(57)【要約】  細胞を保護する方法は、細胞のインフラマソーム、MyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、カスパーゼ-８及び/又はNFκBを阻害することを含む。MyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、カスパーゼ-８及び/又はNFκBの阻害剤の投与は、細胞をAlu-RNA誘導変性から保護することができる。細胞(例えば網膜色素上皮(RPE))の保護は、加齢性黄斑変性及び地図状萎縮に関して治療上有用であり得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のインフラマソーム；細胞のMyD88；細胞のIL-18；細胞のVDAC1；細胞のVDAC2；細胞のカスパーゼ-８；及び細胞のNFκBの１つ以上を阻害することを含んでなる、細胞を保護する方法。
【請求項２】
細胞がRPE細胞、網膜光受容器、又は脈絡叢細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞がRPE細胞である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
細胞がAlu-RNA誘導変性に対して保護される請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
MyD88の阻害がMyD88阻害剤を投与することを含んでなる請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
阻害剤が配列番号１、54及び55の配列から選択されるポリペプチド配列を含んでなる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
阻害剤がMyD88の発現を阻害する二本鎖RNA分子であり、その少なくとも一方の鎖が配列番号３、４、５、６及び56から選択される配列を含む請求項５に記載の方法。
【請求項８】
My D88阻害剤がMyD88ホモ二量体化阻害剤である請求項５に記載の方法。
【請求項９】
MyD88阻害剤がPepinh-MYD(Invitrogen)である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
My D88阻害剤がMyD88の優勢ネガティブ又はスプライス変異型である請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
MyD88阻害剤がエキソン２を欠いているMyD88スプライス変異型である請求項１１に記載の方法。
【請求項１２】
MyD88阻害剤が表Ｃに記載のものから選択さえれる請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
阻害剤が硝子体内注射；網膜下注射；胸膜上注射；テノン嚢下注射；球後注射；球周囲注射；局所的点眼適用；強膜に縫い付けられ若しくは付着され又は強膜上に配置され、又は硝子体液若しくは前眼房中に注入され、又は水晶体包若しくは水晶体嚢に埋め込まれた持続放出インプラントデバイスからの放出；経口投与；又は静脈内投与により投与される請求項５〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
インフラマソームがPYCARDによりコードされるタンパク質を含む請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
インフラマソームがNLRP3インフラマソーム、NLRP1インフラマソーム、NLRC4インフラマソーム、AIM2インフラマソーム及びIFI16インフラマソームから選択される請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
インフラマソームがNLRP3インフラマソームである請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
インフラマソームの阻害がインフラマソーム阻害剤を投与することを含んでなる請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
インフラマソーム阻害剤が表Ａに記載のものから選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
インフラマソーム阻害剤がNLRP3阻害剤及び/又はPYCARD阻害剤である請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
インフラマソーム阻害剤が配列番号７〜16の配列から選択される配列を含んでなる請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
インフラマソーム阻害剤がカスパーゼ-１の阻害剤である請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
インフラマソーム阻害剤がカスパーゼ-１のペプチド阻害剤である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
カスパーゼ-１阻害剤が配列番号17の配列を含んでなる請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
阻害剤が硝子体内注射；網膜下注射；胸膜上注射；テノン嚢下注射；球後注射；球周囲注射；局所的点眼適用；強膜に縫い付けられ若しくは付着され又は強膜上に配置され、又は硝子体液若しくは前眼房中に注入され、水晶体包若しくは水晶体嚢に埋め込まれた持続放出インプラントデバイスからの放出；経口投与；又は静脈内投与により投与される請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
IL-18の阻害がIL-18阻害剤を投与することを含んでなる請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
IL-18阻害剤がIL-18に対する中和抗体である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
IL-18阻害剤がIL-18レセプターへのIL-18結合を遮断する抗体である請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
IL-18阻害剤がIL-18結合性タンパク質である請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
IL-18阻害剤が表Ｄに記載のものから選択される請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
阻害剤が硝子体内注射；網膜下注射；胸膜上注射；テノン嚢下注射；球後注射；球周囲注射；局所的点眼適用；強膜に縫い付けられ若しくは付着され又は強膜上に配置され、又は硝子体液若しくは前眼房中に注入され、水晶体包若しくは水晶体嚢に埋め込まれた持続放出インプラントデバイスからの放出；経口投与；又は静脈内投与により投与される請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
VDAC1の阻害がVDAC1阻害剤を投与することを含んでなる請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
VDAC1阻害剤が配列番号47の配列を含んでなる請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
VDAC2の阻害がVDAC2阻害剤を投与することを含んでなる請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
VDAC2阻害剤が配列番号48の配列を含んでなる請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
VDAC1又はVDAC2阻害剤が表Ｅに記載のものから選択される請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３６】
阻害剤が硝子体内注射；網膜下注射；胸膜上注射；テノン嚢下注射；球後注射；球周囲注射；局所的点眼適用；強膜に縫い付けられ若しくは付着され又は強膜上に配置され、又は硝子体液若しくは前眼房中に注入され、水晶体包若しくは水晶体嚢に埋め込まれた持続放出インプラントデバイスからの放出；経口投与；又は静脈内投与により投与される請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
カスパーゼ-８の阻害がカスパーゼ-８阻害剤を投与することを含んでなる請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
カスパーゼ-８阻害剤が表Ｆに記載のものから選択される請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
阻害剤が硝子体内注射；網膜下注射；胸膜上注射；テノン嚢下注射；球後注射；球周囲注射；局所的点眼適用；強膜に縫い付けられ若しくは付着され又は強膜上に配置され、又は硝子体液若しくは前眼房中に注入され、水晶体包若しくは水晶体嚢に埋め込まれた持続放出インプラントデバイスからの放出；経口投与；又は静脈内投与により投与される請求項３７〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
NFkBの阻害がNFkB阻害剤を投与することを含んでなる請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
NFkB阻害剤が表Ｇに記載のものから選択される請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
阻害剤が硝子体内注射；網膜下注射；胸膜上注射；テノン嚢下注射；球後注射；球周囲注射；局所的点眼適用；強膜に縫い付けられ若しくは付着され又は強膜上に配置され、又は硝子体液若しくは前眼房中に注入され、水晶体包若しくは水晶体嚢に埋め込まれた持続放出インプラントデバイスからの放出；経口投与；又は静脈内投与により投与される請求項４０〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
細胞が対象者に存在する請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
対象者が興味対象の病状を有しているか又は有するリスクにある請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
対象者が地図状萎縮の治療を必要としている請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
対象者が加齢性黄斑変性を有する請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
yD88の発現を阻害する単離二本鎖RNA分子であって、二本鎖RNAの第１の鎖が配列番号３、４、５、６及び56から選択される配列を含んでなり、約11〜約27ヌクレオチドを含む、単離二本鎖RNA分子。
【請求項４８】
NLRP3及び/又はPYCARDび発現を阻害する単離二本鎖RNA分子であって、二本鎖RNAの第１の鎖が配列番号７〜14から選択される配列を含んでなり、約11〜約27ヌクレオチドを含む、単離二本鎖RNA分子。
【請求項４９】
配列番号15の配列を含んでなり、約11〜約27ヌクレオチドを含む、ピリンの発現を阻害する単離二本鎖RNA分子。
【請求項５０】
配列番号16の配列を含んでなり、約11〜約27ヌクレオチドを含む、NALP3の発現を阻害する単離二本鎖RNA分子。
【請求項５１】
配列番号17の配列を含んでなり、約11〜約27ヌクレオチドを含む、カスパーゼ-１の発現を阻害する単離された二本鎖RNA分子。
【請求項５２】
二本鎖RNAの第１の鎖が配列番号47及び48から選択される配列を含んでなり、約11〜約27ヌクレオチドを含む、VDAC1及び/又はVDAC2の発現を阻害する単離された二本鎖RNA分子。
【請求項５３】
MyD88がアップレギュレートされるか、又はオリゴマー化を受けるか、又はIRAK1若しくはIRAK4のリン酸化を誘導する培養細胞を準備し；
細胞を候補化合物と接触させ；
候補化合物がMyD88レベルの変化、二量体化若しくはオリゴマー化MyD88量の変化又はリン酸化IRAK1又はリン酸化IRAK4量の変化を生じるかどうかを決定する
ことを含んでなる、MyD88阻害剤を同定する方法。
【請求項５４】
MyD88がAlu RNA、リポ多糖、CpGヌクレオチド、一本鎖RNA、インターロイキン-１β又はインターロイキン18によりアップレギュレートされる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
MyD88の変化が細胞生存能、又はMyD88シグナル伝達により誘導されることが知られる遺伝子の発現を測定することによりモニターされる、請求項５３又は５４に記載の方法。
【請求項５６】
MyD88シグナル伝達により誘導されることが知られる遺伝子がCox-2、Socs3及びTNF-αから選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
MyD88がアップレギュレートされるか、又はオリゴマー化を受けるか、又はIRAK1若しくはIRAK4のリン酸化を誘導する培養細胞を準備し；
細胞を候補化合物と接触させ；
二量体化若しくはオリゴマー化MyD88量を測定する
ことを含んでなる、MyD88阻害剤を同定する方法。
【請求項５８】
蛍光タンパク質のフラグメントをタグ化した融合MyD88タンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトした培養細胞をMyD88の既知の活性化剤と共に準備し；
蛍光シグナルを測定して試験化合物による蛍光シグナルの阻害の程度を決定する
ことを含んでなる、MyD88阻害剤を同定する方法。
【請求項５９】
蛍光-タグ化PYCARDをコードするプラスミドでトランスフェクトした培養細胞を準備し;
細胞をAlu-RNA又はLPS＋ATPで刺激し；
蛍光PYCARDの凝集をモニターし；
PYCARD凝集に対する試験化合物の効果を測定する
ことを含んでなる、インフラマソーム阻害剤を同定する方法。
【請求項６０】
IL-18でトランスフェクトした細胞を準備し；
細胞をAlu-RNA又はLPS＋ATPで刺激し；
MyD88レベルに対する試験化合物の効果を測定する
ことを含んでなる、IL-18阻害剤を同定する方法。
【請求項６１】
カスパーゼ-１の基質に接合した蛍光分子又はカスパーゼ-１による切断後に蛍光を発する分子を含んでなる、対象者の眼において活性化カスパーゼ-１を画像化するための診断組成物。
【請求項６２】
対象者のRPE細胞に請求項３５に記載の組成物を眼内又は静脈内投与し；
任意に、蛍光の空間的クラスター化をモニターする
ことを含んでなる、対象者の眼において活性化カスパーゼ-１を画像化する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ジャヤクリシュナ  アンバティ(ケンタッキー、レキシントン；アメリカ国籍)；及び
ヴァレリア  タラッロ(ケンタッキー、レキシントン；イタリア国籍)
譲受人：ユニバーシティー  オブ  ケンタッキー  リサーチ  ファウンデイション
代理人整理番号：13177N/1790WO
【０００２】
関連出願
本出願は、2011年７月18日出願の米国仮出願第61/508,867号及び2011年10月４日出願の米国仮出願第61/543,038号(この参照により、これら出願の開示全体が本明細書中に組み込まれる)の優先権を主張する。
政府の権益
本発明は、米国国立衛生研究所の国立眼研究所により認められた政府補助R01EY018350、R01EY018836、R01EY020672、R01EY022238、R21EY019778、RC1EY020442の下でなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本願開示の主題は、インフラマソーム、MyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、カスパーゼ-８及びNFκBの阻害；インフラマソーム、MyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、カスパーゼ-８及びNFκBの阻害剤、細胞の保護方法、並びに阻害剤を同定するスクリーニング法に関する。
【背景技術】
【０００４】
はじめに
加齢性黄斑変性(AMD)(これは先進工業国ではガンと同程度に蔓延している)は、世界中で失明の主原因である。血管新生型AMD(この疾患に対しては多くの認可された治療法が存在する)とは対照的に、遥かにより一般的な萎縮型AMDは十分に解明されておらず、有効な臨床的介入が存在しない。網膜色素上皮(RPE)の広範な萎縮は、重篤な視力喪失に至り、地図状萎縮と名付けられており、その病因は不明である。地図状萎縮は、世界中で数百万人の人々に失明を引き起こし、現時点で認可された治療法が存在しない。
【０００５】
本発明者らは、地図状萎縮を有するヒト眼の網膜色素上皮(RPE)におけるRNase DICER1の劇的な低下を示した(Kanekoら，Nature 2011；この参照により本明細書中に組み込まれる)。本発明者らはまた、DICER1欠損がAlu RNA転写物の蓄積を導き、この転写物が地図状萎縮を有するヒト眼のRPE中でも観察されることを証明した。これらAlu RNA転写物は、ヒトRPE細胞の細胞死及びマウスにおけるRPE変性を誘導する。Alu転写物の細胞毒性の正確な機序は不明である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書で説明するように、本発明者らは、今や、DICER1欠損又はAlu RNA曝露がNLRP3インフラマソームを活性化し、マウスのRPEとヒト及びマウスRPE細胞との両方で、IL-18を介するtoll様レセプター非依存性MyD88シグナル伝達を誘引することを見出した。
【０００７】
要旨
本願開示の主題は、本明細書で提供される情報を学んだ後に当業者に明らかとなるように、上記のニーズの幾つか又は全てを満たす。
この「要旨」は、本願開示の主題の幾つかの実施形態を記載し、多くの場合で、これら実施形態の変形物及び入替物を挙げる。この「要旨」は、単に、多くの多様な実施形態の例示に過ぎない。所与の実施形態の１以上の代表的特徴の言及も同様に例示である。このような実施形態は、典型的には、言及した特徴を有していることもあれば有していないこともある；同様に、これら特徴は、本願開示の主題の他の実施形態(この「要旨」で挙げられていてもいなくても)にあてはまる。過度の繰返しを避けるために、この「要旨」は、この特徴の可能な組合せの全てを列挙せず、示唆もしない。
【０００８】
本願開示の主題は、MyD88阻害剤を同定する方法、MyD88を阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。本願開示の主題は、インフラマソーム阻害剤を同定する方法、インフラマソームを阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。本願開示の主題は、インフラマソームの１つの構成要素の阻害剤を同定する方法、インフラマソームの構成要素を阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。インフラマソームの構成要素としては、例えば、NLRP3、PYCARD及びカスパーゼ-１が挙げられる。本願開示の主題は、IL-18阻害剤を同定する方法、IL-18を阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。本願開示の主題は、VDAC1又はVDAC2阻害剤を同定する方法、VDAC1又はVDAC2を阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。本願開示の主題は、カスパーゼ-８阻害剤を同定する方法、カスパーゼ-８を阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。本願開示の主題は、NFkB阻害剤を同定する方法、NFkBを阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。対象者の眼において活性化カスパーゼ-１を画像化する方法及び組成物もまた提供する。
【０００９】
本願開示の主題は、細胞のインフラマソーム、MyD88及びIL-18の１以上を阻害することを含む方法を包含する。幾つかの実施形態では、本願開示の主題は、細胞のMyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、NFκB、カスパーゼ-８、カスパーゼ-１、NLRP-3、PYCARD及びインフラマソーム(インフラマソームの１つの構成要素(例えば、カスパーゼ１、NLRP-3、PYCARD)を含む)の１以上を阻害することを含む方法を包含する。幾つかの実施形態では、本願開示の主題は、MyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、NFκB、カスパーゼ-８、カスパーゼ-１、NLRP-3、PYCARD及びインフラマソーム(インフラマソームの１つの構成要素(例えば、カスパーゼ１、NLRP-3、PYCARD)を含む)の阻害剤から選択される１以上の阻害剤を投与することを含む方法を包含する。
