(57)【要約】  本実施形態は、炎症状態（例えば、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ））の予防および処置のための方法に関する。より具体的には、本実施形態は、レチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）アゴニストの投与を通じてのＡＬＤの予防および処置に関する。一部の実施形態は、アルコール誘導性肝傷害、アルコール関連肝疾患、脂肪肝疾患、肝脂肪症、アルコール性肝炎またはアルコール性肝硬変の予防および処置におけるタザロテンの使用に関する。【選択図】図３
2014517077.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における少なくとも１つの炎症状態を処置または予防するための方法において、Ｉ型ＮＫＴ細胞の活性化を阻害するのに十分な量のレチノイドを前記患者に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記炎症状態が、脂肪肝疾患、アルコール誘導性肝炎、非アルコール性脂肪症肝炎、肝硬変、劇症肝硬変、突発性肝炎、ウイルス誘発性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型およびその他）、肝胆管癌種と関連する炎症性肝炎、多発性硬化症、１型糖尿病、虚血再灌流傷害、実質臓器移植、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、筋萎縮性側索硬化症、および炎症性腸疾患（クローン病および大腸炎）からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法において、前記レチノイドが、ＡＴＲＡまたはイソトレチノインであることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の方法において、前記レチノイドが、タザロテンであることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載の方法において、前記レチノイドが、レチノールまたはレチノールのエステルであることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れか一項に記載の方法において、ＩＩ型ＮＫＴ細胞を活性化するのに十分な量のスルファチドを投与するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法において、前記スルファチドが、以下の化学構造：
2014517077.tif 000012
を有し、式中、Ｒ１は、結合、水素、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ１〜Ｃ３０置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ３０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ３０置換アルケニルおよびＣ５〜Ｃ１２糖からなる群から選択され；Ｒ２は、水素、ヒドロキシ基、メトキシ基、およびアルコキシ基からなる群から選択され；Ｒ３は、水素、ヒドロキシ基、メトキシ基、エトキシ基、およびアルコキシ基からなる群から選択され；Ｒ４は、水素、ヒドロキシ基およびアルコキシ基からなる群から選択され；Ｒ５は、水素、ヒドロキシル、カルボニル、アルコキシおよび結合からなる群から選択され；Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ４０アルキル、Ｃ１〜Ｃ４０置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ４０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ４０置換アルケニルおよびＣ１〜Ｃ４０アルキンル（ａｌｋｙｎｌ）からなる群から選択され；Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ４０アルキル、Ｃ１〜Ｃ４０置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ４０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ４０置換アルケニルおよびＣ１〜Ｃ４０アルキンル（ａｌｋｙｎｌ）からなる群から選択され；そしてＲ８は、水素、ヒドロキシル基、カルボニル、アルコキシ基および結合からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項６に記載の方法において、前記スルファチドが、以下の化学構造：
2014517077.tif 000013
を有することを特徴とする方法。
【請求項９】
処方薬物または乱用薬物からの化学的肝損傷の危険がある患者における肝損傷を阻害するための方法において、１種以上のＲＡＲアゴニスト、１種以上のスルファチド、またはそれらの組み合わせの有効量を投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、前記ＲＡＲアゴニストが、タザロテン、ＡＴＲＡまたはイソトレチノインからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法において、前記１種以上のスルファチドが、以下の化学構造：
2014517077.tif 000014
を有し、式中、Ｒ１は、結合、水素、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ１〜Ｃ３０置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ３０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ３０置換アルケニルおよびＣ５〜Ｃ１２糖からなる群から選択され；Ｒ２は、水素、ヒドロキシ基、メトキシ基、およびアルコキシ基からなる群から選択され；Ｒ３は、水素、ヒドロキシ基、メトキシ基、エトキシ基、およびアルコキシ基からなる群から選択され；Ｒ４は、水素、ヒドロキシ基およびアルコキシ基からなる群から選択され；Ｒ５は、水素、ヒドロキシル、カルボニル、アルコキシおよび結合からなる群から選択され；Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ４０アルキル、Ｃ１〜Ｃ４０置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ４０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ４０置換アルケニルおよびＣ１〜Ｃ４０アルキンル（ａｌｋｙｎｌ）からなる群から選択され；Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ４０アルキル、Ｃ１〜Ｃ４０置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ４０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ４０置換アルケニルおよびＣ１〜Ｃ４０アルキンル（ａｌｋｙｎｌ）からなる群から選択され；そしてＲ８は、水素、ヒドロキシル基、カルボニル、アルコキシ基および結合からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
患者におけるＩ型ＮＫＴ細胞媒介組織損傷を阻害するための方法において、有効量のＲＡＲアゴニストを前記患者に投与するステップを含み、Ｉ型ＮＫＴ細胞の活性を減少させることを特徴とする、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、前記組織が、肝組織であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の方法において、前記Ｉ型ＮＫＴ細胞活性が、ＩＬ−４分泌であることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１２乃至１４の何れか一項に記載の方法において、前記ＲＡＲアゴニストが、タザロテン、ＡＴＲＡまたはイソトレチノインからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１２乃至１５の何れか一項に記載の方法において、前記ＲＡＲアゴニストが、ＲＡＲ−β２アゴニストであることを特徴とする方法。
【請求項１７】
患者におけるＩ型ＮＫＴ細胞媒介組織損傷を阻害するための方法において、ＩＩ型ＮＫＴ細胞を活性化するのに十分な量のスルファチドを前記患者に投与するステップを含み、Ｉ型ＮＫＴ細胞の活性を減少させることを特徴とする、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、前記スルファチドが、以下の化学構造：
2014517077.tif 000015
を有し、式中、Ｒ１は、結合、水素、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ１〜Ｃ３０置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ３０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ３０置換アルケニルおよびＣ５〜Ｃ１２糖からなる群から選択され；Ｒ２は、水素、ヒドロキシ基、メトキシ基、およびアルコキシ基からなる群から選択され；Ｒ３は、水素、ヒドロキシ基、メトキシ基、エトキシ基、およびアルコキシ基からなる群から選択され；Ｒ４は、水素、ヒドロキシ基およびアルコキシ基からなる群から選択され；Ｒ５は、水素、ヒドロキシル、カルボニル、アルコキシおよび結合からなる群から選択され；Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ４０アルキル、Ｃ１〜Ｃ４０置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ４０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ４０置換アルケニルおよびＣ１〜Ｃ４０アルキンル（ａｌｋｙｎｌ）からなる群から選択され；Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ４０アルキル、Ｃ１〜Ｃ４０置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ４０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ４０置換アルケニルおよびＣ１〜Ｃ４０アルキンル（ａｌｋｙｎｌ）からなる群から選択され；そしてＲ８は、水素、ヒドロキシル基、カルボニル、アルコキシ基および結合からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法において、前記スルファチドが、以下の化学構造：
2014517077.tif 000016
を有することを特徴とする方法。
【請求項２０】
患者における少なくとも１つの炎症状態を処置または予防するための方法において、スルファチドとレチノイドとの組み合わせの有効量を投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
Ｉ型ＮＫＴ細胞の活性化を阻害するための方法において、有効量のレチノイドをＩ型ＮＫＴ細胞に接触させるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
炎症性疾患の患者におけるＩ型ＮＫＴ細胞の活性化を阻害するための方法において、スルファチドとレチノイドとの組み合わせの有効量を前記患者に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】
患者の肝臓内への骨髄細胞の放出を阻害するための方法において、有効量のレチノイドを前記患者に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
患者の肝臓内への骨髄細胞の放出を阻害するための方法において、スルファチドとレチノイドとの組み合わせの有効量を前記患者に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本実施形態は、肝臓の炎症状態の予防および処置においてレチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）を調節するための組成物および方法に関する。
【０００２】
過度のアルコール使用は、西洋における肝疾患の主な原因である。肝傷害の徴候が、１日に４杯以上のアルコール飲料（１２オンスビール４杯、グラスワイン４杯、またはハードリカー４オンス（男性）もしくはその半量（女性））を消費する個体において観察される。どのようにアルコールが肝臓を損傷するかは十分に理解されてはいないが、慢性的なアルコール消費は、炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ６およびＩＬ８）の分泌、酸化ストレス、脂質過酸化反応、およびアセトアルデヒド毒性を結果としてもたらし、その結果として、炎症、アポトーシスおよび最終的には肝細胞の線維化をもたらす。
【０００３】
アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）は、アルコール性脂肪肝疾患、アルコール性肝炎、および肝硬変という３つの主な段階を有する。アルコール性脂肪肝疾患は、肝臓中への脂肪酸の蓄積を特徴とし、通常は無症候性であり、個体が２〜３週間断酒すれば元の状態に戻れる。重度の場合は、衰弱、悪心、腹痛、食欲減退、および倦怠感が経験され得る。ほとんどの大酒家がいくらかのレベルの脂肪肝疾患を示し、場合によっては、深酒を１週間未満以外の期間にわたって毎日行っただけでよいが、大酒家の５人に１人だけがアルコール性肝炎になり、４人に１人が肝硬変になる。アルコール性肝炎は、肝細胞の炎症を特徴とし、一般的に禁酒により元の状態に戻れる。肝硬変は、炎症、線維化（細胞硬化）、および体内の化学物質の無毒化を妨げる損傷膜を特徴とし、瘢痕化および壊死をもたらし、一般的に不可逆的である。
【０００４】
アルコール性肝疾患における肝組織損傷の異なる段階の基礎となる細胞および分子機序は、十分に理解されていない。いくつかの分野で進展が見られたが、この疾患を食い止めるための有効な治療アプローチはまだない。これは、一部には、肝臓が免疫学的にも解剖学的にも独特な臓器であるという事実に起因している。例えば、肝実質細胞が代謝機能を有する一方で、非実質細胞は免疫機能を果たす。肝臓は、肝実質細胞に加えて、ＬＳＥＣ、クップファー細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞などの、全てが免疫に関与し得る、種々の非実質細胞を含有する。どのように免疫応答が調整されてアルコール誘導性損傷に対する耐性または免疫がもたらされるかはいずれも知られていない。
【発明の概要】
【０００５】
本実施形態は、概して、炎症状態と関連する組織損傷を予防および処置するために自然免疫系を調節するための方法および組成物に関する。例えば、本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、自然免疫系を調節することによるアルコール性肝疾患（ＡＬＤ）の予防および処置に関する。
【０００６】
本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、肝臓への炎症関連傷害を処置、軽減または予防するために、Ｉ型ＮＫＴ細胞およびＩＩ型ＮＫＴ細胞の活性化、Ｉ型ＮＫＴ細胞とＩＩ型ＮＫＴ細胞との間の相互作用、ならびに他の肝細胞とのそれらの相互作用を操作するための方法および組成物に関する。一部の実施形態において、炎症関連傷害は、アルコール誘導性肝傷害である。一部の実施形態において、アルコール誘導性肝傷害は、アルコール関連肝疾患、脂肪肝疾患、肝脂肪症、アルコール性肝炎またはアルコール性肝硬変である。
【０００７】
一部の実施形態は、過度のアルコール消費に続く炎症性誘発性肝損傷を、Ｉ型ＮＫＴ細胞活性を阻害することによって予防、緩和または処置する方法に関する。一部の実施形態において、炎症促進性Ｉ型ＮＫＴ細胞活性は、ＡＴＲＡ、レチノール、９−ｃｉｓ−ＲＡまたは１３−ｃｉｓ−ＲＡ、トレチノイン、ＡＭ５８０、ＡＣ５５６４９、ＣＤ１５３０およびタザロテンからなる群から選択される１種以上のＲＡＲアゴニストにより阻害される。一部の実施形態において、炎症促進性Ｉ型ＮＫＴ細胞活性は、１種以上のポリオレフィン性レチノイド（例えば、イソレチノインおよびアシトレチン）によって阻害される。一部の実施形態において、炎症促進性Ｉ型ＮＫＴ細胞活性は、エトレチナート、アシトレチンおよびイソトレチノインからなる群から選択される１種以上のＲＡＲアゴニストによって阻害される。いくつかの実施形態は、タザロテン、タザロテン酸またはそれらの混合物によって炎症促進性Ｉ型ＮＫＴ細胞活性の阻害に関する。一部の実施形態において、炎症促進性Ｉ型ＮＫＴ細胞活性は、２型ＮＫＴ細胞を活性化することによって阻害される。一部の実施形態において、炎症性Ｉ型ＮＫＴ細胞活性は、１種以上のスルファチドによって阻害される。
