(57)【要約】  本発明は、試料中の抗ＴＮＦα薬等の生物製剤に対する中和及び非中和自己抗体の存在又はレベルを検出及び測定するためのアッセイを提供する。本発明は、対象が生物学的治療を受けている間の中和及び／又は非中和抗薬物抗体の経時的な形成をモニタリングするのに有用である。また、本発明は、対象の試料中の中和抗薬物抗体の、代替生物学的治療との交差反応性を予測及び／又は決定するのに有用である。すなわち、本発明は、生物学的製剤による治療を受けている対象のための治療法の決定の指針となる情報を提供し、治療の最適化、毒性の低減及び／又は治療薬の効力のモニタリングの正確性を改善する。【選択図】図７
2014525036.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の中和形のレベル又はパーセントを測定するための方法であって、
（ａ）試料を標識抗ＴＮＦα薬及び標識ＴＮＦαと接触させて、
（ｉ）標識抗ＴＮＦα薬と自己抗体との第１標識複合体、及び／又は
（ｉｉ）標識抗ＴＮＦα薬と標識ＴＮＦαと自己抗体との第２標識複合体
を形成するステップと、
（ｂ）第１標識複合体及び／又は第２標識複合体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、前記複合体を、遊離標識ＴＮＦα、遊離標識抗ＴＮＦα薬、及び／又は標識抗ＴＮＦα薬と標識ＴＮＦαとの複合体から分離するステップと、
（ｃ）サイズ排除クロマトグラフィー後に遊離標識ＴＮＦαのレベルを測定するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において測定された遊離標識ＴＮＦαのレベルを、対照試料中の遊離標識ＴＮＦαの標準化されたレベル又はパーセントと比較するステップであって、対照試料中の遊離標識ＴＮＦαの標準化されたレベル又はパーセントは自己抗体の中和形のレベル又はパーセントに対応するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
抗ＴＮＦα薬は、レミケード（商標）（インフリキシマブ）、エンブレル（商標）（エタネルセプト）、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）、シムジア（登録商標）（セルトリズマブペゴール）、シンポニー（登録商標）（ゴリムマブ、ＣＮＴＯ１４８）及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体は、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｃ）は、サイズ排除クロマトグラフィー後に遊離標識ＴＮＦαのピーク面積を測定することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
対照試料は、遊離標識ＴＮＦαのみを含有する参照試料である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
対照試料中の遊離標識ＴＮＦαのレベル又はパーセントは、標識抗ＴＮＦα薬と標識ＴＮＦαとの間で形成された第３標識複合体の測定されたピーク面積を遊離標識ＴＮＦαの測定されたピーク面積から差し引くことによって標準化される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
対照試料中の遊離標識ＴＮＦαの標準化されたレベル又はパーセントと、ステップ（ｃ）において測定された遊離標識ＴＮＦαのレベルと、の差が自己抗体の非中和形のレベル又はパーセントに対応する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
試料が約３．００％以上の自己抗体の中和形を有する場合に、試料は自己抗体の中和形について陽性である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
試料は血清である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
試料は、抗ＴＮＦα薬による治療を受けている対象から得られる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
標識抗ＴＮＦα薬及び標識ＴＮＦαは異なる蛍光体又は蛍光色素を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
試料中の抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の中和形及び／又は非中和形の存在を検出するための方法であって、
（ａ）試料を標識抗ＴＮＦα薬及び標識ＴＮＦαと接触させて、
（ｉ）標識抗ＴＮＦα薬と自己抗体との第１標識複合体、及び／又は
（ｉｉ）標識抗ＴＮＦα薬と標識ＴＮＦαと自己抗体との第２標識複合体
を形成するステップと、
（ｂ）第１標識複合体及び／又は第２標識複合体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、前記複合体を、遊離標識ＴＮＦα、遊離標識抗ＴＮＦα薬、及び／又は標識抗ＴＮＦα薬と標識ＴＮＦαとの複合体から分離するステップと、
（ｃ）サイズ排除クロマトグラフィー後に遊離標識ＴＮＦαのレベルを測定するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において測定された遊離標識ＴＮＦαのレベルを対照試料中の遊離標識ＴＮＦαのレベルと比較し、それにより自己抗体の中和形及び／又は非中和形の存在を検出するステップと、
を含む方法。
【請求項１３】
抗ＴＮＦα薬は、レミケード（商標）（インフリキシマブ）、エンブレル（商標）（エタネルセプト）、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）、シムジア（登録商標）（セルトリズマブペゴール）、シンポニー（登録商標）（ゴリムマブ、ＣＮＴＯ１４８）及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体は、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｃ）は、サイズ排除クロマトグラフィー後に遊離標識ＴＮＦαのピーク面積を測定することを含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
対照試料は、遊離標識ＴＮＦαのみを含有する参照試料である、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｃ）において測定された遊離標識ＴＮＦαのレベルが対照試料中の遊離標識ＴＮＦαのレベルと同じ又は実質的に同じである場合に、自己抗体の中和形が検出される、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｃ）において測定された遊離標識ＴＮＦαのレベルが対照試料中の遊離標識ＴＮＦαのレベルと比較して減少しているか又は存在しない場合に、自己抗体の非中和形が検出される、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
試料は血清である、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
試料は、抗ＴＮＦα薬による治療を受けている対象から得られる、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
標識抗ＴＮＦα薬及び標識ＴＮＦαは異なる蛍光体又は蛍光色素を含む、請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
第１抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の中和形が第２抗ＴＮＦα薬と交差反応性であるかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）試料中の自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントを、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法に従って検出又は測定して、試料が自己抗体の中和形について陽性であるか陰性であるかを決定するステップ
を含み、
自己抗体の中和形について試料が陽性であるならば、
（ｂ）試料を標識第２抗ＴＮＦα薬と接触させて、標識第２抗ＴＮＦα薬と自己抗体の中和形との標識複合体を形成するステップと、
（ｃ）標識複合体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して標識複合体を分離するステップと、
（ｄ）標識複合体を検出し、それにより、第１抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の中和形が第２抗ＴＮＦα薬と交差反応性であるかどうかを決定するステップと、
をさらに含む方法。
【請求項２３】
第１及び第２抗ＴＮＦα薬は、レミケード（商標）（インフリキシマブ）、エンブレル（商標）（エタネルセプト）、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）、シムジア（登録商標）（セルトリズマブペゴール）、シンポニー（登録商標）（ゴリムマブ、ＣＮＴＯ１４８）及びそれらの組み合わせからなる群より独立して選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
第１抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体は、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
標識複合体の存在が、第１抗ＴＮＦα薬に対する中和自己抗体が第２抗ＴＮＦα薬と交差反応性であることを示す、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
標識複合体の非存在が、第１抗ＴＮＦα薬に対する中和自己抗体が第２抗ＴＮＦα薬と交差反応性でないことを示す、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
試料は血清である、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
試料は、抗ＴＮＦα薬による治療を受けている対象から得られる、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
標識第２抗ＴＮＦα薬は蛍光体又は蛍光色素を含む、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
抗ＴＮＦα薬による治療コースを受けている対象における治療のモニタリング及び／又は前記抗ＴＮＦα薬への治療の最適化を行うための方法であって、
（ａ）抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントを、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法に従って治療コース中の複数の時点で検出又は測定するステップと、
（ｂ）自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントの経時的な変化を検出するステップと、
（ｃ）対象についての治療コースの後続の用量、又は異なる治療コースを対象に対して実施するべきかを、自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントの経時的な変化に基づいて決定するステップと、
を含む方法。
【請求項３１】
抗ＴＮＦα薬は、レミケード（商標）（インフリキシマブ）、エンブレル（商標）（エタネルセプト）、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）、シムジア（登録商標）（セルトリズマブペゴール）、シンポニー（登録商標）（ゴリムマブ、ＣＮＴＯ１４８）及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体は、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
治療コースの後続の用量が、自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントの経時的な変化に基づいて増加、減少又は維持される、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
異なる治療コースは、異なる抗ＴＮＦα薬、又は免疫抑制剤を伴う現在の治療コース、又は抗ＴＮＦα薬でない治療コースへの切り替えを含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
自己抗体の中和形のレベル又はパーセントが経時的に増加する場合に、異なる治療コースが実施される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
第１抗ＴＮＦα薬による治療コースを受けている対象における治療の最適化及び／又は毒性の低減のための方法であって、
（ａ）対象からの試料中の自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントを、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法に従って検出又は測定することによって、第１抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の中和形が第２抗ＴＮＦα薬と交差反応性であるかどうかを決定するステップと、
（ｂ）自己抗体の中和形が第２抗ＴＮＦα薬と交差反応性であるならば、異なる治療コースを対象に対して実施するべきと決定するステップと、
を含む方法。
【請求項３７】
第１及び第２抗ＴＮＦα薬は、レミケード（商標）（インフリキシマブ）、エンブレル（商標）（エタネルセプト）、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）、シムジア（登録商標）（セルトリズマブペゴール）、シンポニー（登録商標）（ゴリムマブ、ＣＮＴＯ１４８）及びそれらの組み合わせからなる群より独立して選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
第１抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体は、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
異なる治療コースは、抗ＴＮＦα薬でない治療コースに切り替えることを含む、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
非抗ＴＮＦα薬は、ＩＬ−６受容体阻害モノクローナル抗体、抗インテグリン分子、ＪＡＫ−２阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、栄養療法及びそれらの混合物からなる群より選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
現在の治療コースの後続の用量を増加するべきか減少するべきかを決定するか、或いは自己抗体の中和形が第２抗ＴＮＦα薬と交差反応性でないならば、異なる治療コースを対象に対して実施するべきと決定するステップをさらに含む、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
[0001]本出願は、米国特許仮出願第６１／５０５，０３１号（出願日：２０１１年７月６日）、米国特許仮出願第６１／５２８，０７２号（出願日：２０１１年８月２６日）及び米国特許仮出願第６１／５３５，８８４号（出願日：２０１１年９月１６日）についての優先権を主張するものである。これらの仮出願の開示内容は、ここで参照されることによってそのまま本明細書に組み入れられる。
【発明の背景】
【０００２】
[0002]自己免疫障害は、重要で普及した医療的問題である。例えば、関節リウマチ（ＲＡ）は、米国において２百万を超える人が罹患している自己免疫疾患である。ＲＡは関節の慢性的炎症であり、典型的には、関節破壊及び機能的障害を引き起こす可能性がある進行性の疾病である。関節リウマチの原因はわかっていないが、遺伝的素因、感染性因子及び環境因子のすべてがこの疾患の原因に関与している。活動性ＲＡでは、症状は、疲労、食欲欠如、微熱、筋肉及び関節の疼痛及び硬直を含み得る。また、疾患再燃中に、関節は、滑膜の炎症により頻繁に赤くなり、肥大し、疼痛及び圧痛がある。さらに、ＲＡは全身性疾患であるので、炎症は、目及び口の腺、肺粘膜、心膜並びに血管を含む、関節以外の体の器官及び領域に影響し得る。
【０００３】
[0003]ＲＡ及び他の自己免疫障害の管理のための伝統的な治療は、迅速に作用する「第１選択薬物」及びより緩徐に作用する「第２選択薬物」を含む。第１選択薬物は疼痛及び炎症を低減する。そのような第１選択薬物の例としては、経口で与えられるか、又は組織及び関節に直接注射される、アスピリン、ナプロキセン、イブプロフェン、エトドラク及び他の非ステロイド性抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）並びに副腎皮質ステロイドが挙げられる。第２選択薬物は、疾患の寛解を促進し、進行性の関節破壊を阻止し、疾患修飾性抗リウマチ薬物又はＤＭＡＲＤとも呼ばれる。第２選択薬物の例としては、金、ヒドロクロロキン、アザルフィジン並びにメトトレキセート、アザチオプリン、シクロホスファミド、クロラムブシル、シクロスポリン等の免疫抑制剤が挙げられる。しかし、これらの薬物の多くは有害な副作用を有し得る。すなわち、関節リウマチ及び他の自己免疫障害のためのさらなる治療が求められている。
【０００４】
[0004]腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）は、単球及びマクロファージを含む多数の細胞型により生成されるサイトカインであり、あるいくつかのマウス腫瘍の壊死を誘導する能力に基づいて最初に同定された。その後、悪液質に付随するカケクチンと呼ばれる因子が、ＴＮＦ−αと同一であることが示された。ＴＮＦ−αは、ショック、敗血症、感染症、自己免疫疾患、ＲＡ、クローン病、移植片拒絶及び移植片対宿主病を含む種々の他のヒト疾患及び障害の病態生理に関与している。
【０００５】
[0005]種々のヒト障害におけるヒトＴＮＦ−α（ｈＴＮＦ−α）の有害な役割のために、ｈＴＮＦ−α活性を阻害又は該活性に対向するための治療的方策が設計されている。特に、ｈＴＮＦ−αと結合して中和する抗体が、ｈＴＮＦ−α活性を阻害するための手段として求められている。そのような抗体の最も初期のもののいくつかは、ｈＴＮＦ−αで免疫されたマウスのリンパ球から調製されたハイブリドーマにより分泌されるマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であった（例えば、Ｍｏｅｌｌｅｒらに対する米国特許第５，２３１，０２４号を参照されたい）。これらのマウス抗ｈＴＮＦ−α抗体は、ｈＴＮＦ−αについての高い親和性をしばしば提示し、ｈＴＮＦ−α活性を中和できたが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの該抗体の使用は、マウス抗体をヒトに投与することに伴う問題（例えば、短い血清半減期、あるいくつかのヒトエフェクター機能を誘引できないこと、及びヒトにおけるマウス抗体に対する望ましくない免疫応答の誘発（「ヒト抗マウス抗体」（ＨＡＭＡ）反応））により制限されている。
【０００６】
[0006]より最近では、関節リウマチ等の自己免疫障害の治療に対して生物学的治療が用いられている。例えば、４つのＴＮＦα阻害剤、すなわち、レミケード（ＲＥＭＩＣＡＤＥ）（商標）（インフリキシマブ）、キメラ抗ＴＮＦαｍＡｂ、エンブレル（ＥＮＢＲＥＬ）（商標）（エタネルセプト）、ＴＮＦＲ−Ｉｇ  Ｆｃ融合タンパク質、ヒュミラ（ＨＵＭＩＲＡ）（商標）（アダリムマブ）、ヒト抗ＴＮＦαｍＡｂ及びシムジア（ＣＩＭＺＩＡ）（登録商標）（セルトリズマブペゴール）、ＰＥＧ化Ｆａｂ断片が、関節リウマチの治療のためにＦＤＡにより承認されている。シムジア（登録商標）は、中等度から重度のクローン病（ＣＤ）の治療のためにも用いられている。そのような生物学的治療は、関節リウマチ及び他の自己免疫障害（例えばＣＤ）の治療において成功することが実証されているが、治療されるすべての対象がそのような治療に対して応答又は良好に応答するわけではない。さらに、ＴＮＦα阻害剤の投与は、薬物に対する免疫応答を誘導し、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）等の自己抗体の生成をもたらし得る。そのようなＨＡＣＡ、ＨＡＨＡ又はＨＡＭＡ免疫応答は、さらなる薬物治療を妨げる過敏性反応並びに免疫治療用ＴＮＦα阻害剤の薬物動態及び体内分布の劇的な変化と関連し得る。すなわち、当技術分野において、患者試料中の抗ＴＮＦα薬等の生物学的製剤に対する自己抗体の存在を検出して、生物学的治療をモニタリングし、治療法の決定の指針となるアッセイに対する必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たし、関連する利点をもたらす。
【発明の概要】
【０００７】
[0007]本発明は、試料中の抗ＴＮＦα薬等の生物製剤に対する中和及び非中和自己抗体の存在又はレベルを検出及び測定するためのアッセイを提供する。本発明は、対象が生物学的治療（例えば抗ＴＮＦα薬治療）を受けている間の中和及び／又は非中和抗薬物抗体の経時的な形成をモニタリングするのに有用である。また、本発明は、対象の試料中の中和抗薬物抗体の、代替生物学的治療（例えば代替抗ＴＮＦα治療）との交差反応性を予測及び／又は決定するのに有用である。すなわち、本発明は、生物学的製剤による治療を受けている対象のための治療法の決定の指針となる情報を提供し、治療の最適化、毒性の低減及び／又は治療薬の効力のモニタリングの正確性を改善する。
【０００８】
[0008]一態様において、本発明は、試料中の生物製剤に対する自己抗体の中和形及び／又は非中和形の存在を検出するための方法であって、
（ａ）試料を標識生物製剤及び標識生物製剤結合部分と接触させて、
（ｉ）標識生物製剤と自己抗体との第１標識複合体（すなわち免疫複合体又はコンジュゲート）（すなわち、ここで第１標識複合体の構成要素は互いに共有結合していない。）、及び／又は
（ｉｉ）標識生物製剤と標識生物製剤結合部分と自己抗体との第２標識複合体（すなわち免疫複合体又はコンジュゲート）（すなわち、ここで第２標識複合体の構成要素は互いに共有結合していない。）
を形成するステップと、
（ｂ）第１標識複合体及び／又は第２標識複合体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、それらの複合体を、遊離（すなわち未結合）標識生物製剤結合部分、遊離標識生物製剤、及び／又は標識生物製剤と標識生物製剤結合部分との複合体から分離するステップと、
（ｃ）サイズ排除クロマトグラフィー後に、（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）後の遊離標識生物製剤結合部分ピークの曲線下面積（ＡＵＣ）を測定することによって）遊離標識生物製剤結合部分のレベルを測定するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において測定された遊離標識生物製剤結合部分のレベルを、（例えば、遊離標識生物製剤結合部分のみを含有する参照試料のＳＥＣ後の遊離標識生物製剤結合部分ピークのＡＵＣを測定することによって）対照試料中の遊離標識生物製剤結合部分のレベルと比較し、それにより自己抗体の中和形及び／又は非中和形の存在を検出するステップと、