【００１０】
本方法の幾つかの実施形態では、細胞は、RPE細胞、網膜光受容器細胞又は脈絡叢細胞から選択される。幾つかの実施形態では、細胞はRPE細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は対象者の細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、興味対象の病状を有しているか、有していると疑われるか又は有するリスクにある対象者の細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、加齢性黄斑変性を有しているか、有していると疑われるか又は有するリスクにある細胞は対象者の細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、地図状萎縮を有しているか、有していると疑われるか又は有するリスクにある対象者の細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、地図状萎縮を有しているか、有していると疑われるか又は有するリスクにある対象者の細胞であり、細胞はRPE細胞である。幾つかの実施形態では、加齢性黄斑変性を有する対象者は、本明細書に記載の方法及び組成物を用いて治療され得る。本方法の幾つかの実施形態では、細胞は、Alu-RNA誘導変性に対して保護される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Alu RNAは、toll様レセプター(TLR)を介して活性化せず、機能もしない。(Ａ〜Ｅ)pAluは、WT(Ａ)、Tlr3-/-(Ｂ)、Tlr7-/-(Ｃ)、Unc93b1 mtマウス(TLR-3、7、9が機能的に欠損している)(Ｄ)、及びTlr4-/-マウス(Ｅ)においてRPE変性を誘導するが、pNullは誘導しない。代表的画像を示す。ｎ=８〜12。眼底写真、上列；閉鎖帯-１(ZO-1)について染色(赤色)した平面マウント、下列。変性は青色矢頭で輪郭を示す。スケールバー、20μm。(Ｆ)２つの異なるAlu RNA配列のいずれかでの、種々のTLRを発現するHEK293細胞株の刺激は、NF-κB活性化を誘発しない。TLR-特異的リガンドを用いるポジティブ(＋)コントロールは、NF-κBを活性化した。ｎ=３。データは平均±SEMとして表す。図８も参照。
【図２】Alu RNAはMyD88を介してRPE変性を誘導する。(Ａ)pAluはMyd88-/-マウスにおいてRPE変性を誘導しない。(Ｂ)WTマウスにおけるpAlu誘導RPE変性は、MyD88ホモ二量体化ペプチド阻害剤(MyD88i)により阻害されるが、コントロールペプチドによっては阻害されない。(Ｃ)WTマウスにおけるpAlu誘導RPE変性は、コレステロール-接合Myd88 siRNAにより阻害されるが、コントロールsiRNAによっては阻害されない。(Ｄ及びＥ)MyD88を標的するsiRNA(siMyD88)は、コントロールsiRNAと比較して、マウスRPE細胞における標的遺伝子(Ｄ)及びタンパク質(Ｅ)の量を低下させる。ｎ=３、* ｐ<0.05(スチューデントｔ検定による)。(Ｆ)pAluはMyd88ヘテロ接合型(het)マウスにおいてRPE変性を誘導しない。(Ｇ)ヒトRPE細胞におけるAlu RNA誘導IRAK1及びIRAK4リン酸化のウェスタンブロット。３つの実験の代表的画像。(Ｈ)pAluはWTの細胞生存能を低下させるが、Myd88-/-マウスRPE細胞の細胞生存能を低下させない。(Ｉ)pAluにより誘導されるヒトRPE細胞生存能の喪失は、MyD88iにより回復される。(Ｊ)AAV1-BEST1-Creは、pAlu誘導RPE変性からMyd88f/fマウスを保護するが、AAV1-BEST1-GFPは保護しない。(Ｋ)pAluは、ELISAにより測定した、ヒトRPE細胞からのIL-18分泌を誘導する。IL-1β分泌は辛うじて検出可能である。ｎ=３、* ｐ<0.05(スチューデントｔ検定による)。(Ｌ)組換えIL-18はWTにおいてRPE変性を誘導するが、Myd88-/-マウスにおいては誘導しない。(Ｍ及びＮ)WTマウスにおけるpAlu誘導RPE変性はIL-18中和抗体により回復する(Ｎ)が、IL-1β中和抗体によっては回復しない(Ｍ)。代表的画像を示す。ｎ=８〜12。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)平面マウント、下列。変性は青色矢頭で輪郭を示す。スケールバー、20μm(Ａ〜Ｃ、Ｆ、Ｊ、Ｌ〜Ｎ)。ｎ=３、* ｐ<0.05(スチューデントｔ検定による)。データは平均±SEMとして表す(Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ)。図９も参照。
【図３】Alu RNAはNLRP3インフラマソームを介してRPE変性を誘導する。(Ａ)ヒトRPE細胞におけるAlu RNAによるカスパーゼ-１活性化(p20サブユニット)のウェスタンブロット。(Ｂ)カスパーゼ-１ペプチド阻害剤で障害された野生型マウスにおけるRPE細胞溶解物中でのpAlu誘導IL-18成熟のウェスタンブロット。(Ｃ)カスパーゼ-１ペプチド阻害剤はpAlu誘導RPE変性からWTマウスを保護する。(Ｄ及びＥ)pAluはCasp1-/-マウスにおけるRPE変性も、(Ｅ)Casp1-/-マウスRPE細胞における細胞毒性も誘導しない。(Ｆ)Alu RNA及びLPS＋ATPは、GFP-PYCARDでトランスフェクトしたヒトRPE細胞におけるPYCARDクラスターの形成を誘導する。(Ｇ及びＨ)pAluは、Nlrp3-/-マウス(Ｇ)においてもPycard-/-マウス(Ｈ)においてもRPE変性を誘導しない。(Ｉ)Nlrp3-/-マウスRPE細胞及びPycard-/-マウスRPE細胞は、pAlu誘導性細胞生存能喪失に対して保護される。(Ｊ)NLRP3又はPYCARDを標的するsiRNAは、コントロールsiRNAと比較して、pAlu誘導細胞毒性からヒトRPE細胞を救った。ｎ=３〜４、* ｐ<0.05(スチューデントｔ検定による)(Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｊ)。３つの実験の代表的画像。ビンキュリンに対して規格化したデンシトメトリー値を括弧内に示す(Ａ、Ｂ)。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)平面マウント、下列。変性は青色矢頭で輪郭を示す。ｎ=８〜12。スケールバー、20μm(Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ)。代表的画像を示す。図11も参照。
【図４】Alu RNAはミトコンドリアROS産生及びNLRP3プライミングを誘導する。(Ａ)pAluはWTマウスRPE細胞及びMyd88-/-マウスRPE細胞においてNLRP3 mRNA及びIL18 mRNAを誘導する。(Ｂ)pAluは、蛍光プローブH2DCFDA(A.U、任意単位)でモニターされるように、ヒトRPE細胞において反応性酸素種(ROS)の生成を誘導する。(Ｃ)DPIはヒトRPE細胞においてpAlu誘導NLRP3 mRNA及びIL18 mRNAをブロックする。(Ｄ)DPIはWTマウスをpAlu誘導RPE変性から保護する。(Ｅ)pAluは、MitoSOX Redの蛍光(緑擬似カラー)により検出されるように、ヒトRPE細胞におけるミトコンドリア反応性酸素種の生成(MitoTracker Deep Red(赤色)で標識される呼吸性ミトコンドリアと共局在する)を誘導する。(Ｆ)PMAは、ヒトRPE細胞において蛍光Fc OXYBURST Greenアッセイ(A.U、任意単位)により評価されるように、ファゴソームROS生成を誘導するが、pAluは誘導しない。(Ｇ)MitoTempo及びMitoQは、WTマウスにおいてAlu RNA誘導RPE変性を予防するが、ビヒクルもdTPPコントロールも予防しない。(Ｈ)NADPHオキシダーゼ阻害剤gp91ds-tat又はスクランブルペプチドは、WTマウスにおけるAlu RNA誘導RPE変性を予防しない。(Ｉ)Alu RNAは、Cybb(NADPHオキシダーゼのgp91phoxサブユニットをコードする)が欠損したRPE変性マウスを誘導する。(Ｊ及びＫ)VDAC1及びVDAC2をそれぞれ標的するsiRNAは、ヒトRPE細胞において、pAlu誘導mROS生成(Ｊ)並びにNLRP3 mRNA及びIL18 mRNAのアップレギュレーション(Ｋ)を予防するが、VDAC3もスクランブルコントロールも予防しない。mROSはMitoSox Red色素で可視化し、細胞核はHoechst染色で可視化した。ｎ=３〜４。* ｐ<0.05(スチューデントｔ検定による)(Ａ〜Ｃ、Ｋ)。NS、スチューデントｔ検定により有意差なし(Ｆ)。代表的画像を示す。ｎ=８〜12。ZO-1染色(赤色)平面マウント。スケールバー、20μm(Ｄ、Ｅ、Ｇ〜Ｉ)。ｎ=３〜４。スケールバー、100μm(Ｊ)。図11も参照。
【図５】RPE変性は、パイロプトーシス(pyroptosis)を介して起きない。(Ａ及びＢ)グリシンは、LPS＋ATPにより誘導されるヒトRPE細胞死を阻害する(Ａ)が、pAluにより誘導されるものは阻害しない(Ｂ)。(Ｃ)組換えIL-18はCasp1-/-マウスにおいてRPE変性を誘導する。ｎ=３〜４(Ａ、Ｂ)。* ｐ<0.05(スチューデントｔ検定による)。代表的画像を示す。ｎ=８〜12。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)平面マウント、下列。変性は青色矢頭で輪郭を示す。スケールバー、20μm(Ｃ)。
【図６】DICER1喪失はインフラマソームを介する細胞死を誘導する。(Ａ)ヒトRPE細胞においてDICER1過剰発現により阻害されたAlu RNA誘導カスパーゼ-１切断(p20)のウェスタンブロット。(Ｂ及びＣ)DICER1過剰発現は、ヒトRPE細胞におけるAlu RNA誘導カスパーゼ-１活性化を低下させる(Caspalux(登録商標)1蛍光基質の切断(Ｂ左パネル、緑色)により測定)。蛍光定量を右パネルに示す。(Ｃ)BEST1-Creマウス又はDicer1f/fマウスと比較したBEST1-Cre;Dicer1f/fマウスのRPE細胞溶解物における増大したカスパーゼ-１活性化(p20サブユニット)のウェスタンブロット；(Ｄ)AAV1-BEST1-Creで処置したDicer1f/fマウスのRPE細胞溶解物における増大したカスパーゼ-１活性化(p20サブユニット)及びIL-18成熟のウェスタンブロット。(Ｅ及びＦ)Dicer1f/fマウスにおいてAAV1-BEST1-Creにより誘導されたRPE変性は、カスパーゼ-１(Ｅ)又はMyD88(Ｆ)にいずれのペプチド阻害剤によっても回復される。(Ｇ)MyD88阻害剤は、DICER1アンチセンス(AS)処置により誘導されるヒトRPE細胞生存能の喪失を回復させる。(Ｈ)ヒトRPE細胞のDICER1アンチセンス(AS)処置は、DICER1を低下させ、IRAK1及びIRAK4のリン酸化を増大させる。(Ｉ)MyD88阻害剤は、Creリコンビナーゼ(Ad-Cre)をコードするアデノウイルスベクターで処置したDicer1f/fマウスRPE細胞において細胞生存能の喪失を回復させる。(Ｊ)Ad-Creは、Dicer1f/fマウスRPE細胞において、Ad-Nullと比較して、グローバルなmiRNA発現欠損を誘導した。MyD88阻害剤処置Dicer1涸渇細胞とコントロールペプチド処置Dicer1涸渇細胞との間でmiRNA量に有意差なし。ｎ=３(Ａ、Ｂ、Ｆ〜Ｈ)。ビンキュリンに対して規格化したデンシトメトリー値を括弧内に示す(Ａ、Ｃ)。変性は青色矢頭で輪郭を示す。ｎ=８(Ｅ、Ｆ)。* ｐ<0.05(スチューデントｔ検定による)(Ｇ、Ｉ)。３つの実験の代表的画像(Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｈ)。図12もまた参照。
【図７】ヒトGAにおけるNLRP3インフラマソーム及びMyD88の活性化。(Ａ)NLRP3量及びIL18量は、正常な年齢適合コントロール(ｎ=12)と比較して、黄斑性GA RPE(ｎ=13)において有意に上昇した。* ｐ<0.05(マンホイットニーＵ検定による)。IL1B量に群間で有意差なし(ｐ=0.32(マンホイットニーＵ検定による))。(Ｂ〜Ｄ)黄斑性GA RPEにおける、NLRP3(Ｂ)、PYCARD(Ｃ)及びカスパーゼ-１(Ｄ)の、年齢適合正常コントロールと比較して増大したイムノ局在化。スケールバー、20μm。(Ｅ)個々のヒトドナー眼からの黄斑性RPE溶解物のウェスタンブロットは、NLRP3、PYCARD及びリン酸化IRAK1/4の量(ハウスキーピングタンパク質ビンキュリンレベルに対して規格化)が、地図状萎縮(GA)において、年齢適合正常コントロールと比較して低下していることを示す。データは平均±SEMとして表す(Ａ)。代表的画像を示す。ｎ=６(Ｂ〜Ｅ)。図13も参照。
【図８】Alu RNAは幾つかのRNAセンサーを活性化しない。(Ａ及びＢ)p7SL(7SL発現ベクター)(Ａ)及びインビトロ合成7SL RNA(Ｂ)は野生型マウスにおいてRPE変性を誘導しない。(Ｃ)野生型マウスにおいてpAluの網膜下注射により誘導されたRPE変性は、TLR4アンタゴニストにより遮断されない。（Ｄ〜Ｅ)Mda5欠損マウス(Ｄ)又はPrkr欠損マウス(Ｅ)は、pAlu誘導RPE変性に感受性である。(Ｆ)脱リン酸化(Dep)Alu RNAは、Alu RNAと同様に、野生型マウスにおいてRPE変性を誘導する。(Ｇ)Mavs欠損マウスは、pAlu誘導RPE変性に感受性である。pNullは、いずれの系統のマウスにおいてもRPE変性を誘導しない。変性は青色矢頭で輪郭を示す。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)RPE平面マウント、下列。ｎ=８(Ａ〜Ｇ)。(Ｈ)Alu RNAにより活性化されない先天免疫経路の概略図。
【図９】Alu RNAは、TRIFでもIFNγでもなくMyD88を介してRPE変性を誘導する。(Ａ)pAluの網膜下投与はTicam1-/-マウスにおいてRPE変性を誘導する。(Ｂ)Alu RNAはMyd88-/-マウスにおいてRPE変性を誘導しない。(Ｃ)異なるAlu発現プラスミド(pAlu(2))の網膜下投与もまた、野生型マウスにおいてRPE変性を誘導するが、Myd88-/-マウスにおいては誘導しない。(Ｄ)Alu RNAは、Myd88+/-ヘテロ接合型(het)マウスにおいてRPE変性を誘導しない。(Ｅ)MyD88阻害性ペプチドは、(ビンキュリン発現に対して規格化した)IRAK1/4のAlu RNA誘導リン酸化を回復させる。(Ｆ)AAV1-BEST1-Creの網膜下注射は、Myd88f/fマウスをAlu RNA誘導RPE変性から保護するが、AAV1-BEST1-GFPの網膜下注射は保護しない。(Ｇ)pAlu及びAlu RNAは、Myd88-/-骨髄を移植された野生型マウス(Myd88-/-→野生型)においてRPE変性を誘導するが、野生型骨髄を移植されたMyd88-/-マウス(野生型→Myd88-/-)においては誘導しなかった。(Ｈ〜Ｋ)pAluの網膜下投与は、Ifng-/-マウス(Ｈ)、Ifngr1-/-マウス(Ｉ)及びIl1r1-/-マウス(Ｊ)においてRPE変性を誘導するが、Il18r1-/-マウス(Ｋ)においては誘導しない。pNull投与は、いずれの系統のマウスにおいてもRPE変性を誘導しない。変性は青色矢頭で輪郭を示す。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)RPE平面マウント、下列。ｎ=８(Ａ〜Ｄ、Ｆ〜Ｋ)。
【図１０】Alu RNAは、NLRP3インフラマソーム活性化を介してRPE変性を誘導する。(Ａ)Alu RNA又はLPS＋ATPは、Caspalux(登録商標)1(蛍光連結ペプチド基質)の、擬処置と比較して増大した切断により評価されるように(緑色、左パネル)、ヒトRPE細胞においてカスパーゼ-１の活性化を誘導する。蛍光の定量を右パネルに示す。(Ｂ)ビンキュリン発現に対して規格化した、THP-1細胞及びHeLa細胞におけるAlu RNA誘導カスパーゼ-１活性化(p20サブユニット)のウェスタンブロット。(Ｃ)カスパーゼ-１阻害剤ペプチドは、ヒトRPE細胞においてAlu RNA誘導基質切断をブロックする。ｎ=３。(Ｄ)Alu RNAの網膜下注射は、Casp1-/-マウスにおいてRPE変性を誘導しない。(Ｅ)Alu RNA又はLPS＋ATPは、ヒトRPE細胞の細胞質中で視認可能なGFP-PYCARDの高輝度蛍光クラスターの出現を誘導する。囲み領域を高倍率で示す。３つの実験の代表的画像。(Ｆ及びＧ)Alu RNAの網膜下注射は、Nlrp3-/-マウス(Ｆ)でもPycard-/-マウス(Ｇ)でもRPE変性を誘導しない。(Ｈ)NLRP3発現ベクターでトランスフェクトしたHEK293細胞中のNLRP3量及びヒトRPE細胞中のPYCARD量は、これら遺伝子を標的するsiRNAのトランスフェクションにより、コントロール(Ctrl)siRNAと比較して低下する。ｎ=３、* ｐ<0.05(Ctrl siRNAとの比較；スチューデントｔ検定による)。(Ｉ)ヒトRPE細胞におけるAlu RNA誘導カスパーゼ-１活性化(p20サブユニット)はMyD88阻害性ペプチドにより影響されない(ビンキュリン発現に対して規格化)。(Ｊ)MyD88阻害性ペプチドは、ヒトRPE細胞において、カスパーゼ-１のAlu RNA誘導切断活性を低下させない(上パネル)。蛍光定量(下パネル)。(Ｋ)網膜下pAlu投与を処置した野生型マウスのRPE細胞溶解物におけるカスパーゼ-１活性化(p20サブユニット)は、抗IL-18中和抗体の硝子体内投与により障害されない。(Ｌ)IRAK1/4のAlu RNA誘導リン酸化は、ヒトRPE細胞においてカスパーゼ-１阻害性ペプチドにより低下する(ビンキュリン発現に対して規格化)。ビヒクルコントロール注射もまたRPEを障害しない。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)RPE平面マウント、下列。ｎ=８(Ｄ、Ｆ、Ｇ)。３つの実験の代表的画像(Ａ、Ｂ、Ｉ、Ｊ〜Ｌ)。
【図１１】NLRP3はAlu RNAと物理的に相互作用せず、VDACはsiRNAによりノックダウンする。(Ａ)pAlu及びpNLRP3-FLAGでトランスフェクトしたヒトRPE細胞におけるRNA結合性タンパク質免疫沈降(RIP)アッセイ。タンパク質-RNA複合体のNLRP3又はFLAGに対する抗体での免疫沈降は、NLRP3とAlu RNAと相互作用を明らかにしなかった。等量の細胞溶解物(IPに供していない)から単離したRNAをAlu PCR用のインプットとして使用した。免疫沈降物中のAlu RNAの相対量(Alu特異的プライマーを用いるリアルタイムRT-PCRにより評価)を、コントロールIgG免疫沈降で得られたレベルに対して規格化した。Ｎ=３。(Ｂ)ヒトRPE細胞におけるVDAC1、VDAC2及びVDAC3 mRNAの量は、これら遺伝子を標的するsiRNAのトランスフェクションにより、コントロール(Lucを標的する)siRNAと比較して低下する。Ｎ=３。* ｐ<0.05(コントロールsiRNAとの比較；スチューデントｔ検定による)。
【図１２】DICER1は、Alu RNAによるカスパーゼ-１活性化のネガティブレギュレーターである。(Ａ)ヒトRPE細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド(AS)によるDICER1のノックダウンは、Caspalux(基質切断の蛍光(重ね合わせで緑色)レポーター)によりモニターするとき、コントロールAS処置と比較して、カスパーゼ-１の切断活性を増大させる。(Ｂ)AS処理によるAlu RNAの阻害は、DICER1 ASで処理したヒトRPE細胞においてCaspalux蛍光を低下させる。Caspalux蛍光の平均値を括弧内に示す。３つの実験の代表的画像。
【図１３】RPE変性及び地図状萎縮に至るDICER1欠損誘導Alu RNAによるNLRP3インフラマソーム活性化の提案モデルの概略図。Alu RNAは、反応性酸素種(ROS)の生成を介してNLRP3及びIL18 mRNAのプライミングを誘導する。NLRP3インフラマソームの活性化は、活性化カスパーゼ-１によるプロIL-18の切断を誘引してIL-18を成熟させる。、IL-18は、MyD88を介して、IRAK1及びIRAK4をリン酸化するようシグナルを送る(リン酸化はRPE細胞死を導く)。
【図１４】カスパーゼ-８阻害剤の硝子体内投与は、野生型マウスをpAlu誘導RPE変性から保護する。代表的画像を示す。ｎ=８〜12。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)平面マウント、下列。
【図１５】カスパーゼ-８阻害剤はヒトRPE細胞をAlu誘導細胞毒性から保護する。カスパーゼ-８阻害性ペプチドZ-IETD-FMK(100μM)はヒトRPE細胞をAlu RNA誘導細胞毒性から保護するが、コントロールペプチドZ-FA-FMK(100μM)は保護しない。
