(57)【要約】本発明は、トロポミオシン関連キナーゼＢレセプター（ＴｒｋＢ）の特定の部分に対するモノクローナル抗体、およびこれらを産生するハイブリドーマ細胞株に関する。これらの抗体のフラグメント、特に相補性決定領域（ＣＤＲs）を示すフラグメント、およびこれらを含むタンパク質は、ガン、疼痛、食欲不振、神経性食欲不振および／または悪液質の処置法において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｓｐ−２９８およびＣｙｓ−３０２を含む、配列番号１のＴｒｋＢの残基２５２〜３２２の配列から選択された、少なくとも１４個のアミノ酸および最大５０個のアミノ酸からなるペプチドに対するモノクローナル抗体。
【請求項２】
Ａｓｐ−２９８およびＣｙｓ−３０２を含む、配列番号１のＴｒｋＢの残基２８０〜３２０の配列から選択された少なくとも１６個のアミノ酸および最大２５個のアミノ酸からなるペプチドに対する請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
配列番号２のＢ１ペプチドに対する請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
２０１１年４月１５日にＤＳＭＺにＤＳＭ ＡＣＣ３１２４番で寄託された、５Ｇ５Ｄ２Ｂ５と命名された請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
２０１１年４月１５日にＤＳＭＺにＤＳＭ ＡＣＣ３１２５番で寄託された、６Ｂ７２Ｃ５と命名された請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
Ａｓｐ−２９８およびＣｙｓ−３０２を含む、配列番号１のＴｒｋＢの残基２５２〜３２２から選択された配列から選択された少なくとも１４個のアミノ酸および最大５０個のアミノ酸からなるペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項７】
Ａｓｐ−２９８およびＣｙｓ−３０２を含む、配列番号１のＴｒｋＢの残基２８０〜３２０の配列から選択された少なくとも１６個のアミノ酸および最大２５個のアミノ酸からなるペプチドに対するモノクローナル抗体を産生する請求項６記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項８】
２０１１年４月１５日にＤＳＭＺにＤＳＭ ＡＣＣ３１２４番で寄託された、５Ｇ５Ｄ２Ｂ５と命名された請求項６記載のハイブリドーマ細胞株。
【請求項９】
２０１１年４月１５日にＤＳＭＺにＤＳＭ ＡＣＣ３１２５番で寄託された、６Ｂ７２Ｃ５と命名された請求項６記載のハイブリドーマ細胞株。
【請求項１０】
請求項１〜５記載の抗体のフラグメント。
【請求項１１】
Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、および相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を提示するタンパク質からなる群より選択される、請求項１０記載のフラグメント。
【請求項１２】
配列番号３〜１４のＣＤＲｓからなる群より選択される請求項１１記載のＣＤＲを含むタンパク質。
【請求項１３】
配列番号３〜１４のＣＤＲｓからなる群より選択されるＣＤＲからなる請求項１２記載のタンパク質。
【請求項１４】
請求項１０〜１３記載の抗体フラグメントを含む薬学的組成物。
【請求項１５】
治療有効量の請求項１０〜１３のいずれか一項記載の抗体フラグメントをそれを必要とする患者に投与することを含む、ガン、疼痛、食欲不振および／または悪液質を処置する方法。
【請求項１６】
ガン、疼痛、食欲不振および／または悪液質の処置における使用のための請求項１０〜１３のいずれか一項記載の抗体フラグメント。
【請求項１７】
ガン、疼痛、食欲不振および／または悪液質の処置のための薬学的組成物の製造のための、請求項１０〜１３のいずれか一項記載の抗体フラグメントの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、トロポミオシン関連キナーゼＢレセプター（ＴｒｋＢ）の特定の部分に対するモノクローナル抗体、これらを産生するハイブリドーマ細胞株、抗体フラグメントおよびこれらを含むタンパク質、薬学的組成物、並びにガン、疼痛、食欲不振および／または悪液質を処置する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
トロポミオシン関連キナーゼレセプター（Ｔｒｋ）は、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３および４／５（ＮＴ３、ＮＴ４／５）を含むニューロトロフィンによって活性化される。Ｔｒｋは、神経発達、生存分化およびシナプス可塑性を調節する（Nikoletopoulou V. et al., 2010, Nature 467:59-63; Chao M.V., 2003, Nat Rev Neurosci 4:299-309）。ニューロトロフィンは、その特異的なＴｒｋサブタイプに結合することによってその細胞応答を開始する。ＮＧＦはＴｒｋＡに対して特異的であり、一方、ＢＤＮＦおよびＮＴ４／５はＴｒｋＢに対して特異的である。ＮＴ３は主にＴｒｋＣを活性化するが、より低い効率で他のＴｒｋも活性化する。Ｔｒｋに結合するニューロトロフィンは、Ｔｒｋの二量体化、および細胞質内ドメインの特定のチロシン残基における自己リン酸化を誘導する。これは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ、ＭＥＫ／ＥＲＫおよびＰＬＣγシグナル伝達経路を活性化するアダプタータンパク質のためのドッキング部位を作る（Huang E.J.およびReichardt L.F., 2003, Annu Rev Biochem 72:609-642）。Ｔｒｋ／ニューロトロフィン複合体の形成はまた、ニューロトロフィンのいくつかの生物学的機能に必要とされるエンドサイトーシスを開始する（Grimes M.L. et al., 1996, J Neurosci 16:7950-7964; Zheng J. et al., 2008, J Biol Chem 283:13280-132）。
【０００３】
