(57)【要約】ＰＤＺドメインペプチドに融合した細胞表面タンパク質およびＰＤＺ結合ペプチドに融合した抗体を含む、ポリペプチドを細胞の表面に提示させるのに有用な新規の材料および方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＰＤＺドメインに融合した細胞表面タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
（ｂ）ＰＤＺ結合ペプチドに融合した、抗体またはその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチドと
を含む、宿主細胞。
【請求項２】
前記ＰＤＺ結合ペプチドが５〜２０アミノ酸長である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
真核細胞および原核細胞からなる群から選択される、請求項１または２に記載の宿主細胞。
【請求項４】
前記真核細胞が酵母細胞または哺乳動物細胞である、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
前記酵母細胞が、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｉｔｉｃａ）、および分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）からなる群から選択される、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記原核細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、および霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）からなる群から選択される、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記細胞表面タンパク質が細胞壁タンパク質である、請求項４または５に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記細胞壁タンパク質が、Ａｇａ１、Ａｇａ２、Ａｇα１、Ｃｗｐ１、Ｃｗｐ２、Ｇａｓ１ｐ、Ｙａｐ３ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｃｒｈ２ｐ、Ｐｉｒ１、Ｐｉｒ２、Ｐｉｒ３、およびＰｉｒ４からなる群から選択される、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記ＰＤＺドメインおよび前記ＰＤＺ結合ペプチドのそれぞれがＣｙｓ残基を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記パート（ａ）のポリヌクレオチドが、エンハンサードメインをさらにコードする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記エンハンサードメインが、ヒトフィブロネクチンの１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）の変異体である、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
前記ＰＤＺドメインが、ＩｎａＤ  ＰＤＺドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ディシブルド１様（ＤＶＬ１Ｌ）ＰＤＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ｐｒｏＴＧＦ−α細胞質ドメイン−相互作用タンパク質１８（ＴＡＣＩＰ１８）ＰＤＺ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＴＡＣＩＰ１８類似体（ＳＩＴＡＣ）ＰＤＺ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０  ＰＤＺ３ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、およびＥｒｂｉｎ  ＰＤＺドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）からなる群から選択される、前記請求項のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記ＰＤＺ結合ペプチドが、ＮｏｒｐＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のＣ末端配列または少なくとも９０％同一であるその断片を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
Ｃｙｓ残基が−１位に位置している、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記ＰＤＺ結合ペプチド配列がＧＫＴＥＦＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）である、前記請求項のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記ＰＤＺ結合ペプチドが、前記抗体またはその抗原結合性断片のＣ末端に融合している、前記請求項のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
前記パート（ａ）のポリヌクレオチド、および／または前記パート（ｂ）のポリヌクレオチドが、蛍光マーカータンパク質をさらにコードする、前記請求項のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
前記パート（ａ）のポリヌクレオチドが、宿主細胞のゲノムに組み込まれている、前記請求項のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
前記パート（ａ）およびパート（ｂ）のポリヌクレオチドが、別個のベクター中に存在するか、または場合によって同じベクター中に存在する、前記請求項のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
前記抗体が、２つの重鎖と２つの軽鎖とを含む四量体ＩｇＧ免疫グロブリンである、前記請求項のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
前記抗体の前記抗原結合性断片が、少なくとも前記重鎖の可変領域および／または前記軽鎖の可変領域を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記抗体の前記抗原結合性断片がＦａｂを含む、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
前記抗体の前記抗原結合性断片がｓｃＦｖを含む、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
前記パート（ａ）のポリヌクレオチドが、前記細胞表面タンパク質を細胞表面に導くシグナル配列をさらに含む、前記請求項のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
宿主細胞が酵母細胞である場合に、前記シグナル配列がＡｇａ２シグナル配列である、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
前記ＰＤＺ結合ペプチドが１５アミノ酸長未満である、前記請求項のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
前記ＰＤＺドメインが約８０〜１００アミノ酸長である、前記請求項のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
前記ＰＤＺドメイン−ＰＤＺ結合ペプチド相互作用が、約１００ｎＭ以下のＫｄを有する、前記請求項のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
それぞれがその表面に異なる抗体またはその抗原結合性断片を発現する、前記請求項のいずれか１項に記載の少なくとも１０＾３種の異なる真核宿主細胞
を含む、複数の細胞。
【請求項３０】
前記真核宿主細胞が酵母細胞である、請求項２９に記載の複数の細胞。
【請求項３１】
前記真核宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項２９に記載の複数の細胞。
【請求項３２】
請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の複数の細胞を培養することを含む、少なくとも１０＾３種の異なる抗体またはその抗原結合性断片を細胞表面に提示させる方法。
【請求項３３】
前記ＰＤＺドメインおよび前記ＰＤＺ結合ペプチドが少なくとも１つのジスルフィド結合で連結している、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記複数の細胞を抗原と接触させることと、場合によって該抗原に結合する細胞を選択することとをさらに含む、請求項３２〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗原に結合する細胞を選択することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記選択することが、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ビーズに基づく選別、または固相パニングによる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ビーズに基づく選別が、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
抗体またはその抗原結合性断片を選択する方法であって、
（ａ）抗体または抗原結合性断片を提示する複数のファージを抗原と接触させ、かつ該抗原に結合するファージを選択することと、
（ｂ）請求項３０に記載の複数の酵母細胞を該抗原と接触させ、かつ該抗原に結合する細胞を選択することと
を含む前記方法。
【請求項３９】
抗体またはその抗原結合性断片を選択する方法であって、
（ａ）抗体または抗原結合性断片を提示する複数のファージを抗原と接触させ、かつ該抗原に結合するファージを選択することと、
（ｂ）請求項３１に記載の複数の哺乳動物細胞を該抗原と接触させ、かつ該抗原に結合する細胞を選択することと
を含む前記方法。
【請求項４０】
抗体またはその抗原結合性断片を選択する方法であって、
（ａ）請求項３０に記載の複数の酵母細胞を抗原と接触させ、かつ該抗原に結合する細胞を選択することと、
（ｂ）請求項３１に記載の複数の哺乳動物細胞を該抗原と接触させ、かつ該抗原に結合する細胞を選択することと
を含む前記方法。
【請求項４１】
抗体または抗原結合性断片を提示する複数のファージを抗原と接触させ、かつ該抗原に結合するファージを選択するステップをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年１２月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／４２７，７２２号、２０１１年９月８日に出願された米国仮特許出願第６１／５３２，４６３号、および２０１１年１２月２日に出願された米国仮特許出願第６１／５６６，４４０号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本明細書と同時に提出されるコンピュータ可読ヌクレオチド／アミノ酸配列表は、参照によりその全体が組み込まれ、これは以下のように特定される：２０１１年１２月２８日に作成されたファイル名「４５６３６Ａ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」の９３５，４１４バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１点。
【０００３】
発明の分野
本発明は、抗体を含むタンパク質を細胞表面に提示させるのに有用な材料および方法に関連する。
【背景技術】
【０００４】
背景
糸状バクテリオファージ表面のペプチド提示、すなわちファージ提示は、多様な標的に結合するペプチドリガンドの単離に汎用性があり、有効な方法であることが証明されている。ファージ提示は、コートタンパク質、例えば、バクテリオファージ粒子のｐＩＩＩ、ｐＶＩＩＩとの末端融合体としてのポリペプチドの位置特定を含む。Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．ａｎｄ  Ｇ．Ｐ．Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９（４９６７）：３８６−３９０（非特許文献１）、およびＬｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０（４５）：１０８３２−１０８３８（非特許文献２）を参照されたい。一般に、対象標的に結合するポリペプチドは、標的とともにインキュベートし、結合していないファージを洗い流し、結合したファージを溶出し、次に新鮮な細菌の培養物に感染させてファージ集団を再増幅することによって単離される。ファージ提示は、ファージ１個当たりに提示されるポリペプチドのコピーが約数千個またはそれ以下に限られ、これはｐＩＩＩが提示に使用されるコートタンパク質である場合にははるかに少なく（１〜５個のコピー）、そのため所望の配列を単離するための高感度の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）法の使用を不可能にする。さらに、ファージは、固定化された標的リガンドから溶出または回収するのが困難である可能性があり、それによりクローンの損失につながる。
【０００５】
ポリペプチドを酵母細胞壁タンパク質に結合させ、酵母細胞に提示させることができることが報告されている（Ｆｅｌｄｈａｕｓ  ａｎｄ  Ｓｉｅｇｅｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２９０，６９−８０（２００４）（非特許文献３）、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５４，１１−１９（２０１０）（非特許文献４）に概説される）。
【０００６】
ＰＤＺドメインは、タンパク質標的化およびタンパク質複合体の組み立てに関与する、モジュラータンパク質相互作用ドメインである。ＰＤＺドメインの構造的特徴により、ＰＤＺドメインは、シグナル伝達または細胞内輸送に関与する大きいタンパク質複合体の組み立ての基礎をなす、特定のタンパク質間相互作用を仲介することができる。構造的に、ＰＤＺドメインは、１個の５〜６本鎖逆平行βバレルおよび２〜３個のαヘリックスからなる。ＰＤＺドメインは、典型的には、標的タンパク質のＣ末端に位置する短い配列を認識するが、一部のＰＤＺドメインは、内部配列を認識することが知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．ａｎｄ  Ｇ．Ｐ．Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９（４９６７）：３８６−３９０
【非特許文献２】Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０（４５）：１０８３２−１０８３８
【非特許文献３】Ｆｅｌｄｈａｕｓ  ａｎｄ  Ｓｉｅｇｅｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２９０，６９−８０（２００４）
【非特許文献４】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５４，１１−１９（２０１０）
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、抗体を含む対象タンパク質を提示させるのに有用な方法および材料に関する。タンパク質−ＰＤＺ結合ペプチド融合体とＰＤＺドメイン−細胞表面タンパク質融合体との相互作用によって細胞表面にタンパク質を提示する、真核宿主細胞（酵母および哺乳動物細胞を含む）および原核宿主細胞が提供される。
【０００９】
本開示の一態様は、ＰＤＺドメインに融合した細胞表面タンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）、および／またはＰＤＺ結合ペプチドに融合した対象タンパク質（ポリペプチド結合剤、抗体、またはその抗原結合性断片など）をコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは同じベクター中に存在し、他の実施形態では、ポリヌクレオチドは異なるベクター中に存在し、また他の実施形態では、１つのポリヌクレオチド、例えばＰＤＺドメインに融合した細胞表面タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞ゲノムに組み込まれる。
【００１０】
本開示の関連態様は、コードされた融合タンパク質の発現を調節する配列に作用可能に連結したこれらのポリヌクレオチド、およびこれらのポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本開示の別の関連態様は、かかるポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含む宿主細胞、ならびにかかる宿主細胞を使用して対象タンパク質を宿主細胞の表面に提示させる方法を提供する。本開示のまた別の関連態様は、宿主細胞の表面に提示されるか、あるいは単離または精製された状態の、このポリヌクレオチドにコードされる融合タンパク質を提供する。特に、ＰＤＺ結合ペプチド部分を保有する単離または精製抗体が想定される。
【００１１】
本明細書に記載される一部または任意の実施形態において、ＰＤＺ結合ペプチドは、５〜２０または５〜１５アミノ酸長、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０アミノ酸長、あるいはこれらの長さのいずれかの間の任意の範囲である。例となる実施形態において、ＰＤＺ結合ペプチドは、１５以下のアミノ酸長、または１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、もしくは５以下のアミノ酸長である。
【００１２】
本明細書における一部または任意の実施形態において、ＰＤＺ結合ペプチドは、ＮｏｒｐＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のＣ末端配列を含むか、または少なくとも７アミノ酸長のその断片と少なくとも８０％、８５％、もしくは９０％同一のペプチドである。
【００１３】
例示的実施形態において、ＰＤＺ結合ペプチド配列はＧＫＴＥＦＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の最後の７個のアミノ酸残基）である。
【００１４】
本明細書における一部または任意の実施形態において、ＰＤＺ結合ペプチドは、対象タンパク質、例えば、抗体またはその抗原結合性断片のＣ末端に融合している。
【００１５】
本明細書における一部または任意の実施形態において、ＰＤＺドメインは、約８０〜１２０アミノ酸長、例えば８０、８１、８１、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、もしくは１２０アミノ酸長、あるいはこれらの長さのいずれかの間の任意の範囲である。
【００１６】
本開示の例となる実施形態において、ＰＤＺドメインは、ＩｎａＤ  ＰＤＺドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ディシブルド１様（ＤＶＬ１Ｌ）ＰＤＺドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ｐｒｏＴＧＦ−α細胞質ドメイン−相互作用タンパク質１８（ＴＡＣＩＰ１８）ＰＤＺ１ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＴＡＣＩＰ１８類似体（ＳＩＴＡＣ）ＰＤＺ１ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０  ＰＤＺ３ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、Ｅｒｂｉｎ  ＰＤＺドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＰＤＺ様ドメイン、ＰＤＺダイマー、タンデムＰＤＺドメイン、あるいはそれらの断片、伸長部、または変異体からなる群から選択される。例となる実施形態において、断片は、少なくとも約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０アミノ酸長である。例となる実施形態において、伸長部は、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、約２０、約２５、または約３０アミノ酸長である。例となる実施形態において、伸長部は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の残基３９４〜３９９を含む。例となる実施形態において、変異体は、かかるドメインの少なくとも５０個のアミノ酸と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一のアミノ酸配列を含む。本明細書における一部または任意の実施形態において、ＰＤＺドメインは、本明細書において定義するＩｎａＤ  ＰＤＺ１ドメインである。
【００１７】
本明細書における一部または任意の実施形態において、ＰＤＺドメインに融合した細胞表面タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、エンハンサードメインをさらにコードする。例となる実施形態において、エンハンサードメインは、ヒトフィブロネクチン（ＦＮ３）の１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインの変異体、例えばＦＮ３の少なくとも５０個のアミノ酸と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一のアミノ酸配列である。
【００１８】
本明細書における一部または任意の実施形態において、ＰＤＺドメインに融合した細胞表面タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および／またはＰＤＺ結合ペプチドに融合した対象タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合性断片）をコードするポリヌクレオチドは、蛍光マーカータンパク質をさらにコードする。
【００１９】
本明細書における一部または任意の実施形態において、宿主細胞は、真核細胞および原核細胞からなる群から選択される。本明細書における一部または任意の実施形態において、真核細胞は、酵母細胞または哺乳動物細胞である。
【００２０】
例となる実施形態において、酵母細胞は、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｉｔｉｃａ）、および分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）からなる群から選択される。
【００２１】
例となる実施形態において、原核細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、および霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）からなる群から選択される。
【００２２】
例となる実施形態において、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ヒト胎児腎細胞系（２９３、またはその変異体、例えば、２９３Ｅ、２９３Ｔ、もしくは懸濁培養での成長用にサブクローニングされた２９３細胞）、ＢＨＫ細胞、ＴＭ４細胞、ＣＶ１細胞、ＶＥＲＯ−７６細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＲＬ  ３Ａ細胞、Ｗ１３８細胞、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞、ＭＭＴ細胞、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ  ５細胞、ＦＳ４細胞、およびＨｅｐ  Ｇ２細胞からなる群から選択される。
【００２３】
例となる実施形態において、宿主細胞が酵母細胞である場合、細胞表面タンパク質は、細胞壁タンパク質、例えば、Ａｇａ１、Ａｇａ２、Ａｇα１、Ｃｗｐ１、Ｃｗｐ２、Ｇａｓ１ｐ、Ｙａｐ３ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｃｒｈ２ｐ、Ｐｉｒ１、Ｐｉｒ２、Ｐｉｒ３、またはＰｉｒ４、あるいはこれらのタンパク質のいずれかの断片もしくは変異体である。
【００２４】
例となる実施形態において、宿主細胞が原核細胞である場合、細胞表面タンパク質は、外膜タンパク質、例えば、ＦｌｉＣ、プルラナーゼ、ＯｐｒＦ、ＯｐｒＩ、ＰｈｏＥ、ＭｉｓＬ、または細胞溶解素、あるいはこれらのタンパク質の断片もしくは変異体である。
【００２５】
例となる実施形態において、宿主細胞が哺乳動物細胞である場合、細胞表面タンパク質は、任意の既知の細胞膜タンパク質の任意の好適な膜貫通ドメイン、あるいはＧＰＩアンカー配列またはその断片もしくは変異体、または切断不可能なＩＩ型シグナルアンカー配列を含むポリペプチドを含む。
【００２６】
例となる実施形態において、かかる細胞壁タンパク質の断片は、少なくとも約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、または２００アミノ酸長である。例となる実施形態において、その変異体は、かかるドメインの少なくとも１００個のアミノ酸と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一のアミノ酸配列を含む。
【００２７】
本明細書における一部または任意の実施形態において、抗体は、２つの重鎖と２つの軽鎖とを含む四量体ＩｇＧ免疫グロブリンである。
【００２８】
本明細書における一部または任意の実施形態において、抗体の抗原結合性断片は、少なくとも重鎖の可変領域および／または軽鎖の可変領域を含む。例となる実施形態において、抗体の抗原結合性断片は、ＦａｂまたはｓｃＦｖを含む。
【００２９】
本明細書における一部または任意の実施形態において、ＰＤＺドメインに融合した細胞表面タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、細胞表面タンパク質を細胞表面に導くシグナル配列をさらに含む。
【００３０】
例となる実施形態において、シグナル配列は、宿主細胞が酵母細胞である場合、Ａｇａ２シグナル配列である。種々の実施形態において、シグナル配列は、接合因子α１（ＭＦα１）、インベルターゼ（ＳＵＣ２）、酸ホスファターゼ（ＰＨＯ５）、βグルカナーゼ（ＢＧＬ２）、イヌリナーゼ（ＩＮＵ１Ａ）、ＡＧＡ１、ＡＧα１、ＦＬＯ１、ＧＡＳ１、ＣＷＰ１、またはＣＷＰ２、あるいはそれらの断片もしくは変異体に由来する。
【００３１】
本明細書における一部または任意の実施形態において、ＰＤＺドメイン−ＰＤＺ結合ペプチド相互作用は、約１００ｎＭ以下のＫｄを有する（このとき、より低い数字は、より強い結合親和性を示す）。種々の実施形態において、ＰＤＺドメイン−ＰＤＺ結合ペプチド相互作用は、約１００ｎＭ以下、約１２０ｎＭ以下、約１４０ｎＭ以下、約１６０ｎＭ以下、約１８０ｎＭ以下、約２００ｎＭ以下、約２４０ｎＭ以下、約２８０ｎＭ以下、約３００ｎＭ以下、約３５０ｎＭ以下、約４００ｎＭ以下、約４５０ｎＭ以下、約５００ｎＭ以下、約６００ｎＭ以下、約７００ｎＭ以下、約８００ｎＭ以下、約９００ｎＭ以下、約１μＭ以下、約１０μＭ以下、約１００μＭ以下、または約５００μＭ以下のＫｄを有する。