【図１６】カスパーゼ-８阻害剤はヒトRPE細胞をpAlu誘導細胞毒性から保護する。カスパーゼ-８阻害性ペプチドZ-IETD-FMK(100μM)はヒトRPE細胞をpAlu誘導細胞毒性から保護するが、コントロールペプチドZ-FA-FMK(100μM)は保護しない。
【図１７】IL-18はカスパーゼ-８活性化を誘導した。野生型マウスにおけるIL-18の網膜下注射は、蛍光定量プレートアッセイによりモニターするとき、カスパーゼ-８の活性化を誘導した。
【図１８】pAluはCD95-/-マウスにおいてRPE変性を誘導しない。代表的画像を示す。ｎ=８〜12。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)平面マウント、下列。
【図１９】Alu RNAはCD95-/-マウスにおいてRPE変性を誘導しない。代表的画像を示す。ｎ=８〜12。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)平面マウント、下列。
【図２０】組換えIL-18はCD95-/-マウスにおいてRPE変性を誘導しない。代表的画像を示す。ｎ=８〜12。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)平面マウント、下列。
【図２１】pAluはFaslgマウスにおいてRPE変性を誘導しない。代表的画像を示す。ｎ=８〜12。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)平面マウント、下列。
【図２２】Alu RNAはFaslgマウスにおいてRPE変性を誘導しない。代表的画像を示す。ｎ=８〜12。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)平面マウント、下列。
【図２３】組換えIL-18は、FaslgマウスにおいてRPE変性を誘導しない。代表的画像を示す。ｎ=８〜12。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)平面マウント、下列。
【図２４】Alu RNAはNfkb1-/-マウスにおいてRPE変性を誘導しない。代表的画像を示す。ｎ=８〜12。眼底写真、上列；ZO-1染色(赤色)平面マウント、下列。
【図２５】Alu RNA又はビヒクル(PBS)を野生型マウスの僚眼の網膜下腔中に注射した。３日後、DyeLight782-VAD-FMK3を両眼の硝子体液中に注射した。24時間後、RPE平面マウント標本を蛍光顕微鏡下で可視化し、生物活性カスパーゼ(緑色蛍光)の領域を可視化した。この領域はAlu RNA注射領域に対応する。
【図２６】Alu RNA又はビヒクル(PBS)を２匹の野生型マウスの僚眼の網膜下腔中に注射した(左パネル及び右パネル)。３日後、DyeLight782-VAD-FMK3を両眼の硝子体液中に注射した。ベースライン(０時間)からその後８時間まで、Topcon 50IXカメラのICGフィルターを通して眼底(網膜)の写真を撮影した。Alu RNAを注射した眼では、生物活性カスパーゼの生成に対応する白色蛍光領域がAlu RNA注射領域に観察された。ビヒクルを注射した眼では、そのような広範な領域は観察されなかった。
【図２７】組換えIL-18又はビヒクル(PBS)を野生型マウスの僚眼の網膜下腔中に注射した。２日後、DyeLight782-VAD-FMK3を両眼の硝子体液中に注射した。ベースライン(０時間)からその後24時間まで、Topcon 50IXカメラのICGフィルターを通して眼底(網膜)の写真を撮影した。IL-18を注射した眼では、生物活性カスパーゼの生成に対応する白色蛍光領域がIL-18注射領域に観察された。ビヒクルを注射した眼では、そのような広範な領域は観察されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
配列表の簡単な説明
配列番号１  IMG-2005-1ペプチド配列：DRQIKIWFQNRRMKWKKRDVLPGT。ここで、最後の７アミノ酸はMyD88ホモ二量体化の阻害に必要であり、先行するアミノ酸配列は、阻害性ペプチドの細胞進入を可能にするアンテナペディア細胞透過配列であり、その結果、これはMyD88をブロックすることができる。
配列番号２  コントロールペプチド配列：DRQIKIWFQNRRMKWKK
配列番号３  MyD88 siRNA #1センス：5'-GAGAAGCCUUUACAGGUdTdT-3'
配列番号４  MyD88 siRNA #1アンチセンス：5'-ACCUGUAAAGGCUUCUCdTdT-3'
配列番号５  MyD88 siRNA #2センス：5'-CAGAGCAAGGAAUGUGAdTdT-3'
【００１３】
配列番号６  MyD88 siRNA #2アンチセンス：5'-UCACAUUCCUUGCUCUGdTdT-3'
配列番号７：NLRP3 siRNA - 5'-GUUUGACUAUCUGUUCUdTdT-3'
配列番号８：NLRP3 siRNA - 5'-GGAUCAAACUACUCUGUGA-3'
配列番号９：NLRP3 siRNA - 5'-UGCAAGAUCUCUCAGCAAA-3'
配列番号10：NLRP3 siRNA - 5'-GAAGUGGGGUUCAGAUAAU-3'
【００１４】
配列番号11：NLRP3 siRNA - 5'-GCAAGACCAAGACGUGUGA-3'
配列番号12：PYCARD siRNA - 5'-GAAGCUCUUCAGUUUCAdTdT-3'
配列番号13：PYCARD siRNA - 5'-GGCUGCUGGAUGCUCUGUACGGGAA-3'
配列番号14：PYCARD siRNA - 5'-UUCCCGUACAGAGCAUCCAGCAGCC-3'
配列番号15：ヒトピリンコーディング配列のsiRNA：GCTGGAGCAGGTGTACTACTTC
【００１５】
配列番号16：ヒトNLRP3コーディング配列のsiRNA：CAGGTTTGACTATCTGTTCT
配列番号17：ヒトカスパーゼ-１の3'UTRのsiRNA：GTGAAGAGATCCTTCTGTA
配列番号18：ヒトIL1B用オリゴヌクレオチドプライマー、フォワード 5'-TTAAAGCCCGCCTGACAGA-3'
配列番号19：ヒトIL1B用オリゴヌクレオチドプライマー、リバース 5'-GCGAATGACAGAGGGTTTCTTAG-3'
配列番号20：ヒトIL18用オリゴヌクレオチドプライマー、フォワード 5'-ATCACTTGCACTCCGGAGGTA-3'
【００１６】
配列番号21：ヒトIL18用オリゴヌクレオチドプライマー、リバース 5'-AGAGCGCAATGGTGCAATC-3'
配列番号22：ヒトNLRP3用オリゴヌクレオチドプライマー、フォワード 5'-GCACCTGTTGTGCAATCTGAA-3'
配列番号23：ヒトNLRP3用オリゴヌクレオチドプライマー、リバース 5'-TCCTGACAACATGCTGATGTGA-3'
配列番号24：ヒトPYCARD用オリゴヌクレオチドプライマー、フォワード 5'-GCCAGGCCTGCACTTTATAGA-3'
配列番号25：ヒトPYCARD用オリゴヌクレオチドプライマー、リバース 5'-GTTTGTGACCCTCGCGATAAG-3'
【００１７】
配列番号26：ヒトVDAC1用オリゴヌクレオチドプライマー、フォワード 5'-ACTGCAAAATCCCGAGTGAC-3'
配列番号27：ヒトVDAC1用オリゴヌクレオチドプライマー、リバース 5'-CTGTCCAGGCAAGATTGACA-3'
配列番号28：ヒトVDAC2用オリゴヌクレオチドプライマー、フォワード 5'-CAGTGCCAAATCAAAGCTGA-3'
配列番号29：ヒトVDAC2用オリゴヌクレオチドプライマー、リバース 5'-CCTGATGTCCAAGCAAGGTT-3')
配列番号30：ヒトVDAC3用オリゴヌクレオチドプライマー、フォワード 5'-TTGACACAGCCAAATCCAAA-3'
【００１８】
配列番号31：ヒトVDAC3用オリゴヌクレオチドプライマー、リバース 5'-GCCAAAACGGGTGTTGTTAC-3'
配列番号32：ヒト18S rRNA用オリゴヌクレオチドプライマー、フォワード 5'-CGCAGCTAGGAATAATGGAATAGG-3'
配列番号33：ヒト18S rRNA用オリゴヌクレオチドプライマー、リバース 5'-GCCTCAGTTCCGAAAACCAA-3'
配列番号34：マウスMyd88用オリゴヌクレオチドプライマー、フォワード 5'-CACCTGTGTCTGGTCCATTG-3'
配列番号35：マウスMyd88用オリゴヌクレオチドプライマー、リバース 5'-AGGCTGAGTGCAAACTTGGT-3'
【００１９】
配列番号36：マウスNlrp3用オリゴヌクレオチドプライマー、フォワード 5'-ATGCTGCTTCGACATCTCCT-3'
配列番号37：マウスNlrp3用オリゴヌクレオチドプライマー、リバース 5'-AACCAATGCGAGATCCTGAC-3'
配列番号38：マウスIl18用オリゴヌクレオチドプライマー、フォワード 5'-GACAGCCTGTGTTCGAGGAT-3'
配列番号39：マウスIl18用オリゴヌクレオチドプライマー、リバース 5'-TGGATCCATTTCCTCAAAGG-3'
配列番号40：マウス18S rRNA用オリゴヌクレオチドプライマー、フォワード 5'-TTCGTATTGCGCCGCTAGA-3'
【００２０】
配列番号41：マウス18S rRNA用オリゴヌクレオチドプライマー、リバース 5'-CTTTCGCTCTGGTCCGTCTT-3'
配列番号42：マウスmiR-184-5'-TGGACGGAGAACTGATAAGGGT-3'；
配列番号43：マウスmiR-221/222-5'-AGCTACATCTGGCTACTGGGT-3'；
配列番号44：マウスmiR-320a-5'-AAAAGCTGGGTTGAGAGGGCGA-3'、及び
配列番号45：マウスマウスmiR-484-5'-TCAGGCTCAGTCCCCTCCCGAT-3'
【００２１】
配列番号46：U6 snRNA-5'-AAATTCGTGAAGCGTTCC-3'
配列番号47：VDAC1 siRNAセンス-5'-CGGAAUAGCAGCCAAGUdTdT-3'
配列番号48：VDAC2 siRNAセンス-5'-CCCUGGAGUUGGAGGCUdTdT-3'
配列番号49：VDAC3 siRNAセンス-5'-GCUUUAAUCGAUGGGAAdTdT-3'
配列番号50：DICER1アンチセンスオリゴヌクレオチド(AS)-5'-GCUGACCTTTTTGCTUCUCA-3'
【００２２】
配列番号51：DICER1 AS用コントロール-5'-TTGGTACGCATACGTGTTGACTGTGA-3'
配列番号52：Alu AS-5'-CCCGGGTTCACGCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCACGAGTAGCTGGGACTACAGGCGCCCGACACCACTCCCGGCTAATTTTTTGTATTTTT-3'
配列番号53：Alu AS用コントロール-5'-GCATGGCCAGTCCATTGATCTTGCACGCTTGCCTAGTACGCTCCTCAACCTATCCTCCTAGCCCGTTACTTGGTGCCACCGGCG-3'
配列番号54：MyD88ホモ二量体化阻害用オリゴペプチド：RDVLPGT
配列番号55：MyD88ホモ二量体化阻害用オリゴペプチド：RDVVPGG
【００２３】
配列番号56  MyD88 siRNA：UUAUUUCCUAAWGGGUCdTdT
配列番号57  VDAC1 siRNAセンス(5'-CGGAAUAGCAGCCAAGUdTdT-3')
配列番号58  VDAC2 siRNAセンス(5'-CCCUGGAGUUGGAGGCUdTdT-3')
配列番号59  VDAC3 siRNAセンス(5'-GCUUUAAUCGAUGGGAAdTdT-3')
【００２４】
例示的実施形態の説明
本願開示の主題は、MyD88阻害剤を同定する方法、MyD88を阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。本願開示の主題は、インフラマソーム阻害剤を同定する方法、インフラマソームを阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。本願開示の主題は、インフラマソームの構成要素の阻害剤を同定する方法、インフラマソームの構成要素を阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。インフラマソームの構成要素としては、例えば、NLRP3、PYCARD及びカスパーゼ-１が挙げられる。本願開示の主題は、IL-18阻害剤を同定する方法、IL-18を阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。本願開示の主題は、VDAC1又はVDAC2阻害剤を同定する方法、VDAC1又はVDAC2を阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。本願開示の主題は、カスパーゼ-８阻害剤を同定する方法、カスパーゼ-８を阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。本願開示の主題は、NFkB阻害剤を同定する方法、NFkBを阻害する方法及び組成物、並びにそれらの使用を包含する。対象者の眼において活性化カスパーゼ-１を画像化する方法及び組成物もまた提供する。
【００２５】
本願開示の主題は、細胞のインフラマソーム、MyD88及びIL-18の１以上を阻害することを含む方法を包含する。幾つかの実施形態では、本願開示の主題は、細胞のMyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、NFκB、カスパーゼ-８、カスパーゼ-１、NLRP-3、PYCARD及びインフラマソーム(インフラマソームの１つの構成要素(例えば、カスパーゼ１、NLRP-3、PYCARD)を含む)の１以上を阻害することを含む方法を包含する。
【００２６】
本方法の幾つかの実施形態では、細胞は、RPE細胞、網膜光受容器細胞又は脈絡叢細胞から選択される。幾つかの実施形態では、細胞はRPE細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は対象者の細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、興味対象の病状を有しているか、有していると疑われるか、又は有するリスクにある対象者の細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、加齢性黄斑変性を有しているか、有していると疑われるか、又は有するリスクにある対象者の細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、地図状萎縮を有しているか、有していると疑われるか、又は有するリスクにある対象者の細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、地図状萎縮を有しているか、有していると疑われるか、又は有するリスクにある対象者の細胞であり、細胞はRPE細胞である。幾つかの実施形態では、加齢性黄斑変性を有する対象者は、本明細書で開示した方法及び組成物を用いて治療することができる。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「対象者」とは、治療法の標的をいう。本明細書に開示の方法の対象者は、脊椎動物、例えば、哺乳動物、魚、鳥、爬虫類又は両生動物であり得る。このように、本明細書に開示の方法の対象者は、ヒトでも、非ヒトでもあり得る。よって、獣医学的治療上の使用が本明細書に開示した主題に従って提供される。
【００２８】
幾つかの実施形態では、細胞のインフラマソーム、MyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、NLRP3、PYCARD、カスパーゼ-１、カスパーゼ-８、及びNFκBの１以上の阻害は、細胞又は対象者に阻害剤を投与することを含む(ここで、細胞は対象者の細胞である)。この阻害剤は、例えば、眼内注射(例えば、局所化眼内療法)；硝子体内注射；網膜下注射；胸膜上注射；テノン嚢下注射；球後注射；球周囲注射；経強膜投与；局所投与、例えば、局所的点眼適用；脈絡膜上投与；強膜に縫い付けられ若しくは付着され若しくは配置されたか又は硝子体液中に注入されたか、前眼房中に注入されたか、又は水晶体包若しくは水晶体嚢に埋め込まれた持続放出送達デバイスからの放出；経口投与；或いは静脈内投与により投与することができる。
【００２９】
本明細書で使用する場合、用語「阻害する」又は「阻害(すること)」とは、ポリペプチド(例えばMyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、カスパーゼ-８、NFκB)又はインフラマソーム(例えば、NLRP3、PYCARD、カスパーゼ-１)のポリペプチドの生物学的活性を抑制し、低下させ、減少させ、又は実質的に消去することをいう。本明細書で使用する場合、阻害されるべきポリペプチドに関する「細胞の」とは、細胞の内側(細胞膜の内側)に存在するポリペプチド、細胞上(細胞膜中、細胞膜上に提示、その他細胞に接して)に存在するポリペプチド、又は細胞外に存在するポリペプチド(ただし、当業者が該ポリペプチドを細胞と関係付けて認識するよう細胞外環境に存在する場合に限る)をいう。例えば、細胞のVDAC1、VDAC2、カスパーゼ-８、NFκB又はインフラマソーム(例えば、NLRP3、PYCARD、カスパーゼ-１)のポリペプチドは、細胞内に存在し得る。別の例として、MyD88は細胞内又は細胞上に存在し得る。更に別の例として、IL-18は、分泌されるので、細胞外に存在し得る(当業者はIL-18を該細胞と関係付けて認識する)。
【００３０】
本出願の検討に際して当業者に理解されるように、細胞のインフラマソーム、MyD88、IL-18、VDAC1、VDAC2、カスパーゼ-１、カスパーゼ-８及びNFκBの阻害は、幾つかの様式で達成することができる。幾つかの実施形態では、阻害は、ポリペプチドの転写又は翻訳に影響することにより、ポリペプチドを分解することにより、ポリペプチドを除去することにより、その他ポリペプチドの生物学的活性に影響を与えることにより達成できる。阻害は阻害剤を投与することを含んでなる。阻害剤は、ポリペプチドの生物学的活性の阻害に影響する化合物である。このような化合物は、例えば、ポリペプチド(オリゴヌクレオチドを含み、興味対象のポリペプチドに結合して阻害に影響するポリペプチドを含む)、小分子(小さな化学物質を含む)、RNA干渉のための化合物(siRNA、miRNA、shRNAを含む)、抗体(例えば、興味対象のポリペプチドに対する中和抗体、興味対象のポリペプチドのレセプターへの結合を遮断する抗体)、アプタマー、優勢ネガティブプラスミド若しくはベクター、又はウイルスがコードするインフラマソームであり得る。
【００３１】
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」(これらは本明細書中で互換可能に使用される)とは、サイズにかかわらず、20種のタンパク質アミノ酸、又はアミノ酸アナログのポリマーをいう。用語「ポリペプチドフラグメント」又は「フラグメント」とは、参照ポリペプチドに関して使用する場合、参照ポリペプチド自体と比較してアミノ酸残基が欠失しているが、残るアミノ酸配列は、通常、参照ポリペプチド中の対応する位置と同一であるポリペプチドをいう。このような欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端若しくはカルボキシ末端で、又は参照ポリペプチドの内部位置から、又はその組合せで起こり得る。フラグメントはまた、当該フラグメントが本明細書で記載するような参照ポリペプチドの活性の幾らか又は全てを保持する場合、「機能的フラグメント」であり得る。
【００３２】
用語「改変アミノ酸」、「改変ポリペプチド」及び「変異型」とは、参照ポリペプチドと１以上のアミノ酸が異なる、例えば１以上のアミノ酸置換で異なるアミノ酸配列をいう。また、参照ポリペプチドの変異型は、参照ポリペプチドのフラグメントの変異型、例えば、参照ポリペプチドに対して１以上のアミノ酸置換がなされているフラグメントをいう。変異型はまた、本明細書で記載するような参照ポリペプチドの活性の幾らか又は全てを保持する「機能的変異型」であり得る。用語 機能的変異型には、参照ポリペプチドの機能的フラグメントの機能的変異型が含まれる。
【００３３】
