(57)【要約】本願は、ある特定の癌バイオマーカーの存在、活性および／または濃度を判定するための方法、ならびに癌の存在の判定におけるその使用に関する。
2014513949.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検対象における癌を特徴付ける方法であって、
第一のアッセイにおいて、被検対象由来の体液の試料を、癌に特異的であるが臓器特異的でない第一のバイオマーカーの活性についてアッセイすること、
第二のアッセイにおいて、ある臓器の癌に特異的であって細胞外PKA以外の第二のバイオマーカーについて被検対象由来のサンプルをアッセイすることを含む方法。
【請求項２】
第一のアッセイが、PKA（cAMP依存性プロテインキナーゼA）活性、抗PKA、フィブリン、フィブリン誘導体又はPCNA（caPCNA；増殖細胞核抗原）についてのアッセイである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第一のバイオマーカーが細胞外PKAである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第一のアッセイの結果を知った後に第二のアッセイを行う、請求項１に記載の方法。 
【請求項５】
第一のアッセイと第二のアッセイがほとんど同時に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第一のアッセイと第二のアッセイを、同じ体液サンプルの別々のアリコートを用いて行う請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
第二のバイオマーカーが少なくとも７０％の感度を有する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
第一のアッセイが、
未凍結のサンプル、PKAペプチド基質、リン酸化剤を含む反応混合物を調製し、
調製した混合物をインキュベートし、
インキュベーションした混合物中に形成されたリン酸化された基質を検出し、そして
アッセイにおいて形成したリン酸化された基質の量を参照値と比較する
ステップを含んでなり、
該参照値が、同じ種の正常な対象の集団に由来する体液サンプルについての、同等の酸化還元条件下で混合物中に形成されたリン酸化された基質の量である、
請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
癌でない被検対象の統計的に有意な集団から得られた細胞外PKAと、癌である被検対象の統計的に有意な集団から得られた細胞外PKAが、該アッセイの条件下でPKA基質のリン酸化に関して有意に異なる活性を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
PKA基質のリン酸化について、癌である被検対象の集団に由来する細胞外PKAの活性に対する癌でない被検対象の集団に由来する細胞外PKAの活性の比が、少なくとも約１．５：１であるまたは０．７：１未満である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
PKA基質のリン酸化について、癌である被検対象の集団に由来する細胞外PKAの活性に対する癌でない被検対象の集団に由来する細胞外PKAの活性の比が、少なくとも約２：１であるまたは０．５：１未満である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
PKA基質のリン酸化について、癌である被検対象の集団に由来する細胞外PKAの活性に対する癌でない被検対象の集団に由来する細胞外PKAの活性の比が、少なくとも約３：１であるまたは０．２：１未満である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
反応混合物の調製が、サンプルを、５μＭ〜５００ｍＭの濃度の、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールまたはジチオエリスリトールで処理することを含んでなる、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
反応混合物の調製が、サンプルを酸化剤で処理することを含んでなる、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
反応混合物の調製が、サンプルを、５μＭ〜５０ｍＭの濃度の酸化剤ジアミドで処理することを含んでなる、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
反応混合物の調製が、サンプルを、１μＭ〜５００ｍＭの濃度の酸化剤過酸化水素で処理することを含んでなる、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
インキュベーションした混合物中で形成したリン酸化された基質が、放射性元素の使用を必要としない方法によって検出される、請求項９〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
第一のアッセイが、
被検対象に由来する体液サンプル、ＰＫＡペプチド基質、リン酸化剤および還元剤を含み−１５０ｍＶ未満または−１１０ｍＶを超える酸化還元電位を有する混合物をインキュベーションし、そして
インキュベーションした混合物中で形成したリン酸化された基質を検出する
ステップを含んでなる、請求項９〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
第一のアッセイが、
サンプル、ＰＫＡペプチド基質、リン酸化剤および還元剤を含み−１１０ｍＶ未満および−２０ｍＶを超える酸化還元電位を有する混合物をインキュベーションし、そして
インキュベーションした混合物中で形成したリン酸化された基質を検出する
ステップを含んでなる、請求項９〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
第一のアッセイが、
サンプル、ＰＫＡペプチド基質、リン酸化剤および還元剤を含み−２０ｍＶ〜２００ｍＶの酸化還元電位を有する混合物をインキュベーションし、そして
インキュベーションした混合物中で形成したリン酸化された基質を検出する
ステップを含んでなる、請求項９〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
癌が、肺癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、膀胱癌および前立腺癌からなる群から選択される、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
体液が、末梢血、全血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、関節液、房水、耳垢、気管支洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または事前射精液、汗、糞便、涙、嚢胞液、胸膜水および腹膜水、息凝縮液、乳頭吸引液、リンパ液、消化粥、乳糜、胆汁、腸液、膿、皮脂、嘔吐物、粘膜分泌液、糞便水、膵液、副鼻腔洗浄液または気管支吸引液である、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
体液が、全血、痰、血清、血漿、尿、脳脊髄液、乳頭吸引液、唾液、細針吸引液およびそれらの組み合わせから選択される、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
体液が血清である、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
特徴付けが、検出、診断、予後判定、薬の有効性の判定、治療に対する患者の応答または許容度の状態のモニタリング、または癌の治療法の選択を含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
被検対象がヒトである請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
第二のバイオマーカーがPSA、PCA3、BTA、NMP-22、ADFP、AQP1、CA19-9、PAM-4、CA125、HE4、CYFRA21-1、GP73、CCSA-2、CCSA-3、CCSA-4、AFP-L3およびDCPから選択される、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
