(57)【要約】本発明は、2-メチレン-ビタミンD類似体、具体的には、(20S)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3ならびに(5E)-(20S)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3および(20R)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3、ならびに、それらの薬学的使用を開示する。これらの化合物は、比較的高い結合活性、および、未分化細胞の増殖を停止させかつ単球へのそれらの分化を誘導する際の顕著な活性を示すことから、特に、骨肉腫、白血病、大腸がん、乳がん、皮膚がん、または前立腺がんの処置または予防のための抗がん剤としての使用を明示している。これらの化合物はまた、比較的高い血漿カルシウム上昇活性を有することから、骨疾患の処置における使用も明示している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式を有する化合物:
2014532622.tif 000030
式中、X1およびX2は、水素およびヒドロキシ保護基からなる群より選択され、Y1およびY2は、それぞれ水素であるかもしくは一緒になってメチレン基を表し、Y3およびY4は、それぞれ水素であるかもしくは一緒になってメチレン基を表すが、但し、Y1およびY2が共に水素である場合、Y3およびY4はメチレン基でなければならないか、または、Y1およびY2が一緒になってメチレン基となる場合、Y3およびY4は共に水素でなければならないか、または、Y3およびY4が共に水素である場合、Y1およびY2はメチレン基でなければならないか、または、Y3およびY4が一緒になってメチレン基となる場合、Y1およびY2は共に水素でなければならず、かつ、Rはアルキル基、水素、ヒドロキシアルキル基、もしくはフルオロアルキル基であってもよいか、またはRは下記式の側鎖を表してもよく、
2014532622.tif 000031
式中、炭素20における立体化学的中心はR配置もしくはS配置を有してもよく、かつ、上記側鎖構造中のZはY、-OY、-CH2OY、-C≡CY、および-CH=CHYより選択され、該側鎖中の二重結合はシス幾何学的配置もしくはトランス幾何学的配置を有してもよく、かつ、Yは水素、メチル、-COR5、および下記構造の基より選択され、
2014532622.tif 000032
式中、mおよびnは独立して0〜5の整数を表し、R1は水素、重水素、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、フルオロ、トリフルオロメチル、およびC1〜5-アルキルより選択され、該C1〜5-アルキルは、直鎖もしくは分岐状であってもよくかつヒドロキシ置換基もしくは保護ヒドロキシ置換基を有してもよく、かつ、R2、R3、およびR4はそれぞれ独立して重水素、重水素化アルキル(deuteroalkyl)、水素、フルオロ、トリフルオロメチル、およびC1〜5アルキルより選択され、該C1〜5アルキルは、直鎖もしくは分岐状であってもよくかつヒドロキシ置換基もしくは保護ヒドロキシ置換基を有してもよく、かつ、R1およびR2は一緒になって、オキソ基、もしくはkが整数である一般式CkH2k-を有するアルキリデン基、=CR2R3基、もしくはpが2〜5の整数である-(CH2)p-基を表し、かつ、R3およびR4は一緒になって、オキソ基、もしくはqが2〜5の整数である-(CH2)q-基を表し、かつ、R5は水素、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、もしくはC1〜5アルキルを表し、かつ、該側鎖中の20位、22位、もしくは23位におけるCH基のいずれかは窒素原子で置き換えられてもよいか、または、20位、22位、および23位における-CH(CH3)-基、-(CH2)m-基、-CR1R2-基、もしくは-(CH2)n-基のいずれかはそれぞれ酸素原子もしくは硫黄原子で置き換えられてもよい。
【請求項２】
X1およびX2が共に水素である、請求項1記載の化合物。
【請求項３】
Rが、
2014532622.tif 000033
より選択される、請求項1記載の化合物。
【請求項４】
X1およびX2が共に水素である、請求項3記載の化合物。
【請求項５】
有効量の請求項1記載の化合物の少なくとも1つを薬学的に許容される賦形剤と共に含有する、薬学的組成物。
【請求項６】
前記有効量が、組成物1グラム当たり約0.01μg〜約1000μgを構成する、請求項5記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記有効量が、組成物1グラム当たり約0.1μg〜約500μgを構成する、請求項5記載の薬学的組成物。
【請求項８】
下記式を有し、かつ、(20S)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3と命名されている、化合物:
2014532622.tif 000034
。
【請求項９】
有効量の(20S)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3を薬学的に許容される賦形剤と共に含有する、薬学的組成物。
【請求項１０】
前記有効量が、組成物1グラム当たり約0.01μg〜約1000μgを構成する、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記有効量が、組成物1グラム当たり約0.1μg〜約500μgを構成する、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
下記式を有し、かつ、(5E)-(20S)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3と命名されている、化合物: 
2014532622.tif 000035
。
【請求項１３】
有効量の(5E)-(20S)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3を薬学的に許容される賦形剤と共に含有する、薬学的組成物。
【請求項１４】
前記有効量が、組成物1グラム当たり約0.01μg〜約1000μgを構成する、請求項13記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記有効量が、組成物1グラム当たり約0.1μg〜約500μgを構成する、請求項13記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
下記式を有し、かつ、(20R)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3と命名されている、化合物:
2014532622.tif 000036
。
【請求項１７】
有効量の(20R)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3を薬学的に許容される賦形剤と共に含有する、薬学的組成物。
【請求項１８】
前記有効量が、組成物1グラム当たり約0.01μg〜約1000μgを構成する、請求項17記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記有効量が、組成物1グラム当たり約0.01μg〜約500μgを構成する、請求項17記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
骨肉腫、白血病、大腸がん、乳がん、皮膚がん、または前立腺がんからなる群より選択される疾患を処置する方法であって、該疾患を有する対象に、下記式を有する2-メチレン-ビタミンD類似体の有効量を投与する段階を含む、方法:
2014532622.tif 000037
式中、X1およびX2は、水素およびヒドロキシ保護基からなる群より選択され、Y1およびY2は、それぞれ水素であるかもしくは一緒になってメチレン基を表し、Y3およびY4は、それぞれ水素であるかもしくは一緒になってメチレン基を表すが、但し、Y1およびY2が共に水素である場合、Y3およびY4はメチレン基でなければならないか、または、Y1およびY2が一緒になってメチレン基となる場合、Y3およびY4は共に水素でなければならないか、または、Y3およびY4が共に水素である場合、Y1およびY2はメチレン基でなければならないか、または、Y3およびY4が一緒になってメチレン基となる場合、Y1およびY2は共に水素でなければならず、かつ、Rはアルキル基、水素、ヒドロキシアルキル基、もしくはフルオロアルキル基であってもよいか、またはRは下記式の側鎖を表してもよく、
2014532622.tif 000038
式中、炭素20における立体化学的中心はR配置もしくはS配置を有してもよく、かつ、上記側鎖構造中のZはY、-OY、-CH2OY、-C≡CY、および-CH=CHYより選択され、該側鎖中の二重結合はシス幾何学的配置もしくはトランス幾何学的配置を有してもよく、かつ、Yは水素、メチル、-COR5、および下記構造の基より選択され、
2014532622.tif 000039
式中、mおよびnは独立して0〜5の整数を表し、R1は水素、重水素、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、フルオロ、トリフルオロメチル、およびC1〜5-アルキルより選択され、該C1〜5-アルキルは、直鎖もしくは分岐状であってもよくかつヒドロキシ置換基もしくは保護ヒドロキシ置換基を有してもよく、かつ、R2、R3、およびR4はそれぞれ独立して重水素、重水素化アルキル、水素、フルオロ、トリフルオロメチル、およびC1〜5アルキルより選択され、該C1〜5アルキルは、直鎖もしくは分岐状であってもよくかつヒドロキシ置換基もしくは保護ヒドロキシ置換基を有してもよく、かつ、R1およびR2は一緒になって、オキソ基、もしくはkが整数である一般式CkH2k-を有するアルキリデン基、=CR2R3基、もしくはpが2〜5の整数である-(CH2)p-基を表し、かつ、R3およびR4は一緒になって、オキソ基、もしくはqが2〜5の整数である-(CH2)q-基を表し、かつ、R5は水素、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、もしくはC1〜5アルキルを表し、かつ、該側鎖中の20位、22位、もしくは23位におけるCH基のいずれかは窒素原子で置き換えられてもよいか、または、20位、22位、および23位における-CH(CH3)-基、-(CH2)m-基、-CR1R2-基、もしくは-(CH2)n-基のいずれかはそれぞれ酸素原子もしくは硫黄原子で置き換えられてもよい。
【請求項２１】
前記ビタミンD類似体を経口投与する、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
前記ビタミンD類似体を非経口投与する、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
前記ビタミンD類似体を経皮投与する、請求項20記載の方法。
【請求項２４】
前記ビタミンD類似体を直腸投与する、請求項20記載の方法。
【請求項２５】
前記ビタミンD類似体を経鼻投与する、請求項20記載の方法。
【請求項２６】
前記ビタミンD類似体を舌下投与する、請求項20記載の方法。
【請求項２７】
約0.01μg/日〜約1000μg/日の投与量で前記ビタミンD類似体を投与する、請求項20記載の方法。
【請求項２８】
前記ビタミンD類似体が、下記式を有し、かつ、(20S)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3と命名されている、請求項20記載の方法: 
2014532622.tif 000040
。
【請求項２９】
前記ビタミンD類似体が、下記式を有し、かつ、(5E)-(20S)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3と命名されている、請求項20記載の方法: 
2014532622.tif 000041
。
【請求項３０】
前記ビタミンD類似体が、下記式を有し、かつ、(20R)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3と命名されている、請求項20記載の方法:
