(57)【要約】  本開示は、卵巣がん予後の予測及び悪性卵巣がんの検出にＤＮＡメチル化バイオマーカーを使用したメチローム分析を提供する。現在の治療プロトコルを受ける患者に対して独立した予後因子であることに加え、これらのＤＮＡメチル化は、特に、脱メチル化剤又は他のエピジェネティックな薬剤といった化学療法を使用することを含む、将来的な個別化医療により患者を処置するための重要なバイオマーカーでもある。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体における卵巣新生物のリスク又は易罹患性を予測する方法であって、前記被検体より得られた卵巣新生物試料中の以下の１又は複数の遺伝子：ＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３、ＫＣＮＡ６、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＲＮＮ、ＨＦＥ２、ＴＷＩＳＴ１、ＧＡＴＡ４、ＣＡＣＹＢＰ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、Ｃ１ｏｒｆ１５８、Ａ４ＧＡＬＴ、ＭＬＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＳＴＣ２、ＡＴＧ４Ａ、ＥＮＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＭＧＳＴ２及びＴＨＲＢ、又はそれらと少なくとも８０％の類似性を有するポリヌクレオチド配列のＤＮＡメチル化を評価することを含み、ＤＮＡメチル化の変化が、前記被検体が卵巣新生物に易罹患性であることを示す、方法。
【請求項２】
卵巣新生物と診断された被検体における予後又は悪性度を予測する方法であって、前記被検体から得られた卵巣がん試料中の以下の１又は複数の遺伝子：ＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３、ＫＣＮＡ６、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＲＮＮ、ＨＦＥ２、ＴＷＩＳＴ１、ＧＡＴＡ４、ＣＡＣＹＢＰ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、Ｃ１ｏｒｆ１５８、Ａ４ＧＡＬＴ、ＭＬＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＳＴＣ２、ＡＴＧ４Ａ、ＥＮＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＭＧＳＴ２及びＴＨＲＢ、又はそれらと少なくとも８０％の類似性を有するポリヌクレオチド配列のＤＮＡメチル化を評価することを含み、ＤＮＡメチル化の変化が、予後不良又は悪性卵巣がんを示す、方法。
【請求項３】
非がん細胞において観察されるＤＮＡメチル化と比較した場合に、ＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３、ＫＣＮＡ６、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＲＮＮ、ＨＦＥ２、ＴＷＩＳＴ１、ＧＡＴＡ４、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＤＴ１Ｈ２ＢＮ、ＴＨＲＢ及びＭＧＳＴ２の１又は複数のＤＮＡの高メチル化、及び／又は非がん細胞において観察されるＤＮＡメチル化と比較した場合に、ＣＡＣＹＢＰ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、Ｃ１ｏｒｆ１５８、Ａ４ＧＡＬＴ、ＭＬＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＳＴＣ２及びＥＮＧの１又は複数のＤＮＡ低メチル化が予後不良を示す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子がＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＡＤＲＡ１Ａ、ＣＡＣＮＢ２、ＧＡＴＡ４、ＫＣＮＡ６、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２若しくはＮＥＦＨ、又はそれらの任意の組合せである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子がＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＣＥＡＣＡＭ４、ＧＡＴＡ４若しくはＩＧＳＦ２１、又はそれらの任意の組合せである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子がＣＥＡＣＡＭ４、ＧＡＴＡ４若しくはＩＧＳＦ２１、又はそれらの任意の組合せである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子がＰＯＵ４Ｆ２、ＮＥＦＨ、ＨＳ３ＳＴ２、又はそれらの任意の組合せである、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
ＤＮＡ低メチル化を伴う遺伝子がＣＡＣＹＢＰ若しくはＣ１ｏｒｆ１５８、又はそれらの組合せである、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
ＤＮＡ低メチル化を伴う遺伝子がＣＡＣＹＢＰ若しくはＭＬＮ、又はそれらの組合せである、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
卵巣がんを有する被検体に対する処置決定を行う方法であって、前記被検体に有効量の脱メチル化剤を投与することを含み、前記被検体が、非がん細胞において観察されるＤＮＡメチル化と比較した場合に、ＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３、ＫＣＮＡ６、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＲＮＮ、ＨＦＥ２、ＴＷＩＳＴ１、ＧＡＴＡ４、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＤＴ１Ｈ２ＢＮ、ＴＨＲＢ及びＭＧＳＴ２の１若しくは複数、又はそれらと少なくとも８０％の類似性を有するポリヌクレオチド配列のＤＮＡ高メチル化を呈する、方法。
【請求項１１】
前記脱メチル化剤が、５−アザ−２’−デオキシシチジン、５−アザ−シチジン、ゼブラリン、プロカイン、又はＬ−エチオニンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子がＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＣＥＡＣＡＭ４、ＧＡＴＡ４、ＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３若しくはＫＣＮＡ６、又はそれらの任意の組合せである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子がＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＡＤＲＡ１Ａ、ＣＡＣＮＢ２、ＧＡＴＡ４、ＫＣＮＡ６、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２若しくはＮＥＦＨ、又はそれらの任意の組合せである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子がＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＣＥＡＣＡＭ４、ＧＡＴＡ４若しくはＩＧＳＦ２１、又はそれらの任意の組合せである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子がＣＥＡＣＡＭ４、ＧＡＴＡ４若しくはＩＧＳＦ２１、又はそれらの任意の組合せである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子がＰＯＵ４Ｆ２、ＮＥＦＨ若しくはＨＳ３ＳＴ２、又はそれらの任意の組合せである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
卵巣がんにおける予後不良又は悪性腫瘍を有する被検体に対する治療計画を決定する方法であって、前記被検体に化学療法を提供することを含み、前記被検体が、非がん細胞において観察されるＤＮＡメチル化と比較した場合に、ＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３、ＫＣＮＡ６、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＲＮＮ、ＨＦＥ２、ＴＷＩＳＴ１、ＧＡＴＡ４、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＤＴ１Ｈ２ＢＮ、ＴＨＲＢ及びＭＧＳＴ２の１若しくは複数、又はそれらと少なくとも８０％の類似性を有するポリヌクレオチド配列のＤＮＡ高メチル化、及び／又は非がん細胞において観察されるＤＮＡメチル化と比較した場合に、ＣＡＣＹＢＰ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、Ｃ１ｏｒｆ１５８、Ａ４ＧＡＬＴ、ＭＬＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＳＴＣ２及びＥＮＧの１又は複数のＤＮＡ低メチル化を有する、方法。
【請求項１８】
ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子がＣＥＡＣＡＭ４、ＧＡＴＡ４、ＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３若しくはＫＣＮＡ６、又はそれらの任意の組合せである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子がＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＡＤＲＡ１Ａ、ＣＡＣＮＢ２、ＧＡＴＡ４、ＫＣＮＡ６、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２若しくはＮＥＦＨ、又はそれらの任意の組合せである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子がＣＥＡＣＡＭ４、ＧＡＴＡ４若しくはＩＧＳＦ２１、又はそれらの任意の組合せである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子がＰＯＵ４Ｆ２、ＮＥＦＨ若しくはＨＳ３ＳＴ２、又はそれらの任意の組合せである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
