ酸１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜５０、１〜６０、１〜７０、１〜８０、１〜９０、１〜１００、１〜１１０、１〜１２０、１〜１３０、１〜１３５、および／または１〜１４０からなるペプチド；ヒトＩＡＰのアミノ酸５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜６０、５〜７０、５〜８０、５〜９５、５〜１００、５〜１１０、５〜１２０、および／または５〜１３５からなるペプチド；ヒトＩＡＰの１０〜２０、１０〜３０、１０〜３５、１０〜４０、１０〜４５、１０〜５０、１０〜６０、１０〜７０、１０〜８０、１０〜９５、１０〜１００、１０〜１１０、１０〜１２０、および／または１０〜１３５からなるペプチド；ヒトＩＡＰのアミノ酸１９〜３０、１９〜３５、１９〜４０、１９〜４５、１９〜５０、１９〜６０、１９〜７０、１９〜８０、１９〜９５、１９〜１００、１９〜１１０、１９〜１２０、および／または１９〜１３５からなるペプチド、ならびにヒトＩＡＰのアミノ酸３０〜５０、３０〜６０、３０〜７０、３０〜８０、３０〜９０、４０〜５０、４０〜６０、４０〜７０、４０〜８０、４０〜９０、４０〜１００、５０〜６０、５０〜７０、５０〜６０、６０〜７０、６０〜８０、７０〜８０、８０〜９０、７０〜９０、５０〜８０、５０〜９０、および／または５０〜１００からなるペプチドが含まれるがこれらに限定されない。本明細書ではまた、本明細書で記載されるＩＡＰペプチドのうちのいずれかの中のＩＡＰペプチドおよび／またはエピトープのうちのいずれかに特異的に結合する本発明の抗体も提供される。
【００６６】
マウス、ヒト、およびラットＩＡＰは全て上記の通りに知られており、本明細書における番号付けは、全長タンパク質内のアミノ酸残基へと割り当てられる標準的な番号付けを指す。ヒトＩＡＰのアミノ酸の番号付けは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース受託番号第ＮＰ＿９４２０８８号（参照により本明細書に組み込まれる）の基準アミノ酸配列に基づき、１と番号付けされた最初のアミノ酸および３０５と番号付けされた最後のアミノ酸を伴う以下の通りである。
MWPLVAALLL GSACCGSAQL LFNKTKSVEF TFCNDTVVIP CFVTNMEAQN TTEVYVKWKF KGRDIYTFDG ALNKSTVPTD FSSAKIEVSQ LLKGDASLKM DKSDAVSHTG NYTCEVTELT REGETIIELK YRVVSWFSPN ENILIVIFPI FAILLFWGQF GIKTLKYRSG GMDEKTIALL VAGLVITVIVIV GAILFVPG EYSLKNATGL GLIVTSTGIL ILLHYYVFST AIGLTSFVIA ILVIQVIAYI LAVVGLSLCI AACIPMHGPL LISGLSILAL AQLLGLVYMK FVASNQKTIQ PPRNN (配列番号7)。
【００６７】
一部の実施形態では、ＩＡＰペプチドが、アミノ酸配列ＦＶＴＮＭＥＡＱＮＴＴＥＶＹＫＷＫ（アミノ酸４２〜５９、配列番号１１）を有するペプチド、アミノ酸配列ＫＷＫＦＫＧＲＤＩＹＴＦＤＧＡＬＮＫ（アミノ酸５７〜７４、配列番号１２）を有するペプチド、アミノ酸配列ＳＴＶＰＴＤＦＳＳＡＫＩＥＶＳＱＬＬＫＧＤ（アミノ酸７５〜９５、配列番号１３）を有するペプチド、アミノ酸配列ＹＴＦＤＧＡＬＮＫＳＴＶＰＴＤＦＳ（アミノ酸６６〜９２、配列番号１４）を有するペプチド、およびこれらの任意の組合せを含む場合もあり、これらから本質的になる場合もあり、これらからなる場合もある。
【００６８】
本発明のなおさらなる態様は、ＳＨＰＳ−１のＩＡＰ結合ドメインを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるタンパク質またはペプチド（例えば、ＳＨＰＳ−１断片；ＳＨＰＳ−１の細胞外Ｉｇ可変ドメイン）である活性薬剤である。
【００６９】
具体例には、マウスＳＨＰＳ−１のアミノ酸１〜１６０からなるポリペプチド；マウスＳＨＰＳ−１のアミノ酸５〜１５０からなるポリペプチド；マウスＳＨＰＳ−１のアミノ酸２９〜１５０からなるポリペプチド；ラットＳＨＰＳ−１のアミノ酸１〜１６０からなるポリペプチド；ラットＳＨＰＳ−１のアミノ酸５〜１５０からなるポリペプチド；ラットＳＨＰＳ−１のアミノ酸２９〜１５０からなるポリペプチド；ヒトＳＨＰＳ−１のアミノ酸１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜５０、１〜６０、１〜７０、１〜８０、１〜９０、１〜１００、１〜１１０、１〜１２０、１〜１３０、１〜１３５、および／または１〜１４０からなるペプチド；ヒトＳＨＰＳ−１のアミノ酸５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜６０、５〜７０、５〜８０、５〜９５、５〜１００、５〜１１０、５〜１２０、および／または５〜１３５からなるペプチド；ヒトＳＨＰＳ−１の１０〜２０、１０〜３０、１０〜３５、１０〜４０、１０〜４５、１０〜５０、１０〜６０、１０〜７０、１０〜８０、１０〜９５、１０〜１００、１０〜１１０、１０〜１２０、および／または１０〜１３５からなるペプチド；ヒトＳＨＰＳ−１のアミノ酸１９〜３０、１９〜３５、１９〜４０、１９〜４５、１９〜５０、１９〜６０、１９〜７０、１９〜８０、１９〜９５、１９〜１００、１９〜１１０、１９〜１２０、および／または１９〜１３５からなるペプチド；ヒトＳＨＰＳ−１のアミノ酸３０〜５０、３０〜６０、３０〜７０、３０〜８０、３０〜９０、４０〜５０、４０〜６０、４０〜７０、４０〜８０、４０〜９０、４０〜１００、５０〜６０、５０〜７０、５０〜８０、５０〜９０、および／または５０〜１００からなるペプチド；ならびにヒトＳＨＰＳ−１のアミノ酸１００〜１２０、１００〜１３０、１００〜１４０、１００〜１５０、１２０〜１４０、１２０〜１３０、１２０〜１５０、１３０〜１４０、および／または１３０〜１５０からなるペプチドが含まれるがこれらに限定されない。本明細書ではまた、ＳＨＰＳ−１ペプチドおよび／または本明細書で記載されるＳＨＰＳ−１ペプチドのうちのいずれかの中のＳＨＰＳ−１エピトープのうちのいずれかに特異的に結合する本発明の抗体も提供される。
【００７０】
マウス、ヒト、およびラットのＳＨＰＳ−１は全て上記の通りに知られており、本明細書における番号付けは、全長タンパク質内のアミノ酸残基へと割り当てられる標準的な番号付けを指す。ヒトＳＨＰＳ−１のアミノ酸の番号付けは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース受託番号第ＢＡＡ１２９７４号（参照により本明細書に組み込まれる）の基準アミノ酸配列に基づき、１と番号付けされた最初のアミノ酸および５０３と番号付けされた最後のアミノ酸を伴う以下の通りである。
MEPAGPAPGR LGPLLCLLLA ASCAWSGVAG EEELQVIQPD KSVSVAAGES AILHCTVTSL IPVGPIQWFR GAGPARELIY NQKEGHFPRV TTVSESTKRE NMDFSISISN ITPADAGTYY CVKFRKGSPD TEFKSGAGTE LSVRAKPSAP VVSGPAARAT PQHTVSFTCE SHGFSPRDIT LKWFKNGNEL SDFQTNVDPV GESVSYSIHS TAKVVLTRED VHSQVICEVA HVTLQGDPLR GTANLSETIR VPPTLEVTQQ PVRAENQVNV TCQVRKFYPQ RLQLTWLENG NVSRTETAST VTENKDGTYN WMSWLLVNVS AHRDDVKLTC QVEHDGQPAV SKSHDLKVSA HPKEQGSNTA AENTGSNERN IYIVVGVVCT LLVALLMAAL YLVRIRQKKA QGSTSSTRLH EPEKNAREIT QDTNDITYAD LNLPKGKKPA PQAAEPNNHT EYASIQTSPQ PASEDTLTYA DLDMVHLNRT PKQPAPKPEP SFSEYASVQV PRK (配列番号15)。
【００７１】
一部の実施形態では、ＳＨＰＳ−１ペプチドが、アミノ酸配列ＲＥＬＩＹＮＱＫＥＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳ（アミノ酸７６〜９３、配列番号１６）を有するペプチド、アミノ酸配列ＶＴＳＬＩＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧ（アミノ酸５７〜７１、配列番号１７）を有するペプチド、アミノ酸配列ＶＫＦＲＫＧＳＰ（アミノ酸１２２〜１２９、配列番号１８）を有するペプチド、およびこれらの任意の組合せを含む場合もあり、これらから本質的になる場合もあり、これらからなる場合もある。
【００７２】
活性薬剤として使用できるＩＡＰ断片およびＳＨＰＳ−１断片は、その類似体を包含する。「類似体」とは、構造が第１の化合物と類似し、第１の化合物と類似する生理学的作用または対照的な生理学的作用を有する化合物である。本発明に特に言及すると、ペプチド類似体とは、対応するタンパク質またはペプチドのアミノ酸配列を有さない一方で、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合をアンタゴナイズすることが可能な化合物である。このような類似体は、ペプチドの場合もあり、以下でさらに詳細に記載される通り、核酸類似体が含まれるがこれらに限定されない、非ペプチド性類似体の場合もある。
【００７３】
受容体（例えば、ＩＡＰまたはＳＨＰＳ−１上の受容体）と相互作用するタンパク質またはペプチド分子では、タンパク質またはペプチドと受容体との相互作用が、一般に、安定的な三次元分子の表面に接触可能な部位において生じる。最重要の結合部位の残基を適切なコンフォメーションで配置することにより、本明細書で記載されるペプチドの本質的な表面特徴を模倣するペプチド類似体を、既知の技法に従い、発生させ、合成することができる。ペプチドの三次元構造およびこれに対する類似体を決定するための方法が知られており、「合理的薬物デザイン法」と称する場合がある。例えば、Ｇｅｙｓｅｎによる米国特許第４，８３３，０９２号；Ｎｅｓｔｏｒによる米国特許第４，８５９，７６５号；Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏによる米国特許第４，８５３，８７１号；Ｂｌａｌｏｃｋによる米国特許第４，８６３，８５７号を参照されたい（本出願者らはとりわけ、本明細書で引用される全ての米国特許の参考文献の開示が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれることを意図する）。また、Ｗａｌｄｒｏｐ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７、２８０２９（１９９０）；Ｒｏｓｓｍａｎｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３３３、３９２（１９８８）；Ｗｅｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３３３、４２６（１９８８）；Ｊａｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０、１９３７（１９９３）（テトラペプチドリガンドの構造および機能に基づく、ベンゾジアゼピンによるペプチド模倣体化合物の開発）も参照されたい。
【００７４】
