(57)【要約】  本発明は、抗菌剤とＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストとの組合せを含む乳房内投与用の獣医学的組成物、および授乳期の反芻動物の乳腺炎を治療するための前記組成物の使用に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分の組合せを含み、該活性成分は、抗菌剤と、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストとからなる、乳房内投与用の獣医学的組成物。
【請求項２】
前記Ｔｏｌｌ様受容体がＴＬＲ４である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＴＬＲ４のアゴニストがリポ多糖である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記リポ多糖がリピドＡ誘導体である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記リピドＡ誘導体がＫｄｏ２−リピドＡである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗菌剤がβ−ラクタム抗生物質である、請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記β−ラクタム抗生物質がペニシリンである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物がさらにネオマイシンを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記β−ラクタム抗生物質がセフキノムまたはその医薬的に許容可能な塩である、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗菌剤がセフキノムであり、前記ＴＬＲアゴニストがＫｄｏ２−リピドＡである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗菌剤がペニシリンおよびネオマイシンであり、前記ＴＬＲアゴニストがＫｄｏ２−リピドＡである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
治療に使用するための、請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
反芻動物の乳腺炎の治療に使用するための、請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
ヒト以外の哺乳類の乳腺炎の治療に有用なキットであって、獣医学的に許容可能な製剤中の単位用量の抗菌剤と、獣医学的に許容可能な製剤中の単位用量のＴＬＲアゴニスト剤と、これらの平行した乳房内投与に関する使用説明書とからなる、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳房内投与用の獣医学的組成物、および授乳期の乳牛の乳腺炎を治療するための前記組成物の使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ウシ乳腺炎は、細菌の乳房内感染によって主に引き起こされる乳腺の炎症である。乳腺炎は、米国だけで２０億ドルを超える損害をもたらす、乳牛にとって最もコストのかさむ一疾患である。この疾患は、高い罹患率（最大５０％）を有し、種々のグラム陽性菌（黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（Ｓ．）  ａｕｒｅｕｓ）またはストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ｓｔｒ．）  ｕｂｅｒｉｓ）等）、またはグラム陰性菌（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（Ｅ．）  ｃｏｌｉ）またはクレブシェラ肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（Ｋ．）  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等）、およびマイコプラズマ属（ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）等）によって引き起こされる。ウシ乳腺炎の抗生物質治療において、治癒率は、ほとんどの細菌による感染について良好である（＞９０％）が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）による感染は例外であり、治癒率は低く、２０から５０％の範囲である（非特許文献１）。
【０００３】
ウシ乳房における黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染の長い永続性を説明しようとするいくつかの仮説がある。これらには、バイオフィルムの形成、細胞内コンパートメント内への細菌の隔離、および病原体依存的または病原体特異的な炎症メディエータの誘導（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の場合、固有の免疫系からのヘルプが不十分となる）が挙げられる。特に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）乳腺炎（炎症の急性化が速いが、通常、感染のクリアランスも速い）と黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）乳腺炎（炎症反応が非常に遅く、弱く、かつ様々であるが、慢性的になる傾向が高い）との差異は著しい（非特許文献２；非特許文献３）。
【０００４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）乳房感染において顕著な炎症反応の多くが、リポ多糖（ＬＰＳ）（グラム陰性菌の外膜の複合糖脂質）の存在（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）では不在のものである）によることを示唆する研究が多数発表されている。実際、乳区へのＬＰＳ攻撃感染（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）によって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）乳腺炎の症状の多くを模倣することができる（非特許文献４）。
【０００５】
