(57)【要約】 リバースエンジニアリングは、ＲＮＡウイルス感染の病理生物学を研究する新しい方法、組換えウイルスを合成するおよびワクチンを開発する新しいより効率的な手段を提供し、発現系としてのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＲＤＲＰ系の多用途性および効率も証明している。しかしながら、現在使用されている方法は、複雑かつ使用しにくいツールのレパートリーを必要とする。本発明は、ウイルスミニゲノムから組換えタンパク質またはＲＮＡを発現させるため、およびマイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノム全体をコードするｃＤＮＡからの組換えウイルスのレスキューのためにＲＤＲＰ酵素活性を使用するより単純なプラスミドに基づく哺乳動物発現系を記載する。この系は、組換えタンパク質、アンチセンスおよび／または選択的干渉ＲＮＡならびにリボザイムを含む治療的ＲＮＡ分子の発現にとって有用であり得る。この系は、遺伝子治療および新しいワクチンを作製するための組換えウイルスの作製のためにも使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複製ヘルパーワクシニアウイルスまたは外来性ＲＮＡポリメラーゼの助け無しに、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して組換えタンパク質を作製するための２プラスミド系であって、
ａ．発現可能なＤＮＡフラグメントを挿入するための２つのマルチクローニングサイトに、容易に操作可能なレプリコンを含む１つのクローニングプラスミド、および
ｂ．Ｎ、Ｐ、Ｌタンパク質をそれぞれ発現するＮ、Ｐ、Ｌ遺伝子を含む１つのヘルパープラスミド
を含む、２プラスミド系。
【請求項２】
前記容易に操作可能なレプリコンが、５’末端においてウイルスリーダー配列および３’末端においてウイルストレーラー配列に隣接した発現可能なＤＮＡフラグメントを挿入するための少なくとも１つのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）、より好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）Ｉ制御配列に作動可能に連結されたウイルス遺伝子間配列によって分断された２つ以上のＭＣＳを含むことにより、真の３’および５’ウイルスゲノム末端を有するアンチセンスＲＮＡ転写物の合成が可能である、請求項１に記載の２プラスミド系。
【請求項３】
前記容易に操作可能なレプリコンが、５’末端においてウイルスリーダー配列および３’末端においてウイルストレーラー配列に隣接した発現可能なＤＮＡフラグメントを挿入するための少なくとも１つのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）、より好ましくは、ＲＮＡＰ  ＩＩ制御配列およびリボザイムに作動可能に連結されたウイルス遺伝子間配列によって分断された２つ以上のＭＣＳを含むことにより、真の３’および５’ウイルスゲノム末端を有するアンチセンスＲＮＡ転写物の合成が可能である、請求項１に記載の２プラスミド系。
【請求項４】
複製ヘルパーワクシニアウイルスまたは外来性ＲＮＡポリメラーゼの助け無しに、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して感染性非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスを作製するための２プラスミド系であって、
ａ．発現可能なＤＮＡフラグメントを挿入するための、ウイルスゲノムＲＮＡ全体をコードするｃＤＮＡを含む１つのウイルスクローニングプラスミド、および
ｂ．Ｎ、Ｐ、Ｌタンパク質をそれぞれ発現するＮ、Ｐ、Ｌ遺伝子を含む１つのヘルパープラスミド
を含む、２プラスミド系。
【請求項５】
ウイルスゲノムＲＮＡをコードする前記ｃＤＮＡが、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）Ｉ制御配列に作動可能に連結されることにより、真の３’および５’ウイルスゲノム末端を有するアンチセンスＲＮＡ転写物の合成が可能である、請求項４に記載の２プラスミド系。
【請求項６】
ウイルスゲノムＲＮＡをコードする前記ｃＤＮＡが、真の３’および５’ウイルスゲノム末端を有するアンチセンスＲＮＡ転写物の合成を可能にするために、ＲＮＡＰ  ＩＩ制御配列およびリボザイムに作動可能に連結されている、請求項４に記載の２プラスミド系。
【請求項７】
前記発現可能なＤＮＡフラグメントが、ＲＮＡ分子またはタンパク質または少なくとも１つの免疫原性エピトープまたは本明細書中の組み合わせをコードする、請求項１および請求項４に記載の２プラスミド系。
【請求項８】
前記Ｎ遺伝子ならびにＩＲＥＳエレメントによって分断されたＰおよびＬ遺伝子をコードするバイシストロニックカセットが、二方向性ＲＮＡＰ  ＩＩプロモーターの支配下にクローニングされている、請求項１および請求項４に記載のヘルパープラスミド。
【請求項９】
前記Ｎ、ＰおよびＬ遺伝子が、ＩＲＥＳエレメントによって分断された、２Ａペプチド配列によって分断されたＮおよびＰの融合タンパク質をコードする遺伝子ならびにＬタンパク質をコードする遺伝子をＲＮＡＰ  ＩＩプロモーターの支配下に含む単一のバイシストロニックＤＮＡカセットにクローニングされている、請求項１および請求項４に記載のヘルパープラスミド。
【請求項１０】
前記Ｎ、ＰおよびＬ遺伝子の各々が、３つの別個の遺伝子としてＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの異なる支配下にクローニングされている、請求項１および請求項４に記載のヘルパープラスミド。
【請求項１１】
複製ヘルパーワクシニアウイルスまたは外来性ＲＮＡポリメラーゼの助け無しに、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの麻疹ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して組換えタンパク質を作製するための２プラスミド系であって、
ａ．発現可能なＤＮＡフラグメントを挿入するための容易に操作可能な麻疹ウイルスレプリコンを２つのマルチクローニングサイトに含む１つのクローニングプラスミド、および
ｂ．麻疹ウイルスＮ、Ｐ、Ｌタンパク質をそれぞれ発現する麻疹ウイルスＮ、Ｐ、Ｌ遺伝子を含む１つのヘルパープラスミド
を含む、２プラスミド系。
【請求項１２】
複製ヘルパーワクシニアウイルスまたは外来性ＲＮＡポリメラーゼの助け無しに、感染性麻疹ウイルスを作製するための２プラスミド系であって、
ａ．発現可能なＤＮＡフラグメントを挿入するための、麻疹ウイルスゲノムＲＮＡ全体をコードするｃＤＮＡを含む１つのウイルスクローニングプラスミド、および
ｂ．麻疹ウイルスＮ、Ｐ、Ｌタンパク質をそれぞれ発現する麻疹ウイルスＮ、Ｐ、Ｌ遺伝子を含む１つのヘルパープラスミド
を含む、２プラスミド系。
【請求項１３】
請求項１および請求項４に記載の２プラスミド系を使用して、組換えタンパク質、ＲＮＡ分子または感染性非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスを作製する方法であって、クローニングプラスミドおよびヘルパープラスミドを宿主細胞に導入する工程、ならびに複製ヘルパーワクシニアウイルスまたは外来性ＲＮＡポリメラーゼの助け無しに、組換えタンパク質、ＲＮＡ分子または感染性非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスを作製する工程を含む、方法。
【請求項１４】
組換え麻疹ウイルスを作製する方法であって、（ａ）請求項４に記載のウイルスクローニングプラスミドを宿主細胞に、（ｂ）請求項１に記載のクローニングプラスミドを宿主細胞に、および（ｃ）請求項１または請求項４に記載のヘルパープラスミドを宿主細胞に導入する工程、ならびに複製ヘルパーワクシニアウイルスまたは外来性ＲＮＡポリメラーゼの助け無しに組換え麻疹ウイルスを作製する工程を含む、方法。
【請求項１５】
容易に操作可能なレプリコンの前記配列が、配列番号１である、請求項１に記載の２プラスミド系。
【請求項１６】
リボザイムに隣接する容易に操作可能なレプリコンの前記配列が、配列番号２のとおりである、請求項１に記載の２プラスミド系。
【請求項１７】
ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼＩターミネーターに隣接する容易に操作可能なレプリコンの前記配列が、配列番号３のとおりである、請求項１に記載の２プラスミド系。
【請求項１８】
前記クローニングプラスミドが、配列番号４または配列番号５または配列番号６または配列番号７のとおりである、請求項１および請求項４に記載の２プラスミド系。
