(57)【要約】  我々は、５’から３’の順序で、配列番号５に示すヌクレオチド配列と、そのすぐ後に続く配列番号７に示すヌクレオチド配列とを含むＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の多型バリアントについて記載する。ＢＩＭ多型バリアントは、配列番号６に示すヌクレオチド配列を欠くことによって特徴付けられ得る。これを用いて、このような多型を含む個体における慢性骨髄性白血病についてのＢＣＲ−ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性（チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性）、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）についてのｃ−ＫＩＴ／ＰＤＧＦＲ非依存性ＴＫＩ耐性、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）についてのＥＧＦＲ非依存性ＴＫＩ耐性または骨髄増殖性疾患についてのＪＡＫ２非依存性ＴＫＩ耐性を検出することができる。
2014502493.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんもしくは骨髄増殖性疾患に対する感受性があるか、またはそれに罹患している個体がチロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性を生じる見込みがあるか、を予測する方法であって、５’から３’の順序で、配列番号５に示すヌクレオチド配列と、その直後に続く配列番号７に示すヌクレオチド配列とを含むＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の多型バリアントを前記個体が有するかを決定するステップを含み、好ましくは、前記ＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の前記多型バリアントが、配列番号６に示すヌクレオチド配列を欠く方法。
【請求項２】
（ａ）前記ＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の前記多型バリアントを有する前記個体の指標として、配列番号１に示す配列を含む核酸増幅生成物の存在を検出するステップ、または（ｂ）前記ＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の前記多型バリアントを欠く前記個体の指標として、配列番号２に示す配列を含む核酸増幅生成物の存在を検出するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）配列番号３に示すヌクレオチド配列、もしくは（ｂ）配列番号４に示すヌクレオチド配列、または例えばプライマーセットとしての（ａ）および（ｂ）の組合せを、用いる核酸増幅生成物を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）前記個体が前記ＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の前記多型バリアントを有すると決定されるならば、前記個体が、チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性を生じる見込みがあり、または（ｂ）前記個体が前記ＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の前記多型バリアントを有さないと決定されるならば、前記個体は、チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性を生じる見込みが低い、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
がんもしくは骨髄増殖性疾患の個体についての治療を選択する方法であって、請求項１から４のいずれかに記載の方法により、患者が、チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性を生じる見込みがあるかを決定するステップと、前記個体がそのような耐性を生じる見込みがあると決定される場合に、
（ａ）前記患者のより頻度が高いモニタリング、
（ｂ）より頻度が高い血液検査および骨髄検査、
（ｃ）骨髄移植、
（ｄ）ニロチニブもしくはダサチニブのようなより効力が高いチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）の投与、
（ｅ）例えばＴＫＩとの組合せでのＢＨ３模倣剤、例えばＡＢＴ−２６３の投与、
（ｆ）チロシンキナーゼ阻害剤、例えばイマチニブの用量の、例えば４００ｍｇ／日の標準用量を超えて６００または８００ｍｇ／日までの増加、または
（ｇ）ＢＣＬ２群タンパク質の生存促進性効果を阻害する薬物を用いる処置
のいずれか１または複数を含む治療を選択するステップと
を含む方法。
【請求項６】
がんもしくは骨髄増殖性疾患の個体に対する特定の治療の成功の見込みを決定する方法であって、前記治療を、請求項５に記載の方法により決定された治療と比較するステップを含む方法。
【請求項７】
（ａ）前記がんもしくは骨髄増殖性疾患が、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含み、チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する前記耐性が、例えば、イマチニブのようなチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性のようなＢＣＲ−ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を含むか、
（ｂ）前記がんもしくは骨髄増殖性疾患が、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）を含み、チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する前記耐性が、例えば、イマチニブのようなチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性のようなｃ−ＫＩＴ／ＰＤＧＦＲ非依存性ＴＫＩ耐性を含むか、
（ｃ）前記がんもしくは骨髄増殖性疾患が、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含み、チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する前記耐性が、例えば、エルロチニブもしくはゲフィチニブのようなチロシンキナーゼ阻害剤またはその他のキナーゼ阻害剤、例えばスニチニブ、ニロチニブおよびソラフェニブに対する耐性のようなＥＧＦＲ非依存性ＴＫＩ耐性を含むか、
（ｄ）前記がんもしくは骨髄増殖性疾患が、真性赤血球増加症、本態性血小板血症および原発性骨髄線維症からなる群から選択されるような骨髄増殖性疾患を含み、チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する前記耐性が、例えば、ＪＡＫ阻害剤に対する耐性のようなＪＡＫ２非依存性ＴＫＩ耐性を含むか、あるいは
（ｅ）前記がんもしくは骨髄増殖性疾患が、血液悪性腫瘍、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患（真性赤血球増加症、本態性血小板血症および原発性骨髄線維症を含む）、固形腫瘍、小細胞肺がん、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、メラノーマおよび神経芽腫からなる群から選択される、
請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
５’から３’の順序で、配列番号５に示すヌクレオチド配列と、その直後に続く配列番号７に示すヌクレオチド配列とを含む、ＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の多型バリアント。
【請求項９】
配列番号６に示すヌクレオチド配列を欠くことによって特徴付けられるＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の多型バリアント。
【請求項１０】
請求項８または９に記載のＢＩＭ多型バリアントから、例えば核酸増幅により得ることができる、配列番号１または配列番号２に示すヌクレオチド配列。
【請求項１１】
このような多型を含む個体において、
（ｉ）ＢＣＲ−ＡＢＬ再活性化がない慢性骨髄性白血病についてのチロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性（ＢＣＲ−ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性）、
（ｉｉ）ｃ−ＫＩＴ／ＰＤＧＦＲ再活性化がない消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）についてのチロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性（ｃ−ＫＩＴ／ＰＤＧＦＲ非依存性ＴＫＩ耐性）、
（ｉｉｉ）ＥＧＦＲ再活性化がない非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）についてのチロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性（ＥＧＦＲ非依存性ＴＫＩ耐性）または
（ｉｖ）ＪＡＫ２再活性化がない骨髄増殖性疾患についてのチロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性（ＪＡＫ２非依存性ＴＫＩ耐性）
と関連する、請求項８もしくは９に記載のＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の多型バリアントまたは請求項１０に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１２】
（ａ）配列番号３に示すヌクレオチド配列、もしくは（ｂ）配列番号４に示すヌクレオチド配列、または（ａ）および（ｂ）の組合せ、例えばプライマーセット。
【請求項１３】
個体における請求項８または９に記載のＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）多型の存在または非存在を検出する方法であって、配列番号１に示す配列または配列番号２に示す配列を含む核酸増幅生成物を、例えば請求項１２に記載のプライマーセットを用いることにより検出するステップを含む方法。
【請求項１４】
がんもしくは骨髄増殖性疾患に罹患している患者を処置する方法であって、前記がんもしくは骨髄増殖性疾患が、ＢＣＲ−ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性ＣＭＬがん、ｃ−ＫＩＴ／ＰＤＧＦＲ非依存性ＴＫＩ耐性ＧＩＳＴがん、ＥＧＦＲ非依存性ＴＫＩ耐性ＮＳＣＬＣがん、またはＪＡＫ２非依存性ＴＫＩ耐性骨髄増殖性疾患であるかを、請求項１から７のいずれかに記載の方法により決定するステップと、請求項５に示す（ａ）〜（ｇ）から選択されるステップを行うことにより前記患者を処置するステップとを含む方法。
【請求項１５】
配列番号１に示す配列を含む核酸増幅生成物を、例えば請求項５に記載のプライマーセットを用いることにより検出するステップを含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
添付の図面の図１から２６を参照して実質的に上に記載され、かつ図１から２６に示すような多型バリアント、ヌクレオチド配列または方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、細胞生物学、分子生物学および遺伝学の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は、造血幹細胞のがんであり、ＣＭＬの患者全てにおいて見出されるＢＣＲ−ＡＢＬとよばれる発癌性融合遺伝子の存在により引き起こされる。
【０００３】
ＢＣＲ−ＡＢＬは、正常な対応物と比較した場合のＣＭＬ細胞の生存および増殖の増加を媒介する構成的活性型チロシンキナーゼをコードする。ＣＭＬの効果的な処置は、ＢＣＲ−ＡＢＬのキナーゼ活性を阻害するクラスの薬物（これは、一般的にチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）とよばれる）の形である。
【０００４】
しかし、少ない割合の患者は、ＴＫＩに対して一次耐性を示して応答せず、他方、他の患者は、初期に応答するが時間が経つとこれらの薬物に対して二次耐性を生じ、この事象は、急性転化（ＢＣ）ＣＭＬへの転換およびより短い生存にしばしば随伴する。ＴＫＩ耐性を有する患者の約６０％において（参考文献Ａ１）、ＴＫＩをＢＣＲ−ＡＢＬと結合しにくくするＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子の変異、または「野生型」ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子もしくはタンパク質の増幅および過剰発現のいずれかによりＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼ活性が再活性化されることが見出されている。
【０００５】
残りの４０％の症例では、ＴＫＩ耐性の原因は不明である。ＢＣＲ−ＡＢＬの再活性化なしでＴＫＩ耐性を媒介する機構（ＢＣＲ−ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性ともよばれる）の発見は、ＴＫＩ耐性を克服するための方策を決定し、ＣＭＬの患者をより良好に管理するために非常に重要である。
【０００６】
よって、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤を用いる治療は、慢性期の慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の患者の大部分において高い割合の疾患管理をもたらしている。しかし、かなりの部分の患者は、まだ最適な応答を達成することができず１、後期疾患のほとんど全ての患者は、疾患により死亡している２。
【０００７】
臨床に基づくリスクスコアを利用して、臨床転帰について患者を階層化するための試みは限定的にしか成功しておらず３、４、その理由は、部分的に、このようなスコアが疾患の分子的特徴または臨床転帰に貢献する患者特異的遺伝的因子を考慮していないからである。実際に、慢性期のＣＭＬに対する応答を予測できるホストの遺伝的因子についてほとんど知られていない５〜７。
【０００８】
その結果、現在の臨床上の推奨は、全ての患者を同じ開始用量のイマチニブで処置し、定期的な間隔でベンチマークとなる臨床応答をモニタリングすることである。これらは、末梢血球数の標準化と、３〜６カ月間隔での細胞遺伝学的および分子学的応答の程度とを含む５。ベンチマークを達成できない場合にのみ、治療が変更される。このような判断点として、イマチニブの用量を増加すること、より効力が高いチロシンキナーゼ阻害剤に交換すること、ならびに高用量の化学療法および移植の準備をすることを含む選択肢がある。
【０００９】
観念的に、最も迅速な応答を達成するとともに薬物耐性または疾患増悪の出現を回避するように白血病および患者の両方に治療を適応させることが可能である。これらの理由から、応答を予測し、治療を手引きするための信頼できるマーカーが必要である。最近の研究は、ＣＭＬにおける薬物耐性および疾患増悪に関連する遺伝的因子への洞察をもたらすアレイに基づく発現プロファイリングに依拠している８。しかし、このようなアプローチは、それらの固有の偏りとともに、これらの発現プロファイルに貢献する、根本的な遺伝子事象を定義できないことにより制限される。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の第１の態様に従って、我々は、がんもしくは骨髄増殖性疾患に対する感受性があるかまたはそれに罹患している個体が、チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性を生じる見込みがあるかを予測する方法を提供する。
【００１１】
この方法は、個体がＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の多型バリアントを有するかを決定するステップを含み得る。多型バリアントまたは多型は、５’から３’の順序で、配列番号５に示すヌクレオチド配列と、その直後に続く配列番号に示すヌクレオチド配列とを含み得る。ＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の多型バリアントは、配列番号６に示すヌクレオチド配列を欠くことがある。
【００１２】
この方法は、ＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の多型バリアントを有する個体の指標として、配列番号１に示す配列を含む核酸増幅生成物の存在を検出するステップを含み得る。この方法は、代わりにまたはさらに、ＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の多型バリアントを欠く個体の指標として、配列番号２に示す配列を含む核酸増幅生成物の存在を検出するステップを含み得る。
【００１３】
この方法は、核酸増幅を含み得る。この方法は、配列番号３に示すヌクレオチド配列を利用してよい。これは、配列番号４に示すヌクレオチド配列を利用してよい。これは、これらの配列の組合せを利用してよい。組合せは、プライマーセットとして含んでよい。
【００１４】
この方法は、個体がＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の多型バリアントを有すると決定されるならば、個体は、チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性を生じる見込みがあるようなものであってよい。代わりにまたはさらに、方法は、個体がＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の多型バリアントを有さないと決定されるならば、個体は、チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性を生じる見込みが低いようなものであってよい。
【００１５】
本発明の第２の態様に従って、がんもしくは骨髄増殖性疾患の個体についての治療を選択する方法が提供される。この方法は、上記の方法により、患者が、チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性を生じる見込みがあるかを決定するステップを含み得る。この方法は、個体がそのような耐性を生じる見込みがあると決定される場合に、治療を選択するようなものであってよい。
【００１６】
治療は、患者のより頻度が高いモニタリングを含み得る。治療は、より頻度が高い血液検査を含み得る。治療は、より頻度が高い骨髄検査を含み得る。治療は、骨髄移植を含み得る。治療は、より効力が高いチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）の投与を含み得る。チロシンキナーゼ阻害剤は、ニロチニブもしくはダサチニブまたはその両方を含み得る。治療は、ＢＨ３模倣物の投与を含み得る。ＢＨ３模倣剤は、ＡＢＴ−２６３を含み得る。ＢＨ３模倣剤は、ＴＫＩと組み合わせて投与してよい。治療は、チロシンキナーゼ阻害剤の用量を増加することを含み得る。チロシンキナーゼ阻害剤は、イマチニブを含み得る。用量は、４００ｍｇ／日の標準用量を超えて６００または８００ｍｇ／日まで増加してよい。治療は、ＢＣＬ２群タンパク質の生存促進性効果を阻害する薬物を用いる処置を含み得る。
【００１７】
我々は、本発明の第３の態様に従って、がんもしくは骨髄増殖性疾患の個体に対する特定の治療の成功の見込みを決定する方法を提供する。このような方法は、該治療を、上記の方法により決定された治療と比較するステップを含み得る。
【００１８】
がんもしくは骨髄増殖性疾患は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含み得る。チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性は、ＢＣＲ−ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を含み得る。チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性は、チロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性を含み得る。チロシンキナーゼ阻害剤は、イマチニブを含み得る。
【００１９】
がんもしくは骨髄増殖性疾患は、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）を含み得る。チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性は、ｃ−ＫＩＴ／ＰＤＧＦＲ非依存性ＴＫＩ耐性を含み得る。チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性は、イマチニブに対する耐性を含み得る。
【００２０】
がんもしくは骨髄増殖性疾患は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含み得る。チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性は、ＥＧＦＲ非依存性ＴＫＩ耐性を含み得る。チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、スニチニブ、ニロチニブおよびソラフェニブのいずれか１もしくは複数またはそれらの組合せに対する耐性を含み得る。
【００２１】
がんもしくは骨髄増殖性疾患は、真性赤血球増加症、本態性血小板血症および原発性骨髄線維症からなる群から選択されるような骨髄増殖性疾患を含み得る。チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性は、ＪＡＫ２非依存性ＴＫＩ耐性を含み得る。チロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性は、ＪＡＫ阻害剤に対する耐性を含み得る。
【００２２】
がんもしくは骨髄増殖性疾患は、血液悪性腫瘍、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患（真性赤血球増加症、本態性血小板血症および原発性骨髄線維症を含む）、固形腫瘍、小細胞肺がん、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、メラノーマおよび神経芽腫からなる群から選択できる。
【００２３】
本発明の第４の態様として、５’から３’の順序で、配列番号５に示すヌクレオチド配列と、その直後に続く配列番号７に示すヌクレオチド配列とを含む、ＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の多型バリアントが提供される。
【００２４】
我々は、本発明の第５の態様に従って、配列番号６に示すヌクレオチド配列を欠くことによって特徴付けられるＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の多型バリアントを提供する。
【００２５】
本発明は、第６の態様において、配列番号１または配列番号２に示すヌクレオチド配列を提供する。このようなヌクレオチド配列は、上記のようなＢＩＭ多型バリアントから得ることができる。これは、核酸増幅により得ることができる。
【００２６】
上記のＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の多型バリアントまたはヌクレオチド配列は、ＢＣＲ−ＡＢＬ再活性化がない慢性骨髄性白血病についてのチロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性（ＢＣＲ−ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性）と関連することがある。これらは、ｃ−ＫＩＴ／ＰＤＧＦＲ再活性化がない消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）についてのチロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性（ｃ−ＫＩＴ／ＰＤＧＦＲ非依存性ＴＫＩ耐性）と関連することがある。これらは、ＥＧＦＲ再活性化がない非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）についてのチロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性（ＥＧＦＲ非依存性ＴＫＩ耐性）と関連することがある。これらは、ＪＡＫ２再活性化がない骨髄増殖性疾患についてのチロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性（ＪＡＫ２非依存性ＴＫＩ耐性）と関連することがある。
【００２７】
本発明の第７の態様では、配列番号３に示すヌクレオチド配列が提供される。我々は、配列番号４に示すヌクレオチド配列をさらに提供する。我々は、このようなヌクレオチド配列の組合せも提供する。これは、プライマーセットとして提供してよい。
【００２８】
本発明の第８の態様に従って、我々は、個体における上記のＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）多型の存在または非存在を検出する方法を提供する。この方法は、配列番号１に示す配列を含む核酸増幅生成物を検出するステップを含み得る。この方法は、配列番号２に示す配列を検出するステップを含み得る。検出は、上記のプライマーセットを用いてよい。
【００２９】
我々は、本発明の第９の態様に従って、がんもしくは骨髄増殖性疾患に罹患している患者を処置する方法を提供する。この方法は、がんもしくは骨髄増殖性疾患が、ＢＣＲ−ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性ＣＭＬがんであるかを決定するステップを含み得る。この方法は、がんもしくは骨髄増殖性疾患が、ｃ−ＫＩＴ／ＰＤＧＦＲ非依存性ＴＫＩ耐性ＧＩＳＴがんであるかを決定するステップを含み得る。この方法は、がんもしくは骨髄増殖性疾患が、ＥＧＦＲ非依存性ＴＫＩ耐性ＮＳＣＬＣがんであるかを決定するステップを含み得る。この方法は、がんもしくは骨髄増殖性疾患が、ＪＡＫ２非依存性ＴＫＩ耐性骨髄増殖性疾患であるかを決定するステップを含み得る。この方法は、上記のとおりであってよい。この方法は、本発明の第２の態様において示す（ａ）〜（ｇ）から選択されるステップを行うことにより患者を処置するステップをさらに含み得る。
【００３０】
このような方法は、配列番号１に示す配列を含む核酸増幅生成物を検出するステップを含み得る。これは、上記のプライマーセットを用いることにより行ってよい。
【００３１】