ＴｒｋＢおよびその内因性リガンドＢＤＮＦはまた、哺乳動物におけるエネルギーバランスの調節および摂食行動にとって重要な成分である。以前の研究において本発明者らおよび他の著者らは、ＢＤＮＦおよびそのＴｒｋＢが、ＭＣ４Ｒの下流メディエーターであることを実証した（Xu B. et al., 2003, Nat Neurosci 6:736-742; Nicholson J.R. et al., 2007, J Neuroendocrinol 19:974-982; Bariohay B. et al., 2009, Endocrinology 150:2646-2653）。ヒトにおいては、ＴｒｋＢまたはＭＣ４Ｒのいずれかの遺伝子的機能不全は、過食症および肥満をもたらす（Yeo G.S. et al., 2004, Nat Neurosci 7:1187-1189）。
【０００４】
ＳｃＦｖ抗体フラグメントは、次世代の生物製剤の代表である（Kontermann R.E., 2010, Curr Opin Mol Ther 176-183）。完全抗体と比較してそのサイズが小さいことから、それらは血液／脳関門を通過することができる（Peter J.C. et al., 2010, J Pharmacol Exp Ther 478-490）。
【０００５】
発明の要約
本発明は、Ａｓｐ−２９８およびＣｙｓ−３０２を含む、配列番号１のＴｒｋＢの残基２５２〜３２２の配列から選択された少なくとも１４個のアミノ酸および最大５０個のアミノ酸からなるペプチドに対するモノクローナル抗体、特に、配列番号２のＢ１ペプチドに対するこのような抗体に関する。さらに、本発明は、本発明の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、特に細胞株５Ｇ５Ｄ２Ｂ５および６Ｂ７２Ｃ５に関する。さらに、本発明は、本発明の抗体のフラグメント、例えばＦａｂフラグメント、ｓｃＦｖフラグメントおよびＣＤＲｓ、このようなＣＤＲｓを含むタンパク質、およびこれらを含む薬学的組成物に関する。本発明はさらに、治療有効量の本発明の抗体フラグメントおよびこれらを含むタンパク質を投与することを含む、ガン、疼痛、食欲不振および／または悪液質を処置する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ａ．Ｂ１ペプチドを用いて免疫化され、抗ＴｒｋＢ抗体（Ａｂｓ）を産生するラット、ＣＯペプチドを用いて免疫化された対照ラット、および偽免疫化ラットの体重の漸進的変化Δ。―■―偽（ｎ＝１０）；―▲―対照（ＣＯペプチド、ｎ＝１０）；---▼---ＴｒｋＢ（Ｂ１ペプチド、ｎ＝１２）；ｘ軸 ｄ＝免疫化後の日数；ｙ軸Δ（ｇ）＝体重Δ（ｇ）。Ｂ１ペプチドを用いて免疫化されたラットは、２つの対照群と比較して、その体重の有意な（＊：ｐ＜０．０５、二元配置分散分析）徐々の増加を示した。ｂ．Ｂ１ペプチドを用いて免疫化されたラットのグルコース負荷試験およびインスリン負荷試験。パネルは、グルコース（グルコース負荷試験、左パネル）またはインスリン（インスリン負荷試験、右パネル）の腹腔内大量瞬時投与を受けたラットの糖血症を示す。対照ラットとＢ１免疫化ラットとの間には差異は全く検出されなかった。ｘ軸 min＝免疫化後の分；ｙ軸Δ（mM）＝グルコースΔ（Ｔｎ−Ｔ０）（mM）。ｃ．ＬＰＳ（７５μg/kg）の腹腔内注射を受け、Ｂ１ペプチドを用いて免疫化されたラットおよび対照ラットの累積的食物摂取。Ｂ１ペプチドを用いて免疫化されたラットは、対照ラットと比較して、ＬＰＳにより誘発された食欲不振に対する有意な早期の抵抗性を示した（＊：ｐ＜０．０５、繰り返しの測定を伴う二元配置分散分析）。ｘ軸 ｈ＝ＬＰＳ注入後の時間；ｙ軸 ｇ＝累積的食物摂取；左の棒（灰色）ＣＯ（ｎ＝１０）；右の棒（黒色）ＴｒｋＢ（ｎ＝１２）。
【図２】精製抗ＴｒｋＢ抗体は、天然型ＴｒｋＢに結合する。ａ．免疫沈降実験。ｂ．精製抗ＴｒｋＢ抗体は、天然型ＴｒｋＢに結合する。阻害ＥＬＩＳＡは、Ｂ１ペプチドおよびＴｒｋＢに対する結合の特異性を確認した。Ｃ＝対照；％Ｉ＝阻害％（ｙ軸）；Ｌｏｇ［Ｉ］（Ｍ）＝Ｌｏｇ［阻害剤］、濃度（Mol）（ｘ軸）；―■―Ｂ１ペプチド；―▲―組換えＴｒｋＢ。
【図３】ａ．ＰＣ１２細胞（左パネル）またはＥＳ細胞から調製されたニューロン（右パネル）において精製抗ＴｒｋＢ抗体（---▼---）および対照抗体（―▲―）を用いて得られた濃度反応曲線。―■―：ＰＢＳのみ。Ｙ軸：％＝リン酸化ＴｒｋＢ（最大に対する％）。１０nMのラット抗ＴｒｋＢ抗体の存在は最大効力を減少させたが、対照抗体は全く効果を及ぼさなかった。ｂ．ＰＣ１２細胞において精製抗ＴｒｋＢ抗体および抗ＴｒｋＢ Ｆａｂを用いて得られた濃度反応曲線。１０nMのラット抗ＴｒｋＢ Ｆａｂ（---▲---）の存在は最大効力を減少させた。―■―：ＰＢＳのみ。結果は、最大リン酸化の比率として表現される。結果は平均±ＳＤとして提示される；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１、Ｆ検定。ｙ軸：ＴｒｋＢリン酸化％；ｘ軸：Ｌｏｇ［ＢＤＮＦ］（Mol）。
【図４】抗ＴｒｋＢ抗体の存在下（破線の引かれた棒）または非存在下でＢＤＮＦを用いて（黒い棒）または用いずに（白い棒）処理されたＰＣ１２−ＴｒｋＢ細胞抽出物のウェスタンブロット。抗ＴｒｋＢ抗体の存在は、単独での内部移行またはＢＤＮＦによって誘発された内部移行を増加させた。結果は、平均内部移行率（％Ｉ）±ＳＤとして表現される；＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。
【図５】ＰＣ１２細胞における精製抗ＴｒｋＢ抗体（---▲---）および対照抗体（―■―）を用いて得られた濃度反応曲線。１０nMのラット抗ＴｒｋＢ抗体の存在は、ＰＬＣγリン酸化（Ｐ％）の最大効力を減少させたが、対照抗体は全く効果を及ぼさなかった。結果は、平均±ＳＤとして表現される；＊、ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。ｘ軸：Ｌｏｇ［ＢＤＮＦ］（Mol）、ｙ軸：ＴｒｋＢリン酸化％。
【図６】ａ．１μgの抗ＴｒｋＢ抗体または対照抗体を第三脳室に脳室内に（i.c.v.）受けたラットの累積食物摂取（ＦＩ）。ｂ．ｃ．及びｄ．  それぞれ、１回目、２回目および３回目の脳室内への注入から２４時間後の間の累積ＦＩを示す。ＴｒｋＢ抗体の脳室内への注入は、対照抗体（下の線）と比べて食物摂取を増加させた。データは平均±ｓｅｍとして提示される。＊、ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、二元配置分散分析検定。Ｙ軸：累積食物摂取（ｇ）；ｘ軸：ｈ＝時間（ｈ）。