【請求項１９】
前記ヘルパープラスミドが、配列番号８または配列番号９のとおりである、請求項１および請求項４に記載の２プラスミド系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２プラスミド哺乳動物発現系に関する。さらに、本発明は、組換えタンパク質および組換えウイルスの作製に関する。さらに、本発明は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのリボ核酸（ＲＮＡ）依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素を再構成するために哺乳動物発現系を組み込む方法、ならびにタンパク質、ＲＮＡ分子および組換えウイルスを作製するための哺乳動物発現系としてのその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学および遺伝子操作の進歩は、ウイルスゲノムのクローニングされた相補（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）コピーから組換えウイルスを作製するプロセスである「逆遺伝学」を発展させた。それは、ウイルスの弱毒化、組織親和性、病原性因子に関する分子決定因子を理解することを助け、近年は、そのｃＤＮＡの操作によるウイルスゲノムの容易な改変を可能にすることによってウイルスワクチンの開発を加速させた。逆遺伝学は、弱毒変異を有する組換えウイルス、または新しいウイルスワクチンもしくは治療薬として使用するための異種遺伝子を発現するキメラウイルスの作製を可能にした。
【０００３】
モルビリウイルス（麻疹ウイルスおよび牛疫ウイルス）
ＭＶおよびＲＰＶは、パラミクソウイルス科のモルビリウイルス属のメンバーである。それらの遺伝情報は、アンチセンス極性の一本鎖ＲＮＡゲノムにコードされており、それぞれ１５８９４ヌクレオチド（ＭＶ）および１５８８２ヌクレオチド（ＲＰＶ）を含む。それらのゲノムは、高度に保存されたユニークな３’および５’末端（それぞれリーダーおよびトレーラー（ｔｒａｉｌｅｒ）と呼ばれる）を有し、同様に保存された遺伝子間配列によって分断された６つの遺伝子、Ｎ（ヌクレオカプシドタンパク質）、Ｐ（リンタンパク質）、Ｍ（マトリックスタンパク質）、Ｆ（融合タンパク質）、Ｈ（赤血球凝集素）およびＬ（巨大タンパク質＝ポリメラーゼ）をコードする。感染細胞では、ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰ）が、リーダー配列内に存在するプロモーターからゲノムＲＮＡの転写を開始し、細胞のリボソームによって対応するタンパク質に翻訳されるメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子を生成する。ウイルスの生活環のある時点およびウイルスタンパク質の適切なプールが合成された後において、ＲＤＲＰ酵素は、モードを切り替え、そのゲノムＲＮＡのリーダー配列内に存在する別のプロモーターから複製を開始する。ウイルスＲＮＡの転写または複製の開始および遺伝子の境界における転写の開始および停止を制御する正確な機序は、十分に理解されていないが、転写および複製のためのプロモーターとして働く保存配列ならびに各遺伝子の境界において転写の開始および終了を命令する配列は、ほとんどのマイナス鎖ＲＮＡウイルス全般の場合、特にＭＶおよびＲＰＶにおいて、明確に定義されている。無関係な任意のＲＮＡ分子にこれらの配列を付加することによって、その同族のＲＤＲＰによって転写および複製され得る「ウイルスゲノム様レプリコン」が形成されることが十分に確認されている。
【０００４】
ＭＶは、乳児および低年齢小児において急性熱性疾病を引き起こす。その有病率は、ワクチン接種によって非常に効率的に制御され得る。Ｓｃｈｗａｒｔｚ、ＭｏｒａｔｅｎおよびＥｄｍｏｎｓｔｏｎ−Ｚａｇｒｅｂ株を含む現在使用されている弱毒生ワクチンの大部分が、非ヒト細胞における複数回の継代による（Ｅｎｄｅｒｓ、１９６２）最初のＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株（Ｅｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｐｅｅｂｌｅｓ、１９５４）に由来している。しかしながら、世界保健機関（ＷＨＯ）の推定によると、主に開発途上国において、毎年１００万人の低年齢小児が、麻疹が原因で死亡している。しかしながら、近年は、ワクチン接種の順守が不十分な米国などの先進国において、麻疹に関連する死亡が発生してきている（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｕｔｔｓ、１９９５）。将来動向を含むＭＶワクチン学の最近の考察については、Ｎｏｒｒｂｙ（１９９５）を参照のこと。過去６０有余年、麻疹ワクチンは、７億人を超える小児に投与され、非常に有効であると証明されており、通常、ＭＶの再感染に対して一生続く免疫能を提供する。
【０００５】
ＲＰＶは、ウシ、スイギュウおよび他の野生生物種の感染性ウイルス性疾患である牛疫を引き起こし、主に、インド、アフリカおよび他の熱帯諸国である。牛疫は、発熱、口腔びらん、下痢、リンパ系壊死および高死亡率を特徴とする。２つのワクチン、Ｐｌｏｗｒｉｇｈｔ（Ｐｌｏｗｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｆｅｒｒｉｓ、１９６２）およびＬａｐｉｎｉｚｅｄ（Ｓｃｏｔ  １９６３）が、牛疫を防御するために広く使用されている。ＲＰＶのＲＢＯＫ株の弱毒化によって得られたＰｌｏｗｒｉｇｈｔワクチンは、最も有効であると証明されている（Ｂａｒｏｎら、２００５）。これらのワクチンが広範に使用されることによって、２０００年までにインドを含む数カ国からのＲＰＶの根絶が助けられた。しかしながら、２００３年の再出現によって、ウシおよび他の感受性動物の集団ワクチン接種が再開された（Ｋｏｃｋら、２００６）。
【０００６】
これらのワクチンの証明された安全性および有効性のおかげで、異種遺伝子を発現させるための理想的なベクターとしてそれらを使用することが支持される。逆遺伝学は、人間および動物における無関係な疾患および／または治療薬に対する潜在的なワクチンとして有用な組換えＭＶまたはＲＰＶを開発するための強力なアプローチを提供する。
【０００７】
逆遺伝学は、ポリオウイルスにおいて、１９８１年にＲａｃａｎｉｅｌｌｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅによってＲＮＡウイルスを作製するために初めて使用された。続いて、いくつかの他のプラス鎖ＲＮＡウイルスが、クローニングされたｃＤＮＡからＴ７またはＴ３  ＲＮＡポリメラーゼによって生成された合成ＲＮＡを使用して作製された（Ｒａｃａｎｉｅｌｌｏ，Ｖ．Ｒ．＆Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｄ．、１９８１）。しかしながら、マイナス鎖ＲＮＡウイルスの作製は、より困難であることが判明した。マイナス鎖ウイルスのゲノムは、プラス鎖ＲＮＡウイルスとは異なり、宿主細胞によって翻訳されることができず、感染性でない。それは、核タンパク質、ならびに転写および複製、その後のウイルス形成を可能にするウイルスＲＤＲＰタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の形態で供給されなければならない。Ｅｎａｍｉら（１９９０）は、インフルエンザウイルス（９つのゲノムＲＮＡサブユニットからなる）を作製する最初の逆遺伝学系を開発した。そのＲＮＰは、小さいサイズであり、インビトロにおいてＲＮＡから組み立てられ得、ウイルスタンパク質であるＮおよびポリメラーゼ構成要素を必要とし得る。初めに、インフルエンザウイルスゲノムサブユニットのウイルス非コード末端配列に埋め込まれた、レポーター遺伝子であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）配列を有する人工ＲＮＡが使用された（Ｌｕｙｔｊｅｓら、１９８９）。後に、クローニングされたＤＮＡからインビトロにおいて転写された単一の真の（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）または変更されたゲノムサブユニットＲＮＡも使用された（Ｅｎａｍｉ  ａｎｄ  Ｐａｌｅｓｅ、１９９１）。組み立てられたＲＮＰは、インフルエンザ感染細胞にトランスフェクションされた際に複製および転写した（それぞれＣＡＴの産生およびインフルエンザウイルスのレスキューによってモニターされる）。いくつかの場合において、莫大な過剰量のリアソートされていない（ｎｏｎ−ｒｅａｓｓｏｒｔｅｄ）ウイルスからの、導入されたサブユニットを含むウイルスの精製は、例えば、ヘルパーウイルスの同族のサブユニットによってコードされるタンパク質に対する特異的な中和抗体を使用した選択によって達成され得る。
