(57)【要約】  本発明は、グルコースの分析に有用なペニシリウム・アマガサキエンスのグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）酵素の突然変異体、並びに特にグルコース電極及びグルコースを燃料として利用するバイオ燃料電池の開発に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペニシリウム・アマガサキエンスの野生型グルコースオキシダーゼに対して少なくとも８０％の同一率を有するグルコースオキシダーゼ突然変異体であって、その５６４位のアミノ酸が、配列番号２のペニシリウム・アマガサキエンスの野生型グルコースオキシダーゼのタンパク質配列に比べて、セリン（Ｖ５６４Ｓ突然変異体）、トレオニン（Ｖ５６４Ｔ突然変異体）又はイソロイシン（Ｖ５６４Ｉ突然変異体）からなる群から選択されるアミノ酸で置換されていることを特徴とする、グルコースオキシダーゼ突然変異体。
【請求項２】
前記Ｖ５６４Ｓ突然変異体が、４２４位のリシンのグルタミン酸（Ｖ５６４Ｓ＋Ｋ４２４Ｅ突然変異体）、グルタミン（Ｖ５６４Ｓ＋Ｋ４２４Ｑ突然変異体）、メチオニン（Ｖ５６４Ｓ＋Ｋ４２４Ｍ突然変異体）又はロイシン（Ｖ５６４Ｓ＋Ｋ４２４Ｌ突然変異体）での置換を更に含むことを特徴とする、請求項１に記載のグルコースオキシダーゼ突然変異体。
【請求項３】
配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号２２、配列番号２４及び配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載のグルコースオキシダーゼ突然変異体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のグルコースオキシダーゼ突然変異体をコードすることを特徴とする核酸分子。
【請求項５】
配列番号１３と配列番号１４との対、配列番号１５と配列番号１６との対、配列番号１７と配列番号１８との対、配列番号１９と配列番号２０との対、配列番号２７と配列番号２８との対、配列番号２９と配列番号３０との対、及び配列番号３１と配列番号３２との対からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド対による、配列番号１の配列を有する核酸分子の突然変異によって得られることを特徴とする、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項６】
配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号２１、配列番号２３及び配列番号２５からなる群から選択される配列を有することを特徴とする、請求項４又は５に記載の核酸分子。
【請求項７】
請求項４及び５のいずれかに記載の核酸分子を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターによって形質転換されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素を発現する宿主細胞。
【請求項９】
サンプル中のグルコース濃度の測定への請求項１〜３のいずれか一項に記載のグルコースオキシダーゼ突然変異体の使用。
【請求項１０】
前記サンプルが生体サンプル、特に血液であることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のグルコースオキシダーゼ突然変異体を含むことを特徴とするグルコースアッセイキット。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のグルコースオキシダーゼ突然変異体を少なくとも１つ含む被着物で被覆された導電材料を含むことを特徴とするグルコース電極。
【請求項１３】
請求項１２に記載の電極からなることを特徴とするグルコースセンサー。
【請求項１４】
アノードである請求項１２に記載の第一電極と、カソードである第二電極とを備えることを特徴とするグルコースバイオ燃料電池。
【請求項１５】
サンプルの溶液中のグルコースを分析する方法であって、
ａ）その還元が色の変化をもたらすレドックス試薬と、請求項１〜３のいずれか一項に記載のグルコースオキシダーゼ突然変異体とを前記サンプル中に導入する工程と、
ｂ）酵素反応後に前記サンプルの着色の強さを測定する工程と、
ｃ）工程ｂ）において測定された着色の強さと、グルコース含量が既知の標準溶液について測定された強さとを比較する工程と、
ｄ）前記サンプル中のグルコース濃度を決定する工程と、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１６】
サンプルのグルコースを分析する方法であって、
ａ）請求項１２に記載のグルコース電極を前記サンプル中に導入する工程と、
ｂ）前記サンプル中の電流の強さを測定する工程と、
ｃ）工程ｂ）において測定された電流の強さと、グルコース含量が既知の標準溶液について測定された強さとを比較する工程と、
ｄ）前記サンプル中のグルコース濃度を決定する工程と、
を含むことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコース、特に糖尿病の個体の血中グルコースの分析において関心がもたれるグルコース電極の開発、及びグルコースを燃料として使用するバイオ燃料電池の使用の分野に関する。
【０００２】
本発明はより具体的には、野生型酵素、特に市販の酵素に比べて有利な特性を有するペニシリウム・アマガサキエンス（Penicillium amagasakiense）のグルコースオキシダーゼ酵素（以下、ＧＯｘとも称される）の突然変異体に関する。
【背景技術】
【０００３】
２型糖尿病にはフランスにおいて２００万人近くの人々が羅患しているが、この数に疾患に気付いていない６０００００人を加える必要がある。米国においては状況は更に深刻である。先進国では、糖尿病は２０歳〜６５歳という年齢層での失明の主要な原因である。
【０００４】
