(57)【要約】  本発明は、サケ科孵化液から得られたか、または得ることが可能なポリペプチドを含む美容組成物、前記組成物の製造方法、および皮膚に対する様々な美容上用途における、特に、哺乳類動物の皮膚の美容上の外観を改善するためのそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類動物の皮膚の美容上の外観を改善する方法であって、
（ｉ）配列番号１〜４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列若しくは前記配列と少なくとも９０％同一である配列、または前記配列いずれかの一部を含むポリペプチド；または
（ｉｉ）（ｉ）および１つ以上の医薬上許容される賦形剤および／または希釈剤を含む美容組成物を、前記動物に投与する方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドまたは組成物が、少なくとも下記工程：
ａ）最小量の水に、魚卵、好ましくはサケ卵を懸濁させる工程；
ｂ）前記卵の同期化させた急速孵化を、好ましくは、９５％を超える胚について、２時間未満に孵化が完了するように、誘発する工程；
ｃ）孵化した卵を濾過し、孵化液を得る工程；および
ｄ）前記孵化液を濾過し、ポリペプチドおよび／または組成物を得る工程
を含む方法によって得られたか、または得ることが可能である方法であって、
前記孵化液を濾過する工程が、少なくとも下記工程：
（ｉ）孔径が５μｍ以上のフィルターを用いて前記孵化液を濾過し、その濾液を回収する工程；
（ｉｉ）孔径が０．３０〜０．６０μｍのフィルターを用いて、工程（ｉ）の前記濾液を濾過し、その濾液を回収する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の前記濾液中の水を、医薬上許容される緩衝液と交換する工程；
（ｉｖ）排除サイズが少なくとも８０ｋＤａのフィルターを用いて、工程（ｉｉｉ）において得られた溶液を濾過し、その濾液を回収する工程；および
（ｖ）孔径が０．１５〜０．３０μｍのフィルターを用いて、工程（ｉｖ）の前記濾液を濾過し、その濾液を回収する工程
を含み、前記濾液が、前記ポリペプチドを含む組成物を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドまたは組成物が、少なくとも下記工程：
ａ’）最小量の水に、魚卵、好ましくはサケ卵を懸濁させる工程；
ｂ’）前記卵の同期化させた急速孵化を、好ましくは、９５％を超える胚について、２時間未満に孵化が完了するように、誘発する工程；
ｃ’）孵化した卵を濾過し、孵化液を得る工程；並びに
ｄ’）前記孵化液を濾過し、ポリペプチドおよび／または組成物を得る工程、を含む方法によって得られたか、または得ることが可能な方法であって、前記孵化液を濾過する工程が、少なくとも下記工程：
（ｉ’）孔径が少なくとも５μｍのフィルターを用いて前記孵化液を濾過し、その濾液を回収する工程；
（ｉｉ’）工程（ｉ’）の前記濾液をイオン交換クロマトグラフィーに供し、その溶出液を回収する工程；
（ｉｉｉ’）工程（ｉｉ’）の前記溶出液中の水を、医薬上許容される緩衝液と交換する工程；および
（ｉｖ’）孔径が０．１５〜０．３０μｍのフィルターを用いて、工程（ｉｉｉ’）において得られた溶液を濾過し、その濾液を回収する工程
を含み、前記濾液が、前記ポリペプチドを含む組成物またはその一部を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
孔径が０．３０〜０．６０μｍのフィルターを用いて、工程（ｉ’）の前記濾液を濾過し、その濾液を回収する更なる工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ｉｉ’）が下記工程：
（ａ）イオン交換カラム、好ましくは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）カラムに前記濾液を充填する工程；
（ｂ）適切な緩衝液、好ましくは、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を含む洗浄液で、前記カラムを洗浄する工程；
（ｃ）溶出緩衝液または溶媒を用いて、前記カラムからポリペプチドを溶出させる工程であって、好ましくは、前記溶出緩衝液が、更に５０ｍＭのＮａＣｌを含む前記洗浄液を含む、工程；および
（ｄ）工程（ｃ）の溶出液を回収する工程
を含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
ａ）工程（ｉ）における前記フィルターの孔径は、５〜１５μｍであり、好ましくは、前記孔径が７μｍであり；
ｂ）工程（ｉｉ）における前記フィルターの孔径は、０．３５〜０．５５μｍであり、好ましくは、前記孔径が０．４５μｍであり；
ｃ）工程（ｉｖ）における前記フィルターの排除サイズは、８０〜１２０ｋＤａであり、好ましくは、前記排除サイズが１００ｋＤａであり；および／または
ｄ）工程（ｖ）における前記フィルターの孔径が０．２２μｍである、
請求項２に記載の方法。
【請求項７】
ａ）工程（ｉ’）における前記フィルターの孔径は、５〜１５μｍであり、好ましくは、前記孔径が７μｍであり；
ｂ）請求項４における前記フィルターの孔径は０．３５〜０．５５μｍであり、好ましくは、前記孔径が０．４５μｍであり；および／または
ｃ）工程（ｉｖ’）における前記フィルターの孔径が０．２２μｍである、
請求項３〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉｉｉ）または（ｉｉｉ’）がダイアフィルトレーションを含む、請求項２〜７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
前記皮膚が、老化した皮膚または瘢痕皮膚である、請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
前記動物の皮膚の美容上の外観を改善することが、皮膚日射病の治療を含む、請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
前記改善が、美容上の外観または皺、小皺、色素沈着過剰、緩み、乾燥皮膚、鱗屑および／もしくは経表皮水分喪失の広がりにおける低減または予防を含む、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
前記動物の皮膚に潤いを与える、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
前記動物の皮膚の美容上の外観における改善が、瘢痕組織を減少若しくは最小限にすること、または、瘢痕の美容上の外観を改善することを含む、請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
前記瘢痕が創傷または線条の結果生じたものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記瘢痕がにきび瘢痕である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記線条が、萎縮性皮膚線条（ｓｔｒｉａｅ  ａｔｒｏｐｈｉｃａｅ）、妊娠線条（ｓｔｒｉａｅ  ｖｅｒｇｅｔｕｒｅｓ）、皮膚伸展線条（ｓｔｒｉａｅ  ｄｉｓｔｅｎｓａｅ）、皮膚萎縮線条（ｓｔｒｉａｅ  ｃｕｔｉｓ  ｄｉｓｔｅｎｓａｅ）、妊娠線（ｓｔｒｉａｅ  ｇｒａｖｉｄａｒｕｍ）、萎縮線条（ｌｉｎｅａｅ  ａｔｒｏｐｈｉｃａｅ）または白線（ｌｉｎｅａ  ａｌｂｉｃａｎｔｅ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記瘢痕が、皮膚治癒の増殖期または成熟期、好ましくは成熟期にある、請求項１３〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチドまたは美容組成物が、前記皮膚への局所投与用である、請求項１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
前記動物の皮膚の美容上の外観を改善することが、表皮および／または真皮に対する表層皮膚損傷を減少または最小限にすることを含む、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
哺乳類動物の皮膚の美容上の外観の改善に使用するための、請求項１〜８のいずれか１つに記載のポリペプチドまたは美容組成物であって、好ましくは、前記皮膚が、請求項９に記載の通りであり、美容上の外観の改善が、請求項１０〜１７若しくは１９のいずれか１つに記載の通りであり、および／または前記投与が、請求項１８に記載の通りである、ポリペプチドまたは美容組成物。
【請求項２１】
哺乳類動物の皮膚の美容上の外観を改善するための薬剤製造における請求項１〜８のいずれか１つに記載のポリペプチドまたは美容組成物の使用であって、好ましくは、前記皮膚が、請求項９に記載の通りであり、美容上の外観の改善が、請求項１０〜１７若しくは１９のいずれか１つに記載の通りであり、および／または前記投与が、請求項１８に記載の通りである、ポリペプチドまたは美容組成物の使用。
【請求項２２】
請求項２〜８のいずれか１つに記載の方法により得ることが可能な美容組成物であって、更に、工程（ｖ）または（ｉｖ’）の前記濾液から前記美容組成物を調製する工程を含む、美容組成物。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１つに記載の方法、使用、ポリペプチドまたは美容組成物であって、前記ポリペプチドまたは美容組成物は、製品、素材または道具に、被覆、含浸または化学結合させる、方法、使用、ポリペプチドまたは美容組成物。
【請求項２４】
請求項２〜８のいずれか１つに記載の方法にしたがって、ポリペプチドを単離する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚への様々な適用における、サケ科孵化液から抽出可能なポリペプチドの使用に関する。特に、当明細書に記載の前記ポリペプチドおよび／または当該ポリペプチドを含有する組成物は、皮膚の美容上の外観を変化させる、好ましくは改善するのに有用である。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、身体の中でより外傷を受けやすい臓器の１つである。皮膚は、直接的または間接的に、常時、外部刺激と関わっており、また、環境要因に暴露され且つ影響されることが多い。実際、皮膚は、外界との最初の接点とみなすことができる。このように常時暴露されることにより、不快なおよび／または不要な物理的且つ目に見える変化が皮膚に、特に、皮膚の美容上の外観に生じ得る。かかる変化は、人の健康を脅かすことはないかもしれないが、かかる変化は、身体的に不快または見掛け上不愉快な場合もある。実際、皮膚は非常に目に触れやすいため、皮膚の外観における変化は、心理的ストレスにつながることもある。従って、皮膚の状態を維持、回復または改善する、特に、皮膚の若々しい外観を回復するための効果的な療法に対する必要性と需要は継続的に存在している。
【０００３】
皮膚は、身体における最大の臓器であり、人の体重の約１２〜１６パーセントを占める。皮膚は、身体内の制御された環境と外界との間のバリアおよび調節作用としての多くの極めて重要な役割を果たす。
【０００４】
皮膚は、表皮、真皮および皮下組織の３層からなる。表皮は、皮膚の最上層の上皮層である。表皮は、物理的なバリアとして作用し、身体からの水分の損失を防ぎ、物質や生物の身体内への侵入を防ぐ。その厚さは、身体の部位によって異なる。
【０００５】
表皮は、重層扁平上皮からなる。すなわち、表皮は、扁平細胞の複数層からなる。皮膚、毛髪および爪は、角質化されており、つまり、ケラチンと呼ばれるタンパク質からなる、死んで硬化した疎水性の表面を有する。表皮は、特に、表皮の中間層（透明層）において、角化細胞に付随する細胞外脂質を含有することにより不浸透性となっている。粘膜（例えば、食道、口腔咽頭腔、生殖器およびその他の粘膜）は、大抵の場合、角質化されておらず、湿性である。表皮には、大きく分けて、角化細胞（皮膚細胞）、メラノサイト（色素形成細胞）およびランゲルハンス細胞（免疫細胞）といった３つのタイプの細胞がある。メルケル細胞は、４番目の有病率の低い表皮細胞である。
【０００６】
角化細胞は、外部に向かって移動するにつれ、ケラチンを蓄積することにより成熟し分化する。角化細胞は、やがて剥がれ落ちるかまたは摩擦により剥がれる。それらは、４層または５層の別個の層を形成し、最表層から最深層に向かって順番に、（ｉ）死んで乾燥した硬質で核のない細胞を有する角質層（Ｓｔｒａｔｕｍ  ｃｏｒｎｅｕｍ／ｈｏｒｎｙ  ｌａｙｅｒ）、（ｉｉ）好塩基性顆粒を含有し、薄い透明層により角質層から外側方向に分離された細胞を有する顆粒層（Ｓｔｒａｔｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ／ｇｒａｎｕｌａｒ  ｌａｙｅｒ）、（ｉｉｉ）細胞が上方に移動するにつれ次第に扁平になる有棘層（有棘（ｓｐｉｎｏｕｓ、ｓｐｉｎｙまたはｐｒｉｃｋｌｅ）細胞層）および（ｉｖ）円柱状の（長い）再生細胞を有する基底層（Ｓｔｒａｔｕｍ  ｂａｓａｌｅ／ｂａｓａｌ  ｌａｙｅｒ）となっている。
【０００７】
表皮のすぐ下には、表皮と真皮との間にある特殊構造体の基底膜がある。
【０００８】
真皮は、皮膚の支持層または線維性結合組織である。その主な繊維は、コラーゲン線維とエラスチンであり、それらは複雑に絡み合っている。
【０００９】
皮下組織（ｓｕｂｃｕｔｉｓ）は、真皮と表皮のすぐ下の脂肪層であり、「ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｔｉｓｓｕｅ」、「ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｓ」または「ｐａｎｎｉｃｕｌｕｓ」とも言われる。皮下組織は主に、脂肪細胞（ｆａｔ  ｃｅｌｌｓ／ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）、神経および血管から成る。
【００１０】
新しい上皮皮膚細胞は、皮膚の下位層である顆粒層で作られる。細胞は徐々に皮膚の表面に移動し、酸性度が高くなる。細胞は、３０日間かけて移動する間に、死んでケラチンで飽和した状態になる。ケラチンおよび関連する脂質は、外部要素から皮膚を保護するため、重要である。
【００１１】
疾病、外傷、環境因子、年齢、ホルモンレベル、薬剤、外用若しくは内服剤、遺伝子疾患、または、これらおよび他の要因の組合せを含む多様な要因が、皮膚の美容上の外観の劣化の原因となり得る。皮膚の美容上の外観における、加齢に伴う劣化は、普遍的要因、特に、光老化、すなわち皮膚日射病である。この劣化は、皮膚における不規則性または異常に見られることがあり、これは、例えば、乾燥皮膚、皺、小皺、悪化した緩み（たるみ）または異常色素沈着として現れる場合もある。
【００１２】
光老化は、長波長紫外線（ＵＶＡ）および中波長紫外線（ＵＶＢ）への慢性暴露により誘発される特性変化に用いられる用語である。代謝ストレスに対処する生物学的機能および能力の低下は、老化現象の主な影響の一つである。老化は、複雑な、進行性プロセスであり、皮膚における機能的および美的変化も引き起こす。
【００１３】
光老化は、自然光であっても合成光であってもよい、約２４５〜２９０ｎｍの紫外線への皮膚の連続的且つ長期的暴露に起因する、皮膚の老化プロセスである。従って、光老化は、長波長紫外線および中波長紫外線による、特に顔、耳、首および手の皮膚の老化としても知られている。
【００１４】
乾燥皮膚および／または鱗屑皮膚は、老化皮膚の最も一般的な徴候の一つである。中には乾燥皮膚および／または鱗屑皮膚に、よりなりやすい人もいるが、乾燥皮膚および／または鱗屑皮膚の外観は、年齢、性別または肌質にかかわらず、誰にでも影響を与え得る。
【００１５】
乾燥皮膚は、皮膚の外層（透明層を有する角質層）の水分が枯渇した場合、すなわち、経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ）によって生じる。この層が十分に湿潤である場合、皮膚を通しての水分喪失を最小限に抑え、刺激物質、アレルゲンおよび病原菌の侵入を防ぐのに役立つ。しかしながら、角質層が完全に乾燥した場合、その防御機能は低下する。これにより、更に多くの水分喪失が生じ、皮膚は環境因子に影響を受けやすい状態になる。
【００１６】
理想的には、角質層の含水量は、１０％〜３０％である。この水分が、皮膚に対し、柔らかく、滑らかで、弾力性のある質感、すなわち、皮膚の若々しい外観に伴う特質を付与する。水分は、周囲環境、皮膚の下位層および汗によりもたらされる。皮膚腺により産生される油と、皮膚細胞により産生される脂肪性の物質は、天然の保湿剤として作用し、角質層が水分を閉じ込めることを可能にする。
【００１７】
身体は、蒸発により皮膚の表面から絶え間なく水分を失っている（ＴＥＷＬ）。本来、損失速度はゆっくりであり、水分は適切に補給される。乾燥皮膚の特徴的な徴候および症状は、水分喪失が水分補給を上回り、角質層の含水量が１０％を下回った場合に生じる。
【００１８】
乾燥皮膚および／または鱗屑皮膚を改善または解消し、皮膚の美容上の外観を改善する保湿剤が非常に望ましい。当技術分野において、多くの保湿剤が公知となっているが、効果的でありながら皮膚に優しい自然製品に対する需要は依然として存在する。
【００１９】
不所望なまたは過度の色素沈着、すなわち、色素沈着過剰、たとえば、肝斑などを呈する表皮細胞は、老化皮膚の別の一般的な徴候である。慣例上、角質除去により、皮膚の美容上の外観に悪影響をもたらす表皮細胞を除去し得る。
【００２０】
