(57)【要約】ＡＣＣアーゼ阻害性除草剤、特にＦＯＰ除草剤に対して抵抗性／耐性の変異体イネが表１に列挙されている。選択に用いられるＡＣＣアーゼ阻害性除草剤には、キザロホップが挙げられる。ノスズメノテッポウのナンバリングシステムを用いる場合、ＡＣＣアーゼコード遺伝子のカルボキシルトランスフェラーゼドメインにおいてＧ２０９６Ｓを有するイネゲノムまたはその等価物を有する、ＡＣＣアーゼ除草剤に対して耐性の例示的な変異体イネが開示されている。この変異は、ＦＯＰ対ＤＩＭ除草剤に対して示差的な応答を示し、匹敵する非抵抗性イネ系統に関してより差が大きい。雑草を制御するための方法、およびトランスジェニックイネを含む除草剤抵抗性イネを生成するための方法が開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水田において雑草を制御する方法であって、
（ａ）イネを水田で育てる工程であって、該イネが変異によりＡＣＣアーゼ阻害性除草剤に対して抵抗性であり、かつ該イネが、育種、組織培養、または形質転換を通してＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１２９３３に由来するものである、工程；および
（ｂ）該除草剤を該水田に施用する工程
を含む方法。
【請求項２】
水田において雑草を制御する方法であって、
（ａ）除草剤抵抗性イネを水田で育てる工程であって、前記イネが複数の除草剤に対して抵抗性である、工程；および
（ｂ）該イネ植物が抵抗性である複数の除草剤と該水田を接触させる工程
を含む方法。
【請求項３】
前記複数の除草剤が、少なくとも１つのＡＣＣアーゼ阻害性除草剤を含み、抵抗性が変異によるものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記除草剤抵抗性イネがＰＴＡ−１２９３３である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＡＣＣアーゼ阻害性除草剤がＦＯＰ除草剤である、請求項１または３に記載の方法。
【請求項６】
前記イネが表１から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ＡＣＣアーゼ除草剤が、キザロホップ、クロジナホップ−プロパルギル、ハロキシホップ−メチル、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１または３に記載の方法。
【請求項８】
抵抗性に関連した前記変異がＧ２０９６Ｓである、請求項１または３に記載の方法。
【請求項９】
前記変異の源が、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１２９３３として寄託された種子である、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
ＡＣＣアーゼ阻害性除草剤に対する抵抗性が、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１２９３３の遺伝子に由来する、ＡＣＣアーゼ阻害性除草剤に対する抵抗性を有するイネを開発するための方法であって、
（ａ）ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１２９３３を有するイネを非抵抗性イネの供給源へ遺伝子移入する工程；および
（ｂ）該イネが抵抗性であることを確認する工程
を含む、方法。
【請求項１１】
除草剤抵抗性イネ植物を生成する方法であって、該方法が、イネ植物を導入遺伝子で形質転換する工程を含み、かつ該導入遺伝子が、請求項７に記載の群から選択される除草剤に対する抵抗性を与える、方法。
【請求項１２】
前記導入遺伝子が配列番号１においてのような核酸配列を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＡＣＣアーゼコード遺伝子のプロモータ、ターミネータ、選択マーカー、または他のドメインが任意に結合した配列番号１を有する核酸分子で、イネを形質転換する工程を含む、請求項１１に記載の除草剤抵抗性イネを生成する方法。
【請求項１４】
請求項１５、１７、１９、２２、または２３に記載の植物を、異なるイネ植物と交配する工程、および結果として生じたハイブリッドイネ種子を採取する工程を含む、イネ種子を産生する方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法によって産生された種子から生じた除草剤抵抗性イネ植物。
【請求項１６】
ＭＬ０８３１２６５−０１４９３と名付けられたイネ種子であって、種子の代表的な試料がＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１２９３３として寄託された、イネ種子。
【請求項１７】
請求項１６に記載の種子を生長させることによって生じるイネ植物またはその一部分。
【請求項１８】
請求項１５または１７に記載の植物の花粉または胚珠。
【請求項１９】
請求項１６に記載のイネ植物の生理学的および形態学的特性の全部を有するイネ植物またはその一部分。
【請求項２０】
請求項１５または１７に記載のイネ植物由来のプロトプラストまたは細胞から産生される組織培養物であって、該組織培養物の該細胞またはプロトプラストが、葉、花粉、胚、子葉、胚軸、分裂組織細胞、根、根冠、雌蕊、葯、花、茎、穎、および穂からなる群から選択される植物部分から産生される、組織培養物。
【請求項２１】
請求項１５または１７に記載の植物から産生されるプロトプラスト。
【請求項２２】
請求項１６に記載のイネ植物の全ての形態学的および生理学的特性を有する、請求項２０に記載の組織培養物から再生されるイネ植物。
【請求項２３】
キザロホップ、クロジナホップ−プロパルギル、ハロキシホップ−メチル、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるＡＣＣアーゼ除草剤に対する抵抗性を与えるＡＣＣアーゼコード遺伝子の色素体カルボキシラーゼトランスフェラーゼドメインで構成されるＤＮＡ配列を含む除草剤抵抗性イネ植物。
【請求項２４】
配列番号１を含む、請求項２３に記載の除草剤抵抗性イネ植物。
【請求項２５】
ＡＣＣアーゼ阻害性化学物質に対する耐性を伝えるＡＣＣアーゼコード遺伝子の色素体カルボキシラーゼトランスフェラーゼドメインの配列番号１を含む、単離されたＤＮＡ配列。
【請求項２６】
図５（配列番号７）においてのようなアミノ酸配列を含む変異体ＡＣＣアーゼ酵素であって、該酵素を有するイネにおいてＡＣＣアーゼ阻害剤に対する抵抗性を与える、酵素。
【請求項２７】
公表された、異なる変異を有するイネの応答より大きいＦＯＰに対する示差的な応答を伝える、請求項２６に記載の変異体酵素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