【００３２】
本開示のポリヌクレオチドは、プロモーター、エンハンサー、または１つまたは複数の他の転写調節配列に、場合によってはこれらの配列を含むベクターの一部として、作用可能に結合していてもよい。かかるポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞は、当分野で既知の方法または本明細書に記載の方法を用いて調製することができる。
【００３３】
かかる宿主細胞を用いて対象タンパク質を宿主細胞表面に提示させる方法は、対象タンパク質を細胞表面に提示する形でコードされた融合タンパク質の発現と融合タンパク質の結合とを可能にする時間および条件下で、宿主細胞を培養することを含んでもよい。
【００３４】
別の態様において、本発明は、少なくとも１０＾３種、少なくとも１０＾４種、少なくとも１０＾５種、少なくとも１０＾６種、少なくとも１０＾７種、少なくとも１０＾８種、少なくとも１０＾９種、または少なくとも１０＾１０種の前述の実施形態のいずれかによる異なる真核宿主細胞であって、それぞれがその表面に異なる対象タンパク質（例えば、ポリペプチド結合剤、または抗体、もしくはその抗原結合性断片）を発現する前記真核宿主細胞を含む、複数の細胞を想定する。
【００３５】
また別の態様において、本発明は、本明細書に記載される複数の細胞を培養することを含む、少なくとも１０＾３種、少なくとも１０＾４種、少なくとも１０＾５種、少なくとも１０＾６種、少なくとも１０＾７種、少なくとも１０＾８種、少なくとも１０＾９種、または少なくとも１０＾１０種の異なる対象タンパク質（例えば、ポリペプチド結合剤、または抗体、もしくはその抗原結合性断片）を細胞表面に提示させる方法を提供する。
【００３６】
本明細書における一部または任意の実施形態において、ＰＤＺドメインおよびＰＤＺ結合ペプチドは相互作用し、これらは少なくとも１つのジスルフィド結合によって結合している。関連実施形態において、ＰＤＺドメインおよびＰＤＺ結合ペプチドはそれぞれ、ジスルフィド結合による結合を可能にするＣｙｓ残基を含む。一部の例となる実施形態において、Ｃｙｓは天然アミノ酸であり、他の例となる実施形態において、ＰＤＺドメイン内および／またはＰＤＺ結合ペプチド内の天然アミノ酸は、Ｃｙｓで置換されている。一部の例となる実施形態において、Ｃｙｓ残基は、ＰＤＺ結合ペプチドの−１位に位置する。
【００３７】
関連態様において、開示は、抗原に結合する１つまたは多数の対象タンパク質をスクリーニングすること含む、異なる対象タンパク質を発現する複数の宿主細胞を使用する方法を提供する。
【００３８】
本明細書における一部または任意の実施形態において、方法は、複数の細胞を抗原と接触させることをさらに含む。別の実施形態において、方法は、抗原に結合する細胞を選択することをさらに含む。
【００３９】
方法の一部または任意の実施形態において、この選択は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ビーズに基づく選別、または固相パニングによる。関連実施形態において、ビーズ選別は磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）である。この選別を実施する方法は、「発明を実施するための形態」でより詳しく説明する。
【００４０】
別の態様において、抗体またはその抗原結合性断片を選択する方法であって、（ａ）抗体または抗原結合性断片を提示する複数のファージを抗原と接触させ、この抗原に結合するファージを選択することと、（ｂ）抗体またはその抗原結合性断片を提示する複数の酵母細胞を前記抗原と接触させ、この抗原に結合する細胞を選択することとを含む前記方法が提供される。
【００４１】
別の態様において、抗体またはその抗原結合性断片を選択する方法であって、（ａ）抗体または抗原結合性断片を提示する複数のファージを抗原と接触させ、この抗原に結合するファージを選択することと、（ｂ）抗体またはその抗原結合性断片を提示する複数の哺乳動物細胞を前記抗原と接触させ、この抗原に結合する細胞を選択することとを含む前記方法が提供される。
【００４２】
別の態様において、抗体またはその抗原結合性断片を選択する方法であって、（ａ）抗体またはその抗原結合性断片を提示する複数の酵母細胞を抗原と接触させ、この抗原に結合する細胞を選択することと、（ｂ）抗体またはその抗原結合性断片を提示する複数の哺乳動物細胞を前記抗原と接触させ、この抗原に結合する細胞を選択することとを含む前記方法が提供される。本明細書における一部または任意の実施形態において、方法は、抗体または抗原結合性断片を提示する複数のファージを抗原と接触させ、この抗原に結合するファージを選択するステップをさらに含む。
【００４３】
本明細書に記載されるそれぞれの特長または実施形態、あるいは組み合わせは、本発明の任意の態様の非限定的な説明のための例であり、したがって本明細書に記載される他の任意の特長または実施形態、あるいは組み合わせと組み合わせ可能であるよう意図されることは理解される。例えば、特長が、「一実施形態」、「一部の実施形態」、「さらなる実施形態」、「具体的な例示的実施形態」、および／または「別の実施形態」などの用語を伴って説明される場合、これらの種類のそれぞれの実施形態は、特長の非限定的な例であり、全ての可能な組み合わせを記載する必要なく、本明細書に記載される他の任意の特長または特長の組み合わせとの組み合わせが意図される。かかる特長または特長の組み合わせは、本発明のいかなる態様にも適用される。同様に、本開示が、特定の特長に特徴付けられるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを説明する場合、それらの特長に特徴付けられるポリペプチド、かかるポリペプチドを発現する宿主細胞、およびかかる宿主細胞を使用する関連する全ての方法もまた、本開示により想定される。範囲に含まれる値の例が開示される場合、これらのいずれの例もある範囲の可能な端点として想定され、かかる端点間のあらゆる数値が想定され、また下端点と上端点のあらゆる組み合わせが想定される。
【００４４】
本発明の現在好ましい実施形態を説明する以下の発明を実施するための形態を考慮すると、数多くの本発明のさらなる態様および利益が当業者に明らかになるであろう。本出願において言及する全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は、参照により全体が本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ＸＰＡ２８  ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが成熟Ａｇａ２タンパク質をコードするＤＮＡ（１９〜８７）に融合した、酵母ベクターｐＴａｍ１５を示す。
【図２】ＩｎａＤの第１のＰＤＺドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸１１〜１０７）（ＩｎａＤ  ＰＤＺ１）がＡｇａ２に融合した、酵母ベクターｐＴａｍ１６を示す。
【図３】ＸＰＡ２８  ｓｃＦｖをコードするＤＮＡがＮｏｒｐＡのＣ末端の７個の残基をコードするＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１０８９〜１０９５）（ＮｏｒｐＡテザー）に融合した、酵母ベクターｐＴａｍ２８を示す。このベクターには、ＩｎａＤ  ＰＤＺ１／Ａｇａ２融合タンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。両タンパク質は、同一のＧＡＬ１プロモーターを用いて、同時に発現される。
【図４】ｐＴａｍ２８（Ａ）、ｐＴａｍ１５（Ｂ）、およびｐＴａｍ１６（Ｃ）で形質転換した酵母細胞のフローサイトメトリー分析を示す。誘導細胞をビオチン化したＩＬ−１βおよびｃ−Ｍｙｃ抗体とともにインキュベートした。ＰＥ蛍光およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７蛍光の２変数グラフは、抗原結合とｓｃＦｖ発現との相関を示す。各象限の細胞数は、全体に占める割合として示される。
【図５】ｐＴａｍ１５およびｐＴａｍ２８で形質転換した酵母細胞によるＩＬ−βの用量依存的結合を示す。ＫＤは、平均ＰＥ蛍光（全体に占める割合）とＩＬ−１β濃度との関係を示すグラフよって決定した。
【図６】ＸＰＡ２８  ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが成熟Ａｇａ１タンパク質をコードするＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸２３〜７２５）に融合している酵母ベクターｐＴａｍ３２を示す。
【図７】ＰＥ蛍光およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７蛍光で測定した、ｐＴａｍ１５（Ａ）および３２（Ｂ）で形質転換した酵母細胞のＩＬ−１β結合およびｃ−Ｍｙｃ染色の２変数グラフを示す。各象限中の細胞数は、全体に占める割合として示される。
【図８】ＸＰＡ２８  ｓｃＦｖがＮｏｒｐＡテザーとともに発現され、ＩｎａＤ  ＰＤＺ１をコードするＤＮＡがＡｇａ１タンパク質をコードするＤＮＡに融合している、酵母ベクターｐＴａｍ３４を示す。
【図９】ＰＥ蛍光およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７蛍光で測定した、ｐＴａｍ２８（Ａ）および３４（Ｂ）で形質転換した酵母細胞のＩＬ−１β結合およびｃ−Ｍｙｃ染色の２変数グラフを示す。各象限中の細胞数は、全体に占める割合として示される。
【図１０】ＩｎａＤ  ＰＤＺ１／Ａｇａ１融合体上の検出タグがｃ−ＭｙｃエピトープからＨＡエピトープに変更されている点を除いては親ベクターｐＴａｍ３４と類似する、酵母ベクターｐＴａｍ３５を示す。
【図１１】ＰＥ蛍光（Ａ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７蛍光（Ｂ）、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８蛍光（Ｃ）でそれぞれ測定した、ｐＴａｍ３５で形質転換した細胞のＩＬ−１β結合、ｃ−ＭｙｃおよびＨＡ染色特性を示す。非誘導細胞（グレーで塗りつぶし）および誘導細胞（塗りつぶしなし）の両者が示される。
【図１２】ｃ−ＭｙｃエピトープがここではＸＰＡ２８  ｓｃＦｖのＣ末端にあるＨｉｓ６タグに先行する点を除いては親ベクターｐＴａｍ３５と類似する、酵母ベクターｐＴａｍ３７を示す。
【図１３】ＰＥ蛍光（Ａ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７蛍光（Ｂ）、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８蛍光（Ｃ）でそれぞれ測定した、ｐＴａｍ３７で形質転換した細胞のＩＬ−１β結合、ｃ−ＭｙｃおよびＨＡ染色特性を示す。非誘導細胞（グレーで塗りつぶし）および誘導細胞（塗りつぶしなし）の両者が示される。
【図１４】パネルＡは、軽鎖および重鎖にそれぞれ先行する単一のプロモーターおよびＩＲＥＳ２を用いた、ＸＰＡ２８  ＩｇＧの発現用の哺乳動物ベクターｐＸＩＢＭ１４を示す。分泌されたＸＰＡ  ＩｇＧをタンパク質Ａセファロースにより精製し、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂ）により分析した。
【図１５】パネルＡは、ＮｏｒｐＡテザーが、０個のアミノ酸スペーサー、３個のアミノ酸スペーサー（ＧＡＡ）、または５個のアミノ酸スペーサー（ＧＧＧＧＳ）のいずれかによってＩｇＧ１重鎖のＣ末端に融合している、一連の哺乳動物ベクターｐＸＩＢＭ３２、３４、および３６を示す。パネルＢは、ＩｎａＤ  ＰＤＺ１がＰＤＧＦＲ  βの膜貫通ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のアミノ酸残基５１３〜５６１）に融合した、哺乳動物ベクターｐＴａｍ２９を示す。
【図１６】ｐＸＩＢＭ１４のみ（Ａ）、ｐＴａｍ２９のみ（Ｂ）、ｐＸＩＢＭ３２およびｐＴａｍ２９（Ｃ）、ｐＸＩＢＭ３４およびｐＴａｍ２９（Ｄ）、ならびにｐＸＩＢＭ３６およびｐＴａｍ２９（Ｅ）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析を示す。細胞をビオチン化ＩＬ−１βとともにインキュベートし、ｃ−Ｍｙｃ抗体で染色した。ＰＥ蛍光およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７蛍光の２変数グラフは、抗原結合とＩｎａＤ  ＰＤＺ１発現との相関を示す。各象限中の細胞数は、全体に占める割合として示される。
【図１７】ｐＸＩＢＭ１４（−ＮｏｒｐＡテザー）およびｐＸＩＢＭ３２（＋ＮｏｒｐＡテザー）でトランスフェクトした細胞由来の精製ＸＰＡ  ＩｇＧの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１８】以下のベクター：（１）ＮｏｒｐＡテザー中にＣ１０９４Ｓ突然変異を含むｐＴａｍ４９；（２）ＩｎａＤ  ＰＤＺ１中にＣ３１Ｓ突然変異を含むｐＴａｍ５０；（３）Ａｇａ２シグナル配列とＩｎａＤ  ＰＤＺ１との間にＴＧＡＴＧＡ挿入を含むｐＴａｍ５１；および（４）Ａｇａ２シグナル配列とＸＰＡ２８  ｓｃＦｖとの間にＴＧＡＴＧＡ挿入を含むｐＴａｍ５２、をもたらすｐＴａｍ３７の改変を示す。
【図１９】ｐＴａｍ３７（Ａ）、ｐＴａｍ４９（Ｂ）、ｐＴａｍ５０（Ｃ）、ｐＴａｍ５１（Ｄ）、およびｐＴａｍ５２（Ｅ）で形質転換されたＢＪ５４６５細胞のフローサイトメトリー分析を示す。細胞をビオチン化ＩＬ−１βとともにインキュベートし、ＨＡ抗体で染色した。ＰＥ蛍光およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８蛍光の２変数グラフは、抗原結合とＩｎａＤ  ＰＤＺ１発現との相関を示す。
【図２０】ＦＡＣＳを用いた、トランスフェリン結合剤のための連続４ラウンド（Ａ〜Ｄ）のライブラリー濃縮を示す。細胞をビオチン化トランスフェリンとともにインキュベートし、ＨＡ抗体で染色した。ＰＥ蛍光およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８蛍光の２変数グラフは、抗原結合とＩｎａＤ  ＰＤＺ１発現との相関を示す。ＦＡＣＳにおいて使用する選別ゲートが示され、採取した細胞の数が母集団に占める割合として示される。
【図２１】４ラウンドのライブラリー濃縮後に単離された３つのｓｃＦｖクローンのトランスフェリンに対する親和性の推定を示す。示される推定ＫＤを導くために、トランスフェリン濃度に対する平均ＰＥ蛍光をプロットする。
【図２２】ベクターｐＴａｍ４８を示す。
【図２３】抗ＩＬ−１βＦａｂを提示するベクターｐＶＶ４７を示す。
【図２４】抗ＩＬ−１βＩｇＧを提示するベクターｐＶＶ４２を示す。
【図２５】異なる抗ＩＬ−１β断片：ｐＴａｍ３７（ｓｃＦｖ）、ｐＶＶ４７（Ｆａｂ）、およびｐＶＶ４２（ＩｇＧ）で形質転換した酵母細胞のフローサイトメトリー分析を示す。各パネルにおいて、８０％を超えるガラクトース誘導細胞が、抗ＨＡ抗体（ＩｎａＤ  ＰＤＺ１／Ａｇａ１融合体上の検出タグ）およびビオチン−ＩＬ−１βの両者について陽性である。
【図２６】磁気細胞分離の前（Ａ）または後（Ｂ）のトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｅ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。３ラウンドのファージパニング後のＴｉｅ２結合のために濃縮されたＩｇＧに対応するＤＮＡで細胞をトランスフェクトした。ＰＥおよびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７の２変数グラフは、Ｔｉｅ２結合とＩｎａＤ  ＰＤＺ１発現との相関を示す。各象限中の細胞数は、全体に占める割合として示される。
【図２７】Ａｎｇ１および１０種の抗Ｔｉｅ２  ＩｇＧ（Ａ３、Ａ１０、Ａ１１、Ｂ１、Ｂ４、Ｂ６、Ｂ８、Ｂ１２、Ｃ３、およびＣ４）で処理したＣＨＯＫ１−Ｔｉｅ２細胞のセリン４７３におけるＡＫＴリン酸化の相対レベルを示す。抗ＫＬＨ処理細胞および未処理細胞を陰性対照として含めた。また、Ｂｉａｃｏｒｅによって決定される、可溶性Ｔｉｅ２のこれらのＩｇＧのうちのいくつかに対する解離定数も示される。
【図２８】ファージＦａｂライブラリーからの第３ラウンドの回収物から構築し、Ｔｉｅ−２に対してパニングを行った、ＩｇＧ酵母提示ライブラリーを示す。酵母ライブラリーのＦＡＣＳにより、抗原結合（ストレプトアビジン−ＰＥで標識したビオチン化Ｔｉｅ−２−Ｆｃにより検出）および抗体提示（ＡＰＣタグ化抗λによって検出）に対して二重陽性である３つの細胞集団を単離した。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
詳細な説明
本発明は、抗体を含む対象タンパク質を細胞表面に提示させるのに有用な材料および方法に関する。細胞表面にタンパク質を提示することができる原核細胞および真核細胞の両者が提供される。本開示において提供される方法および材料は、対象タンパク質を細胞表面に提示するための、対象タンパク質とＰＤＺ結合ペプチドの融合体とＰＤＺドメインと細胞表面タンパク質の融合体との相互作用に関する。本発明の有利な一態様は、特に対象タンパク質が多量体であり、複数の異なるポリペプチド鎖を含み得る場合に、ＰＤＺ結合ペプチドの小さいサイズが、対象タンパク質の折り畳みおよび溶解性への干渉の可能性を低くするということである。例えば、抗体の組み立ておよび抗原との結合への干渉が低下し、抗体またはその抗原結合性断片をＰＤＺ結合ペプチドとともに含む融合タンパク質が容易に単離または精製され、別々に（宿主細胞と会合していない状態で）抗原との結合について試験される。本明細書における例は、本開示の材料および方法が、２つの重鎖と２つの軽鎖とを含む四量体免疫グロブリンを細胞表面に発現させることを可能にすることを示す。
【００４７】
別の潜在的利点は、蛍光活性化細胞選別技術に依存して強い結合特性を示す細胞を濃縮し、分離することができることであり、これは１０−６未満の頻度で出現する候補などの対象の候補タンパク質、例えば抗体を発現する、より希少なクローンを特定することを可能にする。別の潜在的利点は、同じ細胞上に異なる対象タンパク質を提示する能力である。例えば、それぞれＮｏｒｐＡテザーを含む異なる対象タンパク質をクローニングし、ＩｎａＤ  ＰＤＺ１ドメイン／Ａｇａ１融合体の単一コピーで発現してもよい。細胞表面タンパク質との結合に基づく他の技術と比較したときの本発明のまた別の潜在的利点は、多様性が向上した比較的大きいライブラリーを調製することができることである。
【００４８】
Ａ．定義
本明細書において使用する際、「特異的に結合」する、「抗原特異的」である、抗原に対して「特異的」である、または抗原と「免疫反応」する抗体は、無関係ないし類似する配列の他の抗原よりも高い親和性、好ましくは少なくとも１０３、１０４、１０５、または１０６高い親和性で抗原に結合する、本発明の抗体またはポリペプチド結合剤を指す。一態様において、本発明の抗体またはポリペプチド結合剤、あるいはその断片、変異体、もしくは誘導体は、他の種、すなわち非ヒト種の類似する抗原に対するその結合親和性と比較して、より高い親和性でヒト抗原に結合するが、標的の相同分子種を認識し、それに結合するポリペプチド結合剤も想定されている。
【００４９】
例えば、その同種抗原「に対して特異的な」抗体またはその断片であるポリペプチド結合剤とは、その抗体の可変領域が、検出可能な優先性で所望の抗原を認識し、それに結合することを示す（例えば、所望の抗原がポリペプチドである場合、抗体の可変領域は、結合親和性の測定可能な差によって、ファミリーメンバー間に局所的な配列同一性、相同性、または類似性が存在する可能性があるにもかかわらず、抗原ポリペプチドを同じファミリーの他の既知のポリペプチドと区別することができる）。特異抗体が、抗体の可変領域外、特に分子の定常領域の配列との相互作用によって、他のタンパク質（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）タンパク質ＡまたはＥＬＩＳＡ技術における他の抗体）とも相互作用し得ることは理解されるであろう。本発明の方法で使用するためのポリペプチド結合剤、例えば抗体の結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは当分野で周知であり、日常的に行われている。そのようなアッセイの包括的な考察に関しては、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８），Ｃｈａｐｔｅｒ  ６を参照されたい。本発明において使用するための抗体は、当分野で既知の本明細書においてより詳細に説明されるいかなる方法を用いて作製してもよい。
【００５０】
用語「エピトープ」は、抗原結合領域の１つまたは複数において、選択的結合剤が認識し、結合することができるあらゆる分子の部分を指す。エピトープは通常、アミノ酸または炭水化物側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、特定の三次元構造特性および特定の電荷特性を有する。エピトープは、本明細書において使用する際、隣接または非隣接であってよい。
【００５１】
「誘導体」という用語は、ポリペプチド（例えば、対象タンパク質、ポリペプチド結合剤、または抗体もしくはその抗原結合性断片）に関連して用いる場合、ユビキチン化、グリコシル化、脱グリコシル化、治療薬または診断薬とのコンジュゲート化、標識（例えば、放射性核種または様々な酵素）、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）などのポリマー共有結合、およびヒトタンパク質に通常存在しない、オルニチンなどのアミノ酸の化学合成による挿入または置換などの技術によって化学的に改変されたポリペプチドを指す。誘導体は、本発明の非誘導体化分子の結合特性を保持する。
【００５２】
「検出可能部分」または「標識」とは、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段によって検出可能な組成物を指す。例えば、有用な標識には、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光色素、電子密度の高い試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に用いられているもの）、ビオチン−ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、それに対する抗血清またはモノクローナル抗体が入手可能なハプテンおよびタンパク質（例えば、ｃ−ｍｙｃ、ＨＡ）、または別の標識された核酸分子と相補的な配列を有する核酸分子が含まれる。検出可能部分は、しばしば、試料中の結合した検出可能部分の量を定量化するために使用可能な放射性、発色性、または蛍光性のシグナルなどの測定可能なシグナルを生成する。
【００５３】
「宿主細胞」という用語は、特定の１つまたは複数の対象細胞だけではなく、それらの子孫も指すと理解される。また、培養において、後世代で自然突然変異または偶発的突然変異が生じることがあり、そのためかかる子孫が親細胞と完全に同一でない可能性があるが、本明細書において使用するこの用語の範囲に依然として含まれることも理解される。
【００５４】
「作用可能に結合した」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、この用語は、転写調節配列と転写配列との機能的関係を指す。例えば、シス作用性転写制御因子のあらゆる組み合わせを含む、本発明のプロモーター／エンハンサー配列は、それが適切な宿主細胞または他の発現系においてコード配列の転写を刺激または調節する場合、コード配列に作用可能に結合している。一般に、転写配列に作用可能に結合したプロモーター転写調節配列は、その転写配列に物理的に隣接している、すなわちそれらの配列はシス作用性である。しかしながら、エンハンサーなどの一部の転写調節配列は、その配列が転写を増強するコード配列と物理的に隣接するか、または接近している必要はない。ポリリンカーは、コード配列を挿入するのに便利な位置を提供するため、遺伝子はプロモーターに作用可能に結合される。ポリリンカーは、一連の３個以上の狭い間隔の制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含むポリヌクレオチド配列である。
【００５５】
「シグナル配列」という用語は、普通は細胞によって非細胞質の位置に排出（例えば、分泌）されるか、または膜成分となる特定のタンパク質のＮＨ２末端に存在する短いアミノ酸配列（すなわち、シグナルペプチド）をコードするポリヌクレオチド配列を指す。シグナルペプチドは、細胞質から非細胞質の位置へのタンパク質輸送を導く。
【００５６】
本明細書で使用する際、「結合すること」は、水素結合、ファン・デル・ワールス、イオン双極子、および疎水性相互作用を含む弱い力、ならびに強い力であるイオン結合のうちの１つまたは複数からなる非共有相互作用の特定のネットワークによって生じる２つ以上の異なる分子実体間の物理的会合である。結合のレベルまたは程度は、親和性に関して測定することができる。親和性または「結合親和性」は、２つ以上の異なる分子実体間の結合相互作用の強度の尺度であり、平衡結合定数または動的結合速度パラメータによって定義することができる。好適な定数またはパラメータおよびそれらの測定単位の例は、当分野で周知であり、これには平衡会合定数（ＫＡ）、例えば約１０５Ｍ−１以上、約１０６Ｍ−１以上、約１０７Ｍ−１以上、約１０８Ｍ−１以上、約１０９Ｍ−１以上、約１０１０Ｍ−１以上、約１０１１Ｍ−１以上、または約１０１２Ｍ−１以上；平衡解離定数（ＫＤ）、例えば、約１０−５Ｍ以下、または約１０−６Ｍ以下、または約１０−７Ｍ以下、または約１０−８Ｍ以下、または約１０−９Ｍ以下、または約１０−１０Ｍ以下、または約１０−１１Ｍ以下、または約１０−１２Ｍ以下；オン速度（例えば、秒−１、モル−１）およびオフ速度（例えば、秒−１））が含まれるが、これらに限定されない。ＫＡの場合、より高い値が、「より強い」または「強化された」または「より大きい」結合親和性を意味するが、ＫＤの場合は、より低い値が、「より強い」または「強化された」または「より大きい」結合親和性を意味する。本明細書において使用する際、「強化された」結合速度パラメータとは、増加した滞在時間、より速い会合、またはより遅い解離を意味する。本明細書において使用する際、「低下した」結合速度パラメータとは、減少した滞在時間、より遅い会合、またはより速い解離を意味する。
【００５７】
２つの要素間、例えば抗体と抗原との間の親和性は、直接的または間接的に測定することができる。親和性の間接的測定は、親和性を示すおよび／または親和性に比例する代理特性を用いて実施することができる。かかる代理特性には、第１の成分の第２の成分との結合の量もしくはレベル、または第１の成分の第２の成分に対する見かけの結合親和性を予測するもしくはこれと相関する、第１の成分または第２の成分の生物物理学的特徴がある。具体的な例には、第１の成分または第２の成分のいずれかの飽和濃度以下での第１の成分の第２の成分との結合の量またはレベルの測定がある。測定可能な他の生物物理学的特徴には、第１の成分および第２の成分のうちの一方または両方の正味分子電荷、回転活性、拡散速度、融点、静電ステアリングまたは配置が含まれるが、これらに限定されない。また他の測定可能な生物物理学的特徴には、温度、ｐＨ、またはイオン強度の変化の影響に対する結合相互作用の安定性の特定が含まれる。
【００５８】
測定された親和性は、測定に用いた正確な条件に依存し、これらの条件には、他にも多数ある要素の中でも特に、結合要素の濃度、アッセイの設定、結合要素の価数、緩衝液組成、ｐＨ、イオン強度、および温度、ならびに結合反応に加えられる追加要素、例えばアロステリック調節因子および制御因子が含まれる。定量的および定性的方法を用いて、結合相互作用の絶対強度および相対強度の双方を測定してもよい。
【００５９】
Ｂ．ＰＤＺドメインおよびＰＤＺ結合ペプチド
１．ＰＤＺドメイン
