(57)【要約】  遺伝的心臓疾患を有する個体から得たヒト体細胞を多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を誘導するように再プログラミングし、心筋細胞に分化させ、分析、スクリーニングプログラムなどに用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補作用剤を心疾患関連スクリーニングするための方法であって、候補作用剤を、心疾患に関連する突然変異をコードする少なくとも１つの対立遺伝子を含むヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から分化させた心筋細胞の１つまたはパネルと接触させるステップと、前記作用剤の形態学的、遺伝学的または機能的なパラメータに対する効果を決定するステップとを含む方法。
【請求項２】
心疾患が、拡張型心筋症（ＤＣＭ）；肥大型心筋症（ＨＣＭ）；アントラサイクリン誘導心毒性；不整脈源性右心室異形成症（ＡＲＶＤ）；左心室非圧縮（ＬＶＮＣ）；左室性単心室（ＤＩＬＶ）；およびＱＴ延長（１型）症候群（ＬＱＴ−１）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
突然変異が、心筋トロポニンＴ（ＴＮＮＴ２）；ミオシン重鎖（ＭＹＨ７）；トロポミオシン１（ＴＰＭ１）；ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）；５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼサブユニットガンマ−２（ＰＲＫＡＧ２）；トロポニンＩ３型（ＴＮＮＩ３）；タイチン（ＴＴＮ）；ミオシン、軽鎖２（ＭＹＬ２）；アクチン、アルファ心筋１（ＡＣＴＣ１）；電位依存性カリウムチャネル、ＫＱＴ様サブファミリー、メンバー１（ＫＣＮＱ１）；プラコフィリン２（ＰＫＰ２）；および心臓ＬＩＭタンパク質（ＣＳＲＰ３）から選択される遺伝子にある、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
心疾患が拡張型心筋症（ＤＣＭ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
突然変異がＴＮＮＴ２  Ｒ１７３Ｗである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
正常な心筋細胞と比較して、ＤＣＭ心筋細胞が、陽性変力ストレスに応答して、最初に陽性であり、後で不全の特性を伴って陰性になる変時作用を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
心疾患が肥大型心筋症（ＨＣＭ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
突然変異がＭＹＨ７  Ｒ６６３Ｈである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
正常な心筋細胞と比較して、ＨＣＭ心筋細胞が細胞サイズの増大、高発生頻度の異常なＣａ２＋トランジェント、および細胞内Ｃａ２＋レベルの上昇を示す、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
心疾患が不整脈源性右心室異形成症（ＡＲＶＤ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
突然変異が、ＰＫＰ２  ２０１３ｄｅｌＣ突然変異またはＰＫＰ２  Ｑ６１７Ｘ突然変異のうちの１つである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
心疾患がＱＴ延長（１型）症候群（ＬＱＴ−１）である、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
突然変異がＫＣＮＱ１  Ｇ２６９Ｓミスセンス突然変異である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
心筋細胞のパネルが、異なる遺伝子型を有する少なくとも２つの心筋細胞を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
心筋細胞のパネルが、異なる環境条件下にある心筋細胞を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
環境条件の１つまたは複数がβ−アドレナリン作動性アゴニストを用いた刺激を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
作用剤の効果を決定するステップが単一細胞分析を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記単一細胞分析が、原子間力顕微鏡、微小電極アレイ記録、パッチクランプ、単一細胞ＰＣＲ、およびカルシウムイメージングのうちの１つまたは複数を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
候補作用剤が薬物候補である、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
候補作用剤が遺伝性作用剤である、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
心疾患に関連する突然変異をコードする少なくとも１つの対立遺伝子を含むヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から分化させた、心筋細胞の単離された集団または心筋細胞のパネル。
【請求項２２】
心疾患が拡張型心筋症（ＤＣＭ）；肥大型心筋症（ＨＣＭ）；アントラサイクリン誘導心毒性；不整脈源性右心室異形成症（ＡＲＶＤ）；左心室非圧縮（ＬＶＮＣ）；左室性単心室（ＤＩＬＶ）；およびＱＴ延長（１型）症候群（ＬＱＴ−１）から選択される、請求項２１に記載のヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から分化させた心筋細胞の単離された集団または心筋細胞のパネル。
【請求項２３】
突然変異が、心筋トロポニンＴ（ＴＮＮＴ２）；ミオシン重鎖（ＭＹＨ７）；トロポミオシン１（ＴＰＭ１）；ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）；５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼサブユニットガンマ−２（ＰＲＫＡＧ２）；トロポニンＩ３型（ＴＮＮＩ３）；タイチン（ＴＴＮ）；ミオシン、軽鎖２（ＭＹＬ２）；アクチン、アルファ心筋１（ＡＣＴＣ１）；電位依存性カリウムチャネル、ＫＱＴ様サブファミリー、メンバー１（ＫＣＮＱ１）；プラコフィリン２（ＰＫＰ２）；および心臓ＬＩＭタンパク質（ＣＳＲＰ３）から選択される遺伝子にある、請求項２１に記載のヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から分化させた心筋細胞の単離された集団または心筋細胞のパネル。
【請求項２４】
心疾患が拡張型心筋症（ＤＣＭ）である、請求項２１に記載の単離された集団。
【請求項２５】
突然変異がＴＮＮＴ２  Ｒ１７３Ｗである、請求項２４に記載の単離された集団。
【請求項２６】
正常な心筋細胞と比較して、ＤＣＭ心筋細胞が、陽性変力ストレスに応答して、最初に陽性であり、後で不全の特性を伴って陰性になる変時作用を有する、請求項２４に記載の単離された集団。
【請求項２７】
心疾患が肥大型心筋症（ＨＣＭ）である、請求項２１に記載の単離された集団。
【請求項２８】
突然変異がＭＹＨ７  Ｒ６６３Ｈである、請求項２７に記載の単離された集団。
【請求項２９】
正常な心筋細胞と比較して、ＨＣＭ心筋細胞が細胞サイズの増大、高発生頻度の異常なＣａ２＋トランジェント、および細胞内Ｃａ２＋レベルの上昇を示す、請求項２７に記載の単離された集団。
【請求項３０】
心筋細胞のパネルが、異なる遺伝子型を有する心筋細胞を含む、請求項２１に記載の単離された集団。
【請求項３１】
心筋細胞のパネルが、異なる環境条件下にある心筋細胞を含む、請求項２６に記載のパネル。
【請求項３２】
環境条件の１つまたは複数がβ−アドレナリン作動性アゴニストを用いた刺激を含む、請求項３１に記載のパネル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究および開発
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）に授与された契約ＨＬ０９９７７６の下で、政府支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
種々の心臓障害には、基礎をなす遺伝的原因がある。例えば、拡張型心筋症（ＤＣＭ）は、心室の拡張および収縮の機能不全を特徴とする心疾患である。ＤＣＭは、冠動脈疾患および高血圧症後の心不全の最も一般的な原因であるだけでなく、心臓移植の主要な適応症でもある。米国単独でのＤＣＭを管理するための費用は４０億ドルから１００億ドルの間であると推定されている。療法に対する別の重要な状態は、筋節の複製により心筋細胞のサイズが増大する肥大型心筋症（ＨＣＭ）である。さらに、心筋細胞の正常なアラインメントが撹乱され、この現象は心筋錯綜配列（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｄｉｓａｒｒａｙ）として公知である。ＨＣＭは、筋節の９つの遺伝子のうちの１つにおける突然変異に起因することが最も一般的である。
【０００３】
筋節タンパク質、細胞骨格タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、および核膜タンパク質、ならびにカルシウム代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子における突然変異はＤＣＭの症例のおよそ３分の１〜半分に関連づけられる。心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）は、筋節の細いフィラメントの活性および心筋細胞（ＣＭ）における筋肉収縮を調節するトロポニン複合体（トロポニンＴ、トロポニンＣ、およびトロポニンＩ）の３つのサブユニットのうちの１つである。ｃＴｎＴは筋節の集合、収縮、および力発生に必須である。心筋トロポニンＴ遺伝子（ＴＮＮＴ２）における突然変異は、多くの場合、ＤＣＭをもたらし、しばしば、低年齢で心臓突然死および心不全を伴う悪性の表現型として発現される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける生化学試験により、力発生の欠陥をもたらすＣａ２＋感受性および／またはＡＴＰアーゼ活性の減少が、特定のＴＮＮＴ２−突然変異誘導ＤＣＭの基礎をなす機構である得ることが見いだされた。
【０００４】
ＴＮＮＴ２突然変異のマウスモデルにより、ヒトＤＣＭ表現型が再現され、それにより、疾患の可能性のある機構について広範囲にわたる洞察がもたらされた。しかし、マウスモデルとヒトモデルとの間にはいくつかの差異が存在する。例えば、マウスの安静時の心拍数はヒトのおよそ１０倍である。マウスＣＭの電気的性質、イオンチャネル寄与、および心臓の発達もヒトとは異なる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生化学アッセイについて心筋細胞内の複雑な細胞内相互作用が欠如していること、およびマウスモデルとの種差により、ＤＣＭの細胞プロセスおよび生理的プロセスを理解するため、ならびに薬物スクリーニングのためのこれらの方法体系の価値が下がる。
【０００５】
さらに、ＤＣＭ患者由来の心臓組織は入手することが難しく、また、長期培養で生存しない。拡張型心筋症および他の遺伝学的な心臓の状態に対する有効な細胞モデルが、有効な療法のスクリーニングおよび開発のために非常に興味深い。
【０００６】
数十億ドルの産業である医薬物の発見には、治療標的の同定および検証、ならびにリード化合物の同定および最適化が伴う。過去数年にわたるゲノミクスおよびコンビナトリアルケミストリーによる取り組みによって生じた潜在的な新規の標的および化学的実体の数の爆発的な増加により、スクリーニングプログラムに巨大な圧力がかかっている。有用な薬物の同定の見返りは巨大であるが、いずれのスクリーニングプログラムからのヒットの百分率も、一般に非常に低い。望ましい化合物スクリーニング方法では、ハイスループット、したがって多くの個々の化合物を試験することを可能にすることによって、および生物学的に関連性のある情報がもたらされ、したがってスクリーニングアッセイによって生じる情報と化合物の薬学的有効性が良好に相関することの両方によって、この問題が解かれる。
【０００７】
薬学的有効性についてのより重要な特徴のいくつかは、標的とする細胞または疾患に対する特異性、関連する投与量において毒性がないこと、および化合物の、その分子標的に対する特異的活性である。本発明はこの問題に対処する。
【０００８】
刊行物。霊長類の分化した体細胞を多能性の状態に再プログラミングするための方法としては、分化した体細胞の核移植、分化した体細胞を多能性幹細胞と融合し、再プログラミングを導いて人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を産生することが挙げられる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋら（２００７）Ｃｅｌｌ  １３１：８６１−８７２；Ｐａｒｋ  ＩＨら（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  ４５１：１４１−１４６；Ｙｕ  Ｊら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１９１７−１９２０；Ｋｉｍ  Ｄら（２００９）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４：４７２−４７６；Ｓｏｌｄｎｅｒ  Ｆら（２００９）Ｃｅｌｌ．１３６：９６４−９７７；Ｈｕａｎｇｆｕ  Ｄら（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１２６９−１２７５；Ｌｉ  Ｗら（２００９）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４：１６−１９）。
【０００９】
対象の追加的な刊行物としては、ＳｔａｄｔｆｅｌｄらＳｃｉｅｎｃｅ  ３２２、９４５−９４９（２００８）；ＯｋｉｔａらＳｃｉｅｎｃｅ  ３２２、９４９−９５３（２００８）；ＫａｊｉらＮａｔｕｒｅ  ４５８、７７１−７７５（２００９）；ＳｏｌｄｎｅｒらＣｅｌｌ  １３６、９６４−９７７（２００９）；ＷｏｌｔｊｅｎらＮａｔｕｒｅ  ４５８、７６６−７７０（２００９）；ＹｕらＳｃｉｅｎｃｅ（２００９）が挙げられる。
【発明の概要】
【００１０】
治療用薬物および治療レジメンのために心筋細胞を疾患関連スクリーニングするための組成物および方法が提供され、該方法では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞培養またはそれに由来する動物モデルを利用する。特に興味深い疾患としては、拡張型心筋症（ＤＣＭ）；肥大型心筋症（ＨＣＭ）；アントラサイクリン誘導心毒性；不整脈源性右心室異形成症（ＡＲＶＤ）；左心室非圧縮（ＬＶＮＣ）；左室性単心室（ｄｏｕｂｌｅ  ｉｎｌｅｔ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）（ＤＩＬＶ）；およびＱＴ延長（１型）症候群（ＬＱＴ−１）が挙げられ、これらには疾患に関する遺伝的な基礎がある。該方法では、患者または保因者の細胞試料、例えば、脂肪細胞、線維芽細胞などから得ることができるヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を利用する。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態では、心疾患に関連する突然変異をコードする少なくとも１つの対立遺伝子を含むヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から分化させた疾患関連心筋細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞培養が提供される。対象の突然変異としては、遺伝子：心筋トロポニンＴ（ＴＮＮＴ２）；ミオシン重鎖（ＭＹＨ７）；トロポミオシン１（ＴＰＭ１）；ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）；５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼサブユニットガンマ−２（ＰＲＫＡＧ２）；トロポニンＩ３型（ＴＮＮＩ３）；タイチン（ＴＴＮ）；ミオシン、軽鎖２（ＭＹＬ２）；アクチン、アルファ心筋１（ＡＣＴＣ１）；電位依存性カリウムチャネル、ＫＱＴ様サブファミリー、メンバー１（ＫＣＮＱ１）；プラコフィリン２（ＰＫＰ２）；および心臓ＬＩＭタンパク質（ＣＳＲＰ３）における突然変異が挙げられる。対象の特定の突然変異としては、限定することなく、ＭＹＨ７  Ｒ６６３Ｈ突然変異；ＴＮＮＴ２  Ｒ１７３Ｗ；ＰＫＰ２  ２０１３ｄｅｌＣ突然変異；ＰＫＰ２  Ｑ６１７Ｘ突然変異；およびＫＣＮＱ１  Ｇ２６９Ｓミスセンス突然変異が挙げられる。
【００１２】
いくつかの実施形態では、そのような心筋細胞のパネルが提供され、パネルは、２つ以上の異なる疾患関連心筋細胞を含む。いくつかの実施形態では、そのような心筋細胞のパネルが提供され、心筋細胞は複数の候補作用剤、または複数の用量の候補作用剤に供される。候補作用剤としては、対象のＲＮＡの発現を増加または減少させる小分子、すなわち薬物、遺伝子構築物、電気的変化などが挙げられる。いくつかの実施形態では、疾患関連心筋細胞をｉｎ  ｖｉｖｏ環境に、例えば、動物モデルにおいて外植片として導入または誘導して、ｉＰＳ細胞から分化させる。いくつかの実施形態では、パネルとは、２つ以上の別個の心臓の状態、および３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上であってよい別個の状態に由来する、患者特異的心筋細胞を利用するシステムまたは方法を指し、状態は、拡張型心筋症（ＤＣＭ）；肥大型心筋症（ＨＣＭ）；アントラサイクリン誘導心毒性；不整脈源性右心室異形成症（ＡＲＶＤ）；左心室非圧縮（ＬＶＮＣ）；左室性単心室（ＤＩＬＶ）；およびＱＴ延長（１型）症候群（ＬＱＴ−１）から選択される。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態では、疾患関連心筋細胞に対する候補作用剤の活性を決定するための方法であって、候補作用剤を、心疾患に関連する突然変異をコードする少なくとも１つの対立遺伝子を含むヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から分化させた心筋細胞の１つまたはパネルと接触させるステップと、これだけに限定することなく、カルシウムトランジェントの振幅、細胞内のＣａ２＋レベル、細胞サイズ収縮力（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｆｏｒｃｅ）発生、拍動数、筋節α−アクチニン分布、および遺伝子発現プロファイリングを含めた形態学的、遺伝学的または機能的なパラメータに対する作用剤の効果を決定するステップとを含む方法が提供される。単一細胞レベルで分析する方法、例えば、原子間力顕微鏡、微小電極アレイ記録、パッチクランプ、単一細胞ＰＣＲ、カルシウムイメージングなどが特に興味深い。
【００１４】
疾患がＤＣＭである場合、心筋細胞を、候補作用剤と接触させる前、その間、またはその後にβ−アドレナリン作動性アゴニストなどの陽性変力ストレスを用いて刺激することができる。いくつかの実施形態では、β−アドレナリン作動性アゴニストはノルエピネフリンである。本明細書では、ＤＭＣ心筋細胞は陽性変力ストレスに応答して、最初に陽性であり、後で、不全の特性、例えば、拍動数の減少、収縮が弱まること、および異常な筋節α−アクチニン分布を有する細胞が有意に多いことなどを伴って陰性になる変時作用を有することが示されている。β−アドレナリン作動性遮断薬による処理および筋小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ（Ｓｅｒｃａ２ａ）の過剰発現により、機能が改善される。ＤＣＭ心筋細胞は、例えば、表８に示されているように、心臓発生を促進する因子、インテグリンおよび細胞骨格シグナル伝達を含む経路、ならびにユビキチン化経路における遺伝性作用剤を用いて試験することもできる。対照である同じ家族コホート内の健康な個体と比較して、ＤＣＭ心筋細胞はカルシウムトランジェントの振幅の減少、収縮性の低下、および異常な筋節α−アクチニン分布を示す。
【００１５】
疾患がＨＣＭである場合、心筋細胞を、候補作用剤と接触させる前、その間、またはその後にβ−アドレナリン作動性アゴニストなどの陽性変力ストレスを用いて刺激することができる。そのような状態の下では、ＨＣＭ心筋細胞はより高い肥大応答を示し、これは、β−アドレナリン作動性遮断薬によって逆転させることができる。健康な個体と比較して、ＨＣＭ心筋細胞は、細胞サイズの増大およびＨＣＭ関連遺伝子の上方制御、ならびに、二次的な未成熟のトランジェントを特徴とする高発生頻度の異常なＣａ２＋トランジェントを含めた、未成熟の拍動を特徴とする収縮の不規則性を示す。これらの心筋細胞の細胞内Ｃａ２＋レベルは上昇しており、いくつかの実施形態では、候補作用剤はカルシニューリンまたは他のカルシウム親和性に関連する標的を標的とする。
【００１６】
心疾患に関連する突然変異をコードする少なくとも１つの対立遺伝子を含む多能性幹細胞集団も提供される。対象の突然変異としては、遺伝子：心筋トロポニンＴ（ＴＮＮＴ２）；ミオシン重鎖（ＭＹＨ７）；トロポミオシン１（ＴＰＭ１）；ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）；５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼサブユニットガンマ−２（ＰＲＫＡＧ２）；トロポニンＩ３型（ＴＮＮＩ３）；タイチン（ＴＴＮ）；ミオシン、軽鎖２（ＭＹＬ２）；アクチン、アルファ心筋１（ＡＣＴＣ１）；電位依存性カリウムチャネル、ＫＱＴ様サブファミリー、メンバー１（ＫＣＮＱ１）；プラコフィリン２（ＰＫＰ２）；および心臓ＬＩＭタンパク質（ＣＳＲＰ３）における突然変異が挙げられる。対象の特定の突然変異としては、限定することなく、ＭＹＨ７  Ｒ６６３Ｈ突然変異；ＴＮＮＴ２  Ｒ１７３Ｗ；ＰＫＰ２  ２０１３ｄｅｌＣ突然変異；ＰＫＰ２  Ｑ６１７Ｘ突然変異；およびＫＣＮＱ１  Ｇ２６９Ｓミスセンス突然変異が挙げられる。多能性幹細胞集団は、細胞培養物、場合によってフィーダー層を含まない細胞培養物としてもたらすことができる。種々の体細胞がｉＰＳ細胞の供給源として使用され、脂肪由来の幹細胞、線維芽細胞などが特に興味深い。多能性細胞およびそれに由来する心筋細胞を、実験的評価のために、系列および細胞特異的産物などの供給源として移植に使用することができる。これらおよび他の本発明の目的、利点および特徴は、以下により詳しく記載されている本主題の方法および組成物の詳細を読めば当業者には明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】患者特異的ＤＣＭ  ｉＰＳＣの生成を示す図である。（ａ）この試験で採用したＤＣＭ家族の７人の構成員の概略系図である。黒い四角（男性）および丸（女性）は、２つの対立遺伝子のうちの１つの第１染色体に特異的なＴＮＮＴ２  Ｒ１７３Ｗ突然変異を有する個体を示す。（ｂ）ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定によって、ＤＣＭ患者のＴＮＮＴ２遺伝子のエクソン１２にＲ１７３Ｗ点突然変異が存在することが確認された。ＣＯＮは対照である。（ｃ）皮膚生検材料から増大させた、患者由来の皮膚線維芽細胞の代表的な画像である。山中因子を用いて患者由来の皮膚線維芽細胞を再プログラミングすることによって得られた、（ｄ）ＥＳＣ様コロニーおよび（ｅ）ＴＲＡ−１−６０陽性コロニーの代表的な画像である。（ｆ）患者の皮膚線維芽細胞由来のｉＰＳＣの免疫蛍光法およびアルカリホスファターゼ染色について示す画像である。（ｇ）患者特異的ｉＰＳＣにおけるＯｃｔ４およびＮａｎｏｇのプロモーター領域におけるメチル化の状態の定量的バイサルファイトパイロシークエンス分析について示すグラフである。Ｎａｎｏｇプロモーター領域およびＯｃｔ４プロモーター領域はどちらも、患者特異的ｉＰＳＣでは高度に脱メチル化されている。（ｈ）患者特異的ｉＰＳＣを免疫不全マウスの腎臓被膜内に注射することによって得た、３つの胚葉全ての組織を示す奇形腫の画像である。バーは２００μｍである。
【図２】ＮＥ処理後に、異常な筋節α−アクチニン分布を有する細胞の数が有意に多いことおよび初期不全を示したＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭを示す図である。（ａ）分化後３０日目における筋節α−アクチニンおよびｃＴｎＴの免疫染色について示す画像である。単一のＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ点状の筋節α−アクチニン分布パターンを示し、これにより、組織化が乱れた筋フィラメント構造が示されている。マージした顕微鏡写真の囲みをつけた領域の拡大写真に、細胞における詳細なα−アクチニンおよびｃＴｎＴの染色パターンが示されている。バーは２０μｍである。（ｂ）対照ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝３６８）と比較して有意に高い百分率のＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝３９１）で、細胞の総面積の４分の１超における点状の筋節α−アクチニン染色パターンが示された（＊＊ｐ＝０．００８）。（ｃ）対照ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝３６）とＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝３９）との間で細胞サイズに有意差は観察されなかった。（ｄ）対照（ｎ＝１４）の拍動ＥＢとＤＣＭ（ｎ＝１４）の拍動ＥＢの両方の収縮性を、ＮＥ処理を伴って、または伴わずに経時的に追跡した代表的なＭＥＡアッセイについて示すグラフである。ＥＢを、一方の側面をＮＥで処理し、他方は処理していない二重チャンバーＭＥＡプローブに播種した。実験の間、電気信号を同時に記録した。拍動頻度を、ＮＥ処理していないＥＢの拍動頻度に対して正規化した。（ｅ）ビデオ画像による、ＮＥ処理後の経時的なＣＭクラスター（ｎ＝１０）の正規化された拍動頻度を示すグラフである。（ｆ）ＮＥ処理の７日後における単一の対照ｉＰＳＣ−ＣＭおよびＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭに対する筋節α−アクチニン免疫染色の代表的な画像である。対照と比較して、長期のＮＥ処理により、ＤＣＭ細胞の筋節の組織化が有意に悪化した。バーは２０μｍである。（ｇ）ＮＥ処理した（対照、ｎ＝２１０；ＤＣＭ、ｎ＝２５５）またはＮＥ処理していない（対照、ｎ＝２６１ ；ＤＣＭ、ｎ＝２７７）組織化が乱れた筋節の染色パターンを有するＣＭの百分率を示すグラフである。ＮＥ処理により、ＤＣＭ群では組織化が乱れたＣＭの数が著しく増加し（＊＊ｐ＜０．００１）、対照ｉＰＳＣ−ＣＭに対する有意な効果は低かった（＊ｐ＝０．０５）。（ｈ）ＮＥ処理後の経時的なｉＰＳＣ−ＣＭの形態学的変化および収縮性の変化の追跡を示す画像である。バーは２００μｍである。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍとして示されている。