【０００８】
非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルス（モノネガウイルス目）のＲＮＰは、Ｎタンパク質に加えて、組立およびポリメラーゼ補助因子リンタンパク質（Ｐ）ならびにウイルスＲＮＡポリメラーゼ（巨大タンパク質Ｌ）を含み、インビトロにおいて合成ＲＮＡおよび個別のタンパク質から組み立てることがより困難である。ゆえに、多くの研究者は、ウイルスの生活環において生成されるウイルスゲノムの必須配列を含むより小さいサブゲノムＲＮＡ（ウイルスミニゲノム）を使用することを好んだ。次いで、それらは、レポーター遺伝子およびウイルスの必須の非コード配列を含むＤＮＡ構築物（レプリコン）から人工的に転写されたＲＮＡ分子によって置換された。ＣＡＴコード配列およびウイルス非コード末端配列を有するそのようなレプリコンの複製は、センダイウイルス（Ｐａｒｋら、１９９１）、センダイウイルス（ＳｅＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９９３；Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９９１）、ヒトパラインフルエンザウイルス３（Ｄｉｍｏｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ、１９９３）、狂犬病ウイルス（ＲＶ）（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｌｌ、１９９４）およびＭＶ（Ｓｉｄｈｕら、１９９５）において達成された。
【０００９】
類似の系を使用することにより、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（Ｌａｗｓｏｎら、１９９５；Ｓｃｈｎｅｌｌら、１９９４）および狂犬病ウイルス（ＲＶ）が、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの支配下のウイルスゲノムの完全長ｃＤＮＡクローンから完全にレスキューされた。核タンパク質（ＮＰ）を含むウイルスポリメラーゼ複合体の構成要素は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターによって制御されるタンパク質発現プラスミドから提供された。すぐに他の研究者も、水疱性口内炎ウイルス（Ｗｈｅｌａｎら、１９９５）、麻疹ウイルス（Ｒａｄｅｃｋｅら、１９９５）、呼吸器合胞体ウイルス（Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９９５）、センダイウイルス（Ｇａｒｃｉｎら、１９９５；Ｋａｔｏら、１９９６）、牛疫ウイルス（Ｂａｒｏｎ＆Ｂａｒｒｅｔｔ  １９９７）、ヒトパラインフルエンザウイルス（Ｈｏｆｆｍａｎら、１９９７；Ｄｕｒｂｉｎら、１９９７）、サルウイルス（Ｈｅら、１９９７）、ニューカッスル病ウイルス（Ｐｅｅｔｅｒｓら、１９９９）およびヒト重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（Ｙｏｕｎｔら、２００３）に対するクローニングされたゲノムｃＤＮＡからの非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの作製を報告した。
【００１０】
これらの実証、ならびにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰ）酵素活性の再構成および対応するＲＮＡウイルスまたは非ウイルスレポータータンパク質をミニレプリコンからレスキューすることができることについての他の研究によって、単独でまたはレスキューされたウイルスの欠くことのできない部分として組換えタンパク質を発現させるための強力な多用途の系としてのＲＤＲＰ酵素が確立された。
【００１１】
この目的のために使用されている最も一般的な方法は、複数のプラスミド（１つは、基質ＲＮＡを発現し（ウイルスゲノムをコードするｃＤＮＡまたは人工レプリコン）、他のものは、ウイルスのＲＤＲＰ複合体タンパク質、すなわち、ヌクレオカプシド（ＮまたはＮＰタンパク質）、リンタンパク質（Ｐ）および巨大ポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質を発現する）、ならびにこれらのプラスミドからの発現を可能にする外部のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）のトランスフェクションを使用する。Ｔ７ＲＮＡＰは、複数の理由、（１）その高効率、（２）ウイルスゲノムと同一の正しい５’末端を有するＲＮＡを合成することができる点、ならびに（３）細胞質内でＤＮＡ分子を転写することができ、ゆえにＲＮＡスプライシング、ポリアデニル化または他の機序によるｖＲＮＡの改変が排除される点のために使用される。
【００１２】
Ｔ７ＲＮＡＰは、哺乳動物の酵素ではない。ゆえに、Ｐａｔｔｎａｉｋら（１９９０）は、組換え弱毒化ワクシニアウイルス（ＶＶ）（例えば、ＭＶＡ／Ｔ７）を使用した。それは、ＶＳＶ（Ｌａｗｓｏｎら、１９９５）および狂犬病ウイルス（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎ、米国特許第６，０３３，８８６号）、ＲＳＶ（Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９９５）、ＳＶ５（Ｈｅら、１９９７）、ＨＰＩＶ−３（Ｄｕｒｂｉｎら、１９９７）、牛疫ウイルス（Ｂａｒｎ  ａｎｄ  Ｂａｒｒｅｔｔ  １９９７）および麻疹ウイルス（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９７）、耳下腺炎ウイルス（Ｃｌａｒｋｅら、２０００）、ＣＤＶ（Ｇａｓｓｅｎら、２０００）、ＨＰＩＶ−２（Ｋａｗａｎｏら、２００１）およびＢＰＩＶ−３（Ｓｃｈｍｉｄｔら、２０００）の回収のために使用された。同様に、Ｔ７ＲＮＡＰを発現する組換え鶏痘ウイルスもまた、ニューカッスルウイルス（ＮＤＶ）（Ｐｅｅｔｅｒｓら、１９９９）およびキメラ牛疫ウイルス（Ｄａｓら、２０００）の回収のためのＴ７ＲＮＡＰを供給するために使用された。
【００１３】
このアプローチを用いて作製された組換えウイルスは、ワクシニアウイルスと混合されてしまい、精製することが困難であり、それは、特に、免疫原性組成物または遺伝子治療ベクターを調製するためにその組換えウイルスが必要とされる場合、主な問題となり得る。さらに、このヘルパーワクシニアウイルスは、宿主細胞を殺滅して、組換えウイルスの作製の効率を制限する。ゆえに、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを供給するヘルパーウイルスの使用を排除することが望ましいだろう。外部から供給されるＴ７ＲＮＡＰの使用を完全に排除するために、３つの異なるアプローチが使用された。
【００１４】
Ｒａｄｅｃｋｅら（１９９５）は、Ｔ７ＲＮＡＰならびに麻疹ウイルス（ＭＶ）のＮおよびＰタンパク質（ＷＯ９７／０６２７０）を構成的に発現するヘルパー細胞株を作出し、Ｔ７ＲＮＡＰプロモーターに連結されたＭＶゲノムの（＋）鎖配列全体をコードするプラスミドおよびＭＶのＬタンパク質だけをコードする別のプラスミドを導入することが、組換えＭＶをレスキューするために十分である。しかしながら、このヘルパー細胞株の効率は、通常限定的であり、熱ショックを与えることによって増強される必要がある（Ｐａｒｋｓら、１９９９）。また、この細胞株は、ＭＶのレスキューのためだけに有用である。対照的に、ヘルパーＢＨＫ−２１細胞株（ＢＳＲ  Ｔ７／５）は、Ｔ７ＲＮＡＰだけを安定的に発現し、ＢＲＳＶ（Ｂｕｃｈｈｏｌｚら、２０００）、狂犬病ウイルス（Ｆｉｎｋｅ  ａｎｄ  Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ  １９９９）、ＶＳＶ（Ｈａｒｔｙら、２００１）、ＮＤＶ（Ｒｏｍｅｒ−Ｏｂｅｒｄｏｒｆｅｒら、１９９９）およびエボラウイルス（Ｖｏｌｃｈｋｏｖら、２００１）の場合に示されているように種々のウイルスをレスキューするために使用され得る。それは、適切なＮ、ＰおよびＬタンパク質をコードするプラスミドでコトランスフェクトすることによって、任意のウイルスのＲＤＲＰを再構成するために使用され得る。
【００１５】
