(57)【要約】  チクングニアウイルスの任意の遺伝子型バリアントに対して免疫性を付与することができる、チクングニアウイルス感染症の予防及び処置のためのワクチン組成物が開示される。より詳細には、本発明は、チクングニアウイルス感染症に対するワクチン抗原として使用するウイルス様粒子として発現され得る、特定のヌクレオチド配列及びそれから翻訳されるタンパク質を開示する。本発明で開示される組成物は、ヒトスジシマカ及びネッタイシマカを含む任意の適切な疾患媒介生物で伝播され得るチクングニアウイルスの任意の遺伝子型バリアントに対しても防御的である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チクングニアウイルスによって引き起こされる感染症の予防、処置及び診断のための治療的活性成分として、ネッタイシマカに対する前記ウイルスの適応を増加させる１又は２以上のミュータントを有しかつヒトスジシマカに感染し得る不活化チクングニアウイルス株、又は前記株由来の精製ウイルス抗原を含み、それによりチクングニアウイルスの任意の遺伝子型バリアント又はミュータントに対する免疫を付与することのできる安定ワクチン組成物。
【請求項２】
チクングニアウイルス感染症に対する有望なワクチン候補として使用される、真核生物又は原核生物発現ベクターにおける構造的抗原の組換えクローニング及び発現用に、チクングニアウイルス分離株のウイルス株が、配列番号１〜７及び配列番号１５〜２０に開示されるヌクレオチド配列を含有するTN01610、TN015110、TN06210、TN06310、TN06410及びAP109から選択される、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
チクングニアウイルス株が、構造ポリタンパク質内に、Ｅ１構造糖タンパク質のE1-K211Eに対応する非同義変異K1020Eを、単独で、又はチクングニアウイルスの構造ポリタンパク質配列のA232V、D301N、K327N、G380R、K391E、V589A、P867L、G1004R、及びA1035Vから選択される他の変異との組み合わせで有する、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
チクングニアウイルス分離株が、チクングニアウイルス感染症及びその任意の遺伝子型又はミュータントに対するワクチン抗原として使用するための、配列番号１〜７のヌクレオチドにそれぞれ対応する配列番号８〜１４に開示される構造ポリタンパク質配列を有する、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
治療的活性を持つ抗原が、開示されるチクングニアウイルス株のカプシドタンパク質と構造糖タンパク質の組み合わせであり、ウイルス様粒子として発現するためのC-E3-E2-6K-E1、C-E2-E1、及びE2-E1タンパク質を含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
開示されるチクングニアウイルス株の組換えタンパク質の発現のための原核生物発現系が大腸菌であり、真核生物発現系が酵母ピキア・パストリスである、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
チクングニアウイルスが、以下のいずれかの方法で不活性化される、請求項１に記載のワクチン組成物。
ｉ）４５℃〜６０℃で３０分〜４時間、熱不活化；
ii）２５４ｎｍで３０分〜１２０分、紫外線照射；
iii）２℃〜８℃で７日間又は２０℃〜２５℃の範囲の環境温度で２日間、最大１：３０００（ホルマリン：ウイルス）の比でホルマリン処置；
iv）２℃〜８℃で７日間又は２０℃〜２５℃の範囲の環境温度で２日間、最大１：１０００〜１：２５００（ＢＰＬ：ウイルス）の比でβプロピオラクトン（以下、ＢＰＬ）処理であり、添加剤はグリシン、マンニトール、ソルビトール、スクロース及びトレハロースから選択される；
ｖ）６０Ｃｏ源からの１０ｋＧｙ（キログレイ）〜２５ｋＧｙの線量にウイルス試料を曝露することによるγ線照射； 
【請求項８】
（ａ）水酸化アルミニウム、（ｂ）リン酸アルミニウム、（ｃ）γイヌリン、（ｄ）アルガムリン（水酸化アルミニウムとγイヌリンとの組合せ）、（ｅ）油中コレカルシフェロール、（ｆ）１０ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液中にスクアレン、tween-80、Span-85を含有する水中油型エマルジョンＯＷＥＭ１、（ｆ）リン酸−クエン酸緩衝液中にスクアレン、tween-80、Span-85、α−トコフェロールを含有する水中油型エマルジョンＯＷＥＭ２、（ｇ）リン酸−クエン酸緩衝液中にスクアレン、tween-80、Span-85、コレカルシフェロールを含有する水中油型エマルジョンＯＷＥＭ３から選択されるアジュバントをさらに含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
４０ｍＭのリン酸緩衝液及び１５０ｍＭのＮａＣｌ中に、ヒト１回あたり１μｇ〜１００μｇの範囲の用量のウイルス抗原をさらに含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載のワクチン組成物を、筋肉内、皮内、皮下、静脈内、経口又は鼻腔内から選択される経路のいずれかでヒトに投与することを含む、チクングニアウイルス感染症に対するヒト個体の防御的免疫応答を誘導する方法。
【請求項１１】
ヒトにおけるチクングニアウイルス感染症の検出のための免疫診断剤としてのチクングニアウイルス分離株の使用であって、チクングニアウイルス分離株の構造ポリタンパク質遺伝子配列が配列番号１〜７に開示され、それから翻訳されるタンパク質が配列番号８〜１４に開示される、前記使用。
【請求項１２】
ヒトにおけるチクングニアウイルス感染症及び日本脳炎ウイルス感染症に対する防御的免疫応答を誘導するための組合せワクチン組成物であって、
不活化チクングニアウイルス抗原と、
不活化日本脳炎全ウイルス粒子抗原と、
（ａ）水酸化アルミニウム、（ｂ）リン酸アルミニウム、（ｃ）γイヌリン、（ｄ）アルガムリン（水酸化アルミニウムとγイヌリンとの組合せ）、（ｅ）油中コレカルシフェロール、（ｆ）１０ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液中にスクアレン、tween-80、Span-85を含有する水中油型エマルジョンＯＷＥＭ１、（ｆ）リン酸−クエン酸緩衝液中にスクアレン、tween-80、Span-85、α−トコフェロールを含有する水中油型エマルジョンＯＷＥＭ２、及び（ｇ）リン酸−クエン酸緩衝液中にスクアレン、tween-80、Span-85、コレカルシフェロールを含有する水中油型エマルジョンＯＷＥＭ３から選択されるアジュバント
とを含む、前記組合せワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チクングニアウイルスにより引き起こされる任意の感染症を予防及び処置するための安定免疫原性組成物に関する。本発明は、特に、ヒトにおけるチクングニア感染症の予防、治療的処置及び診断のための、チクングニアウイルス（Chikungunya virus、以下、ＣＨＩＫＶと称する）株の組成物、及びチクングニアウイルスのサブユニット抗原の使用に関する。より詳細には、本発明は、チクングニアウイルスの任意の遺伝子型バリアント又はミュータントに対する血清抗体保有に十分な抗体力価を付与するチクングニアウイルスの任意の遺伝子型又は抗原的バリアント又はミュータントに対する予防及び処置のための安定免疫原性ワクチン組成物に関する。また本発明は、限定されないが、日本脳炎ウイルス用のワクチン、デングワクチン、ウエストナイルウイルスワクチン及びチャンディプラウイルスワクチン及び狂犬病ワクチンを含むリストから選択される他の細菌及びウイルス感染症と組み合わせたチクングニアウイルスに対する免疫化のためのワクチン組成物に関する。他のウイルスワクチンとの組み合わせも本発明の範囲内である。
【背景技術】
【０００２】
チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）は、トガウイルス（Togaviridae）科のアルファウイルスである。チクングニアウイルスは、高熱と突然の多発性関節痛の発症により特徴づけられる一般に非致命的な感染症を引き起こすプラス鎖ＲＮＡウイルスである。出血及び神経学的な徴候（例えば、発作、リンパ節腫脹、劇症肝炎、及び従来ＣＨＩＫＶ感染症に関連しなかった結膜炎）が、２００５年の再発性感染症から報告された（Sourisseau M, Schilte C, Casartelli N, Trouillet C, Guivel-Benhassine F, Rudnicka D, Sol-Foulon N, Le Roux K, Prevost MC, Fsihi H, Frenkiel MP, Blanchet F, Afonso PV, Ceccaldi PE, Ozden S, Gessain A, Schuffenecker I, Verhasselt B, Zamborlini A, Saib A, Rey FA, Arenzana-Seisdedos F, Despres  P, Michault A, Albert ML, Schwartz O. 2007. Characterization of reemerging Chikungunya virus. PLoS Pathog 3:e89、Kannan M, Rajendran R, Sunish IP, Balasubramaniam R, Arunachalam N, Paramsivan R, Tewari SC, Samuel PP, Tyagi BK. 2007. A study on Chikungunya outbreak during 2007 in Kerala, south India. Indian J Med Res 129:311-315）。部分的なＥ１構造糖タンパク質配列に基づく系統発生分析により、West African、Asian、及びEast, Central and South African（ＥＣＳＡ）の３つのＣＨＩＫＶ系統が同定された（Powers AM, Brault AC, Tesh RB, Weaver SC. 2000. Re-emergence of Chikungunya and o’nyong-nyong viruses: evidence for distinct geographical lineages and distant evolutionary relationships. J Gen Virol  81:471-479）。Asian系統は、ＥＣＳＡ遺伝子型と入れ替わるまでインド及び東南アジアで周回しており、２００５〜２００６年のインド洋諸島での集団発生で出現してきた（Yergolkar PN, Tandale BV, Arankalle VA, Sathe PS, Sudeep AB, Gandhe SS, Gokhle MD, Jacob GP, Hundekar SL, Mishra AC. 2006. Chikungunya outbreaks caused by African genotype, India. Emerg Infect Dis 12:1580-1583）。局地的に樹立したＥＣＳＡ株の亜系統は、流行地域からアフリカ、アジア及びヨーロッパへの旅行者によって拡大され、局地的な集団発生を引き起こした（Powers AM, Logue CH. 2007. Changing patterns of Chikungunya virus: re-emergence of a zoonotic arbovirus. J Gen Virol 88:2363-2377）。ほぼ１３９万件の、チクングニアウイルスに感染した疑いのある症例が、２００６年にインドで発生したが（National Vector Borne Disease Control Programme（ＮＶＢＤＣＰ）、２００７）、この原因は、E1-226Aを保有するＥＣＳＡ株であった（Arankalle VA, Shrivastava S, Cherian S, Gunjikar RS, Walimbe, AM, Jadhav, SM, Sudeep AB, Mishra AC. 2007. Genetic divergence of Chikungunya viruses in India (1963-2006) with special reference to the 2005-2006 explosive epidemic. J Gen Virol 88:1967-1976）。ヒトスジシマカ（Aedes albopictus）による伝染性を増加させるE1-A226V適応的変異は、それ以来、ウイルスの広い地理的拡大の原因になっている（de Lamballerie X, Leroy E, Charrel RN, Ttsetsarkin K, Higgs S, Gould EA. 2008. Chikungunya virus adapts to tiger mosquito via evolutionary convergence: a sign of things to come? Virol J 5:33）。宿主の免疫圧と、結果的なＣＨＩＫＶゲノムのヒト白血球抗原（ＨＬＡ、human leukocyte antigen）クラス−１制限要素における部位特異的な変異が、２００５年以来の爆発的なチクングニアウイルス集団発生に関与している（Tong JC, Simarmata D, Lin RT, Renia L, Ng LF. 2010. HLA Class I restriction as a possible driving force for Chikungunya evolution. PLoS One 5:e9291）。当該分野で知られる先行技術には、ＥＣＳＡ株由来のいかなるワクチン候補も含むものはない。Bharat Biotech International Limited社は、E1-226Aを有する２００６年のＥＣＳＡ株と、チクングニアウイルス感染症に対す���潜在的なワクチン開発におけるその株の使用とを先に発展させた（国際公開第２００８／０２６２２５号パンフレットに開示）。
【０００３】
都市性（流行性）伝染サイクルのチクングニアウイルス株は、風土病性（野生鳥獣伝染性）伝染サイクルのものより高い進化速度を示し、この２つの伝染サイクル間の進化動態の差異は、ウイルス−宿主相互作用を決定するいくつかの因子、例えば、媒介生物の多様性及び豊富さ、媒介生物の幼生の生息地、及び全個体群における集団免疫によって影響を受ける（Volk SM, Chen R, Tsetsarkin KA, Adams AP, Garcia TI, Sall AA, Nasar F, Schuh AJ, Holmes EC, Higgs S, Maharaj PD, Brault AC, Weaver SC. 2010. Genome-scale phylogenetic analyses of Chikungunya virus reveal independent emergences of recent epidemics and various evolutionary rates. J Virol 84:6497-6504）。チクングニアのようなアルボウイルスは、節足動物宿主と脊椎動物宿主のいずれとも相互作用し、エンベロープ糖タンパク質の選択圧は、媒介生物適応の優先性及び脊椎動物宿主の免疫防御メカニズムによって推進される。ウイルスの進化は、中和化に関与する抗原決定基並びに媒介生物／宿主適応に関与する抗原決定基残基における変異を選択する傾向にある。
【０００４】
開発中のワクチン、例えば、国際公開第２００８／０３０２２０号パンフレット及びAkahata W, Yang ZY, Andersen H, Sun S, Holdaway HA, Kong WP, Lewis MG, Higgs S, Rossmann MG, Rao S, Nabel GJ. 2010. A virus-like particle vaccine for epidemic Chikungunya virus protects nonhuman primates against infection. Nat Med. 2010; 16(3):334-8に開示されるワクチンは、West African遺伝子型とE1-A226V分離株とを利用している。開発中の別のＣＨＩＫＶワクチンは、ＤＮＡワクチン（Mallilankaraman K, Shedlock DJ, Bao H, Kawalekar OU, Fagone P, Ramanathan AA, Ferraro B, Stabenow J, Vijayachari P, Sundaram SG, Muruganandam N, Sarangan G, Srikanth P, Khan AS, Lewis MG, Kim JJ, Sardesai NY, Muthumani K, Weiner DB. 2011: A DNA vaccine against Chikungunya virus is protective in mice and induces neutralizing antibodies in mice and nonhuman primates. PLoS Negl Trop Dis.; 5(1):e928）であるが、本発明に開示の範囲とは異なるものである。弱毒化生ワクチンである初期のプロトタイプワクチンでは、Asian遺伝子型ウイルスが使用された（Edelman R, Tacket CO, Wasserman SS, Bodison SA, Perry JG, Mangiafico JA. 2001: Phase II safety and immunogenicity study of live Chikungunya virus vaccine TSI-GSD-218. Am J Trop Med Hyg. 2000; 62(6):681-5）。ＤＮＡワクチンは、これまで、ヒトの予防接種において成功しておらず、弱毒化ＣＨＩＫＶワクチンは、ワクチンを受けたヒト対象に副作用を引き起こした（Edelman R, Tacket CO, Wasserman SS, Bodison SA, Perry JG, Mangiafico JA. 2001: Phase II safety and immunogenicity study of live Chikungunya virus vaccine TSI-GSD-218. Am J Trop Med Hyg. 2000; 62(6):681-5）。