(57)【要約】  この方法は、医学および生物学に関し、特に、診断目的や研究調査目的で、血液凝固系およびその成分のパラメーターを求めるために使用可能である。  この方法の目的は、いくつかの疾患を診断し、血液凝固パラメータに影響する医薬品の効率を評価するための可能性を与えつつ、フィブリン血栓成長の過程における凝固因子の空間分布を調べることのみならず、不均一系における血液凝固プロセスの異なる相における凝固因子の役割を評価することである。  この目的は、被検媒体試料中に分散された、血漿、全血、水、リンパ液、コロイド溶液、晶質液またはゲル、タンパク質分解酵素またはそのチモーゲンのうちの１つからなる群から選択される被検媒体の試料を含有するin vitro系を提供するステップと、タンパク質分解酵素による蛍光発生基質の切断時に、標識をさらに放出しつつ上述した基質をin vitro系に浸漬するステップと、あらかじめ定められた時点で、被検媒体試料を照明して、標識の蛍光シグナルを励起させるステップと、あらかじめ定められた時点で、照明と同時に、試料中における標識の蛍光シグナルの空間分布を記録するステップと、媒体の成分に対する媒体中での標識の結合を考慮しつつ、「反応−拡散−対流」タイプの逆問題を解くことによって、標識の蛍光強度の一組の空間分布から、タンパク質分解酵素活性の時空間分布を求めるステップと、を含む、不均一系におけるタンパク質分解酵素活性の時空間分布を求める手段を作ることで、解決される。発色基質または発光基質を基質として加えてもよい。この方法を実現するための装置も提供される。
2014521952.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不均一系におけるタンパク質分解酵素活性の時空間分布を求めるための方法であって、
被検媒体試料中に分散された、血漿、全血、水、リンパ液、コロイド溶液、晶質液またはゲル、タンパク質分解酵素またはそのチモーゲンからなる群から選択される被検媒体の試料を含有するin vitro系を提供するステップと、
前記タンパク質分解酵素による蛍光発生基質の切断時に、標識をさらに放出しつつ前記基質を前記in vitro系に浸漬するステップと、
あらかじめ定められた時点で、前記被検媒体試料を照明して、前記標識の蛍光を励起させるステップと、
あらかじめ定められた時点で、前記照明と同時に、前記試料中における前記標識の蛍光シグナルの空間分布を記録するステップと、
前記媒体の成分に対する前記媒体中における前記標識の結合を考慮しつつ、「反応−拡散−対流」タイプの逆問題を解くことによって、前記標識の前記蛍光シグナルの一組の分布から、前記タンパク質分解酵素活性の時空間分布を求めるステップと、を含む方法。
【請求項２】
不均一系におけるタンパク質分解酵素活性の時空間分布を求めるための方法であって、
被検媒体試料中に分散された、血漿、全血、水、リンパ液、コロイド溶液、晶質液またはゲル、タンパク質分解酵素またはそのチモーゲンからなる群から選択される被検媒体の試料を含有するin vitro系を提供するステップと、
前記タンパク質分解酵素による発色基質の切断時に、標識をさらに放出しつつ前記基質を前記in vitro系に浸漬するステップと、
あらかじめ定められた時点で、前記被検媒体試料に、前記標識による相当量の吸収に対応する波長の光を照射するステップと、
あらかじめ定められた時点で、前記試料中での前記標識の光吸収の空間分布を記録するステップと、
前記媒体の成分に対する前記媒体中における前記標識の結合を考慮しつつ、「反応−拡散−対流」タイプの逆問題を解くことによって、前記標識の前記蛍光シグナルの一組の分布から、前記タンパク質分解酵素活性の時空間分布を求める（規定または計算する）ステップと、を含む方法。
【請求項３】
不均一系におけるタンパク質分解酵素活性の時空間分布を求めるための方法であって、
被検媒体試料中に分散された、血漿、全血、水、リンパ液、コロイド溶液、晶質液またはゲル、タンパク質分解酵素またはそのチモーゲンからなる群から選択される被検媒体の試料を含有するin vitro系を提供するステップと、
前記タンパク質分解酵素による発光基質の切断時に、標識をさらに放出しつつ前記基質を前記in vitro系に浸漬するステップと、
あらかじめ定められた時点で、前記試料中での前記標識の発光シグナルの空間分布を記録するステップと、
前記媒体の成分に対する前記媒体中における前記標識の結合を考慮しつつ、「反応−拡散−対流」タイプの逆問題を解くことによって、前記標識の前記蛍光シグナルの一組の分布から、前記タンパク質分解酵素活性の時空間分布を求める（規定または計算する）ステップと、を含む方法。
【請求項４】
前記活性化剤は、前記タンパク質分解酵素活性の時空間分布の変化を引き起こすために、前記in vitro系に加えられる、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記活性化剤は、表面に固定化された組織因子、可溶性の組織因子、組織型プラスミノーゲン活性化因子、組織因子発現能のある細胞、体組織の試料、ガラスまたはプラスチックからなる群から選択される作用剤である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
あらかじめ定められた時点で、前記被検試料媒体にさらに光を照射し、光散乱の空間分布、前記試料中での光透過の空間分布またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、前記被検試料の空間パラメーターを記録する、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記基質は、溶液として前記被検媒体試料に加えられる、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記基質は、前記被検媒体試料を入れる前に前記in vitro系の壁面にフリーズドライ状で適用される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記被検媒体は、多血小板血漿、無血小板血漿、乏血小板血漿からなる群から選択される血漿である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
照明と前記標識の蛍光シグナルの変化の記録は、１分間に１〜１８００回の頻度で行われる、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法のステップはすべて、約３７℃に制御された温度で行われる、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法のステップはすべて、気圧より高い安定した圧力で行われる、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記被検試料のｐＨを、７．２〜７．４の範囲内に安定させる、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
不均一系におけるタンパク質分解酵素活性の時空間分布を求めるための装置であって、
被検媒体試料中に分散された、血漿、全血、水、リンパ液、コロイド溶液、晶質液またはゲル、タンパク質分解酵素またはそのチモーゲンからなる群から選択される被検媒体の試料と、蛍光発生基質または発色基質または発光基質と、を入れるためのキュベットを含むin vitro系と、
決められた時間内に、前記被検媒体試料を照明するための手段と、
決められた時間内に、タンパク質分解酵素による前記基質の切断による標識シグナルの空間分布を記録する手段と、