この疾患のモニタリング及び管理は、とりわけ血中グルコースの毎日の分析及びインシュリンの注射に基づく。様々な会社によって、患者が血糖値を自宅で測定することを可能にするグルコースセンサーが提供されている。これらのセンサーは電流測定センサー、電位差測定センサー又は電量測定センサーであり得るが、これらは全てグルコースを酸化することが可能な酵素の使用に基づいている。２つの主要な酵素はグルコースオキシダーゼ及びＰＱＱ  ｓ−ＧＤＨである。
【０００５】
グルコースオキシダーゼ（以下、ＧＯｘとも称される）は、以下の反応スキームに従うグルコースの過酸化水素及びＤ−グルコノ−δ−ラクトンへの酸化を触媒する酸化還元酵素（ＥＣ  １．１．３．４）である：
【化１】
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【０００６】
グルコースオキシダーゼはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）から初めて単離された。最も一般的に生成されるＧＯｘは、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、ペニシリウム・グラウクム（Penicillium glaucum）、ペニシリウム・パルロゼラム（Penicillium purpurogenum）、ペニシリウム・アマガサキエンス、アスペルギルス・ニガー及びアスペルギルス・フマリクス（Aspergillus fumaricus）に由来するものである。
【０００７】
市販されているＧＯｘは通常、アスペルギルス・ニガー及びペニシリウム・アマガサキエンスに由来するものであり、主に食品産業において、とりわけ過酸化水素源として保存目的で使用されている。これらはグルコースの分析又はグルコースバイオ燃料電池にも使用されている。これら２つの酵素は、とりわけWohlfahart et al.による論文（非特許文献１）において研究及び比較されている。
【０００８】
ペニシリウム・アマガサキエンスに由来するＧＯｘに関しては、Witt et al.が大腸菌を用いたそのクローニング及びその発現について記載している（非特許文献２）。
【０００９】
現在利用可能なグルコースオキシダーゼの欠点は、ＧＯｘによって触媒される反応に電子受容体として関与するＯ２に対するその感受性である。具体的には、酸素はＧＯｘの天然の補因子であり、グルコースの酸化後のＧＯｘの再酸化を可能にする。このため、グルコースセンサーにおけるこれらの酵素の使用時に酸素と、酵素と電極表面との電気的接続をもたらすレドックスメディエータとの間で酵素からの電子の回収に関する競合が存在する。
【００１０】
加えて、グルコースセンサーへの使用に関しては、既存の酵素よりも活性の高いＧＯｘ突然変異体、すなわちより迅速なグルコースのＤ−グルコノラクトンへの変換反応を可能にする突然変異体を利用可能にする必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Acta. Cryst (1999) D55, 969-977
【非特許文献２】Applied and Environmental Microbiology (1998) vol. 64, No. 4, 1405-1411
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、依然として既存のＧＯｘの特性を改善する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、ペニシリウム・アマガサキエンスの野生型ＧＯｘの新規の突然変異体を開発することによってこれを達成することができた。
【００１４】
「突然変異体」又は「変異体」という用語は、そのタンパク質配列が、野生型ＧＯｘのタンパク質配列と比べて少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換を含むＧＯｘを意味する。以下、ＧＯｘの参照ヌクレオチド配列及び参照タンパク質配列は、ペニシリウム・アマガサキエンスの野生型ＧＯｘの配列とする（それぞれ配列番号１及び配列番号２）。
【００１５】
本発明による突然変異体は、５６４位のバリンがセリン（Ｖ５６４Ｓ突然変異体）、トレオニン（Ｖ５６４Ｔ突然変異体）又はイソロイシン（Ｖ５６４Ｉ突然変異体）で置換されているようなものであり、上記バリンがセリンで置換されている場合、４２４位のリシンがグルタミン酸、グルタミン、メチオニン及びロイシンで置換されている突然変異体も本発明の主題である（それぞれＶ５６４Ｓ＋Ｋ４２４Ｅ突然変異体、Ｖ５６４Ｓ＋Ｋ４２４Ｑ突然変異体、Ｖ５６４Ｓ＋Ｋ４２４Ｍ突然変異体及びＶ５６４Ｓ＋Ｋ４２４Ｌ突然変異体）。
【００１６】
このため、本発明の第１の主題は、ペニシリウム・アマガサキエンスの野生型ＧＯｘに対して少なくとも８０％、選好性の低い方から順に（in order of increasing preference）少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％及び９９％の同一率を有し、その５６４位のアミノ酸が、ペニシリウム・アマガサキエンスの野生型ＧＯｘのタンパク質配列（配列番号２）に比べて、セリン（Ｖ５６４Ｓ突然変異体）、トレオニン（Ｖ５６４Ｔ突然変異体）又はイソロイシン（Ｖ５６４Ｉ突然変異体）からなる群から選択されるアミノ酸で置換されていることを特徴とする、ＧＯｘ突然変異体に関する。
【００１７】
特定の変形形態（variant）によると、Ｖ５６４Ｓ突然変異体は４２４位のリシンのグルタミン酸、グルタミン、メチオニン又はロイシンでの置換を更に含む（それぞれＶ５６４Ｓ＋Ｋ４２４Ｅ突然変異体、Ｖ５６４Ｓ＋Ｋ４２４Ｑ突然変異体、Ｖ５６４Ｓ＋Ｋ４２４Ｍ突然変異体及びＶ５６４Ｓ＋Ｋ４２４Ｌ突然変異体）。
【００１８】
アミノ酸のナンバリングは、ペニシリウム・アマガサキエンスの野生型ＧＯｘの配列を基準とする。
【００１９】
参照配列であるペニシリウム・アマガサキエンスの野生型ＧＯｘの配列（配列番号２）に対する配列の同一性は、２つの配列をそれらの間で最大の一致が得られるようにアラインメントした場合に同一であるアミノ酸残基のパーセンテージに応じて評価する。
【００２０】
