(57)【要約】  分子インプリントポリマーの溶解性またはコロイド状のナノ粒子は、固定化されたテンプレートを保持する固相（１４）を含む反応容器（１８）を備えた光反応器内で、確実かつ一貫して製造される。温度、流量、および照射時間などのパラメータは、コンピュータ（５２）によって制御される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を有する分子インプリントポリマーのナノ粒子の製造方法：
（ｉ）固体担体上にテンプレート種を固定化することにより、担持されたテンプレート材料を提供する工程、
（ｉｉ）その担持されたテンプレート材料を、一以上の流れ入口、一以上の流れ出口、容器内容物の温度に影響するのに適した冷却器／加熱器、および容器内部を照射するのに適した照射源、を有する反応容器の中に配置する工程、
（ｉｉｉ）一以上の前記流れ入口を介して、該容器内に重合性組成物を通過させる工程、
（ｉｖ）該容器内部の温度を制御するための冷却器／加熱器を使用しながら、照射源により容器内部を照射して、重合性組成物の制御重合を行う工程、
（ｖ）重合により５００〜１，０００，０００ダルトンの範囲の分子量を有するナノ粒子が生成し、そのナノ粒子の少なくともいくつかが固定化されたテンプレートに結合した段階で照射を終了する工程、
（ｖｉ）一以上の前記入口および一以上の前記出口を介して前記容器内に溶媒を通過させることにより、該重合性組成物の未反応成分および未結合ポリマーを洗浄する工程、および、
（ｖｉｉ）前記結合ナノ粒子の少なくともいくつかが、固定化されたテンプレートから分離され、該容器から捕集容器に到達する条件下で、一以上の前記入口および一以上の前記出口を介して前記容器内に溶媒を通過させる工程（但し、前記条件は該冷却器／加熱器によって生じる一以上の温度増加、およびナノ粒子のテンプレートへの結合を阻害することが可能な溶媒組成物の使用を含む）。
【請求項２】
前記工程（ｖｉｉ）は、
（ａ）比較的弱くテンプレートに結合したナノ粒子が分離され、第１の前記捕集容器まで到達するように選択された条件での第１工程と、
（ｂ）より強く結合したナノ粒子が分離され、第２の捕集容器まで到達するように選択された条件での第二工程と、
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記重合工程（ｉｖ）は、−２０〜＋２０°の範囲で温度制御しながら行われ、
前記第１工程（ｖｉｉ）（ａ）は、２０〜４０°の範囲で温度制御しながら行われ、
前記第２工程（ｖｉｉ）（ｂ）は、６０〜８０°で温度制御しながら行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｉｉｉ）から（ｖｉｉ）は、コンピューター制御の下で行われる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記重合条件は、平均直径が４０〜１００ｎｍの粒子を製造するように制御される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記重合条件は、少なくとも５０％が４０〜１００ｎｍの範囲内の直径を有する粒子を製造するように制御される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記重合が、イニファーター系リビングラジカル重合である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ｖｉｉ）で分離されたナノ粒子を固定化されたテンプレートへ再結合させる後続の工程と、それに続いて、ナノ粒子をテンプレートから分離させる工程と、を有する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記分離したナノ粒子を更に重合させて、ナノ粒子上に、ブロックコポリマーセグメントをグラフト化する後続の工程を有する、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記分離したナノ粒子を、薬として、分析もしくは分離のためのレセプター特異的リガンドとして、または触媒として使用する後続の工程を有する、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
固定化されたテンプレート種を保持する固相を有する反応容器と、
該反応容器の内部を照射するように配置された照射源と、
重合性モノマーを含む流入物、および合成されたナノ粒子を含有する流出物を提供するための、反応容器と連通した流体システムと、
製造プロセスを制御するようにプログラム化されかつ配置されたコンピューターと、
を有する、分子インプリントポリマーのナノ粒子製造用の光反応器。
【請求項１２】
前記反応容器は、固定化されたテンプレート種を保持する前記固相を含有している請求項１１に記載の光反応器。
【請求項１３】
前記重合性モノマーを含有し、前記流体システムに連結された貯蔵容器を有する、請求項１１または１２に記載の光反応器。
【請求項１４】
前記反応容器は温度制御手段を備えている、請求項１１〜１３のいずれかに記載の光反応器。
【請求項１５】
前記照射源はＵＶ光源である、請求項１１〜１４のいずれかに記載の光反応器。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれかに記載の工程の実施に適用される、請求項１１〜１５のいずれかに記載の光反応器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子インプリントポリマーからなるナノ粒子を製造するための新規な方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
用語「テンプレート指示合成」は、新規構造の生成のための型として働くテンプレートの存在下で、物質の化学的変性または二以上の分子の結合による、新規物質の生成を含んでいる。具体例は、一もしくは複数のテンプレートの存在下でのビニルモノマーまたはアクリルモノマーの重合に基づく「分子インプリンティング」である（参考文献１、２参照）。伝統的なアプローチは、高度に架橋されたインプリントポリマーの製造を含み、該インプリントポリマーは水および有機溶媒に不溶性である。それらの固有の不溶性のため、薬理学や医療において分子インプリントポリマー（ＭＩＰｓ）を使用する可能性は限定されている。近年、水溶性または少なくともコロイド形態で存在可能な比較的低分子量のインプリントポリマーの調製のためのプロトコルを開発するために、いくつかの試みがなされてきた。この構成は、ポリマーを、薬理学および医療における生物学的な活性分子（薬、エフェクター、調節剤、阻害剤）、センサーおよびアフィニティー分離において生体分子を置換する「プラスチック抗体」、および酵素のような特性を有する触媒として使用することができる。