【０００８】
本開示の一部の実施形態は、アルコール消費に続く、関連する、または起因する肝傷害に繋がる自然免疫機構に関連する。一部の実施形態は、消化管由来または代謝産物由来の抗原に対する寛容性を元来与えると同時に非自己識別される（ｎｏｎ−ｓｅｌｆ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ）病原体に対する免疫も与えるこれらの細胞間の相互作用を操作することに関する。
【０００９】
一部の実施形態は、Ｉ型およびＩＩ型の両方のＮＫＴ細胞を炎症状態と関連する組織損傷を処置、予防または緩和するための有効な療法の開発の標的とした併用療法アプローチに関する。一部の実施形態において、ＲＡＲアゴニストが、１型ＮＫＴ細胞活性を直接阻害するために使用され、スルファチドが、ＩＩ型ＮＫＴ細胞活性を活性化するために使用される。
【００１０】
一部の実施形態は、全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）の投与を通じての、ＡＬＤと関連する組織損傷の予防および処置に関する。いくつかの実施形態は、アルコール誘導性肝傷害、アルコール関連肝疾患、脂肪肝疾患、肝脂肪症、アルコール性肝炎またはアルコール性肝硬変の予防および処置におけるＡＴＲＡの使用に関する。
【００１１】
一部の実施形態は、タザロテン、タザロテン酸またはそれらの混合物の投与を通じての、ＡＬＤと関連する組織損傷の予防および処置に関する。いくつかの実施形態は、アルコール誘導性肝傷害、アルコール関連肝疾患、脂肪肝疾患、肝脂肪症、アルコール性肝炎またはアルコール性肝硬変の予防および処置におけるタザロテン、タザロテン酸またはそれらの混合物の使用に関する。
【００１２】
一部の実施形態は、１種以上のスルファチドの投与を通じての、炎症と関連する組織損傷の予防および処置に関する。いくつかの実施形態は、アルコール誘導性肝傷害、アルコール関連肝疾患、脂肪肝疾患、肝脂肪症、アルコール性肝炎またはアルコール性肝硬変の予防および処置におけるスルファチドの使用に関する。一部の実施形態において、スルファチドは、以下の化学構造：
2014517077.tif 000003
を有する。
【００１３】
式中、Ｒ１は、結合、水素、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ１〜Ｃ３０置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ３０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ３０置換アルケニルおよびＣ５〜Ｃ１２糖からなる群から選択され；Ｒ２は、水素、ヒドロキシ基、メトキシ基、およびアルコキシ基からなる群から選択され；Ｒ３は、水素、ヒドロキシ基、メトキシ基、エトキシ基、およびアルコキシ基からなる群から選択され；Ｒ４は、水素、ヒドロキシ基およびアルコキシ基からなる群から選択され；Ｒ５は、水素、ヒドロキシル、カルボニル、アルコキシおよび結合からなる群から選択され；Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ４０アルキル、Ｃ１〜Ｃ４０置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ４０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ４０置換アルケニルおよびＣ１〜Ｃ４０アルキンル（ａｌｋｙｎｌ）からなる群から選択され；Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ４０アルキル、Ｃ１〜Ｃ４０置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ４０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ４０置換アルケニルおよびＣ１〜Ｃ４０アルキンル（ａｌｋｙｎｌ）からなる群から選択され；そしてＲ８は、水素、ヒドロキシル基、カルボニル、アルコキシ基および結合からなる群から選択される。一部の実施形態において、スルファチドは、以下の化学構造：
2014517077.tif 000004
を有する。
【００１４】
一部の実施形態は、活性化されたスルファチド反応性ＩＩ型ＮＫＴ細胞によるＩ型ＮＫＴ細胞の調節に関する。いくつかの実施形態は、自己免疫疾患からの保護および抗腫瘍免疫の抑制をもたらすことにおける、活性化されたスルファチド反応性ＩＩ型ＮＫＴ細胞の、Ｉ型ＮＫＴ細胞に対する調節的役割に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１ａ】図１ａは、肝臓におけるＩ型ＮＫＴに対するスルファチドの効果を決定する方法を描写している。
【図１ｂ】図１ｂは、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２の存在下または不在下におけるαＧａｌＣｅｒでのインビトロチャレンジに応答した細胞増殖を測定した２つの独立した実験の代表的なデータを示している。
【図１ｃ】図１ｃは、２０μｇのスルファチドの注射に続く、ＩＦＮ−γ＋細胞を特定するための肝臓中のスルファチド／ＣＤ１ｄ−テトラマー＋およびテトラマー−の個体群の細胞質内染色の結果を示している。ブラケット上の数値は、ＰＢＳまたはスルファチドを注射されたマウスにおける％陽性細胞を示している。
【図１ｄ】図１ｄは、ＣｏｎＡのみ（上段）またはＣｏｎＡ＋ウシ脳スルファチドスルファチド（下段）での処置の１２〜９６時間後にマウスから採取された、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色された代表的な肝臓切片の顕微鏡写真（×２００）を示している。左下は、スルファチドのみを注射されたコントロールマウスからのＨ＆Ｅ染色肝臓切片の代表的な顕微鏡写真を示している。
【図１ｅ】図１ｅは、ＣｏｎＡ（塗りつぶした記号）またはＣｏｎＡ＋スルファチド（白抜きの記号）の注射後の異なる時点におけるＩＬ−１２ｐ４０＋／＋マウス中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルを描写するグラフを示している。値は、１群５匹のマウスの平均±ＳＤである。Ｐ＜０．００１。
【図２ａ】図２ａは、シャム手術（ｓｈａｍｅ  ｓｕｒｇｅｒｙ）または虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）に供された野生型（ＷＴ）マウス、Ｊα１８−／−変異マウスおよびスルファチド処置ＷＴマウスの頭側肝小葉（ｃｅｐｈａｌａｄ  ｌｉｖｅｒ  ｌｏｂｅ）から単離された、Ｇｒ−１／ＣＤ１１ｂ発現細胞のフロープロットを示している。囲みは、図２ｂにおいて分析されたＧｒ−１ｈｉｇｈ個体群およびＧｒ−１ｉｎｔ個体群を示している。囲みのすぐそばの数値は、肝臓白血球中のパーセント陽性細胞を示す。
【図２ｂ】図２ｂは、フローサイトメトリー分析をまとめた棒グラフを示している。左パネルは、％を描写しており、右パネルは、Ｇｒ−１ｈｉｇｈ個体群およびＧｒ−１ｉｎｔ個体群の絶対数を描写している。値は、平均±ＳＥＭである。＊ｐ＜０．００５。
【図２ｃ】図２ｃは、ＩＲＩマウス、シャムマウスおよびスルファチド処置ＩＲＩマウスの肝臓中の％ＩＦＮ−γ＋αＧａｌＣｅｒ／ＣＤ１ｄ−テトラマー＋細胞を描写するグラフを示している。値は、平均±ＳＥＭである。ｐ＜０．０１。
【図３】図３は、Ｉ型およびＩＩ型ＮＫＴ細胞活性のスルファチド介入のモデルを描写している。このモデルによれば、スルファチドがＩＩ型ＮＫＴ細胞の活性化を促進し、延いてはこれが、Ｉ型ＮＫＴ細胞を不活性化する。Ｉ型ＮＫＴ細胞の阻害は、ＩＦＮ−γ分泌の阻害により実証され、骨髄細胞、顆粒球の肝臓動員の減少を結果としてもたらし、その結果として肝細胞および内皮細胞傷害の減少をもたらす。
【図４】図４は、９０分間の肝虚血、それに続く２４時間の再灌流に供されたマウス（ＩＲＩ）（上段）およびシャム手術に供されたマウス（シャム）（下段）の頭側肝小葉からのＨ＆Ｅ染色組織の１００×倍率での代表的な顕微鏡写真を示している。これらのパネルは、左から右に、非処置ＷＴマウス、非処置Ｊα１８−／−マウス、スルファチド処置ＷＴマウス、およびスルファチド処置Ｊα１８−／−マウスからの組織を示している。
【図５】図５は、５％エタノールを含有する液体Ｌｉｅｂｅｒ−Ｄｅｃａｒｌｉ食餌または同様のカロリー数を含有するコントロール食餌の５週間の給餌に続く、雄ＢＬ／６ＷＴマウスまたはＪα１８−／−マウスの群（各４匹）から単離された肝臓ＭＮＣのフローサイトメトリー分析をまとめたグラフを示している。Ｐ値＜０．００５。活性化されたＩ型ＮＫＴ細胞およびＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋骨髄細胞の蓄積は、ＷＴマウスの肝臓においては観察されたが、Ｊａ１８−／−マウスの肝臓においては観察されなかった。
【図６】図６は、２０マイクログラム／マウスのスルファチド（１日目および１０日目）（横線で陰影が付けられた棒（スルファチド））、０．３ミリグラム／動物のＡＴＲＡ（６日目〜１０日目）（縦線で陰影が付けられた棒（ａｔＲＡ））またはビヒクル／ＤＭＳＯ（無地の陰影が付けられた棒（ＥｔＯＨ））を注射（ｉ．ｐ．）され、アルコールを含有するＬｉｅｂｅｒ−ＤｅＣａｒｌｉ液体食餌を給餌されたＷＴ（Ｂ６）マウスおよびＪα１８−／−マウスにおける血清ＡＬＴレベルを描写する棒グラフを示している。コントロール群（陰影が付けられていない棒）には、等カロリーのコントロール食餌が給餌された。Ｐ値＜０．０５。
【図７】図７は、ビヒクル／ＤＭＳＯ、スルファチドおよびＡＴＲＡで処置されたマウスから、慢性的＋過エタノール給餌に続いて採取された肝組織の代表的な顕微鏡写真（×２００）を示している。ビヒクル／ＤＭＳＯマウスからの肝組織は、肝脂肪性肝炎（ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）（脂肪肝疾患）の徴候を示しているが、スルファチドおよびＡＴＲＡで処置されたマウスから得られた肝組織は、比較的正常であるように見える。
【図８ａ】図８ａは、αＧａｌＣｅｒのみ、ＡＴＲＡのみ、または増加していくレベルのＡＴＲＡを含むαＧａｌＣｅｒにおいてインキュベートされた、新たに単離されたＩ型ＮＫＴ脾細胞の増殖（［３Ｈ］−チミジン取り込みにより測定された場合）を描写する棒グラフを示している。
【図８ｂ】図８ｂは、αＧａｌＣｅｒのみまたはαＧａｌＣｅｒおよび増加していくＡＴＲＡレベルに応答したＩ型ＮＫＴ細胞（Ｈｙ１．２）によるＩＬ−２サイトカイン分泌のレベルを描写するグラフを示している。
【図８ｃ】図８ｃは、ＤＭＳＯまたはＡＴＲＡを注射されたマウスから採取され、インビトロでαＧａｌＣｅｒと共にインキュベートされた肝臓Ｉ型ＮＫＴ細胞によるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２サイトカイン分泌のレベルを描写するグラフを示している。示されたデータは、２つの別個の実験を代表している。
【図９ａ】図９ａは、慢性的給餌（液体Ｌｉｅｂｅｒ−ＤｅＣａｒｌｉ食餌中５％のエタノールを１０日）または慢性的＋過給餌（１０日間の液体食餌の慢性的給餌、それに続く５ｇ／ｋｇのエタノールの単回強制飼養）に続く、雄ＢＬ／６およびＪα１８−／−マウスから採取されたＨ＆Ｅ染色肝組織の代表的な顕微鏡写真（×２００）を示している。
【図９ｂ】図９ｂは、コントロールまたはエタノール給餌された雄ＢＬ／６またはＪα１８−／−マウスにおける、慢性的給餌または慢性的＋過給餌に続く、血清ＡＬＴレベルを描写するグラフを示している。
【図１０】図１０は、ナイーブＢ１０．ＰＬ  Ｖβ８．２ＴＣＲトランスジェニックマウスから単離された、ＭＢＰＡｃ１−９のみまたはＭＢＰＡｃ１−９および段階的濃度のＡＴＲＡ（０．１５、１．２、１８．８μｇ／ｍｌ）による刺激に応答した新たに単離されたミエリン塩基性タンパク質ＭＢＰＡｃ１−９反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖（［３Ｈ］−チミジン取り込みにより測定された場合）を描写する棒グラフを示している。
【図１１】図１１は、段階的濃度の脂質抗原αＧａｌＣｅｒおよび０、５、または１０μｇ／ｍｌのＡＴＲＡと共に、インビトロで２４時間にわたり培養されたＩ型ＮＫＴ細胞（Ｈｙ１．２）により分泌されたＩＬ−２のレベルを描写するグラフを示している。
【図１２】図１２は、αＧａｌＣｅｒおよび段階的濃度のＡＴＲＡ、ＲＡＲαのアゴニスト（ＡＭ５８０）、ＲＡＲβ２のアゴニスト（ＡＣ５５６４９）またはＲＡＲγのアゴニスト（ＣＤ１５３０）の存在下において培養された、新たに単離されたＩ型ＮＫＴ脾細胞の増殖（［３Ｈ］−チミジン取り込みにより測定された場合）を描写するグラフを示している。
【図１３】図１３は、αＧａｌＣｅｒおよび段階的濃度のＰＰＡＲ−γのアゴニスト（ロシグリタゾン）またはＰＰＡＲ−γのアンタゴニスト（ＧＷ９６６２）の存在下において培養された、新たに単離されたＩ型ＮＫＴ脾細胞の増殖（［３Ｈ］−チミジン取り込みにより測定された場合）を描写するグラフを示している。
【図１４】図１４は、αＧａｌＣｅｒおよび段階的濃度のＡＴＲＡ、異なるレチノイン酸アナログ、レチノールまたはビタミンＡの存在下において培養された、新たに単離されたＩ型ＮＫＴ脾細胞の増殖（［３Ｈ］−チミジン取り込みにより測定された場合）を描写するグラフを示している。
【図１５】図１５は、最適濃度のαＧａｌＣｅｒ（１０ｎｇ／ｍｌ）および最適濃度のＡＴＲＡ、トレチノイン、ＲＡＲαのアゴニスト（ＡＭ５８０）、ＲＡＲβ２のアゴニスト（ＡＣ５５６４９）またはＲＡＲγのアゴニスト（ＣＤ１５３０）の存在下において培養された、新たに単離されたＩ型ＮＫＴ脾細胞（左）またはＩ型ＮＫＴ細胞ハイブリドーマ（１．２Ｈｙｂ）の増殖（［３Ｈ］−チミジン取り込みにより測定された場合）を描写する棒グラフを示している。これらのグラフは、３つの独立した実験のデータを代表している。
【図１６】図１６は、増加していく濃度のＡＴＲＡまたは選択的ＲＡＲγアゴニストタザロテンの存在下において最適濃度のαＧａｌＣｅｒ（１０ｎｇ／ｍｌ）と共に培養された、新たに単離された脾細胞のインビトロ増殖（上パネル）またはＩ型ＮＫＴ細胞ハイブリドーマ（１．２Ｈｙｂ）のサイトカイン放出アッセイ（下パネル）の結果を描写するグラフを示している。タザロテンは、ＡＴＲＡよりも優れた、Ｉ型ＮＫＴ細胞の阻害を示す。
【図１７】図１７は、タザロテン、ＡＴＲＡまたはＤＭＳＯ（コントロール）で処置されたマウスから単離され、滴定濃度のαＧａｌＣｅｒにより刺激されたＩ型ＮＫＴ細胞の増殖アッセイにおけるエキソビボの結果を描写するグラフを示している。
【図１８】図１８は、ＡＴＲＡ、タザロテンまたはＤＭＳＯ（コントロール）を注射されたマウスの肝臓から単離され、αＧａｌＣｅｒ／ＣＤ１ｄ−テトラマーおよび汎抗ＴＣＲβ鎖抗体で染色された単核細胞のフローサイトメトリーによる分析結果を示している。Ｉ型ＮＫＴ細胞は、囲みに示されている。ＡＴＲＡまたはタザロテン投与動物と比較して、コントロールにおけるＩ型ＮＫＴ細胞の数（囲みのすぐそばに示されている）に著しい差はなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
肝臓は、自然免疫系の多くの特殊化した細胞（クップファー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞および樹状細胞を含む）を含んでいる。ＮＫＴ細胞は、それらはＮＫ細胞の細胞表面レセプター（例えば、ＮＫ１．１）を共有し、さらにＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現して、それらが脂質抗原をＣＤ１ｄ分子に関連して認識し、自然免疫応答を適応免疫に橋渡しすることを可能にしているという点で、独特である。ＮＫＴ細胞は、組織の炎症および関連する細胞損傷に寄与する他の細胞の活性を調節する能力を有している。ＮＫＴ細胞は、活性化すると、大量のＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、ならびに複数の他のサイトカインおよびケモカインを迅速に分泌する。ＮＫＴ細胞はＴｈ１およびＴｈ２サイトカインの両方を分泌することが可能であるので、インビボでのＮＫＴ細胞活性化の結果を予測することは困難である。状況に応じて、ＮＫＴ細胞活性化は、異なる免疫応答を促進または抑制する事象のカスケードの引き金となる。状況により、ＮＫＴ細胞の活性化は、ＮＫ細胞、樹状細胞（ＤＣ）およびＢ細胞の活性化に繋がる。