当業者は配列を比較するためのコンピュータプログラム、例えばＢＬＡＳＴソフトウェア（Altschul et al., NAR, 25, 3389-3402）を用いて同一率を算出することができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、参照配列として示した配列番号２全体からなる比較ウィンドウ上で採用される。
【００２１】
参照配列との同一性が少なくともＸ％のアミノ酸配列を有するペプチドは、本発明においては、該参照ペプチドの機能的特性（本発明の場合、そのグルコース酸化に対する酵素活性）を保持したまま、参照配列の１００個のアミノ酸に対して最大で１００−Ｘ個の変化をその配列中に含むことのできるペプチドとして定義される。本発明の意味において、「変化」という用語は、参照配列におけるアミノ酸の連続的な若しくは分散した欠失、置換、又は挿入を含む。
【００２２】
ペニシリウム・アマガサキエンスの野生型ＧＯｘの５６４位のアミノ酸に対応するアミノ酸は、その相同酵素とペニシリウム・アマガサキエンスのＧＯｘとの配列をアラインメントすることによって同定される。
【００２３】
本発明の特定の主題は、ＧＯｘの突然変異体Ｖ５６４Ｓ、Ｖ５６４Ｔ、Ｖ５６４Ｉ、Ｖ５６４＋Ｋ４２４Ｅ、Ｖ５６４Ｓ＋Ｋ４２４Ｑ、Ｖ５６４Ｓ＋ＫＬ４２４Ｍ及びＶ５６４Ｓ＋Ｋ４２４Ｌのアミノ酸配列のそれぞれに対応する配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号２２、配列番号２４及び配列番号２６から選ばれるアミノ酸配列を有するＧＯｘ突然変異体に関する。これらの突然変異酵素は、好適なオリゴヌクレオチド対によるペニシリウム・アマガサキエンスの野生型ＧＯｘ遺伝子の突然変異によって得られるヌクレオチド断片によってコードされる。
【００２４】
これらの本発明による新規のＧＯｘ突然変異体は、市販のグルコースセンサーに使用される酵素であるアスペルギルス・ニガーの野生型酵素に比べて改善された性能品質を示す。
【００２５】
より具体的には、本発明による突然変異体の改善された特性は、酸素に対する感受性の低減にある。１ｍＭのグルコースの存在下の溶液中及び空気中で、この突然変異体はアスペルギルス・ニガー（A. niger）のＧＯｘよりも酸素に対する感受性が１７倍低い。電極表面へ吸着させると、１ａｔｍのＯ２下及び１ｍＭのグルコースで、この突然変異体はＯ２に対する感受性が７０％低くなる。
【００２６】
本発明によるＧＯｘ突然変異体の有利な特性によって、本発明によるＧＯｘ突然変異体はグルコースをエネルギー源として用いるバイオ燃料電池等の生体電気システム及びグルコースバイオセンサーに特に好適に使用されるものとなる。
【００２７】
本発明は、野生型ＧＯｘ（例えばペニシリウム・アマガサキエンスの野生型ＧＯｘ）を、表Ｉに示されるオリゴヌクレオチド対からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド対で修飾することによって得られる、本発明によるＧＯｘ突然変異体をコードする核酸分子にも関する。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
本発明によるＧＯｘ突然変異体をコードする核酸分子は特に、ペニシリウム・アマガサキエンスによって生成される配列番号１の配列の野生型酵素をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を修飾することによって作製することができる。遺伝子の配列を修飾する幾つかの技法が当業者に既知である（Igarashi et al., Archives of Biochemistry and Biophysocs 428 (2004) 52-63による概説を参照されたい）。特定の作製方法によると、本発明によるＧＯｘ突然変異体をコードする核酸分子は、導入すべき突然変異を有するオリゴヌクレオチドの存在下でのＰＣＲによる突然変異誘発によって作製される（下記の実験の項の２．５を参照されたい）。
【００３０】
特定の実施の形態によると、本発明は、その配列が配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号２１、配列番号２３及び配列番号２５の配列からなる群から選択される、本発明によるＧＯｘ突然変異体をコードする核酸分子に関する。本発明によるＧＯｘ突然変異体をコードする核酸分子を、次いでプラスミド等の発現ベクターにクローニングした後、細菌、酵母又は細胞培養物等の好適な宿主において形質転換させることができる。
【００３１】
「発現ベクター」という用語は、その発現に不可欠なシグナル、特にプロモーター（構成的又は誘導性）、リボソーム結合部位、転写終結シグナル、及び任意で抗生物質抵抗性遺伝子等の選択マーカーの間にヌクレオチドコード配列を挿入するための領域を有するベクターを意味する。
【００３２】
本発明は、上記核酸分子を含む発現ベクター、及び該発現ベクターで形質転換され、本発明によるＧＯｘ突然変異体を発現する宿主細胞にも関する。
【００３３】
発現ベクターの宿主細胞への導入は当業者に既知の任意の方法、特に宿主細胞の膜透過性を例えばカルシウムイオンの存在下で変化させること、又はエレクトロポレーションによって行うことができる。
【００３４】
本発明によるＧＯｘ突然変異体を発現するように形質転換した宿主細胞の培養の後、該細胞を遠心分離によって回収し、本発明による該ＧＯｘ突然変異体を含む酵素を放出するように溶解することができる。
【００３５】
大腸菌（Escherichia coli）が宿主微生物である場合、使用することのできるプラスミドは、特にプラスミドｐＥＴ２４ａ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８等である。
【００３６】
例としては、使用することのできる宿主細胞は、大腸菌ＢＬ２１、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌Ｃ６００、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＪＭ１０１、大腸菌ＤＨ５α等を含む。
【００３７】