ＬＰＳは、ＴＬＲ−４（病原体認識および炎症反応の喚起に関与するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の１メンバー）のアゴニスト（アクティベータ）である。ＴＬＲのアゴニストは、様々な病原体に対する非特異的な防御を誘発する将来性を示してきた。
【０００６】
ＬＰＳによるウシ乳房の炎症反応の誘導が、同種または異種の病原菌によって引き起こされる細菌性乳腺炎を予防または治療するのに有益であり得ることは、早くから認識されてきた（非特許文献５）。
【０００７】
しかしながら、これら先の研究は、例えば黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染を予防または治癒するための独立したＬＰＳ治療に集中してきた。報告されている結果は、商業ベースの追跡調査に至るほど十分に陽性のものではなかった（例えば一過性の効果があるだけで、効力はあまりに低すぎた）。
【０００８】
治療動物の食細胞を、食細胞活性化剤（例えば、免疫モジュレータ、抗菌物質および化学誘引物質の組合せ）により質的および量的に変化させ始めることによって、感染症を治療し得ることがさらに認識されてきた（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】欧州特許第０４０５３１５号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｂａｒｋｅｍａら，「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｏｗ，ｐａｔｈｏｇｅｎ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｍｅｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｕｃｃｅｓｓ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ｍａｓｔｉｔｉｓ」，Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．８９，１８７７−１８９５，２００６
【非特許文献２】Ｂａｎｎｅｒｍａｎら，「Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ｅｌｉｃｉｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｔｒａｍａｍｍａｒｙ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１，４６３−４７２，２００４
【非特許文献３】Ｐｅｔｚｌら，「Ｅ．ｃｏｌｉ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｅｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｕｄｄｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｗ」，Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．３９，１８，２００８
【非特許文献４】Ｓｈｕｓｔｅｒら，Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，「Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｌｋ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍａｓｔｉｔｉｓ」，７４，３７６３−３７７４，１９９１
【非特許文献５】Ｋａｕｆら，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｍａｍｍａｒｙ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｏｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ａｕｒｅｕｓ  ｍａｓｔｉｔｉｓ」，８２，３９−４６，２００７
【発明の概要】
【００１１】
細菌誘導乳腺炎、特に黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）乳腺炎の治療に対してより有効な方法についての必要性が残っている。このため、本発明は、哺乳類に対する乳房内投与用の組成物であって、１つまたは複数の抗菌剤およびＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストの組合せを唯一の活性成分として含む組成物を提供する。
【００１２】
本発明の獣医学的組成物による、細菌誘導乳腺炎、特に黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）乳腺炎の治療は、抗菌剤を唯一の治療剤として含む獣医学的組成物と比較して、より高い細菌学的および臨床的治癒率をもたらすことがわかった。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
乳腺炎は、広範囲の細菌（グラム陽性菌、グラム陰性菌、および細胞壁喪失菌（例えばウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ））が挙げられる）によって引き起こされ得る。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌およびストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）は、疾患を引き起こす最も流行性のグラム陽性菌である。他のグラム陽性病原体は、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）およびエンテロコッカス属種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）である。乳腺炎を引き起こすグラム陰性菌の中で、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシェラ肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、シトロバクター属種（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）およびエンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）が最も一般的である。