本願は、図表および図面を含むその全内容が本明細書の一部を構成する、米国仮出願第61/477597号（出願日2011年4月20日）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、患者における癌の存在を診断あるいは判定するための、医学的診断および方法、キットならびにアッセイに関する。
【背景技術】
【０００３】
多くの場合、従来の癌スクリーニングアッセイは、特定の臓器に限局した癌についての個別の試験に限られている。このような試験には、例えば、乳癌のマンモグラフィー、結腸直腸癌の大腸内視鏡検査、前立腺癌のPSA検査、および子宮頸癌の子宮頸部細胞診などがある。しかしながら、これらの癌は、毎年米国で検出される癌症例の約25％にすぎない。いくつかの他のタイプの癌は、身体症状が現れた場合にしか検出されない。その結果、多くの患者において癌は、死亡率が大幅に増加する遅い段階で検出されている[120]。
【０００４】
2010年に推定で140万例の癌が米国で診断されている[121]。高齢化に伴い、癌の症例数は19％増加すると予想される[122-123]。現在癌と診断されているか、または以前に癌と診断された約1080万人の人が生活している[124]。今年は、2000万人を超える人が乳癌または前立腺癌の検査を受ける。
【０００５】
特定の臓器において癌を検出するために種々の試験が開発されてきたが、理由のひとつとしてスクリーニングの費用対効果が低いために、多くの場合、これらの試験を常套的に用いて他の種類の癌をスクリーニングするということはない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
様々な態様において、本発明は、患者における癌を検出する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
簡潔に言えば、本発明は、患者における癌を特徴付ける方法であって、該方法は：
第一のアッセイにおいて、患者由来の体液の試料を、癌に特異的であるが臓器特異的でない第一のバイオマーカーの活性についてアッセイし、
第二のアッセイにおいて、ある臓器の癌に特異的であって細胞外PKA（「xPKA」）以外の第二のバイオマーカーについて患者由来のサンプルをアッセイする
ステップを含む方法に関する。
【０００８】
一実施形態では、例えば、第一のアッセイはPKA（cAMP依存性プロテインキナーゼA）活性、抗PKA、フィブリン、フィブリン誘導体又はPCNA（caPCNA；増殖細胞核抗原）についてのアッセイであり、本実施形態においてより好ましくは、第一のバイオマーカーは、細胞外PKAである。様々な実施形態において、第一のアッセイは、サンプル、PKAペプチド基質、リン酸化剤を含む反応混合物を調製し、調製された混合物をインキュベートし、インキュベーション混合物中に形成されたリン酸化された基質を検出し、アッセイで形成されたリン酸化された基質の量を参照値と比較することを含み、参照値は、同じ種の正常な対象の集団に由来する体液サンプルの等価な酸化還元条件下で混合物中に形成されたリン酸化された基質の量である。
【０００９】
他の目的および特徴は、一部は明白であり、一部は以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１に詳細に記載するように、見かけのxPKA活性（癌被検対象／正常被験対象）の比に対する酸化還元電位（mV）の影響を示すグラフである。
【００１１】
【図２】実施例２に詳細に記載するように、見かけのxPKA活性（癌被検対象/正常被験対象）の比に対する酸化還元電位（mV）の影響を示すグラフである。
【００１２】
【図３】実施例３に詳細に記載するように、NaF（ホスファターゼ阻害剤）を添加した反応混合物中のxPKA活性レベルを示すグラフである。
【００１３】
【図４】実施例３に詳細に記載するように、酸化還元電位と、NaF（ホスファターゼ阻害剤）を添加した反応混合物中のxPKA活性の癌／正常比を示すグラフである。
【００１４】
【図５】臓器／癌部位により同定される腫瘍特異的マーカーの表である。
【００１５】
【図６】少なくとも７０％の感度を有する臓器／癌部位により同定される腫瘍特異的マーカーの表である。
【００１６】
【図７】実施例１に詳細に記載するように、サンプル調製バッファーにおいて使用した種々濃度の酸化剤または還元剤有りでの、明らかに癌でない被検者由来のサンプルに対する前立腺癌または結腸癌患者由来のサンプルにおける見かけのxPKA活性を示す表である。
【００１７】
【図８】図8（a）〜（c）は、実施例４に詳細に記載するように、アッセイの結果から得られた、これら癌を検出するための一連の受信者動作曲線（「ROC」）プロットである。
【００１８】
【図９】実施例５に詳細に記載するように、４５歳以上の健康と仮定した男性の癌の予備スクリーニングの結果を示すチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
略語及び定義
以下の定義および方法は、本発明をより適切に定義するために、そして本発明の実施に際して当業者を導くために記載するものである。特に断りのない限り、用語は当業者による慣用的な用法に従って理解されるべきである。
【００２０】
本明細書では、「細胞外PKA」または「xPKA」は、体細胞外の体液中に見いだされるcAMP依存性プロテインキナーゼAを意味する。
【００２１】
本明細書において、「正常被験対象」または「正常個体」は、癌であるまたは癌である疑いのあることが知られていない被験対象または個体を意味する。
【００２２】
本明細書では、「ORP」は酸化還元電位を意味する。
【００２３】
詳細な記載
本発明の一態様は、動物、最も好ましくはヒト被験対象、における癌の存在を診断するための新規な方法およびキットに関する。試験される癌としては、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、食道癌、胃癌、神経膠腫、頭頸部癌、腎臓癌、白血病（例えば、急性骨髄性白血病（AML））、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、髄芽腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、皮膚癌、精巣癌、気管癌および外陰癌等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２４】
本方法は、被験対象のサンプル中の全般的な癌の指標の活性又は存在を測定することおよびその全般的な癌の指標の活性または量が対照のサンプルまたは対照集団のレベルよりも高いまたは低いレベルで存在することを判定することからなる、被験対象における癌の存在を判定することに関して記載される。一般に、この方法は、第一のアッセイにおいて第一のバイオマーカーの活性について被験対象由来の体液サンプルをアッセイすること、及び第二のアッセイにおいて第二のバイオマーカーについて被験対象由来のサンプルをアッセイすることを含む。特定の臓器における癌を検出するのに特異的な指標の活性又は存在についてのアッセイは、存在する可能性のある癌の位置を決定するために使用される。
【００２５】
一実施形態では、第一及び第二のアッセイはほとんど同時に行われる。別の実施形態では、第二のアッセイは、第一のアッセイの結果を知った後に行われる。更なる実施形態では、第一のアッセイの結果を知る前に第二のアッセイが行われる。第一のアッセイは癌に特異的であるが臓器特異的ではない。好ましい実施形態では、第一のアッセイは、癌の存在の指標として細胞外PKAの活性レベルの測定を行い、第二のアッセイでは、ある臓器の癌に特異的な細胞外PKA以外のバイオマーカーの測定または検出を行う。
【００２６】
