(57)【要約】【課題】【解決手段】人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその前駆体を多様化する方法、該方法により得られる化合物、該化合物に関する使用及び組成物。該方法は、ａ）下記からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又は化合物の混合物を提供する工程：任意にシアリル化及び／又はフコシル化された式（２）で表されるラクトース誘導体及びその塩（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基であり、Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、Ｒ４は独立にそれぞれシアリル又はＨであり、但し、単独で提供される場合には、式（２）で表される化合物はラクトースのＲ−グリコシドではない）；任意にシアリル化及び／又はフコシル化された式（４）で表されるラクトース誘導体及びその塩（式中、Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、Ｒ４は独立にそれぞれシアリル又はＨであり、但し、単独で提供される場合には、前記一般式４で表される化合物はラクトースではない）；ラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）（Ｉ）；式（ＩＩ）で表されるラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）誘導体（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）；ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）（ＩＩＩ）；式（ＩＶ）で表されるラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）誘導体（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）；ｂ）前記工程ａ）により提供された少なくとも１種の化合物又は化合物の混合物に、トランスグリコシダーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素を添加する工程；及びｃ）前記工程ｂ）により得られた混合物を培養する工程を含む。2014513986.tif 000082【選択図】なし
2014513986.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むことを特徴とする、１種以上の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体若しくは前駆体を調製する方法。
ａ）下記からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又は化合物の混合物を提供する工程、
・任意にシアリル化及び／又はフコシル化された一般式２で表されるラクトース誘導体及びその塩
【化１】
2014513986.tif 000064
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基であり、
Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ４は独立にそれぞれシアリル又はＨであり、
但し、単独で提供される場合には、前記一般式２で表される化合物はラクトースのＲ−グリコシドではない）
・任意にシアリル化及び／又はフコシル化された一般式４で表されるラクトース誘導体及びその塩
【化２】
2014513986.tif 000065
（式中、Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ４は独立にそれぞれシアリル又はＨであり、
但し、単独で提供される場合には、前記一般式４で表される化合物はラクトースではない）
・ラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）、
【化３】
2014513986.tif 000066
・下記式で表されるラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）誘導体、
【化４】
2014513986.tif 000067
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
・ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、
【化５】
2014513986.tif 000068
・下記式で表されるラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）誘導体、
【化６】
2014513986.tif 000069
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
ｂ）前記工程ａ）により提供された少なくとも１種の化合物又は化合物の混合物に、トランスグリコシダーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素を添加する工程、
ｃ）前記工程ｂ）により得られた混合物を培養する工程、
ｄ）工程ａ）において２種の化合物のみが提供され、その１つが３’−シアリルラクトースである、且つ、工程ｂ）において添加されるトランスグリコシダーゼ活性を含む酵素が、トランス−シアリダーゼ活性を含む酵素である場合には、少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）を繰り返す工程、
ｅ）任意に、前記工程ｃ）又はｄ）により得られた混合物を以て、少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）を繰り返す工程、
ｆ）任意に、工程ｃ）、ｄ）又はｅ）後に得られた混合物を水素化分解反応させる工程。
【請求項２】
前記ｄ）において、工程ａ）において２種の化合物のみが提供され、その１つが一般式２又は４で表されるシアリル化ラクトース誘導体である、且つ、工程ｂ）において添加されるトランスグリコシダーゼ活性を含む酵素が、トランス−シアリダーゼ活性を含む酵素である場合には、少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）を繰り返すことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｄ）において、工程ｃ）の結果として１種のＨＭＯ又はその誘導体若しくは前駆体のみが形成され、更に、
工程ａ）において２種の化合物のみが提供され、その１つが３’−シアリルラクトース又は一般式２又は４で表されるシアリル化ラクトース誘導体である、且つ、工程ｂ）において添加されるトランスグリコシダーゼ活性を含む酵素が、トランス−シアリダーゼ活性を含む酵素である場合には、
少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）を繰り返すことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物の混合物が、前記工程ａ）で規定する少なくとも２、３、４、５、１〜５、３〜１０、５〜１０、又は更に異なる種類の化合物を含むことを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記トランスグリコシダーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素が、２、３、４、５、２〜５、２〜１０、５〜１０又は更に異なる種類のトランスグリコシダーゼ活性を含む酵素から選択されることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物又は酵素が同時に又は連続的に添加されることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記トランスグリコシダーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素が、トランス−フコシダーゼ、トランス−シアリダーゼ、トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ及び／又はトランス−Ｎ−アセチルラクトアミニダーゼ活性、好ましくはα−トランス−フコシダーゼ、α−トランス−シアリダーゼ、β−トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ及び／又はβ−トランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性を含む酵素であることを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
培養により以下に規定される人乳オリゴ糖及び／又はその前駆体が得られることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
・一般式１で表される化合物及びその塩、
【化７】
2014513986.tif 000070
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基であり、
Ｒ１はフコシル又はＨであり、
Ｒ２はＮ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基から選択され、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基は、１以上のＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１以上のラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基を有してもよく、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ３はＨ、又は、１以上のＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１以上のラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよい）
・一般式２で表される化合物及びその塩、
【化８】
2014513986.tif 000071
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基であり、
Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ４は独立にそれぞれシアリル又はＨであり、
但し、前記Ｒ１又はＲ４基のうち少なくとも１つはＨではない）
・一般式３で表される化合物及びその塩、及び／又は
【化９】
2014513986.tif 000072
（式中、Ｒ１はフコシル又はＨであり、
Ｒ２はＮ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基から選択され、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基は、１以上のＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１以上のラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基を有してもよく、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ３はＨ、又は、１以上のＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１以上のラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよい）
・一般式４で表される化合物及びその塩
【化１０】
2014513986.tif 000073
（式中、Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ４は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
但し、前記Ｒ１又はＲ４基のうち少なくとも１つはＨではない）
【請求項９】
前記式１及び２で表される化合物が、更に下記一般式１ａ、１ｂ若しくは２又はその塩であり、前記式３及び４で表される化合物が、更に下記一般式３ａ、３ｂ若しくは４又はその塩であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【化１１】
2014513986.tif 000074
【化１２】
2014513986.tif 000075
（式中、Ｒ、Ｒ１及びＲ４は請求項８に規定したとおりであり、
Ｒ２ａは１つのＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１つのラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ３はＨ、又は、ラクト−Ｎ−ビオシル基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ２ｂはシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−ビオシル基であり、
Ｒ３ｂはＨ、又は、１又は２つのＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１つのラクト−Ｎ−ビオシル基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよい）
【請求項１０】
・前記一般式１ａ又は３ａにおけるＲ２ａのグリコシル残基におけるＮ−アセチル−ラクトサミニル基が、別のＮ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している、
・一般式１ａ又は３ａにおけるＲ２ａのグリコシル残基におけるラクト−Ｎ−ビオシル基が、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している、
・一般式１ａ又は３ａにおけるＲ３ａのグリコシル残基におけるラクト−Ｎ−ビオシル基が、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している、
・一般式１ｂ又は３ｂにおけるＲ３ｂのグリコシル残基におけるＮ−アセチル−ラクトサミニル基が、別のＮ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３又は１−６グリコシド間結合で結合している、
・一般式１ｂ又は３ｂにおけるＲ３ｂのグリコシル残基におけるラクト−Ｎ−ビオシル基が、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合していることを特徴とする、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記一般式１ａが、１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−ネオテトラオース、パラ−ラクト−Ｎ−ヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−オクタオース及びラクト−Ｎ−ネオオクタオースのＲ−グリコシドを表わし、前記一般式１ｂが、１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−オクタオース、イソ−ラクト−Ｎ−オクタオース、ラクト−Ｎ−デカオース及びラクト−Ｎ−ネオデカオースのＲ−グリコシドを表わし、前記一般式３ａが、１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−ネオテトラオース、パラ−ラクト−Ｎ−ヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−オクタオース及びラクト−Ｎ−ネオオクタオースを表わし、前記一般式３ｂが、１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−オクタオース、イソ−ラクト−Ｎ−オクタオース、ラクト−Ｎ−デカオース及びラクト−Ｎ−ネオデカオースを表わすことを特徴とする、請求項８乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又はラクト−Ｎ−ビオシル基に結合しているフコシル残基が以下により結合しており、
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のガラクトースに１−２グリコシド間結合で、及び／又は
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のＮ−アセチル−グルコサミンに１−４グリコシド間結合で、及び／又は
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基のＮ−アセチル−グルコサミンに１−３グリコシド間結合で、
前記Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又はラクト−Ｎ−ビオシル基に結合しているシアリル残基が以下により結合していることを特徴とする、請求項８乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のガラクトースに２−３グリコシド間結合で、及び／又は
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のＮ−アセチル−グルコサミンに２−６グリコシド間結合で、及び／又は
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基のガラクトースに２−６グリコシド間結合で。
【請求項１３】
前記化合物が、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、３’−シアリル−３−フコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ＬＮＦＰ−Ｉ、ＬＮＦＰ−ＩＩ、ＬＮＦＰ−ＩＩＩ、ＬＮＦＰ−Ｖ、ＬＳＴ−ａ、ＬＳＴ−ｂ、ＬＳＴ−ｃ、ＦＬＳＴ−ａ、ＦＬＳＴ−ｂ、ＦＬＳＴ−ｃ、ＬＮＤＦＨ−Ｉ、ＬＮＤＦＨ−ＩＩ、ＬＮＤＦＨ−ＩＩＩ、ＤＳ−ＬＮＴ、ＦＤＳ−ＬＮＴ  Ｉ及びＦＤＳ−ＬＮＴ  ＩＩのＲ−グリコシド、及びその塩からなる群より選択されることを特徴とする、請求項８乃至１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｒ−グリコシドが、ベータ−アノマーであり、好ましくはＲがベンジルであることを特徴とする、請求項８乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物が、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、３’−シアリル−３−フコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ＬＮＦＰ−Ｉ、ＬＮＦＰ−ＩＩ、ＬＮＦＰ−ＩＩＩ、ＬＮＦＰ−Ｖ、ＬＳＴ−ａ、ＬＳＴ−ｂ、ＬＳＴ−ｃ、ＦＬＳＴ−ａ、ＦＬＳＴ−ｂ、ＦＬＳＴ−ｃ、ＬＮＤＦＨ−Ｉ、ＬＮＤＦＨ−ＩＩ、ＬＮＤＦＨ−ＩＩＩ、ＤＳ−ＬＮＴ、ＦＤＳ−ＬＮＴ  Ｉ及びＦＤＳ−ＬＮＴ  ＩＩ、及びその塩からなる群より選択ことを特徴とする、請求項８乃至１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
工程ａ）が、下記一般式５で表される少なくとも１種の化合物又は化合物の混合物を提供する工程、
【化１３】
2014513986.tif 000076
（式中、Ｒ’は独立にフコシル又はＨであり、但し、少なくとも１つのＲ’はフコシルであり、
Ｒ＊は水素化分解により除去可能な基又はＨである）
任意に、以下からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又は化合物の混合物を提供する工程を含み、
・任意にシアリル化された下記一般式６で表されるラクトース誘導体及びその塩
【化１４】
2014513986.tif 000077
（式中、Ｒ＊は水素化分解により除去可能な基又はＨであり、
Ｒ”は独立にそれぞれシアリル又はＨである）
・ラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）、
【化１５】
2014513986.tif 000078
・下記式で表されるラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）誘導体、
【化１６】
2014513986.tif 000079
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
・ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、
【化１７】
2014513986.tif 000080
・下記式で表されるラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）誘導体、
【化１８】
2014513986.tif 000081
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
工程ｂ）において、前記工程ａ）により提供された少なくとも１種の化合物又は化合物の混合物に、トランスフコシダーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素を添加することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１７】
前記工程ａ）が、２’−フコシルラクトース又は３−フコシルラクトース、及び、更に２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、ＬＮＴ及びＬＮｎＴからなる群より選択される１種の化合物を提供する工程を含むことを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
培養によって、フコシル化人乳オリゴ糖又は人乳オリゴ糖の混合物が形成され、特に２’，３−ジフコシルラクトース、３−フコシル−３−シアリルラクトース、フコシル化ＬＮＴ又はフコシル化ＬＮｎＴ又はその混合物が形成されることを特徴とする、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記培養工程で得られた化合物が、水素化分解反応されることを特徴とする、請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記培養又は水素化分解工程で得られた化合物が、続いて、好ましくは結晶化又は沈澱により精製されることを特徴とする、請求項１乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
更に前記工程ｃ）、ｄ）又はｅ）で得られた化合物を噴霧乾燥する工程を含むことを特徴とする、請求項１乃至２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
更に前記培養又は水素化分解工程で得られた化合物を、摂取製品に添加する工程を含み、該摂取製品が好ましくは医薬製剤又は栄養製剤の少なくとも１つであることを特徴とする、請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
更に前記培養又は水素化分解工程で得られた化合物に、医薬上許容しうる担体を添加する工程及び／又はをプレバイオティクスを添加する工程を含むことを特徴とする、請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
摂取製品、医薬組成物、栄養製剤又は栄養補助食品の調製への、請求項１乃至１９のいずれか１項に記載の方法によって得られた又は得られる人乳オリゴ糖の使用。
【請求項２５】
前記栄養製剤が、乳児用調製粉乳であることを特徴とする、請求項２４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその前駆体の多様化方法、及び、本発明の方法に好適に用いられる又は本発明の方法によって得られる化合物に関する。更に本発明はそのような化合物の使用及びそのような化合物を含む製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）は、近年多くの関心を集めている。とりわけ、分泌オリゴ糖を含むこれらの複合炭水化物の合成の商業化努力が著しく増加しているが、これは人体で生じる多くの生物学的プロセスにおいて人乳オリゴ糖が果たすその役割によるものである。そのような複合オリゴ糖の天然の乳源の代表的なものの一つは哺乳動物のミルクである。哺乳動物のミルクは最大（up to）１０％の炭水化物を含み、その中、通常は二糖、ラクトース（Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ）が代表的な成分である。また、母乳及び初乳はより少ない量の他の糖類（乳オリゴ糖と称される）を含有しており、これらのほぼ全てはラクトース単位を還元末端に有し、該ラクトース単位にはＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ、Ｆｕｃ及び／又はＮｅｕ５Ａｃ又はＮｅｕ５Ｇｃ残基が結合することができる（非特許文献１及び２）。
【０００３】
これまでに少なくとも１１５の人乳のオリゴ糖の構造が判明しており、質量スペクトル（ＭＳ）データは、人乳又は初乳におけるほぼ１３０のオリゴ糖の存在を示唆している（非特許文献３）。更に、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）は、多糖（サイズ排除クロマトグラフィーが示すように５０を超える単糖残基からなる）も人乳に存在することを示唆している。したがって、１３０をかなり超える異なる糖類がおそらく人乳に存在する（非特許文献４及び５も参照）。
【０００４】