2014532622.tif 000042
。
【請求項３１】
骨量を維持するかまたは増加させることが望まれる代謝性骨疾患を処置する方法であって、該疾患を有する患者に、下記式を有する化合物の有効量を投与する段階を含む、方法:
2014532622.tif 000043
式中、X1およびX2は、水素およびヒドロキシ保護基からなる群より選択され、Y1およびY2は、それぞれ水素であるかもしくは一緒になってメチレン基を表し、Y3およびY4は、それぞれ水素であるかもしくは一緒になってメチレン基を表すが、但し、Y1およびY2が共に水素である場合、Y3およびY4はメチレン基でなければならないか、または、Y1およびY2が一緒になってメチレン基となる場合、Y3およびY4は共に水素でなければならないか、または、Y3およびY4が共に水素である場合、Y1およびY2はメチレン基でなければならないか、または、Y3およびY4が一緒になってメチレン基となる場合、Y1およびY2は共に水素でなければならず、かつ、Rはアルキル基、水素、ヒドロキシアルキル基、もしくはフルオロアルキル基であってもよいか、またはRは下記式の側鎖を表してもよく、
2014532622.tif 000044
式中、炭素20における立体化学的中心はR配置もしくはS配置を有してもよく、かつ、上記側鎖構造中のZはY、-OY、-CH2OY、-C=CY、および-CH=CHYより選択され、該側鎖中の二重結合はシス幾何学的配置もしくはトランス幾何学的配置を有してもよく、かつ、Yは水素、メチル、-COR5、および下記構造の基より選択され、
2014532622.tif 000045
式中、mおよびnは独立して0〜5の整数を表し、R1は水素、重水素、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、フルオロ、トリフルオロメチル、およびC1〜5-アルキルより選択され、該C1〜5-アルキルは、直鎖もしくは分岐状であってもよくかつヒドロキシ置換基もしくは保護ヒドロキシ置換基を有してもよく、かつ、R2、R3、およびR4はそれぞれ独立して重水素、重水素化アルキル、水素、フルオロ、トリフルオロメチル、およびC1〜5アルキルより選択され、該C1〜5アルキルは、直鎖もしくは分岐状であってもよくかつヒドロキシ置換基もしくは保護ヒドロキシ置換基を有してもよく、かつ、R1およびR2は一緒になって、オキソ基、もしくはkが整数である一般式CkH2k-を有するアルキリデン基、=CR2R3基、もしくはpが2〜5の整数である-(CH2)p-基を表し、かつ、R3およびR4は一緒になって、オキソ基、もしくはqが2〜5の整数である-(CH2)q-基を表し、かつ、R5は水素、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、もしくはC1〜5アルキルを表し、かつ、該側鎖中の20位、22位、もしくは23位におけるCH基のいずれかは窒素原子で置き換えられてもよいか、または、20位、22位、および23位における-CH(CH3)-基、-(CH2)m-基、-CR1R2-基、もしくは-(CH2)n-基のいずれかはそれぞれ酸素原子もしくは硫黄原子で置き換えられてもよい。
【請求項３２】
前記化合物を経口投与する、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
前記化合物を非経口投与する、請求項31記載の方法。
【請求項３４】
前記化合物を経皮投与する、請求項31記載の方法。
【請求項３５】
前記化合物を直腸投与する、請求項31記載の方法。
【請求項３６】
前記化合物を経鼻投与する、請求項31記載の方法。
【請求項３７】
前記化合物を舌下投与する、請求項31記載の方法。
【請求項３８】
約0.01μg/日〜約1000μg/日の投与量で前記化合物を投与する、請求項31記載の方法。
【請求項３９】
前記疾患が老人性骨粗鬆症である、請求項31記載の方法。
【請求項４０】
前記疾患が閉経後骨粗鬆症である、請求項31記載の方法。
【請求項４１】
前記疾患がステロイド誘発性骨粗鬆症である、請求項31記載の方法。
【請求項４２】
前記疾患が低回転型骨粗鬆症である、請求項31記載の方法。
【請求項４３】
前記疾患が骨軟化症である、請求項31記載の方法。
【請求項４４】
前記疾患が腎性骨異栄養症である、請求項31記載の方法。
【請求項４５】
前記化合物が、下記式を有し、かつ、(20S)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3と命名されている、請求項31記載の方法: 
2014532622.tif 000046
。
【請求項４６】
前記化合物が、下記式を有し、かつ、(5E)-(20S)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3と命名されている、請求項31記載の方法: 
2014532622.tif 000047
。
【請求項４７】
前記化合物が、下記式を有し、かつ、(20R)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3と命名されている、請求項31記載の方法:
2014532622.tif 000048
。
【請求項４８】
X3およびX4が、水素およびヒドロキシ保護基からなる群より選択される、下記式を有する化合物:
2014532622.tif 000049
。
【請求項４９】
X3およびX4が共にt-ブチルジメチルシリルである、請求項48記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビタミンD化合物、より詳細には2-メチレン-ビタミンD類似体およびそれらの薬学的使用、特に(20S)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3、その生物活性、およびその薬学的使用、ならびに(5E)-(20S)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3、その生物活性およびその薬学的使用、ならびに、(20R)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3、その生物活性、およびその薬学的使用に関する。この後者の化合物は、20-メチル置換基が天然の配向または「R」配向にあることから、1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3と単に呼ばれることもある。
【背景技術】
【０００２】
天然ホルモンである1α,25-ジヒドロキシビタミンD3、およびエルゴステロール系列のその類似体、すなわち1α,25-ジヒドロキシビタミンD2は、動物およびヒトにおける非常に強力なカルシウム恒常性制御因子であることが知られており、細胞分化におけるそれらの作用も立証されている:Ostrem et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2610 (1987)(非特許文献1)。1α-ヒドロキシビタミンD3、1α-ヒドロキシビタミンD2、様々な側鎖同族体化ビタミンおよびフッ素化類似体を含むこれらの代謝産物の多くの構造類似体が調製および試験された。これらの化合物の一部は、細胞分化における作用とカルシウム制御における作用の興味深い隔たりを示す。作用におけるこの差異は、腎性骨異栄養症、ビタミンD抵抗性くる病、骨粗鬆症、乾癬、および特定の悪性腫瘍などの種々の疾患の処置に有用でありうる。
【０００３】
ビタミンD類似体の別のクラス、すなわちいわゆる19-ノル-ビタミンD化合物は、2個の水素原子による、ビタミンD系に典型的なA環外メチレン基(炭素19)の置き換えを特徴とする。そのような19-ノル-類似体(例えば1α,25-ジヒドロキシ-19-ノル-ビタミンD3)の生物学的試験は、細胞分化を誘導する際の高い有効性、および非常に低いカルシウム動員活性を伴う、選択的活性プロファイルを明らかにした。したがって、これらの化合物は悪性腫瘍の処置または様々な皮膚障害の処置のための治療剤として潜在的に有用である。そのような19-ノル-ビタミンD類似体の2つの異なる合成方法が記載されている(Perlman et al., Tetrahedron Lett. 31, 1823 (1990) (非特許文献2); Perlman et al., Tetrahedron Lett. 32, 7663 (1991) (非特許文献3)およびDeLuca et al., 米国特許第5,086,191号(特許文献1))。
【０００４】
米国特許第4,666,634号(特許文献2)では、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3の2β-ヒドロキシ類似体およびアルコキシ(例えばED-71)類似体が潜在的な骨粗鬆症薬および抗腫瘍薬としてChugaiグループによって記載および検討されている。Okano et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 163, 1444 (1989) (非特許文献4)も参照。1α,25-ジヒドロキシビタミンD3の他の2-置換(ヒドロキシアルキル基による、例えばED-120、およびフルオロアルキル基による)A環類似体も調製および試験されている(Miyamoto et al., Chem. Pharm. Bull. 41, 1111 (1993) (非特許文献5); Nishii et al., Osteoporosis Int. Suppl. 1, 190 (1993) (非特許文献6); Posner et al., J. Org. Chem. 59, 7855 (1994) (非特許文献7)およびJ. Org. Chem. 60, 4617 (1995) (非特許文献8))。
【０００５】
興味深く選択的な活性プロファイルを示す1α,25-ジヒドロキシ-19-ノル-ビタミンD3の2-置換類似体、すなわち2位においてヒドロキシ基またはアルコキシ基で置換された化合物(DeLuca et al., 米国特許第5,536,713号(特許文献3))、2位において2-アルキル基で置換された化合物(DeLuca et al 米国特許第5,945,410号(特許文献4))および2位において2-アルキリデン基で置換された化合物(DeLuca et al 米国特許第5,843,928号(特許文献5))も合成された。すべてのこれらの研究は、ビタミンD受容体中の結合部位が合成ビタミンD類似体中のC-2における異なる置換基を収容することができることを示す。
【０００６】
薬理学的に重要なビタミンD化合物の19-ノルクラスを調査する継続的な試みにおいて、炭素2(C-2)におけるメチレン置換基の存在、炭素1(C-1)におけるヒドロキシル基の存在、および炭素20(C-20)に結合した短縮側鎖の存在を特徴とする類似体も合成および試験された。1α-ヒドロキシ-2-メチレン-19-ノル-プレグナカルシフェロールが米国特許第6,566,352号(特許文献6)に記載され、一方、1α-ヒドロキシ-2-メチレン-19-ノル-ホモプレグナカルシフェロールが米国特許第6,579,861号(特許文献7)に記載され、1α-ヒドロキシ-2-メチレン-19-ノル-ビスホモプレグナカルシフェロールが米国特許第6,627,622号(特許文献8)に記載されている。これら3つの化合物はすべて、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3に比べて比較的高いビタミンD受容体に対する結合活性および比較的高い細胞分化活性を有するが、血漿カルシウム上昇活性はあったとしてもほとんど有さない。'352、'861、および'622特許に記載のとおり、これらの化合物は、それらの生物活性により、種々の薬学的使用のための優れた候補となる。
【０００７】
