(57)【要約】  本発明は、少なくとも１個のリボ核酸（ＲＮＡ）分子を官能化する方法であって、ａ）少なくとも  −  イサト酸無水物またはその誘導体により構成される結合分子と、  −  目的の基と、  −  結合分子を目的の基と連結する結合アームとを有するステップと、ｂ）結合分子の無水物官能基を  −  ＲＮＡヌクレオチドの１個のリボースの２’位、ならびに／または  −  ＲＮＡの３’末端のヌクレオチドのリボースの２’および／もしくは３’位の少なくとも１個のヒドロキシル基と反応させるステップと、ｃ）結合アームを介してＲＮＡを目的の基と連結するアントラニル酸を得るステップとを含む方法に関する。  本発明はまた、このような方法に用いることができる官能化試薬、これらの方法により得ることができる官能化生物学的ＲＮＡ分子、およびこのような試薬を含む標的ＲＮＡ分子を検出するためのキットに関する。  前記発明は、インビトロ診断の分野に優先的用途を見出すものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１個のリボ核酸（ＲＮＡ）分子を官能化する方法であって、
ａ）  −  イサト酸無水物またはその誘導体により構成される結合分子と、
−  目的の基と、
−  前記結合分子と前記目的の基とを連結する結合アームと
を少なくとも有するステップと、
ｂ）前記結合分子の無水物官能基と
−  ＲＮＡヌクレオチドの１個のリボースの２’位、ならびに／または
−  ＲＮＡの３’末端のヌクレオチドのリボースの２’および／もしくは３’位
の少なくとも１個のヒドロキシル基とを反応させるステップと、
ｃ）前記結合アームを介して前記ＲＮＡを前記目的の基と連結するアントラニル酸を得るステップと
を含む方法。
【請求項２】
少なくとも１個のリボ核酸（ＲＮＡ）分子を標識する方法であって、
ａ）  −  内因性蛍光を有する、イサト酸無水物またはその誘導体により構成される結合分子と、
−  前記結合分子により発せられるシグナルとは異なる内因性蛍光シグナルを有するか、または内因性蛍光シグナルを有さない目的の基と、
−  前記結合分子を前記目的の基と連結する結合アームと
を少なくとも有するステップと、
ｂ）前記結合分子の無水物官能基を
−  ＲＮＡヌクレオチドの１個のリボースの２’位、ならびに／または
−  ＲＮＡの３’位の末端ヌクレオチドのリボースの２’および／もしくは３’位
の少なくとも１個のヒドロキシル基と反応させるステップと、
前記結合アームを介して前記ＲＮＡを前記目的の基と連結するアントラニル酸を得るステップと
を含む方法。
【請求項３】
少なくとも１個のリボ核酸（ＲＮＡ）分子を捕捉または分離する方法であって、
ａ）  −  イサト酸無水物またはその誘導体により構成される結合分子と、
−  アンチリガンドと相補的なリガンドにより構成される目的の基と、
−  前記結合分子を前記目的の基と連結する結合アームと
を少なくとも有するステップと、
ｂ）前記結合分子の無水物官能基を
−  ＲＮＡヌクレオチドの１個のリボースの２’位、ならびに／または
−  ＲＮＡの３’位の末端ヌクレオチドのリボースの２’および／もしくは３’位
の少なくとも１個のヒドロキシル基と反応させるステップと、
ｃ）前記結合アームにより前記ＲＮＡを前記目的の基と連結するアントラニル酸を得るステップと、
ｄ）リガンド−アンチリガンド反応を通してＲＮＡを捕捉または分離するステップと
を含む方法。
【請求項４】
前記結合アームが、前記結合アームが前記目的の基と会合する前に前記結合分子と会合する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記結合アームが、前記結合アームが前記目的の基と会合した後に前記結合分子と会合する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記結合分子が事前に前記ＲＮＡと会合する、請求項４から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１個の結合分子と、アンチリガンドと相補的なリガンドにより構成される目的の基と、前記結合分子を前記目的の基と連結する結合アームとを用いて、少なくとも１個のＲＮＡ分子を選択的に捕捉する方法であって、前記結合分子が、共有結合を介して
−  ＲＮＡヌクレオチドの１個のリボースの２’位、ならびに／または
−  ＲＮＡの３’位の末端ヌクレオチドのリボースの２’および３’位、ならびに／もしくは
−  ＲＮＡの３’位の前記末端ヌクレオチドのリボースの３’位
のヒドロキシル基に付着するイサト酸無水物またはその誘導体により構成されている方法。
【請求項８】
ＲＮＡ分子を他の生体構成物、特にＤＮＡ分子から分離する方法であって、
・請求項７に記載の捕捉方法を、区別されていない核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡ）を含む生体試料に適用するステップであって、前記目的の基が前記生体試料の残りから容易に分離可能な少なくとも１種の固体担体と会合しているステップと、
・前記ＲＮＡ分子を有する前記結合分子を前記生体試料の残りから分離するステップと
に存する方法。
【請求項９】
式（１）：
2014504282.tif 000034
（式中、
・Ｒ１はＨまたは目的の基を表し、
・Ｒ２はＨあるいは
ａ．標識もしくは標識化前駆体、または
ｂ．安定な複合体を形成するために認識分子もしくは表面もしくは粒子等により認識できるリガンド
であり得る目的の基を表し、
・Ｒ１がＨにより表される場合、Ｒ２は目的の基により表され、逆もまた同じであり、
・Ｘは前記目的の基を前記結合分子と連結する結合アームである）
の官能化試薬。
【請求項１０】
捕捉または分離手段が、磁性もしくは非磁性ポリマーもしくはシリカ粒子またはフィルターなどの固体担体により、あるいは容器の内壁によっても構成される、請求項９に記載の捕捉または分離試薬。
【請求項１１】
前記結合アームＸが、
−  前記結合分子の原子および前記目的の基の原子を連結する単一共有結合、または
−  おそらく置換されており、少なくとも２個の炭素原子の鎖形成が芳香族構造および／もしくはヘテロ原子（酸素、硫黄、窒素等）をおそらく含む、有機結合アーム、例えば、前記結合分子と前記目的の基もしくは単一炭素原子との間の単一共有結合
である、請求項９に記載の官能化試薬。
【請求項１２】
前記結合アームＸが、特定の光、温度、酵素的または化学的条件下で前記結合分子を前記ＲＮＡから分離する物理化学的、光化学的、熱的、酵素的および／または化学的手段により切断することができる官能基または結合を含む、請求項１１に記載の官能化試薬。
【請求項１３】
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法により得ることができる官能化生物学的ＲＮＡ分子。
【請求項１４】
請求項９から１２のいずれか一項に記載の試薬を含む、標的ＲＮＡ分子を検出するためのキット。
【請求項１５】
官能化する各ＲＮＡ鎖の３’位の末端一リン酸基を加水分解することからなる、ステップａ）とｂ）との間の補足ステップを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の官能化法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子、より正確には天然もしくは合成リボ核酸（ＲＮＡ）または合成ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ核酸を、特に官能化、標識、捕捉または分離する新規な方法に関する。本文の残りにおいて、用語「官能化」または関連する用語（例えば、「官能化する」）を使用するが、これらの用語は生体分子を標識、捕捉、分離または阻害することを同様に意味することができる。これらはまた、このように処理または標識化した生体分子、ならびに核酸の検出および分析を用いる分子診断の分野に使用することができるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来技術は、目的の基でヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたは天然もしくは増幅核酸を官能化する多くの方法が存在することを示している。
第１の方法は、目的の基を塩基（それが天然であれ修飾されたものであれ）上に固定することにある。第２の方法は、目的の基を糖（ここでも、それが天然であるか修飾されたものであるかにかかわらず）上に固定することを提案している。第３の方法の目的は、目的の基をリン酸上に固定することである。
塩基上の目的の基は、特に、標識ヌクレオチドを直接組み込むことにより、核酸を標識化するアプローチに用いられてきた。
【０００３】
糖の官能化は、一般的に、感度または塩基に影響を及ぼし、特異性に影響を及ぼすリン酸に行われる官能化よりもかなり中立である。
実際、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体または核酸の官能化を行わなければならない当業者は、この固定を塩基または糖に行う傾向があり、これはより簡便で、彼／彼女により多くの選択肢を提供する。さらに、これは、特に、塩基についてはＥＰ−Ａ−０．０６３．８７９、ＥＰ−Ａ−０．０９７．３７３、ＥＰ−Ａ−０．３０２．１７５、ＥＰ−Ａ−０．３２９．１９８、ＥＰ−Ａ−０．５６７．８４１、ＵＳ−Ａ−５，４４９，７６７、ＵＳ−Ａ−５，３２８，８２４、ＷＯ−Ａ−９３／１６０９４もしくはＤＥ−Ａ−３．９１０．１５１、または糖についてはＥＰ−Ｂ−０．０６３．８７９もしくはＥＰ−Ｂ−０．２８６．８９８などの標識化を扱う多数の文献の研究から明らかになっていることである。
【０００４】
より具体的には、糖の官能化は、しばしば、化学合成により調製した核のプローブの場合に使用する。それにもかかわらず、結合位置に特異的であり、特に水素結合を介して二重らせんの形成に関与する塩基のハイブリダイゼーション特性に影響を及ぼさず、ＲＮＡに特異的でもあり、最後にリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、天然もしくは転写により調製したＲＮＡ核酸、逆転写もしくは酵素的増幅により少なくとも１つのＲＮＡ部分と少なくとも１つのＤＮＡ部分の両方を含む核酸を同様に官能化するための目的の基が必要とされている。
【０００５】
標識化の場合、また標的をＤＮＡチップ上で検出可能にするために、標識を前もってＤＮＡチップ上に固定することが必要である。これは、単独で核酸の存在を検出することおよび診断をすることを可能にするので重要なステップである。そのため、標識化技術が、非常に再現性があり、堅牢かつ敏感であることが重要である。これは、化学標識化試薬の品質および有効性に直接つながる。
【０００６】
さらに、化学官能化技術では、目的の基が核酸のハイブリダイゼーション特性に影響を及ぼしてはならない。
【０００７】
過去に、本出願人は、ジアゾ化合物を含む分子に関する一定数の特許出願を出願した：
−  ２００２年５月３日出願のおよび２０１０年２月１７日に認められた特許ＥＰ−Ｂ−１．３８３．７３２、
−  ２００５年３月２４日出願の出願ＥＰ０５／７３９６６０．８、
−  ２００８年６月９日出願の出願ＥＰ０８／８０５９６１．３、および
−  ２００８年７月２９日出願の出願ＦＲ０８／５５１９０。
【０００８】
背景として、目的のジアゾ−官能−ベース基は、ＲＮＡに化学特異的（ｃｈｅｍｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）でも特定の位置に位置特異的でもない。そのため、これらはＤＮＡおよびＲＮＡを等しく官能化する。さらに、ジアゾ官能基は、例えば、Ｃｙ５などの特定のシアニンとのコンジュゲーションと調和させることが困難である。
【０００９】
例えば、標識化のために官能化機構においてより特異的になることができることが重要である：
Ａ）ｍＲＮＡ発現のレベルを測定するＤＮＡチップの場合、ＲＮＡのみを標識しなければならない。複合生体試料では、ＤＮＡおよびｍＲＮＡが存在し得るので、同時に標識され得る。非化学特異的標識を用いると、ハイブリダイゼーション中のバックグラウンドノイズの増加をもたらし得る。
Ｂ）一般的に大いに過剰に用いられる標識は、標識核酸をチップ上に固定化したプローブと接触させる前に破壊または除去しなければならない。実際、これが事実でないならば、解釈するのが不可能であるような結果をもたらし得るプローブの標識化の危険性が存在し得る。そのため、ＲＮＡに特異的な標識を有することにより、過剰な加水分解していない標識によるプローブの標識化のこの問題を回避することが可能になり得る。
【００１０】
Ｃ）立体効果のために、内側よりもむしろ標的ＲＮＡ鎖の末端（５’または３’）を標識することはオリゴヌクレオチドプローブと核酸からなる標的との間のハイブリダイゼーションにとってあまり破壊的でない。市販の標識化技術は、このような標識化位置特異性を許さない。本発明者らの知る限りでは、過ヨウ素酸塩を用いた酸化の化学技術のみがこの程度の特異性を提供するが、これらは標識化プロトコルの複雑さにひどく影響される（３〜４種を超える試薬および標識ＲＮＡを得る前の２〜３回の精製）。この点については、
−  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９６、第２４巻、第２２号  ４５３５〜４５３２中Ｒｕ−Ｑｉａｎｇ  Ｌｉａｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５、第３３巻、第２号ｅ１７による「Ａｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ＲＮＡ  ｗｉｔｈ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ  ａｎｄ  ｎａｎｏｇｏｌｄ  ｐｒｏｂｅ」または
−  Ｄｍｉｔｒｉ  Ｐｒｏｕｄｎｉｋｏｖによる「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ」  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９６、第２４巻、第２２号  ４５３５〜４５３２
を参照されたい。
【００１１】
実際、ＲＮＡの３’末端は、極めて特異的な酵素技術に基づいて位置特異的に官能化することができるに過ぎない。このような技術は、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ）により、またはＴ４  ＲＮＡ  ＬｉｇａｓｅおよびｐＣｐ−ラベラー型基質による３’でのＲＮＡの特異的標識化を用いるＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ）により、または特定の参考文献：
−  Ｈｕａｎｇ  Ｚ．「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ａｎ  ＲＮＡ ｍｉｘｔｕｒｅ」  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００３  １２９〜１３３、
−  Ｍａｒｔｉｎ  Ｇ．「Ｔａｉｌｉｎｇ  ａｎｄ  ３’−ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｗｉｔｈ  ｙｅａｓｔ  ｐｏｌｙｓ（Ａ）  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」  ＲＮＡ  １９９８  ２２〜２３０、または
−  Ｈｕａｎｇ  Ｚ．「Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ３’−ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ＲＮＡ」  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９６  ４３６０〜４３６１
に記載されている他の酵素技術により用いられている。
【００１２】
酵素技術を用いる問題は、基質の種類（標識するＲＮＡのサイズおよび配列）に対するその感度、ならびに当然、基質および中でも酵素の両者に関するコストである。
さらに、病理学的標識となり得るマイクロＲＮＡ（低分子ＲＮＡオリゴマー）の検出の最近の開発は、特に標識された立体障害の小型二本鎖に対する影響を可能な限り制限するために、ＲＮＡを標識するため、特に３’末端を標識するための組み込み可能で実用的なとりわけ位置特異的な技術を必要とする。さらに、これらの低分子オリゴマーは、参考文献：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００７、第３５巻、第７号ｅ５２にＦ．Ｎａｔｔにより記載されているように、正確にはその大きさのために酵素技術により非常にひどく標識される。