照明手段および記録手段を制御する手段と、からなることを特徴とする、装置。
【請求項１５】
プロセス活性化因子を前記キュベットに配置および挿入するための活性化手段を含み、タンパク質分解酵素活性の時空間分布の変化を開始させる、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記被検媒体試料中の温度を、好ましくは３７℃で安定させる手段を含む、請求項１４に記載の装置。
【請求項１７】
前記被検試料の全量の中を、好ましくは大気圧に対して上昇される安定した圧力にする手段を含む、請求項１４に記載の装置。
【請求項１８】
暗視野法によって、可視光線で、前記被検媒体試料を照明する手段を含む、請求項１４に記載の装置。
【請求項１９】
照明手段および記録手段を制御する前記手段は、オン／オフ時間、照明強度、照明手段と、その間の登録との同期を調節する可能性を与える、請求項１４に記載の装置。
【請求項２０】
経時的なタンパク質分解酵素活性の空間分布を計算する可能性を与えるコンピューター計算装置に接続されるか、そのようなコンピューター計算装置をオンにする、請求項１４に記載の装置。
【請求項２１】
in vitroでの不均一系におけるタンパク質分解酵素活性の時空間分布の変化をもとに、止血系の障害を診断するための方法であって、
試料として、全血、無血小板血漿、乏血小板血漿、多血小板血漿、抗凝血薬を加えた血液、抗凝血薬を加えた血漿からなる群から選択される血液成分を使用するステップと、
被検試料を、表面に固定化された血液凝固活性化因子と接触させること、研究対象となるタンパク質分解酵素によって切断される基質を添加すること、カルシウム塩を添加すること、凝固の接触活性化の阻害因子を添加することからなる群から選択される少なくとも１つの操作を実行することによって、被検試料中にてタンパク質分解酵素を形成する、その観察のための条件を与えるステップと、
決定された瞬間に、前記基質から切断された前記試料中の標識シグナルの空間分布を記録するステップと、
前記媒体の成分に対する前記媒体中での前記標識の結合を考慮しつつ、「反応−拡散−対流」タイプの逆問題を解くことによって、前記標識シグナルの一組の空間分布から、決められた時間に対するタンパク質分解酵素（凝固因子）活性の時空間分布を求めるステップと、
前記タンパク質分解酵素の前記時空間分布のずれによって、止血系の状態を推定するステップと、を含む方法。
【請求項２２】
明確に規定された瞬間に、前記被検試料をさらに照明し、暗視野法によって、前記被検媒体試料中にて形成されるフィブリン血栓からの光散乱の空間分布を記録する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
調べる対象となる凝固因子は、トロンビン、第Ｘａ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＸＩａ因子、プラスミンからなる群から選択されるタンパク質分解酵素である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料中における凝固系の状態を評価し、診断を行うために、トロンビンまたはフィブリンの時空間分布の少なくとも１つのパラメーターを使用し、前記パラメーターは、トロンビン波の空間伝播速度、前記試料中におけるトロンビンの最大濃度、前記波の動いている部分におけるトロンビンの最大濃度、トロンビン濃度の増加率、空間に従ったトロンビン濃度の積分、時間および空間に従ったトロンビン濃度の積分、フィブリンフロントの空間伝播速度（光散乱）、前記試料中における最大フィブリン濃度（光散乱量）からなる群から群から選択されるものとする、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学および生物学に関し、特に、診断目的や研究調査目的で、血液およびその成分の凝固特性を求めるために使用可能であるだけでなく、バイオテクノロジー、薬理学ならびに基本的な生物学的研究調査においても使用可能である。
【背景技術】
【０００２】
現在、複雑な生命システムの研究と、これらの生命システムで生じる空間的異質性のあるプロセスのダイナミクスの研究に、大きな課題が存在する。このようなプロセスとしては、特に、血液凝固、補体、アポトーシス、消化、線溶があり、そこではタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）が重要な役割を果たしている。
【０００３】
タンパク質分解酵素の濃度は、その値が経時的に変化せず分析対象となる試料のすべての箇所で同一であれば、特異的蛍光基質または発色基質を用いて測定可能である。現在、濃度の経時的変化を測定する方法がある。この方法は、基礎研究や、相応の生命システムにおける機能不全の診断法に用いられている。血液凝固障害の特定には、今のところ、血漿中のトロンビン生成を調べる試験が用いられている。そのことが、Hemker HC, Wielders S., Kessels H., Beguin S., Continuous registration of thrombin generation in plasma, its use for the determination of the thrombin potential, J Thromb Haemost. 1993, Oct. 18, 70 (4):617-24の基本論文に開示されていた。この試験は、それまでの凝固試験に比して多くの利点を実証したが、空間的には均一である。すなわち、均一な環境を研究している。これは、後述する、生物における状況には対応していない。
【０００４】
血液凝固調節の空間概念を、図１に概略的に示す。凝固は、膜貫通タンパク質（組織因子、凝固因子（左）である非酵素補因子）を発現する細胞によって活性化され、血漿の奥深くまで伝播する。トロンビンの生成は、プロトロンビナーゼの制限成分である活性化Ｘ因子（第Ｘａ因子、セリンプロテアーゼ）によって調節される。活性化因子（初期相）付近での凝固は、第ＶＩＩａ因子のセリンプロテアーゼと組織因子との複合体である外因性テナーゼによる第Ｘａ因子の産生だけによって決まる。しかしながら、第Ｘａ因子は急速に阻害されてしまい、活性化因子から遠く離れて拡散することができない。このため、第Ｘａ因子は、凝固伝播相では内因性テナーゼによって形成される。一方、内因性テナーゼの制限成分である凝固因子ＩＸａは、外因性テナーゼによって産生される。第Ｘａ因子とは対照的に、凝固因子ＩＸａは阻害速度が遅いため、遠くまで拡散する。血栓がさらに増えると、第ＸＩａ因子によって第ＩＸａ因子が追加で産生され、これによって、ポジティブフィードバックループでトロンビンが産生される。血栓の形成は、トロンボモジュリンの作用によって停止する。すなわち、ネガティブフィードバックループでプロテインＣが活性化され、これによって第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子が機能しなくなり、トロンビンの伝播が停止する（Panteleev M.A., Ovanesov M.V., Kireev D.A., Shibeko A.M, Sinauridze E.I., Ananyeva N.M., Butylin A.A., Saenko E. L., and Ataullakhanov F.I., Spatial Propagation and Localization of Blood Coagulation Are Regulated by Intrinsic and Protein C Pathways, Respectively, Biophys J. 2006 Mar 1; 90(5):1489-500を参照のこと）。この概念については、細かい部分をいくつか修正できるのは事実であるが、拡散プロセスの重要な役割と、凝固の空間的異質性については議論の余地がない（Hoffman M., Monroe DM 3rd, A cell based model of hemostasis, Thromb Haemost. 2001 Jun; 85(6):958-65）。