幾つかの実施形態では、本願開示の主題の方法及び組成物は、興味対象の病状を有しているか、有していると疑われるか、又は有するリスクにある対象者において使用することができる。幾つかの実施形態では、本願開示の主題の方法及び組成物は、興味対象の病状を治療するために使用することができる。興味対象の病状の例としては、下記のものが挙げられるが、これらに限定されない：地図状萎縮(Kaneko, Dridiら，2011)；黄斑変性(Kaneko, Dridiら，2011)；角膜炎(Guo, Gaoら，2011)；痛風(Chen, Shiら，2006)；尋常性ざ瘡(Terhorst, Kalaliら，2010)；クローン病(Reuter and Pizarro 2004；Abreu, Fukataら，2005；Medvedev, Sabroeら，2006)；潰瘍性結腸炎(Reuter and Pizarro 2004；Abreu, Fukataら，2005；Medvedev, Sabroeら，2006)；過敏性腸疾患/過敏性腸症候群(McKernan, Nolanら，2009)；Ｉ型糖尿病(Devaraj, Tobiasら，2011；von Herrath, Filippiら，2011)；２型糖尿病(Hutton, Soukhatchevaら，2010；Nogueira-Machado, Volpeら，2011)；インスリン抵抗性(Ghanim, Mohantyら，2008；Tilich and Arora 2011)；肥満(Fresno, Alvarezら，2011)；溶血性尿毒症症候群(Batsford, Duermuellerら，2011)；ポリオーマウイルス感染(Batsford, Duermuellerら，2011)；免疫複合体腎疾患(Anders, Banasら，2004；Anders and Schlondorff 2007)；急性尿細管傷害(Anders, Banasら，2004；Anders and Schlondorff 2007)；ループス腎炎(Anders, Banasら，2004；Anders and Schlondorff 2007)；家族性寒冷自己炎症症候群(Familial cold autoinflammatory syndrome)(Mariathasan, Weissら，2006；Meng, Zhangら，2009)；マックル‐ウェルズ症候群及び新生児発症多系炎症性疾患(neonatal onset multisystem inflammatory disease)(Mariathasan, Weissら，2006；Meng, Zhangら，2009)；慢性乳児神経性皮膚・関節自己炎症性疾患(Chronic infantile neurologic cutaneous and articular autoinflammatory diseases)、腎虚血-再灌流傷害(El-Achkar and Dagher 2006；Robson 2009)；糸球体腎炎(El-Achkar and Dagher 2006；Robson 2009)；クリオグロブリン血症(Banas, Banasら，2008)；全身性血管炎(Weyand, Ma-Krupaら，2005；Hurtado, Jeffsら，2008；Summers, Steinmetzら，2011)；IgAネフロパシー(Lim, Leeら，2011)；アテローム性動脈硬化症(Curtiss and Tobias 2009)；HIV/AIDS(Brichacek, Vanpouilleら，2010)；マラアリア(Franklin, Ishizakaら，2011)；蠕虫寄生虫(Babu, Blauveltら，2005；Venugopal, Nutmanら，2009)；敗血症及び敗血症性ショック(Knuefermann, Nemotoら，2002；Opal and Huber 2002；Cristofaro and Opal 2003；Chen, Koustovaら，2007)；アレルギー性喘息(Slater, Pauporeら，1998；Park, Goldら，2001)；枯草熱(Slater, Pauporeら，1998；Park, Goldら，2001)；慢性閉塞性肺疾患(Geraghty, Daboら，2011)；薬物誘導肺炎症(Liu, Yangら，2010)；接触皮膚炎(Martin, Duddaら，2008；Yokoi, Niizekiら，2009)；らい病(Krutzik, Tanら，2005；Terhorst, Kalaliら，2010)；Burkholderia cenocepacia感染(Ventura, Balloyら，2009)；RSウイルス感染(Aeffner, Traylorら，2011)；乾癬(Zuany-Amorim, Hastewellら，2002；Barrat and Coffman 2008；Li, Zhouら，2009)；全身性エリテマトーデス(Zuany-Amorim, Hastewellら，2002；Barrat and Coffman 2008；Li, Zhouら，2009)；強皮症(Zuany-Amorim, Hastewellら，2002；Barrat and Coffman 2008；Li, Zhouら，2009)；反応性関節炎(Zuany-Amorim, Hastewellら，2002；Barrat and Coffman 2008；Li, Zhouら，2009)；嚢胞性線維症、梅毒、シェーグレン症候群(Zuany-Amorim, Hastewellら，2002；Barrat and Coffman 2008；Li, Zhouら，2009)；慢性関節リウマチ(Zuany-Amorim, Hastewellら，2002；Barrat and Coffman 2008；Li, Zhouら，2009)；炎症性関節疾患(O'Neill 2008)；非アルコール性脂肪肝疾患(Tan, Fielら，2009)；心臓手術(術中/術後炎症)(Cremer, Martinら���1996；Taylor 1996；Dybdahl, Wahbaら，2002)；急性及び慢性臓器移植拒絶(Alegre, Leemansら，2008；Miller, Rossiniら，2008；Taylor, Ehrhardtら，2008；Krams, Wangら，2010；Wang, Schmadererら，2010；Shin and Harris 2011；Testro, Visvanathanら，2011)；急性及び慢性骨髄移植拒絶(Alegre, Leemansら，2008；Miller, Rossiniら，2008；Taylor, Ehrhardtら，2008；Krams, Wangら，2010；Wang, Schmadererら，2010；Shin and Harris 2011；Testro, Visvanathanら，2011)；アルツハイマー病；及び腫瘍血管新生(Frantz, Vincentら，2005；Schmid, Avraamidesら，2011)。
【００３４】
本明細書で使用する場合、用語 治療は、興味対象の病状の任意の治療(予防的処置及び治療的処置を含むが、これらに限定されない)に関する。よって、用語 処置は、下記を含むがこれらに限定されない：興味対象の病状を予防するか又は興味対象の病状の発症を予防すること；興味対象の病状の進行を抑制すること；興味対象の病状の発症を停止させ又は予防すること；興味対象の病状の重篤度を低減すること；興味対象の病状と関連する症状を緩解又は軽減させること；及び興味対象の病状、又は興味対象の病状と関連する症状の１以上の減退を引き起こすこと。
幾つかの実施形態では、本願開示の主題の方法及び組成物は、細胞をAlu-RNA誘導変性に対して保護するために有用である。よって、幾つかの実施形態では、方法は阻害剤を投与することを含み、細胞がAlu-RNA誘導変性に対して保護される。
【００３５】
インフラマソームの阻害
幾つかの実施形態では、本願開示の主題は、細胞のインフラマソームを阻害することを含んでなる、細胞を保護する方法を包含する。インフラマソームがNLRP3インフラマソーム、NLRP1インフラマソーム、NLRC4インフラマソーム、AIM2インフラマソーム及びIFI16インフラマソームから選択される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。幾つかの実施形態では、インフラマソームはNLRP3インフラマソームである。
【００３６】
幾つかの実施形態では、インフラマソームの阻害は、インフラマソームの１つの構成要素を阻害することを含む。幾つかの実施形態では、インフラマソーム構成要素は、PYCARDによりコードされるポリペプチドを含み得る。幾つかの実施形態では、インフラマソーム構成要素はカスパーゼを含み得る。幾つかの実施形態では、インフラマソーム構成要素はPYCARD、NLRP3及びカスパーゼ-１を含み得る。
【００３７】
幾つかの実施形態では、インフラマソームの阻害はインフラマソーム阻害剤を投与することを含んでなる。インフラマソーム阻害剤は、インフラマソームの１つの構成要素の阻害剤であり得る。幾つかの実施形態では、インフラマソーム
上記のように、幾つかの実施形態では、興味対象のポリペプチドの阻害は、オリゴヌクレオチド又は小RNA分子を投与することを含んでなる。小RNA分子は、例えばNLRP3及び/又はPYCARDを標的することができる。ヌクレオチドは、NLRP3及び/又はPYCARDを標的し、分解することができる。この点に関して、本願開示の主題は、NLRP3及び/又はPYCARDの発現を阻害する単離二本鎖RNA分子(ここで、該二本鎖RNAの第１の鎖は表Ａに示した配列を含んでなり、約14〜25ヌクレオチドを含む)を包含する。上記のように、幾つかの実施形態では、阻害は、優勢ネガティブベクターであるインフラマソーム阻害剤を投与することを含んでなる。幾つかの実施形態では、インフラマソームの阻害は、カスパーゼ-１の阻害剤を投与することを含んでなる。幾つかの実施形態では、カスパーゼ-１の阻害剤はペプチド阻害剤である。
【００３８】
本願開示の主題に従って使用することができるインフラマソーム阻害剤の例としては、表Ａに示すものが挙げられるがこれらに限定されない。このように、本願開示の主題の実施形態は、表Ａに示すインフラマソーム阻害剤を投与することを含み得る。
【００３９】
【表１−１】
2014528700.tif 000003
【表１−２】
2014528700.tif 000004
【表１−３】
2014528700.tif 000005
【００４０】
カスパーゼ-１阻害剤及びプローブに関する更なる情報は、表Ｂに見出し得る。本出願の出願日当時に表Ｂに記載のリンクで見出される情報は、この参照により本明細書中に組み込まれる。
【００４１】
【表２−１】
2014528700.tif 000006
【表２−２】
2014528700.tif 000007
【００４２】
本願開示の主題は、更に、インフラマソームの阻害に有用な組成物を包含する。この組成物は阻害剤を含む。上記のように、阻害剤は、例えば、ヌクレオチド、ポリペプチド、小(化学)分子などであり得る。幾つかの実施形態では、組成物は単離されたRNA分子を含み得る。
【００４３】
本願開示の主題は、インフラマソームの構成要素、例えば、NLRP3、カスパーゼ-１及び/又はPYCARDの発現を阻害する単離RNA分子を包含する。幾つかの実施形態では、二本鎖RNAの第１の鎖は、以下の配列から選択される配列を含んでなり、約14〜25ヌクレオチドを含む：5'-GUUUGACUAUCUGUUCUdTdT-3'(配列番号７)；5'-GGAUCAAACUACUCUGUGA-3'(配列番号８)；5'-UGCAAGAUCUCUCAGCAAA-3'(配列番号９)；5'-GAAGUGGGGUUCAGAUAAU-3'(配列番号10)；5'-GCAAGACCAAGACGUGUGA-3'(配列番号11)；5'-GAAGCUCUUCAGUUUCAdTdT-3'(配列番号12)；5'-GGCUGCUGGAUGCUCUGUACGGGAA-3'(配列番号13)；及び5'-UUCCCGUACAGAGCAUCCAGCAGCC-3'(配列番号14)。
【００４４】
本願開示の主題は、インフラマソーム構成要素の発現を阻害する単離RNA分子を包含する。幾つかの実施形態では、このRNA分子は、下記の配列から選択される配列を含んでなる：GCTGGAGCAGGTGTACTACTTC(配列番号15)、CAGGTTTGACTATCTGTTCT(配列番号16)及びGTGAAGAGATCCTTCTGTA(配列番号17)。
本願開示の主題は更に、候補阻害剤をスクリーニングしてインフラマソーム阻害剤を同定する方法を包含する。幾つかの実施形態では、インフラマソーム阻害剤を同定する方法は、培養細胞を使用する。ここで、インフラマソームの活性化剤(例えば、Alu RNA、リポ多糖＋ATP)に応答してのPYCARD凝集、カスパーゼ-１切断又はIL-1β若しくはIL-18の切断/分泌を測定する細胞ベースの系が提供される。
【００４５】
幾つかの実施形態では、インフラマソーム阻害剤のスクリーニング法は、蛍光-タグ化PYCARDをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞(例えば、RPE細胞)又は細胞株(例えば、THP-1又はRAWマクロファージ)をAlu RNA又はLPS＋ATPで刺激すること；蛍光顕微鏡を用いて蛍光PYCARDの「スペック」−アグレソーム巣への凝集をモニターすること；及びPYCARD「スペック」形成の阻害程度について候補分子を試験することを含む。
幾つかの実施形態では、インフラマソーム阻害剤のスクリーニング法は、細胞(例えば、RPE細胞)又は細胞株(例えば、THP-1又はRAWマクロファージ)をAlu RNA又はLPS＋ATPで刺激すること；CaspaLux(登録商標)1-E2D2アッセイ(OncoImmunin, Inc.)を用いてカスパーゼ-１活性をモニターすること；及びCaspaslux蛍光の阻害程度について候補分子を試験することを含む。
【００４６】
幾つかの実施形態では、インフラマソーム阻害剤のスクリーニング法は、細胞(例えば、RPE細胞)又は細胞株(例えば、THP-1又はRAWマクロファージ)をAlu RNA又はLPS＋ATPで刺激すること；抗カスパーゼ-１抗体を用いるウェスタンブロッティングにより切断されたカスパーゼ-１(p10又はp20アイソフォーム)の量を測定することによってカスパーゼ-１活性をモニターすること；及びカスパーゼ-１切断フラグメント(p10又はp20)の阻害程度について候補分子を試験することを含む。
幾つかの実施形態では、インフラマソーム阻害剤のスクリーニング法は、HEK-BlueTM IL-1β細胞(Invivogen)をAlu RNA又はLPS＋ARPで刺激して、QUANTI-BlueTM(Invivogen)を用い生物活性IL-1βの生成を検出すること；及び呈色シグナルの阻害程度について候補分子を試験することを含む。
【００４７】
MyD88の阻害
幾つかの実施形態では、本願開示の主題は、細胞のMyD88を阻害することを含んでなる細胞を保護する方法を包含する。幾つかの実施形態では、MyD88の阻害はMyD88阻害剤を投与することを含んでなる。
上記のように、幾つかの実施形態では、興味対象のポリペプチドの阻害は、オリゴヌクレオチド又は小RNA分子を投与することを含んでなる。この小RNA分子はMyD88を標的することができる。このヌクレオチドはMyD88を標的し分解することができる。この点に関して、本願開示の主題は、myD88の発現を阻害する単離二本鎖RNA分子(ここで、該二本鎖RNAの第１の鎖は表Ｃに示した配列を含んでなり、約14〜25ヌクレオチドを含む)を包含する。本願開示の主題に従って使用することができるMyD88阻害剤の例はとしては、表Ｃに示すものが挙げられるがこれらに限定されない。このように、本願開示の主題の実施形態は、表Ｃに示すMyD88阻害剤を投与することを含み得る。
【００４８】
【表３】
2014528700.tif 000008
【００４９】
上記のように、幾つかの実施形態では、MyD88の阻害は、MyD88に対する優勢ネガティブベクターであるMyD88阻害剤、例えば、MyD88の死ドメインを欠く短縮型ΔMyD88(アミノ酸152〜296)(Muzioら，IRAK(Pelle) Family Member IRAK-2 and MyD88 as Proximal Mediators of IL-1 Signaling. Science 1997；278:1612-1615)を含有する優勢ネガティブ阻害形態のMyD88(pMyD88-dn)を投与することを含んでなる。
【００５０】
上記のように、幾つかの実施形態では、MyD88の阻害は、小分子(例えば、(１)Bartfaiら「A low molecular weight mimic of the Toll/IL-1 receptor/resistance domain inhibits IL-1 receptor-mediated responses.」 PNAS 2003；100: 7971-7976において化合物4aと呼ばれるヒドロシナモイル-L-バリルピロリジン；又は(２)Carminati, P., Gallo, G., Ruggiero, V., Sassano, M., Mastroianni, D.「MyD88 homodimerization inhibitors」特許第WO2006067091号に記載され、Loiarroら「Inhibition of MyD88 dimerization and recruitment of IRAK1 and IRAK4 by a novel peptidomimetic compound.」 Journal of Leukocyte Biology. 2007;82:801-810において特徴付けられているようなST2825；又は(３)MyD88相互作用を遮断する4-[(E)-2-(1-ヘキシルピリジン-1-イウム-2-イル)エテニル]-N,N-ジメチルアニリン ヨーダイド(これは4-[(E)-2-(1-ヘキシルピリジン-6-イル)エテニル-N,N-ジメチル-アニリン ヨーダイドとしても知られ、PubChemにおいて化学構造CID 5716367としても知られる)、又は(４)Leeら「Application of β-Lactamase Enzyme Complementation to the High-Throughput Screening of Toll-Like Receptor Signaling Inhibitors.」 Molecular Pharmacology 2007；72:868-875において50-F12及び26-J10と呼ばれる化合物)であるか、又は天然物(Villaら「Selective MyD88-dependent pathway inhibition by the cyanobacterial natural product malyngamide F acetate.」 European Journal of Pharmacology 2010；629:140-146)に記載されているようなマリンガミドＦアセテート)であるか、又はSELEXその他のスクリーニング技術により生成された、MyD88に結合するか若しくはMyD88をブロックするDNA若しくはRNAアプタマーであるMyD88阻害剤を投与することを含んでなる。
【００５１】
本願開示の主題は更に、MyD88の阻害に有用な組成物を包含する。このような組成物は阻害剤を含む。上記のように、この阻害剤は、例えば、ヌクレオチド、ポリペプチド、小(化学)分子などであることができる。幾つかの実施形態では、組成物は単離されたRNA分子を含み得る。
本願開示の主題は、myD88の発現を阻害する単離RNA分子を包含する。幾つかの実施形態では、二本鎖RNAの第１の鎖は下記の配列から選択される配列を含んでなり、約14〜25ヌクレオチドを含む：5'-GAGAAGCCUUUACAGGUdTdT-3'(配列番号３)；5'-ACCUGUAAAGGCUUCUCdTdT-3'(配列番号４)；5'-CAGAGCAAGGAAUGUGAdTdT-3'(配列番号５)；及び5'-UCACAUUCCUUGCUCUGdTdT-3'(配列番号６)。
【００５２】
本願開示の主題は、myD88の発現を阻害する単離ポリペプチド分子を含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド分子は、以下：DRQIKIWFQNRRMKWKKRDVLPGT(配列番号１)から選択される配列を含んでなり、約29〜100アミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド分子は、以下：RDVLPGT(配列番号54)及びRDVVPGG(配列番号55)から選択される配列を含んでなる。
幾つかの実施形態では、MyD88阻害剤を同定する方法は、MyD88がアップレギュレートされている培養細胞を利用する。該培養細胞を用いて候補化合物をスクリーニングし、MyD88をモジュレートする効力を決定することができる。候補化合物としては、例えば、小分子、生物製剤及びそれらの組合せ(例えば、複数の化合物を含む組成物)が挙げられる。用語 小分子は、従来の薬学的化合物を含む。用語 生物製剤は、ポリペプチド及びヌクレオチドを含み、siRNA、抗体、アプタマー、及び優勢ネガティブプラスミド又はベクターを含む。
【００５３】
幾つかの実施形態では、スクリーニング法は、MyD88がアップレギュレートされている培養細胞を準備すること；及び候補化合物を該細胞と接触させることを含む。本方法は、MyD88の変化を同定することを更に含み得る。例えば、MyD88レベルの測定可能な変化は、候補化合物と関係する効力を示し得る。MyD88の変化がMyD88の測定可能な減少である幾つかの実施形態では、変化は、候補化合物がMyD88阻害剤であることを示す。このようなMyD88阻害剤は、本明細書で開示する治療的適用に有用性を有し得る。
【００５４】