本願は、２０１１年７月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／５１０，５８５号、および２０１１年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／５４１，８３２号からの優先権を主張し、双方は参考として援用される。ＡＣＣアーゼ阻害剤である除草剤に対する耐性／抵抗性により特徴付けられ、かつ米作物に対して有益な他の特徴を示す新規のイネ植物が記載および開示される。圃場における除草剤抵抗性のイネの使用により雑草を制御する方法、および例えば、変異体ＡＣＣアーゼ酵素をコードする導入遺伝子を用いて、除草剤抵抗性のイネを産生する方法もまた開示される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを経由してＡＳＣＩＩ形式で提出されており、かつ参照により全体として本明細書に組み入れられている配列表を含む。２０１２年７月２０日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１１５７６０＿ＳＥＱ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名前であり、サイズが３２，７６８バイトである。
【背景技術】
【０００３】
米作物の価値
米は、古来の農作物であり、今日、世界の主食作物の一つである。米の２つの栽培種：Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．（アジア米）およびＯｒｙｚａ  ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ  Ｓｔｅｕｄ（アフリカ米）がある。アジア種は、世界の栽培米の事実上全部を構成し、米国において育てられている種である。米国において、以下の３つの主要な米生産地域がある：ミシシッピデルタ（アーカンソー州、ミシシッピ州、ルイジアナ州北東部、ミズーリ州南東部）、湾岸（ルイジアナ州南西部、テキサス州南東部）、およびカリフォルニア州のセントラルバレー。
【０００４】
イネは、根と大気の間における茎を通したガス交換を可能にする独特な構造を有するため、浅水中で生育され得る少数の作物の一つである。浅水中の生長は、最高の収量をもたらし、イネが、通常、重粘土質土壌、または土壌表面のすぐ下に不透水性硬盤層を有する土壌において育てられるという根拠である。これらの土壌型は、通常、他の作物には適していないか、または最高の時でもその作物の収量が乏しいかのいずれかである。
【０００５】
イネの絶え間ない改良は、増加しつつある世界人口に必要な栄養を供給するのに避けられない。世界人口の大部分は、米を主要な栄養源として消費している。イネ改良は、慣用的な育種実施を通して、および組換え遺伝子技術により行われる。この専門領域外の人々にとっては単純そうにみえるが、作物改良は鋭い科学的かつ芸術的技能を必要とする。
【０００６】
特定の育種目的は米生産地域により若干、異なるが、収量の増加は、全てのプログラムにおいて主要な目的である。
【０００７】
植物育種は、現在の栽培品種の強みと弱点の分析および定義から始まり、続いて、特定の育種目的の定義を含め、その弱点に取り組むためのプログラム目標を設定する。目標は、単一の栽培品種において、親の源由来の望ましい形質の向上した組み合わせを合わせることである。これらの重要な形質には、より高い収量、環境ストレス、病気、および虫に対する抵抗性、より丈夫な茎および根、低温への耐性、より良い作物栽培学的特性、ならびに穀粒品質が挙げられ得る。
【０００８】
育種家は、最初に、２つもしくはそれより多くの親系統を選択して、交配し、続いて、その多くの新しい遺伝的組み合わせの中から選択する。育種家は、理論的には、交配を通して、何十億個という新しくかつ異なる遺伝的組み合わせを生み出すことができる。育種家は、細胞レベルでの直接的制御力は持たない；それゆえに、２人の育種家は、決して、同じ系統、または同じイネ形質を有する非常に類似した系統でさえも開発することはない。
【０００９】
系統育種は、一般的に、イネなどの自家受粉作物の改良に用いられる。好ましい相補的な形質を有する２つの親が、交配され、Ｆ１世代を生む。一方または両方の親は、それ自体、以前の交配からのＦ１を表し得る。その後、２つの親が純系である場合には、１個または数個のＦ１を自家受粉させることから生じた種子を生長させ、または親の少なくとも１つがＦ１である場合には、最初の交配から生じた種を直接生長させることにより、分離集団が作製される。最良の個体の選択は、最初の分離集団またはＦ２において始めてもよい；次いで、Ｆ３において始めると、最良ファミリーにおける最良個体が選択される。「最良」とは、特定の育種プログラムの目標、例えば、収量を増加すること、病気に抵抗することに応じて定義される。概して、遺伝的相互作用のため、多因子アプローチが、「最良」を定義するために用いられる。１つの遺伝的背景における望ましい遺伝子は、背景が異なると異なり得る。加えて、遺伝子の導入は、他の好ましい遺伝的特性を破壊する可能性がある。ファミリーの反復試験は、低い遺伝率を有する形質の選択の有効性を向上させるためにＦ４世代において始めることができる。近親交配の進行期（すなわち、Ｆ６およびＦ７）において、最良系統または表現型的に類似した系統の混合物が、新しい親系統としての可能性のある公開（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｒｅｌｅａｓｅ）のために試験される。
【００１０】
戻し交配育種は、遺伝性が高い形質についての遺伝子を、反復親である望ましいホモ接合性栽培品種または近交系へ移入するために用いられている。移入される形質の源は、供与親と呼ばれる。その結果生じた植物は、反復親（例えば、栽培品種）の特質、および供与親から移入される所望の形質を有することが予想される。最初の交配後、供与親の表現型を有する個体が選択され、反復親へ繰り返し、交配（戻し交配）される。その過程は、供与親により供給された新しい形質の追加と共に、反復親の有益な特性の全部を回復するために用いられる。
【００１１】
有望な進歩した育種系統は、商業的標的地域（複数可）を表す環境において、少なくとも３年もしくはそれより長い年数、十分に試験され、適切な標準と比較される。最良系統が、新しい商業品種またはハイブリッドの親の候補である；少数の形質がまだ欠損している系統は、さらなる選択のための新しい集団を作製するための親として用いられてもよい。
【００１２】
上市および流通の最終段階につながるこれらの過程は、通常、最初の交配が行われた時点から８年から１２年間かかり、前駆体としての改良された育種系統の開発に依存し得る。したがって、新しい栽培品種の開発は、正確な将来計画、資源の効率的な使用、および最小限の方向転換を必要とする時間のかかる過程である。
【００１３】
育種を通してのイネの改良は、イネにおける天然の遺伝的バリエーション（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）、および野生型イネなどの雑種に限定される。育種プログラムにおける新しいバリエーション（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）の導入は、通常、系統育種または戻し交配育種などの記載されているような交配プログラムを通して行われる。しかしながら、病害抵抗性または高さ変化などの新しい形質の導入を生じる、自然の変異（ｎａｔｕｒａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）が時々見出される。育種家はまた、イネゲノムへ変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）（ＤＮＡ配列における小さい変化）を導入することにより新しい形質を発生させている。一般的に、ＥＭＳ、またはアジ化ナトリウム＋ＭＮＵは変異原性剤として用いられる。これらの化学物質は、通常ＧおよびＣのＡおよびＴへの、ＤＮＡにおける一塩基変化をランダムに導入する。これらの変化の大部分は、遺伝子コード領域から外れるか、または遺伝子産物のアミノ酸配列を変化させないかのいずれかであるため、作物へ影響することはない。
