(57)【要約】本願は、損なわれた骨折治癒、例えば、非限定的に、癒合不能骨折、変形癒合骨折又は癒合遅延骨折などにおける治療的及び／又は予防的介入のための、インターロイキン８（ＩＬ−８又はＣＸＣＬ８）、ＩＬ−８の機能的フラグメント、ＩＬ−８の機能的変異体及びＩＬ−８受容体のアゴニストからなる群より選択される１つ又は複数の医薬的活性成分を含む組成物を教示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
損なわれた骨折治癒の処置における使用のための、インターロイキン８（ＩＬ−８）、ＩＬ−８の機能的フラグメント、ＩＬ−８の機能的変異体及びＩＬ−８受容体のアゴニストからなる群より選択される１つ又は複数の医薬的活性成分を含む組成物。
【請求項２】
損なわれた骨折治癒が、癒合不能骨折、変形癒合骨折及び癒合遅延骨折からなる群より選択される、請求項１記載の使用のための組成物。
【請求項３】
医薬的活性成分がＩＬ−８ペプチド又はその機能的変異体であり、ＩＬ−８ペプチドが配列番号１又は配列番号２より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は２記載の使用のための組成物。
【請求項４】
組成物が、さらに、ゲル形成材料を含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の使用のための組成物。
【請求項５】
ゲル形成材料が、コラーゲン、グリセリド、グリコサミノグリカン、多糖類、ゼラチン、ポリ乳酸又はポリ乳酸グリコール酸である、請求項４記載の使用のための組成物。
【請求項６】
ゲル形成材料が、コラーゲンであり、医薬的活性成分が、配列番号１又は配列番号２より選択されるアミノ酸配列を含むＩＬ−８ペプチドである、請求項４記載の使用のための組成物。
【請求項７】
組成物が、経皮的に、好ましくは経皮的注射により投与される、請求項１〜６のいずれか一項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、医学的分野における、より正確には新たな治療的標的、薬剤及び方法、特に、例えば、限定せず、癒合不能骨折、変形癒合骨折又は癒合遅延骨折などの損なわれた骨折治癒の処置において有用な標的、薬剤及び方法の分野における。本発明は、また、損なわれた骨折治癒の処置において有用な標的のレベル及び／又は活性を調節する薬剤を同定するための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
【０００３】
損なわれた骨折治癒は、限定を伴わず、変形癒合、癒合遅延、及び癒合不能を含む、例えば不適当な、遅延した、又は非存在の骨折治癒などの骨折治癒の任意の異常及び欠陥を包含する。癒合不能骨折は、また、癒合不能（ＮＵ）として公知であり、とりわけ、堅固な癒合不能及び不安定な癒合不能（偽関節）を含み、自然治癒の希望を伴わない、骨折修復過程の不全により特徴付けられる。報告された癒合不能率は、著者に依存し、全骨折の２%〜１０%の間で変動する（Gaston et al. J. Bone Joint Surg. Br., 2007, vol. 89(12), 1553-1560；Tzioupis and Giannoudis. Injury, 2007, vol. 38 Suppl 2, S3-S9）。癒合不能は、骨断片部位が血管である場合、肥大性又は貧栄養性として分類されうる。肥大性癒合不能は、通常、骨折部位での不安定性により説明される。貧栄養性癒合不能は、典型的には、骨折部位の主要な変位後に生じ、仮骨の非存在により示される通り不適当な治癒反応を提示する。萎縮性として分類される癒合不能において、骨断片は、無血管性、低回転性であり、生物学的反応が不可能である（Frolke et al. Injury, 2007, vol. 38 Suppl 2, S19-S22）。
【０００４】
変形癒合は、以前に断片化された骨の不完全な癒合により特徴付けられる。癒合遅延は、治癒が予定時間中に生じていない、転帰が不確かなままである骨折として定義することができる。
【０００５】
正常な治癒過程において、骨折は、損傷した骨をその本来の状態に回復することができる、一連の炎症、修復及び再造形を惹起する。ヒトにおいて、炎症段階は、約５〜７日続き、血腫の発生を伴い開始し、炎症細胞の浸潤が続く。これらの細胞は、局所細胞との関連において、サイトカイン、ケモカイン及び成長因子を分泌し、修復過程を惹起するために必須である、骨形成前駆細胞及び内皮前駆細胞の動員を促進する（Einhorn. Clin. Orthop. Relat. Res., 1998, vol. 355 Suppl: S7-21）。前駆細胞の動員は４段階：骨折部位への細胞の移行、移動、浸潤及び生着に分けられる。とりわけ、上の過程の任意の１つ又は複数の障害は、損なわれた骨折治癒をもたらしうる。
【０００６】
損なわれた骨折治癒の処置は、典型的には、例えば、感染の除去、骨折断片の間からの瘢痕組織の除去、骨固定デバイス（例えば金属プレート、ロッド、ピン、釘、ワイヤなど）、創外固定器又はイリザロフデバイスを使用した骨折の固定化、ギャップ補充材料の導入及び／又は骨移植片の挿置（例えば海綿又は皮質海綿骨移植など）を含む又はそれらから選ばれる整形外科的な外科的介入に頼る。これらの外科的介入は、長期間の高額な入院に導く、重度の有害事象に関連付けられうる。さらに、極端な措置である切断が、機能的な肢を達成することができない場合、正当化されうる。従って、骨折治癒を刺激するための新規の非侵襲的で安全な治療についての必要性がある。
【０００７】
損なわれた骨折治癒の処置への医薬的又は生物学的アプローチは、せいぜいわずかである。局所的な生物学的刺激治療は、局所的な幹細胞（主に骨髄由来幹細胞）注射、成長因子注射又は多血小板血漿注射を含む。成長因子のインサイチュ注射が有望である。例えば、Dimitriou et al. Injury, 2005, vol. 36, suppl.4, S51-9は、持続性の骨折癒合不能の処置における骨刺激薬剤としての組換え骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）の有効性及び安全性を評価した。Calori et al. Injury, 2008, vol. 39, 1391-402は、持続性の長骨癒合不能の処置において、骨刺激薬剤としての組換えＢＭＰ−７の適用が、それらの臨床的及び放射線学的な有効性に関して、多血小板血漿のものと比較し、優れていると結論付けた。ＢＭＰ−２は、また、骨修復を増強することが臨床治験において証明されている（Govender et al. J. Bone Joint Surg. Am., 2002, vol. 84, 2123-34）。その上、これらの分子が既にクリニックにおいて使用されている場合、それらは、例えば異所性骨形成又は過剰な軟部組織腫脹などの有害事象に関連付けられることがあり、高価な治療的薬剤である。いくつかの前臨床報告が、骨折治癒に対するＰＤＧＦ処置の有益な効果を示している。例えば、Hollinger et al.は、ＰＤＧＦの局所注射を受けた患者における増強した骨折治癒を示している（J. Bone Joint Surg. Am., 2008, vol. 90, Suppl 1: 48-54）。さらに、前向き無作為化対照臨床治験では、Augment（商標）Bone Graft（ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ／β−ＴＣＰ）が足及び足首固定手術において自家移植片と同程度であったことが示されている。その上、他の試験は、長骨癒合不能における単離された経皮的血小板ゲル補給の臨床的な有用性を示すことに失敗してきた（Mariconda et al. J. Orthop Trauma, 2008, vol. 22(5), 342-5）。従って、新たな分子を研究し、骨折治癒を増強し、患者ケアを増強し、長期的な入院の費用を低下させる必要がある（Marsell et al. J. Orthop Trauma, 2010, vol. 24, S4-S8）。
【０００８】
結果的に、癒合不能骨折の処置において有用な、追加の、好ましくは改善された治療的標的、薬剤、及び方法についての継続的な必要性が存在する。標的は、例えば、タンパク質又はポリペプチドなどの生物学的分子を含みうる。
【０００９】
発明の概要
広範な実験及びテストを行ってきたため、本発明者らは、そのレベルが、健常被験者と比較し、骨折の損なわれた治癒において有意に変化し、このように、損なわれた骨折治癒における予防的及び／又は治療的介入のための有用で有望な標的を構成する生物学的分子を同定した。同義の語句「損なわれた骨折治癒」又は「損なわれた骨折治癒」は、本明細書において使用する通り、骨折治癒の任意の奇形、異常、及び欠陥（例えば不適当な、遅延した、又は非存在の骨折治癒など）を包含する。語句は、具体的には、変形癒合、癒合遅延、及び癒合不能を含み、好ましくは、それらを表示し、より好ましくは、とりわけ、堅固な癒合不能及び不安定な癒合不能（偽関節）を含む癒合不全を表示することを意図する。
【００１０】
これらの知見を拡大しながら、本発明者らは、ストローマ由来因子１（ＳＤＦ−１又はＣＸＣＬ１２）、ＳＤＦ−１受容体、インターロイキン８（ＩＬ−８又はＣＸＣＬ８）、ＩＬ−８受容体、インターロイキン６（ＩＬ−６）又はＩＬ−６受容体を、損なわれた骨折治癒における治療的及び／又は予防的介入のための貴重な標的として認識した。本発明者らは、このように、また、これらの分子を、任意の骨折の処置における治療的及び／又は予防的介入のための有用な標的として熟慮する。
【００１１】
本発明者らは、ＳＤＦ−１、ＳＤＦ−１受容体（好ましくは、ＣＸＣＲ４及びＣＸＣＲ７の任意の１つ又は両方）、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体（好ましくは、ＣＸＣＲ１及びＣＸＣＲ２の任意の１つ又は両方）、ＩＬ−６及び／又はＩＬ−６受容体（ＣＤ１２６）のレベル及び／又は活性を、損なわれた骨折治癒に苦しむ被験者において又は任意の骨折を有する被験者において調節することが、そのような被験者を処置するための貴重な選択肢を構成することを理解した。本発明者らは、さらに、損なわれた骨折治癒を処置する際に又は骨折を処置する際に有用なそれらの薬剤を提供又は選択するために、ＳＤＦ−１、ＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−６及び／又はＩＬ−６受容体のレベル及び／又は活性を調節することが可能な薬剤についてスクリーニングし、それらを同定することの重要性を認識した。
【００１２】
広範な研究に続き、本発明者らは、ＩＬ−８、ＩＬ−８の機能的フラグメント、ＩＬ−８の機能的変異体及びＩＬ−８受容体のアゴニストからなる群より選択される１つ又は複数の医薬的活性成分を含む組成物を、損なわれた骨折治癒を処置するための有用な選択肢として認識した。
【００１３】
このように、とりわけ、以下の局面及び実施態様を、本発明に従って提供する：
【００１４】
ＳＤＦ−１、ＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−６及びＩＬ−６受容体からなる群より選択される任意の１つ又は複数の核酸もしくはタンパク質のレベル及び／又は活性を、医薬としての使用のために調節（例えば増加又は低下など）することができる薬剤。
【００１５】
ＳＤＦ−１、ＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−６及びＩＬ−６受容体からなる群より選択される任意の１つ又は複数の核酸もしくはタンパク質のレベル及び／又は活性を、損なわれた骨折治癒の処置における使用のために又は骨折の処置における使用のために調節（例えば増加又は低下など）することができる薬剤。語句「の処置における使用のため」は、語句「を処置する際での使用のため」及び「の処置のための方法における使用のため」と同義として意図する。
【００１６】
ＳＤＦ−１、ＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−６及びＩＬ−６受容体からなる群より選択される任意の１つ又は複数の核酸もしくはタンパク質のレベル及び／又は活性を、損なわれた骨折治癒の処置のための又は骨折の処置のための医薬の製造のために調節（例えば増加又は低下など）することができる薬剤の使用。
【００１７】
ＳＤＦ−１、ＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−６及びＩＬ−６受容体からなる群より選択される任意の１つ又は複数の核酸もしくはタンパク質のレベル及び／又は活性を、損なわれた骨折治癒の処置のために又は骨折の処置のために調節（例えば増加又は低下など）することができる薬剤の使用。
【００１８】
そのような処置の必要がある被験者において損なわれた骨折治癒を処置するため又はそのような処置の必要がある被験者において骨折を処置するための方法であって、前記被験者に、ＳＤＦ−１、ＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−６及びＩＬ−６受容体からなる群より選択される任意の１つ又は複数の核酸もしくはタンパク質のレベル及び／又は活性を調節（例えば増加又は低下など）することができる薬剤の治療的又は予防的に効果的な量を投与することを含む方法。
【００１９】
テスト薬剤の群から、損なわれた骨折治癒の処置において又は骨折の処置において潜在的に有用な候補薬剤を選択又は単離するためのアッセイであって、前記アッセイが、テスト薬剤が、ＳＤＦ−１、ＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−６及びＩＬ−６受容体からなる群より選択される任意の１つ又は複数の核酸もしくはタンパク質のレベル及び／又は活性を調節（例えば増加又は低下など）することができるか否かを決定することを含むアッセイ。
【００２０】
テスト薬剤の群から、損なわれた骨折治癒の処置において又は骨折の処置において潜在的に有用な候補薬剤を選択又は単離するためのアッセイであって、前記アッセイが、テスト薬剤が、ＳＤＦ−１、ＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−６及びＩＬ−６受容体からなる群より選択される任意の１つ又は複数の核酸もしくはタンパク質に特異的に結合することができるか否かを決定することを含むアッセイ。そのような結合薬剤は、それぞれの核酸又はタンパク質を調節するために特に適しうる又は有望でありうる。
【００２１】
損なわれた骨折治癒の非ヒト動物モデルへの、好ましくは、非ヒト哺乳動物モデルへの投与のための組成物の調製のための選択又は単離された薬剤の使用ならびにそれにおいてその予防的及び／又は治療的効果をモニターすることをさらに含む、上記のアッセイの任意の１つ。
【００２２】
上記のアッセイにより選択又は単離された薬剤。
【００２３】
上記のアッセイにより選択又は単離された１つ又は複数の薬剤又は薬学的に許容可能なＮオキシド形態、付加塩、プロドラッグもしくはその溶媒和物の予防的及び／又は治療的に効果的な量、ならびに、薬学的に許容可能な担体の１つ又は複数をさらに含む医薬組成物又は製剤。
【００２４】
前記の１つ又は複数の薬剤を、前記の１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体と混合することを含む、上記の医薬組成物又は製剤を産生するための方法。
【００２５】
好ましくは、本発明の局面は、損なわれた骨折治癒の処置における使用のための、ＩＬ−８、ＩＬ−８の機能的フラグメント、ＩＬ−８の機能的変異体及びＩＬ−８受容体のアゴニストからなる群より選択される１つ又は複数の医薬的活性成分を含む、それから本質的になる、又はなる組成物に関する。
【００２６】
損なわれた骨折治癒の処置における使用のための本明細書において定義する通りの組成物が有利であり、とりわけ、なぜなら、これらの組成物は、例えば癒合不能骨折などの損なわれた骨折治癒の効率的な処置を許すからである。さらに、そのような組成物は、有利には、経皮投与を許し、それにより、侵襲的な外科介入についての必要性を克服する。故に、本組成物は、有利には、損なわれた骨折治癒の処置における増加した患者のコンプライアンスを提供する。
【００２７】
上に言及する通り、正常な骨治癒過程において、骨折は、損傷した骨をその本来の状態に回復することができる、一連の炎症、修復及び再造形を惹起する。しかし、損なわれた骨折治癒を伴う患者において、これらの骨折修復過程は非存在であり、患者は自然に治癒しない。その治癒が正常に進行する骨折と、例えば癒合不能骨折などの損なわれた骨折治癒の間の違いに起因して、本明細書において定義する通りの組成物が、例えば癒合不能骨折などの損なわれた骨折治癒の処置を許すことは予想外である。
【００２８】
また、特定の実施態様において提供するのは、損なわれた骨折治癒の処置のための医薬の製造のための、ＩＬ−８、ＩＬ−８の機能的フラグメント、ＩＬ−８の機能的変異体及びＩＬ−８受容体のアゴニストからなる群より選択される１つ又は複数の医薬的活性成分を含む、それから本質的になる、又はなる組成物の使用である。そのような処置は、典型的には、組成物の経皮投与を含みうる。
【００２９】
さらに、特定の実施態様において提供するのは、損なわれた骨折治癒の処置のための、ＩＬ−８、ＩＬ−８の機能的フラグメント、ＩＬ−８の機能的変異体及びＩＬ−８受容体のアゴニストからなる群より選択される１つ又は複数の医薬的活性成分を含む、それから本質的になる、又はなる組成物の使用である。
【００３０】
また、特定の実施態様において意図するのは、そのような処置の必要がある被験者において損なわれた骨折治癒を処置するための方法であって、前記被験者に、ＩＬ−８、ＩＬ−８の機能的フラグメント、ＩＬ−８の機能的変異体及びＩＬ−８受容体のアゴニストからなる群より選択される１つ又は複数の医薬的活性成分を含む、それから本質的になる、又はなる組成物の治療的又は予防的に効果的な量を投与することを含む方法である。
【００３１】
好ましい実施態様において、損なわれた骨折治癒は、癒合不能骨折、変形癒合骨折及び癒合遅延骨折からなる群より選択されうる。
【００３２】
１つ又は複数の医薬的に活性な成分が、単離されうる、又は、組換え（好ましくは天然ヒト）ＩＬ−８（ＣＸＣＬ−８）、単離もしくは組換え（好ましくは天然ヒト）ＩＬ−８ペプチド、又はその機能的変異体でありうる。例えば、１つ又は複数の医薬的に活性な成分は、ヒト組換えＩＬ−８ペプチド、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有する７７アミノ酸のＩＬ−８ペプチド、配列番号２のアミノ酸配列を有する７２アミノ酸のＩＬ−８ペプチド、又は、Lindley et al. PNAS, 1988, vol. 85(23), 9199-9203により記載される通りに大腸菌から精製された７８アミノ酸のＩＬ−８ペプチドなどでありうる。
【００３３】
特定の実施態様において、１つ又は複数の医薬的活性成分は、ＩＬ−８ペプチド又はその機能的変異体でありうるが、それにおいて、ＩＬ−８ペプチドは、配列番号１又は配列番号２から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３４】