特定の理論に縛られることなく、臓器特異的な癌スクリーニングを、より全般的な癌スクリーニング（臓器特異的でない）と関連づけまたは組み合わせることは、潜在的な全ての癌をスクリーニングするための費用効果の高い手段を提供し得ると考えられ、米国で毎年発見される癌の７０％以上の場所を特定することができる。現在の癌検診率に基づけば、例えば、米国では毎年約2500万人が乳がんや前立腺がんの検診を受ける。本明細書に記載される方法によるコスト削減の潜在的な効果として、例えば、毎年２２，０００症例の卵巣癌が発見される臓器特異的試験を２５００万人の人が受ける代わりに、低コストの試験を用いて２５００万人の人をスクリーニングした後、癌について試験結果が陽性であるとされる１５０万人の人を卵巣癌である被験対象の同定を含め臓器特異的癌検査の群とともに検査するとする。最初の癌スクリーニングの費用は年間で検出される癌の全症例にかかるものであるから、卵巣癌の場合を検出するコストは、ケースあたり55000ドル超から約4000ドルに下がる可能性がある。このように、全般的な癌スクリーニングによる癌の事前検査によって、特定の臓器の癌である人の集団を同定するのに必要な臓器特異的な癌試験の数が減る。これは、特定のタイプの癌を同定するための費用対効果を有意に改善するものである。
【００２７】
最初の癌検診を提供することに加えて、いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、様々な異なるタイプの臨床転帰を予測するために使用することができる。
例えば、本発明は、治療後の疾患状態の再発率、治療後の疾患状態の非再発率、治療の失敗、短い期間での疾患再発（例えば、２年未満、１年未満、または6ヶ月未満）、短い期間での癌の転移（例えば、２年未満、１年未満、または6ヶ月未満）、侵襲性、非侵襲性、癌転移の可能性、遠隔転移の可能性、治療後の生存率が低い、治療後の死亡、無病生存率などを予測するために使用することができる。さらなる例として、本発明のアッセイ方法は、例えば、原発性または二次性（転移性）癌の検出において、無症状の被験対象における早期腫瘍性又は早期発癌性の変化についてのまたは無症状の人の集団において癌（例えば、乳癌、膀胱癌、結腸直腸癌又は前立腺癌）を発症する「リスクのある」人を同定するためのスクリーニング、既に腫瘍細胞があると診断され腫瘍細胞の数を減少させる治療を受けている患者における再発疾患の検出、癌である人の抗癌治療の経過に対する応答の予測、または治療法の選択等に使用することができる。
【００２８】
本明細書に開示した一実施形態は、被験対象のサンプル中の全般的な癌バイオマーカーの発現または発現レベルを検出し、一定の閾値を超えるものとしてその発現をスコアリング（または、より好ましくは、バイナリ応答（すなわち、「はい」または「いいえ」））し、その後または同時に１またはそれ以上の臓器特異的癌バイオマーカー（例えば、そのマーカーが癌に関連する特定の経路に由来する）の発現を検出することにより、癌を診断または癌治療の成果を予測する方法に関し、２つ（またはそれ以上）のスクリーニング結果を組み合わせることで、より正確で、より費用対効果の高い、癌診断またはさらには癌療法の失敗に関する予後判定の指標となる。この方法は、様々な癌について、癌の診断、または癌治療の成果を予測するのに使用することができる。
【００２９】
本発明の方法においてアッセイされるバイオマーカーとしては、癌の経路に関連する任意のマーカーが挙げられる。一実施形態では、例えば、マーカーは、mRNA（メッセンジャーRNA）、DNA、マイクロRNA、又はタンパク質であってよい。
【００３０】
一般に、本明細書に記載した方法は、癌およびその特定の臓器への局在化を検出するために提供される。被験対象または被検者から抽出、スワイプまたは得ることができ、細胞またはタンパク質または核酸等の生物学的物質を含有する生物由来の任意のサンプルを、本明細書に記載した方法に関して使用することができる。本発明のアッセイ法は被験対象から採取した体液サンプルに対して行われるので、それらは比較的非侵襲的であり、必要に応じて繰り返すことができる。好ましい実施形態では、本発明のアッセイ方法において使用するためのサンプルは被験対象から１回採取すればよく、従って、例えば、第一及び第二のアッセイは、体液の同じサンプルの別々のアリコートに分けて用いて行うことができる。本明細書に記載した方法における使用のために被験対象から得ることができる体液としては、末梢血、全血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、関節液、房水、耳垢、気管支洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または事前射精液、汗、糞便、涙、嚢胞液、胸膜水および腹膜水、息凝縮液、乳頭吸引液、リンパ液、消化粥、乳糜、胆汁、腸液、膿、皮脂、嘔吐物、粘膜分泌液、糞便水、膵液、副鼻腔洗浄液、あるいは気管支吸引液が挙げられる。組織、腫瘍組織、細胞、および組織から確立された培養細胞もまた、頬スワブ標本、毛包、および骨髄と同様に使用できる。使用される体液のタイプは、関与する癌のタイプやアッセイにかけられる用途に応じて変更することができる。例えば、第一のアッセイは、好ましくは細胞外PKAについてのアッセイを含み、他方、第二のアッセイは癌に特異的であり細胞外PKA以外のものであるバイオマーカーについてアッセイすることを含み、したがって、例えば、第二のアッセイは、細胞外のバイオマーカーに限定されるものである必要はない。一般に、全血、血清または血漿のサンプルに対して本方法を実行することが好ましい。
【００３１】
本発明の方法は、様々な被検対象において、癌を特徴付けるまたは癌の存在を評価するために有利に使用することができる。被検対象としては、例えば、ウシ、トリ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、または霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類を含む）などの哺乳動物であってよい。被検対象としては、さらに、絶滅が危惧される重要な哺乳動物、またはヒトが消費するために農場で飼育される動物などの経済的に重要な哺乳動物、あるいはペットとして又は動物園で飼育される動物などのヒトにとって社会的に重要な動物が挙げられる。このような動物の例としては、ネコ、イヌ、ブタ、または畜牛、牛、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、ラクダまたはウマなどの反芻動物または有蹄動物が挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態では、被検対象はヒトである。他の実施形態では、被検対象は、ウシ、トリ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタまたは非ヒト霊長類である。
【００３２】
被検対象は、癌など既存の疾患または状態を有し得る。あるいは、被検対象は、任意の既知の既存の状態を伴っていなくても良い。被検対象はまた、癌の治療法として、既存または過去の治療法に非応答性であってもよい。
【００３３】
一般的には、基準値は、所定の種のメンバーに関するものでなければならない。従って、例えば、ヒトの被検対象についてのxPKA値は、同等のアッセイ条件下でヒトの被検対象の統計学的に有意な集団についてのxPKA値と比較しなければならない。同様に、非ヒト被検対象についてxPKA値は、同等のアッセイ条件下で、同じ種の非ヒト被検対象の統計学的に有意な集団についてのxPKA値と比較しなければならない。
【００３４】
細胞外PKAアッセイ
上記のように、本明細書に記載される方法は、好ましくは、最初のスクリーニングとして、全般的ながんの検査を伴う。様々な全般的指標が、癌の徴候を検出するために使用されており、タンパク質、ペプチド、抗体、自己抗体、脂質、糖、核酸、DNA、RNA、mRNA、メチル化DNAおよび循環腫瘍細胞が挙げられる。このような指標の直接的または間接的な試験はまた、活性アッセイ、修正または変更された指標の測定、および指標の存在または量の測定など、多くの形式が可能であり、これらはほんの数例に過ぎない。
【００３５】
一般に、任意の公知の全般的な（例えば、非臓器特異的な）癌スクリーニングを、本明細書に記載される方法に関して使用することができ、様々な全般的な癌スクリーニングが当技術分野で知られている。例えば、様々なバイオマーカー試験が、癌の全般的な指標として提案されている。
【００３６】