一般に、当業者は、本発明のタンパク質またはペプチドのアミノ酸配列に、その活性に過度に有害な影響を及ぼすことなく、微細な欠失または置換を施しうることを察知するであろう。したがって、このような欠失または置換を含有するペプチドが、本発明のさらなる態様である。アミノ酸の置換または置きかえを含有するペプチドでは、ペプチド配列の１または複数のアミノ酸を、１または複数の他のアミノ酸であって、このような置きかえが、その配列の機能に影響を及ぼさないアミノ酸で置きかえることができる。このような変化は、アミノ酸が、本質的に同じ機能的特性を有する他のアミノ酸で置換されるように、電荷密度、疎水性／親水性、サイズ、および立体構成などの物理的特徴における、アミノ酸間の知られた類似性により誘導することができる。例えば、Ａｌａは、ＶａｌまたはＳｅｒで置きかえることができ；Ｖａｌは、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、またはＩｌｅ、好ましくは、ＡｌａまたはＬｅｕで置きかえることができ；Ｌｅｕは、Ａｌａ、Ｖａｌ、またはＩｌｅ、好ましくは、ＶａｌまたはＩｌｅで置きかえることができ；Ｇｌｙは、ＰｒｏまたはＣｙｓ、好ましくは、Ｐｒｏで置きかえることができ；Ｐｒｏは、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、またはＭｅｔ、好ましくは、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、またはＳｅｒで置きかえることができ；Ｃｙｓは、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、またはＭｅｔ、好ましくは、ＰｒｏまたはＭｅｔで置きかえることができ；Ｍｅｔは、ＰｒｏまたはＣｙｓ、好ましくは、Ｃｙｓで置きかえることができ；Ｈｉｓは、ＰｈｅまたはＧｌｎ、好ましくは、Ｐｈｅで置きかえることができ；Ｐｈｅは、Ｈｉｓ、ＴｙｒまたはＴｒｐ、好ましくは、ＨｉｓまたはＴｙｒで置きかえることができ；Ｔｙｒは、Ｈｉｓ、ＰｈｅまたはＴｒｐ、好ましくは、ＰｈｅまたはＴｒｐで置きかえることができ；Ｔｒｐは、ＰｈｅまたはＴｙｒ、好ましくは、Ｔｙｒで置きかえることができ；Ａｓｎは、ＧｌｎまたはＳｅｒ、好ましくは、Ｇｌｎで置きかえることができ；Ｇｌｎは、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、またはＳｅｒ、好ましくは、ＡｓｎまたはＳｅｒで置きかえることができ；Ｓｅｒは、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｃｙｓ、またはＡｌａで置きかえることができ；Ｔｈｒは、ＧｌｎまたはＳｅｒ、好ましくは、Ｓｅｒで置きかえることができ；Ｌｙｓは、ＧｌｎまたはＡｒｇで置きかえることができ；Ａｒｇは、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、またはＧｌｕ、好ましくは、ＬｙｓまたはＡｓｐで置きかえることができ；Ａｓｐは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＧｌｕ、好ましくは、ＡｒｇまたはＧｌｕで置きかえることができ；Ｇｌｕは、ＡｒｇまたはＡｓｐ、好ましくは、Ａｓｐで置きかえることができる。変化がもたらされたならば、それらを常套法によりスクリーニングして、酵素を伴う機能に対するそれらの影響を決定することができる。
【００７５】
また、本発明のタンパク質またはペプチドの非ペプチド性模倣体（すなわち、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合の非ペプチド性アンタゴニスト）も、本発明の態様である。非タンパク質性模倣体は、コンピュータグラフィックモデリングを用いて、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合をアンタゴナイズすることが可能な非ペプチド性の有機分子をデザインするなど、既知の技法に従い作製することができる。例えば、Ｋｎｉｇｈｔ、ＢＩＯ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８：１０５（１９９０）；Ｉｔｚｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６３：４１８（１９９３）（インフルエンザウイルス酵素であるシアリダーゼのペプチド模倣体による阻害剤）を参照されたい。Ｉｔｚｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６３：４１８（１９９３）は、ｘ線結晶構造解析研究に由来するデータを用いて、シアリダーゼ受容体タンパク質の結晶構造をモデル化し、モデルの活性部位に結合する阻害剤を開発しているが、当技術分野ではまた、モデル化のための核磁気共鳴（ＮＭＲ）データの使用についても知られており、このような技法を、本発明を実行するのに使用することができる。また、バイオアベイラビリティーを示す非ペプチド性の環状尿素であって、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤として機能する環状尿素の合理的デザインに関するＬａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６３：３８０（１９９４）も参照されたい。Ｌａｍらは、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の複合体についてのｘ線結晶構造研究に由来する情報を用いて、非ペプチド性阻害剤をデザインした。
【００７６】
類似体またはアンタゴニストはまた、以下でさらに詳細に論じられる、化合物ライブラリーのハイスループットスクリーニングを使用することによっても開発した。このような化合物ライブラリーは、完全なランダムライブラリーの場合もあり、上記の抗体による活性薬剤、ＩＡＰ断片による活性薬剤、またはＳＨＰＳ−１断片による活性薬剤に基づく情報に基づき作製および／または選択したライブラリーの場合もあることに注意されたい。
【００７７】
本発明を実行するのに用いうる前出のアンタゴニストまたは類似体はまた、分子ライブラリーを作製し、アンタゴニストとして作用する分子について選択し、選択されたアンタゴニストを同定および増幅することによっても開発することができる。例えば、Ｋｏｈｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０：１９３４（１９９３）（ｒａｓがんタンパク質依存性の細胞の形質転換を阻害する、タンパク質ファルネシルトランスフェラーゼの阻害剤のためのテトラペプチドの合成およびスクリーニング）を参照されたい。Ｅｌｄｒｅｄら、（Ｊ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．、３７：３８８２（１９９４））は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を模倣する非ペプチド性アンタゴニストについて記載している。同様に、Ｋｕら（Ｊ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．、３８：９（１９９５））は、このような化合物のシリーズの合成についてさらに例示している。オリゴマー性生体分子のコンビナトリアルライブラリーを構築およびスクリーニングして、所与の受容体タンパク質に特異的に結合するオリゴマー性生体分子を同定するための技法が知られている。適切なオリゴマーには、ペプチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物、非オリゴヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド；Ｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ、２０頁、１９９４年２月７日を参照されたい）、および非ペプチド性ポリマー（例えば、Ｓｉｍｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：９３６７（１９９２）の「ペプトイド」を参照されたい）が含まれる。また、Ｓｃｈａｔｚによる米国特許第５，２７０，１７０号；ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：３８６〜３９０（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：４０４４０６（１９９０）；Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ、ＢＩＯ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：２８５（１９９３）も参照されたい。ペプチドライブラリーは、固体支持体上で合成することもでき、バクテリオファージウイルスの表面において発現させる（ファージディスプレイライブラリー）こともできる。当業者は、既知のスクリーニング法を用いて、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングし、アンタゴニストを同定することができる。当技術分野では、合成された分子をスクリーニングして、所望の活性を伴う分子を選択し、選択された活性分子を同定しうるように、ライブラリーのメンバーに標識するための技法が知られている。例えば、ＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５３８１（１９９２）（コンビナトリアルライブラリーにおける分子を標識するための遺伝子タグの使用）；ＢｅｒｇｅｒらによるＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９４８（ウイルスによる転写の誘発を阻害することが可能な潜在的な抗ウイルス分子についてスクリーニングするための、ウイルス性転写活性化エレメントで形質転換された組換え細胞の使用）；Ｓｉｍｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：９３６７（１９９２）（生物学的受容体に対するリガンドを同定するための、オリゴマー性Ｎ置換グリシンである「ペプトイド」の作製およびスクリーニング）；Ｆｉｅｌｄｓらによる米国特許第５，２８３，１���３号（ペプチドを相互作用についてスクリーニングするための、遺伝子改変されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの使用）を参照されたい。
【００７８】
本明細書で用いられる「コンビナトリアルライブラリー」とは、配列の異なる多様なオリゴマー性生体分子のコレクションであって、特定の標的に対するリガンドとしての活性についても同時にスクリーニングしうるコレクションを指す。コンビナトリアルライブラリーはまた、「シェイプライブラリー」とも称する、すなわち、潜在的なリガンドであるランダム化されたポリマーの集団でもありうる。分子のシェイプとは、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、静電相互作用、および動力学的相互作用を含めた、その他の分子との相互作用を統御する分子の特徴を指す。このようなライブラリーと共に用いられうるスクリーニング手順は、以下でより詳細に論じられる。
【００７９】
Ｃ．製剤および投与
投与のためには一般に、投与の前に、本発明の活性薬剤（例えば、抗体またはそれらの抗原結合断片）を、非毒性の薬学的に許容される担体物質（例えば、通常の生理食塩液またはリン酸緩衝生理食塩液）と混合し、医療的に適切な任意の手順、例えば、静脈内注射または動脈内注射などを介する非経口投与（例えば、注射）を用いて投与する。一部の実施形態では、投与を、眼内への注射（例えば、眼内注射、網膜内注射、および／または硝子体内注射）により施すことができる。一部の実施形態では、投与を、処置部位への直接的な注射、例えば、腫瘍への直接的な注射により施すことができる。一部の実施形態では、本発明の活性薬剤を、担体（例えば、ポリエチレングリコール）と連結またはコンジュゲートして、活性薬剤の半減期または他の特性を変化させることができる。
【００８０】
上記の活性薬剤は、既知の技法に従い、医薬担体による投与用に調合することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、「Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」、（９版、１９９５）を参照されたい。本発明に従う医薬製剤の製造では、活性化合物（生理学的に許容されるその塩を含む）を、とりわけ、許容される担体と混合することが典型的である。担体は、当然ながら、製剤中の他の任意の成分と適合性であるという意味で許容されなければならず、患者に対して有害であってはならない。担体は、液体であることが可能であり、重量で０．０１または０．５％〜９５％または９９％の活性化合物を含有しうる単位用量製剤としての化合物により調合することが好ましい。
【００８１】
非経口投与に適する本発明の製剤は、滅菌された水性および非水性の活性化合物の注射溶液を含み、この調製物は、意図されるレシピエントの血液と等張性であることが好ましい。これらの調製物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を、意図されるレシピエントの血液と等張性とする溶質を含有しうる。
【００８２】
活性薬剤は、医療的に適切な任意の手順、例えば、通常の静脈内投与または動脈内投与により投与することができる。特定の場合には、アテローム性動脈硬化性血管に対する直接的な投与が所望されうる。
【００８３】
活性薬剤は、滅菌の無菌容器内の凍結乾燥形態で提供することもでき、滅菌の発熱物質非含有水または滅菌で発熱物質非含有の生理食塩液など、薬学的に許容される担体と組み合わせた医薬製剤により提供することもできる。
【００８４】