を含む方法を提供する。
【０００９】
[0009]あるいくつかの実施形態において、自己抗体の中和形は、ステップ（ｃ）において測定された遊離標識生物製剤結合部分のレベルが、対照試料中の遊離標識生物製剤結合部分のレベルと同じ又は実質的に同じである場合に検出される。あるいくつかの他の実施形態において、自己抗体の非中和形は、ステップ（ｃ）において測定された遊離標識生物製剤結合部分のレベルが、対照試料中の遊離標識生物製剤結合部分のレベルと比較して減少しているか（例えば実質的に減少）又は存在しない（例えば検出不能）場合に検出される。
【００１０】
[0010]別の態様において、本発明は、試料中の生物製剤に対する自己抗体の中和形のレベル又はパーセントを測定するための方法であって、
（ａ）試料を標識生物製剤及び標識生物製剤結合部分と接触させて、
（ｉ）標識生物製剤と自己抗体との第１標識複合体（すなわち免疫複合体又はコンジュゲート）（すなわち、ここで第１標識複合体の構成要素は互いに共有結合していない。）、及び／又は
（ｉｉ）標識生物製剤と標識生物製剤結合部分と自己抗体との第２標識複合体（すなわち免疫複合体又はコンジュゲート）（すなわち、ここで第２標識複合体の構成要素は互いに共有結合していない。）
を形成するステップと、
（ｂ）第１標識複合体及び／又は第２標識複合体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、それらの複合体を、遊離（すなわち未結合）標識生物製剤結合部分、遊離標識生物製剤、及び／又は標識生物製剤と標識生物製剤結合部分との複合体から分離するステップと、
（ｃ）サイズ排除クロマトグラフィー後に、（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）後の遊離標識生物製剤結合部分ピークの曲線下面積（ＡＵＣ）を測定することによって）遊離標識生物製剤結合部分のレベルを測定するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において測定された遊離標識生物製剤結合部分のレベルを、（例えば、遊離標識生物製剤結合部分のみを含有する参照試料のＳＥＣ後の遊離標識生物製剤結合部分ピークのＡＵＣを測定及び標準化して、遊離標識生物製剤結合部分のレベル又はパーセントを算出することによって）対照試料中の遊離標識生物製剤結合部分の標準化されたレベル又はパーセントと比較するステップであって、対照試料中の遊離標識生物製剤結合部分の標準化されたレベル又はパーセントは自己抗体の中和形のレベル又はパーセントに対応するステップと、
を含む方法を提供する。
【００１１】
[0011]いくつかの実施形態において、対照試料中の遊離標識生物製剤結合部分の標準化されたレベル又はパーセントと、ステップ（ｃ）において測定された遊離標識生物製剤結合部分のレベルと、の差は自己抗体の非中和形のレベル又はパーセントに対応する。
【００１２】
[0012]さらに別の実施形態において、本発明は、第１生物製剤に対する自己抗体の中和形が第２（すなわち異なる）生物製剤と交差反応性であるかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）試料中の自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントを、本明細書に記載のアッセイに従って検出又は測定して、自己抗体の中和形について試料が陽性であるか陰性であるかを決定するステップ
を含み、
自己抗体の中和形について試料が陽性であるならば、
（ｂ）試料を標識第２生物製剤と接触させて、標識第２生物製剤と自己抗体の中和形との標識複合体（すなわち、ここで標識複合体の構成要素は互いに共有結合していない。）を形成するステップと、
（ｃ）標識複合体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して標識複合体を（例えば遊離標識第２生物製剤から）分離するステップと、
（ｄ）標識複合体を検出し、それにより、第１生物製剤に対する自己抗体の中和形が第２生物製剤と交差反応性であるかどうかを決定するステップと、
をさらに含む方法を提供する。
【００１３】
[0013]あるいくつかの実施形態において、標識複合体の存在は、第１生物製剤に対する中和自己抗体が第２生物製剤と交差反応性であること、すなわち中和自己抗体が第１及び第２生物学的製剤の両方の活性を阻害することを示す。
【００１４】
[0014]あるいくつかの他の実施形態において、標識複合体の非存在は、第１生物製剤に対する中和自己抗体が第２生物製剤と交差反応性でないこと、すなわち中和自己抗体が第２生物学的製剤の活性を阻害しないことを示す。
【００１５】
[0015]いくつかの実施形態において、生物製剤は、抗体（例えば抗ＴＮＦαモノクローナル抗体）、抗体断片、タンパク質（例えば、インターロイキン等のサイトカイン）、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、多価結合タンパク質、抗体−薬物コンジュゲート、ワクチン、核酸、糖、それらの組換え形、それらの工学改変形及びそれらの組み合わせを含む。
【００１６】
[0016]他の実施形態において、試料は、例えば、生物学的治療を受けている対象からの全血、血清又は血漿試料である。好ましい実施形態において、試料は血清である。特定の実施形態において、対象は、疾患又は障害、例えば、自己免疫疾患（例えば関節リウマチ）、炎症性疾患（例えば、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）等の炎症性腸疾患（ＩＢＤ））、又は癌を有する。
【００１７】
[0017]あるいくつかの実施形態において、試料は、生物製剤に対する自己抗体を有するか、又はその疑いがある。他の実施形態において、生物製剤自己抗体は、それらに限定されないが、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）及びヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）並びにそれらの組み合わせを含む。
【００１８】
[0018]あるいくつかの態様において、本発明のアッセイ方法は、試料を標識生物製剤及び標識生物製剤結合部分と接触させる前、接触中及び／又は接触させた後に試料を酸と接触させることを含む酸解離ステップをさらに含む。
【００１９】
[0019]あるいくつかの他の態様において、本発明のアッセイ方法は、試料中の生物製剤に対する自己抗体の中和形及び／又は非中和形の１又は複数のアイソタイプの存在又はレベルを検出するステップを含む。
【００２０】
[0020]特定の一態様において、本発明は、試料中の抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の中和形及び／又は非中和形の存在を検出するための方法であって、
（ａ）試料を標識抗ＴＮＦα薬及び標識ＴＮＦαと接触させて、
（ｉ）標識抗ＴＮＦα薬と自己抗体との第１標識複合体（すなわち免疫複合体又はコンジュゲート）（すなわち、ここで第１標識複合体の構成要素は互いに共有結合していない。）、及び／又は
（ｉｉ）標識抗ＴＮＦα薬と標識ＴＮＦαと自己抗体との第２標識複合体（すなわち免疫複合体又はコンジュゲート）（すなわち、ここで第２標識複合体の構成要素は互いに共有結合していない。）
を形成するステップと、
（ｂ）第１標識複合体及び／又は第２標識複合体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、それらの複合体を、遊離（すなわち未結合）標識ＴＮＦα、遊離標識抗ＴＮＦα薬、及び／又は標識抗ＴＮＦα薬と標識ＴＮＦαとの複合体から分離するステップと、
（ｃ）サイズ排除クロマトグラフィー後に、（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）後の遊離標識ＴＮＦαピークの曲線下面積（ＡＵＣ）を測定することによって）遊離標識ＴＮＦαのレベルを測定するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において測定された遊離標識ＴＮＦαのレベルを、（例えば、遊離標識ＴＮＦαのみを含有する参照試料のＳＥＣ後の遊離標識ＴＮＦαピークのＡＵＣを測定することによって）対照試料中の遊離標識ＴＮＦαのレベルと比較し、それにより自己抗体の中和形及び／又は非中和形の存在を検出するステップと、
を含む方法を提供する。
【００２１】
[0021]あるいくつかの実施形態において、自己抗体の中和形は、ステップ（ｃ）において測定された遊離標識ＴＮＦαのレベルが、対照試料中の遊離標識ＴＮＦαのレベルと同じ又は実質的に同じである場合に検出される。あるいくつかの他の実施形態において、自己抗体の非中和形は、ステップ（ｃ）において測定された遊離標識ＴＮＦαのレベルが、対照試料中の遊離標識ＴＮＦαのレベルと比較して減少しているか（例えば実質的に減少）又は存在しない（例えば検出不能）場合に検出される。
【００２２】
[0022]別の特定の態様において、本発明は、試料中の抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の中和形のレベル又はパーセントを測定するための方法であって、
（ａ）試料を標識抗ＴＮＦα薬及び標識ＴＮＦαと接触させて、
（ｉ）標識抗ＴＮＦα薬と自己抗体との第１標識複合体（すなわち免疫複合体又はコンジュゲート）（すなわち、ここで第１標識複合体の構成要素は互いに共有結合していない。）、及び／又は
（ｉｉ）標識抗ＴＮＦα薬と標識ＴＮＦαと自己抗体との第２標識複合体（すなわち免疫複合体又はコンジュゲート）（すなわち、ここで第２標識複合体の構成要素は互いに共有結合していない。）
を形成するステップと、
（ｂ）第１標識複合体及び／又は第２標識複合体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、それらの複合体を、遊離（すなわち未結合）標識ＴＮＦα、遊離標識抗ＴＮＦα薬、及び／又は標識抗ＴＮＦα薬と標識ＴＮＦαとの複合体から分離するステップと、
（ｃ）サイズ排除クロマトグラフィー後に、（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）後の遊離標識ＴＮＦαピークの曲線下面積（ＡＵＣ）を測定することによって）遊離標識ＴＮＦαのレベルを測定するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において測定された遊離標識ＴＮＦαのレベルを、（例えば、遊離標識ＴＮＦαのみを含有する参照試料のＳＥＣ後の遊離標識ＴＮＦαピークのＡＵＣを測定及び標準化して、遊離標識ＴＮＦαのレベル又はパーセントを算出することによって）対照試料中の遊離標識ＴＮＦαの標準化されたレベル又はパーセントと比較するステップであって、対照試料中の遊離標識ＴＮＦαの標準化されたレベル又はパーセントは自己抗体の中和形のレベル又はパーセントに対応するステップと、
を含む方法を提供する。
【００２３】
[0023]いくつかの実施形態において、対照試料中の遊離標識ＴＮＦαの標準化されたレベル又はパーセントと、ステップ（ｃ）において測定された遊離標識ＴＮＦαのレベルと、の差は自己抗体の非中和形のレベル又はパーセントに対応する。
【００２４】
[0024]さらに別の特定の態様において、本発明は、第１抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の中和形が第２（すなわち異なる）抗ＴＮＦα薬と交差反応性であるかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）試料中の自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントを、本明細書に記載のアッセイに従って検出又は測定して、自己抗体の中和形について試料が陽性であるか陰性であるかを決定するステップ
を含み、
自己抗体の中和形について試料が陽性であるならば、
（ｂ）試料を標識第２抗ＴＮＦα薬と接触させて、標識第２抗ＴＮＦα薬と自己抗体の中和形との標識複合体（すなわち、ここで標識複合体の構成要素は互いに共有結合していない。）を形成するステップと、
（ｃ）標識複合体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して標識複合体を（例えば遊離標識第２抗ＴＮＦα薬から）分離するステップと、
（ｄ）標識複合体を検出し、それにより、第１抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の中和形が第２抗ＴＮＦα薬と交差反応性であるかどうかを決定するステップと、
をさらに含む方法を提供する。
【００２５】
[0025]あるいくつかの実施形態において、標識複合体の存在は、第１抗ＴＮＦα薬に対する中和自己抗体が第２抗ＴＮＦα薬と交差反応性であること、すなわち中和自己抗体が第１及び第２抗ＴＮＦα薬の両方の活性を阻害することを示す。
【００２６】
[0026]あるいくつかの他の実施形態において、標識複合体の非存在は、第１抗ＴＮＦα薬に対する中和自己抗体が第２抗ＴＮＦα薬と交差反応性でないこと、すなわち中和自己抗体が第２抗ＴＮＦα薬の活性を阻害しないことを示す。
【００２７】
[0027]いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦα薬は、レミケード（商標）（インフリキシマブ）、エンブレル（商標）（エタネルセプト）、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）、シムジア（登録商標）（セルトリズマブペゴール）、シンポニー（ＳＩＭＰＯＮＩ）（登録商標）（ゴリムマブ、ＣＮＴＯ１４８）及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００２８】
[0028]他の実施形態において、試料は、例えば、抗ＴＮＦα薬治療を受けている対象からの全血、血清又は血漿試料である。好ましい実施形態において、試料は血清である。特定の実施形態において、対象は、ＴＮＦα媒介疾患又は障害、例えば、自己免疫疾患（例えば関節リウマチ）又は炎症性疾患（例えば、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）等の炎症性腸疾患（ＩＢＤ））を有する。
【００２９】
[0029]あるいくつかの実施形態において、試料は、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体を有するか、又はその疑いがある。他の実施形態において、抗ＴＮＦα薬自己抗体は、それらに限定されないが、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）及びヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）並びにそれらの組み合わせを含む。
【００３０】
[0030]あるいくつかの態様において、本発明のアッセイ方法は、試料を標識抗ＴＮＦα薬及び標識ＴＮＦαと接触させる前、接触中及び／又は接触させた後に試料を酸と接触させることを含む酸解離ステップをさらに含む。
【００３１】
[0031]あるいくつかの他の態様において、本発明のアッセイ方法は、試料中の抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の中和形及び／又は非中和形の１又は複数のアイソタイプの存在又はレベルを検出するステップを含む。
【００３２】
[0032]さらなる態様において、本発明は、生物製剤による治療コースを受けている対象における治療のモニタリング及び／又は前記生物製剤への治療の最適化を行うための方法であって、
（ａ）生物製剤に対する自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントを、本明細書に記載のアッセイに従って治療コース中の複数の時点で検出又は測定するステップと、
（ｂ）自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントの経時的な変化を検出するステップと、
（ｃ）対象についての治療コースの後続の用量、又は異なる治療コースを対象に対して実施するべきかを、自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントの経時的な変化に基づいて決定するステップと、
を含む方法を提供する。
【００３３】
[0033]特定の一態様において、本発明は、生物製剤による治療コースを受けている対象における治療のモニタリング及び／又は前記生物製剤への治療の最適化を行うための方法であって、
（ａ）対象からの第１試料中の生物製剤に対する自己抗体の中和形のレベル又はパーセントを本明細書に記載のようにして時点ｔ０で測定するステップと、
（ｂ）対象からの第２試料中の自己抗体の中和形のレベル又はパーセントを本明細書に記載のようにして時点ｔ１で測定するステップと、
（ｃ）対象からのｎのさらなる試料を用いて時点ｔｎ＋１（ここで、ｎは、１〜約２５の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５又はその中の任意の範囲）である。）でステップ（ｂ）を任意選択で反復するステップと、
（ｄ）時点ｔ０からｔ１まで又は時点ｔ０からｔｎ＋１までの自己抗体の中和形のレベル又はパーセントの変化を検出するステップと、
（ｅ）対象についての治療コースの後続の用量、又は異なる治療コースを対象に対して実施するべきかを、自己抗体の中和形のレベル又はパーセントの経時的な変化に基づいて決定するステップと、
を含む方法を提供する。
【００３４】
[0034]さらなる態様において、本発明は、第１生物製剤による治療コースを受けている対象における治療の最適化及び／又は毒性の低減のための方法であって、
（ａ）対象からの試料中の自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントを本明細書に記載のアッセイに従って検出又は測定することによって、第１生物製剤に対する自己抗体の中和形が第２（すなわち異なる）生物製剤と交差反応性であるかどうかを決定するステップと、
（ｂ）自己抗体の中和形が第２生物製剤と交差反応性であるならば、異なる治療コースを対象に対して実施するべきと決定するステップと、
を含む方法を提供する。
【００３５】
[0035]特定の一態様において、本発明は、抗ＴＮＦα薬による治療コースを受けている対象における治療のモニタリング及び／又は前記抗ＴＮＦα薬への治療の最適化を行うための方法であって、
（ａ）抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントを、本明細書に記載のアッセイに従って治療コース中の複数の時点で検出又は測定するステップと、
（ｂ）自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントの経時的な変化を検出するステップと、
（ｃ）対象についての治療コースの後続の用量、又は異なる治療コースを対象に対して実施するべきかを、自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントの経時的な変化に基づいて決定するステップと、
を含む方法を提供する。
【００３６】
[0036]別の特定の態様において、本発明は、抗ＴＮＦα薬による治療コースを受けている対象における治療のモニタリング及び／又は前記抗ＴＮＦα薬への治療の最適化を行うための方法であって、
（ａ）対象からの第１試料中の抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の中和形のレベル又はパーセントを本明細書に記載のようにして時点ｔ０で測定するステップと、
（ｂ）対象からの第２試料中の自己抗体の中和形のレベル又はパーセントを本明細書に記載のようにして時点ｔ１で測定するステップと、
（ｃ）対象からのｎのさらなる試料を用いて時点ｔｎ＋１（ここで、ｎは、１〜約２５の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５又はその中の任意の範囲）である。）でステップ（ｂ）を任意選択で反復するステップと、
（ｄ）時点ｔ０からｔ１まで又は時点ｔ０からｔｎ＋１までの自己抗体の中和形のレベル又はパーセントの変化を検出するステップと、
（ｅ）対象についての治療コースの後続の用量、又は異なる治療コースを対象に対して実施するべきかを、自己抗体の中和形のレベル又はパーセントの経時的な変化に基づいて決定するステップと、
を含む方法を提供する。
【００３７】
[0037]さらに別の特定の態様において、本発明は、第１抗ＴＮＦα薬による治療コースを受けている対象における治療の最適化及び／又は毒性の低減のための方法であって、
（ａ）対象からの試料中の自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントを本明細書に記載のアッセイに従って検出又は測定することによって、第１抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の中和形が第２（すなわち異なる）抗ＴＮＦα薬と交差反応性であるかどうかを決定するステップと、
（ｂ）自己抗体の中和形が第２抗ＴＮＦα薬と交差反応性であるならば、異なる治療コースを対象に対して実施するべきと決定するステップと、
を含む方法を提供する。
【００３８】
[0038]本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図面から当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ＮＡｂパーセント（ｙ軸）とＡＴＩレベルとの間に明らかな関係があったことを示す。
【図２】≧６０Ｕ／ｍｌのＡＴＩ濃度がＮＡｂ＋を予測できることを示す。
【図３】０．９３１のＲＯＣ  ＡＵＣでＡＴＩがＮＡｂを予測することを示す。
【図４】本発明の流体相移動度シフトアッセイによるＡＴＩの検出を示す。
【図５】本発明の例示的なＡＴＩ／ＩＦＸ流体相移動度シフトアッセイを示す。
【図６】本発明の非中和抗薬物抗体（ＡＤＡ）アッセイを示す。
【図７】本発明の中和ＡＤＡアッセイを示す。
【図８】１、２又は３ヶ月の期間を置いて採取したＵＣ患者からの５つの試料の経時的なＩＦＸ及びＡＴＩのレベルを示す。
【図９】ＵＣ患者における遊離ＴＮＦαの経時的なパーセンテージを決定するためのピーク分析を示す。
【図１０】２又は３ヶ月の期間を置いて採取し、ＩＦＸを添加したＵＣ患者からの３つの試料中で例示される、非中和自己抗体の存在から中和自己抗体の存在への経時的なシフトを示す。
【図１１】ＩＦＸを添加したＵＣ患者からの試料中の遊離ＴＮＦαの経時的なパーセンテージを決定するためのピーク分析を示す。
【図１２】非中和抗体（Ａｂ）対照としてのウサギ抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃの使用を示す。
【図１３】中和抗体（ＮＡｂ）／非中和抗体（Ａｂ）混合対照としてのＡＴＩ陽性血清の使用を示す。
【図１４】ＡＴＩ陽性血清からのＡＴＩの精製が弱親和性ＮＡｂの喪失をもたらすことを示す。
【図１５】種々の対照中の遊離ＴＮＦαのパーセンテージを決定するための、ＵＣ患者症例研究からのピーク分析を示す。
【図１６】３０週間の期間中に７又は８週間の期間を置いて採取した４つの試料の経時的な遊離ＴＮＦαのパーセンテージを決定するための、ＣＤ患者症例研究からのピーク分析を示す。
【図１７】５０週間の期間中に採取した３つの試料の経時的な遊離ＴＮＦαのパーセンテージを決定するための、別のＣＤ患者症例研究からのピーク分析を示す。
