(57)【要約】本出願は、難聴の治療を、それを必要とする対象に行うための、二本鎖核酸化合物、それを含む組成物、およびそれを使用する方法に関する。本化合物は、好ましくは、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、およびＮＯＴＣＨ１からなる群から選択される、発現される遺伝子の発現を阻害する、化学的に合成および修飾されたｄｓＲＮＡ分子である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下に記載される構造（Ａ２）を有する二本鎖核酸分子であって、
【表１】
2014528704.tif 000036
式中、Ｎ２、Ｎ、およびＮ’のそれぞれは、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非従来的部分であり、
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、オリゴヌクレオチドであり、それぞれの連続するＮまたはＮ’は、共有結合によって隣接するＮまたはＮ’と接合し、
ｘおよびｙのそれぞれは、独立して、１７〜３９の整数であり、
（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に対する相補性を有し、（Ｎ）ｘは、ＨＥＳ１  ｍＲＮＡ（配列番号１）の連続する配列に対する相補性を有し、
Ｎ１は、（Ｎ）ｘと共有結合し、前記ＨＥＳ１  ｍＲＮＡに対してミスマッチであるか、または前記ＨＥＳ１  ｍＲＮＡに相補的なデオキシリボヌクレオチド部分であり、
Ｎ１は、天然もしくは修飾された、ウリジン、デオキシリボウリジン、リボチミジン、デオキシリボチミジン、アデノシン、またはデオキシアデノシンからなる群から選択される部分であり、
ｚ"は、存在しても不在であってもよいが、存在する場合は、Ｎ２−（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合したキャッピング部分であり、
ＺおよびＺ’のそれぞれは、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した、１〜５個の連続するヌクレオチド、連続する非ヌクレオチド部分、またはそれらの組み合わせである、二本鎖核酸分子。
【請求項２】
ｘ＝ｙ＝１８である、請求項１に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項３】
ＨＥＳ１＿１４（配列番号２６６８１および２６６６９）ならびにＨＥＳ１＿３６（配列番号２６６９０および２６６７８）として記載される核酸から選択される、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙを含む、請求項２に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項４】
（Ｎ）ｘは、配列番号２６６８１であり、（Ｎ’）ｙは、配列番号２６６６９である、請求項３に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項５】
（Ｎ）ｘは、配列番号２６６８１であり、（Ｎ’）ｙは、配列番号２６６６９であり、（Ｎ）ｘは、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、任意で、５、６、または７位のうちの少なくとも１つに２’−５’リボヌクレオチドとを含み、（Ｎ’）ｙは、少なくとも１つの２’５’リボヌクレオチドまたは２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、ｚ’’は存在し、ＺおよびＺ’のそれぞれは、存在し、それが存在する鎖の３’末端に共有結合した非ヌクレオチド部分からなる、請求項４に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項６】
（Ｎ）ｘは、１、３、９、１１、１５、および１８位（５’から３’の方向）に、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含み、（Ｎ’）ｙは、１位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、３’末端の１５、１６、１７、１８、および１９位（５’から３’の方向）に、５個の連続する２’５’リボヌクレオチドとを含む、請求項５に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項７】
（Ｎ）ｘは、１、３、９、１１、１４、１５、および１８位（５’から３’の方向）に、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位に２’５’リボヌクレオチドとを含み、（Ｎ’）ｙは、１位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、３’末端の１５、１６、１７、１８、および１９位（５’から３’の方向）に、５個の連続する２’５’リボヌクレオチドとを含む、請求項５に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項８】
（Ｎ）ｘは、１、３、９、１１、１４、１５、および１８位（５’から３’の方向）に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位に存在する２’５’リボヌクレオチドとを含み、（Ｎ’）ｙは、１、４、８、１０、１２、および１６位に２’ＯＭｅ  糖修飾リボヌクレオチドを含む、請求項５に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項９】
ｚ"は、逆位脱塩基部分を含み、Ｚ’は、Ｃ３Ｐｉ部分を含み、Ｚは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、請求項４〜８のいずれか１項に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項１０】
（Ｎ）ｘは、配列番号２６６９０であり、（Ｎ’）ｙは、配列番号２６６７８である、請求項３に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項１１】
（Ｎ）ｘは、配列番号２６６９０であり、（Ｎ’）ｙは、配列番号２６６７８であり、前記（Ｎ）ｘは、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、任意で、５、６、または７位のうちの少なくとも１つに２’−５’リボヌクレオチドとを含み、（Ｎ’）ｙは、少なくとも１つの  ２’５’リボヌクレオチドまたは２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、ｚ’’は存在し、ＺおよびＺ’のそれぞれは、存在し、それが存在する鎖の３’末端に共有結合した非ヌクレオチド部分からなる、請求項１０に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項１２】
（Ｎ）ｘは、３、９、１１、および１５位に、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含み、（Ｎ’）ｙは、３’末端の１５、１６、１７、１８、および１９位に、５個の２’５’リボヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項１３】
ｚ"は、逆位脱塩基部分を含み、Ｚ’は、Ｃ３Ｐｉ部分を含み、Ｚは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項１４】
ＨＥＳ１＿１２（配列番号２６６７９および２６６６７）、ＨＥＳ１＿１３（配列番号２６６８０および２６６６８）、ＨＥＳ１＿１６（配列番号２６６８２および２６６７０）、ＨＥＳ１＿１９（配列番号２６６８３および２６６７１）、ＨＥＳ１＿２０（配列番号２６６８４および２６６７２）、ＨＥＳ１＿２１（配列番号２６６８５および２６６７３）、ＨＥＳ１＿２２（配列番号２６６８６および２６６７４）、ＨＥＳ１＿２４（配列番号２６６８７および２６６７５）、ＨＥＳ１＿２８（配列番号２６６８８および２６６７６）、ならびにＨＥＳ１＿３３（配列番号２６６８９および２６６７７）として記載される核酸から選択される、アンチセンス鎖およびセンス鎖を含む、請求項１または２に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項１５】
前記共有結合は、リン酸ジエステル結合である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項１６】
耳細胞におけるＨＥＳ１の発現を低減させるための、請求項１〜１５のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
【請求項１７】
請求項１７に記載の二本鎖核酸分子と、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。
【請求項１８】
ＨＥＳ１遺伝子の発現は前記聴覚障害／難聴の病因または進行と関連する聴覚障害／難聴を、対象において治療する方法であって、前記対象に、請求項１８に記載の組成物の治療有効量を投与し、それによって、前記対象における前記聴覚障害／難聴を治療することを含む、方法。
【請求項１９】
ＨＥＳ１遺伝子の発現は前記バランス障害の病因または進行と関連するバランス障害を、対象において治療する方法であって、前記対象に、請求項１８に記載の組成物の治療有効量を投与し、それによって、前記対象における前記バランス障害を治療することを含む、方法。
【請求項２０】
ＨＥＳ１遺伝子の発現は前記内耳の耳（感覚）有毛細胞の前記消失の病因または進行と関連する内耳の耳（感覚）有毛細胞の消失を、対象において予防する方法であって、前記対象に、請求項１８に記載の組成物の治療有効量を投与し、それによって、前記対象の前記内耳の耳（感覚）有毛細胞の前記消失を予防することを含む、方法。
【請求項２１】
以下に記載される構造（Ａ２）を有する二本鎖核酸分子であって、
【表２】
2014528704.tif 000037
式中、Ｎ２、Ｎ、およびＮ’のそれぞれは、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非従来的部分であり、
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、オリゴヌクレオチドであり、それぞれの連続するＮまたはＮ’は、共有結合によって、隣接するＮまたはＮ’と接合し、
ｘおよびｙのそれぞれは、独立して、１７〜３９の整数であり、
（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に対する相補性を有し、（Ｎ）ｘは、標的遺伝子における連続する配列に対する相補性を有し、
Ｎ１は、（Ｎ）ｘと共有結合し、前記標的遺伝子に対してミスマッチであるか、または前記標的遺伝子に相補的なデオキシリボヌクレオチド部分であり、
Ｎ１は、天然もしくは修飾された、ウリジン、デオキシリボウリジン、リボチミジン、デオキシリボチミジン、アデノシン、またはデオキシアデノシンからなる群から選択される部分であり、
ｚ"は、存在しても不在であってもよいが、存在する場合は、Ｎ２−（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合したキャッピング部分であり、
ＺおよびＺ’のそれぞれは、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した、１〜５個の連続するヌクレオチド、連続する非ヌクレオチド部分、またはそれらの組み合わせであり、前記センス鎖およびアンチセンス鎖は、配列番号２０３０〜２７０３および２６７０７〜２６７２４（ＨＥＳ５）、配列番号３０２６〜３６３３および２６７８９〜２６８０８（ＩＤ１）、配列番号５０５４〜６２０５および２６８１７〜２６８２４（ＩＤ２）、配列番号６６７２〜７４４３および２６８３３〜２６８５０（ＩＤ３）、配列番号９００８〜１０５３３および２６８６７〜２６８８６（ＣＤＫＮ１Ｂ）、配列番号１１５５０〜１３００３および２６７３３〜２６７６０（ＨＥＹ１）、配列番号１４８０２〜１６３８９および２６７７９〜２６７８４（ＨＥＹ２）、配列番号１８６４４〜２６６６６および２６０１〜２６９１０（ＮＯＴＣＨ１）のいずれかに記載される配列対を含む、二本鎖核酸分子。
【請求項２２】
ｘ＝ｙ＝１８である、請求項２１に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項２３】
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、配列番号２６７０７〜２６７２４（ＨＥＳ５）、配列番号２６７８９〜２６８０８（ＩＤ１）、配列番号２６８１７〜２６８２４（ＩＤ２）、配列番号２６８３３〜２６８５０（ＩＤ３）、配列番号２６８６７〜２６８８６（ＣＤＫＮ１Ｂ）、配列番号２６７３３〜２６７６０（ＨＥＹ１）、配列番号２６７７９〜２６７８４（ＨＥＹ２）、配列番号２６０１〜２６９１０（ＮＯＴＣＨ１）のいずれか１つに記載される配列対である、請求項２２に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項２４】
ＨＥＹ２＿１（配列番号２６７４７および２６７３３）ならびにＨＥＹ２＿２（配列番号２６７４８および２６７３４）として記載される核酸から選択される、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙを含む、請求項２３に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項２５】
ＣＤＫＮ１Ｂ＿３１（配列番号２６８７９および２６８６９）として記載される核酸から選択される、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙを含む、請求項２４に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項２６】
構造（Ａ１）を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であって、
【表３】
2014528704.tif 000038
式中、各ＮおよびＮ’は、非修飾もしくは修飾、または非従来的部分であってもよいリボヌクレオチドであり、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、オリゴヌクレオチドであり、それぞれの連続するＮまたはＮ’が、共有結合によって次のＮまたはＮ’と接合し、
ＺおよびＺ’のそれぞれは、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した、１〜５個の連続するヌクレオチド、１〜５個の連続する非ヌクレオチド部分、またはそれらの組み合わせを含み、
ｚ"は、存在しても不在であってもよいが、存在する場合は、（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合したキャッピング部分であり、
ｘおよびｙのそれぞれは、独立して、１８〜４０の整数であり、
（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に相補的であり、（Ｎ）ｘは、アンチセンス配列を含み、（Ｎ’）ｙは、配列番号２３〜６９３および２６６９１〜２６７０６（ＨＥＳ１）、配列番号１４９６〜２０２９および２６７２５〜２６７３２（ＨＥＳ５）、配列番号２７０４〜３０２５および２６８０９〜２６８１６（ＩＤ１）、配列番号３６３４〜５０５３および２６８２５〜２６８３２（ＩＤ２）、配列番号６２０６〜６６７１および２６８５１〜２６８６６（ＩＤ３）、配列番号７４４４〜９００７および２６８８７〜２６９００（ＣＤＫＮ１Ｂ）、配列番号１０５３４〜１１５４９および２６７６１〜２６７７８（ＨＥＹ１）、配列番号１３００４〜１４８０１および２６７８５〜２６７８８（ＨＥＹ２）、配列番号１６６２２〜１８６４３および２６９２２〜２６９１２（ＮＯＴＣＨ１）のいずれか１つに記載される、センス配列を含む、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子。
【請求項２７】
ｙ＝１９である、請求項２６に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項２８】
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、配列番号２６６９１〜２６７０６（ＨＥＳ１）、配列番号２６７２５〜２６７３２（ＨＥＳ５）、配列番号２６８０９〜２６８１６（ＩＤ１）、配列番号２６８２５〜２６８３２（ＩＤ２）、配列番号２６８５１〜２６８６６（ＩＤ３）、配列番号２６８８７〜２６９００（ＣＤＫＮ１Ｂ）、配列番号２６７６１〜２６７７８（ＨＥＹ１）、配列番号２６７８５〜２６７８８（ＨＥＹ２）、配列番号２６９２２〜２６９１２（ＮＯＴＣＨ１）のいずれか１つに記載される配列対である、請求項２７に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項２９】
ＨＥＳ５＿８（配列番号２６７３２および２６７２８）として記載される核酸から選択される、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙを含む、請求項２８に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項３０】
ＣＤＫＮ１Ｂ（配列番号２６６９０および２６８８７）として記載される核酸から選択される、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙを含む、請求項２８に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項３１】
それぞれの連続するＮおよび／またはＮ’を接合する前記共有結合は、リン酸ジエステル結合である、請求項２１〜３０のいずれか１項に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項３２】
前記核酸分子は、修飾糖部分を含む１つ以上のリボヌクレオチドを含む、請求項１〜３１のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
【請求項３３】
前記核酸分子は、修飾糖部分を含む１つ以上のリボヌクレオチドを含み、前記修飾糖部分は、独立して、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−デオキシ、２’−フルオロ、および２’−アリルからなる群から選択される、請求項１〜３２のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
【請求項３４】
前記核酸分子は、１つ以上の修飾核酸塩基を含む、請求項１〜３３のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
【請求項３５】
前記核酸分子は、１つ以上の修飾核酸塩基を含み、前記１つ以上の修飾核酸塩基は、独立して、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、ならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピル、ならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、５−チオウラシルおよびシトシン、５−プロペニルウラシルおよびシトシン、６−アザウラシル、シトシン、およびチミン、５−ウラシル（擬似ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、ならびに他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチル、ならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、ならびにアシクロヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１〜３４のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
【請求項３６】
前記核酸分子は、前記リン酸ジエステル骨格に対する１つ以上の修飾を含む、請求項１〜３５のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
【請求項３７】
前記核酸分子は、前記リン酸ジエステル骨格に対する１つ以上の修飾を含み、前記リン酸ジエステル骨格に対する前記１つ以上の修飾は、独立して、ホスホロチオエート、３’−（もしくは−５’）デオキシ−３’−（もしくは−５’）チオ−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、３’−（もしくは−５’）デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、３’−（もしくは−５’）デオキシ−３’−（もしくは５’−）アミノホスホロアミデート、水素ホスホネート、ボラノホスフェートエステル、ホスホロアミデート、アルキルもしくはアリールホスホネート、およびホスホトリエステル、またはリン酸連結からなる群から選択される、請求項１〜３６のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
【請求項３８】
前記核酸分子は、前記センス鎖に１つ以上の修飾を含むが、前記アンチセンス鎖には含まない、請求項１〜３７のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
【請求項３９】
前記核酸分子は、前記アンチセンス鎖に１つ以上の修飾を含むが、前記センス鎖には含まない、請求項１〜３８のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
【請求項４０】
前記核酸分子は、前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の両方に１つ以上の修飾を含む、請求項１〜３９のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
【請求項４１】
前記センス鎖は、交互の修飾パターンを含む、請求項１〜４０のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
【請求項４２】
前記アンチセンス鎖は、交互の修飾リボヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチドのパターンを含む、請求項１〜４１のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
【請求項４３】
前記センス鎖は、交互の修飾リボヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチドのパターンを含み、前記修飾は、前記リボヌクレオチドの糖部分に対するものであり、好ましくは、２’−Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチドをもたらす、請求項１〜４２のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
【請求項４４】
前記アンチセンス鎖は、交互の修飾リボヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチドのパターンを含み、前記修飾は、前記リボヌクレオチドの糖部分に対するものであり、好ましくは、２’−Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチドをもたらす、請求項１〜４３のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
【請求項４５】
前記パターンは、前記センス鎖の５’末端において修飾リボヌクレオチドで開始する、請求項４３に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項４６】
前記パターンは、前記アンチセンス鎖の５’末端において修飾リボヌクレオチドで開始する、請求項４４に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項４７】
前記パターンは、前記センス鎖の３’末端において修飾リボヌクレオチドで開始する、請求項４３に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項４８】
前記パターンは、前記アンチセンス鎖の３’末端において修飾ヌクレオチドで開始する、請求項４４に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項４９】
前記センスおよびアンチセンス鎖の両方は、交互の修飾リボヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチドのパターンを含み、前記修飾は、前記リボヌクレオチドの糖部分に対するものであり、好ましくは、２’−Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチドをもたらし、前記パターンは、前記センス鎖のこのような修飾リボヌクレオチドが、前記アンチセンス鎖の非修飾リボヌクレオチドと逆になる、および逆もまた同様であるように、構成される、請求項１〜４８のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
【請求項５０】
前記パターンは、前記センス鎖の各修飾リボヌクレオチドが、前記アンチセンス鎖の修飾リボヌクレオチドと逆になるように構成される、請求項４９に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項５１】
前記センス鎖および／または前記アンチセンス鎖のうちの１つまたは両方は、３’末端に１〜３個のデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項１〜５０のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
【請求項５２】
前記センス鎖および／または前記アンチセンス鎖のうちの１つまたは両方は、５’末端にリン酸基を含む、請求項１〜５１のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
【請求項５３】
前記センス鎖は、少なくとも１つのニックまたはギャップを含む、請求項１〜５２のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
【請求項５４】
細胞内の標的遺伝子の発現を下方制御する方法であって、前記標的遺伝子は、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、およびＮＯＴＣＨ１からなる群から選択され、前記細胞に、前記標的遺伝子の発現を下方制御するのに有効な量で、請求項１〜５３のいずれかに記載の二本鎖核酸分子を導入することを含む、方法。
【請求項５５】
前記細胞は、耳細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記耳細胞は、内耳細胞である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記内耳細胞は、内有毛細胞または外有毛細胞である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記方法は、インビトロで行われる、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記方法は、インビボで行われる、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
患者による使用のためにパッケージ化される、請求項１〜１６および２１〜５３のいずれかに記載の二本鎖核酸分子を含む、組成物。
【請求項６１】
前記組成物は、請求項１〜１６および２１〜５３のいずれかに記載の核酸分子が使用され得る方法に関するある特定の情報を提供する、ラベルまたは添付文書を含む、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
前記ラベルまたは添付文書は、投薬情報を含む、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記ラベルまたは添付文書は、使用のための指示を含む、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
前記ラベルまたは添付文書は、請求項１〜１６および２１〜５３のいずれかに記載の核酸分子が治療における使用に好適であることを示す、請求項６１〜６３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６５】
前記ラベルまたは添付文書は、請求項１〜１６および２１〜５３のいずれかに記載の核酸分子が、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１遺伝子のうちのいずれか１つの発現と関連する疾患を患う患者の治療における使用に好適であることを示す、請求項６０〜６４のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２０１１年８月３日に出願された表題「Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｈｅａｒｉｎｇ  Ｌｏｓｓ」の米国仮特許出願第６１／５１４，５４１号、および２０１２年１月１２日に出願された表題「Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｈｅａｒｉｎｇ  Ｌｏｓｓ」の米国仮特許出願第６１／５８５，６７２号の利益を主張し、これらは、その全体が、全ての目的で、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
【０００２】
本出願は、ファイル名「１２０８０３＿２０９４＿８４４０７＿ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＢＩ」として存在し、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を参照により組み込み、これは、サイズが５．０９７メガバイトであり、２０１２年８月３日にＩＢＭ−ＰＣ機形式で作成され、ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓとのオペレーティングシステム互換性を有し、本明細書とともに提出する。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、その阻害が、難聴の治療、バランス障害の治療、内耳の耳有毛（感覚）細胞の置換、再生、もしくは保護の促進、または聴覚の回復／再生に有用である、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１を含む、難聴と関連する遺伝子の下方制御のための化合物、それを含む薬学的組成物、およびそれを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡの干渉
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ依存性遺伝子に特異的な転写後サイレンシングを伴う現象である。
聴覚障害／難聴
【０００５】
後天性聴覚障害／難聴は、例えば、有害な騒音レベルへの暴露、機械的内耳外傷、加齢過程、シスプラチンおよびアミノグリコシド系抗生物質等であるがこれらに限定されない耳毒性薬物への暴露、ならびに加齢を含む、複数の要因に起因し得る。
【０００６】
本出願の代理人へのＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００７０８４６８４号および同第ＷＯ２００９／１４７６８４号は、聴覚障害および疾患の治療に有用な化合物および組成物に関する。
【０００７】
本出願の代理人への米国特許第７，８２５，０９９号は、聴覚障害を治療するためのｐ５３オリゴヌクレオチド阻害剤の使用に関する。
【０００８】
難聴の治療もしくは緩和、バランス障害の治療、内耳の耳（感覚）有毛細胞の置換、再生、もしくは保護の促進、および／または聴覚の回復／再生をもたらすことに有用な分子、組成物、方法、およびキットが、必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の発現を下方制御するための核酸分子、それを含む組成物およびキット、ならびにそれを使用する方法を、本明細書に提供する。本組成物、方法、およびキットは、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１をコードするヌクレオチド配列（例えばｍＲＮＡ配列）またはそのタンパク質、例えば、配列番号１２〜２２によって例示される１つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットをコードするヒトＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、またはＣＤＫＮ１ＢのｍＲＮＡコード配列（配列番号１〜１１）に結合する、核酸分子（例えば、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））の使用を伴い得る。ある特定の好ましい実施形態において、本明細書に開示される分子、組成物、方法、およびキットは、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ遺伝子の発現を下方制御または阻害する。種々の実施形態において、核酸分子は、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の発現を下方制御するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ等、修飾されていないか、または化学修飾されたｄｓＲＮＡ化合物からなる群から選択される。
【００１０】
いくつかの好ましい実施形態において、阻害剤は、ＨＥＳ１の発現を下方制御する、合成の化学修飾された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物である。ある特定の好ましい実施形態において、「ＨＥＳ１」は、ヒトＨＥＳ１を指す。いくつかの好ましい実施形態において、阻害剤は、ＨＥＳ５の発現を下方制御する、合成の化学修飾された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物である。ある特定の好ましい実施形態において、「ＨＥＳ５」は、ヒトＨＥＳ５を指す。いくつかの好ましい実施形態において、阻害剤は、ＨＥＹ１の発現を下方制御する、合成の化学修飾された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物である。ある特定の好ましい実施形態において、「ＨＥＹ１」は、ヒトＨＥＹ１を指す。いくつかの好ましい実施形態において、阻害剤は、ＨＥＹ２の発現を下方制御する、合成の化学修飾された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物である。ある特定の好ましい実施形態において、「ＨＥＹ２」は、ヒトＨＥＹ２を指す。いくつかの好ましい実施形態において、阻害剤は、ＩＤ１の発現を下方制御する、合成の化学修飾された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物である。ある特定の好ましい実施形態において、「ＩＤ１」は、ヒトＩＤ１を指す。いくつかの好ましい実施形態において、阻害剤は、ＩＤ２の発現を下方制御する、合成の化学修飾された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物である。ある特定の好ましい実施形態において、「ＩＤ２」は、ヒトＩＤ２を指す。いくつかの好ましい実施形態において、阻害剤は、ＩＤ３の発現を下方制御する、合成の化学修飾された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物である。ある特定の好ましい実施形態において、「ＩＤ３」は、ヒトＩＤ３を指す。いくつかの好ましい実施形態において、阻害剤は、ＣＤＫＮ１Ｂの発現を下方制御する、合成の化学修飾された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物である。ある特定の好ましい実施形態において、「ＣＤＫＮ１Ｂ」は、ヒトＣＤＫＮ１Ｂを指す。いくつかの好ましい実施形態において、阻害剤は、ＮＯＴＣＨ１の発現を下方制御する、合成の化学修飾された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物である。ある特定の好ましい実施形態において、「ＮＯＴＣＨ１」は、ヒトＮＯＴＣＨ１を指す。種々の実施形態において、２つ以上の標的遺伝子に対するｄｓＲＮＡの組み合わせが好ましい。ある特定の好ましい実施形態において、「標的遺伝子」とは、ヒト遺伝子ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１を指す。いくつかの実施形態において、好ましい標的遺伝子は、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ２、ＣＤＫＮ１Ｂ、およびＮＯＴＣＨ１からなる群から選択される。
【００１１】
本明細書に提供される化学修飾された核酸分子および組成物は、対応する非修飾核酸分子と比較した場合、血清安定性の向上、細胞取り込みの改善、オフターゲット活性の低減、免疫原性の低減、エンドソーム放出の改善、標的組織または細胞への特異的送達の改善、およびノックダウン／下方制御活性の向上のうちの少なくとも１つを含む、有益な特性を呈する。
【００１２】
障害、疾患、損傷、または状態の治療またはその発生もしくは重症度の予防を、それを必要とする対象に行う方法であって、疾患もしくは状態および／またはそれに関連する症状もしくは病態が、内耳の障害、疾患、損傷、状態、または病態等、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１遺伝子の発現と関連する、方法を本明細書にさらに開示する。いくつかの実施形態において、対象は哺乳動物である。好ましい実施形態において、対象はヒト対象である。
【００１３】
特定の実施形態において、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１を標的とする、化学修飾されたｄｓＲＮＡ化合物、それを含む組成物およびキット、ならびに耳の（耳、聴覚の）状態または病状、特に、内耳の耳（感覚）有毛細胞の死を伴う病状の治療にそれを使用する方法を、本明細書に提供する。治療される他の状態には、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の発現が有害である任意の状態が含まれ、本発明の化合物で治療される。
【００１４】
一態様において、核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）を提供し、ここで、（ａ）核酸分子は、センス鎖と相補的アンチセンス鎖とを含む、二重鎖であり、（ｂ）核酸分子の各鎖は、独立して、１８〜４９個のヌクレオチドの長さであり、（ｃ）アンチセンス鎖の１８〜４９ヌクレオチドの配列は、哺乳動物のＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、もしくはＮＯＴＣＨ１（例えば、配列番号１〜１１）またはその部分をコードするｍＲＮＡの連続する配列に相補的であり、（ｄ）センス鎖およびアンチセンス鎖は、配列番号２３〜２６，６６６のいずれかに記載される配列対を含む。いくつかの実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、配列番号２６，６６７〜２６，９１２のいずれかに記載される配列対を含む。
【００１５】
別の態様において、難聴の発生または重症度の予防を含む、その治療のための方法を提供し、ここで、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、およびＮＯＴＣＨ１遺伝子のうちの１つ以上の発現は、聴覚障害／難聴の病因または進行と関連する。
【００１６】
さらに別の態様において、バランス障害の発生または重症性の予防を含む、その治療のための方法を提供し、ここで、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、およびＮＯＴＣＨ１遺伝子のうちの１つ以上の発現は、バランス障害の病因または進行と関連する。
【００１７】
別の態様において、内耳の耳（感覚）有毛細胞消失の発生または重症度の予防を含む、その治療のための方法を提供し、ここで、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、およびＮＯＴＣＨ１遺伝子のうちの１つ以上の発現は、耳（感覚）有毛細胞消失の病因または進行と関連する。
【００１８】
本明細書に提供される阻害性核酸は、好ましくは、対応する非修飾ｄｓＲＮＡ化合物と比較した場合に、活性を向上させ、安定性を向上させ、および／または毒性を最小限に抑えることができる修飾を有する、ｄｓＲＮＡ分子である。これらの分子は、中耳および内耳への核酸の送達に作用する薬学的ビヒクルと混合した場合、種々の内耳障害の治療に有用な、有効で安全な患者適合性の治療化合物を提供する。ｄｓＲＮＡ分子は、標的遺伝子の発現を下方制御し、標的遺伝子の機能を減弱させるように設計される。ある特定の実施形態において、標的遺伝子は、表１Ａに列挙され、配列番号１〜１１に記載される、ｍＲＮＡポリヌクレオチドのうちのいずれか１つに転写される。
【００１９】
本明細書に提供されるｄｓＲＮＡ分子は、二本鎖の化学修飾されたオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、化学修飾されたｄｓＲＮＡ分子のＲＮＡを生成するのに有用なセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２３〜２６９１２に記載されるセンス鎖オリゴヌクレオチドおよび対応するアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドから選択される。
【００２０】
本明細書に開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）の種々の実施形態において、アンチセンス鎖は、１８〜４９個のヌクレオチドの長さ（例えば、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、もしくは４９個のヌクレオチドの長さ）、または１８〜３５個のヌクレオチドの長さ、または１８〜３０個のヌクレオチドの長さ、または１８〜２５個のヌクレオチドの長さ、または１８〜２３個のヌクレオチドの長さ、または１９〜２１個のヌクレオチドの長さ、または２５〜３０個のヌクレオチドの長さ、または２６〜２８個のヌクレオチドの長さであり得る。本明細書に開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のいくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、１９個のヌクレオチドの長さである。同様に、本明細書に開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のセンス鎖は、１８〜４９個のヌクレオチドの長さ（例えば、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、もしくは４９個のヌクレオチドの長さ）、または１８〜３５個のヌクレオチドの長さ、または１８〜３０個のヌクレオチドの長さ、または１８〜２５個のヌクレオチドの長さ、または１８〜２３個のヌクレオチドの長さ、または１９〜２１個のヌクレオチドの長さ、または２５〜３０個のヌクレオチドの長さ、または２６〜２８個のヌクレオチドの長さであり得る。本明細書に開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のいくつかの実施形態において、センス鎖は、１９個のヌクレオチドの長さである。本明細書に開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のいくつかの実施形態において、アンチセンス鎖およびセンス鎖のそれぞれは、１９個のヌクレオチドの長さである。本明細書に開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）の二重鎖領域は、１８〜４９個のヌクレオチドの長さ（例えば、約１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、もしくは４９個のヌクレオチドの長さ）、１８〜３５個のヌクレオチドの長さ、または１８〜３０個のヌクレオチドの長さ、または１８〜２５個のヌクレオチドの長さ、または１８〜２３個のヌクレオチドの長さ、または１８〜２１個のヌクレオチドの長さ、または２５〜３０個のヌクレオチドの長さ、または２５〜２８個のヌクレオチドの長さであり得る。本明細書に開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）の種々の実施形態において、二重鎖領域は、１９個のヌクレオチドの長さである。
【００２１】
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ核酸分子）のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、別個のオリゴヌクレオチド鎖である。いくつかの実施形態において、別個のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、水素結合、例えば、ワトソンクリック塩基対合を介して、二重鎖としても知られる二本鎖構造を形成する。いくつかの実施形態において、１つ以上のヌクレオチド対は、非ワトソンクリック塩基対を形成する。いくつかの実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、互いに共有結合した２つの別個の鎖である。他の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、センス領域およびアンチセンス領域の両方を有する単一のオリゴヌクレオチドの一部であり、いくつかの好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ヘアピン構造を有する。
【００２２】
ある特定の実施形態において、核酸分子は、オーバーハングに関して対称的であり、両端に平滑末端を有する、二本鎖核酸（ｄｓＲＮＡ）分子である。他の実施形態において、核酸分子は、オーバーハングに関して対称的であり、ｄｓＲＮＡ分子の両端にヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド、またはヌクレオチドと非ヌクレオチドの組み合わせのオーバーハングを有する、ｄｓＲＮＡ分子である。ある特定の好ましい実施形態において、核酸分子は、オーバーハングに関して非対称的であり、分子の一端に平滑末端を有し、分子の他端にオーバーハングを有する、ｄｓＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、非対称ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖に生じる二重鎖の片側に３’−オーバーハングを有し、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の５’末端の両方に生じる分子の反対側に、平滑末端を有する。いくつかの実施形態において、非対称ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖に生じる二重鎖の片側に５’−オーバーハングを有し、センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端の両方に生じる分子の反対側に平滑末端を有する。他の実施形態において、非対称ｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖に生じる二重鎖の片側に３’−オーバーハングを有し、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の５’末端の両方に生じる分子の反対側に平滑末端を有する。いくつかの実施形態において、非対称ｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖に生じる二重鎖の片側に５’−オーバーハングを有し、センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端の両方に生じる分子の反対側に平滑末端を有する。いくつかの実施形態において、オーバーハングはヌクレオチドオーバーハングであり、他の実施形態において、オーバーハングは非ヌクレオチドオーバーハングである。いくつかの実施形態において、オーバーハングは５’オーバーハングであり、代替的な実施形態において、オーバーハングは３’オーバーハングである。
【００２３】
いくつかの実施形態において、核酸分子は、一端にループ構造を有し、他端に平滑末端を有する、ヘアピン構造（１つのオリゴヌクレオチドにセンス鎖およびアンチセンス鎖を有する）を有する。いくつかの実施形態において、核酸分子は、一端にループ構造を有し、他端にオーバーハング末端を有する、ヘアピン構造を有し、ある特定の実施形態において、オーバーハングは３’−オーバーハングであり、ある特定の実施形態において、オーバーハングは５’−オーバーハングであり、ある特定の実施形態において、オーバーハングはセンス鎖にあり、ある特定の実施形態において、オーバーハングはアンチセンス鎖にある。
【００２４】
本明細書に開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、本明細書に記載されるような、１つ以上の修飾または修飾ヌクレオチドを含み得る。例えば、本明細書に提供される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、修飾糖を有する修飾ヌクレオチド、修飾核酸塩基を有する修飾ヌクレオチド、修飾リン酸基を有する修飾ヌクレオチドを含み得る。同様に、本明細書に提供される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、修飾リン酸ジエステル骨格を含んでもよく、および／または修飾末端リン酸基を含んでもよい。
【００２５】
本明細書に提供される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、例えば、本明細書に記載されるような、修飾糖部分を含む、１つ以上のリボヌクレオチドを含み得る。修飾糖部分の非限定的な例は、２’アルコキシ修飾糖部分である。いくつかの好ましい実施形態において、核酸は、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチドを含む。
【００２６】
本明細書に提供される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、例えば本明細書に記載されるような、１つ以上の修飾核酸塩基（複数可）を有し得る。
