(57)【要約】 本発明は、創傷の処置、特に瘢痕形成、特に、肥厚性瘢痕化又はケロイド形成の低減又は抑制に有用な組成物又は方法を提供する。組成物は、平均分子量が約７５，０００Ｄａ〜約２５０，０００Ｄａのゼラチンと、平均分子量が約１０，０００Ｄａ〜約１，０００，０００Ｄａの高分子炭水化物とを含む。したがって、本発明は、肥厚性瘢痕又はケロイド修正手術、さらに、予防、瘢痕阻害方法に有用な方法を含む、処置方法をさらに提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均分子量が約７５，０００Ｄａ〜約２５０，０００Ｄａであるゼラチンと、
平均分子量が約１０，０００Ｄａ〜約１，０００，０００Ｄａである高分子炭水化物とを含む組成物であって、
前記ゼラチンは、前記組成物中に存在する前記ゼラチンと前記高分子炭水化物との組み合わせの総重量に対し約６０重量％以上含まれ、
前記組成物の水和物は、３５℃以上の温度では流動性注射用液体であり、温度では固体又は半固体ゲルマトリックスである、組成物。
【請求項２】
平均分子量が約７５，０００Ｄａ〜約２５０，０００Ｄａであるゼラチンと、
平均分子量が約１０，０００Ｄａ〜約１，０００，０００Ｄａである高分子炭水化物とを含む組成物であって、
前記ゼラチンは、前記組成物中に存在する前記ゼラチンと前記高分子炭水化物との組み合わせの総重量に対し約６０重量％以上含まれ、
前記組成物の水和物は、３５℃以上の温度では流動性注射用液体であり、温度では固体又は半固体ゲルマトリックスであり、
皮膚の創傷に前記組成物を適用することにより、皮膚の創傷により生じる皮膚の瘢痕化もしくはその影響の防止又は低減に使用される組成物。
【請求項３】
前記ゼラチンは、平均分子量が約１２０，０００Ｄａ〜約１８０，０００Ｄａである、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ゼラチンは、前記組成物中に存在する前記ゼラチンと前記高分子炭水化物との組み合わせの総重量に対し約６０重量％〜約９５重量％含まれる、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物の前記水和物中の前記ゼラチンと前記高分子炭水化物との総濃度は、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約４００ｍｇ／ｍＬである、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記流動性注射用液体は、３５℃〜３９℃の温度で、５Ｎのシリンジプランジャの圧力下で、５／８インチの長さ、２５ゲージの針を通りシリンジから押し出された際の流速が１０μＬ／ｓ以上である、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記流動性注射用液体は、３５℃〜約３７℃のピークを示す示差走査熱量曲線を有する、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
前記流動性注射用液体は、固体濃度が約０．５ｇ／ｍＬ以下である、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
前記流動性注射用液体は、３５℃〜３９℃の温度における粘度が、約１．５Ｐａ−ｓ以下である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１０】
直径１ｃｍ、厚さ１ｃｍのゲルマトリックスディスクの形態の前記固体又は半固体ゲルマトリックスは、周囲条件下での圧縮弾性率が約１５ｋＰａ以上である、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、フィブロネクチン結合活性が約３ｎｍｏｌ／ｍｇ以上である、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物は、哺乳類の真皮又は皮下組織における滞留時間が約３日以上である、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項１３】
界面活性剤、吸湿賦形剤、緩衝剤、増量剤、アミノ酸、塩類、防腐剤、及びこれらの組み合わせを含む群より選択される物質をさらに含む、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物は、脂肪酸、脂肪酸塩類、アルキル硫酸、セラミド、ポリオールエステル、ポリオキシエチレンエステル、ポロキサマー、両性界面活性剤、双性イオン界面活性剤、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される界面活性剤を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物は、ポリエチレングリコール、ポリオール、ポリソルベート、シクロデキストリン、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化亜鉛、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される吸湿賦形剤を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、クエン酸塩、グリシン、リン酸塩、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される緩衝剤を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物は、マンニトール、デキストロース、スクロース、トレハロース、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される増量剤を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物は、グルタミン酸、アルギニン、リシン、システイン、アラニル−グルタミン、及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物は、エデト酸２ナトリウム、金属塩、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される塩を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物は、凍結乾燥体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物は、凍結乾燥体から再構成される、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項２２】
前記組成物は、ポリオール、ポリソルベート、生理食塩、単糖、糖アルコール、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される再構成添加剤を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物は、グリセロール、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、塩化ナトリウム、デキストロース、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される再構成添加剤を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組成物は、３５℃〜３９℃の温度、５Ｎのシリンジプランジャ圧で５／８インチの長さの２５ゲージの針を通しシリンジから押し出された際、流量が約１０μＬ／ｓである流動性注射用液体である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記再構成組成物は、３５℃〜３９℃の温度では粘度が約１．５Ｐａ−ｓ以下の流動性注射用液体である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記固体又は半固体ゲルマトリックスは、ｉ）直径１ｃｍ及び厚さ１ｃｍのディスク形態である時、周囲環境下で圧縮弾性率が、約３４ｋＰａを超えること、及びｉｉ）直径８ｍｍ、高さ１．５ｍｍのディスク形態である時、３４℃において、リン酸緩衝生理食塩水中、完全溶解時間が少なくとも約４５分であることのうち、一方又は両方を示す、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項２７】
皮膚創傷から生じる皮膚瘢痕化又はその影響を抑制又は低減する方法であって、前記方法は、前記皮膚創傷にマトリックス組成物を塗布することを含み、
前記マトリックス組成物は、
平均分子量が、約７５，０００Ｄａ〜約２５０，０００Ｄａのゼラチンと、
平均分子量が、約１０，０００Ｄａ〜約１，０００，０００Ｄａの高分子炭水化物とを含み、
前記ゼラチンは、前記マトリックス組成物に存在する前記ゼラチンと前記高分子炭水化物とを組み合わせた総重量に対し、約６０重量％以上含まれ、
前記マトリックス組成物の水和物は、３５℃以上の温度では流動性注射用液体であり、低温で、固体又は半固体ゲルマトリックスである、方法。
【請求項２８】
前記創傷を、縫合糸、ステープル、接着剤、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される閉塞部材を用いて閉塞することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記塗布は、前記流動性注射用液体組成物を前記皮膚創傷の近位にある真皮又は皮下組織に前記流動性注射用液体組成物を注射することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記皮膚創傷は、手術創傷である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
手術創傷は、予め存在する瘢痕の少なくとも一部を切除した後に残る創傷である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記予め存在する瘢痕は、ケロイド、肥厚性瘢痕、又は熱傷に関連する瘢痕である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記方法は、
ケロイド、肥厚性瘢痕、又は熱傷に関連する瘢痕の少なくとも一部を切除し、切除部位を形成し、
前記切除部位又はその周囲の真皮又は皮下組織にマトリックス組成物を塗布することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
修正手術に効果的であり、前記切除部位において、処置の１２ヶ月後、ケロイド形成又は肥厚性瘢痕化の再発を１５％以下とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記修正手術に効果的であり、前記切除及び前記マトリックス組成物の塗布後１２ヶ月に存在する瘢痕組織の外部面積が、切除したケロイド又は肥厚性瘢痕の外部体積に対し、約１５％以下である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記塗布は、前記マトリックス組成物の局所的塗布を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
前記マトリックス組成物は、凍結乾燥体であり、
前記塗布ステップの前に、前記方法は、前記凍結乾燥したマトリックス組成物を再構成することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記再構成は、ポリオール、ポリソルベート、生理食塩、単糖、糖アルコール、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される添加剤と、前記マトリックス組成物を組み合わせることを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ケロイド形成又は肥厚性瘢痕化の形成を抑制又は低減させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
前記瘢痕化の影響を抑制又は低減し、
前記瘢痕化の影響は、痛み、かゆみ、変色、異常な剛性、異常な厚さ、表面の凹凸、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項４１】
前記塗布は、２．５ｃｍの創縁に対し、マトリックス組成物を約０．１ｍＬ〜約１０ｍＬ送達することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項４２】
皮膚瘢痕化の抑制又は低減に適したマトリックス組成物の調製方法であって、
前記方法は、
平均分子量が約７５，０００Ｄａ〜約２５０，０００Ｄａのゼラチンを、平均分子量が約１０，０００Ｄａ〜約１，０００，０００Ｄａの高分子炭水化物と、混合しつつ、溶媒と組み合わせ、徐々に前記ゼラチン及び前記高分子炭水化物を溶解させ、水和マトリックス組成物を形成することを含み、
前記ゼラチンは、前記組成物に存在する前記ゼラチンと前記高分子炭水化物との組み合わせの総重量に対し、約６０重量％〜約９５重量％含まれ、
前記組成物の水和物体における前記ゼラチンと前記高分子炭水化物との総濃度は、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約４００ｍｇ／ｍＬである、方法。
【請求項４３】
前記マトリックス組成物を凍結乾燥させることをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ｉ）前記組み合わせステップの前の前記ゼラチン及び前記高分子炭水化物のうち、一方又は両方、又はｉｉ）前記組み合わせステップにおいて形成される水和マトリックス組成物のいずれかから溶媒への可溶性が低い分画を除去し、前記ゼラチン又は前記高分子炭水化物のうち一方又は両方の平均分子量を増大させることをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、創傷の回復を促進する方法及び組成物に関する。詳細には、本組成物は、創傷治癒の過程を調節し、肥厚治癒、瘢痕形成、及びケロイド形成を抑えることができるように治癒を促進することに効果を示すことができる。
【背景技術】
【０００２】
創傷の回復を遅延又は妨げる、悪化した創傷治癒に由来するもののような、創傷が適切に治癒しない医学的状況は多い。しかし、さらに、結果として生じる機能又は美容術を限定し得る創傷治癒の事象がある。例示的な望まれない結果としては、広範囲な瘢痕、ケロイド又は機能及び可動性を含む創傷拘縮を産する過形成反応を含む。