【０００３】
可溶性のＭＩＰｓを合成する一つの方法は、制御重合による。本明細書では、制御重合は、分子サイズが比較的狭い分布を有する可溶性ポリマーの画分を生成させる方法として定義される。制御重合の典型例は、以下に記載のように、リビング重合の使用である。
【０００４】
イニファーター重合、窒素酸化物介在のラジカル重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、および可逆的付加−開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合などのリビング・フリーラジカル重合の技術は、比較的制御された分子量を有するポリマーの合成のための新規な経路を開くものである（参考文献３〜９参照）。制御された／リビング重合の技術は、ドーマント種と、系内における成長種の濃度を効果的に減少させて停止反応の程度を最小化する活性種との間の微妙なバランスに基づいている。リビング重合は、停止や連鎖移動などの副反応をなくすことができ、それによって非常に明確に規定された分子量分布と構造を有するポリマーを生成することができる。同じアプローチはコポリマーの製造に適用でき、このようにして、適切な順序でモノマーを添加することによってフリーラジカル重合によりブロックコポリマーを製造することが可能となる。リビング重合は、以前、塊状のグラフト化されたＭＩＰｓの製造に使用されてきた（参考文献１０、１１参照）。可溶性ポリマーもリビング重合によって製造され、後にＭＩＰの製造に使用された（参考文献１２参照）。近年、制御リビング重合は、ＭＩＰナノ粒子の調製に使用された（参考文献１３）。ＭＩＰの合成の複雑さの一つは、タンパク質や幾つかの毒素などの高価及び／又は入手困難なテンプレートを頻繁に使用する必要があることである。このようなテンプレートは重合後に回収することも困難であり、得られるＭＩＰの量が制限される。理想的には、これらの制限を克服するために、テンプレートは、再使用可能とすべきである。これを達成する最適な方法は、固定化形態のテンプレートを用いることである。固定化されたテンプレートは、以前から使用されてきた（米国特許第7393909号参照）。本明細書では、テンプレートはシリカの表面上に固定化され、次いで、ポリマーはその周囲の細孔の中で生成された。シリカ担体を溶解させ、テンプレートを除去することによって、様々なモルフォロジ−のＭＩＰｓが得られた。米国特許第7393909号に開示された全ての実施例において、固定化されたテンプレートを担持する表面は溶解プロセスの間に消失し、再使用することができない。他の実施例では、固定化されたテンプレートは、インプリントされた表面の製造に使用された（米国特許第6127154号；米国特許第6458599号；米国特許第7288415号）。潜在的に、これらの報告において開示されたテンプレートを担持している表面は再生することができ、かつ複数回、使用することができる。これらのアプローチは、センサーまたはアレイの製造に使用することができるが、ナノ粒子または小さい可溶な分子の製造に適応させるのは困難である。
【０００５】
ＭＩＰｓに関連した更にもう一つの大きな問題は、製造された結合サイトの不均質性であり、それは一般的に高レベルの非特異的結合の原因となる。この問題は、標的種またはテンプレートの製造後、固定化された標的種またはテンプレートを保持するカラム上での、ＭＩＰナノ粒子のアフィニティー分離によって解決された（参考文献１３）。アフィニティー分離を可能とするために、ＭＩＰｓは適切な形態、好ましくはナノ粒子の形態であるべきことは明白である。
【０００６】
近年の発明は、二つの技術の組み合わせを開示することによって、高性能な架橋ＭＩＰナノ粒子の開発に関する問題に対処している。（ｉ）表面または固定化されたテンプレートを保持する表面の存在下で、制御重合、場合によっては制御ラジカル重合を行い、インプリントナノ粒子を生成すること、および（ｉｉ）選択および精製の目的のために、固定化されたテンプレートとのアフィニティー相互作用により、ナノ粒子を保持すること。このようにして、我々の前の出願、国際公開2011/067563号は、以下の工程を有する、ＭＩＰ粒子の溶液またはコロイド懸濁液の形態の分子インプリントポリマー（「ＭＩＰ」）の調整方法を開示する。
【０００７】
（ａ）表面上で露出するように固定化されたテンプレート材料を有するキャリア物質を提供する工程、
（ｂ）前記表面に接触する重合性組成物を提供する工程、
（ｃ）好ましくはリビングラジカル重合プロセスによって、前記表面に接触した前記重合性組成物を制御重合する工程であって、溶液またはコロイド懸濁液を生成することが可能なＭＩＰ粒子が生成された時に、前記重合を停止する工程、および、
（ｄ）前記表面から前記ＭＩＰ粒子を分離する工程。
【０００８】
この後に、以下の精製工程（ｅ）を行うことができる。
【０００９】
（ｉ）前記ＭＩＰ粒子が前記固定化されたテンプレート材料に結合するように、前記分離されたＭＩＰ粒子を含む溶液または懸濁液を、表面上で露出するように固定化された前記テンプレート材料を有するキャリア物質と接触させること、
（ｉｉ）前記キャリア物質から未結合の材料を分離すること、および  続いて、
（ｉｉｉ）固定化されたテンプレート材料からＭＩＰ粒子を回収して、精製された溶液またはコロイド懸濁液を生成すること。
【００１０】
背景技術の材料は、以下の参考文献中に見出すことできる。
1. Wulff, G. Makromol. Chem. Macromol. Symp., 1993, 70/71  , 285.
2. Vlatakis, G.; et al. Nature, 1993, 361, 645.
3. Moad, G.; Rizzardo E.; Solomon, D.H. Macromolecules 1982, 15, 909;   
4. Matyjaszewski, K.; Xia, J. Chem. Rev. 2001, 101, 2921  . 
5. Kamigaito, M.; Ando, T.; Sawamoto, M. Chem. Rev. 2001, 101, 3689.
6. Hawker, C. J.; Bosman, A. W.; Harth, E. Chem. Rev. 2001,   101, 3661.
7. Fischer, H. Chem. Rev. 2001, 101, 3581.
8. Otsu, T.; Matsumoto, A. Adv. Polym. Sci. 1998, 136,   75-137. 
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10. Ruckert, B.; Hall, A. J.; Sellergren B. J. Mater. Sci. 2002,   12, 2275.
