(57)【要約】細胞におけるｐ５３−依存性の転写活性を増大する組成物及び方法。【選択図】図１Ａ及び図１Ｂ
2014502152.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
方法が：
ｐ５３（例えば、機能的ｐ５３）をコードするか又は発現する細胞を得ること：
細胞中でＨＤＭＸが発現されているか否かを確認すること；及び
ＨＤＭＸが発現されている場合に、細胞をＨＤＭＸ調節剤と接触させること、それによって、細胞中のｐ５３活性を増大させることを含んでなる、細胞中のｐ５３活性を増大する方法。
【請求項２】
ＨＤＭＸ調節剤が：
ｐ５３の転写活性ドメインと少なくとも３０％の同一性を有しているアミノ酸配列を含んでいるペプチド；又は
ｐ５３の転写活性ドメインと少なくとも３０％の同一性を有しているアミノ酸配列を含んでいるペプチド、ここで、このペプチドの相互作用面にあるアミノ酸は保存されている；又は
ｐ５３の転写活性ドメインと少なくとも３０％の同一性を有しているアミノ酸配列を含んでいるペプチド、ここで、ペプチドの相互作用面にある１つ又はそれ以上のアミノ酸は、ペプチドの相互作用面を変化させない同類アミノ酸で置換されている；又は
配列番号２２に記載のアミノ酸配列、
を含んでいる、ここで、ペプチドは内部架橋剤によって架橋されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｐ５３がヒトｐ５３である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＨＤＭＸ調節剤が、図１Ｃに示される架橋されたペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＨＤＭＸ調節剤がＳＡＨ−ｐ５３−８である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞をＨＤＭ２調節剤と接触させるこを更に含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＨＤＭ２調節剤がＮｕｔｌｉｎ−３である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＨＤＭＸが発現されているか否かを確認する工程が、ＨＤＭＸ及び／又はｐ５３−ＨＭＤＸ複合体の存在を検出することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
細胞中でＨＤＭ２が発現されているか否かを確認すること；及び
ＨＤＭ２が発現されている場合に、細胞をＨＤＭ２調節剤と接触させることを更に含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＨＤＭ２調節剤がＮｕｔｌｉｎ−３である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＨＤＭＸ調節剤及びＨＤＭ２調節剤の用量が、相乗的用量又は相加的用量である、請求項６又は９又は１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞がインビトロにある、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞が対象内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
対象が、癌を有している対象である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
方法が：
ＨＤＭ２調節剤（例えば、Ｎｕｔｌｉｎ−３）による処置によってｐ５３活性が実質的に増大しない細胞を得ること；及び
細胞をＨＤＭＸ調節剤と接触させること、それによって細胞中のｐ５３活性を増大させることを含んでなる、細胞中のｐ５３活性を増大する方法
【請求項１６】
ＨＤＭＸ調節剤が：
ｐ５３の転写活性ドメインと少なくとも３０％の同一性を有しているアミノ酸配列を含んでいるペプチド；又は
ｐ５３の転写活性ドメインと少なくとも３０％の同一性を有しているアミノ酸配列を含んでいるペプチド、ここで、ペプチドの相互作用面にあるアミノ酸は保存されている；又は
ｐ５３の転写活性ドメインと少なくとも３０％の同一性を有しているアミノ酸配列を含んでいるペプチド、ここで、ペプチドの相互作用面にある１つ又はそれ以上のアミノ酸は、ペプチドの相互作用面を破壊しない同類アミノ酸で置換されている；又は
配列番号２２に記載のアミノ酸配列、
を含んでいる、ここで、ペプチドは内部架橋剤によって架橋されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ｐ５３がヒトｐ５３である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＨＤＭＸ調節剤が、図１Ｃに示される架橋されているペプチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ＨＤＭＸ調節剤が、ＳＡＨ−ｐ５３−８である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
細胞をＨＤＭ２調節剤と接触させることを更に含んでいる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
ＨＤＭ２調節剤がＮｕｔｌｉｎ−３である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＨＤＭＸ調節剤及びＨＤＭ２調節剤の用量が、相乗的用量又は相加的用量である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
方法が：
ｐ５３（例えば、機能的ｐ５３）をコードするか又は発現する細胞を得ること；
細胞をＨＤＭＸ調節剤及びＨＤＭ２調節剤と接触させること、ここで、ＨＤＭ２調節剤は図１Ｃに示されるステープル状に架橋されたペプチドではない、それによって細胞中のｐ５３活性を増大させることを含んでなる、細胞中のｐ５３活性を増大する方法。
【請求項２４】
ＨＤＭＸ調節剤が：
ｐ５３の転写活性ドメインと少なくとも３０％の同一性を有しているアミノ酸配列を含んでいるペプチド；又は
ｐ５３の転写活性ドメインと少なくとも３０％の同一性を有しているアミノ酸配列を含んでいるペプチド、ここで、ペプチドの相互作用面にあるアミノ酸は保存されている；又は
ｐ５３の転写活性ドメインと少なくとも３０％の同一性を有しているアミノ酸配列を含んでいるペプチド、ここで、ペプチドの相互作用面にある１つ又はそれ以上のアミノ酸は、ペプチドの相互作用面を破壊しない同類アミノ酸で置換されている；又は
配列番号２２に記載のアミノ酸配列、
を含んでなる、ここで、ペプチドは内部架橋剤によって架橋されている、
請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ｐ５３がヒトｐ５３である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＨＤＭＸ調節剤が、図１Ｃに示される架橋されているペプチドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ＨＤＭＸ調節剤がＳＡＨ−ｐ５３−８である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
ＨＤＭ２調節剤がＮｕｔｌｉｎ−３である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
ＨＤＭＸ調節剤及びＨＤＭ２調節剤の用量が、相乗的用量又は相加的用量である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
細胞がインビトロにある、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
細胞が対象中にある、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
対象が癌を有している対象である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
方法が：
対象由来の異常増殖細胞又は癌細胞を含んでいるか又はそれから得られる生体試料中で機能的ｐ５３がコードされているか又は発現することができるか否かを検出すること；
機能的ｐ５３がコードされているか又は発現することができる場合は、試料中のＨＤＭ２、若しくはＨＤＭＸ、又は両方のレベルを検出すること；
（ｉ）ＨＤＭ２調節剤を含む組成物の治療有効量を投与することを含んでいる治療；
（ｉｉ）ＨＤＭＸ調節剤を含む組成物の治療有効量を投与することを含んでいる治療；及び
（ｉｉｉ）ＨＤＭ２調節剤及びＨＤＭＸ調節剤を含む組成物の治療有効量を投与することを含んでいる治療；
よりなる群から治療を選択すること；
ここで、試料中のＨＤＭ２のレベルがＨＤＭＸのレベルより実質的に大きい場合は治療（ｉ）が選択され、試料中のＨＤＭＸのレベルがＨＤＭ２のレベルより実質的に大きい場合は治療（ｉｉ）が選択され、そして試料中のＨＤＭ２とＨＤＭＸのレベルがほぼ等しい場合は治療（ｉｉｉ）が選択され、それによって対象における癌に対する治療を選択すること；及び、
治療（ｉ）、（ｉｉ）、又は（ｉｉｉ）に従って治療を対象に投与すること、ここで、治療を選択する工程、及び治療を投与する工程は、同時に又は異なった時点に独立して又は同じ当事者によって実施される；を含んでなる、対象における癌に対する治療を選択する方法。
【請求項３４】
（ｉ）のＨＤＭ２調節剤が、図１Ｃに示されるステープル状に架橋されたペプチドではない、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＨＤＭ２が発現されていて且つＨＤＭＸが発現されていない場合に、治療（ｉ）が選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
ＨＤＭＸが発現されていて且つＨＤＭ２が発現されていない場合に、治療（ｉｉ）が選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
治療（ｉｉｉ）が、ＨＤＭ２阻害剤及びＨＤＭＸ阻害剤を同時に又は別々に投与することを含んでなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
ＨＤＭＸのレベルを検出する工程が、ｐ５３−ＨＭＤＸ複合体の存在を検出することを含んでなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
ＨＤＭＸ調節剤が：
ｐ５３の転写活性ドメインと少なくとも６０％の同一性を有しているアミノ酸配列を含んでいるペプチド；又は
ｐ５３の転写活性ドメインと少なくとも６０％の同一性を有しているアミノ酸配列を含んでいるペプチド、ここで、ぺプチドの相互作用面にあるアミノ酸は保存されている；又は
ｐ５３の転写活性ドメインと少なくとも６０％の同一性を有しているアミノ酸配列を含んでいるペプチド、ここで、ペプチドの相互作用面にあるアミノ酸は、ペプチドの相互作用面の結合活性を破壊しない同類アミノ酸で置換されている；
を含んでなる、ここで、ペプチドは内部架橋剤によって架橋されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
ｐ５３がヒトｐ５３である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＨＤＭＸ調節剤が、図１Ｃに示される架橋されているペプチドである、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
ＨＤＭＸ調節剤が、ＳＡＨ−ｐ５３−８である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
ＨＤＭ２調節剤が、Ｎｕｔｌｉｎ−３である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４４】
治療（ｉｉｉ）におけるＨＤＭＸ調節剤及びＨＤＭ２調節剤の用量が、相乗的用量又は相加的用量である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４５】
１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤を含んでなる、組成物。
【請求項４６】
１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤が、
ｐ５３の転写活性ドメインと少なくとも６０％の同一性をを有しているアミノ酸配列を含んでいるペプチド；又は
ｐ５３の転写活性ドメインと少なくとも６０％の同一性をを有しているアミノ酸配列を含んでいるペプチド、ここで、ペプチドの相互作用面にあるアミノ酸は保存されている；又は
ｐ５３の転写活性ドメインと少なくとも６０％の同一性をを有しているアミノ酸配列を含んでいるペプチド、ここで、ペプチドの相互作用面にある１つ又はそれ以上のアミノ酸はペプチド相互作用面の結合活性を破壊しない同類アミノ酸で置換されている：
を含んでなる、ここで、ペプチドは内部架橋剤によって架橋されている、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
ｐ５３がヒトｐ５３である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤が、図１Ｃに示される架橋されているペプチドである、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４９】
１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤が、ＳＡＨ−ｐ５３−８である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５０】
１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤が、Ｎｕｔｌｉｎ−３である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５１】
ｐ５３及びＨＤＭＸからなる、単離されたタンパク質複合体。
【請求項５２】
請求項５１に記載の単離されたタンパク質複合体と特異的に結合する、抗体。
【請求項５３】
癌の診断に又は治療有効性を観察するために、請求項５１に記載の単離されたタンパク質複合体を使用する方法。
【請求項５４】
対象における癌を治療するためのオーダーメイドの治療方法を開発するために、請求項５１に記載の単離されたタンパク質複合体を使用する方法。
【請求項５５】
ｐ５３並びに１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ、ＨＤＭ２、及び／又はｐ５３−ＨＭＤＸ複合体を検出するための組成物；及び
１つ又はそれ以上のｐ５３並びに１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ、ＨＤＭ２、及び／又はｐ５３−ＨＭＤＸ複合体の検出に基づいて、癌を有する対象の癌を治療するためのオーダーメイドの治療計画を開発するための使用説明書：
を含んでなる、キット。
【請求項５６】
１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び／又は１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤；１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び／又は１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤の投与に適している１つ又はそれ以上の器具；並びに１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び／又は１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤を如何に投与すべきかを提供する使用説明書を含んでなる、キット。
【請求項５７】
請求項５５に記載のキット及び請求項５６に記載のキットを含んでなる、複合キット。
【請求項５８】
方法が、少なくとも１用量の放射線治療の前に、１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び／又は１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤を対象に投与することを含んでなる、放射線治療を受ける予定になっている対象を治療する方法。
【請求項５９】
方法が、少なくとも１用量の放射線治療の前に、１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び／又は１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤を対象に投与すること及び対象を放射線治療に曝露することを含んでなる、癌を有する対象を治療する方法。
【請求項６０】
１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び／又は１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤を、対象の腸に経口など、局所的に投与する、請求項５８〜５９の何れか一項に記載の方法。
【請求項６１】
１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び／又は１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤が全身投与される、請求項５８〜５９の何れか一項に記載の方法。
【請求項６２】
ＨＤＭＸ調節剤が：
ｐ５３の転写活性ドメインと少なくとも６０％の同一性を有しているアミノ酸配列を含んでいるペプチド；又は
ｐ５３の転写活性ドメインと少なくとも６０％の同一性を有しているアミノ酸配列を含んでいるペプチド、ここで、ペプチドの相互作用面にあるアミノ酸は保存されている；又は
ｐ５３の転写活性ドメインと少なくとも６０％の同一性を有しているアミノ酸配列を含んでいるペプチド、ここで、ペプチドの相互作用面にある１つ又はそれ以上のアミノ酸は、ペプチドの相互作用面の結合活性を破壊しない同類アミノ酸で置換されている；
を含有してなる、ここで、ペプチドは内部架橋剤によって架橋されている、請求項５８〜５９の何れか一項に記載の方法。
【請求項６３】
ｐ５３がヒトｐ５３である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ＨＤＭＸ調節剤が、図１Ｃに示される架橋されているペプチドである、請求項５８〜５９の何れか一項に記載の方法。
【請求項６５】
ＨＤＭＸ調節剤が、ＳＡＨ−ｐ５３−８である、請求項５８〜５９の何れか一項に記載の方法。
【請求項６６】
ＨＤＭ２調節剤が、Ｎｕｔｌｉｎ−３である、請求項５８〜５９の何れか一項に記載の方法。
【請求項６７】
ＨＤＭＸ調節剤及びＨＤＭ２調節剤の用量が、相乗的用量又は相加的用量である、請求項５８〜５９の何れか一項に記載の方法。
【請求項６８】
ＨＤＭ２調節剤が、図１Ｃに示される架橋されているペプチドではない、請求項５８〜５９の何れか一項に記載の方法。
【請求項６９】
アミノ酸配列：Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｐｈｅ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｔｒｐ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｌｅｕ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６（配列番号２２）（式中の、
Ｘａａ１はＬｅｕ又はＧｌｎであるか、又は欠失している；
Ｘａａ２はＳｅｒであるか、又は欠失している；
Ｘａａ３はＧｌｎであるか、又は欠失している；  
Ｘａａ４はＧｌｕ又はＧｌｎ又はＡｌａであり；
Ｘａａ５はＴｈｒ又はＡｌａであり；
Ｐｈｅ６はＰｈｅ又はその同類置換であり；
Ｘａａ７はＳｅｒであり；
Ｘａａ８はＡｓｐ又はＡｓｎであるか、或いはＡｓｐ及びＧｌｕ以外のアミノ酸であり；
Ｘａａ９はＬｅｕであり；
Ｔｒｐ１０はＴｒｐ又はその同類置換であり；
Ｘａａ１１はＬｙｓ又は正に荷電しているアミノ酸であり；  
Ｘａａ１２はＬｅｕ又はＬｙｓ又はＡｌａであり；
Ｌｅｕ１３はＬｅｕ又はその同類置換であり；
Ｘａａ１４はＰｒｏであるか、又は欠失している；
Ｘａａ１５はＧｌｕ又はＧｌｎ又はＡｌａ、又はＡｓｐ及びＧｌｕ以外のアミノ酸であるか、或いは欠失している；
Ｘａａ１６はＡｓｎであるか、又は欠失している）
ここで、該アミノ酸配列の２つ、３つ、又は６つのアミノ酸分離れている少なくとも２つのアミノ酸の側鎖が内部架橋に置き換えられている、
該アミノ酸配列の少なくとも６連続アミノ酸を含んでなる、内部架橋されているポリペプチド。
【請求項７０】
Ｘａａ１がＬｅｕであるか、又は欠失している；
Ｘａａ２がＳｅｒであるか、又は欠失している；
Ｘａａ３がＧｌｎであるか、又は欠失している；  
Ｘａａ４がＧｌｕであり；
Ｘａａ５がＴｈｒであり；
Ｐｈｅ６がＰｈｅであり；
Ｘａａ７がＳｅｒであり；
Ｘａａ８がＡｓｐであり；
Ｘａａ９がＬｅｕであり；
Ｔｒｐ１０がＴｒｐであり；
Ｘａａ１１がＬｙｓであり；  
Ｘａａ１２がＬｅｕであり；
Ｌｅｕ１３がＬｅｕであり；
Ｘａａ１４がＰｒｏであるか、又は欠失している；
Ｘａａ１５がＧｌｕであるか、又は欠失している；
Ｘａａ１６はＡｓｎであるか、又は欠失している、
ここで、Ｐｈｅ６、Ｔｒｐ１０及び／又はＬｅｕ１３のうちの１つ、２つ及び／又は３つが、ペプチドの結合面とＨＤＭＸの間の相互作用を変化させない、同類アミノ酸置換で置換されており；及び／又はＰｈｅ６、Ｔｒｐ１０及び／又はＬｅｕ１３に対応する残基以外のアミノ酸が配列番号１又は配列番号２に記載の配列と少なくとも３０％（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は１００％）同一である、
請求項６９に記載の内部架橋されているペプチド。
【請求項７１】
アミノ酸配列が、配列番号１０に記載の配列である、請求項６９又は７０に記載の架橋されているたペプチド。
【請求項７２】
内部架橋に置き換えられている側鎖を有する少なくとも２つのアミノ酸が、表１に示されているステープル状の架橋から選ばれる、請求項６９〜７１に記載の架橋されているペプチド。
【請求項７３】
内部架橋に置き換えられている側鎖を有する少なくとも２つのアミノ酸が、表１に示されている縫合状の架橋から選ばれる、請求項６９〜７１に記載の架橋されているペプチド。
【請求項７４】
内部架橋に置き換えられている側鎖を有する少なくとも２つのアミノ酸が、表１に示されている２つ又はそれ以上のステープル状の架橋を含んでいる、請求項７２に記載の架橋されているペプチド。
【請求項７５】
内部架橋に置き換えられている側鎖を有する少なくとも２つのアミノ酸が、表１に示されている少なくとも１つのステープル状の架橋及び少なくとも１つの縫合状の架橋を含んでいる、請求項７２に記載の架橋されているペプチド。
【請求項７６】
内部架橋に置き換えられている側鎖を有する少なくとも２つのアミノ酸が、Ｘａａ７とＸａａ１４の間に位置している、請求項６９〜７５に記載の架橋されているペプチド。
【請求項７７】
内部架橋に置き換えられている側鎖を有する少なくとも２つのアミノ酸が１つ又はそれ以上のステープル状の架橋を含んでいて、ここで少なくとも２つのアミノ酸は６つのアミノ酸分離れている、請求項６９〜７６に記載の架橋されているペプチド。
【請求項７８】
内部架橋が、配列番号２〜２１に示されている位置に位置している、請求項６９〜７７に記載の架橋されているペプチド。
【請求項７９】
請求項６９〜７８に記載の架橋されたペプチドを含んでなる、医薬組成物。
【請求項８０】
請求項６９〜７８に記載の架橋されたペプチド及び１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤を含んでなる、医薬組成物。
【請求項８１】
１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤がＮｕｔｌｉｎ−３を含んでなる、請求項８０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は２０１１年１１月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／４１３，１９９号の優先権を主張し、この出願の全てが、そのまま参照により本明細書に明確に取り込まれている。
【０００２】
（連邦支援研究又は開発）
本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health)から与えられた助成金第５Ｐ０１ＣＡ２９６２５号、国立衛生研究所から与えられた助成金第１Ｋ２２ＣＡ１２８８８６号による政府支援によってなされた。政府は本発明のある特定の権利を有している。
【０００３】
（技術分野）
本開示は、癌の治療及び診断のための組成物及び方法に関連している。
【背景技術】
【０００４】
「ゲノムの番人」として、ｐ５３は、老化様現象の停止及びアポトーシスプログラムの導入のように、防御機構を活性化して、遺伝的に変異しているクローンの出現を阻止して欠損細胞の複製を阻止する（Lane, Nature, 358:15-16 (1992); Vogelstein et al., Nature, 408:307-310 (2000)）。癌細胞はｐ５３活性を破壊する多くの分子戦略を採用して病的生存優位性を達成している（例えば、Baker et al., Science, 244:217-221 (1989); Honda et al., FEBS Lett., 420:25-27 (1997); Momand et al., Cell, 69:1237-1245 (1992); Moll et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92:4407-4411 (1995)を参照されたい）。
【０００５】
ｐ５３活性の回復は癌治療のための１つの戦略である（例えば、 Brown et al., Nat. Rev. Cancer, 9:862-873 (2009)を参照されたい）。例えば、Ｅ３ユビキチンリガーゼＨＤＭ２のＮ−末端表面上の疎水性裂溝（Toledo and Wahl, Nat. Rev. Cancer, 6:909-923 (2006); Marine and Dyer, J. Cell. Sci., 120:371-378 (2007); Bartel et al., Int. J. Cancer, 117:469-475 (2005); Shvarts et al., Genomics, 43:34-42 (1997); Danovi et al., Mol. Cell. Biol., 24:5835-5843 (2004)）が、ｐ５３転写促進ドメインの両親媒性α螺旋に直接結合する（Kussie et al., Science, 274:948-953 (1996)）ことを明らかにすることなど、ｐ５３−ＨＤＭ２結合界面の結晶構造を確認することは、このような戦略の開発に寄与した。その結果、ＨＤＭ２のｐ５３−結合ポケットを標的とする小分子及びペプチドが開発された（例えば、Bernal et al., J. Am. Chem. Soc., 129:2456-2457 (2007); Grasberger et al., J. Med. Chem., 48:909-912 (2005); Koblish et al., Mol. Cancer Ther., 5:160-169 (2006); Kritzer et al., J. Am. Chem. Soc., 126:9468-9469 (2004); Shangary et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 105:3933-3938 (2008); Vassilev et al., Science, 303:844-848 (2004); Yin et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 44:2704-2707 (2005)を参照されたい）。このような薬剤の１つはＭＤＭ２阻害剤、Ｎｕｔｌｉｎ−３である（Vassilev et al., Science, 303:844-848 (2004)）。ｐ５３（例えば、野生型ｐ５３）を発現するある特定の腫瘍に、ＨＤＭ２を標的とするこれらの薬剤を用いることがｐ５３レベルに治療的な急増を引き起こすことが示されている。具体的には、Ｎｕｔｌｉｎ−３は他の治療薬が存在していないときにある特定の腫瘍においてアポトーシスを引き起こせることが示されている（例えば、Drakos et al., Clin. Cancer Res., 13:3380-3387 (2007); Tabe et al., Clin. Cancer Res., 15:933-942 (2009)を参照されたい）。しかしながら、このような効果は全ての腫瘍タイプで生じない。特に、ある特定の腫瘍は、ＨＤＭ２−標的治療に対して耐性があるか又は他のものより耐性がある。Ｅ３ユビキチンリガーゼＨＤＭＸのＨＤＭ２との同時発現はＨＤＭ２標的薬剤の有効性を減少させる可能性がある（例えば、Hu et al., Cancer Res., J. Biol. Chem., 281:33030-33035 (2006); Patton et al., Cancer Res., 66:3169-3176 (2006); Wade et al., J. Biol. Chem., 281:33036-33044 (2006)を参照されたい）。
【０００６】
ｐ５３の動態を調節するＨＤＭＸの役割が記述されていて（例えば、Danovi et al., Mol. Cell. Biol., 24:5835-5843 (2004); Laurie et al., Nature, 444:61-66 (2006); Ramos et al., Cancer Res., 61:1839-1842 (2001); Wade et al., J. Biol. Chem., 281:33036-33044 (2006); Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 104:12365-12370 (2007)を参照されたい）、ＨＤＭＸを標的にするいくつかの薬剤に関してインビトロの予備的報告が入手可能である（例えば、Harker et al., Bioorg. Med. Chem., 17:2038-2046 (2009); Hayashi et al.,  Bioorg. Med. Chem., 17:7884-7893 (2009); Hu et al., Cancer Res., 67:8810-8817 (2007); Kallen et al., J. Biol. Chem., 284:8812-8821 (2009); Li et al., J. Am. Chem. Soc., 130:13546-13548 (2008); Michel et al., J. Am. Chem. Soc., 131:6356-6357 (2009); Pazgier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 106:4665-4670 (2009); Reed et al., J. Biol. Chem., 285:10786-10796 (2010)を参照されたい。）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
癌は米国において相変わらず主要な死亡率及び死亡数の要因の１つである。改善された癌治療が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、対象の癌を診断、予測、及び／又は治療する組成物及び方法を提供する。