本発明は、ＰＤＺドメインに融合した細胞表面タンパク質を含む融合タンパク質を用いて、抗体および抗体断片を含むタンパク質を細胞表面に提示させるのに有用な方法および細胞を提供する。ＰＤＺドメインは、当初は、９５ｋＤａのシナプス後肥厚部タンパク質（ＰＳＤ−９５）、ショウジョウバエ腫瘍抑制ｄｉｓｃｓ−ｌａｒｇｅ（ｄｌｇ）、およびタイトジャンクションタンパク質閉鎖帯−１（ＺＯ−１）の間で保存された構造要素を含むとされていた。これらのドメインは、多くの多様なタンパク質に認められる。これらは、一般に、相互作用タンパク質のカルボキシ末端に位置する短いカルボキシ末端ペプチド配列に結合するが、内部配列に結合することもある。
【００６０】
ＰＤＺドメインは、一般に、一個の５〜６本鎖逆平行βバレルおよび２〜３個のαヘリックスからなる。ヘリックスα２および鎖β２は、ＰＤＺドメインの折り畳み内の保存されたペプチド結合クレフトのいずれかの側を形成する。β１鎖とβ２鎖との間のループは、Ｃ末端カルボキシレート結合ループを形成する。Ｃ末端ペプチド（例えば、ＰＤＺ結合ペプチド）は、ヘリックスα２および鎖β２によって形成される溝中の逆平行β鎖として結合する。ＰＤＺドメインの保存されたＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（ＧＬＧＦ）配列は、β１とβ２とを連結するループ内に認められ、これはＣ末端カルボキシレート基の水素結合配位に重要である。ＰＤＺドメインのＮ末端およびＣ末端は、ＰＤＺドメインのペプチド結合部位の反対側で互いの近くに位置する。
【００６１】
ＨｕｎｇおよびＳｈｅｎｇ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：８，５６９９−５７０２（２００２））は、ＰＤＺドメインをそのペプチドリガンドの結合特異性に基づいて３つのクラスに分類した。ＰＤＺドメインの結合特異性は、一般に、ヘリックスα２の最初の残基とＣ末端ＰＤＺ結合リガンドの−２位の残基の側鎖との相互作用によって決定される（番号付けは「０」位のＣ末端アミノ酸に基づく）。クラスＩ  ＰＤＺ相互作用、例えばＰＳＤ−９５の相互作用において、セリンまたはトレオニン残基がＰＤＺ結合リガンドの−２位を占める。側鎖ヒドロキシル基は、α２−１位（第２のαヘリックスであるα２の最初の残基）のヒスチジン残基のＮ−３窒素とともに水素結合を形成し、これはクラスＩ  ＰＤＺドメインの間で高度に保存される。対照的に、クラスＩＩ  ＰＤＺ相互作用は、ＰＤＺ結合ペプチドリガンドの−２位およびＰＤＺドメインのα２−１位の双方にある疎水性残基を特徴とする。神経細胞−酸化窒素シンターゼ（ｎＮＯＳ）などにあるＰＤＺドメインの第３のクラスは、ＰＤＺ結合リガンドの−２位における負荷電アミノ酸を優先する。この特異性は、ＰＤＺ結合リガンドの−２位残基の側鎖カルボキシレートと、α２−１位置のチロシン残基のヒドロキシル基の配位によって決定される。ＰＤＺドメインは、一般に、遊離カルボキシレート基を含む、それらのタンパク質標的のＣ末端の３〜４個のアミノ酸と相互作用する（Ｈｉｌｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：８１２−８１５）。Ｉ型ＰＤＺドメインは、共通配列Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌ（式中、Ｘは任意の残基である）に結合し（Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｃｅｌｌ  ８５：１０６７−１０７６、Ｓｏｎｇｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：７３−７７）、一方ＩＩ型ＰＤＺドメインは、より一般的な配列Φ−Ｘ−Φ（式中、Φは、通常は大きい疎水性残基である）に結合する（Ｄａｎｉｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：３１７−３２５）。
【００６２】
ＰＤＺドメインの分類は、配列または構造に基づく情報を用いて、上述の３つのクラスを超えて拡大され、改善されたＰＤＺドメイン特異性の予測および新規のＰＤＺドメイン／ペプチド相互作用の設計を可能にしている（Ｔｏｎｉｋｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）ＰＬｏｓ  Ｂｉｏｌ  ６：ｅ２３９、Ｋａｕｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｏｄｅｌ．（２０１１）１７：３１５−３２４）。
【００６３】
ＰＤＺドメインの大部分とは対照的に、一部のＰＤＺドメインは、内部ペプチド配列と相互作用する。例えば、ＰＳＤ−９５のＰＤＺドメインは、ｎＮＯＳの内部領域と相互作用する。ｎＮＯＳ−ＰＳＤ−９５  ＰＤＺ複合体の結晶構造において、ｎＮＯＳの標準ＰＤＺドメインと近接するアミノ酸残基は、ＰＳＤ−９５  ＰＤＺドメインのペプチド結合溝中に入る二本鎖βヘアピン「フィンガー」を形成する。βフィンガーの鋭角のβターンは、ペプチドリガンドの末端カルボキシレート基と同じ部位に結合する。内部ペプチド（すなわち、Ｃ末端にあるのではないペプチド）に結合するＰＤＺドメインは、本発明の範囲に含まれるとみなされる。
【００６４】
本明細書において使用する際、「ＰＤＺドメイン」という用語は、ＰＤＺドメインに特徴的な上述の保存された構造要素のうちの１つまたは複数、例えば保存されたペプチド結合クレフトを形成するヘリックスα２および鎖β２、Ｃ末端カルボキシレート結合ループを形成するβ１鎖とβ２鎖との間のループ、ＧＬＧＦ反復、クラスＩ  ＰＤＺドメインの間で高度に保存された、ヘリックスα２の１位のＮ−３含有ヒスチジン残基（または好適な窒素を含むその保存的置換）、クラスＩＩ  ＰＤＺドメインの間で高度に保存された、ヘリックスα２の１位の疎水性残基、および／またはクラスＩＩＩ  ＰＤＺドメインの間で高度に保存された、ヘリックスα２の１位のヒドロキシル含有チロシン残基（またはヒドロキシルを含むその保存的置換）、ならびにそれらの断片、伸長部、または変異体を含む、タンパク質のドメインを指す。例となる実施形態において、断片は、少なくとも約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、またはそれ以上のアミノ酸長である。例となる実施形態において、伸長部は、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、約２０、約２５、または約３０アミノ酸長である。例となる実施形態において、伸長部は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の残基３９４〜３９９を含む。例となる実施形態において、変異体は、かかるドメインの少なくとも５０個のアミノ酸と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一のアミノ酸配列を含み、好ましくは、上記で特定した保存要素のうちの１つまたは複数が保持される。例えば、保存されたペプチド結合クレフトを形成するヘリックスα２および鎖β２が保持され、場合によっては、ＧＬＧＦ反復、クラスＩ  ＰＤＺドメインの間で高度に保存された、ヘリックスα２の１位のＮ−３含有ヒスチジン残基（または好適な窒素を含むその保存的置換）、クラスＩＩ  ＰＤＺドメインの間で高度に保存された、ヘリックスα２の１位の疎水性残基、および／またはクラスＩＩＩ  ＰＤＺドメインの間で高度に保存された、ヘリックスα２の１位のヒドロキシル含有チロシン残基（またはヒドロキシルを含むその保存的置換）もまた保持される。「ＰＤＺドメイン」という用語は、シナプス後肥厚部タンパク質９５（ＰＳＤ−９５）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、腫瘍抑制ｄｉｓｃｓ−ｌａｒｇｅ（ｄｌｇ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、タイトジャンクションタンパク質閉鎖帯（ＺＯ−１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、ＩｎａＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ディシブルド１様（ＤＶＬ１Ｌ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ｐｒｏＴＧＦ−α細胞質ドメイン−相互作用タンパク質１８（ＴＡＣＩＰ１８）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＴＡＣＩＰ１８類似体（ＳＩＴＡＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＰＤＺ様ドメイン、ＰＤＺダイマー、タンデムＰＤＺドメイン（Ｌｅｅ  ＆  Ｚｈｅｎｇ、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ２０１０  ８：８）、ＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０  ＰＤＺ３ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、およびＥｒｂｉｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）のＰＤＺドメイン、または本明細書に記載されるＰＤＺ結合ペプチドと結合することができるその断��、伸長部（Ｐｅｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０６：１８２４９−５４（２００９）およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｅｌｌ  １：７３７−５１（２０１０））、もしくは変異体を含むが、これらに限定されない。これらの実施形態のいずれにおいても、天然にＣｙｓを含むＰＤＺドメイン（例えば、ＩｎａＤまたはＴＡＣＩＰ１８またはＳＩＴＡＣのＰＤＺ１）が想定される。また、「ＰＤＺドメイン」という用語は、ＰＤＺ１ファミリーメンバーの脊椎動物ホモログも含み、これには哺乳動物ホモログおよび鳥類ホモログが含まれるが、これらに限定されない。ＰＤＺドメインファミリーメンバーの代表的な哺乳動物ホモログには、マウスホモログおよびヒトホモログ、または無脊椎動物タンパク質、例えばキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来のものが含まれるが、これらに限定されない。例となる実施形態において、「ＰＤＺドメイン」という用語に含まれるＰＤＺドメインの断片は、少なくとも約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、またはそれ以上のアミノ酸長である。例となる実施形態において、「ＰＤＺドメイン」という用語に含まれる変異体は、かかるＰＤＺドメインの少なくとも５０個のアミノ酸と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、上記で特定した保存要素のうちの１つまたは複数が保持される。
【００６５】
一般ＰＤＺドメイントポロジーを共有するＩｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｎｏ  ａｆｔｅｒ−ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｄ（ＩｎａＤ）由来のＰＤＺ１ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸１１〜１０７として記載される。ＩｎａＤは、十分に特徴付けられたＧタンパク質共役ホスホリパーゼＣ媒介シグナル伝達カスケードであるショウジョウバエの光伝達経路において重要なタンパク質である（Ｓｃｏｔｔ  ＆  Ｚｕｋｅｒ，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９５：８０５−８０８、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４２：５４５−５５５、Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ  １５：９１９−９２７）。ＩｎａＤは、ほぼ完全に５つのＰＤＺドメインからなるため（ｖａｎ  Ｈｕｉｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：２２８５−２２９７、Ｔｓｕｎｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８８：２４３−２４９、Ｓｈｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２６８２−１２６８７）、このドメインが特徴付けられた最初の３つのタンパク質にその名前が由来する：シナプス後肥厚部タンパク質９５、Ｄｉｓｃｓ−ｌａｒｇｅ、および閉鎖帯（Ｋｅｎｎｅｄｙ，（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２０：３５０、Ｍｏｒａｉｓ  Ｃａｂｒａｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：６４９−６５２、Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｃｅｌｌ  ８５：１０６７−１０７６）。ＩｎａＤの各ＰＤＺドメインは、光伝達に関与するタンパク質のうちの１つまたは複数を結合させ、その複合体を効果的シグナル伝達のための正しい細胞位置に集めることに関わっているとされている（Ｔｓｕｎｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８８：２４３−２４９、Ｗｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２：４４７−４５３、Ｍｏｎｔｅｌｌ，（１９９９）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １５：２３１−２６８、Ｆａｎｎｉｎｇ  ＆  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １１：４３２−４３９）。
【００６６】
ショウジョウバエのＩｎａＤタンパク質は、６７４個のアミノ酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を含み、分子量７４，３３２ダルトンを有し、５つのＰＤＺドメインを含む。これらの５つのＰＤＺドメインは、このタンパク質構造の大部分を形成する。このドメインは、ＰＤＺ１からＰＤＺ５まで番号付けされる。ＩｎａＤのＮ末端ドメインであるＰＤＺ１は、ＩｎａＤタンパク質の残基１１〜１０７を含む。本明細書で提示される開示において、ＰＤＺ１は、一部の実施形態で具体的に言及されるが、実施形態、方法、および技術の開示および考察は、ＰＤＺ２、ＰＤＺ３、ＰＤＺ４、およびＰＤＺ５などの別のＰＤＺドメインにも適用可能である。
【００６７】
ＩｎａＤのＰＤＺ１ドメインは、ＮｏｒｐＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のＣ末端に結合することが知られている。この相互作用は、これら２つのタンパク質間に形成されるジスルフィド結合によって仲介される。ジスルフィド結合は、ＮｏｒｐＡのＣｙｓ（−１）（Ｃ末端アミノ酸を「０」位とすることに基づく付番）とＩｎａＤ  ＰＤＺ１のＣｙｓ３１との間に形成される。
【００６８】
一実施形態において、本発明によって有用なＰＤＺドメイン（例えば、ＰＤＺ１ドメイン）は、ショウジョウバエに認められるＩｎａＤタンパク質に由来する、すなわち「ＩｎａＤ  ＰＤＺ１ドメイン」であり、細胞表面タンパク質に融合している。「ＩｎａＤ  ＰＤＺ１ドメイン」には、少なくとも約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、またはそれ以上のアミノ酸長のＩｎａＤ  ＰＤＺ１ドメイン（アミノ酸１１〜１０７）の断片、およびＩｎａＤ  ＰＤＺ１ドメインの少なくとも５０個のアミノ酸と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一のアミノ酸配列を含むその変異体が含まれる。一部の実施形態において、上記で特定した保存要素のうちの１つまたは複数が維持される。本発明のＰＤＺドメイン（例えば、ＰＤＺ１ドメイン）は、いかなる種にも由来すると考えられ、これにはキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、シノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ホホアカクロバエ（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ  ｖｉｃｉｎａ）、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、およびＰＤＺドメインを有する任意の他の種が含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
一実施形態において、ＰＤＺドメインは、ペプチド結合クレフト中にＣｙｓ残基を含む。一実施形態において、Ｃｙｓ残基を含むＰＤＺドメインは、ディシブルド１様（ＤＶＬ１Ｌ）ＰＤＺである。別の実施形態において、Ｃｙｓ残基を含むＰＤＺドメインは、ｐｒｏＴＧＦ−α細胞質ドメイン−相互作用タンパク質１８（ＴＡＣＩＰ１８）ＰＤＺ１である。別の実施形態において、Ｃｙｓ残基を含むＰＤＺドメインは、ＴＡＣＩＰ１８類似体（ＳＩＴＡＣ）ＰＤＺ１である。
【００７０】
種々の実施形態において、ＰＤＺドメインは、約８０〜約１００アミノ酸長である。類似する実施形態において、ＰＤＺドメインは、８０、８１、８１、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、または１２０アミノ酸長、あるいはこれらの端点のいずれかの間の任意の範囲である。
【００７１】
一実施形態において、ＰＤＺドメインは、エンハンサードメインをさらに含む。Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０５：１８，６５７８−８３（２００８）、参照により全体が援用される）は、天然ＰＤＺ結合ペプチドに対する結合親和性が著しく改善された結合部位を作成するようにＰＤＺドメインを操作することができる系を記載している。著者らは、ヒトフィブロネクチンの９１アミノ酸残基１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）を９６アミノ酸残基Ｅｒｂｉｎ  ＰＤＺドメインに融合させた。著者らは、次に、ＦＮ３の３つの表面ループが多様化されたファージ提示ライブラリーを構築した。ＡＲＶＣＦペプチドに対する増強された親和性を示すいくつかのクローンを特定した。ＰＤＺ結合ペプチドに対する増強された親和性でＰＤＺ融合体を作成するこのようなＦＮ３ドメインを「エンハンサードメイン」と名付けた。ＰＤＺ−ＦＮ３融合体を「親和性クランプ」と名付けた。したがって、本明細書における一部または任意の実施形態において、ＰＤＺドメインは、エンハンサードメイン、例えば、ＦＮ３の少なくとも５０個のアミノ酸と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一のアミノ酸配列に融合される。かかる親和性クランプおよびエンハンサードメインは、本発明における使用が想定されている。
【００７２】
種々の実施形態において、ＰＤＺドメインは、タンデムＰＤＺドメインである。ＬｅｅおよびＺｈｅｎｇ（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｍ．  ＆  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，８：８（２０１０）、参照により全体が本明細書に援用される）は、各ＰＤＺドメインが正しい折り畳みのために他方の存在を必要とする、ＧＲＩＰ−１タンパク質由来のＰＤＺドメイン１および２のタンデム配列を記載している。同様に、ＧＲＩＰ−１由来の４番目および５番目のＰＤＺドメインのタンデム配列は、ＧｌｕＲ２／３との相互作用に必要であった。したがって、本明細書における一部または任意の実施形態において、ＰＤＺドメインは、タンデムＰＤＺドメイン、例えばＧＲＩＰ−１（アクセッション番号ＮＰ０８３０１２）由来のＰＤＺ１およびＰＤＺ２、またはＧＲＩＰ−１由来のＰＤＺ４およびＰＤＺ５である。かかるタンデムＰＤＺドメインは、同じまたは異なる配列の少なくとも２個、３個、４個、またはそれ以上のＰＤＺドメインを含んでもよい。
【００７３】
種々の実施形態において、ＰＤＺドメインは、非共有結合または共有結合していてもよく、ＰＤＺ結合ペプチドに結合する能力を保持する、（同じまたは異なる配列の）２つのＰＤＺドメインを含むＰＤＺダイマーである。
【００７４】
種々の実施形態において、ＰＤＺドメインは、ＰＤＺ様ドメインである。ＬｅｅおよびＺｈｅｎｇ（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｍ．  ＆  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，８：８（２０１０））は、２つのヘリックスでキャッピングされた５つのβ鎖からなるＰＤＺ様折り畳みを採用する種々のタンパク質を記載している。ＰＤＺ様ドメインを有するタンパク質は、ＨｔｒＡ（またはＤｅｇＰ）、ＤｅｇＳ、およびＤｅｇＱを含む。したがって、本明細書における一部または任意の実施形態において、ＰＤＺドメインは、ＰＤＺ様ドメイン、ＨｔｒＡ、ＤｅｇＳ、またはＤｅｇＱ由来のＰＤＺ様ドメインである。
【００７５】
２．ＰＤＺ結合ペプチド
本発明により有用なＰＤＺ結合ペプチドは、いかなる長さの配列であってもよいが、一般に、ＰＤＺドメインと相互作用する部分は、ＰＤＺ結合タンパク質のＣ末端の３〜４個のアミノ酸である。本明細書において使用する際、「ＰＤＺ結合ペプチド」は、ＰＤＺ結合タンパク質のＣ末端または内部ＰＤＺ結合領域を取り囲むおよそ１５〜２０アミノ酸領域、あるいは少なくとも５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のアミノ酸長のその断片、あるいはＰＤＺドメインとのジスルフィド結合を可能にするＣｙｓ残基が保持されるという条件で、天然配列に１、２、３、４、５、６、７、８、または９個の置換、好ましくは保存的置換が行われたかかる断片の変異体を指す。
【００７６】
本明細書における一部または任意の実施形態において、ＰＤＺ結合ペプチドはＮｏｒｐＡタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）由来であり（すなわち、ＮｏｒｐＡ  ＰＤＺ結合ペプチド）、これは例えば、ＮｏｒｐＡタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）Ｃ末端の２０個のアミノ酸に由来する。一部の例では、ＮｏｒｐＡ  ＰＤＺ結合ペプチドは、１つまたは複数の置換（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、または９個）、好ましくは保存的置換を含んでもよく、−１位にＣｙｓを保持する、少なくとも４〜２０、５〜１５、または５〜２０アミノ酸長のＣ末端断片である。一部または任意の実施形態において、ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃ−Ｘ４を含み、式中、Ｃは不変システインであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、任意の残基であってよい（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）。代替的実施形態において、これらの可変アミノ酸は以下の通りである：Ｘ１は、トレオニン、セリン、またはチロシンであり、Ｘ２は、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、Ｘ３は、フェニルアラニン、またはチロシンであり、Ｘ４は、アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、またはバリンである（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）。一部または任意の実施形態において、例えば、ＰＤＺ結合ペプチドと相互作用するＰＤＺドメインがＩ型ＰＤＺドメインである場合、ＰＤＺ結合ペプチドは、共通配列Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｖ／Ｌを含み、式中、Ｘは任意の残基である。一部または任意の実施形態において、例えば、ＰＤＺ結合ペプチドと相互作用するＰＤＺドメインがＩＩ型ＰＤＺドメインである場合、ＰＤＺ結合ペプチドは、共通配列Φ−Ｘ−Φを含み、式中、Φは大きい疎水性残基である。本発明のＰＤＺ結合ペプチドは、ＮｏｒｐＡポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載される代表的なＮｏｒｐＡポリペプチド）の任意のセグメントもしくは断片、または本明細書で定義されるようなその機能的同等物を、そのセグメント、断片、またはその機能的同等物が、本明細書で定義されるようなＰＤＺ１ドメインポリペプチドを結合する機能的特徴を示す限り含んでもよい。具体的な実施形態において、ＰＤＺ結合ペプチド配列は、ＴＥＦＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、またはＣｙｓ残基が好ましくは−１位に保持される条件で、１個、２個、３個、もしくは４個の保存的置換が行われた改変ペプチドである。別の実施形態において、ＰＤＺ結合ペプチド配列は、ＧＫＴＥＦＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、またはＣｙｓ残基が好ましくは−１位に保持される条件で、１個、２個、３個、４個、５個、もしくは６個の保存的置換が行われた改変ペプチドである。別の実施形態において、ＰＤＺ結合ペプチド配列は、ＫＴＥＦＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、またはＣｙｓ残基が好ましくは−１位に保持される条件で、１個、２個、３個、４個、もしくは５個の保存的置換が行われた改変ペプチドである。
【００７７】
前述のように、ＩｎａＤ  ＰＤＺ１ドメインは、ＮｏｒｐＡの−１位（すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の最後から２番目の残基）にＣｙｓ残基を有する、ＮｏｒｐＡのＣ末端に結合する。ＩｎａＤ−ＮｏｒｐＡ相互作用と類似する形で同種ＰＤＺドメインと相互作用することが期待される、天然に存在するＣｙｓ残基を例えば−１位に有するタンパク質のさらなる例には、ショウジョウバエ・ウィングレス（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｗｉｎｇｌｅｓｓ）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１３２１７；Ｃ−末端配列ＴＣＬ）、Ｋｎｉｒｐｓ（Ｐ１０７３４；ＶＣＶ）、ネトリンＡ（Ｑ２４５６７；ＴＣＡ）；ヒトＺＦＰ３６（１７２０９；Ｃ−末端配列ＳＣＶ）、ＺＡＰ７０（Ｐ４３４０３；ＡＣＡ）、Ｕｌｋ−１（Ｏ７５３８５；ＩＣＡ）、アデニロスクシナーゼ（Ｐ３０５６６；ＬＣＬ）、Ｐ５３誘導タンパク質１０（Ｏ１４６８２；ＦＣＬ）、ＮＡＧ−２（Ｏ１４８１７；ＹＣＡ）、ｃ−Ｍｙｃ（Ｐ０１１０６；ＳＣＡ）、インスリン様ペプチド４（Ｑ１４６４１；ＬＣＴ）、グルタチオンペルオキシダーゼ（Ｐ０７２０３；ＳＣＡ）、５−ＨＴ−２Ａ（Ｐ２８２２３；ＳＣＶ）、Ｔ−カドヘリン受容体（Ｐ５５２９０；ＡＣＬ）、ＣＤ８６前駆体（Ｐ４２０８１；ＴＣＦ）、エストラジオール１７Ｂヒドロゲナーゼ（Ｐ５６９３７；ＳＣＬ）、ＥＧＲ−３（Ｑ０６８８９；ＴＣＡ）、ガラクトキナーゼＩ（Ｐ５１５７０；ＬＣＬ）、およびＦｒｉｚｚｌｅｄ  １０（ｔｒＥＭＢＬ  Ｑ９ＵＬＷ２；ＴＣＶ）に由来するＰＤＺ結合ペプチドが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、ＰＤＺ結合ペプチドは、ラットＩＩＩ型ヘキソキナーゼ（Ｐ２７２９６；Ｃ末端配列ＡＣＶ）、Ｏｌｉｆ．Ｒｅｃ．様ｐｒｏｔ  Ｉ１５  Ｐ２７２９６；ＦＣＬ）、Ｏｌｉｆ．Ｒｅｃ．様ｐｒｏｔ  Ｆ３  Ｐ２３２６５；ＦＣＹ）、およびＤ３ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼＯ０８６５１；ＦＣＦ）に由来する。これらの実施形態のいずれにおいても、ＰＤＺ結合ペプチドは、少なくとも４〜２０、または５〜１５、または５〜２０アミノ酸長の任意の前述のタンパク質のＣ末端断片であり、これは１つまたは複数の置換（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、または９個）、好ましくは保存的置換を含んでもよく、−１位にＣｙｓを保持する。