11. Hattori, K.; et al. J. Membr. Sci. 2004, 233, 169.
12. Li, Z.; Day, M.; Ding, J. F.; Faid, K. Macromolecules. 2005,   38, 2620.
13. Guerreiro A. R., Chianella I., Piletska E., Whitcombe M. J., Piletsky S. A  . (2009). Biosens. Bioelectron., 24, 2740-2743.
14. Jagur-Grodzinski, J. Reactive & Functional Polymers. 2001,   1, 1.
15. Shim, S.E. et al. Macromolecules. 2003, 36, 7994-8000.  
16. Yu, Q.; Zeng, F.; Zhu S. Macromolecules. 2005, 34, 1612. 
【００１１】
【表１】
2014528014.tif 000002
【発明の概要】
【００１２】
発明の開示
本発明は、以下の工程を有する分子インプリントポリマーのナノ粒子の製造方法を提供する。
（ｉ）固体担体上にテンプレート種を固定化することにより、担持されたテンプレート材料を提供する工程と、
（ｉｉ）担持されたテンプレート材料を、一以上の流れ入口、一以上の流れ出口、容器内容物の温度に影響するのに適した冷却器／加熱器、および容器内部を照射するのに適した照射源、を有する反応容器の中に配置する工程と、
（ｉｉｉ）一以上の前記流れ入口を介して、該容器内に重合性組成物を通過させる工程と、
（ｉｖ）該容器内部の温度を制御するための冷却器／加熱器を使用しながら、照射源により容器内部を照射して、重合性組成物の制御重合を行う工程と、
（ｖ）重合により５００〜１，０００，０００ダルトンの範囲の分子量を有するナノ粒子が生成し、そのナノ粒子の少なくともいくつかが固定化されたテンプレートに結合した段階で照射を終了する工程と、
（ｖｉ）一以上の前記入口および一以上の前記出口を介して前記容器内に溶媒を通過させることにより、該重合性組成物の未反応成分および未結合ポリマーを洗浄する工程と、および、
（ｖｉｉ）前記結合ナノ粒子の少なくともいくつかが、固定化されたテンプレートから分離され、該容器から捕集容器に到達する条件下で、一以上の前記入口および一以上の前記出口を介して前記容器内に溶媒を通過させる工程（但し、前記条件は該冷却器／加熱器によって生じる一以上の温度増加、およびナノ粒子のテンプレートへの結合を阻害することが可能な溶媒組成物の使用を含む）。
【００１３】
本発明はまた、制御された光化学重合によるＭＩＰ粒子の製造に有用な装置−光反応器をも提供する。その装置は、固定化されたテンプレート、前記容器を照射するためのランプ、およびモノマー混合物および合成したナノ粒子の捕集物を供給するための流体システム、を有する自動温度制御の反応容器を備えた光反応器からなり、好ましくは該装置の操作はコンピューター制御のもとで行われる。
【００１４】
我々は、有用なナノ粒子であるＭＩＰｓを首尾よく一貫して製造するためには、反応パラメーターの注意深い制御が決定的であることを見出した。最初に、我々は、照射時間の注意深い制御が極めて重要であることを見出した。図１は、（ａ）生成粒子の直径、および（ｂ）収率に照射時間がどのように、影響を与えるのかを示す、いくつかの実験結果を示している。収率は時間と共にほぼ一定で上昇するが、直径は最初、非常にゆっくりと増加し、３．５分間で約６０ｎｍの値となり、次いで、非常に急速に上昇して４．５分間で約３７５ｎｍとなる。我々はまた、ＭＩＰナノ粒子の親和性は約６０ｎｍでピークに達することを発見したので、実際の製造プロセスを実現するためにはパラメーターの正確な制御が重要であることは明白である。
【００１５】
提案された発明の一態様では、ＭＩＰｓは、制御重合、場合により制御ラジカル光化学重合を用いて、固定化されたテンプレートの存在下で、光反応器中で製造される。本発明において開発された反応の好ましい種類は、ＵＶ照射によって開始され制御される、イニファータに基づくリビングラジカル重合である。重合反応は、合成された分子の大きさが比較的に小さい段階で停止する。このような方法の生成物は、溶液または懸濁液中において溶解形態または安定したコロイド状形態のいずれかで存在する。本発明によるＭＩＰｓのコロイド懸濁液または溶液は、水中または有機液体中のいずれかに存在できる。
【００１６】
光は、重合反応のラジカルの生成および成長を開始させる。本発明において利用される光エネルギーは、紫外（「ＵＶ」）光または可視光である。しかし、光エネルギーはまた、光ファイバー・ケーブルまたは減衰全反射（ＡＴＲ）リンク経由で送られる広帯域とすることができる。
【００１７】
本発明の更なる態様では、高い親和性の粒子は、低い親和性の粒子からの分離を可能とする固定化されたテンプレートを保持する表面に選択的に結合すること（そして後にその表面から回収すること）ができる。固定化されたテンプレートを保持する表面は光反応容器中で使用されるものと同じ表面とすることができ、または、それらは（例えば、引き離されたカラム内に含まれる）固定化された標的を有する区切られた表面とすることができ、その標的はテンプレートと類似または同一であっても良い。本明細書に記載の表面は、アフィニティーカラム、ビーズ、ファイバー、ウェル、マイクロプレート、膜、フィルター、孔、ナノ構造、小胞、カプセル、組織の試料、生細胞等の表面とすることができる。表面は、固体、半固体、または（ミセルまたは界面の場合のように）液体または流体とすることができる。任意選択で、追加の一または複数のカラムを用いて、粒子を更に選別して、潜在的な干渉化合物への親和性を有しない粒子の副画分を選択することができる。あるいは、「クラス選択的」バインダーを製造するために、同様のアプローチを用いて、テンプレートの一以上の類似物へ追加的な親和性を有する粒子の副画分を選択することができる。
【００１８】