【００１７】
ＮＫＴ細胞は、単形性ＭＨＣクラスＩ様分子ＣＤ１ｄと関連して提示される脂質抗原を認識する。ＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞は、Ｉ型およびＩＩ型に分類され、これらは、ＣＤ１ｄ分子により提示される異なる脂質抗原を認識する。両方のＮＫＴ細胞サブセットが、主にＮＫ１．１＋（マウス）またはＣＤ１６１＋／ＣＤ５６＋（ヒト）であるが、それらの相対数はマウスおよびヒトにおいて異なる、すなわち、マウスにおいてはＩ型ＮＫＴ細胞が圧倒的に多く、ヒトにおいてはＩＩ型ＮＫＴ細胞サブセットが圧倒的に多い。
【００１８】
不変ＮＫＴ細胞としても知られるＩ型は、マウスにおいてはＶα１４−Ｊα１８およびＶβ８．２、Ｖβ７、もしくはＶβ２、またはヒトにおいてはＶα２４−ＪαＱおよびＶβ１１により特徴付けられる、半不変Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現し、海洋海綿由来の糖脂質α−ガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）と強反応性であり、フローサイトメトリーにおいてαＧａｌＣｅｒ／ＣＤ１ｄ−テトラマーにより特定される。Ｉ型ＮＫＴ細胞はまた、脂質ベースの抗原（例えば、細菌由来の脂質および自己糖脂質イソグロボトリヘキソシルセラミド（ｉＧｂ３））も認識する。Ｉ型ＮＫＴ細胞は、記憶マーカーを呈し、そしてサイトカインの予備形成されたｍＲＮＡを貯蔵する点で独特である。Ｊα１８遺伝子のないマウス（Ｊα１８マウス）は、Ｉ型ＮＫＴ細胞のみを欠いている。
【００１９】
ＩＩ型ＮＫＴ細胞は、Ｉ型ＮＫＴ細胞とは異なり、いくつかの他の細胞サブセット（Ｉ型ＮＫＴ細胞を含む）の活性を調節し得る調節細胞である。ＩＩ型ＮＫＴ細胞は、マウスおよびヒトの両方において、自己糖脂質スルファチド（３’−スルホガラクトシルセラミド）を認識する。フローサイトメトリーにおいてスルファチド／ＣＤ１ｄ−テトラマーを用いて特定され得るＩＩ型ＮＫＴ細胞の主要なサブセットは、Ｖβ８．１／Ｖβ３．１−Ｊβ２．７およびＶα１／Ｖα３−Ｊα７遺伝子断片を主に利用し、スルファチドと反応性である。ＩＩ型ＮＫＴ細胞の活性化は、候補薬剤に対するＩＩ型ＮＫＴ細胞のインビトロ増殖応答を評価することにより、ならびにＣ０６９発現を評価することおよびＩＦＮ−γ、ＩＬ−４またはＩＬ−１３についての細胞内サイトカイン染色またはリアルタイムＰＣＲによりサイトカイン分泌プロファイルを評価することにより評価され得る。さらに、活性化されたＩＩ型ＮＫＴ細胞のＩ型ＮＫＴ細胞をアネルギー化する能力は、ＣＦ８Ｅ希薄化分析およびαＧａｌＣｅｒ／ＣＯ１ｄ−テトラマー細胞の細胞内サイトカイン染色を用いて、αＧａｌＣｅｒ（Ｉ型ＮＫＴ細胞の強力な活性剤）に対するＩ型ＮＫＴ細胞の増殖応答を評価することにより評価され得る。
【００２０】
虚血再灌流傷害およびコンカナバリンＡ誘導性肝炎に続く肝臓におけるＩ型およびＩＩ型ＮＫＴ細胞活性
再灌流傷害は、虚血期間後に臓器または組織に対して血液供給が回復される時に生じる。肝再灌流傷害は、一般的に、手術または外傷に関連して生じ、肝臓移植後の移植組織の質および機能において主要な役割を果たす。虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）の発症は、クップファー細胞活性化、反応性酸素種の放出、ＣＤ４＋細胞動員および炎症促進性サイトカインの分泌により特色付けられる（約１〜約６時間の再灌流に続く）初期期間と、好中球蓄積および壊死の誘導により特徴付けられる（約６〜約４８時間の再灌流の初期段階に続く）後期期間との、少なくとも２段階で起こる。図２ａに示されるように、野生型（ＷＴ）マウスにおいて、骨髄系前駆細胞および単球を含む骨髄（ＣＤ１１ｂ＋）細胞サブセットＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１ｉｎｔは、虚血再灌流傷害の初期段階において、再灌流された組織中に動員される。好中球以外の骨髄細胞（例えば、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１ｉｎｔサブセット）の動員は、再灌流された組織中への炎症性単球の動員によって傷害が増強されるということを示唆している。
【００２１】
Ｉ型ＮＫＴ細胞もまた、虚血再灌流に続いて活性化された状態になり、ＩＦＮ−γを分泌する。図２ｃを参照されたい。ＩＲＩにおけるＩ型ＮＫＴ細胞の役割を、野生型（ＷＴ）マウスおよびＩ型ＮＫＴ細胞はないが通常のレベルのＩＩ型ＮＫＴ細胞を有するＪα１８−／−マウスの肝臓を比較することによって評価した。図４に示されるように、９０分間の虚血および２４時間の再灌流に続いて、ＷＴマウスの頭側肝小葉には大きな壊死領域があったが、Ｉ型ＮＫＴ細胞欠失マウス（Ｊα１８−／−マウス）における壊死領域は、比較すると著しく減少した。これは、肝臓の虚血再灌流傷害をもたらすことにおいてＩ型ＮＫＴ細胞が果たす病原的役割を示している。
【００２２】
ＮＫＴ−１細胞に対するスルファチド活性化ＮＫＴ−２細胞の作用
参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許第８，０４４，０２９号明細書および米国特許出願第１２／９３８，３１５号明細書に記載されているように、自己糖脂質リガンドであるスルファチド、および合成スルファチドアナログの投与は、Ｉ型およびＩＩ型ＮＫＴ細胞の活性を調節する。スルファチドのＣＤ１ｄ依存性認識は、ＩＩ型ＮＫＴ細胞および主に形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を活性化するが、通常樹状細胞（ｃＤＣ）個体群（通常は１型ＮＫＴ細胞により活性化される）を活性化せず、ＩＬ−１２およびＭＩＰ２依存的な様式での肝臓中へのＩ型ＮＫＴ細胞の迅速な動員に繋がる。しかしながら、動員されたＩ型ＮＫＴ細胞は、活性化されず、サイトカインを分泌せず、アネルギーの状態になる。
【００２３】
インビボでのスルファチド投与に続く免疫調節機構に関連した細胞事象が、図１に示されている。スルファチドの投与は、ａ）αＧａｌＣｅｒによる刺激に応答したＩ型ＮＫＴ細胞のインビトロ増殖を抑制し（図１ｂ）、ｂ）細胞質内ＩＦＮ−γ染色を伴うスルファチド／ＣＤ１ｄ−テトラマー＋細胞の割合を増加させる（図１ｃ）。
【００２４】
虚血再灌流傷害の初期段階の間の肝臓Ｉ型ＮＫＴ細胞によるＩＦＮ−γの分泌は、スルファチドを与えられたマウスにおいて、非処置動物に比べて著しく減少する。図２ｃを参照されたい。さらに、Ｊα１８−／−マウスにおけるＩ型ＮＫＴ細胞の不在の場合と同様に、虚血／再灌流に続く肝傷害は、スルファチドで処置されたマウスにおいて著しく減少する。図４を参照されたい。これは、肝臓の虚血再灌流傷害をもたらすことにおいてＩ型ＮＫＴ細胞が果たす病原的役割を示している。Ｉ型ＮＫＴ細胞によるＩＦＮ−γ分泌の役割は、虚血臓器障害の一般的な特徴であり得る、というのは、腎臓の虚血再灌流傷害もまた、１型ＮＫＴがないＪα１８−／−マウスにおいて和らげられるからである。
【００２５】
ＩＲＩと同様に、スルファチド投与は、肝細胞壊死の減少（図１ｄ参照）、ならびに肝細胞損傷のマーカーであるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血清レベルの減少（図１ｅ参照）により示されるように、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）誘導性肝炎を防ぐ。これは、ＣｏｎＡ誘導性肝炎においてＩ型ＮＫＴ細胞が果たす病原的役割を示している。
【００２６】
まとめると、ＩＲＩおよびＣｏｎＡ誘導性肝炎の両方の肝損傷モデルからのデータは、様々な原因から生じる肝炎症においてＩ型ＮＫＴ細胞が有害な役割を果たし、スルファチド反応性ＩＩ型ＮＫＴ細胞が保護的な役割を果たすところの、免疫調節経路と一致する。そのような保護は、Ｉ型ＮＫＴ細胞によるサイトカイン分泌の阻害（表現型阻害）、未熟骨髄細胞（ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋）ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１−およびＮＫ細胞の肝臓動員の著しい減少と関連する。Ｉ型ＮＫＴ細胞の阻害はまた、通常樹状細胞（ｃＤＣ）の寛容化または調節とも関連し、それらは、阻害されたＩ型ＮＫＴ細胞と相俟って、適応性Ｔｈ１／Ｔｈ１７  ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化／拡大を阻害する。これは、スルファチドの投与がＩＩ型ＮＫＴ細胞の活性を刺激し、延いてはこれがＩ型ＮＫＴ細胞活性およびＩ型ＮＫＴ細胞媒介炎症により引き起こされる肝損傷を阻害する、モデルに繋がる。図３を参照されたい。
【００２７】
アルコール性肝疾患におけるＮＫＴ細胞の役割
アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）は、過剰のアルコール消費により引き起こされる肝細胞への損傷の結果として発症する。複数の傷害が、ＡＬＤの臨床的発現が観察されるまでに必要とされ得る。しかしながら、本明細書に記載されるように、慢性的アルコール消費に続いて、肝臓において、著しく増加した数のＩ型ＮＫＴ細胞（αＧａｌＣｅｒ／ＣＤ１ｄ−テトラマー＋細胞）、ＣＤ４＋細胞、およびＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋骨髄細胞が観察されるが、そのようなＩＩ型ＮＫＴ細胞またはＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１−細胞は観察されない。実施例６および図５を参照されたい。さらに、ＣＤ６９マーカーの増強された発現が、Ｉ型ＮＫＴ細胞が部分的に活性化されていることを示す。したがって、疾患のあらゆる臨床徴候の不在下（前臨床期）においてでさえ、炎症応答を媒介する細胞が、過剰のアルコール消費に続いて肝臓中に蓄積する。Ｉ型ＮＫＴ細胞の不在下（Ｊα１８−／−マウス）において、慢性的アルコール消費に続く肝臓へのＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋骨髄細胞の蓄積は、著しく減少する。実施例６および図５を参照されたい。これらのデータは、Ｉ型ＮＫＴ細胞が、ＡＬＤの前臨床期をもたらすことに関与しているということを示唆している。
【００２８】
ＡＬＤの前臨床期においてＩ型ＮＫＴ細胞が果たす役割を示唆するデータと一致して、過度のアルコール消費に続く肝損傷の臨床的発現は、例えば組織学および肝臓酵素分析により測定される場合、Ｉ型ＮＫＴ細胞欠失（Ｊα１８−／−）マウスにおいて著しく減少する。実施例６ならびに図６および７を参照されたい。これらのデータは、Ｉ型ＮＫＴ細胞が、肝臓へのアルコール性損傷において重要な役割を果たすということを示唆している。
【００２９】
ＮＫＴ細胞は、それが脂質抗原をＣＤ１ｄ分子に関連して認識することを可能にするＴ細胞レセプターを発現する。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、Ｉ型ＮＫＴ細胞は、エタノール消費に続いて、ＣＤ１ｄを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）による酸化された自己脂質の局所的提示により、肝臓において活性化される。活性化されたＩ型ＮＫＴ細胞は、次いで、クップファー細胞活性化、顆粒球の動員／活性化、それに続く肝細胞への炎症性損傷を結果としてもたらす多段階プロセスを開始する。
【００３０】
アルコール消費に続くＮＫＴ細胞亜型間の相互作用が、肝損傷の引き金になり、重度の場合は、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）の引き金になる。本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、アルコール消費に続く肝臓への傷害を処置、軽減または予防するために、Ｉ型ＮＫＴ細胞およびＩＩ型ＮＫＴ細胞の相対する役割ならびに他の肝細胞とのそれらの相互作用を操作するための方法および組成物に関する。
【００３１】
本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、肝臓へのアルコール誘導性傷害を処置、緩和または予防するために、ＮＫＴ細胞亜型の活性を調節することに関する。本明細書に記載されるように、スルファチドまたはレチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）アゴニストの投与は、アルコール誘導性肝損傷を阻害する。例えば、慢性的アルコール消費の間およびエタノール痛飲の前のスルファチドまたはレチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）アゴニストである全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）の注射は、組織学的調査および血清中の肝臓酵素レベルの分析により示されるように、保護効果を有していた。実施例７ならびに図６および７を参照されたい。
【００３２】
いくつかの実施形態は、スルファチドに反応性のＩＩ型ＮＫＴ細胞の主要なサブセットがアルコール誘導性肝傷害において果たす保護的な役割に関する。スルファチドによるこのＮＫＴ細胞サブセットの活性化は、過剰のアルコール消費に続くＩ型ＮＫＴ細胞媒介傷害を阻害する。スルファチド媒介保護は、ＩＩ型ＮＫＴ細胞の活性化ならびに肝臓Ｉ型ＮＫＴ細胞によるＩＦＮ−γ分泌の阻害ならびに肝臓中への骨髄細胞（例えば、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１ｉｎｔおよびＧｒ−１−サブセット）およびＮＫ細胞のＩ型ＮＫＴ細胞媒介動員の抑制と関連する。
【００３３】
スルファチド処置は、過剰のアルコール消費に続く肝損傷からのほぼ完全な保護を結果としてもたらす。図６および７を参照されたい。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、スルファチドの保護効果は、Ｉ型ＮＫＴ細胞およびｃＤＣに対する阻害効果を発揮するＩＩ型ＮＫＴ細胞の直接的な活性化を通じて媒介される。
【００３４】
２人の健康なドナーの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）からのＴ細胞株を、αＧａｌＣｅｒまたはスルファチドのいずれかでのインビトロ刺激に続いて生じさせ、フローサイトメトリーにより分析した。この細胞株において、２サイクルの刺激に続いて、約２％のＴ細胞株が、スルファチド／ｈＣＤ１ｄ−テトラマーで染まる。マウス系と同様、これらの細胞は、不変Ｖα２４−Ｖα１１  ＴＣＲを用いない。これらのデータは、健康な個体におけるスルファチド反応性ＩＩ型ＮＫＴ細胞の存在を示しており、アルコール性肝疾患におけるヒトＩＩ型ＮＫＴ細胞の特徴付けにおけるスルファチド／ヒトＣＤ１ｄ−テトラマーの使用の有効性を示している。
【００３５】
一部の実施形態において、スルファチドは、例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）から入手される約２０種の異なる種類の混合物であるウシ脳由来スルファチドであり得る。他の実施形態において、スルファチドは半合成であり、単一種のスルファチド、例えば、Ｍａｉｔｒｅｙａ  Ｉｎｃ（Ｐｌｅａｓａｎｔ  Ｇａｐ，ＰＡ，ＵＳＡ）から入手されるｃｉｓ−テトラコセノイルスルファチドまたはリゾスルファチドである。さらに他の実施形態において、スルファチドは、完全に合成のスルファチドであり得る。
【００３６】
ウシ脳ミエリン由来のスルファチドは、飽和／不飽和主アシル鎖（Ｃ２４）の２：１混合物からなり、不飽和はＣ１９にある。いくつかの実施形態は、合成スルファチドアナログ（例えば、飽和アシル鎖（Ｃ２４）および不飽和鎖（Ｃ２４：１）を有するアナログ、ならびに脂肪酸またはスフィンゴシン部分において異なる長さのアシル鎖（より短いおよびより長い、例えば、Ｃ１８、Ｃ３２）で構成されているアナログ、およびガラクトース部分上に３’か４’−の硫酸化基（３’−８０３か４’−８０３）を有する位置異性体の使用に関する。
【００３７】
一部の実施形態において、スルファチドは、以下の化学式Ｉ：
2014517077.tif 000005
を有する。
【００３８】