幾つかの実施形態では、MyD88は、Alu RNA又はリポ多糖(LPS)を用いて、例えば細胞(マクロファージ又はRPE細胞)をAlu RNA又はLPSで刺激することによりアップレギュレートさせ得る。幾つかの実施形態では、MyD88は、CpGヌクレオチドを用いて、例えば細胞(マクロファージ又はRPE細胞)を非メチル化CpGジヌクレオチドを含有する合成オリゴヌクレオチド(例えば5'-tcg tcg ttt tgt cgt ttt gtc gtt-3'又は5'-ggG GGA CGA TCG TCg ggg gg-3')で刺激することによりアップレギュレートさせ得る。幾つかの実施形態では、MyD88は、インターロイキン-1β又はインターロイキン18を用いて、例えば細胞(マクロファージ又はRPE細胞)を組換え形態のインターロイキン-1β又はインターロイキン18で刺激することによりアップレギュレートさせ得る。
【００５５】
MyD88阻害剤を同定する方法の幾つかの実施形態では、MyD88の変化は、当業者に既知の方法を使用して、細胞生存能を測定するか、MyD88シグナル伝達により誘導されることが知られている遺伝子(例えば、Cox-2、Socs3、TNF-α)の発現を測定するか、又は当業者により認められている他の基準を用いるによりモニターすることができる。幾つかの実施形態では、培養細胞はRPE細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は網膜光受容器細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は脈絡叢細胞である。
【００５６】
幾つかの実施形態では、MyD88阻害剤を同定する方法は、MyD88がアップレギュレートされているか又はオリゴマー化を受けているか又はIRAK1若しくはIRAK4のリン酸化を誘導している培養細胞を準備すること；細胞を候補化合物と接触させること；及び候補化合物がMyD88レベルの変化又は二量体化若しくはオリゴマー化MyD88の量の変化又はリン酸化IRAK1若しくはリン酸化IRAK4の量の変化を生じるかどうかを決定することを含む。幾つかの実施形態では、MyD88は、下記によりアップレギュレートされる：Alu RNA、リポ多糖、CpGヌクレオチド、一本鎖RNA、インターロイキン-1β又はインターロイキン18。幾つかの実施形態では、MyD88は、細胞生存能を測定すること、又はMyD88シグナル伝達により誘導されることが知られている遺伝子の発現を測定することによりモニターする。幾つかの実施形態では、MyD88シグナル伝達により誘導されることが知られている遺伝子は、Cox-2、Socs3及びTNF-αから選択される。
【００５７】
MyD88阻害剤のスクリーニング法の幾つかの実施形態では、細胞又は細胞株は、MyD88の既知の活性化剤、例えば、Alu RNA又はLPSで刺激することができる。遺伝子(例えばCox2、Socs3又はTNF-α)のRNAレベルは、定量的リアルタイムRT-PCRを用いて測定することができる。候補分子は、これら遺伝子転写物の阻害の程度について試験され得る。
MyD88阻害剤のスクリーニング法の幾つかの実施形態では、細胞又は細胞株は、MyD88の既知の活性化剤(例えば、Alu RNA又はLPS)で刺激することができる。二量体化若しくはオリゴマー化MyD88の量は、非還元条件下で抗MyD88抗体を用いるウェスタンブロッティングにより測定することができる。候補分子は、MyD88の二量体化又はオリゴマー化の阻害の程度について試験され得る。
【００５８】
MyD88阻害剤のスクリーニング法の幾つかの実施形態では、YFP(黄色蛍光タンパク質)のフラグメントに付された融合MyD88タンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞又は細胞株を、MyD88の既知の活性化剤(例えば、Alu RNA又はLPS)で刺激し得る。蛍光シグナルは、二分子蛍光補償技法を用いて測定することができる。候補分子は蛍光シグナルの阻害の程度について試験され得る。
MyD88阻害剤のスクリーニング法の幾つかの実施形態では、細胞又は細胞株は、MyD88の既知の活性化剤(例えば、Alu RNA又はLPS)で刺激することができる。リン酸化形態のIRAK1又はIRAK4の量は、還元条件下で抗ホスホIRAK1抗体又は抗ホスホIRAK4抗体を用いるウェスタンブロッティングにより測定することができる。候補分子はIRAK1又はIRAK4のリン酸化の阻害程度について試験され得る。
【００５９】
IL-18の阻害
幾つかの実施形態では、本願開示の主題は、細胞のIL-18を阻害することを含んでなる、細胞を保護する方法を包含する。幾つかの実施形態では、IL-18の阻害はIL-18阻害剤を投与することを含んでなる。
上記のように、幾つかの実施形態では、興味対象のポリペプチドの阻害は、結合性タンパク質又は抗体を投与することを含んでなる。このような抗体は、IL-18に対する中和抗体又はIL-18レセプターへのIL-18結合をブロックする抗体を含み得る。幾つかの実施形態では、IL-18阻害剤は、IL-18結合性タンパク質(Novickら，1999)であり得る。
本願開示の主題に従って使用することができるIL-18阻害剤の例としては、表Ｄに示したものが挙げられるがこれらに限定されない。このように、本願開示の主題の実施形態は、表Ｄに示したIL-18阻害剤を投与することを含み得る。
【００６０】
【表４】
2014528700.tif 000009
【００６１】
本願開示の主題は更に、IL-18の阻害に有用な組成物を包含する。このような組成物は阻害剤を含む。上記のように、阻害剤は、例えば、ヌクレオチド、ポリペプチド、小(化学)分子などであり得る。幾つかの実施形態では、組成物は単離されたRNA分子を含み得る。幾つかの実施形態では、組成物は抗体又は結合性タンパク質を含み得る。
【００６２】
本願開示の主題は更に、候補阻害剤をスクリーニングして、IL-18阻害剤を同定する方法を包含する。幾つかの実施形態では、IL-18阻害剤を同定する方法は、組換えIL-18R1を表面プラズモン共鳴(SPR)に適切な固相状態表面に貼り付けること；貼り付けた組換えIL-18R1を蛍光-標識組換えIL-18に曝露すること；当該系をIL-18:IL-18R1結合に置き換わる推定のIL-18阻害剤に更に曝露すること；及び蛍光を測定して、阻害程度を決定することを含む。
幾つかの実施形態では、IL-18阻害剤を同定する方法は、細胞(例えば、RPE細胞)又は細胞株(例えば、THP-1又はRAWマクロファージ)を組換えIL-18で刺激すること；MyD88活性化を、例えば増加したMyD88二量体化を(ウェスタンブロッティングにより)測定するか又はIRAK1若しくはIRAK4の増大したリン酸化を測定することにより測定することを含む。
【００６３】
VDAC1及び/又はVDAC2の阻害
幾つかの実施形態では、本願開示の主題は、細胞のVDAC1及び/又はVDAC2を阻害することを含んでなる、細胞を保護する方法を包含する。幾つかの実施形態では、VDAC1及び/又はVDAC2の阻害は、VDAC1阻害剤及び/又はVDAC2阻害剤を投与することを含んでなる。
上記のように、幾つかの実施形態では、興味対象のポリペプチドの阻害は、オリゴヌクレオチド又は小RNA分子を投与することを含んでなる。小RNA分子はVDAC1及び/又はVDAC2を標的することができる。ヌクレオチドは、VDAC1及び/又はVDAC2を標的し、分解することができる。この点に関して、本願開示の主題は、VDAC1及び/又はVDAC2の発現を阻害する単離二本鎖RNA分子(ここで、該二本鎖RNAの第１の鎖は表Ｅに示す配列を含んでなり、約14〜25ヌクレオチドを含む)を包含する。本願開示の主題に従って使用することができるVDAC1及び/又はVDAC2阻害剤の例としては、表Ｅに示すものが挙げられるがこれらに限定されない。このように、本願開示の主題の実施形態は、表Ｅに示すVDAC1及び/又はVDAC2阻害剤を投与することを含み得る。
【００６４】
【表５】
2014528700.tif 000010
【００６５】
本願開示の主題は、更に、VDAC1及び/又はVDAC2の阻害に有用な組成物を包含する。このような組成物は阻害剤を含む。上記のように、阻害剤は、例えば、ヌクレオチド、ポリペプチド、小(化学)分子などであり得る。幾つかの実施形態では、組成物は単離されたRNA分子を含み得る。
本願開示の主題は、VDAC1及び/又はVDAC2の発現を阻害する単離RNA分子を包含する。幾つかの実施形態では、二本鎖RNAの第１の鎖は、以下から選択される配列を含んでなり、約14〜25ヌクレオチドを含む：5'-CGGAAUAGCAGCCAAGUdTdT-3'(配列番号47)及び5'-CCCUGGAGUUGGAGGCUdTdT-3'(配列番号48)。
本願開示の主題は更に、候補阻害剤をスクリーニングしてVDAC1及び/又はVDAC2の阻害剤を同定する方法を包含する。幾つかの実施形態では、細胞又は細胞株ベースの方法が使用される。
【００６６】
カスパーゼ-８の阻害
幾つかの実施形態では、本願開示の主題は、細胞のカスパーゼ-８を阻害することを含んでなる、細胞を保護する方法を包含する。幾つかの実施形態では、カスパーゼ-８の阻害は、カスパーゼ-８阻害剤を投与することを含んでなる。
本願開示の主題に従って使用することができるカスパーゼ-８阻害剤の例としては、表Ｆに示すものが挙げられるがこれらに限定されない。このように、本願開示の主題の実施形態は、表Ｆに示すカスパーゼ８阻害剤を投与することを含み得る。
【００６７】
【表６】
2014528700.tif 000011
【００６８】
本願開示の主題は、更に、カスパーゼ-８の阻害に有用な組成物を包含する。このような組成物は阻害剤を含む。上記のように、阻害剤は、例えば、ヌクレオチド、ポリペプチド、小(化学)分子などであり得る。幾つかの実施形態では、組成物は単離されたRNA分子を含み得る。
本願開示の主題は更に、候補阻害剤をスクリーニングしてカスパーゼ-８阻害剤を同定する方法を包含する。幾つかの実施形態では、細胞又は細胞株ベースの方法が使用される。
【００６９】
NFκBの阻害
幾つかの実施形態では、本願開示の主題は、細胞のNFκBを阻害することを含んでなる、細胞を保護する方法を包含する。幾つかの実施形態では、NFκBの阻害は、NFκB阻害剤を投与することを含んでなる。
本願開示の主題に従って使用することができるNFκB阻害剤の例としては、表Ｇに示すものが挙げられるがこれらに限定されない。このように、本願開示の主題の実施形態は、表Ｇに示すNFκB阻害剤を投与することを含み得る。
【００７０】
【表７】
2014528700.tif 000012
【００７１】
本願開示の主題は、更に、NFκBの阻害に有用な組成物を包含する。このような組成物は阻害剤を含む。上記のように、阻害剤は、例えば、ヌクレオチド、ポリペプチド、小(化学)分子などであり得る。幾つかの実施形態では、組成物は単離RNA分子を含み得る。
本願開示の主題は更に、候補阻害剤をスクリーニングしてNFκB阻害剤を同定する方法を包含する。幾つかの実施形態では、細胞又は細胞株ベースの方法が使用される。
【００７２】
対象者の眼におけるカスパーゼの画像化
幾つかの実施形態では、カスパーゼ-１の基質に接合した蛍光分子又はカスパーゼ-１による切断後に蛍光を発する分子を含んでなる、対象者の眼において活性化カスパーゼを画像化するための診断組成物が提供される。幾つかの実施形態では、対象者のRPE細胞に診断組成物を(例えば、眼内又は静脈内)投与すること及び任意に蛍光の空間的クラスター化をモニターすることを含む、対象者の眼において活性化カスパーゼ-１を画像化する方法が提供される。
【００７３】
本願開示の主題の１以上の実施形態の詳細が本明細書に記載される。本明細書に記載した実施形態に対する改変及び他の実施形態は、本明細書に提供した情報に接した後、当業者に明らかになる。本明細書に提供した情報及び特に記載した例示的実施形態の具体的詳細は、明確な理解のために主に提供されているのであって、不必要な限定はされないと理解すべきである。矛盾する場合、本明細書(定義を含む)が支配する。
【００７４】
本明細書に開示のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列の幾つかは、GENBANK(登録商標)/GENPEPT(登録商標)のアクセッション番号も相互参照されている。GENBANK(登録商標)/GENPEPT(登録商標)データベースで相互参照される配列は、参照により、GENBANK(登録商標)/GENPEPT(登録商標)又は他の公開データベースに存在する等価な配列又は関連する配列が書かれているかのように明示的に組み込まれる。また、本明細書に開示された配列と関係してGENBANK(登録商標)/GENPEPT(登録商標)データベースに存在する全ての注釈も、参照により本明細書中に明示的に組み込まれる。そうではないことが示されていないか又は明らかでない場合には、GENBANK(登録商標)/GENPEPT(登録商標)データベースへの言及は、本出願の出願時点で最新バージョンのデータベースへの言及である。
【００７５】
本明細書で使用する用語は、当業者により十分に理解されると考えられるが、本願開示の主題の説明を容易にするため定義を示す。
そうでないと規定されていない場合、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本願開示の主題が属する分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものに類似するか又は等価である任意の方法、デバイス及び材料を本願開示の主題の実施及び試験に使用できるが、代表的な方法、デバイス及び材料をここに記載する。
【００７６】
長年の特許法上の慣例に従って、用語「a」、「an」及び「the」は、本出願(特許請求の範囲を含む)で使用する場合には、「１以上の」をいうものとする。よって、例えば、「細胞」への言及は複数の当該細胞を含む、といった具合である。
そうでないことが示されていない場合、本明細書及び特許請求の範囲で使用する成分、性質(例えば反応条件)などの量を表す全ての数は、全ての場合で、用語「約」で修飾されていると理解されるべきである。したがって、そうでないことが示されていない場合、本明細書及び特許請求の範囲に示される数値パラメータは、本願開示の主題により得ることが求められる所望の性質に応じて変動し得る近似値である。
【００７７】
本明細書で使用する場合、質量、重量、時間、容量、濃度又はパーセンテージの値又は量に言及するときの用語「約」は、変動が開示された方法を実行するに適切であるように、特定された量からの、幾つかの実施形態では±20％、幾つかの実施形態では±10％、幾つかの実施形態では±５％、幾つかの実施形態では±１％、幾つかの実施形態では±0.5％、幾つかの実施形態では±0.1％の変動を包含するとされる。
【００７８】
本明細書で使用する場合、範囲は、「約」を付した１つの特定値から及び/又は「約」を付した別の１つの特定値までとして表現されることがある。また、本明細書に開示されている値について、各値は、当該値自体に加えて「約」を付した当該特定の値としても開示されていると理解される。例えば、値「10」が開示されている場合、「約10」もまた開示されている。また、２つの特定の単位の間の各単位も開示されていると理解される。例えば、10及び15が開示されている場合、11、12、13及び14も開示されている。
本願開示の主題は、下記の具体的(非限定的)実施例により更に説明される。以下の実施例は、本発明に関連する開発及び実験の過程で種々の時点で集めたデータの代表例であるデータを合併したものを含み得る。
【実施例】
【００７９】
実施例
実施例１
網膜色素上皮(RPE)におけるDICER1欠損に起因するAlu RNA蓄積は、地図状萎縮(GA)(数百万人に失明を引き起こす進行型加齢性黄斑変性)に関わる。Alu RNA誘導細胞毒性の機序は不明である。ここでは、DICER1欠損又はAlu RNA曝露が、RPEにおいて、NLRP3インフラマソームを活性化し、IL-18を介するTLR非依存性MyD88シグナル伝達を誘引することを示す。インフラマソーム構成要素(NLRP3、Pycard、カスパーゼ-１)、MyD88又はIL-18の遺伝子阻害又は薬理学的阻害は、DICER1喪失又はAlu RNA曝露により引き起こされるRPE変性を防止する。これら知見は、ヒトGA RPEが上昇量のNLRP3、PYCARD及びIL-18を含有するという観察並びにカスパーゼ-１及びMyD88の増大した活性化の証拠と併せると、GAにおいてこの経路を標的する合理的根拠を提供する。これら知見はまた、免疫系外でのインフラマソームの新規機能及び可動エレメントの驚くべき免疫調整作用を明らかにする。
【００８０】
加齢性黄斑変性(AMD)は、数百万人の視覚に影響している(Smithら，2001)。AMDは、網膜光受容器と脈絡膜毛細管との間に位置する網膜色素上皮(RPE)の変性によって特徴付けられる(Ambatiら，2003)。RPE機能不全は、光受容器及び脈絡膜脈管系の両方を破壊する(Blaauwgeersら，1999；Lopezら，1996；McLeodら，2009；Vogtら，2011)。これら組織破壊は萎縮性又は新生血管性の疾患表現型を導く。新生血管性AMDの治療法は存在するが、より一般的な萎縮型については有効な治療はない。GA(萎縮型AMDの進行ステージ)は、RPEの変性により特徴付けられ、治療不可能な視覚喪失の主原因である。
【００８１】
近年、RNase DICER1の劇的で特異的な低下がGAのヒト眼のRPEにおいてAlu RNA転写物の蓄積を導くことが示された(Kanekoら，2011)。これら反復性エレメント転写物(これは高度に豊富なAluレトロトランスポゾンにより発現される非コーディングRNAである；Batzer and Deininger, 2002)は、ヒトRPE細胞死及びマウスにけるRPE変性を誘導する。GA RPEにおけるDICER1欠損は包括的な細胞死応答ではなかった。なぜなら、DICER1発現が他の網膜疾患で調節不全でなかったからである。同様に、Alu RNA蓄積は、細胞死亡におけるストレス応答に起因する一般化したレトロトランスポゾン活性化を代表するものではなかった。なぜなら、他のレトロトランスポゾンはGA RPEで上昇しなかったからである。
【００８２】
DICER1は成熟マイクロRNA生合成の中核をなす(Bernsteinら，2001)。にもかかわらず、DICER1欠損後、Alu RNAの蓄積は、RPE細胞生存能の重要な決定因子であったが、成熟マイクロRNAの欠如はそうではなかった(Kanekoら，2011)。更に、7SL RNA、転移RNA及び一次(primary)マイクロRNAはRPE変性を誘導せず(Kanekoら，2011)、このことは過剰な高度に構造化されたRNAの非特異的毒性を除外する。依然として、Alu RNA細胞毒性の正確な機序は不明である。
【００８３】
網膜は免疫特権の例外である(Streilein, 2003)が、先天性免疫センサにより媒介される発作は、著明な炎症をもたらすことがある。３つの主要なクラスの先天性免疫レセプターには、TLR、RIG-I様ヘリカーゼ及びNLRタンパク質が含まれる(Akiraら，2006)。多くの先天性免疫レセプターがRPEで発現し(Kumarら，2004)、幾つかの外因性物質が網膜炎症を誘導することがある(Allensworthら，2011；Kleinmanら，2012)。しかし、この監視機構が宿主の内因性RNAを認識するのか又はこれに応答するのか不明である。先天性免疫機構(この正統な機能は病原因子関連分子パターン及び外来生物由来のその他成分の検出である)もまたAlu RNAを認識し得るという概念が検討された。
【００８４】
事実、Alu転写物は先天性免疫機構を乗っ取り、RPE細胞死を誘導することがあることが示された。驚くべきことに、データが、DICER1欠損又はAlu RNAがNLRP3インフラマソームをMyD88依存性様式であるがTLR非依存性様式で活性化することを示している。インビボでのNLRP3インフラマソーム活性化は、主として免疫細胞に限定されていたが、ケラチノサイトの細胞培養物研究(Feldmeyerら，2007；Kellerら，2008)で示されるように、このデータはNLRP3活性がより広範囲であり得る可能性について門戸を開く。また、データは、DICER1機能の範囲をマイクロRNA生合成を超えて広げ、ヒトゲノムの概ね50％を含む毒性レトロトランスポゾンエレメントの異所性蓄積に対する監視者として同定する(Landerら，2001)。まとめると、これら知見は、新規な自己認識免疫応答を提示する。これにより、内因性非コーディングRNA誘導NLRP3インフラマソーム活性化は、非免疫細胞において、DICER1欠損に起因する。
【００８５】
結果
Alu RNAは種々のTLR又はRNAセンサを活性化しない