特に好ましい全般的な癌スクリーニングは、血液の細胞外PKA活性についての試験の形で利用可能である。非常に低いレベルの細胞外PKA活性は非還元（non-reduced）血液サンプル中で検出され、酵素活性の正確な測定が非常に困難である。xPKAアッセイでの酸化防止剤の添加は酵素を活性化し、PKA活性の測定、および酵素活性の差異（特に減少）を測定するのをはるかに容易にする。血液サンプル中の活性化xPKA活性のアッセイは、活性化xPKA活性のレベルが低いことで癌を有する個体の同定を可能にする。活性におけるこの減少は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌および前立腺癌被験被検対象における癌の存在を決定するために使用することができる。この試験は、一般に、８５％の癌検出の感度を有する。このがんの検出率は、最高の臓器特異的癌バイオマーカー検査およびマンモグラフィに匹敵する。
【００３７】
本発明の一態様によれば、被検対象における癌を特徴付けるために細胞外PKAを使用することができることが示される。より具体的には、癌でない人に由来する細胞外PKAと、癌である人に由来する細胞外PKAとを、反応条件によって区別できることが確認された。ある特定の反応条件下では、癌でない人に由来する細胞外PKAは、癌である人に由来する細胞外PKAよりも、PKA基質のリン酸化に関して高い活性を有する。他の特定の反応条件下では、癌でない人に由来する細胞外PKAは、癌である人に由来する細胞外PKAよりも、PKA基質のリン酸化に関して低い活性を有する。さらに他の反応条件下では、癌でない人に由来する細胞外PKAと、癌である人に由来する細胞外PKAは、PKA基質のリン酸化に関してほぼ同等の活性を有する。
【００３８】
我々は、酸化還元条件によって、癌被検対象の血清中の見かけのPKA活性は、見かけ上健康な対照のものより、高い、低いあるいは同等であることを示す。したがって、アッセイの酸化還元条件が既知であるおよび／または制御されることで、見かけのxPKA活性を、癌の存在の指標として用いることができる。ここでは、がん被検対象と健常者における見かけの細胞外PKA活性との間に上記の関係をそれぞれ達成する酸化還元状態を示し、さらに、癌を検出するためのこのアッセイの使用に好ましい条件を定義する。
【００３９】
本発明の一態様では、従って、ある一組の反応条件の下での、ある被検対象の個体についてのアッセイの結果を、その被検対象において癌を特徴付けるための反応条件についての基準値と比較することができる。例えば、癌である人に由来する細胞外PKAのPKA基質のリン酸化についての活性が、癌でない人に由来する細胞外PKAのPKA基質のリン酸化についての活性（即ち、正常被検対象）よりも高い反応条件下でアッセイを行ない、PKA基質のリン酸化についての、その個体の被検対象のxPKAの活性が、正常な被検対象に特徴的な活性よりも有意に大きい場合には、診断、予後等を判定することができる。あるいは、癌である人に由来する細胞外PKAのPKA基質のリン酸化についての活性が、癌でない人に由来する細胞外PKAのPKA基質のリン酸化についての活性（即ち、正常被検対象）よりも低い反応条件下でアッセイを行ない、PKA基質のリン酸化についての、その個体の被検対象のxPKAの活性が、正常な被検対象に特徴的な活性よりも有意に低い場合には、診断、予後等を判定することができる。
【００４０】
癌である個体と正常な個体に由来する細胞外PKAのPKA基質のリン酸化についての活性の比は、少なくとも部分的には、アッセイにおけるxPKAの酸化状態に依存する。一般に、正常な個体に由来する細胞外PKAの活性は、それが見出される酸化還元環境によって大きく影響されると思われる。正常な個体に由来する細胞外PKAは、酸化還元環境が酸化状態の場合には活性が低く、還元状態の環境では活性が高いようである。したがって、正常な個体に由来する体液サンプル中の細胞外PKAの見かけの活性を、還元剤でサンプルを処理してより還元性のORP値を有する混合物を形成することにより増大することができる、またはサンプルを酸化剤で処理してより減少させることができる。対照的に、癌である人由来の細胞外PKAの活性は、酸化状態に対して比較的感受性が低い。すなわち、酸化剤または還元剤で処理するかどうかにかかわらず活性は比較的一定である。
【００４１】
一実施形態では、サンプルを中程度の還元条件下（すなわち、癌被検対象由来のサンプル中の見かけのxPKA活性が正常な被検対象に特徴的な見かけのxPKA活性より大きい条件の範囲）に暴露した後に見かけ上のxPKA活性をアッセイする。中程度の還元条件は、例えば、約−１１０mV〜約−２０mVの範囲のORP値を有する、サンプルと還元剤を含む混合物を形成することによって、確立することができる。例えば、一実施形態では、サンプルを含有する混合物は、約−１００mV〜−９０mV程度の範囲のORP値を有する。さらなる例として、一実施形態では、サンプルを含有する混合物は約−２０mV〜約−３０mVの範囲のORP値を有する。
【００４２】
別の実施形態では、サンプルを酸化条件下、または中程度または高い還元条件下（すなわち、癌被検対象由来のサンプル中の見かけのxPKA活性が正常な被検対象に特徴的な見かけのxPKA活性より低い条件の範囲）に暴露した後に見かけ上のxPKA活性をアッセイする。高度に還元的な条件は、例えば、約−１１０mV未満のORP値（即ち、約−１１０mVよりもより還元的な条件）を有する、サンプルと還元剤を含む混合物を形成することによって確立することができる。例えば、一実施形態では、サンプルを含有する混合物は、約−１２０mV未満のORP値を有する。さらなる例として、一実施形態では、サンプルを含有する混合物は約−１４５mV未満のORP値を有する。あるいは、中程度に還元的又は酸化的条件は、約−２０mVを超えるORP値（即ち、約−２０mVよりもより酸化的な条件）を有する、サンプルと酸化剤または還元剤を含む混合物を形成することによって確立することができる。例えば、一実施形態では、サンプルを含有する混合物は、少なくとも約−１５mVのORP値を有する。さらなる例として、一実施形態では、サンプルを含有する混合物は少なくとも約１mVのORP値を有する。さらなる例として、一実施形態では、サンプルを含有する混合物は少なくとも約６０mVのORP値を有する。さらなる例として、一実施形態では、サンプルを含有する混合物は少なくとも約１２８mVのORP値を有する。
【００４３】
アッセイが開始される前に、サンプルを、一定の時間、所望のまたは少なくとも既知の酸化還元環境を有する混合物中でインキュベートすることができる。ある特定の実施形態では、例えば、インキュベーション時間は、xPKA活性アッセイ開始前の少なくとも約１分間である。但し、典型的には、より長いインキュベーション時間を用いる。例えば、一実施形態では、インキュベーション時間は、少なくとも約５分間である。さらなる例として、いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は、少なくとも約１０分間である。さらなる例として、いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は少なくとも３０分間である。さらなる例として、いくつかの実施形態では、インキュベーション時間は、少なくとも約１時間である。このような実施形態において、インキュベーション温度は２０〜３７℃の範囲であってよく、ある特定の実施形態では約２５℃が好ましい。これは、例えば、サンプルとPKA基質とを混合する前に調製されたインキュベーション混合物において達成され得る。
【００４４】
現状ではあまり好ましいとはいえないものの、特定の実施形態では、PKA活性アッセイを開始する前にサンプルを酸化剤または還元剤と一定時間インキュベートしない。むしろ、PKA活性を決定するための反応混合物を、サンプルをPKAペプチド基質、リン酸化剤、および必要に応じて還元剤又は酸化剤と組み合わせることによりサンプルから直接調製し、調製した混合物をインキュベートし、インキュベーション混合物中で形成したリン酸化された基質を検出する。この状況では、一般的にアッセイが癌である被検対象の統計的に有意な集団に対する正常な被検対象の統計的に有意な集団に対する活性の比が少なくとも０．０５：１であり、０．８：１未満であることが好ましい。ある特定の実施形態では、癌である被検対象の統計的に有意な集団に対する正常な被検対象の統計的に有意な集団に対する活性の比が少なくとも０．０７５：１であり、０．６：１未満であることが好ましい。ある特定の実施形態では、癌である被検対象の統計的に有意な集団に対する正常な被検対象の統計的に有意な集団に対する活性の比が少なくとも０．１であり、０．４：１未満であることが好ましい。
【００４５】