式中、Ｒ１は、結合、水素、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ１〜Ｃ３０置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ３０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ３０置換アルケニルまたはＣ５〜Ｃ１２糖であり得；Ｒ２は、水素、ヒドロキシ基、メトキシ基、またはアルコキシ基であり得；Ｒ３は、水素、ヒドロキシ基、メトキシ基、エトキシ基、またはアルコキシ基であり得；Ｒ４は、水素、ヒドロキシ基またはアルコキシ基であり得；Ｒ５は、水素、ヒドロキシ基、カルボニル、アルコキシ基または結合であり得；Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ４０アルキル、Ｃ１〜Ｃ４０置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ４０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ４０置換アルケニル、またはＣ１〜Ｃ４０アルキンル（ａｌｋｙｎｌ）であり得；Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ４０アルキル、Ｃ１〜Ｃ４０置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ４０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ４０置換アルケニル、またはＣ１〜Ｃ４０アルキンル（ａｌｋｙｎｌ）であり得；そしてＲ８は、水素、ヒドロキシ基、カルボニル、アルコキシ基または結合であり得る。
【００３９】
他の実施形態において、スルファチドは、以下の化学式ＩＩ：
2014517077.tif 000006
を有する。
【００４０】
式中、Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ４０アルキル、Ｃ１〜Ｃ４０置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ４０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ４０置換アルケニルおよびＣ１〜Ｃ４０アルキンル（ａｌｋｙｎｌ）からなる群から選択され；そしてＲ２は、水素、ヒドロキシル基、カルボニル、アルコキシ基および結合からなる群から選択される。
【００４１】
別の実施形態において、スルファチドは、以下の化学構造：
2014517077.tif 000007
を有する。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「アルキル」とは、任意の非分枝または分枝の飽和炭化水素を意味する。用語「置換アルキル」とは、任意の非分枝または分枝の置換飽和炭化水素を意味する。環式化合物、すなわち、環式炭化水素およびヘテロ原子を有する環式化合物の両方は、「アルキル」の意味の範囲内である。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「置換」とは、官能基での水素原子の任意の置換を意味する。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「官能基」は、その一般的な定義を有し、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、過ハロゲン化アルキル、シロアルキル（ｃｙｌｏａｌｋｙｌ）、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ベンジル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シアノ、およびニトロからなる群から好ましくは選択される化学部分をいう。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語「ハロゲン」および「ハロゲン原子」は、元素の周期表の第１７列の放射安定性原子のうちの任意の１つ、好ましくはフッ素、塩素、臭素、またはヨウ素をいい、フッ素および塩素が特に好ましい。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「アルケニル」とは、任意の非分枝または分枝の、置換または非置換の、不飽和炭化水素を意味する。用語「置換アルケニル」とは、１個以上の官能基で置換されている、任意の非分枝または分枝の、置換不飽和炭化水素を意味し、非分枝Ｃ２〜Ｃ６アルケニル第２級アミン、置換Ｃ２〜Ｃ６第２級アルケニルアミン、および非分枝Ｃ２〜Ｃ６アルケニル第３級アミンは、「置換アルキル」の定義の範囲内である。環式化合物、すなわち、不飽和環式炭化水素およびヘテロ原子を有する環式化合物の両方は、「アルケニル」の意味の範囲内である。
【００４７】
本明細書で使用される場合、用語「アルコキシ」は、任意の非分枝または分枝の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、エーテルをいう。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「スルファチド」は、その一般的な慣例の意味を保持し、分子の糖部分中に１個以上のスルフェート基を含有するセレブロシド硫酸エステルをいう。
【００４９】
本明細書で使用される場合、用語「セレブロシド」は、糖を含有する任意の脂質化合物であって、概して、脳および神経組織において通常見られる種類のものをいう。
【００５０】
式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の化合物は、その薬学的に受容可能な無毒の塩の形態にあり得る。式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の塩としては、酸付加塩、例えば、無機酸（例えば、塩酸、硫酸、硝酸およびリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、オレイン酸、パルミチン酸、クエン酸、コハク酸、酒石酸、フマル酸、グルタミン酸、パントテン酸、ラウリルスルホン酸、メタンスルホン酸およびフタル酸）との塩が挙げられる。
【００５１】
式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の化合物は、その溶媒和物（例えば、水和物）の形態にあり得る。
【００５２】
式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の化合物は、スルファチドを合成するための目的にかなう任意の方法により製造され得る。
【００５３】
式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の化合物はまた、天然物（例えば、生物有機体）から単離され、カラムクロマトグラフィーなどにより精製され得る。
【００５４】
１つの実施形態において、スルファチドは、化学式：（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−Ｎ−ネルボニック（ｎｅｒｖｏｎｉｃ）−１−［−Ｄ−（３−スルフェート）−ガラクトピラノシル］−２−アミノ−オクタデセン−３−オールを有する。この化学式はまた、ｃｉｓ−テトラコセノイルスルファチドとも称される。
【００５５】
一部の実施形態において、患者に投与されるスルファチドの具体的な量は、処置される疾患または状態、ならびに処置される患者の年齢、体重および性別によって異なる。一般的に、そのような最終濃度を例えば腸または血液において達成するためには、本実施形態の単回投与量組成物中のスルファチド分子の量は、概して、約０．１ミリグラム〜約１００ミリグラム、好ましくは約２．０ミリグラム〜約６０ミリグラム、より好ましくは約２０ミリグラム〜約５０ミリグラムである。同様に、本実施形態の単回経口投与量組成物中の第２の治療化合物の量は、概して、約０．０１ミリグラム〜約１０００ミリグラム、より好ましくは約０．１ミリグラム〜約１００ミリグラムの範囲内である。当然、正確な投与量は、処置される疾患または障害によって異なるが、好ましい範囲は、容易に決定できる。
【００５６】
１つの実施形態において、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重のスルファチドが、患者に投与される。より好ましくは、１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重のスルファチドが投与される。好ましくは、この投薬は、必要に応じて毎日繰り返される。
【００５７】
ＮＫＴ細胞活性に対するレチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）アゴニストの作用
本明細書に記載されるように、レチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）アゴニストである全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）の投与は、アルコール消費により引き起こされる肝損傷を著しく阻害する。エタノール摂取は、肝臓レチニルエステルを枯渇させ、かつ、多くの生物学的機能を支持しかつＦｏｘＰ３＋ＴｒｅｇへのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞分化の発生、安定性および機能をＩＬ−６の存在下においても高め得るビタミンＡの生物学的に活性な形態である全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）の生理学的レベルを変化させる。本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、ＡＴＲＡがＩ型ＮＫＴ細胞のエフェクター機能を阻害する（これらの細胞によるサイトカイン分泌を抑制することを含む）という発見に関する。実施例８、９および１１ならびに図８、１０および１１を参照されたい。さらに、ＡＴＲＡは、Ｉ型ＮＫＴ細胞活性に対する直接的な阻害効果を有し、抗原提示細胞の不在下においてその阻害効果を発揮する。実施例１１、図１１を参照されたい。さらに、ＡＴＲＡは、タンパク質抗原（例えば、骨髄塩基性タンパク質またはＭＢＰＡｃ１−９）を認識する通常ＭＨＣ拘束性ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性を直接的には阻害しない。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、これらのデータは、ＡＴＲＡが、Ｉ型ＮＫＴ細胞を阻害することによって過度のアルコール消費により引き起こされる肝損傷を防ぐことを示している。
【００５８】
本明細書に記載されるように、ＲＡＲアゴニストは、Ｉ型ＮＫＴ細胞における阻害を誘導する。図１２、１４および１５〜１７を参照されたい。さらに、過剰のアルコール消費の結果としてもたらされるＩ型ＮＫＴ細胞媒介炎症により引き起こされる肝損傷が、ＲＡＲアゴニストの投与により予防、減少または緩和され得る。肝臓は、様々な異なる理由から、炎症を起こした状態になり得る。例えば、肝炎症は、細菌またはウイルス感染、傷害、または自己の免疫系からの攻撃により引き起こされ得る。炎症は、通常は保護的な応答であり、治癒過程の必須段階であるが、長期のまたは慢性的な炎症は、傷害を引き起こし得る。本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、炎症に続く、関連する、または起因する肝傷害に繋がる自然免疫機構のＲＡＲアゴニスト媒介調節に関する。一部の実施形態は、Ｉ型ＮＫＴ細胞活性のＲＡＲアゴニスト媒介阻害のための方法および組成物であって、非自己識別される病原体に対する自然免疫応答に影響を与えることなくまたはほとんど影響を与えずに、消化管由来または代謝産物由来の抗原に対する寛容性を提供するように自然免疫系成分間の相互作用を調節する方法および組成物に関する。
【００５９】
ＲＡＲアゴニストはＩ型ＮＫＴ細胞を直接アネルギー化し得るので、ＲＡＲアゴニストは、Ｉ型ＮＫＴ細胞が病原的役割を果たすあらゆる適応症を処置するために使用され得る。本開示の実施形態により処置され得る疾患の一部の例としては、アルコール誘導性肝炎、非アルコール性脂肪症肝炎（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｓｉｓ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、肝硬変、劇症肝硬変、突発性肝炎、ウイルス誘発性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型およびその他）、肝胆管癌種と関連する炎症性肝炎、多発性硬化症、１型糖尿病、虚血再灌流傷害、実質臓器移植、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、筋萎縮性側索硬化症、および炎症性腸疾患（クローン病および大腸炎）が挙げられる。
【００６０】
一部の実施形態において、自己免疫または免疫関連の疾患または障害の様々な適応症が、Ｉ型ＮＫＴ細胞活性のＲＡＲアゴニスト媒介阻害により処置、予防または緩和される。特に、本実施形態の１つの態様は、自己免疫または免疫関連の疾患または障害（例えば、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、関節リウマチ、インスリン依存性真性糖尿病、自己免疫性肝炎、喘息、およびセリアック病など）の症状を患っている患者を、有効量のＲＡＲアゴニストで処置する方法に関連する。一部の実施形態において、Ｉ型ＮＫＴ細胞活性のＲＡＲアゴニスト媒介阻害は、喘息症状を処置、予防または緩和する。
【００６１】
一部の実施形態は、虚血再灌流に続くＩ型ＮＫＴ細胞媒介炎症を、ＲＡＲアゴニストを投与することによって阻害または予防する方法に関する。Ｉ型ＮＫＴ細胞は、虚血および再灌流傷害などの状態において病原的役割を果たす。再灌流傷害は、種々の組織において、虚血期間後に血液供給が回復される時に生じ得る。例としては、圧挫後の骨格筋組織、心筋梗塞もしくは心臓手術または虚血性心疾患に関連した心筋、脳卒中または脳外傷に関連した神経組織、ならびに手術または外傷に関連した肝組織および腎組織が挙げられる。虚血再灌流傷害はまた、臓器移植における移植組織の質および機能において主要な役割を果たす。虚血再灌流傷害は、入院期間の増加および長期移植片生着の減少の主な原因である。一部の実施形態において、Ｉ型ＮＫＴ細胞活性のＲＡＲアゴニスト媒介阻害は、手術または外傷に関連した肝虚血再灌流傷害を阻害または予防する。
【００６２】
本明細書に記載される実施形態は、１種以上のレチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）アゴニストによるＩ型ＮＫＴ細胞活性の阻害に関する。レチノイン酸レセプターは、ＲＡＲα、ＲＡＲβ、およびＲＡＲγという３つの主要な亜型を含む。一部の実施形態は、１種以上の汎活性ＲＡＲアゴニスト、そのような汎活性ＲＡＲアゴニストの前駆体およびそれらの混合物によるＩ型ＮＫＴ細胞活性の阻害に関する。本明細書で使用される場合、用語「汎活性（ｐａｎ−ａｃｔｉｖｅ）ＲＡＲアゴニスト」は、ＲＡＲα、ＲＡＲβ、およびＲＡＲγに実質的に等しくまたは非選択的に影響を与える（例えば、活性化する）ＲＡＲアゴニストをいう。一部の実施形態は、ＲＡＲαに比べてＲＡＲβおよびＲＡＲγの少なくとも一方、好ましくは両方に、選択的にまたはさらには特異的に影響を与える（例えば、活性化する）のに有効な、１種以上の活性ＲＡＲアゴニスト、そのような活性ＲＡＲアゴニストの前駆体およびそれらの混合物によるＩ型ＮＫＴ細胞活性の阻害に関する。この文脈において使用される場合、用語「選択的に」とは、ＲＡＲアゴニスト、ＲＡＲアゴニストの前駆体およびそれらの混合物が、ＲＡＲαに比べてＲＡＲβおよびＲＡＲγの少なくとも一方、好ましくは両方に影響を与えるのにより有効、好ましくは少なくとも約１０倍または約１００倍〜約１０００倍またはそれ以上有効であることを意味する。一部の実施形態は、１種以上の亜型選択的ＲＡＲアゴニスト、そのような亜型選択的ＲＡＲアゴニストの前駆体およびそれらの混合物によるＩ型ＮＫＴ細胞活性の阻害に関する。本明細書で使用される場合、用語「亜型選択的ＲＡＲアゴニスト」は、１つのＲＡＲ亜型に選択的に影響を与える（例えば、活性化する）ＲＡＲアゴニストをいう。ＲＡＲα、ＲＡＲβ、およびＲＡＲγ選択性を有するレチノイド化合物は、当該技術分野において知られており、例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許第６，５３４，５４４号明細書および第６，０２５，３８８号明細書に開示されている。
【００６３】
いくつかの実施形態は、１種以上のレチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）アゴニストを投与することにより炎症促進性Ｉ型ＮＫＴ細胞活性を阻害する方法に関する。ＲＡＲアゴニストの例としては、表１に列挙されるＲＡＲアゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。