【図３】より小さな［Ｃａ２＋］ｉトランジェントを示したＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの図である。（ａ）代表的なラインスキャン画像である。（ｂ）ＣＯＮ  ｉＰＳＣ−ＣＭ（左側）およびＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ（右側）における自然発生カルシウムトランジェントを示す図である。（ｃ）対照ｉＰＳＣ−ＣＭおよびＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおける自然発生カルシウムトランジェントの発生頻度を示すグラフである。（ｄ）対照ｉＰＳＣ−ＣＭおよびＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおける［Ｃａ２＋］ｉトランジェントの組込みを示すグラフであり、ＤＣＭが示した各トランジェントにおける放出Ｃａ２＋は対照細胞と比較して少なかった（対照、ｎ＝８７細胞；ＤＣＭ、ｎ＝４０、＊＊Ｐ＝０．００２）。ＣＯＮ細胞とＤＣＭ細胞との間で（ｅ）タイミングの不規則性（標準偏差／平均）または（ｆ）自然発生カルシウムトランジェントの振幅に有意差はなかった。
【図４】Ｓｅｒｃａ２ａの過剰発現によりＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの収縮性が回復したことを示す図である。（ａ）ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭのアデノウイルスによる形質導入後のＳｅｒｃａ２ａ発現のウエスタンブロットを示す図である。Ｓｅｒｃａ２ａタンパク質レベルは、Ａｄ．Ｓｅｒｃａ２ａを用いて形質導入した細胞では上方制御されたが、Ａｄ．ＧＦＰを用いて形質導入した細胞では上方制御されなかった。（ｂ）ＧＦＰ陽性単一拍動ＣＭに接近したＡＦＭカンチレバーを示す代表的な画像である。バーは５０μｍである。（ｃ）１００〜４００回の拍動にわたってＡＦＭによって測定された単一のｉＰＳＣ−ＣＭの全ての収縮力のヒストグラムである。Ｓｅｒｃａ２ａの過剰発現により、ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの収縮力が、対照の収縮力に近いレベルまで有意に回復した。（ｄ）ＡＦＭによって測定された単一のＣＭの平均収縮力のドットプロットである。一元配置ＡＮＯＶＡ分析により、全ての群の平均の中で有意な差異があったことが示された（＊＊ｐ＝０．００２）。チューキーの多重比較検定により、対照ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝１３）（Ｐ＝０．００１）およびＡｄ．Ｓｅｒｃａ２ａ（ｎ＝１２）（Ｐ＝０．００５）で形質導入されたＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭはどちらも、Ａｄ．ＧＦＰ（ｎ＝１７）で形質導入されたものよりも有意に強力な収縮力を示したことが示された。Ａｄ．Ｓｅｒｃａ２ａで形質導入されたＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭは対照ｉＰＳＣ−ＣＭ（Ｐ＝０．５７８）の収縮力に匹敵する収縮力を示した。（ｅ）それぞれＡｄ．ＧＦＰ、およびＡｄ．Ｓｅｒｃａ２ａを用いて形質導入した単一のＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの代表的な自然発生カルシウムトランジェントを示す図である。（ｆ）Ａｄ．Ｓｅｒｃａ２ａを用いて形質導入したＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝２２）は、Ａｄ．ＧＦＰを用いて形質導入した細胞（ｎ＝１４）と比較して全体的なカルシウムトランジェントの増加を示した（＊ｐ＝０．０４）（両側スチューデントｔ検定）。（ｇ）Ａｄ．Ｓｅｒｃａ２ａ（ｎ＝４０）またはＡｄ．ＧＦＰ（ｎ＝４０）が過剰発現しているＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおける組織化が乱れた筋節の染色パターンを有するＣＭの百分率を示すグラフである。２つの群間に有意差は観察されなかった（両側スチューデントｔ検定）。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍとして示されている。
【図５】家族内のＤＣＭ患者に由来するｉＰＳＣにおけるＲ１７３Ｗ突然変異を示す図である。ＴＮＮＴ２の遺伝子座のゲノムＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定により、全てのＤＣＭ患者由来のｉＰＳＣがＲ１７３Ｗ（Ｃ〜Ｔ）突然変異を有したことが示されている。
【図６】ヒトＥＳＣ（Ｈ７）、皮膚線維芽細胞、および患者特異的ｉＰＳＣの全体的なｍＲＮＡ発現パターンのマイクロアレイによる比較を示す図である。ピアソン相関と散布図の両方により、患者特異的ｉＰＳＣの全体的な遺伝子発現パターンが、ヒトＥＳＣの全体的な遺伝子発現パターンと高度に類似していたことが示されている。
【図７】患者特異的ｉＰＳＣが延長培養後に正常な核型を維持したことを示す図である。２０継代にわたって培養した後の２つのＤＣＭ  ｉＰＳＣ株からの代表的な画像が示されている。
【図８】山中再プログラミング因子の総計と内在性山中再プログラミング因子の相対的な発現レベルの定量的ＰＣＲについて示す図である。各再プログラミング因子の総遺伝子発現レベルと内在性遺伝子発現レベルを比較することにより、樹立された患者特異的ｉＰＳＣの大部分において外因性導入遺伝子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−ＭＹＣがサイレンシングされた。患者特異的ｉＰＳＣの全てにおいて内在性Ｎａｎｏｇ発現が上方制御され、これにより、各細胞株の多能性状態が示されている。Ｎａｎｏｇ発現レベルはＨ７ヒトＥＳＣのＮａｎｏｇ発現レベル（示されていない）に対して正規化したことに留意されたい。定量的ＰＣＲのために使用したプライマー情報は補足の表６に列挙されている。
【図９】患者特異的ｉＰＳＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて３つの胚葉由来の細胞に分化することができる。異なる細胞型、例えば、ニューロン、内皮細胞、赤血球など、ならびに中胚葉マーカー平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、内胚葉マーカーα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、および外胚葉マーカー（Ｔｕｊ−１）を発現している細胞が全ての患者特異的ｉＰＳＣの自然発生分化から検出された。バーは１００μｍである。
【図１０】患者特異的ｉＰＳＣの相対的な心臓分化効率を示すグラフである。心臓分化効率は拍動ＥＢの百分率として示されている（各株に対してｎ＝３、データは、平均±ｓ．ｅ．ｍとして示されている）。
【図１１】対照ｉＰＳＣに由来する拍動ＥＢおよびＤＣＭ  ｉＰＳＣに由来する拍動ＥＢ内のｃＴｎＴ陽性ＣＭの百分率のＦＡＣＳ分析を示すグラフである。拍動ＥＢの約５０〜６０％の細胞がｃＴｎＴ陽性心筋細胞であった。
【図１２】ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭおよび対照ｉＰＳＣ−ＣＭにおける野生型（Ｗｔ）ＴＮＮＴ２発現および突然変異体（Ｒ１７３Ｗ）ＴＮＮＴ２発現の対立遺伝子特異的ＰＣＲを示す図である。患者ＩＩａ、ＩＩｂ、およびＩＩＩａでは、そのそれぞれのｉＰＳＣ由来のＣＭにおいて突然変異体ＴＮＮＴ２が発現されていることが確認された。対立遺伝子ＰＣＲのために使用したプライマーは補足の表６に列挙されている。
【図１３】ｉＰＳＣ由来の拍動ＥＢの電気生理学的性質を検査した多電極アレイ（ＭＥＡ）について示す図である。（ａ）ＭＥＡプローブおよび播種した４つの拍動ＥＢの代表的な画像である。（ｂ）（ａ）に示されている４つの拍動ＥＢの電場電位を反映する、ＭＥＡによって記録された電気信号である。（ｃ）電場電位持続時間（ＦＰＤ）、最大陽性振幅（ＭＰＡ）、最大陰性振幅（ＭＮＡ）、およびスパイク間の間隔（ＩＳＩ）を示す抽出されたＭＥＡ電場電位グラフである。
【図１４】２４の対照および２４のＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの分化後３０日目における遺伝子発現レベルを分析した単一細胞ＰＣＲについて示すグラフである。（ａ）心臓特異的転写因子、（ｂ）カルシウムハンドリング（ｃａｌｃｉｕｍ  ｈａｎｄｌｉｎｇ）関連タンパク質、（ｃ）イオンチャネル、（ｄ）筋節タンパク質、および（ｅ）骨格筋特異的タンパク質の遺伝子発現をα−チューブリンの遺伝子発現レベルに対して分析した。対照ＣＭとＤＣＭ  ＣＭとの間に有意差は観察されなかった。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍとして示されている。統計学的差異は両側スチューデントＴ検定を用いて試験した。
【図１５】ｉＰＳＣ−ＣＭにおいて心臓特異的タンパク質が発現されたことを示す画像である。対照ｉＰＳＣ−ＣＭおよびＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭのどちらにおいても心臓特異的タンパク質筋節α−アクチニン、ｃＴｎＴ、コネキシン４３、およびＭＬＣ２ａが発現された。矢印は細胞間接触時の陽性コネキシン４３染色を示す。バーは２０μｍである。
【図１６】図２ａに示されている単一のＣＭにおける筋節α−アクチニンおよびｃＴｎＴの免疫染色の拡大画像である。バーは２０μｍである。
【図１７】図２ｆに示されている単一のＣＭにおける筋節α−アクチニンおよびｃＴｎＴの２重免疫染色を示す画像である。バーは２０μｍである。
【図１８】図２ｆに示されている各細胞のマージしたグラフの拡大画像である。ＮＥ処理後の、いくつかの単一のＤＣＭ  ｉＰＳＣ  ＣＭにおいて、対照ＣＭでは観察されなかった筋フィラメントの完全な変性が示されたことに留意されたい。バーは２０μｍである。
【図１９Ａ−Ｃ】単一のＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭと、対する対照ｉＰＳＣ−ＣＭのリアルタイムＰＣＲにより、ＮＥ処理の１週間後に遺伝子発現の変化が示されたことを示すグラフである。分化後１９日目に対照ｉＰＳＣ−ＣＭおよびＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭを培養皿に播種し、４８時間後に１０μＭのＮＥを用いて、またはそれを用いずに７日間処理した。方法の節に記載の通り、対照ｉＰＳＣ（ＮＥを用いて処理、ｎ＝８；ＮＥなし、ｎ＝８）およびＤＣＭ  ｉＰＳＣ（ＮＥを用いて処理、ｎ＝８；ＮＥなし、ｎ＝８）に由来する単一のＣＭを選び取り、ＰＣＲを実施した。ＮＥを用いて処理した細胞とＮＥを用いずに処理した細胞との間の正味の閾値サイクル（ＣＴ）値を最初に算出した。次いで、データを、対照群の正味のｃｔ値と比較したＤＣＭ群の正味のＣＴ値として示した。ＮＥ処理後に、遺伝子を、上方制御された（＞１サイクルのＣＴの差異）、下方制御された（＞１サイクルのＣＴの差異）、および発現の変化なし（＜１サイクルのＣＴの差異）に群分けした。
【図２０】パッチクランプによって測定されたｉＰＳＣ−ＣＭの電気生理学的特徴を示す図である。（ａ）対照ｉＰＳＣ−ＣＭおよびＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭのどちらにおいても３種類の自然発生ＡＰが観察された（左側、心室様；中央、心房様；右側、結節様）。推定７０〜８０％の細胞が心室様ＣＭであり、他の細胞は心房様細胞および／または結節様細胞であった。対照ｉＰＳＣとＤＣＭ  ｉＰＳＣとの間で心臓の細胞の運命に有意差はない（データは示していない）。（ｂ）電流固定記録を用いた対照心室筋細胞およびＤＣＭ心室筋細胞における自然発生ＡＰを示す図である。ＤＣＭ心室細胞のＡＰは対照細胞と比較してわずかに短かった（Ｐ＝０．１１２）（ｃ）。測定時（分化後１９日目〜２５日目）に対照細胞とＤＣＭ細胞との間で頻度（ｄ）、ＡＰのピーク振幅（ｅ）、または静止膜電位（ｆ）に有意差はなかった（対照、ｎ＝１８；ＤＣＭ、ｎ＝１７）。統計学的差異は両側スチューデントＴ検定を用いて試験した。
【図２１】ｉＰＳＣ−ＣＭの収縮力の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）測定について示す図である。（ａ）単一の心筋細胞レベルでのＡＦＭによる力測定のプロセスの概略図である。（ｂ）単一の心筋細胞を探索するＡＦＭカンチレバーを示す代表的な画像である。バーは２０μｍである。（ｃ）ＡＦＭによって獲得したシグナルおよび検査したパラメータ（力、頻度、および拍動持続時間）を示す代表的なグラフである。
【図２２】ＡＦＭによって測定された単一のｉＰＳＣ−ＣＭの拍動の頻度および持続時間を示すグラフである。（ａ）ＡＦＭによって測定された平均拍動頻度のドットプロットである。対照ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝１３）、Ａｄ．Ｓｅｒｃａ２ａで形質導入されたＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝１２）およびＡｄ．ＧＦＰで形質導入されたＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝１７）との間で拍動頻度および律動に有意差は観察されなかった。（ｂ）ＡＦＭによって測定された平均拍動持続時間のドットプロットである。Ｓｅｒｃａ２ａの過剰発現により、拍動持続時間が有意に短縮された（＊ｐ＝０．０２９）。統計学的差異は一元配置ＡＮＯＶＡ、その後のチューキーの多重比較検定を用いて試験した。１００〜４００回の拍動にわたってＡＦＭによって測定された、単一のｉＰＳＣ−ＣＭの全ての（ｃ）拍動頻度および（ｄ）拍動持続時間のヒストグラムである。
【図２３】ＡＦＭによって測定された各単一細胞についての相対的な細胞サイズ対収縮力のドットプロットを示すグラフである。（ａ）対照群（Ｒ２＝０．００６）、（ｂ）ＤＣＭ／ＤＣＭ−Ａｄ．ＧＦＰ群（Ｒ２＝０．１０５）、および（ｃ）ＤＣＭ−Ａｄ．Ｓｅｒｃａ２ａ群（Ｒ２＝０．０６１）において細胞サイズと収縮力との間に有意な直線関係はない。
【図２４】Ｓｅｒｃａ２ａおよびＧＦＰの過剰発現後の経時的な培養皿中の拍動巣の正規化された百分率を示すグラフである。データは、３つの独立した実験の反復のアベレージを示す（平均±ｓ．ｅ．ｍ）。
【図２５】Ａｄ．Ｓｅｒｃａ２ａアデノウイルスまたはＡｄ．ＧＦＰアデノウイルスを用いて形質導入したｉＰＳＣ−ＣＭの、赤色蛍光Ｃａ２＋指標であるＲｈｏｄ−２ＡＭを用いたＣａ２＋イメージングを示す写真である。（ａ）Ｒｈｏｄ−２色素を取り込んだＧＦＰ陽性ＣＭを示すマージした共焦点像である。（ｂ）（ａ）と同じ細胞を写真に示されている矢印のラインでスキャンした。（ｃ）（ａ）および（ｂ）に示されている特定のＣＭについて記録したラインスキャン画像である。バーは２０μｍである。
【図２６】ＡＦＭによって測定された、Ａｄ．Ｓｅｒｃａ２ａまたはＡｄ．ＧＦＰを用いて形質導入した対照ｉＰＳＣ−ＣＭの収縮性を示すグラフである。Ａｄ．Ｓｅｒｃａ２ａ（ｎ＝１０）またはＡｄ．ＧＦＰ（ｎ＝１０）を用いて形質導入した対照ｉＰＳＣ−ＣＭの（ａ）収縮力のドットプロット、（ｂ）拍動頻度、および（ｃ）拍動持続時間である。各群の平均の間で有意な統計学的差異は観察されなかった。統計学的差異は両側スチューデントＴ検定を用いて試験した。１００〜４００回の拍動にわたってＡＦＭによって測定された全ての単一の対照ｉＰＳＣ−ＣＭの（ｄ）収縮力のヒストグラム、（ｅ）拍動頻度、および（ｆ）拍動持続時間である。
【図２７】Ｓｅｒｃａ２ａが過剰発現しているＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの遺伝子発現プロファイリングにより、ＤＣＭ表現型の救済において機能し得る濃縮経路が同定されたことを示す図である。（ａ）Ｓｅｒｃａ２ａ処理していないＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭと比較して、対照ｉＰＳＣ−ＣＭおよびＳｅｒｃａ２ａ−処理したＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの生物学的反復において１．５倍を超える発現の差がある１９１遺伝子のヒートマップである。（ｂ）Ｓｅｒｃａ２ａの過剰発現によるＤＣＭ表現型の救済に関与する可能性がある濃縮経路のヒートマップである。
【図２８】メトプロロール処理により、ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの筋節の組織化が改善され、ＮＥ処理の増悪作用が和らぐことを示すグラフである。（ａ）１０μＭのメトプロロール処理により、インタクトな筋節の完全性を有するＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの数が増加した（無処理、ｎ＝１００；処理、ｎ＝８６、＊ｐ＝０．０２３）。（ｂ）メトプロロール処理により、ＮＥ処理によって誘導されるＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの増悪が予防された。１μＭ（ｎ＝１０７、＊＊ｐ＝０．００８）のメトプロロールおよび１０μＭ（ｎ＝１０１、＊＊ｐ＝０．００１）のメトプロロールのどちらによっても、組織化が乱れた細胞の数がメトプロロール処理をしていないもの（ｎ＝１０８）と比較して有意に減少した。（ｃ）１０μＭのメトプロロール処理に対照ｉＰＳＣ−ＣＭの筋節の完全性に対する有意な効果はなかった（無処理、ｎ＝８８；処理、ｎ＝７５）。データは、平均±平均値の標準誤差として示されている。統計学的差異は両側スチューデントＴ検定を用いて試験した。
【図２９】ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＥＣおよび対照ｉＰＳＣ−ＥＣの類似した機能的性質を示す図である。（ａ）ＦＡＣＳ分析により、ＤＣＭ  ｉＰＳＣおよび対照ｉＰＳＣのどちらも、ＣＤ３１＋ＥＣへの分化の効率が同様であることが示された。（ｂ）ＦＡＣＳにより、内皮細胞マーカーであるＣＤ３１およびＣＤ１４４の両方を発現している分化したＤＣＭ  ｉＰＳＣおよび対照ｉＰＳＣからＣＤ３１＋細胞が単離された。（ｃ）ＤＣＭ  ｉＰＳＣ由来のＥＣおよび対照ｉＰＳＣ由来のＥＣはどちらも低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）（赤色の蛍光）取り込み能力を示した。（ｄ）対照ｉＰＳＣ由来のＥＣおよびＤＣＭ  ｉＰＳＣ由来のＥＣはどちらも、Ｍａｔｒｉｇｅｌ表面上にクモの巣状の細管を形成することができた。バーは１００μｍである。
【図３０】ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおけるＳｅｒｃａ２ａ遺伝子療法による潜在的な機構の概略図である。心筋トロポニンＴにおける突然変異は、収縮性、筋節形成、およびカルシウムシグナル伝達に負に影響を及ぼし、カルシウム関連遺伝子、例えば、カルセケストリン、ＮＦＡＴ、およびＴＲＩＣチャネルなどの変化を引き起こす。しかし、ＴＮＮＴ２  Ｒ１７３Ｗ  ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおける電気的興奮は正常であった。ＳＲ／ＥＲ膜カルシウムポンプであるＳｅｒｃａ２ａの送達により、カルシウムハンドリング分子のレベルが回復し、損なわれたカルシウムトランジェントおよび収縮性が逆転し、それにより、全体的なＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ機能が改善された。ｃＴｎＴは心筋トロポニンＴであり、ＬＴＣはＬ型カルシウムチャネルであり、ＲｙＲはリアノジン受容体カルシウム放出チャネルであり、ＣＳＱはカルセケストリンであり、ＰＭは原形質膜である。
【図３１Ａ−Ｍ】患者特異的ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの生成および特徴付けを示す図である。（Ａ）下壁の非対称の肥大が実証されている、発端者および対照である対応する家族員の収縮末期および拡張末期の代表的な長軸ＭＲＩ画像である。（Ｂ）ＨＣＭ患者（ＩＩ−１、ＩＩＩ−１、ＩＩＩ−２、ＩＩＩ−３、およびＩＩＩ−８）における、ＭＹＨ７遺伝子のエクソン１８におけるＡｒｇ６６３Ｈｉｓミスセンス突然変異のＰＣＲおよび配列分析による確認を示す。（Ｃ）この試験に採用したＭＹＨ７にＡｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異を有する発端者（ＩＩ−１）ならびにその夫（ＩＩ−２）、および８人の子供（ＩＩＩ−１〜ＩＩＩ−８）の概略系図である。丸は、女性の家族員を示し、四角は男性を示す。黒い記号はＨＣＭ表現型の臨床症状を示し、白い記号は臨床症状が存在しないことを示す。家族員の下の「＋」および「−」は、それぞれＡｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異が存在することまたは存在しないことを示す。２人の個体（ＩＩＩ−３およびＩＩＩ−８）は、Ａｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異を有することが見いだされたが、年齢が低いので、まだＨＣＭ表現型を示さない。（Ｄ）ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおいて対照ｉＰＳＣ−ＣＭと比較して細胞サイズおよび多核化（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ）が増大していることを実証している心筋トロポニンＴおよびＦ−アクチンについての代表的な免疫染色について示す画像である。（Ｅ）４つの対照ｉＰＳＣＣＭ株（ＩＩ−２、ＩＩＩ−４、ＩＩＩ−６、ＩＩＩ−７）（患者株当たりｎ＝５５）および４つのＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ株（ＩＩ−１、ＩＩＩ−１、ＩＩＩ−２、ＩＩＩ−８）（患者株当たりｎ＝５９）についての、心臓分化を誘導した４０日後の細胞サイズの数量化を示すグラフである。（Ｆ）対照ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝５５、４つの患者株）およびＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝５９、４つの患者株）における多核化の数量化を示すグラフである。（Ｇ）代表的な免疫蛍光染色により、ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおいて、対照と比較してＡＮＦ発現が上昇したことが示されている画像である。（Ｈ）心臓分化の誘導後２０日目、３０日目、および４０日目における、対照ｉＰＳＣ−ＣＭおよびＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ（時点当たりｎ＝３２、５つの患者株）における単一細胞定量的ＰＣＲによって測定されたＡＮＦ遺伝子発現の変化を示すグラフである。（Ｉ）ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭおよび対照におけるＭＹＨ７／ＭＹＨ６発現比の数量化を示すグラフである（時点当たりｎ＝３２、５つの患者株）。（Ｊ）ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおけるＮＦＡＴＣ４の核移行を示す代表的な免疫蛍光染色画像である。（Ｋ）対照ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝１８７、５つの患者株）およびＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝１６９、５つの患者株）における陽性ＮＦＡＴＣ４染色を示す心筋細胞の百分率を示すグラフである。（Ｌ）カルシニューリン阻害剤であるＣｓ−ＡおよびＦＫ５０６を用いて５日間連続して処理した後の、対照ｉＰＳＣ−ＣＭおよびＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおける細胞サイズの数量化を示すグラフである（ｎ＝５０、群当たり５つの患者株）。（Ｍ）心臓分化の誘導後２０日目、３０日目、および４０日目における、単一の対照ｉＰＳＣ−ＣＭおよびＨ���Ｍ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおける心肥大に関連する遺伝子についての遺伝子発現のヒートマップ表示である。＊は、ＨＣＭ対対照のＰ＜０．０５を示し、＊＊は、ＨＣＭ対対照のＰ＜０．０００１を示す。
【図３２Ａ−Ｎ】ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおける不整脈および不規則なＣａ２＋調節の評価を示す図である。（Ａ）電流固定モードのパッチクランプによって測定された、対照ｉＰＳＣＣＭおよびＨＣＭ  ｉＰＳＣＣＭにおける自然発生活動電位の電気生理学的測定値である。囲み枠は、拡大した時間尺度におけるＤＡＤ様不整脈を実証しているＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ波形の下線が引かれている部分を示す。（Ｂ）対照ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝１４４、５つの患者株）およびＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝１３１、５つの患者株）におけるＤＡＤ出現の数量化を示すグラフである。ＤＡＤ率は総ＤＡＤ／総拍動と定義される。（Ｃ）推定ＤＡＤを示す対照ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝１４４、５つの患者株）およびＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝１３１、５つの患者株）の百分率の数量化を示すグラフである。（Ｄ）対照ｉＰＳＣ−ＣＭおよびＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおける代表的なラインスキャン画像および自然発生Ｃａ２＋トランジェントを示す図である。赤色の矢印はＨＣＭ細胞では観察されたが対照では観察されなかった頻脈性不整脈様波形を示す。（Ｅ）心臓分化の誘導後２０日目、３０日目、および４０日目における、不規則なＣａ２＋トランジェントを示す対照ｉＰＳＣ−ＣＭおよびＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭについての百分率の数量化を示すグラフである（時点当たりｎ＝５０、５つの患者株）。（Ｆ）Ｈ９  ｈＥＳＣ−ＣＭおよび野生型ＭＹＨ７またはＡｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異を有する突然変異体ＭＹＨ７のレンチウイルス駆動発現を用いて安定に形質導入したｈＥＳＣ−ＣＭについての代表的なラインスキャン画像および自然発生Ｃａ２＋トランジェントを示す図である。赤色の矢じりは不規則なＣａ２＋波形を示す。（Ｇ）ＷＡ０９  ｈＥＳＣ−ＣＭ、野生型ＭＹＨ７を過剰発現しているｈＥＳＣ−ＣＭ、およびＡｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異を有するＭＹＨ７を過剰発現しているｈＥＳＣＣＭにおける不規則なＣａ２＋トランジェントを示す細胞の数量化を示すグラフである（ｎ＝４０、群当たり５つの患者株）。（Ｈ）ｈＥＳＣ−ＣＭ、野生型ＭＹＨ７を過剰発現しているｈＥＳＣ−ＣＭ、およびＡｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異を有するＭＹＨ７を過剰発現しているｈＥＳＣ−ＣＭについて電流固定モードで記録された自然発生活動電位を示す図である。赤色の矢じりはＤＡＤ様波形を示す。（Ｉ）ｈＥＳＣ−ＣＭ、野生型ＭＹＨ７またはＡｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異を有する突然変異体ＭＹＨ７のレンチウイルス駆動発現を用いて安定に形質導入したｈＥＳＣ−ＣＭにおけるＤＡＤ様波形を示す細胞の数量化を示すグラフである（群当たりｎ＝２０、５つの患者株）。（Ｊ）対照ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝１２２、４つの患者株）およびＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝１０５、４つの患者株）についてのベースラインのＦｌｕｏ−４Ｃａ２＋色素強度の数量化を示すグラフである。（Ｋ）Ｉｎｄｏ−１レシオメトリックＣａ２＋色素を使用した、対照ｉＰＳＣ−ＣＭおよびＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの代表的なＣａ２＋トランジェントを示すグラフである。（Ｌ）対照ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝１７、４つの患者株）およびＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝２６、４つの患者株）におけるＩｎｄｏ−１比を測定することによる安静時Ｃａ２＋レベルの数量化を示すグラフである。（Ｍ）対照ｉＰＳＣ−ＣＭおよびＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭからの代表的なＣａ２＋トランジェントの追跡、その後のカフェイン曝露を示すグラフである。（Ｎ）対照ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝２３、３つの株）およびＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝３５、３つの株）についてのＳＲ  Ｃａ２＋負荷量の放出が示されているカフェイン投与後のΔＦ／Ｆ０比の平均ピーク振幅を示すグラフである。＊は、ＨＣＭ対対照のＰ＜０．０５を示し、＊＊は、ＨＣＭ対対照のＰ＜０．０１を示す。
