(57)【要約】  本発明は、円偏光二色性をガイダンスツールとして用いることによって、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシン、及びＬ−リシンを含むポリペプチドの混合物を調製するための新規なプロセスを開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
円偏光二色性をガイダンスツールとして用いることによって、Ｌ−グルタメート、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシン、及びＬ−リシンを含むポリペプチドを調製するプロセスであって、
ｉ．保護Ｌ−グルタメート、Ｌ−アラニン、所望に応じて保護されているＬ−チロシン、及び保護Ｌ−リシンのＮ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）誘導体を重合させることと、
ｉｉ．所望に応じて好適な溶媒中で酸性樹脂によって処理することと、
ｉｉｉ．好適な含水率の好適な溶媒中で塩基によって処理することと、
ｉｖ．酢酸を加えることによって、ｐＨを調節することと、
ｖ．酢酸ガラティラメルを単離することと、
を含むプロセス。
【請求項２】
保護Ｌ−グルタメートＮＣＡ誘導体が、Ｌ−グルタミン酸のγ−アルキルエステルである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
γ−アルキルエステルが、所望に応じて保護されているγ−メチル、γ−エチル、γ−プロピル、γ−ブチルのエステル、又はこれらの混合物である、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
所望に応じて保護されているγ−メチルがγ−ベンジルである、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
所望に応じて保護されているＬ−チロシンが、Ｌ−チロシン、アセチル−Ｌ−チロシン、又はこれらの混合物から選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項６】
保護Ｌ−リシンがεＮトリフルオロアセチルＬリシンである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
酸性樹脂が、Ｌｅｗａｔｉｔ  Ｋ２６２９、Ｄｉａｉｏｎ  ＵＢＫ５５０、Ｄｉａｉｏｎ  ＳＫ１１０、又はＡｍｂｅｒｌｙｓｔ−１５から選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項８】
反応温度が３０〜７０℃である、請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
前記塩基がＭＯＲという式で表されるアルカリ金属アルコキシドから選択され、前記式中、Ｍ＝アルカリ金属、Ｒ＝ＣnＨn+1、ｎ＝１〜１０である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記好適な塩基が、ナトリウムメトキシド、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、カリウムｔｅｒｔブトキシド、ナトリウムエトキシド、又はこれらの混合物から選択される、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記好適な溶媒が、無水メタノール、エタノール、ｔｅｒｔブタノール、ｎ−ブタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、又はこれらの混合物から選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記溶媒の含水率が０．５％を超えてはならない、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記溶媒の含水率が正確に、０．１％未満でなければならない、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
反応温度が−２０〜６０℃である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１５】
反応持続時間が２〜７２時間である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１６】
円偏光二色性をガイダンスツールとして用いることによって、Ｌ−グルタメート、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシン、及びＬ−リシンを含むポリペプチドを調製するプロセスであって、
ｉ．保護Ｌ−グルタメート、Ｌ−アラニン、所望に応じて保護されているＬ−チロシン、及び保護Ｌ−リシンのＮ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）誘導体を重合させることと、