癌である被検対象に対する、正常な被検対象の見かけの細胞外PKAの相対的な活性は、反応条件に依存するため、一般的にアッセイのための反応条件は、活性が有意に異なるような条件であることが好ましい。すなわち、癌である被検対象の統計的に有意な集団に対する正常な被検対象の統計的に有意な集団に対する活性の比が少なくとも１．２：１または０．８：１未満であるような条件下でアッセイを行うことが好ましい。ある特定の実施形態では、癌である被検対象の統計的に有意な集団に対する正常な被検対象の統計的に有意な集団に対する活性の比が少なくとも２：１または０．５：１未満であることが好ましい。ある特定の実施形態では、癌である被検対象の統計的に有意な集団に対する正常な被検対象の統計的に有意な集団に対する活性の比が少なくとも３：１または０．２：１未満であることが好ましい。
【００４６】
PKAは、２つの露出したシステインCys199およびCys343を有している。酵素活性に対するCys343のスルフヒドリル修飾の影響は最小限であることが決定されている。しかしながら、Cys199のスルフヒドリル修飾によって、この酵素は脱リン酸化および不活化されやすくなる[1]。Humphries らは、細胞溶解物中の見かけのPKA活性はPKAの酸化およびホスファターゼの酸化の間の相互作用によって調節されることを実証した。[2]これらの酵素は、酸化に対して異なる応答を示すので、それらは、サンプルの酸化還元状態に異なる反応を示し、PKAの全体の見かけの活性は、サンプルの酸化還元状態に応じて複雑に変化する。
【００４７】
我々は、血清において、酸化還元状態に基づくxPKAとホスファターゼの活性のこの複雑な相互作用が存在すること、およびxPKA活性の第３の調節メカニズムが血液中で観察し得ることを実証した。非特異的ホスファターゼ阻害剤NaFを正常な被検対象由来の血清を含む反応混合物に添加すると、見かけのPKA活性が約５０％減少する。細胞溶解物において、非特異的ホスファターゼ阻害剤NaFをPKA反応混合物に添加した場合、見かけのPKA活性は、活性ホスファターゼが存在する場合には増大する、または不活性なホスファターゼがサンプル中に存在する場合には同じままである。これらの結果をみなくても、むしろ正常な血清サンプル中のxPKA活性の減少は、正常な被検対象由来の血清中にxPKAの活性を低下させるホスファターゼ感受性調節メカニズムが存在することを示す。しかしながら、ホスファターゼ阻害に応答xPKA活性の対応する減少は、これまでのところ、癌被検対象由来の血清中には観測されていない。
【００４８】
癌である被検対象と比較して正常な被検対象についてのxPKA活性の有意差をもたらす反応条件を選択する場合、そのアッセイの結果を、被検対象における癌を特徴付けるために使用することができる。すなわち、アッセイは、癌を検出または診断するために使用することができる。ある特定の実施形態では、予後の判定、薬の有効性の判定、治療に対する被検対象の応答または許容度の状態のモニタリング、または該癌についての治療法の選択に用いることができる。
【００４９】
一般に、細胞外PKAの活性を決定するためのアッセイは、サンプル、リン酸化剤、PKA基質、およびリン酸化された基質を検出するための試薬またはシステムを含む反応混合物を調製することにより行うことができる。
【００５０】
一般的に、体液サンプルは、被検対象の任意の体液に由来するものであってよい。体液の例としては、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、関節液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支洗浄液、精液（前立腺液を含む）、カウパー液または射精前液、女性膣液、汗、糞便、毛髪、涙、嚢胞液、胸膜および腹膜液、心膜液、リンパ液、消化粥、乳び、胆汁、間質液、月経、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、糞便水、膵液、副鼻腔洗浄液、気管支吸引液または他の洗浄液が挙げられる。さらなる体液の例としては、胞胚腔、臍帯血、または胎児や母体の起源の母体循環系が挙げられる。例示的な一実施形態では、体液サンプルは、全血、痰、血清、血漿、尿、脳脊髄液、乳頭吸引液、唾液、細針吸引液、およびそれらの組み合わせから選択される体液に由来する。別の例示的な実施形態では、体液サンプルは、全血、血清、血漿、尿、乳頭吸引液、唾液、およびそれらの組み合わせから選択される体液に由来する。好ましい一実施形態では、体液サンプルは、血液、血漿または血清に由来する。
【００５１】
一実施形態では、サンプルは、還元剤または酸化剤で処理される。この処理の工程は、サンプルを反応混合物の他の成分と混合する前または反応混合物の他の成分と一緒に行ってもよい。
【００５２】
例えば、２−メルカプトエタノール、シリンガルダジン、ヒドロ亜硫酸ナトリウム、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP）などの還元剤を、xPKA反応の酸化還元状態に影響を与えるために還元剤として用いることができる。還元剤は、好ましくは５０μM〜１００mMの濃度で使用することができる。還元剤は、サンプルとアッセイに添加する前にサンプルと混合してもよいし、又は還元剤をアッセイ混合物に組み込むことができる。サンプルは、別々に、または反応混合物中に、好ましくは１分〜６０分間還元剤と共にインキュベートすることができる。
【００５３】
ジアミド、または過酸化水素などの酸化剤は、xPKA反応の酸化還元状態に影響を与えるために酸化剤として使用することができる。酸化剤は、好ましくは５μＭ〜100mMの濃度で使用することができる。還元剤は、サンプルをアッセイに添加する前にサンプルと混合してもよく、又は還元剤をアッセイ混合物に組み込むことができる。サンプルは、別々に、または反応混合物中で、好ましくは１分〜６０分間還元剤と共にインキュベートすることができる。
【００５４】
リン酸化剤は典型的にはATPであるが、他のリン酸化剤をある特定の実施形態で使用することができる。
【００５５】
一般的に、PKA基質は、PKAに対する任意のペプチド基質であってよい。PKA基質の例としては、ヒストンのIIaが挙げられる。好ましい実施形態では、PKA基質はKemptide（Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly）である。
【００５６】
PKAの特異的阻害剤は、他の関連するキナーゼ活性からPKA活性を区別するのに有用であり得る。この目的のために使用され得る１のPKA特異的阻害剤は、PKIペプチドである（Ile-Ala-Ala-Gly-Arg-Thr-Gly-Arg-Arg-Gln-Ala-Ile-His-Asp-Ile-Leu-Val-Ala-Ala-OH）。PKI配列由来の関連ペプチドおよびより短いペプチドはまた、PKA特異的阻害剤として使用することができる。
【００５７】
リン酸化された基質は、種々のシステムを使用して検出することができる。一般的に、リン酸化された基質に対し親和性を有するプローブは、直接または間接的に検出可能である「官能基」とコンジュゲートさせる。プローブは、例えば、抗ホスホセリン抗体であり得る。官能基は、直接または間接的な手段（例えば、放射能標識、光活性分子、発色団、フルオロフォアまたは発光団）によって測定可能である部分、または金コロイドまたは着色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）ビーズ等の分光比色分析標識であってよい。さらなる例として、官能基は、例えば、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、ビオチン、又はジゴキシゲニンのようなハプテン等の間接的に検出可能な部分であってもよい。例示的な一実施形態では、抗体プローブは、検出を容易にするために、例えば、放射性標識、フルオロフォア、発色団、化学発光部分、または酵素などの官能基とコンジュゲートさせる。別の実施形態では、プローブを親和性を有する対のメンバー（例えば、ビオチン）とコンジュゲートさせ、検出可能な標識をその親和性の対の第二のメンバー（例えば、アビジンまたはストレプトアビジン）にコンジュゲートさせる。
【００５８】
放射性標識の例としては、3H、 25I、35S、14C、32Pおよび33Pが挙げられる。
【００５９】
発色団／発光団の例としては、任意の有機または無機色素、フルオロフォア、ホスホフォア、光吸収ナノ粒子（例えば、金、銀、白金、パラジウム）、それらの組み合わせ、またはそれらのメタレート複合体が挙げられる。
【００６０】