【図３３Ａ−Ｅ】陽性変力ストレスによるＨＣＭ表現型の増悪を示す図である。（Ａ）対照ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝５０、５つの患者株）およびＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝５０、５つの患者株）をβ−アゴニストであるイソプロテレノールによって変力刺激することにより、ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおいて、対照対応物と比較して細胞の肥大の症状が加速された。β−遮断薬であるプロプラノロールを同時投与することにより、ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおいて２０のカテコールアミン誘導性肥大が予防された。（Ｂ）イソプロテレノールによって陽性変力刺激した後の、対照ｉＰＳＣ−ＣＭおよびＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおける代表的なＣａ２＋ラインスキャンおよび波形を示す図である。黒色の矢じりは異常なＣａ２＋波形を示す。（Ｃ）イソプロテレノールによる処理およびプロプラノロールの同時投与に応答して不規則なＣａ２＋トランジェントを示す対照ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝５０、５つの患者株）およびＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝５０、５つの患者株）の数量化を示すグラフである。（Ｄ）ベースライン、その後のイソプロテレノールによる陽性変力刺激時の対照ｉＰＳＣ−ＣＭおよびＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおける自然発生活動電位および不整脈の電気生理学的測定値を示す図である。赤い矢印はＤＡＤ様波形を示す。（Ｅ）イソプロテレノールを投与した後の対照ｉＰＳＣ−ＣＭおよびＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおけるＤＡＤ率の数量化を示すグラフである（総ＤＡＤ／総拍動）。＊は、ＨＣＭ対対照のＰ＜０．０５を示し、＊＊は、ＨＣＭ対対照のＰ＜０．００１を示し、＃＃はｉｓｏ＋ｐｒｏ対ｉｓｏのＰ＜０．０１を示す。
【図３４】ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭをベラパミルによって処理することにより、ＨＣＭ表現型の発生が有意に緩和されたことを示す図である。（Ａ）０ｎＭ、５０ｎＭ、および１００ｎＭのＬ型Ｃａ２＋チャネル遮断薬であるベラパミルを用いて、心臓分化を誘導した２５日後に開始して５日間連続して処理したＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの代表的な免疫染色画像である。ベラパミルで処理したＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭについての相対的な細胞サイズの数量化を示す（処理群当たりｎ＝５０、５つの患者株）。（Ｂ）０ｎＭ、５０ｎＭ、および１００ｎＭのベラパミルを用いて５日間連続して処理したＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの代表的なＣａ２＋ラインスキャン画像および波形である。ベラパミルで処理した後に不規則なＣａ２＋トランジェントを示すことが見いだされたＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの百分率の数量化を示す（処理群当たりｎ＝４０、５つの患者株）。（Ｃ）０ｎＭ、５０ｎＭ、および１００ｎＭのベラパミルを用いて５日間連続して処理したＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの自然発生活動電位の代表的な電気生理学的記録である。ベラパミルで処理した後のＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ２１のＤＡＤ発生頻度の数量化を示す（処理群当たりｎ＝２５、５つの患者株）。（Ｄ）ＭＹＨ７においてＨＣＭ突然変異によって引き起こされるＨＣＭ表現型の発生についての概略図である。赤色の囲み枠は、疾患の発生を緩和するための潜在的な方法を示す。＊は無処理対５０ｎＭのベラパミル対１００ｎＭのベラパミルのＰ＜０．０１を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、以下の発明の詳細な説明を付属の図面と併せて読むと最もよく理解される。
【００１９】
本組成物および方法を説明する前に、本発明は記載されている特定の組成物および方法に限定されず、そういうものとして、当然、変動し得ることが理解されるべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書において使用される用語法は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定的なものではないことも理解されるべきである。
【００２０】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間に入る値のそれぞれも、文脈により明確に別段の規定がなされない限り下限の単位の１０分の１まで、明確に開示されることが理解されるべきである。任意の明示された値または明示された範囲の間に入る値およびその明示された範囲内の任意の他の明示された、または間に入る値との間のより小さな範囲はそれぞれ本発明の範囲内に包含される。これらのより小さな範囲の上限と下限は、それぞれ独立に、その範囲に含めることができるか、その範囲から排除することができ、そのより小さな範囲に限界のいずれかが含まれる、どちらの限界も含まれない、またはどちらの限界も含まれる範囲のそれぞれも本発明に包含され、明示された範囲内の任意の特異的に排除される限界に従属する。明示された範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか、またはその両方を除く範囲も、本発明に包含される。
【００２１】
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似した、またはそれと等しい任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、いくつかの潜在的な好ましい方法および材料がここに記載されている。本明細書で言及されている全ての刊行物は、引用されている刊行物と関連して方法および／または材料を開示し、説明するために参照により本明細書に組み込まれる。本開示は矛盾がある限りでは組み込まれた刊行物の任意の開示に取って代わることが理解されるべきである。
【００２２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、および「ｔｈｅ（その）」は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、複数の指示対象を包含することに留意しなければならない。したがって、例えば、「ａ（１つの）再プログラミング因子ポリペプチド」への言及は、複数のそのようなポリペプチドを含み、「ｔｈｅ（その）人工多能性幹細胞」への言及は、１つまたは複数の人工多能性幹細胞および当業者に公知のその等価物などへの言及を含む。
【００２３】
本明細書で考察されている刊行物は、単に、本出願の出願日より前のそれらの開示について提供されている。本明細書における全てが、本発明が、先行発明に基づいてそのような刊行物に先立つ権限がないことを容認するものと解釈されるべきではない。さらに、提供されている刊行物の日付は、それぞれ独立に確認する必要があり得る実際の刊行物の日付とは異なる可能性がある。
【００２４】
定義
拡張型心筋症（ＤＣＭ）は、主に心筋に影響を及ぼす疾患の一群である心筋症の１つである。ＤＣＭでは、多くの場合、いかなる明白な原因も伴わずに心筋の一部が拡張する。心臓の左心室または右心室の収縮期のポンプ機能が損なわれ、リモデリングと称されるプロセスである進行性の心臓の腫大および肥大に至る。多くの場合、病因は明らかではないが、拡張型心筋症は、種々の毒性作用物質、代謝作用物質、または感染作用物質によって生じる可能性がある。患者の約２５〜３５％が、この疾患の家族型を有し、大多数の突然変異が細胞骨格タンパク質をコードする遺伝子に影響を及ぼし、いくつかが収縮に関与する他のタンパク質に影響を及ぼしている。この疾患は遺伝的に不均一であるが、その伝播の最も一般的な形態は、常染色体優性パターンである。ＤＣＭに関与する細胞骨格タンパク質としては、心筋トロポニンＴ（ＴＮＮＴ２）、α−心臓アクチン、デスミン、ならびに核ラミンＡおよびＣ、ならびに種々の他の収縮性タンパク質が挙げられる。
【００２５】
肥大型心筋症（ＨＣＭ）は、筋節の複製により心筋細胞（ｈｅａｒｔ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ）のサイズが増加し、その結果、心筋（ｈｅａｒｔ  ｍｕｓｃｌｅ）が肥厚している状態である。さらに、筋肉細胞の正常なアラインメントが撹乱しており、これは心筋錯綜配列として公知の現象である。ＨＣＭにより、心臓の電気的機能の破壊も引き起こされる。ＨＣＭは、最も一般的には、筋節の９つの遺伝子のうちの１つにおける、突然変異した筋節タンパク質をもたらす突然変異に起因する。ミオシン重鎖突然変異が家族性肥大型心筋症の発生に関連する。肥大型心筋症は、通常、心筋トロポニンＴ（ＴＮＮＴ２）；ミオシン重鎖（ＭＹＨ７）；トロポミオシン１（ＴＰＭ１）；ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）；５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼサブユニットガンマ−２（ＰＲＫＡＧ２）；トロポニンＩ３型（ＴＮＮＩ３）；タイチン（ＴＴＮ）；ミオシン、軽鎖２（ＭＹＬ２）；アクチン、アルファ心筋１（ＡＣＴＣ１）；および心臓ＬＩＭタンパク質（ＣＳＲＰ３）において突然変異が報告されている常染色体優性形質として遺伝する。アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）をコードする遺伝子における挿入／欠失多型により、疾患の臨床的な表現型が変更される。ＡＣＥのＤ／Ｄ（欠失／欠失）遺伝子型は左心室のより顕著な肥大に関連し、有害な転帰のリスクがより高いことと関連する可能性がある。
【００２６】
アントラサイクリン誘導心毒性（およびアントラサイクリン誘導毒性に対する抵抗性）。ドキソルビシンなどのアントラサイクリンは白血病、ホジキンリンパ腫、ならびに他の器官の中でも、乳房、膀胱、胃、肺、卵巣、甲状腺、および筋肉の固形腫瘍を治療するために使用されている最先端の化学療法剤である。アントラサイクリンの主な副作用は心毒性であり、これにより、この化学療法剤を利用するレジメンを受けているレシピエントの多くに重度の心不全が生じる。
【００２７】
不整脈源性右心室異形成症（ＡＲＶＤ）。ＡＲＶＤは、右心室の不整脈および心臓突然死を生じる心臓デスモソームの常染色体優性疾患である。ＡＲＶＤは、肥大型心筋症に次ぐ若年期の心臓突然死の主な原因である。
【００２８】
左心室非圧縮（ＬＶＮＣ、ａｋａ非圧縮心筋症）。ＬＶＮＣは、胚形成の間の心筋（ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ）（心筋（ｈｅａｒｔ  ｍｕｓｃｌｅ））の発生が損なわれることによって生じる遺伝性心疾患である。ＬＶＮＣを引き起こす突然変異を有する患者では、若年期に心不全および異常な心臓の電気生理が発生する。
【００２９】
左室性単心室（ＤＩＬＶ）。ＤＩＬＶは、左心房と右心房の両方が左心室に入り込む先天性心臓欠陥である。結果として、この欠陥を持って生まれた小児は機能的な心室腔を１つしか有さず、酸素添加血液を全身循環中に送り出すことが困難である。
【００３０】
ＱＴ延長（１型）症候群（ＬＱＴ−１、ＫＣＮＱ１突然変異）。ＱＴ延長症候群（ＬＱＴ）は、心電図のＱＴ期が持続し、その結果、不整脈および心臓突然死に対する易罹患性が増大する遺伝性不整脈性疾患である。ＬＱＴに関連する遺伝子が１３種分かっている。
【００３１】
「多能性」および多能性幹細胞とは、そのような細胞が、生物体内の全種類の細胞に分化する能力を有することを意味する。「人工多能性幹細胞」という用語は、胚性幹（ＥＳ）細胞のように、生物体内の全種類の細胞に分化する能力を維持しながら長期にわたって培養することができるが、ＥＳ細胞（胚盤胞の内部細胞塊に由来する）とは異なり、分化した体細胞、すなわち、狭い、より規定された潜在性を有し、実験的な操作の不在下では生物体内の全種類の細胞を生じさせることができない細胞に由来する多能性細胞を包含する。ｉＰＳ細胞はｈＥＳＣ様の形態を有し、大きな核細胞質比、明確な境界および顕著な核を有する平らなコロニーとして成長する。さらに、ｉＰＳ細胞は、これだけに限定されないが、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ  １、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａ１、ＴＥＲＴおよびｚｆｐ４２を含めた、当業者に公知の１種または複数種の重要な多能性マーカーを発現する。さらに、ｉＰＳ細胞は、奇形腫を形成することができる。さらに、ｉＰＳ細胞は、生きている生物体の外胚葉組織、中胚葉組織、または内胚葉組織を形成することまたはそれに寄与することができる。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「再プログラミング因子」とは、細胞に作用して転写を変更し、それにより、細胞を再プログラミングして多分化能または多能性にする生物活性因子の１つまたは複数、すなわち、カクテルを指す。再プログラミング因子は、細胞、例えば、心疾患に関する家族歴または対象の遺伝学的性質を有する個体由来の細胞、例えば、線維芽細胞、脂肪細胞などに、個別にまたは単一の組成物として、すなわち、予備混合した再プログラミング因子の組成物としてもたらすことができる。因子は同じモル比で、または異なるモル比でもたらすことができる。因子は、本発明の細胞を培養する過程において一回または多数回もたらすことができる。いくつかの実施形態では、再プログラミング因子は、これだけに限定することなく、Ｏｃｔ３／４；Ｓｏｘ２；Ｋｌｆ４；ｃ−Ｍｙｃ；Ｎａｎｏｇ；およびＬｉｎ−２８を含めた転写因子である。
【００３３】
体細胞を再プログラミングして多能性にするために、十分な組合せおよび数量の、上で定義された再プログラミング因子と接触させる。再プログラミング因子は、体細胞に、個別にまたは単一の組成物として、すなわち、予備混合した再プログラミング因子の組成物としてもたらすことができる。いくつかの実施形態では、再プログラミング因子をベクター上の複数のコード配列としてもたらす。
【００３４】
種々の目的で、例えば、機能喪失突然変異を有する遺伝子を交換するため、マーカー遺伝子などをもたらすために遺伝子を体細胞またはそれに由来するｉＰＳ細胞に導入することができる、あるいは、アンチセンスｍＲＮＡまたはリボザイムを発現するベクターを導入し、それにより、望ましくない遺伝子の発現を遮断する。遺伝子療法の他の方法は、薬物耐性遺伝子を導入して、正常な前駆細胞が利点を有し、選択圧力、例えば、多数の薬物耐性遺伝子（ＭＤＲ）、またはｂｃｌ−２などの抗アポトーシス遺伝子に供されることを可能にすることである。当技術分野で公知の種々の技法、例えば、電気穿孔、カルシウム沈降ＤＮＡ（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ  ＤＮＡ）、融合、トランスフェクション、リポフェクション、感染などを用いて、上記の通り核酸を標的細胞に導入することができる。ＤＮＡを導入する特定の様式は本発明の実施にとって重大ではない。
【００３５】
ｉＰＳ細胞は、心筋細胞（ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ）に分化させることもできる。骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達を阻害することにより、心筋細胞（ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ）（または心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ））の生成がもたらされる。例えば、Ｙｕａｓａら、（２００５年）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３（５）：６０７−１１を参照されたい。したがって、例示的な実施形態では、誘導された細胞をノギンの存在下で約２日〜約６日、例えば、約２日、約３日、約４日、約５日、または約６日にわたって培養した後に、胚様体を形成させ、胚様体を約１週間〜約４週間、例えば、約１週間、約２週間、約３週間、または約４週間にわたって培養する。
【００３６】
培養物中に心臓作用性剤、例えば、アクチビンＡおよび／または骨形成タンパク質−４などを含めることによって心筋細胞の分化を促進することができる（本明細書の実施例、それぞれが具体的に参照により本明細書に組み込まれるＸｕらＲｅｇｅｎ  Ｍｅｄ．２０１１年１月；６（１）：５３−６６；ＭｉｇｎｏｎｅらＣｉｒｃ  Ｊ．２０１０  ７４（１２）：２５１７−２６；ＴａｋｅｉらＡｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００９−２９６（６）：Ｈ１７９３−８０３を参照されたい）。そのようなプロトコールの例としては、例えば、Ｗｎｔ３ＡなどのＷｎｔアゴニストを、場合によってＢＭＰ４、ＶＥＧＦおよびアクチビンＡなどのサイトカインの存在下で添加し、その後、可溶性ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質などのＷｎｔアンタゴニストの存在下で培養することも挙げられる。しかし、心筋細胞の分化を誘導する任意の適切な方法、例えば、参照により具体的に本明細書に組み込まれる、ＦｕｊｉｗａｒａらＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１１  ６（２）：ｅ１６７３４；ＤａｍｂｒｏｔらＢｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２０１１  ４３４（１）：２５−３５に記載されているシクロスポリンＡ；ＦｏｌｄｅｓらＪ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１１  ５０（２）：３６７−７６に記載されている等軸環状ストレッチ（ｅｑｕｉａｘｉａｌ  ｃｙｃｌｉｃ  ｓｔｒｅｔｃｈ）、アンジオテンシンＩＩ、およびフェニレフリン（ＰＥ）；ＷａｎｇらＳｃｉ  Ｃｈｉｎａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２０１０  ５３（５）：５８１−９に記載されているアスコルビン酸、ジメチルスルホキシドおよび５−ａｚａ−２’−デオキシシチジン、ＣｈｅｎらＪ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１０  １１１（１）：２９−３９に記載されている内皮細胞などを用いることができる。
【００３７】
所望の細胞型のマーカーの発現および表現型の特性に基づいて決定することができる発生の適切な段階で、例えば、約１〜４週間の時点で細胞を回収する。培養物は、対象のマーカーの存在について染色することによって、形態を決定することによってなどで経験的に試験することができる。場合によって、陽性選択ステップの前、またはその後に、薬物選択、パニング、密度勾配遠心分離などによって細胞を濃縮する。別の実施形態では、陰性選択を実施し、選択は、ＥＳ細胞、線維芽細胞、上皮細胞などに見いだされるマーカーのうちの１つまたは複数の発現に基づく。選択には、パニング法、磁気粒子選択、粒子選別機による選択などを利用することができる。
【００３８】
心筋細胞。哺乳動物の心臓の発生の間に生じる心筋細胞の表現型は、主要な心筋細胞、結節性心筋細胞、伝導心筋細胞（ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）および作動心筋細胞（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）に区別することができる。全ての心筋細胞が筋節および筋小胞体（ＳＲ）を有し、ギャップ結合によってカップリングしており、また、自動性を示す。主要な心臓管の細胞は、自動性が高いこと、伝導速度が低いこと、収縮性が低いこと、およびＳＲ活性が低いことを特徴とする。この表現型は、結節性細胞において大規模に持続される。対照的に、心房および心室の作動心筋細胞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｃｅｌｌ）は自動性を実質的に示さず、細胞間カップリングが十分であり、十分に発生した筋節を有し、ＳＲ活性が高い。房室束、脚および末梢心室伝導系由来の伝導細胞は、筋節の発生が不十分であり、ＳＲ活性が低いが、十分にカップリングしており、高い自動性を示す。
【００３９】
α−Ｍｈｃ、β−Ｍｈｃおよび心筋トロポニンＩならびに遅骨格トロポニンＩについて、分化したＥＳ細胞培養物において発生の推移を観察した。多くの場合、ＥＳ細胞培養物中の心室様細胞および心房様細胞の境界を定めるために、それぞれＭｌｃ２ｖおよびＡｎｆの発現を用いるが、ＥＳＤＣにおいては、Ａｎｆ発現では排他的に心房の心筋細胞が同定されず、作動心筋細胞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｃｅｌｌ）の一般的なマーカーでよい。
【００４０】
「心筋細胞前駆体」とは、心筋細胞を含む後代を生じさせることができる細胞と定義される。
【００４１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養細胞としての種々の使用に加えて、心筋細胞は、適切な動物モデルにおいて試験することができる。１つのレベルでは、細胞を、それらの、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生存し、それらの表現型を維持する能力について評価する。細胞組成物を免疫不全動物（例えば、ヌードマウス、または化学的にまたは放射線照射によって免疫不全にした動物など）に投与する。ある期間再成長させた後に組織を回収し、投与した細胞またはその後代がなお存在しているかどうかに関して評価し、対象の処理に対する応答に関して表現型決定することができる。動物モデルにおいて、本発明の分化している細胞を用いた処理の結果として起こる心臓の回復の程度を評価することによって適合性を決定することもできる。そのような試験のためにいくつもの動物モデルが利用可能である。例えば、予冷したアルミニウム棒を左心室前壁の表面と接触させて置くことによって心臓に低温傷害を与える（ｃｒｙｏｉｎｊｕｒｅ）ことができる（Ｍｕｒｒｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：２２０９、１９９６；Ｒｅｉｎｅｃｋｅら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １００：１９３、１９９９；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，０９９，８３２）。より大きな動物では、液体Ｎ２中で冷却した３０〜５０ｍｍの銅の円板プローブを左心室の前壁におよそ２０分置くことによって低温傷害を与えることができる（Ｃｈｉｕら、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６０：１２、１９９５）。左側の主要な冠状動脈を結紮することによって梗塞を誘導することができる（Ｌｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：１９９１、１９９７）。傷害部位を本発明の細胞調製物で処理し、心臓組織を、損傷を受けた領域内の細胞の存在について組織学的検査によって検査する。左心室の拡張終期の圧力、発生圧力、圧力上昇率、圧力減衰率などのパラメータを決定することによって心臓の機能をモニタリングすることができる。
【００４２】
「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」などの用語は、本明細書では、一般に、所望の薬理的効果および／または生理的効果を得ることを指すために使用される。効果は、疾患またはその症候を完全にまたは部分的に予防するという観点で予防的であってよく、かつ／または、疾患および／または疾患に起因する有害作用の部分的なまたは完全な安定化または治癒という観点で治療的であってよい。「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、本明細書で使用される場合、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患または症候の素因がある可能性があるが今のところはまだそれを有すると診断されていない対象において疾患または症候が起こることを予防すること、（ｂ）疾患の症候を抑制する、すなわち、その発生を阻止すること、または（ｃ）疾患の症候を軽減する、すなわち、疾患または症候の退縮を引き起こすことを包含する。
【００４３】
「個体」、「対象」、「宿主」および「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、診断、治療、または療法が望まれる任意の哺乳動物の対象、特にヒトを指す。
【００４４】
本発明の方法
