(57)【要約】本発明は、代謝物質の濃度を測定し、それらを健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較することにより、被験者がアルツハイマー病に進行するリスクの増加を診断するための方法に関する。本発明によると、軽度認知障害を有する被験者がアルツハイマー病に進行するリスクの増加は侵襲的技術なしに診断することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者がアルツハイマー病に進行するリスクの増加を診断するための方法であって、
（ａ）該被験者から生体液サンプルを得るステップと、
（ｂ）２，４−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、２−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、グリセレート、３，４−ジヒドロキシ酪酸および２−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質の濃度を測定するステップと
を含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の増加がＡＤに進行するリスクの増加を示す、方法。
【請求項２】
ＰＣ（１６：０／１８：１）、ＰＣ（１６：０／２０：３）、ＰＣ（１６：０／１６：０）、ＰＣ（１８：０／１８：１）、グリシル−プロリン、クエン酸、アミノマロン酸または乳酸からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質の濃度を測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の増加がＡＤに進行するリスクの増加を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リビトール、フェニルアラニン及びＤ−リボース５−リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質の濃度を測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の減少がＡＤに進行するリスクの増加を示す、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度を、サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離（ＧＣ）において測定された、電子衝撃イオン化（ＥＩ）[７３：９９８  ５５：９９１  ７５：５５８  ９８：３５５  １１７：３５１  ５７：３２８  ８３：２７１  ６９：２３７  ５４：２１７  ８１：２０３  ８４：１４４  １３２：１４３  ５６：１３３  ５１：１２８  １２９：１２６  １７３：１２１  １００：１１８  ６７：１０９  ７１：１０５  ９５：１０３  １１３：７９  １０９：７４  ４５：７０  １０５：６６  １３１：５９  ６０：５９  ４９：５９  １１１：５８  ４７：５７  ６１：５６  １４５：５３  ６５：５１  １４６：４９  １１２：４９  ８２：４７  ６４：４７  ９１：４６  １３０：４３  １１８：４１  ５３：４１  ７８：４０  ８５：３９  １４３：３８  ３１３：３７  １０７：３７  １０２：３６  １７１：３３  ９７：３２  １３３：３１  １０３：３１  ６８：３１  １０４：３０  ７０：２９  １３５：２８  １６２：２５  １１９：２５  １８７：２４  １４９：２４  １４７：２４  ７４：２４  １４２：２３  ２４２：２２  ２６９：２１  １２３：２１  １２１：２１  ８７：２１  １９０：２０  １６０：２０  ６６：２０  ６７０：１９  １６５：１９  １４４：１８  ２４０：１７  ６５５：１６  ５８１：１６  ３２８：１６  ３１１：１６  １７２：１６  ６２：１６  ６８０：１５  ３０９：１５  ２６７：１５  １９９：１５  １８５：１５  １２７：１５  １２２：１５  １０８：１５  ７７：１５]および２７４２＋／−３０の保持指標で質量分析検出器（ＭＳ）を用いて測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の増加がＡＤに進行するリスクの増加を示す、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度を、サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離（ＧＣ）において測定された、電子衝撃イオン化（ＥＩ）[７３：９９９、４５：２７８、２１６：１５２、５７：１２６、７４：８２、３３５：８２、７５：７９、３２０：６１、９１：２８、１７４：２１、１０５：１７、５９：１４、１１５：７、５５：５、７７：２]および２０４０＋／−３０の保持指標で質量分析検出器（ＭＳ）を用いて測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の減少がＡＤに進行するリスクの増加を示す、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度を、サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離（ＧＣ）において測定された、電子衝撃イオン化（ＥＩ）[７５：９９６、７３：９２７、１１７：６６４、５５：４５５、１２９：３４７、１３２：２０５、４５：１９７、６７：１８０、６９：１４０、５７：１３７、８１：１２４、１４５：１２４、７４：９９、４７：９７、１３１：９７、６１：７６、８３：６９、５６：６８、９５：６６、７６：６３、７９：６０、５４：５７、９６：５２、７７：４５、３１３：４５、１１８：４３、８２：４０、６８：３９、８４：３６、９７：３５、９８：３１、５３：２８、９３：２４、８０：２２、１０９：１９、１３３：１９、９１：７、７２：６、１１６：５、５９：４、１１０：４、９４：２]および２７６９．５＋／−３０の保持指標で質量分析検出器（ＭＳ）を用いて測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の減少がＡＤに進行するリスクの増加を示す、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度を、サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離（ＧＣ）において測定された、電子衝撃イオン化（ＥＩ）[７３：９４８、１７４：８５２、８６：６１１、５９：４０９、４５：２９９、１００：２７７、１７０：１７１、１７５：１４３、６９：１１９、８０：７７、５３：７５、７４：７４、９７：６７、１７６：５４、６８：５２、１３０：５０、５８：４８、８９：３４、５４：３０、５５：３０、８７：２９、５７：２６、１２６：２６、７５：２２、１２９：２０、１３９：２０、７８：１５、７０：１３、６０：１１、８１：１１、１０２：１１、５６：１０、１２７：８、６７：７、８３：７、１４０：７、８５：６、１７１：４、７７：３、７９：３、９１：３、１０１：３、１５８：３、４６：２、４７：２、５１：２、７２：２、８２：２、１１７：２、５０：１、６１：１、６６：１、８４：１、９８：１、９９：１、１１２：１、１３１：１]および１５２０．１＋／−３０の保持指標で質量分析検出器（ＭＳ）を用いて測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の減少がＡＤに進行するリスクの増加を示す、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
濃度の相対変化が比較される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
絶対濃度の変化がリスク増加を示す、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
２，４−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、２−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、グリセリン酸、３，４−ジヒドロキシ酪酸および２−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質と、ＰＣ（１６：０／１８：１）、ＰＣ（１６：０／２０：３）、ＰＣ（１６：０／１６：０）、ＰＣ（１８：０／１８：１）、グリシル−プロリン、クエン酸、アミノマロン酸または乳酸からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質との濃度が増加した、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、ＧＣ−ＥＩ／ＭＳ：[７３：９９８  ５５：９９１  ７５：５５８  ９８：３５５  １１７：３５１  ５７：３２８  ８３：２７１  ６９：２３７  ５４：２１７  ８１：２０３  ８４：１４４  １３２：１４３  ５６：１３３  ５１：１２８  １２９：１２６  １７３：１２１  １００：１１８  ６７：１０９  ７１：１０５  ９５：１０３  １１３：７９  １０９：７４  ４５：７０  １０５：６６  １３１：５９  ６０：５９  ４９：５９  １１１：５８  ４７：５７  ６１：５６  １４５：５３  ６５：５１  １４６：４９  １１２：４９  ８２：４７  ６４：４７  ９１：４６  １３０：４３  １１８：４１  ５３：４１  ７８：４０  ８５：３９  １４３：３８  ３１３：３７  １０７：３７  １０２：３６  １７１：３３  ９７：３２  １３３：３１  １０３：３１  ６８：３１  １０４：３０  ７０：２９  １３５：２８  １６２：２５  １１９：２５  １８７：２４  １４９：２４  １４７：２４  ７４：２４  １４２：２３  ２４２：２２  ２６９：２１  １２３：２１  １２１：２１  ８７：２１  １９０：２０  １６０：２０  ６６：２０  ６７０：１９  １６５：１９  １４４：１８  ２４０：１７  ６５５：１６  ５８１：１６  ３２８：１６  ３１１：１６  １７２：１６  ６２：１６  ６８０：１５  ３０９：１５  ２６７：１５  １９９：１５  １８５：１５  １２７：１５  １２２：１５  １０８：１５  ７７：１５]および２７４２＋／−３０の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度がさらに増加した、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、ＧＣ−ＥＩ／ＭＳ：[７３：９９９、４５：２７８、２１６：１５２、５７：１２６、７４：８２、３３５：８２、７５：７９、３２０：６１、９１：２８、１７４：２１、１０５：１７、５９：１４、１１５：７、５５：５、７７：２]および２０４０＋／−３０の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度がさらに減少した、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、ＧＣ−ＥＩ／ＭＳ：[７５：９９６、７３：９２７、１１７：６６４、５５：４５５、１２９：３４７、１３２：２０５、４５：１９７、６７：１８０、６９：１４０、５７：１３７、８１：１２４、１４５：１２４、７４：９９、４７：９７、１３１：９７、６１：７６、８３：６９、５６：６８、９５：６６、７６：６３、７９：６０、５４：５７、９６：５２、７７：４５、３１３：４５、１１８：４３、８２：４０、６８：３９、８４：３６、９７：３５、９８：３１、５３：２８、９３：２４、８０：２２、１０９：１９、１３３：１９、９１：７、７２：６、１１６：５、５９：４、１１０：４、９４：２]および２７６９．５＋／−３０の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度がさらに減少した、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、ＧＣ−ＥＩ／ＭＳ：[７３：９４８、１７４：８５２、８６：６１１、５９：４０９、４５：２９９、１００：２７７、１７０：１７１、１７５：１４３、６９：１１９、８０：７７、５３：７５、７４：７４、９７：６７、１７６：５４、６８：５２、１３０：５０、５８：４８、８９：３４、５４：３０、５５：３０、８７：２９、５７：２６、１２６：２６、７５：２２、１２９：２０、１３９：２０、７８：１５、７０：１３、６０：１１、８１：１１、１０２：１１、５６：１０、１２７：８、６７：７、８３：７、１４０：７、８５：６、１７１：４、７７：３、７９：３、９１：３、１０１：３、１５８：３、４６：２、４７：２、５１：２、７２：２、８２：２、１１７：２、５０：１、６１：１、６６：１、８４：１、９８：１、９９：１、１１２：１、１３１：１]および１５２０．１＋／−３０の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度がさらに減少した、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