本発明の更なる態様は、合成ＭＩＰナノ粒子の用途を記載する。本発明に記載のように合成された分子（ダイマー、オリゴマー、ポリマー、またはそれらの混合物）は、薬理学および医療上の薬として、分析化学におけるレセプター特異的リガンド（センサー、分析）として、バイオテクノロジー、薬学、および食品産業での分離のため、ならびに、合成における触媒として、または、分析における酵素のための代替物として、センサー、および洗浄粉末のような他の用途に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、照射時間と、粒子の直径（ｎｍ）もしくポリマー収率（ｍｇ）との関係を示す図である。
【図２】図２は、ＭＩＰナノ粒子の合成のために使用される光反応器の概略図である。
【図３】図３は、光反応器中で製造されたＭＩＰナノ粒子のＳＥＭ図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
本発明の第１態様は、光反応器中で使用される合成プロセスである。具体的には、本発明の一態様は、生物学的レセプター、核酸、細胞、胞子、ウイルス、微生物、組織試料、炭水化物、オリゴ糖、多糖、ペプチド、核タンパク質、ムコタンパク質、リポタンパク質、合成タンパク質、糖タンパク質、グルコサミノグリカン、ステロイド、ホルモン、免疫抑制剤、ヘパリン、抗生物質、ビタミン、病気または疾患の状態の生体指標、毒素、殺虫剤、除草剤、爆薬、神経剤、汚染物質、内分泌かく乱物質、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、代謝産物、二次代謝産物、薬物代謝産物、薬物中間体、または薬物、または当業者に知られた他の分類のテンプレートであることができる、固定化されたテンプレートの存在下での、制御重合、場合により制御リビングラジカル重合（ＬＲＰ）による、光反応器中でのＭＩＰｓの合成に関する。テンプレートは、重合体、多糖、または例えばビーズの形態のガラスの表面、導波路、光ファイバーを含むファイバー、膜、キャピラリーの表面、または当業者に知られた目的とする用途に適した任意の他の表面に固定化できる。
【００２１】
本発明では、制御重合のいくつかの異なる形態を使用できる。それらは全て、連続的なポリマー層またはネットワークが生成されるよりもむしろ、圧倒的に可溶性ナノ粒子が生成されるようなレベルで付加反応を制御する能力に基づいている。リビングラジカル重合の例では、光化学的刺激、反応性フリーラジカルに可逆的に変換するドーマント種、または連鎖成長剤として働くイオンによって、開始分子が可逆的変換を開始させる。この適用条件については、反応の平衡定数はドーマント種の生成に有利に働くべきであり、ドーマント種と成長種の間で急速な交換をできるようにすべきである。このようにして、成長種の濃度はとても低く、その滞留時間はとても短いので、成長しているポリマー鎖を停止させる副反応の可能性を減らす。リビング重合の例としては、ニトロキシドを介した重合（ＮＭＰ）、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、および可逆的付加開裂連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）が挙げられる。ＲＡＦＴ重合は、可逆的付加開裂連鎖移動平衡に基づき、そこでは活性種とドーマント種との間で交換が起こる。最初のステップで生成したラジカルは、連鎖移動剤として働くことが可能な分子に出会うまで、可逆的な方法で添加されてもよい、モノマーの添加によって成長する。一般的に、リビング重合プロセスでは、従来の開始剤と任意選択で併用されて重合にリビング性を付与できるイニファーター（開始剤、移動剤、停止剤）の使用を可能とする。イニファーターは、ジチオカルバミル基を有する光イニファーター、または炭素−炭素基もしくはアゾ基を運ぶ熱イニファーター（参考文献１４参照）、または当業者に知られた他の種類の化合物であることができる。好ましい種類のイニファーターは、様々なラジカル、反応性が高い一方の炭素ラジカルと、例えばジチオカルバミルラジカル等のより反応性が低い他方のラジカル、を生成するものである。典型的にはベンジルラジカルである該炭素ラジカルは、不飽和モノマーと反応して重合を開始させることができる。例えば、ジチオカルバミルラジカルである、より反応性の低い該ラジカルは、成長しているポリマー鎖と再結合することによって重合を停止させることができる。しかし、末端の生成物は、例えばＵＶ照射などの連続的な刺激の適用に反応して、更に新規な成長ラジカルと停止剤に解離することができる（参考文献１５参照）。
【００２２】
従来のラジカル重合と比べたリビング重合の一つの利点は、後者が観察しうる自己加速なしに低速で進行する一方で、前者はしばしば強い自己加速で進行することである（参考文献１６参照）。本発明は、比較的、低分子量のポリマーの生成を助ける条件下でリビング重合を行うことによって、これを利用している。典型的には、該反応は早い段階で停止し、５００〜１，０００，０００ダルトンの分子量を有するポリマーを生成する。
【００２３】
本発明は、比較的、小さいサイズの粒子を生成するために、反応条件の最適化を促進する。本プロセスの重要な部分は、適当なリビング開始剤を選択すること、および重合反応の条件を最適化することである。あるいは、ラジカルの生成および成長の速度は、反応阻害剤、またはメルカプト誘導体のような連鎖移動剤を添加することによって制御できる。
【００２４】
リビングラジカル重合開始剤は、個々の有機分子、または巨大分子から調製できる。実際は、ヒドロキシ基、カルボキシ基、またはアミノ基を含む大部分の化合物は開始剤に変換でき、それ故、容易にポリマー中に組み込むことができる。これは、単官能開始剤の場合にはポリマーの末端に存在でき、または多官能開始剤の場合にはポリマー鎖の中間に存在できる。
【００２５】