【００２７】
本明細書に提供される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、例えば本明細書に記載されるような、リン酸ジエステル骨格に対する１つ以上の修飾を含んでもよい。
【００２８】
本明細書に提供される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、例えば本明細書に記載されるような、１つ以上の修飾リン酸基（複数可）を有し得る。
【００２９】
種々の実施形態において、提供される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、非修飾アンチセンス鎖および１つ以上の修飾を有するセンス鎖を含み得る。いくつかの実施形態において、提供される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、非修飾センス鎖および１つ以上の修飾を有するアンチセンス鎖を含み得る。好ましい実施形態において、提供される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方に１つ以上の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。
【００３０】
本明細書に提供される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’末端にリン酸基を含み得る（すなわち、５’末端リン酸基）。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の５’末端にリン酸基を含んでもよい。
【００３１】
本明細書に提供される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端にリン酸基を含み得る（すなわち、３’末端リン酸基）。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端にリン酸基を含んでもよい。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、アンチセンス鎖およびセンス鎖の３’末端にリン酸基を含み得る。
【００３３】
本明細書に開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のいくつかの実施形態において、核酸分子のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、３’末端および５’末端の両方でリン酸化されていない。
【００３４】
いくつかの実施形態において、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１遺伝子の発現を下方制御するのに有用な二本鎖核酸化合物を提供する。いくつかの実施形態において、構造（Ａ１）を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であって、
【表１】
2014528704.tif 000002
式中、各ＮおよびＮ’は、非修飾もしくは修飾、または非従来的部分であり得るリボヌクレオチドであり、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、オリゴヌクレオチドであり、それぞれの連続するＮまたはＮ’が共有結合によって次のＮまたはＮ’と接合し、
ＺおよびＺ’のそれぞれは、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した１〜５個の連続するヌクレオチド、１〜５個の連続する非ヌクレオチド部分、またはそれらの組み合わせを含み、
ｚ"は、存在しても不在であってもよいが、存在する場合は、（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合したキャッピング部分であり、
ｘおよびｙのそれぞれは、独立して、１８〜４０の整数であり、
（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に相補的であり、（Ｎ）ｘは、アンチセンス配列を含み、（Ｎ’）ｙは、配列番号２３−６９３および２６６９１−２６７０６（ＨＥＳ１）、配列番号１４９６−２０２９および２６７２５−２６７３２（ＨＥＳ５）、配列番号２７０４−３０２５および２６８０９−２６８１６（ＩＤ１）、配列番号３６３４−５０５３および２６８２５−２６８３２（ＩＤ２）、配列番号６２０６−６６７１および２６８５１−２６８６６（ＩＤ３）、配列番号７４４４−９００７および２６８８７−２６９００（ＣＤＫＮ１Ｂ）、配列番号１０５３４−１１５４９および２６７６１−２６７７８（ＨＥＹ１）、配列番号１３００４−１４８０１および２６７８５−２６７８８（ＨＥＹ２）、配列番号１６６２２−１８６４３および２６９２２−２６９１２（ＮＯＴＣＨ１）のいずれか１つに記載される、センス配列を含む、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を本明細書に提供する。
【００３５】
いくつかの実施形態において、好ましい（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、配列番号２６６９１〜２６７０６（ＨＥＳ１）、配列番号２６７２５〜２６７３２（ＨＥＳ５）、配列番号２６８０９〜２６８１６（ＩＤ１）、配列番号２６８２５〜２６８３２（ＩＤ２）、配列番号２６８５１〜２６８６６（ＩＤ３）、配列番号２６８８７〜２６９００（ＣＤＫＮ１Ｂ）、配列番号２６７６１〜２６７７８（ＨＥＹ１）、配列番号２６７８５〜２６７８８（ＨＥＹ２）、配列番号２６９２２〜２６９１２（ＮＯＴＣＨ１）のいずれかに記載される。
【００３６】
いくつかの実施形態において、各連続するＮおよび／またはＮ’を接合する共有結合は、リン酸ジエステル結合である。
【００３７】
いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙであり、ｘおよびｙのそれぞれは、１９、２０、２１、２２、または２３である。好ましい実施形態においては、ｘ＝ｙ＝１９である。
【００３８】
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、ＨＥＳ５＿８（配列番号２６７３２および２６７２８）として記載される核酸から選択される（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙを含む。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘは、少なくとも１つの２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンまたはプリンリボヌクレオチド、任意で７位の２’５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分（Ｚ）を含み、（Ｎ’）ｙは、少なくとも１つの２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドおよび／または３’末端位置（５’から３’の方向）に３〜５個の連続する２’５’リボヌクレオチドを含み、ｚ’は存在し、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分（Ｚ"）は３’末端に共有結合する。いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘにおいて、１〜８個のピリミジンは２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドであり、２’５’リボヌクレオチドは７位に存在し、Ｚは存在し、（Ｎ’）ｙは、１５〜１９位に５個の２’−５’リボヌクレオチドを含み、ｚ"は存在し、Ｚ’は存在する。好ましい実施形態において、ｚ"は、逆位脱塩基部分を含み、Ｚ’は、Ｃ３Ｐｉ部分を含み、Ｚは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、ＣＤＫＮ１Ｂ＿４（配列番号２６８９４および２６８８７）として記載される核酸から選択される（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙを含む。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘは、少なくとも１つの２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンまたはプリンリボヌクレオチド、任意で７位の２’５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分（Ｚ）を含み、（Ｎ’）ｙは、少なくとも１つの２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドおよび／または３’末端位置（５’から３’の方向）に３〜５個の連続する２’５’リボヌクレオチドを含み、ｚ’は存在し、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分（Ｚ"）は３’末端に共有結合する。いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘにおいて、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドは、１、１３、および１７位に存在し、任意で、２’５’リボヌクレオチドは、７位に存在し、Ｚは、存在し、（Ｎ’）ｙは、２、１１、１５、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含み、ｚ"は、存在し、Ｚ’は存在する。好ましい実施形態において、ｚ"は、逆位脱塩基部分またはアミノＣ３部分を含み、Ｚ’は、Ｃ３Ｐｉ部分を含み、Ｚは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む。
【００４０】
本明細書において構造（Ａ１）で開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のいくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、またはｍｉＲＮＡである。本明細書において開示される構造（Ａ１）の核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のいくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、化学修飾されたｓｉＲＮＡである。
【００４１】
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、アンチセンス鎖の１位（５’末端）にＤＮＡ部分または標的に対するミスマッチを含む。このような二重鎖構造を本明細書に説明する。一実施形態によると、以下に記載される構造（Ａ２）を有する二本鎖ｄｓＲＮＡ分子であって、
【表２】
2014528704.tif 000003
式中、各Ｎ１、Ｎ２、Ｎ、およびＮ’は、独立して、非修飾もしくは修飾ヌクレオチド、または非従来的部分であり、
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、オリゴヌクレオチドであり、それぞれの連続するＮまたはＮ’は、共有結合によって隣接するＮまたはＮ’と接合し、
ｘおよびｙのそれぞれは、独立して、１７〜３９の整数であり、
Ｎ２は、（Ｎ’）ｙと共有結合し、
Ｎ１は、（Ｎ）ｘと共有結合し、標的ｍＲＮＡ（配列番号１〜１１）に対してミスマッチであるか、または標的ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ部分であり、
Ｎ１は、天然もしくは修飾された、ウリジン、デオキシリボウリジン、リボチミジン、デオキシリボチミジン、アデノシン、またはデオキシアデノシン、脱塩基リボース部分、および脱塩基デオキシリボース部分からなる群から選択される部分であり、
ｚ"は、存在しても不在であってもよいが、存在する場合は、Ｎ２−（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合したキャッピング部分であり、
ＺおよびＺ’のそれぞれは、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した１〜５個の連続するヌクレオチド、１〜５個の連続する非ヌクレオチド部分、またはそれらの組み合わせであり、
（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に相補的であり、（Ｎ）ｘの配列は、アンチセンス配列を含み、（Ｎ’）ｙは、配列番号６９４〜１４９５および２６６６７〜２６６９０（ＨＥＳ１）、配列番号２０３０〜２７０３および２６７０７〜２６７２４（ＨＥＳ５）、配列番号３０２６〜３６３３および２６７８９〜２６８０８（ＩＤ１）、配列番号５０５４〜６２０５および２６８１７〜２６８２４（ＩＤ２）、配列番号６６７２〜７４４３および２６８３３〜２６８５０（ＩＤ３）、配列番号９００８〜１０５３３および２６８６７〜２６８８６（ＣＤＫＮ１Ｂ）、配列番号１１５５０〜１３００３および２６７３３〜２６７６０（ＨＥＹ１）、配列番号１４８０２〜１６３８９および２６７７９〜２６７８４（ＨＥＹ２）、配列番号１８６４４〜２６６６６および２６０１〜２６９１０（ＮＯＴＣＨ１）のいずれかに記載されるセンス配列を含む、二本鎖ｄｓＲＮＡ分子を本明細書に提供する。好ましい（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、配列番号２６６６７〜２６６９０（ＨＥＳ１）、配列番号２６７０７〜２６７２４（ＨＥＳ５）、配列番号２６７８９〜２６８０８（ＩＤ１）、配列番号２６８１７〜２６８２４（ＩＤ２）、配列番号２６８３３〜２６８５０（ＩＤ３）、配列番号２６８６７〜２６８８６（ＣＤＫＮ１Ｂ）、配列番号２６７３３〜２６７６０（ＨＥＹ１）、配列番号２６７７９〜２６７８４（ＨＥＹ２）、配列番号２６０１〜２６９１０（ＮＯＴＣＨ１）のいずれかに記載される。構造（Ａ２）の記述に含まれる分子はまた、「１８＋１」または「１８＋１量体」とも称される。
【００４２】
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ化合物を生成するのに有用なＮ２−（Ｎ’）ｙおよびＮ１−（Ｎ）ｘを、表Ｉ〜ＩＸ、特に「１８＋１」型と示される配列に提示する。
【００４３】
構造（Ａ２）のある特定の実施形態において、本明細書に開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）の（Ｎ）ｘは、配列番号２３〜２６９１２のアンチセンス配列のいずれか１つに対応する配列を含む。ある特定の好ましい実施形態において、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、表Ｉ〜ＩＸ（配列番号２６６６７〜２６９１２）に示される配列対から選択される。
【００４４】
構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に完全に相補的である。種々の実施形態において、Ｎ２−（Ｎ’）ｙの配列は、Ｎ１−（Ｎ）ｘの配列に相補的である。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘは、配列番号１〜１１に記載される標的ｍＲＮＡ中の約１７〜約３９個の連続するヌクレオチドに完全に相補的なアンチセンスを含む。他の実施形態において、（Ｎ）ｘは、配列番号１〜１１に記載される標的ｍＲＮＡ中約１７〜約３９個の連続するヌクレオチドに実質的に相補的なアンチセンスを含む。
【００４５】
構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、Ｎ１およびＮ２は、ワトソンクリック塩基対を形成する。他の実施形態において、Ｎ１およびＮ２は、非ワトソンクリック塩基対を形成する。いくつかの実施形態において、塩基対は、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの間で形成される。
【００４６】
構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８、ｘ＝ｙ＝１９、またはｘ＝ｙ＝２０である。好ましい実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８である。Ｎ１−（Ｎ）ｘにおいてｘ＝１８である場合、Ｎ１は、１位を指し、２〜１９位は、（Ｎ）１８に含まれる。Ｎ２−（Ｎ’）ｙにおいてｙ＝１８である場合、Ｎ２は、１９位を指し、１〜１８位は、（Ｎ’）１８に含まれる。
【００４７】
構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、Ｎ１は、（Ｎ）ｘと共有結合し、配列番号１〜１１に記載される標的ｍＲＮＡに対してミスマッチである。種々の実施形態において、Ｎ１は、（Ｎ）ｘと共有結合し、配列番号１〜１１に記載される標的ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ部分である。
【００４８】
構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の１位のウリジンは、天然もしくは修飾された、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、デオキシウリジン（ｄＵ）、リボチミジン、またはデオキシチミジンから選択されるＮ１で置換される。種々の実施形態において、Ｎ１は、天然もしくは修飾された、アデノシン、デオキシアデノシン、またはデオキシウリジンから選択される。例えば、いくつかの実施形態において、１位のシチジンは、アデニンまたはウリジンと置き換えられ、１位のグアノシンは、アデニンまたはウリジンと置き換えられるか、あるいはアデニンがウリジンと置き換えられる。
【００４９】
構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の１位（Ｎ１）のグアノシンは、天然もしくは修飾された、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、デオキシウリジン、リボチミジン、またはデオキシチミジンで置換される。種々の実施形態において、Ｎ１は、天然もしくは修飾された、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、またはデオキシウリジンから選択される。
【００５０】
構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の１位（Ｎ１）のシチジンは、天然もしくは修飾された、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、デオキシウリジン、リボチミジン、またはデオキシチミジンで置換される。種々の実施形態において、Ｎ１は、天然もしくは修飾された、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、またはデオキシウリジンから選択される。
【００５１】
構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の１位（Ｎ１）のアデノシンは、天然もしくは修飾された、デオキシアデノシン、デオキシウリジン、リボチミジン、またはデオキシチミジンで置換される。
【００５２】
構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、Ｎ１およびＮ２は、天然もしくは修飾された、ウリジンまたはデオキシウリジンとアデノシンまたはデオキシアデノシンとの間で塩基対を形成する。他の実施形態において、Ｎ１およびＮ２は、天然または修飾された、デオキシウリジンとアデノシンとの間で塩基対を形成する。
【００５３】
構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、またはｍｉＲＮＡである。本明細書に提供される二本鎖核酸分子はまた、「二重鎖」とも称される。本明細書において開示される構造（Ａ２）による核酸分子（例えばｄｓＲＮＡ分子）のいくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、化学修飾されたｓｉＲＮＡである。
【００５４】
構造（Ａ２）のある特定の好ましい実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８である。いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ）ｘは、配列番号６９４〜１４９５および２６６６７〜２６６９０（ＨＥＳ１）、配列番号２０３０〜２７０３および２６７０７〜２６７２４（ＨＥＳ５）、配列番号３０２６〜３６３３および２６７８９〜２６８０８（ＩＤ１）、配列番号５０５４〜６２０５および２６８１７〜２６８２４（ＩＤ２）、配列番号６６７２〜７４４３および２６８３３〜２６８５０（ＩＤ３）、配列番号９００８〜１０５３３および２６８６７〜２６８８６（ＣＤＫＮ１Ｂ）、配列番号１１５５０〜１３００３および２６７３３〜２６７６０（ＨＥＹ１）、配列番号１４８０２〜１６３８９および２６７７９〜２６７８４（ＨＥＹ２）、配列番号１８６４４〜２６６６６および２６０１〜２６９１０（ＮＯＴＣＨ１）に存在するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる。
【００５５】
いくつかの実施形態において、Ｎ１は、天然ウリジンおよび修飾ウリジンから選択される。いくつかの実施形態において、Ｎ１は、天然ウリジンである。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、（Ｎ’）ｙは、配列番号６９４〜１４９５（ＨＥＳ１）、配列番号２０３０〜２７０３（ＨＥＳ５）、配列番号３０２６〜３６３３（ＩＤ１）、配列番号５０５４〜６２０５（ＩＤ２）、配列番号６６７２〜７４４３（ＩＤ３）、配列番号９００８〜１０５３３（ＣＤＫＮ１Ｂ）、配列番号１１５５０〜１３００３（ＨＥＹ１）、配列番号１４８０２〜１６３８９（ＨＥＹ２）、配列番号１８６４４〜２６６６６（ＮＯＴＣＨ１）に記載される配列対に存在するセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００５６】
いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、配列番号２６６６７〜２６６９０（ＨＥＳ１）、配列番号２６７０７〜２６７２４（ＨＥＳ５）、配列番号２６７８９〜２６８０８（ＩＤ１）、配列番号２６８１７〜２６８２４（ＩＤ２）、配列番号２６８３３〜２６８５０（ＩＤ３）、配列番号２６８６７〜２６８８６（ＣＤＫＮ１Ｂ）、配列番号２６７３３〜２６７６０（ＨＥＹ１）、配列番号２６７７９〜２６７８４（ＨＥＹ２）、配列番号２６０１〜２６９１０（ＮＯＴＣＨ１）に記載される配列対に存在するセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００５７】
いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１は、天然または修飾ウリジン、天然または修飾アデニン、および天然または修飾チミジンから選択される。
【００５８】
構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、Ｎ１は、２’ＯＭｅ糖修飾ウリジンまたは２’ＯＭｅ糖修飾アデノシンである。構造（Ａ２）のある特定の実施形態において、Ｎ２は、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。
【００５９】
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、ＨＥＳ１＿３６（配列番号２６６９０および２６６７８）として記載される核酸から選択される（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙを含む。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘは、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、任意で、５、６、または７位のうちの少なくとも１つに２’−５’リボヌクレオチドとを含み、（Ｎ’）ｙは、少なくとも１つの２’５’リボヌクレオチドまたは２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、ｚ’’は存在し、ＺおよびＺ’のそれぞれは、存在し、それが存在する鎖の３’末端に共有結合した非ヌクレオチド部分からなる。好ましい実施形態において、（Ｎ）ｘは、３、９、１１、および１５位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含み、（Ｎ’）ｙは、３’末端の１５、１６、１７、１８、および１９位に５個の２’５’リボヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、ｚ"は、逆位脱塩基部分を含み、Ｚ’は、Ｃ３Ｐｉ部分を含み、Ｚは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、ＨＥＳ１＿１４（配列番号２６６８１および２６６６９）として記載される核酸から選択される（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙを含む。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘは、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、任意で、５、６、または７位のうちの少なくとも１つに２’−５’リボヌクレオチドとを含み、（Ｎ’）ｙは、少なくとも１つの２’５’リボヌクレオチドまたは２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、ｚ’’は存在し、ＺおよびＺ’のそれぞれは、存在し、それが存在する鎖の３’末端に共有結合した非ヌクレオチド部分からなる。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘは、１、３、９、１１、１５、および１８位（５’から３’の方向）に、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含み、（Ｎ’）ｙは、１位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、３’末端の１５、１６、１７、１８、および１９位（５’から３’の方向）に５個の連続する２’５’リボヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘは、１、３、９、１１、１４、１５、および１８位（５’から３’の方向）に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位に２’５’リボヌクレオチドとを含み、（Ｎ’）ｙは、１位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、３’末端の１５、１６、１７、１８、および１９位（５’から３’の方向）に５個の連続する２’５’リボヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘは、１、３、９、１１、１４、１５、および１８位（５’から３’の方向）に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位に存在する２’５’リボヌクレオチドとを含み、Ｚは存在し、（Ｎ’）ｙは、１、４、８、１０、１２、および１６位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含み、ｚ"およびＺ’は、存在する。好ましい実施形態において、ｚ"は、逆位脱塩基部分を含み、Ｚ’は、Ｃ３Ｐｉ部分を含み、Ｚは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、ＨＥＹ２＿１（配列番号２６７４７および２６７３３）として記載される核酸から選択される（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙを含む。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘは、少なくとも１つの２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンリボヌクレオチド、任意で７位の２’５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分を含み、（Ｎ’）ｙは、少なくとも１つの２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、および／または３’末端の位置（５’から３’の方向）に３〜５個の連続する２’５’リボヌクレオチドを含み、ｚ’は存在し、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分は３’末端に共有結合する。いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘにおいて、ピリミジンリボヌクレオチドのうちの１〜８個は、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドであり、２’５’リボヌクレオチドは７位に存在し、Ｚは存在し、（Ｎ’）ｙは、ピリミジンリボヌクレオチドのうちの１〜８個を含み、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドであり、ｚ"は存在し、Ｚ’は存在する。好ましい実施形態において、ｚ"は、逆位脱塩基部分を含み、Ｚ’は、Ｃ３Ｐｉ部分を含み、Ｚは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む。
【００６２】
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、ＨＥＹ２＿２（配列番号２６７４８および２６７３４）として記載される核酸から選択される（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙを含む。いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、ＨＥＹ２＿１（配列番号２６７４７および２６７３３）として記載される核酸から選択される（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙを含む。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘは、少なくとも１つの２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンリボヌクレオチド、任意で７位の２’５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分を含み、（Ｎ’）ｙは、少なくとも１つの２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、および／または３’末端の位置（５’から３’の方向）に３〜５個の連続する２’５’リボヌクレオチドを含み、ｚ’は存在し、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分は３’末端に共有結合する。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘにおいて、ピリミジンリボヌクレオチドのうちの１〜８個は、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドであり、２’５’リボヌクレオチドは、７位に存在し、Ｚは存在し、（Ｎ’）ｙは、ピリミジンリボヌクレオチドのうちの１〜８個を含み、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドであり、ｚ"は存在し、Ｚ’は存在する。好ましい実施形態において、ｚ"は、逆位脱塩基部分を含み、Ｚ’は、Ｃ３Ｐｉ部分を含み、Ｚは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む。
【００６３】
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、ＣＤＫＮ１Ｂ＿３１（配列番号２６８７９および２６８６９）として記載される核酸から選択される（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙを含む。いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、ＨＥＹ２＿１（配列番号２６７４７および２６７３３）として記載される核酸から選択される（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙを含む。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘは、少なくとも１つの２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンリボヌクレオチド、任意で７位の２’５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分を含み、（Ｎ’）ｙは、少なくとも１つの２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、および／または３’末端の位置（５’から３’の方向）に３〜５個の連続する２’５’リボヌクレオチドを含み、ｚ’は存在し、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分は３’末端に共有結合する。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘにおいて、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドは、１、１３、および１７位、または１、９、１３、１５、および１８位に存在し、任意で、２’５’リボヌクレオチドが７位に存在し、Ｚは存在し、（Ｎ’）ｙは、２、６、１１、１２、１３、１６、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含み、ｚ"は存在し、Ｚ’は存在する。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘにおいて、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドは、１、１３、および１７位、または１、９、１３、１５、および１８位に存在し、任意で２’５’リボヌクレオチドが７位に存在し、Ｚは存在し、（Ｎ’）ｙは、１５〜１９位に２’５’リボヌクレオチドを含み、ｚ"は存在し、Ｚ’は存在する。好ましい実施形態において、ｚ"は、逆位脱塩基部分を含み、Ｚ’は、Ｃ３Ｐｉ部分を含み、Ｚは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、ＮＯＴＣＨ１＿２（配列番号２６９０７および２６９０２）として記載される核酸から選択される（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙを含む。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘは、少なくとも１つの２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンまたはプリンリボヌクレオチド、任意で７位の２’５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分（Ｚ）を含み、（Ｎ’）ｙは、少なくとも１つの２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドおよび／または３’末端位置（５’から３’の方向）に３〜５個の連続する２’５’リボヌクレオチドを含み、ｚ’は存在し、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分（Ｚ"）は３’末端に共有結合する。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘにおいて２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドは、１、１３、および１７位、または１、３、５、９、１１、および１７位に存在し、任意で２’５’リボヌクレオチドが７位に存在し、Ｚは存在し、（Ｎ’）ｙは、１５および１７位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含み、ｚ"は存在し、Ｚ’は存在する。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘにおいて２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドは、１、１３、および１７位、または１、３、５、９、１１、および１７位に存在し、任意で２’５’リボヌクレオチドが７位に存在し、Ｚは存在し、（Ｎ’）ｙは、１５〜１９位に５個の２’−５’リボヌクレオチドを含み、ｚ"が存在し、Ｚ’が存在する。好ましい実施形態において、ｚ"は、逆位脱塩基部分を含み、Ｚ’は、Ｃ３Ｐｉ部分を含み、Ｚは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む。
【００６５】
構造（Ａ１）および／または構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、各Ｎは、非修飾リボヌクレオチドからなる。構造（Ａ１）および／または構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、各Ｎ’は、非修飾リボヌクレオチドからなる。好ましい実施形態において、Ｎおよび／またはＮ’のうちの少なくとも１つは、化学修飾されたリボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチド、化学修飾されたデオキシリボヌクレオチド、または非従来的部分を含む。いくつかの実施形態において、非従来的部分は、ミラーヌクレオチド、脱塩基リボース部分、および脱塩基デオキシリボース部分から選択される。いくつかの実施形態において、非従来的部分は、ミラーヌクレオチド、好ましくはＬ−ＤＮＡ部分である。いくつかの実施形態において、ＮまたはＮ’のうちの少なくとも１つは、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。
【００６６】
構造（Ａ１）および／または構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に完全に相補的である。構造（Ａ１）および／または構造（Ａ２）の他の実施形態において、（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に実質的に相補的である。
【００６７】
構造（Ａ１）および／または構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘは、配列番号１〜１１のいずれか１つに記載される標的ｍＲＮＡ中の約１７〜約３９個の連続するヌクレオチドに完全に相補的なアンチセンス配列を含む。構造（Ａ１）および／または構造（Ａ２）の他の実施形態において、（Ｎ）ｘは、配列番号１〜１１のいずれか１つに記載される標的ｍＲＮＡ中の約１７〜約３９個の連続するヌクレオチドに実質的に相補的なアンチセンスを含む。構造（Ａ１）および／または構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ化合物は、平滑末端であり、例えば、ｚ"、Ｚ、およびＺ’のそれぞれは、不在である。代替的な実施形態において、ｚ"、Ｚ、またはＺ’のうちの少なくとも１つが、存在する。
【００６８】
種々の実施形態において、ＺおよびＺ’は、独立して、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む１つ以上の共有結合した修飾および非修飾ヌクレオチド、あるいは本明細書に定義される、１つ以上の非従来的部分、例えば、逆位脱塩基デオキシリボース部分もしくは脱塩基リボース部分、またはミラーヌクレオチド、１つ以上の非ヌクレオチドＣ３部分もしくはその誘導体、非ヌクレオチドＣ４部分もしくはその誘導体、または非ヌクレオチドＣ５部分もしくはその誘導体、非ヌクレオチドアミノ−Ｃ６部分もしくはその誘導体等を含む。いくつかの実施形態において、Ｚ’は不在であり、Ｚは存在し、１つ以上の非ヌクレオチドＣ３部分を含む。いくつかの実施形態において、Ｚは不在であり、Ｚ’は存在し、１つ以上の非ヌクレオチドＣ３部分を含む。いくつかの実施形態において、ＺおよびＺ’のそれぞれは、独立して、１つ以上の非ヌクレオチドＣ３部分または１つ以上の非ヌクレオチドアミノ−Ｃ６部分を含む。いくつかの実施形態では、ｚ"が存在し、ミラーヌクレオチド、脱塩基部分、および逆位脱塩基部分から選択される。構造（Ａ１）および／または（Ａ２）のいくつかの実施形態において、ＺおよびＺ’のそれぞれは、脱塩基部分、例えば、デオキシリボ脱塩基部分（本明細書に「ｄＡｂ」と称される）またはリボ脱塩基部分（本明細書に「ｒＡｂ」と称される）を含む。いくつかの実施形態において、各Ｚおよび／またはＺ’は、２つの共有結合した脱塩基部分を含み、これは、例えば、ｄＡｂ−ｄＡｂ、またはｒＡｂ−ｒＡｂ、またはｄＡｂ−ｒＡｂ、またはｒＡｂ−ｄＡｂであり、各部分は、好ましくはリンに基づく結合を介して、隣接する部分と共有結合する。いくつかの実施形態において、リンに基づく結合には、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート、またはリン酸ジエステル結合が含まれる。好ましい実施形態において、リンに基づく結合は、リン酸ジエステル結合である。
【００６９】
一部の実施形態において、Ｚおよび／またはＺ’のそれぞれは、独立して、アルキル部分、任意で、プロパン［（ＣＨ２）３］部分（Ｃ３）または例えばプロパノール（Ｃ３ＯＨ）を含むその誘導体、およびプロパンジオールのリン誘導体（「Ｃ３Ｐｉ」）を含む。いくつかの実施形態において、Ｚおよび／またはＺ’のそれぞれは、２つのアルキル部分を含み、いくつかの例では、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨである。Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨの例では、アンチセンス鎖の３’末端および／またはセンス鎖の３’末端は、リンに基づく結合を介してＣ３部分に共有結合し、Ｃ３部分は、リンに基づく結合を介してＣ３ＯＨ部分に共有結合する。いくつかの実施形態において、リンに基づく結合には、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート、またはリン酸ジエステル結合が含まれる。好ましい実施形態において、リンに基づく結合は、リン酸ジエステル結合である。
【００７０】
構造（Ａ１）および構造（Ａ２）の具体的な実施形態において、Ｚは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨを含む。構造（Ａ１）および構造（Ａ２）の具体的な実施形態において、Ｚ’は、Ｃ３ＰｉまたはＣ３ＯＨを含む。構造（Ａ１）および構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、アンチセンス鎖の３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、およびセンス鎖の３’末端に共有結合したＣ３ＰｉまたはＣ３ＯＨ部分を含む。
【００７１】
構造（Ａ１）および／または構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、各Ｎは、非修飾リボヌクレオチドからなる。構造（Ａ１）および／または構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、各Ｎ’は、非修飾リボヌクレオチドからなる。好ましい実施形態において、Ｎおよび／またはＮ’のうちの少なくとも１つは、化学修飾されたリボヌクレオチド、非修飾デオキシリボヌクレオチド、化学修飾されたデオキシリボヌクレオチド、または非従来的部分である。
【００７２】
他の実施形態において、構造（Ａ１）および／または構造（Ａ２）の化合物は、糖残基で修飾された少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、化合物は、糖残基の２’位に修飾を含む。いくつかの実施形態において、２’位における修飾は、アミノ部分、フルオロ部分、アルコキシ部分、またはアルキル部分の存在を含む。ある特定の実施形態において、２’修飾はアルコキシ部分を含む。好ましい実施形態において、アルコキシ部分はメトキシ部分（２’−Ｏ−メチル、２’ＯＭｅ、２’ＯＭｅ、２’−ＯＣＨ３とも称される）である。いくつかの実施形態において、核酸化合物は、アンチセンス鎖およびセンス鎖のうちの１つまたは両方に、２’ＯＭｅ糖修飾交互リボヌクレオチドを含む。他の実施形態において、この化合物は、アンチセンス鎖（Ｎ）ｘまたはＮ１−（Ｎ）ｘのみに２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドと交互である。ある特定の実施形態において、アンチセンス鎖の中央のリボヌクレオチド、例えば、１９量体鎖の１０位のリボヌクレオチドは非修飾である。種々の実施形態において、核酸化合物は、少なくとも５個の交互の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチドを含む。さらなるの実施形態において、構造（Ａ１）および／または（Ａ２）の化合物は、交互の位置に修飾リボヌクレオチドを含み、（Ｎ）ｘまたはＮ１−（Ｎ）ｘの５’末端および３’末端の各リボヌクレオチドは、その糖残基において修飾されており、（Ｎ’）ｙまたはＮ２−（Ｎ）ｙの５’末端および３’末端の各リボヌクレオチドは、その糖残基において非修飾である。種々の実施形態において、交互の位置のリボヌクレオチドは、糖残基の２’位で修飾されている。
【００７３】
いくつかの実施形態において、核酸化合物は、例えば、１、３、５、７、および９位、または１１、１３、１５、１７、１９位（５’から３’の方向）に、少なくとも５個の交互の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、構造（Ａ１）の（Ｎ）ｘまたは構造（Ａ２）のＮ１−（Ｎ）ｘは、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、および１９位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、構造（Ａ１）の（Ｎ）ｘまたは構造（Ａ２）のＮ１−（Ｎ）ｘは、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、構造（Ａ１）の（Ｎ）ｘまたは構造（Ａ２）のＮ１−（Ｎ）ｘは、１つ以上のピリミジンに２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。
【００７４】
構造（Ａ１）および／または（Ａ２）のいくつかの実施形態において、センス鎖もアンチセンス鎖も、３’末端および５’末端でリン酸化されていない。他の実施形態において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のうちの１つまたは両方が、３’末端でリン酸化されている。他の実施形態において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のうちの１つまたは両方が、５’末端でリン酸化されている。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される二本鎖分子は、次の修飾のうちの１つ以上を含む：
アンチセンス鎖の５’末端から５、６、７、８、または９位のうちの少なくとも１つの位置のＮは、ＤＮＡ、ＴＮＡ、２’５’ヌクレオチド、またはミラーヌクレオチドから選択される、
センス鎖の５’末端から９または１０位のうちの少なくとも１つの位置のＮ’は、ＴＮＡ、２’５’ヌクレオチド、および擬似ウリジンから選択される、
（Ｎ’）ｙの３’末端における４、５、または６個の連続する位置のＮ’は、２’５’リボヌクレオチドを含む、
１つ以上のピリミジンリボヌクレオチドは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方において、２’糖修飾される。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される二本鎖分子は、次の修飾の組み合わせを含む
アンチセンス鎖は、５’末端から５、６、７、８、または９位のうちの少なくとも１つの位置に、ＤＮＡ、ＴＮＡ、２’５’ヌクレオチド、またはミラーヌクレオチドを含み、
センス鎖は、５’末端から９または１０位の位置に、ＴＮＡ、２’５’ヌクレオチド、および擬似ウリジンのうちの少なくとも１つを含み、
１つ以上のピリミジンリボヌクレオチドは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方において、２’修飾される。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される二本鎖分子は、次の修飾の組み合わせを含む
アンチセンス鎖は、５’末端から５、６、７、８、または９位のうちの少なくとも１つの位置に、ＤＮＡ、２’５’ヌクレオチド、またはミラーヌクレオチドを含み、
センス鎖は、３’末端の最後から２番目の位置または３’末端位置に、４、５、または６個の連続する２’５’ヌクレオチドを含み、
１つ以上のピリミジンリボヌクレオチドは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方において、２’糖修飾される。
【００７８】
構造（Ａ１）および／または構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、（Ｎ）ｙは、ミラーヌクレオチド、２’５’リボヌクレオチド、およびＴＮＡから選択される、少なくとも１つの非従来的部分を含む。いくつかの実施形態において、非従来的部分はミラーヌクレオチドである。種々の実施形態において、ミラーヌクレオチドは、Ｌ−リボヌクレオチド（Ｌ−ＲＮＡ）およびＬ−デオキシリボヌクレオチド（Ｌ−ＤＮＡ）から選択される。好ましい実施形態において、ミラーヌクレオチドは、Ｌ−ＤＮＡである。ある特定の実施形態において、センス鎖は、９、または１０位（５’末端から）に、非従来的部分を含む。好ましい実施形態において、センス鎖は、９位（５’末端から）に、非従来的部分を含む。一部の実施形態において、センス鎖は、１９個のヌクレオチドの長さであり、１５位（５’末端から）に、４、５、または６個の連続する非従来的部分を含む。いくつかの実施形態において、センス鎖は、１５、１６、１７、および１８位に、４個の連続する２’５’リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、センス鎖は、１５、１６、１７、１８、および１９位に、５個の連続する２’５’リボヌクレオチドを含む。種々の実施形態において、センス鎖は、Ｚ’をさらに含む。いくつかの実施形態において、Ｚ’は、Ｃ３ＯＨ部分またはＣ３Ｐｉ部分を含む。