【００１４】
育種家は、ＤＮＡ配列における変異部位の直接的制御力はもたない。有用な変化の同定は、有効な変異が導入される確率的可能性、および育種家がその変異を選択することができる確率的可能性による。種子は、変異原性化学物質で処理され、すぐに植えられ、生長し、Ｍ２種子を産生する。Ｍ２種子は、多数の新しいバリエーションを有する；それゆえ、２つの実験が同じ組み合わせを生じることはない。これらのバリエーションの中で、イネにおいて以前には存在せず、かつ植物育種家による選択では入手できない新しい形質が見出される可能性があり、イネ改良に用いられ得る。
【００１５】
新しい形質を見出すために、その過程は、完全にランダムであり、かつ有用な新しい組み合わせが極めて低い頻度でしか得られないため、育種家は、効率的かつ戦略的な選択ストラテジーを用いなければならない。何千個という誘導された新しい遺伝的バリエーションバリアントの中で、所望の新しい形質を有するのがたった１個のみである可能性がある。最適選択系は、何千個という新しいバリアントをスクリーニングし、新しい形質を有する可能性がある数個、またはたった１個の植物の検出さえも可能にする。可能性がある新しい形質を同定し、または見出した後、育種家は、系統育種または戻し交配育種、ならびにその新しい形質および栽培品種が米生産者にとって安定した、かつ遺伝性の価値を示すことを検証するための広範な試験によって、新しい栽培品種を開発しなければならない。
【００１６】
組換え遺伝子技術を用いて、イネにおける改良された特性をコードする変異を有する核酸分子は、商業的に適したゲノムを有するイネへ導入され得る。変異が同定された後、それは、組換え技術によりイネへ移入され得る。
【００１７】
イネにおける除草剤抵抗性特許の施用
作物における雑草は、資源において競合し、作物の収量および品質を大いに低下させる。雑草は、雑草を死滅させるが、作物を害しない選択性除草剤の施用によって作物において制御されている。通常、除草剤の選択性は、作物と雑草の間の生化学的バリエーションまたは差異に基づいている。いくつかの除草剤は、非選択性であり、それは、それらが全部、またはほとんど全部の植物を死滅させることを意味する。非選択性または広域スペクトルの除草剤は、除草剤に対する耐性または抵抗性を伝える特定のタンパク質を発現する新しい遺伝子が挿入されている場合には、作物に用いることができる。除草剤に対する抵抗性はまた、タンパク質および生化学的過程を変化させる遺伝的変異を通して作物において達成されている。これらの変異は、天然で起こる可能性があるが、たいてい、それらは、作物において、またはインビトロでの組織培養において誘導されている。残念なことに、場合によっては、特に特定の除草剤の反復使用によって、雑草は、抵抗性を与える天然の変異の意図せぬ選択を通して抵抗性を生じている。雑草が、特定の除草剤に対して抵抗性になった場合、その除草剤はもはや雑草制御に有用ではない。雑草における抵抗性の発生は、雑草を制御する、異なる作用様式の使用に替えて、抵抗性雑草の発生を妨害することを通して遅延させることが最善である。
【００１８】
米生産は、赤米と呼ばれる特に制御困難な雑草に悩まされている。赤米は栽培イネと非常に遺伝的に類似している（それらは時々、他家受粉する）ため、赤米を標的にするが栽培イネを害しないという利用可能な選択性除草剤がないため、その困難が生じている。広域スペクトルの除草剤、例えば、イミダゾリノンおよびスルホニル尿素系除草剤に対する抵抗性をイネに与える、イネに見出された変異の発生を通して、商業的米生産において現在、制御が為されている。
【００１９】
除草剤に対して、および別の作用様式を有する除草剤の組み合わせに対して抵抗性にする、イネにおける新しい変異を見出すことは、米生産にとって多大な利益となる。除草剤抵抗性についての遺伝子を得てイネゲノムへ組み込んで、追加の好ましい特性および別の抵抗性をもたせることは、難しく、予測不可能で、時間および費用がかかるが、世界のますます増加する食料ニーズに対処するために必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
要旨
別の作用様式を有する除草剤に対する独特な抵抗性を有する、特徴的なイネ系統が本明細書に記載されている。これらのイネ系統は、栽培者の圃場に施用される除草剤の種類を循環させ、それにより、雑草での抵抗性の発生を遅らせることができるため、数種類の除草剤の有用寿命を延長させるはずである。雑草制御のために、加えてハイブリッド種子生産の選択肢として、これらの抵抗性をハイブリッドまたは品種へ配置するためのいくつかの方法が可能である。本明細書で記載されたイネ系統は、イネにおける雑草制御のための新しい方法を表し、雑草を制御するための多くの可能なストラテジーのいずれにおいても配置することができ、これを始めとする雑草制御方法の長期使用を提供する。特に、ＡＣＣアーゼ阻害性除草剤に対して耐性の変異体イネが開示される。これらは、定義されたアミノ酸配列を有する植物である。
【００２１】
例えば、ＡＣＣアーゼ変異体Ｇ２０９６Ｓを有するイネは、すでに作物栽培学的に適応しており、本明細書に記載されているような育種または戻し交配を通して、商業的に適した生物材料において除草剤抵抗性を提供する。
【００２２】
ノスズメノテッポウ（Ｂｌａｃｋ  Ｇｒａｓｓ）（Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓ  ｍｙｏｓｕｒｏｉｄｅｓ）ナンバリングシステムを用いた場合、ＡＣＣアーゼ遺伝子のカルボキシルトランスフェラーゼコード領域に変異Ｇ２０９６Ｓを有する、ＡＣＣアーゼ阻害性除草剤に対して耐性の変異体イネが開示される。その変異は、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ酵素を、除草剤として用いられるＡＣＣアーゼ阻害剤に対して耐性／抵抗性にする。
【００２３】
除草剤抵抗性種子由来の細胞、そのような種子から生長した植物およびそのような植物由来の細胞、そのような種子から生長した植物の子孫およびそのような子孫由来の細胞は、この開示の範囲内である。寄託された種子から生じた植物およびそのような植物の子孫の生長は、典型的には、通常では、対応する野生型植物の生長を阻害する除草剤のレベルにおけるアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ阻害性除草剤に対して抵抗性／耐性となる。
【００２４】
イネ植物の近くの雑草の生長を制御するための方法もまた、本開示の範囲内である。そのような方法の１つの例は、通常ではイネ植物の生長を阻害する除草剤のレベルで、雑草およびイネ植物へ１つもしくはそれより多くの除草剤を施用することである。例えば、少なくとも１つの除草剤は、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ活性を阻害する。そのような方法は、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ活性を阻害する任意の除草剤、および任意の抵抗性イネ変異に関して実施されてもよく、例えば、その３つの実施形態が本明細書に開示されている。
【００２５】
