(57)【要約】インスリン感受性を増加させるための方法、および糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）を処置するための方法が本明細書において記載される。被験体における褐色脂肪量を増加させるための方法、および肥満症をはじめとする代謝障害を処置するための方法もまた、本明細書において記載される。例えば、被験体における糖尿病を予防または処置するための方法であって、カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片を該被験体に投与することを含む、方法が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における糖尿病を予防または処置するための方法であって、カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片が、配列番号１〜４１からなる群より選択される配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片が、配列番号３８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片が、配列番号１２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片が、配列番号１と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記糖尿病がＩ型糖尿病である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記糖尿病がＩＩ型糖尿病である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片が、単離されたカリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片を含む医薬組成物を前記被験体に投与することによって投与される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片が、前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片を発現する組換え細胞の集団を前記被験体に投与することによって投与される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換え細胞の集団が、Ｔ細胞、Ｔ細胞前駆体、Ｂ細胞、Ｂ細胞前駆体、骨髄幹細胞、胚性幹細胞、誘導胚性幹細胞、末梢血幹細胞またはそれらの組み合わせを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
被験体におけるインスリン感受性を増加させるための方法であって、カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項１２】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片が、配列番号１〜４１からなる群より選択される配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片が、配列番号３８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片が、配列番号１２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片が、配列番号１と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記被験体がＩ型糖尿病を有する、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験体がＩＩ型糖尿病を有する、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片が、単離されたカリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片を含む医薬組成物を前記被験体に投与することによって投与される、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片が、前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片を発現する組換え細胞の集団を前記被験体に投与することによって投与される、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記組換え細胞の集団が、Ｔ細胞、Ｔ細胞前駆体、Ｂ細胞、Ｂ細胞前駆体、骨髄幹細胞、胚性幹細胞、誘導胚性幹細胞、末梢血幹細胞またはそれらの組み合わせを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
被験体における代謝障害を予防または処置するための方法であって、カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２２】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片が、配列番号１〜４１からなる群より選択される配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片が、配列番号３８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片が、配列番号１２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片が、配列番号１と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記代謝障害が肥満症である、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片が、単離されたカリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片を含む医薬組成物を前記被験体に投与することによって投与される、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片が、前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片を発現する組換え細胞の集団を前記被験体に投与することによって投与される、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記組換え細胞の集団が、Ｔ細胞、Ｔ細胞前駆体、Ｂ細胞、Ｂ細胞前駆体、骨髄幹細胞、胚性幹細胞、誘導胚性幹細胞、末梢血幹細胞またはそれらの組み合わせを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
被験体における糖尿病を予防または処置するための方法であって、該被験体におけるカリクレインファミリーペプチダーゼの発現を増加させる薬剤を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項３１】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼが、Ｋｌｋ１、Ｋｌｋ２、Ｋｌｋ３、Ｋｌｋ４、Ｋｌｋ５、Ｋｌｋ６、Ｋｌｋ７、Ｋｌｋ８、Ｋｌｋ９、Ｋｌｋ１０、Ｋｌｋ１１、Ｋｌｋ１２、Ｋｌｋ１３、Ｋｌｋ１４およびＫｌｋ１５からなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼがＫｌｋ１２である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼがＫｌｋ１である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記薬剤が、低分子、ポリペプチド、抗体または阻害性ＲＮＡ分子である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記薬剤が、Ｒｈｅｂの低分子阻害剤またはＲｈｅｂに特異的な阻害性ＲＮＡ分子である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記糖尿病がＩ型糖尿病である、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記糖尿病がＩＩ型糖尿病である、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
被験体におけるインスリン感受性を増加させるための方法であって、該被験体におけるカリクレインファミリーペプチダーゼの発現を増加させる薬剤を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項３９】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼが、Ｋｌｋ１、Ｋｌｋ２、Ｋｌｋ３、Ｋｌｋ４、Ｋｌｋ５、Ｋｌｋ６、Ｋｌｋ７、Ｋｌｋ８、Ｋｌｋ９、Ｋｌｋ１０、Ｋｌｋ１１、Ｋｌｋ１２、Ｋｌｋ１３、Ｋｌｋ１４およびＫｌｋ１５からなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼがＫｌｋ１２である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼがＫｌｋ１である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記薬剤が、低分子、ポリペプチド、抗体または阻害性ＲＮＡ分子である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記薬剤が、Ｒｈｅｂの低分子阻害剤またはＲｈｅｂに特異的な阻害性ＲＮＡ分子である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記被験体がＩ型糖尿病を有する、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記被験体がＩＩ型糖尿病を有する、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
被験体における代謝障害を予防または処置するための方法であって、該被験体におけるカリクレインファミリーペプチダーゼの発現を増加させる薬剤を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項４７】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼが、Ｋｌｋ１、Ｋｌｋ２、Ｋｌｋ３、Ｋｌｋ４、Ｋｌｋ５、Ｋｌｋ６、Ｋｌｋ７、Ｋｌｋ８、Ｋｌｋ９、Ｋｌｋ１０、Ｋｌｋ１１、Ｋｌｋ１２、Ｋｌｋ１３、Ｋｌｋ１４およびＫｌｋ１５からなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼがＫｌｋ１２である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼがＫｌｋ１である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記薬剤が、低分子、ポリペプチド、抗体または阻害性ＲＮＡ分子である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記薬剤が、Ｒｈｅｂの低分子阻害剤またはＲｈｅｂに特異的な阻害性ＲＮＡ分子である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記代謝障害が肥満症である、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
被験体における糖尿病を予防または処置するための方法であって、１以上の組換え細胞を該被験体に投与することを含み、該１以上の組換え細胞が、Ｒｈｅｂの減少した発現または活性を有する、方法。
【請求項５４】
Ｒｈｅｂ遺伝子またはＲｈｅｂプロモーターが、前記１以上の組換え細胞において変異またはノックアウトされている、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記１以上の組換え細胞が、Ｒｈｅｂ特異的阻害性ＲＮＡ分子を発現する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記１以上の組換え細胞が、Ｔ細胞、Ｔ細胞前駆体、Ｂ細胞、Ｂ細胞前駆体、骨髄幹細胞、胚性幹細胞、誘導胚性幹細胞、末梢血幹細胞またはそれらの組み合わせを含む、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記１以上の組換え細胞が前記被験体と同系である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記被験体の１以上の非組換え細胞を、前記１以上の組換え細胞を作製するのに使用した、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記被験体から前記１以上の非組換え細胞を採取する工程をさらに含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記１以上の非組換え細胞を前記１以上の組換え細胞に変換する工程をさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記変換する工程が、前記１以上の非組換え細胞におけるＲｈｅｂ遺伝子またはＲｈｅｂプロモーターを変異させることによって実施される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記変換する工程が、Ｒｈｅｂ特異的阻害性ＲＮＡ分子発現ベクターを前記１以上の非組換え細胞に導入することによって実施される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