構造が判明している１１５の人乳オリゴ糖は、それらのコア構造に基づき１３のシリーズに分けることができる。そのような１３のコア構造を下記表１に例示する。
【０００５】
【表１】
2014513986.tif 000003
【０００６】
Ｕｒａｓｈｉｍａらが発見したように（非特許文献２及び５も参照）、多くの種類のオリゴ糖は、Ｎｅｕ５Ａｃβ２−３／２−６残基をＧａｌ又はＧｌｃＮＡｃに添加、及びＦｕｃα１−２／１−３／１−４をＧａｌ、ＧｌｃＮＡｃ又はコアユニットの還元Ｇｌｃに添加することで構築される。人乳オリゴ糖の主な構造的特徴は、タイプＩユニット（Ｇａｌ（β１−３）ＧｌｃＮＡｃを含むオリゴ糖、及びタイプＩＩユニット（Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ）を含むオリゴ糖の存在であり、タイプＩを含むオリゴ糖が、タイプＩＩユニットを含むオリゴ糖よりも優勢である。これまでに調査された他の種の乳オリゴ糖の多くはタイプＩＩを発現し、タイプＩユニットを発現しない。
【０００７】
しかし、人乳及び初乳における多種多様なオリゴ糖及び他の種との違いのため、好適な食品（特に調整粉乳）の代替（人乳オリゴ糖の全ての領域の少なくとも一部）を調製することは、かなり難しい。更に、免疫システムの成熟及び免疫調整物質としての予後使用において認められている重要性は、可能な免疫調整物質としての重要性を強調する。
【０００８】
したがって、人乳における様々な複合オリゴ糖に可能な限り似させる又は再生することができる複合オリゴ糖及びその混合物を調製する技術において差し迫った必要がある。
【０００９】
これに対して、有機化学合成を介して、及び、その立体選択性のため酵素的手段を介して個々のＨＭＯを生成するための多くの試みが行われてきた。この２０年ぐらいは酵素的手段について多く調べられてきた。
【００１０】
特に、生物系において、ルロアール型グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴｓ，ＥＣ２．４．１．−）及びグリコシダーゼ（グリコシドヒドロラーゼとも称される：ＧＨｓ，ＥＣ３．２．１．−）が主な２つの炭水化物処理酵素のクラスを構成し、それらはＨＭＯの製造に利用してもよい。いずれの酵素のクラスも、グリコシル基をドナーからアクセプターに転移して、その結果オリゴ糖が生成されるように作用する。しかし、産業プロセスにおける合成にグリコシルトランスフェラーゼを使用することは、発現及び溶解性の問題による望ましい酵素の入手可能性及び活性化ドナー糖の高コストによって限定されている。これらのヌクレオチドドナーは典型的には生体内原位置で（in situ）生じられるが、このプロセスは更に酵素を必要とする（非特許文献６参照）。グリコシルトランスフェラーゼに対して、グリコシダーゼは広範囲のドナー基質を有し、通常、単糖、オリゴ糖又は／及び操作された基質が採用される（すなわち、様々な官能基を有する基質）。これらはしばしば様々な炭水化物及び非炭水化物アクセプターに対して活性を示す。グリコシルトランスフェラーゼと比べたグリコシダーゼを使用する他の利点は、そのロバスト性及び入手可能性である。
【００１１】
生体内において、グリコシダーゼは通常、生成物における立体化学的配置の維持又は転化でグリコシド結合の加水分解を触媒する。生体外において、これらは、トランスグリコシル化又は逆加水分解（すなわち縮合）で新しいグリコシド結合の形成を触媒することができる。動力学的に制御された反応下で、これらの酵素（典型的に、グリコシダーゼを維持）は、よいアノマー脱離基（例えば、ニトロフェニルグリコシド）で活性化されたグリコシルドナーを用いたグリコシド結合の形成に用いることができる。これに対して、熱力学的に制御された逆加水分解は、高濃度の遊離糖を用いる。しかし、合成方向における適切なグリコシダーゼの利用には相当な関心が払われているが、最適な条件としてまだ難しく、反応を望ましい方向に進め、生成物の加水分解を避けられる好適な基質が見つからなくてはならない。
【００１２】
このボトルネックを克服し、グリコシダーゼをよりオリゴ糖合成に好適にする別のアプローチが、修飾された酵素（変異体）を供給することによって最近開発された。したがって、この２０年間、合理的又はコンビナトリアル技術に基づくプロテインエンジニアリングが、改善されたトランスグリコシル化の活性及び効率で、生体触媒を生じさせるのに非常に力があるということが証明されてきた。
【００１３】
しかしながら、基本的な人乳オリゴ糖の構造またはそれらの前駆体のための多くの有機化学合成又は酵素に基づく合成は開示されている（例えばトランス−シアリダーゼ及び３’−ＳＬを用いたいくつかの個々のシアル化ＨＭＯ又はＨＭＯベンジル／置換ベンジル配糖体の合成については、特許文献１及び２を参照）にもかかわらず、一方、このような合成法は、依然として、天然由来のオリゴ糖またはその誘導体の複合混合物を調製できていない。単一ＨＭＯの個々に設計された合成に基づいたそのような混合物の調製は、さらに高価であり、多種多様な天然由来のＨＭＯに似ていない場合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＷＯ９３／１８７８７
【特許文献２】ＷＯ２０１２／００７５８８
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Messer and Urashima, 2002, Trends Glycosci. Glycotech, 14, 153−176
【非特許文献２】Urashima et al., Advanced Dairy Chemistry, Volume 3： Lactose, Water, Salts and Minor Constituents, 2009, pp. 295−349
【非特許文献３】Newburg and Neubauer, 1995, Carbohydrates in milks： Analysis, quantities and significance. In： Handbook of Milk Composition (R.G.Jensen, ed.), pp. 273−249, Academic Press, San Diego, USA
【非特許文献４】Urashima et al., Advanced Dairy Chemistry, Volume 3： Lactose, Water, Salts and Minor Constituents, 2009, pp. 295−349
【非特許文献５】TADASU URASHIMA et al, MILK OLIGOSACCHARIDES, Nova Biomedical Books, New York, 2011, ISBN： 978−1−61122−831−1
【非特許文献６】Hanson, S., et al., Trends Biochem Sci, 2004. 29(12)： p. 656−63
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、本発明は、従来の方法よりも多種多様な人乳オリゴ糖を提供することができる方法、好ましくは費用効率の高い方法であり、好ましくは産業的規模の方法を提供することを目的とする。
更に、オリゴ糖の大規模生産に適するように立体選択的で費用効果の高い方法で、オリゴ糖及び４〜１２の糖単位（例えば６〜１０の糖単位）を有するオリゴ糖の混合物を提供することが望ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
以下の図面は本発明を更に説明するものであって、本発明の対象を限定するものではない。
【図１】図１は、現在知られている人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）の１３のコア構造を表す。
【図２】図２は、ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミニルドナー及びラクト−Ｎ−ビオシルドナーと、酵素β−１，３−トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ、β−１，３−トランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ及びβ−１，６−トランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼを用いたＨＭＯの合成の例を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
第１のアスペクトによれば、本発明は１種以上の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体若しくは前駆体を多様化する（すなわち１種以上の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体若しくは前駆体を調製する）方法を提供し、該方法は以下の工程を含む。
ａ）下記からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又は化合物の混合物を提供する工程、
・任意にシアリル化及び／又はフコシル化された一般式２で表されるラクトース誘導体及びその塩
【００１９】
【化１】
2014513986.tif 000004
【００２０】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基であり、
Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ４は独立にそれぞれシアリル又はＨであり、
但し、単独で提供される場合には、前記一般式２で表される化合物はラクトースのＲ−グリコシドではない）
【００２１】
・任意にシアリル化及び／又はフコシル化された一般式４で表されるラクトース誘導体及びその塩
【００２２】
【化２】
2014513986.tif 000005
【００２３】
（式中、Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ４は独立にそれぞれシアリル又はＨであり、
但し、単独で提供される場合には、前記一般式４で表される化合物はラクトースではない）
【００２４】
・ラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）、
【００２５】
【化３】
2014513986.tif 000006
【００２６】
・下記式で表されるラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）誘導体、
【００２７】
【化４】
2014513986.tif 000007
【００２８】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
【００２９】
・ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、
【００３０】
【化５】
2014513986.tif 000008
【００３１】
・下記式で表されるラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）誘導体、
【００３２】
【化６】
2014513986.tif 000009
【００３３】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
【００３４】
ｂ）前記工程ａ）により提供された少なくとも１種の化合物又は化合物の混合物に、トランスグリコシダーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素を添加する工程、
ｃ）前記工程ｂ）により得られた混合物を培養する工程、
ｄ）任意に、前記工程ｃ）により得られた混合物を以て、少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）を繰り返す工程
ｅ）任意に、工程ｃ）又はｄ）後に得られた培養した混合物を水素化分解反応させる工程。
【００３５】
好ましくは、式２で表される化合物において、Ｒ１又はＲ４の少なくとも１つはＨではない。
【００３６】
同様に好ましくは、式４で表される化合物において、Ｒ１又はＲ４の少なくとも１つはＨではない。
【００３７】
第１のアスペクトの好ましい形態によれば、本発明は１種以上の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその前駆体を多様化する（すなわち１種以上の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体若しくは前駆体を調製する）方法を提供し、該方法は以下の工程を含む。
ａ）下記からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又は化合物の混合物を提供する工程、
・任意にシアリル化及び／又はフコシル化された一般式２で表されるラクトース誘導体及びその塩
【００３８】
【化７】
2014513986.tif 000010
【００３９】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基であり、
Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ４は独立にそれぞれシアリル又はＨであり、
但し、単独で提供される場合には、前記一般式２で表される化合物はラクトースのＲ−グリコシドではない）
【００４０】
・任意にシアリル化及び／又はフコシル化された一般式４で表されるラクトース誘導体及びその塩
【００４１】
【化８】
2014513986.tif 000011
【００４２】
（式中、Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ４は独立にそれぞれシアリル又はＨであり、
但し、単独で提供される場合には、前記一般式４で表される化合物はラクトースではない）
【００４３】
・ラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）、
【００４４】
【化９】
2014513986.tif 000012
【００４５】
・下記式で表されるラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）誘導体、
【００４６】
【化１０】
2014513986.tif 000013
【００４７】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
【００４８】
・ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、
【００４９】
【化１１】
2014513986.tif 000014
【００５０】
・下記式で表されるラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）誘導体、
【００５１】
【化１２】
2014513986.tif 000015
【００５２】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
【００５３】
ｂ）前記工程ａ）により提供された少なくとも１種の化合物又は化合物の混合物に、トランスグリコシダーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素を添加する工程、
ｃ）前記工程ｂ）により得られた混合物を培養する工程、
ｄ）工程ａ）において２種の化合物のみが提供され、その１つが３’−シアリルラクトースである、且つ、工程ｂ）において添加されるトランスグリコシダーゼ活性を含む酵素が、トランス−シアリダーゼ活性を含む酵素である場合には、少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）を繰り返す工程、
ｅ）任意に、前記工程ｃ）又はｄ）により得られた混合物を以て、少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）を繰り返す工程、
ｆ）任意に、工程ｃ）、ｄ）又はｅ）後に得られた混合物を水素化分解反応させる工程。
【００５４】
好ましくは、式２で表される化合物において、Ｒ１又はＲ４の少なくとも１つはＨではない。
【００５５】
同様に好ましくは、式４で表される化合物において、Ｒ１又はＲ４の少なくとも１つはＨではない。
【００５６】
上記好ましい形態によれば、工程ａ）において２種の化合物のみが得られ、その１つが３’−シアリルラクトースである、且つ、工程ｂ）において提供される酵素が、トランス−シアリダーゼ活性を含む酵素である場合には、更に少なくとも１回の培養サイクルが必要である。工程ａ）を繰り返す時、工程ａ）で加える少なくとも１種の化合物は、第１のサイクルで提供されるものと異なることが好ましく、工程ｂ）を繰り返す時、工程ｂ）で加える少なくとも１種の化合物は、第１のサイクルで提供されるものと異なることが好ましい。したがって、オリゴ糖の混合物をシンプルな手順で大規模に製造することが可能である。加えて、シアリル部分を含む長い鎖のオリゴ糖及びその混合物（例えば、４〜１２つの糖ユニット又は６〜１０つの糖ユニットを含有するオリゴ糖）をシンプルに大規模に製造することが可能である。
【００５７】
ある場合には、上記好ましい形態は、１種以上の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその前駆体を多様化する（すなわち１種以上の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体若しくは前駆体を調製する）方法に関し、該方法は以下の工程を含む。
ａ）下記からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又は化合物の混合物を提供する工程、
・任意にシアリル化及び／又はフコシル化された一般式２で表されるラクトース誘導体及びその塩
【００５８】
【化１３】
2014513986.tif 000016
【００５９】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基であり、
Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ４は独立にそれぞれシアリル又はＨであり、
但し、単独で提供される場合には、前記一般式２で表される化合物はラクトースのＲ−グリコシドではない）
【００６０】
・任意にシアリル化及び／又はフコシル化された一般式４で表されるラクトース誘導体及びその塩
【００６１】
【化１４】
2014513986.tif 000017
【００６２】
（式中、Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ４は独立にそれぞれシアリル又はＨであり、
但し、単独で提供される場合には、前記一般式４で表される化合物はラクトースではない）
【００６３】
・ラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）、
【００６４】
【化１５】
2014513986.tif 000018
【００６５】
・下記式で表されるラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）誘導体、
【００６６】
【化１６】
2014513986.tif 000019
【００６７】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
【００６８】
・ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、
【００６９】
【化１７】
2014513986.tif 000020
【００７０】
・下記式で表されるラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）誘導体、
【００７１】
【化１８】
2014513986.tif 000021
【００７２】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
【００７３】
ｂ）前記工程ａ）により提供された少なくとも１種の化合物又は化合物の混合物に、トランスグリコシダーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素を添加する工程、
ｃ）前記工程ｂ）により得られた混合物を培養する工程、
ｄ）工程ａ）において２種の化合物のみが提供され、その１つが一般式２又は４で表されるシアリル化ラクトース誘導体である、且つ、工程ｂ）において添加されるトランスグリコシダーゼ活性を含む酵素が、トランス−シアリダーゼ活性を含む酵素である場合には、少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）を繰り返す工程、
ｅ）任意に、前記工程ｃ）又はｄ）により得られた混合物を以て、少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）を繰り返す工程、
ｆ）任意に、工程ｃ）、ｄ）又はｅ）後に得られた混合物を水素化分解反応させる工程。
【００７４】
好ましくは、式２で表される化合物において、Ｒ１又はＲ４の少なくとも１つはＨではない。
【００７５】
同様に好ましくは、式４で表される化合物において、Ｒ１又はＲ４の少なくとも１つはＨではない。
【００７６】
上記好ましい形態によれば、工程ａ）において２種の化合物のみが提供され、その１つが一般式２又は４で表されるシアリル化ラクトース誘導体である、且つ、工程ｂ）において提供される酵素が、トランス−シアリダーゼ活性を含む酵素である場合には、更に少なくとも１回の培養サイクルが必要である。工程ａ）を繰り返す時、工程ａ）で加える少なくとも１種の化合物は、第１のサイクルで提供されるものと異なることが好ましく、工程ｂ）を繰り返す時、工程ｂ）で加える少なくとも１種の化合物は、第１のサイクルで提供されるものと異なることが好ましい。したがって、オリゴ糖の混合物をシンプルな手順で大規模に製造することが可能である。加えて、シアリル部分を含む長い鎖のオリゴ糖及びその混合物（例えば、４〜１２つの糖ユニット又は６〜１０つの糖ユニットを含有するオリゴ糖）をシンプルに大規模に製造することが可能である。
【００７７】
ある場合には、上記好ましい形態は、フコシル化人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその前駆体を多様化する（すなわち１以上のフコシル化人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体若しくは前駆体を調製する）方法に関し、該方法は以下の工程を含む。
ａ）一般式５で表される少なくとも１種の化合物又は化合物の混合物を提供する工程、
【００７８】
【化１９】
2014513986.tif 000022
【００７９】
（式中、Ｒ’は独立にフコシル又はＨであり、但し、少なくとも１つのＲ’はフコシルであり、Ｒ＊は水素化分解により除去可能な基又はＨである）
【００８０】
任意に、以下からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又は化合物の混合物を提供する工程
・任意にシアリル化された一般式６で表されるラクトース誘導体及びその塩
【００８１】
【化２０】
2014513986.tif 000023
【００８２】
（式中、Ｒ＊は水素化分解により除去可能な基又はＨであり、
Ｒ”は独立にそれぞれシアリル又はＨである）
【００８３】
・ラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）、
【００８４】
【化２１】
2014513986.tif 000024
【００８５】
・下記式で表されるラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）誘導体、
【００８６】
【化２２】
2014513986.tif 000025
【００８７】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
【００８８】
・ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、
【００８９】
【化２３】
2014513986.tif 000026
【００９０】
・下記式で表されるラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）誘導体、
【００９１】
【化２４】
2014513986.tif 000027
【００９２】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
【００９３】
ｂ）前記工程ａ）により提供された少なくとも１種の化合物又は化合物の混合物に、トランスフコシダーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素を添加する工程、
ｃ）前記工程ｂ）により得られた混合物を培養する工程、
ｄ）任意に、工程ｄ）後に得られた混合物を水素化分解反応させる工程。
【００９４】
上記好ましい形態によれば、単一のフコシル化人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体若しくは前駆体、又は、フコシル化人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体若しくは前駆体の混合物をシンプルな手順で大規模に製造することが可能である。特に、工程ａ）において２’−フコシルラクトース又は３−フコシルラクトースが提供され、更に２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、ＬＮＴ及びＬＮｎＴからなる群より選択される１種の化合物が提供されることが好ましい。
【００９５】
上記好ましい方法によって、１種以上のフコシル化人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体若しくは前駆体が形成され、好ましくは１種のフコシル化人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体若しくは前駆体が形成され、より好ましくは１種のフコシル化人乳オリゴ糖が形成され、特に２’，３−ジフコシルラクトース、３−フコシル−３−シアリルラクトース、フコシル化ＬＮＴ又はフコシル化ＬＮｎＴが形成される。
