(57)【要約】  本発明は、トリガー配列と相補的なオリゴヌクレオチド配列、アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド、及び標的核酸分子と相補的なセンス鎖オリゴヌクレオチドを含んでいる、治療用ＲＮＡスイッチを提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリガー配列と結合できる少なくとも１つのポリヌクレオチド配列；及び
アンチセンスオリゴヌクレオチド及びセンスオリゴヌクレオチド、
を含んでなる治療用ＲＮＡスイッチであって、
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡと相補的であり、前記ＲＮＡスイッチはトリガー配列の存在下で不活性状態と活性状態とを切り替えることができる、治療用ＲＮＡスイッチ。
【請求項２】
不活性状態において、部分的に形成されるｓｉＲＮＡ様螺旋が存在していない、請求項１に記載の治療用ＲＮＡスイッチ。
【請求項３】
治療用ＲＮＡスイッチが、アンチセンス及びセンスオリゴヌクレオチドにｓｉＲＮＡ様螺旋を形成させるトリガー配列の存在下で立体構造の変化を受ける、請求項１又は２に記載の治療用ＲＮＡスイッチ。
【請求項４】
ｓｉＲＮＡ様分子が標的ＲＮＡを減少又は阻害する、請求項３に記載の治療用ＲＮＡスイッチ。
【請求項５】
アダプターポリヌクレオチド鎖とプロトファンクショナルポリヌクレオチド鎖の複合体を含んでなり、前記アダプターポリヌクレオチドはトリガー配列と結合でき、アダプターポリヌクレオチド鎖がトリガー配列と結合するときに、前記プロトファンクショナルポリヌクレオチド鎖はｓｉＲＮＡ様ＲＮＡ二重螺旋を形成する、二本鎖治療用ＲＮＡスイッチ。
【請求項６】
ｓｉＲＮＡ様ＲＮＡ二重螺旋が、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びセンスオリゴヌクレオチドを含んでなり、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡに相補的である、請求項５に記載の二本鎖治療用ＲＮＡスイッチ。
【請求項７】
トリガー配列の非存在下で、部分的に形成されるｓｉＲＮＡ様螺旋が存在しない、請求項５又は６に記載の二本鎖治療用ＲＮＡスイッチ。
【請求項８】
ｓｉＲＮＡ様ＲＮＡ二重螺旋が、標的ＲＮＡを減少又は阻害する、請求項５〜７の何れか一項に記載の二本鎖治療用ＲＮＡスイッチ。
【請求項９】
ＤＮＡ輸送ポリヌクレオチド鎖、ＲＮＡアダプターポリヌクレオチド鎖、センスｓｉＲＮＡ鎖、及びアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖を含んでなる複合体であって、前記ＲＮＡアダプターポリヌクレオチド鎖のトリガー配列への結合は複合体からＲＮＡアダプター鎖を除去して立体構造の変化をもたらし、前記センスｓｉＲＮＡ鎖とアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖がｓｉＲＮＡ二本鎖を形成する、四本鎖治療用ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド複合体。
【請求項１０】
トリガー配列の非存在下で、部分的に形成されるｓｉＲＮＡ様螺旋が存在しない、請求項９に記載の四本鎖治療用ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド複合体。
【請求項１１】
四本鎖治療用ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド複合体が、アンチセンス及びセンスオリゴヌクレオチドにｓｉＲＮＡ様螺旋を形成させるトリガー配列の存在下で、立体構造の変化を受ける、請求項９又は１０に記載の四本鎖治療用ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド複合体。
【請求項１２】
ｓｉＲＮＡ様ＲＮＡ分子が、標的ＲＮＡを減少又は阻害する、請求項９〜１１の何れか一項に記載の四本鎖治療用ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド複合体。
【請求項１３】
トリガー配列が、関心のある標的細胞内に存在する核酸である、請求項１〜１２の何れか一項に記載の治療薬。
【請求項１４】
核酸が、標的細胞のゲノムの一部分か又はそれから誘導された、請求項１３に記載の治療薬。
【請求項１５】
トリガー配列が、病的細胞に存在するＲＮＡ転写物又はその一部分である、請求項１３又は１４に記載の治療薬。
【請求項１６】
トリガー配列が、癌関連遺伝子の一部分である、請求項１３に記載の治療薬。
【請求項１７】
癌関連遺伝子が、Ｈｉｆ１アルファ、ＶＥＧＦ、ＤＮＡ修復遺伝子、ＰＡＲＰ、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ７、ｍｉＲ１２８ａ、ｍｉＲ２１０、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ、ＳＭＡＤ、及びＴＮＦアルファからなる群より選ばれる、請求項１６に記載の治療薬。
【請求項１８】
核酸が、病原体のゲノムの一部分か又はそれから誘導された、請求項１３に記載の治療薬。
【請求項１９】
トリガー配列が、病原体のゲノムから誘導されたＲＮＡ転写物又はその一部である、請求項１８に記載の治療薬。
【請求項２０】
病原体がウィルス、細菌、真菌、又は寄生生物である、請求項１８又は１９に記載の治療薬。
【請求項２１】
病原体がＲＮＡウィルスである、請求項２０に記載の治療薬。
【請求項２２】
ＲＮＡウィルスがヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）である、請求項２１に記載の治療薬。
【請求項２３】
トリガー配列が、ＲＮＡウィルスゲノム又はその一部分である、請求項１８に記載の治療薬。
【請求項２４】
標的ＲＮＡが、疾患経過と関連しているタンパク質をコードするＲＮＡ又はその一部分を含んでなる、請求項１〜２３の何れか一項に記載の治療薬。
【請求項２５】
標的ＲＮＡが阻害されたときに治療的に有益な効果を生む、請求項１〜２４の何れか一項に記載の治療薬。
【請求項２６】
標的ＲＮＡが、アポトーシス阻害タンパク質をコードするＲＮＡ又はその一部分を含んでなる、請求項２５に記載の治療薬。
【請求項２７】
アポトーシス阻害タンパク質が、サバイビン、ＢＣＬ−２、ＦＬＩＰ、ＳＴＡＴ３、及びＸＩＡＰよりなる群から選ばれる、請求項２６に記載の治療薬。
【請求項２８】
標的ＲＮＡが、病原性ＲＮＡゲノム、病原体ゲノム由来のＲＮＡ転写物、又はこれらの一部分である、請求項１〜２５の何れか一項に記載の治療薬。
【請求項２９】
標的ＲＮＡが、ウィルスＲＮＡゲノム又はその一部分である、請求項２８に記載の治療薬。
【請求項３０】
ウィルスＲＮＡゲノムがＨＩＶゲノムである、請求項２９に記載の治療薬。
【請求項３１】
認識ドメイン、機能的部分、又はアプタマーを更に含んでいる、請求項１〜３０の何れか一項に記載の治療薬。
【請求項３２】
機能的部分が、蛍光標識、ＲＮＡ−フルオロフォア複合体、細胞取り込みを促進するドメイン、分裂機能性ドメイン、分裂リパーゼ、及び分裂ＧＦＰからなる群より選ばれる、請求項３１に記載の治療薬。
【請求項３３】
アプタマーが、標的細胞上又は細胞内の構造体と結合する、請求項３１に記載の治療薬。
【請求項３４】
構造体が、標的細胞内の核酸分子又はその一部分である、請求項３３に記載の治療薬。
【請求項３５】
核酸分子が、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子である、請求項３４に記載の治療薬。
【請求項３６】
細胞を請求項１〜３５の何れか一項に記載の治療薬の治療有効量と接触させることを含んでなる、細胞内の標的遺伝子の発現を阻害又は減少する方法。
【請求項３７】
細胞を請求項１〜３５の何れか一項に記載の治療薬の治療有効量と接触させることを含んでなる、病原体感染細胞を殺す方法。
【請求項３８】
細胞を請求項１〜３５の何れか一項に記載の治療薬の治療有効量と接触させることを含んでなる、細胞内で病原体の複写を阻害する方法。
【請求項３９】
細胞が対象内にある、請求項３６〜３８の何れか一項に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１〜３５の何れか一項に記載の治療薬の治療有効量を対象に投与することを含んでなる、対象における病原体の負荷量を減少する方法。
【請求項４１】
対象が病原性感染を発症する危険性を有している、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
対象が病原性感染を有していると診断されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１〜３５の何れか一項に記載の治療薬の治療有効量を対象に投与することを含んでなる、対象における病原性感染を治療又は予防する方法。
【請求項４４】
方法が、病原体の負荷量を減少し、それによって病原性感染を治療又は予防する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
方法が、感染した細胞の死を誘発し、それによって病原性感染を治療又は予防する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
対象が哺乳動物である、請求項３９〜４５の何れか一項に記載の方法。
【請求項４７】
対象がヒトである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
病原体がウィルス、細菌、真菌、又は寄生生物である、請求項３７〜４７の何れか一項に記載の方法。
【請求項４９】
病原体がウィルスである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ウィルスがＲＮＡウィルスである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ウィルスがＨＩＶである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
方法が、細胞を第２治療薬の治療有効量と接触させること、又は対象に第２治療薬の治療有効量を投与することを更に含んでなる、請求項３７〜５１の何れか一項に記載の方法。
【請求項５３】
第２治療薬が、病原性感染又は病原性感染に関連する症状を治療する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
第２治療薬が抗ウィルス薬である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
抗ウィルス薬がＨＩＶを治療する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
癌細胞を請求項１〜３５の何れか一項に記載の治療薬の治療有効量と接触させることを含んでなる、腫瘍細胞を殺す方法。
【請求項５７】
方法が、対象に請求項１〜３５の何れか一項に記載の治療薬の治療有効量を投与し、それによって対象を治療することを含んでなる、腫瘍を有している対象を治療する方法。
【請求項５８】
腫瘍細胞が固形癌に存在している癌細胞である、請求項５６又は５７に記載の方法。
【請求項５９】
癌が、乳癌、前立腺癌、黒色腫、膠芽細胞腫、結腸癌、卵巣癌、及び非小細胞肺癌からなる群より選ばれる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
方法が、細胞を第２治療薬の治療有効量と接触させること、又は対象に第２治療薬の治療有効量を投与することを更に含んでいる、請求項５６〜５９の何れか一項に記載の方法。
【請求項６１】
第２治療薬が抗癌剤である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
請求項１〜３５の何れか一項に記載の治療薬を含んでなる、組成物。
【請求項６３】
請求項１〜３５の何れか一項に記載の治療薬を含んでなる、医薬組成物。
【請求項６４】
薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤を更に含んでいる、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
医薬組成物が疾患を治療するためのものである、請求項６３又は６４に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
疾患が腫瘍である、請求項６５に記載の医薬組成物。
【請求項６７】
医薬組成物が抗癌剤を更に含んでいる、請求項６６に記載の医薬組成物。
【請求項６８】
疾患が病原体による感染症である、請求項６５に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
医薬組成物が、病原体による感染症に関連する症状を治療又は減少する第２薬剤を更に含んでなる、請求項６８に記載の医薬組成物。
【請求項７０】
病原体が、ウィルス、細菌、真菌、又は寄生生物である、請求項６８又は６９に記載の医薬組成物。
【請求項７１】
病原体がウィルスである、請求項７０に記載の医薬組成物。
【請求項７２】
ウィルスがＲＮＡウィルスである、請求項７１に記載の医薬組成物。
【請求項７３】
ウィルスがＨＩＶである、請求項７２に記載の医薬組成物。
【請求項７４】
医薬組成物が抗ウィルス剤を更に含んでいる、請求項７３に記載の医薬組成物。
【請求項７５】
請求項１〜３５の何れか一項に記載の治療薬、又は請求項６２〜７４の何れか一項に記載の組成物を含んでなる、キット。
【請求項７６】
キットが第２治療薬を更に含んでなる、請求項７５に記載のキット。
【請求項７７】
第２治療薬が抗癌剤、又は病原体による感染に関連している症状を治療又は減少する薬剤である、請求項７６に記載のキット。
【請求項７８】
キットが請求項３６〜５５の何れか一項に記載の方法のために用いられる、請求項７５〜７７の何れか一項に記載のキット。
【請求項７９】
キットが、請求項３６〜６１の何れか一項に記載の方法でキットを用いるための使用説明書を更に含んでいる、請求項７５〜７８の何れか一項に記載のキット。
【請求項８０】
キットが、標的遺伝子の選択的阻害のために用いられる、請求項７５〜７９に記載のキット。
【請求項８１】
キットが、ＲＮＡの選択的阻害のためにキットを使用するための説明書を含んでいる、請求項８０に記載のキット。
【請求項８２】
キットが、ＲＮＡの阻害のために用いられる、請求項７５〜７９の何れか一項に記載のキット。
【請求項８３】
キットが、ＲＮＡの選択的阻害に用いるための説明書を含んでいる、請求項８２に記載のキット。
【請求項８４】
キットが、腫瘍の治療のために用いられる、請求項７５〜７９の何れか一項に記載のキット。
【請求項８５】
キットが、腫瘍の治療についての説明書を含んでいる、請求項８４に記載のキット。
【請求項８６】
キットが、病原体感染の治療に用いられる、請求項７５〜７９の何れか一項に記載のキット。
【請求項８７】
キットが、病原体感染の治療についての説明書を含んでいる、請求項８６に記載のキット。
【請求項８８】
病原体が、ウィルス、細菌、真菌、又は寄生生物である、請求項８６又は８７に記載のキット。
【請求項８９】
病原体がウィルスである、請求項８８に記載のキット。
【請求項９０】
ウィルスがＲＮＡウィルスである、請求項８９に記載のキット。
【請求項９１】
ＲＮＡウィルスがＨＩＶである、請求項９０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は２０１１年１１月１７日に出願された、米国仮特許出願第６１／５６１，２４７号、及び２０１２年８月１日に出願された、米国仮特許出願第６１／６７８，４３４号の優先権を主張し、その内容はその全てが参照により本明細書に取り込まれている。
【０００２】
（連邦政府支援研究のもとでなされた発明に対する権利の主張）
本出願を裏付けている研究は保健社会福祉省長官によって代表されるアメリカ合衆国によって実施された。連邦政府はこの発明にある特定の権利を有している。
【背景技術】
【０００３】
病的状態にある（標的の）細胞に優先的に望ましい細胞効果（例えば、細胞死、細胞経路の上方又は下方制御など）を引き起こすことが薬物分子にとって重要である。大部分の薬物は受動的な標的若しくは細胞表面受容体に基づく標的を用いるか又は標的を用いないかの何れかである。癌又はウィルス感染のような、幾つかの疾患に対しては、病状は主に細胞内部、例えば、細胞質中のある特定のＲＮＡ又はタンパク質の存在の形式の相違によってその存在を明らかにするので、正確な標的が課題となっている。治療を必要としている細胞を直接標的としている改良された薬剤が必要である。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は病的細胞（癌細胞、又は病原体、例えばウィルス、細菌、真菌若しくは寄生生物によって感染された細胞）を治療する新規な方法を提供し、これは病的細胞中の標的遺伝子を選択的に阻害するという治療効果をもたらす新規な手段によって病的細胞の治療をもたらす。例えば、腫瘍性又は感染されウィルス核酸を含んでいるような細胞におけるトリガーアポトーシス又は細胞破壊経路である。本発明は更に物質の新規な組成物、すなわち病的細胞における標的遺伝子の選択的阻害が可能である、「ＲＮＡスイッチ」又は「ｔｓｗＲＮＡ」と呼ばれるＲＮＡ分子の新規な形態に関する。
【０００５】
特定の態様では、本発明はいくつかのＲＮＡ構造機能相関に基づいて設計されて、病的細胞におけるトリガー細胞破壊経路を介した病的細胞の機能的治療が可能であるＲＮＡスイッチを提供する。
【０００６】
ある特定の態様では、本発明の治療用ＲＮＡスイッチはトリガー配列（例えば、標的細胞で発現される配列、疾患関連遺伝子、癌関連遺伝子、感染細胞に含まれるウィルスＲＮＡゲノムのような病原体（例えば、ウィルス、細菌、真菌又は寄生生物）に関連しているＤＮＡ又はＲＮＡ）と結合できる幾つかの隣接配列領域を含んでいるＲＮＡ分子である。
さらに、治療用ＲＮＡスイッチは１つ又はそれ以上の公知ヒト標的遺伝子に対して相補的なアンチセンス配列を表す配列を含んでいる。
本発明の一実施態様では、ｓｉＲＮＡ様構造を形成できるセンス及びアンチセンス配列は、部分的に形成されるｓｉＲＮＡ様螺旋のいずれでもない。すなわち、不活性なｔｓｗＲＮＡはｓｉＲＮＡ様螺旋に似ている如何なる構造も有していない。
別の実施態様では、１つ又はそれ以上の標的遺伝子は、標的遺伝子の阻害が病的状態の寛解をもたらすように病的状態に関わっている。
別の実施態様では、ヒト標的遺伝子は細胞破壊経路、例えば、アポトーシス又は壊死に関わっている。
ある実施態様では、アンチセンス配列は、これに限定されないが、ＢＣＬ−２、ＦＬＩＰ、ＳＴＡＴ３、及びＸＩＡＰのような、公知のヒトアポトーシス阻害遺伝子に対して相補的である。センス及びアンチセンスＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を介して標的遺伝子を阻害できるｓｉＲＮＡ様ヘアピンを形成するように誘導できる。この過程は、ｔｓｗＲＮＡとトリガー配列の間の結合によってｔｓｗＲＮＡに生じる立体構造の変化を介して活性化される。例えば、ＨＩＶの場合、治療用ＲＮＡスイッチ分子は、ＨＩＶゲノムが存在していないとき、すなわち、細胞がＨＩＶに感染していないときは活性な構造になっていない。しかし、ｔｓｗＲＮＡがウィルスに感染した細胞と接触すると、トリガー配列（すなわち、ＨＩＶウィルスＲＮＡ）に結合しているｔｓｗＲＮＡ中の隣接配列の存在が分子内で所定の立体構造の変化（例えば、分子のコンピューターによる設計によって）を生じる。立体構造の変化は、ＲＮＡを開裂するダイサー（Ｄｉｃｅｒ）酵素に対する基質である二本鎖ＲＮＡ鋳型、すなわち、ｓｉＲＮＡ様ヘアピンを暴露する。開裂したＲＮＡは標的ヒト遺伝子、すなわちヒトアポトーシス阻害遺伝子を阻害するｓｉＲＮＡを放出する。従って、本発明の治療用ＲＮＡスイッチがＨＩＶウィルスを有している細胞内に取り込まれると、治療用ＲＮＡスイッチはＨＩＶ遺伝子の存在下で立体構造の変化を受けて、アポトーシス阻害遺伝子に対するｓｉＲＮＡを作り出す。ダイサー酵素による処理はｓｉＲＮＡを放出しこれは次いでアポトーシス阻害遺伝子の産生を阻害してＨＩＶを有している細胞に対する細胞死の可能性を増大する。
同様に、別の実施態様では、ｔｓｗＲＮＡは、隣接配列が、疾患関連遺伝子であるトリガー配列と結合するように設計される。トリガー配列と結合すると、ｔｓｗＲＮＡは、ダイサーによって処理される二本鎖ｓｉＲＮＡ様螺旋を暴露する立体構造の変化を受ける。遊離したｓｉＲＮＡは次いで標的遺伝子を阻害し、これは病的状態の寛解をもたらす。
さらなる実施態様では、トリガー配列は、阻害することが望ましい核酸又はリボ核酸分子を有している細胞中に存在している配列である。
ある実施態様では、ｔｓｗＲＮＡの細胞内への送達は標的遺伝子の阻害をもたらす。
ある実施態様では、ｔｓｗＲＮＡの細胞内への送達は病原体による感染の治療／寛解（例えば、ウィルス、細菌、真菌又は寄生生物に関連するＤＮＡ又はＲＮＡを阻害し；又は細胞中の標的分子を阻害し、感染細胞の死を引き起こすこと）をもたらす。
【０００７】
一態様では、本発明は一般に、トリガー配列に結合できる少なくとも１つのポリヌクレオチド配列；並びにアンチセンス及びセンスオリゴヌクレオチド（このアンチセンスオリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡと相補的である）を有している治療用ＲＮＡスイッチを特徴としていて、このＲＮＡスイッチはトリガー配列の存在下で不活性状態と活性状態に切り替えることができる。実施態様では、部分的に形成されたｓｉＲＮＡ様螺旋は不活性状態において存在しない。実施態様では、治療用ＲＮＡスイッチは、アンチセンス及びセンスオリゴヌクレオチドにｓｉＲＮＡ様螺旋を形成させるトリガー配列の存在下で、立体構造の変化を受ける。実施態様では、ｓｉＲＮＡ様分子は標的ＲＮＡを減少又は阻害する。
【０００８】
別の態様では、本発明はアダプターポリヌクレオチド鎖及びプロトファンクショナルポリヌクレオチド鎖の複合体を有している二本鎖の治療用ＲＮＡスイッチを特徴としていて、ここでアダプターポリヌクレオチドはトリガー配列と結合できてプロトファンクショナルポリヌクレオチド鎖はアダプターポリヌクレオチド鎖がトリガー配列と結合しているときにｓｉＲＮＡ様ＲＮＡ二重螺旋を形成する。実施態様では、ｓｉＲＮＡ様ＲＮＡ二重螺旋はアンチセンスオリゴヌクレオチド及びセンスオリゴヌクレオチドからなり、ここでアンチセンスオリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡと相補的である。実施態様では、トリガー配列の非存在下では部分的に形成されたｓｉＲＮＡ様螺旋は存在しない。実施態様では、ｓｉＲＮＡ様ＲＮＡ二本鎖は標的ＲＮＡを減少又は阻害する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、ＤＮＡ輸送ポリヌクレオチド鎖、ＲＮＡアダプターポリヌクレオチド鎖、センスｓｉＲＮＡ鎖、及びアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖の間で複合体を有している四本鎖の治療用ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド複合体を特徴としていて、ここでＲＮＡアダプターポリヌクレオチド鎖のトリガー配列との結合はＲＮＡアダプター鎖を複合体から除去して立体構造の変化をもたらしてセンスｓｉＲＮＡ鎖とセンスｓｉＲＮＡ鎖がｓｉＲＮＡ二本鎖を形成する。実施態様では、トリガー配列の非存在下では部分的に形成されるｓｉＲＮＡ様螺旋は存在しない。実施態様では、四本鎖の治療用ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド複合体はトリガー配列の存在下で立体構造の変化を受け、これによりアンチセンス及びセンスオリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡ様螺旋の形成を引き起こす。実施態様では、ｓｉＲＮＡ様分子は標的ＲＮＡを減少又は阻害する。