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【００６４】
いくつかの実施形態において、炎症促進性Ｉ型ＮＫＴ細胞活性は、ＡＴＲＡ、レチノール、９−ｃｉｓ−ＲＡもしくは１３−ｃｉｓ−ＲＡ、トレチノイン、ＡＭ５８０、ＡＣ５５６４９、ＣＤ１５３０またはタザロテンからなる群から選択される１種以上のＲＡＲアゴニストにより阻害される。いくつかの実施形態において、炎症促進性Ｉ型ＮＫＴ細胞活性は、１種以上のポリオレフィン性レチノイド（例えば、イソレチノインおよびアシトレチン）により阻害される。一部の実施形態において、炎症促進性Ｉ型ＮＫＴ細胞活性は、エトレチナート、アシトレチンおよびイソトレチノインからなる群から選択される１種以上のＲＡＲアゴニストにより阻害される。
【００６５】
いくつかの実施形態は、タザロテン、タザロテン酸またはそれらの混合物による炎症促進性Ｉ型ＮＫＴ細胞活性の阻害に関する。タザロテンは、対応する遊離酸であるタザロテン酸へと代謝されるエチルエステルプロドラッグである。タザロテンは、レチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）の天然リガンドである全トランス型レチノイン酸に比べて限られた構造的柔軟性を提供する、硬い、環固定（ｒｉｎｇ−ｌｏｃｋｅｄ）構造を有している。こうした構造変化が、ＲＡＲに対する特異性ならびにＲＡＲβおよびＲＡＲγに対する選択性を有するタザロテン酸をもたらす。
【００６６】
ＲＡＲアゴニストの例としてはさらに、ｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−レチノイン酸のエステル、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、ブチル、イソ−ブチル、ヘキシル、ヘプチル、エチルへキシル、オクチル、ノニル、ラウリル、オレイル、ステアリル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、ベンジル、α−メチルベンジル、α−プロピルフェニル、アミル、イソ−アミル、アニシル、セチル、メンチル、シンナミル、ピナコール、フリル、またはミリスチルを含む（しかしこれらに限定されない）第１級、第２級または第３級アルコールなどのアルキルエステルが挙げられる。
【００６７】
ＲＡＲアゴニストの薬学的に受容可能な塩もまた、Ｉ型ＮＫＴ細胞活性を阻害するために使用され得る。本明細書に開示される化合物は、十分に酸性、十分に塩基性、またはその両方の官能基を有しており、したがって、多くの有機または無機塩基、ならびに無機および有機酸のうちの任意のものと反応して塩を形成し得る。
【００６８】
塩基性基を有するＲＡＲアゴニストから酸付加塩を形成するために使用され得る酸の例としては、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸など）および有機酸（例えば、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニル−スルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸など）が挙げられる。そのような塩の例としては、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、一水素リン酸塩、二水素リン酸塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−二酸塩、ヘキシン−１，６−二酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、マンデル酸塩などが挙げられる。
【００６９】
酸性基を有するＲＡＲアゴニストからの塩基付加塩を形成するために使用され得る塩基の例としては、アルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム、およびリチウム）の水酸化物；アルカリ土類金属（例えば、カルシウムおよびマグネシウム）の水酸化物；他の金属（例えば、アルミニウムおよび亜鉛）の水酸化物；アンモニア、および有機アミン（例えば、非置換またはヒドロキシ置換のモノ、ジ、またはトリアルキルアミン；ジシクロへキシルアミン；トリブチルアミン；ピリジン；Ｎ−メチル、Ｎ−エチルアミン；ジエチルアミン；トリエチルアミン；モノ−、ビス−、もしくはトリス−（２−ヒドロキシ−低級アルキルアミン）（例えば、モノ−、ビス−、もしくはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン）、２−ヒドロキシ−ｔｅｒｔ−ブチルアミン、またはトリス−（ヒドロキシメチル）メチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−Ｎ−（ヒドロキシ低級アルキル）−アミン（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アミン）、またはトリ−（２−ヒドロキシエチル）アミン；Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン；ならびにアミノ酸（例えば、アルギニン、リジン））などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
本明細書で使用される場合、用語「患者」は、治療的処置のレシピエントをいい、動物界内の全ての生物体を含む。好ましい実施形態において、動物は、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、バッファロー、イヌ、ヤギ、ウマ、ロバ、シカおよび霊長類）の科の範囲内にある。最も好ましい動物は、ヒトである。
【００７１】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置すること」および「処置」は、それぞれ「予防する」、「予防すること」および「予防」を含む。
【００７２】
本明細書で使用される場合、薬剤の「有効量」という用語は、炎症促進性Ｉ型ＮＫＴ細胞活性の結果としてもたらされる肝損傷を処置、阻害、または予防するのに十分な量である。
【００７３】
一部の実施形態は、ＡＬＤの臨床的発現に先立つスルファチドおよび／またはＲＡＲアゴニストでの患者の前処置に関する。いくつかの実施形態において、患者は、過アルコール消費に先立って有効量のスルファチドおよび／またはＲＡＲアゴニストで処置される。一部の他の実施形態において、患者は、過アルコール消費の約０．５時間〜約１８時間前に、有効量のスルファチドおよび／またはＲＡＲアゴニストで処置される。一部の他の実施形態において、患者は、慢性的なアルコール消費の期間の間、有効量のスルファチドおよび／またはＲＡＲアゴニストで処置される。
【００７４】
一部の実施形態において、患者に投与されるＲＡＲアゴニストの具体的な量は、処置される疾患または状態、ならびに処置される患者の年齢、体重および性別によって異なる。一般的に、そのような最終濃度を例えば腸または血液において達成するためには、本実施形態の単回投与量組成物中のＲＡＲアゴニストの量は、概して、約０．１ミリグラム〜約１００ミリグラム、好ましくは約２．０ミリグラム〜約６０ミリグラム、より好ましくは約２０ミリグラム〜約５０ミリグラムである。好適な用量の例としては、約０．１〜約１０ｍｇ／日の間；約０．５〜約２ｍｇ／日の間；約０．０１〜１００ｍｇ／日の間；約１〜約５０ｍｇ／日の間；約０．１ｍｇ／日〜約１．０ｍｇ／日の間；約１．０ｍｇ／日〜約５．０ｍｇ／日の間；約５．０ｍｇ／日〜約１０．０ｍｇ／日の間；約１０．０ｍｇ／日〜約１５ｍｇ／日の間；約１５．０ｍｇ／日〜約２０．０ｍｇ／日の間；約２０．０ｍｇ／日〜約２５．０ｍｇ／日の間；約３０．０ｍｇ／日〜約３５．０ｍｇ／日の間；約３５．０ｍｇ／日〜約４０．０ｍｇ／日の間；約４０．０ｍｇ／日〜約４５．０ｍｇ／日の間；約４５．０ｍｇ／日〜約５０．０ｍｇ／日の間；約５０．０ｍｇ／日〜約５５．０ｍｇ／日の間；約５５．０〜約６０．０ｍｇ／日の間；約６０．０ｍｇ／日〜約６５．０ｍｇ／日の間；約６５．０ｍｇ／日〜約７０．０ｍｇ／日の間；約７０．０ｍｇ／日〜約７５．０ｍｇ／日の間；約７５．０ｍｇ／日〜約８０．０ｍｇ／日の間；約８０．０ｍｇ／日〜約８５．０ｍｇ／日の間；約８５．０〜約９０．０ｍｇ／日の間；約８５．０ｍｇ／日〜約９０．０ｍｇ／日の間；約９０．０ｍｇ／日〜約９５．０ｍｇ／日の間；および約９５．０ｍｇ／日〜約１００．０ｍｇ／日の間を含む。当然、正確な投与量は、処置される疾患または障害によって異なるが、好ましい範囲は、容易に決定できる。
【００７５】
タザロテンがＩ型ＮＫＴ細胞活性の減少をもたらすために経口投与される場合、タザロテンの１日投与量は、好ましくは約０．３ｍｇ／日〜約７ｍｇ／日または約８ｍｇ／日の範囲内、より好ましくは約０．６ｍｇ／日〜約６．５ｍｇ／日または約７ｍｇ／日の範囲内にある。一部の実施形態において、経口投与されるタザロテンは、０．４ｍｇ／日、０．７５ｍｇ／日、１．５ｍｇ／日、２．８ｍｇ／日、３ｍｇ／日、４．５ｍｇ／日、６ｍｇ／日および６．３ｍｇ／日を含むタザロテンの１日投与量で投与される。
【００７６】
当該実施形態によれば、ＲＡＲアゴニストは、患者の症状を軽減するために投与され得る、または障害機序自体に対抗するために投与され得る。特定の実施形態において、ＲＡＲアゴニストは、予防的措置（ｐｒｏｐｈａｌａｃｔｉｃ  ｍｅａｓｕｒｅ）として投与され得る。一部の実施形態において、複数回用量のＲＡＲアゴニストが投与される。これらの処置目的が多くの場合に関連していること、および処置が種々の要素に基づき特定の患者に合わせて調整され得ることを、当業者であれば理解するであろう。これらの要素としては、患者の年齢、性別、または健康状態、および自己免疫または免疫関連の疾患または障害の進行が挙げられ得る。患者のための処置方法は、それに応じて、投与量、投与のタイミング、投与経路について調整され得、他の治療の同時または逐次投与により得る。
【００７７】
一部の実施形態において、１種以上のＲＡＲアゴニスト化合物は、単独でまたは別の治療化合物と組み合わせて投与され得る。例えば、１種以上のＲＡＲアゴニスト化合物は、スルファチドと組み合わせて投与され得る。アルコール性肝疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患または再灌流傷害の処置において使用されている任意の現在公知の治療化合物が使用され得る。一部の実施形態において、ＲＡＲアゴニストは、硫化水素（Ｈ２Ｓ）と組み合わせて投与され得る。一部の実施形態において、ＲＡＲアゴニストは、酸化防止剤と組み合わせて投与され得る。一部の実施形態において、ＲＡＲアゴニストは、例えばコルチコステロイド、生物学的製剤（例えば、抗ＴＮＦ−αおよび抗ＩＬ−６）、免疫調節薬（例えば、ＲＵ−４８６）、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ、例えば、レフルノミド）、ＣＯＸ−２インヒビター（セレコキシブ）、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ、例えば、ナプロキセン）、経口抗糖尿病薬（ＯＡＤ、例えば、メトホルミンまたはシタグリプテン（ｓｉｔａｇｌｉｐｔｅｎ））、ＧＬＰ−１アゴニスト、インスリン、ＰＰＡＲアゴニスト／アンタゴニスト、ＥＧＦメディエーター（抗癌薬）、肝癌を処置するのに有効な他の薬剤、肝癌のための細胞ベースの治療；Ｃ型肝炎、多発性硬化症またはエリテマトーデスのためのインターフェロン（ＩＦＮ）；およびＬＦＡ−１アンタゴニストと組み合わせて投与され得る。
【００７８】
本明細書に記載されるＲＡＲアゴニスト化合物およびスルファチド化合物は、薬学的組成物中に組み込まれる有効成分として使用され得る。一部の実施形態において、当該薬学的組成物は、単一の有効成分を含み得る。一部の実施形態において、当該薬学的組成物は、２種、３種、４種、５種またはそれ以上の有効成分を含み得る。あらゆる投与方法（例えば、経口投与、直腸投与、非経口投与、局所投与、または静脈内、筋肉内、胸骨内もしくは皮下注射による、もしくは吸入による適切な形態での投与）が企図される。製剤は、適切な場合には、別個の投薬単位で好都合に与えられ得、薬学の技術分野において周知の方法の任意のものによって調製され得る。有効成分は、１種以上の薬学的に受容可能な賦形剤と共に、公知の確立されたやり方に従って普通に製剤化される。したがって、当該薬学的組成物は、液体、散剤、エリキシル剤、注射可能溶液、懸濁剤、坐剤などとして製剤化され得る。
【００７９】
いくつかの実施形態に従う有効成分は、経口投与の場合は、散剤、賦形剤とのブレンド、液体または溶液、懸濁剤、固溶体の形態で活性物質（ａｃｔｉｖｅ）を含む錠剤、硬ゼラチンカプセル、軟ゼラチンカプセルとして、投与用に製剤化され得る。一部の実施形態に従う有効成分は、口腔内投与（舌下または口腔粘膜）の場合は、迅速に溶解する固体剤形、すなわち沸騰錠、薄膜、バッカルカシェ剤として、または液体もしくは半固体の形態（例えば、ゲル剤、溶液、乳剤、懸濁剤）として、投与用に製剤化され得る。一部の実施形態に従う有効成分は、注射の場合は、水性もしくは非水性の溶液、懸濁剤または乳剤として、投与用に製剤化され得る。油ベースの溶液および懸濁剤は、天然およびまたは合成の油（例えば、ダイズ油、綿実油、鉱油、ゴマ油、ヒマシ油、硬化植物油、蜜蝋）の混合物を含む。一部の実施形態に従う有効成分は、経皮投与の場合は、クリーム剤、ゲル剤、乳剤、水性ベースの溶液、油ベースの溶液、懸濁剤、フィルム剤、貼付剤、泡沫剤として、投与用に製剤化され得る。一部の実施形態に従う有効成分は、経鼻投与の場合は、散剤、懸濁剤、溶液、乳剤として、投与用に製剤化され得る。一部の実施形態に従う有効成分は、肺送達の場合は、微粉化散剤として、投与用に製剤化され得る。経口投与は、初回通過代謝および代謝酵素の誘導と関連する。したがって、経口投与されるレチノイン酸の投薬強度および用法は、最適効果に向けて調整され得る。代替的な送達経路（例えば、舌下、口腔粘膜、注射、肺および経皮）は、経口投与と比較して好ましくあり得る。記載したもののような代替的な投与経路は、初回通過代謝およびＧＩ吸収を回避し、より少ない酵素誘導を示し、かつ安定な反復用量薬物動態をもたらす。
【００８０】
本実施形態に従う薬学的製剤は、即時放出性または調節放出性（例えば、持続放出性、拍動放出性、制御放出性、遅延放出性、緩慢放出性）であり得る。薬理学的量の経口投与されるレチノイド異性体は、これは即効性があるので、副作用を有し得る。この副作用が、治療における経口レチノイドの使用の重大な制約であった。局所適用されるレチノイドは催奇形性の傾向をほとんど有さないが、それらの使用を制限する、皮膚刺激をはじめとするこの投与経路と関連する他の毒性がある。経口および局所の両方の毒性の主な理由は、レチノイドは投与時に全て即時に利用可能であることである。インビボでより緩慢にかつより継続的にレチノイドを利用可能にし得るプロセスであれば、レチノイドの利用可能性のピークと谷を回避し、それにより、より長い期間にわたってインビボ有効レベルの化合物を提供し、また、過度の量の物質が突然利用可能になることの結果としてしばしばもたらされる毒性を回避するまたは大幅に低減するであろう。レチノール、レチノールのエステル、特にレチノールの脂肪エステル、レチノイン酸またはレチノイン酸エステルの、油ベースの注射可能製剤であれば、筋肉内に週単位で投与され得、そのような原則に従う緩慢放出性全身送達を提供し得るであろう。
【００８１】
一部の実施形態において、全トランス型レチノイン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの調製は、次の通りである。無水エーテル中の全トランス型レチノイン酸（１００ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化オキサリル（４２．３ｍｇ、０．３３３ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、その温度で３０分間撹拌し、ピリジン（２８．７ｍｇ、０．３６３ｍｍｏｌ）、２−メチル−２−プロパノール（２６．８ｍｇ、０．３６３ｍｍｏｌ）を添加し、暗闇にて室温で撹拌し、この時間の後、ＴＬＣによって示されたように反応は完結した。次いで、反応混合物を、水でクエンチし、エーテル（３回、１０ｍｌ）、飽和重炭酸ナトリウム溶液（３回、５ｍｌ）および再度水（３回、５ｍｌ）で抽出し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、エバポレートさせた。濃厚な残渣をヘキサン中に再溶解させ、シリカＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（２ｇ）上に適用した。ヘキサン／酢酸エチル（９．７：０．３）での溶出により、レチノイン酸のブチルエステルがもたらされた。最終精製は、ヘキサン／イソプロパノール（９０：１０）溶媒系を用いてＨＰＬＣ（１０ｍｍ×２５ｃｍのＺｏｒｂａｘ−Ｓｉｌカラム、４ｍＬ／分）により達成した。純粋な全トランス型レチノイルブチレート２（９８ｍｇ、８２．６％）が、濃厚油状物として溶出された。