ＤＮＡ低メチル化を伴う遺伝子がＣＡＣＹＢＰ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ若しくはＣ１ｏｒｆ１５８、又はそれらの任意の組合せである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
ＤＮＡ低メチル化を伴う遺伝子がＣＡＣＹＢＰ若しくはＣ１ｏｒｆ１５８、又はそれらの組合せである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
ＤＮＡ低メチル化を伴う遺伝子がＣＡＣＹＢＰ若しくはＭＬＮ、又はそれらの組合せである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記化学療法がアジュバント化学療法である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
卵巣新生物のリスク若しくは易罹患性若しくは予後を予測する、悪性度を検出する及び／又は卵巣がんを有する被検体に対する処置決定を行うキットであって、該キットはＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３、ＫＣＮＡ６、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＲＮＮ、ＨＦＥ２、ＴＷＩＳＴ１、ＧＡＴＡ４、ＣＡＣＹＢＰ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、Ｃ１ｏｒｆ１５８、Ａ４ＧＡＬＴ、ＭＬＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＳＴＣ２、ＡＴＧ４Ａ、ＥＮＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＭＧＳＴ２及びＴＨＲＢの１又は複数の遺伝子、又はそれらと少なくとも８０％の類似性を有するポリヌクレオチド配列のメチル化シトシン残基と非メチル化シトシン残基とを区別する試薬を含み、非がん細胞において観察されるＤＮＡメチル化と比較した場合に、ＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３、ＫＣＮＡ６、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＲＮＮ、ＨＦＥ２、ＴＷＩＳＴ１、ＧＡＴＡ４、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＤＴ１Ｈ２ＢＮ、ＴＨＲＢ及びＭＧＳＴ２の１若しくは複数のＤＮＡ高メチル化、及び／又は非がん細胞において観察されるＤＮＡメチル化と比較した場合に、ＣＡＣＹＢＰ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、Ｃ１ｏｒｆ１５８、Ａ４ＧＡＬＴ、ＭＬＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＳＴＣ２及びＥＮＧの１若しくは複数のＤＮＡ低メチル化が卵巣がんにおける予後不良又は悪性腫瘍を示す、キット。
【請求項２７】
前記新生物の試料が、被検体から得られるか、又は被検体内に存在する試料である、請求項１、２、８、１３及び１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記新生物の試料が、組織、組織試料、若しくは細胞試料、腫瘍、腫瘍試料、生体液、腹腔液、血液、血清、リンパ、又は髄液から得られる、請求項１、２、８、１３及び１９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵巣新生物のリスク若しくは易罹患性、及び／又は卵巣がんの予後及び悪性度を予測する方法（遺伝子バイオマーカー）に関する。特に、本発明は、卵巣新生物の易罹患性、及び／又は卵巣がんの予後及び悪性度を予測する候補遺伝子の選択にＤＮＡメチル化を使用する。
【背景技術】
【０００２】
卵巣がんは、女性生殖器系の他の何れのがんよりも多くの死をもたらす重篤な疾患である。疾患の発症が潜行性であり、信頼のおけるスクリーニング検査が存在しないことから、診断された際には３分の２の患者において疾患が進行しており、播種性腫瘍を有する多くの患者は、標準的な外科療法と細胞傷害性療法との併用に対して当初は反応するものの、９０％近くが再発し、その疾患による死亡を余儀なくされる。卵巣がんの分子基盤の理解は、このがんの診断及び管理を著しく改善する可能性を有しており、最終的には、新規な、より特異的で効果的な治療様式の開発をもたらす可能性がある。特に上記疾患の初期段階にある患者における外科療法及びアジュバント療法の勢いと広がりを導くより優れた予後指標が必要とされている。
【０００３】
ＤＮＡメチル化は、Ｘ染色体不活性化、寄生性ＤＮＡ因子の沈静化、ゲノムインプリンティング、加齢、男性不妊、及びがんを含む多くの重要な生物学的プロセスにおいて役割を果たす、エピジェネティックなメカニズムの１つである。ＤＮＡメチル化は、主にジヌクレオチドＣｐＧのシトシン中に見出される複製後修飾に関与し、ＣｐＧ島と名付けられた小さな領域以外のゲノム全体では稀にしか存在しない（infrarepresented）。これまでの研究により、卵巣腫瘍を含む様々ながんにおけるＣｐＧ島のＤＮＡ高メチル化が、がんに関連する全体的なＤＮＡメチル化レベルの低減と共に示されている。所定の細胞におけるＤＮＡメチル化のパターンが遺伝子発現状態の安定性と関連すると考えられている。当該技術分野において、ＣｐＧメチル化における変化は、配列型依存様式の（in a sequence-type dependent manner）卵巣がんの進行に対して累積的であり、ＣｐＧ島マイクロアレイによって卵巣がんの臨床試料中のＣｐＧメチル化に影響を受ける新規な遺伝子を迅速に発見できることが知られている（非特許文献１）。Caroline A. Bartonらは、がん特異的ＤＮＡメチル化変化の検出を提供し、がん診断と共に予後及び治療反応性の評価における刺激的な新時代の到来を告げ、またさらなる調査を支持している（非特許文献２）。Sahar Houshdaranらは、臨床研究及びバイオマーカー研究の両方において、卵巣腫瘍の異なる組織学的タイプの明確に異なるメチル化プロファイルにより、異なる疾患として卵巣がんの異なる組織構造を処置する必要性が強められることを示している（非特許文献３）。特許文献１は、卵巣がんにおいてエピジェネティックに沈静化された２３のマーカーを提供しており、これらのマーカーを、診断、予後診断、治療、また個々の患者に対してよく適した処置の選択に使用することができる。
【０００４】
しかしながら、卵巣がんの進行及び転帰における高メチル化及び低メチル化の蓄積の役割は未知である。ＤＮＡメチル化に基づく卵巣がんの予後を予測するバイオマーカーの開発の必要性が残されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７，５０７，５３６号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】George S Watts et al., "DNA methylation changes in ovarian cancer are cumulative with disease progression and identify tumor stage," BMC Medical Genomics 2008, 1:47
【非特許文献２】Caroline A. Barton et al., "DNA methylation changes in ovarian cancer: Implications for early diagnosis, prognosis and treatment", 1398412336926_0, 1398412336926_0, April 2008, pages 129-139
【非特許文献３】Sahar Houshdaran et al., "DNA Methylation Profiles of Ovarian Epithelial Carcinoma Tumors and Cell Lines"; PLoS ONE, Volume 5, Issue 2, February 2010, e9359
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、被検体における卵巣新生物のリスク又は易罹患性を予測する方法であって、上記被検体より得られた卵巣新生物試料中の以下の１又は複数の遺伝子：ＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３、ＫＣＮＡ６、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＲＮＮ、ＨＦＥ２、ＴＷＩＳＴ１、ＧＡＴＡ４、ＣＡＣＹＢＰ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、Ｃ１ｏｒｆ１５８、Ａ４ＧＡＬＴ、ＭＬＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＳＴＣ２、ＡＴＧ４Ａ、ＥＮＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＭＧＳＴ２及びＴＨＲＢ、又はそれらと少なくとも８０％の類似性を有するポリヌクレオチド配列のＤＮＡメチル化を評価することを含み、ＤＮＡメチル化の変化が、被検体が卵巣新生物に易罹患性であることを示す、方法に関する。
【０００８】