【００９６】
ある場合には、上記好ましい形態は、人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその前駆体を多様化する（すなわち１種以上の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体若しくは前駆体を調製する）方法に関し、該方法は以下の工程を含む。
ａ）以下からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又は化合物の混合物を提供する工程、
・任意にシアリル化及び／又はフコシル化された一般式２で表されるラクトース誘導体及びその塩
【００９７】
【化２５】
2014513986.tif 000028
【００９８】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基であり、
Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ４は独立にそれぞれシアリル又はＨであり、
但し、単独で提供される場合には、前記一般式２で表される化合物はラクトースのＲ−グリコシドではない）
【００９９】
・任意にシアリル化及び／又はフコシル化された一般式４で表されるラクトース誘導体及びその塩
【０１００】
【化２６】
2014513986.tif 000029
【０１０１】
（式中、Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ４は独立にそれぞれシアリル又はＨであり、
但し、単独で提供される場合には、前記一般式４で表される化合物はラクトースではない）
【０１０２】
・ラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）、
【０１０３】
【化２７】
2014513986.tif 000030
【０１０４】
・下記式で表されるラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）誘導体、
【０１０５】
【化２８】
2014513986.tif 000031
【０１０６】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
【０１０７】
・ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、
【０１０８】
【化２９】
2014513986.tif 000032
【０１０９】
・下記式で表されるラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）誘導体、
【０１１０】
【化３０】
2014513986.tif 000033
【０１１１】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
【０１１２】
ｂ）前記工程ａ）により提供された少なくとも１種の化合物又は化合物の混合物に、トランスグリコシダーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素を添加する工程、
ｃ）前記工程ｂ）により得られた混合物を培養する工程、
ｄ）工程ａ）において２種の化合物のみが提供され、その１つが一般式２又は４で表されるフコシル化ラクトース誘導体である、且つ、工程ｂ）において添加されるトランスグリコシダーゼ活性を含む酵素が、トランス−フコシダーゼ活性を含む酵素である場合には、少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）を繰り返す工程、
ｅ）任意に、前記工程ｃ）又はｄ）により得られた混合物を以て、少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）を繰り返す工程、
ｆ）任意に、工程ｃ）、ｄ）又はｅ）後に得られた混合物を水素化分解反応させる工程。
【０１１３】
好ましくは、式２で表される化合物において、Ｒ１又はＲ４の少なくとも１つはＨではない。
【０１１４】
同様に好ましくは、式４で表される化合物において、Ｒ１又はＲ４の少なくとも１つはＨではない。
【０１１５】
上記好ましい形態によれば、工程ａ）において２種の化合物のみが提供され、その１つが一般式２又は４で表されるフコシル化ラクトース誘導体である、且つ、工程ｂ）において提供される酵素が、トランス−フコシダーゼ活性を含む酵素である場合には、更に少なくとも１回の培養サイクルが必要である。工程ａ）を繰り返す時、工程ａ）で加える少なくとも１種の化合物は、第１のサイクルで提供されるものと異なることが好ましく、工程ｂ）を繰り返す時、工程ｂ）で加える少なくとも１種の化合物は、第１のサイクルで提供されるものと異なることが好ましい。したがって、オリゴ糖の混合物をシンプルな手順で大規模に製造することが可能である。加えて、フコシル部分を含む長い鎖のオリゴ糖及びその混合物（例えば、４〜１２つの糖ユニット又は６〜１０つの糖ユニットを含有するオリゴ糖）をシンプルに大規模に製造することが可能である。
【０１１６】
第１のアスペクトのより好ましい形態によれば、本発明は１種以上の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその前駆体を多様化する（すなわち１種以上の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体若しくは前駆体を調製する）方法を提供し、該方法は以下の工程を含む。
ａ）下記からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又は化合物の混合物を提供する工程、
・任意にシアリル化及び／又はフコシル化された一般式２で表されるラクトース誘導体及びその塩
【０１１７】
【化３１】
2014513986.tif 000034
【０１１８】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基であり、
Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ４は独立にそれぞれシアリル又はＨであり、
但し、単独で提供される場合には、前記一般式２で表される化合物はラクトースのＲ−グリコシドではない）
【０１１９】
・任意にシアリル化及び／又はフコシル化された一般式４で表されるラクトース誘導体及びその塩
【０１２０】
【化３２】
2014513986.tif 000035
【０１２１】
（式中、Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ４は独立にそれぞれシアリル又はＨであり、
但し、単独で提供される場合には、前記一般式４で表される化合物はラクトースではない）
【０１２２】
・ラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）、
【０１２３】
【化３３】
2014513986.tif 000036
【０１２４】
・下記式で表されるラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）誘導体、
【０１２５】
【化３４】
2014513986.tif 000037
【０１２６】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
【０１２７】
・ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、
【０１２８】
【化３５】
2014513986.tif 000038
【０１２９】
・下記式で表されるラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）誘導体、
【０１３０】
【化３６】
2014513986.tif 000039
【０１３１】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
【０１３２】
ｂ）前記工程ａ）により提供された少なくとも１種の化合物又は化合物の混合物に、トランスグリコシダーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素を添加する工程、
ｃ）前記工程ｂ）により得られた混合物を培養する工程、
ｄ）
・工程ｃ）において１種の化合物又はその誘導体若しくは前駆体のみが形成され、更に、
・工程ａ）において２種の化合物のみが提供され、その１つが３’−シアリルラクトース又は一般式２又は４で表されるシアリル化ラクトース誘導体である、且つ、工程ｂ）において添加されるトランスグリコシダーゼ活性を含む酵素が、トランス−シアリダーゼ活性を含む酵素である場合には、
少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）を繰り返す工程、
ｅ）任意に、前記工程ｃ）又はｄ）により得られた混合物を以て、少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）を繰り返す工程、
ｆ）任意に、工程ｃ）、ｄ）又はｅ）後に得られた混合物を水素化分解反応させる工程。
【０１３３】
好ましくは、式２で表される化合物において、Ｒ１又はＲ４の少なくとも１つはＨではない。
【０１３４】
同様に好ましくは、式４で表される化合物において、Ｒ１又はＲ４の少なくとも１つはＨではない。
【０１３５】
上記より好ましい形態によれば、第１のサイクルにおいて１種の生成物のみ（ＨＭＯ、ＨＭＯ誘導体又はＨＭＯ前駆体）が形成される場合には、更に少なくとも１回の培養サイクルが必要である。このケースは、工程ａ）において提供されるいくつかのドナー−アクセプターペアに起こり得る。単一生成物の形成によって、工程ａ）で提供される出発原料が工程ｃ）で得られる混合物に残る。工程ａ）及びｃ）を繰り返す時、工程ａ）により提供される少なくとも１種の化合物は、第１のサイクルで提供されるものと異なることが好ましく、工程ｂ）及びｃ）を繰り返す時、工程ｂ）により添加される少なくとも１種の酵素は、第１のサイクルで提供されるものと異なることが好ましい。工程ａ）〜ｃ）の全てを繰り返す時、好適には、工程ａ）で提供される少なくとも１種の化合物、又は、工程ｂ）で提供される少なくとも１種の酵素のいずれかが、第１のサイクルで提供されるものと異なることが好ましく、両方が第１のサイクルで提供されるものと異なることが好まい。
【０１３６】
上記より好ましい形態は、大規模に行うことが可能である、ＨＭＯ又はその前駆体の混合物をシンプルに単一の反応プロセスで製造することができるプロセスを提供する。
【０１３７】
本発明において、用語「水素化分解によって除去可能な基」は、炭素−ヘテロ原子単結合が水素により開裂又は「溶解」が行われる基を意味する。ヘテロ原子は様々であってよいが、通常は酸素、窒素又は硫黄である。水素化分解は、保護基化学の中でも例外であり、水を溶媒として使用することができる。水素化分解自体は、非常に穏やかな条件下で副生成物の生成を防いで、ほぼ量的にオリゴ糖骨格からＯ−ベンジル／置換Ｏ−ベンジル部分を除去するのに好適な、強力な脱保護プロセスである。また、複合合成経路における最終デブロッキング方法として、反応の完了に必要な試薬は触媒量のみであること、及び、反応からもっぱらトルエン又は置換トルエン誘導体が副生成物として得られることが水素化分解の利点である。トルエン及び置換トルエン誘導体のいずれも数トンの規模でも、水溶性オリゴ糖産物から蒸発及び／又は抽出過程を介して容易に除去することができる。水素化分解に好適な基としてはベンジル、ジフェニルメチル（ベンズヒドリル）、１−ナフチルメチル、２−ナフチルメチル又はトリフェニルメチル（トリチル）基が挙げられ、それらはそれぞれ、アルキル、アルコキシ、フェニル、アミノ、アシルアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ニトロ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジアルキルカルバモイル、アジド、ハロゲンアルキル又はハロゲンから選択される１以上の基で任意に置換されてもよい。そのような置換基が存在する場合、１または複数の芳香環上にあることが好ましい。特に好ましい保護基は、任意にアルキル又はハロゲンから選択された１以上の基で置換されたベンジルである。更に、該保護基は非置換ベンジル、４−クロロベンジル及び４−メチルベンジルから選択されることがより好ましい。これらの特に好ましい及びより好ましい保護基は、水素化分解の副生成物がもっぱらトルエン又は置換トルエンという利点を有する。そのような副生成物は数トンの規模でも、水溶性オリゴ糖産物から蒸発及び／又は抽出過程を介して容易に除去することができる。水素化分解は、触媒量のパラジウム、ラネーニッケル、又は水素化分解で用いられるその他の適切な金属触媒を添加し、その結果ＯＨ基を再生することで行うことができる。このようなタイプの基は当業者によく知られており議論されている（例えば、P.G.M. Wuts and T.W. Greene： Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons (2007)参照）。
【０１３８】
更に、用語「ラクトースのＲ−グリコシド」は、残基Ｒで修飾され、グリコシド結合でグリコシドが形成されたラクトースと理解される。
【０１３９】
更に、用語「ＨＭＯ前駆体」は、残基Ｒで修飾され、グリコシド結合でグリコシドが形成されたＨＭＯのＲ−グリコシドを意味する。
【０１４０】
更に、用語「ＨＭＯ誘導体」は、構造化ＨＭＯ及びそのＲ−グリコシドに似ているオリゴ糖、好ましくは一般式１、２、３及び４で表される誘導体を意味する。
【０１４１】
さらに、本発明中の用語「フコシル」については、α−グリコシド間結合でコアオリゴ糖に結合しているＬ−フコピラノシル基を意味する。
【０１４２】
【化３７】
2014513986.tif 000040
【０１４３】
本発明中の「Ｎ−アセチル−ラクトサミニル」基は、β結合で結合したＮ−アセチル−ラクトサミン（LacNAc、Galpβ1−4GlcNAcp）のグリコシル残基を意味する。
【０１４４】
【化３８】
2014513986.tif 000041
【０１４５】
さらに、本発明中の用語「ラクト−Ｎ−ビオシル」基は、β結合で結合したラクト−Ｎ−二炭糖（LNB、Galpβ1−3GlcNAcp）のグリコシル残基を意味する。
【０１４６】
【化３９】
2014513986.tif 000042
【０１４７】
本発明中の用語「シアリル」は、α結合で結合したシアル酸（Ｎ−アセチル−ノイラミン酸、Neu5Ac）のグリコシル残基を意味する。
【０１４８】
【化４０】
2014513986.tif 000043
【０１４９】
さらに、本発明中の用語「１以上のＮ−アセチル−ラクトサミニル及び／又は１以上のラクト−Ｎ−ビオシル単位を含むグリコシル残基」は、好ましくはグリコシド間結合で互いに結合した前記単位を含む直鎖又は分岐鎖構造を意味する。
【０１５０】
好ましい及びより好ましい形態を含む第１のアスペクトの工程ａ）によれば、少なくとも１種の化合物又は化合物の混合物が提供される。そのような化合物の混合物は、好ましくは工程ａ）の化合物のいずれにより全般に規定したように、少なくとも２、３、４、５、１〜５、５〜１０、１〜１０、２〜１０、２〜２０、３〜２０、４若しくは５〜２０、又は更に異なる種類の化合物の混合物として理解される。したがって、そのような少なくとも１種の化合物又は少なくとも２、３、４、５、１〜５、５〜１０、１〜１０、２〜１０、２〜２０、３〜２０、４若しくは５〜２０、又は更に異なる種類の化合物の混合物は、特に限定されることなく、上述した式２及び／又は４で表される化合物、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ又はＬＮＴ誘導体又はＬＮｎＴ誘導体のいずれから選択することができる。
【０１５１】
好ましい及びより好ましい形態を含む、第１のアスペクトの工程ａ）で規定する成分、特に式２又は４で表される成分又は上述したＬＮＴ、ＬＮｎＴ又はＬＮＴ誘導体又はＬＮｎＴ誘導体のいずれの化合物は、本発明の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体若しくは前駆体を多様化する方法においてドナー又はアクセプターとして働く。本発明において、用語「ドナー」は、化学反応（例えば求核又は求電子置換反応）における特定の部分を、更なる化合物（好ましくはアクセプター）に提供する化合物として好ましくは理解される。同様に、用語「アクセプター」は、化学反応（例えば求核又は求電子置換反応）における特定の部分を、更なる化合物（好ましくはドナー）から受容する化合物として好ましくは理解される。
【０１５２】
特に好ましくは、好ましい及びより好ましい形態を含む第１のアスペクトの工程ａ）で人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）の多様化に用いる上述した式２で表される化合物は、２’−フコシルラクトース（２’−ＦＬ）、３−フコシルラクトース（３−ＦＬ）、２’，３−ジフコシルラクトース（ＤＦ−Ｌ）、３’−シアリルラクトース（３’−ＳＬ）、６’−シアリルラクトース（３’−ＳＬ）及び３’−シアリル−３−フコシルラクトース（ＦＳＬ）のＲ−グリコシド又はその塩からなる群より選択することができる。
【０１５３】
【化４１】
2014513986.tif 000044
【０１５４】
Ｒ−グリコシドはアルファ又はベータ−アノマーであってもよい。好ましくは、該Ｒ−グリコシドはベータ−アノマーである。これらのＲ−グリコシドは、ラクトースコアを有する天然由来のＨＭＯを表す。本発明の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を多様化する方法の工程ａ）に用いる化合物は、上記化合物から選択されることが好ましく、一般式２で表される化合物（Ｒはベンジル）から選択されることがより好ましい。
【０１５５】
また、特に好ましくは、好ましい及びより好ましい形態を含む第１のアスペクトの人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）の多様化のための工程ａ）で採用される化合物は、一般式４で表される化合物及びその塩から選択することができる。
【０１５６】
【化４２】
2014513986.tif 000045
【０１５７】
特に好ましい、本発明の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を多様化する方法の工程ａ）に用いる上述した式４で表される化合物は、２’−フコシルラクトース（２’−ＦＬ）、３−フコシルラクトース（３−ＦＬ）、２’，３−ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）、３’−シアリルラクトース（３’−ＳＬ）、６’−シアリルラクトース（６’−ＳＬ）及び３’−シアリル−３−フコシルラクトース（ＦＳＬ）及びその塩からなる群より選択することができる。
【０１５８】
好ましい及びより好ましい形態を含む人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を多様化させる第１のアスペクトの工程ｂ）において、トランスグリコシダーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素を、工程ａ）により得られた又は提供された少なくとも１種の化合物又は混合物に添加する。そのような培養によって、工程ａ）により得られた又は提供された少なくとも１種の化合物又は混合物を有利に多様化することができる。そのような工程ａ）により得られた又は提供された少なくとも１種の化合物又は混合物の多様化は、工程ｂ）で加えた種々の活性を有する酵素に基づき、また、工程ａ）により得られた又は提供された少なくとも１種の化合物又は混合物にも基づき、そのような化合物それぞれは、多様化反応においてドナー又はアクセプターとして機能することができる。このアプローチを利用して、本発明の方法によって有利にバリエーションが可能であり、そして、シンプルで費用効率よく、混合物に含まれるオリゴ糖の数及びタイプの多様化が可能である。酵素の使用によって更に様々なＨＭＯの多様化を、立体選択的方法で行うことができる。多様化した人乳オリゴ糖又はその誘導体の混合物を得るのによく知られた手法で、分子の所望の位置で新しい結合を形成することなどによるグリコシル部分（例えば、シアリル部分、フコシル部分、Ｎ−アセチルラクトサミニル部分又はラクト−Ｎ−ビオシル部分）の転移によって多様化が生じることが好ましい。
【０１５９】
好ましい及びより好ましい形態を含む第１のアスペクトの工程ｂ）において、少なくとも１種のトランスグリコシダーゼ活性を含む酵素を添加する（好ましくは、トランスグリコシダーゼ活性を含む少なくとも２、３、４、５、２〜５、２〜１０、２〜２０、５〜１０又は更に異なる種類の酵素）。
【０１６０】
好ましい及びより好ましい形態を含む人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を多様化させる第１のアスペクトの工程ｂ）において好適な酵素は、典型的には、トランスグリコシダーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素を含み、好ましくは例えば、フコシダーゼ又はトランス−フコシダーゼ又はフコシンターゼ活性、シアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）又はトランス−シアリダーゼ（トランスノイラミニダーゼ）活性、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ又はトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性及び／又はＮ−アセチルラクトアミニダーゼ又はトランス−Ｎ−アセチルラクトアミニダーゼ活性を有する酵素、又は、そのような活性を有するいずれの更なる酵素から選択される酵素である。より好ましくは、好ましい及びより好ましい形態を含む人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を多様化させる第１のアスペクトの工程ｂ）において好適な酵素は、野生型若しくは変異グリコシダーゼ又はトランスグリコシダーゼ、好ましくはフコシダーゼ、トランス−フコシダーゼ若しくはフコシンターゼ活性、シアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）若しくはトランス−シアリダーゼ（トランスノイラミニダーゼ）活性、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ若しくはトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性及び／又はＮ−アセチルラクトアミニダーゼ若しくはトランス−Ｎ−アセチルラクトアミニダーゼ活性を有する野生型若しくは変異グリコシダーゼ又はトランスグリコシダーゼ、又は好ましくはα−トランス−フコシダーゼ、α−トランス−シアリダーゼ、β−トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ及び／又はβ−トランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性を有する野生型若しくは変異グリコシダーゼ又はトランスグリコシダーゼを含む群より選択される。
【０１６１】
好ましい及びより好ましい形態を含む人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を多様化させる第１のアスペクトの工程ｂ）において好適な酵素は、更に、少なくとも１種の上記酵素（例えば、トランスグリコシダーゼ活性を有する酵素、好ましくはフコシダーゼ若しくはトランス−フコシダーゼ、シアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）若しくはトランス−シアリダーゼ（トランスノイラミニダーゼ）活性、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ若しくはトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性及び／又はＮ−アセチルラクトアミニダーゼ若しくはトランス−Ｎ−アセチルラクトアミニダーゼ活性を有する酵素、又は、好ましくはα−トランス−フコシダーゼ、α−トランス−シアリダーゼ、β−トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ、及び／又は、β−トランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性を有する酵素、又はそのような活性を有するいずれの更なる酵素）を発現する又は分泌する当業者に知られているいずれの属から選択されてもよい。更により好ましくは、人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を多様化させる第１のアスペクトの工程ｂ）において好適な酵素は、桿菌、ビフィドバクテリウム、ラクトバチルス、リューコノストック、乳酸球菌、連鎖球菌、ストレプトミセス、スルホロブス、テルモトガ又はトリパノソーマから選択されるバクテリアから選択してもよい。
【０１６２】
より好ましくは、好ましい及びより好ましい形態を含む人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を多様化させる第１のアスペクトの工程ｂ）において好適なそのような酵素は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＮＣＩＭＢ４１１７１、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＮＣＩＭＢ４１１７１、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＰＲＬ２０１０、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＰＲＬ２０１０、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＳ１７、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＳ１７、ビフィドバクテリウム・デンティウムＢｄ１、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７、ビフィドバクテリウム・ロンガムサブスピーシーズ・ロンガムＪＤＭ３０１、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＪＣＭ１２２２及びラクトバチルス・カゼイＢＬ２３などのバクテリア・バシラス・サーキュランス、ストレプトミセス、スルフォロブス・ソルファタリクスＰ２、テルモトガ・マリチマＭＳＢ８、クルーズトリパノソーマ又は乳酸バクテリアを含む群より選択される。