初期のワクチン開発（国際公開第２００８／０２６２２５号パンフレット）で使用されたＣＨＩＫＶ株は、E1-226Aを有する２００６  ＥＣＳＡ株であった。本発明に開示の、２００９〜２０１０年にインドで単離された株は、ＥＣＳＡ系統の別個の亜系統に属し、Ｅ２及びＥ１エンベロープ糖タンパク質に新規な変異を保有する。本研究で報告される全ての分離株におけるＥ１糖タンパク質の変異の１つは、宿主媒介生物特異性を決定する領域に位置しており、ネッタイシマカ（Adis. aegypti）（前記地域及び実にチクングニアウイルス感染症が現在流行している熱帯諸国において最も数の多い媒介蚊）に対する適応性が向上する顕著な正の選択下にある。これまで報告されていなかった他の新規変異も開示される。このように、チクングニアウイルスＥＣＳＡ株の新たに発展した別個の亜系統に対する免疫を付与し、さらに、媒介生物のネッタイシマカ（Aedis aegypti）によって伝達されるＥＣＳＡ株の他の変異株に対する免疫防御を付与するワクチン組成物を作製することが望ましい。本出願の発明者は、さらに長い研究の後、先のワクチン（国際公開第２００８／０２６２２５号パンフレット）を上回る他の付加的な利点を有する本出願の有効なワクチン、ウイルス不活化の新規方法、並びに、不活化ウイルスワクチン、組換えサブユニットワクチン及びビロソームの免疫原性を増加させる新規アジュバントを有する改善された製剤などを開示し、その内容も本発明に含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００８／０２６２２５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００８／０３０２２０号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Sourisseau M, Schilte C, Casartelli N, Trouillet C, Guivel-Benhassine F, Rudnicka D, Sol-Foulon N, Le Roux K, Prevost MC, Fsihi H, Frenkiel MP, Blanchet F, Afonso PV, Ceccaldi PE, Ozden S, Gessain A, Schuffenecker I, Verhasselt B, Zamborlini A, Saib A, Rey FA, Arenzana-Seisdedos F, Despres  P, Michault A, Albert ML, Schwartz O. 2007. Characterization of reemerging Chikungunya virus. PLoS Pathog 3:e89
【非特許文献２】Kannan M, Rajendran R, Sunish IP, Balasubramaniam R, Arunachalam N, Paramsivan R, Tewari SC, Samuel PP, Tyagi BK. 2007. A study on Chikungunya outbreak during 2007 in Kerala, south India. Indian J Med Res 129:311-315
【非特許文献３】Powers AM, Brault AC, Tesh RB, Weaver SC. 2000. Re-emergence of Chikungunya and o’nyong-nyong viruses: evidence for distinct geographical lineages and distant evolutionary relationships. J Gen Virol  81:471-479
【非特許文献４】Yergolkar PN, Tandale BV, Arankalle VA, Sathe PS, Sudeep AB, Gandhe SS, Gokhle MD, Jacob GP, Hundekar SL, Mishra AC. 2006. Chikungunya outbreaks caused by African genotype, India. Emerg Infect Dis 12:1580-1583
【非特許文献５】Powers AM, Logue CH. 2007. Changing patterns of Chikungunya virus: re-emergence of a zoonotic arbovirus. J Gen Virol 88:2363-2377
【非特許文献６】Arankalle VA, Shrivastava S, Cherian S, Gunjikar RS, Walimbe, AM, Jadhav, SM, Sudeep AB, Mishra AC. 2007. Genetic divergence of Chikungunya viruses in India (1963-2006) with special reference to the 2005-2006 explosive epidemic. J Gen Virol 88:1967-1976
【非特許文献７】de Lamballerie X, Leroy E, Charrel RN, Ttsetsarkin K, Higgs S, Gould EA. 2008. Chikungunya virus adapts to tiger mosquito via evolutionary convergence: a sign of things to come? Virol J 5:33
【非特許文献８】Tong JC, Simarmata D, Lin RT, Renia L, Ng LF. 2010. HLA Class I restriction as a possible driving force for Chikungunya evolution. PLoS One 5:e9291
【非特許文献９】Volk SM, Chen R, Tsetsarkin KA, Adams AP, Garcia TI, Sall AA, Nasar F, Schuh AJ, Holmes EC, Higgs S, Maharaj PD, Brault AC, Weaver SC. 2010. Genome-scale phylogenetic analyses of Chikungunya virus reveal independent emergences of recent epidemics and various evolutionary rates. J Virol 84:6497-6504
【非特許文献１０】Akahata W, Yang ZY, Andersen H, Sun S, Holdaway HA, Kong WP, Lewis MG, Higgs S, Rossmann MG, Rao S, Nabel GJ. 2010. A virus-like particle vaccine for epidemic Chikungunya virus protects nonhuman primates against infection. Nat Med. 2010; 16(3):334-8
【非特許文献１１】Mallilankaraman K, Shedlock DJ, Bao H, Kawalekar OU, Fagone P, Ramanathan AA, Ferraro B, Stabenow J, Vijayachari P, Sundaram SG, Muruganandam N, Sarangan G, Srikanth P, Khan AS, Lewis MG, Kim JJ, Sardesai NY, Muthumani K, Weiner DB. 2011: A DNA vaccine against Chikungunya virus is protective in mice and induces neutralizing antibodies in mice and nonhuman primates. PLoS Negl Trop Dis.; 5(1):e928
【非特許文献１２】Edelman R, Tacket CO, Wasserman SS, Bodison SA, Perry JG, Mangiafico JA. 2001: Phase II safety and immunogenicity study of live Chikungunya virus vaccine TSI-GSD-218. Am J Trop Med Hyg. 2000; 62(6):681-5
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題の一つは、チクングニアウイルスにより引き起こされる感染症を予防し、さらにはその処置を実現することができる安定ワクチン組成物を提供することである。前記ワクチン組成物は、チクングニアウイルスにより引き起こされる感染症の予防及び処置のために、チクングニアウイルスの任意の遺伝子型バリアントに適用可能である。
【０００８】
本発明の別の課題は、チクングニアウイルスの最も一般的に適応可能な媒介生物であり得る媒介生物ヒトスジシマカ（Aedis albopictus）及びネッタイシマカ（Aedis aegypit）によって伝播されるチクングニア感染症の予防及び処置を含め、任意の適切な媒介生物により伝播されるチクングニアウイルスにより引き起こされる感染症を予防し、さらにはその処置を実現することができる安定ワクチン組成物を提供することである。