また、本発明は、卵巣新生物と診断された被検体における予後又は悪性度を予測する方法であって、上記被検体から得られた卵巣がん試料中の以下の１又は複数の遺伝子：ＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３、ＫＣＮＡ６、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＲＮＮ、ＨＦＥ２、ＴＷＩＳＴ１、ＧＡＴＡ４、ＣＡＣＹＢＰ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、Ｃ１ｏｒｆ１５８、Ａ４ＧＡＬＴ、ＭＬＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＳＴＣ２、ＡＴＧ４Ａ、ＥＮＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＭＧＳＴ２及びＴＨＲＢ、又はそれらと少なくとも８０％の類似性を有するポリヌクレオチド配列のＤＮＡメチル化を評価することを含み、ＤＮＡメチル化の変化が、予後不良又は悪性卵巣がんを示す、方法に関する。
【０００９】
また、本発明は、卵巣がんと診断された被検体における予後又は悪性度を検出する方法であって、上記被検体から得られた卵巣がん試料中の以下の１若しくは複数の遺伝子：ＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３、ＫＣＮＡ６、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＲＮＮ、ＨＦＥ２、ＴＷＩＳＴ１、ＧＡＴＡ４、ＣＡＣＹＢＰ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、Ｃ１ｏｒｆ１５８、Ａ４ＧＡＬＴ、ＭＬＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＳＴＣ２、ＡＴＧ４Ａ、ＥＮＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＭＧＳＴ２及びＴＨＲＢ、又はそれらと少なくとも８０％の類似性を有するポリヌクレオチド配列のＤＮＡメチル化を評価することを含み、非がん細胞において観察されるＤＮＡメチル化と比較した場合に、ＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３、ＫＣＮＡ６、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＲＮＮ、ＨＦＥ２、ＴＷＩＳＴ１、ＧＡＴＡ４、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＤＴ１Ｈ２ＢＮ、ＴＨＲＢ及びＭＧＳＴ２の１若しくは複数のＤＮＡ高メチル化、及び／又は非がん細胞において観察されるＤＮＡメチル化と比較した場合に、ＣＡＣＹＢＰ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、Ｃ１ｏｒｆ１５８、Ａ４ＧＡＬＴ、ＭＬＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＳＴＣ２及びＥＮＧの１若しくは複数のＤＮＡ低メチル化が、予後不良又は悪性卵巣がんを示す、方法に関する。
【００１０】
また、本発明は、卵巣がんを有する被検体に対する処置決定を行う方法であって、被検体に有効量の脱メチル化剤を投与することを含み、被検体が、非がん細胞において観察されるＤＮＡメチル化と比較した場合に、ＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３、ＫＣＮＡ６、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＲＮＮ、ＨＦＥ２、ＴＷＩＳＴ１、ＧＡＴＡ４、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＤＴ１Ｈ２ＢＮ、ＴＨＲＢ及びＭＧＳＴ２の１若しくは複数、又はそれらと少なくとも８０％の類似性を有するポリヌクレオチド配列のＤＮＡ高メチル化を呈する、方法に関する。
【００１１】
本発明は更に、卵巣がんにおける予後不良又は悪性腫瘍を有する被検体に対する治療計画を決定する方法であって、被検体に化学療法を提供することを含み、被検体が、非がん細胞において観察されるＤＮＡメチル化と比較した場合に、ＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３、ＫＣＮＡ６、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＲＮＮ、ＨＦＥ２、ＴＷＩＳＴ１、ＧＡＴＡ４、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＤＴ１Ｈ２ＢＮ、ＴＨＲＢ及びＭＧＳＴ２の１若しくは複数、又はそれらと少なくとも８０％の類似性を有するポリヌクレオチド配列のＤＮＡ高メチル化、及び／又は非がん細胞において観察されるＤＮＡメチル化と比較した場合に、ＣＡＣＹＢＰ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、Ｃ１ｏｒｆ１５８、Ａ４ＧＡＬＴ、ＭＬＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＳＴＣ２及びＥＮＧの１又は複数のＤＮＡ低メチル化を有する、方法に関する。
【００１２】
また、本発明は更に、卵巣新生物のリスク若しくは易罹患性又は予後を予測する、悪性度を検出する及び／又は卵巣がんを有する被検体に対する処置決定を行うキットであって、該キットはＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３、ＫＣＮＡ６、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＲＮＮ、ＨＦＥ２、ＴＷＩＳＴ１、ＧＡＴＡ４、ＣＡＣＹＢＰ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、Ｃ１ｏｒｆ１５８、Ａ４ＧＡＬＴ、ＭＬＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＳＴＣ２、ＡＴＧ４Ａ、ＥＮＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＭＧＳＴ２及びＴＨＲＢの１又は複数の遺伝子、又はそれらと少なくとも８０％の類似性を有するポリヌクレオチドのメチル化シトシン残基と非メチル化シトシン残基とを区別する試薬を含み、非がん細胞において観察されるＤＮＡメチル化と比較した場合に、ＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３、ＫＣＮＡ６、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＲＮＮ、ＨＦＥ２、ＴＷＩＳＴ１、ＧＡＴＡ４、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＤＴ１Ｈ２ＢＮ、ＴＨＲＢ及びＭＧＳＴ２の１若しくは複数のＤＮＡ高メチル化、及び／又は非がん細胞において観察されるＤＮＡメチル化と比較した場合に、ＣＡＣＹＢＰ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、Ｃ１ｏｒｆ１５８、Ａ４ＧＡＬＴ、ＭＬＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＳＴＣ２及びＥＮＧの１若しくは複数のＤＮＡ低メチル化が卵巣がんにおける予後不良又は悪性腫瘍を示す、キットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】マイクロアレイにおける差次的メチル化を説明するボルケーノ（volvano）プロットを示す。
【図２ａ】単変量ＣＯＸ比例ハザード回帰分析を使用した２５の遺伝子のメチル化のリスク率（ハザード率、ＨＲ）を説明するヒストグラムを示す。予後不良を伴うＤＮＡ高メチル化を右側に記載し、予後不良を伴うＤＮＡ低メチル化を左側に記載する。
【図２ｂ】単変量ＣＯＸ比例ハザード回帰分析を使用した２５の遺伝子のメチル化のリスク率（ハザード率、ＨＲ）を説明するヒストグラムを示す。卵巣癌を有する患者における全生存のカプランマイヤー生存推定を示す。
【図２ｃ】単変量ＣＯＸ比例ハザード回帰分析を使用した２５の遺伝子のメチル化のリスク率（ハザード率、ＨＲ）を説明するヒストグラムを示す。卵巣癌を有する患者における無増悪生存（ＰＦＳ）のカプランマイヤー生存推定を示す。
【図３】卵巣がん患者における無増悪生存率のカプランマイヤープロット（Ａ）（Ｂ）（Ｅ）及び全生存率（Ｃ）（Ｄ）（Ｆ）を示す。ＡＴＧ４Ａ及びＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮのメチル化状況によって階級化された無増悪生存及び全生存を、カプランマイヤー曲線及びログランク検定によって推定された卵巣がん患者について示す。直線：高メチル化；太線：低メチル化。（Ｅ）（Ｆ）において、低メチル化は両方の遺伝子が低メチル化されていると規定し、高メチル化は少なくとも１つの遺伝子がメチル化されていると規定した。
【図４】卵巣組織において、ｑＭＳＰによって特定されたＡＴＧ４Ａ（Ａ）及びＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ（Ｂ）のプロモーターメチル化状況を示す。＊ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、メチル化分析を使用し、卵巣新生物のリスク若しくは易罹患性及び／又は卵巣がんの予後を予測する、並びに悪性卵巣がんを検出するＤＮＡメチル化バイオマーカーを発見する。現在の治療プロトコルを受ける患者に対して独立した予後予測因子であることに加え、これらのＤＮＡメチル化は、将来的な化学療法（特に、脱メチル化剤又は他のエピジェネティックな薬剤）に関する個別化医療に重要なバイオマーカーである。
【００１５】
本発明は、本明細書に記載される特定の材料及び方法に限定されないものと理解される。また、本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態を説明する目的であって、添付の請求項によってのみ限定される本発明の範囲の限定を意図するものではないことが理解される。
【００１６】
本明細書で使用される場合、単数形（singular forms "a", "an", and "the"）は文脈上他に明白に規定されない限り、複数の指示対象を含む。
【００１７】
本明細書で使用される場合、用語「バイオマーカー」は、コントロール被検体（例えば、陰性診断又は検出不能ながんを有する人、正常又は健康な被検体）から採取された同等の試料と比較した場合に、ヒトがんを有する患者から採取された試料中に存在する核酸分子を指す。