除草剤耐性イネ植物を生長させるための方法は、（ａ）抵抗性イネ種子を植える工程；（ｂ）イネ種子を発芽させる工程；（ｃ）通常ではイネ植物の生長を阻害する除草剤のレベルでイネの芽に１つもしくはそれより多くの除草剤を施用する工程を包含する。例えば、その除草剤の少なくとも１つは、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼを阻害する。そのような方法は、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ活性を阻害する任意の除草剤により実施され得る。
【００２６】
除草剤耐性イネ植物を生成する方法はまた、導入遺伝子を用いてもよい。そのような方法の１つの例は、イネ植物の細胞を導入遺伝子で形質転換することであって、その導入遺伝子は、アリールオキシフェノキシプロピオネート除草剤、シクロヘキサンジオン除草剤、フェニピラゾリン除草剤、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの除草剤に対する耐性を、生じたイネ植物において与える、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ酵素をコードする。これらの方法の実施において任意の適切な細胞が用いられ得、例えば、細胞は、カルスの形をとってもよい。トランスジェニックの実施形態は、２０９６位（ノスズメノテッポウのナンバリングシステム）におけるＧからＳへの、ＡＣＣアーゼをコードする核酸における変異を含むものである。
【００２７】
植物イネの変異誘発したアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む組換えの、変異誘発した、合成の、および／または単離された核酸分子であって、変異誘発したアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼのアミノ酸配列が、対応する野生型植物のアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼのアミノ酸配列と異なる、核酸分子は、本開示の範囲内である。
【００２８】
ＡＣＣアーゼコード遺伝子における種々の変異は、特定の型のＡＣＣアーゼ阻害性除草剤（ＦＯＰＳ）、（ＤＩＭＳ）に対する抵抗性に関連する場合が多い。したがって、種々の変異の特異性は、イネにおける雑草制御についての複数の作用様式を生じる可能性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、旗でマークされた、キザロホップ噴霧の作条１１ＵＳＡＧ５１４７７において生存する植物を示す。
【図２】図２は、移植後のキザロホップ生存体を示す。
【図３】図３は、結実した１１ＵＳＡＧ５２０８４−２イネ植物を示す。
【図４】図４は、ＡＣＣアーゼコード遺伝子におけるカルボキシルトランスフェラーゼコード領域についてのＤＮＡ配列を示す；Ｇ２０９６Ｓからの一塩基変化が変異体系統ＭＬ０８３１２６５−０１４９（０９ＰＭ７２３９９として識別されている）において同定されている。図４は、登場順に、それぞれ、配列番号２〜４を開示する。
【図５】図５は、ＡＣＣアーゼ遺伝子のカルボキシルトランスフェラーゼ領域についてのタンパク質配列の比較を示す；コード０９ＰＭ７２３９９を有する系統は、系統ＭＬ０８３１２６５−０１４９である；この系統は、ノスズメノテッポウと比べて、２０９６位において単一アミノ酸の変化を示す；Ｒ０１４６は、変異集団を作製するために変異誘発物質で処理された元の系統である。図５は、登場順に、それぞれ、配列番号５〜７を開示する。
【図６】図６は、キザロホップ除草剤の異なる施用量におけるＭＬ０８３１２６５−０１４９由来の植物の結果を示す。
【図７】図７は、異なるＡＣＣアーゼ型除草剤の施用でのＭＬ０８３１２６５−０１４９由来の植物の結果を示す。
【図８】図８は、２０９６位（ノスズメノテッポウのナンバーシステム）においてＧの代わりにＳを有するＡＣＣアーゼ酵素をコードする変異体ヌクレオチド配列（配列番号１）である。
【図９】図９は、発表された、異なる変異についての比較と共に、（ａ）Ｇ２０９６Ｓ変異を有するイネ植物；および（ｂ）その変異を含まないイネ植物におけるＦＯＰのＡＣＣアーゼ阻害性除草剤との接触後の傷害％の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
詳細な説明
イネ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．は、重要かつ価値のある農作物である。したがって、イネ育種家の継続的目標は、作物栽培学的に妥当である安定かつ高収量のイネ栽培品種を開発することである。栽培者は、彼らの経済状態を高める手段として新しい品種およびハイブリッドからの収量の増加を絶えず、期待している。人口レベルに加えて、栄養的ニーズが拡大しているが、生産資源に限りがあるため、収量の増加が必要である。この目標を達成するために、イネ育種家は、要求される形質および優れた収量を有するイネ植物を選択し、開発しなければならない。
【００３１】
アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ；ＥＣ  ６．４．１．２）酵素は、植物葉緑体において新生脂肪酸合成経路の起点としてマロニル−ＣｏＡを合成する。イネ科植物葉緑体におけるＡＣＣアーゼは、Ｎ末端輸送ペプチドを介して色素体へ運搬される多機能性、核−ゲノム−コード化、巨大単一ポリペプチドである。イネ科植物葉緑体における活性型は、ホモ二量体タンパク質である。
【００３２】
イネ科植物におけるＡＣＣアーゼ酵素は、３つのクラスの除草活性成分によって阻害される。その２つの最も普及しているクラスは、アリールオキシフェノキシプロパノエート（「ＦＯＰ」）およびシクロヘキサンジオン（「ＤＩＭ」）である。これらの２つのクラスに加えて、３つ目のクラス、フェニルピラゾリン（「ＤＥＮ」）が記載されている。
【００３３】
ＡＣＣアーゼ酵素のカルボキシルトランスフェラーゼ領域における特定の変異は、結果として、ＡＣＣアーゼ除草剤に対して抵抗性になるイネ科植物を生じる。雑草のノスズメノテッポウにおいて、ＡＣＣアーゼ除草剤のＦＯＰまたはＤＩＭクラスに対する抵抗性を与える、少なくとも５つの変異が記載されている。ＡＣＣアーゼ酵素にこれらの除草剤に対する抵抗性を与えるいくつかの変異は、適応度の減少に関連する可能性がある。
【００３４】
変異集団および確立
専有の除草剤耐性系統を開発するために、変異育種プログラムを開始した。Ｐ１００３、Ｒ０１４６、およびＰ１０６２を含む３つの系統の約１０，０００個（穀粒の平均重量により推定）の種子を変異誘発物質のアジ化ナトリウム（ＡＺ）およびメチルニトロソウレア（ＭＮＵ）に曝露することにより、永久的変異体集団を作製した。処理された種子を個体植えした。個々の植物を収穫し、８，２８１個の変異系統を作製した。変異系統は、形質スクリーニングのための永久的変異体集団として維持されている。
【００３５】
除草剤スクリーニング
永久的変異体集団を、キザロホップ除草剤を用いてスクリーニングした。出願人らは、Ｒ０１４６由来の２，７３５個のＭ２子孫の作条、Ｐ１００３由来の３，７７４個のＭ２子孫の作条、およびＰ１０６２由来の６５５個のＭ２子孫の作条を、２反復で植え、各反復において推定上、合計２５０，０００個の植物があった。キザロホップを、定植から２７日後、第１の反復に１５オンス／エーカー（１１５．５９ｇｍａｉ／ｈａ）の量で施用した。除草剤が施用されたとき、植物は、３〜４の葉期であり、活発に生長していた。施用した翌日、圃場を洗い流した。約９日後、生存する植物が、４つの異なる子孫作条に見出され、０．００６％の推定変異率を示した（図１〜３）。