【０００３】
肥厚性瘢痕は、身体がコラーゲンを過産生した際に生じ、瘢痕を周囲の皮膚以上に隆起させる。肥厚性瘢痕は、赤く隆起した塊の形態を取ることがあり、大抵、過剰な張力及び／又は他の外傷性の皮膚の傷がある創傷の感染又は創傷の閉塞後、４〜８週間以内に生じる。特にケロイド形成は、非常に困難な創傷治癒の課題である。ケロイドは、良性線維（繊維芽細胞又は筋線維芽細胞）増殖と定義され、軟部組織腫瘍となる。高密度の線維組織の良性過剰増殖は、皮膚の傷に対する、正常でない治癒反応から発症し、正常な創傷治癒及び肥厚性瘢痕を含む瘢痕化とは異なる。これら相違は、細胞プロセス、コラーゲン産生及び沈着、元の創傷の境界を越える継続的な増殖、及び切除後の高再発率において明らかとなる。正常な瘢痕又は肥厚性瘢痕とは異なり、ケロイドは、プロコラーゲンＩ型、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ１／β２、ＰＤＧＦ−α受容体を過剰産生する線維芽細胞を含有し、アポトーシス速度の低下又はアポトーシス遺伝子調節の低下のいずれかを伴う、成長因子要求性を低下させる（Ｒｏｂｌｅｓら、Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｉｎ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、２００７年）。これら異常な線維芽細胞プロセスは、コラーゲン及び細胞外マトリックスの産生を増加させることがｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、実証されている。正常瘢痕、肥厚性瘢痕、及びケロイド瘢痕をＸ線回析診断することにより、瘢痕線（正常瘢痕）と平行に延びるか又は瘢痕線（肥厚性瘢痕）とやや一直線となるコラーゲン原線維よりもむしろ、ケロイド瘢痕のコラーゲン原線維は、コラーゲンの特定の配向を全く示さないことが実証される（Ｋｏｏｎｉｎらの、Ｓ．Ａ．  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １９６４年）。加えて、該コラーゲンは、蓄積パターン、コラーゲン型（後にＩ型に代わるより多量なＩＩＩ型）の混合、及び過剰量は、他の組織又は瘢痕型と類似しない（ＣｈｅｎｇらのＡｆｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１１年）。最終的に、正常瘢痕又は肥厚性瘢痕とは異なり、ケロイド瘢痕における再発の傾向は、４５〜１００％であると報告されており、ケロイドは、瘢痕又は肥厚性瘢痕に使用される既知の処置に抵抗性がある（ＲｏｂｌｅｓらのＣｌｉｎｉｃｓ  ｉｎ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  ２００７年）。
【０００４】
コラーゲン、すなわち身体の主要な構造タンパク質を使用する創傷治癒を促進する組成物が記載されている。特に、グリコサミノグリカンと組み合わせたコラーゲンの組成物、すなわち身体の構造多糖類も、創傷治癒を促進するか又は創傷修復の組織テンプレートとして作用することが記載されている。例えば、米国特許第４，８３７，０２４号は、コラーゲン及びグリコサミノグリカンの粒子の懸濁液と創傷の表面を接触させることにより、創傷治癒を促進することを記載している。米国特許第４，２８０，９５４号は、合成皮膚などの分解可能な外科的補綴物として有用な、コラーゲンとムコ多糖（グリコサミノグリカン）を含有する組成物質を記載している。変性コラーゲンを使用する組成物も、多糖類を有する創傷治癒組成物に記載されている。米国特許第６，２６１，５８７号及び米国特許第６，７１３，０７９号は、血管新生の刺激及び創傷治癒の促進に使用されるゼラチン、及びデキストラン又はヘパリンの組成物を記載する。それらは、まだ、創傷処置、特にケロイド及び肥厚性真皮治癒への対処に有用な方法及び組成物の必要性を残している。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、治癒を促進する、特に、肥厚性創傷治癒及び／又は瘢痕形成を減少又は抑制するように治癒を促進する創傷処置に有用となり得る方法及び組成物を提供する。したがって、発明の方法及び組成物は、特に、手術後の瘢痕、肥厚性瘢痕、外傷もしくは熱傷、及びケロイドから生じる瘢痕を含む瘢痕化の減少又は抑制に有用となり得るが、これに限定されない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明は、一態様において、瘢痕化の減少又は抑制などの創傷の治療に有用である組成物を提供する。一実施形態において、本発明の組成物は、ゼラチン及び高分子炭水化物を含む水溶性組成物であってもよい。特に、組成物は、１つ以上の特定の状態を示すことができる。例えば、ゼラチンは、約７５，０００Ｄａ以上の範囲、好ましくは約７５，０００Ｄａ〜約２５０，０００Ｄａの範囲といった定義された範囲の平均分子量を有し得る。高分子炭水化物もまた、約１０，０００Ｄａ〜約１，０００，０００Ｄａの範囲といった定義された範囲の平均分子量を有する。ゼラチンは、組成物に存在するゼラチンと高分子炭水化物との組み合わせの総重量に対し、特定の割合範囲又は最小の割合で含まれてもよい。例えば、ゼラチンは、組成物に存在するゼラチンと高分子炭水化物との組み合わせの総重量に対し、約６０重量％以上含まれてもよい。さらに、ゼラチンと高分子炭水化物との組み合わせは、特定の濃度範囲で組成物中に含まれてもよい。例えば、ゼラチンと高分子炭水化物との組み合わせは、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約４００ｍｇ／ｍＬの総濃度で存在し得る。また、組成物は、定められた範囲のｐＨを有し得る。例えば、組成物は、約ｐＨ６〜８であってもよい。特に、組成物は、その相が制御された性質に関して、キャラクタライザーションすることができる。特に、組成物の水和物は、３５℃以上の温度で流動性注射用液体であってもよく、低温で固体又は半固体ゲルマトリックスであってもよい。
【０００７】
特定の実施形態において、本発明は、ゼラチンと高分子炭水化物とを含む水溶性化組成物であって、ゼラチンの平均分子量、高分子炭水化物の平均分子量、高分子炭水化物に対するゼラチンの重量比、及びゼラチンと高分子炭水化物との総濃度は、全て、組成物が３５℃以上の温度で流動性液体であるが、低温では固体又は半固体ゲルマトリックスであるようにする水溶性組成物に関し得る。例えば、一部の実施形態において、組成物は、約３４℃以下の温度で固体であってもよい。この特性により、組織に熱損傷を与えることなく、創傷治癒を支援する局所的状況を提供するため、固体又は半固体ゲルマトリックスへの組成物の変化を伴う、組成物を創傷の近位領域（例えば、創傷の周囲の真皮又は皮下組織の一部又は全て）に注射することができる温度に組成物を加熱することが可能になる。組成物は、特に、無菌水溶性組成物であってもよい。高分子炭水化物は、特に、グリコサミノグリカン又は合成炭水化物であってもよい。さらに、炭水化物は、特に、デキストラン又はその誘導体であってもよい。
【０００８】
組成物は、乾燥体で、特に、予め混合した状態で提供され得る。乾燥組成物は、様々な物理形態を取り得るか、実質的に均一な構造（例えば、乾燥スポンジ状構造）であってもよいか、又は直径数センチからマイクロメートル以下のサイズの粒子までのサイズ範囲の複数の粒子であってもよい。したがって、一部の実施形態において、乾燥組成物は、粉末とみなされ得る。
【０００９】
そのような乾燥又は凍結乾燥体は、使用前に再構成され得る。より詳細には、組成物が乾燥されてもよく、乾燥した組成物は、溶媒（例えば、滅菌水又は緩衝溶液）での再構成後、ゲルを形成し得る。したがって、本発明は、特に、本明細書に記載される分子量のゼラチンと、高分子炭水化物とを含む乾燥組成物を再構成することにより調製される水溶性注射用組成物を含んでもよい。好ましくは、ゼラチンは、組成物に存在するゼラチンと高分子炭水化物との組み合わせの総重量に対し、約６０重量％以上含まれてもよい。さらに、ゼラチンと高分子炭水化物との組み合わせは、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約４００ｍｇ／ｍＬの総濃度で、再構成された注射用組成物中に存在し得る。さらには、本発明は、平均分子量が約７５，０００Ｄａ〜約２５０，０００Ｄａであるゼラチンと、高分子炭水化物とを含む、乾燥形態の組成物に関し得る。好ましくは、そのような組成物において、ゼラチンは、組成物に存在するゼラチンと高分子炭水化物との組み合わせの総重量に対し、約６０重量％以上含まれてもよい。さらに、組成物は、溶媒（例えば、滅菌水又は緩衝溶液）中で再構成されてもよく、流動性注射用液体を形成する。さらなる実施形態において、本発明は、溶媒を用いた再構成の際、水和した組成物が３５℃以上の温度では、流動性注射用液体であるが、低温では固体又は半固体ゲルマトリックスであるような割合又は量でゼラチン及び高分子炭水化物を含む組成物に関し得る。
【００１０】
特定の実施形態において、本開示に係る組成物は、平均分子量が約７５，０００Ｄａ〜約２５０，０００Ｄａであるゼラチンと、平均分子量が約１０，０００Ｄａ〜約１，０００，０００Ｄａである高分子炭水化物とを含んでもよい。好ましくは、組成物の水和物は、３５℃以上の温度では流動性注射用液体であり、低温では固体又は半固体ゲルマトリックスである。詳細には、組成物の水和物は、約３５℃〜約３７℃にピークを示す示差走査熱量曲線を有し得る。さらには、ゼラチンは、組成物中のゼラチンと高分子炭水化物との組み合わせの総重量に対し、約６０重量％以上含まれてもよい。さらに、組成物の水和物中のゼラチンと高分子炭水化物との総濃度は、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約４００ｍｇ／ｍＬであってもよい。特定の実施形態において、流動性注射用液体は、３５℃〜３９℃の温度で、５Ｎのシリンジプランジャ圧で１６ｍｍ（５／８インチ）の長さの２５ゲージの針を通しシリンジから押し出された際、流量が約１０μＬ／ｓであってもよい。また、水和した流動性組成物は、さらなる物理特性に関しキャラクタライザーションされてもよい。例えば、流動性液体は、固体濃度が約０．５ｇ／ｍＬ以下であってもよく、３５℃〜３９℃の温度における粘度が約１．５Ｐａ−ｓ以下であってもよい。周囲条件において固体又は半固体ゲルマトリックスは、（直径１ｃｍ、厚さ１ｃｍのディスクを評価した際の）圧縮弾性率が、約１５ｋＰａ以上であってもよい。好ましくは、組成物は、フィブロネクチン結合活性が、約３ｎｍｏｌ／ｍｇ以上であってもよい。また、組成物は、哺乳類（例えば、ヒト）の真皮又は皮下組織における滞留時間に関してキャラクタライザーションされてもよく、一部の実施形態において、その時間は、約３日以上であってもよい。特定の実施形態において、本発明の固体又は半固体ゲルマトリックスは、ｉ）直径１ｃｍ、厚さ１ｃｍのディスクの形態である時、周囲条件における圧縮弾性率が、約３４ｋＰａ超であること、及びｉｉ）直径８ｍｍ、高さ１．５ｍｍのディスクの形態である時、３４℃におけるリン酸緩衝生理食塩水への完全溶解時間が少なくとも約４５分であることのうち、一方又は両方を示す。
【００１１】
組成物は、様々な別の成分を含んでもよい。例えば、組成物は、界面活性剤、吸湿賦形剤、緩衝溶液、及び増量剤のうち１つ以上を含んでもよい。そのような添加剤は、元の調製された組成物に含まれてもよく、再構成間、凍結乾燥組成物に添加され得る。組成物は、さらに１種以上のアミノ酸及び１種以上の塩を含んでもよい。
【００１２】
別の態様において、本開示は、さらに、創傷処置、並びに瘢痕の予防及び最小化のための組成物、特に、ゼラチンと高分子炭水化物とを含む組成物の製造方法を提供する。一部の実施形態において、そのような製造方法は、ゼラチンと、高分子炭水化物と、ゼラチン及び高分子炭水化物が徐々に溶解可能であり、水和マトリックス組成物を形成するよう混合される溶媒とを、組み合わせることを含んでもよい。ゼラチンは、平均分子量が約７５，０００Ｄａ〜約２５０，０００Ｄａであってもよく、高分子炭水化物は、平均分子量が約１０，０００Ｄａ〜約１，０００，０００Ｄａであってもよい。さらに、ゼラチンは、組成物に存在するゼラチンと高分子炭水化物との組み合わせの総重量に対し、約６０重量％〜約９５重量％含まれてもよく、組成物の水和物中のゼラチンと高分子炭水化物の総濃度は、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約４００ｍｇ／ｍＬであってもよい。
【００１３】
方法は、ゼラチン及び高分子のうち一方又は両方の平均分子量を増やすため、ｉ）組み合わせ工程の前にゼラチン及び高分子炭水化物のうち一方又は両方、又はｉｉ）組み合わせ工程で形成される水和マトリックス組成物のうちいずれかから溶媒への可溶性の低い分画を除去することをさらに含んでもよい。したがって、この工程は、ゼラチン及び高分子炭水化物のうち一方又は両方のうち溶解性の低い分画に対し、組成物を濃縮することとなるであろう。言い換えると、最も可溶な分画は、混合の間、溶解性のより低い組成物の分画を濃縮するよう除去され得る。そのような除去は、例えば、徐々に溶解する間、液相のデンカント又は除去により行われ得る。より詳細には、除去は、濾過を介し得る。他の実施形態において、除去は、混合物を部分的に不溶化し、液体分画を除去することにより行われ得る。そのような不溶化は、有機溶媒の添加により行われ得るか、又はイオン強度の強い溶液に高分子成分を晒すことにより行われ得る。別の実施形態において、濃縮後、得られた組成物は、濃縮前の組成物よりも、ゼラチンの平均分子量が大きくなり得る。同様に、濃縮後得られた組成物は、濃縮前の組成物よりも高分子炭水化物の平均分子量が大きくなり得る。組成物は、凍結乾燥などにより、乾燥されてもよく、その結果、組成物は、乾燥体、特に、再構成可能な塊、又は粉末などとなる。例えば、組成物は、液体含有量が約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、約０．５％以下になるよう乾燥され得る。
【００１４】