Alu RNAは、一本鎖(ss)RNA及び二本鎖(ds)RNAモチーフを有する(Sinnettら，1991)。よって、Alu RNAがtoll様レセプター-３(TLR3)、dsRNAセンサ(Alexopoulouら，2001)又はTLR7(ssRNAセンサ(Dieboldら，2004；Heilら，2004))が欠損したマウスにおいてRPE変性を誘導するかどうかを調べた。Alu RNAをコードするプラスミド(pAlu)の網膜下送達は、Tlr3-/-マウス及びTlr7-/-マウスにおいて、野生型(WT)マウスと同様に、RPE変性を誘導した(図1A〜C)。21ヌクレオチド以上の完全相補性siRNAはRPE細胞のTLR3を活性化することが以前に示されている(Kleinmanら，2011)。Alu RNAによるTLR3活性化の欠如は、TLR3結合を妨げ得る複数のヘアピン及び隆起を含有する複雑な構造に起因する蓋然性が高い。7SL RNA(Alu RNAの進化的前駆体)もp7SLもWTマウスにおいてRPE変性を誘導しなかった(図8A及び8B)。このことは、Alu RNA細胞毒性が、今のところ不明確な構造的特徴に起因し得ることを示唆する。pAluはUnc93b1マウス(これは、TLR3、TLR7及びTLR9シグナル伝達を欠く；Tabetaら，2006)においてRPE変性を誘導した(図1D)。このことは、これら核酸センサがAlu RNAにより重複して活性化されないことを示している。pAluはTlr4-/-マウスにおいてRPE変性を誘導し(図1E)、TLR4アンタゴニストであるRhodobacter sphaeroides LPS(Qureshiら，1991)はWTマウスにおいてpAlu誘導RPE変性を阻害しなかった(図8C)。よって、観察されたRPE細胞死はリポ多糖混入に起因しない。更に、２つの異なるインビトロ転写Alu RNA(Kanekoら，2011)は複数のTLRを活性化しなかった(図1F)。
【００８６】
次に、他のdsRNAセンサ(例えばMDA5(Katoら，2006)又はPKR(Prkrによりコードされる(Yangら，1995))がAlu RNA毒性を媒介し得るかどうかを調べた。しかし、pAluはMda5-/-マウス及びPrkr-/-マウスにおいてRPE変性を誘導した(図8D及び8E)。インビトロ転写Alu RNAの5'-トリホスフェート(これは、この部分を感知するRIG-I又はIFIT-1を活性化し得る)(Hornungら，2006；Pichlmairら，2011)が、RPE変性を担っているかどうかを調べた。脱リン酸化Alu RNAは、脱リン酸化に付されていないAlu RNAと同様に、WTマウスにおいてRPE変性を誘導した(図8F)。このことは、この化学基が観察された細胞死を担っていないことを示している。事実、RIG-Iを活性化する5'-トリホスフェートssRNAは、マウスにおいてRPE変性を誘導しない(Kleinmanら，2011)。更に、pAluはMAVS(これにより、RIG-I及びMDA-5がシグナル伝達する(Kumarら，2006；Sunら，2006))を欠損するマウスにおいてRPE変性を誘導した(図8G)。まとめると、これらデータは、広範な正統RNAセンサにより媒介されないAlu RNA誘導RPE変性の新規な機序を指摘している。
【００８７】
Alu RNA細胞毒性はMyD88及びIL-18により媒介される
次いで、TRIF(Ticam1によりコードされる；TLR3及びTLR4のアダプター(Hoebeら，2003；Yamamotoら，2003))及びMyD88(TLR3以外の全てのTLRのアダプター(Akiraら，2006；Alexopoulouら，2001；Suzukiら，2003))の関与を調べた。Alu RNAは、Tlr3-/-マウス及びTlr4-/-マウスにおける知見と一致して、Ticam1-/-マウスにおいてRPE変性を誘導した(図9A)。予想外にも、Alu RNAも２つの異なるpAluプラスミドもMyd88-/-マウスにおいてRPE変性を誘導しなかった(図2A、9B及び9C)。MyD88ホモ二量体化のペプチド阻害剤(Loiarroら，2005)の硝子体内送達は、WTマウスにおいてAlu RNAにより誘導されるRPE変性を防止した一方、コントロールペプチドは防止しなかった(図2B)。MyD88を標的する短い干渉RNA(siRNA)(これは、長さが21ヌクレオチドより短く、TLR3活性化を防止し、細胞透過を可能にするためにコレステロールに接合されている(Kleinmanら，2008))は、WTマウスにおいて、pAluにより誘導されるRPE変性を阻害したが、コントロールsiRNAは阻害しなかった(図2C〜2E)。Myd88+/-ヘテロ接合型マウスはAlu RNA誘導RPE変性に対して保護された(図2F及び9D)。このことは、MyD88の部分的ノックダウンが治療上十分であるというsiRNA研究を実証している。
【００８８】
インターロイキンにより誘導されるMyD88媒介シグナル伝達は、IRAK1及びIRAK4の動員及びリン酸化を導く(Caoら，1996；Kanakarajら，1999；Suzukiら，2003；Suzukiら，2002)。Alu RNAはヒトRPE細胞においてIRAK1/4リン酸化を増大させた(図2G)。このことは、Alu RNAがMyD88シグナル伝達を誘引するという概念を支持する。MyD88阻害性ペプチドは、ヒトRPE細胞においてAlu RNA誘導IRAK1/4リン酸化を低下させた(図9E)。このことはその作用態様を確証する。
【００８９】
次に、MyD88活性化がヒト及びマウスRPE細胞培養系においてAlu RNA誘導細胞死を媒介するかどうかを評価した。インビボデータと一致して、pAluはWTマウスRPE細胞において細胞生存能を低下させたが、Myd88-/-マウスRPE細胞においては低下させなかった(図2H)。MyD88阻害性ペプチドは、pAluでトランスフェクトしたヒトRPE細胞において細胞死を阻害したが、コントロールペプチドは阻害しなかった(図2I)。まとめると、これらデータは、MyD88がAlu RNA誘導RPE変性の重要なメディエータであることを示唆する。
【００９０】
MyD88は、一般には、免疫細胞のアダプターであると考えられている(O'Neill and Bowie, 2007)。しかし、Alu RNAは、RPE単一培養物においてMyD88を介して細胞死を誘導した。よって、マウスにおけるAlu RNA誘導RPE変性がRPE細胞におけるMyD88活性化のみに依存するかどうかを調べた。Myd88f/fマウスにおけるAAV1-BEST1-Creの網膜下注射によるRPEでのMyD88の条件的除去は、Alu RNA誘導RPE変性に対して保護した(図2J及び9F)。この知見と一致して、Alu RNAは、Myd88-/-の骨髄を投与されたWTマウスにおいてRPE変性を誘導したが、WTの骨髄を投与されたMyd88-/-マウスにおいてはRPE変性を誘導しなかった(図9G)。まとめると、これら結果は、(循環性免疫細胞ではなく)RPEにおけるMyD88発現がAlu RNA誘導RPE変性に重要であることを示している。これら知見は、病変領域で免疫細胞の浸潤が見られないとのヒトGA組織の組織病理学的研究に適合する(私信、C.A. Curcio, H.E. Grossniklaus, G.S. Hageman, L.V. Johnson)。
【００９１】
MyD88はTLRシグナル伝達に重要である(O'Neill and Bowie, 2007)が、Alu RNAによるMyD88活性化はTLR活性化から独立していた。よって、MyD88関与の他の機序を調べた。MyD88は、IFN-γレセプター１(Ifngr1によりコードされる)と干渉することによりIFN-γシグナル伝達を調節することができる(Sun and Ding, 2006)。しかし、pAluはIfng-/-マウス及びIfngr1-/-マウスの両方でRPE変性を誘導した(図9H及び9I)。MyD88はまた、インターロイキン-１シグナル伝達において必須である(Muzioら，1997)。よって、IL-1β及び関連するサイトカインIL-18(共にMyD88を活性化する(Adachiら，1998))がAlu RNA細胞毒性を媒介するかどうかを調べた。興味深いことに、ヒトRPE細胞におけるAlu RNA過剰発現はIL-18分泌を増大させる一方、IL-1β分泌は辛うじて検出可能であった(図2K)。
【００９２】
組換えIL-18はWTマウスにおいてRPE変性を誘導したがMyd88-/-マウスにおいては誘導しなかった(図2L)。IL-18の中和化は、WTマウスにおいてpAlu誘導RPE変性に対して保護したが、IL-1βは保護しなかった(図2M及び2N)。また、pAluはIl1r1-/-マウスにおいてRPE変性を誘導したがIl18r1-/-マウスにおいては誘導しなかった(図9J及び9K)。これらデータは、IL-18がAlu RNA誘導細胞毒性のエフェクターであることを示している。
【００９３】
Alu RNAはNLRP3インフラマソームを活性化する
カスパーゼ-１(Casp1によりコードされる；生物学的に活性な形態へのインターロイキンの成熟を誘導するプロテアーゼである(Ghayurら，1997；Guら，1997；Thornberryら，1992)がAlu RNA誘導RPE変性に関与するかどうかを調べた。ヒトRPE細胞のAlu RNA処理は、ウェスタンブロッティング及び基質切断の蛍光レポーターにより測定されるように、カスパーゼ-１活性化を導いた(図3A及び10A)。事実、Alu RNAは、他の細胞タイプ(例えば、HeLa及びTHP-1単球細胞)において、カスパーゼ-１活性化を誘導した(図10B)。このことは、Alu RNA細胞毒性が多くの系において潜在的に広く関与していることを示唆している。カスパーゼ-１-阻害性ペプチドZ-WEHD-FMKの硝子体内送達は、WTマウスにおいてIL-18成熟及びpAlu誘導RPE変性をブロックしたが、コントロールペプチドZ-FA-FMKの硝子体内送達はブロックしなかった(図3B及び3C)。カスパーゼ-１阻害性ペプチドはヒトRPE細胞においてAlu RNA誘導基質切断をブロックした(図10C)。このことはその作用態様を確証する。同様に、Alu RNA又はpAluで処置したCasp1-/-マウスはRPE変性を示さなかった(図3D及び10D)。また、pAluはCasp1-/-マウスRPE細胞において細胞死を誘導しなかった(図3E)。
【００９４】
カスパーゼ-１は、インフラマソームと呼ばれるマルチタンパク質たる先天性免疫複合体内で活性化され得る(Tschoppら，2003)。最も十分に特徴付けられたインフラマソーム経路は、カスパーゼ-１アダプターであるASC(PYCARDによりコードされる)へのNLRP3の結合により活性化されるものである。インフラマソームアセンブリの１つの顕著な特徴はPYCARDの空間的クラスター化である(Fernandes-Alnemriら，2007)。蛍光タグ化PYCARD(GFP-PYCARD)でトランスフェクトされたヒトRPE細胞において、Alu RNAはLPS及びATP(これはNLRP3インフラマソームを活性化する)での処理と同様に、高輝度の蛍光細胞質クラスターの出現を誘導した(図3F及び10E)(Mariathasanら，2006)。
【００９５】
次に、NLRP3及びPYCARDとAlu RNA細胞毒性との機能的関連性を調べた。pAluもAlu RNAもNlrp3-/-マウス又はPycard-/-マウスのいずれにおいてもRPE変性を誘導しなかった(図3G、3H、10F及び10G)。このことは、Alu RNA細胞毒性におけるインフラマソームの決定的重要性を証明する。また、pAluはNlrp3-/-マウス又はPycard-/-マウスのいずれのRPE細胞においても細胞死を誘導しなかった(図3I)。更に、siRNAによるNLRP3又はPYCARDのノックダウンは、pAlu誘導ヒトRPE細胞死を回復させた(図3J及び10H)。これら知見は、Alu RNAに応答してのNLRP3活性化がRPE細胞において生じるが、他の免疫細胞の存在を必要としないことの直接的証拠を提供する。
【００９６】
(１)MyD88阻害はヒトRPE細胞においてAlu RNA誘導IRAK1/4リン酸化を低下させる(図9E)一方、Alu RNA誘導カスパーゼ-１切断も蛍光基質切断も低下させなかったこと(図10I及び10J)；(２)IL-18の中和化はAlu RNA誘導カスパーゼ-１切断を阻害しなかったこと(図10K)；及び(３)カスパーゼ-１阻害はIRAK1/4のAlu RNA誘導リン酸化を低下させたこと(図10L)を示すことで、IL-18及びMyD88の活性化が確かにカスパーゼ-１活性化の川下にあることが証明された。
【００９７】
Alu RNAはミトコンドリアROS及びNLRP3プライミングを誘導する
NLRP3インフラマソーム機能は２つのシグナルを必要とする。その第１はプライミングと呼ばれる。pAluは、NLRP3 mRNA及びIL18 mRNAの両方をアップレギュレートしたので、インフラマソームプライミングを誘導した。このプライミングは、WTマウス及びMyd88-/-マウスの両方のRPE細胞において等しく生じた(図4A)。このことは更に、MyD88がこの系のNLRP3の下流で機能することを確証する。NLRP3と直接相互作用しない他のインフラマソームアゴニスト(Tschopp and Schroder, 2010)と同様に、Alu RNAとNLRP3との間の物理的相互作用は観察されなかった(図11A)。Alu RNAがどのようにインフラマソームをプライムするかを決定するために、Alu RNAが反応性酸素種(ROS)産生(プライミングのシグナル(Bauernfeindら，2011；Nakahiraら，2011))を誘導するかどうかを調べた。pAluはヒトRPE細胞においてROS生成を誘導し(図4B)、ROS阻害剤であるジフェニルヨードニウム(DPI)は、WTマウスにおいて、pAlu誘導NLRP3 mRNA及びIL18 mRNAのアップレギュレーション及びAlu RNA誘導RPE変性をブロックした(図4C及び4D)。DPIはミトコンドリアROS及びファゴソームROSをブロックする(Li and Trush, 1998)ので、どちらの経路が誘引されるのかを調べた。というのも、NLRP3応答に寄与するROSの供給源をめぐる議論が存在する(Latz, 2010)からである。
【００９８】
ROS生成ミトコンドリアを標識するMitoSOX Redを、呼吸ミトコンドリアを標識するMitoTracker Deep Redと組み合わせて使用した。ファゴソームROS生成をモニターするため、ファゴソーム内でのNADPHオキシダーゼの活性化を測定するFc OxyBURST Greenを使用した。ROS生成ミトコンドリアの顕著な増加が、pAluでトランスフェクトしたヒトRPE細胞において観察された(図4E)。対照的に、ホルボールミリステートアセテー(PMA)は予想されたようにファゴソームROSを誘導した(Savinaら，2006)一方、pAluは誘導しなかった(図4F)。これらデータは、NLRP3応答がミトコンドリアROS阻害剤により害される(Nakahiraら，2011；Zhouら，2011)が、NADPH-オキシダーゼ依存性ROS産生を害する遺伝子変異を有する細胞では保存される(Meissnerら，2010；van Bruggenら，2010)という知見と一致する。
【００９９】
これら報告及び細胞性ROSの主要な供給源がミトコンドリアであるという観察(Murphy, 2009)と一致して、ミトコンドリア標的抗酸化剤Mito-TEMPO及びMitoQ(Murphy and Smith, 2007；Nakahiraら，2011)は共にWTマウスにおいてAlu RNA誘導RPE変性をブロックする一方、dTPP(ミトコンドリアROSを除去しない、MitoQの構造的アナログ)はブロックしないことが見出された(図4G)。対照的に、gp91ds-tat(２つの必須のNADPHオキシダーゼサブユニット(gp91phox及びp47phox)の会合を阻害する細胞透過ペプチド(Reyら，2001))はブロックしなかった(図4H)。これらデータを確証することに、Alu RNAは、Cybb(gp91phoxをコードする)を欠損するマウスにおいて、WTマウスと同様に、RPE変性を誘導した(図4I)。次に、電位依存性陰イオンチャネル(VDAC)を調べた。なぜなら、VDAC1及びVDAC2は、マクロファージにおいてNLRP3活性化因子により産生されるミトコンドリアROSに重要であるが、VDAC3はそうでないからである(Zhouら，2011)。これら観察と一致して、VDAC1及びVDAC2のsiRNAノックダウンは、ヒトRPE細胞において、pAlu誘導ミトコンドリアROS(図4J及び11B)並びにNLRP3 mRNA及びIL18 mRNAの誘導(図4K)を損傷したが、VDAC3のsiRNAノックダウンは損傷しなかった。まとめると、これらデータは、ミトコンドリアROSをAlu RNA誘導NLRP3インフラマソーム媒介RPE変性と結びつける。
【０１００】
Alu RNAはパイロプトーシスを介してRPE変性を誘導しない
Alu RNAはカスパーゼ-１(パイロプトーシスを誘引することができる)を活性化する。ここで、パイロプトーシスは、膜孔の形成及び浸透圧溶解により特徴付けられる細胞死の一形態である(Fink and Cookson, 2006)。細胞保護因子であるグリシン(これはパイロプトーシスを減弱させる(Finkら，2008；Fink and Cookson, 2006；Verhoefら，2005))は、LPS＋ATPにより誘導されるヒトRPE細胞死を阻害したが、Alu RNAにより誘導されるヒトRPE細胞死は阻害しなかった(図5A及び5B)。パイロプトーシスはカスパーゼ-１を必要とするが、IL-18とは独立して進行することができる(Miaoら，2010)。よって、IL-18がCasp1-/-マウスにおいてRPE変性を誘導したという知見(図5C)は、グリシンによる回復の欠如と併せて考えると、Alu RNA誘導RPE変性はパイロプトーシスを介して起こるのではないことが示唆される。
【０１０１】
DICER1喪失はインフラマソームを介して細胞死を誘導する
RPE細胞の健常維持にけるDICER1の鍵となる役割(Kanekoら，2011)が以前に証明されている：DICER1切断Alu RNAはインビボでRPE変性を誘導しなかった；DICER1過剰発現はAlu RNA誘導RPE変性に対して保護した；及び、DICER1喪失誘導RPE変性はAlu RNAの拮抗によりブロックされた(Kanekoら，2011)。また、Alu RNA阻害によるDICER1ノックダウン誘導RPE変性の回復は、マイクロRNA欠損の回復に伴うものではなかった(Kanekoら，2011)。したがって、DICER1もまたAlu RNAによるNLRP3インフラマソーム活性化を防止するかどうかを調べた。ヒトRPE細胞におけるAlu RNA誘導カスパーゼ-１活性化は、DICER1過剰発現により阻害された(図6A及び6B)。逆に、ヒトRPE細胞においてDICER1ノックダウンにより誘導されるカスパーゼ-１切断は、同時のAlu RNAのアンチセンスノックダウンにより阻害された(図12A及び12B)。
【０１０２】
次に、これら経路の関連性を、インビボにおけるDICER1喪失との関連で調べた。カスパーゼ-１切断は、BEST1 Cre;Dicer1f/fマウス(これは発生の間にRPEでのDICER1発現を喪失してRPE変性を示す(Kanekoら，2011))のRPEにおいて増大した(図6C)。Dicer1f/fマウスにおけるAAV1-BEST1-Creの網膜下送達は、RPEにおいて、カスパーゼ-１活性化及びIL-18成熟を誘導した(図6D)。この処置はまたRPE変性を誘導した。RPE変性はカスパーゼ-１阻害性ペプチドの硝子体内送達によりブロックされたが、コントロールペプチドの硝子体内送達ではブロックされなかった(図6E)。Dicer1f/fマウスにおけるAAV1-BEST1-Cre誘導RPE変性はまた、MyD88阻害性ペプチドの硝子体内送達によりブロックされたが、コントロールペプチドの硝子体内送達ではブロックされなかった(図6F)。加えて、MyD88阻害は、DICER1を標的するアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理したヒトRPE細胞において細胞死を防止した(図6G)。ヒトRPE細胞におけるDICER1ノックダウンは、IRAK1/4リン酸化を増加させた。このことはDICER1の喪失に際するMyD88活性化の更なる証拠を提供する(図6H)。MyD88阻害はまた、Creリコンビナーゼをコードするアデノウイルスベクターで処理したDicer1f/fマウスRPE細胞において細胞死を防止した(図6I)。MyD88阻害は、Dicer1ノックダウンにより誘導されるマイクロRNA発現欠損を回復させることなく、RPE細胞死をブロックした(図6J)。これら知見は、DICER1がNLRP3インフラマソーム活性化の本質的な内因性ネガティブレギュレータであり、DICER1欠損がAlu RNA媒介性、MyD88依存性、マイクロRNA非依存性のRPE変性を導くことを証明する。
【０１０３】
ヒトGAにおけるインフラマソーム及びMyD88の活性化
次に、GAを有するヒト眼(RPEにおいてDICER1の喪失及びAlu RNAの蓄積を示す(Kanekoら，2011))もまたインフラマソーム活性化の証拠を示すかどうか調べた。GAを有するヒト眼のRPEにおけるNLRP3 mRNAの量は、コントロールの眼と比較して顕著に増加した(図7A)。IL18 mRNA及びIL1B mRNAの量もまたGA RPEで増加した；しかし、IL18レベルの差のみが統計学的有意に達した(図7A)。免疫局在化研究により、NLRP3、PYCARD及びカスパーゼ-１タンパク質の発現もGA RPEにおいて増加することが示された(図7B〜D)。ウェスタンブロット分析により、GA RPEにおけるNLRP3及びPYCARDの量の増加が確証され、GA RPEにおいて酵素的に活性な切断カスパーゼ-１p20サブユニットのレベルが大きく増大することが明らかになった(図7E)。GA RPEにおいて、リン酸化IRAK1及びIRAK4量も増大した。このことは、MyD88シグナル伝達の増大を示す(図7E)。まとめると、これらデータは、ヒトGAにおけるインサイチュでのNLRP3インフラマソーム及びMyD88の活性化の証拠を提供し、ヒトRPE細胞培養物及びマウスインビボでの機能的データを反映している。