【００１８】
本明細書で使用される場合、用語「予測」は、患者の薬剤又は薬剤セットに対する有利な反応、又は不利な反応が生じる可能性、またそれらの反応を指す。それゆえ、治療予測因子は、予後とは独立した、具体的な処置に対する個々の患者の反応に関する変数である。
【００１９】
本明細書で使用される場合、用語「エピジェネティック状態」又は「エピジェネティック状況」は、一次ヌクレオチド配列以外の核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）の分子レベルでの任意の構造特性を指す。例えば、ゲノムＤＮＡのエピジェネティック状態は、例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターン又はゲノムＤＮＡの細胞タンパク質との関連によって決定された、又は影響を受けたゲノムＤＮＡの二次構造又は三次構造を含んでもよい。
【００２０】
本明細書で使用される場合、用語「メチル化プロファイル」又は「メチル化状況」は、被検体のゲノムＤＮＡにおける１又は複数のがんマーカー遺伝子のメチル化状況の提示を指す。幾つかの実施形態においては、既知のタイプの試料（例えば、がん性試料若しくは非がん性試料、又は異なるステージのがん由来の試料）に由来するメチル化プロファイルを含む標準的なメチル化プロファイルと上記メチル化プロファイルを比較する。幾つかの実施形態においては、本発明の方法を使用してメチル化プロファイルを作成する。上記プロファイルは、グラフ表示（例えば、紙面上又はコンピュータースクリーン上）、物理的表示（例えば、ゲル又はアレイ）、又はコンピューターメモリに保存されたデジタル表示であってもよい。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語「高メチル化」は、正常コントロールＤＮＡ試料内の対応するＣｐＧジヌクレオチドにおいて見出される５−メチルシトシン（５−ｍＣｙｔ）の量と比較した場合の試験ＤＮＡ試料のＤＮＡ配列内の１又は複数のＣｐＧジヌクレオチドにおける５−ｍＣｙｔの存在の増加に対応する平均メチル化状態を指す。
【００２２】
本明細書で使用される場合、用語「低メチル化」は、正常コントロールＤＮＡ試料内の対応するＣｐＧジヌクレオチドにおいて見いだされる５−ｍＣｙｔの量と比較した場合の試験ＤＮＡ試料のＤＮＡ配列内の１又は複数のＣｐＧジヌクレオチドにおける５−ｍＣｙｔの存在の減少に対応する平均メチル化状態を指す。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語「被検体」は、哺乳類等の任意の動物を意味し、マウス及びヒトを含むが、これらに限定されない。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「新生物」は、新形成（neoplasia）の結果である異常組織塊を指す。新形成は細胞の異常増殖である。新生物性細胞の増殖は、その周辺の正常組織の増殖を超過し、またその周辺の正常組織の増殖と調和しない。刺激の停止後であっても同様の過剰な様式で増殖が持続する。通常、新生物は腫瘤又は腫瘍を生じる。新生物は、良性であっても、前がん性（上皮内癌）又は悪性（がん）であってもよい。本発明によれば、新生物試料は、組織、組織試料、又は細胞試料（例えば、組織生検材料、例えば、吸引生検材料、ブラシ生検材料、擦過生検材料、針生検材料、パンチ生検材料、切除生検材料、直視下生検材料、切開生検材料又は内視鏡下生検材料）、腫瘍、腫瘍試料又は生体液（例えば、腹腔液、血液、血清、リンパ、髄液）を含む、被検体、好ましくはヒト被検体から得られた試料、又は被検体、好ましくはヒト被検体内に存在する試料である。
【００２５】
本明細書で使用される場合、用語「易罹患性」は、組織を或る特定の外来刺激に対して特別な方法で反応させ、そのようにして個体を通常よりも或る特定の疾患に対して易罹患性にする傾向がある、体質又は身体状態を指す。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「リスク」は、次の１０年以内、又は一生のうち等といった特定の期間の間に疾患に罹る推定された可能性を指す。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「腫瘍細胞」は、腫瘍内又は腫瘍に由来するがん性細胞を意味する。腫瘍細胞は、血管細胞等の腫瘍中に存在する他の非がん性細胞と明らかに異なる。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「予後診断」は、卵巣がん等の新生物性疾患の再発、転移性拡散及び薬剤耐性を含む、がんに起因する死亡又は進行の可能性の予測を指す。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「マイクロアレイ」は、基体上で規則正しく整列されたハイブリダイズ可能なアレイ構成要素、好ましくはポリヌクレオチドプローブを指す。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「検出する」又は「検出」は、検出対象の目的物の有無又は量を同定することを指す。
【００３１】
本明細書で使用され、用語「処置」は、疾患の病状又は症状が進行するのを防ぐこと又は変えることを目的として実施される介入である。したがって、「処置」は、治療処置と予防（prophylactic or preventative）手段との両方を指す。
【００３２】
一態様において、本発明は、被検体における卵巣新生物のリスク又は易罹患性を予測する方法であって、上記被検体より得られた卵巣新生物試料中の以下の１又は複数の遺伝子：ＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３、ＫＣＮＡ６、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＲＮＮ、ＨＦＥ２、ＴＷＩＳＴ１、ＧＡＴＡ４、ＣＡＣＹＢＰ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、Ｃ１ｏｒｆ１５８、Ａ４ＧＡＬＴ、ＭＬＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＳＴＣ２、ＡＴＧ４Ａ、ＥＮＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＭＧＳＴ２及びＴＨＲＢ、又はそれらと少なくとも８０％の類似性を有するポリヌクレオチド配列のＤＮＡメチル化を評価することを含み、ＤＮＡメチル化の変化が、被検体が卵巣新生物に易罹患性であることを示す、方法を提供する。好ましくは、ＤＮＡメチル化を伴う遺伝子は、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＡＤＲＡ１Ａ、ＣＡＣＮＢ２、ＧＡＴＡ４、ＫＣＮＡ６、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＮＥＦＨ、ＣＡＣＹＢＰ若しくはＣｌｏｒｆ１５８又はそれらの任意の組合せである。より好ましくは、ＤＮＡメチル化を伴う遺伝子は、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＡＤＲＡ１Ａ、ＣＡＣＮＢ２、ＧＡＴＡ４、ＫＣＮＡ６、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２若しくはＮＥＦＨ又はそれらの任意の組合せである。より好ましくは、ＤＮＡメチル化を伴う遺伝子は、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＣＥＡＣＡＭ４、ＧＡＴＡ４若しくはＩＧＳＦ２１又はそれらの任意の組合せである。より好ましくは、ＤＮＡメチル化を伴う遺伝子は、ＣＥＡＣＡＭ４、ＧＡＴＡ４若しくはＩＧＳＦ２１又はそれらの任意の組合せである。より好ましくは、ＤＮＡメチル化を伴う遺伝子は、ＰＯＵ４Ｆ２、ＮＥＦＨ、ＨＳ３ＳＴ２又はそれらの任意の組合せである。より好ましくはＤＮＡメチル化を伴う遺伝子は、ＣＡＣＹＢＰ若しくはＭＬＮ又はそれらの組合せである。
【００３３】
別の態様において、本発明は、卵巣がんと診断された被検体における予後又は悪性度を予測する方法であって、上記被検体から得られた卵巣がん試料中の以下の１又は複数の遺伝子：ＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３、ＫＣＮＡ６、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＲＮＮ、ＨＦＥ２、ＴＷＩＳＴ１、ＧＡＴＡ４、ＣＡＣＹＢＰ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、Ｃ１ｏｒｆ１５８、Ａ４ＧＡＬＴ、ＭＬＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＳＴＣ２、ＡＴＧ４Ａ、ＥＮＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＭＧＳＴ２及びＴＨＲＢ、又はそれらと少なくとも８０％の類似性を有するポリヌクレオチド配列のＤＮＡメチル化を評価することを含み、ＤＮＡメチル化の変化が、予後不良又は悪性卵巣がんを示す、方法を提供する。好ましくは、ＤＮＡメチル化を伴う遺伝子は、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＡＤＲＡ１Ａ、ＣＡＣＮＢ２、ＧＡＴＡ４、ＫＣＮＡ６、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＮＥＦＨ、ＣＡＣＹＢＰ若しくはＣｌｏｒｆ１５８又はそれらの任意の組合せである。より好ましくは、ＤＮＡメチル化を伴う遺伝子は、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＡＤＲＡ１Ａ、ＣＡＣＮＢ２、ＧＡＴＡ４、ＫＣＮＡ６、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２若しくはＮＥＦＨ又はそれらの任意の組合せである。より好ましくは、ＤＮＡメチル化を伴う遺伝子は、ＣＥＡＣＡＭ４、ＧＡＴＡ４若しくはＩＧＳＦ２１又はそれらの任意の組合せである。より好ましくは、ＤＮＡメチル化を伴う遺伝子は、ＰＯＵ４Ｆ２、ＮＥＦＨ、ＨＳ３ＳＴ２又はそれらの任意の組合せである。より好ましくはＤＮＡメチル化を伴う遺伝子は、ＣＡＣＹＢＰ若しくはＭＬＮ又はそれらの組合せである。