別の態様において、本発明は、また、処置の方法（又は、様々な組成物の使用）に関し得る。一部の実施形態において、本発明は、瘢痕の予防、最小化、又は処置の方法に関し得る。そのような方法は、本明細書に記載の、創傷、再手術による肥厚性瘢痕又はケロイド、現存する瘢痕又はケロイドの近位にある真皮又は皮下組織内の流動する温度まで加熱される水溶性組成物を注射することを含んでもよい。特にそのような注射は、瘢痕の修正手術の間、又は現存する瘢痕、慢性的創傷、もしくは外傷性創傷の処置の間など、手術後に行われ得る。別の実施形態において、本発明は、現存する瘢痕又はケロイドの外観を改善する方法に関し得る。そのような方法は、肥厚性瘢痕又はケロイドの少なくとも一部を切除すること、及び肥厚性瘢痕／ケロイド又は切除部位の近位にある真皮又は皮下組織に本明細書に記載の流動性組成物を注射することを含んでもよい。他の実施形態において、本発明は、外科的創傷の処置方法に関し得る。そのような方法は、外科的創傷の近位にある真皮又は皮下組織に本明細書に記載の流動性組成物を注射することを含んでもよい。また別の実施形態において、本発明は、手術で生じた創傷から生じる瘢痕化を抑制又は減少させる方法に関し得る。そのような方法は、手術的創傷の近位にある真皮又は皮下組織に本明細書に記載の流動性組成物を注射することを含んでもよい。
【００１５】
本開示に係る特定の実施形態において、皮膚創傷から生じる皮膚の瘢痕化又はその影響を抑制又は減少させる方法は、皮膚創傷にマトリックス組成物を塗布することを含んでもよい。特に、マトリックス組成物は、平均分子量が約７５，０００Ｄａ〜約２５０，０００Ｄａのゼラチン、及び平均分子量が約１０，０００Ｄａ〜約１，０００，０００Ｄａの高分子炭水化物を含んでもよい。さらに、マトリックス組成物の水和物は、３５℃以上の温度で流動性注射用液体であり、低温で固体又は半固体ゲルマトリックスであってもよい。方法は、縫合糸、ステープル、接着剤、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される閉塞部材を用いて創傷を閉塞することをさらに含んでもよい。塗布ステップは、流動性注射用液体組成物を皮膚創傷の近位の真皮又は皮下組織に注射することを含んでもよい。さらに、注射は、流動性注射用液体組成物を比較的微小な針（例えば、１８ゲージ〜２７ゲージの大きさ、又は２３ゲージ〜２５ゲージの大きさ）を通し、注射することを含んでもよい。特定の実施形態において、塗布ステップは、２．５ｃｍの創縁に対し、約０．１ｍＬ〜約１０ｍＬのマトリックス組成物を伝達することを含んでもよい。
【００１６】
別の実施形態においては、皮膚創傷は、外科創傷であってもよい。例えば、外科創傷は、予め存在する瘢痕の少なくとも一部を切除した後に残る創傷であってもよい。したがって、方法は、予め存在する瘢痕の少なくとも一部を切除するステップを含んでもよい。特に、切除した瘢痕は、ケロイド瘢痕、肥厚性瘢痕、又は熱傷に関連する瘢痕であってもよい。したがって、皮膚創傷は、熱傷であってもよい。さらには、塗布ステップは、マトリックス組成物の局所的塗布を含んでもよい。
【００１７】
一部の実施形態において、マトリックス組成物は、凍結乾燥体であってもよい。したがって、組成物を塗布する前に、方法は、凍結乾燥マトリックス組成物を再構成することを含んでもよい。特に、再構成は、マトリックス組成物を、例えば、ポリオール、ポリオール、ポリソルベート、生理食塩、単糖、糖アルコール及びこれらの組み合わせからなる群より選択される添加剤と組み合わせることを含んでもよい。
【００１８】
特定の実施形態において、本開示は、皮膚ケロイド又は肥厚性瘢痕の修正手術のための方法を提供する。そのような方法は、切除部位を形成するため、ケロイド又は肥厚性瘢痕組織の少なくとも一部を切除すること、及び切除部位又はその周囲の真皮又は皮下組織に、本明細書に記載のマトリックス組成物を塗布することを含んでもよい。方法は、例えば、縫合糸、ステープル、接着剤、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される閉塞部材で、切除部位を閉塞することをさらに含んでもよい。他の実施形態において、塗布ステップは、切除部位の周囲の真皮又は皮下組織に流動性液体マトリックス組成物を注射することを含んでもよい。
【００１９】
他の実施形態において、本開示は、特に、皮膚ケロイド又は肥厚性瘢痕の外部体積を低減するための方法を提供する。そのような方法は、切除部位を形成するため、ケロイド又は肥厚性瘢痕組織の少なくとも一部を切除すること、及び切除部位又はその周囲の真皮又は皮下組織に、本明細書に記載のマトリックス組成物を塗布することを含んでもよい。開示される組成物（本明細書に詳細に述べられるような）に起因して、前述の切除及び切除したケロイド又は肥厚性瘢痕の外部体積に対するマトリックス組成物の塗布後１２ヶ月経った瘢痕組織の外部体積は、定量化されてもよく、例えば、約１５％以下であってもよい。
【００２０】
他の実施形態において、本開示は、平均分子量が約７５，０００Ｄａ〜約２５０，０００Ｄａであるゼラチンと、平均分子量が約１０，０００Ｄａ〜約１，０００，０００Ｄａである高分子炭水化物とを含む組成物であって、ゼラチンは、組成物中に存在するゼラチンと高分子炭水化物との組み合わせの総重量に対し、約６０重量％以上含まれ、組成物の水和物は、３５℃以上の温度では流動性注射用液体であり、低温では固体又は半固体ゲルマトリックスであり、皮膚創傷に組成物を塗布することにより。皮膚創傷に起因する皮膚瘢痕化又はその影響の抑制又は減少に使用される組成物を提供し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本開示に係る例示的な組成物の示差走査熱量曲線を示すグラフである。
【図２】本開示の例示的な実施形態に係る組成物の物理特性を示すグラフである。
【図３】組成物のゼラチン濃度に対する、本開示の別の実施形態に係る組成物の物理特性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
ここで、本発明を、その例示的な実施形態を参照して以下、より十分に記載する。これらの例示的な実施形態は、本開示が十分で完全なものになり、当業者に本発明の範囲が完全に伝わるよう記載される。実際、本発明は、多くの異なる形態で実施することができ、本明細書に示される実施形態に限定されるとみなされるべきではなく、むしろ、それら実施形態は、本開示が適用可能な法的要求事項を満たすよう提供される。本明細書に、及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、文脈により特段に指示のない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、複数のものも含む。
【００２３】
本開示は、創傷、特に、皮膚（すなわち、真皮）の創傷の処置への使用に有利な組成物に関する。ヒトの平均深部体温は、３７℃（±０．５℃）であるが、皮膚の温度は著しく低下することもあり、通常は３３℃（±１℃）の範囲である。本開示は、様々な形態で提供することができ、特に、皮膚創傷の処置に有用となり得るゼラチンと高分子炭水化物とで形成される組成物を記載する。より詳細には、ゼラチン及び高分子炭水化物は、ゼラチンと炭水化物との相互作用が、ほぼ平均的な皮膚温度以下の温度では固体又は半固体ゲルマトリックスを形成するよう組み合わせることができる。より詳細には以下に述べるように、組成物は、３５℃未満の温度では固体又は半固体物質であってもよい。
【００２４】
真皮又は皮下組織において、組成物は、創傷治癒及び創傷化膿過程の間、その物理的な存在、並びにゼラチン及び高分子炭水化物の潜在的相互作用により、実質的に、固体又は半固体ゲルマトリックスの形態である。本開示の組成物は、挿入したマトリックス組成物の周囲の組織により生分解及び／又は生理的に再吸収される。したがって、固体又は半固体マトリックス組成物は、組成物が創傷治癒を向上させるまでの定められた滞留時間を有し、ゆっくりと分解される。組成物は、また、組成物を長期間保存する点で特に有用な乾燥体（例えば、粉末）で提供され得る。そのような粉末組成物は、様々な生理学的に許容可能な溶媒及び添加剤を用いて、再構成可能であってもよい。
【００２５】
本発明は、特定の機構に制限されず、ゼラチンと高分子炭水化物との組み合わせは、創傷の自然治癒環境（例えば、コラーゲン及びグリコサミノグリカンの存在下）と似た環境を提供すると思料される。そのような環境は、肥厚性瘢痕形成及びケロイド形成を含む、肥厚性創傷治癒を低減又は制限し得る。
【００２６】
本開示の組成物は、真皮の平均温度よりわずかに高い温度では流動性（及び注射用）液体であるといった利点を提供するため、近接する組織に熱損傷を与えることなく、注射され得る。しかし、組成物は、ほぼ真皮の平均温度で固体又は半固体ゲルマトリックスに遷移するといった利点をさらに提供するため、創傷治癒過程間の有用な効果を有する真皮損傷の近辺に著しい持続性を表し得る。好ましくは、組成物は、分解可能であるが、実際の創傷治癒期間、例えば、約２週間、持続することができ、コラーゲン成熟及び創傷リモデリングに有益な期間、維持され得る。組成物は、ケロイド瘢痕、肥厚性瘢痕、熱傷に関連する瘢痕の処置、又は特に、瘢痕形成を生じやすい患者における手術創傷の予防処置に有用であり得る。そのようなカテゴリーに分類される患者は、例えば肥厚性瘢痕化、又はケロイド形成などの瘢痕形成の既往歴に基づき特定され得る。さらに、患者は、ケロイド形成（すなわち、濃色素沈着した皮膚）のリスクが高いと当分野において判断される群にキャラクタライザーションされることに基づき、判断され得る。例えば、色素沈着が発生しにくいヒトと比較し、色素沈着が発生しやすいヒトにおけるケロイド発生の頻度は、１５倍である。より詳細には、アフリカ系の人は、ケロイド発生のリスクが増大すると認識される。
【００２７】
本開示の組成物は、特に、その特定の特性に関してキャラクタライザーションされてもよい。例えば、ゼラチンを産生する間、結果として生じるゼラチンのフィブロネクチン及び高分子炭水化物結合特性をも分解し得るコラーゲンの分解に、様々な化学プロセスが使用される。所望の特性を有するため、組成物は、未変化のフィブロネクチン結合活性を有するゼラチンを含むことが好ましい。この目的のため、所定の分子量のゼラチンを使用することが優先され得る。特に、ゼラチンは、平均分子量が、約７５，０００以上、約８０，０００Ｄａ以上、約１００，０００Ｄａ以上、又は約１１０，０００Ｄａ以上であってもよい。特定の実施形態において、ゼラチンは、平均分子量が、約７５，０００Ｄａ〜約２５０，０００Ｄａ、約９０，０００Ｄａ〜約２２５，０００Ｄａ、約１００，０００Ｄａ〜約２００，０００Ｄａ、又は約１２０，０００Ｄａ〜約１８０，０００Ｄａであってもよい。特定の実施形態において、分子量が約１４０，０００Ｄａ〜約１６０，０００Ｄａのゼラチンが特に有用であり得る。
【００２８】
分子量は、重量平均分子量（Ｍｗ）又は数平均分子量（Ｍｎ）と表現され得る。両表現は、分子の平均数（ｎｉ）と、各分子のモル重量（Ｍｉ）とを有するものとして、溶液を含有する高分子溶質の特徴付けに基づく。したがって、数平均分子量は、以下の式１
【数１】
2014532713.tif 000003
により定義される。重量平均分子量（平均分子量としても既知である。）は、光散乱法を使用して直接測定可能であり、以下の式２
【数２】
2014532713.tif 000004
により定義される。
分子量は、Ｚ−平均分子量（Ｍｚ）とも表現することができ、その算出は、モル重量の大きな分子をかなり重視する。Ｚ−平均分子量は、以下の式３
【数３】
2014532713.tif 000005
により定義される。特に断りのない限り、本明細書において、分子量は、重量平均分子得ようとして表現される。
【００２９】
本発明に記載されるように使用されるゼラチンは、動物の皮、結合組織、又は骨由来の少なくとも部分的に加水分解するコラーゲンにより得られるものような、様々な有用な源に由来し得る。あるいは、ゼラチンは、細胞培養由来などのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける合成由来であってもよいか、ヒト由来であってもよいか、又は合成物であってもよい。Ａタイプゼラチン（すなわち、酸処理された前駆体由来）又はＢタイプゼラチン（すなわち、アルカリ処理された前駆体由来）を使用し得る。さらに、ゼラチンは、化学的加水分解及び／又は熱的加水分解により、コラーゲンを変性させることで生じ得る。
【００３０】
組成物の高分子炭水化物は、グリコサミノグリカンなどの天然の炭水化物であってもよいか、又は合成炭水化物であってもよい。所望の温度で、ゼラチンと固体又は半固体ゲルマトリックスを形成する所望の特性を付与するため、分子量が、約１０，０００〜１，０００，０００Ｄａの炭水化物（例えば、デキストラン）が好ましい。その範囲を超える分子量の炭水化物は、より良い物理特性及び安定性を提供し得る。
【００３１】
高分子炭水化物は、グリコサミノグリカン又はムコ多糖などの様々な多糖類及び合成炭水化物を包含し得る。使用される得る高分子炭水化物の特定の非限定の例としては、アガロース、アルギン酸、アミロペクチン、アミロース、カラゲナン、セルロース、キチン、キトサン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、グリコーゲン、ヘパラン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、ケラタン硫酸、及びデンプンを含む。
【００３２】
ゼラチン及び高分子炭水化物の化学量論量は、好ましくは、生理学的ｐＨにおいて、２つの高分子成分の相補的なイオン電荷により、所望の範囲で定式化され得る。所望の物理的及び潜在生物学的特性が、高分子成分（ゼラチンに加え高分子炭水化物）に由来するため、実施例に記載されるような適切な特性を提供するための好ましい化学量論量範囲は、ゼラチンを含む高分子重量が最小でも６０％であることである。したがって、ゼラチン成分は、ゼラチンと高分子炭水化物との組み合わせに対し、約６０重量％以上含まれてもよい。別の実施形態において、ゼラチン成分は、ゼラチンと高分子炭水化物との組み合わせに対し、約６２重量％以上、約６５重量％以上、約６７重量％以上、又は約７０重量％以上含まれてもよい。別の実施形態において、ゼラチンは、組成物全体におけるゼラチンと高分子炭水化物との組み合わせに対し、約６０重量％〜約９５重量％、約６５重量％〜約９０重量％、又は約７０重量％〜約８５重量％含まれてもよい。
【００３３】
既に前述したように、水溶性成分を含む本組成物を形成する物質の組み合わせ全体は、相変化温度範囲が比較的狭い物質を形成するために提供され得る。特に、組成物の高分子物質と添加成分との相互作用により、ほぼ皮膚の平均温度又はそれ未満の温度では固体又は半固体であり、皮膚の平均温度よりわずかに高い温度まで加熱することにより、流動性液体組成物に遷移可能である相を制御可能なハイドロゲルマトリックスを形成し得る。言い換えると、本開示の組成物は、非常に狭い相制御を提供し得る。特に、本組成物は、非常に狭く、特定の遷移温度範囲を有するよう調整されてもよく、例えば、わずかに約０．５℃〜約３℃、約０．８℃〜約２．５℃、又は約１℃〜約２℃などの相違が、固体又は半固体から流動性液体への（又はその逆）相遷移を生じさせるために効果的であってもよい。特定の実施形態において、本開示の水和組成物は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により決定されるように、３５℃以上の温度で流動性液体であってもよい。より詳細には、本開示の組成物は、３５℃以上、約３６℃（±０．５℃）以上、又は約３７℃（±０．５℃）以上の温度で流動性液体であってもよい。他の実施形態において、本開示の組成物は、３５℃未満の温度で固体又は半固体ゲルマトリックスであってもよい。
