(57)【要約】癌について患者をスクリーニングするための方法を提供する。方法は、対象から血液試料を得ることと、該試料中のエクソン１２ａを含むブリッジングインテグレーター１（ＢＩＮ１）アイソフォームのレベルを決定することとを含む。任意選択的に、方法は、試料中の１２ａ＋／１３−  ＢＩＮアイソフォーム（エクソン１２ａを含むが、エクソン１３は欠落している）のレベルを決定することを含む。血液試料中の高いレベルの１２ａ＋（例えば、１２ａ＋／１３−）ＢＩＮ１アイソフォームは、対象が癌を有することを示唆する。また、対象における癌治療薬の有効性を決定するための方法と、癌を治療する方法も提供される。ヒト１２ａ＋  ＢＩＮ１に選択的に結合する単離された抗体はまた、１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１アイソフォームを決定するためのキットも同様に提供される。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において癌をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記対象から血液試料を得ることと、
（ｂ）前記試料中の１２ａ＋ブリッジングインテグレーター１（ＢＩＮ１）ポリペプチドのレベルを検出することと、
（ｃ）前記試料中の１２ａ＋／１３＋  ＢＩＮ１ポリペプチドのレベルを検出することと、
（ｄ）前記試料の１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１値を決定するために、ステップ（ｂ）の前記検出されたレベルをステップ（ｃ）の前記検出されたレベルと比較することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）からの前記１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１値を１つ以上の対照値と比較することであって、高い１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１値は、前記対象が癌を有することを示唆する、比較することと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において同定された前記対象から組織試料を得ることと、を含む、方法。
【請求項２】
高い１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１値は、陰性対照値を１つ以上の陽性対照値と比較することによって決定される閾値に基づいており、前記閾値よりも高い１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１値は、前記対象が癌を有することを示唆する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記閾値は、平均陰性対照値より少なくとも１標準偏差高く設定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記閾値は、平均陰性対照値より少なくとも２標準偏差高く設定される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記閾値は、陽性対照値と比較して統計的に有意な差を示さない、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記癌は、細胞腫、肉腫、またはリンパ腫である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記癌は、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、甲状腺癌、リンパ腫、メラノーマ、および肉腫からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記癌は、肺癌である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記癌は、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、または小細胞癌である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象は、癌を発症するリスクがある、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象は、肺癌を発症するリスクがある、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
肺癌を発症するリスクがある前記対象は、喫煙歴を有するか、アスベストに曝露されてきたか、個人もしくは家族が肺癌の病歴を有するか、または長期的に受動喫煙に曝露された歴史を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１値および前記１つ以上の対照値は、前記対象の年齢によって正規化される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象は、少なくとも５０歳である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
１２ａ＋  ＢＩＮ１ポリペプチドは、１２ａ＋  ＢＩＮ１特異的抗体を使用して検出される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体は、配列番号１に選択的に結合するが、配列番号３には結合しない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体は、モノクローナル抗体または組換え抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、アミノ酸配列の配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体軽鎖のＣＤＲは、アミノ酸配列の配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５を含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
対象における癌治療薬の有効性を決定する方法であって、
（ａ）第１の癌治療薬を用いた治療の前に、癌に罹患する対象から第１の血液試料を得ることと、
（ｂ）前記第１の血液試料中の第１の１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１値を決定することと、
（ｃ）前記第１の癌治療薬を用いた少なくとも１回の治療の後に、癌に罹患する対象から第２の血液試料を得ることと、
（ｄ）前記第２の血液試料中の第２の１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１値を決定することと、
（ｅ）前記第１の１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１値を前記第２の１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１値と比較することと、
（ｅ）前記第２の血液試料中の前記１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１値が、前記第１の血液試料と比較して増加するかもしくは減少しない場合、前記対象のために第２の癌治療薬を選択すること、または、前記第２の血液試料中の前記１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１値が、前記第１の血液試料と比較して低下した場合、前記第１の癌治療薬を用いて前記対象を治療し続けることと、を含む、方法。
【請求項２１】
前記癌は、細胞腫、肉腫、またはリンパ腫である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記癌は、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、および甲状腺癌からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌は、肺癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌は、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、または小細胞癌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
対象において癌を治療する方法であって、
（ａ）前記対象から血液試料を得ることと、
（ｂ）前記試料中の１２ａ＋ブリッジングインテグレーター１（ＢＩＮ１）ポリペプチドのレベルを検出することと、
（ｃ）前記試料中の１２ａ＋／１３＋  ＢＩＮ１ポリペプチドのレベルを検出することと、
（ｄ）前記試料の１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１値を決定するために、ステップ（ｂ）の前記検出されたレベルをステップ（ｃ）の前記検出されたレベルと比較することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）からの前記１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１値を１つ以上の対照値と比較することと、
（ｆ）高い１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１値が決定された場合、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤を前記対象に投与することと、を含む、方法。
【請求項２６】
高い１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１値は、陰性対照値を１つ以上の陽性対照値と比較することによって決定される閾値に基づいており、前記閾値よりも高い１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１値は、前記対象が癌を有することを示唆する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記閾値は、平均陰性対照値より少なくとも１標準偏差高く設定される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記閾値は、平均陰性対照値より少なくとも２標準偏差高く設定される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記閾値は、陽性対照値と比較して統計的に有意な差を示さない、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記癌は、細胞腫、肉腫、またはリンパ腫である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記癌は、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、および甲状腺癌からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記癌は、肺癌である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記癌は、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、または小細胞癌である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記エクソン１２ａ＋  ＢＩＮ１ポリペプチドのレベルは、１２ａ＋  ＢＩＮ１特異的抗体を使用して決定される、請求項２５〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体は、配列番号１に選択的に結合するが、配列番号３には結合しない、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体は、モノクローナル抗体または組換え抗体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、アミノ酸配列の配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体軽鎖のＣＤＲは、アミノ酸配列の配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５を含む、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＩＤＯ阻害剤は、１−メチル−トリプトファンまたは１−メチル−Ｄ−トリプトファンを含む、請求項２５〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
配列番号１には結合するが、配列番号３には結合しない、ヒト１２ａ＋  ＢＩＮ１に選択的に結合する単離された抗体。
【請求項４１】
前記抗体重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、アミノ酸配列の配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２を含む、請求項４０に記載の単離された抗体。
【請求項４２】
前記抗体軽鎖のＣＤＲは、アミノ酸配列の配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５を含む、請求項４０または４１に記載の単離された抗体。
【請求項４３】
前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項４０に記載の単離された抗体。
【請求項４４】
前記抗体は、組換え抗体である、請求項４０に記載の単離された抗体。
【請求項４５】
１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１アイソフォームレベルを決定するためのキットであって、
（ａ）１２ａ＋  ＢＩＮ１ポリペプチドを検出するためのアッセイシステムであって、
（ｉ）１２ａ＋  ＢＩＮ１に選択的に結合する抗体と、
（ｉｉ）複数のヒトＢＩＮ１アイソフォームに選択的に結合する抗体と、を含み、
（ａ）（ｉ）の前記抗体が固体表面に固定化される場合、（ａ）（ｉｉ）の前記抗体は固定化されないか、または（ａ）（ｉ）の前記抗体が固定化されない場合、（ａ）（ｉｉ）の前記抗体が固体表面に固定化される、アッセイシステムと、
（ｂ）１２ａ＋／１３＋  ＢＩＮ１ポリペプチドを検出するためのアッセイシステムであって
（ｉ）１３＋  ＢＩＮ１に選択的に結合する抗体と、
（ｉｉ）１２ａ＋  ＢＩＮ１に選択的に結合する抗体と、を含み、
（ｂ）（ｉ）の前記抗体が固体表面に固定化される場合、（ｂ）（ｉｉ）の前記抗体は固定化されないか、または（ｂ）（ｉ）の前記抗体が固定化されない場合、（ｂ）（ｉｉ）の前記抗体が固体表面に固定化される、アッセイシステムと、を含む、キット。
【請求項４６】
（ａ）（ｉｉ）の前記抗体は、１１＋  ＢＩＮ１に選択的に結合する、請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる、２０１１年９月３０日に出願された米国特許仮出願６１／５４１，５３９号の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌は、米国における主要な死因の１つである。癌の初期診断、ならびに転移および治療効果の効率的な監視が、リスク層別化および治療法決定に役立てることができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
