(57)【要約】ヒトＭＡＭＬから誘導される内部で架橋したペプチドおよびその誘導体が記載および特徴付けされ、それらはＩＣＮ１−ＣＳＬ複合体に親和性を示す。これらのペプチドはＮＯＴＣＨシグナル伝達を干渉し、したがって、ある種の癌を含む様々な疾患の治療に有用である。
2014520120.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部架橋されたポリペプチドであって、配列番号１２〜２０のいずれかのアミノ酸配列を含み、３個または６個のアミノ酸によって隔てられた少なくとも２個のアミノ酸の側鎖が内部架橋で置換されている、内部架橋されたポリペプチド。
【請求項２】
（ａ）第１、第２および第３のアミノ酸の側鎖が内部架橋で置換されており、
（ｂ）第１および第２のアミノ酸が３個または６個のアミノ酸で隔てられ、かつ第２および第３のアミノ酸が３個または６個のアミノ酸で隔てられており、
（ｃ）第１のアミノ酸と第２のアミノ酸との間に内部架橋が存在し、かつ第２のアミノ酸と第３のアミノ酸との間に内部架橋が存在する
請求項１に記載の内部架橋されたポリペプチド。
【請求項３】
Ｘａａ８およびＸａａ１２の側鎖が内部架橋で置換されているか、Ｘａａ４およびＸａａ８の側鎖が内部架橋で置換されているか、またはＸａａ１２およびＸａａ１６の側鎖が内部架橋で置換されている、請求項１に記載の内部架橋されたポリペプチド。
【請求項４】
式（Ｉ）の修飾ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩であって、
【化１】
2014520120.tif 000027
ここで、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立してＨまたはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、またはヘテロシクリルアルキルであり、
Ｒ３はそれぞれ独立して、それぞれ０〜６個のＲ５で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル；［Ｒ４−Ｋ−Ｒ４’］ｎであり；
Ｒ４およびＲ４’は独立してアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり、
Ｒ５はそれぞれ独立してハロ、アルキル、ＯＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＳＲ６、ＳＯＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＣＯ２Ｒ６、Ｒ６、蛍光性部分、またはラジオアイソトープであり、
Ｋはそれぞれ独立してＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＯＮＲ６、または
【化２】
2014520120.tif 000028
であり、
Ｒ６はそれぞれ独立してＨ、アルキル、または治療剤であり、
ｎは１〜４の整数であり、
ｘは２、３または６であり、
ｙおよびｗは独立して０〜１００の整数であり、
ｚは１〜１０の整数であり、
Ｘａａはそれぞれ独立してアミノ酸であり、
前記修飾ポリペプチドは、配列番号１２〜２０のいずれかの少なくとも８個の連続するアミノ酸のうち、（ａ）前記連続する８アミノ酸のうち、３、４または６個のアミノ酸によって隔てられた少なくとも１対のアミノ酸の側鎖が、そのアミノ酸の対のα炭素を式（Ｉ）に示されるように結合する結合基Ｒ３で置換されているもの、および（ｂ）そのアミノ酸の対のうち第１のアミノ酸のα炭素が、式（Ｉ）に示されるようにＲ１で置換されており、かつそのアミノ酸の対のうち第２のアミノ酸のα炭素が、式（Ｉ）に示されるようにＲ２で置換されているもの、を除くものを含む修飾ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
修飾ポリペプチドがＩＣＮ１−ＣＳＬに結合する、請求項１に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項６】
ｘが２である、請求項４に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項７】
ｘが３である、請求項４に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項８】
ｘが６である、請求項４に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項９】
ｘが２、３または６であり、Ｒ３が１個の二重結合を含むアルケニルであり、Ｒ１および独立してＲ２の両方がＨまたはメチルである、請求項４に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項１０】
ｙが独立して３〜１５の整数である、請求項４に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項１１】
ポリペプチドが、配列番号１２〜２０のいずれかの少なくとも１６個の連続するアミノ酸のうち、（ａ）前記連続する８アミノ酸のうち、３、４または６個のアミノ酸によって隔てられた少なくとも１対のアミノ酸の側鎖が、そのアミノ酸の対のα炭素を式（Ｉ）に示されるように結合する結合基Ｒ３で置換されているもの、および（ｂ）そのアミノ酸の対のうち第１のアミノ酸のα炭素が、式（Ｉ）に示されるようにＲ１で置換されており、かつそのアミノ酸の対のうち第２のアミノ酸のα炭素が、式（Ｉ）に示されるようにＲ２で置換されているもの、を除くものを含む請求項４に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項１２】
Ｇｌｕ１Ａｒｇ２Ｘａａ３Ｘａａ４Ａｒｇ５Ａｒｇ６Ｘａａ７Ｘａａ８Ｘａａ９Ｘａａ１０Ａｒｇ１１Ｘａａ１２Ｈｉｓ１３Ｈｉｓ１４Ｓｅｒ１５Ｘａａ１６（配列番号１２）の少なくとも１６個の連続するアミノ酸を含み、
Ｘａａ４およびＸａａ８の側鎖が、そのアミノ酸の対のα炭素を式（Ｉ）に示されるように結合する結合基Ｒ３で置換されており、そのアミノ酸の対のうち第１のアミノ酸のα炭素が、式（Ｉ）に示されるようにＲ１で置換されており、かつそのアミノ酸の対のうち第２のアミノ酸のα炭素が、式（Ｉ）に示されるようにＲ２で置換されている、請求項４に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項１３】
ポリペプチドがｐＨ７で正味の負電荷を持たない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項１４】
ポリペプチドがｐＨ７で正電荷を持つ少なくとも１個のアミノ酸を含む、請求項１７に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項１５】
ポリペプチドがＰＥＧに共有結合している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項１６】
Ｒ１およびＲ２がそれぞれ独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである、請求項４に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項１７】
Ｒ１およびＲ２がそれぞれ独立してＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキルである、請求項４に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項１８】
Ｒ１およびＲ２がメチルである、請求項４に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項１９】
Ｒ３がアルケニルである、請求項１に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項２０】
ｘが３である、請求項４に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項２１】
Ｒ３がＣ８アルケニルである、請求項２０に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項２２】
ｘが６である、請求項４に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項２３】
Ｒ３がＣ１１アルケニルである、請求項２２に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項２４】
Ｒ３がアルケニルである、請求項１に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項２５】
式（ＩＩ）の修飾ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩であって、
【化３】
2014520120.tif 000029
ここで、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立してＨまたはＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、またはヘテロシクリルアルキルであり、
Ｒ３はそれぞれ０〜６個のＲ５で置換されたアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン、あるいは［Ｒ４’−Ｋ−Ｒ４］ｎであり、
Ｒ４およびＲ４’は独立してアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり（例えば、それぞれ独立してＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９またはＣ１０アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり）、
Ｒ５はハロ、アルキル、ＯＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＳＲ６、ＳＯＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＣＯ２Ｒ６、Ｒ６、蛍光性部分、またはラジオアイソトープであり、
ＫはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＯＮＲ６、または
【化４】
2014520120.tif 000030
アジリジン、エピスルフィド、ジオール、アミノアルコールであり、
Ｒ６はＨ、アルキル、または治療剤であり、
ｘは２〜１０の整数であり、
ｗおよびｙは独立して０〜１００の整数であり、
ｚは１〜１０の整数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）であり、
Ｘａａはそれぞれ独立してアミノ酸（例えば２０個の天然のアミノ酸のうちの１つまたは任意の天然非天然のアミノ酸）であり、
Ｒ７はＰＥＧ、ｔａｔタンパク質、アフィニティーラベル、標的部分、脂肪酸由来のアシル基、ビオチン部分、例えばチオカルバメートまたはカルバメート結合を介して結合した蛍光プローブ（例えばフルオレセインまたはローダミン）であり、
Ｒ８はＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ８ａ、ＮＲ８ａＲ８ｂであり、
前記ポリペプチドは、配列番号１２〜２０のいずれかまたはその異型の少なくとも８個の連続するアミノ酸か、あるいは本明細書に記載される別のポリペプチド配列のうち、（ａ）配列番号１２〜２０の連続する８アミノ酸のうち、３、４または６個のアミノ酸によって隔てられた少なくとも１対のアミノ酸の側鎖が、そのアミノ酸の対のα炭素を式（Ｉ）に示されるように結合する結合基Ｒ３で置換されているもの、および（ｂ）そのアミノ酸の対のうち第１のアミノ酸のα炭素が、式（ＩＩ）に示されるようにＲ１で置換されており、かつそのアミノ酸の対のうち第２のアミノ酸のα炭素が、式（ＩＩ）に示されるようにＲ２で置換されているもの、を除くものを含む、修飾ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項２６】
１個以上のＸａａがαメチルアミノ酸である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項２７】
請求項１に記載の修飾ポリペプチドを含み、ＰＥＧまたはスペルミンに結合された複合ペプチド。
【請求項２８】
ＰＥＧまたはスペルミンが修飾ポリペプチドのアミノ末端に結合されている、請求項２７に記載の複合ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、安定化した変異型ＭＡＭＬペプチドおよびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
異常な転写因子機能は、腫瘍の発生および進行の特徴である。これらの重要な調節分子の脱制御は、キナーゼ（例えばＢＣＲ−Ａｂｌ、ｂ−Ｒａｆおよびｋ−Ｒａｓ）のような上流の調節タンパク質の変異、転座や増幅、タンパク質ホスファターゼ（例えばＰＴＥＮ）の欠損または不活性化変異、増殖因子受容体シグナル伝達（例えばＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ）の変化、あるいは転写因子それ自体（例えばＭＹＣ、ｐ５３およびＮＯＴＣＨ１）の直接的な変異、欠損、増幅または融合等の数々の遺伝的事象に起因し得る。これらの例のそれぞれにおいて、シグナル伝達カスケードは最終的に１つまたはそれ以上の転写因子の異なる活性化をもたらし、異常な遺伝子発現ネットワークを引き起こす１。多くの「ドライバー」癌遺伝子が特徴解析されているが、悪性の表現型および癌の進行に最終的に寄与するのはこれらのネットワークである。しかしながら、癌のような遺伝病におけるこれらの重要な役割にもかかわらず、転写因子は従来の小分子薬の開発に関して極めて研究しがいのある標的であることが判明している。
【０００３】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、多タンパク質であるＮＯＴＣＨトランス活性化複合体を介した過剰なシグナル伝達によって引き起こされる癌遺伝子転写ネットワークの典型例である。正常なＮｏｔｃｈシグナル伝達は、神経前駆細胞の特異化、造血幹細胞の維持および系統決定を含む様々な発生過程にとって重要である２，３。これらの過程の厳密な制御の大部分は、活性化したＮｏｔｃｈ経路から発せられるシグナルの期間および量にわたって細胞から通常課せられる精巧な制御に由来する。Ｎｏｔｃｈ経路機能および制御における異常はヒトの様々な疾患と関係している。ＮＯＴＣＨタンパク質機能を失わせる変異は、ＣＡＤＡＳＩＬ４、先天性大動脈弁疾患５およびアラジール（Ａｌｌａｇｉｌｌｅ）症候群６を含む数々の発生学的疾患において確認されている。一方で、Ｎｏｔｃｈ経路の不適切に持続する活性化を引き起こす遺伝的変異には、原因として癌が関係している。実際、ヒトＮＯＴＣＨ１は、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）の患者におけるｔ（７；９）染色体転座へのその関与に基づいて発見された７。その後、ＮＯＴＣＨ１における様々な変異がＴ−ＡＬＬの患者の５０％以上で発見された８。これらのＴ−ＡＬＬにおける重要な発見に続いて、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を増強する更なる遺伝子の損傷が、多数の他の癌の形態で同定され、それらの癌の形態には、乳癌９、卵巣癌１０、肺癌１１，１２、膵臓癌および消化管癌１３があり、他にも、黒色腫４、多発性骨髄腫１５および髄芽腫において同定されている。更に最近では、異常なＮｏｔｃｈシグナル伝達は、癌以外にも、炎症性アテローム性動脈硬化症１６、糸球体硬化症１７、骨粗鬆症１８および動脈性高血圧１９を含む様々な慢性疾患の発症機序に関与しているとされている。
【０００４】
ＮＯＴＣＨタンパク質と疾患との間に広範な因果関係があることから、Ｎｏｔｃｈ経路を遮断する薬剤の開発には高い関心が寄せられている。受容体活性化に続いて、ＮＯＴＣＨタンパク質はＡＤＡＭファミリーメタロプロテアーゼ２０およびγ−セクレターゼ複合体２１〜２３による２つの連続するタンパク質分解的切断事象を経る。γ−セクレターゼによるＮＯＴＣＨ受容体の膜内切断はＮＯＴＣＨ（ＩＣＮ）の細胞内ドメインを放出し、これは核内に移行して、転写因子ＣＳＬおよびマスターマインド（Ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ）様ファミリー（ヒトではＭＡＭＬ１〜３）の補助活性化因子とともに活性ＮＯＴＣＨ転写複合体（ＮＴＣ）を形成する（図１ａ）２４〜２７，２８。ＮＯＴＣＨリガンド２９，３０、ＮＯＴＣＨ受容体の細胞外ドメイン３１，３２およびγ−セクレターゼ複合体３３〜３６を阻害するための治療剤は何種類か開発されている。
【０００５】
特許文献１には、ＭＡＭＬ１から誘導された特定の架橋ペプチドが記載されており、これらは水溶解度、ＩＣＮ−ＣＳＬ複合体への結合強度、および細胞透過性について試験された。そのようなペプチドの１つ、ＳＡＨＭ１は、ＩＣＮ１−ＣＳＬ複合体に特異的に結合し、組換えｄｎＭＡＭＬ１および完全長ＭＡＭＬ１の結合を競合的に阻害することが分かった。ヒトＴ−ＡＬＬ細胞とともに培養すると、ＳＡＨＭ１は標準的なＮｏｔｃｈ標的遺伝子（ＨＥＳ１、ＭＹＣ、ＤＴＸ１）のパネルの発現の阻害を示した。遺伝子発現特徴解析および遺伝子セットエンリッチメント分析を用いた更に包括的な調査では、ＳＡＨＭ１はヒトおよびマウスＴ−ＡＬＬ細胞においてＮｏｔｃｈ遺伝子を抑制する転写シグナル伝達（実際、このシグナル伝達は小分子γ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）での治療により生じたものと顕著な一致を示した）を生じることが実証された。ＮＯＴＣＨ−ＣＳＬ転写活性化の直接阻害は、ヒトＴ−ＡＬＬ細胞株においても、また、臨床で見られた変異ＮＯＴＣＨ１対立遺伝子によって引き起こされたＴ−ＡＬＬの生物発光マウスモデルにおいても、ＮＯＴＣＨ特異的抗増殖作用をもたらした。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００８／０６１１９２号
【発明の概要】
【０００７】
下記に記載するのは、ヒトＭＡＭＬ１（「ステープルド（ｓｔａｐｌｅｄ）ＭＡＭＬ１ペプチド」）の一部分に関連する安定に架橋されたペプチドである。この架橋ペプチドは少なくとも２個の修飾アミノ酸を含み、それらは一緒に、その２個の修飾アミノ酸のα炭素間に内部（分子内）架橋を形成する。この架橋は、このペプチドのαヘリックス二次構造の安定化に寄与する（米国特許第７１９２１７３号およびＶｅｒｄｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１２  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ５０３：３を参照されたい）。いくつかの場合では、ペプチドは４（６、８または１０）個の修飾アミノ酸を含み、これらが対となって内部架橋を形成する。このようなペプチドは、１個以上の、例えば３個のアミノ酸によって隔てられた２（３、４または５）個の内部架橋を有する。いくつかの場合では、ペプチドは３個の修飾アミノ酸を含み、真ん中の修飾アミノ酸が２つの隣接するアミノ酸のそれぞれと架橋を（α炭素の間に）形成する。２個の内部架橋も有するこのような架橋ペプチドは、「ステッチド（ｓｔｉｔｃｈｅｄ）」ペプチドと称される場合もあり、米国特許出願公開第２０１０／０１８４６４５号明細書に記載されている。
【０００８】
本明細書に記載する架橋ポリペプチドは、架橋していない対応するポリペプチドに対して改善された生物学的活性を有し得る。架橋ＭＡＭＬ１ペプチドはＩＣＮ１−ＣＳＬ複合体に結合して組換えＭＡＭＬ１または完全長ＭＡＭＬタンパク質（ＭＡＭＬ１〜３）のＩＣＮ１−ＣＳＬ複合体への結合を競合阻害することができる。ある種の活性ペプチドは、Ｔ−ＡＬＬ細胞またはＮｏｔｃｈシグナル伝達が活性な他の細胞において、Ｎｏｔｃｈにより調節される１つ以上の遺伝子（ＨＥＳ１、ＭＹＣ、ＤＴＸ１等）の発現を阻害することが予測され、この予測はＮｏｔｃｈ−１依存性レポーター遺伝子のいくつかの研究により支持されている。本明細書に記載の内部架橋ＭＡＭＬペプチドは治療用途で、例えば、患者の種々の癌やＮｏｔｃｈ依存性疾患、例えば、Ｎｏｔｃｈ受容体またはＮｏｔｃｈにより活性化される遺伝子の望ましくない活性化によって特徴付けられる癌や他の疾患の治療のために使用することができる。