【００３６】
ＡＣＣアーゼ除草剤に対する抵抗性を示す系統におけるタンパク質配列比較
キザロホップの施用に際して生き残った全ての植物から、色素体ＡＣＣアーゼタンパク質をコードする遺伝子の一部を配列決定した。その遺伝子のカルボキシルトランスフェラーゼコード領域のみを配列決定した（図４）。系統ＭＬ０８３１２６５−０１４９３由来の植物の全部が、ＡＣＣアーゼタンパク質においてアミノ酸変化を引き起こす、ＤＮＡ配列における変異を有した。ノスズメノテッポウにおけるナンバリングに対するアミノ酸２０９６についてのコドンにおいて、１個のＤＮＡ塩基が変化していた。（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＣ８４１６１．１、「Ａｍ」と表示）（図５）。イネとノスズメノテッポウの両方において、２０９６位におけるアミノ酸はグリシンである。ノスズメノテッポウにおける抵抗性変異は、この位置におけるアミノ酸をアラニンに変化させる。名称ＭＬ０８３１２６５−０１４９３に関する、キザロホップの施用を生き残ったイネに見出される変異は、アミノ酸２０９６についてのＤＮＡコドンをＧＧＣからＡＧＣへ変化させ、そのことにより２０９６位においてグリシンの代わりにセリンの挿入が引き起こされた。変異体系統は、変異体集団の最初のスクリーニングにおいてキザロホップに対する抵抗性を示した。キザロホップでのスクリーニング後、ＦＯＰに対する抵抗性を確認した。生存する変異体系統は、ＤＩＭ型ＡＣＣアーゼ阻害性除草剤に対して感受性が高かった。
【００３７】
キザロホップでのスクリーニングに際し生き残った変異体集団からの他の系統のいずれも、ＡＣＣアーゼコード遺伝子のカルボキシルトランスフェラーゼ領域において変異を保有しなかったが、それらは、キザロホップ除草剤に対する抵抗性を有することが確認されている。これらの系統における抵抗性は、ＡＣＣアーゼのカルボキシルトランスフェラーゼ領域の外側での変化に由来する可能性があり、または異なる型の抵抗性機構に由来し得る。
【００３８】
抵抗性植物
除草剤処理後、移植前の生存する植物は、緑色で健康そうであり、一方、作条内および隣接した作条における全ての周囲植物は死んでいた。移植後の植物を維持し、収穫した。子孫を、生産イネにおける除草剤抵抗性の源として維持し、試験し、発育させた（表１）。この形質を、戻し交配し、または専有のイネ系統へと育種し、イネにおいて雑草を制御する別の作用様式を生産者に提供する新しい品種またはハイブリッドを開発するために用いる。栽培者にこの機会を与えることは、高収量を提供すること、および現在用いられている雑草制御テクノロジーの有用寿命を延ばすことの両方において、大きな価値がある。これらの除草剤抵抗性系統は、生長する植物への除草剤の単純な施用を通して、または分子技術を通して、追跡することができる。除草剤抵抗性についての原因となる変異を含め、変異系統の完全な配列は知られているため、抵抗性を有する植物および系統の選択のための一塩基多型マーカーなどの分子マーカーを設計することができる。除草剤バイオアッセイと共にこれらのマーカーは、イネにおいて、少なくともＦＯＰ型のＡＣＣアーゼ除草剤抵抗性の開発を促進する。
【００３９】
育種プログラムにおける除草剤抵抗性イネの選択は、抵抗性を受け継ぐ材料を観察するバイオアッセイにおいて子孫材料に除草剤を噴霧することにより達成される。あるいは、系統ＭＬ０８３１２６５−０１４９３は、その変異を含有する遺伝子領域を配列決定することにより、またはその変異を検出する一塩基多型マーカーを作製することにより、選択され得る。
【００４０】
ＡＣＣアーゼ阻害剤に対して耐性／抵抗性のハイブリッドイネの生成
ＡＣＣアーゼＦＯＰ型の除草剤の施用に基づいた、イネにおける雑草制御についての形質の実践的開発は今、可能である。以前、これらの除草剤は、イネ植物を死滅させるため、イネには施用されなかった。記載されたイネ系統のいずれも、イネ栽培品種またはハイブリッドへと開発されるのに適しており、雑草制御方法としてイネを生成するのに用いられる。その抵抗性形質は、育種および開発を可能にする完全な遺伝性であることが実証された。
【００４１】
前記形質は、通常にはイネを死滅させる量でのＦＯＰ除草剤の施用後、生存し、かつ正常な結実を生成することが実証された。加えて、前記形質は、複数のＦＯＰ除草剤での施用を受け入れられた（ａｍｅｎｄａｂｌｅ）。除草剤抵抗性のレベルは、赤米および他のイネ科植物型雑草の完全な制御を可能にするほどである。
【００４２】
前記形質は、除草剤バイオアッセイかまたは分子マーカーのいずれかで完全に選択可能であり、ＦＯＰ除草剤抵抗性を有する新しいイネ栽培品種またはハイブリッドを開発するための選択および育種ストラテジーを可能にする。系統ＭＬ０８３１２６５−０１４９３において供給される抵抗性は、部分的に優性に、または完全に優性に作用する単一の遺伝子によるものであり、そのことは現在の商業的栽培品種へ戻し交配されるのに理想的に適したものにさせている。あるいは、系統ＭＬ０８３１２６５−０１４９３は、いくつかの市場にとってのいくつかの重要な品質特性を欠くが、それでもなお、系統育種プログラムにおいて親系統として用いられるのに作物栽培学的に適している。あるいは、特定の雌系統と交配された場合の系統は、本明細書に記載されているような除草剤抵抗性を有するハイブリッド種子を直接、生産するために用いられ得る。
【００４３】
本明細書に開示された遺伝子での変換で、ＡＣＣアーゼ阻害性除草剤に対して抵抗性の商業的イネを生成する適切な系統である、イネ種子は、ＰＴＡ−８５０４、ＰＴＡ−８５０５、ＰＴＡ−８３６、およびＰＴＡ−６７９５としてＡＴＣＣに寄託された。変換は、育種によっても組換え方法によってもよい。
【実施例】
【００４４】
実施例１：ＭＬ０８３１２６５−０１４９３植物のキザロホップ除草剤量応答の結果
Ｇ２０９６Ｓ変異を有するイネ系統を、キザロホップ除草剤（Ａｓｓｕｒｅ  ＩＩ（登録商標））に対する抵抗性のレベルについて、一連の異なる施用量の除草剤を試験することにより試験した。除草剤量処理は、図６に示された通りであった。全ての処理を、２〜３葉期において施用した。施用から２１日後、区画を評価した。１０ガロン／エーカーの容量で、１％クロップオイルコンセントレイト（Ｃｒｏｐ  Ｏｉｌ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）と共にその噴霧を施用した。処理を、噴霧されていない対照区画と比較したパーセント傷害として評価した。
【００４５】
Ｇ２０９６Ｓ変異の源は系統ＭＬ０８３１２６５−０１４９３であった。ＭＬ０８３１２６５−０１４９３由来の種子の試料は、ＡＴＣＣに寄託されている。この系統は、それが、ＡＣＣアーゼ遺伝子において２０９６位でのグリシンに代わってのセリンへのアミノ酸変化を引き起こす変異により、いくつかのＡＣＣアーゼ除草剤に対する抵抗性を有することを除いて、Ｒ０１４６と同様である。
【００４６】
全てＧ２０９６Ｓ変異を有するＭＬ０８３１２６５−０１４９３の４つの異なる選択物を、各処理において３回、反復し、非変異体Ｒ０１４６系統と共に試験した。結果は、除草剤施用から２１日後のスコアリングに基づいている。
【００４７】
実施例２：Ｇ２０９６Ｓ変異を有するイネ系統のＡＣＣ阻害性除草剤量応答の結果
Ｇ２０９６Ｓ変異を有するイネ系統（ＭＬ０８３１２６５−０１４９３）を、異なるＡＣＣアーゼ阻害性除草剤に対する応答について試験した。１セットの除草剤（図７）を選択し、変異していない元の品種Ｒ０１４６と共に、Ｇ２０９６Ｓ変異を有する３つのイネ系統に施用した。Ｒ０１４６および変異型系統の応答は図７に示されている。除草剤施用の量は、キザロホップおよびクレトジムを除き、ラベル表示された量のレベルの２倍であり、それは、イネを死滅させるのに十分な量として選択された量の２倍であった。