活性薬剤の用量は、とりわけ、対象の状態、処置される障害またはがんの特定の範疇または種類、投与経路、使用される治療剤の性質、および腫瘍の特定の治療剤に対する感受性に依存する。例えば、用量範囲は、対象の体重１キログラム当たり約０．０２〜約５０００マイクログラムでありうる。罹患集団内の一部の個体において、何らかの有益な効果を結果としてもたらすのに有効である限りにおいて、本発明の抗体またはその抗原結合断片の具体的用量は、それほど重要ではない。一部の実施形態では、用量が、対象の体重１キログラム当たり、約０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、もしくは５０マイクログラム、またはこれを下回る低量、および対象の体重１キログラム当たり、約６０、７５、９０、１００、２５０、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、もしくは５０００マイクログラム、またはこれをなお上回る高量であることが可能である。
【００８５】
本発明の活性薬剤は、場合によって、本明細書で記載される障害または状態を処置するのに有用な化学療法化合物もしくは抗新生物性化合物または放射線療法（例えば、化学療法剤または抗新生物性化合物）など、他の異なる細胞傷害剤と共に投与することもできる。他の化合物は、共時投与することができる。本明細書で用いられる、「共時的」という語は、時間において、影響の組合せをもたらすのに十分な程度に近接していること（すなわち、共時的とは、同時的な場合もあり、互いの前後に施される２回以上の投与の場合もある）を意味する。本明細書で用いられる「放射線療法」という語句には、ビームなど、外部から適用される供給源から送達されるか、または小型放射線源の植込みを介して送達されるｘ線またはガンマ線が含まれるがこれらに限定されない。本明細書で記載される活性薬剤と共時投与されうる他の適切な化学療法剤の例には、アルキル化剤（限定なしに述べると、窒素マスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレアおよびトリアゼンが含まれる）：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（商標））、イホスファミド、メルファラン、クロランブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホルアミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、およびテモゾロミド；代謝拮抗剤（限定なしに述べると、葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤が含まれる）：メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、フルダラビンリン酸エステル、ペントスタチン、およびゲムシタビン；天然生成物およびそれらの誘導体（例えば、ビンカアルカロイド、抗腫瘍性抗生剤、酵素、リンホカインおよびエピポドフィロトキシン）：ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、Ａｒａ−Ｃ、パクリタキセル（パクリタキセルは、Ｔａｘｏｌ（登録商標）として市販されている。）、ミトラマイシン、デオキシコホルマイシン、マイトマイシンＣ、Ｌ−アスパラギナーゼ、インターフェロン（とりわけ、ＩＦＮ−ａ）、エトポシド、およびテニポシドが含まれるがこれらに限定されない。他の抗増殖性細胞傷害剤は、ナベルビン、ＣＰＴ−１１、アナストロゾール、レトラゾール、カペシタビン、レロキサフィン、シクロホスファミド、イホスファミド、およびドロロキシフェンである。さらなる抗増殖性細胞傷害剤には、メルファラン、ヘキサメチルメラミン、チオテパ、シタラビン、エダトレキサート、トリメトレキサート、ダカルバジン、Ｌ−アスパラギナーゼ、カンプトテシン、トポテカン、ビカルタミド、フルタミド、ロイプロリド、ピリドベンゾインドール誘導体、インターフェロン、およびインターロイキンが含まれるがこれらに限定されない。抗増殖性細胞傷害剤の好ましいクラスは、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ−２阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）である（例えば、米国特許第６，５３７，９８８号；米国特許第６，４２０，３７７号を参照されたい）。このような化合物は、それらの投与について現在知られている技法に従い施すことができる。
【００８６】
Ｄ．スクリーニング手順
上記で言及した通り、本発明は、単独で使用することもでき、なおさらなる活性薬剤を作製するための、上記の多様な活性薬剤についての情報と組み合わせて使用することもできるスクリーニング手順を提供する。
【００８７】
例えば、活性薬剤はまた、本明細書で記載される通り、分子のライブラリーを作製し、指定された標的に対するリガンドとして作用する分子について選択し、選択されたリガンドを同定および増幅することにより開発することもできる。
【００８８】
核酸分子もまた、受容体タンパク質に対するリガンドとして作用しうる。例えば、Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ、ＢＩＯ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：２８５（１９９３）を参照されたい。ＧｏｌｄおよびＴｕｅｒｋによる米国特許第５，２７０，１６３号は、ランダム化された配列を伴うＲＮＡ分子のライブラリーから、標的分子に特異的に結合する分子を選択することにより、所与の標的分子に対する核酸リガンドを同定するための方法について記載している。特異的ペプチドと免疫的に交差反応性であるＲＮＡ分子をインビトロにおいて選択するための方法は、Ｔｓａｉ、Ｋｅｎａｎ、およびＫｅｅｎｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：８８６４（１９９２）、ならびにＴｓａｉおよびＫｅｅｎｅ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５０：１１３７（１９９３）において開示されている。上記の方法では、ペプチドに対してもたらされる抗血清を用いて、ＲＮＡ分子をＲＮＡ分子のライブラリーから選択し、選択されたＲＮＡ分子およびペプチドが抗体の結合について競合することから、ＲＮＡのエピトープが、抗体−抗原間相互作用の特異的阻害剤として機能することが示される。
【００８９】
上記で言及した通り、記載される潜在的な活性薬剤または候補化合物は、（ｉ）インスリン様成長因子Ｉによる細胞の活性化の阻害（例えば、ＩＧＦ−１による細胞の成長の阻害）における活性、（ｉｉ）がんもしくは腫瘍（上記で記載した）の処置における活性、ならびに／または（ｉｉｉ）アテローム性動脈硬化（上記で記載した）および／もしくは糖尿病性神経障害および／もしくは網膜症および／もしくはＩＧＦ−１により誘導される細胞の増殖を特徴とする他の任意の所望されない障害の処置における活性について容易にスクリーニングすることができる。この方法は、（ａ）被験化合物を、ＳＨＰＳ−１タンパク質およびＩＡＰタンパク質（この用語は、他方に結合するのに十分なその結合断片を包含する）を含むインビトロ系へと添加するかまたは接触させるステップと；次いで、（ｂ）被験化合物が、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合に対するアンタゴニストであるかどうかを決定するステップと；次いで、（ｃ）被験化合物が、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合に対するアンタゴニストである場合、被験化合物を、（ｉ）インスリン様成長因子１による細胞の活性化の阻害、（ｉｉ）がんもしくは腫瘍の処置、および／または（ｉｉｉ）アテローム性動脈硬化（またはＩＧＦ−１により誘導される細胞の増殖を特徴とする他の障害）の処置において活性であるかもしくは潜在的に活性な化合物として同定するステップとを含む。インビトロ系は、ＳＨＰＳ−１タンパク質およびＩＡＰタンパク質の両方を発現させる細胞など、任意の適切な形態でありうる。代替法では、インビトロ系が、ＳＨＰＳ−１およびＩＡＰまたはその結合断片の水性調製物などの無細胞系でありうる。接触させるステップと、決定するステップと、同定するステップとは、手作業によるか、半自動式か、またはハイスループットスクリーニング装置によるなど、任意の適切な形で実行することができる。決定するステップは、それらの全てを当業者によく知られた手順に従い実行しうる沈殿を介するか、断片のうちの１つの、放射性基などの検出可能基による標識化を介するなど、任意の適切な技法により実行することができる。
【００９０】
以下の非限定的な例において、本発明についてより詳細に説明するが、そこでは、以下の略記法：ダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ−Ｈ）、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−１）、ＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、免疫グロブリン（Ｉｇ）、インテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ）、無血清培地（ＳＦＭ）、平滑筋細胞（ＳＭＣ）、ＳＨ２（ｓｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ２）ドメインを含有するタンパク質チロシンホスファターゼ基質１（ＳＨＰＳ−１）、ＳＨ２（ｓｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ２）を含有するタンパク質チロシンホスファターゼ２（ＳＨＰ−２）を用いる。
【実施例１】
【００９１】
＜インテグリン関連タンパク質とＳＨＰＳ−１との会合は、血管平滑筋細胞におけるＩＧＦ−１受容体によるシグナル伝達を調節する＞
インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−１）とは、平滑筋細胞（ＳＭＣ）の遊走および増殖の強力な刺激因子である（Ｊｏｎｅｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、ＵＳＡ、９３：２４８２〜７（１９９６））。細胞内シグナル伝達を開始させるＩＧＦ−１の能力が、それ自体の膜貫通受容体との会合によって調節されるだけでなく、また、αＶβ３インテグリン（Ｂ．ＺｈｅｎｇおよびＤ．Ｃｌｅｍｍｏｎｓ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、ＵＳＡ、９５：１１２１７〜２２（１９９８）；Ｌ．ＭａｉｌｅおよびＤ．Ｃｌｅｍｍｏｎｓ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７７：８９５５〜６０（２００２））、インテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ（Ｌ．Ｍａｉｌｅら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７７：１８００〜５（２００２）））、およびＳＨ２（ｓｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ２）ドメインを含有するタンパク質チロシンホスファターゼ基質１（ＳＨＰＳ−１）（ＭａｉｌｅおよびＣｌｅｍｍｏｎｓ、前出）などの、他の膜貫通タンパク質によっても調節されることを示す証拠が増加しつつある。
【００９２】
ＳＨＰＳ−１は、ｖ−ＳＲＣで形質転換された線維芽細胞（Ｔ．Ｎｏｇｕｃｈｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７１：２７６５２〜８（１９９６））およびインスリンにより刺激されたチャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｙ．Ｆｕｊｉｏｋａら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１６：６８８７〜９９（１９９６））内のＳＨＰ−２に結合するチロシンリン酸化タンパク質として同定された。ＳＨＰＳ−１の細胞質領域は、２つの免疫受容体チロシンベースの阻害性モチーフ（Ａ．Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖら、Ｎａｔｕｒｅ、３８６：１８１〜６（１９９７））であって、マイトジェンによる多様な刺激（例えば、Ｍ．Ｓｔｏｆｅｇａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７３：７１１２〜７（１９９８）を参照されたい）およびインテグリンが介在する細胞の付着（例えば、Ｔ．Ｔａｋａｄａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７３：９２３４〜４２（１９９８）を参照されたい）に応答してリン酸化する阻害性モチーフを含有する。このリン酸化は、ＳＨ２（ｓｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ２）ドメインチロシンホスファターゼ（ＳＨＰ−２）を動員および活性化するための結合部位を発生させ、これにより、ＳＨＰＳ−１が脱リン酸化する。