角質除去は、表皮の外側の層を除去し、下のより新しい皮膚細胞を露出させる。角質除去は、物理的手段（すなわち、皮膚の剥削）または化学的手段により行い得る。化学的角質除去剤としては、サリチル酸、グリコール酸、フルーツ酵素、クエン酸またはリンゴ酸を含むスクラブが挙げられ、皮膚科医による高濃度のものまたは市販薬における低濃度のものを適用し得る。化学的角質除去は、α−ヒドロキシ酸（ＡＨＡ）若しくはβ−ヒドロキシ酸（ＢＨＡ）、または細胞間結合部位において細胞を結合する接着剤様の物質を薄め、結合部位を緩めるよう作用する酵素を含有する製品の使用を伴う場合もある。このタイプの角質除去は、ざ瘡を治療する人々に推奨される。
【００２１】
角質除去の最大のデメリットは、角質除去を行うために使用される方法や製品が一部高価であることである。角質除去は、当初幾分か皮膚の紅赤をもたらすことがある。化学薬品によるピーリングの終了間近に、皮膚は白っぽくなり、皮膚表面は、明るい白色から灰色まで多種多様の色になることがある。
【００２２】
従って、角質除去よりも皮膚に優しい、皮膚の色素沈着過剰を低減する効果的な方法が望ましい。
【００２３】
老化に加え、物理的損傷は、皮膚の美容上／美的外観を損なわせる場合もある。例えば、軽度の擦過傷、引っ掻き傷等による、皮膚の上（表）層、すなわち、表皮および／または真皮への表面的損傷は、皮膚に不所望な染みを残す場合もある。例えば、創傷、切り傷、感染、ざ瘡などにより生じた、皮膚への物理的損傷は、傷跡を残す場合もある。
【００２４】
創傷は、構造上の組織の完全性が物理的に損なわれる、特に、機械的、化学的、熱的または病原性といった手段により生じた外部または内部損傷である。
【００２５】
瘢痕は、外傷を受けた後、正常な皮膚に取って替わる繊維組織（線維症）の部分である。瘢痕は、身体の皮膚および他の組織における創傷治癒の生物学的過程により生じる。よって、瘢痕形成は、治癒過程の自然な一部である。極軽度の損傷を除いて、全ての（例えば、事故、疾病または手術後の）創傷は、ある程度の瘢痕形成を引き起こす。
【００２６】
瘢痕組織は、機能的にも美容上も、正常な損傷のない皮膚に劣る。この劣等性は、新しい組織形成中に生成される真皮内のコラーゲン線維束の配列の結果であると考えられている。正常な皮膚内のコラーゲン線維束は、皮膚に対し高度の弾力性および損傷に対する復元性を付与する、複雑な３次元の網目配列（「斜子織り（ｂａｓｋｅｔ−ｗｅａｖｅ）」配列と呼ばれることが多い）に配列されている。瘢痕組織内のコラーゲン線維束は、繊維束が、皮膚の表面に平行に配向され、比較的平面的に配列されている。コラーゲン線維束の３次元の網目の消失およびそれに替わる平行配列により、組織の瘢痕形成部位の美容が失われると考えられている。
【００２７】
瘢痕形成はまた、皮膚の個々の層の破壊により生じる場合もある。例えば、伸展線（線条としても知られている）は、真皮の裂傷により生じる。伸展線は、急速な成長（思春期によく見られる）または体重増加（例えば、妊娠、筋肉増強若しくは急速な脂肪の増加）に付随する皮膚の急速な伸長、あるいは、場合によっては、真皮の弾力性を超える、皮膚上での強い引張力が原因である場合が多い。伸展線はまた、思春期、妊娠、筋肉増強、性転換者のためのホルモン補充療法等に付随するホルモンの変化により影響を受ける場合もある。この種のマーキングは、萎縮性皮膚線条（ｓｔｒｉａｅ  ａｔｒｏｐｈｉｃａｅ）、妊娠線条（ｓｔｒｉａｅ  ｖｅｒｇｅｔｕｒｅｓ）、皮膚伸展線条（ｓｔｒｉａｅ  ｄｉｓｔｅｎｓａｅ）、皮膚萎縮線条（ｓｔｒｉａｅ  ｃｕｔｉｓ  ｄｉｓｔｅｎｓａｅ）、妊娠線（ｓｔｒｉａｅ  ｇｒａｖｉｄａｒｕｍ；妊娠により生じる場合）、萎縮線条（ｌｉｎｅａｅ  ａｔｒｏｐｈｉｃａｅ）、白線（ｌｉｎｅａ  ａｌｂｉｃａｎｔｅ）、または単に、線条（ｓｔｒｉａｅ）として知られている。
【００２８】
従って、皮膚の美的外観を向上させるのに適した療法に対する需要はいまだ存在している。すなわち、皮膚の美容上の外観を改善する方法が望ましい。特に、老化皮膚を若々しい外観に戻す方法および／または老化皮膚の徴候対策のための方法に対する需要がある。また、表面的に損傷を受けた皮膚、例えば、表皮および／若しくは真皮への軽度の損傷による染みまたは瘢痕皮膚などの外観の改善、回復またはその対策のための方法に対する需要もある。
【００２９】
サケ科孵化液、すなわち、ロイコレクチンとして知られているポリペプチドに見られるある分子が、驚いた事に、皮膚の美容上の外観の改善、特に、老化皮膚に付随する理学的徴候の低減および表面的に損傷を受けた皮膚の外観の回復に極めて有効であることが現在分かっている。
【００３０】
当初、前記タンパク質は、魚において同定され、魚から精製されたが、これは、その全ての内容を参照により本明細書に援用する国際公開第２０１０／０４９６８８号パンフレット（特許文献１）に記載されている。サケのタンパク質は、２５５個のアミノ酸を有する（配列番号１）。これは、ポリペプチドのプロペプチド型であり、１９アミノ酸Ｎ末端ペプチドを含み、このペプチドは、後の分泌（すなわち、囲卵腔内への分泌）の際のリソソームを標的としていることを示唆している。
【００３１】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列により、エピトープに特異的な抗体の開発が可能となり、引いては、分析した組織によっては、このタンパク質の多く（２〜８）の見せ掛けのアイソフォームの同定が可能となった。少なくとも２個のｍＲＮＡがサケから単離されており、ポリペプチドレベルでわずか７つの変化を生じさせるのみのわずかな配列の相違を有するものである。このタンパク質の切断型は、サケ白血球（配列番号２を参照）からも同定されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３２】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０４９６８８号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３３】
このタンパク質は、公知たんぱく質のいずれともほとんど類似点がなく、任意の公知のタンパク質との全般的な類似性は５０％未満である。タキロレクチン（ｔａｃｈｙｌｏｌｅｃｔｉｎｓ）との若干の類似性が、小さなドメインにおいて観察された。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
これらのタンパク質は、驚いた事に、皮膚の美容上の外観に著しい効果を有することが分かった。理論に縛られたくはないが、ロイコレクチンが、亜鉛依存性エンドペプチダーゼであるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の、皮膚線維芽細胞からの放出を抑制できることは、実施例が実証している。これらの酵素は、皮膚の細胞外基質に存在する多くの異なる種類のタンパク質、例えば、コラーゲン等を分解することができ、これら酵素の放出の抑制が、少なくとも部分的に、皮膚の美容上／美的外観に対するこれらタンパク質の効果に関与していると考えられる。
【００３５】
従って、最も広範囲の態様において、本発明は、皮膚の美的外観の向上に使用する、または皮膚の美的外観を向上させる方法に使用する、本明細書に記載のポリペプチドを提供するものとみなし得る。すなわち、皮膚の美容上の外観の改善に使用する、または皮膚の美容上の外観を改善する方法に使用する、本明細書に記載のポリペプチドである。特に好ましい態様において、本発明は、老化皮膚の若々しい外観への回復および／または老化皮膚の徴候に対する対策に使用する、または老化皮膚を若々しい外観に回復させるためのおよび／または老化皮膚の徴候に対する対策のための方法に使用する、本明細書に記載のポリペプチドを提供するものとみなしてもよい。本発明の別の好ましい態様は、表面的に損傷を受けた皮膚の外観、例えば、表皮および／または真皮に対する軽度の損傷による瘢痕皮膚または染みなどの改善、回復または対策に使用する、またはそれらの改善、回復または対策のための方法に使用する、本明細書に記載のポリペプチドを提供するものとみなしてもよい。
【００３６】
本明細書に記載のポリペプチドを、１つ以上の生理学上または医薬上許容される賦形剤および／または希釈剤を含む美容組成物に提供し得ることは、下記開示から明白となる。
【００３７】
従って、本発明は、一態様において、哺乳類動物の皮膚の美容上の外観の改善に使用するための、
（ｉ）配列番号１〜４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列若しくは当該配列と少なくとも９０％同一である配列、または当該配列のいずれかの一部を含むポリペプチド、または
（ｉｉ）（ｉ）および１つ以上の生理学上若しくは医薬上許容される賦形剤および／または希釈剤を含む美容組成物を提供する。
【００３８】
本発明はまた、上述のポリペプチドまたは美容組成物を哺乳類動物に投与する、当該動物の皮膚の美容上の外観を改善する方法を提供する。
【００３９】
本発明の更なる態様は、哺乳類動物の皮膚の美容上の外観を改善する薬剤の製造における、上述のポリペプチドまたは美容組成物の使用である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、本発明のポリペプチドを含む組成物を用いて治療した被験者の、治療前（ベースライン）、治療の２週間後および１２週間後の写真を示す。老化皮膚の様々な徴候の低減が、２週間後および１２週間後のいずれにおいても明らかである。記載されている値は、３５名の参加者に関する平均変化を示す。
【図２】図２は、本発明のポリペプチドを含む組成物を用いた治療の２週間後および１２週間後に見られた小皺および皺の低減を強調する、図１の被験者のクローズアップ写真を示す。
【図３】図３は、本発明のポリペプチドを含む組成物を用いて治療した被験者の、治療前（ベースライン）および治療の１２週間後のクローズアップ写真を示す。円で囲んだ部位は、治療の１２週間後の皺の明瞭な低減を示す。
【図４】図４は、顔面の両側に関する触覚的／視覚的臨床評価に基づき、老化の様々な徴候が改善されたとみなされる被験者の割合を示す棒グラフである。
【図５】図５は、本発明のポリペプチドを含む組成物を用いて３週間に渡って１日２回治療した後、未治療の状態と比較した４名の被験者に基づく、約２３％の皮膚水分量の平均増加量を示す棒グラフである。
【図６】図６は、本発明のポリペプチドを含む組成物を用いて３週間に渡って１日２回治療した後、未治療の状態と比較した４名の被験者に基づく、約１４．５％の経表皮水分喪失量の平均減少量（皮膚バリア機能の向上）を示す棒グラフである。
【図７】図７は、本発明のポリペプチドを含む組成物を用いて３週間に渡って１日２回治療した後、未治療の状態と比較した４名の被験者に基づく、約２３％の目皺の量の平均減少量を示す棒グラフである。
【図８】図８は、本発明のポリペプチドを含む組成物を用いて３週間に渡って１日２回治療した後、未治療の状態と比較した４名の被験者に基づく、約１０％のメラニン含有量の平均減少量を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本明細書でいう「ポリペプチド」とは、好ましくは５０、１００、１５０、２００若しくは２５０を超える残基および／または５００、４００、３００、２００若しくは１００未満の残基を有するか、あるいはそれらから選択される範囲の数の残基を有する分子のことである。本明細書でいう「一部（ｐｏｒｔｉｏｎ）」は、好ましくは、その一部が抽出される配列の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０以上のアミノ酸を含む。当該一部は、前記配列の中央部、Ｎ末端部またはＣ末端部から得られ得る。好ましくは、当該一部は、ポリペプチドのＮ末端端部、例えば、最初の５０、１００または１５０の残基から得られる。あるいは、好ましくは、ポリペプチドのＣ末端端部、例えば、最後の５０、１００または１５０の残基から得られる部分である。特に好ましい態様は、例えば、天然に存在する変異体にはない部分またはシグナルペプチドを除去するための、当該ポリペプチドの切断を含む。好ましい切断は、Ｎ末端端部で生じ、長さは、１〜５０の残基長、例えば、１〜１０、２０、３０若しくは４０または５〜４０の残基長、例えば、１０〜３５の残基長などである。
【００４２】
好ましくは、当該配列は、比較する配列と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【００４３】
配列同一性は、例えば、可変パムファクター（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｐａｍｆａｃｔｏｒ）、１２．０に設定されたギャップ生成ペナルティーおよび４．０に設定されたギャップ伸長ペナルティー、並びに２つのアミノ酸のウインドウを備えたＦＡＳＴＡ  ｐｅｐ−ｃｍｐを用いるＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴのタンパク質配列データベースを使用することにより決定し得る。好ましくは、当該比較は、配列の全長に渡って行われるが、小さい比較ウインドウで、例えば、２００、１００または５０未満の連続アミノ酸について行われてもよい。
【００４４】
好ましくは、かかる配列同一性関連ポリペプチドは、上述の配列番号に記載のポリペプチドに機能的に同等である。かかる機能的に同等のポリペプチドは、後述するように、誘導体の形を取ってもよい。同様に、前記配列番号に記載の配列を有するポリペプチドは、後述するようにポリペプチドの配列に影響を及ぼすことなく修飾されてもよい。
【００４５】
更に、本明細書に記載の「一部（ｐｏｒｔｉｏｎｓ）」は、機能的に同等であり得る。好ましくは、これら一部は、本明細書に記載された同一性（同等の領域に対する同一性）条件を満たす。
【００４６】
本明細書に記載の如く、「機能的同等性」を得るため、ポリペプチドは、親分子（つまり、例えば、アミノ酸置換によりポリペプチドが抽出された分子）と比較して、美容上の機能を果たす上で有効性が幾分低下する場合があるが、好ましくは、同等に効果的であるかより効果的である。よって、機能的同等性は、本明細書に記載の如く、皮膚の美容上の外観を改善する上で有効なポリペプチドに関連がある。これは、例えば、実施例に記載の生体内分析を行うことにより、誘導体ポリペプチドの効能を、定性的又は定量的な方法で誘導体ポリペプチドが抽出されるポリペプチドと比較することでテストし得る。定量的結果が可能な場合、誘導体は、親ポリペプチドの少なくとも３０％、５０％、７０％または９０％の効果を有する。または、例えば、体外細胞培養液中におけるＭＭＰの放出抑制分析により、生体外テストを行ってもよい。
【００４７】
天然に存在するタンパク質に関連したまたは天然に存在するタンパク質から抽出される機能的に同等なタンパク質は、分子の機能を損なうことなく、１つまたは複数のアミノ酸置換、付加および／または欠失（それらが、上述の配列同一性要件を満たす場合）によって天然アミノ酸配列を修飾することにより得られ得る。好ましくは、前記天然配列は、置換、付加または欠失が２０箇未満、例えば、かかる修飾が１０、５、４、３、２、または１個未満である。かかるタンパク質は、１つ以上の塩基の適切な置換、付加および／または欠失により生成される「機能的に同等な核酸分子」によりコード化される。
【００４８】
好ましい機能的等価物は、アミノおよび／若しくはカルボキシ末端融合タンパク質またはポリペプチドが産生される「付加」変異体であり、親ポリペプチドに融合した付加タンパク質またはポリペプチドを含む。
【００４９】
特に好ましい機能的に同等な変異体は、天然の生物学的変異体であり、特に、同種内におけるか、またはサケ科、特に、タイセイヨウサケ亜科およびタイヘイヨウサケ亜科ではない属における対立遺伝子変異体若しくは地理的変異体、並びに公知の技術を用いて調製された誘導体である。とくに好ましいサケ科の種類としては、タイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）およびタイヘイヨウサケ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍａｓｏｕ）が挙げられる。
【００５０】
上述のポリペプチドは、ポリペプチドの配列に影響を及ぼすことなく、例えば、糖鎖除去または糖鎖付加を含む化学修飾により修飾されるものを含む。かかるポリペプチドは、例えば、特定の残基の一定の糖鎖付加やメチル化等、機能性に影響を及ぼすことなく、ポリペプチドを単離後修飾することにより調製してもよい。
【００５１】
本発明に従って使用するポリペプチドまたは本発明の組成物に使用するポリペプチドはまた、ポリペプチドの機能的特性が保持はされるが異なった、例えば、非ペプチド構造として提示される誘導体とみなされ得るペプチド模倣薬の形を取ってもよい。かかるペプチド模倣薬は、成功裏に開発されており、他の、特に医療の用途に使用されている。
【００５２】
ペプチド模倣薬、特に非ペプチド性分子は、立体配座をベースとする薬物設計、スクリーニング、集中ライブラリーデザインおよび古典的医薬品化学を含む様々なプロセスを通じて生成し得る。非天然アミノ酸のオリゴマーまたは他の有機的構成要素を使用し得るのみならず、炭水化物、複素環若しくは大環状化合物、またはペプチドの三次元立体配座の同様の特性を模倣する分子静電表面を付与する立体配座および構造要素を含む任意の有機分子も当技術分野において公知の方法により使用し得る。
【００５３】
従って、ペプチド模倣薬は、ペプチド骨格に殆どまたは全く類似していない場合もある。ペプチド模倣薬は、完全に合成の非ペプチド型（例えば、適切な置換基を有する炭水化物骨格をベースとするもの）を含んでいてもよく、また、例えば、１つ以上のアミノ酸を誘導体化すること若しくは１つ以上のアミノ酸を代替非ペプチド成分で置換することにより、ベースとするペプチドの１つ以上の要素を保持していてもよい。ペプチド様鋳型には、偽ペプチドおよび環状ペプチドが含まれる。ペプチドの機能に不必要だと思われる構造要素は、足場機能のみを保持するよう最小限に抑えるかまたは必要に応じて除去してもよい。
【００５４】