【０００９】
本明細書に記載の架橋ＭＡＭＬ１ペプチドは、ヒトＭＡＭＬ１の一部分の異型（ｖａｒｉａｎｔｓ）であり、他のＭＡＭＬアイソフォーム（ＭＡＭＬ２およびＭＡＭＬ３）からのアミノ酸置換または新規なアミノ酸変異を含む場合がある。ヒトＭＡＭＬ１の関連する一部分の配列（ＭＡＭＬ１のアミノ酸２１位から開始する）を下記に示す。
（配列番号１）：
Ｇｌｕ１Ａｒｇ２Ｌｅｕ３Ａｒｇ４Ａｒｇ５Ａｒｇ６Ｉｌｅ７Ｇｌｕ８Ｌｅｕ９Ｃｙｓ１０Ａｒｇ１１Ａｒｇ１２Ｈｉｓ１３Ｈｉｓ１４Ｓｅｒ１５Ｔｈｒ１６Ｃｙｓ１７Ｇｌｕ１８Ａｌａ１９Ａｒｇ２０Ｔｙｒ２１Ｇｌｕ２２Ａｌａ２３Ｖａｌ２４Ｓｅｒ２５Ｐｒｏ２６Ｇｌｕ２７Ａｒｇ２８Ｌｅｕ２９（配列番号１）
他の関連するＭＡＭＬ配列は下記を含む：
配列番号２（ＭＡＭＬ−１；アミノ酸１９〜６２位）：
ＶＭＥＲＬＲＲＲＩＥＬＣＲＲＨＨＳＴＣＥＡＲＹＥＡＶＳＰＥＲＬＥＬＥＲＱＨＴＦＡＬＨＱＲ
配列番号３（ＭＡＭＬ−２）：
ＩＶＥＲＬＲＡＲＩＡＶＣＲＱＨＨＬＳＣＥＧＲＹＥＲＧＲＡＥＳＳＤＲＥＲＥＳＴＬＱＬＬＳＬ
配列番号４（ＭＡＭＬ−３）：
ＶＶＥＲＬＲＱＲＩＥＧＣＲＲＨＨＶＮＣＥＮＲＹＱＱＡＱＶＥＱＬＥＬＥＲＲＤＴＶＳＬＹＱＲ
配列番号５（ＭＡＭＬ−１；転写複合体に結合するための予測ドメインを含む）：
ＨＳＡＶＭＥＲＬＲＲＲＩＥＬＣＲＲＨＨＳＴＣＥＡＲＹＥＡＶＳＰＥＲＬＥＬＥＲＱＨＴＦＡＬＨＱＲＣＩＱＡＫＡＫＲＡＧＫＨ
配列番号６（ＭＡＭＬ−２；転写複合体に結合するための予測ドメインを含む）：
ＨＳＡＩＶＥＲＬＲＡＲＩＡＶＣＲＱＨＨＬＳＣＥＧＲＹＥＲＧＲＡＥＳＳＤＲＥＲＥＳＴＬＱＬＬＳＬＶＱＨ  ＧＱＧＡＲＫＡＧＫＨ
配列番号７（ＭＡＭＬ−３；転写複合体に結合するための予測ドメインを含む）：
ＡＶＰＫＨＳＴＶＶＥＲＬＲＱＲＩＥＧＣＲＲＨＨＶＮＣＥＮＲＹＱＱＡＱＶＥＱＬＥＬＥＲＲＤＴＶＳＬＹＱ  ＲＴＬＥＱＲＡＫＫＳ
配列番号８（ＭＡＭＬ−１コア）ＥＲＬＲＲＲＩＥＬＣＲＲＨＨＳＴ
配列番号９（ＭＡＭＬ−２コア）ＥＲＬＲＡＲＩＡＶＣＲＱＨＨＬＳＣ
配列番号１０（ＭＡＭＬ−３コア）ＥＲＬＲＱＲＩＥＧＣＲＲＨＨＶＮ
配列番号１１（ＭＡＭＬ−２フラグメント）：
ＥＲＬＲＡＲＩＡＶＣＲＱＨＨＬＳＣＥＧＲＹＥＲＧＲＡＥＳＳ
配列番号２１（ＭＡＭＬ−３フラグメント）：
ＥＲＬＲＱＲＩＥＧＣＲＲＨＨＶＮＣＥＮＲＹＱＱＡＱＶＥＱＬ
本開示の架橋ペプチドは、配列番号１２〜２０の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含み、３または７個のアミノ酸によって隔てられた２個以上のアミノ酸の側鎖が内部架橋で置換されている。それぞれの場合において、下記に示すアミノ酸は対応するαメチルアミノ酸で置換されてもよい。すなわち、ＬｅｕはαメチルＬｅｕでもよい。本発明の架橋ペプチドは、３または６個のアミノ酸によって隔てられた２個以上のアミノ酸が内部架橋で置換されている配列番号１〜１０の架橋ペプチドをいずれも含まない。
【００１０】
Ｇｌｕ１Ａｒｇ２Ｘａａ３Ｘａａ４Ａｒｇ５Ａｒｇ６Ｘａａ７Ｘａａ８Ｘａａ９Ｘａａ１０Ａｒｇ１１Ｘａａ１２Ｈｉｓ１３Ｈｉｓ１４Ｓｅｒ１５Ｘａａ１６
（配列番号１２；ＭＡＭＬ−１関連）
Ｇｌｕ１Ａｒｇ２Ｘａａ３Ｘａａ４Ａｌａ５Ａｒｇ６Ｘａａ７Ｘａａ８Ｘａａ９Ｘａａ１０Ａｒｇ１１Ｘａａ１２Ｈｉｓ１３Ｈｉｓ１４Ｌｅｕ１５Ｘａａ１６Ｘａａ１７Ｘａａ１８Ｇｌｙ１９Ａｒｇ２０Ｘａａ２１Ｇｌｕ２２Ａｒｇ２３Ｇｌｙ２４Ａｒｇ２５Ａｌａ２６Ｇｌｕ２７Ｓｅｒ２８Ｓｅｒ２９
（配列番号１５；ＭＡＭＬ−２関連）
Ｇｌｕ１Ａｒｇ２Ｘａａ３Ｘａａ４Ｇｌｎ５Ａｒｇ６Ｘａａ７Ｘａａ８Ｘａａ９Ｘａａ１０Ａｒｇ１１Ｘａａ１２Ｈｉｓ１３Ｈｉｓ１４Ｖａｌ１５Ｘａａ１６Ｘａａ１７Ｘａａ１８Ａｓｎ１９Ａｒｇ２０Ｘａａ２１Ｇｌｎ２２Ｇｌｎ２３Ａｌａ２４Ｇｌｎ２５Ｖａｌ２６Ｇｌｕ２７Ｇｌｎ２８Ｌｅｕ２９
（配列番号１８；ＭＡＭＬ−３関連）
ここで、
Ｘａａ３はＬｅｕ、ＴｒｐまたはＰｈｅであり、
Ｘａａ４はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ａｉｂ（アミノイソブチル酸）であり、
Ｘａａ７はＩｌｅ、Ｌｅｕ、またはＮｏｒＬであり、
Ｘａａ８はＧｌｕ、ＡｌａまたはＡｉｂであり、
Ｘａａ９はＬｅｕ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒであり、
Ｘａａ１０はＣｙｓ、ＰｈｅまたはＶａｌであり、
Ｘａａ１２はＡｒｇ、ＡｌａまたはＡｉｂ  Ｘａａ１６はＴｈｒまたはＡｌａまたはＡｉｂであり、
Ｘａａ３がＬｅｕ、Ｘａａ７がＩｌｅ、かつＸａａ９がＬｅｕの場合、Ｘａａ１０はＣｙｓではなく、Ｘａａ７がＩｌｅ、かつＸａａ９がＬｅｕ、かつＸａａ１０がＣｙｓの場合、Ｘａａ３はＬｅｕではなく、Ｘａａ３がＬｅｕ、Ｘａａ９がＩｌｅ、かつＸａａ１０がＣｙｓの場合、Ｘａａ７はＩｌｅではなく、Ｘａａ３がＬｅｕ、Ｘａａ７がＩｌｅ、かつＸａａ１０がＣｙｓの場合、Ｘａａ９はＬｅｕではない。
【００１１】
Ｇｌｕ１Ａｒｇ２Ｘａａ３Ｘａａ４Ａｒｇ５Ａｒｇ６Ｘａａ７Ｘａａ８Ｘａａ９Ｘａａ１０Ａｒｇ１１Ｘａａ１２Ｈｉｓ１３Ｈｉｓ１４Ｓｅｒ１５Ｘａａ１６Ｘａａ１７Ｘａａ１８Ａｌａ１９Ａｒｇ２０Ｘａａ２１
（配列番号１３；ＭＡＭＬ−１関連）
Ｇｌｕ１Ａｒｇ２Ｘａａ３Ｘａａ４Ａｌａ５Ａｒｇ６Ｘａａ７Ｘａａ８Ｘａａ９Ｘａａ１０Ａｒｇ１１Ｘａａ１２Ｈｉｓ１３Ｈｉｓ１４Ｌｅｕ１５Ｘａａ１６Ｘａａ１７Ｘａａ１８Ｇｌｙ１９Ａｒｇ２０Ｘａａ２１
（配列番号１６；ＭＡＭＬ−２関連）
Ｇｌｕ１Ａｒｇ２Ｘａａ３Ｘａａ４Ｇｌｎ５Ａｒｇ６Ｘａａ７Ｘａａ８Ｘａａ９Ｘａａ１０Ａｒｇ１１Ｘａａ１２Ｈｉｓ１３Ｈｉｓ１４Ｖａｌ１５Ｘａａ１６Ｘａａ１７Ｘａａ１８Ａｓｎ１９Ａｒｇ２０Ｘａａ２１
（配列番号１９；ＭＡＭＬ−３関連）
ここで、
Ｘａａ３はＬｅｕ、ＴｒｐまたはＰｈｅであり、
Ｘａａ４はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ａｉｂ（アミノイソブチル）であり、
Ｘａａ７はＩｌｅ、Ｌｅｕ、またはＮｏｒＬであり、
Ｘａａ８はＧｌｕ、ＡｌａまたはＡｉｂであり、
Ｘａａ９はＬｅｕ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒであり、
Ｘａａ１０はＣｙｓ、ＰｈｅまたはＶａｌであり、
Ｘａａ１２はＡｒｇ、ＡｌａまたはＡｉｂであり、
Ｘａａ１６はＴｈｒ、ＡｌａまたはＡｉｂであり、
Ｘａａ１７はＣｙｓ、Ａｉｂ、Ａｌａ、またはＤ−ペンタフルオロフェニルアラニンであり、
Ｘａａ１８はＧｌｕ、ＡｌａまたはＡｉｂである。
【００１２】
Ｇｌｕ１Ａｒｇ２Ｘａａ３Ｘａａ４Ａｒｇ５Ａｒｇ６Ｘａａ７Ｘａａ８Ｘａａ９Ｘａａ１０Ａｒｇ１１Ｘａａ１２Ｈｉｓ１３Ｈｉｓ１４Ｓｅｒ１５Ｘａａ１６Ｘａａ１７Ｘａａ１８Ａｌａ１９Ａｒｇ２０Ｘａａ２１Ｇｌｕ２２Ａｌａ２３Ｖａｌ２４Ｓｅｒ２５Ｐｒｏ２６Ｇｌｕ２７Ａｒｇ２８Ｌｅｕ２９
（配列番号１４）
Ｇｌｕ１Ａｒｇ２Ｘａａ３Ｘａａ４Ａｌａ５Ａｒｇ６Ｘａａ７Ｘａａ８Ｘａａ９Ｘａａ１０Ａｒｇ１１Ｘａａ１２Ｈｉｓ１３Ｈｉｓ１４Ｌｅｕ１５Ｘａａ１６Ｘａａ１７Ｘａａ１８Ｇｌｙ１９Ａｒｇ２０Ｘａａ２１Ｇｌｕ２２Ａｒｇ２３Ｇｌｙ２４Ａｒｇ２５Ａｌａ２６Ｇｌｕ２７Ｓｅｒ２８Ｓｅｒ２９
（配列番号１７；ＭＡＭＬ−２関連）
Ｇｌｕ１Ａｒｇ２Ｘａａ３Ｘａａ４Ｇｌｎ５Ａｒｇ６Ｘａａ７Ｘａａ８Ｘａａ９Ｘａａ１０Ａｒｇ１１Ｘａａ１２Ｈｉｓ１３Ｈｉｓ１４Ｖａｌ１５Ｘａａ１６Ｘａａ１７Ｘａａ１８Ａｓｎ１９Ａｒｇ２０Ｘａａ２１Ｇｌｎ２２Ｇｌｎ２３Ａｌａ２４Ｇｌｎ２５Ｖａｌ２６Ｇｌｙ２７Ｇｌｎ２８Ｌｅｕ２９
（配列番号２０；ＭＡＭＬ−３関連）
ここで、
Ｘａａ３はＬｅｕ、ＴｒｐまたはＰｈｅであり、
Ｘａａ４はＡｒｇ、Ｌｙｓ、ＡｌａまたはＡｉｂ  Ｘａａ７はＩｌｅ、Ｌｅｕ、またはＮｏｒＬであり、
Ｘａａ８はＧｌｕまたはＡｌａまたはＡｉｂであり、
Ｘａａ９はＬｅｕ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒであり、
Ｘａａ１０はＣｙｓ、ＰｈｅまたはＶａｌであり、
Ｘａａ１２はＡｒｇ、ＡｌａまたはＡｉｂであり、
Ｘａａ１６はＴｈｒまたはＡｌａまたはＡｉｂであり、
Ｘａａ１７はＣｙｓ、Ａｉｂ、ＡｌａまたはＤ−ペンタフルオロフェニルアラニンであり、
Ｘａａ１８はＧｌｕ、ＡｌａまたはＡｉｂであり、
Ｘａａ２１はＴｙｒ、１−ナフチルアラニン、Ｔｒｐ、または２−ナフチルアラニンである。
【００１３】
いくつかの実施形態において、上述した架橋ペプチドは、Ｘａａ３がＬｅｕ、Ｘａａ７がＩｌｅ、かつＸａａ９がＬｅｕの場合、Ｘａａ１０はＣｙｓではなく、かつ／または、Ｘａａ７がＩｌｅ、かつＸａａ９がＬｅｕ、かつＸａａ１０がＣｙｓの場合、Ｘａａ３はＬｅｕではなく、かつ／または、Ｘａａ３がＬｅｕ、Ｘａａ９がＩｌｅ、かつＸａａ１０がＣｙｓの場合、Ｘａａ７はＩｌｅではなく、かつ／または、Ｘａａ３がＬｅｕ、Ｘａａ７がＩｌｅ、かつＸａａ１０がＣｙｓの場合、Ｘａａ９はＬｅｕではない。
【００１４】
本明細書に記載の架橋ペプチドにおいて、Ｎ位のアミノ酸のα炭素は、Ｎ＋４位のアミノ酸のα炭素と、両アミノ酸の側鎖を内部架橋で置換することにより架橋させたものであってもよい。ペプチドが２個の内部架橋を有する場合では、Ｎ位のアミノ酸のα炭素は、Ｎ＋４位のアミノ酸のα炭素と、両アミノ酸の側鎖を内部架橋で置換することにより架橋させたものであってよく、また、Ｎ＋８位のアミノ酸のα炭素をＮ＋１２位のアミノ酸のα炭素と、両アミノ酸の側鎖を内部架橋で置換することにより架橋させたものであってよい。１個のアミノ酸が２個の架橋に関与している、すなわち１個のアミノ酸のα炭素が２個の異なるアミノ酸に架橋した２個の架橋を有する所謂ステッチドペプチドの場合、Ｎ位のアミノ酸のα炭素はＮ＋４位のアミノ酸のα炭素に架橋していてもよく、Ｎ＋４位のアミノ酸のα炭素はＮ＋８位のアミノ酸のα炭素に架橋していてもよい。これは通常、Ｎ位のアミノ酸の側鎖をＮ＋４位のアミノ酸のα炭素への架橋と置換すること、Ｎ＋４位のアミノ酸の側鎖およびＨのそれぞれを架橋（１つはＮ位のアミノ酸への架橋、もう１つはＮ＋８位のアミノ酸への架橋）で置換すること、およびＮ＋８位のアミノ酸の側鎖をＮ＋４位のアミノ酸のα炭素への架橋と置換することによって達成される。
【００１５】
配列番号１２（および１３〜２０）において、好ましい架橋は、Ｘａａ４とＸａａ８との間、Ｘａａ８とＸａａ１２との間、Ｘａａ１２とＸａａ１６との間、Ｘａａ４とＸａａ８および同時にＸａａ８とＸａａ１２との間（ステッチドペプチド）、Ｘａａ８とＸａａ１２および同時にＸａａ１２とＸａａ１６との間（ステッチドペプチド）である。
【００１６】
一態様において、本開示は式（Ｉ）の修飾ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を特徴とし、
【００１７】
【化１】
2014520120.tif 000003
ここで、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立してＨまたはＣ１〜Ｃ１０アルキル（好ましくはメチル）、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、またはヘテロシクリルアルキルであり、
Ｒ３はアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン、あるいは［Ｒ４’−Ｋ−Ｒ４］ｎ（それぞれ０〜６個のＲ５で置換される）であり、
Ｒ４およびＲ４’は独立してアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり（例えば、それぞれ独立してＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９またはＣ１０アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり）、
Ｒ５はハロ、アルキル、ＯＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＳＲ６、ＳＯＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＣＯ２Ｒ６、Ｒ６、蛍光性部分、またはラジオアイソトープであり、
ＫはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＯＮＲ６、
【００１８】
【化２】
2014520120.tif 000004
アジリジン、エピスルフィド、ジオール、アミノアルコールまたは
【００１９】
【化３】
2014520120.tif 000005
であり、
Ｒ６はＨ、アルキル、または治療剤であり、
ｎは２、３、４または６であり、
ｘは２〜１０の整数（好ましくは３〜６）であり、
ｗおよびｙは独立して０〜１００の整数であり、
ｚは１〜１０の整数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）であり、
Ｘａａはそれぞれ独立してアミノ酸（例えば２０個の天然のアミノ酸のうちの１つまたは任意の天然非天然のアミノ酸、例えばＤ−アミノ酸またはαアルキルアミノ酸（例えばαメチルアミノ酸））であり、
上記ポリペプチドは、配列番号１２〜２０のいずれかまたはその異型の少なくとも８個の連続するアミノ酸か、あるいは本明細書に記載される別のポリペプチド配列のうち、（ａ）配列番号１２〜２０の連続する８アミノ酸のうち、３、４または６個のアミノ酸によって隔てられた少なくとも１対のアミノ酸の側鎖が、そのアミノ酸の対のα炭素を式（Ｉ）に示されるように結合する結合基Ｒ３で置換されているもの、および（ｂ）そのアミノ酸の対のうち第１のアミノ酸のα炭素が、式（Ｉ）に示されるようにＲ１で置換されており、かつそのアミノ酸の対のうち第２のアミノ酸のα炭素が、式（Ｉ）に示されるようにＲ２で置換されているもの、を除くものを含む。したがって、配列［Ｘａａ］ｗＬ’［Ｘａａ］ｙＬ”［Ｘａａ］ｚ（ここで、Ｌ’およびＬ”は側鎖が結合基Ｒ３で置換されたアミノ酸である）は少なくとも配列番号１２〜２０の連続したアミノ酸を含む。
【００２０】
別の態様において、本発明は式（ＩＩ）の修飾ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を特徴とし、
【００２１】
【化４】
2014520120.tif 000006
ここで、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立してＨまたはＣ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、またはヘテロシクリルアルキルであり、
Ｒ３はＣ８〜Ｃ１６アルキレン、Ｃ８〜Ｃ１６アルケニレン（好ましくは４位と５位の炭素間に二重結合を有するＣ８アルケニレン）またはＣ８〜Ｃ１６アルキニレン、あるいは［Ｒ４’−Ｋ−Ｒ４］ｎ（それぞれ０〜６個のＲ５で置換される）であり、
Ｒ４およびＲ４’は独立してＣ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニレンまたはＣ２〜Ｃ１０アルキニレンであり（例えば、それぞれ独立してＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９またはＣ１０アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり）、
Ｒ５はハロ、アルキル、ＯＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＳＲ６、ＳＯＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＣＯ２Ｒ６、Ｒ６、蛍光性部分、またはラジオアイソトープであり、
ＫはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＯＮＲ６、
【００２２】
【化５】
2014520120.tif 000007
アジリジン、エピスルフィド、ジオール、アミノアルコール、または
【００２３】
【化６】
2014520120.tif 000008
であり、
Ｒ６はＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、または治療剤であり、
ｘは２〜１０の整数（好ましくは３〜６）であり、
ｗおよびｙは独立して０〜１００の整数であり、
ｚは１〜１０の整数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）であり、
Ｘａａはそれぞれ独立してアミノ酸（例えば２０個の天然のアミノ酸のうちの１つまたは任意の天然非天然のアミノ酸）であり、
Ｒ７はＰＥＧ、ｔａｔタンパク質、アフィニティーラベル、標的部分、脂肪酸由来のアシル基、ビオチン部分、例えばチオカルバメート、カルバメート、アミド、アミン、エーテルまたはトリアゾール結合を介して結合した蛍光プローブ（例えばフルオレセインまたはローダミン）であり、
Ｒ８はＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ８ａ、ＮＲ８ａＲ８ｂであり、
上記ポリペプチドは、配列番号１２〜２０のいずれかまたはその異型の少なくとも１４個の連続するアミノ酸か、あるいは本明細書に記載される別のポリペプチド配列のうち、（ａ）配列番号１２〜２０の連続する８アミノ酸のうち、３、４または６個のアミノ酸によって隔てられた少なくとも１対のアミノ酸の側鎖が、そのアミノ酸の対のα炭素を式（Ｉ）に示されるように結合する結合基Ｒ３で置換されているもの、および（ｂ）そのアミノ酸の対のうち第１のアミノ酸のα炭素が、式（ＩＩ）に示されるようにＲ１で置換されており、かつそのアミノ酸の対のうち第２のアミノ酸のα炭素が、式（ＩＩ）に示されるようにＲ２で置換されているもの、を除くものを含む。したがって、ペプチド［Ｘａａ］ｗＸ［Ｘａａ］ｙＸ’［Ｘａａ］ｘ（ここで、［Ｘａａ］ｗ、［Ｘａａ］ｙ、および［Ｘａａ］ｘは式（Ｉ）および（ＩＩ）において上記で定義したとおりであり、ＸおよびＸ’は側鎖が結合基Ｒ３で置換されたアミノ酸を表す）は少なくとも配列番号１２〜２０の連続したアミノ酸を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、［Ｒ４’−Ｋ−Ｒ４］ｎは
【００２５】
【化７】
2014520120.tif 000009
であり、ここで、Ｒ４はそれぞれ独立してＣ２〜Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ７はスペルミン（−（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２）である。
【００２６】
更に、式（ＩＶ）を有するペプチドまたはその薬学的に許容される塩も含まれる。
【００２７】
【化８】
2014520120.tif 000010
ここで、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立してＨまたはＣ１〜Ｃ１０アルキル（好ましくはメチル）、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、またはヘテロシクリルアルキルであり、
Ｒ３はアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン、あるいは［Ｒ４’−Ｋ−Ｒ４］ｎ（それぞれ０〜６個のＲ５で置換される）であり、
Ｒ４およびＲ４’は独立してアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり（例えば、それぞれ独立してＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９またはＣ１０アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり）、
Ｒ５はハロ、アルキル、ＯＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＳＲ６、ＳＯＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＣＯ２Ｒ６、Ｒ６、蛍光性部分、またはラジオアイソトープであり、
ＫはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＯＮＲ６、
【００２８】
【化９】
2014520120.tif 000011
アジリジン、エピスルフィド、ジオール、アミノアルコールまたは
【００２９】
【化１０】
2014520120.tif 000012
であり、
Ｒ６はＨ、アルキル、または治療剤であり、
ｘおよびｘ’は独立して２〜１０の整数（好ましくは３〜６；好ましくは両方とも３、あるいは一方が３で他方が６）であり、
ｗおよびｙは独立して０〜１００の整数であり、
Ｘａａはそれぞれ独立してアミノ酸（例えば２０個の天然のアミノ酸のうちの１つまたは任意の天然非天然のアミノ酸、例えばＤ−アミノ酸またはαアルキルアミノ酸（例えばαメチルアミノ酸））であり、
上記ポリペプチドは、配列番号１２〜２０のいずれかまたはその異型の少なくとも８個の連続するアミノ酸か、あるいは本明細書に記載される別のポリペプチド配列のうち、（ａ）配列番号１２〜２０の連続する８アミノ酸のうち、３、４または６個のアミノ酸によって隔てられた少なくとも１対のアミノ酸の側鎖が、そのアミノ酸の対のα炭素を式（Ｉ）に示されるように結合する結合基Ｒ３で置換されているもの、および（ｂ）そのアミノ酸の対のうち第１のアミノ酸のα炭素が、式（Ｉ）に示されるようにＲ１で置換されており、かつそのアミノ酸の対のうち第２のアミノ酸のα炭素が、式（Ｉ）に示されるようにＲ２で置換されているもの、を除くものを含む。
【００３０】
上述したように、架橋の位置は様々であり得る。特定の例が下記に示される。これらにおいて、「ＡＡ」はアミノ酸側鎖を表し、「Ｌ」は分子内架橋（式（Ｉ）〜（ＩＶ）のＲ３）を表す。
【００３１】
【化１１】
2014520120.tif 000013
【００３２】
【化１２】
2014520120.tif 000014
【００３３】
【化１３】
2014520120.tif 000015
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の場合、下記の実施形態は開示の範囲内である。
【００３４】
ｘ＝２（すなわちＮ＋３結合）の場合、Ｒ３はＣ７アルキレンまたはアルケニレンであり得る。それがアルケニレンである場合、１個以上の二重結合が存在し得る。ｘ＝６（すなわちｉ＋７結合）の場合、Ｒ３はＣ１２またはＣ１３アルキレンまたはアルケニレンであり得る。それがアルケニレンである場合、１個以上の二重結合が存在し得る。ｘ＝３（すなわちｉ＋４結合）の場合、Ｒ３はＣ８アルキレン、アルケニレンであり得る。それがアルケニレンである場合、１個以上の二重結合が存在し得る。
【００３５】
ステープルドペプチドにおいて、Ｇｌｎが占める任意の位置はＧｌｕに替えてもよく、Ｇｌｕが占める任意の位置はＧｌｎに替えてもよい。同様に、Ａｓｎが占める任意の位置はＡｓｐに替えてもよく、Ａｓｐが占める任意の位置はＡｓｎに替えてもよい。いくつかの場合において、ＡｓｎかＡｒｇか、およびＧｌｎかＧｌｕかの選択は、ステープルドペプチドの所望の電荷に依存するであろう。多くの場合、架橋ペプチドは中性であるか、または生理的ｐＨで正味の正電荷を持つことが好ましい。
【００３６】
いくつかの例において、ｗはそれぞれ独立して３〜１５の整数である。いくつかの例において、ｙはそれぞれ独立して１〜１５の整数である。いくつかの例において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。いくつかの例において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立してＣ１〜Ｃ３アルキルである。いくつかの例において、Ｒ１およびＲ２の少なくとも一方はメチルである。例えば、Ｒ１およびＲ２は両方ともメチルである。いくつかの例において、Ｒ３はアルキル（例えばＣ８アルキル）であり、ｘは３である。いくつかの例において、Ｒ３はＣ１１アルキルであり、ｘは６である。いくつかの例において、Ｒ３はアルケニル（例えばＣ８アルケニル）であり、ｘは３である。いくつかの例において、ｘは６であり、Ｒ３はＣ１１アルケニルである。いくつかの例において、Ｒ３は直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。いくつかの例において、Ｒ３は−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。いくつかの例において、Ｒ３は−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。いくつかの例において、Ｒ３は−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００３７】
いくつかの例において、２個のα，α−二置換立体中心（α炭素）は両方ともＲ型またはＳ型（例えばＮ、Ｎ＋４架橋）であるか、または一方の立体中心がＲ型かつ他方がＳ型（例えばＮ、Ｎ＋７架橋）である。したがって、式（Ｉ）が
【００３８】
【化１４】
2014520120.tif 000016
と表される場合、
Ｃ’およびＣ”二置換立体中心は、例えばｘが３の時、両方ともＲ型であってもよく、両方ともＳ型であってもよい。ｘが６の時は、Ｃ’二置換立体中心はＲ型であり、Ｃ”二置換立体中心はＳ型である。ｘが２の時は、Ｃ’二置換立体中心はＲ型であり、Ｃ”二置換立体中心はＳ型である。Ｒ３二重結合はＥ型またはＺ型立体化学形態にあってもよい。式（ＩＩ）において、すぐ上に示した式のＣ’およびＣ”に対応する炭素についても同様の形態が可能である。
【００３９】
いくつかの例において、Ｒ３は［Ｒ４−Ｋ−Ｒ４’］ｎであり、Ｒ４およびＲ４’は独立してアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン（例えば、それぞれ独立してＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９またはＣ１０アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン）である。
【００４０】
いくつかの例において、ポリペプチドは、分子内架橋で置換されたアミノ酸側鎖に加え、配列番号１〜２１（例えば配列番号１２〜２０）のいずれかにおいて１、２、３、４または５個のアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を含む。
【００４１】
架橋はアルキル、アルケニル、またはアルキニル部分（例えば、Ｃ５、Ｃ８またはＣ１１アルキルまたはＣ５、Ｃ８またはＣ１１アルケニル、あるいはＣ５、Ｃ８またはＣ１１アルキニル）を含むことができる。架橋アミノ酸はα二置換（例えばＣ１〜Ｃ３またはメチル）であってもよい。［Ｘａａ］ｙおよび［Ｘａａ］ｗは独立して、異型ＭＡＭＬ１、２または３ペプチド（例えば配列番号１２〜２０のいずれか）の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５個またはそれ以上の連続するアミノ酸（好ましくは２または５個の連続するアミノ酸）を含み得るペプチドであり、［Ｘａａ］ｘは異型ＭＡＭＬ１、２または３ペプチドの少なくとも３または６個の連続するアミノ酸を含み得るペプチドである。
【００４２】
ペプチドは、異型ＭＡＭＬ１、２または３ペプチドの８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個のアミノ酸を含んでいてもよい。これらのアミノ酸は、３または６個のアミノ酸で隔てられたアミノ酸の１個以上の対が、例えばＲ３を介した架橋を形成するアミノ酸置換物により置換されていることを除いて連続している。すなわち、少なくとも２個のアミノ酸は架橋したアミノ酸または架橋したアミノ酸置換物で置換され得る。よって、式（Ｉ）が
【００４３】
【化１５】
2014520120.tif 000017
で表される場合、［Ｘａａ］ｙ’、［Ｘａａ］ｘおよび［Ｘａａ］ｙ”は、それぞれ、同一のまたは異なる異型ＭＡＭＬ１、２または３ペプチドからの連続するポリペプチド配列を含み得る。同じことが式（ＩＩ）についても言える。
【００４４】
ペプチドは、本明細書に記載の異型ＭＡＭＬ１、２または３ポリペプチドの１０個（１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上）の連続するアミノ酸を含んでもよく、３個のアミノ酸（または６個のアミノ酸）によって隔てられた２個のアミノ酸のα炭素はＲ３を介して結合しており、その２個のα炭素のうちの一方はＲ１で置換され、他方はＲ２で置換され、それぞれペプチド結合を介して追加のアミノ酸に結合している。
【００４５】
いくつかの例において、上記ポリペプチドはＮｏｔｃｈ複合体形成の阻害剤として働く。いくつかの例において、上記ポリペプチドは、蛍光性部分またはラジオアイソトープまたはラジオアイソトープをキレートすることが可能な部分（例えば、メルカプトアセチルトリグリシン、またはＲｅ、ＩｎまたはＹの放射活性同位体をキレートした１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ））を更に含む。いくつかの例において、Ｒ１およびＲ２はメチルであり、Ｒ３はＣ８アルキル、Ｃ１１アルキル、Ｃ８アルケニル、Ｃ１１アルケニル、Ｃ８アルキニル、またはＣ１１アルキニルであり、ｘは２、３、または６である。いくつかの例において、上記ポリペプチドはＰＥＧリンカー、ｔａｔタンパク質、アフィニティーラベル、標的部分、脂肪酸由来のアシル基、ビオチン部分、蛍光プローブ（例えばフルオレセインまたはローダミン）または酵素機構をリクルートする別の生物活性分子であって、例えばユビキチンリガーゼ（ヌトリン（ｎｕｔｌｉｎ）、ＳＡＨ−ｐ５３−８）に結合してリクルートする小分子、ヒストンデアセチラーゼタンパク質および複合体（ＳＩＮ３αヘリックス、ＳＡＨＡ）またはコアクチベータータンパク質（ＭＬＬαヘリックス、ＶＰ１６αヘリックス）等の生物活性分子を含む。
【００４６】
また、本明細書には患者を治療する方法であって、本明細書に記載の化合物のいずれかを患者に投与することを含む方法も記載される。いくつかの例において、その方法は追加の治療剤、例えば化学療法剤を投与することも含む。
【００４７】
上記ペプチドは、１個以上の不斉中心を含んでいてもよく、したがって、存在する任意のオレフィンのラセミ化合物およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物および幾何異性体（例えばＺまたはシスおよびＥまたはトランス）として生じる。これらの化合物のそのような異性体はすべて本発明に明示的に包含される。上記化合物は多数の互変異性型で表わされる場合もあり、そのような例において、本発明は、本明細書に記載の化合物のすべての互変異性型を明示的に包含する（例えば、環系のアルキル化は多数の位置のアルキル化をもたらす場合があり、本発明はそのような反応生成物すべてを明示的に包含する）。そのような化合物のそのような立体異性体のすべては、すべての結晶形と同様に包含される。
【００４８】
α炭素と呼ばれる１個の炭素に結合したアミノ基とカルボキシル基とを両方含むアミノ酸。α炭素には更に水素および側鎖が結合している。適切なアミノ酸は、ペプチドに見られる２０個の共通天然アミノ酸（例えば、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ（一文字表記で知られているもの））のＤ型およびＬ型異性体の両方、および有機合成や他の代謝経路で作られる天然および非天然アミノ酸を含むがこれらに限定されない。下記の表は２０個の共通天然アミノ酸の側鎖の構造を示す。この表中、各構造の右側の「−」はα炭素との結合である。
【００４９】
【表１】
2014520120.tif 000018
「非必須」アミノ酸残基は、ポリペプチドの野生型配列から（その活性を失わせることも実質的に変化させることもなく）変化可能な残基である。「必須」アミノ酸残基は、ペプチドの野生型配列から変化したとき、そのペプチドの活性を失わせるか実質的に失わせる残基である。
【００５０】
「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、類似した側鎖を持つアミノ酸残基で置換することである。類似した側鎖を持つアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で既に定義されている。これらのファミリーは塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖を持つアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を持つアミノ酸（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【００５１】
記号
【００５２】
【化１６】
2014520120.tif 000019
は、分子構造の一部として用いられる場合、単結合あるいはトランスまたはシス二重結合を表す。
【００５３】
用語「アミノ酸側鎖」は、アミノ酸におけるα炭素に結合した部分を指す。例えば、アラニンのアミノ酸側鎖はメチル、フェニルアラニンのアミノ酸側鎖はフェニルメチル、システインのアミノ酸側鎖はチオメチル、アスパラギン酸のアミノ酸側鎖はカルボキシメチル、チロシンのアミノ酸側鎖は４−ヒドロキシフェニルメチル、等である。他の非天然アミノ酸側鎖も含まれ、例えば天然の側鎖（例えばアミノ酸代謝産物）や合成により作られる側鎖（例えばα二置換アミノ酸）である。
【００５４】
用語「ポリペプチド」は、共有結合（例えばアミド結合）で結合された２個以上の天然または合成アミノ酸を指す。本明細書に記載のポリペプチドは、完全長タンパク質（例えば完全に形成されたタンパク質）も、それより短いアミノ酸配列（例えば天然タンパク質の断片または合成ポリペプチド断片）も含む。用語「異型ＭＡＭＬ−１ペプチド」は配列番号１２〜１４を含む。用語「異型ＭＡＭＬ−２ペプチド」は配列番号１５〜１７を含む。用語「異型ＭＡＭＬ−３ペプチド」は配列番号１８〜２０を含む。
【００５５】
用語「ハロ」はフッ素、塩素、臭素またはヨウ素の任意のラジカルを指す。用語「アルキル」は、指定された数の炭素原子を含む直鎖でも分岐鎖でもよい炭化水素鎖を指す。例えば、Ｃ１〜Ｃ１０は、その基が１〜１０個（包括的）の炭素原子を有し得ることを示す。数字による指定がない場合、「アルキル」は１〜２０個（包括的）の炭素原子を有する鎖（直鎖または分岐鎖）である。用語「アルキレン」は二価アルキル（すなわち−Ｒ−）を指す。
【００５６】
用語「アルケニル」は、Ｚ型またはＥ型幾何学形態にある１個以上の炭素−炭素二重結合を有する直鎖でも分岐鎖でもよい炭化水素鎖を指す。アルケニル部分は指定された数の炭素原子を含む。例えば、Ｃ２〜Ｃ１０はその基が２〜１０個（包括的）の炭素原子を有し得ることを示す。用語「低級アルケニル」はＣ２〜Ｃ８アルケニル鎖を指す。数字による指定がない場合、「アルケニル」は２〜２０個（包括的）の炭素原子を有する鎖（直鎖または分岐鎖）である。
【００５７】
用語「アルキニル」は、１個以上の炭素−炭素三重結合を有する直鎖でも分岐鎖でもよい炭化水素鎖を指す。アルキニル部分は指定された数の炭素原子を含む。例えば、Ｃ２〜Ｃ１０はその基が２〜１０個（包括的）の炭素原子を有し得ることを示す。用語「低級アルキニル」はＣ２〜Ｃ８アルキニル鎖を指す。数字による指定がない場合、「アルキニル」は２〜２０個（包括的）の炭素原子を有する鎖（直鎖または分岐鎖）である。
【００５８】
用語「アリール」は６炭素単環式または１０炭素二環式芳香環系を指し、ここで、各環の０、１、２、３、または４個の原子は置換基で置換されてもよい。アリール基の例として、フェニル、ナフチル等が挙げられる。用語「アリールアルキル」または用語「アラルキル」はアリールで置換されたアルキルを指す。用語「アリールアルコキシ」はアリールで置換されたアルコキシを指す。
【００５９】
本明細書で用いられる用語「シクロアルキル」は、３〜１２個の炭素、好ましくは３〜８個の炭素、更に好ましくは３〜６個の炭素を有する飽和および一部不飽和の環状炭化水素基であって、その環状アルキル基が任意に置換されていてもよい環状炭化水素基を含む。好ましいシクロアルキル基は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルを含むがこれらに限定されない。
【００６０】
用語「ヘテロアリール」は、芳香族の５〜８員単環系、８〜１２員二環系、または１１〜１４員三環系であって、単環の場合１〜３個のヘテロ原子を、二環の場合１〜６個のヘテロ原子を、三環の場合１〜９個のヘテロ原子を有するものを指す。上記ヘテロ原子はＯ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば、炭素原子および、単環、二環、三環の場合それぞれ１〜３、１〜６、または１〜９個のＮ、Ｏ、またはＳのヘテロ原子）、各環の０、１、２、３、または４個の原子は置換基で置換されていてもよい。ヘテロアリール基の例として、ピリジル、フリルまたはフラニル、イミダゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、ベンゾイミダゾール、ピリミジニル、チオフェニルまたはチエニル、キノリニル、インドリル、チアゾリル等が挙げられる。用語「ヘテロアリールアルキル」または用語「ヘテロアラルキル」はヘテロアリールで置換されたアルキルを指す。用語「ヘテロアリールアルコキシ」はヘテロアリールで置換されたアルコキシを指す。
【００６１】
用語「ヘテロシクリル」は非芳香族の５〜８員単環系、８〜１２員二環系、または１１〜１４員三環系であって、単環の場合１〜３個のヘテロ原子を、二環の場合１〜６個のヘテロ原子を、三環の場合１〜９個のヘテロ原子を有するものを指す。上記ヘテロ原子はＯ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば、炭素原子および、単環、二環、三環の場合それぞれ１〜３、１〜６、または１〜９個のＮ、Ｏ、またはＳのヘテロ原子）、各環の０、１、２または３個の原子は置換基で置換されていてもよい。ヘテロシクリル基の例として、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、アジリジニル、オキシリル、チイリル（ｔｈｉｉｒｙｌ）、モルホリニル、テトラヒドロフラニル等が挙げられる。
【００６２】
用語「置換基」は、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、またはヘテロアリール基の任意の原子の所で「置換された」基を指す。適切な置換基は、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルコキシカルボニル、アミド、カルボキシ、アルカンスルホニル、アルキルカルボニル、アジド、およびシアノ基を含むがそれらに限定されない。
【００６３】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および下記の詳細な説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１Ａ】ＮＯＴＣＨ１−ＭＡＭＬ１−ＣＳＬ三重複合体（ＮＴＣ）のモデリング。ＮＴＣアセンブリおよび標的遺伝子発現の活性化の模式図。ＭＡＭＬ１のＮ末端ヘリックスを模倣したＭＡＭＬ１（ＳＡＨＭ）由来の安定化αヘリックスペプチドは、ＡＮＫ１−ＣＳＬ接触面を標的化し、標的遺伝子の活性化を抑制する。
【図１Ｂ】ＮＯＴＣＨ１−ＭＡＭＬ１−ＣＳＬ三重複合体（ＮＴＣ）のモデリング。ＮＴＣの分子モデリング。左−３５ｎｓＭＤシミュレーションに基づくＮＴＣのＲＭＳＤ（Å）。右−Ａｍｂｅｒ１０のＭＭＧＢＳＡによる、ＮＴＣにおける個々の残基結合エネルギーの分解。ＭＡＭＬ１のドミナントネガティブフラグメント（ｄｎＭＡＭＬ１、残基１３〜７４）、ＮＯＴＣＨ１のＡＮＫドメイン（ＡＮＫ１）およびＣＳＬは、それぞれ赤紫色、赤色および青色で示されている。複合体安定性への寄与が最大であると確認された残基は黄色（上位の残基１〜９）および青緑色（残基１０〜１８）でハイライトされており、ｄｎＭＡＭＬ１中、ならびにＡＮＫ１およびＣＳＬに対する表面において、棒で表されている。下−ＮＴＣ構造においてハイライトされた残基の平均（Ａｖｅ、ｋｃａｌ／ｍｏｌ）結合自由エネルギー。赤色の残基は、そのそれぞれのタンパク質サブユニットにおける最高スコアの残基である。