【００７８】
本明細書における一部または任意の実施形態において、ＰＤＺ結合ペプチドは、５〜２０アミノ酸長または４〜２０アミノ酸長である。他の実施形態において、ＰＤＺ結合ペプチドは、１５アミノ酸長未満、例えば、３〜１５アミノ酸長である。種々の実施形態において、ＰＤＺ結合ペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０アミノ酸長、あるいはこれらの端点のいずれかの間の任意の範囲である。
【００７９】
一実施形態において、ＰＤＺ結合ペプチドは、対象タンパク質、例えば、ポリペプチド結合剤、または抗体もしくはその抗原結合性断片のＣ末端に融合している。
【００８０】
本明細書における一部または任意の実施形態において、ＰＤＺドメインとＰＤＺ結合ペプチドとの対は、表１から選択される。例示的ＰＤＺドメインおよびそのそれぞれのリガンド（すなわち、ＰＤＺ結合ペプチド）は、ＰＤＺＢａｓｅから得られ（Ｂｅｕｍｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２１（６）：８２７−８２８（２００５））、表１に記載される。
【００８１】
（表１）ＰＤＺドメイン／ＰＤＺ結合ペプチド対
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【００８２】
本明細書における一部または任意の実施形態において、ＰＤＺドメインとＰＤＺ結合ペプチドとの対は、表２から選択される。表２に、３つの例示的ＰＤＺドメインおよびそれぞれのＰＤＺ結合ペプチドを記載する。表２に記載される３つのＰＤＺドメインに対するＰＤＺ結合ペプチドは、Ｔｏｎｉｋｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏｓ  Ｂｉｏｌ  ６：９  ｅ２３９（２００８）により報告されるように、ファージ提示によって推定ＰＤＺ結合ペプチドのランダムライブラリーをスクリーニングすることにより単離された。
【００８３】
（表２）ＰＤＺドメインおよびスクリーニングにより特定されたＰＤＺ結合ペプチド
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＊  Ｘは、２０個の天然に存在するアミノ酸のいずれかを表す。
【００８４】
当業者は、Ｔｏｎｉｋｉａｎらにより開示される方法が、本明細書に開示される材料および方法に有用な新規のＰＤＺドメイン／ＰＤＺ結合ペプチド対を作成するのに有用であることを理解するであろう。Ｔｏｎｉｋｉａｎらは、０位にシステインを含むＰＤＺ結合ペプチドを認識する４つのＰＤＺドメインを記載しており、これにはＡＰＢＡ３−１（ヒトアミロイドβＡ４前駆体タンパク質結合ファミリーＡメンバー３、アクセッション番号ＮＰ＿００４８７７）、Ｔ２１Ｇ５．４−１（線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）仮説タンパク質、アクセッション番号ＡＡＢ２８９９）、Ｃ２５Ｇ４．６−２（線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）仮説タンパク質、アクセッション番号ＮＰ＿５０２３８０）、およびＣ５３Ｂ４．４（線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）仮説タンパク質、アクセッション番号ＮＰ＿００１１２２７６４）が含まれる。ＡＰＢＡ３−１、Ｔ２１Ｇ５．４−１、Ｃ２５Ｇ４．６−２、およびＣ５３Ｂ４．４  ＰＤＺドメインは、共通配列ＦＤΩΩＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３４）（式中、Ωは、芳香族アミノ酸（Ｆ、Ｗ、またはＹ）である）と結合する。当業者は、０位にシステイン残基を含むＰＤＺ結合ペプチドと優先的に結合することが示されるＰＤＺドメインが、前述のＰＤＺ結合ペプチドシステインとジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含むように操作可能であることを理解するであろう。さらに、当業者は、構造情報を用いて、上述の天然に存在するＩｎａＤ  ＰＤＺ１ドメイン／ＮｏｒｐＡ対と類似する、ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含むＰＤＺドメイン／ＰＤＺ結合ペプチド対を操作可能であることを理解するであろう。一部の実施形態において、ＰＤＺドメインを操作して、天然アミノ酸残基をＰＤＺドメインのペプチド結合溝中、またはペプチド結合溝外の領域のシステインで置換する。他の実施形態において、ＰＤＺ結合ペプチドを操作して、天然アミノ酸残基をＰＤＺ結合ペプチドのＣ末端、またはＣ末端領域外の領域のシステイン残基で置換する。また、一部の実施形態において、ＰＤＺ結合ドメインおよびＰＤＺ結合ペプチドを操作して、天然残基をシステイン残基で置換することにより、ジスルフィド結合によって結合したＰＤＺドメイン／ＰＤＺ結合ペプチドを作成することも想定されている。ジスルフィド結合が可能なＰＤＺドメイン／ＰＤＺ結合ペプチド対は、ＰＤＺドメイン／ＰＤＺ結合ペプチド相互作用が共有結合性であるという理由でより好適であるという点で有利である。
【００８５】
Ｃ．宿主細胞および細胞表面タンパク質
本明細書において使用する際、「細胞表面タンパク質」は、細胞表面に提示される天然に存在するタンパク質またはその部分、または細胞表面に提示される能力を保持するその断片もしくは変異体である。
【００８６】
１．酵母
一部または任意の実施形態において、酵母株は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、およびカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）からなる群から選択される属に由来する。一部または任意の実施形態において、酵母種は、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、およびカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）からなる群から選択される。
【００８７】
一部または任意の実施形態において、酵母株は、ヒト細胞で実施される種類のグリコシル化反応を実行するように操作されている。酵母の糖操作のための例示的方法は、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３（２）：１１９−２８（２００５）に概説されている。
【００８８】
本発明の方法および細胞は、細胞表面でのタンパク質提示を可能にするために、細胞壁タンパク質に融合したＰＤＺドメインを提供する。宿主細胞が酵母細胞である場合、任意の好適な細胞壁タンパク質をＰＤＺドメインに融合させてもよい。宿主細胞が出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である場合、好適な細胞壁タンパク質の例には、Ａｇａ１、Ａｇａ２、Ａｇα１、Ｃｗｐ１、Ｃｗｐ２、Ｇａｓ１ｐ、Ｙａｐ３ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｃｒｈ２ｐ、Ｐｉｒ１、Ｐｉｒ２、Ｐｉｒ３、またはＰｉｒ４、またはそれらの断片もしくは変異体がある。宿主細胞がハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）である場合、好適な細胞壁タンパク質の例には、ＨｐＳＥＤ１、ＨｐＧＡＳ１、ＨｐＴＩＰ１、またはＨＰＷＰ１がある。宿主細胞がカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）である場合、好適な細胞壁タンパク質の例には、Ｈｗｐ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、またはＲｂｔ５ｐがある。
【００８９】
例となる実施形態において、かかる細胞壁タンパク質の断片は、少なくとも約２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長である。例となる実施形態において、その変異体は、かかるドメインの少なくとも１００個のアミノ酸と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一のアミノ酸配列を含む。
【００９０】
２．哺乳動物細胞
また、本明細書に開示される方法は、哺乳動物宿主細胞を用いて実施することも想定されている。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、例えばＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））、および制御されたフコシル化を生じるように操作されたＣＨＯ細胞（ＭＡｂｓ．１（３）：２３０−３６（２００９））；ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）で形質転換したサル腎臓ＣＶ１系；ヒト胎児腎臓細胞系（懸濁培養での成長用にサブクローニングされた２９３細胞または２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  ３６：５９，１９７７）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１，１９８０）；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌系（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【００９１】
宿主細胞が哺乳動物細胞である場合、細胞表面にタンパク質を提示する能力を保持する細胞表面タンパク質の部分の例には、任意の既知の細胞膜タンパク質の好適な膜貫通ドメイン、あるいはＧＰＩアンカー配列または切断不可能なＩＩ型シグナルアンカー配列を含むポリペプチドが含まれる。哺乳動物細胞における細胞提示に使用する膜アンカー配列の例には、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメイン（Ｃｈｅｓｎｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ１９３（１）：１７−２７，（１９９６）、Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３（２５）：９６３７−４２，（２００６）、参照により全体が援用される）、ヒト崩壊促進因子由来のＧＰＩアンカー（Ａｋａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３２７（１−２）：４０−５２（２００７）、参照により全体が援用される）、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ζ鎖（Ａｌｏｎｓｏ−Ｃａｍｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４（９）：ｅ７１７４（２００９）、参照により全体が援用される）がある。別の例は、ＩＩ型シグナルアンカー配列の使用である（米国特許第７，１２５，９７３号、参照により全体が援用される）である。あるいは、捕捉分子、例えば抗体またはタンパク質を膜アンカー配列に融合し、細胞表面に提示して、対象タンパク質を捕捉することもできる（米国特許第６，９１９，１８３号、参照により全体が援用される）。一部の実施形態では、人為的な細胞表面アンカー配列を哺乳動物細胞の細胞膜内に組み込む、またはかかる細胞膜に結合させる。
【００９２】
３．原核生物
また、本明細書に開示される方法は、原核宿主細胞を用いて実施することも想定されている。したがって、一部または任意の実施形態において、宿主細胞は原核細胞である。この目的で好適な原核生物には、真正細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばエシャリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えば、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えば、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、および赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ならびに桿菌属（Ｂａｃｉｌｌｉ）、例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびリケニホルミス菌（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日出版のＤＤ  ２６６，７１０に開示されているリケニホルミス菌４１Ｐ（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ４１  Ｐ））、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、例えば緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ならびにストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）がある。好ましい大腸菌クローニング宿主は、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）であるが、他の株、例えば大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）、および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）は好適である。これらの例は、説明のためであり、限定するものではない。
【００９３】
宿主細胞が原核細胞である場合、好適な細胞表面タンパク質の例には、好適な細菌外膜タンパク質がある。かかる外膜タンパク質には、線毛および鞭毛、リポタンパク質、氷核形成タンパク質、およびオートトランスポーターがある。異種タンパク質提示に使用する例示的細菌タンパク質には、ＬａｍＢ（Ｃｈａｒｂｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，５（１１）：３０２９−３７（１９８６）、参照により全体が援用される）、ＯｍｐＡ（Ｆｒｅｕｄｌ，Ｇｅｎｅ，８２（２）：２２９−３６（１９８９）、参照により全体が援用される）、およびインチミン（Ｗｅｎｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７４（３０）：２１０３７−４３，（１９９９）、参照により全体が援用される）がある。さらなる例示的外膜タンパク質には、ＦｌｉＣ、プルラナーゼ、ＯｐｒＦ、ＯｐｒＩ、ＰｈｏＥ、ＭｉｓＬ、および細胞溶解素があるが、これらに限定されない。表面提示に使用され、本発明における使用が想定される細菌膜タンパク質の広範なリストは、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２１（１）：４５−５２（２００３）、Ｊｏｓｅ，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，６９（６）：６０７−１４（２００６）、およびＤａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ，１７（４）：４７４−８０（２００７）に詳述されており、これらは全て参照により全体が援用される。一部の実施形態において、アンカータンパク質は、細菌細胞の外面に組み込まれるか、またはかかる外面に結合される、人為的配列である。
【００９４】
Ｄ．ポリペプチド結合剤
一部または任意の実施形態において、対象タンパク質はポリペプチド結合剤である。「ポリペプチド結合剤」という用語は、本明細書において使用する際、別の分子実体（例えば、抗原）に特異的に結合することができるか、または測定可能な結合親和性で別の分子実体に結合することができるポリペプチドを指す。ポリペプチド結合剤の例には、場合により他のペプチド部分または非ペプチド部分とコンジュゲートした、抗体、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、プロテアーゼ、スキャフォールドタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドがある。ポリペプチド結合剤が結合してもよい分子実体には、抗体応答を引き出すことができるか、または非特異的結合よりも高い検出可能な結合親和性でポリペプチド結合剤に結合することができる、任意のタンパク質性分子または非タンパク質性分子がある。
【００９５】
例となる実施形態において、ポリペプチド結合剤は抗体である。「抗体」という用語は、広義で使用され、完全に組み立てられた抗体、四量体抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ｍＡｂ２抗体）、抗原に結合することが可能な抗体断片（例えば、Ｆａｂ'、Ｆ'（ａｂ）２、Ｆｖ、一本鎖抗体、二特異性抗体、ｄＡｂ）、および所望の生物活性を示す限り、前述のものを含む組み換えペプチドを含む。「免疫グロブリン」または「四量体抗体」という用語は、それぞれが可変領域および定常領域を含む２つの重鎖と２つの軽鎖からなる四量体糖タンパク質を指す。抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ技術によって、あるいは無傷の抗体の酵素的切断または化学的切断によって作製することができる。抗体断片または抗原結合部分には、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、Ｆｃａｂ（商標）、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体断片、フレームワーク領域によって結合した２つのみのＣＤＲを含む抗体分子、例えば、ＶＨＣＤＲ１−ＶＨＦＲ２−ＶＬＣＤＲ３融合ペプチド、キメラ抗体、二特異性抗体、三特異性抗体、四特異性抗体、ミニボディ、直鎖状抗体；キレート性組み換え抗体、トリボディまたはバイボディ、細胞内抗体、ナノボディ、小モジュール免疫薬（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、ＶＨＨ含有抗体、またはそれらの変異体もしくは誘導体、および抗体が所望の生物活性を保持する限り、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のＣＤＲ配列など、ポリペプチドに特異的抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが含まれる。
【００９６】
天然に存在する免疫グロブリンでは、それぞれの四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対からなり、それぞれの対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部は、抗原認識に主に関与する、約１００〜１１０個、またはそれ以上のアミノ酸を有する可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を画定する。ヒト軽鎖は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、およびエプシロン（ε）に分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと定義する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸を有する「Ｊ」領域によって連結し、このとき重鎖は、約１０個以上のアミノ酸を有する「Ｄ」領域も含む。概して、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．  ７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（参照によりあらゆる目的で全体が援用される）を参照されたい。それぞれの軽鎖／重鎖対の可変領域は、無傷の免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように、抗体結合部位を形成する。
【００９７】
各重鎖は、一端（ＶＨ）に１つの可変ドメイン、続いて複数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端（ＶＬ）に可変ドメイン、その他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の最初の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられている（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７）。
【００９８】
免疫グロブリン可変ドメインは、同じ一般的構造の３つの超可変領域またはＣＤＲによって連結した比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を示す。Ｎ末端からＣ末端にかけて、軽鎖および重鎖はいずれもドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７  ａｎｄ  １９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３，１９８９）の定義に従う。
【００９９】
抗体の超可変領域とは、抗原結合に関与する抗体のＣＤＲアミノ酸残基を指す。超可変領域は、ＣＤＲからのアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）に記載されるように、軽鎖可変ドメインの残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）、および重鎖可変ドメインの残基３１〜３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３））、および／または超可変ループからの残基（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７（１９８７）に記載されるような、軽鎖可変ドメインの残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの残基２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３））を含む。
【０１００】
フレームワークすなわちＦＲ残基は、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【０１０１】
「重鎖可変領域」とは、本明細書において使用する際、前記抗体重鎖可変ドメインの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体分子の領域を指す。重鎖可変領域は、前記抗体重鎖の１個、２個、または３個のＣＤＲを含み得る。
【０１０２】
「軽鎖可変領域」とは、本明細書において使用する際、前記抗体軽鎖可変ドメインの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体分子の領域を指す。軽鎖可変領域は、前記抗体軽鎖の１個、２個、または３個のＣＤＲを含み得、これは抗体によってカッパまたはラムダ軽鎖のいずれかであり得る。
【０１０３】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに割り当てることができ、これらはサブクラスまたはアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分類してもよい。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置が周知である。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有し、例えば、ＩｇＧ１アイソタイプおよびＩｇＧ３アイソタイプはＡＤＣＣ活性を有する。本発明の抗体は、定常ドメインを含む場合、これらのサブクラスまたはアイソタイプのいずれか、またはそれらの変異体もしくは共通配列、あるいは異なるアイソタイプのハイブリッド（例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッド）あってもよい。
【０１０４】
例示的実施形態において、本発明の抗体は、ヒトカッパ（κ）もしくはヒトラムダ（λ）軽鎖、またはそれに由来するアミノ酸配列、またはそれらのハイブリッドを、場合によっては、ヒト重鎖またはそれに由来する配列とともに、あるいは一本鎖、二量体、四量体（例えば、２つの重鎖と２つの軽鎖）、または他の形態で重鎖および軽鎖を一緒に含んでもよい。
【０１０５】
「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能な自然発生突然変異以外は同一である。
【０１０６】
「抗体変異体」とは、本明細書において使用する際、天然の抗体可変領域ドメインの可変領域に少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含む抗体ポリペプチド配列を指す。変異体は、改変していない抗体と実質的に相同または実質的に同一であってよい。
【０１０７】
「キメラ抗体」とは、本明細書において使用する際、典型的には異なる種を起源とする、２つの異なる抗体に由来する配列を含む抗体（例えば、米国特許４，８１６，５６７号を参照）を指す。最も典型的には、キメラ抗体は、ヒトおよび齧歯動物の抗体断片、一般的にヒト定常領域およびマウス可変領域を含む。
【０１０８】
「中和抗体」は、それが結合する抗原の生物学的機能を排除するか、または著しく減少させることが可能な抗体分子である。したがって、「中和」抗体は、酵素活性、リガンド結合、または細胞内シグナル伝達などの生物学的機能を排除する、または著しく減少させることができる。
【０１０９】
「単離」抗体は、その自然環境の成分から特定、分離、および回収された抗体である。その自然環境の混入成分は、抗体の診断的または治療的使用を妨げるであろう物質であり、これには酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。一部の実施形態において、例えば、（１）ローリー法で測定したときに抗体の９５重量％を上回るまで、好ましくは９９重量％を上回るまで、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クマシーブルーもしくは銀染色を用いて、還元または非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質となるまで、抗体を精製する。単離抗体には、組み換え細胞内でのｉｎ  ｓｉｔｕ抗体が含まれるが、これはこの抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しなしなくなるためである。しかし、通常、単離抗体は少なくとも一つの精製ステップによって調製されるであろう。
【０１１０】