【０１６３】
上記文脈において特に好ましい微生物、特にグリコシダーゼ／トランスグリコシダーゼをターゲットとしたものは乳酸バクテリアを含む。乳酸バクテリア、特にビフィドバクテリウム属に属するバクテリアは、人乳オリゴ糖を認めることができるα−２，３／６シアリダーゼ（ＧＨ３３）、α−１，２／３／４フコシダーゼ（ＧＨ２９及びＧＨ９５）、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ（ＧＨ２０）、β−ガラクトシダーゼ（ＧＨ２）及びβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（ＧＨ２０）を含む一連のグリコシダーゼを含む。ビフィドバクテリア菌株に依って、これらのグリコシダーゼは細胞内又は外酵素である。
【０１６４】
乳酸バクテリアに由来するグリコシダーゼの使用についての更なるアスペクトは、そのようなバクテリアの産業的重要性に関する。なぜなら、それらはＧＲＡＳ（米国食品医薬品局の認可）資格を有するからである。別のより好ましいアスペクトによれば、トランス−フコシダーゼ、トランス−シアリダーゼ、トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ及び／又はトランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性、好ましくはα−トランス−フコシダーゼ、α−トランス−シアリダーゼ、β−トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ及び／又はβ−トランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性を示すグリコシダーゼは、野生型又は操作されたグリコシダーゼである。最も好ましくは、野生型グリコシダーゼは、グリコシダーゼが合理的エンジニアリング又は／及び定方向進化によってトランスグリコシダーゼに転換される乳酸バクテリアからなる群より選択される。乳酸バクテリアからなる群より選択されるグリコシダーゼは、最も好ましくは、ビフィドバクテリウム、ラクトバチルス、乳酸球菌、連鎖球菌又はリューコノストック属に由来するグリコシダーゼである。ビフィドバクテリウム属から選択されるグリコシダーゼは、最も好ましくは、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ロンガムサブスピーシーズ・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム及びビフィドバクテリウム・カテヌラータムに由来するグリコシダーゼである。
【０１６５】
更に、スルフォロブス・ソルファタリクス及びテルモトガ・マリチマなどの好熱生物に由来する操作されたフコシダーゼは、近年開発されており、本発明の方法において用いてもよい。これらの熱安定性グリコシダーゼは、産業的活用に相当な可能性を有している。なぜなら、これらは上昇した温度でバイオテクノロジーのプロセスに用い、それによりプロセスを促進し、汚染のリスクを避け、反応で用いる化合物の溶解性を高めることができる。
【０１６６】
別のより好ましい形態によれば、トランス−フコシダーゼ、トランス−シアリダーゼ、トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ及び／又はトランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性、好ましくはα−トランス−フコシダーゼ、α−トランス−シアリダーゼ、β−トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ及び／又はβ−トランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性を示すグリコシダーゼは、野生型又は操作されたグリコシダーゼである。最も好ましくは、野生型グリコシダーゼは、合理的エンジニアリング又は／及び定方向進化によりグリコシダーゼがトランスグリコシダーゼに転換された好熱生物からなる群より選択される。好熱生物から選択されたα−Ｌ−フコシダーゼは、最も好ましくは、テルモトガ・マリチマ及びスルフォロブス・ソルファタリクスに由来するα−Ｌ−フコシダーゼである。
【０１６７】
好ましくは、前記トランスグリコシダーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素は、フコシダーゼ、フコシンターゼ又はトランス−フコシダーゼ活性を発現する酵素から選択することができ、好ましくは以下に記載するものである。本発明において、フコシダーゼ又はトランス−フコシダーゼ活性、より好ましくはα−トランス−フコシダーゼ活性を有する酵素は、好ましくはフコシダーゼ全般から選択され、より好ましくはα−Ｌ−フコシダーゼ（例えばＥＣ３．２．１．３８及び３．２．１．５１に分類されるα−Ｌ−フコシダーゼ）から選択される。α−Ｌ−フコシダーゼは哺乳動物、植物、菌類及びバクテリアなど生体において存在する。これらの酵素は、ＣＡＺＹ命名法（http：／／www.cazy.or）が規定するグリコシドヒドロラーゼのファミリー２９及び９５（ＧＨ２９及びＧＨ９５）に属する。ＧＨ２９のフコシダーゼは保持酵素である（３Ｄ構造：（β／α）８）。一方、ＧＨ９５のフコシダーゼは転化酵素である（３Ｄ構造：（α／α）６）。ＧＨ２９ファミリーの基質特異性は広いが、ＧＨ９５ファミリーの基質特異性はα１，２−結合フコシル残基に限定される。ＧＨ２９ファミリーは２つのサブファミリーに分かれるようである。典型的には１つのサブファミリーはα１，３−及びα１，４−フルコシル結合に対して限定的な特異性を有する。更なるサブファミリーのメンバーはより広い特異性を有し、全てのα−フコシル結合を対象にしている。α−Ｌ−フコシダーゼは一般的にグリカンの末端フコシル残基を加水分解する。これらの酵素は、トランスフコシル化活性を有するため、本発明の方法において用いることができ、好ましくは速度論的に制御された条件下で、フコシル化反応の触媒としても働くことができる。
【０１６８】
また、本発明において採用してもよいフコシダーゼは、操作されたフコシダーゼを含んでもよい。そのような操作されたフコシダーゼは好ましくは操作されたα−Ｌ−フコシダーゼ、好ましくは上述したフコシダーゼに由来する操作されたフコシダーゼ、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダムに由来する操作されたα−１，２−Ｌ−フコシンターゼ、スルフォロブス・ソルファタリクス及びテルモトガ・マリチマに由来するα−Ｌ−フコシンターゼ等を含んでもよい。そのような操作されたフコシダーゼは、アクセプター依存性位置選択性を示し、生成物の加水分解活性が欠けている。更に、操作されたフコシダーゼは好ましくは、定方向進化によって近年有効なα−Ｌ−トランス−フコシダーゼに転換されたテルモトガ・マリチマに由来するα−Ｌ−フコシダーゼが含まれる（参照：Osanjo, G., et al., Directed evolution of the alpha−L−fucosidase from Thermotoga maritima into an alpha−L−trans−fucosidase. Biochemistry, 2007, 46(4)： p. 1022−33）。
【０１６９】
更により好ましくは、前記フコシダーゼ及び／又はトランス−フコシダーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素は、テルモトガ・マリチマＭＳＢ８、スルフォロブス・ソルファタリクスＰ２、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＪＣＭ１２２２、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＰＲＬ２０１０、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＳ１７、ビフィドバクテリウム・ロンガムスピーシーズ・ロンガムＪＤＭ３０１、ビフィドバクテリウム・デンティウムＢｄ１又はラクトバチルス・カゼイＢＬ２３などに由来するα−Ｌ−フコシダーゼから選択されてもよい。
【０１７０】
更により好ましくは、前記フコシダーゼ及び／又はトランス−フコシダーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素は、以下の寄託番号で規定されるα−Ｌ−フコシダーゼから選択されてもよい：ｇｉ｜４９８０８０６（テルモトガ・マリチマＭＳＢ８、配列番号：１）、ｇｉ｜１３８１６４６４（スルフォロブス・ソルファタリクスＰ２、配列番号：２）、ｇｉ｜３４４５１９７３（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４、配列番号：３）、ｇｉ｜２４２３４５１５５（ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ＪＣＭ１２５４、配列番号：４）、ｇｉ｜２１３５２４６４７（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス、ＡＴＣＣ１５６９７、配列番号：５）、ｇｉ｜２１３５２２６２９（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７）、ｇｉ｜２１３５２２７９９（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７）、ｇｉ｜２１３５２４６４６（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７）、ｇｉ｜３２０４５７２２７（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＪＣＭ１２２２）、ｇｉ｜３２０４５７４０８（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＪＣＭ１２２２）、ｇｉ｜３２０４５９３６９（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＪＣＭ１２２２）、ｇｉ｜３２０４５９３６８（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＪＣＭ１２２２）、ｇｉ｜３１０８６７０３９（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＰＲＬ２０１０）、ｇｉ｜３１０８６５９５３（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＰＲＬ２０１０）、ｇｉ｜３０９２５０６７２（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＳ１７）、ｇｉ｜３０９２５１７７４（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＳ１７）、ｇｉ｜２９６１８２９２７（ビフィドバクテリウム・ロンガムサブスピーシーズ・ロンガムＪＤＭ３０１）、ｇｉ｜２９６１８２９２８（ビフィドバクテリウム・ロンガムサブスピーシーズ・ロンガムＪＤＭ３０１）、ｇｉ｜２８３１０３６０３（ビフィドバクテリウム・デンティウムＢｄ１）、ｇｉ｜１９０７１３１０９（ラクトバチルス・カゼイＢＬ２３、配列番号：６）、ｇｉ｜１９０７１３８７１（ラクトバチルス・カゼイＢＬ２３、配列番号：７）、ｇｉ｜１９０７１３９７８（ラクトバチルス・カゼイＢＬ２３、配列番号：８）など。または、アミノ酸レベルで全体の野生型配列と比較して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、同様により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９５％又は更に９７％、９８％若しくは９９％で上述したフコシダーゼ及び／又はトランス−フコシダーゼ活性を有する酵素配列の１つと配列同一性を発現する配列から選択されてもよい。
【０１７１】
特に好ましいフコシダーゼ／トランス−フコシダーゼ活性を有するα−Ｌ−フコシダーゼを、下記表２に列挙する。
【０１７２】
【表２】
2014513986.tif 000046
【０１７３】
同様に好ましくは、前記トランスグリコシダーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素は、シアリダーゼ又はトランス−シアリダーゼ活性を発現する酵素、好ましくは以下に述べるものから選択してもよい。本発明において、シアリダーゼ又はトランス−シアリダーゼ活性を有する酵素は、好ましくは、以下のシアリダーゼ又はトランス−シアリダーゼ、例えばＧＨ３３ファミリーに分類されるシアリダーゼ（ＥＣ３．２．１．１８）及びトランス−シアリダーゼ（ＥＣ２．４．１．−）から選択される。これらは保持酵素である。シアリダーゼ及びトランス−シアリダーゼは広く自然に分布している。これらは特に様々なウイルスファミリー及びバクテリア、並びに、原生動物、いくつかの無脊椎動物及び哺乳動物に見つけられる。これらの酵素は生化学的性質（例えば、反応速度、結合親和性又は基質選択性）が異なる。にもかかわらず、これらは保存ドメイン及び構造的類似性を有する。トランス−シアリダーゼはシアリダーゼとは異なり、なぜなら、シアル酸（好ましくはα−２，３−結合シアル酸）をドナー分子からアクセプター誘導体へ（好ましくはβ−グリコシド間結合で末端ガラクトース部分である）転移させることができる。この転移の結果、シアル酸とアクセプターとの間にα−グリコシド結合が形成される。しかしながら、好適なアクセプターがない場合は、トランス−シアリダーゼがシアル酸を加水分解する。
【０１７４】
上述した第１のトランス−シアリダーゼ酵素はクルーズトリパノソーマ（シャガス病を引き起こす原生動物）に見られた。このトランス−シアリダーゼ（ＴｃＴＳ）は広く調査されてきた。それ以降、トランス−シアリダーゼはトリパノソーマ・ブルーセイ・ガンビエンス、トリパノソーマ・ブルーセイ・ローデシエンス、トリパノソーマ・ブルーセイ・ブルーセイ及びコンゴトリパノソーマなどのいくつかの他のトリパノソーマタイプで検知されている。更に、トランス−シアリダーゼの存在がエンドトリパヌムタイプ、ジフテリア菌、そして更にヒト血漿にも示されている。
【０１７５】
シアリダーゼは２つの異なるサブグループ（エンド−及びエキソ−シアリダーゼ）に分類することができる。エンド−シアリダーゼは高分子内のシアル酸結合を加水分解し、一方、第２のエキソ−シアリダーゼは末端シアル酸結合を攻撃して、糖タンパク質、グリコペプチド、ガングリオシド、オリゴ糖及び多糖を脱シアリル化する。近年、ビフィドバクテリウム・ビフィダム及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスに由来するシアリダーゼが確認され、クローンが作製され、特徴付けられた。これらのシアリダーゼは開裂することができ、そのためα−２，３−及びα−２，６−結合のシアロシドを認めることができる。ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス由来のシアリダーゼは一貫してα−２，６−結合を選択し、一方、ビフィドバクテリウム・ビフィダム由来のシアリダーゼは一貫してα−２，３−結合を選択する。また、これらの酵素はそのトランス−シアリダーゼ活性のためシアリル化反応の触媒として働くことができ、そのため本発明の方法において用いることができる（好ましくは反応速度が制御された条件下において）。
【０１７６】
また、本発明において採用してもよいシアリダーゼは、操作されたシアリダーゼを含んでもよい。配列及び構造の比較に基づき、トリパノソーマ・ランゲリに由来するシアリダーゼは６つの位置で変異していてもよく、その結果の突然変異体は、著しいレベルのトランス−シアリダーゼ活性を示すことができる（参照：Paris, G., et al., A sialidase mutant displaying trans-sialidase activity. J Mol Biol, 2005. 345(4)： p. 923−34）。
【０１７７】
更により好ましくは，前記シアリダーゼ及び／又はトランス−シアリダーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素は、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＳ１７、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＰＲＬ２０１０、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＮＣＩＭＢ４１１７１、クルーズトリパノソーマなどに由来するシアリダーゼ又はトランス−シアリダーゼから選択してもよい。
【０１７８】
更により好ましくは、前記シアリダーゼ及び／又はトランス−シアリダーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素は、以下の寄託番号で規定されるシアリダーゼ又はトランス−シアリダーゼから選択されてもよい：ｇｉ｜２１３５２４６５９（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７、配列番号：９）、ｇｉ｜２１３５２３００６ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７、配列番号：１０）、ｓｉａｂ２（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４）、更にビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４由来のシアリダーゼ又はトランス−シアリダーゼ）、ｇｉ｜３０９２５２１９１（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＳ１７、配列番号：１１）、ｇｉ｜３０９２５２１９０（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＳ１７、配列番号：１２）、ｇｉ｜３１０８６７４３７（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＰＲＬ２０１０、配列番号：１３）、ｇｉ｜３１０８６７４３８（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＰＲＬ２０１０、配列番号：１４）、ｇｉ｜２２４２８３４８４（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＮＣＩＭＢ４１１７１）、ｇｉ｜３１３１４０６３８（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＮＣＩＭＢ４１１７１）、ｇｉ｜４７２５２６９０（クルーズトリパノソーマ、配列番号：１５）、ｇｉ｜４３２４８５（クルーズトリパノソーマ、配列番号：１６）、ｇｉ｜３４３９５７９９８（コンゴトリパノソーマ、配列番号：２０）、ｇｉ｜３４３９５８００４（コンゴトリパノソーマ、配列番号：２１）など。または、アミノ酸レベルで全体の野生型配列と比較して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、同様により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％及び最も好ましくは少なくとも９５％又は更に９７％、９８％若しくは９９％で上述したシアリダーゼ及び／又はトランス−シアリダーゼ活性を有する酵素配列の１つと配列同一性を発現する配列から選択されてもよい。
【０１７９】
特に好ましいシアリダーゼ／トランス−シアリダーゼ活性を有するシアリダーゼを、下記表３に列挙する。
【０１８０】
【表３】
2014513986.tif 000047
【０１８１】
加えて、前記トランスグリコシダーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素は、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ又はトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を発現する酵素、好ましくは以下に述べるものから選択してもよい。本発明において、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ又はトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有する酵素は、好ましくは、以下のラクト−Ｎ−ビオシダーゼ又はトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ、例えばＧＨ２０ファミリーに分類されるラクト−Ｎ−ビオシダーゼ（ＥＣ３．２．１．１４０）から選択される。ラクト−Ｎ−ビオシダーゼは典型的には保持機構を経る。ストレプトミセス及びビフィドバクテリウム・ビフィダム由来の２種のラクト−Ｎ−ビオシダーゼのみがこれまでに開示され特徴づけられてきており、本発明においてラクト−Ｎ−ビオシダーゼ又はトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼとして用いてもよい（参照：Sano, M., K. Hayakawa, and I. Kato, Proc Natl Acad Sci U S A, 1992. 89(18)： p. 8512−6; Sano, M., K. Hayakawa, and I. Kato, J Biol Chem, 1993. 268(25)： p. 18560−6; Wada, J., et al., Appl Environ Microbiol, 2008. 74(13)： p. 3996−4004.）。ラクト−Ｎ−ビオシダーゼは、β−Ｄ−Ｇａｌ−（１→３）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→３）−β−Ｄ−Ｇａｌ−（１→Ｒ）構造を有するオリゴ糖の非還元末端由来の末端ラクト−Ｎ−ビオシル残基（β−Ｄ−Ｇａｌ−（１→３）−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ）を特異的に加水分解する。また、Wada et al.（上記）及びMurata et al.(Glycoconj. J. 16, 189 (1999)）は、アクセプター（例えば様々な１−アルカノール及びラクトース）と共にドナー基質（例えばラクト−Ｎ−テトラオース及びｐＮＰ−β−ＬＮＢ）を培養することによって、ビフィドバクテリウム・ビフィダム及びオーレオバクテリウム属Ｌ−１０１それぞれに由来するラクト−Ｎ−ビオシダーゼの、トランスグリコシル化を触媒する能力を示した。
【０１８２】
更により好ましくは、前記ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ又はトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＰＲＬ２０１０、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＮＣＩＭＢ４１１７１、オーレオバクテリウム属Ｌ−１０１、又はストレプトマイセス属などに由来するラクト−Ｎ−ビオシダーゼ又はトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼから選択されてもよい。
【０１８３】
更により好ましくは、前記ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ又はトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素は、以下の寄託番号で規定されるラクト−Ｎ−ビオシダーゼ又はトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼから選択されてもよい：ｇｉ｜１６７３６９７３８（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４、配列番号：１７）、ｇｉ｜４０９６８１２（ストレプトマイセス属、配列番号：１８）、ｇｉ｜３１０８６７１０３（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＰＲＬ２０１０）、ｇｉ｜３１３１４０９８５（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＮＣＩＭＢ４１１７１）など。または、アミノ酸レベルで全体の野生型配列と比較して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、同様により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９５％又は更に９７％、９８％若しくは９９％で上述したラクト−Ｎ−ビオシダーゼ又はトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有する酵素配列の１つと配列同一性を発現する配列から選択されてもよい。
特に好ましいラクト−Ｎ−ビオシダーゼ又はトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有するラクト−Ｎ−ビオシダーゼを、下記表４に列挙する。
【０１８４】
【表４】
2014513986.tif 000048
【０１８５】