炭素10(C-10)から炭素2(C-2)へのA環外メチレン基の転位を特徴とする天然ホルモン1α,25-ジヒドロキシビタミンD3の類似体(例えば1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-19-ノル-ビタミンD類似体)が合成および試験された[Sicinski et al., J. Med. Chem., 41, 4662 (1998) (非特許文献9); Sicinski et al., Steroids 67, 247 (2002) (非特許文献10); ならびにDeLuca et al., 米国特許第5,843,928号(特許文献5); 同第5,936,133号(特許文献9)および同第6,382,071号(特許文献10))を参照]。これらの類似体について行った分子力学研究は、A環立体配座の変化がシクロヘキサンジオール環の平坦化を引き起こしうると予測している。また、分子力学計算およびNMR研究は、A環立体配座平衡が約6:4であり、エクアトリアル1α-OHを有する配座異性体に有利であると予測している。さらに、19-ノル-ビタミンD炭素骨格への2-メチレン基の導入がその1α-A環ヒドロキシルおよび3β-A環ヒドロキシルの特性を変化させると予測された。それらは両方とも、天然ホルモン[すなわち1α,25-(OH)2D3]の分子中の1α-ヒドロキシル基と同様のアリル位置に存在する。1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-19-ノル-ビタミンD類似体は著しい生物学的有効性を特徴とすることがわかった。さらに、そのような類似体の生物学的有効性は、「非天然の」(20S)-配置が存在する場合に劇的に強化されうる。これらの発見を考慮して、本発明は、炭素2(C-2)におけるさらなるA環外メチレン基の存在を特徴とするビタミンD化合物(例えば2-メチレン-ビタミンD類似体)に指向するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第5,086,191号
【特許文献２】米国特許第4,666,634号
【特許文献３】米国特許第5,536,713号
【特許文献４】米国特許第5,945,410号
【特許文献５】米国特許第5,843,928号
【特許文献６】米国特許第6,566,352号
【特許文献７】米国特許第6,579,861号
【特許文献８】米国特許第6,627,622号
【特許文献９】米国特許第5,936,133号
【特許文献１０】米国特許第6,382,071号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ostrem et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2610 (1987)
【非特許文献２】Perlman et al., Tetrahedron Lett. 31, 1823 (1990)
【非特許文献３】Perlman et al., Tetrahedron Lett. 32, 7663 (1991)
【非特許文献４】Okano et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 163, 1444 (1989)
【非特許文献５】Miyamoto et al., Chem. Pharm. Bull. 41, 1111 (1993)
【非特許文献６】Nishii et al., Osteoporosis Int. Suppl. 1, 190 (1993)
【非特許文献７】Posner et al., J. Org. Chem. 59, 7855 (1994)
【非特許文献８】Posner et al., J. Org. Chem. 60, 4617 (1995)
【非特許文献９】Sicinski et al., J. Med. Chem., 41, 4662 (1998)
【非特許文献１０】Sicinski et al., Steroids 67, 247 (2002)
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、A環上のC-2位およびC-10位またはA環上のC-2位およびC-4位においてメチレン基を有する2-メチレン-ビタミンD類似体、ならびにそれらの薬学的使用、より具体的には(20S)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3、その生物活性、およびこの化合物の様々な薬学的使用、ならびに(5E)-(20S)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3、その生物活性およびその薬学的使用、ならびに(20R)-1α,25-ヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3、その生物活性およびその薬学的使用に関する。
【００１１】
構造的には、これらの2-メチレン-ビタミンD類似体は、以下に示す一般式Iを特徴とする。
2014532622.tif 000002
式中、X1およびX2は、水素およびヒドロキシ保護基からなる群より選択され、Y1およびY2は、それぞれ水素であるかもしくは一緒になってメチレン基を表し、Y3およびY4は、それぞれ水素であるかもしくは一緒になってメチレン基を表すが、但し、Y1およびY2が共に水素である場合、Y3およびY4はメチレン基でなければならないか、または、Y1およびY2が一緒になってメチレン基となる場合、Y3およびY4は共に水素でなければならないか、または、Y3およびY4が共に水素である場合、Y1およびY2はメチレン基でなければならないか、または、Y3およびY4が一緒になってメチレン基となる場合、Y1およびY2は共に水素でなければならず、かつ、R基は、ビタミンD型化合物について公知の典型的な側鎖のいずれかを表す。したがって、Rはアルキル基、水素、ヒドロキシアルキル基、もしくはフルオロアルキル基であってもよいか、またはRは、下記式の側鎖を表してもよく、
2014532622.tif 000003
式中、炭素20における立体化学的中心はR配置もしくはS配置を有してもよく、かつ、上記側鎖構造中のZは、Y、-OY、-CH2OY、-C≡CY、および-CH=CHYより選択され、該側鎖中の二重結合はシス幾何学的配置もしくはトランス幾何学的配置を有してもよく、かつ、Yは水素、メチル、-COR5、および下記構造の基より選択され、
2014532622.tif 000004
式中、mおよびnは独立して0〜5の整数を表し、R1は、水素、重水素、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、フルオロ、トリフルオロメチル、およびC1〜5アルキルより選択され、該C1〜5アルキルは、直鎖もしくは分岐状であってもよくかつヒドロキシ置換基もしくは保護ヒドロキシ置換基を有してもよく、かつ、R2、R3、およびR4のそれぞれは独立して重水素、重水素化アルキル(deuteroalkyl)、水素、フルオロ、トリフルオロメチル、およびC1〜5アルキルより選択され、該C1〜5アルキルは、直鎖もしくは分岐状であってもよくかつヒドロキシ置換基もしくは保護ヒドロキシ置換基を有してもよく、かつ、R1およびR2は一緒になって、オキソ基、もしくはkが整数である一般式CkH2k-を有するアルキリデン基、=CR2R3基、もしくはpが2〜5の整数である-(CH2)p-基を表し、かつ、R3およびR4は一緒になって、オキソ基、もしくはqが2〜5の整数である-(CH2)q-基を表し、かつ、R5は、水素、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、もしくはC1〜5アルキルを表し、かつ該側鎖中の20位、22位、もしくは23位におけるCH基のいずれかは窒素原子で置き換えられてもよいか、または20位、22位、および23位における-CH(CH3)-基、-(CH2)m-基、-CR1R2-基、もしくは-(CH2)n-基のいずれかはそれぞれ酸素原子もしくは硫黄原子で置き換えられてもよい。
【００１２】
側鎖の特定の重要な例は、天然の20R-配置を有する下記式(a)、(b)、(c)、(d)、および(e)で表される構造、すなわち25-ヒドロキシビタミンD3において見出される側鎖(a); ビタミンD3において見出される側鎖(b); 25-ヒドロキシビタミンD2において見出される側鎖(c); ビタミンD2において見出される側鎖(d); および25-ヒドロキシビタミンD2のC-24エピマーにおいて見出される側鎖(e)である。
【００１３】
側鎖のさらなる重要な例は、20-エピ配置または20S-配置を有する下記式(a)、(b)、(c)、(d)、および(e)で表される構造、すなわち(20S)-25-ヒドロキシビタミンD3において見出される側鎖(a); (20S)-ビタミンD3において見出される側鎖(b); (20S)-25-ヒドロキシビタミンD2において見出される側鎖(c); (20S)-ビタミンD2において見出される側鎖(d); および(20S)-25-ヒドロキシビタミンD2のC-24エピマーにおいて見出される側鎖(e)である。
2014532622.tif 000005
【００１４】
炭素20に対する波線は、炭素20がR配置またはS配置のいずれかを有しうることを示す。
【００１５】
好ましい類似体は、下記式Iaを有する(20S)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3(本明細書では「2EG-S」と呼ぶ):
2014532622.tif 000006
、および下記式Ibを有する(5E)-(20S)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3(本明細書では「T-2EG-S」と呼ぶ):
2014532622.tif 000007
、および下記式Icを有する(20R)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3(本明細書では「2EG-R」と呼ぶ):
2014532622.tif 000008
である。本明細書では、化合物Icは「2-メチレン-1α,25-ジヒドロキシ-ビタミンD3」と命名されうる。
【００１６】
式I、特に、式Ia、Ib、およびIcの上記化合物は、生物活性の望ましい非常に有利なパターンを示す。これらの化合物は、ビタミンD受容体に対する比較的高い結合性を特徴とし、すなわち、それらは、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3とほぼ同等の親和性または1α,25-ジヒドロキシビタミンD3よりもごくわずかに低い親和性で結合する。それらはいずれもHL-60細胞の分化を引き起こす際に非常に強力である。それらはまた、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3に比べて、比較的高い転写活性、ならびに、骨からカルシウムを動員する能力および腸管カルシウム輸送を促進する能力における比較的高い活性を示す。したがって、これらの化合物は、比較的高い血漿カルシウム上昇活性を有することを特徴としうる。
【００１７】
上記化合物I、特にIa、IbおよびIcは、比較的高い結合親和性を有し、比較的高い細胞分化活性を特徴とし、かつ、比較的高い血漿カルシウム上昇活性を有する。したがって、これらの化合物は抗がん剤としての可能性を有し、骨肉腫、白血病、大腸がん、乳がん、皮膚がん、および前立腺がんの予防または処置のための治療剤を提供する。これらの類似体は、老人性骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症、ステロイド誘発性骨粗鬆症、低回転型骨粗鬆症、骨軟化症、および腎性骨異栄養症などの骨疾患の重要な療法としても役立ちうる。
【００１８】
1つまたは複数の前記化合物は、上記の疾患を処置または予防するための組成物中に、該組成物1グラム当たり約0.01μg〜約1000μg、好ましくは該組成物1グラム当たり約0.1μg〜約500μgの量で存在することができ、約0.01μg/日〜約1000μg/日、好ましくは約0.1μg/日〜約500μg/日の投与量で局所投与、経皮投与、経口投与、直腸投与、経鼻投与、舌下投与、または非経口投与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
図1〜図5は、以下「1,25(OH)2D3」と呼ぶ天然ホルモン1α,25-ジヒドロキシビタミンD3と比較した、以下「2EG-S」と呼ぶ(20S)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3の様々な生物活性を示す。
【図１】全長組換えラットビタミンD受容体に対する結合に関して[3H]-1,25-(OH)2-D3と競合する2EG-Sおよび1,25(OH)2D3の相対活性を示すグラフである。