【００１０】
上記態様及び実施態様の何れかでは、トリガー配列は関心のある標的細胞に存在する核酸であってよい。実施態様では、核酸は標的細胞のゲノムの一部分であるか又はゲノムに由来している。例えば、トリガー配列は病的細胞又はその部分に存在しているＲＮＡ転写物であってよい。
【００１１】
関連している実施態様では、トリガー配列は癌関連遺伝子（例えば、Ｈｉｆ１アルファ、ＶＥＧＦ、ＤＮＡ修復遺伝子、ＰＡＲＰ、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ７、ｍｉＲ１２８ａ、ｍｉＲ２１０、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ、ＳＭＡＤ、及びＴＮＦアルファ）の一部分である。
【００１２】
関連している実施態様では、核酸は病原体の遺伝子の一部分であるか又は遺伝子に由来している（例えば、トリガー配列は病原体又はその一部分の遺伝子に由来するＲＮＡ転写物である）。病原体はウィルス、細菌、真菌又は寄生生物であってよい。ある実施態様では、病原体はＲＮＡウィルス（例えば、ＨＩＶ）である。
【００１３】
関連している実施態様では、トリガー配列は病原体又はそのタンパク質のＲＮＡゲノムである。実施態様では、ＲＮＡゲノムはウィルス（例えば、ＨＩＶ）のＲＮＡゲノムである。
【００１４】
上記態様及び実施態様の何れかでは、標的ＲＮＡは阻害したときに治療的に有益な結果を生み出すものである。
【００１５】
実施態様では、標的ＲＮＡは病気の経過に関連しているタンパク質又はその一部分をコードするＲＮＡから成っている。関連している実施態様では、標的ＲＮＡはアポトーシスタンパク質又はその一部分をコードするＲＮＡ（例えば、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ＢＣＬ−２、ＦＬＩＰ、ＳＴＡＴ３、及びＸＩＡＰ）から成る。
【００１６】
実施態様では、標的ＲＮＡは病原性ＲＮＡ遺伝子、病原体の遺伝子由来のＲＮＡ転写物、又はそれらの部分である。ある実施態様では、標的ＲＮＡはウィルスＲＮＡゲノム又はその一部分（例えば、ＨＩＶゲノム）である。
【００１７】
上記態様及び実施態様の何れかでは、治療用鎖はさらに認識標的と結合する認識ドメインを含んでいる。認識標的は核酸分子、ポリペプチド又はこれらの断片であってよい。実施態様では、認識標的は標的細胞内又は細胞上に位置している。標的細胞は病的細胞であってよい。例えば、病的細胞は癌性細胞（腫瘍を有する細胞）であってよい。病的細胞は遺伝障害を有している細胞であってもよい。病的細胞はさらに病原体（例えば、ウィルス、細菌、真菌又は寄生生物）に感染している細胞であってよい。
【００１８】
関連する実施態様では、認識ドメインはアプタマーである。実施態様では、アプタマーは細胞膜ポリペプチド又は細胞膜構造と結合する。細胞膜ポリペプチド又は細胞膜構造は、疾患特異的膜タンパク質又は構造（例えば、癌特異的膜特異的タンパク質又は構造、病原体による感染に関連している特異的膜タンパク質又は構造、など）であってよい。実施態様では、アプタマーは細胞中の分子と結合する。例えば、アプタマーは標的細胞内の核酸分子又はその一部分（例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子又はこれらの断片）と結合できる。
【００１９】
治療用鎖は当該技術分野で公知の機能的な部位を含むこともできる。例えば、治療用鎖は蛍光標識、細胞取り込みを促進するドメイン、分裂機能性ドメイン、分裂リパーゼ、及び分裂ＧＦＰを含むことができる。実施態様では、機能的な部位は会合上にシグナルを放出するＲＮＡ−フルオロフォア複合体であってもよい。Paige, J.S. et al., Science 333:642-646 (2011) を参照されたい。
【００２０】
ある実施態様では、治療用鎖は本明細書（詳細な説明及び図面）に記載されている少なくとも１つの配列を含んでいる。例えば、治療鎖は少なくとも１つの以下の配列を含んでいる：
構築物 ４−１（ＤＮＡ）
５’−ＴＧＴＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＴＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＡＣＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＣＡＴＴＡＣＡＡＣＴＧＴＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＡＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＡＡＣＡ
アダプター ４−１（ＲＮＡ、ｇｇｇａａａ開始配列を有する）
５’−ｇｇｇａａａＣＡＧＣＧＡＵＵＣＡＡＡＧＡＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＵＣＣＧＧＧＡＣＡＧＵＵＧＵＡＡＵＧＧＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧＵＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＡ
ＥＧＦＰ ｓｉＲＮＡ Ｓ１− センス（ＲＮＡ）
５’−ＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵＣＵＧＣＡＣＣａＣｃａｃａａａｃａ
ＥＧＦＰ ｓｉＲＮＡ Ｓ１− アンチセンス（ＲＮＡ）
５’−ｇｕｇｇＵＧＣＡＧＡＵＧＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＣＡ
ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ 断片４−１（ｇｇｇａａａ開始配列を有する）
５’−ｇｇｇａａａＵＣＡＡＧＡＣＣＵＧＵＧＣＣＵＧＣＣＡＵＵＡＣＡＡＣＵＧＵＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＡＵＧＡＣＡＵＣＵＵＵＧＡＡＵＣＧＣＵＧＵＡＣＵＡＣＡＧＧＡ
アダプター ４−１ｂ（ＲＮＡ、ｇｇｇａａａ開始配列を有していない）
５’−ＣＡＧＣＧＡＵＵＣＡＡＡＧＡＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＵＣＣＧＧＧＡＣＡＧＵＵＧＵＡＡＵＧＧＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧＵＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＡ
ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ 断片４−１ｂ（ｇｇｇａａａ開始配列を有していない）
５’−ＵＣＡＡＧＡＣＣＵＧＵＧＣＣＵＧＣＣＡＵＵＡＣＡＡＣＵＧＵＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＡＵＧＡＣＡＵＣＵＵＵＧＡＡＵＣＧＣＵＧＵＡＣＵＡＣＡＧＧＡ
ｔｓｗＲＮＡ 構築物−１
５’−ＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＵＡＵＵＵＧＵＡＵＣＡＵＵＧＣＡＡＡＣＡＡＣＵＧＵＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＡＵＵＡＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＡＡＵＵＡＵＵＣＵＧＧＵＧＧＵＧＣＡＧＡＵＧＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＡＡ
ｔｓｗＲＮＡ アダプター−１
５’−ＣＡＧＣＧＡＵＵＣＡＡＡＧＡＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＵＣＣＧＡＡＡＧＧＡＣＡＧＵＵＧＡＡＡＵＡＡＵＧＧＣＡＧＧＧＣＣＡＵＵＡＡＡＡＧＣＡＡＵＧＡＵＡＣＡＡＡ
ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ 断片−１
５’−ＵＧＵＵＣＡＵＣＡＡＧＡＣＣＵＧＵＧＣＣＵＧＣＣＡＵＵＡＣＡＡＣＵＧＵＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＡＵＧＡＣＡＵＣＵＵＵＧＡＡＵＣＧＣＵＧＵＡＣＵＡＣＡＧＧＡ
ｔｓｗＲＮＡ 構築物−２
５’−ＣＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＵＡＵＵＵＧＵＡＵＣＡＵＵＧＣＡＡＡＣＡＡＣＵＧＵＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＡＵＵＡＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＡＡＵＵＡＵＵＣＵＧＧＵＧＧＵＧＣＡＧＡＵＧＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＡＡ
ｔｓｗＲＮＡ アダプター−２
５’−ＵＣＣＵＧＵＡＧＵＡＣＡＧＣＧＡＵＵＣＡＡＡＧＡＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＵＣＣＧＡＡＡＧＧＡＣＡＧＵＵＧＡＡＡＵＡＡＵＧＧＣＡＧＧＧＣＣＡＵＵＡＡＡＡＧＣＡＡＵＧＡＵＡＣＡＡＡ
ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ 断片−２
５’−ＡＡＧＡＣＣＵＧＵＧＣＣＵＧＣＣＡＵＵＡＣＡＡＣＵＧＵＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＡＵＧＡＣＡＵＣＵＵＵＧＡＡＵＣＧＣＵＧＵＡＣＵＡＣＡＧＧＡＡＧＡＵＧＵＡＣＧＧ
【００２１】
別の態様では、本発明は本明細書に記載されている治療用分子を用いる方法を特徴としている。
【００２２】
態様では、本発明は細胞内で標的遺伝子の発現を阻害又は減少する方法を特徴としている。実施態様では、方法は細胞を本明細書に記載されている少なくとも１つの治療用分子の治療有効量と接触させることを含んでいる。実施態様では、細胞は対象内にある。
【００２３】
態様では、本発明は病原体感染細胞を殺す方法を特徴としている。実施態様では、方法は細胞を本明細書に記載されている少なくとも１つの治療用分子の治療有効量と接触させることを含んでいる。実施態様では、細胞は対象内にある。
【００２４】
態様では、本発明は細胞における病原体の複製を阻害する方法を特徴としている。方法は細胞を本明細書に記載されている少なくとも１つの治療用分子の治療有効量と接触させることを含んでいる。実施態様では、細胞は対象内にある。
【００２５】
態様では、本発明は対象における病原体の負荷量を減少する方法を特徴としている。実施態様では、方法は本明細書に記載されている少なくとも１つの治療用分子の治療有効量の治療有効量を投与することを含んでいる。実施態様では、対象は病原体感染の危険性がある。実施態様では、対象は病原体感染を有していると診断されている。
【００２６】
態様では、本発明は対象における病原体感染を治療又は予防する方法を提供する。実施態様では、方法は本明細書に記載されている少なくとも１つの治療用分子の治療有効量の治療有効量を投与することを含んでいる。実施態様では、方法は病原体の負荷量を減少することによって病原体感染を治療又は予防する。実施態様では、方法は感染細胞の死を誘発することによって病原体感染を治療又は予防する。
【００２７】
上記態様及び実施態様の何れかでは、対象は哺乳動物（例えば、ヒト）であってよい。
【００２８】
上記態様及び実施態様の何れかでは、病原体はウィルス、細菌、真菌、又は寄生生物であってよい。ある実施態様では、病原体はウィルス（例えば、ＨＩＶ）である。
【００２９】
上記態様及び実施態様の何れかでは、方法はさらに、細胞を第二治療薬剤の治療有効量と接触させること又は対象に第二治療薬剤の治療有効量を投与することを含むことができる。第二治療薬剤は病原体感染又は病原体感染に関係している症状を治療することができる。例えば、第二治療薬剤抗ウィルス剤、抗細菌剤、抗真菌剤、又は抗寄生生物剤であってよい。このような薬剤は当該技術分野において公知であって、第二治療薬剤の選択及び適切な用量の決定は医師の権限の範囲内である。例えば、Drug Information Handbook: A Comprehensive Resource for All Clinicians and Healthcare Professionals, 20th Ed., C. F. Lacy et al. (eds.) (Lexi-Comp 2011); Johns Hopkins ABX Guide: Diagnosis & Treatment of Infectious Diseases, 2nd Ed., J. G. Bartlett et al. (eds.) (Jones & Bartlett Publishers 2010); 及び Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases: Expert Consult Premium Edition, 7th Ed., G. L. Mandell (ed.) (Churchill Livingstone 2009); The Sanford Guide to Antimicrobial Therapy 2012, 42nd Ed., D. N. Gilbert et al. (eds.) (Antimicrobial Therapy 2012); Clinical Infectious Disease 2013, 11th Ed., C. G. Weber (ed.) (Pacific Primary Care Software 2012)を参照されたい。これらの内容はその全てが参照により本明細書に取り込まれている。
【００３０】
態様では、本発明は腫瘍細胞を殺す方法を特徴としている。実施態様では、方法は細胞を本明細書に記載されている少なくとも１つの治療用分子の治療有効量と接触させることを含んでいる。実施態様では、細胞は対象内にある。
【００３１】
態様では、本発明は腫瘍を有している対象を治療する方法を特徴としている。実施態様では、方法は本明細書に記載されている少なくとも１つの治療用分子の治療有効量を投与することを含んでいる。
【００３２】
実施態様では、腫瘍細胞は固形腫瘍内に存在している癌細胞である。実施態様では、癌は、乳癌、前立腺癌、黒色腫、膠芽細胞腫、大腸癌、卵巣癌、及び非小細胞肺癌より成る群から選ばれる。
【００３３】
関連する実施態様では、方法は細胞を第二治療薬剤の治療有効量と接触させること又は対象に第二治療薬剤の治療有効量を投与することを含んでいる。ある実施態様では、第二治療薬剤は抗癌剤である。抗癌剤は当該技術分野で公知であって、このような薬剤は本発明で用いるのに適している。例えば、Anticancer Drugs: Design, Delivery and Pharmacology (Cancer Etiology, Diagnosis and Treatments) (eds. Spencer, P. & Holt, W.) (Nova Science Publishers, 2011); Clinical Guide to Antineoplastic Therapy: A Chemotherapy Handbook (ed. Gullatte) (Oncology Nursing Society, 2007); Chemotherapy and Biotherapy Guidelines and Recommendations for Practice (eds. Polovich, M. et al.) (Oncology Nursing Society, 2009); Physicians’ Cancer Chemotherapy Drug Manual 2012 (eds. Chu, E. & DeVita, Jr., V.T.) (Jones & Bartlett Learning, 2011); DeVita, Hellman, and Rosenberg’s Cancer: Principles and Practice of Oncology (eds. DeVita, Jr., V.T. et al.) (Lippincott Williams & Wilkins, 2011); 及び Clinical Radiation Oncology (eds. Gunderson, L.L. & Tepper, J.E.) (Saunders) (2011) を参照されたい。これらの内容はその全てが参照により本明細書に取り込まれている。
例えば制限のない抗癌剤の例としては、酢酸アビラテロン（Aberration Acetate）、アファチニブ（Afatinib）、アルデスロイキン（Aldesleukin）、アレムツズマブ（Alemtuzumab）、アルトレチノイン（Alitretinoin）、アルトレタミン（Altretamine）、アミフォスチン（Amifostine）、アミノグルテチミド（Aminoglutethimide）、アナグレリド（Anagrelide）、アナストロゾール（Anastrozole）、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アザシチジン、アザチオプリン、ベンダムスチン（Bendamustine）、ベバシズマブ（Bevacizumab）、ベクサロチン（Bexarotine）、ビカルタミド（Bicalutamide）、ブレオマイシン、ボルテゾミブ（Bortezomib）、ブスルファン（Busulfan）、カペシタビン（Capecitabine）、カルボプラチン（Carboplatin）、カルムスチン（carmustine）、セツキシマブ（Cetuximab）、クロラムブシル（Chlorambucil）、シスプラチン（Cisplatin）、クラドリビン（Cladribine）、クリゾチニブ（Crizotinib）、シクロホスファミド（Cyclophosphamide）、シタラビン（Cytrabine）、ダカルバジン（Dacarbazine）、ダクチノマイシン（Dactinomycin）、ダサチニブ（Dasatinib）、ダウノルビシン（Daunorubicin）、デニロイキンジフチトクス（Denileukin diftitox）、デシタビン（Decitabine）、ドセタキセル（Docetaxel）、デキサメタゾン（Dexamethasone）、ドキシフルリジン（Doxifluridine）、ドクソルビシン（Doxorubicine）、エピルビシン（Epirubicin）、エポエチン−アルファ（Epoetin Alpha）、エポチロン（Epothilone）、エルロチニブ（Erlotinib）、エストラムスチン（Estramustine）、エンチノスタット（Etinostat）、エトポシド（Etoposide）、エベロリムス（Everolimus）、エクセメスタン（Exemestane）、フィルグラスチム（Filgrastim）、フロクスウリジン（Floxuridine）、フルダラビン（Fludarabine）、フルオロウラシル、フルオキシメステロン（Fluoxymesterone）、フルタミド（Flutamide）、葉酸結合アルカロイド、ゲフィチニブ（Gefitinib）、ゲムシタビン（Gemcitabine）、ゲムツズマブオゾガマイシン（Gemtuzumab ozogamicin）、ＧＭ−ＣＴ−０１、ゴセレリン（Goserelin）、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ（Ibritumomab）、イダルビシン（Idarubicin）、イホスファミド（Ifosfamide）、イマチニブ（Imatinib）、インターフェロン アルファ、インターフェロン ベータ、イリノテカン（Irinotecan）、イキサベピロン（Ixabepilone）、ラパチニブ（Lapatinib）、ロイコボリン（Leucovorin）、リュープロライド（Leuproride）、レナリドミド（Lenalidomide）、レトロゾール（Letrozole）、ロムスチン（Lomustine）、メクロレタミン（Mechlorethamine）、メゲストロール（Megestrol）、メルファラン（Melphalan）、メルカプトプリン、メトトレキート、マイトマイシン、ミトキサントロン（Mitoxantrone）、ネララビン（Nelarabine）、ニロチニブ（Nilotinib）、ニルタミド（Nilutamide）、オクトレオチド（Octreotide）、オファツムマブ（Ofatumumab）、オプレルベキン（Oprelvekin）、オキサリプラチン（Oxaliplatin）、パクリタキセル（Paclitaxel）、パニツムマブ（Panitumumab）、ペメトレキセド（Pemetrexed）、ペントスタチン（Pentostatin）、多糖類ガレクチン阻害剤、プロカルバジン（Procarbazine）、ラロキシフェン（Raloxifene）、レチノイン酸、リツキシマブ（Rituximab）、ロミプロスチム（Romiplostim）、サルグラモスチム（Sargramostim）、ソラフェニブ（Sorafenib）、ストレプトゾシン（Streptozocin）、スニチニブ（Sunitinib）��タモキシフェン（Tamoxifen）、テムシロリムス（Temsirolimus）、テモゾロミド（Temozolamide）、テニポシド（Teniposide）、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ（thiotepa）、チオグアニン（Tioguanine）、トポテカン（Topotecan）、トレミフェン（Toremifen）、トシツモマブ（Tositumomab）、トラメチニブ（Trametinib）、トラスツズマブ（Trastuzumab）、トレチノイン（Tretinoin）、バルルビシン（Valrubicin）、ＶＥＧＦ阻害剤及びトラップ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン（Vindesine）、ビンオレルビン（Vinorelbine）、ビンタフォリド（Vintafolide；ＥＣ１４５）、ボリノスタット（Volinostat）、又はこれらの塩が挙げられる。
【００３４】
上記態様及び実施態様の何れかでは、病原体は公知のウィルス、細菌、真菌、又は当該技術分野で公知の寄生生物であってよい。例えば、Clinical Infectious Diseases 2013, 11th Ed., C.G. Weber (ed.)(Pacific Primary Care Software 2012) を参照されたい。
【００３５】
細菌性病原体の例としては、これに限定されないが、アエロバクター属、アエロモナス属、アシネトバクター属、イスラエル放線菌、アグロバクテリウム属、バチルス属、炭疽菌、バクテロデス属、バルトネラ属、ボルデテラ属、ボルテラ（Bortella）属、ボレリア属、ブルセラ属、バークホルデリア属、カリマトバクテリウム属、カンピロバクター属、シトロバクター属、クロストリジウム属、ウェルシュ菌（Clostridium perfingens）、破傷風菌、コリネバクテリウム属、ジフテリア菌、コリネバクテリウム種、エンテロバクター属、エンテロバクター・エロゲネス、エンテロコッカス属、ブタ丹毒菌、大腸菌属、フランシセラ属、フソバクテリウム・ヌクレアタム、ガードネレラ属、ヘモフィルス属、ハフニア属、ヘリコバクター属、クレブジエラ属、肺炎桿菌、ラクトバチルス属、レジオネラ属、レプトスピラ属、リステリア属、モルガネラ属、モラクセラ属、マイコバクテリウム属、ナイセリア属、パスツレラ属、パスツレラ・マルトシダ、プロテウス属、プロビデンシア属、シュードモナス属、リケッチア属、サルモネラ属、セラチア属、赤痢菌属、ブドウ球菌属、ステノトロホモナス属、連鎖球菌属、ストレプトバチルス・モニリホルム、トレポネーマ属、梅毒トレポネーマ、トレポネーマ・ペルテニュウ、キサントモナス属、ビブリオ属、及びエルシニア属が挙げられる。
