(57)【要約】  本発明は、Ｎ末端からＣ末端にかけて以下を含む融合タンパク質を提供する：ａ）ＧＰＣＲのＴＭ１、ＴＭ２およびＴＭ３を含むファミリーＢ  Ｇプロテイン結合型受容体（ＧＰＣＲ）の第１の部分；ｂ）安定したタンパク質ドメイン；ならびに、ｃ）ＧＰＣＲのＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７を含むＧＰＣＲの第２の部分。また本発明は、本発明の融合タンパク質を供給すること、および、それを結晶化して結晶を得ることを含むＧＰＣＲを結晶化する方法を提供する。
2014525751.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端からＣ末端にかけて以下を含む融合タンパク質：
ａ）ＧＰＣＲのトランスメンブランへリックス（ＴＭ）−１、ＴＭ−２およびＴＭ−３を含むファミリーＢ  Ｇプロテイン結合型受容体（ＧＰＣＲ）の第１の部分；
ｂ）安定したタンパク質ドメイン；ならびに、
ｃ）ＧＰＣＲのＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７を含むＧＰＣＲの第２の部分。
【請求項２】
ＧＰＣＲが、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）、グルカゴン様ペプチド２受容体（ＧＬＰ２Ｒ）、カルシトニン受容体（ＣＴ）、アミリン／ＣＧＲＰ受容体（ＡＭＹ１a）、アミリン受容体（ＡＭＹ２a）、アミリン／ＣＧＲＰ受容体（ＡＭＹ３a）、ＣＧＲＰ／アデノメデュリン受容体（ＣＧＲＰ１a）、アデノメデュリン／ＣＧＲＰ受容体（ＡＭ１a）、アデノメデュリン／ＣＧＲＰ受容体（ＡＭ２a受容体）、コルチコトロピン放出因子受容体（ＣＲＦ１）、ウロコルチン受容体（ＣＲＦ２）、成長ホルモン放出ホルモン受容体（ＧＨＲＨ）、胃酸分泌抑制ポリペプチド受容体（ＧＩＰ）、グルカゴン受容体、セクレチン受容体、ＴＩＰ−３９受容体（ＰＴＨ２）、副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨ１）、ＶＩＰ／ＰＡＣＡＰ受容体（ＶＰＡＣ１）、ＰＡＣＡＰ受容体（ＰＡＣ２）およびＶＩＰ／ＰＡＣＡＰ受容体（ＶＰＡＣ２）などのファミリーＢ  ＧＰＣＲである請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ＧＰＣＲが、元のＧＰＣＲに比べて立体構造の安定性が増加している変異型ＧＰＣＲである請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
安定したタンパク質ドメインが、ＧＰＣＲの第１の部分と第２の部分を結合するＧＰＣＲの細胞内ループ２（ＩＣＬ２）領域に挿入された請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
図６で設定されるヒトＧＬＰＩＲの番号に従ったアミノ酸Ｐｈｅ２５７およびＳｅｒ２６１に対応するアミノ酸残基の間の位置において、安定したタンパク質ドメインがＧＰＣＲのＩＣＬ２領域に挿入された請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
図６に設定されたヒトＧＬＰ１Ｒの番号に従ったアミノ酸Ｐｈｅ２５７に対応するアミノ酸の後およびアミノ酸Ｓｅｒ２６１、Ｐｈｅ２６０またはＶａｌ２５９に対応するアミノ酸の前のＧＰＣＲのＩＣＬ２領域に、安定したタンパク質ドメインが挿入された請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
図６に設定されたヒトＧＬＰ１Ｒの番号に従ったアミノ酸Ｓｅｒ２５８に対応するアミノ酸の後およびアミノ酸Ｓｅｒ２６１、Ｐｈｅ２６０またはＶａｌ２５９に対応するアミノ酸の前のＧＰＣＲのＩＣＬ２領域に、安定したタンパク質ドメインが挿入された請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
安定したタンパク質ドメインが、Ｔ４リゾチームなどのリゾチームのアミノ酸配列を含む請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
さらに、蛍光標識、放射性標識または酵素標識などの検出可能部分を含む請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
検出可能部分がＥＧＦＰである請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む結晶。
【請求項１４】
可溶化型の態様、他のタンパク質を本質的に含まない態様、または、固相担体に固定された態様である請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
結晶化のための、リガンド結合スクリーニングもしくはアッセイの開発における創薬のための、または、バイオセンサーとしての請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質の提供とそれを結晶化して結晶を得ることを含む請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質の結晶化方法。
【請求項１７】
請求項１２に記載の宿主細胞宿主細胞を培養し、融合タンパク質を発現してそのタンパク質を単離することによって融合タンパク質を提供する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
脂質キュービック相結晶構造解析を用いて結晶化が行われる請求項１６または１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、容易に結晶化できないタンパク質、特に、容易に安定化されないため、容易に結晶化できないＧＰＣＲに関する。また、本発明は、そのようなタンパク質を結晶化する方法およびそれらの様々な使用に関する。そのタンパク質は創薬研究および開発研究に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＧＰＣＲは、多くの生理学的プロセスを制御し、多くの有効な薬剤のターゲットとなる非常に大きなタンパク質ファミリーを構成している。特に、非特許文献１には、現存の４分の１以上の薬剤が、ＧＰＣＲをターゲットとすることが示されている。それらは、薬理学的にかなり重要である。ＧＰＣＲのリストは非特許文献２に掲載されており、本明細書中に参照により組み込まれる。
【０００３】
ＧＰＣＲは、単離されると、多大な労力の甲斐なく、一般的に不安定であり、例外的に自然で安定しているウシのロドプシンや、融合タンパク質または抗体断片との複合体として結晶化されるβ２アドレナリン受容体などの少数のＧＰＣＲのみが結晶化することが可能であった。
【０００４】
ＧＰＣＲは、アゴニストおよびアンタゴニストなどの異なる薬理学的クラスのリガンドと結合する複数の立体構造で存在すると考えられており、機能するために、これらの立体構造を一巡させると考えられている（非特許文献３）。また、立体構造間の変化は、受容体の結晶構造を得ることを困難にする。
【０００５】
配列の相同性と分子構造に基づくと、ＧＰＣＲは３つのファミリー（Ａ、ＢおよびＣ）に分類できる。しかし、それらは全て特有の７回膜貫通型（ＴＭ）ドメインが共通している。最も大きいグループであるファミリーＡは、ロドプシンに相同的な受容体から成る。また、セクレチン受容体ファミリーと呼ばれるファミリーＢは、グルカゴンホルモンファミリーなど大きなペプチドホルモンによって制御される受容体である。このファミリーのメンバーは、ジスルフィド架橋のネットワークを形成し、リガンド結合のポケットの一部であるいくつかのシステインを含む比較的大きな細胞外のＮ末端によって特徴づけられる。ファミリーＣは、代謝型グルタミン酸受容体と相同的な受容体から成る。これらの受容体は、非常に長い細胞外のＮ末端鎖と長いＣ末端鎖によって特徴づけられ、そのＮ末端側は、その形状においてＶｅｎｕｓ  ｆｌｙｔｒａｐ（ＶＦＴ）に類似したジスルフィド結合二量体を形成することが示されているリガンド結合ポケットを形成している。