【００８２】
一部の実施形態は、下記のような注射のためのレチノイン酸ブチルエステル（ｂｕｔｙｌ−ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ｅｓｔｅｒ）の製剤化に関する。１０ｇのレチノイン酸ブチルエステル溶液を、０．１ｇのブチルヒドロキシアニソールを含有する７３ｇの綿実油および１０ｇのベンジルアルコールの混合物中に、無菌条件下において、やや高温で、高剪断混合によって溶解させる。この混合物を、滅菌濾過し、後の使用のために（筋肉内注射により投与するために）注射器中に充填する。一部の実施形態は、筋肉内注射のための綿実油中のパルミチン酸レチノールの、上のような製剤化に関する。
【００８３】
一部の実施形態は、下記のような本実施形態の１種以上の有効成分の経口剤形の製剤化に関する。１０ｇのレチノイン酸を、蜜蝋、ブチルヒドロキシアニソール、エデト酸二ナトリウム、硬化ダイズ油フレーク、硬化植物油およびダイズ油アルコールの混合物中に、やや高温で、高剪断混合によって溶解させる。この混合物を、経口投与のために、２ｍｇ、５ｍｇおよび１０ｍｇの投薬強度で軟ゼラチンカプセル中に密封する。
【００８４】
一部の実施形態は、本実施形態の１種以上の有効成分を含有する生体接着性バッカル錠の製剤化に関する。２４％の有効成分、２１％のＨＰＭＣ、１８％のコーンスターチ、２４％のラクトース、１％のシリカ、２．５％のポリカルボフィル（Ｎｏｖｅｏｎ）、７．５％のＣａｒｂｏｍｅｒ  ９７４Ｐ、１．２％のタルクおよび０．７％のステアリン酸マグネシウムを含有する賦形剤ブレンドを調製する。このブレンドを、直径約１ｃｍの錠剤に圧縮成形した。
【００８５】
一部の実施形態は、本実施形態の１種以上の有効成分を含有する舌下フィルムの製剤化に関する。以下のものを５０ｇの水中に混合する：３ｇのＭｅｔｈｏｃｅｌ  Ｅ５、５ｇのＭｅｔｈｏｃｅｌ  Ｅ５０、１ｇのＫｌｕｃｅｌ、１ｇのマルトデキストリン、１ｇのクエン酸、３ｇのスクラロース、５ｇのオレンジ香味料、０．２ｇのパラベン、０．１のエデト酸ナトリウムおよび５ｇのソルビトール。１ｇのレチノイン酸を添加し、混合物を撹拌して脱ガスする。この組成物を、ポリエステルフィルム支持体全体に渡って薄く広げ、分解を回避するために直射光の全くない所において、空気中で乾燥させる。次いで、このフィルムを、２〜１０ｍｇの用量が得られるように適切な大きさに切断する。
【００８６】
一部の実施形態は、１種以上のスルファチド、ＲＡＲアゴニストまたはそれらの任意の組み合わせを、好ましくは薬学的組成物として含み得る、キットに関する。一部の実施形態において、ｃｉｓ−テトラコセノイルが、薬学的に受容可能なキャリア中で提供される。一部の実施形態において、ＡＴＲＡが、薬学的に受容可能なキャリア中で提供される。一部の実施形態において、タザロテンが、薬学的に受容可能なキャリア中で提供される。いくつかの実施形態において、硫化水素（Ｈ２Ｓ）が、任意選択で提供され得る。いくつかの実施形態において、１種以上の酸化防止剤が、任意選択で提供され得る。いくつかの実施形態において、キットは、好適な包装および／または取扱説明書をさらに含み得る。キットはまた、１種以上のスルファチド、ＲＡＲアゴニストまたはそれらの任意の組み合わせの送達のための手段（例えば、吸入器、スプレーディスペンサー（例えば、鼻内スプレー）、注射用注射器、注射針、ＩＶバッグ、またはカプセル剤、錠剤、坐剤のためのプレッシャーパック（ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｐａｃｋ））も含み得る。１種以上のスルファチド、ＲＡＲアゴニストまたはそれらの任意の組み合わせは、乾燥もしくは凍結乾燥された形態、または溶液、特に滅菌溶液中にあり得る。乾燥形態にある場合、当該キットは、液体製剤を調製するための薬学的に受容可能な希釈剤を含み得る。当該キットは、投与のためまたは組成物を投薬するためのデバイス（注射器、ピペット、経皮パッチ、または吸入器を含むがこれらに限定されない）を含有し得る。一部の実施形態は、長期（例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、または８週間以上）にわたって有効な処置を個体に提供するのに十分な投与量の化合物または組成物を含有するキットに関する。
【００８７】
１つの例の実施形態において、処方薬物または乱用薬物からの化学的肝損傷の危険がある７０ｋｇの成人患者に対し、肝損傷を処置するために１．０ｍｌのリン酸緩衝生理的食塩水中の７ｍｇのタザロテンのｉ．ｍ．注射が毎日与えられる。この投薬は、処置の結果および主治医の判断に基づき調整され得る。処置は、少なくとも約１または２週間、好ましくは少なくとも約１または２ヶ月にわたり継続されることが好ましく、長期的に継続され得る。
【００８８】
別の例の実施形態において、処方薬物または乱用薬物からの化学的肝損傷の危険がある７０ｋｇの成人の患者に対し、１型ＮＫＴ細胞の活性を阻害するのに十分な経口用量のＲＡＲアゴニストが与えられる。肝損傷は、血清肝臓酵素レベル分析によってモニタリングされ得る。ＲＡＲアゴニストの投与量は、肝機能試験の結果および主治医の判断に基づき調整され得る。処置は、少なくとも約１または２週間、好ましくは少なくとも約１または２ヶ月にわたり継続されることが好ましく、長期的に継続され得る。一部の実施形態において、処置の継続期間は、患者を化学的肝損傷の危険に曝す行為の継続期間と一致する。一部の実施形態において、ＲＡＲアゴニストは、ＡＴＲＡおよびタザロテンからなる群から選択される。一部の実施形態において、さらに、ＩＩ型ＮＫＴ細胞を活性化するのに十分な用量のスルファチドが、患者に投与される。
【００８９】
上述の記述説明はその最良の態様であると現在考えられるものを当業者が製造および使用することを可能にするが、当業者であれば、本明細書における特定の実施形態、方法、および実施例の変形例、組み合わせ、および均等物の存在を理解し認識するであろう。したがって、本実施形態は、上記の実施形態、方法、および実施例により限定されるべきものではなく、本実施形態の範囲および精神の範囲内の全ての実施形態および方法により限定されるべきものである。
【００９０】
以下の実施例は、例示の目的で示されるものであり、限定として解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９１】
実施例１
スルファチドはスルファチド／ＣＤ１ｄ−テトラマー＋細胞を活性化しつつＩ型ＮＫＴ細胞の阻害を媒介する
２０μｇのスルファチドを１用量、マウスに腹膜内注射した。スルファチド注射に続いて、肝臓由来のＭＮＣを単離し、ＣＦＳＥで標識した。この細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのサイトカインＩＬ−２の存在下または不在下において、９６時間にわたりαＧａｌＣｅｒ（１０ｎｇ／ｍｌ）と共に培養した。コントロールとして、細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２のみと共に培養した。培養に続いて、細胞を採取し、抗ＴＣＲβｍＡｂおよびαＧａｌＣｅｒ／ＣＤ１ｄ−テトラマーで染色し、ＦＡＣｓ選別し、αＧａｌＣｅｒ／ＣＤ１ｄ−テトラマー＋（Ｉ型ＮＫＴ）細胞に対してＣＦＳＥ希薄化分析を行った。図１Ａを参照されたい。図１Ｂに示されるように、スルファチド投与後は、Ｉ型ＮＫＴ細胞は、αＧａｌＣｅｒでのインビトロチャレンジに応答して増殖しない。
【００９２】
ＰＢＳまたは２０μｇのスルファチドを注射したマウスから単離された肝細胞を、スルファチド／ＣＤ１ｄ−テトラマー＋個体群とテトラマー−個体群とに選別し、細胞質内ＩＦＮ−γ＋について染色した。図１Ｃに示されるように、スルファチド注射マウスが、最大％のＩＦＮ−γ陽性細胞を有する。
【００９３】
スルファチドの投与は、Ｉ型ＮＫＴ細胞増殖の阻害および％ＩＦＮ−γ陽性細胞の増加の両方を結果としてもたらす。特定の理論に拘束されるものではないが、スルファチド投与は、サイトカインおよびケモカインを分泌するｐＤＣおよびＩＩ型ＮＫＴ細胞の両方を活性化し、この相互作用がＩ型ＮＫＴ細胞におけるｃＤＣ媒介阻害誘導を結果としてもたらすということが示唆される。
【００９４】
実施例２
スルファチド投与はＣｏｎＡ誘導性肝炎を防ぐ
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、８．５ｍｇ／ｋｇのコンカバリン（Ｃｏｎｃａｖａｌｉｎ）Ａ（ＣｏｎＡ）（発熱物質を含まないリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）に溶解させたもの）で静脈内（ｉ．ｖ．）処置した。これにより、肝炎により引き起こされるものと同様の肝損傷が誘導される。ＣｏｎＡ注射の直後に、マウスに２０μｇ（１ｍｇ／ｋｇ／ｍ）のウシ脳スルファチドまたはＰＢＳを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。
【００９５】
肝臓への損傷は、肝機能試験により検出可能な（肝疾患を示唆する）徴候異常（ｔｅｌｌｔａｌｅ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ）を生じさせる。例えば、ウイルス性肝炎により、損傷を受けた肝細胞中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）酵素およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）酵素が血流中に入り込み、それらの血中レベルを上昇させ得る。肝損傷の試験を行うために、ＣｏｎＡまたはＣｏｎＡ＋スルファチド注射の０、６、１２、２４、４８および７２時間後に血清を収集し、血清酵素ＡＬＴおよびＡＳＴのレベルを測定した。血清酵素レベルは、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡの助けを借りて測定した。図１ｅに示されるように、類似の血清酵素レベルをＣｏｎＡまたはＣｏｎＡ＋スルファチド注射の６時間後に観察したが、１２、２４、および４８時間においては、ＡＬＴおよびＡＳＴの血清レベルは両方とも、ＣｏｎＡおよびスルファチドの両方を注射されたマウスにおいての方が低かった。ＣｏｎＡ（●）注射マウスにおいては、血清ＡＬＴおよびＡＳＴは１２時間の辺りでピークに達し（ＡＬＴ≒１５．８×１０３ＩＵ／ＬおよびＡＳＴ≒２２．７×１０３ＩＵ／Ｌ）、４８時間までにベースラインに戻った。それに対し、ＣｏｎＡ＋スルファチドの組み合わせ（○）の注射に続いて、１２時間までにＡＬＴおよびＡＳＴの血清レベルの著しい減少（ＡＬＴ≒２．５×１０３ＩＵ／ＬおよびＡＳＴ≒５．４×１０３ＩＵ／Ｌ）が記録され、２４時間までにベースラインに戻った。値は、１群５匹のマウスの平均±ＳＤである。Ｐ＜０．００１。
【００９６】
マウスを処置の１２、２４、４８、７２、および９６時間後に犠牲死させ、それらの肝臓を収集した。肝組織を、１０％ホルムアルデヒド溶液中で固定し、使用まで室温で保存した。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を用いた組織学的調査は、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡで行った。
【００９７】
図１ｄに示されるように、Ｈ＆Ｅ染色は、ＣｏｎＡ＋ウシ脳スルファチド処置されたマウスにおいてＣｏｎＡのみで処置されたマウスに比べて著しく改善された肝組織構造を明確に示した。組織学的調査は、ＣｏｎＡ注射マウスに続く示された時点において、びまん性の広範囲の浸潤および重度の壊死を示した（図１ｄ、上パネル）。それに対して、スルファチド＋ＣｏｎＡ注射は、１２時間〜４８時間の肝臓切片中のより少ない浸潤およびより少ない壊死の点から見て軽い傷害と関連付けられ、組織構造は７２時間までに常態に戻った（図１ｄの下パネル）。
【００９８】
考え合わせると、実施例１および実施例２で得られた結果は、（ａ）スルファチドが肝臓中のＩ型ＮＫＴ細胞の阻害を媒介すること、および（ｂ）スルファチド投与がスルファチド／ＣＤ１ｄ−テトラマー＋細胞を活性化し、ＣｏｎＡ誘導性肝炎を防ぐことを示している。これは、寛容化されたｃＤＣおよびアネルギー性のＩ型ＮＫＴ細胞が一緒になって、有害な炎症カスケードの著しい阻害に繋がることを示している。
【００９９】
実施例３
ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋細胞個体群の組成に対する肝虚血再灌流傷害への免疫応答の作用の分析
肝虚血再灌流傷害モデルを、Ｓｈｅｎ  ＸＤ，Ｋｅ  Ｂ，Ｚｈａｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．に記載されているように確立した。肝虚血／再灌流傷害機序においてはＣＤ１５４−ＣＤ４０Ｔ細胞の共刺激経路が必要とされ、その遮断は、ヘムオキシゲナーゼ−１媒介細胞保護を促進しかつこれに依存する。Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２００２，７４：３１５−９が、ほとんど変更することなくその全体が本明細書に援用される。
【０１００】
ＷＴマウスおよびＩ型ＮＫＴ細胞はないが通常のレベルのＩＩ型ＮＫＴ細胞を有するＪα１８−／−マウス（３〜５匹のマウス／群）または２０μｇのスルファチド／マウスで３時間前に処置されたＷＴマウス（２〜３匹のマウス／群）を、６０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射により麻酔した。正中開腹後、非外傷性クリップを、３つの頭側肝小葉の肝三つ組（肝動脈、門脈、胆管）に適用した。尾側小葉（ｃａｕｄａｌ  ｌｏｂｅ）は、健全な血液循環を保持して腸管静脈のうっ血を防いだ。腹膜を閉じ、マウスを加熱パッド（約３７℃）上に置いた。周囲温度は、２５〜２６℃の間の範囲であった。９０分間の部分的な肝臓温阻血の後に、クリップを取り外して再灌流を開始し、腹壁を縫合した。マウスを６時間の再灌流後に安楽死させ、血液および頭側肝小葉を収集した。シャムコントロールは、血管閉鎖以外、同じ手順を受けた。
【０１０１】
細胞調製。Ｈａｌｄｅｒ  ＲＣ，Ａｇｕｉｌｅｒａ  Ｃ，Ｍａｒｉｃｉｃ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｙｐｅ  ＩＩ  ＮＫＴ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｎｅｒｇｙ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ＮＫＴ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００７，１１７：２３０２−１２に記載されているように、機械的粉砕を用い、続いてＰｅｒｃｏｌｌ勾配分離およびＲＢＣ溶解を用いて、白血球をマウスの頭側肝小葉から単離した。
【０１０２】
フローサイトメトリー。白血球を、ＦＡＣＳ緩衝液（０．０２％のＮａＮ３および２％のＦＣＳを含有するＰＢＳ）中に懸濁させ、ブロック（抗マウスＦｃＲ−γ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）し、示されているとおりの負荷ｍＣＤ１ｄ−テトラマー−ＰＥもしくはＰＥ、ＦＩＴＣ、またはＰＥ−Ｃｙ５で標識された抗マウス抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡまたはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色した。肝臓単核細胞（ＭＮＣ）の細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）を、Ｈａｌｄｅｒ  ＲＣ，Ａｇｕｉｌｅｒａ  Ｃ，Ｍａｒｉｃｉｃ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｙｐｅ  ＩＩ  ＮＫＴ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｎｅｒｇｙ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ＮＫＴ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００７，１１７：２３０２−１２に記載されているように行った。分析は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（バージョン４．０．２，ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ計器を用いて行った。Ｇｒ−１ｈｉｇｈ個体群およびＧｒ−１ｉｎｔ個体群にゲートをかけた。図２ａを参照されたい。