【００１４】
本発明に従う獣医学的組成物を形成するために、抗菌剤およびＴＬＲアゴニストは、真の混合物としての投与形態で存在してよいが、これらは、別々の投与形態で個々に投与されて、乳房内にある場合にのみ混合物を形成してもよい。
【００１５】
抗菌剤およびＴＬＲアゴニストが別々の投与形態で個々に投与される場合、これらは平行して投与される。平行とは、抗菌剤およびＴＬＲアゴニストが同時に、すなわち一斉に乳区に投与されてよいことを意味する。しかし、これらは経時的に、すなわち順々に投与されて（すなわち、冒された乳区内に一定期間共存するよう）、所望の効果が生じるようにしてもよい。
【００１６】
一実施形態において、抗菌剤およびＴＬＲアゴニストは、一斉に投与される。一斉に与えられる場合、本発明に従う組成物は、好ましくは、単一の製剤中に抗菌剤およびＴＬＲアゴニストの双方を含む単一の投与形態物として示される。
【００１７】
本発明の組成物に含まれる抗菌剤は、一般に、乳腺炎を引き起こす最も重要な微生物を治療する程度に十分広い範囲の抗菌効力を有する抗菌剤、または抗菌剤の組合せであってよい。このような抗菌剤は、当該技術において広く知られている（β−ラクタム抗生物質、アミノグリコシド抗生物質、マクロライド抗生物質、テトラサイクリン抗生物質他等）。
【００１８】
好ましいのはβ−ラクタム抗生物質である（例えばペニシリンまたはセファロスポリン）。好ましい実施形態において、それはセファロスポリンである。セファロスポリンは、セファロスポリンＣ（糸状菌セファロスポリウム・アクレモニウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）によって生産される天然の抗生物質）に由来する半合成抗生物質である。セファロスポリンは、β−ラクタム抗生物質のクラスに属し、第１世代（例えばセファピリン、セファロチン、セファロリジン、セファゾリン）、第２世代（セファマンドール、セフロキシム、セフォキシチン）、第３世代（例えばセフォタキシム、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフチオフル）または第４世代（セフェピム、セフピロム、セフキノム）産物に分類されている（活性範囲、ならび塩基性分子内に組み込まれている側鎖の位置および種類に従う）。現在、セファロスポリンは感染治療に広く使われている。
【００１９】
用語「セファロスポリン」は、本明細書中で用いる場合、医薬的に許容可能な塩およびそのエステルを含む。
【００２０】
本発明の組成物において有用な抗菌剤の組合せは、例えば、β−ラクタム抗生物質（アンピシリンまたはペニシリン等）をアミノグリコシド（ネオマイシンまたはカナマイシン等）と組み合わせたものである。特に好ましい組合せは、ペニシリン（特にベンジルペニシリン）とネオマイシンとである。
【００２１】
特に好ましいセファロスポリン化合物は、セファピリンである。セファピリン（３−［（アセトキシ）メチル］−８−オキソ−７［［４−ピリジニルチオ）アセチル］アミノ］−５−チア−１−アザビシクロ−［４．２．０］オクト−２−エン−２−カルボン酸）が、第１世代のセファロスポリンである。好ましくは、セファピリンの医薬的に許容可能な塩は、ナトリウム塩である。
【００２２】
本発明の別の好ましい実施形態において、第４世代セファロスポリンセフキノム（Ｉ１［［（６Ｒ，７Ｒ）−７−［［（２Ｚ）−（２−アミノ−４−チアゾリル）−（メトキシイミノ）アセチル］アミノ］−２−カルボキシ−８−オキソ−５−チア−１−アザビシクロ［４．２．０−オクト−２−エン−３−イル］メチル］−５，６，７，８−テトラヒドロ−キノリニウム内塩）が用いられる。セフキノムは、セフォタキシムに似た半合成アミノチアゾリルセファロスポリンである。好ましくは、セフキノムの医薬的に許容可能な塩は、硫酸塩である。
【００２３】
本発明に従う典型的な組成物は、化合物の効力に応じて、１０から５００ｍｇの抗菌剤を含む。獣医学的組成物は、好ましくは２００から４００ｍｇ、より好ましくは３００ｍｇのセファピリン／単位用量を含む。
【００２４】
好ましい実施形態において、授乳期の乳牛に使用するための本発明の獣医学的組成物は、５０から１５０ｍｇのセフキノム／単位用量、より好ましくは５０から１００ｍｇ／単位用量、特に好ましくは７５ｍｇ／単位用量の３回分の服用量を含む（各単位用量は１２時間間隔で（３回の連続搾乳時に）適用される）。
【００２５】
本発明の組成物に含まれるＴｏｌｌ様受容体アゴニストは、ＴＬＲファミリーの１つによって認識されて、免疫促進剤反応を誘導する任意のリガンドであってよい。
【００２６】
ＴＬＲは、哺乳類に固有の免疫反応のために重要である。ＴＬＲは、膜貫通グリコプロテインであり、白血球および粘膜表面の上皮細胞において発現し、細胞外、膜貫通および細胞内シグナリングドメインから構成される。細胞外ドメインは、ロイシンリッチな繰返しモジュールを有しており、病原体によって広く共有される識別可能なリガンドとの結合に関与しており、まとめて病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）として知られている。前記リガンドと結合すると同時に、ＴＬＲシグナリング経路の活性化が起こる（初めのステップは、細胞膜上でのＴＬＲのリガンド誘導二量体化である）（ＪｉｎおよびＬｅｅ；「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆａｍｉｌｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ」，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２９，１８２−１９１，２００８）。主要な２種類のＴＬＲ、すなわち、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９（細胞内コンパートメント（エンドソーム膜）に存在し、ウイルスおよび細菌核酸によって活性化され得る）ならびにＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５およびＴＬＲ６（細胞表面上で発現し、細菌、真菌および原生動物といった生物の外膜コンポーネントによって活性化され得る）がある。アゴニスト化合物によるＴＬＲ活性化と同時に、シグナリング経路が始動して、炎症誘発メディエータ（ケモカイン、サイトカインおよび細胞接着分子等）が生産される（ＫａｉｗａおよびＡｋｉｒａ；「Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｏ  ＮＦ−κＢ  ｂｙ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、Ｔｒｅｎｄ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１３，４６０−４６９，２００７）。