ペプチド模倣薬が１つ以上のペプチド成分、すなわち２つ以上のアミノ酸を保持する場合、かかるアミノ酸は、その非標準または構造類似体で置換してもよい。配列中に保持されるアミノ酸はまた、本発明のポリペプチドの機能特性が保持される限り、誘導体化または修飾（例えば、標識化、グリコシル化若しくはメチル化）してもよい。ペプチド模倣薬は、一定のポリペプチド配列「から導出可能」であるとされる。これは、ペプチド模倣薬は、機能する上で不可欠なペプチドの構造特性を保持するように、特定のポリペプチド配列を基準にしてデザインされるということを意味する。これは、ポリペプチドの特定の側鎖、またはその構造の水素結合能であってもよい。かかる特性は、非ペプチド構成成分若しくは１つ以上のアミノ酸残基により付与されてもよく、またポリペプチドの当該アミノ酸残基を結びつける結合は、機能する上で不可欠なポリペプチドの構造特性を保持しながら、安定性またはプロテアーゼ耐性といった、ポリペプチドの一定の機能が向上するよう修飾されてもよい。
【００５５】
使用可能な非標準または構造類似体アミノ酸の例としては、Ｄアミノ酸、アミドアイソスター（Ｎ−メチルアミド、反転（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｅ）アミド、チオアミド、チオエステル、ホスホン酸塩、ケトメチレン、ヒドロキシメチレン、フルオロビニル、（Ｅ）−ビニル、メチレンアミノ、メチレンチオまたはアルカン等）、Ｌ−Ｎメチルアミノ酸、Ｄ−［α］メチルアミノ酸、Ｄ−Ｎ−メチルアミノ酸が挙げられる。新規アミノ酸の例は、表１に記載している。
【００５６】
【表１】
2014520135.tif 000002
2014520135.tif 000003
2014520135.tif 000004
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【００５７】
使用可能な非標準アミノ酸としては、例えば、Ｔｉｃ（Ｆを置換する）、Ａｉｂ（Ａを置換する）またはピペコリン酸（プロリンを置換する）など、配座固定された類似体が挙げられる。
【００５８】
上述のポリペプチドはまた、例えば、親油性、細胞輸送、溶解性および／または安定性を向上させるため、例えば、標的基または官能基の付加により、例えば、美容上用途（後述する）における使用を容易にするよう修飾された誘導体も含む。従って、オリゴ糖、脂肪酸、脂肪アルコール、アミノ酸、ペプチドまたはポリペプチドを、前述のポリペプチドまたは核酸分子に共役させてもよい。
【００５９】
ポリペプチドはまた、投与後、切断、例えば、エステラーゼの作用により除去され得るエステル化を通して付加された置換基の切断などによって付加構成成分が除去され得るように、「プロドラッグ」または「プロペプチド」の形態で誘導体も含む。かかるプロドラッグは、対象のポリペプチドを得るため、例えば、タンパク質分解により切断される天然に存在するタンパク質の天然前駆物質を含む。かかる前駆物質は、前駆物質の形態では不活性である場合もあるが、タンパク質切断により活性化され得る。上述のような修飾ポリペプチドは、テストし、同一または同様の医療上の効果を有するかどうかを判定することにより、無修飾分子と比較して、確実に機能活性を保持するようにし得る。
【００６０】
本明細書に記載の本発明の使用および組成物において使用されるポリペプチドは、天然に存在する供給源から得られるかまたは抽出される。
【００６１】
便宜上、ポリペプチドは、実施例に記載のプロトコールに従って単離される。かかる方法およびかかる方法の生成物は、本発明の別の態様を成す。
【００６２】
従って、本発明は、別の態様において、（ｉ）ポリペプチドを単離する方法、あるいは（ｉｉ）少なくとも、下記工程：
ａ）最小量（例えば、前記卵の量と同等以下）の水に、サケ科の卵を懸濁させる工程；
ｂ）当該卵の同期化させた急速孵化を（好ましくは、９５％を超える胚について、２時間未満に孵化が完了するように）誘発する工程；
ｃ）任意に、孵化した卵を濾過し、孵化液を得る工程；および
ｄ）前記孵化液を濾過し、ポリペプチドおよび／または組成物を得る工程
を含む、サケ科孵化液（例えば、サケ孵化液）から本明細書に記載の美容組成物を調製する方法を提供する。
【００６３】
任意に、上記の方法から得られたか、または得ることが可能な生成物は、本発明の方法および使用において、前記生成物の使用に先立って適切な濃度に希釈または濃縮してもよい。
【００６４】
第１の実施の形態において、前記孵化液を濾過する工程は、
（ｉ）孔径が少なくとも５μｍ、好ましくは５〜１５μｍ、特に好ましくは孔径７μｍのフィルターを用いて前記孵化液を濾過し、その濾液を回収する工程；
（ｉｉ）孔径が０．３０〜０．６０μｍ、好ましくは孔径０．３５〜０．５５、特に好ましくは０．４０〜０．５０μｍ、最も好ましくは０．４５μｍのフィルターを用いて、工程（ｉ）の濾液を濾過し、その濾液を回収する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の濾液中の水を、医薬上許容される緩衝液と交換する工程；
（ｉｖ）排除サイズが少なくとも８０ｋＤａ、好ましくは８０〜１２０ｋＤａ、最も好ましくは排除サイズが１００ｋＤａのフィルターを用いて、工程（ｉｉｉ）において得られた溶液を濾過し、その濾液を回収する工程；および
（ｖ）孔径が０．１５〜０．３０μｍ、好ましくは孔径０．２２μｍのフィルターを用いて、工程（ｉｖ）の濾液を濾過し、その濾液を回収する工程
を含むいくつかの工程を有していても良く、当該濾液が、前記ポリペプチドを含む組成物を提供する。この方法により得られる生成物は、本発明の別の態様を成す。
【００６５】
または、第２の実施の形態において、前記孵化液を濾過する工程は、
（ｉ）孔径が少なくとも５μｍ、好ましくは５〜１５μｍ、特に好ましくは孔径７μｍのフィルターを用いて孵化液を濾過し、その濾液を回収する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）の濾液を、イオン交換クロマトグラフィーに供し、その溶出液を回収する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の溶出液中の水を、医薬上許容される緩衝液と交換する工程；および
（ｉｖ）孔径が０．１５〜０．３０μｍ、好ましくは孔径０．２２μｍのフィルターを用いて工程（ｉｉｉ）において得られた溶液を濾過し、その濾液を回収する工程を含むいくつかの工程を有していても良く、当該濾液が、当該ポリペプチドを含む組成物またはその一部を提供する。この方法により得られる生成物は、本発明の別の態様を成す。
【００６６】
いくつかの実施の形態において、最初の濾過工程よりも孔径の小さいフィルターを用いて、工程（ｉ）の濾液を更なる濾過工程に供することが有益である場合もある。これは、孵化液の物質がイオン交換カラムを詰まらせる（すなわち、イオン交換カラムを通過する液体の流れを阻害する）のを防止するのに役立つ場合もある。よって、前記孵化液を濾過する工程は、任意の工程：
（ｉ’）孔径が０．３０〜０．６０μｍ、好ましくは孔径０．３５〜０．５５、特に好ましくは０．４０〜０．５０μｍ、最も好ましくは０．４５μｍのフィルターを用いて工程（ｉ）の濾液を濾過し、その濾液を回収する工程を含んでいてもよい。
【００６７】
好ましくは、前記任意の濾過工程は、（ｉ）の濾液をイオン交換クロマトグラフィーに供する工程の前に行われる。よって、イオン交換クロマトグラフィーに供する濾液は、工程（ｉ）または工程（ｉ’）にて得られた濾液であり得る。
【００６８】
例としての実施形態において、工程（ｉｉ）は、
（ａ）ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）カラムなどのイオン交換カラムに前記濾液（工程（ｉ）または工程（ｉ’）の濾液）を充填する工程；
（ｂ）適切な緩衝液、例えば、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を含む洗浄液で、前記カラムを洗浄する工程；
（ｃ）塩、例えば、５０ｍＭのＮａＣｌを更に含む前記洗浄液などの溶出緩衝液または溶媒を用いて、前記カラムからポリペプチドを溶出させる工程；および
（ｄ）工程（ｃ）の溶出液を回収する工程
を含む。
【００６９】
従って、孵化液を濾過する一般的な方法は、上記方法における工程（ｉ）；孔径が０．３０〜０．６０μｍのフィルターを使用する上記第１の方法における工程（ｉｉ）および／またはイオン交換クロマトグラフィーを用いる第２の方法における工程（ｉｉ）；上記方法における工程（ｉｉｉ）；任意に、排除サイズが少なくとも８０ｋＤａのフィルターを用いる上記第１の方法における工程（ｉｖ）および孔径が０．１５〜０．３０μｍのフィルターを用いる上記第１の方法における工程（ｖ）（上記第２の方法における工程（ｉｖ）に相当）を含んでいてもよい。
【００７０】
前記濾液はそれ自体が美容組成物となり得るが、任意に、上記方法により得られたか、または得ることが可能な生成物（第１の実施の形態の工程（ｖ）または第２の実施の形態の工程（ｉｖ）の濾液）は、本発明の使用および方法における、その使用に先立って、適切な濃度に希釈（または濃縮）してもよい。よって、前記方法は、前記組成物を希釈（または濃縮）する更なる工程を含んでいてもよい。好ましくは、前記濾液は、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、５０、１００、１０００、５０００または１００００倍希釈（または濃縮）してもよい。
【００７１】
任意に、１つ以上の医薬上許容される賦形剤および／または希釈剤を、上記方法により得られたか、または得ることが可能な生成物に付加してもよい。よって、前記方法は、１つ以上の医薬上許容される賦形剤および／若しくは希釈剤を前記組成物に付加する、または１つ以上の医薬上許容される賦形剤および／若しくは希釈剤を前記組成物と混合する更なる工程を含んでいてもよい。調製方法の代替または付加的な工程は、前記溶媒の、例えば、ｐＨ、イオン濃度等を変更または修正することを含む。
【００７２】
他の医薬上許容される成分または原料を、上記方法にて得られたか、または得ることが可能な生成物に付加してもよい。他の１つ以上の成分が、有効成分、すなわち、皮膚に効果のある、好ましくは、皮膚の美的外観を改善するか、または、例えば、本明細書に記載している美容上の徴候において、皮膚の美容上の外観を改善する作用もする成分であってもよい。よって、代替的にまたは付加的に、前記方法は、前記組成物に１つ以上の医薬上許容される有効成分を付加するまたは１つ以上の医薬上許容される有効成分と前記組成物を混合する更なる工程を含んでいてもよい。医薬上許容される有効成分は、より詳細に後述するように、ミネラル類、ビタミン類、酵素類、タンパク質類、ペプチド類、アミノ酸類、脂質類、抗酸化剤、多糖類、日焼け止めフィルターとして適した物質、化学的角質除去剤、抽出物およびそれらの混合物を含んでいてもよい。
【００７３】
上記方法において得られたか、または得ることが可能な単離されたポリペプチドおよび／または美容組成物は、本明細書の他の部分に記載しているように、本発明の方法における使用に適している。特に、前記美容組成物は、哺乳類動物における皮膚の美容上の外観を改善するのに使用される。
【００７４】
前記濾液をイオン交換クロマトグラフィーに供する工程は、本発明のポリペプチド（上述のようにその一部を含む）が、精製前に（すなわち、イオン交換クロマトグラフィー前に）孵化液抽出物中に存在する他のポリペプチドのうち少なくとも１つと比べてより濃縮されている濾液が得られる任意の適した方法を用いて行ってもよい。例えば、イオン交換クロマトグラフィーにより、本発明のポリペプチドが、この精製工程前に孵化液抽出物中に存在する他のポリペプチドのうち少なくとも１つ、好ましくは他のポリペプチド全てと比べて少なくとも５％濃縮されている溶出液を得ることも可能である。他のポリペプチドとは、上述のように本発明の方法において使用するためのポリペプチド（つまり、ロイコレクチン）の構造および／または機能定義の範囲にないポリペプチドと定義し得る。好ましくは、前記ポリペプチドは、この工程により、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％濃縮される。特に好ましくは、前記ポリペプチドは、精製前の孵化液抽出物中に存在する他のポリペプチドのうち少なくとも１つと比べて５０％または６０％を超える純度、例えば、７０％、８０％または９０％を超える、好ましくは９５％または９９％を超える純度に精製される。よって、前記溶出液は、イオン交換クロマトグラフィー前の孵化液中に存在する他のポリペプチドを微量のみ、例えば、重量比で０．１％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％または０．００００１％未満含んでいてもよい。
【００７５】
イオン交換クロマトグラフィーは、当技術分野において周知であり、適したイオン交換カラムが市販されている。例としての一実施形態において、イオン交換カラムは、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）カラム、すなわち、ＤＥＡＥに結合しているセルロース、シリカ、セファロース等の不活性な基質のカラムである。しかしながら、他のイオン交換カラムが、上述の方法における使用に適している場合もあり得る。
【００７６】
前記の濾過された孵化液をイオン交換カラムに充填する工程は、本発明のポリペプチドを結合できるように準備または活性化されているイオン交換カラムに孵化液を適用することを含む。イオン交換カラムの準備または活性化は、一般的に、緩衝液、例えば、後述のような洗浄緩衝液でのカラムの洗浄を伴う。この予洗工程により、ポリペプチドのカラムへの結合を可能にする最適な状態（例えば、ｐＨ）にあるイオン交換カラムとなる。よって、前記充填工程は、本発明のポリペプチドをイオン交換カラムに結合させる工程とみなし得る。
【００７７】
前記の濾過された孵化液をイオン交換カラムに充填する工程の後、標準プロトコールに従い、前記カラムを適切な緩衝液で洗浄し、カラムに結合されていない孵化液中に存在する不要な成分を除去してもよい。洗浄は、一定量の洗浄緩衝液のカラムへの適用を伴い、一般的に、カラムに適用される一定量の洗浄緩衝液は、イオン交換カラムの容積と少なくとも同等であり、前記カラムの容積より多い、例えば、少なくとも１．５、２、３、４または５倍であってもよい。実施の形態によっては、前記洗浄工程は、例えば、２、３、４、５回またはそれ以上繰り返してもよい。本発明の方法においては、任意の適した洗浄緩衝液を利用し得る。適した洗浄緩衝液とは、対象のポリペプチドとイオン交換カラムとの相互作用を著しく妨害することのないものであり、例えば、本発明のポリペプチドの１０％未満、例えば、５％、４％、３％、２％又は１％未満が、各洗浄工程によりイオン交換カラムから除去されるものである。好ましい実施の形態において、前記洗浄緩衝液は、１０〜１００ｍＭ、好ましくは１０〜５０ｍＭ、例えば、２０〜３０ｍＭの範囲の、ｐＨが６〜１０、好ましくは７〜９の範囲内、例えば、８．５であるトリス−ＨＣｌ溶液である。前記洗浄工程の素通り画分は、例えば、更なる洗浄工程が必要かどうかを決定する（例えば、精製前に孵化液に存在する不要な成分を代表するポリペプチド、多糖類、塩類等の存在をテストする）ために、回収し廃棄するかまたは回収若しくは廃棄してもよい。
【００７８】
イオン交換カラムからポリペプチドを溶出させる工程は、任意の適切な手段により行うことが可能で、一般的に、溶媒または溶液をカラムに適用し、対象のポリペプチドとイオン交換カラムとの相互作用を妨害することを伴う。一般的に、カラムに適用する溶出緩衝液または溶媒の量は、イオン交換カラムの容積と少なくとも同等であり、それ以上、例えば、カラムの容積の少なくとも１．５、２、３、４または５倍であってもよい。実施の形態によっては、溶出工程を、例えば、２、３、４、５回またはそれ以上繰り返してもよい。前記溶出液（溶出工程の素通り画分）は、各溶出工程から回収してもよく、また、溶出液中の水を交換する工程の前に１つ以上の溶出液を混合してもよい。適した溶出緩衝液または溶媒は、本発明のポリペプチドとイオン交換カラムとの相互作用を妨害するものであり、例えば、カラムに結合された本発明のポリペプチドの、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％が、各溶出工程によりカラムから溶出される。
【００７９】
好ましい実施の形態において、前記溶出緩衝液は、ポリペプチドとイオン交換カラムとの相互作用を妨害することのできる物質（例えば、塩）も含む洗浄緩衝液と同一である。よって、実施の形態によっては、前記溶出緩衝液は、ｐＨが６〜１０、好ましくは７〜９の範囲内、例えば、８．５であり、更に１０〜５００ｍＭ、好ましくは２０〜４００ｍＭ、３０〜３００ｍＭ、４０〜２００ｍＭまたは５０〜１００ｍＭの範囲、例えば、５０ｍＭのＮａＣｌの塩、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌなども含む、１０〜１００ｍＭ、好ましくは１０〜５０ｍＭ、例えば、２０〜３０ｍＭの範囲のトリス−ＨＣｌ溶液である。
【００８０】
前記濾液または溶出液中の水を交換する工程は、当技術分野において公知の任意の適した方法、例えば、ダイアフィルトレーションまたは透析法を用いて行ってもよい。特に好ましい実施の形態において、この工程は、排除サイズが１５ｋＤａ未満、好ましくは１０ｋＤａ以下、例えば、９、８、７、６、５、４、３ｋＤａ以下のフィルターを使用するダイアフィルトレーションを用いて行われる。
【００８１】
ダイアフィルトレーションでは、例えば、塩または他の不要な若しくは不所望の微小溶質を溶液から除去するため、または、溶液の溶媒、例えば、緩衝液を交換する方法として限外濾過膜を使用する。残余分（フィルターを通過しない物質）中の大分子を保持しながら、小分子は、溶液から分離される。微小溶質および溶媒、例えば、水は、一般に、膜を通して容易に洗浄される。一般的に、約３倍量のダイアフィルトレーション溶媒は、９５％の微小溶質を除去する。よって、第１の方法の工程（ｉｉ）の上記濾液または第２の方法の工程（ｉｉ）の溶出液は、最初にダイアフィルトレーションにより処理され、これにより、溶液（孵化液の不要な画分／可溶性不純物を含む）の一部が膜を通過するにつれ、残余分の濃縮物が得られる。そして、前記の残余分を医薬上許容される緩衝液、例えば、０．５ｍＭリン酸ナトリウムおよび１ｍＭ塩化ナトリウム、リン酸緩衝食塩水などで希釈する。この希釈された残余分は、必要に応じて、繰り返しダイアフィルトレーションに供してもよい。