【０１０４】
考察
データにより、GAの病状におけるAlu RNAによる先天性免疫センシング経路の破壊についての機能的役割が確立される。まとめると、これら知見は、NLRP3インフラマソームがGA関連Alu RNA危険シグナルを感知し、RPE変性に寄与し、場合によってはAMDにおける視覚喪失に寄与することを証明する(図13)。今日まで、NLRP3インフラマソームの機能は、インビボでは免疫細胞にほとんど限定されていた。NLRP3インフラマソームがRPE細胞生存において重大な機能を演じているという知見は、このインフラマソームの細胞範囲を広げ、他の非免疫細胞がこのプラットフォームを用い得る可能性を生じさせる。
【０１０５】
NLRP3インフラマソームは、当初は、外部危険シグナル(例えば、微生物毒素)のセンサとして認識されていた(Kannegantiら，2006；Mariathasanら，2006；Muruveら，2008)。その後、内因性結晶、ポリペプチド及び脂質が、痛風、アテローム発生、アルツハイマー病及び２型糖尿病のような疾患においてNLRP3インフラマソームを活性化することが報告された(Halleら，2008；Mastersら，2010；Muruveら，2008；Wenら，2011)。知る限りでは、Alu RNAは、この免疫プラットフォームを活性化することが知られている最初の内因性核酸である。この知見は、慢性ヒト疾患における内因性危険シグナルの多様性を拡げ、このインフラマソームが代謝危険のセンサであるという概念と一致している(Schroderら，2010)。
【０１０６】
インフラマソーム活性化の減弱は、炎症応答の限定に必須であり得る。病原因子は、インフラマソーム活性化を阻害するための多くのストラテジを進化させている(Martinonら，2009)。同様に、宿主の自己貪食タンパク質(Nakahiraら，2011)、Ｉ型インターフェロン(Guardaら，2011)及びＴ細胞のマクロファージとの接触は、このプロセスを阻害し得る(Guardaら，2009)。DICER1がAlu RNAの切断によりNLRP3の活性化を防止するという知見は、宿主インフラマソーム調整能力のレパートリーに加えられ、恒常性抗炎症機序の調節不全が如何にしてAMDを促進し得るかという新たな面を明らかにする(Ambatiら，2003；Takedaら，2009)。
【０１０７】
最近記載された抗アポトーシス及び抗腫瘍に関連する機能に加え、DICER1は多才なタンパク質として浮上する。この機能的汎用性(versatility)が種々の状態においてどのように切り替えられるかは決定されるべきままである。DICER1調節不全は幾つかのヒト疾患において認識されることが増えているので、Alu RNAがこれら病状においても危険シグナルを活性化するインフラマソームであり得ると推測することはもっともなことである。また、興味深いことには、少なくとも成体マウスにおいて並びに種々のマウス細胞及びヒト細胞において、DICER1のマイクロRNA生合成機能は少なくともMyD88欠損環境では細胞の生存に重要ではない(データは示さず)。
【０１０８】
ミトコンドリアROS産生がAlu RNA誘導RPE変性に関与するというデータは、AMDを有するヒト眼のRPEにおける、ミトコンドリアDNA損傷(Linら，2011)、ミトコンドリアエネルギー産生及び輸送に関与するタンパク質のダウンレギュレーション(Nordgaardら，2008)及びミトコンドリアの数及びサイズの減少(Feherら，2006)という観察と一致する。まとめると、これら知見は、ミトコンドリアROS生成との干渉についての潜在的な治療上の有益性を示唆する。
【０１０９】
インフラマソームを標的する現在の臨床プログラムは大部分がIL-1βに焦点を当てている；現在、登録された臨床試験にはIL-18阻害剤は存在しない。しかし、データは、IL-18が、GAにおけるRPE細胞死の媒介に、IL-1βより重要であることを示している(結腸炎モデルにおけるIL-18の選択的関与に類似する(Zakiら，2010))。このことは、インフラマソーム活性化がインターロイキンエフェクターのレベルで又はその直前に二股に分かれる調節機構の存在を指摘する。カスパーゼ-１阻害は魅力的な局所治療ストラテジであり得るが、カスパーゼ阻害剤は代替の細胞死経路を促進し得、おそらくその有用性は限定的である(Vandenabeeleら，2006)。
【０１１０】
MyD88は、病原因子関連分子パターンにより開始されるTLRシグナル伝達の変換について最もよく知られている(O'Neill and Bowie, 2007)が、近年、ヒトガンでも示唆されている(Ngoら，2011；Puenteら，2011)。この知見は、網膜変性及び失明を導き得る移動性エレメント転写物からの死シグナルを発することにおけるMyD88の予想し得ない新たな機能を紹介し、MyD88がカスパーゼ-１を用いる他の非NLRP3インフラマソーム(Schroder and Tschopp, 2010)からのシグナルの中央統合装置であり得る可能性を生じさせる。MyD88の非正統な活性化は、GAにおけるRPE変性の重要なチェックポイントである(図13)ので、MyD88は魅力的な治療標的である。マウスにおける重要な抗微生物機能は潜在的な関心事である(O'Neill and Bowie, 2007)。しかし、Myd88-/-マウスとは対照的に、MyD88欠損を有する成人ヒトは、一般に健常であり、広範な種々の微生物病原体に対して耐性であると記載されている(von Bernuthら，2008)。MyD88欠損ヒトは、化膿性細菌感染に対して狭い範囲の感受性を有し、その上、初期の小児期だけであって成人期にはない(Picardら，2010)。更に、siRNA及びMyd88+/-研究から明らかなように、MyD88の部分的阻害は、Alu RNAに対する保護に十分である。局所眼内治療(網膜疾患のほとんどで現時点で標準のケア)は、有害な感染転帰の見込みを更に限定的にする。GAの予防又は治療用のMyD88阻害剤の開発を予見することはもっともである。
【０１１１】
実験手順
網膜下注射及び画像化。網膜下注射(１μL)は、Pico-Injector(PLI-100, Harvard Apparatus)を用いて行った。プラスミドは、10％ Neuroporter(Genlantis)を用いてインビボでトランスフェクトした。眼底画像は、デジタル画像化システム(Sony)に連結したTRC-50 IXカメラ(Topcon)で撮影した。RPE平面マウントは、閉鎖帯-１に対する抗体(Invitrogen)を用いて免疫標識した。
mRNA量。転写物量は、Applied Biosystems 7900 HT Fast Real-Time PCR systemを用いるリアルタイムRT-PCRで2-ΔΔCt法により定量した。
タンパク質の量及び活性。タンパク質の量は、カスパーゼ-１に対する抗体(1:500；Invitrogen)、pIRAK1に対する抗体(1:500；Thermo Scientific)、pIRAK4に対する抗体(1:500, Abbomax)、PYCARDに対する抗体(1:200, Santa Cruz Biotechnology)、NLRP3に対する抗体(1:500, Enzo Life Sciences)及びビンキュリンに対する抗体(1:1,000；Sigma-Aldrich)を用いるウェスタンブロット分析により評価した。カスパーゼ-１活性は、Caspalux1 E1D2(OncoImmunin)を製造業者の指示に従って用いて視覚化した。
【０１１２】
マウス。全ての動物実験は、研究所の審査委員会により承認され、Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Visual Researchに従った。野生型C57BL/6J、Cybb-/-、Tlr3-/-、Tlr4-/-(C57BL/10ScNJ)、Trif-/-(Ticam1Lps2)、Ifng-/-、Ifngr1-/-、Il1r1-/-、Il18r1-/-、Myd88f/f及びDicer1f/fマウスは、The Jackson Laboratoryから購入した。Casp1-/-、Nlrp3-/-及びPycard-/-マウスは以前に記載されている(Kannegantiら，2006)。Unc93b1変異体マウスは、K. Fitzgeraldを介してB.A. Beutlerにより厚意で提供された。Myd88-/-及びTlr7-/-マウスは、T. Hawn及びD.T. Golenbockを介して、S. Akiraにより厚意で提供された。Mda5-/-マウスはM. Colonnaにより厚意で提供された。Prkr-/-マウスはB.R. Williams及びR.L. Silvermanにより厚意で提供された。Mavs-/-マウスはK. Fitzgeraldを介してZ. Chenにより厚意で提供された。全ての手順について、麻酔は、100mg/kg塩酸ケタミン(Ft. Dodge Animal Health)及び10mg/kgキシラジン(Phoenix Scientific)の腹腔内投与により行い、局所１％トロピカミド(Alcon Laboratories)で瞳孔を散大させた。
【０１１３】
眼底写真撮影。散大したマウス眼の網膜写真を、デジタル画像化システム(Sony)に連結したTRC-50 IXカメラ(Topcon)で撮影した。
ヒト組織。AMDに起因する地図状萎縮を有する患者又はAMDを有しない年齢適合患者からのドナー眼又は眼組織を、種々のアイバンクから得た。診断は、組織若しくは眼の収集前に散大眼検査により、又は死後の眼球検査に際して確証した。研究は、ヘルシンキ宣言の指針に従った。研究所の審査会は標本の分配及び組織学的分析について認可した。
【０１１４】
免疫標識。２〜４％パラホルムアルデヒドで固定したヒト眼を、アイカップとして準備し、30％スクロースで凍結保護し、適切な切断温度の化合物(Tissue-Tek OCT；Sakura Finetek)に包埋し、10μm切片に凍結下で切断した。0.25％過マンガン酸カリウム及び0.1％シュウ酸を用いて脱色を行った。NLRP3に対するウサギ抗体(1:100, Sigma Aldrich)又はカスパーゼ-１に対するウサギ抗体(予め希釈、AbCam)で免疫組織化学染色を行った。一次抗体に代えてアイソタイプIgGを使用して、染色の特異性を評価した。結合抗体は、ビオチン結合二次抗体で検出し、続いてABC試薬とインキュベートし、Vector Blueにより可視化した(Vector Laboratories)。Levamisole(Vector Laboratories)を使用して、内因性アルカリホスファターゼ活性をブロックした。スライドはPBSで洗浄し、ニュートラルレッドで対比染色し(Fisher Scientific)、脱イオン水でリンスし、風乾させた後、Vectamountにマウントした(Vector Laboratories)。ヒト組織の蛍光標識は、PYCARDに対するウサギ抗体(1:50,クローン N-15, Santa Cruz Biotechnology)で行った。免疫標識は、蛍光接合抗ウサギ二次抗体(Invitrogen)により可視化した。組織の自己蛍光は、切片を0.3％スダンブラック(Fisher Scientific)中でインキュベートすることにより消光させた。切片を、DAPIを備えるVectashield(Vector Laboratories)にマウントした。マウスRPE/脈絡膜平面マウントを４％パラホルムアルデヒド又は100％メタノールで固定し、ヒト閉鎖帯-１に対するウサギ抗体(1:100, Invitrogen)で染色し、Alexa594(Invitrogen)で可視化した。画像は全てLeica SP-5又はZeiss Axio Observer Z1顕微鏡を用いて取得した。
【０１１５】
網膜下注射。マウスにおける網膜下注射(１μL)は、Pico-Injector(PLI-100, Harvard Apparatus)を用いて行った。２つの異なるAlu配列をコードするプラスミド(pAlu)又は空のコントロールベクター(pNull)(Bennettら，2008；Kanekoら，2011；Shaikhら，1997)のインビボトランスフェクションは、10％ Neuroporter(Genlantis)を用いて達成した。AAV1-BEST1-Cre(Alexander and Hauswirth, 2008)又はAAV1-BEST1-GFPは、1.0×1011pfu/mLで注射し、インビトロ転写Alu RNAは0.3mg/mLで注射した。
【０１１６】
薬物処置。siRNAは、siRNA緩衝液(HEPES緩衝液(pH7.5)中、20mM KCL、0.2mM MgCl2；Dharmacon)又はリン酸緩衝化生理食塩水(PBS；Sigma-Aldrich)中に処方した；TLR4アンタゴニストUltra Pure Rhodobacter sphaeroides LPS(LPS-RS, InvivoGen)、MyD88ホモ二量体化のペプチド阻害剤IMG-2005(IMGENEX)、コントロール阻害剤(IMGENEX)、組換えIL-18(Medical & Biological Laboratories)、マウスIL-1βに対するラット中和抗体(IMGENEX)、マウスIL-18に対するラット中和抗体(Medical & Biological Laboratories)、コントロールのアイソタイプIgG(必要に応じてR&D Systems又はeBioscience)、カスパーゼ-１阻害剤Z-WEHD-FMK(R&D Systems)、コントロールのカスパーゼ阻害剤Z-FA-FMK(R&D Systems)、DPI(Enzo Life Sciences)、Mito-TEMPO(Enzo Life Sciences)、MitoQ及びdTPP(共に、シクロデキストリンに吸着。M.P. Murphy(MRC Mitochondrial Biology Unit)より提供)並びにgp91ds-tat及びスクランブルgp91 ds-tat(共にAnaspec)をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS；Sigma-Aldrich)又はジメチルスルホキシド(DMSO；Sigma-Aldrich)に溶解し、総容量１μLで33ゲージExmireマイクロシリンジ(Ito Corporation)を用いて硝子体液中に注射した。pAlu誘導RPE変性に対するMyD88遮断の効果を評価するため、１μLのコレステロール(chol)接合MyD88 siRNA(17＋２nt；２μg/μL)を、pAlu注射の１日後に硝子体内注射した。コントロールとして、Luc siRNA-chol(17＋２nt)を同一用量で使用した。
【０１１７】
骨髄キメラ。骨髄移植を使用して、Myd88-/-キメラマウス(Myd88の遺伝子欠損が循環性細胞(Myd88-/-→WT)又は非造血組織(WT→Myd88-/-)のいずれかに限定された)を作製した。簡潔には、骨髄は、類遺伝子型のWT又はMyd88-/-ドナーマウスの大腿骨及び脛骨から、RPMI1640でのフラッシュで回収した。２回の洗浄工程の後、細胞をRPMI1640に再懸濁した。150μLのRPMI1640中１×107細胞を、照射ドナーマウスの尾静脈に注射した。２つのキメラ群を作製した：WT→Myd88-/-(Myd88-/-マウスにWT細胞)及びMyd88-/-→WT(WTマウスにMyd88-/-細胞)。骨髄移植の２ヵ月後、マウスにAlu RNA、ビヒクル、pAlu又はpNullを網膜下注射し、７日後にRPE変性についてモニターした。
【０１１８】
リアルタイムPCR。トータルRNAを、Trizol試薬(Invitrogen)を製造業者の推奨に従って用いて組織又は細胞から抽出し、DNase処理し、逆転写させた(QuantiTect, Qiagen)。RT産物(cDNA)を、Power SYBR green Master Mixを備えたリアルタイム定量PCR(Applied Biosystems 7900 HT Fast Real-Time PCR system)により増幅した。ヒトIL1Bに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(フォワード5'-TTAAAGCCCGCCTGACAGA-3'及びリバース5'-GCGAATGACAGAGGGTTTCTTAG-3')、ヒトIL18に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(フォワード5'-ATCACTTGCACTCCGGAGGTA-3'及びリバース5'-AGAGCGCAATGGTGCAATC-3')、ヒトNLRP3に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(フォワード5'-GCACCTGTTGTGCAATCTGAA-3'及びリバース5'-TCCTGACAACATGCTGATGTGA-3')、ヒトPYCARDに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(フォワード5'-GCCAGGCCTGCACTTTATAGA-3'及びリバース5'-GTTTGTGACCCTCGCGATAAG-3')、ヒトVDAC1に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(フォワード5'-ACTGCAAAATCCCGAGTGAC-3'及びリバース5'-CTGTCCAGGCAAGATTGACA-3')、ヒトVDAC2に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(フォワード5'-CAGTGCCAAATCAAAGCTGA-3'及びリバース5'-CCTGATGTCCAAGCAAGGTT-3')、ヒトVDAC3に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(フォワード5'-TTGACACAGCCAAATCCAAA-3'及びリバース5'-GCCAAAACGGGTGTTGTTAC-3')、ヒト18S rRNAに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(フォワード5'-CGCAGCTAGGAATAATGGAATAGG-3'及びリバース5'-GCCTCAGTTCCGAAAACCAA-3')、マウスMyd88に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(フォワード5'-CACCTGTGTCTGGTCCATTG-3'及びリバース5'-AGGCTGAGTGCAAACTTGGT-3')、マウスNlrp3に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(フォワード5'-ATGCTGCTTCGACATCTCCT-3'及びリバース5'-AACCAATGCGAGATCCTGAC-3')、マウスIl18に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(フォワード5'-GACAGCCTGTGTTCGAGGAT-3'及びリバース5'-TGGATCCATTTCCTCAAAGG-3')及びマウス18S rRNAに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(フォワード5'-TTCGTATTGCGCCGCTAGA-3'及びリバース5'-CTTTCGCTCTGGTCCGTCTT-3')を使用した。QPCRサイクル条件は、50℃にて２分間、95℃にて10分間、続いて40サイクルの２工程増幅プログラム(95℃にて15秒間及び58℃にて１分間)であった。増幅の終時に、Sequence Detection system社の解離プロトコールを用いて融解曲線分析を適用して、非特異PCR産物の混入を排除した。PCR産物はアガロースゲルによっても確証し、予想サイズに唯一の特異バンドが示された。ネガティブコントロールについては、QPCRにおいてRT産物なしをテンプレートとして使用し、ゲルにより検出されるバンドの不在により検証した。標的遺伝子の相対的発現を2-ΔΔCt法により決定した。
【０１１９】
miRNA定量。miRNAを含有するトータルRNAをポリアデニル化し、ユニバーサルリバースプライマーを下記のフォワードプライマーと組み合わせて用いるAll-In-One miRNA q-RT-PCR Detection Kit(GeneCopoeia)を製造業者の仕様に従って用いてユニバーサルプライマーで逆転写した：マウスmiR-184(5'-TGGACGGAGAACTGATAAGGGT-3')；マウスmiR-221/222(5'-AGCTACATCTGGCTACTGGGT-3')；マウスmiR-320a(5'-AAAAGCTGGGTTGAGAGGGCGA-3')及びマウスmiR-484(5'-TCAGGCTCAGTCCCCTCCCGAT-3')。miRNAレベルは、2-ΔΔCt法を用いるU6 snRNA(5'-AAATTCGTGAAGCGTTCC-3')のレベルに対して規格化した。検出は、下記の条件でSYBR green qPCRにより行った：95℃にて10分間、続いて40サイクルの95℃にて10秒間、60℃にて20秒間及び72℃にて20秒間。アンプリコン特異性は、融解曲線分析及びアガロースゲル電気泳動による独特なバンドによって評価した。