【００９３】
安定的に付着した平滑筋細胞（ＳＭＣ）において、ＳＨＰ−２は、細胞膜に近接する部位に局在化しており、ＩＧＦ−１により刺激されたＳＨＰＳ−１のリン酸化の後、そこからＳＨＰＳ−１へと移動する（Ｌ．ＭａｉｌｅおよびＤ．Ｃｌｅｍｍｏｎｓ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７７：８９５５〜６０（２００２））。このＳＨＰ−２の動員の後、ＳＨＰＳ−１の脱リン酸化とＳＨＰ−２のＩＧＦ−１Ｒへの移動とが生じ、ＳＨＰ−２は、その後、そこでこの基質を脱リン酸化させる。ＩＧＦ−１Ｒの脱リン酸化の調節におけるＳＨＰＳ−１のリン酸化の重要性は、ＳＨＰＳ−１の切断形態であって、ＳＨＰ−２への結合部位を欠失させた切断形態を発現させる細胞において裏付けられている。これらの細胞では、ＳＨＰ−２の、ＳＨＰＳ−１およびＩＧＦ−１Ｒのいずれへの移動も遮断され、いずれの分子のリン酸化も維持されることが明らかである。
【００９４】
ＩＡＰはまず、αＶβ３と会合するその能力（Ｅ．Ｂｒｏｗｎら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１１１：２７８５〜９４（１９９０））、およびインテグリンの、そのリガンドに対するアフィニティーを増大させるその能力（Ｅ．Ｂｒｏｗｎら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１１１：２７８５〜９４（１９９０））により同定された。ＩＡＰは、Ｎ末端（細胞外）のＩｇ可変型ドメインに続く、疎水性の５回膜貫通螺旋および細胞質テールからなる（Ｃ．Ｒｏｓａｌｅｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４９：２７５９〜６４（１９９２）；Ｄ．Ｃｏｏｐｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、ＵＳＡ、９２：３９７８〜８２（１９９５））。
【００９５】
ＩＡＰは、ＳＨＰＳ−１に結合することが示されている（Ｐ．Ｊｉａｎｇら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７４：５５９〜６２（１９９９）；Ｐ．Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８８：２０５１〜４（２０００）；Ｍ．Ｓｅｉｆｆｅｒｔら、Ｂｌｏｏｄ、９４：３６３３〜４３（１９９９）；Ｅ．Ｖｅｒｎｏｎ−Ｗｉｌｓｏｎら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、３０：２１３０〜２１３７（２０００）；Ｈ．Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６８：３２１３〜２０（２００２）；Ｉ．Ｂａｂｉｃら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６４：３６５２〜８（２０００））。ＩＡＰのアミノ末端のＩｇドメインとＳＨＰＳ−１の細胞外Ｉｇ可変ドメインは、それらの物理的相互作用に十分である。ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合が、成長因子により刺激されたＳＨＰＳ−１のリン酸化とＳＨＰ−２の動員に対して及ぼす影響については、報告されていない。これらの研究の目的は、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１との会合が、ＩＧＦ−１により刺激されたＳＨＰＳ−１のリン酸化、および後続のＳＨＰ−２の動員に対して及ぼす影響を決定し、これが、ＩＧＦ−１Ｒ依存性のＳＭＣ作用をどのように変化させるのかを研究することであった。
【００９６】
＜実験手順＞
ヒトＩＧＦ−１は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手し、ポリ二フッ化ビニル膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ（商標））は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。オートラジオグラフィー用フィルムは、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）から入手した。ウシ胎仔血清、ダルベッコ改変培地、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）から購入した。ＩＧＦ−１Ｒβ鎖抗体およびホスホチロシンモノクローナル抗体（ＰＹ９９）は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。ＳＨＰ−２ポリクローナル抗体およびＳＨＰＳ−１ポリクローナル抗体は、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ、ＵＳＡ）から購入した。ＩＡＰに対するモノクローナル抗体であるＢ６Ｈ１２は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入したＢ細胞ハイブリッドから精製し、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。ｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）の二重リン酸化（活性）形態に対する抗体およびｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰＫ全タンパク質に対する抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｅｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。全ての他の試薬は、別段に言明しない限り、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。
【００９７】
ブタ大動脈ＳＭＣ（ｐＳＭＣ）は、既に記載される（Ａ．Ｇｏｃｋｅｒｍａｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３６：４１６８〜７３（１９９５））通りに単離し、１０ｃｍの組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）内に、グルコース（４．５グラム／リットル）、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）（ＤＭＥＭ−Ｈ）、および１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ改変培地中で維持した。継代５〜１６の間の細胞を用いた。
【００９８】
＜発現ベクターの作製＞
Ｃ末端のＦＬＡＧエピトープを伴う全長ブタＩＡＰ（ＩＡＰｆｌ）。全長ブタＩＡＰは、ＲＴ−ＰＣＲにより、既に記載される通りに（Ａ．Ｇｏｃｋｅｒｍａｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３６：４１６８〜７３（１９９５））単離されたｐＳＭＣから誘導されたｃＤＮＡライブラリーからクローニングした。５’側プライマー配列である５’ＡＴＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＴＧＧＴＣ（配列番号１）は、ブタ配列のヌクレオチド１２１〜１３９に対応した。３’側プライマー配列は、ＦＬＡＧ配列（下線を付した）および停止コドンをコードする塩基を付加したヌクレオチド１００５〜１０３０と相補的であった。配列は、
５’ＴＣＡＴＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＧＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＣＴ３’（配列番号２）
であった。
【００９９】
配列決定の後、ｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ  Ｖ５  ｈｉｓ  ３．１ベクター（インビトロｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）へとクローニングした。
【０１００】
残基１３５において細胞外ドメインが切断されており、Ｃ末端ＦＬＡＧエピトープを含有するＩＡＰ（ＩＡＰｃｙｔｏ）。ＩＡＰｆｌのｃＤＮＡ配列を含有するｐｃＤＮＡ  Ｖ５  ｈｉｓ  ３．１ベクターを直鎖化し、塩基５２７〜５５６（５’ＴＣＴＣＣＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＴＧＴＴＡＴＴ３’）（配列番号３）をコードする５’側オリゴヌクレオチド、およびＩＡＰｆｌを作製するのに用いた同じ３’側オリゴヌクレオチドによるＰＣＲを用いて、ＩＡＰの突然変異体形態を作製した。ＰＣＲ産物を、ｐｃＤＮＡ  Ｖ５  ｈｉｓ  ３．１へとクローニングした。
【０１０１】
システイン３３および２６１がセリン残基で置換されており、Ｃ末端ＦＬＡＧエピトープを含有する（ＩＡＰｃ−ｓ）。ＩＡＰｆｌのｃＤＮＡを、ｐＲｃＲＳＶ発現ベクターにサブクローニングし、これを、一本鎖突然変異誘発を実施して、２カ所の置換を組み込むための鋳型として用いた。ｐＲｃＲＳＶベクターは、ネオマイシン誘導体（Ｇ４１８）耐性遺伝子およびｃＤＮＡの直鎖状一本鎖の突然変異誘発を可能とするバクテリオファージ複製起点（Ｆ１）遺伝子を含有する。塩基の置換をコードする２つのオリゴヌクレオチドを用いた。２つのオリゴヌクレオチドは、セリンをコードする塩基置換（下線を付した）を除き、ヌクレオチド２０４〜２２５と相補的なＣ３３Ｓ：５’ＧＴＡＡＣＡＧＴＴＧＴＡＴＴＧＧＡＡＡＣＧＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡ３’（配列番号４）、およびセリン残基をコードする塩基置換（下線を付した）を除き、ヌクレオチド８８８〜９１８と相補的なＣ２６１Ｓ：５’ＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＧＴＡＧＡＣＴＣＴＧＡＧＡＣＧＣＡＧ３’（配列番号５）であった。
【０１０２】
配列決定の後、ＤＮＡ構築物を、ｐＭＥＰ４発現ベクター（インビトロｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）へとサブクローニングした。
【０１０３】
ｐＳＭＣのトランスフェクション。７０％の集密度まで成長させた細胞を、既に記載されている（２４）３つのＩＡＰ  ｃＤＮＡ構築物のうちの１つでトランスフェクトした。既に記載される通りに（Ｙ．Ｉｍａｉら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１００、２５９６〜６０５（１９９７））、ハイグロマイシン耐性ｐＳＭＣを、１５％のＦＢＳおよび１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含有するＤＭＥＭ−Ｈ中で選択および維持した。全細胞溶解物を調製し、本明細書で記載される通り、免疫ブロット法を介して、ＦＬＡＧタンパク質の発現を視覚化することにより、タンパク質の発現レベルを評価した。トランスフェクトされたｐＳＭＣであって、独立に実施された２回のトランスフェクションから得られたｐＳＭＣを、後続の実験において用いたところ、得られた結果は、２つの細胞群間で符合した。
【０１０４】