【００８２】
同期化させた孵化は、当技術分野において公知の任意の適した方法により行われても良い。例えば、光操作を用いて、例えば、卵を（孵化を抑制する）光の中から光の無い状態の中に移動させ、卵を同期化させてもよい。脱酸素化（オッペン−バルンツンら（Ｏｐｐｅｎ−Ｂｅｒｎｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）１９９０年、アクアカルチャー（Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ）、８６巻、４１７〜４３０頁）による溶液の温度操作および電気を使用した刺激もまた、同期化させた孵化を生じさせるのに用いることができる。上述の如く、最小量の水は、卵の量と同等以下であってもよく、例えば、１ｍｌの卵につき、１、０．７５、０．５、０．２５ｍｌ以下、例えば、０．５〜１ｍｌの懸濁液体を使用してもよい。
【００８３】
従って、本発明は更に、上述の方法により調製されたポリペプチドおよび／または組成物の使用にも及ぶ。
【００８４】
本明細書に記載のポリペプチドが、白血球から得られる場合、未修飾形態で得られる。サケ科、例えばサケの孵化液から得られるポリペプチドは、（糖鎖付加および／またはリン酸化により）修飾されるが、本明細書に記載の方法においては、いずれの形態も同様に効果的である。
【００８５】
本明細書に記載のポリペプチドは、好ましくは、原料物質または単離過程に若しくはそれら物質の調製に使用される物質に由来するいかなる汚染成分も実質的に含まない。特に好ましくは、この化合物は、重量比（乾燥重量）評価において、５０％または６０％を超える、例えば、＞７０％、８０％または９０％の純度、好ましくは９５％または９９％を超える純度まで精製される。かかる純度レベルは、対象の特定の分子に対応するものであるが、その分解生成物を含む。必要に応じて、例えば、重量比（乾燥重量）評価において、１％、２％、５％または１０％を超える、例えば、２０％、３０％または４０％を超える対象の分子を含む、純度の低い濃縮調製物を使用してもよい。上述のポリペプチドを「単離する（ｉｓｏｌａｔｉｎｇ）」方法とは、上述の純度まで単離することを言う。本明細書に記載のポリペプチドは、例えば、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、サイズ排除、イオン交換、アフィニティー、疎水性相互作用、逆相）またはキャピラリー電気泳動などにより精製してもよい。
【００８６】
本明細書に記載のポリペプチドまたは組成物は、生体外、例えば、細胞または器官培養において使用し、当該細胞の特性に影響を与えてもよく、例えば、細胞外基質のタンパク質の構造および／または組成を変えるためにＭＭＰの放出を抑制してもよい。
【００８７】
しかしながら、前記ポリペプチドおよび組成物は、本明細書に記載の如く、生体内での使用が好ましい。
【００８８】
「医薬上許容される」または「生理学的に許容される」とは、成分が、美容上の用途および組成物に適したものでなければならないことを意味する。この成分はまた、組成物中の他の成分と適合性があると共に、レシピエントにとって生理学的に許容されるものでなければならない。
【００８９】
投与する有効成分は、美容組成物における使用に際し適切に修飾してもよい。例えば、本発明に従って使用される化合物は、上述の如く、誘導体の使用により、分解に対して安定化させてもよい。
【００９０】
前記有効成分はまた、例えば、塩類または非電解質、酢酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸塩若しくは酢酸塩緩衝液、マンニトール、グリシン、人血清アルブミン（ＨＳＡ）またはポリソルベート等の適切な添加物の使用により、組成物中において安定化させてもよい。
【００９１】
本明細書に記載のポリペプチドまたは組成物は、唯一の有効成分として当該組成物中に存在していてもよいし、あるいは、例えば、美容効果（上述のような）を増大させるため、または、組成物を消費者にとってより魅力的なものにするために、他の成分、特に他の有効成分と混合してもよい。
【００９２】
上述の如く、本明細書に記載のポリペプチドおよび組成物は、例えば、表皮および／または真皮に対する軽度の損傷による創傷、染みまたは剥削といった、例えば、皮膚の少なくとも一層の損傷による、皮膚、特に老化皮膚、例えば、光老化皮膚または瘢痕皮膚の美容上の外観を改善する上で有用である特性を示す。
【００９３】
本明細書に記載の１つ以上のポリペプチドを含む組成物はまた、例えば、本発明の当該１つ以上のポリペプチドを天然源から調製した場合、不純物も含んでいてもよい。本明細書に記載の当該１つ以上のポリペプチドを含む組成物において、当該ポリペプチドはそれぞれ、上述の方法に従って調製された美容組成物の０．０００１％〜５０％（重量比）の範囲内で存在していてもよい。好ましくは、当該ポリペプチドは、前記方法に従って調製された、または、以下記載するように、例えば、更なる希釈をして調製された美容組成物の０．０１％〜４０％（重量比）の範囲内で存在する。例えば、このポリペプチドは、美容組成物の０．０００１％〜５％、０．０００１％〜３％、０．０００１％〜２％、０．０００１％〜１％、０．０００１％〜０．５％、０．０００１％〜０．１％（重量比）の範囲内で存在していてもよい。
【００９４】
美容組成物中に存在するポリペプチドまたはその一部の比率は、組成物中の他の溶質（例えば、塩類）（つまり、例えば、水などの溶媒は除く）と比較して決定してもよい。従って、当該ポリペプチドまたはポリペプチドの一部は、組成物の乾燥質量の１０％〜１００％（重量比）の範囲内で存在していてもよい。実施の形態によっては、前記ポリペプチドまたはポリペプチドの一部は、組み合わせて、組成物の乾燥質量の１０％〜９０％（重量比）、例えば、組成物の乾燥質量の１０％〜８０％、１５％〜７０％、２０％〜６０％、３０％〜５０％（重量比）の範囲内で存在していてもよい。他の実施の形態において、前記ポリペプチドまたはポリペプチドの一部は、組み合わせて、組成物の乾燥質量の１０％〜４０％、２０％〜３９％、２５％〜３８％、３０％〜３７％（重量比）などの範囲内で存在していてもよい。本明細書に記載の如く、前記組成物は、本発明に係る使用に際して希釈してもよい。
【００９５】
本発明は、皮膚の美容上の外観を改善する方法に向けられているが、本発明は、障害、異常または疾患の治療を含んでいてもよい。しかし、いかなる場合も、治療は、美容上の性質のものである。
【００９６】
本明細書で言う「美容上の」とは、疾病若しくは障害を治癒、治療若しくは予防するのではなく、スキンケア製品としての役割、または、皮膚の外観、例えば、皮膚の色、きめ若しくは含水量などを修正若しくは改善する役割を果たす治療のことを言う。
【００９７】
本明細書に記載の治療の基礎は、本明細書に開示のポリペプチドの、皮膚の抗老化、瘢痕減少および抗染み／抗剥削効果である。これらの効果は、本明細書に記載の実施例に示されている。
【００９８】
よって、本明細書に記載のポリペプチドの抗老化、抗染み／抗剥削および瘢痕減少特性に基づく治療が考えられる。
【００９９】
従って、本発明は、哺乳類動物の皮膚の外観を改善する美容法であって、上述のポリペプチドまたは美容組成物を当該動物に投与する美容法を提供する。
【０１００】
特に好ましい実施の形態において、前記皮膚は、老化皮膚、染みのある皮膚または瘢痕皮膚である。
【０１０１】
「老化皮膚」とは、１つ以上の老化の徴候または症状、すなわち、皺、小皺、色素沈着過剰、緩み（たるみ）、乾燥皮膚、鱗屑または経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ）の状態を呈する皮膚のことを言う。特に、「老化皮膚」は、正常で最適な皮膚、すなわち、健康で、潤いがあり、正常に色素があり、且つ、老化していない皮膚と比較して判断する。この点において、老化皮膚は、対象者の年齢と関連している必要はなく、例えば、太陽光への長期露出（光損傷）による早老である場合もある。よって、「正常で最適な皮膚」に関する比較パラメーターは、当の対象者と同年齢又は同年代の多くの対象者、例えば、太陽光への長期露出をしていない対象者における上記老化の徴候の平均測定値として求めてもよい。あるいは、「正常で最適な皮膚」に関する比較パラメーターは、当の対象者より若い対象者の測定値としてもよい。つまり、本明細書に記載のポリペプチド、使用および組成物は、より若い対象者の皮膚と比べて、皮膚の若々しい外観の回復に使用してもよい。
【０１０２】
従って、本発明は、哺乳類動物における皮膚日射病の治療のための美容法であって、上述のポリペプチドまたは美容組成物を、当該動物に投与する、好ましくは、当該ポリペプチドまたは組成物を局所投与する美容法を提供する。
【０１０３】
あるいはまた、本発明は、哺乳類動物における皮膚日射病の治療に使用するための上述のポリペプチドまたは美容組成物を提供するものであって、好ましくは、当該ポリペプチドまたは組成物は、当該動物の皮膚への投与用である。特定の実施の形態において、前記ポリペプチドまたは組成物は、局所投与用である。
【０１０４】
特に好ましい実施の形態において、皮膚の美容上の外観（例えば、老化皮膚または光損傷皮膚）の改善は、皺、小皺、色素沈着過剰、緩み、乾燥皮膚、鱗屑および／もしくは経表皮水分喪失の広がりまたは美容上の外観の低減または予防を含む。これらパラメーターの１つ以上を改善し得る。好ましくは、小皺および／または皺を減少させる。
【０１０５】
例えば、老化皮膚若しくは皮膚日射病などの徴候若しくは症状の広がりまたは美容上の外観における低減または予防とは、徴候若しくは症状の数および／または重症度が低減することを意味する場合もある。例えば、小皺および皺の数が低減する場合もあり、並びに／または、皺若しくは小皺のサイズ（例えば、深さ）が低減若しくは最小化する場合もある。さらに、低減または予防とは、新たな徴候若しくは症状の出現を止めるまたはその割合を低減させることを含む場合もある。
【０１０６】
本明細書において言う「乾燥皮膚」とは、水分または皮脂が不足した表皮のことを言い、小皺のパターン、鱗屑、並びに、かゆみおよび／またはヒリヒリ感を特徴とする場合が多い。乾燥皮膚は、本来、（例えば、年齢とともに）皮膚疾患として生じることもあり、また、日焼けによる損傷などの皮膚障害または疾患の症状である場合もある。
【０１０７】
この点において、上述のポリペプチドおよび組成物の保湿効果により、乾燥皮膚、鱗屑、小皺または経表皮水分喪失を低減できる場合もある。
【０１０８】
よって、本発明は、哺乳類動物の皮膚を保湿する美容法または非美容法であって、本明細書に記載のポリペプチドまたは美容組成物を、当該動物に投与する美容法または非美容法を提供するものとみなし得る。
【０１０９】
あるいは、別の言い方をすれば、本発明は、哺乳類動物の皮膚の保湿に使用する、本明細書に記載のポリペプチドまたは美容組成物を提供する。（前記化合物または組成物はまた、それを目的とした美容医薬品の調製に使用してもよい。）
【０１１０】
本明細書において言う「保湿」とは、皮膚からの水分の喪失（例えば、ＴＥＷＬ）を防ぐ保湿剤、並びに、皮膚に適用した場合、水分を誘導し保持する保湿剤（湿潤剤）および皮膚軟化剤（不完全な落屑を改善する）を包含する。
【０１１１】
上述の如く、かかる保湿特性は、皮膚の美容上の外観の改善に有利である。特に好ましい実施の形態において、前記皮膚とは、顔、耳、首、手または頭皮の皮膚である。
【０１１２】
「皺」とは、皮膚のひだ、うねまたは縦溝である。皮膚の皺は、一般的に、老化現象により現れる。この点に関連して、真皮は、皮膚に強度を付与するコラーゲン、皮膚に緊張を与えるグリコサミノグリカン、および皮膚に弾力性または伸縮性を付与するエラスチン繊維を含む、皮膚の構造要素の多くを包含する。
【０１１３】
皮膚の老化に伴って、皮層は薄くなり、また、皮膚が生成するコラーゲンの量も減少する。また、弾力性を付与するエラスチン繊維が摩耗する。皮膚の足場におけるこれらの変化により、皮膚に皺やたるみが生じる。真皮表皮接合部の乳頭間隆起が平坦化することにより、皮膚はより脆弱になり、また皮膚が剪断されやすくなる。この現象はまた、真皮と接触する表面積を減少させることにより、表皮が利用できる栄養分の量も減少させ、また皮膚の正常な修復過程も妨げる。
【０１１４】
皮下層では、年齢とともに脂肪細胞が小さくなる。これにより、脂肪細胞は他の層からの損傷を「補う」ことができないため、より顕著な皺およびたるみ（緩み）が生じる。
【０１１５】
長波長紫外線および中波長紫外線、つまり、太陽光への露出により、コラーゲンは、単なる経時的な老化に比べ、より早い速度で分解される。太陽光は、コラーゲン線維に損傷を与え、また、異常なエラスチンを蓄積させる。この太陽誘発性エラスチンが蓄積すると、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）が大量に生成される。通常、メタロプロテイナーゼは、コラーゲンを生産および再編成することにより、太陽により損傷を受けた皮膚を再構築する。しかしながら、このプロセスは必ずしもうまく作用するとは限らず、またメタロプロテイナーゼのなかには、実際、コラーゲンを分解するものもある。これにより、太陽瘢痕（ｓｏｌａｒ  ｓｃａｒｓ）として知られる無秩序なコラーゲン線維が形成される。この不完全な再構築／再生プロセスの反復により、皺ができ、皮膚の緩みが生じる。
【０１１６】
しかしながら、上述の如く、本明細書に記載のポリペプチドは、ＭＭＰの放出を抑制することが証明されており、よって、本発明のポリペプチドおよび組成物は、皺の形成や皮膚の緩みを低減させるまたは予防するのに有用である。
【０１１７】
更に好ましい態様において、美容上、治療または予防すべき皮膚疾患は、色素沈着疾患、障害または異常である。
【０１１８】
皮膚の色素沈着障害または異常、つまり、色素沈着過剰は、年齢が原因で生じる場合もあるし、また、例えば、日焼けによる損傷などによる早期老化により生じる場合もある。異常色素沈着は、局所的に過剰なメラニン形成細胞、またはメラニン形成細胞の活性の上昇、あるいはその両者により生じ得る。色素沈着障害は、肝斑、太陽または年齢によるしみ（日光黒子）およびそばかすなどの他の染みを含む。
【０１１９】
「瘢痕皮膚」とは、機能上および美容上、正常な未損傷の皮膚より劣る皮膚である。上述の如く、瘢痕形成は、治癒中の皮膚において形成されるコラーゲン線維束の異なった配列が原因で生じると考えられている。
【０１２０】
よって、本発明の一態様は、瘢痕組織を減少または最小限にする、あるいは、哺乳類動物における瘢痕の美容上の外観を改善する美容法の提供であって、上述のポリペプチドまたは美容組成物は、当該動物に投与される、好ましくは、当該ポリペプチドまたは組成物は、局所的に瘢痕組織に投与される。
【０１２１】
あるいはまた、本発明は、瘢痕組織を減少または最小限にする、あるいは哺乳類動物における瘢痕の美容上の外観を改善する上で使用する上述のポリペプチドまたは美容組成物を提供するものであって、好ましくは、当該ポリペプチドまたは組成物は、当該動物の瘢痕組織への投与用である。特定の実施の形態において、前記ポリペプチドまたは組成物は、局所投与用である。前記美容組成物はまた、表面的に損傷を受けた皮膚の治療に使用してもよい。
【０１２２】
例えば、瘢痕または瘢痕組織を生じさせる創傷などの、皮膚治癒には、様々な段階がある（参照により本明細書に援用する国際公開第２００７／０５９５８４号パンフレットに記載されている）。皮膚に対する表面的損傷、つまり、例えば、引っ掻き傷または擦過傷により生じた表皮および／または真皮への軽度の損傷に関しては、皮膚治癒の後期段階が最重要である。
【０１２３】
第一段階は、「炎症」期（０〜６日）であり、皮膚創傷などの創傷を受けた直後の段階である。これは、止血と呼ばれ、それによって、フィブリンおよび血小板により媒介される血管収縮および凝固が始まり、出血を抑制する。血餅はさらに、創傷に入ってくる線維芽細胞および炎症細胞に対する一時的な基質としての、ならびにサイトカインおよび増殖因子の貯蔵所としての機能を果たす。
【０１２４】
止血後、炎症細胞が創傷に侵入し、炎症過程（紅斑、熱、腫脹および疼痛を呈する）を持続させる。これらのうちまず最初は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）およびＩＬ−８などの増殖因子およびサイトカインによって誘引される多形核細胞（ＰＭＮ）である。ＩＬ−８は、ＰＭＮに対する主要な化学誘引物質であり、その急速かつ一時的発現は炎症過程において重要である。ＰＭＮは細胞残屑、異質粒子および細菌を除去することにより創傷の清浄化を始め、比較的短期間（１〜２日）創傷に存在する。外傷後約３日後までには、ＰＭＮは単球に置換され、単球は創傷清浄剤としても作用するマクロファージに形質転換する。線維細胞は、炎症過程において重要な役割を果たし、特にコラーゲンおよびサイトカイン産生に関与する。
【０１２５】
第二段階は、「増殖」期（皮膚損傷後３日〜数週間後に起こる）である。移動性線維芽細胞は、永久コラーゲン系細胞外基質（ＥＣＭ）を産生し、マクロファージは、種々の増殖因子およびサイトカインを産生し、これによって、増殖因子の産生が促進される。マトリックスメタロプロテイナーゼおよびセリンプロテイナーゼは、外傷を受けた後の細胞移動およびＥＣＭ再構築を調節する上で重要な役割を果たし、低減したＥＣＭ再編成は、低下した線維芽細胞ＭＭＰの産生および活性化に関連していることが実証されている。
【０１２６】