【００７９】
構造（Ａ１）および／または構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、（Ｎ）ｙは、ミラーヌクレオチドおよび２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合により隣接するヌクレオチドと接合するヌクレオチドから選択される、少なくとも１つの非従来的部分を含む。いくつかの実施形態において、非従来的部分はミラーヌクレオチドである。種々の実施形態において、ミラーヌクレオチドは、Ｌ−リボヌクレオチド（Ｌ−ＲＮＡ）およびＬ−デオキシリボヌクレオチド（Ｌ−ＤＮＡ）から選択される。好ましい実施形態において、ミラーヌクレオチドはＬ−ＤＮＡである。
【００８０】
構造（Ａ１）のいくつかの実施形態において、（Ｎ’）ｙは、少なくとも１つのＬ−ＤＮＡ部分を含む。いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、１〜１７位および１９位の非修飾リボヌクレオチドと、３’末端から２番目の位置（１８位）の１つのＬ−ＤＮＡとからなる。他の実施形態において、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、１〜１６位および１９位の非修飾リボヌクレオチドと、３’末端から２番目の位置（１７および１８位）の２個の連続するＬ−ＤＮＡヌクレオチドとからなる。種々の実施形態において、非従来的部分は、２’−５’ヌクレオチド間リン酸連結によって隣接するヌクレオチドと接合したヌクレオチドである。種々の実施形態によると、（Ｎ’）ｙは、３’末端に、２’−５’ヌクレオチド間連結によって連結した２、３、４、５、または６個の連続するリボヌクレオチドを含む。一実施形態において、（Ｎ’）ｙの３’末端の４個の連続するリボヌクレオチドは、３個の２’−５’リン酸ジエステル結合によって接合する。一実施形態において、（Ｎ’）ｙの３’末端の５個の連続するリボヌクレオチドは、４個の２’−５’リン酸ジエステル結合によって接合する。いくつかの実施形態において、２’−５’リボヌクレオチドのうちの１つ以上が２’−５’リン酸ジエステル結合を形成する場合、ヌクレオチドは、３’−Ｏ−メチル（３’ＯＭｅ）糖修飾をさらに含む。いくつかの実施形態において、（Ｎ’）ｙの３’末端ヌクレオチドは、３’ＯＭｅ糖修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、１５、１６、１７、１８、および１９位に、２’−５’ヌクレオチド間結合によって隣接するヌクレオチドと接合した２個以上の連続するヌクレオチドを含む。種々の実施形態において、２’−５’ヌクレオチド間結合を形成するヌクレオチドは、リボヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、２’−５’ヌクレオチド間結合は、リン酸ジエステルヌクレオチド間結合である。種々の実施形態において、２’−５ヌクレオチド間結合を形成するヌクレオチドは、３’デオキシリボースヌクレオチドまたは３’メトキシヌクレオチドを含む。種々の実施形態において、２’−５ヌクレオチド間結合を形成するリボヌクレオチドは、３’デオキシリボースリボヌクレオチドまたは３’メトキシリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、１５−１６位間、１６−１７位間、および１７−１８位間、または１６−１７位間、１７−１８位間、および１８−１９位間で、２’−５’ヌクレオチド間結合によって隣接するヌクレオチドと接合したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、１６−１７位間および１７−１８位間、または１７−１８位間および１８−１９位間、または１５−１６位間および１７−１８位間で、２’−５’ヌクレオチド間結合によって隣接するヌクレオチドと接合したヌクレオチドを含む。種々の実施形態において、２’−５’ヌクレオチド間結合を形成するヌクレオチドは、リボヌクレオチドを含む。種々の実施形態において、２’−５’ヌクレオチド間結合を形成するヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。他の実施形態において、（Ｎ’）ｙ中のピリミジンリボヌクレオチド（ｒＵ、ｒＣ）は、２’−５’ヌクレオチド間結合によって隣接するリボヌクレオチドと接合したリボヌクレオチドで置換される。
【００８１】
構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、（Ｎ）ｙは、少なくとも１つのＬ−ＤＮＡ部分を含む。いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、１〜１７位および１９位の非修飾リボヌクレオチドと、３’末端から２番目の位置（１８位）の１つのＬ−ＤＮＡとからなる。他の実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、１〜１６位および１９位の非修飾リボヌクレオチドと、３’末端から２番目の位置（１７および１８位）の２個の連続するＬ−ＤＮＡとからなる。種々の実施形態において、非従来的部分は、２’−５’ヌクレオチド間リン酸連結によって隣接するヌクレオチドと接合したヌクレオチドである。種々の実施形態によると、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、３’末端に、２’−５’ヌクレオチド間連結によって連結した２、３、４、５、または６個の連続するリボヌクレオチドを含む。一実施形態において、Ｎ２−（Ｎ’）ｙの３’末端の４個の連続するリボヌクレオチドは、３個の２’−５’リン酸ジエステル結合によって接合し、２’−５’リン酸ジエステル結合を形成する２’−５’リボヌクレオチドのうちの１つ以上は、３’−Ｏ−メチル（３’ＯＭｅ）糖修飾をさらに含む。いくつかの実施形態において、Ｎ２−（Ｎ’）ｙの３’末端リボヌクレオチドは、２’ＯＭｅ糖修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、１５、１６、１７、１８、および１９位に、２’−５’ヌクレオチド間結合によって隣接するヌクレオチドと接合した、２個以上の連続するヌクレオチドを含む。種々の実施形態において、２’−５’ヌクレオチド間結合を形成するヌクレオチドは、３’デオキシリボースヌクレオチドまたは３’メトキシヌクレオチドを含む。種々の実施形態において、２’−５ヌクレオチド間結合を形成するリボヌクレオチドは、３’デオキシリボースリボヌクレオチドまたは３’メトキシリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、１６−１７位間および１７−１８位間、または１７−１８位間および１８−１９位間、または１５−１６位間および１７−１８位間の２’−５’ヌクレオチド間結合によって隣接するヌクレオチドと接合したヌクレオチドを含む。種々の実施形態において、２’−５’ヌクレオチド間結合を形成するヌクレオチドは、リボヌクレオチドを含む。種々の実施形態において、２’−５’ヌクレオチド間結合を形成するヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。他の実施形態において、（Ｎ’）ｙ中のピリミジンリボヌクレオチド（ｒＵ、ｒＣ）は、２’−５’ヌクレオチド間結合によって隣接するリボヌクレオチドと接合した、リボヌクレオチドを含む。
【００８２】
構造（Ａ１）および構造（Ａ２）のさらなる実施形態において、（Ｎ’）ｙは、１〜８個の修飾リボヌクレオチドを含み、この修飾リボヌクレオチドは、デオキシリボース（ＤＮＡ）ヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、（Ｎ’）ｙは、１、２、３、４、５、６、７、または最大８個のＤＮＡ部分を含む。
【００８３】
現在好ましい実施形態において、本明細書に提供される阻害剤は、ＨＥＳ１発現を下方制御し、表Ｉから選択されるオリゴヌクレオチド対を含む、合成の化学修飾された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物である。現在好ましい実施形態において、本明細書に提供される阻害剤は、ＨＥＳ５発現を下方制御し、表ＩＩから選択されるオリゴヌクレオチド対を含む、合成の化学修飾された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物である。現在好ましい実施形態において、本明細書に提供される阻害剤は、ＨＥＹ１発現を下方制御し、表ＩＩＩから選択されるオリゴヌクレオチド対を含む、合成の化学修飾された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物である。現在好ましい実施形態において、本明細書に提供される阻害剤は、ＨＥＹ２発現を下方制御し、表ＩＶから選択されるオリゴヌクレオチド対を含む、合成の化学修飾された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物である。現在好ましい実施形態において、本明細書に提供される阻害剤は、ＩＤ１発現を下方制御し、表Ｖから選択されるオリゴヌクレオチド対を含む、合成の化学修飾された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物である。現在好ましい実施形態において、本明細書に提供される阻害剤は、ＩＤ２発現を下方制御し、表ＶＩから選択されるオリゴヌクレオチド対を含む、合成の化学修飾された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物である。現在好ましい実施形態において、本明細書に提供される阻害剤は、ＩＤ３発現を下方制御し、表ＶＩＩから選択されるオリゴヌクレオチド対を含む、合成の化学修飾された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物である。現在好ましい実施形態において、本明細書に提供される阻害剤は、ＣＤＫＮ１Ｂ発現を下方制御し、表ＶＩＩＩから選択されるオリゴヌクレオチド対を含む、合成の化学修飾された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物である。現在好ましい実施形態において、本明細書に提供される阻害剤は、ＮＯＴＣＨ１発現を下方制御し、表ＩＸから選択されるオリゴヌクレオチド対を含む、合成の化学修飾された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物である。表Ｉ〜ＩＸを、本明細書で以下に提供する。
表Ｉ  選択されるＨＥＳ１  ｄｓＲＮＡ
【表３】
2014528704.tif 000004
【００８４】
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６６９９および２６６９０１に記載されるＨＥＳ１＿１０アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７００および２６６９２に記載されるＨＥＳ１＿１１アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６６７９および２６６６７に記載されるＨＥＳ１＿１２アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６６８０および２６６６８に記載されるＨＥＳ１＿１３アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６６８１および２６６６９に記載されるＨＥＳ１＿１４アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７０１および２６６９３にＨＥＳ１＿１５アンチセンスおよびセンス配列を記載される有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６６８２および２６６７０に記載されるＨＥＳ１＿１６アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７０２および２６６９４に記載されるＨＥＳ１＿１７アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７０３および２６６９５に記載されるＨＥＳ１＿１８アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６６８３および２６６７１に記載されるＨＥＳ１＿１９アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６６８４および２６６７２に記載されるＨＥＳ１＿２０アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６６８５および２６６７３に記載されるＨＥＳ１＿２１アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６６８６および２６６７４に記載されるＨＥＳ１＿２２アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６６８７および２６６７５に記載されるＨＥＳ１＿２４アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７０４および２６６９６に記載されるＨＥＳ１＿２６アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７０５および２６６９７に記載されるＨＥＳ１＿２７アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６６８８および２６６７６に記載されるＨＥＳ１＿２８アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６６８９および２６６７７に記載されるＨＥＳ１＿３３アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６６９０および２６６７８に記載されるＨＥＳ１＿３６アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。
【００８５】
いくつかの好ましい実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６６８１および２６６６９に記載されるＨＥＳ１＿１４アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの好ましい実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６６９０および２６６７８に記載されるＨＥＳ１＿３６アンチセンスおよびセンス配列アンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。
【００８６】
提供される全ての位置は、センス鎖およびアンチセンス鎖上で５’から３’の方向である。
【００８７】
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６，６８１および２６，６６９に記載されるＨＥＳ１＿１４アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、次の修飾を含む：
センス鎖は、１５、１６、１７、１８、および１９位に５個の連続する２’５’リボヌクレオチドと、５末端で共有結合したキャッピング部分と、３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ部分とを含み、アンチセンス鎖は、１、３、９、１１、１４、１５、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、任意で７位に２’５’リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含む、または
センス鎖は、１、４、８、１０、１２、および１６位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、５末端で共有結合したキャッピング部分と、３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ部分とを含み、アンチセンス鎖は、１、３、９、１１、１４、１５、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、任意で７位に２’５’リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含む。
【００８８】
ＨＥＳ１＿１４配列（配列番号２６６８１および２６６６９に記載されるアンチセンスおよびセンス配列）および上に提供される修飾を有するｄｓＲＮＡの好ましい実施形態において、キャッピング部分は、逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチド部分である。
【００８９】
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６６９０および２６６７８に記載されるＨＥＳ１＿３６アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、次の修飾を含む：
センス鎖は、１５、１６、１７、１８、および１９位に５個の連続する２’５’リボヌクレオチドと、５末端で共有結合したキャッピング部分と、３’末端で共有結合した非ヌクレオチド部分とを含み、アンチセンス鎖は、３、９、１１、および１５位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、任意で７位に２’５’リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合した非ヌクレオチド部分とを含む。
【００９０】
好ましい実施形態において、センス鎖は、１５、１６、１７、１８、および１９位に５個の連続する２’５’リボヌクレオチドと、５末端で共有結合したキャッピング部分と、３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ部分とを含み、アンチセンス鎖は、３、９、１１、および１５位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含む。好ましい実施形態において、キャッピング部分は、逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチド部分である。
表ＩＩ  選択されるＨＥＳ５  ｄｓＲＮＡ
【表４】
2014528704.tif 000005
【００９１】
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７３２および２６７２８に記載されるＨＥＳ５＿８アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７２９および２６７２５に記載されるＨＥＳ５＿１０アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７１６および２６７０７に記載されるＨＥＳ５＿１９アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７１７および２６７０８に記載されるＨＥＳ５＿２０アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７３０および２６７２６に記載されるＨＥＳ５＿２１アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７１８および２６７０９に記載されるＨＥＳ５＿２２アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７１９および２６７１０に記載されるＨＥＳ５＿２３アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７２０および２６７１１に記載されるＨＥＳ５＿２４アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７３１および２６７２７に記載されるＨＥＳ５＿２５アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７２１および２６７１２に記載されるＨＥＳ５＿２６アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７２２および２６７１３に記載されるＨＥＳ５＿２７アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７２３および２６７１４に記載されるＨＥＳ５＿２８アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７２４および２６７１５に記載されるＨＥＳ５＿２９アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。
【００９２】
いくつかの好ましい実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７３２および２６７２８に記載されるＨＥＳ５＿８アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。
表ＩＩＩ  選択されるＨＥＹ１  ｄｓＲＮＡ
【表５】
2014528704.tif 000006
【００９３】
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７４７および２６７３３に記載されるＨＥＹ１＿１アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７４８および２６７３４に記載されるＨＥＹ１＿２アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７４９および２６７３５に記載されるＨＥＹ１＿３アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７７０および２６７６１に記載されるＨＥＹ１＿４アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７５０および２６７３６に記載されるＨＥＹ１＿５アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７５１および２６７３７に記載されるＨＥＹ１＿６アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７７１および２６７６２に記載されるＨＥＹ１＿７アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７７２および２６７６３に記載されるＨＥＹ１＿８アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７５２および２６７３８に記載されるＨＥＹ１＿９アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７５３および２６７３９に記載されるＨＥＹ１＿１０アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７７３および２６７６４に記載されるＨＥＹ１＿１１アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７５４および２６７４０に記載されるＨＥＹ１＿１２アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７７４および２６７６５８に記載されるＨＥＹ１＿１３アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７５５および２６７４１に記載されるＨＥＹ１＿１４アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７７５および２６７６６に記載されるＨＥＹ１＿１５アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７５６および２６７４２に記載されるＨＥＹ１＿１６アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７７６および２６７６７に記載されるＨＥＹ１＿１７アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７５７および２６７４３に記載されるＨＥＹ１＿１８アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７５８２および２６７４４に記載されるＨＥＹ１＿１９アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７７７および２６７６８に記載されるＨＥＹ１＿２０アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７５９および２６７４５に記載されるＨＥＹ１＿２１アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７６０および２６７４６に記載されるＨＥＹ１＿２２アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７７８および２６７６９に記載されるＨＥＹ１＿２３アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。
表ＩＶ  選択されるＨＥＹ２  ｄｓＲＮＡ
【表６】
2014528704.tif 000007
【００９４】
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７８２および２６７７９に記載されるＨＥＹ２＿１アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７８３および２６７８０に記載されるＨＥＹ２＿２アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７８５および２６７８７に記載されるＨＥＹ２＿３アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７８６および２６７８８に記載されるＨＥＹ２＿４アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７８４および２６７８１に記載されるＨＥＹ２＿５アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。
【００９５】
いくつかの好ましい実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７８２および２６７７９に記載されるＨＥＹ２＿１アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの好ましい実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７８３および２６７８０に記載されるＨＥＹ２＿２アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。
【００９６】
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７８２および２６７７９に記載されるＨＥＳ２＿１アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、次の修飾を含む：
センス鎖は、６および１２位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、５末端で共有結合したキャッピング部分と、３’末端で共有結合した非ヌクレオチド部分と、任意で１５、１６、１７、１８、および１９位に５個の連続する２’５’リボヌクレオチドまたは１６および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドとを含み、アンチセンス鎖は、１、３、９、１１、１３、１５、１７、および１９位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、任意で７位に２’５’リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合した非ヌクレオチド部分とを含む。好ましい実施形態において、キャッピング部分は、逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチド部分である。好ましい実施形態において、センス鎖の３’末端で共有結合した非ヌクレオチド部分は、Ｃ３Ｐｉ部分である。好ましい実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端で共有結合した非ヌクレオチド部分は、Ｃ３ＰｉＣ３ＯＨまたはＣ３ＰｉＣ３Ｐｉ部分である。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７８３および２６７８０に記載されるＨＥＹ２＿２アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、次の修飾を含む：
センス鎖は、４、１１、および１３位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、５末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチド部分と、３’末端で共有結合した非ヌクレオチド部分と、任意で１５、１６、１７、１８、および１９位に５個の連続する２’５’リボヌクレオチドまたは１６位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドとを含み、アンチセンス鎖は、１、３、８、１１、１３、１５、１７、および１９位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、任意に７位に２’５’リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合した非ヌクレオチド部分とを含む。好ましい実施形態において、キャッピング部分は、逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチド部分である。好ましい実施形態において、センス鎖の３’末端で共有結合した非ヌクレオチド部分は、Ｃ３Ｐｉ部分である。好ましい実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端で共有結合した非ヌクレオチド部分は、Ｃ３ＰｉＣ３ＯＨまたはＣ３ＰｉＣ３Ｐｉ部分である。
表Ｖ  選択されるＩＤ１  ｄｓＲＮＡ
【表７】
2014528704.tif 000008
【００９７】
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６７９９および２６７８９に記載されるＩＤ１＿１０アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８００および２６７９０に記載されるＩＤ１＿１１アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８１３および２６８０９に記載されるＩＤ１＿１２アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８０１および２６７９１に記載されるＩＤ１＿１３アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８０２および２６７９２に記載されるＩＤ１＿１４アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８０３および２６７９３に記載されるＩＤ１＿１５アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８１４および２６８１０に記載されるＩＤ１＿１６アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８１５および２６８１１に記載されるＩＤ１＿１７アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８０４および２６７９４に記載されるＩＤ１＿１８アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８０５および２６７９５に記載されるＩＤ１＿１９アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８０６および２６７９６に記載されるＩＤ１＿２０アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８０７および２６７９７に記載されるＩＤ１＿２１アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８０８および２６７９８に記載されるＩＤ１＿２２アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８１６および２６８１２に記載されるＩＤ１＿２３アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。
表ＶＩ  選択されるＩＤ２二重鎖
【表８】
2014528704.tif 000009
【００９８】
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８２１および２６８１７に記載されるＩＤ２＿１１アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８２９および２６８２５に記載されるＩＤ２＿１２アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８２２および２６８１８に記載されるＩＤ２＿１３アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８２３および２６８１９２に記載されるＩＤ２＿１４アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８３０および２６８２６に記載されるＩＤ２＿１５アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８３１および２６８２７に記載されるＩＤ２＿１６アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８３２および２６８２８に記載されるＩＤ２＿１７アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８２４および２６８２０に記載されるＩＤ２＿１８アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。
表ＶＩＩ  選択されるＩＤ３二重鎖
【表９】
2014528704.tif 000010
【００９９】
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８５９および２６８５１に記載されるＩＤ３＿９アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８６０および２６８５２に記載されるＩＤ３＿１０アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８６１および２６８５３に記載されるＩＤ３＿１１アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８４２および２６８３３に記載されるＩＤ３＿２５アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８４３および２６８３４に記載されるＩＤ３＿２６アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８４４および２６８３５に記載されるＩＤ３＿２７アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８４５および２６８３６に記載されるＩＤ３＿２８アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８４６および２６８３７に記載されるＩＤ３＿２９アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８６２および２６８５４に記載されるＩＤ３＿３０アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８６３および２６８５５に記載されるＩＤ３＿３１アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８４７および２６８３８に記載されるＩＤ３＿３２アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８６４および２６８５６に記載されるＩＤ３＿３３アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８４８および２６８３９に記載されるＩＤ３＿３４アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８４９および２６８４０に記載されるＩＤ３＿３５アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８６５および２６８５７に記載されるＩＤ３＿３６アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８５０および２６８４１に記載されるＩＤ３＿３７アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８６６および２６８５８に記載されるＩＤ３＿３８アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。
【０１００】
いくつかの好ましい実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ＩＤ３＿３２アンチセンスおよびセンス配列（配列番号２６８４７および２６８３８）を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの好ましい実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ＩＤ３＿３８アンチセンスおよびセンス配列（配列番号２６８６６および２６８５８）を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８４７および２６８３８に記載されるＩＤ３＿３２アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、次の修飾を含む：
センス鎖は、１位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、５末端で共有結合したキャッピング部分と、３’末端で共有結合した非ヌクレオチド部分と、１５、１６、１７、１８、および１９位に５個の連続する２’５’リボヌクレオチドとを含み、アンチセンス鎖は、２、５、８、１３、１５、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含み、任意で５、６、または７位に２’５’リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合した非ヌクレオチド部分とを含む。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、その５’末端でリン酸化されている。好ましい実施形態において、キャッピング部分は、逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチド部分である。好ましい実施形態において、センス鎖の３’末端で共有結合した非ヌクレオチド部分は、Ｃ３Ｐｉ部分である。好ましい実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端で共有結合した非ヌクレオチド部分は、Ｃ３ＰｉＣ３ＯＨまたはＣ３ＰｉＣ３Ｐｉ部分である。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８６６および２６８５８に記載されるＩＤ３＿３８アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、次の修飾を含む：
センス鎖は、１および３位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、５末端で共有結合したキャッピング部分と、３’末端で共有結合した非ヌクレオチド部分と、１５、１６、１７、１８、および１９位に５個の連続する２’５’リボヌクレオチドとを含み、アンチセンス鎖は、１、６、９、１３、１６、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合した非ヌクレオチド部分とを含む。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、その５’末端でリン酸化されている。好ましい実施形態において、キャッピング部分は、逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチド部分である。好ましい実施形態において、センス鎖の３’末端で共有結合した非ヌクレオチド部分は、Ｃ３Ｐｉ部分である。好ましい実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端で共有結合した非ヌクレオチド部分は、Ｃ３ＰｉＣ３ＯＨまたはＣ３ＰｉＣ３Ｐｉ部分である。
表ＶＩＩＩ  選択されるＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７）二重鎖
【表１０】
2014528704.tif 000011
【０１０３】
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８９４および２６８８７に記載されるＣＤＫＮ１Ｂ＿３アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８９５および２６８８８に記載されるＣＤＫＮ１Ｂ＿４アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８９６および２６８８９に記載されるＣＤＫＮ１Ｂ＿１０アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８９７および２６８９０に記載されるＣＤＫＮ１Ｂ＿１１アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８９８および２６８９１に記載されるＣＤＫＮ１Ｂ＿１８アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８６６および２６８５８に記載されるＣＤＫＮ１Ｂ＿２８アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８９９および２６８９２に記載されるＣＤＫＮ１Ｂ＿２９アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８７８および２６８６８に記載されるＣＤＫＮ１Ｂ＿３０アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８７９および２６８６９に記載されるＣＤＫＮ１Ｂ＿３１アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６９００および２６８９３に記載されるＣＤＫＮ１Ｂ＿３２アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８８０および２６８７０に記載されるＣＤＫＮ１Ｂ＿３３アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８８８１および２６８７１に記載されるＣＤＫＮ１Ｂ＿３４アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８８２および２６８７２に記載されるＣＤＫＮ１Ｂ＿３５アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８８３および２６８７３に記載されるＣＤＫＮ１Ｂ＿３６アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８８４および２６８７４に記載されるＣＤＫＮ１Ｂ＿３７アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８８５および２６８７５に記載されるＣＤＫＮ１Ｂ＿３８アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８８６および２６８７６に記載されるＣＤＫＮ１Ｂ＿４０アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。
【０１０４】
いくつかの好ましい実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８９５および２６８８８に記載されるＣＤＫＮ１Ｂ＿４アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの好ましい実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８７９および２６８６９８に記載されるＣＤＫＮ１Ｂ＿３１アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの好ましい実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６８８６および２６８７６に記載されるＣＤＫＮ１Ｂ＿４０アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。
表ＩＸ  選択されるＮＯＴＣＨ１  ｄｓＲＮＡ
【表１１】
2014528704.tif 000012
【０１０５】
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６９０６および２６９０１に記載されるＮＯＴＣＨ１＿１アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６９０７および２６９０２に記載されるＮＯＴＣＨ１＿２アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６９０８および２６９０３に記載されるＮＯＴＣＨ１＿３アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６９０９および２６９０４に記載されるＮＯＴＣＨ１＿４アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６９１０および２６９０５に記載されるＮＯＴＣＨ１＿５アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６９１２および２６９１１に記載されるＮＯＴＣＨ１＿６アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。
【０１０６】
いくつかの好ましい実施形態において、ｄｓＲＮＡは、配列番号２６９０７および２６９０２に記載されるＮＯＴＣＨ１＿２アンチセンスおよびセンス配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、表Ｉ〜ＩＸに記載されるオリゴヌクレオチド対から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡ分子を、本明細書に提供する。別段の指定がない限り、センス鎖またはアンチセンス鎖に沿った全ての位置は、５’から３’へと数える（５’から３’の方向）。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、配列番号２３〜２６，６６６に記載される、好ましくは表Ｉ〜ＩＸ（配列番号２６，６６７〜２６，９１２）に示される、特定のセンス鎖および特定のアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、構造：
【表１２】
2014528704.tif 000013
を有し、式中、各「│」は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
各Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕのうちのいずれか１つであり、独立して、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、非修飾もしくは修飾デオキシリボヌクレオチド、または非従来的部分であり、
ＺおよびＺ’のそれぞれは、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した１〜５個の連続するヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド部分、またはそれらの組み合わせであり、
ｚ"は、存在しても不在であってもよいが、存在する場合は、センス鎖の５’末端で共有結合したキャッピング部分である。
【０１０９】