【０００９】
本発明のさらに別の課題は、チクングニアウイルス、特にＥＣＳＡ株の任意の遺伝子型バリアント及びその適用可能な特定の別個の独特の亜系統に対して有効である安定ワクチン組成物を提供することである。
【００１０】
本発明のもう一つの課題は、ワクチンの抗原性成分が、ウイルス様粒子（Virus Like particle、以下、ＶＬＰと称する）として発現され得る組換えＣＨＩＫＶウイルス株の不活化全ウイルス粒子又はサブユニット抗原を、適切な薬学的に許容される担体、安定化剤、及びアジュバントと組み合わせて含む、安定ワクチン組成物を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに別の課題は、ＣＨＩＫＶウイルスの不活化及び適切な量のアジュバントとの混合を含む、チクングニアウイルスの任意の遺伝子型ミュータント又はバリアントにより引き起こされる感染症を予防し、さらにはその処置を実現するのに十分な免疫応答を誘導することができる安定ワクチン組成物の調製方法を提供することである。
【００１２】
本発明の別の課題は、ヒトにおけるチクングニアウイルス感染症の診断に有用な、チクングニアウイルス株又はそのサブユニット抗原に対して生成される抗体を提供することである。
【００１３】
本発明のもう一つの課題は、有効なワクチン候補として適した、チクングニアウイルスの主要抗原決定基、並びにその開示されるヌクレオチド及びタンパク質配列を提供することに関する。
【００１４】
本発明のさらに別の課題は、チクングニアウイルスにより引き起こされる感染症と、それに限定されないが日本脳炎ウイルスワクチン用のワクチン、デングワクチン、ウエストナイルウイルスワクチン、及びチャンディプラウイルスワクチン及び狂犬病ワクチンを含むリストから選択される他の細菌及びウイルス感染症との予防及び処置に有効である組み合わせワクチン組成物を包含する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一態様によれば、本発明は、特にＣＨＩＫＶウイルス株の不活化全ウイルス粒子又はそのサブユニット抗原を含むワクチン組成物を含む。本発明の組成物は、より詳細には、チクングニアウイルス感染症に対する防御抗体及び強力なＴ細胞応答を誘導することができるワクチンに関する。
【００１６】
本発明の別の態様は、適切なアジュバントと共に高い防御効果を付与する不活化組換えＣＨＩＫＶワクチンを提供することである。
【００１７】
本発明のさらに別の態様は、より詳細には、チクングニアウイルス感染症に対する防御抗体及び強力なＴ細胞応答を誘導することができるワクチンに関する。
【００１８】
本発明のもう一つの態様は、防御的免疫応答を誘導するために使用される、組換えタンパク質、ウイルス様粒子及びビロソームとして発現される定義された配列のチクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）抗原の調製方法及び使用方法に関する。そのようなサブユニットワクチンの効力は、ワクチンに高い免疫原性を付与する条件下で試薬により不活化されるＣＨＩＫＶの不活化全ウイルス粒子からなるワクチンによって誘導される効力に匹敵する。
【００１９】
本発明の別の態様は、安定な製剤中に、熱、γ放射線、紫外線によって又は化学的に不活化した、チクングニアウイルス分離株の全ウイルス粒子を含むウイルスの不活化方法に関する。２種以上の不活化剤の組み合わせも同様の効力で使用された。本発明に開示のウイルス分離株は、ワクチン開発に使用され、全ての方法が、チクングニアウイルスの任意の遺伝子型又は遺伝子型バリアント／血清型／株／ミュータントに適用可能である。
【００２０】
本発明のもう一つの態様は、哺乳動物（好ましくはヒト）に、非経口投与（好ましくは皮内、筋肉内、若しくは皮下投与）するときに強力な免疫反応を誘導し、粘膜投与及び他の経路（例えば、経口経路）により投与するときに有効である、チクングニアウイルスに対するワクチン組成物を提供することである。
【００２１】
本発明のさらに別の課題は、哺乳動物、好ましくはヒトにおけるチクングニアウイルス感染症の処置及び診断に使用するための、チクングニアウイルス又はそのサブユニット抗原に対する抗体を提供することである。
【００２２】
本発明のもう一つの態様は、単独の、又は本発明の範囲に含まれる他のワクチンと組み合わせた、防御抗体及び強力なＴ細胞応答を誘導するための組成物を提供することである。組み合わせる他のワクチンは、それらに限定されないが、日本脳炎ウイルスワクチン、デングワクチン、ウエストナイルウイルスワクチン、及びチャンディプラウイルスワクチン及び狂犬病ワクチン用のワクチンである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】いくつかの不活化方法で不活化されたＣＨＩＫＶ全ウイルス粒子抗原の免疫原性について、効力に関する試験を行った結果を示す図である。不活化手順の詳細は、実施例２に示す。１５μｇの不活化ウイルスワクチンの効力は、４〜６週齢のBalb/cマウス（１群あたり８匹）に、０、７及び２１日目という間隔で３回の筋肉内注射を行い、最後の用量投与から７日後に採血して試験した。比較のために、生ウイルスの１回用量のみの投与を行った。ワクチン調製物の効力は、ＰＲＮＴ５０により中和抗体の力価を評価することによって試験した。
【図２】アジュバント添加及び無添加のＣＨＩＫＶワクチン調製物の免疫原性について、４〜６週齢のBalb/cマウス（１群あたり８匹）に、０、７及び２１日目という間隔で３回の筋肉内注射を行い、最後の用量投与から７日後に採血して試験した結果を示す図である。アジュバント添加ワクチン製剤の組成を、実施例５に示す。ワクチン調製物の効力は、ＰＲＮＴ５０により中和抗体の力価を評価することによって試験した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
配列多様性に基づくＣＨＩＫＶ血清型の進化に関する詳細な研究は報告されていない。本発明者らは、初めて、インド起源の２００９〜２０１０年のウイルス分離株で見出された、ＣＨＩＫＶのＥＣＳＡ株におけるネッタイシマカ（Ae.aegypti）に対する適応的進化を報告する。付言するに、ネッタイシマカは、インド及び実にいくつかの熱帯諸国で最も蔓延している媒介生物である。本発明で報告される分離株の独特な変異にもかかわらず、このウイルス株は、ＣＨＩＫＶのAsian遺伝子型及びＥＣＳＡの種々の亜系統を交差中和することから、ワクチン開発の良好な候補であることを示している。前記領域で最も蔓延している媒介生物により適応するウイルス株又はその株由来の抗原の使用は、ＥＣＳＡ遺伝子型ほど現在広く蔓延していないWest African又はAsian遺伝子型の株を使用するより、ワクチン開発において重要である。ＥＣＳＡ遺伝子型であっても、ヒトスジシマカ（Ae.albopictus）への伝染性が増加する適応的変異であるE1-A226V変異を保有するレユニオン島起源のLR2006分離株などの候補の使用はあまり有利でない。その理由は、媒介生物のヒトスジシマカは、インドでKerala及び南海岸のKarnataka州のようにインド西海岸に沿ってのみ広く分布しているにすぎず、これに対し、インドの残りの地域で最も分布している媒介蚊は、ネッタイシマカであるためである。本発明で単離され、報告されるウイルス株は、ネッタイシマカに対する適応的進化を示すだけでなく、さらにヒトスジシマカにも感染するという点で、独特である。ネッタイシマカ（Aedes aegypti）に対する適応性を増加させる独特な変異とは別に、本発明の利点は、ウイルス分離株が、Asian遺伝子型及び様々なＥＣＳＡバリアント株と交差中和し、したがって優れたワクチン候補であることである。ゆえに、これらの分離株のウイルス抗原又は組換え抗原に由来するサブユニットワクチンも同様に優れたワクチン候補であるが、これは、組換えワクチン抗血清も異なる遺伝子型及び遺伝子型バリアントを交差中和するためである。
【００２５】
したがって、ネッタイシマカに対して独特な適応性を示し、ヒトスジシマカにも感染するIndianウイルス株を使用することは、ネッタイシマカが、世界中でＣＨＩＫＶ感染発生率が最も高いインドで最も広く蔓延している媒介生物であるため、West African株、Asian株又はＥＣＳＡ E1-226A株及び他のバリアント株の使用よりも有利である。
【００２６】
本発明の範囲に含まれるチクングニアウイルス分離株は、ＥＣＳＡ（East, Central and South African）遺伝子型に属し、これらの構造ポリタンパク質配列は、カプシド、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ及びＥ１（C-E3-E2-6K-E1）タンパク質を含む。２００９〜２０１０年のインド集団発生で取得された分離株は、これまで報告されている配列の中で、独特である。C-E3-E2-6K-E1タンパク質を含む構造ポリタンパク質配列は、公的な配列保存施設（GenBank）に、２０１０年４月２７日に寄託され、受託番号HM159385〜HM159390が与えられた。その配列は、仮特許出願の出願日後の２０１２年３月に公開された。本発明で報告される独特なヌクレオチド配列は、配列番号１（分離株TN01610）、配列番号２（分離株TN15110）、配列番号３（分離株TN06210）、配列番号４（TN06310）、配列番号５（TN06410）及び配列番号６（AP0109）であり、これらが翻訳されるときの対応するタンパク質配列は、それぞれ、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３である。ＣＨＩＫＶ株CHIKV/03/06は、配列番号７の構造ポリタンパク質を有し、２００６年のインドの集団発生において単離され、その対応するタンパク質配列は配列番号１４である。ウイルス分離株の名称は、括弧内に示している。本発明の上記ウイルス分離株の完全長ゲノムＲＮＡ配列は、配列番号１５〜２０に示している。