【００２７】
本発明の組成物に用いられてよいＴＬＲアゴニスト／リガンドは、ＴＬＲ１またはＴＬＲ６と複合したＴＬＲ２によって認識されるリポタンパク質またはリポペプチド誘導体（合成トリアシル化リポペプチドＰＡＭ３ＣＳＫ４（ＪｉｎおよびＬｅｅ；上記参照）等）であり、全長リポタンパク質、ジアシル化リポタンパク質誘導体（マイコプラズマ・サリバリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）由来の線維芽細胞刺激リポペプチド−１（ＦＳＬ−１）（すなわちＰａｍ２ＣＧＤＰＫＨＰＫＳＦ）、およびマイコプラズマ・ファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）由来のマクロファージ活性化リポペプチド−２（ＭＡＬＰ−２）（すなわちＳ−［２，３−ビスパルミトイルオキシ−（２Ｒ）−プロピル］−システイニル−ＳＮＮＤＥＳＮＩＳＦＫＥＫ）、酵母チモサン（ベータグルカン）およびリポテイコ酸等）のほとんどの免疫刺激活性を保持する。
【００２８】
ＴＬＲ３によって認識されるＴＬＲアゴニストは、ウイルスの、または合成の二重鎖ＲＮＡ調製物（ポリＩ／ＣまたはポリＡ／Ｕ等）である。
【００２９】
本発明の獣医学的組成物に使用するためのＴＬＲ４アゴニストは、グラム陰性菌の天然株または突然変異株由来のリポ多糖調製物、特にその疎水性コンポーネント（リピドＡ（ＷａｎｇおよびＱｕｉｎｎ；「Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４９，９７−１０７，２０１０）と呼ぶ）およびその合成誘導体（Ｇａｅｋｗａｄら，「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｉｐｉｄ  Ａ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５，２９３７５−２９３８６，２０１０）（リピドＡまたはＫｄｏ−リピドＡ（髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）由来）およびリピドＡまたはＫｄｏ２−リピドＡ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来）等）である。本発明の組成物に使用するための好ましいＴＬＲ４多糖鎖アゴニストは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＬＰＳまたはＫｄｏ２−リピドＡ（Ｒｅ−ＬＰＳ）である。ＬＰＳに勝るＫｄｏ２−リピドＡの利点は、その生産について再現性があり、より定義された天然産物であること、そして動物細胞を刺激するのに用いられる濃度が低くとも、ＥＳＩ／ＭＳによって検出され得ることである。
【００３０】
短い多糖鎖のリポ多糖（ＬＰＳ）アゴニスト（ラフ−ＬＰＳ（突然変異株上に通常見られる））は、化学型Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、ＲｄおよびＲｅと分類される（下付き添字は、与えられたＬＰＳの多糖長さを示す）。Ｒａ−ＬＰＳおよびＲｅ−ＬＰＳはそれぞれ、最長および最短の鎖長を有する突然変異体を示す。
【００３１】
ＴＬＲ５によって認識されるＴＬＲアゴニストは、鞭毛のあるグラム陽性菌およびグラム陰性菌由来のフラジェリンタンパク質である。
【００３２】
ＴＲＬ７およびＴＬＲ８によって認識されるＴＬＲアゴニストは、一本鎖ＲＮＡおよび合成低分子アゴニスト（イミダゾキノリン（Ｒ８４８等）、イミキモドおよびチアゾロキノリン（ＣＬ０７５等）等）である。
【００３３】
ＴＲＬ９によって認識されるＴＬＲアゴニストは、微生物ＤＮＡまたはこれに由来する合成オリゴヌクレオチド（優先的にホスホロチオネートおよびリン酸ジエステルオリゴヌクレオチド）である。
【００３４】
細胞表面に位置するＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５またはＴＬＲ６を活性化するＴＬＲアゴニストの使用に好ましいものとして、Ｒｅ−ＬＰＳ、ＰＡＭ３ＣＳＫ４、ＦＳＬ−１、フラジェリンおよびチモサン等が例示される。
【００３５】
本発明の組成物に使用するためのさらなるＴｏｌｌ様受容体アゴニストの識別を、例えば、ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ、または分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子リポーターアッセイを用いて、ＨＥＫ２９３−ウシＴＬＲトランスフェクタントにおいて行ってよい。このようなトランスフェクタントは、ウシＴＬＲ受容体（好ましくはｂｏｖＴＬＲ４、ｂｏｖＴＬＲ５、ｂｏｖＴＬＲ３、ｂｏｖＴＬＲ７およびｂｏｖＴＬＲ８）のいずれか１つを有してよい。このようなプロセスが、発明者らの同時係属中の欧州特許出願第１０１９７４３５．０号明細書（参照によって本明細書に援用される）にも記載されている。
【００３６】
受容体結合およびＴＬＲモジュレータのインビトロ生物活性を判定する方法が、当該技術において周知である。一般に、発現した受容体を、試験する化合物と接触させて、結合または機能的反応の刺激もしくは阻害を測定する。
【００３７】
機能的反応を測定するために、ＴＬＲ受容体遺伝子（好ましくはウシ受容体遺伝子）をコードする単離ＤＮＡを、適切な宿主細胞（ＨＥＫ２９３細胞等）において発現させる。
【００３８】
組換え型細胞系を構築する方法が、当該技術において周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，最新版）。受容体の発現は、所望のタンパク質をコードするＤＮＡの発現によって達成される。さらなる配列のライゲーションおよび適切な発現系の構築に関する技術は全て、今では当該技術において周知である。所望のタンパク質をコードするＤＮＡの一部または全てを、標準的な固相技術を用いて、好ましくはライゲーションを簡単にするための制限部位を含むように、合成的に構築することができる。含まれるコード配列の転写および翻訳を適切に制御する要素を、ＤＮＡコード配列に与えてよい。周知のように、様々な宿主（原核生物の宿主（細菌等）および真核生物の宿主（酵母、植物細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、鳥類細胞等）が挙げられる）と和合性がある発現系が現在入手可能である。