本発明の実施は、そうでないと示さない限り、当業者の能力の範囲内である化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技術を採用する。このような技術は、文献において説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９５および定期的な補遺；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｃｈ．９、１３および１６、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ、Ｊ．ＣｒａｂｔｒｅｅおよびＡ．Ｋａｈｎ、１９９６、ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．ＰｏｌａｋおよびＪａｍｅｓ  Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ、１９９０、Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編）、１９８４、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉｒｌ  Ｐｒｅｓｓ；Ｄ．Ｍ．Ｊ．ＬｉｌｌｅｙおよびＪ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ、１９９２、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｎｏ．Ｉ、Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ、Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ（１９９９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−５４４−７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ（編）、Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（編）（１９８８、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３１４−２）、１８５５．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ  Ｓｅｅｔｈａｌａ、Ｐｒａｂｈａｖａｔｈｉ  Ｂ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ編（２００１、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ＩＳＢＮ  ０−８２４７−０５６２−９）；ならびにＬａｂ  Ｒｅｆ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｅｃｉｐｅｓ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ，ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｂｅｎｃｈ、Ｊａｎｅ  ＲｏｓｋａｍｓおよびＬｉｎｄａ  Ｒｏｄｇｅｒｓ編、２００２、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−６３０−３を参照されたい。これらの全般的な教科書のそれぞれは、本明細書に参照により組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＵＣＳＣ遺伝子（上）およびＲｅｆＳｅｑ遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ、下）についてのヒトゲノム（ｈｇ１８）ｃｈｒ２：１１１，５９３，２１０〜１１１，６４４，５８１のＵＣＳＣゲノムブラウザからの図である。ＢＩＭ遺伝子および多型を特徴付ける欠失に印を付す。
【図２】６つのＣＭＬゲノムのＤＮＡ−ＰＥＴ分析を示す図である。  図２Ａは、患者試料の臨床病理学的特徴と、ＤＮＡ−ＰＥＴ分析に用いたＣＭＬ株化細胞についてまとめる。  図２Ｂは、Ｃｉｒｃｏｓ２９を用いてＤＮＡ−ＰＥＴデータから作製し、円形プロットとして示す６つのＣＭＬゲノムの核ゲノムマップを示す。３２の正常ゲノムのうちの少なくとも１つで同定されたものとマッチするＳＶを、ふるい分けして除いた（これらのＳＶは、表Ｅ４中のものに相当する）。構造変動（ＳＶ）の異なるカテゴリーを、凡例に示すように同心円の層に配置する。アスタリスク（＊）は、ＢＣＲ−ＡＢＬ１／ＡＢＬ１−ＢＣＲ転座の存在を示す。
【図３】急性転換に伴う体細胞性構造変動を示す図である。  図３Ａは、Ｐ０９８におけるＥＶＩ１遺伝子座中の新規な再編成のゲノムブラウザの図を示す。この遺伝子座中にあることが知られている遺伝子［Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（ＵＣＳＣ）］（Ｒｈｅａｄら２０１０）を赤および青で示す（上）。赤の軌道は、調和性ＰＥＴの断片カバー範囲を反映する。濃い赤およびピンクの水平な矢じりは、挿入の存在を示す、不調和性ＰＥＴのマッピング領域（アンカー）を表す。  図３Ｂは、定量リアルタイムＰＣＲにより測定したＥＶＩ１の発現レベルを示す。ＥＶＩ１レベルは、β−アクチンの発現に対して標準化した２つの急性転化期試料（Ｐ０２２およびＰ０９８）と４つの慢性期試料（Ｐ３０８、Ｐ３５５、Ｐ４９０およびＰ５００）について示す。  図３Ｃは、図３Ａに示すように、第３染色体（ＲＰ１１−１３７Ｈ１７、緑）および第８染色体（ＲＰ１１−８２８Ｌ６、赤；ＲＰ１１−１５９Ｎ７、黄）についての注文製作プローブを用いるＥＶＩ１再編成の蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析を示す。ＥＶＩ１再編成は、正常対照には存在しないが、Ｐ０９８試料において赤−緑−黄の融合シグナルとして見ることができる。
【図４】３つ全ての耐性試料において、ＢＩＭのイントロン２中の多型２９０３ｂｐ欠失が存在することを示す図である。  図４Ａは、チロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性を有する患者からの３つの試料（Ｐ３０８、Ｐ０２２およびＰ０９８）のうち３つにおける（しかし、チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性がある患者または株化細胞からの試料（Ｐ１４５、Ｐ４４０およびＫ５６２）においてではない）、ＤＮＡ−ＰＥＴによるＢＩＭ欠失の検出を示す。５つの臨床ＣＭＬ試料およびＫ５６２のＣｈｒ２：１１１５８００００．．１１１６５００００  ＤＮＡ−ＰＥＴデータは、ゲノムブラウザにおいて示す。緑の線で接続された濃い赤およびピンクの水平の矢じりは、欠失の存在を示す、不調和性ＰＥＴのマッピング領域（アンカー）を表す。垂直の破線は、欠失領域を示す。  図４Ｂは、欠失（ｃｈｒ２：１１１，５９９，６６６．．１１１，６０２，５６８）についてのＵＣＳＣゲノムブラウザ「２８−Ｗａｙ  Ｃｏｎｓ」軌道により示されるように、この領域が哺乳動物において保存されていることを示し、ｙ軸に保存の程度を示す。  図４Ｃは、５名の患者およびＫ５６２細胞からのゲノムＤＮＡ試料を用いるＰＣＲによる欠失の検証を示す。４．２ＫｂのサイズのＰＣＲ生成物は、非欠失対立遺伝子に相当し、１．３ＫｂのサイズのＰＣＲ生成物は、欠失対立遺伝子に相当する。Ｍ、１Ｋｂマーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）。  図４Ｄは、ＰＣＲ生成物のＳａｎｇｅｒ配列決定により３つ全ての欠失含有試料において見出された同一の切断点を示す。欠失配列は、青で示す。
【図５】ＢＩＭ多型の機能的影響を示す図である。  図５Ａは、ＢＩＭＥＬ、ＢＩＭＬおよびＢＩＭＳならびにＢＩＭγ（エキソン３を含有することが知られている唯一のアイソフォーム）３０〜３２を含む主要なＢＩＭアイソフォームについてのエキソンを示す、ＢＩＭのゲノム編成を示す。エキソン２と３の間の多型欠失を、赤線で強調する。開始コドン（開始）、ダイニン結合ドメイン（ＤＢＤ）、ＢＨ３ドメイン（ＢＨ３）および停止コドン／ポリアデニル化シグナル配列（停止／ポリＡ）を含有するエキソンも強調する。この図は、実際の縮尺で描いていない。  図５Ｂは、２３のＣＭＬ患者試料［欠失なし（ＷＴ）がｎ＝１１および欠失あり（キャリア）がｎ＝１２］において定量リアルタイムＰＣＲにより測定し、ＢＩＭのエキソン特異的転写産物の発現レベルを示す。エキソンＥ２Ａ、Ｅ３またはＥ４を含有する様々な転写産物のレベルを、エキソン２Ａまたはβ−アクチンに対して標準化した比として表す。平均および平均の標準誤差を、赤線およびバーで表す。統計的有意性（ｐ）は、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定により算出する。  図５Ｃは、実施例２に記載する方法を用いて、欠失を検出するために行った、東アジア人および非東アジア人のＣＭＬ株化細胞の収集物からのＰＣＲ反応生成物を示す。  図５Ｄは、欠失を有するＣＭＬ株化細胞および有さないＣＭＬ株化細胞におけるエキソン４含有転写産物に対するエキソン３含有転写産物の比を示す。  図５Ｅは、１μＭのイマチニブで２４時間処置した後の、欠失を有する株化細胞および有さない株化細胞から得られた細胞溶解物におけるＢＩＭＥＬのレベルを示すウェスタンブロットである。  図５Ｆは、１μＭのイマチニブを用いて培養した、欠失を有するＣＭＬ株化細胞および有さないＣＭＬ株化細胞の成長曲線を示す。  図５Ｇは、ＫＣＬ２２およびＫＹＯ−１細胞に対するイマチニブ、ダサチニブおよびＡＢＴ−７３７のアポトーシス活性を示す。細胞は、２μＭのイマチニブ、５０ｎＭのダサチニブまたは２．５μＭのＡＢＴ−７３７で４８時間処置し、死滅細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーにより決定した。
【図６】ＢＩＭ多型とチロシンキナーゼ阻害剤に対する臨床耐性との関連を示す図である。２つの東南アジア紹介センターで診察された慢性期または移行期ＣＭＬのいずれかの患者を、欧州ＬｅｕｋｅｍｉａＮｅｔ基準、および耐性を与えることが知られているＢＣＲ−ＡＢＬ変異の存在または非存在によるチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）に対する感受性または耐性に従って類別した。これらの群のそれぞれにおけるＢＩＭ多型の発生率を、次いで決定した。Ｐ値は、Ｆｉｓｈｅｒの両側正確検定を用いて算出した。  図６Ａは、ＢＣＲ−ＡＢＬ変異がないＴＫＩ耐性患者に対するＢＣＲ−ＡＢＬ変異を有するＴＫＩ耐性患者におけるＢＩＭ欠失の頻度を示す。  図６Ｂは、ＢＣＲ−ＡＢＬ変異がないＴＫＩ耐性患者に対するＴＫＩ感受性疾患の患者におけるＢＩＭ欠失の頻度を示す。  図６Ｃは、ＴＫＩ耐性を有する全ての患者と比較した、ＴＫＩ感受性疾患の患者におけるＢＩＭ欠失の頻度を示す。
【図７】ｃＰＥＴタグ計数から推測したコピー数情報を示す図である。染色体を、図の下に示すように緑と黒を交互にして水平軸上に配置する。コピー数の値は、赤で示す平滑化したウィンドウ値とともにＹ軸上に表す。試料ＩＤは、プロットの左上の角に示す。Ｋ５６２についてｙ軸尺度が異なることに注意されたい。
【図８】東アジア人におけるＢＩＭ欠失のゲノム背景を示す図である。  図８Ａ。７４名の東アジアＨａｐＭａｐ第Ｉ期の個体を、ＢＩＭ中のイントロン欠失について遺伝子型決定し、欠失遺伝子型を、ＨａｐｌｏＶｉｅｗソフトウェア（Ｂａｒｒｅｔｔら２００５）を用いてＳＮＰ遺伝子型と相関させた。ＬＤに基づくハプロタイプブロックをＳＮＰとともに、左から右にゲノムの順序で示す。ハプロタイプ頻度は、右に灰色で示す。マーカー＃４９は、Ａ＝欠失なしおよびＣ＝欠失を用いてＢＩＭ欠失を表す。最も頻度が高い赤のハプロタイプと同一の欠失とは別の欠失が、青のハプロタイプの背景上にある。ハプロタイプタギングＳＮＰに矢じりで印をつける。  図８Ｂ。Ａ（＃）におけるタギングＳＮＰのＩＤ（名称）を、それらのヘテロ接合性頻度（ＯｂｓＨＥＴ）、マイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）および対立遺伝子とともに示す。
【図９】ＤＮＡペアエンドタグ（ＰＥＴ）配列決定法を示す図である。ゲノムＤＮＡをハイドロシェアにかけ、ＥｃｏＰ１５Ｉ認識部位をメチル化し、ＥｃｏＰ１５Ｉ  ＣＡＰアダプタをＤＮＡ断片の端にライゲーションした。メチル化ＤＮＡ構築物をアガロースゲル上で分離し、９Ｋｂサイズの断片をライゲーションのために選択して、９Ｋｂ断片の５’（Ｒ３、濃い赤）および３’（Ｆ３、ピンク）の端が２つのフランキング非メチル化ＥｃｏＰ１５Ｉ  ＣＡＰアダプタを有する内部ビオチン化アダプタで接続された環状生成物が得られた。構築物をメチル化感受性ＥｃｏＰ１５Ｉにより消化して、５’および３’ＰＥＴ構築物を遊離させた。配列決定アダプタをＰＥＴ構築物にライゲーションし、これを次いでＰＣＲにより増幅し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＯＬｉＤシステムにより配列決定した。得られたＰＥＴをヒト参照配列ｈｇ１８に対してマッピングした。
【図１０】ｄＰＥＴクラスタによる構造変動（ＳＶ）の同定を示す図である。「判読」は、ヒト参照配列に対するｄＰＥＴクラスタのマッピングパターン（「参照に対するマッピング」）から推測した配列決定されたゲノムのゲノム構造を示す。濃い赤の矢印は、５’アンカー領域を表し、ピンクの矢印は、３’アンカー領域を表す。灰色、青および赤の水平線は、染色体セグメントを表す。赤の矢印は、染色体セグメントの向きを示す。
【図１１】細胞遺伝学的に予測した同腕染色体１７ｑの再構築を示す図である。サイズ２のＤＮＡ−ＰＥＴクラスタは、第１７染色体１７，５９５，０６６位マイナス鎖を、第１７染色体２８，２８２，８５３位プラス鎖に接続する。上、第１７染色体核型図式を、赤の垂直線により示す切断点の位置とともに示す。濃い赤およびピンクの矢印は、ＰＥＴのマッピング位置および向きの符号である。中、ゲノムブラウザ図を、上の赤線に相当する切断点領域について示す。赤の軌道は、調和性マッピングＰＥＴによるカバー範囲を表し、遺伝子は、緑で示し、濃い赤およびピンクの矢印は、ＰＥＴのマッピング位置および向きを示す。下、ＤＮＡ−ＰＥＴデータに基づく同腕染色体１７ｑの再構築。矢印は、ゲノム座標が増加する方向を示す。
【図１２】急性転換に伴う体細胞性構造変動を示す図である。  図１２Ａ。ＢＣＲおよびＡＢＬ１遺伝子のゲノム構造と、転座切断点の位置とを示す。エキソンは、箱で示し、イントロンは、転写の方向を示す（＋鎖、左から右に）羽状の線で表す。切断点の位置は、それぞれの試料ＩＤとともに赤の垂直線で示す。  図１２Ｂ。ＢＣＲをＡＢＬ１と接続するペアエンド読み取りの数（カバー範囲で標準化したクラスタサイズ）の相互事象に対する比は、疾患増悪と相関する。第２２染色体上のＢＣＲおよび第９染色体上のＡＢＬ１のゲノム領域を水平軸上に示し、遺伝子は緑および青で示す。コピー数の見積りを、紫の軌道で表す。ピンクおよび濃い赤の矢印は、ＢＣＲとＡＢＬ１との間の接続性を示す。ＢＣＲ−ＡＢＬ１およびＡＢＬ１−ＢＣＲ転座のＰＥＴ数は、それぞれ青および灰色で示す。垂直の破線は、切断点の位置を示す。  図１２Ｃ。ＤＮＡ−ＰＥＴにより同定されたＢＣＲ−ＡＢＬ１転座のＦＩＳＨによる検証を示す。
【図１３】ＢＩＭのエキソン特異的転写産物の発現レベルを示す図である。発現レベルは、定量リアルタイムＰＣＲにより、ＣＭＬを患っていない正常個体から作製した７つの株化細胞［欠失なし（ＷＴ）がｎ＝３、欠失あり（キャリア）がｎ＝４］において測定する。エキソンＥ２Ａ、Ｅ３またはＥ４を含有する様々な転写産物のレベルは、エキソン２Ａまたはβ−アクチンに対して標準化した比として表す。同定された１名のホモ接合性キャリアについての発現を緑で強調する。統計的有意性（ｐ）は、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの両側順位和検定（赤）および両側ｔ検定（黒）により算出する。
【図１４】ＢＩＭのイントロン２中の２９０３ｂｐ欠失多型が、ＴＫＩ耐性ＣＭＬ患者試料中に存在することを示す図である。  図１４Ａ。５つの臨床ＣＭＬ試料およびＫ５６２細胞からのＣｈｒ２：１１１，５８０，０００．．１１１，６５０，０００を包含するＤＮＡ−ＰＥＴデータのゲノムブラウザ図を示す。イマチニブに対する耐性を有する患者からの３つの試料（Ｐ３０８、Ｐ０２２およびＰ０９８）のうち３つにおける（しかし、イマチニブに対する感受性がある患者または株化細胞からの試料（Ｐ１４５、Ｐ４４０およびＫ５６２）においてではない）、ＤＮＡ−ＰＥＴによるＢＩＭ欠失多型の検出。赤の軌道は、領域（カバー範囲）にマッピングされた配列決定された調和性ＰＥＴの数を表す。緑の線で接続された赤ワイン色およびピンクの水平の矢じりは、不調和性ＰＥＴのマッピング領域を表し、欠失の存在を示す。垂直の破線は、欠失領域を示す。  図１４Ｂ。イントロンＢＩＭ欠失多型およびフランキング配列の模式図。切断点は、ＰＣＲ生成物のＳａｎｇｅｒ配列決定により同定した。欠失配列は、青で強調する。ヒト参照配列座標は、ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３６に基づく。  図１４Ｃ。欠失を挟むプライマーを用いた５名の患者試料およびＫ５６２細胞からのＰＣＲ生成物を示すアガロースゲル。４，２２６ｂｐおよび１，３２３ｂｐのサイズのＰＣＲ生成物は、それぞれ非欠失および欠失対立遺伝子に相当する。４，２２６および１，３２３ｂｐ生成物が共に存在することは、この個体が、欠失多型についてヘテロ接合性であることを示す。  図１４Ｄ。異なる人種集団における欠失多型の頻度を示す表。試料は、ＰＣＲにより遺伝子型決定し、ａに示すようにしてアガロースゲル上で分析した。
【図１５】ＢＩＭ遺伝子機能に対する欠失多型の影響を示す図である。  図１５Ａ。ＢＩＭＥＬ、ＢＩＭＬおよびＢＩＭＳならびにＢＩＭγ（これは、ＢＨ３ドメインを欠く１６）を含む主要なＢＩＭアイソフォームについてのエキソンを示す、ＢＩＭのゲノム編成。エキソン２と３の間の欠失多型を赤線で強調する。開始コドン（開始）、ダイニン結合ドメイン（ＤＢＤ）、ＢＨ３ドメイン（ＢＨ３）および停止コドン／ポリアデニル化シグナル配列（停止／ポリＡ）を含有するエキソンも強調する。この図は、実際の縮尺で描いていない。  図１５Ｂ。Ｋ５６２またはＫＣＬ２２  ＣＭＬ細胞のいずれかにトランスフェクトして、エキソン３／４についてのスプライシングを測定するための読出しとして働いた２つのミニ遺伝子構築物の模式図。エキソン３／４比は、Ｕ−Ｅ３およびＵ−Ｅ４転写産物に特異的なプライマーを用いるＱ−ＰＣＲにより得て、アデノウイルス特異的エキソン配列（Ｕ）に対して標準化した。  図１５Ｃ。Ｋ５６２細胞（左手のグラフ）およびＫＣＬ２２細胞（右手のグラフ）における、欠失ミニ遺伝子構築物と比較した、非欠失ミニ遺伝子構築物におけるＥ４転写産物に対するＥ３転写産物の比の増加のヒストグラム（平均＋／−平均の標準誤差、＊ｐ＝０．０００２、＊＊ｐ＝０．０１２）。  図１５Ｄ。２３のＣＭＬ患者試料［欠失なし（ＷＴ）がｎ＝１１および欠失あり（キャリア）がｎ＝１２］において定量リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により測定したＢＩＭのエキソン特異的転写産物の発現レベル。エキソンＥ２Ａ、Ｅ３またはＥ４を含有する様々な転写産物のレベルは、Ｅ２Ａ（Ｅ３およびＥ４について）またはｂ−アクチン（Ｅ２Ａ［全ＢＩＭ転写産物］について）に対して標準化した比として表す。平均および平均の標準誤差は、赤線およびバーで表す。１名のホモ接合性キャリアについての発現レベルを緑で強調する。統計的有意性は、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定を用いて決定した。  図１５Ｅ。東アジア人および非東アジア人ＣＭＬ株化細胞の収集物における多型を同定する、図１４に記載する方法を用いたＰＣＲ生成物のアガロースゲル。  図１５Ｆ。欠失多型を有するＣＭＬ株化細胞（ＫＣＬ２２）および有さないＣＭＬ株化細胞（Ｋ５６２およびＫＹＯ−１）における、Ｅ４含有転写産物に対するＥ３含有転写産物の比（平均＋／−平均の標準誤差、＊ｐ＝０．０１６、＊＊ｐ＝０．０１１）。  図１５Ｇ。１ｍＭのイマチニブで２４時間処置した後の、欠失多型を有する株化細胞および有さない株化細胞においてＱ−ＰＣＲにより測定した、ＢＩＭのエキソン４特異的転写産物（β−アクチンに対して標準化した）の発現レベル（平均＋／−平均の標準誤差、イマチニブ処置ＫＣＬ２２細胞に対して＊ｐ＝０．０１、＊＊ｐ＝０．００４）。  図１５Ｈ。図１５Ｇのようにして処置した株化細胞からの細胞溶解物におけるＢＩＭＥＬ（エキソン４およびＢＨ３ドメインを含有する）およびＣｒｋＬのレベルを示すウェスタンブロット。３つ全ての株化細胞において、イマチニブ曝露は、ＣｒｋＬの脱リン酸化をもたらし、これは、ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼ活性の阻害を示した。  図１５Ｉ。図１５Ｇのようにして処置した細胞におけるカスパーゼ３切断を示すウェスタンブロット。  図１５Ｊ。ＡＢＴ−７３７とともにまたはなしでイマチニブを用いて処置し、カスパーゼ３切断についてアッセイした株化細胞のウェスタンブロット。
【図１６】ＢＩＭ欠失多型を保有するＣＭＬ株化細胞の新規生成および分析を示す図である。  図１６Ａ。ＢＩＭ欠失多型をＫ５６２  ＣＭＬ株化細胞のゲノムに導入するための、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いる方策の模式図。  図１６Ｂ。ゲノム編集したＫ５６２株化細胞における多型を検出するための、図１６Ａに示すプライマーを用いたＰＣＲ産物（対照としてのＫＣＬ２２細胞も示す）。欠失多型について陰性（Ｋ５６２−ＢＩＭイントロン＋／＋）、ならびにヘテロ接合性（Ｋ５６２−ＢＩＭイントロン＋／−）およびホモ接合性（Ｋ５６２−ＢＩＭイントロン−／−）であったクローンを単離した。  図１６Ｃ。Ｋ５６２−ＢＩＭイントロン＋／＋、Ｋ５６２−ＢＩＭイントロン＋／−およびＫ５６２−ＢＩＭイントロン−／−細胞においてＱ−ＰＣＲにより測定したエキソン３／エキソン４転写産物の比（平均＋／−平均の標準誤差、＊ｐ＝０．００２、＊＊ｐ＝０．０００１）。  図１６Ｄ。Ｋ５６２−ＢＩＭイントロン＋／＋、Ｋ５６２−ＢＩＭイントロン＋／−およびＫ５６２−ＢＩＭイントロン−／−細胞におけるイマチニブ曝露の後のＥ４含有転写産物の発現（平均＋／−平均の標準誤差、＊ｐ＝０．０１５、＊＊ｐ＝０．００１）。  図１６Ｅ。漸増濃度のイマチニブで処置した後のＫ５６２−ＢＩＭイントロン＋／＋、Ｋ５６２−ＢＩＭイントロン＋／−およびＫ５６２−ＢＩＭイントロン−／−細胞からの細胞溶解物のウェスタンブロット。ウェスタンブロットは、ＢＩＭＥＬ、切断カスパーゼ３、ＰＡＲＰ、ＣｒｋＬおよびβ−アクチンに対する抗体を用いて調べた。  図１６Ｆ。それぞれβ−アクチンおよび未切断ＰＡＲＰに対して標準化したＢＩＭＥＬ（＊＊ｐ＝０．００８６、＊＊＊ｐ＝０．０００１６）および切断ＰＡＲＰ（＊Ｐ＝０．０１８、＊＊Ｐ＝０．００８４）についてのｅにおける知見のデンシトメトリーヒストグラム（平均＋／−平均の標準誤差）。  図１６Ｇ。アポトーシス細胞の細胞質画分におけるモノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソームを検出するためのＥＬＩＳＡに基づくアッセイを用いる相対的アポトーシス細胞死（平均＋／−平均の標準誤差、＊＊ｐ＝０．００６、＊＊＊ｐ＝０．０００２１）。  図１６Ｈ。アポトーシスシグナル伝達Ｋ５６２−ＢＩＭイントロン＋／＋、Ｋ５６２−ＢＩＭイントロン＋／−およびＫ５６２−ＢＩＭイントロン−／−細胞に関して、ＢＨ３模倣薬であるＡＢＴ−７３７をイマチニブに加えることの効果を示すウェスタンブロット。
【図１７】ＤＮＡペアエンドタグ（ＰＥＴ）配列決定法を示す図である。ゲノムＤＮＡをハイドロシェアにかけ、ＥｃｏＰ１５Ｉ認識部位をメチル化し、ＥｃｏＰ１５Ｉ  ＣＡＰアダプタをＤＮＡ断片の端にライゲーションした。メチル化ＤＮＡ構築物をアガロースゲル上で分離し、５、７および９Ｋｂサイズの断片をそれぞれライゲーションのために選択して、５、７または９Ｋｂ断片の５’（Ｒ３、濃い赤）および３’（Ｆ３、ピンク）の端が２つのフランキング非メチル化ＥｃｏＰ１５Ｉ  ＣＡＰアダプタを有する内部ビオチン化アダプタにより接続された環状生成物が得られた。構築物をメチル化感受性ＥｃｏＰ１５Ｉにより消化して、５’および３’ＰＥＴ構築物を遊離させた。配列決定アダプタをＰＥＴ構築物にライゲーションし、これを次いでＰＣＲにより増幅し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＯＬｉＤシステムにより配列決定した。得られたＰＥＴをヒト参照配列ＮＣＢＩ  ｂｕｉｌｄ  ３６に対してマッピングした（図はそこから改作した）１。
【図１８】６つのＣＭＬゲノムのＤＮＡ−ＰＥＴ分析を示す図である。Ｃｉｒｃｏｓ１８を用いてＤＮＡ−ＰＥＴデータから作製し、円形プロットとして示す６つのＣＭＬゲノムの核ゲノムマップ。３１の正常ゲノムの少なくとも１つで同定されたものとマッチするＳＶを、ふるい分けして除いた（表Ｈ３〜Ｈ５）。構造変動（ＳＶ）の異なるカテゴリーを、凡例に示すように同心円の層に配置する。アスタリスク（＊）は、ＢＣＲ−ＡＢＬ／ＡＢＬ−ＢＣＲ転座の存在を示す。第９／２２染色体転座は、ｄｅｒ９上の相互ＡＢＬ／ＢＣＲ融合の３Ｍｂ欠失によりＰ０９８において、および複雑な再編成によりＫ５６２において、その均衡の特徴を喪失した。Ｐ４４０で見出された転座は、挿入であった見込みがあり、同じ患者（Ｐ１４５）からの対合する試料中でＰＣＲによっても（しかしＤＮＡ−ＰＥＴによってではない）見出された（表Ｈ５の脚注を参照されたい）。
【図１９】６つのＣＭＬゲノムにおけるＢＣＲ−ＡＢＬ再編成を示す図である。  図１９Ａは、ＢＣＲおよびＡＢＬ１遺伝子のゲノム構造ならびに転座切断点の位置を示す。エキソンは、黒の箱で示し、イントロンは、転写の方向（＋鎖、左から右に）羽状の線で表す。切断点の位置は、それぞれの試料ＩＤとともに赤の垂直線で示す。  図１９Ｂは、ＢＣＲをＡＢＬ１と接続する（青）ペアエンド読み取りの数（クラスタサイズ）、ならびにＡＢＬ１をＢＣＲと接続する（灰色）相互事象の比が、疾患段階と相関することを示す。第２２染色体上のＢＣＲおよび第９染色体上のＡＢＬ１のゲノム領域を水平軸上に示し、ＢＣＲおよびＡＢＬ１は緑で示す。コピー数の見積りを、紫の軌道で示す。ピンクおよび赤ワイン色の矢印は、ＢＣＲとＡＢＬ１との間の接続性を示す。ＢＣＲ−ＡＢＬおよびＡＢＬ−ＢＣＲ転座の試料特異的配列決定深さ（カバー範囲；表Ｈ１を参照されたい）について補正したＤＮＡ−ＰＥＴシグナルを、それぞれ青および灰色で示す。垂直の破線は、切断点の位置を示す。「ＭＭＲ」＝主要分子学的寛解。  図１９Ｃは、ＤＮＡ−ＰＥＴにより同定されたＢＣＲ−ＡＢＬ転座のＦＩＳＨによる検証を示す。ＢＣＲおよびＡＢＬ１についてのＦＩＳＨプローブは、それぞれ緑および赤でラベルを付す。ＤＮＡ−ＰＥＴの結果によると、Ｐ１４５は、均衡転座事象（２つの融合）とそれぞれの１つの正常コピー（１Ｇ１Ｒ）とを示し、Ｐ４４０は、ＢＣＲ遺伝子座とＡＢＬ１遺伝子座の間に転座事象を示さず（２Ｒ２Ｇ）、Ｐ０２２は、均衡転座と、ＢＣＲ−ＡＢＬの余剰のコピーに相当する１つのさらなる融合（３つの融合）と、それぞれの１つの正常コピー（１Ｇ１Ｒ）とを示し、Ｐ０９８は、ＢＣＲ−ＡＢＬ間の融合（１つの融合）と、第９染色体上のＡＢＬ１欠失に相当するＢＣＲプローブについての残存シグナル（１Ｇ）と、それぞれの１つの正常コピー（１Ｇ１Ｒ）とを示す。
【図２０】ＢＩＭのエキソン３は、停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含有することを示す図である。ＢＩＭγのヌクレオチド配列およびそこから導かれるアミノ酸配列を示し、残基および塩基番号を右に示す。エキソン３についてのヌクレオチド配列を青で強調し、エキソン３中の停止コドン（ＴＧＡ）を赤で強調する。エキソン３中のポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）に下線を付す。
【図２１】ＢＩＭＬおよびＢＩＭＳは、ＢＩＭγと比較してより効力が高いアポトーシス誘発物質であることを示す図である。ＢＩＭＬ、ＢＩＭＳおよびＢＩＭγのｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ３プラスミド（Ｋｏｊｉ  Ｉｔａｈａｎａからの厚意による）にクローニングした。５μｇのプラスミドを、ＫＣＬ２２細胞にヌクレオフェクションし、アポトーシス細胞の量を、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ／７−ＡＡＤ染色をヌクレオフェクションの２４時間後に用いて測定した。全てのデータは、３回の独立した実験の平均を示す（＋／−平均の標準誤差）。
【図２２】ＢＩＭγのｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンは、ＫＣＬ２２細胞をイマチニブに対して感受性にしないことを示す図である。  図２２Ａは、ＢＩＭγノックダウンの際のＫＣＬ２２細胞に対するイマチニブのアポトーシス活性を示す。細胞にｓｉＲＮＡを２４時間トランスフェクトし（Ｕ＝非トランスフェクション対照）、２μＭのイマチニブでさらに４８時間処置し、アポトーシス細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーにより決定した。  図２２Ｂは、定量リアルタイムＰＣＲにより測定した、対照またはＥ３特異的ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＫＣＬ２２細胞におけるＢＩＭのＥ３含有転写産物の発現レベルを示す。統計的有意性は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により決定した。  図２２Ｃは、Ｋ５６２およびＫＹＯ１のものと比較した、対照またはＥ３特異的ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＫＣＬ２２細胞におけるＥ４含有転写産物に対するＥ３含有転写産物の比を示す。全てのデータは、３回の独立した実験の平均を示す（＋／−平均の標準誤差）。
【図２３】リンパ芽球様株化細胞におけるＢＩＭ遺伝子スプライシングに対するＢＩＭ欠失多型の機能的影響を示す図である。７名の正常ＨａｐＭａｐ個体［３名は欠失なし（ＷＴ）、４名は欠失あり（キャリア）］からのリンパ芽球様株化細胞において定量リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により測定した、ＢＩＭのエキソン特異的転写産物の発現レベル。エキソンＥ２Ａ、Ｅ３またはＥ４を含有する様々な転写産物のレベルは、Ｅ２Ａ（Ｅ３およびＥ４について）またはβ−アクチン（Ｅ２Ａについて）に対して標準化した比として表す。キャリアのうち１名は、ホモ接合性であった（緑の菱形）。