【０００９】
ある態様では、本開示は、細胞におけるｐ５３活性を増大する方法を提供する。このような方法は、ｐ５３（例えば、機能的Ｐ５３）をコード又は発現する細胞を得ること又は供給すること、細胞中でＨＤＭＸが発現されているか否かを確認すること、そしてＨＤＭＸが発現されている場合は、細胞をＨＤＭＸ調節剤と接触させること、それによって細胞におけるｐ５３活性を増大させることを包含できる。ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤は、ｐ５３の転写促進ドメインと同一性を有しているペプチド（例えば、架橋されていない（non-cross-linked）及び架橋されている（cross-linked）ペプチド）を包含する。ある例では、ペプチドは、ｐ５３転写促進ドメインの相互作用面に存在するアミノ酸に対応するアミノ酸に関してｐ５３転写促進ドメインとの同一性の第１レベル、及び他の全てのアミノ酸（例えば、相互作用面の外にあるもの）に関してｐ５３転写促進ドメインとの同一性の第２レベルを有することができる。例えば、ｐ５３転写促進ドメインの相互作用面上のそれに対応しているペプチド中のアミノ酸は、保存されていてもよく、或いはｐ５３転写促進ドメインの相互作用面にあるアミノ酸の同類置換であってもよく、そして相互作用面のもの以外のアミノ酸は、ペプチドの相互作用面の外にあるそれらアミノ酸と、少なくとも又は約３０％、少なくとも又は約４０％、少なくとも又は約５０％、少なくとも又は約６０％、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、又は１００％の同一性を有することができる。ある態様では、ペプチドは１つ又はそれ以上の内部架橋剤（internal crosslinker）によって架橋されていてもよい。ある実施態様ではｐ５３はヒトｐ５３である。ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤は図１Ｃに示した架橋されたペプチドであってよい。ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤は図１Ｃに示した、ＳＡＨ−ｐ５３−８であってよい。
【００１０】
上に開示した方法は更に、細胞を１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤と接触させることを包含できる。例示的ＨＤＭ２調節剤は、その類縁体、改変体、改良体、及び誘導体を含む、Ｎｕｔｌｉｎ−３（例えば、Ｎｕｔｌｉｎ−３ａ）を包含できる。
【００１１】
ある実施態様では、ＨＤＭＸが発現されているか否かを確認する工程はＨＤＭＸ及び／又はｐ５３−ＨＤＭＸ複合体の存在を検出することを含むことができる。方法は更に、ＨＤＭ２が細胞内で発現されているか否かを確認すること、そしてＨＤＭ２が発現されている場合は、細胞をＨＤＭ２調節剤（例えば、Ｎｕｔｌｉｎ−３）と接触させることを任意に含むこともできる。ある実施態様では、細胞又は対象に投与されるＨＤＭＸ調節剤とＨＤＭ２調節剤の用量は相乗的又は相加的である。ある実施態様では、細胞はインビトロである。或いは又は更に、細胞は対象（例えば、癌を有する対象）内にあってよい。
【００１２】
別の態様では、本開示は、ＨＤＭ２調節剤（例えば、Ｎｕｔｌｉｎ−３）による治療でｐ５３活性が実質的に増大しない細胞を得ること又は提供すること；そしてこの細胞をＨＤＭＸ調節剤と接触させること、それによって細胞中のｐ５３活性を増大することを包含する、細胞中のｐ５３活性を増大する方法を提供する。ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤は本明細書に記載されているペプチドを包含できる。ある実施態様では、ｐ５３は、ヒトｐ５３である。ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤は図１Ｃに示した架橋されたペプチドであってよい。ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤はＳＡＨ−ｐ５３−８であってよい。方法は、細胞をＨＤＭ２調節剤（例えば、Ｎｕｔｌｉｎ−３）と接触させることを任意に含んでいてもよい。ある実施態様では、細胞又は対象を、相乗的又は相加的であるＨＤＭＸ調節剤及びＨＤＭ２調節剤の用量と接触させる（例えば、処置する）ことができる。
【００１３】
更なる態様では、本開示は、ｐ５３（例えば、機能的ｐ５３）をコードするか（例えば、遺伝子的にコードする）又は発現する細胞を得ること又は提供すること、この細胞をＨＤＭＸ調節剤及びＨＤＭ２調節剤と接触させること（ここで、ＨＤＭ２調節剤は図１Ｃに示したステープル状に架橋された(stapled)ペプチドではない）、それによって、細胞においてｐ５３活性を増大することを含んでいる、細胞中のｐ５３活性を増大する方法を提供する。ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤は本明細書に記載されているペプチドを包含できる。ある態様では、ｐ５３は、ヒトｐ５３である。ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤は図１Ｃに示した架橋されているペプチドであってよい。ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤はＳＡＨ−ｐ５３−８であってよい。ある実施態様では、ＨＤＭ２調節剤はＮｕｔｌｉｎ−３であってよい。ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤及びＨＤＭ２調節剤の用量は相乗的又は相加的用量である。ある実施態様では、細胞はインビトロである。或いは、ある例では、細胞は対象（例えば、癌を有する対象）にある。
【００１４】
ある態様では、本開示は対象の癌を治療する方法を含んでいる。これらの方法は、対象由来の異常増殖細胞又は癌細胞を含むか又はこれらから得られる生体試料において、機能的ｐ５３をコードしているか（例えば、遺伝子的にコードしている）又は発現できるか否かを検出すること、機能的ｐ５３をコードしているか又は発現できる場合は、試料におけるＨＤＭ２、若しくはＨＤＭＸ、又は両方のレベルを検出すること、以下よりなる群から治療を選択すること：
（ｉ）ＨＤＭ２調節剤を含有している組成物の治療有効量を投与することを含む治療；
（ｉｉ）ＨＤＭＸ調節剤を含有している組成物の治療有効量を投与することを含む治療；及び
（ｉｉｉ）ＨＤＭ２調節剤及びＨＤＭＸ調節剤を含有している組成物の治療有効量を投与することを含む治療
（ここで、試料においてＨＤＭ２のレベルがＨＤＭＸのレベルより実質的に高い場合は治療（ｉ）が選ばれ、試料においてＨＤＭＸのレベルがＨＤＭ２のレベルより実質的に高い場合は治療（ｉｉ）が選ばれ、そして試料においてＨＤＭ２とＨＤＭＸのレベルがほぼ等しい場合は治療（ｉｉｉ）が選ばれる）、それによって、対象における癌の治療が選ばれること、そして治療（ｉ）、（ｉｉ）、又は（ｉｉｉ）に従って対象を治療すること（ここで、治療の選択及び治療段階の投与は同時点又は別の時点に独立して又は同じ当事者によって行われる）を含むことができる。このような方法のある例では、（ｉ）のＨＤＭ２調節剤は図１Ｃに示したステープル状に架橋されたペプチドではない。ある実施態様では、ＨＤＭ２が発現されてＨＤＭＸが発現されない場合に治療（ｉ）が選ばれる。ある実施態様では、ＨＤＭＸが発現されてＨＤＭ２が発現されない場合に治療（ｉｉ）が選ばれる。ある実施態様では、治療（ｉｉｉ）は、ＨＤＭ２阻害剤及びＨＤＭＸ阻害剤を同時に又は別々に投与することを含む。ある例では、ＨＤＭＸのレベルを検出するステップは、ｐ５３−ＨＤＭＸ複合体の存在を検出することを含んでいる。ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤は本明細書に記載されているペプチドを包含できる。ある実施態様では、ペプチドは１つ又はそれ以上の内部架橋剤によって架橋されていてもよい。ある実施態様では、ｐ５３は、ヒトｐ５３である。ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤は、図１Ｃに示したステープル状に架橋されたペプチドあってよい。ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤はＳＡＨ−ｐ５３−８であってよい。ある実施態様では、ＨＤＭ２調節剤はＮｕｔｌｉｎ−３である。ある実施態様では、治療（ｉｉｉ）で用いられるか又は投与されるＨＤＭＸ調節剤及びＨＤＭ２調節剤の用量は相乗的用量又は相加的用量である。
【００１５】
別の態様では、本開示は、１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤を含有している組成物を提供する。ある実施態様では、１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤は本明細書に記載されているペプチドを包含できる。ある実施態様では、ペプチドは１つ又はそれ以上の内部架橋剤で架橋されていてよい。ある実施態様では、ｐ５３は、ヒトｐ５３である。ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤は図１Ｃに示した架橋されたペプチドであってよい。ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤はＳＡＨ−ｐ５３−８である。ある実施態様では、ＨＤＭ２調節剤はＮｕｔｌｉｎ−３である。
【００１６】
別の態様では、本開示は更に、ｐ５３とＨＤＭＸからなる単離されたタンパク質複合体、並びにこの単離されたタンパク質複合体と特異的に結合する抗体及び／又は抗体断片を提供する。ある実施態様では、本開示は、この単離されたタンパク質複合体を、癌診断に及び／又は治療効果を観察するために用いる方法；並びに／又は対象における癌を治療するためのオーダーメード治療方法を開発するために用いる方法を提供する。
【００１７】
ある態様では、本開示は、ｐ５３並びにＨＤＭＸ、ＨＤＭ２、及び／又はｐ５３−ＨＤＭＸ複合体の１つ又はそれ以上のを検出するための組成物；並びに１つ又はそれ以上のｐ５３及びＨＤＭＸ、ＨＤＭ２、及び／又はｐ５３−ＨＤＭＸ複合体の１つ又はそれ以上の検出に基づく癌を有する対象における癌治療のためのオーダーメード治療計画を開発するための使用説明書を包含しているキットを提供する。ある実施態様では、本開示は１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び／又は１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤；１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び／又は１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤の投与に適している１つ又はそれ以上のデバイス；１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び／又は１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤どのように投与すべきかを提供する使用説明書を含んでいるキットを提供する。ｐ５３並びに１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ、ＨＤＭ２、及び／又はｐ５３−ＨＤＭＸ複合体を検出するための組成物；及び１つ又はそれ以上のｐ５３並びに１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ、ＨＤＭ２、及び／又はｐ５３−ＨＤＭＸ複合体並びに１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び／又は１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤の検出に基づく癌を有する対象における癌治療のためのオーダーメード治療計画を開発するための使用説明書；１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び／又は１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤の投与に適している１つ又はそれ以上のデバイス；並びに１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び／又は１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤をどのようにして投与すべきかを提供する使用説明書を包含しているキットも提供される。
【００１８】
ある態様では、本開示は、放射線治療を受ける予定になっている対象を治療する方法を提供する。このような方法は、１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び／又は１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤を少なくとも１用量の放射線治療の前に対象に投与することを包含できる。
【００１９】
ある態様では、本開示は、癌を有する対象を治療する方法を提供する。これらの方法は、１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び／又は１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤を少なくとも１用量の放射線治療の前に対象に投与し、そして対象を放射線治療に曝すことを包含できる。ある実施態様では、１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び／又は１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤を対象の腸に局所的に投与する。ある実施態様では、１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び／又は１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤を全身投与する。ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤は、ｐ５３の転写促進ドメインと少なくとも６０％同一性を有するアミノ酸配列を有しているペプチド、ｐ５３の転写促進ドメインと少なくとも６０％同一性を有するアミノ酸配列を有しているペプチド（ここで、ペプチドの相互作用面上のアミノ酸は保存されている）、及びｐ５３の転写促進ドメインと少なくとも６０％同一性を有するアミノ酸配列を有しているペプチド（ここで、ペプチドの相互作用面上の１つ又はそれ以上のアミノ酸は、ペプチドの相互作用面を変化させない保存アミノ酸で置換されている）を包含できる。ある実施態様では、ペプチドは１つ又はそれ以上の内部架橋剤で架橋されていてもよい。ある実施態様では、ｐ５３は、ヒトｐ５３である。ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤は図１Ｃに示した架橋されたペプチドであってよい。ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤はＳＡＨ−ｐ５３−８であってよい。ある実施態様では、ＨＤＭ２調節剤はＮｕｔｌｉｎ−３である。ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤及びＨＤＭ２調節剤の用量は相乗的用量又は相加的用量である。ある実施態様では、ＨＤＭ２調節剤は図１Ｃに示した架橋されたペプチドではない。
【００２０】
ある態様では、本開示は、アミノ酸配列、Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｐｈｅ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｔｒｐ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｌｅｕ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６  （配列番号２２）（ここで：Ｘａａ１はＬｅｕ又はＧｌｎ、又は欠失している；Ｘａａ２はＳｅｒ又は欠失している；Ｘａａ３はＧｌｎ又は欠失している；Ｘａａ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｌａであり；Ｘａａ５はＴｈｒ又はＡｌａであり；Ｐｈｅ６はＰｈｅ又はその同類置換であり；Ｘａａ７はＳｅｒであり；Ｘａａ８はＡｓｐ若しくはＡｓｎ又はＡｓｐ及びＧｌｕ以外の何れかのアミノ酸であり；Ｘａａ９はＬｅｕであり；Ｔｒｐ１０はＴｒｐ又はその同類置換であり；Ｘａａ１１はＬｙｓ又は正電荷を有するアミノ酸；Ｘａａ１２はＬｅｕ、Ｌｙｓ又はＡｌａであり；Ｌｅｕ１３はＬｅｕ又はその同類置換であり；Ｘａａ１４はＰｒｏ又は欠失している；Ｘａａ１５はＧｌｕ、Ｇｌｎ若しくはＡｌａ、若しくはＡｓｐ及びＧｌｕ以外の何れかのアミノ酸、又は欠失している；Ｘａａ１６はＡｓｎ又は欠失している、ここで２、３、又は６個のアミノ酸で隔てられている少なくとも２つのアミノ酸の側鎖は内部架橋に置き換えられている）の少なくとも６個の連続アミノ酸を含む内部架橋されたポリペプチドを提供する。ある実施態様では、内部架橋されたペプチドは、Ｘａａ１がＬｅｕ又は欠失している；Ｘａａ２がＳｅｒ又は欠失している；Ｘａａ３がＧｌｎ又は欠失している；Ｘａａ４がＧｌｕであり；Ｘａａ５がＴｈｒであり；Ｐｈｅ６がＰｈｅであり；Ｘａａ７がＳｅｒであり；Ｘａａ８がＡｓｐであり；Ｘａａ９がＬｅｕであり；Ｔｒｐ１０がＴｒｐであり；Ｘａａ１１がＬｙｓであり；Ｘａａ１２がＬｅｕであり；Ｌｅｕ１３がＬｅｕであり；Ｘａａ１４がＰｒｏ又は欠失している；Ｘａａ１５がＧｌｕ又は欠失している；Ｘａａ１６がＡｓｎ又は欠失している；ここでＰｈｅ６、Ｔｒｐ１０、及び／又はＬｅｕ１３の１つ、２つ及び／又は３つは、ペプチド及びＨＤＭＸの結合面間の相互作用を変化させない同類アミノ酸置換で置換されていて；及び／又はＰｈｅ６、Ｔｒｐ１０、及び／又はＬｅｕ１３に対応する残基以外のアミノ酸は配列番号１又は配列番号２の配列と少なくとも３０％（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は１００％）同一である、を包含する。ある実施態様では、ペプチドは配列番号１０のアミノ酸配列を含んでいる。ある実施態様では、内部架橋されたペプチドは表１に示したステープル状の架橋から選ばれる内部架橋に置き換えられた側鎖を有する少なくとも２つのアミノ酸をを包含している。ある実施態様では、内部架橋されたペプチドは、表１に示したステープル状の架橋から選ばれる内部架橋に置き換えられた側鎖を有する少なくとも２つのアミノ酸を包含している。ある実施態様では、内部架橋に置き換えられた側鎖を有する少なくとも２つのアミノ酸は表１から選ばれる１つ又はそれ以上のステープル状の架橋を含んでいる。ある実施態様では、内部架橋に置き換えられた側鎖を有する少なくとも２つのアミノ酸は、表１に示した少なくとも１つのステープル状の架橋及び少なくと���１つの縫合状の架橋（stitch)を含んでいる。ある実施態様では、内部架橋に置き換えられた側鎖を有する少なくとも２つのアミノ酸は、Ｘａａ７とＸａａ１４の間に位置している。ある実施態様では、内部架橋に置き換えられた側鎖を有する少なくとも２つのアミノ酸は、少なくとも２つのアミノ酸が６アミノ酸分離れている１つ又はそれ以上のステープル状の架橋を包含している。ある実施態様では、内部架橋は配列番号２〜２１に示した１つ又はそれ以上の位置に位置している。
【００２１】
ある態様では、本開示は、本明細書で開示された１つ又はそれ以上の架橋されたペプチド（例えば、表１又は図１Ｃに開示された１つ又はそれ以上のペプチド）を含有している医薬組成物を提供する。
【００２２】
ある態様では、本開示は、本明細書で開示された１つ又はそれ以上の架橋されたペプチド（例えば、表１又は図１Ｃに開示された１つ又はそれ以上のペプチド）及び１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤を含有している医薬組成物を提供する。ある実施態様では、１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤はＮｕｔｌｉｎ−３を包含する。
【００２３】
別段の定義がない限り、本明細書で用いられる全ての技術及び科学用語は、本発明に関連する当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有している。方法及び材料は本発明で用いるために本明細書に記載されているほか；当該技術分野で公知の適切な方法及び材料も用いることができる。材料、方法、及び実施例は説明のためだけであって限定を意図していない。本明細書で述べられている全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース登録、及びその他の引例はその全てが参照により本明細書に取り込まれている。矛盾する場合は、定義を含む、本明細書が支配する。
【００２４】
本発明のその他の特徴及び利点は以下の詳細な説明、図面から、そして特許請求の範囲から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】図１Ａは、例示的なステープル状に架橋されたｐ５３α螺旋の構造を示す素描である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、野生型ｐ５３（配列番号２）、ＳＡＨ−ｐ５３−８（配列番号１０）、及びＳＡＨ−ｐ５３−８Ｆ１９Ａ（配列番号１３）のアミノ酸配列の１４〜２９番目のアミノ酸を示す。ペプチドの活性に不可欠なアミノ酸が囲いで示される。繋ぎ止めされたアミノ酸が＊として示される。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＳＡＨ−ｐ５３−８及びその他の例示的なステープル状に架橋されたｐ５３ペプチド（配列番号２〜２１）の配列及び物理的な特性を示す表である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ペプチドをステープル状に架橋する例示的な方法を示す素描である。
【図１Ｅ】図１Ｅは、炭化水素によってステープル状に架橋されたｐ５３ペプチドを作成するために用いることができるオレフィン鎖を含有している多種の非天然アミノ酸を示す。
【図１Ｆａ−１Ｆｄ】図１Ｆａ〜１Ｆｄは、ｉ、ｉ＋３；ｉ、ｉ＋４；及びｉ、ｉ＋７位にまたがる各種の単一のステープル状の架橋を有する組成物、及び単一のステープル状の架橋を有するｐ５３ペプチドのライブラリーを作成するための単一のステープル状の架橋のスキャンニングを示す。
【図１Ｇａ−１Ｇｈ】図１Ｇａ〜１Ｇｈは、多数のステープル状に架橋されたペプチドにおける各種のステープル状の架橋の組成、及び多数のステープル状に架橋されたｐ５３ペプチドのライブラリーを作成するためのステープル状の架橋のスキャンニングを示す。
【図１Ｈａ−１Ｈｉ】図１Ｈａ〜１Ｈｉは、直列にステープル状に架橋されたペプチドにおける各種ステープル状の架橋の組成、及び直列にステープル状に架橋されたｐ５３ペプチドのライブラリーを作成するためのステープル状の架橋のスキャンニングを示す。
【図２Ａ−２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、蛍光偏光（Ａ）で評価した組み換えＨＤＭＸとＦＩＴＣ標識化ｐ５３ペプチド間の直接結合；及びＳＡＨ−ｐ５３−８又はＮｕｔｌｉｎ−３を用いるＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ｐ５３−８とＨＤＭ２（Ｂ）又はＨＤＭＸ（Ｃ）の間の結合を妨害する競合結合アッセイを示す線グラフである。ｍｐはミル偏光の単位である。データは少なくとも３回の独立した実験の平均結果プラス標準偏差を示す。
【図３】図３は、ウェスタンブロッティングで検出した、ＨＤＭＸ、ＨＤＭ２、ＦＩＴＣ−ペプチド又はアクチンのレベルを示す画像である。左側の画像はウェスタンブロッティングで検出された総タンパク質を示す。右側の画像は免疫沈降（ＩＰ）に続いて検出したタンパク質を示す。β−アクチンは負荷コントロールとして包含された。ＦＩＴＣ標識化ペプチドはウェスタンブロッティングの蛍光スキャンによって検出した。
【図４Ａ−４Ｉ】図４Ａ〜４Ｉは、ＳＡＨ−ｐ５３−８、Ｎｕｔｌｉｎ−３又はＳＡＨ−ｐ５３−８Ｆ１９Ａに曝露した各種細胞株における細胞生存能を示す線グラフである。用いた細胞株は、ＨＤＭ２、ＨＤＭＸ／ＭＤＭ２若しくはＭＤＭＸ（図４Ａ〜４Ｅ）又は欠失若しくは機能不全のｐ５３（図４Ｆ〜４Ｈ）の異なる発現レベルを有する癌細胞株（例えば、骨肉腫、絨毛腫、結腸癌、上皮癌、乳癌）、及び非腫瘍コントロール（図４Ｉ）を包含した。細胞をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標、Promega）に曝露して、ＡＴＰで誘導された化学発光によって生存能を評価した。データは少なくとも３度実施した実験に対する平均値プラス標準偏差である。
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａ及び５Ｂは、ＳＡＨ−ｐ５３−８がｐ５３−ＨＭＤＸ複合体の形成を阻害することを示す画像である。  （Ａ）ＪＥＧ−３細胞を賦形剤、２０μＭのＳＡＨ−ｐ５３−８、又は２０μＭのＮｕｔｌｉｎ−３に６時間曝露した。細胞抽出物（インプット）及び抗ＨＤＭＸ免疫沈降物（ＩＰ：ＨＤＭＸ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングに付した。画像は、ウェスタンブロッティングで検出したｐ５３、ＨＤＭＸ、及びＨＡＵＳＰのレベルを示す。  （Ｂ）ＪＥＧ−３細胞を、１０μＭのＭＧ１３２の存在下、ＳＡＨ−ｐ５３−８の濃度を増大させて（すなわち、０〜２０μＭのＳＡＨ−ｐ５３−８）で６時間処置した。細胞抽出物（インプット）及び抗ＨＤＭＸ免疫沈降物（ＩＰ：ＨＤＭＸ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ並びにｐ５３、ＨＤＭＸ、及びＨＡＵＳＰについてのウェスタンブロッティングで分析した。インプットのレベルは総タンパク質を示し、そしてＩＰは免疫沈降に続き検出されたタンパク質レベルを示す。
【図５Ｃ−５Ｅ】図５Ｃ〜５Ｅは、無傷細胞におけるｐ５３−ＨＭＤＸ複合体の形成をＳＡＨ−ｐ５３−８は阻害するがＮｕｔｌｉｎ−３は阻害しないことを示す画像及びそれに由来する棒グラフである。  （Ｃ）ドキシサイクリン誘導性Ｕ２ＯＳ細胞を、Ｎｕｔｌｉｎ−３（１０μＭ）、ＳＡＨ−ｐ５３−８（１０μＭ）、又は両方の存在下、ドキシサイクリンで処置するか又は処置しないで、ＨＡ−ＨＤＭＸ及びｐ５３の誘導を免疫蛍光法で検出及び定量した。スケールバーは１０ミクロンである。  （Ｄ）インキュベートしたＵ２ＯＳ細胞を、Ｎｕｔｌｉｎ−３、ＳＡＨ−ｐ５３−８、又は両方の存在下、ドキシサイクリンで処置するか又は処置せずに、次いでＰ−ＬＩＳＡで処理した。スケールバーは１０ミクロンである。  （Ｅ）Ｐ−ＬＩＳＡで検出されたｐ５３−ＨＤＭＸ複合体の定量。データは平均値±ｓ．ｄ．＊ｐ＝０．０００３、＊＊ｐ＝０．０００１、ウェルチ補正を伴う対応のないｔ−検定。
【図６Ａ】図６Ａは、ｐ５３転写活性はＳＡＨ−ｐ５３−８によって再活性化されることを示す棒グラフである。ＪＥＧ−３細胞を、賦形剤、２０μＭのＳＡＨ−ｐ５３−８（２０μＭ）、又は２０μＭのＮｕｔｌｉｎ−３（２０μＭ）で処置した。転写の上方調節を定量的ＰＣＲで評価した。ＳＡＨ−ｐ５８−８（左棒）、Ｎｕｔｌｉｎ−３（中棒）、及び賦形剤コントロール（右棒）の存在下でのＨＤＭ２、ｐ２１、及びＭＩＣ−１のｍＲＮＡレベルを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ｐ５３−依存性アポトーシスがＳＡＨ−ｐ５３−８によって再活性化されることを示す線グラフである。ＪＥＧ−３細胞を、賦形剤、増大する濃度（すなわち、０．３〜１０μＭのＳＡＨ−ｐ５３−８）、又はＮｕｔｌｉｎ−３で１２時間処置した。細胞をカスパーゼ３／７−Ｇｌｏ（登録商標）試薬に曝露し、そして発光前カスパーゼ３／７基質の開裂を検出することによりアポトーシスのレベルを評価した。
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａ及び７Ｂはそれぞれ、インビボにおいて、ＳＡＨ−ｐ５３−８がＨＤＭＸが介在するｐ５３の抑制を克服して腫瘍の生育を阻害することを示している、線グラフ及び棒グラフを示す。  （Ａ）ＪＥＧ−３を異種移植したマウスの集団（ｎ＝７）を、賦形剤（Ｄ５Ｗ中５％のＤＭＳＯ）、又は１０ｍｇ／ｋｇのＳＡＨ−ｐ５３−８を４日間毎日静脈内投与で導入、又はＮｕｔｌｉｎ−３を４日間毎日静脈内投与で導入、の何れかで処置した。腫瘍体積を１、３、４、及び５日目にノギス測定で観察した（データの統計学的有意性は：３日目；ＳＡＨ−ｐ５３−８対賦形剤  ｐ＝０．０３２、ＳＡＨ−ｐ５３−８対Ｎｕｔｌｉｎ−３  ｐ＝０．０３２、Ｎｕｔｌｉｎ−３対賦形剤  ｐ＝０．９４；４日目；ＳＡＨ−ｐ５３−８対賦形剤  ｐ＝０．００８、ＳＡＨ−ｐ５３−８対Ｎｕｔｌｉｎ−３  ｐ＝０．０２６、Ｎｕｔｌｉｎ−３対賦形剤  ｐ＝０．８８；５日目；ＳＡＨ−ｐ５３−８対賦形剤  ｐ＝０．０１７、ＳＡＨ−ｐ５３−８対Ｎｕｔｌｉｎ−３  ｐ＝０．０３７、Ｎｕｔｌｉｎ−３対賦形剤  ｐ＝０．４６である）。  （Ｂ）腫瘍を切除し、ＲＮＡを単離して、ｐ５３転写標的ＨＤＭ２、ｐ２１、及びＭＩＣ−１をｑＰＣＲで分析した。
【図８】図８は、ｐ５３−ＨＭＤＸ複合体の薬理学的誘導がＮｕｔｌｉｎ−３耐性癌細胞をＨＤＭＸ阻害に対して敏感にすることを示す免疫ブロットの画像である。ＭＣＦ−７乳腺腺癌細胞を、賦形剤、Ｎｕｔｌｉｎ−３（２０μＭ）、又は５若しくは２０μＭのＳＡＨ−ｐ５３−８と組合せたＮｕｔｌｉｎ−３（２０μＭ）に曝露した。細胞を１０μＭのＭＧ−１３２に６時間曝露してＨＤＭＸ−ｐ５３複合体形成を誘導した。細胞抽出物（インプット−左側免疫ブロット）及び抗−ＨＤＭＸ免疫沈降物（ＩＰ：ＨＤＭＸ−右側免疫ブロット）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングで分析した。ｐ５３及びＨＡＵＳＰのレベルを示す。
【図９Ａ−９Ｂ】図９Ａ〜９Ｂは、ＳＡＨ−ｐ５３−８とＮｕｔｌｉｎ−３が腫瘍細胞の生存能を減少させるように相乗的に作用することを示す棒グラフである。  （Ａ）ＭＣＦ−７細胞を２０μＭのＮｕｔｌｉｎ−３の存在下又は非存在下に、増大する濃度（すなわち、５〜２０μＭ）のＳＡＨ−ｐ５３−８に曝露した。細胞生存能を２４時間時点でＣｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）で評価した。  （Ｂ）ＭＣＦ−７細胞を２０μＭのＳＡＨ−ｐ５３−８の存在下又は非存在下に、増大する濃度（すなわち、５〜２０μＭ）のＮｕｔｌｉｎ−３に曝露して、細胞生存能を「（Ａ）」のように評価した
【図１０Ａ−１０Ｄ】図１０Ａ〜１０Ｄは、ＳＡＨ−ｐ５３−８とＮｕｔｌｉｎ−３が相乗作用をもたらすことを示す相乗効果のグラフである。ＭＣＦ−７（Ａ）、ＪＥＧ−３（Ｂ）、ＳＪＳＡ−１（Ｃ）、及びＳＪＳＡ−Ｘ（Ｄ）細胞を０．５〜２０μＭのＳＡＨ−ｐ５３−８、Ｎｕｔｌｉｎ−３、又は等モル混合物で処置した。次いで、用量効果の相乗作用分析を実施してそれを示した。
【図１０Ｅ−１０Ｇ】図１０Ｅ〜１０Ｇは、ＳＡＨ−ｐ５３−８とＮｕｔｌｉｎ−３がリンパ腫及びメラノーマにおいて相乗的な抗腫瘍活性を表わすことを示す相乗効果のグラフである。
【図１１Ａ−１１Ｅ】図１１Ａ〜１１Ｅは、Ｐ５３及びＨＤＭ２（Ａ）、ｐ５３及びＨＤＭＸ（Ｃ）、並びにｐ５３、ＨＤＭ２、及びＨＤＭＸを発現すると同定された癌に対する治療戦略を説明している素描である。（Ｂ）及び（Ｄ）は失敗するであろう治療戦略を示す。