【０００６】
ここ数年間にわたって、多くのファミリーＡ  ＧＰＣＲの構造が解明されており、多くの重要技術の開発によってこれらの偉業が達成された。そのような技術の１つに、結晶化結合を形成する大きな親水性領域を作ると考えられている細胞内の細胞質ループ（ＩＣＬ）３へのＴ４リゾチーム（Ｔ４Ｌ）の挿入がある［２］［３］（非特許文献５，非特許文献６）。脂質キュービック相結晶構造解析と組み合わせたこの技術の応用は、ベータ２、Ａ２ａ、ＣＸＣＲ４およびＤ３受容体の高画像構造決定を可能とした［２］（非特許文献５）。こうして、ファミリーＡ受容体のＴＭバンドル（７回膜貫通ヘリックスがつくるバンドル構造）の起点と組織についてのこれらの構造から重要な情報が収集されている。しかしながら、ファミリーＢとＣ受容体メンバーに関しては、配列の高度な相違が分かる利用可能な情報がほとんどない。ＴＭドメインの構造と組織において、ファミリー間での重大な相違が有りそうである［１］（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｏｖｅｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ５，９９３−９９６
【非特許文献２】Ｆｏｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．５７，２７９−２８８
【非特許文献３】Ｋｅｎａｋｉｎ  Ｔ．（１９９７）Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１２，１１６−１２５
【非特許文献４】Ｋａｗａｔｅ  Ｔ  ａｎｄ  Ｇｏｕａｕｘ  Ｅ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １４（４），６７３−８１（２００４）．
【非特許文献５】Ｆｒｉｍｕｒｅｒ  ＴＭ  ａｎｄ  Ｂｙｗａｔｅｒ  ＲＰ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ３５（４），３７５−８６（１９９９）．
【非特許文献６】Ｋｏｂｉｌｋａ  ＢＫ，Ｋｏｂｉｌｋａ  ＴＳ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｋ，Ｒｅｇａｎ  ＪＷ，Ｃａｒｏｎ  ＭＧ  ａｎｄ  Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ  ＲＪ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０（４８５７）１３１０−６（１９８８）．
【非特許文献７】Ｂｉｌｌ  ＲＭ，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ＰＪ，Ｉｗａｔａ  Ｓ，Ｋｕｎｊｉ  ＥＲ，Ｍｉｃｈｅｌ  Ｈ，Ｎｅｕｔｚｅ  Ｒ，Ｎｅｗｓｔｅａｄ  Ｓ，Ｐｏｏｌｍａｎ  Ｂ，Ｔａｔｅ  ＣＧ  ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌ  Ｈ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（４），３３５−３４０（２０１１）．
【非特許文献８】Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，Ｋ．Ｐｈａｒｍａ  ＆  Ｔｈｅｒａｐ  １０３，２１−８０（２００４）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ファミリーＡ受容体では、へリックス５と６の間の距離がＴ４ＬのＮ末端とＣ末端の間の距離と同程度であると考えられることから、ＩＣＬ３にＴ４Ｌが挿入された。その結果、この位置に融合タンパク質を取り付けることが可能となるが、一方で、他のへリックス間の距離が融合相手のタンパク質の挿入を促すとは考えられない。確かに、Ｔ４ＬはＩＣＬ内で多くの様々なファミリーＡ受容体と融合しており、それぞれの場合において、機能性タンパク質が受容体の柔軟性を低減するという付加価値を伴って発現している。その結果、全体的な安定性が増す。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、ファミリーＢ受容体の内部ループ、特にＩＣＬ３へのＴ４Ｌ挿入の影響を調べた。これらのデータは、ファミリーＢ受容体ではＩＣＬ３内でのＴ４Ｌ融合は許容されないが、ファミリーＡ受容体構造の点からは、驚くべきことに、また予想できないことに、ＩＣＬ２へのＴ４Ｌの付加によりファミリーＢ受容体の生化学的特性が改善されることが示された。ＩＣＬ２は、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７を含むＧＰＣＲの一部に対して、トランスメンブランへリックス（ＴＭ）−１、ＴＭ−２およびＴＭ−３を含むＧＰＣＲの一部を結合する。本データは、ファミリーＡ受容体とは異なり、ファミリーＢ受容体のへリックス３とへリックス４の距離が、へリックス５とへリックス６との距離に比べて、Ｔ４ＬのＮ末端とＣ末端の距離に類似していることを示唆する。
【発明の効果】
【００１０】
したがって、ＧＰＣＲのこれらの２つの部分の間に安定したタンパク質ドメインを挿入することは、これまでに予期されなかったＧＰＣＲの結晶化を促進するための新しい技術を示すものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＧＬＰ１ＲとのＴ４Ｌ融合構築物のデザインを示す概略図である。
【図２】ＧＬＰ１Ｒ−Ｔ４Ｌ融合構築物のＥＧＦＰ総シグナルを示すグラフである。
【図３】野生型ＧＬＰ１Ｒの標準的なｆＳＥＣ溶出プロファイルを示すグラフである。
【図４】ＩＣＬ−２内のＤＤＭで可溶化したＧＬＰ１Ｒ−Ｔ４Ｌ融合構築物のｆＳＥＣ溶出プロファイルを示すグラフである。
【図５】ＩＣＬ−３内のＤＤＭで可溶化したＧＬＰ１Ｒ−Ｔ４Ｌ融合構築物のｆＳＥＣ溶出プロファイルを示すグラフである。
【図６】ＴＭ３、ＩＣＬ２およびＴＭ４の位置を示すファミリーＢ  ＧＰＣＲのアミノ酸配列を示す。
【図７】Ｔ４ファージリゾチームのアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
したがって、本発明の第１の態様は、Ｎ末端からＣ末端にかけて以下を含む融合タンパク質を提供する：
ａ）ＧＰＣＲのＴＭ１、ＴＭ２およびＴＭ３を含むファミリーＢ  Ｇプロテイン結合型受容体（ＧＰＣＲ）の第１の部分；
ｂ）安定したタンパク質ドメイン；ならびに、
ｃ）ＧＰＣＲのＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７を含むＧＰＣＲの第２の部分。
【００１３】
本明細書中では、「ＧＰＣＲ」とは、ＧＰＣＲのシグナル伝達活性を有し、完全な７つのＴＭ領域を保持しているＧプロテイン結合型受容体またはポリペプチドを意味する。当技術分野の正式名称では、Ｎ末端からＣ末端へのＧＰＣＲのトランスメンブランへリックスは、ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７と呼ばれる。トランスメンブランへリックスは、ＴＭ２とＴＭ３の間、ＴＭ４とＴＭ５の間、ＴＭ６とＴＭ７の間の細胞外のアミノ酸伸長物によって結合され、それぞれ、細胞内ループ（ＩＣＬ）１、２、３と呼ばれる。したがって、上記で定義される第１と第２のＧＰＣＲ部分は、ＩＣＬ２領域によって自然に結合され、すなわちＩＣＬ２は、ＴＭ１、ＴＭ２およびＴＭ３を含むＩＣＬ２に対して第１のＮ末端部分に結合し、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７を含むＩＣＬ２に対して第２のＣ末端部分に結合する。