対象を癌についてスクリーニングする方法が提供される。この方法は、対象から血液試料を得ることと、エクソン１２ａによってコードされるポリペプチドを含有するブリッジングインテグレーター１（ＢＩＮ１）アイソフォーム（すなわち、１２ａ＋  ＢＩＮ１）のレベルを試料中で検出することとを含む。陰性対照レベルと比較して、血液試料中の高いレベルの１２ａ＋  ＢＩＮ１アイソフォームは、対象が癌を有することを示唆する。したがって、対象が高い１２ａ＋  ＢＩＮ１アイソフォームのレベルを有する場合、方法は、例えば、癌を確認してさらに定義する目的で、組織学的検査または他の分析のために、対象から組織試料を得ることをさらに含むことができる。
【０００４】
エクソン１２ａによってコードされるポリペプチドを含有するＢＩＮ１の少なくとも５個のアイソフォームが存在する：アイソフォーム１、４、５、６（本明細書においてＣａ−１とも称される）、および本明細書においてＣａ−２と称されるアイソフォームである。したがって、開示される方法は、Ｃａ−１、Ｃａ−２、およびそれらの組み合わせのレベルを含む、ＢＩＮ１アイソフォームのサブセットのレベルを決定することを含むことができる。したがって、開示される方法は、血液試料中のＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームレベルを決定することを含むことができる。
【０００５】
また、ＢＩＮ１アイソフォームＣａ−１およびＣａ−２のレベルの変化に基づいて、対象における癌治療薬の有効性を決定するための方法も提供される。この方法は、第１の癌治療薬を用いた治療の前に、癌に罹患する対象から第１の血液試料を得ることと、第１の血液試料中のＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームの第１のレベルを決定することと、第１の癌治療薬を用いた少なくとも１回の治療の後に、癌に罹患する対象から第２の血液試料を得ることと、第２の血液試料中のＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームの第２のレベルを決定することと、第１のレベルを第２のレベルと比較することとを含むことができる。これらの方法において、第２の血液試料中のＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームの値が、第１の血液試料と比較して増加するかまたは減少しない場合、対象のために第２の癌治療薬を選択することができ、それは、癌治療薬を付加的または代替的な外科手術、化学療法、もしくは放射線療法で補完することまたは置き換えることを含む。例えば、化学療法薬の投与量が増加されてもよい。第２の血液試料中のＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームの値が、第１の血液試料と比較して低下した場合、第１の癌治療薬を用いた対象の治療を継続することができる。Ｃａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームの値が十分に低下した場合、治療薬を中止してもよいか、または維持療法を開始してもよい。この方法は、後続の各癌治療薬ごとに繰り返すことができる。Ｃａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームのレベルは、癌負荷の目安であり、それによって疾患および癌治療薬の効果の定量化が可能となる。
【０００６】
対象において癌を治療する方法がさらに提供される。この方法は、癌に罹患する対象由来の第１の血液試料中のＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームのレベルを決定することと、対象に第１の治療を提供することと、対象由来の第２の血液試料中のＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームのレベルを決定することと、第２の血液試料中のＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームのレベルが、第１の血液試料中の発現レベルよりも高いか、低いか、またはそれと同じであるかに基づいて、対象に第２の治療を提供することとを含む。
【０００７】
また、高いＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームレベルを示す癌のサブタイプを選択し、ＢＩＮ１経路に対応する治療薬を提供することにより、対象において癌を治療する方法も提供される。この方法は、対象から血液試料を得ることと、血液試料中のＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームのレベルを決定することと、Ｃａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームレベルを１つ以上の対照レベルと比較することと、高いＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームレベルが決定された場合、対象にインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤を投与することとを含む。
【０００８】
また、ヒトＢＩＮ１のエクソン１２ａによってコードされるポリペプチド（１２ａ＋  ＢＩＮ１）に選択的に結合する単離された抗体も提供される。Ｃａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームレベルを検出するために、この抗体を含有するキットも提供される。キットは、１２ａ＋  ＢＩＮ１を検出するためのアッセイシステム、１２ａ＋／１３＋  ＢＩＮ１を検出するためのアッセイシステム、および／または１０＋／１２ａ  ＢＩＮ１を検出するためのアッセイシステムを含むことができる。
【０００９】
１つ以上の実施形態の詳細は、以下の添付の図面および発明を実施するための
形態に記載される。他の特徴、目的、および利点は、発明を実施するための形態および図
面、ならびに特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】進行期の癌に罹患するイヌにおいて血清ＢＩＮ１が増加することを示すヒストグラムを示す。検出は、全ＢＩＮ１に基づいている。（＊＊＊Ｐ＜０．００１）
【図２】どちらもエクソン１２ａを含有するＢＩＮ１アイソフォーム１およびアイソフォーム４の配列アラインメントである。
【図３】選択的スプライシングに起因するエクソンの有無に基づくＢＩＮ１アイソフォームの図である。
【図４Ａ】図４Ａおよび４Ｂ。１２ａ＋／１３＋  ＢＩＮ１レベルを検出するためのアッセイ（図４Ａ）および１２ａ＋  ＢＩＮ１を検出するためのアッセイ（図４Ｂ）を使用した、ＢＩＮ１組換えタンパク質の標準曲線である。
【図４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂ。１２ａ＋／１３＋  ＢＩＮ１レベルを検出するためのアッセイ（図４Ａ）および１２ａ＋  ＢＩＮ１を検出するためのアッセイ（図４Ｂ）を使用した、ＢＩＮ１組換えタンパク質の標準曲線である。
【図５】正常試料（四角形）および癌試料（三角形）における１２ａ＋／１３＋  ＢＩＮ１レベル（Ｘ軸）および１２ａ＋  ＢＩＮ１レベル（Ｙ軸）を示すプロットである。
【図６】正常試料中の１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１レベルを年齢の関数として示すプロットである。
【図７】ヒト正常試料、肺癌試料、膵臓癌試料、結腸直腸癌試料、卵巣癌試料、および甲状腺癌試料中の１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１レベルを表すプロットである。水平バーは、中央値を表す。
【図８】併せた癌試料からの１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１レベルを癌の病期の関数として示すプロットである。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｅ。肺癌試料（図９Ａ）、膵臓癌試料（図９Ｂ）、結腸直腸癌試料（図９Ｃ）、卵巣癌試料（図９Ｄ）、および甲状腺癌試料（図９Ｅ）からの１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１レベルの、癌の病期の関数としてのプロットである。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｅ。肺癌試料（図９Ａ）、膵臓癌試料（図９Ｂ）、結腸直腸癌試料（図９Ｃ）、卵巣癌試料（図９Ｄ）、および甲状腺癌試料（図９Ｅ）からの１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１レベルの、癌の病期の関数としてのプロットである。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｅ。肺癌試料（図９Ａ）、膵臓癌試料（図９Ｂ）、結腸直腸癌試料（図９Ｃ）、卵巣癌試料（図９Ｄ）、および甲状腺癌試料（図９Ｅ）からの１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１レベルの、癌の病期の関数としてのプロットである。
【図９Ｄ】図９Ａ〜９Ｅ。肺癌試料（図９Ａ）、膵臓癌試料（図９Ｂ）、結腸直腸癌試料（図９Ｃ）、卵巣癌試料（図９Ｄ）、および甲状腺癌試料（図９Ｅ）からの１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１レベルの、癌の病期の関数としてのプロットである。
【図９Ｅ】図９Ａ〜９Ｅ。肺癌試料（図９Ａ）、膵臓癌試料（図９Ｂ）、結腸直腸癌試料（図９Ｃ）、卵巣癌試料（図９Ｄ）、および甲状腺癌試料（図９Ｅ）からの１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１レベルの、癌の病期の関数としてのプロットである。
【図１０】健常なイヌおよび癌のイヌの血液試料中の１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１レベル（治療前および治療後）を示すプロットである。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｃ。イヌの１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１レベルを示す経時的変化のグラフである。図１１Ａは、＞１５の治療前シグナルを有する１番および４番の動物に関する結果を示す。図１１Ｂは、＜１５であるが＞２の治療前シグナルを有する５番および８番の動物に関する結果を示す。図１１Ｃは、＞２の治療前シグナルを有する９番および１１番の動物に関する結果を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｃ。イヌの１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１レベルを示す経時的変化のグラフである。図１１Ａは、＞１５の治療前シグナルを有する１番および４番の動物に関する結果を示す。図１１Ｂは、＜１５であるが＞２の治療前シグナルを有する５番および８番の動物に関する結果を示す。図１１Ｃは、＞２の治療前シグナルを有する９番および１１番の動物に関する結果を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｃ。イヌの１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１レベルを示す経時的変化のグラフである。図１１Ａは、＞１５の治療前シグナルを有する１番および４番の動物に関する結果を示す。図１１Ｂは、＜１５であるが＞２の治療前シグナルを有する５番および８番の動物に関する結果を示す。図１１Ｃは、＞２の治療前シグナルを有する９番および１１番の動物に関する結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書に記載される方法は、対象由来の血液試料において、エクソン１２ａによってコードされるポリペプチドを含有するＢＩＮ１アイソフォーム（１２ａ＋  ＢＩＮ１）の高いレベルのサブセットを検出することにより、対象において癌を検出することができるという知見に基づいている。陰性対照レベルと比較して、対象由来の血液試料における高いレベルの１２ａ＋  ＢＩＮ１アイソフォームは、その対象が癌を有することを示唆する。したがって、１２ａ＋  ＢＩＮ１の発現は、対象における癌の診断を決定するため、対象における癌の進行レベルまたは転移の可能性を決定するため、および対象における疾患を追跡するためのマーカーとして使用することができる。さらに、１２ａ＋  ＢＩＮ１の発現は、例えば、ＢＩＮ１経路に影響を及ぼす薬剤を含む効果的な治療薬を選択する手段として、対象における癌のサブタイプを決定するために使用することができる。
【００１２】
ブリッジングインテグレーター１（ＢＩＮ１）遺伝子は、選択的スプライシングにより核細胞質タンパク質のいくつかのアイソフォームをコードする。現在のところ、１０個のＢＩＮ１アイソフォームが同定されており、２個のアイソフォームが遍在的に発現される一方で、他のアイソフォームは特異的組織にのみ存在する。異なる機能の中でも、ＢＩＮ１は、発癌性タンパク質ｃ−Ｍｙｃに結合することにより、腫瘍抑制因子として作用する。したがって、いくつかの試験は、癌の進行中にＢＩＮ１の発現の低下を示している。興味深いことに、ＢＩＮ１の異常なスプライシング、およびその結果としての特異的アイソフォーム（複数可）の発現における増加が癌の進行と相関しているという証拠が増加している。表１に列挙される公的なデータベースを使用して、ＢＩＮ１配列において生じる可能性がある生殖細胞系列変異および体細胞変異を同定するため、ならびにヒト疾患進行中の選択的ＢＩＮ１スプライシングと発現との間の相関関係を特定するために、ＢＩＮ１のアイソフォーム４の配列を捕捉するための試験を行った。
【表１】
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【００１３】
ＢＩＮ１遺伝子は、１２７，８０５，５９９ｂｐと１２７，８６４，９０３ｂｐの間の２番染色体（２ｑ１４）に位置し（出典：ＮＣＢＩ）、少なくとも１０個の異なるアイソフォームを形成するように選択的にスプライシングすることができる２０個のエクソンを含む。ＢＩＮ１タンパク質は、ＢＡＲドメイン（ＢＩＮ１−アンフィフィシン−Ｒｖｓ１６７）、ホスホイノシチド結合ドメイン、クラスリン関連タンパク質結合ドメイン（ＣＬＡＰ）、Ｍｙｃ結合ドメイン（ＭＢＤ）、およびＳｒｃ相同性ドメイン３（ＳＨ３）等の個別のドメインを含有する（Ｐｒｅｎｄｅｒｇａｓｔ  ＧＣ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２００９  １７９５（１）：２５−３６）。エクソン１２ａは、ＣＬＡＰドメインの一部をコードする。ＢＩＮ１の４個のアイソフォームは、ＢＩＮ１の最も長いアイソフォーム（変異体１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ００４０１５）、および転写変異体４（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０６８９１８、ＮＭ＿１３９３４６、ＮＰ＿６４７５９６）とも称されるＢＩＮ１＋１２ａを含むエクソン１２ａを含有する。ＢＩＮ１＋１２ａは、ＢＩＮ１の変異体１と比較して、コード領域において４個のインフレームのエクソンが欠落しており、追加のインフレームのエクソン（エクソン１０）を有する。ＢＩＮ１の変異体１および変異体４の配列アラインメントは、図２に提供される。ＢＩＮ１の変異体１および変異体４は、主として中枢神経系において発現される。
【００１４】