２，４−ジヒドロキシブタン酸の濃度が測定される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ホスファチジルコリン（１６：０／１６：０）の濃度が測定される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
クエン酸の濃度が測定される、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
フェニルアラニンの濃度が測定される、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
グリシル−プロリンの濃度が測定される、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
２，４−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、２−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、グリセレート、クエン酸、乳酸、３，４−ジヒドロキシ酪酸および２−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質の濃度がベースレベルと比較して少なくとも５％の増加した、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者がアルツハイマー病に進行するリスクの増加を早期診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は先進国の医療制度および経済にとって深刻化する課題であり、この疾患を患う患者は数百万人おり、高齢化に伴い毎年新たに診断される症例の数は増加している。軽度認知障害（ＭＣＩ）は正常老化とＡＤとの間の移行期と考えられる。ＭＣＩを有する被験者は、主に記憶機能において認知障害を示すが、日常生活の活動を維持し、ＡＤまたはその他の認知症障害の基準を満たさない。ＭＣＩはＡＤを発症するリスクの増加をもたらすが、その状態は正常の認知機能に戻る改善も含むいくつかの考えられる結果を有する。最近の研究はよって、安定性ＭＣＩ（Ｓ−ＭＣＩ）からＡＤ（進行性ＭＣＩ、Ｐ−ＭＣＩ）を発症するＭＣＩ被験者と健康な高齢の対照被験者とを識別する特性を同定するバイオマーカーを得ることに専念した。
【０００３】
文献第ＷＯ２００３／０５０５２８号は、脳組織または脳脊髄液中のスルファチドのレベルの低下がアルツハイマー病の存在と正に相関することを示す。しかしながら、理想的にはＡＤバイオマーカーは（１）疾患に関連する生物学的プロセスを反映し、（２）血液検査のように非侵襲的に測定することができる。潜在的な病原因子に感受性のある分子マーカーは高い重要性を有し、早期疾患検出および診断を補助するだけでなく、その後疾患モニタリングおよび治療応答も促進するだろう。ＡＤを予測できる潜在的なマーカーを同定することを目的とする２つの独立した血漿プロテオミクス研究において、重複しないが有望な結果が得られた。メタボロミクスは、細胞、組織、および生体液中の小分子（すなわち、代謝物質）のグローバル研究に専念する分野である。特定の群の代謝物質の濃度変化は、遺伝的変異、食事、年齢、免疫系状態または腸内微生物相のような病原的に関連する因子に感受性があり得、それらの研究は従って遺伝および環境因子の両方により影響を受ける複雑な表現型を特徴づける強力な方法であり得る。過去に、多数の異なる代謝物質の総合的および定量的な調査を可能にする技術が開発された。
【０００４】
すべてのアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）処理タンパク質は膜貫通タンパク質であるので、代謝物質の中でも脂質がもっとも注目されてきた。脂質は細胞膜の主な構成成分であり、それらの組成は膜結合タンパク質の膜流動性、トポロジー、移動性または活性を維持し、正常な細胞生理を確保するのに重要である。構造的および機能的に多様な脂質のグローバルプロファイルをカバーする疾患関連「リピドーム」の調査は、数百の分子脂質を並列プロファイリングする研究を正確におよび鋭敏に追求する機会を提供する。いわゆるリピドミクス手法は、疾患関連マーカーについての情報を提供するだけではなく、加えて細胞脂質ホメオスタシスの制御の背景にあるメカニズムについてのヒントを伝えることができる。
【０００５】
しかしながら、被験者がアルツハイマー病に進行するリスクを早期診断するという課題が残る。好適には、診断は非侵襲的であり、使いやすく、費用効果的であるべきである。本発明はこれらのニーズを満たす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、アルツハイマー病に進行するリスクが増加した被験者を早期診断するための使いやすい方法を提供することである。本発明は、容易におよび侵襲的ステップなしに、アルツハイマー病の非常に早期の段階にある患者を健康な被験者から識別する方法を提供する。正常な被験者および早期アルツハイマー病を有する被験者において得られる値に視覚的な重複は起こらない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の態様は、被験者がアルツハイマー病に進行するリスクの増加を診断するための方法である。本発明によると、その方法は、前記被験者からサンプルを得るステップおよび少なくとも１つの代謝物質の濃度を測定するステップを含み、濃度の変化がＡＤに進行するリスクの増加を示す。とくに本発明は、請求項１の特徴づけ部分において定義されるステップを有する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本出願の実験部分において記載される実験および分析のワークフローを示す。
【図２Ａ】ＭＣＩと診断されたベースラインの被験者における３つの代謝物質（２，４−ジヒドロキシブタン酸、カルボン酸、ＰＣ（１６：０／１６：０））の濃度に基づく、ＡＤ予測の可能性。（Ａ）サンプルの１／３において独立して試験されたモデルの特性（ＡＵＣ、ＯＲ、ＲＲ）は、２，０００回の交差検証に基づき、平均値（５、９５パーセンタイル）として示される。Ａｃｃ＝分類精度；ＡＵＣ＝受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積；ＯＲ＝オッズ比；ＲＲ＝相対リスク。
【図２Ｂ】モデルに含まれる３つの代謝物質のビーンプロット。
【図２Ｃ】モデルに含まれる２つの代謝物質のＧＣ×ＧＣ−ＴＯＦＭＳスペクトル。
【図３】β−アミロイド１−４２（ＬｉＢＡＭ４２、赤）、２，４−ジヒドロキシブタン酸（青）、および両方のバイオマーカーの組み合わせ（緑）の診断性能。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
略語：ＡＡ＝アラキドン酸；Ａｃｃ＝分類精度；ＡＤ＝アルツハイマー病；ＡＵＣ＝受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積；ＣＳＦ＝脳脊髄液；ＤＨＡ＝ドコサヘキサエン酸；ＥＰＡ＝エイコサペンタエン酸；ＥＳＩ＝エレクトロスプレーイオン化；ＧＣ×ＧＣ−ＴＯＦＭＳ＝二次元ガスクロマトグラフィー−飛行時間型質量分析；ｌｙｓｏＰＣ＝リゾホスファチジルコリン；ＭＣＩ＝軽度認知障害；ＭＳ＝質量分析；ＯＲ＝オッズ比；ＰＣ＝ホスファチジルコリン；ＲＲ＝相対リスク；ＵＰＬＣ−ＭＳ＝超性能液体クロマトグラフィー（商標）−質量分析。
【００１０】
我々は、十分に特徴づけられた前向き研究において、アルツハイマー病への進行およびその診断に関連する血清代謝プロファイルを決定しようとした。ベースライン評価で、研究に登録された被験者を３つの診断グループ：健康な対照、ＭＣＩ、およびＡＤに分類した。脂質から親水性代謝物質まで、広い分析範囲を有する２つのプラットフォームを用いるグローバルメタボロミクス手法を適用し、研究に参加した被験者からのベースライン血清サンプルを分析し、代謝物質プロファイルをベースラインおよびフォローアップでの診断と関連づけた（図１参照）。十分に表現型を示す集団に基づく我々の発見は、特定の代謝異常をアルツハイマー病への進行と関連づける。
【００１１】
本発明によると、軽度認知障害を有する被験者がアルツハイマー病に進行するリスクの増加は、侵襲的技術なしに診断することができる。予後は簡単で迅速であり、精巧な装置は必要としない。ＡＤの進行のリスクの早期予測は、例えば医療画像によるより詳細なモニタリングのための患者の層別化を可能にし、疾患の治療のためのより効率的な薬物療法の開発を促進し、また疾患予防を目的とする早期介入を開始することができる。
【００１２】
本発明の第１実施形態は、被験者がアルツハイマー病に進行するリスクの増加を診断するための方法であり、
（ａ）該被験者からサンプル、好適には生体液を得るステップと、
（ｂ）２，４−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、２−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、グリセレート、３，４−ジヒドロキシ酪酸および２−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質の濃度を測定するステップと
を含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の増加がＡＤに進行するリスクの増加を示す。
【００１３】
上記代謝物質は、２〜５つの炭素原子および、カルボキシル基に加えて、１つ以上のヒドロキシルまたはケトン（オキソ）基を含有するカルボン酸の群に属する。よって、少なくとも１つの代謝物質を前記群から選択することが好ましい。とくに、代謝物質は、ヒドロキシルおよびオキソ基から選択される少なくとも２つの官能基を含有するこうしたカルボン酸から選択される。
【００１４】
本発明の別の実施形態によると、代謝物質は上記カルボン酸群に属する以下の化合物から選択される：
２，４−ジヒドロキシブタン酸、
グリコール酸、
２−ヒドロキシ酪酸、
３−ヒドロキシ酪酸、
３−ヒドロキシプロピオン酸、
グリセレート、
３，４−ジヒドロキシ酪酸、
２−オキソイソ吉草酸、
２，３−ジヒドロキシプロピオン酸、
２−ヒドロキシペンタン酸、
３−ヒドロキシペンタン酸、
４−ヒドロキシペンタン酸、
２−ヒドロキシ−４−オキソ−ペンタン酸、
５−ヒドロキシ−３−オキソ−ペンタン酸、
２，４−ジヒドロキシペンタン酸、
３，５−ジヒドロキシペンタン酸、
４，５−ジヒドロキシペンタン酸、
４−ヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸、および
４，５−ジヒドロキシ−２−オキソ−ペンタン酸。
【００１５】
本明細書では、「被験者」とはＭＣＩを有する人を意味し、ＭＣＩは軽度認知障害と定義され、これは正常老化とアルツハイマー病（ＡＤ）との間の移行期と考えられる。ＭＣＩはＡＤを発症するリスクの増加をもたらすが、その状態は正常な認知機能に戻る改善も含むいくつかの考えられる結果を有する。
【００１６】
本明細書では、「ＡＤに進行するリスクの増加」とは、リスクが健康な人より統計的に有意に増加した（高い）ことを意味する。とくに、本発明を用いることにより、ＡＤに進行すると診断されたグループにおけるＡＤ発症のオッズの、ＡＤに進行しないと診断されたグループにおけるその発症のオッズに対する比は、（１．４４、１９．０２）の９０パーセント信頼区間で、４．２であることを意味する。
【００１７】
サンプルはいずれかの生体液とすることができ、好適には該液は血液、血清または血漿である。別の代替実施形態によると、生体液は血液、血清、血漿、尿または脳脊髄液である。
【００１８】
望ましくは、関心のある代謝物質の評価のための適切な代謝画分を得るため、生体液がまず抽出される。しかしながら、代謝物質マーカーのレベルの評価に用いられる方法に応じて、こうした抽出は必要でない場合もあり得る。測定にもっとも便利な最終サンプルを得るため、最終的に評価に用いられるサンプルに分画処理を行うこともできる。生体液のとくに好適で便利な技術は、選択的なサンプル抽出後が望ましい、質量分析への直接注入である。