有機色素の例としては、クマリン、ピレン、シアニン、ベンゼン、Ｎ−メチルカルバゾール、エリトロシンＢ、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファンアミド、２，５−ジフェニルオキサゾール、ルブレンおよびＮ−（３−スルホプロピル）アクリジンからなる群から選択されるものが挙げられる。好ましいクマリンの具体的な例としては、７−アミノクマリン、７−ジアルキルアミノクマリンおよびクマリン１５３が挙げられる。ベンゼンの例としては、１，４−ビス（５−フェニルオキサゾール−２−イル）ベンゼンおよび１，４−ジフェニルベンゼンが挙げられる。シアニンの例としては、オキサシアニン、チアシアニン、インドシアニン、メロシアニンおよびカルボシアニンが挙げられる。他のシアニンの例としては、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ、ＥＣＦ、Ｃ３−オキサシアニン、Ｃ３−チアシアニン色素（ＥｔＯＨ）、Ｃ３−チアシアニン色素（ＰｒＯＨ）、Ｃ５−インドシアニン、Ｃ５−オキサシアニン、Ｃ５−チアシアニン、Ｃ７−インドシアニン、Ｃ７−オキサシアニン、ＣｙｐＨｅｒ５、Ｄｙｅ−３３、Ｃｙ７、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ３Ｃｙ５ ＥＴ、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ２、ＣＢＱＣＡ、ＮＩＲ１、ＮＩＲ２、ＮＩＲ３、ＮＩＲ４、ＮＩＲ８２０、ＳＮＩＲ１、ＳＮＩＲ２、ＳＮＩＲ４、メロシアニン５４０、ピナシアノールヨージド、１，１−ジエチル−４，４−カルボシアニンヨージド、Ｓｔａｉｎｓ Ａｌｌ、Ｄｙｅ−１０４１またはＤｙｅ−３０４が挙げられる。
【００６１】
無機色素の例としては、メタレート型および非メタレート型のポルフィリン類、フタロシアニン類、クロリン類（例えば、クロロフィルＡおよびＢ）およびメタレート発色団が挙げられる。ポルフィリンの例としては、テトラカルボキシ−フェニル−ポルフィリン（ＴＣＰＰ）およびＺｎ−ＴＣＰＰからなる群から選択されるものが挙げられる。メタレート発色団の例としては、ルテニウムポリピリジル錯体、オスミウムポリピリジル錯体、ロジウムポリピリジル錯体、イリジウム（ＩＩＩ）の３−（１−メチルベンゾイミダゾール−２−イル）−７−（ジエチルアミノ）−クマリン錯体およびイリジウム（ＩＩＩ）の３−（ベンゾチアゾール−２−イル）−７−（ジエチルアミノ）−クマリン錯体が挙げられる。
【００６２】
フルオロフォアおよびホスホフォアの例としては、リン光性色素、フルオレセイン、ローダミン（例えば、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ）およびアントラセン（例えば、９−シアノアントラセン、９，１０−ジフェニルアントラセン、１−クロロ−９，１０−ビス（フェニル−エチニル）アントラセン）が挙げられる。
【００６３】
上記の細胞外PKAアッセイに加えて、またはそのかわりとして、任意の１つまたはそれ以上の様々な他の一般的な癌アッセイを利用することができる。例えば、Onco-Sure (AMDL DR-70) 試験は、血清中のフィブリンやフィブリン分解産物を検出するために使用される。Onco-Sure試験は、乳癌、肺癌、結腸癌、肝臓癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、直腸癌、子宮頸癌、甲状腺癌、食道癌および胃癌を検出するために使用されている。全般的な癌検出のためのこの試験の感度は８４〜９１%であるが、乳癌などのいくつかの特定の癌の検出のための感度は６５％と低い[25-28]。別の全般的な癌アッセイの例では、多くの臓器の部位の癌において同定されており全般的な癌バイオマーカーとして使用することができるPCNA（増殖細胞核抗原）が使用される。免疫染色により検出されるPCNA発現は、後期の癌で検出される発現が最大８５％[29-41]と、後期の疾患で特に顕著であった。LovedayとGreenmanは、癌の全般的な試験として腫瘍関連バイオマーカーのパネルを提案した[42]。hTERT細胞外RNAのhTRの存在が膵臓癌被検対象の７２％（１８のうち１３）で検出され、全般的な癌バイオマーカーであることが暗示された［43］。
【００６４】
上記のように、核酸は、癌を検出するための多くの方法で分析することができる。メチル化DNAは正常な遺伝子発現を調節するために使用されるエピジェネティックな方法の１つである。発癌においては、異常パターンのDNAメチル化が起こり、それが癌の状態の指標となり得る[2、6、8-9、44-46]。mRNAを不安定化する短いmiRNAの発現は変化することがあり、癌の指標となり得る。この後者のバイオマーカーの群は、特定の臓器の癌のサブタイプを決定するために、または被検対象の予後を判定するために使用することもできる[3、47-48]。
【００６５】
本明細書に記載されている全般的なスクリーニング方法に従って使用することができる他の指標およびバイオマーカーとしては、Sga-1m、Tadg-15、エフリン型Ａ受容体10タンパク質、hTRおよびhTERT RNA、炭酸脱水酵素の血清阻害剤などが挙げられる[49〜63]。
【００６６】
臓器特異的癌バイオマーカー
様々な癌指標が生体液中で同定されている。このようなマーカーや指標は、タンパク質、ペプチド、抗体、自己抗体、脂質、糖、核酸、DNA、RNA、mRNA、メチル化DNA及び循環又は培養腫瘍細胞からなる、またはそれに由来し得る。特定の一実施形態では、臓器特異的癌マーカーは、全血、血漿、血清または尿中に同定可能である。タンパク質（または他の）バイオマーカーは、しばしば、病気の段階を判定し、または疾患をモニターし、または予後を判定するために使用されているが、これらのバイオマーカーを、例えば、上述の細胞外PKAアッセイと組み合わせて用い、被検対象または被検者が癌について陽性であると分かった時点で癌の部位を判定することができる。このようなやり方で臓器特異的な癌の診断を用いることは、その前の癌診断で確認できたとしても特定の癌を検出するために行うことが必要であった従来の臓器特異的試験の数を減らすことができ、またそれによって、検出された臓器特異的癌の症例あたりにかかる費用も抑えられるので特に有効である。
【００６７】
臓器特異的スクリーニングアッセイに用いられる腫瘍マーカーは、典型的には、目的とする臓器によって異なる。但し、いくつかの腫瘍マーカーは１以上のタイプまたは臓器の癌に関連し得るので、いくつかの重複が存在し得ることが理解されるであろう。
【００６８】
一般的に、様々な臓器や腫瘍のタイプに関連する数多くの腫瘍特異的マーカーの任意のものが本明細書に記載の臓器特異的スクリーニング法において使用することができる。代表的なマーカーとしては図５に記載したものが挙げられる。
【００６９】
上記のマーカーのメンバーの構成員、断片、抗体、抗原、組換え体、変異体、結合物質、および細胞表面物質を、さらにまたは代替として使用し得ることは理解されるであろう。上記のマーカーの組み合わせを使用することもできる。
【００７０】
第二の（即ち、臓器特異的な）アッセイのためのある特定の好ましいマーカーとしては、上皮成長因子受容体関連タンパク質c-erbB2（Dsouza, B. et al. (1993) Oncogene. 8: 1797-1806）、糖タンパク質MUC1（Batra, S. K. et al. (1992) Int. J. Pancreatology. 12: 271-283）およびシグナル伝達／細胞周期調節タンパク質Myc（Blackwood, E. M. et al. (1994) Molecular Biology of the Cell 5: 597-609）、p53（Matlashewski, G. et al. (1984) EMBO J. 3: 3257-3262; Wolf, D. et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 1887-1893）およびras（またはRas）（Capella, G. et al. (1991) Environ Health Perspectives. 93: 125-131）（抗ras自己抗体を検出するための抗原として使用することができるrasのウイルス発癌性形態を含む）およびBRCA1（Scully, R. et al. (1997) PNAS 94: 5605-10）、BRCA2（Sharan, S. K. et al. (1997) Nature. 