【００３９】
続いて、ＴＬＲ受容体を発現する細胞を、試験化合物と接触させて、結合、または機能的反応の刺激もしくは阻害を観察する。
【００４０】
機能的ＴＬＲ受容体アゴニスト活性を、シグナリングカスケードの変調（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）を判定することによって、測定してよい（例えば、ＡＰ１、ＮＦκＢまたはＩＲＦ転写因子活性化における受容体介在性変化の測定等）。従って、このような方法は、ＴＬＲ受容体を宿主細胞の細胞表面上に発現させることと、細胞を試験化合物に曝すこととを含む。続いて、誘導された転写産物または誘導タンパク質産物（例えばインターロイキン−８）の生産が測定される。転写産物または誘導タンパク質のレベルは、受容体への結合に及ぼす試験化合物の影響に応じて減少または増大する。
【００４１】
暴露細胞中の誘導された転写産物またはタンパク質の直接的な測定に加えて、受容体コードＤＮＡ、およびリポーター遺伝子をコードする第２ＤＮＡでトランスフェクトした細胞を用いてよく、これらの発現は受容体活性化と相関する。一般に、リポーター遺伝子発現は、第２メッセンジャーの変化レベルに反応する任意の反応要素によって制御されてよい。適切なリポーター遺伝子は、例えばＬａｃＺ、アルカリホスファターゼ、ホタルルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質である。このようなトランス活性化アッセイの原理は、当該技術において周知であり、例えばＳｔｒａｔｏｗａ，Ｃ．Ａ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６，５７４（１９９５）に記載されている。
【００４２】
ＴＬＲ４アゴニストの検出に有用な細胞系は、ウシＴＬＲ４プラスミド、増強ウシＭＤ２およびウシＣＤ１４配列を含むプラスミド、ならびにＮＦκＢリポーター遺伝子構築物（ＴＬＲ４アゴニストによる活性化を感知する）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞である。
【００４３】
ＴＬＲ１、ＴＬＲ２またはＴＬＲ６アゴニストについて、アゴニストの検出に有用な細胞系は、これらの受容体を発現し、ウシＣＤ１４（リポタンパク質由来アゴニストに対する反応を増強する）、およびＮＦκＢリポーター遺伝子構築物（ＴＬＲアゴニストによる活性化を感知する）でトランスフェクトしたウシマクロファージ細胞系（ＢＯＭＡＣ）である。
【００４４】
ＴＬＲ３、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８アゴニストの検出に有用な細胞系は、前記ウシＴＬＲプラスミドの１つ、およびＮＦκＢリポーター遺伝子構築物（ＴＬＲアゴニストによる活性化を感知する）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞系である。
【００４５】
各ＴＬＲ受容体上で活性アゴニスト化合物を選択するために、ＥＣ５０値は、＜１０−５Ｍ、好ましくは＜１０−７Ｍ、より好ましくは＜１０−８Ｍでなければならない。
【００４６】
本発明に従う好ましい組成物は、抗生剤およびＴＬＲ４のアゴニストを含む。好ましいＴＬＲ４アゴニストは、リポ多糖、特にリピドＡの誘導体（Ｒｅ−ＬＰＳ（Ｋｄｏ２−リピドＡ）等）である。
【００４７】
本発明の特に好ましい獣医学的組成物は、抗生セフキノムを、ＴＬＲ４アゴニストＲｅ−ＬＰＳ（Ｋｄｏ２−リピドＡ）と組み合わせて含むものである。
【００４８】
本発明の別の特に好ましい獣医学的組成物は、抗生物質ペニシリンおよびネオマイシンを、ＴＬＲ４アゴニストＲｅ−ＬＰＳ（Ｋｄｏ２−リピドＡ）と組み合わせて含むものである。
【００４９】
本発明に従う典型的な組成物は、化合物の効力に応じたＴＬＲアゴニストの量を含む。授乳期の乳牛に使用するための本発明の好ましい獣医学的組成物において、ＴＬＲ４アゴニストは、ＬＰＳ誘導体（ｒｅ−ＬＰＳ等）であり、組成物は、１から２０μｇ／単位用量、より好ましくは１から５μｇ／単位用量の１から５回分、特に３回分の服用量、特に１０μｇ（または１５００ＥＵ）／単位用量の３回分の服用量を含む。一実施形態において、各単位用量は、（およそ）１２時間の投与間隔で（１から５回、特に３回の連続搾乳時に）適用される。
【００５０】
治療スケジュールは、各搾乳の間に、１から５回、特に３回の抗菌剤およびＴＬＲ４アゴニストの連続投与を含む。
【００５１】
高熱反応を引き起こす効力はＬＰＳ調製物の性質に従って変動するので、ＬＰＳ（エンドトキシン）誘導体の効力は好ましくはエンドトキシン単位／ｍｇ（ＥＵ／ｍｇ）で表される。これらの単位は、ＦＤＡによって開発された（これらの判定のためのアッセイも同様である）。最も一般的に用いられるアプローチは、ＬＰＳ誘導体の、カブトガニアメーバ様細胞溶解物（カブトガニ由来の血液細胞の水性抽出物（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  ７．０；Ｃｈａｐｔｅｒ  ２．６．１４．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ．参照））との反応に基づくアッセイであり（ＬＡＬ−試験）、既知の基準（１００ｐｇの米国基準エンドトキシンＥＣ−５は、１ＥＵの活性を有する）と比較するものである。授乳期の乳牛の乳腺炎を治療するための本発明の好ましい獣医学的組成物は、乳区あたり５００から３０００ＥＵ、好ましくは１５００ＥＵの投与用のＬＰＳ誘導体を含む。
【００５２】
本発明の組成物は、医薬的に許容可能な助剤（例えば担体）をさらに含んでよい。活性成分（抗菌剤およびＴＬＲアゴニスト）のための医薬的に許容可能な担体は、毒性がなく、医薬的に許容可能であり、活性成分と和合性があり、投与を可能にする粘度を有するが、薬剤粒子の放出特性を制御するように選択される。
【００５３】
一般的な慣習に従って、乳房内投与のための本発明に従う獣医学的組成物は、適切な担体中の活性成分の懸濁液または溶液を含み、これは水性または油性基剤から製造されてよい。一実施形態において、担体は油性基剤である。本発明の獣医学的組成物の抗生コンポーネントおよびＴＬＲアゴニストコンポーネントは、合わせて単一の医薬製剤に製剤化されてよく、または２つの別々の医薬製剤に製剤化されてよい。
【００５４】