【００１４】
好ましくは、ＧＰＣＲは、例えばＧＰＣＲのひとつ以上の特性（例えば安定性）を改善するために、自然多型または変化した変異型ＧＰＣＲを含む完全長の野性型配列に由来する。
【００１５】
ＧＰＣＲは、野生型および変異型のＧＰＣＲ由来の可能性があり、変異型ＧＰＣＲは、アゴニストまたはアンタゴニストなどの特定の立体構造に偏ったＧＰＣＲを安定化することができる。例えば、安定したタンパク質ドメインは、立体構造的に安定化したＧＰＣＲのＴＭ３とＴＭ４の間に挿入できる。
【００１６】
発明者らは、以前、細胞膜からの精製時にそれらの立体構造、安定性および機能が維持される組み換えＧプロテイン結合型受容体の精製を可能とするＳｔａＲｓ（商品名）として知られる安定化ＧＰＣＲの生成を開示する、生物学的に関連した立体構造におけるＧＰＣＲの安定化方法（ＷＯ２００８／１１４０２０参照）を開発した。また、このプラットホーム技術は、アゴニスト構造またはアンタゴニスト構造のいずれかに偏った受容体を設計する方法を提供する（Ｍａｇｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｓｅｒｒａｎｏ−Ｖｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９参照）。すなわち、それらは特定の立体構造において安定性を増加させる。この安定な受容体は、本発明で使用され、例えば、安定性、精製タンパク質の収率の増加、変性の減少および非特異的な結合の減少などの多くの利点を有する。安定な変異型ＧＰＣＲが本発明に使用される場合、好ましくは、ＰＣＴ出願  ＷＯ２００８／１１４０２０，ＷＯ２００９／１１４０２０およびＷＯ２００９／０８１１３６に記載された方法を用いて選択および作製される。好ましくは、第１と第２のＧＰＣＲ部分は、元のＧＰＣＲに比べて、特定の立体構造で安定性が増加している（すなわち、立体構造が安定している）ＧＰＣＲに由来する。本明細書中では、立体構造の安定性が増加するとは、変性剤または変性条件に曝露されたときに、元のＧＰＣＲと同じ立体構造と比較して、変異型ＧＰＣＲの特異的な立体構造の安定性が増加している（例えば、生存期間の延長）という意味を含む。変性剤／変性条件の例としては、熱、界面活性剤、カオトロピック剤および極端なｐＨが含まれる。当技術分野で周知のように、このような変性剤または変性条件は、タンパク質の一次配列ではなく、二次構造および三次構造に影響し得る。
【００１７】
本発明の実施において使用される適切なＧＰＣＲには、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）、グルカゴン様ペプチド２受容体（ＧＬＰ２Ｒ）、カルシトニン受容体（ＣＴ）、アミリン／ＣＧＲＰ受容体（ＡＭＹ１a）、アミリン受容体（ＡＭＹ２a）、アミリン／ＣＧＲＰ受容体（ＡＭＹ３a）、ＣＧＲＰ／アデノメデュリン受容体（ＣＧＲＰ１a）、アデノメデュリン／ＣＧＲＰ受容体（ＡＭ１a）、アデノメデュリン／ＣＧＲＰ受容体（ＡＭ２a受容体）、コルチコトロピン放出因子受容体（ＣＲＦ１）、ウロコルチン受容体（ＣＲＦ２）、成長ホルモン放出ホルモン受容体（ＧＨＲＨ）、胃酸分泌抑制ポリペプチド受容体（ＧＩＰ）、グルカゴン受容体、セクレチン受容体、ＴＩＰ−３９受容体（ＰＴＨ２）、副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨ１）、ＶＩＰ／ＰＡＣＡＰ受容体（ＶＰＡＣ１）、ＰＡＣＡＰ受容体（ＰＡＣ２）およびＶＩＰ／ＰＡＣＡＰ受容体（ＶＰＡＣ２）などのファミリーＢ  ＧＰＣＲが含まれる。特に好適な実施態様では、ＧＰＣＲはＧＬＰ１Ｒである。他の適切なＧＰＣＲは、当技術分野で周知であり、上記の非特許文献１にリストされている。さらに、国際薬理学連合は、ファミリーＢ  ＧＰＣＲを含むＧＰＣＲのリストを作成し（非特許文献２）、このリストは定期的に、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｕｐｈａｒ−ｄｂ．ｏｒｇ／ＧＰＣＲ／ＲｅｃｅｐｔｏｒＦａｍｉｌｉｅｓＦｏｒｗａｒｄにて更新される。ファミリーＢ  ＧＰＣＲはクラス２のＧＰＣＲとして表２に示す。
【００１８】
多くのＧＰＣＲのアミノ酸配列（および、それらをコードするｃＤＮＡの塩基配列）は、例えばＧｅｎＢａｎｋを参照することにより容易に利用可能である。特に、非特許文献２は、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ）により、ヒトの遺伝子名やヒト、マウスおよびラットの遺伝子ＩＤを提供する。また、注目すべきは、ヒトゲノム配列の解明は実質的に終了していることから、そこからヒトＧＰＣＲのアミノ酸配列が推測できることである。
【００１９】
ＧＰＣＲはいずれのソースからも得ることができるが、特に、真核細胞由来であることが好ましい。特に、哺乳動物などの脊椎動物由来であれば好ましい。特に、ＧＰＣＲが、ラット、マウス、ウサギ、イヌまたは非ヒト霊長類もしくはヒト由来であれば好ましい。誤解を避けるために、本明細書では、本来、ｃＤＮＡや遺伝子を、そのソースからの遺伝物質を用いて入手するという「由来」という意味の中に、その後そのタンパク質を任意の宿主細胞で発現できることも含める。したがって、真核細胞のＧＰＣＲ（鳥類または哺乳動物のＧＰＣＲなど）は、大腸菌などの原核宿主細胞で発現できるが、場合によっては、鳥類または哺乳動物由来と考えられることは明白である。
【００２０】
場合によっては、ＧＰＣＲはひとつ以上の異なるサブユニットで構成される。例えば、カルシトニン遺伝子関連ペプチド受容体は、その生理的なリガンド結合特性を獲得するために、シングルトランスメンブランへリックスタンパク（ＲＡＭＰ１）の結合が必要である。ＧＰＣＲと結合して機能的複合体を形成または調節する作用タンパク質、アクセサリタンパク質、補助タンパク質またはＧＰＣＲ相互作用タンパク質が、当技術分野で周知であり、例えば、受容体キナーゼ、Ｇプロテインおよびアレスチンが含まれる（Ｂｏｃｋａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ａｎｄ    Ｄｅｖ  ７，６４９−６５７）。場合によっては、ＧＰＣＲリガンドにＧＰＣＲは結合する。本明細書では、ＧＰＣＲに結合するいずれの分子も「リガンド」に含める。多くのリガンドが、例えば、本明細書中に参照して組み込まれるＷＯ２００８／１１４０２０およびＮｅｕｂｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５５，５９７−６０６により公知となっている。すなわち、その融合タンパク質は、ＴＭ４，ＴＭ５，ＴＭ６およびＴＭ７を含むＧＰＣＲの一部に結合するＴＭ１，ＴＭ２およびＴＭ３を含むＧＰＣＲの一部を含むことができ、そこでは、ＧＰＣＲはＧＰＣＲ結合パートナーと結合する。このように、他の分子とＧＰＣＲの複合体を結晶化できることによってＧＰＣＲ相互作用に対して構造的洞察を得ることが可能である。その分子がＧＰＣＲのＩＣＬ２に結合するものでないことが好ましい。
【００２１】