被験体におけるインスリン感受性を増加させるための方法であって、１以上の組換え細胞を該被験体に投与することを含み、該１以上の組換え細胞が、Ｒｈｅｂの減少した発現または活性を有する、方法。
【請求項６４】
Ｒｈｅｂ遺伝子またはＲｈｅｂプロモーターが、前記１以上の組換え細胞において変異またはノックアウトされている、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記１以上の組換え細胞が、Ｒｈｅｂ特異的阻害性ＲＮＡ分子を発現する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記１以上の組換え細胞が、Ｔ細胞、Ｔ細胞前駆体、Ｂ細胞、Ｂ細胞前駆体、骨髄幹細胞、胚性幹細胞、誘導胚性幹細胞、末梢血幹細胞またはそれらの組み合わせを含む、請求項６３〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記１以上の組換え細胞が前記被験体と同系である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記被験体の１以上の非組換え細胞を、前記１以上の組換え細胞を作製するのに使用した、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記被験体から前記１以上の非組換え細胞を採取する工程をさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記１以上の非組換え細胞を前記１以上の組換え細胞に変換する工程をさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記変換する工程が、前記１以上の非組換え細胞におけるＲｈｅｂ遺伝子またはＲｈｅｂプロモーターを変異させることによって実施される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記変換する工程が、Ｒｈｅｂ特異的阻害性ＲＮＡ分子発現ベクターを前記１以上の非組換え細胞に導入することによって実施される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
被験体における代謝障害を予防または処置するための方法であって、１以上の組換え細胞を該被験体に投与することを含み、該１以上の組換え細胞が、Ｒｈｅｂの減少した発現または活性を有する、方法。
【請求項７４】
Ｒｈｅｂ遺伝子またはＲｈｅｂプロモーターが、前記１以上の組換え細胞において変異またはノックアウトされている、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記１以上の組換え細胞が、Ｒｈｅｂ特異的阻害性ＲＮＡ分子を発現する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記１以上の組換え細胞が、Ｔ細胞、Ｔ細胞前駆体、Ｂ細胞、Ｂ細胞前駆体、骨髄幹細胞、胚性幹細胞、誘導胚性幹細胞、末梢血幹細胞またはそれらの組み合わせを含む、請求項７３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記１以上の組換え細胞が前記被験体と同系である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記被験体の１以上の非組換え細胞を、前記１以上の組換え細胞を作製するのに使用した、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記被験体から前記１以上の非組換え細胞を採取する工程をさらに含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記１以上の非組換え細胞を前記１以上の組換え細胞に変換する工程をさらに含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記変換する工程が、前記１以上の非組換え細胞におけるＲｈｅｂ遺伝子またはＲｈｅｂプロモーターを変異させることによって実施される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記変換する工程が、Ｒｈｅｂ特異的阻害性ＲＮＡ分子発現ベクターを前記１以上の非組換え細胞に導入することによって実施される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
試験化合物が、糖尿病を処置するための有望な治療剤であるか否かを決定するための方法であって、
（ａ）細胞を該試験化合物と接触させる工程；および
（ｂ）該細胞によるカリクレインファミリーペプチダーゼの発現を検出する工程；
を含み、
ここで、カリクレインファミリーペプチダーゼの発現増加を引き起こす試験化合物は、糖尿病を処置するための有望な治療剤である、方法。
【請求項８４】
前記細胞がマウス細胞であり、前記カリクレインファミリーペプチダーゼがＫｌｋ１ｂ２２である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記細胞がヒト細胞であり、前記カリクレインファミリーペプチダーゼがＫｌｋ１またはＫｌｋ１２である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記細胞がＴ細胞である、請求項８３〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼの前記発現が、カリクレインファミリーペプチダーゼｍＲＮＡを検出することによって検出される、請求項８３〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼの前記発現が、カリクレインファミリーペプチダーゼタンパク質を検出することによって検出される、請求項８３〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼが、検出可能な部分に連結されている、請求項８３〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記カリクレインファミリーペプチダーゼの前記発現が、前記検出可能な部分を検出することによって検出される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
試験化合物が、糖尿病を処置するための有望な治療剤であるか否かを決定するための方法であって、
（ａ）細胞を該試験化合物と接触させる工程であって、該細胞が、カリクレインファミリーペプチダーゼ遺伝子のプロモーターに作動可能に連結された、検出可能な部分をコードする核酸配列を含む、工程；および
（ｂ）該細胞による該検出可能な部分の発現を検出する工程；
を含み、
ここで、該検出可能な部分の発現増加を引き起こす試験化合物が、糖尿病を処置するための有望な治療剤である、方法。
【請求項９２】
前記プロモーターがＫｌｋ１ｂ２２プロモーターである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記プロモーターがＫｌｋ１プロモーターまたはＫｌｋ１２プロモーターである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記細胞がＴ細胞である、請求項９０〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本出願は、２０１１年６月１７日に出願された米国仮出願第６１／４９８，２０２号および２０１１年９月３０日に出願された米国仮出願第６１／５４１，６８６号の利益を主張するものであり、これらの各出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に具体的に援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
真性糖尿病（「糖尿病」）は、不十分なインスリン産生（Ｉ型糖尿病）または産生されるインスリンに対する反応性欠如（ＩＩ型糖尿病）のいずれかによって引き起こされる高血糖レベルを特徴とする慢性代謝疾患である。糖尿病には何百万人もの人々が罹患しており、世界全体におよぶ主要な公衆衛生問題となっている。
【０００３】
Ｉ型糖尿病は、インスリン産生細胞が失われてインスリン不足に至ることを特徴とする。Ｉ型糖尿病は、通常、膵臓β細胞に対するＴ細胞媒介性自己免疫攻撃の結果であり、子供における糖尿病症例の大部分に相当する。Ｉ型糖尿病の治療法は知られておらず、Ｉ型糖尿病患者は、一般に、食事およびインスリン注射によって症状を管理する。
【０００４】
米国における糖尿病患者の大部分は、ＩＩ型糖尿病を患っている。ＩＩ型糖尿病はインスリン抵抗性を特徴とし、肥満症を伴う。ＩＩ型糖尿病患者は、心臓血管疾患、卒中、網膜症、神経障害、腎障害および肝疾患の発症の一因となることが多い一連の代謝障害を示す。Ｉ型糖尿病と同様に、ＩＩ型糖尿病の治療法は知られておらず、ＩＩ型糖尿病患者は、食事および運動によってそれらの症状を管理しなければならない。
【０００５】
したがって、糖尿病を有する個体においてインスリン感受性の増加を高めることができる方法について、大きな必要性がある。このような方法は、ＩＩ型糖尿病を有する個体のインスリン感受性を回復させるため、および多くのＩ型糖尿病患者に残っている少量のインスリンの活性を増加させるために使用され得る。したがって、このような方法は、Ｉ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病の両方の処置において有用となる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
いくつかの実施形態では、被験体におけるインスリン感受性を増加させる方法、被験体における糖尿病（例えば、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病）を予防または処置する方法、被験体における褐色脂肪レベルを増加させる方法、被験体における代謝障害（例えば、肥満症）を予防または処置する方法、被験体における体重減少を促進する方法、被験体における高脂血症を処置する方法、ならびに／または被験体における心臓血管疾患および血管疾患を処置する方法が本明細書において記載される。いくつかの実施形態では、前記被験体は、糖尿病、代謝障害および／もしくは肥満症を有するか、またはこれらの素因を有する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、前記方法は、カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片を前記被験体に投与することを含む。ある種の実施形態では、前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片は、配列番号１〜４１からなる群より選択される配列（例えば、配列番号１、１２または３８）と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片は、治療量の単離されたカリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片を含む医薬組成物を前記被験体に投与することによって投与される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片は、前記カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片を発現する組換え細胞の集団を前記被験体に投与することによって投与される。ある種の実施形態では、前記組換え細胞の集団は、Ｔ細胞、Ｔ細胞前駆体、Ｂ細胞、Ｂ細胞前駆体、骨髄幹細胞、胚性幹細胞、誘導胚性幹細胞、末梢血幹細胞またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記細胞集団は、起源的には、前記被験体に由来する。
【００１０】