【０００５】
トロンビンは、血液凝固系の重要な酵素である。これは、主な反応すなわち、フィブリノーゲンからフィブリンへの変換を触媒する。また、凝固因子Ｖ、ＶＩＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、ＸＩＩＩ、プロテインＣ、血小板、トロンビン活性化線溶阻害因子を活性化するのも、トロンビンである。凝固時、産生されるトロンビンの量は、他のプロテアーゼの産生量と比べると１０〜１００倍であるため、その検出が容易になる。
【０００６】
トロンビンによって触媒される反応では、フィブリノーゲンがフィブリンに変換される。これは、血漿を重合させ、ひいてはゲル化する反応である。
【０００７】
血液凝固についての研究は、実用面で、非常に興味深い。なぜなら、こうした研究は特定の疾患の診断を可能にするだけでなく、血液凝固パラメーターに影響する薬剤の活性を評価することも、できるようにするからである。
【０００８】
発色基質が登場し、その後、蛍光発生基質が登場したことで、凝固に関する研究が加速した。このような合成基質は、タンパク質分解酵素によって認識され、切断される分子である。切断によって、「標識」とも呼ばれるシグナリング分子の基質からの切り離しが起こる。この標識は、溶液の吸光度を変化させる（発色（chromogenic）基質または発色（coloring）基質）か、光線照射時に蛍光を発することができる（蛍光発生基質）か、外部からの励起がなくても自然発光できる（化学発光標識）。トロンビンの基質を血漿に直接添加し、凝固時に現れるシグナル（吸光度または光強度）を記録することが可能である。シグナルの増加率は、トロンビンの濃度に比例する。時間に対するトロンビン依存性は、濃度がわかっているトロンビンまたは別の検量用試料（たとえば、トロンビンとα２−マクログロブリンとの複合体など）の分析下にて、緩衝液または血漿に添加して得られる検量線を使用して、基質の切断速度からトロンビン濃度を単純に微分および計算し、時間に対するシグナルの実験での関係から得られる。
【０００９】
血液凝固パラメーターをin vitroで決定するためのさまざまな方法および装置が、背景技術から知られている。しかしながら、既知の方法および装置はいずれも、通常は、血液または血漿の試料が活性化因子と均一に混合された均一な系で作業するよう設計されている。その点において、これらの系と、複雑かつ不均一な環境であるin vivoの系とは実質的に区別される。
【００１０】
周知のモデルでは、凝固プロセスのin vitro系での条件は、生きた生物で血栓が形成される条件とは基本的に異なっている。人間や動物の循環系において、血栓は血漿全体で形成されるのではなく、非常に局所的すなわち、損傷した血管壁付近の狭いエリアで形成されることが知られている。体内での凝固は、均一ではない。血栓の形成は、空間内で起こる。これは、損傷した血管壁で外因性テナーゼによって誘発され、血漿の大部分で活性化された血小板上のプロトロンビナーゼが関わることで伝播し、健康な血管内皮のトロンボモジュリンが関与する反応によって阻害される。この場合、凝固因子は少量の血漿中に自然に分散され、その中で血栓が形成される。これは、外傷部位で血餅を形成することで血流の完全性を保つという、止血系の基本的な防御機構を反映している。これらのプロセスを、均一な媒体で実施される方法を使って適切に研究することはできない。
【００１１】
このように、現時点では、in vitroでの血液凝固の実験モデリングの問題がある。というのは、血管内で血餅が直接凝集する空間状況を一層完全にシミュレートすると望ましいからである。血栓症および止血に関する基礎研究と、特定用途向けの診断および薬理学上のタスクの両方に、課題が存在する。
【００１２】
ある時間および空間内すなわち、一定量の被検試料の異なる点におけるタンパク質分解酵素の濃度の変化を求める上での課題は、依然として未解決のままである。
【００１３】
最近では、凝固因子の拡散と空間的異質性を考慮できる装置が用いられている。このような装置では、再石灰化血漿を入れたキュベットで、凝固が起こる。活性化因子は、凝固活性化因子（たとえば、組織因子など）が固定化された表面である。凝固は、活性化因子と血漿との接触時に開始された後、血漿の奥へと伝播する。これは、成長していく血栓からの光の散乱で観察できる。
【００１４】
背景技術から、本発明者等は、血液およびその成分の凝固特性を調べるための装置を知っている（ロシア特許第２３９５８１２号、特許分類Ｇ０１Ｎ３３／４９、２０１０年７月２７日公開）。この装置は、キュベットを収容する、サーモスタット制御されたチャンバと、キュベットの内容物と活性化因子付近にできる血栓とに光をあてるためのＬＥＤと、成長していく血栓を記録するためのデジタルカメラと、得られたデータを処理するためのコンピューターと、を備える。このキュベットには、トロンボプラスチン（凝固組織因子）などの被検血漿試料および凝固活性化因子が、当該キュベットに装着されるインサートに塗布された状態で含まれる。
【００１５】
この装置を用いることで、凝固系の最終産物であるフィブリン血栓の形成過程だけを記録する方法を実施できる。
【００１６】
また、本発明者は、空間フィブリン血栓形成を監視するための方法および装置も知っている（国際出願第ＰＣＴ／ＣＨ２００７／０００５４３号、特許分類Ｇ０１Ｎ３３／４９、２００９年５月７日公開、公開番号ＷＯ  ２００９／０５５９４０）。
【００１７】
この装置は、測光分析に用いられるキュベット（チャンバを含む）と、インサートおよび活性化因子と、前記キュベットが配置されるサーモスタットと、を備える。凝固活性化因子は、インサートの底縁に位置している。凝固活性化因子は、組織因子などの生理的活性化因子であるか、ガラスなどの非生理的活性化因子である。キュベットは、透光性ポリスチレンで作製される。
【００１８】
この装置は、フィブリン血栓の形成および／または溶解をin vitroで監視できるようにするものであり、以下のステップを含む。
キュベット内に、ウェルの数に応じて１つまたは２つ以上の血漿試料を入れ、
インサートを活性化因子とともにキュベットに挿入し、血漿を凝固活性化因子と接触させ（血栓形成の場合）、
フィブリン血栓の成長を時間と距離の関数として記録するか、あるいは、
キュベット内に、１つまたは２つ以上のフィブリン血栓を含む１つまたは２つ以上の血漿試料を入れ、
血漿を線溶活性化因子と接触させ（血栓溶解の場合）、
フィブリン血栓の溶解を時間と距離の関数として記録する。
空間フィブリン血栓形成を監視するための方法および装置の主な利点としては、少量の血漿しか必要ないということがあげられる。（３００μｌから最大で１５００μｌではない、すなわち、過去に報告のある同様の他の系を用いる場合の７５分の１かつ標準的な凝固アッセイに必要な最小血漿量の５分の１である）わずか２０μｌという少ない量で、信頼できる高分解能の結果を得ることが可能である。この装置を用いることで、凝固系の最終産物であるフィブリン血栓の形成過程だけを記録する方法を実施できる。
【００１９】