【００１９】
代謝物質の濃度を測定する方法としては、いずれの制限もなく、例えば質量分析、他の分析もしくは電気化学検出器と組み合わせたクロマトグラフおよび／もしくは電気泳動方法、ＭＳ、他の分析もしくは電気化学検出器単独または他の生化学的もしくは免疫化学的方法が挙げられる。本発明は本明細書において記載される特定の方法および構成要素、等に限定されず、それらは異なってもよい。本明細書において用いられる用語は特定の実施形態について記載する目的でのみ用いられ、本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解すべきである。
【００２０】
本明細書において用いられる場合、「レベル」とは被験者からの所定のサンプル中の特定の代謝物質の絶対的または半定量的な濃度または量を指し、「比較」とは被験者からのサンプル中の所定のバイオマーカーの１つ以上の割合、レベルまたは濃度が標準または対照サンプル中の対応する１つ以上のバイオマーカーの割合、レベルまたは濃度にどのように関連するかを評価することを指す。例えば、「比較」とは被験者からのサンプル中の１つ以上のバイオマーカーの割合、レベル、または濃度が標準または対照サンプル中の対応する１つ以上のバイオマーカーの割合、レベル、または濃度と同じ、それより多いもしくは少ない、またはそれとは異なるかを評価することを指すことができる。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態は、制限なく、第１実施形態とおよび互いに組み合わせることができる。後述するさらなる実施形態のほとんどは、第１実施形態により得られる診断と比較してさらにより良好な診断の手段を提供する。
【００２２】
別の実施形態では、その方法は、ＰＣ（１６：０／１８：１）、ＰＣ（１６：０／２０：３）、ＰＣ（１６：０／１６：０）、ＰＣ（１８：０／１８：１）、グリシル−プロリン、クエン酸、アミノマロン酸または乳酸からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質の濃度を測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の増加がＡＤに進行するリスクの増加を示す。
【００２３】
別の実施形態では、その方法は、リビトール、フェニルアラニンまたはＤ−リボース５−リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質の濃度を測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の減少がＡＤに進行するリスクの増加を示す。
【００２４】
１つの実施形態では、被験者がアルツハイマー病に進行するリスクを診断するための方法は、
（ａ）該被験者の生体液中の、２，４−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、２−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、グリセレート、３，４−ジヒドロキシ酪酸および２−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質のレベルと、任意でＰＣ（１６：０／１８：１）、ＰＣ（１６：０／２０：３）、ＰＣ（１６：０／１６：０）、ＰＣ（１８：０／１８：１）脂質、グリシル−プロリン、クエン酸、アミノマロン酸および乳酸からなる群から選択される１つ以上の代謝物質またはリビトール、フェニルアラニンもしくはＤ−リボース５−リン酸からなる群から選択される１つ以上の代謝物質の濃度を測定するステップ；
（ｂ）正常な被験者における対応する液中の、２，４−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、２−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、グリセレート、３，４−ジヒドロキシ酪酸および２−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質のレベルと、任意でＰＣ（１６：０／１８：１）、ＰＣ（１６：０／２０：３）、ＰＣ（１６：０／１６：０）、ＰＣ（１８：０／１８：１）脂質、グリシル−プロリン、クエン酸、アミノマロン酸および乳酸からなる群から選択される１つ以上の代謝物質、またはリビトール、フェニルアラニンもしくはＤ−リボース５−リン酸からなる群から選択される１つ以上の代謝物質の濃度を提供するステップ；
（ｃ）（ａ）において測定された代謝物質のレベルを（ｂ）において提供された正常な被験者のそれと比較するステップ
を含み、（ｃ）における比較が（ａ）における該被験者における該代謝物質の少なくとも１つのレベルが（ｂ）において提供された正常な被験者のものとは統計的に有意に異なることを示す場合、該被験者はアルツハイマー病を発症するリスクが増加した被験者と同定される。
【００２５】
本発明を用いることにより、ＡＤに進行すると診断された場合のＡＤ発症のオッズの、ＡＤに進行しないと診断された場合のその発症のオッズに対する比は、（１．４４、１９．０２）の９０パーセント区間で、４．２である。
【００２６】
１つの実施形態ではさらに、スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度が、サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離（ＧＣ）において測定された、電子衝撃イオン化（ＥＩ）[７３：９９８  ５５：９９１  ７５：５５８  ９８：３５５  １１７：３５１  ５７：３２８  ８３：２７１  ６９：２３７  ５４：２１７  ８１：２０３  ８４：１４４  １３２：１４３  ５６：１３３  ５１：１２８  １２９：１２６  １７３：１２１  １００：１１８  ６７：１０９  ７１：１０５  ９５：１０３  １１３：７９  １０９：７４  ４５：７０  １０５：６６  １３１：５９  ６０：５９  ４９：５９  １１１：５８  ４７：５７  ６１：５６  １４５：５３  ６５：５１  １４６：４９  １１２：４９  ８２：４７  ６４：４７  ９１：４６  １３０：４３  １１８：４１  ５３：４１  ７８：４０  ８５：３９  １４３：３８  ３１３：３７  １０７：３７  １０２：３６  １７１：３３  ９７：３２  １３３：３１  １０３：３１  ６８：３１  １０４：３０  ７０：２９  １３５：２８  １６２：２５  １１９：２５  １８７：２４  １４９：２４  １４７：２４  ７４：２４  １４２：２３  ２４２：２２  ２６９：２１  １２３：２１  １２１：２１  ８７：２１  １９０：２０  １６０：２０  ６６：２０  ６７０：１９  １６５：１９  １４４：１８  ２４０：１７  ６５５：１６  ５８１：１６  ３２８：１６  ３１１：１６  １７２：１６  ６２：１６  ６８０：１５  ３０９：１５  ２６７：１５  １９９：１５  １８５：１５  １２７：１５  １２２：１５  １０８：１５  ７７：１５]および２７４２＋／−３０の保持指標で質量分析検出器（ＭＳ）を用い、測定される。
【００２７】
別の実施形態では、方法は、
−サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離（ＧＣ）において測定された、電子衝撃イオン化（ＥＩ）[７３：９９９、４５：２７８、２１６：１５２、５７：１２６、７４：８２、３３５：８２、７５：７９、３２０：６１、９１：２８、１７４：２１、１０５：１７、５９：１４、１１５：７、５５：５、７７：２]および２０４０＋／−３０の保持指標で質量分析検出器（ＭＳ）を用いて測定される、スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質
−サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離（ＧＣ）において測定された、電子衝撃イオン化（ＥＩ）[７５：９９６、７３：９２７、１１７：６６４、５５：４５５、１２９：３４７、１３２：２０５、４５：１９７、６７：１８０、６９：１４０、５７：１３７、８１：１２４、１４５：１２４、７４：９９、４７：９７、１３１：９７、６１：７６、８３：６９、５６：６８、９５：６６、７６：６３、７９：６０、５４：５７、９６：５２、７７：４５、３１３：４５、１１８：４３、８２：４０、６８：３９、８４：３６、９７：３５、９８：３１、５３：２８、９３：２４、８０：２２、１０９：１９、１３３：１９、９１：７、７２：６、１１６：５、５９：４、１１０：４、９４：２]および２７６９．５＋／−３０の保持指標で質量分析検出器（ＭＳ）を用いて測定される、スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質
−サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離（ＧＣ）において測定された、電子衝撃イオン化（ＥＩ）[７３：９４８、１７４：８５２、８６：６１１、５９：４０９、４５：２９９、１００：２７７、１７０：１７１、１７５：１４３、６９：１１９、８０：７７、５３：７５、７４：７４、９７：６７、１７６：５４、６８：５２、１３０：５０、５８：４８、８９：３４、５４：３０、５５：３０、８７：２９、５７：２６、１２６：２６、７５：２２、１２９：２０、１３９：２０、７８：１５、７０：１３、６０：１１、８１：１１、１０２：１１、５６：１０、１２７：８、６７：７、８３：７、１４０：７、８５：６、１７１：４、７７：３、７９：３、９１：３、１０１：３、１５８：３、４６：２、４７：２、５１：２、７２：２、８２：２、１１７：２、５０：１、６１：１、６６：１、８４：１、９８：１、９９：１、１１２：１、１３１：１]および１５２０．１＋／−３０の保持指標で質量分析検出器（ＭＳ）を用いて測定される、スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質
の１つ以上の濃度を測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の減少がＡＤに進行するリスクの増加を示す。
【００２８】
１つの実施形態では、測定された代謝物質の濃度の相対変化が比較される。１つの実施形態では、２，４−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、２−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、グリセレート、３，４−ジヒドロキシ酪酸および２−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体の少なくとも１つのレベルについて約１０％、好適には３０％以上の相対増加、好適には２，４−ジヒドロキシブタン酸の増加は、アルツハイマー病に進行するリスクの増加を示す。
【００２９】
別の実施形態では、
−ＰＣ（１６：０／１８：１）、ＰＣ（１６：０／２０：３）、ＰＣ（１６：０／１６：０）、ＰＣ（１８：０／１８：１）、グリシル−プロリン、クエン酸、アミノマロン酸または乳酸の少なくとも１つのレベルの約５％、好適には１０％以上；および任意で
−本出願において開示される未同定のカルボン酸のレベルの約１０％、好適には約２０％以上
のさらなる相対増加は、アルツハイマー病に進行するリスクの増加を示す。
【００３０】
本明細書では、「相対濃度の増加」とは、サンプルに添加される内部標準の検出器量と比較した所定の代謝物質の絶対検出器量として定義される、患者における代謝物質の相対応答が健康な被験者の平均応答に対して増加したことを意味する。
【００３１】
別の実施形態では、絶対濃度の増加はリスクの増加を示す。２，４−ジヒドロキシブタン酸について絶対値（正常レベル）は約２〜７μｍｏｌ／Ｌの範囲内であり、ＰＣ（１６：０／１６：０）について約２〜１０μｍｏｌ／Ｌである。「絶対濃度の増加」とは、ＰＣ（１６：０／１６：０）について平均約４〜６μｍｏｌ／Ｌ（２〜１０μｍｏｌ／Ｌ）の正常レベルである所定の代謝物質の濃度が、２．５〜１０μｍｏｌ／Ｌの平均レベルまで２０％増加したことを意味する。
【００３２】
本発明の１つの実施形態では、２，４−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、２−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、グリセリン酸、３，４−ジヒドロキシ酪酸および２−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質とＰＣ（１６：０／１８：１）、ＰＣ（１６：０／２０：３）、ＰＣ（１６：０／１６：０）、ＰＣ（１８：０／１８：１）脂質、グリシル−プロリン、クエン酸、アミノマロン酸または乳酸からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質の濃度が増加した。（健康な被験者の平均応答に対する、患者における）両方の群からの少なくとも１つの代謝物質の濃度の増加はリスク増加のより強い指標である。