【図１２】図１２は、ＨＤＭＸと結合するＳＡＨ−ｐ５３−８によるｐ５３の再活性化を説明している素描である。
【図１３】図１３は、ヒトｐ５３のアミノ酸配列（配列番号１：Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＣＡＡＡ４２６２７（ＣＡＡ４２６２７．１）；ｇｉ：５０６３７）を示す。
【００２６】
各種図面中の同様な参照記号は同様な要素を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本開示は、とりわけ、ステープル状に架橋されたｐ５３ペプチド、例えば、ＨＤＭ２を標的にするために初めに開発されたステープル状に架橋されたｐ５３ペプチドがＨＤＭＸと高い親和性で結合するという予想外の発見に基づいている。更に、ステープル状に架橋されたｐ５３ペプチドは、それらがＨＤＭ２と結合するより２５倍高い親和性でＨＤＭＸと結合する。従って、本開示は、ある特定の癌を治療するため又は治療法を開発するための新規な方法及び組成物（例えば、組成物の組合わせ）を提供する。
【００２８】
治療に適している癌は、癌細胞がある程度のレベルの機能的ｐ５３を発現しているか、又は機能的ｐ５３発現を誘発できるものを包含している。例えば、機能的ｐ５３が発現されるが、ＨＤＭＸによってｐ５３のレベル又は活性が細胞中で低下する何れかの癌細胞、及び／又はＨＤＭＸが本明細書に開示されている組成物又は方法を用いて有利に治療できる何れかの癌細胞である。
【００２９】
本明細書に開示されているように、ｐ５３活性は、癌細胞で、本明細書に開示されているある状況においてＨＤＭＸ調節剤（例えば、図１Ｃに開示されているようなステープル状に架橋されたペプチド）を単独で、又は本明細書に開示されている別の状況においてＨＤＭＸ調節剤をＨＤＭ２調節剤と組み合わせて用いて、増大できる。本明細書で示すように、ｐ５３活性のこのような増大はインビトロ及びインビボにおける癌細胞の生存能の減少又は死をもたらすことができる。従って、本明細書に開示された組成物及び方法は癌の治療に用いることができる。本明細書に開示された組成物及び方法においてＨＤＭＸ調節剤及びＨＤＭ２調節剤として用いるのに適している薬剤は以下に開示されている。
【００３０】
ＨＤＭＸ調節剤
本開示に包含されるＨＤＭＸ調節剤は、細胞におけるｐ５３の発現、レベル及び／又は活性を直接的に（例えば、結合して）、又は間接的に（例えば、ＨＤＭＸ発現及び／又は活性を調節する分子又は経路（例えば、ユビキチン化経路及びＥ３ユビキチンリガーゼのようなこの経路の要素を介して）、細胞におけるＨＤＭＸの発現（例えば、タンパク質又はｍＲＮＡの発現）及び／又はレベル（タンパク質レベル）を阻害することによって、細胞におけるｐ５３の発現、レベル及び／又は活性を増大する薬剤を包含する。
【００３１】
ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤は、以下に開示される１つ又はそれ以上の薬剤を包含できる。例えば、ＨＤＭＸ調節剤は、（１）ＨＤＭＸと結合する１つ又はそれ以上の架橋されていないペプチド；（２）ＨＤＭＸと結合する１つ又はそれ以上のステープル状に架橋された又は縫合状に架橋されたｐ５３ペプチド；（３）ＨＤＭＸと結合する１つ又はそれ以上の小分子；（４）ＨＤＭＸと結合する（例えば、特異的に結合する）１つ又はそれ以上の抗体又は抗体の断片；（５）ＨＤＭＸの発現を減少する１つ又はそれ以上の核酸分子（例えば、抑制性核酸分子（例えば、ＲＮＡｉ又はｓｉＲＮＡ））；（６）ＨＤＭＸの発現及び／又は活性を減少する１つ又はそれ以上の医薬品；及び（７）ＨＤＭＸの発現及び／又は活性を減少する１つ又はそれ以上の方法、並びに（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）及び／又は（７）の何れかの組合わせ又は（１）と（２）、（３）、（４）、（５）、（６）及び／又は（７）との何れかの組合わせを包含できる。
【００３２】
ある実施態様では、本明細書で開示されている方法及び組成物で用いられるＨＤＭＸ調節剤は：本明細書で開示されているＨＤＭ２調節剤と同一ではない（例えば、ＨＤＭＸ調節剤はＨＤＭ２と結合せずに（例えば、実質的に結合しない）ＨＤＭＸと特異的に結合する）。
【００３３】
ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤はＨＤＭＸ及びＨＤＭ２と結合できる。しかしながら、このような実施態様では、ＨＤＭＸ阻害剤は一般に、ＨＤＭ２に対するよりＨＤＭＸ対してより高い結合親和性を有している（例えば、ＨＤＭＸ調節剤の結合親和性は、ＨＤＭ２に対してより、ＨＤＭＸに対して、２、５、１０、２０、２５、５０、７５、１００、２５、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００倍又はそれ以上高い）。
【００３４】
ＨＤＭＸ調節ペプチド
ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤はペプチド（例えば、組み換え又は合成によって産生されたペプチド）である。上記のように、このようなペプチドは、例えば、本明細書に記載されているようにＨＤＭＸと相互作用するペプチドであるならば、架橋されていなくても、ステープル状に架橋されていても又は縫合状に架橋されていてもよい。
【００３５】
ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節タンパク質は野生型ヒトｐ５３タンパク質又はアミノ酸配列（例えば、配列番号１）の部分（複数を含む）に関連しているか又は同一であるアミノ酸配列を包含する（例えば、含む、からなる、又は本質的にからなる）ことができる。例えば、ペプチドは野生型ｐ５３の１つ又はそれ以上のドメインを包含できる。このようなドメインは天然に連続していてもよい。あるいは、非天然連続ｐ５３ドメインを組合せてもよい。ある例では、ペプチドは少なくとも６個（例えば、配列番号１の連続アミノ酸を、３６１、３６１未満、３００未満、２００未満、１００未満、５０未満、２５未満、及び２０未満を包含する、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又はそれ以上）を包含できる。
【００３６】
ある例では、配列番号１の部分（複数を含む）との同一性を有するペプチドは、ｐ５３の相互作用面（例えば、ｐ５３の転写促進ドメインの相互作用面）のアミノ酸に対応するアミノ酸に関して第１レベルの同一性を有して、相互作用面に対応しないアミノ酸に関して第２レベルの同一性を有している。例えば、ｐ５３の相互作用面（例えば、ｐ５３の転写促進ドメインの相互作用面）のアミノ酸に対応するアミノ酸は、保存されていても又はｐ５３の相互作用面（例えば、ｐ５３の転写促進ドメインの相互作用面）に存在するアミノ酸の同類置換であってもよい。対照的に、相互作用面の外のアミノ酸は、配列番号２又は２２〜２３内のペプチドの相互作用面の外のアミノ酸と少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％同一性を有することができる。或いは又は更に、相互作用面の外にあるアミノ酸は同類であろうとなかろうと、アミノ酸の置換及び／又は欠失を包含できる。例えば、相互作用面の外にあるアミノ酸は、同類であろうとなかろうと、１、２、３、４、５、６、７、８、１０未満、５未満、４未満、３未満、又は２未満のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加を包含できる。従って、相互作用面の残基が配列番号２のそれと同一であるか又はその同類置換である限り、本明細書に開示されている何れかのペプチドのアミノ酸配列は変更することができる。
【００３７】
本明細書のペプチドの「相互作用面」は、ＨＤＭＸと相互作用する（例えば、特異的に相互作用する、或いは特異的に結合する）ｐ５３α螺旋のアミノ酸残基を包含する。ｐ５３転写促進ドメインの相互作用面に含まれているアミノ酸残基を包含する、ｐ５３の相互作用面内に含まれているアミノ酸残基は当該技術分野において公知である（例えば、Kussie et al., Science, 274(5289):948-953 (1996), and Joseph et al., Cell Cycle, 9(22):4560-4568 (2010)を参照されたい）。ある例では、Kussie et al., Science, 274(5289):948-953 (1996) 又はJoseph et al., Cell Cycle, 9(22):4560-4568 (2010)によって開示されたようなｐ５３の相互作用面内のアミノ酸に対応する本明細書で開示されたペプチドのアミノ酸は、Kussie et al., Science, 274(5289):948-953 (1996),及びJoseph et al., Cell Cycle, 9(22):4560-4568 (2010)によって開示されたアミノ酸と同一であるか又は同類置換であってよい。例えば、ある例では、本明細書に開示されているペプチドの相互作用面内のアミノ酸は、野生型ｐ５３（配列番号１）のＰｈｅ１９、Ｔｒｐ２３、及びＬｅｕ２６に対応している。ある例では、これらの位置は以下の配列で下線が付されている：ＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬＰＥＮ（配列番号２）。本明細書に開示されているペプチド内に包含させるのに適している同類置換を以下に検討する。例えば、ある例では、「同類アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基を類似する側鎖を有する他のアミノ酸残基と置き換える置換を包含できる。類似側鎖を有しているアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を包含する。ある例では、本明細書に開示されているペプチド（例えば、配列番号１及び配列番号２〜２１）の相互作用面内のアミノ酸に関連して、同類アミノ酸置換は、ペプチドの疎水性相互作用面の構造を変えないアミノ酸置換である。例えば、同類アミノ酸置換はペプチドのＨＤＭＸとの結合を低下させない（実質的に低下させない）アミノ酸置換である。結合における何れかの減少を検出する方法は、同類アミノ酸置換後の結合親和性を比較することを包含し、ここで結合を低下させる（実質的に低下させる）何れのアミノ酸置換も同類アミノ酸置換ではない。ある実施態様では、実質的に低下した結合は、改変していないペプチドのＨＤＭＸとの結合より１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％低い結合を包含する。ペプチドとＨＤＭＸの間の相互作用を評価する方法は本明細書に開示されている。ペプチドの相互作用面を同定する方法は当該技術分野において公知である（例えば、Broglia et al., Protein sci., 14(10):2668-81, 2005; Hammond et al., J. Pharm. Sci., 98(1):4589-603, 2009; Ng and Yang, J. Phys. Chem. B., 111(50):13886-93, 2007; 及び Bird et al., PNAS USA, 197:14093, 2010を参照されたい）。
【００３８】
ある実施態様では、ペプチドは、ｐ５３（例えば、配列番号１）の転写促進ドメインに対応する配列：Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｐｈｅ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｔｒｐ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｌｅｕ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６（配列番号２２）（ここで、Ｘａａ１−Ｘａａ５、Ｘａａ７−Ｘａａ９、及びＸａａ１１−Ｘａａ１６のそれぞれ又は何れかは何れかのアミノ酸（例えば２０個の天然アミノ酸の何れか）であるか又は欠失している）の少なくとも６個（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個）の連続アミノ酸を包含している（例えば、含有する、から成る、又は本質的にからなる）。
【００３９】
ある実施態様では、
Ｘａａ１は、Ｌｅｕ若しくはＧｌｎであるか、又は欠失している；
Ｘａａ２は、Ｓｅｒであるか、又は欠失している；
Ｘａａ３は、Ｇｌｎであるか、又は欠失している；  
Ｘａａ４は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｌａである；
Ｘａａ５は、Ｔｈｒ又はＡｌａである；
Ｐｈｅ６は、Ｐｈｅ又はその同類置換である；
Ｘａａ７は、Ｓｅｒである；
Ｘａａ８は、Ａｓｐ若しくはＡｓｎ、又はＡｓｐ及びＧｌｕ以外のアミノ酸（好ましくはＡｓｎ）である；
Ｘａａ９は、Ｌｅｕである；
Ｔｒｐ１０は、Ｔｒｐ又はその同類置換である；
Ｘａａ１１は、Ｌｙｓ又は正荷電したアミノ酸（好ましくはＡｒｇ）である；  
Ｘａａ１２は、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ又はＡｌａである；
Ｌｅｕ１３は、Ｌｅｕ又はその同類置換である；
Ｘａａ１４は、Ｐｒｏであるか、又は欠失している；
Ｘａａ１５は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ若しくはＡｌａ、若しくはＡｓｐ及びＧｌｕ以外のアミノ酸（好ましくはＧｌｎ）であるか、又は欠失している；
Ｘａａ１６は、Ａｓｎであるか、又は欠失している。
ここで、一つ又はそれ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個）のＸａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｐｈｅ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｔｒｐ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｌｅｕ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６はペプチドの相互作用面を変えない同類アミノ酸置換に置き換えられており；及び／又はＰｈｅ６、Ｔｒｐ１０、及び／又はＬｅｕ１３に対応する残基以外のアミノ酸は配列番号１の配列と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、又は１００％）同一であり；及び／又はＰｈｅ６、Ｔｒｐ１０、及び／又はＬｅｕ１３に対応する残基以外のアミノ酸は１つ又はそれ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、１０未満、５未満、４未満、３未満、又は２未満）の同類又は非同類の置換又は欠失を包含している。
ここでペプチドは任意に安定したα螺旋二次構造を有するように適合されている。
【００４０】
ある場合は、ペプチドは、配列：Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｐｈｅ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｔｒｐ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｌｅｕ１３（配列番号２３）を有する配列番号２２の一部分を包含する（例えば、含有する、から成る、又は本質的にからなる）ことができる。
【００４１】
ある実施態様では、上で示したように、本明細書のペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２の相互作用面に対応するアミノ酸（例えば、Ｐｈｅ６、Ｔｒｐ１０、及び／又はＬｅｕ１３）以外のものを、殆ど制限なしに、変えることができる。例えば、相互作用面の外のアミノ酸は、配列番号２又は２２〜２３内のペプチドの相互作用面の外のアミノ酸と少なくとも又は約３０％、少なくとも又は約４０％、少なくとも又は約５０％、少なくとも又は約６０％、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約９８％、少なくとも又は約９９％、少なくと又は約１００％の同一性を有することができる。或いは又は更に、相互作用面の外のアミノ酸は、同類であろうとなかろうと、アミノ酸の置換及び／又は欠失を包含できる。例えば、相互作用面の外のアミノ酸は、１、２、３、４、５、６、７、８の、１０未満、５未満、４未満、３未満、又は２未満のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加を、同類であろうとなかろうと、包含できる。従って、本明細書に開示されている何れのペプチドのアミノ酸配列も、相互作用面の残基が配列番号２のそれと同一であるか、又はその同類置換である限り、変えることができる。ある例では、ペプチドは、ＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬＰＥＮ（配列番号２）を包含する（例えば、含有する、から成る、又は本質的にからなる）ことができる。
【００４２】
ある実施態様では、ペプチドは、Pazgier et al., PNAS, 106;4665-4670 (2009)（これはその全てが参照により本明細書に取り込まれている）に開示されている１つ又はそれ以上のペプチドを包含する（例えば、含有する、から成る、又は本質的にからなる）ことができる。例えば、ＨＤＭＸ調節剤は、Pazgier et al., PNAS, 106;4665-4670 (2009)に開示されているペプチドＴＳＦＡＥＹＷＮＬＬＳＰ（ＰＭＩと称する（配列番号２４））及びＬＴＦＥＨＹＷＡＱＬＴＳ（ｐＤＩと称する（配列番号２５））を包含できる。
【００４３】
ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節ペプチドは、１つ又はそれ以上の内部ペプチド架橋剤で架橋（例えば、ステープル状に架橋又は縫合状に架橋）されている。「ペプチドをステープル状に架橋する」とは、合成方法（Blackwell et al., J. Org. Chem., 66: 5291-5302, 2001; Angew et al., Chem. Int. Ed. 37:3281, 1994）に由来する造語であり、当該合成方法では、ポリペプチド鎖に存在する２つのオレフィン含有側鎖（例えば、架橋可能な側鎖）を、架橋された環を形成するための閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を用いて共有結合する（例えば、「オレフィン含有側鎖を合わせてステープル状に架橋する」）。本明細書で用いられる用語「ペプチドをステープル状に架橋する」とは、ポリペプチド鎖に存在している、２つの二重結合含有側鎖、２つの三重結合含有側鎖、又は１つの二重結合含有側鎖と１つの三重結合含有側鎖を、このような反応を促進する各種の反応条件及び／又は触媒を用いて、連結して単一の「ステープル状に架橋された」ペプチドを提供することを包含している。更に、本明細書で用いられる用語「ペプチドを縫合状に架橋する」とは、「縫合状に架橋された」（多数のステープル状に架橋された）ポリペプチドをもたらす、単一ポリペプチド鎖における多重及び直列に（例えば、１つのアミノ酸が２つのアミノ酸と架橋されている）ステープル状にペプチドを架橋する事象を示す。ペプチドをステープル状に架橋することは、国際特許公開第ＷＯ２００８１２１７６号及び同第ＷＯ２０１０／０６８６８４号公報に開示されており、両者は参照により本明細書に取り込まれている。
【００４４】
全てが炭化水素の架橋を用いるペプチドのステープル状の架橋化は、特に生理的に適切な条件下で、その元来の立体配座及び／又は二次構造を保持するのに役立つことが示されている（Schafmiester et al., J. Am. Chem. Soc., 122:5891-5892, 2000; Walensky et al., Science, 305:1466-1470, 2004）。
【００４５】
全てが炭化水素の架橋によって本明細書のポリペプチドをα螺旋二次構造を有するようにステープル状に架橋化することは、ポリペプチドをその元来のα螺旋構造に拘束することができる。拘束された二次構造は、例えば、ペプチドのタンパク分解開裂に対する耐性を増大し、ペプチドの疎水性を増大でき、ペプチドの標的細胞の膜内への優れた浸透を可能にでき（例えば、細胞飲作用のようなエネルギー依存性輸送メカニズムを介して）、対応する架橋されていない（例えば、「縫合状に架橋されていない（unstitched）」又は「ステープル状に架橋されていない（unstapled）」）ペプチドと比べてペプチドの生物活性の改善をもたらすことができる。このような拘束はアポトーシス誘発ＢＩＤ−ＢＨ３α螺旋に適用されて、動物モデルにおいて縫合状に架橋されていないポリペプチドと比較して白血病の悪性腫瘍生育のより高い抑制をもたらした（Walensky et al., Science, 305:1466-1470, 2004;米国特許出願公開第２００５／０２５０６８９０号；及び同第２００６／０００８８４８号、これらはそれぞれ参照により本明細書に取り込まれている）。適切な架橋（closs-links；これらは技術分野において繋ぎ止め（tethers）とも呼ばれている）は，本明細書及び米国特許公開第２００５／０２５０６８０号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５８５７５号、米国特許出願第１２／８６４，３７５号（ＷＯ２００９／１０８２６１）、及び国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／１４８３３５号に記載されている。
【００４６】
本明細書に開示されている架橋されたペプチドは、天然又は非天然のアミノ酸を包含し、（アミノ酸の側鎖が置換されている）２つのアミノ酸のα炭素の間に結合（linkage）を有することができる。本明細書に開示されているペプチドを得る（例えば、合成する）ために、及び精製するために適している方法は当該技術分野において公知であり（例えば、Bird et. al., Methods in Enzymol., 446:369-386 (2008); Walensky et al., Science, 305:1466-1470 (2004); Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc., 122:5891-5892 (2000); 米国特許出願第１２／５２５，１２３号（２０１０年３月１８日出願）、及び米国特許第７，７２３，４６８号（２０１０年５月２５日登録）を参照されたい、これらはそれぞれその全てが参照により本明細書に取り込まれている）、そして本明細書に記載されている（例えば、実施例１を参照されたい）。
【００４７】
ある実施態様では、このような架橋されたｐ５３ペプチドは、架橋されていない又はコントロールのペプチド、例えば、同じアミノ酸配列を有している架橋されていないペプチドよりもＨＤＭＸに対してより高い親和性を示すことができる。ある実施態様では、架橋されたｐ５３ペプチドは、細胞膜を貫通でき、或いは架橋されていない又はコントロールのペプチド、例えば、同じアミノ酸配列を有している架橋されていないペプチドよりもより高い細胞透過性を有している。ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤は、Pazgier et al., PNAS, 106;4665-4670 (2009)に開示されているペプチドの１つ又はそれ以上の架橋された型を包含できる。例えば、ＨＤＭＸ調節剤は、Pazgier et al., PNAS, 106;4665-4670 (2009)に開示されているＴＳＦＡＥＹＷＮＬＬＳＰ（ＰＭＩと称する（配列番号２４））又はＬＴＦＥＨＹＷＡＱＬＴＳ（ｐＤＩと称する（配列番号２５））のステープル状に架橋された又は縫合状に架橋された型を包含できる。ある例では、ＰＭＩは、Ｆ、Ｗ及び最後のＬが無傷のままで又は改変されずに残っている限り（例えば、ＴＳＦＡＥＹＷＮＬＬＳＰ（配列番号２４）において下線を付けたアミノ酸が無傷のままで又は改変されずに残っている限り）何れかの２つのアミノ酸の間を架橋（例えば、内部架橋）を用いてステープル状に架橋することができる。ある例では、ｐＤＩは、Ｆ、Ｗ及び最後のＬ又はＴが無傷のままで又は改変されずに残っている限り（例えば、ＬＴＦＥＨＹＷＡＱＬＴＳ（配列番号２５）又はＬＴＦＥＨＹＷＡＱＬＴＳ（配列番号２５）において下線を付けたアミノ酸が無傷のままで又は改変されずに残っている限り）何れかの２つのアミノ酸の間を架橋（例えば、内部架橋）を用いてステープル状に架橋することができる。
【００４８】
配列番号１はヒトｐ５３の配列である。ある例では、架橋されたペプチドは、配列：Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｎ（配列番号１の１４〜２９番目のアミノ酸（配列番号２））を包含できる。架橋されたペプチドは、Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｓｎ（配列番号２６）又は配列：Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｓｎ（配列番号２７）も包含できる。配列の何れかにおいて、２、３、４又は６アミノ酸分離れている２つのアミノ酸の側鎖を結合基（linking group）Ｒ３で置換できる。
【００４９】
ステープル状に架橋されたポリペプチドは以下のアミノ酸配列の全て又は一部（例えば、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個）を包含できる：
Ｘａａ１Ｓｅｒ２Ｇｌｎ３Ｘａａ４Ｔｈｒ５Ｐｈｅ６Ｘａａ７Ｘａａ８Ｌｅｕ９Ｔｒｐ１０Ｘａａ１１Ｌｅｕ１２Ｌｅｕ１３Ｘａａ１４Ｘａａ１５Ａｓｎ１６（配列番号２８）、ここで、Ｘａａ１、Ｘａａ４、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ１１、Ｘａａ１４、Ｘａａ１５のそれぞれは何れかのアミノ酸（例えば、２０個の天然アミノ酸）である。
【００５０】
ある状況では：
Ｘａａ１は、Ｌｅｕ若しくはＧｌｎ、又は側鎖が結合基Ｒ３で置換されているアミノ酸であり；
Ｘａａ４は、Ｇｌｕ若しくはＧｌｎ、又は側鎖が結合基Ｒ３で置換されているアミノ酸であり；
Ｘａａ７は、Ｓｅｒ又は結合基Ｒ３であり；
Ｘａａ８は、Ａｓｐ若しくはＡｓｐ及びＧｌｕ以外の何れかのアミノ酸（好ましくはＡｓｎ；例えば、Ｘａａ８はＡｓｐ又はＡｓｎであってよい）、又は側鎖が結合基Ｒ３で置換されているアミノ酸であり；
Ｘａａ１１は、Ｌｙｓ若しくは正に荷電したアミノ酸（好ましくはＡｒｇ）、又は側鎖が結合基Ｒ３で置換されているアミノ酸であり；
Ｘａａ１４は、Ｐｒｏ、又は側鎖が結合基Ｒ３で置換されているアミノ酸であり；
Ｘａａ１５は、Ｇｌｕ若しくはＡｓｐ及びＧｌｕ以外のアミノ酸（好ましくはＧｌｎ）又は側鎖が結合基Ｒ３で置換されているアミノ酸である。
【００５１】
ある実施態様では、ペプチドは配列番号２８を含み、そこで
Ｘａａ１は、Ｌｅｕ若しくはＧｌｎ、又は側鎖が結合基Ｒ３で置換されているアミノ酸であり；  
Ｘａａ４は、Ｇｌｕ若しくはＧｌｎ、又は側鎖が結合基Ｒ３で置換されているアミノ酸であり；  
Ｘａａ７は、Ｓｅｒ、又は側鎖が結合基Ｒ３で置換されているアミノ酸であり；  
Ｘａａ８は、Ａｓｐ若しくはＡｓｎ、又は側鎖が結合基Ｒ３で置換されているアミノ酸であり；  
Ｘａａ１１は、Ｌｙｓ若しくはＡｒｇ、又は側鎖が結合基Ｒ３で置換されているアミノ酸であり；  
Ｘａａ１４は、Ｐｒｏ、又は側鎖が結合基Ｒ３で置換されているアミノ酸であり；  
Ｘａａ１５は、Ｇｌｕ若しくはＧｌｎ、又は側鎖が結合基Ｒ３で置換されているアミノ酸である。
【００５２】
ステープル状に架橋されたペプチドにおいて、Ｇｌｎで占められている何れかの位置も代わりにＧｌｕであってもよく、Ｇｌｕで占められている何れかの位置も代わりにＧｌｎであってもよい。同様に、Ａｓｎで占められている任意の位置は代わりにＡｓｐであってもよく、Ａｐｓで占められている何れかの位置も代わりにＡｓｎであってもよい。Ａｓｎ又はＡｒｇ及びＧｌｎ又はＧｌｕの選択はステープル状に架橋されたペプチドの所望の電荷によって決まる。
【００５３】
ある場合では、ペプチドは、Ｇｌｎ３Ｘａａ４Ｔｈｒ５Ｐｈｅ６Ｘａａ７Ｘａａ８Ｌｅｕ９Ｔｒｐ１０Ｘａａ１１Ｌｅｕ１２Ｌｅｕ１３（配列番号２９）の一部を含んでいる。
【００５４】
配列番号２９内の、架橋できるアミノ酸の対は、これに限定されないが、５番目と１２番目のアミノ酸；４番目と１１番目のアミノ酸；７番目と１１番目のアミノ酸；及び７番目と１４番目のアミノ酸を包含する。
【００５５】
繋ぎ止め又は架橋は、螺旋の１回転又は２回転（すなわち、約３．４個又は７個のアミノ酸）の長さに渡って伸ばすことができる。従って、ｉとｉ＋３；ｉとｉ＋４；又はｉとｉ＋７に位置するアミノ酸は化学修飾及び架橋化のための理想的な候補である。従って、例えば、ペプチドが配列：…Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９…（ここで、「．．．」は追加アミノ酸の任意の存在を示す）を有している場合には、Ｘａａ１とＸａａ４の間（例えば、ｉ＋３）、又はＸａａ１とＸａａ５の間（例えば、ｉ＋４）、又はＸａａ１とＸａａ８の間（例えば、ｉ＋７）の架橋は、Ｘａａ２とＸａａ５の間（例えば、ｉ＋３）、又はＸａａ２とＸａａ６の間（例えば、ｉ＋４）、又はＸａａ２とＸａａ９の間（例えば、ｉ＋７）の架橋等のように有用である。ポリペプチドは、配列を更に安定化するため、或いはより長いポリペプチドの縫合状の架橋の安定化を促進するためにポリペプチド配列内に１つ以上の架橋を包含できる。ポリペプチドが、１つの部分に容易に合成するには長過ぎる場合は、ネイティブケミカルライゲーション（native chemical ligation）と呼ばれる技術によって独立して合成した架橋されているペプチドを結合することができる（Bang, et al., J. Am. Chem Soc. 126:1377）。
【００５６】
或いはまたは更に、架橋されているペプチドは１つ又はそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、又は２未満の）ステープル状の架橋及び／又は縫合状の架橋を包含できる。
【００５７】
内部架橋（例えば、ステープル状の架橋及び／又は縫合状の架橋）を、ペプチドの結合又は相互作用の面におけるアミノ酸の構造関連性を保存する（例えば、ペプチドの結合界面を保存する）ためにペプチド内のアミノ酸上に位置づけることができる。例えば、ｉ１〜ｉ１６の１つ又はそれ以上（表１を参照されたい）を少なくとも１個の他のアミノ酸とステープル状に架橋又は縫合状に架橋させて、疎水性相互作用面においてアミノ酸の構造関連性を保存できる（例えば、 Kussie et al., Science, 274(5289):948-953 (1996), and Joseph et al., Cell Cycle, 9(22):4560-4568 (2010)を参照されたい）。このような内部架橋は：１つ又はそれ以上のステープル状の架橋；１つ又はそれ以上の縫合状の架橋；及び／又は１つ又はそれ以上のステープル状の架橋の１つ又はそれ以上の縫合状の架橋との組合わせを包含できる。上記のように、例示的な架橋されたペプチドは、配列番号２〜２１（図１Ｃを参照されたい）、及び／又は配列番号９（例えば、ＳＡＨ−ｐ５３−８）に記載の配列を包含する。
【００５８】
改変のためのアミノ酸の選択（例えば、内部架橋をサポートするための）はステープル状の架橋スキャンニングによっても促進される。用語「ステープル状の架橋スキャン」は、ステープル状に架橋されたペプチドのライブラリーの合成を示し、それによりｉとｉ＋３；ｉとｉ＋４；又はｉとｉ＋７の単一及び複数のステープル状の架橋又は縫合状の架橋の位置をペプチド配列の長さにそって順次位置づけ、全ての可能な位置をサンプリングして、ステープル状に架橋された又は縫合状に架橋された構築物に対して望ましい又は最適な特性及び活性を同定する。架橋スキャンニング方法の例は図に説明されている。