特定の実施態様において、本組成物は、さらに、ゲル形成材料を含みうる。用語「ゲル形成」、「１相」又は「単相」は、本明細書において互換的に使用することができる。用語「ゲル形成材料」は、本明細書を通して意図する通り、固体の、ゼリー状構造（ゲル）を形成する又は形成することが可能な材料を包含する。ゲル形成材料は、それ自体がゲルでありうる、あるいは、ゲル形成材料は、ゲルではなく（例、液体又は固体である）、ゲル形成を促す材料及び／又は条件（例えば、非限定的に、適切な液相中に溶解又は分散させた場合、例えば、前記のゲル形成材料と生理学的液体又は体液との接触時での水性溶液中又は分散中など）と組み合わせた、あるいはそれに曝露させた場合にゲルを形成する材料でありうる。故に、ゲル形成材料は、液相例えば水性液相などの液相をゲル化することが可能である材料を包含しうる。
【００３５】
ゲル形成材料は、例えば、コラーゲン、グリセリド、グリコサミノグリカン、多糖類、ゼラチン、ポリ乳酸又はポリ乳酸グリコール酸でありうる。
【００３６】
用語「グリセリド」は、本明細書において使用する通り、グリセロール及び同じ又は別個の脂肪酸の１つ又は複数から形成されるエステルを指す。用語「グリセリド」及び「アシルグリセロール」は、互換的に使用することができる。用語「グリセリド」は、１、２、又は３の脂肪酸が、グリセロールを用いてエステル化されているか否かに依存して、モノグリセリド（モノアシルグリセロール）、ジグリセリド、及びトリグリセリドを包含する。ゲル形成材料は、本明細書において意図する通り、さらに、グリセリン酸、例えば、非限定的に、オレイルグリセリン酸又はフィタニルグリセリン酸などでありうる。
【００３７】
例えば、グリセリドはモノグリセリドである。モノグリセリドは、グリセロール部分上のエステル結合の位置に依存し、１−モノアシルグリセロール又は２−モノアシルグリセロールでありうる。モノグリセリドの非限定的な例は、例えば、グリセロールモノ（オ）レエート（ＧＭＯ）、グリセロールモノリノレエート、グリセロールモノリノレネート、グリセロールモノパルミテート、グリセロールモノステアレート又はグリセロールモノラウレートである。
【００３８】
例えば、グリセリドは、グリセロール及びオレイン酸のエステルでありうる。用語「オレイン酸」は、モノ不飽和オメガ９脂肪酸、特に、シス−９−オクタデセン酸又は１８：１シス−９としてもまた公知である（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン酸を指す。例えば、グリセリドは、オレイン酸を伴うモノグリセリド、即ち、グリセロールモノオレエート（また、一般に、グリセロールモノレエートとして表示される）、モノ（オ）レイン、グリセリルモノオレエート、グリセリルオレエート、（Ｚ）−１−オレオイル−ｓｎ−グリセロール、又は１，２，３−プロパントリオール９−オクタデセン酸でありうる。
【００３９】
用語「グリコサミノグリカン」は、本明細書において使用する通り、繰り返し二糖単位からなる非分岐の多糖を指す。グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸及びその誘導体、プロテオグリカン及びその誘導体、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、キトサン及びその誘導体、ならびにキチン及びその誘導体からなる群より選択されうる。
【００４０】
用語「ヒアルロン酸」又は「ＨＡ」は、「ヒアルロナン」又は「ヒアルロン酸塩」と互換的に使用されうる。用語「ヒアルロン酸」は、交互β−１，４及びβ−１，３グリコシド結合を介して連結された、Ｄ−グルクロン酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから成る二糖のアニオン性非硫酸化ポリマーを指す。ヒアルロン酸誘導体は、非限定的に、ヒアルロン酸の塩、例えばヒアルロン酸ナトリウム又は脂肪族、複素環もしくは脂環式系列のアルコールを伴うヒアルロン酸のエステル、あるいはヒアルロン酸の硫酸化形態又はヒアルロン酸を含む薬剤の組み合わせを含む。
【００４１】
用語「プロテオグリカン」は、１つ又は複数の共有結合的に付着されたグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖を伴うタンパク質を指す。グリコサミノグリカンは、デコリン、ビグリカン、テスチカン、フィブロモジュリン、ルミカン、バーシカン、パールカン、ニューロカン又はアグリカンより選択されるプロテオグリカンでありうる。
【００４２】
用語「コンドロイチン硫酸」は、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びグルクロン酸から成る二糖のポリマーを指し、それらの各々は、可変位置及び量で硫酸化することができる。コンドロイチン硫酸は、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、コンドロイチン−２，６−硫酸、コンドロイチン−４，６−硫酸より選択することができる。
【００４３】
用語「ケラタン硫酸」は、「ケラト硫酸」と互換的に使用してもよく、繰り返し二糖−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−のポリマーを指し、それは、Ｇａｌ又はＧｌｃＮＡｃ単糖のいずれか又は両方の炭素位置６（Ｃ６）で硫酸化することができる。
【００４４】
用語「キトサン」は、無作為に分布したβ−（１−４）−連結Ｄ−グルコサミン（脱アセチル化単位）及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（アセチル化単位）から成る線状ポリマーを指す。
【００４５】
用語「キチン」は、β−（１，４）−連結Ｎ−アセチルグルコサミンから成るポリマーを指す。
【００４６】
特定の実施態様は、損なわれた骨折治癒の処置における使用のための、ゲル形成材料ならびにＩＬ−８、ＩＬ−８の機能的フラグメント、ＩＬ−８の機能的変異体及びＩＬ−８受容体のアゴニストからなる群より選択される１つ又は複数の医薬的活性成分を含む、それらから本質的になる、又はなる組成物に関する。
【００４７】
好ましい実施態様において、ゲル形成材料はコラーゲンでありえ、そして、医薬的活性成分は、配列番号１又は配列番号２より選択されるアミノ酸配列を含むＩＬ−８ペプチドでありうる。
【００４８】
特定の実施態様において、組成物は、経皮投与のために構成されうる。そのような組成物は、有利には、侵襲的で高価な整形外科の外科的介入についての必要性を伴わず、組成物の投与の容易さを増加させる。記述「経皮投与」は、本明細書において使用する通り、内側の器官又は組織へのアクセスが、内側の器官又は組織が曝露される外科手術の使用によるよりむしろ、例えば注射などによる皮膚の針穿刺を介して行われる任意の医学的投与手順を指す。
【００４９】
したがって、特に好ましい実施態様は、皮下投与（即ち、それにおいて、組成物は、皮下投与される（すべきである））による損なわれた骨折治癒の処置における使用のための、本明細書において記載する通りの組成物を提供し、さらにより好ましくは、この組成物は、皮下注射により投与されうる。この目的のために、そのような組成物は、経皮投与のために構成されうる、より好ましくは、注射可能な組成物として構成されうる。
【００５０】
適切である場合、組成物は、さらに、１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体／賦形剤を含みうる。
【００５１】
上の局面及び／又は実施態様の任意の１つ又は複数において、種々の好ましいが、しかし、非限定的な特徴を適用してもよく、例えば：
【００５２】
薬剤は、好ましくは、ＳＤＦ−１及び／又はＳＤＦ−１受容体のレベル及び／又は活性を増加させることができうる。
【００５３】
薬剤は、好ましくは、ＩＬ−８及び／又はＩＬ−８受容体のレベル及び／又は活性を低下させることができうる。
【００５４】
薬剤は、好ましくは、ＩＬ−６及び／又はＩＬ−６受容体のレベル及び／又は活性を低下させることができうる。
【００５５】
薬剤は、好ましくは、ＳＤＦ−１、ＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−６、及びＩＬ−６受容体からなる群より選択される１つ又は複数の核酸もしくはタンパク質に特異的に結合することができうる。
【００５６】
薬剤は、好ましくは、以下を含みうる、それから本質的になりうる、又はなりうる、即ち、薬剤は、好ましくは、抗体又はそのフラグメントもしくは誘導体、タンパク質又はポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣体、アプタマー、光アプタマー、核酸又は化学物質、好ましくは有機分子、より好ましくは小有機分子からなる群より選択されうる。
【００５７】
薬剤は、ＳＤＦ−１、ＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−６及びＩＬ−６受容体からなる群より選択される前記の１つ又は複数の核酸もしくはタンパク質の発現を増加させることができうる。例えば、そのような薬剤は、ＳＤＦ−１、ＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−６及びＩＬ−６受容体の任意の１つ又は複数をコードする前記配列の発現を可能にする、１つ又は複数の調節配列に動作可能に連結された、ＳＤＦ−１、ＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−６及びＩＬ−６受容体の任意の１つ又は複数をコードする配列を含む組換え核酸を含みうるか、それから本質的になりうるか、又はなりうる。被験者へのそのような薬剤の導入（例、トランスフェクション又は伝達による）は、被験者における薬剤によりコードされるＳＤＦ−１、ＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−６及びＩＬ−６受容体の任意の１つ又は複数の発現に影響するはずである（即ち、遺伝子治療）。非限定的な例において、薬剤は、前記組換え核酸を用いて形質転換された（例、一過性に又は安定的に形質転換された、好ましくは、安定的に形質転換された）単離細胞（例、自己、同種、又は異種細胞）を含みうる、それから本質的になりうる、又はなりうる。非限定的な例において、薬剤は、前記タンパク質を自然に発現する又は過剰発現する単離細胞（例、自己、同種、又は異種細胞）を含みうる、それから本質的になりうる、又はなりうる。被験者へのそのような細胞の投与は、被験者における前記細胞によるＳＤＦ−１、ＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−６及びＩＬ−６受容体の任意の１つ又は複数の発現に影響するはずである（即ち、細胞治療）。
【００５８】
あるいは、薬剤は、ＳＤＦ−１、ＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−６及びＩＬ−６受容体からなる群より選択される前記の１つ又は複数の核酸もしくはタンパク質の発現を低下させることができうる。例えば、そのような薬剤は、アンチセンス薬剤、リボザイム及びＲＮＡ干渉を起こすことが可能な薬剤からなる群より選択されうる。
【００５９】
あるいは、薬剤は、ＳＤＦ−１、ＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−６及びＩＬ−６受容体からなる群より選択される前記の１つ又は複数のタンパク質のレベル及び／又は活性を増加させることができうる。例えば、そのような薬剤は、ＳＤＦ−１、ＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−６及び／又はＩＬ−６受容体タンパク質、例えば、好ましくは、単離又は組換えＳＤＦ−１、ＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−６及び／又はＩＬ−６受容体タンパク質を適切に含みうる、それから本質的になりうる又はなりうる；あるいは、薬剤は、ＳＤＦ−１、ＩＬ−８及び／又はＩＬ−６タンパク質のアゴニストあるいはＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８受容体及び／又はＩＬ−６受容体のアゴニストを適切に含みうる、それから本質的になりうる又はなりうる。そのようなアゴニストは、限定を伴わず、抗体又はそのフラグメントもしくは誘導体、タンパク質又はポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣体、アプタマー、光アプタマー、核酸又は化学物質、好ましくは有機分子、より好ましくは小有機分子からなる群より選択されうる。アゴニストが、発現可能な分子、例えば抗体又はそのフラグメントもしくは誘導体、タンパク質又はポリペプチド、ペプチド又は核酸などである場合、アゴニストを被験者に導入してもよく、あるいは、１つ又は複数の調節配列に動作可能に連結された、アゴニストをコードする配列を含む組換え核酸を用いて導入してもよく、アゴニストをコードする前記配列の発現を許す（例、遺伝子治療又は細胞治療、上記）。
【００６０】
あるいは、薬剤は、ＳＤＦ−１、ＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−６及びＩＬ−６受容体からなる群より選択される前記の１つ又は複数のタンパク質のレベル及び／又は活性を低下させることができうる。例えば、薬剤は、ＳＤＦ−１、ＩＬ−８及び／又はＩＬ−６タンパク質のアンタゴニストあるいはＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８受容体及び／又はＩＬ−６受容体のアンタゴニストを適切に含みうる、それから本質的になりうる又はなりうる。そのようなアンタゴニストは、限定を伴わず、抗体又はそのフラグメントもしくは誘導体、タンパク質又はポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣体、アプタマー、光アプタマー、核酸又は化学物質、好ましくは有機分子、より好ましくは小有機分子からなる群より選択されうる。アンタゴニストが、発現可能な分子、例えば抗体又はそのフラグメントもしくは誘導体、タンパク質又はポリペプチド、ペプチド又は核酸などである場合、アンタゴニストを被験者に導入してもよく、あるいは、１つ又は複数の調節配列に動作可能に連結された、アンタゴニストをコードする配列を含む組換え核酸を用いて導入してもよく、アンタゴニストをコードする前記配列の発現を許す（例、遺伝子治療又は細胞治療、上記）。例えば、アンタゴニストは、また、それぞれの天然タンパク質を上回るドミナントネガティブ活性を有するＳＤＦ−１、ＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−６及びＩＬ−６受容体の欠失形態を包含しうる。
【００６１】
例によって及び限定を伴わず、ＳＤＦ−１、より好ましくはヒトＳＤＦ−１（ＳＤＦ−１アゴニスト）のレベル及び／又は活性を増加させる薬剤は、タンパク質又はペプチドアゴニスト、例えば、単離又は組換え（好ましくは天然ヒト）ＳＤＦ−１α、ＳＤＦ−１β、ＳＤＦ−１δ、ＳＤＦ−１φ及び／又はＳＤＦ−１ε、ＣＴＣＥ−０２１４（ＳＤＦ−１αのＣ末端が、Ｎ末端領域に、短い二官能性リンカーにより連結されているＳＤＦ−１類似体）などを包含しうる（それらを含む、それらから本質的になる、又はなる群より選択されうる）（Perez et al. Exp. Hematol., 2004, vol. 32(3), 300-307）。Ｓｕｍｏ−ＳＤＦ−１（Ｓ４Ｖ）（マトリックスメタロプロテイナーゼ２及びエキソペプチダーゼ切断に耐性であり、長期持続効果を提供するプロテアーゼ耐性ＳＤＦ−１（例、Segers et al. Circulation, 2007, vol. 116(15), 1683-1692）、ＳＤＦ−１過剰発現細胞、例えばアデノ−ＳＤＦ１−感染した間葉系又は骨芽細胞株（Zhang et al. FASEB J, 2007, vol. 21(12), 3197-3207；Tang et al. Eur J Cardiothorac. Surg., 2009, vol. 36(4), 644-650）、ＲＮＡ薬剤、例えばｍｉＲ−４３０など（ＳＤＦ１−α及びＣＸＣＲ−７  ｍＲＮＡを調節することが示されているｍｉＲＮＡ（Staton et al. Nat. Genet., 2011, vol. 43(3), 204-211）。
【００６２】
例によって及び限定を伴わず、ＳＤＦ−１、より好ましくはヒトＳＤＦ−１（ＳＤＦ−１アンタゴニスト）のレベル及び／又は活性を低下させる薬剤は、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、例えばＮＯＸ−Ａ１２（Duda et al. Clin. Cancer Res., Feb 2011）などを包含しうる（それを含む、それから本質的になる、又はなる群より選択されうる）。
【００６３】
例によって及び限定を伴わず、ＳＤＦ−１受容体、より好ましくはヒトＳＤＦ−１受容体（ＳＤＦ−１受容体アゴニスト）のレベル及び／又は活性を増加させる薬剤は、タンパク質又はペプチドアゴニスト、例えば、単離又は組換え（好ましくは天然ヒト）ＣＸＣＲ４及び／又はＣＸＣＲ７、あるいはＣＸＣＲ−４過剰発現細胞、例えばアデノ−ＣＸＣＲ４−感染した間葉系又は骨芽細胞株などを包含しうる（それらを含む、それらから本質的になる、又はなる群より選択されうる）（Zhang et al. J. Mol. Cell. Cardiol., vol. 44(2), 281-292）。
【００６４】
例によって及び限定を伴わず、ＳＤＦ−１受容体、より好ましくはヒトＳＤＦ−１受容体（ＳＤＦ−１受容体アンタゴニスト）のレベル及び／又は活性を低下させる薬剤は、ペプチド、例えばＣＸＣＲ４アンタゴニストであるＡＴＩ−２３４１又はペプデュシン（Tchernychev et al. PNAS, 2010, vol. 107(51), 22255-22259）、及び非ペプチド分子、例えばPlerixafor又はＡＭＤ３１００（商標名Mozobil, Genzyme Inc.）（ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、バイサイクラムであり、それにおいて、２つのサイクラム環が芳香族架橋で繋留されている（Teicher, Biochem Pharmacol, 2011, vol. 81(1), 6-12）、又はＣＸＣＲ−７ブロッカーＣＣＸ２０６６（ChemoCentryx Inc.）（Duda et al. Clin. Cancer Res., Feb 2011）などを包含しうる（それらを含む、それらから本質的になる、又はなる群より選択されうる）。
【００６５】
例によって及び限定を伴わず、ＩＬ−８、より好ましくはヒトＩＬ−８（ＩＬ−８アゴニスト）のレベル及び／又は活性を増加させる薬剤は、タンパク質又はペプチドアゴニスト、例えば、単離又は組換え（好ましくは天然ヒト）ＩＬ−８（ＣＸＣＬ−８）（例、ヒト組換えＩＬ−８、例えば、Lindley et al. PNAS, 1988, vol. 85(23), 9199-9203により記載される通りの、大腸菌から生成された７８アミノ酸のＩＬ−８ペプチドなど）、顆粒球走化性タンパク質（ＧＣＰ−１）、白血球細胞由来ケモタキシン（ＬＥＣＴ）、リンパ球由来好中球活性化因子（ＬＹＮＡＰ）、単球由来好中球走化性因子（ＭＤＮＣＦ）、単球由来好中球活性化ペプチド（ＭＯＮＡＰ）、好中球活性化因子（ＮＡＦ）、又は好中球活性化ペプチド１（ＮＡＰ−１）などを包含しうる（それらを含む、それらから本質的になる、又はなる群より選択されうる）。
【００６６】
例によって及び限定を伴わず、ＩＬ−８受容体、より好ましくはヒトＩＬ−８受容体（ＩＬ−８受容体アゴニスト）のレベル及び／又は活性を増加させる薬剤は、タンパク質又はペプチドアゴニスト、例えば、単離又は組換え（好ましくは天然ヒト）ＣＸＣＲ１又はＣＸＣＲ２を包含しうる（それらを含む、それらから本質的になる、又はなる群より選択されうる）。