好ましい実施形態において、二本鎖核酸分子は、修飾リボヌクレオチドおよび非従来的部分を含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖が、５、６、７、または８位（５’から３’の方向）のうちの１つ以上にミラーヌクレオチドまたは２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端で共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分とを含む、二本鎖核酸分子を提供する。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、１つ以上の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖中の１、２、３、４、５、６、または７個のピリミジンリボヌクレオチドは、２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、センス鎖は、３’末端または３’末端から２番目の位置に４または５個の連続する２’−５’連結ヌクレオチドと、３’末端で共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分と、１つ以上の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、５’末端で共有結合したキャッピング部分とを含む。ｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖に５’ホスフェートを含んでもよい。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖が、（５’から３’の方向で）１、３、１１、１４、１５、１７、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖が、（５’から３’の方向で）１５、１６、１７、１８、および１９位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドオーバーハングと、５’末端で共有結合したキャッピング部分とを含む、二本鎖核酸分子を提供する。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、６位、７位、または６位および７位に、２’−５’連結リボヌクレオチドをさらに含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖が、（５’から３’の方向で）１、３、６、１１、１４、１５、１７、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖が、（５’から３’の方向で）１５、１６、１７、１８、および１９位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３ＰｉまたはＣ３ＯＨ部分と、５’末端で共有結合したキャッピング部分とを含む、二本鎖核酸分子を提供する。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖が、（５’から３’の方向で）１、３、６、１１、１４、１５、１７、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖が、（５’から３’の方向で）１５、１６、１７、１８、および１９位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３末端に共有結合したＣ３Ｐｉと、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドキャッピング部分とを含む、二本鎖核酸分子を提供し、いくつかの実施形態においては、アンチセンス鎖が、（５’から３’の方向で）１、３、１１、１４、１５、１７、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、６、７、および８位のうちの１つ以上に２’−５’連結リボヌクレオチドまたはミラーヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖が、（５’から３’の方向で）１５、１６、１７、１８、および１９位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドオーバーハングと、５’末端で共有結合したキャッピング部分とを含む、二本鎖核酸分子を提供する。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖が、（５’から３’の方向で）１、３、１１、１４、１５、１７、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、６位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖が、（５’から３’の方向で）１５、１６、１７、１８、および１９位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３ＰｉまたはＣ３ＯＨ部分と、５’末端で共有結合した脱塩基部分、逆位脱塩基部分、Ｃ６アミノ、およびミラーヌクレオチドから選択されるキャッピング部分とを含む、二本鎖核酸分子を提供する。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖が、（５’から３’の方向で）１、３、１１、１４、１５、１７、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、６位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖が、（５’から３’の方向で）１５、１６、１７、１８、および１９位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３末端に共有結合したＣ３Ｐｉと、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドキャッピング部分とを含む、二本鎖核酸分子を提供する。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖が、（５’から３’の方向で）１、３、１１、１４、１５、１７、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、６位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖が、（５’から３’の方向で）１５、１６、１７、１８、および１９位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３末端に共有結合したＣ３Ｐｉと、５’末端で共有結合したミラーヌクレオチド（Ｌ−デオキシリボグアノシン−３’−ホスフェート）とを含む、二本鎖核酸分子を提供する。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖が、（５’から３’の方向で）１、３、６、１１、１４、１５、１７および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖が、（５’から３’の方向で）１位に任意の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、１５、１６、１７、１８、および１９位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３ＰｉまたはＣ３ＯＨ部分と、５’末端で共有結合した脱塩基部分、逆位脱塩基部分、Ｃ６アミノ、およびミラーヌクレオチドから選択されるキャッピング部分とを含む、二本鎖核酸分子を提供する。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖が、（５’から３’の方向で）１、３、６、１１、１４、１５、１７、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖が、（５’から３’の方向で）１位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、３末端に共有結合したＣ３Ｐｉ部分と、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドキャッピング部分とを含む、二本鎖核酸分子を提供する。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖が、（５’から３’の方向で）１、３、６、１１、１４、１５、１７、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖が、（５’から３’の方向で）１位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、１５、１６、１７、１８、および１９位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３末端に共有結合したＣ３Ｐｉと、５’末端で共有結合したミラーヌクレオチド（Ｌ−デオキシリボグアノシン−３’−ホスフェート）とを含む、二本鎖核酸分子を提供する。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖が、（５’から３’の方向で）１、３、１１、１４、１５、１７、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、６および７位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖が、（５’から３’の方向で）１位に任意の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、１５、１６、１７、１８、および１９位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３ＰｉまたはＣ３ＯＨ部分と、５’末端に共有結合した脱塩基部分、逆位脱塩基部分、およびミラーヌクレオチドから選択されるキャッピング部分とを含む、二本鎖核酸分子を提供する。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖が、（５’から３’の方向で）１、３、１１、１４、１５、１７、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、６および７位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖が、（５’から３’の方向で）１位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、１５、１６、１７、１８、および１９位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３末端に共有結合したＣ３Ｐｉ部分と、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドキャッピング部分とを含む、二本鎖核酸分子を提供する。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖が、（５’から３’の方向で）１、３、１１、１４、１５、１７、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、６位にミラーヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖が、（５’から３’の方向で）１位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、１５、１６、１７、１８、および１９位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３末端に共有結合したＣ３Ｐｉ部分と、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドキャッピング部分とを含む、二本鎖核酸分子を提供する。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖が、（５’から３’の方向で）１、３、１１、１４、１５、１７、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、８位にミラーヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖が、（５’から３’の方向で）１位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、１５、１６、１７、１８、および１９位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３末端に共有結合したＣ３Ｐｉ部分と、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドキャッピング部分とを含む、二本鎖核酸分子を提供する。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、センス鎖が、（５’から３’の方向で）１位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、１５、１６、１７、１８、および１９位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３末端に共有結合したＣ３Ｐｉ部分と、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドキャッピング部分とを含み、アンチセンス鎖が、
（５’から３’の方向で）１位にＵからｄＴへの置換と、１位でデオキシリボチミジンと共有結合した５’ホスフェートと、３、１１、１４、１５、１７、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド、
（５’から３’の方向で）１位にウリジンと共有結合した５’ホスフェートと、３、１１、１４、１５、１７、および１８に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または
（５’から３’の方向で）１位にＵからＣ３への置換と、１位にＣ３と共有結合した５’ホスフェートと、３、１１、１４、１５、１７、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または
（５’から３’の方向で）１位にウリジンと共有結合した５’ホスフェートと、１、３、１１、１４、１５、１７、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される、二本鎖核酸分子を提供する。
【０１２４】
上述の修飾は、配列番号２３〜２６，６６６に記載される核酸対（センスおよび対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド）、ならびにより具体的には、表Ｉ〜ＩＸ（配列番号２６６６７−２６，９１２）に列挙されるｄｓＲＮＡに適用することができる。
【０１２５】
ある特定の好ましい二重鎖を、本明細書において以下の表Ａに記載する
表Ａ
【表１３】
2014528704.tif 000014
【０１２６】
例えば、ＨＥＳ１＿１２＿Ｓ１９３８は、１、２、４、５、６、８、９、１１、１３、１４、１６、１７、１８、および１９位のリボヌクレオチドが非修飾リボヌクレオチドであり、３、７、１０、１２、および１５位のリボヌクレオチドが２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドであり、逆位脱塩基部分が５’末端に共有結合し、Ｃ３−Ｐｉ部分が３’末端に共有結合した、５’から３’の方向でＧＣＣＡＧＣＵＧＡＵＡＵＡＡＵＧＧＡＡというオリゴヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、２、３、５、６、８、１０、１１、１３、１４、１５、１７、および１８位のリボヌクレオチドが非修飾リボヌクレオチドであり、１、４、９、１２、１６、および１９位のリボヌクレオチドが２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドであり、７位のリボヌクレオチドが２’−５’連結リボヌクレオチドであり、ホスフェートが任意で５’末端に共有結合し、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ部分が３’末端に共有結合した、５’から３’の方向でＵＵＣＣＡＵＵＡＵＡＵＣＡＧＣＵＧＧＣというオリゴヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖と、を含む、二重鎖である。
【０１２７】
第２の態様において、１つ以上の本明細書に開示されるこのような核酸化合物と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子は、ネイキッドｄｓＲＮＡとして投与される。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子は、薬学的に許容される担体と混合される。さらに他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、薬物担体中に封入される。
【０１２８】
第３の実施形態において、耳の疾患または障害を患う対象の治療における本明細書に開示される分子の使用を提供する。難聴の発生または重症度の治療または予防を、それを必要とする対象において行うための方法であって、難聴が表１Ａの配列番号１〜１１のいずれかに記載の遺伝子から選択される標的遺伝子の発現と関連する、方法を本明細書に提供する。このような方法は、このような治療を必要とする哺乳動物に、少なくとも１つのこのような標的遺伝子の発現または活性を阻害または低減する１つ以上のこのような化合物の予防有効量または治療有効量を投与することを伴う。種々の実施形態において、本明細書に開示される方法は、１つ以上の本明細書に開示されるｄｓＲＮＡ分子を使用して、耳障害と関連する１つを上回る標的遺伝子を阻害することを提供する。
【０１２９】
したがって、一実施形態において、本方法は、２つ以上の標的遺伝子、ＣＤＫＮ１ＢおよびＩＤ３のうちの少なくとも１つを、任意でＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、またはＨＥＹ２のうちの少なくとも１つと組み合わせて、阻害することによって、耳障害を発症する危険性にあるかまたはそれを患う対象を治療することを対象とする。
【０１３０】
好ましい実施形態において、本方法は、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５のうちの少なくとも１つを対象とするオリゴヌクレオチドを投与する前に、ＣＤＫＮ１ＢおよびＩＤ３のうちの少なくとも１つを対象とするオリゴヌクレオチドを投与することを含む。別の実施形態において、全てのオリゴヌクレオチドは、一緒に投与される。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、ＨＥＳ１およびＨＥＳ５に対するｄｓＲＮＡは、同時投与される。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、ＨＥＳ１に対するｄｓＲＮＡ、ならびにＨＥＳ５および任意でＨＥＹ２に対するにｄｓＲＮＡは、同時投与される。いくつかの実施形態において、ＣＤＫＮ１Ｂを標的とするｄｓＲＮＡに続いて、ＨＥＳ１に対するｄｓＲＮＡ、またはＨＥＳ５に対するｄｓＲＮＡ、またはＨＥＳ１に対するｄｓＲＮＡおよびＨＥＳ５に対するｄｓＲＮＡ、またはＨＥＳ１に対するｄｓＲＮＡおよびＨＥＹ１に対するｄｓＲＮＡ、またはＨＥＳ５に対するｄｓＲＮＡおよびＨＥＹ１に対するｄｓＲＮＡ、またはＨＥＳ１に対するｄｓＲＮＡおよびＨＥＹ２に対するｄｓＲＮＡ、またはＨＥＳ５に対するｄｓＲＮＡおよびＨＥＹ２に対するｄｓＲＮＡ、任意でＩＤ１に対するｄｓＲＮＡ、またはＩＤ２に対するｄｓＲＮＡ、またはＩＤ３に対するｄｓＲＮＡを投与する。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、ＨＥＳ１またはＨＥＳ５を標的とするｄｓＲＮＡの投与の後に、ＨＥＹ１に対するｄｓＲＮＡ、またはＨＥＹ２に対するｄｓＲＮＡが続き、任意で、ＩＤ１に対するｄｓＲＮＡ、またはＩＤ２に対するｄｓＲＮＡ、またはＩＤ３に対するｄｓＲＮＡが続く。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＣＨ１を標的とするｄｓＲＮＡの投与の後に、ＨＥＹ１に対するｄｓＲＮＡまたはＨＥＹ２に対するｄｓＲＮＡが続き、任意で、ＩＤ１にたいするｄｓＲＮＡ、またはＩＤ２に対するｄｓＲＮＡ、またはＩＤ３に対するｄｓＲＮＡが続く。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、少なくとも２つのｄｓＲＮＡ剤は、例えば、同時または順々に、同時投与される。他の実施形態において、少なくとも２つのｄｓＲＮＡ剤は、それらの組み合わせを含む薬学的組成物で投与される。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、およびＮＯＴＣＨ１からなる群から選択される、少なくとも２つの遺伝子および／または遺伝子産物の発現および／または活性を下方制御することができる単剤を意味する、複合阻害剤である。このような単剤の非限定的な例は、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２００７／０９１２６９号に開示される、タンデムおよびマルチアームＲＮＡｉ分子である。
【０１３５】
別の態様において、内耳または中耳の疾患または障害の治療のための薬剤を調製するための、本明細書に開示される核酸化合物の使用を提供する。
【０１３６】
特定の実施形態において、化学修飾されたｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチド、それを含む組成物、ならびに限定されないが、耳毒性物質に誘発される難聴、加齢関連の難聴、内耳有毛細胞に関する末端器官損傷による聴覚障害、例えば、音響性外傷、ウイルス性内リンパ迷路炎、メニエール病；感音障害と診断されるものがある、断続的または継続的であり得る耳鳴；耳帯状疱疹等の細菌またはウイルス感染による難聴；急性中耳炎から生じる化膿性迷路炎、化膿性髄膜炎、慢性中耳炎、ウイルス起源のもの、例えば、流行性耳下腺炎、麻疹、インフルエンザ、水疱瘡、単核球症、およびアデノウイルスを含むウイルスによって引き起こされるウイルス性内リンパ迷路炎を含む突発性難聴；風疹、出生時の無酸素症、出産中の外傷による内耳への出血、母体に投与された耳毒性薬物、胎児赤芽球症、ならびにワールデンブルグ症候群およびフルラー症候群を含む遺伝性疾患によって引き起こされるもの等の先天性難聴を含む、聴覚および前庭の疾患、障害、損傷、および状態の治療におけるその使用方法を本明細書に提供する。
【０１３７】
内耳から脳への音および平衡情報の伝達に関与する聴覚神経（内耳神経または聴神経としても知られている）の変性を予防する方法を、さらに提供する。内耳の有毛細胞は、蝸牛神経と前庭神経とからなり、延髄から出て、顔面神経とともに側頭骨内の内耳道（または内聴道）を通って頭蓋内に入る聴覚神経を介して、脳に情報を伝達する。
【０１３８】
このような方法は、このような治療を必要とする哺乳動物に、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の発現または活性を阻害または低減させる、本明細書に開示される１つ以上の核酸分子の予防有効量または治療有効量を投与することを伴う。
【０１３９】
別の態様において、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の発現と関連する疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害と関連する症状の治療を必要とする対象の治療のための方法であって、配列番号１〜１１に記載されるＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の発現を低減または阻害する核酸分子のある量を、対象に投与することを含む、方法を本明細書に提供する。
【０１４０】
標的遺伝子、特に配列番号１〜１１に記載されるｍＲＮＡ配列の発現を阻害するための、有利な特性を有し、任意の標的配列を対象とするｄｓＲＮＡ分子に適用される、二本鎖オリゴヌクレオチドの新規構造をさらに提供する。本明細書に開示される種々の修飾を含む機能性ｄｓＲＮＡ核酸、薬剤の製造のためのそれらの使用、このような修飾機能性核酸を含む薬学的組成物、および本明細書に開示される疾患または障害を患うか、またはそれらを生じやすい患者の治療のための方法を本明細書に提供する。
【０１４１】
さらに別の実施形態において、患者における聴覚障害の発生または重症度を治療または予防するための方法であって、ネイキッドな化学合成されたｄｓＲＮＡ化合物の有効量を含む組成物を患者に投与することを含む、方法を提供する。好ましくは、ネイキッドｄｓＲＮＡ化合物は、蝸牛の正円窓膜に直接適用されるか、または経鼓膜注射もしくはカニューレを含む経鼓膜デバイスによって、投与される。
【０１４２】
これから記載される好ましい方法、材料、および実施例は、例示のみであり、制限することを意図するものではなく、本明細書に記載されるものに類似するかまたは同等の材料および方法を、本発明の実施または試験に使用することができる。本発明の他の特徴および利点は、以下の図、発明を実施するための形態、および特許請求の範囲から、明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】ＣＢＡ／Ｊマウスにおけるアミノグリコシド（ＡＧ）に誘発される前庭感覚上皮損傷のマウスモデルの実験デザイン。ストレプトマイシンを、後半規管（ＰＳＣ）に注射し、ＨＥＳ５に対するｄｓＲＮＡを１週間後にＰＳＣに注射し、ｄｓＲＮＡ注射の２週間後に評価を行う。読み出し値は次の通りであった：有毛細胞を計数するためのミオシンＶＩＩａ抗体（有毛細胞特異的マーカー）による全載の染色、Ａｔｏｈ１陽性細胞（初期発達有毛細胞のマーカー）に対する全載の染色、Ａｔｏｈ１発現（ｍＲＮＡレベル）およびＨＥＳ５発現（ｍＲＮＡレベル）。
【図２Ａ−２Ｂ】Ｃｙ３標識ｄｓＲＮＡは、ＰＳＣへの局部注射の際に、ＡＧによって損傷した前庭感覚上皮へと送達される。細胞は、ファロイジンで標識化する。図２Ａ：ＰＳＣ、図２Ｂ：卵形嚢。矢印は、Ｃｙ３標識ｄｓＲＮＡを示す。
【図３Ａ−３Ｂ】ＨＥＳ５に対するｄｓＲＮＡでの処置は、ＡＧによって損傷した前庭上皮における有毛細胞の量の増加をもたらす。図３Ａ：ｄｓＲＮＡによる処置。図３Ｂ：ビヒクルによる処置。矢印は、ミオシンＶＩＩａ陽性細胞を示し、これは、分化形質転換した有毛細胞として識別される。ミオシンＶＩＩａは、有毛細胞のマーカーであることが報告されている（Ｈａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＰＮＡＳ  ９２：９８１５−９８１９）。
【図４】ＨＥＳ５に対するｄｓＲＮＡでの処置が有毛細胞の再生を促進するデータを示す。
【図５】ｄｓＲＮＡ  ＨＥＳ５で処置した試料における二重の抗Ａｔｏｈ１および抗ミオシンＶＩＩａ染色を示す。実線の矢印は、Ａｔｏｈ１染色のいくつかを示し、破線の矢印は、ミオシン７ａ染色のいくつかを示す。
【図６】ＨＥＳ５に対するｄｓＲＮＡでの処置がＨＥＳ５  ｍＲＮＡを下方制御し、Ａｔｏｈ１  ｍＲＮＡを上方制御するデータを示す。
【図７Ａ−７Ｂ】本明細書に開示される種々のｄｓＲＮＡ核酸分子の血清安定性結果を示す。図７Ａは、マウスおよびラット血清（３、８、および２４時間）、ならびにラットＣＳＦ（ＣＳ）およびＨＣＴ１１６（ＨＣＴ１）細胞抽出物（３、８、および２４時間）における、２つの異なるＨＥＳ１＿１４  ｄｓＲＮＡの安定性を、１ｎｇの未処置二重鎖（「Ｂｏｘ」）と比較して、示す。図７Ｂは、ＣＳＦ、ラット血漿、細胞抽出物、およびヒト血漿（３、８、２４時間）におけるＨＥＳ１＿３６＿Ｓ２０３６二重鎖の血清安定性を、１ｎｇ未処置二重鎖（「Ｂ」）と比較して示す。図８Ａ〜８Ｂは、ＨＣＴ１１６およびＣＳＦ（３、８、２４時間）におけるＩＤ３  ｄｓＲＮＡ二重鎖の安定性を、１ｎｇの未処置二重鎖（「Ｂｏｘ」）と比較して、示す。
【図８Ａ】マウスおよびラットの血清（３、８、２４時間）におけるＩＤ３  ｄｓＲＮＡ二重鎖の血清安定性を、１ｎｇの未処置二重鎖（「Ｂｏｘ」）と比較して示す。図８Ｂは、ＨＣＴ１１６およびＣＳＦ（３、８、２４時間）におけるＩＤ３  ｄｓＲＮＡ二重鎖の安定性を、１ｎｇの未処置二重鎖（「Ｂｏｘ」）と比較して示す。
【図９Ａ】ラットＣＳＦおよびラット血漿におけるＣＤＫＮ１Ｂ  ｄｓＲＮＡの安定性を示す。図９Ｂは、種々の濃度でのＣＤＫＮ１Ｂ  ｄｓＲＮＡのノックダウン活性を示す。
【図１０Ａ−１０Ｂ】４つの異なるＨＥＹ１  ｄｓＲＮＡ核酸分子の血漿、ＣＳＦ（脳脊髄液）、および細胞抽出物の安定性を示す。図１０Ａは、３、８、および２４時間のマウス（Ｍｓ）およびラット（Ｒｔ）の血漿、およびラットＣＳＦにおける４つのｄｓＲＮＡの安定性を示す。図１０Ｂは、ヒト細胞抽出物（ＨＣＴ１１６）における４つのｄｓＲＮＡの安定性を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１４４】
難聴と関連するある特定の遺伝子の発現を下方制御する、分子および組成物、ならびに難聴を患う対象の治療におけるそれらの使用を、本明細書に提供する。好ましい実施形態において、本方法は、部分的または完全な聴覚の再生を含む。ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、およびＮＯＴＣＨ１の発現の阻害は、聴覚の再生に有益であることが示された。本出願は、特に、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、およびＮＯＴＣＨ１の発現を阻害する、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）化合物を含むｄｓＲＮＡ分子、ならびに難聴の治療におけるこれらのｄｓＲＮＡ分子の使用に関する。ｄｓＲＮＡ分子の生成に有用なセンス鎖および相補的アンチセンス鎖は、配列番号２３〜２６９１２に記載されている。ある特定の現在好ましいセンス鎖およびアンチセンス鎖対は、上記の表Ｉ〜ＩＸに記載される。
【０１４５】
ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１を阻害するための化合物、組成物、および方法は、本明細書に詳細に説明され、前記化合物および／または組成物のいずれも、聴覚障害／難聴を患う患者の治療に有益に利用することができる。
【０１４６】
本発明は、標的ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１遺伝子の発現をインビボで阻害するための方法および組成物を提供する。一般に、本方法は、配列番号１〜１１のいずれか１つから選択される特定のｍＲＮＡを標的とし、生物学的条件下（細胞内）でｍＲＮＡとハイブリダイズするか、もしくはそれと相互作用する、低分子干渉ＲＮＡ（すなわち、ｄｓＲＮＡ）を含むｄｓＲＮＡ分子等のオリゴリボヌクレオチド、または細胞内でｓｉＲＮＡを生成することができる核酸材料を、ＲＮＡ干渉機構によって標的遺伝子の発現を下方制御するのに十分な量で、投与することを含む。
【０１４７】
本発明は、概して、耳細胞、例えば、蝸牛の有毛細胞中に発現する遺伝子の発現を下方制御する化合物に関し、具体的には、新規な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および耳におけるそれらの遺伝子の発現と関連する難聴を患う対象の治療におけるこれらの新規なｓｉＲＮＡの使用に関する。
【０１４８】
耳への化学修飾されたｄｓＲＮＡ分子の送達のための方法を、本明細書において詳細に説明し、前記分子および／または組成物のいずれも、難聴を患う対象の治療において有益に利用することができる。聴覚再生は、完全または部分的なものであり得、これは当業者によって容易に判定される。
【０１４９】
本明細書に開示されるｄｓＲＮＡは、例えば、活性を向上させ、安定性を向上させ、毒性を最小限に抑えることができる構造および修飾を有し、本明細書に開示される化学修飾されたｄｓＲＮＡ分子は、標的遺伝子、特に、本明細書に記載される標的遺伝子の発現の予防または軽減に有用である。
【０１５０】
表示ごとの標的遺伝子の非限定的な例の詳細を、本明細書の以下の表１Ａに提示する。
表１Ａ  難聴の治療のための標的遺伝子
【表１４】
2014528704.tif 000015
【０１５１】
表１Ａは、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤が対象とするヒトｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列の例に対するｇｉ（遺伝子情報識別子）および受託番号を提供する。（「ｖ」は、転写変異体を指す）。
【０１５２】
表１Ａの遺伝子のうちのいずれか１つ以上の阻害が、難聴の治療および聴覚再生に有用である。
【０１５３】
標的遺伝子の簡単な説明は、次の通りである。
１．ＨＥＳ１  ヘアリーおよびスプリットエンハンサー１、（ショウジョウバエ）。正式な符号ＨＥＳ１および名称：ヘアリーおよびスプリットエンハンサー１、（ショウジョウバエ）
別名：ＦＬＪ２０４０８、ＨＥＳ−１、ＨＨＬ、ＨＲＹ、ヘアリーおよびスプリットエンハンサー１、ヘアリー相同体、転写因子ＨＥＳ−１
ＨＥＳ１タンパク質は、転写因子の塩基性へリックス−ループ−へリックスファミリーに属する。これは、転写にｂＨＬＨタンパク質を必要とする遺伝子の転写リプレッサーである。ヒトＨＥＳ１  ｍＲＮＡポリヌクレオチド配列は、配列番号１に記載される。ヒトＨＥＳ１ポリペプチドは、配列番号１２に記載される。
２．ＨＥＳ５  ヘアリーおよびスプリットエンハンサー５（ショウジョウバエ）。正式な符号ＨＥＳ５および名称：ヘアリーおよびスプリットエンハンサー５（ショウジョウバエ）
ヒトＨＥＳ５遺伝子は、関節軟骨細胞におけるＮｏｔｃｈシグナリングの下流マーカーである。ヒトＨＥＳ５  ｍＲＮＡポリヌクレオチド配列は、配列番号２に記載される。ヒトＨＥＳ５ポリペプチド配列は、配列番号１３に記載される。
３．ＤＮＡ結合阻害剤１、優性阻害のへリックス−ループ−へリックスタンパク質。正式な符号ＩＤ１および名称：ＤＮＡ結合阻害剤１、優性阻害のへリックス−ループ−へリックスタンパク質［ホモサピエンス］。別名：ＩＤ、ＤＮＡ結合タンパク質阻害剤ＩＤ−１、ｄＪ８５７Ｍ１７．１．２（ＤＮＡ結合阻害剤１、優性阻害のへリックス−ループ−へリックスタンパク質）、ＤＮＡ結合阻害剤１、分化阻害剤１
ＩＤ１は、転写因子の塩基性ＨＬＨファミリーのメンバーとヘテロ二量体を形成することができるへリックス−ループ−へリックス（ＨＬＨ）タンパク質である。異なるアイソフォームをコードする２つの転写変異体が、この遺伝子に対して見つかっている。ヒトＩＤ１  ｍＲＮＡポリヌクレオチド配列は、配列番号３および４に記載される。ヒトＩＤ１ポリペプチド配列は、それぞれ、配列番号１４および１５に記載される。
４．ＤＮＡ結合阻害剤２、優性阻害のへリックス−ループ−へリックスタンパク質。正式な符号ＩＤ２および名称：ＤＮＡ結合阻害剤２、優性阻害のへリックス−ループ−へリックスタンパク質［ホモサピエンス］。別名：ＧＩＧ８、ＩＤ２Ａ、ＩＤ２Ｈ、ＭＧＣ２６３８９、ＤＮＡ結合タンパク質阻害剤ＩＤ２、細胞成長阻害遺伝子８、へリックス−ループ−へリックスタンパク質ＩＤ２、ＤＮＡ結合阻害剤２、分化阻害剤２
ヒトＩＤ２  ｍＲＮＡポリヌクレオチド配列は、配列番号５に記載される。ヒトＩＤ２ポリペプチド配列は、配列番号１６に記載される。
５．ＤＮＡ結合阻害剤３、優性阻害のへリックス−ループ−へリックスタンパク質。正式な符号ＩＤ３および名称：ＤＮＡ結合阻害剤３、優性阻害のへリックス−ループ−へリックスタンパク質［ホモサピエンス］。別名：ＨＥＩＲ−１
ヒトＩＤ３  ｍＲＮＡポリヌクレオチド配列は、配列番号６に記載される。ヒトＩＤ３ポリペプチド配列は、配列番号１７に記載される。
６．サイクリン依存性キナーゼ阻害因子１Ｂ（ｐ２７、Ｋｉｐ１）。正式な符号ＣＤＫＮ１Ｂおよび名称：サイクリン依存性キナーゼ阻害因子１Ｂ（ｐ２７、Ｋｉｐ１）。別名：ＣＤＫＮ４、ＫＩＰ１、ＭＥＮ１Ｂ、ＭＥＮ４、Ｐ２７ＫＩＰ１
ＣＤＫ阻害剤ＣＤＫＮ１Ａ／ｐ２１と限定的な類似性を共有する、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤。ヒトＣＤＫＮ１Ｂ  ｍＲＮＡポリヌクレオチド配列は、配列番号７に記載される。ヒトＣＤＫＮ１Ｂポリペプチド配列は、配列番号１８に記載される。
７．ＨＥＹ１−ＹＲＰＷモチーフ関連ヘアリー／スプリットエンハンサー１。ヒトＨＥＹ１  ｍＲＮＡポリヌクレオチド配列は、配列番号８および９に記載される。ヒトＨＥＹ１ポリペプチド配列は、配列番号１９および２０に記載される。
８．ＨＥＹ２−ＹＲＰＷモチーフ関連ヘアリー／スプリットエンハンサー２。ヒトＨＥＹ２  ｍＲＮＡポリヌクレオチド配列は、配列番号１０に記載される。ヒトＨＥＹ１ポリペプチド配列は、配列番号２１に記載される。
９．ＮＯＴＣＨ１−ホモサピエンスＮｏｔｃｈ相同体１、転座関連（ショウジョウバエ）。ヒトＮＯＴＣＨ１  ｍＲＮＡポリヌクレオチド配列は、配列番号１１に記載される。ヒトＮＯＴＣＨ１ポリペプチド配列は、配列番号２２に記載される。
【０１５４】
種々の実施形態において、化学修飾された低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ならびに種々の疾患および病状の治療におけるｄｓＲＮＡの使用を提供する。治療される具体的な疾患および状態は、難聴に関連する。具体的な標的遺伝子を、表１Ａに提示する。
【０１５５】
ｄｓＲＮＡの生成に有用な好ましい配列は、配列番号２３〜２６９１２に提供される。配列に、独自のアルゴリズムに従って、それらのスコアに基づいてヒト遺伝子の発現を標的とするための最良の配列として優先順位を付けた。配列番号２３〜６９３および２６６９１〜２６７０６（ＨＥＳ１）、配列番号１４９６〜２０２９および２６７２５〜２６７３２（ＨＥＳ５）、配列番号２７０４〜３０２５および２６８０９〜２６８１６（ＩＤ１）、配列番号３６３４〜５０５３および２６８２５〜２６８３２（ＩＤ２）、配列番号６２０６〜６６７１および２６８５１〜２６８６６（ＩＤ３）、配列番号７４４４〜９００７および２６８８７〜２６９００（ＣＤＫＮ１Ｂ）、配列番号１０５３４〜１１５４９および２６７６１〜２６７７８（ＨＥＹ１）、配列番号１３００４〜１４８０１および２６７８５〜２６７８８（ＨＥＹ２）、配列番号１６６２２〜１８６４３および２６９２２〜２６９１２（ＮＯＴＣＨ１）は、１９量体オリゴマーを示す。配列番号６９４〜１４９５（ＨＥＳ１）、配列番号２０３０〜２７０３（ＨＥＳ５）、配列番号３０２６〜３６３３（ＩＤ１）、配列番号５０５４〜６２０５（ＩＤ２）、配列番号６６７２〜７４４３（ＩＤ３）、配列番号９００８〜１０５３３（ＣＤＫＮ１Ｂ）、配列番号１１５５０〜１３００３（ＨＥＹ１）、配列番号１４８０２〜１６３８９（ＨＥＹ２）、配列番号１８６４４〜２６６６６（ＮＯＴＣＨ１）は、構造Ａ２に従ってｄｓＲＮＡ分子を生成するのに有用な１８量体オリゴマーを示す。
【０１５６】
ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の発現を下方制御する化合物、具体的には、新規な化学修飾された二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡ）、ならびに種々の疾患および病状、特に耳の疾患および障害の治療におけるこれらの新規なｄｓＲＮＡの使用を、本明細書に開示する。一態様によると、本発明は、非修飾および修飾ヌクレオチド、ならびに非従来的部分を含む阻害性オリゴヌクレオチド化合物を提供する。この化合物は、糖修飾、塩基修飾、およびヌクレオチド間連結修飾からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み、ＤＮＡと、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＥＮＡ（エチレン架橋核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アラビノシド、ＰＡＣＥ、ミラーヌクレオチド、２’−５’ヌクレオチド間結合によって隣接するヌクレオチドと接合したヌクレオチド、もしくは６炭素糖を有するヌクレオチドを含む、修飾ヌクレオチドまたは非従来的部分とをさらに含んでもよい。
【０１５７】
ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、またはＣＤＫＮ１Ｂを下方制御する方法、核酸分子、および組成物を本明細書に詳細に説明し、前記分子および／または組成物のいずれも、前記状態のいずれかを患う対象の治療に有益に利用することができる。
【０１５８】
本明細書に提供される核酸化合物は、活性を向上させる、安定性を向上させる、および／または毒性の最小限に抑えることができる構造および修飾を有し、本明細書に開示されるｄｓＲＮＡ化合物の生成に有用な新規の修飾は、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１発現の予防または軽減に有用である二本鎖ＲＮＡに有益に適用することができる。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、構造（Ａ１）を有する二本鎖ＲＮＡ化合物であって、
【表１５】
2014528704.tif 000016
式中、各ＮおよびＮ’は、非修飾もしくは修飾、または非従来的部分であり得る、リボヌクレオチドであり、
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、オリゴヌクレオチドであり、それぞれの連続するＮまたはＮ’は、共有結合によって次のＮまたはＮ’と接合し、
ＺおよびＺ’のそれぞれは、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した１〜５個の連続するヌクレオチド、１〜５個の連続する非ヌクレオチド部分、またはそれらの組み合わせを含み、
ｚ"は、存在しても不在であってもよいが、存在する場合は、（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合したキャッピング部分であり、
ｘおよびｙのそれぞれは、独立して、１８〜４０の整数であり、
（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に相補的であり、（Ｎ）ｘは、アンチセンス配列を含み、（Ｎ’）ｙは、配列番号２３〜６９３および２６６９１〜２６７０６（ＨＥＳ１）、配列番号１４９６〜２０２９および２６７２５〜２６７３２（ＨＥＳ５）、配列番号２７０４〜３０２５および２６８０９〜２６８１６（ＩＤ１）、配列番号３６３４〜５０５３および２６８２５〜２６８３２（ＩＤ２）、配列番号６２０６〜６６７１および２６８５１〜２６８６６（ＩＤ３）、配列番号７４４４〜９００７および２６８８７〜２６９００（ＣＤＫＮ１Ｂ）、配列番号１０５３４〜１１５４９および２６７６１〜２６７７８（ＨＥＹ１）、配列番号１３００４〜１４８０１および２６７８５〜２６７８８（ＨＥＹ２）、配列番号１６６２２〜１８６４３および２６９２２〜２６９１２（ＮＯＴＣＨ１）に記載されるセンス配列を含む、二本鎖ＲＮＡを本明細書に提供する。
【０１６０】
好適な（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、配列番号２６６９１〜２６７０６（ＨＥＳ１）、配列番号２６７２５〜２６７３２（ＨＥＳ５）、配列番号２６８０９〜２６８１６（ＩＤ１）、配列番号２６８２５〜２６８３２（ＩＤ２）、配列番号２６８５１〜２６８６６（ＩＤ３）、配列番号２６８８７〜２６９００（ＣＤＫＮ１Ｂ）、配列番号２６７６１〜２６７７８（ＨＥＹ１）、配列番号２６７８５〜２６７８８（ＨＥＹ２）、配列番号２６９２２〜２６９１２（ＮＯＴＣＨ１）のいずれか１つに記載される。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、それぞれの連続するＮおよび／またはＮ’を接合する共有結合は、リン酸ジエステル結合である。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙであり、ｘおよびｙのそれぞれは、１９、２０、２１、２２、または２３である。好ましい実施形態において、ｘ＝ｙ＝１９である。
【０１６３】
本明細書に開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のいくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、またはｍｉＲＮＡである。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、アンチセンス鎖の１位（５’末端）にＤＮＡ部分または標的に対するミスマッチを含む。このような二重鎖構造を本明細書に説明する。一実施形態によると、以下に記載される構造（Ａ２）を有する二本鎖ｄｓＲＮＡ化合物であって、
【表１６】
2014528704.tif 000017
式中、それぞれのＮ１、Ｎ２、Ｎ、およびＮ’は、独立して、非修飾もしくは修飾ヌクレオチド、または非従来的部分である、
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、オリゴヌクレオチドであり、それぞれの連続するＮまたはＮ’は、共有結合によって隣接するＮまたはＮ’と接合し、
ｘおよびｙのそれぞれは、独立して、１７〜３９の整数であり、
Ｎ２は、（Ｎ’）ｙと共有結合し、
Ｎ１は、（Ｎ）ｘと共有結合し、標的ｍＲＮＡ（配列番号１〜１１）に対してミスマッチであるか、または標的ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ部分であり、
Ｎ１は、天然もしくは修飾された、ウリジン、デオキシリボウリジン、リボチミジン、デオキシリボチミジン、アデノシン、またはデオキシアデノシン、脱塩基リボース部分、および脱塩基デオキシリボース部分からなる群から選択される部分であり、
ｚ"は、存在しても不在であってもよいが、存在する場合は、Ｎ２−（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合したキャッピング部分であり、
ＺおよびＺ’のそれぞれは、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した１〜５個の連続するヌクレオチド、１〜５個の連続する非ヌクレオチド部分、またはそれらの組み合わせであり、
（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に相補的であり、（Ｎ）ｘの配列は、アンチセンス配列を含み、（Ｎ’）ｙは、配列番号６９４〜１４９５（ＨＥＳ１）、配列番号２０３０〜２７０３（ＨＥＳ５）、配列番号３０２６〜３６３３（ＩＤ１）、配列番号５０５４〜６２０５（ＩＤ２）、配列番号６６７２〜７４４３（ＩＤ３）、配列番号９００８〜１０５３３（ＣＤＫＮ１Ｂ）、配列番号１１５５０〜１３００３（ＨＥＹ１）、配列番号１４８０２〜１６３８９（ＨＥＹ２）、配列番号１８６４４〜２６６６６（ＮＯＴＣＨ１）に記載されるセンス配列を含む、二本鎖ｄｓＲＮＡ化合物を提供する。
【０１６５】
好ましいＮ１−（Ｎ）ｘおよびＮ２−（Ｎ’）ｙは、配列番号２６６６７〜２６６９０（ＨＥＳ１）、配列番号２６７０７〜２６７２４（ＨＥＳ５）、配列番号２６７８９〜２６８０８（ＩＤ１）、配列番号２６８１７〜２６８２４（ＩＤ２）、配列番号２６８３３〜２６８５０（ＩＤ３）、配列番号２６８６７〜２６８８６（ＣＤＫＮ１Ｂ）、配列番号２６７３３〜２６７６０（ＨＥＹ１）、配列番号２６７７９〜２６７８４（ＨＥＹ２）、配列番号２６０１〜２６９１０（ＮＯＴＣＨ１）のいずれか１つに記載される。
定義
【０１６６】
便宜上、本明細書、実施例、および特許請求の範囲で用いられるある特定の用語を、本明細書において説明する。
【０１６７】
本明細書に使用される際、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により別途明示されない限り、複数形を含むことに留意されたい。
【０１６８】
本発明の態様または実施形態が、マーカッシュ群または他の選択肢の系列化に関して記載される場合、当業者は、本発明がそれによって、任意の個々の要素または群の要素の亜群に関しても記載されていることを認識するであろう。
【０１６９】
「阻害剤」は、遺伝子の発現またはこのような遺伝子の産物の活性を、所望される生物学的または生理学的効果を達成するのに十分な程度まで、（部分的または完全に）低減させることができる化合物である。本明細書に使用される「阻害剤」という用語は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、合成ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、ならびにリボザイムを含む、オリゴヌクレオチド阻害剤のうちの１つ以上を指す。
【０１７０】
「ｄｓＲＮＡ分子」または「ｄｓＲＮＡ阻害剤」は、遺伝子の発現またはこのような遺伝子の産物の活性を、所望される生物学的または生理学的効果を達成するのに十分な程度まで下方制御または低減させることができ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、合成ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡのうちの１つ以上を含む化合物である。阻害は、下方制御、またはＲＮＡｉについてはサイレンシングとも称され得る。
【０１７１】
本明細書に使用される「阻害する」という用語は、遺伝子の発現またはこのような遺伝子の産物の活性を、所望される生物学的または生理学的効果を達成するのに十分な程度まで低減させることを指す。阻害は、完全または部分的のいずれでもある。
【０１７２】
本明細書に使用される際、標的遺伝子の「阻害」とは、標的遺伝子の遺伝子発現（転写もしくは翻訳）またはポリペプチド活性の阻害を意味し、この標的遺伝子は、配列番号１〜１１のいずれか１つに記載されるｍＲＮＡに転写される遺伝子、またはＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）、またはそれらの他の変異体から選択される。各標的遺伝子のｍＲＮＡに対するｇｉ番号は、表１Ａに記載される。標的ｍＲＮＡ配列またはｍＲＮＡ配列を有する標的遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号１〜１１に記載のｍＲＮＡ配列を指すか、または、配列番号１〜１１に記載のｍＲＮＡのいずれか１つに対して、好ましくは少なくとも７０％の同一性、より好ましくは８０％の同一性、さらにより好ましくは９０％もしくは９５％の同一性を有する、その任意の相同配列を指す。したがって、本明細書に記載されるように突然変異、改変、または修飾を受けた、配列番号１〜１１のいずれか１つに由来するポリヌクレオチド配列は、本発明に包含される。「ｍＲＮＡポリヌクレオチド配列」、「ｍＲＮＡ配列」、および「ｍＲＮＡ」という用語は、互換的に使用される。
【０１７３】
本明細書に使用される際、「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、互換的に使用することができ、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含むヌクレオチド配列を指す。これらの用語は、ヌクレオチド類似体から作製されるＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの類似体を同等物として含むことを理解されたい。本出願全体を通じて、ｍＲＮＡ配列は、対応する遺伝子を表すものとして記載される。
【０１７４】
「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」とは、約２〜約５０個のヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を指す。各ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドは、独立して、天然もしくは合成、および／または修飾もしくは非修飾であり得る。修飾には、オリゴヌクレオチド中の糖部分、塩基部分、および／またはヌクレオチド間の連結に対する変更が含まれる。本発明の化合物は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、およびこれらの組み合わせを含む分子を包含する。
【０１７５】
「実質的に相補的である」とは、別の配列に対する約８４％を上回る相補性を指す。例えば、１９塩基対からなる二重鎖領域において、１つのミスマッチは、９４．７％の相補性をもたらし、２つのミスマッチは、約８９．５％の相補性をもたらし、３つのミスマッチは、約８４．２％の相補性をもたらし、二重鎖領域を実質的に相補的にする。したがって、実質的に同一であるとは、別の配列に対する約８４％を上回る同一性を指す。
【０１７６】