本発明によるＧＯｘ突然変異体は、大腸菌ＢＬ２１株において生成するのが好ましい。本発明によるＧＯｘをコードする核酸分子を、ペニシリウム・アマガサキエンスのＧＯｘ遺伝子を修飾することによって得て、ｐＥＴ２４ａベクターにクローニングする。このようにして生成した突然変異体を、ＧＯｘのシグナル配列を用いて細菌のペリプラズム中に輸送する。このようにして生成した突然変異体を細菌の封入体内に輸送する。次いで、細菌を８Ｍ尿素の存在下で細胞溶解によって破壊し、突然変異体を精製する。
【００３８】
本発明は、溶液中のグルコースの分析、すなわちサンプル、特に生体サンプル、とりわけ血液中のグルコース濃度の測定への本発明によるＧＯｘ突然変異体の使用にも関する。
【００３９】
所与の生体サンプルにおける溶液中のグルコースの分析は、レドックス試薬及び本発明によるＧＯｘ突然変異体を該サンプルに導入した後、得られる着色の強さをグルコース含量が既知の標準溶液と比較することによって行うことができる。
【００４０】
本発明は、本発明によるＧＯｘ突然変異体を含むことを特徴とする、グルコース溶液を分析するキットにも関する。
【００４１】
上記アッセイキットは通常、グルコースアッセイ試験を行うために必要とされる試薬、特に緩衝液（任意の緩衝液を本発明によるキットに使用することができ、性質を限定するものではないが、リン酸緩衝液又は酢酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）緩衝液、Ｎ−モルホリノ−３−プロパンスルホン酸（ＭＰＯＳ）緩衝液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ＴＲＩＳ−酢酸等の緩衝液の混合物を含む緩衝液を挙げることができる）、レドックス試薬（ＧＯｘ突然変異体を酸化する任意の試薬であり得るが、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）と組み合わせたフェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）、フェリシアン化カリウム、フェロセン及びフェロセンメタノール、フェロセンカルボン酸等のフェロセンベースの錯体、並びにオスミウム及びルテニウムの錯体からなる群から選択することができる）、検量線を作成するための標準グルコース溶液、及びアッセイを行うために必要とされる使用説明書も含む。
【００４２】
本発明は、導電性金属、特に白金、銅、銀、アルミニウム、金又は炭素鋼、例えばガラス状炭素、カーボンファイバー、カーボンナノチューブファイバー若しくはダイヤモンド等といった導電材料を含むグルコース電極にも関する。該導電材料は、少なくとも１つの本発明によるＧＯｘ突然変異体を含む被着物で被覆されている。該被着物は、導電材料の導電性を改善するレドックスポリマーを更に含んでいてもよい。
【００４３】
レドックスポリマーは、フェロセン、オスミウム及びルテニウムをベースとしたポリマー、並びにポリピロール及びポリアニリン等の導電性ポリマーから選ばれる。
【００４４】
ＧＯｘ突然変異体を上記導電材料上に固定化する方法は、特にポリマーマトリクスへのＧＯｘ突然変異体の封入、ポリマー膜の表面上へのＧＯｘ突然変異体の吸着、共有結合による固定、又は代替的に電着を含む、当業者が利用可能な標準的な方法から選ぶことができる（Gao et al., Chem. Int. ED. 2002, 41, No. 5, 810-813）。
【００４５】
かかる電極は、グルコースバイオ燃料電池又はグルコースバイオセンサー等の生体電気システムにおいて有利に使用される。
【００４６】
本発明はしたがって、本発明による電極を含むグルコースバイオセンサーにも関する。
【００４７】
グルコースバイオセンサーは、生物学的標的を認識することが可能なバイオレセプターが固定化された電極からなる。バイオレセプターへの生物学的標的の結合によって、膜の物理化学的変化、及び電極に取り付けられた電気化学的変換器（電流測定変換器、電位差測定変換器、電気伝導測定変換器等）による電気信号の生成がもたらされる。本発明の場合、バイオレセプターは本発明によるＧＯｘ突然変異体であり、生物学的標的はその基質（グルコース）である。
【００４８】
１つの実施の形態の変形形態によると、ＧＯｘ突然変異体が固定化された電極はまた、電極からの該突然変異体の脱離を防止する膜で被覆されている。該膜はナフィウム（nafium）、セルロース、又は任意の生体適合性材料、すなわち生理環境と適合する任意の材料からなるものであり得る。
【００４９】
本発明の変形形態によると、グルコースバイオセンサーは皮下に埋め込まれ、血中グルコース濃度を記録することを可能にする。
【００５０】
本発明は、グルコースをエネルギー源として用い、アノードである本発明による第一電極と、カソードである第二電極とを備えるバイオ燃料電池にも関する。カソードは例えば、酸素を還元し、銅をベースとする酵素群（マルチ銅オキシダーゼ）、特にビリルビンオキシダーゼ及びラッカーゼから選ばれる酵素を担持する酵素電極であり得る。カソードは例えば白金、金、又は白金合金若しくは金合金で構成される金属電極であってもよい。
【００５１】
図１は、より具体的には酵素グルコースバイオ燃料電池を説明するものである。かかる酵素バイオ燃料電池は、酵素の固定化によって修飾された２つの電極からなる。グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）が導電性ポリマー「Ｉ」を介してアノード１に結合し、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）が導電性ポリマー「ＩＩ」を介してカソード２に結合する。作動させると、アノードでは電子は生理液中に存在するグルコースからＧＯｘへ、次いでＧＯｘから導電性ポリマー「Ｉ」、導電性ポリマー「Ｉ」からアノードへと移動する。カソードでは電子はカソードから導電性ポリマー「ＩＩ」、次いでＢＯＤへ、最後にＢＯＤから生理液中に存在する酸素へと移動する。
【００５２】
バイオ燃料電池は任意に、電極をそれぞれの酵素で修飾すること、及びアノードについてはフェロセンメタノール、カソードについてはフェリシアン化カリウム等の可溶性メディエータを添加すること、及び必要に応じてアノードとカソードとを隔てる膜を付加することによっても機能し得ることに留意されたい。
【００５３】