ある種の実施形態では、前記方法は、前記被験体におけるカリクレインファミリーペプチダーゼ（例えば、Ｋｌｋ１、Ｋｌｋ２、Ｋｌｋ３、Ｋｌｋ４、Ｋｌｋ５、Ｋｌｋ６、Ｋｌｋ７、Ｋｌｋ８、Ｋｌｋ９、Ｋｌｋ１０、Ｋｌｋ１１、Ｋｌｋ１２、Ｋｌｋ１３、Ｋｌｋ１４またはＫｌｋ１５）の発現を増加させる薬剤を前記被験体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、前記薬剤は、低分子、ポリペプチド、抗体または阻害性ＲＮＡ分子（例えば、Ｒｈｅｂに特異的な阻害性ＲＮＡ分子）である。ある種の実施形態では、前記被験体は、細胞によるカリクレインファミリーペプチダーゼの発現を増加させる核酸分子でトランスフェクションされた細胞を投与される。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記細胞をトランスフェクションする工程を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、前記方法は、Ｒｈｅｂの発現または活性が低下した１以上の組換え細胞（例えば、前記１以上の組換え細胞は、同じタイプの非組換え細胞および／または同じ種に由来する非組換え細胞と比較してＲｈｅｂ発現または活性が低下している）を前記被験体に投与することを含む。ある種の実施形態では、Ｒｈｅｂ遺伝子またはＲｈｅｂプロモーターは、前記１以上の組換え細胞において変異またはノックアウトされている。いくつかの実施形態では、Ｒｈｅｂ遺伝子またはＲｈｅｂプロモーターの両方が、前記１以上の組換え細胞において変異またはノックアウトされている。いくつかの実施形態では、前記１以上の組換え細胞は、Ｒｈｅｂ特異的阻害性ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子またはマイクロＲＮＡ分子）を発現する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、前記１以上の組換え細胞は、Ｔ細胞、Ｔ細胞前駆体、Ｂ細胞、Ｂ細胞前駆体、骨髄幹細胞、胚性幹細胞、誘導胚性幹細胞、末梢血幹細胞またはそれらの組み合わせを含む。ある種の実施形態では、前記１以上の組換え細胞は、前記被験体と同系（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）である。いくつかの実施形態では、前記１以上の組換え細胞は、前記被験体の１以上の非組換え細胞から作製されたものである。
【００１３】
ある種の実施形態では、前記方法はまた、前記被験体から前記１以上の非組換え細胞を採取する工程、および／または前記１以上の非組換え細胞を前記１以上の組換え細胞に変換する工程を含む。いくつかの実施形態では、変換は、（例えば、当該技術分野において公知の標準的な組換え技術を使用して）前記１以上の非組換え細胞におけるＲｈｅｂ遺伝子またはＲｈｅｂプロモーターを変異させることによって実施され、それにより、Ｒｈｅｂ発現が低下した１以上の組換え細胞を作製する。いくつかの実施形態では、前記変換する工程は、Ｒｈｅｂ特異的阻害性ＲＮＡ分子発現ベクターを前記１以上の非組換え細胞に導入することによって実施される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、試験化合物が、インスリン感受性を増加させるための、糖尿病（例えば、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病）を処置するための、褐色脂肪レベルを増加させるための、および／または代謝障害（例えば、肥満症）を処置するための有望な治療剤（ｌｉｋｅｌｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）であるか否かを決定するための方法が本明細書において記載される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、前記方法は、（ａ）細胞（例えば、マウス細胞またはヒト細胞、例えばＴ細胞）を前記試験化合物に接触させる工程、および（ｂ）前記細胞によるカリクレインファミリーペプチダーゼ（例えば、Ｋｌｋ１ｂ２２、Ｋｌｋ１またはＫｌｋ１２）の発現を検出する工程を含み、カリクレインファミリーペプチダーゼの発現増加を引き起こす試験化合物は、有望な治療剤である。ある種の実施形態では、前記カリクレインファミリーペプチダーゼの前記発現は、カリクレインファミリーペプチダーゼｍＲＮＡを検出することによって検出される。いくつかの実施形態では、前記カリクレインファミリーペプチダーゼの前記発現は、カリクレインファミリーペプチダーゼタンパク質を検出することによって検出される。いくつかの実施形態では、前記カリクレインファミリーペプチダーゼは、検出可能な部分に連結されており、前記カリクレインファミリーペプチダーゼの前記発現は、前記検出可能な部分を検出することによって検出される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、前記方法は、（ａ）細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞、例えばＴ細胞）を前記試験化合物に接触させる工程であって、前記細胞が、カリクレインファミリーペプチダーゼ遺伝子プロモーター（例えば、Ｋｌｋ１ｂ２２プロモーター、Ｋｌｋ１プロモーターまたはＫｌｋ１２プロモーター）に機能し得るように連結された検出可能な部分をコードする核酸配列を含む、工程、および（ｂ）前記細胞による前記検出可能な部分の発現を検出する工程を含み、前記検出可能な部分の発現増加を引き起こす試験化合物は、有望な治療剤である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスおよび野生型（ＷＴ）マウスの体重中央値を示す。
【図２】図２は、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスおよび野生型マウスの体脂肪分析を示す。
【図３】図３は、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスおよび野生型マウスのグルコース取り込みおよびインスリン感受性を示す。
【図４】図４は、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスおよび野生型マウスの血清トリグリセリドおよび血清高密度リポタンパク質のレベルを示す。
【図５】図５は、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスおよび野生型マウスの餌消費を示す。
【図６】図６は、１８−Ｆ−ＦＤＧプロトン放出断層撮影イメージングを使用して決定した場合の、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスおよび野生型マウスにおけるグルコースの組織取り込みを示す。
【図７】図７は、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスおよび野生型マウスの肝臓におけるＢＭＰ７、線維芽細胞増殖因子−２１およびアシルＣｏＡチオエステラーゼの発現を示す。
【図８】図８は、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスまたは野生型マウスのいずれかから単離したＴ細胞のＬ−ラクテート産生を示す。
【図９】図９は、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスおよび野生型マウスの呼吸交換率を示す。
【図１０】図１０は、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスまたは野生型マウスのいずれかから単離した骨髄の骨髄移植を受けた放射線照射野生型マウスの体重変化を示す。
【図１１】図１１は、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスまたは野生型マウスのいずれかからＴ細胞移植を受けたＲＡＧ−／／−マウスのグルコース取り込みを示す。
【図１２】図１２は、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスまたは野生型マウスのいずれかからのＴ細胞を受け取る前後両方の糖尿病マウスのインスリン感受性を示す。
【図１３】図１３は、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスまたは野生型マウスのいずれかから採取した血清を投与した後の野生型マウスのグルコース取り込みを示す。
【図１４−１】図１４は、ヒトカリクレインファミリーペプチダーゼのアミノ酸配列を示す。
【図１４−２】図１４は、ヒトカリクレインファミリーペプチダーゼのアミノ酸配列を示す。
【図１４−３】図１４は、ヒトカリクレインファミリーペプチダーゼのアミノ酸配列を示す。
【図１５−１】図１５は、マウスカリクレインファミリーペプチダーゼのアミノ酸配列を示す。
【図１５−２】図１５は、マウスカリクレインファミリーペプチダーゼのアミノ酸配列を示す。
【図１５−３】図１５は、マウスカリクレインファミリーペプチダーゼのアミノ酸配列を示す。
【図１５−４】図１５は、マウスカリクレインファミリーペプチダーゼのアミノ酸配列を示す。
【図１５−５】図１５は、マウスカリクレインファミリーペプチダーゼのアミノ酸配列を示す。
【図１６−１】図１６は、ヒトカリクレインファミリーペプチダーゼの核酸配列を示す。
【図１６−２】図１６は、ヒトカリクレインファミリーペプチダーゼの核酸配列を示す。
【図１６−３】図１６は、ヒトカリクレインファミリーペプチダーゼの核酸配列を示す。
【図１６−４】図１６は、ヒトカリクレインファミリーペプチダーゼの核酸配列を示す。
【図１６−５】図１６は、ヒトカリクレインファミリーペプチダーゼの核酸配列を示す。
【図１６−６】図１６は、ヒトカリクレインファミリーペプチダーゼの核酸配列を示す。
【図１６−７】図１６は、ヒトカリクレインファミリーペプチダーゼの核酸配列を示す。
【図１７−１】図１７は、マウスカリクレインファミリーペプチダーゼの核酸配列を示す。
【図１７−２】図１７は、マウスカリクレインファミリーペプチダーゼの核酸配列を示す。
【図１７−３】図１７は、マウスカリクレインファミリーペプチダーゼの核酸配列を示す。
【図１７−４】図１７は、マウスカリクレインファミリーペプチダーゼの核酸配列を示す。
【図１７−５】図１７は、マウスカリクレインファミリーペプチダーゼの核酸配列を示す。
【図１７−６】図１７は、マウスカリクレインファミリーペプチダーゼの核酸配列を示す。
【図１７−７】図１７は、マウスカリクレインファミリーペプチダーゼの核酸配列を示す。
【図１７−８】図１７は、マウスカリクレインファミリーペプチダーゼの核酸配列を示す。
【図１７−９】図１７は、マウスカリクレインファミリーペプチダーゼの核酸配列を示す。
【図１８】図１８Ａ〜図１８Ｂは、インスリン用量反応に応じたＫｌｋ１ｂ２２によるインスリン受容体リン酸化（図１８Ａ）および長期インスリン受容体リン酸化（図１８Ｂ）の両方が増強されることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
Ｉ．概略
被験体におけるインスリン感受性および／または褐色脂肪レベルを増加させるための組成物および方法、ならびに糖尿病、代謝障害および肥満症をはじめとする広範囲の疾患および障害を処置および予防するための組成物および方法が本明細書において記載される。本明細書において記載される方法において使用され得るさらなる治療剤を同定するための組成物および方法も本明細書において記載される。
【００１９】
糖尿病は、世界全体におよぶ重大な健康問題である。インスリン産生の低下（Ｉ型糖尿病）、またはインスリン感受性の低下（ＩＩ型糖尿病）のいずれかの理由により、糖尿病患者は血中グルコースレベルを調節できない。糖尿病に伴う重篤な長期合併症としては、心臓血管疾患、慢性腎不全および網膜損傷が挙げられる。
【００２０】
ある種の実施形態では、インスリン感受性を増加させるための方法および組成物が本明細書において提供される。このような方法および組成物は、Ｉ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病の両方を処置するのに有用である。例えば、本明細書において記載される組成物および方法を使用するＩ型糖尿病患者の処置は、糖尿病被験体によって産生される低レベルのインスリンの効力を増強するが、ＩＩ型糖尿病患者の処置は、前記糖尿病患者の細胞のインスリン感受性を回復させる。さらに、インスリンの効力を増大させ、治療効果の達成に必要とされる用量を減少させるために、本明細書において記載される組成物および方法は、インスリンまたはインスリン類似体の投与と組み合わせることができる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、治療効果（例えば、インスリン感受性の増加、糖尿病の予防および／または処置、褐色脂肪レベルの増加、代謝障害の予防および／または処置、肥満症の予防および／または処置、体重減少の増大、高脂血症の予防および／または処置、心臓血管疾患および血管疾患の処置および／または予防）は、カリクレインファミリーペプチダーゼまたはその生物学的に活性な断片の投与によって、被験体において達成される。その他の実施形態では、治療効果は、カリクレインファミリーペプチダーゼの発現または活性を増強する治療剤の投与によって達成される。
【００２２】