【図１Ｃ】ＮＯＴＣＨ１−ＭＡＭＬ１−ＣＳＬ三重複合体（ＮＴＣ）のモデリング。ＢＦＥＤによって測定された、ｄｎＭＡＭＬ１の接触領域における全残基（残基１６〜７０）の結合自由エネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。
【図１Ｄ】ＮＯＴＣＨ１−ＭＡＭＬ１−ＣＳＬ三重複合体（ＮＴＣ）のモデリング。マスターマインドホモログ配列アライメント。ヒトＭＡＭＬ１の残基２０〜４１を、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｘ．ｌａｅｖｉｓ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびＤ．ｒｅｒｉｏからの配列とともに整列させた。橙色はすべての種の間で保存されている残基、緑色は保存された置換、青色は半保存的置換。
【図１Ｅ】ＮＯＴＣＨ１−ＭＡＭＬ１−ＣＳＬ三重複合体（ＮＴＣ）のモデリング。左−２０ｎｓＭＤシミュレーションに基づく非修飾ＭＡＭＬ１（２１〜３６）ペプチドの主鎖ＲＭＳＤ（Å）。右−２０ｎｓＭＤシミュレーション軌跡から１ｎｓ毎に抽出されたＭＡＭＬ１（２１〜３６）ペプチドスナップショットを重ね合わせたもの。
【図１Ｆ】ＮＯＴＣＨ１−ＭＡＭＬ１−ＣＳＬ三重複合体（ＮＴＣ）のモデリング。左−２０ｎｓＭＤシミュレーションに基づくＳＡＨＭ１の主鎖ＲＭＳＤ（Å）。右−２０ｎｓＭＤシミュレーション軌跡から１ｎｓ毎に抽出されたＳＡＨＭ１スナップショットを重ね合わせたもの。
【図１Ｇ】ＮＯＴＣＨ１−ＭＡＭＬ１−ＣＳＬ三重複合体（ＮＴＣ）のモデリング。左−ＳＡＨＭ点突然変異についてのＢＦＥＤ計算に関する、コンピュータによる構造−活性関係ワークフローの模式図。右−指定された点突然変異を含むＳＡＨＭペプチドについてのＭＭＧＢＳＡ  ΔΔＧの計算値が、非修飾ＭＡＭＬ１（Ｅ２１〜Ｔ３６）ペプチド（ＷＴ）に対して示されている。
【図２Ａ】ｄｎＭＡＭＬ１−ＲＡＭＡＮＫ１−ＣＳＬ複合体形成の分析およびＡＬＰＨＡスクリーニングアッセイの開発。ＡＬＰＨＡスクリーニング近接アッセイ。合成ビオチン化ｄｎＭＡＭＬ１ペプチドの、等モルのＧＳＴ−ＲＡＭＡＮＫ１およびＣＳＬタンパク質とのインキュベーションは、溶液中での活性ＮＴＣの形成およびストレプトアビジンで覆われたドナービーズと抗ＧＳＴ結合アクセプタービーズとの近位結合をもたらす。６８０ｎｍでのドナービーズの励起は一重項酸素を生じさせ、これが結合したアクセプタービーズにおいて発光カスケードを選択的に開始する。
【図２Ｂ】ｄｎＭＡＭＬ１−ＲＡＭＡＮＫ１−ＣＳＬ複合体形成の分析およびＡＬＰＨＡスクリーニングアッセイの開発。合成ビオチン化ｄｎＭＡＭＬ１（Ｂｉｏ−ｓｄｎＭＡＭＬ１、残基１６〜７０）を、Ｎ末端ジエチレングリコールリンカーおよびビオチンタグを用いて合成した。ＨＰＬＣで精製したペプチドのクロマトグラムおよび質量スペクトルを示す。
【図２Ｃ】ｄｎＭＡＭＬ１−ＲＡＭＡＮＫ１−ＣＳＬ複合体形成の分析およびＡＬＰＨＡスクリーニングアッセイの開発。固定化Ｂｉｏ−ｓｄｎＭＡＭＬ１の、可溶性等モルＲＡＭＡＮＫ１およびＣＳＬの希釈物へのＳＰＲ結合。黒色の曲線は参照細胞で標準化したセンサグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）データを表し、赤色の曲線は２段階動力学的モデルへの動力学的フィッティングを表す。このフィッティングから得られた結合定数が示されている。ｋｏｎは会合速度、ｋｏｆｆは解離速度、Ｋｄは解離定数、ＲＵは反応単位。
【図２Ｄ】ｄｎＭＡＭＬ１−ＲＡＭＡＮＫ１−ＣＳＬ複合体形成の分析およびＡＬＰＨＡスクリーニングアッセイの開発。固定化Ｂｉｏ−ｎｔｓ−ｄｎＭＡＭＬ１の、可溶性等モルＲＡＭＡＮＫ１およびＣＳＬの希釈物へのＳＰＲ結合。黒色の曲線は参照細胞で標準化したセンサグラムデータを表し、赤色の曲線は２段階動力学的モデルへの動力学的フィッティングを表す。このフィッティングから得られた結合定数が示されている。ｋｏｎは会合速度、ｋｏｆｆは解離速度、Ｋｄは解離定数、ＲＵは反応単位。
【図２Ｅ】ｄｎＭＡＭＬ１−ＲＡＭＡＮＫ１−ＣＳＬ複合体形成の分析およびＡＬＰＨＡスクリーニングアッセイの開発。固定化Ｂｉｏ−ＳＡＨＭ１の、可溶性等モルＲＡＭＡＮＫ１およびＣＳＬの希釈物へのＳＰＲ結合。黒色の曲線は参照細胞で標準化したセンサグラムデータを表し、赤色の曲線は２段階動力学的モデルへの動力学的フィッティングを表す。このフィッティングから得られた結合定数が示されている。ｋｏｎは会合速度、ｋｏｆｆは解離速度、Ｋｄは解離定数、ＲＵは反応単位。
【図２Ｆ】ｄｎＭＡＭＬ１−ＲＡＭＡＮＫ１−ＣＳＬ複合体形成の分析およびＡＬＰＨＡスクリーニングアッセイの開発。Ｂｉｏ−ｓｄｎＭＡＭＬ１およびＧＳＴ−ＲＡＭＡＮＫ１−ＣＳＬ結合パートナーの滴定マトリクス。
【図２Ｇ】ｄｎＭＡＭＬ１−ＲＡＭＡＮＫ１−ＣＳＬ複合体形成の分析およびＡＬＰＨＡスクリーニングアッセイの開発。最適条件下（４０ｎＭのＢｉｏ−ｓｄｎＭＡＭＬ１、ＧＳＴ−ＲＡＭＡＮＫ１およびＣＳＬ）でのＡＬＰＨＡスクリーニングシグナルは、全ＮＴＣパートナーの存在下でのみ強固な結合を得た。
【図２Ｈ】ｄｎＭＡＭＬ１−ＲＡＭＡＮＫ１−ＣＳＬ複合体形成の分析およびＡＬＰＨＡスクリーニングアッセイの開発。標識していないｄｎＭＡＭＬ１およびＳＡＨＭ１ペプチドは、ＤＭＳＯ対照と比べ、ＧＳＴ−ＲＡＭＡＮＫ１−ＣＳＬ結合に関してＢｉｏ−ｓｄｎＭＡＭＬ１と競合した。ｆ）以前に報告された非修飾およびステープルドＳＡＨＭペプチドの競合的ＡＬＰＨＡスクリーニングアッセイ。データは、（ｆ）ではマトリクス滴定の、（ｈ）ではペプチド競合アッセイの、２つまたは３つの測定値の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．で示されている。
【図３Ａ】ＳＡＨＭアナログペプチドの設計および生化学的特徴解析。ＭＤシミュレーションに用いられた、２３、２７、２９および３０位に点突然変異を含むＳＡＨＭアナログのパネル。
【図３Ｂ】ＳＡＨＭアナログペプチドの設計および生化学的特徴解析。点突然変異アナログおよび以前に特徴解析されたペプチド（１μＭ）の、ＤＭＳＯと比べた時の、ＧＳＴ−ＲＡＭＡＮＫ１−ＣＳＬ結合に関してＢｉｏ−ｓｄｎＭＡＭＬ１と競合させたＡＬＰＨＡスクリーニング競合アッセイスクリーニング。
【図３Ｃ】ＳＡＨＭアナログペプチドの設計および生化学的特徴解析。Ｃ３０Ｆ点突然変異を含む高スコアＳＡＨＭ点突然変異体のＭＤスナップショット。関連する接触部分がハイライトされており、本文において考察されている。
【図３Ｄ】ＳＡＨＭアナログペプチドの設計および生化学的特徴解析。Ｌ２９Ｗ点突然変異を含む高スコアＳＡＨＭ点突然変異体のＭＤスナップショット。関連する接触部分がハイライトされており、本文において考察されている。
【図３Ｅ】ＳＡＨＭアナログペプチドの設計および生化学的特徴解析。Ｌ２９Ｙ点突然変異を含む高スコアＳＡＨＭ点突然変異体のＭＤスナップショット。関連する接触部分がハイライトされており、本文において考察されている。
【図３Ｆ】ＳＡＨＭアナログペプチドの設計および生化学的特徴解析。Ｉ２７ＮＬ点突然変異を含む高スコアＳＡＨＭ点突然変異体のＭＤスナップショット。関連する接触部分がハイライトされており、本文において考察されている。
【図３Ｇ】ＳＡＨＭアナログペプチドの設計および生化学的特徴解析。Ｌ２３Ｆ点突然変異を含む高スコアＳＡＨＭ点突然変異体のＭＤスナップショット。関連する接触部分がハイライトされており、本文において考察されている。
【図３Ｈ】ＳＡＨＭアナログペプチドの設計および生化学的特徴解析。ヒトＮＴＣ  Ｘ線構造（ＰＤＢアクセッション：２Ｆ８Ｘ）におけるｄｎＭＡＭＬ１のＣ３７〜Ｙ４１（緑色）およびＥ４２〜Ｌ４９（橙色）残基を介したＡＮＫ１ドメイン（赤色）およびＣＳＬ（青色）への追加の接触部分の図。示されているＡＬＰＨＡスクリーニング競合値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【図３Ｉ】ＳＡＨＭアナログペプチドの設計および生化学的特徴解析。ヒトＮＴＣ  Ｘ線構造（ＰＤＢアクセッション：２Ｆ８Ｘ）におけるｄｎＭＡＭＬ１のＣ３７〜Ｙ４１（緑色）およびＥ４２〜Ｌ４９（橙色）残基を介したＡＮＫ１ドメイン（赤色）およびＣＳＬ（青色）への追加の接触部分の図。示されているＡＬＰＨＡスクリーニング競合値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【図４Ａ】ＳＡＨＭアナログペプチドの生化学的特徴解析およびＳＡＲ。Ｅ２１〜Ｔ３６スカフォールド内に天然の変異の組合せを含むアナログペプチドの構造およびＡＬＰＨＡスクリーニングＮＴＣ競合アッセイＩＣ５０値。
【図４Ｂ】ＳＡＨＭアナログペプチドの生化学的特徴解析およびＳＡＲ。Ｅ２１〜Ｙ４１およびＥ２１〜Ｌ４９の延長ステープルドペプチドスカフォールド内に天然の変異の組合せを含むアナログペプチドの構造およびＡＬＰＨＡスクリーニングＮＴＣ競合アッセイＩＣ５０値。
【図４Ｃ】ＳＡＨＭアナログペプチドの生化学的特徴解析およびＳＡＲ。非天然アミノ酸を含むアナログステープルドペプチドの構造およびＡＬＰＨＡスクリーニングＮＴＣ競合アッセイＩＣ５０値。ステッチドペプチドＳＡＨＭ１−２９およびＳＡＨＭ１−３０における青色の「Ｂ５」残基は、ビスペンテニルグリシン誘導体に相当する（補足図３を参照）。競合曲線（右）は、Ｐｒｉｚｍ５において３パラメータＳ字状用量反応曲線に適合させた２回の実験の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す。示されているＡＬＰＨＡスクリーニングＩＣ５０値は、平均の９５％信頼区間（Ｃ．Ｉ．）を表す。
【図４Ｄ】ＳＡＨＭアナログペプチドの生化学的特徴解析およびＳＡＲ。ＡＮＫ１−ＣＳＬ複合体（白色の表面で示す）に結合したＳＡＨＭ１−５６（赤紫色のリボンで示す）のＭＤスナップショット。Ｌ２３Ｗ、Ｌ２９ＹおよびＣ３０Ｆ変異側鎖はハイライトして棒として示す。
【図４Ｅ】ＳＡＨＭアナログペプチドの生化学的特徴解析およびＳＡＲ。ＭＤエネルギー最小化の前（緑色）および後（青色および赤紫色のリボンで示す）の、ＡＮＫ１−ＣＳＬ複合体に結合したＥ２１〜Ｌ４９スカフォールドアナログＳＡＨＭ１−８０のＭＤスナップショットを重ね合わせたもの。
【図４Ｆ】ＳＡＨＭアナログペプチドの生化学的特徴解析およびＳＡＲ。ＡＮＫ１−ＣＳＬ複合体（白色の表面で示す）に結合したＳＡＨＭ１−６２（緑色のリボンで示す）のＭＤスナップショット。Ｌ２３Ｗ、Ｌ２９Ｙ、Ｃ３０Ｆ、Ｃ３７ＦｆおよびＹ４１Ｎｐ１変異側鎖および炭化水素ステープルはハイライトして棒として示す。
【図５Ａ】ＳＡＨＭアナログはＮＯＴＣＨ依存性転写およびＴ−ＡＬＬ細胞増殖を阻害する。全ＳＡＨＭアナログペプチドについてのＡＬＰＨＡスクリーニングＩＣ５０値およびＮＯＴＣＨ１駆動性ＣＳＬルシフェラーゼレポーターの標準化阻害（１５μＭ、１８時間、ＤＭＳＯ対照との比較）の相関プロット。
【図５Ｂ】ＳＡＨＭアナログはＮＯＴＣＨ依存性転写およびＴ−ＡＬＬ細胞増殖を阻害する。ＳＡＨＭ１およびＥ２１〜Ｔ３６およびＥ２１〜Ｙ４１  ＳＡＨＭスカフォールドからの最適化ペプチドによるＮＯＴＣＨ１駆動性二重ルシフェラーゼレポーターアッセイの用量依存的阻害。
【図５Ｃ】ＳＡＨＭアナログはＮＯＴＣＨ依存性転写およびＴ−ＡＬＬ細胞増殖を阻害する。以前にＮＯＴＣＨ１阻害の影響を受けることが示されているヒトＴ−ＡＬＬ細胞株（ＨＰＢ−ＡＬＬおよびＳＵＰＴ−１）またはＮＯＴＣＨ１阻害に対し主に抵抗性であることが示されているヒトＴ−ＡＬＬ細胞株（ジャーカット）の増殖に対する、ＳＡＨＭアナログペプチドの効果。細胞をＳＡＨＭアナログ（２０μＭ）またはＤＭＳＯビヒクルで７２時間処理し、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイによって細胞ＡＴＰ含量を測定することにより、標準化生存率を決定した。
【図５Ｄ】ＳＡＨＭアナログはＮＯＴＣＨ依存性転写およびＴ−ＡＬＬ細胞増殖を阻害する。１０および２０μＭ、７２時間におけるＳＡＨＭ１アナログの、図５Ｃのものと同様の効果。データは３回の実験からの平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【図６】１ターンのｉ、ｉ＋４ステープルドペプチドおよび２ターンのステッチドｉ、ｉ＋４＋４安定化ペプチドの合成に用いられたオレフィン含有“Ｓ５”および“Ｂ５”アミノ酸。残基を従来のＳＰＰＳ、その後、グラブスＩ触媒を用いた閉環オレフィンメタセシスによってステープルドペプチドに組み込んだ。
【図７Ａ】ｂｉｏ−ｓｄｎＭＡＭＬ１の構造。
【図７Ｂ】Ａｃ−ｓｄｎＭＡＭＬ１の構造。
【図７Ｃ】ｂｉｏ−ｎｔ−ｓｄｎＭＡＭＬ１の構造。
【図８】図５ａで提示したレポーター遺伝子アッセイ相関データをグラフに表した図。ΔＥＧＦΔＬＮＲ−ＮＯＴＣＨ１構築物、ＣＳＬ−ホタルルシフェラーゼレポーターおよびウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）−ルシフェラーゼレポーターで共トランスフェクションしたＵ２ＯＳ細胞をアナログステープルドペプチド（１５μＭ、１８〜２４時間）またはビヒクルのみで処理した。各アナログペプチドについて、ＤＭＳＯのみに対して標準化した平均レポーターシグナルが示されている。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
以下に、Ｎｏｔｃｈ転写複合体（ＮＴＣ）の分子ダイナミクス（ＭＤ）コンピュータモデルを説明する。このモデルはＮＴＣの広範囲な安定性およびｄｎＭＡＭＬ１、ＡＮＫ１およびＣＳＬのタンパク質−タンパク質接触面に関与するすべての残基の寄与を調査するために使用された。また、ＮＴＣ複合体形成を測定する生化学的アッセイ、反復的医化学アプローチ、および、ＳＡＨＭよりも強力なペプチドを含む架橋ＭＡＭＬ１ペプチドを設計するための細胞ベースのアッセイと組み合わせたこれらのモデルの使用も以下に説明する。
【００６６】
以下に、ヒトＭＡＭＬ１（およびＭＡＭＬ−２およびＭＡＭＬ−３）に関連する様々な内部架橋αヘリックスドメインポリペプチドを説明する。これらのポリペプチドは、そのポリペプチドのαヘリックス二次構造を優位に促進する２個の非天然アミノ酸（すなわち、側鎖が架橋で置換されている２個のアミノ酸）の間の内部架橋を含む。一般に、架橋（ステープルと称する場合もある）は１または２個のヘリックスターンの長さ（すなわち、約３、４または約７個のアミノ酸）を横切るように延びる。したがって、ｉとｉ＋３、ｉとｉ＋４、またはｉとｉ＋７の位置にあるアミノ酸は、化学的修飾および架橋の理想的な候補である。よって、例えばペプチドが・・・Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９・・・（「・・・」は任意に追加のアミノ酸が存在することを示す）の配列を有する場合、Ｘａａ１とＸａａ４との間の架橋、またはＸａａ１とＸａａ５との間の架橋、またはＸａａ１とＸａａ８との間の架橋は、Ｘａａ２とＸａａ５との間の架橋、またはＸａａ２とＸａａ６との間の架橋、またはＸａａ２とＸａａ９との間等の架橋と同様に有用である。ポリペプチドは、そのポリペプチド配列中に、その配列を更に安定化するため、またはより長いポリペプチド伸長の安定化を容易にするために、１個以上の架橋を含み得る。一部において、ポリペプチドが長すぎて容易に合成できない場合、独立に合成した複数の架橋ペプチドをネイティブケミカルライゲーションと呼ばれる技術によって結合してもよい（Ｂａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６：１３７７）。
【００６７】
本明細書では、ＩＣＮ１−ＣＳＬ複合体に対する親和性を示し、かつ対応する非修飾（架橋されていない）ＭＡＭＬ１ペプチドとは対照的に、より容易に細胞に入り込む機構を示すＭＡＭＬ１の安定化αヘリックス（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｘ）（ＳＡＨ−ＭＡＭＬ１）ペプチドを説明する。
【００６８】
様々な長さのオレフィン側鎖を含むα，α−二置換非天然アミノ酸は、既知の方法で合成することができる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  １１３：９２７６；Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：５８９１）。ｉがｉ＋７に結合したステープルを用いるペプチド（ヘリックスの２個のターンが安定化されている）については、１個のＳ５アミノ酸および１個のＲ８を用いるか、あるいは１個のＳ８アミノ酸および１個のＲ５アミノ酸を用いる。Ｒ８は、出発キラル補助基がＲ−アルキル立体異性体を与えることを除き、同じ手段を用いて合成される。また、８−ヨードオクテンを５−ヨードペンテンの代わりに用いる。阻害剤は、ＭＢＨＡ樹脂上の固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いて固体支持体上で合成する。
【００６９】
単一のアミノ酸が２個の架橋に関与する架橋ペプチドの調製方法は米国特許出願公開第２０１０／１８４６４５号明細書に記載されており、参照により本明細書に援用される。
（ＮＴＣの分子ダイナミクスシミュレーション）
ＮＴＣ（ｄｎＭＡＭＬ１−ＡＮＫ１−ＣＳＬ）のＭＤシミュレーションは、約５ｎｓ後に、この時点後の複合体ＲＭＳＤの相対的安定化により証明されたように、収束した（図１ｂ、左）。タンパク質−ペプチド結合相互作用は、ｄｎＭＡＭＬ１の残基の対とＡＮＫ１−ＣＳＬの接触面における浅い溝との間の多数の弱い相互作用により構成される（図１ｂ、右）。相互作用の結合自由エネルギーに最も寄与する残基、すなわちタンパク質−ペプチド接触面における所謂「ホットスポット」は、いくつかのタンパク質−タンパク質相互作用（例えばｐ５３−ＭＤＭ２接触面）において空間的に集合しており、他は、より大きい結合接触面に沿って、より散らばっている。本発明者らのｄｎＭＡＭＬ１ステープルドペプチドフラグメントの評価および公開されている突然変異誘発実験では、重要な接触の大多数はＮ末端ヘリックス中に含まれるものの、結合エネルギーが接触面のどの程度の範囲まで分布しているかについてはほとんど分かっていないことが示されている。ｄｎＭＡＭＬ１の各残基のＮＴＣ複合体安定性へのエネルギー寄与を確認するために、本発明者らはコンピュータによる結合自由エネルギー分解（ＢＦＥＤ）分析を採用した。類似の方法はコンピュータによるアラニンスキャニング（ＣＡＳ）であり、これは、所定の残基をアラニンに変異させた時の自由エネルギー中の電荷を算定するものである。アラニンへの変異はかなりの立体構造変化を引き起こし得、したがって結合系を乱すが、これはＣＡＳによっては示すことができない。一方、ＢＦＥＤ法は主鎖および側鎖の両方のエネルギー寄与を計算し、アラニン変異の摂動を取り入れない。そのため、本発明者らは、収束ＭＤ軌跡（５〜３５ｎｓ）から抽出したスナップショットに基づくこの系にＢＦＥＤ法を適用した。
【００７０】
Ｎ末端からＰ４６まで（１個のキンク（ｋｉｎｋ）を取り込む以外は連続したヘリックスである）、ｄｎＭＡＭＬ１はＡＮＫ１およびＣＳＬの両方で構成される表面に結合する。Ｐ４６からＣ末端まで、ｄｎＭＡＭＬ１はＣＳＬと相互作用するのみである（図１ｂ、右）。表１は、ｄｎＭＡＭＬ１−ＡＮＫ１−ＣＳＬ結合自由エネルギーに最も寄与する上位１５残基を一覧にしたものである（図１ｂ、右）。本発明者らは、上位１５個のホットスポット残基のうちの１０個（太字のもの）がｄｎＭＡＭＬ１（Ｎ末端からＰ４６）とＡＮＫ１−ＣＳＬとの間の接触面に位置していることを発見した。このことは、この領域が結合にとってより重要であることを示している。上位にランキングされたＮ末端へリックスの外側の残基は、Ｌ５９を有するＣＳＬの疎水性の溝とｄｎＭＡＭＬ１のＴ５６との間の相互作用の周囲に集まる。Ｎ末端へリックス内の上位の残基は、ｄｎＭＡＭＬ１内に、ＡＮＫ１のＤ１９７３およびＥ２００９、ならびにＣＳＬのＥ３７８と安定な塩のブリッジを形成するアルギニンのクラスター（Ｒ２２、Ｒ２５およびＲ３１）を含む。この伸長部における他の重要な残基には、２個のヒスチジン（Ｈ３４およびＨ３３）、および１個のチロシン（Ｙ４１）が含まれ、これらのファンデルワールスエネルギー項は、結合の自由エネルギーの中心となる。以前の実験では、ゲルシフトアッセイにより、Ｒ２５Ｅ／Ｒ２２Ｅの２つからなるｄｎＭＡＭＬ１変異またはＤ１９７３ＲからなるＡＮＫ１変異がＮＴＣ複合体の形成を抑制したことが報告された４５。更に、本発明者らは以前に、Ｒ２２Ｅ／Ｒ２６Ｅ変異を含むステープルドペプチドＳＡＨＭ１−Ｄ１が多くのアッセイで活性の減少を示すことを報告した３７。これらの発見と合致して、本発明者らの計算では、Ｒ２５およびＤ１９７３（図１ｂにおいて赤で色付けされている）はそれぞれ、ｄｎＭＡＭＬ１およびＡＮＫ１において最も重要な残基であることが判明した。このモデルでは、Ｍ３８０（図１ｂにおいて赤で色付けされている）が、ｄｎＭＡＭＬ１のＩ２７、Ｃ３０、Ｒ３１およびＨ３４と相互作用する、ＣＳＬにおける重要な残基であることも予測された。