【００５９】
ある例では、本明細書の架橋されたペプチドは少なくとも２つの内部架橋された又はステープル状に架橋されたアミノ酸を包含し、ここでは少なくとも２つのアミノ酸が２個（すなわち、ｉ、ｉ＋３、表１において□と示した）、３個（すなわち、ｉ、ｉ＋４、表１において○と示した）、又は６個（すなわち、ｉ、ｉ＋７、表１において▲として示した）のアミノ酸分離れている。内部架橋（例えば、ステープル状の架橋をサポートするために少なくとも２個のアミノ酸が必要であるが、内部架橋されたアミノ酸の更なる対を、例えば、更なる内部架橋（例えば、ステープル状の架橋）をサポートするために、ペプチドに包含させることができる。例えば、ペプチドは、１、２、３、４、５又はそれ以上のステープル状の架橋を包含できる。
【００６０】
或いはまたは更に、ペプチドは３つの内部架橋された又は縫合状に架橋されたアミノ酸を包含できる。ペプチドの縫合状の架橋は少なくとも３つの内部架橋されたアミノ酸を包含し、ここで３つのアミノ酸のうちの中央のアミノ酸（本明細書では核又は中心アミノ酸と表わして、表１で「ｉ」と示した）はそれぞれの隣接改変アミノ酸と（α炭素の間に）内部架橋を形成する。核アミノ酸は２つの内部架橋されている側鎖を包含し、これは飽和でも不飽和でもよい。核アミノ酸に架橋されているアミノ酸は核アミノ酸から何れかの方向に２、３、又は６アミノ酸（例えば、ｉ、ｉ−３、ｉ、ｉ−４、ｉ、ｉ−７（表１で、それぞれ、■、●、及び▼と示す）、ｉ、ｉ＋３、ｉ、ｉ＋４、ｉ、ｉ＋７（表１で、それぞれ、□、○、及び▲と示す）、ここで、「ｉ」は核アミノ酸である）分離れてもよい。核の両側にあるアミノ酸の数（例えば、核アミノ酸と核に架橋しているアミノ酸の間）は同一であっても異なっていてもよい。ある例では、縫合状の架橋は３、４、５個、又はそれ以上の内部架橋されているアミノ酸を包含できる。ある例では、ペプチドは１、２、３、４つ、又はそれ以上の縫合状の架橋を含有できる。
【００６１】
ある実施態様では、本明細書のペプチドは少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、又は５つ）のステープル状の架橋と少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、又は５つ）の縫合状の架橋との組み合わせを包含できる。
【００６２】
ある実施態様では、繋ぎ止め、例えば、炭化水素によるステープル状の架橋は螺旋以外の構造を安定化するために用いられる。このような場合は、繋ぎ止めの端部はｉ、ｉ＋３、ｉ＋４、及び１＋７以外の間隔で位置付けることができる。
【００６３】
上に開示したように、本明細書のペプチドは、一緒になって内部（分子内）架橋を形成する少なくとも２つの改変アミノ酸を包含し、ここで少なくとも２つの改変アミノ酸は２個（すなわち、ｉ、ｉ＋３、表１で□と示す）、３個（すなわち、ｉ、ｉ＋４、表１で○と示す）、又は６個（すなわち、ｉ、ｉ＋７、表１で▲と示す）のアミノ酸分離れている。例えば、ペプチドは表１に説明されている１つ又はそれ以上の位置にある架橋されているアミノ酸を含有できる。
【００６４】
【表１】
2014502152.tif 000003
【００６５】
ある実施態様では、本発明は式（Ｉ）の改変ポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を特徴とする。
【００６６】
【化１】
2014502152.tif 000004
【００６７】
式中の、それぞれのＲ１及びＲ２は独立して、Ｈ、又はＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、又はヘテロシクリルアルキルである。
Ｒ３は、アルキレン、アルケニレン又はアルキニレン、或いは［Ｒ４’−Ｋ−Ｒ４］ｎであって、それぞれは０〜６個のＲ５で置換されている。
Ｒ４及びＲ４’は、独立して、アルキレン、アルケニレン又はアルキニレンである（例えば、それぞれは、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９又はＣ１０アルキレン、アルケニレン又はアルキニレンである）。
Ｒ５は、ハロ、アルキル、ＯＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＳＲ６、ＳＯＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＣＯ２Ｒ６、Ｒ６、蛍光部分、又は放射性同位元素である。
Ｋは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＯＮＲ６、又は
【００６８】
【化２】
2014502152.tif 000005
【００６９】
、アジリジン、エピスルフィド、ジオール、又はアミノアルコールである。
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、又は治療薬である。
ｎは、２、３、４又は６である。
ｘは、２〜１０の整数である。
ｗ及びｙは、独立して０〜１００の整数である。
ｚは、１〜１０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）である。
それぞれのＸａａは、独立してアミノ酸（例えば、２０個の天然アミノ酸、又は何れかの天然又は非天然アミノ酸の１つ）である。
【００７０】
ここで、このポリペプチドは、（ａ）配列番号１又は２の８個の連続アミノ酸内の、２、３又は６個のアミノ酸分離れている少なくとも１対のアミノ酸の側鎖が、式（Ｉ）で示されているアミノ酸対のα炭素と連結する、結合基、Ｒ３によって置換されていること；及び（ｂ）アミノ酸の第１対のα炭素が式Ｉで示されているＲ１で置換されていて、アミノ酸の第２対のα炭素が式Ｉで示されているＲ２で置換されていること以外は、配列番号１（ヒトｐ５３）又はその変異体、配列番号２又はその変異体、又は本明細書に記載されているその他のポリペプチド配列の少なくとも８個の連続アミノ酸を含有している。
【００７１】
別の態様では、本発明は式（ＩＩ）の改変ポリペプチド、又はその薬学的に許容される塩を特徴としている。
【００７２】
【化３】
2014502152.tif 000006
【００７３】
式中の、それぞれのＲ１及びＲ２は独立して、Ｈ、又はＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、又はヘテロシクリルアルキルである。
Ｒ３は、アルキレン、アルケニレン又はアルキニレン、或いは［Ｒ４’−Ｋ−Ｒ４］ｎであって、それぞれは０〜６個のＲ５で置換されている。
Ｒ４及びＲ４’は、独立して、アルキレン、アルケニレン又はアルキニレンである（例えば、それぞれは、独立して、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９又はＣ１０アルキレン、アルケニレン又はアルキニレンである）。
Ｒ５は、ハロ、アルキル、ＯＲ６、ＮＨＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＳＲ６、ＳＯＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＣＯ２Ｒ６、Ｒ６、蛍光部分、又は放射性同位元素である。
Ｋは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＯＮＲ６、又は
【００７４】
【化４】
2014502152.tif 000007
【００７５】
、アジリジン、エピスルフィド、ジオール、アミノアルコール、又はジアミンである。
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、又は治療薬である。
ｎは、２、３、４、５又は６である。
ｘは、２〜１０の整数である。
ｗ及びｙは、独立して０〜１００の整数である。
ｚは、１〜１０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）である。
それぞれのＸａａは、独立してアミノ酸（例えば、２０個の天然アミノ酸、又は何れかの天然又は非天然アミノ酸の１つ）である。
Ｒ７は、ＰＥＧ、ｔａｔタンパク質、親和性標識、標的部分、脂肪酸由来アシル基、ビオチン部分、蛍光プローブ（例えば、フルオレセイン又はローダミン）結合を介して、例えば、チオカルバメート又はカルバメート結合である。
Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ８ａ、ＮＲ８ａＲ８ｂである。
【００７６】
ここで、このポリペプチドは、（ａ）配列番号１又は２の８個の連続アミノ酸内の、２、３又は６個のアミノ酸分離れている少なくとも１対のアミノ酸の側鎖が、式（Ｉ）で示されているアミノ酸対のα炭素と連結する、結合基、Ｒ３によって置換されていること；及び（ｂ）アミノ酸の第１対のα炭素が式ＩＩで示されているＲ１で置換されていて、アミノ酸の第２対のα炭素が式ＩＩで示されているＲ２で置換されていこと以外は、配列番号１（ヒトｐ５３）又はその変異体、配列番号２又はその変異体、又は本明細書に記載されているその他のポリペプチド配列の少なくとも８個の連続アミノ酸を含有している。
【００７７】
式Ｉ又は式ＩＩの場合は、以下の実施態様に開示されている。
【００７８】
ｘ＝２（すなわち、ｉ＋３連結）の場合は、Ｒ３はＣ７アルキレン、アルケニレンであってよい。アルケニレンの場合は１つ又はそれ以上の二重結合を有していてよい。ｘ＝６（すなわち、ｉ＋４連結）の場合は、Ｒ３はＣ１、Ｃ１２、又はＣ１３アルキレン又はアルケニレンであってよい。アルケニレンの場合は１つ又はそれ以上の二重結合を有していてよい。ｘ＝３（すなわち、ｉ＋４連結）の場合は、Ｒ３はＣ８アルキレン又はアルケニレンであってよい。アルケニレンの場合は１つ又はそれ以上の二重結合を有していてよい。
【００７９】
ある特定の例では、２つのα、α二置換立体中心（α炭素）は、両方がＲ配置又はＳ配置（例えば、ｉ、ｉ＋４架橋）にあるか、又は一方の立体中心がＲ配置で、他方がＳ配置（例えば、ｉ、ｉ＋７架橋）にある。従って、式Ｉは次のように表わされる：
【００８０】
【化５】
2014502152.tif 000008
【００８１】
ここで、例えば、ｘが３のときに、Ｃ’及びＣ”二置換立体中心は、両方がＲ配置にあるか、又は両方がＳ配置にってよい。ｘが６のときは、Ｃ’二置換立体中心がＲ配置にあって、Ｃ”二置換立体中心がＳ配置にあるか、或いはＣ’二置換立体中心がＳ配置にあって、Ｃ”二置換立体中心がＲ配置にある。Ｒ３二重結合はＥ又はＺ立体化学配置にあってよい。直前に表わした式のＣ’及びＣ”に対応する、式ＩＩの炭素に対しても、同様な配置が可能である。
【００８２】
ある例では、Ｒ３は［Ｒ４−Ｋ−Ｒ４’］ｎであり、そしてＲ４及びＲ４’は独立して、アルキレン、アルケニレン又はアルキニレンである（例えば、それぞれは独立して、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９又はＣ１のアルキレン、アルケニレン又はアルキニレンである）。
【００８３】
ある例では、ポリペプチドは、架橋に置き換えられているアミノ酸側鎖に加えて、配列番号１又は２の何れかにおいて１、２、３、４又は５つのアミノ酸変化を有しているアミノ酸配列を包含する。
【００８４】
鎖は、アルキル、アルケニル、又はアルキニル部分（例えば、Ｃ５、Ｃ８又はＣ１１アルキル、Ｃ５、Ｃ８又はＣ１１アルケニル、又はＣ５、Ｃ８又はＣ１１アルキニル）を包含できる。繋ぎ止めされたアミノ酸は（例えば、Ｃ１〜Ｃ３又はメチルで）α二置換されていてもよい。［Ｘａａ］ｙ及び［Ｘａａ］ｗは、ｐ５３ポリペプチド（例えば、配列番号１又は２の何れか）の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５又はそれ以上の連続アミノ酸（好ましくは、２又は５連続アミノ酸）を独立して含有できるペプチドであって、［Ｘａａ］ｘはｐ５３ペプチドのアミノ酸の３又は６連続アミノ酸を含有できるペプチドである。
【００８５】
ペプチドは、ｐ５３ポリペプチドの、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０のアミノ酸、或いは２０〜５０の何れかの数のアミノ酸、又は列挙された何れか２つのアミノ酸数間の範囲のアミノ酸を含有できる。３個又は６個のアミノ酸分離れているアミノ酸の１つ又はそれ以上の対が、例えば、Ｒ３を介して、架橋を形成するアミノ酸置換に置き換わっていること以外は、アミノ酸は連続している。従って、少なくとも２つのアミノ酸は、繋ぎ止めされたアミノ酸又は繋ぎ止めされたアミノ酸置換に置き換えできる。従って、式Ｉを
【００８６】
【化６】
2014502152.tif 000009
【００８７】
と表わすと、［Ｘａａ］ｙ’、［Ｘａａ］ｘ及び［Ｘａａ］ｙ”はそれぞれ、同一又は異なったｐ５３ペプチド由来の連続したポリペプチド配列を含有できる。
【００８８】
ペプチドは、ｐ５３ポリペプチド（配列番号１又は２）の１０（１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０又はそれ以上）連続したアミノ酸を包含でき、ここで３個のアミノ酸（又は６個のアミノ酸）分離れている２つのアミノ酸のα炭素がＲ３を介して結合していて、２つのα炭素のうちの１つがＲ１で置換されていて、他方がＲ２で置換されていて、それぞれがペプチド結合を介して更なるアミノ酸と結合している。
【００８９】
ある例では、このポリペプチドはｐ５３分解のドミナントネガティブ阻害剤として作用する。ある例では、このポリペプチドは蛍光部分、若しくは放射性同位元素、又は放射性同位元素をキレート化できる（例えば、Ｒｅ、Ｉｎ又はＹの放射性同位元素にキレート化されたメルカプトアセチルトリグリシン又は１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ））部分も包含する。ある例では、Ｒ１及びＲ２がメチルであり；Ｒ３が、Ｃ８アルキル、Ｃ１１アルキル、Ｃ８アルケニル、Ｃ１１アルケニル、Ｃ８アルキニル、又はＣ１１アルキニルであり；そしてｘが２、３、又は６である。ある例では、このポリペプチドは、ＰＥＧリンカー、ｔａｔタンパク質、親和性標識、標的部分、脂肪酸由来アシル基、ビオチン部分、蛍光プローブ（例えば、フルオレセイン又はローダミン）、又は金属キレート基を包含する。
【００９０】
このペプチドは１つ又はそれ以上の不斉中心を含有できるので、ラセミ体及びラセミ混合物、単一エナンチオマー、個々のジアステレオマー及びジアステレオマー混合物、並びに存在する何れかのオレフィンの幾何異性体（例えば、Ｚ又はシス、及びＥ又はトランス）として生じる。これらの化合物のこのような全ての異性体は明確に本発明に包含される。化合物は複数の互変異性で表わすこともでき、そのような場合、本発明は、本明細書に記載されている化合物の全ての互変異性（例えば、平衡状態にある異性体（例えば、ケト−エノール）、ここでは複数部位におけるアルキル化が位置異性体を生じる可能性がある）、位置異性体、及び本明細書に記載されている化合物の酸化産物（本発明はこのような反応産物の全てを明確に包含する）を明確に包含する。このような化合物のこのような異性体形態の全ては全ての結晶形と同様に包含される。
【００９１】
ペプチドは、α炭素と呼ばれている炭素に結合しているアミノ基とカルボキシル基の両方を含有しているアミノ酸も包含できる。水素及び側鎖もα炭素に結合している。適切なアミノ酸は、これに限定されないが、ペプチド中に見出せる２０の通常の天然アミノ酸（例えば、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ（１文字略語として知られている）のＤ及びＬ異性体の両方を、更に有機合成又はその他の代謝経路で製造された天然及び非天然アミノ酸も包含する。以下の表２は２０の通常の天然アミノ酸それぞれの側鎖の構造を提供する。この表において、各構造の右側にある「−」はα炭素への結合である。
【００９２】
【表２】
2014502152.tif 000010
【００９３】
「非必須」アミノ酸残基は、ポリペプチドの野生型配列から（その活性を無効にすることも実質的に改変することもなく）改変できる残基である。「必須」アミノ酸残基は、ポリペプチドの野生型配列から改変した場合に、ポリペプチド活性の無効化又は実質的な無効化をもたらす残基である。
【００９４】
ある実施態様では、本明細書で用いられる用語「必須」アミノ酸残基は、必須アミノ酸の同類置換を包含する。通常、「必須」アミノ酸残基はα螺旋の相互作用面に見られる。
【００９５】
次の記号は、分子構造の部分として用いられた場合に、単一結合又はトランス若しくはシス二重結合を示す。 
【００９６】
【化７】
2014502152.tif 000011
【００９７】
用語「アミノ酸側鎖」は、アミノ酸のα炭素に結合している部分を示す。例えば、アラニンのアミノ酸側鎖はメチルであり、フェニルアラニンのアミノ酸側鎖はフェニルメチルである、システインのアミノ酸側鎖はメチルチオールであり、アスパラギン酸のアミノ酸側鎖はカルボキシメチルであり、チロシンのアミノ酸側鎖は４−ヒドロキシフェニルメチルである等である。その他の非天然アミノ酸側鎖は、例えば天然のもの（例えば、アミノ酸代謝物）又は合成で作られたもの（例えば、α二置換アミノ酸）も包含される。
【００９８】
用語「ポリペプチド」は、共有結合（例えば、アミド結合）で結合している、２個又はそれ以上の天然の又は合成のアミノ酸を包含する。本明細書に記載されているようなポリペプチドは、全長のタンパク質（例えば、十分に処理されたタンパク質）を、更により短いアミノ酸配列（例えば、天然のタンパク質の断片、又は合成ポリペプチドの断片）も包含する。
【００９９】
用語「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素の何れかの基を示す。用語「アルキル」は指定された数の炭素原子を含有している、直鎖であっても分岐鎖であってもよい炭化水素鎖を示す。例えば、Ｃ１〜Ｃ１０は、この基が、その中に１〜１０個の炭素原子を（包括的に）有してもよいことを示している。数の指定がないとき、「アルキル」は、１〜２０個の炭素原子を（包括的に）その中に有している鎖（直鎖又は分岐鎖）である。用語「アルキレン」は２価のアルキル（すなわち、−Ｒ−）を示す。
【０１００】
用語「アルケニル」は、Ｚ又はＥの幾何学的配置において１つ又はそれ以上の炭素−炭素二重結合を有する、直鎖であっても分岐鎖であってもよい炭化水素鎖を示す。アルケニル部分は指定された数の炭素原子を含有している。例えば、Ｃ２〜Ｃ１０は、この基が、その中に２〜１０個の炭素原子を（包括的に）有してもよいことを示している。用語「低級アルケニル」は、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル鎖を示す。数の指定がないとき、「アルケニル」は、２〜２０個の炭素原子を（包括的に）その中に有している鎖（直鎖又は分岐鎖）である。
【０１０１】
用語「アルキニル」は、１つ又はそれ以上の炭素−炭素三重結合を有している直鎖であっても分岐鎖であってもよい炭化水素鎖を示す。アルキニル部分は指定された数の炭素原子を含有している。例えば、Ｃ２〜Ｃ１０は、この基が、その中に２〜１０個の炭素原子を（包括的に）有してもよいことを示している。用語「低級アルキニル」は、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル鎖を示す。数の指定がないとき、「アルキニル」は、２〜２０個の炭素原子を（包括的に）その中に有している鎖（直鎖又は分岐鎖）である。
【０１０２】
用語「アリール」は炭素６個の単環式又は炭素１０個の二環式芳香族環系であり、そこでは各環の０、１、２、３、４、又は５の原子は置換基で置換されていてもよい。アリール基の例は、フェニル、ナフチル等を包含する。用語「アリールアルキル」又は「アラルキル」は、アリールで置換されているアルキルを示す。用語「アリールアルコキシ」は、アリールで置換されているアルコキシを示す。
【０１０３】
本明細書で用いられている「シクロアルキル」は、３〜１２個の炭素、好ましくは３〜８個の炭素、そしてより好ましくは３〜６個の炭素を有している飽和又は部分的に不飽和の環式炭化水素基を包含し、ここで、シクロアルキル基は更に任意に置換されていてもよい。好ましいシクロアルキル基は、これに限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、シクロヘプタジエニル、シクロヘプタトリエニル、シクロオクチル、シクロオクテニル、シクロオクタジエニル、シクロオクタトリエニル、及びシクロオクチニルを包含する。
【０１０４】
用語「ヘテロアリール」は、芳香族の５〜８員の単環式、８〜１２員の二環式、又は１１〜１４員の三環式の環系であって、単環式の場合は１〜３個のヘテロ原子を、二環式の場合は１〜６個のヘテロ原子を、又は三環式の場合は１〜９個のヘテロ原子を有しており、当該ヘテロ原子はＯ、Ｎ、又はＳから選ばれる（例えば、単環式、二環式、又は三環式のそれぞれの場合に、炭素原子と１〜３個、１〜６個又は１〜９個のＮ、Ｏ、又はＳヘテロ原子）。ここで、各環の０、１、２、３、又は４個の原子は置換基で置換されていてもよい。ヘテロアリール基の例は、ピロリル、ピリジル、フリル又はフラニル、イミダゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリダジル、ピリミジル、チオフェニル、キノリニル、インドリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル等を包含する。用語「ヘテロアリールアルキル」又は用語「ヘテロアラルキル」は、ヘテロアリールで置換されたアルキルを示す。用語「ヘテロアリールアルコキシ」はヘテロアリールで置換されたアルコキシを示す。
【０１０５】
用語「ヘテロシクリル」は、非芳香族の５〜８員の単環式、８〜１２員の二環式、又は１１〜１４員の三環式の環系であって、単環式の場合は１〜３個のヘテロ原子を、二環式の場合は１〜６個のヘテロ原子を、又は三環式の場合は１〜９個のヘテロ原子を有しており、当該ヘテロ原子はＯ、Ｎ、又はＳから選ばれる（例えば、単環式、二環式、又は三環式のそれぞれの場合に、炭素原子と１〜３個、１〜６個又は１〜９個のＮ、Ｏ、又はＳヘテロ原子）。ここで、各環の０、１、２、３、又は４個の原子は置換基で置換されていてもよい。ヘテロシクリル基の例は、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、アジリジニル、オキシリル、チイリル（thiiryl）、モルホリニル、テトラヒドロフラニル等を包含する。
【０１０６】
用語「置換基」は、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、又はヘテロアリール基上でその基の何れかの原子と置き換えられている基を示す。適切な置換基は、これに限定されないが、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルコキシカルボニル、アミド、カルボキシ、アルカンスルホニル、アルキルカルボニル、アジド、及びシアノ基を包含する。
【０１０７】
ある例では、本明細書に記載されている炭化水素鎖（すなわち、架橋）を更に操作できる。一例では、炭化水素アルケニル鎖の二重結合（例えば、ルテニウム触媒による閉環メタセシス（ＲＣＭ）を用いて合成したような）を酸化して（例えば、エポキシ化又はジヒドロキシル化によって）以下の化合物の１つを提供することができる。
【０１０８】
【化８】
2014502152.tif 000012
【０１０９】
エポキシド部分又は遊離のヒドロキシル部分の何れかを更に官能基化できる。例えば、エポキシドを求核試薬で処理することができて、これは例えば、タグ（例えば、放射性同位元素又は蛍光タグ）を取り付けるために、用いることができる更なる機能性をもたらす。タグは化合物を体内の所望の位置へ向かわせるために、又は体内の化合物の位置を追跡するために活用できる。或いは、更なる治療薬（例えば、ラパマイシン、ビンブラスチン、タキソール等のような抗癌剤）を官能基化した鎖に化学的に付加することができる。あるいはこのような誘導体化はポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端の、又はアミノ酸側鎖を介して、合成操作によって達成できる。他の薬剤、例えば、ポリペプチドの細胞内への侵入を促進する薬剤を官能基化した鎖に付加することができる。
【０１１０】
炭化水素鎖を記載してきたが、その他の鎖も想定される。例えば、鎖は１つ又はそれ以上のエーテル、チオエーテル、エステル、アミン、又はアミド部分を包含できるる。ある場合は、天然アミノ酸の側鎖を鎖の中に組み込むことができる。例えば、鎖を、セリンのヒドロキシル、システインのチオール、リジンの一級アミン、アスパラギン酸又はグルタミン酸の酸、又はアスパラギン又はグルタミンのアミドのような官能基と結合させることができる。従って、２つの非天然アミノ酸を結合して作る鎖を用いるのではなくて、天然アミノ酸を用いて鎖を作ることが可能である。１つの非天然アミノ酸と天然アミノ酸を用いることも可能である。
【０１１１】
鎖の長さを変えることが更に想定される。例えば、α螺旋二次構造に、より高度の拘束をもたらすことが望ましい場合に、より短い鎖を用いることができ、一方、ある場合には、α螺旋二次構造に対してより小さい拘束が望ましいので、より長い鎖が望まれる。
【０１１２】
また、主にα螺旋の単一面上にある鎖を提供するために、アミノ酸ｉからｉ＋３、ｉからｉ＋４、及びｉからｉ＋７にまたがる鎖の例を記載してきたが、アミノ酸の数の任意の組合わせにまたがるように鎖を合成することができる。
【０１１３】
報告されているように、（Stewart et al, Nature Chem. Biol., 2010; Joseph et al, Cell Cycle, 2010 （上述）、ステープル状の架橋自体が標的タンパク質結合部位の表面での結合相互作用に寄与して、標的親和性は保持しながら、親和性を増大するために用いてもよいことが更に想定される。
【０１１４】
ある例では、α二置換アミノ酸がポリペプチド中でα螺旋二次構造の安定性を改善するために用いられる。しかしながら、α二置換アミノ酸を必要とせずに、モノα置換を用いる例（例えば、繋ぎ止めされたアミノ酸中で）も想定される。
【０１１５】
ある例では、ｐ５３の（例えば、配列番号１の）相互作用面のＰｈｅ６、Ｔｒｐ１０、Ｌｅｕ１３の１つ又はそれ以上（例えば、３つ全部）を、別のアミノ酸、例えば、Ａｌａで置き換えて、ステープル状に架橋された不活性なペプチドを作成することは有用であろう。このようなステープル状に架橋された不活性なペプチドは、例えば、負のコントロールとして有用である。
【０１１６】
ステープル状に架橋されたポリペプチドは薬剤、毒素、ポリエチレングリコールの誘導体、第２ポリペプチド、炭水化物等を包含できる。ポリマー又はその他の物質がステープル状に架橋されたポリペプチドに結合していることは実質的に均質である組成物にとって望ましい。
【０１１７】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子の付加はポリペプチドの薬物動態及び薬力学的特性を改善できる。例えば、ＰＥＧ化は腎クリアランスを低下させることができ、そしてより安定な血漿濃度をもたらすことができる。ＰＥＧは水溶性ポリマーであって、式：
ＸＯ--（ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２--Ｙ（式中の、ｎは２〜１０，０００であり、ＸはＨ又は末端修飾、例えば、Ｃ１〜４アルキルであり、そしてＹはポリペプチドのアミン基へのアミド、カルバメート、又は尿素の結合（これに限定されないが、リジンのイプシロンアミン、又はＮ−末端を包含している）である）のようにポリペプチドに結合するように表わすことができる。Ｙは、チオール基（これに限定されないが、システインのチオール基を包含する）へのマレイミド結合であってもよい。ＰＥＧをポリペプチドに直接又は間接的に結合する別の方法は当業者に公知である。ＰＥＧは線状でも分岐状でもよい。各種の官能基化した誘導体を含むＰＥＧの各種形態が市販されている。
【０１１８】
主鎖に分解可能な結合を有しているＰＥＧを用いることができる。例えば、ＰＥＧは、加水分解されるエステル結合を用いて製造できる。分解可能なＰＥＧ結合を有している複合体は、国際特許出願公開第ＷＯ９９／３４８３３号、同第ＷＯ９９／１４２５９号、及び米国特許第６，３４８，５５８号に記載されている。
【０１１９】
ある実施態様では、高分子ポリマー（例えば、ＰＥＧ）を、仲介リンカーを介して本明細書に記載されている物質に付加する。ある実施態様では、リンカーはペプチド結合で結合している１〜２０個のアミノ酸からで作られ、ここでアミノ酸は２０個の天然アミノ酸から選ばれる。これらのアミノ酸の幾つかは、当業者によく理解されているように、グリコシル化されてもよい。別の実施態様では、１〜２０のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及びリジンから選ばれる。別の実施態様では、リンカーはグリシン及びアラニンのような、立体障害を受けないアミノ酸から大部分が作られる。非ペプチドリンカーも可能である。例えば、−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）−（式中のｎは２〜２０である）のようなアルキルリンカーを用いることができる。これらのアルキルリンカーは更に、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）、低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニル等のような、立体障害のない基で置換されていてもよい。米国特許第５，４４６，０９０号には、二官能性ＰＥＧリンカー及びＰＥＧリンカーのそれぞれの末端にペプチドを有している複合体の形成でのその使用が記載されている。
【０１２０】
別の実施態様において、ステープル状に架橋されたペプチドを、例えば、細胞取り込みを促進するために又はインビボ安定性を増大するために改変することができる。例えば、ペプチド模倣体大環状分子をアシル化又はＰＥＧ化することは細胞の取り込みを促進し、生物学的利用能を増大し、血液循環を増大し、薬物動態を変え、免疫原性を減少し、及び／又は必要とする投与頻度を減少する。
【０１２１】
ある実施態様では、本明細書に開示されているステープル状に架橋されたペプチドは（例えば、ステープル状に架橋されていないペプチドと比較して）増強された細胞膜貫通能力を有している。これらの同じペプチドは、ヒト血清タンパク質に対して１マイクロモル又はそれ以下の見掛け上の親和性も有しているか、或いは有するように改変できる。別の実施態様では、改良された架橋されているポリペプチドはヒト血清タンパク質に対して３マイクロモル又はそれ以下の見掛け上の親和性を有している。別の実施態様では、改良された架橋されているポリペプチドはヒト血清タンパク質に対して１０マイクロモル又はそれ以下の見掛け上の親和性を有している。別の実施態様では、改良された架橋ポリペプチドはヒト血清タンパク質に対して７０マイクロモル又はそれ以下の見掛け上の親和性を有している。別の実施態様では、改良された架橋ポリペプチドはヒト血清タンパク質に対して１〜７０マイクロモルの見掛け上の親和性を有している。別の実施態様では、改良された架橋ポリペプチドはヒト血清タンパク質に対して１〜７００マイクロモルの見掛け上の親和性を有している。ある実施態様では、改良された架橋ポリペプチドは、全血において０．１〜５０％の推定遊離画分を有している。別の実施態様では、改良された架橋ポリペプチドは、全血において０．５〜１０％の推定遊離画分を有している。例えば、架橋されているポリペプチドの見掛け上の血清結合親和性（Ｋｄ＊）が、１、３、１０、７０マイクロモル又はそれ以上になるように、ポリペプチドを選択することができる。別の実施態様では、架橋されているポリペプチドは、それがヒト血液において０．１〜５０％、又は０．１５〜１０％の推定遊離画分を有するように選択される。何れかの特定のペプチドが血清タンパク質と結合する傾向を定量する方法は当該技術分野において公知である（例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２１６８８号（２０１０年８月２６日公開）を参照されたい）。