本発明は、サンプルにおける溶液中のグルコースを分析する方法であって、
ａ）その還元が色の変化をもたらすレドックス試薬と、本発明によるＧＯｘ突然変異体とを上記サンプル中に導入する工程と、
ｂ）酵素反応後にサンプルの着色の強さを測定する工程と、
ｃ）工程ｂ）において測定された着色の強さと、グルコース含量が既知の標準溶液について測定された強さとを比較する工程と、
ｄ）上記サンプル中のグルコース濃度を決定する工程と、
を含む、方法にも関する。
【００５４】
その還元が色の変化をもたらすレドックス試薬は、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）と組み合わせたフェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）、フェリシアン化カリウム及びフェロセンから選ばれる。
【００５５】
本発明は、サンプルのグルコースを分析する方法であって、
ａ）本発明によるグルコース電極を上記サンプル中に導入する工程と、
ｂ）サンプル中の電流の強さを測定する工程と、
ｃ）工程ｂ）において測定された電流の強さと、グルコース含量が既知の標準溶液について測定された強さとを比較する工程と、
ｄ）上記サンプル中のグルコース濃度を決定する工程と、
を含むことを特徴とする、方法にも関する。
【００５６】
本発明は、上述の構成に加えて、他の構成を更に含むが、これらは本発明の適用例及び更には添付の図面を参照して、下記に与えられる説明から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】バイオ燃料電池の概略図である。
【図２】ｐＥＴ２４ａ−ＧＯｘ−ｐｅｎａｇ−ｗｔ−Ｈｉｓベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図３】ペニシリウム・アマガサキエンスに由来する野生型ＧＯｘ及び突然変異ＧＯｘの比活性（Ｕ／ｍｇ）を示すグラフである。
【図４】フェロセンメタノール活性／酸素活性比を示すグラフである。
【図５】グルコース及びキシロースを用いた野生型ＧＯｘ及び突然変異ＧＯｘの比活性の比較を示す図である。
【図６】グルコース濃度に応じたグルコース酸化電流の変化を示すグラフである。
【図７】グルコース濃度に応じた、酸素下のグルコース酸化電流をアルゴン下の電流で割った比の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
１．  材料
１．１  大腸菌の菌株
ＤＨ５α：ｓｕｐＥ４４、ΔｌａｃＵ１６９、（Φ８０  ｌａｃＺＤＭ１５）、ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｒｅｌＡ１（Hanahan, 1983）。この株を、タンパク質発現ベクターを構築する工程においてプラスミドの増幅に使用する。
【００５９】
ＢＬ２１：Ｆ−ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−、ｍＢ−）ｇａｌ  ｄｃｍ（ＤＥ３）（Invitrogen）。この株を、ペニシリウム・アマガサキエンス（ｐｅｎａｇ）に由来するＧＯｘの三角フラスコでの生成に使用する。次いで、ｐＥＴ２４ａベクター中のＴ７プロモーターに依存的なペニシリウム・アマガサキエンスのＧＯｘをコードするＤＮＡ配列を含有するｐＥＴ２４ａプラスミドによってこの株を形質転換する。
【００６０】
１．２  ベクター
ｐＥＴ２４ａ：Ｃ末端６ｘＨｉｓ標識とインフェーズでクローニングしたペニシリウム・アマガサキエンスのＧＯｘをコードするＤＮＡ配列を含有するｐＥＴ２４ａプラスミド（このプラスミドのマップを図２に示す）。
【００６１】
１．３．  培養培地
ＬＢ富栄養培地：
トリプトン１０ｇ／ｌ；
酵母エキス５ｇ／ｌ；
ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ；
蒸留水適量（全量１Ｌ）；
ｐＨ無調整、１バールで５０分間オートクレーブ。
【００６２】
２．  遺伝子工学技法
２．１  エレクトロコンピテント細菌の作製
５ｍｌのＤＨ５α細胞前培養物を１ＬのＬＢに播種し、３７℃で指数増殖期（０．６〜０．８のＯＤ）まで培養する。このようにして４０００ｇの遠心分離によって採取した細胞を、エレクトロコンピテントとなった細胞が２ｍｌ得られるまで冷ｍｉｌｌｉＱ（商標）水で連続して洗浄する。
【００６３】
２．２  エレクトロコンピテント細菌の形質転換
１μｌのプラスミドＤＮＡを４０μｌのエレクトロコンピテント細胞に取り込ませ、エレクトロポレーションタンク（electroporation tank）に入れ、エレクトロポレーターによって即座に形質転換する。５００μｌのＳＯＣ（２％トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含有する培養培地）を添加し、氷中で５分間インキュベートし、３７℃で１時間培養する。次いで、５００μｌの培養物をＬＢ寒天皿に置き、３７℃で一晩インキュベートする。
【００６４】
２．３  ＤＮＡの調製
本工程は、所望のプラスミドで形質転換したＤＨ５α細胞の１０ｍｌの培養物からのプラスミドＤＮＡの抽出及び精製を可能にするＱＩＡｐｒｅｐ（商標）Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Qiagen）を用いて行う。細胞を遠心分離によって回収した後、ＲＮａｓｅの存在下でアルカリ溶解を行い、酢酸によるゲノムＤＮＡの沈殿を更に行う。次いで、ＤＮＡを遠心分離によって取り出し、強い塩濃度の存在下でのプラスミドＤＮＡの選択的吸着を可能にするシリカマトリックスを含むカラムに上清を投入する。エタノールで洗浄して塩、ＲＮＡ及びタンパク質を除去した後、プラスミドＤＮＡをイオン強度の弱い緩衝液（水又は緩衝液：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５））で溶出させる。このようにして精製したＤＮＡは、２６０ｎｍでの紫外可視分光分析によって定量化することができる。吸光度１は５０ｎｇ・μｌ−１のＤＮＡ濃度に相当する。精製したプラスミドＤＮＡを−２０℃で保管する。
【００６５】
２．４  ＤＮＡの消化