再上皮化は、皮膚治癒過程における次の重要な現象であり、主に遊走ケラチノサイトにより開始される。再上皮化は、ケラチノサイトの成長因子およびサイトカインにより促進される増殖により行われ、ケラチノサイトは肉芽組織を通って遊走する。これらの細胞は遊走中にいくつかの表現型変化を起こし、分化中の細胞表現型に関連するタンパク質を発現するものと思われる。遊走が進むにつれて、ケラチノサイトはセリンプロテイナーゼおよびＭＭＰを産生するタンパク質分解表現型を得る。ケラチノサイトは、完了するまで創傷部位へと遊走を続け、有糸分裂活性ケラチノサイトはさらなる表現型変化を起こし、上皮の分化および層形成ならびに基底膜の再形成が起こり、再上皮化過程を完了させる。
【０１２７】
細胞ＥＣＭ接着、プロテイナーゼによるＥＣＭ分解ならびにサイトカインおよび増殖因子によるこれらの過程の全般的調節は、皮膚再構築および治癒に関する他の重要な特徴であり、これらは細胞インテグリン−ＥＣＭ相互作用を介して、細胞遊走および創傷収縮などの細胞機能を協調させる。かかる相互作用は、細胞骨格再編成および新しいインテグリン−ＥＣＭ相互作用を調節する一方で、プロテイナーゼは既存のインテグリン相互作用を排除し、後部脱接着(ｒｅａｒ  ｄｅ−ａｄｈｅｓｉｏｎ)および細胞遊走を可能にする。コラーゲン格子再編成／収縮によって実験的に定量化されるように、後部脱接着の非存在下での細胞収縮性により、皮膚の再編成が生じる。
【０１２８】
皮膚治癒（ひいては瘢痕形成）の最終段階は、「成熟」期（損傷が生じてから４日後〜数週間後または数カ月後までの間に起こる）である。成熟（すなわち、再構築）は、特に、表層皮膚損傷に関しては、数日または数週間しかかからない場合もあるが、全過程は、数年間に渡って続くこともあり得る。この段階では、皮膚の収縮、発赤の減少、厚さの減少、硬化の減少、および強度の増加が観察される。皮膚または瘢痕組織は、筋線維芽細胞の影響下で収縮し、肉芽組織におけるコラーゲン産生が低下し、且つ、血管が縮小する。その後、さらなる再上皮化により皮膚治癒が完了する。
【０１２９】
従って、本明細書に記載のポリペプチドまたは組成物が、皮膚治癒の過程において、特に、増殖期または成熟期において適用される場合、瘢痕組織を減少または最小限にする、すなわち、瘢痕の美容上の外観を改善する効果を有し得ることは上記より明白である。よって、上述の生成物は、表層皮膚損傷または瘢痕の部位に適用してもよく、瘢痕は、部分的にまたは完全に治癒した皮膚とみなしてもよい。好ましい実施の形態において、本明細書に記載のポリペプチドまたは組成物は、成熟期での適用を目的とするものである。
【０１３０】
特に好ましい実施の形態において、前記瘢痕組織は、ざ瘡によるものである。
【０１３１】
別の好ましい実施の形態において、前記瘢痕組織は、伸展線、すなわち線条である。好ましくは、この線条は、萎縮性皮膚線条、妊娠線条、皮膚伸展線条、皮膚萎縮線条、妊娠線、萎縮線条または白線のうちのいずれか１つから選ばれる。
【０１３２】
本明細書において言う、皮膚の美容上の外観の「改善（ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ）」は、正常で最適な皮膚、すなわち、健康で、潤いがあり、正常に色素があり、且つ、老化していない皮膚と比較して判断される。従って、老化皮膚に関して、老化の徴候または症状の１つ以上を、実施例に記載の如く測定し、年代的にまたは生理学的により若い皮膚の同様の徴候と比較してもよく、好ましくは、改善とは、老化の徴候または症状の１つ以上の低減である。
【０１３３】
瘢痕皮膚または染みのできた皮膚に関して、瘢痕組織を減少させるまたは最小限にする、あるいは、瘢痕または染みの美容上の外観を改善するとは、瘢痕または染みの部位が、別の場合には皮膚治癒過程に伴う、瘢痕形成、発赤、皮膚紋理、または色素沈着（色素沈着過剰または低下）のレベル若しくは程度の低減を示し得ることを意味し、これらの性状は、正常な非瘢痕皮膚と比較する。治癒した皮膚または瘢痕の部位およびその周囲の皮膚の抗張力も測定してもよく、抗張力の増加は、皮膚の美容上の外観の改善または瘢痕組織の減少を示す。
【０１３４】
好ましい態様において、美容上の使用は、皮膚への局所投与により行われる。
【０１３５】
本明細書において使用している「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、皮膚に疾患または障害を患っておらず、また当該治療の対象となっていない、当該個人の身体の異なる部位に存在する症状または影響、あるいは、当該治療の対象ではない、相応の正常な個人に存在する症状または影響と比較して、例えば、乾燥皮膚の存在または程度、色素沈着若しくは瘢痕形成の程度または範囲など、当該美容上の疾患若しくは障害の美容上の症状または影響の１つ以上の、好ましくは、正常レベルまでの、低減、緩和または排除のことをいう。
【０１３６】
「予防」または「低減」とは、その症状または影響の発生の程度またはタイミング（例えば、遅延）に関する完全予防または低減若しくは緩和のことを言う。例えば、乾燥皮膚、異常に色素沈着した皮膚、皺の寄った皮膚または瘢痕皮膚に代表される疾患は、そのような疾患が発現する前に、本明細書に記載の組成物を日常的に適用することにより予防し得る。
【０１３７】
好ましくは、当該治療は、本明細書に記載のポリペプチドを用いて行われる。当該ポリペプチドを含む美容組成物が、特に好ましい。
【０１３８】
本発明に係る治療または予防に関する美容法は、例えば、保湿をするためおよび／または障害若しくは疾患の治療または予防に有効な１つ以上の有効成分の投与と有利に組み合わせてもよい。よって、本明細書に記載の美容組成物は、更に１つ以上のかかる有効成分を含んでいてもよい。
【０１３９】
本発明の更なる態様により、本明細書に記載のヒトまたは哺乳類動物の治療法における、同時、個別または連続使用のための複合製剤として、本明細書に記載の１つ以上のポリペプチドおよび任意に１つ以上の更なる有効成分を含む生成物を提供する。
【０１４０】
本発明の組成物は、容易に入手可能な成分を用いて、当技術分野において周知の技術により、１つ以上の生理学的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤を用いて、従来の方法で処方し得る。
【０１４１】
よって、粉末、小袋、オブラートの薬包（ｃａｃｈｅｔｓ）、エリキシル剤、懸濁剤（浸剤液としての）、乳剤、液剤、シロップ剤、エアロゾル剤（固体としてのまたは液状媒体中の）、軟膏剤、無菌包装粉末剤などの従来のガレヌス製剤（ｇａｌｅｎｉｃ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を製造するために、１つ以上の従来の担体、希釈剤および／または賦形剤を用いて、任意に、複合製剤として他の活性物質と共に前記有効成分を含有していてもよい。前記組成物は、凍結乾燥、過冷却またはパーマザイム（Ｐｅｒｍａｚｙｍｅ）の使用により、安定化させてもよい。
【０１４２】
適した賦形剤、担体または希釈剤は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン類、アカシアゴム、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、乳糖カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ  ｌａｃｔｏｓｅ）、コーンスターチ、アルギン酸塩類（ａｇｌｉｎａｔｅｓ）、トラガント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水シロップ、水、水／エタノール、水／グリコール、水／ポリエチレン、グリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、オキシ安息香酸メチル、オキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイル若しくは硬脂肪などの脂肪性の物質、または、適したそれらの混合物である。カルボキシポリメチレン、カルボキシメチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、またはポリ酢酸ビニルなどの、持続放出製剤を得るための薬剤も使用してもよい。
【０１４３】
前記組成物は更に、平滑剤、湿潤剤、乳化剤、粘度増加剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、浸透圧性作用剤（ｏｓｍｏｔｉｃ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ）、懸濁剤、保存剤、甘味剤、香味剤、吸着促進剤（例えば、表面浸透剤、例えば、胆汁酸塩類、レシチン類、界面活性剤、脂肪酸類、キレート剤）、褐変剤、有機溶剤、抗酸化剤、安定化剤、皮膚軟化剤、シリコーン、α-ヒドロキシ酸、粘滑剤、消泡剤、保湿剤、ビタミン、芳香剤、イオン性または非イオン性増粘剤類、界面活性剤、フィラー、イオン性または非イオン性増粘剤、捕捉剤、ポリマー、推進剤、アルカリ化剤または酸性化剤、乳白剤、着色剤および脂肪族化合物等を含有してもよい。これら成分のいくつかは、更に詳細に後述する。
【０１４４】
前記美容組成物における他の有効成分（ａｃｔｉｖｅ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ／ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）は、ミネラル類、ビタミン類、酵素類、タンパク質類、ペプチド類、アミノ酸類、脂質類、多糖類、日焼け止めフィルターとして適した物質、化学的角質除去剤、抽出物、整肌剤、抗酸化剤およびそれらの混合物のうちのいずれか１つ以上から選択してもよい。
【０１４５】
本発明の組成物と混合し得るタンパク質の例としては、コラーゲンおよび／またはその誘導体（例えば、上述のようにその一部）、細胞増殖を促進することのできるペプチドまたはタンパク質、糖タンパク質１、糖タンパク質２およびラミニンが挙げられる。
【０１４６】
本発明の組成物は、これらに限定されないが、フルーツ酵素（例えば、ブロメライン）、スーパーオキシドジスムターゼ、ペルオキシダーゼ、ヒアルロニダーゼおよびムコポリサッカリダーゼのいずれか１つ以上を含む酵素と混合してもよい。
【０１４７】
ペプチド類は、これらに限定されないが、Ｄ，Ｌ−カルノシン、Ｄ−カルノシン、Ｌ−カルノシン、アンセリンおよびマトリキシル（ペンタペプチド（ｐｅｎｔａｐｅｔｉｄｅ）誘導体）のうちいずれか１つ以上から選択してもよい。
【０１４８】
アミノ酸は、これらに限定されないが、表１に記載の非天然型アミノ酸を含め、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ‐シスチン、グリシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンおよびＬ−バリン並びにそれらの誘導体のうちいずれか１つ以上から選択してもよい。抗酸化剤として特に好ましいアミノ酸は、グリシン、リジン、アルギニン、システイン、シスチン、ヒスチジン、チロシンおよびトリプトファンのうちいずれか１つ以上から選択してもよい。
【０１４９】
前記美容組成物は、脂肪類、油類、ワックス類などを含む、１つ以上の脂質を含んでいてもよい。適した極性油類は、例えば、レシチン類および脂肪酸トリグリセリド類、すなわち鎖長が８〜２４、特に、１２〜１８の炭素原子を有する飽和および／または不飽和、分枝および／または非分枝アルカンカルボン酸のトリグリセリンエステル類の群から選ばれるものである。脂肪酸トリグリセリド類は、例えば、オリーブ油、ひまわり油、大豆油、ピーナッツ油、菜種油、アーモンド油、パーム油、ヤシ油、ヒマシ油、小麦胚芽油、グレープシードオイル、アザミ油、月見草油、マカデミアナッツ油など、合成油、半合成油および天然油の群から、例えば、有利に選択してもよい。
【０１５０】
代替的にまたは付加的に、前記油は、揮発性油、不揮発性油またはそれらの混合物から選択してもよい。不揮発性油には、下記定義の少なくとも１つを満たす油が含まれる：（ａ）この油は、２５℃、１気圧で最高０．２ｍｍＨｇの蒸気圧を示す；（ｂ）この油は、１気圧での沸点が少なくとも３００℃である。揮発性油は、上述の「不揮発性」でない物質を含む。
【０１５１】
不揮発性油は、不揮発性シリコーン油、不揮発性炭化水素油およびそれらの混合物から選択してもよい。適した不揮発性シリコーン油は、直鎖ポリメチルシロキサンを含み、好ましくは、不揮発性シリコーン油は、高分子量ジメチコンである。市販の直鎖ポリメチルシロキサンの例としては、ダウコーニング社（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のＤＣ２００フルイド（２０Ｃｓｔ）、ＤＣ２００フルイド（１００Ｃｓｔ）、ＤＣ２００フルイド（３５０Ｃｓｔ）が挙げられる。
【０１５２】
適した不揮発性炭化水素油には、ジグリセリンまたはトリグリセリンの分岐エステル、あるいは、前記エステル類、１，２，３，４ブタントリオールまたはエリスリトール、ジエリスリトール若しくはトリエリスリトール（ｔｒｉ  ｅｒｔｈｙｒｉｔｏｌ）が挙げられる。好ましくは、不揮発性炭化水素油は、トリエチルヘキサン酸エリスリチル（サラコスＥ−３８として日清オイリオから入手可能）およびトリイソステアリン酸ポリグリセリル-２（コスモール４３Ｖとして日清オイリオから入手可能）、炭酸ジエチルヘキシル（テゴソフト（Ｔｅｇｏｓｏｆｔ）ＤＥＣとしてデグサ（Ｄｅｇｕｓｓａ）から入手可能）、ジカプリルエーテル（セチオール（Ｃｅｔｉｏｌ）ＯＥとしてコグニス社（Ｃｏｇｎｉｓ  ＡＧ）から入手可能）、炭酸ジカプリル（セチオール（Ｃｅｔｉｏｌ）ＣＣとしてコグニス社（Ｃｏｇｎｉｓ  ＡＧ）から入手可能）、イソノナン酸イソノニル（ラノール（Ｌａｎｏｌ）９９としてセピック（Ｓｅｐｐｉｃ）社から入手可能）、ネオペンタン酸トリデシル（セラフィル（Ｃｅｒａｐｈｙｌ）５５としてインターナショナル・スペシャルティ・プロダクツ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）から提供）、またはそれらの混合物を含む。
【０１５３】
揮発性油は、揮発性シリコーン油類（官能化および非官能化いずれも）、揮発性炭化水素油類、並びにそれらの混合物から選択してもよい。本発明において有用な揮発性油は、飽和若しくは不飽和であってもよく、直鎖若しくは分岐鎖または環状構造を有していてもよく、あるいは、当該特徴のいずれか１つ以上の組合せを有していてもよい。
【０１５４】
揮発性炭化水素油類の例としては、イソドデカンおよびイソデカン（例えば、プレスパース社（Ｐｒｅｓｐｅｒｓｅ  Ｉｎｃ．）より入手可能なパーメチル−９９Ａ（Ｐｅｒｍｅｔｈｙｌ−９９Ａ））などのポリデカン並びにＣ７〜Ｃ１５イソパラフィン（エクソン化学（Ｅｘｘｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社より入手可能なイソパー・シリーズ（Ｉｓｏｐａｒ  Ｓｅｒｉｅｓ）など）が挙げられる。
【０１５５】
前記揮発性シリコーン油は、シクロペンタシロキサン、シクロヘキサシロキサンまたはそれらの混合物から選択してもよい。市販の揮発性環状シリコーン油類の例としては、ダウコーニング社のＤＣ２４４、ＤＣ２４５、ＤＣ３４４およびＤＣ３４５；モメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ（Ｍｏｍｅｎｔｉｖｅ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）のＳＦ−１２０４およびＳＦ−１２０２シリコーン・フルイド（Ｓｉｌｉｃｏｎｅ  Ｆｌｕｉｄｓ）；ゼネラル・エレクトリック社（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏ．）のＧＥ７２０７および７１５８；並びに、ＳＷＳシリコーンズ社（ＳＷＳ  Ｓｉｌｉｃｏｎｅｓ  Ｃｏｒｐ．）のＳＷＳ−０３３１４が挙げられる。
【０１５６】
直鎖揮発性シリコーン油は、直鎖ポリメチルシロキサンであってもよい。市販の直鎖ポリメチルシロキサン類の例としては、ダウコーニング社のＤＣ２００フルイド（５Ｃｓｔ）が挙げられる。
【０１５７】
本発明の美容組成物は、これらに限定されないが、アニオン性多糖類（例えば、アルギン酸、ペクチン、キサンタンガム、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、アラビアゴム、カラヤガム、トラガントガム、カルボキシメチルキチン、セルロースガム、グリコサミノグリカン）、カチオン性多糖類（例えば、キトサン、アセチル化キトサン、カチオン性グアーガム、カチオン性ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ））、非イオン性多糖類（例えば、デンプン、デキストリン類、グアーガム、セルロースエーテル類（ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロースおよびニトロセルロースなど））、両性多糖類（例えば、カルボキシメチルキトサン、Ｎ−ヒドロキシ−ジカルボキシエチル−キトサン、変性ジャガイモデンプン）および疎水性多糖類（例えば、セチルヒドロキシエチルセルロース、ポリクオタニウム２４）のいずれか１つ以上から選択される１つ以上の多糖類を更に含んでいてもよい。
【０１５８】
前記美容組成物は、有機日焼け止め剤などの日焼け止めフィルターとして適した物質（例えば、桂皮誘導体）を更に含んでいてもよい。有効な前記有機日焼け止め剤は、親水性有機日焼け止め剤、疎水性有機日焼け止め剤、またはそれらの混合物から選択してもよい。日焼け止め剤の適した例は、ＣＴＦＡ国際化粧品用成分事典及びハンドブック（ＣＴＦＡ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）、第７版、第２巻、１６７２頁、ウェニンガー（Ｗｅｎｎｉｎｇｅｒ）及びマキューエン（ＭｃＥｗｅｎ）編（米国化粧品工業会（Ｔｈｅ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ，Ｔｏｉｌｅｔｒｙ，ａｎｄ  Ｆｒａｇｒａｎｃｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．）、ワシントン（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）Ｄ．Ｃ．、１９９７年）に見られ得る。