そのため、ＲＮＡに特異的であることに加えて、標識する基質の大きさおよび配列にかかわらず３’末端に特異的でもあるような低コストの化学官能化技術を有することは非常に有益である。
【００１３】
Ｄ）ジアゾ標識化技術は優れた技術であるが、これらの分子をもたらす合成ステップの性質は、特定の発蛍光団（例えば、Ｃｙ５、これはヒドラジンの存在下で不安定である）の化学的性質に適合性でない。そのため、ジアゾ技術は、目的の基としてビオチンを用いて優先的に用いられる。蛍光ストレプトアビジン分子によりビオチン化化合物を検出するステップなどの補足ステップなしで済ますために、発蛍光団を有する目的の直接的基を有することが本当に必要とされている。そのため、核酸と反応する基（例えば、イサト酸無水物）が例えばＣｙ３またはＣｙ５などの種々の基とのコンジュゲーションに化学的に適合性である多用途の技術を有することが重要である。
【００１４】
Ｅ）最後に、ＲＮＡとＤＮＡ間の化学選択性はまた、ＤＮＡアーゼを用いないＲＮＡの選択、ＤＮＡを含む媒体中のＲＮＡの選択的捕捉、除染、増幅の選択的阻害などの「サンプルプレップ」とも呼ばれる試料調製に用途を有し得る。
【００１５】
１９８２年、Ｍｏｏｒｍａｎ（Ｍｏｏｒｍａｎ  ＪＡＣＳ  １９８２  １０４  ６７８５〜６７８６）が、タンパク質の失活をもたらす、キモトリプシンのセリンとの選択的反応性のためのイサト酸無水物の使用を公開した。この刊行物は、水性媒体中でのイサト酸無水物の生体分子のヒドロキシル基への反応性を示す最初の１つである。しかしながら、奇妙にも、アミン官能基がより求核性であるので、イサト酸無水物はタンパク質上に存在するアミン官能基との優先的な反応性を有することが予想されるのに、アルコール官能基が最初に反応することが明らかになった。
【００１６】
１９８３年、Ｈｉｒａｔｓｕｋａ（Ｈｉｒａｔｓｕｋａ  ＢＢＡ  １９８３  ７４２  ４９６〜５０８）が、イサト酸無水物またはメチル化イサト酸無水物の遊離リボヌクレオシド（５’三リン酸または５’−ＯＨ）への反応性についての最初の論文の１つを公開した。これは、後者を研究するための酵素の蛍光基質を合成するためのものであった。実際、イサト酸無水物は、いったん開環すると、蛍光性になる。しかしながら、混乱を避けるために、アントラニル酸分子になる開環イサト酸無水物の内因性蛍光（励起：３３５〜３５０ｎｍおよび発光：４２７〜４４６ｎｍ）と発蛍光団とのコンジュゲーションによりもたらされる蛍光とを区別することが必要である。実際、イサト酸無水物によるＲＮＡの標識化に言及しているが、これを検出するためにアントラニル酸の内因性蛍光を用いている多数の論文が存在する。これらの結論は以下の通りである：
−  イサト酸無水物は、２’−ＯＨよりもはるかに求核性であると一般的に記載されているにもかかわらず、塩基の環外アミンに反応を示さない、
−  イサト酸無水物は５’−ＯＨに反応性を示すことが知られていない、
イサト酸無水物は、３’−ＯＨ（熱的に好ましい）よりも２’−ＯＨに優先的に（動力学的に）反応性を示す。しかしながら、２’位と３’位との間のアシル基の転位のために、９０％程度の３’のエステルの混合物が得られる。
【００１７】
１９９０年、Ｏｖｏｄｏｖ（Ｏｖｏｄｏｖ、ＦＥＢＳ  １９９０  ２７０  １１１〜１１４）は、１９６３年のＫｈｏｒａｎａの研究（Ｓｔｎａｒｋ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １９６３  ７５  ２５４６およびＫｎｏｒｒｅ  Ｂｉｏｋｈｉｍｉｙａ  １９６５  １２１８〜１２２４）に基づく研究を通して、ＲＮアーゼの作用からＲＮＡを保護するための、無水酢酸による水性媒体中でのメッセンジャーＲＮＡのアシル化を記載している（ＤＭＦ５％、１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ７、周囲温度で２〜３時間）。彼は、ＲＮアーゼの作用を阻害するのに十分な７０〜７５％のアシル化レベルを記載している。
【００１８】
１９９３年、Ｓｅｒｖｉｌｌｏ（Ｓｅｒｖｉｌｌｏ  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９３  ５８３〜５８９）は、水性媒体中、ｐＨ８．８で３時間、周囲温度でのイサト酸無水物（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＵＳＡ）とのインキュベーション後のトランスファーＲＮＡの３’での特異的な「標識化」を示す論文を公開した。これは、種々の技術を用いた、３’での絶対位置特異的官能化を示している。ＲＮアーゼＡおよびＲＮアーゼＴ２による完全加水分解を通して、これは、単一の蛍光ヌクレオシドの存在を示している。ホスホジエステラーゼの阻害により、これは、５’での標識化は言うまでもなく、位置特異的標識化に相当する３’位における完全標識化を示している。
【００１９】
２０００年、Ｋ．Ｍ．ＷｅｅｋｓによるＲＮＡの２’のヒドロキシルの選択的アシル化についての進行中の一連の最初の論文が出た。Ｗｅｅｋｓはこの時、ＲＮＡの２’位ＯＨの選択的アシル化を記載しているので、この一連の論文は、アシル化の位置特異性の点からＳｅｒｖｉｌｌｏの結果を検討している。これは、ＳＨＡＰＥ（選択的２’−ヒドロキシルアシル化およびプライマー伸長）技術の文献を取り扱っており、特に、以下の論文を含む：
−  Ｋ．Ａ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、Ｓ．Ｍ．Ｖａｓａ、Ｋ．Ｅ．Ｄｅｉｇａｎ、Ｓ．Ａ．Ｍｏｒｔｉｍｅｒ、Ｍ．Ｃ．ＧｉｄｄｉｎｇｓおよびＫ．Ｍ．Ｗｅｅｋｓ、Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｏｎ  ｒｉｂｏｓｅ  ２’−ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ＲＮＡ．  ＲＮＡ  １５、１３１４〜１３２１（２００９）。
−  Ｋ．Ｅ．Ｄｅｉｇａｎ、Ｔ．Ｗ．Ｌｉ、Ｄ．Ｈ．ＭａｔｈｅｗｓおよびＫ．Ｍ．Ｗｅｅｋｓ、Ａｃｃｕｒａｔｅ  ＳＨＡＰＥ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６、９７〜１０２（２００９）。
−  Ｓ．Ａ．ＭｏｒｔｉｍｅｒおよびＫ．Ｍ．Ｗｅｅｋｓ、Ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ＲＮＡ  ＳＨＡＰＥ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０、１６１７８〜１６１８０（２００８）。
−  Ｃ．Ｍ．Ｇｈｅｒｇｈｅ、Ｓ．Ａ．Ｍｏｒｔｉｍｅｒ、Ｊ．Ｍ．Ｋｒａｈｎ、Ｎ．Ｌ．ＴｈｏｍｐｓｏｎおよびＫ．Ｍ．Ｗｅｅｋｓ、Ｓｌｏｗ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｔ  Ｃ２’−ｅｎｄｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ＲＮＡ．  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０、８８８４〜８８８５（２００８）。
−  Ｓ．Ａ．ＭｏｒｔｉｍｅｒおよびＫ．Ｍ．Ｗｅｅｋｓ、Ａ  ｆａｓｔ  ａｃｔｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｄ  ｔｅｒｔｉａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｂｙ  ＳＨＡＰＥ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９、４１４４〜４１４５（２００７）。
−  Ｋ．Ａ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、Ｅ．Ｊ．ＭｅｒｉｎｏおよびＫ．Ｍ．Ｗｅｅｋｓ、Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ２’−ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ａｃｙｌａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳＨＡＰＥ）：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｔ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １、１６１０〜１６１６（２００６）。
−  Ｋ．Ａ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、Ｅ．Ｊ．ＭｅｒｉｎｏおよびＫ．Ｍ．Ｗｅｅｋｓ、ＲＮＡ  ＳＨＡＰＥ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｎｏｎ−ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｄｏｍｉｎａｔｅ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔＲＮＡＡｓｐ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ．  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７、４６５９〜４６６７（２００５）。
−  Ｅ．Ｊ．Ｍｅｒｉｎｏ、Ｋ．Ａ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、Ｊ．Ｌ．ＣｏｕｇｈｌａｎおよびＫ．Ｍ．Ｗｅｅｋｓ、ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｔ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ２’−Ｈｙｄｒｏｘｙｌ  Ａｃｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳＨＡＰＥ）．  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７、４２２３〜４２３１（２００５）。
−  Ｓ．Ｉ．ＣｈａｍｂｅｒｌｉｎおよびＫ．Ｍ．Ｗｅｅｋｓ、Ｍａｐｐｉｎｇ  ｌｏｃａｌ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ  ｂｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｃｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ２’−ａｍｉｎｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ＲＮＡ．  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２、２１６〜２２４（２０００）。
【００２０】
著者は、トランスファーＲＮＡまたは短い型のオリゴリボヌクレオチドに反応性を示すよう作成したイサト酸無水物の誘導体（Ｎ−メチル化イサト酸無水物、イサト酸無水物、Ｎ−メチル化ニトロイサト酸無水物、ニトロイサト酸無水物）を用いている（水性媒体、ｐＨ８、周囲温度または３７℃、数時間）。リン酸ジエステル骨格により接近可能でありかつあまり近くないので、２’−ＯＨの最小制限される例のみ、すなわち、二次または三次構造に最小に関与するものがアシル化される。そのため、これらはより反応性となる。次いで、この部分アシル化ＲＮＡを、いくぶん同じ長さのＤＮＡ断片を産生するインビトロ転写に供し、多量の２’−Ｏ−アントラニル酸、すなわち、糖の２’−ＯＨ上に固定されている開環イサト酸無水物分子に遭遇したらいつでも伸長を終結する。キャピラリー電気泳動によるこれらの断片の配列決定または解析後に、こうしてこの技術に供したメッセンジャーＲＮＡの三次構造のマップを確立することが可能である。これがＳＨＡＰＥ技術（プライマー伸長により解析する選択的２’−ヒドロキシルアシル化）の原理である。
【００２１】
２００８年、Ｌｉによる論文、「Ａｐｔａｍｅｒｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ＨＩＶ−１  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ」  Ｎａ  Ｌｉ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８、第３６巻、第２１号  ６７３９〜６７５１は、最も接近可能であり得る２’−ＯＨを特異的に内部標識するために、したがって、当のＲＮＡの構造マップを記載するためにＷｅｅｋｓによる研究を引用している。
２００７年、Ｔｈｏｍａｓ  Ｃｅｃｈ（Ｃｅｃｈ  Ｔ．Ｒ．ＲＮＡ  ２００７  ５３６〜５４８）はまた、この技術を用いて結晶化ＲＮＡの構造を研究している。
【００２２】
従来技術は特許も含む。
特許ＵＳ−Ｂ−７，２４４，５６８は、疎水基（対応する無水物のブチリルまたはペンタノイル）によるＲＮＡの２’−ＯＨの多少部分的な選択的アシル化に関する。したがって、ＲＮＡは、有機溶媒により選択的に抽出されるまたは選択的に固定化される（例えば、逆相、シリカ相、膜等）のに十分疎水性となる。この特許はまた、ＤＮＡ分子に対してＲＮＡ分子を選択的に固定化することを可能にする、酸塩化物または無水物により活性化した固相を記載している。この相は、固定化イサト酸無水物またはＢＣＰＢ（ポリスチレン上に固定化された塩化ベンジル）により行うことができる。最後に、この特許はまた、固相に吸着されたＲＮＡを分析するための技術も記載している：固定化ＲＮＡの２’−ＯＨがイサト酸無水物と反応し、生成した内因性蛍光が固定化ＲＮＡを分析することを可能にする。
さらに先進的な研究は、この特許が使用する無水物は化学特異的でなく、糖のヒドロキシル基とちょうど同じくらい塩基の環外アミンを攻撃するので、この特許により主張されている条件では、ＤＮＡが同様に官能化されることを示している。
【００２３】
特許ＥＰ−Ｂ−１．１９６．６３１は、水性媒体中でＲＮＡの位置特異的アシル化と適合性のアシル化剤を提案している。これらのアシル化剤は、このように修飾されたＲＮＡのハイブリダイゼーション特性を保持するために、過剰に大きい立体障害を提供する必要はない。これは、原則として使用するアセチルまたはホルミル基の導入を可能にするアシル化剤である。次いで、このように修飾されたＲＮＡは、重合反応のための基質として部分的に作用する。これはまた、ノーザンブロット反応でプローブとしても作用し得る。この発想は、ハイブリダイゼーション特性を保持するもの（修飾されたＲＮＡが伸長反応の基質のままである）である一方で、２’の基の存在を通して二次構造を破壊し、このように修飾されたＲＮＡをヌクレアーゼ抵抗性にする。さらに、実施例２２は、ＲＮＡの蛍光標識化が想像されるが、メチル化イサト酸無水物を添加することによってのみであることを示しており、これは内因性蛍光であることを意味する。
【００２４】
特許ＥＰ−Ｂ−１．１９６．６３１は、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはウイルスＲＮＡを含むポリヌクレオチドを提案しており、そのリボースの２５％超は２’−ＯＨ位で共有結合的に修飾されている。さらに、この特許は、ポリメラーゼおよびおそらくプライマーの存在下で複数のモノヌクレオチド（ＵＴＰ、ｄＴＴＰおよび／またはｄＵＴＰ、ＡＴＰおよび／またはｄＡＴＰ、ＧＴＰおよび／またはｄＧＴＰ、ならびにＣＴＰおよび／またはｄＣＴＰ）に基づいて、出発核酸鎖からの二本鎖オリゴ−およびポリヌクレオチドを製造して、出発核酸と相補的な核酸鎖の形成を可能にする方法に関する。
【００２５】
特許出願ＷＯ−Ａ−２００４／０１３１５５は、ＤＮＡとＲＮＡを区別するための、糞便、血液等の型の混合物中のＲＮＡの化学修飾を記載している。無水酢酸はこの区別を行うことができる試薬である。次いで、エステル官能基を加水分解して生物活性ＲＮＡを再生する。そうするために、この出願は、脱保護プロトコルと関連する、ＲＮＡに対して「ぎりぎりで」攻撃性の有機塩基（リジン、ジアミン等）の使用を促進することを提案している。
これらの文献全体から、いったん開環したイサト酸無水物の内因性蛍光のみが用いられていることに留意すべきである。さらに、他の用途のためのこの分子およびその誘導体の使用は、本発明により提案されているようには記載されていない。
【００２６】
イサト酸無水物の蛍光に関する限り、ＲＮＡを検出することができるイサト酸無水物の蛍光を有することのみに利点はほとんどない。したがって、この蛍光は他の蛍光化合物と比較して弱く、検出機械に現在用いられているレーザーの波長と必ずしも適合性でない。さらに、開環イサト酸無水物の内因性蛍光では、用途が単一（ｍｏｎｏｐｌｅｘ）検出に限られ、分子生物学でますますよくあるような多重検出ではない。例えば、使用者は共にイサト酸無水物で標識した、核酸の第１型の検出と核酸の第２型の検出を区別することができないので、ＤＮＡチップの分野の用途のための標識化は、これらの特許では不可能である。