【図７】ａ．及びｂ．ＰＣ１２細胞において精製抗ＴｒｋＢ ｍＡｂ ５Ｇ５Ｄ２Ｂ５および抗ＴｒｋＢ ｓｃＦｖ ５Ｇ５Ｄ２Ｂ５を用いて得られた濃度反応曲線。ｙ軸：％＝リン酸化ＴｒｋＢ（最大に対する％）。３０nMのラット抗ＴｒｋＢ ｍＡｂ ５Ｇ５Ｄ２Ｂ５（ａ．（---▼---））または３００nMのｓｃＦｖ ５Ｇ５Ｄ２Ｂ５（３００nM）（ｂ．（---▼---））の存在は最大効力を減少させた。―■―：ＰＢＳのみ。結果は、最大リン酸化の比率として表現される、＊＊ｐ＜０．０１ Ｆ検定。ｘ軸：Ｌｏｇ［ＢＤＮＦ］（Ｍ）。ｃ．ｓｃＦｖ ５Ｇ５Ｄ２Ｂ５または抗ＴｒｋＢ抗体の存在下または非存在下でＢＤＮＦを用いてまたは用いずに処理されたＰＣ１２−ＴｒｋＢ細胞抽出物のウェスタンブロットによって研究されたＴｒｋＢの内部移行。ｓｃＦｖ ５Ｇ５Ｄ２Ｂ５の存在は、ＢＤＮＦによって誘導された内部移行を増加させた。結果は、平均内部移行率（％Ｉ）±ＳＤとして表現される；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１、一元配置分散分析。
【図８】ａ．１μgのｓｃＦｖ ５Ｇ５Ｄ２Ｂ５（上の曲線）（ｎ＝９）またはＢＳＡ（下の曲線）（ｎ＝７）を第三脳室に脳室内に受けたラットの７日間の累積食物摂取（ＦＩ）。ｓｃＦｖ ５Ｇ５Ｄ２Ｂ５の注入は対照と比較してＦＩを増加させた。ｈ＝時間（ｈ）。ｂ．ｓｃＦｖ ５Ｇ５Ｄ２Ｂ５または対照としてのＢＳＡの脳室内への投与後７日間における体重変化（ｇ）（ｙ軸）。ｓｃＦｖ ５Ｇ５Ｄ２Ｂ５（---▲---）は、ＢＳＡ（―■―）を受けたラットと比較して体重の増加を誘導した。データは、平均±ｓｅｍとして提示される。＊：ｐ＜０．０５、二元配置分散分析ボンフェリーニポストホックテスト。ｄ＝時間（日数）。
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明は、Ａｓｐ−２９８およびＣｙｓ−３０２を含む、配列番号１のＴｒｋＢの残基２５２〜３２２（ＴｒｋＢレセプターのｄ５ドメイン）の配列から選択された少なくとも１４個のアミノ酸および最大５０個のアミノ酸からなるペプチドに対するモノクローナル抗体に関する。
【０００８】
好ましいのは、Ａｓｐ−２９８およびＣｙｓ−３０２を含む、配列番号１のＴｒｋＢの残基２８０〜３２０の配列から選択された少なくとも１６個のアミノ酸および最大２５個のアミノ酸からなるペプチドに対するモノクローナル抗体である。
【０００９】
最も好ましいのは、Ｂ１ペプチド、すなわちTITFLESPTSDHHWCIPFTV（配列番号２）、すなわちＴｒｋＢの残基２８８〜３０７（配列番号１）に対するモノクローナル抗体、特に、Deutsche Sammlung fur Mikrooorganismen und Zellkulturen (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, DSMZ)にＤＳＭ ＡＣＣ３１２４およびＤＳＭ ＡＣＣ３１２５の番号でそれぞれ２０１１年４月１５日に寄託されたハイブリドーマ細胞株５Ｇ５Ｄ２Ｂ５およびハイブリドーマ細胞株６Ｂ７２Ｃ５によって産生されたモノクローナル抗体である。
【００１０】
同様に、本発明は、Ａｓｐ−２９８およびＣｙｓ−３０２を含む、配列番号１のＴｒｋＢの残基２５２〜３２２の配列から選択された少なくとも１４個のアミノ酸および最大５０個のアミノ酸からなるペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に関する。
【００１１】
好ましいのは、Ａｓｐ−２９８およびＣｙｓ−３０２を含む、配列番号１のＴｒｋＢの残基２８０〜３２０の配列から選択された少なくとも１６個のアミノ酸および最大２５個のアミノ酸からなるペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞である。
【００１２】
最も好ましいのは、Ｂ１ペプチド（配列番号２）に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、特に、ＤＳＭＺにＤＳＭ ＡＣＣ３１２４およびＤＳＭ ＡＣＣ３１２５の番号でそれぞれ２０１１年４月１５日に寄託されたハイブリドーマ細胞株５Ｇ５Ｄ２Ｂ５およびハイブリドーマ細胞株６Ｂ７２Ｃ５である。
【００１３】
さらに、本発明は、記載された抗体のフラグメントに関する。考えられるフラグメントは、ＦａｂおよびｓｃＦｖフラグメント、並びに相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、例えば、ｍＡｂ ６Ｂ７２Ｃ５と命名されたモノクローナル抗体のＣＤＲｓ：
【化１】
2014516959.tif 000002
およびｍＡｂ ５Ｇ５Ｄ２Ｂ５と命名されたモノクローナル抗体のＣＤＲｓ：
【化２】
2014516959.tif 000003
を提示するタンパク質；
および配列番号３〜１４のこれらの記載されたＣＤＲｓを含むタンパク質である。
【００１４】
モノクローナル抗体の製造のために、標準的な方法を使用し得る。好ましくは、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、完全フロイントアジュバント中で乳化させた遊離Ｂ１ペプチドを用いて免疫化し、そして１０〜４０μg、例えば２５μgの量を皮下（s.c.）注射し、続いて、不完全フロイントアジュバント中の同量の遊離Ｂ１ペプチドのブースター注射を２〜５週間後、例えば４週間後に行なう。さらに２〜５週間後、より少量の、例えば１０μgのペプチド（アジュバントを含まない）（ＮａＣｌ ０．９％に溶解）を、融合のために脾臓細胞を収集する３日前に静脈内注入する。融合は、好ましくは、ポリエチレングリコール、例えばポリエチレングリコール１５００、またはセンダイウイルスを用いて行われ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ遺伝子）を欠失したミエローマ細胞、例えばＳＰ２／Ｏ細胞と、好ましくはＳＰ２／Ｏミエローマ細胞に対する脾臓細胞が１：２の割合で融合させる。ハイブリドーマを、マウス腹膜マクロファージまたは他のフィーダー細胞で予めコーティングされた９６ウェルプレート中で培養する。１ウェルあたり１０５〜１０６個の融合細胞を、５％ＣＯ２の雰囲気下の３７℃の加湿インキュベーター中の、熱により失活させたウシ胎児血清、グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリンおよび／またはストレプトマイシンの補充されたイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、およびＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）またはＨＡＴを含む等価な培地中に分配する。分泌しているクローンを酵素イムノアッセイによってスクリーニングし、そして限界希釈法によってサブクローニングする。
【００１５】