【００３４】
ゼラチンと高分子炭水化物との総ポリマー濃度は、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約４００ｍｇ／ｍＬ、約７５ｍｇ／ｍＬ〜約３５０ｍｇ／ｍＬ、又は約１００ｍｇ／ｍＬ〜約３００ｍｇ／ｍＬの範囲であってもよい。組成物は、生理的ｐＨ付近まで滴定されてもよく、２つの高分子成分のイオン相互作用によりゲルを形成することが可能になる。緩衝剤約６〜約８の範囲の適切なｐＨを助長するために有用であり得る。生理食塩及びアミノ酸などの他の成分が、組成物に組み込まれてもよく、創傷治癒に関与する細胞に支援環境を提供する。使用され得る例示的なアミノ酸としては、グルタミン酸、アルギニン、リシン、システイン、及びアラニル−グルタミンを含む。アミノ酸のＬ−異性体などの特定の異性体が使用されてもよい。例示的で有用な塩類としては、エデト酸２ナトリウム、並びに亜鉛塩（例えば、硫酸亜鉛）、カルシウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、及びカリウム塩などの金属塩を含む。
【００３５】
本開示の組成物は、ヒト真皮の平均温度よりもわずかに高い温度（すなわち、３５℃以上）まで加熱した際に、組成物は、固体又は半固体物質の状態から、流動性液体に移行する点で特に有用である。好ましくは、流動性液体組成物は、真皮創傷の周囲部分など真皮及び皮下組織に組成物を注射することを可能にする適切な生理的特徴を表す。特定の実施形態において、生理学的特徴は、流動性液体組成物が比較的微小なゲージの針を通して注射することに適しているようなものである。例えば、流動性液体組成物は、公称内径が約０．２ｍｍ以上、約０．２５ｍｍ以上、又は約０．３ｍｍ以上の針などを通して注射することに適し得る。流動性液体組成物は、さらに、公称内径が約０．２ｍｍ〜約０．４ｍｍ、又は約０．２５ｍｍ〜約０．３５ｍｍの針などを通して注射することに適し得る。有用な針ゲージの例としては、１８ゲージ〜２７ゲージの針、２３ゲージ〜２７ゲージの針、又は２３ゲージ〜２５ゲージの針を含む。真皮組織と表現されるものなどの比較的微小な標的に組成物を注射するため、比較的微小なゲージの針が必要となり、非常に粘性の低い注射用組成物が必要である。注射用組成物は、コロイド又は不溶粒子を、注射用針の公称内径よりも小さなものに限定しなければならない。したがって、コロイド又は不溶粒子において、注射用針の公称内径に対し、約１／５以下、約１／６以下、又は約１／８以下の平均径を有することは有益である。より詳細には、コロイド又は不溶粒子は、注射用針の公称内径に対し、約１／５の平均径を有し得る。そのような大きさにすることにより、針が目詰まりすることなく、組成物を注射することができる。
【００３６】
同様に、固体の総含有量は、本組成物の流動能及び注射能に逆の影響を与え得る。好ましくは、流動性液体である場合、組成物は、固体の総含有量が特定の閾値以下であり、特に、微小なゲージの針を通り注射するため適切な粘性を有することが望ましい。例えば、固体の総含有量は、約０．５ｇ／ｍＬ以下、約０．４ｇ／ｍＬ以下、約０．３ｇ／ｍＬ以下、約０．２ｇ／ｍＬ以下、又は約０．１ｇ／ｍＬ以下であることが有益であってもよい。別の実施形態において、流動性注射用組成物の固体の総含有量は、約０．０１ｇ／ｍＬ〜約０．５ｇ／ｍＬ、約０．０２５ｇ／ｍＬ〜約０．４５ｇ／ｍＬ、約０．０５ｇ／ｍＬ〜約０．４ｇ／ｍＬ、約０．１ｇ／ｍＬ〜約０．３ｇ／ｍＬであってもよい。
【００３７】
上述に対しまたさらに、本開示に係る流動性液体組成物は、例えば、微小ゲージの針を通る、物質の注射能と関連性を有し得る。より詳細には、非常に粘性が高いと、手動式シリンジを差し組成物を注射する能力が制限され得る。好ましくは、流動性液体である場合、組成物が、約２Ｐａ−ｓ以下、約１．５Ｐａ−ｓ以下、約１．２５Ｐａ−ｓ以下、約１．１Ｐａ−ｓ以下、約１Ｐａ−ｓ以下、約０．７５Ｐａ−ｓ以下、約０．５Ｐａ−ｓ以下、又は約０．２５Ｐａ−ｓ以下の粘性を有することが望まれ得る。別の実施形態において、流動性液体組成物は、約０．０１Ｐａ−ｓ〜約２Ｐａ−ｓ、約０．０２５Ｐａ−ｓ〜約１．７５Ｐａ−ｓ、約０．０５Ｐａ−ｓ〜約１．５Ｐａ−ｓ、約０．１Ｐａ−ｓ〜約１．２５Ｐａ−ｓ、又は約０．２Ｐａ−ｓ〜約１．１Ｐａ−ｓの粘性を有し得る。粘性を評価する方法の１つは、以下の実施例４に記載され、粘度は、約３９℃の試験温度範囲を基準とし得る。
【００３８】
水和液体組成物の流動性は、針を通る組成物の圧力及び流量に関しキャラクタライザーションされてもよい。例えば、流量は、Ｎｏｒｄｓｏｎ／ＥＦＤから入手可能なものなど、既知の流体分注システムを使用して評価され得る。特定の試験において、１ｍＬの試験流体を１ｍＬシリンジに入れ、１６ｍｍ（５／８インチ）の長さの２５ゲージの針（０．２６ｍｍ公称内径）を通し、流体をシリンジの外へ押し出すため、５ニュートン（Ｎ）のシリンジプランジャ圧を印加し得る。そのような試験は、ＩＳＯ  ７８８６−１を準拠するが、他の試験条件も使用され得る。上記試験条件を使用する場合、本開示の液体水和組成物は、約５μＬ／ｓ以上、約１０μＬ／ｓ以上、約１５μＬ／ｓ以上、約２５μＬ／ｓ以上、約７５μＬ／ｓ以上、約１００μＬ／ｓ以上、又は約２００μＬ／ｓ以上の平均流量を有し得る。特に、平均流量は、約１０μＬ／ｓ〜約４００μＬ／ｓ、約１２μＬ／ｓ〜約３５０μＬ／ｓ、又は約１５μＬ／ｓ〜約３００μＬ／ｓであってもよい。同様に、上記値は、任意のゲージの針、又は本明細書に記載のものを通る流動能に適用され得る。さらに、流動能のそのような値は、約３９℃の試験温度範囲を基準とし得る。
【００３９】
固体又は半固体状態である場合、本開示の組成物は、物質の圧縮強度によりキャラクタライザーションされてもよい。機械強度を評価する機械試験は、特に、以下の実施例６に記載され、そのような試験は、産業上利用可能な物質及び方法を使用して実行され得る。特定の実施形態において、本開示に係る固体又は半固体組成物は、周囲条件下において、約１５ｋＰａ以上、約２０ｋＰａ以上、又は約２５ｋＰａ以上の圧縮弾性率を示し得る。他の実施形態において、圧縮弾性率は、周囲条件下において、約１５ｋＰａ〜約５０ｋＰａ、約２０ｋＰａ〜約４５ｋＰａ、又は約２０ｋＰａ〜約４０ｋＰａであってもよい。別の特定の実施形態において、圧縮弾性率は、周囲条件下において、少なくとも約３４ｋＰａ、少なくとも約３５ｋＰａ、又は少なくとも約３６ｋＰａとしてキャラクタライザーションされてもよい。一部の実施形態において本発明に係る製造方法は、特定の創傷処置においてそのような物質の性能を向上させ得る比較的高レベルな圧縮弾性率を有する本発明の組成物を生産することができる。圧縮弾性率を評価する方法の１つは、実施例６にて述べる。
【００４０】
固体又は半固体状態である場合、本開示の組成物は、物質の溶解特性によっても特徴付けられてもよい。本発明の物質の溶解を評価する試験は、特に以下の実施例６に記載され、そのような試験は、産業上利用可能な物質及び方法を用いて実行され得る。特定の実施形態において、ディスク（直径８ｍｍ、高さ１．５ｍｍの大きさ）として形成される本発明の組成物は、３４℃のリン酸緩衝生理食塩水における目視検査によれば、約４５分超、約４６分超、約４７分超、又は約４８分超で完全な溶解を示し得る。一般的に、溶解へのより良い耐性は、創傷部位に挿入した際の滞留時間を向上させることと相互に関連し、本発明の組成物創傷治癒機能を強化し得る。
【００４１】
本開示の組成物は、その特定の成分に備えられる活性に関して特に有益であってもよい。上述のように、コラーゲンの変性過程（例えば、化学的処理）は、結果として生じたゼラチンのフィブロネクチンと高分子炭水化物との結合特性を劣化させ得る。これは、１つとしてはコラーゲンのα鎖の分解に関し得る。しかし、本開示の組成物は、１つとしては、高分子量のコラーゲンα鎖を保護するため、特に変性コラーゲンを含む他の組成物と比較して、高フィブロネクチン結合活性（ＦＢＡ）を示し得る。特定の実施形態において、本開示に係る組成物は、約３ｎｍｏｌ／ｍｇ以上、約４ｎｍｏｌ／ｍｇ以上、又は約５ｎｍｏｌ／ｍｇ以上のＦＢＡを示し得る。そのような活性は、組成物中のゼラチン濃度を正規化されるゼラチンのフィブロネクチン結合部位の濃度として計測され得る。フィブロネクチン結合活性を計測する方法の１つは、実施例５に記載される。
【００４２】
以下にさらに述べるように、特に、本開示の組成物は、哺乳類、特にヒトの真皮又は皮下組織の処置に使用され得る。一般的に、新たに治癒する又は治癒した創傷の領域など、真皮又は皮下組織の領域に注射され得る。そのため、組成物は、真皮又は皮下組織内での未変化な組成物の滞留時間に関して特徴付けられてもよい。組成物のそのような滞留時間は、組成物の生分解時間、すなわち配置から組成物の物質が周囲組織及び生理的過程により分解又は生体吸収されるまでの時間量とも称し得る。特定の実施形態において、ヒトなどの哺乳類の真皮又は皮下組織における本開示に係る組成物の滞留時間は、約３日以上、約４日以上、約５日以上、約６日以上、又は約７日以上であってもよい。他の実施形態において、滞留時間は、約３日〜約６０日、約４日〜約４５日、約５日〜約４０日、又は約６日〜約３５日であってもよい。
【００４３】
本開示の組成物の調製において、高分子繊維成分は、十分な水（又は他の溶媒）と共に混合されてもよく、ポリマーの相互作用を可能にする。ポリマーは、乾燥撹拌槽に添加され、その後、共に水和され得るか、又は各ポリマーの分離溶液を調整し、その後、共に混合される。緩衝剤又は滴定剤を添加し、ｐＨ及びイオン強度を調整し得る。その後、成分の組み合わせを（例えば、本明細書にて述べた液体遷移温度超の温度まで）加熱して混合し、均一な組成物を形成する。処理の間、特定の方法を利用して、所望の特性をさらに強化するよう組成物を調整し得る。
【００４４】
結果として得られたゲルマトリックスの安定性を促進するため、ｉｎ−ｓｉｔｕにおける最終組成物の安定性に寄与するポリマーの部分を濃縮することが望まれ得る。方法は、組成物の生産において使用されてもよく、所望の特性を有する各ポリマーの部分を濃縮するため、各ポリマー又は混合ポリマーの最も可溶な部分を除去する。所望のポリマーを濃縮する方法の１つは、加熱しつつポリマーを共に徐々に溶解させ、最も可溶な液体をデカント又は除去し、残りのポリマー混合物を濃縮することである。組成物を濃縮する別の方法は、水／アルコールに晒すことによるなど、部分的に溶解した状態、又はＮａＣｌ溶液を用いるなどイオン強度が高い状態にしつつ、各ポリマー又はポリマーの混合物を洗浄することである。そのようなゲル洗浄技術により、組成物の物理特性が強化し、処置部位での持続性が向上した溶解性の低い成分を保つ組成物となり得る。特に、所望のｐＨ範囲でポリマーを混合させながら、組成物を濃縮し、ポリマーと分画間にイオン相互作用を起こさせ、ポリマー組成物のより可溶な部分を除去することは有益である。
【００４５】
当業者にとって既知のバルク分取法（Ｂｕｌｋ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ）は、上述のように、ポリマーを濃縮するために使用され得る。例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー又はゲル浸透クロマトグラフィー）又はＢａｋｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ分取法。本発明の組成物の調製に有用となり得る別の分取法は、Ｆｒａｎｃｕｓｋｉｅｗｉｃｚ，  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  １９９４年で見ることができ、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。そのような分取された組成物は、固体又は半固体状態の場合に、より良い安定性と向上した物理特性を有することが期待される。
【００４６】
本開示の組成物は、その使用を容易にするか又は処置が必要な部位へのその有益な効果を強化するかいずれかのため、他の活性剤をも含んでもよい。そのような活性剤は、止血剤（コラーゲン又はトロンビンを含む）、抗菌剤（構成物質を含む）、殺菌又は静菌剤、成長因子（上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来成長因子、又はインスリン様成長因子を含む）、又は抗炎症剤（コルチコステロイド又は非ステロイド抗炎症剤など）を含んでもよい。
【００４７】
出荷を容易にし、周囲環境下で保存するため、組成物は、乾燥状態に凍結乾燥され、使用前に再構成又は再水和され得る。凍結乾燥された組成物は、安定性が向上し、使用前に室温での保存を可能にする。本発明にて使用され得る例示的な凍結乾燥方法は、米国特許第５，１９２，７４３号、米国特許第７，６６６，４１３号、米国特許７，６９５，７３６、及び米国特許出願公開第２００８／０１４５４０４号に開示される。前述の文書全ての開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。組成物の独特の使用により、凍結乾燥する製剤は、生成物の迅速な再構成を可能にするため、調整され得る。例えば、再構成は、実質的に、約３０秒〜約９０分以内に完了し得る。特定の実施形態において、実質的に再構成が完了する時間は、約９０分以下、約６０分以下、又は約４５分以下であってもよい。特に、再構成の時間は、約１５分〜約９０分又は約３０分〜約６０分の範囲であってもよい。再構成の間、加熱を適用し得るか、又は再構成に使用する液体を特定の温度まで予め加熱し得るか、もしくはその両方であってもよい。例えば、３５℃以上の温度に加熱することが有益であってもよい。好ましくは、再構成は、水溶液を凍結乾燥組成物に添加すること、組成物を含有する容器を開放する必要がある混合法及び医療関係者の使用を複雑にする無菌操作を使用することなく混合することを含む。再構成を容易にする手段は、希薄濃度の組成物の製剤を含んでもよく、低密度及びより多孔質な乾燥物質となる。乾燥物質は、続いて、凍結乾燥をする組成物を調整するために必要とするよりも少ない液体で再水和され得る。
【００４８】