いかなるＧＰＣＲにおいても、当技術分野で標準の技術を用いて当業者はＴＭへリックスを決定することができる。例えば、疎水性に基づくＧＰＣＲのトランスメンブラン領域を作るコンピュータプログラムが利用可能である（Ｋｙｌｅ＆Ｄｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７，１０５−１３２）。同様に、トランスメンブラン予測アルゴリズムサーバーはＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ（例えばＥｘｐａｓｙ）において広く利用可能であり、その多くは疎水性解析に依存している。ＴＭＨＭＭは、使用可能な膜タンパク質トポロジー予測法であり、隠れマルコフモデルに基づく（ＴＭＨＭＭ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｖ．２．０； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／）。トランスメンブラン領域が、例えば、構造解析または疎水性解析によって得られたＧＰＣＲのために既に公知の場合、さらなるＧＰＣＲにおける類似の領域は、多重またはペアワイズシーケンスアラインメントによっても同定できる。例えば、そのアライメントはＣｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）を用いて実施できる。使用するパラメーターは以下とすることができる：高速ペアワイズアラインメントパラメーター（Ｆａｓｔ  ｐａｉｒｗｉｓｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）：Ｋ−タプル（ワード）サイズ（Ｋ−ｔｕｐｌｅ（ｗｏｒｄ）ｓｉｚｅ）；１，ウィンドウ・サイズ（ｗｉｎｄｏｗ  ｓｉｚｅ）；５，ギャップペナルティ（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）；３，トップダイアゴナルの数（ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｏｐ  ｄｉａｇｏｎａｌｓ）；５．スコアリング法（ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）；ｘパーセント（ｘ  ｐｅｒｃｅｎｔ）。マルティプルアラインメントパラメーター（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）：ギャップ開始ペナルティ（ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）；１０，ギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）；０．０５。スコアリングマトリックス（Ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）：ＢＬＯＳＵＭ。
【００２２】
図６は、ファミリーＢ  ＧＰＣＲのアミノ酸配列を示しており、ＴＭ３，ＩＣＬ２およびＴＭ４の位置を強調している。例えば、ヒトのＧＬＰ１Ｒについては、ＴＭ３はＰｈｅ２５７で終わり、ＩＣＬ２はＳｅｒ２５８からＳｅｒ２６１に対応し、ＴＭ４はＧｌｕ２６２から始まる。したがって、都合の良いことに、ＧＰＣＲがファミリーＢ受容体の場合には、ＴＭ３，ＩＣＬ２およびＴＭ４の位置は、図６においてＴＭ３，ＩＣＬ２およびＴＭ４の境界を定義するアミノ酸に対応するアミノ酸残基の位置を決めることによって特定できる。その配列を並べるときには、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗを使用する。
【００２３】
しかし、境界線は明確ではなく、それらを定義するのに用いられたＧＬＰ１Ｒのために提供されるモデルに依存すると認められる。図１では、例えば、ヒトＧＬＰ１ＲのＴＭ３はＬｅｕ２５４で終わり、ＩＣＬ２はＬｅｕ２５５からＴｒｐ２６４に対応し、ＴＭ４はＩｌｅ２６５で始まる。また、そのループ領域は、αへリックスを結合するアミノ酸構造または膜の外部に存在すると予想されるアミノ酸構造と定義することができ、どちらの定義を用いるかによってその境界は変わる。
【００２４】
１つの実施態様では、安定したタンパク質ドメインはＩＣＬ２に挿入される。したがって、本発明は、ＩＣＬ２に安定したタンパク質ドメインが挿入されているＧＰＣＲを提供する。本明細書では、「ＩＣＬ２への挿入」は、ＩＣＬ２のアミノ酸のいずれも削除しないでＩＣＬ２のアミノ酸配列に安定したタンパク質ドメインと定義されるアミノ酸配列を付加すること、および、安定したタンパク質ドメインをコードするアミノ酸配列を用いてＩＣＬ２のひとつ以上または全てのアミノ酸を置換することの両方を含む。この実施態様では、ＧＰＣＲの第１および／または第２の部分が少なくともＩＣＬ２の一部とそれに加えて必要なトランスメンブランへリックスを含み得ると認められる。ＧＰＣＲの第１の部分には、ＴＭ１、ＴＭ２およびＴＭ３ならびにＩＣＬ２のＮ末端部分を含むことができる。ＧＰＣＲの第２の部分にはＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７ならびにＩＣＬ２のＣ末端部分を含むことができる。
【００２５】
安定したタンパク質ドメインは、ＩＣＬ２に挿入し、そのＮ末端および／またはＣ末端のひとつまたは２つのスペーサー部分に配置できることが認められる。このように、安定したタンパク質ドメインはＩＣＬ２に直接結合せずに間接的に結合する。スペーサー部分はへリックスの引っ張りの減少を補助するために使用することができる。
【００２６】
好ましくは、安定したタンパク質ドメインは、安定したタンパク質ドメインのアミノ酸配列を有するＩＣＬ２のアミノ酸配列内のひとつ以上の連続したアミノ酸（例えば、２，３，４もしくは５またはそれ以上のアミノ酸）を置換することによってＩＣＬ２に挿入される。１つの実施態様では、置換されるひとつ以上のアミノ酸は、ＴＭ３のＣ末端および／またはＴＭ４のＮ末端からのひとつ以上のアミノ酸である。言い換えれば、融合タンパク質は、安定したタンパク質ドメインの少なくとも一方の端に、ＩＣＬ２のひとつ以上のアミノ酸を有することができる。
【００２７】
実施例１に記載されているように、本発明においては、ＧＬＰ１ＲのＩＣＬ２の様々な位置にＴ４リゾチームを挿入し、Ｐｈｅ２５７とＳｅｒ２６１間の挿入は、結果として融合ＧＬＰ１Ｒ受容体を生成した。すなわち、図６に設定されているヒトＧＬＰ１Ｒの番号に従うと、Ｐｈｅ２５７とＳｅｒ２６１に対応するアミノ酸残基の間の位置でＧＰＣＲのＩＣＬ２領域に安定したタンパク質ドメインを挿入することが特に好ましい。
【００２８】
したがって、図６に設定されたヒトＧＬＰ１Ｒの番号に従うと、安定したタンパク質ドメインのアミノ酸は、Ｐｈｅ２５７に対応するアミノ酸の後およびＳｅｒ２６１、Ｐｈｅ２６０またはＶａｌ２５９に対応するアミノ酸の前のＧＰＣＲのＩＣＬ２領域に挿入できる。例えば、安定したタンパク質ドメインのアミノ酸配列は、図６に設定されるようにヒトＧＬＰ１Ｒの番号に従って、Ｓｅｒ２５８に対応するアミノ酸、またはＳｅｒ２５８およびＶａｌ２５９に対応するアミノ酸、またはＳｅｒ２５８，Ｖａｌ２５９およびＰｈｅ２６０に対応するアミノ酸に置換することができる。安定したタンパク質ドメインを挿入するその場所は、図１に示されるＧＬＰ１Ｒ−Ｔ４リゾチーム融合の構成１ｃ，２ｃおよび３ｃに対応する。
【００２９】
同様に、安定したタンパク質ドメインのアミノ酸は、図６で設定されるヒトＧＬＰ１Ｒの番号に従うと、Ｓｅｒ２５８に対応するアミノ酸の後およびＳｅｒ２６１、Ｐｈｅ２６０またはＶａｌ２５９に対応するアミノ酸の前でＧＰＣＲのＩＣＬ２領域に挿入できる。例えば、安定したタンパク質ドメインのアミノ酸配列は、図６で設定されるヒトＧＬＰ１Ｒの番号に従うと、Ｖａｌ２５９に対応するアミノ酸と置換するか、または、Ｖａｌ２５９およびＰｈｅ２６０に対応するアミノ酸と置換できる。安定したタンパク質ドメインを挿入するその場所は、図１に示されるＧＬＰ１Ｒ−Ｔ４リゾチーム融合の構成１ｄ，２ｄおよび３ｄに対応する。
【００３０】
本明細書では、「対応するアミノ酸残基」は、ヒトＧＬＰ１Ｒ受容体および他のＧＰＣＲがＭａｃＶｅｃｔｏｒおよびＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて比較される場合、ヒトＧＬＰ１Ｒで得られたアミノ酸残基と並ぶ他のＧＰＣＲのアミノ酸残基という意味を含む。