ＢＩＮ１遺伝子におけるいくつかの遺伝子変異は、筋力低下疾患である中心核ミオパチーと関連付けられている。これらの変異は、ｌｙｓ３５からａｓｎ（Ｋ３５Ｎ）への置換をもたらす、ＢＩＮ１遺伝子におけるホモ接合型１０５のＧからＴへの塩基変換、およびａｓｐ１５１からａｓｎ（Ｄ１５１Ｎ）への置換をもたらす、ホモ接合型４５１のＧからＡへの変換を含む。また、ｌｙｓ５７５からｔｅｒ（Ｋ５７５Ｘ）への置換をもたらす早期停止ＢＩＮ１タンパク質を形成する変異も、ＢＩＮ１遺伝子におけるホモ接合型１７２３のＡからＴへの塩基変換とともに同定されている。最後に、ａｒｇ１５４からｇｌｎ（Ｒ１５４Ｑ）への置換をもたらす、ＢＩＮ１遺伝子のエクソン６におけるホモ接合型４６１のＧからＡへの変換もまた、常染色体劣性遺伝性中心核ミオパチーに罹患する患者において同定されている。ＢＩＮ１のアイソフォーム８（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０６８９１８）は、ＢＩＮ１変異体１と比較して、コード領域において、エクソン１２ａを含む５個のインフレームのエクソンが欠落した、追加のインフレームのエクソン（エクソン１０）を有する変異体であり、骨格筋において特異的に発現される。エクソン１０（ホスホイノシチド結合ドメイン）の排除をもたらすこのアイソフォーム８の選択的スプライシングは、筋緊張性ジストロフィーにおける筋力低下と関連している。最後に、エクソン１２ａ中の２個を含む、ＢＩＮ１遺伝子におけるいくつかの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が記載されている。これら２つのＳＮＰに関する表現型は同定されていない。
【００１５】
ＢＩＮ１は、ｃ−Ｍｙｃへの結合を通して腫瘍抑制因子として作用し、その後、その転写活性を抑制する。したがって、ＢＩＮ１の発現の減衰が、乳癌、前立腺癌、肺癌、脳癌、結腸癌の多くの症例に観察される。興味深いことに、遍在的なアイソフォーム９および１０の癌特異的変異体は、ＣＮＳ特異的エクソン１２ａの異常な封入を示す。１２ａ＋  ＢＩＮ１アイソフォームは、多くの腫瘍細胞および腫瘍細胞株において観察され、ヒトの癌における一般的なスプライシング異常事象を意味する（Ｐｒｅｎｄｅｒｇａｓｔ  ＧＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２００９  １７９５（１）：２５−３６）。例えば、これらの１２ａ＋  ＢＩＮ１アイソフォームは、メラノーマにおいて異常に発現され、この選択的スプライシングは、ＢＩＮ１の腫瘍抑制因子活性を無効にし、プログラム細胞死を誘導せずにｃ−Ｍｙｃの過剰発現を許容する（Ｇｅ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９９  ９６（１７）：９６８９−９４；Ｘｕ  Ｑ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３  ３１（１９）：５６３５−４３）。
【００１６】
ミスセンスおよび同義の両方のＢＩＮ１遺伝子における体細胞変異も、皮膚癌（８個の試料のうち３個）、脳癌（２／４６９）、肺癌（１／１１）、卵巣癌（３／３）、大腸癌（２／１４）、および前立腺癌（３／４）を含む癌のいくつかの症例において報告されている。
【００１７】
さらに、ＢＩＮ１レベルの増加は、異なる種類の癌または癌の進行中に観察されている。ＳＷ４８０結腸癌細胞株およびそれらに関連するリンパ節転移ＳＷ６２０細胞の遺伝子アレイ分析は、原発腫瘍から単離されたＳＷ４８０細胞と比較して、転移細胞ＳＷ６２０におけるＢＩＮ１の転写レベルの統計的に有意な増加を示した。高密度オリゴヌクレオチドを用いて２２個の原発性ヒト進行胃癌組織および８個の非癌性胃組織を分析した別の試験において、ＢＩＮ１転写物のレベルは、患者の癌組織の４０％において正常な胃組織よりも高かった。異なる試験では、ＢＩＮ１のＮ末端またはＣ末端ドメインに対する抗体を使用して、異なる癌に罹患する患者の組織におけるＢＩＮ１タンパク質の発現を測定した。その結果は、悪性リンパ腫（症例の７５％）、悪性神経膠腫（４８％）、および精巣癌（４３％）においてＢＩＮ１の強い発現を示した。さらに、結腸直腸癌（症例の７３％）、前立腺癌（１００％）、卵巣癌（６２％）、皮膚癌（６６％）、腎臓癌（７５％）、および肺癌（４６％）に罹患する患者の癌組織において、中〜強程度の染色が観察された（出典：ＨＰＲＤ）。
【００１８】
このように、ブリッジングインテグレーター１（ＢＩＮ１）遺伝子は、元々は腫瘍抑制因子の特徴を有するＭｙｃ相互作用タンパク質として同定された核細胞質タンパク質をコードする。ＢＩＮ１はまた、アンフィフィシンＩＩ、アンフィフィシン様、およびボックス依存性ＭＹＣ相互作用タンパク質１としても知られている。ＢＩＮ１ｍＲＮＡ前駆体転写物の選択的スプライシングは、異なるアイソフォームをコードする少なくとも１１個の転写変異体を生じる。ＢＩＮ１のアイソフォームには、遍在的に発現されるものもあれば、組織特異的発現を示すものもある。ＢＩＮ１アイソフォーム１〜７は、ニューロンで発現される。アイソフォーム８は筋骨格特異的であるのに対し、アイソフォーム９および１０は遍在的である。中枢神経系において発現されるアイソフォームは、シナプス小胞エンドサイトーシスに関与する可能性があり、ダイナニム、シナプトジャニン、エンドフィリン、およびクラスリンと相互作用し得る。腫瘍細胞株において発現される異常スプライス変異体（通常、中枢神経系において他のエクソン（エクソン１２ｂ〜１２ｄ）を有するＢＩＮ１のｍＲＮＡにスプライシングされるエクソン１２ａを含むアイソフォームを含む）もまた記載されている。エクソン１２ａは、以下のヌクレオチド配列を含むことができる：５’−ＣＴＣＣＧＧＡＡＡＧ  ＧＣＣＣＡＣＣＡＧＴ  ＣＣＣＴＣＣＧＣＣＴ  ＣＣＣＡＡＡＣＡＣＡ  ＣＣＣＣＧＴＣＣＡＡ  ＧＧＡＡＧＴＣＡＡＧ  ＣＡＧＧＡＧＣＡＧＡ  ＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴ  ＧＴＴＴＧＡＧＧＡＣ  ＡＣＧＴＴＴＧＴＣＣ  ＣＴＧＡＧＡＴＣＡＧ  ＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣ  ＣＣＣＴＣＣＣＡＧ−３’（配列番号２）。代替として、ヌクレオチド配列は、配列番号２に対して少なくとも８５、９０、または９５パーセントの同一性を示し、そのような変異体は、発現されたタンパク質においてアミノ酸変化を引き起こす場合または引き起こさない場合がある。
【００１９】
ＢＩＮ１は、一般に、腫瘍抑制因子であるとみなされている。しかしながら、１２ａを含有するＢＩＮ１タンパク質のアイソフォームは、腫瘍プロモーターとして作用する。エクソン１２ａを含まない場合、ＢＩＮ１は、エクソン１３および１４によってコードされるそのｍｙｃ結合ドメインを介してｍｙｃを隔離することによる、腫瘍抑制因子である。しかしながら、悪性転換では、１２ａ＋  ＢＩＮ１は、Ｍｙｃ癌遺伝子を隔離せずに、Ｍｙｃを遊離させて細胞を駆動し、増殖させる。そのため、１２ａ＋  ＢＩＮ１に特異的なアッセイは、癌ＢＩＮ１が優位であるおよび／または活性である生理学的状態を検出することができる。
【００２０】
エクソン１２ａによってコードされるポリペプチドを含有するＢＩＮ１の少なくとも５個のアイソフォーム（１２ａ＋  ＢＩＮ１）が存在する：アイソフォーム１、４、５、６（本明細書においてＣａ−１とも称される）、および本明細書においてＣａ−２と称されるアイソフォームである。本明細書に開示されるように、Ｃａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームの存在は、特に癌を示唆する。開示される方法は、Ｃａ−１、Ｃａ−２、またはそれらの組み合わせのレベルを含む、ＢＩＮ１アイソフォームのサブセットのレベルを決定することを含むことができる。したがって、開示される方法は、血液試料中のＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームレベルを決定することを含むことができる。
【００２１】
アイソフォームＣａ−２は、エクソン１３によってコードされるポリペプチドが存在しないことにより、アイソフォーム１、４、５、および６とは異なる。したがって、開示される方法は、少なくともエクソン１２ａおよびエクソン１３の両方によってコードされるポリペプチドを含有するＢＩＮ１アイソフォーム（すなわち、１２ａ＋／１３＋  ＢＩＮ１）の血中レベルを検出し、それによってＣａ−２アイソフォームを排除することをさらに含むことができる。全ての１２ａ＋  ＢＩＮアイソフォームの、１２ａ＋／１３＋サブセットのアイソフォームに対する比率または差が、Ｃａ−２（すなわち、１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１）アイソフォームのレベルを決定する。同様に、Ｃａ−１レベルは、例えば、少なくともＢＩＮ１のエクソン１０および１２ａによってコードされるポリペプチドを検出することによって、特異的に決定することができる。
【００２２】
全体を通して用いられるＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームレベルの決定への言及は、Ｃａ−１（１０＋／１２ａ＋  ＢＩＮ１）および／またはＣａ−２（１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１）アイソフォームを単離し、そのレベルを決定するための、１２ａ＋  ＢＩＮ１（すなわち、エクソン１２ａによってコードされるポリペプチド）の検出と、１３＋  ＢＩＮ（すなわち、エクソン１３ａによってコードされるポリペプチド）および／または１０＋  ＢＩＮ１（すなわち、エクソン１０によってコードされるポリペプチド）の任意選択的な検出とを含む。
【００２３】
対象において癌を診断する方法が本明細書に提供される。方法は、対象から血液試料を得ることと、試料中のＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームのレベルを検出することとを含む。高いレベルのＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォーム、特に、対照レベルを超えるＣａ−２アイソフォームのレベルは、対象が癌を有することを示唆する。したがって、対象が高いレベルのＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームを有する場合、方法は、例えば、癌を確認してさらに定義する目的で、組織学的検査または他の分析のために、対象から組織試料（生検）を得ることをさらに含むことができる。他の診断ステップは、当業者に既知であり、さらなる臨床検査（例えば、さらなる血液検査、尿検査、または同じＢＩＮ１マーカーもしくは他のマーカーを使用した組織分析）、画像診断等を含む。ＢＩＮ１分析と同時に、またはその後に使用することができる血液検査は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、カルシトニン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、およびその他の分析を含む。さらに、対象が高いレベルのＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームを有する場合、方法は、癌の存在を確認するために、対象の画像診断を行うことをさらに含むことができる。癌のための画像診断法の技術は、Ｘ線、ＣＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩ、および超音波を含む。
【００２４】
開示される方法は、Ｃａ−１、Ｃａ−２、またはそれらの組み合わせのレベルを含む、１２ａ＋  ＢＩＮ１アイソフォームのサブセットのレベルを検出することを含むことができる。したがって、開示される方法は、試料中の１２ａ＋／１３−（Ｃａ−２）ＢＩＮ１アイソフォームのレベルを検出することと、それを対照レベルと比較することとを含むことができる。したがって、方法は、対象から血液試料を得ることと、試料中の１２ａ＋  ＢＩＮ１アイソフォームのレベルを検出することと、試料中の１２ａ＋／１３ａ＋  ＢＩＮ１アイソフォームのレベルを検出することと、試料の１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１（Ｃａ−２）値を決定するために、検出された１２ａ＋  ＢＩＮ１アイソフォームのレベルを検出された１２ａ＋／１３ａ＋  ＢＩＮ１アイソフォームのレベルと比較することと、１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１（Ｃａ−２）値を１つ以上の対照値と比較することとを含むことができる。これらの方法において、高い１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１（Ｃａ−２）値は、対象が癌を有することまたは癌の可能性を示唆するため、対象は、さらなる検査を必要とする。したがって、対象が高い１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１（Ｃａ−２）値を有する場合、方法は、上述のように、例えば、癌を確認してさらに定義する目的で、組織学的検査または他の分析のために、対象から組織試料を得ることをさらに含むことができる。
【００２５】
対照値は、例えば、閾値よりも高いＣａ−１および／またはＣａ−２値は、対象が癌を有することを示唆するように、閾値を確立するために使用することができる。この閾値は、陽性対照（癌または特定の種類のもしくは病期の癌に罹患する対象由来の試料）と陰性対照（癌に罹患していない、または癌の治療に成功した対象由来の試料）とを比較することによって、経験的に決定することができる。そのような対照は、任意選択的に、年齢を適合させるか、または癌の種類もしくは病期にしたがって適合させる。高いＣａ−１および／またはＣａ−２値を識別するために、平均陰性対照値より少なくとも１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、または５標準偏差高く閾値を設定することができる。アッセイに必要とされる所望の予測力の範囲内である閾値を設定するための他の統計的方法が用いられてもよい。例えば、閾値は、通常の統計分析を使用して、閾値と陽性対照値との間に統計的に有意な差が存在しないように設定されてもよい。
【００２６】
本明細書において使用される場合、陰性対照レベルは、癌に罹患していない異なる対象（複数可）、または癌の診断前に同じ対象（複数可）から決定されてもよい。同様に、陽性対照値は、癌に罹患する１人以上の対象から決定されてもよい。代替として、陽性対照は、標準対照中の組換えＢＩＮ１等の既知の濃度のＢＩＮ１アイソフォーム（複数可）を含有する１つ以上の試料に基づいていてもよい。
【００２７】
任意選択的に、１２ａ＋  ＢＩＮ１ポリペプチド配列は、アミノ酸配列ＬＲＫＧＰＰＶＰＰＰ  ＰＫＨＴＰＳＫＥＶＫ  ＱＥＱＩＬＳＬＦＥＤ  ＴＦＶＰＥＩＳＶＴＴ  ＰＳＱ（配列番号１）を含む。代替として、アミノ酸配列は、配列番号１と少なくとも８５、９０、または９５パーセント同一であってもよい。配列における変異は、アミノ酸の挿入、欠失、または置換（例えば、１〜５個の保存アミノ酸置換）を含むことができる。
【００２８】
任意選択的に、癌は、固形腫瘍（例えば、細胞腫、メラノーマ、肉腫、リンパ腫、もしくは神経芽細胞腫）、または血液癌（例えば、白血病もしくはリンパ腫）である。癌は、例えば、原発癌または転移性癌であってもよい。癌は、リンパ肉腫、リンパ肉腫、口腔肉腫、軟組織肉腫、マスト細胞腫瘍からなる群から選択されてもよい。癌は、メラノーマ、リンパ腫、筋腫、筋肉腫、円形細胞腫瘍、腺癌、繊維肉腫、または腺肉腫からなる群から選択されてもよい。癌は、骨髄脂肪腫、骨肉腫、血管肉腫、脂腺癌、肝腺腫、および繊維肉腫からなる群から選択されてもよい。癌は、肺癌、乳癌、脳癌、肝臓癌、前立腺癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌、骨癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌、および白血病からなる群から選択されてもよい。例えば、癌は、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、または甲状腺癌であってもよい。肺癌は、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、または小細胞癌であり得る。肺癌はまた、中皮腫であってもよい。
【００２９】