本開示に係る組成物は、特に、凍結乾燥した物質の再構成に有益な成分をさらに含んでもよい。例えば、界面活性剤は、再構成に必要な水の浸透を制限し得る、凍結乾燥された組成物内の疎水性相互作用を最小化するために利用され得る。適切な界面活性剤の非限定の例としては、陰イオン界面活性剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸塩、及びラウリル硫酸ナトリウムを含むアルキル硫酸）、陽イオン界面活性剤（例えば、セラミド）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオールエステル、ポリオキシエチレンエステル、及びポリソルベート２０及びポリソルベート８０を含むポリソルベート）、及び両性イオン性又は双性イオン性界面活性剤を含む。別の例としては、ポリエチレングリコール、ポリオール（例えば、グリセリン）、ポリソルベート、シクロデキストリン、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、及び塩化亜鉛などの吸湿賦形剤も使用され得る。そのような物質を最初に（すなわち、凍結乾燥前に）調整したヒドロゲルに添加することができ、又は再構成の間添加することができる。
【００４９】
上述のように、緩衝溶液をヒドロゲルマトリックス組成物の調製に利用することができ、適切な緩衝剤を、最初の組成物の製剤中及び／又は凍結乾燥組成物の再構成中に添加することができる。使用することができる例示的な緩衝剤としては、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、クエン酸、グリシン、及び４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸を含む。さらに、防腐剤を添加することができ、脱水又は凍結乾燥間の組成物の保存に有用であり得る。同様に、様々な増量剤を、最初のヒドロゲルマトリックス組成物の調製に利用し得る、及び／又は凍結乾燥組成物の再構成間に添加することができる。理論に束縛されることを望むものではないが、そのような増量剤の添加により、再構成に使用される水又は他の溶媒の浸透をより容易にし得る、凍結乾燥した生成物へと助成すると考えられる。使用することができる例示的な増量剤としては、単糖類及び二糖類（例えば、デキストロース、スクロース、又はトレハロース）、並びにマンニトールなどの糖アルコールを含む。
【００５０】
一部の実施形態において、特定の界面活性剤、吸湿賦形剤、緩衝剤、及び増量剤（又はこれらの組み合わせ）は、凍結乾燥状態を向上させる、凍結乾燥後の浸透を容易にする、及び／又は再構成された物質の特性を向上させる点で有用であり得る。再構成のための好ましい添加剤は、昇温で流動性注射用液体であり、特に、狭い範囲に制御された相変化温度を超える、皮膚（すなわち、真皮及び／又は皮下）の温度で、固体又は半固体ヒドロゲルマトリックスを形成する組成物の性能に影響しないものであってもよい。例えば、ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０）、塩類（例えば、塩化ナトリウムなどの生理食塩）、糖類（例えば、デキストロースなどの単糖）は、上述のような再構成された物質の様々な特性に、特定の向上を提供することができる。
【００５１】
また、本開示は、処置の様々な方法も提供し、それにより、組成物は、創傷の治癒過程を改善するために手術の切開及び切除部位を含む皮膚の創傷に塗布されてもよく、そのため、肥厚性瘢痕化及びケロイド形成を含む瘢痕化の発生を予防又は低減する。本開示の組成物の塗布は、処置部位の性質に応じて変化し、注射同様、創傷の近位（すなわち、創傷の片側に沿って、もしくは部分的又は完全に創傷の周囲）にある真皮又は皮下組織へなど、局所的塗布を含んでもよい。注射を使用する際、特に組成物は、既に上述のように、微小なゲージの針（例えば、２３ゲージ、２５ゲージ、又は２７ゲージ）を通す注射に適し得る。組成物の塗布に加えて、方法は、縫合糸、ステープル、接着剤、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される閉塞部材を使用することなどにより、創傷を閉塞することをも含んでもよい。
【００５２】
一部の実施形態において、方法は、皮膚の切断又は熱傷など事故的な創傷又は慢性的な創傷への塗布を包含し得る。他の実施形態において、方法は、手術の切開など手術で生じた創傷への塗布を包含し得る。特に、手術の創傷は、予め存在する瘢痕（例えば、肥厚性瘢痕、ケロイド瘢痕、又は熱傷に関連する瘢痕）の切除後に残る創傷であってもよい。
【００５３】
特定の実施形態において、本開示の方法は、皮膚のケロイド又は肥厚性瘢痕（もしくは、熱傷に関連する瘢痕を含む、他の種類の瘢痕）の修正のための方法を含んでもよい。肥厚性瘢痕は、コラーゲンの過産生に由来する盛り上がった瘢痕としてキャラクタライザーションすることができる。ケロイドは、大きな肥厚体積又は軟組織腫瘍を生じる良性線維性増殖としてキャラクタライザーションすることができる。そのような修正方法は、切除部位（すなわち、組織を手術で除去する部位）を形成するため、瘢痕組織の少なくとも一部を切除することを含んでもよい。方法は、さらに、本明細書に記載のマトリックス組成物を切除部位及び／又はその周囲の真皮又は皮下組織に塗布することを含んでもよい。したがって、組成物は、切除部位内の晒された組織に直接塗布され得る、及び／又は組成物は、上述のように周囲組織に注射され得る。
【００５４】
塗布する組成物の量は、処置領域の寸法に大きく依存し得る。一部の実施形態において、水和組成物は、創傷の寸法に対する容量で塗布され得る。例えば、相対的な容量は、創傷の縁（すなわち、切開部の各側面）を参照し得る。一部の実施形態において、塗布の総容量は、約０．１ｍＬ〜約１００ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約７５ｍＬ、又は約１ｍＬ〜約５０ｍＬの量であってもよい。他の実施形態において、水和組成物は、２．５ｃｍの創縁に対し約０．１ｍＬ〜約１０ｍＬ、２．５ｃｍの創縁に対し約０．２ｍＬ〜約８ｍＬ、２．５ｃｍの創縁に対し約０．２５ｍＬ〜約６ｍＬ、又は、２．５ｃｍの創縁に対し約０．５ｍＬ〜約４ｍＬの相対容量で塗布され得る。所望であれば、方法は、１つ以上の閉塞部材で切除部位を閉塞することを含む。閉塞部材は、例えば、ステープル、縫合糸、及び接着剤を含んでもよい。様々な実施形態において、組成物は、閉塞前及び／又は閉塞後に注射され得る。
【００５５】
非常に大きな瘢痕は、痛みや不快感を生じさせることがあり、社会的不安や羞恥心の元となり得る。本開示に係る手術の瘢痕の修正は、特に、予め存在する瘢痕を除去するだけでなく、瘢痕の再発を予防又は低減する点で有益となり得る。以前に、肥厚性瘢痕化又はケロイドを形成しやすい患者が修正手術後でさえ、同様の大きさの瘢痕の再発を経験しやすいことは、当分野において認識されている。研究では、修正手術の少なくとも５０％、通常はこれより多く、再発がみられることが示されている。修正手術と組み合わせた本開示の組成物の使用は、この課題をかなり低減し得る。
【００５６】
特に、正常な皮膚の境界層の外側を形成する瘢痕組織の体積に対して、有益な効果を認めることができる。瘢痕の体積の評価は、特に、実施例１２で述べる。特定の実施形態において、本発明のマトリックス組成物を塗布した修正手術後１２ヶ月の瘢痕組織の体積は、修正手術前の瘢痕組織の体積に比べ、約１５％以下である。言い換えると、本明細書に記載の修正方法は、８５％以上減少させることができる。別の実施形態において、修正手術後１２ヶ月の相対的な外部の瘢痕体積は、１０％以下、５％以下、又は２％以下であってもよい。
【００５７】
同様に、組成物の本開示の使用は、ケロイド形成の再発を予防又は低減することができ、処置により、処置後１２ヶ月の時点で、盛り上がった瘢痕組織は、見られなくなる。例えば、処置後１２ヶ月の減少率が２０％以下、１５％以下、１０％以下又は５％以下の処置された患者では、盛り上がった瘢痕組織は見られなくなる。
【００５８】
本開示に係る処置及び組成物の使用は、さらに、瘢痕化の影響に関し特徴付けられてもよい。したがって、組成物の使用及び塗布は、肥厚性瘢痕化及びケロイド形成を含む瘢痕化を予防又は低減するだけでなく、組成物の使用及び塗布は、瘢痕化の影響を予防又は低減し、そのため、形成した瘢痕組織に関する患者の不快感及び／又は不満を予防又は低減し得る。例えば、予防又は低減することができる瘢痕の影響は、瘢痕組織及び／又は周囲組織の痛み、痒み、変色、患者の正常な皮膚組織に対する、瘢痕組織又は周囲組織の異常な剛性、患者の正常な皮膚組織に対する瘢痕組織又は周囲組織の以上な厚さ、及び瘢痕組織又は周囲組織の表面の凹凸（例えば、粗さ及びばらつき）のうち１つ以上を含む。
【００５９】
添付の実施例と組み合わせた前述の記述は、手術後の瘢痕化、肥厚性瘢痕化、熱傷の瘢痕化及び／又はケロイド形成を低減する又は防ぐための創傷部位（慢性的、外傷性、又は手術による）の処置に有用な相制御可能なマトリックス組成物の調製に必要な開示要件を満たす。さらに本開示との組み合わせに有用であり得る組成物を調整する物質及び方法は、米国特許第５，８２４，３３１号、米国特許第６，２３１，８８１号、米国特許第６，２６１，５８７号、米国特許第６，３５２，７０７号、米国特許第６，７１３，０７９号、米国特許第６，９９２，０６２号、米国特許第６，７３０，３１５号、米国特許第７，３０３，８１４号、米国特許第７，７００，６６０号、米国特許第７，７９９，７６７号、米国特許第８，０５３，４２３号、米国特許出願公開第２００８／０１４５４０４号、米国特許出願公開第２００８／０１４５４０４号、米国特許出願公開第２００８／０１９９５０８号、米国特許出願公開第２００９／０１２３５４７号、及び米国特許出願公開第２００９／０１２４５５２号に記載される。前述の文書の開示は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６０】
実施例
以下の実施例により、本発明をより十分に説明する。実施例は、本発明を説明するために示され、限定としてみなされるべきではない。
【００６１】
実施例１．ゼラチン／デキストラン組成物の調製
均一な液体状態を維持するため、撹拌しながら、特定の時点で、液体と粉末原材料（表１）を順に高温で添加することにより本開示の一実施形態に係る組成物を調製した。その後、溶液を無菌濾過し、無菌状態で試料ビンに分配し、密封し、冷蔵温度で保存した。
【表１】
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【００６２】
デキストロース及びＭｅｄｉｕｍ  １９９を計測し、予め加熱した水冷式（５０℃）ガラス容器に移し、撹拌子を使用して混合した。Ｌ−システイン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リシン、及びＥＤＴＡ２ナトリウムをＭｅｄｉｕｍ  １９９と共に容器に分配した後、混合物を５０℃に平衡化させた。平衡時間後、デキストラン粉末を添加し、成分を混合した。デキストランが溶液に溶けたら、ゼラチンを容器に添加し、溶解させた。ゼラチンが溶液に溶けたら、ｐＨを７．４５±０．０５に調整した。ｐＨ調整から平衡後、残りのＬ−グルタミン酸、アルギニン及びＬ−システインを硫酸亜鉛と共に、溶液に入れ撹拌した。総混合時間は約２時間であった。
【００６３】
５０℃での平衡後、混合容器から、加熱した、０．２μｍの陽電荷製薬用ナイロンフィルターを通し、無菌充填前の急冷のため、４０℃の撹拌容器へ溶液を濾過滅菌した。濾過を約３０分行った。溶液を濾過した後、混合を継続し、４０℃を維持しつつ、１２ｍｌの分量の試料ビンに無菌状態で分配した。続いて、試料ビンを閉め、密封し、圧着し、外観検査をし、ラベルをつけ、その後、冷蔵（２〜８℃）で保存した。産生物を、約試料ビン１５０本分得た。組成物の調剤を、約１時間行った。
【００６４】
実施例２．リン酸緩衝剤を含むゼラチン／デキストランの調製
実施例１で記載したプロセス方法を使用して、均一な液体状態を維持するため混合しつつ、高温で、液体と粉末原材料とを順に添加することにより組成物を調整した。その後、溶液を無菌濾過し、無菌状態で分配した。まず、２，２８２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を予め加熱した水冷式（５０℃）ガラス溶液に入れ、撹拌子を使用して混合することにより組成物を調整した。３７５μｌのＬ−システイン、６．９ｍｌのＬ−グルタミン酸、１３．８ｍｌのＬ−リシン、及び２４．２ｍｌのＥＤＴＡ２ナトリウムを、ＰＢＳと共に容器に分配した後、混合物を５０℃に平衡化させた。平衡時間後、１３７．５グラムのデキストラン粉末を添加し、成分を混合した。デキストランが溶液に溶けたら、３３０グラムのゼラチンを容器に添加し、溶解させた。ゼラチンが溶けたら、１０％水酸化ナトリウムを添加し、ｐＨを７．４５±０．０５に調整した。ｐＨ調整の平衡化後、２０．６ｍｌのＬ−グルタミン酸、２０．６ｍｌのアルギニン、１３．８ｍｌの硫酸亜鉛、６．５ｍｌのＬ−システインを溶液に入れ撹拌した。続いて、試料ビンを閉め、密封し、圧着し、外観検査をし、ラベルをつけ、その後、冷蔵（２〜８℃）で保存した。総混合時間は、約２時間であった。
【００６５】
実施例３．組成物の熱特性
実施例１及び実施例２の組成物の熱特性を示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により実験した。実施例１及び２の組成物の試料を５℃で６０分間保温し、その後、走査速度５℃／分で、開始温度５℃、終了温度４５℃でＤＳＣ検査を行った。熱転移の典型的なサーモグラム及びエンタルピーから熱特性を評価する。３５℃〜３７℃の範囲の転移ピークを有する固体組成物の液体への溶解転移を観測した。典型的なサーモグラムを図１に示す。
【００６６】
実施例４．組成物の流動性能／注射性能
６０％のゼラチン及び４０％のデキストランの組成物を、５０℃まで加熱したトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中、０．２ｇ／ｍｌの最終固体濃度で可溶化した。得られた組成物を４ｍｌの試料に分配し、２０ｍｌの試料ビンに入れ、試料が入った試料ビンを４℃で保存した。流動性を評価するため、組成物の試料ビンを保存庫から移動し、室温に置いた。その後、試料ビンを３９℃の加熱器（Ｌａｂ−ｌｉｎｅ  Ｍｕｌｔｉｂｌｏｃｋ  Ｈｅａｔｅｒ）に置き、組成物が固体から流動性液体に遷移するまで監視した。液体組成物を１ｍｌのシリンジに入れ、使い捨ての滅菌済み皮下注射器の国際規格により１ｍＬのシリンジに推奨される力として（ＩＳＯ  ７８８６−１参照）、プランジャ圧を５Ｎに設定した流体分注システムに取り付けた。約１６ｍｍ（５／８インチ）の長さの２５ゲージの針（０．２６ｍｍの公称内径）を取り付け、針を通る１ｍｌの組成物の通過時間を記録した。約３９℃の温度で、針を通して注射した。組成物は、流体を吸引し、充填後すぐに流体を注射することを目的とした、プラスティック材料製の滅菌済み使い捨て皮下注射器への要件（性能を含む）を規定するＩＳＯ  ７８８６−１に準拠した微小なゲージの針を通す注射による投与の条件に適合した。