【００３１】
安定したタンパク質ドメインは、図６で設定されるヒトＧＬＰＩＲの番号に従うと、アミノ酸Ｐｈｅ２５７およびＳｅｒ２６１に対応するアミノ酸残基の間の位置において、ＧＰＣＲのＩＣＬ２領域に挿入されることが好ましいが、この領域の外側に挿入され得ることが認められる。
【００３２】
安定したタンパク質ドメインの機能は、例えばＧＰＣＲの結晶化の性質を改善するために、結晶化結合のための親水性表面を増加させ、ＧＰＣＲの固有の柔軟性を減少させることであると認められる。したがって本明細書では、「安定したタンパク質ドメイン」には、結晶格子結合のための親水性表面を供与する可溶性の折りたたまれたポリペプチドの意味が含まれる。さらに、そのタンパク質ドメインは安定しているので、その折りたたまれた形状は変性に対して抵抗性がある（例えば、熱、界面活性剤、カオトロピック剤などに安定である）。タンパク質の安定性試験は、当技術分野で周知であり、ＷＯ２００８／１１４０２０に記載のものが含まれる。
【００３３】
通常、安定したタンパク質ドメインは、細胞内で融合タンパク質のＧＰＣＲ部分から自動的に折りたたまれるものである。
【００３４】
好都合なことに、安定したタンパク質ドメインは、容易に結晶化可能なものである。したがって、安定したタンパク質ドメインは、その結晶構造が解明されたタンパク質であり、例えば、そのひとつの組み合わせは、タンパク質データバンク（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ／）に保管されている。
【００３５】
安定したタンパク質ドメインの特に好ましい特性は、以下の通りである：
１．ドメインは、可溶性で、よく折りたたまれており、１つ以上の発現システムで容易に発現することができる。
２．ドメインのＮ末端とＣ末端の間隔は、互い接近しており、通常、５〜１７Å、例えば、６〜１６Å，７〜１５Å，７〜１０Å，１０〜１３Åまたは１２〜１５Åの範囲である。
３．ドメインは、タンパク質分解の変性と、熱および化学変性に対して耐性がある。
４．ドメインは、さまざまな空間群および結晶パッケージングアレンジメントにおいて高い結晶化能を有する。
【００３６】
そのドメインは、融合タンパク質のドメイン内またはＧＰＣＲ部分のいずれかでのジスルフィド結合の結合を防ぐために、システイン残基を含まないことが好ましい。そのドメインが可溶性であることから、それは疎水性でなく、または無秩序な形状において凝集する傾向がないことが理解される。
【００３７】
１つの実施態様では、安定したタンパク質ドメインの長さは５０〜１０００のアミノ酸、好ましくは、５０〜３００のアミノ酸、または１００〜３００のアミノ酸、または１５０〜２５０のアミノ酸である。
【００３８】
適切なポリペプチドが安定したタンパク質ドメインに見つかった時点で、そのポリペプチドの末端の骨格において最も近いα炭素原子が５〜１７Å、例えば、６〜１６Å，７〜１５Å，７〜１０Å，１０〜１３Åまたは１２〜１５Åの範囲の距離で間隔を空けた、ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端または両末端からのアミノ酸残基の除去またはそれらの末端への付加によるポリペプチドの修飾が必要であるかもしれない。
【００３９】
安定したタンパク質ドメインの挿入が、結合活性やシグナル経路調節活性などのＧＰＣＲの生物活性に影響しないことが好ましい。理想的には融合タンパク質は、その生物活性の少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％を維持し、最も理想的には、安定したタンパク質ドメインがないときと同じ活性レベルの１００％を保持しているべきである。ＧＰＣＲ結合およびＧＰＣＲシグナルを評価する方法は当技術分野で周知であり、例えば、ＷＯ２００８／１１４０２０とＷＯ２００９／１０１３８３に記載されている。その両方が参照により本明細書に組み込まれる。したがって、生物活性が結合活性であれば、ＧＰＣＲが結合するパートナーに対する結合は当技術分野で知られている通常の結合アッセイを用いて評価でき、生物活性がシグナル経路調節活性であれば、その活性は特異的なシグナル経路のための適切なアッセイ（例えば、受容体遺伝子アッセイ）によって評価できる。
【００４０】
結晶化の目的のためには、保持しているリガンド結合能力が、保持しているシグナル活性に比べてより重要であると認められる。したがって、特に好適な実施態様では、安定したタンパク質ドメインはＧＰＣＲの結合活性に影響しない。
【００４１】
その疑問を回避するために、安定したタンパク質ドメインは、特別なＧＰＣＲのＩＣＬ２ではなく、またはその一部でもない。
【００４２】
好適な実施態様では、安定したタンパク質ドメインはリゾチームである。リゾチームは、容易に結晶化できることが知られており、様々な野性型と変異型のリゾチームの構造がタンパク質データバンク（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）に保管されている。適切な例には、１３５Ｌ、１９３Ｌ、１９４Ｌ、１ＡＫＩ、１ＧＢＳ、１ＩＥＥ、１ＬＺ１、１Ｐ７Ｓ、１ＲＥＸ、１ＶＤＱ、２ＡＮＶ、２ＡＮＸ、２Ｄ４Ｋ、２ＦＢＢ、２ＩＨＬ、２ＮＷＤ、２ＸＢＲ、２ＸＢＳ、２Ｚ２Ｆ、２ＺＹＰ、３Ａ８Ｚ、３Ｋ２Ｒ、３Ｎ９Ａ、３Ｎ９Ｃ、３Ｎ９Ｅおよび３ＯＤ９が含まれる。
【００４３】
いずれのソースから得られたリゾチームも使用できるが、Ｔ４ファージ由来のリゾチームが特に好ましい。図７にＴ４ファージリゾチームの２つのアミノ酸配列を示す。いずれかの配列が本発明の構成中で用いることができる。そのリゾチームは自然な多型を含む完全長の野生型配列由来か、または、例えば１つ以上の性質を改善するために変更された変異型リゾチームであっても良い。したがって、図７に示されたアミノ酸配列の変異型を使用できることが理解される。そのアミノ酸配列は、図７で設定されたいずれかのアミノ酸配列と、少なくとも６０％，６５％，７０％，７５％，８０％，８５％または９０％の配列同一性を有し、より好ましくは、図７で設定されたいずれかの配列と、少なくとも９５％または９９％の配列同一性を有する。
【００４４】
配列同一性はＢＬＡＳＴもしくはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ（１９９７），２５，３３８９−３４０２）などのアルゴリズムまたは隠れマルコフモデル（Ｅｄｄｙ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ（１９９５）Ｓｐｒｉｎｇ  ２（１）９−２３）に基づく方法によって測定できる。通常、２つのポリペプチド間の配列同一性（パーセント）は、任意の適切な計算機プログラム（例えば、ウィスコンシン大学の遺伝子のコンピューターグループのＧＡＰプログラム）を用いて決定し、その同一性パーセントは、最適に配列が並べられたペプチドとの関連で算出される。
【００４５】
リゾチームは、安定したタンパク質ドメインの好ましい例であり、上記で議論した特徴を有する多くのポリペプチドを使用するために一般原理が使用できる。したがって、適切な候補には、例えば、当技術分野で知られているタンパク質データバンクまたは他の結晶データベースを調べることによって見つかるような、容易に結晶化可能なタンパク質のアミノ酸配列を含むものが含まれる。他の例としては、Ｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＢＢＡ  １５６４：３８−４６（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される、シトクロムｂ５６２，フラボドキシン，β−ラクタマーゼおよび７０ｋＤａ熱ショックＡＴＰアーゼ  ドメインなどが含まれる。