細胞の溶解。細胞を、１０ｃｍのディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ；型番：３００３）内に５×１０５個の密度で播種し、次いで、９０％の集密度（約５×１０６個の細胞）まで成長させた。細胞を、０．５％のウシ血清アルブミン（ＳＦＭ）を伴う無血清培地中で一晩にわたりインキュベートし、次いで、必要である場合は、抗ＩＡＰモノクローナル抗体（Ｂ６Ｈ１２）または非関与の対照モノクローナル抗体（４μｇ／ｍｌ）で２時間にわたり前処理し、次いで、１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１または１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦで、適切な長さの時間にわたり処理してから、氷冷溶解緩衝液：５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ４０、０．２５％のデオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭのＥＧＴＡに加えた、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌのペプスタチンＡ、１μｇ／ｍｌのロイペプチン、１μｇ／ｍｌのアプロチニン中で溶解させた。溶解物は、１４，０００×ｇで１０分間にわたる遠心分離により清澄化させた。
【０１０５】
免疫沈降。細胞溶解物は、適切な抗体（１：５００の希釈率を用いるＩＧＦ−１Ｒ、ＳＨＰＳ−１、またはＢ６Ｈ１２）と共に、４℃で一晩にわたりインキュベートした。次いで、プロテインＡセファロースを添加し、４℃でさらに２時間にわたりインキュベートすることにより、免疫複合体を沈降させた。次いで、試料を、１４，０００×ｇで１０分間にわたり遠心分離し、ペレットを溶解緩衝液で４回にわたり洗浄した。ペレットを４５μｌの還元性または非還元性のレムリ緩衝液中に再懸濁させ、５分間にわたり煮沸し、タンパク質を、８％のゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して分離した。
【０１０６】
ｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰキナーゼ活性化の評価。ｐＳＭＣＳを、６ウェルプレート内の０．５％のＦＢＳを伴うＤＭＥＭ−Ｈ中の細胞１×１０６個／ウェルで播種し、３７℃で４８時間にわたりインキュベートした。次いで、プレートをすすぎ、新鮮な０．５％のＦＢＳを伴うＤＭＥＭ−Ｈ中でさらに２時間にわたりインキュベートした。次いで、細胞を、４μｇ／ｍｌのＢ６Ｈ１２または非関与の対照モノクローナル抗体を伴うかまたは伴わずに、ＳＦＭ中で２時間にわたりインキュベートしてから、ＩＧＦ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）へと２０分間にわたり曝露した。次いで、細胞を、２００μｌのレムリ緩衝液で溶解させ、次いで、４０μｌの細胞溶解物中のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％のゲル）で分離した。ｐ４２／４４  ＭＡＰＫの活性化は、本明細書で記載される二重リン酸化（トレオニン２０２およびチロシン２０４）タンパク質（１：１０００の希釈率とする）に特異的な抗体で免疫ブロットすることにより決定した。タンパク質レベルの差についての対照としては、各試料に由来する等容量の細胞溶解物を、さらなる８％のゲルへと投入した。分離および移動の後、ポリクローナルｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰＫ抗体（１：１０００の希釈率とする）を用いて、全ｐ４２／ｐ４４タンパク質レベルを決定した。
【０１０７】
ウェスタン免疫ブロット法。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、タンパク質を、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜へと移動した。膜を、０．１％のＴｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）を伴うトリス緩衝生理食塩液中に１％のＢＳＡ中、室温で２時間にわたりブロッキングし、次いで、６つの一次抗体（ＩＧＦ−１Ｒ、ＳＨＰ−２、ＳＨＰＳ−１、ＰＹ９９、Ｂ６Ｈ１２、またはＦＬＡＧ、１：５００の希釈率）のうちの１つと共に、４℃で一晩にわたりインキュベートし、ＴＢＳＴ中で３回にわたり洗浄した。ペルオキシダーゼで標識された二次抗体の結合は、製造元（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ、ＵＳＡ）の指示書に従い、化学発光の増強を用いて視覚化し、免疫複合体は、オートラジオグラフィー用フィルムへと曝露することにより、またはＧｅｎｅＧｎｏｍｅ  ＣＣＤ造影システム（Ｓｙｎｇｅｎｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ  Ｌｔｄ）を用いて検出した。
【０１０８】
得られた化学発光画像は、ＤｕｏＳｃａｎ  Ｔ１２００（ＡＧＦＡ  Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて走査し、走査される画像のバンド強度は、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ、ｖｅｒｓｉｏｎ  １．６１を用いて解析した。スチューデントのｔ検定を用いて、処置間の差を比較した。示される結果は、少なくとも３回の個別の実験を表す。
【０１０９】
細胞損傷遊走アッセイ。細胞を６ウェルプレートに播種し、培地を１回交換して、７日間にわたりコンフルエント状態まで成長させた。損傷は、既に記載される通りに（Ｊ．Ｊｏｎｅｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、ＵＳＡ、９３：２４８２〜７（１９９６））施した。略述すると、カミソリの刃を用いて、細胞領域をスクレイピングしたところ、剥離領域および鋭く目視可能な損傷線が残された。損傷エッジに沿った６つの１ｍｍの領域を選択し、各処置について記録した。次いで、損傷した細胞単層を、１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１またはＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を伴うかまたは伴わずに、ＳＦＭ（０．２％のＦＢＳを加えた）と共にインキュベートした。次いで、細胞を、固定および染色し（Ｄｉｆｆ  Ｑｕｉｃｋ、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）、損傷領域へと遊走した細胞の数をカウントした。損傷のエッジにおいて既に選択された１ｍｍの領域のうちの少なくとも５つずつが、各データ点についてカウントされた。
【０１１０】
細胞増殖の評価。細胞を、２４ウェルプレート上、２％のＦＢＳを伴うＤＭＥＭ−Ｈ中に５０００個／ｃｍ２で播種し、２４時間にわたり付着および展開させてから、培地を、０．２％のヒト血小板希少血漿を加えたＤＭＥＭ−Ｈへと交換した。さらに２４時間のインキュベーション後、細胞を、Ｂ６Ｈ１２または非関与の対照モノクローナル抗体（４μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、２時間にわたりプレインキュベートしてから、ＩＧＦ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した。各処置は、３連で設定した。次いで、細胞を、４８時間にわたりインキュベートし、各ウェル内の最終細胞数を決定した。スチューデントのｔ検定を用いて、処置間の差を比較した。示される結果は、３回の個別の実験に由来する平均（±ＳＥＭ）を表す。
【０１１１】
＜結果＞
ＩＡＰは、その細胞外ドメインを介して、安定的に付着したｐＳＭＣ内のＳＨＰＳ−１と会合する。図１Ａは、安定的に付着した休眠ＳＭＣでは、免疫沈降のために抗ＩＡＰ抗体および抗ＳＨＰＳ−１抗体の両方を用いる共免疫沈降実験により決定される、ＩＡＰとＳＨＰＳ−１との検出可能な会合がなされることを示す。
【０１１２】
ＩＧＦ−１Ｒによるシグナル伝達における、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１との会合の役割を探索するために、ＩＡＰとＳＨＰＳ−１との会合を破壊する２つの実験モデルを開発した。第１の手法は、抗ＩＡＰモノクローナル抗体であるＢ６Ｈ１２を用いて、２つのタンパク質の結合に干渉する手法であった。図１Ｂは、休眠ｐＳＭＣの、抗ＩＡＰモノクローナル抗体（Ｂ６Ｈ１２）とのインキュベーション後において、ＩＡＰとＳＨＰＳ−１との相互作用が低減されること（７５±７．５％の低減（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；ｎ＝３））を示す。非関与の対照モノクローナル抗体とのプレインキュベーションは、２つのタンパク質間の会合に対して影響を及ぼさない。
【０１１３】
ＩＡＰとＳＨＰＳ−１との結合は、とりわけ、ＩＡＰの細胞外ドメイン内のシステイン３３と、推定膜貫通ドメイン内のシステイン２６１とのインタクトのジスルフィド結合を必要とする（Ｒ．Ｒｅｂｒｅｓら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７６：７６７２〜８０（２００１））。この結合を突然変異誘発により破壊すれば、ＩＡＰのαＶβ３との相互作用は保存されるが、ＳＨＰＳ−１への結合は消失する。ＩＡＰとＳＨＰＳ−１との会合を破壊することが予測されるＩＡＰの２つの突然変異体形態を作製して発現させた。図１Ｃ（上パネル）は、後続の実験で用いられたＩＡＰの３つの形態の発現レベルを示す。これら３つの形態は、ａ）ＦＬＡＧでタグづけされ、完全な細胞外ドメインをアミノ酸残基１３５で欠失させたＩＡＰの突然変異体形態（ＩＡＰｃｙｔｏ）、ｂ）ＦＬＡＧでタグづけされ、２つのシステイン残基３３および２６１がセリンで置換されたＩＡＰの突然変異体形態（ＩＡＰｃ−ｓ）、およびｃ）ＦＬＡＧでタグづけされた全長ＩＡＰ（ＩＡＰｆｌ）を包含した。
【０１１４】
図１Ｃ（下パネル）に示される代表的な実験は、ＩＡＰの細胞外ドメインを破壊すると、ＳＨＰＳ−１と会合するその能力が変化することを示す。ＩＡＰｃｙｔｏが発現する結果として、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１との会合は、ＩＡＰｆｌを発現させる細胞における会合と比較して８８±６．４％（平均±ＳＥＭ；ｎ＝３）低減される。ＩＡＰの細胞外ドメインの切断はまた、そのαＶβ３との会合も破壊するので、ＳＨＰＳ−１／ＩＡＰ間相互作用を、ＩＡＰｃ−ｓ突然変異を発現させる細胞において解析した。ＩＡＰｃ−ｓを発現させる細胞では、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１との会合が、ＩＡＰｆｌを発現させる細胞と比較して、８１±４．５％（平均±ＳＥＭ；ｎ＝３）低減される。対照の免疫ブロットは、同様レベルのＳＨＰＳ−１が免疫沈降することを示す。
【０１１５】
ＩＡＰ−ＳＨＰＳ−１間の会合を遮断すると、ＩＧＦ−１により刺激されたＳＨＰＳ−１のリン酸化およびＳＨＰ−２の動員が阻害される。ＩＡＰとＳＨＰＳ−１との物理的会合が失われることの機能的帰結を決定するために、研究を実行して、抗ＩＡＰモノクローナル抗体であるＢ６Ｈ１２により前処理された野生型細胞における、ＩＧＦ−１に応答したＳＨＰＳ−１のリン酸化を検討した。代表的な実験を、図２Ａに示すが、対照における、ＩＧＦ−１に応答したＳＨＰＳ−１のリン酸化が、４．１±０．９（平均±ＳＥＭ；ｎ＝３）倍となるのとは対照的に、Ｂ６Ｈ１２で前処理された細胞は、ＩＧＦ−１により刺激されたＳＨＰＳ−１のリン酸化の増大の著しい減少（０．９３±０．１２（平均±ＳＥＭ；ｎ＝３ｐ＜０．０５）を示すことが見られうる。非関与の対照モノクローナル抗体と共にプレインキュベートされた細胞では、ＩＧＦ−１により刺激されたＳＨＰＳ−１のリン酸化が、対照細胞と著しくは異ならなかった。これもまた図２Ａにおいて見られうる通り、Ｂ６Ｈ１２の存在下におけるこのＳＨＰＳ−１のリン酸化の低減は、ＩＧＦ−１により刺激されたＳＨＰ−２のＳＨＰＳ−１への動員の著しい減少（Ｂ６Ｈ１２の存在下におけるＳＨＰ−２の会合の、対照細胞における１４±１．５倍の増大と比較した、１．８±１．１倍の増大（平均±ＳＥＭ；ｎ＝３；ｐ＜０．０５））と関連する。ここでもまた、非関与の対照モノクローナル抗体と共にプレインキュベートされた細胞では、ＩＧＦ−１により刺激されたＳＨＰ−２のＳＨＰＳ−１への動員に対する著しい影響は認められなかった。
【０１１６】
ＩＧＦ−１により刺激されたＳＨＰＳ−１のリン酸化およびＳＨＰ−２の動員にはＩＡＰの細胞外ドメインが必要である。ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合を遮断すると、ＩＧＦ−１により刺激されたＳＨＰＳ−１のリン酸化が阻害されることを示唆した前出の観察を確認するために、ＩＡＰの突然変異体形態を発現させる細胞における、ＳＨＰＳ−１のリン酸化を刺激するＩＧＦ−１の能力を、野生型ＩＡＰを発現させる細胞と比較した。代表的な実験からの結果を、図２Ｂに示すと、ＩＡＰｆｌを発現させる細胞における、ＩＧＦ−１に応答したＳＨＰＳ−１のリン酸化の増大が３．６±０．８（平均±ＳＥＭ；ｎ＝３）であるのとは対照的に、ＩＡＰｃｙｔｏ突然変異体またはＩＡＰｃ−ｓ突然変異体を発現させる細胞においては、ＩＧＦ−１に応答したＳＨＰＳ−１の著しいリン酸化の増大を検出できないことが見られうる。