【００２７】
従来技術では、イサト酸無水物の全部で４つの異なる用途が存在する。第１は、特定の酵素の機構を研究するためにアントラニル酸エステルの内因性蛍光特性を活用することである。第２は、核酸の重合を位置選択的に阻害するための、それゆえ最も穏やかで可能な条件下および多少制御された様式で２’での多量の置換基の導入のみを伴う、イサト酸無水物のアシル化特性の使用である。
第３には、従来技術は、抽出ステップ中の分解を防ぐためにイサト酸無水物を用いている。
第４の最後の用途は、アシル化されていないＤＮＡからアシル化ＲＮＡを選択的に抽出することである。そのため、遊離２’ＯＨ官能基およびそれゆえ官能性ＲＮＡを再生するための、エステル官能基の可逆性という着想が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
目的の基とのコンジュゲーションは、予測することが困難な特性である、イサト酸無水物のアシル化特性および安定性さえ修飾することを伴い得るので、少なくとも２種の異なるスポットまたはＤＮＡチップ上のハイブリダイゼーションのためのｍＲＮＡの標識化の用途のためのビオチンまたはＣｙ３とイサト酸無水物分子をコンジュゲートする着想は自明でない。特に、イサト酸無水物の目的の基とのコンジュゲーションは、構造の極めて実質的な不安定化、合成の極めて大きな困難、水への乏しい溶解性、蛍光の減衰による目的の基の物理化学的特性の喪失、ＲＮＡとの極めて乏しい反応性、特に過剰な立体障害によるまたは官能化ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドがもはやポリメラーゼ基質ではないという事実による、標識ＲＮＡとＤＮＡ（捕捉プローブ）との間に形成される二本鎖の極めて大きな不安定性を引き起こし得る原子ならびに結合を介して起こらなければならない。
さらに、本発明者らは、固体担体が有していてもよくまたは有していなくてもよい認識分子により捕捉されることを可能にするためのイサト酸無水物化合物によるＲＮＡの官能化の重要性を理解した。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明は、その内因性蛍光のためではなく、以下に定義するように、ＲＮＡ上に特異的に固定し、目的の基と結合するその能力のために、イサト酸無水物を用いることを提案している。
そのため、本発明は、求核試薬（第一級もしくは第二級アミン、チオールおよびアルコール）と反応して、開環後にＣＯ２、アントラニル酸の誘導体を放出するその能力について長い間知られている（ＪＯＣ  １９５９  Ｓｔａｉｇｅｒ  ２４  １２１４）イサト酸無水物分子を用いることに存する（図１参照）。求核試薬のイサト酸無水物への攻撃は、治療目的のいくつかの複素環の合成に重要な中間体の直接形成を可能にするので、広く研究されてきた。実際、アントラニル酸の誘導体はその後再配列して多数の製薬目的の複素環をもたらすことができる。したがって、求電子試薬に対する反応性（ベンゼン環上の置換）と相まって、イサト酸無水物は、多種多様な分野の用途：農芸化学、製薬業、化学および化粧品産業に用いられる極めて多数の類似体および誘導体を入手できる。その極めて特有の性質が、イサト酸無水物を、乾燥貯蔵下および周囲温度で販売することができ、優先的には加熱（６０〜８０℃）により、最も多くの場合塩基の存在下で、求核試薬の存在下でのみ反応する比較的安定な分子にしている。
【００３０】
これらの特性、ならびにアルコールに対するイサト酸無水物の反応性についての従来技術（上記参照）が、本発明者らに特にＤＮＡチップを介してＲＮＡを標識および検出するためにこの分子を用いることを思いつかせた。したがって、基質の大きさおよび配列と全く関係なくＲＮＡを官能化または選択的に標識することを可能にする方法はほとんどない。ＤＮＡとＲＮＡとの間の大きな違いは２’位のヒドロキシル基の存在によるものであることが分かっている（図２参照）。ＲＮＡリボースのこの２’−ヒドロキシル基は、ＤＮＡチップの用途でも選択的ＲＮＡ対ＤＮＡ選別の用途でもＲＮＡを標識するために決して用いられてこなかった。そのため、本発明者らは、発蛍光団もしくはビオチン（もしくは目的の分子）とのコンジュゲーションにより検出可能にされるまたは官能化されるイサト酸無水物分子を反応させるためにこの官能基を用いた。こうして、ＲＮＡがＤＮＡの存在下で選択的に標識される。
【００３１】
定義により、目的の基は、
・特定の条件下（例えば、求核試薬のおよび求電子試薬の、アジドを有するアルキンの、チオールを有するマレイミドの、アルケンを有するジエンの等）で別の反応性分子または別の反応性基と反応することができる反応性分子または反応性基であり、かつ／または
・開環イサト酸無水物（アントラニル酸エステル）のものとは異なるそれ自体の蛍光を有し、かつ／または
・ビオチン／ストレプトアビジン、疎水性もしくは親水性分子／疎水性もしくは親水性担体、抗原／抗体等の型の安定かつおそらく可逆性の複合体を形成するための、認識分子もしくは表面もしくは粒子等により認識できるリガンドであり、かつ／または
・以下の分子：
−  西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素などの、例えば、比色分析、蛍光、発光により検出可能なシグナルを産生する酵素、
−  着色剤のような発色団、または蛍光、発光化合物、
−  電子顕微鏡により、または導電率、電流測定、ボルタンメトリー、インピーダンスなどの電気特性により検出可能な電子密度を有する基、
−  例えば、その分子がその物理的および／または化学的特性の検出可能な修飾を誘導するのに十分な大きさである検出可能な基、ならびに
−  放射性分子
から選択される直接反応のための標識化分子であり、かつ／または
・以下の型のリガンド／受容体対：
−  ビオチン／ストレプトアビジン、
−  ハプテン／抗体、
−  抗原／抗体、
−  ペプチド／抗体、
−  糖／レクチン、
−  求電子分子／求核分子、
−  ポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド相補体、
−  疎水性リガンド／疎水性固相、または
−  リガンド／配位金属
により構成される間接反応のための標識化分子である
分子である。
【００３２】
結合分子は、イサト酸無水物またはその誘導体を意味すると理解すべきである。イサト酸無水物が求核試薬との反応後に開環すると、アントラニル酸という名称を有することに留意すべきである。
イサト酸無水物誘導体は、イサト酸無水物に相当する部分を含み、後者の芳香族部分または複素環部分に少なくとも１種のラジカル、例えば化学または有機基を有する任意の有機化合物を意味すると理解すべきである。
官能化という用語は、共有または非共有結合による目的の基の核酸上へのグラフト作用に相当する。
【００３３】
結合アームは、結合分子および目的の基を連結することができる有機スペーサーアームとして定義される。これには、物理化学的、光化学的、酵素的、化学的、熱的手段等により切断することができる官能基が含まれ得る。
認識もしくは捕捉手段または分子は、目的の基との強い親和性を有する、固体担体上に固定されていてもされていなくてもよい分子として定義される。
ＲＮＡの定義は、少なくとも２個の修飾もしくは非修飾連続リボヌクレオチド単位から構成される天然または合成ポリマーである。
ＤＮＡという用語は、少なくとも２個の修飾もしくは非修飾連続デオキシリボヌクレオチド単位から構成される天然または合成ポリマーにより定義される。
少なくとも１個のＤＮＡセグメントおよび少なくとも１個のＲＮＡセグメントから構成される単一キメラ鎖を用いることも可能である。
阻害とは、イサト酸無水物誘導体により過剰に官能化されたＲＮＡを、遺伝物質を増幅するための技術（ＮＡＳＢＡ、ＰＣＲ等）により増幅することができないことであると理解される。
定義により、糖という用語は、リボースまたはデオキシリボース化合物を意味する。
【００３４】
本発明は、少なくとも１のリボ核酸（ＲＮＡ）分子を官能化する方法であって、
ａ）少なくとも
−  イサト酸無水物またはその誘導体により構成される結合分子と、
−  目的の基と、
−  結合分子を目的の基と連結する結合アームと
を有するステップと、
ｂ）結合分子の無水物官能基を
−  ＲＮＡヌクレオチドの１個のリボースの２’位、ならびに／または
−  ＲＮＡの３’末端のヌクレオチドのリボースの２’および／もしくは３’位
の少なくとも１個のヒドロキシル基と反応させるステップと、
ｃ）結合アームを介してＲＮＡを目的の基と連結するアントラニル酸を得るステップと
を含む方法に関する。
【００３５】
第１の実施形態によると、本方法は、少なくとも１のリボ核酸（ＲＮＡ）分子を標識することを伴い、これは
ａ）少なくとも
−  内因性蛍光を有する、イサト酸無水物またはその誘導体により構成される結合分子と、
−  結合分子により発せられるシグナルとは異なる内因性蛍光シグナルを有する、または内因性蛍光シグナルを有さない目的の基と、
−  結合分子を目的の基と連結する結合アームと
を有するステップと、
ｂ）結合分子の無水物官能基を
−  ＲＮＡヌクレオチドの１個のリボースの２’位、ならびに／または
−  ＲＮＡの３’位の末端ヌクレオチドのリボースの２’および／もしくは３’位
の少なくとも１個のヒドロキシル基と反応させるステップと、
ｃ）結合アームを介してＲＮＡを目的の基と連結するアントラニル酸を得るステップと
を含む。
【００３６】
第２の実施形態によると、本方法は、少なくとも１のリボ核酸（ＲＮＡ）分子を捕捉または分離することを伴い、これは
ａ）少なくとも
−  イサト酸無水物またはその誘導体により構成される結合分子と、
−  アンチリガンドと相補的なリガンドにより構成される目的の基と、
−  結合分子を目的の基と連結する結合アームと
を有するステップと、
ｂ）結合分子の無水物官能基を
−  ＲＮＡヌクレオチドの１個のリボースの２’位、ならびに／または
−  ＲＮＡの３’位の末端ヌクレオチドのリボースの２’および／もしくは３’位
の少なくとも１個のヒドロキシル基と反応させるステップと、
ｃ）結合アームによりＲＮＡを目的の基と連結するアントラニル酸を得るステップと、
ｄ）リガンド−アンチリガンド反応を通してＲＮＡを捕捉または分離するステップと
を含む。
【００３７】
本方法の実施形態のどれでも、また１つの実施形態の変形によると、結合アームは、前記結合アームが目的の基と会合する前に結合分子と会合する。
本方法の実施形態のどれでも、また別の実施形態の変形によると、結合アームは、前記結合アームが目的の基と会合した後に結合分子と会合する。
前記２つのシナリオでは、結合分子は事前にＲＮＡと会合する。
【００３８】
本発明は、少なくとも１個の結合分子と、アンチリガンドと相補的なリガンドにより構成される目的の基と、結合分子を目的の基と連結する結合アームとを用いて、少なくとも１個のＲＮＡ分子を選択的に捕捉する方法であって、結合分子が、共有結合を介して
−  ＲＮＡヌクレオチドの１個のリボースの２’位、ならびに／または
−  ＲＮＡの３’位の末端ヌクレオチドのリボースの２’および３’位、ならびに／もしくは
−  ＲＮＡの３’位の前記末端ヌクレオチドのリボースの３’位
のヒドロキシル基に付着するイサト酸無水物またはその誘導体により構成されている方法に関する。
【００３９】
本発明はまた、ＲＮＡ分子を他の生体構成物、特にＤＮＡ分子から分離する方法であって
・上記のような捕捉方法を、区別されていない核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡ）を含む生体試料に適用するステップであって、目的の基が生体試料の残りから容易に分離可能な少なくとも１種の固体担体と会合しているステップと、
・ＲＮＡ分子を有する結合分子を生体試料の残りから分離するステップと
に存する方法に関する。
【００４０】
本発明は、式（１）：
2014504282.tif 000002
（式中、
・Ｒ１はＨまたは目的の基を表し、
・Ｒ２はＨあるいは
ａ．標識もしくは標識化前駆体、または
ｂ．安定な複合体を形成するために認識分子もしくは表面もしくは粒子等により認識できるリガンド
であり得る目的の基を表し、
・Ｒ１がＨにより表される場合、Ｒ２は目的の基により表され、逆もまた同じであり、
・Ｘは目的の基を結合分子と連結する結合アームである）
を有する別の官能化試薬に関する。
【００４１】
試薬が上記のような捕捉または分離試薬である場合、捕捉または分離手段は、磁性もしくは非磁性ポリマーもしくはシリカ粒子またはフィルターなどの固体担体により、あるいは容器の内壁によっても構成される。
試薬が上記のような官能化試薬である場合、結合アームＸは、
−  結合分子の原子および目的の基の原子を連結する単一共有結合、または
−  おそらく置換されており、少なくとも２個の炭素原子の鎖形成が芳香族構造および／もしくはヘテロ原子（酸素、硫黄、窒素等）をおそらく含む、有機結合アーム、例えば、結合分子と目的の基もしくは単一炭素原子との間の単一共有結合
である。
【００４２】
官能化試薬のこの後者の実施形態では、結合アームＸは、特定の光、温度、酵素的もしくは化学的条件下で結合分子をＲＮＡから分離する物理化学的、光化学的、熱的、酵素的および／または化学的手段により切断することができる官能基または結合を含む。
本発明はまた、前記のような方法により得ることができる官能化生物学的ＲＮＡ分子に関する。
本発明はまた、前記のような試薬を含む、標的ＲＮＡ分子を検出するためのキットに関する。
本発明は、最後に、官能化する各ＲＮＡ鎖の３’位の末端一リン酸基を加水分解することからなる、ステップａ）とｂ）との間の補足ステップを含む、上に述べた方法による官能化法に関する。
本発明は添付の図面に関して以下に述べる詳細な説明によってよりよく理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】イサト酸無水物と求核試薬の反応を説明する図である。
【図２】本発明による目的の基を有する結合分子によるリボ核酸分子の標識化反応を示す図である。
【図３】実施例１によるイサト酸無水物誘導体の合成を示す図である。
【図４】実施例２によるイサト酸無水物誘導体の合成を説明する図である。
【図５】Ｃｙ３  ＩＡ  Ｍｅ（１３）により官能化されたＯＲＮの酵素的切断および全ての可能なヌクレオシド付加物を検出する原理を説明する図である。
【図６】ＬＣ−ＭＳにより、化合物１３により標識されたＯＲＮの酵素的加水分解中に形成される異なるヌクレオシド付加物を特徴付けそれを同定することを提案する図である。
【図７】記載の配列から検出することができる、実施例３によるアシル化されたもしくはアシル化されていないヌクレオシドおよびジヌクレオチドの質量を示す図である。
【図８】修飾イサト酸無水物濃度（Ｃｙ３  ＩＡ  Ｍｅ  １３）の関数としての２７個の塩基のＯＲＮの官能化の質量スペクトル写真（Ｍａｌｄｉ  Ｔｏｆ）を示す図である。
【図９】化合物１３と反応したＯＤＮまたはＯＲＮ間のＨＰＬＣによる反応モニタリングを示す図である。
【図１０】Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＤＮＡチップ上で、化合物９による４種のビオチン化ＯＲＮのハイブリダイゼーション中に検出された蛍光強度（ＲＦＵ）を示す図である。
【図１１】化合物１１によりビオチン化した６０個の塩基の４種のＯＲＮのＤＮＡチップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｃｈｉｐ）上での検出後の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す図である。
【図１２】化合物９によるビオチン化ＩＶＴのＤＮＡチップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｃｈｉｐ）上での検出後の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す図である。
【図１３】化合物Ｃｙ３  ＩＡ  Ｍｅ  １３によりハイブリダイズされ官能化されたＩＶＴのハイブリダイゼーションの検出時のＡＧＩＬＥＮＴガラススライド上のＤＮＡチップの写真である。
【図１４】配列（化合物Ｃｙ３  ＩＡ  Ｍｅ  １３により官能化されたＩＶＴ）のクラスの関数としてのＡｇｉｌｅｎｔガラススライドチップ上で検出された蛍光の中央強度のヒストグラムを表す図である。
【図１５】実施例１１に記載のようにＯＲＮ／ＯＤＮ混合物から、ＲＮＡを選択的に官能化／捕捉および切断／溶出する方法の２６０ｎｍクロマトグラムを表す図である。
【図１６】化合物５  Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４（ＳＳ）ＩＡ  Ｍｅ（２４）の作用に供したＲＮＡ転写産物の官能化、捕捉、切断および溶出のプロトコルの実行を示す図である。