【００３６】
典型的なウィルスとしては、これに限定されないが、レトロウィルス科（例えば、ＨＩＶ−１（ＨＤＴＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶＥ又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶとも呼ばれる）、又はＨＩＶ−ＩＩＩのようなヒト免疫不全ウィルス；及びＨＩＶ−ＬＰのような、その他の分離株）；ピコルナウィルス科（例えば、ポリオウィルス、Ａ型肝炎ウィルス；エンテロウィルス、ヒト・コクサッキーウィルス、ライノウィルス）；カリシウィルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウィルス科（例えば、ウマ脳炎ウィルス、風疹ウィルス）、フラビウィルス科（例えば、デングウィルス、脳炎ウィルス、黄熱ウィルス）；コロナウィルス科（例えば、コロナウィルス）；ラブドウィルス科（例えば、水疱性口内炎ウィルス、狂犬病ウィルス）；フィロウィルス科（例えば、エボラウィルス）；パラミクソウィルス科（例えば、パラインフルエンザウィルス、ムンプスウィルス、麻疹ウィルス、呼吸器多核体ウィルス）；オルトミクソウィルス科（例えば、インフルエンザウィルス）；ブンガウィルス科（例えば、ハンタンウィルス、ブンガウィルス、フレボウィルス及びナイロウィルス）；アレナウィルス科（出血熱ウィルス）；レオウィルス科（例えば、レオウィルス、オルビウィルス及びロタウィルス）；ビルナウィルス科；ヘパドナウィルス科（Ｂ型肝炎ウィルス）；パルボウィルス科（パルボウィルス）；パポバウィルス科（パピローマウィルス、ポリオーマウィルス）；アデノウィルス科（殆どのアデノウィルス）；ヘルペスウィルス科（単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）１及び２、水痘帯状疱疹ウィルス、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウィルス）；ポックスウィルス科（痘瘡ウィルス、ワクシナウィルス、ポックスウィルス）；及びイリドウィルス科（例えば、アフリカブタ熱ウィルス）；並びに未分類のウィルス（例えば、デルタ肝炎（Ｂ型肝炎ウィルスの不完全な付随体であると考えられる）の病原体、非Ａ非Ｂ型肝炎（クラス１＝内部感染；クラス２＝非経口感染（すなわち、Ｃ型肝炎）の病原体；ノーウォーク及び関連ウィルス、並びにアストトウィルス）がある。
【００３７】
病原性真菌の例としては、これに限定されないが、アルテリナリア属、アスペルギルス属、バシジオボラス属、ビポラリス属、ブラストシゾミセス属、カンジダ属、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・グラブラタ（以前、トルロプシス・グラブラタと呼ばれていた）、カンジダ・パラプローシス、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・シュードトロピカリス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・ドウベリニエンシス、及びカンジダ・ルシタニアエ、コクシオジオイデス属、クラドフィアロフォラ属、クリプトコッカス属、クスダマカビ属（クニンガメラ属）、カーブラリア属、エクソフィアラ属、フォンセケア属、ヒストプラズマ属、マズレラ属、マラセチア属、プラストミセス属、ロドトルラ属、スケドスポリウム属、スコプラリオプシス属、スポロボロマイセス属、白癬、及びトリコスピロン属が挙げられる。
【００３８】
寄生生物は、それらが細胞内であるか細胞外であるかどうかに基づいて分類できる。本明細書で用いられる「細胞内寄生生物」はそれらの全ライフサイクルが細胞内である寄生生物である。ヒト細胞内寄生生物の例としては、リーシュマニア属、プラスモジューム属、トリパノゾーマ・クルージ、トキソプラズマ・ゴンディ、バベシア、及び旋毛虫トリキナが挙げられる。本明細書で用いられる「細胞外寄生生物」は、それらの全ライフサイクルが細胞外である寄生生物である。ヒトを感染することができる細胞外寄生生物は、赤痢アメーバ、ランブル鞭毛虫、エンテロシトゾーン・ビエヌーシ、ネグレリア及びアカントアメーバをさらに多くの蠕虫類も包含する。その他の分類の寄生生物は、主に細胞外に存在するが、それらのライフサイクルにおける重要な段階に細胞内に存在することが必須であるとして定義される。このような寄生生物を本明細書では「偏性細胞内寄生生物」と呼ぶ。これらの寄生生物はそれらの生涯の殆ど又はそれらの生涯のほんの少しの部分を細胞外の環境に存在できるが、それらは全てがそれらのライフサイクルにおいて少なくとも１度の必須（偏性）の細胞内段階を有している。寄生生物のこの後者の種類は、ローデシアトリパノソーマ及びガンビアトリパノソーマ、イソスポーラ属、クリプトスポリジウム、エイメリア属、ネオスポラ属、肉胞子虫属、並びに住血吸虫属を包含する。一態様では、本発明は、細胞内寄生生物、及びそれらのライフサイクルの少なくとも一度が細胞内である偏性細胞内寄生生物由来の感染の予防及び治療に関している。ある実施態様では、本発明は、主に細胞内に存在する偏性細胞内寄生生物由来の感染の予防を対象としている。本発明のある態様のための例示的で非限定的なリストは、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、三日熱マラリア原虫のようなマラリア原虫類、及びトキソプラズマ原虫を包含する。血液感染性の及び／又は組織の寄生生物は、マラリア原虫類、ネズミバベシア、多形バベシア、熱帯リーシュマニア、リーシュマニア類、ブラジルリーシュマニア、ドノバンリーシュマニア、ガンビアトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマ（アフリカ睡眠病）、クルーズトリパノソーマ（シャーガス病）、及びトキソプラズマ原虫を包含する。血液感染性の及び／又は組織の寄生生物は、マラリア原虫、ネズミバベシア、多形バベシア、熱帯リーシュマニア、リーシュマニア、ブラジルリーシュマニア、ドノバンリーシュマニア、ガンビアトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマ（アフリカ睡眠病）、クルーズトリパノソーマ（シャーガス病）、及びトキソプラズマ原虫を包含する。
【００３９】
本発明は本明細書に記載されている少なくとも１つの治療用分子を含有している組成物（医薬組成物を包含する）も特徴としている。実施態様では、組成物は薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤を含んでいる。
【００４０】
実施態様では、本明細書に記載されている少なくとも１つの方法に用いられる。
【００４１】
実施態様では、組成物はさらに、少なくとも１つの追加の治療薬剤を含んでいる。ある実施態様では、第二治療薬剤は病原体による感染に関連している症状を治療又は軽減する。ある実施態様では、第二治療薬剤は抗癌剤である。
【００４２】
本発明はさらに、本明細書に記載されている治療用分子及び／又は組成物を含有しているキットを特徴としている。実施態様では、キットは本明細書に記載されている少なくとも１つの方法に用いられる。関連する実施態様では、キットはさらに、本明細書に記載されている少なくとも１つの方法でキットを用いるための使用説明書を含んでいる。
【００４３】
ある実施態様では、少なくとも１つの追加の治療薬剤を含んでいる。実施態様では、第二治療薬剤は病原体による感染に関連している症状を治療又は軽減する。ある実施態様では、第二治療薬剤は抗癌剤である。
【００４４】
本発明の更なる目的及び利点はその一部が以下の記載に、そして一部が記載から明らかになるだろう、或いは本発明の実施によって獲得することができるだろう。本発明の目的及び利点は、添付されている特許請求の範囲に指摘されているものを含んでいる、本明細書に記載の要素及び組み合わせを用いて明らかにでき、そして獲得することができるだろう。前記の一般的な記載及び以下の詳細な記載の両方は単に例示的且つ説明的であって、特許請求している発明の限定ではないことを理解すべきである。本明細書に取り込まれてその一部を個性している添付図面は、本発明のいくつかの実施態様を説明して、本発明の原理を説明するのに役立っている。
【００４５】
（定義）
別に定義されていない限り、本明細書で用いられる全ての技術及び科学用語は当業者によって通常理解されている意味を有している。以下の参考資料は本発明で用いられる多くの用語の一般的な定義を有している技術を提供している：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 及び Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で用いられる以下の用語は、別に特定されていない限り、以下のそれらのものと見なされている意味を有している。
【００４６】
「治療用ＲＮＡスイッチ」又は「ｔｓｗＲＮＡ」とは、トリガー配列（例えば、認識ドメイン）と相補的である少なくとも１つの領域を有しているＲＮＡ分子又はＲＮＡ含有分子複合体を意味している。トリガー配列は、標的細胞に存在している任意の配列（ＲＮＡ又はＤＮＡ）（例えば、標的細胞に特異的な遺伝子、疾患関連遺伝子、癌関連遺伝子、病原体に関連しているＤＮＡ又はＲＮＡ分子など）であってよい。細胞中に標的ＲＮＡも存在し、これの阻害は病的状態の緩和をもたらす（例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡ、病原体のＲＮＡ媒体物（例えば、細菌性ｍＲＮＡ）、病原体のＲＮＡゲノム（例えば、ＲＮＡウィルス）など）。図１に示したように、ｔｓｗＲＮＡは、ｉ）少なくとも１つのアンチセンス配列（標的ＲＮＡに相補的であり、図１ではｓｉＲＮＡガイド鎖と称されている）、及びｉｉ）それぞれのアンチセンス配列に対して相補的なセンス配列（図１では、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖と称されている）を含んでいる。ｔｓｗＲＮＡの認識ドメインは、トリガー配列と同じか、それと連続している、隣接している、又はそれと関連してないものであってよい。トリガー配列との結合が存在しないと、ｔｓｗＲＮＡは不活性状態であって、ｔｓｗＲＮＡセンス及びｔｓｗＲＮＡアンチセンス領域はｓｉＲＮＡ様分子を形成しない。トリガー配列と結合すると、ｔｓｗＲＮＡは立体構造の変化を受けてｔｓｗＲＮＡセンス及びｔｓｗＲＮＡアンチセンス領域にｓｉＲＮＡ様分子の形成をもたらす。これはダイサーによって処理できる。ダイサーによる開裂はｔｓｗＲＮＡアンチセンスを放出することによって、標的ＲＮＡの開裂を開始する。
【００４７】
「標的遺伝子」、「標的ＲＮＡ」又は「標的ヒトＲＮＡ」とは、その阻害が望ましい機能性を有するポリペプチドをコードするＲＮＡを意味する。例えば、標的遺伝子は、その阻害が病的状態の改善をもたらす疾患関連遺伝子である。
【００４８】
「トリガー配列」とは、ｔｓｗＲＮＡを不活性状態から活性状態にスイッチさせる、ｔｓｗＲＮＡ中の配列と結合する標的細胞内に存在している配列（ＲＮＡ又はＤＮＡ）を意味する。ある特定の実施態様では、トリガー配列は疾患関連配列又は病的状態に特異的な配列である。
【００４９】
「薬剤」とは、任意の小分子化学化合物、抗体、核酸分子、又はポリペプチド、或いはそれらの断片であって、本発明のｔｓｗＲＮＡを含むことができる。
【００５０】
「緩和する」とは、疾患の発症又は進行の減少、抑制、減衰、軽減、停止、又は安定化を意味する。
【００５１】
「変化」とは、本明細書に記載されているような技術分野で公知の標準的な方法によって測定して遺伝子又はポリペプチドの発現レベル又は活性の変化（増大又は減少）を意味する。本明細書で用いられる変化は、発現レベルの１０％変化、好ましくは２５％変化、より好ましくは４０％変化、そして最も好ましくは発現レベルの５０％又はそれ以上の変化を包含する。
【００５２】
「類縁体」とは、同一ではないが、類似した機能又は構造特徴を有している分子を意味する。例えば、ポリペプチド類縁体は対応する天然のポリペプチドの生物活性を保持していて、その上に天然のポリペプチドと比べて類縁体の機能を増大するある特定の生物化学修正を有している。このような生物化学的修正は類縁体のプロテアーゼ耐性、膜透過性、又は半減期を、例えば、リガンド結合を変化せずに、増大することができる。類縁体は非天然のアミノ酸を包含できる。
【００５３】
本開示において、「から成る」、「から成っている」、「含んでいる」、「有している」などは米国特許法でこれらのものと見なしている意味を有していて、「包含する」「包含している」などを意味することができる；「実質的にから成っている」又は「実質的にから成る」などは米国特許法が見なしている意味を有していて、この用語には制約がなく、列挙されているものの基礎的或いは新規な特性が、列挙されているもの以上の存在によって変化しない限り列挙されているもの以上の存在を許容するが、先行技術の実施態様は除外する。
【００５４】
「検出する」は、検知すべき分析物の存在、非存在又は量を同定すること示す。
【００５５】
「検出可能レベル」とは、関心のある分子に結合したときに後者を、分光、光化学、生物化学、免疫化学、又は化学手段によって、検出可能にする組成物を意味する。例えば、有用な標識は、放射性同位元素、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般に用いられる様なもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテンを包含する。
【００５６】
「疾患」とは、細胞、組織、又は器官の正常な機能を損傷するか或いはこれを妨げる病気又は障害を意味する。疾患の制限のない例としては、癌、病原体（例えば、ウィルス、細菌、真菌、又は寄生生物）による感染などがある。例えば、疾患は、これに限定されないが、ウィルス感染、ＲＮＡウィルス感染、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、乳癌、前立腺癌、膠芽細胞腫、骨肉腫、結腸癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、及び黒色腫であってよい。
【００５７】
「有効量」とは、治療されていない患者と比べて疾患の症状を緩和するのに必要な薬剤の量を意味する。疾患の薬物治療のために本発明を実施するために用いられる、活性化合物（複数を含む）の有効量は、投与方法、対象の年齢、体重、及び総体的な健康に基づいて変化する。最終的に、主治医又は獣医が薬剤の適切な量及び投与計画を決定する。このような量を「有効」量と言及する。
【００５８】
本発明は、本明細書で説明されている方法によって特性化された疾患を治療するために特異性の高い薬剤の開発に有用な多数の標的を提供する。さらに、本発明の方法は対象に用いるのに安全な治療を同定する簡便な手段を提供する。また、本発明の方法は、高容量スループット、高感度、及び低い複雑度をもって、本明細書に記載されている疾患に有効な実に多数の化合物を分析する手段を提供する。
【００５９】
「断片」とは、ポリペプチド又は核酸分子の一部分を意味する。この部分は、好ましくは、参照核酸分子又はポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％を含んでいる。断片は１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００ヌクレオチド又はアミノ酸を含むことができる。
【００６０】
「ハイブリダイゼーション」は、相補分子間の水素結合を意味し、これはワトソン−クリック、フーグスティーン、又は逆フーグスティーン水素結合であってよい。例えば、アデニンとチミンは水素結合の形成を介して対合する相補的な核酸塩基である。
【００６１】
「抑制性核酸」とは、哺乳動物の細胞に投与すると標的遺伝子の発現を減少する（例えば、１０％、２５％、５０％、７５％、又はさらに９０〜１００％も）、二本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡ、或いはこれらの部分、又はこれらの模倣体を意味する。一般的に、核酸抑制剤は、少なくとも標的核酸分子、又はそのオーソログの一部分から成っているか、或いは少なくとも標的核酸分子の相補鎖の一部分から成っている。例えば、抑制性核酸分子は少なくとも本明細書で説明されている任意の又は全ての核酸の一部分から成っている。
【００６２】
「単離されたポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子が由来している有機体の天然ゲノムにおいて、遺伝子の側面に位置している遺伝子がない核酸（例えば、ＤＮＡ）を意味する。従ってこの用語は、例えば、ベクター内に；自己複製プラスミド又はウィルス内に；又は原核生物或いは真核生物のゲノムＤＮＡに取り込まれているか；又は他の配列から独立した別の分子（例えば、ｃＤＮＡ又はＰＣＲ又は制限エンドヌクレアーゼ消化で作られたゲノム若しくはｃＤＮＡ断片）である組み換えＤＮＡを包含している。さらにこの用語はＤＮＡから転写されたＲＮＡ分子、並びに追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の部分である組み換え遺伝子を包含している。
【００６３】
「単離されたポリペプチド」とは、天然ではそれに付随している成分から分離されている本発明のポリペプチドを意味する。一般的に、タンパク質及び天然ではそれと結合している天然の有機分子を少なくとも６０重量％含んでいないときにポリペプチドは単離されている。調製物は好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、そして最も好ましくは少なくとも９９重量％が本発明のポリペプチドである。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然物から抽出して、このようなポリペプチドをコードする組み換え核酸の発現によって；又はタンパク質を化学的に合成して得ることができる。純度は適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミド電気泳動、又はＨＰＬＣ分析によって測定できる。
【００６４】
「マーカー」とは、疾患又は障害に関連している発現レベル又は活性の変化を有しているタンパク質又はポリペプチドである。
【００６５】
「薬剤を得ること」として本明細書で用いられる「得ること」は、合成すること、購入すること、又はその他の入手を含んでいる。
【００６６】
「プライマーセット」は例えば、ＰＣＲに用いることができるオリゴヌクレオチドのセットを意味する。プライマーセットは少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、又はそれ以上のプライマーを含んでいる。
【００６７】
「減少する」とは、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、又は１００％の負の変化を意味する。
【００６８】
「参照」とは、標準又は対照条件を意味する。
【００６９】
「参照配列」は、配列比較の基準として用いられる確定された配列である。参照配列は特定配列の一部又は全て；例えば、ｃＤＮＡ又は遺伝子配列の一部分又は全長、或いは全ｃＤＮＡ又は遺伝子配列であってよい。ポリペプチドに関しては、参照ポリペプチド配列の長さは一般に少なくとも約１６アミノ酸、好ましくは少なくとも約２０アミノ酸、より好ましくは約２５アミノ酸、そしてさらにより好ましくは約３５アミノ酸、約５０アミノ酸、又は約１００アミノ酸であろう。核酸に関しては、参照核酸配列の長さは一般に少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、そしてさらにより好ましくは約１００ヌクレオチド、又は約３００ヌクレオチド或いはその近辺又はその間の整数であろう。
【００７０】
「ｓｉＲＮＡ」とは、二本鎖ＲＮＡを意味する。最適には、ｓｉＲＮＡは長さが１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４ヌクレオチドであって、その３’末端に突き出ている２つの塩基を有している。これらのｄｓＲＮＡは個々の細胞又は動物全体に取り込むことができる；例えば、これらは血流を介して全身に取り込むことができる。このようなｓｉＲＮＡはｍＲＮＡのレベル又はプロモータ活性を下方制御するために用いられる。
【００７１】
本明細書で用いられる「アンチセンス鎖」は、標的ＲＮＡの配列に相補的な配列を有している一本鎖の核酸分子を示す。アンチセンス鎖が塩基類似性を有する改変ヌクレオチドを含んでいる場合は、その全長にわたって相補的である必要はないが、少なくとも標的ＲＮＡとハイブリダイズする必要がある。
【００７２】
本明細書で用いられる「センス鎖」は、アンチセンス鎖の配列に相補的な配列を有している一本鎖核酸分子を示す。アンチセンス鎖が塩基類似性を有する改変ヌクレオチドを含んでいる場合は、センス鎖はアンチセンス鎖の全長にわたって相補的である必要はないが、少なくともアンチセンス鎖と二本鎖になっていなければならない。
【００７３】
本明細書で用いられる「ガイド鎖」は「アンチセンス鎖」とも呼ばれ、ｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ含有分子（例えば、本発明の処理済ｔｓｗＲＮＡ）の一本鎖核酸を示し、これは標的ＲＮＡにＲＮＡ干渉をもたらすのに十分な相補性を有している。ダイサーによるｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ含有分子の開裂後、ガイド鎖の断片はＲＩＳＣ（ＲＮＡ−誘発サイレンシング複合体）と結合したままで、ＲＩＳＣ複合体の成分として標的ＲＮＡと結合して、ＲＩＳＣによる標的ＲＮＡの開裂を促進する。本明細書で用いられるガイド鎖は連続した一本鎖核酸を示す必要はなく、ダイサーによって開裂される部位に、任意に切れ目を有していればよい。ガイド鎖はアンチセンス鎖であってよい。
【００７４】
本明細書で用いられる「パッセンジャー鎖」は、ｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ含有分子のオリゴヌクレオチド鎖を示し、これはガイド鎖のそれと相補的な配列を有している。本明細書で用いられるパッセンジャー鎖は連続した一本鎖核酸を示す必要はなく、ダイサーによって開裂される部位に、任意に切れ目を有していればよい。パッセンジャー鎖はセンス鎖であってよい。
【００７５】
「相補性」とは、核酸が他の核酸配列と従来のワトソン・クリック又はその他の従来とは異なる形式の何れかで水素結合（複数を含む）を形成できることを意味する。
【００７６】
本発明の核酸分子に関しては、核酸分子の相補配列との結合遊離エネルギーは核酸の関連機能、例えば、ＲＮＡ干渉活性を進めるのに十分である。核酸分子についての結合遊離エネルギーの測定は当該技術分野において周知である（例えば、Turner et al., 1987, CSH Symp. Quant. Biol. LII pp. 123-133; Frier et al., 1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-9377; Turner et al., 1987, J. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785 を参照されたい）。相補性パーセントは第２核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン・クリック塩基対合）を形成できる核酸分子中の連続残基のパーセントを示す（例えば、第１オリゴヌクレオチドの、合計１０ヌクレオチドのうち５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドが１０ヌクレオチドを有している第２核酸配列と塩基対合したことは、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％の相同性を表す。「完全相同性」は、核酸配列の全連続残基が第２核酸配列中の同数連続残基と水素結合することを意味している。一実施態様では、本発明の製剤のｄｓＲＮＡ分子は、１つ又はそれ以上の標的核酸分子又はその一部分と相同性がある約１９〜約３０（例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）のヌクレオチドから成っている。