【００３４】
一実施形態では、本発明は、卵巣がんと診断された被検体における予後又は悪性度を予測する方法であって、上記被検体より得られた卵巣がん試料中の以下の１又は複数の遺伝子：ＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３、ＫＣＮＡ６、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＲＮＮ、ＨＦＥ２、ＴＷＩＳＴ１、ＧＡＴＡ４、ＣＡＣＹＢＰ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、Ｃ１ｏｒｆ１５８、Ａ４ＧＡＬＴ、ＭＬＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＳＴＣ２、ＡＴＧ４Ａ、ＥＮＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＭＧＳＴ２及びＴＨＲＢ、又はそれらと少なくとも８０％の類似性を有するポリヌクレオチド配列のＤＮＡメチル化を評価することを含み、非がん細胞において観察されるＤＮＡメチル化と比較した場合に、ＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３、ＫＣＮＡ６、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＲＮＮ、ＨＦＥ２、ＴＷＩＳＴ１、ＧＡＴＡ４、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＴＨＲＢ及びＭＧＳＴ２の１若しくは複数のＤＮＡ高メチル化、及び／又は非がん細胞において観察されるＤＮＡメチル化と比較した場合に、ＣＡＣＹＢＰ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、Ｃ１ｏｒｆ１５８、Ａ４ＧＡＬＴ、ＭＬＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＳＴＣ２及びＥＮＧの１若しくは複数のＤＮＡ低メチル化が、予後不良又は悪性卵巣がんを示す、方法を提供する。好ましくは、ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子は、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＡＤＲＡ１Ａ、ＣＡＣＮＢ２、ＧＡＴＡ４、ＫＣＮＡ６、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２若しくはＮＥＦＨ又はそれらの任意の組合せである。より好ましくは、ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子は、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＣＥＡＣＡＭ４、ＧＡＴＡ４若しくはＩＧＳＦ２１又はそれらの任意の組合せである。より好ましくは、ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子は、ＰＯＵ４Ｆ２、ＮＥＦＨ、ＨＳ３ＳＴ２又はそれらの任意の組合せである。より好ましくは、ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子は、ＣＥＡＣＡＭ４、ＧＡＴＡ４若しくはＩＧＳＦ２１又はそれらの任意の組合せである。好ましくはＤＮＡ低メチル化を伴う遺伝子は、ＣＡＣＹＢＰ若しくはＣｌｏｒｆ１５８又はそれらの組合せである。
【００３５】
本発明は、異なる生存転帰を有する被検体のメチル化プロファイルを比較し、卵巣新生物のリスク若しくは易罹患性及び／又は悪性卵巣がんの予後予測及び／又は検出のためのバイオマーカーとしての候補遺伝子を選択する。これらの目的は、少なくとも１又は複数の遺伝子のＣｐＧメチル化状況の分析によって達成される。
【００３６】
本発明の特定の実施形態は、卵巣がんの的確な予後診断を可能とする遺伝子のメチル化レベル及び／又はパターンの分析の新規な適用を提供し、それにより処置の改善を可能とする。本発明は、予後の予測及び卵巣がんの悪性度の検出に特に好ましい。上記方法は、内科医及び患者に、より優れた、より多くの情報に基づく処置決定を行うことを可能とする。これらの目的は、少なくとも１又は複数の遺伝子のＣｐＧメチル化状況の分析によって達成される。
【００３７】
本発明によれば、予後は、生存期間、例えば疾患特異的な生存期間又は全生存であってもよい。代替的には予後は再発までの期間であってもよい。
【００３８】
ＤＮＡメチル化は、メチルトランスフェラーゼと呼ばれる酵素によって行われるＤＮＡの化学的修飾であり、メチル基（ｍ）がＤＮＡの或る特定のシトシン（Ｃ）に付加される。この非突然変異（エピジェネティック）プロセス（ｍＣ）は、遺伝子発現調節において決定的因子である。また、ＤＮＡメチル化は、広範囲に亘る遺伝子の発現の上昇又は減少をもたらすがんに共通する変化であることが示されている（Jones, P. A., Cancer Res. 65:2463 (1996)）。ＤＮＡメチル化は、多くのがんにおいて特異的な遺伝子発現レベルと相関することから、腫瘍の発現プロファイルに対する有用な代用物として働く（Toyota, M. et al., Blood 97: 2823 (2001), Adorjan, P. et al. Nucl. Acids. Res. 10:e21 (2002)）。差次的メチル化分析を行うことによって、本発明は、卵巣新生物のリスク若しくは易罹患性及び／又は卵巣がんにおける予後不良及び／又は卵巣がんにおける悪性腫瘍を示す、ＤＮＡ高メチル化又はＤＮＡ低メチル化を呈する遺伝子セットを発見した。これらの遺伝子及びそれらの配列を下表１に記載する。
【００３９】
【表１】
2014525269.tif 000002
【００４０】
上記表１中の遺伝子のうち、Ｃｌｏｒｆ１５８、ＣＡＣＮＢ２、ＣＡＣＹＢＰ、ＩＧＳＦ２１、ＫＣＮＡ６、ＯＲ２Ｌ１３、ＴＢＸ２０、ＭＬＮ、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＴＨＲＢ、ＳＴＣ２、ＥＮＧ及びＭＧＳＴ２ががん及び遺伝子メチル化と関連することを説明する先行技術は存在しない。一部の先行引用文献は、Ａ４ＧＡＬＴ（J Biol Chem. 2002 Mar 29;277(13):11247-54. Epub 2002 Jan 8; BMB Rep. 2009 May 31;42(5):310-4）、ＡＤＲＡ１Ａ（PLoS One. 2009 Sep 18;4(9):e7068; PLoS One. 2008;3(11):e3742. Epub 2008 Nov 17）及びＣＤ２４８（BMC Cancer. 2009 Nov 30;9:417）が卵巣がん以外のがんと関連することを開示している。一部の先行引用文献は、ＨＳ３ＳＴ２（Oncogene. 2003 Jan 16;22(2):274-80）及びＴＷＩＳＴ１（Cancer Prev Res (Phila). 2010 Sep;3(9):1053-5. Epub 2010 Aug 10）が遺伝子メチル化と関連していることを報告した。一部の先行引用文献は、ＢＮＩＰ３（Tumori. 2010 Jan-Feb;96(1):138-42; BMC Cancer. 2009 Jun 9;9:175; World J Gastroenterol. 2010 Jan 21;16(3):330-8）及びＮＥＦＨ（PLoS One. 2010 Feb 3;5(2):e9003; Cancer. 2009 Aug 1;115(15):3412-26）、ＰＯＵ４Ｆ２（Oncogene. 2008 Jan 3;27(1):145-54. Epub 2007 Jul 16; FEBS Lett. 2007 May 29;581(13):2490-6. Epub 2007 May 2; BMC Med Genomics. 2009 Aug 17;2:53）が卵巣がん以外のがん及びメチル化と関連することを開示している。
【００４１】
高メチル化又は低メチル化は幅広いがんにおいて共通して知られているが、予後のマーカーとしては広く調査されておらず、また卵巣癌由来の悪性度における遺伝子の高メチル化又は低メチル化は当該技術分野において知られていない。当該技術分野において、上記表１中の遺伝子を易罹患性マーカー又は予後マーカーとして使用することができ、良性腫瘍と悪性腫瘍とを区別できることは何ら示されていない。
【００４２】
本発明によれば、上記表１中の１又は複数の遺伝子のＤＮＡメチル化の変化は、被検体が卵巣新生物に易罹患性であることを示す。
【００４３】
上記表１中の遺伝子のうち、非がん細胞において観察されるＤＮＡメチル化と比較した場合に、ＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３、ＫＣＮＡ６、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＲＮＮ、ＨＦＥ２、ＴＷＩＳＴ１、ＧＡＴＡ４、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＴＨＲＢ及びＭＧＳＴ２の１又は複数のＤＮＡ高メチル化が卵巣がんにおける予後不良を示す。好ましくは、ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子は、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＡＤＲＡ１Ａ、ＣＡＣＮＢ２、ＧＡＴＡ４、ＫＣＮＡ６、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２若しくはＮＥＦＨ、又はそれらの任意の組合せである。より好ましくは、ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子は、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＣＥＡＣＡＭ４、ＧＡＴＡ４若しくはＩＧＳＦ２１又はそれらの任意の組合せである。より好ましくは、ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子は、ＰＯＵ４Ｆ２、ＮＥＦＨ、ＨＳ３ＳＴ２又はそれらの組合せである。より好ましくは、ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子は、ＣＥＡＣＡＭ４、ＧＡＴＡ４若しくはＩＧＳＦ２１又はそれらの組合せである。