完全な消化のために、２００ｎｇ〜５００ｎｇのプラスミドＤＮＡを、最終容量１５μｌの適切な反応緩衝液中で０．５μｌのＸｂａｌ制限酵素で消化する。反応は３７℃で１時間行う。
【００６６】
２．５  ＰＣＲ−定方向突然変異誘発
ＧＯｘ突然変異体Ｖ５６４Ｉ、Ｖ５６４Ｓ、Ｖ５６４Ｔ及びＶ５６４Ｓ＋Ｋ４２４Ｅを定方向突然変異誘発によって得る。この方法では、対象の遺伝子（ＧＯｘ）を保有する二本鎖プラスミド（ｐＥＴ２４ａプラスミド）、更には配列が所望の突然変異を除いて修飾すべきＤＮＡ鎖に相補的な２つの合成オリゴヌクレオチドを使用する必要がある。これらのオリゴヌクレオチドは２５個〜４５個の塩基を含有し、融点（Ｔｍ）は７０℃以上である。
Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％ＧＣ）−６７５／Ｎ−％（対応なし）
【００６７】
Ｎは配列中の塩基の数、％ＧＣは配列中のＧ塩基及びＣ塩基のパーセンテージ、％（対応なし）は突然変異した塩基の数（塩基の欠失又は挿入の場合はゼロ値）である。選ばれる配列は少なくとも４０％のＧＣ塩基を含有し、Ｃ又はＧで終わる必要がある。
【００６８】
使用するオリゴヌクレオチドの配列を上の表Ｉに示す。
【００６９】
１０ｎｇの親プラスミド、１２．５ｎｇの各々のプライマー、１μｌの１０ｍＭ濃縮ｄＮＴＰ混合物、５μｌの反応緩衝液、１μｌのＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ・μｌ−１）及び５０μｌ（適量）の滅菌水を滅菌エッペンドルフフラスコ内で混合する。
【００７０】
突然変異誘発を、サーモサイクラーによって自動的に行われる一連の温度サイクルによって行う。各々のサイクルは３つの工程を含む。第一段階では、マトリックスＤＮＡの２つの鎖を熱変性によって分離した後、オリゴヌクレオチドをマトリックスＤＮＡ上のその相補配列と対合する。これらは、ＰｆｕＴｕｒｂｏポリメラーゼ（耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）が親鎖に相補的なＤＮＡを合成する伸長工程のプライマーとなる。
【００７１】
この一連のサイクルが完了した後、親プラスミドのメチル化ＤＮＡ及びヘミメチル化ＤＮＡを特異的に消化するエンドヌクレアーゼであるＤｐｎ  Ｉで反応生成物を処理する。最後に、突然変異したＤＮＡを、ＤＮＡ合成後も自由なプラスミドの末端を連結するコンピテント細胞に導入する。
【００７２】
２．６  二本鎖ＤＮＡのシークエンシング
二本鎖ＤＮＡを、ヴィクトル＝セガレン・ボルドー第２大学（universite Victor Segalen）のゲノミクスプラットフォームを用いてシークエンシングする。シークエンシング反応は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１又はｖ３．１シークエンシングキットを用いて行う。試薬は異なる蛍光マーカーを有する４つのｄｄＮＴＰ（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、及び反応に必要とされる他の全ての成分を含有する。伸長産物をＡＢＩ  ３１３０ｘ１シークエンサーにかける前に精製して、取り込まれなかったマーカー、塩及び他の汚染物質を除去しなくてはならない。
【００７３】
３．  ペニシリウム・アマガサキエンスのグルコースオキシダーゼ酵素の生成及び精製
３．１  野生型ＧＯｘ酵素及び突然変異ＧＯｘ酵素の生成
ＧＯｘ酵素を、大腸菌ＢＬ２１株において野生型ＧＯｘ又は突然変異ＧＯｘをコードする配列を保有する組み換えプラスミドｐＥＴ２４ａによって生成させる。カナマイシン（１倍）を添加した２ｍｌのＬＢ培地の前培養物に、カナマイシン（１倍）を添加したＬＢ寒天皿上で単離されたクローンを播種し、３７℃で一晩、２２０ｒｐｍで攪拌する。次いで、５０ｍｌの培養物を、２５０ｍｌ容三角フラスコ内のカナマイシン（１倍）を添加したＬＢ培地に２５倍希釈して播種する。このフラスコを３７℃で攪拌しながら（２２０ｒｐｍ）、ＯＤ６００ｎｍが０．８ＯＤ６００ｎｍ／ｍＬ〜１ＯＤ６００ｎｍ／ｍＬとなるまでインキュベートする。次いで、培養物を５００μＭのＩＰＴＧによって誘導した後、３７℃で２時間攪拌する（２２０ｒｐｍ）。
【００７４】
３．２  可溶性抽出物の調製
遠心分離（４５００ｇ、４℃）によって採取した細胞を、初めに５ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡで洗浄する。次いで、遠心分離（４５００ｇ、４℃）によって採取した細胞を、３Ｍ尿素を含有する５ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡで洗浄して、細胞膜を脆化させる。採取した細胞（４５００ｇ、４℃）を氷上で１時間、８Ｍ尿素を含有する５ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下でインキュベートして、細胞を完全に溶解させる。４５００ｇ、４℃で遠心分離して上清を採取した後、−２０℃で保管する。
【００７５】
３．３  ＧＯｘの再構成
大腸菌ＢＬ２１細菌において、ペニシリウム・アマガサキエンスに由来するグルコースオキシダーゼをそのアポ型で、すなわちその補因子フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）の非存在下で過剰発現させる。このため、これを化学的に再構成することが必要である。そのために、得られた可溶性抽出物５ｍｌを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）中の１０％グリセロール、１ｍＭの還元型グルタチオン、１ｍＭの酸化型グルタチオン、１００μＭのＦＡＤを含有する５００ｍｌの再構成溶液に、タンパク質の沈殿を避けるために激しく撹拌しながら滴加する。この溶液を４℃で５日間遮光して保管する。
【００７６】
３．４  ＧＯｘの精製
陰イオン交換クロマトグラフィー