386: 804-810）、APC（Su, L. K. et al. (1993) Cancer Res. 53: 2728-2731; Munemitsu, S. et al. (1995) PNAS 92: 3046-50）、CA125 （Nouwen, E. J. et al. (1990) Differentiation. 45: 19２−8）およびPSA（Rosenberg, R. S. et al. (1998) Biochem Biophys Res Commun. 248: 935-939）が挙げられる。さらに使用することができるマーカーとしては、CEA遺伝子ファミリーのメンバー、PTH-RP、CYFRA21-1、カリクレイン、プロガストリン、ガストリンG17、ガストリンG34、CA19- 9、CA7２−4、バソプレシン、ガストリン放出ペプチド、SCC、TK、αFP、p62、アネキシンIおよびII、HvおよびKOCまたはHPVの抗原、好ましくは癌のリスクに関連するサブタイプ、が挙げられる。上述したように、アッセイは、ヒトの体液または培養細胞から単離されたこれらタンパク質の形態、その抗原性断片、または完全長もしくはトランケートされた組換えタンパク質またはその抗原性断片である、腫瘍マーカー抗原を用いて行うことができる。
【００７１】
好ましい一実施形態では、本明細書に記載した方法において使用するために選択された臓器特異的癌検査は、特定の癌の検出に関して７０％以上の感度を有する。例えば、図６に列挙されるバイオマーカーは、一つ以上の臓器特異的癌スクリーニングで使用することができる[64〜85]。
【００７２】
その他、一般的にはあまり好ましい実施形態ではないが、７０％未満の感度を有する臓器特異的なバイオマーカーを使用することができる。その一例は、前立腺癌のスクリーニング試験として使用されるPSA（前立腺特異抗原）血液検査である。
【００７３】
バイオマーカーのマルチマーカーパターンは、特定の癌を検出するために使用されている。これらの多変量検定は、mRNA発現に関する試験、タンパク質バイオマーカー、および自己抗体を含む[91-105]。mRNAの発現およびmRNA発現パターンの変化はまた、特定の癌を検出するために使用されている[12、106-110]。
【００７４】
本明細書に記載の腫瘍または臓器特異的マーカーの発現または発現レベルは、サンプルを、免疫学的アッセイ（ELISA、ラジオイムノアッセイ、など）、蛍光共局在化分析、蛍光in situハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に基づく方法（リアルタイムPCR、定量的RT-PCR分析など）、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、S1ヌクレアーゼアッセイ、ノーザンブロット分析、核酸配列決定、これらの組み合わせから選択されるアッセイにかけることなどが挙げられるがこれらに限定されない、当分野において知られている検出手段によって、決定または検出することができる。
【００７５】
一般的には、免疫学的アッセイを使用する場合には、このようなアッセイは、固体支持体上に固定化されていてもよい抗原を使用する。試験される生物学的サンプル（またはその一部）を抗原と接触させ、腫瘍マーカータンパク質に特異的な自己抗体がサンプル中に存在すれば、それらが抗原と免疫学的に反応して、検出することができるまたは定量的に測定することができる自己抗体−抗原複合体を形成する。好ましくは、自己抗体−抗原複合体の検出は抗ヒト免疫グロブリン二次抗体、典型的には、それぞれすべてのヒトIgGまたはIgMに共通の一般的特徴を認識する抗IgGまたは抗IgM、を用いて行われる。二次抗体は、通常、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）等の酵素とコンジュゲートさせ、自己抗体／抗原／二次抗体複合体の検出を、酵素基質を添加して酵素反応産物の比色、化学発光または蛍光検出することにより達成されるようにする。
【００７６】
癌の特定のタイプに応じて、被検対象のサンプルおよび／または腫瘍マーカーは分析されるが、本明細書に記載のアッセイは、単一の腫瘍マーカーまたは２個以上（例えば、5、10、15、20など）の腫瘍マーカーの群に向けられる。ある特定の実施形態では、アッセイにおける特定の腫瘍アッセイの部分は、パネルアッセイの一部として行われてもよい。本発明のパネルアッセイは、腫瘍マーカー関連抗原のパネルを用いる。パネルは、特定の癌、または種々の異なる癌、または進行のある特定の段階での癌を検出するように適合させることができる。腫瘍マーカー抗原は、正常な人、癌患者または腫瘍マーカータンパク質を発現する細胞系に由来する生物学的液のサンプルから単離された野生型または変異型の腫瘍マーカータンパク質であってよく、またはそれらは完全長の組換え腫瘍マーカータンパク質、腫瘍マーカータンパク質のウイルスの発がん性形態または上記タンパク質の任意のいずれかの抗原性断片（例えば、免疫反応を惹起可能な断片）であってよい。パネルアッセイは、マルチウエルアッセイプレートの別々のウェルそれぞれに、２以上の抗原のうちの１つを加えるマルチウェルフォーマットか、あるいは、１つの容器に抗原のパネル全体を加えるシングルポットフォーマットで行ってもよい。パネルアッセイは、目的が自己抗体の存在または非存在の単なる検出である質的な形式で行ってもよいし、サンプル中に存在する自己抗体の量を定量的に測定する定量的な形式で行うこともできる。
【００７７】
さらなる癌指標
本明細書に記載したアッセイ方法の前に、あるいはその後に、他の癌の指標およびスクリーニング法を利用することができる。これらには、例えば、超音波、X線、腹腔鏡検査、穿刺術、マンモグラフィー、生検、結腸内視鏡検査、身体スキャン（例えば、MRI、赤外線等、CTスキャン等）、核酸配列決定などが挙げられる。一例として、被検対象が本明細書に記載の全般的および特異的アッセイに基づいて、陽性（または陰性の場合でも）であるとの検査結果を得た後、追加のスクリーニング方法を実施してもよい。
【００７８】
本発明を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲から逸脱することなく改変および変更が可能であることは明らかであろう。さらに、本開示における全ての例示は、非限定的な例として記載したものであることは理解されるべきである。
【００７９】
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに説明するために記載される。以下の実施例に開示された技術は、本発明の実施において十分機能すると発明者が認めるアプローチを代表するものであり、その実施のための形態の例であると考えられることは当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示する具体的な実施形態において多くの変更がなされ得ること、そして本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解すべきである。
【実施例】
【００８０】
実施例１
癌患者および癌でないことが明かな人からの血清サンプルをProMedDx、LLCおよびProteoGenexから入手した。１つの実施形態において、前立腺癌患者および癌ではないと推定される正常な対照からの血液サンプルをPKA活性についてアッセイした。このアッセイでは、サンプル中の細胞外PKAを、基質として使用される定義されたペプチドと混合した。基質ペプチドを、マイクロタイターアッセイプレートのウェルに結合させた。ペプチドのリン酸化は、ストレプトアビジンにコンジュゲートさせたペルオキシダーゼを用いてELISAフォーマットで検出される、ビオチン化したホスホセリン抗体を用いて検出した。結合したペルオキシダーゼの検出は、アッセイキットに含まれている発色ペルオキシダーゼ基質を使用して行った。標準活性曲線を作成するために種々の濃度でウシPKA触媒単位を使用した。アッセイプロトコールの詳細を以下に記載する。
１．参照：キットの説明書
２．材料
ａ．MESACUPプロテインキナーゼアッセイキット（MBLコード番号5230）
ｂ．ATP：10mM水溶液
ｉ．60ｍgのATP（Sigma製品番号A2383）を水1.0ｍＬに溶解
ｉｉ.259 nmにてPBS中1/1000希釈液の吸光度を測定