上記の通り心疾患に関連する突然変異をコードする少なくとも１つの対立遺伝子を含むヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から分化させた疾患関連心筋細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞培養物を獲得し、使用するための方法が提供される。対象の特定の突然変異としては、限定することなく、ＭＹＨ７  Ｒ６６３Ｈ突然変異、ＴＮＮＴ２  Ｒ１７３Ｗ；ＰＫＰ２  ２０１３ｄｅｌＣ突然変異；ＰＫＰ２  Ｑ６１７Ｘ突然変異；およびＫＣＮＱ１  Ｇ２６９Ｓミスセンス突然変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、そのような心筋細胞のパネルが提供され、パネルは、２つ以上の異なる疾患関連心筋細胞を含む。いくつかの実施形態では、そのような心筋細胞のパネルが提供され、心筋細胞は複数の候補作用剤、または複数の用量の候補作用剤に供される。候補作用剤としては、対象のＲＮＡの発現を増加または減少させる小分子、すなわち、薬物、遺伝子構築物、電気的変化などが挙げられる。
【００４５】
疾患関連心筋細胞に対する候補作用剤の活性を決定するための方法であって、候補作用剤を、心疾患に関連する突然変異をコードする少なくとも１つの対立遺伝子を含むヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から分化させた心筋細胞の１つまたはパネルと接触させるステップと、これだけに限定することなく、カルシウムトランジェントの振幅、細胞内のＣａ２＋レベル、細胞サイズ収縮力（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｆｏｒｃｅ）発生、拍動数、筋節α−アクチニン分布、および遺伝子発現プロファイリングを含めた、作用剤の形態学的、遺伝学的または機能的なパラメータに対する効果を決定するステップとを含む方法が提供される。
【００４６】
疾患がＤＣＭである場合、心筋細胞を、候補作用剤と接触させる前、その間、またはその後にβ−アドレナリン作動性アゴニストなどの陽性変力ストレスを用いて刺激することができる。いくつかの実施形態では、β−アドレナリン作動性アゴニストはノルエピネフリンである。本明細書では、ＤＭＣ心筋細胞は陽性変力ストレスに応答して、最初に陽性であり、後で、不全の特性、例えば、拍動数が減少すること、収縮が弱まること、および異常な筋節α−アクチニン分布を有する細胞が有意に多いことなどを伴って陰性になる変時作用を有することが示されている。β−アドレナリン作動性遮断薬処理および筋小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ（Ｓｅｒｃａ２ａ）の過剰発現により、機能が改善される。ＤＣＭ心筋細胞は、例えば、表８に示されている心臓発生を促進する因子、インテグリンおよび細胞骨格シグナル伝達、ならびにユビキチン化経路を含めた経路における遺伝性作用剤を用いて試験することもできる。対照である同じ家族コホート内の健康な個体と比較して、ＤＣＭ心筋細胞はカルシウムトランジェントの振幅の減少、収縮性の低下、および異常な筋節α−アクチニン分布を示す。
【００４７】
疾患がＨＣＭである場合、心筋細胞を、候補作用剤と接触させる前、その間、またはその後にβ−アドレナリン作動性アゴニストなどの陽性変力ストレスを用いて刺激することができる。そのような状態の下では、ＨＣＭ心筋細胞は、より高い肥大応答を示し、これは、β−アドレナリン作動性遮断薬によって逆転させることができる。健康な個体と比較して、ＨＣＭ心筋細胞は、細胞サイズの増大およびＨＣＭ関連遺伝子の上方制御、ならびに、二次的な未成熟のトランジェントを特徴とする高発生頻度の異常なＣａ２＋トランジェントを含めた、未成熟の拍動を特徴とする収縮の不規則性を示す。これらの心筋細胞の細胞内Ｃａ２＋レベルは上昇しており、いくつかの実施形態では、候補作用剤はカルシニューリンまたは他のカルシウム親和性に関連する標的を標的とする。
【００４８】
小分子についてのスクリーニングアッセイでは、候補作用剤を培養物中の細胞に添加することの効果を、細胞のパネルおよび細胞環境を用いて試験し、細胞環境は、イオン性、薬物刺激などの変更を含めた電気刺激の１つまたは複数を含み、細胞のパネルは、遺伝子型、対象の環境への事前の曝露、提供される作用剤の用量などが変動してよく、通常、少なくとも１つの対照、例えば、陰性対照および陽性対照が包含される。細胞の培養は、一般には、滅菌環境、例えば、加湿した９２〜９５％の空気／５〜８％のＣＯ２雰囲気を含有するインキュベーター内、３７℃で実施される。細胞培養は、ウシ胎仔血清などの未定義の生体液を含有する栄養混合物、または完全に定義された血清を含まない培地で行うことができる。環境を変更することの影響を、形態学的変化、機能的変化および遺伝学的変化を含めた多数の出力パラメータをモニタリングすることによって評価する。
【００４９】
遺伝性作用剤についてのスクリーニングアッセイでは、細胞の遺伝組成を変更するために、パネル内の細胞の１つまたは複数にポリヌクレオチドを添加する。出力パラメータをモニタリングして、表現型に変化があるかどうかを決定する。このように、対象の経路内のタンパク質をコードするまたはその発現に影響を及ぼす遺伝子配列を同定する。結果をデータプロセッサに入力して、スクリーニング結果のデータセットをもたらすことができる。異なる条件下で得られたスクリーニング結果を比較し、分析するためにアルゴリズムが使用される。
【００５０】
分析するための方法としては、細胞に適切な色素をローディングし、対象の状態でカルシウムに曝露させ、例えば共焦点顕微鏡を用いて画像化するカルシウムイメージングが挙げられる。Ｃａ２＋応答を数量化することができ、次いで、時間依存性Ｃａ２＋応答を、連続的なＣａ２＋トランジェントのタイミングの不規則性について、およびトランジェント当たりの総Ｃａ２＋流入について分析した。各トランジェントの間に放出された総Ｃａ２＋を、各波の下の面積をベースラインについて積分することによって決定した。
【００５１】
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて、収縮力（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｆｏｒｃｅ）を測定することができる。拍動細胞を、カンチレバーを使用したＡＦＭによって調べる。力を測定するために、細胞にカンチレバーの先端を穏やかに接触させ、次いで、カンチレバーの先端を、ふれのデータが収集される間の間隔にわたってその位置のままにする。各細胞について、力、拍動間の間隔、および各収縮の持続時間に関する統計値を算出することができる。
【００５２】
細胞は、拍動心筋細胞をＭＥＡプローブ上にプレーティングし、電場電位持続時間（ＦＰＤ）を測定し、決定して電気生理学的パラメータをもたらす微小電極アレイ（ＭＥＡ）によって分析することもできる。
【００５３】
単一細胞レベルで分析する方法、例えば、上記の原子間力顕微鏡、微小電極アレイ記録、パッチクランプ、単一細胞ＰＣＲ、カルシウムイメージング、フローサイトメトリーなどが特に興味深い。
【００５４】
パラメータは細胞の数量化できる構成成分、特に、望ましくはハイスループットシステムで正確に測定することができる構成成分である。パラメータは、細胞表面決定因子、受容体、タンパク質またはそのコンフォメーションの修飾もしくは翻訳後修飾、脂質、炭水化物、有機分子もしくは無機分子、核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡなど、またはそのような細胞構成成分に由来する部分またはそれらの組合せを含めた任意の細胞構成成分または細胞産物であってもよい。大多数のパラメータにより定量的な読み取りがもたらされるが、いくつかの場合には、半定量的な結果または定性的な結果が許容される。読み取りは、単一の決定値を含んでもよく、平均値、中央値または分散などを含んでもよい。変動性が予測され、試験パラメータの設定のそれぞれについての値の範囲は、単一の値をもたらすために用いられる一般的な統計学的方法を用いる標準の統計学的方法を用いて得られる。
【００５５】
対象のパラメータは、細胞質の、細胞表面の、または分泌される生体分子、しばしば、バイオポリマー、例えば、ポリペプチド、多糖、ポリヌクレオチド、脂質などの検出を含む。細胞表面分子および分泌される分子は、細胞伝達および細胞エフェクター応答を媒介し、また、より容易にアッセイすることができるので、好ましいパラメータの種類である。一実施形態では、パラメータは特異的なエピトープを含む。エピトープは、しばしば特異的なモノクローナル抗体または受容体プローブを使用して同定される。いくつかの場合には、エピトープを含む分子実体は、２つ以上の物質由来であり、定義済みの構造を含む。例としては、組み合わせで決定された、ヘテロ二量体インテグリンと会合したエピトープが挙げられる。パラメータは、特異的に修飾されたタンパク質またはオリゴ糖の検出であってよい。パラメータは、特異的なモノクローナル抗体またはリガンドもしくは受容体結合決定因子によって定義することができる。
【００５６】
対象の候補作用剤は、多数の化学的クラス、主に、有機金属分子を含んでよい有機分子、無機分子、遺伝子配列などを包含する生物学的に活性な作用剤である。本発明の重要な態様は、候補薬物を評価すること、好ましい生物学的応答機能を有する治療用抗体およびタンパク質に基づく治療薬を選択することである。候補作用剤は、タンパク質との構造的な相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、一般には、少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基、しばしば、官能性化学基の少なくとも２つを含む。候補作用剤は、多くの場合、上記の官能基の１つまたは複数で置換された環式炭素構造もしくは複素環式構造および／または芳香族構造または多芳香族構造を含む。候補作用剤は、ペプチド、ポリヌクレオチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体またはそれらの組合せを含めた生体分子の中にも見いだされる。
【００５７】
薬理活性のある薬物、遺伝的活性のある分子などが包含される。対象の化合物としては、化学療法剤、抗炎症性作用剤、ホルモンまたはホルモンアンタゴニスト、イオンチャネル修飾因子、および向神経活性剤が挙げられる。本発明のために適した医薬品の例は、全て参照により本明細書に組み込まれる、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９９６年）、第９版、節：Ｄｒｕｇｓ  Ａｃｔｉｎｇ  ａｔ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｓｉｔｅｓ；Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｒｕｇｓ；Ｖｉｔａｍｉｎｓ、Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ；およびＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙに記載のものである。
【００５８】
試験化合物は上記の分子のクラスの全てを含み、含有量が分からない試料をさらに含んでよい。植物などの天然の供給源に由来する天然に存在する化合物の複合混合物が対象である。多くの試料は、溶液の状態の化合物を含むが、適切な溶媒に溶解させることができる固体試料もアッセイすることができる。対象の試料としては、環境試料、例えば、地下水、海水、採鉱廃棄物など；生体試料、例えば、作物、組織試料から調製した溶解物など；製造的試料、例えば、医薬品を調製する間の時間経過；ならびに分析のために調製した化合物のライブラリーなどが挙げられる。対象の試料は、潜在的な治療的価値について評価されている化合物、すなわち、薬物候補を含む。
【００５９】
試料という用語は、追加的な構成成分、例えば、イオン強度、ｐＨ、総タンパク質濃度などに影響を及ぼす構成成分が添加されている上記の流体も包含する。さらに、試料を処理して少なくとも部分的な分画または濃縮を実現することができる。生体試料は、化合物の分解を減少させる注意が払われれば、例えば、窒素の下で、凍結させて、またはそれらの組合せにおいて保管することができる。使用する試料の体積は、測定可能な検出を可能にするために十分なものであり、通常、約０．１ｍｌ〜１ｍｌの生体試料で十分である。
【００６０】
候補作用剤を含めた化合物は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含めた多種多様な供給源から得られる。例えば、無作為化したオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含めた、生体分子を含めた多種多様な有機化合物のランダムな合成および指向性合成のために多数の手段が利用可能である。あるいは、細菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能である、または容易に産生される。さらに、天然の、または合成で産生したライブラリーおよび化合物は、従来の化学的手段、物理的手段および生化学的手段によって容易に改変され、また、これを用いてコンビナトリアルライブラリーを産生することができる。公知の薬理作用剤を、指向性のまたはランダムな化学的修飾、例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などに供して、構造類似体を産生することができる。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「遺伝性作用剤」という用語は、ポリヌクレオチドおよびその類似体を指し、本発明のスクリーニングアッセイにおいて遺伝性作用剤を細胞に添加することによって試験する。遺伝性作用剤を導入することにより、細胞の遺伝組成の全体が変更される。ＤＮＡなどの遺伝性作用剤により、一般に配列を染色体に組み込むことによって、細胞のゲノム内に変化を実験的に導入することができる。遺伝学的変化は一過性であってもよく、その場合、外因性の配列は組み込まれないが、エピソーム性作用剤として維持される。アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの遺伝性作用剤も、ｍＲＮＡの転写または翻訳に干渉することによって、細胞の遺伝子型を変化させることなくタンパク質の発現に影響を及ぼし得る。遺伝性作用剤の効果は、細胞における１つまたは複数の遺伝子産物の発現を増加または減少させることである。
【００６２】
ポリペプチドをコードする発現ベクターの導入を用いて、その配列を欠く細胞においてコード産物を発現させること、または産物を過剰発現させるができる。構成的である、または外部の調節に供されている種々のプロモーターを使用することができ、後者の状況では、遺伝子の転写をオンまたはオフにすることができる。これらのコード配列は、全長のｃＤＮＡまたはゲノムのクローン、それに由来する断片、または天然に存在する配列と他のコード配列の機能的ドメインもしくは構造的ドメインを組み合わせたキメラを含んでよい。あるいは、導入された配列は、アンチセンス配列をコードしてよく、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉであってよく、ドミナントネガティブ突然変異、またはネイティブな配列の優性もしくは構成的に活性な突然変異、変更された調節配列などをコードしてよい。
【００６３】
アンチセンスおよびＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の方法によって化学的に合成することができる。好ましいオリゴヌクレオチドは、ネイティブなリン酸ジエステル構造から、それらの細胞内の安定性および結合親和性を増大させるために化学修飾される。いくつものそのような修飾が文献に記載されており、骨格、糖または複素環式塩基の化学的性質が変更されている。骨格化学の有用な変化としては、ホスホロチオエート；非架橋酸素の両方が硫黄で置換されたホスホロジチオエート；ホスホロアミダイト；アルキルホスホトリエステルおよびボラノホスフェートが挙げられる。アキラルリン酸誘導体としては、３’−Ｏ’−５’−Ｓ−ホスホロチオエート、３’−Ｓ−５’−Ｏ−ホスホロチオエート、３’−ＣＨ２−５’−Ｏ−ホスホン酸エステルおよび３’−ＮＨ−５’−Ｏ−ホスホロアミデートが挙げられる。ペプチド核酸でペプチド結合を伴うリボースリン酸ジエステル骨格全体を置き換える。安定性および親和性を増強するために糖修飾、例えば、モルホリノオリゴヌクレオチド類似体も用いられる。デオキシリボースの−アノマーも使用することができ、その場合、天然の−アノマーに対して塩基が反転している。リボース糖の２’−ＯＨを変更して２’−Ｏ−メチル糖または２’−Ｏ−アリル糖を形成することができ、これにより、親和性を含まずに分解に対する抵抗性がもたらされる。
【００６４】
作用剤を、１つまたは複数の環境条件において、例えば、β−アドレナリン作動性アゴニストを用いた刺激の後、電気的刺激または機械的刺激後などに、少なくとも１つの細胞、通常は複数の細胞に添加することによって、生物活性についてスクリーニングする。作用剤に応答したパラメータの読み取りの変化を測定し、望ましくは正規化し、次いで、得られたスクリーニング結果を参照スクリーニング結果と、例えば、他の対象の突然変異を有する細胞、正常な心筋細胞、他の家族員に由来する心筋細胞などと比較することによって評価することができる。参照スクリーニング結果は、異なる環境の変化、公知の薬物を含んでも含まなくてもよい他の作用剤を用いて得られたスクリーニング結果などの存在下、および不在下での読み取りを含んでよい。
【００６５】
作用剤は、溶液、または易溶性の形態で、培養中の細胞の培地に都合よく添加される。作用剤は、別の静的な溶液に、フロースルーシステムにおいて断続的または継続的な流れとして添加すること、あるいは、化合物のボーラスとして、単独でまたは増加的に添加することができる。フロースルーシステムでは、２つの流体を用い、一方は生理的に中性の溶液であり、他方は加える試験化合物と同じ溶液である。第１の流体が細胞を通過し、その後第２の流体が通過する。単一溶液法では、試験化合物のボーラスを、細胞を取り囲む培地の体積に添加する。培養培地の構成成分の全体的な濃度は、ボーラスを添加することにより、またはフロースルー法における２つの溶液間で有意に変化しないべきである。
【００６６】
好ましい作用剤の製剤は、製剤全体に対する有意な影響を有する可能性がある防腐剤などの追加的な構成成分を含まない。したがって、好ましい製剤は、生物活性のある化合物、および生理的に許容される担体、例えば、水、エタノール、ＤＭＳＯなどから本質的になる。しかし、化合物が溶媒を伴わない液体である場合、製剤は、化合物自体から本質的になる。
【００６７】
種々の作用剤濃度を用いて複数のアッセイを並行して実行して、さまざまな濃度に対する示差的な反応を得ることができる。当技術分野で公知の通り、作用剤の有効濃度の決定には、一般には、１：１０、または他の対数尺度、希釈度によって生じる種々の濃度範囲を用いる。濃度は、必要であれば、第２の一連の希釈によってさらに精密にすることができる。一般には、これらの濃度のうちの１つが陰性対照としての機能を果たす、すなわち、ゼロ濃度にある、または作用剤の検出のレベルを下回る、または表現型に検出可能な変化を生じさせない作用剤の濃度のレベル以下である。
【００６８】
上記の機能的なパラメータに加えて選択されたパラメータの存在を数量化するために、種々の方法を利用することができる。存在する分子の量を測定するための都合のよい方法は、分子を、蛍光、発光、放射性、酵素活性などであってよい検出可能部分、特に高親和性を有するパラメータに特異的に結合する分子を用いて標識することである。実質的に任意の生体分子、構造、または細胞型を標識するための蛍光部分が容易に入手可能である。免疫蛍光部分は、特定のタンパク質だけでなく、特定のコンフォメーション、切断産物、またはリン酸化のような部位修飾にも結合するようにすることができる。個々のペプチドおよびタンパク質を、例えば、細胞の内側で緑色蛍光タンパク質キメラとして発現させることによって、自己蛍光を発するように操作することができる（概説について、Ｊｏｎｅｓら（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１２）：４７７−８１を参照されたい）。したがって、抗体を、それらの構造の一部として蛍光色素をもたらすように遺伝子改変することができる。
【００６９】
選択した標識に応じて、蛍光標識以外を使用し、放射免疫測定法（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、均一系酵素免疫測定法、および関連する非酵素的技法などの免疫測定技法を用いてパラメータを測定することができる。これらの技法では、レポーター分子として特異的抗体を利用し、これは、単一の分子標的を付着させるための特異性の程度が高いので、特に有用である。米国特許第４，５６８，６４９号には、シンチレーション測定を用いたリガンド検出システムが記載されている。これらの技法は、タンパク質もしくは修飾されたタンパク質パラメータもしくはエピトープ、または炭水化物決定因子に対して特に有用である。タンパク質および他の細胞決定因子についての細胞の読み取りは、蛍光または他のやり方でタグを付けたレポーター分子を使用して得ることができる。細胞に基づくＥＬＩＳＡまたは関連する非酵素的方法または蛍光に基づく方法により、細胞表面パラメータおよび分泌されたパラメータを測定することが可能になる。捕捉ＥＬＩＳＡおよび関連する非酵素的な方法では、通常、２つの特異的抗体またはレポーター分子を使用し、この方法は溶液中のパラメータを測定するために有用である。フローサイトメトリー法は、細胞表面および細胞内のパラメータ、ならびに形状の変化および粒度を測定するため、および抗体連結試薬またはプローブ連結試薬として使用するビーズを分析するために有用である。そのようなアッセイからの読み取りは、個々の蛍光抗体により検出された細胞表面分子またはサイトカインと関連づけられる平均蛍光、または蛍光強度のアベレージ、蛍光強度の中央値、蛍光強度の分散、またはこれらの間のいくつかの関係であってよい。
【００７０】
定量的イメージングおよび蛍光および共焦点顕微鏡によって入力細胞型を同定し、パラメータを読み取る単一細胞多パラメータ多重アッセイおよび多細胞多パラメータ多重アッセイはどちらも当技術分野において使用されている。Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１２２．）Ｐａｄｄｏｃｋ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、１９９８を参照されたい。これらの方法は、１９９９年１１月２３日に発行された米国特許第５，９８９，８３３号に記載されている。
【００７１】
核酸、特にメッセンジャーＲＮＡの定量化も対象のパラメータである。これらは、核酸ヌクレオチドの配列に依存するハイブリダイゼーション技法によって測定することができる。技法は、ポリメラーゼ連鎖反応法ならびに遺伝子アレイ技法を含む。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２０００；Ｆｒｅｅｍａｎら（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２６（１）：１１２−２２５；Ｋａｗａｍｏｔｏら（１９９９）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ９（１２）：１３０５−１２；およびＣｈｅｎら（１９９８）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５１（３）：３１３−２４を参照されたい。
【００７２】
試験化合物から得られたスクリーニング結果と参照スクリーニング結果（複数可）との比較は、適切な演繹プロトコール、ＡＩシステム、統計比較などを用いることによって実現される。スクリーニング結果を参照スクリーニング結果のデータベースと比較することが好ましい。参照スクリーニング結果のデータベースはコンパイルすることができる。これらのデータベースは、公知の作用剤または作用剤の組合せを含むパネルからの参照結果、ならびに単一のもしくは多数の環境条件またはパラメータを除去または特異的に変更した環境条件下で処理した細胞の分析からの参照を含んでよい。参照結果は、特定の細胞の経路を選択的に標的とするまたは調節する遺伝子構築物を有する細胞を含有するパネルから生成することもできる。
【００７３】
読み取りは、平均、アベレージ、中央値もしくは分散または他の測定値に関連する統計学的または数学的に導かれた値であってよい。パラメータの読み取り情報は、対応する参照読み取りと直接比較することによってさらに精密にすることができる。各パラメータについて同一の条件下で得られる絶対値は、生きている生物系に固有の変動性を示し、個々の細胞の変動性ならびに個体間に固有の変動性も反映する。
【００７４】
便宜上、本発明のシステムは、キットに入れて提供することができる。キットは、生存能力を維持するために凍結、冷蔵、またはいくつかの他の様式で処理されていてよい、使用するための細胞と、パラメータを測定するための試薬と、スクリーニング結果を作成するためのソフトウェアとを含んでよい。ソフトウェアで結果を受け取り、分析を実施し、また、ソフトウェアは参照データを含んでよい。ソフトウェアにより、対照培養物からの結果を用いて結果を正規化することもできる。組成物は、場合によって、適切な容器内に、例えばスクリーニング方法などの所望の目的のための使用説明書と一緒に包装されていてよい。
【００７５】
本発明の実施において有用な一般的な技法をさらに綿密なものにするために、実践者は、細胞生物学、組織培養、発生学、および心臓生理学（Ｃａｒｄｉｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）における標準の教本および概説を参照することができる。組織培養および胚性幹細胞に関して、読者は、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．１９８７）；Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓｅｒｍａｎら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００、１９９３）；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｐ．Ｄ．Ｒａｔｈｊｅｎら、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．１０：３１、１９９８）を参照することを希望することができる。心臓細胞の培養に関しては、標準の参照として、Ｔｈｅ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｅｌｌ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ａ．Ｐｉｎｓｏｎ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８７）、Ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ａｄｕｌｔ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ＆ＩＩ、Ｐｉｐｅｒ＆Ｉｓｅｎｂｅｒｇ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）、Ｈｅａｒｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｈａｒｖｅｙ＆Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９８）が挙げられる。
【００７６】