【図１７】官能化していない、および異なる濃度の分子５  Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４（ＳＳ）ＩＡ  Ｍｅ（２４）で官能化したＨＩＶ転写産物の電気泳動的プロファイルを示す図である。
【図１８】図１７と同じものであるが別のグラフ表現（ゲル型）のものを示す図である。
【図１９】ストレプトアビジンコーティングした磁性粒子に暴露した、官能化していない、および異なる濃度の分子５  Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４（ＳＳ）ＩＡ  Ｍｅ（２４）で官能化したＨＩＶ転写産物の上清に相当する電気泳動的プロファイルを示す図である。
【図２０】ストレプトアビジンコーティングした磁性粒子に暴露し、次いで、ジスルフィド結合（ＳＳ）の化学的切断により溶出した、官能化していない、および異なる濃度の分子５  Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４（ＳＳ）ＩＡ  Ｍｅ（２４）で官能化したＨＩＶ転写産物の電気泳動的プロファイルを示す図である。
【図２１】異なる濃度（１５、３０、１２０および１８０ｍＭ）の分子（２４）で官能化し、ストレプトアビジンコーティングした磁性粒子上に補捉し、次いで、ＤＴＴによる化学的切断により溶出し、ＮＡＳＢＡにより増幅した、ＨＩＶ転写産物（１０００、１００、５０、１０および１コピー）の範囲の重ね合わせを表す図である。
【図２２】特定のイサト酸無水物による、本発明によるＲＮＡの官能化の反応図を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下の略語を、以下に記載する実施例に使用する。
・ＡＣＮ：アセトニトリル、
・Ａｒ：芳香族、
・ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー、
・ＣＤＣｌ３：重水素化クロロホルム、
・ｄ：二重項、
・ＤＣＭ：ジクロロメタン、
・ｄｄ：分裂二重項、
・ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド、
・ＤＭＳＯ−ｄ６：ジメチルスルホキシド、
・ＤＭＳＯ−ｄ６：重水素化ジメチルスルホキシド、
・ＭｉｌｌｉＱ水：超純水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｏｌｓｈｅｉｍ、フランス）、
・Ｅｑ：当量、
・ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー、
・ＩＡ：イサト酸無水物、
・ＩＶＴ：インビトロ転写産物、
・Ｍ：多重項、
・ｍ：クラスター、
・Ｍｅ：メチル、
・ＭｅＯＨ：メタノール、
・Ｎｂ  ｅｘｐ：実験反復数、
・ｎｄ：未決定、
・ＮＭＯ：Ｎ−メチルモルホリン、
・ＮＰ１：ヌクレアーゼＰ１、
・ＯＤＮ：オリゴ−デオキシリボヌクレオチド、
・ＯＲＮ：オリゴ−リボヌクレオチド、
・ＡＰ：アルカリホスファターゼ、
・ＰＢＳ  １ｘ：リン酸緩衝食塩水＝（０．０１Ｍ  ＰＯ４−、０．００２７Ｍ  ＫＣｌ、０．１３７Ｍ  ＮａＣｌ、２５℃でｐＨ＝７．４  ＳＩＧＭＡ  参照番号４４１７、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）、
・ｑ：四重項、
・Ｙｌｄ：収率、
・ＲｆまたはＲＴ：保持時間、
・ＮＭＲ：核磁気共鳴、
・ｒｐｍ：毎分回転数、
・ｓ：一重項、
・ＳＳ：ジスルフィド結合、
・ｔ：三重項、
・ＴＥＡＡｃ：酢酸トリエチルアンモニウム、
・Ｆｒ：官能化率、
・ＡＴ：周囲温度、
・ＵＶ：紫外線。
【００４５】
以下の実施例に用いる化合物の分析および合成のための一般的条件を以下に記載する：
ＬＣ−ＭＳ分析は、３０℃で１ｍｌ／分の流れを用いて（２６０ｎｍまたは最大プロットで検出）、ＰＤＡ９９６（Ｗａｔｅｒｓ）ダイオードアレイ検出器、ＺＱ２０００（Ｗａｔｅｒｓ）質量分析検出器、Ｅｍｐｏｗｅｒバージョン２ソフトウェアおよびＷＡＴＥＲＳ  ＸＴｅｒｒａ  ＭＳ  Ｃ１８カラム（４．６×３０  ２．５μＭ）を備えるＨＰＬＣ  ＷＡＴＥＲＳ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２７９５  ｃｈａｉｎにより行った。ＺＱ２０００質量分析器はエレクトロスプレーイオン化源を有する。イオン化は、２０Ｖのコーン電圧および３．５ｋＶのキャピラリー電圧を用いてポジティブモードで行った。
【００４６】
いくつかの種類の勾配をＨＰＬＣ分析のために使用した。
2014504282.tif 000003
ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ２００または５００ＭＨｚ分光計（分子１３についてのみ）で記録した。化学シフト（δ）は、内部標準とみなす溶媒ピーク（２５℃でＣＤＣｌ３：７．２４ｐｐｍ；ＤＭＳＯ−ｄ６：２．４９ｐｐｍ；Ｄ２Ｏ：４．８０ｐｐｍ）に対するｐｐｍで与える。スペクトルは、上記略語：ｓ、ｄ、ｔ、ｑ、ｑｕ、ｍおよびＭで記載する。カップリング定数（Ｊ）はヘルツ（Ｈｚ）で表す。
【００４７】
吸光度スペクトルは、ＵＶ可視Ｖａｒｉａｎ分光光度計、Ｃａｒｙ  ３００  Ｂｉｏモデルで記録した。蛍光による分析は、Ｖａｒｉａｎ蛍光光度計、Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅモデル（Ｖａｒｉａｎ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）で行った。
イオンクロマトグラフィー分析は、ＩｏｎＰａｃ  ＣＳ１２Ａカラム（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてカチオンモードで、ＤＩＯＮＥＸ  ＩＣＳ  １０００クロマトグラフ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で行った。
薄層クロマトグラフィー分析は、２５４ｎｍでのＵＶ検出のＡＬＵＧＲＡＭ（登録商標）  ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ  ＳＩＬ  Ｇ／ＵＶ２５４シリカプレート、４×８ｃｍ、（Ｄｕｒｅｎ、ドイツ）、または逆相ＴＬＣ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｒｅｎ、ドイツ、Ａｌｕｇｒａｍ  ＲＰ−１８Ｗ  ４０×８０ｍｍ）で行った。
【００４８】
生成物の精製は、ＦＬＵＫＡ  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０（４０〜６３μｍ）でクロマトグラフィーにより行った。「フラッシュ」クロマトグラフィー（アルゴン圧力下）による分離の条件は、Ｃｌａｒｋ  Ｓｔｉｌｌら（Ｃｌａｒｋ  Ｓｔｉｌｌ，Ｗ．；Ｋａｈｎ，Ｍ．；Ｍｉｔｒａ，Ａ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７８、４３、２９２３〜２９２５）により記載されている条件、すなわち、シリカの高さを１５ｃｍに固定する、５ｃｍ／分の流れで流す、カラムの直径は精製する生成物の量およびＲｆによる、を厳密に尊重する。特定の親水性生成物の精製は、シリカゲル、ＭＥＲＣＫ  ＲＰ−１８シリカゲル（４０〜６３μｍ）でのクロマトグラフィーにより行った。薄層クロマトグラフィーによる分析は、ＭＥＲＣＫ  １８  Ｆ２５４シリカプレートで行い、２５４ｎｍのＵＶ下でまたは肉眼により直接見た。
【００４９】
実施例１および２の前書き：実施例１および２に記載する化合物の合成の一般的記載
イサト酸無水物またはその誘導体の目的の基とのコンジュゲーションは、反応性官能基を有するイサト酸無水物とやはり反応性官能基を有する目的の分子との間の化学反応を意味する。このカップリング中にイサト酸無水物部分の完全性を保つことが特に重要であることに留意すべきである。当業者は、２つの分子両方に共通の特性を有する新規な分子を得るために、２つの分子をコンジュゲートする多数の方法を知っている。
【実施例】
【００５０】
（実施例１）芳香環が有する目的の基とコンジュゲートしたイサト酸無水物のアルキル化誘導体の合成
本発明の特定の実施形態では、イサト酸無水物は、目的の基、例えば、図３に明確に示すように芳香環を介してイサト酸無水物である結合分子と結合するＣｙ３、ビオチン、不安定基を有するビオチンなどの標識とコンジュゲートしている。
したがって、本発明者らは、アミド型結合アームにより、イサト酸無水物の芳香族部分を介してイサト酸無水物および目的の分子を連結することを選択した。これは、
−  化合物（６）、（２３）または（７）を得るために、
−  カップリング試薬（クロロギ酸イソブチル）により、
−  ５−アミノＩＡ（１）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）を
−  カルボン酸（親水性アーム（３）もしくは化学不安定（ｃｈｅｍｏｌａｂｉｌｅ）アーム（２２）を有するまたは有さないビオチン）あるいはＣｙ３−ＣＯＯＨ（４））
と反応させること（方法１）により行われる。
【００５１】
イサト酸無水物の５−アミノ基はあまり求核性ではないので、本発明者らは、
−  ５−アミノＩＡ（１）と
−  目的の分子の活性化エステル
との間の反応（方法２）により直接ペプチドカップリングを行うよりも方法１を用いることを好んだ。
方法１は、本発明者らが化合物Ｂｉｏｔ  ＩＡ（５）を入手するために行ったような５−アミノＩＡとビオチンＰＦＰ（２）の直接カップリング（方法２）よりもはるかに優れた収率で、イサト酸無水物のコンジュゲート（Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４  ＩＡ（６）、Ｃｙ３  ＩＡ（７）またはＢｉｏｔ  ＰＥＧ４  ＳＳ  ＩＡ（２３））の入手を可能にする。
蛍光ストレプトアビジン分子により容易に検出可能な親水性化合物であるので、ビオチン化誘導体（３）を選択した。
【００５２】
ストレプトアビジン分子により容易に検出可能な親水性化合物であり、さらに、媒体中で、捕捉されたＲＮＡ分子を遊離することを可能にする化学不安定ジスルフィド結合（ＳＳ）を有するので、ビオチン化誘導体（２２）を選択した。
その光安定性および特定の生体構成物の自己蛍光からはるかに離れた波長での蛍光特性（λ励起＝５４５ｎｍおよびλ発光＝５７０ｎｍ）のために、生物医学的用途または分子診断用途に一般的に用いられている発蛍光団であるので、シアニン３  Ｃｙ３−ＣＯＯＨ（４）を目的の基の例として選択した。この分子は、Ｗａｇｇｏｎｅｒら（Ｗａｇｇｏｎｅｒ  Ａ．Ｓ．、Ｍｕｊｕｍｄａｒ  Ｒ．Ｂ．、Ｅｒｎｓｔ  Ｌ．Ａ．、Ｍｕｊｕｍｄａｒ  Ｓ．Ｒ．、Ｌｅｗｉｓ  Ｃ．Ｊ．、Ｃｙａｎｉｎｅ  Ｄｙｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ：Ｓｕｌｆｏｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｅｓｔｅｒｓ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９３、４、１０５〜１１）により記載されている合成経路に従って合成した。
【００５３】
当業者は、芳香環上の種々の位置にある結合および基を介してイサト酸無水物を任意の他の目的の分子にカップリングさせるための他の従来の有機化学反応を用いることを知っていることが理解されることに留意すべきである。そのため、本発明者らは自身を５位に限定しないこと、および他の置換位置を用いることができ、それがイサト酸無水物の求核試薬との反応性を調節するよう作用さえし得ることも理解される。
【００５４】
これらの化合物のＲＮＡの２’ＯＨとの反応性を増加させるために、本発明者らは、ハロゲン化合物またはこの位置のアルキル化後に反応性を増加させるこの官能基に反応性の化合物を用いたアルキル化により、イサト酸無水物の環内−ＮＨ−上に種々の基を導入した。したがって、化合物５Ｂｉｏｔ  ＩＡ  Ｍｅ（９）、５Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４  Ｍｅ（１１）、５Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４  ＳＳ  ＩＡ  Ｍｅ（２４）またはＣｙ３−ＩＡ  Ｍｅ（１３）は、対応する前駆体化合物とヨウ化メチルの反応により得た。求核試薬との優れた反応性を保持しながら、イサト酸無水物の求核基（この場合、ＲＮＡのヒドロキシル）との反応性を増加させ、なおまた補足の官能性（溶解性、二本鎖の安定性、標識化等）を提供するために、他のアルキル化化合物を用いてもよいことに留意すべきである。したがって、化合物５Ｂｉｏｔ  ＩＡ  Ｓ０３−１０、５Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４  Ｓ０３−１２またはＣｙ３−ＩＡ  Ｓ０３−１４は、対応する前駆体化合物とスルトン８の反応により得た。
【００５５】
したがって、その特性を調節するために、極めて多数の求電子化合物をイサト酸無水物またはその誘導体のＮＨ基と反応させることができることが理解される。多数の反応および試薬によりＮＨ上のイサト酸無水物の誘導体をアルキル化することが可能になることが理解される。
【００５６】
実施例１．１：ビオチンおよびペンタフルオロフェノールエステル（２）の合成
2014504282.tif 000004
ビオチン（５ｇ；２３．１ｍｍｏｌ；１．０ｅｑ）を無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）およびピリジン（２．０７ｍＬ；２５．４ｍｍｏｌ；１．１ｅｑ）に懸濁させる。５分の撹拌後、トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ−ＴＦＡ：４．６２１ｍＬ、すなわち、７．５０ｇ；２５．４ｍｍｏｌ；１．１ｅｑ）を添加する。一晩の撹拌後に反応を終結させる。溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させる。蒸発残渣をエチルエーテル１００ｍＬで溶解して懸濁させ、次いで、焼結ガラス上でスピンドライする。残渣を最小限のエーテルですすぐ。
得られる質量＝７．１０６ｇ、すなわち、８１％の収率。順相ＴＬＣ溶出液：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９０／１０。
Ｍ＋Ｈ：４１１．１ｇ．ｍｏｌ−１
NMR 1H(200MHz, DMSO): 1.2〜1.8(m, 6H, 7-8-9); 2.3〜2.9(m, 4H, 5-10); 3.05(q, 1H, 6); 4.00および4.40(M, 2H, 3-4); 6.2および6.5(s, 2H, 1-2)。
【００５７】
実施例１．２：５−ビオチン−イサト酸無水物（５）の合成
2014504282.tif 000005
５−アミノ−イサト酸無水物１（５００ｍｇ；２．８１ｍｍｏｌ；１．０ｅｑ）をＤＭＦ（１４ｍＬ）およびトリエチルアミン（３．１５ｍＬ；２２．４ｍｍｏｌ；８．０ｅｑ）の混合物の溶液に入れる。色が暗褐色の得られた溶液を、ビオチンおよびペンタフルオロフェノールエステル（２）（１．６１２５ｇ；３．９３ｍｍｏｌ；１．４ｅｑ）を同時に添加する前に、ＡＴで５分間撹拌する。反応を撹拌下で１６時間放置する。溶媒を乾燥するまで蒸発させ、次いで、ロータリーエバポレーターで無水アセトニトリルと２回同時蒸発させる。蒸発残渣をＤＭＦ（２１．２ｍＬ）およびトリエチルアミン（４．８０ｍＬ；３３．９２ｍｍｏｌ；８．０ｅｑ）に溶解し、次いで、１６時間撹拌する。撹拌し、次いで７０００ｒｐｍで５分間遠心分離する前に、２℃の塩酸（３８ｍＬ；１Ｍ；１５．８ｅｑ）を混合物に添加する。上清を除去し、沈渣を連続して３回水（６８ｍＬ）に溶解し、撹拌し、遠心分離し、上清を再度除去する。上清のｐＨは７に等しくなければならない。次いで、沈渣を、真空下周囲温度のオーブン中での乾燥を促進するために、連続して数回エチルエーテルで乾燥させる。生成物を最小限のＤＭＦに溶解し、これに１スパーテルのＲＰ１８シリカを添加し、この混合物を蒸発させ、次いで、直径３ｃｍ×高さ１０ｃｍの逆相クロマトグラフィーカラム（Ｍｅｒｃｋ  ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ  ＲＰ−１８シリカ（４０〜６３μｍ）  参照番号：１．１３９００．１０００）上に沈着させる前にアセトニトリルと２回同時蒸発させる。生成物をアセトニトリル／ＤＭＦ：９０／１０の混合液で溶出する。
得られる質量＝５５７ｍｇ、すなわち、３２％の収率。
Ｍ＋Ｈ：４０５．１ｇ．ｍｏｌ−１