更に、前記トランスグリコシダーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素は好ましくは、Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ又はトランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性を発現する酵素、好ましくは以下に述べるものから選択してもよい。本発明において、Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ又はトランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性を有する酵素は、好ましくは、以下のＮ−アセチルラクトサミニダーゼ又はトランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ、例えばＧＨ２０ファミリーに分類されるラクト−Ｎ−ビオシダーゼ（ＥＣ３．２．１．１４０）から選択される。特に好ましくは、バシラス・サーキュランス由来のキチナーゼ、より好ましくはｇｉ｜１４２６８８（配列番号：１９）として寄託されているバシラス・サーキュランスＷＬ−１２由来のキチナーゼＡ１をＮ−アセチルラクトサミニダーゼ又はトランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼとして用いてもよい。または、アミノ酸レベルで全体の野生型配列と比較して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、同様により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９５％又は更に９７％、９８％若しくは９９％で上述したＮ−アセチルラクトサミニダーゼ又はトランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性を有する酵素配列の１つと配列同一性を発現する配列から選択されてもよい。特に、Ｓｈｏｄａらは、バチルス・サーキュランスＷＬ−１２由来のキチナーゼＡがＮ−アセチルラクトサミンをβ−１，６グリコシド結合でＮ−アセチルラクトサミンの１，２−オキサゾリン誘導体を用いて転移動させることができることを示している（参照：Shoda, S.−i., et al., Cellulose, 2006. 13(4)： p. 477−484.)。
【０１８６】
特に好ましいＮ−アセチルラクトサミニダーゼ又はトランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼを、下記表５に列挙する。
【０１８７】
【表５】
2014513986.tif 000049
【０１８８】
上述したように、上記トランスグリコシダーゼ活性を含むタンパク質は、トランスグリコシダーゼ活性を含む操作されたタンパク質を含んでもよい。特にトランスフコシダーゼ、トランスシアリダーゼ、トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ及び／又はトランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性、好ましくはα−トランスフコシダーゼ、α−トランスシアリダーゼ、β−トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ及び／又はβ−トランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性を示す野生型又は変異グリコシダーゼは、本発明においてそのようなオリゴ糖の製造に用いることができる。そのような酵素の調製は、好ましくは特定部位の突然変異誘発アプローチ又は定方向進化を介して行われる。
【０１８９】
合理的エンジニアリングにおいて、新規の変異酵素（突然変異体）は、特定部位の突然変異誘発アプローチを介して、好ましくは点突然変異の導入により産生される。この技術は一般的に静的３Ｄタンパク質構造への依存を必要とする。前記突然変異は、通常、酵素の活性部位に影響を及ぼし、酵素はそのトランスグリコシル化生成物を分解する能力を失うが、合成する能力は維持する。好ましい戦略は、非求核残基による触媒的求核試薬の置換からなる。この修飾の結果として、トランスグリコシル化に必要な反応性ホスト−ゲスト錯体形成のための適切な環境がないため、不活性突然変異体又はトランスグリコシル化活性の低い変異酵素が形成される。しかしながら、グリコシル酵素中間体を模倣するグリコシルドナーに比べ活性の高いグリコシル（例えばグリコシルフルオリド）の存在下においては、突然変異酵素は、グリコシル部分を適切なアクセプターへ効率的に転移して、アノマー立体化学が反転したグリコシドを生じさせることができる。
【０１９０】
第２の好ましい技術は定方向進化と呼ばれている。この戦略は選択されたグリコシダーゼの遺伝子に適用されたランダム変異導入法を含み、グリコシダーゼを発現する遺伝学的に多様な遺伝子のライブラリが創られる。配列の多様性は公知の方法で生み出すことができる。最も好ましいのは、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応（ｅｐＣＲ）方法である。このジーンライブラリはわずかに変異した特性を持つ組換え変異体の産生に好適な微生物（大腸菌又は出芽酵母など）に挿入されてもよい。改良された酵素を発現するクローンは、迅速かつ信頼できるスクリーニング法で同定され、選択され、突然変異プロセスの次のラウンドに持ち込まれる。繰り返される突然変異、組み換え及び選択のサイクルは、所望の活性及び／又は特異性を有する突然変異体が得られるまで続けられる。これまでに、グリコシダーゼのための異なる高スループットのスクリーニング手法が開発されてきた。これらのアプローチを適用して、高性能な操作されたトランスグリコシダーゼを産生し、単離することができた。テルモトガ・マリチマ由来のα−Ｌ−フコシダーゼが近年、効率的なα−Ｌ−トランスフコシダーゼに定方向進化によって転換されてきた。得られた酵素のトランスフェラーゼ／加水分解の比は、天然型酵素の３０倍も高かった（参照：Osanjo, G., et al., Biochemistry, 2007. 46(4)： p. 1022−33）。
【０１９１】
また、上述したトランスグリコシダーゼ活性を含むタンパク質は、これらのタンパク質配列のフラグメント又は変異体を含んでもよい。そのようなフラグメント又は変異体は典型的には、アミノ酸レベルで全体の野生型配列と比較して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、同様により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９５％又は更に９７％、９８％若しくは９９％で上記タンパク質配列の１つと配列同一性を有する配列を含む。
【０１９２】
また、本発明において、タンパク質又はペプチドの「フラグメント」は本明細書に規定したタンパク質又はペプチドの配列を含んでもよく、それはそのアミノ酸配列に関して、オリジナル（天然型）のタンパク質のアミノ酸配列と比べてＮ−末端で、Ｃ−末端で、及び／又は配列内で切断されている。したがって、そのような切断は、アミノ酸レベルで生じても、準じて核酸レベルで生じてもよい。したがって、そのような上述したフラグメントの配列同一性は好ましくは、上述したタンパク質又はペプチド全体、又は、そのようなタンパク質又はペプチドの（コードする）核酸分子全体を意味する。同様に、本発明において、核酸の「フラグメント」は、本明細書で規定する核酸の配列を含み、それはその核酸分子に関して、オリジナル（天然型）の核酸分子の核酸分子と比べて５’−，３’−及び／又は配列内で切断されている。したがって、本明細書に規定されたそのようなフラグメントに関する配列同一性は、好ましくは、本明細書に規定されたように核酸全体を意味する。
【０１９３】
本発明において規定するタンパク質又はペプチドの「変異体」(例えば、本明細書で規定した核酸でエンコードされているように）は、ポリメリックキャリアカーゴ複合体の核酸分子でエンコードされてもよい。これにより、１以上の置換、挿入及び／又は欠失させたアミノ酸など１以上の突然変異においてオリジナルの配列とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドが産生されてもよい。好ましくは、これらのフラグメント及び／又は変異体は、完全長の天然型タンパク質と比べて同じ生物的機能又は特異活性を有する（例えば、特異抗原特性）。
【０１９４】
また、本発明において規定するタンパク質又はペプチドの「変異体」（例えば、本明細書で規定した核酸でエンコードされているように）は、天然型の（すなわち非変異の生理的な）配列と比較して保存的なアミノ酸置換を含んでもよい。これらのアミノ酸配列、及び、特にそれらのエンコードするヌクレオチド配列も、本明細書で規定する変異体に含まれる。同じクラスに由来するアミノ酸が互いに交換した置換を保存的な（conservative）置換と呼ぶ。特に、これらは、脂肪族側鎖、正又は負帯電側鎖、側鎖の芳香族基を有するアミノ酸、又は、例えば、ヒドロキシル官能基を有する側鎖など側鎖が水素結合を形成することができるアミノ酸である。これは、例えば、極性側鎖を有するアミノ酸が、別の同様に極性側鎖を有するアミノ酸で置換される、又は、例えば、疎水性側鎖を有するアミノ酸が別の同様に疎水性側鎖を有するアミノ酸で置換される（例えば、トレオニン（セリン）によりセリン（トレオニン）又はイソロイシン（ロイシン）によりロイシン（イソロイシン））ことを意味する。挿入及び置換は可能であり、特に３次元構造に修飾を引き起こさない又は結合領域に影響を与えない配列の位置で可能である。挿入又は欠失による３次元構造への修飾は、ＣＤスペクトル（円二色性スペクトル）を用いて容易に決定することができる（Urry, 1985, Absorption, Circular Dichroism and ORD of Polypeptides, in： Modern Physical Methods in Biochemistry, Neuberger et al. (ed.), Elsevier, Amsterdam）。
【０１９５】
更に、本発明において規定するタンパク質又はペプチドの変異体はまた、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列それぞれの変化に至ることなく、遺伝子コードの変性に従い核酸のヌクレオチドが交換されている配列を含んでもよい（すなわち、上記意味の範囲内で１以上の突然変異においてアミノ酸配列又はその少なくとも一部がオリジナルの配列と異ならなくてもよい）。
【０１９６】
２つの配列（例えば、本明細書において規定する複数の核酸配列又はアミノ酸配列、好ましくは本明細書において規定するポリマー担体の核酸配列によりエンコードされたアミノ酸配列、又は、アミノ酸配列自体）が同一であるパーセンテージを決定するには、その後に互いに比較するために配列を配置することができる。したがって、例えば、第１の配列の位置は、第２の配列の対応する位置と比較することができる。第１の配列のある位置が第２の配列における位置と同じ成分で占められている場合には、２つの配列はこの位置において同一である。そうでない場合は、この位置においてこれらの配列は異なる。第１の配列と比較して、第２の配列に挿入が生じている場合、第１の配列にギャップを挿入して更なる配置を可能にすることができる。第１の配列と比較して、第２の配列に欠失が生じている場合、第２の配列にギャップを挿入して更なる配置を可能にすることができる。そして、２つの配列が同一であるパーセンテージは、同一の位置の数を、１つの配列のみで占められている位置を含む位置の合計数で除した関数である。２つの配列が同一であるパーセンテージは、数学的アルゴリズムを用いて決定することができる。これに限定されないが、用いることができる数学的アルゴリズムの好ましい例は、Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90：5873−5877又はAltschul et al. (1997), Nucleic Acids Res., 25：3389−3402のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムはBLASTプログラムに組み込まれている。本発明の配列とある程度同一である配列は、このプログラムによって同定することができる。
【０１９７】
好ましい及びより好ましい形態を含む第１のアスペクトの工程ｂ）で添加されるタンパク質は、遊離した形態で提供されてもよいし、或いは、表面に結合又は固定化されていてもよい。この特定の場合においては、工程ａ）及びｂ）の順序は反転されることが好ましい。表面への結合又は固定化は、例えば、静電結合、ファンデルワールス結合、共有結合等により行ってもよい。更に、表面への結合又は固定化は、共有結合リンカーまたは架橋剤、又は、タンパク質の精製について当業者に知られているタグを用いて行ってもよい。そのようなタグは、とりわけ例えば、アフィニティータグまたはクロマトグラフィータグを含む。アフィニティータグは、例えば、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、または連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐ）タグを含むことができる。ポリ（Ｈｉｓ）タグは、広く使用されているタンパク質タグであり、金属マトリックスに結合する。クロマトグラフィータグは、特定の分離技術にわたって異なる分析を得るために、タンパク質のクロマトグラフィー特性を改変するために使用され、例えば、ＦＬＡＧ−タグなどのポリアニオン性アミノ酸ベースのタグを含む。前記表面は、バイオリアクターまたは任意の適切な反応チャンバーの表面であってもよい。
【０１９８】
好ましい及びより好ましい形態を含む第１のアスペクトの人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）の多様化するための更なる工程ｃ）において、工程ａ）で規定される少なくとも１種の化合物又はその混合物、及び、工程ｂ）で添加される少なくとも１種の酵素を含む混合物は好ましくは培養され、本明細書で記載したようにトランスグリコシダーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素を用いて酵素的手段を介して人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体を多様化することができる。
【０１９９】
好ましい及びより好ましい形態を含む第１のアスペクトの工程ｃ）による培養は、１ｍＵ／ｌ〜１，０００Ｕ／ｌ、好ましくは１０ｍＵ／ｌ〜１００Ｕ／ｌの濃度の酵素（各酵素の濃度）で、例えばグリコトランスフェラーゼではグリコース含有複合炭水化物の生成が３７℃、１分間で行われることが好ましい。ここで、規定の抽出物から始まり、１μｍｏｌの規定のタンパク質のための特定の生成物を形成可能な活量（activity）を１ユニット（Ｕ）と定義する。本明細書で規定する各酵素の活性はその天然由来の又は操作された基質に対して評価することができる。
【０２００】
好ましい及びより好ましい形態を含む第１のアスペクトの工程ｃ）による培養は、本発明の方法の工程ｂ）により得られた混合物、及び任意に水、リン酸塩緩衝剤、カーボネイト緩衝剤、アセテート緩衝剤、ボレート緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤及びトリスバッファー又はこれらの組み合わせ等の緩衝剤、メタノール及びエタノールなどのアルコール、エチルアセテートなどのエステル、アセトンなどのケトン、アセトアミドなどのアミド等を含む反応媒体（好ましくは水性媒体）において行われてもよい。
【０２０１】
更に、好ましい及びより好ましい形態を含む第１のアスペクトの工程ｃ）による培養は、上述した反応媒体で行うことができ、必要に応じて任意に界面活性剤又は有機溶媒を加えても良い。本発明の可能性のある生成物として本発明で規定する複合炭水化物の形成を促進することができるいずれの界面活性剤も、界面活性剤として用いることができる。例えば、ポリオキシエチレンオクタデシルアミン（例えば、Ｎｙｍｅｅｎ  Ｓ−２１５、日油株式会社製）などの非イオン性界面活性剤、セチルトリメチル臭化アンモニウム及びアルキルジメチルベンジル塩化アンモニウム（例えば、日油株式会社製のカチオンＦ２−４０Ｅ）などのカチオン性界面活性剤、及び、ラウロイルサルコシン酸などのアニオン性界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば、日油株式会社製の第三級アミンＦＢ）などの第三級アミンが挙げられる。これらは単独又は２種以上を混合して用いてもよい。界面活性剤は通常、０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いることができる。有機溶媒としては、キシレン、トルエン、脂肪酸アルコール、アセトン及び酢酸エチルなどが挙げられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いることができる。
【０２０２】
好ましい及びより好ましい形態を含む第１のアスペクトの工程ｃ）による培養は、更に上述した反応媒体で行うことができ、好ましくはｐＨ３〜１０、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜８である。
【０２０３】
好ましい及びより好ましい形態を含む第１のアスペクトの工程ｃ）による培養は、更に、約０℃〜約１００℃、好ましくは約１０〜約５０℃、例えば約２０℃から約５０℃で行ってもよい。必要に応じて無機塩類（例えばＭｎＣｌ２及びＭｇＣｌ２）を反応媒体に加えてもよい。
【０２０４】
好ましい及びより好ましい形態を含む第１のアスペクトの工程ｃ）による培養は、バイオリアクター中で行ってもよい。バイオリアクターは、連続モードまたは不連続モードのいずれかに適していることが好ましい。
【０２０５】
好ましい及びより好ましい形態を含む第１のアスペクトの工程ｃ）による培養は、連続モードまたは不連続モードで行われてもよい。連続モードで行う場合、本発明の方法は、好ましくは全ての成分（酵素を含む）の濃度を所定レベルに維持しながら化合物及び／又は必要であれば酵素の連続流を提供する（好ましくは反応混合物に反応の抽出物を連続的に供給する、及び反応混合物から生成物を連続的に除去することによって提供する）。連続モードで使用する酵素は、遊離形態で又は表面に結合若しくは固定化されて加えられてもよい。
【０２０６】
本発明の第１のアスペクトに関して、任意の工程ｄ）にしたがって、工程ｃ）によって得られた混合物で、少なくとも工程ａ）及びｃ）又は工程ｂ）及びｃ）を繰り返してもよい。この混合物は、本明細書に規定した工程ａ）の少なくとも１種の化合物と、本明細書に規定した工程ｂ）の少なくとも１種の酵素によって既に培養され、処理されている。このような段階的な手順は、複数のラウンド内において制御可能な方法による規定の１セットの抽出物の、限定された１セットの化合物への合理的な多様化を可能にする。所定の順序による工程ａ）で規定された特定の化合物及び工程ｂ）で規定された種々のタンパク質の添加により、特定の成分の合理的な除外を提供することができる。そのような多様性を得るためには、化合物及び／又は酵素は、同時に又は連続的に添加してもよく、好ましくは化合物及び／又は酵素は、一工程で同時に及び／又は異なる複数の工程で連続的に添加してもよい。
【０２０７】
あるいは、本明細書に規定した工程ａ）の化合物又は化合物の混合物と、本明細書に規定した工程ｂ）の少なくとも１種の酵素は、一工程で培養してもよく、全ての化合物が同時に提供されることが好ましい。このような手順は、最大の種類の多様化した生成物に至ることがあるため、特定の状況において好ましい場合がある。
【０２０８】
第１のアスペクトの好ましい及びより好ましい形態に関して、第１のサイクルの工程ａ）において２種の化合物のみが提供され、その１つが３’−シアリルラクトースである、且つ、第１のサイクルの工程ｂ）において得られる酵素が、トランス−シアリダーゼ活性を含む酵素である場合には、少なくとも更に１回の培養サイクルｄ）が必要である。特に、工程ｃ）で得られた混合物で、少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）を繰り返すことが好ましい。工程ａ）及びｃ）を繰り返す時、工程ａ）により添加された少なくとも１種の化合物は好ましくは第１のサイクルで提供されたものと異なるものであり、工程ｂ）及びｃ）を繰り返す時、工程ｂ）により添加される少なくとも１種の酵素は好ましくは第１のサイクルで提供されたものと異なるものである。工程ａ）〜ｃ）の全てを繰り返す時、好適には、工程ａ）に提供された少なくとも１種の化合物、又は、工程ｂ）に提供された少なくとも１種の酵素は、第１のサイクルで提供されたものと異なるものであり、好ましくは、両方が第１のサイクルで提供されたものと異なる。
【０２０９】
本発明の第１のアスペクトの好ましい形態に関して、第１のサイクルの工程ａ）において２種の化合物のみが提供され、その１つが式２又は４で表されるシアリル化ラクトース誘導体である、且つ、第１のサイクルの工程ｂ）において得られる酵素が、トランス−シアリダーゼ活性を含む酵素である場合には、少なくとも更に１回の培養サイクルｄ）が必要である。特に、工程ｃ）で得られた混合物で、少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）を繰り返すことが好ましい。工程ａ）及びｃ）を繰り返す時、工程ａ）により添加された少なくとも１種の化合物は好ましくは第１のサイクルで提供されたものと異なるものであり、工程ｂ）及びｃ）を繰り返す時、工程ｂ）により添加される少なくとも１種の酵素は好ましくは第１のサイクルで提供されたものと異なるものである。工程ａ）〜ｃ）の全てを繰り返す時、好適には、工程ａ）に提供された少なくとも１種の化合物、又は、工程ｂ）に提供された少なくとも１種の酵素は、第１のサイクルで提供されたものと異なるものであり、好ましくは、両方が第１のサイクルで提供されたものと異なる。
【０２１０】
本発明の第１のアスペクトの好ましい形態に関して、第１のサイクルの工程ａ）において２種の化合物のみが提供され、その１つが式２又は４で表されるフコシル化ラクトース誘導体である、且つ、第１のサイクルの工程ｂ）において得られる酵素が、トランス−フコシダーゼ活性を含む酵素である場合には、少なくとも更に１回の培養サイクルｄ）が必要である。特に、工程ｃ）で得られた混合物で、少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）を繰り返すことが好ましい。工程ａ）及びｃ）を繰り返す時、工程ａ）により添加された少なくとも１種の化合物は好ましくは第１のサイクルで提供されたものと異なるものであり、工程ｂ）及びｃ）を繰り返す時、工程ｂ）により添加される少なくとも１種の酵素は好ましくは第１のサイクルで提供されたものと異なるものである。工程ａ）〜ｃ）の全てを繰り返す時、好適には、工程ａ）に提供された少なくとも１種の化合物、又は、工程ｂ）に提供された少なくとも１種の酵素は、第１のサイクルで提供されたものと異なるものであり、好ましくは、両方が第１のサイクルで提供されたものと異なる。
【０２１１】
更に、本発明の第１のアスペクトの好ましい形態に関して、任意の工程ｅ）にしたがって、工程ｃ）得られた混合物で、少なくとも工程ａ）及びｃ）又は工程ｂ）及びｃ）を繰り返してもよい。好ましくは、この混合物は、本明細書に規定した工程ａ）の少なくとも１種の化合物と、本明細書に規定した工程ｂ）の少なくとも１種の酵素によって既に培養され、処理されている。このような段階的な手順は、複数のラウンド内において制御可能な方法による規定の１セットの抽出物の、限定された１セットの化合物への合理的な多様化を可能にする。所定の順序による工程ａ）で規定された特定の化合物及び工程ｂ）で規定された種々のタンパク質の添加により、特定の成分の合理的な除外を提供することができる。そのような多様性を得るためには、化合物及び／又は酵素は、同時に又は連続的に添加してもよく、好ましくは化合物及び／又は酵素は、一工程で同時に及び／又は異なる複数の工程で連続的に添加してもよい。
【０２１２】
あるいは、本明細書に規定した工程ａ）の化合物又は化合物の混合物と、本明細書に規定した工程ｂ）の少なくとも１種の酵素は、一工程で培養してもよく、全ての化合物が同時に提供されることが好ましい。このような手順は、最大の種類の多様化した生成物に至ることがあるため、特定の状況において好ましい場合がある。
【０２１３】
本発明の第１のアスペクトのより好ましい形態に関して、第１のサイクル後に１種の生成物（ＨＭＯ又はＨＭＯ誘導体又はＨＭＯ前駆体）のみが提供される場合には、少なくとも更に１回の培養サイクルｄ）が必要である。このような状況として含まれるのは、第１の培養工程ｃ）後に得られる混合物が、第１の工程ａ）からの出発物質、及び、該出発物質と少なくとも1種の酵素との反応による生成物として１種のＨＭＯ又はＨＭＯ誘導体又はＨＭＯ前駆体を含む場合である。特に、工程ｃ）で得られた混合物で、少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）を繰り返すことが好ましい。工程ａ）及びｃ）を繰り返す時、工程ａ）により添加された少なくとも１種の化合物は好ましくは第１のサイクルで提供されたものと異なるものであり、工程ｂ）及びｃ）を繰り返す時、工程ｂ）により添加される少なくとも１種の酵素は好ましくは第１のサイクルで提供されたものと異なるものである。工程ａ）〜ｃ）の全てを繰り返す時、好適には、工程ａ）に提供された少なくとも１種の化合物、又は、工程ｂ）に提供された少なくとも１種の酵素は、第１のサイクルで提供されたものと異なるものであり、好ましくは、両方が第１のサイクルで提供されたものと異なる。
【０２１４】
当業者は、第１の培養工程後に１種のＨＭＯ又はＨＭＯ誘導体又はその前駆体のみが形成されたか、及び、目標達成のために少なくとも更に１回の培養サイクル必要かを調べて決定することができる。可能な場合には、特定のドナー、特定のアクセプター及び特定の酵素の選択は、１種のみの生成物につながる。１種を超えるドナー及び／又は１種を超えるアクセプター及び／又は１種を超える酵素が、１回の培養サイクルでＨＭＯ、ＨＭＯ誘導体又はＨＭＯ前駆体の生成に用いられる場合には、１種を超える生成物が形成されることが予想される。同様に、用いるグリコシダーゼ及び／又はグリコシンターゼ酵素がより少ない（レギオ）選択性を有する場合には、１種のアクセプターみのが提供されたとしても、酵素はグリコシル部分をアクセプターの様々な部分に転移させることができるため、より多くの生成物が形成されることが予想される。更に、通則によれば、ドナーとアクセプターの比は、生成物の多様性に大きなインパクトを有する。ドナー−アクセプターの比が高いほど、１ドナー−１アクセプターの系において１種を超える生成物を得る確率が高くなる。当業者は、１以上の生成物が形成されたかが分かるための質的及び量的に検知及びモニターする方法のレパートリーを有する（例えば、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、ＧＣ、ＧＣ−ＭＳ、電気泳動等）。