【０１０３】
統計。データは、各群についての平均±ＳＥＭとして表される。Ｐ＜０．００５。群間の統計的差異は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン５．０ａ，ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、対応のない片側スチューデントｔ検定により評価した。
【０１０４】
結果。細胞のＧｒ−１ｉｎｔサブセットは、主に単球および骨髄系前駆細胞からなる。ＷＴマウスの肝臓においては、Ｇｒ−１ｉｎｔ細胞は、虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）に続いてシャムに比べて約３．５倍増加した（ｐ＜０．００５）が、Ｊα１８−／−マウスにおいては、虚血再灌流傷害に続いて増加は何ら観察されなかった。図２ｂの上パネルを参照されたい。したがって、虚血再灌流傷害の間の骨髄細胞サブセットの肝臓動員は、Ｊα１８−／−マウスにはないＩ型ＮＫＴ細胞の存在に依存している。
【０１０５】
スルファチド処置したマウスにおいては、Ｇｒ−１ｉｎｔ細胞サブセットは、ＩＲＩに続いて非処置のマウスに比べて約５０％減少した。これは、Ｉ型ＮＫＴ細胞の骨髄細胞動員活性が、スルファチド処置に続いて減少したことを示唆している。
【０１０６】
主として顆粒球からなるＧｒ−１ｈｉｇｈ細胞サブセットは、シャムコントロールの肝臓と虚血再灌流傷害誘導マウスの肝臓との間で著しく異ならなかった。図２ｂの下パネル。
【０１０７】
実施例４
虚血再灌流傷害誘導に先立つスルファチド投与はＩ型ＮＫＴ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を著しく阻害する
１つのＷＴマウス群（ｎ＝３）に、虚血誘導の３時間前にスルファチド（２０μｇ／マウス、ｉ．ｐ．）を注射し（スルファチド、ＩＲＩ）、他の群（ＩＲＩ（ｎ＝３）、シャム（ｎ＝２））には前処置を行わなかった。肝虚血再灌流傷害（９０分間の虚血および６時間の再灌流）およびシャム手術を、実施例３に記載したように行った。
【０１０８】
細胞調製。Ｈａｌｄｅｒ  ＲＣ，Ａｇｕｉｌｅｒａ  Ｃ，Ｍａｒｉｃｉｃ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｙｐｅ  ＩＩ  ＮＫＴ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｎｅｒｇｙ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ＮＫＴ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００７，１１７：２３０２−１２に記載されているように、機械的粉砕を用い、続いてＰｅｒｃｏｌｌ勾配分離およびＲＢＣ溶解を用いて、白血球をマウスの頭側肝小葉から単離した。
【０１０９】
フローサイトメトリー。白血球を、ＦＡＣＳ緩衝液（０．０２％のＮａＮ３および２％のＦＣＳを含有するＰＢＳ）中に懸濁させ、ブロック（抗マウスＦｃＲ−γ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）し、αＧａｌＣｅｒ負荷ｍＣＤ１ｄ−テトラマー−ＰＥ抗マウス抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡまたはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色した。分析は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（バージョン４．０．２，ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ計器を用いて行った。
【０１１０】
統計。データは、各群についての平均±ＳＥＭとして表される。Ｐ＜０．０１。群間の統計的差異は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン５．０ａ，ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、対応のない片側スチューデントｔ検定により評価した。
【０１１１】
結果。虚血再灌流傷害誘導後、Ｉ型ＮＫＴ細胞は、シャム手術からのＩ型ＮＫＴ細胞に比べて増加したＩＦＮ−γ産生を示すが、虚血再灌流傷害の３時間前のスルファチドの投与により、Ｉ型ＮＫＴ細胞によるＩＦＮ−γ分泌は有意に減少した。図２ｃを参照されたい。
【０１１２】
実施例５
Ｉ型ＮＫＴ細胞の抑制はＩＲＩに続く肝臓壊死の減少を結果としてもたらす
Ｍａｔｒｅｙａ  Ｉｎｃ．，Ｐｌｅａｓａｎｔ  Ｇａｐ，ＰＡから購入した精製ウシミエリン由来スルファチド（＞９０％純粋）を、ビヒクル（０．５％ポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）および０．９％ＮａＣｌ溶液）に溶解させ、ＰＢＳ中で希釈した。ＢＬ／６マウス（ＷＴスルファチド）群およびＪα１８−／−マウス（Ｊα１８−／−スルファチド）群を、虚血誘導またはシャム手術の３〜４８時間前にスルファチド（２０μｇ／マウス）で腹腔内処置した。肝虚血再灌流傷害およびシャム手術を、スルファチド処置および非処置のＷＴおよびＪα１８−／−マウスに対して、実施例３に記載したように実施した。９０分間の虚血および２４時間の再灌流に続いて、肝組織（頭側小葉）を、１０％ホルマリン中で固定し、パラフィン中に包埋し、切片を、組織学的分析のためにヘマトトキシリン（ｈｅｍａｔｏｔｏｘｙｌｉｎ）およびエオシンで染色した（ＩＤＥＸＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，Ｍａｉｎｅ）。
【０１１３】
スルファチドで前処置されたＷＴマウス（ＷＴスルファチド）およびＪα１８−／−マウスは、ＩＲＩ後に、肝臓壊死をほんの僅かしかまたは全く発症しなかったが、非処置（ＷＴ）マウスの頭側肝小葉においては、大きな壊死領域が見出された。図４の上パネルを参照されたい。シャムコントロールは、壊死を全く示さなかった。図４の下パネルを参照されたい。組織学的分析により、ＩＲＩに続く壊死が、１型ＮＫＴ細胞のないマウス（Ｊα１８−／−マウス）および１型ＮＫＴ細胞の活性がスルファチド処置により抑制されているマウスの肝臓において減少することが示された。
【０１１４】
実施例６
ＷＴおよび１型ＮＫＴ細胞涸渇（Ｊα１８−／−）マウスにおけるアルコール性肝疾患の誘導
１週間の栄養的に十分なＬｉｅｂｅｒ−ＤｅＣａｒｌｉ液体食餌での順化に続いて、６〜８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｂ６）および１型ＮＫＴ細胞はないが２型ＮＫＴ細胞はあるＪα１８−／−マウスに、５％のエタノールを含有する液体食餌または等カロリーのデキストリンマルトース含有食餌（Ｂｉｏ−Ｓｅｒｖ，ＮＪ）に自由に接近させた。滅菌した餌箱中にオートクレーブ処理された水を用いて毎日新たに食餌を調製し、餌を毎日取り換えるように注意した。
【０１１５】
エタノール含有食餌が与えられたＢ６マウスおよびＪα１８−／−マウスを、慢性的エタノール給餌群と慢性的＋過エタノール給餌群との２つの群に分けた。慢性的エタノール給餌群のマウスには、４〜５週間までの間、５％のエタノールを含有する液体食餌が給餌された。慢性的＋過エタノール給餌群のマウスには、１０日間にわたり５％のエタノールを含有する液体食餌が給餌され、続いて（１１日目に）単回の高用量の強制飼養エタノール（５ｇ／ｋｇ体重）が給餌された。コントロール群のマウスは、等カロリーのデキストリンマルトースで強制飼養された。強制飼養に続いて、マウスを、温度制御された温暖パッド上に維持し、モニタリングした。当初はゆっくりとした動きであったが、高用量の強制飼養エタノールが与えられたほとんどのマウスが、数時間のうちに正常な行動を取り戻した。マウスを、強制飼養の８〜９時間後に安楽死させた。
【０１１６】
Ｈ＆Ｅ染色を、エタノール給餌された雄Ｂ６およびＪα１８−／−マウスから、１０日間または４〜５週間の慢性的エタノール給餌または慢性的＋過エタノール給餌のいずれかに続いて得られた肝小葉組織に対して行った。図９ａ（上パネル）に示されるように、組織病理学的分析は、１０日間にわたり慢性的エタノール給餌に供されたＢ６またはＪα１８−／−マウスのいずれにおいても肝損傷を示さなかった。さらに、４〜５週間にわたり慢性的エタノール給餌に供されたＢ６およびＪα１８−／−マウスの肝組織の組織病理学的分析により、肝損傷は何ら観察されなかった（データは示していない）。しかしながら、慢性的＋過エタノール給餌に供されたＢ６マウスからの肝組織の組織病理学的分析では、著しい損傷が示された。図９ａの左下パネルを参照されたい。一方、慢性的＋過エタノール給餌に供されたＪα１８−／−マウスからの肝組織は、比較的少ない損傷を示した。図９ａの右下パネルを参照されたい。
【０１１７】
血清ＡＬＴレベルを、コントロールのＢ６およびＪα１８−／−マウスならびにエタノール給餌されたＢ６およびＪα１８−／−マウスにおいて、１０日間または４〜５週間の慢性的エタノール給餌および慢性的＋過給餌のいずれかに続いて測定した。図９ｂの左パネルに示されるように、慢性的エタノールは、血清ＡＬＴレベルの著しい上昇に繋がらなかった。血清ＡＬＴレベルは、コントロールに比べて、慢性的＋過エタノール給餌に供されたＢ６マウスにおいて著しく高まり、慢性的＋過エタノール給餌に供されたＪα１８−／−マウスにおいてはより小さい程度に高まった。図９ｂの右パネルを参照されたい。
【０１１８】
組織構造またはＡＬＴ／ＡＳＴ血清レベルにより実証されるように、（エタノールなしのコントロールに比べて）最大の肝損傷は、高用量エタノール強制飼養の６〜８時間後に、Ｂ６およびＪα１８−／−マウスにおいて観察された。慢性的＋過エタノール給餌が与えられた群の間では、１型ＮＫＴ細胞のないＪα１８−／−マウスの方が、少ない肝損傷を示した。
【０１１９】
組織病理学的分析によりおよび血清ＡＬＴ／ＡＳＴレベルの著しい変化がないことにより実証されるように、１０日間または４〜５週間にわたる慢性的エタノール給餌は何らの著しい肝損傷にも繋がらなかったので、これは、前臨床または無症状期のＡＬＤと称される。臨床期のＡＬＤは、第２の工程の慢性的−過アルコール給餌に続いて誘導された。
【０１２０】
５％のエタノールを含有する液体Ｌｉｅｂｅｒ−Ｄｅｃａｒｌｉ食餌（慢性的エタノール給餌）または同様のカロリー数を含有するコントロール食餌のいずれかでの５週間の給餌に続いて、雄Ｂ６およびＪα１８−／−マウスの群（各４匹）から、肝臓単核細胞（ＭＮＣ）を単離した。単離された肝臓ＭＮＣを、種々の細胞表面抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。活性化されたＩ型ＮＫＴ細胞およびＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋骨髄細胞の蓄積は、前臨床ＡＬＤ期にあるＢ６マウスの肝臓においては観察されたが、Ｊα１８−／−マウスの肝臓においては観察されなかった。図５を参照されたい。
【０１２１】
実施例７
スルファチドまたは全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）によるアルコール誘導性肝損傷の予防
７週齢のＢ６（ＷＴ）およびＪα１８−／−の雄マウスの群に、１日目および１０日目に２０マイクログラム／マウスのスルファチド；６〜１０日目に０．３ミリグラム／マウスのＡＴＲＡ、またはビヒクル／ＤＭＳＯを注射（ｉ．ｐ．）し、１０日間にわたる５％のエタノールを含有する液体食餌、それに続く（１１日目における）単回の高用量の強制飼養エタノール（５ｇ／ｋｇ体重）（慢性的＋過エタノール給餌群）または等カロリーのデキストリンマルトース含有食餌、それに続く等カロリーのデキストリンマルトース強制飼養（コントロール群）のいずれかを給餌した。強制飼養の６〜８時間後に、マウスを安楽死させ、血清および肝組織を採取した。
【０１２２】
血清ＡＬＴレベルを、各マウス群について測定した。図６に示されるように、血清ＡＬＴレベルは、慢性的＋過エタノール給餌に供されたビヒクル／ＤＭＳＯ注射Ｂ６マウス（黒い棒）において著しく高まったが、スルファチド（横縞模様の棒）またはＡＴＲＡ（縦縞模様の棒）のいずれかの注射を受けた慢性的＋過エタノール給餌Ｂ６マウスにおける血清ＡＬＴレベルは、コントロール給餌Ｂ６マウス（陰影の付いていない棒）のものと同様であった。血清ＡＬＴレベルは、慢性的＋過エタノール給餌に供されたビヒクル／ＤＭＳＯ注射Ｊα１８−／−マウス（黒い棒）において、コントロール給餌Ｊα１８−／−マウス（陰影の付いていない棒）に比べて高まったが、しかしながら、慢性的＋過エタノール給餌に供されたビヒクル／ＤＭＳＯ注射Ｊα１８−／−マウスは、慢性的＋過エタノール給餌に供されたビヒクル／ＤＭＳＯ注射Ｂ６マウスに比べて減少した血清ＡＬＴレベルを有していた。図６を参照されたい。
【０１２３】
肝脂肪性肝炎（脂肪肝疾患）についての組織学的調査を、ビヒクル／ＤＭＳＯ、スルファチドまたはＡＴＲＡを注射されたＢ６マウスから、慢性的＋過エタノール給餌に続いて採取された肝組織に対して行った。図７に示されるように、ビヒクル／ＤＭＳＯを注射されたＢ６マウスからの肝組織は、慢性的＋過エタノール給餌に続いて損傷の著しい徴候を示した。しかしながら、スルファチドまたはＡＴＲＡを注射されたＢ６マウスから得られた肝組織は、脂肪肝疾患の徴候をほとんど示していない。
【０１２４】
組織学的および血清肝臓酵素分析は、スルファチドまたはレチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）アゴニストであるＡＴＲＡの投与がいずれも過度のアルコール消費によって引き起こされる肝損傷を防ぎ得るということを示唆している。
【０１２５】
実施例８
ＡＴＲＡによるＩ型ＮＫＴ細胞増殖の阻害
Ｉ型ＮＫＴ細胞を、ナイーブＢ６マウスの脾臓から単離し、［３Ｈ］−チミジンおよび最適濃度のαＧａｌＣｅｒのみ、最適濃度のαＧａｌＣｅｒ＋０．１５μｇ／ｍｌ、１．２μｇ／ｍｌ、もしくは１８．８μｇ／ｍｌのＡＴＲＡ、またはＡＴＲＡのみと共に、インビトロで培養した。１型ＮＫＴ細胞の増殖を、［３Ｈ］−チミジン取り込みにより測定した。図８ａに示されるように、細胞増殖は、０．１５μｇ／ｍｌのＡＴＲＡおよびαＧａｌＣｅｒまたはαＧａｌＣｅｒのみで培養された１型ＮＫＴ細胞について同様であったが、比較すると、増殖は、１．２μｇ／ｍｌまたは１８．８μｇ／ｍｌのＡＴＲＡおよびαＧａｌＣｅｒで培養された１型ＮＫＴ細胞については減少した。αＧａｌＣｅｒ誘導１型ＮＫＴ細胞増殖の最も大きな阻害を、１８．８μｇ／ｍｌのＡＴＲＡについて観察した。ＡＴＲＡのみで培養された１型ＮＫＴ細胞については、増殖は、全くまたはほとんど観察されなかった。
【０１２６】
実施例９
ＡＴＲＡによるＩ型ＮＫＴ細胞活性の阻害
αＧａｌＣｅｒでのインビトロチャレンジに応答したＩ型ＮＫＴ細胞によるＩＬ−２サイトカイン分泌に対するＡＴＲＡの作用を、ＮＫＴ細胞（Ｈｙ１．２）および放射線照射された抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、ＡＴＲＡ（０．１５μｇ／ｍｌ、１．２μｇ／ｍｌ、または１８．８μｇ／ｍｌ）の存在下または不在下において、最適濃度のαＧａｌＣｅｒと共に、インビトロで１６時間にわたり共培養することによって試験した。上清を収集し、分泌されたＩＬ−２レベルを、ＩＬ−２サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定した。
【０１２７】
ＩＬ−２分泌レベルは、０．１５μｇ／ｍｌのＡＴＲＡによる著しい影響を受けなかったが、しかしながら、ＩＬ−２分泌の著しい減少が、１．２μｇ／ｍｌまたは１８．８μｇ／ｍｌのＡＴＲＡの存在下において培養されたＩ型ＮＫＴ細胞細胞について観察された。ＩＬ−２分泌の最大の減少は、１８．８μｇ／ｍｌのＡＴＲＡにより達成された。図８ｂを参照されたい。
【０１２８】