【図１８】治療の導入若しくは維持中又は導入若しくは維持後の特定の週の試料中の遊離ＴＮＦαのパーセンテージを決定するための、４つのさらなるＣＤ患者症例研究からのピーク分析を示す。
【図１９】移動度シフトアッセイによる非中和抗体活性の検出を示す。
【図２０】ＩＦＸ及びＡＤＬの両方に対するＡＤＡの交差反応性を示す。ここで、ＡＤＡの結合部位はＴＮＦαの結合部位を模倣しており、そのため複数の抗ＴＮＦ薬と結合できる。
【図２１】２つの患者の例（患者１及び２）を示す。これらの例では、ある抗ＴＮＦ薬に応答して生成されたＮＡｂの交差反応性を他の抗ＴＮＦ薬について決定した。具体的には、患者がレミケード（ＩＦＸ）を受けている場合に発生したＮＡｂをヒュミラ（ＡＤＬ）に対して試験した。
【図２２】ＩＦＸ、ＡＤＬ等の薬物に対する非中和抗体（非ＮＡｂ）（上）又は中和抗体（ＮＡｂ）（下）の存在を検出するための本発明のアッセイの例示的な実施形態を示す。
【図２３】ＮＡｂ標準曲線の作製及び使用を示す。
【図２４】ＩＦＸに対して生じたＮＡｂのＡＤＬに対する交差反応性を決定するための、ＩＦＸで治療されたがＩＦＸに対する応答を喪失した患者３についての症例研究の結果を示す。
【図２５】ＩＦＸに対して生じたＮＡｂのＡＤＬに対する交差反応性を決定するための、ＩＦＸで治療されたがＩＦＸに対する応答を喪失した患者４についての症例研究の結果を示す。
【図２６】ＡＴＩ親和性成熟及び交差反応性ＡＴＩの発生を実証する患者研究の非限定的な例を示す。
【発明の詳細な説明】
【００４０】
Ｉ．イントロダクション
[0065]本発明は、サイズ排除クロマトグラフィーと、任意選択で、免疫複合体の平衡化を可能にする酸解離と、を用いる均質移動度シフトアッセイが、抗ＴＮＦα薬等の生物製剤に対して生じる自己抗体の中和形及び非中和形（例えば、ＨＡＣＡ、ＨＡＨＡ）の存在又はレベルを測定するために特に有利であることを見出したことに一部基づく。そのような自己抗体は抗薬物抗体又はＡＤＡとしても知られ、それらの中和形及び非中和形はそれぞれＮＡｂ及び非ＮＡｂとしても知られる。
【００４１】
[0066]特定の実施形態において、本発明の均質移動度シフトアッセイは、対象の試料を（例えば蛍光）標識生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）及び（例えば蛍光）標識生物製剤結合部分（例えばＴＮＦα）と接触させることによって行われる。本明細書に記載のアッセイは、少なくとも次の理由により有利である。該アッセイは、低親和性ＡＤＡを除去する洗浄ステップの必要性を除去する；該アッセイは、バックグラウンド及び血清干渉の問題を低減する、可視、ＩＲ及び／又は近ＩＲ（ＮＩＲ）スペクトルでの検出を可能にする特異的な標識（例えば蛍光体）を使用する；該アッセイは、蛍光標識検出の感度が高く、対象での低力価の中和及び／又は非中和ＡＤＡを検出する能力を増加させる；該アッセイは、液相反応として生じ、そのため、固体表面（例えばＥＬＩＳＡプレート）への結合によるエピトープのどのような変化の可能性も低減する。
【００４２】
[0067]例示的な実施形態において、本発明のアッセイは、異なる時点での複数の試料中の中和及び／又は非中和抗薬物抗体の形成をモニタリングするための、抗ＴＮＦα薬治療を受けているＩＢＤ対象の経時的症例研究を可能にする点で有利である。また、本発明のアッセイは、対象が抗ＴＮＦα薬治療を受けている間に経時的に非中和抗薬物抗体から中和抗薬物抗体へのシフトがあるかを決定できる点で有利である。いずれの特定の理論にも束縛されるものではないが、中和抗薬物抗体は、抗ＴＮＦα薬とＴＮＦαとの間の結合を阻害し、それにより効力の喪失を誘導することから、著しい負の臨床結果をもたらし得る。
【００４３】
[0068]さらなる例示的な実施形態において、本発明のアッセイは、対象の試料中の中和抗薬物抗体の、他の抗ＴＮＦ薬等の代替生物学的製剤との交差反応性の予測及び／又は決定において利用できる。単純化して言うと、試料がある抗ＴＮＦα薬に対する中和ＡＤＡを含有するならば、これらの中和ＡＤＡは、他の抗ＴＮＦα薬と交差反応性で、かつ該薬物を中和する可能性があり、そのため、該対象に関しては、異なる作用機序を有する薬物（例えば非抗ＴＮＦ薬）に切り替えるように治療法を調整することが推奨される。しかし、試料が、ある抗ＴＮＦα薬に対する非中和ＡＤＡを含有するならば、該対象に関しては、別の抗ＴＮＦα薬に切り替えるように治療法を調整することが推奨される。
【００４４】
[0069]すなわち、本発明は、抗ＴＮＦα薬治療を受けている対象についての治療法の決定の指針とするのに有用な情報を提供することによって、抗ＴＮＦα薬（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ）の投与に付随する現在の限界に一部対処し、かつ該限界を克服する。本発明の方法は、抗ＴＮＦα薬を受けている対象をモニタリングして、（例えば、抗ＴＮＦα薬治療コース中に経時的に）中和ＡＤＡの形成及び／又は発生を検出又は測定するのに特に有用であり、また、対象が抗ＴＮＦα薬治療を受けている間の経時的な、非中和ＡＤＡと比較した中和ＡＤＡの量、パーセント又は比率の変化（例えば増加）を検出又は測定するのに有用である。
【００４５】
[0070]すなわち、本発明は、いつ及び／又はどのように（１）中和ＡＤＡの存在、レベル若しくはパーセントを考慮して抗ＴＮＦα薬の後続の用量を調整若しくは改変（例えば増加又は減少）し、治療効力を最適化及び／又は毒性を低減するか、（２）中和ＡＤＡの存在、レベル若しくはパーセントを考慮して（例えば、初期、増加、減少又は同じ用量で）抗ＴＮＦα薬を１若しくは複数の免疫抑制剤（例えば、メトトレキセート（ＭＴＸ）、アザチオプリン（ＡＺＡ））と組み合わせるか、及び／又は（３）中和ＡＤＡの存在、レベル若しくはパーセントを考慮して現在の治療コースを変更する（例えば、異なる抗ＴＮＦα薬又は異なる機序を標的にする薬物に切り替える）か、を決定するための方法を提供する。そのような方法は、抗ＴＮＦα薬を受けている対象が正しい用量を受けていること、該対象が薬物に対する免疫応答を発生しないこと、及び該対象が初期薬物の失敗（例えば、初期抗ＴＮＦα薬に対する交差反応性中和ＡＤＡの発生）により異なる薬物に切り替えるべきであることを確実にするのに有用である。
【００４６】
ＩＩ．定義
[0071]本明細書において、以下の用語は、特に断らない限り、それらの用語に割り当てられた意味を有する。
【００４７】
[0072]用語「生物製剤」（ｂｉｏｌｏｇｉｃ）又は「生物学的製剤」（ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ａｇｅｎｔ，  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｒｕｇ）は、本明細書において、生物系（例えば生体）から生成又は抽出された生成物及び物質を包含する。生物製剤の非限定的な例としては、抗体、抗体断片、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質（例えばＩｇ融合タンパク質又はＦｃ融合タンパク質）、多価結合タンパク質（例えばＤＶＤ  Ｉｇ）、抗体−薬物コンジュゲート、ワクチン、核酸、糖、それらの組換え形、それらの工学改変形及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４８】
[0073]用語「生物製剤結合部分」は、生物製剤と（例えば特異的に）結合又は相互作用する任意の分子、薬剤又は物質を含む。あるいくつかの場合において、自己抗体の中和形は生物製剤結合部分と生物製剤との間の結合を阻害する。あるいくつかの他の場合において、自己抗体の非中和形は生物製剤結合部分と生物製剤との間の結合を阻害しない。非限定的な一例として、生物製剤が抗ＴＮＦα薬を含む場合に、生物製剤結合部分はＴＮＦαを含む。別の非限定的な例として、生物製剤がインターロイキン（例えばＩＬ−２）を含む場合に、生物製剤結合部分はインターロイキン受容体（例えば、インターロイキン受容体の可溶性細胞外断片）を含む。
【００４９】
[0074]用語「抗ＴＮＦα薬」又は「ＴＮＦα阻害剤」は、本明細書において、タンパク質、抗体、抗体断片、融合タンパク質（例えばＩｇ融合タンパク質又はＦｃ融合タンパク質）、多価結合タンパク質（例えばＤＶＤ  Ｉｇ）、小分子ＴＮＦαアンタゴニスト及び同様の天然若しくは非天然に存在する分子、及び／又は、例えば、ＴＮＦαとＴＮＦαの細胞表面受容体との相互作用を阻害すること、ＴＮＦαタンパク質生成を阻害すること、ＴＮＦα遺伝子発現を阻害すること、細胞からのＴＮＦαの分泌を阻害すること、ＴＮＦα受容体シグナル伝達を阻害すること若しくは対象におけるＴＮＦα活性の減少をもたらす任意のその他の手段により、ＴＮＦα活性を直接若しくは間接的に阻害するその組換え及び／又は工学改変形を含む物質を包含することを意図する。用語「抗ＴＮＦα薬」又は「ＴＮＦα阻害剤」は、ＴＮＦα活性を阻害する物質を含むことが好ましい。抗ＴＮＦα薬の例としては、限定することなく、インフリキシマブ（レミケード（商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ヒト抗ＴＮＦモノクローナル抗体アダリムマブ（Ｄ２Ｅ７／ヒュミラ（商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、エタネルセプト（エンブレル（商標）、Ａｍｇｅｎ）、セルトリズマブペゴール（シムジア（登録商標）、ＵＣＢ，Ｉｎｃ．）、ゴリムマブ（シンポニー（登録商標）、ＣＮＴＯ１４８）、ＣＤＰ５７１（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）、ＣＤＰ８７０（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）、並びにＴＮＦα活性を阻害して、ＴＮＦα活性が有害な障害（例えばＲＡ）に罹患しているか又は罹患するリスクのある対象に投与された場合に該障害を治療する他の化合物が挙げられる。
【００５０】
[0075]用語「ＴＮＦα」は、１７ｋＤａの分泌形及び２６ｋＤａの膜結合形で存在し、生物活性形は非共有結合した１７ｋＤａ分子の３量体で構成されるヒトサイトカインを含むことを意図する。ＴＮＦαの構造は、例えばＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３３８：２２５〜２２８頁（１９８９）にさらに記載されている。用語ＴＮＦαは、ヒトＴＮＦα、組換えヒトＴＮＦα（ｒｈＴＮＦ−α）又はヒトＴＮＦαタンパク質と少なくとも約８０％同一であるＴＮＦαを含むことを意図する。ヒトＴＮＦαは、３５アミノ酸（ａａ）の細胞質ドメイン、２１ａａの膜貫通セグメント及び１７７ａａの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）からなる（Ｐｅｎｎｉｃａ，Ｄ．ら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７２４頁）。ＥＣＤ内で、ヒトＴＮＦαは、アカゲザルＴＮＦαと９７％のａａ配列同一性、及びウシ、イヌ、コットンラット、ウマ、ネコ、マウス、ブタ及びラットＴＮＦαと７１％〜９２％のａａ配列同一性を有する。ＴＮＦαは、標準的な組換え発現方法により調製できるか、又は商業的に購入できる（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログＮｏ．２１０−ＴＡ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．）。
【００５１】
[0076]あるいくつかの実施形態において、「ＴＮＦα」は、抗ＴＮＦα薬が結合できる分子又は分子の一部を含む「抗原」である。ＴＮＦαは、１又は１より多いエピトープを有することができる。あるいくつかの場合において、ＴＮＦαは、高度に選択的な様式で抗ＴＮＦα抗体と反応する。抗体、断片及び抗ＴＮＦα抗体の領域と結合する好ましい抗原は、ヒトＴＮＦαの少なくとも５アミノ酸を含む。あるいくつかの場合において、ＴＮＦαは、抗ＴＮＦα抗体、断片及びその領域と結合できるＴＮＦαのエピトープを有する十分な長さである。
【００５２】
[0077]用語「サイズ排除クロマトグラフィー」又は「ＳＥＣ」は、溶液中の分子が、サイズ及び／又は流体力学的容積に基づいて分離されるクロマトグラフィーの方法を含む。サイズ排除クロマトグラフィーは、大分子又は巨大分子複合体（例えば、タンパク質又はそれらのコンジュゲート）に用いられる。典型的には、カラムを通して試料を輸送するために水性溶液を用いる場合、この技術はゲルろ過クロマトグラフィーとして知られる。
【００５３】
[0078]用語「複合体」、「免疫複合体」、「コンジュゲート」及び「イムノコンジュゲート」は、それらに限定されないが、抗ＴＮＦα薬と（例えば非共有的手段により）結合したＴＮＦα、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体（例えば中和又は非中和抗薬物抗体）と（例えば非共有的手段により）結合した抗ＴＮＦα薬、並びにＴＮＦα及び抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体（例えば中和又は非中和抗薬物抗体）の両方と（例えば非共有的手段により）結合した抗ＴＮＦα薬を含む。
【００５４】
[0079]本明細書において、用語「標識」で修飾された物体は、実験的に検出可能な別の分子又は化学物体とコンジュゲートした任意の物体、分子、タンパク質、酵素、抗体、抗体断片、サイトカイン又は関連する種を含む。標識物体のための標識として適切な化学種は、それらに限定されないが、蛍光色素（例えば、アレクサフロール（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）（登録商標）６４７等のアレクサフロール（登録商標）色素）、量子ドット、光学色素、発光色素、及び放射性核種（例えば１２５Ｉ）を含む。
【００５５】
[0080]「蛍光標識検出」というフレーズは、蛍光標識を検出するための手段を含む。検出のための手段は、それらに限定されないが、分光計、蛍光計、光度計、及びクロマトグラフィー機器（例えばサイズ排除−高性能液体クロマトグラフィー）と一般的に組み合わせられた検出装置（例えばＡｇｉｌｅｎｔ−１２００  ＨＰＬＣシステム）を含む。
【００５６】
[0081]「治療を最適化する」というフレーズは、特定の治療の用量（例えば有効量又はレベル）及び／又は種類を最適化することを含む。例えば、抗ＴＮＦα薬の用量を最適化することは、対象に続いて投与される抗ＴＮＦα薬の量を増加又は減少することを含む。あるいくつかの場合において、抗ＴＮＦα薬の種類を最適化することは、投与される抗ＴＮＦα薬を、ある薬物から異なる薬物（例えば異なる抗ＴＮＦα薬又は異なる機序を標的にする薬物）に変更することを含む。他の場合において、治療を最適化することは、ある用量の抗ＴＮＦα薬（例えば以前の用量から増加、減少したか又は以前の用量と同じ用量）を１又は複数の免疫抑制薬と組み合わせて共投与することを含む。
【００５７】
[0082]用語「共投与」は、１より多い活性薬剤を投与して、ある活性薬剤の生理的効果の持続期間が第２活性薬剤の生理的効果とオーバーラップするようにすることを含む。
【００５８】
[0083]用語「対象」又は「患者」又は「個体」は、典型的にはヒトが挙げられるが、その他の動物（例えば、他の霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタ）であってもよい。
【００５９】
[0084]用語「治療コース」は、疾患又は障害に付随する１又は複数の症状を和らげるか又は予防するために採用される任意の治療アプローチを含む。該用語は、疾患又は障害を有する個体の健康を改善するのに有用な任意の化合物、薬物、手順及び／又は計画を投与又は実施することを包含し、本明細書に記載の任意の治療薬を含む。非限定的な例として、治療コース又は現在の治療コースの用量は、ＴＮＦα、抗ＴＮＦα薬及び／又は抗薬物抗体の存在又は濃度レベル（例えば、本発明の方法を用いて決定された中和及び／又は非中和抗薬物抗体の存在、レベル又はパーセント）に基づいて変更（例えば増加又は減少）できる。
【００６０】
[0085]用語「免疫抑制薬」又は「免疫抑制剤」は、免疫抑制効果（例えば、免疫応答の阻止又は減退）を、照射により又は薬物（例えば、代謝拮抗薬、抗リンパ球血清、抗体）の投与により生じさせることができる任意の物質を含む。免疫抑制薬の例としては、限定することなく、チオプリン系薬剤（例えば、アザチオプリン（ＡＺＡ）及びその代謝産物）；代謝拮抗薬（例えばメトトレキセート（ＭＴＸ））；シロリムス（ラパマイシン）；テムシロリムス；エベロリムス；タクロリムス（ＦＫ−５０６）；ＦＫ−７７８；抗リンパ球グロブリン抗体、抗胸腺細胞グロブリン抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体及び抗体−毒素コンジュゲート；シクロスポリン；ミコフェノール酸塩；ミゾリビン一リン酸；スコパロン；酢酸グラチラマー；それらの代謝産物；それらの薬学的に許容される塩；それらの誘導体；それらのプロドラッグ；並びにそれらの組み合わせが挙げられる。
【００６１】
[0086]用語「チオプリン系薬剤」は、アザチオプリン（ＡＺＡ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）又は治療効力を有するそれらの任意の代謝産物を含み、限定することなく、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、６−メチルメルカプトプリンリボシド、６−チオイノシンヌクレオチド（例えば６−チオイノシン一リン酸、６−チオイノシン二リン酸、６−チオイノシン三リン酸）、６−チオグアニンヌクレオチド（例えば６−チオグアノシン一リン酸、６−チオグアノシン二リン酸、６−チオグアノシン三リン酸）、６−チオキサントシンヌクレオチド（例えば６−チオキサントシン一リン酸、６−チオキサントシン二リン酸、６−チオキサントシン三リン酸）、それらの誘導体、それらの類似体及びそれらの組み合わせを含む。
【００６２】
[0087]用語「試料」は、個体から得られた任意の生物学的検体を含む。試料は、限定することなく、全血、血漿、血清、赤血球、白血球（例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、多形核（ＰＭＮ）細胞）、管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液（例えばリンパ節の播種性腫瘍細胞）、骨髄吸引液、唾液、尿、大便（すなわち糞便）、痰、気管支洗浄液、涙、穿刺吸引液（例えば無作為乳輪周囲穿刺吸引により採集された）、任意の他の体液、組織試料、例えば炎症部位の生検（例えば針生検）、それらの細胞抽出物、及びこれらの体液若しくは組織の１又は複数に由来する免疫グロブリン濃縮画分を含む。いくつかの実施形態において、試料は、全血、その分画構成要素（例えば、血漿、血清、細胞ペレット）、又はその免疫グロブリン濃縮画分である。当業者であれば、試料（例えば血清試料）を分析前に希釈できることを理解するであろう。あるいくつかの実施形態において、試料は、当技術分野において知られる任意の技術を用いてＰＢＭＣ及び／又はＰＭＮ細胞を単離することによって得られる。あるいくつかの他の実施形態において、試料は、例えば炎症部位（例えば、胃腸管又は滑膜組織の一部）からの組織生検である。
【００６３】
[0088]本発明の方法のステップは、それが記載された特定の順序で行われる必要はない。当業者であれば、本発明の方法のステップの他の順序が本発明の範囲内に包含されることを理解するであろう。
【００６４】
[0089]括弧［  ］は、括弧内の種がその濃度により言及されることを示す。
【００６５】
ＩＩＩ．実施形態の説明
[0090]本発明は、試料中の抗ＴＮＦα薬等の生物製剤に対する中和及び非中和自己抗体の存在又はレベルを検出及び測定するためのアッセイを提供する。本発明は、対象が生物学的治療（例えば抗ＴＮＦα薬治療）を受けている間の中和及び／又は非中和抗薬物抗体の経時的な形成をモニタリングするのに有用である。また、本発明は、対象の試料中の中和抗薬物抗体の、代替生物学的治療（例えば代替抗ＴＮＦα治療）との交差反応性を予測及び／又は決定するのに有用である。すなわち、本発明は、生物学的製剤による治療を受けている対象についての治療法の決定の指針となる情報を提供し、治療を最適化すること、毒性を低減すること及び／又は治療薬の効力をモニタリングすることの正確性を改善する。
【００６６】
[0091]一態様において、本発明は、試料中の生物製剤に対する自己抗体の中和形及び／又は非中和形の存在を検出するための方法であって、
（ａ）試料を標識生物製剤及び標識生物製剤結合部分と接触させて、
（ｉ）標識生物製剤と自己抗体との第１標識複合体（すなわち免疫複合体又はコンジュゲート）（すなわち、ここで第１標識複合体の構成要素は互いに共有結合していない。）、及び／又は
（ｉｉ）標識生物製剤と標識生物製剤結合部分と自己抗体との第２標識複合体（すなわち免疫複合体又はコンジュゲート）（すなわち、ここで第２標識複合体の構成要素は互いに共有結合していない。）
を形成するステップと、
（ｂ）第１標識複合体及び／又は第２標識複合体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、それらの複合体を、遊離（すなわち未結合）標識生物製剤結合部分、遊離標識生物製剤、及び／又は標識生物製剤と標識生物製剤結合部分との複合体から分離するステップと、
（ｃ）サイズ排除クロマトグラフィー後に、（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）後の遊離標識生物製剤結合部分ピークの曲線下面積（ＡＵＣ）を測定することによって）遊離標識生物製剤結合部分のレベルを測定するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において測定された遊離標識生物製剤結合部分のレベルを、（例えば、遊離標識生物製剤結合部分のみを含有する参照試料のＳＥＣ後の遊離標識生物製剤結合部分ピークのＡＵＣを測定することによって）対照試料中の遊離標識生物製剤結合部分のレベルと比較し、それにより自己抗体の中和形及び／又は非中和形の存在を検出するステップと、
を含む方法を提供する。
【００６７】
[0092]いくつかの実施形態において、自己抗体の中和形は生物製剤と生物製剤結合部分との間の結合を阻害する。他の実施形態において、自己抗体の非中和形は生物製剤と生物製剤結合部分との間の結合を阻害しない。
【００６８】
[0093]いくつかの場合において、遊離標識生物製剤結合部分は、結合している生物製剤（例えば標識及び／又は未標識生物製剤）が実質的にない標識生物製剤結合部分からなる。
【００６９】
[0094]あるいくつかの実施形態において、自己抗体の中和形は、ステップ（ｃ）において測定された遊離標識生物製剤結合部分のレベルが、対照試料中の遊離標識生物製剤結合部分のレベルと同じ又は実質的に同じである場合に検出される。あるいくつかの他の実施形態において、自己抗体の非中和形は、ステップ（ｃ）において測定された遊離標識生物製剤結合部分のレベルが、対照試料中の遊離標識生物製剤結合部分のレベルと比較して減少しているか（例えば実質的に減少）又は存在しない（例えば検出不能）場合に検出される。
【００７０】
[0095]特定の実施形態において、ステップ（ｃ）において測定された遊離標識生物製剤結合部分のレベルは、該レベルが対照試料中で測定された遊離標識生物製剤結合部分のレベルの少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である場合に、対照試料中の遊離標識生物製剤結合部分のレベルと実質的に同じであるとみなされる。特定の実施形態において、ステップ（ｃ）において測定された遊離標識生物製剤結合部分のレベルは、該レベルが対照試料中で測定された遊離標識生物製剤結合部分のレベルの少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％未満である場合に、対照試料中の遊離標識生物製剤結合部分のレベルと比較して実質的に減少しているとみなされる。