「ヌクレオチド」とは、天然もしくは合成、および／または修飾もしくは非修飾であり得る、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを包含することを意味する。修飾には、オリゴリボヌクレオチド中の糖部分、塩基部分、および／またはリボヌクレオチド間の連結に対する変化が含まれる。本明細書に使用される際、「リボヌクレオチド」という用語は、天然および合成の非修飾および修飾リボヌクレオチドを包含する。修飾には、オリゴヌクレオチド中の糖部分、塩基部分、および／またはリボヌクレオチド間の連結に対する変更が含まれる。
【０１７７】
ヌクレオチドは、天然に存在するか、合成修飾された塩基から選択され得る。天然に存在する塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルが含まれる。ヌクレオチドの修飾された塩基には、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、２−プロピル、および他のアルキルアデニン類、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザシトシンおよび６−アザチミン、擬似ウラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオールアルキルアデニン類、８−ヒドロキシルアデニンおよび他の８置換アデニン類、８−ハログアニン類、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン類、８−ヒドロキシルグアニンおよび他の置換グアニン類、他のアザおよびデアザアデニン類、他のアザおよびデアザグアニン類、５−トリフルオロメチルウラシル、ならびに５−トリフルオロシトシンが挙げられる。いくつかの実施形態において、オリゴマー中の１つ以上のヌクレオチドは、イノシンで置換される。
【０１７８】
いくつかの実施形態によると、本発明は、非修飾および修飾ヌクレオチド、ならびに／または非従来的部分を含む、阻害性オリゴヌクレオチド化合物を提供する。この化合物は、糖修飾、塩基修飾、およびヌクレオチド間連結修飾からなる群から選択される、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み、ＤＮＡと、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＥＮＡ（エチレン架橋核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アラビノシド、ホスホノカルボキシレート、またはホスフィノカルボキシレートヌクレオチド（ＰＡＣＥヌクレオチド）、ミラーヌクレオチド、または６炭糖を有するヌクレオチド等の修飾ヌクレオチドとを含み得る。
【０１７９】
ヌクレオチド／オリゴヌクレオチドの全ての類似体またはそれに対する修飾が本明細書で利用されるが、ただし、前記類似体または修飾が、ヌクレオチド／オリゴヌクレオチドの機能に実質的に悪影響を及ぼさないことを条件とする。許容される修飾には、糖部分の修飾、塩基部分の修飾、ヌクレオチド間連結における修飾、およびこれらの組み合わせが含まれる。
【０１８０】
糖修飾には、糖残基の２’部分の修飾が含まれ、アミノ、フルオロ、アルコキシ、例えばメトキシ、アルキル、アミノ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＣＮ、ＣＦ、イミダゾール、カルボキシレート、チオエート、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリルもしくはアラルキル、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ、もしくはＮ−アルケニル、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ヘテロジクロアルキル、ヘテロジクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、または置換シリル、とりわけ欧州特許第ＥＰ  ０  ５８６  ５２０  Ｂ１号または同第ＥＰ  ０  ６１８  ９２５  Ｂ１号に記載されているものを包含する。
【０１８１】
一実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子は、糖部分の２’修飾を含む少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む。（「２’糖修飾」）ある特定の実施形態において、本化合物は、場合により交互の位置に、２’Ｏ−アルキルまたは２’−フルオロまたは２’Ｏ−アリルまたは任意の他の２’修飾を含む。他の安定化させる修飾もまた可能である（例えば、末端修飾）。いくつかの実施形態において、好ましい２’Ｏ−アルキルは、２’Ｏ−メチル（メトキシ）糖修飾である。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの骨格は、修飾され、ホスフェート−Ｄ−リボース実体を含むが、チオホスフェート−Ｄ−リボース実体、トリエステル、チオエート、２’−５’架橋骨格（５’−２’とも称され得る）、ＰＡＣＥ等もまた含み得る。
【０１８３】
本明細書に使用される際、「非対合ヌクレオチド類似体」という用語は、６デスアミノアデノシン（ネブラリン）、４−Ｍｅ−インドール、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、Ｄｓ、Ｐａ、Ｎ３−ＭｅリボＵ、Ｎ３−ＭｅリボＴ、Ｎ３−Ｍｅ  ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ−ｄＴ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＧ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＡ、Ｎ３−エチル−ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ  ｄＣを含むがこれらに限定されない非塩基対合部分を含む、ヌクレオチド類似体を意味する。いくつかの実施形態において、非塩基対合ヌクレオチド類似体は、リボヌクレオチドである。他の実施形態において、これは、デオキシリボヌクレオチドである。さらに、１つ以上のヌクレオチドの構造が本質的に改変されており、治療的または実験的試薬としてより適している、ポリヌクレオチドの類似体を調製することがでる。ヌクレオチド類似体の例は、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）中のデオキシリボース（またはリボース）のリン酸骨格が、ペプチドに見られるものと類似のポリアミド骨格と置き換えられている、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ類似体は、酵素分解に対して耐性であり、インビボおよびインビトロで向上した安定性を有することが示されている。オリゴヌクレオチドに行うことができる他の修飾には、ポリマー骨格、環状骨格、非環状骨格、チオホスフェート−Ｄ−リボース骨格、トリエステル骨格、チオエート骨格、２’−５’架橋骨格、人工核酸、モルホリノ核酸、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、アラビノシド、およびミラーヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシドの代わりにβ−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド）が含まれる。ＬＮＡヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ分子の例は、Ｅｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（ＮＡＲ  ２００５，３３（１）：４３９−４４７）に開示されている。
【０１８４】
本発明の化合物は、１つ以上の逆位ヌクレオチド、例えば、逆位チミジンまたは逆位アデニンを使用して、合成することができる（例えば、Ｔａｋｅｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００２，ＪＢＣ  ２７７（２６）：２３８００−０６を参照されたい）。
【０１８５】
「ミラー」ヌクレオチドは、天然に存在するかまたは広く用いられるヌクレオチドとは逆のキラリティを有するヌクレオチド、すなわち、天然に存在する（Ｄ−ヌクレオチド）の鏡像（Ｌ−ヌクレオチド）であり、ミラーリボヌクレオチドの場合はＬ−ＲＮＡおよび「スピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）」とも称される。ヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドであり得、少なくとも１つの糖、塩基、および／または骨格の修飾をさらに含み得る。米国特許第６，５８６，２３８号を参照されたい。さらに、米国特許第６，６０２，８５８号は、少なくとも１つのＬ−ヌクレオチド置換を含む核酸触媒を開示する。
【０１８６】
他の修飾は、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’部分の末端修飾を含み、これは、キャッピング部分としても知られている。このような末端修飾は、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、脂質、ペプチド、糖、および逆位脱塩基部分から選択される。
【０１８７】
「アルキル部分またはその誘導体」とは、直鎖または分枝鎖炭素部分、および部分自体、またはアルコール、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、ホスホノアセテートを含む官能基をさらに含む部分を指し、アミン、カルボン酸、エステル、アミド、アルデヒドもまた含む。「炭化水素部分」および「アルキル部分」は、互換的に使用される。
【０１８８】
「末端官能基」には、ハロゲン基、アルコール基、アミン基、カルボン酸基、エステル基、アミド基、アルデヒド基、ケトン基、エーテル基が含まれる。
【０１８９】
インビボで標的遺伝子の発現を阻害するための方法および組成物を提供する。一般的に、本方法は、標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡを標的とするオリゴリボヌクレオチド、特に低分子干渉ＲＮＡ（すなわちｓｉＲＮＡ）を、ＲＮＡ干渉機構によって標的遺伝子の発現を下方制御するのに十分な量で、投与することを含む。具体的には、本主題の方法を使用して、疾患の治療のために、標的遺伝子の発現を阻害することができる。本明細書に開示される標的遺伝子を対象とし、種々の眼および前庭系病態を治療する治療剤として有用なｄｓＲＮＡ分子を、本明細書に提供する。
【０１９０】
インビボで難聴関連遺伝子の発現を阻害するための方法および組成物を提供する。一般的に、本方法は、ｍＲＮＡを標的とするオリゴリボヌクレオチド、特に二本鎖ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ等）、またはそれを含む薬学的組成物を、ＲＮＡ干渉機構によって標的遺伝子の発現を下方制御するのに十分な量で投与することを含む。具体的には、本主題の方法を使用して、本明細書に開示される疾患または障害または状態の治療のために、難聴関連遺伝子の発現を阻害することができる。
【０１９１】
配列番号１〜１１のいずれか１つに記載されるポリヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡに転写された標的遺伝子の発現を下方制御する、化学修飾されたｄｓＲＮＡ化合物、および１つ以上のこのような化合物を含む薬学的組成物を、本明細書に開示する。
【０１９２】
インビボでＨＥＳ１の発現を阻害するための方法および組成物を本明細書に提供する。インビボでＨＥＳ５の発現を阻害するための方法および組成物を本明細書に提供する。インビボでＨＥＹ１の発現を阻害するための方法および組成物を本明細書に提供する。インビボでＨＥＹ２の発現を阻害するための方法および組成物を本明細書に提供する。インビボでＩＤ１の発現を阻害するための方法および組成物を本明細書に提供する。インビボでＩＤ２の発現を阻害するための方法および組成物を本明細書に提供する。インビボでＩＤ３の発現を阻害するための方法および組成物を本明細書に提供する。インビボでＣＤＫＮ１Ｂの発現を阻害するための方法および組成物を本明細書に提供する。インビボでＮＯＴＣＨ１の発現を阻害するための方法および組成物を本明細書に提供する。一般に、本方法は、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡを標的とする、オリゴリボヌクレオチド、特に二本鎖ＲＮＡ（すなわち、ｄｓＲＮＡ）、または細胞内でｄｓＲＮＡを生成することができる核酸材料を、例えばＲＮＡ干渉機構によってＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の発現を下方制御するのに十分な量で投与することを含む。具体的には、本主題の方法を使用して、疾患、障害、または損傷の治療のために、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の発現を下方制御することができる。本発明に従って、核酸分子、またはＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、もしくはＮＯＴＣＨ１の阻害剤は、種々の病態を治療するために薬物として使用される。本発明に従って、核酸分子、またはＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、もしくはＮＯＴＣＨ１の阻害剤は、耳の疾患または障害を治療するために薬物として使用される。
【０１９３】
本発明のｄｓＲＮＡは、センス鎖が標的遺伝子のｍＲＮＡポリヌクレオチド配列の１８〜４０個の連続するヌクレオチドセグメントに実質的に相補的であり、アンチセンス鎖がセンス鎖に実質的に相補的である、二重鎖オリゴリボヌクレオチドである。一般に、標的ｍＲＮＡ配列からの多少の偏差は、ｓｉＲＮＡ活性を損なうことなく許容される（例えば、Ｃｚａｕｄｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３，３１（１１）：２７０５−２７１６を参照されたい）。本発明のｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの破壊を伴ってか、または伴わずに、転写後レベルで遺伝子発現を阻害する。理論に束縛されることなく、ｓｉＲＮＡは、特異的開裂および分解のためにｍＲＮＡを標的とすることができる、および／または標的メッセージからの翻訳を阻害することができる。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、一端または両端が、平滑末端である。より具体的には、ｄｓＲＮＡは、第１の鎖の５’末端および第２の鎖の３’末端によって定義される末端、または第１の鎖の３’末端および第２の鎖の５’末端によって定義される末端が、平滑末端である。
【０１９５】
他の実施形態において、２つの鎖のうちの少なくとも１つは、５’−末端に少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを有し得、オーバーハングは、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドからなり得る。鎖のうちの少なくとも１つはまた、任意で、３’−末端に少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを有してもよい。オーバーハングは、約１〜約５個のヌクレオチドからなり得る。
【０１９６】
ＲＮＡ二重鎖の長さは、約１８〜約４０個のリボヌクレオチドであり、好ましくは、１９〜２３個のリボヌクレオチドである。さらに、各鎖（オリゴマー）の長さは、独立して、約１８〜約４０塩基、好ましくは１８〜２３塩基、より好ましくは１９、２０、または２１個のリボヌクレオチドからなる群から選択される長さを有し得る。
【０１９７】
さらに、ある特定の好ましい実施形態において、前記第１の鎖と標的核酸との間の相補性は、完全なものである。いくつかの実施形態において、鎖は、実質的に相補的である、すなわち、前記第１の鎖と標的核酸との間に１、２、または最大３つのミスマッチを有する。
【０１９８】
さらに、ｓｉＲＮＡの第１の鎖の５’末端は、第２の鎖の３’末端に連結させることができるか、または第１の鎖の３’末端を、第２の鎖の５’末端に連結させることができ、前記連結は、典型的に３〜１００個のヌクレオチド、好ましくは約３〜約１０個のヌクレオチドの長さを有する核酸リンカーを介するものである。
【０１９９】
本発明のｓｉＲＮＡ化合物は、活性の向上、安定性の向上、毒性の低減、オフターゲット効果の低減、および／または免疫応答の低減のうちの１つ以上を与える、構造および修飾を有する。本発明のｓｉＲＮＡ構造は、標的遺伝子発現、特に本明細書に記載の標的遺伝子の、予防または減弱化に有用な二本鎖ＲＮＡに有益に適用される。
【０２００】
一態様によると、本発明は、糖修飾、塩基修飾、およびヌクレオチド間連結修飾からなる群から選択される、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、化学修飾された二本鎖オリゴヌクレオチドを提供する。したがって、本発明の化学修飾された二本鎖オリゴヌクレオチド化合物は、ＤＮＡ、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＥＮＡ（エチレン架橋核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アラビノシド、ＰＡＣＥ、ミラーヌクレオチド、または６炭糖を有するヌクレオチド等、修飾ヌクレオチドを含有する。ＰＡＣＥヌクレオチドおよび類似体の例は、米国特許第６，６９３，１８７号および同第７，０６７，６４１号に開示され、いずれも参照により本明細書に組み込まれる。オリゴヌクレオチドは、場合により交互の位置に、２’Ｏ−メチルまたは２’−フルオロまたは２’Ｏ−アリルまたは任意の他の２’修飾をさらに含む。活性を著しく低減させない他の安定化する修飾もまた、可能である（例えば、末端修飾）。オリゴヌクレオチドの活性部の骨格は、ホスフェート−Ｄ−リボース実体を含み得るが、チオホスフェート−Ｄ−リボース実体、トリエステル、チオエート、２’−５’架橋骨格（５’−２’とも称され得る）、ＰＡＣＥ、または任意の他の種類の修飾もまた含み得る。オリゴヌクレオチドの５’および／または３’部分の末端修飾もまた可能である。このような末端修飾は、脂質、ペプチド、糖、逆位脱塩基部分、または他の分子であり得る。
【０２０１】
本発明はまた、本明細書に開示される遺伝子の発現を下方制御する化合物に関し、具体的には、新規なｄｓＲＮＡ、および種々の疾患および病的状態の治療におけるこれらの新規なｄｓＲＮＡの使用に関する。治療される具体的な疾患および状態は、難聴または本明細書に開示される障害に関連する。本発明において使用されるｓｉＲＮＡの一覧は、表２Ａ〜１０Ｄに提供される。２１または２３量体ｓｉＲＮＡ配列はまた、本明細書に開示される１９量体配列の５’および／または３’伸長によって生成することができる。このような伸長は、好ましくは、対応するｍＲＮＡ配列に相補的である。本発明のｄｓＲＮＡは、活性の向上、安定性の向上、オフターゲット効果の低減、免疫応答の減少、および／または毒性の低減を行うことができる、構造および修飾を有する。本発明のｄｓＲＮＡ構造は、本明細書に開示される標的遺伝子の１つ以上の発現の予防または減弱化に有用な二本鎖ＲＮＡに有益に適用される。
【０２０２】
本明細書に開示される遺伝子を阻害する本発明の方法、分子、および組成物を、本明細書に詳細に説明し、前記分子および／または組成物のいずれも、前記状態のうちの１つ以上を患う対象の治療に有益に利用される。
【０２０３】
本発明の態様または実施形態が、マーカッシュ群または他の選択肢の系列化に関して記載される場合、当業者は、本発明が、それによって、任意の個々の要素または群の要素の亜群に関しても記載されていることを認識するであろう。
ヒトの耳
【０２０４】
耳は、外耳、中耳、および内耳の３つの主要な構造的要素から構成され、これらは、音波を神経インパルスへと変換するように一緒に機能し、これが脳に伝わり、そこで、音として認識される。内耳はまた、バランスの維持を助ける。
【０２０５】
中耳および内耳の生体構造は、当業者に周知である（例えば、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ｏｒｇａｎｓ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ａｎｄｒｓ  Ｃｓｉｌｌａｇ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００５），ｐａｇｅｓ１−８２を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる）。簡単に言うと、中耳は、鼓膜と、鼓膜を内耳と連結させる、耳小骨として知られる一連の３つの小さな骨を含む空気が充填された小さな室とからなる。
【０２０６】
内耳（迷路）は、聴覚器官である蝸牛とバランス器官である前庭系とからなる複雑な構造である。前庭系は、位置感覚を判定する球形嚢および卵形嚢、ならびにバランスの維持を助ける半規管からなる。
【０２０７】
蝸牛は、コルチ器を収容し、これは、部分的に、「内耳有毛細胞」または「有毛細胞」と呼ばれる約２０，０００個の特殊な感覚細胞からなる。これらの細胞は、蝸牛流体中に延在する小さな毛髪様突起（繊毛）を有する。中耳の耳小骨から内耳の卵円窓に伝達された音振動が、流体および繊毛を振動させる。蝸牛の異なる部分にある有毛細胞が、異なる音周波数に応じて振動し、その振動を神経インパルスに変換し、これが、処理および解釈のために脳に送信される。内耳有毛細胞は、内耳支持細胞に包囲されている。支持細胞は、内耳内で、感覚有毛細胞の下にあり、少なくとも部分的にそれを包囲し、物理的にそれを支持する。支持細胞の代表的な例には、内柱（柱細胞）、外柱（柱細胞）、内指節細胞、外指節細胞（ダイテルス細胞）、ヘルド細胞、ヘンゼン細胞、クラウディウス細胞、ベッチェル細胞、歯間細胞、および聴歯（フシュケ細胞）が挙げられる。
【０２０８】
らせん神経節は、音の表現を蝸牛から脳へ送信する、神経細胞群である。らせん神経節ニューロンの細胞体は、蝸牛のらせん構造内に見られ、中枢神経系の一部である。それらの樹状突起は、有毛細胞の基部とシナプス結合を行い、それらの軸索は、束になって第８脳神経（内耳神経）の聴覚部分を形成する。
難聴
【０２０９】
聴覚有毛細胞は、音の検出に関与する、蝸牛のコルチ器内に位置する感覚受容器である。蝸牛有毛細胞には、外有毛細胞および内有毛細胞という２つの解剖学的および機能的に異なる種類がある。聴覚有毛細胞は、音情報を電気信号に変換し、それが、神経線維を介して脳に送信され、処理される。
【０２１０】
内耳の前庭器官（卵形嚢、球形嚢、膨大部）に位置する前庭有毛細胞は、頭部位置の変化を検出し、この情報を脳に伝達して、バランス姿勢および眼の位置の維持を助ける。
【０２１１】
聴覚有毛細胞がない場合、音波は神経信号に変換されず、聴覚欠損、例えば、聴覚感度の減少、すなわち、感音性難聴が起こる。前庭有毛細胞がない場合には、バランス欠損が生じる。
【０２１２】
音響反射という保護効果にも関わらず、大きな騒音は、有毛細胞を損傷し、破壊し得る。不可逆的な有毛細胞の死は、活性酸素種（ＲＯＳ）に関わる有毛細胞の代謝的または生化学的変化によって誘発される。ある特定の薬物への暴露および大きな騒音への継続した暴露は、とりわけ、進行性の損傷を引き起こし、最終的には耳に音が鳴り響くこと（耳鳴）および／または難聴をもたらす。
【０２１３】
後天性難聴は、有害な騒音レベルへの暴露、シスプラチンおよびアミノグリコシド系抗生物質といった耳毒性薬物への暴露、ならびに加齢を含む、複数の要因によってもたらされ得る。
【０２１４】
本発明の代理人に対する米国出願第１１／６５５，６１０号は、全体として、および具体的には５３ページにおいて、アポトーシス促進性遺伝子の阻害による聴覚障害を治療する方法に関する。国際特許公開第ＷＯ２００５／１１９２５１号は、難聴を治療する方法に関する。国際特許公開第ＷＯ／２００５／０５５９２１号は、耳障害の治療のための泡状組成物に関する。米国特許第７，０８７，５８１号は、内耳の疾患および障害を治療する方法に関する。本出願の代理人に付与され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２００９／１４７６８４号は、耳の障害および疾患を治療するためのある特定の化合物および組成物を開示する。
ｄｓＲＮＡおよびＲＮＡ干渉
【０２１５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ依存性遺伝子特異的転写後サイレンシングに関与する現象である。この現象を研究し、実験的に哺乳動物細胞を操作しようという最初の試みは、長いｄｓＲＮＡ分子に応答して活性化された活性な非特異的抗ウイルス防御機構によって妨げられた（Ｇｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，２０００．５：１０７−１１４）。のちに、２１ヌクレオチドのＲＮＡの合成二重鎖が、包括的抗ウイルス防御機構を刺激することなく、哺乳動物細胞において遺伝子特異的ＲＮＡｉを媒介し得ることが発見されたＥｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００１，４１１：４９４−４９８およびＣａｐｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ２００１，９８：９７４２−９７４７）。結果として、短い二本鎖ＲＮＡである低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、遺伝子発現の阻害および遺伝子機能の理解のために、広く使用されている。
【０２１６】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ１９９８，３９１：８０６）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（Ａｍｂｒｏｓ  Ｖ．Ｎａｔｕｒｅ２００４，４３１：３５０−３５５）およびＢａｒｔｅｌ  ＤＰ．Ｃｅｌｌ．２００４  １１６（２）：２８１−９７）によって媒介される。対応するプロセスは、一般的に、植物において観察される場合は特異的な転写後遺伝子サイレンシングと称され、真菌において観察される場合はクエリングと称される。
【０２１７】
ｓｉＲＮＡ化合物は、内在性または外来性の遺伝子／ｍＲＮＡの発現を下方制御またはサイレンシングする（すなわち、完全もしくは部分的に阻害する）、二本鎖ＲＮＡである。ＲＮＡ干渉は、ある特定のｄｓＲＮＡ種が、特異的なタンパク質複合体に進入し、次いで相補的細胞ＲＮＡに対する標的とされ、それらを特異的に分解する能力に基づく。したがって、ＲＮＡ干渉応答は、一般にＲＮＡ誘発性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称されるｓｉＲＮＡを含有するエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とし、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの開裂を媒介する。標的ＲＮＡの開裂は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で行われ得る（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，２００１，１５：１８８）。より詳細には、より長いｄｓＲＮＡは、ＩＩＩ型ＲＮＡｓｅ（ＤＩＣＥＲ、ＤＲＯＳＨＡ等（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４０９：３６３−６およびＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００３，４２５：４１５−９を参照されたい）によって消化され、短い（１７〜２９ｂｐ）ｄｓＲＮＡフラグメント（短い阻害性ＲＮＡまたは「ｓｉＲＮＡ」とも称される）になる。ＲＩＳＣタンパク質複合体は、これらのフラグメントおよび相補的ｍＲＮＡを認識する。全プロセスは、標的ｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼ開裂によって終了する（ＭｃＭａｎｕｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ，２００２，３：７３７−４７、Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈａｎｎｏｎ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００３，５（３）：２１７−２４）。（これらの用語および提案される機構に関するさらなる情報は、例えば、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ．２００１，７（１１）：１５０９−２１、Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ，Ｃｅｌｌ．２００１，１０７（４）：４１５−８、およびＰＣＴ公開第ＷＯ０１／３６６４６号を参照されたい）。
【０２１８】
既知の遺伝子に対応するｄｓＲＮＡ化合物の選択および合成は、広く報告されており、例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６；６５０５２、Ｃｈａｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＢＲＣ．２００４，３１９（１）：２６４−７４、Ｓｉｏｕｄ  ａｎｄ  Ｌｅｉｒｄａｌ，Ｍｅｔ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．；２００４，２５２：４５７−６９、Ｌｅｖｅｎｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．２００４，２０（３）：４３０−２、Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ  ２００４，３２（３）：９３６−４８を参照されたい。修飾ｓｉＲＮＡの使用および生成の例については、Ｂｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００３，４２（２６）：７９６７−７５、Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，２００３，９（９）：１０３４−４８、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０１５１０７号（ａｔｕｇｅｎ）、同第ＷＯ０２／４４３２１号（Ｔｕｓｃｈｌら）、および米国特許第５，８９８，０３１号および同第６，１０７，０９４号を参照されたい。
【０２１９】
いくつかのグループは、細胞内にｓｉＲＮＡを生成することができるＤＮＡに基づくベクターの開発について記載している。この方法は、一般に、細胞内にｓｉＲＮＡを形成するように効果的に処理される、低分子ヘアピンＲＮＡの転写を伴う（Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ２００２，９９：１４４３−１４４８、Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ&Ｄｅｖ  ２００２，１６：９４８−９５８、Ｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ２００２，８：５５１５−５５２０、およびＢｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２００２，２９６：５５０−５５３）。これらの報告は、多数の内在的および外来的に発現された遺伝子を特異的に標的とすることができるｓｉＲＮＡを生成する方法を説明する。
【０２２０】
研究により、ｓｉＲＮＡが、哺乳動物およびヒトの両方において、インビボで有効であり得ることが明らかとなった。具体的には、Ｂｉｔｋｏらは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ヌクレオカプシドＮ遺伝子を対象とする特異的なｓｉＲＮＡが、経鼻投与した場合にマウスの治療に有効であることを示した（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００５，１１（１）：５０−５５）。ｓｉＲＮＡの治療用途に関する概説については、例えば、Ｂａｒｉｋ（Ｍｏｌ．Ｍｅｄ  ２００５，８３：７６４−７７３）およびＣｈａｋｒａｂｏｒｔｙ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２００７  ８（３）：４６９−８２）を参照されたい。さらに、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）を治療するためのＶＥＧＦＲ１受容体を標的とする低分子ｓｉＲＮＡを用いた臨床試験が、ヒト患者において実施されている（Ｋａｉｓｅｒ，Ａｍ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２００６  １４２（４）：６６０−８）。治療剤としてのｓｉＲＮＡの使用に関するさらなる情報は、Ｄｕｒｃａｎ，２００８．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａ．５（４）：５５９−５６６、Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ，２００８．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４４：６１３−６１６、Ｇｒｉｍｍ  ａｎｄ  Ｋａｙ，２００７，ＪＣＩ，１１７（１２）：３６３３−４１に見出される。
化学合成
【０２２１】
本発明の化合物は、当該技術分野で周知である、リボ核酸（またはデオキシリボ核酸）オリゴヌクレオチドの合成のための方法のうちの任意のものによって合成することができる。このような合成は、とりわけ、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９２；４８：２２２３−２３１１、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９３；４９：６１２３−６１９４、およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７；１５４：２８７−３１３に記載され、チオエートの合成は、とりわけ、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８５；５４：３６７−４０２に記載され、ＲＮＡ分子の合成は、Ｓｐｒｏａｔ，ｉｎ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ２００５  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ  Ｐ．；Ｋａｐ．２：１７−３１に記載され、それぞれの後続プロセスは、とりわけ、Ｐｉｎｇｏｕｄ  ｅｔ．ａｌ．，ｉｎ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｏｌｉｖｅｒ  Ｒ．Ｗ．Ａ．；Ｋａｐ．７：１８３−２０８に記載されている。
【０２２２】
他の合成手順は、例えば、Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５、Ｓｃａｒｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，ＮＡＲ．，１８，５４３３、Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＮＡＲ．２３，２６７７−２６８４、およびＷｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９に記載される手順が当該技術分野で既知であり、これらの手順は、５′末端のジメトキシトリチルおよび３′末端のホスホラミダイト等、一般的な核酸保護基および結合基を利用し得る。修飾（例えば、２′−Ｏ−メチル化）ヌクレオチドおよび非修飾ヌクレオチドが、所望により組み込まれる。
【０２２３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、別個に合成して、例えば、ライゲーション（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６，９９２３、Ｄｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，国際特許公開第ＷＯ９３／２３５６９号、Ｓｈａｂａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＮＡＲ  １９，４２４７、Ｂｅｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ&Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６，９５１、Ｂｅｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．８，２０４）、または合成および／もしくは脱保護後のハイブリダイゼーションによって、合成後に一緒に接合することができる。
【０２２４】
市販入手可能な機械（とりわけ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能）が使用可能であり、オリゴヌクレオチドは、本明細書に開示される配列に従って調製されることに留意されたい。化学的に合成したフラグメントの重複する対は、当該技術分野で周知の方法（例えば、米国特許第６，１２１，４２６号を参照されたい）を使用してライゲートすることができる。鎖を別個に合成し、次いで、管内で互いにアニールする。次いで、二本鎖ｓｉＲＮＡを、アニールされなかった（例えば、それらの一方が過剰であったため）一本鎖オリゴヌクレオチドから、ＨＰＬＣによって分離する。本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡフラグメントに関連して、２つ以上のこのような配列を合成し、本発明で使用するために一緒に連結させることができる。
【０２２５】
本発明の化合物はまた、例えば、米国特許公開第ＵＳ２００４／００１９００１号（ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ）に記載のようなタンデム合成方法によって合成することもでき、ここで、両方のｓｉＲＮＡ鎖は、開裂可能なリンカーによって分離された単一の隣接するオリゴヌクレオチドフラグメントまたは鎖として合成され、これが、その後で開裂されて、ハイブリダイズしてｓｉＲＮＡ二重鎖の精製を可能にする別個のｓｉＲＮＡフラグメントまたは鎖をもたらす。リンカーは、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーであり得る。
【０２２６】
本発明は、本明細書に言及される疾患および状態のいずれかの治療のための、２つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む薬学的組成物をさらに提供し、前記２つの分子は、同等の活性もしくはそうでなければ有益な活性を生成する量で、薬学的組成物中に物理的に一緒に混合することができるか、あるいは共有もしくは非共有結合するか、または２〜１００個、好ましくは２〜５０個もしくは２〜３０個の範囲のヌクレオチドの長さの核酸リンカーによって一緒に接合され得る。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、本明細書に記載される二本鎖核酸構造から構成され、２つのｄｓＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドから選択される。したがって、ｓｉＲＮＡ分子は、共有結合もしくは非共有結合するか、またはリンカーによって接合されて、タンデムｓｉＲＮＡ化合物を形成することができる。２つのｓｉＲＮＡ配列を含むこのようなタンデムｄｓＲＮＡ分子は、典型的に、３８〜１５０個のヌクレオチドの長さであり、より好ましくは３８もしくは４０〜６０個のヌクレオチドの長さであり、２つを上回るｓｉＲＮＡ配列がタンデム分子に含まれる場合は、それに応じてより長くなる。細胞内処理によって生成されるｓｉＲＮＡをコードする２つ以上のより長い配列から構成される、より長いタンデム化合物、例えば、長いｄｓＲＮＡもまた、２つ以上のｓｈＲＮＡをコードするタンデム分子同様、想定される。このようなタンデム分子もまた、本開示の一部と見なされる。本明細書に開示される２つ（タンデム）またはそれ以上（ＲＮＡｉｓｔａｒ）のｄｓＲＮＡ配列を含む化合物が想定される。このような「タンデム」または「ｓｔａｒ」分子の例は、本出願の代理人に付与され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許公開第２００７／０９１２６９号に提供される。
【０２２７】
ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１を標的とするｄｓＲＮＡ分子は、薬学的組成物中の主要な活性成分であり得るか、または２つ以上のｄｓＲＮＡ（または、２つ以上のｄｓＲＮＡをコードする分子もしくは１つ以上のタンデム分子の混合物であれば、２つ以上のｄｓＲＮＡをコードするか、もしくは内在的に生成する分子）を含有する薬学的組成物の１つの活性成分であり得、前記薬学的組成物は、さらに、１つ以上の追加の遺伝子を標的とする１つ以上の追加のｄｓＲＮＡ分子から構成される。前記追加の遺伝子（複数可）の同時阻害は、本明細書に開示される疾患の治療に追加または相乗効果を有する可能性が高い。
【０２２８】
さらに、本明細書に開示されるｄｓＲＮＡまたはこのようなｄｓＲＮＡを含むかまたはコードする任意の核酸分子は、本明細書に開示される疾患の治療のための標的化の向上を達成するために、標的細胞上に発現される細胞表面内面化可能分子に対する抗体（アプタマー分子を含む）に連結または結合（共有結合または非共有結合）することができる。例えば、抗Ｆａｓ抗体（好ましくは、中和抗体）を、任意のｄｓＲＮＡと（共有結合または非共有結合で）組み合わせてもよい。別の例において、リガンド／抗体のように作用し得るアプタマーを、任意のｄｓＲＮＡと（共有結合または非共有結合で）組み合わせてもよい。
【０２２９】
本明細書に開示される核酸分子は、直接またはウイルスもしくは非ウイルスベクターを用いてのいずれかで、送達することができる。直接送達する場合は、一般に、配列をヌクレアーゼ耐性にする。あるいは、配列が本明細書で以下に記載されるように細胞内で発現されるように、配列を、発現カセットまたは構築物に組み込んでもよい。一般に、構築物は、配列が標的細胞内で発現されるのを可能にする、適切な調節配列またはプロモーターを含有する。本発明の化合物の送達のために任意で使用されるベクターは、市販入手可能であり、本発明の化合物の送達の目的で、当業者に既知の方法によって修飾することができる。
化学修飾
【０２３０】
ヌクレオチド／オリゴヌクレオチドの全ての類似体またはそれに対する修飾を、本発明で利用することができるが、ただし、前記類似体または修飾が、ヌクレオチド／オリゴヌクレオチドの機能に実質的に影響を及ぼさないことを条件とする。ヌクレオチドは、天然に存在するか、または合成修飾された塩基から選択することができる。天然に存在する塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルが含まれる。ヌクレオチドの修飾塩基は、本明細書に記載される。
【０２３１】
さらに、１つ以上のヌクレオチドの構造が、本質的に改変されており治療的および実験的試薬としてより適している、ポリヌクレオチドの類似体を調製することができる。ヌクレオチド類似体の例は、ＤＮＡ（またはＲＮＡ中のデオキシリボース（またはリボース）リン酸骨格が、ペプチドに見られるものと類似のポリアミド骨格と置き換えられている、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ類似体は、酵素分解に対して耐性であり、インビボおよびインビトロで向上した安定性を有することが示されている。オリゴヌクレオチドに行うことができる他の修飾には、ポリマー骨格、環状骨格、非環状骨格、チオホスフェート−Ｄ−リボース骨格、トリエステル骨格、チオエート骨格、２’−５’架橋骨格、人工核酸、モルホリノ核酸、ロックド核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、アラビノシド、およびミラーヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシドの代わりにβ−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド）が含まれる。ＬＮＡヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ分子の例は、Ｅｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（ＮＡＲ  ２００５，３３（１）：４３９−４４７）に開示されている。
【０２３２】
本発明の核酸化合物は、１つ以上の逆位ヌクレオチド、例えば、逆位チミジンまたは逆位アデニンを使用して合成することができる（例えば、Ｔａｋｅｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００２，ＪＢＣ  ２７７（２６）：２３８００−０６を参照されたい）。
【０２３３】
本明細書に使用される「非従来的部分」という用語は、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、非塩基対合ヌクレオチド類似体、および隣接するヌクレオチドに２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合によって接合されたヌクレオチド、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、およびＣ６部分、ＬＮＡおよびエチレン架橋核酸を含む架橋核酸を指す。
【０２３４】
本明細書に使用される「キャッピング部分」という用語には、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、２’Ｏアルキル修飾を含む脱塩基リボースおよび脱塩基デオキシリボース部分の修飾、逆位脱塩基リボースおよび脱塩基デオキシリボース部分ならびにそれらの修飾、Ｃ６−イミノ−Ｐｉ、Ｌ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡを含むミラーヌクレオチド、５’ＯＭｅヌクレオチド、および４’，５’−メチレンヌクレオチドを含むヌクレオチド類似体、１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、５’−アミノ−アルキルホスフェート、１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート、６−アミノへキシルホスフェート、１２−アミノドデシルホスフェート、ヒドロキシプロピルホスフェート、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、α−ヌクレオチド、スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−セコヌクレオチド、３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆位脱塩基部分、１，４−ブタンジオールホスフェート、５’−アミノ、ならびに架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５’−メルカプト部分が含まれる。
【０２３５】
脱塩基デオキシリボース部分には、例えば、脱塩基デオキシリボース−３’−ホスフェート、１，２−ジデオキシ−Ｄ−リボフラノース−３−ホスフェート、１，４−アンヒドロ−２−デオキシ−Ｄ−リビトール−３−ホスフェートが含まれる。逆位脱塩基デオキシリボース部分には、逆位デオキシリボ脱塩基、３’，５’逆位デオキシリボ脱塩基５’−ホスフェートが含まれる。
【０２３６】
「ミラー」ヌクレオチドは、天然に存在するかまたは一般に利用されるヌクレオチドとは逆のキラリティを有するヌクレオチド、すなわち、天然に存在する（Ｄ−ヌクレオチド）の鏡像（Ｌ−ヌクレオチド）である。ヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドであり得、少なくとも１つの糖、塩基、および／または骨格の修飾をさらに含み得る。米国特許第６，６０２，８５８号は、少なくとも１つのＬ−ヌクレオチド置換を含む核酸触媒を開示する。ミラーヌクレオチドには、例えば、Ｌ−ＤＮＡ（Ｌ−デオキシリボアデノシン−３’−ホスフェート（ミラーｄＡ）、Ｌ−デオキシリボシチジン−３’−ホスフェート（ミラーｄＣ）、Ｌ−デオキシリボグアノシン−３’−ホスフェート（ミラーｄＧ）、Ｌ−デオキシリボチミジン−３’−ホスフェート（鏡像ｄＴ））、およびＬ−ＲＮＡ（Ｌ−リボアデノシン−３’−ホスフェート（ミラーｒＡ）、Ｌ−リボシチジン−３’−ホスフェート（ミラーｒＣ）、Ｌ−リボグアノシン−３’−ホスフェート（ミラーｒＧ）、Ｌ−リボウラシル−３’−ホスフェート（ミラーｄＵ）が挙げられる。
【０２３７】
構造Ａ１または構造Ａ２の種々の実施形態において、ＺおよびＺ’は、不在である。他の実施形態において、ＺまたはＺ’は、存在する。いくつかの実施形態において、Ｚおよび／またはＺ’のそれぞれは、独立して、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、またはＣ６アルキル部分、任意で、プロパノール（Ｃ３−ＯＨ／Ｃ３ＯＨ）、プロパンジオール、およびプロパンジオールのリン酸ジエステル誘導体（「Ｃ３Ｐｉ」）を含むＣ３［プロパン、−（ＣＨ２）３−］部分またはその誘導体を含む。好ましい実施形態において、Ｚおよび／またはＺ’のそれぞれは、２つの炭化水素部分を含み、いくつかの例では、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨまたはＣ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉである。各Ｃ３は、共有結合、好ましくはリンに基づく結合を介して、隣接するＣ３と共有結合で抱合する。いくつかの実施形態において、リンに基づく結合は、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート、またはリン酸ジエステル結合である。
【０２３８】