第２のアプローチは、ＲＮＡポリメラーゼＩ（ＲＮＡＰＩ）の使用を含む。ＲＮＡＰＩは、通常、哺乳動物細胞においてリボソーム遺伝子の転写に関与する。ＲＮＡＰＩによって合成されたＲＮＡは、５’メチルキャップ構造および３’ポリＡテイルを含まない。ＲＮＡＰＩに対する転写開始シグナルおよび転写終結シグナルは、正確に定義されており、ウイルスゲノムｃＤＮＡ分子またはウイルスゲノム様ｃＤＮＡ分子をｒＲＮＡプロモーターシグナルとターミネーターシグナルとの間に挿入することによって生成されたＲＮＡ分子は、真のウイルス５’および３’末端を有し、さらなるプロセシングを必要とせず、発現された場合、ウイルスのＲＤＲＰによって直接、基質として使用され得る（Ｚｏｂｅｌら、１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，２１：３６０７−３６１２；Ｆｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｐｅｔｔｅｒｓｏｎ，２００１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１６４３−１６５５；）。ゆえに、ＲＮＡＰＩ転写は、プラスミドからウイルスゲノムまたはゲノム様ｃＤＮＡを合成するために使用され、インフルエンザウイルス（Ｎｅｕｍａｎｎら、１９９９）、ボルナ病ウイルスおよびＭＶ（Ｍａｒｔｉｎら、２００６，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．８０：５７０８−５７１５）の場合ではウイルスをレスキューするために使用されている。
【００１６】
より最近では、Ｍａｒｔｉｎら（２００６）は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰＩＩ）によって生成された転写物からウイルスゲノムＲＮＡを発現させる第３のストラテジーを使用した。彼らは、ハンマーヘッド型リボザイムをそのウイルスゲノム配列のすぐ上流に配置し、ゲノムデルタ肝炎ウイルスリボザイムをそのウイルスゲノム配列のすぐ下流に配置した。これらのリボザイムは、ＲＮＡＰＩＩによって転写されたＲＮＡから、真の３’および５’末端を有するゲノムＲＮＡを切断した。
【００１７】
そのようなストラテジーは、ヘルパーウイルスの必要性を排除するが、なおも、ウイルスのＮ、ＰおよびＬタンパク質を発現する別個のヘルパープラスミドが必要である。１つの細胞において同時に非常に多くのプラスミドのトランスフェクションを行うこと、およびＲＤＲＰの効率的な再構成のために、所望のタンパク質の有用なレベルの発現を保証することは、困難であり得る。所望のすべての遺伝子を発現する単一のヘルパープラスミドが使用可能であることは、トランスフェクトされたすべての細胞が、ＲＤＲＰ酵素活性の再構成のために必要なヘルパータンパク質の完全な補完を享受するのを保証することによって、ウイルスレスキューの効率を高めることを助ける。
【００１８】
この複数のプラスミドの必要性は、ウイルスレスキューのためにＲＤＲＰに基づく系を使用することも制限している一方で、レポータータンパク質をコードする人工レプリコンを用いた研究から、ＲＤＲＰによって媒介される発現系が、組換えタンパク質の高レベルの発現を可能にし得ることが示されている。必要とされるＮ、ＰおよびＬタンパク質を供給するために単一のヘルパープラスミド／試薬が使用可能であることによって、組換えタンパク質の大規模発現のためのＲＤＲＰ酵素の使用範囲の拡大が助けられる。ゆえに、ＲＤＲＰ活性の効率的な再構成、ならびに組換えタンパク質、ＲＮＡ分子の発現および／または組換えウイルスのレスキューのためにその利用を可能にする新しいより単純な方法および試薬に対する必要性が当該分野に存在する。
【００１９】
ここで、本発明者らは、ＲＤＲＰ酵素活性の再構成、ならびに組換えタンパク質、ＲＮＡ分子の発現のためのそのレスキューおよび組換えウイルスのレスキューのために使用され得る容易に操作可能な単純なプラスミドベクター系の調製法および使用を記載する。この目的のために、本発明者らは、モデルとして２つのウイルス、麻疹ウイルス（ＭＶ）および牛疫ウイルス（ＲＰＶ）のＲＤＲＰ系を使用した。これらのプラスミドは、非ウイルスタンパク質、ＲＮＡ分子またはウイルスゲノム全体を発現するように容易に改変され得る。このベクター系は、タンパク質の発現ならびに／あるいはワクチン接種もしくは他の治療目的にとって有用なさらなるタンパク質および／またはＲＮＡ分子を発現する改変された組換えウイルスの作製（ウイルスレスキュー）に関する応用法の開発において有用であり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の主な目的は、組換えタンパク質および組換えウイルスを作製するための２プラスミド哺乳動物発現系を提供することである。
【００２１】
別の目的は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを再構成するための方法および哺乳動物発現系としてのその利用の方法を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、組換えタンパク質、核酸、ウイルス、ＲＮＡ分子を発現させるための哺乳動物発現系を提供することである。
【００２３】
本発明のなおもさらなる目的は、アプタマー、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイムなどのようなＲＮＡ分子の細胞内発現のための哺乳動物発現系を提供することである。
【００２４】
本発明のさらに別の目的は、ワクチンまたは治療薬として有用な組換えウイルスを作製するための試薬を提供することである。
【００２５】
本発明の別の目的は、そのような哺乳動物発現系を調製するプロセスを記載することである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、哺乳動物細胞においてタンパク質、ＲＮＡ分子の発現および組換えウイルスを作製するためのモルビリウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素の使用を特徴とする。１つの態様において、これは、ＭＶのＮ、ＰおよびＬタンパク質を発現するプラスミドＤＮＡ分子を提供する。本発明の別の態様において、本発明は、任意のタンパク質、ＲＮＡまたは改変されたウイルスを作製するために使用され得るＲＤＲＰの容易に操作可能なＲＮＡ基質を発現する別のプラスミドを提供する。これらのプラスミドは、タンパク質もしくはＲＮＡ分子の発現または組換えウイルスの作製あるいはそれらの組み合わせのための試薬キットとして使用され得る。さらに、本発明は、細胞の遺伝子発現を調節するために有用であり得るＲＮＡ分子の細胞内発現のためにこれらのプラスミドを使用するための方法を提供する。これらのプラスミドは、クローニングキットの形式で使用され得る。
【００２７】
本明細書において使用される以下の用語／省略形は、本明細書以後述べられるとき、それらに帰される意味を有する。
【００２８】
ＭＶ：麻疹ウイルス、ＲＰＶ：牛疫ウイルス、ＲＮＡ：リボ核酸、ＤＮＡ：デオキシリボ核酸、ＲＤＲＰ：ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ｃＤＮＡ：相補ＤＮＡ、−ＶＲＮＡ：マイナス鎖ウイルスＲＮＡ、ＲＮＰ：リボ核タンパク質、Ｐ：リンタンパク質、Ｌ：巨大ポリメラーゼタンパク質、Ｎ：ヌクレオカプシド、ＣＭＶ：サイトメガロウイルス、ＩＲＥＳ：内部リボソーム侵入部位、ＣＨＯ細胞株：チャイニーズハムスター卵巣細胞株、ＲＮＡ  ＰｏｌＩ−ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＭＯＩ：感染効率、ｓｉＲＮＡ：選択的干渉ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ：マイクロＲＮＡ、ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質、ＨＧＨ：ヒト成長ホルモン
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】２つのレポーター遺伝子をコードする麻疹ミニレプリコンをコードするクローニングプラスミドの模式図。Ａ．基本的なレプリコンのデザイン。Ｂ．構築物１：ＨＨ−レプリコン−ＨＤＶ。Ｃ．構築物２：Ｐ１Ｐ−レプリコン−Ｐ１Ｔ。
【図２】作製されたクローニングプラスミドの模式的表示。クローニングプラスミド１：ベクターｐＵＣ５７を使用して、Ｐ１Ｐ＿レプリコン＿Ｐ１Ｔ構築物をクローニングした。クローニングプラスミド２：ベクターｐＩＲＥＳを使用して、ｐＩＲＥＳ＿Ｐ１Ｐ＿レプリコン＿Ｐ１Ｔ構築物を調製した。クローニングプラスミド３：ベクターｐＩＲＥＳを使用して、ｐＩＲＥＳ＿ＨＨ＿レプリコン＿ＨＤＶを調製した。