ｓｃＦｖｓの製造は、同様に、標準的な方法を使用して実施することができる。例えば、全ＲＮＡは、ＲＮＡｎｏｗキット（BiogentexInc., Seabrook, TX, USA)）を使用して、約１０７個の新しくサブクローニングされたハイブリドーマ細胞から調製される。第１鎖ｃＤＮＡは、iScript（商標）ｃＤＮＡ合成キット(Biorad, Hercules, CA, USA)を使用して合成され得る。ＶＨ鎖およびＶＬ鎖ドメインは、ＩｇＧプライマーセット（Novagen, Gibbstown, NJ, USA）を使用してＰＣＲによって増幅される。ｓｃＦｖタンパク質は、そのＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を共に、オーバーラップ伸長によるＰＣＲスプライシングによって、ＶＨ遺伝子のＣ末端とＶＬ遺伝子のＮ末端との間の１５アミノ酸リンカー（Ｇ４−Ｓ）３をコードするオリゴヌクレオチドを使用して接続することによって創造される。
【００１６】
さらに、本発明は、ヒト抗体フレームワークまたはヒトｓｃＦｖフレームワークへの前記したＣＤＲｓの移植に関する。
【００１７】
さらに、本発明は、抗体フラグメントを含む薬学的組成物に関する。非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る、水性および非水性無菌注射溶液；懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性無菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単位投与量または複数回投与量用の容器で、例えば封をしたアンプルおよびバイアルで提示され得、そして使用直前に無菌液体担体、例えば注射用水の添加だけを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。即時注射溶液および懸濁液は、以前に記載された種類の無菌粉末、顆粒剤および錠剤から調製され得る。本発明のｓｃＦｖ抗体は、当業者に公知の製剤方法を使用して、薬学的に許容される組成物中の合成ペプチドまたは単離されたおよび実質的に精製されたタンパク質またはタンパク質フラグメントまたはその組合せとして提供され得る。これらの組成物は、標準的な経路によって投与され得る。
【００１８】
さらに、本発明は、治療有効量の本発明の抗体フラグメントをそれを必要とする患者に投与することを含む、ガン、疼痛、悪液質または神経性食欲不振の処置法に関する。
【００１９】
処置しようとするガンの例としては、神経系のガン、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、グリア腫瘍、ミエローマ、カポジ肉腫、白血病、メラノーマ、前立腺腺ガン、並びに肝臓および膵臓の腺腫が挙げられる。本発明は同様に、血管新生、腫瘍形成および転移を抑制することによってガンを処置することに関する。
【００２０】
疼痛処置の態様において、疼痛は、神経因性疼痛および／またはＣＮＳ機能不全に関連している。さらなる態様において、疼痛は、神経因性疼痛、体性疼痛または内臓痛であり得る。例えば、神経因性疼痛は、神経または神経経路の損傷に関連し得る。さらに別の態様において、疼痛は、慢性炎症疼痛、関節炎に関連した疼痛、線維筋痛症、背部痛、ガン関連疼痛、消化管の疾病に関連した疼痛、クローン病に関連した疼痛、自己免疫疾病に関連した疼痛、内分泌疾病に関連した疼痛、糖尿病性腎症に関連した疼痛、幻肢痛、自発痛、慢性術後疼痛、慢性側頭下顎疼痛、灼熱痛、ヘルペス後神経痛、ＡＩＤＳ関連疼痛、Ｉ型およびＩＩ型複合性局所疼痛症候群、三叉神経痛、慢性背部疼痛、並びに脊髄損傷または再発性急性疼痛に関連した疼痛であり得る。
【００２１】
悪液質および神経性食欲不振は、体重の深刻な減少によって特徴付けられる生命を脅かす疾病である。悪液質は、ガン、炎症または感染などの種々の基礎疾患によって引き起こされるが、罹患率および死亡率に対する独立したリスク因子である。神経性食欲不振は、精神疾病であり、強い空腹感にも関わらず患者が食べることを計画的に拒絶することによって体重の減少が引き起こされる。これらの患者の負のエネルギーバランスはしばしば、増加した身体活動によって増強される。
【００２２】
同様に、本発明は、ガン、疼痛、悪液質または神経性食欲不振の処置における使用のための抗体フラグメント、およびガン、疼痛、悪液質または神経性食欲不振の処置のための薬学的組成物の製造のための本発明の抗体フラグメントの使用に関する。
【００２３】
科学的な根拠は以下の通りである：
【００２４】
ラットを、ＴｒｋＢとその内因性リガンドであるＢＤＮＦの相互作用の特異性に関与するＴｒｋＢの細胞外ループに由来するペプチドに対して免疫化した。このペプチドを用いて免疫化されたラットは、特異的な抗体を生じ、これを精製し、そしてＴｒｋＢを発現するＰＣ１２細胞またはマウスＥＳ細胞から調製されたニューロンを使用して、一連のin vitro実験において評価した。抗ＴｒｋＢ抗体を産生したラットは、ＴｒｋＢの遮断と一致して、実験の時間経過中に体重の徐々の増加を示した。増加した食物摂取が、ラットへの精製抗ＴｒｋＢ抗体の中枢への投与後に観察された。
【００２５】
ラットの免疫化により、ＴｒｋＢ遮断と一致する穏やかな表現型が得られ、明らかな神経学的作用を全く伴わなかった。in vitro並びにin vivoにおいて実証されたＴｒｋＢ活性に対する抗体の効力のために、これらの抗体を、薬理学的ツールとして使用することができ、そして治療剤としての使用のために改変させることができる。
【００２６】
抗ＴｒｋＢ抗体を産生するラットは、対照ラットと比較して次第にそして有意にその体重を増加させた（図１ａ、ｐ＜０．０５、繰り返しの測定を伴う二元配置分散分析、ボンフェローニポストホックテスト）。グルコース負荷またはインスリン負荷のいずれによっても、免疫化ラットのグルコース代謝の有意な変化は判明しなかった（図１ｂ）。免疫化から８０日後、ラットは、リポ多糖（ＬＰＳ）の腹腔内注入を受けた。抗ＴｒｋＢ抗体を発達させたラットの食物摂取は、対照ラットと比較して有意により高かった（ｐ＜０．０５、繰り返しの測定を伴う二元配置分散分析）（図１ｃ）。実験終了時に、代謝並びに臓器重量における差異は全く見られなかった（表ＩおよびＩＩ）。体重および体重／体長の比は、ＴｒＫＢ免疫化ラットにおいてより高かった。
【００２７】
【表１】
2014516959.tif 000004
【００２８】
【表２】
2014516959.tif 000005
【００２９】
抗体の選択性を、免疫細胞蛍光法、免疫沈降法および阻害ＥＬＩＳＡによって研究した。ＰＣ１２細胞からの膜調製物を使用した免疫沈降は、抗ＴｒｋＢ抗体とＴｒｋＢとの間の相互作用を実証した（図２ａ）。阻害ＥＬＩＳＡはこの相互作用を確認し、そして抗ＴｒｋＢ抗体が、ＴｒｋＢに対するのと比べてＢ１ペプチドに対して一見したところ１０００倍高い親和性を有することを示した（図２ｂ）。