分子細胞生物学の一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９６）；Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）；Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ＆Ｌｏｅｗｙ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）；およびＣｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９８）などの標準の教本に見いだすことができる。本開示において参照している遺伝子操作のための試薬、クローニングベクター、およびキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、およびＣｌｏｎＴｅｃｈなどの民間のベンダーから入手可能である。
【００７７】
本明細書において引用されている刊行物はそれぞれ、あらゆる目的についてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７８】
本発明は、記載されている特定の方法体系、プロトコール、細胞株、動物種または属、および試薬に限定されず、そういうものとして、変動し得ることが理解されるべきである。本明細書において使用される用語法は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも理解されるべきである。
【００７９】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎｄ（および）」、および「ｔｈｅ（その）」は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「ａ（１つの）細胞」への言及は、複数のそのような細胞を包含し、「ｔｈｅ（その）培養物」への言及は、１つまたは複数の培養物および当業者に公知のその等価物への言及を包含するなどである。本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、別段の明確な指示がなければ、本発明が属する当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００８０】
以下の実施例は、本発明をどのように行い、使用するかについての完全な開示および記載を当業者に提供するために提示され、発明者らがその発明とみなすものの範囲を限定するものでも、以下の実験が、実施した全ての実験または唯一の実験であることを示すものでもない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して正確さを確実にするための試みが行われているが、いくらかの実験的な誤差および偏差が考慮されるべきである。別段の指定のない限り、部分は重量による部分であり、分子量は重量アベレージ分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は、大気または大気付近の圧力である。
【実施例１】
【００８１】
拡張型心筋症（ＤＣＭ）は、心室拡張、収縮機能不全、および進行性心不全を特徴とする最も一般的な心筋症である。ＤＣＭは、心臓移植に至り、また世界的な健康管理に相当な負担をかけている最も一般的な診断である。本発明では、筋節タンパク質心筋トロポニンＴをコードする遺伝子に点突然変異（Ｒ１７３Ｗ）を有するＤＣＭ家族の患者に由来するｉＰＳＣから心筋細胞（ＣＭ）を生成した。対照である同じ家族コホート内の健康な個体と比較して、ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭは、カルシウムトランジェントの振幅の減少、収縮性の低下、および異常な筋節α−アクチニン分布を示した。β−アドレナリン作動性アゴニストを用いて刺激したところ、ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭは、不全の特性、例えば、拍動数が減少すること、収縮が弱まること、および異常な筋節α−アクチニン分布を有する細胞が有意に多いことなどを示した。β−アドレナリン作動性遮断薬処理および筋小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ（Ｓｅｒｃａ２ａ）の過剰発現により、ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの機能が改善された。我々の試験により、ヒトＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭが疾患表現型を形態学的かつ機能的に再現し、したがって、分子および細胞機構を探索するため、およびこの特定の疾患の治療を最適化するための有用なプラットフォームとしての機能を果たし得ることが実証された。
【００８２】
タンパク質ｃＴｎＴの１７３位のアミノ酸のアルギニン（Ｒ）からトリプトファン（Ｗ）への突然変異を引き起こす、遺伝子ＴＮＮＴ２のエクソン１２における常染色体優性の点突然変異を有するＤＣＭ発端者からの７個体のコホートを採用した。この特定の点突然変異のＤＣＭに対する因果効果を、１７種の主要なＤＣＭ関連遺伝子のパネルの遺伝学的スクリーニング（表１）および遺伝子同時分離試験（表２）によって確認した。この突然変異は、完全に無関係のベルギー人の家族においても報告された。採用された７個体は３世代（Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ）を包含した（図１ａ）。４人の患者（Ｉａ、ＩＩａ、ＩＩｂ、およびＩｌＩａ）では、ＴＮＮＴ２のゲノムの遺伝子座をＰＣＲで増幅し、ＤＮＡ配列決定することによって２つの対立遺伝子のうちの１つにＴＮＮＴ２  Ｒ１７３Ｗ突然変異を有することが確認されたが、他の３個体（Ｉｂ、ＩＩｃ、およびＩＩＩｂ）は正常であることが確認され、その後の試験において対照としての機能を果たした（図１ｂ）。特異的なＲ１７３Ｗ突然変異を有する４人の患者全員で左心室の拡張および駆出率の低下を伴う臨床的なＤＣＭの症候が顕在化し、医学的に処置した（表２）。１４歳の疾患患者（ＩＩＩａ）は臨床症候が重度であったので、同所性心臓移植を行った。最新のＤＣＭ関連遺伝子３２種のパネルを用いてこの特定の患者ＩＩＩａについてエキソーム配列決定することによるさらなる遺伝学的スクリーニングでは、疾患に関連づけられる任意の他の追加的な変異体は見いだされなかった（表３）。
【００８３】
７個体について患者特異的ｉＰＳＣを生成するために、各個体から取得した皮膚生検材料から皮膚線維芽細胞を増大させ（図１ｃ）、フィーダーフリー条件下で４種のレンチウイルス山中因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−ＭＹＣ）を用いて再プログラミングさせた。ＴＲＡ−１−６０＋染色およびヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）様形態を有するコロニー（図１ｄおよび１ｅ）を選び取り、増大させ、個々のｉＰＳＣ株として樹立した。その後の分析のために、各個体について３つ〜４つのｉＰＳＣ株を樹立した。ゲノムＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定により、ＤＣＭ  ｉＰＳＣ株の全てが特異的なＲ１７３Ｗ突然変異を含有することが確認された（図５）。樹立ｉＰＳＣ株の全てが多能性マーカーであるＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ−１−８１、およびＳＳＥＡ−４を発現し、アルカリホスファターゼに対して陽性であった（図１ｆ）。マイクロアレイ分析により、これらのｉＰＳＣ株が親の皮膚線維芽細胞とは別個であり、よりｈＥＳＣと類似した全体的な遺伝子パターンを発現していることが示された（図６）。定量的バイサルファイトシークエンシングにより、試験したｉＰＳＣ株の全てにおいてＯｃｔ４およびＮａｎｏｇのプロモーター領域が低メチル化状態であることが示され、これは、多能性遺伝子の転写が活性であることを示している（図１ｇ）。樹立ｉＰＳＣ株は延長した継代後に正常な核型を維持し（図７）、その大多数が外因性導入遺伝子のサイレンシングおよび内在性Ｎａｎｏｇの再発現を示した（図８）。導入遺伝子サイレンシングが不完全なｉＰＳＣ株はその後の試験から除いた。これらの患者特異的ｉＰＳＣはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて３つの胚葉全ての細胞に分化することができ（図９）、免疫不全マウスの腎臓被膜に注射されると奇形腫を形成できた（図１ｈ）。
【００８４】
次に、Ｙａｎｇ，Ｌら、Ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ｆｒｏｍ  ａ  ＫＤＲ＋  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ−ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４５３、５２４−５２８（２００８）によって開発された、十分に確立された３Ｄ分化プロトコールを用いてＤＣＭ  ｉＰＳＣを心血管系列に分化させた。自然発生拍動胚様体（ＥＢ）に分化させるために各個体から２つのｉＰＳＣ株を選択した。早ければ分化後８日目に自然発生拍動が観察された。心臓系列への分化の効率は異なる株の間で変動した（図１０）。対照ｉＰＳＣおよび患者ｉＰＳＣに由来する拍動ＥＢはおよそ５０〜６０％のｃＴｎＴ陽性ＣＭを含有した（図１１）。３人のＤＣＭ患者の３つのｉＰＳＣクローンに由来する拍動ＥＢの対立遺伝子特異的ＰＣＲにより、野生型ＴＮＮＴ２遺伝子および突然変異体（Ｒ１７３Ｗ）ＴＮＮＴ２遺伝子の二対立遺伝子の発現が示された（図１２）。対照ｉＰＳＣ由来の拍動ＥＢおよびＤＣＭ  ｉＰＳＣ由来の拍動ＥＢを多電極アレイ（ＭＥＡ）プローブ上に播種し（図１３ａ）、それらの電気生理学的性質を記録した（図１３ｂ）。対照ｉＰＳＣ由来の拍動ＥＢ（ｎ＝４５）およびＤＣＭ  ｉＰＳＣ由来の拍動ＥＢ（ｎ＝５７）はどちらも、ベースラインにおいて匹敵する拍動頻度、電場電位、スパイク間の間隔、および電場電位持続時間（ＦＰＤ）を示した（表４および図１３ｃ）。
【００８５】
次に、さらに分析するために、拍動ＥＢを小さな拍動クラスターおよび単一の拍動ＣＭに解離させた。対照ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝２４）およびＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝２４）に対するマイクロフルイディクス技術を用いた単一細胞ＰＣＲ分析により、選択された心臓関連転写因子、筋節タンパク質、およびイオンチャネルの遺伝子発現に有意差はないことが示された（図１４）。次に、ｉＰＳＣ−ＣＭにおける筋原線維の組織化を免疫細胞化学によって評価した。対照ｉＰＳＣ−ＣＭおよびＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭはどちらも筋節タンパク質ｃＴｎＴ、筋節α−アクチニン、およびミオシン軽鎖２ａ（ＭＬＣ２ａ）、ならびに心臓のマーカーギャップ結合タンパク質コネキシン４３（図１５）を発現した。しかし、分化後３０日目において、対照ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝３６８）と比較して有意に高い百分率のＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝３９１）が細胞の総面積の４分の１にわたる筋節α−アクチニンの点状の分布を示した（ｐ＝０．００８）（図２ａ、２ｂおよび図１６）。この段階で対照ｉＰＳＣ−ＣＭとＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭとの間で細胞サイズに有意差はなかった（図２ｃ）。この表現型は、それぞれ４人のＤＣＭ患者に由来する２つの異なるＤＣＭ  ｉＰＳＣ株において一貫して観察されており、これにより、疾患を引き起こすＲ１７３Ｗ突然変異との相関が均一であることが示唆されている。特に、点状の筋節α−アクチニン分布を有するＣＭの大多数は単一細胞または拍動クラスターの周辺にある細胞であった。筋節α−アクチニンは、筋節の完全性および変性に対する優れたマーカーである。これらの結果により、個々のＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭが筋節の完全性の維持において機能不良である傾向が強いことも示唆されている。
【００８６】
陽性変力ストレスにより、ＤＣＭのトランスジェニックマウスモデルにおいてＤＣＭ表現型を誘導し、臨床患者において疾患を悪化させることができる。次に、β−アドレナリン作動性アゴニストなどの陽性変力試薬を用いた処理によって、ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの表現型の応答を迅速にすることができるかどうかを検査した。実際に、ＭＥＡ記録に反映された通り、ＤＣＭ  ｉＰＳＣ由来の拍動ＥＢ（ｎ＝１４）では、１０μＭのノルエピネフリン（ＮＥ）処理により最初の陽性変時作用が誘導され、その後陰性になり、最終的に自発性収縮の不全に至った。対照的に、対照ｉＰＳＣ由来の拍動ＥＢ（ｎ＝１４）は、持続性の陽性変時活性を示した（図２ｄ）。１週間のＮＥ処理により、ＤＣＭ  ｉＰＳＣクローン由来の点状の筋節α−アクチニン分布を有するＣＭの数が著しく増加し、ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭのほぼ９０％が、組織化が乱れた筋節のパターンを有することが見いだされた（図２ｆ、２ｇ、図１７および１８）。数個の単一のＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭが、持続したＮＥ処理後に、対照細胞では観察されなかった筋フィラメントの完全な変性を示した。ＮＥを用いて処理した対照ｉＰＳＣ−ＣＭおよびＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの両方の個々の拍動クラスターのビデオ画像を用いて経時的に追跡することにより、別個の転帰が示された。ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭでは変力活性および変時活性の低下が観察されたが、対照ｉＰＳＣ−ＣＭでは観察されなかった（図２ｅ、２ｈ）。単一細胞ＰＣＲ分析により、ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝１６）と対照ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝１６）のＮＥ処理後の別個の遺伝子発現の変化も明らかになった（図１９）。これらの結果により、β−アドレナリン作動性の刺激により、ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの表現型が悪化することが示された。
【００８７】
ＣＭ収縮は、膜活動電位（ＡＰ）に反映される通り、筋細胞の電気的興奮から開始される。ＤＣＭの可能性のある基礎をなす機構を調査するために、ｃＴｎＴにおけるＤＣＭに関連づけられるＲ１７３Ｗ突然変異がＣＭの電気的興奮に影響を及ぼすかどうかを評価した。解離させた単一の拍動ｉＰＳＣ−ＣＭの電気的活性をパッチクランプによって検査した。対照ｉＰＳＣ−ＣＭおよびＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭのどちらにおいても３種類の自然発生ＡＰ（心室様、心房様、およびｎｏｄａｌ様）が観察された（図２０ａ）。ＤＣＭ心室筋細胞（ｎ＝１７）は対照（ｎ＝１８）と同程度の正常なＡＰを示した（図２０ｂ）。ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの９０％再分極（ＡＰＤ９０）における活動電位持続時間のアベレージは、対照ｉＰＳＣ−ＣＭにおいて見られたものと有意に異ならなかった（図２０ｃ）。ＡＰ発生頻度のアベレージ、ピーク振幅、および静止電位も２つの群間で非常に類似していた（図２０ｄ、２０ｅ、および２０ｆ）。これらの結果により、ベースラインにおける対照ｉＰＳＣ−ＣＭおよびＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの電気的興奮活性は正常であったことが示された。
【００８８】
基礎をなすＤＣＭ疾患機構をさらに調査するために、蛍光Ｃａ２＋イメージングによってＣａ２＋ハンドリング性を興奮−収縮カップリングレベルで測定した。ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝４０）は、対照ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝８７）のものに匹敵する全体的な［Ｃａ２＋］ｉトランジェントの律動的な頻度、タイミング、および振幅を示した（図３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｅ、および３ｆ）。しかし、ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭは、対照ｉＰＳＣ−ＣＭのものと比較して有意に小さい［Ｃａ２＋］ｉトランジェントの振幅を示し（ｐ＝０．００２）（図３ｄ）、これは、ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの各収縮に利用可能な［Ｃａ２＋］ｉが有意に少なかったことを示している。ＣＭの小さな［Ｃａ２＋］ｉトランジェントは検査した４人のＤＣＭ患者に由来するＤＣＭ  ｉＰＳＣ株の全てにおいて一貫して観察され、これにより、ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおける力発生が弱いことが示唆されている。
【００８９】
収縮力（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｆｏｒｃｅ）発生の欠乏は、誘導性ＤＣＭおよび心不全に関与する最も重要な機構の１つである。次に、これをさらに調査するために、培養したニワトリ胚ＣＭを測定するために使用した原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を使用してｉＰＳＣ−ＣＭの収縮力を測定した。ＡＦＭにより、収縮性を単一細胞レベルで探索することが可能になった（図２１）。単一の対照ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝１３）と比較して、ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝１７）は同様の拍動頻度および持続時間を示したが、収縮力は有意に弱かった（図４ｃ、４ｄ、図２２、および表５）。ＡＦＭによって測定された各単一細胞の細胞サイズと収縮力との間に相関はなかった（図２３）。
【００９０】
先の試験により、前臨床試験において調査した処理であるＳｅｒｃａ２ａの過剰発現により、動物モデルにおいて細胞内のＣａ２＋が動員され、不全のヒト心臓における心筋細胞の収縮性が回復し、不全の心臓機能が改善されたことが示された。ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭではＣａ２＋トランジェントが小さく、収縮性が弱まることを示す我々の結果を考慮して、Ｓｅｒｃａ２ａの過剰発現により、ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの表現型を救済することができると仮説を立てた。Ｓｅｒｃａ２ａとＧＦＰを同時発現しているアデノウイルス（Ａｄ．Ｓｅｃａ２ａ）（方法の節を参照されたい）を感染多重度（ＭＯＩ）１００で用いてＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭに形質導入することにより、これらの細胞においてＳｅｒｃａ２ａの過剰発現が導かれた（図４ａ）。ＧＦＰのみを有するアデノウイルス（Ａｄ．ＧＦＰ）を用いて形質導入したＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭと比較して（ＭＯＩ１００）、Ｓｅｒｃａ２ａの過剰発現により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて経時的に、より多数の自発性収縮巣がもたらされた（図２４）。Ｓｅｒｃａ２ａとＧＦＰを同時発現により、形質導入された細胞を認識し、収縮力（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｆｏｒｃｅ）をＡＦＭによって測定することが可能になった（図４ｂ）。Ｓｅｒｃａ２ａの過剰発現（ｎ＝１２）により、単一のＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの収縮力（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｆｏｒｃｅ）が対照ｉＰＳＣ−ＣＭにおいて見られるものと同様のレベルまで回復したが（図４ｃ、４ｄ、および表５）、筋節の組織化は改善されなかった（図４ｇ）。赤色蛍光Ｃａ２＋指標であるＲｈｏｄ−２ＡＭを使用したカルシウムイメージング（図２５）により、ＧＦＰを同時発現しているＡｄ．Ｓｅｒｃａ２ａを用いて形質導入されたＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝２２）の全体的な［Ｃａ２＋］ｉトランジェントが、Ａｄ．ＧＦＰのみを用いて形質導入した細胞（ｎ＝１４）と比較して有意に増加したことが示され（図４ｅおよび４ｆ）（ｐ＝０．０４）、これは、力発生が回復したことと一致する。対照的に、対照ｉＰＳＣ−ＣＭにおけるＳｅｒｃａ２ａの過剰発現では、収縮性に統計的に有意な増加を生じることはできず（図２６）、これにより、対照ｉＰＳＣ−ＣＭとＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭとの間にカルシウムハンドリングの天然の差異があることが示唆されている。総じて、これらの結果により、Ｓｅｒｃａ２ａの過剰発現により、ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの［Ｃａ２＋］ｉトランジェントおよび収縮力が増加し、それらの機能が改善されたことが示された。
【００９１】
Ｓｅｒｃａ２ａ遺伝子療法は現在臨床試験中であるが、Ｓｅｒｃａ２ａ遺伝子療法後の個々のＣＭ細胞の応答の全体的な機構は以前に広範囲にわたって試験されている。したがって、Ｓｅｒｃａ２ａ送達によりＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおける欠陥が回復する機構の調査について説明する。Ｓｅｒｃａ２ａの過剰発現後のＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの遺伝子発現プロファイリングにより、１９１遺伝子（６５遺伝子が上方制御され、１２６遺伝子が下方制御された）が１．５倍を超える発現の変化を有し、対照ｉＰＳＣ−ＣＭにおける発現レベルと同様の発現レベルまで救済されたことが示された（図２７ａ）。濃縮経路分析により、カルシウムシグナル伝達、プロテインキナーゼＡシグナル伝達、およびＧ−タンパク質共役受容体シグナル伝達などのいくつかの以前から公知の経路がＳｅｒｃａ２ａの過剰発現によるＤＣＭ表現型の救済に有意に関与することが示された。興味深いことに、心臓発生を促進する因子、インテグリンおよび細胞骨格シグナル伝達、ならびにユビキチン化経路を含めた以前はＤＣＭと関連づけられていなかったいくつかの経路もＤＣＭ  ＣＭ機能の救済に関与することが見いだされた（図２７ｂおよび表７）。
【００９２】
臨床試験により、β１選択的β−アドレナリン作動性遮断薬であるメトプロロールが、ＤＣＭ患者の臨床症候および血行動態の状態に対する有益な効果を有することが示された。１０μＭのメトプロロールで処理したところ、筋節α−アクチニン染色によって示される通り、ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭは筋節の組織化の改善を示した（図２８ａ）。メトプロロール処理により、ＮＥ処理によって誘導されるＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの増悪も予防された（図２８ｂ）。メトプロロールで処理した対照ｉＰＳＣ−ＣＭでは筋節α−アクチニン分布に対する有意な効果は観察されなかった（図２８ｃ）。これらの結果は、β−アドレナリン作動性経路の遮断が、ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの機械的劣化に対する抵抗に役立ったことを示唆している。
【００９３】
要約すると、筋節タンパク質ｃＴｎＴに単一の点突然変異を有するＤＣＭ家族由来の患者特異的ｉＰＳＣおよびこれらのｉＰＳＣ由来の誘導ＣＭを生成した。これにより、多数のＤＣＭ特異的ＣＭを生成すること、およびそれらの機能的性質を分析し、基礎をなす疾患機構を探究し、有効な療法を試験することが可能になった（表８）。ベースラインのＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの電気生理学的活性は、対照のものと有意に異ならなかったが、ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭは、有意に小さい［Ｃａ２＋］ｉトランジェントおよび収縮力（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｆｏｒｃｅ）の減少を示した。ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭには機械的刺激に抵抗する能力が弱いことも伴った。筋節α−アクチニン染色に反映された通り、ＮＥ刺激により、それらの自発性収縮の休止が誘導され、筋節の組織化が著しく悪化した。このＴＮＮＴ２  Ｒ１７３Ｗ突然変異は、ＣＭ機能にのみ影響を及ぼし、心血管系列由来の他の細胞には影響を及ぼさないと思われる（図２９）。総合すると、我々のデータにより、ＴＮＮＴ２  Ｒ１７３Ｗ突然変異により、ＣＭの力発生に機能傷害が引き起こされ、これが患者におけるＤＣＭの臨床的な表現型の最終的な出現の主要な理由である可能性があることが示された（図３０）。両方のβ−遮断薬であるメトプロロールによりＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ表現型を救済することができることが示された。さらに、現在臨床試験中の心不全に対する新規の遺伝子療法処理であるＳｅｒｃａ２ａの過剰発現により、ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの機能を有意に改善することができる。遺伝子発現プロファイリングにより、ユビキチン化およびインテグリンシグナル伝達経路を含めた、Ｓｅｒｃａ２ａ救済に関与するいくつかの新規の経路がさらに同定された。総合すると、我々の発見は、ｉＰＳＣプラットフォームにより、ＤＣＭの疾患機構および治療の標的を調査することにおける新しい興味深い研究の領域が開かれることを実証している。
【００９４】
方法
患者特異的ｉＰＳＣの誘導、培養、および特徴付け。この試験のプロトコールは全てＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄにより認可された。患者特異的ｉＰＳＣ株の生成、維持、および特徴付けを以前に記載されている通り実施した。
【００９５】