比較的、低分子量のポリマーを生成する反応条件としては、以下の条件が挙げられるが、これらに限定されない。（ｉ）開始剤とモノマーの化学量論比を使用すること；（ｉｉ）反応物を冷却すること、または反応の早い段階で新規な成長種の生成を終了させる、ＵＶ源もしくは他の照射源を除去すること；（ｉｉｉ）例えば、濾過またはクロマトグラフィーによって、成長しているポリマー鎖との接触物からモノマーを除去すること；（ｉｖ）反応物に禁止剤を添加すること；（ｖ）非常に希薄な溶液中で重合を行うこと；（ｖｉ）連鎖移動剤を添加すること。好ましい選択肢は、照射源の除去、またはその遮断である。あるいは、モノマーおよび他の反応剤は、溶出によって、固定化されたテンプレートに結合した成長中のＭＩＰから除去することができる。制御リビング重合の結果、ＭＩＰ粒子は５００〜１，０００，０００ダルトンの大きさの範囲内で生成でき、それは、固定化されたテンプレートからの分離後に、溶解状態または少なくともコロイド形態で存在できる。
【００２６】
本発明では、ＭＩＰの調製のために使用できるモノマーとしては、ビニルモノマー、アリルモノマー、アセチレン、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、クロロアクリレート、イタコネート、トリフルオロメチルアクリレート、アミノ酸誘導体、ヌクレオシド、ヌクレオチド、および炭水化物が挙げられる。重合は、二重結合を含む粒子の存在下、または該粒子の表面上で行うことができる。架橋モノマーは、得られたポリマーの構造がテンプレートの構造に対して相補的な状態を維持するように、ポリマーの構造を固定または安定化するために使用される。ＭＩＰｓの合成に好適な架橋剤の典型例としては、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ジビニルベンゼン、メチレンビスアクリルアミド、エチレンビスアクリルアミド、およびＮ，Ｎ’−ビスアクリロイルピペラジンが挙げられるが、これらに限定されない。架橋剤の機能は、二重結合を含む粒子もしくは前駆体ポリマー、または機能性モノマーに結合できる、多官能性を有する粒子もしくはポリマーによって発揮させることができる。当業者は、特別な系に好適なモノマー、および架橋剤を選択することができる。あるいは、組み合わされた計算上の様々な方法が、この選択に役立つように使用できる。
【００２７】
合成されたナノ粒子は、モノマー、非特異的オリゴマー、および低親和性のポリマー（例えば、テンプレートの不存在下で大量の体積中で生成されたもの）よりも、固定化されたテンプレートに対してより高い親和性を有する。このようにして、提案された本発明の一態様では、弱く結合した物質は、洗浄によって、固定化されたテンプレートに結合したナノ粒子から除去される。固定化されたテンプレートからの高親和性のナノ粒子の分離は、複合体の生成を阻害する加熱によって、溶液のｐＨを変えることによって、イオン強度を変えることによって、または尿素、グアニジン、もしくは他の物質、もしくはポリマーよりも強くテンプレートと相互作用する物質を添加することによって、達成できる。
【００２８】
本発明の第二の態様は、ＭＩＰの製造のために使用される装置、およびその機能に関する。
【００２９】
反応器の機能は、ＭＩＰナノ粒子の合成のために好適で制御された環境を提供することである。それは好適には、流体貯蔵器、ポンプ、バルブ、管類、ガラス類、ならびにモノマーおよび溶媒の輸送、および副生成物、未反応物質の溶出、および合成したナノ粒子の捕集のための連結器を含む流体システムを備えている。場合により、反応剤の輸送、洗浄および溶出プロセス、ならびに、反応器内の温度および照射時間がコンピュータによって制御される。図１は、このような反応器の一つの非限定的な例を示している。
【００３０】
反応容器１０は、該容器内で重合を開始させるのに必要な波長の光に対して十分に透明であるならば、ガラス、石英、またはプラスチック、またはこれらの材料の二以上の組み合わせから製造することができる。反応容器内への光の入射経路は一方向から、または全ての方向からとすることができる。あるいは、光源１２は反応容器内に配置してもよく、または反応容器内の透明な区画に配置してもよく、または光は一以上の光ファイバーもしくは導波管を介して反応容器内に導いてもよい。光源１２が反応容器１０内に配置され、または反応容器内の透明な区画に配置され、または光が一以上の光ファイバーもしくは導波管を介して反応容器内に導かれる場合、反応容器の内容物を視覚的に検査できるようにする要望がある場合は別として、一般的には反応容器を透明にする必要性はない。このようにして、金属、セラミック、繊維強化複合材料、ＰＴＦＥ、または他の非透明材料を含む、より広範囲の材料を使用できる。
【００３１】
重合は、照射、好ましくはＵＶまたは可視光の照射によって開始され、種の反応性に応じて、重合には通常、数分または数時間がかかる。光はラジカルの生成を開始させ、重合反応を伝播させる。本発明で利用される光エネルギーは、紫外（「ＵＶ」）光または可視光である。しかし、光エネルギーは広帯域とすることもでき、光ファイバ−ケーブルまたは減衰全反射（ＡＴＲ）リンク経由で送ることができる。この点については、図１の光反応器は、例えば、紫外線ランプなどの光源からの光エネルギーの入射のための透明な窓、または導波管を有している。照射は、光ファイバーケーブルまたは導波管を介して、反応物の内部から送ることもできる。
【００３２】
光反応容器１０は、固定化されたテンプレートを保持する固相１４を含むように設計される。固相１４は、（充填した、または大まかに充填した）ビーズ、膜、または繊維の形態とすることができる。ビーズは、ＭＩＰ製造プロセスの一部または全ての間、固定すること、あるいは攪拌することができる。反応容器は、一以上の入口ポート１６、および出口ポート１８を有することができる。入口ポートは、それぞれ場合により、逆止めバルブで固定され、反応容器内に固相を保持するため、モノマーの輸送および溶媒の洗浄のためのガラス材料である。出口ポートは、場合により、逆止めバルブで固定され、反応容器内に固相を保持するため、反応剤、未反応モノマー、および合成ナノ粒子の溶出のためのガラス材料であり、廃棄物もしくは生成物の捕集用の適当な捕集貯蔵器２２、２４、２６に流れを向かわせるための切り替えバルブ２０を介して連結されている。この発明の本実施形態の操作方法および使用方法は、以下に、より具体的に記載されている。