NMR 1H(200MHz, DMSO): 1.3〜1.8(m, 6H, 7-8-9); 2.34(t, 2H, 10); 2.6(d, 2H, 5); 2.9(dd, 1H, 6); 3.15(M, 1H, 10); 4.10および4.40(M, 2H, 3-4); 6.47および6.39(s, 2H, 1-2); 7.13(d, 1H, 14); 7.85(dd, 1H, 13); 8.30(s, 1H, 12)。
【００５８】
実施例１．３：１−メチル−５−ビオチン−イサト酸無水物（９）の合成
2014504282.tif 000006
生成物（５）（５２２ｍｇ；１．２９ｍｍｏｌ；１．０ｅｑ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解する。炭酸カリウム（３７５ｍｇ；２．７１ｍｍｏｌ；２．１ｅｑ）をこの混合液に懸濁させ、ヨウ化メチル（１０５μｌ；１．６８ｍｍｏｌ；１．３ｅｑ）を添加する前に周囲温度で５分間撹拌する。１時間２０分の撹拌後、反応媒体を空隙率３の焼結ガラスに濾過する。乾燥するまで蒸発させ、次いでアセトニトリルと２回同時蒸発させる前に、１スパーテルのＲＰ１８シリカを濾液に添加する。得られた粉末を、直径３ｃｍおよび高さ１０ｃｍの逆相クロマトグラフィーカラム（Ｍｅｒｃｋ  ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ  ＲＰ−１８シリカ（４０〜６３μｍ）参照番号：１．１３９００．１０００）上に沈着させる。生成物を２種の混合液、最初に水／ＡＣＮ／ＤＭＦ：７９／２０／１、次いで水／ＡＣＮ／ＤＭＦ：６９／３０／１で溶出する。生成物（９）を第２溶出液で回収する。
得られる質量＝６５ｍｇ、すなわち、１２％の収率。
Ｍ＋Ｈ：４１９．１ｇ．ｍｏｌ−１
NMR 1H(200MHz, DMF): 1.6〜2.1(m, 6H, 7-8-9); 2.7(t, 2H, 10); 2.9〜3.3(m, 6H, 5-6-15); 3.5(M, 1H, 10); 4.5および4.8(M, 2H, 3-4); 6.5および6.6(s, 2H, 1-2); 7.7(d, 1H, 14); 8.2(d, 1H, 13); 8.8(s, 1H, 12)
【００５９】
実施例１．４：１−プロピルスルホン−５−ビオチン−イサト酸無水物（１０）の合成
2014504282.tif 000007
生成物（５）（５０ｍｇ；１２３．６μｍｏｌ；１．０ｅｑ）をＤＭＦ（１．２ｍＬ；１００ｍＭ）に溶解する。炭酸カリウム（６３．６ｍｇ；４０８μｍｏｌ；３．３ｅｑ）をこの混合液に懸濁させる。１分当たり１０００回転のボルテックスで２分の撹拌後、プロパンスルトン（１４２μｌ；１６１μｍｏｌ；１．３ｅｑ）を添加する前に装置を＋４℃のコールドチャンバーに入れる。２２時間の撹拌後、反応媒体を遠心分離し、上清を回収する。沈渣をＤＭＦで再度２回洗浄する。乾燥するまで蒸発させ、次いでアセトニトリルと２回同時蒸発させる前に、１スパーテルのＲＰ１８シリカを上清に添加する。得られた粉末を、直径１ｃｍおよび高さ１０ｃｍの逆相クロマトグラフィーカラム（Ｍｅｒｃｋ  ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ  ＲＰ−１８シリカ（４０〜６３μｍ）参照番号：１．１３９００．１０００）上に沈着させる。生成物を２種の混合物、最初にＡＣＮ／ＤＭＦ：１００／０、次いでＡＣＮ／ＤＭＦ：９０／１０、ＡＣＮ／ＤＭＦ：８０／２０、ＡＣＮ／ＤＭＦ：６０／４０、ＡＣＮ／ＤＭＦ：０／１００で溶出する。生成物（１０）をＡＣＮ／ＤＭＦ溶出液：９０／１０で回収する。
得られる質量＝２３ｍｇ、すなわち、３５％の収率。
Ｍ＋Ｈ：５２７．１ｇ．ｍｏｌ−１
NMR 1H(200MHz, DMSO): 1.3〜1.75(m, 6H, 7-8-9); 1.90(qu, 2H, 16); 2.31(t, 2H, 10); 2.48(M, 2H, 15); 2.65(M, 2H, 5); 2.85(dd, 1H, 6); 3.15(M, 1H, 10); 4.00および4.40(M, 2H, 3-4); 6.47および6.38(s, 2H, 1-2); 7.64(d, 1H, 14); 7.90(dd, 1H, 13); 8.42(sd, 1H, 12); 10.22(s, 1H, 18)
【００６０】
実施例１．５：５−ビオチン−ヘキシルエチレングリコール−イサト酸無水物（６）の合成
2014504282.tif 000008
５−アミノ−イサト酸無水物（１）（６６３ｍｇ；３．７２ｍｍｏｌ；１．０ｅｑ）をＤＭＦ（１８．６ｍＬ；２００ｍＭ）に溶解し、乾燥させ、最後にＤＭＦ１８．６ｍＬに溶解する前に、アセトニトリルと２回同時蒸発させる。次いで、氷浴中で０℃に冷却した後で、Ｎ−メチルモルホリン  ＮＭＯ（４０９μｌ；３．７２μｍｏｌ；１．０ｅｑ）およびクロロギ酸イソブチル（４８２μｌ；３．７２μｍｏｌ；１．０ｅｑ）を媒体に添加する。５分後、Ｂｉｏｔ−ＥＧ４−ＣＯＯＨ（３）（１．８３１ｇ；３．７２ｍｍｏｌ；１．０ｅｑ、ＱｕａｎｔａＢｉｏ  ｄｅｓｉｇｎ、Ｐｏｗｅｌｌ  ＵＳＡ、参照番号：１０１９９）を粉末形態で添加する。反応の収率を増加させるために、試薬の連続添加を、以下の表１に要約するように経時的に添加する。
2014504282.tif 000009
【００６１】
第１段階で、栗茶色粉末を得るために、反応媒体をアセトン中で５回およびエーテル中で２回粉砕する。第２段階で、得られた粉末を、直径４ｃｍおよび高さ１１ｃｍの逆相クロマトグラフィーカラム（Ｍｅｒｃｋ  ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ  ＲＰ−１８シリカ（４０〜６３μｍ）参照番号：１．１３９００．１０００）上に沈着させる。生成物を混合液、水／ＤＭＦ：５０／５０で溶出する。最終段階で、目的の溶出液を蒸発させ、エチルエーテル中で粉砕する。
得られる質量＝４４７ｍｇ、すなわち、１８％の収率。
Ｍ＋Ｈ：６５２．３ｇ．ｍｏｌ−１
NMR 1H(200MHz, DMSO): 1.1〜1.8(m, 6H, 7-8-9); 2.07(t, 2H, 10); 2.5〜3(m, 7H, 5-6-11-20); 3〜3.6(m, 16H, 12〜19); 4.1および4.3(M, 2H, 3-4); 6.4および6.4(s, 2H, 1-2); 7.1(d, 1H, 24); 7.8(dd, 1H, 23); 8.3(sd, 1H, 22); 10.2(s, 1H, 21); 11.7(s, 1H, 25)
【００６２】
実施例１．６：１−メチル−５−ビオチン−ヘキシルエチレングリコール−イサト酸無水物（１１）の合成
2014504282.tif 000010
生成物６（２００ｍｇ；３０７μｍｏｌ；１．０ｅｑ）をＤＭＦ（３．０５ｍＬ）に溶解し、これに炭酸カリウム（８９．１ｍｇ；６４４μｍｏｌ；２．１ｅｑ）を添加する。ヨウ化メチル（２５μｌ；４００μｍｏｌ；１．３ｅｑ）を添加する前に、不均一媒体を周囲温度で５分間撹拌する。９０分の撹拌後、反応物を濾紙に濾過し、次いで、ＤＭＦ５００μｌに可溶化する前に、乾燥するまで濾液を蒸発させる。溶液を、直径２ｃｍおよび高さ１０ｃｍの逆相クロマトグラフィーカラム上に沈着させる。生成物をＡＣＮ：１００％で溶出する。分画を乾燥するまで蒸発させ、次いで、得られた固体をエチルエーテル中で粉砕する。
得られる質量＝２４０．４ｍｇ、すなわち、１００％の収率。
Ｍ＋Ｈ：６６６．３ｇ．ｍｏｌ−１
NMR 1H(200MHz, DMSO): 1.1〜1.7(m, 6H, 7-8-9); 2.05(t, 2H, 10); 2.5〜3(m, 7H, 5-6-11-20); 3〜3.7(m, 16H, 12〜19); 3.9(M, 3H, 25); 4.1および4.3(M, 2H, 3-4); 6.38および6.44(s, 2H, 1-2); 7.4(d, 1H, 24); 7.9(dd, 1H, 23); 8.4(sd, 1H, 22); 10.2(s, 1H, 21)
【００６３】
実施例１．７：５−Ｃｙ３イサト酸無水物（７）の合成
2014504282.tif 000011
アルゴン下０℃（氷浴）の１０ｍＬ丸底フラスコ中で、Ｃｙ３−ＣＯＯＨ  ４  ２４９ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ；１ｅｑ）を、ＤＭＦ３ｍＬ溶液に入れる。次いで、Ｎ−メチルモルホリン８７μＬ（０．７９４ｍｍｏｌ；１ｅｑ）ならびにクロロギ酸イソブチル１０４μＬ（０．７９８ｍｍｏｌ；１ｅｑ）を添加し、反応を撹拌下０℃で放置する。１５分後、５−アミノイサト酸無水物２１３．１ｍｇ（１．１９６ｍｍｏｌ；１．５ｅｑ）を添加し、反応媒体を周囲温度での撹拌下で放置する。ＬＣ−ＭＳモニタリング（条件１）は、反応が瞬間的であることを示している。２０分の反応後、１ｅｑのＮ−メチルモルホリン／クロロギ酸イソブチルを添加し、５−アミノイサト酸無水物の全体をカルバミン酸エステルに転換するために、反応を撹拌下で１０分間放置する。次いで、反応媒体を蒸発させ、エチルエーテルに溶解し、焼結ガラスに濾過し、カルバミン酸エステルに転換した過剰のイサト酸無水物を除去するために最後にアセトン１５ｍＬで３回洗浄する。次いで、こうして得られたピンク色固体を溶出液勾配（Ｈ２Ｏ／ＤＭＦ  ７５：２５、次いでＨ２Ｏ、次いでＨ２Ｏ／ＤＭＦ  ５０：５０）を用いてＣ１８シリカゲルカラムで精製し、次いで、残渣ＤＭＦを除去するために真空下で乾燥させる。最終生成物は、５０％の収率（３３９ｍｇ；０．４ｍｍｏｌ）でピンク色粉末の形態で得られる。
Ｍ＋Ｈ＝７９１．９ｇ．ｍｏｌ−１、ＴＬＣ：（Ｈ２Ｏ／ＤＭＦ  ８／２；ＵＶ展開）  Ｒｆ＝０．５
ＬＣ／ＭＳ：条件１：ＲＴ＝７．４分；最大吸収λ＝２６６．４；５１８．４および５５２．５ｎｍ；［Ｍ＋Ｈ］＋：７９１．５。
1H NMR(500MHz, DMSO-d6): δ 1.31(t, 3H, β'-CH3, Jβ'-CH3-α'-CH2=7Hz); 1.44(m, 2H, γ-CH2); 1.66(m, 2H, δ-CH2); 1.70(s, 12H, 2×C(CH3)2); 1.77(m, 2H, β-CH2); 2.32(t, 2H, ε-CH2, Jε-CH2-δ-CH2=7Hz); 3.98(m, 2H,); 4.15(m, 4H, α-CH2およびα'-CH2); 6.52(2d, 2H, ビニルα-CHおよびビニルα'-CH, Jα-CH-β-CH=Jα'-CH-β-CH=13.5Hz); 7.10(d, 1H, ArH IA, J=8.5Hz); 7.40(dd, 2H, H7およびH7', JH7-H4=4.5Hz, JH7-H6=8.5Hz); 7.68(m, 2H, H6およびH6'); 7.76(dd, 1H, ArH IA, J=2Hz, J=8.5Hz); 7.81(dd, 2H, H4およびH4', JH4-H6=1Hz, JH4-H7=5Hz); 8.29(d, 1H, ArH IA, J=2Hz); 8.35(t, 1H, ビニルβ-CH, Jβ-CH-α-CH=J β-CH-α'-CH=13.5Hz), 11.64(s, 1H, ArSO3H)。
【００６４】
実施例１．８：１−メチル５−Ｃｙ３−イサト酸無水物（１３）の合成
2014504282.tif 000012
２５ｍＬ丸底フラスコ中で、コンジュゲートＣｙ３−ＩＡ  ７  ５００ｍｇ（０．６３ｍｍｏｌ；１ｅｑ）をＤＭＦ２．６ｍＬ溶液に入れる。次いで、Ｋ２ＣＯ３１７５ｍｇ（１．２６ｍｍｏｌ；２ｅｑ）ならびにヨードメタン１９８μＬ（３．１６ｍｍｏｌ；５ｅｑ）を添加し、反応を周囲温度での撹拌下で放置する。ＬＣ−ＭＳモニタリングは、出発生成物が１時間後には完全に消費されていることを示している。１時間の反応後、乾燥するまで反応媒体を蒸発させ、次いで、溶出液勾配（２−プロパノール／ＤＭＦ  ９５：５、次いで２−プロパノール／ＤＭＦ  ５０：５０）を用いてＣ１８シリカゲルカラムで精製し、次いで、残渣ＤＭＦを除去するために真空下で乾燥させる。（生成物は２−プロパノール／ＤＭＦ  ９５：５混合物に可溶性ではないので、ＤＭＦ中で固体沈着物が調製される）。最終生成物は、９５％の収率（５０５ｍｇ；０．６ｍｍｏｌ）でピンク色粉末の形態で得られる。イオンクロマトグラフィー分析は、生成物が一カリウム塩の形態で得られることを示した。
Ｍ＋Ｈ＝８４３ｇ．ｍｏｌ−１、ＴＬＣ：（Ｈ２Ｏ／ＤＭＦ  ８／２；ＵＶ展開）  Ｒｆ＝０．１
ＬＣ／ＭＳ：条件１：ＲＴ＝７．８分；最大吸収λ＝２６７．６；５１８．４および５５１．２ｎｍ；［Ｍ＋Ｈ］＋：８０５．６。
1H NMR(500MHz, DMSO-d6): δ 1.31(t, 3H, β'-CH3, Jβ'-CH3-α'-CH2=7Hz); 1.44(m, 2H, γ-CH2); 1.68-1.71(m, 14H, δ-CH2+2×C(CH3)2); 1.79(m, 2H, β-CH2); 2.34(t, 2H, ε-CH2, Jε-CH2-δ-CH2=7Hz); 3.45(s, 3H, NCH3); 4.16(m, 2H, α-CH2およびα'-CH2); 6.66(2d, 2H, ビニルα-CHおよびビニルα'-CH, Jα-CH-β-CH=Jα'-CH-β-CH=13.5Hz); 7.42(m, 3H, ArH IA+H7およびH7'); 7.68(m, 2H, H6およびH6'); 7.76(m, 3H, ArH IA+H4およびH4'); 8.36(m, 2H, ArH IA+ビニルβ-CH)。
【００６５】
実施例１．９：３−（２−（２−（３−ビオチン−ｄＰＥＧ３−プロパンアミド）エチル）ジスルファニル）プロパン酸（２２）の合成
2014504282.tif 000013
ＮＨＳ−Ｓ−Ｓ−ｄＰＥＧ４−ビオチン（１．３９０ｇ；１．８４９ｍｍｏｌ；Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ、Ｐｏｗｅｌｌ、ＵＳＡ、参照番号：１０１９４）をＤＭＦ（５２ｍＭ）１７．５６ｍＬ溶液に入れ、１００ｍＬ丸底フラスコに導入する。水１７．５６ｍＬを添加し、媒体を冷媒下７５℃に置く。
この温度で４時間後、ＬＣ−ＭＳモニタリングは、ＮＨＳ−Ｓ−Ｓ−ｄＰＥＧ４−ビオチンが完全に加水分解されたことを示す。
乾燥するまで蒸発後、粘着性の黄色がかった油が得られ、これを残っている水を除去するためにＡＣＮ／ＤＭＦ混合液：５ｍＬ／３ｍＬと３回同時蒸発させ、次いで、これを乾燥させて残渣ＤＭＦを除去するためにエーテルと共に３回粉砕する。
【００６６】
生成物をジクロロメタン／メタノール／酢酸混合液：７９／２０／１  ２ｍＬに溶解し、順相クロマトグラフィーカラム（シリカゲル６０、Ｆｌｕｋａ、参照番号：６０７３７）上に沈着させる。同じ混合液を用いて溶出を行う。３−（２−（２−（３−ビオチン−ｄＰＥＧ３−プロパンアミド）エチル）ジスルファニル）プロパン酸を含む分画を集め、これらから残っている酢酸を除去するためにトルエン／ＤＭＦ混合液：１０ｍＬ／５ｍＬと同時蒸発させ、次いで乾燥するまで蒸発させる。
得られる質量：１．０２ｇ、すなわち、８４％の収率。
Ｍ＋Ｈ＝６５５．２ｇ．ｍｏｌ−１
【００６７】
実施例１．１０：５−（３−（２−（２−（ビオチン−ｄＰＥＧ３−プロパンアミド）エチル）ジスルファニル）プロパンアミド）イサト酸無水物（２３）の合成
2014504282.tif 000014
３−（２−（２−（ビオチン−ｄＰＥＧ３−プロパンアミド）エチル）ジスルファニル）プロパン酸  ２２（４８６ｍｇ；０．７４１ｍｍｏｌ；１．０ｅｑ）をＤＭＦ  ７．４２ｍＬ（１００ｍＭ溶液）に溶解し、アルゴン下に置かれている２５ｍＬ二口丸底フラスコに導入する。丸底フラスコを氷浴中で０℃に冷却し、次いで、Ｎ−メチルモルホリン（１０６μＬ；０．９６５ｍｍｏｌ；１．３ｅｑ）およびクロロギ酸イソブチル（１２６μＬ；０．９６５ｍｍｏｌ；１．３ｅｑ）を媒体に添加する。０℃での撹拌下で１５分後、２００ｍＭ  ＤＭＦ溶液（４．８２ｍＬ）中５−アミノイサト酸無水物  １（１７２ｍｇ；０．９６５ｍｍｏｌ；１．３ｅｑ）を周囲温度で導入する。
【００６８】
周囲温度で１時間後、丸底フラスコを氷浴に戻し、Ｎ−メチルモルホリン（１０６μＬ；０．９６５ｍｍｏｌ；１．３ｅｑ）およびクロロギ酸イソブチル（１２６μＬ；０．９６５ｍｍｏｌ；１．３ｅｑ）の第２の添加を行う。０℃で１５分後、氷浴を除去し、ＤＭＦ（８６ｍｇ；０．４８２ｍｍｏｌ；０．６５ｅｑ）中２００ｍＭ  ５−アミノイサト酸無水物ストック溶液２．４１ｍＬを添加する。
【００６９】
周囲温度での撹拌下さらに２０分後、丸底フラスコを氷浴に戻し、Ｎ−メチルモルホリン（１０６μＬ；０．９６５ｍｍｏｌ；１．３ｅｑ）およびクロロギ酸イソブチル（１２６μＬ；０．９６５ｍｍｏｌ；１．３ｅｑ）の最後の添加を行う。０℃で１５分後、氷浴を除去し、反応をさらに３０分間撹拌下で放置する。
【００７０】