血液試料は、例えば、全血、血漿、または血清であってもよい。血液試料は、末梢静脈穿刺（静脈穿刺）または当該技術分野で既知の他の方法によって得ることができる。血液試料は、癌に罹患する対象から、または代替として、癌を発症するリスクのある対象から得ることができる。例えば、対象は、肺癌を発症するリスクがある可能性がある。肺癌に関連するリスクは、喫煙、アスベストへの曝露、個人もしくは家族の肺癌の病歴、または受動喫煙への長期曝露を含む。
【００３０】
任意選択的に、癌は、病期０、病期Ｉ、病期ＩＩ、病期ＩＩＩ、または病期ＩＶの癌である。病期による癌の分類は、癌の進行を説明するために、０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶといった数字を用いる。癌の病期は、どれくらい癌が広がったかを示唆し、サイズおよび離れた臓器への腫瘍の転移を考慮する場合もある。病期０、Ｉ、およびＩＩの癌は、早期の腫瘍とみなされる。病期ＩＩＩおよびＩＶは、後期の癌とみなされる。病期０は、ｉｎ  ｓｉｔｕの細胞腫、すなわち、周辺組織の浸潤が見られないことによって定義される、細胞腫の早期形態を意味する。病期Ｉの癌は、体の一部分に局在化している。病期ＩＩの癌は、局所的に進行しており、病期ＩＩＩの癌も同様である。したがって、癌が病期ＩＩまたは病期ＩＩＩであると指定されるかどうかは、診断に応じて異なる。病期ＩＶの癌は、他の臓器または体全体に転移または広がっている。提供される方法は、早期の癌（病期０、Ｉ、およびＩＩ）ならびに後期の（病期ＩＩＩおよびＩＶ）癌を診断するために使用することができる。
【００３１】
提供される方法はまた、早期（病期０、Ｉ、もしくはＩＩ）の癌を後期（ＩＩＩもしくはＩＶ）の癌と区別するため、または癌の進行を監視するためにも使用することができる。具体的には、ある後期の癌では、早期または対照と比較してＣａ−１および／またはＣａ−２の血中レベルが上昇する。したがって、特定の病期０、Ｉ、およびＩＩの癌におけるｅＣａ−１および／またはＣａ−２の血中レベルは、対応する病期ＩＩＩまたはＩＶの癌におけるＣａ−１および／またはＣａ−２の血中レベルよりも低い。ｅＣａ−１および／またはＣａ−２の血中レベルは、転移が増加するまたは腫瘍サイズが増加する特定の癌において上昇し得る。よって、対象における癌の進行段階を決定する方法が提供される。方法は、癌に罹患する対象を選択することと、対象から血液試料を得ることと、試料中のＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームの血中レベルまたはその計算値を決定することとを含む。Ｃａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームの血中レベルは、既知の値もしくは参照試料、または対象由来の以前の血液試料と比較することができる。
【００３２】
Ｃａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームの血中レベルまたはその計算値は、例えば、対象由来の以前の血液試料と比較することができる。以前の血液試料は、最も最近の血液試料の単離前の時点で単離された、同じ対象に由来する試料であり得る。以前の血液試料と比較してより高い発現のレベルは、癌の進行または転移を示唆する。進行または転移は、通常、さらなる検査、治療投薬量もしくは頻度の変更、またはより侵襲性の高い治療（すなわち、新しい治療剤）の必要性を示唆する。以前の血液試料と比較してより低い発現のレベルは、癌の改善を示唆する。一般に、そのような改善は、治療の成功を示唆する。そのような場合、治療は、継続されてもよいか、あるいはＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームのレベルもしくはその計算値が十分に低い場合は、中止することさえもできる。
【００３３】
Ｃａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームの血中レベルまたはその計算値は、例えば、既知の値または参照試料（複数可）と比較することができる。病期ＩＩＩまたはＩＶの癌のための既知の値または参照試料と比較して、より低いＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームの血中レベルまたはその計算値は、対象が病期０、Ｉ、またはＩＩの癌を有することを示唆することができる。病期０、Ｉ、またはＩＩの癌のための既知の値または参照試料と比較して、より高いＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームのレベルまたはその計算値は、対象が病期ＩＩＩまたはＩＶの癌を有することを示唆することができる。病期０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、もしくはＩＶの癌のための既知の値または参照試料と同様のＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームのレベルまたはその計算値は、対象が、それぞれ、病期０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、もしくはＩＶの癌の有することを示唆することができる。
【００３４】
本明細書において使用される場合、既知の値は、例えば、未処理の試料、種々の病期および／もしくは治療条件の同じ対象に由来する試料、または異なる対象に由来する試料（処理もしくは未処理）を意味し得る、非疾患試料、疾患試料、または一群の試料から得られた値（例えば、Ｃａ−１および／もしくはＣａ−２アイソフォームの血中レベル）を指す。既知の値は、例えば、癌の治療の前に同じ対象由来の血液試料から得られた値であってもよく、癌は、指定された病期（例えば、病期Ｉの癌）を割り当てられている。既知の値は、例えば、癌の治療の後に同じ対象由来の血液試料から得られた値であってもよい。参照試料は、例えば、病期０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの癌に罹患する治療を受けていない対象を含むことができる。別の例として、参照試料は、病期０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの癌に罹患する治療を受けた対象を含むことができる。別の例として、参照試料は、病期０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの癌に罹患する患者における発現のベースラインレベルであってもよい。参照試料または参照値は、既知の値を含むことができるか、または実験試料と並行して調べられる陽性もしくは陰性対照の試料であってもよい（任意選択的に、実験試料（複数可）を用いて年齢、癌の病期、または癌の種類について適合させる）。
【００３５】
Ｃａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームレベルは、場合によっては、若年対象において高齢対象よりも高い。したがって、場合によっては、開示される方法の対象は、少なくとも３５、４０、４５、５０、または５５歳である。任意選択的に、Ｃａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームの血中レベルならびに陽性および陰性対照値は、対象の年齢によって正規化される。
【００３６】
また、Ｃａ−１および／またはＣａ−２の血中レベルにおける変化またはその計算値に基づいて、対象における癌治療薬の有効性を決定する方法も提供される。方法は、第１の癌治療薬を用いた治療の前に、癌に罹患する対象から第１の血液試料を得ることと、第１の血液試料中の第１のＣａ−１および／またはＣａ−２値を（すなわち、ベースラインの測定値として）決定することと、第１の癌治療薬を用いた少なくとも１回の治療の後に、癌に罹患する対象から第２の血液試料を得ることと、第２の血液試料中の第２のＣａ−１および／またはＣａ−２値を（すなわち、治療効果を評価するための手段として）決定することと、第１の値を第２の値と比較することとを含む。この方法において、第１の血液試料から第２の血液試料へのＣａ−１および／またはＣａ−２の減少は、例えば、血中レベルが陰性対照レベルに達するまで、または維持投与計画に減少されるまで継続することができる、効果的な癌治療薬の指標である。しかしながら、第１の血液試料から第２の血液試料へのＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームレベルにおける最小限の減少または増加は、癌治療薬の効果が不十分であり、第２の癌治療薬または投与計画における増量（投与量もしくは現在の治療剤を使用する頻度の増加）が対象のために選択されるべきであることの指標である。第２の癌治療薬はまた、複数の化学療法薬の併用投与、外科手術、および／または放射線療法も含むことができる。当業者は、適切な用量または投与計画における変更を決定することができる。
【００３７】
エクソン１２ａによってコードされるポリペプチドを含まないＢＩＮ１アイソフォームは、腫瘍抑制因子として機能し、この活性は、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の抑制と関連する可能性がある（Ｍｕｌｌｅｒ  ＡＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００５  １１（３）：３１２−３１９）。ＩＤＯは、肺癌を含む特定の形態の癌において活性であることが示されている（Ｓｍｉｔｈ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２０１２  ２（８）：７２３−７３５）。ＢＩＮ１によるＩＤＯの抑制を模倣する癌治療薬が開発中である（Ｎｏｖｉｔｓｋｉｙ  ＳＶ  ａｎｄ  Ｍｏｓｅｓ  ＨＬ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２０１２  ２（８）：６７３−５）。したがって、開示される方法は、ＩＤＯが活性である生理学的状態を検出するために使用されてもよい。ＩＤＯ遮断剤が癌治療薬として開発されているため、開示される方法は、ＩＤＯ遮断治療薬に反応する癌患者のその特定のサブセットを同定するために使用されてもよい。ＩＤＯ拮抗薬を使用して登録されている現在の臨床試験の中で、肺癌が標的とされており、本明細書において、肺癌の大部分が、高い血中ＢＩＮ１癌アイソフォームシグナルのレベルを有することが示されている。
【００３８】
したがって、高いＣａ−１および／またはＣａ−２値を有する対象にＩＤＯの阻害剤を投与することを含む、対象において癌を治療する方法もまた提供される。方法は、対象から血液試料を得ることと、Ｃａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームの血中レベルまたはその計算値を決定することと、これらのレベルを１つ以上の対照レベルまたは対照値と比較することとを含む。これらの方法において、Ｃａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームの高い血中レベルまたはその計算値の決定は、対象が、ＩＤＯの抑制剤を用いて治療されるべき癌のサブセットを有するということの指標である。ＩＤＯ阻害剤の例として、１−メチル−トリプトファン（１−ＭＴ）、１−メチル−Ｄ−トリプトファン、およびＩＮＣＢ０２４３６０（ＩｎＣｙｔｅ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）が挙げられる。
【００３９】
Ｃａ−１および／またはＣａ−２はまた、結核等のＩＤＯの高い血中レベルに応答する病態におけるより特異的なマーカーであってもよい。したがって、Ｃａ−１および／またはＣａ−２を、診断薬として、およびＩＤＯ関連疾患の治療有効性を評価するためのアッセイとして使用する方法もまた開示される。
【００４０】
また、対象における癌の再発を検出する方法も提供される。方法は、寛解状態にある癌に罹患する対象を選択することと、対象から血液試料を得ることと、血液試料中のＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームのレベルまたはその計算値を決定することとを含む。陰性対照レベルまたは値と比較して、高いレベルのＣａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームまたはその計算値は、対象が癌の再発を有するか、または癌の再発のリスクがあることを示唆する。再発または再発のリスクが検出された場合、さらなる検査または治療を行うことができる。そのような検査および治療は、本明細書に記載されており、当該分野の技術の範囲内である。
【００４１】
Ｃａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームのレベルは、例えば、生体試料中の１２ａ＋  ＢＩＮ１ポリペプチドを検出することによって決定することができる。任意選択的に、１２ａ＋  ＢＩＮ１ポリペプチドのレベルは、ＢＩＮ１のエクソン１２ａによってコードされるポリペプチド（１２ａ＋  ＢＩＮ１）特異的抗体に特異的な抗体を使用して決定される。例えば、抗体は、任意選択的に、配列番号１（エクソン１２ａによってコードされるポリペプチド）に選択的に結合することができるが、エクソン１２ａが欠落したアイソフォーム２には結合しない。ヒトＢＩＮ１のアイソフォーム２は、アミノ酸配列の配列を有することができる：
ＭＡＥＭＧＳＫＧＶＴ  ＡＧＫＩＡＳＮＶＱＫ  ＫＬＴＲＡＱＥＫＶＬ  ＱＫＬＧＫＡＤＥＴＫ  ＤＥＱＦＥＱＣＶＱＮ  ＦＮＫＱＬＴＥＧＴＲ  ＬＱＫＤＬＲＴＹＬＡ  ＳＶＫＡＭＨＥＡＳＫ  ＫＬＮＥＣＬＱＥＶＹ  ＥＰＤＷＰＧＲＤＥＡ  ＮＫＩＡＥＮＮＤＬＬ  ＷＭＤＹＨＱＫＬＶＤ  ＱＡＬＬＴＭＤＴＹＬ  ＧＱＦＰＤＩＫＳＲＩ  ＡＫＲＧＲＫＬＶＤＹ  ＤＳＡＲＨＨＹＥＳＬ  ＱＴＡＫＫＫＤＥＡＫ  ＩＡＫＰＶＳＬＬＥＫ  ＡＡＰＱＷＣＱＧＫＬ  ＱＡＨＬＶＡＱＴＮＬ  ＬＲＮＱＡＥＥＥＬＩ  ＫＡＱＫＶＦＥＥＭＮ  ＶＤＬＱＥＥＬＰＳＬ  ＷＮＳＲＶＧＦＹＶＮ  ＴＦＱＳＩＡＧＬＥＥ  ＮＦＨＫＥＭＳＫＬＮ  ＱＮＬＮＤＶＬＶＧＬ  ＥＫＱＨＧＳＮＴＦＴ  ＶＫＡＱＰＳＤＮＡＰ  ＡＫＧＮＫＳＰＳＰＰ  ＤＧＳＰＡＡＴＰＥＩ  ＲＶＮＨＥＰＥＰＡＧ  ＧＡＴＰＧＡＴＬＰＫ  ＳＰＳＱＦＥＡＰＧＰ  ＦＳＥＱＡＳＬＬＤＬ  ＤＦＤＰＬＰＰＶＴＳ  ＰＶＫＡＰＴＰＳＧＱ  ＳＩＰＷＤＬＷＥＰＴ  ＥＳＰＡＧＳＬＰＳＧ  ＥＰＳＡＡＥＧＴＦＡ  ＶＳＷＰＳＱＴＡＥＰ  ＧＰＡＱＰＡＥＡＳＥ
ＶＡＧＧＴＱＰＡＡＧ  ＡＱＥＰＧＥＴＡＡＳ  ＥＡＡＳＳＳＬＰＡＶ  ＶＶＥＴＦＰＡＴＶＮ  ＧＴＶＥＧＧＳＧＡＧ  ＲＬＤＬＰＰＧＦＭＦ  ＫＶＱＡＱＨＤＹＴＡ  ＴＤＴＤＥＬＱＬＫＡ  ＧＤＶＶＬＶＩＰＦＱ  ＮＰＥＥＱＤＥＧＷＬ  ＭＧＶＫＥＳＤＷＮＱ  ＨＫＥＬＥＫＣＲＧＶ  ＦＰＥＮＦＴＥＲＶＰ  （配列番号３、受入番号ＮＰ＿６４７５９４．１）。
【００４２】
したがって、配列番号１に選択的に結合するが、配列番号３には結合しない単離された抗体が開示される。抗体は、モノクローナル抗体または組換え抗体であってもよい。エクソン１２ａに特異的に結合するモノクローナル抗体（９Ｄ７  １Ｃ１）については、実施例３に開示して記載する。９Ｄ７  １Ｃ１抗体の重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、アミノ酸配列の配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２を含む。９Ｄ７  １Ｃ１抗体の軽鎖のＣＤＲは、アミノ酸配列の配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５を含む。したがって、１２ａ＋  ＢＩＮ１ポリペプチドに選択的に結合する開示されるモノクローナル抗体または組換え抗体は、少なくともこれらのＣＤＲ、または配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５に対して少なくとも９５％〜９９％の同一性を有するＣＤＲを含む。
【００４３】