【００７１】
[0096]いくつかの実施形態において、遊離標識生物製剤結合部分のレベルは、サイズ排除クロマトグラフィー（例えばＳＥＣ−ＨＰＬＣ）からの溶出時間の関数としてのシグナル強度のプロットからの遊離標識生物製剤結合部分ピークの曲線下面積（ＡＵＣ）を積分することによって測定される。
【００７２】
[0097]いくつかの実施形態において、生物製剤は、抗体（例えば抗ＴＮＦαモノクローナル抗体）、抗体断片、タンパク質（例えば、インターロイキン等のサイトカイン）、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、多価結合タンパク質、抗体−薬物コンジュゲート、ワクチン、核酸、糖、それらの組換え形、それらの工学改変形及びそれらの組み合わせを含む。
【００７３】
[0098]他の実施形態において、試料は、例えば、生物学的治療を受けている対象からの全血、血清又は血漿試料である。好ましい実施形態において、試料は血清である。特定の実施形態において、対象は、疾患又は障害、例えば、自己免疫疾患（例えば関節リウマチ）、炎症性疾患（例えば、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）等の炎症性腸疾患（ＩＢＤ））、又は癌を有する。
【００７４】
[0099]あるいくつかの実施形態において、試料は、生物製剤に対する自己抗体を有するか、又はその疑いがある。他の実施形態において、生物製剤自己抗体は、それらに限定されないが、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）及びヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）並びにそれらの組み合わせを含む。
【００７５】
[0100]別の態様において、本発明は、試料中の生物製剤に対する自己抗体の中和形のレベル又はパーセントを測定するための方法であって、
（ａ）試料を標識生物製剤及び標識生物製剤結合部分と接触させて、
（ｉ）標識生物製剤と自己抗体との第１標識複合体（すなわち免疫複合体又はコンジュゲート）（すなわち、ここで第１標識複合体の構成要素は互いに共有結合していない。）、及び／又は
（ｉｉ）標識生物製剤と標識生物製剤結合部分と自己抗体との第２標識複合体（すなわち免疫複合体又はコンジュゲート）（すなわち、ここで第２標識複合体の構成要素は互いに共有結合していない。）
を形成するステップと、
（ｂ）第１標識複合体及び／又は第２標識複合体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、それらの複合体を、遊離（すなわち未結合）標識生物製剤結合部分、遊離標識生物製剤、及び／又は標識生物製剤と標識生物製剤結合部分との複合体から分離するステップと、
（ｃ）サイズ排除クロマトグラフィー後に、（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）後の遊離標識生物製剤結合部分ピークの曲線下面積（ＡＵＣ）を測定することによって）遊離標識生物製剤結合部分のレベルを測定するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において測定された遊離標識生物製剤結合部分のレベルを、（例えば、遊離標識生物製剤結合部分のみを含有する参照試料のＳＥＣ後の遊離標識生物製剤結合部分ピークのＡＵＣを測定及び標準化して、遊離標識生物製剤結合部分のレベル又はパーセントを算出することによって）対照試料中の遊離標識生物製剤結合部分の標準化されたレベル又はパーセントと比較するステップであって、対照試料中の遊離標識生物製剤結合部分の標準化されたレベル又はパーセントは自己抗体の中和形のレベル又はパーセントに対応するステップと、
を含む方法を提供する。
【００７６】
[0101]いくつかの実施形態において、対照試料中の遊離標識生物製剤結合部分の標準化されたレベル又はパーセントと、ステップ（ｃ）において測定された遊離標識生物製剤結合部分のレベルと、の差は自己抗体の非中和形のレベル又はパーセントに対応する。
【００７７】
[0102]いくつかの場合において、遊離標識生物製剤結合部分は、結合している生物製剤（例えば標識及び／又は未標識生物製剤）が実質的にない標識生物製剤結合部分からなる。
【００７８】
[0103]特定の実施形態において、対照試料中の遊離標識生物製剤結合部分のレベル又はパーセントは、標識生物製剤と標識生物製剤結合部分との間で形成された複合体（例えば「標識複合体」）のピーク面積を（例えば、ＡＵＣを測定することによって）測定し、次いで、標識複合体の測定されたピーク面積を、（例えば、遊離標識生物製剤結合部分ピークのＡＵＣを測定することによって得られた）遊離標識生物製剤結合部分のピーク面積から差し引くことによって標準化する。
【００７９】
[0104]あるいくつかの実施形態において、遊離標識生物製剤結合部分のレベルは、サイズ排除クロマトグラフィー（例えばＳＥＣ−ＨＰＬＣ）からの溶出時間の関数としてのシグナル強度のプロットからの遊離標識生物製剤結合部分ピークの曲線下面積（ＡＵＣ）を積分することによって測定される。他の実施形態において、標識生物製剤と標識生物製剤結合部分との間で形成された複合体のレベルは、サイズ排除クロマトグラフィー（例えばＳＥＣ−ＨＰＬＣ）からの溶出時間の関数としてのシグナル強度のプロットからの遊離標識生物製剤結合部分ピークのＡＵＣを積分することによって測定される。
【００８０】
[0105]あるいくつかの実施形態において、生物製剤に対する自己抗体（例えばＡＤＡ）の部分集団は自己抗体の中和形（例えばＮＡｂ）である。いくつかの実施形態において、試料中の生物製剤に対する自己抗体の総レベルは、本発明の方法に従って測定された中和形及び非中和形の両方の自己抗体のレベルを加えることによって算出できる。
【００８１】
[0106]いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）において測定された遊離標識生物製剤結合部分のレベルは陰性対照、陽性対照又はそれらの組み合わせとさらに比較される。さらなる実施形態において、ステップ（ｄ）において決定される自己抗体の中和形（例えばＮＡｂ）のパーセントは、健常対照（例えば正常ヒト血清）から確立されたカットオフ値又は基準範囲と比較される。いくつかの実施形態において、カットオフ値又は基準範囲は、ＮＡｂについて陽性とみなされるために試料が有さなければならないＮＡｂの閾値パーセントとして表現される。そのような実施形態において、試料は、ステップ（ｄ）において決定されたＮＡｂのパーセントが健常対照から確立されたカットオフ値又は基準範囲以上である場合に、ＮＡｂについて陽性である。他の実施形態において、試料は、ステップ（ｄ）において決定されたＮＡｂのパーセントが健常対照から確立されたカットオフ値又は基準範囲未満である場合に、ＮＡｂについて陰性である。カットオフ値又は基準範囲の非限定的な例は、例えば、少なくとも約０．２５％、０．５０％、０．７５％、１．００％、１．５０％、２．００％、２．５０％、２．６０％、２．７０％、２．８０％、２．９０％、３．００％、３．０１％、３．０２％、３．０３％、３．０４％、３．０５％、３．０６％、３．０７％、３．０８％、３．０９％、３．１０％、３．２０％、３．３０％、３．４０％、３．５０％、４．００％、４．５０％、５．００％、５．５０％、６．００％、６．５０％、７．００％、７．５０％、８．００％、８．５０％、９．００％、９．５０％、１０．００％ＮＡｂ又はその中の任意の範囲を含む。
【００８２】
[0107]いくつかの実施形態において、生物製剤に対する自己抗体はすべて中和抗体であり、試料は、１００％中和抗薬物抗体（ＮＡｂ）及び／又は０％非中和抗薬物抗体（非ＮＡｂ）を有するものとされる。これらの実施形態では、ステップ（ｃ）において測定された遊離標識生物製剤結合部分のレベルは対照試料中の遊離標識生物製剤結合部分のレベルと概して同じであり、自己抗体は、生物製剤と生物製剤結合部分との間の結合を完全に遮断又は阻害すると予測される。
【００８３】
[0108]他の実施形態において、生物製剤に対する自己抗体はいずれも中和抗体でなく、試料は、１００％非ＮＡｂ及び／又は０％ＮＡｂを有するものとされる。これらの実施形態では、ステップ（ｃ）において測定された遊離標識生物製剤結合部分のレベルは、対照試料中の遊離標識生物製剤結合部分のレベルと比較して概して存在せず（例えば検出不能）、自己抗体は、生物製剤と生物製剤結合部分との間の結合を完全には遮断又は阻害しないと予測される。
【００８４】
[0109]さらなる実施形態では、中和形及び非中和形の両方の自己抗体が試料中に存在する場合、各々のパーセントはそのまま（例えば、５０％ＮＡｂ又は５０％非ＮＡｂは、試料中のＮＡｂ及び非ＮＡｂの割合が等しいことを指すものとする。）又は比率として表現される。あるいくつかの場合において、比率は、ＮＡｂのパーセントを非ＮＡｂのパーセントで除するか又はその逆により算出される。他の場合において、比率は、ＮＡｂのレベルを非ＮＡｂのレベルで除するか又はその逆により算出される。
【００８５】
[0110]いくつかの実施形態において、生物製剤は、抗体（例えば抗ＴＮＦαモノクローナル抗体）、抗体断片、タンパク質（例えば、インターロイキン等のサイトカイン）、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、多価結合タンパク質、抗体−薬物コンジュゲート、ワクチン、核酸、糖、それらの組換え形、それらの工学改変形及びそれらの組み合わせを含む。
【００８６】
[0111]他の実施形態において、試料は、例えば、生物学的治療を受けている対象からの全血、血清又は血漿試料である。好ましい実施形態において、試料は血清である。特定の実施形態において、対象は、疾患又は障害、例えば、自己免疫疾患（例えば関節リウマチ）、炎症性疾患（例えばクローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）等の炎症性腸疾患（ＩＢＤ））、又は癌を有する。
【００８７】
[0112]あるいくつかの実施形態において、試料は、生物製剤に対する自己抗体を有するか、又はその疑いがある。他の実施形態において、生物製剤自己抗体は、それらに限定されないが、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）及びヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）並びにそれらの組み合わせを含む。
【００８８】
[0113]さらに別の態様において、本発明は、第１生物製剤に対する自己抗体の中和形が第２（すなわち異なる）生物製剤と交差反応性であるかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）試料中の自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントを、本明細書に記載のアッセイに従って検出又は測定して、自己抗体の中和形について試料が陽性であるか陰性であるかを決定するステップ
を含み、
自己抗体の中和形について試料が陽性であるならば、
（ｂ）試料を標識第２生物製剤と接触させて、標識第２生物製剤と自己抗体の中和形との標識複合体（すなわち、ここで標識複合体の構成要素は互いに共有結合していない。）を形成するステップと、
（ｃ）標識複合体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して標識複合体を（例えば遊離標識第２生物製剤から）分離するステップと、
（ｄ）標識複合体を検出し、それにより、第１生物製剤に対する自己抗体の中和形が第２生物製剤と交差反応性であるかどうかを決定するステップと、
をさらに含む方法を提供する。
【００８９】
[0114]あるいくつかの実施形態において、標識複合体の存在は、第１生物製剤に対する中和自己抗体が第２生物製剤と交差反応性であること、すなわち中和自己抗体が第１及び第２生物学的製剤の両方の活性を阻害することを示す。
【００９０】
[0115]あるいくつかの他の実施形態において、標識複合体の非存在は、第１生物製剤に対する中和自己抗体が第２生物製剤と交差反応性でないこと、すなわち中和自己抗体が第２生物学的製剤の活性を阻害しないことを示す。
【００９１】
[0116]いくつかの実施形態において、第１及び第２生物製剤は、抗体（例えば抗ＴＮＦαモノクローナル抗体）、抗体断片、タンパク質（例えば、インターロイキン等のサイトカイン）、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、多価結合タンパク質、抗体−薬物コンジュゲート、ワクチン、核酸、糖、それらの組換え形、それらの工学改変形及びそれらの組み合わせからなる群より独立して選択される。
【００９２】
[0117]他の実施形態において、試料は、例えば、生物学的治療を受けている対象からの全血、血清又は血漿試料である。好ましい実施形態において、試料は血清である。特定の実施形態において、対象は、疾患又は障害、例えば、自己免疫疾患（例えば関節リウマチ）、炎症性疾患（例えば、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）等の炎症性腸疾患（ＩＢＤ））、又は癌を有する。
【００９３】
[0118]あるいくつかの実施形態において、試料は、生物製剤に対する自己抗体を有するか、又はその疑いがある。他の実施形態において、生物製剤自己抗体は、それらに限定されないが、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）及びヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）並びにそれらの組み合わせを含む。
【００９４】
[0119]あるいくつかの態様において、本発明のアッセイ方法は、試料を標識生物製剤及び標識生物製剤結合部分と接触させる前、接触中及び／又は接触させた後に試料を酸と接触させることを含む酸解離ステップをさらに含む。
【００９５】
[0120]あるいくつかの他の態様において、本発明のアッセイ方法は、試料中の生物製剤に対する自己抗体の中和形及び／又は非中和形の１又は複数のアイソタイプの存在又はレベルを検出するステップを含む。
【００９６】
[0121]特定の一態様において、本発明は、試料中の抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の中和形及び／又は非中和形の存在を検出するための方法であって、
（ａ）試料を標識抗ＴＮＦα薬及び標識ＴＮＦαと接触させて、
（ｉ）標識抗ＴＮＦα薬と自己抗体との第１標識複合体（すなわち免疫複合体又はコンジュゲート）（すなわち、ここで第１標識複合体の構成要素は互いに共有結合していない。）、及び／又は
（ｉｉ）標識抗ＴＮＦα薬と標識ＴＮＦαと自己抗体との第２標識複合体（すなわち免疫複合体又はコンジュゲート）（すなわち、ここで第２標識複合体の構成要素は互いに共有結合していない。）
を形成するステップと、
（ｂ）第１標識複合体及び／又は第２標識複合体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、それらの複合体を、遊離（すなわち未結合）標識ＴＮＦα、遊離標識抗ＴＮＦα薬、及び／又は標識抗ＴＮＦα薬と標識ＴＮＦαとの複合体から分離するステップと、
（ｃ）サイズ排除クロマトグラフィー後に、（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）後の遊離標識ＴＮＦαピークの曲線下面積（ＡＵＣ）を測定することによって）遊離標識ＴＮＦαのレベルを測定するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において測定された遊離標識ＴＮＦαのレベルを、（例えば、遊離標識ＴＮＦαのみを含有する参照試料のＳＥＣ後の遊離標識ＴＮＦαピークのＡＵＣを測定することによって）対照試料中の遊離標識ＴＮＦαのレベルと比較し、それにより自己抗体の中和形及び／又は非中和形の存在を検出するステップと、
を含む方法を提供する。
【００９７】
[0122]いくつかの実施形態において、自己抗体の中和形は抗ＴＮＦα薬とＴＮＦαとの間の結合を阻害する。他の実施形態において、自己抗体の非中和形は抗ＴＮＦα薬とＴＮＦαとの間の結合を阻害しない。
【００９８】
[0123]いくつかの場合において、遊離標識ＴＮＦαは、結合している抗ＴＮＦα薬（例えば標識及び／又は未標識抗ＴＮＦα薬）が実質的にない標識ＴＮＦαからなる。
【００９９】
[0124]あるいくつかの実施形態において、自己抗体の中和形は、ステップ（ｃ）において測定された遊離標識ＴＮＦαのレベルが、対照試料中の遊離標識ＴＮＦαのレベルと同じ又は実質的に同じである場合に検出される。あるいくつかの他の実施形態において、自己抗体の非中和形は、ステップ（ｃ）において測定された遊離標識ＴＮＦαのレベルが、対照試料中の遊離標識ＴＮＦαのレベルと比較して減少しているか（例えば実質的に減少）又は存在しない（例えば検出不能）場合に検出される。
【０１００】
[0125]特定の実施形態において、ステップ（ｃ）において測定された遊離標識ＴＮＦαのレベルは、該レベルが対照試料中で測定された遊離標識ＴＮＦαのレベルの少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である場合に、対照試料中の遊離標識ＴＮＦαのレベルと実質的に同じであるとみなされる。特定の実施形態において、ステップ（ｃ）において測定された遊離標識ＴＮＦαのレベルは、該レベルが対照試料中で測定された遊離標識ＴＮＦαのレベルの少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％未満である場合に、対照試料中の遊離標識ＴＮＦαのレベルと比較して実質的に減少しているとみなされる。
【０１０１】
[0126]あるいくつかの実施形態において、遊離標識ＴＮＦαのレベルは、サイズ排除クロマトグラフィー（例えばＳＥＣ−ＨＰＬＣ）からの溶出時間の関数としてのシグナル強度のプロットからの遊離標識ＴＮＦαピークの曲線下面積（ＡＵＣ）を積分することによって測定される。
【０１０２】
[0127]いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦα薬は、レミケード（商標）（インフリキシマブ）、エンブレル（商標）（エタネルセプト）、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）、シムジア（登録商標）（セルトリズマブペゴール）、シンポニー（登録商標）（ゴリムマブ、ＣＮＴＯ１４８）及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０１０３】
[0128]他の実施形態において、試料は、例えば、抗ＴＮＦα薬治療を受けている対象からの全血、血清又は血漿試料である。好ましい実施形態において、試料は血清である。特定の実施形態において、対象は、ＴＮＦα媒介疾患又は障害、例えば、自己免疫疾患（例えば関節リウマチ）又は炎症性疾患（例えば、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）等の炎症性腸疾患（ＩＢＤ））を有する。
【０１０４】
[0129]あるいくつかの実施形態において、試料は、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体を有するか、又はその疑いがある。他の実施形態において、抗ＴＮＦα薬自己抗体は、それらに限定されないが、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）及びヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）並びにそれらの組み合わせを含む。
【０１０５】
[0130]別の特定の態様において、本発明は、試料中の抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の中和形のレベル又はパーセントを測定するための方法であって、
（ａ）試料を標識抗ＴＮＦα薬及び標識ＴＮＦαと接触させて、
（ｉ）標識抗ＴＮＦα薬と自己抗体との第１標識複合体（すなわち免疫複合体又はコンジュゲート）（すなわち、ここで第１標識複合体の構成要素は互いに共有結合していない。）、及び／又は
（ｉｉ）標識抗ＴＮＦα薬と標識ＴＮＦαと自己抗体との第２標識複合体（すなわち免疫複合体又はコンジュゲート）（すなわち、ここで第２標識複合体の構成要素は互いに共有結合していない。）
を形成するステップと、
（ｂ）第１標識複合体及び／又は第２標識複合体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、それらの複合体を、遊離（すなわち未結合）標識ＴＮＦα、遊離標識抗ＴＮＦα薬、及び／又は標識抗ＴＮＦα薬と標識ＴＮＦαとの複合体から分離するステップと、
（ｃ）サイズ排除クロマトグラフィー後に、（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）後の遊離標識ＴＮＦαピークの曲線下面積（ＡＵＣ）を測定することによって）遊離標識ＴＮＦαのレベルを測定するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において測定された遊離標識ＴＮＦαのレベルを、（例えば、遊離標識ＴＮＦαのみを含有する参照試料のＳＥＣ後の遊離標識ＴＮＦαピークのＡＵＣを測定及び標準化して、遊離標識ＴＮＦαのレベル又はパーセントを算出することによって）対照試料中の遊離標識ＴＮＦαの標準化されたレベル又はパーセントと比較するステップであって、対照試料中の遊離標識ＴＮＦαの標準化されたレベル又はパーセントは自己抗体の中和形のレベル又はパーセントに対応するステップと、
を含む方法を提供する。
【０１０６】
[0131]いくつかの実施形態において、対照試料中の遊離標識ＴＮＦαの標準化されたレベル又はパーセントと、ステップ（ｃ）において測定された遊離標識ＴＮＦαのレベルと、の差は自己抗体の非中和形のレベル又はパーセントに対応する。
【０１０７】
[0132]いくつかの場合において、遊離標識ＴＮＦαは、結合している抗ＴＮＦα薬（例えば標識及び／又は未標識抗ＴＮＦα薬）が実質的にない標識ＴＮＦαからなる。
【０１０８】
[0133]特定の実施形態において、対照試料中の遊離標識ＴＮＦαのレベル又はパーセントは、標識抗ＴＮＦα薬と標識ＴＮＦαとの間で形成された複合体（例えば「標識複合体」）のピーク面積を（例えば、ＡＵＣを測定することによって）測定し、次いで、標識複合体の測定されたピーク面積を、（例えば、遊離標識ＴＮＦαピークのＡＵＣを測定することによって得られた）遊離標識ＴＮＦαのピーク面積から差し引くことによって標準化する。
【０１０９】
[0134]あるいくつかの実施形態において、遊離標識ＴＮＦαのレベルは、サイズ排除クロマトグラフィー（例えばＳＥＣ−ＨＰＬＣ）からの溶出時間の関数としてのシグナル強度のプロットからの遊離標識ＴＮＦαピークの曲線下面積（ＡＵＣ）を積分することによって測定される。他の実施形態において、標識抗ＴＮＦα薬と標識ＴＮＦαとの間で形成された複合体のレベルは、サイズ排除クロマトグラフィー（例えばＳＥＣ−ＨＰＬＣ）からの溶出時間の関数としてのシグナル強度のプロットからの遊離標識ＴＮＦαピークのＡＵＣを積分することによって測定される。
【０１１０】