【００４８】
全ての処理を、種子を植えてから約２０日後、２〜３葉期に施用した。施用から２１日後、区画を評価した。１０ガロン／エーカーの容量で、１％クロップオイルコンセントレイトと共にその噴霧を施用した。処理を、噴霧されていない対照区画と比較したパーセント傷害として評価した。
【００４９】
ＭＬ０８３１２６５−０１４９３由来の種子の試料は、ＡＴＣＣに寄託されている。この系統は、それが、ＡＣＣアーゼ遺伝子において２０９６位でのグリシンに代わってのセリンへのアミノ酸変化を引き起こす変異により、いくつかのＡＣＣアーゼ除草剤に対する抵抗性を有することを除いて、Ｒ０１４６と類似している。
【００５０】
全てＧ２０９６Ｓ変異を有するＭＬ０８３１２６５−０１４９３の３つの異なる選択物を、各処理において２回または３回、反復し、非変異体Ｒ０１４６系統と共に試験した。結果は、除草剤施用から２１日後のスコアリングに基づいている。
【００５１】
ＡＣＣアーゼコード遺伝子における種々の変異は、特定の型のＡＣＣアーゼ阻害性除草剤（ＦＯＰＳ）、（ＤＩＭＳ）に対する抵抗性に関連する場合が多い。したがって、種々の変異の特異性は、イネにおける雑草制御についての複数の作用様式を生じる可能性を示す。例えば、図９は、本明細書に開示されたＧ２０９６Ｓ変異が、別の最近発表された変異より、２つの一般的なＦＯＰ型のＡＣＣアーゼ阻害性除草剤に対して、イネにおいてより大きい耐性を伝えることを示している。イネ系統ＭＬ０８３１２６５−０１４９３のＦＯＰ除草剤に対する異なる応答は、この系統または本質的に類似した系統の商業的開発が、他の供給源からは現在入手できない、雑草制御についての新しい作用様式を提供することを示している。
【００５２】
実施例３：変異体イネ系統ＭＬ０８３１２６５−０１４９３は、ＡＣＣアーゼ阻害剤抵抗性イネ以外の特性において、非変異Ｒ０１４６イネと明らかな違いを示さない
研究区画において、変異体系統ＭＬ０８３１２６５−０１４９３を、元の非変異体系統Ｒ０１４６と並べて観察した。観察可能な違いは同定されなかった。植物は、同じ生長パターンを示した。植物の健康状態および頑強さもまた、いかなる検出可能な違いもなく類似しているようであった。測定された場合のいくつかの特性はまた、変異体系統ＭＬ０８３１２６５−０１４９３と非変異系統Ｒ０１４６との間に新しい有意な違いを示した（表２）。系統ＭＬ０８３１２６５−０１４９３におけるＧ２０９６Ｓ変異は、植物の正常な生長または適応度に対し負の影響を示さない。
【００５３】
実施例４：変異を有する植物を選択するためのＤＮＡマーカーの開発
ＤＮＡマーカーは、表現型を観察する必要なく、特定の形質についての選択を可能にする。系統ＭＬ０８３１２６５−０１４９３の場合、抵抗性の原因となる変異は、特定のＤＮＡ配列および周囲の配列を含め、既知である。その配列を知ることにより、一塩基多型を検出する任意のマーカー系の設計、作製、および使用が可能になる。
【００５４】
たいていの一塩基検出アッセイにおいて、プライマーは、特定の蛍光色素で標識され、変異部位における１個のヌクレオチドとアニールするようにそのＤＮＡ配列に基づいて合成される。第２のプライマーもまた、変異部位における別のヌクレオチドとアニールするように異なる色の第２の蛍光色素を有して作製される。その後、両方のプライマーを、個々の植物由来のＤＮＡの試料とアニールさせる。洗浄後、アニーリングマッチを有するプライマーのみが試料中に残存する。蛍光を測定し、検出される色に基づいて、変異部位におけるヌクレオチドを決定する。単一の色は、試料が、検出された色に依存して非変異体型かまたは変異体型のいずれかについて、ホモ接合性であったことを示し、両方の色の検出は、試料がヘテロ接合性であったことを示す。
【００５５】
変異についての一塩基マーカーを適用することにより、植物への除草剤施用の影響を観察する必要なしに、除草剤抵抗性についての選択が可能になる。分子マーカーかまたは表現型検査のいずれかによる試験は、新しい系統が、変異についてホモ接合性であることが証明されるまで必要とされる。分子マーカーは、系統または植物がホモ接合性であるかヘテロ接合性であるかを示し、除草剤を施用することの影響を観察することで可能になるものより１世代早く、ホモ接合性の検出を可能にする。
【００５６】
実施例５：ＡＣＣアーゼ抵抗性の商業的系統への組込み
Ｇ２０９６Ｓ変異を有する系統ＭＬ０８３１２６５−０１４９３（供与親）からの植物、および反復親（この実施例においてはＰ１２３３である）からの植物を生長させる。Ｐ１２３３植物を、標準交配手順に従って、除雄し、系統ＭＬ０８３１２６５−０１４９３の植物由来の花粉を授粉させる。交配種を作製するために個々の植物の２〜４インチ葉材料を集合的に使用し、植物を分子マーカーで分析して、１セットの多型マーカーを同定する。イネゲノムにわたって均等に間隔をあけた約１００個の多型マーカーを同定することが最善である。Ｐ１２３３植物からＦ１種子を収穫し、それは、交配における雌親として用いた。
【００５７】
Ｆ１種子および反復親系統、Ｐ１２３３を再び、植えて生長させる。Ｆ１実生に除草剤を噴霧し、除草剤抵抗性供与親から生じた交配の成功を検証した。抵抗性を受け継いでいない植物は死ぬことになる。加えて、植物はまた、それらが真のＦ１植物である、すなわち、両方の親からマーカーを受けたことを検証するために数個の多型マーカーで試験することができ、除雄され、かつ雌親として用いられる系統Ｐ１２３３からの植物へ、雄親または花粉供与親として抵抗性Ｆ１植物を用いることにより交配プロセスを繰り返す。種子が成熟した後、ＢＣ１Ｆ１種子を収穫する。
【００５８】
ＢＣ１Ｆ１種子および反復親系統、Ｐ１２３３を植え、生長させる。ＢＣ１Ｆ１実生に除草剤を噴霧し、供与親から除草剤耐性変異を受け継いだものを同定する。葉組織を耐性実生から収集し、多型マーカーでの分析のために研究所に提出する。マーカー分析に基づいて系統Ｐ１２３３ゲノムの最高部分を示す５つの植物を選択する。それらを、系統Ｐ１２３３の除雄された植物へ花粉供与体として用いる。種子が成熟した後、ＢＣ２Ｆ１種子を採取する。
【００５９】
ＢＣ２Ｆ１および反復親系統、Ｐ１２３３を植え、生長させる。ＢＣ２Ｆ１実生に除草剤を噴霧し、供与親から除草剤耐性変異を受け継いだものを同定する。葉組織を耐性実生から収集し、全ての非固定（分離）マーカーでの分析のために研究所に提出する。Ｐ１２３３ゲノムの９５％より多い回復を示す５つの植物を選択し、これらを自家受粉させる。どの個体もＰ１２３３ゲノムの少なくとも９５％回復を示さない場合には、戻し交配工程を繰り返す。ＢＣ２Ｆ２種子を、個々の自家受粉した植物から採取する。
【００６０】
各植物からの少なくとも２４個の個々のＢＣ２Ｆ２種子を植え、生長させる。葉組織を収集する；ホモ接合性状態でＧ２０９６Ｓ変異を有する個体を同定するために、ＤＮＡを抽出し、配列決定する。その植物を自家受粉させる。これらの植物からのＢＣ２Ｆ３種子を採取し、Ｐ１２３３の新しい除草剤耐性系統として同定する。系統または子孫の作条を、先頭作条で生長させ、ハイブリッド交配および収量試験へ進めるために、最良の作条についての選択を行う。
【００６１】