【００２７】
本発明に開示される分離株の配列は、S27-Africanプロトタイプ（Gen Bank受託番号AF369024）と比較するとき、他のアミノ酸変化に加えて、構造ポリタンパク質配列内にT1766C（E2-V264A）＋A3058G（E1-K211E）＋3104C（E1-226A）の組み合わせなどの独特な遺伝子シグネチャー（genetic signature）を有する。構造ポリタンパク質のヌクレオチド置換の位置及びポリタンパク質内の個々のタンパク質における対応するアミノ酸変化は、括弧内に示す。報告される他の独特な変異は、カプシド-A232V（TN06310内）、E3-D40N（TN15110内）、E2-K47N（TN06210内）、E2-G55R（TN01610及びAP0109内）、E2-K66E（TN064110内）、E1-P58L（AP0109内）、並びにE1-G195R（TN15110及びTN06310内）である。ＥＣＳＡ株の「ω」（同義置換に対する非同義置換の比率）の最尤法によるコドン分析によるコドンは、本発明で報告される分離株（配列番号８〜１３）のアミノ酸変異E1-K211Eが、有意な正の選択下にあること（≧０．９７の事後確率；ｐ＜０．０５）を示し、アエデス属媒介蚊（Aedes mosquito vectors）、特にネッタイシマカでの感染性を増加させる適応的変異を示唆している。E1-211Eのアミノ酸残基は、ネッタイシマカによって周回されるＣＨＩＫＶのAsian遺伝子型に保存されている。本発明に開示されるさらなる変異、例えば、３つの新規変異E2-K47N、E2-G55R及びE2-K66Eも、ネッタイシマカへのシンドビスウイルスの感染性を増加させることが報告されているＥ２タンパク質の同じ領域に密集している。Ｅ２のａａ５２−８２領域は、細胞受容体の接触部位の突起上部に露出している。ＳＬＡＣ（Single Likelihood Ancestor Counting、一尤度先祖計数）、ｅＦＥＬ（Fixed Effects Likelihood、固定効果尤度）、ｉＦＥＬ（internal Fixed Effects Likelihood、内部固定効果尤度）及びＲＥＬ（Random Effects Likelihood、ランダム効果尤度）を用いる「ω」のコドン最尤法によるコドンにより、有意な純化選択下にあるカプシド及び構造糖タンパク質にわたるアミノ酸部位が同定された。負に選択されたアミノ酸部位の中から、E2-199Y残基が、４つ全ての尤度推定法（事後確率＞０．９９（ＲＥＬによる）、ｐ＜０．０１（ｉＦＥＬによる）、ｐ＝０．００１（ＳＬＡＣによる）、及びｐ＝０．００（ｅＦＥＬによる））により最も有意な純化選択下にある遺伝子座として選択された。E2-199Yは、チクングニアウイルスの蚊へのウイルス適合性を決定する重要な残基である。
【００２８】
ウイルスの進化は、中和化に関与する抗原決定基並びに媒介生物／宿主適応に関与する残基における変異を選択する傾向にある。その高い免疫学的特異性のために、血清中和試験は、多くの場合、他の血清学的技術の特異性を評価する至適基準である。本発明で報告されるウイルス分離株に対して惹起された抗血清は、Asian及びＥＣＳＡ系統のウイルス分離株と、E1-A226V ＥＣＳＡバリアント株を含むＥＣＳＡ遺伝子型の複数のバリアント株とを中和し、広範な中和活性を示すことから、優れたワクチン候補であることが示される。
【００２９】
免疫原としてのチクングニアウイルス粒子の特性、ウイルスの宿主細胞株における高力価への適応と拡大、ＲＴ−ＰＣＲによるウイルスの同一性の決定、ウイルスの精製及び不活化方法、ヒトへの投与に好適な薬学的に許容される担体中での安定ワクチン製剤の調製、動物モデルにおけるワクチン効力に関するウイルス分析及び試験も、本発明の範囲内である。感染患者から得られたか、ウイルスが存在する、ウイルスの媒介生物から単離されたウイルス粒子は、細胞株に適応し、インビトロ細胞培養における数世代の継代で繁殖する。
【００３０】
不活化全ウイルス粒子ワクチンの開発におけるＣＨＩＫＶ株の使用は、本発明の一態様である。チクングニアウイルス株を、ビリオンの産生のために哺乳類細胞株に感染させた。哺乳類細胞としては、限定されないが、ベロ細胞（ATCC CCL-81）、ＭＲＣ−５、又はヒトで使用するワクチンの生産に好適な任意の他の細胞株が挙げられる。
【００３１】
細胞培養物から取得した全ウイルス粒子を、様々な不活化剤で不活化した。不活化プロセスにおける、時間の最適化、温度の最適化、安定化剤（例えば、スクロース、ラクトース、トレハロース及び他の糖などの糖類、並びに糖類の組み合わせ）の使用、及び糖アルコール（例えば、マンニトール又はソルビトール）の単独で又は異なる糖と組み合わせた添加、ヒト血清アルブミンの単独で又は糖、アミノ酸、及び糖アルコールと組み合わせた添加は、本発明の範囲内である。ウイルスは、ワクチン調製物の高免疫原性を維持する条件下で、熱、γ線照射、若しくは紫外線によって、又は化学的手段、特にホルマリン及びβ−プロピオラクトン（beta-propiolactone、ＢＰＬ）、のいずれかで不活化することによって非感染性にした。ウイルス不活化の条件は最適化し、実施例２に示す。化学的不活化剤は、限定されないが、ホルマリン、β−プロピオラクトン、グルタルアルデヒド、Ｎ−アセチルエチレンイミン、バイナリーエチレンイミン、ターシャリーエチレンイミン、アスコルビン酸、カプリル酸、ソラレン（psolaren）、洗剤（非イオン洗剤など）を含むリストから選択され、ウイルス懸濁物に添加されて、ウイルスを不活化する。糖類、糖アルコール、ヒト血清アルブミン、及びアミノ酸の濃度は、単独で又は種々の組み合わせで使用するとき、０．０１％〜２０％、好ましくは０．１％〜１０％、最も好ましくは０．１％〜５％の濃度範囲である。安定化剤が存在する場合の不活化の時間及び温度は、種々の期間（例えば、３０分〜２０日）における２〜８℃から３７℃で最適化した。そのようなワクチン製剤は、免疫原性が高く、防御中和抗体を誘導した。
【００３２】
チクングニアウイルスの構造糖タンパク質C-E3-E2-6K-E1は、主要抗原決定基である。したがって、この構造糖タンパク質は、ＣＨＩＫＶ感染予防のためのサブユニットワクチンに対する優れたワクチン候補である。構造タンパク質の配列は、配列番号８〜１４で定義されるとおりである。組換え非構造タンパク質も免疫原性であり、良好なワクチン候補である。選択し得る真核生物発現系としては、哺乳類細胞、昆虫細胞のバキュロウイルス、及びあらゆる種の酵母細胞、最も好ましくはピキア・パストリス（Pichia pastoris）又は出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）が挙げられる。サブユニット抗原をコードする遺伝子は、任意の適切な原核生物発現ベクターを使用した原核細胞（例えば、大腸菌（E.coli））でも発現した。組換え発現宿主としてのピキア・パストリスは、他の真核生物発現系と比較して、大規模生産におけるコスト効率が良いことから産業規模での利点がある。ピキア・パストリス由来の組換えタンパク質は商業化に成功しており、ヒトでの使用における安全性もわかっている。本出願に配列を開示する構造タンパク質（例えばC-E3-E2-6K-E1）は、「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）を構築することができる。あるいは、ＶＬＰは、E3-E2-6K-E1若しくはE2-6K-E1タンパク質のみ、又はE2-E1タンパク質のみを含有し、免疫原性であり、動物に投与されたときに防御的免疫応答を誘導する。ＣＨＩＫＶはエンベロープウイルスであるため、E3-E2-6K-E1又はE2-6K-E1を含むサブユニット抗原も、ビロソームを構築することができる。また、E3-E2-6K-E1若しくはE2-6K-E1又はE2-E1のみを含むビロソームも免疫原性である。リポソーム及びビロソームは、脂溶性物質（例えば、限定されないが、コレカルシフェロール、コレステロール、リン脂質など）とウイルスエンベロープタンパク質との種々の組み合わせを含有することができる。ビロソームの調製方法、例えば、洗剤若しくは短鎖リン脂質によるウイルス粒子の可溶化、並びに、カオトロピック剤、非エンベロープタンパク質、及び任意のエンベロープウイルスに適用され得るＲＮＡを除去後のエンベロープタンパク質の再構築なども、ＣＨＩＫＶに適用可能である。
【００３３】