【図２４】慢性期の間および同じ患者からの寛解の後に得られた試料においてＤＮＡ−ＰＥＴにより同定されたｄＰＥＴクラスタの比較を示す図である。「低信頼度のクラスタの排除」を通過したｄＰＥＴクラスタを、患者試料Ｐ１４５とＰ４４０の間で比較した。クラスタは、２つの群に類別した：両方の試料において同定されたクラスタ（共有クラスタ）および２つの試料のうち一方だけで観察されたクラスタ（ユニーククラスタ）。これらの群のうちで、サイズ２から５０のクラスタの画分を示す。
【図２５】ＢＩＭ欠失多型を保有するＮＳＣＬＣ株化細胞であるＨＣＣ２２７９が、ゲフィチニブに対して元来耐性であることを示す図である。  図２５Ａ。以前に記載された方法１３を用いてＨＣＣ２２７９細胞における多型を同定するＰＣＲ生成物のアガロースゲル。  図２５Ｂ。欠失多型を有する（ＨＣＣ２２７９）および有さない（ＰＣ９）ＮＳＣＬＣ株化細胞におけるＥ４含有転写産物に対するＥ３含有転写産物の比（平均＋／−平均の標準誤差）。  図２５Ｃ。対照（ＤＭＳＯ）または０．５μＭのゲフィチニブで２４時間処置した後のＰＣ９およびＨＣＣ２２７９においてＱ−ＰＣＲにより測定した、エキソン４含有ＢＩＭ転写産物（β−アクチンに対して標準化した）の発現レベル（平均＋／−平均の標準誤差、ゲフィチニブ処置ＰＣ９細胞に対して＊ｐ＝０．００２５）。  図２５Ｄ。対照または０．５μＭのゲフィチニブで２４時間処置した株化細胞からの細胞溶解物におけるＢＩＭＥＬ（エキソン４およびＢＨ３ドメインを含有する）およびＰＡＲＰのレベルを示すウェスタンブロット。  図２５Ｅ。０．５μＭのゲフィチニブ、２．５μＭのＡＢＴ−７３７またはこれら両方で２４時間処置した細胞におけるホスホ−ＥＧＦＲ（ｐ−ＥＧＦＲ）、ＰＡＲＰおよびカスパーゼ３切断のレベルを示すウェスタンブロット。  図２５Ｆ。０．５μＭのゲフィチニブ、２．５μＭのＡＢＴ−７３７またはこれら両方で４８時間処置したＰＣ９およびＨＣＣ２２７９の細胞生存性。細胞生存性は、トリパンブルー排除により決定し、非薬物対照に対するパーセンテージとしてプロットした（平均＋／−平均の標準誤差、ゲフィチニブ処置およびＡＢＴ−７３７処置ＰＣ９細胞に対して＊ｐ＝０．００００４）。
【図２６】ＢＩＭ欠失多型が、ＥＧＦＲ  ＴＫＩ治療で処置されたＥＧＦＲ変異非小細胞肺がんの患者における無増悪生存期間がより不良であることを予測することを示す図である。ＢＩＭ欠失多型の存在または非存在は、ＥＧＦＲの活性化変異を有することがわかっており、ＴＫＩ治療を受けたシンガポールおよび日本からの１４１名のＮＳＣＬＣ患者において決定した。各群についての無増悪生存期間は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を用いて評価した。
【００３３】
配列表
配列番号１は、ＢＩＭ＿ｄｅｌ＿ＦおよびＢＩＭ＿ｄｅｌ＿Ｒプライマーを用いて、記載される欠失を有するＢＩＭ遺伝子から増幅したＰＣＲ断片の配列である（長さ１，３２３ｂｐ）。
配列番号２は、ＢＩＭ＿ｄｅｌ＿ＦおよびＢＩＭ＿ｄｅｌ＿Ｒプライマーを用いてのＢＩＭ野生型遺伝子からのＰＣＲ断片の配列である（長さ４，２２６ｂｐ）。
配列番号３は、Ｂｉｍ＿ｄｅｌ＿Ｆフォワードプライマーの配列である（＋ｃｈｒ２：１１１，５９９，０５１．．１１１，５９９，０７０、ｈｇ１８）。
配列番号４は、Ｂｉｍ＿ｄｅｌ＿Ｒリバースプライマーの配列である（−ｃｈｒ２：１１１，６０３，２５７．．１１１，６０３，２７６、ｈｇ１８）。
配列番号５は、ＢＩＭにおける欠失：ｃｈｒ２：１１１，５９９，６６６〜１１１，６０２，５６８（ｈｇ１８）の上流の１０００ｂｐフランキング配列ｃｈｒ２：１１１，５９８，６６６〜１１１，５９９，６６５の配列である。
配列番号６は、ＢＩＭにおける欠失：ｃｈｒ２：１１１，５９９，６６６〜１１１，６０２，５６８（ｈｇ１８）の配列である。
配列番号７は、ＢＩＭにおける欠失：ｃｈｒ２：１１１，５９９，６６６〜１１１，６０２，５６８（ｈｇ１８）の下流の１０００ｂｐフランキング配列ｃｈｒ２：１１１，６０２，５６９〜１１１，６０３，５６８の配列である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、我々が東アジア人集団においてＢＩＭ遺伝子中で見出した新規な多型について記載する。この多型は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の患者における薬物耐性の発生と関連する。
【００３５】
この多型を保有するＣＭＬ患者は、有さない患者よりも、ＣＭＬについての標準的な治療に対する耐性を生じる見込みが高い。この多型を検査することは、薬物耐性の予測、ならびに代替および／またはより攻撃的な治療により利益を受ける可能性がある患者の早期の同定のためのバイオマーカーとして有用である。さらに、ＢＩＭ遺伝子は、他の型のがんにおける治療誘発性細胞死の重要なメディエーターであるので、我々の発明は、東アジア人集団における広範囲のヒトのがんにも関連し得る。
【００３６】
ＴＫＩ耐性の機構を見出すために、我々は、ハイスループット配列決定と結び付けたゲノムペアエンドタグまたはＤＮＡ−ＰＥＴとよばれる新規な技術（参考文献Ａ２、参考文献Ａ３）を用いて、薬物耐性を有するかまたは有さない患者からのＣＭＬ細胞のゲノムを調べた。このようにすることにより、我々は、ＢＣＲ−ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性の発生と関連する、ＢＩＭ遺伝子中の以前は知られていなかった欠失を明らかにした。この欠失を有する患者は、欠失を有さない患者よりも、ＢＣＲ−ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を有する見込みが４から５倍（１７．４対３．９％）高い（ｐ＝０．０４、Ｆｉｓｈｅｒの両側正確検定）。さらに、我々は、ＢＩＭ欠失の存在または非存在を、患者からのＣＭＬ株化細胞におけるＢＣＲ−ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性と相関させることもでき、これは、ＴＫＩ耐性におけるＢＩＭ欠失についての直接的な機構的役割を示唆する。ＢＩＭタンパク質のアポトーシス促進性アイソフォームの上方制御がＴＫＩ媒介ＣＭＬ細胞死に必要であることがわかっているので（参考文献Ａ４〜Ａ７）、我々は、ＢＩＭ欠失がアポトーシス促進性ＢＩＭの発現を減退させると仮定する。
【００３７】
ＢＩＭ多型
我々は、１または複数のＢＩＭ多型核酸分子を含む単離ポリヌクレオチドについて記載する。これらは、対応するポリペプチドとともに、本文書において、「ＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の多型バリアント」または単純に「ＢＩＭ多型」として様々に記載される。
【００３８】
単離ポリヌクレオチドは、様々な診断法において用いることができる。単離多型ＢＩＭ核酸分子は、本明細書で記載する場合、以下の方法の１または複数において用いることができる：ａ）スクリーニングアッセイ、ｂ）予測のための医薬（例えば診断アッセイ、予後アッセイ、モニタリング臨床試験および薬理遺伝学）およびｃ）処置方法（例えば治療的および予防的）。
【００３９】
ＢＩＭ遺伝子は、本文書の他の場所で記載するように、当該技術において知られている。ＢＩＭ遺伝子の起源は、任意の哺乳動物ＢＩＭ遺伝子であり得る。一般的に、診断アッセイのために、ＢＩＭ遺伝子の動物起源は、試験される核酸を有する動物と同じ種である。
【００４０】
単離多型ＢＩＭ核酸分子は、１または複数のＢＩＭ多型を含む。例えば、ＢＩＭ多型は、５’から３’の順序で、配列番号５に示すヌクレオチド配列と、その直後に続く配列番号７に示すヌクレオチド配列とを含み得る。ＢＩＭ多型バリアントは、配列番号６に示すヌクレオチド配列を欠くことによって特徴付けられ得る。
【００４１】
いくつかの、例えばスクリーニングアッセイにおける使用のために、ＢＩＭ多型核酸分子は、少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔまたは少なくとも約２５ｎｔの長さであり、しばしば少なくとも約５０ｎｔである。このような小さいＤＮＡ断片は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ハイブリダイゼーションスクリーニングなどのためのプライマーとして有用である。より大きいポリヌクレオチド断片、例えば少なくとも約５０ｎｔ、少なくとも約１００ｎｔ、少なくとも約２００ｎｔ、少なくとも約３００ｎｔ、少なくとも約５００ｎｔ、少なくとも約１０００ｎｔ、少なくとも約１５００ｎｔ、コード領域全体まで、またはコード領域全体とＢＩＭ遺伝子からの約１０００ｎｔまでの５’および／もしくは約１０００ｎｔまでの３’フランキング配列は、コードされるポリペプチド、プロモーターモチーフなどを生成するために有用である。ＰＣＲのような増幅反応における使用のために、プライマーの対を用いる。プライマー配列の正確な組成は重要でないが、ほとんどの用途のために、プライマーは、当該技術において知られるように、ストリンジェント条件下で対象配列とハイブリダイズする。
【００４２】
プローブとして用いる場合、単離多型ＢＩＭ核酸分子は、追加の非ＢＩＭヌクレオチド配列が検出アッセイに干渉しない限り、非ＢＩＭヌクレオチド配列を含んでよい。プローブは、単離多型ＢＩＭ配列と、任意の数の非ＢＩＭヌクレオチド配列（例えば約１ｂｐから約１ｋｂ以上まで）を含んでよい。
【００４３】
スクリーニングの目的のために、多型配列のハイブリダイゼーションプローブを用いることができ、ここでは、両方の形が、別々の反応において、固相マトリクス上で空間的に離れて、または互いに区別できるように標識されて存在する。アッセイは、記載される多型の１または複数とハイブリダイズする核酸を利用してよい。
【００４４】
本明細書で記載する単離多型ＢＩＭ核酸分子は、固体基材と直接または間接的（例えばリンカー分子を介して）に結合（例えば化学的コンジュゲート）できる。固体基材は、それらに限定されないが、ビーズ、例えばポリスチレンビーズ；チップ、例えばガラス、シリカなど；プラスチック表面、例えばポリスチレン、ポリカーボネートプラスチックマルチウェルプレートなどを含む、当該技術において知られるいずれであってもよい。
【００４５】
単離多型ＢＩＭ核酸分子は、化学的もしくは生化学的合成により、組換えＤＮＡ技術により、もしくは生物学的供給源から核酸を単離することにより、または上記の任意の組合せにより得ることができる。例えば、核酸は、当該技術において知られるように固相合成技術を用いて合成できる。オリゴヌクレオチド合成は、Ｅｄｇｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：７５６頁；Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈら（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：１６９１頁ならびにＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９頁にも記載されている。核酸の調製の後に、核酸を、次いで、発現系の他のメンバーにライゲーションして、転写開始および終結領域（これらが、適切な条件下で対象ポリペプチド生成物への核酸の発現をもたらす）と作動可能に組み合わさった対象生成物をコードする核酸を含む発現カセットまたは系を生成する。
【００４６】
追加のＢＩＭ遺伝子多型は、それらに限定されないが、ＳＳＣＰ、変性ＨＰＬＣおよび配列決定を含む当該技術において知られる任意の様々な方法を用いて同定してよい。ＳＳＣＰは、追加のＢＩＭ遺伝子多型を同定するために用いてよい。一般的に、ＰＣＲプライマーおよび制限酵素は、約２５ｂｐから約５００ｂｐまで、または約１００ｂｐから約２５０ｂｐまで、またはその範囲内の任意の中間もしくは重複する範囲のサイズの生成物を生じるように選択される。
【００４７】
多型ＢＩＭポリペプチド
我々は、単離多型ＢＩＭポリペプチドについてさらに記載する。単離多型ＢＩＭポリペプチドは、ＢＩＭポリペプチドの生物活性を改変する薬剤をスクリーニングするためのアッセイにおいて有用であり得る。
【００４８】
用語「多型ＢＩＭポリペプチド」は、全長天然ポリペプチドおよびその断片、特に生物活性断片および／または機能的ドメイン、例えば生物活性を有する領域もしくはドメインなどに相当する断片；その抗原性断片を含み、かつ他のタンパク質もしくはその一部と対象ポリペプチドとの融合体を含む、既知のＢＩＭポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされるアミノ酸配列を包含する。ＢＩＭポリペプチドのアミノ酸配列は開示されている。例えばＭｏｏｒｅら、既出を参照されたい。ＢＩＭポリペプチドにおける多型は、一般的に、参照配列に対して定義される。
【００４９】
本明細書で用いる場合、「多型ＢＩＭポリペプチド」は、ｉ）天然多型ＢＩＭポリペプチド、ｉｉ）多型ＢＩＭポリペプチドの断片、ｉｉｉ）多型ＢＩＭポリペプチドのポリペプチド類似体、ｉｖ）多型ＢＩＭポリペプチドのバリアント、ｖ）多型ＢＩＭポリペプチドの免疫活性断片およびｖｉ）多型ＢＩＭポリペプチドを含む融合タンパク質のアミノ酸配列を有する組換えまたは非組換えポリペプチドのアミノ酸配列のことをいう。多型ＢＩＭポリペプチドは、生体試料から、または自然、合成、半合成もしくは組換えのいずれかの供給源から得ることができる。
【００５０】
用語「多型ＢＩＭポリペプチド」は、少なくとも約５アミノ酸、少なくとも約１０アミノ酸、少なくとも約１５アミノ酸、少なくとも約２５アミノ酸、少なくとも約５０アミノ酸、少なくとも約７５アミノ酸、少なくとも約１００アミノ酸、少なくとも約２００アミノ酸、少なくとも約３００アミノ酸、少なくとも約４００アミノ酸から、または多型ＢＩＭポリペプチドのポリペプチド全体までを含むポリペプチドを包含する。いくつかの実施形態では、多型ＢＩＭポリペプチドは、生物活性を示し、例えば、ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＢ細胞の増殖および免疫グロブリンの生成を引き起こす。ＢＩＭ生物活性についての他のアッセイは、当該技術において知られており、多型ＢＩＭポリペプチドが生物活性を示すかを決定し、かつ所望により、ＢＩＭ生物活性を定量するために用いることができる。ＢＩＭ生物学的アッセイは、様々な出版物、例えばＭｏｏｒｅら、既出に記載されている。
【００５１】
多型ＢＩＭポリペプチドは、融合タンパク質の一部であってよい。適切な融合パートナー（例えば非ＢＩＭポリペプチドまたは「異種ポリペプチド」）は、それらに限定されないが、免疫認識をもたらす異種ポリペプチド、例えばエピトープタグ；検出可能なシグナルをもたらす異種ポリペプチド、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼなど；触媒機能をもたらす異種ポリペプチド；および細胞への侵入を容易にする異種ポリペプチドを含む。融合パートナーは、多型ＢＩＭポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端またはその両方にインフレームで、ポリペプチドの合成の標準的な方法を用いて、または組換え法を用いて結合させることができる。
【００５２】
多型ＢＩＭポリペプチドは、自然の供給源からの単離；化学合成による生成；および標準的な組換え技術による生成を含む任意の既知の方法、またはそのような方法の組合せにより得ることができる。
【００５３】
多型ＢＩＭポリペプチドは、生物学的供給源から、親和性クロマトグラフィーを用いて、例えば固体支持体に固定化されたＢＩＭポリペプチドに特異的な抗体を用いて単離できる。ポリペプチドは、発現の目的に応じて、従来の様式に従って原核または真核生物において発現できる。タンパク質の大規模生成のために、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような単細胞生物、バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞、または脊椎動物、特に哺乳動物のような高等生物の細胞、例えばＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などを発現宿主細胞として用いてよい。いくつかの状況では、遺伝子を真核細胞において発現させることが望ましく、ここでは、タンパク質は、天然のフォールディングと翻訳後修飾により利益を受ける。ポリペプチドは、次いで、細胞培養物上清または細胞溶解物から、上記のように親和性クロマトグラフィー法またはアニオン交換／サイズ排除クロマトグラフィー法を用いて単離できる。
【００５４】
発現宿主を採用することにより大量のタンパク質またはその断片を入手して、タンパク質を従来の様式に従って単離および精製してよい。溶解物を発現宿主から調製し、溶解物を、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィーまたは他の精製技術により精製できる。
【００５５】
ＢＩＭ多型の検出
多型または変異、例えば本明細書に記載するＢＩＭ多型についてＤＮＡを分析するためにいくつかの異なる方法が、通常、用いられる。
【００５６】
よって、個体に由来するポリヌクレオチド試料中のＢＩＭ多型の検出は、それらに限定されないが、特異的プライマーを用いる配列の増幅；ポリヌクレオチド試料のヌクレオチド配列の決定；ハイブリダイゼーション分析；１本鎖高次構造多型分析；変性勾配ゲル電気泳動；ミスマッチ切断検出などを含む当該技術において知られる任意の手段により達成できる。ＢＩＭ多型の検出は、ＢＩＭ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物レベルの変化；ＢＩＭ遺伝子の異常改変、例えば異常メチル化パターン；ＢＩＭ  ｍＲＮＡの非野生型スプライシングパターンの存在；ＢＩＭポリペプチドレベルの変化；および／またはＢＩＭポリペプチド生物活性の変化の検出により達成することもできる。
【００５７】
試料
個体に由来する（例えば個体から得られる）ポリヌクレオチド試料は、個体から採取された生体試料から得られる。個体からのポリヌクレオチドを含む任意の生体試料は、用いるのに適している。生体試料は、ポリヌクレオチドを単離するように処理してもよい。代わりに、全細胞または他の生体試料を、その中に含まれるポリヌクレオチドを単離することなく用いてよい。
【００５８】
核酸増幅
ポリヌクレオチド試料を分析することによるＢＩＭ多型の検出は、いくつかの様式で行うことができる。試験核酸試料は、ＢＩＭ多型（複数可）を含むことが知られている配列領域を増幅するプライマーを用いて増幅できる。ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを、直接用いることができる。代わりに、対象の領域を適切なベクターにクローニングして、分析のために十分な量に成長させることができる。
【００５９】
核酸は、分析のために十分な量を提供するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）などのような従来の技術により増幅してよい。ポリメラーゼ連鎖反応の使用は、例えば「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（２０００）Ｊ．Ｍ．Ｓ．ＢａｒｔｌｅｔｔおよびＤ．Ｓｔｉｒｌｉｎｇ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；ならびに「ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ」（１９９９）Ｉｎｎｉｓ、ＧｅｌｆａｎｄおよびＳｎｉｎｓｋｙ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを含む様々な出版物に記載されている。
【００６０】
検出可能な標識を増幅反応に含めてよい。適切な標識は、蛍光色素、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリスリン、アロフィコシアニン、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）またはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、放射活性標識、例えば３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈなどを含む。標識は、２段階系であってよく、ここでは、増幅ＤＮＡが、高親和性結合パートナー、例えばアビジン、特異的抗体などを有するビオチン、ハプテンなどとコンジュゲートし、結合パートナーが検出可能な標識とコンジュゲートする。標識は、プライマーの一方または両方とコンジュゲートしてよい。代わりに、増幅に用いたヌクレオチドのプールを標識して、標識を増幅生成物中に組み込む。
【００６１】
ＢＩＭ多型を含む領域を一旦増幅すると、ＢＩＭ多型は、ＰＣＲ生成物中で、ヌクレオチド配列決定により、ＳＳＣＰ分析により、または当該技術において知られる任意の他の方法により検出できる。
【００６２】
核酸配列決定
最も決定的な方法は、ＤＮＡまたは転写されたｍＲＮＡ（入手可能であれば）を配列決定して、実際の塩基配列を決定することである（ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ、１９７７；Ｓａｎｇｅｒら、１９７７）。
【００６３】
試料の核酸は、ジデオキシ鎖ターミネーション法またはその他の公知の方法により配列決定できる。ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを直接用いてよい。ｍＲＮＡを用いるならば、ｃＤＮＡコピーをまず作製してよい。所望により、試料の核酸は、ＰＣＲを用いて増幅できる。当該技術において知られる様々な配列決定反応を用いて、ＢＩＭ遺伝子または特定の多型が生じることが知られているその一部を直接配列決定して、試料の核酸の配列を、ＢＩＭ多型を含有する参照ポリヌクレオチドと比較することにより多型を検出できる。様々な自動化配列決定手順のいずれも用いることができる。例えば、ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ３６：１２７〜１６２頁を参照されたい。
【００６４】
このような方法は最も決定的であるが、これは、最も費用と時間がかかる方法でもある。
【００６５】
制限マッピング分析（ＲＦＬＰ分析）
個体における特定のＤＮＡ配列、例えばＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の多型バリアントをコードする遺伝子は、ＤＮＡの配列の欠失、重複する配列の挿入、配列の逆位または単一ヌクレオチドから別のものへの変換のような多くの異なる変化を受けることがある。特定のＤＮＡ配列中の変化は、４〜６ヌクレオチドの特異的ＤＮＡ配列を認識する制限酵素を用いることにより追跡できる。
【００６６】
制限マッピング分析は、よって、多型についてのＤＮＡの分析においても用いることができる。ある制限酵素についての認識部位を変化させる部位にて既知の多型について探しているならば、この制限酵素を用いて単純にＤＮＡを消化し、断片をゲル上でまたはサザンブロットを用いて分析して、多型の存在または非存在を決定することが可能である。この型の分析は、全体的な挿入または欠失の存在または非存在を決定するためにも有用である。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは、既知の多型の存在を決定するためのさらに別の方法である。
【００６７】
制限酵素は、ＤＮＡを、それらの特異的認識配列にて切断（消化）し、１百万程度の破片をもたらす。制限酵素により認識される配列を、認識されないものに変化させる相違が存在する場合、領域を切断することにより生成されるＤＮＡの破片は、異なるサイズのものである。よって、ある領域からの様々な可能性のある断片サイズは、領域内のＤＮＡの精密な配列に依存する。
【００６８】
生成される断片の変動は、「制限断片長多型」（ＲＦＬＰ）とよばれる。異なるバリアントＤＮＡ配列を反映する異なるサイズの断片は、消化されたＤＮＡをそのサイズに従って分離することにより視覚化できる。ゲルまたはキャピラリー電気泳動、特にアクリルアミドまたはアガロースゲルのような様々な手段により分画を行ってよい。
【００６９】
例えば、ＤＮＡ断片は、アガロースゲル上にあって、放射活性標識ＤＮＡ「プローブ」とのアニーリングにより個別の断片を視覚化してよい。各個体は、特定の配列の２つの異なる形を有することがある。２つのホモログが同じ形の多型を保有する場合、１つのバンドが観察される。２以上の形の多型が、集団中の特定のＤＮＡマーカーについて存在することがあるが、１つの家系において、４つの形だけが可能である（それぞれの親から２つ）。それぞれの子供は、それぞれの親から１つの形の多型を受け継ぐ。よって、各染色体領域の起源を追跡できる（母性または父性起源）。
【００７０】
上記の技術は、当該技術において公知である。これらの技術についての詳細な記載は、例えば「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ＤＮＡ」（１９９７）Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓおよびそこで引用される参考文献を含む様々な出版物において見出すことができる。
【００７１】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
代わりにまたはさらに、ＲＴ−ＰＣＲを行うことができる。ＰＣＲは、よって、多型に特異的なプライマーを用いることにより多型が存在するかを決定するためにも用いてよい。
【００７２】
このような方法は、鋳型として個体の遺伝物質を含む生体試料を個体から回収するステップと、場合によって、鋳型核酸（ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはその両方）を生体試料から単離するステップと、鋳型核酸試料を、ＢＩＭ多型核酸分子と特異的にハイブリダイズする１もしくは複数のプライマーと、試料中の鋳型核酸分子のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じる条件下で接触させるステップと、増幅生成物の存在、非存在および／もしくは相対的量を検出するステップと、タイの長さを対照試料と比較するステップとを含み得る。予想されるサイズの増幅生成物が観察されることは、ＢＩＭ多型プライマー内に含まれるＢＩＭ多型が、試験核酸試料中に存在することを示す。
【００７３】
ハイブリダイゼーション条件、ＢＩＭ多型プライマー長、およびＢＩＭ多型プライマー内の多型の位置のようなパラメータは、プライマー（複数可）内に存在する多型が試料の核酸内にも存在しない限りハイブリダイゼーションが生じないように選択できる。当業者は、このようなパラメータをどのように選択し、変動させるかをよく認識している。例えば、Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３頁；およびＳａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６２３０頁を参照されたい。
【００７４】
ハイブリダイゼーション分析
バリアント配列とのハイブリダイゼーションを用いて、ＢＩＭ多型の存在を決定することもできる。
【００７５】
ハイブリダイゼーション分析は、それらに限定されないが、サザンブロット、ノザンブロット、ドットブロット、マイクロアレイなどを含むいくつかの異なる様式で行うことができる。米国特許第５，４４５，９３４号またはＷＯ９５／３５５０５に記載されるような、固体支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイへの対照およびバリアント配列のハイブリダイゼーションパターンは、バリアント配列の存在を検出するための手段として用いてもよい。
【００７６】
核酸試料中の多型の同定は、試料および対照の核酸を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイにハイブリダイズさせることにより行うことができる。Ｃｒｏｎｉｎら（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ７：２４４〜２５５頁；およびＫｏｚａｌら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２：７５３〜７５９頁。
【００７７】
質量分析
既知遺伝子内の多型の存在を決定するための質量分析の使用は、米国特許第５，８６９，２４２号に開示されている。
【００７８】
オリゴヌクレオチドライゲーション
代わりに、オリゴヌクレオチドライゲーションを、多型を検出する手段として利用する様々な方法が当該技術において知られている。例えばＲｉｌｅｙら（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：２８８７〜２８９０頁；およびＤｅｌａｈｕｎｔｙら（１９９６）Ａｍ．Ｊ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５８：１２３９〜１２４６頁を参照されたい。
【００７９】
１本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析
１本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析は、多型を検出するための迅速で有効な方法である（Ｄｅａｎら、Ｃｅｌｌ  ６１：８６３頁、１９９０；ＧｌａｖａｃおよびＤｅａｎ、Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ２：４０４頁、１９９３；Ｐｏｄｕｓｌｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４９：１０６頁、１９９２）。ＳＳＣＰでは、ゲル上での異常な鎖の移動性は、遺伝子内の変異事象と関連する。