１スパーテルの逆相シリカ（ＲＰ１８シリカ／４０〜６３μｍ、Ｍｅｒｃｋ  ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ）の添加後、乾燥するまで媒体を蒸発させ、次いで、極めて乾燥した栗茶色粉末が得られるまでアセトニトリル／ＤＭＦ混合液：５０／５０と３回同時蒸発させる。
次いで、固体を、直径２．５ｃｍおよび高さ１５ｃｍの逆相クロマトグラフィーカラム（ＲＰ１８シリカ／４０〜６３μｍ、Ｍｅｒｃｋ  ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ）上に沈着させ、以下の連続混合液：ＤＭＦ／水：５０／５０、次いでＤＭＦ／水：６０／４０、次いで、ＤＭＦ／水：７５／２５、最後にＤＭＦ／水：８０／２０で溶出する。
【００７１】
最後に、媒体を乾燥するまで蒸発させ、アセトニトリル７ｍＬと３回同時蒸発させる。生成物は、オレンジ色結晶の形態で現れる。
得られる質量：２２０ｍｇ、すなわち、３６％の収率。
Ｍ＋Ｈ＝８１５．３ｇ．ｍｏｌ−１
NMR 1H(200MHz, DMSO): 1.0〜1.75(m, 7H, 11-11-12+1H帰属不明); 2.08(t, 2H, 13); 2.32(t, 2H, 30); 2.75〜2.85(m, 4H, DMSO+38); 2.86(s, 8H, DMF); 2.82〜2.98(m, 9H, 6-8-17+2H非分割); 3.02〜3.44(m, 11H, 非分割クラスター); 3.45〜3.55(m, 12H, 20-21-23-24-26-27、すなわち、PEG鎖); 3.55〜3.65(m, 4H, 18-29); 4.22(2m, 2H, 3-4); 6.43(2s, 2H, 1-5); 8.0(m, 3H, 32-15+1H非分割)。
【００７２】
実施例１．１１：Ｎ−メチル５−（３−（２−（２−（ビオチン−ｄＰＥＧ３−プロパンアミド）エチル）ジスルファニル）プロパンアミド）イサト酸無水物（２４）の合成
2014504282.tif 000015
５−（３−（２−（２−（ビオチン−ｄＰＥＧ３−プロパンアミド）エチル）ジスルファニル）プロパンアミド）イサト酸無水物  ２３（５０ｍｇ；０．０６１ｍｍｏｌ；１．０ｅｑ；ＤＭＦ中２４．２ｍＭ溶液２．４９ｍＬ）を氷浴中撹拌下で２５ｍＬ丸底フラスコに入れる。ＤＭＦ中懸濁した炭酸カリウム（９．３ｍｇ；０．０６７ｍｍｏｌ；１．１ｅｑ）を直ちに添加し、媒体を０℃で、５分間撹拌下で放置する。
次いで、ヨードメタン（１５．２μＬ；０．２４４ｍｍｏｌ；４．０ｅｑ）を媒体に導入し、反応を０℃で、４５分間撹拌下で放置する。
得られた生成物から残っている炭酸カリウムを除去するために、これを直径１ｃｍおよび高さ１０ｃｍの逆相クロマトグラフィーカラム（ＲＰ１８シリカ／４０〜６３μｍ、Ｍｅｒｃｋ  ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ）上に沈着させ、１００％アセトニトリルで溶出する。
乾燥するまで媒体を蒸発させた後、生成物をエーテル５ｍＬと共に４回粉砕する。生成物は、黄色薄片の形態で現れる。
得られる質量：５５．７ｍｇ（過剰な質量は最終生成物中に捕捉されたＤＭＦの存在のためである）。
Ｍ＋Ｈ：８２９．３ｇ．ｍｏｌ−１
NMR 1H(200MHz, DMSO): 1.2〜1.75(m, 6H, 23-24-25); 2.085(t, 2H, 26); 2.338(t, 2H, 43); 2.5〜2.7(m, 2H, 51); 2.75〜2.95(m, 24H, 55-19-47-50+16H帰属不明-おそらくはDMFに由る); 3.05〜3.30(m, 6H, 19および5H帰属不明); 3.3〜3.7(m, 41H, 21-46および30-31-33-34-36-37-39-40-42(PEG鎖)+20H帰属不明(おそらくは残存水に由る)); 4.150および4.319(m, 2H, 16-17); 6.418(d, 2H, 14-18); 7.477(d, 1H, 11); 7.887(t, 1H, 45); 7.976(m, 3H, 13+2H帰属不明(おそらくはDMFに由る)); 8.091(t, 1H, 28); 8.363(d, 1H, 12); 10.389(s, 1H, 9)。
ＮＢ：この分子について予測される５８個の代わりに、合計９５個のプロトンが検出される。余分なプロトンは、３つの主な集団を形成し、それぞれ水およびＤＭＦに相当する。
【００７３】
（実施例２）イサト酸無水物の環内窒素が有する目的の基とコンジュゲートしたイサト酸無水物の誘導体の合成
この実施例は、芳香環上にないように思われる別のイサト酸無水物官能化部位の評価を説明する。この目的のため、本発明者らは、前記イサト酸無水物の環内ＮＨのアルキル化反応を用いて、その中に目的の分子をコンジュゲートさせることを選択した。したがって、この位置は、図４に記載するように、ビオチンのハロゲン誘導体などの、目的の化合物の求電子誘導体によりアルキル化することができる。
ヨードアセチル−ＬＣ−ビオチン  １７またはビオチン化化合物  ２０を、Ｋ２ＣＯ３またはＤＩＰＥＡの存在下でイサト酸無水物  １と反応させて、−ＮＨ−のアルキル化により、ビオチン化化合物１８または２１を形成する。
この方法は、未置換イサト酸無水物に限定されず、実際、芳香環を適当に置換することにより、イサト酸無水物部分の求核試薬（例えば、２’ＯＨヒドロキシルなど）との反応性を調節することが可能である。Ｗｅｅｋｓ  ２００８  ＪＡＣＳ  ８８８４頁の参考文献は、ＮＯ２の誘引効果のために、ニトロＩＡ  ＭｅがＩＡ  Ｍｅより約４０倍大きい反応性を有することを記載している。したがって、当業者は、イサト酸無水物の反応性を増加または低下させるために用いるべき置換基を極めて正確に発想する。
芳香族部分の置換のイサト酸無水物の反応性への影響を説明するために、この実施例は、ヨードアセチル−ＰＥＧ２−ビオチン（１７）と５−アセトアミドＩＡ（１６）（５−アミノＩＡ  １５のアセチル化により合成される）の反応によるＮ（Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ２）アセトアミドＩＡ（１９）化合物の合成を記載している。
目的の分子とカップリングしたイサト酸無水物を、適当に官能化したアントラニル酸を構成し、次いで、イサト酸無水物を当量のホスゲンで閉環することにより合成することも可能であることに留意すべきである。
【００７４】
実施例２．１：１−ビオチン−エチレングリコール−イサト酸無水物（１８）の合成
2014504282.tif 000016
イサト酸無水物  １５（４５．１ｍｇ；２７６．６μｍｏｌ；３．０ｅｑ）をＤＭＦ（４６０μｌ；６００ｍＭ）に溶解する。炭酸カリウム（３８．２ｍｇ；２７６．６μｍｏｌ；３．０ｅｑ）をこの混合液に懸濁させる。１０００ｒｐｍのボルテックスで５分の撹拌後、ＤＭＦ（７３０μｌ；１２６ｍＭ；１．３ｅｑ）中溶液のヨードアセチル−ＰＥＧ２−ビオチン  １７（５０ｍｇ；９２．２μｍｏｌ；１．０ｅｑ、Ｐｉｅｒｃｅ−Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｈａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）を供給する前に、装置を４℃のコールドチャンバーに入れる。９０分後、ヨードアセチル−ＰＥＧ２−ビオチンは消失し、反応が終結した。管を遠心分離し、上清を回収する。沈渣をＤＭＦ  ２００μＬで２回洗浄する。上清を集め、溶媒を乾燥するまで蒸発させる前に１スパーテルのＲＰ１８シリカを添加する。得られた粉末を、直径１ｃｍおよび高さ１０ｃｍのカラムで逆相クロマトグラフィーにより精製する。溶出液は水／ＡＣＮ／ＤＭＦ混合液：７９／２０／１とする。
得られる質量＝１１．８ｍｇ、すなわち、２２％の収率（約６０％の純度）
Ｍ＋Ｈ：５７８．２ｇ．ｍｏｌ−１
【００７５】
実施例２．２：５−アセトアミド−イサト酸無水物（１６）の合成
2014504282.tif 000017
５−アミノ−イサト酸無水物（７４０ｍｇ；４．１５ｍｍｏｌ；１．０ｅｑ）をＤＭＦ（２１ｍｌ；２００ｍＭ）に溶解し、無水酢酸（３９５μｌ；４．１５ｍｍｏｌ；１．０ｅｑ）を添加する前に２分間撹拌する。３時間４０分後、反応を終結させる。形成した生成物を水２１０ｍｌ中に沈殿させ、次いで、空隙率３の焼結ガラスでスピンドライする。次いで、得られた残渣をオーブンで乾燥する。得られる質量＝７５３ｍｇ、すなわち、８２．４％の収率。
Ｍ＋Ｈ：２２１．０ｇ．ｍｏｌ−１
【００７６】
実施例２．３：１−ビオチン−ジエチレングリコール−５−アセトアミド−イサト酸無水物（１９）の合成
2014504282.tif 000018
５−アセトアミド−イサト酸無水物（４９．５ｍｇ；２２４．８μｍｏｌ；２．５ｅｑ）を８ｍｌフラスコ中で秤量し、これに炭酸カリウム（８２．１ｍｇ；５９４μｍｏｌ；６．６ｅｑ）を添加する。ＤＭＦ（２．６５ｍｌ；１００ｍＭ）をこの混合物に添加する。媒体を２分間撹拌し、次いで−２５℃に置く。並行して、ヨードアセチル−ＰＥＧ２−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ−Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｈａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）（４８．６ｍｇ；８９．６μｍｏｌ；１．０ｅｑ）の溶液をＤＭＦ（８９５μｌ）で調製する。ヨードアセチル−ＰＥＧ２−ビオチン溶液を反応媒体中に添加し、４℃のコールドチャンバー中、８００ｒｐｍで、１６時間ボルテックスで撹拌する。反応媒体を紙に濾過し、濾液を固体沈着物と共に逆相クロマトグラフィーにより精製する。カラムは、直径１ｃｍおよび高さ１０ｃｍを有する。溶出液は水／ＡＣＮ混合液：８０／２０とする。
得られる質量＝１５ｍｇ、すなわち、１０．５％の収率（５０％未満の純度）
Ｍ＋Ｈ：６３５．２ｇ．ｍｏｌ−１
【００７７】
実施例２．４：Ｎ−（ビオチン−ｄＰＥＧ３−プロピル）−６−ブロモヘキサンアミド（２０）の合成
2014504282.tif 000019
５０ｍＬ丸底フラスコ中、６−ブロモカプロン酸３１７ｍｇ（１．６２４ｍｍｏｌ；１．３ｅｑ）をＤＭＦ  ５ｍＬと連続して２回同時蒸発させる。６−ブロモカプロン酸をＤＭＦ（８１．２ｍＭ）２０ｍＬに溶解し、アルゴン下１００ｍＬ二口丸底フラスコ中に移す。次いで、氷浴中で０℃に冷却した後、Ｎ−メチルモルホリン（３１６μｌ；２．８７３ｍｍｏｌ；２．３ｅｑ）およびクロロギ酸イソブチル（２１２μｌ；１．６２４ｍｍｏｌ；１．３ｅｑ）を媒体に添加する。撹拌下０℃で５分後、ビオチン−ｄＰＥＧ３−ＮＨ３＋−ＴＦＡ−（０．７ｇ；１．２４９ｍｍｏｌ；１．０ｅｑ、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ、Ｐｏｗｅｌｌ、ＵＳＡ、参照番号：１０１９３）のＤＭＦ（２００ｍＭ）６．２３５ｍＬ中溶液を周囲温度で媒体に添加する。撹拌下で３０分後、丸底フラスコの内容物を乾燥するまで蒸発させ、アセトニトリル１０ｍＬと２回同時蒸発させる。次いで、ジクロロメタン３０ｍＬに溶解した黄色がかった極めて粘着性の油１．３３２ｇが得られる。残渣ビオチン−ｄＰＥＧ３−ＮＨ３＋−ＴＦＡ−を除去するために、有機相を１０ｍＭ  ＨＣｌ  ２０ｍＬで２回洗浄し、次いで、飽和ＮａＨＣＯ３溶液２０ｍＬで２回、最後にＮａＣｌ（食塩水）２０ｍＬで２回洗浄する。ジクロロメタンの蒸発後、固体４３４ｍｇが得られ、これをジクロロメタン３ｍＬに溶解し、直径３ｃｍおよび高さ１５ｃｍの順相クロマトグラフィーカラム（シリカゲル６０、Ｆｌｕｋａ、参照番号：６０７３７、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）上に沈着させる。生成物を５ｃｍ／分の速度でジクロロメタン／メタノール混合液：８０／２０で溶出し、これにより、反応中に形成される３種の共生成物（ｃｏｐｒｏｄｕｃｔ）のうちの１種を取り除くことが可能になる。乾燥するまで蒸発後、黄色がかった極めて粘着性の油３０６ｍｇが得られる。これを白色粉末が得られるまで３回エーテルと共に粉砕する。
得られる質量：１２０ｍｇ、すなわち、１５％の収率。
Ｍ＋Ｈ：６２３．３ｇ．ｍｏｌ−１
NMR 1H分析(200MHz, DMSO): 1.25〜1.9(m, 18H, 10-11-12-32-33-34-35-17-27); 2.07(t, 4H, 13-32); 3.0〜3.2(m, 5H, 8-16-28); 3.25〜3.60(m, 14H, 18-20-21-23-24-26-36); 4.1〜4.4(m, 2H, 3-4); 6.4(2s, 2H, 2-5); 7.8(m, 2H, 15-29)。
【００７８】
実施例２．５：Ｎ−（Ｎ−（ビオチン−ｄＰＥＧ３−プロピル）−６−ブロモヘキサンアミド）イサト酸無水物（２１）の合成
2014504282.tif 000020
Ｎ−（ビオチン−ｄＰＥＧ３−プロピル）−６−ブロモヘキサンアミド（（２０）；２８０ｍｇ；０．４４９ｍｍｏｌ；１．０ｅｑ）およびイサト酸無水物（（１５）；１１０ｍｇ；０．６７４ｍｍｏｌ；１．５ｅｑ）をＤＭＦと２回同時蒸発させ、ＤＭＦ  ２ｍＬに溶解する。２種の試薬を２５ｍＬ丸底フラスコに導入し、媒体を乾燥するまで蒸発させる。
【００７９】
丸底フラスコを冷媒下に置き、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン（７６８μＬ；５．４６７ｍｍｏｌ；１２．２ｅｑ）を添加する前に１２０℃に加熱する。媒体は急速に明るい黄色になる。１２０℃で４５分後、塩基性媒体中で有利なイサト酸無水物の開環を防ぐために、媒体のｐＨを、０．０１５Ｎ  ＨＣｌの連続添加により９から５〜６の間の値にもっていく。次いで、生成物を直径１．５ｃｍおよび高さ１５ｃｍの逆相カラム（ＲＰ１８シリカ／４０〜６３μｍ、Ｍｅｒｃｋ  ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ）上に沈着させる。以下の混合液：ＡＣＮ／水：１０／９０、次いでＡＣＮ／水：２５／７５、最後にＡＣＮ／水：５０／５０で溶出を行う。
得られる質量：３７ｍｇ、すなわち、１１．６％の収率。
Ｍ＋Ｈ：７０６．３ｇ．ｍｏｌ−１
【００８０】
（実施例３）シアニン３とコンジュゲートしたイサト酸無水物誘導体（Ｃｙ３  ＩＡ  Ｍｅ、１３）の２７個の塩基を有するモデルオリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）との反応性の実証  アシル化の位置特異性および官能化率の測定
本発明者らは、イサト酸無水物誘導体のＲＮＡとの反応性を評価し、そのため、２７個の塩基を有するモデルＯＲＮ（配列：５’−ＡＡＣ−ＣＧＣ−ＡＧＵ−ＧＡＣ−ＡＣＣ−ＣＵＣ−ＡＵＣ−ＡＵＵ−ＡＣＡ−３’  Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、Ｌｉｅｇｅ、ベルギー）の選択的官能化を示す。この目的のため、一定量のＯＲＮを、種々の温度条件、持続条件、反応媒体条件等の下で、目的の分子とコンジュゲートしたイサト酸無水物誘導体（Ｃｙ３  ＩＡ  Ｍｅ（１３））と反応させる。２６０ｎｍでの反応のＨＰＬＣモニタリングにより、初期ＯＲＮに相当するピークの消失およびアシル化ＯＲＮに相当するピークの出現を検出することが可能になる。これらの生成物は、より長い保持時間を有し、ＯＲＮのものと蛍光標識のものの両者に相当する吸収スペクトルを有する。
そのため、これらのピークの出現自体がＯＲＮの官能化の実証となる。しかしながら、官能化部位についてのより高い精度および官能化率（Ｆｒ）を正確に評価するために、ＯＲＮ集団（標識されたものおよび標識されていないもの）をアセトン／過塩素酸リチウムを用いた沈殿により、またはゲル浸透（ＮＡＰ  ５（商標）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ）により過剰の標識から分離する。次いで、こうして得られたＯＲＮを、ＯＲＮのリン酸ジエステル結合を加水分解するために、ヌクレアーゼＰ１（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）およびアルカリホスファターゼ（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）による加水分解に供する。
【００８１】
この混合物のＬＣ−ＭＳ分析（質量分析計に結合したクロマトグラフィー鎖）により、図５に記載するようないくつかの集団を特徴付けそれを同定することが可能になる：
−  標識されていないリボヌクレオシド
−  より長い保持時間ならびに核酸および標識のＵＶスペクトル特性により極めて明確に異なる標識モノヌクレオシド付加物（例えば、Ｃｙ３の場合）
−  ２’で目的の基により置換されたアントラニル酸基のために、ヌクレアーゼＰ１により切断することができない２’でアシル化されたジヌクレオチド。多量の基が２’に導入されている場合のリン酸ジエステル結合のヌクレアーゼに対する抵抗性は当業者に周知である。