【０１１７】
ＩＡＰの突然変異体形態を発現させる細胞において観察されるＳＨＰＳ−１のリン酸化の欠如が、ＩＧＦ−１に応答したＳＨＰ−２のＳＨＰＳ−１への動員の阻害と関連することは、Ｂ６Ｈ１２を用いて得られた結果と符合する（図２Ｂ）。
【０１１８】
ＳＨＰＳ−１は、複数の成長因子に応答してリン酸化することが示されているので、研究を行って、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合の要請の特異性を探索した。図２Ｃは、ＰＤＧＦが、ＩＡＰｆｌを発現させる細胞における曝露の５分後に、顕著なＳＨＰＳ−１のリン酸化の増大を誘導することを示す。しかし、ＩＧＦ−１とは対照的に、ＰＤＧＦはまた、ＩＡＰｃ−ｓ細胞におけるＳＨＰＳ−１のリン酸化も刺激した。
【０１１９】
ＩＡＰの細胞外ドメインとＳＨＰＳ−１とが会合すると、そのＳＨＰ−２の動員の調節を介して、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化の持続時間が調節される。ＳＨＰ−２がＩＧＦ−１Ｒへと移動し、これにより、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化の持続時間が調節されるには、ＳＨＰＳ−１のリン酸化が要請され（Ｔ．Ｎｏｇｕｃｈｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７１：２７６５２〜８（１９９６））、したがって、研究を実行して、Ｂ６Ｈ１２で前処理された細胞およびＩＡＰの突然変異体形態を発現させる細胞における、ＩＧＦ−１ＲによるＳＨＰ−２の動員およびＩＧＦ−１Ｒのリン酸化の持続時間を検討した。対照細胞では、ＩＧＦ−１による処理の１０分後において、ＩＧＦ−１により、ＳＨＰ−２のＩＧＦ−１受容体への動員の、３．３±０．４（平均±ＳＥＭ；ｎ＝３）倍の増大が刺激される。しかし、Ｂ６Ｈ１２で前処理された細胞では、ＳＨＰ−２のＩＧＦ−１Ｒへの動員に著しい増大が見られない（図３Ａ）。ＳＨＰ−２のＩＧＦ−１Ｒへの動員が、ＩＧＦ−１による刺激の２０分後に観察される受容体のリン酸化の低減に先行することは、前出の結果（Ｌ．ＭａｉｌｅおよびＤ．Ｃｌｅｍｍｏｎｓ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７７：８９５５〜６０（２００２））と符合する。しかし、Ｂ６Ｈ１２と共にプレインキュベートされた細胞では、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化の低減が２０分後の時点において検出可能でないことは、ＳＨＰ−２の動員の欠如と符合する。Ｂ６Ｈ１２で前処理された細胞における、ＳＨＰ−２のＩＧＦ−１Ｒへの動員の欠如が、ＩＡＰ／ＳＨＰＳ−１間相互作用の特異的破壊に起因したことを確認するため、ＩＡＰｃ−ｓを発現させる細胞における、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を検討した。図３Ｂは、これらの細胞では、ＩＧＦ−１に応答したＳＨＰ−２のＩＧＦ−１Ｒへの動員の増大が認められず、これもまた、全長ＩＡＰを発現させる細胞においてＩＧＦ−１による刺激の２０分後に観察されるＩＧＦ−１Ｒの脱リン酸化の量の減少と関連することを示す。
【０１２０】
ＩＧＦ−１により刺激されたＭＡＰＫ活性は、ＳＨＰ−２の移動が破壊された後に阻害される。前出の研究は、ＳＨＰ−２の不活性形態が発現する結果として、ＩＧＦ−１により刺激されたＭＡＰＫの阻害がもたらされることを示している（Ｓ．Ｍａｎｅｓら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、４：３１２５〜３５（１９９９））。ＩＡＰ−ＳＨＰＳ−１間の結合が破壊された後に、ＳＨＰ−２の移動が失われることの帰結を検討するため、Ｂ６Ｈ１２の存在下におけるＩＧＦ−１に応答したＭＡＰＫの活性化について解析した。
【０１２１】
図４Ａは、１０分間にわたりＩＧＦ−１で処理することにより、ｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰＫの二重リン酸化の評価により決定されるＭＡＰＫの活性化の顕著な増大（７０±５％のＳ．Ｅ．Ｍ．；ｎ＝４）が刺激されることを示す。しかし、細胞を、Ｂ６Ｈ１２と共にプレインキュベートしたところ、ＩＧＦ−１は、ｐ４２／ｐ４４  ＭＡＰＫのリン酸化の増大の維持を刺激することが不可能であった。ＭＡＰＫは、ＩＧＦ−１が細胞の増殖を刺激するのに必要である。
【０１２２】
ＩＡＰ−ＳＨＰＳ−１間の会合の破壊が、ＳＭＣにおけるＩＧＦ−１作用に対して及ぼす帰結を検討するため、Ｂ６Ｈ１２が、ＩＧＦ−１により刺激された細胞の増殖に対して及ぼす影響を決定した。図４Ｂは、ＩＧＦ−１により、細胞の増殖の、２．２±０．２（平均±ＳＥＭ；ｎ＝３）倍の増大が刺激されることを示す。しかし、細胞をＢ６Ｈ１２と共にインキュベートすると、ＩＧＦ−１により刺激された細胞の増殖が、Ｂ６Ｈ１２の非存在下においてインキュベートされた細胞と比較して、著しく低減される（１．０３±０．０１（平均±ＳＥＭ；ｎ＝３；ｐ＜０．０５））。細胞の増殖の阻害は、ＩＧＦ−１により刺激されたＭＡＰＫ活性化の阻害と符合する。
【０１２３】
ＩＡＰのＳＨＰＳ−１との相互作用を破壊すると、ＩＧＦ−１により刺激された細胞の遊走が阻害される。ｐＳＭＣのＢ６Ｈ１２とのプレインキュベーションは、ＩＡＰとαＶβ３との相互作用を変化させることにより、ＩＧＦ−１により刺激された遊走を部分的に阻害する（Ｌ．Ｍａｉｌｅら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７７：１８００〜５（２００２））。Ｂ６Ｈ１２の影響の少なくとも一部がまた、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合の阻害にも起因するのかどうかを決定するために、ＩＧＦ−１に応答した細胞の遊走を、ＩＡＰｆｌを発現させる細胞とＩＡＰｃ−ｓ突然変異体とにおいて比較した。図５では、ＩＧＦ−１により、ＩＡＰｆｌを発現させる細胞におけるｐＳＭＣの遊走の著しい増大が刺激されたことを見ることができる。しかし、ＩＡＰｃ−ｓ突然変異体を発現させる細胞では、ＩＧＦ−１により刺激された遊走が著しく低減される。これに対し、ＩＡＰｃ−ｓ細胞のＰＤＧＦにより刺激された細胞遊走は、全長ＩＡＰを発現させる細胞と著しくは異ならない。
【０１２４】
＜考察＞
細胞内シグナル伝達におけるＳＨＰＳ−１の役割は、大部分がＳＨＰＳ−１の細胞質テールにおけるＩＴＩＭモチーフ内に含有されるリン酸化したチロシンへのＳＨＰ−２の動員、および後続のＳＨＰ−２ホスファターゼ活性の活性化に帰せられている（Ｌ．Ｍａｉｌｅら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７７：１８００〜５（２００２）；Ｔ．Ｔａｋａｄａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７３：９２３４〜４２（１９９８）；Ｊ．Ｔｉｍｍｓら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ、９：９２７〜３０（１９９９））。ＩＧＦ−１などの成長因子がそれらの生理学的作用を刺激するために、活性化したＳＨＰ−２の、下流のシグナル伝達分子への移動が必要であることは、ＳＨＰ−２のドミナントネガティブ形態を発現させる結果として、成長因子により刺激されるＭＡＰキナーゼ（Ｔ．Ｎｏｇｕｃｈｉら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１４：６６７４〜８２（１９９４）；Ｋ．ＭｉｌａｒｓｋｉおよびＡ．Ｓａｌｔｉｅｌ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２６９：２１２３９〜４３（１９９４）；Ｓ．Ｘｉａｏら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２６９：２１２４４〜８（１９９４）；Ｋ．Ｙａｍａｕｃｈｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、９２：６６４〜８（１９９５）；Ｇ．Ｐｒｏｎｋら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１４：１５７５〜８１（１９９４）；Ｔ．Ｓａｓａｏｋａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２６９：１０７３４〜８（１９９４））およびＰＩ−３キナーゼ（Ｃ．Ｗｕら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２０：６０１８〜２５（２００１）；Ｓ．Ｕｇｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７１：１２５９５〜６０２（１９９６）；Ｓ．Ｚｈａｎｇら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２２：４０６２〜７２（２００２））の増大が適正に活性化されなくなるほか、ＳＨＰ−２が下流のシグナル伝達分子へと動員されなくなることを示す研究により強く示唆されている。ＩＧＦ−１については、とりわけ、ＳＨＰ−２のドミナントネガティブの突然変異体を発現させる結果として、ＩＧＦ−１に応答したＭＡＰキナーゼまたは細胞の遊走が活性化されなくなることが示された（Ｓ．Ｍａｎｅｓら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、４：３１２５〜３５（１９９９））。これらのデータは、ＩＡＰとＳＨＰＳ−１との相互作用が、ＳＨＰ−２の動員および移動に必要であることを示しているので、本研究からの結果は、この相互作用が、ＩＧＦ−１によるシグナル伝達の鍵となる調節因子であることを裏付けている。２つの独立の手法を用いて２つのタンパク質の間の相互作用を破壊した結果、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化の延長に反映される、ＳＨＰ−２のＳＨＰＳ−１への動員および後続のＩＧＦ−１Ｒへの移動が失われた。ＳＨＰ−２の動員および移動の欠如の帰結は、ＩＧＦ−１がＭＡＰＫの活性化を刺激できず、その後、細胞の増殖または細胞の遊走を刺激できないことにより明らかであった。
【０１２５】
ＳＨＰＳ−１とＩＡＰとの相互作用は、抗ＩＡＰモノクローナル抗体により、小脳ニューロン、赤血球、および胸腺細胞の、Ｐ８４を含有する基質への付着が遮断されることを裏付ける実験によりまず示唆された（脳におけるＳＨＰＳ−１の相同体）（Ｐ．Ｊｉａｎｇら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７４：５５９〜６２（１９９９）；Ｍ．Ｓｅｉｆｆｅｒｔら、Ｂｌｏｏｄ、９４：３６３３〜４３（１９９９））。この相互作用が、細胞間付着において役割を果たしうることは、ＳＩＲＰ陰性細胞内のＳＩＲＰαの細胞外ドメインの発現により初代造血幹細胞の接着が支援され、抗ＩＡＰモノクローナル抗体によりこの相互作用が再度阻害されることを裏付ける実験において実証された（Ｅ．Ｖｅｒｎｏｎ−Ｗｉｌｓｏｎら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、３０：２１３０〜２１３７（２０００））。
【０１２６】