代替的には、非がん細胞において観察されるＤＮＡメチル化と比較した場合に、ＣＡＣＹＢＰ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、Ｃ１ｏｒｆ１５８、Ａ４ＧＡＬＴ、ＭＬＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＳＴＣ２及びＥＮＧの１又は複数のＤＮＡ低メチル化が、卵巣がんにおける予後不良又は悪性卵巣がんを示す。好ましくは、ＤＮＡ低メチル化を伴う遺伝子は、ＣＡＣＹＢＰ若しくはＣｌｏｒｆ１５８又はそれらの任意の組合せである。本発明の実施形態において、卵巣がんにおける予後不良又は悪性卵巣がんを示すのに好ましいＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子は、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＣＥＡＣＡＭ４、ＧＡＴＡ４、ＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３若しくはＫＣＮＡ６又はそれらの任意の組合せである。より好ましくは、ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子は、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＡＤＲＡ１Ａ、ＣＡＣＮＢ２、ＧＡＴＡ４、ＫＣＮＡ６、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２若しくはＮＥＦＨ又はそれらの任意の組合せである。より好ましくは、ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子は、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＣＥＡＣＡＭ４、ＧＡＴＡ４若しくはＩＧＳＦ２１又はそれらの任意の組合せである。より好ましくは、ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子は、ＰＯＵ４Ｆ２、ＮＥＦＨ、ＨＳ３ＳＴ２又はそれらの任意の組合せである。より好ましくは、ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子は、ＣＥＡＣＡＭ４、ＧＡＴＡ４若しくはＩＧＳＦ２１又はそれらの任意の組合せである。卵巣がんにおける予後不良又は悪性卵巣がんを示すのに好ましいＤＮＡ低メチル化を伴う遺伝子は、ＣＡＣＹＢＰ若しくはＣ１ｏｒｆ１５８又はそれらの任意の組合せである。卵巣がんにおける予後不良又は悪性卵巣がんを示すのに好ましいＤＮＡ低メチル化を伴う遺伝子は、ＣＡＣＹＢＰ若しくはＭＬＮ又はそれらの組合せである。
【００４４】
上記表１中に明記されるバイオマーカー遺伝子は、公的に利用可能なデータベース登録において見いだされる特定の配列のみならず、対立遺伝子多型を含むこれらの配列の変異体をも包含する。変異体配列は、データベース登録の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する。同一性パーセントを特定するコンピュータープログラムは、全米バイオテクノロジー情報センターから利用可能なＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）を含め、当該技術分野において利用可能である。
【００４５】
従来のＤＮＡメチル化の検出方法は、制限酵素ランドマーク分析（restriction landmark analysis）のためのメチル化特異的制限酵素及び／又はメチル化感受性制限酵素を使用する。バイサルファイト配列決定法、メチル化特異的ＰＣＲ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ、マイクロアレイ、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）系電子電荷検出器（field effect transistor (FET) based electronic charge detector）を含む幾つかの先進的な方法がＤＮＡメチル化検出のため開発されている。メチル化状況を検出する方法は、例えば、米国特許第６，２１４，５５６号、同第５，７８６，１４６号、同第６，０１７，７０４号、同第６，２６５，１７１号、同第６，２００，７５６号、同第６，２５１，５９４号、同第５，９１２，１４７号、同第６，３３１，３９３号、同第６，６０５，４３２号及び同第６，３００，０７１号、並びに米国特許出願公開第２００３０１４８３２７号、同第２００３０１４８３２６号、同第２００３０１４３６０６号、同第２００３００８２６０９号及び同第２００５０００９０５９号に記載されており、これらの全てが引用することにより本明細書の一部をなすものとする。他のアレイに基づくメチル化分析方法は、米国特許出願第１１／０５８，５６６号（付与前の公報である米国特許出願公開第２００５０１９６７９２号）及び米国特許出願第１１／２１３，２７３号（付与前の公報である米国特許出願公開第２００６０２９２５８５号）に開示されており、それら両方の全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。幾つかのメチル化検出方法の総説については、Oakeley, E. J., Pharmacology & Therapeutics 84:389-400 (1999)を参照されたい。利用可能な方法としては、逆相ＨＰＬＣ、薄層クロマトグラフィー、標識化メチル基の取り込みによるＳｓｓＩメチルトランスフェラーゼ、クロロアセトアルデヒド（chloracetaldehyde）反応、差次的感受性制限酵素（differentially sensitive restriction enzymes）、ヒドラジン又は過マンガン酸塩処理（ｍ５Ｃは過マンガン酸塩処理によって開裂されるが、ヒドラジン処理によっては開裂されない）、亜硫酸水素ナトリウム、結合重硫酸塩制限分析（combined bisulphate-restriction analysis）、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳＰ）、ＣｐＧ島マイクロアレイ及びインフィニウムメチル化アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
別の態様において、本発明は、卵巣がんを有する被検体に対する処置決定を行う方法であって、被検体に有効量の脱メチル化剤を投与することを含み、被検体が、非がん細胞において観察されるＤＮＡメチル化と比較した場合に、ＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３、ＫＣＮＡ６、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＲＮＮ、ＨＦＥ２、ＴＷＩＳＴ１、ＧＡＴＡ４、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＤＴ１Ｈ２ＢＮ、ＴＨＲＢ及びＭＧＳＴ２の１若しくは複数、又はそれらと少なくとも８０％の類似性を有するポリヌクレオチド配列のＤＮＡ高メチル化を呈する、方法を提供する。好ましくは、ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子は、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＡＤＲＡ１Ａ、ＣＡＣＮＢ２、ＧＡＴＡ４、ＫＣＮＡ６、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２若しくはＮＥＦＨ又はそれらの任意の組合せである。より好ましくは、ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子は、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＣＥＡＣＡＭ４、ＧＡＴＡ４若しくはＩＧＳＦ２１又はそれらの任意の組合せである。より好ましくは、ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子は、ＰＯＵ４Ｆ２、ＮＥＦＨ、ＨＳ３ＳＴ２又はそれらの任意の組合せである。より好ましくはＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子は、ＣＥＡＣＡＭ４、ＧＡＴＡ４若しくはＩＧＳＦ２１又はそれらの組合せである。
【００４７】
本発明によれば、好適な脱メチル化剤として、５−アザ−２’−デオキシシチジン、５−アザ−シチジン、ゼブラリン、プロカイン、及びＬ−エチオニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
更なる態様において、本発明は、卵巣がんにおける予後不良又は悪性腫瘍を有する被検体に対する治療計画を決定する方法であって、被検体に化学療法を提供することを含み、被検体が、非がん細胞において観察されるＤＮＡメチル化と比較した場合に、ＮＰＴＸ２、ＴＮＮＩ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２、ＣＡＣＮＢ２、ＴＢＸ２０、ＯＲ２Ｌ１３、ＩＧＳＦ２１、ＣＤ２４８、ＡＤＲＡ１Ａ、ＮＥＦＨ、ＢＮＩＰ３、Ｃ１ＱＴＮＦ３、ＫＣＮＡ６、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＲＮＮ、ＨＦＥ２、ＴＷＩＳＴ１、ＧＡＴＡ４、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＴＨＲＢ及びＭＧＳＴ２の１若しくは複数、又はそれらと少なくとも８０％の類似性を有するポリヌクレオチド配列のＤＮＡ高メチル化、及び／又は非がん細胞において観察されるＤＮＡメチル化と比較した場合に、ＣＡＣＹＢＰ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、Ｃ１ｏｒｆ１５８、Ａ４ＧＡＬＴ、ＭＬＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＳＴＣ２及びＥＮＧの１又は複数のＤＮＡ低メチル化を有する、方法を提供する。好ましくは、ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子は、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＡＤＲＡ１Ａ、ＣＡＣＮＢ２、ＧＡＴＡ４、ＫＣＮＡ６、ＰＯＵ４Ｆ２、ＨＳ３ＳＴ２若しくはＮＥＦＨ又はそれらの任意の組合せである。より好ましくは、ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子は、ＡＴＧ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＣＥＡＣＡＭ４、ＧＡＴＡ４若しくはＩＧＳＦ２１又はそれらの任意の組合せである。より好ましくは、ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子は、ＰＯＵ４Ｆ２、ＮＥＦＨ、ＨＳ３ＳＴ２又はそれらの任意の組合せである。より好ましくは、ＤＮＡ高メチル化を伴う遺伝子は、ＣＥＡＣＡＭ４、ＧＡＴＡ４若しくはＩＧＳＦ２１又はそれらの任意の組合せである。好ましくはＤＮＡ低メチル化を伴う遺伝子は、ＣＡＣＹＢＰ若しくはＣｌｏｒｆ１５８又はそれらの任意の組合せである。より好ましくはＤＮＡ低メチル化を伴う遺伝子は、ＣＡＣＹＢＰ若しくはＭＬＮ又はそれらの組合せである。