１２ａ＋  ＢＩＮ１ポリペプチドの発現を決定する際に有用な分析技術の例として、免疫組織化学的検査、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、タンパク質アレイ、または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。エクソン１２ａ  ＢＩＮ１ポリペプチドに対する特異的抗体を使用して、ＦＡＣＳは、血液および／もしくは微小粒子中を循環するエクソン１２ａ＋  ＢＩＮ１を発現する細胞、ならびに／または血漿もしくは血清中を循環する１２ａ＋  ＢＩＮ１を発現する腫瘍細胞および／もしくはアポトーシス細胞断片を検出するために使用することができる。これらの技術は、当業者に既知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１）を参照されたい。
【００４４】
また免疫組織化学的方法は、１２ａ＋  ＢＩＮ１ポリペプチドの発現レベルを検出するために使用されてもよい。したがって、１２ａ＋  ＢＩＮ１ポリペプチドに特異的な抗体または抗血清（ポリクローナル抗血清等）およびモノクローナル抗体が１２ａ＋  ＢＩＮ１ポリペプチドの発現を評価するために使用されてもよい。抗体は、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチン等のハプテン標識、または西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ等の酵素を用いて、ＢＩＮ１抗体自体の直接標識によって検出することができる。代替として、未標識の一次抗体が、一次抗体に結合する抗血清、ポリクローナル抗血清、またはモノクローナル抗体を含む標識された二次抗体と併せて使用される。標識された三次抗体も同様に使用することができる。任意選択的に、患者由来の血液試料における１２ａ＋  ＢＩＮ１ポリペプチドの発現が、健常対象または癌の前もしくは後の同じ対象の血液試料における１２ａ＋  ＢＩＮ１ポリペプチドの発現と比較されてもよい。
【００４５】
特定の場合において、血液試料中に存在する１２ａ＋  ＢＩＮ１アイソフォームのレベルは、ウェスタンブロットによって決定されてもよい。例えば、血液試料由来の全細胞ライセート中に存在するポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されてもよく、分離されたポリペプチドはニトロセルロース膜に移され、１２ａ＋  ＢＩＮ１ポリペプチドは、ＢＩＮ１に特異的な抗体もしくは抗血清、または１２ａ＋  ＢＩＮ１の特異的アイソフォームを使用することにより検出される。少なくとも１つの正規化ポリペプチド、例えば、ＣａＶ１．２またはハウスキーピングポリペプチド（ＧＡＰＤＨ等）は、同時にまたは並行して検出することができ、ＢＩＮポリペプチドの発現レベルを正規化するために使用される。ＢＩＮ１の発現レベルは、過剰な抗ＢＩＮ１抗体（例えば、１２ａ＋  ＢＩＮ１ポリペプチドに特異的な抗体）を使用してＢＩＮ１の免疫沈降を行うことにより決定されてもよい。免疫沈降の後にはＳＤＳ−ＰＡＧＥによる免疫沈降物の分離が続き、分離されたポリペプチドはニトロセルロース膜に移され、例えば、クーマシーブルーまたは銀染色によりゲルを染色することによって検出される。ＧＡＰＤＨまたはユビキチン等の対照タンパク質の免疫沈降も、同時にまたは並行して実行されてもよい。任意選択的に、対応する正常組織または健常対象由来の試料に対して同じ手順が実行されてもよい。
【００４６】
特定の場合において、ヒト血液中の細胞または微小粒子中の１２ａ＋  ＢＩＮ１アイソフォームのレベルは、ＦＡＣＳ分析によって決定することができる。ＦＡＣＳは、細胞および循環する微小粒子を検出するために使用される確立された方法である。ＦＡＣＳによる微小粒子の分析は、血栓性疾患の診断および予後のために成功裏に使用されてきた。癌において、特定の転移した癌の場合、１２ａ＋  ＢＩＮ１を発現する腫瘍細胞は、潜在的に循環中に放出される可能性がある。これらの細胞は、１２ａ＋  ＢＩＮ１を担持する微小粒子を放出し得る。ヒト血液試料は、パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で固定することができ、続いて、１２ａ＋  ＢＩＮ１ポリペプチドに対して特異的な抗体を用いて細胞および／または微小粒子が標識化される。抗体は、蛍光標識、または一次抗体に特異的な抗血清、ポリクローナル抗血清、もしくはモノクローナル抗体を含む標識された二次抗体と併せて使用される未標識の一次抗体を用いたＢＩＮ１抗体の直接標識によって検出することができる。蛍光標識された１２ａ＋  ＢＩＮ１陽性細胞および／または微小粒子は、ＦＡＣＳ分析によりソーティングすることができる。任意選択的に、患者由来の血液試料における１２ａ＋  ＢＩＮ１ポリペプチドの発現は、健常対象、または癌の前もしくは後の同じ対象の血液試料における１２ａ＋  ＢＩＮ１ポリペプチドの発現と比較されてもよい。同様に、結合抗体（例えば、１２ａ＋  ＢＩＮ１選択性の抗体）を有する蛍光ビーズのような可動性の固体支持体をＦＡＣＳ分析において使用することができ、その場合、異なる結合抗体と相関させるために異なる蛍光のビーズが使用される。
【００４７】
任意選択的に、１２ａ＋  ＢＩＮ１の発現レベルは、試料中のエクソン１２ａまたはその断片を含むＢＩＮ１核酸（例えば、エクソン１２ａ＋  ＢＩＮ１  ｍＲＮＡ）を検出することにより決定することができる。エクソン１２ａ＋  ＢＩＮ１  ｍＲＮＡの発現を決定する際に有用な分析技術の例として、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ワンステップＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、プライマー伸長アッセイ、マイクロアレイ分析、遺伝子チップ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、およびノーザンブロットが挙げられる。
【００４８】
エクソン１２ａ＋  ＢＩＮ１  ｍＲＮＡの発現を決定するためにＲＴ−ＰＣＲを使用する場合、試料からｍＲＮＡが単離されてもよい。任意選択的に、対象の血液または血漿からＲＮＡが単離される。別の対象の正常な血液または血漿が対照であってもよい。癌の前または癌の治療に成功した後の同じ対象由来の正常な血液または血漿試料が対照であってもよい。
【００４９】
一般的なｍＲＮＡ抽出のための方法は、当該技術分野において周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７）を含む分子生物学の標準的な教本に開示されている。パラフィン包埋組織からのＲＮＡ抽出のための方法は、Ｒｕｐｐ  ａｎｄ  Ｌｏｃｋｅｒ，Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．５６：Ａ６７（１９８７）、およびＤｅ  Ａｎｄｒeｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：４２０４４（１９９５）に開示されている。任意選択的に、ＲＮＡの単離は、商業製造者からの精製キット、緩衝液セット、およびプロテアーゼを使用して、該製造者の指示に従って行うことができる。例えば、全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニカラム（Ｈｉｌｄｅｎ，ＤＥ）を使用して単離することができる。他の市販のＲＮＡ単離キットは、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（登録商標）完全ＤＮＡおよびＲＮＡ精製キット（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、およびＰａｒａｆｆｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を含む。組織試料からの全ＲＮＡは、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（登録商標）（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ、Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）を使用して単離することができる。生物試料から調製されるＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心法により、単離することができる。
【００５０】
ＲＮＡ鋳型は、ｃＤＮＡに転写することができ、その後、ＰＣＲ反応におけるその指数関数的増幅が続く。限定されないが、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、および高度好熱菌（Ｔｔｈ）由来の逆転写酵素を含む多数の逆転写酵素のうちの１つ以上が使用されてもよい。逆転写ステップは、典型的には、状況およびＲＴ−ＰＣＲの目的に応じて、特異的プライマー、ランダムヘキサマー、またはオリゴｄＴプライマーを使用して開始される。例えば、抽出されたＲＮＡは、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、製造者の指示に従って逆転写することができる。次いで、誘導されたｃＤＮＡを、その後のＰＣＲ反応における鋳型として使用することができる。
【００５１】
ＰＣＲステップは、様々な熱安定性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼを使用することができるが、典型的には、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するが、３’−５’プルーフリーディングエンドヌクレアーゼ活性が欠落したＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが用いられる。したがって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲは、典型的には、ＴａｑまたはＴｔｈポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性を利用して、その標的アンプリコンに結合したハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、同等の５’ヌクレアーゼ活性を有するいずれの酵素が使用されてもよい。２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲ反応に典型的なアンプリコンを生成する。第３のオリゴヌクレオチド、またプローブは、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するように設計される。このプローブは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって伸長されず、レポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素によって標識される。２つの色素がプローブ上にあるため、互いに近接して位置する場合、レポーター色素からの任意のレーザー誘起発光は消光色素によって消光される。増幅反応中、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、鋳型依存的な様式でプローブを切断する。得られたプローブ断片は、溶液中で解離し、放出されたレポーター色素からのシグナルには、第２のフルオロフォアの消光効果が見られない。新しく合成される各分子ごとにレポーター色素の１つの分子が遊離され、消光されていないレポーター色素の検出が、データの定量的解釈のための基盤を提供する。
【００５２】
ＲＴ−ＰＣＲは、例えば、  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００ＴＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＤＥ）等の市販の機器を使用して行うことができる。任意選択的に、５’ヌクレアーゼの手順は、リアルタイム定量ＰＣＲデバイス上で実行される。そのようなシステムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラ、およびコンピュータを含むことができる。システムは、サーモサイクラーにて９６ウェルフォーマットで試料を増幅する。増幅中、９６ウェル全てについて、光ファイバーケーブルを介してレーザー誘起蛍光シグナルがリアルタイムで収集され、ＣＣＤで検出される。システムは、機器を作動させるためおよびデータを分析するためのソフトウェアを含む。
【００５３】
５’−ヌクレアーゼアッセイのデータは、最初は、閾値サイクル（Ｃｔ）として表される。各サイクルの間に蛍光値が記録され、増幅反応においてその時点までに増幅された産物の量を表す。蛍光シグナルが、統計的に有意であると最初に記録される時点が、閾値サイクル（Ｃｔ）である。
【００５４】
誤差および試料間変動の影響を最小限に抑えるために、ＲＴ−ＰＣＲは、任意選択的に、内部標準を使用して行われる。理想的な内部標準は、異なる組織の間で一定レベルで発現され、実験的処理による影響を受けない。遺伝子発現のパターンを正規化するために最も頻繁に使用されるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびβアクチンのｍＲＮＡである。
【００５５】
ＲＴ−ＰＣＲ技術の変形例は、二重標識蛍光発生プローブを介してＰＣＲ産物の蓄積を測定するリアルタイム定量ＰＣＲである。リアルタイムＰＣＲは、各標的配列の内部競合相手が正規化のために使用される定量競合ＰＣＲと、試料内に含有される正規化された遺伝子、またはＲＴ−ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を使用する定量比較ＰＣＲとの両方に適合する。
【００５６】
アッセイされるＲＮＡの量の差、および使用されるＲＮＡの質の変動性の両方を補正する（正規化する）ために、アッセイは、任意選択的に、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ１、ユビキチン等の周知のハウスキーピング遺伝子を含む特定の参照遺伝子（または「正規化遺伝子」）の発現の分析を組み込むことができる。
【００５７】
代替として、正規化は、アッセイされる全ての遺伝子、またはそれらの大きいサブセットのシグナルの平均値または中央値に基づいていてもよい（しばしば、「グローバルノーマライゼーション」手法と称される）。遺伝子対遺伝子の原則に基づいて、対象組織のｍＲＮＡの正規化された測定量を、対応する正常組織に見られる量と比較してもよい。
【００５８】
例えば、（例えば、ＰＣＲ増幅に基づく方法において使用するための）プライマーおよびプローブは、増幅されるエクソン配列に基づいて設計することができる。したがって、プライマー／プローブの設計は、対象とする遺伝子中の標的エクソン配列（例えば、ＢＩＮ１のエクソン１２ａ）を決定することを含むことができる。これは、Ｋｅｎｔ，Ｗ．Ｊ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２（４）：６５６−６４（２００２）によって開発されたＤＮＡ  ＢＬＡＳＴソフトウェア等の公的に利用可能なソフトウェアによって、またはＢＬＡＳＴソフトウェア（その変形例を含む）によって行うことができる。その後のステップは、ＰＣＲプライマーおよびプローブ設計の十分に確立された方法に従う。
【００５９】
非特異的シグナルを回避するために、プライマーおよびプローブを設計するときに、遺伝子の標的配列中の反復配列を任意選択的にマスクすることができる。次いで、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＭＧＢ  Ａｓｓａｙ−ｂｙ−Ｄｅｓｉｇｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）等の、任意の市販のまたは別様に公的に利用可能なプライマー／プローブ設計パッケージを使用してプライマーおよびプローブ配列を設計するために、マスクされた配列を使用することができる。
【００６０】
ＰＣＲプライマーの設計において考慮されるべき因子は、プライマー長、融解温度（Ｔｍ）、Ｇ／Ｃ含量、特異性、相補的プライマー配列、および３’−末端配列を含むことができる。ＰＣＲプライマーは、任意選択的に、１７〜３０塩基長であってもよく、約２０〜８０％のＧ＋Ｃ塩基（例えば、約５０〜６０％のＧ＋Ｃ塩基）を含有することができる。Ｔｍは、５０℃〜８０℃、例えば、約５０℃〜６５℃である。