免疫蛍光法およびアルカリホスファターゼ染色。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色を、定量的アルカリホスファターゼＥＳ特徴付けキット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を製造者の説明書に従って使用して実施した。免疫蛍光法を、適切な一次抗体およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒとコンジュゲートした二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、以前に記載されている通り実施した。この試験では、Ｏｃｔ３／４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、Ｓｏｘ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＳＳＥＡ−３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＳＳＥＡ−４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＴｒａＡ−１−６０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｔｒａ−１−８１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｎａｎｏｇ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＡＦＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）（Ｓｉｇｍａ）、Ｔｕｊ−１（Ｃｏｖａｎｃｅ）、ｃＴｎＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、筋節α−アクチニン（Ｃｌｏｎｅ  ＥＡ−５３、Ｓｉｇｍａ）、コネキシン４３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、およびミオシン軽鎖（ＭＬＣ−２ａ）（Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対する一次抗体を使用した。
【００９６】
バイサルファイトパイロシークエンス。１μｇの試料ＤＮＡを、Ｚｙｍｏ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を製造者の説明書に従って使用して重硫酸塩処理した。次いで、ＰＣＲ産物を一本鎖ＤＮＡ鋳型に変換し、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＰＳＱ９６ＨＳ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｔａｇｅ）によって配列決定した。ＱＣｐＧソフトウェア（Ｂｉｏｔａｇｅ）を使用して各遺伝子座のメチル化の状態をＴ／Ｃ  ＳＮＰとして個別に分析した。
【００９７】
ヒトＥＳＣおよびｉＰＳＣの心臓分化。Ｈ７  ＥＳＣおよび誘導ｉＰＳＣ株の心臓系列への分化を、Ｙａｎｇらに記載されている十分に確立されたプロトコールを用いて実施した。機能分析のために、Ｉ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）を用いて拍動ＥＢを解離させ、ゼラチンコーティングした培養皿、ガラスチャンバースライド、またはカバーガラスに播種した。
【００９８】
カルシウムイメージング。カルシウムイメージングのために、解離させたｉＰＳＣ−ＣＭを、ゼラチンコーティングした４ウェルＬＡＢ−ＴＥＫ（登録商標）ＩＩチャンバー（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、チャンバー＃１．５Ｇｅｒｍａｎ  ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ）に播種した。細胞を、５μＭのＦｌｕｏ−４ＡＭまたはＲｈｏｄ−２ＡＭ（ＧＦＰを発現している細胞用）および０．０２％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（全てＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから）を用いて、Ｔｙｒｏｄｅｓ溶液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣＩ、１ｍＭのＭｇＣＩ２、１０ｍＭのグルコース、１．８ｍＭのＣａＣＩ２、および１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２５℃でＮａＯＨを用いてｐＨ７．４）中に、３７℃で１５分間ローディングした。次いで、細胞をＴｙｒｏｄｅｓ溶液で３回洗浄した。カルシウムイメージングを、６３×レンズ（ＮＡ＝１．４）を備えた共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、ＬＳＭ５１０  Ｍｅｔａ）を使用し、Ｚｅｎソフトウェアを用いて行った。ラインスキャンモードを使用し、試料採取速度１．９２ｍｓ／ラインで自然発生Ｃａ２＋トランジェントを室温で獲得した。１９．２秒の記録で合計１０，０００ラインを獲得した。
【００９９】
カルシウムイメージングトレースの分析。ＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の誘導体であるＦｉｊｉを使用してＣａ２＋応答を数量化して、各株の蛍光強度を平均した。次いで、時間依存性Ｃａ２＋応答を、連続的なＣａ２＋トランジェントのタイミングの不規則性について、およびトランジェント当たりの総Ｃａ２＋流入について、ＭＡＴＬＡＢを使用して分析した。トランジェント間の時間（タイミング）を２回の連続的なスパイクのピーク間の時間と定義した。ＭＡＴＬＡＢのＳｉｇｎａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｔｏｏｌｂｏｘを使用して第２の誘導体のゼロ交差を算出することによってスパイクを決定した。各トランジェントの間に放出された総Ｃａ２＋を、各波の下の面積をベースラインについて積分することによって決定した。ベースラインを全ての最小値の中央値と定義した。スパイクのタイミングと振幅の両方についての不規則性を標準偏差（ｓ．ｄ．）と一連の測定値の平均との比と定義した。
【０１００】
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）。各実験前にｉＰＳＣ−ＣＭをガラス底のペトリ皿に播種し、培養培地を温かいＴｙｒｏｄｅ溶液に切り換えた。細胞を実験中ずっと３６℃で維持した。拍動細胞を、窒化ケイ素カンチレバー（ばね定数約０．０４Ｎ／ｍ、ＢｕｄｇｅｔＳｅｎｓｏｒｓ）を使用し、ＡＦＭ（ＭＦＰ−３Ｄ  Ｂｉｏ、Ａｓｙｌｕｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって調べた。力を測定するために、細胞に、１００ｐＮの力でカンチレバーの先端を穏やかに接触させ、典型的な細胞のへこみをおよそ１００〜２００ｎｍにし、次いで、カンチレバーの先端を、Ｚピエゾフィードバックを伴わずに多数回の逐次的な２分間隔でその位置のままにし、試料速度２ｋＨｚでふれのデータを収集した。これらの測定の間の典型的なノイズはおよそ２０ｐＮであった。ばね定数を掛けることによって、ふれのデータを力に変換した。一般には、各単一細胞について１００〜４００回の拍動を収集し、各細胞について、力、拍動間の間隔、および各収縮の持続時間に関して統計値を算出した。細胞全てにわたる力を、両側スチューデントｔ検定を用いて比較した。
【０１０１】
ｉＰＳＣ−ＣＭへのアデノウイルスによる形質導入。Ｓｅｒｃａ２ａを駆動するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターと、それに加えてＧＦＰを駆動する別のＣＭＶプロモーターを有する第１世代５型組換えアデノウイルス（Ａｄ．Ｓｅｒｃａ２ａ）、および対照としてＧＦＰのみを駆動するＣＭＶプロモーターを有するアデノウイルス（Ａｄ．ＧＦＰ）を使用した。拍動ＥＢから解離させたｉＰＳＣ−ＣＭにＭＯＩ１００で一晩形質導入し、次いで、培養培地（１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ）を補給した。形質導入の４８時間後に、細胞をその後の実験ために使用した。
【０１０２】
統計分析。データを、ＥｘｃｅｌまたはＲのいずれかを使用して分析した。２つの群間の統計学的差異を、両側スチューデントｔ検定を用いて試験した。３つ以上の群間の統計学的差異を、一元配置ＡＮＯＶＡ検定、その後のチューキーの多重比較検定を用いて分析した。ｐ値が０．０５未満である場合に有意差を決定した。
【０１０３】
遺伝学的試験。患者から末梢血を抜き取ってＥＤＴＡに入れ、ゲノムＤＮＡの単離および商業的な遺伝学的試験のために、ＧｅｎｅＤｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）に送付した。「次世代」ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してＤＮＡを増幅し、配列決定した。ＤＣＭ遺伝子パネルは以下の遺伝子：ＬＭＮＡ、ＭＹＨ７、ＴＮＮＴ２、ＡＣＴＣ１、ＤＥＳ、ＭＹＢＰＣ３、ＴＰＭ１、ＴＮＮＩ３、ＬＤＢ３、ＴＡＺ、ＰＬＮ、ＴＴＲ、ＬＡＭＰ、ＳＧＣＤ、ＭＴＴＬ１、ＭＴＴＱ、ＭＴＴＨ、ＭＴＴＫ、ＭＴＴＳ１、ＭＴＴＳ２、ＭＴＮＤ１、ＭＴＮＤ５、およびＭＴＮＤ６の完全なコード領域およびスプライス部位の配列決定を含む。結果をヒト参照配列（ｃＤＮＡ  ＮＭ＿００１０８００５）と比較した。可能性のある疾患関連配列をジデオキシＤＮＡ配列決定によって確認した。３３５の民族性が混在する推定健康対照における候補疾患関連変異体の存在も決定した。ＴＮＮＴ２遺伝子において変異体が同定された（ｐ．Ａｒｇ１７３Ｔｒｐ）。これは、親水性陽性アルギニンと疎水性中性チロシンの保存されていないアミノ酸置換である。このアルギニンはいくつかの種にわたって１７３位に高度に保存されている。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析（ＰｏｌｙＰｈｅｎ）では、このアミノ酸置換は心筋トロポニンＴ２タンパク質の構造および機能に損傷を与えるものであると予測される。この変異体は、血統が混在する３３５の対照個体には見いだされなかった。
【０１０４】
エキソーム配列決定およびデータ分析。個体ＩＩＩａ由来のゲノムＤＮＡをＮｉｍｂｌｅｇｅｎ  ＳｅｑＣａｐ  ＥＺ  Ｅｘｏｍｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｖ２．０（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用したエキソーム配列決定に供した。ＤＣＭの基礎をなす３２種の最新の常染色体遺伝子１（補足の表３）を突然変異について検査した。これらの遺伝子の全てがエキソーム捕捉で標的とされ、全部で１９０ｋｂが含まれた。ＨｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）の１つのレーンを用いた配列決定により、適用範囲の中央値２１７×（四分位範囲１５２×〜２４３×）が生じた。Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ、Ｐｉｃａｒｄ、ＳＡＭｔｏｏｌｓ、ＧＡＴＫ、およびＡＮＮＯＶＡＲを含んでなる分析パイプラインを使用することによって一塩基変異体（ＳＮＶ）が見いだされた。ＳＮＰを、ＳＮＰデータベースｄｂＳＮＰ１３２を比較することによって確認した。ＳＩＦＴアルゴリズムによって有害なＳＮＶを同定した。
【０１０５】
マイクロアレイハイブリダイゼーションおよびデータ分析。対照ｉＰＳＣおよびＤＣＭ  ｉＰＳＣ（Ｓｅｒｃａ２ａ過剰発現処理したまたは処理していない）に由来する未分化のｉＰＳＣまたは４週齢のＣＭの生物学的複製由来の全ＲＮＡ試料を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  １．０ＳＴアレイにハイブリダイズさせ、次いで、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅソフトウェアによって正規化し、アノテートした。試料の各対について、全ての試料の中で標準偏差が０．２を超える転写物の発現レベルを使用してピアソン相関係数を算出した。階層クラスタリングに関しては、平均連結クラスタリングのためにピアソン相関を用いた。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ツールを使用して、濃縮経路を同定した。遺伝子の数＞５の経路のみを選択した。
【０１０６】
ヒトＥＳＣおよびｉＰＳＣの心臓分化。ヒトＥＳＣおよびｉＰＳＣを、ｍＴＥＳＲ−１ヒト多能性幹細胞培養培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を伴うＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）コーティングした表面上で８０％集密まで培養した。０日目に、アキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）（Ｓｉｇｍａ）を用いて細胞を解離させて、細胞１０〜２０個を含有する小さな凝集塊にし、基本培地（ＳｔｅｍＰｒｏ３４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２ｍＭのグルタミンを含有する、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、０．４ｍＭのモノチオグリセロール、Ｓｉｇｍａ、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、Ｓｉｇｍａ、および０．５ｎｇ／ｍｌ−ＢＭＰ４、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）２ｍｌに再懸濁させて、胚様体（ＥＢ）を形成した。１日目〜４日目に、心臓特異化のためにＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）、ヒトｂＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）、およびアクチビンＡ（３ｎｇ／ｍｌ）を基本培地に加えた。４日目〜８日目に、ＥＢにヒトＤＫＫ１（５０ｎｇ／ｍｌ）およびヒトＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有する基本培地を補給し、次いで、８日目から開始してヒトｂＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）およびヒトＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有する基本培地を補給した。全ての因子をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。５％ＣＯ２／空気環境で培養物を維持した。
【０１０７】
微小電極アレイ（ＭＥＡ）記録。分化後１９日目〜４７日目における実験の１〜３日前に、１〜６つの拍動ｉＰＳＣ−ＣＭ  ＥＢをゼラチンコーティングしたＭＥＡプローブ（Ａｌｐｈａ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にプレーティングした。ＭＥＤ６４増幅器（Ａｌｐｈａ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて２０ｋＨｚにおけるシグナルを獲得し、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ａ／ＤカードおよびＭＥＤ６４Ｍｏｂｉｕｓ  ＱＴソフトウェアを備えたＰＣを使用してデジタル化した。電場電位持続時間（ＦＰＤ）を測定し、記載の通り決定し、ＩＧＯＲ  Ｐｒｏ（Ｌａｋｅ  Ｏｓｗｅｇｏ）およびＭＳ  Ｅｘｃｅｌを使用してオフラインで補正した。Ｂａｚｚｅｔ補正式：ｃＦＰＤ＝ＦＰＤ／√スパイク間の間隔を使用して、ＦＰＤを拍動頻度に対して正規化した。ＤＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭと対照ｉＰＳＣ−ＣＭの電気生理学的パラメータを比較する統計分析を両側スチューデントｔ検定を用いて実施した。
【０１０８】
パッチクランプ。実験のために、解離させたｉＰＳＣ−ＣＭを、ゼラチンコーティングした２４ウェルプレート中の１５ｍｍの丸いカバーガラスに播種した。カバーガラス上で対照ｉＰＳＣおよびＤＣＭ  ｉＰＳＣから生成したＣＭにおける細胞全体でのパッチクランプ記録を、ＥＰＣ−１０パッチクランプ増幅器（ＨＥＫＡ）および倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、ＴＥ２０００−Ｕ）を使用して行った。フィラメント（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、＃ＢＦ１５０−１１０−１０）を伴うホウケイ酸ガラスを使用し、以下のパラメータ（熱、速度、時間）：１）７４０、２０、２５０；２）７３０、２０、２５０；３）７３０、２０、２５０；４）７１０、４７、２５０を使用し、マイクロピペットプラー（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、モデルＰ−８７）を使用してガラスピペットを調製した。以下のピペット溶液を使用して記録を行った：Ｔｙｒｏｄｅｓ溶液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣＩ、１ｍＭのＭｇＣＩ２、１０ｍＭのグルコース、１．８ｍＭのＣａＣＩ２、および１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２５℃でＮａＯＨを用いてｐＨ７．４）中１２０ｍＭのＫ  Ｄ−グルコン酸、２５ｍＭのＫＣＩ、４ｍＭのＭｇＡＴＰ、２ｍＭのＮａＧＴＰ、４ｍＭのＮａ２−クレアチンリン酸、１０ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＣａＣＩ２および１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（２５℃でＫＣＩを用いてｐＨ７．４）。両側スチューデントｔ検定を用いて統計分析を実施した。
【０１０９】
単一細胞マイクロ流体ＰＣＲ。単一の拍動ＣＭを顕微鏡の下で手動で選び取った。各細胞を、反応緩衝液（ＣｅｌｌｓＤｉｒｅｃｔ  ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＴＥ緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）、対象のプライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ／Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の混合物１０μｌを含有するＰＣＲチューブに導入した。逆転写および特異的な転写物増幅を、サーモサイクラー（ＡＢＩ  Ｖｅｒｉｔｉ）で以下の通り実施した：５０℃で１５分、７０℃で２分、９４℃で２分、次いで、９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、および６８℃で４５秒を１８サイクル、次いで、６８℃で７分。増幅されたｃＤＮＡを、Ｎａｎｏｆｌｅｘ  ＩＦＣ制御器（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を使用してＢｉｏｍａｒｋ４８．４８  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｒｒａｙチップにローディングした。相対的な蛍光強度の測定値として閾値サイクル（ＣＴ）をＢｉｏＭａｒｋ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）によって抽出した。
【０１１０】
内皮細胞分化。１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞およそ５００〜１，０００個を含有する細胞凝集体内にｉＰＳＣを分散させた。細胞凝集体を、超低付着細胞培養ディッシュ内の２０％ＥＳ−Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ  ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＫｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ中で、誘導性サイトカイン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を以下の通り補充して浮遊培養した：０日目〜７日目：２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４；１日目〜４日目：１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ；２日目〜１４日目：８ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２；４日目〜１４日目：２５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−Ａ。内皮前駆細胞を、マウス抗ヒトＣＤ３１抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して磁気によって分離し、ＥＧＭ−２内皮細胞培養培地（Ｌｏｎｚａ）中で増大させた。
【０１１１】
【表１】
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【０１１２】
【表２】
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【０１１３】
【表３】
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【０１１４】
【表４】
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【０１１５】
【表５】
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【０１１６】
【表６】
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【０１１７】
【表７】
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【０１１８】
【表８】
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【実施例２】
【０１１９】
肥大型心筋症の患者由来の心筋細胞
肥大型心筋症（ＨＣＭ）は、心臓の筋節の常染色体優性疾患であり、世界中で最も蔓延している遺伝性の心臓の状態であると推定される。ＨＣＭの患者は、血行力学的負荷の増加の不在下で左心室の（ＬＶ）心筋の異常な肥厚を示し、進行性心不全、不整脈、および心臓突然死（ＳＣＤ）などの臨床合併症リスクが高まっている。二十年前からの分子遺伝学的試験により、ＨＣＭは、心臓の筋節内のタンパク質をコードする遺伝子の突然変異によって引き起こされることが実証されている。特異的な突然変異の同定によりＨＣＭの遺伝的原因は定義されているが、筋節の突然変異によって筋細胞肥大および心室性不整脈が導かれる経路は十分に理解されていない。ＨＣＭの発生の基礎をなす機構を解明するための試みにより、矛盾する結果がもたらされ、疾患の発生を説明するためのミオシン機能の損失とミオシン機能の獲得の両方のモデルが逆説的に支持されている。これらの不一致を解決するための試みは、ヒト心臓組織を得ることの難しさおよび心臓試料を培養物中で繁殖させることができないことによって妨げられている。
【０１２０】
これらの障害を回避するために、半数が、βミオシン重鎖遺伝子（ＭＹＨ７）のエクソン１８に、アミノ酸６６３位におけるアルギニンからヒスチジンへの置換（Ａｒｇ６６３Ｈｉｓ）をコードする常染色体優性のミスセンス突然変異を有する１０個体の家族由来の人工多能性幹細胞由来の心筋細胞（ｉＰＳＣ−ＣＭ）を生成した。患者特異的ｉＰＳＣ−ＣＭの生成により、単一細胞レベルでのＨＣＭの発生反復が可能になり、ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの前臨床モデリングによりこの疾患の発生の基礎をなす機構を解明することができる。これらの所見は、ｉＰＳＣ技術が、筋節の突然変異がＨＣＭの発生をどのように引き起こすかを理解するため、およびこの疾患の新規の治療の標的を同定するための新規の方法であることを検証している。
【０１２１】
ＨＣＭ家族コホートの採用ならびに疾患遺伝子型および表現型の評価。皮膚線維芽細胞を単離するために、２世代（ＩＩおよびＩＩＩ）にわたる構成員１０人の家族コホートを採用した。発端者は、動悸、息切れ、および労作時胸痛で診察を受けにきた５３歳のアフリカ系米国人女性患者（ＩＩ−１）であった。包括的試験の結果から、下中隔および下壁（図３１Ａ）の顕著な肥厚を伴う求心性左室肥大（ＬＶＨ）が明らかになった。ＨＣＭを引き起こす突然変異の存在を確認するために、ＨＣＭに関連する１８遺伝子のパネルを用いて発端者のゲノムＤＮＡを突然変異についてスクリーニングした。ヌクレオチド配列分析により、β−ミオシン重鎖遺伝子のエクソン１８に、アミノ酸６６３位においてアルギニンからヒスチジンへの置換（Ａｒｇ６６３Ｈｉｓ；図３１Ｂ）を引き起こす公知の家族性ＨＣＭミスセンス突然変異が実証された。その後の発端者の家族の遺伝学的評価により、発端者の子供８人のうち４人（ＩＩＩ−１、ＩＩＩ−２、ＩＩＩ−３、ＩＩＩ−８；年齢２１歳、１８歳、１４歳、１０歳）がＡｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異を有することが明らかになった（図３１Ｃ）。発端者の家族は同じ包括的な臨床評価を受け、それにより、２人の年長の保因者に心エコー検査およびＭＲＩで軽度のＬＶＨ、ならびに通院モニタリングで時々の心室期外収縮が明らかになった。２人の年下の保因者（ＩＩＩ−３およびＩＩＩ−８；年齢１４歳および１０歳）は表現型が完全には発生していなかったが、心エコー検査により運動過多性機能が示された。発端者の夫（ＩＩ−２；５５歳）および他の４人の子供（ＩＩＩ−４、ＩＩＩ−５、ＩＩＩ−６、ＩＩＩ−７；年齢２０歳、１６歳、５  １４歳、１３歳）。
【０１２２】
【表９】
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【０１２３】
患者特異的ｉＰＳＣの生成および多能性の確認
１０個体全ての初代線維芽細胞から、再プログラミング因子であるＯｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ−４およびｃ−Ｍｙｃをレンチウイルスにより感染させることによって患者特異的ｉＰＳＣを生成した。患者当たり最低３つの別個の株を生成し、一連の試験を通じて多能性についてアッセイした。樹立されたｉＰＳＣは、ＥＳＣマーカーであるＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびアルカリホスファターゼについて陽性免疫染色、ならびに転写因子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇについてタンパク質の発現を示した。定量的バイサルファイトパイロシークエンスおよび定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、ＮａｎｏｇプロモーターおよびＯｃｔ−４プロモーターの低メチル化、内在性多能性転写因子の活性化、およびレンチウイルス導入遺伝子のサイレンシングが実証された。皮膚線維芽細胞、ｉＰＳＣ、およびヒトＥＳＣ（ＷＡ０９株）の全ゲノムの発現プロファイルを比較したマイクロアレイ分析により、全ての細胞株が上首尾に再プログラミングされたことがさらに確認された。核型分析により、全てのｉＰＳＣ株において３０回の継代を通じて安定な染色体の完全性が実証された。自然発生胚様体（ＥＢ）および奇形腫形成アッセイにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで３つの胚葉全ての細胞誘導体がもたらされ、これにより、生成したｉＰＳＣの多能性が確認された。制限酵素消化および配列決定により、ＨＣＭ  ｉＰＳＣのＭＹＨ７遺伝子座にＡｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異が存在し、対照ｉＰＳＣのＭＹＨ７遺伝子座にＡｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異が存在しないことが検証された。