【０１５９】
前記有機日焼け止め剤は、アルキルβ，β-ジフェニルアクリレート誘導体、α-シアノ-β，β-ジフェニルアクリレート誘導体、アントラニレート誘導体、ベンゾフェノン誘導体、カンファー誘導体、ジベンゾイルメタン誘導体、ｐ−アミノ安息香酸誘導体、サリチル酸誘導体、トリアジン誘導体、またはそれらの混合物から選択してもよい。例えば、前記疎水性有機日焼け止め剤は、４−（１，１−ジメチルエチル）−４’−メトキシジベンゾイルメタン；４−イソプロピルジベンゾイルメタン；４−（１，１−ジメチルエチル）−４’−メトキシジベンゾイルメタン、２−エチルヘキシル−２−シアノ−３，３−ジフェニルアクリレートまたはそれらの混合物から選択してもよい。
【０１６０】
ブチルメトキシジベンゾイルメタンまたはアボベンゾン（Ａｖｏｂｅｎｚｏｎｅ）としても知られている、市販の４−（１，１−ジメチルエチル）−４’−メトキシジベンゾイルメタンの例としては、ジボーダン・ルール（Ｇｉｖａｕｄａｎ  Ｒｏｕｒｅ）Ｓ．Ａ．社のパーソル（Ｐａｒｓｏｌ）（登録商標）１７８９およびメルク社（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．、Ｉｎｃ）のユーソレックス（Ｅｕｓｏｌｅｘ）（登録商標）９０２０が挙げられる。イソプロピルジベンゾイルメタンとしても知られている市販の４−イソプロピルジベンゾイルメタンの例としては、メルク社のユーソレックス（Ｅｕｓｏｌｅｘ）（登録商標）８０２０が挙げられる。オクトクリレン（Ｏｃｔｏｃｒｙｌｅｎｅ）としても知られている市販の２−エチルヘキシル−２−シアノ−３，３−ジフェニルアクリレートの例としては、ＢＡＳＦのユビナール（Ｕｖｉｎｕｌ）Ｎ５３９ＳＧ；およびロナ／メルク（Ｒｏｎａ／Ｍｅｒｃｋ）のユーソレックス（Ｅｕｓｏｌｅｘ）ＯＣＲが挙げられる。
【０１６１】
実施の形態によっては、前記親水性有機日焼け止め剤は、２−フェニルベンズイミダゾール（ｐｈｅｎｙｌｂｅｎｚｉｍｉｄａｏｌｅ）−５−スルホン酸であってもよい。ＰＢＳＡとしても知られている、市販の２−フェニルベンズイミダゾール（ｐｈｅｎｙｌｂｅｎｚｉｍｉｄａｏｌｅ）−５−スルホン酸の例としては、ロナ／メルクのユーソレックス（Ｅｕｓｏｌｅｘ）２３２が挙げられる。
【０１６２】
桂皮誘導体日焼け止め剤の適した例は、ＣＴＦＡ国際化粧品用成分事典及びハンドブック、第７版、第２巻、１６７２頁、ウェニンガー及びマキューエン編（米国化粧品工業会、ワシントンＤ．Ｃ．、１９９７年）に見られ得る。前記桂皮誘導体は、２−エチルヘキシル−ｐ−メトキシシンナメート、ジエタノールアミンメトキシシンナメート、２−エトキシエチル−ｐ−メトキシシンナメート、またはそれらの混合物から選択してもよい。例えば、前記桂皮誘導体は、２−エチルヘキシル−ｐ−メトキシシンナメートであってもよい。
【０１６３】
前記美容組成物は、これらに限定されないが、サリチル酸、グリコール酸、クエン酸およびリンゴ酸といった、α−ヒドロキシ酸（ＡＨＡ）、β−ヒドロキシ酸（ＢＨＡ）またはポリヒドロキシ酸のいずれか１つ以上から選択される化学的角質除去剤と混合してもよい。
【０１６４】
前記美容組成物に取り入れてもよい抽出物には、これらに限定されないが、植物抽出物が挙げられ、これは、例えば、フラボノイド（例えば、グリコシルルチン、フェルラ酸、コーヒー酸）、フルフリリデングルシトール、ブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、ノルジヒドログアヤレチン樹脂酸、ノルジヒドログアヤレチン酸、トリヒドロキシブチロフェノンおよびそれらの誘導体などのフェノール化合物を含んでいてもよい。本発明の組成物において使用する特定の植物抽出物としては、アロエベラ抽出物、人参エキスおよびトクサエキスが挙げられる。
【０１６５】
人参エキスは、親水性溶媒（特に、水、エタノール、グリコール、またはそれらの任意の混合物）で、オタネニンジンの根を抽出することにより得ることができる。この抽出物は、サポニン類、ステロール類、炭水化物類、ペクチン、ビタミン類、ミネラル類および脂質類を含む。
【０１６６】
トクサエキスは、親水性溶媒（例えば、水、エタノール、グリコール、またはそれらの任意の混合物）で、スギナの全草を抽出することにより得ることができる。この抽出物は、ケイ酸塩類、フラビノイド類、サポノシド類、コーヒー酸およびフェルラ酸を含む。
【０１６７】
前記美容組成物は、整肌剤を更に含んでいてもよい。この整肌剤は、湿潤剤、角質除去剤、皮膚軟化剤またはそれらの混合物から選択してもよい。湿潤剤としては、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、ヒドロキシプロピルソルビトール、ヘキシレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，２，６−ヘキサントリオール、エトキシル化グリセリン、プロポキシル化グリセリンまたはそれらの混合物などの多価アルコール類が挙げられる。
【０１６８】
本発明の組成物と混合し得る抗酸化剤の例としては、これらに限定されないが、アミノ酸類、ビタミン類、ミネラル類、カロテノイド類、ペプチド類、チオール類、スルホキシイミン化合物類、キレート剤、不飽和脂肪酸類、フェノール化合物類、植物抽出物、スチルベン類、尿酸、マンノース、クロロゲン酸、イミダゾール類（例えば、ウロカニン酸）、フルフリリデンソルビトール、ユビキノン、ユビキノール、プラストキノン、フィトステロール類およびそれらの誘導体（例えば、塩類、エステル類、エーテル類、糖類、ヌクレオチド類、ヌクレオシド類、ペプチド類および／または脂質誘導体）などが挙げられ、これらのうちいくつかは上述した。
【０１６９】
ビタミン類は、これらに限定されないが、ビタミンＡおよびそれらの誘導体（例えば、レチノイド若しくはレチノールまたはパルミチン酸レチニル若しくはプロピオン酸レチニルなどのそれらの誘導体）、ビオチン、葉酸、パントテン酸カルシウム、ニコチンアミド、ピリドキシン塩酸塩、ピリドキサール塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩、チミジン、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ３（例えば、ナイアシンアミド）、ビタミンＢ５（例えば、パンテノール）、ビタミンＣおよびそれらの誘導体（例えば、アスコルビン酸パルミテート、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸アセテート）、トコフェロール類および誘導体（例えば、ビタミンＥアセテート）のうちいずれか１つ以上から選択してもよい。
【０１７０】
ミネラル類は、これらに限定されないが、モリブデン酸塩（例えば、（ＮＨ4）ＯＭｏ7Ｏ24）、アルミニウム（例えば、ＡｌＣｌ3）、カルシウム（例えば、ＣａＣｌ2）、コバルト（例えば、ＣｏＣｌ2）、クロム（例えば、ＣｒＫ（ＳＯ4））、銅（例えば、ＣｕＳＯ4）、鉄（例えば、Ｆｅ（ＮＯ3）3、ＦｅＳＯ4）、カリウム（例えば、ＫＣｌ）、マグネシウム（例えば、ＭｇＣｌ2）、マンガン（例えば、ＭｎＣｌ2、ＭｎＳＯ4）、リン酸塩（例えば、Ｎａ2ＨＰＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4）、炭酸塩（例えば、ＮａＨＣＯ3）、ケイ酸塩（例えば、Ｎａ2ＳｉＯ3）、ナトリウム（例えば、ＮａＣｌ）、バナジン酸塩（例えば、ＮＨ4ＶＯ3）、ニッケル（例えば、ＮｉＣｌ2）、スズ（例えば、ＳｎＣｌ2）、亜鉛（例えば、ＺｎＯ、ＺｎＳＯ4）、セレン（例えば、セレノメチオニン、エブセレン、Ｈ2ＳｅＯ3、Ｎａ2ＳｅＯ3）、硫酸塩および硝酸塩の塩のいずれか１つ以上から選択してもよい。
【０１７１】
カロテノイド類は、これらに限定されないが、例えば、α−カロチン、β−カロチン、ψ−リコピン、フィトエンなどのカロチン類およびそれらの誘導体のいずれか１つ以上から選択してもよい。
【０１７２】
チオール類は、これらに限定されないが、オーロチオグルコース、プロピルチオウラシル、チオレドキシン、リポ酸、グルタチオン、システイン、シスチン、シスタミンおよびそれらのグリコシル、Ｎ−アセチル、メチル、エチル、プロピル、アミル、ブチルおよびラウリル、パルミトイル、オレイル、γ−リノレイル、コレステリルおよびグリセリルエステル類並びにそれらの塩、ジラウリルチオジプロピオネート、ジステアリルチオジプロピオネート、チオジプロピオン酸およびそれらの誘導体のいずれか１つ以上から選択してもよい。
【０１７３】
スルホキシイミン化合物類は、これらに限定されないが、ホモシステインスルホキシイミン、ブチオニンスルホン、ペンタ−、ヘキサ−、ヘプタチオニンスルホキシイミンのうちいずれか１つ以上から選択してもよく、これらは、極低用量（例えば、ｐｍｏｌ〜μｍｏｌ／ｋｇ）で付加され前記組成物に含まれていても良い。
【０１７４】
キレート剤は、これらに限定されないが、アポフェリチン、デスフェラル（ｄｅｓｆｅｒｒａｌ）、ラクトフェリン、α−ヒドロキシ脂肪酸類、パルミチン酸、フィチン酸、α−ヒドロキシ酸類（例えば、クエン酸、乳酸、リンゴ酸）、フミン酸、胆汁酸、胆汁エキス、ビリルビン、ビリベルジン、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびそれらの誘導体のうちいずれか１つ以上から選択してもよい。
【０１７５】
不飽和脂肪酸類は、これらに限定されないが、γ−リノレン酸、リノール酸、オレイン酸およびそれらの誘導体のうちいずれか１つ以上から選択してもよい。
【０１７６】
スチルベン類およびそれらの誘導体は、例えば、スチルベンオキシドおよびトランス−スチルベンオキシドを含む。
【０１７７】
種々の付加的な任意有効成分を、本発明の美容組成物に取り入れてもよい。それら付加的な成分の非限定的な例としては、ファルネソール、ビサボロール、フィタントリオール、尿素、グアニジン（例えば、アミノグアニジン）；ヘキサミニジン（ｈｅｘａｍｉｎｉｄｉｎｅ）化合物類、それらの塩または誘導体；糖アミン類；セルフ・タンニング剤（例えば、デヒドロキシアセトン）；構造化剤；親水性ゲル化剤；抗ざ瘡薬剤（レゾルシノール、サリチル酸など）；アラントインなどの皮膚鎮静および治癒剤；並びに、精油、芳香剤、皮膚感覚剤、乳白剤、芳香族化合物類（例えば、チョウジ油、メントール、カンフル、ユーカリ油、およびオイゲノール）などの美容目的に適した薬剤などの付加的なスキンケア活性剤（ｓｋｉｎ  ｃａｒｅ  ａｃｔｉｖｅｓ）が挙げられる。
【０１７８】
本明細書に記載の組成物は、当技術分野において周知となっている技術を用いることにより、身体に投与した後の有効成分の速放性、徐放性または遅放性を付与するよう処方してもよい。
【０１７９】
前記組成物は、例えば、有効成分を吸収、吸着、取り込みまたは結合し得るリポソーム、ニオソーム、ミクロスフェア、ナノ粒子などにおいて、または乳濁剤として、送達を可能にするため、または特定の細胞若しくは組織を標的とするため、任意の適切な剤形であってもよい。これにより、生成物を効果的に不溶型に変換することができる。これらの微粒子型は、安定性（例えば、分解）と送達の問題をいずれも克服し得る。
【０１８０】
溶液剤、懸濁剤、ゲル剤および乳濁剤の使用が好ましく、例えば、前記有効成分は、水、気体、水性液剤、油、ゲル剤、乳濁剤、水中油型若しくは油中水型乳濁剤、分散剤またはそれらの混合剤に担持させてもよい。
【０１８１】
乳化剤は、非イオン性乳化剤、アニオン性乳化剤、カチオン性乳化剤、双性イオン性乳化剤、両性乳化剤またはそれらの混合物から選択してもよい。乳化剤は、当技術分野において公知である。例えば、マカッチャン（ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ）著、洗剤と乳化剤（Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ）（北米版（１９８６年）、アルレッド・パブリッシング・コーポレーション（Ａｌｌｕｒｅｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）出版）を参照のこと。
【０１８２】
美容上許容される担体がシリコーン中水型乳剤である場合、乳化剤は、好ましくは、ポリオキシアルキレン共重合体、ポリグリセリル共重合体またはそれらの混合物から選択される。ポリオキシアルキレン共重合体は、シリコーンポリエーテルとしても知られており、米国特許第４，２６８，４９９号明細書に詳述されている。市販のポリオキシアルキレン共重合体の例としては、ダウコーニング社のＤＣ５２２５ＣまたはＤＣ２−５１８５Ｃ（ＰＥＧ／ＰＰＧ−１８／１８、シクロペンタシロキサンとの混合物として入手可能なジメチコン）；および信越社のＫＦ６０１７またはＫＦ６０２８（ＰＥＧ−９、ジメチコン）が挙げられる。市販のポリグリセリル乳化剤の例としては、信越社のＫＦ６１００およびＫＦ６１０４が挙げられる。
【０１８３】
組成物は、好ましくは、局所（つまり、皮膚への）投与用である。
【０１８４】
局所組成物としては、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、噴霧剤、ローション剤、膏薬、粘着剤、石鹸剤、粉末剤、フィルム剤、エアロゾル剤、点滴剤、気泡剤、溶液剤、乳濁剤、懸濁剤、分散剤、例えば、非イオン性小胞分散剤、乳剤および当技術分野における他の任意の従来の化粧品形態を含む。
【０１８５】
軟膏剤、ゲル剤およびクリーム剤は、例えば、適した増粘剤および／またはゲル化剤を添加し、水性または油性基剤を用いて処方してもよい。ローション剤は、水性または油性基剤を用いて処方してもよく、また一般的に、乳化剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤または着色剤も１つ以上含む。粉末剤は、任意の適した粉末基剤を用いて形成してもよい。点滴剤および溶液剤は、分散剤、可溶化剤または懸濁剤も１つ以上含む水性または非水性基剤を用いて処方してもよい。エアロゾルスプレーは、便宜上、適した推進剤を用いて加圧パックから送達される。
【０１８６】
実施の形態によっては、本明細書に記載のポリペプチドおよび美容組成物は、ポリペプチドまたは組成物が塗布、含浸または化学結合された製品、道具または素材を介して、皮膚に局所投与してもよい。そのために、包帯、絆創膏（例えば、粘着性の貼付剤）、ガーゼ、外科用テープ、綿棒または他の吸収材料、例えば、パフ、フリース若しくはスポンジ、あるいは、支持母材を、本明細書に記載のポリペプチドまたは組成物で、被覆、含浸または化学結合させてもよい。例えば、多くの組成物は、当技術分野において、例えば、参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第２００８／００３８３００号明細書、米国特許出願公開第２００９／００４３２３６号明細書、国際公開第２００５／０６７４９９号パンフレットおよび国際公開第２００９／０８５３０２号パンフレットに十分説明されている皮膚パッチを用いて皮膚に適用し得る。実施の形態によっては、本明細書に記載のポリペプチドまたは組成物を含む素材は、例えば、治療を受ける対象者が身につけられる道具の形態であってもよい。例えば、本明細書に記載のポリペプチドまたは組成物は、おむつ、手袋、ソックス等の全体または一部を成す素材または支持母材に塗布、含浸または化学結合させてもよい。
【０１８７】
前記美容組成物は、投与に関する説明書と共に、容器、パックまたはディスペンサーに入っていてもよい。
【０１８８】
よって、本発明の更なる態様は、本明細書に記載のポリペプチドまたは組成物を被覆、含浸または化学結合させた製品、素材または道具の提供を含む。本発明はまた、本明細書に記載の使用を目的としたかかる製品、素材または道具にも及ぶ。好ましくは、当該製品は、包帯、絆創膏（例えば、粘着性の貼付剤）、ガーゼ、外科用テープ若しくは綿棒であり、また、当該道具は、おむつ、手袋若しくはソックスである。
【０１８９】
本発明の組成物における有効成分の濃度は、投与方法、治療経過、対象者の年齢および体重、美容上の徴候、治療する身体または身体部位によって決まり、また選択によって変更または調節してもよい。しかしながら、一般に、本明細書に記載の化合物の濃度範囲は、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％または０．０１％〜５０％、例えば、０．０００５％〜４０％、例えば、０．０１％〜２５％、０．１％または０．５％〜５％など、例えば、１％〜５％（投与、特に局所投与用の最終製剤の重量比または容量比）であり、例えば、本発明の方法に従って調製した前述の組成物の１％溶液である。
【０１９０】
２種以上の化合物が含まれる場合、例えば、本明細書に記載の付加的な保湿剤など、各化合物は上述の量で含まれていてもよい。前記濃度は、化合物自体の量を参考にし決定されるため、組成物の純度を考慮に入れるため、適切な調整をするものとする。ポリペプチドの有効な単回投与量は、局所的に適用する場合、治療対象の哺乳類動物によって、単回投与量として０．００１〜１００ｍｇ／ｃｍ2／日、例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｃｍ2／日、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ／ｃｍ2／日、例えば、０．１〜１０ｍｇ／ｃｍ2／日の範囲内である。
【０１９１】
好ましくは、液体溶液剤、クリーム剤または懸濁剤が、本明細書に記載のポリペプチドまたは組成物の局所投与に使用される。
【０１９２】