２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６）中で透析して残存するアポ型を沈殿させた再構成溶液を、Ａｍｉｃｏｎ  ＹＭ１０膜で５ｍｌまで濃縮した後、０．２２μｍフィルターで濾過する。この溶液を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）で平衡化したＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒシステム（GE Healthcare（商標））に接続したＱＦＦ陰イオン交換カラム（GE Healthcare（商標））に注入する。溶出は０％から３０％という勾配の５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ３）で、１ｍｌ／分の流速で行う。ＧＯｘタンパク質を含有する画分をＡＢＴＳ活性試験によって同定し、合わせて濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ  ＹＭ１０膜での遠心分離によって１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５）で脱塩する（desalified）。この段階でＧＯｘタンパク質は純粋であり、可溶型で４℃で保管することができる。
【００７７】
４．  野生型ＧＯｘ酵素及び突然変異ＧＯｘ酵素の特性化
４．１  濃度の測定
タンパク質濃度決定を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５）中、２５℃でバリアン分光光度計を用いた紫外可視分光分析によって行う。精製ＧＯｘタンパク質は２００ｎｍ〜８００ｎｍに特徴的なスペクトルを有する。２８０ｎｍでの最初のバンドは芳香族アミノ酸の吸収に特徴的であり、酵素濃度を得ることを可能にする（ε＝２６３ｍＭ−１・ｃｍ−１）。３８０ｎｍ及び４６１ｎｍでの他の２つのバンドは、タンパク質に組み込まれたＦＡＤに特徴的である。４６１ｎｍでの吸光度値は、タンパク質中に存在する補因子の濃度を得ることを可能にする（ε＝１２．８３ｍＭ−１・ｃｍ−１）。タンパク質が完全に再構成された場合、ＧＯｘ濃度とＦＡＤ濃度との比は２に等しい。
【００７８】
４．２  酵素試験
酵素試験を空気中でバリアン分光光度計を用いた紫外可視分光分析によって行う。
【００７９】
メディエータによるＧＯｘの再酸化のみを観察することができるように大過剰のグルコース（１５０ｍＭ）の存在下で酵素試験を行う。
【００８０】
２回の酵素試験を行う。最初の試験は、酸素による再酸化を観察することができるようにＡＢＴＳ−ＨＲＰ混合物（２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）−ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を用いて行う。ＡＢＴＳをＨＲＰ及びＨ２Ｏ２の存在下で酸化する。また、２回目の試験は、電気化学に使用するものに近い酸化還元電位を有するレドックスメディエータによるＧＯｘの再酸化を観察することができるように、酸化型フェロセンメタノールを用いて行う。
【００８１】
４．２．１  ＡＢＴＳ−ＨＲＰ酵素試験
１００μｌのＨＲＰ（６０Ｕ／ｍｌ）、２４μＬのＡＢＴＳ（１１．５ｍｇ／ｍｌ）及び１５０ｍＭグルコースを含有する３ｍｌ容量の３７℃の１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５）中で試験を行う。ＡＢＴＳ酸化を４０５ｎｍで時間に応じてモニタリングする（ε＝３６．８ｍＭ−１・ｃｍ−１）。酵素の比活性は、酵素１ｍｇ当たりに生じた生成物のμｍｏｌ量（Ｕ／ｍｇ）で表される。酵素を０．０５ＯＤ４０５ｎｍ／分と０．３ＯＤ４０５ｎｍ／分との間の傾きの測定が可能となるように５０ｎＭまで希釈する。
【００８２】
４．２．２  フェロセンメタノール酵素試験（ＦＭｏｘ）
４．２．２．１  フェロセンメタノールの調製
市販のフェロセンメタノールは還元型であるため、酵素試験に使用するためには酸化する必要がある。そのために、１００ｍｇの還元型フェロセンメタノールを５０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を含有する焼結体（sinter）中に置かれた作用電極（炭素電極）、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極、白金対電極を備える電解セルに入れる。このシステムはアルゴン下にある。電気分解を０．５Ｖで４時間行う。
【００８３】
４．２．２．２  酵素試験
１ｍＭ  ＦＭｏｘ及び１５０ｍＭグルコースを含有する３ｍｌ容量の３７℃の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で試験を行った。フェロセンメタノールの還元を６２５ｎｍで時間に応じてモニタリングする（ε＝０．４１３ｍＭ−１・ｃｍ−１）。酵素の比活性は、酵素１ｍｇ当たりに生じた生成物のμｍｏｌ量（Ｕ／ｍｇ）で表される（図３）。酵素を０．００１ＯＤ６２５ｎｍ／分と０．１ＯＤ６２５ｎｍ／分との間の傾きの測定が可能となるように５０ｎＭまで希釈する。
【００８４】
４つの突然変異体が、野生型ＧＯｘに比べて酸素に対する活性の著しい低下を示すことが留意される。
【００８５】
フェロセンメタノールに対する活性は突然変異体によって異なる。このため、野生型ＧＯｘに比べて、Ｖ５６４Ｓ突然変異体はより低い活性を有し、Ｖ５６４Ｉ突然変異体は同様の活性を示すが、Ｖ５６４Ｔ突然変異体は活性の強い増大を示す。
【００８６】
ＦＭｏｘ活性／ＡＢＴＳ活性比から、基質（ＡＢＴＳ又はＦＭｏｘ）に対する酵素の特異性を得ることが可能になる。この比が大きいほど、酵素の酸素に対する感受性は低くなる（図４）。
【００８７】
突然変異体Ｖ５６４Ｓ及びＶ５６４Ｔが酸素に対して極めて非感受性であり、電気化学システムへの使用に良好な候補となることが留意される。
【００８８】
同じ酵素試験をキシロースの存在下で行った（図５）。キシロースのＡＢＴＳ活性及びＦＭｏｘ活性は、グルコースの活性と比較して非常に低い。キシロースは、ペニシリウム・アマガサキエンスの野生型グルコースオキシダーゼ及び突然変異グルコースオキシダーゼの基質としてグルコースと競合しない。
【００８９】
５．  電気化学的試験