【００７１】
図１ｃは、ｄｎＭＡＭＬ１の各残基のＢＦＥＤ寄与を示し、ここで、負の値は重要な相互作用を表し、小さい値または正の値は重要でないか有害な相互作用をそれぞれ表す。これらの計算は、本発明者らの報告したステープルドペプチド評価の結果を要約したものである。ここで、重要な接触の大多数は、ＳＡＨＭ１の生成に用いたＥ２１〜Ｔ３６までの伸長部に含まれている。この領域における高密度の結合エネルギー分布は、多くの種からのマスターマインドオルソログのこのペプチド伸長部における高度な保存を説明する（図１ｄ）。重要なことに、これらの計算は、結合には関与するが利用されなくてもよい多くの残基（ｄｎＭＡＭＬ１のこの伸長部においてＬ２３、Ｉ２７、Ｌ２９およびＣ３０を含む）もハイライトする。これらの残基の天然または非天然アミノ酸への変異により、より強力かつ特異的なＮＯＴＣＨ複合体のステープルドペプチド阻害剤が生成される可能性がある。
【００７２】
（非修飾およびステープルドＭＡＭＬペプチドの分子ダイナミクスシミュレーション）
本発明者らは次に、ステープルドペプチドを正確に描き、かつＮＴＣを標的とするＳＡＨＭアナログの設計情報を与えることが可能な分子ダイナミクスモデルの開発に努めた。公開されている多数の報告が、ステープルドペプチドを研究するためにＭＤシミュレーションを採用している。しかしながら、これらは主に炭化水素ステープルのペプチド安定性およびヘリシティへの影響に関するものである４７、４８。本発明者らは、ステープルドペプチド結合の定量的な情報を得るため、およびアナログのＳＡＲパラメータを開発するためにＭＤシミュレーションを成功裏に採用した報告を全く知らない。本発明者らの計算において、Ｅ２１〜Ｔ３６ｄｎＭＡＭＬ１ペプチド［ＭＡＭＬ１（２１〜３６）］がヘリックスを保つ程度を最初に評価するため、ＮＯＴＣＨ複合体から抽出した対応するヘリックス構造についてＭＤシミュレーションを実施した。また、Ｅ２８およびＲ３２をｉ→ｉ＋４結合α，α−二置換「Ｓ５」アミノ酸に変異させることにより（図６）、対応するステープルドペプチドアナログ（ＳＡＨＭ１）も作製した。ＮＴＣシミュレーションと同様のパラメータを用いて、陽溶媒中のＭＡＭＬ１（２１〜３６）およびＳＡＨＭ１について２０ｎｓＭＤシミュレーションを実施した。ＭＤ軌跡により、ＭＡＭＬ１（２１〜３６）は約６〜９ｎｓ後にそのαヘリックス構造を失い（図１ｅ）、一方、ＳＡＨＭ１は２０ｎｓＭＤシミュレーションの全体に亘り、Ｃ末端のセリン−トレオニン伸長部に僅かな無秩序があるものの、そのヘリックス内容をほぼ保持することが判明した（図１ｆ）。ＭＡＭＬ１（２１〜３６）のシミュレーション中、Ｅ２８とＲ３２との間の塩ブリッジは崩壊し、主鎖の水素結合は失われ、これによりペプチドの折り畳みはほどかれた。反対に、ＳＡＨＭ１の中心的な炭化水素ステープルはペプチドの中央でヘリックスターンを保持し、Ｅ２１はＲ２４またはＲ２５と一時的な塩ブリッジを形成した。これらの定性的な結果は、以前にＭＡＭＬ１（２１〜３６）およびＳＡＨＭ１のヘリシティを比較した円偏光二色性測定結果と合致している３７。
【００７３】
（ＳＡＨＭ１アナログのＡＮＫ１−ＣＳＬとのシミュレーションおよびＢＦＥＤ計算）
これらのＭＤモデルに誘導され、本発明者らは続いて、改善されたＳＡＨＭ１アナログを設計できるか否か決定することを目標とした。非天然アミノ酸リンカーを含むアナログペプチドを、最初のＸ線構造（ＰＤＢｉｄ：２ｆ８ｘ）に基づき作成し、ｄｎＭＡＭＬ１をＳＡＨＭ１アナログで置換することによりＭＤシミュレーションを実行した。変異させた天然／非天然残基（ステープルを含む）をＭａｅｓｔｒｏ（登録商標）８．５で作成した。非天然残基の作成のためのパラメータは実験方法の節に詳述されている。変異したアミノ酸を有する新たなＮＯＴＣＨ複合体それぞれの立体構造の調査は、Ｍａｃｒｏｍｏｄｅｌを用いて行い、その後エネルギー最小化を行った。変異させた残基の自由な動きを許容し、４Å以内の周囲の残基を定数２００（）によって規制し、かつ他の残基を固定したままにすることによって、Ｍａｃｒｏｍｏｄｅｌのｍｉｘｅｄ  ｔｏｒｓｉｏｎａｌ／ｌｏｗモードモンテカルロ法を適用した。最低エネルギーの立体構造を、ＮＴＣシミュレーションで用いたものと同じパラメータ設定のＭＤシミュレーションの出発構造として用いた。ＳＡＨＭ１アナログが異なる新たな複合体それぞれについて、１６ｎｓＭＤシミュレーションを実施した。収束ＭＤ軌跡に沿ってスナップショットを抽出し、ＳＡＨＭ１アナログのＡＮＫ１−ＣＳＬ複合体への相対結合親和性を比較するために、ＭＭＧＢＳＡスコアを算出した。
【００７４】
前述したＮＴＣ  ＭＤシミュレーションの結果から、残基Ｌ２３、Ｉ２７、Ｌ２９およびＣ３０は、ｄｎＭＡＭＬ１結合自由エネルギーに大きくは寄与しないことが示された。これにより、ＡＮＫ１−ＣＳＬとのより強力な相互作用を得るために、これらの残基を変異させてもよいことが示唆される。この前提を試験するため、これらの位置に疎水性点突然変異を含むアナログペプチドの集中的ライブラリーを構築した。各ペプチドのＭＤ軌跡の分析およびＭＭＧＢＳＡスコアを用い、各変異が好ましいものであるか否か、ならびに、各位置についてどれが最良の変異（複数の変異を含む）であるかを決定した。非修飾ＭＡＭＬ１（２１〜３６）ペプチドに対するＭＭＧＢＳＡスコアを算出し、図１ｇに示す。注目すべき点として、Ｃ３０およびＬ２３から、より大きい芳香族側鎖（それぞれ、フェニルアラニンおよびトリプトファン）への変異はＭＭＧＢＳＡスコアに最も大きい効果を及ぼすようであった。Ｌ２９およびＩ２７への変異は正の効果を有する場合があり（Ｌ２９Ｆ／Ｙ／Ｗ、Ｉ２７Ｌ）、他では有害であった（Ｌ２９Ｉ、Ｉ２７Ｆ／Ｗ）。全体として、これらの計算は、最適化相互作用がこれらの変異を介して与えられ得るという見解を支持する。よって、本発明者らはＮＴＣアセンブリを測定する確固たる生化学的アッセイを開発し、そしてこの一連のアナログを試験することに努めた。これらの変異の効果についての構造上の根拠は、下記で説明し、生化学的研究の結果と比較する。
【００７５】
（ＡＬＰＨＡスクリーニングアッセイの開発とＮＴＣの生化学）
ＮＴＣアセンブリの生物物理学を、電気泳動移動度シフト解析２４、等温滴定型熱量測定４９、および様々な免疫沈降法を含む比較的ロースループットのアッセイを用いて調べた。最近では、デル・ビアンコ（Ｄｅｌ  Ｂｉａｎｃｏ）らが、ＮＴＣアセンブリ時のドナーフルオロフォア標識ＡＮＫタンパク質のアクセプター標識オリゴヌクレオチドへの近接度を測定するＦＲＥＴベースのシステムの使用を報告しており、このシステムは、複合体全体についての相対平衡定数の測定を可能にする４５。本発明者らも、ＮＴＣコンポーネント同士の会合およびＮＴＣコンポーネントとステープルドペプチドとの会合を測定する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および蛍光極性アッセイの使用を報告した３７。しかしながら、今日まで、ｄｎＭＡＭＬ１−ＮＯＴＣＨ−ＣＳＬ複合体形成を定量的に測定するハイスループットアッセイは報告されていない。本発明者らは本願において、ｄｎＭＡＭＬ１のＮＯＴＣＨ−ＣＳＬヘテロダイマーへの結合を測定するための、ＡＬＰＨＡスクリーニング技術を用いた確固たる均質なアッセイを紹介する。ＡＬＰＨＡスクリーニング技術（ＡＬＰＨＡはａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ａｓｓａｙを意味する）は、溶液中で同種の結合パートナーの会合を検出するために、機能性を付与した直径約２００ｎｍのビーズを使用する５０、５１。ドナービーズのレーザ励起（６８０ｎｍ）により、一重項酸素流が放出され、これは個別の半減期に起因して、約２００ｎｍで拡散する。結合相互作用を介して近位に局在しているアクセプタービーズは、低波長（５２０〜６２０ｎｍ）の放射を放出する発光カスケードにおいて一重項酸素を利用する。図２ａに示すように、このアッセイは、合成ビオチン化ｄｎＭＡＭＬ１ペプチドの、ＣＳＬおよびＧＳＴ標識ＲＡＭＡＮＫ１の複合体との会合を検出するように構成された（ＲＡＭドメインおよびＡＮＫドメインは、ＣＳＬ結合に関してＩＣＮの最小サブユニットを構成する）。このアッセイ形式を可能にするために、本発明者らは最初に、完全合成ｄｎＭＡＭＬ１ポリペプチド（ｓｄｎＭＡＭＬ１、残基１６〜７０）を合成および精製する方法を開発した。その方法は、従来の方法による固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ、図２ｂ）のサイズ制限を超える。マイクロ波を利用したペプチド合成および僅かに変更したＳＰＰＳプロトコールは、ビオチン化ｓｄｎＭＡＭＬ１ペプチド（ｂｉｏ−ｓｄｎＭＡＭＬ１、他は代替のＮ末端修飾）を、ＬＣＭＳ分析による純度９５％超で容易に提供した（図２ｂ、図７）。
【００７６】
ＳＰＲを、固定化ｂｉｏ−ｓｄｎＭＡＭＬ１ペプチドと等モルのＲＡＭＡＮＫ１−ＣＳＬ複合体との間の結合動態を測定するために用い、高親和性結合（ＫＤ＝０．０４μＭ、図２ｃ）が確認された。本発明者らの知る限りでは、これらの実験は、ＮＴＣの任意のコンポーネントへのｄｎＭＡＭＬ１の親和性を最初に報告したものである。本発明者らの以前の結果およびＭＤ計算が示唆するように、Ｎ末端ヘリックスが単独でＲＡＭＡＮＫ１−ＣＳＬに結合する能力を持つのか否かを確認するために、ＳＰＲによってｂｉｏ−ｎｔ−ｓｄｎＭＡＭＬ１（残基１６〜４５）の親和性も測定した（図２ｄ、図６）。Ｎ末端ｄｎＭＡＭＬ１ペプチドはＲＡＭＡＮＫ１−ＣＳＬに結合することが確認されたが（ＫＤ＝０．４μＭ）、ｂｉｏ−ｓｄｎＭＡＭＬ１やｂｉｏ−ＳＡＨＭ１ほど強くはなかった（ＫＤ＝０．１μＭ、図２ｄ、ｅ）。
【００７７】
ＮＴＣ  ＡＬＰＨＡスクリーニングアッセイの最適条件を決定するために、様々なＧＳＴ−ＲＡＭＡＮＫ１−ＣＳＬおよびｂｉｏ−ｓｄｎＭＡＭＬ１濃度の滴定マトリクスを試験した。これらの実験により、１０〜１００ｎＭの範囲の結合コンポーネントで最大約４５０００ｃ．ｐ．ｓ．の発光シグナルにおける用量依存的増加が明らかになった（図２ｆ）。重要なことに、より高濃度のタンパク質で特徴的な「フック効果（ｈｏｏｋ  ｅｆｆｅｃｔ）」が観察され、これはＧＳＴ標識タンパク質がＡＬＰＨＡスクリーニングビーズの結合能を上回って阻害性になるポイントを表す。最適条件下および最適結合パートナー濃度（全パートナーが４０ｎＭ）では、このアッセイは顕著に優れたシグナル対ノイズ比（約３０倍）をもたらすことが示され、全結合パートナーの存在に対して特異的であった（図２ｇ）。非標識Ａｃ−ｓｄｎＭＡＭＬ１ペプチドまたはＡｃＷ−ＳＡＨＭ１の、予備インキュベートされたｂｉｏ−ｓｄｎＭＡＭＬ１−ＧＳＴＲＡＭＡＮＫ１−ＣＳＬの複合体への滴定は、複合体の用量依存的解離およびシグナル減少をもたらした（図２ｈ）。総合すると、これらの結果は、ＮＴＣ阻害剤のスクリーニングに理想的に適切な、ＮＴＣアセンブリを調べるための確固たるハイスループットの生化学的アッセイの創出を支援する。
【００７８】
（ＳＡＨＭアナログＳＡＲ試験）
本発明者らのＭＤ計算の関連性を相関させるために、図１ｇに示す一連の点突然変異ＳＡＨＭアナログを合成し、競合的ＡＬＰＨＡスクリーニングによって特徴分析を行った（図３ａ）。一般的に、観察された阻害活性はＭＤ予測とよく一致した。Ｃ３０をＶａｌまたはＰｈｅで置換したペプチドは、ＳＡＨＭ１と比べて優れた複合体阻害を示し、一方、Ｃ３０Ｌ化合物の作用は弱かった（図３ｂ）。本発明者らのＣ３０Ｆ変異体（ＳＡＨＭ１−３）での計算およびＭＤスナップショットの視覚的検査と酷似したこれらの結果により、ＣＳＬのＦ３０とＭ３５６との間、Ｌ３８８とＮ３４９との間の安定な相互作用が明らかになった。更に、Ｆ３０はＡＮＫ１中に、ＣＳＬに向かって移動しＡ２００７との相互作用を生み出すループも取り込んでいた（図３ｃ）。Ｌ２９の周囲の溝はかなり大きく、かつ極性であり、ＭＤスナップショットの検査では、Ｌ２９ＩやＬ２９Ｆ変異については明らかな効果は判明しなかった。しかしながら、Ｌ２９ＦはＭＭＧＢＳＡスコアを向上させた。Ｌ２９のトリプトファンへの変異（ＳＡＨＭ１−６）は、ＡＮＫ１のＡ２００７およびＬ２００６の側鎖およびＮ２０４１の主鎖との疎水性相互作用を促進するようであった。ＣＳＬのＲ３８２もＷ２９に近づくように移動し、潜在的なカチオン−π相互作用を形成した（図３ｄ）。Ｌ２９Ｙ（ＳＡＨＭ１−１４）変異体も、ＣＳＬのＲ３８２とのこの相互作用に加え、ＡＮＫ１のＮ２０４１の側鎖アミドならびにＮ２０４０およびＶ２０３９の主鎖カルボニルとの水素結合を形成するようであった（図３ｅ）。モデリング結果では、Ｌ２９ＹおよびＬ２９Ｗ変異が結合を向上させることが示されていたが、Ｌ２９のみの変異は全体的にペプチド性能に強い影響を及ぼさなかった。したがって、これらの変異は後に組合せ変異アナログにおいて調査した。
【００７９】
Ｉ２７のロイシンへの変異（ＳＡＨＭ１−７）は、ＳＡＨＭ１に比べて高い阻害活性をもたらした。（図３ｂ）。反対に、Ｉ２７のメチオニン等量式（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）ノルロイシン（ＮＬ）またはフェニルアラニンへの変異は性能を有意には向上させなかった。一方、より大きいアミノ酸であるトリプトファンへの変異はＮＴＣ阻害にとって有害であった。これらのデータは基本的にはコンピュータによる計算と一致しているが、ＭＤスナップショットでは、Ｉ２７ＮＬ変異体がそのロイシン同位体よりも強力であると予測された（図１ｇ）。ＭＤスナップショットにより、ロイシン側鎖およびノルロイシン側鎖の両方が、Ｖ３５４、Ｍ３５６、Ｍ３８０およびＶ３９０に取り囲まれたＣＳＬ上の疎水性ポケットに、より効果的に嵌合し、ＭＭＧＢＳＡスコアを向上させることが判明した（図３ｆ）。ＭＭＧＢＳＡスコアおよび競合的ＡＬＰＨＡスクリーニング性能に対する最大の向上は、Ｌ２３の変異によって生じる。ＭＤシミュレーションにおいて、ＳＡＨＭ１へのＬ２３ＦまたはＬ２３Ｗの導入は、ＣＳＬの残基Ｎ３４９〜Ｍ３５６を含むフレキシブルループにおける立体構造変化を引き起こすことが分かった。このフレキシブル領域の翻訳は、変異ペプチドを含むＭＤスナップショットにおいてＬ２３Ｆ／ＷならびにＩ２７およびＲ２４への接触を改善した（図３ｇ）。同様に、この位置における増加した疎水性部分はＡＬＰＨＡスクリーニング競合（ＳＡＨＭ１−１１からＳＡＨＭ１−１３）において反復的減少をもたらし、ＳＡＨＭ１−１３がＳＡＨＭ１に対して最も強力な単一変異であった（図３ｂ）。
【００８０】
全体として、これらの結果は変異ＮＴＣ  ＭＤシミュレーションとＮＴＣ形成に対する生化学的性能との間の凡その一致を表し、したがって、本発明者らのステープルドペプチド−ＮＴＣ  ＭＤモデルをアナログインヒビターの設計のための方策として使用することの正当性を実証する。
【００８１】
ｄｎＭＡＭＬ１のＥ２１〜Ｔ３６領域に由来するアナログペプチドの設計に加え、ＢＦＥＤ計算（図２ｂ、ｃ）により、ＳＡＨＭ１スカフォールドのＣ末端延長がより強力かつ特異的なステープルドペプチドを生じ得ることが示された。具体的には、Ｙ４１への延長（ＳＡＨＭ１−２４）はｄｎＭＡＭＬ１のＣ３７、Ｅ３８、Ｒ４０およびＹ４１由来の相互作用を追加することが予測された（図３ｈ）。Ｌ４９への延長（ＳＡＨＭ１−７５）は、ＡＮＫ１ドメインをキャップするＥ４２、Ｖ４４、Ｅ４７およびＬ４９由来の潜在的な接触を更に追加するであろう（図３ｉ）。これらの延長スカフォールドペプチドは、好ましい点突然変異を同時に多数の位置に組み込むことによって、更に複数回のＳＡＨＭ１スカフォールドとの最適化に含められた。最初の組合せ変異体は、Ｉ２７変異およびＬ２９変異を、最も効果的な点突然変異であるＬ２３ＷおよびＣ３０Ｆのそれぞれと、および両方と併用した時の効果を決定することに注目した（図４ａ）。ＡＬＰＨＡスクリーニング競合実験により、Ｌ２３Ｗ／Ｉ２７Ｌ二重変異は、単一変異で観察された活性の利益を保持するが、この二重変異の有意な利益はないことが判明した（ＳＡＨＭ１−３１／ＳＡＨＭ１−３６と比較したＳＡＨＭ１−２１／ＳＡＨＭ１−２３）。その理由は、両方の残基がＣＳＬ上の同じ疎水性の溝を標的とし、この溝はより大きい組合せには恐らく耐えられないためだと考えられる。Ｌ２３Ｗ／Ｃ３０Ｆ変異の組合せは、Ｉ２７Ｌ変異およびＬ２９Ｙ変異の異なる組合せの存在下で、ペプチドの性能を向上させると考えられる（ＳＡＨＭ１−２１、ＳＡＨＭ１−３１およびＳＡＨＭ１−５６；図４ｄ）。
【００８２】
更に、Ｌ２３Ｗ／Ｌ２９Ｗ組合せ変異体は、それぞれ競合性を向上させ好ましいＭＭＧＢＳＡスコアを得ることが確認されており、Ｃ３０での小さい置換基（ただしＣ３０Ｆ変異以外）との組合せで低いＩＣ５０値を有するペプチドをもたらした（図４ａ）。この一般的なＳＡＲ傾向は、Ｌ２３Ｗ／Ｃ３０ＦおよびＬ２３Ｗ／Ｌ２９Ｗ二重変異を含むより強力なペプチドを伴う、より大きいＥ２１〜Ｙ４１ステープルドペプチドスカフォールドにおいても観察された（ＳＡＨＭ１−２５、ＳＡＨＭ１−２７、図４ｂ）。Ｅ２１〜Ｙ４１スカフォールド由来のペプチドは以前に報告されたものよりも大きいため、低下したヘリシティは低い標的親和性をもたらすかも知れない。ペプチド主鎖の下への多数のステープルの組み込みが活性を向上させるか否か決定するために、本発明者らは、αへリックスの２個の配列ターンに及ぶステープルを有する２個の「ステッチド」ペプチドを合成した（ＳＡＨＭ１−２９、ＳＡＨＭ１−３０、図８）。興味深いことに、どちらもその対応するステープルドペプチドほど活性は強くなかった（ＳＡＨＭ１−２４、図４ｂ）。最も大きいペプチドスカフォールド（Ｅ２１〜Ｌ４９）由来のアナログはＳＡＨＭ１およびＳＡＨＭ１−２４よりも強力であった（図４ｂ）。しかしながら、最も強力なＥ２１〜Ｌ４９ペプチドのコンピュータによるＭＤシミュレーションでは、ペプチドの大部分については安定な結合であったが、プロリンに誘発されたキンク後のＣ末端伸長ではかなり無秩序であった（図４ｅ）。
【００８３】
本発明者らのＮＴＣ  ＭＤモデルにより可能となった予測される構造に基づく設計の利益を得る努力において、本発明者らは、非天然アミノ酸の組み込みがステープルドペプチドの性能も向上させるか否かを決定することに興味を持った。前述した点突然変異コンピュータスクリーニングと同様の手法において、本発明者らは市販の非天然アミノ酸のライブラリーを本発明者らのＭＤシミュレーションにインポートした。非天然アミノ酸は、ＭＤで決定された最適化（Ｌ２３、Ｃ３０、Ｃ３７およびＹ４１を含む）のためにＥ２１〜Ｙ４１スカフォールドの有望な部位内で置換された。結果として生じる変異体を、各結合部位−アミノ酸の対にドッキングし、ＭＭＧＢＳＡ自由エネルギー値およびＭＤスナップショットを得た。ＭＭＧＢＳＡスコアおよびドッキング構造の比較により、これらの非天然アミノ酸を少数含むペプチドが結合を改善することが示唆され、結果として生じるペプチドが合成された（図４ａ、ｃ；図８）。この努力から、いくつかの非天然アミノ酸が比較的ペプチド性能を保持すると同時に、タンパク質を構成しない側鎖を取り込むことが分かった（図４ｃ）。注目すべき例は、Ｃ３７のＤ−ペンタフルオロフェニルアラニンへの変異およびＹ４１の１−ナフチルアラニンへの変異である（図４ｃ、ｆ）。対照的に、ＭＤスクリーニングにおけるいくつかのヒットは、Ｌ２３のニコチニルリシンアミノ酸での置換（ＳＡＨＭ１−５３、図４ａ）のような有意に減少した活性を持つペプチドを得た。これらの結果は、ＭＤシミュレーションがステープルドペプチドアナログに適切なタンパク質非構成残基を決定可能であるが、一方でいくつかの予測された立体構成は利用できず、有害な相互作用をもたらす場合があることを示唆する。しかしながら、一般に、これらのＳＡＲ試験は本発明者らの最初のＭＤシミュレーションの結果とよく合致し、主としてＬ２３およびＣ３０を、確立された（Ｅ２１〜Ｔ３６）および新規な（Ｅ２１〜Ｙ４１）ステープルドペプチドスカフォールドの両方において、最適化の最も有望な部位であると決定した。Ｉ２７との接触を形成するＣＳＬの比較的固い疎水性の溝のＭＤスナップショットは改善の可能性を明らかにしたが、Ｉ２７と有効なＬ２３Ｗ変異とを組み合わせた変異はかなりの追加の利益を示した。反対に、Ｌ２９によって標的化されるＡＮＫ１の比較的極性かつ平坦な表面は、多数の組合せ変異アナログにおけるチロシンまたはトリプトファンへの変異を介した改善の部位であった。Ｙ４１およびＬ４９に延長されたステープルドペプチドスカフォールドへの好ましい変異の包含は、性能の増大をもたらすことも分かった。