【００８０】
ゲルマトリクス中での変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、ミスマッチ切断検出およびヘテロ２重鎖分析も、多型を検出するために用いてよい。
【００８１】
制限エンドヌクレアーゼフィンガープリンティング（ＲＥＦ）
制限エンドヌクレアーゼフィンガープリンティング（ＲＥＦ）を、場合によってＲＴ−ＰＣＲを行った後に行うこともできる。ＲＥＦは、１本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）法の改変であり、２ｋｂの長さまでのＤＮＡ断片中の配列の変更を効率よく検出することを可能にする（ＬｉｕおよびＳｏｍｍｅｒ、１９９５）。
【００８２】
多型の遺伝子分析は、なかでも米国特許第５，５５２，２８号、第５，６５４，１３号、第５，６７０，３３号、第５，８０７，６７号、第５，８５８，６６号、第５，６９１，１５号、第５，９２２，５７号、第５，９７２，６０号、第６，１３６，５３号および第５，９５５，２６号に詳細に開示されている。
【００８３】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ドットブロット分析
特定の遺伝子上の多型を検出するための別の方法は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ドットブロット分析に従うことである（Ｃｏｎｎｅｒ，Ｂ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０、２７８〜２８２頁（１９８３））。この方法は、標的多型を挟むように設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いたＰＣＲ増幅遺伝子断片の対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズ可能なＤＮＡ断片をドットブロット分析に供することにより行うことができる。この様式で、このようなＤＮＡ断片上の多型を検出できる。
【００８４】
ポリペプチド分析
多型がアミノ酸の変化を含む場合、分析される遺伝子の発現生成物を用いて多型の分析を行うことが可能である。この場合、多型部位に相当するアミノ酸を含有する限り、部分タンパク質または部分ペプチドを分析のための試料として用いることができる。多型部位にてアミノ酸を直接アッセイする方法または免疫学的方法をこの場合に用いてよい。エドマン法のような既知のアミノ酸配列分析法を前者において用いてよく、遺伝子の発現生成物に特異的な結合活性を有するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いる方法、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法または免疫拡散法を後者において用いてよい。
【００８５】
上記のようにして得られる多型についての情報は、統計的に合計して、疾患の診断、罹患についての相対的リスクの検出および識別、ならびに療法の選択のために用いてよい。
【００８６】
発現分析
特定の試料中の多型ＢＩＭ核酸分子、例えば多型ＢＩＭ  ｍＲＮＡまたは多型ＢＩＭポリペプチドの発現レベルを決定するために、いくつかの方法が利用可能である。診断をいくつかの方法により行って、患者の試料中の正常もしくは異常ＢＩＭ  ｍＲＮＡの存在または非存在または量の変化を決定してよい。例えば、検出は、従来の方法に従って行われる、標識抗体を用いる細胞または組織学的切片の染色を利用してよい。細胞は、細胞質の分子を染色するために透過にされる。対象の抗体を細胞試料に加え、エピトープとの結合を可能にするのに十分な時間、通常少なくとも約１０分間インキュベートする。抗体は、放射性同位体、酵素、蛍光剤、化学発光剤または直接検出のためのその他の標識を用いて標識してよい。代わりに、第２段階の抗体または試薬を用いてシグナルを増幅する。このような試薬は、当該技術において公知である。例えば、１次抗体をビオチンとコンジュゲートさせ、セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートアビジンを第２段階試薬として加えてもよい。代わりに、２次抗体を蛍光化合物、例えばフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッドなどとコンジュゲートさせる。最終検出は、ペルオキシダーゼの存在下で色の変化を経る基質を用いる。抗体結合の非存在または存在は、解離細胞のフローサイトメトリー、顕微鏡観察、Ｘ線撮影法、シンチレーション計数などを含む様々な方法により決定してよい。多型ＢＩＭポリペプチドの存在および／またはレベルは、当業者に知られる任意の様式で検出および／または定量してもよい。
【００８７】
さらに、試験は、ＢＩＭ  ｍＲＮＡの発現の測定を含み得る。生化学的研究を行って、ＢＩＭコード領域または制御領域内の配列多型が疾患と関連するかを決定してよい。疾患関連多型は、遺伝子の欠失もしくは切断、発現レベルを変更する変異、タンパク質の活性に影響する変異などを含むことがある。
【００８８】
ＢＩＭの発現レベルに影響し得るプロモーターまたはエンハンサー配列中の変化を、当該技術において知られる様々な方法により、正常対立遺伝子の発現レベルと比較できる。プロモーターまたはエンハンサー強度を決定する方法は、発現した自然タンパク質の定量；簡便な定量をもたらすβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなどのようなレポーター遺伝子とともにベクターへのバリアント制御エレメントの挿入などを含む。
【００８９】
多型ＢＩＭポリペプチド中の変異についてのスクリーニングは、タンパク質の機能的または抗原性の特徴に基づいてよい。タンパク質切断アッセイは、タンパク質の生物活性に影響し得る欠失を検出するために有用である。多型ＢＩＭポリペプチド内の多型を検出するために設計された様々なイムノアッセイを、スクリーニングにおいて用いてよい。多くの多様な遺伝子変異が特定の疾患表現型を導く場合、機能的タンパク質アッセイが、効果的なスクリーニングツールであることが証明されている。コードされる多型ＢＩＭポリペプチドの活性は、特定の多型を欠く参照ＢＩＭポリペプチドとの比較により決定できる。
【００９０】
ＢＩＭ遺伝子発現のレベルが興味の対象である診断方法は、対象の試料のＢＩＭ核酸の豊富さを、対照値のものと比較して、いずれかの相対的な相違を決定することを典型的に含み、ここで、相違は、定性的および／または定量的に測定してよく、この相違を、次いで、異常ＢＩＭ遺伝子発現パターンの存在または非存在と関連させる。試料中の核酸の豊富さを決定するための様々な異なる方法が当業者に知られており、対象の具体的な方法は、Ｐｉｅｔｕら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．（１９９６年６月）６：４９２〜５０３頁；Ｚｈａｏら、Ｇｅｎｅ（１９９５年４月２４日）１５６：２０７〜２１３頁；Ｓｏａｒｅｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９７年１０月）８：５４２〜５４６頁；Ｒａｖａｌ、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９４年１１月）３２：１２５〜１２７頁；Ｃｈａｌｉｆｏｕｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９４年２月１日）２１６：２９９〜３０４頁；ＳｔｏｌｚおよびＴｕａｎ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９６０年１２月  ６：２２５〜２３０頁；Ｈｏｎｇら、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９８２）２：９０７頁；ならびにＭｃＧｒａｗ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４）１４３：２９８頁に記載されるものを含む。また、ＷＯ９７／２７３１７（その開示は、本明細書に参照により組み込まれている）に開示される方法も対象である。
【００９１】
ＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）
ＢＩＭは、ＢＡＭ；ＢＩＭ；ＢＯＤ；ＢｉｍＬ；ＢｉｍＥＬ；ＢＩＭ−ベータ６；ＢＩＭ−ベータ７；ＢＩＭ−アルファ６；ＢＣＬ２Ｌ１１としても知られる。
【００９２】
ＢＩＭ遺伝子およびポリペプチドのＧｅｎＢａｎｋ受託番号およびＵＣＳＣ遺伝子ＩＤは、次のとおりである。
【００９３】
ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号：
遺伝子（転写産物）            タンパク質
ＮＭ＿２０７００２            ＮＰ＿９９６８８５
ＮＭ＿１３８６２１            ＮＰ＿６１９５２７
ＮＭ＿００６５３８            ＮＭ＿００６５３８
【００９４】
ＵＣＳＣ遺伝子ＩＤ：
遺伝子（転写産物）            タンパク質
ｕｃ００２ｔｇｗ．１          タンパク質なし
ｕｃ００２ｔｇｘ．１          タンパク質なし
ｕｃ０１０ｆｋｄ．１          タンパク質なし
ｕｃ００２ｔｇｙ．１          タンパク質なし
ｕｃ００２ｔｇｚ．１          Ｏ４３５２１
ｕｃ０１０ｆｋｅ．１          タンパク質なし
ｕｃ００２ｔｈａ．１          Ｏ４３５２１
ｕｃ００２ｔｈｂ．１          タンパク質なし
ｕｃ００２ｔｈｃ．１          タンパク質なし
ｕｃ００２ｔｈｄ．１          Ｏ４３５２１
【００９５】
以下の転写産物についての記載は、上に列挙するＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号およびＵＣＳＣ遺伝子ＩＤに相当する。
【００９６】
ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＢａｎｋ（ＲｅｆＳｅｑ）
ＮＭ＿２０７００２．２
Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＢＣＬ２様１１（アポトーシス促進物質）（ＢＣＬ２Ｌ１１）、転写産物バリアント９、ｍＲＮＡ。
ＮＭ＿１３８６２１．３
Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＢＣＬ２様１１（アポトーシス促進物質）（ＢＣＬ２Ｌ１１）、転写産物バリアント１、ｍＲＮＡ。
ＮＭ＿００６５３８．３
Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＢＣＬ２様１１（アポトーシス促進物質）（ＢＣＬ２Ｌ１１）、転写産物バリアント６、ｍＲＮＡ。
【００９７】
ＵＣＳＣ遺伝子
ｂｉｍ−アルファ１（ｕｃ００２ｔｇｗ．１）
Ｂｉｍ−アルファ１、完全ｃｄｓ。
ＲｅｆＳｅｑ（ＮＭ＿００６５３８）：
ｂｉｍ−アルファ１（ｕｃ００２ｔｇｘ．１）
Ｂｉｍ−アルファ１、完全ｃｄｓ。
ＲｅｆＳｅｑ（ＮＭ＿００６５３８）：
ｂｉｍ−アルファ１（ｕｃ０１０ｆｋｄ．１）
Ｂｉｍ−アルファ１、完全ｃｄｓ。
ＲｅｆＳｅｑ（ＮＭ＿００６５３８）：
ｂｉｍ−アルファ１（ｕｃ００２ｔｇｙ．１）
Ｂｉｍ−アルファ１、完全ｃｄｓ。
ＲｅｆＳｅｑ（ＮＭ＿００６５３８）：
ｂｉｍ−アルファ１（ｕｃ００２ｔｇｚ．１）
ＢＣＬ２様１１転写産物バリアント９。
ＲｅｆＳｅｑ（ＮＭ＿００６５３８）
ｂｉｍ−アルファ１（ｕｃ０１０ｆｋｅ．１）
Ｂｉｍ−アルファ１、完全ｃｄｓ。
ＲｅｆＳｅｑ（ＮＭ＿００６５３８）：
ＢＣＬ２Ｌ１１（ｕｃ００２ｔｈａ．１）
ＢＣＬ２様１１アイソフォーム９
ＲｅｆＳｅｑ（ＮＭ＿１３８６２１）：
ｂｉｍ−アルファ１（ｕｃ００２ｔｈｂ．１）
Ｂｉｍ−アルファ１、完全ｃｄｓ。
ＲｅｆＳｅｑ（ＮＭ＿００６５３８）：
ｂｉｍ−アルファ１（ｕｃ００２ｔｈｃ．１）
Ｂｉｍ−アルファ１、完全ｃｄｓ。
ＲｅｆＳｅｑ（ＮＭ＿００６５３８）：
ＢＣＬ２Ｌ１１（ｕｃ００２ｔｈｄ．１）
ＢＣＬ２様１１アイソフォーム９
ＲｅｆＳｅｑ（ＮＭ＿００６５３８）：
【００９８】
ＵＣＳＣゲノムブラウザデータベース／データについての文献
Ｒｈｅａｄ  Ｂ、Ｋａｒｏｌｃｈｉｋ  Ｄ、Ｋｕｈｎ  ＲＭ、Ｈｉｎｒｉｃｈｓ  ＡＳ、Ｚｗｅｉｇ  ＡＳ、Ｆｕｊｉｔａ  Ｐ、Ｄｉｅｋｈａｎｓ  Ｍ、Ｓｍｉｔｈ  ＫＥ、Ｒｏｓｅｎｂｌｏｏｍ  ＫＲ、Ｒａｎｅｙ  ＢＪ、Ｐｏｈｌ  Ａ、Ｐｈｅａｓａｎｔ  Ｍ、Ｍｅｙｅｒ  Ｌ、Ｈｓｕ  Ｆ、Ｈｉｌｌｍａｎ−Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｊ、Ｈａｒｔｅ  ＲＡ、Ｇｉａｒｄｉｎｅ  Ｂ、Ｄｒｅｓｚｅｒ  Ｔ、Ｃｌａｗｓｏｎ  Ｈ、Ｂａｒｂｅｒ  ＧＰ、Ｈａｕｓｓｌｅｒ  Ｄ、Ｋｅｎｔ  ＷＪ．Ｔｈｅ  ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  ｄａｔａｂａｓｅ：ｕｐｄａｔｅ  ２０１０．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１０年１月；３８（データベース版）：Ｄ６１３〜９．Ｅｐｕｂ  ２００９年１１月１１日。
【００９９】
この遺伝子によりコードされるタンパク質は、ＢＣＬ−２タンパク質ファミリーに属する。ＢＣＬ−２ファミリーメンバーは、ヘテロ二量体またはホモ二量体を形成し、広い多様性の細胞活動に関与する抗アポトーシスまたはアポトーシス促進性の調節物質として働く。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、Ｂｃｌ−２ホモロジードメイン３（ＢＨ３）を含有する。これは、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１／ＢＣＬ−Ｘ（Ｌ）およびＭＣＬ１を含むＢＣＬ−２タンパク質ファミリーの他のメンバーと相互作用し、アポトーシスアクチベーターとして働くことが示されている。この遺伝子の発現は、神経増殖因子（ＮＧＦ）により、およびフォークヘッド転写因子ＦＫＨＲ−Ｌ１により誘発でき、このことは、神経およびリンパ球アポトーシスにおけるこの遺伝子の役割を示唆する。マウスでの対応物のトランスジェニック研究は、この遺伝子が、胸腺細胞の負の選択におけるアポトーシスの必須の発動因子として機能することを示唆した。この遺伝子のいくつかの代替スプライス転写産物バリアントが同定されている［ＲｅｆＳｅｑにより提供される］。
【０１００】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）におけるチロシンキナーゼ阻害剤処置に対する耐性の予測
我々の発見は、以下の状況において臨床的利用性を有し得る。
【０１０１】
ＢＩＭ欠失を有する患者は、その状態をより頻繁にモニタリングすることにより利益を受けることができる。このことにより、代替および／またはより攻撃的な治療、例えば骨髄移植をより早期に用いることが可能になり、より良好な臨床転帰を潜在的に導くことができる。
【０１０２】
ＢＩＭ欠失は、治療の手引きとして用いることができる。例えば、欠失を有する患者は、ＢＨ３模倣剤として知られるクラスの薬物に対して特に感受性が高いことがあるＴＫＩ耐性患者の部分群であり得る（参考文献Ａ８〜Ａ１２）。ＡＢＴ−２６３（現在、早期段階の臨床試験中）のようなこのような薬物は、ＢＣＬ２ファミリーのタンパク質の生存促進性メンバー（これは、通常、ＢＩＭタンパク質の死滅促進性ファミリーに対抗する）を選択的に標的にする。
【０１０３】
ＣＭＬは、造血幹細胞のがんであり、ＢＣＲ−ＡＢＬとよばれる発癌性融合遺伝子（これは、疾患の原因因子であると考えられる）の存在により引き起こされる。ＢＣＲ−ＡＢＬは、正常な対応物と比較した場合にＣＭＬ細胞の生存および増殖の増加を媒介する構成的活性型チロシンキナーゼをコードする。
【０１０４】
ＣＭＬに対する効果的な処置は、ＢＣＲ−ＡＢＬのキナーゼ活性を阻害するクラスの薬物の形であり、これらは、一般的に、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）とよばれる。しかし、時間が経つと、一部分の患者は、これらの薬物に対して臨床耐性を生じ、この事象は、急性転化（ＢＣ）ＣＭＬへの転換およびより短い生存にしばしば随伴する。
【０１０５】
約６０％の患者において、ＴＫＩ耐性は、ＴＫＩをＢＣＲ−ＡＢＬと結合しにくくするＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子の変異、または「野生型」ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子もしくはタンパク質の過剰発現によるＢＣＲ−ＡＢＬの再活性化を伴う。両方の場合において、ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼ活性は、ＴＫＩの存在下で回復し、よってＢＣＲ−ＡＢＬ依存性ＴＫＩ耐性との用語が用いられる。残りの４０％の症例では、ＴＫＩ耐性は、ＢＣＲ−ＡＢＬ再活性化の非存在下で生じ、ＢＣＲ−ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性とよばれる。
【０１０６】
現在までに、ＢＣＲ−ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性の原因は不明であり、この形の耐性を媒介する機構の理解が深まることは、ＴＫＩ耐性を克服するための方策を決定するために重要である。ＴＫＩ耐性は、ＴＫＩ耐性を生じる患者とそうでない患者との間の後天性または遺伝性の遺伝子の相違により媒介されるはずであるので、我々は、このような相違の同定が、ＴＫＩ耐性の機構を解明するための見込みのあるアプローチであると推論する。
【０１０７】
したがって、我々は、ハイスループット配列決定と結び付けたゲノムペアエンドタグまたはＤＮＡ−ＰＥＴとよばれる新規な技術を用いて、薬物耐性を有するかまたは有さず、ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼドメイン変異を有するおよび有さない患者からの初代ＣＭＬ細胞のゲノムを調べた。
【０１０８】
本開示では、我々は、我々のチームによる以下の新規な発見について記載する。
【０１０９】
ＤＮＡ−ＰＥＴの使用により、我々は、ＢＣＲ−ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性の発生と関連する、ＢＩＭ遺伝子中の以前は知られていなかった欠失を明らかにした。ＣＭＬ患者試料の臨床的にアノテートされたセットを用いて、我々は、この欠失を有する患者が、欠失を有さない患者よりも、ＢＣＲ−ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を有する見込みが４から５倍高いことを見出した（ｐ＝０．０４、Ｆｉｓｈｅｒの両側正確検定）。
【０１１０】
次に、我々は、患者由来ＣＭＬ株化細胞におけるＢＩＭ欠失の存在が、ＢＣＲ−ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性と強く関連することを見出した。７つの患者由来ＣＭＬ株化細胞のパネルを用いて、我々は、欠失を有する１つの株化細胞を見出した。重要なことに、ＢＩＭ欠失含有株化細胞だけが、ＢＣＲ−ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性を示した。これらの結果は、ＢＣＲ−ＡＢＬ非依存性ＴＫＩ耐性におけるＢＩＭ欠失についての直接的な機構的役割を示唆する。ＢＩＭタンパク質の上方制御がＴＫＩ媒介ＣＭＬ細胞死に必要であることがわかっているので、我々は、ＢＩＭ欠失がＢＩＭのアポトーシス促進性アイソフォームの発現を減退させると仮定する。
【０１１１】
ＢＩＭ欠失のさらなる分析（図４Ｃに示す配列番号３および４に記載するプライマーを用いる実施例２に記載するようなＰＣＲアッセイ、ＳＮＰ分析ならびにＨａｐＭａｐデータを用いて）により、欠失が、実際は、東アジア系の個体のおよそ１０％の頻度を有する正常な多型であることが明らかになった。欠失多型は、６０の白人ＨａｐＭａｐ試料および４４６のドイツ人血液提供者のスクリーニングに基づいて白人には存在しない見込みがあるか、または６０のヨルバ族ＨａｐＭａｐ試料のスクリーニングに基づいて、アフリカ人（ヨルバ族）集団にも存在しない見込みがある（表Ｅ６）。ＢＩＭ欠失の人種による分離と一貫して、ｂ．に記載する欠失を有する株化細胞は、ＣＭＬの日本人個体に由来することが見出された（参考文献Ａ３１）。
【０１１２】
【表１】
2014502493.tif 000003
【０１１３】
この知見は、以下の項に記載するように、いくつかの意味および潜在的な臨床的使用を有する。
【０１１４】
本発明は、次のようにして用いることができる。
【０１１５】
ＣＭＬ患者がＴＫＩ耐性を生じるかを発症時に予測することは、現在のところ不可能である。ＴＫＩ耐性を生じるリスクの増加と関連する遺伝的因子を同定することにより、東アジア人集団において、このような個体を同定することが今回可能になり得る。ＢＩＭ欠失を有する患者を、次いで、医師がより密接に追跡し、現在推奨されているよりも高い頻度で疾患状態をモニタリングすることを勧めることができる。これらは、より頻度が高い血液および骨髄検査を含み得る。
【０１１６】
さらに、ＢＩＭ欠失の存在は、特定の代替治療方策に対する感受性を予測できる。これらは、４００ｍｇ／日の標準用量を超えて６００または８００ｍｇ／日までイマチニブの用量を増加することを含む。代わりに、このような患者は、ＢＣＬ２群タンパク質（ＢＩＭタンパク質が通常対抗する）の生存促進性効果を阻害する新規なクラスの薬物を用いて処置できる可能性がある。この後者の可能性について、我々の研究室で現在調べている。
【０１１７】
重要なことに、ＴＫＩおよび他の標的治療は非常に高価であるので、ＢＩＭ欠失を有することが見出された患者を管理する医師は、この知見を、より高い薬物用量の使用もしくは治療の変更に伴う費用の増加を患者および／または第三者支払人に対して正当化するため、または欠失の非存在下でのこれらの方策を回避するための根拠として用いることができる。
【０１１８】
その他の疾患
他のがんの患者におけるＢＩＭ欠失の存在も、薬物耐性の発生についての予測因子および代替治療のための手引きとして用いることができる。
【０１１９】
これは、ＣＭＬについて記載した状況と同じであり、他の血液悪性腫瘍（慢性リンパ球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病および多発性骨髄腫）、骨髄増殖性疾患（真性赤血球増加症、本態性血小板血症および原発性骨髄線維症を含む）ならびに最も一般的な固形腫瘍（非小細胞および小細胞肺がん、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、メラノーマおよび神経芽腫）および消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）を包含し得る。
【０１２０】
よって、本明細書で開示するＢＩＭ多型は、ＥＧＦＲ駆動型非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ、ＧｏｒｄｏｎおよびＦｉｓｈｅｒ、２０１０）のような他の疾患におけるキナーゼ阻害剤処置に対する耐性を検出するために用いることもできる。
【０１２１】
したがって、本明細書で開示するＢＩＭ多型を保有するこのようながんおよび腫瘍の患者は、それらのそれぞれの発癌性キナーゼを標的にする治療に対して耐性がある見込みがより高い。
【０１２２】
さらに、Ｗｉｌｌら、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＪＡＫ２  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｂｉｍ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＢＨ３  ｍｉｍｅｔｉｃ  ＡＢＴ−７３７  ｉｎ  ＪＡＫ２  ｍｕｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  ８  ２０１０年４月、１１５巻、１４号も参照される。この文書は、ＪＡＫ２活性化変異によって特徴付けられる骨髄増殖性疾患について記載している。この文献は、ＪＡＫ阻害剤も感受性のためにＢＩＭ発現を必要とすることの証拠を提供する。
【０１２３】
したがって、本明細書で開示するＢＩＭ多型は、さらに、真性赤血球増加症、本態性血小板血症および原発性骨髄線維症のような骨髄増殖性疾患におけるキナーゼ阻害剤処置に対する耐性を検出するために用いることができる。本明細書で開示するＢＩＭ多型を保有する患者のような骨髄増殖性疾患の患者は、それらのそれぞれの発癌性キナーゼを標的にする治療に対して耐性がある見込みがより高い。
【０１２４】
我々は、このような多型を含む個体における、ＥＧＦＲ駆動型非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、ｃ−ＫＩＴ／ＰＤＧＦＲ駆動型消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）またはＪＡＫ２駆動型骨髄増殖性疾患に罹患している個体におけるキナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性と関連するＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の多型バリアントを開示する。
【０１２５】
ＥＧＦＲ駆動型非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を処置するために用いるキナーゼ阻害剤の例は、ゲフィチニブおよびエルロチニブを含み、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）を処置するために用いるキナーゼ阻害剤の例は、イマチニブである。骨髄増殖性疾患は、それらの原因因子キナーゼに対するキナーゼ阻害剤、例えばＪＡＫ２に対する阻害剤を用いて処置できる。
【０１２６】
ＢＩＭ多型は、５’から３’の順序で、配列番号５に示すヌクレオチド配列と、その直後に続く配列番号７に示すヌクレオチド配列とを含む、ＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）遺伝子の多型バリアントを含み得る。多型バリアントＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）は、配列番号６に示すヌクレオチド配列を欠くことによって特徴付けられ得る。
【０１２７】
我々は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）に罹患している個体が、キナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性を生じる見込みがあるかを予測する方法であって、個体が、記載されるＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）多型を有するかを決定するステップを含む方法を開示する。耐性は、ＥＧＦＲ再活性化に依存しないことがある。非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）は、ＥＧＦＲ駆動型非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）のようにＥＧＦＲ活性化と関連するかまたはそれにより引き起こされる非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含み得る。
【０１２８】
我々は、さらに、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）に罹患している個体が、キナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性を生じる見込みがあるかを予測する方法であって、個体が、記載されるＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）多型を有するかを決定するステップを含む方法を開示する。耐性は、ｃ−ＫＩＴ／ＰＤＧＦＲ再活性化に依存しないことがある。消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）は、ｃ−ＫＩＴ／ＰＤＧＦＲ駆動型消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）のようなｃ−ＫＩＴ／ＰＤＧＦＲ活性化と関連するかまたはそれにより引き起こされる消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）を含み得る。
【０１２９】