ペプチダーゼのカリクレインファミリーは、高度に保存されたセリンプロテアーゼの多重遺伝子ファミリーである。ヒトカリクレインファミリーペプチダーゼのアミノ酸配列を配列番号１〜１５および図１４に示す。マウスカリクレインファミリーペプチダーゼのアミノ酸配列を配列番号１６〜４１および図１５に示す。ヒトカリクレインファミリーペプチダーゼの核酸配列を配列番号４２〜５６および図１６に示す。マウスカリクレインファミリーペプチダーゼの核酸配列を配列番号５７〜８２および図１７に示す。本明細書において記載されるように、被験体におけるカリクレインファミリーペプチダーゼレベルの増加は、インスリン感受性の増加、グルコース取り込みの増加および褐色脂肪レベルの増加をもたらす。それにより、カリクレインファミリーペプチダーゼまたはカリクレインファミリーペプチダーゼの発現もしくは活性を増加させる薬剤の投与は、糖尿病、および肥満症をはじめとする代謝障害を処置するのに有用である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、治療効果（例えば、インスリン感受性の増加、糖尿病の予防および／または処置、褐色脂肪レベルの増加、代謝障害の予防および／または処置、肥満症の予防および／または処置、体重減少の増大、高脂血症の予防および／または処置、心臓血管疾患および血管疾患の処置および／または予防）は、Ｒｈｅｂ発現または活性が低下した１以上の組換え細胞（例えば、Ｔ細胞などのリンパ球、または造血幹細胞などのリンパ球前駆体）の投与によって、被験体において達成される。Ｒｈｅｂは、細胞の増殖および生存の調節において重要な役割を果たしている、ｍＴＯＲシグナル伝達経路の低分子量ＧＴＰアーゼメンバーである。ヒトＲｈｅｂ  ｍＲＮＡ配列はＧＩ：１００９１３２１４に提供されており、一方、ヒトＲｈｅｂタンパク質配列はＧＩ：５０３２０４１に提供されている（これらはそれぞれ参考として援用される）。マウスＲｈｅｂ  ｍＲＮＡ配列はＧＩ：１３３８９３２１１に提供されており、一方、マウスＲｈｅｂタンパク質配列はＧＩ：２８６２６５０８に提供されている（これらはそれぞれ参考として援用される）。
【００２４】
ＩＩ．定義
本発明がより容易に理解され得るように、一定の用語を最初に定義する。さらなる定義は、詳細な説明全体を通して記載する。
【００２５】
「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、その冠詞の１つまたは１つより多くの（すなわち、少なくとも１つの）文法的対象を指すために本明細書において使用される。例として、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つより多くの要素を意味する。
【００２６】
本明細書において使用される場合、「投与する」という用語は、薬剤（例えば、カリクレインファミリーペプチダーゼ、またはカリクレインファミリーペプチダーゼの発現もしくは活性を増加させる薬剤）または組成物を被験体に提供することを意味し、医療専門家による投与および自己投与を含むがこれらに限定されない。
【００２７】
「薬剤」という用語は、化合物、低分子、化合物の混合物、生体高分子（核酸、抗体、タンパク質またはそれらの一部など）、または細菌、植物、真菌または動物（特に、哺乳動物）細胞もしくは組織などの生物学的材料から作製された抽出物を表すのに本明細書において使用される。薬剤は、本明細書において以下に記載されるスクリーニングアッセイによって、特定の活性（例えば、インスリン感受性の増強）を有すると同定され得る。このような薬剤の活性により、それらは、被験体において局所的にまたは全身的に作用する生物学的、生理学的または薬学的に活性な物質（複数物質も可）である「治療剤」として適切なものになり得る。
【００２８】
「アミノ酸」という用語は、天然または合成のものに関係なく、アミノ官能基および酸性官能基の両方を含み、天然に存在するアミノ酸のポリマーに含まれ得るすべての分子を包含することを意図する。例示的なアミノ酸としては、天然に存在するアミノ酸；その類似体、誘導体および同類物（ｃｏｎｇｅｎｅｒ）；バリアント側鎖を有するアミノ酸類似体；ならびに前記のいずれかの立体異性体すべてが挙げられる。
【００２９】
「生物学的に活性な断片」という用語は、カリクレインファミリーペプチダーゼ全体の生物学的活性の少なくとも一部（例えば、インスリン感受性を増強する能力）を保持するカリクレインファミリーペプチダーゼの断片を指す。
【００３０】
本明細書において使用される「糖尿病」という用語は、多数の周知の状態を指す。インスリン抵抗性は、グルコース負荷に対する正常応答を上回る循環インスリンレベルが、正常血糖状態を維持するのに必要とされる状態と定義されている（Ｆｏｒｄ  Ｅ  Ｓら、ＪＡＭＡ．（２００２）２８７：３５６−９（これは、参照により明確に援用される））。インスリン抵抗性、および治療に対するインスリン抵抗性を有する被験体の応答は、インスリン抵抗性の信頼できる指標である、インスリン抵抗性に対するホメオスタシスモデル評価（ＨＯＭＡ−ＩＲ）スコアを評価することによって定量され得る（Ｋａｔｓｕｋｉ  Ａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２００１；２４：３６２−５（これは、参照により明確に援用される））。ホメオスタシス評価モデル（ＨＯＭＡ）−ＩＲスコアによるインスリン抵抗性の評価は、式（Ｇａｌｖｉｎ  Ｐら、Ｄｉａｂｅｔ  Ｍｅｄ  １９９２；９：９２１−８）：ＨＯＭＡ−ＩＲ＝［空腹時血清インスリン（μＵ／ｍＬ）］×［空腹時血漿グルコース（ｍｍｏｌ／Ｌ）／２２．５］を用いて計算される。耐糖能障害（ＩＧＴ）または２型糖尿病を発症する素因を有する被験体は、正常血糖を有する高インスリン血症者であり、定義上インスリン抵抗性である。インスリン抵抗性を有する典型的な被験体は、通常、体重過多または肥満である。「前糖尿病」という用語は、個体が２型糖尿病を発症する素因を有する状態である。前糖尿病は、耐糖能障害の定義を拡大して、空腹時血中グルコースが１００ｍｇ／ｄＬの高正常範囲内であり（Ｊ．Ｂ．Ｍｅｉｇｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２００３；５２：１４７５−１４８４（これは、参照により明確に援用される））、空腹時高インスリン血症（血漿インスリン濃度の上昇）を有する個体まで含む。重篤な健康への脅威として前糖尿病を同定するための科学的かつ医学的な根拠は、「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｒ  Ｄｅｌａｙ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  ２  Ｄｉａｂｅｔｅｓ」とのタイトルのＰｏｓｉｔｉｏｎ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎおよびｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓによる共同出版（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２００２；２５：７４２−７４９（これは、参照により明確に援用される））において説明されている。インスリン抵抗性を有する可能性がある個体は、以下の属性のうちの２つ以上を有する者である：１）体重過多または肥満、２）高血圧症、３）高脂血症、４）ＩＧＴまたは２型糖尿病と診断された一親等血縁者が１人以上いること。インスリン抵抗性は、これらの個体においてＨＯＭＡ−ＩＲスコアを計算することによって確認され得る。インスリン抵抗性は、個体が＞４．０のＨＯＭＡ−ＩＲスコアを有するか、またはグルコースおよびインスリンアッセイを実施する研究所について定義される正常の上限を上回るＨＯＭＡ−ＩＲスコアを有する臨床状態と定義されてもよい。２型糖尿病は、被験体が、１２５ｍｇ／ｄｌ（６．９４ｍｍｏｌ／Ｌ）よりも大きい空腹時血中グルコースまたは血清グルコース濃度を有する状態と定義される。加えて、インスリン受容体リン酸化の調節（例えば、インスリン受容体リン酸化の増加）および／または長期化されたインスリン受容体リン酸化についての測定結果にしたがう本発明のいくつかの実施形態では、糖尿病の処置、予防または診断が、測定または達成され得る。
【００３１】
「単離されたポリペプチド」という用語は、ある種の実施形態では組換えＤＮＡもしくはＲＮＡから調製されたポリペプチド、または合成起源のポリペプチド、またはそれらの何らかの組み合わせであって、（１）天然ではそれが通常付随して見い出されるタンパク質に付随していないもの、（２）それが通常存在する細胞から単離されるもの、（３）同じ細胞起源からの他のタンパク質を伴わずに単離されるもの、（４）異なる種に由来する細胞によって発現されるもの、または（５）天然に存在しないものを指す。
【００３２】
「代謝障害」という用語は、被験体における代謝異常（すなわち、エネルギーを生命プロセスおよび生命活動に提供する生細胞における化学変化）によって引き起こされるか、または前記代謝異常を特徴とする障害、疾患または状態を含む。代謝障害は、熱産生の異常または異常脂肪細胞（例えば、褐色脂肪細胞または白色脂肪細胞）含量もしくは機能に関連する疾患、障害または状態を含む。代謝障害は、細胞の機能、例えば細胞の増殖、成長、分化または移動、細胞のホメオスタシス調節、細胞間または細胞内の連絡；組織の機能、例えば肝機能、筋機能または脂肪細胞機能；生物における全身性反応、例えばホルモン反応（例えば、インスリン反応）に有害な影響を与え得る。
【００３３】
代謝障害の例としては、肥満症（例えばインスリン抵抗性肥満症）、糖尿病、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭまたはＩＩ型糖尿病）、インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭまたはＩ型糖尿病）、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性（例えば耐糖能障害）、耐糖能低下、アテローム硬化症、アテローム性疾患、心疾患、高血圧症、卒中、Ｘ症候群、過食症、内分泌異常、トリグリセリド貯蔵病、バルデー・ビードル症候群、ローレンス・ムーン症候群、プラダー・ラブハート・ウィリー症候群、ウェルナー症候群、脂質生合成、脂質運搬、トリグリセリドレベル、血漿レベルおよび血漿コレステロールに関連する機能不全、高脂血症、遊離脂肪酸上昇、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、低密度リポタンパク質−（ＬＤＬ）−コレステロール上昇、極低密度リポタンパク質−（ＶＬＤＬ）−コレステロール上昇、中密度リポタンパク質−（ＩＤＬ）−コレステロール上昇または高密度リポタンパク質−（ＨＤＬ）−コレステロール低減に関連する異脂肪血症が挙げられる。代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）は、代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）の少なくとも１つの症状が軽減されるか、終結されるか、遅延されるかまたは予防される場合、「処置されて」いる。本明細書において使用される場合、代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）はまた、代謝障害（例えば、糖尿病および／または肥満症）の再発または転移が低減されるか、遅くされるか、遅延されるかまたは予防される場合、「処置され」ている。
【００３４】
加えて、代謝障害は、１つまたはそれより多くの別個の表現型に関連する。例えば、被験体のボディマス指数（ＢＭＩ）は、ＢＭＩがｋｇ／ｍ２の単位を有するように体重（キログラム単位）を身長（メートル単位）の二乗で割ったものと定義される。いくつかの実施形態では、肥満症は、個体が３０ｋｇ／ｍ２に等しいかまたはそれより高いＢＭＩを有する状態と定義される。別の態様では、この肥満症という用語は、いくつかの実施形態ではウエスト・ヒップ比が男性では１．０および女性では０．８であると定義でき、別の態様ではインスリン抵抗性および前糖尿病の発症のリスクを規定する、内臓型肥満を意味するのに使用される。一実施形態では、正常血糖は、被験体が、７０ｍｇ／ｄｌ（３．８９ｍｍｏｌ／Ｌ）よりも大きく、１１０ｍｇ／ｄｌ（６．１１ｍｍｏｌ／Ｌ）未満の正常範囲内の空腹時血中グルコース濃度を有する状態と定義される。空腹時という単語は、医学用語としての通常の意味を有する。一実施形態では、耐糖能障害（ＩＧＴ）は、被験体が、１１０ｍｇ／ｄｌよりも大きく、１２６ｍｇ／ｄｌ（７．００ｍｍｏｌ／Ｌ）未満の空腹時血中グルコース濃度または空腹時血清グルコース濃度を有するか、または１４０ｍｇ／ｄｌ（７．７８ｍｍｏｌ／Ｌ）よりも大きく、２００ｍｇ／ｄｌ（１１．１１ｍｍｏｌ／Ｌ）未満の食後２時間血中グルコースまたは血清グルコース濃度を有する状態と定義される。耐糖能障害という用語は、空腹時血糖異常の状態に適用することも意図する。一実施形態では、高インスリン血症は、正常血糖を有するかまたは有さない、インスリン抵抗性を有する被験体が、インスリン抵抗性を有さず、＜１．０（男性の場合）または＜０．８（女性の場合）のウエスト・ヒップ比を有する痩せた正常個体の場合より上に上昇した空腹時または食後の血清または血漿中インスリン濃度を有する状態と定義される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、「肥満症」は、３０ｋｇ／ｍ２またはそれより高いボディマス指数（ＢＭＩ）を指す（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ（１９９８）（これは、参照により明確に援用される））。しかしながら、本発明のいくつかの実施形態では、少なくとも部分的には、２５ｋｇ／ｍ２もしくはそれより高い、２６ｋｇ／ｍ２もしくはそれより高い、２７ｋｇ／ｍ２もしくはそれより高い、２８ｋｇ／ｍ２もしくはそれより高い、２９ｋｇ／ｍ２もしくはそれより高い、２９．５ｋｇ／ｍ２もしくはそれより高い、または２９．９ｋｇ／ｍ２もしくはそれより高い（これらはすべて、典型的には、体重過多と称される）ボディマス指数（ＢＭＩ）を特徴とする疾患、障害または状態を含むものとする（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ（１９９８）（これは、参照により具体的に援用される））。本明細書において記載される肥満症は、遺伝的なものであろうと環境的なものであろうと、何らかの原因によるものであり得る。一実施形態では、「肥満症の予防」は、肥満状態が始まる前に処置が施される場合に肥満症または肥満症関連障害が起こるのを防ぐことを指す。また、肥満症または肥満症関連障害を既に患っているかまたはこれらの症状を有する被験体において処置が開始される場合には、このような処置は、肥満症または肥満症関連障害を阻止するかまたはこれらの進行を阻止すると予想される。