【０２１５】
更に、本発明の第１のアスペクトの好ましい形態に関して、任意の工程ｅ）にしたがって、工程ｃ）で得られた混合物で、少なくとも工程ａ）及びｃ）又は工程ｂ）及びｃ）を繰り返してもよい。好ましくは、この混合物は、本明細書に規定した工程ａ）の少なくとも１種の化合物と、本明細書に規定した工程ｂ）の少なくとも１種の酵素によって既に培養され、処理されている。このような手順は、複数のラウンド内において制御可能な方法による規定の１セットの抽出物の、限定された１セットの化合物への合理的な多様化を可能にする。所定の順序による工程ａ）で規定された特定の化合物及び工程ｂ）で規定された種々のタンパク質の添加により、特定の成分の合理的な除外を提供することができる。そのような多様性を得るためには、化合物及び／又は酵素は、同時に又は連続的に添加してもよく、好ましくは化合物及び／又は酵素は、一工程で同時に及び／又は異なる複数の工程で連続的に添加してもよい。
【０２１６】
あるいは、本明細書に規定した工程ａ）の化合物又は化合物の混合物と、本明細書に規定した工程ｂ）の少なくとも１種の酵素は、一工程で培養してもよく、全ての化合物が同時に提供されることが好ましい。このような手順は、最大の種類の多様化した生成物に至ることがあるため、特定の状況において好ましい場合がある。
【０２１７】
上述した本発明の方法は、第１のアスペクトのいずれの形態の工程ｃ）後（好ましくは、第１のアスペクトのいずれの形態の工程ｄ）又はｅ）による必須又は任意の工程の繰り返し後）、工程ａ）で提供される化合物の多様化に至る。好ましくは、本明細書に開示した本発明の方法は、以下の単一人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体、あるいは、２種以上の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体を含む多様化した混合物をもたらす。その単一化合物は、以下に規定されるものであってもよい：
・一般式１で表される化合物及びその塩、
【０２１８】
【化４３】
2014513986.tif 000050
【０２１９】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基であり、
Ｒ１はフコシル又はＨであり、
Ｒ２はＮ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基から選択され、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基は、１以上のＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１以上のラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基を有してもよく、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ３はＨ、又は、１以上のＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１以上のラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよい）
【０２２０】
・一般式２で表される化合物及びその塩、
【０２２１】
【化４４】
2014513986.tif 000051
【０２２２】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基であり、
Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ４は独立にそれぞれシアリル又はＨであり、
但し、前記Ｒ１又はＲ４基のうち少なくとも１つはＨではない）
【０２２３】
・一般式３で表される化合物及びその塩、及び／又は
【０２２４】
【化４５】
2014513986.tif 000052
【０２２５】
（式中、Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ２はＮ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基から選択され、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基は、１以上のＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１以上のラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基を有してもよく、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ３はＨ、又は、１以上のＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１以上のラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよい）
【０２２６】
・一般式４で表される化合物及びその塩
【０２２７】
【化４６】
2014513986.tif 000053
【０２２８】
（式中、Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ４は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
但し、前記Ｒ１又はＲ４基のうち少なくとも１つはＨではない）
【０２２９】
更により好ましくは、本発明の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を多様化する方法は、第１のアスペクトのいずれの形態の培養する工程ｃ）、又は、第１のアスペクトのいずれの形態の工程ｄ）又はｅ）による必須又は任意の工程の繰り返し後、上述したように単一の人乳オリゴ糖誘導体、又は、２種以上の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）誘導体を含む多様化された混合物をもたらし、式１及び２で表される化合物は更に下記一般式１ａ、１ｂ又は２、及びその塩で表される。
【０２３０】
【化４７】
2014513986.tif 000054
【０２３１】
（式中、Ｒ、Ｒ１及びＲ４は上述したとおりであり、
Ｒ２ａは１つのＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１つのラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ３はＨ、又は、ラクト−Ｎ−ビオシル基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ２ｂはシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−ビオシル基であり、
Ｒ３ｂはＨ、又は、１又は２つのＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１つのラクト−Ｎ−ビオシル基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよい）
【０２３２】
特に好ましくは、上述した本発明の多様化する方法により得られた化合物は、その結合及び修飾に特徴を有する。好ましくは、第１のアスペクトのいずれの形態の工程ｃ）、又は、第１のアスペクトのいずれの形態の工程ｄ）又はｅ）による必須又は任意の工程の繰り返し後に本発明の方法により得られる化合物、好ましくは下記一般式１ａ及び１ｂで表される化合物は、以下の特徴を有する：
・一般式１ａにおけるＲ２ａのグリコシル残基におけるＮ−アセチル−ラクトサミニル基が、別のＮ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している、
・一般式１ａにおけるＲ２ａのグリコシル残基におけるラクト−Ｎ−ビオシル基が、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している、
・一般式１ａにおけるＲ３ａのグリコシル残基におけるラクト−Ｎ−ビオシル基が、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している、
・一般式１ｂにおけるＲ３ｂのグリコシル残基におけるＮ−アセチル−ラクトサミニル基が、別のＮ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３又は１−６グリコシド間結合で結合している、
・一般式１ｂにおけるＲ３ｂのグリコシル残基におけるラクト−Ｎ−ビオシル基が、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している。
【０２３３】
好ましくは、本発明の方法により、第１のアスペクトのいずれの形態の工程ｃ）、又は、第１のアスペクトのいずれの形態の工程ｄ）又はｅ）による必須又は任意の工程の繰り返し後に得られる化合物は、一般式１ａが、１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−ネオテトラオース、パラ−ラクト−Ｎ−ヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−オクタオース及びラクト−Ｎ−ネオオクタオースのＲ−グリコシドを表わし、一般式１ｂが、１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−オクタオース、イソ−ラクト−Ｎ−オクタオース、ラクト−Ｎ−デカオース及びラクト−Ｎ−ネオデカオースのＲ−グリコシドを表わすことを特徴とする。
【０２３４】
好ましくは、本発明の方法により、培養工程ｃ）及び／又は工程ｄ）若しくはｅ）による工程の繰り返しの後に得られる化合物は、以下の特徴を有する：
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又はラクト−Ｎ−ビオシル基に結合しているフコシル残基が以下により結合している：
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のガラクトースが１−２グリコシド間結合で、及び／又は
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のＮ−アセチル−グルコサミンが１−４グリコシド間結合で、及び／又は
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基のＮ−アセチル−グルコサミンが１−３グリコシド間結合で、
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又はラクト−Ｎ−ビオシル基に結合しているシアリル残基が以下により結合している：
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のガラクトースが２−３グリコシド間結合で、及び／又は
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のＮ−アセチル−グルコサミンが２−６グリコシド間結合で、及び／又は
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基のガラクトースが２−６グリコシド間結合で。
【０２３５】
更に好ましいアスペクトによれば、本発明の多様化の方法により得られる化合物、好ましくは式１若しくは２、又は、一般下位式（general subformulae）１ａ、１ｂ又は２で表される化合物は、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、３’−シアリル−３−フコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ＬＮＦＰ−Ｉ、ＬＮＦＰ−ＩＩ、ＬＮＦＰ−ＩＩＩ、ＬＮＦＰ−Ｖ、ＬＳＴ−ａ、ＬＳＴ−ｂ、ＬＳＴ−ｃ、ＦＬＳＴ−ａ、ＦＬＳＴ−ｂ、ＦＬＳＴ−ｃ、ＬＮＤＦＨ−Ｉ、ＬＮＤＦＨ−ＩＩ、ＬＮＤＦＨ−ＩＩＩ、ＤＳ−ＬＮＴ、ＦＤＳ−ＬＮＴ  Ｉ及びＦＤＳ−ＬＮＴ  ＩＩのＲ−グリコシド、またはその塩からなる群より選択することができる。これらの化合物のコア構造を下記表６に示す。Ｒ−グリコシドはアルファ又はベータ−アノマーであってもよい。好ましくは、該Ｒ−グリコシドはベータ−アノマーである。
【０２３６】
【表６】
2014513986.tif 000055
【０２３７】
最も好ましくは、本発明の多様化する方法により得られる化合物、好ましくは式１若しくは２、又は、一般下位式１ａ、１ｂ若しくは２で表される化合物は、Ｒがベンジルである化合物又はその塩から選択されてもよい。
【０２３８】
本発明の方法の更に特定のアスペクトによれば、本発明の方法により得られる化合物、好ましくは式１若しくは２、又は、一般下位式１ａ、１ｂ若しくは２のいずれかで表される化合物は、任意に、工程ｃ）による培養及び／又は工程ｄ）若しくはｅ）による更なる繰り返しに続き、水素化分解反応させてもよく、その結果、一般式３及び４で表されるＨＭＯが形成される。
【０２３９】
同様に好ましくは、本発明の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を多様化する方法は、好ましくは培養工程ｃ）及び任意の工程ｄ）若しくはｅ）による工程の繰り返しの後、上述した人乳オリゴ糖をもたらし、式３及び４で表される化合物は、更に一般式３ａ、３ｂ又は４及びその塩で表される。
【０２４０】
【化４８】
2014513986.tif 000056
【０２４１】
（式中、Ｒ１及びＲ４は上述したとおりであり、
Ｒ２ａは１つのＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１つのラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又はラクト−Ｎ−ビオシル基は１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ３はＨ、又は、ラクト−Ｎ−ビオシル基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、いずれのＮ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基も１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ２ｂはシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−ビオシル基であり、
Ｒ３ｂはＨ、又は、１又は２つのＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１つのラクト−Ｎ−ビオシル基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、いずれのＮ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基も１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよい）
【０２４２】
特に好ましくは、上述した本発明の多様化する方法により得られた化合物は、その結合及び修飾に特徴を有する。好ましくは、本発明の方法により、培養工程ｃ）及び任意の工程ｄ）若しくはｅ）による工程の繰り返し後に得られる化合物、好ましくは一般式３ａ又は３ｂで表される化合物は、以下の特徴を有する：
・一般式３ａにおけるＲ２ａのグリコシル残基におけるＮ−アセチル−ラクトサミニル基が、別のＮ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している、
・一般式３ａにおけるＲ２ａのグリコシル残基におけるラクト−Ｎ−ビオシル基が、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している、
・一般式３ａにおけるＲ３ａのグリコシル残基におけるラクト−Ｎ−ビオシル基が、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している、
・一般式３ｂにおけるＲ３ｂのグリコシル残基におけるＮ−アセチル−ラクトサミニル基が、別のＮ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３又は１−６グリコシド間結合で結合している、
・一般式３ｂにおけるＲ３ｂのグリコシル残基におけるラクト−Ｎ−ビオシル基が、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している。
【０２４３】
好ましくは、本発明の方法により、培養工程ｃ）及び任意の工程ｄ）若しくはｅ）による工程の繰り返し後に得られる化合物は、一般式３ａが、１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−ネオテトラオース、パラ−ラクト−Ｎ−ヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−オクタオース及びラクト−Ｎ−ネオオクタオースを表わし、一般式３ｂが、１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−オクタオース、イソ−ラクト−Ｎ−オクタオース、ラクト−Ｎ−デカオース及びラクト−Ｎ−ネオデカオースを表わすことを特徴とする。
【０２４４】
好ましくは、本発明の方法により、培養工程ｃ）及び／又は工程ｄ）若しくはｅ）による工程の繰り返し後に得られる化合物は、以下の特徴を有する：
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又はラクト−Ｎ−ビオシル基に結合しているフコシル残基が以下により結合している：
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のガラクトースに１−２グリコシド間結合で、及び／又は
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のＮ−アセチル−グルコサミンに１−４グリコシド間結合で、及び／又は
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基のＮ−アセチル−グルコサミンに１−３グリコシド間結合で、
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又はラクト−Ｎ−ビオシル基に結合しているシアリル残基が以下により結合している：
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のガラクトースに２−３グリコシド間結合で、及び／又は
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のＮ−アセチル−グルコサミンに２−６グリコシド間結合で、及び／又は
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基のガラクトースに２−６グリコシド間結合で。
【０２４５】
更に好ましいアスペクトによれば、本発明の多様化させる方法により得られる化合物、好ましくは一般下位式３ａ、３ｂ又は４で表される化合物は、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、３’−シアリル−３−フコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ＬＮＦＰ−Ｉ、ＬＮＦＰ−ＩＩ、ＬＮＦＰ−ＩＩＩ、ＬＮＦＰ−Ｖ、ＬＳＴ−ａ、ＬＳＴ−ｂ、ＬＳＴ−ｃ、ＦＬＳＴ−ａ、ＦＬＳＴ−ｂ、ＦＬＳＴ−ｃ、ＬＮＤＦＨ−Ｉ、ＬＮＤＦＨ−ＩＩ、ＬＮＤＦＨ−ＩＩＩ、ＤＳ−ＬＮＴ、ＦＤＳ−ＬＮＴ  Ｉ及びＦＤＳ−ＬＮＴ  ＩＩ、またはその塩からなる群より選択することができる。これらの化合物のコア構造を上記表６に示す。
【０２４６】
培養工程ｃ）及び任意の工程ｄ）若しくはｅ）による工程の繰り返し後、本発明の方法により得られる化合物は、上述したトランスグリコシダーゼ活性を含む少なくとも１種の酵素の選択に依って得られる。そのような酵素は、本発明の方法を用いて多様化する間に行われる望ましい結合又は修飾に依って選択してもよい。
【０２４７】
上述した野生型又は操作されたフコシダーゼを本発明において使用することができ、トランスフコシダーゼ活性を表すこと、及びα，１−２、α，１−３及び／又はα，１−４レギオ選択性を示すことが、本発明においてターゲットとしていることである。そのような野生型又は操作されたフコシダーゼは、好ましくはトランスフコシダーゼ活性を表し、フコシル残基の以下への転移を触媒する：
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のガラクトースへα，１−２グリコシド間結合で、及び／又は
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のＮ−アセチル−グルコサミンへα，１−４グリコシド間結合で、及び／又は
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基のＮ−アセチル−グルコサミンへα，１−３グリコシド間結合で。
【０２４８】
そのような結合は、野生型又は操作されたフコシダーゼを用いる場合には、本発明の方法、及び本発明の化合物において非常に好ましい。
【０２４９】
更に、上述した野生型又は操作されたシアリダーゼは本発明に用いることができ、トランス−シアリダーゼ活性を表し、α，２−３及び／又はα，２−６レギオ選択性を示す。そのような結合が好ましくは本発明においてターゲットとしている。そのような野生型又は操作されたシアリダーゼは、好ましくはトランス−シアリダーゼ活性を表し、シアリル残基の以下への転移を触媒する：
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のガラクトースへα，２−３グリコシド間結合で、及び／又は
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のＮ−アセチル−グルコサミンへα，２−６グリコシド間結合で、及び／又は
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基のガラクトースへα，２−６グリコシド間結合で。
【０２５０】
そのような結合は、野生型又は操作されたシアリダーゼを用いる場合には、本発明の方法、及び本発明の化合物において非常に好ましい。
更に、トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を表し、β，１−３レギオ選択性を示す、上述した野生型又は操作されたラクト−Ｎ−ビオシダーゼを本発明において用いてもよい。そのような野生型又は操作されたラクト−Ｎ−ビオシダーゼは、好ましくはトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を表し、ラクト−Ｎ−ビオシル残基のＮ−アセチル−ラクトサミニル基への１−３グリコシド間結合による転移を触媒し、本発明はこれをターゲットとする。そのような結合は、野生型又は操作されたラクト−Ｎ−ビオシダーゼを用いる場合には、本発明の方法、及び本発明の化合物において非常に好ましい。
【０２５１】
最後に、上述した野生型又は操作されたグリコシダーゼは本発明に用いることができ、トランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性を表し、β，１−３及び／又はβ，１−６レギオ選択性を示し、本発明はこれをターゲットとする。そのような野生型又は操作されたグリコシダーゼは好ましくはトランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性を表し、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基の別のＮ−アセチル−ラクトサミニル基への１−３又は１−６グリコシド間結合による転移を触媒する。そのような結合は、野生型又は操作されたＮ−アセチルラクトサミニダーゼを用いる場合には、本発明の方法、及び本発明の化合物において非常に好ましい。
【０２５２】
本発明の方法の更に特定のアスペクトによれば、本発明の方法により得られる化合物、好ましくは式１、２、３若しくは４、又は、一般下位式１ａ、１ｂ若しくは２、又は、一般下位式３ａ、３ｂ若しくは４のいずれかで表される化合物は、好ましくは結晶化又は沈澱により、任意に精製反応させてもよい。
【０２５３】
本発明の方法の更に特定のアスペクトによれば、本発明の方法により得られる化合物、好ましくは式１、２、３若しくは４、又は、一般下位式１ａ、１ｂ若しくは２、又は、一般下位式３ａ、３ｂ若しくは４のいずれかで表される化合物は、任意に噴霧乾燥させてもよい。
【０２５４】
更に特定のアスペクトにおいて、本発明の方法により得られる化合物は、１以上の天然由来のＨＭＯ  Ｒ−グリコシド、好ましくは式１若しくは２、又は、一般下位式１ａ、１ｂ若しくは２で表される化合物、又は、１以上の天然由来のＨＭＯ、好ましくは一般式３若しくは４、又は、一般下位式３ａ、３ｂ若しくは４で表される化合物であってもよい。天然型ＨＭＯはTADASU URASHIMA et al, MILK OLIGOSACCHARIDES, Nova Biomedical Books, New York, 2011, ISBN： 978−1−61122−831−1, Table 4 in pp. 14−25に列挙されている。
【０２５５】
更に最も特定のアスペクトにおいて、本発明の方法により得られる化合物は、ベンジルで誘導化されている１種以上のＨＭＯであってもよい。
【０２５６】