【０１２０】
ウェスタンブロッティング。組織又は細胞を、溶解緩衝液(10mM Tris塩基、pH7.4、150mM NaCl、１mM EDTA、１mM EGTA、１％ Triton X-100、0.5％ NP-40、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル(Roche))中でホモジナイズした。タンパク質濃度は、標準物質としてウシ血清アルブミンを用いてBradfordアッセイキット(Bio-Rad)で決定した。タンパク質(40〜100μg)をNuPAGE Bis-Trisゲル(Invitrogen)上で泳動し、Immun-Blot PVDFメンブレン(Bio-Rad)に転移させた。細胞は、温Laemmli緩衝液(62.5mM Tris塩基、pH6.8、２％SDS、５％ 2-メルカプトエタノール、10％グリセロール、0.01％ブロモフェノールブルー)中に擦り取った。サンプルを沸騰させ、４〜20％ NuPAGE Tris-Glycineゲル(Invitrogen)上で泳動した。転移メンブレンをRTにて１時間ブロックし、ヒトカスパーゼ-１に対する抗体(1:500；Invitrogen)、マウスカスパーゼ１に対する抗体(1:500；MBL)、NLRP3に対する抗体(1:1000；Enzo Life Sciences)、PYCARDに対する抗体(1:1000, RayBiotech)、ホスホ-IRAK1(S376)に対する抗体(1:500, Thermo Scientific)、ホスホ-IRAK4(T345)に対する抗体(1:500, AbboMax)、DICER1に対する抗体(1:2,000；Bethyl)、MyD88に対する抗体(1:1,000；細胞シグナル伝達)及びマウスIL-18に対する抗体(1:200；MBL)と４℃にて一晩インキュベートした。タンパク質負荷量は、抗ビンキュリン抗体(1:1,000；Sigma-Aldrich)を用いる免疫ブロッティングにより評価した。二次抗体(1:5,000)をRTにて１時間使用した。シグナルは、増強化学発光(ECL plus)により視覚化し、VisionWorksLS Image Acquisition and Analysisソフトウェア(Version 6.7.2, UVP, LLC)により取り込んだ。
【０１２１】
細胞培養。全ての細胞培養物を37℃にて５％ CO2で維持した。初代マウスRPE細胞は以前(Yangら，2009)に記載されたように単離し、20％ FBS及び標準の抗生物質濃度を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で増殖させた。初代ヒトRPE細胞は以前(Yangら，2008)に記載されたように単離し、10％ FBS及び抗生物質を補充したDMEMで維持した。HeL細胞は、20％ FBS及び標準の抗生物質濃度を補充したDMEMで維持した。THP-1細胞は、10％ FBS及び抗生物質を補充したRPMI 1640培地で培養した。
【０１２２】
Alu RNAのインビトロ転写。２種のAlu RNAを合成した：cDNAクローンTS 103を起源とする281nt Alu配列(Shaikhら，1997)及び地図状萎縮を有するヒト眼のRPEから単離した302nt Alu配列。これらAlu配列を隣接の5' T7プロモーターと共に含有する線状化プラスミドを、製造業者の指示に従ってAmpliScribeTM T7-FlashTM Transcriptionキット(Epicentre)に供した。DNase処理RNAを、MEGAclearTM(Ambion)を用いて精製し、完全性をゲル電気泳動によりモニターした。このことにより、Pol III由来転写物と同一の規定された二次構造に折り畳まれる一本鎖RNAが得られる。示される場合、転写RNAはウシ腸アルカリホスファターゼ(Invitrogen)を用いて脱リン酸化し、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール沈降により再精製した。
【０１２３】
一過性トランスフェクション。ヒト又はマウスのRPE細胞は、リポフェクタミン2000(Invitrogen)を製造業者の指示に従って用いて、pUC19、pAlu、pCDNA3.1/Dicer-FLAG、pCDNA3.1、Alu RNA、NLRP3 siRNAセンス(5'-GUUUGACUAUCUGUUCUdTdT-3')、PYCARD siRNAセンス(5'-GAAGCUCUUCAGUUUCAdTdT-3')、MyD88 siRNAセンス(センス：5'-CAGAGCAAGGAAUGUGAdTdT-3')、VDAC1 siRNAセンス(5'-CGGAAUAGCAGCCAAGUdTdT-3')、VDAC2 siRNAセンス(5'-CCCUGGAGUUGGAGGCUdTdT-3')、VDAC3 siRNAセンス(5'-GCUUUAAUCGAUGGGAAdTdT-3')、DICER1アンチセンスオリゴヌクレオチド(AS)(5'-GCUGACCTTTTTGCTUCUCA-3')、コントロール(DICER1用)のAS(5'-TTGGTACGCATACGTGTTGACTGTGA-3')、Alu AS(5'-CCCGGGTTCACGCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCACGAGTAGCTGGGACTACAGGCGCCCGACACCACTCCCGGCTAATTTTTTGTATTTTT-3')、コントロール(Alu用)のAS(5'-GCATGGCCAGTCCATTGATCTTGCACGCTTGCCTAGTACGCTCCTCAACCTATCCTCCTAGCCCGTTACTTGGTGCCACCGGCG-3')でトランスフェクトした。
【０１２４】
アデノウイルス感染。細胞を15×103/cm2の密度で播種し、16時間後、約50％コンフルーエンス時に、細胞にAdCre又はAdNull(Vector Laboratories)を1,000の多重感染度で感染させた。
細胞生存能。MTSアッセイを、CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferationアッセイ(Promega)を製造業者の指示に従って用いて行った。Alu RNA誘導細胞死におけるグリシンの細胞保護効果を調べるために、ヒトRPE細胞をpNull/pAluでトランスフェクトした。トランスフェクション後６時間で、細胞を、グリシン(５mM)含有完全培地又はビヒクルとインキュベートし、24時間後に細胞生存能を評価した。同様に、LPS(５μg/mlで６時間)でプライムしたヒトRPE細胞を、グリシン含有培地(５mM)の存在下にATP(25μM)で処理した。ATP処理の30分後に細胞生存能を上記のように評価した。
カスパーゼ-１活性。カスパーゼ-１活性は、細胞をCaspalux1E1D2試薬(OncoImmunin)と共に製造業者の指示に従ってインキュベートすることにより可視化した。Caspalux1E1D2シグナルは、Synergy 4リーダー(Biotek)を用いて蛍光(励起552nm、発光580nm)を読み取って定量した。画像からの蛍光の定量は、Adobe Photoshop CS5において画像をグレースケールに変換し、ImageJソフトウェア(NIH)(Bogdanovichら，2008)を用いて白黒画像の積算密度を測定することにより行った。
【０１２５】
ROS産生。細胞ROS産生は、ROS特異的プローブ2'7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(H2DCFDA, BioChemica, Fluka)を用いて評価した。ミトコンドリアROS産生は、MitoSOXTM Red(Invitrogen)を用いて評価した。サブコンフルーエントのヒトRPE細胞をpNull又はpAluでトランスフェクトした。24時間後、細胞に、10μMのH2DCFDA又は生存細胞の画像化用のMitoSOXTM Red(Invitrogen)ミトコンドリアスーパーオキシドインジケーターを37℃にて10分間ロードし、PBSで２回洗浄した。H2DCFDAについては、蛍光を、96ウェルプレート中、FITCフィルター(励起485nm、発光538nm)を用いてSynergy 4リーダー(Biotek)で記録した。ミトコンドリアROSシグナルとの共定位のために呼吸ミトコンドリアを可視化するため、PBS洗浄後、細胞をMitoTracker Deep RedTM(Invitrogen)と共に37℃にて30分間インキュベートし、その後PBSで２回洗浄した。蛍光シグナルは、Leica SP-5又はZeiss Axio Observer Z1顕微鏡を用いて検出した。ファゴソームROS産生は、Fc-OXYBURST GreenTMアッセイ(Invitrogen)を用いて評価した。サブコンフルーエントなヒトRPE細胞をpNull又はpAluでトランスフェクトしたか、又はPMA(0.5μg/ml；Sigma-Aldrich)で処理した。細胞をクレブスリンガーPBS(KRP)と共に37℃にて20分間インキュベートした後、Fc-OXYBURST GreenTMを添加した。細胞からの総蛍光を、Fc-OXYBURST GreenTMの添加直後に、FITCフィルター(励起485nm、発光538nm)を用いてSynergy 4リーダー(Biotek)で測定した。
【０１２６】
RNA結合性タンパク質免疫沈降(RIP)：NLRP3とAlu RNAとの間の物理的相互作用を、RNA ChIP-ITキットを製造業者(Active Motif)の指示に従って用いて調べた。簡潔には、ヒトRPE細胞をpAlu及びpNLRP3-FLAG(G. Nunezより提供)でトランスフェクトし、タンパク質-RNA複合体を、NLRP3に対する抗体(Enzo Life Sciences)若しくはFLAG(Sigma-Aldrich)に対する抗体又はコントロールIgG(Sigma-Aldrich)で免疫沈降させた。これら免疫沈降物から単離したRNAを、Alu特異的プライマーを用いるリアルタイムRT-PCRにより分析した。
ELISA。馴化細胞培養培地中の分泌サイトカイン含量を、ヒトIL-1β及びIL-18 ELISAキット(R&D)を製造業者の指示に従って用いて分析した。
【０１２７】
TLRスクリーニング。カスタムTLRリガンドスクリーニングを、個々のTLRファミリーメンバーを過剰発現するHEK293細胞をAP-1/NF-κBレポーター系と組み合わせて用いるInvivoGenにより行った。細胞は、インビトロ転写により合成した２種のAlu RNAの各々又はTLR特異的ポジティブコントロールリガンドで刺激した。
統計学。結果は、平均±SEMとして表し、ｐ<0.05を統計学的に有意と見なす。群間の差は、必要に応じてマンホイットニーＵ検定又はスチューデントｔ検定を用いて比較し、両側ｐ値を報告する。
【０１２８】
実施例２
インビトロ転写Alu RNA及びAluをコードするプラスミド(pAlu)が共にIL-18分泌を誘導することによりRPE細胞死を誘導し、IL-18分泌がカスパーゼ-３活性化を導くMyD88依存性シグナル伝達を誘引することが示された。この細胞死経路に介在する機序工程を決定することが求められた。
【０１２９】
カスパーゼ-８はカスパーゼ-３を活性化することが知られている(Stennickeら，1998)。したがって、カスパーゼ-８阻害がAlu RNA又はpAluにより誘導されるRPEの細胞死又は変性を阻害するかどうかを調べた。カスパーゼ-８阻害性ペプチドZ-IETD-FMKは、野生型マウスにおいてpAluにより誘導されるRPE変性をブロックするが、コントロールペプチドZ-FA-FMKはブロックしないことが見出された(図14)。Z-IETD-FMKはまた、Alu RNA(図15)又はpAlu (図16)により誘導されるヒトRPE細胞死を阻害した。組換えIL-18の網膜下注射が、野生型マウスのRPEにおいて、蛍光アッセイによりモニターされるように、カスパーゼ-８の活性化を誘導することも見出された(図17)。これらデータは、Alu RNA-又はpAlu誘導IL-18がカスパーゼ-３活性化の上流でカスパーゼ-８活性化を導くことを示唆する。
【０１３０】
MyD88は、Fas関連死ドメインタンパク質(FADD)に結合し、カスパーゼ８を介してアポトーシスを誘導することが知られている(Aliprantisら，2000)。したがって、Fas(CD95によりコードされる)又はFasL(Faslgによりコードされる)の除去がAlu RNA、pAlu又はIL-18により誘導されるRPEの細胞死又は変性を阻害するかどうかを調べた。pAlu(図18)もAlu RNA(図19)もCD95-/-(Faslpr)マウスにおいてRPE変性を誘導しないことが見出された。加えて、組換えIL-18もまた、CD95-/-(Faslpr)マウスにおいてRPE変性を誘導しなかった(図20)。同様に、pAlu(図21)、Alu RNA(図22)及びIL-18(図23)は、Faslg-/-(Faslgld)マウスにおいてRPE変性を誘導しなかった。
【０１３１】
Alu RNAはNLRP3インフラマソームを介してRPE変性を誘導することが示されている。NF-κB活性化はNLRP3活性化に必要とされる(Bauernfeindら，2009；Qiaoら，2012)ので、Alu RNAがRPE変性を誘導するためにNF-κBを必要とするかどうかを調べた。事実、Alu RNAはNfkb1-/-マウスにおいてRPE変性を誘導しないことが見出された。このことは、NF-κB活性化がこの細胞死経路における重要な工程であることを確証する。
【０１３２】
実験手順
マウス。全ての動物実験は、研究所の審査委員会により承認され、Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Visual Researchに従った。野生型C57BL/6J、Fas-/-(CD95又はFaslprとしても知られる)、Faslg-/-(Fasgldとしても知られる)及びNfkb1-/-マウスはThe Jackson Laboratoryから購入した。全ての手順について、麻酔は、100mg/kg塩酸ケタミン(Ft. Dodge Animal Health)及び10mg/kgキシラジン(Phoenix Scientific)の腹腔内投与により行い、局所１％トロピカミド(Alcon Laboratories)で瞳孔を散大させた。
【０１３３】
眼底写真撮影。散大したマウス眼の網膜写真を、デジタル画像化システム(Sony)に連結したTRC-50 IXカメラ(Topcon)で撮影した。
網膜下注射。マウスにおける網膜下注射(１μL)は、Pico-Injector(PLI-100, Harvard Apparatus)を用いて行った。２つの異なるAlu配列をコードするプラスミド(pAlu)又は空のコントロールベクター(pNull)(Bennettら，2008；Kanekoら，2011；Shaikhら，1997)のインビボトランスフェクションは、10％ Neuroporter(Genlantis)を用いて達成した。インビトロ転写Alu RNAは0.3mg/mLで注射した。
【０１３４】
薬物処置。組換えIL-18(Medical & Biological Laboratories)、カスパーゼ-８阻害剤Z-IETD-FMK(R&D Systems)、コントロールカスパーゼ阻害剤Z-FA-FMK(R&D Systems)、IRAK1/4阻害剤(Calbiochem)は、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS；Sigma-Aldrich)又はジメチルスルホキシド(DMSO；Sigma-Aldrich)に溶解し、総容量１μLで33ゲージExmireマイクロシリンジ(Ito Corporation)を用いて硝子体液中に注射した。
【０１３５】
細胞培養。全ての細胞培養物を37℃にて５％ CO2で維持した。初代マウスRPE細胞は以前(Yangら，2009)に記載されたように単離し、20％ FBS及び標準の抗生物質濃度を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で増殖させた。初代ヒトRPE細胞は以前(Yangら，2008)に記載されたように単離し、10％ FBS及び抗生物質を補充したDMEMで維持した。HeL細胞は、20％ FBS及び標準の抗生物質濃度を補充したDMEMで維持した。THP-1細胞は、10％ FBS及び抗生物質を補充したRPMI 1640培地で培養した。
【０１３６】
Alu RNAのインビトロ転写。我々は、地図状萎縮を有するヒト眼のRPEから単離した302nt Alu配列を合成した。このAlu配列を隣接の5' T7プロモーターと共に含有する線状化プラスミドを、製造業者の指示に従ってAmpliScribeTMT7-FlashTM Transcriptionキット(Epicentre)に供した。DNase処理RNAを、MEGAclearTM(Ambion)を用いて精製し、完全性をゲル電気泳動によりモニターした。このことにより、Pol III由来転写物と同一の規定された二次構造に折り畳まれる一本鎖RNAが得られる。示される場合、転写RNAはウシ腸アルカリホスファターゼ(Invitrogen)を用いて脱リン酸化し、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール沈降により再精製した。
【０１３７】
一過性トランスフェクション。ヒトRPE細胞は、リポフェクタミン2000(Invitrogen)を製造業者の指示に従って用いて、pUC19、pAlu、Alu RNA、VDAC1 siRNAセンス(5'-CGGAAUAGCAGCCAAGUdTdT-3')、VDAC2 siRNAセンス(5'-CCCUGGAGUUGGAGGCUdTdT-3')、VDAC3 siRNAセンス(5'-GCUUUAAUCGAUGGGAAdTdT-3')でトランスフェクトした。
細胞生存能。MTSアッセイを、CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferationアッセイ(Promega)を製造業者の指示に従って用いて行った。
【０１３８】
カスパーゼ-８活性。RPE組織を、溶解緩衝液(10mM Tris塩基、pH7.4、150mM NaCl、１mM EDTA、１mM EGTA、１％ Triton X-100、0.5％ NP-40、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル(Roche))中でホモジナイズした。タンパク質濃度は、標準物質としてウシ血清アルブミンを用いてBradfordアッセイキット(Bio-Rad)で決定した。カスパーゼ-３活性は、Caspase-8 Fluorimetric Assay(R&D)を製造業者の指示に従って用いて測定した。
統計学。結果は、平均±SEMとして表し、ｐ<0.05を統計学的に有意と見なす。群間の差は、必要に応じてマンホイットニーＵ検定又はスチューデントｔ検定を用いて比較し、両側ｐ値を報告する。
【０１３９】
カスパーゼ画像化法
Alu RNA又は組換えIL-18を、０日目に野生型マウスの網膜下腔に注射した。DyeLight782-VAD-FMK3(ThermoScientific)(生物活性カスパーゼの存在下に蛍光を発するプローブ)を、注射後２日目又は３日目に野生型マウスの硝子体液中に注射した。
平面マウント画像化。DyeLight782-VAD-FMK3の注射後24時間で、アイカップをマウスから切り出し、神経網膜を除去し、RPEの平面マウントを調製し、蛍光顕微鏡下で観察した。
生存眼におけるインビボバイオ画像化。DyeLight782-VAD-FMK3の注射後０〜24時間の間に、ICGフィルターを用いてTopcon 50IXカメラで眼底写真を撮影した。
【０１４０】
本明細書を通じて、種々の参考文献が挙げられる。このような全ての参考文献は、各個の参考文献が個別具体的に参照により組み込まれる場合と同程度に、参照により本明細書中に組み込まれる。参考文献には、以下のリストに記載される参考文献が含まれる：
【０１４１】
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【０１６０】
201) 2011年１月14日出願の米国仮特許出願第61/432,948号
202) 2011年６月１日出願の国際特許出願第PCT/US11/38753号
203) 2011年１月18日出願の米国仮特許出願第61/508,867号
204) 2011年10月４日出願の米国仮特許出願第61/543,038号
205) 2012年１月13日出願の米国仮特許出願第61/586,427号
【０１６１】
本明細書中で開示した主題の種々の詳細は、本明細書中に開示した主題の範囲を逸脱することなく、変更できることが理解される。更に、前記の説明は、例示の目的のためだけであり、限定を目的としていない。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図５】
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【図７】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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