【００３６】
「肥満症関連障害」という用語は、肥満症に随伴するか、または少なくとも部分的には肥満によって引き起こされるすべての障害を含む。肥満症関連障害としては、例えば、糖尿病；心臓血管疾患；高血圧症；深部静脈血栓症；変形性関節症；閉塞性睡眠時無呼吸；癌および非アルコール性脂肪肝疾患が挙げられる。
【００３７】
「パーセント同一（の）」という用語は、２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の配列同一性を指す。同一性はそれぞれ、比較目的でアラインメントされ得る各配列の位置を比較することによって決定できる。比較される配列の相当する（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）位置が同一の塩基またはアミノ酸によって占められている場合、それらの分子はその位置において同一である；相当する部位が同一または類似の（例えば、立体的および／または電子的な性質が類似の）アミノ酸残基によって占められている場合、それらの分子はその位置において相同（類似）であるということができる。相同性、類似性または同一性のパーセンテージとしての表現は、比較される配列によって共有される位置における同一または類似のアミノ酸の数の関数を指す。相同性、類似性または同一性のパーセンテージとしての表現は、比較配列によって共有される位置における同一または類似アミノ酸の数の関数を指す。ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＥＮＴＲＥＺをはじめとする種々のアラインメントアルゴリズムおよび／またはプログラムを使用してもよい。ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴはＧＣＧ配列解析パッケージ（ウィスコンシン大学、マディソン、ウィスコンシン）の一部として利用可能であり、例えばデフォルト設定で使用できる。ＥＮＴＲＥＺは、国立衛生研究所の国立医学図書館の国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）（ベセスダ、メリーランド）を通して利用可能である。一実施形態では、２つの配列の同一性パーセントは、ギャップウェイトを１としたＧＣＧプログラム（例えば、各アミノ酸ギャップは、それが２つの配列間の１個のアミノ酸またはヌクレオチドのミスマッチであったかのように重み付けする）によって決定できる。
【００３８】
その他のアラインメント技術はＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第２６６巻：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６）（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ＆Ｃｏ．の一部門、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）に記載されている。好ましくは、配列中のギャップを許容するアラインメントプログラムを利用して、配列をアラインメントする。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメント中のギャップを許容するアルゴリズムの一種である。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７（１９９７）（これは、参考として本明細書に援用される）を参照。また、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアラインメント法を使用するＧＡＰプログラムを利用して、配列をアラインメントすることもできる。代替的な検索戦略は、ＭＡＳＰＡＲコンピュータで動作するＭＰＳＲＣＨソフトウェアを使用する。ＭＰＳＲＣＨはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して、大規模並列処理コンピュータで配列をスコア化する。この手法は遠縁の一致を見つける能力を改善し、小さなギャップおよびヌクレオチド配列エラーに対して特に寛容である。核酸によってコードされるアミノ酸配列を使用して、タンパク質データベースおよびＤＮＡデータベースの両方を検索できる。
【００３９】
「薬学的に許容され得る担体」という用語は当該技術分野において認められており、任意の対象組成物またはその成分を一臓器または体の一部から別の臓器または体の一部に運搬または輸送するのに関与する薬学的に許容され得る材料、組成物またはビヒクル（例えば、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料）を指す。各担体は、対象組成物およびその成分と適合性であり、患者に有害ではないという意味で「許容され得る」ものでなければならない。薬学的に許容され得る担体として機能し得る材料のいくつかの例としては、以下のものが挙げられる：（１）糖類、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）デンプン類、例えばコーンスターチおよびジャガイモデンプン；（３）セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；（４）トラガカント粉末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えばココアバターおよび坐剤ワックス；（９）油類、例えば落花生油、綿実油、紅花油，ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油；（１０）グリコール類、例えばプロピレングリコール；（１１）ポリオール類、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質不含有蒸留水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝溶液；ならびに（２１）医薬製剤に用いられるその他の非毒性適合性物質。
【００４０】
「ポリペプチド断片」または「断片」という用語は、参照ポリペプチドを参照して使用される場合、参照ポリペプチドそれ自体と比較してアミノ酸残基が欠失しているが、残りのアミノ酸配列は、通常、参照ポリペプチドの対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。このような欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端、あるいはその両方で起こり得る。断片は、典型的には、少なくとも５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０アミノ酸長、少なくとも７５アミノ酸長、または少なくとも１００、１１５、１２５、１３５、１５０、１６０、１７５、１８０、１９０、２００、２１５、２３０、２５０、２７５、２９０、３００、２５０、４００、４２５、４５０、４７５、５００もしくはそれより長いアミノ酸長である。断片は、参照ポリペプチドの生物学的活性のうちの１つまたはそれより多くを保持し得る。ある種の実施形態では、断片は、ドラッガブル（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）領域と、場合により、前記ドラッガブル領域の一端または両端上にある追加のアミノ酸を含み得、この追加のアミノ酸は、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、または最大１００個もしくはそれより多くの数の残基であり得る。さらに、断片は、特定領域のサブ断片であって、それが由来する領域の機能を保持するサブ断片を含み得る。別の実施形態では、断片は、免疫原特性を有し得る。断片は、野生型タンパク質のＮ末端またはＣ末端の約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、７５個、１００個またはそれより多くのアミノ酸が欠けていてもよい。
【００４１】
「低分子」という用語は当該技術分野において認められており、約２０００ａｍｕ未満または約１０００ａｍｕ未満、およびさらには約５００ａｍｕ未満の分子量を有する構成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を指す。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質またはその他の有機（炭素含有）分子もしくは無機分子であり得る。多くの製薬会社は、化学的および／または生物学的な混合物（しばしば、真菌、細菌または藻類の抽出物）の大規模なライブラリーであって、本明細書において記載されるアッセイのいずれかでスクリーニングできるライブラリーを有する。「小有機分子」という用語は、有機化合物または医薬化合物であるとしばしば同定される低分子を指し、もっぱら核酸、ペプチドまたはポリペプチドである分子を含まない。
【００４２】
本明細書において使用される「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」および「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔｓ）」という用語は、動物（例えば、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ロバ、ヤギ、ラクダ、ネコ、イヌ、モルモット、ラット、マウス、ヒツジ）、および霊長類（例えば、サル、例えばカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）、ゴリラ、チンパンジーおよびヒト）をはじめとする哺乳動物）を指す。いくつかの実施形態では、被験体または患者は、肥満症などの代謝障害に罹患している。
【００４３】
本明細書において使用される場合、「治療有効量」および「有効量」という語句は、本発明の化合物、本発明の化合物を含む材料または組成物の量であって、動物の細胞の少なくとも部分集団において、任意の医療処置に適用可能な合理的な利点／リスク比で何らかの所望の治療効果をもたらすのに有効な量を意味する。
【００４４】
被験体における疾患を「処置する」または疾患を有する被験体を「処置する」は、疾患の少なくとも１つの症状を軽減するか、または悪化するのを予防するように、被験体を薬学的な処置に供すること、例えば薬物を投与することを指す。
【００４５】
ＩＩＩ．カリクレインファミリーペプチダーゼ
本明細書において使用される場合、「カリクレインファミリーペプチダーゼ」または「カリクレインファミリーメンバータンパク質」という用語は、そのアミノ酸配列が配列番号１〜４１に示されているセリンプロテアーゼ（ｓｅｒｅｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）のファミリー、ならびにその生物学的に活性な断片（例えば、少なくとも、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２２５、２３０、２３５または２４０のアミノ酸の断片）およびそれらの生物学的に活性な相同バリアント（例えば、配列番号１〜４１に示されている配列と少なくとも、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するタンパク質）を指す。カリクレインファミリーメンバーの例示的な生物学的に活性な断片および／または相同バリアントは、例えば、セリンプロテアーゼ活性、および／またはインスリン感受性を増強する能力を有し得る。カリクレインファミリーメンバータンパク質のバリアントは、部位特異的変異誘発法およびランダム変異誘発法をはじめとする標準的な手段によって製造され得る。いくつかの実施形態では、カリクレイン関連ペプチダーゼは、Ｋｌｋ１ｂ２２（配列番号３８）またはその断片もしくは相同バリアントである。いくつかの実施形態では、カリクレイン関連ペプチダーゼは、Ｋｌｋ１（配列番号１）もしくはＫｌｋ１２（配列番号１２）またはそれらの断片もしくは相同バリアントである。
【００４６】
カリクレインファミリーメンバータンパク質は、しばしば、不活性なプレタンパク質の形態で翻訳され、この後、このプレタンパク質はタンパク質分解的に切断されて活性タンパク質になる（例えば、Ｓｃｈｍａｉｅｒ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ８：１６１−１６５（２００８）（これは、参照により本明細書に明確に援用される）参照）。本明細書において使用される場合、「カリクレインファミリーペプチダーゼ」および「カリクレインファミリーメンバータンパク質」という用語は、不活性なプロタンパク質およびそのタンパク質の活性形態の両方を包含する。