【０１２２】
ある実施態様では、改良された架橋されているポリペプチドは、全血において０．１〜５０％の推定遊離画分を有している。別の実施態様では、改良された架橋ポリペプチドは、全血において０．５〜１０％の推定遊離画分を有している。
【０１２３】
ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤は、米国特許出願公開第２０１０／０１６８３８８号（２０１０年７月１日公開）、同第２０１０／０２１６６８８号（２０１０年８月２６日公開）、同第２０１０／０１８４６２８号（２０１０年７月２２日公開）、同第２００９／００４７７１１号（２００９年２月１９日公開）、同第２００９／００８８５３３号（２００９年４月２日公開）、同第２００９／０３２６１９２号（２００９年１２月３１日公開）、同第２００９／０２７５５１９号（２００９年１１月５日公開）、同第２００８／０２６２２００号（２００８年１０月２３日公開）、同第２０１０／０２２５４９号（２０１０年１月２８日公開）、同第２０１０／０１１３４６６号（２０１０年５月６日公開）、同第２００９／００６９３３４号（２００９年３月１２日公開）（これらはそれぞれその全てが参照により本明細書に取り込まれている）の何れかの１つ又はそれ以上に開示されているステープル状に架橋されたペプチドであってよく、又はステープル状に架橋されたペプチドの改変体を包含できる。
【０１２４】
ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤はステープル状に架橋されたペプチドであってよく、又はステープル状に架橋されたペプチド、例えば、アミノ及び／又はカルボキシ末端の改変体を包含できる。ある実施態様では、アミノ及び／又はカルボキシ末端の改変体は、これに限定されないが、例えば、Ｎ−末端ビオチン、Ｎ−末端Ａｃ、Ｎ−末端Ａｃ−ｂａｌａ、Ｎ−末端ＰＥＧ、Ｃ−末端アミド、及び／又はＣ末端ＣＯＯＨを包含するアミノ及び／又はカルボキシ末端誘導体を包含できる。
【０１２５】
ある実施態様では、上記のように、ＨＤＭＸ調節剤はＨＤＭ２（例えば、GenBank（登録商標）Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号２２８９５２；ＧＩ２２８９５２）及び／又はＨＤＭ４（ＨＤＭＸとも称する；GenBank（登録商標）Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号８８７０２７９１；ＧＩ８８７０２７９１）とも結合できる。このような場合は、ＨＤＭＸ調節剤のＨＤＭＸに対する親和性は、ＨＤＭＸ調節剤のＨＤＭ２又はＨＤＭ４に対する親和性より高くなる（例えば、実質的により高い、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、１０００、又は２０００倍高く、或いは２０００倍以上高い）。
【０１２６】
ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤はＨＤＭ２及びＨＤＭＸの両方と結合できるが、ＨＤＭＸの活性のみを阻害する（例えば、実質的に阻害する）。
【０１２７】
上記のように、本明細書に開示されている化合物の合成方法は当該技術分野において公知である。それでも、下記の例示的な方法を用いることができる。当然のことながら、所望の化合物を得るために順序又は順番を変えて各種工程を実施することができる。本明細書に記載されている化合物の合成に有用な、合成化学変換及び保護基方法（保護及び脱保護）は当該技術分野で公知であって、例えば、R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3d. Ed., John Wiley and Sons (1999); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); 及び L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)、並びにこれらの続刊に記載されているようなものを包含する。
【０１２８】
本発明のペプチドは、当業者に周知の化学合成法によって製造できる。例えば、Fields et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, N.Y., 1992, p. 77 を参照されたい。従って、例えば、Applied Biosystems Peptide Synthesizer モデル４３０Ａ又は４３１上で、側鎖保護アミノ酸を用いるｔ−Ｂｏｃ又はＦｍｏｃ化学のいずれかにより保護されたα−ＮＨ２を用いる固相合成の自動化したメリフィールド技術を用いてペプチドを合成できる。
【０１２９】
本明細書に記載されているペプチドを作成する１つの方法は固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いることである。Ｃ−末端アミノ酸は、リンカー分子によって酸不安定結合を介して架橋されているポリスチレン樹脂と結合している。この樹脂は合成に用いられる溶媒に不溶性であって、過剰な試薬及び副産物を比較的単純に且つ速く洗い流すようにする。Ｎ−末端は、酸に安定で塩基によって除去可能な、Ｆｍｏｃ基で保護される。側鎖官能基の何れかを塩基に安定で酸に不安定な基で保護する。
【０１３０】
より長いペプチドは、ネイティブケミカルライゲーションを用いて個々の合成ペプチドを結合することによって作成できる。あるいは、より長い合成ペプチドを周知の組み換えＤＮＡ技術によって合成できる。このような技術は、詳細なプロトコルを有する周知の標準マニュアルに提供されている。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するために、好ましくは遺伝子が発現される生物に最適なコドンを用いて、アミノ酸配列を逆転写してアミノ酸配列をコードする核酸配列を得る。次に、典型的には、ペプチド及び所望により調節要素をコードするオリゴヌクレオチドを合成して、合成遺伝子を作成する。合成遺伝子を適切なクローニングベクターに挿入して宿主細胞にトランスフェクトする。次いで、選択された発現系及び宿主に適している適切な条件下でペプチドを発現する。ペプチドを精製して標準的な方法で特徴づける。
【０１３１】
ペプチドは、ハイスループットな、組合せ方法で、例えば、Advanced Chemtech から入手可能な、ハイスループットマルチチャンネル組合せシンセサイザーを用いて、作成できる。
【０１３２】
改変ポリペプチドにおいて、１つ又はそれ以上の従来のペプチド結合は、体内でペプチドの安定性を増大できる異なる結合で置き換えた。ペプチド結合は：レトロインベルソ（retro-inverso）結合（Ｃ（Ｏ）−ＮＨ）；還元アミド結合（ＮＨ−ＣＨ２）；チオメチレン結合（Ｓ−ＣＨ２又はＣＨ２−Ｓ）；オキソメチレン結合（Ｏ−ＣＨ２又はＣＨ２−Ｏ）；エチレン結合（ＣＨ２−ＣＨ２）；チオアミド結合（Ｃ（Ｓ）−ＮＨ）；トランス−オレフィン結合（ＣＨ＝ＣＨ）；フッ素置換トランス−オレフィン結合（ＣＨ＝ＣＨ）；ケトメチレン結合（Ｃ（Ｏ）−ＣＨＲ又はＣＨＲ−Ｃ（Ｏ）、ここでＲはＨ又はＣＨ３である）；及びフルオロケトメチレン結合（Ｃ（Ｏ）−ＣＦＲ又はＣＦＲ−Ｃ（Ｏ）、ここでＲはＨ又はＦ又はＣＨ３である）で置換できる。
【０１３３】
ポリペプチドは更に、アセチル化、アミド化、ビオチニル化、シンナモイル化、ファルネシル化、フルオレセイン化、ホルミル化、ミリストイル化、パルミトイル化、リン酸化（Ｓｅｒ、Ｔｙｒ又はＴｈｒ）、ステアロイル化、スクシニル化及びスルフリル化によって改変できる。本発明のポリペプチドは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；アルキル基（例えば、Ｃ１〜Ｃ２０の直鎖又は分岐鎖アルキル基）；脂肪酸基；及びこれらの組合わせと共役することもできる。
【０１３４】
多種の長さのオレフィン側鎖を含有しているα，α二置換非天然アミノ酸を公知の方法（Williams et al. J. Am. Chem. Soc., 113:9276, 1991; Schafmeister et al., J. Am. Chem Soc., 122:5891, 2000; 及び Bird et al., Methods Enzymol., 446:369, 2008）で合成できる。ｉ＋７ステープル状の架橋に結合しているｉが用いられるペプチドでは（螺旋の２回転が安定化されている）、１個のＳ５アミノ酸及び１個のＳ８アミノ酸が用いられるか、又は１個のＳ８アミノ酸及び１個のＳ５アミノ酸が用いられる。Ｒ８は、開始キラル補助基がＲ−アルキル立体異性体をもたらす以外は、同様な経路を用いて合成される。また、８−ヨードオクテンが５−ヨードペンテンの代わりに用いられる。阻害剤は、ＭＢＨＡ樹脂上で固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いて固体支持体上で合成される。
【０１３５】
（オレフィンアミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｓ５−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｒ８−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｒ８−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓ８−Ｏ及びＦｍｏｃ−Ｒ５−ＯＨ以外の）Ｆｍｏｃ−保護αアミノ酸、２−（６−クロロ−１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、及びＲｉｎｋ ＡｍｉｄｅＭＢＨＡは、例えば、Novabiochem (San Diego, CA)から市販されている。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、１，２−ジクロロエタン（ＤＣＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、及びピペリジンは、例えば、Sigma-Aldrich から市販されている。オレフィンアミノ酸合成は当該技術分野において報告されている（Williams et al., Org. Synth., 80:31, 2003）。
【０１３６】
ある実施態様では、ステープル状に架橋されたペプチドは以下の方法を用いて作成できる。ペプチドは、０．４〜０．６ミリモル／ｇ樹脂の濃度を負荷して、ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂上で、Ｆｍｏｃ固相ペプチド化学を用いて手作業で合成できる。以下のプロトコルを用いた。
１．Ｆｍｏｃ保護基を、ＮＭＰ中の２０％ピペリジンで３０分間かけて除去した。
２．樹脂をＮＭＰで５回洗浄した。
３．その後のＦｍｏｃ−保護アミノ酸をＦｍｏｃ−ＡＡ（１０当量、架橋剤に対して４当量）、ＨＣＴＵ（９．９当量、架橋剤に対して３．９当量）、及びＤＩＥＡ（２０当量、架橋剤に対して７．８当量）を用いて３０分間（架橋剤に対して６０分間）カップリングした。
４．樹脂をＮＭＰで５回洗浄した。
５．工程１から繰り返す。
【０１３７】
全てのペプチドのＮ−末端をβアラニン残基で保護した。ＣＤ実験はＮ−末端がアセチル化されているペプチドを活用する。アセチル化反応は上に概説したＦｍｏｃ基の脱保護からなり、その後無水酢酸及びＤＩＥＡを用いて反応した。示したその他の実験は、Ｎ−末端を蛍光標識化したペプチドを活用する。この目的を達成するために、脱保護したＮ−末端を有するペプチドを、ＤＩＥＡの存在下に１晩、ＤＭＦ中でフルオレセインイソチアネートに曝露した。
【０１３８】
閉環メタセシス反応は、使い捨てフリット反応器中の固体支持体上にあるままで、Ｎ−末端保護ペプチド上で実施できる。樹脂を、１，２−ジクロロエタン又はジクロロメタン中のビス（トリシクロヘキシルホスフィン）ベンジリジンルテニウム（ＩＶ）ジクロライド（グルブスの第１世代触媒）の１０ｍＭ溶液に２時間曝露した。触媒付加及び２時間のメタセシス反応を１度繰り返した。樹脂に結合したペプチドをＣＨ２Ｃｌ２で３回洗浄して窒素気流下で乾燥した。
【０１３９】
ペプチドは、試薬Ｋ（８２．５％のＴＦＡ、５％のチオアニソール、５％のフェノール、５％の水、２．５％のエタンジチオール）又は９５％のＴＥＡ、２．５％の水、２．５％のトリイソプロピルシランに曝露して樹脂から解離し、脱保護して、４℃でメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルで沈殿させて凍結乾燥することができる。ペプチドは、例えば、ＨＰＬＣを用いて、任意に凍結乾燥して、精製できる。
【０１４０】
ある実施態様では、ペプチドはステープル状に架橋されていないペプチド混入物を実質的に含まないか、又は単離されている。ペプチドを精製する方法は、例えば、固相支持体上でペプチドを合成することを含んでいる。環化に続いて、固相支持体を単離して、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ／ジクロロメタン混合液、又はＤＭＳＯ／ＮＭＰ混合液のような溶媒溶液中に懸濁する。ＤＭＳＯ／ジクロロメタン、又はＤＭＳＯ／ＮＭＰ混合物は約３０％、４０％、５０％、又は６０％のＤＭＳＯを含有できる。特定の実施態様では、５０％／５０％のＤＭＳＯ／ＮＭＰ溶液が用いられる。溶液を１、６、１２又は２４時間インキュベートして、続いて、樹脂を例えばジクロロメタン又はＮＭＰで洗浄する。ある実施態様では、樹脂はＮＭＰで洗浄する。溶液中での不活性ガスの撹拌及び泡立ても実施できる。
【０１４１】
本発明の架橋されたポリペプチドの特性を、例えば、以下に記載した方法を用いてアッセイすることができる。
【０１４２】
（α螺旋性を確認するアッセイ）
（例えば、５０ｍＭのリン酸カリウム溶液（ｐＨ７）、又は蒸留したＨ２Ｏに、濃度が２５〜５０μＭになるように）化合物を水溶液に溶解する。標準的な測定パラメーター（例えば、温度、２０℃；波長、１９０〜２６０ｎｍ；ステップ分解能、０．５ｎｍ；速度２０ｎｍ／秒；蓄積、１０；応答、１秒；バンド幅、１ｎｍ；路長、０．１ｃｍ）を用いて分光偏光計（例えば、Jasco J-710）上で円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを得た。各ペプチドのα螺旋含量は、平均残渣楕円率を、モデル螺旋デカペプチドについて報告されている値（Yang et al., Methods Enzymol. 130:208 (1986)）で割って算出した。
【０１４３】
（融点（Ｔｍ）を確認するアッセイ）
ペプチド模倣体大環状分子又は改変していないペプチドを蒸留したＨ２Ｏに（例えば、５０μＭの最終濃度に）溶解して、標準的なパラメータ（例えば、波長、２２２ｎｍ；ステップ分解能、０．５ｎｍ；速度、２０ｎｍ／秒；蓄積、１０；応答、１秒；バンド幅、１ｎｍ；温度上昇速度、１℃／分；路長、０．１ｃｍ）を用いて分光偏光計（例えば、Jasco J-710）上で温度範囲（例えば、４〜９５℃）に渡る楕円率の変化を測定してＴｍを決定した。
【０１４４】
（プロテアーゼ耐性アッセイ）
ペプチド骨格のアミド結合はプロテアーゼによる加水分解に敏感であるので、ペプチド化合物がインビボで迅速な分解を受けやすくする。しかしながら、ペプチド螺旋形成は典型的にアミド骨格を隠し、それによって、これをタンパク質分解から防御できる。本発明のペプチド模倣体大環状分子は、対応する架橋されていないポリペプチドと比較した分解速度の変化を評価するために、インビトロのトリプシンタンパク質分解に付すことができる。例えば、ペプチド模倣体大環状分子及び対応する架橋されていないポリペプチドをトリプシンアガロースとインキュベートして、遠心分離によって多様な時点で反応を止めて、次いでＨＰＬＣ注入して、２８０ｎｍにおける紫外線吸収によって残存基質を定量する。すなわち、ペプチド模倣体大環状分子及びペプチド模倣体前駆体（５ｍｃｇ）をトリプシンアガロース（Pierce）（Ｓ／Ｅ．約１２５）と０、１０、２０、９０、及び１８０分間インキュベートする。反応を高速の卓上遠心分離器で止めて；単離した上澄液中の残存基質を２８０ｎｍでＨＰＬＣベースのピーク検出によって定量する。一次速度則及び速度定数ｋを示すタンパク質分解反応を、ｌｎ［Ｓ］対時間のプロットから確認した。
【０１４５】
（エクスビボ安定性のアッセイ）
ペプチド模倣体大環状分子及び／又は対応する架橋されていないポリペプチドをそれぞれ、新鮮なマウス、ラット及び／又はヒトの血清（例えば、１〜２ｍＬ）と３７℃で、例えば、０、１、２、４、８、及び２４時間インキュベートできる。異なった濃度の大環状分子の試料を血清と連続希釈して調製することができる。無傷化合物のレベルを確認するために、以下の手順を用いることができる。１００μｌの血清を２ｍｌの遠心分離管に移した後、１０μｌの５０％ギ酸及び５００μｌのアセトニトリルを加えて、４±２℃で１０分間、１４，０００ＲＰＭで遠心分離する。次いで、上澄液を新鮮な管に移して、Ｎ２＜１０ｐｓｉ、３７℃で、Turbovap上で濃縮する。試料を１００μｌの５０：５０アセトニトリル：水にもどして、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に付す。エクスビボ安定性を試験する同じ又は類似の手法は公知であって、血清中の大環状分子の安定性を確認するために用いることができる。
【０１４６】
（インビトロ結合アッセイ）
ペプチド模倣体大環状分子及びペプチド模倣体前駆体の受容体タンパク質に対する結合及び親和性を評価するために、例えば、蛍光偏光アッセイ（ＦＰＡ）を用いることができる。ＦＰＡ技術は、偏光及び蛍光トレーサーを用いて、分子配向及び分子移動性を測定する。偏光で励起すると、高い見掛け分子量を有する分子に結合したＦＩＴＣのような蛍光トレーサー（例えば、巨大タンパク質に結合したＦＩＴＣ標識化ペプチド）は、小分子に結合した蛍光トレーサー（例えば、溶液中で遊離しているＦＩＴＣ標識化ペプチド）と比較して、その低い速度の回転に起因して高レベルの偏光蛍光を発生させる。
【０１４７】
（ペプチド−タンパク質相互作用の拮抗剤を特徴づけるインビトロ置換アッセイ）
ペプチドと受容体タンパク質の間の相互作用に拮抗する化合物の結合及び親和性を評価するために、例えば、ペプチド模倣体前駆体の配列に由来する蛍光標識化ペプチド模倣体大環状分子を利用する蛍光偏光アッセイ（ＦＰＡ）を用いる。ＦＰＡ技術は、偏光及び蛍光トレーサーを用いて、分子配向及び分子移動性を測定する。偏光で励起すると、高い見掛け分子量を有する分子に結合したＦＩＴＣのような蛍光トレーサー（例えば、巨大タンパク質に結合したＦＩＴＣ標識化ペプチド）は、小分子に結合した蛍光トレーサー（例えば、溶液中で遊離しているＦＩＴＣ標識化ペプチド）と比較して、その低い速度の回転に起因して高レベルの偏光蛍光を発生させる。蛍光標識化ペプチド模倣体大環状分子と受容体タンパク質の間の相互作用に拮抗する化合物は競合結合ＦＰＡ実験で検出されるだろう。
【０１４８】
（無傷細胞における結合アッセイ）
ペプチド又は架橋されているポリペプチドの、無傷細胞におけるそれらの天然の受容体との結合を、例えば、本明細書に記載されているような、免疫沈降実験で測定することができる。
【０１４９】
（Ｐ−ＬＩＳＡ及び免疫蛍光法）
無傷細胞におけるｐ５３／ＨＤＭＸの細胞内複合体を妨害するＳＡＨ−ｐ５３−８の能力を評価するために、Ｐ−ＬＩＳＡアッセイを適用した。ドキシサイクリン誘発性ＨＡ−ＨＤＭＸ構築物を発現するＵ２ＯＳ細胞（Wang et al., 2007）をカバースリップ上に播種してドキシサイクリンで２４時間処置した。ＳＡＨ−ｐ５３−８（１０μＭ）、エナンチオマーのＮｕｔｌｉｎ−３（１０μＭ）（Roche）、又は両方の化合物を処置の最終８時間に添加した。細胞を３．７％のパラホルムアルデヒド中に固定し、ＰＢＳ中で洗浄して、０．２％のトリトンＸ−１００中で５分間透過処理した。次いで、カバースリップをＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）中で２時間ブロックした。Ｐ−ＬＩＳＡのために、ＨＡ．１１（BabCo、１：５００）及びＦＬ３９３（Santa Cruz、１：１０００）をＰＢＳ／ＥＤＴＡ／０．２％トリトンＸ−１００／２％／ＮＧＳ中に希釈して４℃で１晩インキュベートした。ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄した後、近接ライゲーション ｉｎ ｓｉｔｕ アッセイ（Ｐ−ＬＩＳＡ）を、以下を除いて製造会社のプロトコル（Detection Kit 613, OLink BioScience）に従って実施した。ヤギ抗ウサギ（マイナス）及び抗マウス（プラス）Ｐ−ＬＩＳＡプローブを１：５ではなく１：１０でＮＧＳ中に希釈した。カバースリップを顕微鏡スライドに設置し、そしてOpenLabソフトウェア(Improvision)及びZeiss Axioplan 2 顕微鏡を使用して画像を得た。核内フォーカス（処置当たり少なくとも１００細胞）をBlobfinder ソフトウェア (Centre for Image Analysis, Uppsala University, Sweden）を用いて定量した。全ての曝露時間及び強度閾値はドキシサイクリン／Ｎｕｔｌｉｎ−３併用処置に基づいて設定して、各処置に対して一定に保った。観察された処置条件の間のフォーカス数の差異についての統計学的有意性を、ウェルチ補正と共に対応のないｔ−検定を用いて確認した。ｐ５３及びＨＤＭＸの標準的な免疫蛍光の画像化のために、上記の抗体を再び、但しＰＢＳ洗浄の後に用い、スライドを１μｇ／ｍｌのHoechst を含有しているヤギ抗ウサギＡＦ５６８（１：１０００）及びヤギ抗マウスＡＦ４８８（１：５００）（Investrogen/Molecular Probes）とインキュベートした（１時間、室温）。OpenLab において 各Hoechst 画像から密度スライスを作成して、Ｐ５３及びＨＤＭＸの両方の核強度を定量するマスクとして使用した。総強度を平均画素強度×核領域と定義して、核サイズの差に対して補正した。Microsoft Excel 及び Prism ソフトウェア（GraphPad）を用いてグラフ表示及び統計分析を実施した。
【０１５０】
（細胞透過性アッセイ）
ペプチド又は架橋されているポリペプチドの細胞透過性を測定するために、無傷細胞を蛍光標識化した架橋されているポリペプチド（１０μＭ）と、無血清培地又はヒト血清を補完した培地中、３７℃で４時間インキュベートし、培地で２回洗浄して、トリプシン（０．２５％）と３７℃で１０分間インキュベートする。細胞を再度洗浄して、ＰＢＳに懸濁する。細胞蛍光を、例えば、FACSCalibur フローサイトメーター、又はCellomics' KineticScan.RTM. HCS Reader の何れかを用いて分析する。
（細胞有効性アッセイ）
ある特定の架橋されたポリペプチドの有効性を、例えば、ヒト又はマウス細胞集団に由来する各種の腫瘍形成性及び非腫瘍形成性の細胞株及び初代細胞を用いる、細胞に基づいた殺傷アッセイで確認する。細胞生存能を、例えば、架橋されているポリペプチド（０．５〜５０μＭ）と２４〜９６時間培養して観察して、ＥＣ５０＜１０μＭで殺傷するものを同定する。細胞生存能を測定するいくつかの標準的なアッセイは市販されていいて、架橋されているポリペプチドの有効性を評価するために任意に用いられる。さらに、アネキシンＶ及びカスパーゼ活性化を測定するアッセイは、架橋されているポリペプチドがアポトーシス機構を活性化して細胞を殺傷するか否かを評価するために任意に用いられる。例えば、Cell Titer-Glo（登録商標）アッセイは、細胞間ＡＴＰ濃度の機能として、細胞生存能を確認するために用いられる
【０１５１】
（インビボ安定性アッセイ）
架橋されているポリペプチドのインビボ安定性を調べるために、化合物を、例えば、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度で、マウス及び／又はラットにＩＶ、ＩＰ、ＰＯ又は吸入経路で投与して、注射後０分、５分、１５分、３０分、１時間、４時間、８時間及び２４時間時点で血液試料を採取する。次いで、新鮮血清２５μＬ中の無傷化合物の濃度を上記のようにＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定する。
【０１５２】
（動物モデルにおけるインビボ有効性）
インビボにおける本発明の架橋されているポリペプチドの抗腫瘍形成活性を確認するために、化合物を、例えば、単独で（ＩＰ、ＩＶ、ＰＯ、吸入又は経鼻経路で）又は関連する化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、ドクソルビシン、エトポシド）の準最適用量と併用して投与する。例えば、マウスにＤ−ルシフェリン（６０ｍｇ／ｋｇ）を注射して麻酔した動物を画像化（例えば、Xenogen In Vivo Imaging System, Caliper Life Sciences, Hopkinton, Mass.）することによって、白血病を観察できる。全身バイオルミネセンスをLiving Image Software（Caliper Life Sciences, Hopkinton, Mass.）によって光子移動（光子／ｓｅｃ）の積分で定量する。ペプチド模倣体大環状分子を単独で、又は関連化学療法剤の準最適用量との組み合わせを、例えば、白血病マウス（注射／実験１日目の１０日後、１４〜１６の範囲のバイオルミネセンスにおいて）に尾静脈又はＩＰ経路によって、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で７〜２１日間投与する。任意に、実験を通して１日おきにマウスを画像化して、実験期間中毎日生存を観察する。期間終了後のマウスを任意に実験の最後に解剖する。別の動物モデルは、安定にルシフェラーゼ発現する、ヒト濾胞性リンパ腫に由来する細胞株である、ＤｏＮＨ２の、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスへの移植である。別の動物モデルは、安定にルシフェラーゼを発現する、ヒト繊毛癌由来の細胞株である、Ｌｕｃ−ＪＥＧ−３の、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスへの移植である。これらのインビボ試験は任意に予備的薬物動態、薬力学及び毒物学的データを作成する。
【０１５３】
（臨床試験）
本発明の架橋されているポリペプチドの、ヒトの治療に対する適合性を確認するために、臨床試験を実施することができる。例えば、癌を有すると診断されて治療を必要としている患者を選択して、治療群と１つ又はそれ以上のコントロール群に分ける。ここで治療群には本発明の架橋されているポリペプチドを投与し、一方、コントロール群にはプラセボ又は公知の抗癌剤を投与する。本発明の架橋されているポリペプチドの治療安全性及び有効性は、生存時間及び生活の質のような因子に関する患者群の比較を実施して評価することができる。この実施例では、架橋されているポリペプチドで治療した患者群は、プラセボで治療した患者群と比較して改善された長期間の生存を示す。
【０１５４】
ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤は、Reed et al., J. Biol. Chem., 285:10786-10796 (2010)（これはその全てが参照により本明細書に取り込まれている）に開示されている１つ又はそれ以上の小分子を包含できる。例えば、ＨＤＭＸ調節剤は、Reed et al., J. Biol. Chem., 285:10786-10796 (2010)に開示されている小分子ＳＪ−１７２５５０を包含できる。
【０１５５】
ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤は、Harker et al., Bioorg. Med. Chem., 17:2038-2046 (2009)（これはその全てが参照により本明細書に取り込まれている）に開示されている１つ又はそれ以上の３１４−螺旋β−ペプチドを含有できる。例えば、ＨＤＭＸ調節剤は、Harker et al., Bioorg. Med. Chem., 17:2038-2046 (2009)に開示されているβ３−ペプチドβ５３−１２を包含できる。
【０１５６】
ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤は、Hayashi et al., Bioorg. Med. Chem., 17:7884-7893 (2009)（これはその全てが参照により本明細書に取り込まれている）に開示されている１つ又はそれ以上のＮ−アシルポリアミン（ＮＡＰＡｓ）を包含できる。例えば、ＨＤＭＸ調節剤は、Hayashi et al., Bioorg. Med. Chem., 17:7884-7893 (2009)に開示されているＮＡＰＡ２５を包含できる。
【０１５７】
ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤は、Li et al., J. Am. Chem. Soc., 130:13546-13548 (2008)（これはその全てが参照により本明細書に取り込まれている）に開示されている１つ又はそれ以上の改変スコルピオン毒素ミニチュアタンパク質を包含できる。例えば、ＨＤＭＸ調節剤は、Li et al., J. Am. Chem. Soc., 130:13546-13548 (2008)に開示されているストッピン−１（stoppin-1）を包含できる。
【０１５８】
ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤は、Hu et al., Cancer Res., 67:8810-8817 (2007); Kallen et al., J. Biol. Chem., 284:8812-8821 (2009)（これはその全てが参照により本明細書に取り込まれている）に開示されている１つ又はそれ以上のチオレドキシン−共役ペプチドを包含できる。例えば、ＨＤＭＸ調節剤は、Phan et al., J. Biol. Chem., 285:2174-2183 (2010)に開示されているｐＤＩペプチドを包含できる。
【０１５９】
ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤は、Markey, et al Oncogene, 1-10 (2008)（これはその全てが参照により本明細書に取り込まれている）に開示されている１つ又はそれ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を包含できる。例えば、ＨＤＭＸ調節剤は、Markey, et al Oncogene, 1-10 (2008)に開示されているｍｉＲＮＡｍｉＲ−３４ａを包含できる。
【０１６０】
ＨＤＭ２調節剤
本開示が網羅するＨＤＭ２調節剤は、細胞中のＨＤＭ２の活性（例えば、Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性）、発現（例えば、タンパク質又はｍＲＮＡ発現）及び／又はレベル（例えばタンパク質レベル）を直接（例えば、ＨＤＭ２に結合して）又は間接的に（例えば、ＨＤＭ２発現の及び／又は活性を制御する分子又は経路に作用して）調節すること（例えば、阻害する）によって細胞内のｐ５３の発現、レベル及び／又は活性を増大する何れかの物質を包含する。
【０１６１】