ウイルスの精製は物理的手段又は化学的手段で行い、好ましくは、それらの組み合わせで行った。物理的方法は、ウイルスの物理的性質、例えば、密度、大きさ、質量、沈降係数などを利用するものであり、限定されないが、超遠心分離、密度勾配遠心分離、限外濾過などの任意の技術が挙げられる。化学的手段による精製は、化学的又は生理化学的な反応を通じた吸着／脱着などの方法を利用し、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトマトリックス、無機塩類（１例として硫酸アンモニウム）による塩析、並びに、特許権を取得しているHimax（商標）技術、有機塩及び有機化合物（例えば、ポリエチレングリコール）の使用によるものが挙げられる。ウイルス又は組換えウイルス抗原の精製は、上述の方法のいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせで達成した。
【００３４】
上述のＣＨＩＫＶ候補ワクチン、例えば、不活化全ウイルス粒子ワクチン又は組換えワクチンなどの抗原性組成物は、哺乳類、好ましくはヒトの免疫化のために、薬学的に許容される担体で製剤化される。チクングニアウイルスワクチン製剤には、アジュバント添加を行い、アジュバントは、限定するものではないが、以下に列挙されるものから選択した：ミョウバン；リン酸カルシウム；任意の多形形態のイヌリン、好ましくはγイヌリン；イヌリンと他の有機若しくは無機化合物（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムリン酸塩及びリン酸カルシウム）との組み合わせを含有するアジュバント；リポソーム、キトサン、及び複合炭水化物（例えば、デキストラン、デキストリン、でんぷん、イヌリン、マンナン、及びグルコマンナン、ガラクトマンナン、β−グルカン、ヘパリン、セルロース、ペクチン、及びペクチネート、レクチン）、並びに、任意の原料から合成される又は由来する任意の他の炭水化物、任意の生分解性及び生体適合性ポリマー（例えば、ポリラクチド及びポリ（ラクチド コ−グリコリド）（poly(lactide co-glycolides、ＰＬＧ）若しくはＰＬＧＡなど）；任意のエマルジョン、例えば、限定されないが、水中油型エマルジョン（例えば、ＡＳＯ３、他のスクアレン系アジュバント（例えば、ＭＦ５９）など）、任意の油中水型エマルジョン；他の脂溶性化合物と共に成分の１つとしてコレカルシフェロールを用いて調製されたリポソーム；他の組成のリポソーム；ＲＩＢＩアジュバント系、サポニン（例えば、限定されないが、ＱＳ−２１、ＱｕｉｌＡ、トマチン、ＩＳＣＯＭ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸなど）、リポペプチド、糖ペプチド、リポ多糖、ムラミルジペプチド及び任意のペプチド系アジュバント、オリゴヌクレオチド、アジュバントとしての任意のＴＬＲリガンド、任意のサイトカイン、ビタミン及び非毒性細菌毒素など。最も適合性及びコスト効率の良いアジュバントは、アジュバント添加により増強した免疫原性を試験した後の最終ワクチン製剤において選択した。上記に加え、優れた免疫増強活性を有する任意の他の有機及び無機物質も、アジュバントとして、単独で又は併用で、チクングニアウイルスワクチンの免疫原性を向上させるために使用し得る。不活化全ウイルス粒子ワクチンに加え、上述のアジュバント又はアジュバント組み合わせは、組換えサブユニット抗原がビロソーム、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）で提供されるか、又は個々の組換えタンパク質として発現、精製及び製剤化されて使用される組換えチクングニアウイルスワクチンに用いても効果的である。ワクチン製剤における好適なアジュバントの使用は、抗原の必要量を低減し、低価格ワクチンの製造に役立ち、経済的な利点を与える。
【００３５】
製剤で使用される緩衝液は、リン酸緩衝液若しくはリン酸−クエン酸緩衝液、又は、任意の他の薬学的に許容される緩衝液である。ワクチンは、保存剤（単数又は複数）、安定化剤（単数又は複数）などを含有していてもよい。賦形剤は、限定されないが、還元及び非還元糖類、糖アルコール（例えば、ソルビトール及びマンニトール）、グリセロール、アミノ酸、ヒト血清アルブミン、イヌリン、チメロサール（thiomerosol）及び上述のアジュバントのリストから選択されるアジュバントを含むリストから選択した。賦形剤は、液体製剤に対しては０．０１％〜２０％の範囲で、凍結乾燥製剤に対しては全固形物の６０％までで添加される。ワクチン製剤は、油中水型エマルジョン又は水中油型エマルジョンのいずれかのエマルジョンとしても提供された。そのようなワクチン抗原のエマルジョンは、保存剤、安定化剤、及び他のアジュバントを含有する。液体形態若しくは凍結乾燥形態のいずれか及び薬学的に許容される緩衝液若しくは水で再構成後の免疫原のそのような安定な製剤は、ヒト宿主への非経口投与に好適であり、粘膜投与用にも製剤化される。ワクチン製剤は高度に免疫原性であり、同種起源及び異種起源のＣＨＩＫＶ株を中和した。
【００３６】
ワクチンの効力試験については、Balb/cマウス及びウサギでワクチン製剤を試験した。得られる血清をインビトロ中和試験により評価し、抗体力価をＥＬＩＳＡで決定する。本発明に記載のワクチン製剤で免疫化した動物において、抗体陽転が観察された。防御的免疫応答を与える組換えワクチンの有効性は、全ウイルス粒子ワクチンの有効性に匹敵し、中和抗体応答の力価は、数ある方法の中から、血清中和試験（ＳＮＴ、serum neutralization test）、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ５０、plaque reduction neutralization test）及びＥＬＩＳＡのいずれかで測定した。ワクチン抗体の受動免疫により、ウイルス感染症に対する良好な防御がもたらされ、ＣＨＩＫＶ抗体の治療的用途が示された。感染患者の試料におけるウイルスの存在は、ＣＨＩＫＶ抗体を使用して正確に測定された。本発明の範囲に含まれる方法により得られたチクングニアウイルスワクチンは、他のワクチンと組み合わせて、強力な中和抗体を誘導する。組み合わせに含めることができるワクチンは、限定されないが、日本脳炎ウイルス用のワクチン、デングワクチン、ウエストナイルウイルスワクチン及びチャンディプラウイルスワクチン及び狂犬病ワクチンを含むリストから選択される。他のウイルスワクチンとの組み合わせも、本発明の範囲内である。当業者に知られるように、二価又は多価ワクチンは、２種以上のＣＨＩＫＶ株から生産されるワクチンを、抗原含有量に基づく適切な比率で混合することにより調製することができる。そのような混合により、感染防御のための広範な抗原スペクトルを有するワクチン調製物が得られる。
【００３７】
本発明によれば、本発明のＣＨＩＫＶ株の方法及び組成物は、任意のＣＨＩＫＶ株に適用可能である。本発明のワクチンは、ワクチンの生産に使用されるウイルス株に加えて、複数のＣＨＩＫＶ株に対して良好な免疫防御を与えた。本研究で報告されるＣＨＩＫＶ分離株は、ＣＨＩＫＶの異なる遺伝子型／遺伝子型バリアント／株を交差中和するため、広範な中和活性を有し、これらのウイルス分離株に由来する抗原を含む不活化全ウイルス粒子ワクチン又は組換えワクチンの開発における理想的なワクチン候補である。本発明に開示される方法は、チクングニアウイルスの任意の遺伝子型／遺伝子型バリアント／血清型／株に適用可能であり、実証されるように、チクングニアウイルスの多重遺伝子型／遺伝子型バリアントに対して良好な交差防御を提供する。
【００３８】
本発明を、以下の実施例において、さらに詳述する。本発明の特定の態様、実施形態又は実施例と共に記述される特色、整数、特徴、範囲、化合物、及び／又は群が、矛盾しない限り、本明細書に記載の任意の他の態様、実施形態又は実施例に適用可能であり、それらも本発明の範囲内とみなされることに留意すべきである。
【実施例１】
【００３９】
ウイルス株の単離
ウイルス株は、２００９〜２０１０年のインドでの流行発生中に、インフォームドコンセントを受けた発熱患者から回収した血液試料から単離した。血液試料は、患者が高熱、急性多発性関節痛及び関節における痛みのある腫れ並びに発疹を報告した、チクングニアウイルス感染症の急性期に回収した。患者の血清試料は、ドライアイス上で、研究所へ輸送した。約０．０５ｍｌの血清を使用して、２５２ｃｍフラスコ内の、１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、fetal bovine serum）含有ＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle Medium、ダルベッコ改変イーグル培地；Sigma-Aldrichカタログ番号D5523）を含有する培地中のベロ細胞（ATCC No.CCL-81）に感染させた。フラスコを、３４℃〜３７℃でインキュベートした。ウイルスは感染の４８時間後に採取した。ウイルスのスケールアップ培養は、セルスタック、セルファクトリー、又はバイオリアクターの液体培養で行った。全ての血液試料は、特異的ＩｇＭのＥＬＩＳＡ（National Institute of Virology, Pune）によるデング感染症について陰性であった。ウイルスの感染力価は、ウイルス粒子を、乳飲みマウスの脳で１回継代培養した後、若しくは蚊細胞株（例えばC6/36細胞）で継代培養した後、及びインビトロ細胞培養でウイルスを複数回継代培養させた後も、１０倍を超えて増加した。
【実施例２】
【００４０】
ＣＨＩＫＶウイルスの精製と不活化