構造Ａ１の特定の実施形態において、ｘ＝ｙ＝１９であり、Ｚは、少なくとも１つのＣ３アルキルオーバーハングを含む。構造Ａ２の特定の実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｚは、少なくとも１つのＣ３アルキルオーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ３−Ｃ３オーバーハングは、共有結合による連結、好ましくはリン酸ジエステル連結を介して、（Ｎ）ｘまたは（Ｎ’）ｙの３’末端に共有結合する。いくつかの実施形態において、第１のＣ３と第２のＣ３との間の連結は、リン酸ジエステル連結である。いくつかの実施形態において、３’非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉである。いくつかの実施形態において、３’非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓである。いくつかの実施形態において、３’非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨである（ＯＨはヒドロキシである）。いくつかの実施形態において、３’非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨである。
【０２３９】
種々の実施形態において、アルキル部分は、末端ヒドロキシル基、末端アミノ基、または末端リン酸基を含む、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、またはＣ６アルキル部分を含むアルキル誘導体を含む。いくつかの実施形態において、アルキル部分は、Ｃ３アルキルまたはＣ３アルキル誘導体部分である。いくつかの実施形態において、Ｃ３アルキル部分は、プロパノール、プロピルホスフェート、プロピルホスホロチオエート、またはそれらの組み合わせを含む。Ｃ３アルキル部分は、リン酸ジエステル結合を介して、（Ｎ’）ｙの３’末端および／または（Ｎ）ｘの３’末端に共有結合する。いくつかの実施形態において、アルキル部分は、プロパノール、プロピルホスフェート、プロピルホスホロチオエートを含む。いくつかの実施形態において、ＺおよびＺ’のそれぞれは、独立して、プロパノール、プロピルホスフェート、プロピルホスホロチオエート、それらの組み合わせ、またはそれらの倍数、特に、２もしくは３個の共有結合したプロパノール、プロピルホスフェート、プロピルホスホロチオエート、またはそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、ＺおよびＺ’のそれぞれは、独立して、プロピルホスフェート、プロピルホスホロチオエート、プロピルホスホ−プロパノール；プロピルホスホ−プロピルホスホロチオエート；プロピルホスホ−プロピルホスフェート；（プロピルホスフェート）３、（プロピルホスフェート）２−プロパノール、（プロピルホスフェート）２−プロピルホスホロチオエートから選択される。いずれのプロパンまたはプロパノール抱合部分も、ＺまたはＺ’に含まれ得る。
【０２４０】
例示的な３’末端非ヌクレオチド部分の構造は、次の通りである。
【化１】
2014528704.tif 000018
【０２４１】
本明細書に開示される分子および組成物は、耳の疾患および障害、ならびに本明細書に記載される他の疾患および状態の治療に有用である。
耳障害
【０２４２】
本発明は、種々の耳障害を患うか、またはその危険性にある患者の治療に有用な組成物および方法を対象とする。耳障害には、例えば、耳毒性物質、過剰な騒音、または加齢によって誘発される難聴が挙げられる。中耳および内耳の障害は、多数の同じ症状をもたらし、中耳の障害は、内耳に影響を及ぼし得、その逆もまた同様である。
【０２４３】
難聴に加えて、耳障害には、種々のウイルスおよび細菌によって引き起こされる鼓膜の感染症である鼓膜炎、例えば、頭部打撃による側頭部骨折、聴覚神経腫瘍（聴神経腫、聴神経鞘腫、前庭神経鞘腫、第８神経腫瘍）が挙げられる。
【０２４４】
種々の実施形態において、本明細書に開示される方法および組成物は、難聴の種々の状態の治療に有用である。理論に束縛されるものではないが、難聴は、アポトーシス性内耳有毛細胞損傷または消失（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２００３．１２０：１９１−２０５、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２３（（２４）：８５９６−８６０７）に起因し得、損傷または消失は、感染、機械的損傷、大きな音（騒音）、加齢（老年性難聴）、または化学物質によって誘発される耳毒性によって引き起こされる。
【０２４５】
本明細書に開示される文脈において、「耳毒性物質」とは、その化学作用を通じて、聴覚に関連する神経系の音受容要素の活性を損傷、障害、または阻害し、それが聴覚（および／またはバランス）を障害する、物質を意味する。本発明の文脈において、耳毒性には、内耳有毛細胞への有害な作用が含まれる。耳毒性物質には、抗腫瘍剤、サリチル酸塩、ループ利尿薬、キニーネ、およびアミノグリコシド系抗生物質を含む治療薬、食物または薬品中の混入物質、ならびに環境または産業汚染物質が挙げられる。典型的に、治療は、特に、治療薬の投与からもたらされるか、またはそれからもたらされることが予測される、耳毒性を予防または低減するために実行される。好ましくは、本発明の化学修飾されたｓｉＲＮＡ化合物の治療有効量を含む組成物を、暴露直後に投与して、耳毒性作用の予防または低減を行う。より好ましくは、治療は、耳毒性薬剤または耳毒性物質への暴露の前または同時のいずれかで、本発明の薬学的組成物を投与することによって、予防的に提供される。聴覚およびバランス障害の説明および診断に関して、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８２），Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ&Ｄｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎ．Ｊ．の第１９６章、第１９７章、第１９８章、および第１９９章、ならびに最新の第１６版の第２０７章および第２１０章を含む）対応する章が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２４６】
したがって、一態様において、哺乳動物、好ましくはヒトを、聴覚の障害（ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）、障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、または平衡失調、好ましくは耳毒性物質に誘発される聴覚状態の予防、低減、または治療のために、このような治療を必要とする哺乳動物に、本発明の化学修飾されたｓｉＲＮＡ化合物を投与することによって、治療するための方法および薬学的組成物を提供する。一実施形態は、耳毒性が耳毒性薬学的薬物の治療有効量の投与からもたらされる、聴覚の障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）または障害（ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）を治療するための方法を対象とする。典型的な耳毒性薬物は、化学療法剤、例えば、抗腫瘍剤および抗生物質である。他の可能性のある候補には、ループ利尿薬、キニーネ、キニーネ様化合物、ＰＤＥ−５阻害剤、およびサリチル酸塩、またはサリチル酸塩様化合物が挙げられる。
【０２４７】
耳毒性は、抗生物質投与の用量を制限する副作用である。１日につき１グラムを、１週間を上回って受容した患者の４〜１５％が、測定できるほどの難聴を発症し、これは、治療を継続すると、徐々に悪化し、完全な恒久性難聴につながり得る。耳毒性アミノグリコシド系抗生物質には、ネオマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、リビドマイシン、カナマイシン、アミカシン、トブラマイシン、バイオマイシン、ゲンタマイシン、シソマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、ジベカシン、ホルチミシン、およびジヒドロストレプトマイシン、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗生物質には、ネオマイシンＢ、カナマイシンＡ、カナマイシンＢ、ゲンタマイシンＣ１、ゲンタマイシンＣ１ａ、およびゲンタマイシンＣ２等が挙げられ、これらは、このような抗微生物剤の有用性を低減させる、重度毒性、特に耳毒性および腎毒性を有することが既知である（Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ａ．Ｇｏｏｄｍａｎ  Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ；Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１１６９−７１（１９８０）を参照されたい）。
【０２４８】
耳毒性はまた、抗癌剤の用量を制限する重大な副作用でもある。耳毒性の抗腫瘍剤には、ビンクリスチン、ビンブラスチン、シスプラチンおよびシスプラチン様化合物、ならびにタキソールおよびタキソール様化合物が挙げられるが、これらに限定されない。シスプラチン様化合物は、とりわけ、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、テトラプラチン、オキサリプラチン、アロプラチン、およびトランスプラチンが含まれ、白金系化学療法薬である。
【０２４９】
既知の耳毒性副作用を有する利尿薬、特に「ループ」利尿薬には、フロセミド、エタクリル酸、および水銀薬が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５０】
耳毒性キニーネには、通常マラリアの治療に使用されるキニーネの合成代替物が挙げられるがこれに限定されない。いくつかの実施形態において、聴覚障害は、シルデナフィル（Ｖｉａｇｒａ（登録商標））、バルデナフィル（Ｌｅｖｉｔｒａ（登録商標））、およびタダラフィル（Ｃｉａｌｉｓ）を含む、５型ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ−５）の阻害剤の副作用である。
【０２５１】
アスピリン等のサリチル酸塩は、それらの抗炎症、鎮痛、解熱、および抗血栓作用のために最も一般的に使用される治療薬である。残念なことに、それらも耳毒性の副作用を有する。それらは、しばしば耳鳴（「耳に音が鳴り響く」）および一過性難聴をもたらす。さらに、薬物を高用量で長期にわたり使用した場合、聴覚障害は、持続性で不可逆的なものになり得る。
【０２５２】
いくつかの実施形態において、アミノグリコシド系抗生物質の投与による哺乳動物の感染症の治療のための方法を提供し、この改善は、このような治療を必要とする対象に、標的遺伝子の発現を下方制御する１つ以上の化学修飾されたｓｉＲＮＡ化合物の治療有効量を投与して、この抗生物質と関連する耳毒性物質に誘発される聴覚障害を低減または予防することを含む。
【０２５３】
本明細書に記載される分子および薬学的組成物はまた、音響性外傷または機械的外傷、好ましくは内耳有毛細胞消失につながる音響性または機械的外傷の治療に有効である。より重度の暴露により、損傷は、隣接する支持細胞の消失から、コルチ器の完全な破壊へと進行し得る。感覚細胞の死は、進行性ウォラー変性および一次聴覚神経線維の消失につながり得る。提供される方法は、極めて大きな騒音への１回の暴露によってか、もしくは８５デシベルを上回る日常的な大きな音への長期的な暴露の後に引き起こされる音響性外傷の治療、例えば、内耳への電子デバイスの挿入からもたらされた機械的内耳外傷の治療、またはその操作に関連する内耳有毛細胞の損傷の予防もしくは最小化に有用である。
【０２５４】
別の種類の難聴は、老年性難聴であり、これは、加齢とともにほとんどの個人に徐々に生じる難聴である。６５〜７５歳の年齢の成人の約３０〜３５パーセント、および７５歳以上の人の４０〜５０パーセントが、難聴を経験する。本発明の方法は、老年性難聴と関連する内耳障害および聴覚障害の発症および／またはその重症度の予防、低減、または治療に有用である。
音響性外傷
【０２５５】
音響性外傷は、大きな騒音への長期にわたる暴露によって引き起こされる、難聴の一種である。理論に束縛されることを望むものではなく、大きな騒音への暴露は、蝸牛の有毛細胞の感受性を低下させる。より重度の暴露により、損傷は、隣接する支持細胞の消失から、コルチ器の完全な破壊へと進行し得る。感覚細胞の死は、進行性ウォラー変性および一次聴覚神経線維の消失につながり得る。音響性外傷に起因する難聴を軽減するのに有用な分子、薬学的組成物、および方法を、本明細書に開示する。音響性外傷に暴露された対象における音響性外傷の治療および予防のための、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１のうちのいずれか１つを標的とするｄｓＲＮＡ分子を提供する。
【０２５６】
対象の外耳道に、オリゴヌクレオチド阻害剤および薬学的に許容される賦形剤、またはそれらの混合物を含む薬学的組成物を局所投与し、それによって、対象の治療に有効な量で、対象の耳における障害と関連する遺伝子の発現を低減することを含む、耳障害を患うかまたはその危険性にある対象を治療する方法を提供する。対象の外耳道に、オリゴヌクレオチド阻害剤および薬学的に許容される賦形剤、またはそれらの混合物を含む薬学的組成物を経鼓膜投与し、それによって、対象の治療に有効な量で、対象の耳における障害と関連する遺伝子の発現を低減することを含む、耳障害を患うかまたはその危険性にある対象を治療する方法を、さらに提供する。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、後半規管造瘻術（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｓｅｍｉｃｉｒｃｕｌａｒ  ｃａｎａｌｏｓｔｏｍｙ）を介して送達される。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、点耳薬として送達される。
【０２５７】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、対象の頭部を一方に傾け、治療される耳が上を向いているときに、外耳道に適用される。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、点耳薬用の容器、例えば、例として１滴当たり１０〜１００マイクロリットルの点滴器、またはウィックを使用して、耳に適用される。
【０２５８】
いくつかの実施形態において、耳障害は、化学物質に誘発される難聴、例えば、とりわけ、シスプラチンおよびその類似体、アミノグリコシド系抗生物質、キニーネおよびその類似体、サリチル酸塩およびその類似体、ホスホジエステラーゼ５型（ＰＤＥ５）阻害剤、またはループ利尿薬によって誘発される難聴に関連する。いくつかの実施形態において、耳障害は、騒音によって誘発される難聴を指す。他の実施形態において、耳障害は、加齢関連の難聴である。
【０２５９】
理論に束縛されるものではなく、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の阻害は、任意でＡｔｏｈ１発現の増加を介して、有毛細胞の再生をもたらし得る。本発明の化合物は、蝸牛内の支持細胞または外もしくは内有毛細胞の増殖を促進することが必要とされる、任意で耳毒性物質に誘発される難聴と関連する、任意の疾患、障害、または損傷の治療、緩和、または予防に有用である。
前庭系の疾患および障害
【０２６０】
種々の実施形態において、本発明の核酸化合物および薬学的組成物は、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の発現が有害である、前庭系に影響を及ぼす障害および疾患、例えばメニエール病を治療するのに有用である。ヒトを含むほとんどの哺乳動物の前庭感覚系は、バランス、ならびに空間的方向性および安定性の感覚に寄与する。これは、蝸牛とともに、内耳の迷路を構成する。前庭系は、回転運動を示す半規管系および直線加速を示す耳石の２つの構成要素を含む。
メニエール病
【０２６１】
特発性内リンパ水腫（ＥＬＨ）としても知られるメニエール病は、目まいおよび耳鳴、さらに最終的には神経損傷をもたらし、難聴につながる内耳の障害である。メニエール病の正確な原因は解明されていないが、発症機序は、内リンパ液の蓄積による膜迷路の歪みと考えられている。内リンパ液は、主に、蝸牛内の血管条によって、さらには前庭迷路内の半月面および暗細胞によって生成される（Ｓａｊｊａｄｉ  Ｈ，Ｐａｐａｒｅｌｌａ  ＭＭ．Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｌａｎｃｅｔ．３７２（９６３６）：４０６−１４）。内リンパ液腔から前庭水管を通って内リンパ嚢に至る内リンパ液の流れが妨げられると、内リンパ水腫が発生する。メニエール病は、対象の片耳または両耳に影響を及ぼす可能性がある。メニエール病と関連する主な病的状態は、衰弱性の性質の目まいおよび進行性難聴である。現在の治療法は、神経変性および関連する難聴の進行の予防に成功していない。内耳神経を含む内耳のニューロンを損傷から保護する、および／または内耳神経の再生を誘導して、それによって、メニエール病患者の難聴を緩和または予防する治療的治療は、非常に望ましい。
【０２６２】
本明細書に提供される核酸、組成物、方法、およびキットは、メニエール病の危険性にあるか、またはそれを患う対象の治療に有用である。
【０２６３】
結論として、本明細書に開示される状態の予防および／または治療に有効な治療形態は存在しない。利用可能な治療は、とりわけ、選択的標的化の欠如による深刻な副作用の不利益を被り、そのため、これらの目的の新規の化合物および治療方法を開発する必要性が依然として存在する。
【０２６４】
種々の実施形態において、本発明の化合物および薬学的組成物は、本明細書において以下に開示されるがこれらに限定されない疾患、障害、および損傷等、耳に影響を及ぼす種々の疾患、障害、および損傷の治療または予防に有用である。理論に束縛されることなく、本発明の分子は、耳内の種々の種類の細胞の死を予防すると考えられる。
薬学的組成物
【０２６５】
ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、もしくはＮＯＴＣＨ１遺伝子発現の下方制御を媒介することができる、またはＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、もしくはＮＯＴＣＨ１遺伝子発現に対するＲＮＡ干渉を媒介する、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子等、小核酸分子を使用することによって、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１発現を下方制御するための組成物および方法を提供する。
【０２６６】
本明細書に開示される分子を、未加工の化学物質として投与することは可能であるが、それらを薬学的組成物として提供することが好ましい。したがって、本明細書に開示されるｄｓＲＮＡ分子のうちの１つ以上と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物を提供する。この組成物は、２つ以上の異なる核酸化合物の混合物を含み得る。
【０２６７】
本明細書に提供される組成物、方法、およびキットは、独立して、または組み合わせで、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、もしくはＮＯＴＣＨ１タンパク質および／またはＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、もしくはＮＯＴＣＨ１タンパク質をコードする遺伝子、ならびに／あるいはＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、もしくはＮＯＴＣＨ１と関連する疾患、状態、または障害、特に耳と関連する障害の維持および／または発症と関連するタンパク質および／または遺伝子の発現を調節（例えば、下方制御）する、１つ以上の核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）および方法を含み得る。種々の態様および実施形態の説明は、例示的な遺伝子ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１に関連して提供される。しかしながら、種々の態様および実施形態はまた、ホモログ遺伝子および転写変異体等の他の関連遺伝子、ならびにある特定のＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１遺伝子と関連する多型（例えば、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ））を対象とする。したがって、種々の態様および実施形態はまた、例えば、本明細書に記載される疾患、特性、または状態の維持または発症に関与するシグナル変換または遺伝子発現のＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１媒介経路に関与する、他の遺伝子も対象とする。これらの追加の遺伝子は、本明細書において、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１遺伝子について記載される方法を使用して、標的部位について分析することができる。したがって、他の遺伝子の下方制御、および他の遺伝子のこのような調節の効果は、本明細書に記載されるように実施、判定、および測定することができる。
【０２６８】
ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の発現を下方制御するのに効果的な量で、１つ以上の本発明の化合物と共有結合または非共有結合した少なくとも１つの本発明の化合物と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物をさらに提供する。本化合物を、内在的細胞複合体によって細胞内で処理して、１つ以上の本発明のオリゴリボヌクレオチドを生成してもよい。
【０２６９】
薬学的に許容される担体と、ヒトＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の細胞内での発現を阻害するのに有効な量で、本発明の化合物のうちの１つ以上とを含む、薬学的組成物をさらに提供し、この化合物は、（Ｎ）ｘの配列に実質的に相補的な配列を含む。
【０２７０】
実質的に相補的であるとは、別の配列に対する約８４％を上回る相補性を指す。例えば、１９塩基対からなる二重鎖領域において、１つのミスマッチは、９４．７％の相補性をもたらし、２つのミスマッチは、約８９．５％の相補性をもたらし、３つのミスマッチは、約８４．２％の相補性をもたらし、二重鎖領域を実質的に相補的にする。したがって、実質的に同一であるとは、別の配列に対する約８４％を上回る同一性を指す。
【０２７１】
さらに、本発明は、対照と比較して、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の発現を、少なくとも２０％、少なくとも３０％。少なくとも４０％、好ましくは５０％、６０％、または７０％、より好ましくは７５％、８０％。または９０％阻害する方法であって、本発明のｍＲＮＡ転写物を本発明の化合物のうちの１つ以上と接触させることを含む方法を提供する。
【０２７２】
一実施形態において、本明細書に開示されるオリゴリボヌクレオチド化合物、組成物、および方法は、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１遺伝子を阻害／下方制御し、この阻害／下方制御は、遺伝子機能の阻害／下方制御、ポリペプチドの阻害／下方制御、およびｍＲＮＡ発現の阻害／下方制御を含む群から選択される。
【０２７３】
一実施形態において、本明細書に提供される組成物および方法は、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ遺伝子（例えば、配列番号１〜１１に例示されるヒトＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１のｍＲＮＡコード配列）の発現を下方制御する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）化合物を含み、この核酸分子は、約１５〜約４９個の塩基対を含む。
【０２７４】
一実施形態において、本明細書に開示される核酸を使用して、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、もしくはＮＯＴＣＨ１遺伝子、またはＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、もしくはＮＯＴＣＨ１遺伝子ファミリーの発現を阻害することができ、遺伝子または遺伝子ファミリーの配列は、配列相同性を共有する。このような相同配列は、例えば、配列アライメントを使用して、当該技術分野で既知のように、識別することができる。核酸分子は、例えば、完全に相補的な配列を使用して、または追加の標的配列を提供することができる非標準塩基対、例えばミスマッチおよび／もしくはゆらぎ塩基対の組み込みによって、このような相同配列を標的とするように設計することができる。ミスマッチが識別された場合には、非標準塩基対（例えば、ミスマッチおよび／またはゆらぎ塩基対）を使用して、１つを上回る遺伝子配列を標的とする核酸分子を生成することができる。非限定的な例において、ＵＵおよびＣＣ塩基対等の非標準塩基対を使用して、配列相同性を共有する異なるＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１標的の配列を標的とすることができる核酸分子を生成する。したがって、本明細書に開示されるｄｓＲＮＡｓを使用することの１つの利点は、単一の核酸を、相同遺伝子間で保存されるヌクレオチド配列に相補的な核酸配列を含むように設計できることである。このアプローチでは、異なる遺伝子を標的とするために、１つを上回る核酸分子を使用する代わりに、単一の核酸を使用して、１つを上回る遺伝子の発現を阻害することができる。
【０２７５】
核酸分子を使用して、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１ファミリー遺伝子等の遺伝子ファミリー（複数可）に対応する保存配列を標的とすることができる。したがって、複数のＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１標的を標的とする核酸分子は、増加した治療効果を提供することができる。さらに、核酸を使用して、種々の用途における遺伝子機能の経路を特徴付けることができる。例えば、核酸分子を使用して、経路における標的遺伝子（複数可）の活性を阻害して、遺伝子機能分析、ｍＲＮＡ機能分析、または翻訳分析において、特徴が明らかになっていない遺伝子（複数可）の機能を判定することができる。核酸分子を使用して、医療開発に向けて、種々の疾患および状態に関与する可能性のある標的遺伝子の経路を判定することができる。核酸分子を使用して、例えば、耳障害に関与する遺伝子発現の経路を理解することが可能である。
【０２７６】
一実施形態において、本明細書に提供される核酸化合物、組成物、および方法は、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１ポリペプチドを阻害し、この阻害は、機能の阻害（これは、とりわけ、酵素アッセイまたは天然の遺伝子／ポリペプチドの相互作用物質を用いた結合アッセイによって試験可能である）、タンパク質の下方制御またはタンパク質の阻害（これは、とりわけ、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、または免疫沈降法によって試験可能である）、およびｍＲＮＡ発現の阻害（これは、とりわけ、ノーザンブロット、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、インサイツハイブリダイゼーション、またはマイクロアレイハイブリダイゼーションによって試験可能である）を含む群から選択される。
【０２７７】
一実施形態において、本明細書に提供される組成物および方法は、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１  ＲＮＡに対するＲＮＡｉ活性を有する核酸分子を含み、この核酸分子は、配列番号１〜１１に記載される配列等、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１をコードする配列有する任意のＲＮＡに対して相補的な配列を含む。別の実施形態において、核酸分子は、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１  ＲＮＡに対するＲＮＡｉ活性を有してもよく、この核酸分子は、例えば、配列番号１〜１１には示されていないが、神経変性および／またはニューロパチーの発生および／または維持および／または発症と関連することが当該技術分野で知られている他の突然変異ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１遺伝子、例えばＳＮＰ等、変異ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１をコードする配列を有するＲＮＡに対して相補的な配列を含む。本明細書に記載される化学修飾は、本明細書に開示されるいずれの核酸構築物にも適用可能である。別の実施形態において、本明細書に開示される核酸分子は、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用し、それによって、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１遺伝子発現の下方制御またはサイレンシングを媒介することができるヌクレオチド配列を含み、例えば、この核酸分子は、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１遺伝子発現の制御を、遺伝子のクロマチン構造またはメチル化パターンを調節し、遺伝子の転写を予防する細胞プロセスによって、媒介する。
【０２７８】
より具体的には、１つの鎖が、５’から３’の方向に、配列番号２３〜２６９１２に記載される化合物またはそれらの相同体を有する連続するヌクレオチドを含み、各末端領域中のリボヌクレオチドが改変される、二本鎖核酸分子を提供する。
送達および製剤
【０２７９】
本発明のＲＮＡ分子は、外耳への薬学的組成物の直接適用によって、経鼓膜注射によって、または点耳薬によって、耳に送達することができる。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、外耳道に適用される。耳への送達はまた、ｓｉＲＮＡ、浸透強化剤、および薬学的に許容されるビヒクルを含む、聴覚性または耳性送達とも称され得る。
【０２８０】
本発明の核酸分子は、担体または希釈剤とともに調製したネイキッド分子の直接適用によって、標的組織に送達することができる。
【０２８１】
用語「ネイキッド核酸」または「ネイキッドｄｓＲＮＡ」または「ネイキッドｓｉＲＮＡ」とは、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポフェクチン、または沈殿剤等が含む、細胞への侵入を補助、促進、または容易にするように作用するいずれの送達ビヒクルも含まない核酸分子を指す。例えば、ＰＢＳ中のｄｓＲＮＡは、「ネイキッドｄｓＲＮＡ」である。
【０２８２】
本明細書に開示される核酸分子は、ウイルスベクター、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポフェクチン、または沈殿剤等を含む、細胞への侵入を補助、促進、または容易にするように作用する担体または希釈剤とともに、直接送達または投与することができる。
【０２８３】
核酸分子は、対象への投与のための、リポソームを含む送達ビヒクル、担体、および希釈剤、ならびにそれらの塩を含んでもよく、および／または薬学的に許容される製剤中に存在してもよい。いくつかの実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、リポソーム製剤やリポフェクチン製剤等の形態で送達され、当業者に周知の方法で調製することができる。このような方法は、例えば、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，５８９，４６６号、および同第５，５８０，８５９号に記載され、これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２８４】
哺乳動物細胞内へのｓｉＲＮＡの送達の強化および改善を特に目的とした送達系が開発されている（例えば、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔ．２００３，５３９：１１１−１１４、Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００２，２０：１００６−１０１０、Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｖｉｓｉｏｎ  ２００３，９：２１０−２１６、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００３．３２７：７６１−７６６、Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２００２，３２：１０７−１０８、およびＳｉｍｅｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ  ２００３，３１，１１：２７１７−２７２４を参照されたい）。ｓｉＲＮＡは、近年、霊長類における遺伝子発現の阻害のための使用に成功している（例えば、Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｔｉｎａ  ２４（４）：６６０を参照されたい）。
【０２８５】
耳、任意で内耳へのネイキッドまたは製剤化されたＲＮＡ分子の送達は、とりわけ、経鼓膜注射によって、または点耳薬として製剤化された所望の化合物の投与によって、達成される。ｄｓＲＮＡを含む耳性組成物は、本出願の代理人への米国公開第２０１１０１４２９１７号に開示され、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２８６】
所望の対象への核酸の導入を容易にするポリペプチドは、例えば、米国特許出願第２００７０１５５６５８号に記載されているもの（例えば、２，４，６−トリグアニジノトリアジンおよび２，４，６−トリアミドサルコシルメラミンなどのメラミン誘導体、ポリアルギニンポリペプチド、および交互のグルタミン残基およびアスパラギン残基を含むポリペプチド）等、当技術分野において周知である。
【０２８７】
薬学的に許容される担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント、およびビヒクル、ならびに移植担体は、一般に、本発明の活性成分と反応しない不活性な非毒性の固体または液体の充填剤、希釈剤、または封入材料を指し、それらには、リポソームおよびミクロスフェアが含まれる。本発明において有用な送達系の例には、米国特許第５，２２５，１８２号、同第５，１６９，３８３号、同第５，１６７，６１６号、同第４，９５９，２１７号、同第４，９２５，６７８号、同第４，４８７，６０３号、同第４，４８６，１９４号、同第４，４４７，２３３号、同第４，４４７，２２４号、同第４，４３９，１９６号、および第４，４７５，１９６号が含まれる。多数の他の移植片、送達系、およびモジュールは、当業者に周知である。
【０２８８】
特定の実施形態において、投与には、経鼓膜投与が含まれる。別の実施形態において、投与には、局所または局部投与が含まれる。化合物は、点耳薬、耳用クリーム、耳用軟膏、泡状剤、ムース、または上述のもののいずれかと送達デバイスとの組み合わせとして、投与される。化合物の移植片もまた有用である。液体の形態は、点滴剤として調製される。液体組成物は、有機共溶媒含有または不含の水溶液、水性または油性の懸濁液、食用油を含むエマルジョン、ならびに同様の薬学的ビヒクルを含む。これらの組成物はまた、経鼓膜注射することができる。点耳薬はまた、耳点滴剤または聴覚点滴剤とも称され得る。好ましい実施形態において、点耳薬は、点滴剤の外耳道からの漏れを予防するために、約３０分間、外耳道に留まる。したがって、点滴剤を受容する対象が、点滴剤の外耳道からの漏れを予防するために、治療される耳が上を向いている状態でその頭部を一方向に保つことが好ましい。
【０２８９】
核酸分子の送達のための方法は、Ａｋｈｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，２：１３９（１９９２）、Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，（１９９５）、Ｍａｕｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，１６：１２９−１４０（１９９９）、Ｈｏｆｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３７：１６５−１９２（１９９９）、およびＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，７５２：１８４−１９２（２０００）、米国特許第６，３９５，７１３号、同第６，２３５，３１０号、同第５，２２５，１８２号、同第５，１６９，３８３号、同第５，１６７，６１６号、同第４，９５９２１７号、同第４．９２５，６７８号、同第４，４８７，６０３号、および同第４，４８６，１９４号、ならびにＳｕｌｌｉｖａｎらのＰＣＴ第ＷＯ９４／０２５９５号、ＰＣＴ第ＷＯ００／０３６８３号、ＰＣＴ第ＷＯ０２／０８７５４号、ならびに米国出願公開第２００３０７７８２９号に記載される。これらの手順は、実質上あらゆる核酸分子の送達にも利用可能である。核酸分子は、当業者に既知の様々な方法によって細胞に投与することができ、これにはリポソーム中へのカプセル化、イオン導入によるもの、または他のビヒクル、例えば、生分解性ポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリン（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１０：１０６８−１０７４（１９９９）、ＷａｎｇらのＰＣＴ国際公開第ＷＯ０３／４７５１８号および同第ＷＯ０３／４６１８５号を参照されたい）、ポリ（ラクティック−コ−グリコリック）酸（ＰＬＧＡ）およびＰＬＣＡミクロスフェア（例えば、米国特許第６，４４７，７９６号および米国特許出願公開第２００２１３０４３０号）、ならびに生分解性ナノ粒子へ組み込みによるもの、および生体付着性ミクロスフェア、またはタンパク質性ベクターによるもの（Ｏ’ＨａｒｅおよびＮｏｒｍａｎｄのＰＣＴ国際公開第ＷＯ００／５３７２２号）が含まれるが、これらに制限されない。あるいは、核酸／ビヒクルの組み合わせは、直接注射または注入ポンプの使用によって、局部送達される。本発明の核酸分子の直接注射は、硝子体内、皮下、経鼓膜、筋肉内、または皮内にかかわらず、標準的な針と注射器の方法を使用して、またはＣｏｎｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５：２３３０−２３３７（１９９９）およびＢａｒｒｙらのＰＣＴ国際公開第ＷＯ９９／３１２６２号に記載されるもの等、針を用いない技術によって、行うことができる。本発明の分子は、薬学的薬剤として使用することができる。薬学的薬剤は、対象における疾患状態の症状をある程度（好ましくは症状の全てを）予防、発生を調節、または治療、または軽減する。本発明の１つの具体的な実施形態において、局所製剤および経皮製剤を選択してもよい。
【０２９０】
本発明のｄｓＲＮＡまたは薬学的組成物は、個々の対象の臨床状態、治療しようとする疾患、投与の部位および方法、投与の計画、患者の年齢、性別、体重、ならびに医師に公知の他の要因を考慮して、適切な医療行為に従って投与および服用される。
【０２９１】
別の実施形態において、投与は、点眼剤、点耳剤、または軟膏による局所または局部投与を含む。非限定的な例において、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１を標的とするｄｓＲＮＡ化合物は、耳の損傷を患う対象の治療に有用であり、このｄｓＲＮＡ化合物は、局所送達（例えば、点耳薬または軟膏）を介して耳に送達される。核酸分子は、カチオン性脂質と複合体を形成するか、リポソーム内に封入されるか、または別の方法で標的細胞もしくは組織に送達される。核酸または核酸複合体は、バイオポリマーに組み込んで、または組み込まずに、直接皮膚適用、経皮適用、または注射によって、エキソビボまたはインビボで関連組織に局部投与することができる。ｄｓＲＮＡ分子の生成に有用な好ましいオリゴヌクレオチドは、本明細書に開示される。
【０２９２】
送達系は、ポリ（エチレングリコール）脂質を含む表面修飾リポソーム（ＰＥＧ−修飾、または長期循環リポソーム、またはステルスリポソーム）を含み得る。これらの製剤は、標的組織における薬物の蓄積を増加させる方法を提供する。この分類の薬物担体は、単核食細胞系（ＭＰＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン化および排除に対する耐性を有し、それによって血液循環時間が長くなり、封入された薬物の組織への暴露が促進される（Ｌａｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１−２６２７、Ｉｓｈｉｗａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，４３，１００５−１０１１）。
【０２９３】
核酸分子は、ポリエチレンイミン（例えば、直鎖または分枝鎖ＰＥＩ）、および／または、例えばポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）誘導体もしくはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ｔｒｉＧＡＬ）誘導体を含むポリエチレンイミン誘導体、グラフトＰＥＩ、例えばガラクトースＰＥＩ、コレステロールＰＥＩ、抗体によって誘導体化されたＰＥＩ、およびそのポリエチレングリコールＰＥＩ（ＰＥＧ−ＰＥＩ）誘導体とともに製剤化または複合体化されてもよい（例えば、Ｏｇｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，ＡＡＰＡ  ＰｈａｒｍＳｃｉ，３，１−１１、Ｆｕｒｇｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１４，８４０−８４７、Ｋｕｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９，８１０−８１７、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２２，４６−５２、Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１０，５５８−５６１、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１３，８４５−８５４、Ｅｒｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔ，１，１−１８、Ｇｏｄｂｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９６，５１７７−５１８１、Ｇｏｄｂｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，６０，１４９−１６０、Ｄｉｅｂｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４，１９０８７−１９０９４、Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｋｌｉｂａｎｏｖ，２００２，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９９，１４６４０−１４６４５、Ｓａｇａｒａの米国特許第６，５８６，５２４号、および米国特許出願公開第２００３００７７８２９号を参照されたい）。
【０２９４】
核酸分子は、米国特許出願公開第２００１０００７６６６号に記載されているもの等、膜破壊剤と複合体を形成してもよい。膜破壊剤（複数可）および核酸分子はまた、米国特許第６，２３５，３１０号に記載されている脂質等、カチオン性脂質またはヘルパー脂質分子と複合体を形成してもよい。
【０２９５】
本明細書に開示される核酸分子は、中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）に投与してもよい。実験により、ニューロンによる効率的なインビボでの核酸の取り込みが実証されている。例えば、Ｓｏｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，８，７５、Ｅｐａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，１０，４６９、Ｂｒｏａｄｄｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．，８８（４），７３４、Ｋａｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍｏｃｏｌ．，３４０（２／３），１５３、Ｂａｎｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７８４（１，２），３０４、Ｒａｊａｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｓｙｎａｐｓｅ，２６（３），１９９、Ｗｕ−ｐｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，ＢｉｏＰｈａｒｍ，１２（１），３２、Ｂａｎｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃ．，３（１），８３、およびＳｉｍａｎｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，７４（１），３９を参照されたい。核酸分子は、したがって、ＣＮＳおよび／またはＰＮＳ中の細胞、例えば、ニューロン、マクロファージ、白質軸索、および内皮細胞への送達およびそれらによる取り込みに適している。
【０２９６】
送達系は、例えば、水性および非水性ゲル、クリーム、多相エマルジョン、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水性溶液および非水性溶液、ローション、エアロゾル、炭化水素基剤、ならびに粉末を含んでもよく、可溶化剤、浸透促進剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコール、およびアミノ酸）、ならびに親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）等の賦形剤を含有し得る。一実施形態において、薬学的に許容される担体は、リポソームまたは経皮促進剤である。本発明の化合物とともに使用することができるリポソームの非限定的な例には、次のものが挙げられる：（１）ＣｅｌｌＦｅｃｔｉｎ、カチオン性脂質Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラメチル−Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラパルミト−ｙ−スペルミンおよびジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１．５（Ｍ／Ｍ）リポソーム製剤（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、（２）Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ  ＧＳＶ、カチオン性脂質およびＤＯＰＥの２：１（Ｍ／Ｍ）リポソーム製剤（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、（３）ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリ−メチル−アンモニウムエチルサルフェート）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ）、および（４）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ポリカチオン性脂質ＤＯＳＰＡ、中性脂質ＤＯＰＥの３：１（Ｍ／Ｍ）リポソーム製剤（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、ならびにジアルキル化アミノ酸（ＤｉＬＡ２）。
【０２９７】
送達系は、パッチ、錠剤、坐剤、ペッサリー、ゲル、水性溶液および非水性溶液、ローション、クリーム含んでもよく、賦形剤、例えば可溶化剤および促進剤（例えば、プロピレングリコール、胆汁塩、およびアミノ酸）、ならびに他のビヒクル（例えば、ポリエチレングリコール、グリセロール、脂肪酸エステル、および誘導体、ならびに親水性ポリマー、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびヒアルロン酸）を含有し得る。
【０２９８】
核酸分子は、生体分子抱合体、例えば、Ｖａｒｇｅｅｓｅらの米国特許出願第１０／４２７，１６０号、米国特許第６，５２８，６３１号、米国特許第６，３３５，４３４号、米国特許第６，２３５，８８６号、米国特許第６，１５３，７３７号、米国特許第５，２１４，１３６号、米国特許第５，１３８，０４５号に記載されているような核酸抱合体を含み得る。
【０２９９】
本明細書に開示される組成物、方法、およびキットは、核酸分子の発現を可能にする様式で、少なくとも１つの本発明の核酸分子をコードする核酸配列を含む、発現ベクターを含み得る。核酸分子またはｄｓＲＮＡの鎖を発現することができる１つ以上ベクターを、細胞環境中に導入する方法は、細胞の種類およびその環境の性質に依存するであろう。核酸分子またはベクター構築物は、細胞内に直接導入してもよく（すなわち、細胞内導入）、または腔内、間質腔、生物の循環内に細胞外導入しても、経口導入してもよく、あるいはｄｓＲＮＡを含有する溶液に生物または細胞を浸漬することによって導入してもよい。細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞である。発現ベクターの核酸分子は、センス領域およびアンチセンス領域を含み得る。アンチセンス領域は、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１をコードするＲＮＡまたはＤＮＡ配列に相補的な配列を含み得、センス領域は、アンチセンス領域に相補的な配列を含み得る。核酸分子は、相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を有する、２つの明白に異なる鎖を含んでもよい。核酸分子は、相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を有する単一の鎖を含んでもよい。
【０３００】