【００６１】
対象の血液試料および正常または対照血液試料におけるエクソン１２ａ＋  ＢＩＮ１の差次的発現を検出するために、マイクロアレイ技術が使用されもよい。この方法では、対象とするポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）が、マイクロチップ基板上にプレーティングされるか、またはアレイ化される。次いで、アレイ化された配列が、対象とする血液試料に由来する特異的ＤＮＡプローブとハイブリダイズされる。ＲＴ−ＰＣＲ法と同様に、ｍＲＮＡの源は、任意選択的に、対象の血液試料から、および任意選択的に、対応する正常または対照血液試料から単離された全ＲＮＡである。
【００６２】
蛍光標識されたｃＤＮＡプローブは、対象とする組織から抽出したＲＮＡの逆転写による蛍光ヌクレオチドの組み込みによって作製することができる。チップに適用される標識ｃＤＮＡプローブは、アレイ上のＤＮＡの各スポットと特異性を伴ってハイブリダイズする。非特異的に結合したプローブを除去するためのストリンジェントな洗浄の後、共焦点レーザー顕微鏡法によって、または、例えばＣＣＤカメラ等の別の検出方法によってチップを走査する。各アレイ化された要素のハイブリダイゼーションの定量化を用いて、対応するｍＲＮＡの存在量を評価することができる。
【００６３】
二色蛍光を用いて、２つのＲＮＡ源から作製された、別々に標識したｃＤＮＡプローブを、対ごとにアレイにハイブリダイズさせる。したがって、指定された各遺伝子に対応する２つの源からの転写物の相対的な存在量が同時に決定される。マイクロアレイ法は、細胞当たり数個のコピーで発現される稀な転写物を検出するため、および発現レベルにおける少なくとも約２倍の差を再現可能に検出するための感度を有することが示されている（Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３（２）：１０６−１４９（１９９６））。
【００６４】
アレイ化されたオリゴヌクレオチドは、エクソン１２ａ＋  ＢＩＮ１核酸の特定の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含んでもよい。特定の実施形態において、エクソン１２ａ＋  ＢＩＮ１核酸の第１の領域に特異的にハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチドの複数のコピーがアレイ化される。特定の実施形態において、エクソン１２ａ＋  ＢＩＮ１核酸の第１および第２の領域にそれぞれ特異的にハイブリダイズする第１のおよび第２のオリゴヌクレオチドの複数のコピーがアレイ化される。特定の実施形態において、エクソン１２ａ＋  ＢＩＮ１核酸の発現レベルは、これらのオリゴヌクレオチドの各々からのシグナルの平均値によって決定される。アレイはまた、ハウスキーピング遺伝子、または正常組織に対して疾患組織において有意に差次的に発現されないことが分かっている他の遺伝子（例えば、ＣａＶ１．２）等の正規化遺伝子の核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含んでもよい。
【００６５】
任意選択的に、検出されるＢＩＮ１ポリペプチド、核酸、または前記ポリペプチドもしくは核酸の断片は、ヒトである。任意選択的に、検出されるＢＩＮ１ポリペプチド、核酸、または前記ポリペプチドもしくは核酸の断片は、非ヒト哺乳類（例えば、げっ歯類、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、またはネコ）である。
【００６６】
ＧｅｎＢａｎｋ上で開示される様々なＢＩＮ１配列が存在し、これらの配列および他の配列は、その中に含有される個々の部分配列または断片と同様に、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。本明細書において使用される場合、ＢＩＮ１は、その相同体、変異体、およびアイソフォームを含む。
【００６７】
ＢＩＮ１アイソフォーム１〜１０のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、アイソフォーム１についてはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿１３９３４３．２およびＮＰ＿６４７５９３．１、アイソフォーム２についてはＮＭ＿１３９３４４．２およびＮＰ＿６４７５９４．１、アイソフォーム３についてはＮＭ＿１３９３４５．２およびＮＰ＿６４７５９５．１、アイソフォーム４についてはＮＭ＿１３９３４６．２およびＮＰ＿６４７５９６．１、アイソフォーム５についてはＮＭ＿１３９３４７．２およびＮＰ＿６４７５９７．１、アイソフォーム６についてはＮＭ＿１３９３４８．２およびＮＰ＿６４７５９８．１、アイソフォーム７についてはＮＭ＿１３９３４９．２およびＮＰ＿６４７５９９．１、アイソフォーム８についてはＮＭ＿００４３０５．３およびＮＰ＿０４２９６．１、アイソフォーム９についてはＮＭ＿１３９３５０．２およびＮＰ＿６４７６００．１、アイソフォーム１０についてはＮＭ＿１３９３５１．２およびＮＰ＿６４７６０１．１に見出すことができる。報告されている他の２つのエクソン１２ａ＋  ＢＩＮ１腫瘍アイソフォームは、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列については、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０６８９１８．１およびＡＡＣ２３７５１．１に見出されるＢＩＮ１  ＋１２ａ、ならびにヌクレオチドおよびアミノ酸配列については、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０６８９１７．１およびＡＡＣ２３７５０．１に見出されるＢＩＮ１−１０  ＋１２ａを含む。エクソン１２ａのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２および配列番号１によって付与される。
【００６８】
したがって、前述のＧｅｎＢａｎｋ受入番号のヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれ以上同一のヌクレオチド配列を含むエクソン１２ａ＋を含むＢＩＮ１のヌクレオチド配列（配列番号２）が提供される。また、上述のＧｅｎＢａｎｋ受入番号の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれ以上同一なアミノ酸配列を含むエクソン１２ａ＋のコードされたアミノ酸配列（配列番号１）を含むＢＩＮ１ポリペプチドのアミノ酸配列も提供される。
【００６９】
１２ａ＋  ＢＩＮ１またはそのポリペプチド断片を含む前述のポリペプチドに結合する抗体は、生体試料中の１２ａ＋  ＢＩＮ１アイソフォームを検出するために使用することができる。例えば、上述のポリペプチドは、１２ａ＋  ＢＩＮ１に対する抗体を生成するために使用することができる。
【００７０】
本明細書において使用される場合、抗体という用語は、任意のクラスの全免疫グロブリン（すなわち、無傷の抗体）を包含するが、これに限定されない。二重または複数の抗原もしくはエピトープ特異性を有するキメラ抗体およびハイブリッド抗体、ならびにハイブリッド断片を含むＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等の断片が、本明細書において有用である。したがって、それらの特異的抗原に結合する能力を保持する抗体の断片が、本明細書において教示される方法において提供され、また有用である。例えば、癌において発現される１２ａ＋  ＢＩＮ１への結合活性を維持する抗体の断片は、抗体またはその断片という用語の意味に含まれる。そのような抗体および断片は、当該技術分野で既知の技術によって作製することができ、抗体を生成して特異性および活性について抗体をスクリーニングする一般的な方法に従って、特異性および活性についてスクリーニングすることができる（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと）。
【００７１】
また、例えば、米国特許第４，７０４，６９２号（その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるような抗体断片と抗原結合タンパク質（単鎖抗体）との複合体も、本明細書に記載される方法において有用である。
【００７２】
任意選択的に、抗体は、モノクローナル抗体である。本明細書において使用される場合のモノクローナル抗体という用語は、実質的に均一な抗体の集団からの抗体を指す：すなわち、少量で存在し得る、天然に存在する可能性のある突然変異を除いて、集団を構成する個々の抗体が同一である。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）またはＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）によって記載されるもの等のハイブリドーマ法を使用して調製されてもよい。ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物が、典型的には、免疫剤に特異的に結合する抗体を生成するかまたは生成することができるリンパ球を誘発するように、免疫剤で免疫される。代替として、リンパ球は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫されてもよい。免疫剤は、癌において発現される１２ａ＋  ＢＩＮ１、またはその免疫原性断片であってもよい。
【００７３】
モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるような組換えＤＮＡ法によって作製されてもよい。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）容易に単離および配列決定することができる。ＤＮＡはまた、例えば、相同なマウス配列の代わりに、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列で置換することにより、または、免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部を共有結合的に結合することにより、修飾されてもよい。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、癌において発現される１２ａ＋  ＢＩＮ１に対して特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作製するために、本明細書に提供される抗体の定常ドメインと置換されてもよいか、または抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインと置換されてもよい。
【００７４】
インビトロ法もまた、一価抗体を調製するために好適である。抗体の断片、特に、Ｆａｂ断片を生成するための抗体の消化は、当該技術分野において既知の日常的技術を使用して達成することができる。例えば、消化は、パパインを使用して行うことができる。パパイン消化の例は、国際公開第ＷＯ９４／２９３４８号、米国特許第４，３４２，５６６号、およびＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）に記載されている。抗体のパパイン消化は、典型的には、各々が、単一の抗原結合部位と残基Ｆｃ断片とを有する、Ｆａｂ断片と称される２つの同一の抗原結合断片を生成する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、尚も抗原を架橋することができる、Ｆ（ａｂ’）２断片と称される断片を生じる。
【００７５】
抗体の消化において生成されるＦａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメインも含有することができる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む、重鎖ドメインのカルボキシ末端における数個の残基の付加により、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ’断片を含む二価断片である。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を担持するＦａｂ’の本明細書における名称である。
【００７６】
さらに、抗体のヒト化形態またはヒト形態が、本明細書に提供される。ヒト化およびヒト抗体は、当業者に既知の方法を使用して作製することができ、例えば、ヒト抗体は、生殖細胞系列変異動物を使用して、またはファージディスプレイライブラリーによって生成することができる。
【００７７】
抗体はまた、他の種において作製することもでき、ヒトへの投与のためにヒト化することができる。代替として、完全ヒト抗体は、完全ヒト抗体を作製することができるマウスまたは他の種（例えば、ヒト抗体を生成するように遺伝子操作されたマウス）を免疫することにより、および、癌において発現されるエクソン１２ａ＋  ＢＩＮ１に結合するクローンをスクリーニングすることにより作製することもできる。例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３，（１９９５）を参照のこと（参照により、完全ヒト抗体を生成する方法のために、その全体が本明細書に組み込まれる）。本明細書において使用される場合、抗体に関するヒト化およびヒトという用語は、ヒト対象において治療的に許容される弱い免疫原性反応を誘発することが予測される任意の抗体に関する。したがって、この用語は、完全ヒト化または完全ヒト、および部分的ヒト化または部分的ヒトを含む。
【００７８】
開示される抗体のうちの１つ以上を含むキットも、Ｃａ−１および／またはＣａ−２アイソフォームレベルを検出するために提供される。キットは、１２ａ＋  ＢＩＮ１ポリペプチドを検出するためのアッセイシステムと、１２ａ＋／１３＋  ＢＩＮ１  ポリペプチドを検出するためのアッセイシステムとを含むことができる。例えば、キットは、１２ａ＋  ＢＩＮ１に選択的に結合する抗体と、複数のヒトＢＩＮ１アイソフォームに選択的に結合する抗体とを含む１２ａ＋  ＢＩＮ１アイソフォームを検出するための第１のアッセイシステムを含むことができる。アッセイはまた、サンドイッチアッセイであってもよく、これら２つの抗体のうちの１つが固体表面に固定化される。キットは、１３＋  ＢＩＮ１に選択的に結合する抗体と、ＢＩＮ１の１２ａ＋に選択的に結合する抗体とを含む１２ａ＋／１３＋  ＢＩＮ１ポリペプチドを検出するための第２のアッセイシステムを含むことができる。アッセイはまた、サンドイッチアッセイであってもよく、これら２つの抗体のうちの１つが固体表面に固定化される。固体支持体は、プレート、アレイ、チップ、またはビーズを含むことができる。任意選択的に、キットの抗体が標識される。キットは、任意選択的に、１つ以上の二次および／もしくは三次抗体（任意選択的に標識される）、抗体のための容器、ならびに／または標識の検出のための試薬を含む。アッセイシステムは、任意選択的に、選択された抗体（単数または複数）が結合した１つ以上の固体支持体を含む。
【００７９】
本明細書を通して使用される場合、対象は、脊椎動物、より具体的には哺乳類（例えば、ヒト、ウマ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネズミ、ウサギ、ラット、およびモルモット）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、ならびにいずれの他の動物であってもよい。この用語は、特定の年齢または性別を意味しない。したがって、オスまたはメスにかかわらず、成体および新生の対象が包含されることが意図される。本明細書において使用される場合、患者または対象は、交換可能に使用されてもよく、疾患もしくは障害（例えば、癌）を有する対象を指すことができる。患者または対象という用語は、ヒトおよび動物の対象を含む。
【００８０】