ｉｉ．好適な含水率の好適な溶媒中でアルカリ金属アルコキシドによって処理することと、
ｉｉｉ．ｐＨを酢酸で調節することと、
ｉｖ．酢酸ガラティラメルを単離することと、
を含むプロセス。
【請求項１７】
保護Ｌ−グルタメートＮＣＡ誘導体がγ−アルキルエステルである、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項１８】
γ−アルキルエステルが、所望に応じて保護されているγ−メチル、γ−エチル、γ−プロピル、γ−ブチルのエステル、又はこれらの混合物である、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項１９】
所望に応じて保護されているγ−メチルがγ−ベンジルである、請求項１８に記載のプロセス。
【請求項２０】
所望に応じて保護されているＬ−チロシンが、Ｌ−チロシン、アセチル−Ｌ−チロシン、又はこれらの混合物から選択される、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項２１】
保護Ｌ−リシンがεＮトリフルオロアセチルＬリシンである、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項２２】
用いる前記アルカリ金属アルコキシドが、ＭＯＲという式で表されるものであり、前記式中、Ｍ＝アルカリ金属、Ｒ＝ＣnＨn+1、ｎ＝１〜１０である、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記好適な溶媒が、無水メタノール、エタノール、ｔｅｒｔブタノール、ｎ−ブタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、又はこれらの混合物から選択される、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記溶媒の含水率が０．５％を超えてはならない、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項２５】
前記溶媒の含水率が正確に、０．１％未満でなければならない、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２６】
反応温度が−２０〜６０℃である、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項２７】
反応持続時間が２〜７２時間である、請求項１６に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
アミノ酸のＬ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシン、及びＬ−リシンから構成されるランダムポリペプチドの新規調製プロセス、並びに、この合成の際の分析ツールとして円偏光二色性を用いることを開示する。製薬学的に許容可能な塩の形態であるガラティラメルとして、このランダムポリマー混合体を用いて、多発性硬化症を治療する。
【背景技術】
【０００２】
円偏光二色性（ＣＤ）分光法は、物質による右円偏光と左円偏光の吸光度の差を測定する吸光分光法の一形態である。この現象から得られるスペクトルはＣＤスペクトルと呼ばれており、このスペクトルでは、ＣＤシグナルはミリ度（ｍｄｅｇ）という単位で表される。この現象は、光学活性なキラル分子の吸収帯で発現する。ＣＤ分光法には、多種多様な分野において広範な用途がある。最も顕著には、ＵＶ  ＣＤは、タンパク質の二次構造を調べるのに用いられる。ＵＶ／Ｖｉｓ  ＣＤは、電荷移動遷移を調べるのに用いられる。この技法は、Ｘ線結晶構造解析又はＮＭＲ分光法から得られる原子座標がもたらすような情報をすべてもたらすわけではないが、生物製剤の製造において構造的再現性を見るのに非常に有用である。生物によって合成されるほぼすべての分子は光学的に活性である。自然界では、片方の化学異性体がもう一方よりも優位を占めている（例えば、大半の生物ではＬ−アミノ酸はＤ−アミノ酸よりも優位を占めており、Ｄ−糖は各Ｌ型異性体よりも優位を占めている）。鏡面又は反転中心のないこれらのような分子はキラルであるので、偏光光を変調する。タンパク質の二次構造は、「遠紫外」スペクトル領域（２００〜２６０ｎｍ）でのＣＤ分光法によって割り出すことができる。これらの波長では、発色団はペプチド結合であり、ペプチド結合が通常のフォールドされた環境に置かれていると、シグナルが現れる。
【０００３】