【００３３】
機能性モノマーもしくはモノマー、イニファーター、一もしくは複数の架橋剤、および任意選択で一もしくは複数の連鎖移動剤を含むモノマー混合物を、適当な溶媒中に溶解させ、テンプレート−モノマー相互作用を最適化するように選択された前記モノマー混合物は、上記のように定義された、固定化されたテンプレートを含む反応容器内へ注入される。容器内容物へのＵＶまたは可視光の照射によって反応容器の内容物が所定温度、好ましくは低温（典型的には、−２０℃以上＋２０℃以下）に達した時に、重合プロセスが開始される。ナノ粒子は、溶液中、および固定化されたテンプレートを保持する表面上で生成される。反応は、照射を止めることによって停止する。未反応モノマー、部分的に生成されたポリマー、およびテンプレートへの親和性が低い粒子は、次いで、モノマー混合物中で使用されたものと同じまたは異なる洗浄溶媒で洗浄することによって除去される。洗浄液を含むカラムからの流出物の流れは、切り替えバルブによって、適当な廃棄物貯蔵器（２６）に向けられる。反応容器の温度は、洗浄溶媒の連続的な流れによって低い親和性のＭＩＰナノ粒子が流出する２０℃以上４０℃以下まで増加させる。最終的に、反応容器の温度を６０℃以上８０℃以下まで増加させて、溶出溶媒を用いて容器内容物の溶出を行うことにより、望ましい高い親和性のＭＩＰナノ粒子を捕集する。この溶出溶媒は、洗浄溶媒と同じ溶媒または異なる溶媒とすることができ、ナノ粒子の溶出を促進させるために、添加物として一以上の化合物を任意選択で含有させることができる。溶媒を含有する、溶出したナノ粒子の流れは、切り替えバルブによって、一または複数の反応生成物の捕集用の適当な一または複数の容器２２、２４に向けられる。ナノ粒子の溶出はまた、溶出溶媒のｐＨを変えることによって、または酸性化合物、塩基性化合物、もしくは表面活性化合物の添加によって、またはテンプレートとＭＩＰナノ粒子間の結合を別の方法で妨害する化合物の添加によって、促進および／または制御できる。反応容器内の温度を監視する便利な方法は、一以上の熱電対２８の使用による。反応器内のモノマー混合物の加熱および冷却は、自動調温制御（場合により、液体循環を伴う）３０を使用して、またはペルチェ素子の使用によって、達成できる。
【００３４】
このアプローチによる利点は非常に多く、ＭＩＰ合成用の固定化されたテンプレートを再利用する可能性を有すること、低親和性粒子および未反応モノマーから高親和性を有するＭＩＰｓを分画する可能性を有すること、合成したＭＩＰｓをテンプレートから容易に除去できること、固定化されたテンプレートに結合したままの状態でＭＩＰｓを後機能化できること、製造プロセスなどを部分的または完全に自動化する能力を有すること、である。本発明の他の利点は、当業者に明らかである。
【００３５】
本発明の実施形態の一つの好ましいタイプでは、合成ＭＩＰナノ粒子の分離および精製は、そのインプリントプロセスで使用される固定化されたテンプレートを担持する固相と同じ固相上で達成される。分離は、合成されたＭＩＰナノ粒子と固定化されたテンプレート分子との間のアフィニティー相互作用に依存する。穏やかな条件（任意選択で、−２０℃以上＋４０℃以下の温度、および複合体阻害剤（complex-disrupting agents）やｐＨ変化などが不存在の条件）下での洗浄により、固相から低親和性の粒子を除去できる。テンプレートへ強い親和性を有する特異的なＭＩＰナノ粒子は、高温で、ｐＨを変化させることによって、または複合体阻害剤、もしくは溶媒、もしくはこれらの混合物の組み合わせの使用により、捕集のために除去できる。
【００３６】
合成した高親和性ＭＩＰナノ粒子は、クロマトグラフィー、ろ過、および／または電気泳動法によって追加的に精製することができる。合成ポリマーの分離は、同じかもしくは類似の固定化されたテンプレートまたは標的化合物への、ナノ粒子の結合が、テンプレートに最大の親和性を有するポリマー粒子の画分の精製に使用される時には、アフィニティークロマトグラフィーあるいは選択的溶出によって達成でき、ならびに／あるいは、様々なサイズのポリマー画分を分離できるゲル浸透クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）によって達成できる。アフィニティー分離の間の分画、分離、および精製は、様々なｐＨ、イオン強度の緩衝液を使用した洗浄および溶出によって、あるいは、酸、塩基、界面活性剤、尿素、グアニジン、ポリマーよりも強くテンプレートと相互作用する他の一つもしくは複数の物質の添加によって達成される。あるいは、高い親和性を有する粒子の分画は、ろ過、電気泳動法、クロマトグラフィー分離、洗浄、遠心分離、または透析によって達成できる。アフィニティークロマトグラフィーは特に強力な手段であり、テンプレートへの狭い範囲の親和性を有するＭＩＰｓの調製を可能とするため、特に好ましい。標的またはテンプレート構造に対して高い親和性を有するが、一以上の阻害化合物に対しては低い親和性を有する粒子の副画分であって、標的またはテンプレート構造に結合するが、阻害化合物には結合しない画分の選択による、粒子の副画分を選択するためにアフィニティー分離を追加的に使用することができる。また、標的またはテンプレート構造には高い親和性を有するが、バインダーが必要とされる化合物のクラスの代表例を含むテンプレートまたは標的の一以上の類似構造物にも高い親和性を示す画分を選択することによって、広いまたはクラス特異的な結合特性を有する追加的な副画分を選択できる。
【００３７】