【図３】ＭＶ−Ｅゲノム全体のｃＤＮＡの合成。図３ａ：ＭＶ−Ｅのアンチゲノム全体をコードするｃＤＮＡの作製：Ｇｅｎｅｊｅｔ  ＲＮＡ精製キット（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用してウイルスＲＮＡを精製し、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩおよびランダムヘキサマープライマーを使用して逆転写した。これを使用することにより、７つの重複フラグメントを、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩおよび特異的プライマーを用いて増幅し、マルチクローニングサイトがＮｈｅＩ＿ＮｏｔＩ＿ＰａｃＩ＿ＰｍｅＩリンカーで置き換えられたｐＣＤＮＡ３．１にクローニングした。図３ｂ：ＭＶ−ＥゲノムのｃＤＮＡをコードするプラスミド：ＭＶ−Ｅのアンチゲノム全体をコードするｃＤＮＡを、７つの重複ＰＣＲ増幅フラグメントを組み立てることによって合成し、ｐＣＤＮＡ３．１（−）のＮｏｔＩおよびＰｍｅＩ部位にクローニングした。
【図４】作製されたヘルパープラスミドの２つのバリアントの模式的表示。ヘルパープラスミド１：ベクターｐＢｉＣＭＶ−１を使用して、ｐＢｉＣＭＶ＿ＭＶ−Ｎ＿ＭＶ−Ｐ＿ＩＲＥＳ＿ＭＶ−Ｌを調製した。ヘルパープラスミド２：ベクターｐＩＲＥＳを使用して、ｐＩＲＥＳ＿ＭＶ−Ｎ＿ｐ２Ａ＿ＭＶ−Ｐ＿ＭＶ−Ｌを調製した。
【図５】Ｖｅｒｏ細胞を、ｅＧＦＰおよびＨＧＨをコードするクローニングプラスミドおよびＨＰＶ１またはＨＰＶ２でコトランスフェクトし、３７℃で４８時間インキュベートし、蛍光およびＨＧＨについて観察した。Ａ：ｐＵＣ１８のみ；Ｂ：ｐＧＦＰ（ポジティブコントロール）；Ｃ：ｐＵＣ＿Ｐ１Ｐ−レプリコン−Ｐ１Ｔのみ；Ｄ：ｐＵＣ−Ｐ１Ｐ−レプリコン−Ｐ１ＴおよびヘルパーＨＰＶ；Ｅ：ｐＩＲＥＳ−ＨＨ−レプリコン−ＨＤＶのみ；Ｆ：ｐＩＲＥＳ−ＨＨ−レプリコン−ＨＤＶおよびＨＰＶ。注意：ヘルパープラスミド１と２の両方が、Ｎ、ＰおよびＬタンパク質を供給することができた。それらは似ていたので、ＨＰＶ１のみの代表的な像が示されている。
【図６】断片化されたＭＶのレスキュー：等量のプラスミドｐＣＤＮＡ−ＭＶゲノム、クローニングプラスミド１（ｐＩＲＥＳ＿ＨＨ−レプリコン−ＨＤＶ）およびＨＰＶ１を、Ｘｆｅｃｔを使用してＶｅｒｏ細胞にコトランスフェクトし、３７℃でインキュベートし、合胞体の形成について毎日観察した。合胞体の形成が＞８０％〜９０％をカバーした後にＭＶ−Ｅを培養上清から回収し、ＴＣＩＤ５０を用いて力価測定した。同時にＥＧＦＰプラスミドの発現について細胞を観察した。Ａ：ｐＵＣ−Ｐ１Ｐ−ｒｅｐ−Ｐ１Ｔ、ｐＣＤＮＡ−ＭＶゲノムおよびヘルパープラスミドバリアント１でトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞；Ｂ：ｐＩＲＥＳ−ＨＨ−ｒｅｐ−ＨＤＶ、ｐＣＤＮＡ−ＭＶゲノムおよびヘルパープラスミドバリアント１でトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、組換えタンパク質の発現またはウイルスレスキューのためのＲＤＲＰ酵素活性の細胞再構築のために容易に使用され得る発現系に関する。それは、２つのプラスミド（１．ＭＶウイルスのＮ、ＰおよびＬタンパク質を発現するヘルパープラスミドならびに２．容易に操作可能なウイルスＲＮＡまたはウイルス様ＲＮＡ分子（ミニレプリコン）を発現するクローニングプラスミド）を含む。クローニングプラスミドは、発現される標的分子をコードするＤＮＡを容易に挿入するためのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む。ここで、ＭＶおよびＲＰＶは、モデル系として使用される。
【実施例】
【００３１】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明されるが、この実施例は、請求項に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【００３２】
１．細胞およびウイルス
Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル腎臓）細胞を、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）が補充されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において単層として生育した。ＭＲＣ５細胞を、１０％ＦＣＳが補充されたＤＭＥＭにおいて単層として生育した。麻疹ウイルス（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）（ＭＶ−Ｅ）株を、Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａから購入した（ＭＶＡＣ、１０３ＴＣＩＤ５０／バイアル）。播種用ストック（ｓｅｅｄ  ｓｔｏｃｋ）を調製するために、ＶｅｒｏまたはＭＲＣ５細胞を、２５ｓｑ．ｃｍフラスコに１０５細胞／フラスコで播種し、３６時間インキュベートした。次いで、細胞をＨＢＳＳで洗浄し、０．１ＭＯＩのＭＶ−Ｅとともに播種し、無血清ＤＭＥＭを補充した。２４時間間隔でウイルスを回収した。７２時間にわたって回収されたウイルスを合わせてプールし、定量し、播種用ストックとして使用した。
【００３３】
２．プラスミド構築
２．１  クローニングプラスミド
２．１．１  レプリコン構築物のデザイン
ＭＶリーダー（ｎｔｄ１〜１０７）、ＭＶトレーラー（ｎｔｄ１５７８６〜１５８９４）およびＭＶ−Ｎタンパク質に対するタンパク質コード領域とＭＶ−Ｐタンパク質に対するタンパク質コード領域との間の遺伝子間領域（ｎｔｄ．Ｎｏ１６８６〜１８０６）を、ＧｅｎｂａｎｋからのＡＹ４８６０８４．１配列（Ｂａｒｉｃｅｖｉｃら、２００５）から選択した。レポータータンパク質として使用される緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）およびヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）に対するコード領域を、それぞれＵ５５７６２．１およびＮＭ−０００５１５．３から単離した。これらの配列のすべてを、インシリコにおいて、２つの遺伝子カセットを含むＭＶ−Ｅゲノム様レプリコンに組み立てた。ＡｆｅＩ、ＡｇｅＩ、ＡｓｃＩ、ＭｌｕＩ、ＮｒｕＩ、ＰｃｉＩ、ＳａｃＩＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、ＳｂｆＩおよびＸｂａＩに対する認識部位に対応するヌクレオチド配列を、２つのオリゴヌクレオチドに整列させて２つのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ１およびＭＣＳ２）を合成し、上記レプリコン内のＥＧＦＰおよびＨＧＨ遺伝子の近傍に挿入した。結果として、ＥＧＦＰタンパク質は、ＭＣＳ１領域内のＡｓｃＩ部位に、ＨＧＨタンパク質は、ＭＣＳ２内のＰａｃＩ部位にクローニングされたとみられた（図１Ａ）。レポーター遺伝子を含まないレプリコンの配列は、配列番号１に与えられている。
【００３４】
５’ハンマーヘッド型リボザイムに対応する配列を、Ｃｏｍｂｒｅｄｅｔら（２００３）から再構築し、上記レプリコンの５’末端に結合させた。同様に、３’デルタ肝炎ウイルスリボザイムに対する配列を、Ｗａｌｋｅｒら（２００３）から取り入れ、レプリコンの３’末端に付加することにより、ＨＨ−レプリコン−ＨＤＶ構築物（図１Ｂ；配列番号２）が生成された。
【００３５】
チャイニーズハムスターＲＮＡポリメラーゼＩ（Ｐ１Ｐ）に対するプロモーターをコードする配列を、Ｔｏｗｅｒら（１９８９）から選択し、マウスＲＮＡポリメラーゼＩターミネーター（Ｐ１Ｔ）に対するターミネーター配列を、Ｇｒｕｍｍｔら（１９８５、１９８６）によって報告された基本配列に対して選択した。そのＰ１Ｐ配列を、５’末端のすぐ上流に付加し（すぐ上流）、Ｐ１Ｔ配列をレプリコンの３’末端のすぐ下流に付加することにより、Ｐ１Ｐ−レプリコン−Ｐ１Ｔ構築物（図１Ｃ；配列番号３）を作製した。
【００３６】
２．１．２  クローニングプラスミドの合成
ＨＨ−レプリコン−ＨＤＶ（ＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間）およびＰ１Ｐ−レプリコン−Ｐ１Ｔ（ＳａｃＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間）に対応する配列を、Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｎｇ（２００４）の遺伝子合成法を使用して合成し、ｐＵＣ５７にクローニングすることにより、それぞれｐＵＣ＿ＨＨ−レプリコン−ＨＤＶおよびｐＵＣ＿Ｐ１Ｐ−レプリコン−Ｐ１Ｔを作製した。次いで、それらを、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製のｐＩＲＥＳベクターのＮｈｅＩ部位とＮｏｔＩ部位との間にサブクローニングすることにより、ｐＩＲＥＳ＿ＨＨ−レプリコン−ＨＤＶおよびｐＩＲＥＳ＿Ｐ１Ｐ−レプリコン−Ｐ１Ｔプラスミドを作製した。これらのプラスミドを、哺乳動物細胞においてＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰ）によって媒介されるＧＦＰおよびＨＧＨタンパク質の発現を試験するために使用した。