【００６７】
例によって及び限定を伴わず、ＩＬ−８受容体、より好ましくはヒトＩＬ−８受容体（ＩＬ−８受容体アンタゴニスト）のレベル及び／又は活性を低下させる薬剤は、非ペプチド分子、例えばＲｅｐｅｒｔａｘｉｎ又はＲ（−）−２−（４−イソブチルフェニル）プロピオニルメタンスルホンアミド）、Ｌ−リシン塩（Casilli et al. Biochem. Pharmacol., 2005, vol. 69(3), 385-394；Teicher, Biochem Pharmacol, 2011, vol. 81(1), 6-12）、ＳＣＨ−４７９８３３又はＳＣＨ−５２７１２３（Singh et al. Clin. Cancer. Res., 2009, vol. 15(7), 2380-2386；Teicher, Biochem Pharmacol, 2011, vol. 81(1), 6-12）などを包含しうる（それらを含む、それらから本質的になる、又はなる群より選択されうる）。
【００６８】
例によって及び限定を伴わず、ＩＬ−６、より好ましくはヒトＩＬ−６（ＩＬ−６アゴニスト）のレベル及び／又は活性を増加させる薬剤は、タンパク質又はペプチドアゴニスト、例えば、単離又は組換え（好ましくは天然ヒト）ＩＬ−６（例、Rozen et al. Bone, 2007, vol. 41(3), 437-445により記載される通りのヒト組換えＩＬ−６）、肝細胞刺激因子（ＨＳＦ）、ハイブリドーマ成長因子（ＨＧＦ）、Ｔ細胞分化因子（ＣＤＦ）、Ｂ細胞刺激因子２（ＢＳＦ２）、又はインターフェロンβ２（ＩＦＮＢ２）などを包含しうる（それらを含む、それらから本質的になる、又はなる群より選択されうる）。
【００６９】
例によって及び限定を伴わず、ＩＬ−６受容体、より好ましくはヒトＩＬ−６受容体（ＩＬ−６受容体アゴニスト）のレベル及び／又は活性を増加させる薬剤は、タンパク質又はペプチドアゴニスト、例えば、単離又は組換え（好ましくは天然ヒト）ＩＬ−６受容体（ＣＤ１２６）、例えば、組換えＩＬ−６受容体（Rozen et al. Bone, 2007, vol. 41(3), 437-445により記載される通り）などを包含しうる（それらを含む、それらから本質的になる、又はなる群より選択されうる）。
【００７０】
例によって及び限定を伴わず、ＩＬ−６受容体、より好ましくはヒトＩＬ−６受容体（ＩＬ−６受容体アンタゴニスト）のレベル及び／又は活性を低下させる薬剤は、モノクローナル抗体、例えばトシリズマブ（登録商標）（Roche）（Hennigan & Kavanaugh. Ther. Clin. Risk. Manag, 2008, vol. 4(4), 767-775；Kato et al. Exp. Mol. Pathol., 2008, vol. 84(3), 262-270）などを包含しうる（それらを含む、それらから本質的になる、又はなる群より選択されうる）。
【００７１】
損なわれた骨折治癒は、変形癒合骨折、癒合遅延骨折及び癒合不能骨折からなる群より選択されうる。
【００７２】
上に示す通りのスクリーニングアッセイにおいて、テスト薬剤による、ＳＤＦ−１、ＩＬ−８及びＩＬ−６からなる群より選択される前記の１つ又は複数の核酸もしくはタンパク質のレベル及び／又は活性の調節を、有利には、前記の１つ又は複数の核酸もしくはタンパク質をテスト薬剤と、そのような調節について一般的に促す条件下で接触させる（即ち、組み合わせる、曝露する又はインキュベートする）ことによりテストしてもよい。例及び非限定によって、前記の１つ又は複数の核酸もしくはタンパク質の活性及び／又はレベルの調節が、前記の１つ又は複数の核酸もしくはタンパク質へのテスト薬剤の結合からもたらされる場合、前記条件は、一般的に、そのような結合について促しうる。例えば及び限定を伴わず、テスト薬剤による前記の１つ又は複数の核酸もしくはタンパク質の活性及び／又はレベルの調節が、インビトロで適切にテストされうる；あるいは、前記の１つ又は複数の核酸もしくはタンパク質を含む宿主細胞又は宿主生物においてテストし、テスト薬剤に曝露し、又はそれを発現するように構成しうる。
【００７３】
上に示す通りのスクリーニングアッセイにおいて、テスト薬剤とＳＤＦ−１、ＩＬ−８及びＩＬ−６からなる群より選択される前記の１つ又は複数の核酸もしくはタンパク質の間の結合を、有利には、前記の１つ又は複数の核酸もしくはタンパク質をテスト薬剤と、そのような結合について一般的に促す条件下で接触させる（即ち、組み合わせる、曝露する又はインキュベートする）ことによりテストしてもよい。例えば及び限定を伴わず、テスト薬剤と前記の１つ又は複数の核酸もしくはタンパク質の間での結合が、インビトロで適切にテストされうる；あるいは、前記の１つ又は複数の核酸もしくはタンパク質を含む宿主細胞又は宿主生物においてテストし、テスト薬剤に曝露し、又はそれを発現するように構成しうる。
【００７４】
限定を伴わず、薬剤は、本明細書を通して意図される通り、ＳＤＦ−１、ＩＬ−８及びＩＬ−６からなる群より選択される任意の１つ又は複数の核酸もしくはタンパク質に結合する、あるいは、ＳＤＦ−１、ＩＬ−８及びＩＬ−６からなる群より選択される任意の１つ又は複数の核酸もしくはタンパク質のレベル及び／又は活性を、インビトロで、細胞中で、器官中で及び／又は生物中で調節することが可能でありうる。
【００７５】
本発明の上の及びさらなる局面ならびに好ましい実施態様を、以下のセクション中に及び添付の請求項において記載する。添付の請求項の対象物が、本明細書により、本明細書中に具体的に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１Ａ】図１は、癒合不能患者（ＮＵ）の群を健常コントロール（ＨＶ）と比較する実験におけるＳＤＦ−１の血漿レベルを例示する。（Ａ）全てのサンプル（ＨＶ、ｎ＝４９；ＮＵ、ｎ＝１５）、（Ｂ）血漿がヘパリンチューブ中に採取されるサンプル（ＨＶ、ｎ＝２６；ＮＵ、ｎ＝１１）、（Ｃ）血漿がＥＤＴＡチューブ中に採取されるサンプル（ＨＶ、ｎ＝４０；ＮＵ、ｎ＝５）
【図１Ｂ】図１は、癒合不能患者（ＮＵ）の群を健常コントロール（ＨＶ）と比較する実験におけるＳＤＦ−１の血漿レベルを例示する。（Ａ）全てのサンプル（ＨＶ、ｎ＝４９；ＮＵ、ｎ＝１５）、（Ｂ）血漿がヘパリンチューブ中に採取されるサンプル（ＨＶ、ｎ＝２６；ＮＵ、ｎ＝１１）、（Ｃ）血漿がＥＤＴＡチューブ中に採取されるサンプル（ＨＶ、ｎ＝４０；ＮＵ、ｎ＝５）
【図１Ｃ】図１は、癒合不能患者（ＮＵ）の群を健常コントロール（ＨＶ）と比較する実験におけるＳＤＦ−１の血漿レベルを例示する。（Ａ）全てのサンプル（ＨＶ、ｎ＝４９；ＮＵ、ｎ＝１５）、（Ｂ）血漿がヘパリンチューブ中に採取されるサンプル（ＨＶ、ｎ＝２６；ＮＵ、ｎ＝１１）、（Ｃ）血漿がＥＤＴＡチューブ中に採取されるサンプル（ＨＶ、ｎ＝４０；ＮＵ、ｎ＝５）
【図２】図２は、癒合不能患者（ＮＵ、ｎ＝４）の群を健常コントロール（ＨＶ、ｎ＝１８）と比較する実験におけるＩＬ−８の血清レベルを例示する。
【図３】図３は、癒合不能患者（ＮＵ；ｎ＝１３）の群を健常コントロール（ＨＶ；ｎ＝２９）と比較する実験におけるＩＬ−６の血清レベルを例示する。
【図４Ａ】図４Ａは、癒合不能患者（ＮＵ、ｎ＝６）の群を健常コントロール（ＨＶ、ｎ＝９）と比較する骨芽細胞（ＯＢ）培養の上清中でのＳＤＦ−１のレベルを例示する。
【図４Ｂ】図４Ｂは、癒合不能患者（ＮＵ、ｎ＝６）の群を健常コントロール（ＨＶ、ｎ＝９）と比較する間葉細胞（ＭＳＣ）培養の上清中でのＳＤＦ−１のレベルを例示する。
【図５】図５は、癒合不能患者（ＮＵ、ｎ＝６）の群を健常コントロール（ＨＶ、ｎ＝１０）と比較する骨芽細胞（ＯＢ）培養の上清中でのＩＬ−６のレベルを例示する。
【図６】図６は、陰性コントロール（媒質、ＰＢＳ−ＨＳＡ）のためのマウスにおける頭蓋冠モデルにおける骨形成の結果を例示する写真を表す；（Ａ）頭蓋冠欠損の撮像（Ｘ線）、（Ｂ）ヘマトキシリン−エオシンを用いた、２０倍の倍率での、（１）頭蓋冠骨欠損及び（２）正常骨の冠状断面上で作られた組織学的分析、（Ｃ）マッソントリクロームを用いた、２０倍の倍率での、（１）頭蓋冠骨欠損及び（２）正常骨の冠状断面上で作られた組織学的分析。
【図７】図７は、陽性コントロール（ＢＭＰ−２、５μｇ）のためのマウスにおける頭蓋冠モデルにおける骨形成の結果を例示する写真を表す；（Ａ）頭蓋冠欠損の撮像（Ｘ線）、（Ｂ）冠状断面上で作られた、ヘマトキシリン−エオシンを用いた、２０倍の倍率での組織学的分析、（Ｃ）冠状断面上で作られた、マッソントリクロームを用いた、２０倍の倍率での組織学的分析。ボックス及び矢印は、骨形成が観察されたゾーンを示す。
【図８】図８は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＩＬ−８ペプチドを含む組成物を用いて処置されたマウスにおける頭蓋冠モデルにおける骨形成の結果を例示する写真を表す；（Ａ）頭蓋冠欠損の撮像（Ｘ線）、（Ｂ）冠状断面上で作られた、ヘマトキシリン−エオシンを用いた、２０倍（左）及び４０倍（右）の倍率での組織学的分析、（Ｃ）冠状断面上で作られた、マッソントリクロームを用いた、２０倍（左）及び４０倍（右）の倍率での組織学的分析、（Ｄ）冠状断面上で作られた、サフラニン−Ｏを用いた、２０倍（左）及び４０倍（右）の倍率での組織学的分析。ボックス及び矢印は、骨形成が観察された領域を示す。（１）新たな骨形成；（２）肥大軟骨細胞。
【図９】図９は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＩＬ−８ペプチドを含む組成物を用いて処置されたマウスにおける頭蓋冠モデルにおける骨形成の結果を例示する写真を表す；（Ａ）頭蓋冠欠損の撮像（Ｘ線）、（Ｂ）頭蓋冠欠損の２つの冠状断面上で作られた、ヘマトキシリン−エオシンを用いた、２０倍（左）及び４０倍（右）の倍率での組織学的分析、（Ｃ）冠状断面上で作られた、マッソントリクロームを用いた、２０倍（左）及び４０倍（右）の倍率での組織学的分析、（Ｄ）冠状断面上で作られた、サフラニン−Ｏを用いた、２０倍（左）及び４０倍（右）の倍率での組織学的分析。ボックス及び矢印は、骨形成が観察された領域を示す。（１）肥大軟骨細胞。
【００７７】
発明の詳細な説明
本明細書において使用する通り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別を指示しない場合、単数形及び複数形の両方の参照を含む。
【００７８】
用語「含んでいる（comprising）」、「含む（comprises）」、及び「から成る（comprised of）」は、本明細書において使用する通り、「含んでいる（including）」、「含む（includes）」又は「含んでいる（containing）」、「含む（contains）」と同義であり、包括的又はオープンエンドであり、追加の非列挙要素、構成単位又は方法工程を除外しない。この用語は、また、「からなる」及び「から本質的になる」を包含する。
【００７９】
エンドポイントによる数値範囲の列挙は、それぞれの範囲内に包含される全ての数字及び分数、ならびに列挙されたエンドポイントを含む。
【００８０】
用語「約」は、本明細書において使用する通り、例えばパラメーター、量、時間的持続などの測定可能な値に言及する場合、特定値の及びそれからの変動、特に、そのような変動が、開示する発明において実施することが適当である限りにおいて、特定値の及びそれからの＋／−１０%又はそれ以下、好ましくは＋／−５%又はそれ以下、より好ましくは＋／−１%又はそれ以下、及びさらにより好ましくは＋／−０．１%又はそれ以下の変動を包含することを意味する。修飾語「約」が言及する値は、それ自体が、また、具体的に、及び好ましくは、開示されると理解すべきである。
【００８１】
用語「１つ又は複数の」、例えば要素の群の１つ又は複数の要素などは、さらなる例証によって、それ自体が明らかであるのに対し、この用語は、とりわけ、前記要素の任意の１つあるいは前記要素の任意の２つ又はそれ以上、例えば、前記要素の任意の≧３、≧４、≧５、≧６、又は≧７など、及び全ての前記要素までを包含する。
【００８２】
本明細書において引用する全ての文書は、本明細書により、それらの全体において参照により組み入れられる。
【００８３】
他に特定しない限り、技術的及び科学的用語を含む本発明を開示する際に使用する全ての用語は、本発明が属する技術分野における当業者により一般に理解される通りの意味を有する。さらなるガイダンスによって、用語の定義は、本発明の教示をより良く認めるために含まれうる。
【００８４】
本発明に関連する一般的な方法については、参照が、とりわけ、周知のテキストブックに作られ、例えば、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.”（Sambrook et al., 1989）、Animal Cell Culture（R. I. Freshney, ed., 1987）、the series Methods in Enzymology（Academic Press）、Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells（J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987）；“Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Ed.”（F. M. Ausubel et al., eds., 1987 & 1995）；Recombinant DNA Methodology II（R. Wu ed., Academic Press 1995）を含む。
【００８５】
細胞培養及び培地の使用における一般的な技術を、とりわけ、Large Scale Mammalian Cell Culture（Hu et al. 1997. Curr Opin Biotechnol 8: 148）；Serum-free Media（K. Kitano. 1991. Biotechnology 17: 73)；又はLarge Scale Mammalian Cell Culture（Curr Opin Biotechnol 2: 375, 1991）において概説する。
【００８６】
用語「タンパク質」は、本明細書において使用する通り、一般的に、１つ又は複数のポリペプチド鎖を含む巨大分子、即ち、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基のポリマー鎖を包含する。この用語は、自然に、組換え的に、半合成的に、又は合成的に産生されたタンパク質を包含しうる。この用語は、また、ポリペプチド鎖の１つ又は複数の発現同時もしくは後修飾、例えば、限定を伴わず、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、スルホン化、メチル化、ユビキチン化、シグナルペプチドの除去、Ｎ末端Ｍｅｔの除去、活性形態へのプロ酵素又はプレホルモンの変換などを保有するタンパク質を包含する。この用語は、さらに、また、例えば、アミノ酸の欠失、付加及び／又は置換などの対応する天然タンパク質に対する、アミノ酸配列変異を保有するタンパク質の変異体又は突然変異体を含む。この用語は、完全長タンパク質及びタンパク質部分又はフラグメント、例えば、そのような完全長タンパク質のプロセシングから続く自然発生タンパク質の部分の両方を熟慮する。
【００８７】
用語「核酸」は、本明細書において使用する通り、一般的に、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドから本質的に成る、任意の長さのポリマーを包含する。核酸は、プリン及び／又はピリミジン塩基ならびに／あるいは他の天然（例、キサンチン、イノシン、ヒポキサンチン）、化学的又は生化学的に修飾された（例、メチル化された）、非天然、又は誘導体化ヌクレオチド塩基を含むことができる。核酸の骨格は、ＲＮＡもしくはＤＮＡにおいて典型的に見出すことができる通りの糖及びリン酸基、及び／又は、修飾もしくは置換された糖（例えば、２’−Ｏ−アルキル化、例、２’−Ｏ−メチル化又は２’−Ｏ−エチル化；又は２’−Ｏ，４’−Ｃ−アルキル化（ａｌｋｙｎｅｌａｔｅｄ）、例えば２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチル化糖など）ならびに／あるいは１つ又は複数の修飾もしくは置換されたリン酸基（例、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、３’−チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、３’−Ｎ−カルバメート、モルホリノカルバメート及びペプチド核酸（ＰＮＡ））を含むことができる。用語「核酸」は、さらに好ましくは、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子（具体的には、ｈｎＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、増幅産物、オリゴヌクレオチド及び合成（例、化学的に合成された）ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含む）を包含する。核酸は、自然発生しうる、例えば、自然中に存在しうる又はそれから単離されうる、組換え体でありうる、即ち、組換えＤＮＡ技術により産生されうる、及び／又は、部分的もしくは全体的に、化学的もしくは生化学的に合成されうる。「核酸」は、二本鎖、部分的に二本鎖、又は一本鎖でありうる。一本鎖の場合、核酸はセンス鎖又はアンチセンス鎖でありうる。さらに、核酸は環状又は線状でありうる。
【００８８】
用語「単離された」は、特定の成分（例えば、核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドなど）への参照を伴い、一般的に、そのような成分が、その天然環境の１つ又は複数の他の成分からの分離において存在し、例えば、それから分離されており、あるいはそれからの分離において調製及び／又は維持されていることを示す。例えば、単離されたヒト又は動物タンパク質もしくは複合体は、それが自然に生じるヒト又は動物の身体からの分離において存在しうる。
【００８９】
用語「単離された」は、本明細書において使用する通り、好ましくは、また、修飾語「精製された」を包含しうる。例によって、核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドへの参照を伴う用語「精製された」は、絶対的純度を要求しない。代わりに、そのような核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドが、別々の環境中にあることを表示し、それにおいて、他の核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドと比べた、それらの存在量（便利には、質量又は重量又は濃度の単位で表現される）は、生物学的サンプル中よりも大きい。別々の環境は、例えば、単一の溶液、ゲル、沈殿物、凍結乾燥物などの単一の培地を表示する。精製された核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドは、例えば、実験室又は組換え合成、クロマトグラフィー、調製用の電気泳動、遠心、沈殿、親和性精製などを含む公知の方法により得てもよい。
【００９０】
本発明者らは、ストローマ由来因子１（ＳＤＦ−１又はＣＸＣＬ１２）、ＳＤＦ−１受容体、インターロイキン８（ＩＬ−８又はＣＸＣＬ８）、ＩＬ−８受容体、インターロイキン６（ＩＬ−６）又はＩＬ−６受容体を、損なわれた骨折治癒における治療的及び／又は予防的介入のための貴重な標的として同定した。本発明者らは、このように、任意の骨折の処置における治療的及び／又は予防的介入のための有用な標的としてこれらの分子を熟慮する。