前記組成物を適用または投与する動物は、哺乳動物に限定される。好ましくは、この哺乳動物は、霊長類、飼育動物、家畜および実験動物である。よって、好ましい哺乳類動物としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ネコ、イヌ、サル、ブタ、雌ウシ、ヤギ、ヒツジおよびウマが含まれる。特に好ましくは、前記組成物は、ヒトに適用または投与する。
【０１９３】
以下の実施例は、単なる例として挙げるものであり、その中で参照する図は以下の通りである：
図１は、本発明のポリペプチドを含む組成物を用いて治療した被験者の、治療前（ベースライン）、治療の２週間後および１２週間後の写真を示す。老化皮膚の様々な徴候の低減が、２週間後および１２週間後のいずれにおいても明らかである。記載されている値は、３５名の参加者に関する平均変化を示す。
図２は、本発明のポリペプチドを含む組成物を用いた治療の２週間後および１２週間後に見られた小皺および皺の低減を強調する、図１の被験者のクローズアップ写真を示す。
図３は、本発明のポリペプチドを含む組成物を用いて治療した被験者の、治療前（ベースライン）および治療の１２週間後のクローズアップ写真を示す。円で囲んだ部位は、治療の１２週間後の明瞭な皺の低減を示す。
図４は、顔面の両側に関する触覚的／視覚的臨床評価に基づき、老化の様々な徴候が改善されたとみなされる被験者の割合を示す棒グラフである。
図５は、本発明のポリペプチドを含む組成物を用いて３週間に渡って１日２回治療した後、未治療の状態と比較した４名の被験者に基づく、約２３％の皮膚水分量の平均増加量を示す棒グラフである。
図６は、本発明のポリペプチドを含む組成物を用いて３週間に渡って１日２回治療した後、未治療の状態と比較した４名の被験者に基づく、約１４．５％の経表皮水分喪失量の平均減少量（皮膚バリア機能の向上）を示す棒グラフである。
図７は、本発明のポリペプチドを含む組成物を用いて３週間に渡って１日２回治療した後、未治療の状態と比較した４名の被験者に基づく、約２３％の目皺の量の平均減少量を示す棒グラフである。
図８は、本発明のポリペプチドを含む組成物を用いて３週間に渡って１日２回治療した後、未治療の状態と比較した４名の被験者に基づく、約１０％のメラニン含有量の平均減少量を示す棒グラフである。
【実施例１】
【０１９４】
＜ロイコレクチンの単離およびロイコレクチン含有調製物＞
ロイコレクチンタンパク質（後述）およびその提供方法は、その全ての内容を参照により本明細書に援用する、国際公開第２０１０／０４９６８８号パンフレットに詳細に記載されている。しかしながら、完全を期すため、ロイコレクチン含有組成物の好ましい調製方法を以下に記載し、上述の方法を例示する。
【０１９５】
本発明のポリペプチドを単離するための出発物質として使用し得る、部分的に精製したゾナーゼ（ｚｏｎａｓｅ）の調製方法は、参照により本明細書に援用する国際公開第９９／２９８３６号パンフレットに記載されている（特に、記載の方法の実施例１であるが、任意に、尿素工程はなくてもよい）。
【０１９６】
ロイコレクチンは、サケ孵化液から精製した。孵化液のタンパク質濃度を高めるため、サケ卵は、孵化に先立って最小量の水に移した。高度に同期した孵化は、高（室）温により、または脱酸素化（オッペン−バルンツンら、１９９０年、アクアカルチャー、８６巻、４１７〜４３０頁）により誘発することができ、粗ロイコレクチンおよび関連タンパク質の高度に濃縮された調製物が少量得られる。孵化は、９５％を超える胚について、２時間未満に完了するものとする。
【０１９７】
前記孵化液は、孔径７μｍの標準フィルター用いて濾過し、後続の濾過工程においてフィルターを詰まらせる可能性のある物質を除去する。この濾液、すなわち処理した孵化液は、解凍され更なるタンパク質精製に使用されるまで、顕著な分解が生じることなく長期に渡って凍結させ得る。これにより、サケのロイコレクチンを精製するための出発物質の製造は大いに簡易化される。
【０１９８】
前記処理した孵化液を、孔径０．４５μｍのフィルターを用いて濾過し、その濾液を回収した。その後、この濾液を排除サイズが８ｋＤａのフィルターを用いてダイアフィルトレーションし、孵化液の水を緩衝液と交換した。この場合、この緩衝液は、０．５ｍＭのリン酸塩および１ｍＭのＮａＣｌを含んでいたが、他の緩衝液であっても同様に適切である。例えば、リン酸緩衝食塩水または中性付近若しくはややアルカリ性（ｐＨ７．５〜８．５）のｐＨでミリモル濃度のトリス（例えば、１０ｍＭ）を含有する緩衝液や５ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液が適切である。ダイアフィルトレーション工程の残余分を回収し、緩衝液を添加することにより希釈した。
【０１９９】
このダイアフィルトレーションにより得られた濾過液は、排除サイズが１００ｋＤａの限外濾過膜を用いて限外濾過し、前記ロイコレクチンを含有する濾液を回収した。最後に、前記濾液を孔径０．２２μｍのフィルターを通して濾過し、最終濾液を回収した。この濾液は、ロイコレクチンの濃縮調製物である。
【実施例２】
【０２００】
＜線維芽細胞に対するロイコレクチンの生体外活性＞
材料および方法
実施例１の方法に従って調製した組成物を、老化線維芽細胞（ヒト皮膚線維芽細胞、ヘイフリック老化モデル、ヘイフリック，Ｌ．およびムーアヘッド，Ｐ．Ｓ．（Ｈａｙｆｌｉｃｋ，  Ｌ．ａｎｄ  Ｍｏｏｒｈｅａｄ，  Ｐ．Ｓ．）１９６１の複製。「ヒト二倍体細胞株の連続培養（Ｔｈｅ  ｓｅｒｉａｌ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｐｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｓ．）」Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２５：５８５−６２１）に適用した。この点に関して、老化線維芽細胞は、若い線維芽細胞に比べＭＭＰの放出量が増え、上述の如く、ＭＭＰ活性は、老化の徴候および症状並びに瘢痕形成のいずれとも関連している。特に、間質コラゲナーゼまたは線維芽細胞コラゲナーゼとして知られている、ＭＭＰ−１は、間質性コラーゲンのタイプＩ、ＩＩおよびＩＩＩを切断するため、細胞外基質の分解に関与している。
【０２０１】
３つの異なる濃度のロイコレクチン組成物（０．０１５％、０．０５０％および０．１５０％［容量比］）を、老化線維芽細胞に適用した。この組成物は、ロイコレクチンの濃縮調製物であり、前記容量比は、単位容量当りの前記濃縮調製物（非ロイコレクチン成分を含む）の総容量のことを言う。ＭＭＰ−１の濃度は、ＥＬＩＳＡ法により測定した。２つの対照実験を同時に行った。第１の対照は、顔などの異なった場所からの成人皮膚または若い包皮の真皮から単離した正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を使用することから、ＭＭＰ−１（Ｐ７−ＮＨＤＦ）の正常な「非老化」レベルを示す。第２の対照は、ロイコレクチンの代わりにＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍｌ）と接触させた老化細胞を含む。ＴＧＦ−β（トランスフォーミング増殖因子β）は、細胞増殖および分化、組織のモデリングおよび修復を制御する多機能性サイトカインである。ＴＧＦ−βは、ＭＭＰ−１の放出を抑制することが知られている。結果を表２に示すが、濃度０．０５０％および０．１５０％のロイコレクチン組成物により、老化線維芽細胞からのＭＭＰ−１放出は略完全に抑制され、そのレベルは、若い線維芽細胞のレベルをも下回っていることが表２から分かる。これらの結果は、ロイコレクチンが、皮膚の美容上の外観、特に、ＭＭＰレベルの増加および／または異常なＭＭＰ活性を示す老化および瘢痕皮膚を改善する上で有用であることが期待できることを示す。事実、ロイコレクチン含有組成物の効果を示す以下の結果は、老化皮膚へのかかる組成物の効果を裏付けるものである。
【０２０２】
以下、表の記号を解説する：
(1)：統計的有意性の閾値
ｎｓ：＞０．０５、有意ではない
＊：０．０１〜０．０５、有意である
＊＊：０．００１〜０．０１、非常に有意である
＊＊＊：＜０．００１、極めて有意である。
「＜」または「＞」：検出限界より低いまたは高い
【０２０３】
【表２】
2014520135.tif 000006
【実施例３】
【０２０４】
＜老化皮膚に対するロイコレクチンの生体内効果＞
ロイコレクチン含有組成物を、実施例１に記載の如く調製したが、最後から２番目の工程である、排除サイズが１００ｋＤａのフィルターを通しての限外濾過の工程は省略した。前記組成物を、試験に際し２つの活性スキンローションである、１％および３％スキンローション［容量比］（ローション単位容量当りの組成物の総容量）として調製し、有効成分、つまり、孵化液組成物を含んでいない対照スキンローションと比較した。前記スキンローションは、水中油型（Ｏ／Ｗ）乳剤であった。この油相は、組成物全体の９％に相当し、水素添加レシチンで乳化した。
【０２０５】
二重盲検プラセボ対照臨床試験を行い、軽度から中等度の光損傷を受けた、すなわち、老化した顔面皮膚を有する女性における局所皮膚治療の有効性および許容度を評価した。この試験の継続期間は、１２週間であり、ベースライン、第２週目、第６週目および第１２週目に来院日を設けた。視覚的評価、計測手段、ＶＩＳＩＡ−ＣＲデジタル写真および被験者による自己評価アンケートを用いて有効性を評価した
【０２０６】
被験者の数
１０１名の女性被験者がこの試験への参加を完了した（３つの治療、すなわち、１つのプラセボと、有効成分、つまり、ロイコレクチンを異なる濃度で含む２つの組成物に関して；Ｎ＞３０）。
【０２０７】
被験者集団および特定
被験者は、４０〜６５歳の健康な女性であり、臨床試験番号と共に使用した場合、その試験における各被験者を一意的に特定する３桁の番号を割り当てた。この番号は、この試験の全期間を通して被験者に使用され、実験の匿名性を維持した。
【０２０８】
適格性基準
＜試験対象被験者基準＞
１．健康および適格性アンケートにより判断した、全般的に健康である、４０〜６５歳までの女性。
２．試験の期間中、試験の必要条件に従い、協力および参加しようとする意志並びにいかなる有害な症状も直ちに報告しようとする意志。
３．スコア３〜７の修正グリフィス評価尺度（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈ’ｓ  ｇｒａｄｉｎｇ  ｓｃａｌｅ）に相応する、臨床的に判断した軽度から中等度の顔面における光損傷（小皺、皺、色素沈着過剰、緩みおよび荒れ）。
４．テスト部位の評価を損なう、または試験への参加により被験者の健康リスクが増える可能性のあるいかなる疾病状態または物理的な顔面皮膚疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、脂漏性皮膚炎）もないこと。
５．試験の期間中、長時間に渡る太陽への露出および日焼けマシーンの全使用を避けようとする意志。サングラスを含め保護用の衣服を着用し、午前１０時〜午後４時まで太陽への露出を避けるよう特別な注意を払うものとする。
６．試験の期間中、全ての通常のブランドのカラー化粧品、洗顔料、化粧水（該当する場合）およびメイク落としの使用を継続しようとする意志。各個人は、割り当てられた試験物質以外のいかなる抗老化製品または皮膚美白製品も使用を控えなければならなかった。
７．指定された各クリニック訪問に先立ち、少なくとも２０分前に、全ての化粧を落とそうとする意志。試験訪問が終わるまで、他の局所製品を、顔面または目の周りに適用しないものとした。被験者が化粧を全て落とすことなく到着した場合は、クリニックで残りの化粧を落とし、処置に先立って少なくとも２０分待たなければならなかった。
８．ホルモン補充療法を受けているか、または受胎調節用ホルモンを服用している個人は、試験開始に先立って少なくとも１カ月間は、安定したレジメンに従っていなければならず、また、試験の期間中、この薬剤を変えることなく続ける意志があることが必要であった。試験開始の時点でホルモン補充療法（ＨＲＴ）を受けていないまたはホルモンを服用していない個人は、試験過程の間、使用を開始しない意志があることが必要であった。
９．試験の必要条件に従い、協力および参加しようとする意志並びにいかなる有害な症状も直ちに報告しようとする意志。
【０２０９】
＜除外基準＞
１．任意のパーソナルケア製品に対する不耐性またはアレルギーの既往歴のある個人。
２．試験エントリーの前３０日未満に、任意の処方薬または市販の皮膚美白製品を使用したことのある個人。
３．検査する研究者が、参加に不適当とみなした皮膚の疾患および／または疾病を有していた個人。
４．授乳していた、妊娠していた、またはこの試験期間中に妊娠を予定していた個人。
５．試験エントリーの前３０日未満に、何らかの抗老化、抗皺、局所的抗酸化剤を日常的に使用していた個人。
６．試験開始前６カ月以内に酵素によるフェイシャルスキントリートメントをしたことのある個人。
７．レチン−Ａ（Ｒｅｔｉｎ−Ａ；登録商標）、レチン−Ａマイクロ（Ｒｅｔｉｎ−Ａ  Ｍｉｃｒｏ；登録商標）、レノバ（Ｒｅｎｏｖａ；登録商標）、アビタ（Ａｖｉｔａ；登録商標）、タゾラック（Ｔａｚｏｒａｃ；登録商標）、Ａｖａｇｅ（登録商標）若しくはディフェリン（Ｄｉｆｆｅｒｉｎ；登録商標）または他の局所レチノイドの試験開始前３カ月以内における使用、あるいは、アキュテイン（Ａｃｃｕｔａｎｅ）または経口レチノイドの過去６カ月以内における服用。
８．α−、β−またはポリ−ヒドロキシ酸（サリチル酸およびラクハイドリン（Ｌａｃｈｙｄｒｉｎ）を含む）、レチノール若しくはレチノールの誘導体を含有する製品、または他の「抗老化」製品の試験開始前３０日以内における顔面への日常的使用。
９．治療前３カ月以内または試験期間中に顔の皮膚擦傷術またはケミカルピーリングトリートメントを受けた個人。
１０．治療前６カ月以内または試験期間中に、治療エリア内の治療部位に、ライトＲＦ（ｌｉｇｈｔ  ＲＦ）または他の装置を使用した治療を受けた個人。
１１．治療前９カ月以内または試験期間中に、治療部位にボトックス、コラーゲン、脂肪注入またはその他の注射物質または注入物質を用いたオーグメンテーション法を受けた個人。
１２．この試験の開始前１２カ月以内にリサーフェシング治療、フェースリフトまたは目若しくはまぶたの手術を受けたことのある個人。
１３．顔面に既存のおよび／若しくは潜伏皮膚疾患（例えば、白斑、アトピー性皮膚炎、乾癬、酒さ、湿疹、脂漏性皮膚炎、重度の表皮剥離など）または研究者の見解において、試験の結果に干渉し得る医学的疾患／疾病を有していた個人。
１４．免疫抑制剤／免疫不全障害（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）または後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含む）の既往歴を有していたか、またはその時点で免疫抑制薬を使用していた個人。
１５．任意の他の臨床使用試験（パッチ試験は容認）に参加していた個人。
１６．糖尿病、高血圧症、甲状腺機能亢進症または甲状腺機能低下症といった抑制不可能な疾病を有していた個人。複数の健康上の疾患を有していた数人に関しては、たとえ、それらの疾患が、食事制限、薬剤などにより抑制されていたとしても、参加を拒否した。
１７．この試験への参加前２８日以内に何らかの臨床試験に参加したことのある個人。
【０２１０】
各個人は、病歴並びに試験開始前のインタビューおよび検査の結果に基づいて、研究者または当該研究者が指名した者の自己の判断によりこの試験への参加が認められた。
【０２１１】
＜試験デザイン＞
二重盲検プラセボ対照臨床試験を行い、軽度から中等度の光損傷を受けた、すなわち、老化した顔面皮膚を有する女性における局所皮膚治療の有効性を評価した。この試験の期間は、１２週間であり、ベースライン、第２週目、第６週目および第１２週目に来院日を設けた。視覚的評価、計測手段、ＶＩＳＩＡ−ＣＲデジタル写真および被験者による自己評価アンケートを用いて有効性を評価した。
【０２１２】
１グループにつき３０名を超える３つのグループがこの試験を完了した。被験者には、１２週間顔面に適用する、有効なスキントリートメント、すなわち、上述のロイコレクチン組成物または溶媒対照（水）が施された。被験者を３グループに分ける際の無作為化は、所定の無作為化により行った。
【０２１３】
【表３】
2014520135.tif 000007
【０２１４】
＜有効性および許容度の評価＞
熟練した臨床評価者が、下記に示すパラメーターに関して、顔面の右側および左側を評価した。修正グリフィス尺度を使用し、０＝なし、１〜３＝軽度、４〜６＝中等度および７〜９＝重度とした。皮膚の状態をよりよく描写する上で必要な場合は、半ポイントを使用した。
・小皺
・皺
・色素沈着過剰
・緩み
・くすみ／艶が無い（透明度）
・触覚的粗さ
【０２１５】
熟練した臨床評価者が、下記に示すパラメーターに関して、顔面の右側および左側を評価した。４点尺度を使用し、０＝なし、２＝軽度、３＝中等度および４＝重度とした。皮膚の状態をよりよく描写する上で必要な場合は、半ポイントを使用した。
・紅斑
・乾燥／鱗屑
・ヒリヒリ感／チクチク感
・かゆみ
・突っ張り感／乾燥感
【０２１６】
ＶＩＳＩＡ−ＣＲデジタル写真
顔面の右側および左側のＶＩＳＩＡ−ＣＲ画像を撮影した。被験者は、髪は後方に流し、宝石類は外し、目は閉じ、フレーム内の中央に位置させ、またニュートラルな表情をした状態で撮影した。
【０２１７】
経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ）
計器測定に先立ち、被験者は、少なくとも２０分間、クリニックの環境条件に平衡させた。環境条件は、試験訪問中、１時間ごとに記録した。この時間の間に、被験者は評価され、アンケートに記入し、なお且つ／またはＶＩＳＩＡ−ＣＲ画像撮影が行われた。
【０２１８】
テヴァメーター（Ｔｅｗａｍｅｔｅｒ）を使用し、全訪問時に、経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ）測定を行った。測定は、右頬および左頬上の、目尻から下方に延びる線と鼻の下部を水平に横切る線との交差点で行った。