他の例となる実施形態において、ポリペプチド結合剤はプロテアーゼである。「プロテアーゼ」という用語は、本明細書において使用する際、ペプチド結合の加水分解を触媒する任意のタンパク質分子を指す。これには、天然に存在するタンパク質分解酵素、ならびにプロテアーゼ変異体が含まれる。また、これはタンパク質分解酵素の任意の断片、または前述のタンパク質のうちの１つを含む分子複合体もしくは融合タンパク質も含む。プロテアーゼには、トリプシン、キモトリプシン、スブチリシン、トロンビン、プラスミン、Ｘａ因子、ｕＰＡ、ｔＰＡ、ＭＴＳＰ−１、グランザイムＡ、グランザイムＢ、グランザイムＭ、エラスターゼ、キマーゼ、パパイン、好中球エラスターゼ、血漿カリクレイン、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、補体因子のセリンプロテアーゼ、ＡＤＡＭＴＳ  １３、中性エンドペプチダーゼ／ネプリライシン、フューリン、およびクルザインが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
さらなる例となる実施形態において、ポリペプチド結合剤はスキャフォールドである。タンパク質スキャフォールドには、ＡｄＮｅｃｔｉｎ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ、ＤＡＲＰｉｎ、操作されたＫｕｎｉｔｚ−ｔｙｐｅ阻害剤、テトラネクチン、Ａドメインタンパク質、リポカリン、反復タンパク質、例えばアンキリン反復タンパク質、免疫タンパク質、α２ｐ８ペプチド、昆虫デフェンシンＡ、ＰＤＺドメイン、カリブドトキシン、ＰＨＤフィンガー、ＴＥＭ−１  β−ラクタマーゼ、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、ＣＴＬＡ−４、Ｔ−細胞受容体、ノッチン、ネオカルチノスタチン、炭水化物結合モジュール４−２、緑色蛍光タンパク質、チオレドキシンが含まれるが、これらに限定されない（Ｇｅｂａｕｅｒ  ＆  Ｓｋｅｒｒａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．  １３：２４５−５５（２００９）、Ｇｉｌｌ  ＆  Ｄａｍｌｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ  １７：６５３−５８（２００６）、Ｈｏｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  １５：１４−２７（２００６）、Ｓｋｅｒｒａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ  １８：２９５−３−４（２００７））。
【０１１２】
Ｅ．ベクター
本発明のベクターは、一般に、外因性ポリペプチドを発現するのに必要な転写または翻訳制御配列を含む。好適な転写または翻訳制御配列は、複製起点、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー結合領域、転写開始部位、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、ならびに転写および翻訳の終結部位を含むが、これらに限定されない。
【０１１３】
一部または任意の実施形態において、ＰＤＺドメインに融合した細胞表面タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ＰＤＺ結合ペプチドに融合した対象タンパク質（例えば、ポリペプチド結合剤、または抗体もしくはその抗原結合性断片）をコードするポリヌクレオチドとは、同じベクター上に存在する。一部または任意の実施形態において、ＰＤＺドメインに融合した細胞表面タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ＰＤＺ結合ペプチドに融合した対象タンパク質（例えば、ポリペプチド結合剤、または抗体もしくはその抗原結合性断片）をコードするポリヌクレオチドとは、異なるベクター上に存在する。当業者に理解されるであろうように、融合体をコードするポリヌクレオチドはそれぞれ、宿主細胞の適切な発現を可能にするための好適な転写および翻訳制御配列ならびにシグナル配列を有することになる。
【０１１４】
一部または任意の実施形態において、ＰＤＺドメインに融合した細胞表面タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。宿主細胞が酵母細胞である場合、酵母組み込み型プラスミド（ＹＩｐ）を使用して、ポリヌクレオチドを酵母細胞のゲノムに組み込むことができる。組み込み部位は、制限エンドヌクレアーゼによってＹＩｐプラスミド中の酵母セグメントを切断し、その線状化プラスミドで酵母株を形質転換することによって標的化することができる。線端部は組み換え型であり、これらの端部と相同なゲノム内の部位への組み込みを導く。さらに、線状化は、組み込み形質転換の効率を１０倍〜５０倍向上させる。ＹＩｐプラスミドで形質転換した株は、選択圧の不在下であっても、極めて安定である。
【０１１５】
本発明の一部または任意の実施形態において、発現ベクターは、少なくとも２つの非関連発現系において複製が可能なシャトルベクターである。かかる複製を容易にするために、ベクターは、一般に、各発現系において有効な少なくとも２つの複製起点を含む。シャトルベクターは、真核細胞発現系および原核細胞発現系において複製可能であってよい。あるいは、シャトルベクターは、２つの異なる真核細胞系、例えば酵母系および哺乳動物系において、あるいは２つの異なる原核細胞系において複製可能であってもよい。このことは、真核細胞宿主におけるタンパク質発現および原核細胞宿主におけるベクターの増幅の検出を可能にする。一実施形態において、１つの複製起点はＣＥＮ  ｏｒｉであり、１つはｐＵＣ由来であるが、ベクターの複製を導くという条件で、当分野で既知の任意の好適な起点を用いてもよい。ベクターがシャトルベクターである場合、ベクターは、少なくとも２つの選択可能なマーカー（例えば、真核細胞用に１つと原核細胞用に１つ）を含む。使用する発現系で機能するという条件で、当分野で既知または本明細書に記載の任意の選択可能なマーカーを使用することができる。
【０１１６】
１．複製起点
複製起点（一般に、ｏｒｉ配列と称する）は、好適な宿主細胞におけるベクターの複製を可能にする。ｏｒｉの選択は、使用する宿主細胞の種類に依存することになる。宿主細胞が原核生物である場合、発現ベクターは、典型的には、原核細胞内でのベクターの自律複製を導くｏｒｉを含む。この種のｏｒｉの非限定的例には、ｐＭＢ１、ｐＵＣ、および他の細菌起点がある。
【０１１７】
高等真核生物は、複数のＤＮＡ複製起点（推定１０４〜１０６ｏｒｉ／哺乳動物ゲノム）を含むが、ｏｒｉ配列はそれほど明確に定義されていない。哺乳動物ベクターの好適な起点は、通常は真核生物ウイルスに由来する。例示的真核生物ｏｒｉ配列には、ＳＶ４０  ｏｒｉ、ＥＢＶ  ｏｒｉ、およびＨＳＶ  ｏｒｉがあるが、これらに限定されない。酵母細胞の例示的ｏｒｉ  配列には、２μｍ  ｏｒｉ配列およびＣＥＮ  ｏｒｉ配列があるが、これらに限定されない。
【０１１８】
２．シグナル配列
原核生物および真核生物の双方に由来するシグナル配列は、いくつかの共通の特徴を共有する。これらは約１５〜３０アミノ酸長であり、正荷電Ｎ末端領域、中央疎水性領域、およびより極性の高いＣ末端領域の３つの領域からなる。宿主細胞が酵母細胞である場合、タンパク質が分泌するよう、および／または細胞壁に向かうよう導くことが可能な、当分野で既知の任意のシグナル配列を使用することができる。例えば、このシグナル配列は、接合因子α１（ＭＦα１）（Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８１（１７）：５３３０−４（１９８４））、インベルターゼ（ＳＵＣ２）（Ｔａｕｓｓｉｇ  ａｎｄ  Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １１（６）：１９４３−５４（１９８３））、酸ホスファターゼ（ＰＨＯ５）（Ａｒｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １１（６）：１６５７−７２（１９８３））、βグルカナーゼ（ＢＧＬ２）（Ａｃｈｓｔｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １１０（１）：２５−３１（１９９２））、およびイヌリナーゼ（ＩＮＵ１Ａ）（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ４９（４）：４７３−９（１９９６））から得ることができる。細胞壁に共有結合し、細胞表面タンパク質提示に適合する、ＡＧＡ２、ＡＧＡ１、ＡＧα１、ＦＬＯ１、ＧＡＳ１、ＣＷＰ１、およびＣＷＰ２などの酵母ＧＰＩタンパク質のシグナル配列もまた、本発明の範囲に含まれる（Ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ２０（９）：７８１−９６（１９９２））。
【０１１９】
宿主細胞が原核細胞である場合、融合ポリペプチドのペリプラズム分泌を導くシグナル配列には、ｓｐＡ、ｐｈｏＡ、リボース結合タンパク質、ｐｅｌＢ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＴ、ｄｓｂＡ、ｔｏｒＡ、ｔｏｒＴ、およびｔｏｌＴに由来するものが含まれる（ｄｅ  Ｍａｒｃｏ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，８：２６（２００９））。米国特許第５，８４６，８１８号および第５，５７６，１９５号に開示されるｐｅｌＢシグナル配列は、参照により全体が援用される。
【０１２０】
また、本発明の範囲には、原核宿主細胞（例えば、大腸菌）においてもシグナル配列として機能する、真核細胞に由来するシグナル配列も含まれる。かかる配列は、米国特許第７，０９４，５７９号に開示され、その内容は参照により全体が援用される。
【０１２１】
Ｗａｔｓｏｎ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：５１４５−５１６４（１９８４））は、シグナル配列の集積を開示している。米国特許第４，９６３，４９５号は、宿主生物のペリプラズム空間における、３'末端で成熟タンパク質をコードするＤＮＡの５'末端に連結した原核生物の分泌シグナル配列ＤＮＡを用いた、成熟真核生物タンパク質の発現および分泌を開示している。Ｃｈａｎｇら（Ｇｅｎｅ  ５５：１８９−１９６（１９８７））は、大腸菌においてｈＧＨを分泌するためのＳＴＩＩシグナル配列の使用を開示している。Ｇｒａｙら（Ｇｅｎｅ  ３９：２４７−２４５（１９８５））は、ヒト成長ホルモンの天然シグナル配列の使用、ならびに大腸菌アルカリ性ホスファターゼプロモーターおよび大腸菌におけるヒト成長ホルモンの分泌のためのシグナル配列の使用を開示している。Ｗｏｎｇら（Ｇｅｎｅ６８：１９３−２０３（１９８８））は、大腸菌におけるＬａｍＢおよびＯｍｐＦ分泌リーダー配列と融合したインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）の分泌、ならびにｐｒｌＡ４突然変異の存在下でのこれらのシグナル配列の処理効率の向上を開示している。Ｆｕｊｉｍｏｔｏら（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．８：７７−８６（１９８８））は、大腸菌におけるヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）の分泌のための４つの異なる大腸菌エンテロトキシンシグナル配列、ＳＴＩ、ＳＴＩＩ、ＬＴ−Ａ、およびＬＴ−Ｂの使用を開示している。Ｄｅｎｅｆｌｅら（Ｇｅｎｅ  ８５：４９９−５１０（１９８９））は、成熟ヒトインターロイキン１βの分泌のためのＯｍｐＡおよびＰｈｏＡシグナルペプチドの使用を開示している。上記の全ての文献の内容は、参照により全体が援用される。
【０１２２】
３．プロモーター
真核細胞の好適なプロモーター配列には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、または他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、およびグルコキナーゼのプロモーターが含まれる。成長条件によって制御される転写のさらなる利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、および前述のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域である。哺乳動物細胞の好適なプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、βアクチンプロモーター、およびそれらのハイブリッドである。酵母細胞に好適なプロモーターには、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＡＬ１０、ＧＡＬ１、ＴＥＦ１、ＣＵＰ１、ＡＤＨ２、ＧＰＤ、およびピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＧＡＰ、ＡＯＸ１が含まれるが、これらに限定されない。様々な強力な原核細胞プロモーターが当分野で既知である。好適なプロモーターは、ラックプロモーター、Ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、およびｐＢＡＤプロモーターである。
【０１２３】
４．ターミネーター
ターミネーター配列は、好ましくは、１つまたは複数の転写終結配列（ポリアデニル化配列など）を含み、転写のリードスルーをさらに中断するために付加的ＤＮＡ配列を含めることによって長くなってもよい。本発明の好適なターミネーター配列（または終結部位）は、遺伝子と、それに続くその遺伝子自体の終結配列または異種終結配列のいずれかの転写終結配列とを有する。かかる終結配列の例には、当分野で既知であり、広く入手可能な、種々の酵母転写終結配列または哺乳動物ポリアデニル化配列に結合した終止コドンがある。
【０１２４】
５．選択可能なマーカー
上述の要素の他に、ベクターは、選択可能なマーカー（例えば、そのベクターで形質転換した宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードする遺伝子）を含んでもよいが、かかるマーカー遺伝子は、宿主細胞に共導入された別のポリヌクレオチド配列上にあってもよい。選択可能な遺伝子が導入されている宿主細胞のみが、選択条件下で生存および／または成長することになる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン、Ｇ４１８、メトトレキサートなどに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠損を補完する、または（ｃ）複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。正しいマーカー遺伝子の選択は、宿主細胞に依存し、様々な宿主に適切な遺伝子は当分野で既知である。
【０１２５】
本発明に包含されるベクターは、組み換えクローニング法を用いて、および／または化学合成によって得ることができる。ＰＣＲ、制限エンドヌクレアーゼ消化、およびライゲーションなどの莫大な数の組み換えクローニング技術が、当分野で周知である。また、当業者は、本明細書において提供される配列データ、または公共または独自のデータベース内の配列データを使用して、当分野で利用可能な任意の合成手段によって所望のベクターを得ることができる。さらに、周知の制限およびライゲーション技術を用いて、種々のＤＮＡ源から適切な配列を切り取って、外因性配列と作用可能な関係で組み込んで、本発明に従って発現させることが可能である。
【０１２６】
Ｆ．ライブラリーを調製およびスクリーニングする方法
一部または任意の実施形態において、少なくとも１０＾３種、少なくとも１０＾４種、少なくとも１０＾５種、少なくとも１０＾６種、少なくとも１０＾７種、少なくとも１０＾８種、少なくとも１０＾９種、または少なくとも１０＾１０種の異なる宿主細胞、例えば酵母細胞を含み、それぞれのかかる宿主細胞がその表面に異なる対象タンパク質（例えば、ポリペプチド結合剤、抗体、またはその抗原結合性断片）を提示する、細胞のライブラリーが想定されている。対象タンパク質、例えば、抗体またはその抗原結合性断片の提示は、本明細書に記載されるような、ＰＤＺドメインとＰＤＺ結合ペプチドとの間の相互作用を利用した融合タンパク質の発現によって達成される。抗体またはその抗原結合性断片のライブラリーを含む宿主細胞を生成する方法は、当分野で既知であり、また本明細書に記載される。かかる細胞ライブラリーを当分野で既知であり、本明細書に記載される方法（ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳなど）を用いてスクリーニングして、標的タンパク質／抗原に結合する抗体またはその抗原結合性断片を特定する。
【０１２７】
本発明は、細胞表面に提示される抗体または抗原結合性断片のライブラリーを作成することを含む、標的特異的抗体またはその抗原結合部分を生成する方法を想定している。抗体または抗原結合性断片のライブラリーは、免疫化源または非免疫化源から調製することができ、また天然、半合成、または合成であってよい（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１０５−１１１６（２００５）において概説される）。
【０１２８】
また、本発明は、ライブラリーを標的タンパク質またはその一部に接触させることと、標的に結合する細胞を選択または単離または選別することと、その細胞から抗体またはその抗原結合性断片を得ることとを含む、標的特異的抗体またはその抗原結合部分を特定する方法も想定している。選択のための方法の例は、下記の「細胞選別」に記載する。
【０１２９】
一例として、本明細書で開示される細胞表面提示方法で使用するための抗体または抗原結合性断片のライブラリーを調製するための方法は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を標的抗原またはその抗原部分で免疫して、免疫応答を引き起こすステップと、その免疫した動物から抗体産生細胞を抽出するステップと、その抽出した細胞からＲＮＡを単離するステップと、そのＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを生成するステップと、そのｃＤＮＡを増幅するステップと、そのｃＤＮＡを本明細書で開示される提示ベクターに挿入して、抗体を宿主細胞の細胞表面に発現させるステップと、を含む。抗体ライブラリーを構築およびスクリーニングするための方法は、ＷｉｎｔｅｒらＰＣＴ国際公開第ＷＯ９０／０５１４４号、および米国特許第６，０５７，０９８号（参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【０１３０】
別の例として、本明細書で開示される細胞表面提示方法で使用するための抗体または抗原結合性断片のライブラリーを調製するための方法は、動物、例えばヒトの脾臓細胞、または末梢血リンパ球からｍＲＮＡを単離するステップと、そのＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを生成するステップと、そのｃＤＮＡを増幅するステップと、そのｃＤＮＡを本明細書で開示される提示ベクターに挿入して、抗体を宿主細胞の細胞表面に発現させるステップと、を含む。あるいは、異なるヌクレオチド配列のライブラリーは、既存の抗体コード配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発によって得ることができる。
【０１３１】
さらなる例として、本明細書で開示される細胞表面提示方法で使用するためのプロテアーゼ変異体のライブラリーは、国際公開第ＷＯ／０４０３１７３３および国際公開第ＷＯ／０６１２５８２７号（参照により本明細書に援用される）に記載される方法によって調製してもよい。コード配列に変更を導入する様々な戦略には、単点もしくは多点突然変異、単一もしくは複数のヌクレオチドトリプレットの交換、１つもしくは複数のコドンの挿入もしくは欠失、異なる遺伝子間の相同もしくは非相同組み換え、そのコード配列の一端における付加的コード配列の融合、または付加的コード配列の挿入、あるいはこれらの方法の任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３２】
一部または任意の実施形態では、対象タンパク質のライブラリーが既存の提示ライブラリーからサブクローニングされ、これは例えば、抗原に対する１ラウンドまたは複数ラウンドのパニングによって作成されたファージ提示サブライブラリーである。例えば、国際公開第ＷＯ／９８４７３４３号は、濃縮ライブラリーの提示されたポリペプチドをコードする核酸を提示ベクターから発現ベクターにサブクローニングして、抗体および他のポリペプチドのポリクローナルライブラリーを生成する方法を記載している。さらなる例として、Ｊｏｓｔｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８９，６５−８０（２００４）は、ファージベクター中のＦａｂ断片の哺乳動物ベクター中のＩｇＧへのバッチ再編成を記載している。
【０１３３】
ライブラリーをスクリーニングする方法は、実施例に記載する。抗体提示ライブラリーを生成およびスクリーニングする際に使用できるさらなる方法および試薬は、当分野で利用可能である（例えば、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，２２３，４０９号、Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９２／１８６１９号、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９１／１７２７１号、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９２／２０７９１号、Ｍａｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９２／１５６７９号、Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９３／０１２８８号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号、Ｇａｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９２／０９６９０号、Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２、Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２２６：８８９−８９６、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８、Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：３５７６−３５８０、Ｇａｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７、およびＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２を参照されたい）。
【０１３４】
Ｇ．細胞選別
フローサイトメトリーは、合成コンビナトリアルライブラリーからの生物活性分子の単離、微生物中の病原性遺伝子の特定、およびタンパク質機能の研究および操作を含む数多くの用途を有する、強力なハイスループットのライブラリースクリーニング手段である。フローサイトメトリーを用いて、リガンド結合、触媒作用、発現レベル、および安定性を含む所望の機能について、微生物において発現させたタンパク質突然変異体の巨大なライブラリーを定量的にスクリーニングすることができる。１０−６未満の頻度で出現する希少な標的細胞を検出し、細胞選別と成長による増幅の１サイクルまたは複数サイクルを用いて、不均一ライブラリー集団から単離することができる。フローサイトメトリーが特に強力であるのは、スクリーニング過程を観察し、定量的に最適化するまたとない機会を提供するためである。しかしながら、集団内でそのような低い頻度で出現する細胞を単離する能力には、スクリーニングパラメータの検討および最適化が必要とされる。
【０１３５】
表面に抗体断片を提示する細胞のライブラリーを、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）のいずれかによって、抗原結合についてスクリーニングする。ＦＡＣＳは、他にもあるより高度なレベルの検出の中でも特に、複数のカラーチャネル、低角および鈍角の光散乱検出チャネル、ならびにインピーダンスチャネルを用いて、細胞を分離または選別する。所望の細胞の生存能力に悪影響がない限り、いかなるＦＡＣＳ技術を用いてもよい。（ＦＡＣＳの例示的方法については、米国特許第５，０６１，６２０号を参照）。サイズが１０８を上回るライブラリーについては、典型的にはＭＡＣＳを用いてライブラリーのサイズを減少させることで、その後のＦＡＣＳによるスクリーニングを実現可能な時間で実施できるようにする。ＭＡＣＳにおいて、ビオチン標識抗原に結合するライブラリーのメンバーをストレプトアビジン被覆磁気ビーズおよび磁気分離を用いて単離した後、さらなるスクリーニングのために増殖させる。ＦＡＣＳにおいて、二色検出法を用いた抗原結合および抗体発現の同時評価により、高親和性クローンの集団が特定でき、これらのクローンをその後のスクリーニングラウンドのために増殖させる。
【０１３６】
分離手順には、抗原被覆磁気ビーズを用いた磁気分離、および固体マトリクスに付着した抗原を使用する「パニング」を含み得る。磁気ビーズおよび他の固体マトリクス、例えばアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、中空繊維膜、およびプラスチック製ペトリ皿に付着した抗体は、直接分離を可能にする。抗原が結合した細胞は、細胞懸濁液から固体支持体を単に物理的に分離することによって、細胞懸濁液から除去することができる。細胞の固相結合抗原とのインキュベーションの正確な条件および時間は、使用するシステム特有のいくつかの要因によって異なることになる。しかしながら、適切な条件の選択は、当分野の技能の範囲内である。
【０１３７】
一部の実施形態において、抗原をビオチンとコンジュゲートした後、これを支持体に結合したアビジンまたはストレプトアビジンによって除去する。他の実施形態において、抗原を蛍光色素とコンジュゲートして、これを蛍光活性化細胞選別装置で使用して、細胞分離を可能にすることができる。
【０１３８】
Ｈ．親和性成熟
対象タンパク質の細胞表面提示を含む本発明の方法は、親和性成熟に特に有用である。本発明によると、多数の置換変異体を生成し、複数の細胞の細胞表面に提示し、その細胞を標的タンパク質と接触させることによって、所望の標的結合特性のために選択することができる。親和性成熟は、一般に、親ポリペプチドのＣＤＲ内に置換を有するポリペプチド変異体、例えば抗体変異体を調製およびスクリーニングすることと、親ポリペプチドと比較して、改善された生物学的特性、例えば結合親和性を有する変異体を選択することとを含む。かかる置換変異体を生成するのに都合のよい方法は、親和性成熟である。簡潔に述べると、一部の方法では、いくつかの超可変領域部位（例えば６〜７部位）を突然変異させて、各部位にアミノ置換を生成する。そのようにして生成した抗体変異体を細胞表面に一価の状態で提示させる。次に、細胞表面提示変異体をその生物活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。親和性成熟のファージ提示法の例については、例えば、国際出願第ＷＯ９２／０１０４７号、第ＷＯ９３／１１２３６６号、第ＷＯ９５／１５３８８号、および第ＷＯ９３／１９１７２号を参照されたい。
【０１３９】