【００７７】
「特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチドを認識して結合するが、試料、例えば、天然に本発明のポリペプチドを含んでいる生体試料中の他の分子を実質的に認識して結合しない化合物又は抗体を意味する。
【００７８】
本発明の方法に有用な核酸分子は、本発明のポリペプチド又はその断片をコードする任意の核酸分子を包含している。このような核酸分子は内因性核酸配列と１００％同一である必要はないが、一般的に実質的な同一性を示すだろう。内因性配列と「実質的に同一性」を有しているポリヌクレオチドは一般に、二本鎖核酸分子の少なくとも一本鎖とハイブリダイズ可能である。本発明の方法に有用な核酸分子は、本発明のポリペプチド又はその断片をコードする任意の核酸分子を包含している。このような核酸分子は内因性核酸配列と１００％同一である必要はないが、一般的に実質的な同一性を示すだろう。内因性配列と「実質的に同一性」を有しているポリヌクレオチドは一般に、二本鎖核酸分子の少なくとも一本鎖とハイブリダイズ可能である。「ハイブリダイズ」とは、ストリンジェンシーの様々な条件下で、相同性のあるポリペプチド（例えば、本明細書に記載の遺伝子）、又はその部分の間で二本鎖分子を形成する対合を意味する。（例えば、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507 を参照されたい）。
【００７９】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は通常約７５０ｍＭのＮａＣｌ及び７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム未満、好ましくは約５００ｍＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム未満、より好ましくは約２５０ｍＭのＮａＣｌ及び２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム未満であろう。有機溶媒、例えば、ホルムアミドの非存在下では低いストリンジェントなハイブリダイゼーションが得られるのに対して、少なくとも約３５％のホルアミド、より好ましくは少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で高いストリンジェントなハイブリダイゼーションが得られる。ストリンジェントな温度条件は、通常少なくとも約３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、そして最も好ましくは約４２℃を包含する。ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、キャリアＤＮＡの混入又は除外のような様々な追加のパラメータは当業者に周知である。ストリンジェンシーの各種レベルは必要に応じてこれらの多種条件を組み合わせて達成される。好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーションは７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、及び１％のＳＤＳ中、３０℃で生じるだろう。より好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーションは５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミド、及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中、３７℃で生じるだろう。最も好ましい態様では、ハイブリダイゼーションは２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、及び２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ中、４２℃で生じるだろう。これらの条件の有用な変更は当業者には直ちに明らかになるだろう。
【００８０】
殆どの適用に関して、ハイブリダーゼションに続く洗浄工程はストリンジェントの点で異なっている。洗浄ストリンジェント条件は塩濃度によってそして温度によって明確にできる。上記のように、洗浄ストリンジェントは塩濃度の減少によって又は温度の上昇によって増大することができる。例えば、洗浄工程に対するストリンジェントな塩濃度は約３０ｍＭのＮａＣｌ及び３ｍＭのクエン酸三ナトリウム未満であることが好ましく、そして１４ｍＭのＮａＣｌ及び１．４ｍＭのクエン酸三ナトリウム未満がより好ましい。洗浄工程に対するストリンジェントな温度条件は、通常少なくとも約２４℃の、より好ましくは少なくとも約４２℃の、そしてさらにより好ましくは少なくとも６８℃の温度を包含する。好ましい実施態様では、洗浄工程は、３０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのクエン酸三ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳ中２５℃で生じるだろう。より好ましい実施態様では、洗浄工程は、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳ中４２℃で生じるだろう。より好ましい実施態様では、洗浄工程は、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳ中６８℃で生じるだろう。これらの条件に対する更なる変更は当業者に直ちに明らかであろう。ハイブリダーゼション技術は当業者に周知であって、例えば、Benton and Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); 及び Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York に記載されている。
【００８１】
「実質的に同一である」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されている任意の一つのアミノ酸配列）又は核酸配列（例えば、本明細書に記載されている任意の一つの核酸配列）に対して少なくとも５０％同一性を示しているポリペプチド又は核酸分子を意味する。好ましくは、このような配列が比較に用いた配列に対してアミノ酸レベル又は核酸において少なくとも６０％、より好ましくは８０％又は８５％、そしてさらに好ましくは９０％、９５％又はさらに９９％同一である。
【００８２】
配列同一性は一般に配列分析ソフトウェア（例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705、BLAST、BESTFIT、GAP、又は PILEUP/PRETTYBOX プログラム）を用いて測定する。このようなソフトウェアは、各種の置換、欠失、及び／又はその他の修飾に対する同一性の程度を割り当てて同一又は類似配列を適合する。同類置換は通常、以下のグループ内の置換を包含する：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を測定する典型的な手法として、ＢＬＡＳＴプログラム近縁の配列を示すｅ−３〜ｅ−１００の確率スコアを有する、ＢＬＡＳＴプログラムを用いることができる。
【００８３】
「対象」とは、これに限定されないが、ヒト又は、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ若しくはネコのような非ヒト哺乳動物を包含している、哺乳動物を意味する。
【００８４】
本明細書で提供されている範囲は、範囲内の全ての値に対する省略であると理解されている。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０よりなる群からの任意の数、数の組み合わせ、又は部分的な範囲を包含していると理解される。
【００８５】
本明細書で用いられる用語「治療する」、「治療すること」、「治療」などは疾患及び／又はそれに伴う症状を回復又は改善することを示す。当然のことながら、妨げるものではないが、疾患又は病気の治療は疾患、病気又はそれらに関連する症状を完全に取り除く必要はない。
【００８６】
明確に述べているか或いは文脈から明瞭である場合を除いて、本明細書で用いられる用語「又は（ｏｒ）」は包括的であると理解される。明確に述べているか或いは文脈から明瞭である場合を除いて、本明細書で用いられる用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は単数又は複数であると理解される。
【００８７】
明確に述べているか或いは文脈から明瞭である場合を除いて、本明細書で用いられる用語「約」は、当該技術分野において通常の許容範囲内、例えば、平均値の２標準誤差範囲内であると理解される。約は、述べられた値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内と理解できる。文脈から明確である場合を除いて、本明細書で提供されている数値は用語約で修飾されている。
【００８８】
本明細書の可変物の何れかの定義における化学基を列挙した記述は、単一の基又は列挙された基の組み合わせの何れかとしての可変物の定義を包含している。本明細書の可変物又は態様に関する実施態様は任意の単一実施態様或いは他の任意の実施態様又はそれらの一部との組み合わせとしての実施態様を包含している。
【００８９】
本明細書で提供されている組成物又は方法は、本明細書で提供されている１つ又はそれ以上の他の任意の組成物及び方法と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
実施例を用いているが、発明を記載されている具体的な実施態様に限定していない以下の詳細な説明は、添付の図面を併用して理解することができるだろう。
【００９１】
【図１】図１は、本明細書に記載されている治療用スイッチングＲＮＡの経路の概略を描写している本発明の実施態様である。  工程１において、標的のウィルスゲノムが存在していないために、ｔｓｗＲＮＡは不活性な構造である。  工程２において、ウィルスゲノムが存在すると、ｔｓｗＲＮＡはウィルスゲノムと結合し、立体構造の変化を受けて、活性なｔｓｗＲＮＡを形成する。ここで、活性形態は露出した或いは明白なｓｉＲＮＡ様部分を含んでいる。  工程３において、ダイサーは活性ｔｓｗＲＮＡのｓｉＲＮＡ部分を認識して開裂する。  工程４において、ｔｓｗＲＮＡのガイド鎖部分がＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体）内に取り込まれて、負荷ＲＩＳＣ複合体を形成する。  工程５において、標的のヒトｍＲＮＡが負荷ＲＩＳＣ複合体によって認識されて分解される。
【図２】図２は、ｔｓｗＲＮＡの説明のための実例において予想される第２構造の概略図である。
【図３】図３Ａ及び３Ｂは、結合していない（不活性状態の）ｔｓｗＲＮＡの三次元構造を表している。
【図４】図４は、結合している（活性状態の）ｔｓｗＲＮＡの構造を表している。
【図５】図５は、二本鎖ｔｓｗＲＮＡの説明のための実例を示している。
【図６】図６は、トリガー配列の非存在下における二本鎖ｔｓｗＲＮＡプロトファンクショナル鎖の予測される折り畳みの説明図である。
【図７】図７は、不活性構造における二本鎖ｔｓｗＲＮＡの説明のための実例における第二構造モデルの説明図である。
【図８】図８は、アダプター鎖を有していない二本鎖ｔｓｗＲＮＡ複合体の予測構造、すなわち、トリガー配列の存在下における活性構造の説明図である。
【図９】図９は、偽結び目構造相互作用を含む二本鎖ｔｓｗＲＮＡの説明のための実例の予測される構造を示す。
【図１０】図１０は、トリガー配列（ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ）の存在下における不活性形態から活性形態への移行中の二本鎖ｔｓｗＲＮＡの立体構造の変化を示している説明図である。
【図１１】図１１は、二本鎖ｔｓｗＲＮＡの構造を示している説明図である。
【図１２】図１２は、二本鎖ｔｓｗＲＮＡ複合体の三次元モデルの説明図である。
【図１３】図１３は、輸送鎖、アダプター鎖、アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖、及びセンスｓｉＲＮＡ鎖からなる四本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド複合体の説明図である。
【図１４】図１４は、四本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド複合体の構造特徴及びトリガー配列に応答する立体構造の変化を示している説明図である。
【図１５】図１５は、四本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド複合体の説明のための実例の配列を示す。
【図１６】図１６は、例示的な四本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド複合体の予測される二次構造である。
【図１７】図１７は、トリガー配列（ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ）の存在下における不活性形態から活性形態への移行中の四本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド複合体の立体構造の変化を示している説明図である。
【図１８】図１８は、逐次手法による四本鎖スイッチのアセンブリーを示す。最初に、アダプター−構築物−アンチセンスの三量体を形成し、次いでセンス鎖を付加して５５℃で２０分培養した。全四本鎖（アダプター、構築物、アンチセンス及びセンス）を混合すると、四本鎖スイッチの形成は不可能である（右側の最終レーン）。３つの異なったプロトコールを三量体形成のために試験した。プロトコール＃１：アダプター、構築物及びトーホールドを混合して９５℃で２分間培養し、次いで直ちに５５℃まで冷却して２０分間培養した。プロトコール＃２：アダプター、構築物及びトーホールドを混合して９５℃で２分間培養し、次いで直ちに室温（ＲＴ）まで冷却して２０分間培養した。プロトコール＃３：アダプター、構築物及びトーホールドを混合して９５℃で２分間培養し、次いで直ちに２０℃まで冷却して２０分間培養した。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
本発明は、病的細胞中の標的核酸分子を特異的に阻害するのに有用な組成物及び方法を特徴としている。ある特定の実施態様では、病的細胞は腫瘍細胞又は病原体に感染している細胞であって、標的核酸分子の阻害は病的細胞及び／又は病原体の死及び根絶をもたらす。本発明は、治療用のＲＮＡスイッチ（ｔｓｗＲＮＡ）を特徴としていて、これはトリガー配列（例えば、標的細胞に特異的な遺伝子、疾患関連遺伝子、癌関連遺伝子、病原体に関連しているＤＮＡ又はＲＮＡ分子など）に相補性がある少なくとも１つの配列を有し、そして標的核酸分子（例えば、目的の遺伝子でコードされる標的ＲＮＡのような、その阻害が病的細胞の治療、例えば、アポトーシス又は壊死経路を介する死、をもたらしやすい標的ヒトＲＮＡ；その阻害が病原体の複製を阻害することによって感染及び／又はその関連症状を治療する、病原性ＲＮＡ）に相補性があるアンチセンスを有しているＲＮＡ分子又はＲＮＡ含有分子複合体である。ｔｓｗＲＮＡはアンチセンス配列（ｔｓｗＲＮＡセンス鎖）に相補性があるセンス鎖も含んでいる。トリガー配列の非存在下では、ｔｓｗＲＮＡは不活性状態にあって、そのような場合はｔｓｗＲＮＡセンス及びｔｓｗＲＮＡアンチセンス配列はｓｉＲＮＡ様分子を形成しない。しかしながら、トリガー配列の存在下では、ｔｓｗＲＮＡはトリガー配列との結合の結果として立体構造の変化を受ける。立体構造の変化はｔｓｗＲＮＡが活性状態になってそこでｔｓｗＲＮＡセンス及びｔｓｗＲＮＡアンチセンス配列がｓｉＲＮＡ様分子を形成するようにする。ｓｉＲＮＡ様分子はダイサーによって処理されて、その後ｔｓｗＲＮＡアンチセンス鎖（すなわち、ガイド鎖）は標的ＲＮＡの分解をもたらすＲＩＳＣ複合体の一部となる。
【００９３】
トリガー分子と結合して立体構造の変化を受けるというｓｉＲＮＡ含有ＲＮＡ構築物の前記概念とは対照的に、特許請求されている構築物はその不活性状態において部分的に形成されたｓｉＲＮＡ様螺旋を含んでいない。不活性な構造において、ｓｉＲＮＡガイド（ｔｓｗＲＮＡアンチセンス）及びｓｉＲＮＡパッセンジャー（ｔｓｗＲＮＡアンチセンス）に対応する配列領域はＲＮＡ塩基対合を介して相互作用しない。その代わりに、構築物がトリガー配列と結合する場合に限りｓｉＲＮＡ様螺旋が形成される。このことはＲＮＡｉ活性化ＲＮＡスイッチの２つの問題を打開する。第１に、その不活性状態においてＲＮＡスイッチのダイサーによる望ましくない処理が起こりそうもない。第２に、（ヌクレアーゼ分解によって生じる）部分的に分解したＲＮＡスイッチが、ｓｉＲＮＡ様螺旋の形成を誘導しにくく、それによってＲＮＡ干渉経路を間違えて活性化しにくくする。これは、治療用ＲＮＡ干渉経路は、それが無傷であってその活性構造にあるならばＲＮＡスイッチによってのみ活性化されるので、記載されているＲＮＡスイッチは殆ど副作用を有していないという効果を有している。さらに、実施態様では、単鎖ヌクレオチドの最小数を含むようにしてヌクレアーゼの効果を最小にするように活性構造を設計できる。
【００９４】
実施態様では、本発明のｔｓｗＲＮＡは、少なくともそれらの１つがＲＮＡ（二本鎖ｔｓｗＲＮＡ）を完全に又は部分的に含んでいる核酸鎖から成っている。アダプター鎖はＲＮＡ、ＤＮＡ、その他のヌクレオチド類縁体から成っていて、不活性構造においてプロトファンクショナル（protofunctional）ＲＮＡ鎖と結合する。トリガー配列の存在下で、ｔｓｗＲＮＡはトリガー配列と結合する。結合しない残りのプロトファンクショナル鎖はｓｉＲＮＡ様ＲＮＡ二重螺旋を形成する立体構造の変化を受ける。ｓｉＲＮＡ様二重螺旋はダイサー（ＤＩＣＥＲ）によって認識されて処理され、それによってＲＮＡサイレンシング経路の活性化を引き起こす。ＲＮＡサイレンシング経路の活性化は望ましい標的核酸分子又は経路の下方制御を引き起こす。
【００９５】
さらに別の実施態様では、四本鎖：ＤＮＡ輸送鎖、ＲＮＡアダプター鎖、センスｓｉＲＮＡ鎖、及びアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖からなる、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド複合体が提供される。この四本鎖は結合してハイブリッド複合体を形成する。トリガー配列の非存在下では、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド複合体は不活性形態にある、トリガー配列の存在下では、ｔｓｗＲＮＡはトリガー配列と結合してアダプター鎖をＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド複合体から除去する。残りの複合体は輸送鎖、センスｓｉＲＮＡ鎖、及びアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖から成り、これはｓｉＲＮＡ螺旋及び自己フォールディング輸送鎖の形成をもたらす立体構造の変化を受ける。アダプター鎖の大部分はトリガー配列に逆相補性である。輸送鎖はいくつかの領域：センスｓｉＲＮＡと結合できる領域、アダプター鎖と結合できる領域、及びアンチセンスｓｉＲＮＡと結合できる領域：から成っている。輸送鎖はさらに、アダプター鎖の除去の後にｓｉＲＮＡ二重螺旋の形成を促進する追加の相補領域を含んでいる。ｓｉＲＮＡ二重螺旋はダイサーによって認識されて処理され、それによってＲＮＡサイレンシング経路の活性化を引き起こす。ＲＮＡサイレンシング経路は望ましい標的核酸分子又は経路の下方制御を引き起こす。
【００９６】
実施態様では、トリガー配列は標的細胞中に存在する配列であり、それによってｔｓｗＲＮＡが標的細胞中で活性化される。別の実施態様では、標的細胞は病的細胞であってトリガー配列は疾患関連又は疾患特異的な配列（例えば、疾患のマーカー）である。別の実施態様では、トリガー配列は病原性ＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。ｔｓｗＲＮＡの活性化は標的ＲＮＡ（例えば、細胞性ＲＮＡ又は病原性ＲＮＡ）を阻害するので病的状態を緩和する。
【００９７】
本発明の一態様では、病的細胞は病原体（例えば、ウィルス、細菌、真菌、又は寄生生物）に感染した細胞である。実施態様では、ｔｓｗＲＮＡは細胞性タンパク質を標的にするので、感染した細胞の死を引き起こす。別の実施態様では、ｔｓｗＲＮＡはゲノムＲＮＡ（例えば、ウィルス性ＲＮＡ）又は病原体に関連しているＲＮＡ中間体（例えば、細菌性ｍＲＮＡ）を標的にする。病原性ＲＮＡの分解は病原体の付加を減少するので、感染及び／又は関連する症状を治療する。関連する実施態様では、トリガー配列は病原性ＤＮＡ又はＲＮＡ、或いは病原性感染に関連している細胞性ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、細胞マーカー）であってよい。
【００９８】
実施態様では、病原体はウィルスであって、トリガー配列はウィルス性ゲノムである。関連する実施態様では、ウィルスはＨＩＶである。いくつかの関連する実施態様では、ウィルス性ゲノムはＨＩＶゲノムであって、標的ＲＮＡはアポトーシス阻害タンパク質をコードする。このようなｔｓｗＲＮＡがＨＩＶに感染した細胞に導入されると、ｔｓｗＲＮＡはアポトーシス阻害分子の阻害をもたらしこれはＨＩＶ感染細胞の死を引き起こす。
【００９９】
本発明は、ｔｓｗＲＮＡの治療有効量を投与することによって対象における病原体の感染を治療する方法をも提供する。いくつかの実施態様では、ｔｓｗＲＮＡ病原性ＲＮＡ又はＤＮＡの存在下で活性されて標的のアポトーシス阻害剤の分解をもたらし、それによって感染した細胞の死をもたらす。
【０１００】
実施態様では、病原体はウィルス（例えば、ＲＮＡウィルス）である。関連する実施態様では、ｔｓｗＲＮＡはＨＩＶゲノムの存在下で活性化されて標的のアポトーシス阻害剤の分解をもたらし、それによってＨＩＶに感染した細胞の死及び対象における感染の治療及び／又は減少をもたらす。
【０１０１】
別の実施態様では、病的細胞は腫瘍細胞である。関連する実施態様では、トリガー配列は癌関連遺伝子である。このようなｔｓｗＲＮＡが腫瘍細胞に導入されると、ｔｓｗＲＮＡはｓｉＲＮＡ様螺旋を活性化して暴露する。活性化によって生産されたｓｉＲＮＡは標的遺伝子を阻害してこれは腫瘍細胞の死をもたらす。
【０１０２】
本発明は、ｔｓｗＲＮＡの有効量を投与することによる新生物を有している対象を治療する方法も提供する。実施態様では、ｔｓｗＲＮＡは癌関連遺伝子の存在下で活性化されて標的アポトーシス阻害剤の破壊をもたらし、それによって腫瘍細胞の死及び対象から新生物の治療及び／又は減少をもたらす。
【０１０３】
本明細書の方法は、（このような治療が必要であると認定された対象を含む）対象に本明細書に記載されている化合物又は本明細書に記載されている組成物の治療有効量を投与してこのような効果を発揮することを含んでいる。このような治療を必要としている対象の認定は、対象又は医療専門家の判断であってよく、主観的（例えば、意見）又は客観的（例えば、試験又は診断方法による測定）であってもよい。