上述した装置および方法の欠点は、被検試料が加熱されると、対応領域内でキュベット内に気泡が形成されることである。これによって、フィブリン血栓からの光散乱シグナルが歪んでしまう。
【００２０】
赤色光線など、波長が１つしかない光源では、蛍光物質の時空間分布を研究できない。
【００２１】
さらに、上述した装置および方法では、空間フィブリン血栓の成長過程を調節する、ＩＩａ、Ｘａ、ＶＩＩａ、ＸＩａなどの別々の凝固因子の空間分布と形成過程を記録できる可能性は得られない。
【００２２】
本方法および装置と最も密接に関連しているのは、Kondratovich A.Y., Pohilko A.V. and Ataullahanov F.I., Spatiotemporal Dynamics of Contact Activation Factors of Blood Coagulation, Biochim Biophys Acta. 2002 Jan 15; 1569 (1-3):86-104）の文献に開示されている装置および方法である。
【００２３】
上述した方法を実施するために、乏血小板血漿を使用する。研究対象となる血漿試料の第ＸＩａ因子およびカリクレインの分布を、これらの因子に特異的な蛍光発生基質の切断産物である７−アミノ−４−メチル−クマリン（ＡＭＣ）のインジゴ発光を記録することで求める。
【００２４】
測定前に、各被検血漿試料に基質を加え、３７℃で試料を攪拌した。媒体のｐＨについては、この温度で７．４に維持した。
【００２５】
図２は、この方法を実施するのに用いられる装置を概略的に示している。この装置は、研究対象となる血漿試料２の入ったポリスチレンディッシュ１を有する。血漿２に、基質を加える。ガラス毛細管の先端５を、凝固活性化因子として使用した。また、この装置は、水銀ランプである光源６と、サーモスタット７と、ガラスフィルター８と、半透鏡９と、デジタルカメラ１０と、蛍光を発するプラスチックラベル１２も含む。この装置を、コンピューター１１にプラグ接続した。
【００２６】
二次元の（平らな）媒体すなわち、攪拌していない血漿の薄層において、凝固因子の活性化を研究した。ディッシュ１を３７℃のサーモスタット７に移し、毛細管の端５が血漿中に浸るように、活性化因子をすみやかに下げた。
【００２７】
ガラスとの接触によって活性化される凝固因子は、ＡＭＣを形成しつつ、基質を切断した。ＡＭＣの蛍光を、以下のようにして記録した。血漿試料に、光源６から出て半透鏡９で反射した光を照射した。フィルター８が、光源スペクトルの可視部分を遮断した。半透鏡の後ろに装着されたデジタルカメラ１０で、ＡＭＣ蛍光を記録した。記録された視野の測定値は、９．０×６．５ｍｍであった。カメラのＲＧＢ出力信号の青色チャネルが、ＡＭＣ蛍光の全範囲におよんでいた。画像データを連続的にコンピューター１１に送り、そのモニター上に表示し、指定の間隔で保存した。蛍光を発するプラスチック片１２を、その画像が常にカメラの視野に入るようにしてサーモスタット７の下に固定した。これを、較正目的ならびに、光のばらつきを考慮に入れる目的で使用した。
【００２８】
画像を分析する際、活性化因子の中心から始まる放射状の線を選択した。この線に沿ったＡＭＣ濃度の時空間分布を、専用のソフトウェアで求め（図３）、これに基づいて、凝固因子濃度の時空間分布を再現した。
【００２９】
この方法の欠点として、接触している活性化因子（特に第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン）しか測定できず、かつ、これらの因子がシグナルにどのように影響するかの度合いを区別しにくく、凝固プロセスすなわちフィブリン血栓の形成の空間的動態を測定できないことがあげられる。
【００３０】
この装置の欠点としては、高効率の研究を行う際に用いられるディッシュが不便である、水銀ランプでの不安定な照明を使用するが、これでは厳密な測定を行うことができない、被検試料の加熱時に、プロセスを記録するエリアで気泡が形成される、蛍光シグナルが歪むことがあげられる。
【００３１】
この方法では、生理的な特性がin vivo系と似ているin vitro系をモデリングすることはできず、血液凝固系における障害の一層正確な診断をすることもできない。
【００３２】
さらに、上記の方法を用いると、フィブリン血栓が成長する過程で凝固因子（まず第一にトロンビン）の空間的動態の適切に調べることができず、不均一系における血液凝固プロセスの異なる相で凝固因子の役割を評価する機会が得られない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３３】
よって、血液および血液成分の凝固特性を、さらに良く求めるための既存の方法および装置を改善することには、明らかに需要がある。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
本発明の目的は、フィブリン血栓が成長する過程における凝固因子の空間的動態を調べ、不均一系における血液凝固プロセスの異なる相での凝固因子の役割を評価することにある。これは、いくつかの疾患を診断し、血液凝固パラメーターに影響する薬剤の活性を評価するのに利用できる。
【００３５】
本明細書にて提案する解決策を実現することで得られる技術的な成果は、血液凝固における血漿部分および血小板部分の障害に対する、方法の感受性を高めることである。
この目的は、不均一系におけるタンパク質分解酵素活性の時空間分布を求めるための方法であって、
被検媒体試料中に分散された、血漿、全血、水、リンパ液、コロイド溶液、晶質液またはゲル、タンパク質分解酵素またはそのチモーゲンからなる群から選択される被検媒体の試料を含有するin vitro系を提供するステップと、
タンパク質分解酵素による蛍光発生基質の切断時に、標識をさらに放出しつつ前記基質をin vitro系に浸漬するステップと、
あらかじめ定められた時点で、被検媒体試料を照明して標識の蛍光を励起させるステップと、
あらかじめ定められた時点で、前記照明と同時に、試料中における標識の蛍光の空間分布を記録するステップと、
研究対象となる媒体の成分に対する標識の結合を考慮しつつ、「反応−拡散−対流」タイプの逆問題を解くことによって、特定の瞬間に対する標識蛍光の一組の空間分布から、タンパク質分解酵素活性の時空間分布を得るステップと、を含む方法を提供することによって達成される。
【００３６】
また、この目的は、タンパク質分解酵素活性の時空間分布を求めるための第２変形例の方法であって、
被検媒体試料中に分散された、血漿、全血、水、リンパ液、コロイド溶液、晶質液またはゲル、タンパク質分解酵素またはそのチモーゲンからなる群から選択される被検媒体の試料を含有するin vitro系を提供するステップと、
タンパク質分解酵素による発色基質の切断時に、標識をさらに放出しつつ前記基質をin vitro系に浸漬するステップと、
あらかじめ定められた時点で、前記被検媒体試料に、標識による光の吸収が相当量になるような波長の光を照射するステップと、
あらかじめ定められた時点で、媒体中での標識による光吸収の空間分布を記録するステップと、
媒体の成分に対する媒体中での標識の結合を考慮しつつ、「反応−拡散−対流」タイプの逆問題を解くことによって、特定の瞬間に対する標識による光吸収の一組の空間分布から、タンパク質分解酵素活性の時空間分布を求める（規定または計算する）ステップと、を含む方法を提供することによって達成される。
【００３７】
また、この目的は、タンパク質分解酵素活性の時空間分布を求めるための第３変形例の方法であって、
被検媒体試料中に分散された、血漿、全血、水、リンパ液、コロイド溶液、晶質液またはゲル、タンパク質分解酵素またはそのチモーゲンからなる群から選択される被検媒体の試料を含有するin vitro系を提供するステップと、