獣医学的組成物において油性基剤に用いてよいオイルは、一般に天然のものであり、例えば植物性のもの、半合成または合成モノ−、ジ−もしくはトリグリセリドである。用いてよい植物性オイルは、例えばゴマ油、オリーブ油、綿実油、ヒマシ油、ラッカセイ油またはココヤシ油である。本発明に従う組成物における医薬的に許容可能な担体は、好ましくは油性基剤を含み、そして１つまたは複数の添加剤（増粘剤、乾燥剤および抗酸化剤等）を含んでもよい。適切な医薬賦形剤が、当該技術において知られている。乳房内製剤用の担体のためのこのような医薬賦形剤は、例えば「Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（第２０版，２０００）（参照によって本明細書に援用される）に記載されている。
【００５５】
従来の増粘剤は、例えばステアリン酸アルミニウム、シリカまたは脂肪酸エステル（グリセロールモノステアレート等）である。増粘剤の適切な量は、０から３０重量％の範囲内である。乾燥剤は、例えばシリケート、活性白土、シリカゲルおよび分子篩である。特に好ましいのはケイ酸ナトリウムアルミニウムである。用いてよい乾燥剤の適切な量は、０から１５重量％、好ましくは０から１０重量％の範囲内である。適切な抗酸化剤は、例えばブチルヒドロキシトルエンまたはヒドロキシアニソールである。抗酸化剤は通常、０から１０重量％の範囲内で存在するものとする。他の添加剤が、微量の割合で担体中に存在してもよい。
【００５６】
本発明はさらに、治療において使用するための、特に授乳期の乳牛の乳腺炎の治療において使用するための獣医学的組成物を提供する。
【００５７】
本発明の獣医学的組成物は、細菌誘導乳腺炎、特に、ブドウ球菌属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）またはストレプトコッカス属種（Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）の病原菌によって、特に黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ステプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）またはステプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）の感染によって引き起こされる乳腺炎の治療において特に有用である。
【００５８】
本発明に従う獣医学的組成物は、臨床乳腺炎の治療を必要とする全てのヒト以外の哺乳類の種に主に適用されてよい。乳腺炎は、任意の哺乳類の種に影響を及ぼし得るが、特に、ヒトが消費するミルクを生産するのに利用される反芻動物（ウシ、バッファロー、ラクダ科の動物、ヒツジおよびヤギ等）において重要である。
【００５９】
本発明の別の態様は、乳腺炎、特に黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の感染によってヒト以外の哺乳類において引き起こされる乳腺炎の治療に有用なキットであり、獣医学的に許容可能な製剤中の単位用量の抗菌剤、および獣医学的に許容可能な製剤中の単位用量のＴＬＲアゴニスト剤、ならびにこれらの平行した乳房内投与に関する使用説明書を含む。
【００６０】
本明細書中で用いる「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上、そうでないとする明確な指示がない限り、単数および複数の対象を含む。従って、例えば、「活性成分（ａｎ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）」と表す場合は、単一の活性成分を含むだけでなく２種類以上の活性成分も組み合わせて含み、「担体（ａ  ｃａｒｒｉｅｒ）」と表す場合は、２つ以上の担体の混合物を含むだけでなく単一の担体も含み、他のものも同様である。
【実施例１】
【００６１】
材料：
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）株Ｎｅｗｂｏｕｌｄ  ３０５（ＡＴＣＣ  ２９７４０）の株懸濁液（約１０１１ＣＦＵ／ｍｌ）を、１０％のグリセロールを有するペプトン生理水中にて−８０℃で凍結保存した。０日目に、貯蔵液を解凍し、ペプトン生理水中にておよそ１０００ｃｆｕ／ｍｌの濃度に希釈した。
【００６２】
硫酸セフキノム
乳房内使用のためのインジェクタが、８グラム（油性相）あたり７５ｍｇの抗生セフキノムを含む。攻撃感染に用いる黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株Ｎｅｗｂｏｕｌｄ  ３０５に対するセフキノムのＭＩＣは、０．２５μｇ／ｍｌである。
【００６３】
Ｒｅ−ＬＰＳ
Ｒｅ−ＬＰＳ（Ｋｄｏ２−リピドＡとも呼ぶ）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞壁から抽出した糖リピドグリカンの調製物である（Ｒａｅｔｚら、「Ｋｄｏ２−Ｌｉｐｉｄ  Ａ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，ａ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｔｈａｔ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｖｉａ  ＴＬＲ−４」、Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ４７，１０９７−１１１，２００６）。産物を、１μｇ／ｍｌの滅菌水溶液として、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，ＵＳＡ；（バッチｎｒ．：ＫＤＯＯ２ＬＡ−１２）から得た。産物は以下のほぼ均質なＲｅ−ＬＰＳサブ構造を有し、エンドトキシン活性は天然のＬＰＳの活性と同等である：
【００６４】
【化１】
2014516950.tif 000002
Ｋｄｏ２−リピドＡは、ＬＰＳ合成における中間生成物である。これは、コアの代わりに、２つの３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソン酸（Ｋｄｏ）糖残基を有しており、Ｏ−抗原を有していない。ＴＬＲ４を活性化する能力は、天然のＬＰＳの能力に匹敵する。
【００６５】
試験系：
０日目に、８頭のＰｒｉｍ’Ｈｏｌｓｔｅｉｎの授乳期の乳牛（２から５歳であり、授乳期が少なくとも２ヶ月の動物）について、乳房内接種を２つの同側区内に行った（区あたり１ｍｌの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）懸濁液（およそ１０００ｃｆｕ／区）を、滅菌済み２ｍｌのシリンジにより乳頭槽内へ接種）。乳頭先端は、注入前に、消毒液に浸したタオルで消毒した。
【００６６】