【０１０４】
本明細書で用いる用語「治療する」、「治療すること」、「治療」などは、疾患及び／又はそれに関連する症状を減少又は緩和することを示す。当然のことながら、妨げはしないが、疾患又は病気を治療することは疾患、病気又はこれらに付随する症状が完全に取り除かれることを必要としない。
【０１０５】
本明細書で用いられる用語「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的治療」などは、疾患又は病気を有していないが、これを発症する危険性があるか又はこれに敏感である対象における疾患又は病気を発症する可能性を減少することを示す。
【０１０６】
本発明の治療方法（予防的治療を含む）は、一般に、本明細書に記載の処方の化合物のような本明細書の化合物の治療有効量を、それを必要としている哺乳動物、特にヒトを含む対象（例えば、動物、ヒト）へ投与することを含んでいる。このような治療は、疾患、病気、又はこれらの症状に罹っている、患っている、感受性がある、又は罹る危険性がある対象、特にヒトに適切に投与されるだろう。「危険性がある」対象の確定は、診断試験又は対象若しくは医療提供者の意見（例えば、遺伝子検査、酵素若しくはタンパク質マーカー、マーカー（本明細書で定義した）、家族歴、など）による主観的又は客観的な確定によって行うことができる。本明細書の化合物は標的遺伝子が関与しているその他の疾患の治療にも用いることができる。
【０１０７】
一実施態様では、本発明は治療の進捗状況を監視する方法を提供する。方法は病的細胞に関する診断マーカー（例えば、本明細書の化合物によって調節される本明細書で説明した標的、タンパク質又はその指標となるもの、など）のレベルを決定する工程、又は病的細胞に関連している疾患又はその症状に罹っているか又はそれに敏感な対象（対象は疾患又はその症状を治療するのに十分な治療量の本明細書の化合物を投与されている）における診断測定する（例えば、スクリーニング、アッセイ）工程を含んでいる。この方法で確定されたマーカーのレベルを健常な対照又は罹病患者何れかにおけるマーカーの公知レベルと比較して対照の病状を確立できる。好ましい実施態様では、対象のマーカーの第２レベルを第１レベルの確定より後の時点に確定して、２つのレベルを比較して病気の経過又は治療の効果を観察する。ある特定の好ましい実施態様では、対象におけるマーカーの治療前レベルを本発明に従う治療開始の前に確定し：このマーカーの治療前レベルを次いで治療開始後の対象におけるマーカーのレベルと比較して治療の効果を確認する。
【０１０８】
（医薬治療）
本開示は、病的細胞における標的タンパク質の発現又は活性化を減少するｔｓｗＲＮＡを提供する。一実施態様では、本開示は、病的細胞（例えば、腫瘍細胞又は病原体感染細胞）におけるアポトーシス阻害剤の発現又は活性化を阻害するｔｓｗＲＮＡを含有している医薬化合物を提供する。さらなる実施態様では、病的細胞はＨＩＶウィルスに感染している。治療的使用のために、本明細書に開示された使用に用いるように特定された組成物又は薬剤は、例えば、薬学的に許容される担体又は送達賦形剤中に製剤化されて全身投与することができる。投与の好ましい経路としては、例えば、患者に連続、持続レベルの薬剤を提供する皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、又は皮内注射が挙げられる。ヒト患者又は他の動物の治療は、生理学的に許容される担体中の癌治療剤の治療有効量を用いて実施できる。適切な担体及びそれらの製剤は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin に記載されている。投与される治療薬剤の量は、投与の方法、患者の年齢及び体重、及び癌の進行及び転移の臨床症状によって異なる。一般に、量は癌の進行又は転移の治療に用いられている他の薬剤に用いられているものの範囲内であってよいが、ある特定の場合は化合物の増大した特異性のために低い量が必要となる。化合物は当業者に公知の診断方法によって、又は癌の進展又は転移と関連している遺伝子の転写活性化を測定するアッセイを用いて確認される癌の進行又は転移の臨床的又は生理的症状を制御する用量で投与できる。
【０１０９】
（医薬組成物の製剤）
病的細胞の治療のための、本開示のｔｓｗＲＮＡ又はそれらの類縁体の投与は、他の成分と組み合わせて、疾患を改善し、回復し、根絶し、或いは安定化するのに有効であるｔｓｗＲＮＡの量をもたらす適切な手段で行うことができる。好ましくは、送達又は投与の様式は、細胞、好ましくは、ｔｓｗＲＮＡが病的細胞に特異的なトリガー配列と相互作用することができる病的細胞に、ｔｓｗＲＮＡの侵入をもたらす傾向があるものである。一実施態様では、ｔｓｗＲＮＡの投与は標的核酸分子の発現又は活性化を減少し、この阻害は疾患の改善をもたらす。別の実施態様では、新生物に関連している疾患又は病原体感染を予防又は治療するためにｔｓｗＲＮＡを対象に投与する。
【０１１０】
このようなｔｓｗＲＮＡを投与する方法は当該技術分野において公知である。本開示は当該技術分野で公知の手段による薬剤の治療用投与を提供する。化合物は、適切な担体物質中に妥当な量で含有できて、一般に組成物の総量の１〜９５重量％の量で存在する。組成物は非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、又は腹腔内）投与経路に適している剤形で提供できる。医薬組成物は通常の製剤慣行に従って製剤化できる（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick 及び J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York を参照されたい）。適切な製剤には、経口投与用の形態、デポ製剤、貼付剤による送達用製剤、及び局所的に又は経皮的に送達するための半固形形態が挙げられる。
【０１１１】
本開示に従う医薬組成物は、実質的に投与と同時に、或いは投与後の任意の所定時間又は時点に活性化合物を放出する製剤であってよい。組成物の後者のタイプは一般に制御放出製剤として知られていて、これは（ｉ）長期間に渡って体内に薬剤の実質的に一定濃度を作り出す製剤；（ｉｉ）所定の遅延時間後に長期間に渡って体内に薬剤の実質的に一定濃度を作り出す製剤；（ｉｉｉ）活性物質の血漿レベルの変動（鋸歯型の動態パターン）に関わる望ましくない副作用の最小化を伴う体内の比較的一定な効果レベルを保持することによって所定期間の間、作用を持続する製剤；（ｉｖ）例えば、放出制御組成物の空間配置を中枢神経系又は脳脊髄液に又はその中に隣接させることによって作用を局在化させる製剤；（ｖ）用量を、例えば、１週間又は２週間に１度投与するように、便利な投薬を許容する製剤；及び（ｖｉ）癌の中でその機能が乱されている特定の細胞型に特定の薬剤を送達する担体又は化学誘導体を用いることによって腫瘍を標的にする製剤を包含する。いくつかの適用に関しては、放出制御製剤は血漿レベルを治療レベルに持続するために日中の頻回投薬の必要性をなくす。
【０１１２】
放出速度が問題の化合物の代謝速度を上回る放出制御を得るために多数の戦略のいくつかを遂行することができる。一例においては、例えば、各種の放出制御組成物及びコーティングを含む、各種製剤パラメータ及び成分の適切な選択によって放出制御が得られる。従って、投与によって治療薬を制御方式で放出する治療薬を適切な賦形剤と共に医薬組成物に製剤化する。例としては、単一又は複数ユニットの錠剤、又はカプセル組成物、油状溶液、懸濁剤、乳剤、マイクロカプセル、マイクロスフェア、分子錯体、ナノ粒子、貼付剤、及びリポソームが挙げられる。
【０１１３】
治療用ｔｓｗＲＮＡを感染した対象の細胞へ輸送する本発明が目論んでいる送達媒体は、適切な標的手段を活用することによって特定の細胞も標的にできる。このような手段としては、送達部分又は標的部分を送達媒体に組み込んで、特定の細胞又は組織又は体の領域へのｔｓｗＲＮＡの標的送達が可能にすることが挙げられる。
【０１１４】
本明細書で用いられる用語「送達部分」又は「標的部分」は、結合又は付着した送達媒体又は本発明の裸のＲＮＡの、インビトロ又はインビボの何れかにおける、細胞、組織又は対象の細胞、細胞型、対象内の組織又は部位と付随、結合又は侵入する能力を増強できる部分である。ある特定の実施態様では、送達部位はポリペプチド、炭水化物又は脂質である。随意に、送達部位はアプタマー、抗体、抗体断片、又はナノボディである。典型的な送達部位としては、ソマスタチン（ｓｓｔ２）、ボンベスチン／ＧＲＰ、黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ／Ｙ１）、ニューロテンシン（ＮＴ１）、血管作動性腸管ポリペプチド（ＶＩＰ／ＶＰＡＣ１）及びコレシストキニン（ＣＣＫ／ＣＣＫ２）のような、腫瘍標的部位が挙げられる。ある特定の実施態様では、送達部分は本発明の化合物と非共有結合している。別の実施態様では、送達部分は本発明の送達媒体に付着しており、共有結合していてもよい。更なる実施態様では、送達部分は本発明の送達媒体に付着しており、共有結合していてもよい。追加の実施態様では、送達部分は本発明の「送達物」（例えば、本発明のｔｓｗＲＮＡ）と直接付着しており、共有結合でもよい。特定の実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、アプタマーに付着した「裸の」ＲＮＡとして送達され、アプタマーは特定の細胞型を標的にする。
【０１１５】
ある特定の場合は、本発明の製剤は、標的細胞型上の特定の受容体と相互作用できる標的リガンドのような、リガンドを含んでいる。典型的なリガンドとしては、脂質、両親媒性脂質、担体化合物、生物親和性化合物、生体材料、バイオポリマー、分析的に検出可能な化合物、治療効果のある化合物、酵素、ペプチド、タンパク質、抗体、免疫促進剤、放射標識、発蛍光団、ビオチン、薬剤、ハプテン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖類、リポソーム、ビロソーム、ミセル、免疫グロブリン、官能基、その他の標的部位、又は毒素を挙げられる。
【０１１６】
ある特定の別の実施態様では、ｔｓｗＲＮＡ送達物をウィルス感染細胞へ送達する送達媒体は、リポプレックス（例えば、米国特出願公開第２００３０２０３８６５号；及び Zhang et al., J. Control Release, 100:165-180 (2004) を参照されたい）、ｐＨ感受性リポプレックス（例えば、米国特許出願公開第２００２／０１９２２７５号を参照されたい）、可逆的にマスクされたリポプレックス（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１８０９５０号を参照されたい）、カチオン性脂質から成る化合物（例えば、米国特許第６，７５６，０５４号；及び米国特許出願公開第２００５／０２３４２３２号を参照されたい）、カチオン性リポソーム（例えば、米国特許出願公開第２００３／０２２９０４０号、同第２００２／０１６００３８号、及び同第２００２／００１２９９８号；米国特許第５，９０８，６３５号；及び国際特許出願公開ＷＯ ０１／７２２８３号を参照されたい）、アニオン性リポソーム（例えば、米国特許出願公開第２００３／００２６８３１号を参照されたい）、ｐＨ感受性リポソーム（例えば、米国特許出願公開第２００２／０１９２２７４号；及びＡＵ２００３／２１０３０３号を参照されたい）、抗体をコーティングしたリポソーム（例えば、米国特許出願第２００３／０１０８５９７号；及び国際特許出願公開第ＷＯ ００／５０００８号を参照されたい）、細胞型特異的リポソーム（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１９８６６４号を参照されたい）、核酸及びペプチドを含有しているリポソーム（例えば米国特許第６，２０７，４５６号を参照されたい）、放出可能な親水性ポリマーで誘導体化した脂質を含有しているリポソーム（例えば、米国特許出願公開第２００３／００３１７０４号を参照されたい）、脂質封入核酸（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ ０３／０５７１９０号及び同第ＷＯ ０３／０５９３２２号を参照されたい）、脂質カプセル化核酸（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１２９２２１号；及び米国特許第５，７５６，１２２号を参照されたい）、その他のリポソーム組成物（例えば、米国特許出願公開第２００３／００３５８２９号及び同第２００３／００７２７９４号；及び米国特許第６，２００，５９９号を参照されたい）、リポソームと乳剤の安定な混合物（例えば、ＥＰ１３０４１６０を参照されたい）、乳剤組成物（例えば、米国特許第６，７４７，０１４号を参照されたい）、及び核酸マイクロエマルション（例えば、米国特許出願公開第２００５／００３７０８６号を参照されたい）を包含している、本発明で使用するために適切な脂質から成る担体システムを包含でき、この開示はそれぞれ参照によりその全てが取り込まれている。
【０１１７】
本発明のｔｓｗＲＮＡを投与するために用いられる送達媒体は、これに限定されないが、カチオン性ポリマー−核酸複合体（すなわち、ポリプレックス）を含むことができるポリマーから成る担体系も包含できる。ポリプレックスを形成するために、送達物（例えば、本発明のｔｓｗＲＮＡ）を通常は、細胞表面でアニオン性プロテオグリカンと相互作用してエンドサイトーシスによって細胞に侵入できる正電荷をもつ粒子内に送達物を凝集する直線状、分岐状、星状又は樹枝状ポリマー構造を有しているカチオン性ポリマーと複合体化する。ある実施態様では、ポリプレックスは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（例えば、米国特許第６，０１３，２４０号を参照されたい、In vivo jetPEI （登録商標）としてQbiogene, Inc. (Carlsbad, Calif.) から市販されている、ＰＥＩの直線状形態）、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＡＥ）ポリマー（例えば、Lynn et al., J. Am. Chem. Soc., 123:8155-8156 (2001)を参照されたい）、キトサン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー（例えば、Kukowska-Latallo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:4897-4902 (1996) を参照されたい）、ポルフィリン（例えば、米国特許第６，６２０，８０５号を参照されたい）、ポリビニルエーテル（例えば、米国特許出願公開第２００４０１５６９０９号を参照されたい）、多環式アミジニウム（例えば、米国特許出願公開第２００３０２２０２８９号を参照されたい）、１級アミン、イミン、グアニジン、及び／又はイミダゾール基を含有しているその他のポリマー（例えば、米国特許第６，０１３，２４０号；国際特許出願公開第ＷＯ／９６０２６５５号；国際特許出願公開第ＷＯ９５／２１９３１号；Zhang et al., J. Control Release, 100:165-180 (2004); 及び Tiera et al., Curr. Gene Ther., 6:59-71 (2006) を参照されたい）、及びこれらの混合物のような、カチオン性ポリマーと複合体化した核酸を含んでいる。別の実施態様では、ポリプレックスは米国特許出願公開第２００６／０２１１６４３号、同第２００３／０１２５２８１号、及び同第２００３／０１８５８９０号、及び国際特許出願公開第ＷＯ ０３／０６６０６９号に記載されているようなカチオン性ポリマー−核酸複合体；米国特許出願公開第２００４／００７１６５４号に記載されているような生物分解性ポリ（β−アミノエステル）ポリマー−核酸複合体；米国特許出願公開第２００４／０１４２４７５号に記載されているようなポリマーマトリックスを含有している微小粒子；米国特許出願公開第２００３／０１５７０３０号に記載されているようなその他の微小粒子組成物；２００５／０１２３６００号に記載されているような縮合された核酸；Ａｕ ２００２３５８５１４及び国際特許出願公開第ＷＯ ０２／０９６５５１号に記載のようなナノカプセルとマイクロカプセルの複合体を含んでいる。これらの開示内容は参照により本明細書に取り込まれている。
【０１１８】
ある特定の場合は、ｔｓｗＲＮＡ送達物はシクロデキストリン又はそのポリマーと複合体化される。シクロデキストリンから成る担体システムの限定されない例としては、米国特許第６，５０９，３２３号、同第６，８８４，７８９号、及び同第７，０９１，１９２号に記載されているようなシクロデキストリン−改変ポリマー−核酸複合体；及び米国特許第７，０１８，６０９号に記載されているようなシクロデキストリンポリマー−錯化剤−核酸複合体が挙げられる。ある特定の別の場合は、送達物（例えば、ＤｓｉＲＮＡのような核酸）はペプチド又はポリペプチドと複合体化できる。タンパク質から成る送達システムの例としては、これに限定されないが、国際特許出願公開第ＷＯ９５／２１９３１号に記載されているようなカチオン性オリゴペプチド−核酸複合体が挙げられる。これらの開示内容は参照により本明細書に取り込まれている。
【０１１９】
（医薬組成物）
ある特定の実施態様では、本発明は本発明のｔｓｗＲＮＡを含有している医薬組成物を提供する。このような組成物は適切に製剤化されて発明の組成物の十分な部分が細胞に侵入して送達物／搭載物を細胞に送達される手段によって細胞の環境内に導入される。多くの製剤が当該技術分野で公知であって、それが作用できるように発明の製剤が標的細胞に侵入する限り、用いることができる。例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０３１４５Ａ１号及び同第２００５／００５４５９８Ａ１号を参照されたい。例えば、本発明の発明製剤を、リン酸緩衝食塩水及びカプシドのような緩衝溶液中で更に製剤化することができる。リポフェクチン（米国特許第５，７０５，１８８号）のようなカチオン性脂質、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリリジン（国際特許出願公開第ＷＯ９７／３０７３１号）のようなポリカチオン性分子を本発明の製剤中で用いることできる。随意に、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン（Life Technologies）、ＮＣ３８８（Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., Boulder, Colo.）、又はＦｕＧｅｎｅ６（Roche）を用いることができ、これらは全て製造会社の取扱説明書に従って使用できる。
【０１２０】
このような組成物は脂質製剤及び薬学的に許容される担体を含むことができる。本明細書で用いられる言葉「薬学的に許容される担体」としては、医薬投与に適合する食塩水、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤、などが挙げられる。補助活性化合物も製剤中に取り込むことができる。
【０１２１】
医薬組成物は意図された投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、及び直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、又は皮下適用のために用いられる溶液又は懸濁液は以下の成分を包含できる：注射用蒸留水、食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又はその他の合成溶媒のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩のような緩衝剤及び塩化ナトリウム又はブドウ糖のような浸透圧を調節する物質。ｐＨを、塩酸又は水酸化ナトリウムのような、酸又は塩基で調整することができる。非経口製剤をガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、又は複数用量のバイアルに注入することができる。
【０１２２】
投与は当該技術分野で公知の方法、例えば、注射、経口投与、吸入（鼻腔内又は気管内）、経皮適用、又は直腸投与の何れかでできる。投与は単回用量又は分割投与を介して達成される。医薬組成物は非経口、すなわち、関節内、静脈内、腹腔内、皮下又は筋肉内に投与される。ある実施態様では、医薬組成物はボーラス注射によって静脈内又は腹腔内に投与される（例えば、米国特許第５，２８６，６３４号を参照されたい）。細胞内への積み荷の送達は、Straubringer et al., Methods Enzymol., 101: 512; Mannino et al, Biotechniques, 6: 682; Nicolau et. al,, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 6:239 (1989); 及び Behr, Ace. Chem. Res., 26: 274. でも検討されている。脂質から成る治療薬を投与する更に別の方法が、例えば、米国特許第３，９９３，７５４号；同第４，１４５，４１０号；同第４，２３５，８７１号；同第４，２２４，１７９号；同第４，５２２，８０３号及；及び同第４，５８８，５７８号に記載されている。脂質−送達物製剤粒子を疾患の部位への直接注射又は疾患の部位から遠位の部位への注射によって投与することができる（例えば、Culver, HUMAN GENE THERAPY, MaryAnn Liebert, Inc., Publishers, New York. pp.70-71 を参照されたい）。本発明の製剤を単独で又はその他の適切な成分と組み合わせて、吸入（例えば、鼻腔内又は気管内；Brigham et al., Am. J. Sci., 298: 278 を参照されたい）を介して投与するエアゾール（すなわち、これらを「噴霧」できる）にすることができる。エアゾール製剤はジクロロフルオロメタン、プロパン、窒素などのような、圧縮可能な噴霧剤中に入れることができる。
【０１２３】
ある特定の実施態様では、医薬組成物を鼻腔内噴霧、吸入、及び／又はその他のエアゾール送達媒体によって送達することができる。核酸組成物をエアゾールスプレーで直接肺へ送達する方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号、及び同第５，８０４，２１２号に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂及びリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号）を用いる薬剤の送達も製薬技術分野において周知である。同じように、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での経粘膜的薬物送達は米国特許第５，７８０，０４５号に記載されている。
【０１２４】
例えば、関節内（関節の中に）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、及び皮下経路によるような、非経口投与に適している製剤としては、これは抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を対象とする被投与者の血液と等張にする溶質を含むことができる水性及び非水性の等張滅菌注射溶液、及び懸濁化剤、可溶化剤、増量剤、安定化剤、及び保存剤を含むことができる水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。本発明の実施に際して、製剤を、例えば、静脈内に点滴で、経口で、局所に、腹腔内に、膀胱内に、又は髄腔内に投与することができる。