【００３３】
さらなる実施形態では、５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、ＧＣ−ＥＩ／ＭＳ：[７３：９９８  ５５：９９１  ７５：５５８  ９８：３５５  １１７：３５１  ５７：３２８  ８３：２７１  ６９：２３７  ５４：２１７  ８１：２０３  ８４：１４４  １３２：１４３  ５６：１３３  ５１：１２８  １２９：１２６  １７３：１２１  １００：１１８  ６７：１０９  ７１：１０５  ９５：１０３  １１３：７９  １０９：７４  ４５：７０  １０５：６６  １３１：５９  ６０：５９  ４９：５９  １１１：５８  ４７：５７  ６１：５６  １４５：５３  ６５：５１  １４６：４９  １１２：４９  ８２：４７  ６４：４７  ９１：４６  １３０：４３  １１８：４１  ５３：４１  ７８：４０  ８５：３９  １４３：３８  ３１３：３７  １０７：３７  １０２：３６  １７１：３３  ９７：３２  １３３：３１  １０３：３１  ６８：３１  １０４：３０  ７０：２９  １３５：２８  １６２：２５  １１９：２５  １８７：２４  １４９：２４  １４７：２４  ７４：２４  １４２：２３  ２４２：２２  ２６９：２１  １２３：２１  １２１：２１  ８７：２１  １９０：２０  １６０：２０  ６６：２０  ６７０：１９  １６５：１９  １４４：１８  ２４０：１７  ６５５：１６  ５８１：１６  ３２８：１６  ３１１：１６  １７２：１６  ６２：１６  ６８０：１５  ３０９：１５  ２６７：１５  １９９：１５  １８５：１５  １２７：１５  １２２：１５  １０８：１５  ７７：１５]および２７４２＋／−３０の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度も増加した。いくつかの指標となる代謝物質の増加は予後の精度を向上する。
【００３４】
さらなる実施形態では、
−５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、ＧＣ−ＥＩ／ＭＳ：[７３：９９９、４５：２７８、２１６：１５２、５７：１２６、７４：８２、３３５：８２、７５：７９、３２０：６１、９１：２８、１７４：２１、１０５：１７、５９：１４、１１５：７、５５：５、７７：２]および２０４０＋／−３０の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する
−５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、ＧＣ−ＥＩ／ＭＳ：[７５：９９６、７３：９２７、１１７：６６４、５５：４５５、１２９：３４７、１３２：２０５、４５：１９７、６７：１８０、６９：１４０、５７：１３７、８１：１２４、１４５：１２４、７４：９９、４７：９７、１３１：９７、６１：７６、８３：６９、５６：６８、９５：６６、７６：６３、７９：６０、５４：５７、９６：５２、７７：４５、３１３：４５、１１８：４３、８２：４０、６８：３９、８４：３６、９７：３５、９８：３１、５３：２８、９３：２４、８０：２２、１０９：１９、１３３：１９、９１：７、７２：６、１１６：５、５９：４、１１０：４、９４：２]および２７６９．５＋／−３０の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する
−５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、ＧＣ−ＥＩ／ＭＳ：[７３：９４８、１７４：８５２、８６：６１１、５９：４０９、４５：２９９、１００：２７７、１７０：１７１、１７５：１４３、６９：１１９、８０：７７、５３：７５、７４：７４、９７：６７、１７６：５４、６８：５２、１３０：５０、５８：４８、８９：３４、５４：３０、５５：３０、８７：２９、５７：２６、１２６：２６、７５：２２、１２９：２０、１３９：２０、７８：１５、７０：１３、６０：１１、８１：１１、１０２：１１、５６：１０、１２７：８、６７：７、８３：７、１４０：７、８５：６、１７１：４、７７：３、７９：３、９１：３、１０１：３、１５８：３、４６：２、４７：２、５１：２、７２：２、８２：２、１１７：２、５０：１、６１：１、６６：１、８４：１、９８：１、９９：１、１１２：１、１３１：１]および１５２０．１＋／−３０の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する
代謝物質の１つ以上の濃度が測定され、減少はアルツハイマー病に進行するリスクの増加を示す。
【００３５】
１つの実施形態では、２，４−ジヒドロキシブタン酸の濃度が測定される。２，４−ジヒドロキシブタン酸の増加は、アルツハイマー病に進行するリスクの増加との強い相関を示す。
【００３６】
１つの実施形態では、ホスファチジルコリン（１６：０／１６：０）の濃度が測定される。２，４−ジヒドロキシブタン酸の増加と相関するホスファチジルコリン（１６：０／１６：０）の増加は、アルツハイマー病の予後をさらに向上する。
【００３７】
さらなる実施形態では、クエン酸、フェニルアラニンおよび／またはグリシル−プロリンの濃度が測定され、濃度の増加はＡＤに進行するリスクの増加のさらなる指標である。
【００３８】
本発明の１つの実施形態では、２，４−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、２−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、グリセレート、３，４−ジヒドロキシ酪酸および２−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質の濃度は少なくとも５％増加し、好適にはベースレベルと比較した少なくとも１０％の増加はアルツハイマー病に進行するリスクの増加を示す。
【実施例】
【００３９】
本発明は以下の非限定的な例により示される。しかしながら、上記説明および実施例において提供される実施形態は例示目的のためのみのものであり、本発明の範囲内で各種変更および修正が可能であることを理解すべきである。
【００４０】
実施例
以下の実施例は、当業者に本明細書において記載および特許請求されるバイオマーカー、組成物、装置、および／または方法がどのように生成および評価されるかの完全な開示および説明を提供するものであり、純粋に例示的であることを意図し、本発明者らが彼らの発明とみなすものの範囲を限定することを意図しない。数字（例えば、量、温度、等）についての正確さを確保する努力はなされたが、本明細書ではいくらかの誤差および偏差を考慮すべきである。用いることができる方法条件、例えば、成分濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力ならびに他の反応範囲および条件のいくつかの変形および組み合わせがある。
【００４１】
参加者
ＭＣＩの臨床ＡＤ認知症への変換の予測因子に注目する、ＰｒｅｄｉｃｔＡＤプロジェクト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｄｉｃｔａｄ．ｅｕ／）内では、ＭＣＩと診断された１４３人の被験者をクオピオ大学で集められた縦断的研究のデータベースからプールし、彼らの所見を４６人の健康な対照被験者および３７人のＡＤ患者のものと比較した（Ｈａｎｎｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｋｉｖｉｐｅｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｐｅｎｎａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。研究グループの記述および臨床データは表１に提示する。
【００４２】
【表１】
2014521928.tif 000002
ａε４対立遺伝子の対照に対するカイ二乗Ｐ＜０．００１、オッズ比４．０（ＣＩ２．０−８．３）、および安定性ＭＣＩに対するＰ＜０．０１、オッズ比２．２（１．３−３．７）。
ｂε４対立遺伝子の対照に対するカイ二乗Ｐ＝０．００１、オッズ比３．５（１．６−７．６）、および安定性ＭＣＩに対するＰ＝０．０２、オッズ比１．９（１．１−３．５）。
＊対照、安定性ＭＣＩおよび進行性ＭＣＩに対するＰ＜０．０１
＊＊対照に対するＰ＝０．０３
＊＊＊対照に対するＰ＜０．００１および安定性ＭＣＩに対するＰ＝０．０３
＊＊＊＊対照、安定性ＭＣＩおよび進行性ＭＣＩに対するＰ＜０．００１
【００４３】
この研究に含まれる健康な対照被験者は集団ベースのコホートからのボランティアであり、対照被験者の識別に用いられる方法は以前の研究において説明されている（Ｈａｎｎｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｋｉｖｉｐｅｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。彼らは神経または精神疾患の病歴を有さず、詳細な神経心理学的評価において障害を示さなかった。
【００４４】
ＭＣＩはメイヨークリニックアルツハイマー病研究センターにより独自に提案された基準を用いて診断した（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。これらの基準はその後修正されたが、この研究集団を募集したとき、必要なＭＣＩ基準は以下のとおりだった：（１）患者、家族、または内科医による記憶の病訴；（２）日常生活の正常な活動；（３）正常なグローバル認知機能；（４）年齢に応じた平均より標準偏差＞１．５下のスコアにより明らかな記憶または認知機能の１つの他の領域における客観的障害；（５）０．５の臨床認知症評価（ＣＤＲ）スコア；および（６）認知症の非存在。被験者はわずかに異なる神経心理学的試験バッテリーを有する異なる研究データベースからプールされたので、彼らの認知状態を記述するのにすべてのＭＣＩ被験者で行われた２つのスケール、ＭＭＳＥおよび臨床認知症評価尺度（ＣＤＲ−ＳＢ）を選択した。ＭＣＩを診断するのに用いられた神経心理学的試験バッテリーはわずかに異なったが、すべてのＭＣＩ被験者は募集時、その症候群の健忘亜型を有すると考えられた。
【００４５】
ＡＤの診断は、病歴の評価、内科医により行われる身体および神経心理検査、ならびに詳細な神経心理学的評価を含んだ。認知低下の重症度はＣＤＲスケールに従ってランクづけした（Ｂｅｒｇ，１９８８）。症候をもたらす他の考えられる病理を除外するため、脳ＭＲＩスキャン、脳脊髄液（ＣＳＦ）分析、心電図検査（ＥＫＧ）、胸部Ｘ線、高血圧およびうつ病のスクリーニングならびに血液検査も行った。認知症の診断は精神障害の診断・統計マニュアル、第４版（ＤＳＭ−ＩＶ）（アメリカ精神医学会、１９９４）の基準に基づき、ＡＤの診断は米国立神経障害・脳卒中研究所とアルツハイマー病関連障害協会（ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ）基準（ＭｃＫｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）に基づいた。すべてのＭＲ画像も経験ある神経放射線科医により読み取られ、重度の白質病変または他の異常を有する被験者を除外した。脳卒中または一過性虚血発作の病歴を有する研究被験者は、広範にコンフルエントな白質病変を有する被験者と同様に除外した。
【００４６】
フォローアップ中にＡＤを発症したＭＣＩ被験者は進行性ＭＣＩ（Ｐ−ＭＣＩ）被験者と考え（ｎ＝５２）、状態が安定したままの被験者または改善した被験者（すなわち、その後対照と診断された被験者）は安定性ＭＣＩ（Ｓ−ＭＣＩ）を有すると考えた（ｎ＝９１）。Ｐ−ＭＣＩ被験者のフォローアップ時間（２７±１８か月、表１）はベースライン日に開始し、ＡＤ診断時に完了したと考えた。Ｓ−ＭＣＩ被験者の場合、フォローアップ時間（２８±１６か月、表１）はベースライン日から最新の評価日までの時間として計算した。すべての被験者について、ＭＲ画像はクオピオ大学病院臨床放射線科において１．５Ｔ  ＭＲＩスキャンで取得した（Ｊｕｌｋｕｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。研究被験者のＡＰＯＥ遺伝子型は標準プロトコルを用いることにより決定した（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。研究グループ内でのＡＰＯＥ対立遺伝子分布は表１に提示する。