攻撃感染後の６日目に、４頭の乳牛（８乳区）を７５ｍｇのセフキノム（３回の連続搾乳のそれぞれの後の１インジェクタ）で治療した（グループＡ）。感染させた他の４頭の乳牛を、同様に７５ｍｇのセフキノムで治療したが、各セフキノム注入の直前に、１０μｇのｒｅ−ＬＰＳを注入した（グループＢ）。
【００６７】
酪農業において乳腺炎を測定するための標準的なアッセイは、ミルク中の細胞（乳牛に由来する）の数を数えることである。この推定は体細胞数計測（ＳＣＣ）と呼ばれる。具体的には、ＳＣＣは、細胞（免疫細胞（感染動物の乳房のライニングおよび組織から乳房のキャビティ内に放出される白血球等）を含む）のレベルを反映する。与えられた容積（通常は１ｍｌ）のミルク中の体細胞数は、乳腺炎の程度の半定量的推定を可能にする。なぜなら、無影響の動物は通常、低いＳＣＣレベルを有するからである。
【００６８】
ミルクサンプルを、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の存在およびＳＣＣレベルについて、研究中のいくつかの時点で調査した（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の攻撃感染後２日目、６日目、９日目、１３日目、１６日目、２０日目、２３日目の細菌学）。
【００６９】
細菌学的治癒を、治療終了後１６日目（すなわち攻撃感染後２３日目）に評価し、少なくとも２つの最後の連続的ミルクサンプルについて、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）陰性（＜１０ｃｆｕ／ｍｌ）とわかる（許容可能なＳＣＣレベル（＜２５００００細胞／ｍｌ）である）ものとして定義した。
【００７０】
臨床的治癒を、治療終了後１６日目（すなわち攻撃感染後２３日目）に評価し、少なくとも２つの最後の連続的ミルクサンプルについて、ＳＣＣ＜２５００００細胞／ｍｌであるものとして定義した。
【００７１】
結果の要約を、以下の表１に示す。
【００７２】
示す数字がＳＣＣである；文字種が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌学的状態を示す（標準文字＝陰性サンプル、太文字／下線付き文字＝黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）陽性サンプル）。
【００７３】
【表１】
2014516950.tif 000003
０日目の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）による感染
セフキノム（グループＡ）またはセフキノム＋ｒｅ−ＬＰＳ（グループＢ）による６日目の治療
感染後、ＳＣＣの著しい増加が概して観察された。
【００７４】
Ｒｅ−ＬＰＳ治療により、１ｍｌあたり１．１０６細胞を超えるＳＣＣレベルが誘導された。１３日目から、ＳＣＣ値は両グループで匹敵した。２３日目に治癒したとみなされた乳区は、１３日目または１６日目からすでにほぼ標準的なＳＣＣレベルを有した。
【００７５】
研究終了時（治療終了後１６日目）の細菌学的治癒率は以下の通りであった：セフキノムグループについて５０％（８乳区中４区）、およびｒｅ−ＬＰＳ／セフキノムグループについて８６％（７乳区中６区（感染後も黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）陰性状態であったため、１区を除外した））。
【００７６】
【表２】
2014516950.tif 000004
【実施例２】
【００７７】
材料：
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）株Ｎｅｗｂｏｕｌｄ  ３０５（ＡＴＣＣ  ２９７４０）の株懸濁液（約１０９ＣＦＵ／ｍｌ）を、１０％のグリセロールを有するペプトン生理水中にて−８０℃で凍結保存した。０日目に、貯蔵液を解凍し、ペプトン生理水中にておよそ２００ｃｆｕ／ｍｌの濃度に希釈した。
【００７８】
ネオマイシン＋ペニシリン治療
ネオマイシンおよびベンジルペニシリンを、２つの抗生物質を含む単一の油性懸濁液として製剤化した。製剤を、乳房内治療用の１０ｍＬの単回使用インジェクタ内に満たした。各インジェクタは、８グラムの油性基剤あたり２５０ｍｇのネオマイシンおよび１６９ｍｇのベンジルペニシリンを含んだ。攻撃感染に用いる黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｎｅｗｂｏｕｌｄ株に対するネオマイシンおよびベンジルペニシリンのＭＩＣはそれぞれ、２μｇ／ｍｌおよび０．０６４μｇ／ｍｌである。
【００７９】
Ｒｅ−ＬＰＳ
Ｒｅ−ＬＰＳ（Ｋｄｏ２−リピドＡとも呼ぶ）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞壁から抽出した糖リピドグリカンの調製物である（Ｒａｅｔｚら、「Ｋｄｏ２−Ｌｉｐｉｄ  Ａ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，ａ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｔｈａｔ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｖｉａ  ＴＬＲ−４」、Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ４７，１０９７−１１１，２００６）。産物を、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，ＵＳＡから得た。産物はほぼ均質なＲｅ−ＬＰＳサブ構造であり、エンドトキシン活性は天然のＬＰＳの活性と同等である。
【００８０】
Ｋｄｏ２−リピドＡは、ＬＰＳ合成における中間生成物である。これは、コアの代わりに、２つの３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソン酸（Ｋｄｏ）糖残基を有しており、Ｏ−抗原を有していない。ＴＬＲ４を活性化する能力は、天然のＬＰＳの能力に匹敵する。
【００８１】
Ｒｅ−ＬＰＳを、１μｇ／ｍｌの滅菌水溶液として調製した。
【００８２】
試験系：
０日目に、１２頭のＰｒｉｍ’Ｈｏｌｓｔｅｉｎの授乳期の乳牛（２から８歳であり、授乳期が少なくとも１ヶ月の動物）について、乳房内経路で接種を２つの同側区内に行った（区あたり５ｍｌの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）懸濁液（およそ１０００ｃｆｕ／区）、５ｍｌのシリンジを使用）。乳頭先端は、注入前に、消毒液に浸したタオルで消毒した。
【００８３】