−  理論上形成し得るが、統計学的にほとんど十分に見受けられない過アシル化（ｐｅｒａｃｙｌａｔｅｄ）２’ＯＨトリヌクレオチドまたは四ヌクレオチド（その場合、２’ＯＨの２または３連続アシル化があることが必要であるだろうと思われるため）は認められない。
アシル化５’Ｏ誘導体はほとんど十分に見受けられないに過ぎず、Ｓｅｒｖｉｌｌｏ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９３  ５８３〜５８９）により記載されているようには目に見えないことに留意すべきである。
これらの異なる標識ヌクレオシドまたはヌクレオチド付加物の検出により、２’のヒドロキシルおよびＯＲＮの末端（３’位および２’位）上の官能化を示すことが可能になる。
ＯＲＮ官能化率（Ｆｒ）は、
−  ４種のリボヌクレオシドに相当するピークの面積と比較して、
−  末端モノヌクレオシド付加物（２’および３’で官能化されている）に相当する面積ならびにアシル化ジヌクレオシド（２’ＯＨで、内部で官能化されている）に相当する面積
を測定することにより評価する。
アシル化の内部／外部位置特異性を、ＨＰＬＣにより容易に検出可能な
−  ２’および３’でアシル化された末端モノヌクレオチド
−  ならびに２’ＯＨで、内部でアシル化されたジヌクレオチド
に相当する面積の相対割合を測定することにより評価する。
【００８２】
ＯＲＮ官能化率およびアシル化の外部／内部位置特異性の測定を、図６に記載する（グラフＡ：２７個の塩基を有する天然ＯＲＮ。グラフＢ：化合物１３で官能化し沈殿させたＯＲＮ。グラフＣ：前記化合物１３で官能化し、沈殿させ、酵素的に加水分解したＯＲＮ。グラフＤ：ヌクレオシド付加物または官能化ヌクレオチドの検討でのグラフＣの拡大（ピーク１はそれぞれアシル化ジヌクレオチド（４２％）に相当し、ピーク２および３は２’または３’でアシル化されたヌクレオシド（５８％）に相当し、ピーク４は２’および３’でアシル化されたヌクレオシドに相当する。＊はアントラニル酸Ｃｙ３−ＮＭｅの分子で官能化されたジヌクレオチドまたはヌクレオシドを表す。ピーク１、２、３および４全体により、官能化率を測定することが可能になる）。
【００８３】
動作モード：標準的実験では、２７個の塩基を有するＯＲＮ（５’−ＡＡＣ−ＣＧＣ−ＡＧＵ−ＧＡＣ−ＡＣＣ−ＣＵＣ−ＡＵＣ−ＡＵＵ−ＡＣＡ−３’（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、Ｌｉｅｇｅ、ベルギー）８ｎｍｏｌの当量の水溶液を前もって２ｍＬプラスチックエッペンチューブ中で遠心エバポレーター（ＲＣＴ６０、Ｊｏｕａｎ、Ｓｔ  Ｈｅｒｂｌａｉｎ、フランス）で乾燥する。次いで、ＯＲＮを可溶化するために水４０μＬを乾燥残渣に添加し、次いで、緩衝溶液（例では、トリエチルアンモニウムアセタート緩衝液、ｐＨ７、１Ｍ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ  参照番号：０９７４８−１００ｍｌ）２０μＬ、最後に目的の基で官能化したイサト酸無水物誘導体のＤＭＳＯ中１２０ｍＭ溶液（すなわち、この実施例では分子Ｃｙ３  ＩＡ  Ｍｅ（１３））２０μＬを添加する。混合物を事前に温度を釣り合わせたラック上のオーブン中で、６５℃で６０分間インキュベートする。ＨＰＬＣ注入（条件３）により、図６に記載するように特定の量のアシル化ＯＲＮの形成を監視することが可能になる。次いで、塩および過剰な標識を除去するために、混合物をＳｅｐｈａｄｅｘ  ＮＡＰ  ５ゲル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）で精製し、かつ／または１８０ｍＭアセトン／ＬｉＣｌＯ４  ７５／２５混合液１．２ｍＬ中に３回沈殿させる。最後に、沈渣をアセトンで乾燥させ、遠心エバポレーター（ＲＣＴ６０、Ｊｏｕａｎ、Ｓｔ  Ｈｅｒｂｌａｉｎ、フランス）で蒸発させる。次いで、残渣をＨ２Ｏ／ＤＭＳＯ  ８５／１５溶液３３μＬに溶解し、標識の適切な除去を確認するためにＨＰＬＣ注入（条件３）を行う。その緩衝液：２０ｍＭ酢酸ナトリウム  ｐＨ５．５中１Ｕ／μｌ溶液のヌクレアーゼＰ１  ２μＬ（参照番号：Ｎ８６３０  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）；１ｍＭ  ＺｎＣｌ２；５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび水中７ｕ／μｌアルカリホスファターゼ（参照番号Ｐ７９２３−２ＫＵ  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）１μＬを混合物に添加する。媒体を周囲温度で４〜６時間放置する。次いで、ＯＲＮの完全な加水分解を確認するためならびに上記のことにしたがっておよび図６に記載のように得られる断片の性質を分析するために、これをＨＰＬＣ（条件３）に注入する。
【００８４】
１−  結果：この実施例のクロマトグラム特性のＬＣ−ＭＳ分析により、以下に列挙する異なる種類の生成物を同定することが可能になる（ＨＰＬＣ条件３）：質量分析およびそのＵＶプロファイルにより容易に同定可能な、アシル化されていないリボヌクレオシドシトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）およびアデニン（Ａ）（１．５〜５分のＲｔ）。その存在は、ＯＲＮをヌクレオシドの全てをアシル化するわけではない制御されたアシル化に供するに過ぎないという事実により説明される。そのため、ヌクレアーゼＰ１はアシル化されていないヌクレオシド間の結合を切断することができる。
【００８５】
２−  ヌクレアーゼＰ１の作用に対して非感受性であり、より長い保持時間（１１．８〜１２．５分のＲｔ）を有する２’でアシル化されたジヌクレオチド。これらは、質量分析により、ならびにアントラニル酸、ヌクレオシドおよびＣｙ３の吸収バンド特性のおかげで（それぞれ２６０、３６０および５５０ｎｍ）ＵＶにより同定することができる。モデルとして作用するＯＲＮ配列が以下：５’−ＡＡＣ−ＣＧＣ−ＡＧＵ−ＧＡＣ−ＡＣＣ−ＣＵＣ−ＡＵＣ−ＡＵＵ−ＡＣＡ−３’であるので、ＯＲＮの制御された標識化および加水分解後に、配列に依存する特定の数のみの二量体を得ることができることを理解することが重要である。したがって、ＯＲＮ配列に沿ってずらすことにより、２’−アシル化二量体：５’−ＡＡ、ＡＣ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＣ、ＣＡ、ＡＧ、ＧＵ、ＵＧ、ＧＡ、ＡＣ、ＣＡ、ＡＣ、ＣＣ、ＣＣ、ＣＵ、ＵＣ、ＣＡ、ＡＵ、ＵＣ、ＣＡ、ＡＵ、ＵＵ、ＵＡ、ＡＣおよびＣＡ−３’を検出することが予測可能である。ＧＧ塩基対は配列中に見つけることができないので、これは実際、ＬＣ−ＭＳで見られないだろう。
【００８６】
３−  リン酸ジエステル結合を有さないので、さらにより長い保持時間（１２．７〜１３．８分のＲｔ）を有する、２’、３’または２’と３’の両位置でアシル化されたリボアデニン。これらの付加物は、質量分析により、ならびにヌクレオシド、アントラニル酸およびＣｙ３の吸収バンド特性のおかげで（それぞれ２６０、３６０および５５０ｎｍ）ＵＶにより同定することができる。１種のみの単一の種類の標識ヌクレオシド（ｒＡのみ）が検出されるという事実は、２’−ＯＨ基がイサト酸無水物誘導体によりアシル化される場合にリン酸ジエステル結合が完全に安定であることを示している。実際、これがヌクレアーゼＰ１による加水分解に対して感受性であったならば、オリゴリボヌクレオチド鎖全体のランダムな標識化により、４種の標識ヌクレオシド付加物が形成されただろう。そのため、アシル化ｒＡ付加物の存在は、ＮＰ１による加水分解中に鎖の残りから脱離するＯＲＮの３’末端に位置するヌクレオシド（ｒＡ）の標識化により説明される。
実際、Ｃｙ３に連結したアントラニル酸の質量と共にこれらの断片の全ての質量の質量分析による特定の研究により、図６および７に示すようなその形成を実証することが可能となる。
【００８７】
官能化率は、４種のリボヌクレオシドに相当する集団に対する、アシル化ジヌクレオチドおよびアシル化ヌクレオシドに相当する集団の積分により、２６０ｎｍでＵＶにより評価する。３’末端の官能化の割合を評価するために、アシル化ヌクレオシドの集団に対するアシル化ジヌクレオチドの集団の割合を同様に評価する。
【００８８】
コメント：本発明の枠組みの中で提供される官能化率値は、ヌクレオシドの各々の２６０ｎｍでのモル吸光係数により、およびそれらがヌクレオシドであるかジヌクレオチドであるかにより適用しなければならない補正因子を考慮する。したがって、測定される面積を、
−  アシル化されていないヌクレオシドについてはｒＣ、ｒＵ、ｒＧおよびｒＡの２６０ｎｍでのモルε、
−  アシル化ジヌクレオチドについては、５’ＡＡ、ＡＣ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＣ、ＣＡ、ＡＧ、ＧＵ、ＵＧ、ＧＡ、ＡＣ、ＣＡ、ＡＣ、ＣＣ、ＣＣ、ＣＵ、ＵＣ、ＣＡ、ＡＵ、ＵＣ、ＣＡ、ＡＵ、ＵＵ、ＵＡ、ＡＣおよびＣＡ３’の２６０ｎｍでのモルεの平均値、ならびに
−  アシル化モノヌクレオシドについては、ｒＡの２６０ｎｍでのモルε（表２参照）
にしたがって補正する。
2014504282.tif 000021
【００８９】
考察および結論：４．５％に補正した官能化率およびアシル化の内部／外部位置特異性は、５８／４２で評価される（以降の実施例５の表３の項目７参照）。これは、これらの条件では、１００塩基ごとに平均して約５個のヌクレオシドが標識されること、すなわち、２０塩基ごとに１標識を意味する。これは、優れた検出に十分な標識数と過剰に多数のかさ高い基により影響されないハイブリダイゼーションとの間の折衷を尊重することが推奨されている標識化率と完全に一致する。
同様に、５８／４２の比は、３’末端が２’位よりも３６倍反応性であることを示している（０．５８×１）／（０．４２／２６）。これは、３’末端のより高い反応性を示す文献（Ｎａｗｒｏｔ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９９８  ８１５〜８２９）のデータと一致している。
この実施例により、本発明者らは、イサト酸無水物の蛍光誘導体によるＯＲＮの官能化を示している。
【００９０】
(実施例４)  ＭＡＬＤＩ  Ｔｏｆ質量分析技術を介した、Ｃｙ３  ＩＡ  Ｍｅ（１３）による２７個の塩基を有するＯＲＮの官能化の実証
目的：
本発明者らは、イサト酸無水物誘導体、Ｃｙ３  ＩＡ  Ｍｅ（１３）と反応したＯＲＮがいくつかのＣｙ３−アントラニル酸付加物を有するアシル化ＯＲＮをもたらすことを示す。
動作モード：
実施例３と全く同じプロトコルに従うが、それぞれ２．６および４．２％の補正官能化率を与えるために、ＯＲＮを１５ｍＭまたは３０ｍＭのＣｙ３  ＩＡ  ＭＥ（１３）のいずれかで官能化する。官能化し加水分解していないＯＲＮの一部を、９／１の割合の３−ヒドロキシピコリン酸およびクエン酸二アンモニウムの混合物と混合し、次いで、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析（Ｂｒｕｋｅｒ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）により分析する。スペクトル写真の分析により、それぞれＯＲＮならびにアントラニル酸−Ｃｙ３付加物で１回および２回官能化されたＯＲＮに相当する、８５１９．２１；９２８１．１４および１００４３．０７ダルトンでＭ＋Ｈ付加物を検出することが可能になる（図８）。数字はダルトンで表す。グラフ１は、ＯＲＮ単独の分析に相当し、グラフ２および３はそれぞれ１５および３０ｍＭの化合物１３で官能化された同じＯＲＮに相当する。
結果および結論：
このことは、イサト酸無水物誘導体がＯＲＮに反応すること、および付加物の数は官能化試薬の濃度に依存することの直接的証拠を提供する。ＯＲＮの化学的性質はＲＮＡ鎖と厳密に同じであるので、本発明者らは、本発明の出願の実施例９および１２でさらに示すように、ＲＮＡ鎖が同様に官能化されることを確信することができる。
【００９１】
（実施例５）目的の分子とコンジュゲートした他のイサト酸無水物誘導体の、２７個の塩基を有するモデルオリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）との反応性の実証  官能化率の測定
目的：実施例３に記載の標識化プロトコルにしたがって、目的の分子とコンジュゲートした他のイサト酸無水物誘導体、すなわち、
−  ５Ｂｉｏｔ  ＩＡ  ５、
−  ５Ｂｉｏｔ  ＩＡ  Ｍｅ  ９、
−  ５Ｂｉｏｔ  ＩＡ  ＳＯ３−  １０、
−  ５Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４  ＩＡ  ６、
−  ５Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４  ＩＡ  Ｍｅ  １１、
−  Ｃｙ３  ＩＡ  ７、
−  Ｃｙ３  ＩＡ  Ｍｅ  １３、
−  Ｎ（Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ２）ＩＡ  １８、
−  Ｎ（Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ２）アセトアミドＩＡ  １９、
−  Ｎ（Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４）ＩＡ  ２１、
−  ５Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４  ＳＳ  ＩＡ  ２３、および
−  ５Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４  ＳＳ  ＩＡ  Ｍｅ  ２４、
の、２７個の塩基を有するモデルＯＲＮとの反応性を示すこと。
動作モード：手短に言えば、２７個の塩基を有するＯＲＮ（８ｎｍｏｌ）を、２５０ｍＭ  ＴＥＡＡｃ  ｐＨ７および２５％ＤＭＳＯの混合物の存在下で、化合物５、９、１０、６、１１、７、１３、１８、１９、２１、２３または２４のいずれか１種を含む３０ｍＭ溶液中６５℃で１時間インキュベートする。次いで、標識ＯＲＮを実施例３のように精製および処理する。ここから、異なるイサト酸無水物誘導体による官能化率およびアシル化の外部／内部位置特異性を示す以下の表３が作られる。また、これらの化合物のいくつかの溶解度は、本出願人により出願され、番号ＷＯ−Ａ−２０１０／０１２９４９で公開されている先行する特許出願と同じプロトコルに従って決定した。
2014504282.tif 000022
【００９２】
結果および結論：実施例３の化合物Ｃｙ３ＩＡＭｅ  １３の場合のように、目的の分子と多様にコンジュゲートした他のイサト酸無水物誘導体はＯＲＮと反応して、加水分解後に、アシル化ヌクレオシドまたはジヌクレオチドをもたらすことが示されている。したがって、０．７〜４．５％の間のＦｒというＯＲＮの官能化が示され、これは、思い出さなければならないように、例えば、１００塩基ごとに１〜数標識の間を有することが求められるので、標識化用途に極めて十分である。
イサト酸無水物の環内窒素のメチル化は、ビオチンの場合（項目１および２）ならびにＣｙ３の場合（項目６および７）に官能化収率を二倍にすることが一般的に示されている。他の場合、収率は二倍にならないが、ビオチンＰＥＧ４の場合（項目４および５）には少なくとも改善する。奇妙にも、これは、誘導体５  Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４  ＳＳ  ＩＡおよび５  Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４  ＳＳ  ＩＡ  Ｍｅには当てはまらない。本発明者らは、その反応性に影響を及ぼすように思われるＩＡが有する目的の基の性質によりこれを説明する。
【００９３】
一般的に、またイサト酸無水物誘導体が何でも、標識モノヌクレオシド／標識ジヌクレオチドの比は６０／４０に近いままである（項目１〜１２）ことも示されている。これは、３’末端が内部２’−ＯＨ基よりもかなり反応性であること、およびイサト酸無水物とコンジュゲートした目的の分子は位置特異性を修飾しないことを証明している。３’末端の最大反応性は、シス−ジオール２’，３’の存在に起因する。本発明者らはこの計算でε補正を適用していないので、この比は内部標識化のためにわずかに過大評価されていることに留意すべきである。情報としてまた一般的に、６０／４０の外部／内部アシル化の未補正位置選択性は、ε補正後に７０／３０に等しくなる。
逆に、実施例２に記載されているように、イサト酸無水物の環内−ＮＨ−上の目的の分子のコンジュゲーションは、内部標識化の増加を示すように思われる（項目８、９および１０）。そのため、目的の分子のイサト酸無水物とのコンジュゲーションの部位は、アシル化の位置特異性ならびにその大きさおよび電荷（本特許出願中で伝えていない結果に基づく）に影響を及ぼすように思われるだろう。