タンパク質分解酵素による発光基質の切断時に、標識をさらに放出しつつ前記基質をin vitro系に浸漬するステップと、
あらかじめ定められた時点で、試料中における標識の発光シグナルの空間分布を記録するステップと、
媒体の成分に対する媒体中での標識の結合を考慮しつつ、「反応−拡散−対流」タイプの逆問題を解くことによって、特定の瞬間に対する標識発光の一組の空間分布から、タンパク質分解酵素活性の時空間分布を求める（規定または計算する）ステップと、を含む方法を提供することによって達成される。
【００３８】
また、これは、タンパク質分解酵素活性の時空間分布の変化を引き起こす活性化剤を、in vitro系にさらに加えることによっても達成される。
【００３９】
また、これは、表面に固定化された組織因子、可溶性の組織因子、組織型プラスミノーゲン活性化因子、組織因子発現能のある細胞、体組織の試料、ガラスまたはプラスチックからなる群から選択される活性化剤を選択することによっても達成される。
【００４０】
また、これは、特定の瞬間に、調べる対象となる被検媒体試料をさらに照明し、光散乱の空間分布、試料中での光透過の空間分布またはこれらの組み合わせからなる群から選択される被検試料の空間パラメーターを登録することによっても達成される。
【００４１】
また、これは、被検媒体試料に溶液状で基質を添加することによっても達成される。
【００４２】
また、被検媒体試料を加える前にin vitro系の壁面にフリーズドライ状で基質を適用することも達成される。
【００４３】
また、前記照明と標識蛍光の変化の記録を、１分間に１〜１８００回の頻度で実施することも達成される。
【００４４】
また、前記試料が、全血あるいは、多血小板血漿、無血小板血漿、乏血小板血漿からなる群から選択される血漿であることも達成される。
【００４５】
また、この方法のすべてのステップを、好ましくは約３７℃に制御された、被検試料全量に対して安定する温度で実施することも達成される。
【００４６】
また、この方法が、好ましくは、大気圧に対して上昇される被検試料全量で安定した圧力を必要とすることも達成される。
【００４７】
好ましくは、試料のｐＨを７．２〜７．４の範囲で安定させる。
【００４８】
被検媒体中の研究対象となるタンパク質分解酵素は、生化学的プロセスの結果としてチモーゲンから得られるものであってもよい。また、これは、系内の生化学的プロセスの結果として、被検媒体中で徐々に分解されるものであってもよい。
【００４９】
標識および形成される血栓の空間分布は、特定の瞬間に可視化される。
【００５０】
被検媒体試料からの光散乱は、暗視野法を用いて登録される。
【００５１】
標識蛍光は、蛍光顕微鏡法を用いて登録される。
【００５２】
特定の瞬間に、光学系の焦点を定め直し、照明／照射処理系の焦点も定め直す共焦点顕微鏡法も使用して、被検媒体における光散乱の分布と標識蛍光の分布を実行する。
【００５３】
目的は、不均一系におけるタンパク質分解酵素活性の時空間分布を求めるための装置であって、
媒体の試料中に分散された、血漿、全血、水、リンパ液、コロイド溶液、晶質液またはゲル、タンパク質分解酵素またはそのチモーゲンからなる群から選択される被検媒体の試料と、蛍光発生基質または発色基質または発光基質と、を入れるためのキュベットを含むin vitro系と、
あらかじめ定められた時点で、被検媒体の試料を照明するための手段と、
あらかじめ定められた時点で、タンパク質分解酵素による上述した基質の切断時に形成される標識のシグナルの空間分布を記録するための手段と、
前記照明手段／記録手段を制御するための手段と、を備える装置を提供することによっても達成される。
【００５４】
これは、活性化因子をキュベットに配置および挿入し、タンパク質分解酵素活性の時空間分布の変化を開始させる手段を含んでいることは、もちろんである。
【００５５】
これは、被検媒体試料中を、好ましくは３７℃の安定した温度にする手段を含んでいることは、もちろんである。
【００５６】
これは、被検媒体試料全量の中を、好ましくは大気圧に対して上昇される安定した圧力にする手段を含んでいることは、もちろんである。
【００５７】
これは、暗視野法に従って、被検媒体試料に、可視光線を照射する手段を含んでいることは、もちろんである。
【００５８】
照明手段および記録手段を制御する手段は、オン／オフする瞬間、照明強度、照明手段と記録手段との同期を調節する可能性を与えることは、もちろんである。
【００５９】
これは、経時的なタンパク質分解酵素活性の空間分布を計算する可能性を与えるコンピューター計算装置に接続されるか、前記装置をオンにすることは、もちろんである。
【００６０】
この目的は、in vitroでの不均一系におけるタンパク質分解酵素（凝固因子）の活性の時空間分布の記録をもとに、止血系における障害を診断するための方法であって、
試料として、全血、無血小板血漿、乏血小板血漿、多血小板血漿、抗凝血薬を加えた血液、抗凝血薬を加えた血漿からなる群から選択される血液成分を使用するステップと、
被検試料を、表面に固定化された血液凝固活性化因子と接触させること、研究対象となるタンパク質分解酵素によって切断される基質を添加すること、カルシウム塩を添加すること、接触凝固活性化の阻害因子を添加することからなる群から選択される少なくとも１つの操作を実行することによって、被検試料中にてタンパク質分解酵素を形成し、これを観察できる条件を与えるステップと、
決定された瞬間に、試料中にて基質から切断された標識のシグナルの空間分布を記録するステップと、
媒体の成分に対する媒体中での標識の結合を考慮しつつ、「反応−拡散−対流」タイプの逆問題を解くことによって、特定の瞬間に対する標識シグナルの一組の空間分布から、タンパク質分解酵素（凝固因子）の活性の時空間分布を求めるステップと、
タンパク質分解酵素の時空間分布のずれによって、止血系の状態を推定するステップと、を含む方法を提供することで、さらに達成される。
【００６１】
明確に限定された瞬間に、被検試料をさらに照明し、暗視野法を用いて被検媒体試料中にて形成されるフィブリン血栓からの光散乱の空間分布を記録することにもよる。
【００６２】
凝固因子として、トロンビン、第Ｘａ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＸＩａ因子、プラスミンからなる群から選択されるタンパク質分解酵素を調べることにもよる。
【００６３】
試料中における凝固系の状態を評価し、診断を行うために、トロンビンまたはフィブリンの時空間分布の少なくとも１つのパラメーターを使用することにもよる。このパラメーターは、トロンビン波の空間伝播速度、試料中におけるトロンビンの最大濃度、波の動いている部分におけるトロンビンの最大濃度、トロンビン濃度の増加率、空間に従ったトロンビン濃度の積分、時間および空間に従ったトロンビン濃度の積分、フィブリンフロントの空間伝播速度（光散乱）、試料中における最大フィブリン濃度（光散乱量）からなる群から選択されるものでなければならない。
【００６４】
本明細書にて提案される方法を用いると、生理的特性がin vivo系に近いin vitro系でのモデリングができるようになるだけでなく、血液凝固系の障害を一層正確に診断できるようになる。
【００６５】
得られる時空間データアレイすなわち、タンパク質分解酵素活性の時空間分布を使用し、各点において、空間および時間内のタンパク質分解酵素活性の変化率をコンピューターで計算する。これに従うと、以下のことが可能になる。
試料中における血液凝固系の状態について判断すること
健常なドナーと比較することで、患者の凝固系の状態についての結論を出すこと