【００４７】
同意書はヘルシンキ宣言に従ってすべての被験者から取得し、研究はクオピオ大学病院の倫理委員会より認可された。
【００４８】
実験および分析のワークフローは図１に示す。
【００４９】
実施例１．ＵＰＬＣ−ＭＳを用いるリピドミクス分析
１０の脂質（０．２μｇ／サンプル；ＰＣ（１７：０／０：０）、ＰＣ（１７：０／１７：０）、ＰＥ（１７：０／１７：０）、ＰＧ（１７：０／１７：０）、Ｃｅｒ（１８：１／１７：０）、ＰＳ（１７：０／１７：０）、ＰＡ（１７：０／１７：０）、ＭＧ（１７：０／０：０／０：０）、ＤＧ（１７：０／１７：０／０：０）、ＴＧ（１７：０／１７：０／１７：０））からなる標準混合物が添加されたエッペンドルフチューブ中で血清サンプル（１０μｌ）を１０μｌの０．９％塩化ナトリウムと混合し、１００μｌのクロロホルム／メタノール（２：１）で抽出した。撹拌（２分）および放置（１時間）後、チューブを１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、６０μｌの下方有機相を分離し、３つの標識脂質（０．１μｇ／サンプル；ＬＰＣ（１６：１／０：０−Ｄ３）、ＰＣ（１６：１／１６：１−Ｄ６）、ＴＧ（１６：０／１６：０／１６：０−１３Ｃ３））を含有する標準混合物を添加した。
【００５０】
脂質抽出物をＡｃｑｕｉｔｙ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＬＣ（商標）（ＵＰＬＣ；Ｗａｔｅｒｓ、マサチューセッツ州ミルフォード）と組み合わせたＷａｔｅｒｓ  Ｑ−Ｔｏｆ  Ｐｒｅｍｉｅｒ質量分析計上でランダムな順序で分析した。カラム（５０℃）は１．７μｍの粒子を有するＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（商標）ＢＥＨ  Ｃ１８  １×５０ｍｍだった。溶媒系は１）超純水（１％  １Ｍ  ＮＨ４Ａｃ、０．１％  ＨＣＯＯＨ）および２）ＬＣ−ＭＳグレードのアセトニトリル／イソプロパノール（５：２、１％  １Ｍ  ＮＨ４Ａｃ、０．１％  ＨＣＯＯＨ）を含んだ。勾配はＡ６５％／Ｂ３５％から開始し、６分でＢ１００％に達し、次の７分間そのままだった。次回前に５分の再平衡ステップがあった。流速は０．２００ｍｌ／分、注入量は１．０μｌだった（Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｏｒｇａｎｉｚｅｒ；Ｗａｔｅｒｓ、マサチューセッツ州ミルフォード）。レセルピンをロックスプレー参照化合物として用いた。脂質プロファイリングはＥＳＩ＋モードを用いて行い、データはｍ／ｚ３００〜１２００の質量範囲、０．２秒のスキャン時間で回収した。データはＭＺｍｉｎｅ  ２ソフトウェア（Ｐｌｕｓｋａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）を用いることにより処理し、脂質同定は内部スペクトルライブラリーに基づいた。
【００５１】
超性能液体クロマトグラフィー−質量分析（ＵＰＬＣ−ＭＳ）に基づくグローバルリピドミクス法のプラットフォームは、リン脂質、スフィンゴ脂質、および神経脂質のような分子脂質をカバーする（Ｎｙｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。分析はマイナスイオン化モード（ＥＳＩ−）で行い、よって主に極性リン脂質をカバーする。最終データセットは、すべてのサンプルについて、プラットフォーム特異的な方法を用いて計算された、代謝物質のピーク（同定または未同定）およびそれらの濃度のリストで構成された。すべての代謝物質のピークを、未同定のものを含み、データ分析に含めた。我々は、プラットフォームから得られた完全なデータを含むことはグローバルメタボロームを最良に表し、未同定のピークは有意義であると考えられた場合追加の実験を用いるデノボ同定でその後フォローアップすることもできると考えた。
【００５２】
分析プラットフォームを用い、合計１３９の分子脂質を測定した。データは次にクラスター分析のためにさらに転送した。
【００５３】
実施例２．ＧＣ×ＧＣ−ＴＯＦＭＳを用いるメタボロミクス分析
各血清サンプル（３０μｌ）に内部標準（２０μｌの標識パルミチン酸、ｃ＝２５８ｍｇ／Ｌ）を添加し、混合物を次に４００μｌのメタノールで抽出した。遠心分離後、上澄み液を乾燥するまで蒸発させ、もとの代謝物質を次に２段階誘導体化によりそれらのメトキシム（ＭＥＯＸ）およびトリメチルシリル（ＴＭＳ）誘導体に変換した。まず、２５μｌのＭＯＸ試薬を残渣に添加し、混合物を６０分間４５℃でインキュベートした。次に、２５μｌのＭＳＴＦＡを添加し、混合物を６０分間４５℃でインキュベートした。最後に、ヘキサン中の保持指標標準混合物（ｎ−アルカン）を混合物に添加した。
【００５４】
分析には、低温調節器を備えたＬｅｃｏ  Ｐｅｇａｓｕｓ  ４Ｄ  ＧＣ×ＧＣ−ＴＯＦＭＳ装置（Ｌｅｃｏ  Ｃｏｒｐ．、ミシガン州セントジョセフ）を用いた。装置のＧＣ部分は、スプリット／スプリットレス注入器を備えた、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６８９０ガスクロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州パロアルト）だった。一次元クロマトグラフィーカラムは０．１８ｍｍの内径および０．２０μｍの固定相膜厚を有する１０ｍ  ＲＴＸ−５キャピラリーカラムであり、二次元クロマトグラフィーカラムは１００μｍの内径および０．１μｍの膜厚を有する１．５ｍ  ＢＰＸ−５０キャピラリーカラムだった。ＤＰＴＭＳ不活性化保持ギャップ（３ｍ×内径０．５３ｍｍ）を第１カラムの前に用いた。高純度ヘリウムをキャリアガスとして定圧モード（３９．６ｐｓｉｇ）で用いた。５秒の分離時間を二次元で用いた。ＭＳスペクトルを４５〜７００ａｍｕで、１００スペクトル／秒で測定した。２６０℃でのスプリット注入（１μｌ、スプリット比１：２０）を用いた。昇温プログラムは以下のとおりだった：一次元カラムオーブンランプを５０℃で開始し、１分保持後、温度を１０℃／分の速度で２９５℃まで昇温し、次にこの温度で３分間保持した。二次元カラム温度を対応する一次元カラムより２０℃高く維持した。昇温速度および保持時間は２つのカラムで同じだった。
【００５５】
包括的二次元ガスクロマトグラフィー−飛行時間型質量分析（ＧＣ×ＧＣ−ＴＯＦＭＳ）に基づく小さな極性代謝物質のためのこのプラットフォームは、アミノ酸、遊離脂肪酸、ケト酸、さまざまな他の有機酸、ステロール、および糖のような小分子をカバーする（Ｃａｓｔｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。合計５４４の小さな極性代謝物質がサンプル中に検出された。データは次にクラスター分析のためにさらに転送した。
【００５６】
実施例３．クラスター分析
代謝物質の高い共調節度のため（Ｓｔｅｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、すべての測定された代謝物質が独立していると仮定することはできない。グローバルメタボロームは従って、データをベイズモデルベースのクラスタリングを用いてクラスターのサブセットにクラスタリングすることによりまず調査した（Ｆｒａｌｅｙ  ａｎｄ  Ｒａｆｔｅｒｙ，２００７）。リピドミクスプラットフォームデータを７つのクラスター（ＬＣ）に、ＧＣ×ＧＣ−ＴＯＦＭＳベースのメタボロミクスデータを６つのクラスター（ＭＣ）に、それぞれ分解した。各クラスターおよび代表的な代謝物質の記述は表２に示す。予想されるように、クラスターの分割は、主に、異なる代謝物質機能または構造グループに従う。データはゼロ平均および単位分散に調整し、互いに比較できる代謝物質プロファイルを得た。ベイズモデルベースのクラスタリングを調整データに適用し、すべてのサンプルにわたり同様に発現した脂質をグルーピングした。分析は、パッケージ「ｍｃｌｕｓｔ」として統計的言語Ｒ（Ｄａｌｇａａｄ，２００４）で実施される、ＭＣＬＵＳＴ（Ｆｒａｌｅｙ  ａｎｄ  Ｒａｆｔｅｒｙ，２００７）法を用いて行った。ＭＣＬＵＳＴでは、観測データはいくつかのクラスターの混合物として見られ、各クラスターは独有の確率密度関数から得る。混合物中のクラスターの数は、確率分布を制限するクラスター特異的パラメーターとともに、その後他と比較することができるモデルを定義する。クラスタリングプロセスは最適モデルを選択し、データパーティションを適宜決定する。我々の研究では、４〜１５の範囲内のクラスターの数およびすべての入手可能なモデルファミリーを考慮した。モデルは周辺尤度の近似であるベイズ情報量基準（ＢＩＣ）を用いて比較した。最良モデルはデータの最大周辺尤度、すなわち、最高ＢＩＣ値をもたらすものである。
【００５７】
【表２】
2014521928.tif 000003
ａベースラインの対照、ＭＣＩ、およびＡＤ診断グループのＡＮＯＶＡ。
略語：ＡＡ、アラキドン酸；ＤＨＡ、ドコサヘキサエン酸；ＥＰＡ、エイコサペンタエン酸；ｌｙｓｏＰＣ、リゾホスファチジルコリン；ＰＣ、ホスファチジルコリン。
【００５８】
実施例４．記述統計分析
臨床データの統計分析をＷｉｎｄｏｗｓ用ＳＰＳＳソフトウェアリリース１４．０．１（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ；イリノイ州シカゴ）により行った。異なる研究グループ間の比較を独立サンプルｔ検定により行った。その他、正規性の仮定が満たされなかった場合、ノンパラメトリック検定を行った。カテゴリカルデータについて、異なるグループ間の比較はカイ二乗検定で行った。
【００５９】
Ｍａｔｌａｂ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ、マサチューセッツ州ナトリック）で実施される、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を適用し、平均クラスター内代謝物質プロファイルを診断グループ間で比較した。個別の代謝物質レベルでの統計分析はＲを用いて行った。ベースラインの３つの診断グループの代謝物質の中央値はクラスカル−ウォリス一元配置分散分析を用いて比較したが、Ｐ−ＭＣＩおよびＳ−ＭＣＩグループの中央値はウィルコクソン検定により比較した。個別の代謝物質レベルは、「ビーンプロット」Ｒパッケージで実施される、ビーンプロット（Ｋａｍｐｓｔｒａ，２００８）を用いて視覚化した。ビーンプロットは各グループ内の平均代謝物質レベル、データ点分布の密度についての情報を提供し、また個別のデータ点を示す。
【００６０】
実施例５．診断モデル
最良のマーカーの組み合わせを２つのフェーズで探した：第１フェーズでは罰則つき一般化線形モデル（Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）を用い、卓越したマーカーセットを予備スクリーニングし、第２フェーズでは段階的最適化アルゴリズムを用い、マーカーの組み合わせを最適化した。両方のフェーズで１０００回の交差検証を行った。各回では、サンプルの２／３および１／３をそれぞれ訓練および試験セットにランダムに選択した。第１フェーズでは、最低ＣＶ誤差をもたらすマーカーを選択した。第２フェーズでは、Ｒで実施される、ロジスティック回帰モデルを適用し、関心のあるグループを識別した。ロジスティック回帰モデルにおける最良のマーカーの組み合わせは、赤池情報量基準を用いる段階的アルゴリズムにより選択した（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。最良モデルを次に試験セットサンプルに適用し、それらの予測クラスを計算した。交差検証の各回における最適なマーカーの組み合わせ、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線と曲線下面積（ＡＵＣ）統計、オッズ比および相対リスクを記録した。異なるバイオマーカー指標を次に、最高性能モデルとしてそれらが選択された回数に基づき比較した。最上位の指標の性能を次に、上記と同じ手順を用いるが、代謝物質の選択された組み合わせのみを考慮して報告した。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線と曲線下面積（ＡＵＣ）統計、予測精度、オッズ比および相対リスクを、２０００回の交差検証の各回について独立試験データ（サンプルの１／３）における性能に基づき記録した。
【００６１】