攻撃感染後の７日目に、６頭の乳牛の感染乳区（１２区）をネオマイシン／ペニシリンで治療した（グループＡ）。治療は、感染した乳区につき１回のネオマイシン／ペニシリンインジェクタの注入で構成された。合計で２回の注入を実行した（２４時間の注入間隔であった）。感染させた他の６頭の乳牛を、同様にネオマイシン／ペニシリンインジェクタで治療したが、各ネオマイシン／ペニシリン注入の直前に、１０μｇのｒｅ−ＬＰＳを注入した（グループＢ）。
【００８４】
酪農業において乳腺炎を測定するための標準的なアッセイは、ミルク中の細胞（乳牛に由来する）の数を数えることである。この推定は体細胞数計測（ＳＣＣ）と呼ばれる。具体的には、ＳＣＣは、細胞（免疫細胞（感染動物の乳房のライニングおよび組織から乳房のキャビティ内に放出される白血球等）を含む）のレベルを反映する。与えられた容積（通常は１ｍｌ）のミルク中の体細胞数は、乳腺炎の程度の半定量的推定を可能にする。なぜなら、無影響の動物は通常、低いＳＣＣレベルを有するからである。
【００８５】
ミルクサンプルを、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の存在およびＳＣＣレベルについて、研究中のいくつかの時点で調査した（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の攻撃感染後３日目、７日目、１０日目、１４日目、１７日目、２１日目、２４日目の細菌学）。
【００８６】
細菌学的治癒を、治療終了後１６日目（すなわち攻撃感染後２４日目）に評価し、少なくとも２つの最後の連続的ミルクサンプルについて、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）陰性（＜５ｃｆｕ／ｍｌ）とわかるものとして定義した。
【００８７】
臨床的治癒を、治療終了後１６日目（すなわち攻撃感染後２４日目）に評価し、少なくとも２つの最後の連続的ミルクサンプルについて、ＳＣＣ＜２５００００細胞／ｍｌであるものとして定義した。
【００８８】
結果の要約を、以下の表３に示す。
【００８９】
【表３】
2014516950.tif 000005
示す数字がＳＣＣである；文字種が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌学的状態を示す（標準文字＝陰性サンプル、太文字／下線付き文字＝黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）陽性サンプル）。
【００９０】
０日目の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）による感染。ネオマイシン／ペニシリン（グループＡ）またはネオマイシン／ペニシリン＋ｒｅ−ＬＰＳ（グループＢ）による７日目の治療。
【００９１】
感染後、ＳＣＣの著しい増加が概して観察された。
【００９２】
除外：（１）試験参加基準に適合しない乳区；（２）黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）が治療前（攻撃感染後）に回収されなかった乳区。
【００９３】
Ｒｅ−ＬＰＳ治療により、１ｍｌあたり１．１０６細胞を超えるＳＣＣレベルが誘導された。１４日目から、ＳＣＣ値は両グループで匹敵した。２４日目に治癒したとみなされた乳区は、１４日目または１７日目からすでにほぼ標準的なＳＣＣレベルを有した。
【００９４】
研究終了時（治療終了後１６日目）の細菌学的治癒率は以下の通りであった：ネオマイシン／ペニシリングループについて７０％（１０乳区中７区、２区を除外した）、およびｒｅＬＰＳ−ネオマイシン／ペニシリングループについて９１％（１１乳区中１０区、１区を除外した）。
【００９５】
治癒率を、以下の表４に要約する。
【００９６】
【表４】
2014516950.tif 000006
【実施例３】
【００９７】
ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）株（０９９／００２４）を用いて、授乳期の乳牛に乳腺炎を誘導する。攻撃感染後、動物を、ネオマイシン／ペニシリン、またはネオマイシン／ペニシリンとｒｅ−ＬＰＳとの組合せで治療した。
【００９８】
接種菌の調製
乳房内攻撃感染用のストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒ．ｕｂｅｒｉｓ）接種菌を、生理媒体中に約２００ｃｆｕ／ｍｌの濃度で調製する。
【００９９】
ネオマイシン＋ペニシリン治療
ネオマイシンおよびベンジルペニシリンを、実施例２で上述したように、製剤化する。
【０１００】
Ｒｅ−ＬＰＳ
Ｒｅ−ＬＰＳを、実施例１で示したように、調製する。
【０１０１】
研究設計：
０日目に、１０頭のＰｒｉｍ’Ｈｏｌｓｔｅｉｎの授乳期の乳牛（２から８歳であり、授乳期が少なくとも１ヶ月の動物）について、乳房内経路で接種を２つの同側区内に行う（区あたり５ｍｌのストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒ．ｕｂｅｒｉｓ）菌懸濁液（およそ１０００ｃｆｕ／区））。
【０１０２】
攻撃感染後の３日目に、５頭の乳牛の感染乳区（１０区）をネオマイシン／ペニシリンで治療する（グループＡ）。治療は、感染した乳区につき１回のネオマイシン／ペニシリンインジェクタの注入で構成される。合計で２回の注入を実行する（２４時間の注入間隔である）。感染させた他の５頭の乳牛（グループＢ）を、同様にネオマイシン／ペニシリンインジェクタで治療するが、各ネオマイシン／ペニシリン注入の直前に、１０μｇのｒｅ−ＬＰＳを注入する。
【０１０３】
ミルクサンプルを、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒ．ｕｂｅｒｉｓ）菌の存在および体細胞数計測（ＳＣＣ）レベルについて、研究中のいくつかの時点で調査するストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒ．ｕｂｅｒｉｓ）菌の攻撃感染後３日目、６日目、１０日目、１３日目、１７日目および２４日目の細菌学）。
【０１０４】
細菌学的治癒を、少なくとも２つの最後の連続的ミルクサンプルについて、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒ．ｕｂｅｒｉｓ）菌陰性とわかるものとして定義する。
【０１０５】
臨床的治癒を、少なくとも２つの最後の連続的ミルクサンプルについて、ＳＣＣ＜２５００００細胞／ｍｌであるものとして定義する。
【０１０６】
治癒率を、２つの治療間で比較する。
【国際調査報告】
2014516950.tif 000007
2014516950.tif 000008
2014516950.tif 000009