ある実施態様では、ＨＤＭ２調節剤は、以下に開示されている１つ又はそれ以上の物質を包含できる。例えば、ＨＤＭ２調節剤は：（１）ＨＤＭ２と結合する１つ又はそれ以上のステープル状に架橋されていないペプチド；（２）ＨＤＭ２と結合する１つ又はそれ以上のステープル状に架橋されているｐ５３ペプチド；（３）ＨＤＭ２と結合する１つ又はそれ以上の小分子；（４）ＨＤＭ２と結合する（例えば特異的に結合する）抗体又は抗体の断片；（５）ＨＤＭ２の発現を減少させる１つ又はそれ以上の核酸分子（例えば、抑制性核酸分子（例えば、ＲＮＡｉ又はｓｉＲＮＡ））；（６）ＨＤＭ２の発現及び／又は活性を減少させる１つ又はそれ以上の医薬；及び（７）ＨＤＭ２の発現及び／又は活性を減少させる１つ又はそれ以上の方法、並びに（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）及び／又は（７）の組合わせの何れかを包含できる。
【０１６２】
ある実施態様では、本明細書に開示されている方法及び組成物で用いられるＨＤＭ２調節剤は、本明細書に開示されているＨＤＭＸ調節剤とは同じではない（例えば、ＨＤＭ２調節剤は、ＨＤＭＸと結合（例えば、実質的に結合）しないで特異的にＨＤＭ２と結合する）。
【０１６３】
ある実施態様では、ＨＤＭ２調節剤はＨＤＭ２及びＨＤＭＸと結合できる。しかしながら、このような実施態様では、ＨＤＭＸ阻害剤は一般に、ＨＤＭＸに対するよりＨＤＭ２に対してより高い結合親和性を有している（例えば、ＨＤＭ２調節剤の結合親和性はＨＤＭＸに対するよりＨＤＭ２に対して２、５、１０、２０、２５、５０、７５、１００倍又はそれ以上である）。
【０１６４】
ある実施態様では、ＨＤＭ２調節剤はＨＤＭ２及びＨＤＭＸの両方と結合できるが、ＨＤＭ２の活性のみを阻害する（例えば、実質的に阻害する）。
【０１６５】
ある実施態様では、ＨＤＭ２調節剤は、ペプチド又はステープル状に架橋されているペプチドがＨＤＭ２と結合するか及び／又はこれを調節する限り、本明細書に開示されている１つ又はそれ以上のペプチド又はステープル状に架橋されているペプチドを包含できる（物質がＨＤＭ２の発現又は活性を調節できるか否かを評価する方法は当該技術分野において公知である（例えば、米国特許出願番号第１２／５２５，１２３号（これは参照により本明細書に取り込まれている）を参照されたい））。
【０１６６】
ある実施態様では、本明細書に開示されている方法及び組成物で用いられるＨＤＭ２調節剤は、本明細書に開示されている方法及び組成物で用いられるＨＤＭＸ調節剤とは同じではない（例えば、ＨＤＭ２調節剤は、ＨＤＭＸと結合（例えば、実質的に結合）しないで特異的にＨＤＭ２と結合する）か、又は本明細書に開示されている方法及び組成物で用いられるＨＤＭＸ調節剤と同じであるが、ＨＤＭＸに対するよりＨＤＭ２に対してより高い結合親和性を有している（例えば、ＨＤＭＸ調節剤の結合親和性はＨＤＭＸに対するよりＨＤＭ２に対して２、５、１０、２０、２５、５０、７５、１００倍又はそれ以上である）。
【０１６７】
ある実施態様では、ＨＤＭ２調節剤は架橋されているペプチドではない。ある実施態様では、ＨＤＭ２調節剤は図１Ｃに示す架橋されているペプチドではない。ある実施態様では、ＨＤＭ２調節剤はＳＡＨ−ｐ５３−８ではない。
【０１６８】
ある実施態様では、ＨＤＭ２調節剤はＮｕｔｌｉｎ−３ａ（例えば、Ｃ３０Ｈ３０Ｃ１２Ｎ４Ｏ４；分子量：５８１．４８９６［ｇ／ｍｏｌ］（二次元及び三次元構造は、ワールドワイドウェブアドレス、pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=216345 に示されている ) (F. Hoffmann-La Roche Ltd)（Arya et al., British J. Cancer, 103:186-195 (2010); Laurie et al. Nature, 444:61-66 (2006): Ｎｕｔｌｉｎ−３はＨＤＭ２及びＨＤＭＸと結合するがＨＤＭＸよりより高い親和性でＨＤＭ２と結合するという報告を参照されたい）、例えば、市販のＮｕｔｌｉｎ−３又はＮｕｔｌｉｎ−３ａを包含できる。
【０１６９】
ある実施態様では、ＨＤＭ２調節剤は、Shangary et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. 105:3933-3938 (2008)、これは参照によりその全てが本明細書に取り込まれている）に開示される１つ又はそれ以上のスピロ−オキシンドールを包含できる。ある実施態様では、ＨＤＭ２調節剤は、Ding et al. (J. Am. Chem. Soc. 127:10130-10131 (2005)、これは参照によりその全てが本明細書に取り込まれている）に開示されるスピロ−オキシンドールを包含できる。
【０１７０】
ある実施態様では、ＨＤＭ２調節剤は、Grasberger et al. (J. Med. Chem. 48:909-912 (2005)、これは参照によりその全てが本明細書に取り込まれている）に開示される、１つ又はそれ以上のベンゾジアゼピンジオンを包含できる。
【０１７１】
ある実施態様では、ＨＤＭ２調節剤は、Yin et al. (Angew. Chem. Int. Ed. 44:2704-2707 (2005)、これは参照によりその全てが本明細書に取り込まれている）に開示される、１つ又はそれ以上のテルフェニルに基づく螺旋模倣体を包含できる。
【０１７２】
ある実施態様では、ＨＤＭ２調節剤は、ＨＤＭ２と結合する（例えば、特異的に結合する）抗体（例えば、モノクローナル又はポリクローナル抗体、或いはＨＤＭ２と結合する（例えば特異的に結合する）モノクローナル又はポリクローナル抗体の抗原結合断片）を包含できる。ある実施態様では、Anderson et al. (International J. Oncology, 31:545-555 (2007)、これは参照によりその全てが本明細書に取り込まれている）に開示されるモノクローナル抗体ＭＤＭ２−Ｆ４−１４を包含できる。
【０１７３】
ある実施態様では、ＨＤＭ２調節剤は、Kritzer et al. (ChemBioChem, 7:29-31 (2006)、これは参照によりその全てが本明細書に取り込まれている）に開示される１つ又はそれ以上の「ミニチュアタンパク質」を包含できる。ある実施態様では、ＨＤＭ２調節剤は、Kritzer et al. (ChemBioChem, 7:29-31 (2006)）に開示されるミニチュアペプチドｐ５３ＡＤ１５−３１を包含できる。
【０１７４】
ある実施態様では、ＨＤＭ２調節剤は、Pichiorri, et al（Cancer Cell, 18:367-381 (2010)、これは参照によりその全てが本明細書に取り込まれている）に開示される１つ又はそれ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を包含できる。例えば、ＨＤＭ２調節剤は、Pichiorri, et al（Cancer Cell, 18:367-381 (2010)）に開示されるｍｉＲＮＡｍｉＲ−１９２を包含できる。
【０１７５】
ｐ５３の発現及び／又は活性を誘発する組成物及び／又は方法
上記のように、ＨＤＭＸ調節剤の何れかの組合わせ、又はＨＤＭ２調節剤と組合わせたＨＤＭＸ調節剤は、ｐ５３の発現及び／又は活性を誘発する組成物及び／又は方法と組合わせて用いることができる。例示的なｐ５３の発現及び／又は活性を誘発する組成物及び／又は方法は、これに限定されないが、イオン化放射；紫外線；エトポシド、アクチノマイシンＤ、ドクソルビシン、パクリタキセル、及びその他の化学療法剤のようなＤＮＡ損傷剤を包含できる。
【０１７６】
ある実施態様では、細胞中のｐ５３活性は、活性なｐ５３を細胞に導入する（例えばウィルス（例えば、レトロウィルス）及び／又はＤＮＡの導入を用いて）ことによって増大できる。ある実施態様では、活性なｐ５３は対象から得られる核酸配列から発現でき、及び／又は活性なｐ５３は対象から得た単離されたタンパク質であってよく、任意にｐ５３の細胞透過性を増強する部分と結合させることができる。ある実施態様では、ｐ５３の活性は、癌細胞（例えば、ｐ５３活性が減退している癌細胞）に的を絞った方法でｐ５３のレトロウィルスによる再構築によって増大することができる。
【０１７７】
ある実施態様では、ｐ５３の発現及び／又は活性を誘発する組成物及び／又は方法は、本明細書に開示されている１つ又はそれ以上のＨＤＭ２阻害剤を包含できる。
【０１７８】
本明細書で用いられる用語「発現」は、タンパク質及び／又は核酸の発現及び／又はタンパク質活性を包含する。
【０１７９】
医薬組成物
ある実施態様では、本明細書に開示されている、医薬組成物を含んでいる組成物は：（１）１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤；及び／又は（２）１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤；及び／又は（３）ｐ５３の発現及び／又は活性を誘発する１つ又はそれ以上の組成物及び／又は方法を包含し、これは（１）〜（３）の何れかの組合わせ、例えば、（１）と（２）及び／又は（３）（例えば、（１）と（２）、（１）と（３）、そして（１）と（２）と（３））の組合わせの何れかを包含している。
【０１８０】
更に、本明細書に開示されている方法はこれらの組成物の何れか、例えば、組成物又は医薬組成物のような、の使用を包含する。
【０１８１】
本明細書で用いられるような、本明細書に記載されている式の化合物を包含している、本発明の組成物は、それらの薬学的に許容される誘導体又はプロドラッグを包含するように定義される。「薬学的に許容される誘導体又はプロドラッグ」は、レシピエントに投与すると、本発明の化合物を（直接的又は間接的に）もたらすことができる本明細書に開示されている化合物又は物質の、薬学的に許容される塩、エステル、エステルの塩、又は他の誘導体の何れかを意味する。特に好ましい誘導体及びプロドラッグは、このような化合物を哺乳動物に投与したときに化合物のバイオアベラビリティーを増大する（例えば、経口投与された化合物をより容易に血中に吸収されるようにすることによって、又は親化合物の生体区画（例えば、脳又はリンパ系）への送達を親種と比べて増強するものである。好ましいプロドラッグは、水溶性又は腸膜を介する能動輸送を増大させる基が本明細書に開示されている式の構造に付加している誘導体を包含する。
【０１８２】
本発明の化合物は選択的な生物特性を増強する適切な官能基を付加することによって改変できる。このような改変は当該技術分野において公知であって、所定の生体区画（例えば、血液、リンパ系、中枢神経系）内への生物学的浸透を増大し、経口アベイラビリティーを増大し、注射による投与を可能にするために溶解性を増大し、代謝を変え、そして排泄速度を変えるものを包含する。
【０１８３】
本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される無機及び有機の酸及び塩基から誘導されるものを包含する。適切な酸塩の例は、酢酸塩、アジピン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、パルモ酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、トリフルオロメチルスルホン酸塩、及びウンデカン酸塩を包含する。適切な塩基に由来する塩は、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）、アンモニウム及びＮ−（アルキル）４＋塩を包含する。本発明は本明細書に開示されている化合物の何れかの塩基性窒素含有基の四級化も想定している。水溶性又は脂溶性或いは分散性の生成物もこのような四級化で得られる。
【０１８４】
本明細書に開示されている式の化合物は、例えば、約０．００１〜１００ｍｇ／体重ｋｇの範囲の用量を用いて、又は特定薬剤の要求に従って、注射、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、又は皮下注射で；又は経口で、口腔内に、経鼻的に、経粘膜で、局所に、眼科製剤で、又は吸入によって投与されてよい。あるいは又は更に、本発明の化合物は食品医薬品局（Food and Drug Adminstaration）が承認した何れかの方法、例えば、CDER Data Standards Manual, version number 004（fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htm で入手できる）に記載されているような、に従って投与できる。
【０１８５】
本明細書の方法は、所望の又は定められた効果を達成する化合物又は化合物組成物の有効量の投与を意図している。典型的には、本発明の医薬組成物は１日当り約１〜約６回或いは、連続輸液として投与される。このような投与は長期治療又は救急治療として利用できる。単回用量製剤を作成するために担体物質と混合できる活性成分の量は、治療される対象及び特定の投与方法によって変わる。典型的な製剤は約５％〜約９５％の活性化合物（Ｗ／Ｗ）を含有している。或いは、このような製剤は約２０％〜約８０％の活性化合物を含有している。
【０１８６】
ある実施態様では、ＨＤＭＸ調節剤（例えば、ｐ５３のステープル状に架橋されているペプチド）の有効用量は、これに限定されないが、例えば、約、０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜１００００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜５０００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜２５００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜１０００；．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜９００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜８００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜７００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜６００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜５００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜４００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜３００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜２００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜１００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜９０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜８０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜７０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜６０；０．００００、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜５０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜４０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０１、０．１、１又は１０〜３０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜２０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜３０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１〜１５、０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜３０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１〜１０、０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜３０；又は０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１〜５ｍｇ／ｋｇ／日の、例えば、静脈内投与を包含できる。
【０１８７】
ある実施態様では、ＳＡＨ−ｐ５３−８の有効用量は、これに限定されないが、例えば、約、０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜１００００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜５０００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜２５００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜１０００；．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜９００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜８００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜７００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜６００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜５００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜４００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜３００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜２００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜１００；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜９０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜８０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜７０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜６０；０．００００、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜５０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜４０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０１、０．１、１又は１０〜３０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜２０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜３０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１〜１５、０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜３０；０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１〜１０、０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１又は１０〜３０；又は０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１〜５ｍｇ／ｋｇ／日の、例えば、静脈内投与を包含できる。
【０１８８】
上で述べたものより低い又は高い用量を必要とするかもしれない。何れか特定の患者に対する特定の用量及び治療計画は、用いられる具体的な化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食生活、投与の時間、排泄の速度、薬剤の組合わせ、病気、症状又は疾患の重症度及び経過、患者の病気、疾患又は症状に対する素質、及び治療医師の判断を含む各種因子によって決まるだろう。
【０１８９】
患者の疾患の改善によって、所望により、本発明の化合物、組成物又は組合せの維持用量を投与してよい。続いて、投与の用量又は回数、或いはその両方を、症状に応じて改善された疾患が維持されるレベルまで減少させてよい。しかしながら、患者は病状の何らかの再発に基づき間欠的治療を必要とするかもしれない。
【０１９０】
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されている式の化合物又はそれらの薬学的に許容される塩；例えば、モルフィン又はコデインを包含する追加の薬剤；及び薬学的に許容される担体、補助剤又は賦形剤の何れかを含有している。本発明の別の組成物は、本明細書に記載されている式の化合物又はそれらの薬学的に許容される塩；及び薬学的に許容される担体、補助剤又は賦形剤を含有している。本明細書で説明されている組成物は、疾患又は疾患の症状の調節を達成するのに有効な量の、本明細書で説明されている式の化合物の、更には存在するなら、追加の治療剤を含有している。
【０１９１】
用語「薬学的に許容される担体又は補助剤」は、本発明の化合物と共に患者に投与でき、そして化合物の治療量を送達するのに十分な用量を投与したときにそれらの薬学的な活性を失わせず、無毒性である担体又は補助剤を示す。
【０１９２】
本発明の医薬組成物で用いられてよい薬学的に許容される担体、補助剤及び賦形剤は、これに限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００コハク酸エステルのような自己乳化送達系（ＳＥＤＤＳ）、ツイーン又はその他の類似のポリマー送達マトリックスのような、医薬剤形で用いられる界面活性剤、ヒト血清アルブミンのような血清タンパク質、リン酸塩のような緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質（硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩のような）、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロック重合体、ポリエチレングリコール及び羊毛脂を包含する。α−、β−、及びγ−シクロデキストリンのようなシクロデキストリン類は本明細書に記載されている式の化合物の送達を増強するために有利に用いることもできる。
【０１９３】
本発明の医薬組成物は、経口、非経口、吸入スプレーで、局所、経鼻、口腔内、膣内又は移植容器を介して、好ましくは経口投与又は注射投与で、投与できる。本発明の医薬組成物は何れかの通常の非毒性で薬学的に許容される担体、補助剤又は賦形剤を含有できる。ある場合は、製剤化した化合物又はその送達形態の安定性を向上させるために、製剤のｐＨを薬学的に許容される酸、塩基又は緩衝剤で調節できる。本明細書で用いられる用語、非経口は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内投与、胸骨下、髄腔内、病巣内及び頭蓋内注射、又は点滴術を包含する。あるいは又は更に、本発明の医薬組成物は食品医薬品局（Food and Drug Adminstaration）が承認した何れかの方法、例えば、CDER Data Standards Manual, version number 004（fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htm で入手できる）に記載されているような、に従って投与できる。
【０１９４】
医薬組成物は無菌注射製剤、例えば、無菌注射用の水性又は油性の懸濁液のような形態にできる。この懸濁液は、適切な分散又は湿潤剤（例えば、ツイーン８０のような）及び懸濁剤を用いて当該技術分野で公知の技術に従って製剤化できる。無菌注射製剤は、非毒性で非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌の注射用溶液又は懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール溶液であってよい。許容される賦形剤及び溶媒のうちで使用できるものは、マンニトール、水、リンゲル溶液及び等張食塩溶液である。更に、無菌の固定油は溶媒又は懸濁化媒体として通常に用いられている。この目的のために、合成モノ−又はジグリセリドを包含する、何れかの無刺激性固定油を用いることができる。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体のような、脂肪酸は、オリーブ油又はひまし油のような、天然の薬学的に許容される油と同様に、特にそのポリオキシエチル化バージョンでは、注射用製剤において有用である。これらの油性溶液又は懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤又は分散剤、又は乳剤及び／又は懸濁剤のような薬学的に許容される剤形の製剤化で通常用いられているカルボキシメチルセルロース又は同様な懸濁化剤も含有できる。ツイーン類又はスパン類のようなその他の通常用いられている界面活性剤及び／又は薬学的に許容される固体、液体又はその他の剤形の製造で通常用いられている同様な乳化剤又はバイオアベイラビリティーの増強剤も製剤化の目的のために用いることができる。
【０１９５】
本発明の医薬組成物は、これに限定されないが、カプセル剤、錠剤、乳剤及び水性懸濁剤、分散液並びに溶液を包含する経口投与に許容される何れかの剤形で経口投与できる。経口使用のための錠剤の場合は、通常用いられる担体は乳糖及びコーンスターチを包含している。ステアリン酸マグネシウムのような、滑沢剤も一般的に添加される。カプセル形態で経口投与するために、有用な希釈剤は乳糖及び乾燥コーンスターチを包含している。水性懸濁剤及び／又は乳剤を経口投与する場合は、油層に懸濁又は溶解した活性成分を乳化及び／又は懸濁化剤と混合できる。所望により、ある特定の甘味及び／又は着香及び／又は着色剤を加えることができる。
【０１９６】
本発明の医薬組成物は直腸内投与用の坐剤の形態で投与することもできる。これらの製剤は本発明の化合物を、室温では固体であるが直腸温度では液体であるので直腸内で溶解して活性成分を放出する、適切な非刺激性賦形剤と混合することによって製造できる。このような物質は、これに限定されないが、ココアバター、蜜蝋及びポリエチレングリコールを包含する。
【０１９７】
本発明の医薬組成物は経鼻エアゾール又は吸入によって投与できる。このような組成物は、医薬製剤の技術分野で公知である技術に従って製造され、ベンジルアルコール又はその他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティーを増強する吸収促進剤、フッ化炭素、及び／又は当該技術分野で公知のその他の安定化又は分散化剤を用いて、生理食塩水の溶液として製造できる。
【０１９８】
本発明の組成物が本明細書に記載されている式の化合物と１つ又はそれ以上の追加の治療又は予防薬剤との組み合わせを含んでいるときは、本化合物及び追加薬剤の両方は、単独治療法で通常投与される用量の約１〜１００％、より好ましくは５〜９５％の用量レベルで存在させるべきである。追加薬剤は、本発明の化合物とは別に、多剤投与の一部として投与できる。或いはこれらの薬剤を、本発明の化合物と共に単一の組成物中に混合した、単一剤形の一部とすることができる。
【０１９９】
本明細書で用いられる用語「有効量」及び「治療に有効な」は、その投与により意図した効果又は生理的な転帰がもたらされるという意味で有効である、ある期間（救急投与又は慢性投与、及び継続又は連続投与を包含する）用いられる、本明細書に記載されている１つ又はそれ以上の化合物又は医薬組成物の量又は濃度を示す。
【０２００】
本発明で用いられる１つ又はそれ以上の化合物又は医薬組成物の有効量は、細胞中のｐ５３濃度（例えば、タンパク質濃度）及び／又はｐ５３活性（例えば、生物活性）の増大を促進する量を包含する。化合物の治療有効量は疾患の治癒を必要としないが疾患の治療をもたらすだろう。
【０２０１】
ある実施態様では、本開示は、下記方法において本明細書中に開示されている１つ又はそれ以上の組成物（以下に「Ｘ」と示してある）の何れかを用いる方法を提供する：
【０２０２】
本明細書に開示されている１つ又はそれ以上の病気又は疾患（例えば、癌、以下の実施例で「Ｙ」と示してある）の治療において薬剤として用いるための物質Ｘ。Ｙの治療のための薬剤の製造のための物質Ｘの使用；及びＹの治療において使用するための物質Ｘ。
【０２０３】
治療方法／オーダーメイド治療
本開示は、癌の治療方法、例えば対象（例えば、ヒト対象）における癌を治療する方法を包含している。本明細書で用いられる「治療」は、病気又は疾患（例えば、癌）の１つ又はそれ以上の症状を改善するかあるいは有益に変える何れかの方法を意味する。本明細書で用いられているような、特定の疾患（例えば、癌）の症状の改善は、永続的又は一時的、持続的又は過渡的に関わらず、本発明の組成物及び方法による治療に起因する、あるいは治療に関連する、何らかの減少を示す。ある実施態様では、治療は、例えば、治療前の癌細胞の数（例えば、対象中の）に比べて癌細胞の数（例えば、対象中の）の減少；治療前の癌細胞（例えば、対象中の）の生存能（例えば、平均（average/mean）生存能）と比べた癌細胞（例えば、対象中の）の生存能（例えば、平均（average/mean）生存能）の減少；治療前の腫瘍サイズと比べた腫瘍サイズの低下；及び／又は治療前の対象の症状と比べた対象における１つ又はそれ以上の癌に関連する１つ又はそれ以上の症状の減少を促進するか又はもたらすことができる。
【０２０４】
ある実施態様では、方法は治療を必要としている対象（例えば、１つ又はそれ以上の癌に罹る危険性がある、癌を有している、又は癌に罹っている対象）を選択すること、及び（１）１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤；（２）１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤；及び（３）ｐ５３の発現及び／又は活性を誘発する１つ又はそれ以上の組成物及び又は方法：の１つ又はそれ以上の有効用量を対象に投与することを包含していて、対象を治療するのに十分な条件下及び期間、（１）の（２）及び（３）との何れかの組合わせ（例えば、（１）と（２）；（１）と（３）；及び（１）と（２）と（３））を包含する。このような方法は、治療の有効性を確認するために組成物の投与の間及び投与後に対象を観察又は評価すること、及び、必要により、有効性を向上させるために治療を調節すること（例えば、組成物を変えて、組成物の単回投与の用量を増量して、１日当りに投与される組成物の投与回数を増やして、及び／又は組成物を投与する日数を増やして）も包含している。
【０２０５】