【００９１】
用語「癒合不能骨折」、「骨折癒合不能」、「癒合不能」又は「ＮＵ」は、互換的に、種々の因子に起因し、正常な期間において治癒に失敗する骨折に関する。ＮＵは、とりわけ、堅固な癒合不能及び不安定な癒合不能又は偽関節を含む。用語「変形癒合骨折」、「骨折変形癒合」又は「変形癒合」は、互換的に、以前に断片化した骨の不完全な癒合に関する。用語「癒合遅延骨折」又は「癒合遅延」は、互換的に、治癒が予定時間中に生じていない、転帰が不確かなままである骨折に関する。癒合不能骨折、変形癒合骨折及び癒合遅延骨折は、本明細書において、用語「損なわれた骨折治癒」又は「損なわれた骨折治癒」により包含される。損なわれた骨折治癒は、故に、治癒を刺激するための介入の特定の形態を要求する。
【００９２】
損なわれた骨折治癒が診療において結論付けられる期間は、特定の骨折に依存して変動するが、しかし、一般的に、傷害後６ヶ月までに治癒しない骨折は、介入を伴わずに治癒しないことが受け入れられる。また、骨折が傷害後３ヶ月までに治癒に向かって進行する徴候を示さない場合、又は、単純に、経験豊富な骨折外科医がそれが治癒すると予測しうる時間内に骨折が治癒しなかった場合、損なわれた骨折治癒がもたらされうると結論付けられることが示唆されている。
【００９３】
本明細書を通した疾患又は状態への参照は、特定の列挙の文脈と一致する限りにおいて本明細書において開示する通りの任意のそのような疾患又は状態を包含し、より具体的には、損なわれた骨折治癒を包含する。本明細書における骨折の処置への参照は、損なわれた骨折治癒の処置を包含しうる。
【００９４】
本明細書において使用する通り、任意の１つの核酸又はタンパク質への参照は、当技術分野におけるそれぞれの命名の下で一般に公知の核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドに対応する。これらの用語は、任意の生物の（見出される場合）、特に動物、好ましくは温血動物、より好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくはヒト及び非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物、さらにより好ましくはヒトのそのような核酸、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを包含する。これらの用語は、特に、天然配列を伴うそのような核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを包含し、即ち、それらのものは、一次配列が、自然において見出される又はそれに由来する核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドのものと同じである。当業者は、天然配列が、そのような種の間での遺伝的多様性に起因する、異なる種の間で異なりうることを理解する。さらに、天然配列は、所与の種内の正常な遺伝的多様性（変動）に起因する、同じ種の異なる個体の間で又はその内で異なりうる。また、天然配列は、転写後又は翻訳後修飾に起因する、同じ種の異なる個体の間で又はさらにはその内で異なりうる。核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの任意のそのような変異体又はアイソフォームを本明細書において意図する。したがって、天然において見出される又はそれに由来する核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの全配列を「天然」と考える。これらの用語は、生きた生物、器官、組織又は細胞の部分を形成する場合、生物学的サンプルの部分を形成する場合、ならびに、そのような供給源から少なくとも部分的に単離される場合、核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを包含する。これらの用語は、また、組換え又は合成手段により産生される場合、核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを包含する。
【００９５】
本明細書において教示する通りの例示的なヒト核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドは、下に与えるNCBI Genbank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）受入番号の下で注釈付きとされうる。当業者は、また、一部の例において、前記配列が、本明細書において教示する通りの核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの前駆体（例、プレタンパク質）のものでありうる、及び、成熟核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドから離れてプロセシングされる部分を含みうることを認めることができる。当業者は、さらに、１つだけ又は複数のアイソフォームが以下に列挙されうるが、全てのアイソフォームが意図されることを認めることができる。他に特定しない限り、下のエントリーを以下の形態において提示する：名称（コード；１つ又は複数の代表的なｍＲＮＡ配列（例、アイソフォーム）についてのGenbank受入番号、ピリオド及びGenbank配列バージョンが続く；１つ又は複数の対応する代表的なアミノ酸配列（例、アイソフォーム）についてのGenbank受入番号、ピリオド及びGenbank配列バージョンが続く）：
【００９６】
ストローマ由来因子１ならびにアイソフォームα、β、γ、φ、及びε（ＳＤＦ−１又はＣＸＣＬ１２；ＮＭ＿１９９１６８．３、ＮＭ＿０００６０９．５、ＮＭ＿００１０３３８８６．２、ＮＭ＿００１１７８１３４．１；ＮＰ＿９５４６３７．１、ＮＰ＿０００６００．１、ＮＰ＿００１０２９０５８．１、ＮＰ＿００１１７１６０５．１）
【００９７】
インターロイキン８（ＩＬ−８、ＣＸＣＬ８、ＧＣＰ−１、ＧＣＰ１、ＬＥＣＴ、ＬＵＣＴ、ＬＹＮＡＰ、ＭＤＮＣＦ、ＭＯＮＡＰ、ＮＡＦ、ＮＡＰ−１又はＮＡＰ１；ＮＭ＿０００５８４．３；ＮＰ＿０００５７５．１）
【００９８】
インターロイキン６（ＩＬ−６、ＨＳＦ、ＨＧＦ、ＣＤＦ、ＢＳＦ２又はＩＦＮＢ２；ＮＭ＿０００６００．３、ＮＰ＿０００５９１．１）
【００９９】
ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４アイソフォームａ及びｂ（ＣＸＣＲ４、ＦＢ２２、ＨＭ８９、ＬＡＰ３、ＬＣＲ１、ＮＰＹＲ、ＷＨＩＭ、ＣＤ１８４、ＬＥＳＴＲ、ＮＰＹ３Ｒ、ＮＰＹＲＬ、ＨＳＹ３ＲＲ、ＮＰＹＹ３Ｒ、Ｄ２Ｓ２０１Ｅ；ＮＭ＿００１００８５４０．１、ＮＭ＿００３４６７．２、ＮＰ＿００１００８５４０．１、ＮＰ＿００３４５８．１）
【０１００】
ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体７（ＣＸＣＲ７、ＲＤＣ１、ＣＭＫＯＲ１、ＧＰＲ１５９、ＮＭ＿０２０３１１．２、ＮＰ＿０６４７０７．１）
【０１０１】
ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体１（ＣＸＣＲ１、Ｃ−Ｃ、ＣＤ１２８、ＣＤ１８１、ＣＫＲ−１、ＩＬ８Ｒ１、ＩＬ８ＲＡ、ＣＭＫＡＲ１、ＩＬ８ＲＢＡ、ＣＤｗ１２８ａ、Ｃ−Ｃ−ＣＫＲ−１、ＮＭ＿０００６３４．２、ＮＰ＿０００６２５．１）
【０１０２】
ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体２転写物変異体１及び２（ＣＸＣＲ２、ＣＤ１８２、ＩＬ８Ｒ２、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＣＭＫＡＲ２、ＣＤｗ１２８ｂ、ＮＭ＿００１１６８２９８．１、ＮＭ＿００１５５７．３、ＮＰ＿００１１６１７７０．１、ＮＰ＿００１５４８．１）
【０１０３】
インターロイキン６受容体アイソフォーム１及び２（ＣＤ１２６、ＩＬ６ＲＡ、ＩＬ−６Ｒ−１、ＭＧＣ１０４９９１、ＩＬ−６Ｒアルファ、ＩＬ６Ｒ、ＮＭ＿０００５６５．２、ＮＭ＿１８１３５９．１、ＮＰ＿０００５５６．１、ＮＰ＿８５２００４．１）
【０１０４】
他に文脈から明らかでない限り、任意の核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドへの本明細書における参照は、一般的に、また、例えば発現後又は化学的修飾（例えば、リン酸化、グリコシル化、脂質化、メチル化、システイン化、スルホン化、グルタチオン化、アセチル化、メチオニンスルホキシド又はメチオニンスルホンへのメチオニンの酸化などを含む）を持つなどの、前記の核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの修飾形態を包含する。
【０１０５】
核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドは、好ましくは、ヒトでありうる、即ち、それらの一次配列が、自然発生するヒト核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの又はその中に存在する対応する一次配列と同じでありうる。故に、修飾語「ヒト」は、この関連において、その起源又は供給源よりもむしろ、それぞれの核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの一次配列に関する。例えば、そのような核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドは、ヒト被験者のサンプル中に存在しうる又はそれから単離されうる、あるいは他の手段により（例えば、組換え発現、無細胞翻訳又は非生物学的ペプチド合成により）得られうる。
【０１０６】
任意の核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドへの本明細書における参照は、また、それらのフラグメントを包含しうる。核酸の用語「フラグメント」は、一般的に、前記核酸の５’及び／又は３’末端欠失もしくは切断形態を指す。タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの用語「フラグメント」は、一般的に、前記タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端欠失もしくは切断形態を指す。限定を伴わず、核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドのフラグメントは、前記核酸のヌクレオチド配列の又は前記タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドのアミノ酸配列の少なくとも約５%又は少なくとも約１０%、例えば、≧２０%、≧３０%又は≧４０%、例えば、好ましくは≧５０%、例えば、≧６０%、≧７０%又は≧８０%、あるいは、より好ましくは≧９０%又は≧９５%を表しうる。
【０１０７】
任意の核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドへの本明細書における参照は、また、それらの変異体を包含しうる。核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの用語「変異体」は、核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを指し、その配列（即ち、それぞれヌクレオチド配列又はアミノ酸配列）は、前記の列挙する核酸、タンパク質又はポリペプチドの配列と実質的に同一であり（即ち、大部分が、しかし、全体的ではなく同一であり）、例えば、少なくとも約８０%同一である、又は少なくとも約８５%同一である、例えば、好ましくは、少なくとも約９０%同一である、例えば、少なくとも９１%同一である、９２%同一である、より好ましくは、少なくとも約９３%同一である、例えば、少なくとも９４%同一である、さらにより好ましくは、少なくとも約９５%同一である、例えば、少なくとも９６%同一である、さらにより好ましくは、少なくとも約９７%同一である、例えば、少なくとも９８%同一である、及び、最も好ましくは、少なくとも９９%同一である。好ましくは、変異体は、列挙する核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの全配列が配列アラインメント中で問い合わせされた場合（即ち、全体的な配列同一性）、列挙する核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドへの同一性のそのような程度を表示しうる。また、核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドのフラグメント及び変異体の間に含まれるのは、前記の核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドと、別の、通常は無関係の核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドとの融合産物である。
【０１０８】
配列同一性を、配列アラインメントの実施及びそれ自体公知の配列同一性の決定のための適切なアルゴリズムを使用して決定してもよい。例示的な、しかし、非限定的なアルゴリズムは、本来はAltschul et al.1990（J Mol Biol 215: 403-10）により記載されているBasic Local Alignment Search Tool（BLAST）、例えば、Tatusova and Madden 1999（FEMS Microbiol Lett 174: 247-250）により記載されている「Ｂｌａｓｔ  ２配列」アルゴリズムに基づき、例えば、公開されたデフォルト設定又は他の適切な設定（例えば、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムについて：ギャップを開くためのコスト＝５、ギャップを拡張するためのコスト＝２、ミスマッチについてのペナルティ＝−２、マッチについての報酬＝１、ギャップｘ＿ドロップオフ＝５０、期待値＝１０．０、ワードサイズ＝２８；又はＢＬＡＳＴＰアルゴリズムについて：マトリックス＝Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップを開くためのコスト＝１１、ギャップを拡張するためのコスト＝１、期待値＝１０．０、ワードサイズ＝３）を使用したものを含む。
【０１０９】
核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの変異体は、前記核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドのホモログ（例、オルソログ又はパラログ）でありうる。本明細書において使用する通り、用語「相同性」は、一般的に、２つの巨大分子の間での、特に、同じ又は異なる分類群からの２つの核酸、タンパク質又はポリペプチドの間での構造的類似性を表示し、それにおいて、前記の類似性は共通の祖先に起因しうる。
【０１１０】
本明細書が、核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドのフラグメント及び／又は変異体を指す又はそれを包含する場合、これは、好ましくは、「機能的」である、即ち、それぞれの核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの生物学的活性又は意図する機能性を少なくとも部分的に保持する変異体及び／又はフラグメントを表示する。例及び非限定によって、アンチセンス薬剤又はＲＮＡｉ薬剤の機能的フラグメント及び／又は変異体は、前記薬剤の機能性、即ち、標的分子（遺伝子）の発現を低下又は消失させるその能力を少なくとも部分的に保持しなければならない。別の例及び非限定によって、ＳＤＦ−１、ＩＬ−８又はＩＬ−６の核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの機能的フラグメント及び／又は変異体は、それぞれＳＤＦ−１、ＩＬ−８又はＩＬ−６の生物学的活性を少なくとも部分的に保持しなければならない。例えば、それは、ＳＤＦ−１、ＩＬ−８又はＩＬ−６の生物学的活性の１つ又は複数の局面、例えば、１つ又は複数の同族受容体に結合する、１つ又は複数の細胞経路において関与する、などの能力を保持しなければならない。別の例及び非限定によって、ＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８受容体又はＩＬ−６受容体の核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの機能的フラグメント及び／又は変異体は、それぞれＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８受容体又はＩＬ−６受容体の生物学的活性を少なくとも部分的に保持しなければならない。例えば、それは、ＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８受容体又はＩＬ−６受容体の生物学的活性の１つ又は複数の局面、例えば、１つ又は複数の同族リガンドに結合する、リガンドに結合した場合に細胞シグナル伝達に影響する、などの能力を保持しうる。好ましくは、機能的フラグメント及び／又は変異体は、対応する核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドと比較し、少なくとも約２０%、例えば、少なくとも３０%、又は少なくとも約４０%又は少なくとも約５０%、例えば、少なくとも６０%、より好ましくは少なくとも約７０%、例えば、少なくとも８０%、さらにより好ましくは少なくとも約８５%、さらにより好ましくは少なくとも約９０%、及び最も好ましくは少なくとも約９５%又はさらに約１００%もしくはそれより高い、意図する生物学的活性又は機能性を保持しうる。
【０１１１】
用語「調節する」又は「調節している」は、一般的に、調節されているものの増加（例、活性化）又は減少（例、阻害）の両方を特異的に包含する定性的又は定量的変更、変化又は変動を表示する。この用語は、そのような調節の任意の範囲を包含する。
【０１１２】
例えば、調節が決定可能な又は測定可能な変数に影響する場合、次に、調節は、前記調節を伴わない参照状況と比較し、前記変数の値における、少なくとも約１０%だけ、例えば、少なくとも約２０%だけ、好ましくは少なくとも約３０%だけ、例えば、少なくとも約４０%だけ、より好ましくは少なくとも約５０%だけ、例えば、少なくとも約７５%だけ、さらにより好ましくは少なくとも約１００%だけ、例えば、少なくとも約１５０%、２００%、２５０%、３００%、４００%だけ、又は少なくとも約５００%だけの増加を包含しうる；あるいは、調節は、前記調節を伴わない参照状況と比較し、前記変数の値における、少なくとも約１０%だけ、例えば、少なくとも約２０%だけ、少なくとも約３０%だけ、例えば、少なくとも約４０%だけ、少なくとも約５０%だけ、例えば、少なくとも約６０%だけ、少なくとも約７０%だけ、例えば、少なくとも約８０%だけ、少なくとも約９０%だけ、例えば、少なくとも約９５%だけ、例えば、少なくとも約９６%、９７%、９８%、９９%だけ、又はさらに１００%だけの減少又は低下を包含しうる。
【０１１３】