ＡＴＲＡ投与に続くＩ型ＮＫＴ細胞における機能変化をさらに試験した。２つの独立した実験において、Ｂｌａｃｋ  ６（ＷＴ）マウスの群に、５日間にわたり毎日、０．３ｍｇ／動物（約１５ｍｇ／Ｋｇ体重）のＡＴＲＡまたはビヒクル（ＤＭＳＯ）を腹腔内注射した。Ｉ型ＮＫＴ細胞を精製し、増加していく濃度のαＧａｌＣｅｒと共にインビトロで培養した。細胞増殖を測定し、上清を収集した。αＧａｌＣｅｒでのインビトロチャレンジ後の単離されたＩ型ＮＫＴのサイトカイン応答を、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１３についてサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。ＡＴＲＡ注射マウスから単離されたＩ型ＮＫＴ細胞は、αＧａｌＣｅｒ刺激に応答して増殖しなかった（データは示していない）。図８ｃに示されるように、ビヒクル（ＤＭＳＯ）注射マウスから単離されたＩ型ＮＫＴ細胞は、αＧａｌＣｅｒ刺激に応答してＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、およびＩＬ−１３を分泌するが、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、またはＩＬ−１２を分泌しない。αＧａｌＣｅｒ刺激に応答したＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、またはＩＬ−１３の分泌は、ＡＴＲＡ注射マウスから単離されたＩ型ＮＫＴ細胞からは何ら検出されなかった。ＩＬ−４分泌レベルの減少が、ＡＴＲＡ注射マウスから単離された、αＧａｌＣｅｒ刺激に応答したＩ型ＮＫＴ細胞から観察された。図８ｃを参照されたい。
【０１２９】
実施例１０
ＡＴＲＡはクラスＩＩＭＨＣ拘束性通常ＣＤ４Ｔ細胞を阻害しない
クラスＩＩＭＨＣ拘束性通常ＣＤ４Ｔ細胞に対するＡＴＲＡの作用を、ナイーブＢ１０．ＰＬ  Ｖβ８．２ＴＣＲトランスジェニックマウスからミエリン塩基性タンパク質ＭＢＰＡｃ１−９反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、段階的濃度のＡＴＲＡ（０．１５、１．２、１８．８μｇ／ｍｌ）の存在下または不在下において、細胞を［３Ｈ］−チミジンおよび最適濃度のＭＢＰＡｃ１−９と共にインビトロで培養することによって試験した。ＭＢＰＡｃ１−９反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を、［３Ｈ］−チミジン取り込みにより測定した。ＭＢＰＡｃ１−９刺激増殖の阻害は、ＡＴＲＡ処理した培養物においては何ら観察されなかった。図１０を参照されたい。これは、ＡＴＲＡがＭＨＣ拘束性ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性を直接的に阻害しないということを示唆している。
【０１３０】
実施例１１
抗原提示細胞の不在下におけるＡＴＲＡ処理は１型ＮＫＴ細胞機能を阻害する
抗原提示細胞の不在下におけるＩ型ＮＫＴ細胞に対するＡＴＲＡ処理の作用もまた測定した。Ｉ型ＮＫＴハイブリドーマ細胞（Ｈｙ１．２）を、ＡＴＲＡなしかまたは５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、もしくは２０μｇ／ｍｌのＡＴＲＡと共に、２４時間にわたりインビトロで培養した。次いで、細胞を３回洗浄し、段階的濃度の脂質抗原αＧａｌＣｅｒの存在下において、放射線照射された脾細胞（ＡＰＣ）と共に共培養した。１６時間後に上清を収集し、ＩＬ−２サンドイッチＥＬＩＳＡを用いてＩＬ−２レベルを測定した。図１１に示されるように、ＡＴＲＡによるＩ型ＮＫＴハイブリドーマ細胞（Ｈｙ１．２）の処理は、ＩＬ−２分泌を阻害する。これは、抗原提示細胞の不在下におけるＡＴＲＡ処理がＩ型ＮＫＴ細胞のエフェクター機能を阻害するということを示唆している。
【０１３１】
実施例１２
サブタイプ特異的ＲＡＲアゴニストによるＩ型ＮＫＴ細胞活性の阻害
レチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）は、ＲＡＲα、ＲＡＲβ、およびＲＡＲγという３つの主要な亜型を含む。ＲＡＲアゴニストＡＴＲＡは、特定の亜型に対する選択性はない。Ｉ型ＮＫＴ細胞活性の阻害へのＲＡＲ亜型の寄与を、亜型選択的ＲＡＲアゴニストを用いて次のように試験した。脾細胞を、ナイーブＢ６（ＷＴ）マウスから単離し、［３Ｈ］−チミジン、最適濃度のαＧａｌＣｅｒ、および段階的濃度の汎ＲＡＲアゴニストＡＴＲＡ、ＲＡＲαアゴニストＡＭ５８０、ＲＡＲβ２アゴニストＡＣ５５６４９またはＲＡＲγアゴニストＣＤ１５３０の存在下において、インビトロで培養した。αＧａｌＣｅｒ刺激に応答したＩ型ＮＫＴ細胞の増殖を、［３Ｈ］−チミジン取り込みにより測定した。
【０１３２】
ＡＴＲＡ、ＡＭ５８０、およびＣＤ１５３０の存在下において培養されたＩ型ＮＫＴ細胞は、１０１μｇ／ｍｌの濃度までは同様のレベルの細胞増殖を示した。図１２を参照されたい。１０１μｇ／ｍｌのＡＴＲＡまたはＣＤ１５３０の存在下において培養された細胞は、低量のまたはほんの僅かな増殖を示したが、１０１μｇ／ｍｌのＡＭ５８０において培養された細胞については、増殖は維持された。低量またはほんの僅かな増殖がＡＣ５５６４９、ＡＴＲＡまたはＣＤ１５３０において培養された細胞について観察された濃度である１０１μｇ／ｍｌを除く、試験した全ての濃度において、他のＲＡＲアゴニストに比べた細胞増殖の減少が、ＲＡＲβ２アゴニストＡＣ５５６４９について観察された。
【０１３３】
これらの結果は、ＲＡＲβ２アゴニストＡＣ５５６４９がＩ型ＮＫＴ細胞活性の有効なインヒビターであるということ、およびレチノイン酸レセプター−β２（ＲＡＲ−β２）シグナル伝達経路がＩ型ＮＫＴ細胞の阻害に関与しているということを示唆している。
【０１３４】
実施例１３
Ｉ型ＮＫＴ細胞に対するＰＰＡＲ−γ経路調節の作用
ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター（ＰＰＡＲ）は、甲状腺ホルモン、レチノイド、ステロイドホルモンおよびビタミンＤに対するレセプターも含む核内ホルモンレセプタースーパーファミリーに属するリガンド誘導性転写因子である。ＰＰＡＲは、ヘテロ二量体パートナーとしてのレチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）と共に、ＤＮＡにおける特定のペルオキシソーム増殖因子応答エレメント（ＰＰＲＥ）に結合することによって、遺伝子発現を調節する。ＰＰＡＲは、脂質代謝およびエネルギー代謝、炎症、胚移植、糖尿病および癌においてある役割を果たすと指摘されてきた。
【０１３５】
Ｉ型ＮＫＴ細胞の阻害におけるＰＰＡＲ−γ経路の役割を、新たに単離された脾臓Ｉ型ＮＫＴ細胞を、段階的濃度のＲＲＡＲ−γアゴニストロシグリタゾンまたはＰＰＡＲ−γアンタゴニストＧＷ９６６２の存在下または不在下において、［３Ｈ］−チミジンおよび最適濃度のαＧａｌＣｅｒと共に培養することによって試験した。αＧａｌＣｅｒ刺激に応答した脾臓Ｉ型ＮＫＴ細胞の増殖を、［３Ｈ］−チミジン取り込みにより定量化した。同様のレベルの増殖が、ＰＰＡＲ−γアゴニストロシグリタゾン、またはＰＰＡＲ−γアンタゴニストＧＷ９６６２のいずれかにおいて培養された細胞について、全ての濃度において観察された。図１３を参照されたい。これらの結果は、ＰＰＡＲ−γ経路の特異的な阻害または活性化がＩ型ＮＫＴ細胞増殖を直接的に阻害しないということを示唆している。
【０１３６】
実施例１４
Ｉ型ＮＫＴ細胞活性に対するレチノールアナログの作用の調査
膵細胞を、ナイーブＢ６マウスから単離し、段階的濃度のＡＴＲＡ、レチノール、９−ｃｉｓ−ＲＡまたは１３−ｃｉｓ−ＲＡの存在下または不在下において、［３Ｈ］−チミジンおよび最適濃度のαＧａｌＣｅｒと共に、インビトロで培養した。αＧａｌＣｅｒ刺激に応答した膵臓Ｉ型ＮＫＴ細胞の増殖を、［３Ｈ］−チミジン取り込みにより定量化した。図１４に示されるように、１０１μｇ／ｍｌのＡＴＲＡにおいて培養された細胞については、増殖は、全くまたはほとんど観察されなかったが、Ｉ型ＮＫＴ細胞増殖の同じレベルの阻害は、１０１μｇ／ｍｌを超えるレチノール、９−ｃｉｓ−ＲＡまたは１３−ｃｉｓ−ＲＡの濃度でしか観察されなかった。
【０１３７】
実施例１５
Ｉ型ＮＫＴ細胞活性に対するＲＡＲアゴニストの作用の調査
インビトロ増殖およびサイトカイン放出アッセイを、新たに単離された脾細胞およびＩ型ＮＫＴ細胞ハイブリドーマ（１．２Ｈｙｂ）に対して行った。細胞を、［３Ｈ］−チミジンおよび最適濃度のαＧａｌＣｅｒ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下において、滴定濃度のＡＴＲＡ、トレチノイン、ＲＡＲαアゴニストＡＭ５８０、ＲＡＲβアゴニストＡＣ５５６４９またはＲＡＲγアゴニストＣＤ１５３０と共に培養した。αＧａｌＣｅｒ刺激に応答したＩ型ＮＫＴ細胞の増殖を、［３Ｈ］−チミジン取り込みにより定量化した。ＩＬ−２レベルを、ＩＬ−２サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定した。ＲＡＲアゴニストの最適濃度を決定した。ＲＡＲアゴニストのそれらの最適濃度における作用の比較を、図１５に示す。最低レベルの増殖は、ＡＴＲＡ、トレチノイン、ＲＡＲγアゴニストＣＤ１５３０の存在下において培養された細胞について観察された。ＲＡＲγアゴニストＣＤ１５３０の存在下において培養された細胞が、最低レベルのＩＬ−２分泌を示した。これらの結果は、ＲＡＲγアゴニストＣＤ１５３０が、Ｉ型ＮＫＴ細胞活性の有効なインヒビターであることを示している。
【０１３８】
実施例１６
タザロテンおよびＡＴＲＡによるＩ型ＮＫＴ細胞の阻害の比較
Ｉ型ＮＫＴ細胞活性に対する選択的ＲＡＲγアゴニストタザロテンの作用を、インビトロ増殖およびサイトカイン放出アッセイにより調べた。
【０１３９】
インビトロ増殖およびサイトカイン放出アッセイは、新たに単離された脾細胞およびＩ型ＮＫＴ細胞ハイブリドーマ（１．２Ｈｙｂ）に対して行った。細胞を、［３Ｈ］−チミジンおよび最適濃度のαＧａｌＣｅｒ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下において、増加していく濃度のＡＴＲＡまたはタザロテンと共に培養した。αＧａｌＣｅｒ刺激に応答したＩ型ＮＫＴ細胞の増殖を、［３Ｈ］−チミジン取り込みにより定量化した。ＩＬ−２レベルを、ＩＬ−２サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定した。ＡＴＲＡおよびタザロテンによるＩ型ＮＫＴ細胞阻害の比較を、図１６に示す。ＲＡＲアゴニストによりＩ型ＮＫＴ細胞増殖およびＩＬ−２分泌が阻害されるが、タザロテンの方が、より低い濃度においてその阻害効果を達成する。図１６を参照されたい。
【０１４０】
実施例１７
タザロテンおよびＡＴＲＡのインビボ投与に続くＩ型ＮＫＴ細胞の阻害
タザロテンまたはＡＴＲＡのインビボ投与に続くＩ型ＮＫＴ細胞における機能変化を試験した。マウスの各群に、３００μｇのＡＴＲＡ（１５ｍｇ／ｋｇ）、３００μｇのタザロテン（１５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（ＤＭＳＯ）を、５日間にわたり毎日腹腔内注射した。脾臓Ｉ型ＮＫＴ細胞を精製し、増加していく濃度のαＧａｌＣｅｒと共にインビトロで培養した。細胞増殖を、［３Ｈ］−チミジン取り込みの定量化により測定した。その結果を図１７にて示す。ＡＴＲＡ注射マウス、タザロテン注射マウス、またはビヒクル（ＤＭＳＯ）注射マウスから単離された細胞のαＧａｌＣｅｒ刺激に対する増殖応答の比較は、ＡＴＲＡまたはタザロテンのインビボ投与がいずれもＩ型ＮＫＴ細胞活性を阻害することを示している。しかしながら、最低レベルの増殖は、タザロテン注射マウスから単離されたＩ型ＮＫＴ細胞について観察された。図１７を参照されたい。
【０１４１】
単核細胞を、ＡＴＲＡ、タザロテンまたはビヒクル（ＤＭＳＯ）のいずれかを注射されたマウスの肝臓から単離し、αＧａｌＣｅｒ／ＣＤ１ｄ−テトラマーおよび汎抗ＴＣＲβ抗体で染色した。フローサイトメトリーを行い、αＧａｌＣｅｒ／ＣＤ１ｄ−テトラマー／ＴＣＲβ発現細胞（Ｉ型ＮＫＴ細胞）の個体群を、図１８に示されるように定量化した。コントロール対ＡＴＲＡまたはタザロテン投与動物の肝臓中のＩ型ＮＫＴ細胞の数に著しい差は観察されなかった。図１８を参照されたい。これらの結果は、ＡＴＲＡまたはタザロテン投与が肝臓Ｉ型ＮＫＴ細胞を涸渇させないことを示している。
【０１４２】
予備的実施例１８
ＲＡＲアゴニスト投与によるＡＬＤの予防
アルコール性肝疾患の予防または緩和におけるＲＡＲアゴニストの有効性を、有効量のＡＴＲＡ、タザロテン、トレチノイン、ＲＡＲαアゴニストＡＭ５８０、ＲＡＲβアゴニストＡＣ５５６４９、ＲＡＲγアゴニストＣＤ１５３０、またはビヒクル／ＤＭＳＯを、５日間にわたり毎日マウスの各群に注射することにより試験する。この期間中、マウスは、１０日間にわたり５％のエタノールを含有する液体食餌、それに続く（１１日目における）単回の高用量の強制飼養エタノール（５ｇ／ｋｇ体重）（慢性的＋過エタノール給餌群）または等カロリーのデキストリンマルトース含有食餌、それに続く等カロリーのデキストリンマルトース強制飼養（コントロール群）のいずれかである。マウスを強制飼養の６〜８時間後に安楽死させ、血清および肝組織を採取する。
【０１４３】
血清ＡＬＴレベルを、各マウス群について測定する。血清ＡＬＴレベルは、慢性的＋過エタノール給餌に供されたビヒクル／ＤＭＳＯ注射マウスにおいて、コントロール給餌マウスに比べて著しく増加することが予想される。ＡＴＲＡ、タザロテン、トレチノイン、ＡＭ５８０、ＡＣ５５６４９、ＣＤ１５３０の注射を受けた慢性的＋過エタノール給餌マウスは、慢性的＋過エタノール給餌に供されたビヒクル／ＤＭＳＯ注射マウスに比べて減少した血清ＡＬＴレベルを有することが予想される。慢性的＋過エタノール給餌に供された、ＡＴＲＡ、タザロテン、またはトレチノイン注射マウスの血清ＡＬＴレベルは、コントロール給餌マウスにおいて観察される血清ＡＬＴレベルと同様であることが予想される。肝脂肪性肝炎（脂肪肝疾患）についての組織学的調査は、慢性的＋過エタノール給餌に続いてビヒクルＤＭＳＯ注射マウスから採取される肝組織の著しい損傷を示すことが予想されるが、慢性的＋過エタノール給餌に続いてＡＴＲＡ、タザロテン、トレチノイン、ＡＭ５８０、ＡＣ５５６４９、またはＣＤ１５３０注射マウスから採取される肝組織については、損傷の減少または損傷がないことが予想される。
【０１４４】
予言的実施例１９
ＡＴＲＡ処置されたまたはタザロテン処置されたＢＬ／６マウスからのαＧａｌＣｅｒ／ＣＤ１ｄ−テトラマー精製Ｉ型ＮＫＴ細胞を用いる養子移入実験を使用して、段階的な数のこれらの細胞がナイーブＢＬ／６レシピエントに移入された場合に慢性的＋過エタノール給餌に続いて肝傷害を阻害し得るか否かを調べる。
【０１４５】
精製（選別）されたスルファチド−ＣＤ１ｄ−テトラマー＋Ｔ細胞を、それらがＣＤ１ｄ＋／＋およびＣＤ１ｄ−／−マウスへの養子移入によりＡＬＤを防止し得るか否かを決定するために試験する。サイトカインノックアウトマウスをスルファチド反応性Ｔ細胞のドナーとして用いて、ＡＬＤの調節におけるＩＩ型ＮＫＴ細胞によるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０分泌の役割を直接決定する。スルファチド反応性Ｔ細胞をテトラマーを用いて単離し、段階的な数（５０万〜１００万個）をＣＤ１ｄ＋／＋およびＣＤ１ｄ−／−Ｃ５７ＢＬ／６レシピエントに養子移入する。約１５０万個のスルファチド−ＣＤ１ｄ−テトラマー＋細胞を、１８匹のナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスから単離する。１日後に、レシピエントを、慢性的＋過エタノール給餌に曝露する。ＩＩ型ＮＫＴ細胞によるサイトカイン分泌の役割を分析するために、ＢＬ／６バックグラウンド（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ）のＩＦＮ−γ、ＩＬ−４−／−またはＩＬ−１０−／−を最初に用いる。ＢＬ／６野生型またはノックアウトマウス群にスルファチド（２０μｇ／動物）を注射し、次いでＡＬＤを誘導する。これらの２型サイトカインの不在下において、スルファチド投与は、ＡＬＤを妨げることが予想される。養子細胞移入実験をさらに、特定のサイトカインノックアウトマウスからのスルファチド−ＣＤ１ｄ−テトラマー＋細胞を用いて行い、ここでは、段階的な数（５０万〜１００万個）をＣＤ１ｄ−／−Ｃ５７ＢＬ／６マウスに移入する。１日後、レシピエントマウスに、エタノール摂餌を続けさせる。並行して、ポジティブコントロールとして、スルファチド−ＣＤ１ｄ−テトラマー＋Ｔ細胞を、野生型マウスからＣＤ１ｄ＋／＋ＢＬ／６マウスに移入する。これらの実験は、ＡＬＤの制御におけるスルファチド反応性Ｔ細胞により分泌されるこれらのサイトカインの役割を直接確認することが予想される。
【０１４６】
均等物
上述の明細書は、当業者が本実施形態を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。上述の記載は、特定の好ましい実施形態を詳述し、本発明者らにより企図される最良の態様を記載している。しかしながら、上述のものが本文中でいかに詳細であるように見えようとも、本実施形態は、いろいろなやり方で実施されることができ、添付の特許請求の範囲およびそのあらゆる均等物にしたがって解釈されるべきであることが理解されるであろう。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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