現在の抗体親和性成熟方法は、確率論的および非確率論的の２つの突然変異誘発カテゴリーに属する。エラープローンＰＣＲ、ミューテーター細菌株（Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２６０，３５９−６８（１９９６））、および飽和突然変異誘発（Ｎｉｓｈｉｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７５：１２８１３−２０（２０００）、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｐ．Ｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １７８，２６９−８５（２００２））は、確率論的な突然変異誘発法の典型的な例である（Ｒａｊｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １０２：８４６６−７１（２００５））。非確率論的な技術は、しばしばアラニンスキャニングまたは部位特異的突然変異誘発を使用して、特定の変異体の限定された集合を生成する。一部の方法をさらに詳細に後述する。
【０１４０】
１．パニング法による親和性成熟
組み換え抗体の親和性成熟は、一般的に、漸減量の抗原の存在下での候補抗体の数ラウンドのパニングによって実施する。ラウンドごとに抗原の量を減らすことにより、その抗原に対して最も高い親和性を有する抗体を選択し、それによって巨大な出発材料のプールから高親和性の抗体が得られる。パニングによる親和性成熟は、当分野で周知であり、例えば、Ｈｕｌｓら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ５０：１６３−７１（２００１））に記載されている。この一般的概念は、本発明の方法および材料に容易に適合可能である。
【０１４１】
２．ルックスルー突然変異誘発
ルックスルー突然変異誘発（ＬＴＭ）（Ｒａｊｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １０２：８４６６−７１（２００５））は、抗体結合部位を迅速にマッピングするための方法を提供する。ＬＴＭでは、２０個の天然のアミノ酸によって提供される主要な側鎖化学を代表する９つのアミノ酸を選択して、抗体の６つ全てのＣＤＲ中のあらゆる位置における結合への官能性側鎖の寄与を分析する。ＬＴＭは、ＣＤＲ内に一連の位置的な単一突然変異を生じ、それぞれの「野生型」残基が、９個の選択されたアミノ酸のうちの１つで系統的に置換される。突然変異ＣＤＲを組み合わせて、全ての変異体の定量的提示を妨げることなく複雑性およびサイズが増加する、コンビナトリアル一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ライブラリーを生成する。正の選択後、結合が改善されたクローンを配列決定し、有益な突然変異をマッピングする。同様に、この一般的概念は、本発明の方法および材料に容易に適合可能である。
【０１４２】
３．エラープローンＰＣＲ
エラープローンＰＣＲは、異なる選択ラウンド間の核酸のランダム化を含む。このランダム化は、使用するポリメラーゼの固有エラー率によって低い率で生じるが、転写時の高い固有エラー率を有するポリメラーゼ（Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２２６：８８９−９６（１９９２））を用いたエラープローンＰＣＲによって増進することができる（Ｚａｃｃｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２８５：７７５−７８３（１９９９））。突然変異サイクル後、本発明の方法および材料を使用して、抗原に対する親和性が改善されたクローンを選択する。
【０１４３】
４．遺伝子部位飽和突然変異誘発（ＧＳＳＭ）
ＧＳＳＭは、所定のコドン位置における全ての可能な塩基トリプレットの導入を含み、それによって標的位置に２０個全てのアミノ酸交換を含むライブラリーの形成をもたらす（Ｋｒｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．  ３８８：３−１１（２００４））。これは、縮重突然変異誘発プライマーを用いて遺伝子レベルで実現される。続いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＣＲ増幅を用いて、元の遺伝子の完全な飽和に必要な全てのコドン変異を有する遺伝子のライブラリーを生成する。
【０１４４】
５．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ（商標）（ＴＡＥ、標的化親和性成熟）
ＴＡＥは、終止コドンを含み、システインおよびメチオニンを含まない１８個のアミノ酸残基と等しい提示をコードする縮重コドンの使用を含む。縮重コドンは、それぞれ集合的に１８個のアミノ酸残基をコードし、１つまたは複数のアミノ酸残基の過剰提示をもたらし得るいかなる冗長性も排除する。結果として、この方法は、対象位置に１８個のアミノ酸置換を含む、より小さい、集中的なライブラリーの生成を可能にする（国際公開第ＷＯ０９／０８８９３３号）。この一般的概念は、本発明の方法および材料に容易に適合可能である。
【０１４５】
６．ＤＮＡシャフリング
核酸シャフリングは、より短いまたは小さいポリヌクレオチドのプールをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで相同組み換えして、変異体ポリヌクレオチドを生成するための方法である。ＤＮＡシャフリングは、米国特許第６，６０５，４４９号、米国特許第６，４８９，１４５号、国際公開第ＷＯ０２／０９２７８０号、およびＳｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，９１：１０７４７−５１（１９９４）に記載されている。一般に、ＤＮＡシャフリングは、３つのステップ：（１）ＤＮａｓｅ  Ｉによるシャッフルすべき遺伝子の断片化、（２）断片のランダムハイブリダイゼーション、およびＤＮＡポリメラーゼの存在下でのＰＣＲ（セクシャルＰＣＲ）による断片化された遺伝子の再組み立てまたはフィリング、ならびに、（３）再組み立てされた産物の従来のＰＣＲによる増幅、からなる。
【０１４６】
ＤＮＡシャフリングは、逆の連鎖反応であるという点でエラープローンＰＣＲとは異なる。エラープローンＰＣＲでは、ポリメラーゼ開始部位の数および分子の数が、指数関数的に増加する。対照的に、ランダムポリヌクレオチドの核酸再組み立てまたはシャフリングでは、開始部位の数およびランダムポリヌクレオチドの数（サイズではない）は、経時的に減少する。
【０１４７】
抗体の場合、ＤＮＡシャフリングは、例えば、全てのＣＤＲ１と全てのＣＤＲ２と全てのＣＤＲ３との自由な組み合わせ関係を可能にする。複数の配列ファミリーを、同じ反応でシャッフルできることが想定される。さらに、シャフリングは、例えば、ＣＤＲ２の位置にＣＤＲ１が見られなくなるように、一般に相対的順序を保存する。シャフラント（ｓｈｕｆｆｌａｎｔ）は、まれに多数の最良の（例えば、最高の親和性の）ＣＤＲを含み、これらの希少なシャフラントをその優れた親和性に基づいて選択することができる。
【０１４８】
ＤＮＡシャフリングで使用可能な鋳型ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。それらは、組み換えまたは再組み立てを行う遺伝子またはより短いもしくは小さいポリヌクレオチドのサイズに応じて、様々な長さであってもよい。好ましくは、鋳型ポリヌクレオチドは、５０ｂｐ〜５０ｋｂである。鋳型ポリヌクレオチドは、多くの場合二本鎖であるべきである。
【０１４９】
遺伝子選択の最初のステップにおいて、鋳型ポリヌクレオチドと同一の領域および鋳型ポリヌクレオチドと異種の領域を有する一本鎖または二本鎖の核酸ポリヌクレオチドを、鋳型ポリヌクレオチドに付加してもよいことが想定される。また、２つの異なるが関連するポリヌクレオチド鋳型を最初のステップにおいて混合してよいことも想定される。これらの技術は、本発明の方法および材料に容易に適合可能である。
【０１５０】
Ｉ．変更されたグリコシル化
本発明により有用な抗体変異体には、親抗体と比較して改変されたグリコシル化パターン、例えば、この抗体中に認められる１つまたは複数の炭水化物部分の欠失、および／またはこの抗体中に存在しない１つまたは複数のグリコシル化部位の付加を有する抗体が含まれる。
【０１５１】
抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖との炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的グリコシル化部位が生じる。したがって、Ｎ結合型グリコシル化部位は、これらのトリペプチド配列のうちの１つまたは複数を含むようにアミノ酸配列を変更することによって、抗体に付加することができる。Ｏ結合型グリコシル化とは、糖類であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つと、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的にはセリンまたはトレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用可能である）との結合を指す。Ｏ結合型グリコシル化部位は、元の抗体の配列に、１つまたは複数のセリンもしくはトレオニン残基を挿入または置換することによって、抗体に付加することができる。
【０１５２】
また、改善されたＡＤＣＣ活性を示す、フコシル化が不在または減少した抗体分子も本発明により想定される。これを達成するための様々な方法が、当分野で既知である。例えば、ＡＤＣＣエフェクター活性は、抗体分子のＦｃγＲＩＩＩ受容体との結合によって媒介され、これはＣＨ２ドメインのＡｓｎ−２９７におけるＮ結合型グリコシル化の糖鎖構造に依存することが示されている。非フコシル化抗体は、向上した親和性でこの受容体に結合し、天然のフコシル化抗体よりも効果的にＦｃγＲＩＩＩ媒介エフェクター機能を誘発する。例えば、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ酵素を欠損させたＣＨＯ細胞における非フコシル化抗体の組み換え産生は、ＡＤＣＣ活性が１００倍に増加した抗体を生じる（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ８７：６１４−２２（２００４））。同様の効果は、例えばｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ処理によってこの酵素またはフコシル化経路の他の酵素の活性を減少させることによって、細胞系を操作して酵素を欠損させることによって、または選択的グリコシル化阻害剤とともに培養することによっても達成することができる（Ｒｏｔｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２６：１１１３−２３（１９８９））。一部の宿主細胞株、例えばＬｅｃ１３またはハイブリドーマＹＢ２／０細胞系は、より低いフコシル化レベルの抗体を自然に生成する（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７７：２６７３３−４０（２００２）、Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７８：３４６６−７３（２００３））。ＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現する細胞中で組み換えによって抗体を産生することによる分岐炭水化物のレベルの上昇も、ＡＤＣＣ活性を増加させることが確認されている（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １７：１７６−８０（１９９９））。２つのフコース残基のうちの１つのみの不在が、ＡＤＣＣ活性を増加させるのに十分であり得ると予測されている（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ９３：８５１−６１（２００６））。
【０１５３】
Ｊ．標識
一部の実施形態において、細胞および／またはポリペプチド結合剤は、それらの検出を容易にするために標識する。「標識」または「検出可能部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的手段によって検出可能な組成物である。例えば、本発明における使用に好適な標識には、放射性標識（例えば、３２Ｐ）、フルオロフォア（例えば、フルオレセイン）、電子密度の高い試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般的に使用されるようなもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、ならびに例えばハプテンまたはペプチドに放射性標識を組み込むことによって検出可能にすることができるか、またはそのハプテンまたはペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用可能なタンパク質がある。
【０１５４】
本発明における使用に好適な標識の例には、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡで一般的に使用される他の酵素）、および比色標識、例えばコロイド金、着色ガラス、またはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５５】
標識は、当分野で周知の方法によるアッセイの所望の成分に直接的または間接的に結合させてよい。好ましくは、一実施形態における標識は、本発明による作用物質のコンジュゲート化のためのイソシアネート試薬を用いてバイオポリマーに共有結合させてもよい。本発明の一態様では、本発明の二官能性イソシアネート試薬を使用して、標識をバイオポリマーとコンジュゲートして、作用物質をそれに結合させずに、標識バイオポリマーコンジュゲートを形成することができる。標識バイオポリマーコンジュゲートは、本発明による標識されたコンジュゲートの合成のための中間体として使用してもよく、あるいはバイオポリマーコンジュゲートを検出するのに使用してもよい。前述のように、多種多様な標識を使用することができ、この標識の選択は、要求される感度、アッセイの所望の成分とのコンジュゲート化の容易性、安定性要件、利用可能な器具、および処理規定に依存する。非放射性標識は、間接的手段によって結合されることが多い。一般に、リガンド分子（例えば、ビオチン）が、その分子に共有結合される。次にそのリガンドを本質的に検出可能であるか、または例えば検出可能な酵素、蛍光化合物、もしくは化学発光化合物などのシグナル系に共有結合した別の分子（例えば、ストレプトアビジン）分子に結合する。
【０１５６】
また、本発明により有用なポリペプチド結合剤は、例えば、酵素またはフルオロフォアとのコンジュゲート化によって、シグナル生成化合物と直接コンジュゲートしてもよい。標識としての使用に好適な酵素には、ヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼ、およびグリコシダーゼ、またはオキシドターゼ（ｏｘｉｄｏｔａｓｅ）、特にペルオキシダーゼが含まれるが、これらに限定されない。標識としての使用に好適な蛍光化合物、すなわち、フルオロフォアには、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが含まれるが、これらに限定されない。好適なフルオロフォアのさらなる例には、エオシン、ＴＲＩＴＣ−アミン、キニーネ、フルオレセインＷ、アクリジンイエロー、リサミンローダミン、Ｂスルホニルクロリドエリスロセイン、ルテニウム（トリス、ビピリジニウム）、テキサスレッド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチドなどが含まれるが、これらに限定されない。標識としての使用に好適な化学発光化合物には、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノールが含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法で使用可能な種々の標識系およびシグナル生成系の概説については、米国特許第４，３９１，９０４号を参照されたい。
【０１５７】
標識を検出するための手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、標識が放射性である場合、検出のための手段には、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーで使用する写真フィルムが含まれる。標識が蛍光標識である場合、適切な波長の光で蛍光色素を励起し、その結果生じた蛍光を検出することによって、この標識を検出することができる。蛍光は、視覚的に、あるいは電子検出装置、例えば電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管などの使用などによって検出することができる。同様に、酵素標識は、その酵素に適切な基質を提供し、その結果生じた反応生成物を検出することによって検出することができる。比色標識または化学発光標識は、単に標識に関連する色を観察することによって検出することができる。本発明の方法における使用に好適な他の標識および検出系は、当業者に容易に認識されるであろう。このような標識されたモジュレーターおよびリガンドは、疾患または健康状態の診断に使用することができる。
【０１５８】
前述の発明は理解を明確にする目的で詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲の範囲内で特定の変更を行ってもよいことは明らかであろう。本明細書で引用する全ての刊行物および特許文献は、それぞれが個別に参照により援用されることが示されているのと同様に、参照により全体があらゆる目的で援用される。以下の実施例は、説明の目的で提供するものであり、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【０１５９】
実施例１
一般的な材料および方法
酵素、抗体、および組み換えタンパク質
制限エンドヌクレアーゼおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼをＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から購入した。ＫＯＤ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ポリメラーゼ（ＥＭＤ４Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）を用いてＰＣＲを実施した。フローサイトメトリー用の抗体をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手した。組み換えヒトＩＬ−１βをＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）から購入し、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳビオチン標識キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用い、製造業者の使用説明に従ってビオチンで標識した。
【０１６０】
酵母クローンおよび株
酵母クローンＹＮＲ０４４Ｗ（ＡＧＡ１）およびＹＧＬ０３２Ｃ（ＡＧＡ２）は、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）から購入し、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＪ５４６５は、ＡＴＣＣから入手した。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＥＢＹ１００は、Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５，５５３−５５７（１９９７）に記載されている。
【０１６１】
培地および緩衝液
ＳＤＣＡＡ培地：３８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、７１ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２％（ｗ／ｖ）Ｄ−デキストロース、０．６７％（ｗ／ｖ）酵母窒素ベース、０．５％（ｗ／ｖ）カザミノ酸、ｐＨ７．５。
【０１６２】
ＳＧＣＡＡ培地：ＳＤＣＡＡと同様であるが、Ｄ−デキストロースの代わりにガラクトースを使用。
【０１６３】
ＳＤＣＡＡおよびＳＧＣＡＡの両培地、トリプトファン、ウラシル、およびリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）は、ＴＥＫｎｏｖａ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）から購入した。フローサイトメトリー用の洗浄緩衝液は、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むフィルター滅菌したＰＢＳからなる。
【０１６４】
トランスフェクション培地：４ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＨｙＣｌｏｎｅ  ＳＦＭＴｒａｎｓｆｘ−２９３  Ｍｅｄｉａ。
【０１６５】
成長培地：ＨｙＣｌｏｎｅ  ＳＦＭＴｒａｎｓｆｘ−２９３  Ｍｅｄｉａ、１０％（ｗ／ｖ）ＨｙＣｌｏｎｅ  ＦＢＳ、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および２５０μｇ／ｍＬ  ジェネテシン。
【０１６６】
ＨｙＣｌｏｎｅ  ＳＦＭＴｒａｎｓｆｘ−２９３培地およびＦＢＳは、ともにＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から購入し、Ｌ−グルタミンおよびジェネテシンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。
【０１６７】
酵母形質転換および成長
Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を用いて、化学的にコンピテントな酵母細胞を調製した。形質転換した細胞をデキストロース培地プレート上で、３０℃で７２時間成長させた。次に、単離したコロニーを振盪（２５０ｒｐｍ）しながら３０℃で１６時間、培養物として成長させた。デキストロース培地をガラクトース培地に交換し、細胞を２０時間成長させて抗体発現を誘導した。
【０１６８】
哺乳動物細胞トランスフェクションおよび成長
２０マイクログラムのプラスミドＤＮＡを１ｍＬのトランスフェクション培地中の２０μｇのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）とともに、室温で２５分間インキュベートした。次に、この混合物を２０ｍＬのトランスフェクション培地中の１．６×１０７のヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｅ細胞に滴下添加した。次に、細胞を５％ＣＯ２および振盪（９５ｒｐｍ）下、３７℃で成長させた。４日後にフローサイトメトリー分析用に、７日後にタンパク質発現および精製用に細胞を収集した。可溶性ＩｇＧを精製するために、トランスフェクト細胞を遠心分離し（３２００ｒｐｍ、１０分間、４℃）、馴化培地を除去し、２００μＬのタンパク質ＡセファロースＣＬ−４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｗａｕｋｅｓｈａ，ＷＩ）とともに、室温で２時間または４℃で１６時間インキュベートした。この樹脂をＰＢＳで洗浄し、７００μＬの溶出緩衝液（０．２Ｍ  グリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．５）とともにインキュベートした後、中和緩衝液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０）を添加した。次いで、精製したＩｇＧを４℃で１６時間ＰＢＳに透析し、ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度を分析した。
【０１６９】
フローサイトメトリー
２００万個の酵母細胞または５×１０４のＨＥＫ２９３細胞を洗浄緩衝剤で洗浄した後、ビオチン標識ＩＬ−１β（１００ｎＭ）およびニワトリ抗ｃ−Ｍｙｃ（４μｇ／ｍＬ）とともに室温で１時間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＰＥ）（１０μｇ／ｍＬ）、抗ニワトリＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲート（２０μｇ／ｍＬ）、および抗血球凝集素（ＨＡ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲート（１０μｇ／ｍＬ）とともに、氷上、遮光下で３０分間インキュベートした。次いで、Ｃ６フローサイトメーター（Ａｃｃｕｒｉ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）またはＦＡＣＳｃａｎ機器（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）のいずれかで分析する前に、細胞を最後にもう１度洗浄した。典型的には、１試料当たり１０，０００事象を採取した。その後の分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて実施した。
【０１７０】
実施例２
ベンチマークとしてのＡｇａ２融合体提示ベクターの構築
ＧＡＬ１プロモーター、Ａｇａ２シグナルペプチドをコードするＤＮＡ（１〜１８）、クローニングのためのＢａｍＨＩ制限部位、ｃ−ＭｙｃエピトープタグをコードするＤＮＡ、成熟Ａｇａ２タンパク質をコードするＤＮＡ（１９〜８７）、ＭＡＴα転写ターミネーター、ＴＲＰ１遺伝子、ＣＥＮ６／ＡＲＳＨ４起点、ＡＭＰ耐性遺伝子、およびｐＵＣ細菌起点を含むベクターｐＴａｍ１４をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成した。
【０１７１】
ビオチン標識ＩＬ−１βに対する抗体ファージ提示ライブラリーの可溶性パニングを３ラウンド行った後、そのクローンであるＸＰＡ２８  ｓｃＦｖを特定した。配列決定により、ＸＰＡ２８  ｓｃＦｖが、ＶＨ３およびＶＬ１ファミリーに相当する重鎖およびラムダ軽鎖を有することが明らかになった。ＸＰＡ２８  ｓｃＦｖをベクターｐＸＨＭＶにサブクローニングし（ＲｏｎｄｏｎらのＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１０／０４００７３号）、このときｓｃＦｖをエピトープタグ６ｘ  Ｈｉｓ、ｃ−Ｍｙｃ、Ｖ５、およびバクテリオファージ由来のｐＩＩＩとインフレームで融合する。
【０１７２】
ベクターｐＴａｍ１５を、まず、順方向プライマー
2014504503.tif 000016
および逆方向プライマー
2014504503.tif 000017
を用いて、プラスミドｐＸＨＭＶ／ＸＰＡ２８  ｓｃＦｖからＸＰＡ２８  ｓｃＦｖをＰＣＲ増幅することによって構築し、ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、アクセプターベクターｐＴａｍ１４も同様に消化した。その断片とベクターを連結し、その結果ベクターｐＴａｍ１５（図１）を生じた。
【０１７３】
実施例３
ＮｏｒｐＡテザー提示系のためのベクター構築
ベクターｐＴａｍ１６を、まずＩｎａＤのＰＤＺ１  ドメイン（１１〜１０７）を合成し、次にその断片を
2014504503.tif 000018
を用いてＰＣＲ増幅することによって構築した。増幅した断片およびｐＴａｍ１４の双方をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、これらを連結して、その結果ベクターｐＴａｍ１６（図２）を生じた。
【０１７４】