【００６７】
微小ゲージの針を通す注射への適性を評価する組成物の固体含有量を試験するため、組成物中のデキストラン及びゼラチンのポリマー総含有量を表２に示すように変化させた。ポリマーを、１０ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、０．１３８Ｍ  ＮａＣｌ、及び０．００２７Ｍ  ＫＣｌ）に５０℃、１５ｍｌの円錐管にてゆっくりと混合させながら、溶解させた。
【表２】
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【００６８】
調製後、サンプルを冷却させた。上述の検査方法を使用して、サンプルを３９℃のヒートブロックに入れ、１ｍｌを長さ１インチ（２２．５ｍｍ）の２５ゲージ及び２３ゲージの針を通して注射した。各サンプルを各大きさの針を通し少なくとも３回、注射速度を試験した。少なくとも０．５ｍｌを、針を通して注射できない場合には、試験は失敗であり、うまく注射されるまでサンプルを加熱し続けた。注射検査の結果を表３に示す。
【表３】
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【００６９】
注射性能を検査した製剤を、注射可能な最大粘性を決定する粘性によってキャラクタライザーションした。注射性能を検査した同一比率のゼラチン及びデキストランを用いたサンプル製剤を前述のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中の様々なポリマー総含有量で調製した。サンプルを５０℃に予め調整し、検査用の三次元的なクェット配置を用いるＲｈｅｏｍｅｔｒｉｃｓ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＲＦＳＩＩレオメーターに掛けた。３９℃の新たに充填したサンプルを用いて、粘性が計測値に平衡するよう安定化するまで、複数の計測を行った。各サンプルのせん断速度範囲をレオメーターのトルク範囲に調整したが、最大１０００ｓ−１のせん断速度を検出した。せん断速度範囲は、高濃度のサンプルで減少した。
【００７０】
１９０〜３８０ｍｇ／ｍＬの総ポリマーのサンプルは、ニュートンの粘性反応を示した。高濃度のサンプルは、わずかに非線形粘性反応を示したが、一般的な線形回帰分析によるキャラクタライザーションに適していた。粘性の結果を表４にまとめる。製剤の粘性が０．４５６５Ｐａ−ｓ超であると、２５ゲージの針を通す注射に適さなかった。最大１．１６１８Ｐａ−ｓの粘性は、２３ゲージの針を通して注射可能であった。
【表４】
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【００７１】
実施例５．組成物のフィブロネクチン結合活性
実施例１の組成物をゼラチンのフィブロネクチン結合活性と比較して評価した。アッセイは、捕捉タグ付きフィブロネクチンの蛍光の直接測定を蛍光標識ヒト血漿フィブロネクチンに結合するマイクロタイタープレートのウェル表面に検査物質が固定される直接ＥＬＩＳＡ結合フォーマットに従った。このアッセイにおいて、実施例１の組成物は、完全に溶け（３９℃、３０分間のインキュベーションによる）、ｐＨ９．６の緩衝剤で希釈し、１〜１０μｇ／ｍＬの範囲の最終ゼラチン濃度を得、蛍光測定に最適な高結合オペーク９６−ウェルのウェルを覆った。組成物に使用されるゼラチンは、３９℃、１時間のプレートのインキュベーションにより、ウェル表面に不可逆的に固定された。過剰な非結合物質及び緩衝剤を除去し、プレートを１Ｍ  ＮａＣｌ（Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ）を含有するＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で３回洗浄した。非特異性の結合部位を室温で３０分間、ＰＢＳ中３％の乳剤（Ｂｌｏｃｋｅｒ）により遮断した。過剰な緩衝剤を除去し、前述のように、プレートをＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて３回洗浄した。ヒト血漿フィブロネクチンをフィブロネクチン分子に対し１〜５のフルオレセイン分子と共に包含し、Ｂｌｏｃｋｅｒで希釈し、最終濃度を４５μｇ／ｍＬとし、その後、プレートウェルに添加した。プレートを覆い、室温で２時間ゆっくりと回転させ、暗中で最大限結合させた。過剰な蛍光標識フィブロネクチンを除去し、プレートを以前実行したように、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した。各ウェルにＰＢＳ（１００μＬ）を添加し、励起波長４８５ｎｍ、発光波長５３０ｎｍを使用してプレートリーダーにより蛍光を記録した。プレートを複数回、読み込み、データの平均を求めた。
【００７２】
サンプルと標準物質との両方を２度測定した。組成物に使用するゼラチン原物質を７つの濃度で検査し（表５参照）、標準曲線を作製した。組成物サンプルを４つの希釈濃度で検査した。各サンプルのゼラチンの濃度を線形回帰による標準物質の範囲から決定した。
【表５】
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【００７３】
組成物のフィブロネクチン結合量と比較するため、タンパク含有量も測定し、各サンプルのフィブロネクチン結合部位の量を正規化するため使用した。タンパク質濃度を製造者の指示に従い、比色分析ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット、＃２３２３５）により測定した。簡潔に言うと、ゼラチン原物質を２倍希釈した濃度である１．５６〜１００μｇ／ｍＬに、ＰＢＳ（ｐＨ７．４，Ｓｉｇｍａ  Ｐ５３６８）を用いて調整した。サンプル（通常、ＰＢＳ出発物質において５ｍｇ／ｍＬ）をＰＢＳ（０．５ｍｇ／ｍＬタンパク質及び９０〜９５μＬＰＢＳを５〜１０μＬ）中、２５〜５０μｇ／ｍＬに希釈した。反応をクリア９６−ウェルプレートで、ＵＶ／Ｖｉｓ吸光度測定に最適化し、１００μＬのサンプルを１００μＬのＢＣＡ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（２５：２４：１，Ｒｅａｇｅｎｔ  ＭＡ：ＭＢ：ＭＣ）と混合し、プレートを３７〜３９℃のオーブンで１５〜３０分ゆっくりと回転させ、紫色を示すタンパク質を発現させることにより、実行した。その後、各反応の５６２ｎｍにおける吸光度を分光光度プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）により記録した。サンプル及び標準物質の両方の各濃度を２度行い、平均化した。
【００７４】
表６は、実施例１にて調製した組成物の小さい番号の試料ビンと大きい番号の試料ビンとにおける、フィブロネクチンのｍｇ／ｍＬタンパク質における比率を比較することによりタンパク質濃度に正規化したフィブロネクチン結合部位の計測濃度を示す。最初に、サンプルを３９℃（１時間）で溶解し、ＰＢＳを用いて５ｍｇ／ｍＬに希釈した。その後、サンプルを３９℃で３０分、溶解させ、フィブロネクチン結合及びＢＣＡタンパク質アッセイのため、ＰＢＳでさらに０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈される前に、ゼラチンを完全に溶解させた。
【表６】
2014532713.tif 000011
【００７５】
検査結果は、ゼラチン原物質が著しいフィブロネクチン結合活性を示すことを示した。フィブロネクチン結合特性は、産生中に早くに収集した試料ビン（試料ビン＃８）と、産生の終わり近くで収集した試料ビン（＃１４４）との両方から、本開示の組成物に保持される。
【００７６】
実施例６．組成物の物理特性
創傷における滞留時間の測定として生理溶液中の溶解（溶出）から統合性損失への組成物の抵抗を測定するため、溶出アッセイを使用した。このアッセイは、模擬真皮環境にて少体積の検査用に変更した、米国薬局方（ＵＳＰ）ＸＸＩＩＩ，１９９５：１７９１‐１７９３における標準溶出試験に基づいていた。アッセイは、３４℃のオーブンでゆっくりと回転させた（２００〜２５０ｒｐｍ）１２０ｍＬの試料ビン中、３ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対し、１つのディスクといったセットの所定の条件下で、皮膚温度である３４℃で、組成物のサンプルディスクの完全溶出の総時間（分）を測定した。
【００７７】
成形ディスクを形成するため、実施例１からの組成物の試料ビンを３５℃で１．５時間溶かし、１０〜１５回試料ビンを回転させつつ、反転により混合した。溶かした組成物を１ｍＬのアリコートで除去し、ポリプロピレン型の６〜１２円形ウェル（直径８ｍｍ、高さ１．５ｍｍのディスク）に充填し、薄いゴムマットにより平坦金属プレートにしっかりと密封した。型から除去し、予め重量を計測したキャップ付きチューブで保存する前にディスクを室温で３０分間冷却し、ゲルを形成させた。同定により、ディスクの重量は、通常７０〜１００ｍｇの範囲であることが決定した。ディスクを検査前に、合わせて１〜２時間、室温に置いた。組成物の各試料ビンごとに、気泡を最小にした３つのディスクを完全溶出試験用に選択した。各ディスクを予め３４℃に加温した３ｍＬのＰＢＳに添加し、３４℃のオーブン中の回転台に置いた。各検査ごとに、試料ビンを５〜１５分間隔で、同時に目視検査により監視した。サンプルは、表面の物質が可溶化したため、検査中、徐々に小さくなる統合ディスクであることが観察された。サンプルの観察は、それらサンプルの温度変化を最小化するため、素早く行われた。各ディスクの完全溶出時間を記録した（図２参照）。
【００７８】
また、組成物の圧縮強度も組成物から円柱検査サンプル成形の機械的検査により試験した。検査は、少ないヒドロゲルサンプルを検査するため変更した、ＡＳＴＭ  Ｄ５７５−９１（２００７）のゴムの圧縮特性用試験法に記載される圧縮の機械的試験に基づいていた。成形サンプルシリンダを形成するため、組成物の試料ビンを３５℃で１．５時間溶かし、１０〜１５回試料ビンを回転させつつ、反転することにより混合した。溶かした組成物を１ｍＬのアリコートで除去し、１５ウェルのＤｅｌｒｉｎの型の各円形ウェル（直径１ｃｍ、高さ１ｃｍのシリンダ）に過充填にせず、完全に充填し、薄いゴムマットにより平坦金属プレートにしっかりと密封した。通常、５つのシリンダを各試料ビンから成形した。
【００７９】
型を１．５時間室温に放置し、サンプルを型からゆっくりと取り外した。同定のため、シリンダの重量を計測し（範囲＝０．７〜１ｇ）、検査前に合わせて１〜４時間室温に放置し放置した。その後、各シリンダをプラスティック製シリンダ用保持器（直径１．５ｃｍ、高さ１．５ｃｍ）に置き、平ピン（直径１ｃｍ、高さ１０ｍｍの頭部を有する）により圧縮し、機械的検査器（Ｉｎｓｔｒｏｎ  Ｍｏｄｅｌ  ５５４２）にしっかりとクランプした。圧縮弾性率を、５ニュートンの荷重セルを使用して、３ｍｍ／分の速度で、Ｉｎｓｔｒｏｎにより測定した。Ｉｎｓｔｒｏｎにより算出される各シリンダを圧縮する弾性係数を、自動弾性係数（単位：ｋＰａ）として記録した。各試料ビンごとに、３〜４つのシリンダを測定した。各シリンダにおいて、３〜４つの連続する一定値の平均を求めた。最大圧縮荷重（ｇｆ）及び最大圧縮荷重における圧縮応力（ｋＰａ）値をも、Ｉｎｓｔｒｏｎの器具により測定した。実施例１の組成物の試料ビンからの試験結果は、図２に示すように、バッチプロセスの間、後に産生した番号の大きな試料ビンからより良い物理特性を示した。
【００８０】
実施例７．組成物の化学量論
適切な製剤の化学量論を試験するため、様々な量のゼラチン（Ｇｅｌｉｔａ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ａタイプブタゼラチン）及びデキストラン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，デキストラン  ５００，０００  ＭＷ）の重量を計測し、５ｍＬのスナップキャップチューブに取り付け、２ｍＬＰＢＳ、ｐＨ７．４を添加した。２００ｍｇ／ｍｌ及び２３０ｍｇ／ｍｌのポリマー総重量（デキストランを加えたゼラチン）を調製し、検査した。一晩保温する前に、サンプルを短時間、ボルテックスで混合した。全てのサンプルを５０℃のオーブンで、約１９時間、８ｒｐｍで、ゆっくりと回転させた。この時、サンプルは、均質な流動性組成物になった。溶出検査に使用した型に、組成物を注ぐことにより、組成物ごとに、６〜９つのディスクを成形し、３０分間室温に放置し放置した。型から外したディスク（組成物ごとに３つ）をさらに１．５時間室温に置いた。サンプルディスクを、３４℃でゆっくりと回転させる、３ｍＬのＰＢＳに晒した、各検査組成物ごとに３つのディスクを使用して、実施例６に記載される物理的統合性のための溶出アッセイで検査した。ディスクサンプルについて、物理的完全性を１５分間隔で、監視した。
【００８１】
表７の溶出結果は、両ポリマー濃度が、６０重量％以下のゼラチンを含むサンプルの物理的完全性が失われていることを示す。６０重量％超のゼラチンを含むサンプルは、生理学的ｐＨ及びイオン強度を検査した際と、ほぼ同じ分の溶出抵抗を示した。
【表７】
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【００８２】
第２の実験において、以前の試験のゼラチン及びデキストランをＰＢＳで、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％のゼラチンを含む、総ポリマーが１７０ｍｇ／ｍｌの濃度に製剤化した。デキストランへの５つの異なる比率のゼラチンの製剤を加熱し、物質を液化し、実施例６の方法を使用して物理特性のキャラクタライザーションのため、ディスクサンプルを成形した。結果は、以前の試験と同様に、６０％超のゼラチンを含む製剤の溶出抵抗を示した。製剤の圧縮検査は、６０％超のゼラチンを含む製剤の物理特性の著しい上昇も示した。検査結果を図３に示す。
【００８３】
実施例８．組成物の凍結乾燥及び使用のための再構成