ｉｉｉ．−２０℃で保存。
ｉｖ．吸光度とモル吸光係数（E259、pH7=15400）に基づいて使用直前に１０ｍＭに希釈
ｃ．PKI阻害剤：0.5ｍＭ水溶液（Santa Cruz製品番号sc- 201160）
ｉ．1 mgを水1.0ｍＬに溶解
ｉｉ．−２０℃で保存。
ｄ．PKA希釈液：25mM KH2PO4、5mM EDTA、150mM NaCl、50％（w/v）グリセロール、1 mg/ml BSA、および濃度または酸化還元電位により図のデータに直接示した種々濃度の還元剤または酸化剤（２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、又はジアミド）、 pH6.5。
ｅ．PKA触媒サブユニット標準：
ｉ．ウシPKA（Sigma社製品番号P2645）を冷PKA希釈液に溶解（終濃度１μg／ｍL）
ｉｉ．−２０℃で保存。
ｆ．ペルオキシダーゼ基質溶液（Sigma製品番号T8665）
３．手順
ｇ．サンプル調製
ｉ．血清サンプルの解凍
ｉｉ．16,000×gにて５分遠心
ｉｉｉ．透明な上清を回収
ｉｖ．上清0.0108mLを希釈液0.0012mLと希釈プレートにて混合（１サンプルあたり２ウェル）
ｖ．室温で1時間インキュベート
ｈ．検量線の作成
ｉ．PKA希釈液中でPKA20〜0.4ng / mlの1/2段階希釈液を調製
ｉｉ．希釈プレートのウェル毎に0.012mLを分注
ｉ．反応バッファー（下記最終濃度）の調製：
ｉ．25 mM tris-HCl, pH 7.0
ｉｉ．3 mM MgCl2
ｉｉｉ．1 mM ATP
ｉｖ．0または5μＭ PKI
ｊ．希釈プレートの各サンプルまたはキャリブレータウェルに0.108ｍＬの反応バッファー（PKIありまたはなし）を添加
ｋ．25℃で5分間プレインキュベート
ｌ．アッセイプレートにウェル当たり0.100ｍＬを移す
ｍ．750 rpmで振盪しながら25℃で20分間インキュベート。
ｎ．キットのストップソリューションをウェルあたり0.100ｍＬ添加
ｏ．キットの洗浄バッファーで３回洗浄
ｐ．キットのビオチン化抗ホスホセリンをウェルあたり0.100ｍＬ添加
ｑ．750 rpmで振盪しながら25℃で60分間インキュベート
ｒ．キットの洗浄バッファーで３回洗浄
ｓ．キットのペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンをウェルあたり0.100ｍＬ添加
ｔ．750 rpmで振盪しながら25℃で60分間インキュベート
ｕ．キットの洗浄バッファーで３回洗浄
ｖ．ペルオキシダーゼ基質溶液をウェルあたり0.100ｍＬ添加
ｗ．750 rpmで振盪しながら25℃で3分間インキュベート
ｘ．キットのストップソリューションをウェルあたり0.100ｍＬ添加
ｙ．十分に混合するまで簡単に振る
ｚ．450 nmの吸光度を読み取る
４．結果の計算
ａａ．検量線の濃度に対し吸光度をプロット
ｂｂ．データに最小二乗線形回帰を実行、またはデータに第三次の多項式曲線（3次スプライン）を使用して標準曲線を決定
ｃｃ．標準曲線上の値の補間からサンプル中のキナーゼ濃度を決定
ｄｄ．サンプル中の正味のPKAを計算
ｉ．正味PKA（ng / mL）=キナーゼ（0μM PKI）−キナーゼ（0.5μＭ PKI）
【００８１】
サンプル調製バッファーの酸化還元電位（ORP）を白金酸化還元プローブを用いて測定した。ORPをmV単位で表す。正常サンプルに対する癌患者由来のサンプルついての見かけxPKA活性は、種々のORP値の溶液に対してプロットした。図１に示すように、酸化条件下、穏やかな還元条件下または高度の還元条件下で、前立腺癌患者からの血清サンプルにおける見かけxPKA活性は、明かに癌ではない人由来のサンプルの活性よりも低かった。中程度の還元条件下では、前立腺癌患者からの血清サンプルの見かけxPKA活性は、明らかに癌を有さない人からのサンプルの活性よりも高かった。
【００８２】
図７は、サンプル調製バッファー中酸化剤または還元剤を種々の濃度で添加した、明らかに癌でないヒト由来のサンプルに対する、前立腺および結腸癌患者からのサンプルにおける相対的な見かけxPKA活性を示す。xPKA活性の同じパターンが前立腺癌および結腸癌患者のサンプルの両方で観察される。癌患者の相対的なxPKA活性は、サンプル調製バッファーにおいて使用した酸化剤または還元剤の濃度に依存して、明らかに癌を有しない人のサンプルよりも高い、低いまたは同じである。
【００８３】
実施例２
反応バッファーに酸化剤を添加した、還元剤を添加した、あるいは無添加であることを除いては、実施例１と同様の手順を用いてxPKA活性を測定した。サンプルは、サンプルバッファー中でプレインキュベートしなかったが、アッセイプレートのウェルに反応混合物を添加する前に、750 rpmで振盪しながら反応緩衝液中25℃で5分間インキュベートした。
【００８４】
反応バッファーの酸化還元電位（ORP）を白金酸化還元プローブを用いて測定した。ORPをmV単位で表す。正常サンプルに対する癌患者由来のサンプルついての見かけPKA活性は、種々のORP値の溶液に対してプロットした。酸化剤または還元剤で手短に処理することにより（図２）、サンプル中に観察される活性は全体的に低く、正常サンプルに対する癌患者のサンプルの見かけPKA活性は一貫して低い（０．４：１未満）。
【００８５】
実施例３
サンプルを実施例１と同様に処理した。一組の反応混合物にNaFを２mMの濃度で添加した。NAFは、ホスファターゼの非特異的阻害剤である。NaF阻害剤で反応を行い実際のPKA活性の尺度を求める。図３は、ホスファターゼ阻害により、癌患者由来のサンプル中の実際のPKA活性が、酸化還元状態の変化により若干変化していることを示している。しかし正常な被検対象では、ホスファターゼ阻害により、実際のPKA活性は、全体で約５０％減少し、xPKAは依然として酸化還元状態による調節を受けた。これは酵素活性と見かけxPKAの活性を制御する酸化還元状態の複雑な相互作用を示し、それは、癌患者における見かけxPKA活性と明らかに癌を有しない人の見かけxPKA活性との間の関連性を制御する。図４は、NaFを含む反応における酸化還元電位の関数として見かけxPKA活性（癌患者／正常被検者）の比を示す。癌／正常xPKA活性の比は酸化還元条件に依存して劇的に変化している。
【００８６】
実施例４
PKA希釈液中５０mMの２−メルカプトエタノールを用い、サンプルを実施例１と同様に処理した。xPKAアッセイを開始する前に、サンプルを、PKA希釈液中で３０分間プレインキュベートした。４５歳以上の、癌患者および明らかに健康な人からの血清を、それらのxPKAレベルについて試験した。これらのアッセイから得られた、３種類の癌を検出するための受信者動作曲線のプロットを図８ａ〜８ｃに示す。特定の癌を検出するための試験の特異度は９０％を超え、肺および腎臓癌の感度も９０％を超えた。前立腺癌の検出感度は７４％であった。同様の結果が、卵巣癌、膵臓癌および肝臓癌を有する被検対象からの血清サンプルで得られた。血清中のxPKAレベルの測定は、多くのタイプの癌の予備スクリーニング指標として使用することが可能と考えられる。
【００８７】
実施例５
PKA希釈液中５０mMの２−メルカプトエタノールを用い、サンプルを実施例１と同様に処理した。xPKAアッセイを開始する前に、サンプルを、PKA希釈液中で３０分間プレインキュベートした。４５歳以上のみかけ健康な人からの血清サンプル（２１）を試験してそれらの細胞外PKA活性を決定した。１２個のサンプルは、癌患者に見られるものと同様の低い活性（< 53mUnits/ml）を有していた（図９）。これらのサンプルをさらにPSAアッセイを用いて試験し、これらのサンプルのいずれかが、前立腺癌を有する人のものかどうかを決定した。低いxPKA活性を有する１２の正常と仮定したサンプルのうち、１人は高いPSA活性を有し、前立腺癌が存在する可能性があることを示した。この比率、即ち１２のうち１つの陽性は、男性の全ての他の癌に対する前立腺癌の割合（８のうち１）と同様である。換言すれば、８〜１２人の男性の癌被検対象のうち１つの前立腺癌症例が見つかると予測したであろうが、これは我々が観察したのと同様である。xPKA活性が正常レベルであったすべてのサンプル（９個）はPSAレベルも同様に正常であった。
【００８８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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