【００３０】
抗ＴｒｋＢ抗体の薬理活性は、ＴｒｋＢを発現しているＰＣ１２細胞およびマウスＥＳ細胞から調製されたニューロンにおいて研究された。これらの実験において、細胞を、抗ＴｒｋＢ抗体の存在下または非存在下で漸増濃度のＢＤＮＦを用いて処理した。その活性化を反映するＴｒｋＢのリン酸化は、ウェスタンブロット実験によって研究された（図３ａ）。１０nMの抗ＴｒｋＢ抗体の存在下、ＴｒｋＢリン酸化に対するＢＤＮＦの最大効果は、両方の細胞型において有意に減少した（ｐ＜０．００１、Ｆ検定；図３ｂ）。抗ＣＯ抗体の存在は、最大効果に影響を及ぼさなかった。さらに精製抗ＴｒｋＢ抗体から調製されたＦａｂフラグメントは、ＰＣ１２細胞に対して同じ効果を及ぼした（図３ｃ）。
【００３１】
ＴｒｋＢの内部移行は、ＴｒｋＢを発現しているＰＣ１２細胞において研究された。ＢＤＮＦの処理は、ＴｒｋＢの内部移行を増加させた（図４）。抗ＴｒｋＢ抗体の存在は、ＴｒｋＢの基礎内部移行およびＢＤＮＦの存在下における内部移行の５０％の増加を誘導した（図４）。
【００３２】
ＴｒｋＢシグナル伝達経路に対する抗ＴｒｋＢ抗体の効果が研究され、ＴｒｋＢ遮断の下流における効果が確認された。抗ＴｒｋＢ抗体の存在は、漸増濃度のＢＤＮＦを用いてのＰＣ１２細胞の処理時に、ＰＬＣγリン酸化の最大活性化の有意な減少を誘導した（図５）。
【００３３】
精製抗ＴｒｋＢ抗体または抗ＣＯ抗体（１μg）を、ラットの第三脳室に注入した。抗ＴｒｋＢ抗体を受けたラットは、対照ラットと比較して、７２時間におよび食物摂取の有意な増加を示した（ｐ＜０．０５、繰り返しの測定を伴う二元配置分散分析、図６ａ）。効果は最初の２４時間では中程度であったが（＋１５％）、注射後の２回目の２４時間の期間ではより強力（＋２８％）および有意（ｐ＜０．０１、繰り返しの測定を伴う二元配置分散分析）となった（図６ｂ、ｃ）。３回目の２４時間後では、効果は依然として存在しているようであったが（＋１９％）、もはや有意ではなかった（図６ｄ）。これらのラットにおいては副作用（神経障害）は全く観察されなかった。
【００３４】
これらの結果は、ＭＣ４Ｒの下流経路の一部であるＴｒｋＢに対する薬理学的に活性な抗体を生成することができることを実証した。抗原として使用される適切なターゲットペプチドの選択は、成功裏な免疫化にとって必要条件である。ＴｒｋＢレセプターのＤ５ドメインの結晶構造から、ＮＴ４／ＢＤＮＦの推定結合部位に対応するループが選択された。その細胞外ループに対する体液性免疫応答を誘導することによって、誘導された抗体はニューロトロフィンの接近を遮断し、それ故、ＴｒｋＢレセプターの活性化を遮断する。
【００３５】
担体タンパク質へと結合させていない、完全フロイントアジュバント中のペプチドが注入された。
【００３６】
抗ＴｒｋＢ抗体の特性を、Ｂ１ペプチドの免疫吸着による精製後に一連のin vitro実験において評価した。ヒトＴｒｋＢを発現しているＰＣ１２細胞における免疫化学実験、免疫沈降実験または阻害ＥＬＩＳＡは、ＴｒｋＢに対する抗体の特異的結合を実証した。抗体の見かけの親和性は、ペプチドＢ１と比較してＴｒｋＢに対してより低いようであった。これはおそらく、ペプチドと比較してレセプターの結合部位へより接近しにくいことに起因するのだろう。
【００３７】
ＴｒｋＢを発現しているＰＣ１２細胞における実験において、抗ＴｒｋＢ抗体の存在は、ＴｒｋＢリン酸化に対するＢＤＮＦの最大効力を減少させた。この薬理学的プロファイルは、マウスＥＳ細胞から調製されたニューロンにおいて確認された。抗ＴｒｋＢ抗体はレセプターの内部移行をトリガーし、それによりＢＤＮＦへのレセプターの曝露を制限した。内部移行実験は、抗ＴｒｋＢ抗体の存在が、基礎内部移行およびＢＤＮＦにより誘発された内部移行を２倍、倍加させたことを示した。
【００３８】
抗ＴｒｋＢ抗体は、レセプターに対するアゴニスト特性を有し、そしてその内部移行を誘導した。完全分子と同じ遮断特性を有する一価Ｆａｂフラグメントが産生された。さらに、ＢＤＮＦ処理時のＰＬＣγリン酸化が、抗ＴｒｋＢ抗体の存在下または非存在下においてＰＣ１２細胞において研究された。ＰＬＣγリン酸化に対するＢＤＮＦの最大効力の同じ減少が観察され、これによりＴｒｋＢの遮断が確認された。総合すると、これらの情報は、観察された内部移行の現象は、二量体化に応答したレセプターの活性化に因るものではなく、そして全体的細胞応答は、ＰＬＣγの減少した効力であることを示す。
【００３９】
免疫化後、ラットは抗ＴｒｋＢ抗体を発達させ、そして体重の徐々の増加を示した。抗ＴｒｋＢ抗体を発達させたラットは、そのグルコース代謝の障害を全く示さず、グルコース負荷試験もインスリン負荷試験も、対照ラットと比較して差異を全く示さなかった。さらに、臓器重量の差異も検出されなかった。対照と比べてこれらのラットにおいて、体重のみが増加した。
【００４０】
ＴｒｋＢに対して能動免疫化させておいたラットにＬＰＳを注入した場合、食物摂取の減少が部分的に防御された。これらの結果は、抗ＴｒｋＢ抗体が、ＬＰＳにより誘発される食欲不振に対して有意な防御を付与することを示す。ＢＤＮＦがＭＣ４Ｒ刺激後に放出されることを考慮すると、これらの観察は、薬理学的手段または遺伝子操作によるＭＣ４Ｒの遮断がＬＰＳモデルにおいて防御的作用を有することを実証した報告と一致する。
【００４１】
総合すると、これらの実験は、ＴｒｋＢペプチドを用いてのラットの免疫化により、増加した体重を有する表現型が得られることを実証した。精製抗ＴｒｋＢ抗体は、ＴｒｋＢの遮断剤としてin vitroにおいて特徴付けられ、これはその内部移行を増強することによって作用した。精製抗体の受動移入は、食物摂取の増加を誘発した。急性または慢性のＴｒｋＢ遮断の主な効果は、正のエネルギーバランスの誘導であるようである。それ故、このような抗体およびその誘導体を、食欲不振および悪液質を処置するために使用することができる。
【００４２】
実施例
ペプチド
ＴｒｋＢのＤ５ドメインの第１ループに対応するペプチド（Banfield M.J. et al., Structure 9:1191-1199）（Ｂ１ペプチド、TITFLESPTSDHHWCIPFTV（配列番号２）、残基２８８〜３０７）および対照（ＣＯ）ペプチド（Peter J.C. et al., 2007, Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 292:R2151-2158）を合成した（Neimark J.およびBriand J.P., 1993, Pept Res 6:219-228）。
【００４３】
動物