我々は、骨髄増殖性疾患に罹患している個体が、キナーゼ阻害剤を用いる処置に対する耐性を生じる見込みがあるかを予測する方法であって、個体が、記載されるＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）多型を有するかを決定するステップを含む方法も開示する。耐性は、ＪＡＫ２再活性化に依存しないことがある。骨髄増殖性疾患は、ＪＡＫ２駆動型骨髄増殖性疾患のようなＪＡＫ２活性化と関連するかまたはそれにより引き起こされる骨髄増殖性疾患を含み得る。
【０１３０】
我々は、例えば配列番号３に示すヌクレオチド配列と配列番号４に示すヌクレオチド配列とを含むプライマーセットを用いることにより、配列番号１に示す配列を含む核酸増幅生成物の存在を検出するステップを含む方法であって、個体がＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）多型を有すると決定されるならば、該個体は、キナーゼ阻害剤を用いる非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の処置に対する耐性を生じる見込みがある方法を開示する。
【０１３１】
我々は、さらに、個体がＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）多型を有すると決定されるならば、該個体は、キナーゼ阻害剤を用いる消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）の処置に対する耐性を生じる見込みがあるそのような方法を開示する。
【０１３２】
我々は、個体がＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）多型を有すると決定されるならば、該個体は、キナーゼ阻害剤を用いる骨髄増殖性疾患の処置に対する耐性を生じる見込みがあるそのような方法も開示する。
【０１３３】
逆に、このような個体がＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）多型を有さないと決定されるならば（例えば配列番号２に示す配列を含む核酸増幅生成物の存在が検出されるならば）、該個体は、キナーゼ阻害剤を用いる非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の処置に対する耐性を生じる見込みがより低い。
【０１３４】
同様に、このような方法では、個体がＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）多型を有さないと決定されるならば、該個体は、キナーゼ阻害剤を用いる消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）の処置に対する耐性を生じる見込みがより低い。
【０１３５】
また、このような方法では、個体がＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）多型を有さないと決定されるならば、該個体は、キナーゼ阻害剤を用いる骨髄増殖性疾患の処置に対する耐性を生じる見込みがより低い。
【０１３６】
我々は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）もしくは消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）もしくは骨髄増殖性疾患または上記のいずれかの組合せの個体に対する特定の治療の成功の見込みを決定する方法であって、該治療を、上記の方法により決定される治療と比較するステップを含む方法について記載する。
【０１３７】
我々は、さらに、個体におけるキナーゼ阻害剤耐性非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の診断方法であって、個体における上記のＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）多型の存在を検出するステップを含む方法について記載する。我々は、個体におけるキナーゼ阻害剤耐性消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）の診断方法であって、個体における上記のＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）多型の存在を検出するステップを含む方法についても記載する。我々は、個体におけるキナーゼ阻害剤耐性骨髄増殖性疾患の診断方法であって、個体における上記のＢＩＭ（ＢＣＬ２Ｌ１１）多型の存在を検出するステップを含む方法について記載する。
【０１３８】
我々は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および／または消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）および／または骨髄増殖性疾患に罹患している患者を処置する方法であって、がんがキナーゼ耐性がんであるかを上記の方法により決定するステップと、患者を処置するステップとを含む方法を提供する。
【実施例】
【０１３９】
実施例１．Ｂｉｍ−アルファ１における欠失の存在をスクリーニングするためのアッセイ
標準的プロトコール／ＤＮＡ抽出用キット
血液からのＤＮＡ抽出のためにＱｉａｇｅｎ血液および細胞培養物ＤＮＡ  Ｍｉｄｉキット（ｃａｔ．Ｎｏ  １３３４３）（詳細についてＱＩＡＧＥＮ＿Ｇｅｎｏｍｉｃ＿ＤＮＡ＿Ｈａｎｄｂｏｏｋ．ｐｄｆを参照されたい）
または
頬側スワブからのＤＮＡ抽出のためにＭａｓｔｅｒＡｍｐ（商標）頬側スワブＤＮＡ抽出キット。
【０１４０】
Ｑｉａｇｅｎ  Ａｌｌｐｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡミニキット（ｃａｔ．Ｎｏ  ８０２０４）、Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａを用いることも可能である。
【０１４１】
実施例２．Ｂｉｍ欠失検出のためのゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲアッセイ
プライマー（１００ｕＭ）      各０．２μｌ
ゲノムＤＮＡ                  １μｌ（５０ｎｇ）
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）          ２．５μｌ
Ｊｕｍｐｓｔａｒｔ  Ｔａｑ    ２．５μｌ（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ．Ｄ１３１３）
１０×緩衝液                  ５μｌ
Ｈ２Ｏ                         ５０μｌまで加える
【０１４２】
ＰＣＲプログラム
ステップ１：９６℃、３０秒
ステップ２：９４℃、１５秒
ステップ３：６４℃、３０秒
ステップ４：６８℃、５分
ステップ５：ステップ２〜４を１１回反復
ステップ６：９４℃、１５秒
ステップ７：６０℃、３０秒
ステップ８：６８℃、５分
ステップ９：ステップ６〜８を１７回反復
ステップ１０：６８℃、２０分
１６℃を永続
【０１４３】
プライマー
Ｂｉｍ＿ｄｅｌ＿Ｆ  ＡＡＴＡＣＣＡＣＡＧＡＧＧＣＣＣＡＣＡＧ（＋ｃｈｒ２：１１１，５９９，０５１．．１１１，５９９，０７０）
Ｂｉｍ＿ｄｅｌ＿Ｒ  ＧＣＣＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧ（−ｃｈｒ２：１１１，６０３，２５７．．１１１，６０３，２７６）
【０１４４】
ＰＣＲ生成物は、臭化エチジウムを用いて１％アガロースゲル上で泳動させ、
欠失なしで４，２２６ｂｐ
欠失ありで１，３２３ｂｐ
のサイズの生成物をＵＶスクリーン上で視覚化する。
【０１４５】
実施例３．材料および方法：患者および試料
臨床試料は、ＩＲＢ承認プロトコールに従って、ｔｈｅ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ＨｏｓｐｉｔａｌおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｌａｙａで診察された患者から得た。
【０１４６】
単核細胞をＦｉｃｏｌｌ遠心分離により単離し、製造者の使用説明に従ってＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡ／ＲＮＡを抽出した。
【０１４７】
実施例４．材料および方法：ＤＮＡ−ＰＥＴ分析および検証
ゲノムＤＮＡをハイドロシェアにかけて５、７および９Ｋｂの断片にし、配列決定ライブラリーの構築のために用い、大量並列ＳＯＬｉＤシーケンサー（表Ｅ１および以下の記載を参照されたい）を用いて配列決定した。
【０１４８】
【表２】
2014502493.tif 000004
【０１４９】
ペアエンド（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの用語：メイトペア）ライブラリーを、図９に示すようにして構築した。簡単に述べると、５〜９ＫｂのＤＮＡ断片の両端に対応した２×２５ｂｐのタグ構築物を、ＥｃｏＰ１５Ｉを用いて作製した。２×２５ｂｐライブラリーのハイスループット配列決定を、製造者の推奨に従ってＳＯＬｉＤシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。配列タグを、ヒト参照配列（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３６、ｈｇ１８）に対してマッピングし、タグあたり２つの色コードミスマッチを可能にするＳＯＬｉＤシステム分析パイプラインツール、Ｃｏｒｏｎａ  Ｌｉｔｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて対合させた。ライブラリー挿入分布内であったペアエンドタグ（ＰＥＴ）を、調和性ＰＥＴ（ｃＰＥＴ）に類別した。ｃＰＥＴ基準により却下されたＰＥＴを、不調和性ＰＥＴ（ｄＰＥＴ）に類別した。これらは、さらに、５つの異なるカテゴリーに分けた；（ｉ）異なる染色体上にマッピングされた２つのタグ、（ｉｉ）同じ染色体上であるが異なる鎖上にマッピングされた２つのタグ、（ｉｉｉ）同じ染色体上であるが、間違った順序（３’の下流に５’）でマッピングされた２つのタグ、（ｉｖ）同じ染色体上、同じ鎖上に正しい順序であるが、１．１×最大ライブラリーサイズより大きいスパン距離でマッピングされた２つのタグ、（ｖ）同じ染色体上、同じ鎖上に正しい順序であるが、最小ライブラリーサイズより小さいスパン距離でマッピングされた２つのタグ。カテゴリー（ｖ）をさらなる分析から除外した。配列タグが１０Ｋｂ以内で同じゲノム領域に対して両側にマッピングされたｄＰＥＴを、一緒にクラスタ分けした。第１タグの左および右に対する１０Ｋｂ検索ウィンドウを、最も外側のタグ座標に従って１０Ｋｂに広げた。左（５’）および右（３’）のタグがマッピングされた領域を、アンカー領域と記載した。サイズ３以上のクラスタを、ＳＶの同定のために保存した。単一ｄＰＥＴクラスタは、５’マッピングアンカー領域が３’マッピングアンカー領域から遠く離れているならば欠失、マッピング順序が通常の５’から３’でなく３’から５’であるならば直列重複、マッピングの向きが逆（異なる鎖上）であるならば不対合逆位、ならびに５’および３’アンカーが異なる染色体にマッピングされるならば孤立染色体間転座のような１つの再編成点を有するＳＶを同定できた。２つの位置が近いｄＰＥＴクラスタを用いて、図１０に記載する逆位、挿入および均衡転座のような２つの再編成点を有するＳＶを推測できた。
【０１５０】
異なるゲノムにわたるクラスタの比較を、両側に１０Ｋｂだけ拡張した５’および３’アンカー領域のオーバーラップに基づいて行った。第２ライブラリーのクラスタの５’アンカー領域が第１ライブラリーのクラスタの５’拡張アンカー領域とオーバーラップし、同じことが３’アンカー領域にもいえるならば、２つのクラスタを一緒に群分けし、アンカー領域の１０Ｋｂ拡張を最も外側の開始および終了アンカー座標に従って調整した。遺伝子アノテーションは、ライブラリー特異的切断点を用いて２００９年５月１４日にＵＣＳＣ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／；Ｒｈｅａｄら、２０１０）からダウンロードしたＲｅｆＳｅｑ遺伝子に基づいた。同定したＳＶを、本文書の他の場所で記載する３２の正常個体のＳＶおよびＤＮＡ−ＰＥＴ品質基準に基づいてふるい分けした。
【０１５１】
いくつかの遺伝子座は、ｄＰＥＴクラスタの蓄積を示した。これらの遺伝子座にて、特定のＳＶをあるｄＰＥＴクラスタに割り当てることは誤り導く可能性がある（例えば、直列重複の切断点が欠失および／または転座に囲まれているならば、再編成は直列重複と解釈しないほうがよい）。よって、切断点に基づく相互接続ネットワークを確立して、複雑な領域内の切断点を、孤立し、かつ複雑さがより少ないＳＶから分けた。切断点の近隣を決定するために、各ｄＰＥＴクラスタアンカー領域の始点および終点を、検索ウィンドウとしてそれぞれのゲノムライブラリーの最大挿入サイズだけ拡張した。近隣クラスタのウィンドウが互いにオーバーラップするならば、ｄＰＥＴクラスタを一緒にスーパークラスタに群分けした。この手順により、クラスタＢを介してクラスタＡからＣへの間接的接続が可能になった。スーパークラスタに一緒に加えることができるｄＰＥＴクラスタの数を、スーパークラスタサイズとして表した。３を超えるｄＰＥＴクラスタを相互接続した場合、切断点の対は「複雑」と分類した（染色体内および染色体間）。
【０１５２】
蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を次のようにして行った。細胞を０．７５Ｍ  ＫＣｌで２０分間、３７℃にて処置することにより核を採集した。次いで、数回の固定の後に、核をＦＩＳＨ用のスライド上に滴下した。ＥＶＩ１プローブ（クローンＲＰ１１−１３７Ｈ１７）を緑色で標識し、ｃｈｒ８：１２７，９５０，６３７から１３０，６６４，９１９の挿入（それぞれクローンＲＰ１１−８２８Ｌ６およびＲＰ１１−１５９Ｎ７）をそれぞれ赤および黄で標識した。フォスミドプローブ調製のために、ＤＮＡを、ニックトランスレーションシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるビオチン−１６−ｄＵＴＰの存在下でのニックトランスレーションにより標識した。１μｇ／μｌのＣｏｔ１  ＤＮＡの存在下で、ＤＮＡコスミドクローンを５ｎｇ／μｌの濃度でハイブリダイゼーション緩衝液（２ＳＳＣ、１０％デキストラン硫酸、１×ＰＢＳ、５０％ホルムアミド）に再懸濁した。ハイブリダイゼーションの前に、核のスライドを０．０１％ペプシンで３７℃にて５分間処置した後に、１×ＰＢＳでのすすぎ、１％ホルムアルデヒドでの１０分間の処置、１×ＰＢＳでのすすぎ（５分間）および一連のエタノールによる脱水（７０％、８０％および１００％）を行った。変性プローブを、これらの前処置したスライドに施用し、７５℃にて５分間同時変性させ、３７℃にて１晩ハイブリダイズした。２回のハイブリダイゼーション後の洗浄を４５℃にて２ＳＳＣ／５０％ホルムアミド中で７分間行い、それぞれの後に２ＳＳＣ中、４５℃にて７分ずつの洗浄を２回行った。ブロッキングの後に、スライドを、アビジンコンジュゲートフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて明示した。洗浄の後に、ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを用いてスライドを顕微鏡に載せ、落射蛍光顕微鏡で観察した。画像分析は、Ｍｅｔａｓｙｓｔｅｍソフトウェアを用いて行った。
【０１５３】
予測されるＳＶの検証のために、予測される切断点を挟むＰＣＲプライマーを用いて、後続のＳａｎｇｅｒ配列決定のために再編成領域を増幅した。
【０１５４】
リアルタイムＰＣＲアッセイのために、製造者の使用説明に従ってＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、トータル細胞ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写し、ｉＱ５マルチカラーリアルタイム検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を、２５ｕｌの全反応容量で用いて定量的に評価した。プライマーを５９℃にて２０秒間アニーリングし、アンプリコンを７２℃にて３０秒間伸長した。定めたサイクルの総数は、４０であった。β−アクチンまたはＢＩＭのエキソン２Ａの転写産物レベルを用いて、試料間を標準化した。用いたプライマーは次のとおりである：ＢＩＭエキソン２Ａ（順方向：ＡＴＧＧＣＡＡＡＧＣＡＡＣＣＴＴＣＴＧＡＴＧ；逆方向：ＧＧＣＴＣＴＧＴＣＴＧＴＡＧＧＧＡＧＧＴ）、ＢＩＭエクソン３（順方向：ＣＡＡＴＧＧＴＡＧＴＣＡＴＣＣ−ＴＡＧＡＧＧ；逆方向：ＧＡＣＡＡＡＡＴＧＣＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＧＧ）、ＢＩＭエクソン４（順方向：ＴＴＣＣＡＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＣ；逆方向：ＣＣＴＣＣＴＴＧＣＡＴＡＧＴＡＡＧＣＧＴＴ）、β−アクチン（順方向：ＧＧＡＣＴＴＣＧＡＧＣＡＡＧＡＧＡＴＧＧ；逆方向：ＡＧＣＡＣＴＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣ−ＡＧ）およびＥＶＩ１（順方向：ＡＣＣＣＡＣＴＣＣＴＴＴＣＴＴＴＡＴＧＧＡＣＣ；逆方向：ＴＧＡＴＣ−ＡＧＧＣＡＧＴＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧ）。
【０１５５】
実施例５．材料および方法：株化細胞および組織培養
ＣＭＬ系統は、ＡＴＣＣ（ＭＥＧ−０１およびＫＵ８１２）、ＪＣＲＢ（ＮＣＯ２）およびＤＳＭＺ（ＫＣＬ２２、Ｋ５６２、ＫＹＯ１、ＪＫ１、ＢＶ１７３およびＮＡＬＭ１）から得た。細胞を、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミンおよび１０％胎児ウシ血清を補ったＲＰＭＩ１６４０培地で成長させ、３７°、５％ＣＯ２の湿潤インキュベータ中でインキュベートした。
【０１５６】
実施例６．結果：ＣＭＬ患者試料
我々は、４つのフィラデルフィア（Ｐｈ）染色体陽性ＣＭＬ患者試料および１つのＣＭＬ株化細胞を、ＤＮＡ−ＰＥＴ分析のために選択した（図２Ａ）。
【０１５７】
これらの試料は、チロシンキナーゼ阻害剤に対する臨床感受性または耐性を示す患者を代表し、慢性および骨髄急性転化期の患者を２名ずつ含む。慢性期の患者のうち１名と両方の急性転化期の患者はチロシンキナーゼ阻害剤に耐性であり、急性転化期試料のうちの一方はＰｈ染色体とともにさらなる核型異常を示した。
【０１５８】
我々は、Ｋ５６２  ＣＭＬ株化細胞および処置感受性患者からの寛解試料も、Ｐｈ染色体についてのそれぞれ陽性および陰性対照として含めた。
【０１５９】
実施例７．結果：ＣＭＬゲノムのＤＮＡ−ＰＥＴ分析
我々は、２７８百万を超える重複のないＰＥＴに由来する７２．１Ｇｂのマッピング可能ＤＮＡ配列を作製し、各ゲノムについて平均で１０９倍の物理的（断片）カバー範囲を達成した（上の表Ｅ１）。８５．４％のＰＥＴが参照ゲノムと調和してマッピングされ、１４．６％のＰＥＴはそのようにマッピングされなかった。後者を不調和性ＰＥＴ（ｄＰＥＴ）として分類した。同じ２つのゲノム領域を接続する多重ｄＰＥＴのクラスタ分けにより、我々は、３，４０８の異なる構造変動（ＳＶ）を同定でき、かつ各ｄＰＥＴについてＳＶの型を定義できた（図１０ならびに以下の表Ｅ２およびＥ３を参照されたい）。
【０１６０】
【表３】
2014502493.tif 000005
【０１６１】
【表４】
2014502493.tif 000006
【０１６２】
【表５】
2014502493.tif 000007
【０１６３】
正常集団に存在するさらなるＳＶを除外するためおよび偽陽性の割合を減らすために、３２の正常で無関係の個体から得られたさらなるＤＮＡ−ＰＥＴデータにより、および以下のバイオインフォマティクスにより定義される品質基準によりＳＶをさらにふるい分けした。（ｉ）クラスタが、１００を超えるスーパークラスタサイズにより示される１００以上の他のクラスタと相互接続される、（ｉｉ）クラスタが、切断点に向かう１５Ｋｂの拡張を含む２つのアンカー領域間の２０００を超えるＢｌａｓｔスコアで示される２つの接合切断点領域間で高い配列類似性を有する、（ｉｉｉ）クラスタが、２つのアンカー／拡張領域間で３００を超えるＢｌａｓｔスコアを示し、配列類似性が、一方の側でアンカー内にあり、他方の側で拡張内にある（ＥＣタイプ）、（ｉｖ）クラスタが、２のクラスタサイズを有するならば、クラスタを除外した。このことにより、４５９のＣＭＬ特異的ＳＶ（表Ｅ３および表Ｅ４）およびコピー数情報（図７）が得られ、我々は、各ゲノムについて核ゲノムマップを作製できた（図２Ｂ）。
【０１６４】
重要なことに、ＤＮＡ−ＰＥＴを用いて、我々は、寛解試料以外の全てにおいてＢＣＲ−ＡＢＬ転座を同定できた。このデータセットを次に、疾患段階または薬物耐性のいずれかとともに追跡されるＳＶを同定するために用いた。
【０１６５】
実施例８．結果：急性転換のＤＮＡ−ＰＥＴ分析
急性転化期において見出されるさらなる染色体異常および分子異常が、臨床挙動に貢献すると考えられる。しかし、これらの事象の数的または構造的性質のいずれについての網羅的な評価も、特にコピー数の変化がないＳＶの検出について、技術的に難しい。したがって、我々は、急性転化期の発生の際に生じるＳＶの分析に注目することにした。ここで、表Ｅ４に示すように、我々は、急性転化期におけるＳＶの数の漸進的な増加を観察し、これは、核型決定およびＦＩＳＨ分析と良好に相関した（表Ｅ７ならびに図３Ｄおよび１１）。我々は、次いで、ＳＶの性質を類別し、２名の急性転化期患者におけるＳＶの最も顕著なカテゴリーが欠失（Ｐ０９８およびＰ０２２、ｎ＝８１［全てのＳＶの５８．７％］）であり、続いて不対合逆位（ｎ＝２４［１７．４％］）、孤立転座（ｎ＝１２［８．７％］）および直列重複（ｎ＝９［６．５％］）であり、他のＳＶカテゴリーのそれぞれについて５％未満であったことを見出した（図２Ａ）。急性転化期株化細胞Ｋ５６２は、予想されたように、急性転化期患者試料と比較して、より多くの再編成を示した（２３７に対してそれぞれ６３および７５）。Ｋ５６２において最も顕著なカテゴリーは直列重複であり（ｎ＝１０４［４３．９％）、続いて欠失（ｎ＝７１［３０％］）、不対合逆位（ｎ＝２６［１１％］）および複雑な染色体内再編成（ｎ＝１４［５．９％］）であった。興味深いことに、２つの急性転化期試料およびＫ５６２株化細胞においてＢＣＲ−ＡＢＬ１に加えて均衡転座は観察されなかった。
【０１６６】
【表６】
2014502493.tif 000008
【０１６７】
我々は、次に、急性転化期特異的ＳＶを、ＵＣＳＣゲノムバイオインフォマティクスホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）（Ｒｈｅａｄら２０１０）からダウンロードしたＲｅｆＳｅｑ遺伝子と交差させることにより、個別の体細胞性ＳＶのうちのどれが急性転化期に対して生物学的に貢献できるかについて調べて、遺伝子機能に直接影響すると予測される２０５の候補ＳＶを同定した。この群のうちで、我々は、ｄＰＥＴクラスタサイズの増加として認識可能であったＢＣＲ−ＡＢＬ１自体の増幅を観察し、これは、転換の認識された特徴である（図１２）６、１０。我々は、相互ＡＢＬ１−ＢＣＲ転座を示すクラスタサイズと段階との間の逆の相関も観察した（図１２）。注目すべきことに、ＤＮＡ−ＰＥＴは、ＦＩＳＨによるｄｅｒ９中の欠失と一貫して、試料Ｐ０９８におけるＡＢＬ１−ＢＣＲの完全喪失を検出した（図１２）。我々が同定した別の候補は、第３染色体上のＭＥＣＯＭのイントロン１（以前はＥＶＩ１およびＭＤＳ１として知られていた）への第８染色体の２．７Ｍｂの挿入（図３Ａ）であり、これについて、我々は、ＦＩＳＨにより確認した（図３Ｃ）。ＥＶＩ−１は、ジンクフィンガー転写因子であり、正常造血幹細胞（ＨＳＣ）の増殖および維持において必須の役割を演じ１１〜１３、ＨＳＣにおいて過剰発現されると、骨髄過剰増殖およびミエロイド分化遮断をもたらす。我々が知るところでは、ＥＶＩ１内またはその上流の同等の挿入は報告されておらず、挿入部位の分析は、第８染色体の挿入が、より短い転写産物の転写レベルを変更し得ることを示唆し、これについて、我々は、ＲＴ−ＰＣＲにより確認した（図３Ｂ）。
【０１６８】
これらをまとめると、我々のＤＮＡ−ＰＥＴ分析は、急性転化期増悪の既知および新規な特徴をともに同定でき、ヒトがんモデルにおいて生じる構造変化の数および性質についての最初の評価を提供する。
【０１６９】
実施例９．結果：イマチニブ耐性試料における東アジア人ＢＩＭ多型
我々は、次に、耐性関連ＳＶについて調べ、３つ全ての耐性試料に生じる２つの欠失と、３つのうち少なくとも２つにおける６つのＳＶとを見出した。２．５Ｋｂのサイズの１つの欠失は、ＣＭＬとまだ結び付けられていない遺伝子であるＺＮＦ３８５Ｄのイントロン１内にあった。興味深いことに、３つ全ての耐性試料において観察された他方の欠失は、アポトーシス促進性遺伝子ＢＣＬ２Ｌ１１（ＢＯＤ、ＢＩＭＬ、ＢＩＭＥＬまたはＢＩＭとしても知られる）のイントロン２内にあった（図４Ａ）。重要なことに、ＢＩＭ上方制御を妨げることによりＣＭＬがイマチニブ耐性になるので１４〜１６、イマチニブによるＢＩＭ上方制御は、この薬物がアポトーシスを誘発するために必要であると他者は報告している。我々は、この欠失をＰＣＲおよび配列決定により確認し、３つ全ての試料において同一の２，９０３ｂｐの欠失を見出し（図４Ｃおよび図４Ｄ）、このことは、欠失が生殖系列であり、よって多型を構成することを示唆した。したがって、我々は、国際ＨａｐＭａｐプロジェクト１７からの７４の正常東アジア人試料をスクリーニングして、ＢＩＭ欠失キャリアの頻度が１７．６％であることを決定した（１２のヘテロ接合性および１のホモ接合性個体；９．５％の対立遺伝子頻度）。ＢＩＭ欠失は、再発性の体細胞性事象ではなく構造的多型であることがわかったが、我々は、３名全ての耐性患者が、イマチニブ感受性にとって必要な遺伝子である１４〜１６ＢＩＭ欠失のキャリアであるという事実に興味を持った。
【０１７０】
実施例１０．結果：ＢＩＭ多型の機能的影響
ＢＩＭ遺伝子構造の分析は、欠失が、互いに排他的な様式でのエキソン３および４の選択的スプライシングをもたらす可能性を示唆した。この可能性は、欠失が、エキソン３のイントロン−エキソン境界の５’端の近傍（１０７ｂｐ）にあるとともに、エキソン３自体の中に停止コドンが存在することにより示唆された（図５Ａ）。この仮説を試験するために、我々は、欠失を有する（ｎ＝１２）および有さない（ｎ＝１１）初代ＣＭＬ試料を得て、エキソン３含有転写産物およびエキソン４含有転写産物ならびに全般的なＢＩＭ転写についての読出しとしてのエキソン２含有転写産物（エキソン２は、全てのＢＩＭアイソフォームに存在するので）１８の発現レベルを測定した。図５Ｂに示すように、我々は、欠失が、エキソン３含有転写産物の増加とともにエキソン４含有転写産物の減少と関連するが、全般的なＢＩＭ転写は影響されなかったことを見出した。これらの結果は、正常個体からのリンパ芽球様株化細胞において反映され、このことは、欠失の影響が、系統非依存性であることを示した（図１３）。
【０１７１】
ＢＩＭのアポトーシス促進性の特性はエキソン４のみで見出される（図５Ａ）１８、１９ＢＨ３ドメイン内にあるので、我々は、エキソン４含有転写産物の減少が、イマチニブ耐性と関連するかという疑問を持った。幸運なことに、我々は、欠失を保有する１つのＣＭＬ株化細胞ＫＣＬ２２を同定でき、これらの細胞を用いてこの疑問に対処した（図５Ｃ）。顕著なことに、この系統は、日本人患者から元々得られ、ほとんどの他のＣＭＬ系統とは対照的に、イマチニブ耐性を最初から示していた２０〜２２。我々は、細胞が、エキソン３／エキソン４転写産物の比の増加を示し（図５Ｄ）、このことが、欠失を有さない系統と比較して、イマチニブ曝露の前後両方でＫＣＬ２２株化細胞において主要なエキソン４含有ＢＩＭアイソフォームであるＢＩＭＥＬのタンパク質発現の減少と関連したことを確認した（図５Ｅ）。我々は、ＫＣＬ２２細胞が、イマチニブとともにより効力が高い第２世代チロシンキナーゼ阻害剤に対して耐性であったことも確認した（図５Ｆ）。
【０１７２】
これらの結果から、我々は、早期の臨床試験２３にあるＢＨ３模倣剤が、ＫＣＬ２２細胞をイマチニブに対して感受性にし得るかという疑問を持った。図５Ｇに示すように、我々は、このことが実際にそうであり、イマチニブまたはダサチニブとＡＢＴ−７３７との組合せが、ＫＣＬ２２細胞において（しかしＫＹＯ−１細胞においてではない）アポトーシスを相乗的に誘発するように働いたことを見出した。
【０１７３】
実施例１１．結果：ＢＩＭ多型と慢性骨髄性白血病におけるチロシンキナーゼ阻害剤に対するＢＣＲ−ＡＢＬ非依存性臨床耐性との関連
我々は、次に、東アジア人ＣＭＬ患者のより大きいコホートにおける多型の頻度を決定し、これが１２．０％（１５８名のうち１９名）に存在することを見出した。我々は、多型が、臨床耐性を予測できるという仮説についても試験した。この分析において、我々は、ＫＣＬ２２細胞により例示されるように多型の存在が、チロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性を与えるために十分であるが、その非存在下では、耐性は、耐性を与えるＢＣＲ−ＡＢＬ変異を保有するクローンの出現を必要とする２４と推論した。
【０１７４】