【０１２５】
注射使用に適している医薬組成物としては、滅菌水性溶液（水に溶けるところの）又は分散液、及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製用滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与のために、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、そして注射可能な範囲内において流動性でなければならない。組成物は製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、そして細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）及びこれらの適切な組み合わせを含む、溶媒又は分散媒体であってよい。例えば、レクチンのような被膜を用いて、分散剤の場合に所要の粒径を保持して、及び界面活性剤の使用によって、適切な流動性を保持できる。微生物の作用の防止は多種の抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成できる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムのような糖類、ポリアルコール類を含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延する物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、及びゼラチンを含ませることによってもたらすことができる。
【０１２６】
滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、上で説明した成分の１つ又は組み合わせと共に適切な溶媒中に取り込み、必要に応じて、次いで滅菌濾過して調製することができる。一般に、分散剤は活性化合物を、基本的な分散媒体及び上で説明したその他の必要成分を含んでいる滅菌媒体に取り込むことによって調製する。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、任意の調製方法は、先に滅菌濾過したその溶液から活性成分プラス追加の成分の粉末を生じる、真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０１２７】
経口用組成物は通常不活性希釈剤又は食用担体を含んでいる。経口治療用投与の目的のために、活性成分を賦形剤と組み合わせて、錠剤、トローチ、又はカプセル、例えば、ゼラチンカプセルの形態で用いることができる。経口用組成物は口内洗浄液として用いるために液体の担体を用いても調製できる。薬学的に適合できる結合剤、及び／又は補助剤を組成物の一部として含有することができる。錠剤、丸剤、トローチなどは以下の成分の何れか、又は同様の特性を有する化合物を含有することができる：微結晶性セルロース、トラガカントガム又はゼラチンのような結合剤；澱粉又は乳糖のような賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Primogel）、又はコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸又はステロート（Sterote）のような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような流動促進剤；蔗糖又はサッカリンのような甘味剤；又はペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジエッセンスのような香味料。
【０１２８】
吸入による投与のために、適切な高圧ガス、例えば、二酸化炭素のようなガスを含んでいる過圧容器又はディスペンサー、或いは噴霧器からのエアゾールの形態で製剤を送達する。このような方法としては、米国特許第６，４６８，７９８号に記載されているものが挙げられる。
【０１２９】
経粘膜又は経皮方法によって全身投与もできる。経粘膜又は経皮投与のために、浸透すべきバリアーに適している浸透剤が製剤中で用いられる。このような浸透剤は当該技術分野で一般に公知であって、例えば、経粘膜投与に関しては、洗浄剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体を包含する。経粘膜投与は経鼻スプレー又は坐薬の使用によって達成される。経皮投与のために、活性な製剤は当該技術分野において公知の軟膏（ointments、salves）、ゲル、又はクリームに製剤化される。
【０１３０】
製剤は、直腸送達のための坐薬（例えば、ココナツバター及びその他のグリセリドのような通常の坐薬基剤と共に）又は滞留浣腸の形態に製剤化することもできる。
【０１３１】
これに限定されないが、McCaffrey et al. (2002), Nature, 418(6893), 38-9 (hydrodynamic transfection); Xia et al. (2002), Nature Biotechnol., 20(10), 1006-10 (viral-mediated delivery); 又は Putnam (1996), Am. J. Health Syst. Pharm. 53(2), 151-160, erratum at Am. J. Health Syst. Pharm. 53(3), 325 (1996) に記載されている方法を含む、当該技術分野で公知の方法を用いてトランスフェクション又は感染によって製剤を投与することもできる。
【０１３２】
ある特定の実施態様では、ＤＮＡワクチンのような、核酸物質の投与に適している任意の方法によって製剤を投与することもできる。これらの方法としては、遺伝子銃、バイオインジェクター、及び皮膚貼付剤、並びに米国特許第６，１９４，３８９号に開示されている微粒子ＤＮＡワクチン技術のような無針方法、及び米国特許第６，１６８，５８７号に開示されているような粉末形態のワクチンを用いる哺乳動物経皮無針方法を挙げられる。更に、とりわけ、Hamajima et al. (1998), Clin. Immunol. Immunopathol., 88(2), 205-10 に記載されているような、鼻腔内送達が可能である。リポソーム（例えば、米国特許第６，４７２，３７５号に記載されている）及びマイクロカプセル化も使用することができる。生物分解性標的微粒子送達システムも使用できる（例えば、米国特許第６，４７１，９９６号に記載されている）。
【０１３３】
ある特定の態様では、移植片及びマイクロカプセル化送達システムを含む、放出制御製剤のような、身体からの急速な排泄に対して製剤を保護する担体を用いて製剤を調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリアクリル酸のような、生物分解性、生物適合性ポリマーを使用できる。このような製剤は標準的な技術を用いて調製できる。材料は Alza Corporation 及び Nova Pharmaceuticals, Inc. から購入することもできる。リポソーム懸濁液（ウィルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染された細胞を標的にしているリポソームを含んでいる）も薬学的に許容される担体として使用できる。これらは当業者に公知の方法、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載のような方法に従って調製できる。
【０１３４】
経口投与に適している製剤は、例えば、（ａ）水、食塩水、又はＰＥＧ４００のような希釈剤に懸濁している有効量のパッケージ化された積み荷（例えば、核酸）のような、液体溶液；（ｂ）それぞれが、液体、固体、顆粒、又はゼラチンとして、所定量の積み荷を含んでいるカプセル、小袋、又は錠剤；（ｃ）適切な液体中の懸濁液；及び（ｄ）適切な乳剤から成る。錠剤の形態は１つ又はそれ以上の乳糖、蔗糖、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、微結晶性セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、及びその他の賦形剤、着色剤、増量剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、香味料、色素、崩壊剤、及び薬学的に適合する担体を含むことができる。薬用キャンディー形態は香味料、例えば、蔗糖を含むことができ、更にトローチ剤はゼラチンとグリセリン、又は蔗糖とアカシアガム乳剤、ゲルなどのような不活性基剤中に積み荷を含んでいて、積み荷に加えて当該技術分野で公知の担体を含んでいる。
【０１３５】
本発明の方法は様々な宿主において実施することができる。典型的な宿主としては、霊長類（例えば、ヒト並びにチンパンジー及びその他の非ヒト霊長類）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、齧歯動物（例えば、ラット及びマウス）、ウサギ、及びブタのような、哺乳類種が挙げられる。
【０１３６】
このような製剤の毒性及び治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％致死用量）及びＥＤ５０（集団の５０％における治療有効用量）を確認するために、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手段によって確認することができる。毒性と治療効果の間の用量比は治療インデックスであって、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表される。高い治療インデックスを示す製剤は推奨しうる。毒性副作用を示す製剤は使用できるが、感染していない細胞への潜在的な損傷を最小することによって副作用を減少するために、罹患した組織の部位をこのような製剤が標的にするような送達システムを設計するように注意を払う必要がある。
【０１３７】
細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータをヒトで用いるための用量の範囲を策定するために用いることができる。このような製剤の用量は任意に殆ど又は全く毒性がないＥＤ５０を含んでいる血中濃度の範囲内にある。用量は用いられる剤形及び利用される投与経路によってこの範囲内を変動してもよい。本発明の方法で用いられる何れかの剤形に関して、治療有効用量は細胞培養アッセイから初めに推測できる。用量は、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含んでいる血漿濃度を達成する動物モデルにおいて細胞培養で確認したように策定できる。このような情報をヒトにおける有用な用量をより正確に確認するために用いることができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーで測定できる。
【０１３８】
本明細書で定義したように、製剤の治療有効量（すなわち、有効用量）は選択された製剤によって決まる。例えば、ｔｓｗＲＮＡ製剤が選択されたら、（このような製剤の全体として又は積み荷成分の何れかの）単回用量は約１ｐｇ〜１０００ｍｇの範囲で投与でき；ある実施態様では、１０、３０、１００、又は１０００ｐｇ、又は１０、３０、１００、又は１０００ｎｇ、又は１０、３０、１００、又は１０００μｇ、又は１０、３０、１００、又は１０００ｍｇを投与できる。ある実施態様では、１〜５ｇの製剤を投与できる。製剤は１日に１回又はそれ以上から１週間に１回又はそれ以上まで（１日おきに１回を含む）投与できる。ある特定の因子が対象を有効に治療するために必要な用量及びタイミングに影響することを当業者は理解でき、この因子としては、これに限定されないが、疾患又は病気の重症度、以前の治療、対象の一般的な健康状態及び／又は年齢、及び存在しているその他の疾患が挙げられる。更に、タンパク質、ポリペプチド、核酸又は抗体の治療有効量を用いる対象の治療には単回治療が含まれ、又は、任意に、連続治療が含まれる。
【０１３９】
当然のことながら、製剤を細胞の環境に導入する方法は細胞のタイプ及びその環境構造によって決まる。例えば、細胞が液体中に見出される場合は、一つの選択される製剤はリポフェクタミンに見られるような脂質製剤を伴って製剤を細胞の脂質環境へ直接付加することができる。脂質製剤は、静脈内、筋肉内、又は腹腔内注射によって、又は経口で、又は吸入で、又は当該技術分野で公知のその他の方法で、動物に投与することもできる。製剤が哺乳動物のような動物そしてより特定的にはヒトに投与することが適切である場合は、製剤は薬学的にも許容される。ペプチド、タンパク質及び核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）を投与するための薬学的に許容される製剤は公知であって使用することができる。ｄｓＲＮＡ（例えば、ｔｓｗＲＮＡ薬剤）を導入するための適切な方法については、米国特許出願公開第２００４／０２０３１４５Ａ１号を参照されたい。
【０１４０】
製剤の適切な量を導入すべきであって、これらの量は標準的な方法を用いて実験的に確認できる。一般的に、細胞環境における個々の製剤の又は個々の製剤の積み荷の有効濃度は、薬学的に許容される５０ナノモル又はそれ以下、１０ナノモル又はそれ以下であるか、或いは約１ナノモル又はそれ以下の濃度である組成物を用いることができる。別の実施態様では、約２００ピコモル又はそれ以下の濃度、及び更に薬学的に許容される５０ピコモル又はそれ以下、約２０ピコモル又はそれ以下、約１０ピコモル又はそれ以下、或いは５ピコモル又はそれ以下の濃度を用いる方法を多くの状況において用いることができる。
【０１４１】
本発明の適切に製剤化された医薬組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道（エアゾール）、直腸内、膣内、及び局所（口腔、舌下を含む）投与を含む、非経口経路によるような当該技術分野で公知の手段によって投与することができる。ある実施態様では、医薬組成物は静脈内又は腹腔内の点滴又は注射によって投与される。
【０１４２】
（非経口用組成物）
好ましい実施態様では、医薬組成物は、一般的な、非毒性の薬学的に許容される担体及び補助薬を含んでいる剤形、製剤において、或いは適切な送達デバイス又は移植片を介して注射、点滴又は移植（皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内など）によって非経口的に投与することができる。このような組成物の剤形及び製剤は医薬製剤の分野における当業者にとって公知である。剤形は Remington：The Science and Practice of Pharmacy （前出）に見出すことができる。
【０１４３】
非経口使用のための組成物は単位剤形で（例えば、単回用量アンプルで）、又は複数用量を含んでいて適切な保存剤を添加してもよいバイアルで提供することができる。組成物は溶液、懸濁液、乳剤、点滴容器、又は移植用送達デバイスの形態であってよく、或いは使用前に水又はその他の適切な媒体で再構成するための乾燥粉末として提示することもできる。活性治療薬（複数を含む）の他に、組成物は適切な非経口的に許容される担体及び／又は賦形剤を含むことができる。放出制御のために、活性治療薬（複数を含む）をマイクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソームなどに取り込むことができる。更に、組成物は懸濁化剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、浸透圧調節剤、及び／又は分散剤を含むことができる。
【０１４４】
前述の通り、本開示による医薬組成物は滅菌注射に適している形態にすることができる。このような製剤を調製するためには、適切な活性治療薬（複数を含む）を経口的に供される液体媒体に溶解又は懸濁する。
【０１４５】
（放出制御非経口用組成物）
放出制御非経口用組成物は、懸濁液、マイクロスフェア、マイクロカプセル、磁気マイクロスフェア、油性溶液、油性懸濁液、又は乳剤の形態にできる。あるいは、活性薬剤を生物適合性の担体、リポソーム、ナノ粒子、移植片、又は点滴用デバイスに取り込むことができる。マイクロスフェア及び／又はマイクロカプセルの製造に用いる材料は、例えば、ポリガラクチン、ポリ−（シアノアクリル酸イソブチル）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタム−ニン）及びポリ（乳酸）のような、生分解性／生体内分解性ポリマーである。放出制御非経口用製剤を製剤化するときに用いることができる生物適合性担体は、炭水化物（例えば、デキストラン）、タンパク質（例えば、アルブミン）、リポタンパク質、又は抗体である。移植片に用いる材料は非生分解性（例えば、ポリジメチルシロキサン）又は生分解性（例えば、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）又はポリ（オルトエステル）或いはこれらの組み合わせ）であってよい。
【０１４６】
（抑制性核酸）
本明細書に記載されているｔｓｗＲＮＡ分子は、トリガー配列の存在下に抑制性核酸分子を形成して作動する。このような抑制性核酸は、標的ＲＮＡ（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）をコードする核酸分子を結合する一本鎖又は二本鎖核酸分子、並びに標的ポリペプチドに直接結合してその生物活性を調節する核酸分子（例えば、アプタマー）を含んでいる。
【０１４７】
リボザイム
本開示のアンチセンス標的ＲＮＡ配列を含んでいる触媒ＲＮＡ分子又はリボザイムはインビボにおいて標的ＲＮＡの発現を阻止するために用いることができる。アンチセンスＲＮＡ内のリボザイム配列の内容物はそれにＲＮＡ開裂活性をもたらすことによって、構築物の活性を増大する。ＲＮＡ特異的リボザイムの設計及び使用は、Haseloff et al., Nature 334:585-591. 1988, 及び米国特許出願公開第２００３／０００３４６９ Ａ１号に記載されており、これらはそれぞれ参照により取り込まれている。
【０１４８】
従って、本開示は、結合手に８〜１９の連続核酸塩基を有しているアンチセンスＲＮＡを含有している触媒ＲＮＡ分子も特徴としている。本開示の好ましい実施態様では、触媒核酸分子はハンマーヘッド又はヘアピンモチーフに形成される。このようなハンマーヘッドモチーフの例は、Rossi et al., Aids Research and Human Retroviruses, 8:183, 1992 によって説明されている。ヘアピンモチーフの例は、１９８８年９月２０日出願の米国特許第０７／２４７，１００号の一部継続出願である、１９８９年９月２０日に出願されたHampel et al., “RNA Catalyst for Cleaving Specific RNA Sequences,”、 Hampel and Tritz, Biochemistry, 28:4929, 1989, 及び Hampel et al., Nucleic Acids Research, 18: 299, 1990 によって説明されている。これらの具体的なモチーフは本開示を限定しておらず、当業者は本開示の酵素的核酸分子において重要なことの全ては、それが標的遺伝子ＲＮＡ領域の１つ又はそれ以上と相補性を有する特異的基質結合部位を有していること、及び酵素的核酸分子が、ＲＮＡ開裂活性をこの分子に与える基質結合部位内又はその周囲に核酸配列を有していることであると認識するだろう。
【０１４９】
低分子ヘアピンＲＮＡは、任意に３'ＵＵ突出部を有するステムループ構造から成っている。変動の可能性はあるが、ステムは２１〜３１ｂｐ（望ましくは２５〜２９ｂｐ）に広がり、そしてループは４〜３０ｂｐ（望ましくは４〜２３ｂｐ）に広がる。細胞内でｓｈＲＮＡを発現するために、ポリメラーゼＩＩＩ Ｈ１−ＲＮＡ又はＵ６プロモータの何れか、ステムループ型ＲＮＡ挿入用のクローニング部位、及び４−５チミジン転写終止シグナルを含んでいるプラスミドベクターを用いることができる。ポリメラーゼＩＩＩプロモータは明確に定義された開始及び停止部位並びに転写物欠失ポリ（Ａ）尾部を有している。これらのプロモータに対する終止シグナルはポリチミジントラクトによって定義されて、転写は通常、第２ウリジンの後で開裂される。この位置における開裂は発現されたｓｈＲＮＡ内に３'ＵＵ突出部を生じ、これは合成ｓｉＲＮＡの３'突出部と類似している。哺乳動物細胞においてｓｈＲＮＡを発現する更なる方法は上記の引例に記載されている。
【０１５０】
ｓｉＲＮＡ
短い２１〜２５ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡは下方制御遺伝子発現に有効である（Zamore et al., Cell 101: 25-33; Elbashir et al., Nature 411: 494-498, 2001、参照により本明細書に取り込まれている）。哺乳動物におけるｓｉＲＮＡ手法の治療効果は McCaffrey et al. (Nature 418: 38-39,2002) によってインビトロで明らかにされた。標的遺伝子の配列を前提として、その遺伝子を不活性化するためにｓｉＲＮＡを設計できる。このようなｓｉＲＮＡは、例えば、罹患組織に直接投与でき、或いは全身投与できる。Ｐａｒｌ遺伝子を、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を設計するために用いることができる。２１〜２５ヌクレオチドのｓｉＲＮＡを、例えば、癌の進行又は転移を治療する治療薬剤として用いることができる。
【０１５１】
本開示の抑制性核酸分子を、標的ＲＮＡ発現のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）―介在ノックダウンのための二本鎖ＲＮＡとして用いることができる。一実施態様では、標的ＲＮＡ発現はウィルス感染細胞において減少する。別の実施態様では、標的ＲＮＡはアポトーシス阻害タンパク質をコードして細胞はＨＩＶに感染している。ＲＮＡｉは目的の特定タンパク質の細胞発現を減少する方法である（Tuschl, ChemBioChem 2:239-245, 2001; Sharp, Gene Dev 15:485-490, 2000; Hutvagner and Zamore, Curr Opin Genet Devel 12:225-232, 2002; 及び Hannon, Nature 418:244-251, 2002 に概説されている）。ｄｓＲＮＡのトランスフェクションによるか、或いはプラスミドによる発現システムを用いるｓｉＲＮＡの発現を介した、ｓｉＲＮＡの細胞内への導入は、哺乳動物細胞において機能喪失表現型を創出するために次第に用いられてきている。
【０１５２】
本開示の一実施態様では、本開示の核酸塩基オリゴマーの８〜１０の連続核酸塩基を含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が作られる。ｄｓＲＮＡは、二重鎖を有しているか、又は自己二重鎖化を有している単一ＲＮＡ鎖（小分子ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ）である、ＲＮＡの２つの異なった鎖であり得る。一般に、ｄｓＲＮＡは約２１又は２２塩基対であるが、所望によりより短くてもより長くてもよい（最大約２９塩基対まで）。ｄｓＲＮＡは標準的な技術（例えば、化学合成又はインビトロ転写）を用いて作成できる。例えば、Ambion (Austin, Tex.) 及び Epicentre (Madison, Wis.) からキットを入手できる。哺乳動物の細胞においてｄｓＲＮＡを発現する方法は、Brummelkamp et al. Science 296:550-553, 2002; Paddison et al. Gene Dev 16:948-958, 2002. Paul et al. Nat Biotechnol 20:505-508, 2002; Sui et al. Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520, 2002; Yu et al. Proc Natl Acad Sci USA 99:6047-6052, 2002; Miyagishi et al. Nat Biotechnol 20:497-500, 2002; 及び Lee et al. Nat Biotechnol 20:500-505, 2002 に記載されていて、これらのそれそれぞれは参照により本明細書に取り込まれている。