【００４９】
本発明によれば、上記方法は、予後不良の被検体に化学療法を行う、又は予後が良好な被検体には化学療法を行わないといった、卵巣がんを有する被検体について処置決定を行うことを更に含んでもよい。上記方法は、上記被検体をアジュバント化学療法により処置することを更に含んでもよい。
【００５０】
その他のさらなる態様において、本発明は、卵巣新生物のリスク若しくは易罹患性、又は卵巣がんの予後若しくは悪性度を予測する、又は卵巣がんを有する被検体について処置決定を行うキットを提供する。上記キットは、メチル化を検査する試薬の集合である。典型的には上記キットは、全ての要素を含み、任意に指示書を備えたパッケージである。上記パッケージは、望まれるまで構成要素が混ざらないように分割されてもよい。構成要素は異なる物理学的状態にあってもよい。例えば、幾つかの構成要素は凍結乾燥されてもよく、また幾つかは水溶液であってもよい。幾つかは凍結されてもよい。個々の構成要素はキット内で別々に包装されてもよい。上記キットは、メチル化シトシン残基と非メチル化シトシン残基とを区別する上述の試薬を含んでもよい。望ましくは、上記キットは、本発明によって同定された遺伝子の転写開始部位内の領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを含む。典型的には、上記キットは、単一の遺伝子についてフォワードプライマー及びリバースプライマーの両方を含む。具体的なハイブリダゼーションは、典型的には、標的テンプレートに相補的な、少なくとも１２、１４、１６、１８、又は２０の連続したヌクレオチドを有するプライマーによって達成される。上記プライマーは、標的テンプレートと１００％同一であることが多い。例えば、１２、１５、１８又は２０ヌクレオチドの十分な相補性領域が存在すれば、上記プライマーは、ハイブリダイゼーションに干渉しないが、他の操作に有用な可能性のある付加的なヌクレオチド残基を含んでもよい。かかる他の残基の例として、制限エンドヌクレアーゼ切断部位、リガンド結合部位又は因子結合部位若しくはリンカー部位であってもよい。オリゴヌクレオチドプライマーは、修飾メチル化残基に特異的であってもよく、又はそうでなくてもよい。上記キットは、任意に、オリゴヌクレオチドプローブを含んでもよい。上記プローブは、修飾メチル化残基を含む配列、又は非メチル化残基を含む配列に特異的であってもよい。上述のプライマーのように、特異的なハイブリダイゼーションは、上記標的に対して十分な相補性領域を有することによって達成される。上記キットは、任意に、メチル化シトシン残基を修飾する試薬を含んでもよい。また、上記キットは、ＤＮＡポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオチド等の増幅を実施する構成要素を含んでもよい。また、プライマー又はプローブ上に検出可能な標識を含む検出手段を、キットに備えてもよい。また、キットは、本発明のマーカーの１つについて遺伝子発現を検出する試薬を含んでもよい。かかる試薬は、例えば、プローブ、プライマー、又は抗体を含み得る。酵素又はリガンドの場合、基質又は結合パートナーは、マーカーの存在を評価するのに適している可能性がある。
【００５１】
本発明の方法において使用される材料は、よく知られた手法に従って生産されるキットの調製に適している。それゆえ、本発明は、予後の転帰若しくは悪性レベルの予測について開示された遺伝子の発現を定量する遺伝子特異的若しくは遺伝子選択的プローブ及び／又はプライマーを含み得る、作用因子を含むキットを提供する。かかるキットは、任意に、腫瘍試料、特に、固定されたパラフィン包埋組織試料からのＲＮＡ抽出用試薬及び／又はＲＮＡ増幅用試薬を含んでもよい。さらに、上記キットは、任意に、識別記述（identifying description）若しくはラベル、又は本発明の方法における使用に関する指示書を有する試薬（複数の場合もあり）を含んでもよい。上記キットは、例えば、組み立て式マイクロアレイ、緩衝溶液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ；又はｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ及びＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、並びに本発明の１又は複数のプローブ及びプライマー（例えば、適切な長さのポリ（Ｔ）又はＲＮＡポリメラーゼに反応性のプロモーターに連結されたランダムプライマー）を含む、上記方法において利用される１又は複数の様々な試薬（典型的には濃縮形態）を各々含む容器（上記方法の自動化された実施における使用に好適なマイクロタイタープレートを含む）を含んでもよい。また、予後又は予測情報を推定又は定量するために使用される数学的アルゴリズムは、適切な可能性のあるキットの構成要素である。
【００５２】
本出願において引用される全ての出版物及び特許文献は、個別の出版物又は特許文献が各々そのように表示される場合と同じ程度で全ての目的のためにそれらの全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。本明細書におけるそれらの様々な参考文献の引用により、本出願人らは、いかなる特定の参照文献も本発明に対する「先行技術」として認めるものではない。
【実施例】
【００５３】
実施例１  本発明の２５のバイオマーカー遺伝子の同定
本実施例は、卵巣がんの予後予測及びスクリーニングのための新規なＤＮＡメチル化バイオマーカーを発見するものである。台湾の台北にあるTri-Service General Hospitalの国防医学院（National Defense Medical Center）において、患者とのインフォームドコンセントのもと組織試料を採取した。この研究は、治験審査委員会によって承認された。４９の悪性組織及び１２の良性組織を含む６１名の独立した患者の卵巣試料を使用した。これらの試料を手術中に取得し、液体窒素中で急速凍結して分析まで−８０℃で保存した。悪性細胞の存在を組織学的検査によって確認した。組織構造を評価するため、婦人科病理学者によって全ての標本を再調査した。最初の手術から進行性疾患までの時間として無増悪生存（ＰＦＳ）を規定した。第１選択の標準的治療後に持続性疾患を呈する患者をＰＦＳ分析から除外した。全生存（ＯＳ）を最初の手術からＥＯＣによる死亡までの時間として規定した。
【００５４】
市販のＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡａｍｐ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ；Qiagen、ドイツ、ヒルデン）を使用してゲノムＤＮＡを組織試料から抽出した。使用者用マニュアルに記載されるプロトコルに従って、市販のＤＮＡ血液ミニキット（ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；Qiagen）を使用してゲノム血清ＤＮＡを１ｍｌの血清から抽出した。
【００５５】
製造業者の推奨に従って、ＣｐＧｅｎｏｍｅ  Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Chemicon-Millipore、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）を使用して、１μｇのゲノムＤＮＡをバイサルファイト修飾し、ヌクレアーゼフリーの水７０ｍｌに再溶解した。本発明者らは、バイサルファイト修飾、定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ＱＭＳＰ）を使用して上皮性卵巣がんの患者、良性及び正常な卵巣組織を有する患者におけるプロモーターメチル化状況を比較し、パイロシーケンシング分析により確認した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Roche、米国インディアナ州インディアナポリス）を使用してＴａｑＭａｎプローブシステムにおいてＱＭＳＰを行った。ＤＮＡメチル化を、式：１００００×２［（ＣＯＬ２ＡのＣｐ）−（遺伝子のＣｐ）］を用いて、メチル化インデックス（Ｍインデックス）で推定した。ＣＯＬ２Ａに対するＣｐ値が３６より大きい試験結果を検出失敗と規定した。バイサルファイト処理ＤＮＡを増幅して配列決定するために、パイロシーケンシング用プライマーを、ＰｙｒｏＭａｒｋ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ２．０ソフトウェア（Qiagen）によって設計した。ユニバーサルプライマー及び増幅プライマーを先行文献に従って得た。ビオチン化ＰＣＲ産物を、ストレプトアビジンセファロースビーズに結合させ、洗浄し、変性させた。１本鎖ＰＣＲ産物にシーケンシングプライマーを添加した後、製造業者の指示書に従って、ＰｙｒｏＭａｒｋ  Ｑ２４ソフトウェア（Qiagen、ドイツ）によってパイロシーケンシングを行った。
【００５６】