治療効率を推定すること
医薬品個々の最適用量を選択すること
医薬品の作用機序を求めること
医薬品の開発過程で化学物質をスクリーニングすること
血液凝固系の動作のメカニズムに関する情報を取得すること
血液系障害の病原および病因について研究すること
フィブリン血栓が成長する過程における凝固因子の空間的動態を研究すること
不均一系における異なる血液凝固相における凝固因子の役割についての評価を可能にすること。
【００６６】
本方法は、初期段階において、本方法以外のすべての試験で明らかにできない場合に、凝固亢進状態の信頼できる診断を保証するものである。医療実務では初めて、さまざまな病因の凝固亢進症候群、出血、血栓症、心臓麻痺および心発作を含む広範囲にわたる病態に対して患者の素因を高精度で検出し、疾患の病原を研究し、昔からある医薬品や新世代の医薬品（抗血友病薬を含む）をモニタリングすることを可能にしている。
【００６７】
本装置を用いると、本発明による方法を実現し、不均一系におけるタンパク質分解酵素活性の時空間分布を一層正確に求めることができる。
【００６８】
添付の図面を参照した本発明の好ましい実施形態の説明によって、についてさらに示す。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】血液凝固調節の空間概念を概略的に示す。
【図２】凝固因子の空間的動態を求めるための既知の装置の概略図である。
【図３】凝固している第ＸＩａ因子の時空間分布の研究で得られた、距離および時間に対するＡＭＣ濃度の典型的な依存性を示す。凝固活性化因子は、座標原点に位置している。
【図４】本発明による、不均一系におけるタンパク質分解酵素活性の時空間分布を求めるための装置の概略図である。
【図５ａ】フルオロフォアを用いる場合の、フィブリン血栓形成の空間的動態を可視化したものである。
【図５ｂ】本発明による、フィブリン血栓形成の空間的動態を可視化したものである。
【図６ａ】本発明による装置の補助で得られたin vitro系における、フィブリン血栓形成の時空間動態の例を示す。凝固活性化因子は、座標原点に位置している。
【図６ａ】本発明による装置の補助で得られたin vitro系における、タンパク質分解酵素（トロンビン）の濃度を示す。凝固活性化因子は、座標原点に位置している。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
方法の第１の実施形態
本発明によれば、不均一系におけるタンパク質分解酵素活性の時空間分布を求めるための方法が提供される。この方法は、以下のようにして実現される。
【００７１】
被検媒体試料中に分散された、in vitro系を使用して、血漿、全血、水、リンパ液、コロイド溶液、晶質液またはゲル、タンパク質分解酵素またはそのチモーゲンからなる群から選択される被検媒体の試料を入れる。
【００７２】
このin vitro系に蛍光発生基質を浸漬する。
【００７３】
タンパク質分解酵素と蛍光発生基質との反応時、基質が切断され、標識すなわちフルオロフォアがそこから放出される。
【００７４】
あらかじめ定められた時点で、励起光を被検媒体試料に照射して、標識の蛍光を励起させる。あらかじめ定められた時点で、照明と同時に、試料中における標識蛍光の空間分布を記録する。
【００７５】
試料中における標識シグナルの空間分布の記録だけでなく、あらかじめ定められた時点で、被検媒体試料を照明し、光散乱の空間分布、試料中での光透過の空間分布またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、試料の光学特性を記録することが可能である。これと一緒に、フィブリンの空間分布を記録する。
【００７６】
媒体の成分に対する標識の結合度合いを考慮しつつ、「反応−拡散−対流」タイプの逆問題を解くことによって、標識蛍光の一組の空間分布から、タンパク質分解酵素活性の時空間分布を求める。
【００７７】
標識（フルオロフォア）の励起スペクトルに応じて励起波長を選択する。照明波長については、信号対雑音比が最大になるよう選択する。特に凝固系の研究では、信号はフィブリン血栓からの光散乱であり、雑音はin vitro系の血漿および他の要素の光散乱である。
【００７８】
実験では、タンパク質分解酵素活性の時空間分布の変化を引き起こすために、in vitro系に活性化剤を加えてもよい。活性化剤は、表面に固定化された組織因子、可溶性の組織因子、組織型プラスミノーゲン活性化因子、組織因子発現能のある細胞、体組織の試料、ガラスまたはプラスチックからなる群から選択される作用剤であってもよい。
【００７９】
一実施形態では、分析下のタンパク質分解酵素は、生化学的プロセスの結果として、そのチモーゲンから、被検媒体で直接形成される。別の実施形態では、分析対象となるタンパク質分解酵素は、媒体中で生じる生化学的プロセスによって、被検媒体中で徐々に分解される。
【００８０】
試料中における標識の蛍光と光散乱の空間分布については、あらかじめ定められた時点で、光学系の焦点を定め直し、照明／照射処理系の焦点も定め直す共焦点顕微鏡法によって記録してもよいし、蛍光顕微鏡によって記録してもよい。
【００８１】
標識および得られる血栓の空間分布を、あらかじめ定められた時点で、さらに可視化する。
【００８２】
暗視野技術を使用して、被検媒体試料からの光散乱を記録する。
【００８３】
方法の第２の実施形態
第２の実施形態は、基質が発色基質であるという点で、第１の実施形態とは異なる。
【００８４】
タンパク質分解酵素と発色基質との反応時、基質が切断され、標識すなわち発色団がそこから放出される。この系に、光が発色団によって実質的に吸収される波長の光をあてる。被検媒体の色の変化の空間分布を、あらかじめ定められた時点で記録する。試料の色の変化の空間分布から、試料中における発色団の空間分布を求める。媒体の成分に対する媒体中での発色団の結合を考慮しつつ、「反応−拡散−対流」タイプの逆問題を解くことによって、発色団の分布から、タンパク質分解酵素活性の時空間分布を求める。
【００８５】
あらかじめ定められた時点で、被検媒体の試料に光をあて、光散乱の空間分布、試料中での光透過の空間分布またはこれらの組み合わせからなる群から選択される試料の光学特性を、写真用カメラによって記録する。
【００８６】
方法の第３の実施形態
この方法の第３の実施形態は、基質が、タンパク質分解酵素によって反応時に切断されて化学発光産物を放出する基質であるという点で、第１の実施形態とは異なる。あらかじめ定められた時点で、試料中における発光強度の空間分布を記録する。媒体の成分に対する媒体中での化学発光産物の結合を考慮しつつ、「反応−拡散−対流」タイプの逆問題を解くことによって、発光分布から、タンパク質分解酵素活性の時空間分布を求める。
【００８７】
あらかじめ定められた時点で、被検媒体試料に光をあて、光散乱の空間分布、試料中での光透過の空間分布またはこれらの組み合わせからなる群から選択される被検試料の光学特性を、写真用カメラによって記録する。
【００８８】
この方法のすべての実施形態において、in vitro系の全量において、好ましくは約３７℃の均一な温度を維持する。この目的で、系を熱的に調節する。被検試料中での気泡の形成を避けるために、in vitro系の圧力を、好ましくは大気圧よりも高いレベルに維持する。試料のｐＨを、７．２〜７．４の範囲に安定させる。
【００８９】
基質は、溶液状で被検媒体の試料に加えてもよい。また、被検媒体試料を入れる前にin vitro系の壁面にフリーズドライ状で基質を適用することも可能である。
【００９０】