ガラティラメルは、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシン、及びＬ−リシンという４つのアミノ酸から構成されるペプチド系ポリマーである。その製薬学的に許容可能な塩である酢酸ガラティラメルは、ＦＤＡから認可されており、多発性硬化症の治療用に、Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）として市販されている。Ｃｏｐａｘｏｎｅは、コポリマー−１及びｃｏｐ−１としても知られている。多発性硬化症は、神経細胞のミエリン鞘の損傷（その結果、軸索の脱髄が生じる）により、脳及び中枢神経系に影響を及ぼす自己免疫疾患である。酢酸ガラティラメルは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の合成ポリペプチドアナログである。薬理学的には、Ｃｏｐａｘｏｎｅは、多発性硬化症による攻撃を抑える非インターフェロンかつ非ステロイド性の免疫調節剤である。酢酸ガラティラメルは、皮下注射によって投与する。
【０００４】
化学的には、酢酸ガラティラメルは、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−リシン、及びＬ−チロシンのポリマーの酢酸塩と称される。その構造式は以下のとおりである。
【０００５】
【化１】
2014532692.tif 000002
【０００６】
酢酸ガラティラメルの平均分子量は５，０００〜１１，０００ダルトンであり、上記の各アミノ酸の平均モル分率は０．１４１、０．４２７、０．０９５、及び０．３３８である。
【０００７】
米国特許第３，８４９，５５０号には、免疫療法剤によって実験的アレルギー性脳脊髄炎（多発性硬化症に類似する疾患）におけるＭＢＰの抑制が観察されることが記載されている。継続的な努力により、酢酸ガラティラメルは、安全性と効能が向上した、多発性硬化症治療用の進歩的なアナログとして得られている。
【０００８】
米国特許第５，８００，８０８号、同第５，９８１，５８９号、同第６，０４８，８９８号には、アラニン、γ−ベンジルグルタメート、Ｎ−トリフルオロアセチルリシン、及びチロシンに由来するＮ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）を用いる、酢酸ガラティラメルの調製プロセスが記載されている。重合してから、グルタメートのγ−ベンジルエステルと、リシンのＮε−トリフルオロアセチル誘導体を順次切断し、酢酸塩を形成させて、最後に精製するという工程に従う。米国特許第６，６２０，８４７号には、リシンのトリフルオロアセチルの切断にピペリジン水溶液を用いる、酢酸ガラティラメルの調製プロセスが記載されている。米国特許第７，０４９，３９９号には、グルタメートのγ−ベンジルエステルの切断に、触媒移動水素化を用いる、ポリペプチド−１の調製プロセスが記載されている。欧州特許第１，８０７，４６７号には、アラニン、チロシン、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルＬ−リシン、及び保護グルタミン酸のＮＣＡを用いる、ガラティラメルの調製プロセスであって、保護基がγ−メトキシベンジルおよびγ−ベンジルから選択されるプロセスが記載されている。米国特許第７，４９５，０７２号には、精製臭化水素酸を用いる、ポリペプチドの混合物の調製プロセスが記載されている。これらのすべてのプロセスの大きな欠点は、不純物の生成、多数の精製工程、同じプロセスを用いて製造した異なるバッチ間での二次構造のばらつきである。
【０００９】
ＧＡに存在する固有のランダム性のため、質量分光法、ペプチドマッピング、及びクロマトグラフィーベースの方法など、ペプチドの同定のための通常用いられている分析技法では、異なる合成ルートによって作られたＧＡ間に、全体的な違いがある場合、速やかにその違いの存在を明確に解明することができない。一方、遠紫外ＣＤスペクトルは、上記のランダムコポリマーを構成するペプチドアンサンブルにおける違いについての知見を得る助けとなることができる決定的ツールであることが立証されている。ＧＡの遠紫外ＣＤスペクトル（図１、実線）は、２つの別個の二次構造特性、すなわちランダムコイル（波長域１９５〜２１５ｎｍにおけるＣＤ吸光度）とαヘリックス（２２２ｎｍにおけるＣＤ吸光度）の存在を示している。したがって、ＧＡは、２つのペプチドアンサンブルによって構成されていると言ってよい。この配列からの逸脱はいずれも、図１に示されているように、遠紫外ＣＤスキャンによって認識される。
【００１０】
したがって、遠紫外ＣＤスペクトルは、酢酸ガラティラメルランダムコポリマーを構成する適当なペプチドアンサンブルを得るための合成ルーツを設計する際のガイドツールとして用いることができる。
【００１１】
酢酸ガラティラメルを合成するための本発明の新規なプロセスは、バッチ間での二次構造のばらつきを防ぎ、酢酸ガラティラメルを製造するための強固なプロセスであることが分かっている。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、酢酸ガラティラメルを調製するための新規かつ強固なプロセスを説明する。本発明は、樹脂とアルカリ金属アルコキシドを独立して用いることによる、保護ポリマーの脱保護を開示するプロセスを示す。実施形態のうちの１つでは、アラニン、チロシン、Ｎ−トリフルオロアセチルＬ−リシン、及び保護グルタミン酸のＮＣＡの重合後、酸性樹脂に続いて好適な塩基を用いて、保護Ｌ−グルタメート部分と保護ｌ−リシンを別々に脱保護する。