２つのウイルス分離株TN01610及びTN15110を、始めにスケールアップ培養物に細胞破片を除去するための限外濾過を行い、３００ｋＤ膜を通しての濾過及び濃縮を行い、その後、イオン交換及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーによる精製を行って、感染ベロ細胞単層から精製した。ウイルスの熱不活化を、４５℃〜６０℃の範囲の様々な温度で３０分〜４時間、最適には５６℃で３０分間、実施した。紫外（ＵＶ、ultraviolet）線による不活化は、２５４ｎｍで、３０〜１２０分の間での様々な時間、最適には４０分間、氷上で行った。チクングニアウイルスは、ホルマリンにより、ホルマリン：ウイルスの最大比率１：３０００、２℃〜８℃、最大７日間で効果的に不活化され、β−プロピオラクトンを用いて、１：１０００〜１：２５００（β−プロピオラクトン：ウイルス）で、最大７日間、２℃〜８℃で効果的に不活化された。いずれの場合も、不活化の時間は、＋２０〜２５℃の環境温度で実施すると２４〜４８時間に短縮された。ホルマリンとβ−プロピオラクトンは、透析により除去した。不活化において、添加剤（例えば、グリシン、マンニトール、ソルビトール、並びに糖類及び糖類の組み合わせ）の使用は、ワクチン調製物の安定性を高めた。使用される糖類は、０．５％〜５％までの種々の濃度でのスクロース、ラクトース、トレハロース及びマルトースから選択し得る。ウイルスのγ線照射による不活化は、ウイルス試料に、６０Ｃｏ線源（Ms.Gamma Agro-Medical Processings Pvt.Ltd. Hyderabad）から、１０ｋＧｙ（キログレイ）〜２５ｋＧｙ、最適には２０ｋＧｙの線量を曝露させることによって実施した。上述の全ての方法によってウイルス試料が完全に不活化されたことは、３回連続継代したベロ細胞においてウイルスによる細胞変性効果がないこと、さらに２日齢マウスの脳に大脳内経路で接種したときに発育異常及び死が生じないことによって確認した。この不活化ウイルス抗原に、ワクチン候補として、効力に関する試験を行った。
【実施例３】
【００４１】
逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）及び配列決定
ウイルスＲＮＡを、感染したベロ細胞（ATCC CCL-81）から、一回継代後、Absolutely RNA Miniprep kit（Stratagene, La Jolla, CA）を使用して単離した。ＲＴ−ＰＣＲを、AccuScript High Fidelity 1stStrand cDNA Synthesis Kit（Stratagene）を使用して、キットプロトコルに従って実施し、３７４７ｂｐの構造ポリタンパク質遺伝子を、PfuUltra High-FidelityＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）で増幅した。ＰＣＲプライマーは、S27-Africanプロトタイプ（AF369024）とIndian 2006分離株（HM159384）とのコンセンサス配列に基づき設計し、これを用いて構造ポリタンパク質遺伝子のオーバーラップ配列を増幅させた。ＰＣＲ反応は、初期変性を９５℃で１分間、続いて３２サイクルの熱工程［９４℃で４０秒、アニーリングを５２〜６５℃（プライマー対によって変わる）で３０秒、及び伸長を７０℃で３分］、その後、最終伸長を７０℃で１０分間、として構成した。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル上での分離後にQIAquickゲル抽出キット（QIAGEN, Hilden, Germany）で精製し、ＤＮＡ配列決定に使用した。ＣＨＩＫＶ構造ポリタンパク質遺伝子のゲル精製ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列決定は、BigDye terminator v3.1 reaction（Applied Biosystems, Foster City, CA）によりＤＮＡの両鎖について配列決定を行い、配列データをSequencher v4.7（GeneCodes, Ann Arbor, MI）を使用して分析した。配列は、本件の仮特許出願前の２０１０年４月２７日にGenBankに寄託し、２０１２年３月２日にGenBankにより公開された。本発明で報告される独特なヌクレオチド配列は、配列番号１（分離株TN01610）、配列番号２（分離株TN15110）、配列番号３（分離株TN06210）、配列番号４（TN06310）、配列番号５（TN06410）及び配列番号６（AP0109）であり、その翻訳したときの対応するタンパク質配列は、それぞれ、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３である。ＣＨＩＫＶ株CHIKV/03/06は、配列番号７の配列の構造ポリタンパク質遺伝子を有し、２００６年のインドでの流行の間に単離され、その対応するタンパク質配列は配列番号１４である。ウイルス分離株の名称は、括弧内に示す。完全なゲノムＲＮＡ配列のため、配列決定反応は、Illumina GAIIx（Genotypic Technology Pvt. Ltd. Bangalore）での合成による配列決定（ＳＢＳ、sequencing by synthesis）技術を使用して行った。上記ウイルス株のウイルスゲノムＲＮＡの完全ヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ形態）を、配列番号１５〜２０に示す。S27-Africanプロトタイプ株（AF369024）を参照して同定した変異を、個々の構造タンパク質に位置づけ、表１に表した。
【００４２】
【表１】
2014520117.tif 000002
Tamil   Nadu州及びAndhra   Pradesh州起源の2009〜2010年のCHIKV分離株のカプシド、E1、E2及びE3構造糖タンパク質で同定した独特な変異。
「.」は参照株のS27-Africanプロトタイプ(AF369024)と同一のアミノ酸。Tamil   Nadu起源の分離株のGenBank受託番号は、HM159385(TN01610)、HM159386(TN15110)、HM159387(TN06210)、HM159388(TN06310)、HM159389(TN06410)であり、Hyderabad、Andhra   Pradesh起源の分離株のGenBank受託番号は、HM159384(CHIKV/03/06)及びHM159390(AP0109)である。
【実施例４】
【００４３】
系統発生解析及び選択圧の推論
この研究で報告される配列及びGenBankから検索した配列は、系統発生分析に先だって、遺伝的アルゴリズム組換え検出（ＧＡＲＤ、Genetic Algorithm Recombination Detection）（Kosakovsky Pond et al. 2006）によって組換えのためにスクリーニングした。進化分析は、１０００個のブートストラップ複製を用いるKimura-2 parameterヌクレオチド置換モデルを使用するＭＥＧＡ５（Tamura et al. 2007）で行った。多重配列アラインメントを、ClustalW2.0.3を使用して行った。GenBankから検索した２００５〜２０１０年のＥＣＳＡ構造ポリタンパク質配列及び本研究で報告されるＥＣＳＡ構造ポリタンパク質配列を使用して、ＥＣＳＡ系統の選択圧を推論した。分析のためにGenBankから検索した５８個の配列から、Hyphy（Pond et al. 2005）により、約５２個の独特な配列を選抜候補にした。ω又はｄＮ／ｄＳ（同義置換に対する非同義置換の比率）のコドンに基づく最大尤度推定値を、変量効果尤度（ＲＥＬ）法、固定効果尤度（ｅＦＥＬ）によって推論し、系統発生の内部分岐に沿った選択を、HyPhyの内部固定効果尤度（ｉＦＥＬ）法を使用して試験した。尤度法において、正の選択は、尤度比試験（ＬＲＴ、likelihood ratio test）のｐ値が０．０５未満の場合又はある部位でのベイズ因子が１００以上であったときに有意として推論した。タンパク質全体の正の選択操作の統計学的試験は、HyPhyの一尤度祖先計算（ＳＬＡＣ）法によって推論した。正の選択のためのＭＥＣ（Mechanistic Empirical Combination、機構論経験論組み合わせ）モデルと、純化及び中立選択のためのＭ８ａモデルとを用いた、ＬＲＴ（Likelihood Ratio Test、尤度比試験）を使用する経験ベイズ法によるωの推論は、Selecton v2.2（Stern et al. 2007）を使用して実施した。有意な正の選択及び純化選択下でのＣＨＩＫＶ構造タンパク質のアミノ酸部位を、付随する表ＩＩに示す。
【００４４】
【表２】
2014520117.tif 000003
【００４５】
２００９〜２０１０年のIndianＣＨＩＫＶ分離株におけるカプシド（Ｃ）内、並びにＥ１、Ｅ２及びＥ３糖タンパク質内の正の選択下でのアミノ酸は、変量効果尤度（ＲＥＬ）法、及びHyPhyパッケージを使用した内部固定効果尤度（ｉＦＥＬ）法によって推論した。Ｅ１及びＥ２タンパク質それぞれにおける有意な正の選択及び純化選択下でのアミノ酸部位（ベイズ因子＞５００、事後確率≧０．９７及びｐ＜０．０５）は、太字体で示す。†ベイズ因子は、その部位での正の選択（ｄＮ＞ｄＳ）についての事後オッズ／事前オッズの統計学的推定である。