我々は、安定性および進行性ＭＣＩグループをベースラインのメタボロミクスプロファイルに基づき比較することにより、ＡＤの予測の可能性を調査した。ＡＤの予測の可能性を評価するため、我々は、クラスターのそれぞれからのベースラインのＡＤおよび対照グループの比較に基づき最上位の代謝物質を選択し、複数回の交差検証においてモデル選択を行った。こうした初期代謝物質選択の理由は、クラスターが密接に関連する代謝物質のグループをすでにある程度示すことだった。
【００６２】
最良モデルは３つの代謝物質を含有した：ＬＣ３からのＰＣ（ＰＣ（１６：０／１６：０））、カルボン酸（ＭＣ２）および２，４−ジヒドロキシブタン酸（ＭＣ１；ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ  １９２７４２）。最上位モデルは１０００回の交差検証のうち１９５回において選択された。他の最良に選択されたモデルは、異なる脂質（ｌｙｓｏＰＣ（１６：０）、ＰＣ（１６：０／２０：５）、ＰＣ（１８：０／２０：４）またはＰＣ（Ｏ−１８：１／１６：０）を含む）の有無にかかわらず、２つの代謝物質（カルボン酸および２，４−ジヒドロキシブタン酸）を含有した。図２は、２０００回のサンプリングから収集された独立試験データに基づく、３つの代謝物質を組み合わせた診断モデルの概要を示す。
【００６３】
ＡＤへの進行を予測することができる代謝物質バイオマーカー指標を同定した（図２）。Ｐ−ＭＣＩおよびＳ−ＭＣＩ患者を識別するマーカーパネルにおいて主に寄与する代謝物質は２，４−ジヒドロキシブタン酸だった。興味深いことに、この有機酸はＣＳＦの主成分であるが（Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｓｔｏｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、血漿中ではＣＳＦ中よりほぼ２倍低い濃度で見られる（Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。２，４−ジヒドロキシブタン酸の生化学については非常に少ないデータしか得られない。１つの報告では、この代謝物質は低酸素条件下でＤ−ガラクツロン酸（Ｎｉｅｍｅｌａ  ａｎｄ  Ｓｊｏｓｔｒｏｍ，１９８５）、グルコロン酸の立体異性体である尿酸から過剰生成された。グルコロン酸は我々の研究のＰ−ＭＣＩグループにおいて周辺有意レベルで減少した（Ｐ＝０．１０）。この解釈を支持して、経路分析により示されるように、リボース−５−リン酸の減少および乳酸、解糖作用の最終生成物の増加を含み、ペントースリン酸経路には有意な差があった。低酸素条件下、脳ではより多くのグルコースがペントースリン酸経路によって代謝されることが知られる（Ｈａｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７６）。ＡＰＰ２３トランスジェニックマウスにおける研究は実際、低酸素がアルツハイマー病への進行を促進することを示した（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【００６４】
実施例６．脳脊髄液中でのメタボロミクス分析
ＧＣ×ＧＣ−ＴＯＦＭＳプラットフォームを同様に適用し、血清メタボロミクス研究に含まれる患者のサブセットからの脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルを分析した（表１）。２つのグループを比較した：（１）対照グループ―対照および安定性ＭＣＩの組み合わせ（Ｎ＝２６）、ならびに（２）ＡＤグループ―ＡＤおよび進行性ＭＣＩ（ｎ＝４０）。我々の研究は、血液中で測定されたＡＤに関連する代謝物質のいくつかはＣＳＦ中にも存在することを確認した。さらに、２，４−ジヒドロキシブタン酸はＡＤグループにおいて有意に上方調節されたことが見出され（Ｐ＜０．０５）、この代謝物質の血清レベルの増加は脳における２，４−ジヒドロキシブタン酸代謝の変化を反映し得ることを示した。
【００６５】
ＡＤの構築されたＣＳＦマーカー、β−アミロイド１−４２（Ａβ４２）、総タウタンパク質（Ｔ−ｔａｕ）、およびトレオニン１８１部位でのタウリン酸化（Ｐ−ｔａｕ）も測定した。これらの中でも、Ａβ４２のみがＡＤグループにおいて有意に下方調節された（Ｐ＜０．０５）。しかしながら、Ａβ４２および２，４−ジヒドロキシブタン酸のＣＳＦプロファイルは相関しなかった。両方のバイオマーカーは単独で適用された場合同様の診断モデルを生成したが、モデルはＡβ４２および２，４−ジヒドロキシブタン酸を組み合わせた場合有意に向上した（ＡＵＣ＝０．８０）（図３）。ＣＳＦ中の２，４−ジヒドロキシブタン酸のＡＤとの関連は、その代謝物質がＡＤ病態生理に関与することを示す。
[参照文献］
【００６６】
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Ｓｍｉｔｈ  ＧＥ，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ＲＣ，Ｐａｒｉｓｉ  ＪＥ，Ｉｖｎｉｋ  ＲＪ，Ｋｏｋｍｅｎ  Ｅ，Ｔａｎｇａｌｏｓ  ＥＧ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ，ｃｏｕｒｓｅ，ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｍｉｌｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ．Ａｇｉｎｇ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌ  Ｃｏｇｎ．１９９６；３（２）：１４１−７．
Ｓｔｅｕｅｒ  Ｒ，Ｋｕｒｔｈｓ  Ｊ，Ｆｉｅｈｎ  Ｏ，Ｗｅｃｋｗｅｒｔｈ  Ｗ．Ｏｂｓｅｒｖｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００３；１９（８）：１０１９−２６．
Ｓｔｏｏｐ  ＭＰ，Ｃｏｕｌｉｅｒ  Ｌ，Ｒｏｓｅｎｌｉｎｇ  Ｔ，Ｓｈｉ  Ｓ，Ｓｍｏｌｉｎｓｋａ  ＡＭ，Ｂｕｙｄｅｎｓ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｓａｍｐｌｅｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２０１０；９（９）：２０６３−７５．
Ｓｕｎ  Ｘ，Ｈｅ  Ｇ，Ｑｉｎｇ  Ｈ，Ｚｈｏｕ  Ｗ，Ｄｏｂｉｅ  Ｆ，Ｃａｉ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｙｐｏｘｉａ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ＢＡＣＥ１  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００６；１０３（４９）：１８７２７−３２．
Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ  Ｋ，Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｔ，Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ  Ｔ，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  Ｍ，Ｋａｔｏ  Ｈ，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＰＣＲ−ＲＦＬＰ  ｏｆ  ａｐｏ  Ｅ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ａ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ．１９９３；１２１（４）：５９８−６０２．
Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｔ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｋ，Ｋａｍｉｍｕｒａ  Ｒ．Ａ  Ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ＡＩＣ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｎｅａｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｏｍｍｕｎ  Ｓｔａｔ  Ｔｈｅｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００７；３６（１３）：２３９５−４０３．
【図１】
2014521928.tif 000004
【図２Ａ】
2014521928.tif 000005
【図２Ｂ】
2014521928.tif 000006
【図２Ｃ】
2014521928.tif 000007
【図３】
2014521928.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成25年4月10日(2013.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者がアルツハイマー病に進行するリスクの増加を診断するための方法であって、
（ａ）該被験者から血液、血清、血漿もしくは尿サンプルまたは脳脊髄液サンプルを得るステップと、
（ｂ）２，４−ジヒドロキシブタン酸およびその誘導体の濃度と、任意でグリコール酸、２−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、グリセレート、３，４−ジヒドロキシ酪酸および２−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体の濃度とを測定するステップと
を含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の少なくとも１０％の増加がＡＤに進行するリスクの増加を示す、方法。
【請求項２】
ＰＣ（１６：０／１８：１）、ＰＣ（１６：０／２０：３）、ＰＣ（１６：０／１６：０）、ＰＣ（１８：０／１８：１）、グリシル−プロリン、クエン酸、アミノマロン酸または乳酸からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質の濃度を測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の増加がＡＤに進行するリスクの増加を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リビトール、フェニルアラニン及びＤ−リボース５−リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質の濃度を測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の減少がＡＤに進行するリスクの増加を示す、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度を、サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離（ＧＣ）において測定された、電子衝撃イオン化（ＥＩ）[７３：９９８  ５５：９９１  ７５：５５８  ９８：３５５  １１７：３５１  ５７：３２８  ８３：２７１  ６９：２３７  ５４：２１７  ８１：２０３  ８４：１４４  １３２：１４３  ５６：１３３  ５１：１２８  １２９：１２６  １７３：１２１  １００：１１８  ６７：１０９  ７１：１０５  ９５：１０３  １１３：７９  １０９：７４  ４５：７０  １０５：６６  １３１：５９  ６０：５９  ４９：５９  １１１：５８  ４７：５７  ６１：５６  １４５：５３  ６５：５１  １４６：４９  １１２：４９  ８２：４７  ６４：４７  ９１：４６  １３０：４３  １１８：４１  ５３：４１  ７８：４０  ８５：３９  １４３：３８  ３１３：３７  １０７：３７  １０２：３６  １７１：３３  ９７：３２  １３３：３１  １０３：３１  ６８：３１  １０４：３０  ７０：２９  １３５：２８  １６２：２５  １１９：２５  １８７：２４  １４９：２４  １４７：２４  ７４：２４  １４２：２３  ２４２：２２  ２６９：２１  １２３：２１  １２１：２１  ８７：２１  １９０：２０  １６０：２０  ６６：２０  ６７０：１９  １６５：１９  １４４：１８  ２４０：１７  ６５５：１６  ５８１：１６  ３２８：１６  ３１１：１６  １７２：１６  ６２：１６  ６８０：１５  ３０９：１５  ２６７：１５  １９９：１５  １８５：１５  １２７：１５  １２２：１５  １０８：１５  ７７：１５]および２７４２＋／−３０の保持指標で質量分析検出器（ＭＳ）を用いて測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の増加がＡＤに進行するリスクの増加を示す、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度を、サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離（ＧＣ）において測定された、電子衝撃イオン化（ＥＩ）[７３：９９９、４５：２７８、２１６：１５２、５７：１２６、７４：８２、３３５：８２、７５：７９、３２０：６１、９１：２８、１７４：２１、１０５：１７、５９：１４、１１５：７、５５：５、７７：２]および２０４０＋／−３０の保持指標で質量分析検出器（ＭＳ）を用いて測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の減少がＡＤに進行するリスクの増加を示す、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度を、サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離（ＧＣ）において測定された、電子衝撃イオン化（ＥＩ）[７５：９９６、７３：９２７、１１７：６６４、５５：４５５、１２９：３４７、１３２：２０５、４５：１９７、６７：１８０、６９：１４０、５７：１３７、８１：１２４、１４５：１２４、７４：９９、４７：９７、１３１：９７、６１：７６、８３：６９、５６：６８、９５：６６、７６：６３、７９：６０、５４：５７、９６：５２、７７：４５、３１３：４５、１１８：４３、８２：４０、６８：３９、８４：３６、９７：３５、９８：３１、５３：２８、９３：２４、８０：２２、１０９：１９、１３３：１９、９１：７、７２：６、１１６：５、５９：４、１１０：４、９４：２]および２７６９．５＋／−３０の保持指標で質量分析検出器（ＭＳ）を用いて測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の減少がＡＤに進行するリスクの増加を示す、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度を、サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離（ＧＣ）において測定された、電子衝撃イオン化（ＥＩ）[７３：９４８、１７４：８５２、８６：６１１、５９：４０９、４５：２９９、１００：２７７、１７０：１７１、１７５：１４３、６９：１１９、８０：７７、５３：７５、７４：７４、９７：６７、１７６：５４、６８：５２、１３０：５０、５８：４８、８９：３４、５４：３０、５５：３０、８７：２９、５７：２６、１２６：２６、７５：２２、１２９：２０、１３９：２０、７８：１５、７０：１３、６０：１１、８１：１１、１０２：１１、５６：１０、１２７：８、６７：７、８３：７、１４０：７、８５：６、１７１：４、７７：３、７９：３、９１：３、１０１：３、１５８：３、４６：２、４７：２、５１：２、７２：２、８２：２、１１７：２、５０：１、６１：１、６６：１、８４：１、９８：１、９９：１、１１２：１、１３１：１]および１５２０．１＋／−３０の保持指標で質量分析検出器（ＭＳ）を用いて測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の減少がＡＤに進行するリスクの増加を示す、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
濃度の相対変化が比較される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
絶対濃度の変化がリスク増加を示す、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
２，４−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、２−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、グリセリン酸、３，４−ジヒドロキシ酪酸および２−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質と、ＰＣ（１６：０／１８：１）、ＰＣ（１６：０／２０：３）、ＰＣ（１６：０／１６：０）、ＰＣ（１８：０／１８：１）、グリシル−プロリン、クエン酸、アミノマロン酸または乳酸からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質との濃度が増加した、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、ＧＣ−ＥＩ／ＭＳ：[７３：９９８  ５５：９９１  ７５：５５８  ９８：３５５  １１７：３５１  ５７：３２８  ８３：２７１  ６９：２３７  ５４：２１７  ８１：２０３  ８４：１４４  １３２：１４３  ５６：１３３  ５１：１２８  １２９：１２６  １７３：１２１  １００：１１８  ６７：１０９  ７１：１０５  ９５：１０３  １１３：７９  １０９：７４  ４５：７０  １０５：６６  １３１：５９  ６０：５９  ４９：５９  １１１：５８  ４７：５７  ６１：５６  １４５：５３  ６５：５１  １４６：４９  １１２：４９  ８２：４７  ６４：４７  ９１：４６  １３０：４３  １１８：４１  ５３：４１  ７８：４０  ８５：３９  １４３：３８  ３１３：３７  １０７：３７  １０２：３６  １７１：３３  ９７：３２  １３３：３１  １０３：３１  ６８：３１  １０４：３０  ７０：２９  １３５：２８  １６２：２５  １１９：２５  １８７：２４  １４９：２４  １４７：２４  ７４：２４  １４２：２３  ２４２：２２  ２６９：２１  １２３：２１  １２１：２１  ８７：２１  １９０：２０  １６０：２０  ６６：２０  ６７０：１９  １６５：１９  １４４：１８  ２４０：１７  ６５５：１６  ５８１：１６  ３２８：１６  ３１１：１６  １７２：１６  ６２：１６  ６８０：１５  ３０９：１５  ２６７：１５  １９９：１５  １８５：１５  １２７：１５  １２２：１５  １０８：１５  ７７：１５]および２７４２＋／−３０の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度がさらに増加した、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、ＧＣ−ＥＩ／ＭＳ：[７３：９９９、４５：２７８、２１６：１５２、５７：１２６、７４：８２、３３５：８２、７５：７９、３２０：６１、９１：２８、１７４：２１、１０５：１７、５９：１４、１１５：７、５５：５、７７：２]および２０４０＋／−３０の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度がさらに減少した、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、ＧＣ−ＥＩ／ＭＳ：[７５：９９６、７３：９２７、１１７：６６４、５５：４５５、１２９：３４７、１３２：２０５、４５：１９７、６７：１８０、６９：１４０、５７：１３７、８１：１２４、１４５：１２４、７４：９９、４７：９７、１３１：９７、６１：７６、８３：６９、５６：６８、９５：６６、７６：６３、７９：６０、５４：５７、９６：５２、７７：４５、３１３：４５、１１８：４３、８２：４０、６８：３９、８４：３６、９７：３５、９８：３１、５３：２８、９３：２４、８０：２２、１０９：１９、１３３：１９、９１：７、７２：６、１１６：５、５９：４、１１０：４、９４：２]および２７６９．５＋／−３０の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度がさらに減少した、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、ＧＣ−ＥＩ／ＭＳ：[７３：９４８、１７４：８５２、８６：６１１、５９：４０９、４５：２９９、１００：２７７、１７０：１７１、１７５：１４３、６９：１１９、８０：７７、５３：７５、７４：７４、９７：６７、１７６：５４、６８：５２、１３０：５０、５８：４８、８９：３４、５４：３０、５５：３０、８７：２９、５７：２６、１２６：２６、７５：２２、１２９：２０、１３９：２０、７８：１５、７０：１３、６０：１１、８１：１１、１０２：１１、５６：１０、１２７：８、６７：７、８３：７、１４０：７、８５：６、１７１：４、７７：３、７９：３、９１：３、１０１：３、１５８：３、４６：２、４７：２、５１：２、７２：２、８２：２、１１７：２、５０：１、６１：１、６６：１、８４：１、９８：１、９９：１、１１２：１、１３１：１]および１５２０．１＋／−３０の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度がさらに減少した、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
２，４−ジヒドロキシブタン酸の濃度が測定される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ホスファチジルコリン（１６：０／１６：０）の濃度が測定される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
クエン酸の濃度が測定される、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
フェニルアラニンの濃度が測定される、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
グリシル−プロリンの濃度が測定される、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
２，４−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、２−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、グリセレート、クエン酸、乳酸、３，４−ジヒドロキシ酪酸および２−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質の濃度がベースレベルと比較して少なくとも５％の増加した、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成26年4月25日(2014.4.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者のアルツハイマー病に進行するリスクの増加を示すための方法であって、
該被験者に由来する生体液サンプル中の２，４−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、２−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、グリセレート、３，４−ジヒドロキシ酪酸および２−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質の濃度を測定するステップと
該被験者に由来する生体液サンプル中の前記代謝物質の濃度を健康な被験者に由来する生体サンプル中のそれぞれの平均濃度と比較するステップとを
含み、
前記濃度の増加がＡＤに進行するリスクの増加を示す、方法。
【請求項２】