実施例２の組成物を冷凍し、凍結乾燥させ、乾かした。組成物を約０．０５℃／分の冷却速度で、約−３０℃まで冷凍し、約１２時間−３０℃に保持した。−３０℃の凍結組成物を約２４時間真空にした。その後、温度を、約０．２５℃／分の速度で、約−１０℃まで徐々に上昇させた。その後、組成物を約−１０℃で、少なくとも１２時間、真空下で保持し、温度を約０．０５℃／分の速度で、約２０℃までさらに上昇させた。その後、凍結乾燥組成物の重量を測定し、試料ビンに入れた。
【００８４】
凍結乾燥組成物を含有する試料ビンを、脱イオン水を用いて再構成し、創傷への投与に適した流動性組成物を作製した。凍結乾燥組成物１グラムを試料ビン中で、５ｍｌの水と混合し、最終濃度０．２ｇ／ｍｌを得た。試料ビンを３９℃で１時間加熱し、ボルテックスで１５分及び３０分混合した。上述のように、真皮及び皮下組織への注射に適した流動性注射用組成物が得られた。
【００８５】
凍結乾燥組成物を実施例５及び６に記載の方法を使用して、フィブロネクチン結合、溶出時間及び圧縮弾性率のアッセイを行った。再構成組成物は、５．１３〜５．８８ｎｍｏｌ／ｍｇの範囲のフィブロネクチン結合、３０〜４５分の範囲の溶出時間、及び１７〜２９ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を示した。１％グリセロールと、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０とを再構成流体に添加した場合、再構成組成物は、３３分の溶出時間、３４ｋＰａの圧縮弾性率を示した。０．１５Ｍ  ＮａＣｌと１％  Ｔｗｅｅｎ２０とを再構成流体に添加した場合、再構成組成物は、３０分の溶出時間、及び３３ｋＰａの圧縮弾性率を示した。
【００８６】
実施例９．創傷／組織への注射のための、凍結乾燥組成物の再構成
実施例８に記載の組成物の再構成を様々な条件下で試験した。凍結乾燥組成物の試料ビンを予め３９℃に加熱した５ｍｌの再構成流体と混合し、固体量を０．２ｇ／ｍｌにした。試料ビンを３９℃のブロック加熱器に置き、５分後観察し、ボルテックスで混合した。続いて、流動性均質液体が観察されるまで、試料ビンを１〜２分ごとに目視検査した。その後、実施例４に記載の条件下で、２５ゲージの針を通し、１ｍｌのシリンジを使用した注射により、再構成組成物の流動性能を試験した。
【００８７】
０．５ｍｌの流体を注射可能かどうかの注射性能について、液体組成物を考察した。０．５ｍｌ未満の容量の注射の間、針に詰まりが観察された場合、試料ビンを注射が成功するまで、加熱及び混合し続けた。結果を表８にまとめる。なお、成分の割合は、特段記載しない限り、重量％とする。
【表８】
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【００８８】
結果は、微小なゲージの針により注射可能な流体に再構成される生成物の凍結乾燥組成物の性能を示した。吸湿賦形剤、増量剤、及び界面活性剤を含む再構成添加剤は、凍結乾燥組成物を注射可能な流体に再構成する時間を短縮する、及び／又は標準的な５Ｎの注射力下で組成物を注射するまでの時間を短縮する性能を示した。
【００８９】
実施例１０．動物真皮モデルにおける組成物の組織反応
実施例１の組成物のサンプルを３８度まで兼加熱し、注射に適した流動性液体組成物を形成した。組成物を、４４匹の麻酔した成体雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの腹部真皮に注射した。注射後、１、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７及び２８日ごとに、４匹の動物を検視するまで、動物を毎日監視した。組織サンプルを注射部位で収集し、組織学的に調製した。注射部位から組織のＨ＆Ｅ組織病理を細胞反応及び注射組成物の存在のため検査した。
【００９０】
組織病理は、組成物が、全体として不均一に拡散した好酸性線維のわずかに染色された１かたまりの物質として皮下空間に存在することを示した。組成物は、３日目に細胞浸潤の量を増加させつつ、１日目で、組成物及び周囲組織への多形核白血球（ＰＭＮ）の経度の湿潤を示した。組成物の量は、３日目に減少を見せた。挿入６日目は、組成物を徐々に少なくなったことを示した。挿入９日目には、動物のうち２匹に組成物は存在せず、対応して、存在する炎症細胞も減少したことを示した。１２日目、１５日目、及び１８日目以降、１つの動物の組織には、わずかな量の組成物がはっきりと表れた。２１日目の組織に、組成物の証拠は見つからなかった。２４日目の２匹の動物の組織に、組成物はわずかな量見つかった。２７日目及び２８日目以降の組織に組成物の証拠は見つからなかった。挿入物質はもはや現れなくなった後、注射部位組織は、ＰＭＮは最小限存在し、マクロファージは有意には存在せず、新たなコラーゲン沈着又は瘢痕形成は現れなかったことを実証し、非常に両性な組織反応を示した。その後の組織病理は、組成物に関するコラーゲン沈着又は血管新生がなかったことを決定した。
【００９１】
実施例１１．手術の創傷を処置するための組成物の投与
実施例１の組成物を用いる単一の処置に続き、瘢痕形成の指標及び症状を評価することにより創傷治癒における改善を評価するための前向き無作為化した同様の瘢痕制御試験に参加する、開腹又は腹腔鏡検査の婦人科手技を受ける１８〜６０歳の１００人の女性対象を９０人の対象は注射により処置され、１０人の対象はカテーテルによって処置された。
【００９２】
対象の外科的切開を半分に分け、半分は、組成物を用いた「処置」に無作為に割り当て、その他半分は、縫合糸を用いて切開部を閉塞する前のみ、「対照」（処置せず）に割り当てた。患者は、外科的切開の半分を評価するため、処置後１２ヶ月にわたり外来通院した。
【００９３】
注射により処置した９０人の被験者において創傷の閉塞時、組成物を３９℃（±２℃）に加熱し、流動性注射用液体を形成した。医師は、シリンジ及び１８〜２５ゲージの針を使用し組成物を創縁に注射した。針を、真皮と皮下との界面に十分に深く、可能な限り、切開創傷縁に平行に挿入した。針痕及び周囲組織に多量の組成物を注ぎ込み、針痕を含む周囲領域に創縁２．５ｃｍあたり、約１〜２ｍＬの組成物を供給した。瘢痕のキャラクタライザーションの観察者（外科医）及び患者の評価（すなわち、以前に検証した視覚性アナログスケール（Ｖｉｓｕａｌ  Ａｎａｌｏｇ  Ｓｃａｌｅ、ＶＡＳ）に基づいたアンカー付き視覚性アナログスケール（Ａｎｃｈｏｒｅｄ  Ｖｉｓｕａｌ  Ａｎａｌｏｇ  Ｓｃａｌｅｓ、ＡＶＡＳ）、及び患者及び観察者瘢痕評価スケール（ＰＯＳＡＳ））を使用する、検証した瘢痕評価スケールを用いて効果を評価した。
【００９４】
標準的なＶＡＳ評価は、「予想される最悪の瘢痕」を左端に、「予想される最良な瘢痕」を右端にマークした１００ｍｍの水平な視覚性アナログ美容スケールを使用する。評価者に、瘢痕の全体的な美観を示す水平スケールに沿ってマークさせる。スケールの低端から評価者のマークまでの水平距離を測定し、近似するミリメートル値に丸めることにより、数値スコアを算出した。ＡＶＡＳスケールは、スケールの右端の正常な皮膚を使用しつつ、スケールの左端のアンカーの最悪な瘢痕の中間を評価者に選択させる、水平視覚性アナログ美容スケールを使用する。評価者に、２つの端部間のより良い瘢痕中間の全体的な美観を示す水平スケールに沿ってマークさせる。スケールの低端から評価者のマークまでの水平距離を測定し、測定値を近似するミリメートル値に丸めることにより、数値スコアを算出した。
【００９５】
１２ヶ月にわたる、観察者及び患者のＡＶＡＳスコアを、対象が同一である観察者のうち予測される相関を考慮した縦断的データを分析する方法である、一般化推定方程式（ＧＥＥ）を使用して分析した。ＡＶＡＳ分析は、回帰構造を推定して実行された。ＧＥＥ分析は、処置間（対照側と処置済み側）全体の推定平均差を得るため、ＡＶＡＳスコアの個々の特徴のため、統計的有意性の両面正規近似試験を実行するため使用した。
【００９６】
組成物の注射により処置された９０人の対象は、アンカー付き視覚性アナログスケール（ＡＶＡＳ）を使用して、外科医の観察者及び処置された被験者により評価された。登録された最初の３０人の被験者において、ＡＶＡＳスケールを含むプロトコルは修正された。登録された最初の３０人の被験者において、９及び１２ヶ月の外来通院においてのみ、観察者及び患者からＡＶＡＳスコアを収集した。登録された次の６０人の対象は、外来通院時すべての時点で、観察者及び患者から収集したＡＶＡＳデータを有した。処置済み対対照のＡＶＡＳを評価する際、１２ヶ月を通し観察者及び患者の評価の全体として推定ＡＶＡＳ差は、それぞれ、処置した側に有利に、７．４９ｍｍ（ｐ＝０．００１８）及び９．８６ｍｍ（ｐ＝０．０００９）であった。観察者及び患者のＡＶＡＳの結果を表９に示す。
【表９】
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【００９７】
瘢痕特徴づけの観察者（医師／研究者）及び患者の生体評価を使用して、ＧＥＥにより有効なＰＯＳＡＳ瘢痕評価スケールを用いて組成物の効果をも評価した。ＰＯＳＡＳの観察者スケールは、１〜１０のスケール上で数値的にスコア化した５つの創傷治癒のキャラクタライザーションを含み、ここで、１は、最良のスコアであり、１０は最悪である観察者スケールの総スコアは、５つの項目のそれぞれのスコア（５〜５０の範囲）を追加することを含む。最低スコア（５）は、正常な皮膚を表す。結果を以下の表１０及び表１１に示す。処置済み対対照の観察者ＰＯＳＡＳスコアを評価する際、１２ヶ月にわたり全体として推定される差は、処置済み側に有利に、０．９８（ｐ＝０．００５１）であり、個々の観察者が評価したキャラクタライザーションにおける推定ＰＯＳＡＳの差は、０．２０〜０．２６の範囲であり、完全に処置された瘢痕の中間に著しく有利であった。処置済み対対照の患者のＰＯＳＡＳスコアを評価する際、１２ヶ月にわたり全体として推定される差は、処置済み側に有利に、１．１９（ｐ＝０．００１２）であり、個々の患者が評価したキャラクタライザーションの推定ＰＯＳＡＳ差は、０．０９〜０．３６の範囲であり、完全に処置された瘢痕の中間に著しく有利であった。
【表１０】
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【表１１】
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【００９８】
実施例１２．ケロイドの修正手術のための組成物の投与
最新の文献で報告される再発率と比較して、ケロイド組織の切除によるケロイド瘢痕の修正手術を受ける被験者におけるケロイド瘢痕化に関連する、体積、外観、及び／又は症状の減少における組成物の使用を評価するため、研究を行った。
【００９９】
２６の耳部ケロイドを有する１９人の対象を研究として登録した。研究対象の耳部にあるケロイドは、外科的に除去され、切開の創縁を同定した。実施例１の組成物を注射前に、少なくとも６０分間３９℃（±２℃）に加熱した。２５ゲージの針を真皮／皮下界面にある組織まで十分に深く、切開創縁に可能な限り平行に挿入した。研究者は、組成物を注射し、針を引き出した際、組成物を注射痕及び周囲組織内へ拡散した。創縁の針痕及び周囲組織に、創縁の両側の切開の長さが２．５ｃｍ増えるごとに平均１．４８ＭＬの多量な組成物を注ぎ込んだ。また、研究者は、注射により生じた皮膚の伸張、針からの組成物の流動の容易さ、組織の脱色、及び組成物を含有する組織の物理性能などの注射過程の間の視覚及び触覚フィードバックにより誘導された。全ての切開位置（すなわち、右耳、左耳及び／又は両耳）を同様の手段で閉塞した。
【０１００】
病変の大きさの体積を測定するため、歯科用アルギニンを用いた印象を使用してケロイドの体積を測定するプロトコルを使用した。アルギニン印象を水で充填し、目盛り付スケールで体積を測ることにより、ケロイドの体積を測定した。これにより、病変の体積の数値が得られる。印象は、アルギニン印象に変更可能な病変のもので生成され得る。アルギニン印象を生成し、基準線における各対象を算出した。１２ヶ月目の外来通院時、５つの耳部（１９．２％）は、外科的試験に基づき、再発していることが認められた。型を各耳で成形した。型の手術前の体積及び１２ヶ月目の体積を以下の表１２に含む。さらに、手術前の体積の割合を各１２ヶ月目の型に関し算出している。組成物を用いた処置からの５つの再発のうち、２つの再発は、１２ヶ月目で、５％以上の臨床的に有意な病原の大きさであることを示した。
【表１２】
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【０１０１】
外科的切除後のケロイド再発に特化した文献は、併用療法（例えば、外科的切除／コルチコステロイド注射）が標準治療となっていることを示す。外科的切除後単体で、ケロイド再発に最も関連する文献を以下の表１３に含む。
【表１３】
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【０１０２】
再発は、４４〜９３％と文献に記載された。Ｂｅｒｍａｎら(Berman B., Flores F.  「Recurrence rates of excised keloids treated with postoperative triamcinolone acetonide injections or interferon alfa-2b injections」、J AM Acad Dermatol. 1997年; 37:755-7)による研究は、出版物が多量な被験者のデータセットを含むため、最良の比較文献であるとみなされる。特に、耳たぶのケロイドの外科的切除を考慮すると、Ｂｅｒｍａｎらは、外科的切除のみを受ける４３人の患者（８６％が、耳たぶ又は耳の輪裂ケロイドを有する）研究し、平均６．５ヶ月で、５１．２％のケロイドが再発した。Ｂｅｒｍａｎら（１９９７）の結果と、組成物を使用する処置の結果とを比較して分析を行った。
【０１０３】
２×２分割表を使用して、本開示の組成物（上述）を使用した処置結果をＢｅｒｍａｎらの公報と比較した。フィッシャー抽出試験を使用する分析は、両側測定Ｐ値が０．０１１であることを実証し、統計的に有意な差を示した。組成物は、１２ヶ月目に評価した際、ケロイド再発を防ぐため、報告される外科的切除のみと比較して非常に優れていることが分かった。組成物は、ケロイド修正手術の間、微小なゲージの針を用いて注射した際、ケロイドの再発を防ぎ、最小化する性能を示した。
【０１０４】