本明細書において使用される場合、治療、治療する、治療すること、という用語は、疾患、または障害、または疾患もしくは障害の症状の影響を軽減する方法を指す。したがって、開示される方法において、治療は、確立された疾患、または障害、または疾患もしくは障害の症状の重症度における１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の軽減を指すことができる。例えば、疾患を治療するための方法は、対照と比較して、対象における疾患の１つ以上の症状が１０％軽減された場合に、治療であるとみなされる。したがって、軽減は、天然または対照のレベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１０％〜１００％の任意の軽減の割合であり得る。治療は、疾患、障害、または疾患もしくは障害の症状の治癒または完全な消失を指す必要はないことを理解されたい。
【００８１】
開示される方法および組成物のために使用することができるか、それらと併せて使用することができるか、それらの調製に使用することができるか、またはそれらの産物である、材料、組成物、および構成要素が開示される。これらおよび他の材料は、本明細書に開示されており、これらの化合物のそれぞれの様々な個別的および集合的な組み合わせならびに順列の特定の言及が明確に開示され得ないが、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループ等が開示されときに、それぞれ本明細書において具体的に企図および説明されることを理解する。例えば、方法が開示され、論じられ、この方法を含むいくつかの分子に加えることができるいくつかの修正が論じられる場合、この方法のありとあらゆる組み合わせおよび順列、ならびに可能な修正は、それとは反対に具体的に示されない限り、具体的に企図される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも具体的に企図および開示される。この概念は、開示される組成物を使用する方法におけるステップを含むが、これらに限定されない本開示の全ての態様に適用される。したがって、実行され得る様々なさらなるステップが存在する場合、これらのさらなるステップがそれぞれ、開示される方法の任意の特定の方法ステップまたは方法ステップの組み合わせとともに実行されてもよく、それぞれのかかる組み合わせまたは組み合わせのサブセットが具体的に企図され、開示されるとみなされるべきであることを理解する。
【００８２】
本明細書に引用される刊行物およびそれらが引用される資料は、参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる。
【実施例】
【００８３】
実施例１：血液試料中のＢＩＮ１のイヌ試験
方法
イヌの選択および血清の調達    細胞腫の絶対的診断を有する３１匹のイヌと、対照としての７匹の健康なイヌから静脈血試料を得た。筋肉内の汚染物質が多い（クレアチニンキナーゼ＞１０００ＩＵ／Ｌ）ために２つの試料を除外し、不完全な臨床データのために別の２つの試料を除外した。残りの２７個の試料は、各それぞれの癌ごとに標準化された臨床的（生検ベースではない）病期分類ガイドラインに従って、それらの癌を病期分類（Ｉ〜ＩＶ）した。癌は、リンパ腫、肉腫、腺肉腫、および未分化腫瘍を含む固形腫瘍と血液腫瘍の混合であった。
【００８４】
各イヌを胸骨臥位で保定した。２１ゲージ−１インチ針を有する１２．０ｍｌ注射器を使用して、７．０ｍｌガラスＥＤＴＡチューブ内に頸静脈から５ｍｌの静脈血を採取した。ＥＤＴＡと混合した後、次いで血液を４℃で２０分、４，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清の血清を１．７ｍｌエッペンドルフチューブに収集し、後に分析するために−８０℃の冷凍庫に保存した。
【００８５】
捕捉ＥＬＩＳＡによる血清ＢＩＮ１タンパク質の検出    丸底９６ウェルプレートを、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液に希釈（１／１０００）したｐＨ９．０のマウス抗ＢＩＮ１（Ｃｌｏｎｅ９９Ｄ、Ｓｉｇｍａ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で１６時間４℃でコーティングした。トリス緩衝生理食塩水Ｔｗｅｅｎ−２０（商標）（ＴＢＳＴ）でプレートを３回洗浄して未結合抗体を除去し、ＴＢＳＴ（ブロッキング緩衝液）中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて室温で１時間ブロックした。１００μｌの各血清試料を２通り加え、プレートを軌道回転させながら４℃で一晩インキュベートした。次いで、試料を吸引し、プレートを迅速に２回洗浄した後、ＴＢＳＴで５分間３回洗浄した。次いで、ヤギ抗ＢＩＮ１（ブロッキング緩衝液中１／１０００）（Ｅｖｅｒｅｓｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を検出抗体として適用し、プレートを回転させながら室温で２時間インキュベートした。次いで、検出抗体を吸引し、プレートを迅速に２回洗浄した後、ＴＢＳＴで５分間３回洗浄した。その後、２回の迅速な洗浄およびＴＢＳＴを用いた３回の５分間洗浄の前に、ＨＲＰ複合ロバ抗ヤギＩｇＧ（ブロッキング緩衝液中１／２０００）（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いて、室温で１時間プレートをインキュベートした。ＴＭＢ基質を加え、１Ｎ塩酸（ＨＣＬ）を用いて反応を停止する前に１時間暗所でプレートをインキュベートした。反応停止後、ＥＬｘ８００  ＢｉｏＴｅｋマイクロプレート分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用してプレートを読み取り、４０５ｎｍでＯＤ値を測定した。全ての値を２歳の９キログラムの健康なイヌの値に正規化した。
【００８６】
結果
血清ＢＩＮ１レベルと臨床的に評価された癌の病期との間の相関関係を決定するためにイヌ試験を行った。この試験のために、細胞腫の絶対的診断を有する２７匹のイヌを調べた。動物から血清を採取し、ＥＬＩＳＡによりＢＩＮ１含量についてアッセイした。ＥＬＩＳＡ試験の捕捉抗体は、ＢＩＮ１エクソン１３によってコードされる領域に対する市販のモノクローナルＢＩＮ１抗体（Ｃｌｏｎｅ  ９９Ｄ、Ｓｉｇｍａ）であった。図１に示すように、限定的な癌に罹患するイヌ（第Ｉ病期）は、進行癌に罹患するイヌ（第ＩＩＩおよびＩＶ病期）よりも有意に少ない血清ＢＩＮ１を有する。このコホートのイヌは、体重、年齢、またはクレアチニンホスホキナーゼ（筋肉試料採取の指標）の間に有意な差はなかったことに留意されたい。
【００８７】
この原理証明は、血液を利用することができる癌診断ツールとしてＢＩＮ１を支持するものである。静脈血の血清分画におけるＢＩＮ１の上昇は、イヌにおいて細胞腫の第ＩＩＩおよびＩＶ病期の状態を有意に予測する。ＢＩＮ１は、ヒトの転移性癌の定量的血液バイオマーカーとなり得る。
【００８８】
実施例２：９Ｄ７  １Ｃ１モノクローナル抗体の配列分析
材料および方法
全ＲＮＡ抽出    Ｑｉａｇｅｎキットを使用してハイブリドーマから全ＲＮＡを抽出した。
【００８９】
第１ラウンドのＲＴ−ＰＣＲ    ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（カタログ番号２１０２１０）を使用した。重鎖および軽鎖に特異的なプライマーセットを使用してＲＴ−ＰＣＲを行った。各ＲＮＡ試料ごとに、可変領域のリーダー配列を網羅する縮重順方向プライマー混合物を使用して、１２個の個々の重鎖と１１個の軽鎖のＲＴ−ＰＣＲ反応を誘発した。逆方向プライマーは、重鎖および軽鎖の定常領域に位置する。プライマーに制限部位を人工的に作製することはしなかった。反応設定は、５．０μｌの５×ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、０．８μｌのｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（各ｄＮＴＰを１０ｍＭ含有）、０．５μｌのプライマーセット、０．８μｌのＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ、２．０μｌの鋳型ＲＮＡ、および２０．０μｌまでのＲＮａｓｅを含まない水を含んでいた。ＰＣＲ条件は、５０℃、３０分、９５℃、１５分、（９４℃、２５秒；５４℃、３０秒；および７２℃、３０秒）を２０サイクル、その後、７２℃で１０分間の最終伸長であった。
【００９０】
第２ラウンドのセミネステッドＰＣＲ      第１ラウンドの反応からのＲＴ−ＰＣＲ産物を、第２ラウンドのＰＣＲにおいてさらに増幅した。抗体可変領域に特異的なセミネステッドプライマーセットを使用して、１２個の個々の重鎖および１１個の軽鎖のＲＴ−ＰＣＲ反応を誘発した。反応設定は、１０μｌの２×ＰＣＲ混合物、２μｌのプライマーセット、および８μｌの第１ラウンドの生成物を含んでいた。ＰＣＲ条件は、９５℃、５分、（９５℃、２５秒；５７℃、３０秒；および６８℃、３０秒）を２５サイクル、その後、６８℃で１０分間の最終伸長であった。
【００９１】
ＰＣＲの終了後、ＰＣＲ反応試料をアガロースゲル上に流し、増幅したＤＮＡ断片を可視化した。正しい抗体可変領域ＤＮＡ断片は、４００〜５００塩基対のサイズを有するはずである。
【００９２】
ＰＣＲ陽性のバンドをＴＯＰＯクローニングした。ＴＯＰＯクローンをＰＣＲ増幅してからゲル電気泳動を行い、アガロースゲルから回収した。次いで、約２４個のクローンを配列決定し、これらの配列データを使用してＣＤＲ分析を行った。
【００９３】
結果
クローニングしたＤＮＡ断片を配列決定した後、いくつかのマウス抗体重鎖および軽鎖を同定した。抗体ＣＤＲの分析により、１つの重鎖および２つの軽鎖を同定した。配列決定の結果の概要を表２に示す。
【表２】
2014531020.tif 000004
【００９４】
以下は、表２に列挙される配列である：ＧＦＮＩＫＤＹＹ（配列番号１０）、ＩＤＰＥＮＧＮＴ（配列番号１１）、ＶＲＧＥＤＹＧＧＹＡＭＤＹ（配列番号１２）、ＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号１３）、ＭＱＨＬＥＦＰＦＴ（配列番号１４）、ＱＤＶＳＴＡ（配列番号１５）、およびＱＱＨＹＳＴＰＦＴ（配列番号１６）。
【００９５】
可変ＶＨ領域の配列
ＦＡＳＴＡフォーマットでのアミノ酸配列（ＭＨＣ２９９Ｈ１．１＼；Ｍ１３Ｒ）：ＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＡＬＶＫＬＳＣＫＡＳＧＦＮＩＫＤＹＹＶＹＷＶＫＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩＧＷＩＤＰＥＮＧＮＴＩＹＤＰＥＦＱＡＫＡＳＩＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＬＱＬＳＳＬＴＳＥＧＴＡＶＹＹＣＶＲＧＥＤＹＧＧＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号４）
【００９６】
ＦＡＳＴＡフォーマットでのヌクレオチド配列（ＭＨＣ２９９Ｈ１．１＼；Ｍ１３Ｒ）：ＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＧＣＣＡＧＧＧＧＣＣＴＴＡＧＴＣＡＡＧＴＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＴＡＡＡＧＡＣＴＡＣＴＡＴＧＴＧＴＡＴＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＡＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＴＧＧＡＴＴＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＴＧＧＴＡＡＴＡＣＴＡＴＡＴＡＴＧＡＣＣＣＧＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＡＴＡＡＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＧＣＡＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＴＴＡＧＡＧＧＧＧＡＧＧＡＴＴＡＣＧＧＧＧＧＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号５）
【００９７】
可変ＶＬ領域の配列
ＦＡＳＴＡフォーマットでのアミノ酸配列（ＭＨＣ２９９Ｌ６．３＼；Ｍ１３Ｒ）：ＤＩＶＶＴＱＡＡＰＳＶＰＶＴＰＧＥＳＶＳＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＳＷＦＬＱＲＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＭＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＡＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＨＬＥＦＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号６）
【００９８】
ＦＡＳＴＡフォーマットでのヌクレオチド配列（ＭＨＣ２９９Ｌ６．３＼；Ｍ１３Ｒ）：ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＣＣＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＴＣＡＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＴＣＡＧＴＴＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＧＴＡＡＧＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＴＡＧＴＡＡＴＧＧＣＡＡＣＡＣＴＴＡＣＴＴＧＴＣＴＴＧＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＣＧＧＡＴＧＴＣＣＡＡＣＣＴＴＧＣＣＴＣＡＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＡＧＧＣＡＣＴＧＣＴＴＴＣＡＣＡＣＴＧＡＧＡＡＴＣＡＧＴＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＴＧＧＧＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＴＧＣＡＡＣＡＴＣＴＡＧＡＡＴＴＴＣＣＣＴＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣ（配列番号７）
【００９９】
可変ＶＬ領域の配列
ＦＡＳＴＡフォーマットでのアミノ酸配列（ＭＨＣ２９９Ｌ７．２＼；Ｍ１３Ｒ）：
ＤＩＶＭＴＱＳＨＫＦＭＳＴＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＬＹＹＣＱＱＨＹＳＴＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号８）
【０１００】
ＦＡＳＴＡフォーマットでのヌクレオチド配列（ＭＨＣ２９９Ｌ７．２＼；Ｍ１３Ｒ）：ＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＡＣＡＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＣＡＣＡＴＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＡＧＴＡＣＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＴＣＴＣＣＴＡＡＡＣＴＡＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＧＧＧＣＡＴＣＣＡＣＣＣＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＣＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＡＴＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＣＡＣＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＴＡＴＡＧＣＡＣＴＣＣＡＴＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣ（配列番号９）