【図２】2EG-Sおよび1,25(OH)2D3の濃度の関数としてのHL-60細胞分化パーセントを示すグラフである。
【図３】1,25(OH)2D3のインビトロ転写活性の2EG-Sに対する比較を示すグラフである。
【図４】1,25(OH)2D3の骨カルシウム動員活性の2EG-Sに対する比較を示す棒グラフである。
【図５】1,25(OH)2D3の腸管カルシウム輸送活性の2EG-Sに対する比較を示す棒グラフである。
【００２０】
図6〜図10は、以下「T-2EG-S」と呼ぶ(5E)-(20S)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3の様々な生物活性の、以下「1,25(OH)2D3」と呼ぶ天然ホルモン1α,25-ジヒドロキシビタミンD3に対する比較を示す。
【００２１】
【図６】全長組換えラットビタミンD受容体に対する結合に関して[3H]-1,25-(OH)2-D3と競合するT-2EG-Sおよび1,25(OH)2D3の相対活性を示すグラフである。
【図７】T-2EG-Sおよび1,25(OH)2D3の濃度の関数としてのHL-60細胞分化パーセントを示すグラフである。
【図８】1,25(OH)2D3のインビトロ転写活性のT-2EG-Sに対する比較を示すグラフである。
【図９】1,25(OH)2D3の骨カルシウム動員活性のT-2EG-Sに対する比較を示す棒グラフである。
【図１０】1,25(OH)2D3の腸管カルシウム輸送活性のT-2EG-Sに対する比較を示す棒グラフである。
【００２２】
図11〜図15は、以下「2EG-R」と呼ぶ(20R)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3の様々な生物活性の、以下「1,25(OH)2D3」と呼ぶ天然ホルモン1α,25-ジヒドロキシビタミンD3に対する比較を示す。
【００２３】
【図１１】全長組換えラットビタミンD受容体に対する結合に関して[3H]-1,25-(OH)2-D3と競合する2EG-Rおよび1,25(OH)2D3の相対活性を示すグラフである。
【図１２】2EG-Rおよび1,25(OH)2D3の濃度の関数としてのHL-60細胞分化パーセントを示すグラフである。
【図１３】1,25(OH)2D3のインビトロ転写活性の2EG-Rに対する比較を示すグラフである。
【図１４】1,25(OH)2D3の骨カルシウム動員活性の2EG-Rに対する比較を示す棒グラフである。
【図１５】1,25(OH)2D3の腸管カルシウム輸送活性の2EG-Rに対する比較を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
本明細書および特許請求の範囲において使用される「ヒドロキシ保護基」という用語は、ヒドロキシ官能基の一時的保護に一般に使用される任意の基、例えばアルコキシカルボニル基、アシル基、アルキルシリル基またはアルキルアリールシリル基(以下単に「シリル」基と呼ぶ)、およびアルコキシアルキル基を意味する。アルコキシカルボニル保護基とは、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、イソブトキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルまたはアリルオキシカルボニルなどのアルキル-O-CO-基のことである。「アシル」という用語は、すべての異性体形態の炭素数1〜6のアルカノイル基、またはオキサリル基、マロニル基、スクシニル基、グルタリル基などの炭素数1〜6のカルボキシアルカノイル基、またはベンゾイルなどの芳香族アシル基、またはハロ置換、ニトロ置換もしくはアルキル置換ベンゾイル基を意味する。本明細書または特許請求の範囲において使用される「アルキル」という用語は、すべての異性体形態の炭素数1〜10の直鎖または分岐状のアルキル基を示す。「アルコキシ」とは、酸素によって結合する任意のアルキル基、すなわち「アルキル-O-」で表される基を意味する。アルコキシアルキル保護基とは、メトキシメチル、エトキシメチル、メトキシエトキシメチル、またはテトラヒドロフラニルおよびテトラヒドロピラニルなどの基のことである。好ましいシリル保護基としては、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、t-ブチルジメチルシリル基、ジブチルメチルシリル基、ジフェニルメチルシリル基、フェニルジメチルシリル基、ジフェニル-t-ブチルシリル基および類似のアルキル化シリル基がある。「アリール」という用語は、フェニル基、または、アルキル置換フェニル基、ニトロ置換フェニル基、もしくはハロ置換フェニル基を指す。
【００２５】
「保護ヒドロキシ」基とは、ヒドロキシ官能基の一時的または恒久的保護に一般に使用される上記の基のいずれか、例えば既に定義のシリル基、アルコキシアルキル基、アシル基またはアルコキシカルボニル基で誘導体化または保護されたヒドロキシ基のことである。「ヒドロキシアルキル」、「重水素化アルキル」および「フルオロアルキル」という用語は、それぞれ1個または複数のヒドロキシ基、重水素基またはフルオロ基で置換されたアルキル基を意味する。「アルキリデン」とは、kが整数である一般式CkH2k-を有する基を意味する。
【００２６】
基本構造Iの2-メチレン-ビタミンD類似体の調製は、通常の一般的方法によって、すなわち、二環式ビニル化合物IIとジエニンIIIとの薗頭カップリングによって達成することができる。
2014532622.tif 000009
【００２７】
構造IIおよびIIIでは、X基は、ハロゲン(ヨウ素、臭素、または塩素)、およびアルキル-もしくはアリール-スルホニルオキシ、例えばメシルオキシ、トシルオキシ、または最も好ましくはトリフルオキシより選択される脱離基を表す。Y1基、Y2基、およびR基は上記で定義された基を表し、Y1およびY2はヒドロキシ保護基であることが好ましく、また、感受性を有しうるかまたはカップリング反応に干渉するR中の任意の官能基が、当技術分野において周知の通り好適に保護されることが理解される。上記に示すプロセスは収束的合成の概念の適用を表すものであり、この概念はビタミンD化合物の調製のために効果的に適用された[Mascarenas et al., Tetrahedron 47, 3485 (1991), Barrack et al., J. Org. Chem., 53, 1790 (1988); Sanchez-Abella et al., Bioorg. Med. Chem. 16, 10244 (2008)]。
【００２８】
一般構造IIの二環式化合物は、公知であるか、または対応するWindaus-Grundmann型ケトンから公知の方法で容易に調製可能である。そのような公知の二環式ケトンの特定の重要な例としては、下記の側鎖(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、および(n)を有する構造、すなわち25-ヒドロキシGrundmannケトン(h)[Baggiolini et al., J. Org. Chem, 51, 3098 (1986)]; Grundmannケトン(i)[Inhoffen et al., Chem. Ber., 90, 664 (1957)]; 25-ヒドロキシWindausケトン(j)[Baggiolini et al., J. Org. Chem., 51, 3098 (1986)]; Windausケトン(k)[Windaus et al., Ann., 524, 297 (1936)]; (20S)-25-ヒドロキシGrundmannケトン(l)[Sicinski et al., J. Med. Chem., 41, 4662 (1998)]; (20S)-Grundmannケトン(m)[Grzywacz et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 89-90, 13 (2004)]; および(20S)-25-メチルGrundmannケトン(n)[Grzywacz et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 89-90, 13 (2004)]がある。
2014532622.tif 000010
【００２９】
構造IIIのジエニンの調製に関して新規合成経路が確立された。スキームIに記載のように、Glebockaら[J. Med. Chem., 49, 2909 (2006)]の方法によって市販の(1R,3R,4S,5R)-キナ酸から効率的に調製される二環式ケトラクトン1を、メチルトリフェニルホスホニウムブロミドおよびn-ブチルリチウムから発生するイリドとのWittig反応に供した。次に、形成された2のメタノリシスによって、第二級ヒドロキシルがシリルエーテルとして選択的に保護されたエステル3を得た。マーチンスルフラン試薬を使用して第三級ヒドロキシル化合物4の脱水を行ってα,β-不飽和エステル5を得た。この生成物をジアゾメタンの1,3-双極子環付加に供して二環式化合物6を形成した。DMSO中125℃でのその熱分解によって予想の不飽和エステル7を得て、これをDIBALHでアリルアルコール8に還元した。この化合物のPDC酸化によって不飽和アルデヒド9を得た。(トリメチルシリル)ジアゾメタンとのその反応によってエチニル置換基を導入し、所望のA環断片10を得た。
【００３０】
スキームIIは、得られたA環ジエニン10と、保護25-ヒドロキシGrundmannケトンから誘導されたC,D-断片を表すエノールトリフレート11[Sanchez-Abella et al., Bioorg. Med. Chem. 16, 10244 (2008)]との引き続く薗頭カップリングを示す。この反応は、酢酸ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)-ヨウ化銅(I)触媒およびジエチルアミンの存在下で優先的に行われるはずである。カップリングによってトリエニン12を形成し、これをリンドラー触媒およびキノリンの存在下でさらに水素化した。次に、そのような接触水素化の予想生成物であるプレビタミンD化合物13をヘキサン中での熱反応に供した。保護ビタミンD化合物14を得て、フッ化テトラブチルアンモニウムによるヒドロキシル脱保護後に所望の1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3(15)を得た。この合成経路は本明細書の実施例Iに記載されている。
【００３１】
スキームIIIは、C20における「非天然」の配置を有するビタミンD化合物をもたらす合成順序を示す。スキームIIIに記載の通りに、C,D-断片を表す対応するエノールトリフレート17を保護(20S)-25-ヒドロキシGrundmannケトン16から容易に調製することができる[Sicinski et al., J. Med. Chem., 41, 4662 (1998)]。LDAを-78℃で加えることで発生した16のエノール型をN-フェニルトリフルイミドで処理して17を得た。続いて、得られたA環ジエニン10とエノールトリフレート17との薗頭カップリングによってトリエニン18を形成し、これをリンドラー触媒およびキノリンの存在下でさらに水素化した。次に、そのような接触水素化の予想生成物であるプレビタミンD化合物19をヘキサン中での熱反応に供した。保護ビタミンD化合物20を得て、フッ化テトラブチルアンモニウムによるヒドロキシル脱保護後に所望の(20S)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3(21)を得た。この合成経路は本明細書の実施例IIに記載されている。
【００３２】
実施例Iおよび実施例IIから明らかである通り、異なる側鎖を有する他のビタミンD類似体を、本明細書に記載の方法で合成することができる。
【００３３】
本発明を以下の例示的な実施例により説明する。これらの実施例において、アラビア数字(例えば1、2、3など)により同定される特定の生成物は、前記の明細書においておよびスキームI、スキームII、およびスキームIIIにおいてそのように同定された特定の構造を指す。
【実施例】
【００３４】