例として、図６はＰＢＳ緩衝液中、アルゴン下、３７℃でのグルコース濃度に応じたグルコース酸化電流の変化を示す。各電極は５質量％のグルコースオキシダーゼ、１０質量％の架橋剤及び７５質量％のレドックスポリマーから構成される。図７はグルコース濃度に応じた、酸素下のグルコース酸化電流をアルゴン下の電流で割った比の変化を示す。図７は、突然変異酵素を使用した場合のグルコース酸化に対する酸素の影響の低下を明らかに示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年5月21日(2014.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペニシリウム・アマガサキエンスの野生型グルコースオキシダーゼに対して少なくとも９５％の同一率を有するグルコースオキシダーゼ突然変異体であって、その５６４位のアミノ酸が、配列番号２のペニシリウム・アマガサキエンスの野生型グルコースオキシダーゼのタンパク質配列に比べて、セリン（Ｖ５６４Ｓ突然変異体）、トレオニン（Ｖ５６４Ｔ突然変異体）又はイソロイシン（Ｖ５６４Ｉ突然変異体）からなる群から選択されるアミノ酸で置換されていることを特徴とする、グルコースオキシダーゼ突然変異体。
【請求項２】
前記Ｖ５６４Ｓ突然変異体が、４２４位のリシンのグルタミン酸（Ｖ５６４Ｓ＋Ｋ４２４Ｅ突然変異体）、グルタミン（Ｖ５６４Ｓ＋Ｋ４２４Ｑ突然変異体）、メチオニン（Ｖ５６４Ｓ＋Ｋ４２４Ｍ突然変異体）又はロイシン（Ｖ５６４Ｓ＋Ｋ４２４Ｌ突然変異体）での置換を更に含むことを特徴とする、請求項１に記載のグルコースオキシダーゼ突然変異体。
【請求項３】
配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号２２、配列番号２４及び配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載のグルコースオキシダーゼ突然変異体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のグルコースオキシダーゼ突然変異体をコードすることを特徴とする核酸分子。
【請求項５】
配列番号１３と配列番号１４との対、配列番号１５と配列番号１６との対、配列番号１７と配列番号１８との対、配列番号１９と配列番号２０との対、配列番号２７と配列番号２８との対、配列番号２９と配列番号３０との対、及び配列番号３１と配列番号３２との対からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド対による、配列番号１の配列を有する核酸分子の突然変異によって得られることを特徴とする、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号２１、配列番号２３及び配列番号２５からなる群から選択される配列を有することを特徴とする、請求項４又は５に記載の核酸分子。
【請求項７】
請求項４又は５に記載の核酸分子を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターによって形質転換されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のグルコースオキシダーゼ突然変異体を発現する宿主細胞。
【請求項９】
サンプル中のグルコース濃度の測定への請求項１〜３のいずれか一項に記載のグルコースオキシダーゼ突然変異体の使用。
【請求項１０】
前記サンプルが生体サンプルであることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のグルコースオキシダーゼ突然変異体を含むことを特徴とするグルコースアッセイキット。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のグルコースオキシダーゼ突然変異体を少なくとも１つ含む被着物で被覆された導電材料を含むことを特徴とするグルコース電極。
【請求項１３】
請求項１２に記載の電極からなることを特徴とするグルコースセンサー。
【請求項１４】
アノードである請求項１２に記載の第一電極と、カソードである第二電極とを備えることを特徴とするグルコースバイオ燃料電池。
【請求項１５】
サンプルの溶液中のグルコースを分析する方法であって、
ａ）その還元が色の変化をもたらすレドックス試薬と、請求項１〜３のいずれか一項に記載のグルコースオキシダーゼ突然変異体とを前記サンプル中に導入する工程と、
ｂ）酵素反応後に前記サンプルの着色の強さを測定する工程と、
ｃ）工程ｂ）において測定された着色の強さと、グルコース含量が既知の標準溶液について測定された強さとを比較する工程と、
ｄ）前記サンプル中のグルコース濃度を決定する工程と、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１６】
サンプルのグルコースを分析する方法であって、
ａ）請求項１２に記載のグルコース電極を前記サンプル中に導入する工程と、
ｂ）前記サンプル中の電流の強さを測定する工程と、
ｃ）工程ｂ）において測定された電流の強さと、グルコース含量が既知の標準溶液について測定された強さとを比較する工程と、
ｄ）前記サンプル中のグルコース濃度を決定する工程と、
を含むことを特徴とする、方法。 
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本発明の特定の主題は、ＧＯｘの突然変異体Ｖ５６４Ｓ、Ｖ５６４Ｔ、Ｖ５６４Ｉ、Ｖ５６４Ｓ＋Ｋ４２４Ｅ、Ｖ５６４Ｓ＋Ｋ４２４Ｑ、Ｖ５６４Ｓ＋Ｋ４２４Ｍ及びＶ５６４Ｓ＋Ｋ４２４Ｌのアミノ酸配列のそれぞれに対応する配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号２２、配列番号２４及び配列番号２６から選ばれるアミノ酸配列を有するＧＯｘ突然変異体に関する。これらの突然変異酵素は、好適なオリゴヌクレオチド対によるペニシリウム・アマガサキエンスの野生型ＧＯｘ遺伝子の突然変異によって得られるヌクレオチド断片によってコードされる。
【国際調査報告】
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