したがって、我々は、耐性を有する全ての患者からの試料を、ＢＣＲ−ＡＢＬ変異を有するものと有さないものとに分け、２つの群の間の多型の頻度の有意な相違を見出した：ＢＣＲ−ＡＢＬ変異を有するもの４２のうち２（４．８％）に対して、有さないもの５５のうち１３（２３．６％）（ｐ＝０．０１）（図６Ａ）。
【０１７５】
ＢＣＲ−ＡＢＬ変異の非存在下で感受性疾患の患者と耐性疾患の患者とにおける多型の頻度を我々が決定した場合に、相違はこれもまた有意であった：イマチニブ感受性患者において６１名のうち４名に対してイマチニブ耐性患者について５５名のうち１３名（ｐ＝０．０２）（図６Ｂ）。しかし、イマチニブ感受性患者（６１名のうち４名）と、全てのイマチニブ耐性患者（９７名のうち１５名）との間に多型の頻度の有意な相違はなかった（ｐ＝０．１３）（図６Ｃ）。
【０１７６】
この結果は、ここでの統計的有意性が、一般的なＣＭＬ集団におけるＢＩＭ多型の頻度に依存することに鑑みて、予想できたことであった。
【０１７７】
実施例１２．考察
我々は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ両方でのチロシンキナーゼ阻害剤に対する臨床耐性と関連するＢＩＭ遺伝子のイントロン２における新規な多型について報告する。正常東アジア人集団における欠失キャリアの頻度は１７．６％であり、２つの東南アジアの紹介センターで診察されたＣＭＬ患者において１２．０％である。このコホートでは、多型は、ＢＣＲ−ＡＢＬ変異の非存在下で、耐性を有する症例の４分の１（１３／５５または２３．６％）を占めた。我々は、ＣＭＬの世界的な発生率において地理的な変動が欠如していること２５に鑑みて、原因論的役割の可能性が低いと考えている。
【０１７８】
我々は、多型の存在が、ＢＩＭ遺伝子のエキソン４を含有する転写産物に対してエキソン３を含有する転写産物の発現の増加をもたらすことも示し、臨床耐性の発生と多型の存在との間の著しい関連を見出し、これは、欠失を有する個体が、有さない個体よりも耐性を発生するリスクが相対的に１．３４倍である（ヘテロ接合性遺伝子型の相対的リスク；９５％信頼区間０．９４〜１．５９）というものであった。さらに、耐性がＢＣＲ−ＡＢＬ阻害に依存しないことを決定することにより、我々は、耐性および欠失を有する患者が、欠失を有さない患者よりも、ＢＣＲ−ＡＢＬ中に耐性を与える変異を有するＣＭＬクローンを保有する見込みが低いと予測することができた。この知見は、このようなクローンが、治療の選択圧の下でのみ、他の耐性を与える機構の非存在下２４で出現するという考えと一貫している。
【０１７９】
現在の臨床ガイドラインは、耐性の出現の際にチロシンキナーゼ阻害剤の用量を増加することまたはより効力が高いチロシンキナーゼ阻害剤に変更すること５について支持している。よって、これらのガイドラインに従い、後続の応答データが入手可能であったＢＩＭ多型関連耐性を有する４名の患者がだれも応答しなかったことは大きな関心事である。事例的であるが、この観察結果は、ＢＩＭ欠失関連耐性がＢＣＲ−ＡＢＬ非依存性であるという我々の知見と一貫する。しかし、我々のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの観察結果は、この状況での耐性が、チロシンキナーゼ阻害剤とＢＨ３模倣剤とを組み合わせることにより克服できることも示唆する。つまり、ＢＩＭ多型は、チロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性とＢＨ３模倣剤に対する応答との両方の予測因子として用いることができる。この多型のスクリーニングは、よって、東アジアのＣＭＬ患者の管理において有用である可能性がある。我々の知見を、薬物感受性がＢＩＭ媒介アポトーシスに依存する他のがんに適用できることも、調査を正当化する２６〜２８。
【０１８０】
実施例１３および１４．ＢＩＭ多型と非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）におけるチロシンキナーゼ阻害剤に対するＥＧＦＲ非依存性臨床耐性との関連
ＴＫＩがＮＳＣＬＣ株化細胞を死滅させることができるようにするために、変異ＥＧＦＲ駆動型ＮＳＣＬＣがＢＩＭ発現を必要とすることが以前に示されている（ＣｒａｇｇらＰＬＯＳ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００７；ＣｏｓｔａらＰＬＯＳ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００７）。
【０１８１】
したがって、我々は、ＢＩＭ多型を保持する株化細胞および拡張により患者が、変異ＥＧＦＲを標的にする薬物に対して耐性であると予測する。
【０１８２】
さらに、我々は、耐性株化細胞が、ＢＨ３模倣薬（例えばＡＢＴ−７３７およびＡＢＴ−２６３）と抗ＥＧＦＲ薬との組合せに対する感受性があると予測する。
【０１８３】
実施例１３．ＢＩＭ多型と非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）におけるチロシンキナーゼ阻害剤に対するＥＧＦＲ非依存性臨床耐性との関連−ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの相関
ＥＧＦＲに活性化変異を有するＮＳＣＬＣ株化細胞を同定する。
【０１８４】
株化細胞を、次いで、以前に記載されるＰＣＲ分析により、ＢＩＭ多型の存在または非存在について分析する。
【０１８５】
抗ＥＧＦＲ薬に対する様々な株化細胞の感受性および／または耐性を、細胞成長、増殖およびアポトーシスについての標準的な細胞アッセイを用いて決定する。
【０１８６】
株化細胞を、単独薬剤としてまたはＥＧＦＲを標的にする薬物との組合せのいずれかでのＢＨ３模倣剤に対する感受性についても試験する。
【０１８７】
多型の存在または非存在を、次いで、試験される薬物に対するＮＳＣＬＣ株化細胞の感受性／耐性の程度と相関させる。
【０１８８】
我々は、ＢＩＭ多型の存在と薬物耐性との間に正の相関があると予想する。
【０１８９】
具体的に、我々は、ＢＩＭ多型を保持するＥＧＦＲの活性化変異を有するＮＳＣＬＣ系統は、ＢＩＭ多型を保持しないものよりも抗ＥＧＦＲ薬に対してより耐性であると予測する。
【０１９０】
さらに、我々は、ＢＩＭ多型を有し、かつＥＧＦＲを標的にする薬物に対して耐性がある株化細胞は、ＢＨ３模倣薬（例えばＡＢＴ−７３７およびＡＢＴ−２６３）と抗ＥＧＦＲ薬との組合せに対する感受性があると予測する。
【０１９１】
実施例１４．ＢＩＭ多型と非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）におけるチロシンキナーゼ阻害剤に対するＥＧＦＲ非依存性臨床耐性との関連−患者の相関
ＥＧＦＲに活性化変異を有するＮＳＣＬＣ患者を同定する。
【０１９２】
患者および／またはその腫瘍からのＤＮＡを、以前に記載されるＰＣＲ分析により、ＢＩＭ多型の存在または非存在について分析する。
【０１９３】
抗ＥＧＦＲ治療に対する患者の応答を、次いで、臨床基準を用いて決定する。これらのデータは、腫瘍サイズ、腫瘍増殖停止期間、無増悪生存期間、全生存および活動指標のような臨床パラメータを含む。
【０１９４】
多型の存在または非存在を、次いで、上記の臨床パラメータと相関させる。
【０１９５】
我々は、ＢＩＭ多型の存在と、多型を有さない患者と比較して劣った抗ＥＧＦＲ治療に対する応答との間に正の相関が存在すると予想する。このことは、腫瘍のサイズが減少できないこととして観察されることがある。
【０１９６】
さらに、このような患者は、より短い腫瘍増殖停止期間、無増悪生存期間および／または全生存を有することがある。
【０１９７】
実施例１５および１６．ＢＩＭ多型と消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）におけるチロシンキナーゼ阻害剤に対するｃ−ＫＩＴ／ＰＤＧＦＲ非依存性臨床耐性との関連
ＴＫＩがＧＩＳＴ株化細胞を死滅させることができるようにするために、ｃ−ＫＩＴ／ＰＤＧＦＲ駆動型ＧＩＳＴがＢＩＭ発現を必要とすることが以前に示されている（ＧｏｒｄｏｎらＪＢＣ、２０１０）。
【０１９８】
したがって、我々は、ＢＩＭ多型を保持する株化細胞および拡張により患者が、変異ｃ−ＫＩＴを標的にする薬物に対して耐性であると予測する。
【０１９９】
さらに、我々は、耐性株化細胞が、ＢＨ３模倣薬（例えばＡＢＴ−７３７およびＡＢＴ−２６３）と抗ｃ−ＫＩＴ薬との組合せに対する感受性があると予測する。
【０２００】
実施例１５．ＢＩＭ多型と消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）におけるチロシンキナーゼ阻害剤に対するｃ−ＫＩＴ／ＰＤＧＦＲ非依存性臨床耐性との関連−ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの相関
ｃ−ＫＩＴに活性化変異を有するｃ−ＫＩＴ駆動型ＧＩＳＴ株化細胞を同定する。
【０２０１】
株化細胞を、次いで、以前に記載されるＰＣＲ分析により、ＢＩＭ多型の存在または非存在について分析する。
【０２０２】
抗ｃ−ＫＩＴ薬に対する様々な株化細胞の感受性および／または耐性を、細胞成長、増殖およびアポトーシスについての標準的な細胞アッセイを用いて決定する。
【０２０３】
株化細胞を、単独薬剤としてまたはｃ−ＫＩＴを標的にする薬物との組合せのいずれかでのＢＨ３模倣剤に対する感受性についても試験する。
【０２０４】
多型の存在または非存在を、次いで、試験される薬物に対するＧＩＳＴ株化細胞の感受性／耐性の程度と相関させる。
【０２０５】
我々は、ＢＩＭ多型の存在と薬物耐性との間に正の相関があると予想する。
【０２０６】
具体的に、我々は、ＢＩＭ多型を保持するｃ−ＫＩＴの活性化変異を有するＧＩＳＴ系統は、ＢＩＭ多型を保持しないものよりも抗ｃ−ＫＩＴ薬に対してより耐性であると予測する。
【０２０７】
さらに、我々は、ＢＩＭ多型を有し、かつｃ−ＫＩＴを標的にする薬物に対して耐性がある株化細胞は、ＢＨ３模倣薬（例えばＡＢＴ−７３７およびＡＢＴ−２６３）と抗ｃ−ＫＩＴ薬との組合せに対する感受性があると予測する。
【０２０８】
実施例１６．ＢＩＭ多型と消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）におけるチロシンキナーゼ阻害剤に対するｃ−ＫＩＴ／ＰＤＧＦＲ非依存性臨床耐性との関連−患者の相関
ｃ−ＫＩＴに活性化変異を有するＧＩＳＴ患者を同定する。
【０２０９】
患者および／またはその腫瘍からのＤＮＡを、以前に記載されるＰＣＲ分析により、ＢＩＭ多型の存在または非存在について分析する。
【０２１０】
抗ｃ−ＫＩＴ治療に対する患者の応答を、次いで、標準的臨床基準を用いて決定する。これらのデータは、腫瘍サイズ、腫瘍増殖停止期間、無増悪生存期間、全生存および活動指標のような臨床パラメータを含む。
【０２１１】
多型の存在または非存在を、次いで、上記の臨床パラメータと相関させる。
【０２１２】
我々は、ＢＩＭ多型の存在と、多型を有さない患者と比較して劣った抗ｃ−ＫＩＴ治療に対する応答との間に正の相関が存在すると予想する。このことは、腫瘍のサイズが減少できないこととして観察されることがある。さらに、このような患者は、より短い腫瘍増殖停止期間、無増悪生存期間および／または全生存を有することがある。
【０２１３】
実施例１〜１６についての参考文献
【表７Ａ】
2014502493.tif 000009
【表７Ｂ】
2014502493.tif 000010
【表７Ｃ】
2014502493.tif 000011
【表７Ｄ】
2014502493.tif 000012
【表７Ｅ】
2014502493.tif 000013
【表７Ｆ】
2014502493.tif 000014
【表７Ｇ】
2014502493.tif 000015
【表７Ｈ】
2014502493.tif 000016
【０２１４】
実施例Ｈ１〜Ｈ８
実施例Ｈ１〜Ｈ８は、ＢＩＭ遺伝子中の共通の欠失多型が、慢性骨髄性白血病におけるイマチニブに対する内在性の耐性に貢献することを証明する。
【０２１５】
実施例Ｈ１．材料および方法
倫理委員会承認
臨床ＣＭＬ試料は、ｔｈｅ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、秋田大学医学部付属病院、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｌａｙａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｒｅおよびｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅで診察された患者から得た。ドイツ人の対照試料は、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｎでの血液提供者から得た。マレー人、中国人およびインド人の対照試料は、最近行われた地方集団研究に由来した４、５。書面でのインフォームドコンセントおよび参加施設における施設調査委員会の承認を、本研究に試料を提供した全ての患者および正常個体から得た。
【０２１６】
配列タグのマッピング
ペアタグを、ＳＯＬｉＤシステム分析パイプラインツールＣｏｒｏｎａ  Ｌｉｔｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、タグあたり２つの色コードミスマッチを可能にする色空間で参照配列（ＮＣＢＩ  ｂｕｉｌｄ  ３６）に対して個別にマッピングした。未解明の位置を有する参照配列のコンティグ（ｒａｎｄｏｍ＿ｃｈｒ）および代替ＭＨＣハプロタイプを、マッピングのための参照から除外した。個別にマッピングしたタグを、Ｃｏｒｏｎａ  Ｌｉｔｅにより対合させた。一方または両方のタグが多重のマッピング位置を有する場合、「レスキュー」とよばれるプロセスにより、調和性ＰＥＴが創出できた（両方のタグが同じ染色体、同じ鎖、同じ向き、正しい５’→３’の順序および互いに予想される距離にある）。
【０２１７】
不調和性ＰＥＴ（ｄＰＥＴ）のクラスタ分け
ペアエンドタグ（ＰＥＴ）を、両方のタグが同じ染色体、同じ鎖、正しい５’から３’の順序および予想されるスパン範囲内にマッピングされる調和性ＰＥＴ（ｃＰＥＴ）として類別した。スパン範囲は、Ｈｉｌｌｍｅｒら１に記載されるようなスパン分布の勾配に基づいて決定した。ｃＰＥＴ基準から却下されたＰＥＴは、不調和性ＰＥＴ（ｄＰＥＴ）と分類した。同じ融合点に広がる異なるｄＰＥＴをクラスタ分けするために、以下の手順を用いた。あるｄＰＥＴの５’および３’タグのマッピング位置を、両方向に、それぞれのゲノムライブラリーの最大挿入サイズだけ拡張して、５’および３’ウィンドウを創出した。第２ｄＰＥＴの５’および３’タグが第１ｄＰＥＴの５’および３’ウィンドウ内にマッピングされたならば、２つのＰＥＴは、サイズ２のクラスタと定義し、５’および３’ウィンドウを、（最大ライブラリーサイズの）第２ｄＰＥＴのタグ拡張を含有するように調整した。その後、５’および３’タグがそれぞれこの５’および３’ウィンドウ内にマッピングされたｄＰＥＴを、このクラスタに割り当て、必要であればウィンドウを調整した。融合点の周囲に一緒にクラスタ分けされるｄＰＥＴの数を、クラスタサイズにより表した。クラスタの５’タグによりカバーされるゲノム領域を５’アンカーと定義し、クラスタの３’タグによりカバーされるゲノム領域を３’アンカーと定義した。５００ｂｐ未満のアンカー領域を有するｄＰＥＴクラスタを、さらなる分析から除外した。
【０２１８】
Ｋ５６２のＤＮＡ−ＰＥＴ配列決定は、以前に記載されている１。同じＫ５６２  ｄＰＥＴクラスタを本研究で用いたが、セントロメア領域は除外せず（以前の研究ではそのようにされた）、５００ｂｐ未満のアンカー領域を有するｄＰＥＴクラスタを除外し（以前は１０００ｂｐ未満）、新しい除外／ふるい分け手順を用いた（以下を参照されたい）。
【０２１９】
低信頼度クラスタの除外
我々は、一連の統計検定を用いて、低信頼度クラスタをさらなる分析から除外した。検定は、キメラ配列構築物または局所挿入サイズ変動から生じ得るｄＰＥＴクラスタについてのライブラリー特異的閾値を決定する。特に、短い欠失を示すｄＰＥＴクラスタは、非均一スパン分布のアーチファクトとして生じ得るので、我々は、ゲノム（最大ライブラリーサイズのビンに離散化される）上の「伸展」ｄＰＥＴ（端が最大ライブラリーサイズより長く離れていることだけによる不調和性）の分布について２項分布モデルを用いて、最小クラスタサイズ閾値を見積もり、平均で１未満の偽陽性が予想されるようにした（ゲノムビンの数によりｐ値をボンフェローニ補正した）。具体的に、閾値（端が最大ライブラリーサイズの２倍未満隔たっているクラスタにのみ当てはめた）は：
【数１】
2014502493.tif 000017
（ここで、Ｎは、伸展ｄＰＥＴの数であり、ｂは、ビンの数であり、ｆ（ｋ；ｎ，ｐ）は、成功確率ｐでのｎ回の独立試行についてｋでの２項分布密度関数である）
と計算される。
【０２２０】
ライブラリー準備における環状化ステップから生じるキメラＰＥＴ構築物は、ゲノムにわたって分散し、よって、ｄＰＥＴクラスタを形成する見込みは低いと予想される。しかし、莫大な量の配列により、少数のこのようなクラスタが生じ、我々は、以前と同様の２項分布モデルを採用して、ライブラリー特異的最小クラスタサイズ閾値を設定した（平均で１未満の偽陽性が予想される）。
【数２】
2014502493.tif 000018
（ここで、Ｄは、ｄＰＥＴの数である）。なお、伸展ｄＰＥＴクラスタは単一のビン（第１の近似に対して）により定義できるが、一般的に、ｄＰＥＴクラスタを定義するために２つのビンを選択しなければならず、このことは、上の等式における２次因数を説明する。キメラＰＥＴクラスタは、端が互いに非常に近傍にあるように生じる見込みが低いので、上記の閾値は、端が、
【数３】
2014502493.tif 000019
（式中、Ｇは、ゲノムのサイズであり、ｂ（ｔ）は、サイズｔの領域内のビンの数である）より近いクラスタには当てはめない。この方法論により定義されるクラスタサイズ閾値を、表Ｈ１２に示す。
【０２２１】
スーパークラスタ分け
いくつかの遺伝子座は、ｄＰＥＴクラスタの蓄積を示した。これらの遺伝子座では、特定のＳＶをあるｄＰＥＴクラスタに割り当てることは誤り導く可能性があるので、我々は、切断点に基づく相互接続ネットワーク（スーパークラスタ分け１）を確立して、複雑な領域にある切断点を、孤立し、かつ複雑さが低いＳＶから分けた。切断点の近隣を決定するために、各ｄＰＥＴクラスタアンカー領域の始点および終点を、各ゲノムライブラリーの最大挿入サイズだけ、検索ウィンドウとして拡張した。近隣クラスタのウィンドウが互いにオーバーラップするならば、ｄＰＥＴクラスタをスーパークラスタに一緒に群分けした。この手順により、クラスタＢを介してクラスタＡからＣへの間接的接続が可能になった。スーパークラスタに一緒に加えることができるｄＰＥＴクラスタの数を、スーパークラスタサイズとして表した。３を超えるｄＰＥＴクラスタを相互接続した場合、切断点の対は「複雑」と分類した（染色体内および染色体間）。この相互接続ネットワークを、低信頼度クラスタの除外（上を参照されたい）の後であるが、ＤＮＡ−ＰＥＴデータキュレーション（以下を参照されたい）の前に確立した。
【０２２２】
ＤＮＡ−ＰＥＴデータキュレーション
未処理ＤＮＡ−ＰＥＴデータは、６つのＣＭＬ試料において３，４０８の異なるＳＶを予測した（表Ｈ４）。
【０２２３】
我々は、以下の品質基準に基づいてデータをふるい分けした：ｉ）我々は、対合した慢性期／寛解試料（Ｐ１４５およびＰ４４０）のｄＰＥＴクラスタのクラスタサイズを比較し、クラスタを２つの群に分けた：ａ）両方の試料で同定されたクラスタ、およびｂ）２つのうち一方だけで観察されたクラスタ。この階層化により、サイズ２から４のクラスタは、アーチファクトが豊富であることが示唆された（図２４）。確実にするために、我々は、サイズ２〜５の全てのｄＰＥＴクラスタを、ＳＶ召集から除外した。ｉｉ）マッピングアーチファクトは、配列類似性が高い領域間にｄＰＥＴクラスタを創出できる。ＳＯＬｉＤ対合パイプラインの「レスキュー」とよばれる手順は、このようなアーチファクトを、２つのタグの調和性の対合に有利にすることにより大きく低減するが、領域間の配列類似性は、それでもアーチファクトを創出できる。しかし、配列類似性が非対立遺伝子相同組換えによる再編成を誘引できるので、配列類似性が高い全てのｄＰＥＴクラスタを除外することは問題である。切断点間の配列類似性を評価するために、我々は、左および右のアンカー領域を１５Ｋｂだけ、切断点に向かって拡張し、２つの領域をＢＬＡＳＴプログラム（ｂｌ２ｓｅｑ）６によりアラインメントした。２つの領域のアラインメントは、通常、多重のアラインメントをもたらすが、我々は、最も高いスコアのものを用いた（表Ｈ６において「ＢｌａｓｔＳｃｏｒｅ１」と定義する）。
【０２２４】
Ｂｌａｓｔスコアが２，０００を超えた場合では、検証のために特異的ＰＣＲプライマーを設計することは通常困難であったので、我々は、このような高いＢｌａｓｔスコアを有するｄＰＥＴクラスタを除外した。ｉｉｉ）特に、２つの予測される対合切断点の一方の側のアンカー領域と他方の側のアンカーの拡張との間の配列類似性は、マッピングアーチファクトの指標である（「拡張−クラスタ」についてのＥＣアラインメントタイプ）。これは、他のアンカーの拡張に対するアンカータグの正しいマッピング（これらは配列特徴を共有する）がｃＰＥＴを創出するという仮定に基づく。我々は、３００を超えるＢｌａｓｔスコアおよびＥＣアラインメントタイプを有するｄＰＥＴクラスタを除外した。ｉｖ）いくつかのゲノム領域は、マッピングアーチファクトを蓄積する傾向があり、我々は、１００を超えるスーパークラスタサイズを有する全てのｄＰＥＴクラスタを除外した。我々は、株化細胞においてのみ（しかし、臨床試料（および未公開のデータ）においてではない１）このような複雑さの真の再編成を観察した。このふるい分け手順は、ＣＭＬ試料において１，３４９の異なる予測ＳＶをもたらした（表Ｈ４）。
【０２２５】
交差ゲノム比較
異なるゲノムにわたるクラスタの比較を、両側に１０Ｋｂだけ拡張した５’および３’アンカー領域のオーバーラップに基づいて行った。第２ライブラリーのクラスタの５’アンカー領域が、第１ライブラリーのクラスタの５’拡張アンカー領域とオーバーラップし、同じことが３’アンカー領域にもいえるならば、２つのクラスタを一緒に群分けし、アンカー領域の１０Ｋｂ拡張を最も外側の開始および終了アンカー座標に従って調整した。切断点の位置を用いて、同定したＳＶを、がんでない個体のペアエンド配列決定研究７、８に基づく、公開されているＳＶと比較した。公開されているＳＶとオーバーラップする予測ＳＶの画分を、より大きい事象に対するオーバーラップのパーセンテージにより算出した。遺伝子アノテーションは、ＵＣＳＣ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／；９）から２００９年５月１４日にダウンロードしたＲｅｆＳｅｑ遺伝子に基づいた。
【０２２６】
我々は、９名の中国人、６名のヨーロッパ人、３名のアフリカ人、２名のメキシコ人および１名のインド人を含む２１名の正常個体のＤＮＡ−ＰＥＴデータ（２２のライブラリー、未公開データ）を、交差ゲノム比較に含めた。２１の正常試料の１または複数のＳＶとマッチしたＣＭＬ患者の全てのＳＶを生殖系列ＳＶに類別し、さらなる分析から除外した。さらに、５名のアフリカ人、３名のヨーロッパ人、１名の日本人および１名の中国人を含む１０名のがんでない個体におけるペアエンド配列決定アプローチ７、８により同定されたＳＶと８０％以上オーバーラップしたＳＶを生殖系列と類別して除外した。３１の正常試料を用いるこの「生殖系列ふるい分け手順」は、ＣＭＬ試料における３０９の異なる予測ＳＶをもたらした（表Ｈ４〜Ｈ６）。ＣＭＬゲノムにおける予測ＳＶの検証のために、予測切断点を挟むＰＣＲプライマーを用いて、後続のＳａｎｇｅｒ配列決定のために再編成領域を増幅した。
【０２２７】
急性転化期再編成の特徴付け
急性転化期への移行における一貫した分子的知見は、ＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質自体のレベルの増加である３、１０、１１。このことは、ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子増幅およびＰｈ染色体の重複を含むいくつかの機構により生じる３、１０、１１。したがって、我々は、２つの慢性期試料（Ｐ１４５およびＰ３０８）と比較した場合に、急性転化期試料（Ｐ０２２、Ｐ０９８、Ｋ５６２）においてＢＣＲ−ＡＢＬについてのＤＮＡ−ＰＥＴシグナルの増加を検出でき、我々は、これをＦＩＳＨと相関させた（図１９Ｂおよび図１９Ｃ）。我々は、相互ＡＢＬ−ＢＣＲ転座を表すＤＮＡ−ＰＥＴシグナルと段階との間の逆の相関も観察した（図１９Ｂ）。ｄｅｒ９上のＡＢＬ−ＢＣＲ再編成点の欠失について記載されており１２、我々は、逆の相関の根底にある急性転化試料Ｐ０９８およびＫ５６２におけるＡＢＬ−ＢＣＲの完全喪失（図１９Ｂおよび１９Ｃ）を検出した。
【０２２８】
我々は、急性転化期試料における可能性のある体細胞性ＳＶの性質を類別し、２名の急性転化期患者におけるＳＶの最も顕著なカテゴリーが欠失（Ｐ０９８およびＰ０２２、ｎ＝７９［全てのＳＶの７９％］）、続いて直列重複（ｎ＝６［６％］）および孤立転座（ｎ＝５［５％］）であり、他のＳＶカテゴリーのそれぞれについて５％未満であったことを見出した（表Ｈ５）。
【０２２９】
【表８】
2014502493.tif 000020
１）ＳＶ統計は、ｄＰＥＴクラスタの数を反映する（逆位、挿入および均衡転座は、事象あたり２のｄＰＥＴクラスタで構成される）
２）相互ＡＢＬ−ＢＣＲではないＢＣＲ−ＡＢＬ転座が、派生第９染色体の欠失により存在する
３）相互ＡＢＬ−ＢＣＲではないＢＣＲ−ＡＢＬ転座が、派生第９染色体の喪失または複雑な再編成により存在する
４）慢性期患者試料Ｐ１４５における４つの予測ＳＶは、同じ患者の寛解試料（Ｐ４４０）において予測されず（寛解における非存在）、Ｐ１４５においてＤＮＡ−ＰＥＴが示されなかった７つのＳＶがＰ４４０において予測された（慢性における非存在）。「寛解における非存在」カテゴリーにおいて、再編成点のうち２つはＢＣＲ−ＡＢＬおよびＡＢＬ−ＢＣＲであり、２つの５Ｋｂ欠失がＰ４４０で見つからなかったが、両方の試料においてＰＣＲにより同定された。「慢性における非存在」カテゴリーにおいて、欠失および孤立転座はＰＣＲにより検証できず、リストから除外され、５つの残りの矛盾したＳＶは、慢性および寛解試料の両方でＰＣＲにより検出でき、ＤＮＡ−ＰＥＴにより慢性試料において見つからなかった。
【０２３０】
急性転化期株化細胞Ｋ５６２は、予想されたように、急性転化期患者試料と比較してより多くの再編成を示した（１５３に対してそれぞれ４０および６０）。Ｋ５６２においても欠失が最も顕著なカテゴリーであり（ｎ＝７０［４６％）、続いて直列重複（ｎ＝３９［２５％］）、不対合逆位（ｎ＝２０［１３％］）、孤立転座（ｎ＝１１［７％］）および複雑な染色体内再編成（ｎ＝１１［７％］）であった。興味深いことに、２つの急性転化期試料およびＫ５６２株化細胞においてＢＣＲ−ＡＢＬに加えて均衡転座は観察されなかった。
【０２３１】
株化細胞および細胞培養条件
ＣＭＬ系統は、ＡＴＣＣ（ＭＥＧ−０１およびＫＵ８１２）、独立行政法人  医薬基盤研究所  ＪＣＲＢ細胞バンク（ＮＣＯ２）およびｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＫＣＬ２２、Ｋ５６２、ＫＹＯ−１、ＪＫ１、ＢＶ１７３およびＮＡＬＭ１）から得た。細胞は、ペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミンおよび１０％ＦＢＳを補ったＲＰＭＩ−１６４０培地で成長させ、３７℃、５％ＣＯ２の湿潤インキュベータ中でインキュベートした。
【０２３２】
蛍光Ｉｎ  Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
細胞を０．７５Ｍ  ＫＣｌで１５分間、３７℃にて処置することにより核を採集した。固定の後に、核をＦＩＳＨ用のスライド上に滴下した。ＢＣＲ−ＡＢＬ融合は、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ（遺伝子座特異的識別子）ＢＣＲ／ＡＢＬ１  ２重融合転座プローブ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）により検出した。ＬＳＩ  ＢＣＲプローブを、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎで標識し、ＬＳＩ  ＡＢＬ１プローブを、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅで標識した。ＬＳＩ  ＢＣＲ／ＡＢＬ１  ２色２重融合転座プローブ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を用いるＦＩＳＨアッセイを、製造者の使用説明にわずかな改変を加えて、固定細胞に対して行った。簡単に述べると、スライドを一連のアルコール中で脱水し、同時変性を３分間、７５℃にて行い、その後、３７℃にて１晩ハイブリダイゼーションした。ＦＩＳＨシグナルの評価は、１０００倍の倍率の下で蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ６０）を用いて行った。それぞれの場合に、約２００の間期の核をシグナルパターンについて評価した。