【００３７】
これらのプラスミドが、ＲＤＲＰの支配下においてＧＦＰおよびＨＧＨを発現したことを確かめた後、ＥＧＦＰおよびＨＧＨに対する遺伝子を、ＡｓｃＩおよびＰａｃＩを用いた連続的な消化およびライゲーションによって除去することにより、クローニングプラスミドの３つのバリアント（クローニングプラスミドバリアント１（ＨＨ−レプリコン−ＨＤＶ）およびクローニングプラスミドバリアント２（Ｐ１Ｐ−レプリコン−Ｐ１Ｔ）およびクローニングプラスミドバリアント３（ｐＵＣ＿Ｐ１Ｐ−レプリコン−Ｐ１Ｔ））を作製した。作製された種々のプラスミドを表１に列挙する。
【００３８】
【表１】
2014516564.tif 000002
表１：作製された種々のミニレプリコンプラスミド。番号名称説明配列番号1クローニングプラスミド１（ｐＵＣ−Ｐ１Ｐ−レプリコン−Ｐ１Ｔ）レポーター遺伝子を含まないｐＵＣ５７におけるＣＨＯ細胞ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびマウスＲＮＡポリメラーゼＩターミネーターの支配下のレプリコン配列番号６2ｐＵＣ−ＨＨ−レプリコン−ＨＤＶ５’および３’末端においてハンマーヘッド型リボザイムおよびデルタ肝炎ウイルスリボザイムに隣接し、レポーター遺伝子を含まないｐＵＣ５７ベクターにクローニングされた、レプリコン配列番号７3クローニングプラスミド２（ｐＩＲＥＳ−Ｐ１Ｐ−レプリコン−Ｐ１Ｔ）レポーター遺伝子を含まないＣｌｏｎｅｔｅｃｈ製のｐＩＲＥＳベクターのＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ部位にサブクローニングされた、ＣＨＯ細胞ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびマウスＲＮＡポリメラーゼＩターミネーターの支配下のレプリコン配列番号５4クローニングプラスミド３（ｐＩＲＥＳ−ＨＨ−レプリコン−ＨＤＶ）５’および３’末端においてハンマーヘッド型リボザイムおよびデルタ肝炎ウイルスリボザイムに隣接し、レポーター遺伝子を含まないＣｌｏｎｅｔｅｃｈ製のｐＩＲＥＳベクターのＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ部位にサブクローニングされた、レプリコン配列番号４5レポーター遺伝子を含むクローニングプラスミド１ｐＵＣ５７にクローニングされた、ＣＨＯ細胞ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびマウスＲＮＡポリメラーゼＩターミネーターの支配下の、レポーター遺伝子ｅＧＦＰおよびＨＧＨを含むレプリコン6レポーター遺伝子を含むクローニングプラスミド２Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製のｐＩＲＥＳベクターのＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ部位にサブクローニングされた、ＣＨＯ細胞ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびマウスＲＮＡポリメラーゼＩターミネーターの支配下の、レポーター遺伝子ｅＧＦＰおよびＨＧＨを含むレプリコン 配列番号Ｆ7レポーター遺伝子を含むクローニングプラスミド３５’および３’末端においてハンマーヘッド型リボザイムおよびデルタ肝炎ウイルスリボザイムに隣接し、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製のｐＩＲＥＳベクターのＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ部位にサブクローニングされた、レポーター遺伝子ｅＧＦＰおよびＨＧＨを含むレプリコン配列番号Ｇ
２．１．３  ＭＶ−Ｅゲノム全体のｃＤＮＡの合成
ＭＶ−Ｅ  ｃＤＮＡを、Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ，Ｉｎｄｉａ）から購入したあるバッチのＭＶ−Ｅワクチンから精製されたウイルス粒子からクローニングした。製造者のプロトコルに従って製造者のＲＮＡ精製キットに従うＧｅｎｅＪｅｔ  ＲＮＡ精製キット（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用して、１０５個の溶解ウイルス粒子からウイルスＲＮＡを抽出した。そのウイルスＲＮＡを、ランダムヘキサマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼを使用してｃＤＮＡに逆転写した。ウイルスゲノム全体を網羅する７つの重複ｃＤＮＡフラグメント（図３ａに示されるような）を、ＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼおよび以下のプライマーを使用するＰＣＲによって作製した。
【００３９】
（１）５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＡＡＡＣ−３’；（２）５’−ＣＣＴＧＡＣＣＧＣＧＧＡＴＧＣ−３’；（３）５’−ＡＣＣＴＣＧＣＡＴＣＣＧＣＧＧ−３’；（４）５−ＣＣＴＣＣＡＧＡＧＴＡＡＴＣＧＡＴＴＡＡＧＧ−３’；（５）５’−ＡＡＴＣＧＡＴＴＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧ−３’；（６）５’−ＣＴＴＧＣＡＣＣＣＴＡＡＧＴＴＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＡＣ−３’；（７）５’−ＧＡＡＣＡＡＴＡＴＣＧＧＴＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＣ−３’；（８）５’−ＴＧＡＧＧＧＡＣＴＣＧＡＧＣＡＴＡＣＴＣ−３’；（９）５’−ＡＴＡＡＧＡＴＡＧＴＡＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＡＴ−３’；（１０）５’−ＧＴＡＧＧＧＣＣＡＴＧＴＧＣＴＧＧＧ−３’；（１１）５’−ＣＡＴＡＧＣＣＧＴＡＡＣＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＣ−３’；（１２）５’−ＧＡＧＣＡＴＣＡＡＧＴＧＡＡＧＧＡＣＣＡＴＧ−３’；（１３）５’−ＧＣＡＴＴＧＴＧＧＴＡＴＴＡＴＡＧＡＧＣＣＴＡＴＣ−３’；（１４）５’−ＣＧＧＴＴＴＡＡＡＣＣＡＧＡＣＡＡＡＧＣＴＧ−３’
プラスミドｐＣＤＮＡ３．１（−）のマルチクローニングサイトを、ＮｈｅＩおよびＰｍｅＩを用いた消化によって除去し、それを、ＮｈｅＩ−ＮｏｔＩ−ＰａｃＩ−ＰｍｅＩ部位を含むリンカーｐＣＤＮＡ−Ｎｏｔ＿Ｐａｃ＿Ｐｍｅで置き換えた。種々のプライマー対７、８（ＰａｃＩ、ＸｈｏＩ）、９、１０（ＸｈｏＩ、ＫｐｎＩ）、１１、１２（ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ）および１３、１４（ＮｃｏＩ、ＰｍｅＩ）を使用することによってフラグメントを作製し、ＰａｃＩ−ＰｍｅＩで消化されたｐＣＤＮＡ−Ｎｏｔ＿Ｐａｃ＿Ｐｍｅにライゲートすることにより、ｐＣＤＮＡ＿Ｎｏｔ＿Ｐａｃ＿ＭＶｇ＿Ｐｍｅと呼ばれる、ＭＶ−ＥアンチゲノムのＰａｃＩから３’末端までのヌクレオチドを含むプラスミドを作製した。他の３つの対１、２（ＮｏｔＩ、ＳａｃＩＩ）、３、４（ＳａｃＩＩ、ＣｌａＩ）、５、６（ＣｌａＩ、ＰａｃＩ）によって作製されたフラグメントを、ＮｏｔＩ−ＰａｃＩで消化されたｐＣＤＮＡ＿Ｎｏｔ＿Ｐａｃ＿ＭＶｇ＿Ｐｍｅプラスミドにライゲートすることにより、ｐＣＤＮＡ＿ＭＶゲノムを作製した（図３ｂ）。
【００４０】
２．２  ヘルパープラスミド