好ましくは、意図する標的（特に、ＳＤＦ−１、ＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−６又はＩＬ−６受容体）の活性及び／又はレベルの調節は、特異的又は選択的でありうる、即ち、意図する標的の活性及び／又はレベルは、無作為の、無関係な標的の活性及び／又はレベルの実質的な変更を伴わず調節されうる。
【０１１４】
標的の「活性」への参照は、一般的に、標的の生物学的活性の任意の１つ又は複数の局面、例えば、限定を伴わず、細胞、組織、器官又は生物内でのその生化学的活性、酵素活性、シグナル伝達活性、相互作用活性、リガンド活性、受容体活性及び／又は構造的活性の任意の１つ又は複数の局面などを包含しうる。別の例及び非限定によって、ＳＤＦ−１、ＩＬ−８又はＩＬ−６の活性への参照は、リガンドとしてのそれらの活性、即ち、１つ又は複数の同族受容体に結合するためのそれらの能力及び／又はシグナル伝達分子としてのそれらの活性、即ち、１つ又は複数の細胞シグナル伝達経路に関与するためのそれらの能力などを特に表示しうる。別の例及び非限定によって、ＳＤＦ−１受容体、ＩＬ−８受容体又はＩＬ−６受容体の活性への参照は、受容体としてのそれらの活性、即ち、１つ又は複数の同族リガンドに結合するため、及びリガンドにより結合された場合に下流の細胞シグナル伝達に影響するため、などのそれらの能力を特に表示しうる。
【０１１５】
標的の「レベル」への参照は、好ましくは、例えば、細胞、組織、器官又は生物内での標的の量及び／又は利用能（例、その生物学的活性を実施するための利用能）を包含しうる。
【０１１６】
記述する場合を除き、「被験者」又は「患者」を互換的に使用し、動物、好ましくは温血動物、より好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくは霊長類を指し、具体的には、ヒト患者ならびに非ヒト哺乳動物及び霊長類を含む。好ましい患者はヒト被験者である。
【０１１７】
本明細書において使用する通り、語句、例えば「処置の必要のある被験者」は、所与の状態、特に損なわれた骨治癒の処置から利益を得うる被験者を含む。そのような被験者は、限定を伴わず、前記状態を診断されている者、前記状態に罹る、もしくはそれを発生する傾向がある者、及び／又は前記状態を防止すべき者を含みうる。
【０１１８】
用語「処置する」又は「処置」は、既に発生した疾患又は状態の治療的処置、例えば既に発生した損なわれた骨折治癒の治療など、ならびに、予防的又は防止的措置の両方を包含し、それにおいて、目的は、非所望の苦痛の出現の可能性を防止する又は減らすこと、例えば、損なわれた骨折治癒の罹病及び進行の可能性を防止することなどである。有益な又は所望の臨床結果は、限定を伴わず、１つ又は複数の症状あるいは１つ又は複数の生物学的マーカーの軽減、疾患の程度の縮小、疾患の安定化（即ち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の寛解又は緩和などを含みうる。「処置」は、また、処置を受けていない場合に予測される生存と比較し、延長した生存を意味しうる。
【０１１９】
用語「予防的に効果的な量」は、研究者、獣医、医師又は他の臨床医により求められている通りに、被験者において障害の発症を阻害又は遅延させる活性化合物又は医薬の量を指す。用語「治療的に効果的な量」は、本明細書において使用する通り、研究者、獣医、医師又は他の臨床医により求められている、とりわけ、処置されている疾患又は状態の症状の軽減を含みうる、被験者における生物学的又は医薬品反応を誘発する活性化合物又は医薬の量を指す。方法は、当技術分野において、本薬剤についての治療的及び予防的に効果的な用量を決定するために公知である。
【０１２０】
本明細書において使用する通り、用語「薬剤」は、広くは、任意の化学物質（例、無機又は有機）、生化学的又は生物学的物質、分子又は巨大分子（例、生物学的巨大分子）、それらの組合せ又は混合物、未決定組成物のサンプル、あるいは、例えば細菌、植物、真菌又は動物細胞もしくは組織などの生物学的材料から作られた抽出物を指す。好ましいが、非限定的な「薬剤」は、核酸、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ポリペプチド又はタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体ならびにそのフラグメント及び誘導体、アプタマー、光アプタマー、化学物質、好ましくは有機分子、より好ましくは小有機分子、脂質、炭水化物、多糖類など、ならびにそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１２１】
本明細書において教示する通り、薬剤は、例えば、標的に特異的に結合しうる。用語「特異的に結合する」は、本明細書を通して使用する通り、薬剤が、１つ又は複数の所望の標的に、例えば１つ又は複数の所望の核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドなどに、無作為又は無関係である他の分子の実質的に排除まで、場合により、構造的に関連する他の分子の実質的に排除まで結合することを意味する。標的への薬剤の結合は、とりわけ、従来の相互作用−問い合わせ方法、例えば、同時免疫沈降、イムノアッセイ方法、クロマトグラフィー方法、ゲル電気泳動方法、酵母ツーハイブリッド方法、又はそれらの組み合わせなどを使用して評価されうる。
【０１２２】
用語「特異的に結合する」は、薬剤が、その意図した標的に排他的に結合することを必ずしも要求しない。例えば、薬剤は、結合の条件下でのそのような意図される標的についてのその親和性が、非標的分子についてのその親和性よりも少なくとも約２倍大きい、好ましくは少なくとも約５倍大きい、より好ましくは少なくとも約１０倍大きい、さらにより好ましくは少なくとも約２５倍大きい、さらにより好ましくは少なくとも約５０倍大きい、さらにより好ましくは少なくとも約１００倍又はそれより大きい場合、所望の核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドに特異的に結合すると言ってもよい。
【０１２３】
好ましくは、薬剤は、その意図する標的に、そのような結合の親和性定数（ＫＡ）ＫＡ≧１×１０６M-1、より好ましくはＫＡ≧１×１０７M-1、さらにより好ましくはＫＡ≧１×１０８M-1、さらにより好ましくはＫＡ≧１×１０９M-1、さらにより好ましくはＫＡ≧１×１０１０M-1又はＫＡ≧１×１０１１M-1を伴い結合しうるが、それにおいて、ＫＡ＝［Ａ＿Ｔ］／［Ａ］［Ｔ］であり、Ａは薬剤を表示し、Ｔは意図する標的を表示する。ＫＡの決定は、当技術分野において公知の方法により、例えば、平衡透析及びスキャッチャードプロット分析などを使用して行うことができる。
【０１２４】
本明細書において含まれる薬剤の特定の型が、以下においてより詳細に記載される。
【０１２５】
本明細書において使用する通り、用語「抗体」は、その最も広い意味において使用され、一般的に、任意の免疫学的結合薬剤を指す。該用語は、具体的には、無傷モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価（例、２、３又はそれ以上の価）及び／又は少なくとも２つの無傷抗体から形成される多特異的抗体（例、二又はそれ以上の特異的抗体）、ならびに、それらが所望の生物学的活性（特に、目的の抗原に特異的に結合する能力）を示す限りにおいて、抗体フラグメント、ならびにそのようなフラグメントの多価及び／又は多特異的複合体を包含する。用語「抗体」は、免疫化を含む方法により生成される抗体を含んでいるだけでなく、しかし、また、任意のポリペプチド、例えば、組換え発現されたポリペプチドを含み、それは、目的の抗原上のエピトープに特異的に結合することが可能な少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含するように作られる。故に、この用語は、それらがインビトロで、細胞培養において、又はインビボで産生されるかにかかわらず、そのような分子に適用される。
【０１２６】
実施態様において、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭクラスのいずれか、好ましくはＩｇＧクラス抗体でありうる。
【０１２７】
実施態様において、抗体は、ポリクローナル抗体、例えば、抗血清又はそれから精製された（例、親和性精製された）免疫グロブリンでありうる。
【０１２８】
別の好ましい実施態様において、抗体は、モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体の混合物でありうる。モノクローナル抗体は、特定の抗原又は抗原内の特定のエピトープを、より大きな選択性及び再現性を伴い標的とすることができる。
【０１２９】
例及び非限定によって、モノクローナル抗体は、Kohler et al.1975（Nature 256: 495）により最初に記載されたハイブリドーマ方法により作られうる、又は、組換えＤＮＡ方法（例、ＵＳ  ４，８１６，５６７における通り）により作られうる。モノクローナル抗体は、また、例えば、Clackson et al.1991（Nature 352: 624-628）及びMarks et al. 1991（J Mol Biol 222: 581-597）により記載される通りの技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離されうる。
【０１３０】
さらなる実施態様において、抗体薬剤は抗体フラグメントでありうる。「抗体フラグメント」は、抗原結合領域又はその可変領域を含む、無傷抗体の部分を含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多価及び／又は多特異的抗体、例えば、ジボディ、トリボディ及びマルチボディを含む。上の命名、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどは、それらの技術分野で確立された意味を有することが意図される。
【０１３１】
用語「抗体」は、任意の動物種、好ましくは脊椎動物種（例、鳥及び哺乳動物を含む）に由来する１つ又は複数の部分から生じる又はそれを含む抗体を含む。限定を伴わず、抗体は、鶏、七面鳥、ガチョウ、アヒル、ホロホロチョウ、ウズラ又はキジでありうる。また、限定を伴わず、抗体は、ヒト、ネズミ（例、マウス、ラットなど）、ロバ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ラクダ（例、Ｃａｍｅｌｕｓ  ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ及びＣａｍｅｌｕｓ  ｄｒｏｍａｄｅｒｉｕｓ）（また、ラクダ重鎖抗体ＶＨＨを含む）、ラマ（例、Ｌａｍａ  ｐａｃｃｏｓ、Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ又はＬａｍａ  ｖｉｃｕｇｎａ）（また、ラマ重鎖抗体ＶＨＨを含む）又はウマでありうる。
【０１３２】
当業者は、抗体が、そのような変化が、それぞれの抗原のその結合を保存する限りにおいて、１つ又は複数のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換（例、保存的置換）を含みうることを理解するであろう。抗体は、また、その構成アミノ酸残基の１つ又は複数の天然又は人工修飾（例、グリコシル化など）を含みうる。
【０１３３】
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体ならびにそれらのフラグメントを産生する方法は、当技術分野において周知であるが、組換え抗体又はそれらのフラグメントを産生するための方法の通りである（例えば、Harlow and Lane, “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1988；Harlow and Lane, “Using Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1999, ISBN 0879695447；“Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques”, by Zola, ed., CRC Press 1987, ISBN 0849364760；“Monoclonal Antibodies: A Practical Approach”, by Dean & Shepherd, eds., Oxford University Press 2000, ISBN 0199637229；Methods in Molecular Biology, vol. 248: “Antibody Engineering: Methods and Protocols”, Lo, ed., Humana Press 2004, ISBN 1588290921を参照のこと）。
【０１３４】
動物、例えば実験室又は農場動物などの非ヒト動物を、提示性担体、及び免疫血清からの抗体又は細胞試薬の調製物に、場合により融合した、又は共有結合的もしくは非共有結合的に連結、結合もしくは吸着した免疫化抗原（例えば、本明細書において開示する複合体など）を使用して免疫化するための方法が、それ自体周知であり、本明細書において他に言及される文書中に記載されている。免疫化すべき動物は、任意の動物種、好ましくは温血種、より好ましくは、例えば鳥及び哺乳動物を含む脊椎動物種を含みうる。限定を伴わず、抗体は、鶏、七面鳥、ガチョウ、アヒル、ホロホロチョウ、ウズラ又はキジでありうる。また、限定を伴わず、抗体は、ヒト、ネズミ（例、マウス、ラットなど）、ロバ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ラクダ、ラマ又はウマでありうる。用語「提示性担体」又は「担体」は、一般的に、第２分子に結合した場合、後者への免疫反応を、通常、追加のＴ細胞エピトープの提供を通じて増大させる免疫原性分子を表示する。提示性担体は、（ポリ）ペプチド構造又は非ペプチド構造、例えば、とりわけ、グリカン、ポリエチレングリコール、ペプチド模倣体、合成ポリマーなどでありうる。例示的で、非限定的な担体は、ヒトＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質、複数のＣ３ｄドメイン、破傷風毒素フラグメントＣ又は酵母Ｔｙ粒子を含む。
【０１３５】
他の分子（非標的）の排除までの、目的の１つ又は複数の標的に特異的に結合する薬剤の選択は、適切には、前記の１つ又は複数の標的に結合する薬剤から、１つ又は複数の非標的と交差反応又は交差結合もするそれらの薬剤を減ずる又は除去するための方法を含みうる。そのような除去は、当技術分野において公知の通りに、種々の親和性分離方法、例えば親和性クロマトグラフィー、親和性固相抽出、親和性磁気抽出などにより容易に実施されうる。
【０１３６】
用語「アプタマー」は、一本鎖又は二本鎖オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ又はオリゴＤＮＡ／ＲＮＡあるいはそれらの任意の類似体を指し、それらは、標的分子に特異的に結合することができる。有利には、アプタマーは、それらの標的についてかなり高い特異性及び親和性（例、１×１０９M-1程度のＫＡ）を呈しうる。アプタマー産生は、とりわけ、ＵＳ  ５，２７０，１６３；Ellington & Szostak 1990（Nature 346: 818-822）；Tuerk & Gold 1990（Science 249: 505-510）；又は“The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications”, by Klussmann, ed., Wiley-VCH 2006, ISBN 3527310592において記載されており、参照により本明細書において組み入れられる。用語「光アプタマー」は、標的分子に共有結合的に結合する又はそれと架橋することができる１つ又は複数の光反応性官能基を含むアプタマーを指す。
【０１３７】
用語「ペプチド模倣体」は、対応するペプチドのトポロジー類似体である非ペプチド薬剤を指す。ペプチドのペプチド模倣体を合理的に設計する方法は、当技術分野において公知である。例えば、硫酸化８−ｍｅｒペプチドＣＣＫ２６−３３に基づく３つのペプチド模倣体、及び１１−ｍｅｒペプチドサブスタンスＰに基づく２つのペプチド模倣体の合理的な設計、ならびに関連するペプチド模倣体の設計原理が、Horwell 1995（Trends Biotechnol 13: 132-134）において記載されている。
【０１３８】
用語「小分子」は、医薬品において一般的に使用されるそれらの有機分子と同程度のサイズを有する化合物、好ましくは、有機化合物を指す。この用語は、生物学的巨大分子（例、タンパク質、核酸など）を除外する。好ましい小有機分子は、サイズにおいて、約５０００Ｄａまで、例えば、約４０００まで、好ましくは３０００Ｄａまで、より好ましくは２０００Ｄａまで、さらにより好ましくは約１０００Ｄａまで、例えば、約９００、８００、７００、６００まで又は約５００Ｄａまでの範囲である。
【０１３９】
用語「アンチセンス」は、一般的に、例えば、標的ＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ、プレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ中などの標的核酸中の所与の配列と特異的にアニールする（それにハイブリダイズする）ように構成された薬剤（例、オリゴヌクレオチド）を指し、典型的には、前記の標的核酸配列と相補的である又は実質的に相補的である核酸配列を含む、それから本質的になる、又はなる。本明細書における使用のための適切なアンチセンス薬剤は、典型的には、それぞれの標的核酸配列と高いストリンジェンシー条件でアニーリングする（それとハイブリダイズする）ことが可能でありうる、及び、標的に、生理学的条件下で特異的にハイブリダイズすることが可能でありうる。
【０１４０】
用語「相補的な」又は「相補性」は、核酸への参照を伴い本明細書において使用する通り、許容的な塩（イオン強度）及び温度条件下での、塩基対合、好ましくはワトソン−クリック塩基対合による一本鎖核酸の正常な結合を指す。例によって、相補的なワトソン−クリック塩基対合が、塩基ＡとＴ、ＡとＵ又はＧとＣの間で生じる。例えば、配列５’−Ａ−Ｇ−Ｕ−３’は、配列５’−Ａ−Ｃ−Ｕ−３’と相補的である。
【０１４１】
用語「リボザイム」は、一般的に、ポリヌクレオチドを触媒的に切断することが可能な、核酸分子、好ましくはオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体を指す。好ましくは、「リボザイム」は、所与の標的タンパク質のｍＲＮＡを切断することが可能であり、それにより、その翻訳を低下させる。本明細書において熟慮する例示的なリボザイムは、限定を伴わず、ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型のリボザイム、デルタ型リボザイムなどを含む。リボザイム及びその設計に関する教示については、例えば、ＵＳ  ５，３５４，８５５、ＵＳ  ５，５９１，６１０、Pierce et al. 1998（Nucleic Acids Res 26: 5093-5101）、Lieber et al.1995（Mol Cell Biol 15: 540-551）、及びBenseler et al. 1993（J Am Chem Soc 115: 8483-8484）を参照のこと。
【０１４２】