【０２３３】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
製造者の使用説明に従ってＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、トータル細胞ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写し、ｉＱ５マルチカラーリアルタイム検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を、２５μｌの全反応容量で用いて定量的に評価した。プライマーを５９℃にて２０秒間アニーリングし、アンプリコンを７２℃にて３０秒間伸長した。定めたサイクルの総数は、４０であった。β−アクチンまたはＢＩＭのエキソン２Ａの転写産物レベルを用いて、試料間を標準化した。以下のプライマーを用いた：ＢＩＭエクソン２Ａ（順方向：ＡＴＧＧＣＡＡＡＧＣＡＡＣＣＴＴＣＴＧＡＴＧ；逆方向：ＧＧＣＴＣＴＧＴＣＴＧＴＡＧＧＧＡＧＧＴ）、ＢＩＭエクソン３（順方向：ＣＡＡＴＧＧＴＡＧＴＣＡＴＣＣＴＡＧＡＧＧ；逆方向：ＧＡＣＡＡＡＡＴＧＣＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＧＧ）、ＢＩＭエクソン４（順方向：ＴＴＣＣＡＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＣ；逆方向：ＣＣＴＣＣＴＴＧＣＡＴＡＧＴＡＡＧＣＧＴＴ）およびβ−アクチン（順方向：ＧＧＡＣＴＴＣＧＡＧＣＡＡＧＡＧＡＴＧＧ；逆方向：ＡＧＣＡＣＴＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣ−ＡＧ）。
【０２３４】
ウェスタンブロット
ウェスタンブロッティングを、ヒトＢＩＭ、ＣｒｋＬ、ｐＣｒｋＬ、カスパーゼ３、切断カスパーゼ３、ＰＡＲＰ（全てＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから）およびβ−アクチン（Ｓｉｇｍａ）に対する抗体を用いて行った。検出は、ウサギ（Ｓｉｇｍａ）またはマウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）に特異的なＨＲＰコンジュゲート２次抗体を用いて行った。メンブレンは、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ化学発光試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて視覚化した。
【０２３５】
アネキシンＶ染色による細胞死の検出
製造者の使用説明に従ってアネキシンＶ−ＦＩＴＣ／７−ＡＡＤキット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてアポトーシスを測定した。簡単に述べると、処置または未処置細胞を、アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよび７−ＡＡＤで、１×結合緩衝液中で１５分間、室温にて染色し、次いで、フローサイトメトリーにより分析した。
【０２３６】
Ｅ３含有ＢＩＭ転写産物のｓｉＲＮＡノックダウン
Ｅ３含有ＢＩＭ転写産物に対する小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（ＢＩＭγｓｉＲＮＡ１：ＣＣＡＣＣＡＵＡＧＵＣＡＡＧＡＵＡＣＡ；ＢＩＭγｓｉＲＮＡ２：ＣＡＧＡＡＣＡＡＣＵＣＡＡＣＣＡＣＡＡ）および陰性対照ｓｉＲＮＡ（ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ非ターゲティングｓｉＲＮＡ＃１）を、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｉｎｃ．から購入した。ヌクレオフェクションを、ＫＣＬ２２細胞に対して、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖ（Ｌｏｎｚａ）をｓｉＲＮＡの存在下で用いて行った。
【０２３７】
ＢＩＭにおける欠失についてのスクリーニング
我々は、ＨａｐＭａｐ１３ホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｓｎｐ．ｃｓｈｌ．ｏｒｇ／）からダウンロードしたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘゲノムワイドヒトＳＮＰアレイ６．０強度データを用いて、ＢＩＭにおける欠失多型のコピー数を推測した。２つの遺伝子型決定された単一ヌクレオチド位置が、欠失内にあった：ＳＮＰ＿Ａ−４１９５０８３およびＣＮ＿１７３５５０。２つのマーカーの未処理強度を用いて、Ｋｏｒｎら１４により提案されるアルゴリズムと類似の混合ガウスモデルを用いてコピー数変動事象を求めた。この手順を用いて、我々は、コピー数を予測し、それにより、ヨーロッパ人（ｎ＝６０）、ヨルバ族（ｎ＝６０）および中国人／日本人（ｎ＝９０）起源の無関係のＨａｐＭａｐ試料における欠失の存在または非存在を予測した。我々は、次いで、以下の温度サイクル条件：９６℃で３０秒間、（９４℃で１５秒間、６４℃で３０秒間、６８℃で５分間）×１２、（９４℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で５分間）×１８、６８℃で２０分間を用いて、プライマーＢｉｍ＿ｄｅｌ＿Ｆ  ＡＡＴＡＣＣＡＣＡＧＡＧＧＣＣＣＡＣＡＧおよびＢｉｍ＿ｄｅｌ＿Ｒ  ＧＣＣＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧならびにＪｕｍｐＳｔａｒｔ  ＲｅｄＡｃｃｕＴａｑ  ＬＡ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）を用いるＰＣＲにより、我々が有していた中国人／日本人ＤＮＡ試料（ｎ＝７４）における欠失の遺伝子型を決定した。欠失を有する（１，３２３ｂｐ）および欠失を有さない（４，２２６ｂｐ）得られたＰＣＲ生成物を、１％アガロースゲル上で分析した。我々は、ＰＣＲに基づく遺伝子型を用いて、ヨーロッパ人およびヨルバ族試料における遺伝子型召集についての単一ヌクレオチド強度カットオフを精密化し、頻度評価のために東アジア人試料のＰＣＲにより検証された遺伝子型だけを用いた。
【０２３８】
ヨーロッパ人集団における欠失が中程度の頻度であるが、ＨａｐＭａｐ試料において偶然見つからなかったのかをさらに調べ、アジアにおける欠失頻度をより精密に決定するために、我々は、ＰＣＲアッセイにより、５９５のドイツ人、６００のマレー人、６０８の中国人および６０５のインド人試料について遺伝子型決定した。
【０２３９】
ＢＩＭ欠失についての寄与分画の算出
東アジア人患者の処置耐性の集団寄与分画を算出するために、我々は、ＰＡＦ＝（ｆ（ＯＲ−１））／（ｆ（ＯＲ−１）＋１）（患者のうちの欠失キャリアの頻度（ｆ＝０．１３５）ｆ、およびＴＫＩ処置に対して耐性の患者と感受性の患者との間の欠失キャリアのオッズ比（ＯＲ）（ＯＲ＝３．１９））を用いた。
【０２４０】
ミニ遺伝子プラスミド構築
ｐＩ−１２スプライシング構築物を、Ｍａｒｉａｎｏ  Ｇａｒｃｉａ−Ｂｌａｎｃｏからの厚意として得た。標準的なクローニング技術を用いて、２つの他のミニ遺伝子構築物であるｐＩ−１２−ＷＴおよびｐＩ−１２−ＭＵＴを構築した。簡単に述べると、ＢＩＭエキソン４とエキソン４の上流の６５９ｂｐ配列とを一緒に、ＫＣＬ２２ゲノムＤＮＡから、５’−ＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＴＣＴＣＣＡＴＧＴＧＧＴＧＴＴＴＧ−３’をフォワードプライマーとしておよび５’−ＧＣＣＧＡＡＧＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴＧＣＡＴＡＧＴＡＡＧＣＧＴＴ−３’をリバースプライマーとして用いて増幅した。ＰＣＲ生成物を、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＩ−１２プラスミドのＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。ＢＩＭエキソン３と欠失多型を有するおよび有さない上流領域とを、ＫＣＬ２２ゲノムＤＮＡから、５’−ＧＣＣＧＧＡＴＡＴＣＡＴＧＧＡＡＧＧＡＡＣＴＧＡＣＣＴＧＧＴＧ−３’をフォワードプライマーとしておよび５’−ＧＣＣＧＡＴＣＧＡＴＧＴＡＧＧＡＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣ−３’をリバースプライマーとして用いて増幅した。４５００ｂｐおよび１５９７ｂｐのサイズの２つのＰＣＲ生成物を得て、これらをゲル精製し、ＥｃｏＲＶおよびＣｌａＩで消化し、プラスミドのＥｃｏＲＶおよびＣｌａＩ部位にクローニングして、欠失多型を含有しないｐＩ−１２−ＷＴ構築物および欠失多型を含有するｐＩ−１２−ＭＵＴ構築物を得た。
【０２４１】
ＢＩＭ欠失多型をゲノム編集するために用いたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）
ＺＦＮは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＣｏｍｐｏＺｒ  ＴＭ  ＺＦＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＵＳＡ）により注文製作された。このＺＦＮは、欠失多型に相当する領域の５’端から５５１ｂｐ下流の部位を切断した（図１４Ｂ）。修復鋳型は、２つのフランキングホモロジーアームだけを含有したが、ＢＩＭ欠失多型領域を含有しなかった（図１６Ａ）。修復鋳型を、鋳型としてＫＣＬ２２ゲノムＤＮＡと、以下のプライマー：５’ＣＡＴＡＡＡＴＡＣＣＡＣＡＧＡＧＧＣＣＣＡＣＡＧＣ３’（このフォワードプライマーは、ＢＩＭ欠失多型領域の５’端から６１９ｂｐ上流にある）、５’ＣＣＣＴＣＧＡＡＧＡＣＡＣＣＴＣＴＡＴＴＧＧＧＡＧＧＣ３’（このリバースプライマーは、ＢＩＭ欠失多型領域の３’端の７４３ｂｐ下流にある）とを用いるＰＣＲにより構築した。
【０２４２】
我々は、１３６２ｂｐ長のＰＣＲ生成物を単離し、これをＤＮＡベクターｐＣＲ（登録商標）−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）にクローニングした。我々は、修復鋳型を配列決定し、正しい配列が得られたことを確認した。修復鋳型およびＺＦＮコードプラスミドをＫ５６２細胞に、以前に言及されたプロトコール１５を用いることによりトランスフェクトした。ＰＣＲに基づく検出アッセイを開発して、トランスフェクトされたＫ５６２細胞集団のうちでＢＩＭ欠失多型を有するクローンの存在を検出した。このＰＣＲに基づくアッセイにおいて用いたプライマーは、修復鋳型の外側で見出されるＢＩＭイントロン領域にアニーリングした（図１６Ａ）。その結果、このアッセイは、修復鋳型を検出しなかった（データは示さず）。用いたプライマーの配列は、５’ＧＧＣＣＴＴＣＡＡＣＣＡＣＴＡＴＣＴＣＡＧＴＧＣＡＡＴＧＧ３’（このフォワードプライマーは、ＢＩＭ欠失多型領域の５’端から１５０７ｂｐ上流にある）、５’ＧＧＴＴＴＣＡＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣＴＧＧＧＡＣＴＣＣ３’（このリバースプライマーは、ＢＩＭ欠失多型領域の３’端の７６７ｂｐ下流にある）であった。
【０２４３】
ＢＩＭ欠失多型を有するゲノム編集されたＫ５６２クローンを、希釈クローニングにより単離した。トランスフェクトしたＫ５６２細胞を、２．５細胞／ｍｌの密度に希釈した。９６ウェルプレートフォーマットを用いて、各ウェルに、次いで、２００ｕｌの希釈したトランスフェクトされたＫ５６２細胞を播種した。各ウェルからうまく増幅したクローンを採集し、ゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＥａｓｙキットを用いて単離した。
【０２４４】
ゲノム編集されたＫ５６２クローンに対するイマチニブおよびＡＢＴ−７３７実験
野生型およびゲノム編集されたＫ５６２クローンを、ペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミンおよび２０％ＦＢＳを補ったＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し、３７℃、５％ＣＯ２の湿潤インキュベータ中でインキュベートした。６ウェルプレート中で、１×１０６細胞を各ウェルに２×１０５細胞／ｍｌの密度で播種した。適当な薬物との４８時間のインキュベーションの後に、細胞をウェスタン分析のために採集した（図１６）。
【０２４５】
アポトーシスアッセイのために、４×１０５細胞を１２ウェルプレートの各ウェルに２×１０５細胞／ｍｌの密度で播種した。アポトーシス細胞中のモノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソームの存在を、細胞死検出ＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｈｅ）を用い、製造者の使用説明に従うことにより検出した。
【０２４６】
【表９】
2014502493.tif 000021
１）発症（Ｐ１４５）および寛解（Ｐ４４０）にて同じ個体
２）４６，ＸＹ，＋８，ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１．２），ｉ（１７）（ｑ１０）［ｃｐ２］／４８，ｉｄｅｍ，＋ｄｅｒ（２２）ｔ（９；２２）［７］／４８，ｉｄｅｍ，＋１９［ｃｐ４］／４８，ｉｄｅｍ，ｔ（１２；１７）（ｐ１３；ｑ１１．２），＋１９［ｃｐ３］／４９，ｉｄｅｍ，＋８，＋１９［２］／４６，ＸＹ［３］。
表Ｈ１．ＤＮＡ−ＰＥＴ分析に用いた患者およびＣＭＬ株化細胞（Ｋ５６２）の臨床病理学的特徴
【０２４７】
【表１０】
2014502493.tif 000022
表Ｈ２．ＳＯＬｉＤプラットフォームでの大量並列ＰＥＴ配列決定の統計
１）配列決定した２５ｂｐタグの数
２）ヒト参照ゲノム（ＮＣＢＩ  ｂｕｉｌｄ  ３６）に対してマッピングした２５ｂｐタグの数
３）マッピングした２５ｂｐタグを対合した後に作製されたペアエンドタグ（ＰＥＴ）の数
４）非重複ＰＥＴ；両方のペアタグについて同じ始点を有するＰＥＴを、これらが同じＰＣＲ生成物に由来する（独立した生物学的情報でない）という仮定に基づいて除外した
５）調和性ＰＥＴ
６）非重複ｃＰＥＴ（４を参照されたい）
７）ｃＰＥＴによる物理的カバー範囲；染色体位置を交差するｃＰＥＴ接続の平均数
８）非重複不調和性ＰＥＴ（４を参照されたい）
９）「低信頼度クラスタの除外」を通過した同じ潜在的再編成点の周囲のｄＰＥＴのクラスタ。
【０２４８】
【表１１】
2014502493.tif 000023
表Ｈ３．５つの患者試料およびＫ５６２株化細胞においてＤＮＡ−ＰＥＴにより予測されるＳＶ１）
１）ＳＶ統計は、ｄＰＥＴクラスタの数を反映する（逆位、挿入および均衡転座は、事象あたり２のｄＰＥＴクラスタで構成される）
２）相互ＡＢＬ−ＢＣＲではないＢＣＲ−ＡＢＬ転座が、派生第９染色体の欠失により存在する
３）相互ＡＢＬ−ＢＣＲではないＢＣＲ−ＡＢＬ転座が、派生第９染色体の喪失または複雑な再編成により存在する
【０２４９】
【表１２】
2014502493.tif 000024
表Ｈ４．５つの患者試料およびＫ５６２株化細胞においてＤＮＡ−ＰＥＴにより予測されるＳＶのふるい分け１）ＳＶ統計は、ｄＰＥＴクラスタの数を反映する（逆位、挿入および均衡転座は、事象あたり２のｄＰＥＴクラスタで構成される）
２）異なるゲノムにおける同じＳＶは１回計数する。
３）スーパークラスタサイズが１００を超えるか、またはＢｌａｓｔスコアが２０００を超えるか、またはＢｌａｓｔアラインメントがＥＣタイプであるか、またはクラスタサイズが２〜５である（上記を参照されたい）ｄＰＥＴクラスタをふるい分けした
４）２１名の正常個体の２２の正常ライブラリーのＤＮＡ−ＰＥＴ情報および１０の正常試料の公開されているペアエンド配列決定データ７、８によりデータをふるい分けした後。
【０２５０】
【表１３】
2014502493.tif 000025
表Ｈ５．５つの患者試料およびＫ５６２株化細胞においてＤＮＡ−ＰＥＴにより予測されるＣＭＬ特異的ＳＶ１）
１）ＳＶ統計は、ｄＰＥＴクラスタの数を反映する（逆位、挿入および均衡転座は、事象あたり２のｄＰＥＴクラスタで構成される）
２）相互ＡＢＬ−ＢＣＲではないＢＣＲ−ＡＢＬ転座が、派生第９染色体の欠失により存在する
３）相互ＡＢＬ−ＢＣＲではないＢＣＲ−ＡＢＬ転座が、派生第９染色体の喪失または複雑な再編成により存在する。
４）慢性期患者試料Ｐ１４５における４つの予測ＳＶは、同じ患者の寛解試料（Ｐ４４０）において予測されず（寛解における非存在）、Ｐ１４５においてＤＮＡ−ＰＥＴが示されなかった７つのＳＶがＰ４４０において予測された（慢性における非存在）。「寛解における非存在」カテゴリーにおいて、再編成点のうち２つはＢＣＲ−ＡＢＬおよびＡＢＬ−ＢＣＲであり、２つの５Ｋｂ欠失がＰ４４０で見つからなかったが、両方の試料においてＰＣＲにより同定された。「慢性における非存在」カテゴリーにおいて、欠失および孤立転座はＰＣＲにより検証できず、リストから除外され、５つの残りの矛盾したＳＶは、慢性および寛解試料の両方でＰＣＲにより検出でき、ＤＮＡ−ＰＥＴにより慢性試料において見つからなかった。
【０２５１】
【表１４Ａ】
2014502493.tif 000026
【表１４Ｂ】
2014502493.tif 000027
【表１４Ｃ】
2014502493.tif 000028
【表１４Ｄ】
2014502493.tif 000029
【表１４Ｅ】
2014502493.tif 000030
【表１４Ｆ】
2014502493.tif 000031
表Ｈ７．ＰＣＲにより検証した再編成点
１）両方の切断点にて同じ配列のマイクロホモロジーを太字で示し、左の切断点に割り当てる。２つのゲノム切断点の間の挿入配列を太字および下線で示す。
【０２５２】
【表１５】
2014502493.tif 000032
ＣＨＲ＝血液学的完全応答、ＰＣｙＲ＝細胞遺伝学的部分応答、ＣＣｙＲ＝細胞遺伝学的完全応答、ＣＣＡ＝クローン染色体異常。
表Ｈ８．早期慢性期におけるファーストラインイマチニブに対する奏功の欧州ＬｅｕｋｅｍｉａＮｅｔ（ＥＬＮ）基準１６
【０２５３】
【表１６】
2014502493.tif 000033
表Ｈ９．ＢＩＭ欠失多型とベースライン特徴との関連。ＢＩＭ多型とベースライン特徴との間の関連について試験する統計分析は、個別のコホート表にあるｔ検定＊、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和＾およびＦｉｓｈｅｒの正確検定＊＊を用いて行った。組み合わせたコホートデータについてのロジスティック回帰分析は、ＢＩＭ多型群（ＢＩＭ、ＢＩＭなし）間の平均年齢の有意差（ｐ＝０．０２０）と、コホート間の有意でない差（ｐ＝０．９８４）とを示した。ＢＩＭ多型とチロシンキナーゼ阻害剤に対する臨床耐性との関連は、統計的に有意であった（ｐ＝０．０２２）。主文献における表１について、両方のコホートにおいて示される群年齢の相違のかなりの大きさ（およそ７歳）と、シンガポール人／マレーシア人コホートの年齢の相違が統計的有意性に近づいた（ｐ＝０．０５５）という事実とにより、年齢の相違を調整することが適当であると考えられた。
【０２５４】
【表１７】
2014502493.tif 000034
【０２５５】
【表１８】
2014502493.tif 000035
【０２５６】
【表１９】
2014502493.tif 000036
表Ｈ１０．ＢＩＭ欠失多型を有する患者の臨床特徴。略語：ＩＦＮ、インターフェロン；ＩＭ、イマチニブ；ＴＫＩ、チロシンキナーゼ阻害剤；ＥＬＮ、欧州Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｎｅｔ；ＣＰ、慢性期；ＡＰ、移行期；ＢＣ、急性転化；Ｈ、高；Ｌ、低；ＵＮＫ、不明；ＣＨＲ、血液学的完全応答；ＰＣｙＲ、細胞発生的部分応答；ＣＣｙＲ、細胞遺伝学的完全応答；ＭＭＲ、主要分子学的応答；ＣＭＲ、分子学的完全応答。
【０２５７】
【表２０】
2014502493.tif 000037
表Ｈ１１．ＢＩＭ欠失多型とＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼドメイン変異の非存在下でのイマチニブ耐性との関連。表１における患者の２つのコホートをそれぞれ３つの群にさらに分けた：ＢＣＲ−ＡＢＬ変異なしの耐性（群Ｉ）、ＢＣＲ−ＡＢＬ変異ありの耐性（群ＩＩ）および感受性（群ＩＩＩ）。したがって、これらのデータを、ロジスティック回帰を用いて分析した。シンガポール人／マレーシア人と日本人コホートとの間に有意差はなかった（ｐ＝０．３１）が、Ｆｉｓｈｅｒの正確検定により示されるように群の間に有意差があった（ｐ＝０．０３）。オッズ比についてのペアワイズ９５％信頼区間は、群Ｉ対群ＩＩＩ、ならびに群Ｉ対群ＩＩおよびＩＩＩの間の有意差を示したが、群Ｉ対群ＩＩ（オッズ比＝２．０３、０．６８〜７．５８の９５％ＣＩ）、および群ＩＩ対群ＩＩＩ（オッズ比＝１．６６、０．４１〜５．８９の９５％ＣＩ）の間に有意差はなかった。群Ｉ対群ＩＩＩを比較することにより、３．３７のオッズ比（１．３５〜９．２３の９５％ＣＩ）が得られ、群Ｉ対群ＩＩおよびＩＩＩを比較することにより、１．９０のオッズ比（２．０８〜４．３５の９５％ＣＩ）が得られた。全ての計算は、ＳＡＳ  Ｖ９．２  １７を用いて行った。
【０２５８】
【表２１】
2014502493.tif 000038
表Ｈ１２．「低信頼度クラスタの除外」により定義される閾値１）左アンカー開始が右アンカー開始の２×最大ライブラリーサイズ未満離れている（欠失）クラスタについての最小ｄＰＥＴクラスタサイズ
２）「２×ライブラリーサイズまで伸展」したものおよび「近傍閾値」内のものを除く全てのｄＰＥＴクラスタについての最小ｄＰＥＴクラスタサイズ
３）サイズ２のｄＰＥＴクラスタは、両方のアンカーが記載される距離以内（「伸展ｄＰＥＴ」規則以外）であるならば、許容する。
【０２５９】
上記の閾値を通過したｄＰＥＴクラスタは、スーパークラスタ分け（以下を参照されたい）の基礎となった。
【０２６０】
【表２２】
2014502493.tif 000039
表Ｈ１３．アネキシンＶ染色により決定した、イマチニブで処置したＫＣＬ２２、ＫＹＯ−１およびＮＣＯ２株化細胞のＩＣ５０
【０２６１】
実施例Ｈ２．実施例Ｈ１についての参考文献
以下は、実施例Ｈ１．材料および方法についての参考文献である。
【表２３Ａ】
2014502493.tif 000040
【表２３Ｂ】
2014502493.tif 000041
【０２６２】
実施例Ｈ３．序論
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の患者のほとんどは、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）での治療に応答する１。しかし、患者の１５〜２０％は、ＴＫＩに対して最適に応答せず２、ＴＫＩ耐性を有する。代替治療に対する臨床耐性または感受性を予測するための信頼できるバイオマーカーは、現在のところない。今回、我々は、ＢＩＭ遺伝子中の２．９Ｋｂ欠失多型により媒介される固有のＴＫＩ耐性の新規な機構を同定する。この欠失は、死滅促進性ＢＨ３ドメインを含有するＢＩＭアイソフォームからスプライシングがなくなるように偏らせ、ＢＨ３含有転写産物を上方制御するＴＫＩの能力を減退させた。このことにより、鈍いアポトーシス応答と固有のＴＫＩ耐性（ＢＨ３模倣薬を用いて克服できた耐性）が導かれた。興味深いことに、多型は、東アジア人個体に制限され（１２．３％キャリア率）、アフリカ人および白人には存在しなかった（０％）。東アジア人ＣＭＬ患者（ｎ＝２０３）は、多型の存在と劣ったＴＫＩ応答との間の強い関連を示した（ｐ＝０．０２）。我々の結果は、共通の欠失多型がどのようにしてＴＫＩ（広範囲のキナーゼ駆動型がんに対して効力が証明されたクラスの薬物）に対する臨床応答に影響できるかを示す。重要なことに、ＢＩＭ機能に対する多型の影響を明らかにすることにより、我々は、ＢＨ３模倣剤がこの形のＴＫＩ耐性を克服できることを証明する。
【０２６３】
ＢＩＭは、ＢＣＬ２ファミリーの生存促進性メンバー（ＢＣＬ２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＭＣＬ１およびＡ１）に対抗するか、または細胞死の遠位エフェクターＢＡＸおよびＢＡＫに直接結合することにより細胞死を活性化する３、ＢＨ３のみのタンパク質のファミリーメンバーである。ＢＣＲ−ＡＢＬ１は、部分的に、ＢＩＭ転写を抑制することとともにＢＩＭタンパク質をＥＲＫ依存性リン酸化によるプロテアソーム分解に向ける４〜６ことにより、ＣＭＬ細胞の生存についての有利性を維持する。重要なことに、ＴＫＩは、ＣＭＬ細胞において、ＢＩＭ転写を上方制御することによりアポトーシスを誘発するが、ＢＩＭ発現を妨げることは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴＫＩ耐性を与えるために十分である４〜６。ＴＫＩ臨床耐性は、ＢＣＲ−ＡＢＬ１のキナーゼドメインにおける後天性体細胞変異（これは、ＢＣＲ−ＡＢＬ１と結合してそれを阻害するＴＫＩの能力を減少させる７）と最も一般的に関連する。しかし、このような変異は、応答に全く失敗するかまたは臨床基準により定義されるように２準最適ＴＫＩ応答を有する患者の大部分において見出すことができない。さらに、ＴＫＩに対する患者の様々な応答は、生殖系列バリアントまたは多型も、ＣＭＬにおける薬物耐性に貢献する可能性をもたらす２、８。
【０２６４】
実施例Ｈ４．ＴＫＩ感受性ＣＭＬにおけるＢＩＭ遺伝子のイントロン２における構造バリアント
ＣＭＬにおける新規なＴＫＩ耐性機構を同定するために、我々は、ペアエンドタグの大量並列ＤＮＡ配列決定９、１０（図１４）を用いて、ＴＫＩに対して感受性または耐性である患者から得られた５つのＣＭＬ試料のゲノムを調べた（表Ｈ１）。
【０２６５】
我々は、全てのＣＭＬ試料（しかし対照ではない）において、ＢＣＲ−ＡＢＬ１転座とともにいくつかの新規な構造変動（ＳＶ）を同定した（図１８および図１９ならびに表Ｈ２〜Ｈ７）。
【０２６６】
全ての耐性試料において共通のＳＶのうち、我々は特に１つに注目した。なぜなら、これは、ＢＩＭ遺伝子のイントロン２中に生じたからである（図１４Ａ）。このＳＶは、同一の２，９０３ｂｐ欠失を含み（図１４Ａ、図１４Ｂおよび図１４Ｃ）、これが生殖系列および多型であることを示唆した。実際に、２４６５の正常個体のスクリーニングにより、我々は、欠失多型が、東アジア人の個体に共通して生じる（１２．３〜１４．３％のキャリア頻度）が、アフリカ人およびヨーロッパ人集団には存在しない（０％）ことを見出した（図１４Ｄ）。
【０２６７】
実施例Ｈ５．ＢＩＭ遺伝子のスプライシング
ＢＩＭ遺伝子構造を調べることは、欠失多型が、互いに排他的な様式でエキソン３および４のスプライシングをもたらすことを示唆し、この可能性は、エキソン３のイントロン−エキソン境界の５’端の近傍（１０７ｂｐ）にあるとともに、エキソン３自体の中に停止コドンおよびポリアデニル化シグナルが存在する（図１５Ａおよび図２０）１１ことにより示唆された。ＢＩＭ発現に対する多型の影響を確認するために、我々は、ミニ遺伝子を構築して、欠失の存在下または非存在下でのエキソン４に対するエキソン３のスプライシングを測定し（図１５Ｂ）１２、欠失が、エキソン４よりもエキソン３へのスプライシングに少なくとも５倍好ましいことを見出した（図１５Ｃ）。重要なことに、多型含有試料は、エキソン４含有転写産物に対して高いレベルのエキソン３含有転写産物を発現したが、全般的なＢＩＭ転写は影響されなかった（図１５Ｄ）ので、患者からの初代ＣＭＬ細胞は同じ現象を示した。同様の結果が、正常ＨａｐＭａｐ個体から得られたリンパ芽球様株化細胞において観察され、このことは、細胞系統非依存性の影響を示した（図２３）。アポトーシス促進性ＢＨ３ドメインは、エキソン４においてのみ見出され（図１４Ａ）、ＢＩＭアポトーシス機能のために必要である１３、１４ので、我々の観察結果は、ＴＫＩ耐性についての新規な機構を示唆した。このモデルにおいて、ＴＫＩ曝露の際に、多型含有ＣＭＬ細胞は、エキソン４含有ＢＩＭ転写産物に対してエキソン３含有ＢＩＭ転写産物の発現に有利となり、ＢＨ３含有ＢＩＭアイソフォームの発現を減少させ、その結果、ＢＨ３ドメイン依存性アポトーシスを減退させた。これらの研究を容易にするために、我々は、欠失を含有する日本人ＣＭＬ株化細胞ＫＣＬ２２を同定し１５（図１５Ｅ）、これらが、欠失非含有細胞と比較して、エキソン３／エキソン４転写産物の比の増加を示すことを確認した（図１５Ｆ）。ＫＣＬ２２細胞は、また、ＴＫＩ曝露の後のエキソン４含有転写産物の誘発の減少（図１５Ｇ）と、主要ＢＨ３含有ＢＩＭアイソフォームであるＢＩＭＥＬタンパク質のより低いレベル（図１５Ｈ）とを示した１６。以前の報告１５、１７、１８と一貫して、ＫＣＬ２２細胞は、効果のあるＢＣＲ−ＡＢＬ阻害にもかかわらずイマチニブに対して耐性であり（図１５Ｈおよび表Ｈ１３）、イマチニブ曝露の際のアポトーシスシグナル伝達の減退を示した（図１５Ｉ）。
【０２６８】
ＫＣＬ２２細胞は、エキソン４／ＢＨ３含有（しかしエキソン３含有ではない）ＢＩＭアイソフォームの増加する発現に対しても非常に感受性であったが（図２１）、エキソン３含有転写産物のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンは、イマチニブに対してＫＣＬ２２細胞を感受性にせず（図２２）、このことは、イマチニブにより誘発されるアポトーシスの減退が、ＢＨ３模倣薬の添加により回復できることを示唆した１９。図１４Ｊに示すように、我々は、これが実際にそうであることを見出した。