化学的性質。融点(未補正)をThomas-Hoover毛細管融点装置において決定した。旋光度をクロロホルム中22℃でPerkin-Elmer 241自動旋光計を使用して測定した。紫外線(UV)吸収スペクトルをエタノール中でPerkin-Elmer Lambda 3B紫外可視分光光度計によって記録した。1H核磁気共鳴(NMR)スペクトルをジュウテリオクロロホルム中にて400および500MHzでそれぞれBruker DMX-400およびBruker DMX-500分光計によって記録した。13C核磁気共鳴(NMR)スペクトルをジュウテリオクロロホルム中にて100および125MHzでそれぞれBruker DMX-400およびBruker DMX-500分光計によって記録した。化学シフト(δ)を内部Me4Si(δ 0.00)から低磁場で報告した。電子衝撃(EI)質量スペクトルをMicromass AutoSpec(マサチューセッツ州Beverly)機器によって得た。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を、モデル6000A溶媒送達システム、モデルU6Kユニバーサルインジェクターおよびモデル486波長可変吸光度検出器を備えたWaters Associates液体クロマトグラフにおいて行った。THFを使用前にアルゴン下でナトリウムベンゾフェノンケチルから新たに蒸留した。
【００３５】
化合物5〜10のプロトンMMR信号の記述では、最終ビタミンD化合物では1α-OTBSおよび1α-OHになると考えられるOTBS基の配向を任意で「α」と設定した。
【００３６】
実施例I
1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3(15)の調製
(a) ケトン1のWittig反応(スキームI)。(1R,3R,5R)-1-アセトキシ-3-[(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ]-4-メチレン-6-オキサビシクロ[3.2.1]オクタン-7-オン(2)。メチルトリフェニルホスホニウムブロミド(280mg、784.6μmol)の無水THF(5.5mL)中攪拌懸濁液に0℃でカリウムtert-ブトキシドのTHF溶液(1.0M; 746μL、746μmol)に滴下した。混合物を室温に昇温させ、さらに10分間攪拌した。ケトン1(126mg、382.7μmol)のTHF(1.6mL)溶液をカニューレ経由で加え、攪拌を室温で1時間続けた。水を加え、混合物を酢酸エチルで抽出し、MgSO4で乾燥させ、濃縮した。残渣をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサン/酢酸エチル(95:5)で溶離して化合物2(91mg、73%)を得た。
2: [α]20D -79°(c 1.0 CHCl3);
2014532622.tif 000011
; HRMS(ESI) C16H26O5SiNa(M++Na)の計算精密質量349.1447、測定精密質量349.1451。
【００３７】
(b) ラクトン2のメタノリシスおよびヒドロキシル保護。(3R,5R)-3,5-ビス[(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ]-1-ヒドロキシ-4-メチレン-シクロヘキサンカルボン酸メチルエステル(4)。ナトリウムメトキシドのメタノール溶液(0.04M; 10mL、0.4mmol)中にてアルゴン下、室温でラクトン2(330mg、1.01mmol)の溶液を17時間激しく攪拌した。水を加え、混合物を酢酸エチルで抽出し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。残渣をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサン/酢酸エチル(7:3)で溶離してジオール3(253mg、79%)を無色油として得た。
【００３８】
-40℃に冷却した無水塩化メチレン(4.5mL)にジオール3(274mg、865.8μmol)を溶解させ、2,6-ルチジン(191μL、1.65mmol)、続いてtert-ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート(300μL、1.3mmol)を滴下した。反応混合物を-40℃で1時間攪拌し、飽和NaHCO3を加えた。冷却浴を除去し、反応混合物を室温にゆっくりと昇温させた。混合物を塩化メチレンで抽出し、一緒にした有機層を5% HClおよび水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。残渣をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサン/酢酸エチル(93:7)で溶離して化合物4(353.5mg、95%)を無色油として得た。
4: [α]20D -31.5°(c 1.0 CHCl3);
2014532622.tif 000012
; HRMS(ESI) C21H42O5Si2Na(M++Na)の計算精密質量453.2469、測定精密質量453.2458。
【００３９】
(c) ヒドロキシエステル4の脱水。(3R,5R)-3,5-ビス[(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ]-4-メチレン-シクロヘキサ-1-エンカルボン酸メチルエステル(5)。アルコール4(326mg、756.8μmol)の無水四塩化炭素(8.2mL)中攪拌溶液にアルゴン下、室温でビス[α,α-ビス(トリフルオロメチル)ベンジルオキシ]ジフェニル硫黄(752mg、1.12mmol)の無水四塩化炭素(6mL)溶液を加えた。反応液を30分間攪拌し、水を加えた。混合物を塩化メチレンで抽出し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。得られた残渣をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサン/ジエチルエーテル(98:2)で溶離して、脱水試薬が混入した所望の生成物を得た。ヘキサン/ジエチルエーテル(92:8)を使用する分取TLCプレート(シリカゲル60F254、20×20cm、層厚250nm)上におけるさらなる精製によって不飽和エステル5(276mg、90%)を無色油として得た。
5: [α]20D -106°(c 1.0 CHCl3);
2014532622.tif 000013
; HRMS(ESI) C21H40O4Si2Na(M++Na)の計算精密質量435.2363、測定精密質量435.2364。
【００４０】
(d) ジアゾメタンのエステル5への付加。(3aR,4R,6R,7aR)-4,6-ビス[(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ]-5-メチレン-3,3a,4,5,6,7-ヘキサヒドロ-インダゾール-7a-カルボン酸メチルエステル(6)。エステル5(264mg、639.7μmol)の無水エチルエーテル(1mL)溶液に室温でジアゾメタンのジエチルエーテル溶液[2.7mL; Arndt, Org. Synth., 15, 3, 48 (1935)の手順に従って調製]を加えた。反応混合物を光から保護し、2時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をヘキサンに溶解させ、シリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサン/酢酸エチル(97:3)で溶離して二環式付加体6(288mg、99%)を無色油として得た。
6: [α]20D -142°(c 1.0 CHCl3);
2014532622.tif 000014
; HRMS(ESI) C22H42O4N2Si2Na(M++Na)の計算精密質量477.2581、測定精密質量477.2573。
【００４１】
(e) 付加体6の熱分解。(3R,5R)-3,5-ビス[(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ]-2-メチル-4-メチレン-シクロヘキサ-1-エンカルボン酸メチルエステル(7)。新たに蒸留した無水DMSO(0.6mL)中の化合物6(14mg、32.54μmol)の溶液をアルゴン下、125℃で32時間攪拌した。加熱浴を除去し、水を加え、混合物をヘキサンで抽出し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサン/ジエチルエーテル(97:3)で溶離して不飽和エステル7(9mg、65%)を得た。
7: [α]20D -87°(c 1.0 CHCl3);
2014532622.tif 000015
; HRMS(ESI) C22H42O4Si2Na(M++Na)の計算精密質量449.2519、測定精密質量449.2521。
【００４２】
(f) エステル7の還元。[(3'R,5'R)-3',5'-ビス[(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ]-2'-メチル-4'-メチレン-シクロヘキサ-1'-エニル]-メタノール(8)。エステル7(25mg、58.6μmol)のトルエン/塩化メチレン(2:1; 3mL)中攪拌溶液にアルゴン下、-78℃で水素化ジイソブチルアルミニウム(トルエン中1.0M; 260μL、260μmmol)をゆっくりと加えた。攪拌を-78℃で2時間続けた。酒石酸カリウム-ナトリウム(2N、4mL)、HCl水溶液(2N、4mL)およびH2O(16mL)をゆっくりと加えることで混合物を反応停止させ、酢酸エチルで抽出した。一緒にした有機層をブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濃縮した。残渣をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサン/酢酸エチル(98:2)で溶離してアルコール8(14mg、60%)を得た。
8: [α]20D -89°(c 1.0 CHCl3);
2014532622.tif 000016
; HRMS(ESI) C21H42O3Si2Na(M++Na)の計算精密質量421.2570、測定精密質量421.2572。
【００４３】
(g) アルコール8の酸化。(3R,5R)-3,5-ビス[(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ]-2-メチル-4-メチレン-シクロヘキサ-1-エンカルボアルデヒド(9)。アルコール8(16mg、40.2μmol)および二クロム酸ピリジニウム(48.5mg、225.1μmol)の無水塩化メチレン(0.7mL)中混合物を室温で4時間激しく攪拌した。次に反応混合物をセライトパッド(塩化メチレンで洗浄)を通して濾過し、溶媒を減圧除去した。粗生成物をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサン/ジエチルエーテル(98:2)で溶離してアルデヒド9(12.6mg、79%)を無色油として得た。
9: [α]20D -112°(c 1.0 CHCl3);
2014532622.tif 000017
; HRMS(ESI) C21H40O3Si2Na(M++Na)の計算精密質量419.2414、測定精密質量419.2417。
【００４４】
(h) アルデヒド9からジエニン10への変換。(3R,5R)-3,5-ビス[(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ]-1-エチニル-2-メチル-4-メチレン-シクロヘキセン(10)。(トリメチルシリル)ジアゾメタン(ヘキサン中2.0M、19.5μL、39μmol)の無水THF(50μL)溶液にアルゴン下、-78℃でn-BuLi(ヘキサン中1.6M; 25.5μL、40.8μmol)を加え、アルデヒド9(12.6mg、31.8μmol)の乾燥THF(100μL+50μL)溶液をカニューレ経由で加えた。1時間後、冷却浴を取り外し、攪拌を室温で終夜続けた。水を加え、混合物をヘキサンで抽出し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサンで溶離してジエニン10(10mg、82%)を得た。
10: [α]20D -102°(c 1.0 CHCl3);
2014532622.tif 000018
; HRMS(ESI) C22H40O2Si2Na(M++Na)の計算精密質量415.2465、測定精密質量415.2455。