細胞の細胞外マトリックスへの付着を媒介する細胞接着分子、例えば、インテグリン、および細胞間接着分子、例えば、カドヘリンは、細胞の付着に重要なだけでなく、また、細胞の増殖、生存、および分化の調節にも重要である。成長因子によるシグナル伝達のインテグリン受容体による調節については、十分に立証されている。既に、リガンドによるαＶβ３の占有が、ＩＧＦ−１により刺激された受容体によるシグナル伝達に必要であることが報告されており、また、αＶβ３とＰＤＧＦ受容体との間の類似の協同的関係も記載されている（Ｓ．Ｍｉｙａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１３５：１６６３３〜１６４２（１９９６））。ＩＧＦ−１は、細胞接着分子に対して同種親和性である多様な細胞の調節因子であることが示されている。Ｇｕｖａｋｏｖａらは、ＩＧＦ−１Ｒが、Ｅ−カドヘリンと共局在化し、Ｅ−カドヘリンに結合して、その細胞骨格との相互作用を安定化させるＺＯ−１の発現を増大させることにより、ＭＣＦ−７細胞の細胞接着を増大させることについて報告した（Ｌ．Ｍａｕｒｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：３９８９２〜３９８９７）。逆にまた、ヒト結腸がん細胞では、ＩＧＦ−１が、Ｅ−カドヘリンのリン酸化を刺激するその能力を介して、膜におけるＥ−カドヘリンレベルの低減および関連する細胞接着の低減を結果としてもたらすことも示されている。ＩＧＦ−１は、これもまた細胞接着の減少と関連するＴ−カドヘリンの発現を下方調節することもまた報告されている。細胞機能の調節における、細胞間接着受容体の明らかな役割にも関わらず、成長因子の作用を調節するそれらの能力に関するデータはほとんど存在しない。既に、ニューロンの細胞接着分子が、線維芽細胞の成長因子受容体と相互作用すると、自己リン酸化を介して、受容体の活性化がもたらされることが示されている。ＶＥＧＦは、ＣＥＡＣＡＭの発現の増大を結果としてもたらし、ＶＥＧＦの影響の少なくとも一部は、ＣＥＡＣＡＭ−１を媒介することが示されている。これらの実験からの結果は、細胞間接着分子であるＩＡＰとＳＨＰＳ−１との相互作用が、細胞接着を仲介することに加えてまた、成長因子によるシグナル伝達の調節に関する重要な役割も果たすことを裏付けている。細胞機能の調節における、細胞間接着分子の重要性を踏まえると、成長因子によるシグナル伝達の、細胞間接着分子による調節は、成長因子の作用を調節するための一般的機構であると結論付けることが妥当である。ＰＤＧＦによるシグナル伝達は、ＩＡＰ−ＳＨＰＳ−１間相互作用の破壊により影響されなかった。
【０１２７】
ＰＤＧＦは、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合の非存在下においてもなお、ＳＨＰＳ−１のリン酸化を刺激しうるので、これは、ＰＤＧＦとＩＧＦ−１とが、２つの異なるキナーゼを介してＳＨＰＳ−１のリン酸化を刺激しうることを示唆する。ＳＨＰＳ−１は、インスリン受容体キナーゼにより直接的にリン酸化することが示されている（Ｙ．Ｆｕｊｉｏｋａら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１６、６８８７〜９９（１９９６））。インスリンにおけるチロシンキナーゼドメインとＩＧＦ−１Ｒとの相同性（例えば、８４％）を踏まえると、ＳＨＰＳ−１はまた、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼの直接的な基質である可能性もある。ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合が、ＳＨＰＳ−１を受容体キナーゼの近傍に局在化させることにより、この過程を調節する可能性もあろうし、代替的に、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合が、ＳＨＰＳ−１細胞質ドメインのコンフォメーションを変化させ、そのチロシンを、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼに接触可能とする可能性もあろう。
【０１２８】
ＳＭＣの遊走および増殖を刺激するその能力により、ＩＧＦ−１は、アテローム性動脈硬化の発症に対する重要な寄与物質である可能性が高い（Ｊ．Ｊｏｎｅｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、ＵＳＡ、９３：２４８２〜７（１９９６））；Ｍ．Ｋｈｏｒｓａｎｄｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９０：１９２６〜１９３１（１９９２）；Ｂ．Ｃｅｒｅｋら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、６６：１７５５〜１７６０（１９９０）；Ｐ．Ｈａｙｒｙら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、９：１３３６〜１３４４（１９９５））。ＳＭＣ内でＩＧＦ−１が過剰発現したマウスでは、ＳＭＣの増殖および遊走の増大から結果として生じたと考えられる頸動脈傷害の後、新内膜形成の速度が増大した。対照動物と比較して同等レベルの血清ＩＧＦ−１にも関わらず、影響は明らかであったことから、局所的に作製されるＩＧＦ−１の傍分泌効果が示唆される（Ｂ．Ｚｈｕら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４２：３５９８〜３６６６（２００１））。ＩＧＦ−１のアテローム性動脈硬化の発症における明らかな役割、およびこの相互作用のＩＧＦ−１によるシグナル伝達に対する影響を踏まえると、この系が、アテローム性動脈硬化の発症において役割を果たすことが可能であり、この相互作用の破壊が、とりわけ、ＩＧＦ−１の作用を阻害するための新規の治療戦略を表しうる可能性が高い。ＩＧＦ−１によるシグナル伝達を標的とするための最新の手法は、抗体またはペプチドを用いて、受容体自体の活性を遮断することに焦点を当てている。細胞間接着分子の相互作用の破壊であって、とりわけ、成長因子によるシグナル伝達を阻害する破壊は、新規の治療戦略をもたらす。
【実施例２】
【０１２９】
＜ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合を破壊するモノクローナル抗体（ＮＰＧ−１）による糖尿病性網膜症の処置＞
＜インビボにおける血管透過性の測定＞
ラットに、Ｎｅｍｂｕｔａｌ（８０ｍｇ／ｋｇ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ）を注射した。深い麻酔が達成されたら、温熱化したエバンスブルー（４５ｍｇ／ｋｇ）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）溶液を、尾静脈を介して注射した。２時間後、致死用量の麻酔剤（１００ｍｇ／ｋｇ）を投与した。胸腔を開き、注射針を左心室へと挿入した。右心房をクリッピングし、血液を１２，０００×ｇで５分間にわたり遠心分離した。ラットを、クエン酸中に１％のパラホルムアルデヒドで潅流し、次いで、眼を摘出し、ＰＢＳ中に入れた。網膜を摘出し、凍結乾燥させ、次いで、ホルムアミド中に再懸濁させ、７０℃でインキュベートした。１８時間後、網膜／ホルムアミドを１３，０００×ｇで１０分間にわたり遠心分離した。
【０１３０】
エバンスブルーの希釈系列を用いて検量線を作成した（３０ｍｇ／ｕｌ）。検量線の吸光度に加えて、各網膜を、それぞれ、６２０および７４０ｎｍの励起波長および発光波長を用いるＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。各網膜からのエバンスブルーの透過量は、この式：
【数１】
2014525940.tif 000006
を用いて計算した。
【０１３１】
＜糖尿病誘導プロトコール＞
対照（ＣＯＮ）ラットには、溶媒の注射を施した。ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）は、腹腔内注射（５０ｍｇ／ｋｇ；１００ｍｌ）により施した。６日後、血中グルコースが＞３５０ｍｇ／ｄｌであるラットを、糖尿病を有すると称した。ＳＴＺ処置群を２群に分けた。注射の２０日後、第１群には、対照であるマウスＩｇＧ（５．０ｍｇ／ｋｇ）の注射を、７２時間ごと、３０日間にわたり施した。第２群には、ラット抗ＩＡＰ抗体であるＮＰＧ−１（５．０ｍｇ／ｋｇ）の注射を、７２時間ごとに３０日間にわたり施した。ラットは、毎日体重を測り、体重の減少が明らかであれば、インスリン（４〜８単位／ｋｇ）を施した。
【０１３２】
＜細胞の溶解、免疫沈降、および免疫ブロット法＞
溶解物は、多様な処置へと曝露された内皮細胞の細胞単層から調製した。溶解物を免疫沈降させ、免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へと移動してから、免疫ブロット法を行い、タンパク質を視覚化した。免疫ブロット法に用いた抗体は、抗ホスホチロシン抗体（ＰＹ９９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗ＳＨＰＳ−１抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅｓ）、および抗オクルディン抗体（インビトロｇｅｎ）であった。
【０１３３】
＜インビトロにおける透過性アッセイ＞
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサート（２４ウェル）を、１０ｕｇ／ｃｍ２のコラーゲン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、２２℃で１時間にわたりコーティングした。ＨＵＶＥＣを、コーティングされたインサート上に、インサート１つ当たりの成長培地（１５ｍＭのグルコース）１ｍｌ中の細胞５×１０４個で播種した。２４時間後、５００μｌの成長培地を、下側チャンバー内に入れた。２４時間後、培地を、抗ＩＡＰ抗体であるＮＰＧ−１（１μｇ／ｍｌ）を加えたＩＧＦ−１（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有する、ＳＦＭ−１９９（１５ｍＭのグルコース）へと交換した。１４時間後、蛍光標識されたデキストランを添加した（Ｓｉｇｍａ）（０．５ｍｇ／ｍｌ）。１時間後、培地を下側チャンバーから除去し、蛍光検出用マイクロプレートリーダー（Ｆｌｕｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ５９５；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）（それぞれ、２９４および５２１ｎｍの励起波長および発光波長を用いる）により、ＦＩＴＣ−デキストランの量を測定した。
【０１３４】
＜インビトロにおける管形成アッセイ＞
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、コンフルエント状態まで成長させ、次いで、１４時間にわたり、ＩＧＦ−１（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＮＰＧ−１（１μｇ／ｍｌ）を含有するＳＦ  Ｍ−１９９へと交換した。ＨＵＶＥＣを、トリプシン処理し、ＳＦ  Ｍ−１９９（１５ｍＭのグルコース）中に再懸濁させ、次いで、５００μｌの成長因子低減マトリゲル（ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングされた２４ウェルプレート上に播種した（ウェル１つ当たり１ｍｌ当たりの細胞１．５×１０５個）。４時間後、プレートを１０倍で撮影し、各ウェルの６つのランダムの領域内の面積１ｃｍ２当たりの管の数を決定した。１本の管は、２つの分岐点の間の領域である（図７Ｃに画像上の２つの「×」印の間の領域として示される）。
【０１３５】
＜内皮細胞培養＞
初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）を、５ミリモル／ｌのグルコースを含有するＥＧＭ−２  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ補充物質（Ｌｏｎｚａ）を加えた、Ｍ−１９９（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）中で成長させた。ＨＵＶＥＣは、３日間にわたり、１５ミリモル／ｌのグルコースを含有する成長培地へと切り替えた。オスモル濃度の差についての対照として、マンニトール（１０ミリモル／ｌ）を、５ミリモル／ｌのグルコースを含有する培地へと添加した。培養物を５または１５ミリモル／ｌのグルコースを含有する無血清Ｍ−１９９中で、１４時間にわたり休眠させ、抗ＩＡＰ抗体、ＮＰＧ−１（１μｇ／ｍｌ）を伴うかまたは伴わずに、ＩＧＦ−１（５０ｎｇ／ｍｌ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）へと曝露した。ヒト細胞の使用は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。
【０１３６】
＜結果＞