【実施例５】
【００４６】
構造ポリタンパク質配列のクローニング及び発現
本特許において報告されるウイルス分離株を、全てのウイルス抗原のクローニング及び発現のための供給源として用いた。配列番号１でコードされるチクングニアウイルス構造ポリタンパク質の完全なオープンリーディングフレームは、フォワードプライマーとしてＣＨＫＶＣＰＦＰプライマー、及びリバースプライマーとしてＣＨＫＶＥ１ＲＰプライマーを使用するウイルスゲノムＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、約３７４７ｂｐのＰＣＲフラグメントを得た。ＰＣＲ増幅のために使用したＰＣＲプライマーの配列は、以下のとおりである：
ＣＨＫＶＣＰＦＰ：
5’ ACAGAATTCATATGGAGTTCATCCCAACCCAAAC 3’
ＣＨＫＶＥ１ＲＰ：
5’AATTGGATCCGCGGCCGCTTAGTGCCTGCTGAACGACACGC 3’
【００４７】
ＰＣＲフラグメントを、NdeIとBamHIとで消化し、原核生物発現ベクターpET-11BのNde1及びBamHI部位へクローニングし、挿入部位を含有する組換えプラスミドを、大腸菌DH5aで形質転換した。DH5aから単離した組換えプラスミドＤＮＡを使用して、大腸菌株BL21（DE3）を形質転換した。ＰＣＲ遺伝子フラグメントを、EcoRI及びNotIで消化し、標準プロトコルでゲル精製し、酵母発現ベクターpPIC3.5K（Invitrogen Corporation, Carlsbad, USA）のEcoRI及びNotI部位でクローニングし、大腸菌DH5aで形質転換した。大腸菌クローンから単離した組換えプラスミドＤＮＡを、BglIIで直線化し、製造業者（Invitrogen）のプロトコルに従ってピキア・パストリスGS115に形質転換した。遺伝子をAOX1遺伝子座にクローニングし、メタノール誘導により、AOX1プロモーター下で発現した。組換えピキア株のクローニング、スクリーニング、単離、及びメタノールを用いたクローン遺伝子の誘導は、ユーザーマニュアル「A Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins in Pichia pastoris」（Version M、2002年1月、ピキア発現キット、カタログ番号K1710-01, Invitrogen Corporation, Carlsbad, USA）に従って実施した。
【実施例６】
【００４８】
ワクチン製剤についてのインビボ効力試験
ワクチン製剤の不活化ウイルス試料について、種々のアジュバントを用いて効力を試験した。試験したアジュバント（ヒト１回用量あたりの濃度）には、ａ）水酸化アルミニウム（０．５ｍｇのアルミニウム含有量）、ｂ）リン酸アルミニウム（０．５ｍｇのアルミニウム含有量）、ｃ）γイヌリン（１０ｍｇ）、ｄ）アルガムリン（algammulin）（水酸化アルミニウムとγイヌリンとの組み合わせ）（１０ｍｇ）、ｅ）油中コレカルシフェロール（１用量あたり０．７５ｍｇ）、ｆ）１０ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液中に４．３％スクアレン、０．５％のtween-80、及び０．５％のSpan-85を含有する水中油型エマルジョンＯＷＥＭ１（Sigma Aldrich 製品番号S7135）、ｆ）リン酸−クエン酸緩衝液中に９．５ｍｇのスクアレン、１ｍｇのtween-80、１ｍｇのSpan-85、１１ｍｇのα−トコフェロールを含有する水中油型エマルジョンＯＷＥＭ２、ｇ）α−トコフェロールを１〜１０ｍｇのコレカルシフェロールで置き換えたことを除いて、ＯＷＥＭ２と同じ濃度の賦形剤を含有する水中油型エマルジョンＯＷＥＭ３が含まれる。製剤化及びアジュバント添加後のワクチン調製物を、マウスに筋肉内注射し、最初の用量の投与から７日後及び２１日後に追加免疫用量を投与した。最初の用量の投与から２８日後に血液を回収した。各試験群からプールした血清を、５６℃で約３０分間、補体不活化した。全ての製剤は、４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ含有）中１５μｇのウイルス抗原を含んでいた。血清試料を使用して、中和抗体の評価を行い、またＥＬＩＳＡにより抗体力価を評価した。ワクチン接種を受けた動物は、ウイルスチャレンジ用量１０４．５ｐｆｕ／ｍｌでチャレンジウイルスを静脈内／腹腔内投与した後、７２時間にわたってモニターした時、ウイルス血症から完全に防御されていた。別の実験では、受動免役によりＰＲＮＴ５０力価６４０のウサギ抗血清の静脈内投与を受けた４〜６週齢のBalb/cマウスは、１０４．５ｐｆｕ／ｍｌのチャレンジウイルスで攻撃した時、ウイルス血症から完全に防御された。血清型分析では、CHIKV/03/06に対する抗血清は、Asian遺伝子型（GenBank受託番号 EF027140, １９６３年にKolkataで単離）、ＥＣＳＡ（E1-A226V, E1-211K, GenBank受託番号FJ000069, ２００７年にKeralaで単離）、及びＥＣＳＡ（E1-226A, E1-K211E, GenBank受託番号HM159386, ２０１０年にTamil Naduで取得）のヘテロタイプウイルス分離株を中和抗体力価≧４０で中和し、遺伝子型バリアントに対するヘテロタイプな防御を示し、別の血清型を展開しないことも示した。
【実施例７】
【００４９】
プラーク減少中和アッセイ
アッセイ前のある一日に、６ウェルのプレートに、ウェルあたり２．５ｘ１０３のベロ細胞（ATCC CCL-81）を播種し、そのプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータでインキュベートした。２％ウシ胎仔血清含有ＭＥＭ中の血清試料の４倍希釈液に、同等量の標準化ウイルス（１０５ｐｆｕ／ｍｌ）を加え、３７℃、５％ＣＯ２で９０分間インキュベートした。細胞を、１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）（１０ｍＭのリン酸及び１５０ｍＭのＮａＣｌ）で２回洗浄し、０．３ｍｌの希釈血清−ウイルス混合物それぞれを対応するウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで９０分間インキュベートした。それぞれのアッセイは、３連で実施した。１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン及び１％Ｌ−グルタミン含有ＭＥＭ中の０．８５％メチルセルロース２ｍｌで、細胞を覆った。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータで、５日間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、プラークを１０％ホルマリンで固定し、１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、０．１％クリスタルバイオレットで可視化した。最も高い希釈率の血清は、コントロールウイルス試料により形成されたプラークの５０％減少を生じ、ＰＲＮＴ５０の力価として評価された。ＰＲＮＴ５０アッセイを実施して、様々な不活化法によるワクチン調製物の効力、並びに、アジュバント添加ＣＨＩＫＶワクチン、及びＪＥＶワクチンとのワクチン組み合わせを試験した。
【実施例８】
【００５０】
ワクチン組み合わせ
β−プロピオラクトンにより不活化したＣＨＩＫＶワクチン組み合わせを、ホルマリンで不活化した日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ、Japanese encephalitis virus）用のワクチンとの組み合わせで試験した。１５μｇのＣＨＩＫＶワクチン抗原のミョウバン配合物（０．５ｍｇアルミニウム／用量）を、６μｇの日本脳炎ウイルス全ウイルス粒子抗原を同様のミョウバン配合物とした不活化ＪＥ（ＪＥＶ）ウイルスワクチンと組み合わせて試験した。ワクチン組み合わせを、８匹のBalb/cマウスに注射し、いずれかの抗原を単独で投与した適切なコントロールと、また同等量のミョウバンを投与したコントロール動物も用意した。動物に、最初の免疫から７日後と２１日後に追加免疫を行った。最後の追加免疫注射から７日後に血液を回収した。各グループからのプール血清を、５６℃で約３０分間、補体不活化した。血清試料を使用して、ＣＨＩＫＶとＪＥＶとの両方について、ＰＲＮＴ５０による中和抗体の評価を行った。全ての製剤で使用した緩衝液は、４０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ含有）であった。上記に開示した全ての方法が、チクングニアウイルスの任意の遺伝子型／遺伝子型バリアント／血清型及び株に適用可能である。
【００５１】
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【図１】
2014520117.tif 000004
【図２】
2014520117.tif 000005
【配列表】
2014520117000001.app
【国際調査報告】
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2014520117.tif 000007
2014520117.tif 000008