実験開始時に６週令の雄のＳＤラット（最初の体重は約２００ｇ）を、チャールス・リバー(Charles River Laboratories, L’Arbresle, France)から入手し、そして一定温度（２２℃）および湿度（５０％）を有する部屋で１２時間の明暗サイクル（午前６：００から午後６：００まで明るい）で保持した。ラットを実験開始の１週間前に個別に収容し、そして水道水および標準的な飼料（ＮＡＦＡＧ３４３２、３．０kcal/g、炭水化物から６１．６％の総カロリー、タンパク質から２４．８％、および脂肪から１３．６％、Nafag Ecosan, Switzerland）に自由に近づけるようにした。全ての実験は、動物実験のためのスイス規則（Swiss regulations for animal experimentation.）に従って実施された。
【００４４】
ラットにおける能動免疫化
ラットを３群に分けた：偽処理された対照群（偽、ｎ＝１０）、Ｂ１ペプチドを用いて免疫化された群（ｎ＝１２）、およびＣＯペプチドを用いて免疫化された群（ｎ＝１０）。ペプチドを首の後ろに皮下に（s.c.）適用した（初回の注射では０．２mlの完全フロイントアジュバント中２５μgのペプチド／ラット）。３０および６０日後、ラットは不完全フロイントアジュバント中のペプチドの２回のブースター注射を受けた。免疫化手順の効力を推定するために、イソフルランによる麻酔下で尾を出血させることによって、各注射の前に血液を収集し、そして抗ペプチド抗体（Ａｂｓ）の存在をＥＬＩＳＡ試験によって評価した。体重および食物摂取を、午前９：００に１週間に１回記録した。実験終了時にラットをイソフルラン麻酔下で断頭によって屠殺し、そして血液をＥＤＴＡで処理したチューブに収集した。
【００４５】
直接ＥＬＩＳＡによる免疫応答の決定
Ｂ１およびＣＯペプチド（２μM）を、３７℃で１時間インキュベーションすることによって、９６ウェルマイクロタイタープレート（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）上に炭酸緩衝液（Ｎａ２ＣＯ３１５mM、ＮａＨＣＯ３３５mM、ｐＨ９．６）を用いて５０μl／ウェルで吸着させた。プレートを、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Sigma, St. Louis, MO, USA）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Fluka, Buchs, Switzerland）（ＰＢＳ−Ｔ ＢＳＡ）の補充されたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Ｎａ２ＨＰＯ４１０mM、ＮａＣｌ １５０mM、ＫＣｌ ２７mM、ｐＨ７．４）を用いて室温（ＲＴ）で１時間かけて飽和させた。ラット血清の連続希釈液をプレートに加え、そして室温で１時間インキュベーションした。その後、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）を含むＰＢＳを用いて洗浄し、そして１／５０００に希釈したヤギ抗ラット免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）セイヨウワサビペルオキシダーゼ抱合体（Jackson Immunoresearch Laboratories, San Diego, CA, USA)）と共にインキュベーションした。プレートをＰＢＳ−ＴおよびＰＢＳを用いて洗浄した後、酵素反応を、０．０４％Ｈ２Ｏ２の存在下で３，３’−５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を加えることによって室温で実施した。反応を、ＨＣｌ（１Ｎ）の添加によって１５分後に停止した。４５０nmにおける吸光度を、マイクロプレートリーダーMultiscan RC (Labsystem, Kilsyth, Victoria, Australia)を使用することによって測定した。
【００４６】
阻害ＥＬＩＳＡ
精製ＴｒｋＢ抗体を、漸増濃度の（２×１０−１２から２×１０−６Ｍ）Ｂ１ペプチドまたは組換えＴｒｋＢの溶液と共にプレインキュベーションした。混合物を標準的なＥＬＩＳＡ手順にかけた（Peter J.C.et al., 2007, Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 292: R2151-2158）。
【００４７】
抗体（Ａｂｓ）の精製
ラット血清からの抗ＴｒｋＢ抗体または抗ＣＯ抗体をそれぞれ、製造業者の指示に従って、そのＮ末端によって活性化ＣＮＢｒ−セファロース４Ｂカラム（Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）に結合させた、Ｂ１またはＣＯペプチド上でアフィニティ精製した。ＰＢＳ中で２倍に希釈した血清をカラムに４℃でローディングした。抗体を、０．２ＭグリシンｐＨ２．７を用いて溶出し、１Ｍトリス緩衝液ｐＨ８を含むチューブに収集し、続いてＰＢＳに対して４℃で一晩かけて透析し、そして最後に−２０℃で保存した。
【００４８】
Ｆａｂフラグメント調製
Ｆａｂフラグメントを、アフィニティ精製した抗ＴｒｋＢ抗体のパパイン（Fluka）による消化（パパイン／抗体の比は１／１００）によって得た。３７℃で８時間後、反応をヨードアセトアミド３０mM（Sigma）によって停止した。ＦａｂフラグメントをＰＢＳに対して透析し、そしてＴｒｋＢペプチドに結合させたＣＮＢｒ−セファロース４Ｂ（GE Healthcare）上でのアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。Ｆａｂの純度は、銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって評価した。
【００４９】
細胞培養
胚幹細胞を分化させ、そしてBibel M et al., 2004, Nat Neurosci 7:1003-1009によって記載されている通りに培養した。ヒト（ｈ）ＴｒｋＢを発現しているＰＣ１２細胞を、１０％ウマ血清および５％ウシ胎児血清（Bioconcept, Allschwil, Switzerland）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco, Grand Island, NY, USA）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Sigma, St. Louis, MO, USA）中で７％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７℃で培養した。