【００４５】
(i) ジエニン10とトリフレート11とのカップリング(スキームII)。1α,3β-ビス[(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ]-2-メチレン-25-[(トリエチルシリル)オキシ]-9,10-セココレスタ-5(10),8-ジエン-6-イン(12)。ジエニン10(8mg、20.4μmol)およびトリフレート11(8.4mg、15.9μmol)の無水DMF(200μL)溶液にアルゴン下、室温でCuI(0.45mg、2.37μmol)、(PPh3)2Pd(OAc)2(0.34mg、0.45μmol)およびEt2NH(159μL)を加えた。45分後、混合物は濃赤褐色になった。水を加え、混合物をヘキサンで抽出し、MgSO4で乾燥させ、濃縮した。得られた生成物をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサンで溶離してトリエニン12(8.3mg、92%)および回収アセチレン10(2.2mg)を得た。
12:
2014532622.tif 000019
; HRMS(ESI) C46H84O3Si3Na(M++Na)の計算精密質量791.5626、測定精密質量791.5637。
【００４６】
(j) トリエニン12の水素化およびプレビタミンD化合物13の熱反応。1α-[(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ]-2-メチレン-25-[(トリエチルシリル)オキシ]-ビタミンD3 tert-ブチルジメチルシリルエーテル(14)。トリエニン12(8.3mg、10.8μmol)のヘキサン(3mL)およびキノリン(2μL)溶液にリンドラー触媒(25mg)を加え、混合物を水素正圧下、室温で攪拌した。リンドラー触媒を2.5時間中に2回(20mgずつ)加えた後、混合物をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサン/エーテル(98:2)で溶離してシリル化プレビタミン13(5.8mg、70%)を得た。次にプレビタミンを無水ヘキサン(3mL)に溶解させ、アルゴン下、60℃で14時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサン/ジエチルエーテル(99.6:0.4)で溶離して保護ビタミン14(5.8mg、100%)を得た。
14:
2014532622.tif 000020
; HRMS(ESI) C46H86O3Si3Na(M++Na)の計算精密質量793.5782、測定精密質量793.5778。
【００４７】
(k) ビタミンD化合物14中のヒドロキシルの脱保護。1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3(15)。保護ビタミン14(5.8mg、7.52μmol)のTHF(1mL)溶液にアルゴン下、室温でフッ化テトラブチルアンモニウム(THF中1.0M; 450μL、450μmol)を加えた。攪拌を20時間続け、ブラインを加え、混合物を酢酸エチルで抽出した。有機抽出物をMgSO4で乾燥させ、蒸発させた。残渣を、ヘキサン/2-プロパノール(9:1)溶媒系を使用するHPLC(9.4mm×25cm Zorbax-Silカラム、4mL/分)で精製し、ビタミン15(1.28mg、40%)をRV 36mLで収集した。メタノール/水(88:12)溶媒系を使用するHPLC(9.4mm×25cm Zorbax Eclipse XDB-C18カラム、4mL/分)後にビタミンの分析試料を得た(RV 33mL)。
15: UV(EtOH) λmax 269.0nm;
2014532622.tif 000021
; HRMS(ESI) C28H44O3Na(M++Na)の計算精密質量451.3188、測定精密質量451.3177。
【００４８】
実施例II
(20S)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3(21)および(5E)-(20S)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3(22)の調製
(a) Grundmannケトン16からエノールトリフレート17への変換(スキームIII)。(20S)-25-[(トリエチルシリル)オキシ]-8-トリフルオロメタンスルホニルオキシ-デス-A,B-コレスタ-8-エン(17)。LDA(THF/ヘプタン/エチルベンゼン中2.0M; 40μL、80μmol)の乾燥THF(100μL)溶液にアルゴン下、-78℃でケトン16(28.5mg、72.19μmol)の無水THF(350μL)溶液をゆっくりと加えた。次にN-フェニルトリフルイミド(28.3mg、79.27μmol)の乾燥THF(100μL)溶液を加えた。2時間後、冷却浴を除去し、反応混合物を室温に昇温させた。攪拌を30分間続け、水を加えた。混合物をヘキサンで抽出し、MgSO4で乾燥させ、濃縮した。残渣をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサンで溶離してエノールトリフレート17(17.2mg、回収基質を考慮して82%)および未反応ケトン16(12mg)を得た。
16: [α]20D -5.3°(c 0.86 CHCl3);
2014532622.tif 000022
; HRMS(ESI) C25H45F3O4SSiNa(M++Na)の計算精密質量549.2658、測定精密質量549.2637。
【００４９】
(b) ジエニン10とトリフレート17とのカップリング。(20S)-1α,3β-ビス[(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ]-2-メチレン-25-[(トリエチルシリル)オキシ]-9,10-セココレスタ-5(10),8-ジエン-6-イン(18)。ジエニン10(15.5mg、39.54μmol)およびトリフレート17(12.5mg、27.73μmol)の無水DMF(240μL)溶液にアルゴン下、室温でCuI(0.67mg、3.52μmol)、(PPh3)2Pd(OAc)2(0.50mg、0.67μmol)およびEt2NH(240μL)を加えた。45分後、混合物は濃赤褐色になった。水を加え、混合物をヘキサンで抽出し、MgSO4で乾燥させ、濃縮した。得られた生成物をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサンで溶離してトリエニン18(10.3mg、54%)および回収ジエニン10(5.7mg)を得た。
18:
2014532622.tif 000023
; HRMS(ESI) C46H84O3Si3Na(M++Na)の計算精密質量791.5626、測定精密質量791.5638。
【００５０】
(c) トリエニン18の水素化およびプレビタミンD化合物19の熱反応。(20S)-1α-[(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ]-2-メチレン-25-[(トリエチルシリル)オキシ]-ビタミンD3 tert-ブチルジメチルシリルエーテル(20)。トリエニン18(9mg、11.7μmol)のヘキサン(1.3mL)およびキノリン(2.2μL)溶液にリンドラー触媒(31mg)を加え、混合物を水素正圧下、室温で攪拌した。45分後、混合物をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサン/エーテル(99:1)で溶離してシリル化プレビタミン19(7.6mg、84%)を得た。次にプレビタミンを無水ヘキサン(6mL)に溶解させ、アルゴン下、60℃で19時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をシリカSep-Pakカートリッジ上に適用し、ヘキサン/ジエチルエーテル(99.6:0.4)で溶離して保護ビタミン20(6.3mg、70%)を得た。
20:
2014532622.tif 000024
; HRMS(ESI) C46H86O3Si3Na(M++Na)の計算精密質量793.5782、測定精密質量793.5788。
【００５１】
(d) ビタミンD化合物20中のヒドロキシルの脱保護。(20S)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3(21)。保護ビタミン20(6.3mg、8.17μmol)のTHF(1mL)溶液にアルゴン下、室温でフッ化テトラブチルアンモニウム(THF中1.0M; 750μL、750μmol)を加えた。攪拌を20時間続け、ブラインを加え、混合物を酢酸エチルで抽出した。有機抽出物をMgSO4で乾燥させ、蒸発させた。残渣を、ヘキサン/2-プロパノール(92:8)溶媒系を使用するHPLC(9.4mm×25cm Zorbax-Silカラム、4mL/分)で精製し、ビタミン21(567μg、16%)をRV 36mLで収集した。メタノール/水(88:12)溶媒系を使用するHPLC(9.4mm×25cm Zorbax Eclipse XDB-C18カラム、4mL/分)後にビタミンの分析試料を得た(RV 30mL)。
21: UV(EtOH) λmax 270.0nm;
2014532622.tif 000025
; HRMS(ESI) C28H44O3Na(M++Na)の計算精密質量451.3188、測定精密質量451.3174。
【００５２】
(e)各(5E)-異性体22への(5Z)-ビタミン21の異性化は、ヨウ素を触媒として使用する周知の手順[Havinga et al., Rec. Trav. Chim. 78, 1004 (1959)]によって達成することができる。メタノール/水(84:16)溶媒系を使用するHPLC(9.4mm×25cm Zorbax Eclipse XDB-C18カラム、4mL/分)後にビタミンの分析試料を得た(RV 55mL)。
22: UV(EtOH) λmax 278.0nm;
2014532622.tif 000026
; HRMS(ESI) C28H44O3Na(M++Na)の計算精密質量451.3188、測定精密質量451.3193。
【００５３】
スキームI、スキームII、およびスキームIIIは以下に記載の通りである。
【００５４】
2014532622.tif 000027
【００５５】
2014532622.tif 000028
【００５６】
2014532622.tif 000029
【００５７】
(20S)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3(2EG-S)の生物活性
2位に対するメチレン基の導入、炭素10においてメチレン置換基を保持すること、および炭素20におけるメチル基をエピ配置またはS配置に向けることは、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3に比べて、全長組換えラットビタミンD受容体への結合に対する効果をほとんどまたは全く示さなかった。化合物2EG-Sは標準的1,25-(OH)2D3に比べてほぼ同等の親和性で該受容体に結合する(図1)。これらの結果からは、化合物2EG-Sが同等の生物活性を有すると予想されうる。しかし驚くべきことに、化合物2EG-Sは、独自の生物活性を有する非常に選択的な類似体である。
【００５８】
図5は、腸管カルシウム輸送を刺激する際に、2EG-Sが、天然ホルモンである1,25-ジヒドロキシビタミンD3(1,25(OH)2D3)の活性に比べて比較的高い活性を有することを示す。2EG-Sは、腸管にわたる活性カルシウム輸送を促進する際に1,25(OH)2D3よりも強力である。
【００５９】
図4は、2EG-Sが1,25(OH)2D3に比べて比較的高い骨カルシウム動員活性を有することを示す。2EG-Sは、骨カルシウムストアを放出する際に天然ホルモンよりも強力である。
【００６０】
したがって図4および図5は、2EG-Sが比較的高い血漿カルシウム上昇活性を有することを特徴としうることを示す。
【００６１】
図2は、2EG-Sが、HL-60細胞分化に関して1,25(OH)2D3よりも強力であることから、がんの処置、特に骨肉腫、白血病、大腸がん、乳がん、皮膚がん、および前立腺がんの予防または処置のための優れた候補となることを示す。