【０１２４】
患者特異的ｉＰＳＣの心筋細胞への分化。標準の３Ｄ  ＥＢ分化プロトコールを用いて、全ての対象由来の樹立ｉＰＳＣ株を心筋細胞系列（ｉＰＳＣ−ＣＭ）に分化させた。分化開始の１０〜２０日後に、光学顕微鏡の下で、自発性収縮するＥＢが出現することが観察された。心筋トロポニンＴについての免疫染色により、対照ｉＰＳＣ株およびＨＣＭ  ｉＰＳＣ株のどちら由来の拍動ＥＢも６０〜８０％の心筋細胞の純度を有することが示された。電気生理学的性質を評価するために、拍動ＥＢを多電極アレイ（ＭＥＡ）プローブに播種した。対照ｉＰＳＣ由来のＥＢとＨＣＭ  ｉＰＳＣ由来のＥＢはどちらも、ベースラインにおいて匹敵する拍動頻度、電場電位、および上昇速度（ｕｐｓｔｒｏｋｅ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ）を示した。その後、さらなる分析のために、ＥＢを単一のｉＰＳＣ−ＣＭに解離させ、ゼラチンコーティングしたチャンバースライド上でプレーティングした。ＨＣＭ家族員由来および対照家族員由来の単一の解離したｉＰＳＣ−ＣＭはどちらも、自発性収縮を維持し、心筋トロポニンＴおよびミオシン軽鎖などの筋節タンパク質について陽性染色を示した（図３１Ｄ）。
【０１２５】
Ａｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異を有するｉＰＳＣ−ＣＭは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＨＣＭ表現型を再現する
心臓分化および単一の拍動細胞への解離後、疾患ｉＰＳＣ−ＣＭおよび対照である対応するｉＰＳＣ−ＣＭを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＨＣＭ表現型の発生反復について特徴付けた。肥大性ｉＰＳＣ−ＣＭは、心臓分化を誘導した６週間後に始まる細胞の腫大および多核化などのＨＣＭの特徴を示した（Ａｒａｄら、２００２）。誘導後４０日目に、ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭは対照である対応するｉＰＳＣ−ＣＭ（１１７５＋３２８画素；ｎ＝２２０、４つの患者株）よりも著しく大きくなり（１８５９＋５１７画素；ｎ＝２３６、４つの患者株）、有意に高い多核化の発生頻度を示した（ＨＣＭ：４９．７＋８．５％；ｎ＝２３６、４つの株対対照：２３．０＋３．７％；ｎ＝２２０、４つの株）（図３１Ｄ〜Ｆ）。突然変異体ｉＰＳＣ−ＣＭでは、免疫染色によって検出された通り、心房ナトリウム利尿性因子（ＡＮＦ）の発現、β−ミオシン／α−ミオシン比の上昇、カルシニューリン活性化、および活性化されたＴ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）の核移行を含めた他のＨＣＭの特徴も実証された（図３１Ｇ〜Ｋ）。カルシニューリン−ＮＦＡＴシグナル伝達は成体の心筋細胞における肥大の誘導に対する重要な転写活性化因子であるので、ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおける肥大性の発生に対するこの経路の重要性を試験しようとした。シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）およびＦＫ５０６によりＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおけるカルシニューリン−ＮＦＡＴ相互作用を遮断することにより、肥大が４０％超減少した（図３１Ｌ）。阻害の不在下では、ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおいて、ＧＡＴＡ４およびＭＥＦ２Ｃなどの肥大のＮＦＡＴ活性化メディエーターが有意に上方制御され、これは心臓分化の誘導後４０日目に始まり、その時点より前には始まらないことが見いだされた。総合すると、これらの結果は、カルシニューリン−ＮＦＡＴシグナル伝達が、Ａｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異によって引き起こされるＨＣＭ表現型の発生において中心的な役割を果たすことを示している。
【０１２６】
単一細胞遺伝子発現プロファイリングによりＨＣＭ関連遺伝子の活性化が実証される
ＨＣＭの臨床症状は、一般には、影響を受けた個体において数十年にわたって生じる。Ａｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異のＨＣＭ発生に対する一時的な影響を細胞レベルで調査するために、ＨＣＭ患者由来および対照患者由来の単一の精製されたｉＰＳＣ−ＣＭの両方における肥大性関連遺伝子の発現を評価した。分化の開始から２０日目、３０日目、および４０日目に、単一の収縮心筋細胞を培養皿から手動で引き上げ、３２種の心筋細胞関連転写物のパネルを使用した単一細胞定量的ＰＣＲ分析に供した。４０日目に始まり、ＧＡＴＡ４、ＴＮＮＴ２、ＭＹＬ２、およびＭＹＨ７などの肥大性関連遺伝子がＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおいて上方制御されることが見いだされた（図３１Ｍ）。この時点まではＨＣＭ関連遺伝子の発現に有意な増加は見いだされなかった。
【０１２７】
Ａｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異を有するｉＰＳＣ−ＣＭは、単一細胞レベルで電気生理学的および収縮性不整脈を示す
不整脈はＨＣＭの臨床的な特徴であり、心臓突然死を含めた疾患に関連する罹患率および死亡率の重要な部分に関与する。したがって、次に、Ａｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異を有するｉＰＳＣＣＭの電気生理学的性質を細胞全体のパッチクランプによって検査した。ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭと対照ｉＰＳＣ−ＣＭはどちらも結節様電気波形、心室様電気波形、および心房様電気波形を特徴とする筋細胞集団を含有した。分化の誘導後最初の４週間に、両群由来の細胞は同様の活動電位頻度、ピーク振幅、および静止電位を示した。しかし、３０日目に始まり、対照（５．１＋７．１％；ｎ＝１４４、５つの患者株）と比較して大きなＨＣＭ筋細胞の細画分（４０．４＋１２．９％；ｎ＝１３１、５つの患者株）が、活動電位のトリガーとなることができない遅延後脱分極（ＤＡＤ）に似た頻繁な小さな脱分極および拍動の密集を含めた不整脈性の波形を示すことが観察された（図３２Ａ１、３２Ａ２、３２Ｂ〜Ｃ）。光学顕微鏡の下での単一の拍動ｉＰＳＣ−ＣＭの微速度撮影ビデオにより、電気生理学的欠損により収縮性不整脈がもたらされることが確認された。定期的な拍動間隔を有した対照ｉＰＳＣＣＭ（１．４＋１．９％；ｎ＝６８、５つの患者株）と比較して、ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭは不規則な頻度で拍動する多数の細胞を含有した（１２．４＋５．０％；ｎ＝６４、５つの患者株）。単一細胞ビデオ記録を画素数量化ソフトウェアによって分析することにより、ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭ収縮の不整脈性が確認された。総合すると、これらの所見は、筋節の突然変異は、単一細胞レベルで電気生理学的および収縮性不整脈を誘導することができることを実証している。
【０１２８】
正常なｈＥＳＣ−ＣＭにおけるＡｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異の過剰発現により、ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭのカルシウムハンドリング異常が再現される
カルシウム（Ｃａ２＋）は、心臓における興奮収縮連関および電気生理学的シグナル伝達の調節において基本的な役割を果たす。次に、Ａｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異を有する筋細胞における不整脈の基礎をなす可能性のある機構を調査するために、対照患者およびＨＣＭ患者由来のｉＰＳＣ−ＣＭのＣａ２＋ハンドリング性を蛍光Ｃａ２＋色素であるＦｌｕｏ−４アセトキシメチルエステル（ＡＭ）を使用して分析した。健康な個体に由来するｉＰＳＣ−ＣＭと比較して、ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭでは、有意なＣａ２＋トランジェント不規則性、例えば、おそらく誘発された不整脈様電圧波形に関連する、対照細胞では実質的に存在しない多数の事象などが実証された（図３２Ｄ〜Ｅ）。興味深いことに、ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおいて、細胞の肥大が発症する前に不規則なＣａ２＋トランジェントが起こることが観察され、これにより、異常なＣａ２＋ハンドリングが肥大性表現型の誘導の原因因子である可能性があることが示唆される。自発性収縮に固有の変動によりＣａ２＋トランジェントが潜在的に混乱する可能性があるので、ラインスキャニングの間、ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭおよび対照ｉＰＳＣ−ＣＭを１Ｈｚのペーシングに供した。自発性収縮からのデータと一致して、異常なＣａ２＋トランジェントがＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭではよく見られ（１２．５＋４．９％；ｎ＝１９、５つの患者株）、対照ｉＰＳＣ−ＣＭでは存在しなかった（ｎ＝２０、５つの患者株）。電気生理およびＣａ２＋調節において観察された欠損がＡｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異に起因することをさらに確実にするために、次に、突然変異体形態のミオシンをヒト胚性幹細胞由来心筋細胞（ｈＥＳＣ−ＣＭ；ＷＡ０９株）において過剰発現させた。Ａｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異体ＭＹＨ７転写物を過剰発現しているｈＥＳＣ−ＣＭが同様の不整脈および異常なＣａ２＋トランジェントを示すことが見いだされた（図３２Ｆ〜Ｉ）。
【０１２９】
先の報告により、細胞内のＣａ２＋（［Ｃａ２＋］ｉ）上昇が不整脈および細胞の肥大のトリガーとして関連づけられた。したがって、対照ｉＰＳＣ−ＣＭにおける［Ｃａ２＋］ｉと疾患ｉＰＳＣ−ＣＭにおける［Ｃａ２＋］ｉをさらに比較した。Ｆｌｕｏ−４のベースラインの強度によって［Ｃａ２＋］ｉを予備数量化することにより、誘導後３０日目に、ＨＣＭ  ｉＰＳＣＣＭ（ｎ＝１０５、４つの患者株）では対照対応物（ｎ＝１２２、４つの患者株）よりも［Ｃａ２＋］ｉがおよそ３０％高かったことが示唆された（図３２Ｊ）。拡張期の［Ｃａ２＋］ｉの差異を確認するために、対照ｉＰＳＣ−ＣＭおよびＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにレシオメトリックＣａ２＋色素であるＩｎｄｏ−１も使用した。Ｉｎｄｏ−１イメージングにより、Ａｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異を有するｉＰＳＣ−ＣＭ（ｎ＝２６、４つの患者株）では対照細胞（ｎ＝１７、４つの患者株）と比較して拡張期の［Ｃａ２＋］ｉが高かったこと（Ｉｎｄｏ−１比が２５．１％上昇）、および不整脈活性はＡｒｇ６６３Ｈｉｓ筋細胞でのみ明らかであったことが実証された。これらの所見により、ＨＣＭの病理発生における不規則なＣａ２＋サイクリングの役割が強調される（図３２Ｋ〜Ｌ）。
【０１３０】
筋小胞体（ＳＲ）Ｃａ２＋貯蔵の測定により、Ｃａ２＋が細胞質で保持されることによりＳＲ  Ｃａ２＋取り込みが妨げられることによってＳＲ  Ｃａ２＋負荷量が減少することが示されているので、疾患ｉＰＳＣ−ＣＭにおいて［Ｃａ２＋］ｉが上昇しているという所見がさらに裏付けられる。ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭおよび対照ｉＰＳＣ−ＣＭにＦｌｕｏ−４をローディングし、ＳＲ  Ｃａ２＋貯蔵の細胞質への放出を誘導するカフェインに曝露させた。Ａｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異を有する筋細胞を、ＳＲ  Ｃａ２＋放出（平均ピークΔＦ／Ｆ０比＝３．０５＋０．２０、ｎ＝３５、３つの患者株）が対照ｉＰＳＣ−ＣＭ（平均ピークΔＦ／Ｆ０比＝３．９６＋０．１８、ｎ＝２３、３つの患者株）と比較して有意に小さいと特徴付けた（図３２Ｍ〜Ｎ）。これらの所見により、Ａｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異によって引き起こされるＨＣＭの病理発生におけるＣａ２＋サイクリング機能障害および［Ｃａ２＋］ｉの上昇の中心的な役割が実証される。
【０１３１】
変力刺激により、疾患ｉＰＳＣ−ＣＭにおけるＨＣＭ表現型が増悪する
Ａｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異を有するｉＰＳＣ−ＣＭによりｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＨＣＭ表現型の多数の態様が再現されるので、我々のプラットフォームはＨＣＭに対する医薬物の効果を単一細胞レベルで評価するためのスクリーニングツールとしても使用することができるという仮説を立てた。ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの、医薬物応答を正確にモデリングする能力を試験するために、まず、単一の対照ｉＰＳＣ−ＣＭおよび疾患ｉＰＳＣ−ＣＭを、筋細胞肥大および心室性頻脈のトリガーとなることが公知の陽性変力刺激に供した。分化の誘導の３０日後に始めて５日間毎日、患者特異的心筋細胞をβ−アドレナリン作動性アゴニスト（２００μＭのイソプロテレノール）と一緒にインキュベートした。以前は、ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭは、一般には、誘導後４０日目まで細胞の肥大を示さなかったが（図３１Ｅ）、イソプロテレノールで処理した場合、３０日目から３５日目の間で、対照対応物と比較して細胞サイズが１．７倍増加することが見いだされた（図３３Ａ）。β−アドレナリン作動性の刺激により、ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおける不規則なＣａ２＋トランジェントおよび不整脈の症状が著しく増悪することも見いだされた（図３３Ｂ〜Ｃ）。重要なことに、β−アドレナリン作動性遮断薬（４００μＭのプロプラノロール）とイソプロテレノールの同時投与により、肥大、Ｃａ２＋ハンドリング欠損、および不整脈のカテコールアミン誘導性増悪が有意に改善された。
【０１３２】
Ｃａ２＋調節不全の処理により、ＨＣＭ表現型の発生が予防される
したがって、対照ｉＰＳＣ−ＣＭおよび突然変異体ｉＰＳＣ−ＣＭをＬ型Ｃａ２＋チャネル遮断薬であるベラパミルで処理することによるＣａ２＋進入の薬学的阻害がＨＣＭ表現型の発生の予防に役立つかどうかを評価した。ＭＥＡ用量応答実験によって検出された通り、対照細胞と比較して、ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおける自然発生拍動数はベラパミルに対して比較的抵抗性であり（ＨＣＭ  ＩＣ５０＝９３０．６１＋８０．０ｎＭ、対照ＩＣ５０＝１０３．０＋６．０ｎＭ）、Ａｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異を有するｉＰＳＣ−ＣＭにおいて［Ｃａ２＋］ｉが上昇することと一致した。驚くべきことに、ベラパミルを治療投与量（５０〜１００μＭ）で単一の疾患ｉＰＳＣ−ＣＭに連続した１０〜２０日にわたって継続的に添加することにより、筋細胞肥大、Ｃａ２＋ハンドリング異常、および不整脈を含めたＨＣＭ表現型の全ての態様が有意に改善された（図３４Ａ〜Ｃ）。
【０１３３】
不整脈性ｉＰＳＣ−ＣＭを潜在的な薬学的処理について単一細胞レベルでスクリーニングすることができる
ＨＣＭに対する現行の薬学的療法はＣａ２＋チャネル遮断薬に加えてβ−遮断薬および抗不整脈薬の使用を含むので、ＨＣＭを治療するために臨床的に使用されている他の薬物１２種のパネルを、ＨＣＭ表現型を単一細胞レベルで改善するそれらの潜在性についてさらにスクリーニングした。ベラパミルが細胞の肥大を予防することができることが見いだされた唯一の作用剤であるが、Ｎａ＋流入を阻害する抗不整脈薬、例えば、リドカイン、メキシレチン、およびラノラジンなども、ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおいて、おそらくＮａ＋／Ｃａ２＋交換体による細胞へのＣａ２＋進入を制限することによって正常な拍動頻度を回復させる潜在性が実証されている。他の抗不整脈剤はＫ＋チャネルを標的とし、変力刺激の不在下で投与されたβ−遮断薬は単一細胞においていかなる治療効果も有さなかった。総じて、これらの結果により、Ｃａ２＋調節の不均衡が細胞のレベルでのＨＣＭの発生の基礎をなす中心的な機構として関連づけられ、ＨＣＭを治療するための新規の医薬品を同定するための有力なツールとしての患者特異的ｉＰＳＣ−ＣＭの潜在性を実証している。
【０１３４】
【表１０】
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ＨＣＭの遺伝的原因は、数十年前に最初に同定された。しかし、心臓の筋節をコードする遺伝子における突然変異がＨＣＭの発生を引き起こし得る機構は不明なままである。患者特異的ｉＰＳＣ−ＣＭの生成により、拡張型心筋症、ＬＥＯＰＡＲＤおよびＱＴ延長症候群を含めた遺伝性心血管障害の深さモデリングが可能になった。ＨＣＭ発生の基礎をなすシグナル伝達経路を解明するために、ｉＰＳＣ技術を利用して、半数がＭＹＨ７遺伝子にＨＣＭ  Ａｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異を有する構成員１０人の家族コホートの皮膚線維芽細胞から機能性心筋細胞を生成した。患者特異的ｉＰＳＣ−ＣＭは細胞の肥大、カルシニューリン−ＮＦＡＴ活性化、肥大転写因子の上方制御、および収縮性不整脈を含めたＨＣＭのいくつもの特性を再現した。不規則なＣａ２＋トランジェントおよび拡張期の［Ｃａ２＋］ｉの上昇が他の表現型の異常の症状よりも先に起こることが観察され、これにより、Ｃａ２＋サイクリングの調節不全が疾患の病理発生の中心的な機構として強力に関係づけられる。Ｃａ２＋恒常性の不均衡は、多数の報告においてＨＣＭの重要な特性として記載されている。しかし、これらの異常がＨＣＭの症候または原因因子であるかどうかを詳細に説明するための証拠はほとんど存在しない。
【０１３５】
この試験では、Ａｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異によって引き起こされるＨＣＭの発生におけるＣａ２＋の極めて重要な役割についてのいくつかのラインの証拠を示す。詳細には、我々の発見は、Ａｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異によって媒介される［Ｃａ２＋］ｉの上昇により、細胞の肥大と収縮性不整脈の両方が誘導され得ることを示している。［Ｃａ２＋］ｉの持続性の上昇は、ストレス状態での筋細胞の肥大の重大なエフェクターであるＣａ２＋依存性ホスファターゼであるカルシニューリンの活性化の公知のトリガーである。活性化されたカルシニューリンはＮＦＡＴ３転写因子を脱リン酸化し、ＧＡＴＡ４およびＭＥＦ２などの肥大の古典的なメディエーターと直接相互作用するためにそれらの核への移行を可能にする。心臓分化の誘導後の単一のｉＰＳＣ−ＣＭの時間に基づく遺伝子発現プロファイリングにより、肥大の下流のエフェクターの発現は［Ｃａ２＋］ｉの上昇およびＮＦＡＴの核移行に左右されることが観察されたので、このモデルが確認された。ＣｓＡおよびＦＫ５０６によるカルシニューリン活性の阻害ならびにベラパミルによるＣａ２＋流入の低下により、細胞の肥大が緩和され、これにより、ＨＣＭの病理発生におけるＣａ２＋機能障害およびカルシニューリン−ＮＦＡＴシグナル伝達の役割が確認される（図３４Ｄ）。Ｃａ２＋サイクリングの変更は、脳卒中または心臓突然死を誘導するそれらの潜在性に起因してＨＣＭの重症の臨床合併症である心不整脈の一般的なトリガーである。
【０１３６】
ＨＣＭの患者における不整脈の基礎をなす機構は十分に理解されていないが、報告により、間質性線維症、異常な心臓の解剖学的構造、筋細胞錯綜配列、細胞サイズの増大、およびＣａ２＋恒常性における機能障害が可能性のあるメディエーターとして関係づけられている。我々の発見は、ＭＹＨ７遺伝子におけるＡｒｇ６６３Ｈｉｓ突然変異が、細胞の肥大の不在下でさえも、単一細胞レベルで電気生理学的および収縮性不整脈を直接もたらし得ることを初めて実証するものである。個々のＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおける不整脈の発生の最も可能性が高い機構は［Ｃａ２＋］ｉの蓄積であり、それにより遅延後脱分極（ＤＡＤ）が誘導され、それによって筋小胞体Ｃａ２＋放出が活動電位の再分極後にトランジェント内向き電流のトリガーとなる。継続したＤＡＤの症状が今度は、再発性不整脈に罹患している患者の場合と同様に心室性頻脈および心臓突然死を導き得る。
【０１３７】
ＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの細胞全体の電流固定実験により、疾患筋細胞における頻繁な自然発生ＤＡＤ様波形の実証を通じてこの仮説が裏付けられた。これらの結果は、単一細胞レベルでＡｒｇ６６３Ｈｉｓなどの特定のＨＣＭ突然変異が不整脈の直接のトリガーとしての機能を果たし得ることを実証する最初の報告であると我々は考える。
【０１３８】
筋細胞Ｃａ２＋ローディングの上昇の機構的役割は、肥大と催不整脈の両方の中核をなすと思われる。突然変異体ｉＰＳＣ−ＣＭの医薬物スクリーニングにより、［Ｃａ２＋］ｉの上昇が不整脈発生の中心的な機構としてさらに裏付けられた。使用した１３種の作用剤のうち、Ｃａ２＋およびＮａ＋進入の薬学的遮断のみがＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭにおける収縮性不整脈を緩和した。Ｎａ＋流入の低下により、Ｃａ２＋をより容易に除去するためのＮａ＋／Ｃａ２＋交換が可能になることによって［Ｃａ２＋］ｉが制限される。我々の結果は、ＨＣＭの発生および関連する誘発された不整脈をモデリングするため、ならびに、該疾患に対する潜在的な治療剤を同定するためのｉＰＳＣに基づく技術の有用性を実証するものである。これらの結果は、単一細胞レベルでのＨＣＭの発生の開始因子としてのＣａ２＋恒常性における不均衡の直接の証拠をもたらす最初のものである。
【０１３９】
実験手順
患者の採用。発端者および家族の臨床評価は、身体検査、ＥＣＧ、心臓磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および２４時間のホルター心電図を含んだ。結果により、発端者（ＩＩ−１）および年長の２人の保因者（ＩＩＩ−１およびＩＩＩ−２）において収縮末期における頂端壁のほぼ完全な閉塞を伴う運動過多性心室収縮機能が明らかになった。発端者または保因者においてコントラスト増強ＭＲＩで増強の遅延は見いだされなかった。通院モニタリングにより、時々の心室期外収縮が明らかになった。年少の２人の保因者（ＩＩＩ−３およびＩＩＩ−８；年齢１４歳および１０歳）は運動過多性の心臓機能を示したが、他のＨＣＭの臨床的特徴は示さず、これは年齢が低いことに起因する可能性が最も高い。
【０１４０】
線維芽細胞の単離および維持。新たに単離した皮膚生検材料をＰＢＳですすぎ、１．５ｍｌのチューブに移した。コラゲナーゼＩ（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中１ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で組織を細かく切り、３７℃で６時間にわたって消化させた。解離した皮膚線維芽細胞をプレーティングし、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４．５ｇ／Ｌのグルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１１０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および５０ｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤＭＥＭを用い、加湿したインキュベーター内、３７℃、９５％空気、および５％ＣＯ２で維持した。全ての細胞を５回の継代の範囲内で再プログラミングために使用した。
【０１４１】
レンチウイルスの産生および形質導入。２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１００ｍｍのディッシュにおいて８０％集密度でプレーティングし、１２μｇのレンチウイルスベクター（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−ＭＹＣ）と、８μｇのパッケージングｐＰＡＸ２および４μｇのＶＳＶＧプラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用してトランスフェクトした。トランスフェクトした４８時間後に上清を採取し、ポアサイズ０．４５μｍの酢酸セルロースフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を通して濾過し、ＰＥＧ−ｉｔ  Ｖｉｒｕｓ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）と４℃で一晩混合した。次の日に１，５００ｇでウイルスを沈殿させ、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁させた。
【０１４２】
患者特異的ｉＰＳＣの誘導。患者特異的ｉＰＳＣ株の生成、維持、および特徴付けを、ｍＴＥＳＲ−１ｈＥＳＣ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）を伴うＭａｔｒｉｇｅｌコーティングした組織培養ディッシュ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）において、上記の通り産生したレンチウイルスを使用して、以前に記載されている通り実施した。
【０１４３】
アルカリホスファターゼ染色。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色を先の試験の場合と同様に、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ＥＳ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ＫｉｔＳ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用い、製造者の説明書を使用して行った。
【０１４４】