更に本発明の方法の特定のアスペクトにおいて、本発明の方法により得られる化合物、好ましくは式１若しくは２、又は、一般下位式１ａ、１ｂ若しくは２のいずれかで表される単一化合物又は２種以上の化合物の混合物は、工程ｃ）による培養及び／又は工程ｄ）若しくはｅ）による更なる繰り返しに続き、水素化分解反応されてもよく、その結果、一般式３及び４で表される単一ＨＭＯ又は２種以上のＨＭＯの混合物が形成される。
【０２５７】
水素化分解の工程において、工程ｃ）、ｄ）又はｅ）後の式１若しくは２、又は、一般下位式１ａ、１ｂ若しくは２のいずれかで表される単一化合物又は２種以上の化合物の混合物は、例えば、本明細書に開示しているように水素化分解反応させてもよい。本発明において、そのような水素化分解の工程は、好ましくは天然由来の裸のＨＭＯ（例えば上述した式で表れている）を得るため、及び、好ましくはベンジル基など可能性のある保護基を除去するために行われる。
【０２５８】
触媒水素化分解は、通常、プロトン性溶媒又はプロトン性溶媒の混合液中で発生する。プロトン性溶媒は、水、酢酸またはＣ１−Ｃ６アルコールからなる群より選択することができる。１以上のプロトン性溶媒と、該プロトン性溶媒と部分的あるいは完全な混和性を有する１以上の適切な非プロトン性有機溶媒の混合液も使用することができる（例えば、ＴＨＦ、ジオキサン、酢酸エチル、アセトン等）。水、１以上のＣ１−Ｃ６アルコール、又はそれらの混合液は、溶媒系として好ましく用いられる。炭水化物誘導体を含有する溶液は適切ないかなる濃度であってもよく、炭水化物誘導体と選択した溶媒との懸濁液もまた使用することができる。反応混合液は１０〜１００℃の温度範囲内、好ましくは２０〜５０℃で、１〜５０バールの絶対圧（１００〜５０００ｋＰａ）の水素雰囲気下、触媒の存在下で反応が完了するまで撹拌する。該触媒としては、例えば、パラジウム、ラネーニッケル、又はその他の適切な金属触媒が挙げられ、好ましくはチャコール担持パラジウム又はパラジウムブラックが挙げられる。また、水素がシクロヘキセン、シクロヘキサジエン、ギ酸又はギ酸アンモニウムからその場（in situ）で発生する場合は、移動水素化分解も行うことができる。また、有機又は無機塩基又は酸及び／又は塩基性又は酸性イオン交換樹脂を添加し、水素化分解の反応速度を向上することも可能である。ハロゲン置換基が前駆体の置換ベンジル部分上に存在する、及び／又は、マンノサミン塩基の形成が望ましい場合、塩基性物質を用いることが特に好ましい。好ましい有機塩基としてはトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、アンモニア、カルバミン酸アンモニウム、及びジエチルアミン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。マンノサミン塩が目的生成物である場合には、有機又は無機酸が共溶媒又は添加剤として好ましく用いられる。好ましい酸としてはギ酸、酢酸、プロピオン酸、クロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、ＨＣｌ、ＨＢｒ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。上述した条件により簡易で、便利でデリケートな溶媒の除去が可能であり、純度の高いＨＭＯの混合物又はブレンドが得られる。
【０２５９】
したがって、本発明の更なるアスペクトは、単一化合物又は２種以上の化合物の混合物の提供に関し、該化合物は一般式１及びその塩、又は、一般式２及びその塩で表される。
【０２６０】
【化４９】
2014513986.tif 000057
【０２６１】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基であり、
Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ２はＮ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基から選択され、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基は、１以上のＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１以上のラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基を有してもよく、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ３はＨ、又は、１以上のＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１以上のラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
但し、単独で提供される場合には前記化合物はＬＮｎＴ  Ｒ−グリコシド又はＬＮＴベンジルグリコシドではない）
【０２６２】
【化５０】
2014513986.tif 000058
【０２６３】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基であり、
Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ４は独立にそれぞれシアリル又はＨであり、
但し、前記Ｒ１又はＲ４基のうち少なくとも１つはＨではなく、単独で提供される場合には前記化合物は３’−シアリルラクトースベンジルグリコシドナトリウム塩又は６’−シアリルラクトース  Ｒ−グリコシドではない）
【０２６４】
更により好ましくは、本発明は、単一人乳オリゴ糖誘導体、又は、２種以上の人乳オリゴ糖(ＨＭＯ)誘導体を含む多様な混合物の提供に関し、上記一般式１及び２で表される化合物は更に、一般式１ａ、１ｂ又は２及びその塩で表される。
【０２６５】
【化５１】
2014513986.tif 000059
【０２６６】
（式中、Ｒ、Ｒ１及びＲ４は上述したとおりであり、
Ｒ２ａは１つのＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１つのラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ３ａはＨ、又は、ラクト−Ｎ−ビオシル基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ２ｂはシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−ビオシル基であり、
Ｒ３ｂはＨ、又は、１又は２つのＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１つのラクト−Ｎ−ビオシル基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよい）
【０２６７】
特に好ましくは、上述した化合物は、その結合及び修飾に特徴を有する。好ましくは、一般式１ａ及び１ｂで表される化合物は、以下の特徴を有する：
・一般式１ａにおけるＲ２ａのグリコシル残基におけるＮ−アセチル−ラクトサミニル基が、別のＮ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している、
・一般式１ａにおけるＲ２ａのグリコシル残基におけるラクト−Ｎ−ビオシル基が、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している、
・一般式１ａにおけるＲ３ａのグリコシル残基におけるラクト−Ｎ−ビオシル基が、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している、
・一般式１ｂにおけるＲ３ｂのグリコシル残基におけるＮ−アセチル−ラクトサミニル基が、別のＮ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３又は１−６グリコシド間結合で結合している、
・一般式１ｂにおけるＲ３ｂのグリコシル残基におけるラクト−Ｎ−ビオシル基が、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している。
【０２６８】
好ましくは、一般式１ａで表される化合物は、１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−ネオテトラオース、パラ−ラクト−Ｎ−ヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−オクタオース及びラクト−Ｎ−ネオオクタオースのＲ−グリコシドを表し、一般式１ｂで表される化合物は、１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−オクタオース、イソ−ラクト−Ｎ−オクタオース、ラクト−Ｎ−デカオース及びラクト−Ｎ−ネオデカオースのＲ−グリコシドを表す。
【０２６９】
好ましくは、１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換された一般式１ａ及び１ｂで表される化合物は、更に以下の特徴を有する：
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又はラクト−Ｎ−ビオシル基に結合しているフコシル残基が以下により結合している：
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のガラクトースに１−２グリコシド間結合で、及び／又は
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のＮ−アセチル−グルコサミンに１−４グリコシド間結合で、及び／又は
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基のＮ−アセチル−グルコサミンに１−３グリコシド間結合で、
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又はラクト−Ｎ−ビオシル基に結合しているシアリル残基が以下により結合している：
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のガラクトースに２−３グリコシド間結合で、及び／又は
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のＮ−アセチル−グルコサミンに２−６グリコシド間結合で、及び／又は
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基のガラクトースに２−６グリコシド間結合で。
【０２７０】
更に好ましいアスペクトによれば、上述した化合物は、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、３’−シアリル−３−フコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ＬＮＦＰ−Ｉ、ＬＮＦＰ−ＩＩ、ＬＮＦＰ−ＩＩＩ、ＬＮＦＰ−Ｖ、ＬＳＴ−ａ、ＬＳＴ−ｂ、ＬＳＴ−ｃ、ＦＬＳＴ−ａ、ＦＬＳＴ−ｂ、ＦＬＳＴ−ｃ、ＬＮＤＦＨ−Ｉ、ＬＮＤＦＨ−ＩＩ、ＬＮＤＦＨ−ＩＩＩ、ＤＳ−ＬＮＴ、ＦＤＳ−ＬＮＴ  Ｉ及びＦＤＳ−ＬＮＴ  ＩＩのＲ−グリコシド、またはその塩からなる群より選択することができる。前記Ｒ−グリコシドはアルファ又はベータ−アノマーであってもよい。好ましくは、該Ｒ−グリコシドはベータ−アノマーであり、より好ましくは、Ｒはベンジルである。
【０２７１】
更なる形態によれば、本発明の方法は更に、好ましくは本明細書に記載されているように、培養工程で及び／又は水素化分解工程後に得られた化合物を摂取製品（consumable product）に添加する工程を含む。摂取製品は、好ましくは医薬製剤又は栄養製剤の少なくとも１つであり、好ましくは液体又は固体である。他の形態によれば、本発明の方法は更に、培養工程で及び／又は水素化分解工程後に得られた化合物に、医薬上許容しうる担体を添加する工程、及び／又は、プレバイオティクスを添加する工程を含む。
【０２７２】
第２のアスペクトによれば、本発明はまた、本明細書に開示した本発明の方法により得られた又は得られる、上記化合物（特に多様化したＨＭＯの混合物）を提供する。第２のアスペクトの更なる形態によれば、本発明は、本明細書に開示した本発明の方法により得られた又は得られる化合物（好ましくは化合物の混合物、より好ましくはＨＭＯの混合物）を提供する。本発明において、本明細書に開示した本発明の方法により得られた又は得られる化合物の混合物は、上述したように、少なくとも２〜１０、２〜１０、２〜２０、２〜２０、２〜１００、２〜２００種の、或いは更に多くの異なる化合物の混合物であることが好ましい。そのような化合物は、限定されることなく、式１、２、３若しくは４、又は、部分式（subformulae）のいずれに規定した化合物、又は、上述した選択肢から選択することができる。
【０２７３】
第３のアスペクトによれば、本発明は、また、本発明において例えばアクセプターとして利用することができる化合物、及び、本発明の多様化させる方法中に得られる化合物を提供する。
【０２７４】
また、本発明は、ここで定義する化合物の塩を提供する又は利用する。そのような塩は、好ましくは塩の形態で少なくとも１つのシアリル残基を含有する一般式１〜４又はその部分式で表される化合物の塩から選択される（一般式１〜４又はその下位式（subformulae）に含まれるシアリル化オリゴ糖の負電荷を有する酸残基と、１以上のカチオンとからなる、いかなる化学量論比の結合イオン対）。本明細書の文脈で用いられているカチオンは、正電荷を有する原子又は分子である。該カチオンは無機カチオンでも有機カチオンでもよい。好ましい無機カチオンにはアンモニウムイオン、アルカリ金属、アルカリ土類金属及び遷移金属イオンがある。より好ましくはＮａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋、Ｆｅ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋及びＣｕ２＋であり、最も好ましくはＫ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋、Ｆｅ２＋及びＺｎ２＋である。正に帯電した塩基性有機化合物は関連性のある有機カチオンであってもよい。このような正電荷を帯びたカウンターパートは、好ましくはジエチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、イミダゾール、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ベンジルアミン、エチレンジアミン、メグルミン、ピロリジン、コリン、トリス−（ヒドロキシメチル）−メチルアミン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピロリジン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペリジン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン又はＬ−リジン単位を有するオリゴペプチド、又はＮ末端上に遊離アミノ基を有するオリゴペプチド等が挙げられ、これらはすべてプロトン化されたものである。このような塩の形成は安定性、添加剤との適合性、溶解性及び結晶形性能等の複合分子全般の性質の改変に用いることができる。
【０２７５】
第３のアスペクトの特定の形態によれば、本明細書に記載の化合物は、好ましくは、ＲがＨではない場合、更により好ましくは、Ｒがベンジルである場合に、例えば本明細書に開示されているように水素化分解反応させてもよい。このような水素化分解反応は、上述したように行われることが好ましい。好ましくは、Ｒ基は本明細書に規定したもので、上述したように水素化分解反応において開裂してもよい。
【０２７６】
第３のアスペクトの更なる形態において、本明細書に開示した本発明の方法により得られた又は得られる化合物若しくは化合物の混合物、より好ましくはＨＭＯの混合物、又は、本明細書に開示したいずれの更なる化合物は、摂取製品の調製、好ましくは医薬組成物、栄養製剤若しくは栄養補助食品の調製に用いることができる。本明細書に開示した本発明の方法により得られた又は得られる化合物若しくは化合物の混合物、より好ましくはＨＭＯの混合物は、特に新生児の免疫システムの向上及び成熟に効果的であり、インフルエンザなどウイルス感染の二次感染に対する予防効果がある。本明細書に開示した本発明の方法により得られた又は得られる化合物若しくは化合物の混合物、より好ましくはＨＭＯの混合物の、プレバイオティックとしての使用は、幼児の初期ビフィドジェニック腸内微生物（early bifidogenic intestinal microbiota）の発達の促進、開発リスク又は小児アレルギー及び／又はぜんそくの低減、及び、幼児の下痢などの病原体感染の防止及び治療における、ラクトバチルス及びビフィドバクテリウム属などのプロバイオティクスの有用な効果及び効率を促進する。
【０２７７】
第４のアスペクトにおいて、本発明は、本明細書に開示した本発明の方法により得られた又は得られる化合物若しくは化合物の混合物、より好ましくはＨＭＯの混合物、及び好ましくは医薬上許容しうる担体を含む医薬組成物を提供する。「医薬上許容しうる担体」は、これらに限定されないが、添加剤、アジュバント、賦形剤、および希釈剤（水、ゼラチン、タルク、糖類、デンプン、アラビアゴム、植物ガム、植物油、ポリアルキレングリコール、香味剤、保存剤、安定剤、乳化剤、潤滑剤、着色剤、充填剤、湿潤剤など）が含まれる。適切な担体は、この分野の標準的な参考書であるRemington's Pharmaceutical Sciencesの最新版に記載されている。投与のための剤形は、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、点滴剤、カプセル剤、注射剤、液剤、エリキシル剤、抽出物およびチンキ剤を含む。
【０２７８】
第５のアスペクトにおいて、好ましくは本明細書に開示した本発明の方法により得られた又は得られる化合物若しくは化合物の混合物、より好ましくはＨＭＯの混合物を含む、食品又は飲料などの栄養製剤（nutritional formulation）が提供される。また、栄養製剤は食用の微量栄養素、ビタミンおよびミネラルを含んでもよい。このような成分の量は、製剤が正常で健康な幼児、子供、大人、または特別なニーズを持つ者（例えば代謝障害に苦しむ者）での使用を意図しているかどうかによって異なる場合がある。微量栄養素は、例えば食用油、脂肪または脂肪酸（ヤシ油、大豆油、モノグリセリド、ジグリセリド、パームオレイン、ヒマワリ油、魚油、リノール酸、リノレン酸など）、炭水化物（グルコース、フルクトース、スクロース、マルトデキストリン、スターチ、加水分解コーンスターチ等）、及び、カゼイン、大豆、ホエー又はスキムミルク、またはこれらのタンパク質の加水分解物由来のタンパク質（他のソース由来のタンパク質（インタクト又は加水分解された）も使用することができる）を含む。ビタミン類は、ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、葉酸、イノシトール及びニコチン酸からなる群より選択することができる。栄養製剤は、以下のミネラル及び微量元素を含んでもよい：ＣＡ、Ｐ、Ｋ、Ｎａ、Ｃｌ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｓｅ、Ｃｒ又はＩ。
【０２７９】
第５のアスペクトの全般の形態によれば、上述した栄養製剤は更に、１以上のプロバイオティクス（例えば、ラクトバクテリア、ビフィドバクテリウム属）、フルクトオリゴ糖及びガラクトオリゴ糖などのプレバイオティクス、カゼイン、大豆、ホエー又はスキムミルク由来のタンパク質、ラクトース、サッカロース、マルトデキストリン、デンプンまたはそれらの混合物などの炭水化物、脂質（例えば、パームオレイン、ヒマワリ油、ヒマワリ油）、及び、日常の食物に不可欠なビタミン類及びミネラルを含んでもよい。また、プロバイオティクスは、好ましくは、個人（好ましくは幼児、子供及び／又は成人）において所望の効果を達成するのに十分な量で栄養製剤に含まれる。
【０２８０】
好ましい実施形態において、上記で定義した栄養製剤は、乳児用調製粉乳である。本発明の文脈において、「乳児用ミルク」は、好ましくは、生後４〜６ヶ月または生後４〜１２ヶ月の乳児の特定の栄養的使用に意図された、それだけで乳幼児の栄養的要求を満たす食品をいう。それは、例えば、１以上のプロバイオティクビフィドバクテリウム属、フルクトオリゴ糖およびガラクトオリゴ糖などのプレバイオティクス、カゼイン、大豆、ホエー又はスキムミルク由来のタンパク質、ラクトース、サッカロース、マルトデキストリン、デンプンまたはそれらの混合物などの炭水化物、脂質（例えば、パームオレイン、ヒマワリ油、ヒマワリ油）、及び、日常の食物に不可欠なビタミン類及びミネラルを含有することができる。
【０２８１】
第６のアスペクトにおいて、栄養補助食品を提供することができる。そのような栄養補助食品は、好ましくは上記栄養食品のための上記成分を含む（例えば、本明細書に開示した本発明の方法により得られた又は得られる化合物若しくは化合物の混合物、より好ましくはＨＭＯの混合物、ビタミン、ミネラル、微量元素および他の微量栄養素など）。栄養補助食品は、例えば、錠剤、カプセル剤、トローチ又は液体の形態でであってもよい。該栄養補助食品は、これに限定されないが、結合剤、コーティング、乳化剤、可溶化剤、カプセル化剤、皮膜形成剤、吸着剤、担体、充填剤、分散剤、湿潤剤、ゲル化剤、ゲル形成剤などから選択される従来の添加剤を含んでもよい。
【０２８２】
好ましい実施形態によれば、栄養補助食品は、本明細書に開示した本発明の方法により得られた又は得られる化合物若しくは化合物の混合物、より好ましくはＨＭＯの混合物の投与としての消化性健康機能性食品であり、消化系の健康に有益な効果を提供する。消化性健康機能性食品は、好ましくは、本明細書に開示した本発明の方法により得られた又は得られる化合物若しくは化合物の混合物、より好ましくはＨＭＯの混合物を、錠剤、カプセル、粉末等の形態で生理学的機能要素又は成分として利用した、消化系の健康を促進し、維持することを意図して使用される加工食品である。栄養補助食品（dietary supplement）、栄養補助食品（nutraceutical）、設計された食品、または健康製品など種々の用語もまた、消化性健康機能性食品をさしている。
【０２８３】
更なるアスペクトにおいて、本明細書に開示した本発明の方法により得られた又は得られる化合物若しくは化合物の混合物、より好ましくはＨＭＯの混合物は、食品、飲料、飼料などの栄養製剤、好ましくは乳児用調製粉乳、栄養補助食品、消化性健康機能性食品、好ましくは上述したこれらのものの調製に用いてもよい。栄養製剤は通常の方法で調製することができる。
【０２８４】
本発明の理解を助けるために、化合物及び酵素の特定の組み合わせに適用された時の本発明の方法の結果についての説明を以下に記載する。
【０２８５】
好適には、本発明の方法の工程ａ）において提供される化合物は、２’−フコシルラクトースであってもよく、工程ｂ）において提供される酵素は、トランスフコシダーゼであってもよい。この系において２’−フコシルラクトースが、ドナーおよびアクセプターとして作用し得るため、培養工程ｃ）の結果は、ジフコシルラクトースおよびラクトースの生成であってもよい。ラクトースは、厳密に言えば人乳オリゴ糖ではないので、工程ｃ）の結果は単一のＨＭＯの生成であると考えられ、したがって、本発明のより好ましい形態においては、ＨＭＯの混合物に達するために、少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）の第２の繰り返しを行わなければならない。
【０２８６】
好適には、本発明の方法の工程ａ）において提供される化合物は、３’−シアリルラクトース（ドナー）及び３−フコシルラクトース（アクセプター）であってもよく、工程ｂ）において提供される酵素は、トランスシアリダーゼであってもよい。培養工程ｃ）の結果は、シアリル−フコシル−ラクトースおよびラクトースの生成であってもよい。ラクトースは、厳密に言えば人乳オリゴ糖ではないので、工程ｃ）の結果は単一のＨＭＯの生成であると考えられ、したがって、本発明のより好ましい形態においては、ＨＭＯの混合物に達するために、少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）の第２の繰り返しを行わなければならない。
【０２８７】
好適には、本発明の方法の工程ａ）において提供される化合物は、３’−シアリルラクトース（ドナー）及びラクトース（アクセプター）であってもよく、工程ｂ）において提供される酵素は、１−６−選択的トランスシアリダーゼであってもよい。培養工程ｃ）の結果は、６−シアリル−ラクトースおよびラクトースの生成であってもよい。ラクトースは、厳密に言えば人乳オリゴ糖ではないので、工程ｃ）の結果は単一のＨＭＯの生成であると考えられ、したがって、本発明のより好ましい形態においては、ＨＭＯの混合物に達するために、少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）の第２の繰り返しを行わなければならない。
【０２８８】
好適には、本発明の方法の工程ａ）において提供される化合物は、２’−フコシルラクトース（ドナー）及びラクトース（アクセプター）であってもよく、工程ｂ）において提供される酵素は、１−３−選択的トランスフコダーゼであってもよい。培養工程ｃ）の結果は、３−フコシルラクトースおよびラクトースの生成であってもよい。ラクトースは、厳密に言えば人乳オリゴ糖ではないので、工程ｃ）の結果は単一のＨＭＯの生成であると考えられ、したがって、本発明のより好ましい形態においては、ＨＭＯの混合物に達するために、少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）の第２の繰り返しを行わなければならない。
【０２８９】
好適には、本発明の方法の工程ａ）において提供される化合物は、３’−シアリルラクトース（ドナー）及びＬＮＴ（アクセプター）であってもよく、工程ｂ）において提供される酵素は、トランスシアリダーゼであってもよい。培養工程ｃ）の結果は、シアリル−ＬＮＴおよびラクトースの生成であってもよい。ラクトースは、厳密に言えば人乳オリゴ糖ではないので、工程ｃ）の結果は単一のＨＭＯの生成であると考えられ、したがって、本発明のより好ましい形態においては、ＨＭＯの混合物に達するために、少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）の第２の繰り返しを行わなければならない。