[0135]あるいくつかの実施形態において、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体（例えばＡＤＡ）の部分集団は自己抗体の中和形（例えばＮＡｂ）である。いくつかの実施形態において、試料中の抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の総レベルは、本発明の方法に従って測定された中和形及び非中和形の両方の自己抗体のレベルを加えることによって算出できる。
【０１１１】
[0136]いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）において測定された遊離標識ＴＮＦαのレベルは陰性対照、陽性対照又はそれらの組み合わせとさらに比較される。陰性対照の非限定的な例は、マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ試料及び／又はウサギモノクローナル抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ試料を含む。陽性対照の非限定的な例は、プールしたＡＤＡ陽性患者血清試料及び／又は抗ＴＮＦα薬のＦ（ａｂ’）２断片に対するウサギポリクローナル抗体の試料を含む。
【０１１２】
[0137]さらなる実施形態において、ステップ（ｄ）において決定された自己抗体の中和形（例えばＮＡｂ）のパーセントは、健常対照（例えば正常ヒト血清）から確立されたカットオフ値又は基準範囲と比較される。特定の実施形態において、カットオフ値又は基準範囲は、ＮＡｂについて陽性とみなされるために試料が有さなければならないＮＡｂの閾値パーセントとして表現される。そのような実施形態において、試料は、ステップ（ｄ）において決定されたＮＡｂのパーセントが健常対照から確立されたカットオフ値又は基準範囲以上である場合に、ＮＡｂについて陽性である。他の実施形態において、試料は、ステップ（ｄ）において決定されたＮＡｂのパーセントが健常対照から確立されたカットオフ値又は基準範囲未満である場合に、ＮＡｂについて陰性である。カットオフ値又は基準範囲の非限定的な例は、例えば、少なくとも約０．２５％、０．５０％、０．７５％、１．００％、１．５０％、２．００％、２．５０％、２．６０％、２．７０％、２．８０％、２．９０％、３．００％、３．０１％、３．０２％、３．０３％、３．０４％、３．０５％、３．０６％、３．０７％、３．０８％、３．０９％、３．１０％、３．２０％、３．３０％、３．４０％、３．５０％、４．００％、４．５０％、５．００％、５．５０％、６．００％、６．５０％、７．００％、７．５０％、８．００％、８．５０％、９．００％、９．５０％、１０．００％ＮＡｂ又はその中の任意の範囲を含む。いくつかの場合において、カットオフ値又は基準範囲は、約３．００％ＮＡｂ又は約３．０６％ＮＡｂ又は約３．００％〜３．１０％ＮＡｂである。
【０１１３】
[0138]いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦα薬に対するすべての自己抗体は中和抗体であり、試料は、１００％中和抗薬物抗体（ＮＡｂ）及び／又は０％非中和抗薬物抗体（非ＮＡｂ）を有するものとされる。これらの実施形態では、ステップ（ｃ）において測定された遊離標識ＴＮＦαのレベルは対照試料中の遊離標識ＴＮＦαのレベルと概して同じであり、自己抗体は、抗ＴＮＦα薬とＴＮＦαとの間の結合を完全に遮断又は阻害すると予測される。
【０１１４】
[0139]あるいくつかの他の実施形態において、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体はいずれも中和抗体でなく、試料は、１００％非ＮＡｂ及び／又は０％ＮＡｂを有するものとされる。これらの実施形態では、ステップ（ｃ）において測定された遊離標識ＴＮＦαのレベルは、対照試料中の遊離標識ＴＮＦαのレベルと比較して概して存在せず（例えば検出不能）、自己抗体は、抗ＴＮＦα薬とＴＮＦαとの間の結合を完全には遮断又は阻害しないと予測される。
【０１１５】
[0140]さらなる実施形態では、中和形及び非中和形の両方の自己抗体が試料中に存在する場合、各々のパーセントはそのまま（例えば、５０％ＮＡｂ又は５０％非ＮＡｂは、試料中のＮＡｂ及び非ＮＡｂの割合が等しいことを指すものとする。）又は比率として表現される。あるいくつかの場合において、比率は、ＮＡｂのパーセントを非ＮＡｂのパーセントで除するか又はその逆により算出される。他の場合において、比率は、ＮＡｂのレベルを非ＮＡｂのレベルで除するか又はその逆により算出される。
【０１１６】
[0141]いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦα薬は、レミケード（商標）（インフリキシマブ）、エンブレル（商標）（エタネルセプト）、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）、シムジア（登録商標）（セルトリズマブペゴール）、シンポニー（登録商標）（ゴリムマブ、ＣＮＴＯ１４８）及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０１１７】
[0142]他の実施形態において、試料は、例えば、抗ＴＮＦα薬治療を受けている対象からの全血、血清又は血漿試料である。好ましい実施形態において、試料は血清である。特定の実施形態において、対象は、ＴＮＦα媒介疾患又は障害、例えば、自己免疫疾患（例えば関節リウマチ）又は炎症性疾患（例えば、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）等の炎症性腸疾患（ＩＢＤ））を有する。
【０１１８】
[0143]あるいくつかの実施形態において、試料は、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体を有するか、又はその疑いがある。他の実施形態において、抗ＴＮＦα薬自己抗体は、それらに限定されないが、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）及びヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）並びにそれらの組み合わせを含む。
【０１１９】
[0144]さらに別の特定の態様において、本発明は、第１抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の中和形が第２（すなわち異なる）抗ＴＮＦα薬と交差反応性であるかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）試料中の自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントを、本明細書に記載のアッセイに従って検出又は測定して、自己抗体の中和形について試料が陽性であるか陰性であるかを決定するステップ
を含み、
自己抗体の中和形について試料が陽性であるならば、
（ｂ）試料を標識第２抗ＴＮＦα薬と接触させて、標識第２抗ＴＮＦα薬と自己抗体の中和形との標識複合体（すなわち、ここで標識複合体の構成要素は互いに共有結合していない。）を形成するステップと、
（ｃ）標識複合体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して標識複合体を（例えば遊離標識第２抗ＴＮＦα薬から）分離するステップと、
（ｄ）標識複合体を検出し、それにより、第１抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の中和形が第２抗ＴＮＦα薬と交差反応性であるかどうかを決定するステップと、
を含む方法を提供する。
【０１２０】
[0145]あるいくつかの実施形態において、標識複合体の存在は、第１抗ＴＮＦα薬に対する中和自己抗体が第２抗ＴＮＦα薬と交差反応性であること、すなわち中和自己抗体が第１及び第２抗ＴＮＦα薬の両方の活性を阻害することを示す。
【０１２１】
[0146]あるいくつかの他の実施形態において、標識複合体の非存在は、第１抗ＴＮＦα薬に対する中和自己抗体が第２抗ＴＮＦα薬と交差反応性でないこと、すなわち中和自己抗体が第２抗ＴＮＦα薬の活性を阻害しないことを示す。
【０１２２】
[0147]特定の実施形態において、第１及び第２抗ＴＮＦα薬は、レミケード（商標）（インフリキシマブ）、エンブレル（商標）（エタネルセプト）、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）、シムジア（登録商標）（セルトリズマブペゴール）、シンポニー（登録商標）（ゴリムマブ、ＣＮＴＯ１４８）及びそれらの組み合わせからなる群より独立して選択される。
【０１２３】
[0148]他の実施形態において、試料は、例えば、抗ＴＮＦα薬治療を受けている対象からの全血、血清又は血漿試料である。好ましい実施形態において、試料は血清である。特定の実施形態において、対象は、ＴＮＦα媒介疾患又は障害、例えば、自己免疫疾患（例えば関節リウマチ）又は炎症性疾患（例えば、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）等の炎症性腸疾患（ＩＢＤ））を有する。
【０１２４】
[0149]あるいくつかの実施形態において、試料は、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体を有するか、又はその疑いがある。他の実施形態において、抗ＴＮＦα薬自己抗体は、それらに限定されないが、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）及びヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）並びにそれらの組み合わせを含む。
【０１２５】
[0150]あるいくつかの態様において、本発明のアッセイ方法は、試料を標識抗ＴＮＦα薬及び標識ＴＮＦαと接触させる前、接触中及び／又は接触させた後に試料を酸と接触させることを含む酸解離ステップをさらに含む。
【０１２６】
[0151]酸解離を用いて抗薬物抗体を検出するための方法は、本明細書及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２５４３７（出願日：２０１２年２月１６日）（その開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。）に記載されている。
【０１２７】
[0152]あるいくつかの他の態様において、本発明のアッセイ方法は、試料中の抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の中和形及び／又は非中和形の１又は複数のアイソタイプの存在又はレベルを検出するステップを含む。非限定的な例として、本発明のアッセイは、抗ＴＮＦα薬（例えば、レミケード（商標）（インフリキシマブ）、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ））を受けているＡＤＡ陽性患者からの試料中の異なる中和及び／又は非中和ＡＤＡアイソタイプを決定するために用いることができる。あるいくつかの実施形態において、１又は複数のアイソタイプは少なくとも２、３、４、５又はそれ以上のアイソタイプを含む。他の実施形態において、１又は複数のアイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭアイソタイプ、それらのサブクラス並びにそれらの組み合わせからなる群より選択される。あるいくつかの実施形態において、各自己抗体アイソタイプは、該アイソタイプの保持時間により特徴決定、同定及び／又は検出される。他の実施形態において、各自己抗体アイソタイプは、検出部分（例えば、標識抗ＴＮＦα薬、及び異なる抗体アイソタイプに特異的な標識抗Ｉｇ抗体）の近接結合により生じるシグナルにより特徴決定、同定及び／又は検出される。あるいくつかの場合において、シグナルは、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）により検出できる蛍光シグナルを含む。
【０１２８】
[0153]抗薬物抗体（ＡＤＡ）アイソタイプを検出するための方法は、国際公開第２０１２／０５４５３２号パンフレット（その開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。）にさらに記載されている。
【０１２９】
[0154]生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）又は生物製剤結合部分（例えばＴＮＦα）は、種々の検出可能基のいずれを用いても標識できる。好ましい実施形態において、生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）及び生物製剤結合部分（例えばＴＮＦα）は異なる標識を含む。あるいくつかの実施形態において、生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）又は生物製剤結合部分（例えばＴＮＦα）は蛍光体又は蛍光色素で標識される。蛍光体又は蛍光色素の非限定的な例としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓカタログ（その内容は、参照により本明細書に組み入れられている。）に列挙されているものが挙げられる（Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ−Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、第１０版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（２００５）を参照されたい）。そのような例示的な蛍光体又は蛍光色素は、それらに限定されないが、アレクサフロール（登録商標）色素、例えば、アレクサフロール（登録商標）３５０、アレクサフロール（登録商標）４０５、アレクサフロール（登録商標）４３０、アレクサフロール（登録商標）４８８、アレクサフロール（登録商標）５１４、アレクサフロール（登録商標）５３２、アレクサフロール（登録商標）５４６、アレクサフロール（登録商標）５５５、アレクサフロール（登録商標）５６８、アレクサフロール（登録商標）５９４、アレクサフロール（登録商標）６１０、アレクサフロール（登録商標）６３３、アレクサフロール（登録商標）６３５、アレクサフロール（登録商標）６４７、アレクサフロール（登録商標）６６０、アレクサフロール（登録商標）６８０、アレクサフロール（登録商標）７００、アレクサフロール（登録商標）７５０及び／又はアレクサフロール（登録商標）７９０、並びに他の蛍光体、例えば、それらに限定されないが、ダンシルクロリド（ＤＮＳ−Ｃｌ）、５−（ヨードアセトアミド）フルオレセイン（５−ＩＡＦ）、フルオレセイン５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン５−（及び６−）イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン（アクリロダン）、７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３，−ジアゾール−４−イルクロリド（ＮＢＤ−Ｃｌ）、臭化エチジウム、ルシファーイエロー、５−カルボキシローダミン６Ｇ塩酸塩、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）（商標）スルホニルクロリド、ＢＯＤＩＰＹ（商標）、ナフタラミンスルホン酸（例えば、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（ＡＮＳ）、６−（ｐ−トルイジニル）ナフタレン−２−スルホン酸（ＴＮＳ））、アンスロイル脂肪酸、ＤＰＨ、パリナリン酸、ＴＭＡ−ＤＰＨ、フルオレニル脂肪酸、フルオレセイン−ホスファチジルエタノールアミン、テキサスレッド−ホスファチジルエタノールアミン、ピレニル−ホスファチジルコリン、フルオレニル−ホスファチジルコリン、メロシアニン５４０、１−（３−スルホナトプロピル）−４−［β−［２［（ジ−ｎ−ブチルアミノ）−６ナフチル］ビニル］ピリジニウムベタイン（ナフチルスチリル）、３，３’ジプロピルチアジアカルボシアニン（ｄｉＳ−Ｃ３−（５））、４−（ｐ−ジペンチルアミノスチリル）−１−メチルピリジニウム（ｄｉ−５−ＡＳＰ）、Ｃｙ−３ヨードアセトアミド、Ｃｙ−５−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｃｙ−７−イソチオシアネート、ローダミン８００、ＩＲ−１２５、チアゾールオレンジ、アズールＢ、ナイルブルー、Ａｌフタロシアニン、オキサジン１、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ヘキスト３３３４２、ＴＯＴＯ、アクリジンオレンジ、エチジウムホモダイマー、Ｎ（エトキシカルボニルメチル）−６−メトキシキノリニウム（ＭＱＡＥ）、Ｆｕｒａ−２、カルシウムグリーン、カルボキシＳＮＡＲＦ−６、ＢＡＰＴＡ、クマリン、フィトフロール、コロネン、金属−リガンド錯体、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＲＳ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＤＹ６７６、ＤＹ６８０、ＤＹ６８２、ＤＹ７８０及びそれらの混合物を含む。さらなる適切な蛍光体は、酵素補因子；ランタニド、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質又はそれらの変異体及び誘導体を含む。本発明の一実施形態において、特異的結合対の第２メンバーには検出可能基が結合している。
【０１３０】
[0155]典型的には、蛍光基は、ポリメチン、フタロシアニン、シアニン、キサンテン、フルオレン、ローダミン、クマリン、フルオレセイン及びＢＯＤＩＰＹ（商標）を含む色素の範疇から選択される蛍光体である。
【０１３１】
[0156]一実施形態において、蛍光基は、約６５０〜約９００ｎｍの範囲で発光する近赤外（ＮＩＲ）蛍光体である。近赤外蛍光技術を用いることは、生物学的アッセイにおいて有利である。なぜなら、該技術は、生物基質の自己蛍光からのバックグラウンドを実質的に排除又は低減するからである。近ＩＲ蛍光技術の別の利益は、散乱強度は波長の４乗の逆数に比例するので、励起源からの散乱光が大きく低減されることである。低いバックグラウンド蛍光及び低い散乱は、高いシグナル対ノイズ比をもたらし、高いシグナル対ノイズ比は、高い感度での検出のために必須である。さらに、生体組織における近ＩＲ領域（６５０ｎｍ〜９００ｎｍ）における光学的に透明なウィンドウにより、ＮＩＲ蛍光は、光が生物学的構成要素を透過することが要求されるｉｎ  ｖｉｖｏイメージング及び細胞より小さいレベルの検出用途のための価値のある技術になる。本実施形態の態様内で、蛍光基は、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＲＳ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００、アレクサフロール（登録商標）６６０、アレクサフロール（登録商標）６８０、アレクサフロール（登録商標）７００、アレクサフロール（登録商標）７５０、アレクサフロール（登録商標）７９０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＤＹ６７６、ＤＹ６８０、ＤＹ６８２及びＤＹ７８０からなる群より選択されるのが好ましい。あるいくつかの実施形態において、近赤外基は、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００又はＤｙｎｏｍｉｃ  ＤＹ６７６である。
【０１３２】
[0157]蛍光標識化は、蛍光体の化学反応性誘導体を用いて達成される。一般的な反応性基は、アミン反応性イソチオシアネート誘導体（例えば、ＦＩＴＣ及びＴＲＩＴＣ（フルオレセイン及びローダミンの誘導体））、アミン反応性スクシンイミジルエステル（例えばＮＨＳ−フルオレセイン）、及びスルフヒドリル反応性マレイミド活性化フロール（例えばフルオレセイン−５−マレイミド）（これらの多くは市販で入手可能）を含む。これらの反応性色素のいずれかと生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）又は生物製剤結合部分（例えばＴＮＦα）との反応は、蛍光体と生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）又は生物製剤結合部分（例えばＴＮＦα）との間の安定な共有結合の形成をもたらす。
【０１３３】
[0158]あるいくつかの場合には、蛍光標識化反応の後に標識標的分子から任意の未反応蛍光体を除去することがしばしば必要である。該除去は、蛍光体と標識タンパク質との間のサイズの差を利用して、サイズ排除クロマトグラフィーによりしばしば達成される。
【０１３４】
[0159]反応性蛍光色素は、多くの供給源から入手可能である。反応性蛍光色素は、標的分子内の種々の官能基への結合のための異なる反応性基を用いて得ることができる。反応性蛍光色素は、標識化反応を行うためのすべての構成要素を含有する標識化キット中で入手可能でもある。好ましい一態様では、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ−２０３４７）からのアレクサフロール（登録商標）６４７  Ｃ２マレイミドを用いる。
【０１３５】
[0160]中和及び／又は非中和抗薬物抗体（例えばＮＡｂ及び／又は非ＮＡｂ）と生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）及び／又は生物製剤結合部分（例えばＴＮＦα）との特異的免疫学的結合は、直接又は間接的に検出できる。直接標識は、例えば、抗体に結合した蛍光又は発光タグ、金属、色素、放射性核種を含む。あるいくつかの場合において、異なる放射性核種で標識した生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）又は生物製剤結合部分（例えばＴＮＦα）は、試料中のＮＡｂ及び／又は非ＮＡｂの存在又はレベルを決定するために用いることができる。他の場合には、化学発光生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）及び生物製剤結合部分（例えばＴＮＦα）を用いる化学発光アッセイが、試料中のＮＡｂ及び／又は非ＮＡｂの存在又はレベルの高感度で非放射活性の検出のために適切である。特定の場合には、異なる蛍光色素で標識した生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）及び生物製剤結合部分（例えばＴＮＦα）が、試料中のＮＡｂ及び／又は非ＮＡｂの存在又はレベルの検出のために適切である。蛍光色素の例としては、限定することなく、アレクサフロール（登録商標）色素、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、ヘキスト３３２５８、Ｒ−フィコシアニン、Ｂ−フィコエリスリン、Ｒ−フィコエリスリン、ローダミン、テキサスレッド及びリサミンが挙げられる。蛍光色素と連結される２次抗体は、商業的に得ることができ、例えばヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣは、Ｔａｇｏ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）から入手可能である。
【０１３６】