【００１３】
別の実施形態では、アラニン、チロシン、Ｎ−トリフルオロアセチルＬ−リシン、及び保護グルタミン酸のＮＣＡの重合後、アルカリ金属アルコキシドを用いることによって、保護Ｌ−グルタメート部分と保護ｌ−リシンを１回の工程で脱保護する。
【００１４】
脱保護後、上記のいずれのケースでも、プロセスを進めて酢酸塩を作製してから、任意に応じて精製を行う。
【００１５】
開示のプロセスは、大規模での取扱い、操作、及び単離のしやすさが向上している。ＨＢｒ、Ｈ2ＳＯ4など、保護基を切断するための他の試薬に比べて、本発明において脱保護で用いる酸性樹脂は、危険性が小さく、取扱いやすく、反応混合物からの分離が良好である。
【００１６】
さらに、さまざまな種類の塩基を用いて、酢酸ガラティラメルの合成を行い、サイズ排除クロマトグラフィー及び円偏光二色性を含む各種の分析技法を用いて分析した。
【００１７】
さまざまな種類の塩基を用いて合成した酢酸ガラティラメルの分子量分布曲線（ＳＥＣ）が、ＲＬＤのものとともに重ねて示されているが、ＲＬＤと比較したところ、遠紫外ＣＤスペクトルに差異があった。
【００１８】
図２は、一般的なＧＡとＲＬＤの分子量分布曲線（ＳＥＣ）を重ねて示したものである。
【００１９】
図３は、ＲＬＤとの遠紫外ＣＤスペクトルの比較を示している。
【００２０】
上記の分析データに基づき、分子量分布と遠紫外−ＣＤスペクトルをＲＬＤと比較できるように、新規かつ代替的なプロセスを開発した。
【００２１】
本発明は、トリフルオロアセチル基の脱保護で、アルカリ金属アルコキシド、より正確には、カリウムｔｅｒｔブトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、及びナトリウムｔｅｒｔブトキシド（これらに限らない）を用いて、酢酸ガラティラメルを合成することを開示する。
【００２２】
図４は、アルカリ金属アルコキシドを用いて合成した一般的なＧＡと、ＲＬＤの分子量分布曲線（ＳＥＣ）を重ねて示したものである。
【００２３】
図５は、ＲＬＤとの遠紫外ＣＤスペクトルの比較を示している。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、一般的なＧＡ（実線）とＲＬＤ（破線）の重ね書き遠紫外ＣＤスペクトルである。
【図２】図２は、一般的なＧＡとＲＬＤの分子量分布曲線（ＳＥＣ）を重ねて示したものである。
【図３】図３は、ＲＬＤとの遠紫外ＣＤスペクトルの比較を示している。
【図４】図４は、アルカリ金属アルコキシドを用いて合成した一般的なＧＡと、ＲＬＤの分子量分布曲線（ＳＥＣ）を重ねて示したものである。
【図５】図５は、ＲＬＤとの遠紫外ＣＤスペクトルの比較を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
保護Ｌ−グルタメート、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシン、及び保護Ｌ−リシンのＮＣＡ誘導体は、既知の手順に従うことによって調製する。重合すると、これらの誘導体は、対応する保護コポリマーを生成させる。好適な試薬によって保護基を脱保護すると、粗ガラティラメルが得られ、さらに氷酢酸で処理し、精製して、純粋な酢酸ガラティラメルを得る。
【００２６】
本発明の一実施形態では、保護ポリマー１を固体酸性樹脂で処理し、後処理手順を行って、酸不安定基を切断することによって、対応する保護ポリマー２を生成させる。大規模でも、反応はスムーズに短時間で進行し、続いて、簡潔な後処理及び単離工程を行った。別の既知の文献の酸に比べると、これらの樹脂介在反応の反応後処理手順は非常に簡潔である。
【００２７】
【化２】
2014532692.tif 000003
【００２８】
そのポリマーにおける成分の１つとしてγ−ベンジルグルタメートのＮＣＡ誘導体を用いて、保護ポリマー１を生成させ、Ｌｅｗａｔｉｔ  Ｋ２６２９、Ｄｉａｉｏｎ  ＵＢＫ５５０、Ｄｉａｉｏｎ  ＳＫ１１０、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ−１５、又はこれらの混合物から選択された酸性樹脂で処理して、対応する保護コポリマー２を生成させた。興味深いことに、上記の樹脂を適切な条件の好適な溶媒中の塩化アルミニウム、ＮａＩ／ＴＭＳＣｌと置換することによって、同じ保護ポリマー２が生成された。この溶媒は、ジオキサン、ＴＨＦ、アセトニトリル、水、又はこれらの混合物から選択される。次の工程では、アルカリ金属アルコキシド、より正確には、カリウムｔｅｒｔブトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、及びカリウムｔｅｒｔブトキシド、又はこれらの混合物から選択される好適な試薬を用いて、塩基不安定保護基を切断した。続いて、酢酸でｐＨを５．５に調節し、最後に精製して、酢酸ガラティラメルを得た。