【００５０】
免疫細胞蛍光
ＴｒｋＢを発現しているＰＣ１２細胞を、２％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液を用いて１５分間かけて固定した。スライドを、１％ＢＳＡの補充されたＰＢＳを用いて飽和させた。抗ＴｒｋＢ抗体または抗ＣＯペプチド抗体（７μg/ml）を細胞上に室温で１時間かけて適用した。ＰＢＳを用いて２回洗浄した後、ヤギ抗ラットAlexafluor 594抱合体（１／５００、Molecular Probes, Junction City, OR, USA）を固定された一次抗体と室温で１時間かけて反応させた。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）（１μg/ml、Molecular Probes）を核染色のために使用した。同じ拡大率（４００倍）および露光時間（５００ms）を各スライドについて使用した。
【００５１】
免疫沈降
ＴｒｋＢを発現しているＰＣ１２細胞を、氷上で１時間かけて抗プロテアーゼカクテル（Roche）の補充された冷ＲＩＰＡ緩衝液（５０mMトリスｐＨ８、１５０mM ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０ ０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）中で溶解した。１０，０００×ｇで３０分間遠心分離した後、タンパク質濃度をＢＣＡキット（Pierce Chemical, Rockford, IL, USA）を使用することによって決定した。１００μgのＴｒｋＢ膜調製物を、２５μgの精製抗ＴｒｋＢ抗体または２．５μgの市販の抗ＴｒｋＢ抗体（ｓｃ−１１、Santa Cruz)と共に４℃で一晩かけてインキュベーションした。混合物を３０μgのプロテインＧと共に免疫沈降させた。試料を１０％ポリアクリルアミドゲル上にローディングし、そしてニトロセルロース膜上に転写した。ＴｒｋＢの存在を、抗ＴｒｋＢ ｍＡｂ １／５００（BD Biosciences）を使用して検出した。
【００５２】
ＴｒｋＢリン酸化アッセイ
ＴｒｋＢを発現しているＰＣ１２細胞を、実験の３日前にポリＬ−リジン（Sigma）で予め処理しておいた６ウェル培養プレートに移した。ＰＣ１２細胞またはニューロンを、ダルベッコ改変イーグル培地（Sigma-Aldrich）を用いて４時間かけて洗浄し、そして３７℃で３０分間かけて１０nMの精製抗ＴｒｋＢ抗体と共に、０．１％ＢＳＡ（Sigma）の補充されたＰＢＳ中でプレインキュベーションした。その後、細胞を、漸増濃度のＢＤＮＦ（１０−１０Ｍから１０−６Ｍ）を用いて１５分間かけて３７℃で処理した。細胞をＰＢＳで洗浄し、チューブに収集し、そしてペレットを、抗プロテアーゼ（Roche）および抗ホスファターゼ（１／１００、Sigma P2850およびP5726）の補充された冷ＲＩＰＡ緩衝液（５０mMトリスｐＨ８、１５０mM ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０ ０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）を用いて氷上で１時間かけて溶解した。１０，０００×ｇで３０分間遠心分離した後、１５μgの上清（ＢＣＡキットを使用することによって決定、Pierce Chemical, Rockford, IL）を１０％ポリアクリルアミドゲル上にローディングし、そしてニトロセルロース膜へと転写した。リン酸化ＴｒｋＢの存在を、抗リン酸化ＴｒｋＢ抗体 １／１００（Cell Signaling）を使用して検出し、そしてシグナルを抗ＴｒｋＢ ｍＡｂ １／５００（BD Biosciences）を使用して正規化した。リン酸化ＰＬＣγの存在を、抗リン酸化ＰＬＣγ抗体 １／５００（Cell Signaling）によって検出し、そしてシグナルを抗ＰＬＣγ抗体 １／２０００（Cell Signaling）を使用して正規化した。結果は、リン酸化Ｔｒｋと全ＴｒｋまたはＰＬＣγタンパク質との間の最大比率として表現される。
【００５３】
ＴｒｋＢ内部移行アッセイ
ＴｒｋＢ内部移行アッセイは、Du et al., 2003によって記載された通りに実施された。ＴｒｋＢを発現しているＰＣ１２細胞を、４℃で３０分間の間に１０nMの抗ＴｒｋＢ抗体を用いてまたは用いずに前処理した。その後、細胞をＢＤＮＦ（１０−８Ｍ）を用いて１５分間かけて４℃で刺激した。細胞を３回冷ＰＢＳを用いて洗浄した。細胞表面タンパク質を、１０mM Ｃａ２＋および１０mM Ｍｇ２＋を含むＰＢＳ中０．５mg/mlのＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン（Pierce Chemical Co）を用いて２．５分間かけて３７℃で標識し、そしてその後、氷冷ＰＢＳを用いて十分に洗浄した。内部移行は、３０分間かけて温培地（３７℃）へと切り替えることによって開始された。残りのビオチニル化表面タンパク質を、グルタチオン緩衝液（５０mM還元グルタチオン、１００mM ＮａＣｌ、１mg/ml ＢＳＡ、１mg/mlグルコースおよび５０mMトリス、ｐＨ８．６）を用いて３回３０分間かけて４℃で洗浄することによって脱ビオチニル化した。細胞を、さらに２回、ＰＢＳを用いて洗浄し、そして溶解緩衝液（ＴｒｋＢリン酸化アッセイを参照）を用いて収集した。内部移行しビオチニル化されたタンパク質（５０μg）を、固定ストレプトアビジンによって沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてモノクローナル抗ＴｒｋＢ抗体（１：２００；Cell Signaling）を使用してウェスタンブロットにかけた。
【００５４】
グルコースおよびインスリン負荷試験
グルコースまたはインスリン負荷試験の前日に、ラットを、５０％の食物制限にかけた。翌日、ラットは、グルコース負荷試験のために１０mg/kgでグルコースの腹腔内（i.p.)注射を、またはインスリン（２mg/kgで０．４５Ｕ/ml）を午前９：３０に受けた。血液を、腹腔内への注入からｔ＝０、１５、３０、６０および１２０分後に尾の出血によって収集した。血漿中グルコース（ＲＴＵキット、Biomerieux, Marcy l’Etoile, France）および血漿中インスリン（ラットインスリンＲＩＡキットLinco, St. Charles, Mo, USA）を測定した。同じ実験を、インスリン負荷試験のために腹腔内（２mL/kgで０．４５Ｕ/mL）で実施し、血漿中グルコース測定を行なった。
【００５５】
脳室内（i.c.v.）へのカニューレ挿入