「ＲＮＡ干渉」又は「ＲＮＡｉ」技術は、当技術分野において公知であり、一般的には、特に短い干渉核酸（ｓｉＮＡ）により媒介される、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングの過程及び手段を指す。ＲＮＡｉ分子及びその設計に関する教示については、とりわけ、例えば、Elbashir et al. 2001（Nature 411: 494-501）、Reynolds et al. 2004（Nat Biotechnol 22: 326-30）、http://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress, Wang & Mu 2004（Bioinformatics 20: 1818-20）、Yuan et al. 2004（Nucleic Acids Res 32(Web Server issue): W130-4）、M Sohailによる、2004（“Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application”, 1st ed., CRC, ISBN 0849321417）、U Schepers 2005（“RNA Interference in Practice: Principles, Basics, and Methods for Gene Silencing in C.elegans, Drosophila, and Mammals”, 1st ed., Wiley-VCH, ISBN 3527310207）及びDR Engelke & JJ Rossi 2005（“Methods in Enzymology, Volume 392: RNA Interference”, 1st ed., Academic Press, ISBN 0121827976）を参照のこと。
【０１４３】
ＲＮＡｉ薬剤は、典型的には、アニーリングした相補鎖の二本鎖部分又は領域（一本鎖オーバーハングの任意の潜在的に好ましい存在にもかかわらず）を含み、それから本質的になり、又はなり、その１つは、下方調節すべき標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に（故に、ｍＲＮＡの少なくとも部分に）対応する配列を有する。ＲＮＡｉ薬剤の他の鎖は、前記の標的ヌクレオチド配列に相補的である。
【０１４４】
ＲＮＡｉ薬剤の配列は、下方調節すべき標的配列と完全に同一である必要はないのに対し、ＲＮＡｉ薬剤の標的配列とヌクレオチド配列の間のミスマッチの数は、好ましくは、５塩基中１、又は１０塩基中１、又は２０塩基中１、又は５０塩基中１以下である。
【０１４５】
好ましくは、無関係分子を上回る、所望の標的に向かうＲＮＡｉ薬剤の特異性を確実にするために、前記ＲＮＡｉ薬剤の配列は、それぞれの標的配列と、少なくとも約８０%同一であり、好ましくは少なくとも約９０%同一であり、より好ましくは少なくとも約９５%同一であり、例えば、約９６%、約９７%、約９８%、約９９%及び１００%まで同一である。
【０１４６】
ＲＮＡｉ薬剤は、別々のセンス鎖及びアンチセンス鎖により、又は、あるいは、ＲＮＡｉ薬剤の２つのアニーリング鎖が共有結合的に連結されるフォールドバックステムループ又はヘアピン設計を提供する共通の鎖により形成されうる。
【０１４７】
ｓｉＲＮＡ分子は、典型的には、別々の、実質的に相補的な鎖の二本鎖分子として産生（例えば、合成）されうるが、それにおいて、各々の鎖は、約１８〜約３５塩基長、好ましくは約１９〜約３０塩基長、より好ましくは約２０〜約２５塩基長、さらにより好ましくは約２１〜約２３塩基長である。
【０１４８】
ｓｈＲＮＡは、ヘアピン構造の形態である。ｓｈＲＮＡは、外因的に合成することができる、又はインビボでＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターから転写することにより形成することができる。好ましくは、ｓｈＲＮＡを宿主細胞又は生物において操作し、所望の遺伝子の継続的で安定的な抑制を確実にすることができる。ｓｉＲＮＡは、ヘアピンＲＮＡを細胞中でプロセシングすることにより産生することができることが公知である。
【０１４９】
ＲＮＡｉ薬剤は、本明細書において意図する通り、それらの治療的特性を改善するために、核酸及びオリゴヌクレオチドについて本明細書において他に示す通りの任意の修飾を含みうる。
【０１５０】
ＲＮＡｉ分子の少なくとも１つの鎖は、約１〜約６塩基長、例えば、２〜４塩基、より好ましくは１〜３塩基の３’オーバーハングを有しうる。例えば、１つの鎖は３’オーバーハングを有しうる、他の鎖は平滑末端でありうる又は、また、３’オーバーハングを有しうる。オーバーハングの長さは、各々の鎖について同じでありうる又は異なりうる。３’オーバーハングは、分解に対して安定化することができる。例えば、ＲＮＡは、例えばＡ又はＧヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含むことにより安定化されうる。あるいは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば２’−デオキシチミジンによるＵ３’オーバーハングの置換が許容され、ＲＮＡｉの効率に影響しない。
【０１５１】
例示的な、しかし、非限定的なｓｉＲＮＡ分子は、以下の基準の任意の１つ又は複数により、好ましくは全てにより特徴付けられうる：
−  標的ｍＲＮＡと少なくとも約８０%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０%の配列同一性、又は少なくとも約９５%、又は少なくとも約９７%の配列同一性；
−  成熟ｍＲＮＡ中に存在する標的遺伝子の領域を標的とする配列を有する（例、エクソン又は選択的スプライシングされたイントロン）；
−  標的遺伝子の３’末端を標的とするための優先度を示す。
【０１５２】
例示的なｓｉＲＮＡは、さらに、以下の基準の１つ又は複数あるいは全てにより特徴付けられうる：
−  １６〜３０塩基の間の、好ましくは、１８〜２３塩基の間の、好ましくは１９ヌクレオチドの二本鎖核酸長を有し；
−  約３０〜約５０%の間のＧＣ含量を有し
−  ３’末端にＴＴ（Ｔ）配列を有し；
−  二本鎖形態を採用する場合、二次構造を示さず；
−  ２０℃より低いＴｍ（融解温度）を有し
−  ヌクレオチドの配列において本明細書で下に示すヌクレオチドを有し、それにおいて、「ｈ」はＡ、Ｃ、Ｔ／Ｕであるが、しかし、Ｇではなく；それにおいて、「ｄ」はＡ、Ｇ、Ｔ／Ｕであるが、しかし、Ｃではなく、及び、それにおいて、「ｗ」はＡ又はＴ／Ｕであるが、しかし、Ｇ又はＣではない：
【０１５３】
【表１】
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【０１５４】
例えばアンチセンス薬剤及びＲＮＡｉ薬剤などの、本明細書において意図する薬剤の産生は、当技術分野において公知の任意の過程により、例えば、とりわけ、部分的又は全体的に、化学的合成（例、ルーチン的に公知の固相合成；修飾固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成するための例示的な、非限定的な方法が、ＵＳ  ４，４５８，０６６において記載されている；別の例において、ジエチル−ホスホルアミダイトを出発材料として使用し、Beaucage et al.1981（Tetrahedron Letters 22: 1859-1862）により記載される通りに、合成されうる）、あるいは、部分的又は全体的に、生化学的（酵素的）合成により、例えば、Ｔ７又はＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼなどの適切なポリメラーゼを使用した核酸構築物（鋳型）からのインビトロ転写により、あるいは、宿主細胞又は宿主生物におけるベクターからの発現などの組換え核酸技術により行うことができる。ヌクレオチド類似体は、インビトロでの化学的又は生化学的合成により導入することができる。実施態様において、本発明のアンチセンス薬剤は、インビトロで合成され、生物学的起源のアンチセンス組成物又はアンチセンス分子のインビボ合成に向けるように設計された遺伝子ベクター構築物を含まない。
【０１５５】
他で記述される通り、薬剤は、１つ又は複数の調節配列に動作可能に連結された、１つ又は複数の所望のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードする配列を含む組換え核酸を含みうるが、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードする前記配列又は配列の発現を、例えば、インビトロで、宿主細胞、宿主器官及び／又は宿主生物において許す（発現構築物）。そのような組換え核酸は、適切なベクター中に含まれうる。
【０１５６】
「コードする」により、核酸配列又はその部分が、問題の生物の遺伝子コードによって、特定のアミノ酸配列、例えば、１つ又は複数の所望のタンパク質もしくはポリペプチドのアミノ酸配列に対応することを意味する。
【０１５７】
好ましくは、１つ又は複数のタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドをコードする核酸は、前記の１つ又は複数のタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドをコードする１つ又は複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含みうる。「オープンリーディングフレーム」又は「ＯＲＦ」は、翻訳開始コドンを用いて開始し、それ自体公知の翻訳終結コドンを用いて終わり、任意の内部インフレーム翻訳終結コドンを含まず、潜在的に、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードすることが可能な、コードヌクレオチドトリプレット（コドン）の連続を指す。故に、この用語は、当技術分野において使用される通り、「コード配列」と同義でありうる。
【０１５８】
「動作可能な連結」は、調節配列及び発現されることが求められている配列が、前記発現を許容するような方法で接続されている連結である。例えば、プロモーター及びＯＲＦなどの配列は、前記配列の間での連結の性質が以下でない場合、動作可能に連結されていると言ってもよい：（１）フレームシフト変異の導入をもたらす、（２）ＯＲＦの転写へ向けるプロモーターの能力に干渉する、（３）プロモーター配列から転写されるＯＲＦの能力に干渉する。
【０１５９】
発現のために要求される調節配列又はエレメントの正確な性質は、発現環境の間で変動し、しかし、典型的には、プロモーター及び転写ターミネーター、ならびに、場合により、エンハンサーを含みうる。
【０１６０】
「プロモーター」又は「エンハンサー」への参照は、その最も広い文脈において取るべきであり、正確な転写開始ならびに、適用可能な場合、遺伝子発現の正確な空間的及び／又は時間的制御、あるいは、例えば、内部又は外部（例、外因的）刺激へのその反応のために要求される転写調節配列を含む。特に、「プロモーター」は、核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子上の領域を描写しうるが、それにＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写を開始する。プロモーターは、好ましくは、（しかし、必ずしもそうではないが）、その転写がそれによって制御される配列の上流、即ち、５’に位置付けられる。典型的には、原核生物において、プロモーター領域は、それ自体のプロモーター及び、ＲＮＡ中に転写された場合、タンパク質合成の開始をシグナル伝達しうる配列（例、シャイン−ダルガルノ配列）の両方を含みうる。
【０１６１】
実施態様において、本明細書において熟慮するプロモーターは、構成的又は誘導的でありうる。
【０１６２】
用語「ターミネーター」又は「転写ターミネーター」は、一般的に、転写の終結をシグナル伝達する転写ユニットの末端の配列エレメントを指す。例えば、ターミネーターは、通常、目的のポリペプチドをコードするＯＲＦの下流、即ち、３’に位置付けられる。例えば、組換え核酸が２つ又はそれ以上のＯＲＦを含む、例えば、連続的に順序付けられ、マルチシストロン転写ユニットを一緒に形成する場合、転写ターミネーターは、有利には、最も下流のＯＲＦへの３’に位置付けられうる。
【０１６３】
用語「ベクター」は、一般的に、核酸分子、典型的にはＤＮＡを指し、それに、核酸セグメントが挿入及びクローン化されうる、即ち、伝播されうる。故に、ベクターは、典型的には、１つ又は複数の固有の制限部位を含み、クローン化配列が再生可能であるように、定義された宿主又は媒体生物において自己複製が可能でありうる。ベクターは、限定を伴わず、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージ、バクテリオファージ由来ベクター、ＰＡＣ、ＢＡＣ、線状核酸、例えば、線状ＤＮＡ、ウイルスベクターなどを、適当である場合、含みうる。発現ベクターは、一般的に、所望の発現系、例えばインビトロで、宿主細胞、宿主器官及び／又は宿主生物において核酸又はそれに導入されたＯＲＦの発現を可能にする及び／又はもたらすように構成される。例えば、発現ベクターは、有利には、適切な調節配列を含みうる。
【０１６４】
他で記述される通り、薬剤は、単離又は精製されたタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドを含みうる。そのようなものは、宿主細胞又は宿主生物（前記の宿主細胞又は宿主性物において、前記のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードし、その発現のための構成された発現構築物を用いて形質転換されている）による発現、それに続く、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの精製を通じて適切に得てもよい。発現構築物を上に考察する。
【０１６５】
用語「宿主細胞」及び「宿主生物」は、適切に、例えば細菌などの原核生物ならびに例えば酵母、真菌、原生動物、植物及び動物などの真核生物の両方を包含する細胞又は生物を指しうる。宿主細胞として熟慮されるのは、とりわけ、単細胞生物、例えば細菌（例えば、大腸菌、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｍｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）又はバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、酵母（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））、（培養された）植物細胞（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）又はニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔｏｂａｃｃｕｍ）からの）、及び（培養された）動物細胞（例えば、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞、ヒト細胞又は昆虫細胞）などである。宿主生物として熟慮されるのは、とりわけ、例えば植物及び動物などの多細胞生物、好ましくは動物、より好ましくは温血動物、さらにより好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくは霊長類である；特に熟慮されるのは、非ヒトである、そのような動物及び動物カテゴリーである。
【０１６６】
本開示の種々の活性薬剤又はその薬学的に許容可能な誘導体は、１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体／賦形剤を用いて、医薬組成物又は製剤中に製剤化されうる。
【０１６７】
用語「薬学的に許容可能な」は、本明細書において使用する通り、当技術分野と一致しており、医薬組成物の他の成分と適合し、そのレシピエントに有害ではないことを意味する。
【０１６８】
本明細書において使用する通り、「担体」又は「賦形剤」は、任意の及び全ての溶媒、希釈剤、緩衝液（例えば、中性緩衝化生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、又は、場合により、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、もしくはリン酸緩衝液など）、可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０など）、コロイド、分散媒、ビヒクル、充填剤、キレート薬剤（例えば、ＥＤＴＡ又はグルタチオンなど）、アミノ酸（例えば、グリシンなど）、タンパク質、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、湿潤薬剤、乳化剤、甘味料、着色料、香味料、芳香剤、増粘剤、デポー効果を達成するための薬剤、コーティング剤、抗真菌薬剤、保存剤（例えば、Thimerosal（商標）、ベンジルアルコールなど）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウムなど）、張度調整剤、吸収遅延薬剤、アジュバント、増量薬剤（例えば、ラクトース、マンニトールなど）などを含む。医薬的な活性物質のためのそのような媒質及び薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒質又は薬剤が活性物質と不適合である限りを除き、治療的組成物中でのその使用が熟慮されうる。適切な医薬的担体が、とりわけ、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)において記載されている。
【０１６９】
医薬組成物を製剤化する際での使用のための例示的な、非限定的な担体は、例えば、水中油型又は油中水型エマルジョン、静脈内（ＩＶ）使用のための適切な有機共溶媒の含有を伴う又は伴わない水性組成物、リポソーム又は界面活性剤含有小胞、とりわけ、ポリ乳酸又はポリグリコール酸などのポリマー化合物を伴う粒子状調製物、マイクロスフェア、マイクロビーズ及びミクロソーム、粉末、錠剤、カプセル、坐剤、水性懸濁剤、エアロゾル剤ならびに当業者に明らかな他の担体を含む。
【０１７０】
医薬的担体は、滅菌液体、例えば、水及び石油、動物、植物又は合成起源のものを含む油、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含みうる。
【０１７１】
本発明の医薬組成物は、本質的に任意の投与の経路、例えば、限定を伴わず、経口投与（例えば、経口摂取又は吸入など）、鼻腔内投与（例えば、鼻腔内吸入又は鼻腔内粘膜適用など）、肺内（例えば、粉末又はエアロゾルの吸入もしくは吹送による、など）、非経口投与（例えば、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内又は胸骨内注射もしくは注入、あるいは頭蓋内、例えば、髄腔内又は脳室内投与など）、骨内及び／又は病変内投与、表皮及び経皮又は経粘膜（例えば、経口、舌下、鼻腔内など）投与、局所投与（とりわけ、点眼投与を含む）、直腸、膣又は気管内点滴などのために製剤化されうる。この方法において、本発明の方法及び組成物により達成可能な治療的効果は、例えば、本発明の所与の適用の特定の必要性に依存し、全身、局所、組織特異的などでありうる。
【０１７２】