ある実施態様では、方法は、癌を有する患者に対するオーダーメイド治療計画を開発することを包含できる。このような方法は、例えば、ＨＤＭ２調節剤に対して感受性のある癌細胞を有している対象を同定すること、及び１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤で対象を治療すること；ＨＤＭＸ調節剤に対して感受性のある癌細胞を有している対象を同定すること、及び１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤で対象を治療すること；並びにＨＤＭ２調節剤及び／又はＨＤＭＸ調節剤に耐性を示す癌細胞を有している対象を同定すること、及び１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤と１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤の相乗作用のある組合わせで対象を治療することを包含できる（図１１及び１２を参照されたい）。ある実施態様では、方法は、癌を有していると確認された患者に最も適している治療を確認すること（例えば、本明細書に開示される組成物を用いる治療に対する対象の１つ又はそれ以上の癌細胞の感受性を確認（例えば、インビトロで）することによって）、対象に対する治療計画を開発すること、及び治療計画に従って対象に組成物を任意に投与することを包含できる。これらの方法は、例えば、以下の方法を包含できる。
【０２０６】
（ｉ）癌を有する患者を選択すること；患者の癌における（例えば、対象から入手した（例えば、生検で入手した）癌細胞中の）ｐ５３の発現及び／又は活性を評価すること（例えば、検出すること）；及び、ｐ５３の発現及び／又は活性が検出されたら、１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤の有効量を対象に投与することを包含しているオーダーメイド治療計画を対象に提供すること。ある実施態様では、方法は、対象を治療するのに十分な条件下で及び十分な期間、対象に１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤を投与することを包含している。
【０２０７】
（ｉｉ）癌を有する患者を選択すること；対象から入手した（例えば、生検で得た癌細胞）試料（例えば、癌細胞）におけるｐ５３−ＨＤＭＸ複合体の存在及び／又はレベルを検出すること；そして、ｐ５３−ＨＤＭＸ複合体が検出されたら、１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤の有効量を対象に投与することを包含しているオーダーメイド治療計画を患者に提供すること。ある実施態様では、方法は、対象を治療するのに十分な条件下で及び十分な期間、対象に１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤を投与することを包含している。
【０２０８】
（ｉｉｉ）癌を有する患者を選択すること；対象から入手した（例えば、生検で得た癌細胞）試料（例えば、癌細胞）におけるｐ５３−ＨＤＭＸ複合体の存在及び／又はレベルを検出すること；そして、ｐ５３−ＨＤＭＸ複合体が検出されたら、対象を治療するのに十分な条件下で及び十分な期間、対象に１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤を投与すること；組成物の投与の間及び投与後に対象を観察又は評価して治療の有効性を確認すること；そして治療の有効性が低い場合は、１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤を対象に投与すること。
【０２０９】
（ｉｖ）癌を有する患者を選択すること；対象から入手した（例えば、生検で得た癌細胞）試料（例えば、癌細胞）におけるｐ５３−ＨＤＭＸ複合体の存在及び／又は濃度を検出し、そして試料中のｐ５３のレベルを評価してｐ５３のレベル又は活性が（例えば、１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤に接触させたときに減少した生存能を示す癌細胞におけるｐ５３のレベル又は活性と比較して）低いか否かを確認すること。ある実施態様では、ｐ５３のレベルをＪｅｇ−３及び／又はＭＣＦ−７細胞（複数を含む）中のｐ５３のレベルと比較する。ある実施態様では、活性は本明細書に記載のように、ＨＤＭＸ−ｐ５３複合体の解離を滴定することによって評価でき、そしてｐ５３−ＨＤＭＸ複合体が検出されてｐ５３のレベルが低いときは、１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤の有効量を対象に投与することを包含しているオーダーメイドの治療計画を対象に提供すること。ある実施態様では、方法は、ｐ５３の発現及び／又は活性を誘発する組成物及び／又は方法の有効量を投与することを更に含んでいる、オーダーメイド治療計画を対象に提供することも含んでいる。ある実施態様では、方法は、対象を治療するのに十分な条件下及び期間、１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤、並びに、任意に対象に対してｐ５３の発現及び／又は活性を誘発する組成物及び／又は方法を投与することを含有している。
【０２１０】
（ｖ）以前に１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤（例えば、Ｎｕｔｌｉｎ−３）を投与されたが、それらの癌細胞がＨＤＭ２調節剤（例えば、Ｎｕｔｌｉｎ−３）に耐性（例えば、部分的な耐性）を示した、癌を有する対象を選択すること；そして１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤、並びに任意に、ｐ５３の発現及び／又は活性を誘発する組成物及び／又は方法の有効量を投与することを包含するオーダーメイドの治療計画を対象に提供すること。ある実施態様では、方法は、対象を治療するのに十分な条件下及び期間、１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤、並びに任意にｐ５３の発現及び／又は活性を誘発する組成物を対象に投与することを包含している。及び／又は
【０２１１】
（ｖｉ）以前に１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤（例えば、ＳＡＨ−ｐ５３−８）を投与されたが、それらの癌細胞がＨＤＭＸ調節剤に耐性（例えば、部分的な耐性）を示した癌を有する対象を選択すること；そして１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤、並びに任意に、ｐ５３の発現及び／又は活性を誘発する組成物の有効量を投与することを包含しているオーダーメイド治療計画を対象に提供すること。ある実施態様では、方法は、対象を治療するのに十分な条件下及び期間、１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤、並びに任意にｐ５３の発現及び／又は活性を誘発する組成物を対象に投与することを包含している。
【０２１２】
方法（ｉ）〜（ｖｉ）は独立して又は共に及び何れの順番でも実施できることに注目すべきである。方法（ｉ）〜（ｖｉ）の何れも、組成物の投与の間及び投与後に対象を観察又は評価して治療の有効性を確認して、必要によって、有効性を向上させるために治療を調節すること（例えば、組成物を変えて、組成物の単回投与の用量を増やして、１日当りに投与される組成物の投与回数を増やして、及び／又は組成物を投与する日数を増やして）も包含できる。
【０２１３】
ある実施態様では、本明細書のＨＤＭＸ調節組成物及び方法は、対象の治療において他の抗癌治療剤又は治療方法と組合わせて用いることができる。例えば、本明細書のＨＤＭＸ調節組成物及び方法は、化学療法、放射線治療、及び抗体治療と組合わせて用いることができる。
【０２１４】
ある実施態様では、本開示は放射線誘発胃腸症候群を発症する危険のある対象を治療するための組成物及び方法を包含する（検討のために、例えば、Krisch et al., Sceience, 327:593-596(2010)を参照されたい）。電離放射線への急性曝露はＧＩ症候群として知られている疾患を誘導する胃腸（ＧＩ）管に致命的な損傷を引き起こす。例えば、ＧＩ管の上皮細胞における、Ｐ５３の過剰発現は急性電離放射線が引き起こす障害に対してＧＩを保護する（Krisch et al. (2001)）。
【０２１５】
従って、ある実施態様では、本開示は放射線治療（例えば、電離放射線治療）を受ける予定になっている対象を選択すること及びこの対象のための治療計画を開発することを含んでいる。治療計画は、放射線（例えば、電離放射線）に曝露される前（例えば、直前、１日前、１日以上前、１週間前、１週間以上前）に１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤（例えば、ＳＡＨ−ｐ５３−８）の有効用量及び／又は１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤（例えば、Ｎｕｔｌｉｎ−３）の有効用量で対象を治療すること（例えば、投与すること）を包含できる。ある実施態様では、放射線（例えば、電離放射線）に曝露される前（例えば、直前、１日前、１日以上前、１週間前、１週間以上前）に、１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤（例えば、ＳＡＨ−ｐ５３−８）及び／又はＨＤＭ２調節剤（例えば、Ｎｕｔｌｉｎ−３）の単回用量又は複数回用量を用いて、対象を治療することができる。ある実施態様では、用量（複数も含む）は全身投与される。あるいは又は更に、用量（複数も含む）は局所的に（例えば、ＧＩへ又はＧＩの上皮細胞へ局所的に）投与される。ある実施態様では、治療は１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤（例えば、ＳＡＨ−ｐ５３−８）の有効用量を含んでいる。ある実施態様では、治療は１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤（例えば、Ｎｕｔｌｉｎ−３）の有効用量を含んでいる。ある実施態様では、治療は１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤（例えば、ＳＡＨ−ｐ５３−８）及び１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤（例えば、Ｎｕｔｌｉｎ−３）の相乗効果をもたらす用量を含んでいる。方法は、投与の間及び投与後に対象を観察又は評価して治療の有効性を確認して、必要によって、例えば、更なる放射線治療の前に、治療の有効性を向上させるために治療を調節すること（例えば、組成物を変えて、組成物の単回投与の用量を増やして、１日当りに投与される組成物の投与回数を増やして、及び／又は組成物を投与する日数を増やして）も包含できる。これらの方法は放射線治療と組合わせた、１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤及び／又は１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤を対象に投与することも含んでいる。
【０２１６】
対象の選択
用語「対象」は本明細書を通して、本発明の方法による治療が提供される、動物、ヒト又は非ヒトを記載するために用いられる。
【０２１７】
本明細書で用いられる用語「癌」、「過剰増殖性」及び「腫瘍性」は、自立的増殖能を有する、すなわち、急速に増殖する細胞生育によって特徴付けられる異常な状態又は条件の細胞を示す。本明細書で述べられているように、本発明の方法は機能的ｐ５３を発現できる何れかの癌細胞を治療するために用いることができる。例えば、機能的ｐ５３が発現しているが、その細胞中のｐ５３のレベル又は活性がＨＤＭＸ及び／又はＨＤＭ２によって減少する癌細胞は何れも本明細書に開示されている組成物及び方法を用いて有益に治療することができる。野生型ｐ５３の活性は必要としていない。例えば、いくつかの機能を保持している突然変異ｐ５３を発現する細胞を有益に治療することができる。
【０２１８】
従って、本開示は：（１）癌を有する対象を同定すること；及び（２）対象の癌細胞が機能的ｐ５３をコードするか又は発現するかを確認すること；及び（３）対象の癌細胞が機能的ｐ５３を発現した場合は、本明細書に開示されている組成物及び方法を用いて対象を治療するか又は対象の治療法を開発することを包含できる。例えば、ｐ５３の機能は以下の癌の何れかで評価できる。
【０２１９】
ある場合は、対象又は対象由来の細胞は機能的なｐ５３を発現することができる。このような機能的ｐ５３はいくつかのｐ５３機能を有しているが、野生型ｐ５３と同様な機能レベルを有する必要はない。従って、機能的ｐ５３は幾らかの機能レベルを保持している突然変異ｐ５３を包含できる。ある場合は、機能的ｐ５３は野生型ｐ５３（例えば、同じ対象の非腫瘍性細胞内の野生型ｐ５３）の機能活性の１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又はそれ以上を有している。ある実施態様では、細胞は機能的ｐ５３を発現することができるが、機能的ｐ５３は検出不能である（例えば、細胞中で機能的ｐ５３は発現するが急速に劣化する）。このような細胞は、細胞が機能的ｐ５３をコードすることを検出することにより同定できる。このような方法は、例えば、ＤＮＡプローブを用いて及び／又は細胞又はそれに由来する試料中のｐ５３ｍＲＮＡを検出することにより、実施できる。
【０２２０】
癌又は腫瘍性疾患の例は、これに限定されないが、線維肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋腫瘍、横紋筋腫瘍、胃癌、食道癌、直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、頭頸部癌、皮膚癌、脳腫瘍、扁平上皮癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆道癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、又はカポジ肉腫を包含する。
【０２２１】
増殖性疾患の例は造血器腫瘍性疾患を包含する。本明細書で用いられる用語「造血器腫瘍性疾患」は、造血器の過形成／腫瘍性細胞、例えば、骨髄、リンパ又は赤血球系列から生じる細胞、又はその前駆細胞を含有している疾患を包含する。好ましくは、疾患は低分化型急性白血病、例えば、赤血球性白血病及び急性巨核芽球性白血病から生じる。更なる典型的な骨髄疾患は、これに限定されないが、急性前骨髄細胞性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を包含し（Vaickus (1991), Crit Rev. Oncol./Hemotol. 11:267-97 に概説されている）；リンパ性腫瘍は、これに限定されないが、Ｂ系列ＡＬＬ及びＴ系列ＡＬＬを包含する急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、毛様細胞白血病（ＨＬＬ）及びワルデンシュトレームマクロフルブリン血症（ＷＭ）を包含する。悪性リンパ腫の更なる形態は、これに限定されないが、非ホジキンリンパ腫及びその異型、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大型顆粒球リンパ球白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病、並びにリード・シュテンベルグ病を包含する。
【０２２２】
乳腺の細胞増殖及び／又は分化疾患の例は、これに限定されないが、例えば、上皮過形成、硬化性腺症、及び小管乳頭腫を包含する、増殖性乳腺疾患；腫瘍、例えば、線維腺腫、葉状腫瘍、及び肉腫のような間質性腫瘍、並びに大管乳頭腫のような上皮腫瘍；非浸潤性乳管癌（パージェット病を含む）及び非浸潤性小葉癌を包含する非浸潤性腫瘍、並びに、これに限定されないが、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、髄様癌、膠様（粘液性）癌、管状腺癌、及び浸潤性乳頭癌を包含する浸潤性腫瘍を含んでいる乳腺の腫瘍、並びに混合型悪性腫瘍を包含する。男性乳腺の疾患は、これに限定されないが、女性化乳房及び腫瘍を包含する。
【０２２３】
肺の細胞増殖及び／又は分化疾患の例は、これに限定されないが、腫瘍随伴性症候群、細気管支肺胞腫瘍、及び気管支カルチノイドのような神経内分泌腫瘍、混合型腫瘍、及び転移性腫瘍を包含する気管支癌；炎症性胸水、非炎症性胸水、気胸、並びに単発性線維性腫瘍（胸膜線維腫）及び悪性中皮腫を包含する胸膜癌を包んでいる胸膜の病変を包含する。
【０２２４】
結腸の細胞増殖及び／又は分化疾患の例は、これに限定されないが、非腫瘍性ポリープ、腺腫、家族性症候群、結腸直腸発癌、結腸直腸腫瘍、及びカルチノイド腫瘍を包含する。
【０２２５】
肝臓の細胞増殖及び／又は分化疾患の例は、これに限定されないが、結節性過形成、腺腫、並びに肝臓の原発性癌及び転移性腫瘍を含む悪性腫瘍を包含する。
【０２２６】
卵巣の細胞増殖及び／又は分化疾患の例は、これに限定されないが、体腔上皮の腫瘍、漿液腫瘍、粘液性腫瘍、内膜性腫瘍、透明細胞腺癌、嚢胞腺線維腫、ブレンナー腫瘍、表面上皮腫瘍のような卵巣癌；成熟（良性）奇形腫、単胚葉性奇形腫、未成熟悪性奇形腫、未分化胚細胞腫、卵胞嚢腫瘍、絨毛腫瘍のような生殖細胞腫瘍；顆粒膜−卵胞膜細胞腫瘍、卵胞膜線維腫、セルトリ間質細胞腫瘍（アンドロブラストーマ）、門細胞腫瘍（hill cell tumors）、及び性腺芽細胞腫のような性索間質腫瘍；及びクルケンベルグ腫瘍のような転移性腫瘍を包含する。
【０２２７】
癌を発症する危険性のある対象及び／又は癌を有している対象を同定する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、癌を発症する危険性のある対象（例えば、癌を発症する見込みが増大している対象）を同定する方法は当該技術分野で公知である（例えば、米国特許第７，６１１，８７０号及びJie Li et al., Nature, Identification of high-quality cancer prognostic markers and metastasis network modules (2010)を参照されたい）。癌を有している患者を同定する方法も当該技術分野で公知であって、自己評価、臨床評価（身体検査及び生検を含む）、検査室分析（例えば、バイオマーカー分析）、パパニコロー検査（パップスメア）、及び画像化方法（例えば、マンモグラフィー、ＭＲＩ、ＰＥＴ及び／又はＣＴスキャン及び血管造影）を含む。ある実施態様では、本明細書に開示されているｐ５３−ＨＭＤＸバイオマーカを癌（例えば、ＨＤＭＸ調節剤による治療に感受性がある癌）を有している対象の同定に用いる。
【０２２８】
本明細書で用いられているように、ｐ５３活性は、これに限定されないが、例えば、ｐ５３転写活性（これは、例えば、ｐ５３の標的、例えばｐ５３転写標的の、転写、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベルをモニタリングすることによって評価できる）を包含できる。適切なｐ５３転写標的は当該技術分野で公知であって、これに限定されないが、例えば、ＳＦＮ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＣＲＹＺ、Ｓ１００Ａ２、ＢＴＧ２、ＯＤＣ１、ＴＰ５３Ｉ３、ＴＧＦＡ、ＰＣＢＰ４、ＰＬＫ２、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＣＮＧ１、ＩＥＲ３、ＴＡＰ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＥＥＦ１Ａ１、ＴＨＢＳ２、ＡＮＬＮ、ＩＧＦＢＰ３、ＥＧＦＲ、ＨＧＦ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＭＥＴ、ＮＯＳ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＳＣＡＲＡ３、ＲＲＭ２Ｂ、ＧＭＬ、ＤＫＫ１、ＦＡＳ、ＳＣＤ、ＬＲＤＤ、ＣＴＳＤ、ＣＤ８２、ＨＳＰＡ８、Ｐ５３ＡＩＰ１、ＳＬＣ３８Ａ２、ＭＤＭ２、ＨＤＭ２、ＲＢ１、ＢＤＫＲＢ２、ＭＭＰ２、ＣＸ３ＣＬ１、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＧＤＦ１５、ＢＢＣ３、ＢＡＸ、ＰＣＮＡ、ＴＲＰＭ２、及びＰ２ＲＸＬ１）及び／又はｐ５３機能活性（例えば、ｐ５３タンパク質−相互作用に基づく機能、例えば、細胞死（例えば、壊死及びアポトーシス）、及び細胞周期停止）を包含する。ｐ５３活性は、ｐ５３転写、ｍＲＮＡ、又はタンパク質レベルを確認することによっても評価できる。これらの例示的な方法のそれぞれを実施する方法は当該技術分野において周知である。
【０２２９】
キット
本明細書に記載されている化合物及び医薬組成物はキットで提供することができる。例えば、キットは、組成物及び癌を有する対象のためにオーダーメイドの治療方法を開発する方法を包含できる。ある実施態様では、これらのキットは、ＨＤＭＸとの複合体中のｐ５３のバイオマーカー（例えば、複合体及び／又はｐ５３若しくはＨＤＭＸを免疫沈降するために必要な成分と特異的に結合して、免疫ブロッティングでｐ５３若しくはＨＤＭＸを検出する抗体）を検出するための組成物を包含できる（例えば、キットは、ｐ５３を免疫沈降させる第１抗体（例えば、抗ｐ５３抗体）及び免疫ブロッティングでＨＤＭＸを検出する第２抗体（例えば、抗ＨＤＭＸ抗体）を包含できる；又はキットはＨＤＭＸを免疫沈降する第１抗体（例えば、抗ＨＤＭＸ抗体）及び免疫ブロッティングで検出する第２抗体（例えば、抗ｐ５３抗体）を提供できる。ある実施態様では、キットは更に、（１）１つ又はそれ以上のＨＤＭＸ調節剤（例えば、ＳＡＨ−ｐ５３−８）；及び／又は（２）１つ又はそれ以上のＨＤＭ２調節剤（例えば、Ｎｕｔｌｉｎ−３）；及び／又は（３）ｐ５３の発現及び／又は活性を誘発する１つ又はそれ以上の組成物及び／又は方法を包含し、（１）〜（３）の何れかの組合わせ、例えば、（１）と（２）及び／又は（３）の何れかの組合わせ（例えば、（１）と（２）、（１）と（３）、及び（１）と（２）と（３））を包含している、対象に投与するための医薬組成物を含んでいる、組成物を更に包含できる。このような場合は、対象に投与するための組成物は対象に対してオーダーメイドすることができる。或いは、対象に投与する組成物はオーダーメイドされない。ある実施態様では、オーダーメイド治療方法を開発するための組成物及び方法と、対象に投与するための組成物は別々に独立したキットで提供される。
【０２３０】
キットは、組成物及び組成物を用いる方法に関する情報資料も包含できる。情報資料は、本明細書に記載されている方法及び／又は本明細書に記載されている方法についての薬剤の使用に関する、記述的、取扱い説明、販促又はその他の資料であってよい。例えば、情報資料は、癌を有しているか、又は発症の危険性がある対象を治療するための化合物の使用に関連している。キットは、１つ又はそれ以上の化合物を細胞（培地中又はインビボ）に投与するための及び／又は細胞を患者に投与するための、そして本明細書に記載されている方法の何れかの組合わせのための用具一式も包含できる。
【０２３１】
一実施態様では、情報資料は、ヒトを治療するために医薬組成物及び／又は細胞（複数を含む）を適切な方法で、例えば、適切な用量、剤形又は投与方法で（例えば、本明細書に記載されている用量、剤形又は投与方法）で投与するための使用説明書を包含できる。別の実施態様では、情報資料は、医薬組成物を適切な対象、例えば、ヒト、例えば、癌を有しているか、又は発症の危険性のあるヒトに投与するための使用説明書を包含できる。
【０２３２】
キットの情報資料はその形態に制限はない。多くの場合、情報資料（例えば、使用説明書）は、活字、図面、及び／又は写真のような印刷物で、ラベル又は印刷紙で、提供される。しかしながら、情報資料は、点字、コンピュータ読み込み可能な物質、録画、又は録音のような、別の形式で提供されてもよい。勿論、情報資料は形式の何れかの組合わせで提供されてもよい。
【０２３３】
化合物に加えて、キットの組成物は、溶媒又は緩衝液、安定化剤、保存剤及び／又は本明細書に記載されている病気又は疾患を治療するための第２の薬剤のような、その他の成分を包含できる。或いは、その他の成分をキットに包含してよいが、化合物とは異なった組成物又は容器中に包含してもよい。このような実施態様では、キットは、薬剤と他の成分を混合するための、又は１つ又はそれ以上の化合物をその他の成分と共に用いるための使用説明書を包含してもよい。
【０２３４】
キットは、医薬組成物のために１つ又はそれ以上の容器を包含できる。ある実施態様では、キットは組成物と情報資料を分ける容器、仕切り又は区画を収容できる。例えば、組成物はボトル、バイアル、又は注射器に収容することができ、そして情報資料はプラスチックの管又はパケット内に収容できる。別の実施態様では、キットの別々の構成要素を１つの分かれていない容器に収容できる。例えば、情報資料をラベル形態で付着させているボトル、バイアル又は注射器内に組成物を収容できる。ある実施態様では、キットは、それぞれが医薬組成物の単回投与剤形（例えば、本明細書に記載されている剤形）の１つ又はそれ以上を収容している複数の別々の容器（例えば、パック）を含んでいる。例えば、キットは、それぞれが医薬組成物の単回用量を収容している、複数の注射器、アンプル、ホイルパケット、又はブリスターパックを含むことができる。キットの容器は気密及び／又は防水性にすることができて、容器は特定用途用のラベルを貼ることができる。例えば、容器に聴覚障害を療するために用いるとラベル付けすることができる。
【０２３５】
上記のように、キットは、組成物の投与に適した器具（例えば、注射器、ピペット、鉗子、スポイト、綿棒、又は何れかのそのような送達器具を任意に包含している。
【実施例】
【０２３６】
本発明を以下の実施例で更に記載する。これは特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定しない。
【０２３７】
実施例１：ステープル状に架橋されたｐ５３ペプチドの設計、合成、及び特徴づけ
ＳＡＨ−ｐ５３化合物を設計するために、合成オレフィン誘導体を、ＨＤＭ２との結合に必須の残基を回避する位置に置いた。ｉ、ｉ＋７位に架かる炭化水素によるステープル状の架橋を、図１Ａに示すように、オレフィンメタセシスで作成した。
【０２３８】
ペプチド合成、オレフィンメタセシス、ＦＩＴＣ誘導体化、逆相ＨＰＬＣ精製、及びアミノ酸分析を、既に報告されているように実施した。
【０２３９】
より詳細には、図１ＢにＳＡＨ−ｐ５３−８と示される、ＳＡＨ−５８−８の配列は、これも図１ＢにＷＴｐ５３１４−２９と示される、野生型ｐ５３転写促進ドメインアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸１４〜２９）の改変からもたらされた。すなわち、Ｓ２０とＰ２７位にあるアミノ酸を合成オレフィン残基に置換した。次いで、構造補強「炭化水素によるステープル状の架橋を Bird et al., (Methods Enzymol., 446:369-386 (2008))に記載されている方法に従って、オレフィンメタセシスにより作成した。この方法は参照により本明細書に取り込まれていて、図１Ｄに説明されている。ＨＤＭ２相互作用に必要ではない追加の残基もペプチドの溶解性及び取り込みを改善するために Bernal et al. (J. Am. Chem. Soc., 129:2456-2457 (2007))に記載されるようにして改変した。ＳＡＨ−ｐ５８−８及びＳＡＨ−ｐ５３−８の設計及び合成に用いた方法はBernal et al. (J. Am. Chem. Soc., 129:2456-2457 (2007)) に記載されていて、この開示は参照により本明細書に取り込まれている。
【０２４０】
コントロールペプチドであるＳＡＨ−ｐ５３−８Ｆ１９を、ＳＡＨ−ｐ５３−８のアミノ酸Ｆ１９（ＨＤＭ２相互作用に対する必須アミノ酸（Bottger et al., J. Mol. Biol., 269:744-756 (1997)）をアラニンで置換して作成した。ＳＡＨ−ｐ５３−８Ｆ１９は、本明細書に記載されている生物学的実験に対するネガティブコントロールとして働く。
【０２４１】
これら及びその他のステープル状に架橋されたｐ５３ペプチドの配列及びその他の特性は図１Ｃに示されている。これらのペプチドの特性を評価した。より詳細には、全てが炭化水素のｉ、ｉ＋７のステープル状の架橋の導入の構造的な効果を評価するために、円偏光二色性（ＣＤ）実験を行ってα螺旋性を確認した。
【０２４２】
図１Ｃに示すように、野生型ｐ５３ペプチドがｐＨ７．０の水中で１１％のα螺旋含量を示したのに対して、ＳＡＨ−ｐ５３−１〜４は１０〜５９％のα螺旋性を示した。ＳＡＨ−ｐ５３−４はタンパク分解安定性の向上も示した。また図１Ｃに示すように、ＳＡＨ−ｐ５３化合物は無傷ＪｕｒｋａｔＴ細胞に浸透できなかったのに対して、ＳＡＨ−ｐ５３−５〜８は細胞に浸透して生理的なｐＨで正に帯電した。従って、この正荷電は、細胞に浸透するペプチドの特性、又は要件であるかもしれない。
【０２４３】
ＳＡＨ−ｐ５３−５〜８は、アスパラギン酸とグルタミン酸をアスパラギンとグルタミンで置き換えてペプチドの電荷を調節し、そしてｐ５３の核外輸送（Ｌ１４Ｑ）及び潜在的なユビキチン化（Ｋ２４Ｒ）に関与すると既に報告されている選択アミノ酸を変異させた。これらの改変により、α螺旋含量の２〜８．５倍の増大を示し、ＨＤＭ２に対する高い結合親和性を保持し、そしてＦＡＣＳ及び共焦点顕微鏡によって時間及び温度依存性の細胞取り込みを明らかにしたステープル状に架橋されたペプチドがもたらされた。ＳＡＨ−５３ペプチドに曝露したＲＫＯ又はＳＪＳＡ−１癌細胞を用いる細胞生存能アッセイにより、核外輸送及びユビキチン化部位の両方に点突然変異を含んでいる、ＳＡＨ−ｐ５３−８が構造的に安定で細胞浸透性で、そして細胞死を促進することが示された。
【０２４４】
実施例２：ＳＡＨ−ｐ５３−８はＨＤＭＸ及びＨＤＭ２と結合する
ＳＡＨ−ｐ５３−８のＨＤＭＸとの相互作用を、全長ＨＤＭＸ及びＦＩＴＣで標識化したステープル状に架橋されたペプチド、ＷＴ−ｐ５３１４−２９、ＳＡＨ−ｐ５３−８、並びにＳＡＨ−ｐ５３−８Ｆ１９Ａを用いる蛍光偏光を用いて評価した。
【０２４５】
先に報告されている（Bernal et al., J. Am. Chem. Soc., 129:2456-2457 (2007)）ようにして組み換えＨＤＭ２を作成した。
【０２４６】
組み換えＨＤＭＸを作成するために、Ｎ−末端チオレドキシン、Ｓ、及びヘキサヒスチジンタグを有する全長ＨＤＭＸをコードするプラスミド、及び組み換えＴＥＶプロテアーゼ開裂部位（ｐＥＴ３２−ＬＩＣベクター、Novagen）を含有している大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含有しているＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地中でインキュベートして、０．１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシドで誘発した。６時間後に３２００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞を採取し、緩衝液Ａ（２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．５ＭのＮａＣＬ）に懸濁して、超音波で溶解した。１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して細胞残屑をペレット化して、上澄液をＮｉ−ＮＴＡアガロース（Quiagen）と２時間培養した。樹脂を緩衝液Ａで洗浄して５ｍＭ〜５００ｍＭ範囲のイミダゾールの濃度勾配で溶出した。溶出したタンパク質を含有している画分を濃縮して組み換えＴＥＶ Ｓ２１９Ｖプロテアーゼ（Kapust et al., Protein Eng., 14:993-1000 (2001)）で１晩４℃で処理した。反応液を２ｍＬまで濃縮してＧ２００カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーで精製した。タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価して、その同一性をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により確認した。