[0161]間接標識は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ等の、当技術分野において公知の種々の酵素を含む。セイヨウワサビペルオキシダーゼ検出系は、例えば発色基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）とともに用いることができ、該発色基質は、過酸化水素の存在下、４５０ｎｍで検出可能な可溶性生成物を産生する。アルカリホスファターゼ検出系は、例えば発色基質ｐ−ニトロフェニルホスフェートとともに用いることができ、該発色基質は、４０５ｎｍで容易に検出可能な可溶性生成物を産生する。同様に、β−ガラクトシダーゼ検出系は、発色基質ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）とともに用いることができ、該発色基質は、４１０ｎｍで検出可能な可溶性生成物を産生する。ウレアーゼ検出系は、尿素−ブロモクレゾールパープル（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）等の基質とともに用いることができる。酵素と連結される有用な２次抗体は、いくつかの商業的な供給源から得ることができ、例えば、ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ−アルカリホスファターゼは、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）から購入できる。
【０１３７】
[0162]直接又は間接標識からのシグナルは、例えば発色基質からの色を検出するための分光光度計；放射線を検出するための放射線測定器（例えば、１２５Ｉの検出のためのガンマ線測定器）；又はある波長の光の存在下で蛍光を検出するための蛍光計を用いて分析できる。酵素連結抗体の検出のために、ＮＡｂ及び／又は非ＮＡｂレベルの定量分析を、製造者の使用説明に従って分光光度計（例えば、ＥＭＡＸマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ））を用いて行うことができる。所望により、本発明のアッセイは、自動化するか又はロボットにより行うことができ、複数の試料からのシグナルを同時に検出できる。
【０１３８】
[0163]あるいくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーが使用される。ＳＥＣの根底をなす原理は、異なるサイズの粒子が異なる速度で定常相を通って溶出（ろ過）されるということである。この結果、サイズに基づいて粒子の溶液が分離される。すべての粒子が同時又はほぼ同時に装填されることを条件として、同じサイズの粒子は一緒に溶出される。各サイズ排除カラムは分離可能な分子量の範囲を有する。排除限界は該範囲の上端の分子量を規定し、定常相に捕捉されるには分子が大きすぎるところである。浸透限界は分離の範囲の下端の分子量を規定し、十分に小さいサイズの分子が定常相の孔に完全に浸透し、この分子質量未満のすべての分子は単一バンドとして溶出されるほど小さいところである。
【０１３９】
[0164]あるいくつかの態様において、溶離液は一定容積又は画分で回収される。粒子のサイズが似ているほど、それらの粒子は同じ画分にあり、別々に分離されない可能性がより高い。回収された画分を分光技術により調べて、溶出された粒子の濃度を決定することが好ましい。典型的には、本発明において有用な分光検出技術は、それらに限定されないが、蛍光分析、屈折率（ＲＩ）及び紫外線（ＵＶ）を含む。あるいくつかの場合において、溶出容積は、分子流体力学的容積の対数とともにほぼ直線的に減少する（すなわち、まず重い部分が落ちる）。
【０１４０】
[0165]さらなる態様において、本発明は、生物製剤による治療コースを受けている対象における治療のモニタリング及び／又は前記生物製剤への治療の最適化を行うための方法であって、
（ａ）生物製剤に対する自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントを、本明細書に記載のアッセイに従って治療コース中の複数の時点で検出又は測定するステップと、
（ｂ）自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントの経時的な変化を検出するステップと、
（ｃ）対象についての治療コースの後続の用量、又は異なる治療コースを対象に対して実施するべきかを、自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントの経時的な変化に基づいて決定するステップと、
を含む方法を提供する。
【０１４１】
[0166]あるいくつかの実施形態において、複数の時点は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上の時点を含む。
【０１４２】
[0167]特定の一態様において、本発明は、生物製剤による治療コースを受けている対象における治療のモニタリング及び／又は前記生物製剤への治療の最適化を行うための方法であって、
（ａ）対象からの第１試料中の生物製剤に対する自己抗体の中和形のレベル又はパーセントを本明細書に記載のようにして時点ｔ０で測定するステップと、
（ｂ）対象からの第２試料中の自己抗体の中和形のレベル又はパーセントを本明細書に記載のようにして時点ｔ１で測定するステップと、
（ｃ）対象からのｎのさらなる試料を用いて時点ｔｎ＋１（ここで、ｎは、１〜約２５の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５又はその中の任意の範囲）である。）でステップ（ｂ）を任意選択で反復するステップと、
（ｄ）時点ｔ０からｔ１まで又は時点ｔ０からｔｎ＋１までの自己抗体の中和形のレベル又はパーセントの変化を検出するステップと、
（ｅ）対象についての治療コースの後続の用量、又は異なる治療コースを対象に対して実施するべきかを、自己抗体の中和形のレベル又はパーセントの経時的な変化に基づいて決定するステップと、
を含む方法を提供する。
【０１４３】
[0168]あるいくつかの他の実施形態において、自己抗体の中和形（例えばＮＡｂ）のレベル又はパーセントは、生物学的製剤治療コース中の例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、８０、９０、１００週目のうちの１又は複数（例えば複数）の週に測定される。
【０１４４】
[0169]いくつかの実施形態において、対象についての治療コースの後続の用量を決定することは、対象についての治療コースの後続の用量を維持、増加又は減少することを含む。他の実施形態において、対象についての異なる治療コースを決定することは異なる生物学的製剤による治療を含む。他の実施形態において、対象についての異なる治療コースを決定することは、別の治療薬とともに現在の治療コースを用いる治療を含む。さらなる実施形態において、対象についての異なる治療コースを決定することは、現在の治療コースを変更すること（例えば、異なる生物製剤又は異なる機序を標的にする薬物に切り替えること）を含む。
【０１４５】
[0170]特定の実施形態において、自己抗体の中和形（例えばＮＡｂ）のレベル又はパーセントの経時的な増加は、該対象に関して治療法の調整が推奨されることを示す。あるいくつかの他の実施形態において、自己抗体の中和形（例えばＮＡｂ）の非存在から該抗体の存在への経時的な変化は、該対象に関して治療法の調整が推奨されることを示す。これらの実施形態では、対象を、１又は複数の他の治療薬とともに現在の治療コース（例えば、現行の生物製剤の服用）を用いて治療できる。あるいくつかの代替の実施形態において、対象は、異なる生物製剤に切り替えることができる。あるいくつかの他の代替の実施形態において、対象は、異なる機序を標的にする薬物（例えば、生物製剤及び／又は非生物製剤）に切り替えることができる。
【０１４６】
[0171]さらなる態様において、本発明は、第１生物製剤による治療コースを受けている対象における治療の最適化及び／又は毒性の低減のための方法であって、
（ａ）対象からの試料中の自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントを本明細書に記載のアッセイに従って検出又は測定することによって、第１生物製剤に対する自己抗体の中和形が第２（すなわち異なる）生物製剤と交差反応性であるかどうかを決定するステップと、
（ｂ）自己抗体の中和形が第２生物製剤と交差反応性であるならば、異なる治療コースを対象に対して実施するべきと決定するステップと、
を含む方法を提供する。
【０１４７】
[0172]あるいくつかの実施形態において、異なる治療コースを実施するべきと決定することは、異なる機序を標的にする薬物（例えば、生物製剤及び／又は非生物製剤）に切り替えることを含む。
【０１４８】
[0173]いくつかの実施形態において、方法は、自己抗体の中和形が第２生物製剤と交差反応性でないならば、現在の治療コースの後続の用量を増加若しくは減少する、又は対象に対して異なる治療コースを実施するべきと決定するステップをさらに含む。あるいくつかの場合において、異なる治療コースは第２生物製剤による治療を含む。あるいくつかの他の場合において、異なる治療コースは、１又は複数の他の治療薬とともに第１又は第２生物製剤を用いる治療を含む。
【０１４９】
[0174]特定の一態様において、本発明は、抗ＴＮＦα薬による治療コースを受けている対象における治療のモニタリング及び／又は前記抗ＴＮＦα薬への治療の最適化を行うための方法であって、
（ａ）抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントを、本明細書に記載のアッセイに従って治療コース中の複数の時点で検出又は測定するステップと、
（ｂ）自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントの経時的な変化を検出するステップと、
（ｃ）対象についての治療コースの後続の用量、又は異なる治療コースを対象に対して実施するべきかを、自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントの経時的な変化に基づいて決定するステップと、
を含む方法を提供する。
【０１５０】
[0175]あるいくつかの実施形態において、複数の時点は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上の時点を含む。
【０１５１】
[0176]別の特定の態様において、本発明は、抗ＴＮＦα薬による治療コースを受けている対象における治療のモニタリング及び／又は前記抗ＴＮＦα薬への治療の最適化を行うための方法であって、
（ａ）対象からの第１試料中の抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の中和形のレベル又はパーセントを本明細書に記載のようにして時点ｔ０で測定するステップと、
（ｂ）対象からの第２試料中の自己抗体の中和形のレベル又はパーセントを本明細書に記載のようにして時点ｔ１で測定するステップと、
（ｃ）対象からのｎのさらなる試料を用いて時点ｔｎ＋１（ここで、ｎは、１〜約２５の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５又はその中の任意の範囲）である。）でステップ（ｂ）を任意選択で反復するステップと、
（ｄ）時点ｔ０からｔ１まで又は時点ｔ０からｔｎ＋１までの自己抗体の中和形のレベル又はパーセントの変化を検出するステップと、
（ｅ）対象についての治療コースの後続の用量、又は異なる治療コースを対象に対して実施するべきかを、自己抗体の中和形のレベル又はパーセントの経時的な変化に基づいて決定するステップと、
を含む方法を提供する。
【０１５２】
[0177]あるいくつかの他の実施形態において、自己抗体の中和形（例えばＮＡｂ）のレベル又はパーセントは、抗ＴＮＦα薬治療コース中の例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、８０、９０、１００週目のうちの１又は複数（例えば複数）の週に測定される。
【０１５３】
[0178]いくつかの実施形態において、対象についての治療コースの後続の用量を決定することは、対象についての治療コースの後続の用量を維持、増加又は減少することを含む。他の実施形態において、対象についての異なる治療コースを決定することは異なる抗ＴＮＦα薬による治療を含む。他の実施形態において、対象についての異なる治療コースを決定することは、それらに限定されないが、抗ＴＮＦ治療、免疫抑制剤、副腎皮質ステロイド、異なる機序を標的にする薬物、栄養療法及び他の併用治療を含む別の治療薬とともに現在の治療コースを用いる治療を含む。さらなる実施形態において、対象についての異なる治療コースを決定することは、現在の治療コースを変更すること（例えば、異なる抗ＴＮＦ薬、又は異なる機序を標的にする薬物（例えば、ＩＬ−６受容体阻害モノクローナル抗体、抗インテグリン分子（例えば、タイサブリ、ベドリズマブ）、ＪＡＫ−２阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤）、又は栄養療法（例えば特別炭水化物食）に切り替えること）を含む。
【０１５４】
[0179]特定の実施形態において、自己抗体の中和形（例えばＮＡｂ）のレベル又はパーセントの経時的な増加は、該対象に関して治療法の調整が推奨されることを示す。あるいくつかの他の実施形態において、自己抗体の中和形（例えばＮＡｂ）の非存在から該抗体の存在への経時的な変化は、該対象に関して治療法の調整が推奨されることを示す。これらの実施形態では、対象を、１又は複数の免疫抑制剤（例えば、メトトレキセート（ＭＴＸ）、アザチオプリン（ＡＺＡ））とともに現在の治療コース（例えば、現行の抗ＴＮＦα薬の服用）を用いて治療できる。あるいくつかの代替の実施形態において、対象は、異なる抗ＴＮＦα薬に切り替えることができる。あるいくつかの他の代替の実施形態において、対象は、異なる機序を標的にする薬物（例えば非抗ＴＮＦα薬）に切り替えることができる。
【０１５５】
[0180]さらに別の特定の態様において、本発明は、第１抗ＴＮＦα薬による治療コースを受けている対象における治療の最適化及び／又は毒性の低減のための方法であって、
（ａ）対象からの試料中の自己抗体の中和形の存在、レベル又はパーセントを本明細書に記載のアッセイに従って検出又は測定することによって、第１抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の中和形が第２（すなわち異なる）抗ＴＮＦα薬と交差反応性であるかどうかを決定するステップと、
（ｂ）自己抗体の中和形が第２抗ＴＮＦα薬と交差反応性であるならば、異なる治療コースを対象に対して実施するべきと決定するステップと、
を含む方法を提供する。
【０１５６】
[0181]あるいくつかの実施形態において、異なる治療コースを実施するべきと決定することは、異なる機序を標的にする薬物（例えば非抗ＴＮＦα薬）に切り替えることを含む。そのような薬物の非限定的な例としては、ＩＬ−６受容体阻害モノクローナル抗体、抗インテグリン分子（例えば、タイサブリ、ベドリズマブ）、ＪＡＫ−２阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、栄養療法（例えば特別炭水化物食）及びそれらの混合物が挙げられる。
【０１５７】
[0182]いくつかの実施形態において、方法は、自己抗体の中和形が第２抗ＴＮＦα薬と交差反応性でないならば、現在の治療コースの後続の用量を増加若しくは減少する、又は対象に対して異なる治療コースを実施するべきと決定するステップをさらに含む。あるいくつかの場合において、異なる治療コースは第２抗ＴＮＦα薬による治療を含む。あるいくつかの他の場合において、異なる治療コースは、１又は複数の免疫抑制剤（例えば、ＭＴＸ、ＡＺＡ）とともに第１又は第２抗ＴＮＦα薬を用いる治療を含む。
【０１５８】
[0183]抗ＴＮＦα薬及び抗薬物抗体を検出するための方法は、国際公開第２０１１／０５６５９０号パンフレット（その開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。）にさらに記載されている。
【０１５９】
[0184]あるいくつかの場合において、本発明は、治療有効量の治療コース（例えば、抗ＴＮＦα薬、又はＴＮＦα媒介疾患若しくは障害（例えば、ＣＤ、ＵＣ等のＩＢＤ）に付随する１若しくは複数の症状を治療するのに有用な異なる機序を標的にする薬物（例えば非抗ＴＮＦα薬））を対象に対して実施するステップをさらに含んでもよい。治療用途に関して、治療コースは単独で実施できるか、又は本明細書に記載の１又は複数のさらなる薬剤と組み合わせて共投与できる。すなわち、本発明は、治療法の決定の指針を与え、適切な薬物が適切な患者に適切な時間に与えられるように抗ＴＮＦα薬についての治療の選択及び最適化を知らせることによって、臨床医が「個別化医療」を有利に実施することを可能にする。
【０１６０】
ＩＶ．酸解離
[0185]あるいくつかの態様において、本発明のアッセイ方法は、酸解離ステップをさらに含み、例えば抗ＴＮＦα薬等の生物製剤に対して生じる中和自己抗体（ＮＡｂ）、非中和自己抗体（非ＮＡｂ）及び／又はそのアイソタイプの存在又はレベルを測定するための免疫複合体の平衡化を可能にする。結果として、必要とする対象に投与された生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）に対するＮＡｂ及び／又は非ＮＡｂの存在又はレベルは、対象の試料中に存在する投与された生物製剤から実質的に妨害されることなく測定できる。特に、対象の試料は、生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）の存在下であっても高い生物学的製剤レベルから実質的に妨害されることなくＮＡｂ及び／又は非ＮＡｂの存在又はレベルの測定をもたらすのに十分な量の酸とともにインキュベートできる。
【０１６１】
[0186]いくつかの実施形態において、本発明のアッセイ方法のステップ（ａ）は、
（ａ’）試料を酸と接触させて、自己抗体（例えば、その中和形及び／又は非中和形を含む。）と生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）との予め形成された複合体を解離させるサブステップと、
（ｂ’）予め形成された複合体の解離後に試料を標識生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）及び標識生物製剤結合部分（例えばＴＮＦα）と接触させるサブステップと、
（ｃ’）試料中の酸を中和して、
（ｉ）標識生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）と自己抗体との第１標識複合体、及び／又は
（ｉｉ）標識生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）と標識生物製剤結合部分（例えばＴＮＦα）と自己抗体との第２標識複合体
を形成するサブステップと、
を含んでもよい。
【０１６２】
[0187]いくつかの代替の実施形態において、サブステップ（ａ’）及び（ｂ’）は同時に行い、例えば、試料を同時に酸、標識生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）及び標識生物製剤結合部分（例えばＴＮＦα）と接触させる。他の代替の実施形態において、サブステップ（ｂ’）は、サブステップ（ａ’）の前に行い、例えば、試料をまず標識生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）及び標識生物製剤結合部分（例えばＴＮＦα）と接触させ、次いで酸と接触させる。さらなる実施形態において、サブステップ（ｂ’）及び（ｃ’）は同時に行い、例えば、試料を標識生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）及び標識生物製剤結合部分（例えばＴＮＦα）と接触させ、同時に（例えば、試料を１又は複数の中和剤と接触させることによって）中和する。
【０１６３】
[0188]特定の実施形態では、試料を、自己抗体と生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）との予め形成された複合体を解離するのに十分な量の酸と接触させ、標識生物製剤結合部分（例えばＴＮＦα）、標識生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）、未標識生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）、及び生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）に対する自己抗体が平衡化して、それらの間で複合体を形成できるようにする。あるいくつかの実施形態では、試料を、高レベルの生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）の存在下で自己抗体の検出及び／又は測定を可能にするのに十分な量の酸と接触させることができる。
【０１６４】
[0189]いくつかの実施形態において、「高レベルの生物製剤」（例えば、高レベルの抗ＴＮＦα薬）というフレーズは、約１０〜約１００μｇ／ｍＬ、約２０〜約８０μｇ／ｍＬ、約３０〜約７０μｇ／ｍＬ又は約４０〜約８０μｇ／ｍＬの薬物レベルを含む。他の実施形態において、「高レベルの生物製剤」（例えば、高レベルの抗ＴＮＦα薬）というフレーズは、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００μｇ／ｍＬ以上の薬物レベルを含む。
【０１６５】
[0190]いくつかの実施形態において、酸は有機酸を含む。他の実施形態において、酸は無機酸を含む。さらなる実施形態において、酸は有機酸と無機酸との混合物を含む。有機酸の非限定的な例としては、クエン酸、イソクエン酸、グルタミン酸、酢酸、乳酸、ギ酸、シュウ酸、尿酸、トリフルオロ酢酸、ベンゼンスルホン酸、アミノメタンスルホン酸、カンファ−１０−スルホン酸、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、プロパン酸、ブタン酸、グリセリン酸、コハク酸、リンゴ酸、アスパラギン酸及びそれらの組み合わせが挙げられる。無機酸の非限定的な例としては、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、ホウ酸、フッ化水素酸、臭化水素酸及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１６６】
[0191]あるいくつかの実施形態において、酸の量は、約０．０１Ｍ〜約１０Ｍ、約０．１Ｍ〜約５Ｍ、約０．１Ｍ〜約２Ｍ、約０．２Ｍ〜約１Ｍ又は約０．２５Ｍ〜約０．７５Ｍの酸又は酸の混合物の濃度に相当する。他の実施形態において、酸の量は、約０．０１Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ、８Ｍ、９Ｍ又は１０Ｍ以上の酸又は酸の混合物の濃度に相当する。酸のｐＨは、例えば、約０．１、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０又は６．５であり得る。
【０１６７】
[0192]いくつかの実施形態では、試料を、自己抗体と生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）との予め形成された複合体を解離するのに十分な時間、酸と接触させる。あるいくつかの場合には、約０．１時間〜約２４時間、約０．２時間〜約１６時間、約０．５時間〜約１０時間、約０．５時間〜約５時間又は約０．５時間〜約２時間、試料を酸と接触させる（例えばインキュベートする）。他の場合には、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９又は１０時間以上の期間、試料を酸と接触させる（例えばインキュベートする）。試料は、酸と４℃、室温（ＲＴ）又は３７℃で接触させることができる。
【０１６８】