【００４７】
カリクレインファミリーメンバータンパク質がインスリン感受性を増強する能力は、当該技術分野において公知の任意の方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかで決定され得る。例えば、カリクレインファミリーメンバータンパク質がインスリン感受性を増強する能力をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定するためには、培養中に増殖している細胞株に前記タンパク質を添加し、そしてインスリンに応じたインスリン受容体のリン酸化を経時的に測定し得る。カリクレインファミリーメンバータンパク質がインスリン感受性を増強する能力をｉｎ  ｖｉｖｏで測定するためには、前記タンパク質を動物（例えば、マウス）に注射するか、または前記動物で発現させ、そしてグルコースのボーラス投与後またはインスリン注射後の血中グルコースクリアランスを決定し得る。インスリン感受性を測定する方法の非限定的な例も以下の実施例に示されている。
【００４８】
ある種の実施形態では、本明細書において記載されるタンパク質は、異種ポリペプチド（例えばその溶解度を増加させ、ならびに／またはその精製、同定、検出および／もしくは構造特性決定を容易にするドメインを含むポリペプチド）にさらに連結されている。本明細書において記載されるタンパク質は、少なくとも、２個、３個、４個、５個またはそれより多くの異種ポリペプチドに連結され得る。ポリペプチドは、複数コピーの同じ異種ポリペプチドに連結されてもよいし、２種以上の異種ポリペプチドに連結されてもよい。融合は、ポリペプチドのＮ末端、ポリペプチドのＣ末端、またはポリペプチドのＮ末端およびＣ末端の両方で起こり得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の構築を容易にするために、または融合タンパク質のタンパク質発現もしくは構造的拘束を最適化するために、リンカー配列が、本明細書において記載されるタンパク質と融合ドメインとの間に含まれる。
【００４９】
別の実施形態では、タンパク質は、その細胞膜横断速度が増加するように改変され得る。例えば、前記ポリペプチドは、「トランスサイトーシス」（例えば、細胞によるペプチドの取り込み）を促進する第２のペプチドに融合され得る。前記ペプチドは、ＨＩＶ転写活性化（ＴＡＴ）タンパク質の一部（例えば、ＴＡＴの３７位〜６２位または４８位〜６０位の残基に対応する断片（これらの部分は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞によって迅速に取り込まれることが観察されている（ＧｒｅｅｎおよびＬｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５５：１１７９−１１８８）））であり得る。あるいは、内在化ペプチドは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａアンテナペディア（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）タンパク質またはその相同体に由来し得る。ホメオタンパク質アンテナペディアの６０アミノ酸長のホメオドメインは生体膜を通してトランスロケーションすることが実証されており、それが結合している異種ポリペプチドのトランスロケーションを容易にすることができる。したがって、トランスサイトーシスのために、前記ポリペプチドは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａアンテナペディアのほぼアミノ酸４２〜５８からなるペプチドまたはより短い断片に融合され得る（Ｄｅｒｏｓｓｉら、（１９９６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：１８１８８−１８１９３；Ｄｅｒｏｓｓｉら、（１９９４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：１０４４４−１０４５０；およびＰｅｒｅｚら、（１９９２）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １０２：７１７−７２２（これらはすべて、参考として援用される、））。トランスサイトーシスポリペプチドはまた、天然に存在しない膜トランスロケーション配列（ＭＴＳ）（例えば、米国特許第６，２４８，５５８号（これは、参考として援用される）に開示されているペプチド配列）であり得る。
【００５０】
ＩＶ．カリクレインファミリーペプチダーゼ発現の誘導因子
本明細書において記載されるある種の方法は、カリクレインファミリーペプチダーゼの活性および／または発現を増加または減少させる薬剤の投与に関する。カリクレインファミリーペプチダーゼの発現または活性を増加させるのに使用され得る薬剤としては、抗体（例えば、コンジュゲート抗体）、タンパク質、ペプチド、低分子および阻害性ＲＮＡ分子、例えばｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。このような薬剤は、本明細書において記載されるもの、当該技術分野において公知のもの、または慣用のスクリーニングアッセイ（例えば、本明細書において記載されるスクリーニングアッセイ）によって同定されたものであり得る。例えば、いくつかの実施形態では、前記薬剤は、ＲｈｅＢ  ＧＴＰアーゼに特異的な阻害性ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ分子）である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、アッセイは、本明細書において記載される方法において有用な薬剤を同定するのに使用される。例えば、試験化合物が、インスリン感受性を増加させるための、褐色脂肪レベルを増加させるための、糖尿病を処置するための、代謝障害を処置するための、または肥満症を処置するための有望な治療剤であるか否かを決定するための方法が本明細書において提供される。一般に、このような方法は、（ａ）細胞を前記試験化合物に接触させる工程；および（ｂ）前記細胞によるカリクレインファミリーペプチダーゼ（例えば、Ｋｌｋ１ｂ２２、Ｋｌｋ１またはＫｌｋ１２）の発現を検出する工程を含む。（例えば、プラセボで処置された細胞または未処置細胞と比較して）カリクレインファミリーペプチダーゼの発現増加を引き起こす試験化合物は、有望な治療剤である。
【００５２】
任意の細胞が、上記スクリーニング方法において使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、前記細胞は、マウス細胞またはヒト細胞である。ある種の実施形態では、前記細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞株である。スクリーニングにおいて使用される細胞は初代細胞でもよいし、細胞株でもよい。本明細書において記載されるスクリーニングアッセイにおいて有用なその他の細胞株の例としては、２９３−Ｔ細胞、３Ｔ３細胞、７２１細胞、９Ｌ細胞、Ａ２７８０細胞、Ａ１７２細胞、Ａ２５３細胞、Ａ４３１細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＨＣＡ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ジャーカット細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞およびベロ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５３】
カリクレインファミリーペプチダーゼの発現は、当該技術分野において公知の任意の方法を使用して検出され得る。例えば、カリクレインファミリーペプチダーゼの発現は、例えば、検出可能に標識された核酸プローブ、ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはマイクロアレイ技術を使用して、カリクレインファミリーペプチダーゼｍＲＮＡを検出することによって検出され得る。カリクレインファミリーペプチダーゼの発現はまた、例えば、カリクレインファミリープロテアーゼに対する結合特異性を有する検出可能に標識された抗体を使用して、カリクレインファミリーペプチダーゼタンパク質を検出することによって検出され得る。
【００５４】
いくつかの実施形態では、アッセイの実施を容易にするように遺伝子操作された細胞が、スクリーニングアッセイにおいて使用される。例えば、いくつかの実施形態では、前記細胞は、カリクレインファミリーペプチダーゼが、検出可能な部分（例えば、ＧＦＰなどの蛍光部分、またはルシフェラーゼなどの発光部分）に連結された異種タンパク質として発現するように操作される。その他の実施形態では、前記細胞は、カリクレインファミリーメンバーのプロモーターに作動可能に連結された検出可能な部分をコードする核酸配列を含有する。このような実施形態では、カリクレインファミリーペプチダーゼの発現を検出するのではなく、前記検出可能な部分の発現が直接検出される。このような細胞は、当該技術分野において周知の標準的な組換え技術を使用して作製され得る。
【００５５】
本発明の方法において有用な薬剤は、天然および／または合成の化合物の系統的ライブラリーを含む任意の利用可能な供給源から得られ得る。薬剤は、当該技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数の手法のいずれかによっても得ることができ、この手法としては、生物学的ライブラリー；ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能を有するが新規な非ペプチド骨格を有する分子であって、酵素分解耐性であるにもかかわらず生物活性を保持する分子のライブラリー；例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８−８５（これは、参考として援用される）参照）；空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ−１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法が挙げられる。生物学的ライブラリーおよびペプトイドライブラリーの手法はペプチドライブラリーに限定されるが、その他の４つの手法は、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは低分子のライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ，１９９７，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５（これは、参考として援用される））。
【００５６】
分子ライブラリーを合成するための方法の例は、当該技術分野において、例えばＤｅＷｉｔｔら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、（１９９４）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら、（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら、（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら、（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３（これらはすべて、参照により本明細書に援用される）に見い出され得る。
【００５７】
Ｖ．Ｒｈｅｂの活性または発現が低下した組換え細胞
本明細書において記載されるある種の実施形態は、Ｒｈｅｂの発現または活性が低下した１以上の組換え細胞の投与に関する。ある種の実施形態では、Ｒｈｅｂの低下したレベルの発現または活性は、前記組換え細胞と同じタイプおよび種の非組換え細胞と比較してのものである。例えば、前記組換え細胞は、非組換えヒトＴ細胞と比較してＲｈｅｂ発現が低下した組換えヒトＴ細胞であり得る。ある種の実施形態では、前記組換え細胞および比較される前記非組換え細胞は、同じ生物（例えば、同一人物）に由来するものである。ある種の実施形態では、前記組換え細胞のＲｈｅｂの発現または活性は、前記非組換え細胞のＲｈｅｂ発現の７５％、５０％、４０％、３５％、５０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％である。前記レベルまたはＲｈｅｂの発現は、例えば、当該技術分野において公知の方法（例えば定量的ＲＴ−ＰＣＲまたはウエスタンブロッティング）を使用して決定され得る。いくつかの実施形態では、前記組換え細胞は、Ｒｈｅｂの発現も活性も有しない。
【００５８】
前記組換え細胞におけるＲｈｅｂ発現のレベルは、当該技術分野において公知の組換えＤＮＡ技術を使用して低減され得る。例えば、ある種の実施形態では、細胞におけるＲｈｅｂ遺伝子および／またはＲｈｅｂプロモーターの一方または両方を変異またはノックアウトして、前記組換え細胞を作製する。いくつかの実施形態では、Ｒｈｅｂ特異的阻害性ＲＮＡ発現ベクターを前記組換え細胞に導入して、それらがＲｈｅｂ特異的阻害性ＲＮＡ分子を発現するようにする。
【００５９】