本発明の実施形態はまた、合成したナノ粒子の後変性を含んでもよい。合成したＭＩＰナノ粒子は、直鎖または架橋した他の一つもしくは複数のポリマーによって変性でき、あるいは、ＭＩＰｓに一以上の特異的性質を導入する目的で特異的な一もしくは複数の官能基を有する一または複数の化合物で変性できる。この変性は、ＭＩＰナノ粒子の溶解特性もしくは生体適合性を変更するため、ＭＩＰナノ粒子の抽出もしくは他の形態の分離を促進するため、ＭＩＰナノ粒子の検出を可能にするため、追加の認識性もしくは触媒の機能性を導入するために行われる。この変性は、第二の分子インプリント工程での、シクロデキストリン、クラウンエーテル、カリックスアレーン、ククルビツリル（curcubituril）、もしくは超分子結合、もしくは触媒官能基の付加、染料分子、場合により蛍光染料、金属結合リガンド、プロドラッグ、抗生物質、免疫刺激剤、生物学的配位子などを付加させることを含むが、これらに限定されない。この変性は、表面結合イニファーター基の再活性化またはそれらの選択的化学変性によるのが好ましく、ＭＩＰナノ粒子がまだ、固定化されたテンプレート相へ結合している間に行われるのが好ましい。この例は、例えば、有機溶媒による水性溶液からのポリマーの抽出、水層−有機層の界面におけるＭＩＰナノ粒子の配置を可能とする、疎水性の「後尾部」が生成されるように、一以上の疎水性モノマーの直鎖ポリマーを生成することができる。アフィニティー吸着体によってポリマーの選択的除去を可能とする特異的な結合基、例えばビオチンを導入すること、または、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサー装置、もしくは音センサー、電極、もしくは当業者に知られたいずれか他のセンサー装置などのバイオセンサーの表面に結合すること、が可能である。当業者は、この変性及び対応する分離が行われるのを可能にする、大量の実験プロトコルを熟知している。好ましくは、変性は、前の例に記載したように、ポリマーが固定化されたテンプレートに結合もしくは遊離している間、または、追加の分離および／もしくは精製工程が行われた後、表面上で、直接的に光反応容器内で達成される。
【００３８】
一態様では、本発明は、合成された粒子の特性または機能を変えるために、インプリントポリマーが他の種類の分子で変性される時に引き続いて起きる重合に関する。ＭＩＰナノ粒子が他のポリマー、または官能基で変性して、その分離を促進できることは既に述べた。リビング重合の一つの重要な特性は、反応を停止させ、後に単に、例えば、反応混合物へのＵＶ照射の停止と再適用を行うことにより反応を続けられることである。成長しているポリマー鎖の末端は、新たに一連の重合を開始するために再活性化することができる開始剤種を含んでいる。このようにして、ドーマントポリマー鎖の終端を、他のモノマーもしくはモノマー混合物、および連続した重合物（polymerisation continued）に曝すことができ、その結果として直鎖もしくは架橋したポリマーまたは架橋したナノ粒子の表面にグラフト化されたコポリマーを生成し、ブロックコポリマー構造をグラフト化するために、追加の二以上のモノマー溶液が導入され、続いて光照射される。新規な一または複数のモノマーは、ポリマー粒子に新規な機能を導入できる。このようにして、最初のＭＩＰによって提供された、最初のテンプレートへの親和性に加えて、その系の中へ導入された第二のテンプレートへの親和性を有するか、または、遷移状態の類似物をインプリントすることによって触媒的な機能を有する、延長されたポリマーを製造できる。延長されたグラフトポリマー、コポリマー、またはブロックコポリマーは、診断に有用な末端基に結合した蛍光タグを有することができる。生物学的特性を有する活性種、触媒基、同位体ラベル、固定化に有用な基、センシング、（造影剤などの）イメージングなどを生じさせる能力などの、他の機能を導入する他の種類の変性も可能である。これらの機能はまた、対応する機能化された開始剤を使用することによってポリマー中に導入できる。前の例に記載したように粒子が固定化されたテンプレートに結合もしくは遊離している間、または、追加の分離および／もしくは精製工程が行われた後に、変性は表面上で直接的に、達成できる。
【００３９】
本発明はまた、合成したナノ粒子の用途に関する。これらは、薬理学および医療における薬として、分析化学（センサー、分析）におけるレセプター特異的リガンドとして、バイオテクノロジー産業、薬産業、および食品産業における分離用、ならびに、触媒としての合成粒子の用途を含んでいる。合成ポリマーの溶解性は、それらを薬としての使用のための理想的な候補にする。酵素、レセプター、または他の生物学的分子への選択的結合は、これらの分子の生物学的機能に影響を及ぼすように使用できる。このようにして、リビング重合によって合成されたＭＩＰｓは、生物学的プロセスの調節のために、インビトロで使用できる。
【００４０】
本発明に記載のようにして調製されたポリマーは、テンプレートのエフェクター（活性剤、阻害剤、または基質）に似ており、仮にテンプレートが生理学的プロセス、またはそのような分子もしくは構造の有効な類似物中に含まれる場合、それ自体は生物学的活性を有することができる。このようなポリマーは例えば、薬理学および医療における薬として使用できる。
【００４１】
アイソトープまたは蛍光タグに結合された時、ＭＩＰｓは、選択的造影剤として、または他の形態の診断において使用できる。例えば一重項分子状酸素のようにある条件で製造可能なリガンドが結合したＭＩＰｓは、選択的殺菌剤として使用できる。リビング重合によって調製されたＭＩＰｓに抗生特性を導入するために、当業者によって、様々な他の変性が提案できる。合成したＭＩＰｓは、天然の抗体ならびに分析およびセンサーの様々な形態のレセプターの代替物として使用できる。いくつかの特徴により、リビング重合によって調製されたＭＩＰｓは、センサーの用途で特に魅力的なものとなる。このようにして、合成したＭＩＰｓには、依然として例えば、機能性を有する二重結合によって固体表面にポリマーを共有結合させるのに有用なラジカルの生成に使用できる開始剤が含まれる。このようにして、単なるＵＶ照射が、二重結合で覆われた表面にＭＩＰｓを結合させるのに十分である可能性がある。
【００４２】