【００８４】
（ステープルドペプチドアナログの細胞ベースの活性）
これらのＳＡＲ試験により、３個のＭＡＭＬ１スカフォールドに基づくアナログステープルドペプチドが、野生型配列のみに基づくペプチドよりもＮＴＣ形成をより強く阻害可能であることが立証された。観察された活性の獲得にも関わらず、これらの改善は必ずしも向上した機能的有効性の指標とはならない。標的の嵌合に加え、ステープルドペプチドの細胞性活性を左右する主な要因は細胞内アクセス、細胞内分布および化学的安定性である。本明細書に記載のアナログが細胞内でＮＯＴＣＨ１−ＣＳＬトランス活性化を拮抗可能か否かを決定するために、構造的に活性化したＮＯＴＣＨ１によって決定される確立されたレポーター−遺伝子アッセイにおいてすべてのアナログを試験した３７、４６。Ｕ２ＯＳ細胞をＣＳＬ調節ホタルルシフェラーゼ構築物、対照のウミシイタケルシフェラーゼ構築物および短縮ΔＥＧＦΔＬＮＲ−ＮＯＴＣＨ１対立遺伝子で共トランスフェクションした後、アナログ化合物またはビヒクルで処理した。ＡＬＰＨＡスクリーニングアッセイにおけるステープルドペプチドのＩＣ５０値の比較およびＮＯＴＣＨ１駆動性レポーター遺伝子シグナルの標準化阻害の比較により、アナログのライブラリーについて、生化学的活性と細胞ベースの活性との間の強い相関関係が明らかになった（図５ａ、図９）。この分析により、Ｅ２１〜Ｔ３６およびＥ２１〜Ｙ４１の両方のスカフォールドからのより強力なアナログは、ほぼ完全にレポーターを抑制可能であることが示された（図５ｂ）。興味深いことに、より短いスカフォールドからの最適化アナログ（ＳＡＨＭ１−３１、ＳＡＨＭ１−５６）での用量依存的試験は、ＡｃＷ−ＳＡＨＭ１と比較して僅かに低いＥＣ５０値が明らかになったのみである。より長いＥ２１〜Ｙ４１スカフォールドに基づくアナログ（ＳＡＨＭ１−２５、ＳＡＨＭ１−６２）は、それぞれ約１０μＭおよび５μＭの有意に低いＥＣ５０値を示した。注目すべきは、最も長いスカフォールドクラス（Ｅ２１〜Ｌ４９）からのペプチドがＳＡＨＭ１−２５およびＳＡＨＭ１−６２に類似したＡＬＰＨＡスクリーニングＩＣ５０値を示したのに対し、これらはＮＯＴＣＨ１／ＣＳＬレポーターシグナルの中程度の抑制しかもたらさなかったことである（図５ａ）。
【００８５】
多くの試験により、γセクレターゼ阻害剤、モノクローナル抗体およびステープルドペプチドを用いたＮｏｔｃｈ経路の抑制が、活性化ＮＯＴＣＨ１変異を抱える多くのヒトＴ−ＡＬＬ細胞株で増殖抑制およびアポトーシスを引き起こすことが実証されている４６、５２３２、３７。これと一致して、本発明者らは、２つの確立されたＮＯＴＣＨ１依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株ＳＵＰＴ１およびＨＰＢ−ＡＬＬの最適化ＳＡＨＭアナログでの処理が、３日後に有意に低下した細胞生存率をもたらすことを発見した（図５ｃ）。ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞およびＳＵＰＴ１細胞とは対照的に、ジャーカットＴ−ＡＬＬ細胞は、代替シグナル伝達経路への増加した信頼性に起因してＮｏｔｃｈ阻害剤への感受性の低下を示した５３〜５５、３７。ジャーカット細胞のアナログＳＡＨＭペプチドのパネルでの処理は、３日後の細胞増殖に穏やかな効果を与えた（図５ｃ）。加えて、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞の用量依存的処理は、アナログペプチドのレポーターアッセイで観察されたのと同様の有効濃度で増殖を阻害した（図５ｄ）。まとめると、これらの結果により、Ｅ２１〜Ｔ３６およびＥ２１〜Ｙ４１スカフォールドクラスからの最適化ＳＡＨＭペプチドはＮＯＴＣＨ／ＣＳＬ駆動性転写およびＮＯＴＣＨ１依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株の細胞増殖を阻害することが確認された。これらは更に、Ｅ２１〜Ｙ４１スカフォールドからの最適化ペプチドが、確立されたＥ２１〜Ｔ３６スカフォールドおよび新規なＥ２１〜Ｌ４９スカフォールドからのペプチドよりも強力であることを示す。
【００８６】
転写因子は、多くの疾患において最も注目される立証された標的のいくつかを代表する。それにもかかわらず、このタンパク質クラスの合成モジュレーターの発見は、従来の創薬努力にとって困難な課題を維持している。タンパク質治療剤の認識性能を小分子の合成アクセシビリティとともに組み込むことによって、炭化水素ステープルドペプチドは、治療上の潜在性に関する多くの細胞内タンパク質−タンパク質相互作用を標的化する性能を実証した。今日までの新規なステープルドペプチドの設計および特徴を詳述した報告は、主に、構造的安定化の程度が最も高いペプチドの同定および細胞透過性に着目したものである４１〜４３、３７。すべての場合において、これらの２つの特性は細胞内および生体内で最も活性の高いステープルドペプチドと関連していた。更に、これらの研究は主に、結合相互作用を変化させたり最適化するような試みをせずに天然ペプチド配列を安定化することに着目していた。これは、高親和性短ペプチドがこれらの標的の大部分に関して以前に説明されていたことに起因していると思われる。本研究では、ＮＴＣのアセンブリに関与するタンパク質−タンパク質接触を定量的に説明するために、分子モデリングおよび構造に基づく設計を使用し、これらの知見を、ＮＯＴＣＨ複合体の一層強力なステープルドペプチド阻害剤を設計するために使用することを試みた。タンパク質−タンパク質結合立体構造および相互作用親和性の予測は、これまで常に困難な課題であった。その理由は、結合表面の大部分が比較的大きく平坦かつフレキシブルであるためである。これらの特性は、遥かに大きい立体構造空間の調査および多くの弱い相互作用が寄与する結合親和性の予測を必要とするため、スコアリング関数の適用は困難である。本願では、ｄｎＭＡＭＬ１、ＡＮＫ１およびＣＳＬの各残基が複合体形成および安定性に寄与する程度を算定するため、ヒトＸ線構造に基づくＮＴＣの分子ダイナミクスシミュレーションおよび結合自由エネルギー分解を採用した。得られたモデルは、ｄｎＭＡＭＬ１接触残基が大きいヘリックス接触面全体に分布しているものの、複合体形成に強く寄与する接触の大多数はＮ末端ヘリックスにあることを示した。これらの計算は変異の研究４５および本発明者らの報告したステープルドペプチドスクリーニング３７と合致し、この領域に由来する安定化ペプチドが最も高いリガンド効率を有し得ることを示唆する。本発明者らはその後、表面プラズモン共鳴を用いて合成ｄｎＭＡＭＬ１ペプチド（ｓ−ｄｎＭＡＭＬ１）の予め形成したＲＡＭＡＮＫ１−ＣＳＬ複合体への結合親和性を測定した。本発明者らは、ｓ−ｄｎＭＡＭＬ１（ヒトＸ線構造において明白な接触残基をすべて含む）が高い親和性（ＫＤ＝０．０４μＭ）で複合体に結合すること、およびＮ末端ヘリックスの短縮化（ｓｎｔ−ｄｎＭＡＭＬ１）が単独で親和性を約１０倍低下させることを発見した。これらの結果は、以前に提案された「クランプ様の（ｃｌａｍｐ−ｌｉｋｅ）」モデル５６を介した高親和性複合体結合への両方のヘリックスの寄与を裏付けるが、Ｎ末端ヘリックス単独では強固な特異的結合を保持する。全体では、これらの結果はｄｎＭＡＭＬ１ポリペプチドのＮＯＴＣＨ−ＣＳＬ���合体への結合親和性を最初に報告するものであり、ＮＴＣ複合体形成の定量的モデルを提供する。本明細書に提示したように、構造に基づくリガンド最適化のためにこのモデルを適用することに加え、本発明者らは、これが、ＭＡＭＬ１−３およびＮＯＴＣＨ１−４におけるアイソフォーム特異的残基の定量的解析を通して、アイソフォーム特異的ＮＴＣの選択的形成への知見を提供可能であると仮定した。更に、これらのモデルは、小分子ドッキングのような将来のコンピュータによるリガンド発見努力に適用可能であろう。
【００８７】
ＮＴＣのＭＤモデルを用いて、本発明者らは、ＳＡＨＭ１において、変異させると結合親和性が高まる可能性のあるいくつかの疎水性残基を同定した。これらの位置における変異の相対的効果を算定するために、本発明者らは、非修飾天然ペプチド配列（ＭＡＭＬ１［２１〜３６］）、既知のステープルドペプチド（ＳＡＨＭ１）、変異を含むステープルドペプチドスカフォールド、およびＭＡＭＬ１に由来する新規なステープルドペプチドスカフォールドを比較するために採用することのできるステープルドペプチドＭＤシミュレーションモデルを開発した。ステープルドペプチドＳＡＨＭ１およびその対応する非修飾ペプチドのシミュレーションにより、２０ｎｓ間に亘ってペプチドにステープルされた中心となる炭化水素の有意な安定化効果が判明した。これは、以前の円偏光二色性実験と合致している。その後、疎水性点突然変異、ならびにＭＡＭＬ１のＥ２１〜Ｙ４１およびＥ２１〜Ｌ４９に由来する延長ＳＡＨＭスカフォールドを含む一連のＳＡＨＭ１誘導体の相対的ＢＦＥＤスコアを算出するために、このモデルを適用した。このコンピュータによるスクリーニングの結果は、残基Ｌ２３およびＣ３０の変異（両方ともＣＳＬ上の疎水性表面を標的とする）が結合を向上させ得るという見解を支持した。更に、ＭＤシミュレーションにより、Ｅ２１〜Ｙ４１に由来するステープルドペプチドが、主にＹ４１の追加を介してＮＴＣ結合を向上させ得ることを示した。
【００８８】
本発明者らのＭＤモデルの予測が、活性の向上した化合物を生じるか否かを決定するために、合成ビオチン化ｄｎＭＡＭＬ１ペプチドとＧＳＴタグ付きＲＡＭＡＮＫ１−ＣＳＬタンパク質複合体との会合を測定する小型化ハイスループットＡＬＰＨＡスクリーニング競合アッセイを開発した。このアッセイは、すべての複合体メンバーの存在に特異的であることが判明し、優れたシグナル対ノイズ比を示し、更に非標識ｄｎＭＡＭＬ１またはＳＡＨＭ１ペプチドによる競合への感度が高かった。そのため、ＮＴＣ拮抗作用のためにＳＡＨＭアナログを定量的に特徴分析するために、このアッセイを採用した。この具体的な適用の域を超えて、このアッセイはＮＯＴＣＨ複合体形成を測定するための新規な形式を表し、小分子や他の化学物質群のハイスループットスクリーニングに適切であるはずである。
【００８９】
概して、本発明者らの競合的ＡＬＰＨＡスクリーニングアッセイ特徴分析の結果は本発明者らのＭＤシミュレーションと合致した。Ｌ２３Ｗ、Ｃ３０Ｆ、Ｉ２７ＬおよびＬ２９Ｗ点突然変異を含むアナログは、これらのそれぞれの位置において、ＮＴＣ形成の最も大きい阻害を示した。これらの変異を、ＳＡＨＭ１およびＥ２１〜Ｙ４１スカフォールド内の関連する組合せに後に取り込ませると、ＩＣ５０値がおよそ３〜７倍向上したペプチドが得られた。両方のスカフォールドにおいて、Ｌ２３Ｗ／Ｃ３０Ｆ、Ｌ２３Ｗ／Ｌ２９Ｗ、およびＬ２３Ｗ／Ｃ３０Ｆ／Ｌ２９Ｙの変異の組合せは一貫したＡＬＰＨＡスクリーニングＩＣ５０の向上をもたらした。最も大きいＥ２１〜Ｌ４９スカフォールドに由来するペプチドも、ＳＡＨＭ１およびＳＡＨＭ１−２４に対して向上した生化学的活性を示すことが分かった。最後に、本発明者らのＭＤモデルにおけるステープルドペプチドアナログの柔軟な設計の利点を活用して、本発明者らは、非天然アミノ酸の多数の位置への組み込みが活性を保持または向上させるか否かを決定することを試みた。市販のライブラリーをスクリーニングすることによって、タンパク質を構成しない有望な変異を少数同定し、対応するアナログペプチドを合成した。注目すべきことに、これらの残基のいくつかは活性を保持したのに対し、他の残基では活性が有意に減少した。これらの結果により、本発明者らのモデルがいくつかの場合では有効な相互作用を同定可能であるが、他の場合では提案される結合立体構造は利用できないかも知れないということを示した。非天然残基に関する本発明者らの調査は比較的小さい市販のライブラリーに限られていた。恐らく、幅広い化学的多様性のライブラリーのサンプリングを将来行うことで、より有効な相互作用が得られるであろう。
【００９０】
文献で報告されたステープルドペプチドの細胞ベースの活性は、結合親和性のみにではなく、ヘリックスの安定化の程度および細胞透過性に強く関連していることが判明した。この現象は、ステープルドペプチドが能動的なエンドサイトーシス機構を介して細胞に入り込むという観察結果に起因し、受動拡散により細胞に入り込む大部分の小分子とは対照的である。この点を考慮し、本明細書の研究の大きな目標は、ＳＡＨＭペプチドの生化学的性能が最適化可能か否かを決定すること、そして、細胞ベースの活性が影響を受ける程度を決定することであった。すべてのアナログペプチドを、確立されたＮＯＴＣＨ１レポーター遺伝子アッセイを用いてＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害に関してスクリーニングした。結果として得られた標準化レポーター阻害を各ペプチドのＡＬＰＨＡスクリーニングＩＣ５０と比較すると、ライブラリーについて、生化学的活性と細胞ベースの活性との間に正の相関がみられた。
【００９１】
４個の代表的なアナログペプチドを用いた用量依存的研究では、すべてのペプチドでＳＡＨＭ１に対して細胞ベースの活性が増加したが、ＩＣ５０の改善の度合いはＡＬＰＨＡスクリーニングアッセイの時よりも穏やかであった。最も有望なペプチドであるＳＡＨＭ１−２５およびＳＡＨＭ１−６２の２つは、それぞれ、ＳＡＨＭ１よりも約２倍および４倍低いＩＣ５０値を示した。Ｅ２１〜Ｔ３６スカフォールドからのこの２つのアナログは、１．５〜２倍の改善を示した。更に、アナログペプチドは、レポーター遺伝子アッセイの時と同じ有効濃度で、ＮＯＴＣＨ１依存性Ｔ−ＡＬＬ細胞株に対し抗増殖作用を持つことが分かった。総合すると、これらの結果は、本研究で開発されたいくつかのステープルドペプチドアナログはＮｏｔｃｈシグナル伝達のより強力な阻害剤であるという見解を支持する。更に、本発明者らの研究によれば、改善された生化学的性能は細胞ベースの活性の上昇に寄与する可能性があり、一方で、ステープルドペプチドの能動的細胞取り込みの現象はＮＴＣのステープルドペプチド阻害剤に関するこれらの改善に制限を課す可能性があることが示唆される。
【００９２】
実験手順
（ステープルドペプチド分子モデリング）
ヒトＮＯＴＣＨ複合体３９（ＰＤＢｉｄ：２Ｆ８Ｘ）におけるＥ２１〜Ｔ３６ｄｎＭＡＭＬ１に基づくステープルドペプチドＳＡＨＭ１の最初の構造を、Ｅ２８およびＲ３２を結合α，α−二置換「Ｓ５」アミノ酸に変異させることにより得た。「Ｓ５」非天然アミノ酸の立体構造の調査は、ＳＡＨＭ１の最も低いエネルギーの立体構造を作り出すためのＭａｃｒｏｍｏｄｅｌで行い、続いてこれをエネルギー最小化、平衡化および２０ｎｓ分子ダイナミクスシミュレーションのための出発座標として使用した。部分的電荷計算のパラメータ、非天然アミノ酸のための力場およびＭＤシミュレーション設定は下記のとおりである。
【００９３】
（ＮＯＴＣＨ複合体モデリング）
ＨＥＳ１プロモーター配列を含有するオリゴに結合したｄｎＭＡＭＬ１−ＡＮＫ１−ＣＳＬのＸ線結晶構造（ＰＤＢｉｄ：２ｆ８ｘ、３．２５Å）をＮＴＣ  ＭＤシミュレーションのための出発座標として使用した。最初の構造はＭａｅｓｔｒｏ（登録商標）８．５のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｐａｎｅｌで処理した。ＤＮＡおよび溶媒分子を構造から除去した。プロトン化状態をＨｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ残基に割り当て、手動で調査した。その後、構造をＡｍｂｅｒ１０のａｎｔｅｃｈａｍｂｅｒ  ｓｕｉｔｅ内で調製した。ＬＥａＰモジュールにおいて、Ａｍｂｅｒ１０内のｆｆ０３力場を用いてこの系をシミュレートした。Ｎａ＋を添加して系を中和し、続いてこれを、複合体から１０Å延長しているＴＩＰ３Ｐ水ボックス内に溶媒和させた。最終的な系は約７００アミノ酸残基を含んでいた。Ａｍｂｅｒ１０のＳＡＮＤＥＲ．ＭＰＩモジュールを用いて、タンパク質最小化、平衡化および分子ダイナミクスシミュレーションを実施した。温度を３００Ｋに制御するためにランジュバン（Ｌａｎｇｅｖｉｎ）ダイナミクスを適用しながら、長期の相互作用を処理するためにＰａｒｔｉｃｌｅ−Ｍｅｓｈ−Ｅｗａｌｄ（ＰＭＥ）総和を採用した。ＳＨＡＫＥアルゴリズムを用いて、２ｆｓの積分時間ステップを許容した。３５ｎｓＭＤシミュレーションを実施して、ｄｎＭＡＭＬ１とＡＮＫ１−ＣＳＬとの間の柔軟な相互作用を調査した。ＮＴＣのスナップショットを、ＭＤシミュレーション軌跡の最後の３０ｎｓから毎１０ｐｓで抽出した。
【００９４】
（ＭＤシミュレーションのための非天然アミノ酸のコンピュータ設計）
非標準残基については、ＭＤシミュレーションの力場パラメータに加え、電荷を算出する必要がある。この非標準残基はペプチドの中心的な残基であるため、本発明者らはＡＣＥおよびＮＭＥキャップをそれに追加した（ＣＨ３ＣＯ−（ＮＨ−Ｘ−ＣＯ）−ＮＨＣＨ３）。幾何学的最適化の後、ＨＦ／６−３１Ｇ＊における単一点電荷算出をＧａｕｓｓｉａｎ（登録商標）０３において適用した。ａｎｔｅｃｈａｍｂｅｒ  ｓｕｉｔｅのＲＥＳＰプログラムを用いて、キャップの総電荷をゼロに規制することにより電荷を原子に適合させた。Ａｍｂｅｒ１０のＬＥａＰモジュールを用いて構造を調製した。非天然残基を他の残基に結合させ、角度や二面角のような欠失しているパラメータを、ｐａｒｍ９９からの存在するパラメータを用いて注意深く割り当てた。これは非常に類似した環境における原子を表現する。ｆｆ０３を標準残基の力場として用いた。非天然残基を含む複合体は、ＮＴＣシミュレーションに関して説明した手順と同様に、その後Ｎａ＋を用いて中和し、ＴＩＰ３Ｐ水内で溶媒和させた。
【００９５】
（ｄｎＭＡＭＬ１  ＢＦＥＤ計算）
結合自由エネルギー分解（ＢＦＥＤ）計算は、ｄｎＭＡＭＬ１の収束５〜３５ｎｓ  ＭＤシミュレーションから１０ｐｓ毎に抽出したスナップショットの集合の平均ＭＭＧＢＳＡスコアに基づく。ＢＦＥＤ計算は、Ａｍｂｅｒ１０のＭＭＧＢＳＡを用いて実施した。分子力学法（ＭＭ）を適用して、ｄｎＭＡＭＬ１とＡＮＫ１−ＣＳＬとの間の気相相互作用エネルギーを算出した。溶媒和エネルギーの静電成分を、Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｂｏｒｎ（ＧＢ）法を用いて算出し、一方、非極性溶媒和エネルギーは溶媒露出面積（ＳＡＳＡ）から推定した。本発明者らの計算には、エントロピー項は含めなかった。エントロピー項はペプチドアナログを比較するのに正確でも必要でもないため、類似の単純化手法が他の研究者によって用いられている。ＢＦＥＤは、２つのコンポーネント（ｄｎＭＡＭＬまたはＣＳＬ／ＡＮＫ）からの各残基の、総結合自由エネルギーへの寄与を評価する。そのため、対相互作用エネルギー（例えば静電相互作用）の半分は、２個の残基にそれぞれ属する２個の相互作用する原子の各々に配分される。各残基の結合自由エネルギーへの非極性の寄与は、自由分子および複合体における各残基の露出表面の差に比例する。
【００９６】
（ＳＡＨＭアナログ結合計算）
ＳＡＨＭアナログ複合体のＭＤシミュレーションのための出発構造は、ＮＯＴＣＨ複合体Ｘ線構造（ＰＤＢｉｄ：２Ｆ８Ｘ）に基づいて、ｄｎＭＡＭＬの個々の残基を変異させることにより得た。複合体における変異ペプチドの最も低エネルギーの立体構造の検索方法、部分的電荷の計算方法、ならびにエネルギー最小化、平衡化およびＭＤシミュレーションの設定方法は上述したものと非常に近い。１８ｎｓＭＤシミュレーションを各ＳＡＨＭアナログ複合体に適用した。ＭＭＧＢＳＡ結合自由エネルギー計算を、収束ＭＤ軌跡に基づいて実施した。ＭＤ軌跡は、複合体の動的挙動を理解するため、また、変異がどのように結合親和性に影響するのかを説明するためにも分析した。
【００９７】
（タンパク質発現および精製）
Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ（残基９〜４３５）を有するヒトＣＳＬ、ＲＡＭＡＮＫ１（残基１７６１〜２１２７）およびＧＳＴ標識ＲＡＭＡＮＫ１をＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で発現させ、以前に説明されたように精製した３７。