標的ＲＮＡ分子と相互作用し、遺伝子をコードする標的ＲＮＡ分子（例えば、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１  ｍＲＮＡ、配列番号１〜１１）を下方制御する核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写ユニットから発現され得る。組み換えベクターは、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターであり得る。核酸分子を発現するウイルスベクターは、限定されないがアデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアルファウイルスに基づいて構築することができる。核酸分子を発現することができる組み換えベクターは、本明細書に記載されるように送達され、標的細胞中で存続することが可能である。あるいは、核酸分子の一過性発現を提供するウイルスベクターを使用してもよい。このようなベクターは、必要に応じて、繰り返し投与することができる。一旦発現すると、核酸分子は結合して、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により遺伝子の機能または発現を下方制御する。核酸分子を発現するベクターの送達は全身性であってよく、例えば、静脈内または筋肉内投与によって、局部投与によって、対象から外植された標的細胞への投与に続いて対象への再導入によって、または所望の標的細胞への導入を可能にするであろう任意の他の手段によって行われ得る。
【０３０１】
発現ベクターは、少なくとも１つの本明細書に開示される核酸分子をコードする核酸配列を、核酸分子の発現を可能にする様式で含んでもよい。例えば、ベクターは、二重鎖を含む核酸分子の両鎖をコードする配列（複数可）を含有してもよい。ベクターはまた、自己相補的であり、それにより核酸分子を形成する、単一の核酸分子をコードする配列（複数可）も含有し得る。このような発現ベクターの非限定的例は、Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５０５、Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ａｎｄ  Ｔａｉｒａ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，４９７、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５００、およびＮｏｖｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ａｄｖａｎｃｅ  ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ７２５に記載されている。発現ベクターはまた、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞に含まれてもよい。
【０３０２】
発現ベクターは、核酸二重鎖の一方もしくは両方の鎖、または核酸二重鎖に自己ハイブリダイズする単一の自己相補的鎖をコードしてもよい。核酸分子をコードする核酸配列は、核酸分子の発現を可能にする様式で、作用可能に連結させることができる（例えば、Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５０５、Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ａｎｄ  Ｔａｉｒａ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，４９７、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５００、およびＮｏｖｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ａｄｖａｎｃｅ  ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ７２５を参照されたい）。
【０３０３】
発現ベクターは、以下のうちの１つ以上を含み得る：ａ）転写開始領域（例えば真核生物ｐｏｌ  Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ開始領域）、ｂ）転写終結領域（例えば真核生物ｐｏｌ  Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ終結領域）、ｃ）イントロン、およびｄ）核酸分子のうちの少なくとも１つをコードする核酸配列であって、核酸分子の発現および／または送達を可能にする様式で、開始領域および終結領域に作用可能に連結した配列。ベクターは、場合により、核酸分子をコードする配列の５’側または３’側に作用可能に連結したタンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、および／またはイントロン（介在配列）を含んでもよい。
【０３０４】
核酸分子配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）のプロモーターから引き起こすことができる。ｐｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからの転写産物は、全ての細胞において高いレベルで発現され、所与の細胞型における所与のｐｏｌ  ＩＩプロモーターのレベルは、付近に存在する遺伝子調節配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存する。原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた使用されるが、ただし、その原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が、適切な細胞において発現されることを条件とする（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，６７４３−７、Ｇａｏ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ  １９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１，２８６７−７２、Ｌｉｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７，４７−６６、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，４５２９−３７）。数人の研究者が、このようなプロモーターから発現された核酸分子が、哺乳動物細胞において機能し得ることを実証している（例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５、Ｏｊｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０８０２−６、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６３４０−４、Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１１，４４１１−８、Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９０，８０００−４、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３，２２５９、Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ&Ｃｅｃｈ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１５６６）。より具体的には、転写ユニットは、Ｕ６低分子核酸（ｓｎＲＮＡ）、転移（ｔＲＮＡ）、およびアデノウイルスＶＡ  ＲＮＡをコードする遺伝子から誘導されたもの等の転写ユニットは、細胞内で、ｓｉＮＡ等の所望されるＲＮＡ分子を高濃度で生成するのに有用である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，上記、Ｃｏｕｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，上記、Ｎｏｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２２，２８３０、Ｎｏｏｎｂｅｒｇらの米国特許第５，６２４，８０３号、Ｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，４，４５、ＢｅｉｇｅｌｍａｎらのＰＣＴ国際公開第ＷＯ９６／１８７３６号）。上述の核酸転写ユニットは、哺乳動物細胞への導入のために、プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクター等）、またはウイルスＲＮＡベクター（レトロウイルスまたはアルファウイルスベクター）を含むがこれらに制限されない種々の���クターに組み込むことができる（Ｃｏｕｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６上記を参照されたい）。
【０３０５】
核酸分子は、細胞内で真核生物プロモーターから発現させることができる（例えば、Ｉｚａｎｔ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９，３４５、ＭｃＧａｒｒｙ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８３，３９９、Ｓｃａｎｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１０５９１−５、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５、Ｄｒｏｐｕｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，１４３２−４１、Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，５５３１−４、Ｏｊｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０８０２−６、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９、Ｓａｒｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１２２２−１２２５、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３，２２５９、Ｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，４，４５を参照されたい。当業者であれば、任意の核酸を、真核生物細胞内で適切なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから発現させることができることを理解する。このような核酸の活性は、酵素的核酸による一次転写産物からのそれらの放出によって、増加させることができる（ＤｒａｐｅｒらのＰＣＴ第ＷＯ９３／２３５６９号およびＳｕｌｌｉｖａｎらのＰＣＴ第ＷＯ９４／０２５９５号、Ｏｈｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２７，１５−６、Ｔａｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９，５１２５−３０、Ｖｅｎｔｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１，３２４９−５５、Ｃｈｏｗｒｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２５８５６。
【０３０６】
ウイルス粒子中にパッケージングされたウイルス構築物は、発現構築物の細胞への効率的な導入、および発現構築物によりコードされるｄｓＲＮＡ構築物の転写の両方を達成するであろう。
【０３０７】
経口導入のための方法には、その生物の食物へのＲＮＡの直接混入、ならびに食物として使用される種を、ＲＮＡを発現するように操作し、影響を受ける生物に摂取させる、工学的アプローチが含まれる。物理的方法を用いて、核酸分子溶液を細胞に導入してもよい。核酸を導入する物理的方法には、核酸分子を含有する溶液の注射、核酸分子で被覆した粒子による衝撃、細胞もしくは生物のＲＮＡ溶液への浸漬、または核酸分子の存在下での細胞膜のエレクトロポレーションが含まれる。一実施形態において、本明細書に開示される核酸分子を含む細胞を、本明細書に提供する。
【０３０８】
リン酸カルシウム等の化学物質媒介輸送といった、核酸を細胞に導入するための当技術分野において既知の他の方法を使用してもよい。したがって、核酸分子は、次の活性のうちの１つ以上を行う構成成分とともに導入してもよい：細胞によるＲＮＡの取り込みの強化、二本鎖のアニーリングの促進、アニーリングされた鎖の安定化、あるいはそうでなければ標的遺伝子の阻害／下方制御の向上。
【０３０９】
高分子ナノカプセルまたはマイクロカプセルは、封入または結合したｄｓＲＮＡの細胞中への輸送および放出を容易にする。これらは、ポリマー材料およびモノマー材料を含み、特に、ポリブチルシアノアクリレートを含む。材料および製造方法の概要は公開されている（Ｋｒｅｕｔｅｒ，１９９１を参照されたい）。重合／ナノ粒子生成ステップにおいてモノマーおよび／またはオリゴマーの前駆物質から形成されるポリマー材料は、それ自体が、ナノ粒子製造分野の当業者が通常の技能により好適に選択することができるポリマー材料の分子量および分子量分布と同様に、先行技術から公知である。
【０３１０】
核酸分子は、マイクロエマルジョンとして製剤化してもよい。マイクロエマルジョンは、単一の光学的に等方性で、熱力学的に安定な液体溶液である、水、油、および両親媒性物質の系である。通常、マイクロエマルジョンは、まず油を界面活性剤水溶液に分散させ、次いで十分な量の４番目の成分、一般に中間鎖長のアルコールを添加して、透明の系を形成することによって調製する。
【０３１１】
マイクロエマルジョンの調製に使用可能な界面活性剤には、単独または共界面活性剤と組み合わせた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ  ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレエート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡ０７５０）が含まれるが、これらに限定されない。通常はエタノール、１−プロパノール、および１−ブタノールなどの短鎖アルコールである共界面活性剤は、界面活性剤膜に浸透し、その結果、界面活性剤分子間に生じた空隙により不規則な膜を作成することで、界面流動性を増加させるように機能する。
【０３１２】
送達製剤は、１つ以上の分解性架橋性脂質部分、１つ以上のＰＥＩ部分、および／または１つ以上のｍＰＥＧ（ＰＥＧのメチルエーテル誘導体（メトキシポリ（エチレングリコール））を含む水溶性の分解性架橋ポリマーを含み得る。
投与量
【０３１３】
投与される有用な投与量および具体的な投与形態は、当業者には容易に理解されるように、細胞型、またはインビボでの使用の場合、年齢、体重、ならびに治療する具体的な動物およびその領域、使用される具体的な核酸および送達方法、意図される治療上または診断上の使用、ならびに、例えば、懸濁剤、エマルジョン、ミセル、またはリポソームのような製剤の形態といった要因に応じて異なることになる。通常、投与量は、低レベルで投与され、所望の効果が達成されるまで増加される。
【０３１４】
本明細書における目的での「治療有効用量」は、したがって、当技術分野において知られている検討項目によって決定される。用量は、生存率の改善もしくはより迅速な回復、または症状の改善もしくは解消、および当業者により適切な尺度として選択されるような他の指標が含まれるが、これらに限定されない改善を達成するのに有効でなければならない。
【０３１５】
好適な量の核酸分子を導入することができ、この量は標準的方法を用いて経験的に決定することができる。細胞環境における個々の核酸分子種の有効な濃度は、約１フェムトモル、約５０フェムトモル、１００フェムトモル、１ピコモル、１．５ピコモル、２．５ピコモル、５ピコモル、１０ピコモル、２５ピコモル、５０ピコモル、１００ピコモル、５００ピコモル、１ナノモル、２．５ナノモル、５ナノモル、１０ナノモル、２５ナノモル、５０ナノモル、１００ナノモル、５００ナノモル、１マイクロモル、２．５マイクロモル、５マイクロモル、１０マイクロモル、１００マイクロモル、またはそれ以上であり得る。
【０３１６】
一般に、ヒトの場合の核酸化合物の活性用量は、単回用量、１〜４週間またはそれ以上の期間にわたって、１日１用量、または１日２用量もしくは３用量以上の投与計画で、１日につき受容者の体重１ｋｇ当たり１ｎｇ／ｋｇから約２０〜１００ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）の範囲、好ましくは１日につき受容者の体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇから約２〜１０ｍｇの範囲である。核酸分子の好適な投与量単位は、１日につき受容者の体重１キログラム当たり０．００１〜０．２５ミリグラムの範囲、または１日につき体重１キログラム当たり０．０１〜２０マイクログラムの範囲、または１日につき体重１キログラム当たり０．０１〜１０マイクログラムの範囲、または１日につき体重１キログラム当たり０．１０〜５マイクログラムの範囲、または１日につき体重１キログラム当たり０．１〜２．５マイクログラムの範囲であってもよい。投与量は、体重１ｋｇ当たり０．０１ｕｇ〜１ｇ（例えば、体重１ｋｇ当たり０．１ｕｇ、０．２５ｕｇ、０．５ｕｇ、０．７５ｕｇ、１ｕｇ、２．５ｕｇ、５ｕｇ、１０ｕｇ、２５ｕｇ、５０ｕｇ、１００ｕｇ、２５０ｕｇ、５００ｕｇ、１ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇ、または５００ｍｇ）であってもよい。
【０３１７】
１日につき体重１キログラム当たり約０．１ｍｇ〜約１４０ｍｇ程度の投与量レベルは、上に示した状態の治療に有用である（１日につき１対象当たり約０．５ｍｇ〜約７ｇ）。単一剤形を生成するために担体材料と合わせることができる活性成分の量は、治療される宿主および特定の投与形態に応じて異なる。単位投与量形態は、一般に、約１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を含有する。
【０３１８】
いずれの特定の対象に対する具体的な用量レベルも、採用される具体的な化合物の活性、年齢、体重、全般的な健康、性別、食事、投与時間、投与経路、および排泄速度、薬物の組み合わせ、ならびに治療を受ける特定の疾患の重症度を含む、様々な要因に応じて異なることが理解される。
【０３１９】
本明細書に開示される核酸分子を含む薬学的組成物は、１日１回（ＱＤ）、１日２回（ｂｉｄ）、１日３回（ｔｉｄ）、１日４回（ｑｉｄ）、または任意の間隔で、医学的に適切な任意の期間、投与することができる。しかしながら、治療薬はまた、１日を通して適切な間隔で投与される、２回、３回、４回、５回、６回またはそれ以上の副用量を含む投与量単位で投与してもよい。その場合、各副用量に含まれる核酸分子を、１日当たりの総投与量単位を達成するために、それに応じて小さくすることができる。投与量単位は、例えば、数日間の期間にわたって、ｄｓＲＮＡの持続および一定した放出を提供する、従来の持続放出製剤を用いて、数日間にわたる単回用量用に調合することもできる。持続放出製剤は、当技術分野において周知である。投与量単位は、対応する倍数の１日用量を含有してもよい。組成物は、複数単位の核酸の合計が十分な用量を含有するように調合することができる。
薬学的組成物、キット、および容器
【０３２０】
核酸分子を患者に投与または分配するための、本明細書に提供されるＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の発現を下方制御するための核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ分子）を含む、組成物、キット、容器、および製剤もまた、本明細書に提供する。キットは、少なくとも１つの容器および少なくとも１つのラベルを含み得る。好適な容器には、例えば、瓶、バイアル、注射器、および試験管が含まれる。容器は、ガラス、金属、またはプラスチック等、様々な材料から形成され得る。容器は、アミノ酸配列（複数可）、小分子（複数可）、核酸配列（複数可）、細胞集団（複数可）、および／または抗体（複数可）、および／または関連する実験、予後、診断、予防、および治療の目的で必要とされる任意の他の成分を保持することができる。このような使用についての指示および／または用法は、このような容器上または容器とともに、試薬および他の組成物またはこのような目的で使用される器具と同様に、含まれ得る。
【０３２１】
容器は、代替的に、状態の治療、診断、予後、または予防に有効な組成物を保持してもよく、無菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静注溶液バッグ、または皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。組成物中の活性成分は、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１  ｍＲＮＡと特異的に結合する、および／またはＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の機能を下方制御することができる核酸分子であり得る。
【０３２２】
キットは、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、および／またはデキストロース溶液等の薬学的に許容される緩衝液を含む第２の容器を、さらに含み得る。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、撹拌器、針、注射器、ならびに／または使用のための指示および／もしくは説明を有する添付文書を含む、商業的立場および使用者の立場から望ましい他の材料をさらに含み得る。
【０３２３】
米国連邦法により、ヒトの治療における薬学的組成物の使用には、連邦政府機関による承認が求められる。米国では、食品医薬品局（ＦＤＡ）が実施を担当し、ＦＤＡはそのような承認のための適切な規制を発行し、これは２１  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§３０１−３９２に詳述されている。動物の組織から作製される製品を含む生物材料に関する規制は、４２  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§２６２に規定されている。諸外国のほとんどは同様の承認を要求している。規制は国によって異なるが、個々の手順は当業者に周知であり、本明細書に開示される組成物および方法は、好ましくは適宜準拠する。
【０３２４】
本明細書に開示される核酸分子は、耳、前庭感覚系における疾患、損傷、状態、または病態、ならびに細胞または組織内のＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１のレベルと関連するか、またはそれに応答する任意の他の疾患または状態等、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１と関連する疾患、状態、または障害を治療するために、単独でか、または他の療法と組み合わせて使用可能である。したがって、本明細書に開示される組成物、キット、および方法は、ラベルまたは添付文書を含んで、本明細書に開示される核酸分子を包装することを含み得る。ラベルは、メニエール病、音響性外傷、難聴（ｄｅａｆｎｅｓｓ）、難聴（ｈｅａｒｉｎｇ  ｌｏｓｓ）、老年性難聴、および本明細書に開示される任意の他の疾患または状態を含むがこれらに限定されない、耳または前庭系の疾患、障害、損傷、および状態の治療または予防のための使用等、核酸分子の使用のための指示を含み得る。ラベルは、神経変性の治療または防止または軽減のための使用等、核酸分子の使用のための指示を含んでもよい。神経変性には、例えば、聴覚神経（内耳神経または聴神経としても知られ、内耳から脳への音および平衡情報の伝達に関与する）の変性を含み、内耳の有毛細胞は、蝸牛神経と前庭神経とからなり、延髄から出て、顔面神経とともに側頭骨内の内耳道（または内聴道）を通って頭蓋内に入る、聴覚神経を介して脳へと情報を伝達する。ラベルは、単独でかまたは他の療法と組み合わせた、細胞または組織内のＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１のレベルに関連するか、またはそれに応答する任意の他の疾患または状態の治療または予防のための使用等、核酸分子の使用のための指示を含み得る。ラベルは、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の発現を低減および／または下方制御する際の使用のための指示を含んでもよい。「添付文書」とは、治療用製品の商品パッケージに慣例的に含まれる使用説明書を指して使用され、これは適応症、使用法、投与量、用法、禁忌、包装されている製品と併用する他の治療用製品、および／またはそのような治療用製品の使用に関する注意等についての情報を含む。
【０３２５】
当業者であれば、当技術分野で既知の他の治療、薬物、および療法が、本明細書の核酸分子（例えば、ｄｓＮＡ分子）と容易に組み合わせることができ、したがって本明細書において企図されることを理解するであろう。
治療方法
【０３２６】
別の態様において、本発明は、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の異常な発現と関連する疾患または障害の治療を必要とする対象の治療のための方法であって、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の発現を低減または阻害する、ある量の阻害剤を対象に投与することを含む、方法に関する。
【０３２７】
一実施形態において、核酸分子を使用して、疾患または状態（例えば、神経変性）と関連する、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、もしくはＮＯＴＣＨ１、ならびに／またはＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、もしくはＮＯＴＣＨ１および／もしくはハプロタイプ多型から生じるＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、もしくはＮＯＴＣＨ１タンパク質の発現を下方制御または阻害することができる。ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、もしくはＮＯＴＣＨ１、および／またはＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、もしくはＮＯＴＣＨ１遺伝子、および／またはタンパク質もしくはＲＮＡレベルの分析を使用して、このような多型を有する対象、または本明細書に記載される特性、状態、もしくは疾患の危険性にある対象を識別することができる。これらの対象は、治療、例えば、本明細書に開示される核酸分子、ならびにＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、もしくはＮＯＴＣＨ１、および／またはＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、もしくはＮＯＴＣＨ１遺伝子の発現に関連する疾患の治療に有用な任意の他の組成物を用いた治療に適している。したがって、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、もしくはＮＯＴＣＨ１、および／またはタンパク質もしくはＲＮＡのレベルの分析を使用して、対象を治療する際の治療の種類および治療過程を決定することができる。タンパク質またはＲＮＡレベルの監視を用いて、治療結果を予測し、特性、状態、または疾患と関連するある特定の遺伝子および／またはタンパク質のレベルおよび／または活性を調節する、化合物および組成物の有効性を判定することができる。
【０３２８】
本発明は、対象と比較して、配列番号１〜１１のいずれか１つに記載されるｍＲＮＡに転写された遺伝子からなる群から選択される標的遺伝子のうちのいずれか１つの発現を、少なくとも４０％、好ましくは５０％、６０％、または７０％、より好ましくは７５％、８０％、または９０％阻害する方法であって、本発明の標的遺伝子のｍＲＮＡ転写産物を、本発明の化合物のうちの１つ以上と接触させることを含む、方法を提供する。
【０３２９】
一実施形態において、オリゴリボヌクレオチドは、本明細書に開示される標的遺伝子のうちの１つ以上を阻害し、阻害は、遺伝子機能の阻害、ポリペプチドの阻害、およびｍＲＮＡ発現の阻害を含む群から選択される、
【０３３０】
一実施形態において、化合物は、標的ポリペプチドを阻害し、この阻害は、機能の阻害（これは、例えば、とりわけ、酵素アッセイまたは天然の遺伝子／ポリペプチドの既知の相互作用物質を用いた結合アッセイによって試験可能である）、タンパク質の阻害（これは、例えば、とりわけ、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、または免疫沈降法によって試験可能である）、およびｍＲＮＡ発現の阻害（これは、例えば、とりわけ、ノーザンブロット、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、インサイツハイブリダイゼーション、またはマイクロアレイハイブリダイゼーションによって試験可能である）を含む群から選択される。
【０３３１】
一実施形態において、本化合物は、哺乳動物ポリペプチドを下方制御し、この下方制御は、機能の下方制御（これは、例えば、とりわけ、酵素アッセイまたは天然の遺伝子／ポリペプチドの既知の相互作用物質を用いた結合アッセイによって試験可能である）、タンパク質の下方制御（これは、例えば、とりわけ、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、または免疫沈降法によって試験可能である）、およびｍＲＮＡ発現の下方制御（これは、例えば、とりわけ、ノーザンブロット、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、インサイツハイブリダイゼーション、またはマイクロアレイハイブリダイゼーションによって試験可能である）を含む群から選択される。
【０３３２】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号１〜１１のいずれか１つに記載されるｍＲＮＡに転写された遺伝子からなる群から選択される、上昇したレベルの哺乳動物遺伝子を伴う疾患を患う患者を治療する方法であって、本発明の化合物または組成物を治療有効用量で患者に投与し、それによって患者を治療することを含む、方法を提供する。
【０３３３】
本発明の哺乳動物遺伝子またはポリペプチドを阻害する方法、分子、および組成物は、本明細書に詳細に説明され、前記分子および／または組成物のいずれも、前記状態のいずれかを患う患者の治療に有益に利用される。既知の化合物は、本発明から除外されることを、明確に理解されたい。既知の化合物および組成物を使用した治療の新規な方法は、本発明の範囲内に含まれる。
【０３３４】
本発明の方法は、難聴関連遺伝子の発現を下方制御する１つ以上の化合物の治療有効量を投与することを含む。「毒性剤への暴露」とは、毒性剤が、哺乳動物に利用されるか、または哺乳動物と接触することを意味する。毒性剤は、神経系に対して毒性であり得る。毒性剤への暴露は、直接投与によって、例えば、食物、薬品、または治療剤、例えば化学療法剤の摂取または投与によって、事故による混入によって、または環境暴露、例えば、空気中または水中暴露によって、発生し得る。
【０３３５】
薬学的組成物を調製するプロセスであって、
１つ以上の本明細書に開示される二本鎖分子を提供することと、
前記分子を薬学的に許容される担体と混合することと、を含む、方法をさらに提供する。
【０３３６】
好ましい実施形態において、薬学的組成物の調製に使用される分子は、薬学的有効用量で担体と混合される。特定の実施形態において、本発明の化合物は、ステロイド、脂質、または別の好適な分子、例えばコレステロールと抱合される。
【０３３７】
ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、もしくはＮＯＴＣＨ１遺伝子発現を下方制御するか、またはＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、もしくはＮＯＴＣＨ１遺伝子発現に対するＲＮＡ干渉を媒介することができる、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子等の本明細書に提供される小核酸分子を使用することによって、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１発現を阻害するための組成物および方法を提供する。本明細書に開示される組成物および方法はまた、例えば、前庭感覚系の障害、疾患、および損傷等、種々の状態または疾患の治療にも有用である。
【０３３８】
本明細書に開示される核酸分子は、個別に、または他の薬物との組み合わせもしくは併用で、本明細書に記載される疾患、障害、および損傷等、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１と関連する疾患、特性、状態、および／または障害の予防または治療に使用することができる。
【０３３９】
本明細書に開示される核酸分子は、配列特異的な様式で、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の発現を下方制御することができる。核酸分子は、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１  ｍＲＮＡの一部分に少なくとも部分的に相補的（アンチセンス）な連続するヌクレオチドを含む、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み得る。
【０３４０】
いくつかの実施形態において、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１に特異的なｄｓＲＮＡは、他の治療剤、および／または限定されないが、種々のアポトーシス性遺伝子等、他の分子標的に特異的なｄｓＲＮＡと、併用することができる。
【０３４１】
対象または生物におけるＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１関連疾患または状態を治療または予防するための方法は、対象または生物を、対象または生物における遺伝子の発現を下方制御するのに好適な条件下で、本明細書に提供される核酸分子と接触させることを含み得る。
【０３４２】
対象または生物における耳障害を治療または予防するための方法は、対象または生物を、対象または生物におけるＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１遺伝子の発現を下方制御するのに好適な条件下で、核酸分子と接触させることを含み得る。
【０３４３】
好ましい実施形態において、治療される対象は、温血動物、および特に、ヒトを含む哺乳動物である。
【０３４４】
本明細書に開示される方法は、対象に、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の発現を下方制御する１つ以上の阻害性化合物、特に、ｓｉＲＮＡを治療有効用量で投与して、それによって、対象を治療することを含む。
【０３４５】
本明細書に開示される分子は、特に、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の発現の下方制御が有益である疾患または状態の治療において、新規な二本鎖ＲＮＡ化合物（ｄｓＲＮＡ）に対して、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の発現を下方制御する。
【０３４６】
ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１を下方制御する方法、分子、および組成物を、本明細書に詳細に説明し、前記分子および／組成物のいずれも、前記状態のいずれかを患う対象の治療に有益に利用することができる。ｄｓＲＮＡを生成するのに有用なセンス鎖およびアンチセンス鎖のオリゴヌクレオチド配列は、配列番号２３〜２６９１２に記載される。ＨＥＳ１の発現を下方制御するｄｓＲＮＡの調製に有用な好ましいオリゴヌクレオチド配列は、配列番号２６６６７〜２６６９０および２６６９１〜２６７０６に記載され、ＨＥＳ５のものは、配列番号２６７０７〜２６７２４および２６７２５−２６７３２に記載され、ＨＥＹ１のものは、配列番号２６７３３〜２６７６０および２６７６１〜２６７７に記載され、ＨＥＹ２のものは、配列番号２６７７９〜２６７８４および２６７８５〜２６７８８に記載され、ＩＤ１のものは、配列番号２６７８９〜２６８０８および２６８０９〜２６８１６に記載され、ＩＤ２のものは、配列番号２６８１７〜２６８２４および２６８２５〜２６８３２に記載され、ＩＤ３のものは、配列番号２６８３３〜２６８５０および２６８５１〜２６８６６に記載され、ＣＤＫＮ１Ｂのものは、配列番号２６８６７〜２６８８６および２６８８７〜２６９００に記載される、またはＮＯＴＣＨ１のものは、配列番号２６９０１〜２６９１０および２６９１１〜２６９１２に記載される。好ましい実施形態において、治療される対象は、温血動物、特に、ヒトを含む哺乳動物である。
【０３４７】
本明細書に開示される方法は、表１Ａ（配列番号１〜１１）の遺伝子の発現を下方制御する１つ以上の阻害性化合物、特に、治療有効量のｓｉＲＮＡを対象に投与し、それによって対象を治療することを含む。
【０３４８】
「治療」とは、治療的治療および防止的もしくは予防的措置の療法を指し、聴覚の障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）または障害（ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）（もしくはバランス障害）等の障害の予防または障害の症状の低減、あるいは本明細書に列挙される難聴関連疾患と関連する細胞死の予防または低減を目的とする。治療を必要とする者には、疾患または状態を既に経験している者、疾患または状態を有する傾向にある者、および疾患または状態が予防されるべき者が含まれる。本発明の化合物は、疾患または状態の発症の前、最中、または後に投与される。
【０３４９】
理論に束縛されるものではなく、聴覚障害は、アポトーシス性内耳有毛細胞損傷または消失のためであり得、この損傷または消失は、感染、機械的損傷、大きな騒音、加齢、または特に化学物質に誘発される耳毒性によって、引き起こされる。耳毒性物質は、抗腫瘍剤、サリチル酸塩、キニーネ、およびアミノグリコシド系抗生物質を含む治療薬、食物または薬品中の混入物質、ならびに環境または産業汚染物質が挙げられる。典型的に、治療は、特に、治療薬の投与からもたらされるか、またはそれからもたらされることが予測される、耳毒性を予防または低減するために実行される。好ましくは、治療有効組成物を、暴露直後に投与して、耳毒性作用の予防または低減を行う。より好ましくは、治療は、耳毒性薬剤または耳毒性物質への暴露の前または同時にのいずれかで組成物を投与することによって、予防的に提供される。
【０３５０】
本明細書の文脈において「耳毒性物質」とは、その化学作用を通じて、聴覚に関連する神経系の音受容要素の活性を損傷、障害、または阻害し、それが聴覚（および／またはバランス）を障害する、物質を意味する。本発明の文脈において、耳毒性には、内耳有毛細胞への有害な影響が含まれる。聴覚障害を引き起こす耳毒性剤には、ビンクリスチン、ビンブラスチン、シスプラチンおよびシスプラチン様化合物、タキソールおよびタキソール様化合物、ジデオキシ化合物、例えば、ジデオキシイノシンといった抗腫瘍剤；アルコール；金属；職業上または環境上の暴露に関与する産業毒素；食物または薬品の混入物質；ならびにビタミン剤または治療薬、例えば、ペニシリンまたはクロラムフェニコール等、抗生物質の過剰摂取、およびビタミンＡ、Ｄ、またはＢ６、サリチル酸塩、キニーネ、およびループ利尿薬の大量投与が挙げられるが、これらに限定されない。「耳毒性剤への暴露」とは、耳毒性剤が、哺乳動物に利用されるか、または哺乳動物と接触することを意味する。耳毒性剤への暴露は、直接投与によって、例えば、食物、薬剤、または治療剤、例えば化学療法剤の摂取または投与によって、事故による混入によって、または環境暴露、例えば、空気または水中暴露によって、発生し得る。
【０３５１】
本発明に関する聴覚障害は、内耳有毛細胞に関与する末端器官損傷によるもの、例えば、音響性外傷、ウイルス性内リンパ迷路炎、メニエール病であり得る。聴覚障害には耳鳴が挙げられ、これは、音響刺激の不在下における音の認知であり、断続的または継続的であり得、感音障害と診断されるものがある。難聴は、耳帯状疱疹等の細菌またはウイルス感染、急性中耳炎から生じる化膿性迷路炎、化膿性髄膜炎、慢性中耳炎、ウイルス起源のもの、例えば、流行性耳下腺炎、麻疹、インフルエンザ、水疱瘡、単核球症、およびアデノウイルスを含むウイルスによって引き起こされるウイルス性内リンパ迷路炎を含む突発性難聴によるものであり得る。難聴は、風疹、出生時の無酸素症、出産中の外傷による内耳への出血、母体に投与された耳毒性薬物、胎児赤芽球症、ならびにワールデンブルグ症候群およびフルラー症候群を含む遺伝性疾患によって引き起こされるもの等、先天性のものであり得る。
【０３５２】
難聴は、騒音によって誘発されるものであり得、一般に、内耳を損傷する８５デシベル（ｄｂ）を上回る騒音によるものであり得る。特定の態様において、難聴は、内耳の聴覚部分、特に内耳有毛細胞に影響を与える耳毒性薬物によって引き起こされる。聴覚およびバランス障害の説明および診断に関して、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８２），Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ&Ｄｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎ．Ｊ．の第１９６章、第１９７章、第１９８章、および第１９９章、ならびに最新の第１６版の第２０７章および第２１０章を含む）に相当する章が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３５３】
一実施形態において、聴覚（またはバランス）障害を有するもしくは生じる傾向がある哺乳動物を治療する、または本発明の遺伝子の阻害が有用である状態において予防的に哺乳動物を治療するための方法を提供する。本方法は、内耳細胞の損傷、消失、または変性に起因するであろう、特に、耳毒性薬剤によって引き起こされる聴覚（またはバランス）障害の発生または重症度を予防または低減する。本方法は、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の発現を下方制御する１つ以上の化合物、特に、本発明の新規のｓｉＲＮＡの治療有効量を投与することを含む。
【０３５４】
聴覚の障害（ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）、障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、または平衡失調、任意に耳毒性物質に誘発される聴覚状態を、予防、低減、または治療するために、このような治療を必要とする哺乳動物に本発明の組成物を投与することによって、哺乳動物を治療するための方法および組成物を提供することが目的である。本発明の一実施形態は、耳毒性が、耳毒性薬学的薬物の治療有効量の投与からもたらされる、聴覚障害または損傷を治療するための方法である。典型的な耳毒性薬物は、化学療法薬、例えば、抗腫瘍剤および抗生物質である。他の可能な候補には、ループ利尿薬、キニーネまたはキニーネ様化合物、およびサリチル酸塩またはサリチル酸塩様化合物が挙げられる。
【０３５５】
本明細書に開示される方法および組成物はまた、耳毒性化合物が抗生物質、好ましくは、アミノグリコシド系抗生物質である場合にも有効である。耳毒性アミノグリコシド系抗生物質としては、ネオマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、リビドマイシン、カナマイシン、アミカシン、トブラマイシン、バイオマイシン、ゲンタマイシン、シソマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、ジベカシン、ホルチミシン、およびジヒドロストレプトマイシン、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗生物質には、ネオマイシンＢ、カナマイシンＡ、カナマイシンＢ、ゲンタマイシンＣ１、ゲンタマイシンＣ１ａ、およびゲンタマイシンＣ２が含まれる。本方法および組成物はまた、耳毒性化合物が、ビンクリスチン、ビンブラスチン、シスプラチンおよびシスプラチン様化合物、ならびにタキソールおよびタキソール様化合物等の抗腫瘍剤である場合にも有効である。本方法および組成物はまた、音響性外傷または機械的外傷、好ましくは内耳有毛細胞消失または外耳有毛細胞消失につながる音響性または機械的外傷の治療にも有効である。本発明において治療されるべき音響性外傷は、１２０〜１４０デシベルを上回る極めて大きな音への１回の暴露によってか、または８５デシベルを上回る日常的な大きな音への長期的な暴露の後に引き起こされ得る。本発明の組成物はまた、音響性外傷が予測される患者における予防的治療としても有効である。本発明において治療される機械的内耳外傷は、例えば、内耳内への電子デバイスの挿入のための操作後の内耳外傷である。本明細書に開示される分子および組成物は、この操作と関連する内耳有毛細胞への損傷を予防または最小化する。
【０３５６】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される分子および組成物は、耳毒性物質と同時投与される。例えば、アミノグリコシド系抗生物質の投与による哺乳動物の感染症の治療のための改善された方法が提供され、この改善は、このような治療を必要とする患者に、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の発現を下方制御する１つ以上の化合物（特に、新規のｓｉＲＮＡ）の治療有効量を投与して、この抗生物質と関連する耳毒性物質に誘発される聴覚障害の低減または予防することを含む。ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１の発現を下方制御する化合物、特に、新規のｓｉＲＮＡは、好ましくは内耳内に局部投与される。
【０３５７】
さらに別の実施形態において、化学療法化合物の投与による哺乳動物における癌治療のための改善された方法が提供され、この改善は、このような治療を必要とする患者に、本発明の組成物の治療有効量を投与して、化学療法薬と関連する耳毒性物質に誘発される聴覚障害の低減または予防することを含む。耳毒性物質に誘発される聴覚障害を低減または予防する化合物、例えば、本明細書に開示されるｄｓＲＮＡ分子は、とりわけ、好ましくは、ＰＢＳまたは他の生理溶液等のビヒクル中のネイキッドｄｓＲＮＡとして蝸牛に直接投与されるが、代替的に、上述のように送達ビヒクルとともに投与してもよい。
【０３５８】
別の実施形態において、本治療方法は、化学療法剤の投与からもたらされる聴覚障害の治療に、その耳毒性副作用を治療するために適用される。本発明の方法に適している耳毒性化学療法剤としては、シスプラチンまたはシスプラチン様化合物、タキソールまたはタキソール様化合物を含む抗腫瘍剤、および耳毒性物質に誘発される聴覚障害を引き起こすと考えられる他の化学療法剤、例えば、ビンクリスチン、血液学的悪性腫瘍および上皮性悪性腫瘍を治療するために使用される抗腫瘍薬が挙げられるが、これらに限定されない。シスプラチン様化合物には、とりわけ、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、テトラプラチン、オキサリプラチン、アロプラチン、およびトランスプラチンが含まれる。
【０３５９】
別の実施形態において、本方法は、通常マラリアの治療に使用されるキニーネおよびその合成代替物の投与からもたらされる聴覚障害に、その耳毒性副作用を治療するために適用される。
【０３６０】
別の実施形態において、本方法は、利尿薬の投与からもたらされる聴覚障害に、その耳毒性副作用を治療するために適用される。利尿薬、特に、「ループ」利尿薬、すなわち、ヘンレループに主として作用するものが、候補耳毒性物質である。本発明の方法に限定されない、例示的な例には、フロセミド、エタクリル酸、および水銀薬が含まれる。利尿薬は、一般的には、浮腫を予防または除去するために使用される。利尿薬はまた、非浮腫の状態、例えば、高血圧、高カルシウム血症、突発性高カルシウム尿症、および腎性尿崩症においても使用される。
【０３６１】
いくつかの実施形態において、併用療法が好ましい。併用療法は、それぞれが別々に製剤化され投与される２つ以上の薬剤（すなわち、２つ以上のｄｓＲＮＡ、または少なくとも１つのｄｓＲＮＡおよび少なくとも１つの別の治療剤）を投与することによって、または２つ以上の薬剤を単一の製剤で投与することによって達成される。他の組み合わせも、併用療法に包含される。例えば、２つの薬剤を一緒に製剤化し、第３の薬剤を含有する別の製剤と併せて投与することができる。併用療法において、２つ以上の薬剤は、同時に投与することができるが、必ずしもそうする必要はない。例えば、第１の薬剤（もしくは薬剤の組合わせ）の投与は、分、時間、日、または週の単位で第２の薬剤（もしくは薬剤の組合わせ）の投与に先行させることができる。したがって、２つ以上の薬剤は、互いに数分間以内、または互いに１時間もしくは数時間以内、または互いに１日もしくは数日間以内、または互いに数週間以内に、投与することができる。いくつかの場合においては、より長い間隔が可能である。併用療法で使用される２つ以上の薬剤は、患者の体内に同時に存在してもよく、または存在しなくてもよい。併用療法は、組み合わせて使用される薬剤のうちの１つ以上を２回以上投与することを含む。例えば、ｄｓＲＮＡ１およびｄｓＲＮＡ２（すなわち、ｄｓＲＮＡ１が遺伝子１を標的とし、ｄｓＲＮＡ２が遺伝子２を標的とする）を組み合わせて使用する場合、例えば、ｄｓＲＮＡ１−ｄｓＲＮＡ２、ｄｓＲＮＡ２−ｄｓＲＮＡ１、ｄｓＲＮＡ１−ｄｓＲＮＡ２−ｄｓＲＮＡ１、ｄｓＲＮＡ２−ｄｓＲＮＡ１−ｄｓＲＮＡ２、ｄｓＲＮＡ１−ｄｓＲＮＡ１−ｄｓＲＮＡ２、ｄｓＲＮＡ１−ｄｓＲＮＡ２−ｄｓＲＮＡ２等の順序で、１回以上、それらを任意の組み合わせで連続して投与してもよい。
聴覚再生
【０３６２】
感覚前駆細胞は、有毛細胞または支持細胞のいずれかとして成長し得る。アブレーション研究は、有毛細胞の除去が、周囲の細胞の運命を支持細胞から有毛細胞へと変化させることを示す。この反応は、有毛細胞が、隣接細胞を有毛細胞として成長しないようにする阻害シグナルを生成することを示唆する。この種の相互作用は、Ｎｏｔｃｈ媒介性側方抑制の作用と一致する。この仮説と一致して、Ｊａｇ２およびデルタ１（Ｄｌｌ１）の２つのＮｏｔｃｈリガンドは、Ａｔｏｈ１陽性細胞のサブセットにおいて急速に上方制御される。これらのリガンドの発現は、Ｎｏｔｃｈ１の活性化、ならびに支持細胞として成長するであろう細胞においてＨｅｓ１およびＨｅｓ５の２つのＮｏｔｃｈ経路標的遺伝子の転写亢進をもたらす。この経路中のいずれかの遺伝子の欠失は、有毛細胞の過剰産生をもたらし、これは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が、前駆細胞を有毛細胞の運命から転換する役割を担うことを示唆している。この転換の機構は、ケリカー器官中の細胞を用いて調査されている。第１に、Ａｔｏｈ１およびＨｅｓ１によるケリカー器官細胞の同時形質転換は、有毛細胞形成を阻害するのに十分であり、これは、Ａｔｏｈ１転写が耳においてＨＥＳ１の標的であることを示唆している。第２に、ケリカー器官細胞のパッチ内のＡＴＯＨ１の一時的活性化は、これらの細胞内のＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の活性化、ならびにこれらの細胞のサブセットにおけるＡＴＯＨ１および有毛細胞の運命の抑制をもたらす。