ＧｅｎｅＪｅｔ  ＲＮＡ精製キット（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を製造者のプロトコルに従って使用して、Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ，Ｉｎｄｉａ）から購入した精製されたＭＶ−ＥウイルスからＲＮＡを調製した。１μｇのＲＮＡを、ランダムヘキサマーを使用して逆転写し、標準的な分子クローニング法を使用して、Ｍａｒｔｉｎら（２００６）およびＣｏｍｂｒｅｄｅｔら（２００３）によって報告されているように、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、Ｎ（Ｆ：５’−ＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＣＴＴＴＴＡＡＧＧ−３’およびＲ  ５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＴＴ−３’）、Ｐ（Ｆ  ５’−ＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＡＧＧ−３’、Ｒ  ５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＣＴＴＣＡＴＴＡＴＴＡＴＣ−３’）およびＬ（Ｆ  ５’−ＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＡＣＴＣＧＣＴＡＴＣＴＧＴＣＡＡＣ−３、Ｒ  ５−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＴＣＣＴＴＡＡＴＣＡＧ−３）タンパク質コード領域に特異的なプライマーを使用して増幅した。増幅されたｃＤＮＡを、ｐＩＲＥＳベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）のＮｈｅＩ部位とＮｏｔＩ部位との間にクローニングすることにより、ｐＩＲＥＳ＿Ｎ、ｐＩＲＥＳ＿ＰおよびｐＩＲＥＳ＿Ｌプラスミドを作製した。
【００４１】
２．２．１  ヘルパープラスミドバリアント１の合成
Ｎタンパク質遺伝子を、ｐＩＲＥＳ＿Ｎから増幅し、ｐＢｉＣＭＶ１のＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ部位にサブクローニングすることにより、ｐＢｉＣＭＶ＿Ｎプラスミドを作製した。次いで、Ｐタンパク質配列を増幅し、ＮｈｅＩおよびＥａｇＩ部位にクローニングすることにより、ｐＢｉＣＭＶ＿ＮＰ構築物を作製した。次いで、Ｌタンパク質配列を、ｐＢｉＣＭＶ＿ＮＰプラスミドのＥａｇＩおよびＳａｌＩ部位にサブクローニングすることにより、ｐＢｉＣＭＶ＿ＮＰＬプラスミドを作製した。このプラスミドは、二方向性ＣＭＶプロモーターを含み、ＮおよびＰタンパク質を発現し得る。しかしながら、Ｌ配列は、ＰとともにバイシストロニックＲＮＡとして転写され、翻訳されない。ゆえに、Ｃｈａｐｐｅｌｌら（２０００）によって初めて報告され、後にＴｏｕｚｌｅｔら（２００８）によって効率的な翻訳を促進すると確かめられた哺乳動物ベータグロビンＩＲＥＳエレメント（ｉｒｅｓ）を、Ｌコード領域のすぐ上流に挿入した。５’末端においてＥａｇＩに対する部位および３’末端においてＬタンパク質の最初の１０ヌクレオチドに隣接した五量体ＩＲＥＳエレメントをコードするオリゴヌクレオチド（５’ＧＧＣＣＧＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣＧＧＣＧＧＧＴＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣＧＧＣＧＧＧＴＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣＧＧＣＧＧＧＴＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣＧＧＣＧＧＧＴＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣＧＧＣＧＧＧＴＧＡＣＴＣＡＣＡＡＣＧＧＡＴＣＣＡＡＣＡＧＡＣＡＴＡＴＧＧＡＣＴＣＧＣ３’）を合成し、部位特異的突然変異誘発によってｐＢｉＣＭＶ＿ＮＰＬに挿入することにより、ヘルパープラスミドバリアント１（ＨＰＶ１）（配列番号８）とも呼ばれるｐＢｉＣＭＶ＿ＮＰｉｒｅｓＬプラスミドを作製した。
【００４２】
２．２．２  ヘルパープラスミドバリアント２の合成
Ｎタンパク質配列を、増幅し、ＮｈｅＩ部位とＸｈｏＩ部位との間にサブクローニングすることにより、ｐＩＲＥＳ＿Ｎを得た。次いで、Ｐタンパク質配列を、ｐＩＲＥＳ＿Ｐから増幅し、ＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩ部位にクローニングすることにより、ｐＩＲＥＳ＿ＮＰを作製した。最後に、Ｌ配列を、ｐＩＲＥＳ＿Ｌから増幅し、ＳａｌＩ部位とＮｏｔＩ部位との間のｐＩＲＥＳ＿ＮＰにクローニングすることにより、ｐＩＲＥＳ＿ＮＰＬを得た。この形式では、このプラスミドは、ＮおよびＬタンパク質を発現するが、Ｐを発現しない。ゆえに、最近報告された２Ａペプチドベクターに基づくストラテジーを用いることにより、Ｐタンパク質の発現を促進した（ｓｚｙｍｃｚａｋ  ａｎｄ  Ｖｉｇｎａｌｉ（２００５））。５’末端においてＭＶ  Ｎタンパク質の終止コドンの直前のコドンに隣接し、３’末端においてＭＶ  Ｐタンパク質の最初の数コドンに隣接する、Ｓｚｙｍｃｚａｋら（２００７）によって報告されたブタテッショウウイルス２Ａペプチドをコードするオリゴヌクレオチド（５’ＡＴＣＴＴＣＴＡＧＡＣＧＧＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＴＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＣＧＧＴＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＡ３’）を部位特異的突然変異誘発によって挿入することによって、ｐＩＲＥＳ＿ＮＰＬのＮおよびＰのオープンリーディングフレームを融合し、それにより、ＮおよびＰタンパク質領域が単一のＮ２ＡＰ融合タンパク質に融合され、ヘルパープラスミドバリアント２（ＨＰＶ２）（配列番号９）とも呼ばれるｐＩＲＥＳ＿Ｎ２ａＰＬプラスミドが得られた。
【００４３】
プラスミドＨＰＶ１（ｐＢｉＣＭＶ＿ＮＰｉｒｅｓＬ）およびＨＰＶ２（ｐＩＲＥＳ＿Ｎ２ａＰＬ）を図４に模式的に表す。
【００４４】
２．２．３  他のマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＮ、ＰおよびＬタンパク質をコードする等価なヘルパープラスミドの合成
次いで、これらのヘルパープラスミドを作製するために使用されたクローニングストラテジーを、他のマイナス鎖ＲＮＡウイルス（主に、ＭＶ、牛疫（ＲＰＶ）、小反芻動物病（ＰＰＲＶ）、イヌジステンパー（ＣＤＶ）、ニューカッスル病（ＮＤＶ）およびセンダイウイルス（ＳｅＶ））に対するその適用性について試験した。ヌクレオカプシド、リンタンパク質および巨大タンパク質のコード領域を、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＮｈｅＩ、ＥａｇＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、ＭｌｕＩおよびＮｏｔＩの存在について解析した。
【００４５】
ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩに対する部位は、ＭＶおよびＣＤＶのヌクレオカプシドタンパク質に存在しなかった。同様に、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩに対する部位は、ＭＶおよびＳｅＶのヌクレオカプシドタンパク質に存在しなかった。しかしながら、他のウイルスのヌクレオカプシドでは、酵素ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩに対する様々な数の部位が検出された（表２）。
【００４６】
【表２】
2014516564.tif 000003
表２：様々なマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＮタンパク質におけるＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩに対する部位の存在。ウイルスＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＥｃｏＲＩＰｓｔＩＮｈｅＩＸｈｏＩＭＶＡＹ４８６０８４．１００００ＲＰＶＡＢ５４７１９０．１１３１０ＰＰＲＶＨＱ１９７７５３．１０２０１ＣＤＶＡＢ６８７７２１．２０１２０ＮＤＶＨＱ００８３３７．１００１２SENDAIＮＣ＿００１５５２．１０１００
酵素ＥａｇＩ、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩに対する部位は、ＭＶ、ＰＰＲＶ、ＣＤＶおよびＮＤＶのＬタンパク質には存在しなかった。ＲＰＶおよびＳｅＶは、それらのＬタンパク質にＳａｌＩに対する１つの部位を含んだ（表３）。
【００４７】
【表３】
2014516564.tif 000004
表３：様々なマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＬタンパク質におけるＥａｇＩ、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩに対する部位の存在ウイルスＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＥａｇＩＳａｌＩＮｏｔＩＭＶＡＹ４８６０８４．１０００ＲＰＶＡＢ５４７１９０．１０１１ＰＰＲＶＨＱ１９７７５３．１０００ＣＤＶＡＢ６８７７２１．２０００ＮＤＶＨＱ００８３３７．１０００SENDAIＮＣ＿００１５５２．１０１１