【０２４７】
先に記載されている（Bernal et al., J. Am. Chem. Soc., 129:2456-2457 (2007); Pitter et al., Methods Enzymol., 446:387-408 (2008)）ようにしてＦＰアッセイを実施した。すなわち、ペプチド−タンパク質相互作用の解離定数を、蛍光標識化ペプチド（２５ｎＭ）を全長ＨＤＭＸ又はＨＤＭ１７−１２５（２５ｐＭ〜１００ｎＭ）と培養して測定した。次いで、平衡状態で蛍光偏光をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５マイクロプレートリーダー（Molecular Devices）上で測定した。
【０２４８】
図２Ａに示したように、ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ｐ５３−８はＨＤＭＸに対して強い親和性（ＫＤ＝２．３±０．２ｎＭ）を示した。このＳＡＨ−ｐ５３−８の親和性はＨＤＭ２に対するＳＡＨ−ｐ５３−８の親和性（Bernal et al., (J. Am. Chem. Soc., 129:2456-2457 (2007)によって以前に報告された、ＫＤ＝５５±１１ｎＭ）を上回った。その一方、図２Ａに示されるように、ＷＴ−ｐ５３１４−２９及びＳＡＨ−ｐ５３−８Ｆ１９Ａは同じ用量範囲でＨＤＭＸとの相互作用を示さなかった。
【０２４９】
アセチルで覆われているＳＡＨ−ｐ５３−８のＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ｐ５３−８のＨＤＭ２及びＨＤＭＸとの高親和性複合体を破壊する能力を試験するために競合結合アッセイも実施した。
【０２５０】
ＦＰアッセイは、ＦＩＴＣ−ペプチド（２５ｎＭ）をＮｕｔｌｉｎ−３（EMD Chemicals）又は標識化していないＳＡＨ−ｐ５３−８の連続希釈と組合せたのちＨＤＭ２又はＨＤＭＸタンパク質（１００ｎＭ）を添加すること以外は、実質的に上記のようにして（ＦＰアッセイを）行った。ＦＩＴＣ−ペプチド置換に対するＩＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（GraphPad）を用いる非線形回帰分析で計算した。
【０２５１】
図２Ｂに示したように、ＳＡＨ−ｐ５３−８と選択的ＨＤＭ２阻害剤Ｎｕｔｌｉｎ−３の両方は、ＨＤＭ２結合に対してＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ｐ５３−８と効果的に競合した（小分子と比べて比較的大きなステープル状に架橋されたペプチドの相互作用面が、ある程度、このアッセイで何故ＳＡＨ−ｐ５３−８がＮｕｔｌｉｎ−３より有効であるかを説明するだろう）。その一方、図２Ｃに示したように、ＳＡＨ−ｐ５３−８だけがＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ｐ５３−８／ＨＤＭＸ相互作用を断ち切ることができた。
【０２５２】
これらのデータにより、ＳＡＨ−ｐ５３−８はインビトロでＨＤＭ２及びＨＤＭＸの両方を標的にして、そしてＨＤＭ２に対するよりもＨＤＭＸに対して２５倍強い結合を示すことが明らかにされる。
【０２５３】
実施例３：ＳＡＨ−ｐ５３−８は細胞内ＨＤＭＸ及びＨＤＭ２と結合する
ＳＡＨ−ｐ５３−８の細胞内ＨＤＭ２及びＨＤＭＸを標的にする能力を、ＨＤＭＸも過剰発現するように遺伝子を組み換えたＨＤＭ２を過剰発現する骨肉腫細胞株である、ＳＪＳＡ−Ｘ細胞（Wade et al., Cell Cycle, 7:1973-1982 (2008)）において免疫沈降実験を行って評価した。
【０２５４】
すなわち、抗ＦＩＴＣ破壊実験を以前に記載された（Pitter et al., Methods Enzymol., 446:387-408 (2008); Walensky et al., Mol. Cell., 24:199-210 (2006)）ようにして、以下のように実施した。細胞（１．５×１０６）をＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ｐ５３ペプチド（１５μＭ）で処理して緩衝液Ｂ（０．１％のトリトンＸ−１００、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦ、ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤錠（Roche）、及び２０単位／ｍＬのベンゾナーゼヌクレアーゼ（EMD Chemicals））に溶解した。タンパク質をヤギ抗ＦＩＴＣ抗体（AbCam）と共免疫沈降して、電気泳動タンパク質のウェスタン分析をマウス抗ＨＤＭ２（IF2; EMD Chemicals）、ウサギ抗ＨＤＭＸ（BL1258; Bethyl Laboratories）、及びβ−アクチン（Sigma）抗体を用いて実施した。Ｔｙｐｈｏｏｎ ８６００ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ (Molecular Dynamics)を用いてブロットの蛍光画像化を実施した。
【０２５５】
細胞を、賦形剤、ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ｐ５３−８、又はＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ｐ５３−８Ｆ１９Ａで１２時間処理した。細胞溶解物中にＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ｐ５３−８及びＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ｐ５３−８Ｆ１９Ａの存在を確認するためにウェスタンブロッティングを用い、両方のＳＡＨ−ｐ５３ペプチドが無傷ＳＪＳＡ−Ｘ細胞に有効に透過することを確認した。次いで、細胞を溶解して、抗ＦＩＴＣ破壊を実施した後ＨＤＭ２及びＨＤＭＸウェスタン分析を実施した。図３に示したように、天然のＨＤＭ２及びＨＤＭＸはＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ｐ５３−８と特異的に共免疫沈降したが、ＦＩＴＣ−ＳＡＨ−ｐ５３Ｆ１９Ａとは共免疫沈降しなかった。
【０２５６】
これらのデータは、ＳＡＨ−ｐ５３−８が細胞内のＨＤＭ２及びＨＤＭＸ標的の両方にアクセスできることを明らかにしてインビトロの知見を拡張する。
【０２５７】
実施例４：ＳＡＨ−ｐ５３−８はＨＤＭＸ、ＨＤＭ２、又はＨＤＭＸとＨＤＭ２の両方を過剰発現する癌細胞に対して細胞傷害性を示す
細胞生存能に対するＳＡＨ−ｐ５３−８処置の影響を、異なったレベルのＨＤＭ２及び／又はＨＤＭＸを発現する固形腫瘍細胞のパネルを処置して評価した。使用のために選択した細胞は、ＨＤＭ２及び／又はＨＤＭＸのレベルをｐ５３の機能を減少する程度まで変えられる何種類かの癌を示す。例えば、用いた細胞株は、機能的ＨＤＭ２が過剰発現されるがＨＤＭＸが存在していない（ＳＪＳＡ−１を参照されたい）；ＨＤＭ２は存在していないが機能的ＨＤＭＸが過剰発現している（ＪＥＧ−３を参照されたい）；機能的ＨＤＭ２及び機能的ＨＤＭＸが両方過剰発現されている（ＳＪＳＡ−Ｘを参照されたい）；そしてＨＤＭ２とＨＤＭＸが発現されている（ＭＣＦ−７を参照されたい）ヒト癌を表わす。細胞株は、野生型ｐ５３を発現するものも包含した。用いた細胞株は以下のものを包含した。
【０２５８】
ＳＪＳＡ−１、ＨＤＭＸを発現しないＨＤＭ２過剰発現骨肉腫（すなわち、ＨＤＭ２＋＋／ＨＤＭＸ−細胞株）；
ＨＤＭ２とＨＤＭＸの両方を過剰発現する組み換えＳＪＳＡ−Ｘ誘導体（すなわち、ＨＤＭ２＋＋／ＨＤＭＸ＋＋細胞株）；
ＨＤＭ２を発現しない、ＨＤＭＸ過剰発現絨毛癌細胞株ＪＥＧ−３（すなわち、ＨＤＭ２−／ＨＤＭＸ＋＋細胞株）；及び
ＨＤＭ２を発現してＨＤＭＸを発現する乳癌及び結腸癌細胞株ＭＣＦ−７及びＨＣＴ１１６（すなわち、ＨＤＭ２＋／ＨＤＭＸ＋細胞株）（Bunz et al.,  1999; Chen et al., 2007; Drukteinis et al., 2005; Kwok et al., 1994; Wade et al., 2008; Xia et al., 2008 を参照されたい）。本明細書に開示されている治療戦略におけるｐ５３の重要性を評価するための、ドミナントネガティブｐ５３−ＤＤタンパク質を発現するＳＪＳＡ−ＤＤ細胞（Shaulian et al., Mol. Cell. Biol., 12:5581-5592 (1992) 及び Wade et al., Cell Cycle, 7:1973-1982 (2008)）、ｐ５３が欠けているＨＣＴ１１６細胞（Bunz et al., J. Clin. Invest., 104:263-269 (1999)）、及びＲ２７３Ｈｐ５３突然変異を有するＡ４３１メラノーマ細胞（Kwok et al., Cancer Res., 54:2834-2836 (1994)）。最後に、ＷＳＩ正常ヒト線維芽細胞を試験して、腫瘍細胞対非形質転換細胞における相対毒性を評価した。これらの細胞株の使用により、癌細胞中のＨＤＭ２又はＨＤＭＸ或いはその両方を標的とする治療戦略の有効性又は効力の分析が可能になる。
【０２５９】
培養した細胞をウシ胎仔血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを補完した適切な培地中で保持した（ＳＪＳＡ−１、ＳＪＳＡ−Ｘ、ＳＪＳＡ−ＤＤ、Ａ４３１（ＤＭＥＭ）；ＪＥＧ−３、ＭＣＦ−７、ＷＳ１（ＥＭＥＭ）；ＨＣＴ１１６（ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ））。生存能分析のために、１×１０４個の細胞を１晩９６ウェルのプレートに播種し、ＰＢＳ中で洗浄し、次いでＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）中で２４時間示した用量でステープル状に架橋されたｐ５３ペプチド、Ｎｕｔｌｉｎ−３（EMD Chemicals）、又はその両方とインキュベートした。生存能を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）化学発光試薬を加えて製造会社（Promega）のプロトコルに従ってアッセイした。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５マイクロプレートリーダー（Molecular Devices）を用いて発光を測定した。データを賦形剤で処置したコントロールと正規化して、ＳＡＨ−ｐ５３−８とＮｕｔｌｉｎ−３の間の適切な相乗効果を、Ｃａｌｃｕｓｙｎソフトウェアパッケージ（Chou, 2006）（Biosoft; Cambridge, UK）を用いて計算した。全ての生存能アッセイを少なくとも３回繰返し実施した。
【０２６０】
上記のように、培養した細胞を、Ｎｕｔｌｉｎ−３、ＳＡＨ−ｐ５３−８、又はＳＡＨ−５３−８Ｆ１９Ａ点突然変異コントロールの連続希釈で処置した。図４Ａに示したように、ＳＪＳＡ−１細胞はＮｕｔｌｉｎ−３による処置に対して非常に感受性があったのに対して、ＳＪＳＡ−Ｘ及びＪＥＧ−３細胞はＮｕｔｌｉｎ−３に対して全くか殆ど反応を示さなかった（それぞれ、図４Ｂ及び４Ｃを参照されたい）。つまり、Ｎｕｔｌｉｎ−３は機能的ＨＤＭ２を発現するがＨＤＭＸを発現しない細胞（すなわち、ＳＪＳＡ−１）の細胞生存能を減少する；しかしながら、Ｎｕｔｌｉｎ−３は、ＨＤＭ２を発現しないがＨＤＭＸを発現する細胞（すなわち、ＪＥＧ−３）に有効ではく、そしてＮｕｔｌｉｎ−３の有効性はＨＤＭ２とＨＤＭＸの両方を発現する細胞（すなわち、ＳＪＳＡ−Ｘ）で減少する。これらの観察はＮｕｔｌｉｎ−３がＨＤＭ２を標的にするがＨＤＭＸを標的にしないという能力と一致する。
【０２６１】
図４Ｄ及び４Ｅに示したように、ＨＤＭ２とＨＤＭＸを発現するが、何れのタンパク質も過剰に発現しない、ＭＣＦ−７及びＨＣＴ１１６細胞もＮｕｔｌｉｎ−３処置に対して多少は感受性があり、これらの細胞におけるＨＤＭ２とＨＤＭＸの同時発現と一致する。従って、これらのデータにより、ＨＤＭ２が過剰発現又は発現されるとき、Ｎｕｔｌｉｎ−３は細胞生存能を減少させるが、単独で用いたときのＮｕｔｌｉｎ−３の有効性は、ＨＤＭＸも過剰に発現している細胞においては減少することが明らかにされる。
【０２６２】
対照的に、図４Ａ〜４Ｅに示したように、ＳＡＨ−ｐ５３−８は、５つの細胞株全てにおいて細胞生存能の用量依存的な阻害をもたらした。この観察は、細胞が上昇した又は正常のレベルでＨＤＭ２、ＨＤＭＸ、又は両方のタンパク質を発現するときに、ＳＡＨ−ｐ５３−８はｐ５３経路を再活性化できるということを裏付けている。
【０２６３】
注目すべきは、図２Ｂに示したように、インビトロでのＮｕｔｌｉｎ−３と比べて、ｐ５３のトランス活性化螺旋をＨＤＭ２から移動するＳＡＨ−ｐ５３−８の能力は相対的に増大したにも関わらず、Ｎｕｔｌｉｎ−３はＳＪＳＡ−細胞においてＳＡＨ−ｐ５３−８より細胞傷害性であることである（図４Ａを参照されたい）。この明確な食い違いは恐らく（１）ＳＡＨ−ｐ５３−８のＨＤＭ２と比べて優先的なＨＤＭＸ結合活性によって、ＨＤＭ２標的化に利用可能なＳＡＨ−ｐ５３−８の有効濃度が低下すること、及び（２）ステープル状に架橋されているペプチドに関する細胞取り込みメカニズム（すなわち、飲食細胞作用（Bernal et al., J. Am. Chem. Soc., 129:2456-2457 (2007); Walensky et al., Science, 305:1466-1470 (2004)）及び小分子（すなわち、拡散））の潜在的に異なる効率、に由来しているようだ。ＳＡＨ−ｐ５３−８のＨＤＭ２よりもＨＤＭＸとの結合優先性を明らかにしている（図２Ａを参照されたい）、本明細書に示したインビトロ結合データと一致して、ＳＪＳＡ−Ｘ細胞はＳＪＳＡ−１細胞よりもＳＡＨ−ｐ５３−８に影響を受けやすかった（図４Ａ及び４Ｂを参照されたい）。更に、ＨＤＭＸを過剰に発現するＪＥＧ−３細胞はＳＡＨ−ｐ５３−８に対して最も感受性があったが、Ｎｕｔｌｉｎ−３に対して最も耐性があった（図４Ｃを参照されたい）。この知見を以下のメカニズム分析で検討する。
【０２６４】
ＳＡＨ−ｐ５３−８の細胞傷害性は、野生型ｐ５３タンパク質の活性に特異的に依存していて、正常な線維芽細胞の生存能に有意に影響しないことが確認された（図４Ｉを参照されたい）。ＨＣＴ１１６細胞からのｐ５３の遺伝子欠失又はＳＪＳＡ−１細胞におけるｐ５３のドミナントネガティブ形態の過剰発現は、両方の細胞型をＮｕｔｌｉｎ−３及びＳＡＨ−ｐ５３−８に対して完全に非感受性にする（図４Ｆ及び４Ｇを参照されたい）。図４Ｈに示したように、不活性化されているｐ５３の点突然変異を有している、Ａ４３１メラノーマ細胞株は、同様に治療による効果がなかった。上記のように、ＳＡＨ−ｐ５３−８は、Ｎｕｔｌｉｎ−３と同様に、正常ヒト線維芽細胞の生存能に対して影響を与えないことが明らかになった（図４Ｉを参照されたい）。
【０２６５】
特異性を更に測定すると、突然変異ペプチドＳＡＨ−ｐ５３−８Ｆ１９Ａは試験した細胞株全てにおいて不活性であることが観察された（図４Ａ〜４Ｉを参照されたい）。これらのデータはさらに、ＳＡＨ−ｐ５３−８の抗腫瘍細胞活性がペプチド配列依存性であって、そのＨＤＭ２及びＨＤＭＸの細胞内標的化に由来していることを示している。
【０２６６】
実施例５：ＳＡＨ−ｐ５３−８は、ＨＤＭＸが介在するｐ５３の隔離を阻止してｐ５３の腫瘍抑制経路を再活性化する
免疫沈降の検討
Ｎｕｔｌｉｎ−３耐性細胞におけるＳＡＨ−ｐ５３−８の薬理学的効果がＨＤＭＸ標的化に由来しているのか否かを確認するために、ＪＥＧ−３細胞株（ＨＤＭ２−／ＨＤＭＸ＋＋細胞株）において免疫沈降の検討を実施した。
【０２６７】
ＨＤＭＸ免疫沈降実験のために、細胞（１．５×１０６個）を指示された用量のＳＡＨ−ｐ５３−８単独又はＮｕｔｌｉｎ−３（EMD Chemicals）単独のいずれかと、０．５ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標、Invitrogen）中、１０μＭのＭＧ−１３２を用いて又は用いないで６時間培養したこと以外は、実施例３に記載したようにして、細胞培養及び免疫沈降を実施した。ＰＢＳ（２×１ｍＬ）で洗浄した後、細胞を細胞緩衝液Ｂに溶解した。ＨＤＭＸは、抗ＨＤＭＸ抗体（BL1258; Bethyl Laboratories）と免疫沈降して、ｐ５３（DO-1; EMD Chemicals 又は FL-393; Santa Cruz Biotechnology）、ＨＤＭＸ（MDMX-82; Abcam）及びＨＡＵＳＰ（抗−ＵＳＰ７、Bethyl Labs）、並びに  Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ化学発光試薬 (PerkinElmer)を用いて、電気泳動されたタンパク質のウェスタン分析を行った。賦形剤、ＳＡＨ−ｐ５３−８、又はＮｕｔｌｉｎ−３で６時間処置した後、細胞抽出物を調製して抗ＨＤＭＸ破壊に付し、続いてｐ５３ウエスタン分析を行った。
【０２６８】
図５に示したように、ＪＥＧ−３は、しっかりとしたレベルのｐ５３タンパク質を有していることが分かり、ＨＤＭＸと共免疫沈降した（図５Ａを参照されたい）。ＳＡＨ−ｐ５３−８又はＮｕｔｌｉｎ−３の何れかで処置すると、ｐ５３レベルの増大が観察された（図４Ａの「インプット」を参照されたい）が、ＳＡＨ−ｐ５３−８処置のみがＪＥＧ−３細胞の生存能に影響を与えた。
【０２６９】
ＳＡＨ−ｐ５３−８処置がＨＤＭＸが介在するｐ５３の隔離を、特にｐ５３レベルがＨＤＭ２阻害によって更に促進されているときに、阻害するか否かを試験するためにＨＭＤＸ ＩＰを用いた。図５Ａ「ＩＰ：ＨＤＭＸ」に示したように、ＳＡＨ−ｐ５３−８は、ｐ５３−ＨＤＭＸ複合体の形成を効果的に阻害し、ＨＤＭＸによって少量のｐ５３が免疫沈降した。対照的に、ｐ５３−ＨＭＤＸ複合体は、Ｎｕｔｌｉｎ−３で処置した細胞内に、増加はしなかったが、保存された（図５Ａ「ＩＰ：ＨＤＭＸ」を参照されたい）。図５Ｂに示したように、ｐ５３レベルはプロテアソーム阻害剤ＭＧ−１３２で細胞を処理することによって更に安定化された。更に、沈降したＨＤＭＸ−ｐ５３複合体の増大によって明らかにされたこの安定性の増大は、ＳＡＨ−ｐ５３−８での処理により用量依存的に減少した（図５Ｂを参照されたい）。
【０２７０】
ＳＡＨ−ｐ５３−８が細胞状況においてｐ５３／ＨＤＭＸ相互作用を妨害することを立証するために、近接ライゲーションｉｎ ｓｉｔｕ分析（proximity ligation in situ assay）、すなわちＰ−ＬＩＳＡを用いて、細胞におけるｐ５３−ＨＤＭＸ複合体形成及び薬理学的解離を直接観察した（Soderberg et al., 2006）（図５Ｃ〜Ｅ）。ドキシサイクリン誘導性ＨＡ−ＨＤＭＸ構築物を含有しているＵ２ＯＳ骨肉腫細胞（Wang et al., 2007）をＳＡＨ−ｐ５３−８、Ｎｕｔｌｉｎ−３、又は両方の存在下又は非存在下に、ドキシサイクリンで処理した。ドキシサイクリンのみの存在下で、ＨＡ−ＨＤＭＸは内因性ｐ５３への結合を生じ、検出可能であるが低強度のＰ-ＬＩＳＡ病巣の形成をもたらした（図５Ｄ、５Ｅ）。ドキシサイクリンとＮｕｔｌｉｎ−３処置の組み合わせにより強いＰ−ＬＩＳＡシグナルが生じ、これはｐ５３／ＨＡ−ＨＤＭＸ複合体の十分な形成を表わしている（図５Ｄ、５Ｅ）。ＳＡＨ−ｐ５３−８又はＮｕｔｌｉｎ−３の単剤に対する応答において同様なレベルのｐ５３が誘導された（図５Ｃ）にもかかわらず、ドキシサイクリンでの処置によって生じたＰ−ＬＩＳＡシグナルはＳＡＨ−ｐ５３−８との併用処置によって阻害された（図５Ｄ、５Ｅ）。さらに、ＳＡＨ−ｐ５３−８をドキシサイクリン／Ｎｕｔｌｉｎ−３と組合わせると、ドキシサイクリン／Ｎｕｔｌｉｎ−３の組合わせ単独により生じたＰ−ＬＩＳＡシグナルを有意に減少した（図５Ｄ、５Ｅ）。
【０２７１】
まとめると、これらのデータは、Ｎｕｔｌｉｎ−３ではなく、ＳＡＨ−ｐ５３−８が、細胞内ＨＤＭＸを標的にするその能力に起因して、ｐ５３−ＨＭＤＸ複合体の形成を阻害することを裏付けている。
【０２７２】
定量的ＰＣＲ及びアポトーシスの検討
ＳＡＨ−ｐ５３−８によるｐ５３−ＨＭＤＸタンパク質複合体の薬理学的破壊を、ｐ５３腫瘍抑制経路の再活性化と関連付けるために、ｐ５３転写活性を、ｑＰＣＲ分析を用いてｐ５３標的の転写活性を評価して、間接的に分析した。ｐ５３活性も、アポトーシス活性を用いて間接的に、又はカスパーゼ−３／７活性化アッセイを用いてアポトーシスを測定してより特異的に評価した。
【０２７３】
ｑＰＣＲの検討を以下のように実施した。ＪＥＧ−３細胞（７．５×１０６個）を６ウェルのプレートに播種して、賦形剤、又は２０μＭのＳＡＨ−ｐ５３−８若しくはＮｕｔｌｉｎ−３（EMD Chemicals）で処置し、そして３７℃で６時間インキュベートした。ＲＮＥａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Quiagen）を用いてＲＮＡ試料を作成した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Invitrogen）を用いて全てのＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。誘導されたｃＤＮＡを、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Applied Biosystems）を用いるＰＲＩＳＭ  ７７００システム上でのｑＲＴ−ＰＣＲによる相対転写レベルを測定するための基質として使用した。ＨＤＭ２、ｐ２１、ＭＩＣ−１及びＵＢＢコントロールに特異的なプライマーを使用した。９６ウェルの光学ＰＣＲプレート中で反応を３回繰返し行った。繰返し試験のそれぞれについて閾値サイクル（Ｃｔ）値を自動的に計算して、処置及び未処置試料の両方についてＵＢＢと比較した関心のある遺伝子の相対発現を、２−△△Ｃｔ法（Livak and Schmittgen, Methods, 25:402-408 (2001)）によって測定するために用いた。
【０２７４】
ＪＥＧ−３細胞を賦形剤、Ｎｕｔｌｉｎ−３（２０μＭ）、又はＳＡＨ−ｐ５３−８（２０μＭ）で６時間３７℃で処置した後、ＲＮＡを単離し、逆転写して、ＨＤＭ２、ｐ２１、及びＭＩＣ−１プライマーを用いて、誘導されたｃＤＮＡ基質のｑＰＣＲ分析を行った。図６Ａに示したように、Ｎｕｔｌｉｎ−３は賦形剤に比べてｐ５３転写標的の小幅な１．５〜４倍の上方調節を誘発したのに対して、ＳＡＨ−ｐ５３−８は同じ標的遺伝子に対して有意に高い（５〜１４倍の）ｍＲＮＡレベルを誘発した。
【０２７５】
アポトーシスの検討を以下のように実施した。ＪＥＧ−３細胞（１ｘ１０４）を９６ウェルのプレートに１晩播種し、ＰＢＳ中で洗浄し、次いで指定した用量のＳＡＨ−ｐ５３−８又はＮｕｔｌｉｎ−３（EMD Chemicals）とＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）中で１２時間インキュベートした。カスパーゼ−３／７−Ｇｌｏ（登録商標）化学発光試薬を製造会社（Promega）のプロトコルに従って添加し、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５マイクロプレートリーダー（Moleculr Devices）を用いて発光を測定してカスパーゼ−３／７活性をアッセイした。
【０２７６】
図６Ｂに示したように、ＳＡＨ−ｐ５３−８処置は、カスパーゼ−３／７の用量反応性の活性を引き起こしたのに対して、Ｎｕｔｌｉｎ−３は殆ど効果がなかった。
【０２７７】
従って、Ｎｕｔｌｉｎ−３耐性ＪＥＧ−３細胞におけるＳＡＨ−ｐ５３−８によるｐ５３−ＨＤＭＸ複合体の標的とする破壊は、ｐ５３転写標的の上方調節、カスパーゼ−３／７活性化、及び腫瘍細胞生存能の減少と一致して起きる。
【０２７８】
実施例６：インビボにおけるｐ５３経路の再活性化によるＪＥＧ−３腫瘍生育の抑制
ＳＡＨ−ｐ５３−８がインビボでｐ５３経路を調節してそれにより腫瘍の生育を阻害できるのか否かを確認するために、賦形剤、Ｎｕｔｌｉｎ−３、及びＳＡＨ−ｐ５３−８の活性をＪＥＧ−３ネズミ移植モデルで比較した。
【０２７９】
すなわち、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウス（Jackson Labs）の脇腹内に１０７個の細胞を皮下注射して、ＪＥＧ−３移植を確立した。腫瘍が平均容量１００ｍｍ３に達したときに、実験群（ｎ＝７）を、賦形剤（Ｄ５Ｗ中５％のＤＭＳＯ）、ＳＡＨ−ｐ５３−８（１０ｍｇ／ｋｇ）又はＮｕｔｌｉｎ−３（１０ｍｇ／ｋｇ）（EMD Chemicals）を１日１回４日間静脈内投与して処置した。１、３、４及び５日目に腫瘍サイズをノギスで測定した。５日目にマウスを安楽死させ、腫瘍を切除し、各腫瘍の一部を急速冷凍して、上記のように、ｑＲＴ-ＰＣＲ分析のためにＲＮＡを単離した。各動物の残り部分をブアン固定液中で固定して、完全に解剖するために、the Dana-Farber/Harvard Cancer Center (DF/HCC) Rodent Histopathology Core に提出した。動物実験は、Institutional Animal Care and Use Committee of the Dana-Farber Cancer Institute に承認され、且つ規定されるガイダンス及び規制に従って実施した。
【０２８０】
図７Ａに示したたように、腫瘍生育速度はＮｕｔｌｉｎ−３処置による影響を受けなかったが、ＳＡＨ−ｐ５３−８は、５日間の評価期間を通して賦形剤及びＮｕｔｌｉｎ−３と比べて全身腫瘍組織量の３７〜４６％の低減を達成及び保持して、腫瘍生育を有意に抑制した。
【０２８１】
５日目に腫瘍を切除し、急速冷凍して、ＨＤＭ２、ｐ２１、及びＭＩＣ−１プライマーセットを用いるｑＰＣＲ分析のためにＲＮＡを抽出した。培養したＪＥＧ−３細胞を用いて実施した対応するインビトロでの検討と同様に、ＳＡＨ−ｐ５３−８は処置したマウスの腫瘍においてＨＤＭ２、ｐ２１、及びＭＩＣ−１の統計的に有意な転写活性を誘発した（図７Ｂを参照されたい）。ＳＡＨ−ｐ５３−８で処理したマウスの組織学的検査では、培養ＷＳ１線維芽細胞を用いる細胞生存能アッセイにおけるＳＡＨ−ｐ５３−８の不活性と一致して、正常組織に対する化合物の明確な毒性は示されなかった（図４Ｉ）。
【０２８２】
これらのインビボデータは、ＨＤＭＸが介在するｐ５３の抑制及びＮｕｔｌｉｎ−３耐性に関連して、ｐ５３経路を再活性化することにより腫瘍生育を機能的に抑制することを標的にするＨＤＭＸの薬理学的潜在力を強調するものである。
【０２８３】
実施例７：ＨＤＭ２、ＨＤＭＸ、又は二重機能阻害剤を感受性癌細胞に適合させるための計画
基礎ｐ５３レベルが自然に上昇したとき、ＳＡＨ−ｐ５３−８によるＨＤＭＸの標的化が腫瘍細胞の生存能の減少に最も効果的であったので、ＳＡＨ−ｐ５３−８が介在するＨＤＭＸの阻害が細胞をＮｕｔｌｉｎ−３が介在するｐ５３を上方調節するように再感作できるか否かを試験するためにＮｕｔｌｉｎ−３耐性細胞において相乗効果試験を実施した。
【０２８４】
高いＨＤＭＸを有している細胞において、Ｎｕｔｌｉｎ−３での処置によって誘発されるｐ５３のプールを、ｐ５３−ＨＤＭＸ複合体中に隔離して、Ｎｕｔｌｉｎ−３活性を妨害することができる。従って、そのような細胞におけるＳＡＨ−ｐ５３−８によるＨＤＭＸの阻止は、ＨＤＭＸが介在するｐ５３の隔離を妨害してＮｕｔｌｉｎ−３の活性を回復させることができると仮定した。乳腺腺癌細胞株ＭＣＦ−７は、ＨＤＭＸを過剰発現し（Danovi et al., Mol. Cell. Biol., 24:5835-5843 (2004)）、そしてＮｕｔｌｉｎ−３の処置に対して僅かに感受性があるだけである（Wade et al., Cell Cycle, 7:1973-1982 (2008)）。図８に示したように、ＭＣＦ−７細胞においてＮｕｔｌｉｎ−３はｐ５３レベルを上昇させることができるが、このｐ５３の上昇はＮｕｔｌｉｎ−３の細胞傷害性を制限する、阻害性ｐ５３−ＨＭＤＸ複合体の出現と同時に起きる。しかしながら、本明細書に示したように、Ｎｕｔｌｉｎ−３を用いることによって、ＭＣＦ−７細胞は、ＨＤＭＸとの複合体におけるｐ５３の量の増大を明らかに示すＪＥＧ−３様状態に薬学的に変換される（図９〜１０を参照されたい）。より具体的には、組み合わせると、ＳＡＨ−ｐ５３−８とＮｕｔｌｉｎ−３は用量反応性の方法で互いに感作する（図９Ａ〜９Ｂを参照されたい）。図１０Ａに示したように、Chou (Pharmacol. Rev., 58:621-681 (2006))に記載されるＣａｌｃｕＳｙｎ用量効果分析を用いて相乗効果が確認された。ＳＡＨ−ｐ５３−８との併用処置において観察された細胞傷害性の増大は図９Ａに示したそのｐ５３−ＨＭＤＸ複合体形成の阻害と相関していて、ＭＣＦ−７細胞における耐性の主要な要因であるＨＤＭＸを標的にするＳＡＨ−ｐ５３−８の更なる能力と一致している。更に、図１０Ｂに示したように、内因性ｐ５３レベルは既に上昇しているので、Ｎｕｔｌｉｎ−３はＪＥＧ−３細胞においてＳＡＨ−ｐ５３−８と相乗作用しない。逆に、ＳＪＳＡ−１細胞のように、ＨＤＭＸ及びｐ５３の発現レベルが低くて、むしろＨＤＭ２発現によって細胞表現型が操作されている場合は、ＳＡＨ−ｐ５３−８との併用処置はＮｕｔｌｉｎ−３に更なる利点をもたらさない（図１０Ｃを参照されたい）。しかしながら、この同種細胞株へのＨＤＭＸの発現の誘導により、相乗効果の結果を完全に変化させて、Ｎｕｔｌｉｎ−３を単剤として効果がないものとして、ＳＡＨ−ｐ５３−８に対する感受性を回復し、そしてＮｕｔｌｉｎ−３をＳＡＨ−ｐ５３−８治療と組合わせることの相乗効果を再確立する（図１０Ｄを参照されたい）。ＳＡＨ−ｐ５３−８とＮｕｔｌｉｎ−３を組合わせることによる相乗的抗腫瘍活性の更なる例がリンパ腫及びメラノーマ癌細胞についても示されている（図１０Ｅ〜Ｇ）
【０２８５】
これらの相乗効果分析により、癌におけるｐ５３経路を再活性化するＨＤＭ２及びＨＤＭＸ標的化剤を如何に適切に適用するかを決定するための機構的な枠組みが提供される。実際に、検出可能なｐ５３−ＨＤＭＸ複合体の存在、治療効果を予測するための潜在的に価値のあるバイオマーカー、及び治療の薬力学的効果のモニタリングに反映されるように、ｐ５３レベルが自然に又は薬理学的に増大しているときに、ＨＤＭＸ標的化は最大に効果的である。
【０２８６】
本明細書に示したように、ＳＡＨ−ｐ５３−８はインビトロ及びインビボでＨＤＭＸと高い親和性で結合する。この結合の結果として、ＳＡＨ−ｐ５３−８はｐ５３−ＨＭＤＸ相互作用を減少させ、それによって、例えば、インビトロ及びインビボの両方における（例えば、動物モデルにおいて）腫瘍細胞生存能の減少及びｐ５３標的の転写の上方調節から明らかなように、ｐ５３経路を回復させる。
【０２８７】
本明細書に示したデータは、腫瘍細胞中のある特定のタンパク質のレベルを特徴づけることによって癌を治療するための治療戦略を開発又は改善できることをも明らかにしている。例えば、このような方法は、例えば、腫瘍細胞（例えば、対象における腫瘍細胞又は対象から得た腫瘍細胞（例えば、生検試料中の腫瘍細胞））中の機能的ｐ５３の発現（野生型ｐ５３発現及び突然変異ｐ５３が幾つかの機能（例えば、細胞を本明細書に開示されている１つ又はそれ以上の処置に曝露したときに癌細胞の生存能を減少させるのに十分なp５３機能）を保持している限りは突然変異ｐ５３発現を包含する）並びにＨＤＭＸ及び／又はＨＤＭ２の発現を確認すること、を包含している。このような方法は以下により詳細に記載されている。
【０２８８】
その他の実施態様
本発明はその詳細な説明と組み合わせて記載されているが、前記記載は添付した特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明を説明することを意図していて、本発明の範囲を限定することは意図していない。その他の態様、利点、及び改変は以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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