[0193]あるいくつかの実施形態において、酸を中和するサブステップは、試料のｐＨを上昇させて、本明細書に記載の第１及び／又は第２標識複合体の形成を可能にすることを含む。いくつかの実施形態では、１又は複数の中和剤（例えば、強塩基、弱塩基、緩衝剤溶液、及びそれらの組み合わせ）を加えることによって酸を中和する。当業者であれば、中和反応がｐＨ７をもたらすことを必ずしも意味しないことを理解するであろう。いくつかの場合において、酸の中和は塩基性の試料をもたらす。他の場合において、酸の中和は酸性（しかし、中和剤を加える前の試料のｐＨより高い）の試料をもたらす。特定の実施形態において、中和剤は緩衝剤（例えば、約７．３のｐＨのリン酸塩緩衝食塩水（例えば、１０×ＰＢＳ））を含む。
【０１６９】
[0194]いくつかの実施形態において、サブステップ（ｂ’）は、内部対照を、標識生物製剤（例えば抗ＴＮＦα薬）及び標識生物製剤結合部分（例えばＴＮＦα）と一緒に試料に接触させることをさらに含む（例えば予め形成された複合体の解離前、解離中又は解離後）。あるいくつかの場合において、内部対照は標識内部対照（例えばビオシチン−アレクサ４８８）を含む。あるいくつかの他の場合において、標識内部対照の量は、分析試料１００μＬ当たり約１ｎｇ〜約２５ｎｇ、約５ｎｇ〜約２５ｎｇ、約５ｎｇ〜約２０ｎｇ、約１ｎｇ〜約２０ｎｇ、約１ｎｇ〜約１０ｎｇ又は約１ｎｇ〜約５ｎｇの範囲である。さらなる場合において、標識内部対照の量は、分析試料１００μＬ当たり約１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ又は２５ｎｇ以上である。
【０１７０】
[0195]本発明の方法の非限定的な一例として、試料、例えば血清試料（例えば、抗ＴＮＦα薬（例えばレミケード（ＩＦＸ））による治療を受けている対象からの血清）を、０．５Ｍクエン酸、ｐＨ３．０と１時間、室温でインキュベートできる。（未標識）抗ＴＮＦα薬と抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体（例えば、抗ＩＦＸ抗体（ＡＴＩ）等の抗薬物抗体）との間の予め形成された複合体の解離後に、標識抗ＴＮＦα薬（例えばＩＦＸ−アレクサ４８８）、標識ＴＮＦα（例えばＴＮＦα−アレクサ５３２）、及び任意選択で内部対照を加え、反応混合物を、中和剤（例えば、１０×ＰＢＳ，ｐＨ７．３）を用いて（例えば直ちに）中和できる。中和後に、反応混合物を室温で（例えばプレート振とう器上で）さらに１時間インキュベートして平衡化を可能にし、標識ＴＮＦα、標識抗ＴＮＦα薬、未標識抗ＴＮＦα薬、及び／又は抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の間の免疫複合体の再形成を完了できる。次いで、試料をろ過し、本明細書に記載のようにしてＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析できる。
【０１７１】
[0196]特定の実施形態において、（例えば、酸解離とその後の均質溶液相結合動態とを含む）本発明の方法は、ＮＡｂ及び／又は非ＮＡｂ  ＡＴＩを約６０μｇ／ｍＬまでのＩＦＸの存在下で測定できるほどＩＦＸ薬物耐容性を著しく増加する。言い換えると、本発明の方法は、抗ＴＮＦα薬に対するＮＡｂ及び／又は非ＮＡｂ（例えばＡＴＩ）並びに他の抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の存在又はレベルを、高レベルの抗ＴＮＦα薬（例えばＩＦＸ）の存在下であっても高レベルの該薬物から実質的に妨害されることなく検出できる。
【０１７２】
[0197]酸解離を用いて抗薬物抗体を検出するための方法は、２０１２年２月１６日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２５４３７（その開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。）にさらに記載されている。
【０１７３】
Ｖ．生物学的治療
[0198]本発明のアッセイは、対象（例えば、生物学的治療を受けている対象）からの試料中の任意の生物製剤に対する中和及び／又は非中和自己抗体の存在若しくは非存在（例えば、陽性であるか陰性であるか）、レベル又はパーセントを検出及び／又は測定するために適切である。生物製剤の非限定的な例としては、抗体、抗体断片、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質（例えばＩｇ融合タンパク質又はＦｃ融合タンパク質）、多価結合タンパク質（例えばＤＶＤ  Ｉｇ）、抗体−薬物コンジュゲート、ワクチン、核酸、糖、それらの組換え形、それらの工学改変形及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１７４】
[0199]抗体ベースの生物製剤の例としては、それらに限定されないが、治療用モノクローナル抗体及びその抗原結合断片が挙げられる。特定の実施形態において、抗体は、抗ＴＮＦα薬、例えば、レミケード（商標）（インフリキシマブ）、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）、シムジア（登録商標）（セルトリズマブペゴール）、シンポニー（登録商標）（ゴリムマブ、ＣＮＴＯ１４８）又はそれらの組み合わせを含む。抗体ベースの生物製剤のさらなる例としては、アドセトリス（Ａｄｃｅｔｒｉｓ）（商標）（ブレンツキシマブベドチン）等の抗体−薬物コンジュゲートが挙げられる。表１は、承認されているか又は現在開発中のいずれかである治療用モノクローナル抗体の例示的なリストを示す。臨床開発中及び承認された製品中のモノクローナル抗体治療薬の網羅的なリストは、「４１８  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｐｒｏｍｉｓｅ  ｔｏ  Ｂｏｌｓｔｅｒ  ｔｈｅ  Ａｒｓｅｎａｌ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ」との表題の２００６  ＰｈＲＭＡレポート（その開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。）に示されている。
【０１７５】
【表１−１】
2014525036.tif 000003
【表１−２】
2014525036.tif 000004
【表１−３】
2014525036.tif 000005
【表１−４】
2014525036.tif 000006
【表１−５】
2014525036.tif 000007
【０１７６】
[0200]タンパク質ベース又はポリペプチドベースの生物製剤の非限定的な例としては、サイトカイン（例えばインターロイキン）、ケモカイン、増殖因子、血液生成刺激タンパク質（例えばエリスロポエチン）、ホルモン（例えばエロンヴァ（Ｅｌｏｎｖａ）（登録商標）（卵胞刺激ホルモン）、成長ホルモン）、酵素（例えばプルモザイム（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）（登録商標）（ドルナーゼアルファ））、凝固因子、インスリン、アルブミン、それらの断片、それらの保存的改変バリアント、それらの類似体及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１７７】
[0201]サイトカインの例としては、それらに限定されないが、ＴＮＦα、ＴＮＦ関連アポトーシス弱誘導因子（ＴＷＥＡＫ）、オステオプロテジェリン（ＯＰＧ）、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン（例えばＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３及びＩＬ−２７）、アディポサイトカイン（例えば、レプチン、アディポネクチン、レジスチン、活性又はトータルプラスミノゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）、ビスファチン及びレチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４））及びそれらの組み合わせが挙げられる。特定の実施形態において、インターロイキンはＩＬ−２（例えば、プロリューキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）（登録商標）（アルデスロイキン；組換えＩＬ−２））を含む。
【０１７８】
[0202]ケモカインの例としては、それらに限定されないが、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯ１／ＧＲＯα、ＣＸＣＬ２／ＧＲＯ２、ＣＸＣＬ３／ＧＲＯ３、ＣＸＣＬ４／ＰＦ−４、ＣＸＣＬ５／ＥＮＡ−７８、ＣＸＣＬ６／ＧＣＰ−２、ＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０、ＣＸＣＬ１１／Ｉ−ＴＡＣ、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１、ＣＸＣＬ１３／ＢＣＡ−１、ＣＸＣＬ１４／ＢＲＡＫ、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７／ＤＭＣ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ６／Ｃ１０、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３、ＣＣＬ８／ＭＣＰ−２、ＣＣＬ９／ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１／エオタキシン、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ−５、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ−４、ＣＣＬ１４／ＨＣＣ−１、ＣＣＬ１５／ＭＩＰ−５、ＣＣＬ１６／ＬＥＣ、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＣＣＬ１８／ＭＩＰ−４、ＣＣＬ１９／ＭＩＰ−３β、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ−３α、ＣＣＬ２１／ＳＬＣ、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ１、ＣＣＬ２４／エオタキシン−２、ＣＣＬ２５／ＴＥＣＫ、ＣＣＬ２６／エオタキシン−３、ＣＣＬ２７／ＣＴＡＣＫ、ＣＣＬ２８／ＭＥＣ、ＣＬ１、ＣＬ２、ＣＸ３ＣＬ１及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１７９】
[0203]増殖因子の非限定的な例としては、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヘパリン結合上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ；ＳＥＲＰＩＮＦ１としても知られる）、アンフィレギュリン（ＡＲＥＧ；シュワン細胞腫由来増殖因子（ＳＤＧＦ）としても知られる）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子−β（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、エンドセリン−１（ＥＴ−１）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ；ＦＧＦ７としても知られる）、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ１〜ＢＭＰ１５）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、β−神経増殖因子（β−ＮＧＦ）、神経栄養因子（例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ３）、ニューロトロフィン４（ＮＴ４））、増殖分化因子−９（ＧＤＦ−９）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１８０】
[0204]受容体構築物ベース又は融合タンパク質ベースの生物製剤の例としては、それらに限定されないが、免疫グロブリンフレームと連結された自然に存在する受容体（例えば、オレンシア（Ｏｒｅｎｃｉａ）（登録商標）（アバタセプト；免疫グロブリンＣＴＬＡ−４融合タンパク質）、アメビブ（Ａｍｅｖｉｖｅ）（登録商標）（アレファセプト；ＩｇＧ１融合タンパク質）、エンブレル（商標）（エタネルセプト；組換えヒトＴＮＦ受容体融合タンパク質））、２つの異なるポリペプチド種を組み合わせる工学改変タンパク質（例えば、オンタック（Ｏｎｔａｋ）（登録商標）（デニロイキンジフチトクス；インターロイキン−２とジフテリア毒素とを含む工学改変タンパク質））、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１８１】
[0205]本発明は、本明細書及び表１に記載の疾患又は障害の１又は複数（例えば、下記疾患又は障害の１又は複数）についての生物学的治療を受けている対象からの試料中の抗ＴＮＦα薬等の生物製剤に対する中和及び非中和自己抗体の存在又はレベルを検出及び測定するための方法において使用できる。
【０１８２】
炎症性疾患、例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ））、ぶどう膜炎、サルコイドーシス、ウェゲナー肉芽腫症、及び炎症が中心的特徴である他の疾患；
自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強直性脊椎炎（ベヒテレフ病）、ループス、乾癬性関節炎、若年性特発性関節炎、乾癬、及びエリテマトーデス；
癌、例えば、消化器及び胃腸の癌（例えば、大腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、小腸（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ（ｓｍａｌｌ  ｂｏｗｅｌ））癌、消化管間質腫瘍、消化管カルチノイド腫瘍、結腸癌（ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ）、直腸癌（ｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肛門癌、胆管癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ（ｓｔｏｍａｃｈ））癌、食道癌、虫垂癌）、胆のう癌、肝癌、膵癌、乳癌、肺癌（例えば非小細胞肺癌）、前立腺癌、卵巣癌、腎癌（例えば腎細胞癌）、中枢神経系の癌、皮膚癌、絨毛癌、頭頚部癌、血液悪性腫瘍（例えば、白血病、リンパ腫（例えばＢ細胞性非ホジキンリンパ腫））、骨肉腫（例えばユーイング肉腫）、軟部組織肉腫（例えば隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）、横紋筋肉腫）、その他の軟部組織悪性腫瘍、及び甲状腺乳頭癌；
感染性疾患、例えば、クロストリジウム・ディフィシル病、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、ＨＩＶ、炭疽、カンジダ症、ブドウ球菌感染症、及びＣ型肝炎；
血液障害、例えば、敗血症、敗血症性ショック、発作性夜間ヘモグロビン尿症、及び溶血性尿毒症症候群；
循環器疾患、例えば、アテローム動脈硬化症、急性心筋梗塞、心肺バイパス術、及びアンギナ；
代謝疾患、例えば糖尿病（例えばＩ型糖尿病）；
遺伝性疾患、例えば発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）；
神経障害、例えば、変形性関節症痛及びアルツハイマー病；
呼吸器疾患、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、鼻ポリポーシス、及び小児喘息；
皮膚疾患、例えば、慢性で中等度から重度の尋常性乾癬を含む乾癬；
移植片拒絶、例えば、急性腎移植片拒絶、心肝移植片拒絶の反転、腎移植片拒絶の防止、急性腎移植片拒絶の予防、及び腎移植片拒絶；及び／又は
他の障害、例えば、腎臓炎症、閉経後骨粗鬆症（骨障害）、好酸球増加症候群、好酸球性食道炎、及びピーナッツアレルギー。
【０１８３】
[0219]特定の実施形態において、対象は、ＴＮＦα媒介疾患又は障害、例えば、自己免疫疾患（例えば関節リウマチ）又は炎症性疾患（例えば、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）等の炎症性腸疾患（ＩＢＤ））を有する。
【０１８４】
ＶＩ．実施例
[0220]本発明を具体的な実施例によりさらに詳細に説明する。以下の実施例は説明のために提供されるものであり、本発明を限定することを意図したものではない。当業者であれば、変更又は改変しても本質的に同じ結果が得られる種々の重要でないパラメータを容易に理解するであろう。
【０１８５】
[0221]国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２５４３７（出願日：２０１２年２月１６日）の実施例は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。
【０１８６】
実施例１（ＩＢＤ患者における中和抗薬物抗体の形成をモニタリングするための新規アッセイの開発）：
[0222]本実施例は、標識（例えば蛍光標識）抗ＴＮＦα薬及び標識ＴＮＦαの存在下でサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、患者試料（例えば血清）中の中和及び／又は非中和抗薬物自己抗体（ＡＤＡ）の存在又はレベルを検出又は測定するための新規な均質アッセイを説明する。特定の実施形態において、本アッセイは次の理由により有利である。低親和性ＡＤＡを除去する洗浄ステップの必要性を除去する；バックグラウンド及び血清干渉の問題を減少させる可視及び／又はＩＲスペクトルでの検出を可能にする特異的な標識（例えば蛍光体）を使用する；蛍光標識検出の感度が高く、患者での低力価の中和及び／又は非中和ＡＤＡを検出する能力を増加させる；液相反応として生じ、そのため、固体表面（例えばＥＬＩＳＡプレート）への結合によるエピトープのどのような変化の可能性も低減する。
【０１８７】
[0223]インフリキシマブ（ＩＦＸ）及びアダリムマブ（ＡＤＬ）は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の治療のために処方される抗ＴＮＦモノクローナル抗体である。治療コース中にしばしば抗薬物抗体（ＡＤＡ）が発生する。これらのＡＤＡの一部は中和抗体（ＮＡｂ）である。ＡＤＡは薬物動態に負の影響を及ぼすが、ＮＡｂの存在は、薬物の結合部位を遮断することによって薬物の効力の喪失をさらに引き起こす。本実施例は、ＩＦＸ治療を受けているＩＢＤ患者におけるＮＡｂの発生を、均質移動度シフトアッセイ（ＨＭＳＡ）プラットフォームに基づいてモニタリングするためのアッセイについて記載し、インフリキシマブに対する抗体（ＡＴＩ）成熟とＮＡｂ形成との間の相関を示す。
【０１８８】
[0224]方法：
ＩＦＸ及びＡＴＩの血清濃度は、例えば国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２５４３７（出願日：２０１２年２月１６日）及び国際公開第２０１１／０５６５９０号パンフレット（それらの開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。）に記載されるＨＭＳＡにより測定した。ＮＡｂアッセイのために、ＡＴＩを含有する患者血清をまず酸解離し、次いで、２つの標識タンパク質（例えばＩＦＸ−アレクサ４８８及びＴＮＦアルファ−アレクサ５３２）を加えた後に中和した。溶液を２％血清まで希釈し、ＨＰＬＣによりサイズ排除カラムに注入し、複合体を蛍光によりモニタリングした。各スペクトル（例えばプロット又はクロマトグラム）における遊離ＴＮＦ−アレクサ５３２ピークの曲線下面積（ＡＵＣ）を対照及び患者試料について算出し、次いで、パーセントＮＡｂを算出した。抗原結合を完全に遮断したＡＴＩは１００％ＮＡｂとされ、５０％は、試料中の等しい割合のＡＴＩが非ＮＡｂであることを意味し、０％は、すべてのＡＴＩが非ＮＡｂであることを意味する。基準範囲は、７５名の健常ボランティアからの血清を用いて確立した。ＩＦＸ及びＡＴＩレベルについてスクリーニングした１３２名の残りのＩＢＤ患者血清からのＡＴＩ陽性血清試料（＞３．１３Ｕ／ｍＬ）をＮＡｂについて分析した。陽性対照は、プールしたＡＴＩ陽性患者血清を用いて創出した。
【０１８９】
[0225]データ分析に関しては、ピーク検出アルゴリズムを用いて、実験ごとの各スペクトルにおけるすべてのピーク及び谷を見出す。３次平滑化スプラインを各スペクトルに当てはめ、ピーク及び谷をシグナルの１次導関数の変化と定義する。ピークは、スペクトルの傾きの正から負への符号の変化である。逆に、谷は負から正への符号の変化として定義する。遊離ＴＮＦ−アレクサ５３２ピークの予測される位置（例えば１１．５〜１３分）でのウィンドウ内の最高のピークを遊離ピーク自体とする。検出された遊離ピークのすぐ上及び下の谷はピーク自体の上限及び下限を規定する。結合ピーク、遊離（ＴＮＦ及びＩＦＸ）ピーク及び陰性対照ピークの下の面積は、台形公式を用いる上記限界内のピーク面積を積分することによって求められる。次いで、ＴＮＦ−アレクサ５３２ピーク面積の％を、式：
％＝［（ａ−ｂ）／ｃ］×１００
［式中、ａ＝未知試料中のＴＮＦ−アレクサ５３２ピークのＡＵＣ、ｂ＝ＮＡｂ陰性対照（例えば、正常ヒト血清中のＩＦＸ−アレクサ４８８＋ＴＮＦ−アレクサ５３２）からのＴＮＦ−アレクサ５３２ピークのＡＵＣ、及びｃ＝正常ヒト血清中の遊離ＴＮＦ−アレクサ５３２のＡＵＣ］
を用いて各試料について算出する。算出のために、「ｃ」は１００％に設定し、「ｂ」は可能な限り０％に近い（ただし、反応条件により変動し得る）。「ｂ」及び「ｃ」の間の範囲が感度の最大ウィンドウを規定する。
【０１９０】
[0226]結果：
本発明のＮＡｂアッセイは高い再現性、正確度及び精度を示す。アッセイ内及びアッセイ間精度はＣＶの２０％未満であり、アッセイの正確度は２５％以内である。本発明のＮＡｂアッセイを用いて得られる精度及び正確度は細胞ベースのアッセイ又はＥＬＩＳＡよりも実質的に優れている。ＩＦＸ薬物耐容性は約６μｇ／ｍＬであるが、ＴＮＦαは１．０ｎｇ／ｍＬを超えると障害となる。プールしたＡＴＩ陽性患者血清からの陽性対照は、４０〜５％のＮＡｂから直線的に希釈する。健常対照の分析は、≧３％（例えば３．０６％）の値を戻す試料がＮＡｂ陽性とみなされることを示す。３０を超えるＡＴＩ陽性患者血清試料（３．１２〜１９９．４３Ｕ／ｍＬ）をＮＡｂについてスクリーニングし、１３２のＡＴＩ陽性患者血清試料のうち２６（１９．７％）がＮＡｂ陽性であった（平均２２．４７％、範囲３．２９〜５１．６３％）。６０Ｕ／ｍＬを超えるＡＴＩレベルは高度に中和性のＡｂに相当した。ＮＡｂ陽性試料のさらなる分析は、ＡＴＩ力価とＮＡｂ陽性との間の直線的な相関を明らかにする。特に、図１は、ＮＡｂパーセント（ｙ軸）とＡＴＩレベルとの間に明らかな関係があったことを説明する（スピアマン順位相関係数、ロー＝０．５６４、ｐ＜＜０．０００１）。図２は、≧６０Ｕ／ｍｌのＡＴＩ濃度がＮＡｂ陽性（ＮＡｂ＋）を予測できることを説明する。感度＝７７．８％；特異度＝９８．１％；オッズ比＝６３．６、ｐ＜＜０．０００１、フィッシャーの正確確率検定。図３は、ＡＴＩカットオフ分析を説明し、０．９３１のＲＯＣ  ＡＵＣでＡＴＩがＮＡｂを予測することを示す。真陽性率（ＴＰＲ）＝感度；偽陽性率（ＦＰＲ）＝１−特異度。
【０１９１】
[0227]結論：