【００９８】
（ペプチド合成および精製）
ステープルペプチドは、Ｔｅｔｒａｓマルチチャネル自動ペプチド合成装置（Ｔｈｕｒａｍｅｄ）で、標準Ｆｍｏｃベース固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ；ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）法により合成した。オレフィン含有「Ｓ５」および「Ｂ５」アミノ酸および非天然アミノ酸はＡｎａｓｐｅｃ  Ｉｎｃ．社から購入した。合成後、ジクロロエタン中のグラブスＩ触媒（ベンジリデン−ビス（トリシクロヘキシルホスフィン）ジクロロルテニウム）を用いて、窒素下で閉環メタセシスを行った。その後、すべてのステープルドペプチドをβアラニンスペーサおよびＮ−アセチルトリプトファンでキャップして、ペプチドを２８０ｎｍの吸光によって定量できるようにした。トリプトファンおよびチロシンには、それぞれ５５００Ｍ−１ｃｍ−１および１４９０Ｍ−１ｃｍ−１の理論吸光係数を使用した。注目すべきことに、以前に報告されたＮ末端ＦＩＴＣラベルを含有するペプチドは、ＡＬＰＨＡスクリーニングアッセイでスペクトル干渉があったために、これらの調査には適切でなかった。合成後、ステープルドペプチドを樹脂から切断し、Ｃ１８カラムでの逆相ＨＰＬＣにより精製し、定量し、凍結乾燥し、ＤＭＳＯ（５〜１０ｍＭ）に再懸濁して−２０℃で保存した。化合物一致度および純度を液相クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）によって評価した。
【００９９】
合成ｄｎＭＡＭＬ１ポリペプチドを、低ローディングＮｏｖａＰＥＧ樹脂（ＥＭＤ）を用いて、ＣＥＭ  Ｌｉｂｅｒｔｙ  Ｍｉｃｒｏｗａｖｅペプチド合成装置でのＳＰＰＳによって合成した。β分岐アミノ酸、疎水性残基の伸長部およびアルギニンには、延長した結合時間または二重結合を用いた。５０℃で結合するヒスチジンおよびシステインのラセミ化の抑制を期待して、すべての結合は７０℃で行った。ビオチン化ペプチド（ビオ−ｓ−ｄｎＭＡＭＬ１およびｂｉｏ−ｓｎｔ−ｄｎＭＡＭＬ１）をβアラニンスペーサ、２０原子ジエチレングリコール（ＥＭＤ）スペーサおよびビオチンでキャップした。非標識競合ペプチド（Ａｃ−ｓ−ｄｎＭＡＭＬ１）はアセチル化βアラニンスペーサでキャップした。すべてのペプチドを、ステープルペプチドの時と同じように切断、精製および定量した。
【０１００】
（ＡＬＰＨＡスクリーニング競合アッセイ）
簡単に説明すると、ＡＬＰＨＡスクリーニングアッセイは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ３８４ウェル光学プレートを用いて行い、測定はＡＬＰＨＡスクリーニング性能を有するＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ３８４ウェル光学プレートリーダーで行った。精製ＧＳＴ−ＲＡＭＡＮＫ１およびＣＳＬを結合バッファー（２０ｍＭ  トリス  ｐＨ８．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．０５％透析ＢＳＡ）中に透析し、各実験用に別々に保管した。簡単に説明すると、結合バッファー中の（望ましい最大濃度の）４Ｘステープルドペプチド原料１５μＬを、最上段以外のウェルにはすべて１０μＬの結合バッファーを入れてあるプレートの最上段に添加した。すべてのウェルに１０μＬを残すことで段階的に３倍希釈した。注目すべきことに、予備実験では中間ナノモラー濃度でフルオロフォアがＡＬＰＨＡスクリーニングシグナルに干渉することが示されたため、非蛍光性ペプチドのみをこれらのアッセイに用いた。ＣＳＬ（８０ｎＭ）、ＧＳＴ−ＲＡＭＡＮＫ１（８０ｎＭ）およびＢｉｏ−ｓｄｎＭＡＭＬ１（８０ｎＭ）の２Ｘ原料を、結合バッファーを溶媒として作成し、直ちに希釈ペプチド原料を含むウェルに添加した。この３０μＬ溶液を室温に３０分間置くことでインキュベートした。これとは別に、抗ＧＳＴアクセプタービーズ（１６０μｇ／ｍＬ、最終濃度２０μｇ／ｍＬ）の８Ｘ原料を、暗室で結合バッファー中に再懸濁した。５μＬのアクセプタービーズ溶液をウェルに添加し、プレートを１分間５００ｒｐｍで遠心分離し、更に３０分間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジンドナービーズの８Ｘ原料（１６０μｇ／ｍＬ、最終濃度２０μｇ／ｍＬ）を暗室で結合バッファーを溶媒として作成し、５μＬのドナービーズ溶液をバッファーに直接加え（遠心分離なし）、４０μＬの混合液を、暗室で更に３０分間室温でインキュベートした。プレートを標準ＡＬＰＨＡスクリーニング設定を用いて読み取り、データをＰｒｉｚｍ５ソフトウェアを用いて、非線形回帰分析およびデータを３パラメータＳ字曲線への適合を適用することにより処理した。
【０１０１】
（表面プラズモン共鳴）
Ｂｉａｃｏｒｅ３０００ＳＰＲ装置（Ｂｉａｃｏｒｅ−ＧＥ、スウェーデン国ウプサラ）を用いて、ＲＡＭＡＮＫ１およびＣＳＬの可溶性複合体へのＢｉｏ−ｓｄｎＭＡＭＬ１ペプチド、Ｂｉｏ−ｓｎｔＭＡＭＬ１ペプチドおよびＢｉｏ−ＳＡＨＭ１ペプチドの結合を測定した。ペプチドはｂｉａｃｏｒｅ結合バッファー（２０ｍＭ  トリス  ｐＨ８．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．０５％  Ｐ−２０）に溶解し、ストレプトアビジン−ＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅチップの個別フローセル上に、１０μＬ／分で１０分間注入することにより固定化した。ＲＡＭＡＮＫ１およびＣＳＬの等モル希釈物（１μＭから０．０３１２５μＭまでの２倍希釈、ブランク２つを含む）をｂｉａｃｏｒｅ結合バッファー中に混合し、ＮＴＣ会合キネティクスを測定するために、ペプチド官能化表面上に１２０〜１８０秒間注入した。その後、ＮＴＣ流を止め、ペプチド解離キネティクスを測定するためにバッファーを注入した。適切な解離時間の経過後（概ね６分以上）、高塩濃度再生バッファーを（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  トリス  ｐＨ８．４、１ｍＭ  ＤＴＴおよび０．０５％  Ｐ−２０）用いてチップ表面を再生することにより全結合複合体を除去し、実験のキャリーオーバーを防止した。結合データは参照細胞で標準化し、ＣｌａｍｐＸＰソフトウェアを用いて処理した：（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｒｅｓ．ｕｔａｈ．ｅｄｕ／ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ／ｃｌａｍｐ．ｈｔｍｌ）。処理したデータセットに２サイト結合モデルを適用して、ペプチド−ＮＴＣ相互作用の動態パラメータを決定した。
【０１０２】
（ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ）
Ｕ２ＯＳ細胞を、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭを含有する白色９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種し、一晩順化させた。空のｐｃＤＮＡ３またはΔＥＧＦΔＬＮＲ−ＮＯＴＣＨ１プラスミド（５ｎｇ／ウェル）を、ＣＳＬ調節ホタルルシフェラーゼレポーター構築物および構成的に活性なウミシイタケルシフェラーゼ（ｐＲＬＴＫ）対照プラスミド（１０：１のウミシイタケ：ホタルプラスミド比率）で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて一過性に共トランスフェクションした。４６、３７。トランスフェクション後約２４時間の細胞を、１０％ＦＢＳを補足した新鮮なＤＭＥＭ中で、ＤＭＳＯビヒクル対照、または所与の濃度のステープルドペプチドで処理し、１８〜２４時間インキュベートした。その後、ルシフェラーゼ活性を二重ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて測定し、ＮＯＴＣＨ依存性拮抗作用を、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼシグナルの標準化により測定した。
【０１０３】
（細胞増殖およびアポトーシスアッセイ）
５×１０４個の細胞を、白色９６ウェルＣｏｒｎｉｎｇプレートにおいて、総量１２５μＬのＲＰＭＩ−１６４０培地（１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％ＦＢＳおよび指定濃度のＤＭＳＯまたはＳＡＨＭアナログペプチドを含む）中に播種した。３日後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて細胞のＡＴＰ含量を測定することにより、細胞生存率を決定した。
【０１０４】
アナログステープルドペプチドに使用された非天然アミノ酸の構造、名称、略称および導入部位は下記のとおりである。
【０１０５】
【表２】
2014520120.tif 000020
（ポリペプチド）
いくつかの例において、本明細書に記載の炭化水素架橋は更に操作されてもよい。一例において、炭化水素アルケニル架橋の二重結合（例えば、ルテニウム触媒閉環メタセシス（ＲＣＭ）を用いて合成されたもの）を（例えばエポキシ化やジヒドロキシ化により）酸化して下記の化合物のうちの一方を提供してもよい。
【０１０６】
【化１７】
2014520120.tif 000021
エポキシド部分または複数の自由ヒドロキシ部分のうちの１つのいずれか一方は、更に官能化されてもよい。例えば、エポキシドは求核試薬で処理されてもよく、これは例えばタグ（ラジオアイソトープや蛍光タグ等）の結合に使用可能な更なる官能性を提供する。タグは、化合物を体内の所望の位置に向かわせたり、体内の化合物の位置をたどるのを支援するために使用することができる。あるいは、追加の治療剤（例えば、ラパマイシン、ビンブラスチン、タキソール（登録商標）等の抗癌剤）を官能化した架橋に化学的に結合させてもよい。そのような誘導体化は代替として、ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端の合成操作により、またはアミノ酸側鎖を介して達成されてもよい。他の薬剤、例えば、ポリペプチドの細胞への進入を容易にする薬剤が官能化した架橋に結合可能である。
【０１０７】
炭化水素架橋を説明したが、他の架橋も想定される。例えば、架橋は１個以上のエーテル、チオエーテル、エステル、アミン、１，４−トリアゾール、１，５−トリアゾール、ヒドラゾンまたはアミド部分を含んでいてもよい。いくつかの例において、天然アミノ酸側鎖が架橋に包含されてもよい。例えば、セリン中のヒドロキシル、システイン中のチオール、リシン中の第１級アミン、アスパラギン酸またはグルタミン酸中の酸、あるいはアスパラギンまたはグルタミン中のアミドのような官能基に架橋を結合してもよく、いずれも内部架橋部分を含んでいてもよいし含んでいなくてもよい（例えば、一対のシステインを伴うビス求電子剤含有アルカンのように）。したがって、２個の非天然アミノ酸を結合させて作った架橋を用いるのではなく、天然アミノ酸を用いて架橋を形成することが可能である。また、単一の非天然アミノ酸を天然アミノ酸と共に使用することも可能である。
【０１０８】
更に、架橋の長さを変えられることも想定される。例えば、長さの短い架橋は、αヘリックス二次構造に比較的高度の制約を課すのが望ましい場合に使用することができる。一方、場合によってはαヘリックス二次構造に少ない制約を課すことが望まれ、その場合には長い架橋が望まれ得る。
【０１０９】
更に、主にαヘリックスの単一面上の架橋を提供するために、アミノ酸ｉからｉ＋３、ｉからｉ＋４、およびｉからｉ＋７に及ぶ架橋の例を説明したが、アミノ酸の任意の個数の組合せに及ぶ架橋を合成することができる。
【０１１０】
いくつかの例において、α−二置換アミノ酸は、αヘリックス二次構造の安定性を向上させるために、ポリペプチドにおいて用いられる。しかしながら、α−二置換アミノ酸は必須ではなく、（例えば、架橋アミノ酸において）α−一置換基も想定される。
【０１１１】
当業者には理解可能であるように、本明細書に記載の化合物の合成方法は、当技術分野における通常の技術者には明白である。更に、所望の化合物を得るために、様々な合成工程を代替の順序で、あるいは順序を交替して実施可能である。本明細書に記載の化合物の合成に有用な合成化学変換および保護基方法論（保護および脱保護）は当技術分野において既知であり、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９９）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９４）；およびＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９５）およびそれらのその後の版を含む。
【０１１２】
本発明のペプチドは、通常の技術者に周知の化学合成法により製造することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＰｅｐｔｉｄｅｓのＣｈａｐｔｅｒ  ３：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，ｅｄ．Ｇｒａｎｔ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９２，ｐ．７７を参照されたい。したがって、ペプチドは、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の４３０Ａモデルまたは４３１モデルのペプチド合成装置によって、側鎖保護アミノ酸を用い、ｔ−ＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学成分のいずれかで保護したα−ＮＨ２を用いる固相合成の自動化メリフィールド技術によって合成することができる。
【０１１３】
本明細書に記載のペプチドを製造する一つの方法は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いる。Ｃ末端のアミノ酸を、リンカー分子と共に酸に不安定な結合を介して架橋ポリスチレン樹脂に結合させる。この樹脂は合成に使用される溶媒には不溶であり、これにより過剰な試薬および副産物を洗い流すことが比較的簡単かつ迅速になる。Ｎ末端は酸に安定であるが塩基によって除去可能なＦｍｏｃ基で保護される。任意の側鎖官能基は塩基に安定で酸に不安定な基で保護される。長いペプチドは、ネイティブケミカルライゲーションを用いて個々の合成ペプチドを結合することにより形成することができる。あるいは、長い合成ペプチドは周知の組換えＤＮＡ技術によって合成してもよい。そのような技術は周知の標準マニュアルにおいて、詳細なプロトコールと共に提示されている。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するために、アミノ酸配列を逆転写して、好ましくはその遺伝子を発現させようとする生物に最適なコドンで、そのアミノ酸配列をコードする核酸配列を得る。次に、典型的にはそのペプチドと、必要であれば任意の調節エレメントとをコードするオリゴヌクレオチドを合成することにより、合成遺伝子を形成する。合成遺伝子を適切なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞にトランスフェクションする。その後、選択された発現系および宿主に合った適切な条件下でペプチドが発現される。ペプチドを精製し、標準的な方法で特徴解析する。ペプチドはハイスループットコンビナトリアル様式で、例えばＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ社から入手可能なハイスループットマルチチャネル型コンビナトリアル合成装置を用いて形成することができる。制御可能なマイクロ波装置に囲まれた反応室内において標準的固相ペプチド合成法を用いるマイクロ波支援ペプチド合成により、長いペプチドや複合ペプチドも形成可能である。これらの方法は、反応環境の急速な加熱および冷却を可能にすることにより収率を高め、他の方法では困難なペプチド合成を容易にする。
【０１１４】
修飾ポリペプチドにおいて、１個以上の通常のペプチド結合は、体内でのポリペプチドの安定性を高め得る異なる結合によって置換される。ペプチド結合は、レトロ−インベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）結合（Ｃ（Ｏ）−ＮＨ）；還元アミド結合（ＮＨ−ＣＨ２）；チオメチレン結合（Ｓ−ＣＨ２またはＣＨ２−Ｓ）；オキソメチレン結合（Ｏ−ＣＨ２またはＣＨ２−Ｏ）；エチレン結合（ＣＨ２−ＣＨ２）；チオアミド結合（Ｃ（Ｓ）−ＮＨ）；トランスオレフィン結合（ＣＨ＝ＣＨ）；フルオロ置換トランスオレフィン結合（ＣＦ＝ＣＨ）；ケトメチレン結合（Ｃ（Ｏ）−ＣＨＲ）またはＣＨＲ−Ｃ（Ｏ）（ただしＲはＨまたはＣＨ３）；およびフルオロ−ケトメチレン結合（Ｃ（Ｏ）−ＣＦＲまたはＣＦＲ−Ｃ（Ｏ）（ただしＲはＨまたはＦまたはＣＨ３））で置換されてもよい。
【０１１５】
ポリペプチドは更に、アセチル化、アミド化、ビオチン化、シンナモイル化、ファルネシル化、蛍光化、ホルミル化、ミリストイル化、パルミトイル化、リン酸化（Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＴｈｒ）、ステアロイル化、サクシニル化およびスルフリル化によって修飾されてもよい。本発明のポリペプチドは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；アルキル基（例えばＣ１〜Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル基）；脂肪酸ラジカル；およびそれらの組合せに結合することもできる。
【０１１６】
（治療方法）
本発明は、異常な（例えば過剰な）Ｎｏｔｃｈ活性に関連する疾患もしくは遺伝子、遺伝子産物、あるいはＮｏｔｃｈタンパク質（アイソフォーム１〜４）、ＭＡＭＬタンパク質（アイソフォーム１〜３）および／またはＣＳＬによって（正にまたは負に）調節される分子シグナル伝達経路の異常な活性に関連する疾患のリスクのある（またはその疾患に罹りやすい）対象者またはその疾患を有する対象者を治療するための予防方法および治療方法の両方を提供する。その理由は、ポリペプチドがＮｏｔｃｈファミリー、ＭＡＭＬファミリーおよびＣＳＬタンパク質ファミリーのドミナントネガティブインヒビターとして作用すると予測されるためである。本明細書において使用される用語「治療」とは、疾患、疾患の症状または疾患に罹りやすい性質に対し、治療、治癒、緩和、軽減、変化、是正、改良、改善または影響を与える目的で、その疾患、疾患の症状または疾患に罹りやすい性質を有する患者に治療剤を適用または投与すること、あるいはそのような患者から単離した組織または細胞株に治療剤を適用または投与することと定義される。
【０１１７】
本発明のポリペプチドは、癌および腫瘍性疾患の治療、予防、および／または診断に使用することができる。本明細書において、「癌」、「過剰増殖性」および「腫瘍性」という用語は、自律的増殖をする能力を持つ、すなわち、急速に増殖する細胞成長によって特徴付けられる異常な状態または条件にある細胞を指す。過剰増殖性および腫瘍性の病気の状態は、病理学的なもの、すなわち病気の状態を特徴付けまたは構成するものとして分類されてもよいし、または非病理学的なもの、すなわち病気の状態とは関係しないが正常からは逸脱したものとして分類されてもよい。この用語は全種類の癌の増殖または腫瘍形成過程、転移組織または悪性形質転換した細胞、組織、または３０の器官、病理組織学的種類または侵襲性のステージとは無関係のものを包含するものとする。「病理学的過剰増殖性」細胞は、悪性腫瘍増殖によって特徴付けられる病状において生じる。非病理学的過剰増殖性細胞の例としては、創傷治癒に伴う細胞の増殖が挙げられる。
【０１１８】