【０２９０】
好適には、本発明の方法の工程ａ）において提供される化合物は、ＬＮｎＴ（ドナー及びアクセプター）であってもよく、工程ｂ）において提供される酵素は、トランス−Ｎ−アセチル−ラクトサミニダーゼであってもよい。培養工程ｃ）の結果は、パラ−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）又はラクト−Ｎ−ネオヘキサオース（ＬＮｎＨ）、およびラクトースの生成であってもよい。ラクトースは、厳密に言えば人乳オリゴ糖ではないので、工程ｃ）の結果は単一のＨＭＯの生成であると考えられ、したがって、本発明のより好ましい形態においては、ＨＭＯの混合物に達するために、少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）の第２の繰り返しを行わなければならない。
【０２９１】
好適には、本発明の方法の工程ａ）において提供される化合物は、ＬＮｎＴ（ドナー）及びＬＮＴ（アクセプター）であってもよく、工程ｂ）において提供される酵素は、トランス−Ｎ−アセチル−ラクトサミニダーゼであってもよい。培養工程ｃ）の結果は、ラクト−Ｎ−ヘキサオース（ＬＮＨ）およびラクトースの生成であってもよい。ラクトースは、厳密に言えば人乳オリゴ糖ではないので、工程ｃ）の結果は単一のＨＭＯの生成であると考えられ、したがって、本発明のより好ましい形態においては、ＨＭＯの混合物に達するために、少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）の第２の繰り返しを行わなければならない。
【０２９２】
好適には、本発明の方法の工程ａ）において提供される化合物は、ＬＮＴ（ドナー）及びＬＮｎＴ（アクセプター）であってもよく、工程ｂ）において提供される酵素は、トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼであってもよい。培養工程ｃ）の結果は、パラ−ラクト−Ｎ−ヘキサオース（ｐＬＮＨ）およびラクトースの生成であってもよい。ラクトースは、厳密に言えば人乳オリゴ糖ではないので、工程ｃ）の結果は単一のＨＭＯの生成であると考えられ、したがって、本発明のより好ましい形態においては、ＨＭＯの混合物に達するために、少なくとも工程ａ）及びｃ）、又は、工程ｂ）及びｃ）の第２の繰り返しを行わなければならない。
【０２９３】
ドナー及び／又はアクセプターの対応するベンジルグリコシドを用いた類似のバリエーションを用いてもよい。
【０２９４】
本発明において、特に明示されていない限り、選択し及び形態の種々の特徴は、適している場合には互いに組み合わせてもよい。
【０２９５】
好ましい形態を参照して本発明を説明したが、当然のことながら、本発明の範囲内において様々な変形を行ってもよい。
【０２９６】
本明細書において、他に明記のない限り、単語「又は（or）」は、述べられた条件の一方又は両方が満たされる場合に真値を返す演算子という意味で用いられており、これと対照的なのは、複数ある条件の中の１つだけ満たすことを要する「排他的ＯＲ（eｘclusive or）」という演算子である。単語「を含む（comprising）」は「を含む（including）」という意味で用いられているのであって、「からなる（consisting of）」ではない。上記で認めた全ての従来の教示は本明細書に参照することにより組み込まれる。本明細書における先に発行された文献のいかなる認識も、該文献の教示が本明細書の時点におけるオーストラリア又は他国の共通の一般知識であるという自白又は表明として捉えるべきではない。
【実施例】
【０２９７】
（実施例１）
トランスグリコシル化反応の一般的な手順：
ｐＨ５．０〜９．０の培養緩衝液中、適切なグリコシルドナー及びグリコシルアクセプター（１０ｍＭ〜１Ｍ）（例えば、一般式２、４で表される化合物、ＬＮＴ、ＬＮＴ−ＯＲ、ＬＮｎＴ又はＬＮｎＴ−ＯＲ）を含む溶液を、組換えグリコシダーゼ、トランスグリコシダーゼ又はグリコシンターゼ（例えば、α−フコシダーゼ、α−トランスフコシダーゼ、α−フコシンターゼ、α−シアリダーゼ、α−トランスシアリダーゼ、β−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ、β−トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ、β−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ又はβ−トランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ）を用いて培養した。１５〜７０℃で反応混合液を撹拌した。反応の様々な時間で複数のサンプルを採取した。ｐＨ１０の１Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液を添加して反応を停止し、生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は／及び液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）又は／及び液体クロマトグラフタンデム型質量分析計（ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ）で分析した。完了後、酵素を変性させ、遠心分離させた。得られた溶液を減圧下で蒸発させた。凍結乾燥後、乾燥残渣を水に溶解し、生成物を、水を用いてバイオジェル・クロマトグラフィーで（Ｐ−２  Ｂｉｏｇｅｌ、１６ｘ９００ｍｍ）、又は逆相クロマトグラフィーで精製した。
【０２９８】
以下の組換え酵素をトランスグリコシル化反応で使用及びテストした：
トランスフコシダーゼＰ２５  テルモトガ・マリチマ（配列番号１参照）より  突然変異体Ｇ２２６Ｓ  Ｙ２３７Ｈ  Ｔ２６４Ａ  Ｌ３２２Ｐ含有；
トランスフコシダーゼＭ３  テルモトガ・マリチマ（配列番号１参照）より  突然変異体Ｙ２３７Ｈ  Ｙ２６７Ｆ  Ｌ３２２Ｐ含有
トランスフコシダーゼＣ２  テルモトガ・マリチマ（配列番号１参照）より  突然変異体Ｔ２６４Ａ  Ｙ２６７Ｆ  Ｌ３２２Ｐ含有
トランスシアリダーゼ  クルーズトリパノソーマ（配列番号１５、１６）より
フコシダーゼＢｌｏｎ＿２３３６  ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス  ＡＴＣＣ  １５６９７（配列番号５）より
【０２９９】
Osanjo et al. Biochemistry 46, 1022 (2007), Sela et al. Appl. Environ. Microbiol. 78, 795 (2012), Agusti et al. Glycobiology 14, 659 (2004)及びNeubacher et al. Org. Biomol. Chem. 3, 1551 (2005)に報告されているように、これらのトランスグリコシダーゼが大腸菌に産生された。精製したトランスグリコシダーゼを−２０℃〜＋４℃で保管した。
【０３００】
（実施例２）
３−ＳＬをドナーとして用いたシアリル化
一般的な手順：１５℃で、培養緩衝液中（０．５ｍｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．０）、３−ＳＬ及び適切なシアリルアクセプターを含む溶液を、クルーズトリパノソーマ由来の組換えトランスシアリダーゼ（４５μｌ、９０ｍｇ／ｍｌ）を用いて培養した。３、６及び２４時間後にそれぞれサンプルを採取し（各５０μｌ）、反応の経過を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）でモニタリングした。
【０３０１】
高い転換率の媒体は、以下のシアル化反応で検出された：
ドナー：３−ＳＬ（７５ｍＭ）、アクセプター：ＬＮＴ（５０ｍＭ）、生成物：シアリル化ＬＮＴ
ドナー：３−ＳＬ（７５ｍＭ）、アクセプター：ＬＮｎＴ（５０ｍＭ）、生成物：シアリル化ＬＮｎＴ
ドナー：３−ＳＬ（７５ｍＭ）、アクセプター：３−ＦＬ（２５ｍＭ）、生成物：シアリル化３−ＦＬ
【０３０２】
（実施例３）
ドナーとして２’−ＦＬを用いたフコシル化
一般的な手順：６０℃で、脱気培養緩衝液中（０．５ｍｌ、５０ｍＭ  クエン酸塩／リン酸塩、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）、２’−ＦＬ及びＬＮＴを含む溶液を、トランスフコシダーゼ（テルモトガ・マリチマ由来のＰ２５、テルモトガ・マリチマ由来のＭ３）を用いて培養した。２１時間後にサンプルを採取し、ＨＰＬＣにより転換率を判定した。
【０３０３】
結果：
Ｐ２５突然変異体：
５００ｍＭ  ２’−ＦＬ，５００ｍＭ  ＬＮＴ，転換率：２５％  フコシル化ＬＮＴ（フコシル化の位置は判定せず）
１０００ｍＭ  ２’−ＦＬ，５００ｍＭ  ＬＮＴ，転換率：３１％  フコシル化ＬＮＴ（フコシル化の位置は判定せず）＋４％  ジフコシル化ＬＮＴ（フコシル化の位置は判定せず）
【０３０４】
Ｍ３突然変異体：
５００ｍＭ  ２’−ＦＬ，５００ｍＭ  ＬＮＴ，転換率：３６％  フコシル化ＬＮＴ（フコシル化の位置は判定せず）
【０３０５】
（実施例４）
２’−ＦＬをドナーとして用いたフコシル化反応
一般的な手順：６０℃で２４時間、脱気培養緩衝液中（１ｍｌ、５０ｍＭ  クエン酸／リン酸ナトリウム緩衝液、及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）、２’−ＦＬとアクセプター（１０〜５００ｍＭ、ドナー／アクセプター比は５：１〜１：５）とを含む溶液を、トランスフコシダーゼ（テルモトガ・マリチマ由来のＰ２５、テルモトガ・マリチマ由来のＭ３）を用いて培養した。反応の様々な時間で複数のサンプルを採取し、ｐＨ１０の１Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液を添加して反応を停止し、生成物をＴＬＣ及び／又はＨＰＬＣで分析した。完了後、酵素を変性させ、遠心分離させた。得られた溶液を減圧下で蒸発させた。凍結乾燥後、乾燥残渣を水に溶解し、水を用いてバイオジェル・クロマトグラフィーで（Ｐ−２  Ｂｉｏｇｅｌ、１６ｘ９００ｍｍ）、又は逆相クロマトグラフィーで精製した。生成物をＬＣ−ＭＳを用いて同定した。
【０３０６】
ＬＣ−ＭＳの条件：
機器：ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ２０００  ｔａｎｄｅｍ  ＭＳ
イオン化モード：ポジティブモードのエレクトロスプレー
スキャンタイプ：Ｑ１ＭＳ
サンプル挿入モード：ＨＰＬＣ
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＨＩＬＩＣ  ２５０ｘ４．６ｍｍ
流れ：均一濃度（水：アセトニトリル＝２２：７８）
流速：１ｍｌ／分  注入量：５μｌ
【０３０７】
結果：
アクセプター：Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−Ｂｎ
生成物：モノフコシル化Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−Ｂｎ
正確な分子量をＬＣ−ＭＳにより確認した（９４４［Ｍ＋Ｈ］＋，９６１［Ｍ＋ＮＨ４］＋，９６６［Ｍ＋Ｎａ］＋）
【０３０８】
アクセプター：Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−Ｂｎ
生成物：モノフコシル化Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−Ｂｎ
正確な分子量をＬＣ−ＭＳにより確認した（９４４［Ｍ＋Ｈ］＋，９６１［Ｍ＋ＮＨ４］＋，９６６［Ｍ＋Ｎａ］＋）
【０３０９】
（実施例５）
３−ＦＬをドナーとして用いたフコシル化
一般的な手順：１５℃で、培養緩衝液中（ＫＨＰＯ４、１００ｍＭ、ｐＨ７．０）、３−ＦＬ（ドナー、２００ｍＭ）と２’−ＦＬ（アクセプター、２００ｍＭ）との溶液を、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７由来の組換えフコシダーゼＢｌｏｎ＿２３３６を用いて培養した。３０℃で３０分間、反応混合液を撹拌した。ｐＨ１０の１Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液を添加して反応を停止した。生成物をＨＰＬＣで分析した。
【０３１０】
検出された生成物：２’，３−ジフコシルラクトース（２’，３−ジフコシルラクトースの標準サンプルと比較してＨＰＬＣで同定した）
【０３１１】
（実施例６）
３−ＳＬをドナーとして用いた複数アクセプターのシアリル化
プロトコル：
ｐＨ７．０の培養緩衝液中（トリス−ＨＣｌ、１００ｍＭ）、ドナーとして３−ＳＬ（７５ｍＭ）と、アクセプターとして３−ＦＬ、ラクト−Ｎ−テトラオース及びラクト−Ｎ−ネオテトラオース（各２５ｍＭ）とを含む溶液を、クルーズトリパノソーマに由来する組換えトランスシアリダーゼを用いて培養した。３０℃で２４時間、ｐＨ１０の１Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液を添加して反応を停止した。（ＳＦＬ、ＬＳＴＡａ、ＬＳＴｄ用）参照標準を用いて、生成物をＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳで分析した。
【０３１２】
検出された生成物：
３’−シアリル−３−フコシルラクトース、
ＬＳＴａ：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、
シアリル化ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＳＴｄ）：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、ジシアリル化ラクト−Ｎ−テトラオース及び／又はジシアリル化ラクト−Ｎ−ネオテトラオース
正確な分子量をＬＣ−ＭＳにより確認した（１２９０［Ｍ＋Ｈ］＋，１３０７［Ｍ＋ＮＨ４］＋，１３２８［Ｍ＋Ｋ］＋）
【０３１３】
（実施例７）
３−ＦＬをドナーとして用いた複数アクセプターのフコシル化
プロトコル：
ｐＨ７．０の培養緩衝液中（ＫＨＰＯ４、１００ｍＭ）、ドナーとして３−フコシルラクトース（２００ｍＭ）と、アクセプターとしてラクト−Ｎ−テトラオース−β−ＯＢｎ及びラクト−Ｎ−ネオテトラオース−β−ＯＢｎ（各１００ｍＭ）とを含む溶液を、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７に由来する組換えフコシダーゼＢｌｏｎ＿２３３６を用いて培養した。３０℃で３０分間、該反応混合液を撹拌した。生成物をＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳで分析した。
【０３１４】
検出された生成物：フコシル化ラクト−Ｎ−テトラオース−（β）−ＯＢｎ、フコシル化ラクト−Ｎ−ネオテトラオース−（β）−ＯＢｎ（β）
【０３１５】
（実施例８）
複数ドナー及び酵素を用いたＬＮＴのグリコシル化
プロトコル：
第１のサイクルにおいて、ｐＨ７．０の培養緩衝液中（ＫＨＰＯ４、１００ｍＭ）、ドナーとして３’−シアリルラクトース（１００ｍＭ）と、アクセプターとしてラクト−Ｎ−テトラオース（２００ｍＭ）とを含む溶液を、クルーズトリパノソーマ由来の組換えトランスシアリダーゼを用いて培養した。３０℃で２４時間、該反応混合液を撹拌した。
【０３１６】
第２のサイクルにおいて、得られた反応混合液に、２００ｍＭの２’−フコシルラクトース及びテルモトガ・マリチマ由来の組換えトランスフコシダーゼＭ３を加えた後、３０℃で更に２４時間、培養した。
【０３１７】
第３のサイクルにおいて、得られた反応混合液に、１００ｍＭの３−フコシルラクトース及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７由来の組換えフコシダーゼＢｌｏｎ＿２３３６を加えた後、３０℃で更に３０分間、培養した。ｐＨ１０の１Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液を添加して反応を停止し、生成物をＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＳ及びＬＣ−ＭＳ−ＭＳで分析した。
【０３１８】
ＬＣ−ＭＳの条件：
機器：ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ２０００  ｔａｎｄｅｍ  ＭＳ
イオン化モード：ポジティブモードのエレクトロスプレー
スキャンタイプ：Ｑ１ＭＳ
サンプル挿入モード：ＨＰＬＣ
カラム：ＴＳＫ  Ｇｅｌ  ａｍｉｄｅ８０（Ｔｏｓｏｈ、３μｍ、１５０ｘ４．６ｍｍ）
溶離液：１０ｍＭ  ギ酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ＝６）−アセトニトリド：３０％／７０％
流速：１ｍｌ／分  注入量：５μｌ
【０３１９】
結果：            
【０３２０】
【表７】
2014513986.tif 000060
【０３２１】
（実施例９）
複数ドナー及び酵素を用いたＬＮｎＴのグリコシル化
プロトコル：
第１のサイクルにおいて、ｐＨ７．０の培養緩衝液中（ＫＨＰＯ４、１００ｍＭ）、ドナーとして３’−シアリルラクトース（１００ｍＭ）と、アクセプターとしてラクト−Ｎ−ネオテトラオース（２００ｍＭ）とを含む溶液を、クルーズトリパノソーマ由来の組換えトランスシアリダーゼを用いて培養した。３０℃で２４時間、該反応混合液を撹拌した。
【０３２２】
第２のサイクルにおいて、得られた反応混合液に、２００ｍＭの２’−フコシルラクトース及びテルモトガ・マリチマ由来の組換えトランスフコシダーゼＭ３を加えた後、更に２４時間間、培養した。
【０３２３】
第３のサイクルにおいて、得られた反応混合液に、１００ｍＭの３−フコシルラクトース及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７由来の組換えフコシダーゼＢｌｏｎ＿２３３６をを加えた後、更に３０分間、培養した。ｐＨ１０の１Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液を添加して反応を停止し、生成物をＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳで分析した。
【０３２４】
結果（ＨＰＬＣ条件：実施例８を参照）
【０３２５】
【表８】
2014513986.tif 000061
【０３２６】
（実施例１０）
３−ＦＬをドナーとして用いたフコシル化
一般的な手順：
ｐＨ７．０の培養緩衝液中（ＫＨＰＯ４、１００ｍＭ）、ドナーとして３−ＦＬ（２００ｍＭ）と、アクセプターとしてＬＮＴ（２００ｍＭ）とを含む溶液を、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７に由来する組換えフコシダーゼＢｌｏｎ＿２３３６を用いて培養した。３０℃で３０分間、該反応混合液を撹拌した。ｐＨ１０の１Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液を添加して反応を停止た。生成物をＨＰＬＣで分析した。
【０３２７】
検出された生成物：フコシル化ＬＮＴ（ＨＰＬＣ条件：実施例８を参照）
【０３２８】
【表９】
2014513986.tif 000062
【０３２９】
（実施例１１）
３−ＦＬをドナーとして用いたフコシル化
一般的な手順：
ｐＨ７．０の培養緩衝液中（ＫＨＰＯ４、１００ｍＭ）、ドナーとして３−ＦＬ（２００ｍＭ）と、アクセプターとしてＬＮｎＴ（２００ｍＭ）とを含む溶液を、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７に由来する組換えフコシダーゼＢｌｏｎ＿２３３６を用いて培養した。３０℃で３０分間、該反応混合液を撹拌した。ｐＨ１０の１Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液を添加して反応を停止た。生成物をＨＰＬＣで分析した。
【０３３０】
検出された生成物：フコシル化ＬＮｎＴ（ＨＰＬＣ条件：実施例８を参照）
【０３３１】
【表１０】
2014513986.tif 000063
【０３３２】
（実施例１２）
アクセプター  ベンジル／置換ベンジルグリコシドの製造
Ａ）ベンジル／置換ベンジルラクトシド
Ａ１）一般的方法：室温で、ラクトース（５ｇ、１４．６ｍｍｏｌ）及びＴｓＯＨ・Ｈ２Ｏ（０．２ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を一度に、ＤＭＦ（２０ｍｌ）及びベンズアルデヒドジメチルアセタール（５．５ｍｌ、３５．４ｍｍｏｌ、２．４当量）の混合液に加えた。該反応混合液を、防湿下、７０℃で１時間強撹拌した。冷却後、トリエチルアミン（０．１５ｍｌ）を加え、揮発性成分（ＭｅＯＨ、トリエチルアミン、残存ベンズアルデヒドジメチルアセタール）を真空で除去した。この反応混合液に、ベンジルブロミド誘導体（１．５当量；試薬が固体の場合、予め５〜１０ｍｌのＤＭＦに溶解したもの）を加え、該混合液を２０分間０℃で冷却した。更に冷却中、ＮａＨ（０．８ｇ、５５％鉱油分散液、１．３当量）を一度に加え、該混合液を冷却下、水素の形成が停止するまで撹拌し、その後室温で２〜３時間、撹拌した。メタノール（２ｍｌ）を注意深く加え、該反応混合液をさらに５分撹拌した。該反応混合液を、１００ｍｌのＤＣＭと１００ｍｌの水に分け、抽出した。水層は、１００ｍｌのＤＣＭで二回逆抽出した。混合有機相を蒸発させた、残留物を１００ｍｌのアセトニトリルに溶解し、１００ｍｌのヘキサンで抽出した。アセトニトリルを蒸留除去し、５０℃にて、残留物をイソプロパノール（１０ｍｌ）及びイソプロピルエーテル（５０ｍｌ）に得た。２〜１２時間、透明溶液を−２０℃まで冷却させた。得られた結晶をろ過して得て、ＴＢＭＥで二回洗浄し、乾燥させた。ＴＢＭＥ（約５０ｍｌ）及びエタノール（約２０ｍｌ）の混合液から再結晶化を行ってもよい。
【０３３３】
４−クロロベンジル４’，６’−Ｏ−ベンジリデン−β−ラクトシド
収量：１．７１ｇ
４−メチルベンジル４’，６’−Ｏ−ベンジリデン−β−ラクトシド
収量：３．２０ｇ
３−フェニルベンジル４’，６’−Ｏ−ベンジリデン−β−ラクトシド
収量：２．７０ｇ
２−ナフチルメチル４’，６’−Ｏ−ベンジリデン−β−ラクトシド
収量：１．７７ｇ
【０３３４】
Ｂ１）室温で、メタノール（１０ｍｌ）及び水（０．５ｍｌ）中の上記ベンジリデンアセタール（５００ｍｇ）のうちの１つの混合液に、ＴＦＡを加え、防湿下で該反応混合液を２〜４時間撹拌し、その後蒸発させた。残存する物質を、エタノールで３〜４回共蒸発させ、粗固体を得た。乾燥後、得られた粗固体を、メタノール（約１０〜３５ｍｌ）及び水（約０〜２ｍＬ）の混合液から再結晶化してもよい。
【０３３５】
４−クロロベンジルβ−ラクトシド
収量：３３３ｍｇ
１３Ｃ−ＮＭＲ（７５．１ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ＝１３５．２５、１３３．６７、１３０．３０、１２８．７０、１０３．００、１０１．１３、７８．３９、７５．４４、７４．８９、７４．４９、７２．８８、７２．５８、７１．０３、７０．８３、６８．６２、６１．１１、６０．１３．
【０３３６】
４−メチルベンジルβ−ラクトシド
収量：４３９ｍｇ
１３Ｃ−ＮＭＲ（７５．１ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ＝１３８．９１、１３３．５０、１２９．３７、１２９．０７、１０３．０１、１００．９６、７８．４３、７５．４４、７４．８７、７４．５２、７２．９０、７２．５９、７１．４７、７１．０３、６８．６３、６１．１１、６０．１７、２０．３４．
【０３３７】
３−フェニルベンジルβ−ラクトシド
収量：４３８ｍｇ
１３Ｃ−ＮＭＲ（７５．１ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ／ｄ４−ＭｅＯＨ／Ｄ２Ｏ  ８：１：１）：δ＝１４０．２９、１４０．２４、１３８．８８、１２９．１３、１２９．０２、１２７．６６、１２６．８８、１２６．８３、１２６．０３、１２５．９０、１０３．９５、１０２．０３、８０．７６、７５．６５、７５．０７、７５．００、７３．３４、７３．２８、７０．６６、６９．８１、６８．２７、６０．５６．
【０３３８】
２−ナフチルメチルβ−ラクトシド
収量：３７８ｍｇ
１３Ｃ−ＮＭＲ（７５．１ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ／ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ＝１３４．９６、１３３．２４、１３３．１２、１２８．５９、１２８．３１、１２８．０８、１２７．４６、１２６．９８、１２６．９０、１２６．７９、１０３．２６、１０１．５９、７８．８９、７５．６２、７５．０９、７４．８１、７３．１４、７２．８１、７１．３３、７１．１４、６８．７５、６１．２２、６０．３９．
【０３３９】
Ｂ）Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−Ｂｎ（１−Ｏ−ベンジル−β−ＬＮＴ）をA. Malleron et al. Carbohydr. Res. 341, 29 (2006)に従って、調製することができる。
Ｃ）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−Ｂｎ（１−Ｏ−ベンジル−β−ＬＮｎＴ）をＷＯ２０１１／１００９８０に従って、調製することができる。
Ｄ）シアリル化及び又はフコシル化ラクトースのベンジル／置換ベンジルグリコシド、ＬＮＴ又はＬＮｎＴをＷＯ２０１２／００７５８５に従って、アノメリックアルキル化によって調製することができる。
【図１】
2014513986.tif 000083
【図２】
2014513986.tif 000084
【配列表】
2014513986000001.app
【国際調査報告】
2014513986.tif 000085
2014513986.tif 000086
2014513986.tif 000087