【００６２】
図3は、化合物2EG-Sが1α,25-ジヒドロキシビタミンD3よりも大きな骨細胞中での転写活性を有することを示す。骨細胞中では、2EG-Sは、24-ヒドロキシラーゼ遺伝子の転写を増加させる際に1,25(OH)2D3よりも約40倍強力である。この結果は、図2の細胞分化活性と共に、2EG-Sが、細胞分化、遺伝子転写を引き起こす際、および細胞増殖を抑制する際の直接的な細胞活性を有することから、がんと呼ばれる上記のものを処置するのに非常に有効であることを示唆している。
【００６３】
実験方法
本発明の化合物を以下の方法を使用して調製および試験した。
【００６４】
ビタミンD受容体結合性
試験材料
タンパク質源
全長組換えラット受容体を大腸菌(E. coli)BL21(DE3)コドン＋RIL細胞中で発現させ、2つの異なるカラムクロマトグラフィーシステムを使用して均一になるまで精製した。第1のシステムは、このタンパク質上でC末端ヒスチジンタグを用いるニッケルアフィニティー樹脂とした。この樹脂から溶離したタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィー(S-セファロース高速流)を使用してさらに精製した。精製タンパク質のアリコートを液体窒素中で急速凍結させ、使用まで-80℃で保管した。結合アッセイ法での使用のために、タンパク質を0.1% Chaps界面活性剤を伴うTEDK50(50mM Tris、1.5mM EDTA、pH7.4、5mM DTT、150mM KCI)中で希釈した。受容体タンパク質およびリガンドの濃度を、添加された放射標識リガンドの20%以下が受容体に結合するように最適化した。
【００６５】
試験薬
非標識リガンドをエタノールに溶解させ、濃度を紫外分光光度法(1,25(OH)2D3: モル吸光係数＝18,200、λmax＝265nm)を使用して決定した。放射標識リガンド(3H-1,25(OH)2D3、約159Ci/ミリモル)をエタノール中に最終濃度1nMで加えた。
【００６６】
アッセイ条件
放射標識リガンドおよび非標識リガンドを希釈タンパク質100mclに最終エタノール濃度10%以下で加え、混合し、結合平衡に到達するように氷上で終夜インキュベートした。翌日、ヒドロキシルアパタイトスラリー(50%)100mclを各管に加え、10分間隔で30分間混合した。ヒドロキシルアパタイトを遠心分離で収集した後、0.5% Titron X-100を含有するTris-EDTA緩衝液(50mM Tris、1.5mM EDTA、pH7.4)で3回洗浄した。最終洗浄後、ペレットをBiosafe IIシンチレーションカクテル4mlを収容するシンチレーションバイアルに移し、混合し、シンチレーションカウンターに入れた。放射標識リガンドのみを収容する管から全結合量を決定した。
【００６７】
HL-60分化
試験材料
試験薬
試験薬をエタノールに溶解させ、紫外分光光度法を使用して濃度を決定した。細胞培養液中に存在するエタノールの最終濃度(0.2%以下)を変化させずにある範囲の薬物濃度を試験することができるように、系列希釈液を調製した。
【００６８】
細胞
ヒト前骨髄球性白血病(HL60)細胞を、10%ウシ胎仔血清を含有するRPMI-1640培地中で増殖させた。細胞を5% CO2の存在下、37℃でインキュベートした。
【００６９】
アッセイ条件
HL60細胞を1.2×105細胞/mlでプレーティングした。プレーティングの18時間後、二通りの細胞を薬物で処理した。4日後、細胞を収集し、ニトロブルーテトラゾリウム還元アッセイ法を行った(Collins et al., 1979; J. Exp. Med. 149:969-974)。分化細胞の割合を、合計200個の細胞を計数して細胞内黒青色ホルマザン沈着物を含む数を記録することで決定した。単球細胞への分化の確認を、食細胞活性を測定することで決定した(データは示さず)。
【００７０】
インビトロ転写アッセイ法
ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に24-ヒドロキシラーゼ(24OHアーゼ)遺伝子プロモーターを安定的に形質移入させたROS 17/2.8(骨)細胞中で転写活性を測定した(Arbour et al., 1998)。ある範囲の用量を細胞に与えた。投与の16時間後、細胞を収集し、ルミノメーターを使用してルシフェラーゼ活性を測定した。RLU＝相対ルシフェラーゼ単位。
【００７１】
腸管カルシウム輸送および骨カルシウム動員
雄の離乳Sprague-Dawleyラットに食餌11(Suda et al, J. Nutr. 100:1049, 1970)(0.47% Ca) + ビタミンAEKを1週間、続いて食餌11(0.02% Ca) + ビタミンAEKを3週間与えた。次にラットを1週間の0.47% Caを含有する同一の食餌、続いて2週間の0.02% Caを含有する同一の食餌に切り換えた。用量投与を0.02%カルシウム食餌の最終週の間に始めた。4回の連続した腹腔内用量を約24時間の間隔で与えた。最終投与の24時間後、切断した頸部から血液を採取し、血清カルシウム濃度を骨カルシウム動員の尺度として原子吸光分光法により決定した。腸管の最初の10cmも、反転腸管法を使用する腸管カルシウム輸送分析のために採取した。
【００７２】
データの解釈
VDR結合性、HL60細胞分化、および転写活性
2EG-S(Ki=1×10-10M)は、全長組換えラットビタミンD受容体に対する結合に関して[3H]-1,25(OH)2D3と競合する能力において天然ホルモン1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(Ki=1×10-10M)とほぼ同等の活性を有する(図1)。また、2EG-Sは、HL60分化を促進する能力(効果または有効性)において、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(EC50=3×10-9M)に比べて強力である(EC50=6×10-11M)(図2参照)。また、化合物2EG-S(EC50=5×10-12M)は、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(EC50=2×10-10M)の約40倍の骨細胞中での転写活性を有する(図3参照)。これらのデータは、2EG-Sが、細胞分化を引き起こす際、および細胞増殖を抑制する際の直接的な細胞活性を有することから、特に骨肉腫、白血病、大腸がん、乳がん、皮膚がん、および前立腺がんを予防または処置するための、抗がん剤としての有意な活性を有することを示す。
【００７３】
ビタミンD欠乏動物における、骨からのカルシウム動員および腸管カルシウム吸収
低カルシウム食(0.02%)を摂取するビタミンD欠乏ラットを使用して、腸管および骨中の2EG-Sおよび1,25(OH)2D3の活性を試験した。予想通り、天然ホルモン(1,25(OH)2D3)は試験投与量で血清カルシウムレベルを増加させた(図4)。図4はまた、2EG-Sが、骨からカルシウムを動員する際の1,25(OH)2D3よりも有意に高い活性を有することを示す。2EG-Sの780pmol/日で連続4日間の投与により、有意な骨カルシウム動員が生じた。2EG-Sは、骨カルシウムストアを放出する際に天然ホルモンよりも少なくとも10倍強力である。
【００７４】
腸管カルシウム輸送を同一の動物群において反転腸管法を使用して評価した(図5)。これらの結果は、化合物2EG-Sが、推奨されるより低い投与量で投与される場合に、腸管カルシウム輸送活性を促進する際の、1,25(OH)2D3に比べて非常に有意な活性を有することを示す。したがって、2EG-Sが試験用量において比較的高い腸管カルシウム輸送活性を有すると結論づけることができる。
【００７５】
これらの結果は、2EG-Sが本明細書に記載の数多くのヒト療法のための優れた候補であることをさらに示す。2EG-Sは、(1)有意なVDR結合性、転写活性および細胞分化活性を有し、(2)容易に合成されることから、がんを処置するための優れた候補となる。この類似体は、老人性骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症、ステロイド誘発性骨粗鬆症、低回転型骨粗鬆症、骨軟化症および腎性骨異栄養症のような骨疾患の重要な療法としても役立ちうる。
【００７６】
(5E)-(20S)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3(T-2EG-S)の生物活性
2位に対するメチレン基の導入、炭素10におけるメチレン置換基の除去、炭素4におけるメチレン置換基の導入、および炭素20におけるメチル基をエピ配置またはS配置に向けることは、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3に比べて、全長組換えラットビタミンD受容体への結合に対する効果をほとんどまたは全く示さなかった。化合物T-2EG-Sは標準的1,25-(OH)2D3に比べてほぼ同等の親和性で該受容体に結合する(図6)。これらの結果からは、化合物T-2EG-Sが同等の生物活性を有すると予想されうる。しかし驚くべきことに、化合物T-2EG-Sは、独自の生物活性を有する非常に選択的な類似体である。
【００７７】
図10は、腸管カルシウム輸送を刺激する際に、T-2EG-Sが、天然ホルモンである1,25-ジヒドロキシビタミンD3(1,25(OH)2D3)の活性に比べて比較的高い活性を有することを示す。T-2EG-Sは、腸管にわたる活性カルシウム輸送を促進する際の、1,25(OH)2D3とほぼ同等の有効性を有する。
【００７８】
図9は、T-2EG-Sが1,25(OH)2D3に比べて比較的高い骨カルシウム動員活性を有することを示す。T-2EG-Sは、骨カルシウムストアを放出する際に天然ホルモンよりも強力である。
【００７９】
したがって図9および図10は、T-2EG-Sが比較的高い血漿カルシウム上昇活性を有することを特徴としうることを示す。
【００８０】
図7は、T-2EG-Sが、HL-60細胞分化に関して1,25(OH)2D3よりも強力であることから、がんの処置、特に骨肉腫、白血病、大腸がん、乳がん、皮膚がん、および前立腺がんの予防または処置のための優れた候補となることを示す。
【００８１】
図8は、化合物T-2EG-Sが1α,25-ジヒドロキシビタミンD3よりも大きな骨細胞中での転写活性を有することを示す。骨細胞中では、T-2EG-Sは、24-ヒドロキシラーゼ遺伝子の転写を増加させる際に1,25(OH)2D3よりも約10倍強力である。この結果は、図7の細胞分化活性と共に、T-2EG-Sが、細胞分化、遺伝子転写を引き起こす際、および細胞増殖を抑制する際の直接的な細胞活性を有することから、がんと呼ばれる上記のものを処置するのに非常に有効であることを示唆している。
【００８２】
データの解釈
VDR結合性、HL60細胞分化、および転写活性
T-2EG-S(Ki=1×10-10M)は、全長組換えラットビタミンD受容体に対する結合に関して[3H]-1,25(OH)2D3と競合する能力において天然ホルモン1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(Ki=1×10-10M)とほぼ同等の活性を有する(図6)。また、T-2EG-Sは、HL60分化を促進する能力(効果または有効性)において、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(EC50=3×10-9M)に比べて強力である(EC50=3×10-10M)(図7参照)。また、化合物T-2EG-S(EC50=3×10-11M)は、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(EC50=2×10-10M)の約10倍の骨細胞中での転写活性を有する(図8参照)。これらのデータは、T-2EG-Sが、細胞分化を引き起こす際、および細胞増殖を抑制する際の直接的な細胞活性を有することから、特に骨肉腫、白血病、大腸がん、乳がん、皮膚がん、および前立腺がんを予防または処置するための、抗がん剤としての有意な活性を有することを示す。
【００８３】
ビタミンD欠乏動物における、骨からのカルシウム動員および腸管カルシウム吸収