【００４６】
融合タンパク質は、例えば、ビオチン化または放射性標識、蛍光標識もしくは酵素標識などの当技術分野で知られている検出可能な標識を導入することによって容易に検出できるように、修飾することができる。特に、好適実施態様では、その標識はＥＧＦＰなどの蛍光標識である。同様に、例えば、ＧＳＴタグ，６ｘ  Ｈｉｓタグ，ＭＢＰまたは他のエピトープタグなどの当技術分野で知られているアフィニティ部分を導入することにより融合タンパク質を修飾して精製を促進することができる。これらの修飾は、ＧＰＣＲのＮ末端もしくはＣ末端に、または外部ループ中にすることができる。
【００４７】
実施例１で示されるように、本発明の融合タンパク質は、安定したタンパク質ドメインが挿入されていないＧＰＣＲと比べて生物化学的性質が改善されていると考えられる。この改善された性質は、融合たんぱく質をより結晶化しやすくする。したがって、融合タンパク質は、結晶化結合のための高い親水性の表面を有すると予想される。同様に、その融合タンパク質は、安定したタンパク質ドメインが挿入されていないＧＰＣＲに比べて溶解しやすい（例えば、界面活性剤溶液で凝集がほとんど見られない）と予想される。ＧＰＣＲの溶解性を評価する方法は、当技術分野で周知であり、実施例１で記載されるように、ＤＤＭ中での溶解度を評価するために用いられる蛍光サイズ排除クロマトグラフィーなどのサイズ排除クロマトグラフィーが含まれる。また、融合タンパク質は、安定したタンパク質ドメインが挿入されていないＧＰＣＲに比べて安定である（例えば、熱、界面活性剤、カオトロピック剤などに対して）。ＧＰＣＲの安定性を評価するための方法は当技術分野で知られており、ＷＯ２００８／１１４０２０に記載されているものが含まれる。
【００４８】
好都合なことに、融合タンパク質は、標準的な分子生物学と遺伝子組み換え技術で生産される。例えば、第１と第２のＧＰＣＲ部分をコードするＤＮＡ断片および安定したタンパク質ドメインは、当技術分野で周知である標準的なクローニング技術やＰＣＲを用いて作製される。そして、その断片は、従来の実施方法に従って、例えば、ライゲーション用の平滑末端もしくは付着末端、適切な末端を提供するための制限酵素の消化、適切な付着末端の補充、望まない結合を避けるためのアルカリフォスファターゼ処理および酵素的ライゲーションを用いることによって、インフレームで一緒にライゲーションすることができる。
【００４９】
同様に、融合構築物は、ＩｎＦｕｓｉｏｎまたはＧａｔｅｗａｙなどのリガーゼ非依存的クローニング手法を用いて作製できる。また、この構築物はデノボ遺伝子合成によって合成的にも作製できる。
【００５０】
ＧＰＣＲと安定したタンパク質ドメインの一方または両方は、変異させることで、溶解性、安定性、発現性および結晶性を改善できることが認められる。
【００５１】
ＤＮＡを変異させるための遺伝子およびｃＤＮＡのクローニングおよび操作、ならびに、宿主細胞中でのポリヌクレオチドからのポリペプチド発現の分子生物学的手法は、本明細書に参照により組み込まれる「“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（ｅｄｓ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ」で例示されように当技術分野で周知である。
【００５２】
適切な発現システムには、バクテリアまたは酵母における構成的または誘導的発現システム；バキュロウイルス、セムリキ森林熱ウイルスおよびレンチウイルスなどのウイルス発現システム；または昆虫もしくは哺乳動物細胞における一時的な形質導入が含まれる。適切な宿主細胞には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ），乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ），出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ），シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ），ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ），スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）およびキンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）の細胞が含まれる。適切な動物宿主細胞にはＨＥＫ２９３，ＣＯＳ，Ｓ２，ＣＨＯ，ＮＳＯ，ＤＴ４０などが含まれる。いくつかのＧＰＣＲでは、機能するために特異的な脂質（例えば、コレステロール）が必要であることが知られている。その場合、脂質を含む宿主細胞を選択することが好ましい。代替的に又は追加的に、融合タンパク質の単離および精製の間に脂質を付加することができる。精製はアフィニティクロマトグラフィーなどの標準の技術によって実施できる。
【００５３】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様に従って、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。そのポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはＤＮＡとすることができるが、通常はＤＮＡである。
【００５４】
ポリヌクレオチドはベクターに挿入することができ、また、本発明の第２の態様に従って、本発明はポリヌクレオチドを含むベクターを提供することも認められる。
【００５５】
適切なベクターは、原核細胞（バクテリア）または真核細胞（哺乳動物）中で融合タンパクを伝播および／または発現させるものである。例えば、そのベクターは、プラスミド、コスミド、ファージまたは細菌人工染色体（ＢＡＣ）である。そのベクターのポリヌクレオチド配列は、意図する宿主細胞の性質、発明の第２の態様のポリペプチドの宿主細胞への挿入の方法、およびエピソームの維持または統合が必要かどうかに依存している。好都合なことに、そのベクターは少なくともひとつの抗菌剤耐性（例えば、カナマイシンまたはネオマイシン）などの選択的マーカーを含む。
【００５６】
ベクターは、本発明の第２の態様のポリヌクレオチドを複製するために有用であり、また、ポリヌクレオチドを用いた形質導入に有用であり、また、融合タンパク質の発現を促進することができる。
【００５７】
典型的な原核生物のベクタープラスミドは、Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（リッチモンド，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入可能なｐＵＣ１９，ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社（ピスカタウェイ，ＮＪ，ＵＳＡ）から購入可能なｐＴｒｃ９９Ａ，ｐＫＫ２２３−３，ｐＫＫ２３３−３，ｐＤＲ５４０およびｐＲＩＴ５；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ラホーヤ，ＣＡ  ９２０３７，ＵＳＡ）から購入可能なｐＢＳベクター，Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター，Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター，ｐＮＨ８Ａ，ｐＮＨ１６Ａ，ｐＮＨ１８Ａ，ｐＮＨ４６Ａである。
【００５８】