薬物及びＡＤＡレベルに加えてＮＡｂをモニタリングすることは、ＡＤＡ応答についての必要な情報を提供し、早期の治療的介入の指針を得る助けとなる。本方法は、任意の生物学的治療に対するＡＤＡの特徴決定のために用いることができる。
【０１９２】
実施例２（経時的な中和抗薬物抗体形成をモニタリングするための患者症例研究）：
[0228]本実施例は、標識（例えば蛍光標識）抗ＴＮＦα薬及び標識ＴＮＦαの存在下でサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、患者試料（例えば血清）中の中和及び／又は非中和抗薬物自己抗体（ＡＤＡ）の存在又はレベルを検出又は測定するための新規な均質アッセイのさらなる実施形態を説明する。さらに、本実施例は、中和及び／又は非中和抗薬物抗体の形成、及び／又は患者が治療を受けている間の非中和抗薬物抗体から中和抗薬物抗体へのシフトをモニタリングするための、抗ＴＮＦα薬治療を受けているＩＢＤ患者の経時的症例研究を示す。
【０１９３】
１．薬物及び抗薬物抗体アッセイ
[0229]図４は、本明細書に記載の流体相移動度シフトアッセイによるＡＴＩ（すなわちＩＦＸに対する抗体；「ＨＡＣＡ」）の検出を説明する。例えば、４４４ｎｇのアレクサ４８８標識ＩＦＸ（１００％血清中に１８．８μｇ／ｍｌ）を試料に添加して、遊離ＩＦＸと競合させる。特定の実施形態では、ＩＦＸとＡＴＩとの複合体を含有する患者血清試料を酸解離に供することができ、ここでは、酸解離を用いる平衡化と標識添加及びそれに続く中和とを行う。
【０１９４】
[0230]図５は、本発明の例示的なＡＴＩ／ＩＦＸ流体相移動度シフトアッセイを説明する。例えば、蛍光標識インフリキシマブ（ＩＦＸ−４８８）と平衡化した種々の濃度のＡＴＩ（標準又は未知）を含有する試料を２％血清の状態でサイズ排除カラムに注入した。図５は、大きいＩＦＸ−４８８／ＡＴＩ複合体がまず溶出し、その後、より小さい複合体、次いで未結合ＩＦＸ−４８８及びアレクサ４８８装填対照が溶出したことを示す。未知濃度は標準曲線からの補間により決定した。ＩＦＸの検出は同様の方法に従った。
【０１９５】
２．中和及び非中和抗薬物抗体アッセイ
[0231]図６及び７は、ＡＴＩ等の抗薬物抗体が中和又は非中和自己抗体のいずれであるかを、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて決定して、蛍光標識ＴＮＦαの存在下で蛍光標識抗ＴＮＦα薬とこれらの自己抗体との結合を検出するための本発明のアッセイを説明する。例示的な一実施形態では、ＩＦＸ等の抗ＴＮＦα薬を蛍光体「Ｆ１」で標識し、該蛍光体は可視及びＩＲスペクトルのいずれか又は両方で検出できる。同様に、ＴＮＦαを蛍光体「Ｆ２」で標識し、該蛍光体も可視及びＩＲスペクトルのいずれか又は両方で検出でき、「Ｆ１」及び「Ｆ２」は異なる蛍光体である。標識抗ＴＮＦα薬及び標識ＴＮＦαを液相反応においてヒト血清とインキュベートして、標識抗ＴＮＦα薬（例えばＩＦＸ）、標識ＴＮＦα及び／又は血清中に存在する抗薬物抗体（例えばＡＴＩ）の間の複合体（すなわち免疫複合体）の形成を可能にする。
【０１９６】
[0232]インキュベーション後に、試料をサイズ排除カラムに直接装填し、ＨＰＬＣ移動度シフトアッセイに供する。図６は、本発明の非中和抗薬物抗体（ＡＤＡ）アッセイを説明し、該アッセイでは、抗薬物抗体（例えばＡＴＩ）及び標識ＴＮＦα（例えば、アレクサ５３２標識ＴＮＦα；「ＴＮＦ−５３２」）の両方と標識抗ＴＮＦα薬（例えば、アレクサ４８８標識ＩＦＸ；「ＩＦＸ−４８８」）との結合が、遊離ＴＮＦ−５３２レベルの減少をもたらす。図７は、本発明の中和ＡＤＡアッセイを説明し、該アッセイでは、抗薬物抗体（例えばＡＴＩ）と標識抗ＴＮＦα薬（例えばＩＦＸ−４８８）との結合（標識ＴＮＦα（例えばＴＮＦ−５３２）と結合せずに）が、ＴＮＦ−５３２対照と実質的に同じ量の遊離ＴＮＦ−５３２レベルをもたらす。
【０１９７】
３．中和及び非中和抗薬物抗体をモニタリングするための経時的研究
[0233]図８〜１１は、本発明の移動度シフトアッセイを用いてＡＴＩ等の抗薬物抗体が中和又は非中和自己抗体であるかを決定するためのＵＣ患者症例研究からのデータを説明する。例えば、図８は、１、２又は３ヶ月の期間を置いて採取した５つの試料の経時的なＩＦＸ及びＡＴＩのレベルを説明する。図９は、遊離ＴＮＦαの経時的なパーセンテージを決定するためのピーク分析を示す。特に、ＴＮＦ−５３２／ＩＦＸ−４８８複合体のピーク面積をすべての試料の遊離標識ＴＮＦα面積から差し引き、その後、遊離ＴＮＦαの％を算出した。顕著なことに、図９は、１、２又は３ヶ月の期間を置いて採取した５つの試料の経時的な遊離ＴＮＦαのレベルの増加を示し、該増加は中和自己抗体レベルの増加を示す。図１０は、２又は３ヶ月の期間を置いて採取し、ＩＦＸを添加した３つの試料中で例示される、非中和自己抗体の存在から中和自己抗体の存在への経時的なシフトを説明する。「１年目１１月」試料について、非中和抗体は添加されたＩＦＸと結合し、ＴＮＦ−５３２ピークの減少を示す。「２年目１月」試料について、中和抗体（ＮＡｂ）／非中和抗体（Ａｂ）混合物は、初期複合体のレベルと比べてＴＮＦ−５３２ピークのわずかな減少を示す。ＡＴＩはほぼ完全に中和性になる（「２年目４月」試料）ので、高いＩＦＸレベルはＩＦＸと結合するＡＴＩに打ち勝てず、いずれのＴＮＦα結合も妨げられる。すなわち、図１０は、ＡＴＩプロファイルが非中和ＡＴＩプロファイルから中和ＡＴＩ及び非中和ＡＴＩの混合物を含有するプロファイル、さらに中和ＡＴＩプロファイルへとＩＦＸ治療コースにわたってシフトするＵＣ患者ＡＴＩプロファイルを示す。図１１は、ＩＦＸを添加した試料中の遊離ＴＮＦαの経時的なパーセンテージを決定するためのピーク分析を示す。特に、ＴＮＦ−５３２／ＩＦＸ−４８８複合体のピーク面積をすべての試料の遊離ＴＮＦα面積から差し引き、その後、遊離ＴＮＦαのパーセント（％）を算出した。顕著なことに、図１１は、ＵＣ患者から採取した試料の経時的な遊離ＴＮＦαのレベルの増加を示し、該増加は、患者がＩＦＸ治療を受けている間の中和自己抗体レベルの増加及び非中和ＡＴＩから中和ＡＴＩへのシフトを示す。
【０１９８】
[0234]図１２〜１４は、本発明の移動度シフトアッセイを用いて行った種々の対照を説明する。特に、図１２は、非中和抗体（Ａｂ）対照としてのウサギ抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃの使用を示す。図１３は、中和抗体（ＮＡｂ）／非中和抗体（Ａｂ）混合対照としてのＡＴＩ陽性血清の使用を示す。図１４は、ＡＴＩ陽性血清からのＡＴＩの精製が弱親和性ＮＡｂの喪失をもたらすことを示す。図１５は、種々の対照中の遊離ＴＮＦαのパーセンテージを決定するための、ＵＣ患者症例研究からのピーク分析を説明する。特に、ＴＮＦ−５３２／ＩＦＸ−４８８複合体のピーク面積をすべての試料の遊離ＴＮＦα面積から差し引き、その後、遊離ＴＮＦαのパーセント（％）を算出した。
【０１９９】
[0235]図１６〜１８は、本発明の移動度シフトアッセイを用いてＡＴＩ等の抗薬物抗体が中和又は非中和自己抗体であるかを決定するための、ＣＤ患者症例研究からのデータを説明する。例えば、図１６は、３０週間の期間中に７又は８週間の期間を置いて採取した４つの試料の経時的な遊離ＴＮＦαのパーセンテージを決定するための、ＣＤ患者症例研究からのピーク分析を示す。さらに、図１７は、５０週間の期間中に採取した３つの試料の経時的な遊離ＴＮＦαのパーセンテージを決定するための、別のＣＤ患者症例研究からのピーク分析を示す。さらに、図１８は、治療の導入若しくは維持中又は導入若しくは維持後の特定の週の試料中の遊離ＴＮＦαのパーセンテージを決定するための、４つのさらなるＣＤ患者症例研究からのピーク分析を示す。
【０２００】
実施例３（ＨＰＬＣ移動度シフト競合リガンド結合アッセイによる中和抗体（ＮＡｂ）活性の検出）：
[0236]本実施例は、ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーアッセイを用いて、患者試料（例えば血清）中の中和及び／又は非中和抗薬物自己抗体（ＡＤＡ）の存在又はレベルを検出又は測定するための新規な均質アッセイのなおさらなる実施形態を説明する。さらに、本実施例は、代替生物学的製剤（例えば、他の抗ＴＮＦ薬）とのＮＡｂの交差反応性を予測及び／又は決定するための方法を実証する。
【０２０１】
[0237]いくつかの実施形態において、免疫原性試験のための多段アプローチは、迅速で高感度なスクリーニングアッセイによる薬物及び抗薬物抗体の両方の第１スクリーニングを含む。本アプローチは、ＦＤＡ及びＥＭＥＡの両方により推奨されており、大規模臨床試験及び患者当たり複数の時点のための有用な管理ツールである。ＡＴＩ等のＡＤＡの存在を確認した後に、患者試料を、著しい負の臨床結果をもたらすことがある中和抗体の存在についてさらに調べる。中和抗体は、活性部位と若しくは活性部位付近に結合することによって、又は効力の喪失を導く高次構造変化を導入することによって生物活性に干渉する。ＡＴＩを含有する試料は、アイソタイプ及びエピトープ特異性についてもスクリーニングしてもよい。ＡＤＡ発生前後の生成物に対する患者の臨床応答の比較により、ＡＤＡ発生（及び抗体の特徴）と臨床応答との間の相関についての情報を得ることができる。
【０２０２】
[0238]ＨＰＬＣ移動度シフトアッセイを利用するＮＡｂアッセイは本明細書に記載のようにして開発された。あるいくつかの実施形態において、多段アプローチ又は試験は、次の段階のいずれか１、２又は３つすべてを含むか又はそれからなる。（１）スクリーニングを行って、試料がＮＡｂ陽性であるかを定性的に決定する（正常ヒト血清の分析から確立されたカットポイントに基づく肯定／否定）；（２）例えば免疫競合及び／又は免疫枯渇を用いて試料がＮＡｂ陽性であることを確認する；及び／又は（３）代替生物学的製剤とのＮＡｂの交差反応性を予測及び／又は決定する。
【０２０３】
Ｉ．スクリーニング段階
[0239]患者試料がＡＤＡについて陽性であると確認した後に該試料をＮＡｂについてスクリーニングできる。あるいくつかの態様において、ＡＤＡの部分集団はＮＡｂである。あるいくつかの実施形態では、ＡＤＡ（例えば、ＩＦＸに対する抗体（「ＡＴＩ」又は「ＨＡＣＡ」としても知られる。））を含有する患者血清を、まず、ＨＰＬＣ水中の０．５Ｍクエン酸を用いて１時間、室温（ＲＴ）で酸解離する。試料を９６ウェルプレート中に調製し、暗所中、プレート振とう器上でインキュベーションを行う。次いで、２つの標識タンパク質（例えば、０．１％ＢＳＡを含有するＨＰＬＣ水中の薬物−アレクサ４８８（例えばＩＦＸ−アレクサ４８８）及びＴＮＦα−アレクサ５３２）を加える。１０×ＰＢＳ、ｐＨ７．３を加え、暗所中、プレート振とう器上で１時間、ＲＴでインキュベートすることによって試料を中和する。さらなる１０×緩衝剤及びＨＰＬＣ水を用いて試料を２％血清まで希釈する。次いで、試料をＨＰＬＣによりサイズ排除カラムに注入する。異なるサイズの複合体又は種は、蛍光、例えば、遊離ＴＮＦα−アレクサ５３２（「ＴＮＦ５３２」）、遊離ＩＦＸ−アレクサ４８８（「ＩＦＸ４８８」）、ＴＮＦ５３２／ＩＦＸ４８８複合体、ＴＮＦ５３２／ＩＦＸ４８８／ＡＴＩ複合体（非中和Ａｂ）及びＡＴＩ／ＩＦＸ４８８複合体（ＮＡｂ）により分離及びモニタリングされる。結果を陰性（例えば図１２、１９を参照されたい）及び陽性（例えば図１３を参照されたい）対照並びに正常ヒト血清から確立したカットオフ（例えば、３．０６％ＮＡｂの基準範囲）と比較した後に、試料をＮＡｂについて陽性又は陰性に割り当て、力価を決定できる。
【０２０４】
[0240]図１９は、移動度シフトアッセイによる非中和抗体活性の検出を示す。ＴＮＦ５３２とＩＦＸ４８８との組み合わせにより、約８分の保持時間へのシフトがあり、該シフトは、より高い分子量の複合体の形成を示す。遊離ＩＦＸ−４８８ピーク（１０．５分付近）は完全に消滅し、遊離ＴＮＦ−５３２ピーク（１２分付近）もほぼ完全に消滅する（ＡＴＩ／ＩＦＸ／ＴＮＦ３元複合体の形成を示す）。ＩＦＸの活性部位から離れて結合する非中和Ａｂは、同様のパターンをたどる。マウスモノクローナル抗体（例えば７分付近）は所望の通りに挙動する。
【０２０５】
[0241]図１３は、移動度シフトアッセイによる中和抗体活性の検出を示す。完全に中和するＡｂは、ＴＮＦと結合するＩＦＸの能力を（例えば、活性部位の遮断により）妨げる。このことは、クロマトグラムにおいて、ＩＦＸ−４８８ピークの消滅及びより高い分子量種の形成として観察される。ＴＮＦ−５３２ピークは変化しない。実際には、ほとんどの患者は、図１３中のプールした患者血清（ＡＴＩ陽性血清、黒の実線）において観察されるように非中和／中和Ａｂの組み合わせを経験する。改良ＮＡｂ陽性対照としてのＩＦＸ／ヒュミラのＦ（ａｂ’）２断片に対するウサギポリクローナル抗体も有用である。
【０２０６】
[0242]図８は、ＩＦＸ治療の過程中の患者における経時的なＮＡｂ応答の発生を説明する。患者はすべての時点でＡＴＩについて陽性であるが、２年目の１月（淡い灰色の矢印、約１２分の上から３つ目）の時点までＮＡｂは発生しない。ＡＴＩ／ＩＦＸ−４８８複合体は、わずかに異なる保持時間（約７．８分）までシフトし、該シフトは、ＴＮＦ５３２／ＩＦＸ４８８／ＡＴＩの複合体（約８．２及び８．８分）と比較して異なるサイズの複合体を示す。無関係のタンパク質に対するさらなるＩＦＸの存在における中和活性の確認（免疫競合）も行うことができる。そのような患者は治療法の調整の理想的な候補である。
【０２０７】
[0243]図９は、残存している％遊離ＴＮＦピークのＡＵＣの棒グラフとしてデータをプロットし、患者がＮＡｂを経時的に発生していることを明らかに実証する。早期の時点で観察される低レベルのＮＡｂの発生も疾患の再発を予測できる。この活性を示す患者に関しては治療法の調整が推奨される。例えば、患者は、現行の抗ＴＮＦ薬を服用しつつ１又は複数の免疫抑制剤（例えば、メトトレキセート（ＭＴＸ）、アザチオプリン（ＡＺＡ））を使用し、及び／又は異なる抗ＴＮＦ薬に切り替えるべきである。
【０２０８】
ＩＩ．確認段階
[0244]確認段階では、薬物（例えば抗ＴＮＦα抗体）を試料に種々の濃度（例えば、１〜５０μｇ／ｍＬ）で添加して、試料の中和能力を決定する。並行して、非特異的ＩｇＧを同様のレベルで添加する。薬物を添加した試料は薬物に対する用量応答を示すはずであり、ＮＡｂのＥＣ５０を算出できる。非特異的ＩｇＧは何の影響も有しないはずである。必要であれば、免疫枯渇を行って母体の影響を除外することもできる。
【０２０９】
[0245]図１０は、２又は３ヶ月の期間を置いて採取し、ＩＦＸを添加した３つの試料中で例示される、非中和自己抗体の存在から中和自己抗体の存在への経時的なシフトを説明する。各時点での患者血清は添加されたＩＦＸに対して応答し、応答の特異性を示す。経時的にＮＡｂはより中和性になり、最終的に、＞２０μｇ／ｍＬのＩＦＸを中和できる（２年目４月試料はＩＦＸを添加しても減少しない）。完全な力価決定を行って、各時点でのＮＡｂのＥＣ５０を決定できる。
【０２１０】
ＩＩＩ．交差反応性段階
[0246]交差反応性段階は、患者が薬物又は治療（例えば、抗ＴＮＦα薬又は治療）に応答するかを予測するのに特に有用である。
【０２１１】
[0247]いくつかの実施形態において、本発明は、一連の異なる抗ＴＮＦ治療薬と交差反応する抗薬物抗体（ＡＤＡ）の能力に基づいて、どの治療薬が患者（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎又は関節リウマチ患者）において働くか否かを迅速に決定する方法を提供する。非限定的な例として、レミケード（インフリキシマブ）に対するＮＡｂを有する患者（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎及び／又は関節リウマチ患者）において、次の薬物の１又は複数を試験できる。エンブレル（エタネルセプト）；ヒュミラ（アダリムマブ）；シムジア（セルトリズマブペゴール）；及びシンポニー（ゴリムマブ）。具体的な薬物（例えばＩＦＸ）を用いてＮＡｂについての陽性を試験した後に、ＮＡｂアッセイを、一連の他の薬物（例えば蛍光標識薬物）を用いて上記初期ＮＡｂ試験法により行うことができる。
【０２１２】
[0248]本発明の予測試験は、患者の抗体により中和される薬物（例えば抗ＴＮＦα薬）の使用を防止することによって患者の治療の管理に有用である。いずれの特定の理論にも束縛されるものではないが、中和ＡＤＡの結合部位の配列は、ＴＮＦαのそれに類似するように発生した可能性がある（図２０を参照されたい）。ＮＡｂが他のいずれかの抗ＴＮＦ薬を中和するならば、これらの他の抗ＴＮＦ薬は、既に投与されている薬物の代替としては乏しい可能性がある。なぜなら、患者は免疫応答を有する可能性があるからである。いくつかの実施形態では、正常ヒト血清から確立されたカットオフを用いて、患者からの試験試料が陽性であるか陰性であるかを決定できる。試験は、迅速で費用対効果の高い様式でｉｎ  ｖｉｔｒｏの設定で行うことができる。
【０２１３】
[0249]以下の非限定的な症例研究は、レミケード（インフリキシマブ）で治療されたが、レミケードに対する応答をその後喪失した患者１及び２を含んだ。患者１はＵＣを有し、患者２はＣＤを有した。本明細書に記載の移動度シフトアッセイは、患者１及び２が抗レミケード抗体（例えばＡＴＩ）を発生するにつれてレミケードに対する応答を喪失することを明らかに実証した。次いで、これらの抗レミケード抗体は中和抗体（例えばＮＡｂ）であることが示された。
【０２１４】
[0250]図２１は、患者１及び２が中和抗体（ＮＡｂ）を発生したことを説明する。これらのＮＡｂはレミケード結合部位についてＴＮＦαと競合する。重要なことに、これらのＮＡｂは他の抗ＴＮＦ治療薬と交差反応性であり得る。ＮＡｂが他の抗ＴＮＦ治療薬と交差反応するならば、別の抗ＴＮＦ治療薬に変更することは患者の助けにならない。すなわち、本発明の予測アッセイは、別の抗ＴＮＦ剤に変更することにより陽性ＨＡＣＡ（検出可能な抗体）を管理する、レミケードに対する応答を喪失した患者を管理する現在の方法（例えば、Ａｆｉｆら，Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１０５（５）：１１３３〜９頁（２０１０）を参照されたい）に対して利点を提供する。
【０２１５】
[0251]ある抗ＴＮＦ薬に応答して生成されたＮＡｂの、他の抗ＴＮＦ薬との交差反応性を決定するために、患者がレミケード（ＩＦＸ）を受けているときに発生したＮＡｂをヒュミラ（アダリムマブ）に対して試験した。図２１に示すデータは、ＩＦＸに対して生じたＮＡｂがヒュミラと交差反応することを明らかに実証した。図２１は、遊離ヒュミラピーク（１０〜１１分の間、各患者研究の下のパネル）が、ＮＡｂを含有する患者血清を加えたときにより高い分子量に完全にシフトすることを説明する（約１２分、患者研究＃１；約１２分、患者研究＃２；各患者研究の下のパネル）。これらの結果は、ＴＮＦαがヒュミラの抗原結合部位にアクセスすることをＮＡｂがある程度妨げるような様式でＮＡｂがヒュミラと結合することを示す。図２２は、このことをＮＡｂ及び非ＮＡｂ決定の両方について模式的に描く。
【０２１６】
[0252]あるいくつかの実施形態において、本発明のアッセイ方法は、これらの患者がヒュミラ又はいずれの他の抗ＴＮＦ治療薬にも応答しないことを予測する。患者は、抗ＴＮＦ治療により治療されるべきでなく、それらに限定されないが、関節リウマチ（ＲＡ）についてアクテムラ、キネレット、オレンシア、リツキサン及び／又はアルゼラ、又はクローン病（ＣＤ）についてタイサブリ及び／又はステロイドを含む代替治療選択肢に切り替えるべきである。
【０２１７】
[0253]したがって、本発明の方法は、患者からの試料中の中和抗体（ＮＡｂ）及び／又は非ＮＡｂの存在及び／又は濃度レベルを決定又は測定することによって、患者が抗ＴＮＦα治療に応答するかを予測することに関して特に有利である。一実施形態では、試料がある抗ＴＮＦα薬に対するＮＡｂを含有するならば、これらのＮＡｂは、他の抗ＴＮＦα薬と交差反応し、かつ該薬物を中和する可能性があり、そのため、該患者に関しては、異なる作用機序を有する薬物（例えば非抗ＴＮＦ薬）に切り替えるように治療法を調整することが推奨される。別の実施形態では、試料がある抗ＴＮＦα薬に対する非中和ＡＤＡを含有するならば、該患者に関しては、別の抗ＴＮＦα薬に切り替えるように治療法を調整することが推奨される。
【０２１８】
実施例４（中和抗薬物抗体（ＮＡｂ）の存在及び交差反応性の検出のためのアッセイ）：
[0254]本実施例は、試料がＮＡｂ陽性であるかを決定するためのスクリーニング、並びに代替生物学的製剤とのＮＡｂの交差反応性の予測及び／又は決定（例えば実施例３を参照されたい）のための本発明のアッセイ方法に関するさらなる実施形態を説明する。特定の実施形態において、本明細書に記載のアッセイ方法は、対象から得られた試料がＮＡｂについて陽性又は陰性のいずれであるかを決定することによって、第１抗ＴＮＦα薬を受けている対象が代替抗ＴＮＦα治療に応答するかを予測するのに有用である。試料がＮＡｂについて陽性であるならば、方法は、ＮＡｂが第２抗ＴＮＦα薬と交差反応するかを決定するステップと、ＮＡｂが第２抗ＴＮＦα薬と交差反応する場合に、非抗ＴＮＦα薬に切り替えることを対象に推奨するステップとを含む。試料がＮＡｂについて陰性であるならば、方法は、第２抗ＴＮＦα薬に切り替えることを対象に推奨するステップを含む。
【０２１９】
[0255]図２３は、本発明の例示的ＮＡｂ標準曲線の作製及び使用を示す。蛍光標識ＴＮＦ−５３２／ＩＦＸ−４８８と平衡化した種々の濃度のウサギ（Ｒｂ）抗ＩＦＸ抗体（ＡＴＩ）血清（標準又は未知）を含有する試料を２％血清の状態でサイズ排除カラムに注入した。大きい免疫複合体がまず溶出し、その後、より小さい複合体、次いで未結合のＩＦＸ−４８８及びＴＮＦ−５３２が溶出した。未知濃度は標準曲線からの補間により決定できる。ＮＡｂ及び非ＮＡｂの異なる混合物を含有するウサギ血清を組み合わせて、対象を作製できる。本明細書に記載のＮＡｂアッセイは、１１．６３％の古いカットオフと比較して、２．７２％の改善されたカットオフを有する（Ｎ＝５０正常試料）。表２は、患者によるＮＡｂ臨床研究のサマリーを示す。
【０２２０】
【表２】
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【０２２１】
[0256]本発明の交差反応性アッセイ方法は、別の生物学的治療への切り替えが有益であるかを予測するのに特に有用である。患者がある薬物に対してＮＡｂ陽性であることを見出した後に、蛍光標識代替薬物をアッセイにおいて用いることができる。患者血清が中和能力をまだ示すならば、新しい薬物は成功する可能性が低い。そのような方法は、最良の治療選択肢の提案又は提示を可能とするような費用対効果が高く時宜を得た様式で一連の薬物をスクリーニングするのに使用できる点で有利である。
【０２２２】
[0257]図２４及び２５は、実施例３に記載し、図２１に示す患者研究についてのさらなる症例研究を示す。特に、レミケード（インフリキシマブ，ＩＦＸ）で治療されたが、ＩＦＸに対する応答をその後喪失した患者３及び４は、ヒュミラ（アダリムマブ，ＡＤＬ）に対して応答しない可能性がある患者として同定された。なぜなら、患者がＩＦＸを受けているときに生じたＮＡｂがＡＤＬと交差反応性であると決定されたからである。
【０２２３】
[0258]図２６は、ＡＴＩ親和性成熟及び交差反応性ＡＴＩの発生を実証する患者研究の非限定的な例を示す。
【０２２４】
[0259]本明細書に記載の発明は、明確な理解を目的として図面及び実施例によりいくらか詳細に説明されているが、あるいくつかの変更及び改変が添付の特許請求の範囲内で行われ得ることは当業者であれば理解するであろう。また、本明細書で提示される各文献は、参照により個別に組み入れられているのと同じ程度に、その全体が参照により組み入れられている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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