照明と標識シグナルの記録は、１分間に１〜１８００回の頻度で実施する。試料の温度を安定させた後で、照明を実施する。
【００９１】
被検血漿試料、接触相阻害因子、塩化カルシウム、被検凝固因子に特異的な基質の混合物を調製する。この混合物を、研究のすべてのバリエーションで使用する。
【００９２】
試料は、特に、全血あるいは、多血小板血漿、無血小板血漿、乏血小板血漿からなる群から選択される血漿である。
【００９３】
分析される凝固因子は、特に、トロンビンである。
【００９４】
本発明によれば、in vitroでの不均一系におけるタンパク質分解酵素（凝固因子）活性の時空間分布の変化に基づいて、止血系における障害を診断するための方法であって、試料として、全血、無血小板血漿、乏血小板血漿、多血小板血漿、抗凝血薬を加えた血液、抗凝血薬を加えた血漿からなる群から選択される血液成分を使用する必要のある方法が、提供される。
【００９５】
被検試料を、表面に固定化された血液凝固活性化因子と接触させること、研究対象となるタンパク質分解酵素によって切断される基質を添加すること、カルシウム塩を添加すること、接触凝固活性化の阻害因子を添加することからなる群から選択される少なくとも１つの操作を実行することによって、被検試料においてタンパク質分解酵素を形成し、これを観察するための条件が与えられる。
【００９６】
決められた瞬間に、基質から切断された試料中の標識のシグナルの空間分布を記録する。
【００９７】
試料の温度を、２５〜４５℃の範囲で、１℃の精度で安定して維持する。試料のｐＨを、７．２〜７．４の範囲に安定させる。
【００９８】
媒体の成分に対する媒体中での標識の結合を考慮しつつ、「反応−拡散−対流」タイプの逆問題を解くことによって、決められた時間に対する標識シグナルの一組の空間分布から、タンパク質分解酵素（凝固因子）の活性の時空間分布を求める。これに基づいて、経時的な凝固因子分布の時空間分布を計算する。
【００９９】
タンパク質分解酵素の時空間分布のずれによって、止血系の状態を推定する。
【０１００】
また、明確に限定された瞬間に、被検試料を照明し、暗視野法を用いて被検媒体試料中にて形成されるフィブリン血栓からの光散乱の空間分布を記録して、形成されたフィブリン血栓を可視化する。
【０１０１】
調べる対象となる凝固因子は、トロンビン、第Ｘａ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＸＩａ因子、プラスミンからなる群から選択されるタンパク質分解酵素である。
【０１０２】
試料中における凝固系の状態を評価し、診断を行うために、トロンビンまたはフィブリンの時空間分布の少なくとも１つのパラメーターを使用する。このパラメーターは、トロンビン波の空間伝播速度、試料中におけるトロンビンの最大濃度、波の動いている部分におけるトロンビンの最大濃度、トロンビン濃度の増加率、空間に従ったトロンビン濃度の積分、時間および空間に従ったトロンビン濃度の積分、フィブリンフロントの空間伝播速度（光散乱）、試料中における最大フィブリン濃度（光散乱量）からなる群から選択されるものでなければならない。
【０１０３】
不均一系におけるタンパク質分解酵素活性の時空間分布を求める前記方法（その実行のバリエーション）を実現するための装置（device）（装置（apparatus））は、被検媒体試料中に分散された、血漿、全血、水、ゲルおよびリンパ液、コロイド溶液、晶質液またはゲル、タンパク質分解酵素またはそのチモーゲンからなる群から選択される被検媒体の試料２１を入れるためのキュベット２０（図４）を含むin vitro系を備える。キュベット２０は、特定の幾何学的寸法と形状を有し、断面は矩形で、プラスチック製である。
【０１０４】
対流を減らし（層が薄くなればなるほど、液体運動の減衰が速まる）、高速加熱を保証するには、試料層の厚さを最小にする必要がある。シグナル強度を増すには、試料層の厚さを最大にする必要がある。最適な厚さは、０．１〜１．５ｍｍの間である。
【０１０５】
この装置は、タンパク質分解酵素活性の時空間分布の変化を開始させるプロセス活性化因子２３をキュベットに配置および挿入するよう設計された活性化手段２２をさらに含む。
【０１０６】
この装置（device）（装置（apparatus））は、in vitro系において均一な温度を保証するための手段２４をさらに含む。この装置では、水温制御および気温制御を含む異なるタイプの温度制御が可能であり、ゲルを温度制御にも利用できるが、この場合、媒体が光線に対して透明でなければならないことを考慮すべきである。本明細書に記載の実施形態では、水温制御を用いる。温度制御時、温度を１℃の精度で２５〜４５℃の範囲内に維持する。また、この装置は、in vitro系の圧力を維持するための手段（図示せず）も含む。前記手段は、被検試料媒体を囲む空間において一定の空気圧を維持するよう設計される（これは、均一な温度を維持するための手段２４と一緒に、温度・圧力制御ユニット２５を形成する）。この手段は、０．２から０．５ａｔｍの過剰圧力を維持する。これによって、分析下の試料中における気泡の形成が防止される。泡の形成は、試料に含まれる溶存気体の溶解性低下が原因である。通常、この現象は、試料の加熱と関連している。泡は、媒体を泡がない場合より生理的でなくする、すなわち、シミュレートしている条件からのずれと、酵素分布の計算という両方の観点で、局所的な歪みを引き起こす。
【０１０７】
この装置は、あらかじめ定められた時点で、試料に蛍光発生基質を加える場合は標識の蛍光を励起するための励起光線を被検媒体試料２１に照射し、試料に発色基質を加える場合は標識によってかなり吸収される波長の光を照射するための手段２６を含む。手段２６は、サーモスタット２４に設けられた窓を通して、キュベット２０の壁に垂直に光線を印加する。照明手段２６は、たとえばＵＶ  ＬＥＤなどのＵＶ源を含む。可視光を被検媒体試料にあてるための手段２７は、キュベット２０の壁との間に角度をなす光を与える。この装置は、光線をキュベットに送るためのミラー２８のみならず、蛍光シグナルを抽出するための励起フィルター２９および放射フィルター３０を含む。光学素子の放射は、試料の局所的な加熱を引き起こすべきではない。手段２６〜３０の組み合わせで、照明／光照射ユニット３１が形成される。
【０１０８】
この装置は、あらかじめ定められた時点で、被検媒体試料における標識蛍光強度／光散乱（または発色団標識による吸収）の空間分布を記録するためのユニット３２をさらに含む。記録ユニット３２は、試料の異なる深度から画像を得るための手段を含む。この手段は、光学素子の焦点を合わせるための光学系３３と、アパチャー（図示せず）とを含む。蛍光強度は、分析下にあるタンパク質分解酵素の活性に左右される。基質からの蛍光は、キュベット２０の壁に垂直に伝播し、この放射スペクトルに対しては透明なミラー２８を通過した後、放射フィルター３０を通過し、光学系３３を介して、デジタル写真用カメラであってもよい記録装置３４に入射する。
【０１０９】
この装置は、オン／オフ時間、照明／光照射の強度と時間、照明手段／光照射手段と記録手段（図示せず）の動作の同期を制御するプロセッサ（図示せず）などの照明／光照射オン／オフ制御手段を備える。
【０１１０】
コンピューター計算装置（図示せず）が、経時的なタンパク質分解酵素活性の空間分布を計算する。
【０１１１】
暗視野技術によって、形成されている／溶解されている血栓を可視化するための手段ならびに、標識（フルオロフォア／発色団）（図示せず）の形成／分解の空間画像を可視化するための手段も、制御手段に接続される。
【実施例】
【０１１２】
以下、装置の機能と不均一系におけるタンパク質分解酵素活性の時空間分布の定義方法について、網羅的ではない実施例で検討する。