【００２９】
【化３】
2014532692.tif 000004
【００３０】
別の実施形態では、アルキルグルタメート、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシン、及びε−Ｎ−トリフルオロアセチルＬ−リシンのＮＣＡ誘導体を用いて、保護ポリマー１を生成させた。アルキルグルタメートにおけるアルキル基は、炭素数１〜炭素数４のアルカンから選択され、所望に応じて、フェニル基で保護される。保護ポリマー１のすべての保護基の切断は、好適な溶媒中でアルカリ金属アルコキシドを用いて行った。さらに、氷酢酸を用いてｐＨを５．５に調節してから、精製し、酢酸ガラティラメルを得た。
【００３１】
アルカリ金属アルコキシドを脱保護用試薬として用いて合成した酢酸ガラティラメルは、ＲＬＤと比較したところ、一貫して、同様の二次構造プロファイルを示したとともに、バッチ間でのばらつきも見られなかった。
【００３２】
さらに別の実施形態では、アルカリ金属アルコキシドを用いて、２０〜６０℃の温度で、２〜７２時間の期間にて、塩基不安定基を脱保護した。
【００３３】
実施例：
実施例１：カリウムｔｅｒｔブトキシドを用いた酢酸ガラティラメルの調製：
保護ポリマー２の調製：
保護コポリマー（１ｇｍ）をＴＨＦと水の混合物に入れ、この混合物に、Ｌｅｗａｔｉｔ  Ｋ２６２９樹脂（１ｇｍ）を加え、６５℃で２４時間攪拌した。この樹脂をブフナー漏斗に通して濾過し、ＴＨＦ（５ｍｌ）で洗浄した。この反応マスを蒸留して体積を３〜４分の１にし、水を加え、沈殿生成物を濾過し、ＶＴＤ中で２４時間、４０〜４５℃にて乾燥した。収量：０．６ｇｍ。
【００３４】
酢酸ガラティラメルの調製：
保護ポリマー２（０．６ｇ）を無水メタノール（９ｍｌ）に溶解させた攪拌溶液に、カリウムターシャリーブトキシド（０．６ｇ）を加え、１時間攪拌した。反応マスを減圧下（３５℃未満）で濃縮した。この反応マスに水（０．６ｍＬ）を加え、ｐＨを氷酢酸で５．５に調節した。アセトンで結晶化することによって、粗酢酸ガラティラメルを単離した。結晶化固体を濾過し、吸引乾燥した。収量：０．４ｇ。
【００３５】
得られた粗酢酸ガラティラメルを精製のためにゲルパーミエーションクロマトグラフィーにかけた。
【００３６】
実施例２：ナトリウムメトキシドを用いた酢酸ガラティラメルの調製：
保護ポリマー２の調製：
保護コポリマー（１ｇｍ）をＴＨＦ（８ｍｌ）と水（ｍｌ）の混合物に入れ、この混合物に、Ｌｅｗａｔｉｔ  Ｋ２６２９樹脂（１ｇｍ）を加え、６５℃で２４時間攪拌した。この樹脂をブフナー漏斗に通して濾過し、ＴＨＦ（５ｍｌ）で洗浄した。この反応マスを蒸留して体積を３〜４分の１にし、水を加え、沈殿生成物を濾過し、ＶＴＤ中で２４時間、４０〜４５℃にて乾燥した。収量：０．６ｇｍ。
【００３７】
酢酸ガラティラメルの調製：
保護ポリマー２（０．６ｇ）を無水メタノール（６ｍｌ）に溶解させた攪拌溶液に、ナトリウムメトキシド（０．９ｇ）を無水メタノール（４．５ｍＬ）に溶解させた溶液を加え、７時間攪拌した。反応マスを減圧下（３５℃未満）で濃縮した。この反応マスに水（０．６ｍＬ）を加え、ｐＨを氷酢酸で６に調節した。アセトンで結晶化することによって粗酢酸ガラティラメルを単離した。結晶化固体を濾過し、吸引乾燥した。収量：０．４ｇ。
【００３８】
得られた粗酢酸ガラティラメルを精製のためにゲルパーミエーションクロマトグラフィーにかけた。
【００３９】
実施例３：ＴＭＳＣｌ／ＮａＩに続きナトリウムメトキシドを用いた酢酸ガラティラメルの調製：
保護ポリマー１（２０ｇ）を窒素雰囲気下でＴＨＦ（２００ｍｌ）に入れ、ヨウ化ナトリウム（１ｇ）に続き、トリメチルシリルクロリド（２０ｍｌ）を室温で加え、３時間攪拌した。反応の終了後、反応マスを水（２０ｍｌ）でクエンチした。その固体を濾過し、水（１００ｍｌ）で洗浄し、高真空下で乾燥して、保護コポリマー２（１０ｇ）を得た。
【００４０】
得られた保護ポリマー２を無水メタノール（１００ｍｌ）に懸濁させ、ナトリウムメトキシド（１５ｇ）を無水メタノール（７５ｍｌ）に溶解させた溶液を加え、室温で７時間攪拌した。反応の終了後、ｐＨを氷酢酸で６に調節し、そのマスを精製し、酢酸ガラティラメル（６ｇ）を得た。
【００４１】
実施例４：保護ポリマー３からの酢酸ガラティラメルの調製：無水メタノール（１０ｍｌ）中の保護コポリマー３（１ｇ）に、ナトリウムメトキシド（１．５ｇ）を無水メタノール（７．５ｍｌ）に溶解させた溶液を室温で加え、７時間攪拌した。反応の終了後、ｐＨを氷酢酸で５に調節した。得られたマスを精製して、酢酸ガラティラメル（０．６ｇ）を得た。
【００４２】
実施例１〜４に記載されているプロセスを用いて合成した酢酸ガラティラメルの遠紫外ＣＤスペクトルにより、波長域１９５〜２１５ｎｍにランダムコイル、２２２ｎｍの波長域にαヘリックスが存在することが示された（図５）。
【国際調査報告】
2014532692.tif 000005
2014532692.tif 000006
2014532692.tif 000007