典型的な哺乳動物細胞のベクタープラスミドは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社（ピスカタウェイ，ＮＪ，ＵＳＡ）から購入可能なｐＳＶＬである。このベクターは、クローン化された遺伝子の発現を作動させるために、ＣＯＳ−１細胞などのＴ抗原産生細胞で見つかっている最も高レベルで発現するＳＶ４０後期プロモータを使用する。別の例は、ＣＯＳ−１またはＣＯＳ−７細胞でされるｐｃＤＮＡ３．１（ｎｅｏ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）である。また、誘導できる哺乳動物発現ベクターの例はＰｈａｒｍａｃｉａ社（ピスカタウェイ，ＮＪ，ＵＳＡ）から購入可能なｐＭＳＧである。このベクターは、クローン化された遺伝子の発現を作動するためのマウス乳がん細胞ウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）のグルココルチコイド誘導プロモーターを使用する。
【００５９】
有用な酵母プロモーターは、ｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６であり、通常、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ラホーヤ，ＣＡ  ９２０３７，ＵＳＡ）から購入できる。プラスミドｐＲＳ４０３，ｐＲＳ４０４，ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母選択マーカーであるＨＩＳ３，ＴＲＰ１，ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を組み込む。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は、酵母セントロメアプラスミド（ＹＣｐｓ）である。
【００６０】
好適実施態様では、本発明の第２の態様のポリヌクレオチドを含むベクターはｐｃＤＮＡ３．１である。
（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｉｖｇｎ／ｐｒｏｄｕｃｔ／Ｖ７９０２０）
【００６１】
上記で説明したライゲーションの技術を含む本発明の第２の態様のポリヌクレオチドを含むベクターを構築するために、当技術分野で知られるいずれの適切な方法も使用できる。
【００６２】
本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様に従ったポリヌクレオチドを含む細胞または前記のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。その細胞は、本発明の第２の態様のポリヌクレオチドを複製するために使用することができ、または、本発明の第１の態様の融合タンパク質を発現するために使用できる。
【００６３】
その細胞は原核生物または真核生物のいずれかである。
【００６４】
本発明の第２の態様のポリヌクレオチドの構築および増幅は、都合よく細菌細胞内で行われる。ポリヌクレオチドの発現は哺乳動物細胞または細菌細胞などの細胞内で行われる。
【００６５】
細菌細胞は、好ましくは真核宿主細胞であり、通常は大腸菌株である。例としては、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ベテスダ，ＭＤ，ＵＳＡ）から購入可能な大腸菌株ＤＨ５およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（ロックビル，ＭＤ，ＵＳＡ）から購入可能な大腸菌株ＲＲ１（Ｎｏ  ＡＴＣＣ  ３１３４３）である。好ましい真核宿主細胞には、酵母、昆虫胞および哺乳動物の細胞または細胞株が含まれ、好ましくは、例えばマウス、ラットまたはヒトからの脊椎動物細胞または細胞株が含まれる。特に好ましい細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などのヒト腎臓細胞である。
【００６６】
融合タンパク質の発現に使用される細胞は、安定的または非安定的に遺伝子導入できる。
【００６７】
本発明の第４の態様は、本発明の第１の態様に従った融合タンパク質を結晶化する方法、本発明の第１の態様に従った融合タンパク質の提供を含む方法およびそれを結晶化して結晶を得る方法を提供する。
【００６８】
実施態様では、本発明の第３の態様に従った宿主細胞を培養し、融合タンパク質を発現し、そのタンパク質を単離することによって融合タンパク質を提供する。
【００６９】
参照により本明細書に組み込まれる「Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ；ＩＳＢＮ：０−８７９６９−６１７−６）でレビューされるような、あらゆる適切な結晶化方法を、融合タンパク質を結晶化するために、使用することができる。
【００７０】
好適実施態様では、結晶化は脂質立方相の結晶学を用いて実施される（本明細書に参照により組み込まれるＵＳ２０１１／００３１４３８参照）。
【００７１】
本発明の第５の態様は、本発明の第１の態様の融合タンパク質を含む結晶を提供する。
【００７２】
本明細書に開示された融合タンパク質は、結晶化研究に有用であり、創薬プログラムにおいて有用である。例えば、表面プラズモン共鳴または蛍光技術などによる、受容体／リガンドキネティクスおよび熱力学パラメータの生理学的な測定においてこれらは使用できる。これらは、リガンド結合スクリーニングにおいて使用でき、ハイスループットスクリーニングにおいて、または、バイオセンサーチップとして使用するために、固体表面と結合できる。融合タンパク質を含むバイオセンサーチップは、分子（特に生体分子）を検出するために使用できる。
【００７３】
ここで、以下の図と実施例を用いて本発明を説明する。
【００７４】
図１：ＧＬＰ１ＲとのＴ４Ｌ融合構築物のデザイン
Ｔ４ＬはＩＣＬ２（左）およびＩＣＬ３（右）内で示された残基の後ろに挿入された。構築物１ａは、Ｔ４ＬがＬ２５５とＳ２６１の間に挿入されたことを意味する。ＴＭドメインとループのモデルは参考文献［４］に基づいている。
【００７５】
図２：野生型（ＷＴ）サンプルおよびモック遺伝子導入（Ｕ）サンプルと比較したＧＬＰ１Ｒ−Ｔ４Ｌ融合構築物のＥＧＦＰ総シグナル
各測定は総細胞材料５０μｇを用いて２連で実施した。エラーバーは、平均からの標準誤差を示す。
【００７６】
図３：野生型ＧＬＰ１Ｒの標準的なｆＳＥＣ溶出プロファイル
【００７７】
図４：野生型プロファイルに重ね合わせた、ＩＣＬ−２内のＤＤＭで可溶化したＧＬＰ１Ｒ−Ｔ４Ｌ融合構築物のｆＳＥＣ溶出プロファイル
それぞれのケースにおいて、野生型プロファイルを赤で、融合構築物を青で示した。
【００７８】
図５：野生型プロファイルに重ね合わせた、ＩＣＬ−３内のＤＤＭで可溶化したＧＬＰ１Ｒ−Ｔ４Ｌ融合構築物のｆＳＥＣ溶出プロファイル
それぞれのケースにおいて、野生型プロファイルを赤で、融合構築物を青で示した。
【００７９】
図６：ＴＭ３、ＩＣＬ２およびＴＭ４の位置を示すファミリーＢ  ＧＰＣＲのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１−２２）
ＧＬＰ１Ｒ融合構築物１ｃ内でＴ４Ｌと置換されたＩＣＬ２の位置を、マウス、ラットおよびヒトの他のファミリーＢ受容体中で強調した。
【００８０】
図７：Ｔ４ファージリゾチームのアミノ酸配列：（Ａ）ファミリーＡ受容体のＩＣＬ３に挿入された配列［２］，［３］（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２３）；（Ｂ）ファミリーＢ受容体のＩＣＬ２に挿入された配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２４）（実施例参照）。異なる配列を四角で囲む。
【実施例】
【００８１】
実施例１：ＩＣＬ２へのＴ４Ｌの挿入は、ＧＬＰ１Ｒの生物化学的特性を改善する。
【００８２】
概要
ファミリーＢ受容体の内部ループへのＴ４Ｌの挿入の影響を調べた。