当業者にとって、前述の明細書及び添付の図面に示す教示の利益を有する本発明に関する限り、本発明の多くの変形及び他の実施形態が想到されるであろう。したがって、本発明は、本明細書に開示される特定の実施形態に限定されないものとし、変形及び他の実施形態が、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されていることを理解されたい。特定の用語を本明細書において採用したが、それらは、一般的な説明の意味でのみ使用され、限定を目的としていない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年8月29日(2013.8.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均分子量が約７５，０００Ｄａ〜約２５０，０００Ｄａであるゼラチンと、
平均分子量が約１０，０００Ｄａ〜約１，０００，０００Ｄａである高分子炭水化物とを含む組成物であって、
前記ゼラチンは、前記組成物中に存在する前記ゼラチンと前記高分子炭水化物との組み合わせの総重量に対し約６０重量％以上含まれ、
前記組成物の前記水和物中の前記ゼラチンと前記高分子炭水化物との総濃度は、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約４００ｍｇ／ｍＬであり、
前記ゼラチンと前記高分子炭水化物とを組み合わせ、前記水和物中で、前記ゼラチンと前記高分子炭水化物との相互作用は、およそ皮膚の平均温度以下の温度では、固体又は半固体ゲルマトリックス組成物を形成し、３５℃以上の温度では、流動性注射用液体を形成する、組成物。
【請求項２】
平均分子量が約７５，０００Ｄａ〜約２５０，０００Ｄａであるゼラチンと、
平均分子量が約１０，０００Ｄａ〜約１，０００，０００Ｄａである高分子炭水化物とを含む組成物であって、
前記ゼラチンは、前記組成物中に存在する前記ゼラチンと前記高分子炭水化物との組み合わせの総重量に対し約６０重量％以上含まれ、
前記組成物の前記水和物中の前記ゼラチンと前記高分子炭水化物との総濃度は、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約４００ｍｇ／ｍＬであり、
前記組成物の水和物は、３５℃以上の温度で、流動性注射用液体であり、およそ皮膚の平均温度以下の温度では、固体又は半固体ゲルマトリックスであり、
皮膚の創傷に前記組成物を適用することにより、皮膚の創傷により生じる皮膚の瘢痕化もしくはその影響の防止又は低減に使用される組成物。
【請求項３】
前記ゼラチンは、平均分子量が約１２０，０００Ｄａ〜約１８０，０００Ｄａである、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ゼラチンは、前記組成物中に存在する前記ゼラチンと前記高分子炭水化物との組み合わせの総重量に対し約６０重量％〜約９５重量％含まれる、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記流動性注射用液体は、３５℃〜３９℃の温度で、５Ｎのシリンジプランジャの圧力下で、５／８インチの長さ、２５ゲージの針を通りシリンジから押し出された際の流速が１０μＬ／ｓ以上である、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記流動性注射用液体は、３５℃〜約３７℃のピークを示す示差走査熱量曲線を有する、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記流動性注射用液体は、固体濃度が約０．５ｇ／ｍＬ以下である、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
前記流動性注射用液体は、３５℃〜３９℃の温度における粘度が、約１．５Ｐａ−ｓ以下である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項９】
直径１ｃｍ、厚さ１ｃｍのゲルマトリックスディスクの形態の前記固体又は半固体ゲルマトリックスは、周囲条件下での圧縮弾性率が約１５ｋＰａ以上である、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、フィブロネクチン結合活性が約３ｎｍｏｌ／ｍｇ以上である、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、哺乳類の真皮又は皮下組織における滞留時間が約３日以上である、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項１２】
界面活性剤、吸湿賦形剤、緩衝剤、増量剤、アミノ酸、塩類、防腐剤、及びこれらの組み合わせを含む群より選択される物質をさらに含む、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物は、脂肪酸、脂肪酸塩類、アルキル硫酸、セラミド、ポリオールエステル、ポリオキシエチレンエステル、ポロキサマー、両性界面活性剤、双性イオン界面活性剤、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される界面活性剤を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物は、ポリエチレングリコール、ポリオール、ポリソルベート、シクロデキストリン、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化亜鉛、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される吸湿賦形剤を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、クエン酸塩、グリシン、リン酸塩、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される緩衝剤を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物は、マンニトール、デキストロース、スクロース、トレハロース、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される増量剤を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物は、グルタミン酸、アルギニン、リシン、システイン、アラニル−グルタミン、及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物は、エデト酸２ナトリウム、金属塩、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される塩を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物は、凍結乾燥体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物は、凍結乾燥体から再構成される、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物は、ポリオール、ポリソルベート、生理食塩、単糖、糖アルコール、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される再構成添加剤を含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記組成物は、グリセロール、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、塩化ナトリウム、デキストロース、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される再構成添加剤を含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物は、３５℃〜３９℃の温度、５Ｎのシリンジプランジャ圧で５／８インチの長さの２５ゲージの針を通しシリンジから押し出された際、流量が約１０μＬ／ｓである流動性注射用液体である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
前記再構成組成物は、３５℃〜３９℃の温度では、粘度が約１．５Ｐａ−ｓ以下の流動性注射用液体である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２５】
前記固体又は半固体ゲルマトリックスは、ｉ）直径１ｃｍ及び厚さ１ｃｍのディスク形態である時、周囲環境下で圧縮弾性率が、約３４ｋＰａを超えること、及びｉｉ）直径８ｍｍ、高さ１．５ｍｍのディスク形態である時、３４℃において、リン酸緩衝生理食塩水中、完全溶解時間が少なくとも約４５分であることのうち、一方又は両方を示す、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項２６】
皮膚創傷から生じる皮膚瘢痕化又はその影響を抑制又は低減する方法であって、前記方法は、前記皮膚創傷にマトリックス組成物を塗布することを含み、
前記マトリックス組成物は、
平均分子量が、約７５，０００Ｄａ〜約２５０，０００Ｄａのゼラチンと、
平均分子量が、約１０，０００Ｄａ〜約１，０００，０００Ｄａの高分子炭水化物とを含み、
前記ゼラチンは、前記マトリックス組成物に存在する前記ゼラチンと前記高分子炭水化物とを組み合わせた総重量に対し、約６０重量％以上含まれ、
前記組成物の前記水和物中の前記ゼラチンと前記高分子炭水化物との総濃度は、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約４００ｍｇ／ｍＬであり、
前記ゼラチンと前記高分子炭水化物とを組み合わせ、前記水和物中で、前記ゼラチンと前記高分子炭水化物との相互作用は、およそ皮膚の平均温度以下の温度では、固体又は半固体ゲルマトリックス組成物を形成し、３５℃以上の温度では、流動性注射用液体を形成する、方法。
【請求項２７】
前記創傷を、縫合糸、ステープル、接着剤、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される閉塞部材を用いて閉塞することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記塗布は、前記流動性注射用液体組成物を前記皮膚創傷の近位にある真皮又は皮下組織に前記流動性注射用液体組成物を注射することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記皮膚創傷は、手術創傷である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
手術創傷は、予め存在する瘢痕の少なくとも一部を切除した後に残る創傷である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記予め存在する瘢痕は、ケロイド、肥厚性瘢痕、又は熱傷に関連する瘢痕である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記方法は、
ケロイド、肥厚性瘢痕、又は熱傷に関連する瘢痕の少なくとも一部を切除し、切除部位を形成し、
前記切除部位又はその周囲の真皮又は皮下組織にマトリックス組成物を塗布することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
修正手術に効果的であり、前記切除部位において、処置の１２ヶ月後、ケロイド形成又は肥厚性瘢痕化の再発を１５％以下とする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記修正手術に効果的であり、前記切除及び前記マトリックス組成物の塗布後１２ヶ月に存在する瘢痕組織の外部面積が、切除したケロイド又は肥厚性瘢痕の外部体積に対し、約１５％以下である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記塗布は、前記マトリックス組成物の局所的塗布を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
前記マトリックス組成物は、凍結乾燥体であり、
前記塗布ステップの前に、前記方法は、前記凍結乾燥したマトリックス組成物を再構成することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記再構成は、ポリオール、ポリソルベート、生理食塩、単糖、糖アルコール及びこれらの組み合わせからなる群より選択される添加剤と、前記マトリックス組成物を組み合わせることを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ケロイド形成又は肥厚性瘢痕化の形成を抑制又は低減させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３９】
前記瘢痕化の影響を抑制又は低減し、
前記瘢痕化の影響は、痛み、かゆみ、変色、異常な剛性、異常な厚さ、表面の凹凸、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】
前記塗布は、２．５ｃｍの創縁に対し、マトリックス組成物を約０．１ｍＬ〜約１０ｍＬ送達することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項４１】
皮膚瘢痕化の抑制又は低減に適したマトリックス組成物の調製方法であって、
前記方法は、
平均分子量が約７５，０００Ｄａ〜約２５０，０００Ｄａのゼラチンを、平均分子量が約１０，０００Ｄａ〜約１，０００，０００Ｄａの高分子炭水化物と、混合しつつ、溶媒と組み合わせ、徐々に前記ゼラチン及び前記高分子炭水化物を溶解させ、水和マトリックス組成物を形成することを含み、
前記ゼラチンは、前記組成物に存在する前記ゼラチンと前記高分子炭水化物との組み合わせの総重量に対し、約６０重量％〜約９５重量％含まれ、
前記組成物の水和物体における前記ゼラチンと前記高分子炭水化物との総濃度は、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約４００ｍｇ／ｍＬである、方法。
【請求項４２】
前記マトリックス組成物を凍結乾燥させることをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ｉ）前記組み合わせステップの前の前記ゼラチン及び前記高分子炭水化物のうち、一方又は両方、又はｉｉ）前記組み合わせステップにおいて形成される水和マトリックス組成物のいずれかから溶媒への可溶性が低い分画を除去し、前記ゼラチン又は前記高分子炭水化物のうち一方又は両方の平均分子量を増大させることをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【国際調査報告】
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