ＡＣＣアーゼＦＯＰ型除草剤に対する抵抗性を有する他の系統を開発するために同じ過程に従ってもよい。ハイブリッド産生に用いられる雌親において抵抗性を発生するように、反復親をＳ系統として選択する。あるいは、１つより多い反復親において抵抗性を発生させてもよい。１つの反復親系統は、ハイブリッドに用いられる雄系統であり、他は、ホモ接合性状態で抵抗性（Ｇ２０９６Ｓ変異）を有するハイブリッドを作製するためのハイブリッドに用いられる雌系統である。反復親の他の例は、他の除草剤抵抗性またはさらにトランスジェニック形質などの現在の商業的形質を有する系統であってもよい。他の親を、変異体系統の他のスクリーニングから引き出し、選択して、複数の形質を単一の系統へと組み合わせることができる。
【００６２】
実施例６：ＡＣＣアーゼＦＯＰ型除草剤に対する抵抗性を有する新しい商業的系統の開発
ＡＣＣアーゼＦＯＰ型除草剤に対するイネにおける抵抗性は、育種アプローチを通してハイブリッド親系統かまたは品種のいずれかにおいて発現される。系統ＭＬ０８３１２６５−０１４９３の固有の強さおよび弱点について注意深い分析を行って、系統ＭＬ０８３１２６５−０１４９３における弱点を補正する系統を同定する。交配の成功を検証するために単純なバイオアッセイ（植物に除草剤を噴霧し、抵抗性を受け継いだ個体として生きる植物を観察すること）を適用することができるように、雄親として除草剤抵抗性を有する系統ＭＬ０８３１２６５−０１４９３を用いる。
【００６３】
１つもしくはそれより多くの適切な親を選択した後、まず、１つの選択された系統に交配を行う。追加の形質または遺伝的バリエーションに寄与するように、後世代において他の親との交配を行うことができる。この実施例において、発生過程は、変異体系統ＭＬ０８３１２６５−０１４９３の弱い特性を改善するためにＰ１００３への１回のみの交配を含む。他の親は、別の除草剤に対する抵抗性を有する変異体集団から選択され、そのことにより、複数の除草剤が米生産において除草制御のために用いられることが可能になる。すでに開発され、商業化された除草剤抵抗性またはトランスジェニック形質を有する親もまた選択される。
【００６４】
第１工程において、雌として用いられることになっており、固有の特性を提供すると考えられ、かつ系統ＭＬ０８３１２６５−０１４９３で組み換えられた場合、ハイブリッドのための新しい品種または親系統の発生をもたらす、選択された親系統Ｐ１００３を、除雄する。Ｇ２０９６Ｓ変異を有する変異体系統ＭＬ０８３１２６５−０１４９３由来の花粉を用いて、系統Ｐ１００３の除雄された植物に授粉させる。Ｆ１種子を採取し、植える。必要に応じて、その親系統のいずれかへ、または他の特性および遺伝的バリエーションを導入することを目的として別の親へ追加の交配を行うことができる。
【００６５】
交配が成功したことを検証するために、Ｆ１種子を生長させ、除草剤の施用を行う。生存する植物は、真のＦ１であるはずであり、それらを自家受粉させ、Ｆ２種子を生じさせる。その後、Ｆ２種子を植え、再び噴霧して、除草剤抵抗性を受け継いだ植物を同定する。生き続ける植物は、抵抗性形質についてホモ接合性かまたはヘテロ接合性のいずれかであるはずである。他の形質が興味の対象である場合には、それらはまた、Ｆ２植物における遺伝についてこの工程で評価されるべきである。除草剤処理に際し生き残るＦ２植物の中から選択し、それらを自家受粉させ、Ｆ３種子を生じさせる。個々の植物からＦ３種子を採取し、個々のＦ３ファミリーとして維持する。
【００６６】
その後、Ｆ３ファミリーを条播し、再び除草剤を施用して、除草剤抵抗性についてホモ接合性であるＦ２植物およびＦ３ファミリーを同定する。除草剤抵抗性についてホモ接合性であるＦ３ファミリーの中から、興味の対象である他の形質および特性について選択を行う。選択された作条からＦ４種子を採取する。
【００６７】
新しい品種を開発するために、Ｆ４種子を直接、収量試験に用い、または収量試験における試験のためのハイブリッド種子を産生するために親を選択するように検定交配する。収量ならびに品質などの他の標的形質および特性について、収量試験における系統の中から選択を行う。Ｆ４種子はまた、Ｆ５へと増加されるべきであり、その時点において、標的形質についての選択もまた行うことができる。Ｆ５種子は、ハイブリッド種子に関する収量試験のために検定交配に再び用いられるべきであり、加えて、品種が開発されることになっている場合には、収量試験に直接かけられるべきである。
【００６８】
複数位置の反復試験、および形質応答の完全試験を含む収量試験後、１つまたは２、３の系統を同定するために最終選択を行い、コード化された系統として公開する。その後、これらの系統を、種子増加のために用い、新しい品種かまたはハイブリッドにおける親のいずれかとして公開する。
【００６９】
実施例７：ハイブリッドに配置された除草剤抵抗性
系統ＭＬ０８３１２６５−０１４９３において記載された除草剤抵抗性は、優性または部分的優性かのいずれかである可能性がある。抵抗事象は、雄親、雌親、または両方の親へ組み込まれることによってハイブリッドに配置される。いずれの組み合わせも、ＡＣＣアーゼＦＯＰ型除草剤を用いてイネにおいて雑草をうまく制御するために開発される。上記の実施例のプロセスに従うことにより、親系統を、ＡＣＣアーゼ除草剤抵抗性を有するように発生させる。その後、これらの親系統を、ハイブリッド種子産生系に用いて、ＦＯＰ型の除草剤に対するＡＣＣアーゼ抵抗性を有するハイブリッド種子が産生される。種子産生プロセスは、雄系統の隣の作条に雌系統を植えることを含む。雌系統は、自家受粉を防ぐために雄性不稔性である。その後、雌系統は雄系統によって授粉され、それらを収穫して、Ｆ１種子を得る。Ｆ１種子はハイブリッド種子であり、栽培者によって植えられ、米粒が生産される。品種が開発される状況においては、種子は隔離して植えられ、その後、採取されて、米粒を生産するために栽培者に販売される。
【００７０】
ＭＬ０８３１２６５−０１４９３由来のＡＣＣアーゼ抵抗性を有する選択された系統からハイブリッド種子または品種種子のいずれかを産生するための調製において、まず、系統を精製し、広範に試験し、増加させなければならない。
【００７１】
ＡＣＣアーゼＦＯＰ型の除草剤に対する抵抗性を有するハイブリッド種子を産生する例において、抵抗性は、雄親、雌親、または両方の親において提供され得る。除草剤が施用された場合、除草剤のイネに対する損傷を防ぐのに十分高いレベルの抵抗性を有するために、両方の親において抵抗性を提供することが必要であり得る。しかしながら、ハイブリッドにおいてより適切な送達機構があるならば、抵抗性を雌親のみかまたは雄親のみのいずれかで提供することができる。
【００７２】
抵抗性を雄親おいてのみ提供することにより、栽培者の圃場において任意の雌の自家受粉された種子を排除する過程が与えられる。抵抗性が雄親からのみ提供されることになっている場合、栽培者が彼の圃場に除草剤を施用したとき、雌の自家受粉した植物の全部は、除草剤に対して感受性があり、したがって、死滅させる。栽培者の圃場は、化学的に間引かれ、その結果として、ハイブリッド植物の純群落を生じる。
【００７３】
他の形質と組み合わせることを通してＦＯＰ除草剤に対するＡＣＣアーゼ抵抗性を提供することもまた可能である。例えば、別の作用様式での除草剤抵抗性、または虫害抵抗性、耐乾燥性などの他の形質。他の形質と組み合わせることは、慣用的方法またはトランスジェニック方法のいずれかによるものであり得る。
【００７４】