ベクターｐＴａｍ２１を以下のように構築した。ｐＸＨＭＶ／ＸＰＡ２８  ｓｃＦｖ中のＶ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）をコードするＤＮＡを、ＮｏｒｐＡのＣ末端７残基（ＧＫＴＥＦＣＡ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）からなるＮｏｒｐＡテザーをコードするＤＮＡ（１０８９〜１０９５）で置換した。これは、変異プライマーである
2014504503.tif 000019
を用いて、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的突然変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）によって実施した。Ｈｉｓ６、ｃ−ｍｙｃタグ、およびＮｏｒｐＡを含むＸＰＡ２８  ｓｃＦｖに対応するＤＮＡを、
2014504503.tif 000020
プライマーを用いて増幅し、ＮｈｅＩおよびＰｍｅＩで消化し、ＮｈｅＩ／ＰｍｅＩ消化ｐＴａｍ１４中に連結した。
【０１７５】
変異プライマーである
2014504503.tif 000021
を用い、プラスミドｐＴａｍ１６のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）突然変異誘発によって、ベクターｐＴａｍ２７を構築した。これによりサイレント突然変異を導入し、Ａｇａ２シグナルペプチド内のＮｈｅＩ制限部位を削除した。
【０１７６】
ベクターｐＴａｍ２８を以下のように構築した。鋳型としてのｐＴａｍ２１、
2014504503.tif 000022
プライマーを用いて、Ａｇａ２シグナルペプチド、ＸＰＡ２８  ｓｃＦｖ、Ｈｉｓ６タグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＮｏｒｐＡテザー、およびＭＡＴαターミネーターに対応するＤＮＡをＰＣＲ増幅した。鋳型としてのｐＴａｍ２７、
2014504503.tif 000023
プライマーを用いて、Ｇａｌ１プロモーター、Ａｇａ２シグナルペプチド、ＩｎａＤ  ＰＤＺ１、およびｃ−Ｍｙｃタグに対応するＤＮＡをＰＣＲ増幅した。これら２つのＰＣＲ断片は、相同な３０塩基対を含み、オーバーラップＰＣＲ伸長を用いて結合した。簡潔に述べると、これらの２つの断片（それぞれ１００ｎｇ）の混合物に、最終伸長ステップで休止する前に６サイクルにわたる加熱サイクルを実施した（７０℃）。続いて、最も外側のプライマー（Ｔａｍ８９およびＴａｍ９２）を最終濃度３００ｎＭまで添加し、さらに２６サイクルにわたり反応を継続させた。結合した断片（２１２７塩基対）に対応するＤＮＡバンドをゲル精製し、ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、アクセプターベクターｐＴａｍ１４も同様にした。続いてその断片とベクターを連結し、その結果ベクターｐＴａｍ２８（図３）を生じた。
【０１７７】
実施例４
ＮｏｒｐＡテザー提示系の構築および検証
ＥＢＹ１００細胞をｐＴａｍ１５、１６、および２８で形質転換し、ＳＤＣＡＡ培地で成長させた。単一コロニーを成長させ、ＳＧＣＡＡ培地で誘導した。フローサイトメトリー分析のために、実施例１に記載のように細胞を洗浄し、標識した。図４Ａに示すように、ＮｏｒｐＡテザー系を用いたＸＰＡ２８  ｓｃＦｖ（ｐＴａｍ２８）を提示する細胞は、ＩＬ−１βに結合し、ＰＥ蛍光およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７蛍光によって観察されるｃ−Ｍｙｃ染色が陽性である。しかしながら、抗原結合およびｓｃＦｖ発現は、ｃ−ＭｙｃエピトープタグがＸＰＡ２８  ｓｃＦｖとＩｎａＤ  ＰＤＺ１との双方のカルボキシル末端に存在することから、直接的相関ではない。Ａｇａ２融合体としてＸＰＡ２８  ｓｃＦｖ（ｐＴａｍ１５、図４Ｂ）を提示する細胞と比較すると、ＮｏｒｐＡテザー系によるＩＬ−１β結合の量はより低い。対照として、ＩｎａＤ  ＰＤＺ１のみ（ｐＴａｍ１６）を発現する細胞は、ＩＬ−１βに結合しない（図４Ｃ）。次に、ｐＴａｍ１５および２８を発現する細胞を漸増濃度のビオチン標識ＩＬ−１β（１６．９ｐＭ〜１μＭ）とともにインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。各試料の平均ＰＥ蛍光を測定し、全体に占める割合として算出した。次に、これをＩＬ−１β濃度に対してプロットし、最大半量（ＥＣ５０）における濃度として解離定数（ＫＤ）を決定した。図５に示すように、２つの提示系を用いたＸＰＡ２８  ｓｃＦｖによるＩＬ−１β結合のＫＤは類似しており、これはＮｏｒｐＡテザー系（ｐＴａｍ２８）で９．２ｎＭ、Ａｇａ２融合体提示（ｐＴａｍ１５）で２０．５ｎＭであり、この種の分析の誤差の範囲内であった（Ｃｈａｏ，Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６）。これらの結果は、ＩＬ−１βに対するＸＰＡ２８の親和性が、ＮｏｒｐＡテザー系において損なわれていないことを示唆している。むしろ、Ａｇａ２融合体提示（図４Ｂ）と比較して、ＮｏｒｐＡテザー系を用いて観察されたより低いレベルの抗原結合（図４Ａ）は、細胞表面に見られるｓｃＦｖの総レベルの減少に起因する可能性がある。最後に、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定した場合、ＮｏｒｐＡテザー系を用いて測定されたＫＤは、ＩｇＧ１として再編成された可溶性ＸＰＡ２８のＫＤと十分一致している（１５．１±４．５ｎＭ）。
【０１７８】
ベクターｐＴａｍ１８を以下のように構築した。Ａｇａ２シグナルペプチドをコードするＤＮＡ（１〜１８）、ＸＰＡ２８  ｓｃＦｖ、ｃ−Ｍｙｃタグ、グリシンセリンリンカー、およびＡｇａ２（１９〜８７）からなるＤＮＡ断片を４つのより小さい断片を用いてオーバーラップ伸長ＰＣＲにより生成した。まず、Ａｇａ２シグナルペプチドに対応するオリゴを合成し
2014504503.tif 000024
、順方向プライマーおよび逆方向プライマー（それぞれ、
2014504503.tif 000025
）を用いてＰＣＲ増幅した。
2014504503.tif 000026
プライマーを用いたＰＣＲ増幅の鋳型として、ベクターｐＸＨＭＶ／ＸＰＡ２８  ｓｃＦｖを使用した。ｃ−Ｍｙｃエピトープタグおよびグリシンセリンリンカーに対応するオリゴを合成し
2014504503.tif 000027
、順方向プライマーおよび逆方向プライマー（それぞれ、
2014504503.tif 000028
）を用いてＰＣＲ増幅した。
2014504503.tif 000029
プライマーを用いて、ＹＧＬ０３２Ｃ（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）から成熟Ａｇａ２タンパク質（１９〜８７）を増幅した。これら４つの断片を別個にゲル精製し、プライマーＲｂｓＡｇａ２ＳＳ  ２およびＡｇａ２  ２を用いて、実施例１に記載のようにオーバーラップ伸長ＰＣＲにより結合した。４つ全ての断片のサイズに相当する単一断片（１２０９塩基対）をゲル精製し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）クローニング（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて、ＳａｃＩ／ＰｍｅＩ消化ｐＹＣ２／ＣＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。
【０１７９】
ベクターｐＴａｍ３２を以下のように構築した。２つの断片を用いたオーバーラップ伸長ＰＣＲにより、ｃ−Ｍｙｃタグ、グリシンセリンリンカー、および成熟Ａｇａ１タンパク質（２３〜７２６）をコードするＤＮＡ断片を生成した。ｃ−Ｍｙｃタグおよびグリシンセリンリンカーに対応するオリゴを合成し
2014504503.tif 000030
、ＰＣＲ増幅を
2014504503.tif 000031
プライマーを用いて行った。
2014504503.tif 000032
プライマーを用いて、クローンＹＮＲ０４４Ｗ（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）からＡｇａ１ｐ（２３〜１７６）を増幅した。これらの２つの断片をゲル精製し、増幅のためのプライマーＴａｍ１５９およびＴａｍ１２２を用いて、オーバーラップ伸長ＰＣＲにより結合した。この結合断片およびｐＴａｍ１８の両者をＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｍｅＩで消化し、連結して、その結果ベクターｐＴａｍ３２（図６）を生じた。
【０１８０】
ＥＢＹ１００細胞およびＢＪ５４６５細胞をそれぞれｐＴａｍ１５および３２で形質転換した。ＳＤＣＡＡ（ＥＢＹ１００、ｐＴａｍ１５）または４０μｇ／ｍＬのトリプトファンを含むＳＤＣＡＡ（ＢＪ５４６５、ｐＴａｍ３２）のいずれかで成長させた後、形質転換体を特定した。次に液体培地で単一コロニーを成長させ、対応するガラクトース培地（ＳＧＣＡＡまたは４０μｇ／ｍＬのトリプトファンを含むＳＧＣＡＡ）で誘導した。フローサイトメトリー分析のために、実施例１に記載のように、細胞を洗浄し、標識し、分析した。図７に示すように、ＰＥ蛍光およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７蛍光により観察されるｐＴａｍ１５（Ａ）およびｐＴａｍ３２（Ｂ）形質転換細胞の抗原結合およびｃ−Ｍｙｃ染色特性は、極めて類似しており、Ａｇａ１が、ＸＰＡ２８  ｓｃＦｖの細胞壁アンカーとしてのＡｇａ２の好適な代替物であることを示している。
【０１８１】
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）突然変異誘発、ならびに
2014504503.tif 000033
プライマーを用いて、まずｐＴａｍ３２中のＵＲＡ３遺伝子とＣＥＮ６／ＡＲＳＨ４複製起点との間のＮｈｅＩ制限部位を排除することにより、ｐＴａｍ３４を構築した。得られたプラスミドｐＴａｍ３２ｂをＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、以下のインサートに対するアクセプターベクターとした。ＸＰＡ２８  ｓｃＦｖ、Ｈｉｓ６、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＮｏｒｐＡテザー、ＭＡＴαターミネーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＩｎａＤ  ＰＤＺ１、およびｃ−Ｍｙｃタグに対応するＤＮＡ断片をＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてｐＴａｍ２８から切り取った。このインサートとアクセプターベクターとを連結させ、その結果ベクターｐＴａｍ３４（図８）を生じた。
【０１８２】
ＥＢＹ１００細胞およびＢＪ５４６５細胞をそれぞれｐＴａｍ２８および３４で形質転換し、ＳＤＣＡＡ（ＥＢＹ１００、ｐＴａｍ２８）または４０μｇ／ｍＬのトリプトファンを含むＳＤＣＡＡ（ＢＪ５４６５、ｐＴａｍ３４）のいずれかで成長させた。フローサイトメトリー分析のための標識前に、細胞を対応するガラクトース培地（ＳＧＣＡＡまたは４０μｇ／ｍＬのトリプトファンを含むＳＧＣＡＡ）で誘導した。図９に示すように、ＰＥ蛍光およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７蛍光により観察されるｐＴａｍ２８（Ａ）およびｐＴａｍ３４（Ｂ）形質転換細胞の抗原結合およびｃ−Ｍｙｃ染色特性は、極めて類似していた。これは、Ａｇａ１が、ＩｎａＤ  ＰＤＺ１を酵母細胞壁に固定するという点で、Ａｇａ２の好適な代替物となったことを示している。
【０１８３】
ｐＴａｍ３５を以下のように構築した。血球凝集素（ＨＡ）エピトープ
2014504503.tif 000034
に相当するＤＮＡ配列
2014504503.tif 000035
を合成し、
2014504503.tif 000036
プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。増幅したインサートは、ＩｎａＤ  ＰＤＺ１のカルボキシル末端で、ｃ−Ｍｙｃタグの５'側および３'側に隣接する配列と相同な領域を含む。プラスミドｐＴａｍ３４をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、インサートをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）クローニングを用いてクローニングした。ｐＴａｍ３５のベクターマップに示すように、ＩｎａＤ  ＰＤＺ１に融合されたｃ−Ｍｙｃエピトープタグは、ここではＨＡタグに置換されている（図１０）。
【０１８４】
ＢＪ５４６５細胞をｐＴａｍ３５で形質転換し、４０μｇ／ｍＬのトリプトファンを含むＳＤＣＡＡで成長させ、４０μｇ／ｍＬのトリプトファンを含むＳＧＣＡＡで誘導してから標識した。非誘導細胞および誘導細胞の両者をフローサイトメトリーで分析した（図１１）。図１１に示すように、ＰＥ蛍光およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８蛍光により評価したとき、誘導細胞（白抜き）は、非誘導細胞（グレー塗りつぶし）と比較して、ＩＬ−１βに結合し（Ａ）、ＩｎａＤ  ＰＤＺ１を発現する（Ｃ）。しかしながら、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７蛍光により観察したとき、ｓｃＦｖは検出されなかった（Ｂ）。細胞がＩＬ−１βに結合したため、このことは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７蛍光の欠如が、ｃ−Ｍｙｃ抗体がこのエピトープタグに結合できないことによるものであり、ｓｃＦｖ発現の欠如によるものではないことを示している。発明者らは、ＮｏｒｐＡテザーとＩｎａＤ  ＰＤＺ１との複合体形成が、ｃ−Ｍｙｃ抗体とタグとの結合を妨げ得るとさらに仮定した。この問題に取り組むために、ｃ−Ｍｙｃエピトープタグが一次配列においてＮｏｒｐＡテザーからさらに離れた、ベクターｐＴａｍ３７を構築した。
【０１８５】
まず、
2014504503.tif 000037
プライマーを用いて、ベクターバックボーンのｐＴａｍ３５を増幅することにより、ベクターｐＴａｍ３７を構築した。ｃ−Ｍｙｃ、Ｈｉｓ６、およびＮｏｒｐＡテザーに、この特定の順序で対応するＤＮＡ断片
2014504503.tif 000038
を合成し、
2014504503.tif 000039
プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。増幅した断片は、増幅したバックボーンと相同な１８塩基対を含み、これはＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）を用いたクローニングを可能にした。図１２に示すように、ｐＴａｍ３７は、ここではｃ−ＭｙｃタグがＨｉｓ６タグに先行するという点でｐＴａｍ３５と異なる。
【０１８６】
ＢＪ５４６５細胞をｐＴａｍ３７で形質転換し、４０μｇ／ｍＬのトリプトファンを含むＳＤＣＡＡで成長させ、４０μｇ／ｍＬのトリプトファンを含むＳＧＣＡＡで誘導してから標識した。非誘導細胞および誘導細胞の両者をフローサイトメトリーで分析した。図１３に示すように、誘導細胞（白抜き）は、ＩＬ−１βに結合し（Ａ）、ＩｎａＤ  ＰＤＺ１を発現する（Ｂ）が、非誘導細胞（グレー塗りつぶし）はそうではない。ｐＴａｍ３７（図１３Ｂ）とｐＴａｍ３５（図１１Ｂ）とのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７蛍光の比較は、おそらく２つのベクター間のタグアクセス性の差によると思われる、ｃ−Ｍｙｃエピトープタグの検出における著しい差を示している。これらの結果を考慮して、小さい非免疫ｓｃＦｖライブラリーを構築するためのベクターとして、プラスミドｐＴａｍ３７を選択した。
【０１８７】
実施例５
哺乳動物細胞上のＩｇＧのＮｏｒｐＡテザー提示
ベクター構築過程におけるタンパク質発現を評価するためのモデル抗体として、ＩｇＧ１抗体である抗ＫＬＨ８を使用した。抗ＫＬＨ８の重鎖全体に対応するＤＮＡをＫＬＨ８−ＨＣ−Ｘｂａ１順方向プライマー
2014504503.tif 000040
およびＫＬＨ８−ＨＣ−Ｎｏｔ１逆方向プライマー
2014504503.tif 000041
を用いてＰＣＲ増幅し、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩを用いた制限部位クローニングにより、ｐＩＲＥＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）中に連結した。次にこのプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、ＩＲＥＳ１の代わりに合成ＩＲＥＳ２配列（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）をクローニングした。次に、ＩＲＥＳ２配列および抗ＫＬＨ８  ＨＣをＩＲＥＳ２  Ｘｈｏ１順方向プライマー
2014504503.tif 000042
およびＸｈｏ１−ＫＬＨ８  ＨＣ逆方向プライマー
2014504503.tif 000043
を用いてＰＣＲ増幅した。増幅した断片をＸｈｏＩで消化し、単一ＸｈｏＩ部位に定常ラムダ（Ｃλ）軽鎖（ＸＯＭＡ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ；国際出願第ＷＯ０６／０６０７６９号）および抗ＫＬＨ８  ＶＬを含む一過性発現ベクターであるアクセプターベクターｐＭＸＴ１３／抗ＫＬＨ８  ＶＬにクローニングした。抗ＫＬＨ８  ＬＣおよびＨＣがそれぞれＣＭＶプロモーターおよびＩＲＥＳ２によって調節される得られたベクターｐＸＩＢＭ−ＩＲＥＳ２は、これで単一ベクターからの完全なＩｇＧの発現を可能にする。次に、抗ＫＬＨ８  ＬＣに先行するＩｇＧリーダーペプチドをＵＳ２シグナルペプチド（米国特許第７，０９４，５７９号）に置き換えた。ＵＳ２シグナルペプチド、抗ＫＬＨ８  ＬＣ、およびＩＲＥＳ２からなるＤＮＡ断片を２ステップＰＣＲ反応により生成した。一次ＰＣＲ反応は、ＵＳ２配列（ＵＳ２−ＫＬＨ８  ＬＣ順方向プライマー：
2014504503.tif 000044
および逆方向プライマー（ＩＲＥＳ２−ＰｍｌＩ逆方向プライマー：
2014504503.tif 000045
を含む伸長した順方向プライマーを用いた、抗ＫＬＨ８  ＬＣおよびＩＲＥＳ２の増幅からなった。上記の逆方向プライマーおよび第２の順方向プライマー（Ｓａｌ１−ＵＳ２順方向プライマー：
2014504503.tif 000046
を用いた二次ＰＣＲ反応を実施して、ＵＳ２シグナル配列を完成し、クローニングのためのＳａｌＩ部位を付加した。次に、ＰＣＲ断片をＳａｌＩおよびＰｍｌＩ部位を用いた制限部位クローニングによりｐＸＩＢＭ−ＩＲＥＳ２にクローニングし、その結果ベクターｐＸＩＢＭ−ＵＳ２−ＩＲＥＳ２を生じた。最後に、抗ＫＬＨ８  ＬＣおよびＨＣを対応するＸＰＡ２８の可変領域に置き換えた。Ｓｆｉ１−ＶＬ順方向プライマー
2014504503.tif 000047
、ＶＬ  ＡｖｒＩＩ逆方向プライマー
2014504503.tif 000048
、Ｎｃｏ１−ＶＨ順方向プライマー
2014504503.tif 000049
、およびＶＨ  Ｎｈｅ１逆方向プライマー
2014504503.tif 000050
を用いて、鋳型ｐＸＨＭＶ／ＸＰＡ２８  ｓｃＦｖからＸＰＡ２８  ＬＣおよびＨＣを増幅した。ＸＰＡ２８のＬＣおよびＨＣをそれぞれＳｆｉＩ／ＡｖｒＩＩおよびＮｃｏＩ／ＮｈｅＩ制限酵素対を用いた制限部位クローニングにより、ｐＸＩＢＭ−ＵＳ２−ＩＲＥＳ２に挿入した。得られたベクターｐＸＩＢＭ１４（図１４Ａ）は、ＩｇＧ１のＣλ領域およびＣＨ１−３領域とそれぞれインフレームで融合したＸＰＡ２８のＶＬおよびＶＨを特徴とする。ｐＸＩＢＭ１４で一過性にトランスフェクトした細胞は、可溶性ＸＰＡ２８  ＩｇＧを発現し、これをタンパク質Ａセファロースで精製した。ＨＣおよびＬＣの電気泳動移動度は、ＸＰＡ２８  ｓｃＦｖが全長抗体（ＸＰＡ２８  ＩｇＧ）（図１４Ｂ）として正しく再構成されたことを予想通り示していた。
【０１８８】
細胞表面にＸＰＡ２８  ＩｇＧを提示するために、重鎖のカルボキシル末端にＮｏｒｐＡテザーを融合した。順方向プライマーＮｈｅ１−ＨＣ  Ｆｗｄ
2014504503.tif 000051
と、３つの逆方向プライマー（Ｘｈｏ１−ＰＤＺ−ＮｏＡＡ  Ｒｅｖ：
2014504503.tif 000052
、３アミノ酸スペーサー（Ｘｈｏ１−ＰＤＺ−３ＡＡ  Ｒｅｖ：
2014504503.tif 000053
、および５アミノ酸結合スペーサー（Ｘｈｏ１−ＰＤＺ−５ＡＡ  Ｒｅｖ：
2014504503.tif 000054
のうちの１つとを用いて、ｐＴａｍ３７からＮｏｒｐＡテザーをＰＣＲ増幅して、スペーサーが結合していないテザーを生成した。
【０１８９】
これら３つの異なるＮｏｒｐＡテザーＰＣＲ断片をｐＸＩＢＭ１４のＮｈｅ１制限部位およびＸｈｏ１制限部位にクローニングして、結果としての３つのベクター：ＣＨ３とＮｏｒｐＡテザーとの間にスペーサーを含まないｐＸＩＢＭ３２；３アミノ酸スペーサー（ＧＡＡ）を含むｐＸＩＢＭ３４；および５アミノ酸スペーサー（ＧＧＧＧＳ）を含むｐＸＩＢＭ３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）を生成し、これらを図１５に示す。
【０１９０】
ベクターｐＴａｍ２９を以下のように構築した。ＩｇＧリーダーペプチド、ＩｎａＤ  ＰＤＺ１、ｃ−Ｍｙｃエピトープ、グリシンセリンリンカー、および血小板由来成長因子受容体β（ＰＤＧＦＲ−β）の膜貫通ドメインをコードするＤＮＡ断片を２つの断片を用いたオーバーラップ伸長ＰＣＲにより生成した。
2014504503.tif 000055
プライマーを用いて、ＩｎａＤ  ＰＤＺ１に対応するＤＮＡをＰＣＲ増幅した。
2014504503.tif 000056
プライマーを用いて、プラスミドであるｐＤｉｓｐｌａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から、ＰＤＧＦＲ−βの４９アミノ酸膜貫通ドメイン（５１３〜５６１）をＰＣＲ増幅した。これら２つの断片をゲル精製し、プライマーのＴａｍ９９
2014504503.tif 000057
およびＴａｍ１００
2014504503.tif 000058
を用いて、オーバーラップ伸長ＰＣＲにより結合した。結合した断片およびアクセプターベクターｐＭＸＴ３２（ＸＯＭＡ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ；国際公開第ＷＯ０６／０６０７６９号）の双方をＢｓｍＩおよびＸｈｏＩで消化し、これらを連結して、その結果ベクターｐＴａｍ２９（図１５Ｂ）を生じた。
【０１９１】
ＨＥＫ２９３Ｅ細胞を実施例１に記載のようにトランスフェクトした。トランスフェクションの９６時間後、フローサイトメトリーにより、ＩＬ−１β結合およびＩｎａＤ  ＰＤＺ１発現について細胞を分析した（図１６）。対照として、ｐＸＩＢＭ１４でトランスフェクトした細胞は、ＩＬ−１βおよびｃ−Ｍｙｃ染色の双方について陰性であった（Ａ）。予想通り、ｐＴａｍ２９でトランスフェクトした細胞は、ｃ−Ｍｙｃのみについて陽性であった（Ｂ）。対照的に、ｐＸＩＢＭ３２およびｐＴａｍ２９（Ｃ）、ｐＸＩＢＭ３４およびｐＴａｍ２９（Ｄ）、ならびにｐＸＩＢＭ３６およびｐＴａｍ２９（Ｅ）で共トランスフェクトした細胞は、ＰＥ蛍光およびＡｌｅｘａ６４７蛍光で測定したときに、ＩＬ−１β結合およびＰＤＺ発現の双方について陽性であった。さらに、ＸＰＡ２８ＩｇＧのＣ末端とＮｏｒｐＡテザーとの間の間隔が違いをもたらすとは思われなかった。これらの結果は、ＮｏｒｐＡテザー提示系が酵母と同様に哺乳動物抗体提示に適用できることの立証に成功した。ＩｎａＤ  ＰＤＺ１発現の不在下で、３つ全てのＸＰＡ２８  ＩｇＧ／ＮｏｒｐＡテザータンパク質が馴化培地に分泌され、またタンパク質Ａセファロースを用いて十分に精製することができ、ＮｏｒｐＡテザー中の不対システインがＸＰＡ２８  ＩｇＧの発現および折り畳みに影響を与えなかったことを示している。また、３つの融合タンパク質の精製収率は、ＮｏｒｐＡテザーを含まずに、ＸＰＡ２８  ＩｇＧに匹敵した。ＮｏｒｐＡテザーおよびＧＧＧＧＳスペーサーを含むＸＰＡ２８  ＩｇＧ、ならびにこれらを含まないＸＰＡ２８  ＩｇＧの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、単離タンパクの純度および重鎖に融合したＮｏｒｐＡテザーの存在を確認した（図１７）。
【０１９２】
実施例６
抗体結合にとってのＩｎａＤ  ＰＤＺ１／ＮｏｒｐＡジスルフィド結合の重要性の試験
ＮｏｒｐＡのＣ末端７残基（１０８９〜１０９５）と複合したＩｎａＤ  ＰＤＺ１ドメイン（１１〜１０７）の結晶構造は、ＩｎａＤ  ＰＤＺ１およびＮｏｒｐＡのそれぞれＣ３１とＣ１０９４の間のジスルフィド結合を示す（Ｋｉｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１  ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：４４１４−４４２２）。テザー提示系におけるこのジスルフィド結合の重要性を調査するために、鋳型プラスミドとしてのｐＴａｍ３７および以下に概説する変異プライマーを用いたＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）突然変異誘発により、ベクターｐＴａｍ  ４９〜５２を構築した。
【０１９３】
ｐＴａｍ４９〜Ｔａｍ１９０
2014504503.tif 000059
【０１９４】
ｐＴａｍ５０〜Ｔａｍ１９２
2014504503.tif 000060
【０１９５】
ｐＴａｍ５１〜Ｔａｍ２２０
2014504503.tif 000061
【０１９６】
ｐＴａｍ５２〜Ｔａｍ２２２
2014504503.tif 000062
【０１９７】
ｐＴａｍ４９において、ＮｏｒｐＡテザーの最後から２番目のシステイン残基（Ｃ１０９４）をセリンに変異させ、対応する突然変異（Ｃ３１Ｓ）をＩｎａＤ  ＰＤＺ１ドメインに作成し、その結果ｐＴａｍ５０（図１８）を生じた。ｐＴａｍ５１および５２の双方は、ＩｎａＤ  ＰＤＺ１およびＸＰＡ２８  ｓｃＦｖそれぞれの最初のコドンの直前に挿入された２つの終止コドンを含む（図１８）。
【０１９８】
ＢＪ５４６５細胞をｐＴａｍ３７、４９、５０、５１、および５２で形質転換し、４０μｇ／ｍＬのトリプトファンを含むＳＤＣＡＡで成長させた後、ガラクトース誘導を行った。次に、フローサイトメトリーを用いて、ＩＬ−１β結合、ならびにｃ−ＭｙｃおよびＨＡエピトープタグの存在について細胞を分析した。図１９Ａに示すように、ｐＴａｍ３７で形質転換した細胞はＩＬ−１βに結合するが、ＮｏｒｐＡ  Ｃ１０９４Ｓ突然変異体（ｐＴａｍ４９）で形質転換した細胞はＩＬ−１βに結合しない（図１９Ｂ）。興味深いことに、ＩｎａＤ  ＰＤＺ１  Ｃ３１Ｓ突然変異体（ｐＴａｍ５０）は、ｐＴａｍ３７よりも低いレベルではあるが、ＩＬ−１β結合を保持する（図１９Ｃ）。したがって、データは、ＩｎａＤ  ＰＤＺ１およびＮｏｒｐＡのそれぞれＣ３１とＣ１０９４の間のジスルフィド結合の重要性を立証する。３個全てのベクターにおいて、細胞表面上のＰＤＺの存在が、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ（登録商標）４８８蛍光により観察された。最後に、ＩＬ−１β結合は、ＩｎａＤ  ＰＤＺ１（ｐＴａｍ５１）またはＸＰＡ２８  ｓｃＦｖ（ｐＴａｍ５２）を含まない細胞には存在せず（図１９ＤおよびＥ）、ＩＬ−１βとＩｎａＤ  ＰＤＺ１または細胞表面との間に非特異的相互作用が存在しないことが示された。
【０１９９】
実施例７
抗体テザー提示ライブラリーの構築