例えば、経口投与のため、医薬組成物は、丸剤、錠剤、ラッカー錠剤、コーティングされた（例えば、糖コーティングされた）錠剤、顆粒剤、硬質及び軟質ゼラチンカプセル、水性、アルコール性もしくは油性溶液、シロップ、エマルジョン又は懸濁液の形態において製剤化してもよい。例において、限定を伴わず、経口投与形態の調製物は、適切には、均一に及び密接に粉末の形態における活性化合物の適切な量を一緒に混ぜ（場合により、また、細かく分割した１つ又は複数の固体担体を含む）、及び混合物を丸剤、錠剤又はカプセル中に製剤化することにより達成されうる。例示的な、しかし、非限定的な固体担体は、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖（例えば、グルコース、マンノース、ラクトース又はスクロース）、糖アルコール（例えば、マンニトール）、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックス及びイオン交換樹脂を含む。医薬組成物を含む圧縮錠剤を、均一に及び密接に活性成分を上に記載する通りの固体担体と混合し、必要な圧縮特性を有する混合物を提供すること、及び、次に、適切な機械において混合物を所望の形状及びサイズに圧縮することにより調製することができる。成形錠剤は、適切な機械において、不活性液体希釈剤を用いて湿らせた粉末化合物の混合物を成形することにより作られうる。軟質ゼラチンカプセル及び坐剤のための適切な担体は、例えば、脂肪、ワックス、半固体及び液体ポリオール、天然又は硬化油などである。
【０１７３】
例えば、経口もしくは経鼻エアロゾル又は吸入投与のために、医薬組成物は、例示的な担体、例えば、生理食塩水、ポリエチレングリコールもしくはグリコール、ＤＰＰＣ、メチルセルロースを伴う溶液中など又は粉末分散薬剤との混合物中で、さらに、ベンジルアルコールもしくは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを増強するための吸収促進剤、フッ化炭素及び／又は当技術分野において公知の他の可溶化もしくは分散薬剤を用いて製剤化してもよい。エアロゾル又はスプレーの形態における投与のための適切な医薬的製剤は、例えば、エタノールもしくは水又はそのような溶媒の混合物などの薬学的に許容可能な溶媒中での、本発明の化合物又はそれらの生理学的に許容できる塩の溶液、懸濁液又はエマルジョンである。要求される場合、製剤は、また、加えて、他の医薬的補助剤、例えば界面活性剤、乳化剤及び安定剤などならびに噴霧剤を含むことができる。例示的には、送達は、単一使用の送達装置、ミスト噴霧器、呼吸活性化粉末吸入器、エアロゾル定量吸入器（ＭＤＩ）又は当技術分野において利用可能な多数の噴霧器送達装置の任意の他の使用によりうる。加えて、ミストテント又は気管内チューブを通じた直接投与を、また、使用してもよい。
【０１７４】
粘膜表面を介した投与のための担体の例は、例えば、経口、舌下、鼻腔内など特定の経路に依存する。経口投与される場合、例示的な例は、医薬品グレードのマンニトール、デンプン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリド、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含み、マンニトールが好ましい。鼻腔内投与される場合、例示的な例は、ポリエチレングリコール、リン脂質、グリコール及び糖脂質、スクロース、ならびに／あるいはメチルセルロース、例えばラクトースなどの増量薬剤及び例えば塩化ベンザルコニウム、ＥＤＴＡなどの保存剤を伴う又は伴わない粉末懸濁剤を含む。特に例示的な実施態様において、リン脂質１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）を、約０．１〜３．０mg/mlの濃度での本発明の化合物の鼻腔内投与のために、約０．０１〜０．２%での等張水性担体として使用する。
【０１７５】
例えば、非経口投与のために、医薬組成物は、有利には、適切な溶媒、希釈剤、可溶化剤又は乳化剤などを用いて、溶液、懸濁液又はエマルジョンとして製剤化されうる。適切な溶媒は、限定を伴わず、水、生理食塩水溶液又はアルコール、例えば、エタノール、プロパノール、グリセロール、加えて、また、例えばグルコースなどの糖溶液、転化糖、スクロース又はマンニトール溶液など、あるいは上に言及する種々の溶媒の混合物である。注射可能な溶液又は懸濁液は、公知の技術に従って、適切な非毒性の非経口的な許容可能な希釈剤又は溶媒、例えばマンニトール、１，３−ブタンジオール、水、リンゲル溶液もしくは等張性塩化ナトリウム溶液又は適切な分散もしくは湿潤および懸濁薬剤、例えば滅菌、無刺激、合成モノ又はジグリセリドを含む固定油など、及びオレイン酸を含む脂肪酸を使用して製剤化されうる。本発明の化合物及びその薬学的に許容可能な塩は、また、凍結乾燥することができ、得られた凍結乾燥物は、例えば、注射又は注入調製物の産生のために使用することができる。例えば、静脈内使用のための担体の１つの例示的な例は、１０%ＵＳＰエタノール、４０%ＵＳＰプロピレングリコール又はポリエチレングリコール６００及び注射用平衡ＵＳＰ水（ＷＦＩ）の混合物を含む。静脈内使用のための他の例示的な担体は、１０%  ＵＳＰエタノール及びＵＳＰ  ＷＦＩ；０．０１〜０．１%トリエタノールアミン（ＵＳＰ  ＷＦＩ中）；又は０．０１〜０．２%ジパルミトイルジホスファチジルコリン（ＵＳＰ  ＷＦＩ中）；及び１〜１０%スクアレン又は非経口水中植物油型エマルジョンを含む。水又は生理食塩水溶液ならびに水性デキストロース及びグリセロール溶液は、好ましくは、担体として、特に注射用溶液のため用いてもよい。皮下又は筋肉内使用のための担体の例示的な例は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、５%デキストロース（ＷＦＩ中）及び０．０１〜０．１%トリエタノールアミン（５%デキストロース中）又は０．９%塩化ナトリウム（ＵＳＰ  ＷＦＩ中）、あるいは１０%ＵＳＰエタノール、４０%プロピレングリコールの１：２又は１：４混合物及び平衡許容可能等張液（例えば５%デキストロース又は０．９%塩化ナトリウム）；あるいは、０．０１〜０．２%ジパルミトイルジホスファチジルコリン（ＵＳＰ  ＷＦＩ中）及び１〜１０%スクアレン又は非経口植物油中水型エマルジョンを含む。
【０１７６】
水性製剤が好ましい場合、そのようなものは、１つ又は複数の界面活性剤を含みうる。例えば、組成物は、少なくとも１つの適切な界面活性剤、例えばリン脂質界面活性剤を含むミセル分散の形態であることができる。リン脂質の例示的な例は、ジアシルホスファチジルグリセロール、例えばジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＭＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）及びジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）など、ジアシルホスファチジルコリン、例えばジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＰＭＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）及びジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）など；ジアシルホスファチジン酸、例えばジミリストイルホスファチジン酸（ＤＰＭＡ）、ジパルミトイル（ｄｉｐａｈｎｉｔｏｙｌ）ホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）及びジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）など；ならびにジアシルホスファチジルエタノールアミン、例えばジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＭＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）などを含む。典型的には、水性製剤中の界面活性剤：活性物質のモル比は、約１０：１〜約１：１０、典型的には約５：１〜約１：５でありうるが、しかし、界面活性剤の任意の効果的な量を、水性製剤中に使用し、目的の特定の対象物に最も適するようにしてもよい。
【０１７７】
坐剤の形態において直腸性に投与された場合、これらの製剤は、本発明に従った化合物を、適切な非刺激性賦形剤、例えばココアバター、合成グリセリドエステル又はポリエチレングリコールなど（それらは、常温で固体であるが、しかし、直腸腔において液化及び／又は溶解し、薬物を放出する）と混合することにより調製されうる。マイクロカプセル、インプラント又はロッドのための適切な担体は、例えば、グリコール酸及び乳酸のコポリマーである。
【０１７８】
当業者は、上の記載が、網羅的よりむしろ、例示的であることを認識するであろう。実際に、多くの追加の製剤技術ならびに薬学的に許容可能な賦形剤及び担体溶液が、本明細書において記載する特定の組成物を、種々の処置計画において使用するための適切な投与及び処置計画の開発と同様に、当業者に周知である。
【０１７９】
医薬組成物は、骨の創傷及び欠損の修復において有用なさらなる成分を含みうる。例えば、そのような成分は、限定を伴わず、骨形成タンパク質、骨マトリックス（例えば、細胞により又は他の方法によりインビトロで産生された骨マトリックス）、ヒドロキシアパタイト／リン酸三カルシウム粒子（ＨＡ／ＴＣＰ）、セメント（例えば、ヒドロキシアパタイト；モノ、ジ又はトリリン酸カルシウム）、ゼラチン、ポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール酸、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、キトサン、多糖、ポリ−Ｌ−リジン及びコラーゲンを含みうる。例えば、そのような成分は、限定を伴わず、骨形成タンパク質、骨マトリックス、ＨＡ／ＴＣＰ、ゼラチン、ポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール酸、ヒアルロン酸、キトサン、ポリ−Ｌ−リジン及びコラーゲンを含みうる。医薬組成物は、相補的な生理活性因子、例えば骨形成タンパク質など、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ７もしくはＢＭＰ４など、血小板由来成長因子又は他の成長因子をさらに含むことができる、あるいは、それと同時投与することができる。他の潜在的な共存成分は、骨の再生を補助するために適切なカルシウム又はリン酸の無機供給源を含む（ＷＯ  ００／０７６３９）。
【０１８０】
さらに、核酸（例えば、アンチセンス及びＲＮＡｉ薬剤）を、動物細胞中に導入するいくつかの周知の方法があり、それらのいずれも本明細書において使用されうる。最も簡単には、核酸は、標的細胞／標的組織中に直接的に注射することができる。他の方法は、レシピエント細胞と、核酸を含む細菌プロトプラストとの融合、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、塩化リチウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、カチオン性脂質もしくはリポソームなどの組成物の使用、又は受容体媒介性エンドサイトーシス、バイオリスティック粒子ボンバードメント（「遺伝子銃」方法）、ウイルスベクターを用いた感染、エレクトロポレーションなどの方法を含む。標的細胞へ核酸分子を送達するために適切である他の技術又は方法は、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）ポリマーマイクロスフェアからのＮＡ分子の連続送達又は産物を送達するマイクロポンプ中への保護（安定化）されたＮＡ分子の直接注射を含む。別の可能性は、移植可能な薬物放出生分解性ミクロスフェアの使用である。また、想定されるのは、リポソーム（免疫リポソーム、ＰＥＧ化（免疫）リポソーム）、カチオン性脂質及びポリマー、ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｕｌｅｓ）又はデンドリマー、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）ポリマーマイクロスフェア、移植可能な薬物放出性の生分解性マイクロスフェア等の種々の型におけるＮＡのカプセル化；ならびに、ヌクレアーゼ阻害剤アウリントリカルボン酸などの保護薬剤を用いたＮＡの同時注射である。また、異なる上記の送達様式又は方法の組み合わせを使用しうることが明らかであるはずである。
【０１８１】
例えばアンチセンス薬剤及びＲＮＡｉ薬剤などの核酸の送達のさらなる方法で、以前に公表された方法を用いてもよい。例えば、核酸の細胞内送達は、核酸分子及びブロックコポリマーの効果的な量の混合物を含む組成物を介してもよい。この方法の例が、ＵＳ  ２００４／０２４８８３３において記載されている。
【０１８２】
核への核酸の送達の他の方法が、Mann et al. 2001（Proc Natl Acad Science 98(1): 42-47）において及びGebski et al. 2003（Human Molecular Genetics 12(15): 1801-1811）において記載されている。
【０１８３】
ネイキッドＤＮＡ又は脂質担体への複合体のいずれかとしての発現ベクターの方法による、核酸分子を細胞中へ導入するための方法が、ＵＳ  ６，８０６，０８４において記載されている。
【０１８４】
コロイド分散系において核酸分子を送達することが望ましいであろう。コロイド分散系は、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ及び水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソーム又はリポソーム製剤を含む脂質ベースの系を含む。リポソームは、インビトロ及びインビボで送達媒質として有用である人工膜小胞である。これらの製剤は、正味のカチオン性、アニオン性又は中性の電荷特性を有してもよく、インビトロ、インビボ及びエクスビボ送達方法と共に有用な特性である。大きな単層小胞（ＬＵＶ）（サイズが０．２〜４．０ＰＨＩ．ｍの範囲）は、大きな巨大分子を含む水性緩衝液の十分な割合をカプセル化することができる。ＲＮＡ及びＤＮＡを水性内部内にカプセル化し、生物学的に活性な形態で細胞に送達することができる（Fraley et al. 1981 (Trends Biochem ScL 6: 77)）。
【０１８５】
リポソームが効率的な遺伝子導入媒質であるために、以下の特徴が存在すべきである：（１）それらの生物学的活性を損なうことなく高い効率での目的の核酸分子のカプセル化；（２）非標的細胞との比較における、標的細胞への優先的及び実質的な結合；（３）高い効率での標的細胞の細胞質への小胞の水性内容物の送達；及び（４）遺伝情報の正確で効果的な発現（Mannino et al.1988（Biotechniques 6: 682））。
【０１８６】
リポソームの組成物は、通常、リン脂質、特に高相転移温度リン脂質の組み合わせ、通常はステロイド、特にコレステロールとの組み合わせである。他のリン脂質又は他の脂質も使用されうる。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度及び二価カチオンの存在に依存する。
【０１８７】
あるいは、核酸分子を、他の薬学的に許容可能な担体又は希釈剤と組み合わせ、医薬組成物を産生しうる。適切な担体及び希釈剤は、等張生理食塩水溶液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水を含む。組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼内、経口又は経皮投与用に製剤化してもよい。
【０１８８】
記載する投与の経路は、ガイドとしてだけ意図される。なぜなら、当業者は、容易に投与の最適経路ならびに任意の特定の動物及び状態のための任意の投与量を決定することができるからである。細胞中に機能的な新たな遺伝材料を導入するための複数のアプローチが、インビトロ及びインビボの両方で試みられている（Friedmann 1989 （Science 244: 1275-1280））。これらのアプローチは、改変レトロウイルス中への、発現させるべき遺伝子の組込み（Friedmann 1989、上記；Rosenberg. Cancer Res. 1991, vol. 51(18), 5074S-79S）；非レトロウイルスベクター中への組込み（Rosenfeld et al. Cell, 1992, vol. 68,143-55；Rosenfeld et al. Science, 1991, vol. 252, 431-4）；又は、リポソームを介した、異種プロモーター−エンハンサーエレメントに連結されたトランスジーンの送達（Friedmann 1989、上記；Brigham et al. Am. J. Med. Sci., 1989, vol. 298, 278-81;Nabel et al. Science, 1990, vol. 249, 1285-8;Hazinski et al. Am. J. Resp. Cell. Molec. Biol., 1991, vol. 4, 206-9；Wang & Huang. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1987, vol. 84, 7851-5）；リガンド特異的な、カチオンベースの輸送系への共役（Wu & Wu. J. Biol. Chem., 1988, vol. 263, 14621-4）又はネイキッドＤＮＡ発現ベクターの使用（Nabel et al. 1990、上記；Wolff et al. Science, 1990, vol. 247, 1465-8）を含む。組織中へのトランスジーンの直接注入は、局在化された発現だけを産生する（Rosenfeld.1992、上記；Rosenfeld et al.1991、上記；Brigham et al.1989、上記；Nabel 1990、上記；Hazinski et al.1991、上記）。Brigham et al.のグループ（Am. J. Med. Sci., 1989, vol. 298, 278-81；Clin. Res., 1991, vol. 39、要約）は、マウスの肺だけのインビボトランスフェクション、それに続く、ＤＮＡリポソーム複合体の静脈内又は気管内のいずれかの投与を報告している。ヒト遺伝子治療手順のレビュー論文の例は、Anderson. Science, 1992, vol. 256, 808-13である。
【０１８９】
本明細書において開示する通りの医薬的製剤は、便利には単位投与形態において提示されうるが、医薬的産業において周知の従来技術に従って調製してもよい。そのような技術は、一般的に、活性成分を医薬的担体又は賦形剤と会合に至らせる工程を含みうる。一般的に、製剤は、活性成分を液体担体もしくは微粉固体担体又は両方と均一に及び密接に会合に至らせ、次に、必要な場合、産物を成形することにより調製される。
【０１９０】
本活性薬剤は、単独で、又は、例えばＢＭＰ−２などの損なわれた骨治癒の処置のための当技術分野において公知の任意の治療法との組み合わせにおいて（「組み合わせ治療」）使用してもよい。本明細書において熟慮する通りの組み合わせ治療は、本発明の少なくとも１つの活性薬剤及び少なくとも１つの他の医薬的又は生物学的に活性な成分の投与を含みうる。前記の本活性薬剤及び前記の医薬的又は生物学的に活性な成分は、同じ又は異なる医薬的製剤中で、同時に又は任意の順番において連続的に投与されうる。