【０２６９】
実施例Ｈ６．欠失多型を再現するための遺伝子ターゲティング
我々は、次に、ジンクフィンガーヌクレアーゼにより促進される遺伝子ターゲティングを採用して、イマチニブ感受性Ｋ５６２  ＣＭＬ細胞のＢＩＭ遺伝子における欠失多型を精密に再現した（図１５Ａ）。我々は、次いで、ＢＩＭスプライシングおよび発現の変化ならびにＴＫＩにより誘発されるアポトーシスについてこれらの細胞を分析した。我々は、欠失多型についてヘテロ接合性（Ｋ５６２−ＢＩＭイントロン＋／−）またはホモ接合性（Ｋ５６２−ＢＩＭイントロン−／−）のサブクローンを作製し（図１６Ｂ）、これらの細胞において、多型量依存性の様式で増加するエキソン３／エキソン４転写産物の比を確認した（図１６Ｃ）。欠失多型含有細胞は、また、イマチニブ曝露の後のエキソン４含有転写産物の誘発の減少（図１６Ｄ）、ＢＩＭＥＬタンパク質の上方制御の減退およびアポトーシスシグナル伝達と細胞死の両方の減衰（図１６Ｅ、図１６Ｆおよび図１６Ｇ）を示した。ＫＣＬ２２細胞においてと同様に、ＡＢＴ−７３７をイマチニブに加えることにより、多型含有細胞においてアポトーシスを活性化する後者の能力が増強された（図１６Ｈ）。これらをまとめると、我々の研究は、多型が、ＢＨ３含有ＢＩＭアイソフォームからスプライシングがなくなるように偏らせることによりイマチニブに対するアポトーシス応答を減退させ、ＣＭＬ細胞をイマチニブに対して元来耐性にするために十分であることを確立する。重要なことに、我々は、イマチニブに対するアポトーシス応答が、多型含有細胞において、ＢＨ３模倣薬により回復できることも示す。
【０２７０】
実施例Ｈ７．回顧的分析（Retrospective Analysis）
次に、我々は、東アジア人ＣＭＬ患者におけるＴＫＩ応答に対する多型の影響について回顧的分析を行った。２つの独立する東アジア人（シンガポール／マレーシアおよび日本）コホートからの新しく診断された慢性期ＣＭＬ患者の群（ｎ＝２０３）を用いて、我々は、標準的な用量のイマチニブ（４００ｍｇ／日）を用いるファーストライン治療に対する臨床応答を、欠失多型を有する個体と有さない個体との間で比較した。臨床応答は、欧州ＬｅｕｋｅｍｉａＮｅｔ（ＥＬＮ）基準（表Ｈ８）２に従って分類し、耐性患者は、ＥＬＮ基準により「準最適応答者」または「失敗」と定義し、感受性患者は、ＥＬＮにより定義される「最適応答者」に相当した。
【０２７１】
両方の地理的コホートにおいて、欠失多型を有する患者は、対照と比較して、感受性疾患に対して耐性疾患を有する見込みがより高かった（表１）。一緒に分析した場合に、欠失多型を有さない患者に対して、欠失多型を有する患者のうちで耐性疾患についての全体的なオッズ比は、２．９４であった（ｐ＝０．０２、１．１７〜７．４３の９５％ＣＩ）。比較により、我々は、診断からイマチニブの開始までの時間の中央値、診断時のＳｏｋａｌスコアまたはインターフェロンの以前の使用（表Ｈ９）を含む他の可能性のある予後または交絡因子に関して２つの群の間に有意な差を見出さなかった。
【０２７２】
事例的であるが、我々は、多型を有する耐性患者の大多数が、その後、第２世代ＴＫＩ治療に対して応答しないことにも注目し（表Ｈ１０）、この知見は、我々が株化細胞において観察した固有の耐性と一致した。
【０２７３】
ＴＫＩ耐性は、ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼドメインにおける体細胞性変異の獲得と最も一般的に関連する７。しかし、欠失多型は、固有のＴＫＩ耐性と関連するので（図１６）、我々は、このような患者が、キナーゼドメイン変異の非存在下で耐性であると予測した。したがって、我々は、患者を次の３つの臨床群に分けた：ＢＣＲ−ＡＢＬ変異なしの耐性（群Ｉ）、ＢＣＲ−ＡＢＬ変異ありの耐性（群ＩＩ）または感受性（群ＩＩＩ）。我々は、多型を有する患者が、有さない患者と比較して、群ＩＩおよび群ＩＩＩを組み合わせたものに対して群Ｉにある見込みがより高いことを見出した（オッズ比＝１．９０、２．０８〜４．３５の９５％ＣＩ）（表Ｈ１１）。これらのデータは、我々の仮説に対する第２の臨床的検証を提供する。
【０２７４】
実施例Ｈ８．考察（実施例Ｈ１〜Ｈ６）
まとめると、我々の知見は、がんはそれらの体細胞により獲得された「駆動」変異に従って分類されるべきであるが、生殖系列多型は、「標的」治療に対するこのようながんの応答を直接調節でき、臨床転帰に影響できるという原理を証明する。重要なことに、我々は、共通ＢＩＭ欠失多型がどのようにして、部分的に、均一に定義され処置されたＣＭＬ患者の群において見られる不均質な応答の原因になり得るかを示す。著しいことに、多型は、東アジア諸国の個体においてのみ見出され、これらについて、ヨーロッパおよび北米と比較して（２６％）、イマチニブに対する細胞遺伝学的不完全応答のより高い比率（約５０％）が報告されている８。これらの人種の相違に対する欠失多型の相対的貢献を評価するために、我々は、多型が、東アジア人の症例における約２３％の耐性（集団寄与分画）の根底にあると見積もった。このことは、これらの世界の２つの集団の間で観察される細胞遺伝学的完全応答比率における相違を部分的に説明し得る。
【０２７５】
ＢＩＭ機能に対する欠失多型の影響を明らかにすることにより、我々は、それにより多型がＣＭＬにおける薬物耐性に貢献する新規なスプライシング機構についても記載する。つまり、耐性がＢＨ３含有ＢＩＭアイソフォームの発現の減退によることを証明することにおいて、我々は、ＢＩＭ機能の薬理学的回復が、この特定の形のＴＫＩ耐性を克服できたことを確認できた。我々は、欠失多型の存在は臨床ＴＫＩ耐性と強く関連するが、後天的および遺伝的なその他の遺伝的因子が、ＣＭＬ患者におけるＴＫＩ治療に対する最終応答を指図する見込みがあることに注目する。それにもかかわらず、この多型についてのスクリーニングは、ＴＫＩに対する耐性を予測するために、東アジア人系統のＣＭＬ患者の管理において有用である可能性がある。
【０２７６】
ＢＩＭ発現は、広範囲のヒトのがんにおけるＴＫＩ感受性に必要であるので２０〜２３、我々は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）駆動型非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）におけるＢＩＭ欠失多型の影響についても調べた。随伴する文献において記載されるように、我々は、欠失多型が、ＮＳＣＬＣ株化細胞におけるＥＧＦＲ阻害剤に対する固有の耐性をもたらし、ＥＧＦＲ活性化変異を有することがわかっているＮＳＣＬＣ患者においてＥＧＦＲ阻害剤に対して著しくより短い無増悪生存期間を予測する２４ことを見出した。まとめると、我々のデータは、ＢＩＭ欠失多型が、ヒトのキナーゼ駆動型がんにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＫＩ耐性についての生殖系列バイオマーカーであることを明確に証明する。
【０２７７】
最後に、多型の人種による分離はそれ自体で興味深いが、これが、異なる世界の集団における固有の薬物耐性の原因であるまだ見つかっていない他の多型の原型であることが、我々の知見においてより重要であると考えられる。
【０２７８】
実施例Ｈ９．実施例Ｈ３〜Ｈ８についての参考文献
以下は、実施例Ｈ３〜実施例Ｈ８についての参考文献である。
【表２４Ａ】
2014502493.tif 000042
【表２４Ｂ】
2014502493.tif 000043
【表２４Ｃ】
2014502493.tif 000044
【０２７９】
実施例Ｎ１〜Ｎ４
実施例Ｎ１〜Ｎ４は、ＥＧＦＲ駆動型非小細胞肺がんにおけるＢＩＭ欠失多型と関連する無増悪生存期間の短縮を証明する。
【０２８０】
実施例Ｎ１．材料および方法
倫理委員会承認
臨床ＮＳＣＬＣ試料は、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ、東邦大学医療センター大森病院、日本、愛知県がんセンター、日本およびｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅで診察された患者から得た。書面でのインフォームドコンセントおよび参加施設における施設調査委員会の承認を、本研究に試料を提供した全ての患者から得た。
【０２８１】
細胞培養条件および試薬
ＮＳＣＬＣ細胞（ＰＣ９およびＨＣＣ２２７９）は、ペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミンおよび１０％ＦＢＳを補ったＲＰＭＩ−１６４０培地で成長させ、３７℃、５％ＣＯ２の湿潤インキュベータ中でインキュベートした。ゲフィチニブおよびＡＢＴ−７３７は、ＤＭＳＯに再懸濁して−２０℃にて保存した。
【０２８２】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）
製造者の使用説明に従ってＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、トータル細胞ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写し、ｉＱ５マルチカラーリアルタイム検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を、２５μｌの全反応容量で用いて定量的に評価した。プライマーを５９℃にて２０秒間アニーリングし、アンプリコンを７２℃にて３０秒間伸長した。定めたサイクルの総数は、４０であった。β−アクチンまたはＢＩＭのエキソン２Ａの転写産物レベルを用いて、試料間を標準化した。以下のプライマーを用いた：ＢＩＭエクソン２Ａ（順方向：ＡＴＧＧＣＡＡＡＧＣＡＡＣＣＴＴＣＴＧＡＴＧ；逆方向：ＧＧＣＴＣＴＧＴＣＴＧＴＡＧＧＧＡＧＧＴ）、ＢＩＭエクソン３（順方向：ＣＡＡＴＧＧＴＡＧＴＣＡＴＣＣＴＡＧＡＧＧ；逆方向：ＧＡＣＡＡＡＡＴＧＣＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＧＧ）、ＢＩＭエクソン４（順方向：ＴＴＣＣＡＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＣ；逆方向：ＣＣＴＣＣＴＴＧＣＡＴＡＧＴＡＡＧＣＧＴＴ）およびβ−アクチン（順方向：ＧＧＡＣＴＴＣＧＡＧＣＡＡＧＡＧＡＴＧＧ；逆方向：ＡＧＣＡＣＴＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣ−ＡＧ）。
【０２８３】
ウェスタンブロット
ウェスタンブロッティングを、ヒトＢＩＭ、カスパーゼ３、切断カスパーゼ３、ＰＡＲＰ、ホスホ−ＥＧＦＲ（Ｙ１０６８）（全てＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから）およびβ−アクチン（Ｓｉｇｍａ）に対する抗体を用いて行った。検出は、ウサギ（Ｓｉｇｍａ）またはマウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）に特異的なＨＲＰコンジュゲート２次抗体を用いて行った。メンブレンは、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ化学発光試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて視覚化した。
【０２８４】
トリパンブルー生存性アッセイ
ＰＣ９またはＨＣＣ２２７９細胞を、２４ウェルプレート中に、ウェルあたり５×１０５または１．６×１０細胞にて３重に播種し、ＤＭＳＯ（薬物なし）、０．５μＭゲフィチニブ、２．５μＭ  ＡＢＴ−７３７またはゲフィチニブとＡＢＴ−７３７との組合せで処置した。トリパンブルー染色を行って、処置の４８時間後の生存細胞の数を評価した。
【０２８５】
ＥＧＦＲ変異分析
肺腫瘍のＦＦＰＥスライドを、キシレンおよび無水エタノールでスライドを洗浄することによりパラフィン除去した。各スライドからの肺がん領域を掻きとり、１．５ｍｌチューブに移し、ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡａｍｐ  ＦＦＰＥ組織キットを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。ＥＧＦＲエキソン１８から２１を、配列決定した。５０ｎｇのＦＦＰＥ  ｇＤＮＡを、１０μｌのＧｏＴａｑホットスタートＴａｑ無色マスターミックス（Ｍ５１３３、Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有する２０ｕｌの反応容量でのＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間、３５サイクルの９５℃で５０秒間、５８℃で５０秒間、７２℃で６０秒間のＤＮＡ増幅、および７２℃で１０分間の最終伸長であった。用いたＰＣＲプライマーは、エキソン１８（フォワード：ＴＧＧＣＡＣＴＧＣＴＴＴＣＣＡＧＣＡＴＧＧ；リバース：ＣＴＣＣＣＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＴＧＡＧＡＧＧ）、エクソン１９（順方向：ＡＴＣＡＣＴＧＧＧＣＡＧＣＡＴＧＴＧＧＣＡ；逆方向：ＣＣＴＧＡＧＧＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＣ）、エクソン２０（順方向：ＣＡＴＧＣＧＡＡＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＧＴＧ；逆方向：ＧＣＡＴＧＴＧＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣ）、エクソン２１（順方向：ＧＡＴＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＣＡＧＣＡＧＧ；逆方向：ＧＧＴＧＴＣＡＧＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＧＣＴＧ）であった。ＰＣＲ生成物を、エキソヌクレアーゼＩ（Ｍ０２９３Ｌ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ）−エビアルカリホスファターゼ（Ｍ８２０１、Ｐｒｏｍｅｇａ）処置により精製した。精製ＰＣＲ生成物を、フォワードおよびリバース方向に、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅターミネーターサイクル配列決定レディ反応キット（バージョン３）をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７３０遺伝子分析機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ）において用いて配列決定した。クロマトグラムを、ＳｅｑＳｃａｐｅ  Ｖ２．５および手動での調査により分析した。
【０２８６】
ＢＩＭにおける多型欠失のスクリーニング
ＤＮＡを、患者の血液試料から抽出するか、またはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検スライド／ブロックから回収した。血液からのゲノムＤＮＡについて、我々は、以下の温度サイクル条件：９６℃で３０秒間、（９４℃で１５秒間、６０℃で６０秒間、６８℃で１０分間）×２９、６８℃で２０分間を用いて、プライマーＢｉｍ＿ｄｅｌ＿Ｆ  ＡＡＴＡＣＣＡＣＡＧＡＧＧＣＣＣＡＣＡＧおよびＢｉｍ＿ｄｅｌ＿Ｒ  ＧＣＣＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧならびにＪｕｍｐＳｔａｒｔ  ＲｅｄＡｃｃｕＴａｑ  ＬＡ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）を用いる単一ＰＣＲ反応により、試料中の欠失の遺伝子型を決定した。欠失（１，３２３ｂｐ）および野生型（４，２２６ｂｐ）対立遺伝子から得られたＰＣＲ生成物を、１％アガロースゲル上で分析した。
【０２８７】
ＦＦＰＥ組織から回収したＤＮＡについて、ＰＣＲ反応を独立して行って、野生型および欠失対立遺伝子の存在を決定した。プライマーＢＩＭ  ＦＦＰＥ  Ｆ５  ＣＣＡＣＣＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧＧＴＴＣＡおよびＢＩＭ  ＦＦＰＥ  Ｒ１  ＣＴＧＴＣＡＴＴＴＣＴＣＣＣＣＡＣＣＡＣを用いて、野生型対立遺伝子を遺伝子型決定した。プライマーＢＩＭ  ＦＦＰＥ  Ｆ５  ＣＣＡＣＣＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧＧＴＴＣＡおよびＢＩＭ  Ｄｅｌ  ＦＦＰＥ  Ｒ２  ＧＧＣＡＣＡＧＣＣＴＣＴＡＴＧＧＡＧＡＡを用いて、欠失対立遺伝子を遺伝子型決定した。ＰＣＲ反応は、ＧｏＴａｑホットスタートポリメラーゼ（ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、以下の温度サイクル条件：９５℃で５分間、（９５℃で５０秒間、５８℃で５０秒間、７２℃で１分間）×３９、７２℃で１０分間を用いて行った。欠失（２８４ｂｐ）および野生型（３６２ｂｐ）対立遺伝子からのＰＣＲ生成物を、２％アガロースゲル上で分析し、配列決定して切断点を確認した。
【０２８８】
ＥＧＦＲ  ＮＳＣＬＣ患者データ分析
１次エンドポイントは、東アジア諸国からのＥＧＦＲ  ＴＫＩで処置されたＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣ患者の無増悪生存期間（ＰＦＳ）に対するＢＩＭ欠失多型の影響を調べることであった。ＰＦＳは、ＥＧＦＲ  ＴＫＩ治療の開始から腫瘍増悪または任意の原因での死亡のいずれかまでで算出した。ＴＫＩ治療が副作用により停止されるならば、観察を検閲した。生存曲線を比較するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ検定のＰ値は、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定およびログランク検定を用いて算出した。ｔ検定およびＦｉｓｈｅｒの正確検定を用いて、ＢＩＭ欠失および野生型集団の臨床特徴間の差について検定した。
【０２８９】
Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析を用いて、単変量および多変量ハザード比を、以下の因子について得た：年齢、性別、組織学、喫煙歴、エキソンおよび特異的変異によるＥＧＦＲ変異の型、段階、ファーストまたはセカンドラインＴＫＩ治療、民族、ＴＫＩ（ゲフィチニブまたはエルロチニブ）およびＥＣＯＧ指標。段階的回帰において変量を入力するための有意水準は、０．０５であった。Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＳＡＳシステム、バージョン９．２  ＰＨＲＥＧ手順を用いて計算を行った。
【０２９０】
【表２５Ａ】
2014502493.tif 000045
【表２５Ｂ】
2014502493.tif 000046
表Ｎ１．ＢＩＭ多型の状態による患者の特徴
【０２９１】
実施例Ｎ２．序論
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）中に活性化変異を有する全てではないが多くの非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）患者は、ＥＧＦＲ阻害剤に応答する。しかし、ＥＧＦＲ阻害剤に対する初期の応答は、応答持続期間を予測しない。我々は、新規なＢＩＭ欠失多型が、株化細胞におけるＥＧＦＲ阻害剤に対するアポトーシス促進性ＢＩＭ応答を減退させ、患者における無増悪生存期間のかなりの短縮を予測することを報告する。
【０２９２】
ＥＧＦＲにおける活性化変異は、ＮＳＣＬＣ患者のうちで高い応答比率を予測する１、２。このようながんは、東アジア諸国において特に一般的であり、ここでは、非小細胞肺がんの５０％まででＥＧＦＲ変異を見出すことができ、これは、興味深いことに、女性、東アジア人、非喫煙者においてより一般的である３〜５。これとは対照的に、ＥＧＦＲ活性化変異は、西洋における肺がんの約１０％で見出すことができるだけである。しかし、患者の人種と関係なく、活性化変異を保有する腫瘍におけるＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を用いる治療は、より高い応答比率６〜８、および細胞毒性化学療法と比較して著しく延長された無増悪生存期間９と関連する。しかし、高い奏功率にもかかわらず、応答持続期間（週から年）および腫瘍縮小の程度（完全応答から安定疾患）に関してかなりの不均質性が存在する１０〜１２。
【０２９３】
これらの臨床的観察結果は、根底にある「駆動」変異、例えばＢＣＲ−ＡＢＬまたはＥＧＦＲキナーゼが効果的に阻害されていても、遺伝子的またはエピジェネティックな修飾因子がＴＫＩ治療に対する腫瘍応答を調節し得ることを示唆する。ゲノムワイドなペアエンド配列決定アプローチを用いて、我々は、最近、慢性骨髄性白血病株化細胞における固有のイマチニブ耐性と、イマチニブに対する劣った臨床応答とをもたらすＢＩＭ遺伝子中の欠失多型を見出した１３。著しいことに、多型は、東アジア人系統の個体に限定され（１２．３％キャリア率）１３、これは、上記のように、感受性を増すＥＧＦＲ変異を有するＮＳＣＬＣ患者について豊富になる、興味をそそる人口統計である。機構的に、欠失は、死滅促進性ＢＨ３ドメインをコードするエキソン４を含有するＢＩＭアイソフォームからスプライシングがなくなるように偏らせ、そのことによりＢＨ３含有ＢＩＭタンパク質アイソフォームを上方制御するＴＫＩの能力を減退させる。このことは、次に、ＴＫＩ曝露の後の鈍いアポトーシス応答と、ＴＫＩに対する固有の耐性とを導く１３。ＥＧＦＲ阻害剤は、アポトーシスを活性化するためにＢＨ３含有ＢＩＭアイソフォームの誘発も必要とし１４、１５、１７、１８、ＢＩＭ誘発を妨げることにより、ＴＫＩに対してＥＧＦＲ変異肺がん細胞を耐性にしたので１６、１７、我々は、ＢＩＭ欠失多型も、ＥＧＦＲ変異を有するＮＳＣＬＣにおいてＴＫＩ応答を減退させるかという疑問を持った。
【０２９４】
実施例Ｎ３．ＨＣＣ２７７９は、ＴＫＩ感受性を増すＥＧＦＲ変異を有するが、ＴＫＩ耐性である
この疑問に答えることを補助するために、我々は、ＴＫＩ感受性を増すＥＧＦＲ変異を保有するが、不可解なことにＴＫＩ耐性である（既知の２次耐性を与える変異のいずれも欠くと定義される）ＮＳＣＬＣ株化細胞を検索した。我々は、あるそのような系統であるＨＣＣ２２７９を同定でき、これは、特に、有効なＥＧＦＲ阻害にもかかわらずアポトーシスを活性化できない１６、１７、１９、２０。我々は、ＨＣＣ２７７９細胞におけるＢＩＭ欠失多型の存在を確認し（図２５Ａ）、ＢＩＭ機能に対する欠失多型の影響を決定した。予想されたように、欠失は、多型を有さない細胞と比較して、エキソン４／ＢＨ３含有ＢＩＭアイソフォームに対するエキソン３含有ＢＩＭアイソフォームの発現が増加した（図２５Ｂ）。さらに、ＴＫＩ曝露は、対照細胞と比較して、転写産物およびタンパク質のレベルにてエキソン４／ＢＨ３含有ＢＩＭアイソフォームの発現の減少と、アポトーシスシグナル伝達の活性化の減退を伴った（図２５Ｃおよび図２５Ｄ）。ＴＫＩ耐性は、ＢＨ３含有ＢＩＭタンパク質のレベルの減少によるとの見解と一貫して、ＢＨ３模倣薬であるＡＢＴ−７３７の添加は、ＴＫＩにより誘発されるアポトーシスシグナル伝達および細胞死を増強した（図２５Ｅおよび図２５Ｆ）。これとは別に、我々は、イマチニブ感受性ＣＭＬ細胞に欠失多型を新規導入することが、このような細胞を元来イマチニブ耐性にするために十分であることも示し１６、このことは、多型がＨＣＣ２２７９細胞におけるＴＫＩ耐性の大部分を担うことを示唆する。
【０２９５】
実施例Ｎ４．ＢＩＭにおける欠失は、ＥＧＦＲ  ＴＫＩに対する応答の持続期間と相関する
次に、我々は、欠失が、ＥＧＦＲ活性化変異を有するＮＳＣＬＣ患者におけるＥＧＦＲ  ＴＫＩに対する応答の持続期間と相関するかという疑問を持った。欠失多型を有するかまたは有さない患者は、既知の予後因子に関して異ならなかった（表Ｎ１）。それにもかかわらず、多型の存在は、著しくより短い無増悪生存期間を予測でき、多型を有さない個体についての１１．９カ月と比較して６．６カ月の中央値であった（ｎ＝１４１、ｐ＝０．００２７）（図２６）。Ｃｏｘ回帰モデルを用いる多変量分析では、ＴＫＩ耐性エキソン２０変異の存在（ハザード比＝６．００、９５％信頼区間２．０５〜１７．５７、ｐ＝０．００１１）１８、１９に加えて欠失多型（ハザード比＝２．１４、９５％信頼区間１．３０〜３．５０、ｐ＝０．００２６）だけが、より不良な無増悪生存期間についての独立した予後因子であることがわかった。
【０２９６】
まとめとして、我々は、ＢＩＭ欠失多型が、正常およびがん細胞におけるＢＨ３含有ＢＩＭアイソフォームのスプライシングおよび発現の減退をもたらすことを見出す（図２５および参考文献１６）。チロシンキナーゼ駆動型がんの状況では、多型により与えられる異常スプライシングは、根底にある「駆動」変異にかかわらずＴＫＩに対する固有の細胞耐性をもたらすために十分である（図２５および参考文献１６）。重要なことに、ＣＭＬまたはＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣのいずれかの患者では、多型の存在は、著しく劣ったＴＫＩ応答とも関連する（図２６および参考文献１６）。
【０２９７】
標的がん治療の関係において、我々の結果は、均質に定義され、処置された患者のうちでの腫瘍応答の不均質性についての説明を提供する。我々のデータは、単一生殖系列多型がどのようにして、重要な遺伝子内にそれが生じた場合に、共通の生物学による異なるがんにおける臨床転帰に強く影響できるかにも光を当てる。このことは、これらの疾患におけるＴＫＩ感受性の媒介におけるＢＩＭの中心的役割を反映するようである１４、１５、２０。我々は、ＢＩＭ多型がＴＫＩ応答に影響するがんのリストが、感受性についてＢＩＭ発現に依存する２１〜２３他のものも含むように拡大されると期待する。我々のデータは、治療応答に対する多型の影響に焦点を当てているが、ヒト多型が、がんの生物学の他の態様のうちでの不均質性の原因でもあることが可能である。ＢＩＭ欠失と異なって、これらは、おそらく、治療応答の増強をもたらし得るか、または「駆動」変異と協調してがんの増悪を加速または遅延させることさえできる。我々が証明したように、このような多型がどのようにして遺伝子機能に影響するかを機構的に理解することにより、予後判定および治療に関するがん患者の管理の改善を導き得る。ＢＩＭ多型を有する患者におけるＴＫＩ耐性の場合、ＢＨ３模倣剤を標準的なＴＫＩ治療に加えることにより、耐性を克服するための個別化された処置が可能になることがある。
【０２９８】
実施例Ｎ５．実施例Ｎ２〜Ｎ４についての参考文献
以下は、実施例Ｎ２〜実施例Ｎ４についての参考文献である。
【表２６Ａ】
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【表２６Ｂ】
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【０２９９】
本文書で言及する各出願および特許、ならびに上記の各出願および特許において引用または参照される各文書（各出願および特許の審査中（「出願引用文書」）を含む）、ならびに各出願および特許ならびにいずれの出願引用文書においても引用または言及されたいずれの製品についてのいずれの製造者の使用説明またはカタログも、本明細書に参照により組み込まれる。さらに、本文において引用した全ての文書、および本文において引用した文書において引用または参照される全ての文書、および本文において引用または言及したいずれの製品についてのいずれの製造者の使用説明またはカタログも、本明細書に参照により組み込まれる。
【０３００】
本発明の記載される方法およびシステムの様々な改変および変形が、本発明の範囲および精神を逸脱することなく当業者にとって明らかである。本発明を、具体的な好ましい実施形態との関連において記載したが、請求される本発明は、このような具体的な実施形態に不当に限定されないことが理解される。実際に、分子生物学または関連する分野の当業者にとって明らかな本発明を行うための記載される形態の様々な改変が、特許請求の範囲内であることを意図する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ−１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
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【図１５Ｈ】
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【図１５Ｉ】
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【図１５Ｊ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１６Ｈ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２５Ｆ】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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