ｐＴａｍ３７中のＸＰＡ２８を１．５キロベースのスタッファーＤＮＡ断片で置換して、アクセプターベクターｐＴａｍ４８を作成した。次に、このベクターをＮｈｅＩおよびＳｆｉＩで消化してスタッファーＤＮＡを除去し、ゲル精製した。ｓｃＦｖライブラリーに対応するインサートＤＮＡを以下のように生成した。Ｖ−Ｂａｓｅから設計したプライマーを用いて、健康なドナー３０名の骨髄、ＰＢＭＣ、または脾臓から単離したｃＤＮＡから、ＶＨ領域およびＶλ領域をＰＣＲ増幅した。Ｖセグメントにアニーリングする順方向プライマーと、ＶＨおよびＶＬそれぞれのためのＶＪおよびＣＨ１領域でアニーリングする逆方向プライマーとを使用して、ＶＨ（１〜７）およびＶＬ（１〜１０）の各ファミリーを別個に増幅した。次に、ＰＣＲ反応を実施して、ＶＨの５'末端にＮｈｅＩ制限部位を、ＶＬ領域の３'末端にＳｆｉＩ制限部位付加した。さらに、ＶＨ用の逆方向二次プライマーおよびＶＬ用の順方向二次プライマーは相補的であり、グリシン−セリンリンカーをコードする。ＶＨのＰＣＲ産物をサブファミリー（ＶＨ１〜７）に基づいてプールし、ＶＬの単一プールを作成した（ＶＬ全体）。ＶＨ１〜７およびＶＬ全体からのＤＮＡを５：１の比率で混合し、アセンブリプライマー
2014504503.tif 000063
を用いたオーバーラップ伸長ＰＣＲにより、ｓｃＦｖに対応する単一の混合断片を生成した。両アセンブリプライマーは、線状化アクセプターベクターｐＴａｍ４８と相同な４８の相補的塩基対を含む。７個のアセンブリＰＣＲ産物（ＶＨ１〜７／ＶＬプール）をＶ−Ｂａｓｅに記載される天然分布（ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）に従って混合し、単一のプールにした。ベクターおよびインサートＤＮＡを相同的組み換えによって混合した。線状化ベクター（８μｇ）およびｓｃＦｖ  ＤＮＡ（２４μｇ）をＢＪ５４６５細胞に電気穿孔で導入し、その結果ライブラリーサイズ１．７４×１０８の形質転換体を生じた。
【０２００】
実施例８
抗トランスフェリンｓｃＦｖｓの抗体テザー提示ライブラリーからの単離
第１ラウンドのパニングのために、実施例７に記載のライブラリーからの１×１０１０の細胞を１μＭのビオチン標識トランスフェリンとともにＦＡＣＳ緩衝液（０．１％  ＢＳＡ含有ＰＢＳ）中、室温で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、ストレプトアビジン磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とともに、氷上で１０分間インキュベートした。次に、この細胞懸濁液をＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に添加し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、４０μｇ／ｍＬのトリプトファンを含むＳＤＣＡＡ培地中に溶出し、１６〜２４時間成長させた。続いて、細胞を継代し、さらに２４時間成長させた。ＦＡＣＳに備えて、細胞を次いで４０μｇ／ｍＬのトリプトファンを含むＳＧＣＡＡ培地に移し、２０〜２４時間成長させた。第２ラウンドのパニングのために、細胞を抗ｃ−Ｍｙｃ（４μｇ／ｍＬ）およびビオチン化トランスフェリンともに、室温で１時間インキュベートした。次に、細胞を冷たいＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＰＥ）（１０μｇ／ｍＬ）、抗ニワトリＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲート（２０μｇ／ｍＬ）、および抗血球凝集素（ＨＡ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲート（１０μｇ／ｍＬ）とともに、４℃、遮光下で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）機器（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を用いて、標識された細胞を選別した。図２０Ａに示すように、集団の４．０％に対応する選別ゲートを使用して、ＰＥ蛍光およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８蛍光の双方について陽性のクローンを選別した。選別した細胞を４０μｇ／ｍＬのトリプトファンを含むＳＤＣＡＡ中に採取し、パニングの次のラウンドの間３０℃で成長させた。その後のパニングラウンドにおいて、より蛍光性が高いクローンを単離するために選別ゲートの位置を変更した（図２０Ｂ〜Ｄ）。ＦＡＣＳによる４ラウンドの濃縮後、プレーティングにより単一クローンを単離し、単一の９６ウェルプレートの培地に接種するために使用した。個々のｓｃＦｖクローンによるトランスフェリン結合をフローサイトメトリーにより評価した。続いて、１８個の固有配列を特定し、抗原滴定曲線を用いてさらに特徴付けた。次に、細胞を漸増濃度のビオチン標識トランスフェリン（１ｎＭ〜２μＭ）とともにインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。平均ＰＥ蛍光（全体に占める割合）を抗原濃度に対してプロットし、最大半量（ＥＣ５０）における濃度として解離定数（ＫＤ）を決定した。３つの例示的クローンの推定親和性を図２１に示す。
【０２０１】
実施例９
ＩｇＧおよびＦａｂの酵母細胞表面提示
抗体ＸＰＡ２８  ＩｇＧを酵母細胞の表面に提示するために、プライマーであるＴａｍ１４７
2014504503.tif 000064
を用いて、ベクターｐＴａｍ４８（実施例７を参照）をまずＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）突然変異誘発によって改変して、第２のＰｍｅＩ部位（図２２）を不活性化した。得られたベクターをＮｈｅＩおよびＰｍｅＩで消化してスタッファー配列、ｃＭｙｃおよびＨｉｓ６エピトープタグ、ならびにＮｏｒｐＡテザーを除去した。次に、得られた８ｋｂ断片をＮｈｅＩ−ＨＦおよびＰｍｅＩで消化した３ｋｂのオーバーラップ伸長ＰＣＲ断片に連結した。この後者の断片は、以下の３つのＰＣＲ増幅から構成された：
（１）プライマー
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を用いて増幅した、ベクターｐＸＩＢＭ３６由来の軽鎖（図１５Ａを参照）；
（２）プライマー
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を用いて増幅した、ベクターｐＴａｍ４８由来のＭＡＴαターミネーター、Ｇａｌ１プロモーター、およびＡｇａ２シグナル配列；
（３）プライマー
2014504503.tif 000067
を用いて増幅した、ベクターｐＸＩＢＭ３６由来のＶＨおよびＣＨ１−３領域。
【０２０２】
クローニングの目的で、ＵＲＡ３遺伝子中のＮｃｏＩ部位をＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）突然変異誘発、ならびにプライマー
2014504503.tif 000068
によって不活性化した。最終的ベクターであるｐＶＶ４２を図２３に示す。
【０２０３】
プライマー
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およびｏＶＶ８２ＰＣＲ逆方向
2014504503.tif 000070
（下線部分の配列の逆方向成分は、ＮｏｒｐＡテザーアミノ酸ＧＫＴＥＦＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）をコードする）を用いて、ベクターｐＶＶ４２からＶＨおよびＣＨ１ドメインを増幅することによって、ＩｇＧベクターｐＶＶ４２（図２４）のＦｃ領域をコードする配列を除去した。次に、ＰＣＲ断片をＮｃｏＩおよびＰｍｅＩで消化し、ＮｃｏＩおよびＰｍｅＩですでに消化しておいたｐＶＶ４２中に連結して、その結果新しいベクターであるｐＶＶ４７（図２４）を生じた。
【０２０４】
ＢＪ５４６５酵母細胞をベクター：ｐＴａｍ３７（ＸＰＡ２８  ｓｃＦｖ）、ｐＶＶ４７（ＸＰＡ２８  Ｆａｂ）、およびｐＶＶ４２（ＸＰＡ２８  ＩｇＧ１）で形質転換し、４０μｇ／ｍＬのトリプトファンを含むＳＤＣＡＡで成長させ、ガラクトースで誘導した。フローサイトメトリー分析のために、細胞を洗浄緩衝剤で洗浄した後、ビオチン標識ＩＬ−１β（１００ｎＭ）とともに、室温で１時間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＰＥ）（１０μｇ／ｍＬ）および抗血球凝集素（ＨＡ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲート（１０μｇ／ｍＬ）とともに、氷上、遮光下で３０分間インキュベートした。次に、分析前に最後に１回細胞を洗浄した。図２５に示すのは、ＰＥ蛍光およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８蛍光の２変数グラフであり、酵母細胞表面上のビオチン−ＩＬ−１βおよびＩｎａＤ  ＰＤＺ１／Ａｇａ１融合体それぞれの存在を示している。これらの結果は、生成された３つ全ての構築物が、ＩＬ−１βに結合したタンパク質を提示したことを示す。ｓｃＦｖ形式を提示する細胞は、これら３つの形式の中で最も高いレベルの抗原結合を示し、その次にＦａｂ、次にＩｇＧが続いた（図２５）。ＰＤＺ／Ａｇａ１提示のレベルは、抗体サイズとは無関係と思われ、３つ全ての構築物に関して類似していた。この実験は、開示されるＰＤＺテザー提示系を用いて、複数の抗体タイプを酵母細胞表面に提示することができることを立証した。
【０２０５】
実施例１０
組み込みファージ、酵母、哺乳動物提示を用いた、Ｔｉｅ２結合抗体の特定および特徴付け
ＸＦａｂ１ライブラリーの構築
ＸＦａｂ１ファージライブラリーを以下のように調製した。標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））を用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより３０名のドナーからｃＤＮＡを調製した（ＡｌｌＣｅｌｌｓ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）。Ｖ  ＢＡＳＥ（ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）からの生殖系列配列に基づくプライマーを用いて、ＶＬ領域およびＶＨ領域をＰＣＲ増幅した。次に、増幅したＶＨ断片およびＶＬ断片をｐＸＨＭＶ−ＵＳ２−Ｌ−ＦａｂベクターまたはｐＸＨＭＶ−ＵＳ２−Ｋ−Ｆａｂベクター中に順次連結させた。連結したＤＮＡをエレクトロコンピテントＴＧ１細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＵＳＡ）に電気穿孔で導入した。得られたＸＦａｂ１ライブラリーのサイズは、２．５×１０１１形質転換体であった。
【０２０６】
Ｔｉｅ２抗原に対するファージパニング
ファージパニングに備えて、ストレプトアビジン結合Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、５％ミルクを含むＰＢＳで３回洗浄した。次に、このビーズおよびファージ（１００×ライブラリー当量）を、５％ミルクを含むＰＢＳで、室温で１時間ブロックした。ブロックしたファージをブロックしたビーズ１００μＬとともに室温で３０分間インキュベートすることにより、除外ステップを実施した。このステップをもう１回繰り返した。抗原Ｔｉｅ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）をＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ  Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で標識した。第１ラウンドのパニングのために、抗原１００ピコモルをブロックしたビーズ１００μＬとともに３０分間インキュベートした。洗浄後、Ｔｉｅ２結合ビーズを除外されたライブラリーファージとともに、室温で１時間インキュベートした。次に、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および５％ミルクを含むＰＢＳを用いてビーズを３回洗浄した。洗浄したビーズを５００μＬの１００ｍＭ  ＴＥＡ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，Ｎ．Ｊ）に２０分間懸濁させてから、等容積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）で中和することにより、結合したファージを溶出した。次に、このファージ／ビーズ溶液を用いて対数期ＴＧ１大腸菌（１０ｍＬ）細胞を１００ｒｐｍ振盪下、３７℃で１時間感染させた。感染細胞を２ＹＴＣＧ培地（１００ｇ／ｍＬカルベニシリンおよび２％グルコースを含む２ＹＴ）に蒔き、３０℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を掻き取って採取し、新鮮な液体２ＹＴＣＧ培地に接種するために使用した。
【０２０７】
前のラウンドからの回収ファージの１００倍の数の細胞を用いて、６００ｎｍ（ＯＤ６００）における最終光学密度が０．０５になるように、２ＹＴＣＧ細胞の培養物に接種した。次に、この培養物を振盪下（２５０ｒｐｍ）、３７℃で、ＯＤ６００が０．５に達するまで成長させた。Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を感染多重度（ＭＯＩ）２０でこの培養物に添加した。この培養物を振盪下（１００ｒｐｍ）、３７℃で１時間、さらにインキュベートした。次に、感染細胞をペレット化し、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンおよび５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ培地に再懸濁させ、振盪下（２５０ｒｐｍ）、３０℃で一晩成長させた。翌日、細胞をペレット化し、ファージ上澄みは取っておいた。第２ラウンドのパニングのために、１ｍＬのファージ上澄みおよび５０ピコモルのビオチン標識Ｔｉｅ２を使用した。第３ラウンドでは、１００μＬのファージ上澄みを用いたが、抗原の量には変化はなかった（５０ピコモル）。他の全てのパニング条件は、第１ラウンドと同様であった。
【０２０８】
濃縮ファージクローンの哺乳動物提示ベクターへの移入
第３ラウンドのパニングからの感染細胞を２ＹＴＣＧ培地で前述の通り３０℃で一晩成長させた。翌日、細胞を掻き取り、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドＤＮＡ（３０μｇ）をＳｆｉＩおよびＮｈｅＩで消化して、ＶＬ領域、ＣＬ領域、およびＶＨ領域を含む単一インサートを切り取った。アクセプターベクターであるｐＸＩＢＭ３６も同じ制限酵素で消化した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、インサートおよび切断したベクターの両者をゲル精製した。ベクター対インサートの比率２：１からなる合計１マイクログラムのＤＮＡをＴ４  ＤＮＡリガーゼとともに、１６℃で一晩インキュベートした。１マイクロリットルのライゲーション反応物を使用して、ＴＯＰ１０大腸菌（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に電気穿孔した。プレーティングおよび一晩の成長後、第３ラウンドのファージ収量の１０倍に相当するコロニーを掻き取り、プラスミドＤＮＡを前述の通り単離した。次に、ＤＮＡをＡｖｒＩＩおよいｂＮｃｏＩで消化して、大腸菌に最適化されたＣＬ、およびＶＨ領域に先行するｐｅｌＢシグナル配列含む断片を除去した。これをライゲーションによりヒトＣＬ、ＩＲＥＳ２、およびＩｇＧリーダー配列を含む断片で置換し、前述の通りＴＯＰ１０細胞に電気穿孔した。再び、プレーティングおよび一晩の成長後、第３ラウンドのファージ収量の１０倍に相当するコロニーを掻き取り、ＤＮＡを得るために処理した。精製したプラスミドＤＮＡはこのとき、ＩｇＧ１バックボーンに移入されたファージ由来ＶＬ領域およびＶＨ領域を含んだ。
【０２０９】
哺乳動物提示を用いた抗Ｔｉｅ２  ＩｇＧの特定
１：１の比率のＩｇＧおよびｐＴａｍ２９をコードするプラスミドＤＮＡ合計２０μｇを用いて、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞を実施例１に記載のようにトランスフェクトした。２４時間のトランスフェクション後、細胞を最終濃度５μｇ／ｍＬのビオチン−Ｔｉｅ２およびニワトリ抗ｃ−Ｍｙｃ（４μｇ／ｍＬ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）とともに、４℃で１時間インキュベートした。その後の標識・フローサイトメトリー分析は、実施例１に記載のように実施した。図２６Ａに示すように、分析した細胞の大部分は、Ｔｉｅ２結合およびＰＤＺ提示の双方について陽性であり、ファージベクター由来のＶＬおよびＶＨの哺乳動物提示ベクターへのトランスフェクションおよび２ステップクローニングの双方が成功したことを裏付けた。次に、トランスフェクト細胞に、もう１ラウンドの磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）を用いた濃縮を実施した。端的に述べると、細胞（２×１０７）を０．５％  ＦＢＳおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳで洗浄し、１０ピコモルのビオチン標識Ｔｉｅ２とともに、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を再び洗浄し、４０μＬの抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）とともに、４℃で１５分間インキュベートした。細胞を再び洗浄し、最終容積５００μＬになるように、０．５％  ＦＢＳおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳに再懸濁させた。次に、７０μｍナイロンメッシュを用いて細胞懸濁液を濾過してから、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）に装填した。ＭｉｄｉＭａｃｓ（商標）分離装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用いて、製造業者の使用説明に従ってＴｉｅ２結合細胞を単離した。フローサイトメトリーによる溶出した細胞の分析は、ＭＡＣＳによる追加ラウンドのパニングが、集団中のＴｉｅ２結合細胞の割合を前のパニングラウンド（図２６Ａ）と比較して２０％さらに高めた（図２６Ｂ）ことを明らかにした。
【０２１０】
Ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて溶出した細胞からプラスミドＤＮＡを単離し、ＴＯＰ１０大腸菌細胞に電気穿孔で導入し、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ培地で、３７℃で一晩成長させた。翌日、配列分析のためにコロニーを収集し、そのうち３４個が固有コロニーであった。さらなる特徴付けのための可溶性ＩｇＧを精製するために、実施例１に記載のトランスフェクション手順に以下の変更を加えた。
【０２１１】
１０マイクロリットルのＩｇＧミニプレップＤＮＡを１μｇのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）とともに、室温で２０分間インキュベートした。次に、この混合物を９６ウェル培養プレートに播種した１００μＬのＨＥＫ２９３Ｅ細胞に添加した。３７℃、５％ＣＯ２で４８時間成長させた後、細胞培地を採取した。
【０２１２】
次に、ＣＨＯＫ１細胞上に発現したＴｉｅ２に対する結合についてＩｇＧクローンをスクリーニングした。これを達成するために、分泌されたＩｇＧの上澄みを含む２５μＬの細胞培地を２５μＬのＣＨＯＫ１−Ｔｉｅ２細胞（２×１０６細胞／ｍＬ）とともに、４℃で３０分間インキュベートした。この前に、ＣＨＯＫ１−Ｔｉｅ２細胞をＣＳＦＥ色素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で事前標識して、フローサイトメトリーによって識別できるようにしておいた。次に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中の２５μＬのマウス抗ｃ−Ｍｙｃ（４００ｎｇ／ｍＬ）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）とともに３０分間インキュベートした。細胞ペレットを再び洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中のアロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｌａｂｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）の１：２００希釈物２５μＬとともに、４℃で１５分間インキュベートした。標識後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液と４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の１：１混合物５０μＬに再懸濁させてから、フローサイトメトリー分析を行った。
【０２１３】
抗Ｔｉｅ２  ＩｇＧの親和性測定および機能的特徴付け
ＣＨＯ−Ｔｉｅ２結合スクリーニングに基づき、上位１０個のＩｇＧクローンを２４ウェル培養プレート内に増殖させ、親和性測定用のＩｇＧを生成するためにさらに３日間成長させた。分泌したＩｇＧを含む培地をまずアッセイ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、ｐＨ  ７．４）で約２μｇ／ｍＬ（総タンパク質）まで希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ａ１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｗａｕｋｅｓｈａ，ＷＩ）を用いた抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）結合バイオセンサーに注入した。次に、連続３倍希釈物（１０ｎＭ〜０．０４ｎＭ）中の６つの濃度のＴｉｅ２を捕捉したＩｇＧ上に注入し、これを２回繰り返した。Ｔｉｅ２の注入は３０μＬ／分で４分であり、解離時間は１０分であった。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ａ１００評価ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｗａｕｋｅｓｈａ，ＷＩ）を用いて、収集したデータを１：１ラングミュア相互作用モデルに当てはめた。１０個のＩｇＧクローンのうち６個について解離定数を算出した（図２７）。素晴らしいことに、６個のＩｇＧが、可溶性Ｔｉｅ２に対して１桁または２桁のナノモル親和性を示した。
【０２１４】
Ｂｉａｃｏｒｅに加え、結合スクリーニングからの上位１０個のクローンにも機能アッセイを実施した。血清飢餓ＣＨＯＫ１−Ｔｉｅ２細胞をＴｉｅ２リガンド、Ａｎｇ１（１０μｇ／ｍＬ）、または抗Ｔｉｅ２  ＩｇＧ（１０および５０μｇ／ｍＬ）とともに、３７℃で１０分間インキュベートした。次に、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔキット（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、セリン４７３における細胞Ａｋｔリン酸化を特定した。図２７に示すように、Ｔｉｅ２に結合するクローン１０個のうち９個が、Ｔｉｅ２シグナル伝達を活性化することが認められた。Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔレベルは、Ａｎｇ１で見られるレベルの４０〜６０％であることが観察された。ごくわずかなリン酸化は、陰性対照である抗ＫＬＨ処理細胞および未処理細胞で観察された。
【０２１５】
濃縮ファージクローンの酵母提示ベクターへの移入
１０５〜１０６ｃｆｕからなる、ラムダＦａｂファージ提示ライブラリーＸＦａｂ１からのＴｉｅ２第３ラウンド産出物を酵母提示ベクターｐＶＶ４２（図２３）にクローニングした。第１のステップにおいて、ライゲーションにより（ベクター：インサートのモル比１：２）、この回収物由来のＳｆｉＩ／ＮｈｅＩ断片を同様に消化したｐＶＶ４２にバルク移入した。３ｕＬのライゲーション（１６５ｎｇのベクター）を４０ｕＬのＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）に電気穿孔で導入することにより、約４×１０９形質転換体を生じた。クローニングの第２ステップにおいて、可変ドメイン間で細菌配列を酵母配列で置き換えた。具体的には、ｐＶＶ４２（ＣＬ−ＭＡＴａｌｐｈａターミネーター−Ｇａｌ１プロモーター−ＵＳ２シグナル配列からなる）由来のＡｖｒＩＩ／ＮｃｏＩ断片を第１ステップで構築し、同様に消化したライブラリー中に、１：６のベクター：インサート比で連結した。２２の形質転換それぞれにおいて２．５ｕＬのライゲーション（９１ｎｇのベクター）を５０ｕＬのＴＯＰ１０大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に電気穿孔で導入することにより、約４０００コロニーを生じた。
【０２１６】
酵母にこれらの細菌コロニーから単離したＤＮＡを電気穿孔した。酵母株ＢＪ５４６５をエレクトロコンピテントにし、Ｂｅｎａｔｕｉｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ２３，１５５−９（２０１０）に記載されているように形質転換した。ＤＮＡをＰｅｌｌｅｔ  Ｐａｉｎｔ（登録商標）共沈物（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で濃縮し、２．５μｇを約３．２×１０９の酵母細胞に電気穿孔して、約２×１０５酵母コロニー形成単位を生じた。
【０２１７】
酵母ＦＡＣＳ、スクリーニング、および配列決定：ライブラリーで形質転換した酵母からの発現を（ＳＤＣＡＡ＋４０μｇ／ｍＬのトリプトファン中で４８時間後）ＳＧＣＡＡ＋４０μｇ／ｍＬのトリプトファン＋ガラクトース中で２６時間インキュベートすることにより誘導した。酵母を約４００ｎｇ／ｍＬのビオチン化Ｔｉｅ２−Ｆｃとともに１時間、次いで蛍光ＰＥタグ化ストレプトアビジン、ならびに検出抗体である１０μｇ／ｍＬの蛍光ＡＰＣタグ化抗ラムダＩｇＧ（Ｂｒｏｏｋｗｏｏｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）とともにインキュベートすることにより、抗原との結合を検出した。標識した細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）機器（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を用いて選別した。図２８に示すように、Ｔｉｅ２結合および抗体提示の二重陽性細胞の３つの集団が回収された。次いで誘導された９４コロニーの全てが、フローサイトメトリーにより、Ｔｉｅ２と結合していることが検証された。配列決定された５８個のクローン中、２０個が固有であり、重鎖および軽鎖相補性決定領域のファミリーの多様性を示している。
【０２１８】
組み込み提示プラットフォームを用いて発見された固有クローンの分析
酵母提示のみを用いて発見された固有Ｆａｂクローンの配列を酵母または哺乳動物提示を用いて回収された固有Ｆａｂクローンと比較した。各提示プラットフォームについて、クローンの大部分は、それ以外の提示技術を用いて回収されなかった（表３-他の選択方法を用いても認められた各選択からのクローンの割合は、網掛けなしの欄に示し、１つの選択方法に固有のクローンの割合は網掛け欄に示す）。したがって、組み込み提示方法の使用は、１つのプラットフォームを用いては到達できなかったさらなる多様なクローンの発見を可能にした。
【０２１９】
（表３）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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