【０１９１】
さらなる例において、本明細書において記載する通りの薬剤は、損なわれた骨折治癒に対して治療的効果を有する細胞と組み合わせてもよく、又は、本明細書において記載する通りの組成物は、さらに、それを含んでもよい。例によって、そのような細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、骨髄ストローマ細胞（ＢＭＳＣ）、骨芽細胞、例えば前骨芽細胞もしくは骨芽細胞など又は骨細胞でありうる。有利には、そのような細胞は、自己でありうるか、又は、より好ましくは同種でありうる。
【０１９２】
使用する本活性薬剤の投与量又は量は、場合により、投与すべき１つ又は複数の他の活性化合物との組み合わせにおいて、個々の症例に依存し、慣例により、最適な効果を達成するために個々の状況に適応させる。このように、それは、処置すべき障害の性質及び重症度、ならびに、また、性別、年齢、体重、一般的健康、食事、投与の様式及び時間及び処置すべきヒト又は動物の個々の反応性に、投与の経路、有効性、使用される化合物の代謝安定性及び作用の持続時間に、治療が急性もしくは慢性又は予防的であるかに、あるいは他の活性化合物が本発明の薬剤に加えて投与されるか否かに依存する。
【０１９３】
限定を伴わず、疾患の型及び重症度に依存し、典型的な１日投与量は、上に言及する因子に依存し、約１ng/kg〜１００mg/kg体重の範囲又はそれ以上でありうる。数日間にわたる又はそれより長い反復投与のために、状態に依存して、処置は、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続される。本発明の活性物質の好ましい投与量は、約０．０５mg/kg〜約１０mg/kg体重の範囲にありうる。このように、約０．５mg/kg、２．０mg/kg、４．０mg/kg又は１０mg/kg（又はそれらの任意の組み合わせ）の１つ又は複数の用量を患者に投与してもよい。そのような用量を、断続的に、例えば、毎週又は２もしくは３週間毎に投与しうる。
【０１９４】
実施態様において、医薬組成物は、約１０nM〜約１μMの間、好ましくは約２０nM〜約６００nMの間、例えば、約１００nM又は約２００nM、又は約３００nM、又は約４００nM又は約５００nMの本明細書において教示する通りのアンチセンス薬剤又はＲＮＡｉ薬剤を含みうる。
【０１９５】
非限定的な実施態様において、損なわれた骨折治癒の部位での投与のために、約１ng〜約５００μgの間のＳＤＦ−１タンパク質を投与しうる。
【０１９６】
非限定的な実施態様において、損なわれた骨折治癒の部位での投与のために、約１ng〜約１mgの間のＩＬ−８タンパク質を投与しうる。
【０１９７】
非限定的な実施態様において、損なわれた骨折治癒の部位での投与のために、約１ng〜約１００μgの間のＩＬ−６タンパク質を投与しうる。
【０１９８】
本発明に従い、上に示す通りの実質的な利点を提供する産物、方法及び使用が提供されていることは明らかである。本発明は、その具体的な実施態様と併せて記載されており、多くの代替物、修飾及び変動が、先行する記載に照らして、当業者に明らかであろうことは明白である。したがって、全てのそのような代替物、修飾及び変動を、以下の通りに、添付の請求項の精神及び広い範囲において包含することを意図する。
【０１９９】
上の局面及び実施態様は、さらに、以下の非限定的な実施例により支持される。
【０２００】
実施例
実施例１：血清／血漿中の変化したタンパク質レベルの測定
被験者の２群が試験に入った：（１）健常ボランティア（ＨＶ）、（２）損なわれた骨折治癒を伴う、特に癒合不能骨折（ＮＵ）を伴う患者。患者集団は以下の通りに分布した：
【０２０１】
【表２】
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【０２０２】
２群における平均年齢は、３０〜４０歳の間で変動した。癒合不能患者はより高齢で（Ｐ＝０．０１２）、大半が男性であった。しかし、結果は、性別及び年齢に非依存的に不変のままであった。骨部位は、中足骨の２つの骨折及び踵骨の２つの骨折を除き、長骨（橈骨、上腕骨、腓骨、脛骨及び肘）にあった。骨折とサンプル収集の間の遅延は、２５ヶ月前後変動し、１５ヶ月の標準偏差を伴った。
【０２０３】
癒合不能において変化した存在を有するタンパク質を同定するために、血清を乾燥チューブ中に採取し、血漿をヘパリン又はＥＤＴＡチューブ中に採取し、遠心し、分注し、使用まで−２０℃で凍結した。これらを使用し、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、成長因子及びタンパク質のレベルを決定した。
【０２０４】
ストローマ由来因子１を血漿中で測定した（ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２，Duoset，R&D Systems, Abingdon, United Kingdom）。以下のバイオマーカーを、血清中で測定した：血小板由来成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ，Quantikine（商標），R&D Systems, Abingdon, United Kingdom）、インターロイキン８（ＩＬ８／ＣＸＣＬ８，Quantikine（商標），R&D Systems, Abingdon, United Kingdom）及びインターロイキン６（ＩＬ−６，Quantikine（商標），R&D Systems, Abingdon, United Kingdom）。
【０２０５】
全ての連続値を中央値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表現し、全ての報告されたＰ値は片側であり、統計的有意性を１０%レベルで評価する。分布の正規性を、コルモゴロフ−スミルノフ検定を用いてテストした。コルモゴロフ−スミルノフ検定が失敗した場合、群間の差を、マン−ホイットニー検定により分析した。
【０２０６】
ＨＶと比較した場合、ＮＵ患者において、ＳＤＦ−１の血漿レベルは減少した（図１Ａ）。減少は、ＥＤＴＡチューブ中に採取した血漿と比較し、ヘパリンチューブ中に採取した血漿中でより顕著であった（図１Ｂ及び１Ｃ）。
【０２０７】
健常ボランティア（ＨＶ）と比較した場合、ＩＬ−８の血清レベルがＮＵ患者において増加した（図２）。
【０２０８】
健常ボランティア（ＨＶ）と比較した場合、ＩＬ−６の血清レベルがＮＵ患者において増加する傾向にあった（図３）。
【０２０９】
実施例２：被験者からの細胞の培養
これらのタンパク質の存在は、細胞中、又は被験者から得られ、インビトロで培養された細胞の上清中で、好ましくは骨芽細胞（ＯＢ）又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から測定した場合にも変化を示した。以下は、そのような細胞の単離、分化及び培養のための適切なプロトコールを提供する。
【０２１０】
ヘパリン化骨髄（ＢＭ）の２０〜６０mlを、骨折部位から離れた腸骨稜から得た。ＢＭを、リン酸緩衝生理食塩水と混合し（ＰＢＳ：ＢＭ比率（ｖ：ｖ）：２）、密度勾配フィコール溶液上に重層した。遠心後、単核細胞を界面から収集し、ＰＢＳ中で２回洗浄した。細胞を、１．４３×１０６個細胞／２５cm2フラスコで、２つの異なる培地中に播種した；（１）ＤＭＥＭ、１０%ウシ胎児血清、１%Ｌグルタミン、１%ペニシリン及び１%ストレプトマイシンから成る間葉系培地；（２）骨形成培地。細胞を、５%ＣＯ２を含む３７℃の加湿雰囲気中で維持した。培地の変化を２〜３日毎に行った。コンフルエント時、一次培養の細胞を剥離し、二次培養のために再播種した。これらの２つの培養継代の上清を採取し、使用まで凍結した。
【０２１１】
血液サンプルのために使用するＥＬＩＳＡ試薬プロトコールは、ルーチンな適応を伴う細胞上清に適用する。
【０２１２】
実施例３：骨芽細胞又は間葉系幹細胞のオートクライン／パラクライン活性
損なわれた骨折治癒における骨前駆細胞のオートクライン／パラクライン活性を試験するために、骨芽細胞（ＯＢ）又は間葉細胞培養（ＭＳＣ）の上清中に分泌された成長因子のレベルをＥＬＩＳＡにより評価した。以下の成長因子を測定した：ストローマ由来因子１（ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２，Duoset，R&D Systems, Abingdon, United Kingdom）及びインターロイキン６（ＩＬ−６，Duoset，R&D Systems, Abingdon, United Kingdom）。値は、上清のpg/mlで表した。
【０２１３】
健常ボランティア（ＨＶ）と比較した場合、ＳＤＦ−１は、癒合不能患者（ＮＵ）のＯＢ及びＭＳＣ培養の上清中に、一次細胞培養の終了時に、より少なく分泌された（図４Ａ及び４Ｂ）。
【０２１４】
さらに、ＩＬ−６は、ＮＵ患者のＯＢ培養の上清中に、一次及び二次細胞培養の終了時に、ＨＶと比較し、より少なく分泌された（図５）。
【０２１５】
実施例４：マウスにおける頭蓋冠欠損修復における成長因子ＳＤＦ−１、ＩＬ−８及び／又はＩＬ−６の効果
本実施例は、各々の単独又は任意の２つもしくは３つ全ての組み合わせにおける、インサイチュでの投与における、頭蓋冠欠損のマウスモデルにおける骨修復に対するＳＤＦ−１α、ＩＬ−８及びＩＬ−６の有効性に関する。
【０２１６】
雄成体マウス（各々＋／−２５g）の７群が、試験において含まれる（ｎ＝３５）。０日目に、全身麻酔後、マウスは頭蓋冠骨切断を受ける：大きな骨欠損（直径２ｍｍ）を実施する。
【０２１７】
マウスを７群中に無作為に割り当て、以下の項目の１つを受ける：
１群：ゼラチンから成る媒質溶液（５０μl、ｎ＝５）
２群：媒質溶液中のＢＭＰ２（５０μg）（５０μl、ｎ＝５）
３群：媒質溶液中のＳＤＦ−１α（１０μg）（５０μl、ｎ＝５）
４群：媒質溶液中のＩＬ−８（１μg）（５０μl、ｎ＝５）
５群：媒質溶液中のＩＬ−６（４０ng）＋ＩＬ−６の受容体（１００ng）（５０μl、ｎ＝５）
６群：媒質溶液中のＳＤＦ−１α（１０μg）＋ＩＬ−８（１μg）（５０μl、ｎ＝５）７群：媒質溶液中のＳＤＦ−１α（１０μg）＋ＩＬ−６（４０ng）＋ＩＬ−６の受容体（１００ng）（５０μl、ｎ＝５）
８群：媒質溶液中のＳＤＦ−１α（１０μg）＋ＩＬ−８（１μg）＋ＩＬ−６（４０ng）＋ＩＬ−６の受容体（１００ng）（５０μl、ｎ＝５）
【０２１８】
成長因子は、無菌状態において、骨切断手術直後（病変を縫合する前）、頭蓋冠欠損中に投与される。２、４及び６週間後、骨形成をＣＴスキャン撮像により評価する。骨修復進行は、骨切断部位における石化組織の存在として決定する。プロトコールの終わりに、マウスを安楽死させ、サンプルを、免疫組織化学分析のために採る。
【０２１９】
ＢＭＰ−２は、実験において、骨修復の陽性コントロールとして使用される。実際に、任意の基質の非存在において、ＢＭＰ−２は、１００〜２００μgの濃度で、皮下送達後、骨の形成を誘導することができることが示されている（Wang et al. PNAS, 1990, vol. 87, 2220-2224）。同じ観察が、８０μgのｒｈＢＭＰ２を骨折中に注射した際に作られている（Einhorn et al.J. Bone Joint Surg Am., 2003, vol. 85-A, 1425-1435）。
【０２２０】
ＳＤＦ−１α、ＩＬ−８及び／又はＩＬ−６が投与されるマウスが、ＳＤＦ−１α、ＩＬ−８及び／又はＩＬ−６の投与を伴わないそれぞれのコントロールマウスと比較し、有意に改善した骨形成及び頭蓋冠欠損の治癒を呈することが待たれる。
【０２２１】
実施例５：ヌードマウスにおけるＳＤＦ−１α及び／又は骨芽幹細胞の脛骨骨髄内投与
本実施例は、脛骨髄内腔における骨芽細胞を伴う又は伴わないＳＤＦ−１αの注射に続く、骨形成の有効性に関する。
【０２２２】
雄成体ヌードマウス（各々±２５ｇ）の６群が、試験において含まれる（ｎ＝３０）。０日目、全身麻酔後、マウスを無作為に割り当て、以下の項目の１つの脛骨内投与を受ける：
１群：ＰＢＳ＋５%  ＨＡＳを含む媒質溶液（４０μl、ｎ＝５）
２群：媒質溶液中のＢＭＰ２（５０μg）（４０μl、ｎ＝５）
３群：媒質溶液中のＳＤＦ−１α（１０μg）（４０μl、ｎ＝５）
４群：媒質溶液中のＩＬ−８（１μg）（４０μl、ｎ＝５）
５群：媒質溶液中のＩＬ−６（４０ng）＋ＩＬ−６の受容体（１００ng）（４０μl、ｎ＝５）
６群：媒質溶液中の骨芽幹細胞（１×１０６個細胞）（４０μl、ｎ＝５）
７群：媒質溶液中のＳＤＦ−１α（１０μg）＋骨芽幹細胞（１×１０６個細胞）（４０μl、ｎ＝５）
８群：媒質溶液中のＩＬ−８（１μg）＋骨芽幹細胞（１×１０６個細胞）（４０μl、ｎ＝５）
９群：媒質溶液中のＩＬ−６（４０ng）＋ＩＬ−６の受容体（１００ng）＋骨芽幹細胞（１×１０６個細胞）（４０μl、ｎ＝５）
１０群：媒質溶液中のＳＤＦ−１α（１０μg）＋ＩＬ−８（１μg）＋ＩＬ−６（４０ng）＋ＩＬ−６の受容体（１００ng）＋骨芽幹細胞（１×１０６個細胞）（４０μl、ｎ＝５）
【０２２３】
投与を、無菌条件において層流下で実施する。４及び８週間後、骨形成をＣＴスキャン撮像により評価する。骨形成の存在は、髄内空洞中への石化組織の存在として決定する。プロトコールの終わりに、マウスを安楽死させ、サンプルを、免疫組織化学分析のために採る。
【０２２４】
ＳＤＦ−１αが投与されるマウスが、ＳＤＦ−１αの投与を伴わないそれぞれのコントロールマウスと比較し、有意に改善した骨形成を呈することが待たれる。
【０２２５】
実施例６：骨切断のマウスモデルにおけるＳＤＦ−１α及び／又は骨芽幹細胞投与の有効性
本実施例は、骨切断のマウスモデルにおける骨修復に対する、骨芽細胞を伴う又は伴わないＳＤＦ−１αの投与の有効性に関する。
【０２２６】
雄成体ヌードラット（各々±２５０g）の６群が、試験において含まれる（ｎ＝１８）。０日目に、全身麻酔後、ラットは脛骨骨切断を受ける：大きな骨欠損（５ｍｍ）を実施し、骨断片の縁が焼灼される。
【０２２７】
１日目、ラットを無作為に６群中に割り当て、骨切断の部位で、以下の項目の１つを受ける：
１群：ＰＢＳ＋５%  ＨＡＳを含む媒質溶液（４０μl、ｎ＝５）
２群：媒質溶液中のＢＭＰ２（５０μg）（４０μl、ｎ＝５）
３群：媒質溶液中のＳＤＦ−１α低用量（１ｎｇ）（４０μl、ｎ＝５）
４群：媒質溶液中のＩＬ−８（１μg）（４０μl、ｎ＝５）
５群：媒質溶液中のＩＬ−６（４０ng）＋ＩＬ−６の受容体（１００ng）（４０μl、ｎ＝５）
６群：媒質溶液中の骨芽幹細胞（１×１０６個細胞）（４０μl、ｎ＝５）
７群：媒質溶液中のＳＤＦ−１α（１μg）＋骨芽幹細胞（１×１０６個細胞）（４０μl、ｎ＝５）
８群：媒質溶液中のＩＬ−８（１μg）＋骨芽幹細胞（１×１０６個細胞）（４０μl、ｎ＝５）
９群：媒質溶液中のＩＬ−６（４０ng）＋ＩＬ−６の受容体（１００ng）＋骨芽幹細胞（１×１０６個細胞）（４０μl、ｎ＝５）
１０群：媒質溶液中のＳＤＦ−１α（１μg）＋ＩＬ−８（１μg）＋ＩＬ−６（４０ng）＋ＩＬ−６の受容体（１００ng）＋骨芽幹細胞（１×１０６個細胞）（４０μl、ｎ＝５）
【０２２８】
投与を、無菌条件において層流下で実施する。２、４及び６週間後、骨形成をＣＴスキャン撮像により評価する。骨修復進行は、骨切断部位における石化組織の存在として決定する。プロトコールの終わりに、ラットを安楽死させ、サンプルを、免疫組織化学分析のために採る。
【０２２９】
ＳＤＦ−１αが投与されるラットが、ＳＤＦ−１α、ＩＬ−８及び／又はＩＬ−６の投与を伴わないそれぞれのコントロールラットと比較し、有意に増強した骨形成及び脛骨骨切断欠損の治癒を呈することが待たれる。
【０２３０】
実施例７：癒合不能骨折についてのマウスモデルにおけるインビボでの骨形成
骨形成を、頭蓋冠欠損のマウスモデルを使用して試験した。ＩＬ−８ペプチド（３０μｇ）を含む組成物を、頭蓋冠欠損中への注射／沈着により投与した。組成物は、さらに、例えばブタコラーゲンなどのゲル形成材料を含んだ。ＩＬ−８ペプチドは、配列番号１（表１）を有するヒトＩＬ−８ペプチド及び配列番号２（表１）を有するヒトＩＬ−８ペプチドであった；これらのＩＬ−８ペプチドは、また、本明細書において、「長いＩＬ−８ペプチド」及び「短いＩＬ−８」ペプチドとしてそれぞれ言及される。長いＩＬ−８ペプチドは、７７のアミノ酸、すなわち、アミノ酸３〜７９を含んだ。短いＩＬ−８ペプチドは、７２のアミノ酸、すなわち、アミノ酸８〜７９を含んだ。
【０２３１】
【表３】
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【０２３２】
穿頭後、４匹のマウスが、長いＩＬ−８ペプチドを含む組成物を受け、３匹のマウスが、短いＩＬ−８ペプチドを含む組成物を受けた。媒質（ＰＢＳ−ＨＳＡ）及びＢＭＰ−２（２、５、１０及び２０μg/ml）を、陰性及び陽性コントロールとしてそれぞれ使用した。陰性コントロール及び陽性コントロールについての結果を、図６及び図７にそれぞれ示す。長いＩＬ−８ペプチドを含む組成物及び短いＩＬ−８ペプチドを含む組成物についての結果を、図８及び図９においてそれぞれ例示する。マウスを穿頭後４又は６週間に屠殺した。骨形成をＣＴスキャン撮像により評価した。骨修復進行は、骨切断部位における石化組織の存在として決定する。プロトコールの終わりに、ラットを安楽死させ、サンプルを、免疫組織化学分析のために採る。マッソントリクロームを使用し、コラーゲン線維を可視化した；筋肉は赤色に着色し、骨は青色に着色。サフラニン−Ｏを使用し、肥大軟骨細胞を強調した。
【０２３３】
長いＩＬ−８ペプチドを含む組成物を受けた４匹のマウス及び短いＩＬ−８ペプチドを含む組成物を受けた３匹のマウスが、媒質と比較し、骨修復を提示した（図６、図８及び図９）。ヘマトキシリン−エオシン及びマッソントリクロームの組織学的スライド上で、新たな骨形成が、陰性コントロールと比較し、ＩＬ−８ペプチドを含む組成物を受けたマウスについてより濃く見えた（図６、図８及び図９）。図６〜９において、ボックス及び矢印は、骨形成が観察された領域を示す。短いＩＬ−８ペプチドを含む組成物を用いた処置について（図９）、頭蓋冠欠損における２つの異なるレベルが、マッソントリクローム及びサフラニン−Ｏ染色が同じレベルで実施されなかったという事実に起因して、例示されていることに注意すること。
【０２３４】
組織学的スライド（ヘマトキシリン−エオシン、マッソントリクローム、サフラニン−Ｏ）上では、ＩＬ−８ペプチドを含む両方の組成物が、ゲル形成材料における類骨の発生を伴い、頭蓋冠欠損の骨修復を誘導することが観察された。文献において、頭蓋冠の修復が膜内骨化により生じることが受け入れられている。予想外に、肥大軟骨細胞は、また、組織学的スライド上で観察され、ＩＬ−８ペプチドを含む組成物を使用する場合での軟骨内骨化を明らかにした（図８及び９）。従って、これらのデータは、ＩＬ−８ペプチドの各々が、有利には、マウスにおける頭蓋冠欠損における骨修復に対して正の効果を有したとのインビボでの証拠を提供する。マウスにおける骨頭蓋冠欠損は、癒合不能骨折についてのモデルである。故に、提示したデータは、ＩＬ−８ペプチドの各々が、有利には、癒合不能骨折における骨修復に対して正の効果を有したとのインビボでの証拠を提供する。正常な骨折治癒と骨折修復の不全により特徴付けられる癒合不能骨折の間での違いに起因し、ＩＬ−８ペプチドを含む組成物の存在における骨修復は、予想外の観察であった。
【０２３５】
結論的には、より強い骨化が、陰性コントロールと比較し、ＩＬ−８ペプチドを含む組成物を使用し、癒合不能骨折において観察された。
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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