【０１５３】
低分子ヘアピンＲＮＡは、任意に３'ＵＵ突出部を有するステムループ構造から成っている。変動の可能性はあるが、ステムは２１〜３１ｂｐ（望ましくは２５〜２９ｂｐ）に広がり、そしてループは４〜３０ｂｐ（望ましくは４〜２３ｂｐ）に広がる。細胞内でｓｈＲＮＡを発現するために、ポリメラーゼＩＩＩ Ｈ１−ＲＮＡ又はＵ６プロモータの何れか、ステムループ型ＲＮＡ挿入用のクローニング部位、及び４−５チミジン転写終止シグナルを含んでいるプラスミドベクターを用いることができる。ポリメラーゼＩＩＩプロモータは明確に定義された開始及び停止部位並びに転写物欠失ポリ（Ａ）尾部を有している。これらのプロモータに対する終止シグナルはポリチミジントラクトによって定義されて、転写は通常、第２ウリジンの後で開裂される。この位置における開裂は発現されたｓｈＲＮＡ内に３'ＵＵ突出部を生じ、これは合成ｓｉＲＮＡの３'突出部と類似している。哺乳動物細胞においてｓｈＲＮＡを発現する更なる方法は上記の引例に記載されている。
【０１５４】
本発明は、ｔｓｗＲＮＡがダイサーの基質として作用することを改変が阻止しない限り、分子の機能を安定化及び／又は増強する働きをする、本発明のｔｓｗＲＮＡになされる特定の改変も目論んでいる。塩基対をなしているデオキシリボヌクレオチドをＤｓｉＲＮＡ分子と結合でき、増大したＲＮＡｉ有効性及び持続性をもたらすが、このような進展はダイサー処理を妨げない延長した分子の領域（例えば、センス鎖のダイサー開裂部位の３'／アンチセンス鎖のダイサー開裂部位の５'）で行われる。一実施態様では、ｔｓｗＲＮＡである積み荷のダイサー処理を増強する１つ又はそれ以上の改変がなされる。第２の実施態様では、より効果的なＲＮＡｉ創出をもたらす１つ又はそれ以上の改変がなされる。第３の実施態様では、より大きいＲＮＡｉ効果をサポートする１つ又はそれ以上の改変がなされる。第４の実施態様では、細胞に送達されるそれぞれのｔｓｗＲＮＡ積み荷毎により大きな有効性をもたらす１つ又はそれ以上の改変がなされる。改変は３'−末端領域、５'−末端領域、３'−末端及び５'−末端の両領域、又はある場合には配列中の多くの位置に取り入れることができる。上記の制限を考慮して、改変の任意の数及び組み合わせをｔｓｗＲＮＡ積み荷に取り入れることができる。複数の改変が存在する場合、これらは同一であっても異なっていてもよい。塩基、糖部分、リン酸骨格、及びこれらの組み合わせに対する改変が目論まれている。どちらか一方の５'−末端をリン酸化できる。
【０１５５】
リン酸骨格に目論まれている改変の例としては、ホスホン酸メチルを含む、ホスホン酸エステル、ホスホロチオエート、及びアルキルホスホン酸トリエステルのようなホスホン酸トリエステル改変などが挙げられる。糖部分に対して目論まれている改変の例としては、２'−Ｏ−メチルのような２'アルキルピリミジン、２'−フルオロ、アミノ、及びデオキシ改変などが挙げられる（例えば、Amarzguioui et al., 2003 を参照されたい）。塩基性基に目論まれている改変の例としては、塩基性の糖、２−Ｏ−アルキル改変ピリミジン、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、及び５−（３−アミノメチル）ウラシルなどが挙げられる。固定された核酸、すなわちＬＮＡも取り入れることができる。その他の多くの改変が知られていて、上記の基準を満たす限りこれを用いることができる。改変の例は、米国特許第５，６８４，１４３号、同第５，８５８，９８８号及び同第６，２９１，４３８号、並びに米国特許出願公開第２００４／０２０３１４５ Ａ１号にも開示されている。その他の改変は、Herdewijn (2000)、 Eckstein (2000)、 Rusckowski et al. (2000)、 Stein et al. (2001); Vorobjev et al. (2001) に開示されている。それぞれは参照により本明細書に取り込まれている。
【０１５６】
本発明は、３'−末端及び５'−末端エクソヌクレアーゼ並びにエンドヌクレアーゼに対する保護を与える改変を有する安定化したオリゴヌクレオチドを包含している。このような改変は標的親和性を保持しながらインビボにおける安定性を増大することが望ましい。多くの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは任意の核酸配列もリボース及び／又はリン酸及び／又は塩基の位置に化学置換を含んでいる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドはリボース部分の２'位における化学改変、アプタマーの環化、３'キャッピング、及び「シュピーゲルマー（spiegelner）」技術を含んでいる。Ａ及びＧヌクレオチドをそれらの２'−ＯＣＨ３改変対応物で連続的に置き換えたオリゴヌクレオチドは本発明の方法において特に有用である。このような改変は親和性及び特異性を保持するという観点から特によく許容される。多くの実施態様では、オリゴヌクレオチドは少なくとも１０％、２５％、５０％、又は７５％の改変されたヌクレオチドを含んでいる。別の実施態様では、オリゴヌクレオチドの８０〜９０％ものヌクレオチドが安定化置換を含んでいる。別の実施態様では、２'−ＯＭｅ含有オリゴヌクレオチドが合成される。このようなオリゴヌクレオチドは、これらを合成するのに安価であって、天然のポリメラーゼは２'−ＯＭｅヌクレオチド三リン酸を基質として受け入れられず２'−ＯＭｅヌクレオチドは宿主ＤＮＡに再利用されないので、望ましい。本明細書に記載されている方法の使用では、オリゴヌクレオチドは増大したインビボ安定性について選択されるだろう。一実施態様では、２'−Ｆ及び２'−ＯＣＨ３改変を有しているオリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ耐性アプタマーを作製するために用いられる。別の実施態様では、本発明の核酸は１つ又はそれ以上の固定された核酸（ＬＮＡ）を有している。ＬＮＡは改変ＲＮＡヌクレオチドを示す。ＬＮＡのリボースは、リボースをＮｏｒｔｈすなわち３'−エンドコンフォメーションに固定する２'酸素及び４'炭素を連結する外部架橋によって改変されている。例えば、Kaur, H. et al., Biochemistry, vol. 45, pages 7347-55; 及び Koshkin, A.A., et al., Tetrahedron, vol. 54, pages 3607-3630 を参照されたい。別の実施態様では、本発明の１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドがモルホリノ構造を取り込んでいて、そこでは核酸塩基がデオキシリボース環の代わりにモルホリン環に結合していてリン酸エステルの代わりにホスホロジアミデート基を介して結合している。例えば、Summerton, J. and Weller, D., Antisense & Nucleic Acid Drug Development, vol. 7, pages 187-195 を参照されたい。更に別の実施態様では、（ＰＳ）−リン酸硫黄改変を包含し、そこでは核酸のリン酸骨格が１つ又はそれ以上の硫黄基のリン酸骨格の酸素基への置換によって改変されている。核酸を安定化するその他の改変は当業界で公知であって、例えば、米国特許第５，５８０，７３７号；及び米国特許出願公開第２００５００３７３９４号、同第２００４０２５３６７９号、同第２００４０１９７８０４号、及び同第２００４０１８０３６０号に記載されている。
【０１５７】
（ヌクレオチドからなるオリゴマーの送達）
本発明は、本発明の裸の阻害性核酸分子（例えば、本発明のｔｓｗＲＮＡ）、又はその類縁体の送達及び／又は投与も目論んでいて、これは哺乳動物細胞に侵入して目的の遺伝子の発現を阻害できて、具体的には、この哺乳動物細胞は標的のＲＮＡに感染している。それにも関わらず、本発明のｔｓｗＲＮＡ、又は本発明の核酸の細胞への送達に役立つ製剤の使用が望ましい（例えば、米国特許第５，６５６，６１１号、同第５，７５３，６１３号、同第５，７８５，９９２号、同第６，１２０，７９８号、同第６，２２１，９５９号、同第６，３４６，６１３号、及び同第６，３５３，０５５号を参照されたい。これらのそれぞれは参照により本明細書に取り込まれている）。
【０１５８】
送達された核酸の検出
本発明のｔｓｗＲＮＡを投与するための脂質から成る送達媒体を使用する実施態様では、積み荷−脂質製剤粒子を対象内で粒子の投与後８、１２、４８、６０、７２、又は９６時間後、或いは６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２２、２４、２５、又は２８日後に検出することができる。粒子の存在を対象由来の細胞、組織、又はその他の生体試料で検出できる。粒子は、例えば、粒子の直接検出；改変した積み荷（例えば、核酸）の検出；積み荷が核酸である場合、標的配列の発現を停止させる核酸の検出；標的及び／又は目的の標的配列の検出（すなわち、標的及び／又は目的の配列の発現又は減少した発現を検出することによる）、又はこれらの組み合わせによって検出できる。本発明のペプチド−改変脂質からなる積み荷−脂質製剤は、検出方法、例えば、蛍光標識又はＰＣＲで測定して、対照の製剤と比較すると、積み荷−脂質製剤粒子を少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％までも増大する。
【０１５９】
積み荷−脂質製剤粒子は当該技術分野で公知の任意の方法を用いて検出することができる。例えば、当該技術分野で周知の方法を用いて、担体システムの成分に標識を直接又は間接的に結合することができる。要求される感度、担体システム成分との結合の容易さ、安定性要件、及び入手可能な機器及び使い捨ての条件に基づく標識の選択を踏まえて、多種の標識を用いることができる。適切な標識としては、これに限定されないが、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及びオレゴングリーン（登録商標）のようなその誘導体、並びにローダミン、及びテキサスレッド及びテトラローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）のようなその誘導体など）、ジゴキシゲニン、ビオチン、フィコエリトリン、ＡＭＣＡ及びＣｙＤｙｅｓ（登録商標）などのようなスペクトル標識；３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ，'Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐなどのような放射性標識；西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどのような酵素；コロイド金、着色ガラス及びポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスのようなプラスチックビーズなどのスペクトル比色分析標識を挙げられる。標識は当該技術分野で公知の任意の方法によって検出できる。
【０１６０】
ここで積み荷は当業者に周知の多数の方法のいずれかで検出及び定量することができる。核酸の検出はサザン分析、ウェスタン分析、ゲル電気泳動、ＰＣＲ、放射性標識、シンチレーションカウント、及びアフィニティークロマトグラフィーのような周知の方法で実施する。分光光度法、Ｘ線検査法、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、及び高拡散クロマトグラフィーのような更なる分析用生化学手法も本発明の製剤の積み荷のために利用できる。
【０１６１】
核酸である積み荷に関して、ハイブリダーゼション形式の選択は重要ではない。多種の核酸ハイブリダイゼーション形式が当業者に公知である。例えば、一般的な形式としては、サンドイッチアッセイ及び競合又は置換アッセイを挙げられる。ハイブリダイゼーション技術は、例えば、“Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach,” Eds. Hames and Higgins, IRL Press (1985) に概説されている。
【０１６２】
ハイブリダーゼーションアッセイの感度を、検出すべき標的核酸を増大する核酸増幅システムの使用によって増強することができる。分子プローブとして使用するための増幅配列に、又はその後のサブクローニングのために核酸断片を作製するために適しているインビトロにおける増幅技術が知られている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、Ｑβ−レプリカーゼ増幅及びその他のポリメラーゼ介在技術（例えば、ＮＡＳＢＡ（登録商標））を含んでいる、このようなインビトロ増幅方法に当業者を導くのに十分な技術の例は、Sambrook et al, In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2000)； 及び Ausubel et al, SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (2002); 並びに米国特許第４，６８３，２０２号； PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds.) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990); Arnheim & Levinson (October 1, 1990), C&EN 36； The Journal Of NIH Research, 3:81 (1991)； Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA, 86:1173 (1989)； Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1874 (1990)； Lomell et al., J. Clin. Chem., 35: 1826 (1989)； Landegren et al, Science, 241 :1077 (1988)； Van Brunt, Biotechnology, 8:291 (1990)； Wu and Wallace, Gene, 4:560 (1989)； Barringer et al, Gene, 89: 117 (1990)；及び Sooknanan and Malek, Biotechnology, 13:563 (1995) に見られる。増幅された核酸をインビトロでクローニングする改良された方法は米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。当該技術分野において記載されているその他の方法は核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ（登録商標）、Cangene, Mississauga, Ontario）及びＱβ−レプリカーゼシステムである。これらのシステムは、突然変異体を直接同定するために用いることができ、そこではＰＣＲ又はＬＣＲプライマーが、選択配列が存在している場合のみ伸長又は連結できるように設計されている。或いは、選択配列を、例えば非特異的ＰＣＲプライマーを用いて一般に増幅し、その後、増幅された標的領域を、突然変異を示す特異的な配列に対してプローブすることもできる。
【０１６３】
例えばインビトロ増幅方法でプローブとして、遺伝子プローブとして、又は阻害成分として用いる核酸は通常、Beaucage et al , Tetrahedron Letts., 22: 1859 1862 (1981)によって記載されている固相ホスホラミダイトトリエステル法に従って、例えば、Needham VanDevanter et al, Nucleic Acids Res., 12:6159 (1984)に記載されているような、自動シンセサイザーを用いて、化学的に合成される。ポリヌクレオチドの精製は、必要により、天然アクリルアミドゲル電気泳動によって、或いはPearson et al, J. Chrom., 255: 137 149 (1983)に記載のようにアニオン交換ＨＰＬＣによって一般的に実施される。合成ポリヌクレオチドの配列は、Grossman and Moldave (eds.) Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65:499 の Maxam and Gilbert (1980) の化学開裂方法を用いて確認できる。
【０１６４】
核酸／遺伝子（例えば、標的遺伝子）の転写レベルを測定する別の方法はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションである。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイは周知であって、Angerer et al., Methods Enzymol, 152: 649 に概説されている。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイにおいては、細胞を固体の支持体、一般にガラスのスライドに固定する。ＤＮＡを精査する場合は、細胞を熱又はアルカリで変性する。次いで細胞を中温でハイブリダイゼーション溶液と接触させて標識されている特定プローブのアニールを可能にする。プローブは随意に放射性同位元素又は蛍光レポーターで標識される。
【０１６５】
（用量）
動物モデルと比較してヒトに対して用量を修正することは当該技術分野においては通常のことであると当業者は認識しているので、マウスで用いた化合物の量から外挿してヒトの用量を最初に決定できる。ある特定の実施態様では、用量は化合物約１ｍｇ／体重Ｋｇ〜化合物約５０００ｍｇ／体重Ｋｇ、又は化合物約５ｍｇ／体重Ｋｇ〜化合物約４０００ｍｇ／体重Ｋｇ、又は化合物約１０ｍｇ／体重Ｋｇ〜化合物約３０００ｍｇ／体重Ｋｇ、又は化合物約５０ｍｇ／体重Ｋｇ〜化合物約２０００ｍｇ／体重Ｋｇ、又は化合物約１００ｍｇ／体重Ｋｇ〜化合物約１０００ｍｇ／体重Ｋｇ、又は化合物約１５０ｍｇ／体重Ｋｇ〜化合物約５００ｍｇ／体重Ｋｇと異なるであろうと想定される。別の実施態様では、この用量は約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００ｍｇ／体重Ｋｇであろう。別の実施態様では、より高い用量が用いられると予想されて、このような用量は化合物約５ｍｇ／体重Ｋｇ〜化合物約２０ｍｇ／体重Ｋｇの範囲内であろう。別の実施態様では、用量は約８、１０、１２、１４、１６、又は１８ｍｇ／体重Ｋｇであろう。当然ながら、この用量は、最初の臨床試験の結果及び特定患者の要求に従って、このような治療プロトコールにおいて通常行われているように、上方又は下方に調節できる。
【０１６６】
（治療方法）
本開示は、疾患（例えば、新生物、病原体感染など）を治療する方法、特に病的細胞内の標的核酸分子を特異的に阻害又は減少することによる方法を提供する。方法は、トリガー配列と相補性がある少なくとも１つの配列を含んでいる核酸、並びにセンス及びアンチセンス配列を含む医薬組成物であって、ここでアンチセンス（すなわち、ガイド鎖）は標的ＲＮＡと相補性があって、センス及びアンチセンス配列はトリガー配列の存在下にｓｉＲＮＡ分子を形成する医薬組成物の治療有効量を投与することからなる。従って本発明は、標的遺伝子の阻害が細胞の治療又は疾患状態の緩和をもたらす何れかの疾患の治療を提供する。一実施態様は、ウィルス（ＨＩＶ）感染に罹っているか又は感染しやすい対象を治療する方法である。別の実施態様は、癌に罹っているか又は罹りやすい対象を治療する方法である。方法は、疾患又はその症状を治療するのに十分な本明細書の化合物の治療量又は量を疾患が治療されるような条件下で、対象に投与する段階を含んでいる。
【０１６７】
本明細書の方法は、対象（このような治療を必要としていると特定されている対象を含む）にこのような効果を発揮すると本明細書に記載されている化合物又は組成物を投与することを含んでいる。このような治療を必要としている対象の特定は、対象又は医療専門家の判断でよく、そして主観的（意見）又は客観的（試験又は診断方法により測定できる）であってよい。
【０１６８】
予防的治療を含んでいる本開示の治療方法は、一般に、本明細書の製剤の化合物のような本明細書の薬物の治療有効量を、それを必要としている哺乳動物、特にヒトを含んでいる対象（例えば、動物、ヒト）への投与を含んでいる。このような治療法は、癌の進行又は転移或いはその症状を患っている、有している、罹りやすい、又はその危険性がある対象、特にヒトへ適切に投与されるだろう。「危険性のある」対象の確認は、診断試験又は対象若しくは臨床専門家の意見（例えば、遺伝子試験、酵素又はタンパク質マーカー、（本明細書で定義されているような）マーカー、家族歴など）による客観的又は主観的な判断の何れかによってなされる。本明細書の薬剤は転写活性が関与しているその他の任意の疾患の疾患にも用いることができる。
【０１６９】
一実施態様では、本開示は治療の経過を観察する方法を提供する。方法はＨＩＶ又はＡＩＤＳに関連している疾患又はその症状に罹っているか又は罹りやすい対象で、対象が疾患又はその症状を治療するのに十分な本明細書の化合物の治療量を投与されている対象における診断マーカー（マーカー）（例えば、ＨＩＶ感染を示すマーカー）又は診断測定（例えば、スクリーニング、アッセイ）のレベルを確認する段階を含んでいる。方法で確認されたマーカーのレベルを健常な正常対照又は罹病患者の何れかにおけるマーカーのレベルと比較して対象の病状を確立できる。一実施態様では、マーカーはＨＩＶウィルスそれ自体である。好ましい実施態様では対象におけるマーカーの第２レベルを第１レベルの確認より遅い時点で測定して、２つのレベルを比較して疾患の経過又は治療の効果を観察する。ある特定の好ましい実施態様では、対象におけるマーカーの治療前レベルを本開示に従う治療を開始する前に確認して、このマーカーの治療前レベルを対象における治療開始後のマーカーのレベルと比較して治療の効果を確認できる。
【０１７０】
（キット）
本開示は疾患の治療又は予防のためのキットを提供する。ある特定の実施態様はＨＩＶ感染又はＡＩＤＳを含むウィルス感染の治療又は予防のためのキットを提供する。別の実施態様では、癌の治療又は予防のためのキットを提供する。一実施態様では、キットは単位剤形中に本発明の薬剤（例えば、ｔｓｗＲＮＡ）の有効量を含んでいる治療用又は予防用組成物を含んでいる。ある実施態様では、キットは治療用又は予防用化合物を収容している滅菌容器を含んでいて；このような容器は箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスターパック、又は当該技術分野で公知の適切な容器形態であってよい。このような容器はプラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、又は医薬品を保持するのに適しているその他の材質から作ることができる。
【０１７１】