【０１０１】
実施例３：ヒト癌患者由来の血液試料におけるＢＩＮ１の検出
ブリッジングインテグレーター１（ＢＩＮ１）遺伝子は、核細胞質タンパク質のいくつかのアイソフォームをコードする。ＢＩＮ１遺伝子中の２０個のエクソンを選択的にスプライシングして、遍在的または組織特異的な発現を示す少なくとも１０個のＢＩＮ１アイソフォームを生じさせた（図３）。エクソン１２ａを含有する２個のＢＩＮ１アイソフォームは、腫瘍アイソフォームとして記載されている（Ｐｒｅｎｄｅｒｇａｓｔ  ＧＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２００９  １７９５（１）：２５−３６）：一方は、報告されているアイソフォーム６（ＮＭ＿１３９３４８）に対する配列相似性を有するエクソン１３（受入番号：ＡＦ０６８９１７．１）を含み、文献においてＢＩＮ１アイソフォーム６、また本明細書においてＢＩＮ１  Ｃａ−１と称され、他方は、エクソン１３を含まず、本明細書においてＢＩＮ１  Ｃａ−２と称され、新しい癌のアイソフォームを表す（図３）。
【０１０２】
この試験は、異なる特異性の抗体の組み合わせを用いて、ヒトのる正常および癌由来の血液試料において検出可能なこれらのアイソフォームのレベルを間接的に測定することにより、癌の循環バイオマーカーとしてエクソン１２ａを含有するＢＩＮ１癌アイソフォームを特徴付けることを目標とする。
【０１０３】
抗体サンドイッチアッセイの組み合わせ（表３）は、エクソン１２ａおよびエクソン１３の両方によってコードされるポリペプチドを含有するアイソフォームを検出するように（アッセイ番号１）、または、エクソン１２ａ、およびエクソン１３を有するかまたは有しない１２ａ＋  ＢＩＮ１を捕捉するように設計された遍在的に発現されるエクソン１１によってコードされるポリペプチドを含有するアイソフォームを検出するように（アッセイ番号２）設計した。癌原遺伝子スプライシング因子ＳＦ２／ＡＳＦの存在に照らして、１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１の存在を検出した（Ｋａｒｎｉ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２００７  １４（３）：１８５−１９３）。この１２ａ＋／１３−  ＢＩＮ１アイソフォームは、本明細書においてＣａ−２（図３）と称される。
【０１０４】
材料および方法
抗体    血液試料中のＢＩＮ１癌アイソフォームのレベルを測定するために、４つのＢＩＮ１抗体のセットを酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）において使用した。全てのＢＩＮ１アイソフォーム中に存在するエクソン１１によってコードされるポリペプチドを特異的に認識する、この試験においてｐ１１と称されるＥｖｅｒｅｓｔ（カタログ番号ＥＢ０８７２４）の抗ＢＩＮ１ヤギポリクローナル抗体を使用して、全てのＢＩＮ１アイソフォームの検出を行った。この試験においてｍ１３と称されるＳｉｇｍａ（カタログ番号Ｂ９４２８）の抗ＢＩＮ１マウスモノクローナル抗体を使用して、エクソン１３によってコードされるポリペプチドを含有するＢＩＮ１アイソフォームのサブセットの検出を行った。エクソン１２ａによってコードされるポリペプチドを含有するＢＩＮ１アイソフォームのサブセットの検出のために、特別に作製した２つの抗体を使用した：この試験においてｐ１２ａと称される抗ＢＩＮ１ウサギポリクローナル抗体（番号Ａ５２９９）、およびこの試験においてｍ１２ａと称される抗ＢＩＮ１マウスモノクローナル抗体（番号９Ｄ７１Ｃ１）。
【０１０５】
アッセイおよび試験    捕捉サンドイッチＥＬＩＳＡによる血清ＢＩＮ１タンパク質の検出    抗体の組み合わせを表３に列挙する。丸底９６ウェルプレートを、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液に希釈（ｐＨ９．０）した捕捉抗体（約５μｇ／ｍｌ）で、１６時間４℃でコーティングした。トリス緩衝生理食塩水ＴＷＥＥＮ−２０（ＴＢＳＴ）でプレートを３回洗浄して未結合抗体を除去し、ＴＢＳＴ（ブロッキング緩衝液）中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて室温で１時間ブロックした。５０μｌの標準物質（組換えＢＩＮ１タンパク質）および各血清試料を２通り加え、プレートを回転させながら４℃で一晩インキュベートした。次いで、試料を吸引し、プレートを迅速に２回洗浄およびＴＢＳＴで５分間３回洗浄した。次いで、一次検出抗体（ブロッキング緩衝液中５μｇ／ｍｌ）を検出抗体として適用し、プレートを回転させながら室温で１時間インキュベートした。次いで、検出抗体を吸引し、プレートを迅速に２回洗浄した後、ＴＢＳＴで５分間３回洗浄した。その後、２回の迅速な洗浄およびＴＢＳＴを用いた３回の５分間洗浄の前に、ＨＲＰ複合二次抗体（ブロッキング緩衝液中１／２０００）を用いて室温で１時間プレートをインキュベートした。３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を加え、１Ｎ塩酸（ＨＣＬ）を用いて反応を停止する前に１時間暗所でプレートをインキュベートした。反応停止後、ＥＬｘ８００マイクロプレート分光光度計（ＢＩＯＴＥＫ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用してプレートを読み取り、４０５ｎｍで光学濃度（ＯＤ）値を決定した。既知のタンパク質濃度のタンパク質標準物質のＯＤ値から標準曲線を作成した。次いで、その標準曲線から各試料のＢＩＮ１濃度を導き出した。
【０１０６】
これらの抗体の２つの異なる組み合わせを使用して、２つの別個のアッセイを定義した（表３）。アッセイ番号１において、捕捉にはｍ１３を使用し、検出にはｐ１２ａを使用して、癌アイソフォームＣａ−１を含む４つのＢＩＮ１アイソフォームのレベルを測定した。アッセイ番号２において、捕捉にはｍ１２を使用し、検出にはｐ１１を使用して、２つの癌アイソフォームＣａ−１およびＣａ−２を含む５つのＢＩＮ１アイソフォームのレベルを測定した。
【表３】
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【０１０７】
アッセイ番号２の場合、二次ＨＲＰ複合抗体は、ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ａｂｃａｍ）であった。アッセイ番号１の場合、二次ＨＲＰ複合抗体は、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａｂｃａｍ）であった。
【０１０８】
ＢＩＮ１の新規癌アイソフォームＣａ−２のレベルを評価するために、比率アッセイ番号２／アッセイ番号１を使用して、ＢＩＮ１癌試験番号１と名付けた。
【０１０９】
ヒト試料    ＩＲＢの下に収集された、関連臨床データを含むヒト臨床試料リポジトリを有する商業ベンダーを特定した。固有の臨床的に健常な２５〜７９歳の範囲の対象から４２個の血液試料を得た（Ｃｏｎｖｅｒｓａｎｔ、Ａｓｔｅｒａｎｄ）。肺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、卵巣癌、および甲状腺癌の各々１０個の、５０個のヒト血液試料を得た（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  ＲｅｓｅａｒｃｈおよびＣｏｎｖｅｒｓａｎｔ）。癌患者の年齢は、１８〜８４歳であった。血液試料は、病期ＩおよびＩＶの疾患に罹患する肺癌患者から、癌病期ＩＩＩおよびＩＶの疾患に罹患する膵臓癌患者から、病期ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶの疾患に罹患する結腸直腸癌患者、ならびに全ての病期（Ｉ〜ＩＶ）に罹患する卵巣癌および甲状腺癌患者から得た。
【０１１０】
結果
標準曲線    この試験において使用したＥＬＩＳＡアッセイの陽性対照として、ＢＩＮ１組換えタンパク質（Ｃａ−１）をヒトＨＥＫ−２９３細胞において過剰発現させ、アッセイ番号１（ｍ１３−ｐ１２ａ）およびアッセイ番号２（ｍ１２−ｐ１１）を使用して全ライセートを分析した。アッセイ番号１およびアッセイ番号２の２つの標準曲線を、それぞれ図４Ａおよび図４Ｂに表す。アッセイ番号１およびアッセイ番号２の両方において、ＢＩＮ１組換えタンパク質の量における増加は、ＢＩＮ１抗体を使用して検出されたシグナルの増加と相関している。
【０１１１】
図５は、２つの癌アイソフォームであるＣａ−１とＣａ−２との間の関係を示す。アッセイ番号１では、正常および癌の両方の多くの試料が、高いシグナルを発した（Ｘ軸）。これをアッセイ番号２のシグナルと組み合わせると、はるかに良好な癌特異性がもたらされる。１０を超えるアッセイ番号２のレベルを有する１０個の癌試料（三角形）はまた、１０を超えるアッセイ番号１のレベルも有していた。後にさらに論じるように、これらの試料を年齢ごとに検討することも有益であり、健常対象におけるより高い信号は、若年対象の試料において生じる。このグラフは、両方のアッセイが癌においてシグナルの増加を示したことを示すものであり、Ｃａ−１およびＣａ−２の両方が重要であることが示唆される。しかしながら、アッセイ番号２／アッセイ番号１の比率を用いて下のように試料を分析することにより、Ｃａ−２癌アイソフォームレベルの決定が可能となる。
【０１１２】
ＢＩＮ１癌アイソフォームＣａ−２のレベルを評価するために、ＢＩＮ１癌試験番号１を使用した（比率アッセイ番号２／アッセイ番号１）。図６は、正常な血液試料における対象の年齢に関連するＢＩＮ１癌試験番号１の結果を示す。３つの正常試料が、１０を超える結果（すなわち、Ｙ軸上のハッチング線）を示した。これらの試料は、２５〜４３歳のより若年の患者に由来する。ほぼ全ての正常試料が、非常に低い癌試験番号１の値を有する。
【０１１３】
図７において、ＢＩＮ１癌試験番号１を使用して癌試料を評価し、これらの結果を、正常試料で得られた結果とともにプロットした。１０を超える試験値が、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、および甲状腺癌を含む１０個の癌試料において観察された。肺癌は、定量的および数値的の両方で最も高いＣａ−２（エクソン１２ａ＋／１３−ＢＩＮ１）のレベルを示し、したがって、１０個のうち５個の試料が陽性であり、これらは観察された最も高いレベルに含まれる。結腸直腸癌におけるＣａ−２  ＢＩＮ１癌アイソフォームのレベルは、一様に非常に低く、２個の膵臓試料、２個の卵巣試料、および１個の甲状腺試料を含む他の癌型の各々に罹患する対象由来の少数の試料が、１０を超えるレベルを示した。
【０１１４】
この小規模調査において、１０を超える試験値を有する最も若年の癌患者は５６歳であったのに対し、高いＢＩＮ１試験値を有する３人の健常対象のうち、最も高齢なのは４３歳であった。したがって、癌スクリーニング試験を考慮する可能性の高い年齢群において、癌試料と正常試料の試験結果の分離は、レベル１０で非常に良好である：癌の２０％は陽性であり、５０歳を超える人々では健常対象に陽性は存在しない。肺癌試料の半数が陽性であることから、喫煙者および肺癌の高いリスクを有する他の対象をスクリーニングするためのＢＩＮ１試験の使用が示唆される。興味深いことに、検出されたこれらの肺癌のうちの３つは病期Ｉであり、したがって、これらの患者は、早期検出および直接的な治療の大きな恩恵を受け得る。
【０１１５】
表４は、ＢＩＮ１癌試験番号１および増加する試験シグナルの閾値を使用したヒトの臨床結果を要約している（＊これらの健常対象は４３歳以下であり、＾これらの癌対象は５６歳以上である）。
【表４】
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【０１１６】
図８は、この試験で使用した全ての癌試料について異なる癌の進行段階（Ｉ〜ＩＶ）に関連して、癌患者におけるＢＩＮ１癌試験番号１の結果を表す。病期ＩＩＩと比較して、病期ＩＶにおいて、ＢＩＮ１癌試験シグナルにおける全体的な増加が観察された。図９Ａ〜図９Ｅは、各癌の種類において検出された癌の病期に関連する試験結果を表す。肺癌では、２個の試料が高いＢＩＮ１癌試験の結果を有していた：１個の病期Ｉおよび病期ＩＶ（図９Ａ）。膵臓癌では、病期ＩＩＩの癌患者と比較して、２人の病期ＩＶの癌患者が比較的高いＢｉｎ１癌試験の結果を有していた（図９Ｂ）。卵巣癌では、２個の試料が高いＢｉｎ１癌試験の結果を有していた：１個の病期Ｉおよび病期ＩＶ（図９Ｃ）。最後に、甲状腺癌では、病期ＩＩの癌試料におけるＢｉｎ１癌試験の結果が最も高かった（図９Ｅ）。
【０１１７】
このように、ＢＩＮ１癌試験は、いくつかの癌において癌試料のサブセットを検出する。これらのサブセットは、病期に対応する場合があるが、必ずしも病期と相関しているわけではない。ＢＩＮ１陽性サブセットは、これらの癌診断法において腫瘍サブタイプを反映し得る、すなわち、活性または異なる宿主応答が作動する異なる生化学的経路を有する可能性のあるサブタイプである。このことは、肺癌、卵巣癌、甲状腺癌、膵臓癌のサブセットを同定することにより、ＢＩＮ１が、これらの患者における治療選択に有用であり得ることを示唆している。
【０１１８】
実施例４：癌の治療を受けたイヌ由来の血液試料におけるＢＩＮ１の検出
材料および方法
イヌ試料    この試験のために、見かけ上健康なイヌ（健常対象と称される）からの１４個の血液試料と、新たに癌であると診断されたイヌ（癌／治療前と称される）からの４３個の血液試料を採取した。何匹かのイヌは、外科的切除、および／または放射線療法、ならびに化学療法を含む治療を受けた。治療を受けたイヌのサブセットから、治療から１週間後、またある場合には２週間後に第２の血液試料を採取した（それぞれ、治療後１および治療後２）。
【０１１９】
結果
ＢＩＮ１癌試験番号１を使用して５７個のイヌ試料（１４個の正常および４３個の新規診断）を分析し、治療前および治療後の正常イヌ試料対癌イヌ試料でＢＩＮ１癌アイソフォームのレベルを検出した。正常試料において、ＢＩＮ１癌アイソフォームの検出は検出されなかった（図１０）。癌試料において、ＢＩＮ１癌アイソフォームの増加が検出された。癌治療の後、ＢＩＮ１癌アイソフォームのレベルが減少した（図１０）。
【０１２０】
１４個の治療前癌試料が、正常試料と比較して１を超えるレベルの高いＢＩＮ１癌試験の結果を示した（全ての正常試料はゼロであった）。癌治療後、１１個の試料中８個において、ＢＩＮ１癌アイソフォームのレベルが減少した（図１１Ａ〜１１Ｃ）。イヌ試料番号４、番号７、および番号８において、治療後、ＢＩＮ１癌アイソフォームのレベルに変化が見られなかった。イヌ番号４は、見かけ上異常のない外科的切除端２ｃｍの口腔肉腫を有していた。しかしながら、術後ＢＩＮ１レベルの高さは、持続性の疾患を示唆するものであり、経過観察の病理組織学により該切除端に異常があり、癌細胞が高い分裂指数を有していたことが示された。治療優先度が緩和ケアに移行し、さらなる外科手術は行わなかった。イヌ番号７は、外科的に除去された甲状腺癌を呈したが、外科的および病理組織学分析により血管侵入性転移が示されたことから、不十分な治療が示唆された。イヌ番号８は、治療に対する不良な反応を示すマスト細胞腫瘍を呈し、癌が転移し続けたため、後に該イヌを安楽死させた。したがって、血液試料において検出された高いレベルのＢＩＮ１癌アイソフォームは、癌の進行または癌治療に対する反応が見られないことと相関していた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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