１つの例において、ＡＣＣアーゼ抵抗性は、雌親へ組み込まれ、別の除草剤抵抗性が雄親へ組み込まれる。その種子は、両方の除草剤に対して抵抗性であり、栽培者は、雑草制御のために一方または両方の除草剤を用いてもよい。あるいは、１つの型の抵抗性のみが、単一のハイブリッドに送達される。両方の系、および他のストラテジーは全て、雑草を制御するための追加の選択肢を栽培者に提供し、除草剤の有用寿命を延ばす可能性がある。１つの親のみまたは１つのハイブリッドのみにおいて配置する場合、外交配を通して抵抗性を発生する任意の赤米は、１つの型の抵抗性を受け継ぐのみであり、別の作用様式をもつ除草剤の施用を通して、なお制御可能となる。
【００７５】
実施例８：種子産生
除草剤抵抗性は、ハイブリッド種子の産生に用いられ得る。例として、系統ＭＬ０８３１２６５−０１４９３からの遺伝を通してＡＣＣアーゼＦＯＰ型除草剤に対する抵抗性を有する雌親が発現される場合には、除草剤は、種子産生において、雄親を排除するために用いることができる。雌親に配置し、それを抵抗性にすることによって、除草剤は、種子産生圃場に施用され、種子を結ぶ前であるが、授粉の後に雄植物を死滅させる。このようにして、雄親は、種子を結ぶことが妨げられ、種子産生圃場が、雌作条だけを収穫する代わりに、バルクとして収穫されることが可能になる。加えて、ハイブリッド種子の純度もまた、１つの親のみにおいて抵抗性を配置することを通して検証され得る。他の親の自家受粉した種子のいずれも除草剤の施用によって死滅する。
【００７６】
寄託情報
上記で開示され、かつ添付の特許請求の範囲において挙げられた、ＲｉｃｅＴｅｃ，Ｉｎｃ．ＭＬ０８３１２６５−０１４９３の寄託は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ユニバーシティー・ブールバール、マナサス、バージニア２０１１０に行われている。寄託日は、２０１２年５月３０日であった。特許の付与で全ての制限が解除され、その寄託は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．  ．ｓｃｔｎ．．ｓｃｔｎ．１．８０１−１．８０９の必要条件の全部を満たすものとする。ＡＴＣＣアクセッション番号はＰＴＡ−１２９３３である。寄託は、３０年間、または最近の請求後５年間、または特許の権利行使可能期間のいずれか長い方、寄託機関で維持され、その期間中、必要に応じて取り換えられることになる。
【００７７】
種子は、寄託のために他の除草剤抵抗性系統から調製されている。
【００７８】
いくつかの例示的態様および実施形態が上記で考察されているが、当業者であれば、特定の改変、並べ替え、追加、およびそれらの部分的組み合わせを認識するはずである。したがって、以下の添付の特許請求の範囲および今後紹介される特許請求の範囲は、それらの真の精神および範囲内にある、全てのそのような改変、並べ替え、追加、および部分的組み合わせを含むと解釈されるものとする。
【００７９】
定義
以下に続く記載および表において、いくつかの用語が用いられている。そのような用語に与えられる範囲を含む、本明細書および特許請求の範囲の明快かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される：
対立遺伝子。対立遺伝子は、遺伝子の多くの選択的形態のいずれか１つであり、それらは全て、一般的に、１つの形質または特性に関連している。二倍体細胞または生物体において、所定の遺伝子の２つの対立遺伝子は、１対の相同染色体の対応する座位を占める。
【００８０】
戻し交配。ハイブリッド子孫をその親の１つに交配する、例えば、第１世代ハイブリッドＦ１をそのＦ１ハイブリッドの親の遺伝子型の１つと交配する過程。
【００８１】
ブレンド。イネハイブリッドのイネ種子を、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれより多くの別のイネハイブリッド、イネ品種、またはイネ近交系の種子と物理的に混合して、このブレンドにおけるイネ種子および植物の全部の特性を含有する作物を産生すること。
【００８２】
細胞。本明細書で用いられる場合、細胞には、単離されているか、組織培養物においてか、または植物もしくは植物部分に組み入れられているかに関わらず、植物細胞が挙げられる。
【００８３】
栽培品種。栽培下で持続する品種または株（ｓｔｒａｉｎ）。
【００８４】
胚。胚は、成熟種子内に含有される小さい植物である。
【００８５】
本質的に全部の生理学的および形態学的特性。変換された遺伝子に由来する特性を除く、ハイブリッドまたは栽培品種の本質的に全部の生理学的および形態学的特性を有する植物。
【００８６】
穀粒収量。所定の面積から収穫された穀粒の重量。穀粒収量はまた、面積あたりの穂の数に、１穂あたりの穀粒の数を掛け、そして、穀粒重量を掛けることによって間接的に決定することができる。
【００８７】
座位。座位は、ＤＮＡ配列によって占有される染色体上の位置である；それは、例えば、雄性不稔、除草剤耐性、虫害抵抗性、病害抵抗性、ワキシースターチ、改変型脂肪酸代謝、改変型フィチン酸代謝、改変型糖代謝、および改変型タンパク質代謝などの１つもしくはそれより多くの形質を与える。形質は、例えば、戻し交配によりその品種のゲノムへ導入された天然に存在する遺伝子、天然もしくは導入された変異、または遺伝子形質転換技術を通して導入された導入遺伝子によって与えられ得る。座位は、単一の染色体位置に組み込まれた１つもしくはそれより多くの対立遺伝子を含む場合がある。
【００８８】
植物。本明細書で用いられる場合、用語「植物」は、種子または穀粒または葯が除去されている植物を含む、未成熟または成熟植物総体への言及を含む。植物を産生することになる種子または胚もまた、植物であるとみなされる。
【００８９】
植物部分。本明細書で用いられる場合、用語「植物部分」（またはイネ植物もしくはその一部分）は、プロトプラスト、葉、茎、根、根冠、葯、種子、穀粒、胚、花粉、胚珠、子葉、胚軸、穎、穂、花、苗条、組織、細胞、および分裂組織細胞などを含む。
【００９０】
量的形質座位（ＱＴＬ）。通常、連続的に分布する、数値的に測定可能な形質をある程度まで制御する遺伝子座。
【００９１】
再生。再生は、組織培養からの植物の発生を指す。
【００９２】
単一遺伝子の変換（変換）。単一遺伝子の変換（変換）は、戻し交配と呼ばれる植物育種技術によって発生した植物であって、交配および戻し交配によって近交系へ移入された単一遺伝子を保持しながら、近交系の所望の形態学的および生理学的特性の本質的に全部が回復している、植物を含む。その用語はまた、当技術分野において知られた遺伝子操作技術を通しての単一遺伝子の導入を指すことができる。
【００９３】
表１−キザロホップ除草剤に対する抵抗性を有することが確認された永久的変異体集団における生存する植物由来のイネ系統。ＡＴＣＣアクセッション番号は、ＡＣＣアーゼ遺伝子のカルボキシルトランスフェラーゼ領域における変異を有する系統について示されている。ＡＴＣＣアクセッション番号は、その他の２つの系統については保留中である。
【００９４】
【表１】
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表２−変異体系統ＭＬ０８３１２６５−０１４９と、元の非変異系統Ｒ０１４６との比較（その２つの系統間で高い類似性を示している）
【００９５】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５】
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【図８】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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