所望により、本開示の薬剤はこれをＨＩＶ感染又はＡＩＤＳに罹っているか又は罹りやすい対象へ投与するための使用説明書と共に提供される。使用説明書は通常、ＨＩＶ感染又はＡＩＤＳの治療又は予防のための組成物の使用に関する情報を含んでいる。別の実施態様では、使用説明書は以下のものの少なくとも１つを含んでいる。化合物の説明、ＨＩＶ感染若しくはＡＩＤＳ又はそれらの症状の治療又は予防に対する処方計画及び管理、使用上の注意、警告、適応症、禁忌、過剰投与情報、副作用、動物薬理、臨床試験及び／又は参考文献。使用説明書は（ある場合には）容器に直接印刷するか、ラベルとして容器に貼るか、或いは独立したシート、パンフレット、カード、又はホルダーとして容器内又は容器と共に供給される。
【０１７２】
更に、本開示の薬剤は所望により、進行性の癌を有しているか又はその危険性のある対象へそれを投与するための使用説明書と共に提供される。使用説明書は一般に、癌を治療又は予防するための組成物の使用に関する情報を含んでいる。別の実施態様では、使用説明書は次のうちの少なくとも１つを含んでいる。化合物の説明、癌又はその症状を治療又は予防するための処方計画及び管理、注意、警告、適応症、禁忌、過剰投与情報、副作用、動物薬理、臨床試験及び／又は参考文献。使用説明書は（ある場合には）容器に直接印刷するか、ラベルとして容器に貼るか、或いは独立したシート、パンフレット、カード、又はホルダーとして容器内又は容器と共に供給される。
【０１７３】
別の実施態様では、本開示の組成物はタンパク質ＦＬＩＰを阻害する活性を有している。更なる実施態様では、組成物は、「Ｆａｓ／ＣＤ９５−リガンド、及びＴＲＡＩＬ」のようなデスリガンドであるかそのような薬剤と併用して投与される。このような実施態様では、本開示の組成物は腫瘍細胞を併用薬によるアポトーシスに対して敏感にする。
【０１７４】
（疾患を治療するための併用療法）
本開示の組成物及び方法を当該技術分野で公知の任意の従来の療法と併用できる。一実施態様では、本開示の抗ＨＩＶ活性を有している組成物（例えば、ｔｓｗＲＮＡを含んでいる組成物）を当該技術分野で公知の任意の抗ウィルス剤と併用できる。
【０１７５】
別の実施態様では、抗癌活性を有している本開示の組成物を１つ又はそれ以上の化学療法剤と併用することができる。別の実施態様では、１つ又はそれ以上の化学療法剤は、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、オーリスタチン、アザシチジン、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ−１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｎ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリル−Ｌ−プロリン−ｔ−ブチルアミド、カケクチン、カペシタビン、セマドチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シクロホスファミド、３'，４'−ジデヒドロ−４'−デオキシ−８'−ノルビン−カロイコブラスチン、ドセタクソール、ドキセタキセル、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、シスパチン、クリプトフィシン、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダスチニブ、ダウノルビシン、ドラスタチン、ドクソルビシン（アドリアマイシン）、エルロチニブ、エトポシド、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ヒドロキシウレア、ヒドロキシウレアタキサン、エルロチニブ、イホスファミド、イマチニブ、イリノテカン、レナリドミド、リアロゾール、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、ニルタミド、オナプリストン、パクリタキセル、パニツムマブ、パゾパニブ、プレドニムスチン、プロカルバジン、リツキシマブ、ＲＰＲ１０９８８１、ソラフェニブ、リン酸エストラムスチン、スニチニブ、タモキシフェン、タソネルミン、タクソール、テマゾロミド、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、ビンフルニン、及びボリノスタットよりなる群から選ばれる。
【０１７６】
（組み換えポリペプチド発現）
本発明の実施は、別段の指示がない限り、十分に当業者の理解の範囲内である分子生物学（組み換え技術を含んでいる）、微生物学、細胞生物学、生物化学及び免疫学を利用する。このような技術は、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition (Sambrook, 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (Gait, 1984); “Animal Cell Culture” (Freshney, 1987); “Methods in Enzymology” “Handbook of Experimental Immunology” (Weir, 1996); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (Miller and Calos, 1987); “Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel, 1987); “PCR:  The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis, 1994); “Current Protocols in Immunology” (Coligan, 1991) のような文献に十分に説明されている。これらの技術は本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの生産に適用可能であって、そのようにして、本発明を作製及び実施するに当たって考慮することができる。特定の実施態様のために特に有用な技術は以下に続くセクションで検討されている。
【０１７７】
以下の実施例は、当業者に本発明のアッセイ、スクリーニング、及び治療方法を如何に作成して用いるかについて完全な開示及び記述を提供するために提示されていて、発明者らが自らの発明と見なしているものの範囲を限定するように意図されていない。
【実施例】
【０１７８】
本発明を、説明の目的で提示され如何なる方法によっても制限する意図がない、以下の実施例を参照して説明する。当該技術分野で周知の標準的な技術又は以下に具体的に説明されている技術が使われた。
【０１７９】
実施例１：感染した細胞又は癌細胞を標的にしている治療用ＲＮＡスイッチ
コンピューターで設計された治療用ＲＮＡスイッチは感染及び癌の機能的な治癒に向けて重要なステップを示す。小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は小分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を用いて、標的ｍＲＮＡの発現を通常ノックダウンすることが可能である。更に、いくつかのヒトアポトーシス阻害遺伝子をｓｉＲＮＡで連続的に標的にすると細胞死（アポトーシス）を誘発することが可能である。この提案の重要な着想は細胞質において病原性ＤＮＡ又はＲＮＡ、或いは癌ＤＮＡ及びＲＮＡマーカーの存在によって引き金が引かれたときにのみアポトーシスを誘発するｓｉＲＮＡ類縁体を構築することである。
【０１８０】
代表的な治療用スイッチングＲＮＡ（本明細書ではｔｓｗＲＮＡと呼ぶ）の概略図を図１に示す。ＨＩＶ ＲＮＡゲノムの非存在下では、ｔｓｗＲＮＡは活性な治療用構造にはならない。ｔｓｗＲＮＡは、ウィルスＲＮＡゲノムと結合できる１つ又はそれ以上の隣接領域を保持するように設計される（図２、３Ａ、及び３Ｂの認識ドメインを参照されたい）。計算による予測は、薬剤−ウィルス複合体の形成は合成ｔｓｗＲＮＡにおいて立体構造の変化を誘発することを示した。薬剤とウィルスゲノムの間に形成された複合体は、ｓｉＲＮＡ様ヘアピンを顕在化する。図４。ヒト酵素ダイサーはこのヘアピン構造を開裂できて、その鎖の１つ（ガイド鎖）をＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に移動し、これは次にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を活性化する。ガイド鎖は標的ＲＮＡにアンチセンスになるように設計される。ＲＮＡｉ経路の活性化は標的ＲＮＡ発現（例えば、ｍＲＮＡ又は病原性ＲＮＡ）の抑制をもたらすので、感染した細胞のアポトーシスの可能性を増大する。
【０１８１】
ある特定の実施態様では、いくつかのヒトアポトーシス阻害遺伝子（ＢＣＬ−２、ＦＬＩＰ、ＳＴＡＴ３及びＸＩＡＰ）を標的として用いることができる。
【０１８２】
トリガー配列及び標的ｓｉＲＮＡの設計をさまざまな用途のために改変することは当業者の理解の範囲内である。具体的には、当業者は公知のトリガー及びｓｉＲＮＡを本明細書に記載されている方法及び設計に容易に適用することができる。
【０１８３】
ＨＩＶに感染した細胞を選択的に殺すことを目的にして、異なったｔｓｗＲＮＡのライブラリーを設計して合成できる。
【０１８４】
治療用スイッチングＲＮＡのライブラリーのインビトロ及びインビボ試験は、一般に癌、ＨＩＶの多数のサブタイプ、及びＲＮＡウィルスを標的にしている。最初のインビトロ実験はＥＧＦＰ遺伝子を含有しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞内で行われる。この遺伝子のｍＲＮＡの存在が、我々の設計したスイッチがこれらの細胞においてアポトーシスを誘発する引き金となる。一実施態様では、遺伝子ＴＷＩＳＴ又はＣＴＧＦのｍＲＮＡは、ＲＮＡスイッチに活性な構造をもたらし、抗アポトーシス遺伝子サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）を標的にするｓｉＲＮＡの形成を引き起こす。別の実施態様では、遺伝子ＴＷＩＳＴ又はＣＴＧＦのｍＲＮＡは、ＲＮＡスイッチに活性な構造をもたらし、ＥＧＦＰ遺伝子のｍＲＮＡを標的にするｓｉＲＮＡの形成を引き起こす。開発されたＲＮＡ構築物はＤＮＡを包含している改変ヌクレオチドから構成されていてもよい。また、構築物は２つ以上のヌクレオチド配列から構成されていてもよい。ＨＩＶに対する潜在的な初期認識部位の例は、Ｌｄｒ−３ ＧＧＡＧＡＧＡＧＡＵＧＧＧＵＧＣＧＡＧＴＴ ７８２位；Ｇａｇ−５ ＧＡＡＧＡＡＡＵＧＡＵＧＡＣＡＧＣＡＵＴＴ １８１９位；Ｐｏｌ−１ ＡＣＡＧＧＡＧＣＡＧＡＵＧＡＵＡＣＡＭＴ ２３２８位；Ｐｏｌ−２９ ＣＡＧＵＧＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＡＵＡＴＴ ４８１１位；Ｐｏｌ−４７ ＧＵＧＡＡＧＧＧＧＣＡＧＵＡＧＵＡＡＵＴＴ ４９６３位；Ｒ／Ｔ−５ ＡＵＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＴＴ ５９６９位：であり、標的として潜在的なヒト抗アポトーシス遺伝子（Ｂｃｌ−２、ＦＬＩＰ、ＳＴＡＴ３、ＸＩＡＰ、サバイビンなど）を伴う。潜在的な癌認識部位はＢＣＲ−ＡＢＬであり、標的として先に述べた抗アポトーシス遺伝子を伴う。ＢＣＬ−２抗アポトーシス遺伝子のｍＲＮＡを標的にする設計された抗ＨＩＶ ＲＮＡスイッチは配列：
ＵＡＵＡＡＵＧＣＡＡＵＡＡＵＧＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＵＵＡＡＵＵＵＣＵＵＵＵＡＡＵＧＵＵＧＵＡＵＵＡＵＣＵＧＵＵＣＵＵＧＵＧＵＣＵＧＵＧＧＣＡＵＵＡＵＣＧＣＵＵＣＣＵＵＵＵＡＡＵＵＧＣＣＣＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＣＡＵＣＵＵＣＣＵＧＧＣＣＵＧＣＡＵＵＡＵＡＵＵＵＧＵＧＧＵＡＵＵＡＵＵＧＵＡＵＵＡＵＡＡＡ：
で示される。
【０１８５】
本明細書に記載されているように、ｓｉＲＮＡの標的は病原性ＲＮＡであってよい。更に、ｓｉＲＮＡの標的としては、癌関連遺伝子、例えば、低酸素経路；Ｈｉｆｌアルファ、ＶＥＧＦ；ＤＮＡ修復経路；ＰＡＲＰ；マイクロＲＮＡＳ；ｍｉＲ２１、ｍｉＲ７、ｍｉＲ１２８ａ、ｍｉＲ２１０；癌幹細胞；ＮＯＴＣＨ、ＨＥＤＧＥＨＯＧ、ＰＴＥＮ、ＷＮＴ、ＴＧＦベータ経路中の遺伝子；免疫調節；インターロイキン（ＩＬ−６、ＩＬ−１０）及びＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＳＭＡＤ、ＴＮＦアルファ中の遺伝子を挙げられる。原則として、多くの遺伝子関連疾患を含むように概念を拡張することができる。
【０１８６】
コンピューターによる方法
ＲＮＡ二次元構造予測、ＲＮＡの３Ｄ構造モデリング、及びＲＮＡ配列設計のために、いくつかの新規で優れたバイオインフォマティクス手段を、治療用ＲＮＡスイッチをコンピューターによって設計して試験するために用いた。設計したＲＮＡスイッチのコンピューターによる結果は、トリガー配列と結合していない状態では不活性であって、トリガー配列と結合すると活性であることを示している。活性なｔｓｗＲＮＡで得られるヘアピンはＢＣＬ−２遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ類縁体である。残りの遺伝子ＳＴＡＴ３、ＦＬＩＰ及びＸＩＡＰを標的とする同様な条件のＲＮＡを設計できる。更に、分子動力学シミュレーションに付すことができる三次元モデルを作成できる。これは、合成ＲＮＡスイッチの動的挙動に関する重要な情報をもたらすだろう。
【０１８７】
実験方法
コンピューターで設計したｔｓｗＲＮＡのライブラリーをインビトロ及びＨＩＶ感染細胞中で試験できる。最初に、新たに合成された全てのｔｓｗＲＮＡを、ｉ）非結合状態において正確に折り畳まれるそれらの能力及びｉｉ）ＨＩＶ ｍＲＮＡの相補的断片の存在下でヒト組み換えダイサーによって処理されるそれらの能力（ＨＩＶ ＲＮＡと結合することが、それらの治療的活性状態への切り替えを介してｔｓｗＲＮＡの活性化を誘発することを示している）についてインビトロで試験できる。ダイサー活性はＨＩＶ ＲＮＡが存在している場合のみに期待できる。必要により、その活性状態におけるｔｓｗＲＮＡのダイサー処理能力を促進するためにｔｓｗＲＮＡ構造に適切な化学修飾を行うことができる。次に、ＨＩＶに感染したヒト細胞（Ｈ９及び／又はジャーカット（Ｊｕｒｋａｒｔ）細胞）をｔｓｗＲＮＡの異なったタイプ、組み合わせ及び濃度でトランスフェクトして、ＢＤ（登録商標）ＭｉｔｏＳｃｒｅｅｎ（ＪＣ−１）フローサイトメトリーキットを用いるフローサイトメトリーでアポトーシスを測定する。インフェクトしない細胞株を対照として用いる。次のステップは、最も期待できる治療用スイッチングＲＮＡの詳細な特徴付け（スイッチのメカニズム、動力学、熱力学、結合親和性など）である。我々は脂質からなる薬剤送達手段を適用する（研究室はリポソーム及び双頭型両親媒性化合物の使用に関して専門知識を有している）。これは、ヒト臨床試験の長期目標を有する、異なった動物モデルにおける設計したｔｓｗＲＮＡの更なる試験を可能にするだろう。最後に、これは別のウィルスに対する潜在的な機能的治療の開発のために容易に改変できる一般的な手段であると想定していることを強調する。
【０１８８】
実施例２：二本鎖ＲＮＡスイッチ
２本のヌクレオチド鎖、アダプター鎖及びプロトファンクショナル鎖からなるｔｓｗＲＮＡを設計する（図５）。トリガー配列の非存在下で、二本鎖ｔｓｗＲＮＡは不活性状態にある（図６）。しかしながら、この二本鎖ＲＮＡ−ＲＮＡ（又は、代わりとしてＲＮＡ−ＤＮＡ）複合体は、（特異的に発現したｍＲＮＡの存在のように）病的状態についてのバイオマーカー及びトリガーとして作用するヌクレオチド配列の存在下で活性化する（図７及び８）。限定されない実施例では、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡの領域がトリガーとして作用する（遺伝子ＣＴＧＦは多種の癌において高度に発現される；ＣＴＧＦは同義語ＣＣＮ２又はＩＧＦＢＰ８としても知られている）（図９）。類似の構造は、癌細胞（例えば、腫瘍遺伝子のｍＲＮＡ）又は病原体に感染した細胞（例えば、ウィルスゲノムＲＮＡ又は病原体ｍＲＮＡ）で特異的に発現した他のＲＮＡのヌクレオチド配列領域をトリガーとして用いることができる。
【０１８９】
ＥＧＦＰ（高感度ＧＦＰ）遺伝子の下方制御が、原理を明らかにするために、ＣＴＧＦ（トリガー配列）及びＥＧＦＰ（標的配列）を発現する細胞株を用いた機能性を示す説明のための実例として用いられるだろう。すなわち、トリガー配列（ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ）の存在下でアダプターがトリガーと結合し、ｔｓｗＲＮＡのプロトファンクショナル鎖はダイサーで処理可能なｓｉＲＮＡ様螺旋を露出するように折り畳まれ、ダイサーで処理されると、プロトファンクショナル鎖はＥＧＦＰ遺伝子を標的にしてそれを下方制御し、その結果、検出される蛍光発光の減少がもたらされる（図１０）。標的遺伝子としてのＥＧＦＰの代わりに、類似の構造は、アポトーシス阻害剤（その下方制御は細胞死の増大を誘導する）などの他の遺伝子、又は他の標的配列であってその阻害が治療上有益な効果をもたらす配列を標的とするｓｉＲＮＡ領域を組み込むことができる。標的配列は非コードＲＮＡであってもよい。
【０１９０】
二本鎖の構造はプロトファンクショナルＲＮＡ鎖、及びＲＮＡ又はＤＮＡであってよいアダプター鎖から成っている（図１１及び１２）。プロトファンクショナル鎖は（他のヌクレオチド鎖と対に成っていない場合）ダイサーで処理可能なｓｉＲＮＡ様二重螺旋を露出する構造に折り畳まれる（ここではＥＧＦＰを標的にするｓｉＲＮＡを含んでいる）。
【０１９１】
プロトファンクショナル鎖とアダプター鎖の複合体はダイサーで処理可能なｓｉＲＮＡ様螺旋を露出しない構造に折り畳まれる。プロトファンクショナル鎖は、ダイサーで処理される領域の後ろに、センス及びアンチセンスｓｉＲＮＡに対応する２つの配列領域を含んでいる。これら２つのｓｉＲＮＡ領域はプロトファンクショナル鎖の５’末端及び３’末端に位置している。
【０１９２】
不活性な構造（プロトファンクショナル鎖とアダプター鎖の複合体）は、アダプター鎖及びプロトファンクショナル鎖に位置している幾つかのデコイ領域の助けにより安定化され、デコイ領域はアダプター鎖とプロトファンクショナル鎖の拡大した塩基対合を促進し、そして安定なｓｉＲＮＡ二本鎖領域と比較して構造上の選択肢（ｄｅｃｏｙ（おとり））を提供する。
【０１９３】
アダプター鎖の大部分は、バイオマーカー及びトリガーとして作用するヌクレオチド鎖（例えば、ＣＴＧＴｍＲＮＡの領域）の逆相補にある。アダプター鎖及びプロトファンクショナル鎖の両方は、立体衝突することなく複合体構造への折り畳みを促進するためにｔｓｗＲＮＡの一本鎖領域に対応している領域（ループ）を保持している（図６−「ループ領域」として示される）。プロトファンクショナル鎖とアダプター鎖の複合体は、アダプター鎖とトリガーＲＮＡ領域の結合の開始を促進する一本鎖トーホールド領域（アダプター鎖の５'末端付近）を露出している。類縁体の設計において、１つ又は幾つかの一本鎖トーホールド領域を５'末端以外のアダプター鎖領域に位置付けることができる。
【０１９４】
コンピューターツール（ＲＮＡ ｆｏｌｄ、ＲＮＡ ｃｏｆｏｌｄ、ＮＵＰＡＣＫ、ＣｙｌｏＦｏｌｄ（多鎖バージョン）、ＮａｎｏＴｉｌｅｒ、ＲＮＡ Ｃｏｍｐｏｓｅｒ）を用い、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡによって誘発されＥＧＦＰ ｍＲＮＡを標的にする二本鎖ｔｓｗＲＮＡに対応している２つのＲＮＡを設計した（図５）。
【０１９５】
同様な実施態様：アダプター鎖はＲＮＡの代わりにＤＮＡであってよい。プロトファンクショナル鎖とアダプター鎖の両方は図に示したものとは異なって大量又は少量のループ領域とデコイ領域を順に並べて含んでいてもよい。
【０１９６】
実施例３：四本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体
別の実施態様では、治療用ヌクレオチド複合体は、３本のＲＮＡ鎖（１本のセンスｓｉＲＮＡ、１本のアンチセンスｓｉＲＮＡ、及び１本のアダプターＲＮＡ）及び１本のＤＮＡ鎖（輸送鎖と呼ばれる）から成っている（図１３及び１８）。アダプター鎖の大部分はトリガー及びバイオマーカーとして作用するヌクレオチド領域鎖と逆相補的である（図１４）。説明のための実例を設計する際に、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡの領域をトリガーとして作用するように選択して、細胞株においてＥＧＦＰの発現を阻害するｓｉＲＮＡ鎖を設計した（図１５及び１６）。ヌクレオチドトリガー配列の非存在下では、治療用複合体は不活性な構造にある（図１７）。類縁体の設計において、（癌遺伝子のｍＲＮＡ、ウィルスゲノムＲＮＡのような）別のＲＮＡ又はＤＮＡの領域が、トリガー配列として機能する。
【０１９７】
アダプター鎖のトリガー鎖領域への結合は治療用複合体からアダプター鎖の解離を誘発する（図１４及び１７）。アダプター鎖のトリガー鎖への結合（及び治療用複合体からアダプター鎖の解離）の後、輸送鎖（ＤＮＡ）及び２本のｓｉＲＮＡ鎖を含む残りの複合体は、構造を変えてｓｉＲＮＡ二本鎖及び自己フォールディング輸送鎖の形成を誘発する。別の設計では、アダプター鎖はトリガーヌクレオチド配列と結合するが、輸送鎖から完全に解離しない。
【０１９８】
輸送鎖は幾つかの領域：センスｓｉＲＮＡと結合できる領域、アダプター鎖と結合できる領域、及びアンチセンスｓｉＲＮＡと結合できる領域：から成っている（図１３及び１４）。輸送鎖はアダプター鎖の除去後にｓｉＲＮＡの形成を促進する追加の相補領域を含んでいる（図１４）。別の設計では、輸送鎖は追加の相補領域を含んでいない。更に別の設計では、輸送鎖は幾つかの追加の相補領域を含んでいる。
【０１９９】
（トリガー鎖のアダプター鎖への結合の結果として形成される）ｓｉＲＮＡ二本鎖は、ダイサーによって認識されて処理され、それによってＲＮＡサイレンシング経路の活性化をもたらす（図１４）。ＲＮＡサイレンシング経路の活性化は目的の標的遺伝子又は経路の下方制御をもたらす。図１５〜１７に説明した構造では、標的遺伝子はＥＧＦＰである。（別のｓｉＲＮＡを用いた）類似の構造は、抗アポトーシス遺伝子、癌遺伝子、サイトカイン、又はウィルス遺伝子のような、その他のｍＲＮＡを標的にできる。別の実施態様では、標的遺伝子産物はｍＲＮＡではなく非コードＲＮＡである。
【０２００】
異なったタイプのｓｉＲＮＡ及び異なったタイプのトリガー配列を取り込むことは当業者の理解の範囲内である。４本鎖構造においてｓｉＲＮＡを変えてもアダプター鎖配列に影響を及ぼさない。ｓｉＲＮＡ鎖との塩基対合を促進するためには、構築物／輸送鎖のｓｉＲＮＡとの塩基対合の一部分のみを改変しなければならない。トリガー配列の変更は、（トリガー配列と塩基対を形成するように）アダプター鎖の変更をもたらし、アダプター鎖と塩基対を形成するように構築物／輸送鎖の部分に変更をもたらす。
【０２０１】
（その他の実施態様）
先の記載から、多種の使用及び条件に適合させるために本明細書に記載されている発明に変更及び修正を行えることは明らかである。このような実施態様も以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【０２０２】
本明細書における可変物のいずれかの定義において、要素を列挙した記述は、いずれかの単一要素又は列挙されている要素の組み合わせ（又はサブコンビネーション）として、可変物の定義を包含している。本明細書の実施態様の記述は、いずれかの単一の実施態様又はいずれかの他の実施態様若しくはその一部との組み合わせを包含している。
【０２０３】
この明細書において言及されている全ての特許及び文献は、それぞれ独立した特許及び文献が具体的に且つ独立して参照により取り込まれているのと同じ程度で、参照により本明細書に取り込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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