しかしながら、これらの両方のタンパク質に対する遺伝子の各々が、単一のタンパク質をコードする。ゆえに、それらのタンパク質のコード領域に同義変異を作製することおよびこれらの制限酵素に対する部位を除去することが容易に可能であり得る。ゆえに、同じクローニングストラテジーを使用することにより、ヘルパープラスミドバリアント１またはヘルパープラスミドバリアント２と類似のヘルパープラスミド構築物にヌクレオカプシドおよび巨大タンパク質のコード領域を容易にクローニングすることができる。
【００４８】
上記の結果と同様に、これらのウイルスのリンタンパク質のコード領域の解析から、酵素ＮｈｅＩ、ＥａｇＩ、ＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩに対する様々な数の部位の存在が明らかになった（表４）。これらの酵素に対する部位は、ＭＶ、ＣＤＶおよびＮＤＶのリンタンパク質のコード領域には存在しなかった。
【００４９】
【表４】
2014516564.tif 000005
表３：様々なマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＰにおけるＮｈｅＩ、ＥａｇＩ、ＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩに対する部位の存在。ウイルスＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮｈｅＩＥａｇＩＥｃｏＲＩＭｌｕＩＭＶＡＹ４８６０８４．１００００ＲＰＶＡＢ５４７１９０．１１１３０ＲＰＶＺ３０６９７．２００００ＰＰＲＶＨＱ１９７７５３．１００１０ＣＤＶＡＢ６８７７２１．２００００ＮＤＶＨＱ００８３３７．１００００SENDAIＮＣ＿００１５５２．１００１０
ＲＰＶのＰタンパク質（ＡＢ５４７１９０）配列は、ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩによって消化されるが、これらの酵素の認識部位に対応する領域は、ＲＰＶの種々の株（例えば、ＧｅｎｂａｎｋにおけるＺ３０６９７．２）ごとに異なる。他方、ＰＰＲＶのＰタンパク質におけるＥｃｏＲＩ部位は、ほとんどのＰＰＲＶ株において高度に保存されているとみられる。しかしながら、Ｐタンパク質のコード配列のこの領域は、Ｐ遺伝子転写物によってもコードされるＣおよびＶタンパク質のコード領域と重複していない。したがって、ＭＶ、ＣＤＶ、ＲＰＶ、ＰＰＲＶおよびＮＤＶに対するヘルパープラスミドを調製するために本発明者らが提案するストラテジーを使用することを可能にする、ＲＰＶおよびＰＰＲＶのＰタンパク質に同義変異を導入することが可能であり得る。
【００５０】
ゆえに、同じ制限酵素を使用することにより、ヘルパープラスミドバリアント１およびヘルパープラスミドバリアント２として記載されているものと等価なヘルパープラスミド構築物が、他のマイナス鎖ＲＮＡウイルスのヌクレオカプシド（ＮまたはＮＰ）、リンタンパク質（Ｐ）および巨大（Ｌ）タンパク質から合成され得る。そのようなバリアントは、対応するウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素を再構成するためおよびタンパク質またはＲＮＡの発現のためにそれを利用するため、ならびにまた、新規ワクチンおよび／または治療薬として組換えウイルスを作製するための、ヘルパープラスミドとして有用であり得る。
【００５１】
３．プラスミドによってコードされるＲＤＲＰによる組換えタンパク質の発現
第１に、クローニングプラスミドが、ＭＶのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰ）に対する基質として働き得るＲＮＡ分子を発現する能力を、Ｍａｒｔｉｎら（２００６）によって報告された系と類似の系を使用して評価した。簡潔には、Ｖｅｒｏ細胞を、製造者のプロトコルに従って、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、クローニングプラスミドならびにＭＶ−ＥのＮ、ＰおよびＬタンパク質を発現する個別のプラスミドによって１：１：１：０．５の比でトランスフェクトした。細胞を３７℃、５％ＣＯ２において４８時間インキュベートし、顕微鏡観察によっておよびマイクロプレートリーダーを使用した蛍光測定によって緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の発現について評価した。
【００５２】
その後の実験では、Ｖｅｒｏ細胞を、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｘｆｅｃｔ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）において、等割合の１つのクローニングプラスミド（ｐＵＣ−Ｐ１Ｐ−レプリコン−Ｐ１ＴまたはｐＩＲＥＳ−ＨＨ−レプリコン−ＨＤＶまたはｐＩＲＥＳ−Ｐ１Ｐ−レプリコン−Ｐ１Ｔ）および１つのヘルパープラスミド（ヘルパーバリアント１またはヘルパーバリアント２）でトランスフェクトし、３７℃、５％ＣＯ２において４８時間インキュベートし、顕微鏡観察および蛍光によって緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の発現について評価した。
【００５３】
４．ＭＶ−Ｅのレスキュー
ヘルパープラスミドがｃＤＮＡからＭＶ−Ｅをレスキューする能力を試験した。プラスミドｐＣＤＮＡ＿ＭＶゲノムを、Ｘｆｅｃｔを使用してＶｅｒｏ細胞においてヘルパープラスミドバリアント１またはヘルパープラスミドバリアント２とコトランスフェクトし、３７℃において一晩インキュベートした。トランスフェクション培地を新鮮培地に置き換え、細胞をさらに２日間インキュベートした。合胞体が細胞層の８０％〜９０％に及んだら、感染細胞を掻き取り、細胞および培地を凍結融解し、遠心分離して、細胞残屑を除去することによって、ウイルスを回収した。ＴＣＩＤ５０力価測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）法を用いて、回収されたウイルスの力価測定を行った。簡潔には、Ｖｅｒｏ細胞を、９６ウェルプレートに播種し（７５００細胞／ウェル）、５％ＤＣＳを含むＤＭＥＭにおけるウイルスサンプルの１：１０段階希釈物によって感染させた。３７℃での７日間のインキュベーションの後、細胞をクリスタルバイオレットで染色し、試験単位の５０％を感染させたウイルス希釈を測定した。組織培養感染量として記載される５０％エンドポイント（ＴＣＩＤ５０）をＫａｂｅｒ法によって計算した。ｐＣＤＮＡ＿ＭＶゲノム＋ヘルパープラスミドからレスキューされたウイルスは、１０６〜１０７ＴＣＩＤ５０／ｍＬの力価を有した。
【００５４】
５．プラスミドによってコードされるＲＤＲＰを使用した断片化ＭＶ−Ｅのレスキュー
ヘルパープラスミドが、断片化された組換えＭＶ−ＥをｃＤＮＡからレスキューする能力を試験した。Ｖｅｒｏ細胞を、Ｘｆｅｃｔを使用して、ｐＣＤＮＡ＿ＭＶゲノム、ｅＧＦＰをコードするクローニングプラスミドおよびＨＰＶ１またはＨＰＶ２を等割合でコトランスフェクトし、３７℃で一晩インキュベートした。トランスフェクション培地を新鮮培地で置き換え、合胞体の形成について毎日観察しながらインキュベートを続けた。合胞体が細胞層の８０％〜９０％に及んだら、感染細胞を掻き取り、細胞および培地を凍結融解し、遠心分離して、細胞残屑を除去することによって、ウイルスを回収した。ＴＣＩＤ５０力価測定法を用いて、回収されたウイルスの力価測定を行った。簡潔には、Ｖｅｒｏ細胞を、９６ウェルプレートに播種し（７５００細胞／ウェル）、５％ＤＣＳを含むＤＭＥＭにおけるウイルスサンプルの１：１０段階希釈物によって感染させた。３７℃での７日間のインキュベーションの後、細胞をクリスタルバイオレットで染色し、試験単位の５０％を感染させたウイルス希釈を測定した。組織培養感染量として記載される５０％エンドポイント（ＴＣＩＤ５０）をＫａｂｅｒ法によって計算した。最初にトランスフェクトされた細胞からレスキューされたウイルスは、１０６〜１０７ＴＣＩＤ５０／ｍＬの力価を有した。最初にトランスフェクトされたｖｅｒｏ細胞から回収されたウイルスに感染した細胞もまた、ｅＧＦＰを発現したことから、ｅＧＦＰをコードするミニレプリコンがＭＶ−Ｅゲノムとともにビリオンに首尾よくパッケージングされ、それが新しい細胞に移入したことが示唆される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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