細胞増殖性疾患および／または細胞分化性疾患の例としては、例えば上皮性悪性腫瘍、または非上皮性悪性腫瘍のような癌が挙げられる。上記の化合物（すなわちステープルドポリペプチド）は、乳癌、Ｔ細胞癌およびＢ細胞癌をコントロールする新規な治療剤として作用し得る。これらのポリペプチドは、粘表皮癌や髄芽腫の治療にも有用である可能性がある。増殖性疾患の例としては、造血腫瘍性疾患が挙げられる。本明細書において、「造血腫瘍性疾患」という用語は造血起源の、例えば、骨髄、リンパまたは赤血球系列、またはそれらの前駆細胞から生じる過形成性／腫瘍性細胞に関与する疾患を包含する。疾患の例としては、急性白血病、例えば赤芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病が挙げられる。他の骨髄疾患の例としては、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｖａｉｃｋｕｓ，Ｌ．（１９９１）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１１：２６７−９７に説明されている）が挙げられるがこれらに限定されない。リンパ性悪性疾患には、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）（Ｂ系列ＡＬＬおよびＴ系列ＡＬＬを含む）、慢性リンパ性白血病（ｅＬＬ）、前リンパ性白血病（ＰＬＬ）、多発性骨髄腫、有毛細胞白血病（ＨＬＬ）、およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）が挙げられる。悪性リンパ腫の他の例には、非ホジキンリンパ腫およびその異型、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病およびリード−スタンバーグ病が挙げられるがこれらに限定されない。胸部の細胞増殖性疾患および／または細胞分化性疾患の例としては、上皮過形成、硬化性乳管増生症、小管乳頭腫等の増殖性胸部疾患；線維腺腫、葉状腫瘍、および非上皮性悪性腫瘍のような間質性腫瘍、大管乳頭腫のような上皮性腫瘍等の腫瘍；非浸潤性乳管癌（ページェット病を含む）および上皮内小葉癌を含む（非侵襲性）上皮内癌、および、侵襲性乳管癌、侵襲性小葉癌、髄様癌、膠様（粘液性）癌、管状腺癌、および侵襲性乳頭癌を含むがこれらに限定されない侵襲性（浸潤性）上皮性悪性腫瘍を含む胸部の上皮性悪性腫瘍、および種々の悪性腫瘍が挙げられるがこれらに限定されない。男性の胸部の疾患には、女性化乳房および上皮性悪性腫瘍が挙げられるがこれらに限定されない。治療可能な他の増殖性疾患には、肺、膵臓、卵巣、消化管および肝臓の癌または転移性播種性腫瘍ならびに黒色腫および髄芽腫が挙げられるがこれらに限定されない。ポリペプチドは、血管新生（血液供給の維持）のためにＮｏｔｃｈを必要とするシグナル伝達および転移細胞の癌幹細胞様特性に基づく任意の転移性腫瘍の治療にも用いられ得る。ＮｏｔｃｈおよびＣＳＬ以外のＭＡＭＬと相互作用するタンパク質はＮＦ−κ−Ｂを含み、そのようなタンパク質の過剰活性に関連する癌。
【０１１９】
本明細書に記載のポリペプチドは、骨粗鬆症、自己免疫疾患、炎症性アテローム性動脈硬化症および肺高血圧症を含む過剰に活性なＮｏｔｃｈシグナル伝達に関連する多くの非癌性疾患の治療に用いられ得る。また、免疫不全のようなＮＦ−κ−Ｂシグナル伝達に関連する他の疾患が、本明細書のポリペプチドで治療され得る。更に、本明細書のポリペプチドは、再生医療や幹細胞治療のために、患者からの組織または細胞を（生体内または生体外で）治療するのに用いられ得る。
【０１２０】
（医薬組成物および投与経路）
本明細書において、本明細書に記載の式の化合物を含む本発明の化合物は、それらの薬学的に許容される誘導体またはプロドラッグを含むものとして定義される。「薬学的に許容される誘導体またはプロドラッグ」とは、レシピエントに投与すると、本発明の化合物を（直接的にまたは間接的に）提供可能な本発明の化合物の任意の薬学的に許容される塩、エステル、エステルの塩、または他の誘導体を意味する。特に好ましい誘導体およびプロドラッグは、本発明の化合物が哺乳類に投与された時に（例えば、経口投与された化合物がより血液に吸収され易くさせることにより）、その化合物のバイオアベイラビリティを増大させるもの、または親化合物の生物学的区分（例えば脳またはリンパ系）への送達を、親の種に対して促進するものである。好ましいプロドラッグは、水溶性または消化管膜を通る能動輸送を高める基が、本明細書に記載の式の構造に付加された誘導体を含む。
【０１２１】
本発明の化合物は、選択した生物学的特性を高めるために適切な官能基を付加することにより修飾されてもよい。そのような修飾は当技術分野において既知であり、所与の生物学的区分（例えば、血液、リンパ系、中枢神経系）への生物学的浸透を促進し、経口利用率を高め、注射による投与を可能にするように可溶性を高め、代謝を変化させ、また排泄率を変化させるものを含む。
【０１２２】
本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される無機および有機の酸および塩基に由来するものを含む。適切な酸性塩の例として、酢酸塩、アジピン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホナート、酪酸塩、クエン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩（ｈｅｍｉｓｕｌｆａｔｅ）、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、パルモ酸塩（ｐａｌｍｏａｔｅ）、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシラート、トリフルオロメチル硫酸塩、およびウンデカン酸塩（ｕｎｄｅｃａｎｏａｔｅ）が挙げられる。適切な塩基に由来する塩には、アルカリ金属（例えばナトリウム）、アルカリ土類金属（例えばマグネシウム）、アンモニウムおよびＮ−（アルカリ）４＋塩が挙げられる。本発明は、本明細書に開示された化合物の任意の窒素含有基の四級化も想定している。水または油に可溶性あるいは分散性の産物が、そのような四級化により得られる場合がある。
【０１２３】
本明細書に記載の式の化合物は、例えば、注射により、静脈内に、動脈内に、皮下に（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）、腹腔内に、筋肉内に、または皮下に（ｓｕｂｃｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、または経口的に、口腔内に、経鼻的に、経粘膜的に、局所に、眼科用製剤により、または吸入により、約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で、または特定の薬剤の要求に従って投与することができる。本明細書の方法は、望ましいまたは記述された効果を達成するための有効量の化合物または化合物の組成物の投与を考慮している。典型的には、本発明の医薬組成物は約１〜６回／日あるいは継続的な点滴で投与される。このような投与は長期治療または救急治療として使用できる。単一用量形態を提供するために担体材料と組み合わせられ得る活性成分の量は、治療の受給者および投与の特定の様式によって異なる。典型的な調剤は約５％〜約９５％の活性化合物（ｗ／ｗ）を含有する。あるいは、そのような調剤は約２０％〜約８０％の活性化合物を含有する。
【０１２４】
上記の用量よりも少ないまたは多い用量が要求される場合もある。任意の特定の患者のための特定の用量および治療計画は、採用する特定の化合物の活性、年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食事、投与時間、排泄率、薬剤の組合せ、疾患の重症度および経過、状態または症状、患者の病気に対する体質、状態または症状および担当医の判断を含む様々な要因に依存するであろう。
【０１２５】
患者の状態を改善する際、必要であれば、本発明の化合物、組成物または組合せの維持用量を投与してもよい。その後、投与の用量または頻度あるいはそれらの両方を、症状に応じて、改善した状態が維持されるレベルまで低減させてもよい。しかしながら、患者は病状の再発があれば、長期的に断続的な治療を必要とする場合がある。
【０１２６】
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載の式の化合物またはその薬学的に許容される塩と、例えばモルヒネまたはコデインを含む追加の薬剤と、任意の薬学的に許容される担体、アジュバントまたは賦形剤とを含む。本発明の代替的な組成物は、本明細書に記載の式の化合物またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体、アジュバントまたは賦形剤とを含む。本明細書に記述された組成物は、本明細書に記述された式の化合物と、存在する場合は追加の治療剤とを、疾患または病状の変調を達成するのに有効な量で含む。「薬学的に許容される担体またはアジュバント」という用語は、本発明の化合物と一緒に患者に投与することができ、かつその薬理活性を失わせず、更にその化合物の治療量を送達するのに十分な用量で投与された時に非毒性である担体またはアジュバントを指す。
【０１２７】
本発明の医薬組成物に使用され得る薬学的に許容される担体、アジュバントおよび賦形剤は、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００コハク酸エステルのような自己乳化型ドラッグデリバリーシステム（ＳＥＤＤＳ）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）や他の類似のポリマーデリバリーマトリックスのような医薬剤形で用いられる界面活性剤、ヒト血清アルブミンのような血清タンパク質、リン酸のような緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウムのような塩または電解質、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂を含むがこれらに限定されない。α−、β−、およびγ−シクロデキストリンのようなシクロデキストリンも、本明細書に記載の式の化合物の送達を促進するために有利に用いることができる。
【０１２８】
本発明の医薬組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーにより、局所的に、直腸内に、経鼻的に、口腔内に、経膣的にまたは埋め込まれたリザーバを介して、好ましくは経口投与または注射により投与され得る。本発明の医薬組成物は、任意の従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバントまたは賦形剤を含有してもよい。いくつかの場合、調製される化合物またはその送達形態の安定性を高めるために、製剤のｐＨは薬学的に許容される酸、塩基または緩衝剤で調整されてもよい。本明細書において、非経口という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨下、髄腔内、病巣内および頭蓋内への注射または点滴技術を含む。
【０１２９】
医薬組成物は、無菌の注射可能な製剤の形態、例えば、無菌の注射可能な水性または油性の懸濁液としてもよい。この懸濁液は、当技術分野において既知の技術に従って、適切な分散剤または湿潤剤（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）８０のような）および懸濁剤を用いて調製することができる。無菌の注射可能な製剤は、非毒性かつ非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌の注射可能な溶液または懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液とすることもできる。使用され得る許容される賦形剤および溶媒の中では、マンニトール、水、リンガー液および等張の塩化ナトリウム溶液である。更に、滅菌固定油は溶媒または懸濁媒体として従来用いられている。この目的のために、合成モノ−またはジグリセリドを含む任意の無菌固定油が使用され得る。オレイン酸やそのグリセリド誘導体のような脂肪酸、オリーブ油やヒマシ油、天然の薬学的に許容される油脂、特にそれらのポリオキシエチレン化物は、注射剤の調製に有用である。これらの油性溶液または懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤または分散剤、あるいはカルボキシメチルセルロースまたは乳液や懸濁液のような薬学的に許容される剤形の調製に一般に用いられる類似の分散剤を含んでもよい。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）やＳｐａｎｓのような他の一般に用いられる界面活性剤および／または、薬学的に許容される固体、液体、または他の剤形を製造するために一般に使用される他の類似の乳化剤またはバイオアベイラビィティ促進剤は、調剤の目的で用いることもできる。
【０１３０】
本発明の医薬組成物は、カプセル、錠剤、乳液および水性の懸濁液、分散液および溶液を含むがこれらに限定されない任意の経口的に許容される剤形で経口投与され得る。経口用途の錠剤の場合、一般に使用される担体はラクトースおよびコーンスターチを含む。ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤も、典型的に添加される。カプセル形態での経口投与については、有用な希釈剤はラクトースおよび乾燥コーンスターチを含む。水性懸濁液および／または乳液が経口投与されるとき、活性成分は、乳化剤および／または懸濁剤と組み合わされた油性相内に懸濁または溶解される場合がある。所望の場合、ある種の甘味剤および／または香料および／または着色剤を添加してもよい。
【０１３１】
本発明の医薬組成物は、直腸投与のために坐薬の形態で投与されてもよい。これらの組成物は、本発明の化合物を、室温では固体であるが直腸温度では液体である適切な非刺激性賦形剤と混合することにより調製することができる。したがって、直腸内で溶融して活性成分が放出される。このような材料は、ココアバター、蜜蝋およびポリエチレングリコールを含むがこれらに限定されない。
【０１３２】
本発明の医薬組成物は鼻用エアロゾルまたは吸入によって投与されてもよい。そのような組成物は、医薬調剤の技術分野で周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを高めるための促進剤、フルオロカーボン、および／または当技術分野で既知の他の可溶化剤または分散剤を用いつつ、生理食塩水中の溶液として調製され得る。
【０１３３】
本発明の組成物が本明細書に記載の式の化合物と、１つ以上の追加の治療剤または予防剤との組合せを含む場合、化合物および追加の薬剤の両方とも、単剤治療レジメンで通常投与される用量の約１〜１００％、より好ましくは約５〜９５％の用量レベルで存在するべきである。追加の薬剤は、多数の用法の一部として、本発明の化合物とは別に投与されてもよい。あるいは、これらの薬剤は、本発明の化合物と一緒に混合されて単一の組成物とされる単一剤形の一部であってもよい。
【０１３４】
（ポリペプチドの修飾）
ステープルドポリペプチドは、薬剤、毒素、ポリエチレングリコールの誘導体；第２のポリペプチド；炭化水素、などを含んでもよい。ポリマーまたはほかの作用物質がステープルドペプチドに結合している場合、組成物は実質的に均質であることが好ましい場合がある。
【０１３５】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子の添加により、ポリペプチドの薬物動態および薬力学的特性を向上させることができる。例えば、ＰＥＧ化は腎クリアランスを低下させ、より安定な血漿濃度をもたらし得る。ＰＥＧは水に可溶のポリマーであり、下記式のポリペプチドに結合される：
ＸＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙ  ここで、ｎは２〜１０，０００およびＸはＨまたは末端修飾、例えば、Ｃ１〜４アルキル；およびＹはポリペプチドのアミン基（リシンのイプシロンアミンまたはＮ末端を含むがこれらに限定されない）とのアミド結合、カルバメート結合または尿素結合である。Ｙはチオール基（システインのチオール基を含むがこれに限定されない）とのマレイミド結合であってもよい。ＰＥＧをポリペプチドに直接または間接的に結合させる他の方法は当業者に既知である。ＰＥＧは直鎖でも分岐鎖でもよい。様々な官能化誘導体を含む様々な形態のＰＥＧが市販されている。
【０１３６】
主鎖に分解性結合を有するＰＥＧを用いてもよい。例えば、ＰＥＧは加水分解に供されるエステル結合を伴って調製されてもよい。分解性ＰＥＧ結合を有する複合体は、国際公開第９９／３４８３３号、国際公開第９９／１４２５９号、および米国特許第６３４８５５８号に記載されている。
【０１３７】
ある実施形態において、巨大分子ポリマー（例えばＰＥＧ）は、中間リンカーを介して本明細書に記載の作用物質に結合される。ある実施形態において、リンカーはペプチド結合でつながった１〜２０個のアミノ酸から形成され、これらのアミノ酸は２０個の天然アミノ酸から選択される。これらのアミノ酸のいくつかは、当業者によく理解されているようにグリコシル化されてもよい。他の実施形態において、１〜２０個のアミノ酸はグリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリシンから選択される。他の実施形態において、リンカーはグリシンおよびアラニンのような、立体障害のないアミノ酸から大部分が形成される。非ペプチドリンカーも可能である。例えば、−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）−（ｎ＝２〜２０）のようなアルキルリンカーを用いることができる。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル（例えばＣ１〜Ｃ６）、低級アシル、ハロゲン（例えばＣｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニル等の非立体障害基で更に置換されてもよい。米国特許第５４４６０９０号には、二官能性ＰＥＧリンカー、およびＰＥＧリンカーの各末端にペプチドを有する複合体の形成にそれを使用することが記載されている。
【０１３８】
いくつかの場合、溶解度および／またはαヘリシティは、ペプチドのアミノ末端をスペルミンを結合させて修飾することにより改善してもよい（Ｍｕｐｐｉｄｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  ７４１２）。
【０１３９】
（スクリーニングアッセイ）
本明細書に記載のアッセイは、個々の候補化合物とともに実施可能であるか、複数の候補化合物とともに実施可能である。アッセイが複数の候補化合物とともに実施される場合、アッセイは候補化合物の混合物を用いて実施可能であるか、またはそれぞれ１つの候補化合物を有する複数の反応を並行して行うことができる。試験化合物または作用物質は、当技術分野において既知であるコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチの任意のものを用いて得ることができる。
【０１４０】
（他の適用）
本発明の多くの実施形態を説明してきたが、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく様々な変更を行うことができることが理解されよう。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内にある。
【０１４１】
参考文献
【０１４２】
【表３】
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【図１Ａ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ−３Ｉ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図６】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｈ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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