２種類の内皮細胞（ラット内皮細胞およびヒト内皮細胞）を、インビトロアッセイに用いた。ヒトＩＡＰタンパク質のアミノ酸７１〜８０を指向するモノクローナル抗体ＮＰＧ−１（本明細書で提示される基準配列に従うアミノ酸の番号付け）は、ヒトＩＡＰに特異的に結合する。図６Ａは、対照とＮＰＧ−１との比較を示し、この抗体が、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合を破壊しうることの直接的な裏付けを提示する。細胞を、ＮＰＧ−１と共にプレインキュベートし、次いで、ＳＨＰＳ−１を免疫沈降させ、免疫沈降物をＩＡＰについて免疫ブロットした。破壊の結果、ＩＧＦ−１によるシグナル伝達の阻害がもたらされるため、ＩＧＦ−１に応答して活性化される最重要のシグナル伝達エレメントが阻害されることが予測されるであろう。図６Ｂは、細胞をＮＰＧ−１と共にプレインキュベートすると、内皮細胞内で活性化するにはＳＨＰＳ−１に結合しなければならないＳｈｃが正常に結合しないことを示す。ＩＡＰと反応する大半の抗体はまた、ＩＡＰのαｖβ３への結合も破壊する。図６Ｃは、ＮＰＧ−１が、ＩＡＰのβ３への結合を破壊することなく、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合を破壊する点で特異的であることを示す。これは、ＩＡＰのβ３への結合が破壊されると、血小板凝集の増大などの副作用がもたらされうるために重要である。これは、ＮＰＧ−１の重要で際立った特色である。図６Ｄに示される通り、ＳＨＰＳ−１のＩＡＰとの会合は、対照ラット（Ｃｏｎ）、糖尿病性ラット（Ｄ）、および抗ＩＡＰ抗体（Ｒ５６９）で処理した糖尿病性ラット（Ｄ＋ＡＢ）に由来する大動脈ホモジネートにおいて決定した。抗体はインビボにおいて完全に活性であり、ＩＡＰ／ＳＨＰＳ−１間の会合を阻害した。
【０１３７】
本研究との比較として述べると、ヒト内皮細胞の管形成能力を、インビボにおいて生じる毛細血管の形成についてのインビトロアッセイにおいて裏付ける実験が示される。内皮細胞における管形成を、図７Ｃに示す。図７Ａは、インビトロにおいて、デキストランブルーの透過に基づき測定される細胞透過性を示す。内皮細胞は、細胞単層においても、血管における場合と全く同様に成長し、この色素の細胞単層を透過する能力が測定される。図７Ａから見ることができる通り、ＩＧＦ−１により、透過が刺激されるが、これは、ＩＡＰ抗体の存在下で阻害される。図７Ｂは、内皮細胞が透過性に対する障壁を形成することを可能とする密着結合タンパク質オクルディンが、ＩＧＦ−１の存在下で破壊される、すなわち、オクルディンが、正常に形成された密着結合複合体から離脱し、細胞内に拡散することを示す。このために、免疫ブロットにおけるオクルディンバンドの強度が低下する。抗体ＮＰＧ−１の存在下では、このＩＧＦ−１の影響が完全に阻害される。図７Ｃでは、ＩＧＦ−１で処理された細胞において、毛細血管細胞が互いに毛細血管と合体している管形成を見ることができる。図７Ｃの下側の２つのパネルおよび１ｃｍ２当たりの管の数を示す棒グラフにおいて示される通り、抗体ＮＰＧ−１の存在下では、これが完全に破壊される。
【０１３８】
図８および図９において記載される研究を、ラットの内皮細胞において実行した。これは、ＩＡＰタンパク質のアミノ酸配列７１〜８０が、種間で保存されないためである。ラットＩＡＰ（ＮＫＮＳＴＴＲＥＱＮ、配列番号８）におけるアミノ酸７１〜８０は、ヒトＩＡＰ（ＡＬＮＫＳＴＶＰＴＤ、配列番号６）に照らして異なるため、このアミノ酸配列が、同じ機能的意義を有することを示すための研究を実行した。これが必要なのは、ＩＡＰに対するヒト抗体をインビボにおいてラットへと投与してそれが作用しないとしても、それは、このアミノ酸配列が、種間で保存されず、したがって、ヒト抗体が、ラットＩＡＰのラットのＳＨＰＳ−１への結合を破壊しないと予測されるためであった。したがって、モノクローナル抗体を調製するのに用いたヒトＩＡＰ配列と相同なラットＩＡＰに由来する１０アミノ酸の配列からなる免疫原でウサギを免疫化することにより、抗ラットＩＡＰ抗体を調製した。本明細書で言明した通り、このペプチドをＫＬＨへとコンジュゲートし、ウサギを免疫化した。次いで、タンパク質Ａセファロースを用いて、ＩｇＧをウサギ血清から精製した。これが、毛細血管の透過性を阻害するためにラットへと注射される精製ＩｇＧであった。このラット抗体を、ヒト抗体を検証するのと同じ形で検証して、ラット抗体が、ラットの内皮細胞におけるＩＡＰ／ＳＨＰＳ−１間の会合を阻害し、これが、ＩＧＦ−１によるシグナル伝達を阻害することを示した。図８Ａに示す通り、対照抗体（Ｃｏｎ）が、ＩＡＰ／ＳＨＰＳ−１間の相互作用に対して効果を及ぼさなかったのに対し、抗ラットＩＡＰ抗体（ＡＢ）は、それらの会合を完全に破壊した。図８Ｂは、ＩＧＦ−１による刺激の後、ＳＨＰＳ−１のチロシンがリン酸化され、ＡＫＴおよびＭＡＰＫの活性化が刺激され、これらが抗ラットＩＡＰ抗体の存在下で阻害されることを示す。
【０１３９】
図９は、インビトロのラットの内皮細胞においてＳＨＰＳ１／ＩＡＰ間の会合を破壊する同じ抗体を、インビボにおいてラットへと注射する、インビボ実験の結果を示す。この実験は、３週間にわたり実行した。ラットを、本明細書で記載される通りに糖尿病性とし、次いで、精製抗ラット抗体の注射を毎週２回ずつ施した。次いで、糖尿病性ラットの網膜の毛細血管から網膜へのエバンスブルー色素の透過を測定した。図９に示す通り、糖尿病性ラット（高血糖性ラット）では、毛細血管の透過性が大幅に増大するが、これは糖尿病性網膜症の特徴である。また、図９にも示す通り、抗ラットＩＡＰ抗体を注射することにより、この透過性の増大が阻害された。血管透過性は、ヒト糖尿病性網膜症で生じる最初の変化のうちの１つである。このラットのモデルは、血管透過性を測定するための標準的なアッセイである、エバンスブルーの漏出（Ｋｅｒｎ、「インビボ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ」Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ、２：１３７〜１５１（２００８）；ＢｈａｔｔおよびＡｄｄｅｐａｌｌｉ、「Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ  ｂｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＭＰ−２  ａｎｄ  ＭＭＰ−９  ｕｓｉｎｇ  ａｓｐｉｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ  ｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ−ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒａｔｓ」、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｒｅｓ、２（２）：１８１〜１８９（２０１０）を参照されたい）を示す。したがって、当技術分野では、これが、ヒト糖尿病性網膜症で生じるこれらの早期の変化についての代理動物モデルとして知られている。この血管漏出は、その結果として、黄斑近傍における眼液の蓄積をもたらし、黄斑損傷は、糖尿病性網膜症を伴う患者における重度の視力の減退の既知の原因であるので、視力の減退と直接的に関連している。さらに、この毛細血管の漏出を阻害する血管内皮成長因子阻害剤などの因子は、糖尿病性網膜症で生じる他の変化を阻害することが示されている。まとめると、ラットＩＡＰのアミノ酸７１〜８０（ヒトＩＡＰにおける同じ配列と相同な領域）を指向する抗体は、網膜の毛細血管の漏出を阻害するので、ヒトＩＡＰの対応する領域を指向する抗体は、ヒト糖尿病性網膜症に有効な処置となることが予測される。
【実施例３】
【０１４０】
根拠：また、ＩＡＰおよびＣＤ４７としても知られるインテグリン関連タンパク質は、細胞上の自己認識抗原として機能する膜貫通タンパク質である。これは、ＩＡＰがマクロファージの表面上に局在化するタンパク質（ＳＨＰＳ−１と称する）に結合すると、これらの細胞は細胞の死滅を活性化させるサイトカインを分泌せず、ＩＡＰを発現させる標的細胞は依然として生存可能であることを意味する。正常なアポトーシスを経る多くの細胞型は、ＩＡＰを発現させず、したがって、この死滅が効率的に生じることが可能となる。これに対し、いくつかのがん細胞型は、ＩＡＰの発現が異常であるか、またはＳＨＰＳ−１結合部位をＩＡＰからタンパク質分解により切断することがなく、したがって、活性化したマクロファージによる貪食に対して耐性である。ＩＡＰ／ＳＨＰＳ−１間の会合が破壊されると、腫瘍細胞の殺滅が増大することが仮定されている。しかし、異なる自己認識配列のうちの複数の種類をコードすることが可能な程度に十分な異質性を保有する、ＩＡＰ内のアミノ酸配列はまだ同定されていない。本発明の研究は、アミノ酸７１〜８０内の領域が、この自己認識情報を含有し、この領域が、ＩＡＰのＳＨＰＳ−１への結合に関与することを確立した。ＩＡＰ／ＳＨＰＳ−１間の会合を破壊するように開発された他の種類の抗体とは対照的に、本発明の抗体は、アミノ酸７１〜８０内のこの配列を標的とし、これにより、自己認識に直接的に干渉し、したがって、腫瘍細胞の貪食を結果としてもたらす。重要なことは、本発明の抗体がＩＡＰと、アルファＶベータ３インテグリンのベータ３サブユニットなどの他の細胞表面タンパク質との相互作用を妨げないことである。これらの他の相互作用により、正常細胞の生理学的機能を維持するのに必要な細胞過程が媒介されるために、これは重要である。
【０１４１】
本発明の抗体は、この特異的部位を指向するので、この部位の腫瘍細胞上のＳＨＰＳ−１への結合を破壊して、がん細胞の成長の阻害が結果としてもたらされることを確立するための実験が実施される。これらの実験は、２つの相で実施される。第１相では、本発明のモノクローナル抗体または対照のＩｇＧを、標準的な条件下にある培養物内で成長させたがん細胞（例えば、本明細書で記載される乳がん細胞、前立腺がん細胞、結腸がん細胞、膀胱がん細胞、卵巣がん細胞など）へと添加し、１０％のウシ胎仔血清により成長を刺激した。ＩＡＰ／ＳＨＰＳ−１間の会合は、ＩＧＦ−Ｉにより刺激される細胞の増殖に関与することが知られているので、さらなる培養物は、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）を含有してもよいだろう。濃度を０．０５〜５．０ｕｇ／ｍｌの間で増大させる抗体を、培養物へと添加し、４８時間後に、直接的な計数により細胞の増殖を測定する。対照培養物には、等濃度のＩｇＧを施す。ＩＧＦ−Ｉは、５０ｎｇ／ｍＬの濃度で用いられる。抗体が腫瘍細胞の増殖を阻害するのに成功すれば、インビボ実験を企図する。この実験では、例えば、１ｍｌ当たりの腫瘍細胞３００万個を免疫障害マウスに皮下注射する。例えば、１つの処置当たり１２匹ずつのマウスとする。１つの群には、インビトロ実験の結果から決定される濃度で活性抗体を施す。例えば、１００ｎｇ／ｍｌの抗体濃度により、細胞成長の完全な阻害が結果としてもたらされる場合、この血清濃度を達成するためには、４００μｇを各マウスへと腹腔内注射することになる。活性処置群における全てのマウスに、６週間〜８週間にわたり毎週投与される同じ濃度の抗体を施す。対照動物には、等濃度のマウスＩｇＧを施す。いずれの群内の動物も屠殺し、腫瘍の容量および重量を決定した。腫瘍の転移は、肺、肝臓、腎臓、および脳の組織学的切片を解析することにより決定する。腫瘍組織はまた、無傷ＩＡＰの存在についてもＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析し、ＩＡＰ／ＳＨＰＳ−１間の会合についてのＳＨＰＳ−１の免疫沈降に続き、ＩＡＰについても免疫ブロット法で解析する。また、既知の技法を用いてそれらの活性化形態を決定するための、ＡＫＴキナーゼおよびＭＡＰキナーゼなど、細胞の増殖に関与するキナーゼの活性化についてのさらなる解析も企図する。この実験の結果により、ＩＡＰにおけるこの特異的部位のＳＨＰＳ−１への結合を破壊する結果として、腫瘍細胞の増殖の阻害がもたらされることが確立されるであろう。
【０１４２】
前出は、本発明を例示するものであり、その限定としてみなされるものではないものとする。本発明は、以下の特許請求の範囲により規定されるが、これらの特許請求の範囲の同等物も、その中に包含されるものとする。
【図１Ａ−１Ｃ】
2014525940.tif 000007
【図２Ａ】
2014525940.tif 000008
【図２Ｂ】
2014525940.tif 000009
【図２Ｃ】
2014525940.tif 000010
【図３Ａ−３Ｂ】
2014525940.tif 000011
【図４Ａ】
2014525940.tif 000012
【図４Ｂ】
2014525940.tif 000013
【図５】
2014525940.tif 000014
【図６Ａ−６Ｄ】
2014525940.tif 000015
【図７Ａ−７Ｂ】
2014525940.tif 000016
【図７Ｃ】
2014525940.tif 000017
【図８Ａ−８Ｂ】
2014525940.tif 000018
【図９】
2014525940.tif 000019
【国際調査報告】
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