【０３６３】
有糸分裂再生は、出生後の哺乳動物の蝸牛において示されたことがない。しかしながら、最近の結果は、哺乳動物の内耳の細胞中のＭａｔｈ１（Ａｔｏｈ１）の強制発現が有毛細胞へのそれらの分化をもたらし得ることを示す。鳥類における再生とは異なり、この分化は、支持細胞の増殖を同時に起こすことなく生じると見られる。ヒトにおける有効な治療戦略は、新しい支持細胞ならびに新しい有毛細胞の生成を必要とする可能性があるため、哺乳動物の支持細胞が出生後の時点で分裂および分化する能力を試験することは重要である。Ｗｈｉｔｅらは、予め識別された、有糸分裂後、出生後の支持細胞が増殖し、続いて、有毛細胞への分化形質転換することができることを実証する。さらに、支持細胞がｐ２７Ｋｉｐ１を下方制御する能力の年齢によって異なる変化は、培養物およびインビボの両方における有毛細胞の消失に応答して支持細胞が増殖できないことの機構的説明を示唆する。
【０３６４】
細胞周期の出口および細胞分化の調整は、細胞および組織パターニングにおいて重要な役割を果たす。いくつかのシステムにおいて、Ａｔｏｈ１等のｂＨＬＨ遺伝子の活性は、早期分化を防ぐために活発に抑制されなければならない。この抑制において役割を果たす因子の１つのファミリーが、Ｉｄ（分化抑制因子）ファミリーである。これらは、一般的な二量体パートナー、Ｅ４７に対する競合を通してｂＨＬＨ活性を抑制するＨＬＨ分子である。有毛細胞の形成前に、３つのＩｄ遺伝子（Ｉｄ１、Ｉｄ２、およびＩｄ３）が、Ａｔｏｈ１発現ドメインを含む、蝸牛管床全体に広範に発現する。成長が継続するにつれて、Ｉｄ発現は、成長している有毛細胞において特異的に下方制御され、これは、Ｉｄ機能の消失がこれらの細胞におけるＡｔｏｈ１活性の抑制を軽減することを示唆している。この仮説と一致して、感覚前駆細胞におけるＩｄ３の長期発現は、有毛細胞の形成を抑制し、これは、Ｉｄファミリーの下方制御が有毛細胞の成長において重要なステップであることを示唆している。
【０３６５】
Ｚｉｎｅら（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００１  ２１（１３）：４７１２−２０）は、Ｈｅｓ１およびＨｅｓ５の活性が、それぞれ、前駆細胞のＩＨＣおよびＯＨＣの運命への遂行を、恐らくはＭａｔｈ１を拮抗することによって抑制するために重要であることを示す。この負の制御は、正しい数の有毛細胞が産生されるために、ならびに単列のＩＨＣおよび３列のＯＨＣの正常な蝸牛のモザイクの構築のために重要である。前庭系において、Ｈｅｓ１およびＨｅｓ５はまた、卵形嚢および球形嚢の上皮内の有毛細胞の分化の負の調節因子としての役割も果たす。蝸牛におけるＨｅｓ１およびＨｅｓ５の両方の同時下方制御が、消失した聴覚有毛細胞の置き換えを刺激するために用いられ得ることは可能である。そのような研究は、疾患、外傷、および加齢による聴覚有毛細胞の消失が、難聴（ｈｅａｒｉｎｇ  ｌｏｓｓ）および／または難聴（ｄｅａｆｎｅｓｓ）の一般的原因であるため、有意な治療的価値を有し得る。
【０３６６】
本明細書に開示される化合物が治療剤として有用なある特定の適応症の詳細は、本明細書に記載される。
【０３６７】
本発明は、例示的な様式で記載されており、使用される専門用語は、限定のためというよりもむしろ説明の言葉の性質であることを意図することが理解されよう。
【０３６８】
明らかに、多くの改変および変形が、上記の教示の観点から見て可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の範囲内で、本発明は、具体的に記載された方法とは別の方法で実施され得ることが理解されるべきである。
【０３６９】
本出願を通して、米国特許を含む種々の刊行物は、著者および年により参照され、特許は、番号により参照される。これらの刊行物、特許、および特許出願の開示は、本発明が関連する最先端技術をより完全に記載するために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３７０】
本発明は、実施例を参照して以下に詳細に例示されるが、それらに限定されると解釈されるべきではない。
【０３７１】
本明細書におけるいかなる文書の引用も、このような文書が関連する従来技術であることの承認であること、または本出願の任意の特許請求の範囲の特許性の問題とみなされることを意図するものではない。いかなる文書の内容または日付に関する任意の記述も、出願人が出願時に入手可能な情報に基づくものであり、このような記述の正確性の承認を構成するものではない。
実施例
【０３７２】
さらなる詳述なしに、当業者は、前述の説明を使用して、本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の好ましい特定の実施形態は単に説明として解釈され、請求の範囲に記載されている発明をどのような方法でも限定しない。
【０３７３】
当技術分野において公知であり、具体的に本明細書に記載されていない標準的な分子生物学プロトコルに関しては、概ね、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ（１９８９，１９９２）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８８）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）、およびＷａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ（ｅｄｓ）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌｓ．１−４  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）に記載されるもの、ならびに米国特許第４，６６６，８２８号、第４，６８３，２０２号、第４，８０１，５３１号、第５，１９２，６５９号、および第５，２７２，０５７号に記載の方法に本質的に従い、それらは参照により本明細書に組み込まれる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標準ＰＣＲプロトコル：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されるように行った。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）と組み合わせたインサイツＰＣＲは、特定のＤＮＡおよびｍＲＮＡ配列を含有する細胞の検出に使用することができる（Ｔｅｓｔｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １９９６，８７：３８２２）。ＲＴ−ＰＣＲを実施する方法は当技術分野で周知である。
実施例１：ｄｓＲＮＡ分子のインビトロ試験
【０３７４】
ウェル当たり約１．５〜２×１０５の被験細胞（ヒト遺伝子を標的にしたｓｉＲＮＡの場合、ＨｅＬａ細胞および／または２９３Ｔ細胞、ならびにラット／マウス遺伝子を標的にしたｓｉＲＮＡの場合、ＮＲＫ５２（正常ラット腎臓近位尿細管細胞）細胞および／またはＮＭｕＭＧ細胞（マウス乳房上皮細胞株））を、６ウェルプレートに播種した（７０〜８０％コンフルエント）。
【０３７５】
２４時間後、細胞に、５ｎＭまたは２０ｎＭの最終濃度でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｄｓＲＮＡ分子をトランスフェクトした。これらの細胞を、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７２時間インキュベートした。
【０３７６】
トランスフェクションの陽性対照として、ＰＴＥＮ−Ｃｙ３標識ｄｓＲＮＡ分子を使用した。ＧＦＰ  ｄｓＲＮＡ分子を、ｓｉＲＮＡ活性の陰性対照として使用した。
【０３７７】
トランスフェクションの７２時間後、細胞を採取し、細胞からＲＮＡを抽出した。トランスフェクション効率を蛍光顕微鏡検査で試験した。
【０３７８】
特定の好ましいｓｉＲＮＡ構造を用いた遺伝子発現の阻害パーセントを、内在性遺伝子を発現する細胞中の標的遺伝子のｑＰＣＲ解析を用いて判定した。
体液／細胞安定性アッセイ
【０３７９】
本明細書に開示される修飾化合物を、ヒト、ラット、もしくはマウス血漿、またはヒト、ラット、もしくはマウス血清（モデル系で試験するため）、またはＣＳＦ（脳脊髄液；ヒト、マウス、もしくはラット）、またはヒト細胞抽出物における二重鎖の安定性について、以下のように試験する。
例えば、最終濃度７ｕＭのｄｓＲＮＡ分子を、１００％のヒト血清（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ４５２２）中、３７℃でインキュベートする。（ｓｉＲＮＡ原液１００ｕＭを、ヒト血清または種々の組織型からのヒト組織抽出物に１：１４．２９で希釈）。５ｕＬを、異なる時点（例えば、０、３０分、１時間、３時間、６時間、８時間、１０時間、１６時間、および２４時間）で、１５ｕＬの１．５×ＴＢＥローディング緩衝液に添加する。試料を、液体窒素中で直ちに凍結させ、−２０℃に維持する。
【０３８０】
各試料を、当技術分野において既知の方法に従って調製した非変性２０％アクリルアミドゲルに加える。オリゴを、紫外線下、エチジウムブロマイドで視覚化する。
エクソヌクレアーゼ安定性アッセイ
【０３８１】
核酸分子に対する３’非ヌクレオチド部分の安定化効果を調査するために、センス鎖、アンチセンス鎖、およびアニーリングしたｄｓＲＮＡ二重鎖を、異なる細胞型から調製した細胞質抽出物中でインキュベートする。
【０３８２】
抽出物：ＨＣＴ１１６細胞質抽出物（１２ｍｇ／ｍＬ）。
【０３８３】
抽出緩衝液：２５ｍＭのＨｅｐｅｓ  ３７℃でｐＨ−７．３、８ｍＭのＭｇＣｌ、１ｍＭのＤＴＴを含む１５０ｍＭのＮａＣｌを、使用直前に新たに添加した。
【０３８４】
方法：３．５ｍＬの試験ｄｓＲＮＡ（１００ｍＭ）を、１２０ｍｇのＨＣＴ１１６細胞質抽出物を含む４６．５ｍＬと混合した。この４６．５ｍＬは、１２ｍＬのＨＣＴ１１６抽出物と、ＤＴＴおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル／１００（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ｓｅｔＩＩＩ−５３９１３４）を添加した３４．５ｍＬの抽出緩衝液とからなる。インキュベーションチューブ中のｓｉＲＮＡの最終濃度は７ｍＭである。試料を、３７℃でインキュベートし、指示された時点で、５ｍＬを新たなチューブに移し、１５ｍＬの１ＸＴＢＥ−５０％グリセロールローディング緩衝液と混合し、液体窒素中で急速凍結する。ローディング緩衝液中のｓｉＲＮＡの最終濃度は１．７５ｍＭ（２１ｎｇ  ｓｉＲＮＡ／ｍＬ）である。天然ＰＡＧＥおよびＥｔＢｒ染色による分析については、レーン当たり５０ｎｇを加える。ノーザン分析については、レーン当たり１ｎｇの試験ｓｉＲＮＡを加える。
【０３８５】
図７Ａ、７Ｂ、８Ａ、８Ｂ、９Ａ、１０Ａ、および１０Ｂは、本明細書に開示されるｄｓＲＮＡの血漿およびまたは細胞抽出物の安定性を示す。
ｄｓＲＮＡ分子に対する先天的免疫応答：
【０３８６】
新鮮なヒト血液（室温で）を、室温で滅菌０．９％  ＮａＣｌと１：１の比率で混合し、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ，Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄカタログ番号１１１４５４７）に徐々に加える（比率１：２）。スイング式遠心分離機で試料を室温で３０分間遠心分離し（２２ＯＣ  、８００ｇ）、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、１０分間遠心分離する（室温、２５０ｇ）。細胞を計数し、最終濃度１．５×１０６細胞／ｍＬで成長培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳ＋２ｍＭのＬ−グルタミン＋１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）に播種し、ｄｓＲＮＡ処理の前に３７℃で１時間インキュベートする。製造業者の指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、細胞を異なる濃度の試験ｄｓＲＮＡに暴露し、５％  ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間インキュベートする。
【０３８７】
ＩＦＮ応答に対する陽性対照として、細胞を最終濃度０．２５〜５．０μｇ／ｍＬのＴＬＲ３リガンドである二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の合成類似体のポリ（Ｉ：Ｃ）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ  カタログ番号ｔｌｒｌ−ｐｉｃ）、または最終濃度０．０７５〜２μｇ／ｍＬのＴＬＲ７／８リガンドであるチアゾロキノロン（ＣＬＯ７５）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ  カタログ番号ｔｌｒｌ−ｃ７５）のいずれかで処理する。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００試薬で処理した細胞を、ＩＦＮ応答に対する陰性（参照）対照として使用する。
【０３８８】
インキュベーションの約２４時間後に、細胞を回収し、上清を新しい試験管に移す。試料を液体窒素中で直ちに凍結し、製造業者の指示に従って、ＩＬ−６、ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＤＹ２０６０）およびＴＮＦ−α、ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＤＹ２１０）を用いて、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αサイトカインの分泌を試験した。ＲＮＡを細胞ペレットから抽出し、ヒト遺伝子ＩＦＩＴ１（テトラトリコペプチド反復配列１を含むインターフェロン誘導タンパク質）およびＭＸ１（ミクソウイルス（インフルエンザウイルス）耐性１、インターフェロン誘導性タンパク質ｐ７８）のｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲによって測定した。測定したｍＲＮＡの量を、参照遺伝子ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（サイクロフィリンＡ；ＣｙｃｌｏＡ）のｍＲＮＡの量に対して正規化する。ＩＦＮシグナル伝達の誘導は、処理細胞からのＩＦＩＴ１遺伝子およびＭＸ１遺伝子からのｍＲＮＡの量を未処理細胞における量と比較することによって評価する。ｑＰＣＲの結果は、ＱＣ基準に合格したもの、すなわち標準曲線の傾きの値が間隔［−４，−３］であり、Ｒ２>０．９９であり、プライマーダイマーが存在しなかったものである。ＱＣ要件に合格しなかった結果は、分析に不適格とする。
【０３８９】
一般的に、インビトロ試験のために選択された特定の配列を有するｄｓＲＮＡは、ヒト、およびラットまたはウサギ遺伝子等の第２の種に対して特異的であった。ヒト（Ｈｕ）、マウス（Ｍｓ）、ラット（Ｒｔ）、チンチラ（Ｃｈｎ）およびまたはモルモット（ＧＰ）標的遺伝子に対する活性についてｄｓＲＮＡが試験された。例えば、チンチラにおける活性は、チンチラ標的遺伝子（すなわち、ＣＤＫＮ１Ｂ）をクローニングし、２９３またはＨｅＬａ細胞系で発現させることによって試験された。これらのＲＮＡ配列を有し、本明細書に記載されるように修飾されたｓｉＲＮＡを用いて、同様の結果が得られる。
【０３９０】
以下の表Ｂは、ｄｓＲＮＡ核酸の修飾パターンを示し、種々の修飾を有する核酸分子のいくつかに対して得られたインビトロ結果を要約する。実験において使用されたｓｉＲＮＡは全て、１９量体である。表Ｂ中のインビトロ活性は、対照に対する標的ｍＲＮＡの残存％として示される。＿Ｓ５００  ｄｓＲＮＡ分子は、次の修飾を有する：交互の２’−Ｏ−メチル（Ｍｅ）糖修飾リボヌクレオチドは、アンチセンス鎖の１位、３位、５位、７位、９位、１１位、１３位、１５位、１７位、および１９位に存在し、それによって、全く同じ修飾、すなわち、２’−Ｏ−Ｍｅ糖修飾リボヌクレオチドが、センス鎖の２位、４位、６位、８位、１０位、１２位、１４位、１６位、および１８位に存在する。
【０３９１】
＿Ｓ１２９および＿ｓ５０５  ｄｓＲＮＡ分子は、次の修飾：１位、３位、５位、７位、９位、１１位、１３位、１５位、１７位、１９位（＿Ｓ１２９）または２位、４位、６位、８位、１１位、１３位、１５位、１７位、１９位（＿Ｓ５０５）に２’−Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチドを有し、センス鎖は、次の修飾：１８位にＬ−ＤＮＡヌクレオチド、１５位（＿Ｓ２１５）にＤＮＡヌクレオチド、および５’末端に任意に逆位脱塩基ヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、またはＣ６−リン酸アミンを有する。
表Ｂ
【表１７】
2014528704.tif 000019
2014528704.tif 000020
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【０３９２】
以下の表Ｃは、本明細書に開示されるｄｓＲＮＡ分子を調製する際に用いられた修飾リボヌクレオチド／非従来的部分の凡例を提供する。
表Ｃ  凡例
【表１８】
2014528704.tif 000029
【０３９３】
表Ｄ  ＡＳ−ＣＭ（アンチセンス完全マッチ）配列におけるｐｓｉＣＨＥＣＫシステムを用いたＨｅＬａ細胞中の活性（ｍＲＮＡの残存％）
【表１９】
2014528704.tif 000030
2014528704.tif 000031
【０３９４】
表Ｅ  ｑＰＣＲによるラットＲＥＦ５２細胞における活性（ｍＲＮＡの残存％）
結果は、残存（％対照）ラットＨＥＳ１遺伝子である。
【表２０】
2014528704.tif 000032
【０３９５】
表Ｆ  ｑＰＣＲによるモルモットＨＥＳ１遺伝子を外来的に発現するラットＲａｔ−１細胞における活性（ｍＲＮＡの残存％）
【表２１】
2014528704.tif 000033
【０３９６】
表Ｇ  活性（ｍＲＮＡの残存％）：ｓｉＣＤＫＮ１Ｂ＿４アンチセンス完全マッチｐｓｉＣＨＥＣＫ
【表２２】
2014528704.tif 000034
【０３９７】
表Ｈ  センス鎖のオフターゲットノックダウン可能性を示すｓｉＣＤＫＮ１Ｂ＿４センス完全マッチｐｓｉＣＨＥＣＫ
【表２３】
2014528704.tif 000035
【０３９８】
ＣＤＫＮ１Ｂ＿４＿Ｓ２０１８、ＣＤＫＮ１Ｂ＿４＿Ｓ２０７５、およびＣＤＫＮ１Ｂ＿４＿Ｓ２０７６は、アンチセンス鎖およびセンス鎖の配列番号（２６８９５および２６８８８）に対して、アンチセンス鎖およびセンス鎖修飾（アンチセンス鎖は、１位、１３位、および１７位に２’ＯＭｅ  糖修飾リボヌクレオチド、７位に２’５’リボヌクレオチド、および３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖は、２位、６位、１５位、１８位に２’ＯＭｅ  糖修飾リボヌクレオチドおよび３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ部分を含む）に対して同一であり、ＣＤＫＮ１Ｂ＿４＿Ｓ２０１８がそのセンス鎖上に５’キャッピング部分を有さず、一方、ＣＤＫＮ１Ｂ＿４＿Ｓ２０７５およびＣＤＫＮ１Ｂ＿４＿Ｓ２０７６がそのセンス鎖上にそれぞれ、逆位デオキシ脱塩基キャッピング部分およびアミノＣ６キャッピング部分を有する点では異なる。３つ全てに対する活性は同様である（表Ｇ）であるが、ＣＤＫＮ１Ｂ＿４＿Ｓ２０７５およびＣＤＫＮ１Ｂ＿４＿Ｓ２０７６に対するオフターゲットノックダウンの可能性は、ＣＤＫＮ１Ｂ＿４＿Ｓ２０１８に対するものよりも少ない。ＣＤＫＮ１Ｂ＿４ＣＤＫＮ１Ｂ＿４＿Ｓ２０７５およびＣＤＫＮ１Ｂ＿４＿Ｓ２０７６の血漿安定性を図９Ａに示す。ノックダウン活性を図９Ｂに示す。
実施例２：標的遺伝子に対する活性ｄｓＲＮＡ分子に対する配列の生成およびｓｉＲＮＡの産生
【０３９９】
独自のアルゴリズムおよび本明細書に開示される標的遺伝子のｍＲＮＡの既知配列を使用し、多くの潜在的なｄｓＲＮＡの配列、すなわち、ｓｉＲＮＡが生成された。重要な配列表を以下に記載する。
配列番号２３〜２６、９１２は、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＮＯＴＣＨ１の遺伝子の発現を下方制御するのに有用なｄｓＲＮＡを生成するためのセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を記載する。各センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、５’から３’の方向に示される。
具体的には、配列番号２３〜３８１は、ヒト１９量体のオリゴヌクレオチドを提供し、配列番号３８２〜６９３は、最良の１９量体のヒト異種間オリゴヌクレオチドを提供し、配列番号６９４〜１３６７は、ヒト１８量体のオリゴヌクレオチドを提供し、配列番号１６〜１４９５は、ＨＥＳ１発現を下方制御するためのｄｓＲＮＡを生成するのに有用な最良の１８量体のヒト異種間オリゴヌクレオチドを提供し、表Ｉは、ＨＥＳ１発現を下方制御するためのｄｓＲＮＡを生成するのに有用な配列番号２６，６６７〜２６，６９０に示される構造Ａ１に基づいた、および配列番号２６，６９１〜２６，７０６に示される構造Ａ２に基づいた、ある特定の好ましい１９量体のオリゴヌクレオチドを含む。
【０４００】
配列番号１４９６〜１７５９は、ヒト１９量体のオリゴヌクレオチドを提供し、配列番号１７６０〜２０２９は、最良の１９量体のヒト異種間オリゴヌクレオチドを提供し、配列番号２０３０〜２５７５は、ヒト１８量体のオリゴヌクレオチドを提供し、配列番号２５７６〜２７０３は、ＨＥＳ５発現を下方制御するためのｄｓＲＮＡを生成するのに有用な最良の１８量体のヒト異種間オリゴヌクレオチドを提供し、表ＩＩは、ＨＥＳ５発現を下方制御するためのｄｓＲＮＡを生成するのに有用な配列番号２６，７０７〜２６，７２４に示される構造Ａ１に基づいた、および配列番号２６，７２５〜２６，７３２に示される構造Ａ２に基づいた、ある特定の好ましい１９量体のオリゴヌクレオチドを含む。
【０４０１】
配列番号１０５３４〜１１２６７は、ヒト１９量体のオリゴヌクレオチドを提供し、配列番号１１２６８〜１１５４９は、最良の１９量体のヒト異種間オリゴヌクレオチドを提供し、配列番号１１５５０〜１２９０３は、ヒト１８量体のオリゴヌクレオチドを提供し、配列番号１２９０４〜１３００３は、ＨＥＹ１発現を下方制御するためのｄｓＲＮＡを生成するのに有用な最良の１８量体のヒト異種間オリゴヌクレオチドを提供し、表ＩＩＩは、ＨＥＹ１発現を下方制御するためのｄｓＲＮＡを生成するのに有用な配列番号２６，７３３〜２６，７６０に示される構造Ａ１に基づいた、および配列番号２６，７６１〜２６，７７８に示される構造Ａ２に基づいた、ある特定の好ましい１９量体のオリゴヌクレオチドを含む。
【０４０２】
配列番号１３００４〜１４０７７は、ヒト１９−量体のオリゴヌクレオチドを提供し、配列番号１４０７８〜１４８０１は、最良の１９量体のヒト異種間オリゴヌクレオチドを提供し、配列番号１４８０２〜１６３８９は、最良のヒト１８量体のオリゴヌクレオチドを提供し、配列番号１６３９０〜１６６２１は、ＨＥＹ２発現を下方制御するためのｄｓＲＮＡを生成するのに有用な最良の１８量体のヒト異種間オリゴヌクレオチドを提供し、表ＩＶは、ＨＥＹ２発現を下方制御するためのｄｓＲＮＡを生成するのに有用な配列番号２６，７７９〜２６，７８４に示される構造Ａ１に基づいた、および配列番号２６，７８５〜２６，７８８に示される構造Ａ２に基づいた、ある特定の好ましい１９量体のオリゴヌクレオチドを含む。
【０４０３】
配列番号２７０４〜２９４１は、ヒト１９量体のオリゴヌクレオチドを提供し、配列番号２９４２〜３０２５は、最良の１９量体のヒト異種間オリゴヌクレオチドを提供し、配列番号３０２６〜３５７５は、ヒト１８量体のオリゴヌクレオチドを提供し、配列番号３５７６〜３６３３は、ＩＤ１発現を下方制御するためのｄｓＲＮＡを生成するのに有用な最良の１８量体のヒト異種間オリゴヌクレオチドを提供し、表Ｖは、ＩＤ１発現を下方制御するためのｄｓＲＮＡを生成するのに有用な配列番号２６，７８９〜２６，８０８に示される構造Ａ１に基づいた、および配列番号２６，８０９〜２６，８１６に示される構造Ａ２に基づいた、ある特定の好ましい１９量体のオリゴヌクレオチドを含む。
【０４０４】
配列番号３６３４〜４１０７は、ヒト１９量体のオリゴヌクレオチドを提供し、配列番号４１０８〜５０５３は、最良のヒト異種間オリゴヌクレオチドを提供し、配列番号５０５４〜５７５１は、ヒト１８量体のオリゴヌクレオチドを提供し、配列番号５７５２〜６２０５は、ＩＤ２発現を下方制御するためのｄｓＲＮＡを生成するのに有用な最良の１８量体のヒト異種間オリゴヌクレオチドを提供し、表ＶＩは、ＩＤ２発現を下方制御するためのｄｓＲＮＡを生成するのに有用な配列番号２６，８１７〜２６，８２４０に示される構造Ａ１に基づいた、および配列番号２６，８２５１〜２６，８３２に示される構造Ａ２に基づいた、ある特定の好ましい１９量体のオリゴヌクレオチドを含む。
【０４０５】
配列番号６２０６〜６５３１は、ヒト１９量体のオリゴヌクレオチドを提供し、配列番号６５３２〜６６７１は、最良のヒト異種間オリゴヌクレオチドを提供し、配列番号６６７２〜７３５３は、ヒト１８量体のオリゴヌクレオチドを提供し、配列番号７３５４〜７４４３は、ＩＤ３発現を下方制御するためのｄｓＲＮＡを生成するのに有用な最良の１８量体のヒト異種間オリゴヌクレオチドを提供し、表ＶＩＩは、ＩＤ３発現を下方制御するためのｄｓＲＮＡを生成するのに有用な配列番号２６，８３３〜２６，８５０に示される構造Ａ１に基づいた、および配列番号２６，８５１〜２６，８６６に示される構造Ａ２に基づいた、ある特定の好ましい１９量体のオリゴヌクレオチドを含む。
【０４０６】
配列番号７４４４〜８１８５は、ヒト１９量体のオリゴヌクレオチドを提供し、配列番号８１８６〜９００７は、最良のヒト異種間オリゴヌクレオチドを提供し、配列番号９００８〜１０２３３は、ヒト１８量体のオリゴヌクレオチドを提供し、配列番号１０２３４〜１０５３３は、ＣＤＫＮ１Ｂ発現を下方制御するためのｄｓＲＮＡを生成するのに有用な最良の１８量体のヒト異種間オリゴヌクレオチドを提供し、表ＶＩＩＩは、ＣＤＫＮ１Ｂ発現を下方制御するためのｄｓＲＮＡを生成するのに有用な配列番号２６，８６７〜２６，８８６に示される構造Ａ１に基づいた、および配列番号２６，８８７〜２６，９００に示される構造Ａ２に基づいた、ある特定の好ましい１９量体のオリゴヌクレオチドを含む。
【０４０７】
配列番号１６６２２〜１８４６９は、ヒト１９量体のオリゴヌクレオチドを提供し、配列番号１８４７０〜１８６４３は、最良のヒト異種間オリゴヌクレオチドを提供し、配列番号１８６４４〜２６２１１は、ヒト１８量体のオリゴヌクレオチドを提供し、配列番号２６２１２〜２６６６６は、ＮＯＴＣＨ１発現を下方制御するためのｄｓＲＮＡを生成するのに有用な最良の１８量体のヒト異種間オリゴヌクレオチドを提供し、表ＩＸは、ＮＯＴＣＨ１発現を下方制御するためのｄｓＲＮＡを生成するのに有用な配列番号２６，９０１〜２６，９１０に示される構造Ａ１に基づいた、および配列番号２６，９１１〜２６，９１２に示される構造Ａ２に基づいた、ある特定の好ましい１９量体のオリゴヌクレオチドを含む。
【０４０８】
オリゴヌクレオチド配列に、独自のアルゴリズムにおけるそれらのスコアに基づいて、ヒト遺伝子発現を標的とするための最良の予測された配列として優先順位を付けた。
【０４０９】
「１８＋１」は、１９ヌクレオチドの長さである分子を指し、構造Ａ２に従って、アンチセンス鎖の１位に標的ｍＲＮＡに対するミスマッチを含む。好ましい実施形態において、センス鎖は、アンチセンス鎖と完全に相補的である。いくつかの実施形態において、センス鎖は、１、２、または３位において、アンチセンス鎖に対してミスマッチである。
実施例３：二本鎖ＲＮＡ分子のオンターゲットおよびオフターゲット試験：
【０４１０】
ｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭシステムは、ガイド鎖（ＧＳ）（アンチセンス）およびパッセンジャー鎖（ＰＳ）（センス鎖）が、標的化（オンターゲット）およびオフターゲット効果を引き起こすかを、その標的配列の発現レベルの変化をモニターすることによって評価することができる。各試験分子ＧＳおよびＰＳ鎖の標的活性と、潜在的なオフターゲット活性の評価のために、４個のｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）２に基づく（Ｐｒｏｍｅｇａ）構築物を調製した。各構築物において、試験分子ＰＳまたはＧＳの完全な標的配列またはシード標的配列のいずれかの１コピーまたは３コピーを、３’−ＵＴＲ領域のウミシイタケルシフェラーゼの翻訳停止コドンの下流に位置するマルチクローニングサイトにクローニングした。得られたベクターは、以下のように命名した。
完全な標的配列（試験分子のＧＳの全１９塩基配列と完全に相補的なヌクレオチド配列）を１コピー含む、ＧＳ−ＣＭ（ガイド鎖、完全マッチ）ベクター、
完全な標的配列（試験分子のＰＳの全１９塩基配列と完全に相補的なヌクレオチド配列）を１コピー含む、ＰＳ−ＣＭ（パッセンジャー鎖、完全マッチ）ベクター、
シード領域標的配列（試験分子のＧＳのヌクレオチド１〜８に相補的な配列）を１コピーまたは３コピー含む、ＧＳ−ＳＭ（ガイド鎖、シードマッチ）ベクター、
シード領域標的配列（試験分子のＰＳのヌクレオチド１〜８に相補的な配列）を１コピー含む、ＰＳ−ＳＭ（パッセンジャー鎖、シードマッチ）ベクター。
【０４１１】
命名法：
ガイド鎖：ＲＩＳＣ複合体に侵入し、相補的なＲＮＡ配列の開裂／サイレンシングをガイドするｓｉＲＮＡの鎖。
シード配列：ガイド鎖の５’末端からのヌクレオチド２〜８。
ｃｍ（完全マッチ）：ｓｉＲＮＡのガイド鎖と完全に相補的なＤＮＡフラグメント。このＤＮＡフラグメントは、レポーター遺伝子の３’ＵＴＲにクローニングされ、直接的なＲＮＡサイレンシングの標的として用いられる。
ｓｕｍ（シードマッチ）：ｓｉＲＮＡのガイド鎖のｎｓ２〜８と完全に相補的なヌクレオチドｎｓ１２〜１８を有する１９量体のＤＮＡフラグメント。このＤＮＡフラグメントは、レポーター遺伝子の３’ＵＴＲにクローニングされ、「オフターゲット」サイレンシングの標的として用いられる。
Ｘ１：レポーター遺伝子の３’ＵＴＲにクローニングされた、ｃｍまたはｓｕｍの単一のコピー。
Ｘ３  レポーター遺伝子の３’ＵＴＲにクローニングされた、ｃｍまたはｓｕｍの３個のコピーであり、４個のヌクレオチドで互いに分離される。
実施例４：チンチラの蝸牛におけるカルボプラチンに誘発される有毛細胞死に対する標的遺伝子ｄｓＲＮＡ処置の効果
【０４１２】
８匹のチンチラは、各動物の左耳に、生理食塩水中でＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１のｓｉＲＮＡ（表２Ａ〜１０Ｄ中に開示される化合物）を直接投与することによって前処置する。生理食塩水を、プラセボとして各動物の右耳に投与する。ｓｉＲＮＡの投与の２日後、動物を、カルボプラチン（７５ｍｇ／ｋｇ  腹腔内）で処置する。チンチラの殺処分後（カルボプラチン処置の２週間後）、左耳（ｓｉＲＮＡで処置）および右耳（生理食塩水で処置）の、内有毛細胞（ＩＲＣ）および外有毛細胞（ＯＮＣ）の死細胞％を計算する。ｓｉＲＮＡの効果は用量を通して同様であるため、データは、３つの用量からプールされる。前に示されたように、カルボプラチンは、７５ｍｇ／ｋｇの用量でチンチラの内有毛細胞を選択的に損傷するが、一方、外有毛細胞は無傷にとどまる。本明細書に提供されるｄｓＲＮＡ化合物は、蝸牛において耳毒性物質に誘発される（例えば、カルボプラチンに誘発される）内有毛細胞消失を減少させる。
実施例５：チンチラの蝸牛における音響に誘発される有毛細胞死に対するｄｓＲＮＡ処置の効果
【０４１３】
音響性外傷モデルにおける本発明のｄｓＲＮＡ分子の活性を、チンチラにおいて研究する。７匹の動物の一群を、２．５時間１０５ｄＢで、４ｋＨｚを中心とした騒音のオクターブ帯域に暴露することによって音響性外傷を施す。騒音に暴露させたチンチラの左耳を、約１０μＬの生理食塩水中の約３０μｇのｓｉＲＮＡで前処置（音響性外傷の４８時間前）し、右耳をビヒクル（生理食塩水）で前処置する。複合活動電位（ＣＡＰ）は、蝸牛から伝達される神経活動を測定するための便利かつ信頼性のある電気生理学的方法である。クリック音またはトーンバースト等の音刺激が突然作動するときに生成される局所電場電位を検出するために、電極を蝸牛の基底付近に設置することによって、ＣＡＰを記録する。音響性外傷の約２．５週間後、それぞれの耳の機能状態を評価する。具体的に、ｄｓＲＮＡで処置された耳の閾値が、非処置（生理食塩水）耳よりも低い（良い）かどうかを判定するために、正円窓から記録された複合活動電位の平均閾値を、音響性外傷の２．５週間後に測定する。さらに、内および外有毛細胞消失量を、ｓｉＲＮＡで処置された耳および対照耳において測定する。これらの結果は、本明細書に提供されるｄｓＲＮＡが蝸牛の音響性外傷誘発性ＯＮＣ消失を減少させることができることを示す。
実施例６：ラットの蝸牛におけるシスプラチン誘発性有毛細胞死に対するｄｓＲＮＡ処置の効果
【０４１４】
雄のウィスターラットを、シスプラチン処置前に、クリック音、８、１６、および３２ｋＨｚのシグナルに対する基底聴性脳幹反応（ＡＢＲ）の閾値について試験する。基底聴性脳幹反応試験後、シスプラチンを、３０分間にわたり、１２ｍｇ／ｋｇの腹腔内注入により投与する。処置した耳に、ＰＢＳ中の１ｕｇ／４マイクロリットルのいずれかの本明細書に開示されるｄｓＲＮＡを受容させる（正円窓膜に直接適用）。対照耳は、無関係のＧＦＰ  ｄｓＲＮＡまたはＰＢＳのいずれかで処置する。ｄｓＲＮＡ分子は、蝸牛に対する保護効果を可能にするために、シスプラチン投与前の３〜５日間投与する。
【０４１５】
聴性脳幹反応（ＡＢＲ）試験を、シスプラチン投与の３日後に繰り返す。聴性脳幹反応の閾値を、処置前と処置後の間で比較し、その閾値の変化を測定する。シスプラチン処置後の閾値の変化が大きいほど、蝸牛における有毛細胞消失の重症度がより大きいことを示す。聴性脳幹反応試験を繰り返した後、動物を殺処分し、蝸牛を摘出し、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）により鉤状領域（高周波領域）における外有毛細胞（ＯＮＣ）消失を定量化するために処理する。外有毛細胞消失％は、消失したかまたは重度の損傷を受けた細胞の数を写真空間内の外有毛細胞の総数で除すことによって計算する。これらの結果は、本明細書に開示されるｄｓＲＮＡ化合物を、耳毒性物質（例えば、シスプラチン）投与前に投与した場合、蝸牛に対して保護効果を提供することを示す。
実施例７：さらなる難聴モデル
Ａ）モルモットにおける聴覚再生（可塑性）モデル
【０４１６】
カナマイシン（４５０〜５００ｍｇ／ｋｇ）の単回皮内注射、続いて、エタクリン酸（ＥＡ）の単一の静脈内（頸部）注射によって、アルビノモルモットを全身的に処置することによって難聴を誘発する。この薬理学的な難聴誘発により、おおよそ１〜２日後には両側の全ての有毛細胞を排除し、支持細胞を分化させたままにする。治療核酸を、経鼓膜注射（ＴＴ）で中耳に、または点耳法（ＥｒＤ）で外耳道もしくは鼓膜に適用する。
ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１を標的とするｄｓＲＮＡを、上記に記載のように適用する。
【０４１７】
ｄｓＲＮＡの有効性を以下の通りに試験する。
１）蝸牛を、ミオシンＶＩＩａ（有毛細胞マーカー）およびファロイジンに対して染色された全載として、形態学的に分析する。
２）ＢｒｄＵの組み込みを、有毛細胞の増殖速度の指標として測定する。
Ｂ）モルモットにおける騒音誘発性急性難聴モデル
【０４１８】
騒音は、一過性または恒久的な感音性難聴（ＳＮＨＬ）および耳鳴を伴う聴覚損傷を引き起こし得る。ＳＮＨＬおよび耳鳴は、単独で発生し得るか、または併発し得る。ヒトにおいて、騒音誘発性難聴（ＮＩＨＬ）は、純音オージオグラム、動員、閾値上聴力検査の病理学的結果、および耳音響放射の振幅の減少における閾値の変化によって示される。聴覚損傷は、連続騒音または衝撃騒音への暴露によって誘発される。さらに、衝撃騒音外傷または爆傷の可能性を、考慮に入れるべきである。衝撃騒音への暴露は、連続騒音への暴露よりも、より重度の内耳の病変をもたらし得る。騒音損傷の発症に対する重要な基準は、音圧レベル（ＳＰＬ）、速度増加レベル、暴露時間、ならびに個々の感受性（「脆弱な内耳」）である。騒音暴露は、通常、ある程度は後に解決され得る閾値の上昇をもたらし、その結果、この一時的な要素は「一時的閾値変動」（ＴＴＳ）と称される。ＴＴＳ後の回復段階において完全な原状回復がない場合、これは、恒久的な内耳損傷（恒久的閾値変動＝ＰＴＳ）をもたらす恐れがある。非常に高い音響強度は、即時の細胞死および内耳およびＰＴＳにおける構造の機械的破壊を引き起こし得る。
【０４１９】
このモデルにおいて、両側性病変を、騒音暴露に誘発し、モルモットを、１１７ｄＢのＳＰＬ広帯域騒音に６時間暴露させる。
【０４２０】
このモデルによる予備的研究において、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１を標的とするｄｓＲＮＡを、同様の結果を有するこのモデルで使用する。
実施例８：聴覚障害のある動物の支持細胞中のｄｓＲＮＡ
【０４２１】
実験デザインは、本質的には図１に示される通りであった。アミノグリコシド、ストレプトマイシンを用いて、マウスにおける内耳有毛細胞消失を誘発した。ストレプトマイシン（２００ｍｇ／ｍｌ）を後半規管（ＰＳＣ）に注射し、７日後、ＨＥＳ５に対するｄｓＲＮＡ（２ｕｇ／ｕｇ）をＰＳＣに注射した。内耳有毛細胞再生を、ｄｓＲＮＡ注射の２週間後に評価した。
【０４２２】
ｄｓＲＮＡがＣｙ３標識ｄｓＲＮＡをＰＳＣに適用することによってＰＳＣ中の標的細胞に送達され得ることを示すために、予備的実験が行われた。ｄｓＲＮＡは、ＰＳＣへの局部注射時に、正常の前庭感覚上皮に送達される。（図は示されない）。より重要なことには、ｄｓＲＮＡは、ＰＳＣへの局部注射時に、ＡＧ損傷した前庭感覚上皮に送達される（図２Ａ〜２Ｂ）。
【０４２３】
図３Ａ〜３Ｂは、ＨＥＳ５に対するｄｓＲＮＡでの処置が、ＡＧ損傷した前庭上皮における有毛細胞の量を増加させることを示す。
【０４２４】
図４は、ＨＥＳ５に対するｄｓＲＮＡでの処置が、有毛細胞再生を促進することを示す。ｙ軸は、有毛細胞の数を示す。カラムは、次の通りに標識される：ＡＳＣＣ−前半規管、ＬＳＣＣ−側半規管、ＰＳＣＣ−後半規管。
ＨＥＳ５に対するｄｓＲＮＡでの処置は、二重の抗Ａｔｏｈ１および抗ミオシンＶＩＩａ染色を用いて識別されるように、前庭有毛細胞（Ａｔｏｈ１−陽性）の量を増加させる（図５）。図６は、ＨＥＳ５に対するｄｓＲＮＡでの処置が、ＨＥＳ５を下方制御し、Ａｔｏｈ１発現を上方制御することを示す。
結論
【０４２５】
１．後半規管造瘻術を通して得られたｓｉＲＮＡは、正常マウスおよびＡＧ損傷したマウスの前庭における前庭感覚上皮に影響を及ぼし得る。
２．ＡＧ損傷の３週間後、前庭有毛細胞再生は、Ｈｅｓ５  ｓｉＲＮＡの投与によって促進された。
使用されたＨｅｓ５  ｄｓＲＮＡの配列は以下の通りであった。
センス鎖：ＧＧＧＵＵＣＵＡＵＧＡＵＡＵＵＵＧＵＡ（配列番号２６７２８）、構造：ｒＧ；ｍＧ；ｒＧ；ｍＵ；ｒＵ；ｍＣ；ｒＵ；ｍＡ；ｒＵ；ｍＧ；ｒＡ；ｍＵ；ｒＡ；ｍＵ；ｒＵ；ｍＵ；ｒＧ；ｍＵ；ｒＡ
アンチセンス鎖：ＵＡＣＡＡＡＵＡＵＣＡＵＡＧＡＡＣＣＣ（配列番号２６７３２）、構造：ｍＵ；ｒＡ；ｍＣ；ｒＡ；ｍＡ；ｒＡ；ｍＵ；ｒＡ；ｍＵ；ｒＣ；ｍＡ；ｒＵ；ｍＡ；ｒＧ；ｍＡ；ｒＡ；ｍＣ；ｒＣ；ｍＣ
３．ＡＧ損傷の２週間後、Ａｔｏｈ１の陽性細胞数は、Ｈｅｓ５  ｄｓＲＮＡで処置したマウスにおいて、より高い。
４．Ｈｅｓ５  ｍＲＮＡの発現は、ｓｉＲＮＡ処置群において、さらに下方制御された。
５．Ａｔｏｈ１  ｍＲＮＡの発現は、ｓｉＲＮＡ処置群において、さらに上方制御された。
実施例９：騒音によって誘発される内耳の耳感覚細胞死に対する標的遺伝子ｓｉＲＮＡ処置の効果
モデルシステム：２時間１３０ｄＢのＳＰＬで、６ｋＨｚを中心とした１オクターブ帯域の騒音へのモルモットの暴露（Ｆｕｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ  １９：２７７−２８１，２００８）
実験群
【０４２６】
正常なプライエルの反射を伴う成熟ハートリーアルビノモルモット（３月齢）を騒音に暴露し、以下の群にランダム化する。処置なしの騒音対照群（ｎ＝６）、ビヒクルによる騒音対照動物（ｎ＝６）、１μｇの用量でＨＥＳ１遺伝子の発現を下方制御する本明細書に提供されるｄｓＲＮＡ化合物で処置された動物（ｎ＝６）、５μｇの用量でＨＥＳ１遺伝子の発現を下方制御する本明細書に提供されるｄｓＲＮＡ化合物で処置された動物（ｎ＝６）、１０μｇの用量でＨＥＳ１遺伝子の発現を下方制御する本明細書に提供されるｄｓＲＮＡ化合物で処置された動物（ｎ＝６）、５０μｇの用量でＨＥＳ１遺伝子の発現を下方制御する本明細書に提供されるｄｓＲＮＡ化合物で処置された動物（ｎ＝６）、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、および５０μｇのそれぞれの用量で、ＥＧＦＰ遺伝子の発現を下方制御する対照ｄｓＲＮＡ化合物による４つの騒音対照動物群（各ｎ＝６）。
【０４２７】
処置は、騒音暴露の１時間前に行われ、その後、３日間１日１回行われる。
【０４２８】
次の例示的なビヒクルをこの実験において使用する：ＰＢＳ、人工外リンパ溶液。
【０４２９】
ｄｓＲＮＡ試験化合物およびｄｓＲＮＡ対照化合物は、実験のビヒクル中で投与のために製剤化される。
【０４３０】
ビヒクル、ｄｓＲＮＡ試験化合物、またはｄｓＲＮＡ対照化合物を、腹腔内に注射するか、または静脈内ボーラスによって注射する。全ての動物は、致死量の麻酔薬を用いて、機能評価後に殺処分する：免疫標識のために１日目に各群に対して３匹の動物、および２１日目に残りの動物、これらのうちの３匹は、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）のためにさらに処理する。
騒音暴露
【０４３１】
音響性外傷は、波形発生器（例えば、Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ＬＡＧ−１２０Ｂ，Ｌｅａｄｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐ，Ｙｏｋｏｈａｍａ，Ｊａｐａｎ）によって発生された６ｋＨｚの連続純音によって誘発され、音声増幅器（例えば、Ａ−２０７Ｒ，Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｌｏｎｇ  Ｂｅａｃｈ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）によって増幅される。麻酔下で、全ての動物は、オープンフィールド（例えば、ｄｏｍｅ  ｔｗｅｅｔｅｒ  ＴＷ３４０ｘ０，Ａｕｄａｘ，Ｃｈａｔｅａｕ  ｄｅ  Ｌｏｉｒ，Ｆｒａｎｃｅ）中で示される、６ｋＨｚ、１２０ｄｂのＳＰＬ（音圧レベル）音に、４０分間暴露される。
聴覚機能の電気生理学的測定
【０４３２】
聴性脳幹反応（ＡＲＢ）は、騒音暴露前、および騒音暴露の１時間後、３日後、７日後、および２１日後に測定される。動物は、軽く麻酔をかけて、防音室に入れる。３つの電極を、右側乳突部（活性）、頭極部（参照）、および左側乳突部（接地）に皮下挿入する。コンピュータ制御されたデータ収集システム、例えば、リアルタイムデジタル信号処理を有するＴＤＴ  Ｓｙｓｔｅｍ  ３（Ｔｕｃｋｅｒ−Ｄａｖｉｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｌａｃｈｕ，Ｆｌｏｒｉｄａ，ＵＳＡ）データ収集システムを用いて、ＡＢＲを記録し、聴覚刺激を生成する。２〜２４ｋＨｚの範囲の純音のトーンバースト（上昇／下降時間１ミリ秒；全持続時間１０ミリ秒；繰り返し率２０／秒）を、オープンフィールド内で片耳に示す。反応にフィルタ処理を行い（０．３〜３ｋＨｚ）、デジタル化し、それぞれの周波数レベルの組み合わせで、５００個の別々の試料を全体で平均化する。
形態学的研究：走査電子顕微鏡法
【０４３３】
ＳＥＭ分析は、例えば、Ｓｅｒｇｉ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｉｄｅｂｅｎｏｎｅ  ｉｎ  ｎｏｉｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｅａｒｉｎｇ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ．ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ  ２００６；１７：８５７−８６１に記載されるように行う。簡潔に言えば、各群の３匹の動物の蝸牛（ｎ＝３）を、０．１Ｍのリン酸緩衝液中の２．５％のグルタルアルデヒドで還流し、一晩固定させ、次いで、２％の四酸化オスミウムカコジル酸緩衝液中で２時間インキュベートする。顕微解剖後、蝸牛を、３０〜１００％のエタノールの濃度を増加させて脱水し、臨界点乾燥させ、最後に、金で被覆する。それぞれの標本を視察し、例えば、Ｚｅｉｓｓ  Ｓｕｐｒａ  ５０  Ｆｉｅｌｄ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ＳＥＭ装置（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって撮影する。コルチ器の表面形態の定量的ＥＭ観察は、２０セグメント（それぞれＩｍｍ長さの基底膜）内の有毛細胞数を測定することによって行われる。有毛細胞は、不動毛の束がない場合、または不動毛の束が完全に融合された場合、欠損として計数される。有毛細胞計数の結果は、蝸牛の全長にわたって内有毛細胞および外有毛細胞のそれぞれの列における残りの有毛細胞のパーセンテージとして表される。
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰニック末端標識アッセイ
【０４３４】
各群の３匹の動物の蝸牛（ｎ＝３）を、Ｂ  Ｓｅｒｇｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｉｄｅｂｅｎｏｎｅ  ｉｎ  ｎｏｉｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｅａｒｉｎｇ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ．ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ（２００６）１７：８５７−８６１に記載されるように、ＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰニック末端標識）アッセイ（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｓｌｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて染色する。簡潔に言えば、蝸牛を、０．１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１０％のホルムアルデヒドで、ｐＨ７．３で固定する。顕微解剖後、コルチ器の表面処理物を、氷冷７０％（ｖ／ｖ）エタノールで一晩インキュベートし、次いで、１０μＬの反応緩衝液、０．７５μＬのＴｄＴ酵素、８．０μＬのＢｒｄＵＴＰ、および３１．２５μＬのｄＨ２Ｏを含む、新たに調製されたＤＮＡ標識溶液中で、室温で１６時間インキュベートする。次いで、これらの組織を、ＴＵＮＥＬアッセイキット（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）に含まれるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８染色標識した抗ＢｒｄＵ抗体で染色する（５μＬの抗体＋９５μＬのコルチ器を、室温で２０分間、ヨウ化プロピジウム（１０ｍＭのＰＢＳ中５μｇ／ｍＬ）で二重染色する。ＰＢＳ中で洗い流した後、コルチ器を、退色防止剤（例えば、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）を含むスライド上に載置する。標本を、共焦点レーザー走査顕微鏡（例えば、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ２，Ｌｅｉｃａ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて観察する。
結果
【０４３５】
このモデルにおいて得られた結果は、本明細書に提供されるｄｓＲＮＡが、
（ａ）騒音に誘発される閾値変動を減衰させ、
（ｂ）騒音に誘発される外有毛細胞消失を減少させ、騒音に誘発される難聴（ＮＩＨＬ）に対する保護を提供したことを示す。
【０４３６】
このモデルは、例えば、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＣＤＫＮ１Ｂ、またはＮＯＴＣＨ１遺伝子を下方制御する可能性があるｄｓＲＮＡ分子の有効性を試験するために有用である。
【０４３７】
上記の例は、本発明の実施形態を実施するための特定の方法を例示するが、実際には、当業者であれば、本明細書に明白に示されない、本発明の実施例を実施する代替の方法を理解するであろう。本開示は、本発明の原理の例証として見なされるべきであり、例示された実施形態に対して本発明を限定することを意図するものでないことを理解されるべきである。
【０４３８】
当業者は、日常の実験のみを使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の等価物を認識するか、または解明することができるであろう。そのような等価物は、下記の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図２Ａ】
2014528704.tif 000039
【図２Ｂ】
2014528704.tif 000040
【図３Ａ】
2014528704.tif 000041
【図３Ｂ】
2014528704.tif 000042
【図１】
2014528704.tif 000043
【図４】
2014528704.tif 000044
【図５】
2014528704.tif 000045
【図６】
2014528704.tif 000046
【図７Ａ】
2014528704.tif 000047
【図７Ｂ】
2014528704.tif 000048
【図８Ａ】
2014528704.tif 000049
【図８Ｂ】
2014528704.tif 000050
【図９Ａ】
2014528704.tif 000051
【図９Ｂ】
2014528704.tif 000052
【図１０Ａ】
2014528704.tif 000053
【図１０Ｂ】
2014528704.tif 000054
【配列表】
2014528704000001.app
【国際調査報告】
2014528704.tif 000055
2014528704.tif 000056