得られたデータは、ファミリーＢ受容体がＩＣＬ３内でのＴ４Ｌ融合を許容できないことを示しているが、ＩＣＬ２にＴ４Ｌを付加すると受容体の生物化学的特性が改善される。
【００８３】
結果
ＧＬＰ１Ｒのモデルに従いＧＬＰ１Ｒのループ領域を決定し、ＩＣＬ２とＩＣＬ３内の異なった場所にＴ４ＬをコードするＤＮＡを挿入した（図１）。蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィーを用いて全体の発現と単分散をモニターするためにＧＬＰ１Ｒ構築物のＣ末端をＥＧＦＰでタグ化した。
【００８４】
配列を確認した後、これらの構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で一過的に発現した。初期の解析として、発現の総レベルを評価するために全細胞のＥＧＦＰシグナルを測定した。興味深いことに、ＩＣＬ３内に挿入した構築物はいかなるＥＧＦＰシグナルも生成しなかった。このことは、ＧＬＰ１Ｒのこの領域中のＴ４Ｌ融合がこの受容体の全体の構造と互換性がないことを示している。しかしながら、ＩＣＬ２内での融合はＧＬＰ１Ｒの強い発現をもたらした（図２）。
【００８５】
ＧＬＰ１Ｒ−Ｔ４Ｌ融合タンパク質の生化学的特性を解析するために、これらの構築物を発現する細胞をドデシルマルトシド（ＤＤＭ）で溶解し、蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー（ｆＳＥＣ）にかけた。ｆＳＥＣは、タンパク質の単分散および凝集の状態に関するデータを提供するため、特に、事前の結晶化スクリーニングにおいて広く使用されている［５］。一般的に、より好都合な条件は、より良い単分散および凝集の低下をもたらす。ＤＤＭで可溶化した野生型ＧＬＰ１ＲのｆＳＥＣ溶出プロファイルは、タンパク質分解の結果である遊離のＥＧＦＰと、凝集ショルダーを有する主要な単分散ピークの存在を示す（図３）。
【００８６】
図２に示されたＥＧＦＰシグナルデータと一致して、ＩＣＬ２  Ｔ４Ｌ融合タンパク質構築物１ａ，１ｂ，２ａ，２ｂ，３ａおよび３ｂの溶出プロファイルから、細胞がこれらの融合タンパク質を発現しなかったことが示された（図４）。これは、おそらくＴＭＩＩＩとＴ４ＬのＮ末端が近く、全体的な構造が壊れるからと考えられる。反対に、構築物１ｃ，１ｄ，２ｃ，２ｄ，３ｃおよび３ｄの溶出プロファイルからは、生産された融合受容体が発現されること、より顕著には、Ｔ４Ｌ融合タンパク質が凝集ピークの減少および単分散ピークの同時改善をもたらすことが判明し、それが受容体のこの領域へのＴ４Ｌ挿入が可溶化受容体の生化学的特性に対して有益な効果を有することが示された（図４）。この効果は構築物１ｃと２ｃで最も顕著である。
【００８７】
同じ解析をＩＣＬ３融合タンパク質構築物で実施したところ、図２に示されたＥＧＦＰシグナルデータと一致して、ＩＣＬ３内のＴ４Ｌ融合タンパク質はいずれの融合受容体も発現しなかった（図５）。
【００８８】
まとめると、これらのデータはＧＬＰ１Ｒの３番目の細胞質ループ内で融合されたＴ４Ｌ融合タンパク質は許容されないが、第２の細胞質ループ内のある位置に挿入されたＴ４Ｌは許容されるだけではなく、可溶化された受容体の生化学的特性も改善されることが示された。ファミリーＢ  ＧＰＣＲのメンバーの高い相同性を考えると、これらの結果がこのファミリーの他のメンバーに拡大できることが示唆される。図６に示されるように、最も良好な構築物（１ｃ）内で置換されたＩＣＬ２の一部を他のファミリーＢ中で示す。
【００８９】
方法と材料
標準の分子生物学的技術を用いて、Ｔ４リゾチームをヒトＧＬＰ１Ｒの第２および第３の細胞質ループに挿入した。この構築物はＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で修飾ｐｃＤＮＡ３．１から一過的に発現され、そのＣ末端にＥＧＦＰが融合した受容体が生産される。使用説明書に従い、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて遺伝子導入を実施した。通常、１０ｃｍのプレートの接着性細胞３×１０６個に対して６μｇのＤＮＡを遺伝子導入のために用いた。遺伝子導入の４０時間前に細胞を採取し、ＥＤＴＡが全く入っていないプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ社）を補完した５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．５ｍＭ  ＥＤＴＡで再懸濁した。通常、それぞれ６５０μｇのサンプルを１％ＤＤＭで総量２００μＬに４℃で１時間かけて溶解し、次に、５０，０００ｒｐｍで３０分間遠心した。５０μＬの上清を、予めＳＥＣバッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．０３％ＤＤＭ）で平衡化させたＢｉｏＳＥｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ３０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）にロードし、１ｍＬ／分の流速で１５分間、流した。その溶離液は、以下の設定のオンライン蛍光光度計に通した：励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１３ｎｍ、１３ゲイン。
【００９０】
［参考文献］
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［２］Ｂｉｌｌ  ＲＭ，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ＰＪ，Ｉｗａｔａ  Ｓ，Ｋｕｎｊｉ  ＥＲ，Ｍｉｃｈｅｌ  Ｈ，Ｎｅｕｔｚｅ  Ｒ，Ｎｅｗｓｔｅａｄ  Ｓ，Ｐｏｏｌｍａｎ  Ｂ，Ｔａｔｅ  ＣＧ  ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌ  Ｈ．Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ  ｂａｒｒｉｅｒｓ  ｔｏ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（４），３３５−３４０（２０１１）
［３］Ｋｏｂｉｌｋａ  ＢＫ，Ｋｏｂｉｌｋａ  ＴＳ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｋ，Ｒｅｇａｎ  ＪＷ，Ｃａｒｏｎ  ＭＧ  ａｎｄ  Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ  ＲＪ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｌｐｈａ  ２−，ｂｅｔａ  ２−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０（４８５７）１３１０−６（１９８８）
［４］Ｆｒｉｍｕｒｅｒ  ＴＭ  ａｎｄ  Ｂｙｗａｔｅｒ  ＲＰ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＧＬＰ１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ３５（４），３７５−８６（１９９９）
［５］Ｋａｗａｔｅ  Ｔ  ａｎｄ  Ｇｏｕａｕｘ  Ｅ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １４（４），６７３−８１（２００４）
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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