免疫蛍光染色。免疫蛍光染色を、以下の一次抗体：ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＡＮＦ、Ｔｕｊ−１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＡＦＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、Ｓｏｘ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、平滑筋アクチン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、筋節α−アクチニン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ｃＴｎＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＩＬ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ミオシン軽鎖２ａ（ＭＬＣ２ａ）、ミオシン軽鎖２ｖ（ＭＬＣ２ｖ）（Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍｎａｙ）、および以前に記載されているＡｌｅｘａＦｌｕｏｒとコンジュゲートした二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実施した。
【０１４５】
バイサルファイトパイロシークエンス。Ｚｙｍｏ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を使用して、製造者の説明書の通り１μｇの試料ＤＮＡをバイサルファイトで処理した。ＰＣＲ後、ｃＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ鋳型に変換し、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＰＳＱ９６  ＨＳ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｔａｇｅ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ、ＮＣ）によって配列決定した。ＱＣｐＧソフトウェア（Ｂｉｏｔａｇｅ）を用いて個々の遺伝子座をＴ／Ｃ  ＳＮＰとして分析した。
【０１４６】
マイクロアレイハイブリダイゼーションおよびデータ分析。ＲＮＡをｉＰＳＣから単離し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ１．０ＳＴ  Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）にハイブリダイズさせた。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によって発現を正規化し、アノテートした。試料の各対について、全ての試料の中で０．２を超える標準偏差を示す転写物の発現レベルを使用してピアソン相関係数を算出した。
【０１４７】
自然発生ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化。胚様体（ＥＢ）を形成させるために、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングしたプレート上で、コラゲナーゼＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｉＰＳＣコロニーを解離させ、低付着６ウェルプレート中、１５％ＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４．５ｇ／Ｌのグルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１１０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および５０ｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＫｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に播種して、胚様体（ＥＢ）を形成させた。５日後に、ＥＢを接着性のゼラチンコーティングしたチャンバースライドに移し、同じ培地でさらに８日間培養した。
【０１４８】
奇形腫の形成。未分化のｉＰＳＣ１×１０６個をＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１０μＬに懸濁させ、２８．５ゲージのシリンジで８週齢のＳＣＩＤ  Ｂｅｉｇｅマウスの腎被膜下に送達した。細胞送達の８週間後に、ヘマトキシリン・エオシン染色のために腫瘍を外植した。
【０１４９】
ウエスタンブロット。細胞全体の抽出物を、ＲＩＰＡ緩衝液を使用して単離し、タンパク質１０μｇを、Ｏｃｔ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、Ｓｏｘ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対する特異的な抗体を使用して、ウエスタンブロットによって分析した。
【０１５０】
ヒトＥＳＣおよびｉＰＳＣの心臓分化。ヒトＨ９  ＥＳＣおよびｉＰＳＣを以前に記載されている通り心筋細胞に分化させた。簡単に述べると、８０％集密時にアキュターゼ（ａｃｃｕｔａｓｅ）（Ｓｉｇｍａ）を用いて多能性幹細胞を解離させて細胞１０〜２０個の小さな凝集塊にした。細胞を、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭのグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．４ｍＭのモノチオグリセロール（Ｓｉｇｍａ）、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、および０．５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を含有する基本培地２ｍｌに再懸濁させて、ＥＢを形成させた。１〜４日目の心臓分化のために、細胞を、基本培地に添加した１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、５ｎｇ／ｍｌのヒトｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、および３ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で処理した。４〜８日目から、ＥＢに、ヒト５０ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および１０ｎｇ／ｍｌのヒトＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する基本培地を補給した。８日目以降、細胞を、５ｎｇ／ｍｌのヒトｂＦＧＦおよび１０ｎｇ／ｍｌのヒトＶＥＧＦを含有する基本培地で処理した。培養物を５％ＣＯ２／空気環境で維持した。
【０１５１】
心筋細胞サイズの測定。単一の心筋細胞を分析するために、拍動ＥＢをゼラチンコーティングしたディッシュにプレーティングした。プレーティングの３日後に、ＥＢをトリプシン処理し、ポアサイズが４０ｍｍサイズのフィルターを通して濾過し、単一細胞を、ゼラチンコーティングしたチャンバースライド（Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）に低密度で再プレーティングした。再プレーティングの３日後に、細胞を、４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を用いて固定し、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ（Ｓｉｇｍａ）中に透過処理し、５％ＢＳＡを用いてブロッキングし、心筋トロポニンＴ（１：２００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）について４℃で一晩染色した。染色された細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４ロバ−抗マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒に１時間インキュベートした。正常ｉＰＳＣ−ＣＭおよびＨＣＭ  ｉＰＳＣ−ＣＭの細胞面積を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアパッケージ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用して分析した。
【０１５２】
単一細胞マイクロ流体ＰＣＲ。光学顕微鏡の下で単一の拍動ｉＰＳＣ−ＣＭを手動で選び取り、以前に記載されている逆転写および指定のプライマーを用いたｃＤＮＡ増幅のために別々のＰＣＲチューブに入れた。増幅されたｃＤＮＡを、ＢｉｏＭａｒｋ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）によって分析するためにＢｉｏｍａｒｋ４８．４８  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｒｒａｙチップ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）にローディングした。
【０１５３】
カルシウム（Ｃａ２＋）イメージング。カルシウムイメージングのために、ｉＰＳＣ−ＣＭを解離させ、ゼラチンコーティングした８ウェルＬＡＢ−ＴＥＫ（登録商標）ＩＩチャンバー（Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に播種した。細胞に５μＭのＦｌｕｏ−４ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＴｙｒｏｄｅｓ溶液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣＩ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのグルコース、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、および１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２５℃でＮａＯＨを用いてｐＨ７．４）中０．０２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３７℃で１５分間ローディングした。Ｆｌｕｏ−４ローディング後に、細胞をＴｙｒｏｄｅｓ溶液で３回洗浄した。６３×レンズを備えた共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、ＬＳＭ５１０Ｍｅｔａ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、Ｚｅｎソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を使用してイメージングを行った。ペース調整したカルシウム色素イメージングのために、４９５＋２０ｎｍの励起および５１５±２０ｎｍの放出において蛍光を測定した。１０秒の記録時間にわたって２０ｆｐｓでビデオを撮った。細胞を１Ｈｚおよび２Ｈｚで刺激した。Ｌａｍｂｄａ  ＤＧ−４  ３００Ｗ  Ｘｅｎｏｎ光源（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）、ＯＲＣＡ−ＥＲ  ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ）、およびＡｘｉｏＶｉｓｏｎ４．７ソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を備えたＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）倒立顕微鏡で測定値を取得した。各ビデオフレームにおいて、対象領域（ＲＯＩ）を、色素強度ｆ／ｆ０の変化について、各ビデオの第１のフレームで決定される静止蛍光値ｆ０を用いて分析した。バックグラウンドの強度を全ての値から引き算し、プロットをゼロに対して正規化した。
【０１５４】
Ｉｎｄｏ−１−ＡＭを使用した基底の［Ｃａ２＋］ｉの測定。心筋細胞を、５μＭのＩｎｄｏ−１ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．０２％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する培養培地に３７℃で２０分にわたってローディングした。Ｉｎｄｏ−１ローディング後に、細胞を２ｍＭのＣａ２＋Ｒｉｎｇｅｒ（１５５ｍＭのＮａＣｌ、４．５ｍＭのＫＣＩ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤ−グルコース、および５ｍＭのＮａ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、室温で２０分インキュベートして、Ｉｎｄｏ−１を脱エステル化させた。Ｃａ２＋Ｒｉｎｇｅｒ中、３２℃で、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ落射蛍光顕微鏡を使用して心筋細胞を画像化し、０．６ＵＶＮＤフィルター（励起強度を弱毒化するため）および４００ＤＣＬＰを使用してＩｎｄｏ−１を３５０±１０ｎｍで励起させた。放出された光を、Ｃａｉｒｎ  Ｏｐｔｏｓｐｌｉｔ  ＩＩ（４２５二色性、４８８／２２帯域フィルター、Ｋｅｎｔ、ＵＫ）を使用して分離した。自然発生Ｃａ２＋トランジェントを、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を１００ｍｓの露光で使用して、ストリーム取得モードで、４×４画素ビニングで収集した。画像分析のために、Ｃａｉｒｎ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｐｌｉｔｔｅｒ  ＩｍａｇｅＪプラグインを使用して短い波長放出チャネルと長い波長放出チャネルをアラインメントした。
【０１５５】
ｉＰＳＣ−ＣＭのカフェイン処理。細胞に１．８ｍＭのＣａ２＋および１ｍＭのマグネシウムを含有するＰＢＳを用いて灌流適用し、１Ｈｚにペース調整して定期的なトランジェントを見た。灌流装置を通じて、２０ｍＭのストックカフェイン溶液の２秒のひと吹きを送達した。Ｃａ２＋放出を正確に測定するために、カフェインが細胞に到達する前にペース調整をオフにした。
【０１５６】
カルシウムイメージングラインスキャンの分析。Ｃａ２＋ラインスキャンについての蛍光強度のアベレージを、Ｆｉｊｉ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）を使用して数量化した。トランジェント間のタイミングを２回の連続的なスパイクのピーク間の時間と定義した。Ｃａ２＋ベースラインを全てのトランジェントの最小値の中央値と定義した。スパイクのタイミングの不規則性を標準偏差（ｓ．ｄ．）と平均の比と定義した。
【０１５７】
微小電極アレイ（ＭＥＡ）記録。対照ｉＰＳＣおよびＨＣＭ  ｉＰＳＣを、ＣＭの純度が６０〜８０％にわたる拍動ＥＢに分化させ、電場電位持続時間（ＦＰＤ）および拍動頻度（１分当たりの拍動、ＢＰＭ）およびスパイク間の間隔（ＩＳＩ）を記録するために多電極４０アレイに播種した。分化後２０〜４０日の実験の前に拍動ｉＰＳＣ−ＣＭ  ＥＢをゼラチンコーティングしたＭＥＡプローブ（Ａｌｐｈａ Ｍｅｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）にプレーティングした。ＭＥＤ６４増幅器（Ａｌｐｈａ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて２０ｋＨｚにおけるシグナルを獲得し、ＰＣを使用して、ＭＥＤ６４Ｍｏｂｉｕｓ  ＱＴソフトウェア（Ｗｉｔｗｅｒｘ、Ｉｎｃ．、Ｔｕｓｔｉｎ、ＣＡ）を実行するＰＣＩ−６０７１  Ａ／Ｄカード（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いてデジタル化した。全ての実験を、血清または抗生物質を伴わないＤＭＥＭ中、３５．８〜３７．５℃で実施した。ストックベラパミル溶液を再蒸留水中５０ｍＭの濃度で作製した。用量応答実験を、ＤＭＥＭ中０．４〜２μＬの１０００×ベラパミル濃度を体積１〜２ｍｌのＭＥＡプローブに各用量で１０分間添加することによって実施した。Ｍｏｂｉｕｓ  ＱＴを使用して拍動頻度および電場電位波形データをオフラインで抽出し、ＣＳＶファイルで保存した。ＦＰＤおよびＶｍａｘの測定のために波形データをＩＧＯＲ  Ｐｒｏ（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）に入力した。拍動頻度をベラパミル用量応答実験についてのベースラインに対して正規化し、Ｂａｚｅｔｔ補正式：ｃＦＰＤ＝ＦＰＤ／√スパイク間の間隔を使用してＦＰＤを拍動頻度に調整した。
【０１５８】
パッチクランプ。細胞全体でのパッチクランプ記録を、ＥＰＣ−１０パッチクランプ増幅器（ＨＥＫＡ、Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して行った。収縮ＥＢを機械的に単離し、酵素により単一細胞に分散させ、ゼラチンコーティングしたカバーガラス（ＣＳ−２２／４０、Ｗａｒｎｅｒ、Ｈａｍｄｅｎ、ＣＴ）に付着させた。記録している間、プレーティングした心筋細胞またはｈＥＲＧ−ＨＥＫ２９３細胞を含有するカバーガラスを、倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）のステージに載せたＲＣ−２６Ｃ記録チャンバー（Ｗａｒｎｅｒ）に移した。薄膜ホウケイ酸ガラス（Ｗａｒｎｅｒ）を使用し、マイクロピペットプラー（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）を用いてガラスピペットを調製し、マイクロフォージ（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して研磨し、２〜４ＭΩの抵抗を持たせた。急速溶液交換体（Ｂｉｏ−ｌｏｇｉｃ、Ｇｒｅｎｏｂｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を用い、１分を要する溶液交換を伴って細胞外の溶液灌流を継続させた。ＰａｔｃｈＭａｓｔｅｒソフトウェア（ＨＥＫＡ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してデータを獲得し、１．０ｋＨｚでデジタル化した。ＰｕｌｓｅＦｉｔ（ＨＥＫＡ）、Ｉｇｏｒ  Ｐｒｏ（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）、Ｏｒｉｇｉｎ  ６．１（Ｍｉｃｒｏｃａｌ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）、およびＰｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用してデータを分析した。ｉＰＳＣから生成したヒト心筋細胞の細胞全体でのパッチクランプ記録のために、ＴＣ−３２４Ｂ加熱システム（Ｗａｒｎｅｒ）によって温度を一定して３６〜３７℃に維持した。１４０ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣＩ、１ｍＭのＭｇＣＩ２、１０ｍＭのグルコース、１．８ｍＭのＣａＣＩ２および１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（２５℃でＮａＯＨを用いてｐＨ７．４）を含有する通常のＴｙｒｏｄｅ溶液で電流固定記録を行った。ピペット溶液は１２０ｍＭのＫＣＩ、１ｍＭのＭｇＣＩ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３ｍＭのＭｇ−ＡＴＰ、１０ｍＭのＥＧＴＡ（２５℃でＫＯＨを用いてｐＨ７．２）を含有した。ベラパミル（Ｓｉｇｍａ）をＨ２Ｏに溶解させ、ガラスバイアル中に１０ｍＭのストックとして調製した。ストック溶液を室温で１０分間、勢いよく混合した。試験のために、外液を使用して化合物をガラスバイアル中に希釈した。希釈物は使用する前３０分のうちに調製した。最終希釈物には等量のＤＭＳＯ（０．１％）が存在していた。
【０１５９】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ。ＴＲＩＺＯＬを使用して総ｍＲＮＡを単離し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡを合成するために１μｇを使用した。反応混合物０．２５μＬを用いて、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したｑＰＣＲによって遺伝子発現を数量化した。発現値をＧＡＰＤＨの発現のアベレージに対して正規化した。
【０１６０】
薬物処理。単一の収縮ｉＰＳＣ−ＣＭを、即時分析のために医薬品で１０分間処理し、次いで洗い流した。変力刺激実験のために、２００μＭのイソプロテレノールおよび４００μＭのプロプラノロールを細胞の培地に５日間連続して添加した。ベラパミル処理を、５０μＭおよび１００μＭをｉＰＳＣ−ＣＭの培養培地に１０〜２０日連続して毎日添加することによって行った。
【実施例３】
【０１６１】
アントラサイクリン毒性を有する患者由来の心筋細胞
アントラサイクリン誘導心毒性（およびアントラサイクリン誘導毒性に対する抵抗性）。ドキソルビシンなどのアントラサイクリンは白血病、ホジキンリンパ腫、ならびに他の器官の中でも、乳房、膀胱、胃、肺、卵巣、甲状腺、および筋肉の固形腫瘍を治療するために使用されている最先端の化学療法剤である。アントラサイクリンの主な副作用は心毒性であり、これにより、この化学療法剤を利用するレジメンを受けているレシピエントの多くに重度の心不全が生じる。アントラサイクリン誘導心毒性に対して易罹患性である個体ならびにアントラサイクリン誘導心毒性に対して易罹患性ではない個体から患者特異的ｉＰＳＣ−心筋細胞（ｉＰＳＣ−ＣＭ）を得た。
【０１６２】
これらの細胞は、心毒性化学療法薬を検出し、滴定するため、ならびにアントラサイクリン誘導心毒性に対する易罹患性／抵抗性に関与する遺伝子を同定するために有用である。アントラサイクリンに基づく化学レジメンを受けている、年齢が適合する患者を採用し、その患者にアントラサイクリン誘導心不全が発生するかどうかを評価した。皮膚試料を患者から採取し、線維芽細胞からｉＰＳＣ−ＣＭを生成した。
【０１６３】
線維芽細胞を単離し維持するための方法；患者特異的ｉＰＳＣ細胞株を誘導するための方法；および細胞の心臓分化のための方法を実施例１または実施例２に記載の通り実施した。
【実施例４】
【０１６４】
ＡＲＶＤの患者由来の心筋細胞
不整脈源性右心室異形成症（ＡＲＶＤ）。ＡＲＶＤは、右心室の不整脈および心臓突然死を生じる心臓デスモソームの常染色体優性疾患である。ＡＲＶＤは、肥大型心筋症に次ぐ若年期の心臓突然死の主な原因である。ＡＲＶＤに関する遺伝性の突然変異を有する患者のコホートならびに家族対応対照から患者特異的ｉＰＳＣ−心筋細胞（ｉＰＳＣ−ＣＭ）を得た。これらの細胞株は薬物スクリーニングのため、および疾患表現型に関与する分子標的を同定するために使用することができる。
【０１６５】
線維芽細胞を単離し維持するための方法；患者特異的ｉＰＳＣ細胞株を誘導するための方法；および細胞の心臓分化のための方法を実施例１または実施例２に記載の通り実施した。
【０１６６】
６人の患者の血液からｉＰＳＣ−ＣＭを作製した。２人の患者はＰＫＰ２遺伝子にＰ６７２ｆｓＸ７４０  ２０１３ｄｅｌＣ突然変異を有し、２人の患者はＰＫＰ２遺伝子にＱ６１７Ｘ  １８４９Ｃ＞Ｔ突然変異を有し、２人の患者は家族対応対照の対象であった。
【実施例５】
【０１６７】
ＬＶＮＣの患者由来の心筋細胞
左心室非圧縮（ＬＶＮＣ、ａｋａ非圧縮心筋症）。ＬＶＮＣは、胚形成の間の心筋（ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ）（心筋（ｈｅａｒｔ  ｍｕｓｃｌｅ））の発生が損なわれることによって生じる遺伝性心疾患である。ＬＶＮＣを引き起こす突然変異を有する患者では、若年期に心不全および異常な心臓の電気生理が発生する。
【０１６８】
ＬＶＮＣ患者のコホートならびに家族対応対照の対象から患者特異的ｉＰＳＣ−心筋細胞（ｉＰＳＣ−ＣＭ）を得た。これらの細胞株は、薬物スクリーニングのため、および疾患表現型に関与する分子標的を同定するために使用することができる。
【０１６９】
線維芽細胞を単離し維持するための方法；患者特異的ｉＰＳＣ細胞株を誘導するための方法；および細胞の心臓分化のための方法を実施例１または実施例２に記載の通り実施した。
【実施例６】
【０１７０】
ＤＩＬＶの患者由来の心筋細胞
左室性単心室（ＤＩＬＶ）。ＤＩＬＶは、左心房と右心房の両方が左心室に入り込む先天性心臓欠陥である。結果として、この欠陥を持って生まれた小児は機能的な心室腔を１つしか有さず、酸素添加血液を全身循環中に送り出すことが困難である。
【０１７１】
この疾患を有する１個体から患者特異的ｉＰＳＣ−心筋細胞（ｉＰＳＣ−ＣＭ）を得た。これらの細胞株は、薬物スクリーニングのため、および疾患表現型に関与する分子標的を同定するために使用することができる。
【０１７２】
線維芽細胞を単離し維持するための方法；患者特異的ｉＰＳＣ細胞株を誘導するための方法；および細胞の心臓分化のための方法を実施例１または実施例２に記載の通り実施した。
【実施例７】
【０１７３】
ＱＴ延長の患者由来の心筋細胞
ＱＴ延長（１型）症候群（ＬＱＴ−１、ＫＣＮＱ１突然変異）。ＱＴ延長症候群（ＬＱＴ）は、心電図のＱＴ期が持続し、その結果、不整脈および心臓突然死に対する易罹患性が増大する遺伝性不整脈性疾患である。ＬＱＴに関連する遺伝子が１３種分かっている。
【０１７４】
最も一般的に突然変異するＬＱＴ遺伝子であり、この疾患の全症例の３０〜３５％に関与するＫＣＮＱ１遺伝子に突然変異を有するＬＱＴ患者のコホートから患者特異的ｉＰＳＣ−心筋細胞（ｉＰＳＣ−ＣＭ）を得た。遺伝子はＧ２６９Ｓミスセンス突然変異を有した。これらの細胞株は、薬物スクリーニングのため、および疾患表現型に関与する分子標的を同定するために使用することができる。
【０１７５】
線維芽細胞を単離し、維持するための方法；患者特異的ｉＰＳＣ細胞株を誘導するための方法；および細胞の心臓分化のための方法を実施例１または実施例２に記載の通り実施した。
【０１７６】
上記では、ただ単に本発明の原理が例示されている。当業者は本明細書においてはっきりとは記載されていない、または示されていないが、本発明の原理を具体化し、その主旨および範囲内に含まれる種々の取り合わせを考案することができることが理解されよう。さらに、本明細書において列挙されている全ての例および条件付きの言葉は、読者が本発明の原理および当技術分野を推進するために発明者らが与える概念を理解するために役立つことが主に意図されており、そのような具体的に列挙された例および条件に限定されないと解釈されるべきである。さらに、本明細書において、本発明の原理、態様および実施形態ならびにその特定の例が列挙されている全ての記載は、それらの構造的等価物および機能的等価物の両方を包含するものとする。さらに、そのような等価物は、現在公知の等価物および今後開発される等価物、すなわち、構造にかかわらず、同じ機能を実施する、開発される任意の要素をどちらも包含するものとする。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示され、記載されている例示的な実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲および主旨は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３】
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【図３４】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年3月24日(2014.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014520572000001.app
【国際調査報告】
2014520572.tif 000048