インフィニウムメチル化アッセイを使用し、各臨床試料のメチル化プロファイルを分析した（Laurent L., Wong E., Li G., Huynh T., Tsirigos A., et al., 2010, "Dynamic changes in the human methylome during differentiation," Genome Res 20: 320-331）。異なる生存転帰を有する患者のメチル化プロファイルを比較する差次的メチル化分析を実施して、候補遺伝子を選択した（Pavlidis P, Noble WS, 001, "Analysis of strain and regional variation in gene expression in mouse brain," Genome Biol 2: RESEARCH0042）。卵巣がん異常細胞株（ovarian carcinoma mad cell line）プールにおいてメチル化ＤＮＡを検証するための体系的方法が下記概略図に示される。各患者の試料を卵巣コホートにおいて検証した。
【００５７】
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【００５８】
本発明者らは、受信者動作特性（ＲＯＣ）の曲線下面積（ＡＵＣ）を算出することによって、再発患者と非再発患者とを区別するための各遺伝子のメチル化状況に関するカットオフ値の強い識別性について評価した。本発明者らは、死亡患者と生存患者とを区別するための適切なカットオフ値を推定するために同一の戦略を使用した。ＡＵＣ分析による適切なカットオフ値に従い、本発明者らは、さらなる統計を行うため、全てのメチル化値を高値及び低値の二項コード（binomial code）として規定した。カイ二乗検定、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定又はマンホイットニーＵ検定を使用して、異なる群のカテゴリー変数間の相関を特定した。ＰＦＳ及びＯＳは、カプランマイヤー生存分析、単変量及び多変量ＣＯＸ回帰分析に関する生存関数を説明するものであった。単変量ＣＯＸ回帰分析により、各候補遺伝子に関する臨床病理学的特性リスクの評価のため、ハザード率（ＨＲ）及び９５％信頼区間（ＣＩ）を算出した。ログランク検定によって、候補遺伝子における高メチル化患者対低メチル化患者について、生存期間の中央値を算出した。多変量Ｃｏｘ比例ハザードモデルを実施して、年齢、ＤＮＡメチル化状況、ステージ、グレード、及び組織学的サブタイプの独立した予後値を決定した。全統計について両側検定を考慮し、０．０５未満のｐ値を有意とした。最初にｗｉｎｄｏｗｓ用統計パッケージＳＰＳＳバージョン１７．０（SPSS，Inc.、イリノイ州シカゴ）を使用して、全ての統計学的計算を行った。
【００５９】
統計学的有意性、及び短期生存と長期生存との間で大きな差次的メチル化を有する２５の遺伝子を検出した。表２は、ポリメラーゼ連鎖反応及びバイサルファイトパイロシーケンシングプライマーの要約を示す。表３は、２５の遺伝子における全生存の単変量ＣＯＸ回帰分析を示す。表４は、良性腫瘍と悪性腫瘍との間の差次的メチル化レベルを示す。表５は、メチル化の多変量分析、並びに無増悪生存（ＰＦＳ）及び全生存（ＯＳ）に対する臨床病理学的因子を示す。
【００６０】
【表２】
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【００６１】
【表３】
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【００６２】
【表４】
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【００６３】
【表５】
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【００６４】
図１は、異なる予後（長期生存及び短期生存）を有する患者の差次的メチル化分析を示す。生存３年目において患者を２群に分けた。図１に示されるように、第１ブロック、第２ブロックにおける点は、差次的にメチル化された遺伝子（右）又は非メチル化遺伝子（左）を表す。最も有意な点は、さらなる評価のため選択された候補遺伝子である。図２ａ〜図２ｃは、候補遺伝子のＤＮＡメチル化と生存との相関を示す。結果より、１９の遺伝子が高メチル化状況における高リスクを有し、他の６遺伝子は低メチル化においてより高いリスクを有することを示す。図２ａに示されるように、予後不良のＤＮＡ高メチル化を右側に記載する。予後不良のＤＮＡ低メチル化を左側に記載する。図２ｂは、卵巣がんの患者における全生存（ＯＳ）のカプランマイヤー生存推定を示す。ＰＯＵ４Ｆ２及びＨＳ３ＳＴ２について、０．４ＡＶＧ値に従って患者を高メチル化（Ｈ）及び低メチル化（Ｌ）にグループ分けし、高メチル化患者は短い生存期間を呈する。ＣＡＣＹＢＰ及びＣｌｏｒｆ１５８について、０．４ＡＶＧ値に従って患者を高メチル化（Ｈ）及び低メチル化（Ｌ）にグループ分けし、低メチル化患者は短い生存期間を呈する。図２ｃは、卵巣がんを有する患者における無増悪生存（ＰＦＳ）のカプランマイヤー生存推定を示す。ＮＥＦＨ及びＨＳ３ＳＴ２の高メチル化が危険因子である一方で、ＰＯＵ４Ｆ２の低メチル化が危険因子である。これらのメチル化状況の任意の危険因子を有する患者（患者は、１、２又は３の危険因子を有する可能性がある）は、左に示されるように予後不良となる。これらのメチル化状況のいかなる危険因子も有していない患者は、右に示されるように、より良好な予後を有する。これらの３つの危険因子のうちいずれか２つを有する患者（患者は２又は３の危険因子を有する可能性がある）は、左に示されるように予後不良となる。いかなる危険因子も有していない患者又は１つの危険因子のみを有する患者は、より良好な予後を有する。
【００６５】
実施例２  本発明の６つのバイオマーカー遺伝子の同定
台湾の台北にあるTri-Service General Hospitalの国防医学院において、患者とのインフォームドコンセントのもと組織試料を採取した。この研究は治験審査委員会によって承認された。患者には、卵巣上皮癌（ＥＯＣ）を有する１１０名、良性卵巣腫瘍を有する６０名、診断が組織学的サブタイプ及び組織学的グレードを含むものであった正常卵巣組織を有する２８名が含まれる。手術中にこれらの試料を取得し、液体窒素中で急速凍結し、分析まで−８０℃で保存した。組織学的検査によって悪性細胞の存在を確認した。組織構造を評価するため、婦人科病理医によって全ての標本を再調査した。無増悪生存（ＰＦＳ）を最初の手術から進行性疾患までの時間として規定した。第１選択の標準的な治療後に持続的な疾患を呈する患者を、ＰＦＳ分析から除外した。全生存（ＯＳ）を最初の手術からＥＯＣによる死亡までの時間として規定した。
【００６６】
ゲノムＤＮＡ抽出、ＱＭＳＰ、インフィニウムメチル化アッセイ、差次的メチル化分析及びカプランマイヤー生存分析を、実施例１に示される通り行った。統計学的に有意であり、短期生存と長期生存との間の大きな差次的メチル化を有する６つの遺伝子を検出した。バイサルファイトパイロシーケンシングプライマーを表６に示す。
【００６７】
これらのＤＮＡメチル化の予後有意性を試験した。無増悪生存（ＰＦＳ）及び全生存（ＯＳ）に対する単変量Ｃｏｘ回帰分析の結果を表８に提示する。予測された通り、ＦＩＧＯステージ及び組織学的グレードはＰＦＳ及びＯＳと関連した。ＡＴＧ４Ａ低メチル化は、ＰＦＳ（ＨＲ＝２．５０；９５％ＣＩ  １．１８〜５．２６）及びＯＳ（ＨＲ＝２．０９；９５％ＣＩ  １．０８〜４．０４）と有意に関連した。ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮのメチル化の存在及び再発間の境界線上の有意な相関が観察された。ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮの低メチル化を有する患者の予後は、より悪い生存と僅かに関連した。ＨＲ値は６．０８（９５％ＣＩ、０．８３〜４４．４５）であった。がん患者のＰＦＳ及びＯＳに対するカプランマイヤー分析により、ＡＴＧ４Ａ又はＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮの低メチル化を有する患者は、追跡期間内において、高メチル化を有する患者よりも有意に短いＰＦＳ（図３Ａ及び図３Ｂ；それぞれＰ＝０．０１及び０．０６）を与え、死亡する確率がより高い（図３Ｃ及び図３Ｄ；それぞれＰ＝０．０３及び０．０５）ことが明らかとなった。シスプラチン抵抗性の患者は、ＡＴＧ４Ａの低メチル化と有意に関連した（表７）。多変量Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析において、関連する因子について補正した後のＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮのメチル化は、ＰＦＳ及びＯＳに対して独立した影響を示した（表８）。ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮの低メチル化を有する患者は、ＰＦＳについてハザード率５．１６（９５％ＣＩ、１．２２〜２１．９４）及びＯＳについてハザード率８．０８（９５％ＣＩ、１．１０〜５９．３７）であった。ＡＴＧ４Ａの低メチル化は単変量分析における死亡の有意な予測因子であるものの、この影響は多変量分析においてはもはや明らかではなかった。さらに、本発明者らは、ＡＴＧ４Ａ及びＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮを一組として捉え、両方の遺伝子が低メチル化されているものとして低メチル化群を規定し、それ以外を高メチル化群と規定した。図３Ｅ及び図３Ｆにおいて、がん患者のＰＦＳ及びＯＳの低メチル化群と高メチル化群との間において優れた識別力が示されている（それぞれログランクＰ＝０．００２及びＰ＝０．００４）。
【００６８】
ｑＭＳＰを使用して、正常卵巣組織、良性腫瘍組織及び悪性腫瘍組織を含む臨床材料において、ＡＴＧ４Ａ及びＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮのメチル化状況を更に検証した（図３Ａ及び図３Ｂ）。良性腫瘍及び悪性腫瘍の両方が、正常卵巣組織よりも有意に高いメチル化レベルを与える。
【００６９】
【表６】
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【００７０】
【表７】
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【００７１】
【表８】
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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