ＭＩＰ調製物を様々な親和性を有するいくつかの画分に分離するためにアフィニティークロマトグラフィーを使用する能力は、検出範囲を変えることで、センサー／分析の調製に有利とすることができる。いくつかの用途では、リビング重合によって調製されたブランクポリマー（いずれのテンプレートも存在しないが、ＭＩＰｓと同じようにして調製されたもの）も使用できる。しかしながら、ある親和性またはこの特別な用途に必要な他の特性を有するモノマーを用いて、このようなポリマーを調製する必要がある。当業者は、例えば、計算上または組み合わされたアプローチを用いて、このようなモノマーの選択法を知っている。対応する実施形態に記載の様式で調製されたＭＩＰｓおよびブランクポリマーの両方を使用することは、本発明の範囲に及ぶことを明確にする必要がある。
【００４３】
以下に非限定的な実施例を参照して、本発明を更に説明する。
【実施例】
【００４４】
〔実施例１〕  テンプレートを誘導体化した固体担体の調製：
ガラスビーズを４Ｍ―ＮａＯＨ中で１０分間、煮沸させることによって活性化し、次いで、再蒸留水およびアセトンで洗浄し、８０℃で乾燥した。次いで、そのビーズを、トルエン中の３−アミノプロピルトリメトキシシランの２％ｖ／ｖ溶液中で終夜、インキュベートし、アセトンで洗浄し、続いて、それらを再蒸留水ですすいだ後、ｐＨ７．２のＰＢＳバッファー中のグルタルアルデヒドの７％ｖ／ｖ溶液中で２時間インキュベートした。ｐＨ７．２のＰＢＳにおいて、テンプレートの５ｍｇ／ｍｌ溶液中で４℃で終夜、ビーズをインキュベートすることによって、テンプレートの表面固定化を行った。メラミンの固定化の間、共溶媒として、メチルピロリドン（１０％ｖ／ｖ）も添加した。ガラスビーズを水で洗浄し、真空下で乾燥し、次いで、使用するまで４℃で保存した。
【００４５】
メラミンに対して特異性を有するインプリント粒子の自動合成：
使用された合成器は、８つの独立した供給ラインを通して、テンプレートが誘導体化された固体担体１４が充填され、温度制御されたガラス反応容器１０（反応器、図１）まで送る、二つのポンプ３２、３４から構成されていた。一つのライン３６はモノマー混合物を供給するために使用され、残り３８は洗浄液および溶出溶媒を送るために使用された。前記反応容器１０の出口１８は、６つの出口を有する多流路バルブ２０（図１には、３つのみが示されている）に接続され、画分捕集器として使用され、一つのライン４０は廃棄物画分のために使用され、残り４２は捕集バイアル２２、２４に接続された。反応器から２０ｃｍの位置に配置された４つの８Ｗ水銀ランプを備えたＵＶ源１２は、重合を開始するために使用した。ポンプ、温度制御器３０、ＵＶランプ、および多流路バルブはコンピュータインタフェース５０に接続され、コンピュータ５２中のプログラム制御できるソフトウェアによってコンピュータ制御された。ソフトウェアは、流量の制御、供給ラインの選択、反応器温度、照射タイミング／時間、反応器の溶出時間、およびマルチウェイバルブの設定を可能にする。インプリントポリマー粒子の合成については、メラミン被覆ビーズ（２３．５ｇ）を、温度制御されたガラス反応器に充填した。次の工程は制御ソフトウェア中に全てプログラム化されており、合成器は自動モードで操作された。反応器は、コンピュータ制御されたポンプ３４によって、２ｍｌ／分で送られた溶媒（アセトニトリル）で満たされた。カラムを４℃まで冷却し、異なる供給ライン３６から４ｍｌのモノマー混合物をカラムに注入した。モノマー混合物の組成（重量／重量％）は、アセトニトリル５０．５％、エチレングリコールジメタクリレート（ＥＧＤＭＡ）１５．５％、トリメチロールプロパントリメタクリレート（ＴＲＩＭ）１５．５％、メタクリル酸（ＭＡＡ）１３．８％、ベンジルジエチルジチオカルバメート（イニファーター）３．７％、ペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）（ＣＴＡ）０．８６％であった。ポンプのスイッチを切り、ＵＶ照射を３．５分間続けて重合を開始させた。その後、未反応のモノマー、ならびにテンプレートに対する親和性が乏しいかまたは親和性がない粒子を溶出させるために、溶剤ポンプ３４のスイッチを入れ、２ｍｌ／分の流量および４℃で３０分間流した。次いで、カラムの温度を２５°Ｃに上昇させ、溶媒をアセトニトリル：１０ｍＭのギ酸に切り替え、２ｍｌ／分の流量で１１分間、流した。最後に、テンプレートに対して高い親和性を有する粒子を溶出させるために、温度を６０℃に上昇させ、２ｍｌ／分の流量で２０分間、粒子を捕集した。
【００４６】
〔実施例２〕バンコマイシンに対する特異性を有するインプリント粒子の自動合成：
インプリントポリマー粒子の合成については、実施例１に記載したように、バンコマイシンで被覆されたガラスビーズ（２３．５ｇ）を一般的に調製し、温度制御されたガラス製反応器内に充填した。使用手順は、実施例１に記載したように行った。次の手順はすべて、制御ソフトウェア中でプログラム化されており、合成器は自動モードで操作した。反応器は、コンピュータ制御されたポンプによって送られた溶媒（アセトニトリル）で満たした。カラムを４℃まで冷却し、異なる供給ラインから４ｍｌのモノマー混合物をカラムに注入した。モノマー混合物の組成（重量／重量％）は、アセトニトリル７９％、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡｍ）１０％、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（ＴＢＡｍ）８．５％、ベンジルジエチルジチオカルバメート（イニファーター）１．６２％、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）０．５％であった。ＵＶ照射を３．５分間続けて重合を開始させた。その後、未反応のモノマー、ならびにテンプレートに対する親和性が乏しいかまたは親和性がない粒子を溶出させるために、溶剤ポンプのスイッチを入れ、２ｍｌ／分の流量および２５℃で３０分間流した。次いで、カラムの温度を６０°Ｃに上昇させ、テンプレートに対して高い親和性を有する粒子を溶出させて、２ｍｌ／分の流量で２０分間、粒子を捕集した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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