【０２１９】
テヴァメーターは、オープンチャンバーシステムを用いて、ＴＥＷＬを測定する。皮膚表面に置いた手持ちプローブは、表面上の２点で相対湿度をサンプリングし、測定した湿度勾配から水分喪失率が算出される。
【０２２０】
キュートメーターＭＰＡ５８０
全被験者は、全訪問時において、キュートメーター測定を行った。キュートメーターを使用し、皮膚の粘弾性特性（すなわち、伸張性および弾力性）を評価した。当該装置は、皮膚の小さな部位に真空を適用し、皮膚の弾性応答（開口部内および開口部外への皮膚の動き）を光学的手法により測定する。
【０２２１】
この試験に関しては、２ｍｍのプローブを使用し、３００ｍｂａｒの真空を適用し、且つ、吸着および解放を２サイクル行った。サイクルタイムは、５秒オン、１０秒オフとした。
【０２２２】
測定は、右頬および左頬上の、目尻から下方に延びる線と鼻の下部を水平に横切る線との交差点、または、顎付近の別の部位で行った。
【０２２３】
皮膚評価および自己評価アンケート
被験者は、顔の右側および左側における、自己の顔の皮膚外観および状態を被験者がどのように知覚しているかを記述する質問を含む、皮膚自己評価アンケートに記入した。
【０２２４】
結果
＜小皺＞
有効組成物の１つを含むスキンローションで治療した被験者は、第２週目において、プラセボ（変化率４．５８％）に比べて、小皺の低減（例えば、変化率５．５９％（１％溶液）および５．６５％（３％溶液））を示した。この小皺の低減は、第６週目（例えば、１４．３４％（１％溶液）、１４．８６％（３％溶液）および８．９８％（プラセボ））および第１２週目（例えば、２３．４３％（１％溶液）、２５．９９％（３％溶液）および１４．６８％（プラセボ））でも続いた。図１および図２は、小皺が２８％低減した被験者を示す。
【０２２５】
＜皺＞
有効組成物の１つを含むスキンローションで治療した被験者は、第２週目において、プラセボ（変化率０．７０％）に比べて、皺の低減（例えば、変化率２．１５％（１％溶液）および１．７５％（３％溶液））を示した。この皺の低減は、第６週目（例えば、６．１３％（１％溶液）、７．３２％（３％溶液）および３．７０％（プラセボ））および第１２週目（例えば、１４．７２％（１％溶液）、１５．１５％（３％溶液）および９．５７％（プラセボ））でも続いた。図１は、皺が１２．５％低減した被験者を示す。図３は、皺が２６．３２％低減した被験者を示す。
【０２２６】
＜色素沈着過剰＞
有効組成物の１つを含むスキンローションで治療した被験者は、第２週目において、プラセボ（変化率０．４０％）に比べて、色素沈着過剰の低減（例えば、変化率２．１１％（１％溶液）および２．６８％（３％溶液））を示した。この色素沈着過剰の低減は、第６週目（例えば、５．６１％（１％溶液）、７．９１％（３％溶液）および３．１６％（プラセボ））および第１２週目（例えば、１０．５３％（１％溶液）、１５．３５％（３％溶液）および５．７３％（プラセボ））でも続いた。図１は、１２週間後、年齢による染みの色素沈着が１５％低減した被験者を示す。
【０２２７】
＜緩み＞
有効組成物の１つを含むスキンローションで治療した被験者は、第２週目において、プラセボ（変化率０．８７％）に比べて、緩みの低減（例えば、変化率２．６４％（１％溶液）および１．６２％（３％溶液））を示した。この緩みの低減は、第６週目（例えば、６．３３％（１％溶液）および６．６１％（３％溶液）、２．５１％（プラセボ））および第１２週目（例えば、１０．５５％（１％溶液）および１１．３３％（３％溶液）、５．１８％（プラセボ））でも続いた。図１は、１２週間後、緩み（たるみ）が７．６９％低減した被験者を示す。
【０２２８】
＜くすみ／艶が無い（透明度）＞
有効組成物の１つを含むスキンローションで治療した被験者は、第２週目において、プラセボ（変化率１０．６７％）に比べて、皮膚透明度の向上（例えば、変化率１２．９５％（１％溶液）および１６．００％（３％溶液））を示した。この向上は、第６週目（例えば、２９．２６％（１％溶液）、２８．５０％（３％溶液）および１９．０７％（プラセボ））および第１２週目（例えば、３７．１７％（１％溶液）、３９．１８％（３％溶液）および２６．７２％（プラセボ））でも続いた。図１は、くすみが３３．３３％低減した被験者を示す。
【０２２９】
＜触覚的粗さ＞
有効組成物の１つを含むスキンローションで治療した被験者は、第２週目において、プラセボ（変化率１３．３８％）に比べて、皮膚の触覚的粗さの低減（例えば、変化率１６．５１％（１％溶液）および２０．２４％（３％溶液））を示した。この改善は、第６週目（例えば、２４．７７％（１％溶液）、２６．６５％（３％溶液）および１６．７９％（プラセボ））でも続いたが、第１２週目（例えば、２６．６１％（１％溶液）、２９．１９％（３％溶液）、および１５．７９％（プラセボ））での更なる低減はなかった。図１は、触覚的粗さが１２．５％低減した被験者を示す。
【０２３０】
＜乾燥／鱗屑＞
有効組成物の１つを含むスキンローションで治療した被験者は、第２週目において、プラセボ（変化率６４．７１％）に比べて、皮膚の乾燥／鱗屑の低減（例えば、変化率７２．０９％（１％溶液）および１００．００％（３％溶液））を示した。しかしながら、第６週目（例えば、８６．０５％（１％溶液）、８４．６２％（３％溶液）および１００．００％（プラセボ））および第１２週目（例えば、９０．７０％（１％溶液）、１００．００％（３％溶液）および８９．４７％（プラセボ））では、プラセボに比べて更なる低減はなかった。
【０２３１】
＜ＴＥＷＬ＞
有効組成物の１つを含むスキンローションで治療した被験者は、第２週目において、ＴＥＷＬの低減を示したが、これは、プラセボ（変化率１７．２６％）に比べて、プラセボとの明らかな違いはなかった（例えば、変化率１５．３５％（１％溶液）および１４．５３％（３％溶液））。しかしながら、第６週目（例えば、２９．４６％（１％溶液）、２６．６６％（３％溶液）および２２．９６％（プラセボ））および第１２週目（例えば、３７．４６％（１％溶液）、４０．０４％（３％溶液）、および３４．２１％（プラセボ））においては、プラセボよりも大きく更なる低減が見られた。
【０２３２】
＜伸張性＞
有効組成物の１つを含むスキンローションで治療した被験者は、第２週目において皮膚の伸張性の改善を示したが、これは、プラセボ（変化率１０．８２％）と比べて、プラセボとわずかに異なるのみであった（例えば、変化率１６．１８％（１％溶液）および１７．２１％（３％溶液））。第６週目において、３つの治療間における明らかな違いはなかった（例えば、１８．０４％（１％溶液）、１７．１８％（３％溶液）および１９．９０％（プラセボ））が、第１２週目において、有効成分を含む組成物を用いた皮膚治療に関して、更なる改善が見られ、これは、プラセボよりも大きく改善した（例えば、３１．８４％（１％溶液）、３３．５７％（３％溶液）、および１６．４８％（プラセボ））。
【０２３３】
試験の開始時（ベースライン）および１２週間の治療後に行った顔面の両側に関する触覚的／視覚的臨床評価の比較によると、全被験者が、本発明のポリペプチドを含む組成物を用いた治療後、皮膚のくすみおよび荒れの改善を示し、且つ、大多数の被験者が、小皺（被験者の９７％）、皺（被験者の９１％）、色素沈着過剰（被験者の８７％）およびたるみ（被験者の８０％）の改善を示した（図４）。
【０２３４】
６週間の使用により、全体的な外観、全体的な感覚、滑らかさ、柔らかさ、透明度および弾力性に関する見解の平均スコアにおいて、プラセボと本発明のポリペプチドを含む美容組成物との間に統計的に有意な違いが見られたことがアンケートから明らかになっている。
【０２３５】
従って、プラセボと比べて、ロイコレクチンを含む組成物が、老化皮膚の各特徴への効果を実証したことは上記結果から明らかである。
【実施例４】
【０２３６】
＜ロイコレクチン含有組成物の別の製造方法＞
ロイコレクチン含有組成物の別の製造方法の初期工程は、実施例１に記載のものと同様である。しかしながら、この別の製造方法は、孔径７μｍの標準フィルター用いて孵化液を濾過し、後続の濾過工程においてフィルターを詰まらせる可能性のある物質を除去した後、実施例１の方法から逸脱する。この別の方法においては、この濾液、すなわち処理した孵化液を、メーカーの使用説明書に従ってジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）イオン交換カラムに充填し、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５０）溶液で洗浄した。素通り画分は廃棄した。ロイコレクチンタンパク質は、５０ｍＭのＮａＣｌを含む洗浄液を用いてカラムから溶出させた。この溶出液は、回収した後、排除サイズが８ｋＤａのフィルターを用いてダイアフィルトレーションし、孵化液の水を緩衝液と交換した。この場合、この緩衝液は、リン酸緩衝食塩水であったが、他の緩衝液も同様に適切である。例えば、０．５ｍＭのリン酸塩および１ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液または中性付近またはややアルカリ性（ｐＨ７．５〜８．５）のｐＨでミリモル濃度のトリス（例えば、１０ｍＭ）を含有する緩衝液、５ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液が適切である。ダイアフィルトレーション工程の残余分を回収し、緩衝液を添加することにより希釈した。
【０２３７】
最後に、前記濾液を孔径０．２２μｍのフィルターを通して濾過し、最終濾液を回収した。この濾液は、孵化液のペプチド類を全く含まないかまたは微量のみ含むロイコレクチンの高度濃縮調製物である。
【実施例５】
【０２３８】
＜老化皮膚に対するロイコレクチン組成物の生体内効果＞
＜試験の目的＞
この二重盲検スキンケア試験の目的は、実施例４のロイコレクチン調製物を３％含むゲル剤を用いた３週間の治療計画後、未治療状態と比較し、前腕における皮膚水分量および経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ）に関する変化を評価することであった。さらに、手の年齢によるしみの色素沈着（メラニン含有量）および選択した目の皺の量に対するロイコレクチンの効能を、未治療状態と比較し分析した。
【０２３９】
＜材料および方法＞
この試験は、測定時点は変更したが、標準操作手順（ＳＯＰ）「ハウプトプフレーゲ−プリューフング・スタンダード（Ｈａｕｔｐｆｌｅｇｅ−Ｐｒuｆｕｎｇ  Ｓｔａｎｄａｒｄ；スキンケアテスト基準）（第４版、２００３年１月２９日）」に従って行った。
【０２４０】
この試験は、４名の女性被験者において二重盲検で実施した。被験者は、前腕の乾燥皮膚（ベースライン：角質水分測定値（ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｒｙ  ｖａｌｕｅｓ）＜２０）と、外眼角の目皺と、両手の年齢によるしみとを有することにより、この試験への参加に適格であるとみなされた。４名全被験者が、正しく且つ完全にこの試験を終えた。４名全被験者の結果をデータ分析に含めた。４名の被験者の年齢は、５６．３〜７０．９歳（平均６４．３±６．３年）であった。
【０２４１】
皮膚水分量および経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ）を分析するためのテスト部位は両前腕であった。前腕に４つのテスト部位、すなわち、各前腕の内側に２つずつとした。２つの部位は、ロイコレクチン調製物を含むゲル剤で治療し、１つは、グリセリン（対照）で治療し、４つ目は、治療しないままとした。テスト部位への治療の割り当て方は変化させた。
【０２４２】
目皺の測定のためのテスト部位は、右眼および左眼（外眼角）周囲の皺の部分とした。無作為化により、片側は、ロイコレクチン調製物を含むゲル剤で治療し、他方は、治療しないままとした。
【０２４３】
それぞれの手の選択された１つの年齢による染みに関し、色素沈着に対するロイコレクチン調製物を含むゲル剤の効果を分析した。また、無作為化により、一方の手は、手の甲をゲル剤で治療し、他方は治療しないままとした。
【０２４４】
測定および治療の開始前には、７日間の事前調整期間を設けた。この期間内およびこの試験の全期間中、前腕、両目の外眼角および両手の甲に対する、スキンケア製品、日焼け止め製品、油性または保湿性皮膚クレンジング製品の使用および皮膚治療は禁止した。更に、テスト部位を紫外線（太陽またはサンルーム）に集中的に露出させることは禁止した。研究所での試験日には、化粧の使用は禁止した。
【０２４５】
治療は、３週間に渡って、自宅で１日２回被験者により行われた。対応する前腕テスト部位（無作為化により、１つのテスト部位は治療しないままとし、もう１つは対照としてグリセリンで治療した）に約２ｍｇ／ｃｍ2の量の前記製品を適用した。さらに、ロイコレクチン調製物を含むゲル剤を、顔面の片側の外眼角および一方の手の甲（左または右−無作為化による）に適用し、反対側は治療しないままとした。
【０２４６】
製品の初回適用を始める前（ｔ０）および３週間の治療後（ｔ１）、下記パラメーターを測定した：前腕の皮膚水分量（コルネオメーター（Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ）ＣＭ８２５（登録商標）、１０回の反復測定）；前腕の経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ、ダーマラボ（ＤｅｒｍａＬａｂ）（登録商標）、３回の反復測定）；手の甲の年齢によるしみの色素沈着（Ｓｉａｓｃｏｐｅ（登録商標）、１回測定、メラニン含有量）；および３Ｄ生体内皮膚測定システムＰＲＩＭＯＳ（登録商標）Ｐｉｃｏを用いて外眼角での選択された１つの目皺の量の生体内測定（３回の反復測定、生成された高さの画像により算出された１ｍｍ3当たりの皺の量）。
【０２４７】
正確な製品適用に関する被験者のコンプライアンスは、製品治療開始１週間後にチェックした。
【０２４８】
全測定は、２１．５℃（±１℃）および相対湿度５０％（±５％）の、温度と湿度が調節された部屋で行われ、被験者の覆われていないテスト部位を、少なくとも３０分間これらの屋内環境条件に適応させた後行われた。ｔ１の時点での測定および治療は、最後の製品治療後１０〜２０時間後に行われた。
【０２４９】
＜脱落者＞
脱落者はなかった。
【０２５０】
＜不快な有害皮膚反応＞
不快な有害反応はなかった。
【０２５１】
＜結果＞
３容量％（ｖ／ｖ）のロイコレクチン調製物を含むゲル剤で治療した皮膚は、３週間の１日２回の製品治療後、未治療状態と比べ、４名の被験者の平均で、皮膚水分量は約２３％増加したことを示した（図５）。
【０２５２】
前記ゲル剤で治療された皮膚は、３週間の１日２回の治療後、未治療テスト部位と比べ、４名の被験者の平均で、経表皮水分喪失は約１４．５％低下したこと（皮膚バリア機能の改善）を示した（図６）。
【０２５３】
前記ゲル剤で治療された皮膚は、３週間の１日２回の治療後、未治療テスト部位と比べ、約２３％目皺の量が減少したことを示した（図７）。
【０２５４】
前記ゲル剤で治療された年齢によるしみは、３週間の１日２回の治療後、未治療テスト部位と比べ、４名の被験者の平均で、約１０．０％色素沈着（メラニン含有量）が減少したことを示した（図８）。
【０２５５】
＜配列：＞
１．サケの胚のロイコレクチンポリペプチド：
ＭＲＴＴＡＡＦＬＬＶＬＣＬＬＡＩＳＨＡＷＤＣＱＥＶＶＮＩＫＮＬＭＱＩＤＡＧＬＧＱＶＶＡＴＤＴＳＱＩＰＹＹＬＶＧＤＫＷＩＲＬＰＧＳＬＫＨＩＴＶＧＰＡＧＩＷＧＶＮＫＤＹＡＩＹＫＹＶＡＧＮＷＶＱＡＡＧＬＬＫＱＬＤＡＧＧＥＱＦＩＶＧＡＮＭＮＤＴＰＹＣＬＴＳＳＡＴＶＧＹＫＧＰＧＳＰＬＰＷＴＧＬＰＧＡＶＫＹＹＳＣＧＰＦＧＣＷＡＶＮＫＮＤＤＩＹＬＭＳＬＮＱＤＣＱＮＫＧＷＳＨＩＥＧＫＬＳＭＩＥＶＡＴＤＧＳＶＦＧＶＮＳＡＧＳＶＹＴＲＤＧＩＴＡＳＫＰＥＧＴＧＷＳＮＩＰＭＧＭＬＭＧＨＶＴＹＤＬＧＲＬＷＶＶＳＫＳＡＶＴＭＶＣＴＨ
【０２５６】
２．サケ白血球のロイコレクチンポリペプチド：
ＳＩＰＹＹＬＶＧＤＫＷＩＲＬＰＧＳＬＫＨＩＴＶＧＰＡＧＩＷＧＶＮＫＤＹＡＩＹＫＹＶＡＧＮＷＶＱＡＡＧＬＰＫＱＬＤＡＧＧＥＱＦＩＶＧＡＮＭＤＤＴＰＹＣＬＴＳＳＡＴＶＧＹＫＧＰＧＳＰＬＰＷＴＧＬＰＧＡＶＫＹＹＳＣＧＰＦＧＣＷＡＶＮＫＮＤＤＩＹＬＭＳＬＮＱＤＣＱＮＮＧＷＳＨＩＥＧＫＬＳＭＩＥＶＡＴＤＧＳＶＦＧＶＮＳＡＧＳＶＹＴＲＤＧＩＴＡＳＫＰＥＧＴＧＷＳＮＩＰＭＣＭＬＭＧＨＶＴＹＤＬＧＲＬＷＶＶＳＫＳＡＶＴＭＶＣＴＨ
【０２５７】
３．サケのロイコレクチン−２ポリペプチド：
ＭＲＴＴＡＡＦＬＬＶＬＣＬＬＡＩＳＨＡＷＤＣＱＥＶＶＮＩＫＮＬＭＱＩＤＡＧＬＧＱＶＶＡＴＤＴＳＱＩＰＹＹＬＶＧＤＫＷＩＲＬＰＧＳＬＫＨＩＴＶＧＰＡＧＩＷＧＶＮＫＤＹＡＩＹＫＹＶＡＧＮＷＶＱＡＡＧＬＬＫＱＬＤＡＧＧＮＱＦＶＶＧＡＮＭＤＤＴＰＦＣＬＴＳＳＡＴＶＧＹＫＧＰＧＳＰＬＰＷＴＧＬＰＧＡＶＫＹＹＳＣＧＨＦＧＣＷＡＶＮＫＮＤＤＩＦＬＭＳＬＮＱＤＣＱＮＮＧＷＳＨＩＤＧＫＬＳＭＩＥＶＡＴＤＧＳＶＦＧＶＮＳＡＧＳＶＹＴＲＤＧＩＴＡＳＫＰＥＧＴＧＷＳＮＩＰＭＧＭＬＭＧＨＶＴＹＤＬＧＲＬＷＶＶＳＫＳＧＧＴＭＶＣＴＨ
【０２５８】
４．サケのロイコレクチン−３ポリペプチド：
ＭＧＴＴＡＡＦＬＬＶＬＣＬＬＡＩＳＨＡＷＤＣＱＥＶＶＮＩＫＮＬＭＱＩＤＡＧＬＧＱＶＶＡＴＤＴＳＱＩＰＹＹＬＶＧＤＫＷＩＲＬＰＧＳＬＫＨＩＴＶＧＰＡＧＩＷＧＶＮＫＤＹＡＩＹＫＹＶＡＧＮＷＶＱＡＡＧＬＬＫＱＬＤＡＧＧＥＱＦＩＶＧＡＮＭＮＤＴＰＹＣＬＴＳＳＡＴＶＧＹＫＧＰＧＳＰＬＰＷＴＧＬＰＧＡＶＫＹＹＳＣＧＰＦＧＣＷＡＶＮＫＮＤＤＩＹＬＭＳＬＮＱＤＣＱＮＫＧＷＳＨＩＥＧＫＬＳＭＩＥＶＡＴＤＧＳＶＦＧＶＮＳＡＧＳＶＹＴＲＤＧＩＴＡＳＫＰＥＧＴＧＷＳＮＩＰＭＧＭＬＭＧＨＶＴＹＤＬＧＲＬＷＶＶＹＫＳＡＶＴＭＶＣＴＨ
【配列表フリーテキスト】
【０２５９】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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