いくつかの実施形態では、前記組換え細胞は、免疫細胞または免疫細胞前駆体（例えばリンパ球またはリンパ球前駆体）である。例えば、いくつかの実施形態では、前記組換え細胞は、Ｔ細胞、Ｔ細胞前駆体、Ｂ細胞、Ｂ細胞前駆体、骨髄幹細胞、胚性幹細胞、誘導胚性幹細胞、末梢血幹細胞またはそれらの組み合わせである。
【００６０】
いくつかの実施形態では、前記組換え細胞は、それらが投与されることになっている前記被験体と同系である。前記被験体と同系の組換え細胞は、例えば、前記被験体から採取された非組換え細胞を、Ｒｈｅｂの発現または活性が低下した組換え細胞に変換するための組換え遺伝子技術を使用することによって作製され得る。
【００６１】
ＶＩ．医薬組成物
本明細書において記載される薬剤（例えば、カリクレインファミリーペプチダーゼ、Ｒｈｅｂの活性もしくは発現が低下した細胞、および／またはカリクレインファミリーペプチダーゼの発現もしくは活性を増加させる薬剤）は、被験体に投与するのに適切な医薬組成物に組み込まれ得る。前記組成物は、単一のこのような薬剤、または本明細書において記載される調節剤の任意の組み合わせと、薬学的に許容され得る担体とを含有し得る。前記医薬組成物は、糖尿病または代謝障害（例えば肥満症）を処置するのに有用なさらなる薬剤をさらに含み得る。
【００６２】
本明細書において記載される場合、「薬学的に許容され得る担体」という用語は、医薬投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含することを意図する。このような媒質および薬剤を薬学的に活性な物質に使用することは、当該技術分野において周知である。任意の従来の媒質または薬剤が前記活性化合物に不適合である場合を除いて、それらを組成物において使用することが企図される。補助的な活性化合物も前記組成物に組み込まれ得る。
【００６３】
本発明の医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、例えば、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、口腔、経皮（局所）、経粘膜および直腸での投与が挙げられる。
【００６４】
本明細書において記載される薬剤の毒性および治療有効性は、（例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定するための）細胞培養または実験動物において、標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性効果の用量と治療効果の用量との比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０という比として表され得る。毒性副作用を示す化合物も使用され得るが、非感染細胞に対する潜在的な損傷を最小限に抑えて副作用を減少させるためには、このような化合物を罹患組織の部位にターゲティングする送達システムを設計するように注意すべきである。
【００６５】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための投与量範囲を策定（ｆｏｒｍｕｌａｔｅ）するのに使用され得る。このような化合物の投与量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全く伴わない循環濃度（ＥＤ５０を含む）の範囲内にある。投与量は、採用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本明細書において記載される本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療有効用量は、細胞培養アッセイから最初に推測され得る。用量は、細胞培養において決定された場合のＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するための動物モデルにおいて策定され得る。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するのに使用され得る。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【００６６】
薬剤の適切な用量は、通常の技能を有する医師、獣医または研究者の知識範囲内の多数の要因に依存する。低分子の用量は、例えば、処置される被験体または試料の正体、大きさおよび状態に応じて、さらには、該当する場合には、前記組成物の投与経路、および本発明の核酸またはポリペプチドに対して低分子が有すると実施者によって所望される効果に応じて変化する。
【００６７】
ＶＩＩ．治療方法
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書において記載される薬剤（例えば、カリクレインファミリーペプチダーゼ、Ｒｈｅｂの発現もしくは活性が低下した組換え細胞、またはカリクレインファミリーペプチダーゼの発現を増加させる薬剤）を被験体（例えば、それを必要とする被験体）に投与することによって、インスリン感受性を増加させるための方法、糖尿病（例えば、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病）を予防または処置するための方法、褐色脂肪レベルを増加させるための方法、代謝障害（例えば、肥満症）を予防または処置するための方法、体重減少を促進するための方法、高脂血症を処置するための方法、ならびに／または心臓血管疾患および血管疾患を処置するための方法に関する。
【００６８】
それを必要とする被験体としては、例えば、糖尿病と診断された被験体、代謝疾患と診断された被験体、肥満である被験体、または代謝疾患もしくは糖尿病について処置された被験体（例えば過去の処置に対して難治性であった被験体）が挙げられ得る。それを必要とする被験体としては、例えば、代謝疾患または糖尿病の素因を有する被験体（例えば肥満症の素因を有する被験体、体重過多である被験体、および代謝疾患または糖尿病の家族歴を有する被験体）も挙げられ得る。
【００６９】
ある種の実施形態では、本明細書において記載される方法は、糖尿病の処置に関する。本明細書において記載される方法は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病および妊娠糖尿病をはじめとする任意の糖尿病型を処置するのに使用され得る。
【００７０】
ある種の実施形態では、本明細書において記載される方法は、任意の代謝障害の処置を包含する。ある種の実施形態では、処置される前記代謝障害は、肥満症、インスリン抵抗性、高インスリン血症、低インスリン血症、ＩＩ型糖尿病、高血圧、肝脂肪過多症（ｈｙｐｅｒｈｅｐａｔｏｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、高尿酸血症、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝疾患、多嚢胞性卵巣症候群、黒色表皮腫、過食症、内分泌異常、トリグリセリド蓄積症、バルデー・ビードル症候群、ローレンス・ムーン症候群、プラダー・ラブハート・ウィリー症候群または筋形成不全である。ある種の実施形態では、前記代謝障害は、肥満症関連障害、例えば糖尿病、心臓血管疾患、高血圧症、深部静脈血栓症、変形性関節症、閉塞性睡眠時無呼吸、癌または非アルコール性脂肪肝疾患である。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本明細書において記載される医薬組成物は、予防的または治療的な処置の一環として、組み込まれる治療剤またはその他の材料の治療有効量を患者に送達するのに十分な量で送達されるべき治療剤を組み込むことになる。活性薬剤の所望濃度は、薬物の吸収、不活性化および排出速度ならびに化合物の送達速度に依存する。投与量の値も緩和されるべき状態の重症度により変化し得ることに留意するべきである。さらに、任意の特定被験体については、個々の必要性および組成物投与を管理または監督する者の専門的な判断にしたがって、具体的な投与レジメンを経時的に調整するべきであることは言うまでもない。典型的には、投与は、当業者に公知の技術を使用して決定される。
【００７２】
対象薬剤の投与量は、薬剤の血漿中濃度を参照することによって決定され得る。例えば、最大血漿中濃度（Ｃｍａｘ）、および時間０から無限大までの血漿中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ（０−４））を使用してもよい。本発明の投与量は、ＣｍａｘおよびＡＵＣ（０−４）についての上記値を生じさせるもの、およびそれらのパラメータについてより大きい値またはより小さい値をもたらすその他の投与量を含む。
【００７３】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者に対する毒性を伴わずに、特定の患者、組成物および投与様式について所望の治療反応を達成するのに有効な量の有効成分が得られるように変化し得る。
【００７４】
選択される投与量レベルは、用いられる特定薬剤の活性、投与経路、投与時間、用いられる特定化合物の排出または代謝の速度、処置期間、用いられる特定化合物と組み合わせて使用されるその他の薬物、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的健康および以前の病歴、ならびに医療分野において周知である同様の要因をはじめとする様々な要因に依存する。
【００７５】
当該技術分野における通常の技能を有する医師または獣医は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定および処方できる。例えば、医師または獣医は、医薬組成物において用いられる本発明の薬剤の用量を、所望の治療効果を達成するために必要とされる用量よりも低いレベルで処方および／または投与し、そして所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることができる。
【００７６】
一般に、本明細書において記載される薬剤の適切な１日用量は、治療効果を生じさせるのに有効な最低用量の薬剤の量である。このような有効量は、一般に、上記要因に依存する。
【００７７】
ある種の実施形態では、前記カリクレインファミリーペプチダーゼは、前記カリクレインファミリーペプチダーゼを発現する細胞の集団を前記被験体に投与することによって、前記被験体に投与される。ある種の実施形態では、前記細胞は、上昇したレベルの前記カリクレインファミリーペプチダーゼを発現するように操作される。例えば、標準的な組換え技術を使用して、構成的プロモーターまたは条件的プロモーターのいずれかに作動可能に連結されたカリクレインファミリーペプチダーゼコード核酸を含有する導入遺伝子を前記細胞に挿入し得る。あるいは、前記細胞は、内因性Ｒｈｅｂ  ＧＴＰアーゼ遺伝子をノックアウトすることによって、または構成的プロモーターもしくは条件的プロモーターのいずれかに機能し得るように連結されたＲｈｅｂ  ＧＴＰアーゼ阻害性ＲＮＡ分子コード核酸を含有する導入遺伝子を挿入することによって、減少したレベルのＲｈｅｂ  ＧＴＰアーゼを発現するように操作され得る。
【００７８】
ある種の実施形態では、カリクレインファミリーペプチダーゼを発現する細胞の集団であって、前記被験体に投与される細胞の集団は、Ｔ細胞、Ｔ細胞前駆体、Ｂ細胞、Ｂ細胞前駆体、骨髄幹細胞、胚性幹細胞、誘導胚性幹細胞、末梢血幹細胞またはそれらの組み合わせを含有する。ある種の実施形態では、前記被験体自身の細胞が、カリクレインを発現する前記細胞の集団を作製するのに使用される。例えば、いくつかの実施形態では、骨髄幹細胞または末梢血幹細胞を前記被験体から単離し、上記のように上昇したレベルのカリクレインファミリーペプチダーゼを発現するように操作し、次いで前記被験体に投与して戻す。このような実施形態では、前記細胞が拒絶される可能性がより低い。
【００７９】
以下の実施例によって本発明をさらに説明するが、以下の実施例は限定的なものと解されるべきではない。本出願全体を通して引用したすべての参考文献、特許および公開特許出願の内容、ならびに図は、参考として本明細書に援用される。
【実施例】
【００８０】
実施例１
ｍＴＯＲシグナル伝達経路は、細胞の増殖および生存の調節において重要な役割を果たしている栄養素感受性カスケードである。ＬｏｘＰ−ｃｒｅ技術を使用して、Ｔ細胞においてのみ、このシグナル伝達カスケードのメンバーであるＲｈｅｂを欠くマウス系統を開発した（本明細書においてＲｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅと称される）。
【００８１】
Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスは、それらの野生型（ＷＴ）カウンターパートよりも速い速度で体重が増加した（図１）。これらのマウスは体脂肪沈着量の実質的な増加を示し、７週齢Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスは、それらの野生型（ＷＴ）カウンターパートと比較して３〜６倍の体脂肪量を示した（図２ａ、図２ｂ）。Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスでは、除脂肪体重（ｌｅａｎ  ｍａｓｓ  ｂｏｄｙ  ｍａｓｓ）の増加はなかった（図２ｃ）。
【００８２】
Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスのグルコース取り込み能を調査したところ、それらは、腹腔内Ｄ−グルコース負荷後に血流からグルコースを取り込む能力の増加（図３ａ）、およびインスリン感受性の増加（図３ｂ）を示すことが観察された。Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスは野生型（ＷＴ）対照よりも低い血清トリグリセリドレベルを有する（図４ａ）が、血清高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レベルには違いがない（図４ｂ）ことも観察された。これは、「健康（ｆｉｔ）」状態に伝統的に関連した表現型であって、重度の肥満個体で通常見られる表現型ではない。
【００８３】
２４時間の期間では、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスは年齢適合野生型（ＷＴ）対照よりも多くの餌を食べたが（図５ａ）、体重３０ｇにつき１時間あたりに食べた餌の量には違いがなく（図５ｂ）、これは、体重の増加が、神経障害によるものではなく、むしろ栄養素代謝についての何らかの違いに起因するものであったことを示唆している。
【００８４】
どの組織が、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスのグルコース取り込みの増強およびインスリン感受性の増加に関与していたのかを決定するために、１８Ｆ−ＦＤＧプロトン放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングを使用して、放射性グルコースの組織内取り込みを可視化した。ＷＴマウスでは、検出可能な（ｄｅｔｅｃｔｉｂｌｅ）シグナルの大部分は、膀胱、脳、心臓および腸に局在していた（図６ａ）。しかしながら、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスでは、肩甲骨間の背部上の組織において、高レベルのグルコース取り込みがあった（図６ｂ）。この解剖学的位置および代謝プロファイルは、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスが、ＷＴ対照と比較して顕著な褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の沈着を有することを示唆している。ＢＡＴは多血管性であり、高いグルコース代謝率を有することが公知である。
【００８５】
肝臓および脂肪の組織のリアルタイムＰＣＲ分析を実施して、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスにおいて観察された表現型を説明する遺伝子発現プロファイルを検出した。Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスの肝臓では、褐色脂肪組織の発達を増強するＴＧＦ−βファミリーのメンバーである骨形態形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）の発現増加が観察された（図７ａ）。Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスでは、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ−２１）の発現増加も観察された。ＦＧＦ−２１は、脂肪組織におけるグルコース取り込みを刺激する因子である（図７ｂ）。最後に、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスの肝臓では、アシルＣｏＡチオエステラーゼＩの発現減少が観察された（図７ｃ）。
【００８６】
Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスに由来するＴ細胞のグルコース利用能を調べた。Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスから単離したＣＤ４  Ｔ細胞は、乳酸産生によって測定した場合に、それらのＷＴカウンターパートよりも低い解糖速度を有する（図８）。
【００８７】
Ｏｘｙｍａｘ間接熱量測定法を使用して、ＷＴおよびＲｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスにおける呼吸交換率（ＲＥＲ）を測定した。この技術は、マウスによって使用された代謝基質の性質を決定し、１に近いスコアは炭水化物の利用を示し、０．７に近いスコアは脂肪の利用を示す。Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスは、明／暗周期の間にＲＥＲスコアの劇的な揺れ幅を示した（図９）。これらの結果は、餌を消費する暗期では、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスは、それらの食餌で消費した炭水化物をエネルギー生産に主に利用することを示唆している。しかしながら、餌をほとんど消費しない明期では、それらは脂肪蓄積に依存している。これらの結果は、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスの高インスリン感受性（ｈｙｐｅｒ−ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）と一致している。
【００８８】
Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスにおいて観察された表現型が、Ｔ細胞以外の組織における異所性Ｒｈｅｂ欠失に起因するものではなかったことを確実にするために、ＷＴおよびＲｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスから単離した骨髄を使用して骨髄移植（ＢＭＴ）を実施し、放射線照射ＷＴレシピエントに注射した。親系統と同様に、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスから骨髄を受け取っているマウスは、ＷＴ骨髄を受け取っているマウスよりも速く体重が増加した（図１０）。
【００８９】
次に、ＣＤ４  Ｔ細胞をＷＴおよびＲｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスからＲａｇ−／−レシピエントに移植した。２．５週間後、マウスを６時間絶食させ、それらが血流からグルコースを取り出す能力を試験した。図１１に示されているように、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスからＣＤ４  Ｔ細胞を受け取っているマウスは、血流からグルコースを取り出す能力の増強を示した。これは、Ｒｈｅｂ活性を欠くＣＤ４  Ｔ細胞集団を単に提供することによって、ホストにおける全体的なグルコース感受性を調節することが可能であることを実証している。
【００９０】
ＷＴおよびＲｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスから単離したＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞のマイクロアレイ解析を実施した。Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスから単離したＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞の両方において、カリクレインプロテアーゼファミリーのメンバーである遺伝子Ｋｌｋ１ｂ２２が非常に高度に発現していた。ＲＴ−ＰＣＲによってこの結果を確認した。
【００９１】
次に、Ｒｈｅｂ欠損Ｔ細胞の養子移植が、長期間の高脂肪食によって誘導されたインスリン不感受性を打ち消すことができるか否かを試験した。この目的を達成するために、ＷＴマウスを６０％脂肪食で２５週間維持したところ、これ以降、マウスの約４０％が顕著なインスリン不感受性を示した。この時点において、糖尿病マウスを低放射線照射（７００ｒａｄ）し、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスから単離した４×１０６個のＣＤ４  Ｔ細胞を静脈内注射した。１週間後、糖尿病マウスを採血して、養子移植したＴ細胞の増殖レベルを決定し、それらのインスリン感受性を決定した。Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅ  Ｔ細胞移植を受けているマウスの約５０％は、インスリン感受性の増加を示した（図１２ａ）。さらに、インスリン感受性が最も強く増加しているマウスは、ドナーＴ細胞による再構成が最も高度なマウスであった（図１２ｂ）。したがって、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅ  Ｔ細胞をＩＩ型糖尿病マウスに移植することにより、それらの糖尿病を治癒することができた。
【００９２】
Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウス血清が高いグルコース取り込みを伝達する能力を試験した。ＷＴおよびＲｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウスを２時間絶食させ、次いで心穿刺によって採血し、それらの血清を単離した。４時間絶食させたＷＴマウスに、１００μｌの血清を静脈内注射した。３０分後、レシピエントマウスに１．５ｇ／ｋｇのＤ−グルコースを腹腔内注射した。血中グルコースレベルを、ＯｎｅＴｏｕｃｈ  Ｕｌｔｒａシステムを使用して測定した。図１３に示されているように、Ｒｈｅｂｆｌ／ｆｌＣＤ４ｃｒｅマウス由来の血清を投与したマウスは、ＷＴマウス由来の血清を投与したマウスと比較して顕著に上昇したレベルのグルコース取り込みを有していた。
【００９３】
実施例２
【００９４】
本実施例では、Ｋｌｋ１ｂ２２が、インスリン用量反応に応じたインスリン受容体リン酸化および長期インスリン受容体リン酸化の両方を増強することをさらに決定した。具体的には、組換え（Ｆｌａｇタグで単離した）Ｋｌｋ１ｂ２２の存在下または非存在下で種々の用量のインスリンと一緒に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をインキュベーションした。溶解産物を回収し、ウエスタンブロット分析によってインスリン受容体リン酸化を評価した（図１８Ａ）。同様に、組換え（Ｆｌａｇタグで単離した）Ｋｌｋ１ｂ２２の存在下または非存在下で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をインキュベーションした。種々の時点で溶解産物を回収し、ウエスタンブロット分析によってインスリン受容体リン酸化を評価した（図１８Ｂ）。図１８Ａ〜図１８Ｂに示されているデータは、Ｋｌｋ１ｂ２２が、インスリン用量反応に応じたインスリン受容体リン酸化および長期インスリン受容体リン酸化の両方を増強することを実証している。
【００９５】
均等物
当業者であれば、本明細書において記載される本発明の具体的な実施形態についての多くの均等物を認識し、または慣用実験にすぎないものを使用して確認できるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるものとする。
【図１】
2014520119.tif 000002
【図２】
2014520119.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
2014520119.tif 000014
【図１４−２】
2014520119.tif 000015
【図１４−３】
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【図１５−１】
2014520119.tif 000017
【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１６−６】
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【図１６−７】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１７−５】
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【図１７−６】
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【図１７−７】
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【図１７−８】
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【図１７−９】
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【図６】
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【図１８】
2014520119.tif 000039
【手続補正書】
【提出日】平成26年2月25日(2014.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014520119000001.app
【国際調査報告】
2014520119.tif 000040
2014520119.tif 000041