ＰＣ（１６：０／１８：１）、ＰＣ（１６：０／２０：３）、ＰＣ（１６：０／１６：０）、ＰＣ（１８：０／１８：１）、グリシル−プロリン、クエン酸、アミノマロン酸または乳酸からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質の濃度を測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の増加がＡＤに進行するリスクの増加を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リビトール、フェニルアラニン及びＤ−リボース５−リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質の濃度を測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の減少がＡＤに進行するリスクの増加を示す、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度を、サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離（ＧＣ）において測定された、電子衝撃イオン化（ＥＩ）[７３：９９８  ５５：９９１  ７５：５５８  ９８：３５５  １１７：３５１  ５７：３２８  ８３：２７１  ６９：２３７  ５４：２１７  ８１：２０３  ８４：１４４  １３２：１４３  ５６：１３３  ５１：１２８  １２９：１２６  １７３：１２１  １００：１１８  ６７：１０９  ７１：１０５  ９５：１０３  １１３：７９  １０９：７４  ４５：７０  １０５：６６  １３１：５９  ６０：５９  ４９：５９  １１１：５８  ４７：５７  ６１：５６  １４５：５３  ６５：５１  １４６：４９  １１２：４９  ８２：４７  ６４：４７  ９１：４６  １３０：４３  １１８：４１  ５３：４１  ７８：４０  ８５：３９  １４３：３８  ３１３：３７  １０７：３７  １０２：３６  １７１：３３  ９７：３２  １３３：３１  １０３：３１  ６８：３１  １０４：３０  ７０：２９  １３５：２８  １６２：２５  １１９：２５  １８７：２４  １４９：２４  １４７：２４  ７４：２４  １４２：２３  ２４２：２２  ２６９：２１  １２３：２１  １２１：２１  ８７：２１  １９０：２０  １６０：２０  ６６：２０  ６７０：１９  １６５：１９  １４４：１８  ２４０：１７  ６５５：１６  ５８１：１６  ３２８：１６  ３１１：１６  １７２：１６  ６２：１６  ６８０：１５  ３０９：１５  ２６７：１５  １９９：１５  １８５：１５  １２７：１５  １２２：１５  １０８：１５  ７７：１５]および２７４２＋／−３０の保持指標で質量分析検出器（ＭＳ）を用いて測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の増加がＡＤに進行するリスクの増加を示す、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度を、サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離（ＧＣ）において測定された、電子衝撃イオン化（ＥＩ）[７３：９９９、４５：２７８、２１６：１５２、５７：１２６、７４：８２、３３５：８２、７５：７９、３２０：６１、９１：２８、１７４：２１、１０５：１７、５９：１４、１１５：７、５５：５、７７：２]および２０４０＋／−３０の保持指標で質量分析検出器（ＭＳ）を用いて測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の減少がＡＤに進行するリスクの増加を示す、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度を、サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離（ＧＣ）において測定された、電子衝撃イオン化（ＥＩ）[７５：９９６、７３：９２７、１１７：６６４、５５：４５５、１２９：３４７、１３２：２０５、４５：１９７、６７：１８０、６９：１４０、５７：１３７、８１：１２４、１４５：１２４、７４：９９、４７：９７、１３１：９７、６１：７６、８３：６９、５６：６８、９５：６６、７６：６３、７９：６０、５４：５７、９６：５２、７７：４５、３１３：４５、１１８：４３、８２：４０、６８：３９、８４：３６、９７：３５、９８：３１、５３：２８、９３：２４、８０：２２、１０９：１９、１３３：１９、９１：７、７２：６、１１６：５、５９：４、１１０：４、９４：２]および２７６９．５＋／−３０の保持指標で質量分析検出器（ＭＳ）を用いて測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の減少がＡＤに進行するリスクの増加を示す、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度を、サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離（ＧＣ）において測定された、電子衝撃イオン化（ＥＩ）[７３：９４８、１７４：８５２、８６：６１１、５９：４０９、４５：２９９、１００：２７７、１７０：１７１、１７５：１４３、６９：１１９、８０：７７、５３：７５、７４：７４、９７：６７、１７６：５４、６８：５２、１３０：５０、５８：４８、８９：３４、５４：３０、５５：３０、８７：２９、５７：２６、１２６：２６、７５：２２、１２９：２０、１３９：２０、７８：１５、７０：１３、６０：１１、８１：１１、１０２：１１、５６：１０、１２７：８、６７：７、８３：７、１４０：７、８５：６、１７１：４、７７：３、７９：３、９１：３、１０１：３、１５８：３、４６：２、４７：２、５１：２、７２：２、８２：２、１１７：２、５０：１、６１：１、６６：１、８４：１、９８：１、９９：１、１１２：１、１３１：１]および１５２０．１＋／−３０の保持指標で質量分析検出器（ＭＳ）を用いて測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の減少がＡＤに進行するリスクの増加を示す、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
濃度の相対変化が比較される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
絶対濃度の変化がリスク増加を示す、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
２，４−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、２−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、グリセリン酸、３，４−ジヒドロキシ酪酸および２−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質と、ＰＣ（１６：０／１８：１）、ＰＣ（１６：０／２０：３）、ＰＣ（１６：０／１６：０）、ＰＣ（１８：０／１８：１）、グリシル−プロリン、クエン酸、アミノマロン酸または乳酸からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質との濃度が増加した、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、ＧＣ−ＥＩ／ＭＳ：[７３：９９８  ５５：９９１  ７５：５５８  ９８：３５５  １１７：３５１  ５７：３２８  ８３：２７１  ６９：２３７  ５４：２１７  ８１：２０３  ８４：１４４  １３２：１４３  ５６：１３３  ５１：１２８  １２９：１２６  １７３：１２１  １００：１１８  ６７：１０９  ７１：１０５  ９５：１０３  １１３：７９  １０９：７４  ４５：７０  １０５：６６  １３１：５９  ６０：５９  ４９：５９  １１１：５８  ４７：５７  ６１：５６  １４５：５３  ６５：５１  １４６：４９  １１２：４９  ８２：４７  ６４：４７  ９１：４６  １３０：４３  １１８：４１  ５３：４１  ７８：４０  ８５：３９  １４３：３８  ３１３：３７  １０７：３７  １０２：３６  １７１：３３  ９７：３２  １３３：３１  １０３：３１  ６８：３１  １０４：３０  ７０：２９  １３５：２８  １６２：２５  １１９：２５  １８７：２４  １４９：２４  １４７：２４  ７４：２４  １４２：２３  ２４２：２２  ２６９：２１  １２３：２１  １２１：２１  ８７：２１  １９０：２０  １６０：２０  ６６：２０  ６７０：１９  １６５：１９  １４４：１８  ２４０：１７  ６５５：１６  ５８１：１６  ３２８：１６  ３１１：１６  １７２：１６  ６２：１６  ６８０：１５  ３０９：１５  ２６７：１５  １９９：１５  １８５：１５  １２７：１５  １２２：１５  １０８：１５  ７７：１５]および２７４２＋／−３０の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度がさらに増加した、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、ＧＣ−ＥＩ／ＭＳ：[７３：９９９、４５：２７８、２１６：１５２、５７：１２６、７４：８２、３３５：８２、７５：７９、３２０：６１、９１：２８、１７４：２１、１０５：１７、５９：１４、１１５：７、５５：５、７７：２]および２０４０＋／−３０の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度がさらに減少した、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、ＧＣ−ＥＩ／ＭＳ：[７５：９９６、７３：９２７、１１７：６６４、５５：４５５、１２９：３４７、１３２：２０５、４５：１９７、６７：１８０、６９：１４０、５７：１３７、８１：１２４、１４５：１２４、７４：９９、４７：９７、１３１：９７、６１：７６、８３：６９、５６：６８、９５：６６、７６：６３、７９：６０、５４：５７、９６：５２、７７：４５、３１３：４５、１１８：４３、８２：４０、６８：３９、８４：３６、９７：３５、９８：３１、５３：２８、９３：２４、８０：２２、１０９：１９、１３３：１９、９１：７、７２：６、１１６：５、５９：４、１１０：４、９４：２]および２７６９．５＋／−３０の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度がさらに減少した、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
５％フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、ＧＣ−ＥＩ／ＭＳ：[７３：９４８、１７４：８５２、８６：６１１、５９：４０９、４５：２９９、１００：２７７、１７０：１７１、１７５：１４３、６９：１１９、８０：７７、５３：７５、７４：７４、９７：６７、１７６：５４、６８：５２、１３０：５０、５８：４８、８９：３４、５４：３０、５５：３０、８７：２９、５７：２６、１２６：２６、７５：２２、１２９：２０、１３９：２０、７８：１５、７０：１３、６０：１１、８１：１１、１０２：１１、５６：１０、１２７：８、６７：７、８３：７、１４０：７、８５：６、１７１：４、７７：３、７９：３、９１：３、１０１：３、１５８：３、４６：２、４７：２、５１：２、７２：２、８２：２、１１７：２、５０：１、６１：１、６６：１、８４：１、９８：１、９９：１、１１２：１、１３１：１]および１５２０．１＋／−３０の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度がさらに減少した、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
２，４−ジヒドロキシブタン酸の濃度が測定される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ホスファチジルコリン（１６：０／１６：０）の濃度が測定される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
クエン酸の濃度が測定される、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
フェニルアラニンの濃度が測定される、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
グリシル−プロリンの濃度が測定される、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
２，４−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、２−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、グリセレート、クエン酸、乳酸、３，４−ジヒドロキシ酪酸および２−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの代謝物質の濃度がベースレベルと比較して少なくとも５％の増加した、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
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