雄Sprague-Dawleyラット（２７５〜３２５ｇ）を、医療用酸素中のイソフルラン（麻酔誘導のためには４％、および麻酔維持のためには２％）を用いて麻酔した。ステンレス鋼カニューレ（２６ゲージ、１０mm長）を、十字縫合に対して、以下の座標を使用して、第３脳室に移植した：前後−２．３mm、正中線の側方０mm、および頭蓋骨の表面に対して腹側−７．５mm。誘導用カニューレを４つのステンレス鋼ねじ並びに歯用アクリルおよびセメントを用いて所定の位置に固定し、そして探り針を挿入して使用までカニューレに封をした。Temgesic（登録商標）（Essex Chemie AG, Lucerne, Switzerland）（０．０３mg/kg）を手術後２日間皮下に投与した。手術から回復した７日後、第３脳室へのカニューレ配置の正確度を、５μlの注入容量中の２０pmolのアンギオテンシンＩＩの脳室内への注入に対する口渇誘発応答（１５分間以内に少なくとも５mlの水を直ちに飲む）を測定することによって試験した。
【００５６】
脳室内への注射
精製抗ＴｒｋＢ抗体を、ハミルトンシリンジを使用して２μlの容量中１μgの用量で午前９：００に脳室内へとゆっくりと（１分間）注入した。ラット抗体の注入後、食物摂取を、１時間間隔で自動食物摂取装置（TSE Systems, Bad Homburg, Germany）を使用してその後の３日間の間に連続的に記録した。
【００５７】
リポ多糖の注入
リポ多糖（ＬＰＳ）（Sigma）を、午前５：３０に、すなわち暗期間の開始３０分前に、７５μg/kgの用量で腹腔内（i.p.）に注入した。食物摂取を連続的に測定した。
【００５８】
モノクローナル抗体の製造
Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、完全フロイントアジュバント中で乳化させた２５μgの遊離Ｂ１ペプチドを用いて免疫化し、そして皮下（s.c.）に注入した。４週間後、不完全フロイントアジュバント中の２５μgのブースター注射を投与した。さらに４週間後、ＮａＣｌ ０．９％に溶解した１０μgのペプチドを、融合のために脾臓細胞を収集する３日前に静脈内注入した。融合は、ポリエチレングリコール１５００（Sigma, Saint Louis, MO, USA）を用いて、１つのＳＰ２Ｏミエローマ細胞に対して２つの脾臓細胞の比率で実施した。ハイブリドーマを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの１０００個の細胞／ウェルの腹膜マクロファージで予めコーティングされた９６ウェルプレートで培養した。１ウェルあたり５×１０５個の細胞を、３７℃の加湿インキュベーター中、５％ＣＯ２の雰囲気下の、１０％の熱で失活させたウシ胎児血清、２００mMグルタミン、１００mMピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリンストレプトマイシン（Omnilab, Mettmenstetten, Switzerland）、３％ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン（HAT, Gibco, Lucerne, Switzerland）の補充されたイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）に分配した。分泌しているクローンを、酵素イムノアッセイによってスクリーニングし、そして限界希釈によってサブクローニングした（Oi et al., J Exp Med 1980;151:1260-1274)。
【００５９】
ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子の単離
全ＲＮＡを、ＲＮＡｎｏｗキット（Biogentex Inc., Seabrook, TX, USA）を使用して１０７個の新たにサブクローニングされたハイブリドーマ細胞から調製し、そして第１鎖ｃＤＮＡを、iScript（登録商標）cDNA Synthesisキット(Biorad, Hercules, CA, USA)を使用して合成した。ＶＨおよびＶＬ鎖ドメインを、ＩｇＧプライマーセット（Novagen, Gibbstown, NJ, USA）を使用してＰＣＲによって増幅した。５０μlのＰＣＲ混合物は、５０ngのハイブリドーマｃＤＮＡ、２０pmolの各々の適切なプライマー、２５０μMの各ｄＮＴＰ、１×Ｔａｑ緩衝液（Sigma)および１ＵのThermophilus aquaticus (Taq)ポリメラーゼを含んでいた。増幅は、サーモサイクラー（PTC-150, MJ Research, Waltham, MA, USA）における、９４℃で１．５分間、５５℃で２．５分間および７２℃で３分間を５０サイクル含んでいた。増幅ＤＮＡｓをｐＧＥＭＴベクター（Promega, Madison, WI, USA）にライゲーションし、そして組換えプラスミドをミニプレップキット（Qiagen, Hombrechtikon, Switzerland）を使用して精製した。クローニングされたＶＨおよびＶＬ挿入断片のＤＮＡ配列を、ABI PRISM Cycle Sequencingキット（Applied Biosystem（登録商標）, Carlsbad, CA, USA）並びにＭ１３フォワードおよびリバースプライマーを使用して決定した。Ｖ遺伝子の配列は、正確さを確実にするために、２つの独立したＲＮＡ調製物のバッチで決定された。
【００６０】
ｓｃＦｖ遺伝子の構築
ｓｃＦｖタンパク質を、ＶＨ遺伝子のＣ末端とＶＬ遺伝子のＮ末端との間の１５アミノ酸リンカー（Ｇ４−Ｓ）３をコードするオリゴヌクレオチドを使用して、オーバーラップ伸長によるＰＣＲスプライシングによってそのＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子とを一緒に接続することによって創造した。１Ｅ８ａ ｍＡｂ可変遺伝子の末端を、マウスＩｇＧプライマーセット（NOVAGEN）からの特異的プライマーを使用してＰＣＲによって改変した。ｓｃＦｖ遺伝子を、ＰｅｌＢ配列とインフレームで、発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（EMD Biosciences, Darmstadt, Germany）のＮｃｏＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に挿入した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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