低カルシウム食(0.02%)を摂取するビタミンD欠乏ラットを使用して、腸管および骨中のT-2EG-Sおよび1,25(OH)2D3の活性を試験した。予想通り、天然ホルモン(1,25(OH)2D3)は試験投与量で血清カルシウムレベルを増加させた(図9)。図9はまた、T-2EG-Sが、骨からカルシウムを動員する際の、1,25(OH)2D3よりも有意に高い活性を有することを示す。T-2EG-Sの780pmol/日で連続4日間の投与により、有意な骨カルシウム動員が生じた。T-2EG-Sは、骨カルシウムストアを放出する際に天然ホルモンよりも少なくとも10倍強力である。
【００８４】
腸管カルシウム輸送を同一の動物群において反転腸管法を使用して評価した(図10)。これらの結果は、化合物T-2EG-Sが、推奨されるより低い投与量で投与される場合に、腸管カルシウム輸送活性を促進する際の、1,25(OH)2D3に比べて非常に有意な活性を有することを示す。したがって、T-2EG-Sが試験用量において比較的高い腸管カルシウム輸送活性を有すると結論づけることができる。
【００８５】
これらの結果は、T-2EG-Sが本明細書に記載の数多くのヒト療法のための優れた候補であることをさらに示す。T-2EG-Sは、(1)有意なVDR結合性、転写活性および細胞分化活性を有し、(2)容易に合成されることから、がんを処置するための優れた候補となる。この類似体は、老人性骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症、ステロイド誘発性骨粗鬆症、低回転型骨粗鬆症、骨軟化症および腎性骨異栄養症のような骨疾患の重要な療法としても役立ちうる。
【００８６】
(20R)-1α,25-ジヒドロキシ-2-メチレン-ビタミンD3(2EG-R)の生物活性
2位に対するメチレン基の導入、炭素10においてメチレン置換基を保持すること、および炭素20におけるメチル基を天然配置またはR配置に向けることは、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3に比べて、全長組換えラットビタミンD受容体への結合に対する効果をほとんどまたは全く示さなかった。化合物2EG-Rは標準的1,25-(OH)2D3に比べてほぼ同等の親和性で該受容体に結合する(図1)。これらの結果からは、化合物2EG-Rが同等の生物活性を有すると予想されうる。しかし驚くべきことに、化合物2EG-Rは、独自の生物活性を有する非常に選択的な類似体である。
【００８７】
図15は、高い腸管カルシウム輸送を刺激する際に、2EG-Rが、天然ホルモンである1,25-ジヒドロキシビタミンD3(1,25(OH)2D3)の活性に比べて比較的高い活性を有することを示す。2EG-Rは、腸管にわたる活性カルシウム輸送を促進する際に1,25(OH)2D3よりも強力である。
【００８８】
図14は、2EG-Rが1,25(OH)2D3に比べて比較的高い骨カルシウム動員活性を有することを示す。2EG-Rは、骨カルシウムストアを放出する際に天然ホルモンよりも強力である。
【００８９】
したがって図14および図15は、2EG-Rが比較的高い血漿カルシウム上昇活性を有することを特徴としうることを示す。
【００９０】
図12は、2EG-Rが、HL-60細胞分化に関して1,25(OH)2D3よりも強力であることから、がんの処置、特に骨肉腫、白血病、大腸がん、乳がん、皮膚がん、および前立腺がんの予防または処置のための優れた候補となることを示す。
【００９１】
図13は、化合物2EG-Rが1α,25-ジヒドロキシビタミンD3よりも大きな骨細胞中での転写活性を有することを示す。骨細胞中では、2EG-Rは、24-ヒドロキシラーゼ遺伝子の転写を増加させる際に1,25(OH)2D3よりも約10倍強力である。この結果は、図12の細胞分化活性と共に、2EG-Rが、細胞分化、遺伝子転写を引き起こす際、および細胞増殖を抑制する際の直接的な細胞活性を有することから、がんと呼ばれる上記のものを処置するのに非常に有効であることを示唆している。
【００９２】
データの解釈
VDR結合性、HL60細胞分化、および転写活性
2EG-R(Ki=6×10-11M)は、全長組換えラットビタミンD受容体に対する結合に関して[3H]-1,25(OH)2D3と競合する能力において天然ホルモン1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(Ki=1×10-10M)とほぼ同等の活性を有する(図11)。2EG-Rは、HL60分化を促進する能力(効果または有効性)において、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(EC50=3×10-9M)に比べてわずかに強力ではない(EC50=7×10-9M)(図12参照)。また、化合物2EG-R(EC50=3×10-11M)は、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(EC50=2×10-10M)の約10倍の骨細胞中での転写活性を有する(図13参照)。これらのデータは、2EG-Rが、細胞分化を引き起こす際、および細胞増殖を抑制する際の直接的な細胞活性を有することから、特に骨肉腫、白血病、大腸がん、乳がん、皮膚がん、および前立腺がんを予防または処置するための、抗がん剤としての有意な活性を有することを示す。
【００９３】
ビタミンD欠乏動物における、骨からのカルシウム動員および腸管カルシウム吸収
低カルシウム食(0.02%)を摂取するビタミンD欠乏ラットを使用して、腸管および骨中の2EG-Rおよび1,25(OH)2D3の活性を試験した。予想通り、天然ホルモン(1,25(OH)2D3)は試験投与量で血清カルシウムレベルを増加させた(図14)。図14はまた、2EG-Rが、骨からカルシウムを動員する際の、1,25(OH)2D3よりも有意に高い活性を有することを示す。2EG-Rの780pmol/日で連続4日間の投与により、有意な骨カルシウム動員が生じた。2EG-Rは、骨カルシウムストアを放出する際に天然ホルモンよりも少なくとも10倍強力である。
【００９４】
腸管カルシウム輸送を同一の動物群において反転腸管法を使用して評価した(図15)。これらの結果は、化合物2EG-Rが、推奨されるより低い投与量で投与される場合に、腸管カルシウム輸送活性を促進する際の、1,25(OH)2D3に比べて非常に有意な活性を有することを示す。したがって、2EG-Rが試験用量において比較的高い腸管カルシウム輸送活性を有すると結論づけることができる。
【００９５】
これらの結果は、2EG-Rが本明細書に記載の数多くのヒト療法のための優れた候補であることをさらに示す。2EG-Rは、(1)有意なVDR結合性、転写活性および細胞分化活性を有し、(2)容易に合成されることから、がんを処置するための優れた候補となる。この類似体は、老人性骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症、ステロイド誘発性骨粗鬆症、低回転型骨粗鬆症、骨軟化症および腎性骨異栄養症のような骨疾患の重要な療法としても役立ちうる。
【００９６】
予防および/または処置の目的で、式I、Ia、Ib、およびIcにより定義される本発明の化合物を、当技術分野において公知である従来の方法に従って、無害の溶媒中の溶液剤として、または好適な溶媒もしくは担体中の乳剤、懸濁液剤もしくは分散液剤として、または固体担体と共に丸剤、錠剤、もしくはカプセル剤として、治療的適用のために製剤化することができる。任意のそのような製剤は、安定剤、抗酸化剤、結合剤、着色料、または乳化剤もしくは味覚変革剤などの他の薬学的に許容される無毒の賦形剤を含有してもよい。
【００９７】
式Iの化合物、特に、式Iaの2EG-S、式IbのT-2EG-S、および式Icの2EG-Rを、経口投与、局所投与、非経口投与、直腸投与、経鼻投与、舌下投与、または経皮投与することができる。本化合物は、好適な滅菌溶液剤の注射もしくは静脈内注入によって、または消化管を経由する液体用量もしくは固体用量の形態で、または経皮適用に好適なクリーム剤、軟膏剤、パッチ剤、もしくは同様のビヒクルの形態で投与することが有利である。1日当たり0.01μg〜1000μg、好ましくは1日当たり約0.1μg〜約500μgの用量の化合物I、特に2EG-S、T-2EG-S、および2EG-Rは予防および/または処置の目的に適しており、そのような用量は、当技術分野において十分理解されているとおり、処置される疾患、その重症度、および対象の応答に従って調整される。本化合物が作用特異性を示すことから、それぞれ単独で好適に投与することができるか、または、異なる程度の骨塩動員およびカルシウム輸送刺激が有利であるとわかる状況では、段階的用量の別の活性ビタミンD化合物、例えば、1α-ヒドロキシビタミンD2もしくはD3、または1α,25-ジヒドロキシビタミンD3と共に好適に投与することができる。
【００９８】
上記の処置において使用するための組成物は、有効成分としての上記式I、Ia、Ib、およびIcにより定義される化合物I、特に、2EG-S、T-2EG-S、および2EG-Rの有効量、ならびに好適な担体を含む。本発明に従って使用されるそのような化合物の有効量は、組成物1グラム当たり約0.01μg〜約1000μg、好ましくは組成物1グラム当たり約0.1μg〜約500μgであり、かつ、約0.01μg/日〜約1000μg/日、好ましくは約0.1μg/日〜約500μg/日の投与量で、局所投与、経皮投与、経口、投与直腸投与、経鼻投与、舌下投与、または非経口投与することができる。
【００９９】
化合物I、特に2EG-S、T-2EG-S、および2EG-Rをクリーム剤、ローション剤、軟膏剤、局所パッチ剤、丸剤、カプセル剤もしくは錠剤、坐薬、エアロゾル剤として、または薬学的に無害でありかつ許容される溶媒もしくは油中の溶液剤、乳剤、分散液剤もしくは懸濁液剤などの液体形態で製剤化することができ、そのような調製物は安定剤、抗酸化剤、乳化剤、着色料、結合剤、または味覚変革剤などの他の薬学的に無害または有益な成分をさらに含有しうる。
【０１００】
化合物I、特に2EG-S、T-2EG-S、および2EG-Rは、前骨髄球の正常マクロファージへの分化を実行するために十分な量で投与することが有利でありうる。上記の投与量が好適であり、当技術分野において十分に理解されるとおり、疾患の重症度、ならびに対象の状態および応答に従って投与量を調整すべきであると理解される。
【０１０１】
本発明の製剤は、有効成分と薬学的に許容されるその担体および任意で他の治療用成分との結合を含む。担体は、製剤の他の成分に適合性があってそのレシピエントに有害でないという意味で「許容される」ものでなければならない。
【０１０２】
経口投与に好適な本発明の製剤は、それぞれ所定量の有効成分を含有するカプセル剤、サシェ剤、錠剤もしくは舐剤などの分離単位の形態; 散剤もしくは顆粒剤の形態; 水性液体もしくは非水性液体中の溶液剤もしくは懸濁液剤の形態; または水中油型乳剤もしくは油中水型乳剤の形態でありうる。
【０１０３】
直腸投与のための製剤は、有効成分とカカオバターなどの担体とを包含する坐薬の形態、または浣腸剤の形態でありうる。
【０１０４】
非経口投与に好適な製剤は、レシピエントの血液と等張性であることが好ましい有効成分の滅菌油性または水性調製物を好都合に含む。
【０１０５】
局所投与に好適な製剤としては、リニメント剤、ローション剤、塗布剤、水中油型もしくは油中水型乳剤、例えばクリーム剤、軟膏剤、もしくはペースト剤、または、溶液剤もしくは懸濁液剤、例えば液滴剤、またはスプレー剤などの、液体調製物または半液体調製物が挙げられる。
【０１０６】
経鼻投与のために、スプレー缶、ネブライザー、または噴霧器によって分配される、散剤、自己推進式（self-propelling）製剤、またはスプレー製剤の吸入を使用することができる。製剤は、分配される場合に10〜100μの範囲の粒径を有することが好ましい。
【０１０７】
製剤は用量単位形態で好都合に提示することができ、薬学分野において周知の方法のいずれかによって調製することができる。「用量単位」という用語は、有効成分それ自体を含むかまたは固体もしくは液体の薬学的な希釈剤もしくは担体とのその混合物を含む、物理的および化学的に安定な単位用量として患者に投与できる一体の、すなわち単一の用量を意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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