【０１１３】
材料
以下の作用剤を使用した。ホスファチジルセリンおよびホスファチジルコリン、７−アミノ−４−メチル−クマリン（ＡＭＣ）、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、トウモロコシトリプシン阻害因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子試験、第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿、糖タンパク質ＩＩｂ−ＩＩＩａアンタゴニスト。
【０１１４】
採血および血漿調製
健常なドナーの新鮮なヒト血液から、正常な血漿の試料を得た。血液は、３．８％クエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中に、容量比９：１で採取した。血液を１６００ｇで１５分間遠心処理した後、上清を１００００ｇで５分間さらに遠心処理して、無血小板血漿を得た。次に、上清を凍結させ、−７０℃で保管した。各実験の前に、試料を水浴中にて解凍した。
【０１１５】
多血小板血漿を調製するために、血液を１００ｇで８分間遠心処理した。無血小板血漿とともに溶解することで、血小板の濃度を細胞２５０，０００個／μｌにした。ｐＨを安定させるために、血漿に２８ｍＭのＨｅｐｅｓを加えた（ｐＨ７．４）。
【０１１６】
多血小板血漿で実施したようにして、何種類かの凝固因子が欠乏した市販の血漿を解凍し、Ｈｅｐｅｓで処理してｐＨを安定させた。
【０１１７】
活性化因子の調製
上述したように、活性化因子すなわち、プラスチック表面に固定化された組織因子（ＴＦ）の単層を用いて、凝固を活性化した。活性化因子を＋４から＋８℃で保管した。
【０１１８】
実験
異なる被検媒体試料における空間血栓成長について検討する。
【０１１９】
Ａ）無血小板血漿における血栓の空間成長
上述したようにして調製した血漿に、たとえばトウモロコシトリプシン阻害因子などの阻害因子（０．２ｍｇ／ｍｌ）、０．１μＭの脂質ベシクル（モル比２０／８０のホスファチジルセリン／ホスファチジルコリン）を補った。トロンビンの形成を観察するために、基質Ｚ−ＧＧＲ−ＡＭＣ（８００μＭ）を加えた。試料を３７℃で１０分間インキュベートした後、カルシウム塩、特にＣａＣｌ2（２０ｍＭ）を加えた。調べる対象となる試料を実験用のキュベットに入れ、調製した血漿試料と接触させることで表面を組織因子で覆った活性化因子によって血栓の形成を開始した。
【０１２０】
実験は、特別に設計したビデオ顕微鏡系を用いて行った。顕微鏡系では、空間分布またはフィブリン血栓の成長とタンパク質分解酵素、特に、トロンビンを、同時に観察できた。チャンバ内の温度を３７℃に維持し、赤（６２５ｎｍ）と紫外線（３６５ｎｍ）のＬＥＤで光を照射した。赤色の光（図５ａ）を照射したときに、試料の光散乱から血栓の成長を検出し、紫外線ＬＥＤ（図５ｂ）によって、ＡＭＣ蛍光を励起させた。マルチレーン放射フィルターを使用して、赤色の光散乱、ＡＭＣ放射、励起放射を分離した。マクロレンズを通過する赤色光の散乱と蛍光を、デジタルＣＣＤカメラで検出した。赤色光と青色光の画像を、通常は１分あたり１〜４回、順次取得した。ＡＭＣおｎバーンアウトを防止するために、ＬＥＤをカメラと同期させ、露光時すなわち、約０．５秒間のみスイッチを入れた。
【０１２１】
Ｂ）多血小板血漿における血栓の空間成長
血栓の退縮を防止するために、２５μｇ／ｍｌの糖タンパク質阻害因子ＩＩｂ／ＩＩＩａを使用した。また、実験は、０．５％低融点アガロースゲルで行った。これは、場合によっては高濃度のアンタゴニストでも退縮を完全には阻害しないかったからである。
【０１２２】
無血小板血漿に代えて多血小板血漿を用いたこと以外は、上述したようにして試料を調製した。カルシウム再沈着後、血漿を２分間で４２℃まで予熱した。アガロース溶液を加え、実験用のチャンバで混合物を３分間インキュベートして、ゲルを形成した。その後、上述したようにして実験を開始した。
【０１２３】
データ処理
画像処理
まず、赤色光および紫外光の画像を同じようにして処理した。光散乱（図６ａ）またはＡＭＣ蛍光のプロファイルを得るために、活性化因子の表面に垂直なラインに沿って、それぞれの範囲におけるフレームごとに光強度を測定した。これらの値を平均して、ライン１５０〜３００本にした。
【０１２４】
光散乱プロファイル上の最大強度点の半分の動きから、血栓成長速度を計算した。初期成長速度は、血栓成長の最初の１０分間における血栓サイズ時間依存性図の直線部分の勾配として求めた。血栓の成長に対する影響が些細になるほど、血栓の境界が活性化因子から遠い場合、血栓成長の４０分後に、同じようにして定常速度を計算した。
【０１２５】
ＡＭＣ蛍光強度のプロファイルを、較正によってその濃度のプロファイルに変換した。強度較正プロファイルについては、同じ血漿における既知のＡＭＣ濃度を用いて、均一な分布内で計算した。各点のＡＭＣ濃度（Ｃi）は、以下のようにして計算した。
【数１】
2014521952.tif 000003
式中、Ｉiは蛍光強度、Ｉbgrは背景強度、Ｉcalは、ＡＭＣ濃度がわかっている場合の蛍光強度（いずれもフレームの同一点でのもの）であり、ＣcalはＡＭＣの較正濃度である。
【０１２６】
トロンビン濃度の計算
以下の反応−拡散式に対する逆問題を解くことで、ＡＭＣの一次元分布から、トロンビン濃度（図６ｂ）を計算した。
【数２】
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式中、ＡＭＣ、ＳおよびＩＩａは、それぞれ、ＡＭＣ、蛍光発生基質、トロンビンの濃度であり、ＤAMCはＡＭＣ拡散係数であり、Ｋｍ、ｋｃａｔは、ミカエリス定数すなわち、トロンビンによる基質切断の反応定数である。
【０１２７】
ＡＭＣ拡散係数については、実験の拡散プロファイルを理論的な拡散プロファイルにフィットさせることによって、実験的に測定した。
【０１２８】
トロンビン濃度分布の逆問題は悪い状態のため、実験ノイズはもとより、ＡＭＣプロファイルの小さな歪みですらも、それがあると解が得られなくなる。これを解決するために、数値アルゴリズムを使用して、ＡＭＣシグナルのノイズと歪みのレベルを小さくした。
【０１２９】
ＡＭＣシグナルの歪みは、フィブリン血栓での光散乱の励起によるものである。蛍光強度は、血栓内部で増加する。この増加は、ＡＭＣ濃度および血栓密度に比例する。これを解決し、実際のＡＭＣ濃度を計算するために、以下の式を用いた。
【数３】
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式中、ＡＭＣvisibleは較正によるＡＭＣ濃度であり、ＡＭＣrealは実際のＡＭＣ濃度であり、Ｃｌｏｔはフィブリンによる光強度の散乱であり、係数ｋi、ｋ2、ｋ3は、実験的に測定された。
【０１３０】
ノイズを抑えるために、以下の微分係数計算のアルゴリズムを用いた。
【数４】
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式中、Δｔはフレーム間の時間、一般に１分間であり、Δｘは画素サイズ（４．３μｍ）であり、ＩおよびＪの値は、最小限のシグナル歪みでノイズを最小にするのに最適なように選択される。典型的には、Ｊ＝３およびＩ＝４０を選択し、この場合、単位数より大きいＩ値とＪ値から総計を開始してもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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