【００９４】
（実施例６）目的の基とコンジュゲートしたイサト酸無水物誘導体（５−ｂｉｏｔ  ＩＡ  Ｍｅ  ９、Ｃｙ３  ＩＡ  Ｍｅ  １３または５−Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４  ＳＳ  ＩＡ  Ｍｅ）のＲＮＡ対ＤＮＡ化学選択性の実証
目的：ＲＮＡ対ＤＮＡの官能化の選択性を示すために、イサト酸無水物誘導体５−ｂｉｏｔ  ＩＡ  Ｍｅ  ９、Ｃｙ３  ＩＡ  Ｍｅ  １３または５−Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４  ＳＳ  ＩＡ  Ｍｅ  ２４の１つの作用に供した５３個の塩基を有するＯＤＮと２７個の塩基を有するＯＲＮとの間で比較試験を行った。
動作モード：５３個の塩基を有するＯＤＮ：配列：５’−ＡＡＴ−ＴＣＴ−ＡＡＴ−ＡＣＧ−ＡＣＴ−ＣＡＣ−ＴＡＴ−ＡＧＧ−ＧＴＧ−ＣＴＡ−ＴＧＴ−ＣＡＣ−ＴＴＣ−ＣＣＣ−ＴＴＧ−ＴＴＣ−ＴＣＴ−ＣＡ−３’（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、Ｌｉｅｇｅ、ベルギー）８ｎｍｏｌまたは２７個の塩基を有するＯＲＮ：配列：５’−ＡＡＣ−ＣＧＣ−ＡＧＵ−ＧＡＣ−ＡＣＣ−ＣＵＣ−ＡＵＣ−ＡＵＵ−ＡＣＡ−３’（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、Ｌｉｅｇｅ、ベルギー）８ｎｍｏｌをＤＭＳＯ／ＴＥＡＡｃの２５／７５混合物緩衝液（２５０ｍＭ  ｐＨ７）中３０ｍＭの化合物９または１３または２４と６５℃で１時間反応させる。アセトンによる沈殿ならびにヌクレアーゼＰ１およびアルカリホスファターゼによる加水分解の後、加水分解した断片を実施例３に記載するようにＬＣ−ＭＳにより分析する。ＯＤＮまたはＯＲＮと化合物１３の反応を監視するクロマトグラムの例を図９に示す。ここではグラフＡ、ＢおよびＣはそれぞれ、ＯＲＮ、化合物１３で官能化し沈殿させたＯＲＮ、および１３で官能化し、沈殿させ、加水分解したＯＲＮを表す。グラフＤ、ＥおよびＦは、同じものを表すが、ＯＤＮである。
結果および結論：ＯＲＮの補正官能化率は標識１３で４．５％、標識９で２．６％および標識２４で２．８％で評価する一方で、ＯＤＮの補正官能化率は３つの場合で０．１％で評価する。これらの実験条件では、ＯＤＮはほとんど官能化されておらず、このことはＲＮＡについてのイサト酸無水物誘導体の官能化の選択性および塩基への反応性の欠如を確認している。実際、塩基がイサト酸無水物誘導体に反応したならば、ＯＤＮとの反応後にアントラニル酸ヌクレオシド付加物が形成しただろう。ＯＤＮの０．１％の官能化は、ＤＮＡの５’−ＯＨおよび３’−ＯＨ末端の極めて低い反応性に由来するものであることに留意すべきである（この点に関しては、Ｎａｗｒｏｔ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９９８  ８１５〜８２９参照）。
この実施例は、ＯＤＮに対する、ＯＲＮについての目的の分子とコンジュゲートしたイサト酸無水物誘導体の化学特異性を示している。ＯＲＮ上の２’−ＯＨ基の存在は、ＯＤＮ上にはないが、ＯＲＮへの化学特異的反応の源である。
【００９５】
（実施例７）
５Ｂｉｏｔ  ＩＡ  Ｍｅ（９）または５Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４  ＩＡ  Ｍｅ（１１）により官能化されたオリゴリボヌクレオチドのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＤＮＡチップ上での検出の実証
目的：本発明者らは、５Ｂｉｏｔ  ＩＡ  Ｍｅ（９）または５Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４  ＩＡ  Ｍｅ（１１）との反応によりビオチン化されたオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡチップ上で検出可能になることを示している（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙ、参照番号９００４７０、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓｔ  Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ）。
動作モード：
それぞれ、Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  ＤＮＡチップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓｔ  Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ）により検出されるハウスキーピング遺伝子ＤＡＰ３＿Ｐ２、ＧＡＰＤＨ＿Ｐ１５、ＨＳＡ＿Ｐ１２およびＬＹＳ３＿Ｐ７の配列の一部に相当する、３０個の塩基を有する４種の合成オリゴリボヌクレオチド（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、Ｓｅｒａｉｎｇ、ベルギー）をそれぞれ６μＭまで水溶液に入れる（合計で２４μＭ）。
４種のＯＲＮの溶液４２μｌを取り、次いで、リン酸カリウム溶液（ｐＨ７、１Ｍ）４２μｌ、超純水４２μｌおよび化合物５Ｂｉｏｔ  ＩＡ  Ｍｅ（９）もしくは５Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４  ＩＡ  Ｍｅ（１１）のＤＭＳＯ中１２０ｍＭ溶液４２μｌと混合する。これらを６５℃のオーブン中で６０分間、次いで、氷中で５分間放置してインキュベートする。
過剰の試薬を除去するために、０．３倍容の３Ｍ酢酸ナトリウム、次いで０．７倍容の純粋なイソプロパノールを添加する。ボルテックス撹拌を行い、即時に遠心分離を＋４℃、１４，０００ｒｐｍで３０分間行う。上清を除去し、沈渣を７０％エタノール５０μＬですすぐ。遠心分離を＋４℃で１５分間（１４，０００ｒｐｍ）もう一度行う。上清を除去し、沈渣を加熱することなくロータリーエバポレーター（Ｊｏｕａｎ、Ｓｔ  Ｈｅｒｂｌａｉｎ、フランス）で５分間乾燥させる。残渣を超純水７０μＬに溶解する。
【００９６】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙキット（参照番号９００４７０）およびマニュアル：ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  Ｗｉｔｈ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈ，ａｎｄ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ  Ｐ／Ｎ  ７０２２３２  Ｒｅｖ．３に記載されているプロトコルにしたがって、官能化ＯＲＮのハイブリダイゼーションおよび検出を行う。
官能化し、ハイブリダイゼーション緩衝液と混合したＯＲＮを、２００μｌの容積において７ｎＭ〜７０ｐＭの間で変化する濃度でＧｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙチップ上に沈着させる。ハイブリダイゼーションを、ＦＳ４５０  ｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｓｔａｔｉｏｎ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ）上で４５℃で１６時間行う。すすいだ後、フィコエリトリンとカップリングしたストレプトアビジンと複合体を形成させ、引き続いて、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００およびＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ）を用いて検出される蛍光を測定することにより、ビオチン化ＯＲＮの検出を行う。５Ｂｉｏｔ  ＩＡ  Ｍｅ（９）による官能化後に収集された蛍光強度（ＲＦＵ）を図１０に示し、５Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４  ＩＡ  Ｍｅ（１１）によるものを図１１に示す。
【００９７】
結果および結論：
２つの分子により誘導される蛍光強度は極めて類似しており、官能化されていないＯＲＮにより産生されるバックグラウンドノイズ（約３０ＲＦＵ、図１０および１１では図示せず）よりも極めて実質的に大きいことに留意する。４種の遺伝子間の差は、標的に対するＯＲＮの親和性の差に由来する。これらの実験は、ＯＲＮとビオチン化イサト酸無水物分子との間の反応によりビオチン基をＯＲＮ上に移すことが可能であることを示している。その結果、ＯＲＮ上のビオチンの存在により、固体担体上に固定化されている対応する相補的な標的との特異的ハイブリダイゼーションが存在するかどうかを検出することが可能になる。
したがって、ＤＮＡチップ技術におけるリボ核酸の標識化のためのイサト酸無水物誘導体の有用性および有効性が示されている。
【００９８】
（実施例８）５Ｂｉｏｔ  ＩＡ  Ｍｅ（９）によりビオチン化されたＲＮＡ転写産物のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＤＮＡチップ上での検出の実証
目的：本発明者らは、ここで、実施例７と類似の実証を行うことを望むが、今回はＤＮＡチップ上での試験の実態に相当する生体試料を用いる。そのため、インビトロＲＮＡ転写産物のパネルを用いる。これらの転写産物は、生体試料に由来する全ＲＮＡ中に存在するｍＲＮＡに相補的なＲＮＡである。
次いで、このように得たインビトロ転写産物を、５Ｂｉｏｔ  ＩＡ  Ｍｅ（９）との反応によりビオチン化し、ＤＮＡチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙ、参照番号９００４７０、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓｔ  Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ）上で検出する。
動作モード：インビトロ転写産物を、ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ  ＩＩキット（参照番号ＡＭ１７５１、ＡＭＢＩＯＮ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）を用いて、血液試料から抽出した全ＲＮＡのインビトロ転写により産生する。手短に言えば、血液細胞からの全ＲＮＡの抽出後、ｍＲＮＡと相補的なＤＮＡ鎖（ｃＤＮＡ）を産生するために、酵素Ｔ７  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによる第１の逆転写ステップを行う。次いで、ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡの二本鎖を形成する前に、ＲＮＡ鎖をＲＮａｓｅ  Ｈにより分解する。最後に、転写酵素Ｔ７を用いて、ｃＤＮＡからアンチセンスＲＮＡ（インビトロ転写産物）を得る。
前で得られたインビトロＲＮＡ転写産物（５６８ｎｇ／μｌ）の溶液１７．６μＬ、超純水９．４μＬおよび１００ｍＭ  Ｚｎ（ＯＡｃ）２  ｐＨ６．５  ３μＬを混合する。次いで、この溶液を７０℃で１５分間インキュベートし、次いで、直ちに氷中に入れる。
この溶液３０μＬをサンプリングし、これにリン酸カリウム溶液（ｐＨ７、１Ｍ）３０μＬ、超純水３０μＬおよび化合物５Ｂｉｏｔ  ＩＡ  Ｍｅ（９）のＤＭＳＯ中１２０ｍＭ溶液３０μｌを添加する。これを６５℃のオーブン中で６０分間インキュベートし、次いで氷中に５分間入れる。
次いで、イソプロパノールによる沈殿により実施例７と同様に過剰の試薬を除去する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙ、参照番号９００４７０、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓｔ  Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ）上での沈着、蛍光の検出および測定も同様である。得られた結果を図１２に示す。
【００９９】
結果および結論：
対応するビオチン化標的が今回は全部存在するので（標識ＩＶＴ）、先行する実施例７と比較して、より多くの遺伝子がこのチップ上で検出される。観察される蛍光強度は官能化されていない標的ＩＶＴにより産生されるバックグラウンドノイズ（約３０ＲＦＵ、図１０では図示せず）よりも極めて実質的に大きいことに留意する。異なる遺伝子間の強度差は、試料中のこれらの遺伝子のそれぞれの頻度に由来する。現実の生体試料からのこの実験は、ＲＮＡ鎖とビオチン化イサト酸無水物分子（９）との間の反応によりビオチン基をＲＮＡ鎖のパネル上に移すことが可能であることを示している。その結果、ＲＮＡ鎖上のビオチンの存在により、相補的な標的との特異的ハイブリダイゼーションが存在するかどうかを検出することが可能になる。
したがって、天然ＲＮＡ鎖の標識化のためのビオチン化イサト酸無水物誘導体の有用性および有効性が示されている。
【０１００】
（実施例９）Ｃｙ３  ＩＡ  Ｍｅ（１３）との反応により蛍光性にされるＲＮＡ転写産物のＡｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡチップ上での検出の実証
目的：ここでは、本発明者らは、実施例８と類似の実証を行っているが、今回は、蛍光Ｃｙ３分子をＲＮＡ上に移すために、官能化ステップ用のＣｙ３  ＩＡ  Ｍｅ（１３）分子を用いる。こうして得られた蛍光転写産物をハイブリダイズし、蛍光ストレプトアビジン分子を用いることなく、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡチップ（Ｓｔ  Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ）上で直接検出する。
動作モード：  インビトロ転写産物を実施例８に記載するのと同様に産生する。この実施例では、本発明者らは、最も感受性の官能化ＩＶＴを検出するために最も適した濃度を決定するために、４種の濃度の官能化分子Ｃｙ３  ＩＡ  Ｍｅ（１３）を用いた。
インビトロ転写産物６μｇを総容積２０μＬの１０ｍＭ  Ｚｎ（ＯＡｃ）２溶液  ｐＨ６．５に溶解する。この溶液を、ＲＮＡを部分的に断片化するために、断片の大部分が２５〜２００塩基の間の大きさのもので得られるまで、７０℃で１５分間インキュベートする。このインキュベーション後、溶液を直ちに氷中に入れる。
次いで、酢酸亜鉛を除去するために、イソプロパノールによる精製を行う。これを行うために、３Ｍ酢酸ナトリウム６μＬ（すなわち、３０容積％）およびイソプロパノール１４μＬ（すなわち、７０容積％）を添加する。ボルテックス撹拌を行い、遠心分離を４℃、１４，０００ｒｐｍ（２０，８００ｇ）で３０分間行う。上清を除去し、ＲＮＡ沈渣を７０％エタノール５０μＬですすぐ。遠心分離を４℃、１４，０００ｒｐｍ（２０，８００ｇ）で１５分間行い、次いで、上清を除去し、残渣を水１１μＬに溶解する前に、ロータリーエバポレーターを用いて真空下で乾燥を行う。
転写産物溶液１１μＬを、ＮａＨＣＯ３の５００ｍＭ溶液４μＬ  ｐＨ８〜８．５およびＣｙ３  ＩＡ  Ｍｅ（１３）のＤＭＳＯ中１２０、２４０、３６０または４８０ｍＭ溶液５μＬと混合して、それぞれ３０、６０、９０または１２０ｍＭの官能化試薬溶液を得る。これらの溶液を６５℃で１時間インキュベートする。
【０１０１】
過剰の官能化試薬および過剰の異なる塩を、イソプロパノール沈殿、次いで、アセトン沈殿により除去する。これを行うために、３Ｍ酢酸ナトリウム６μＬ（すなわち、３０容積％）およびイソプロパノール１４μＬ（すなわち、７０容積％）を官能化溶液に添加する。ボルテックス撹拌を行い、遠心分離を４℃、１４，０００ｒｐｍ（２０，８００ｇ）で３０分間行う。上清を除去し、次いで、沈渣を７０％エタノール５０μＬですすぐ。遠心分離を再度４℃、１４，０００ｒｐｍ（２０，８００ｇ）で１５分間行い、上清を除去する。
水２８０μＬ、３Ｍ  ＬｉＣｌＯ４  １８μＬおよびアセトン９００μＬを沈渣に添加する。ボルテックス撹拌を行い、遠心分離を行い、上清を除去する。次に、水２８０μＬ、３Ｍ  ＬｉＣｌＯ４  １８μＬおよびアセトン９００μＬを沈渣に添加する。ボルテックス撹拌を行い、遠心分離を行い、上清を除去する。沈渣を７０％エタノール５０μＬですすぎ、次いで、遠心分離を４℃、１４，０００ｒｐｍ（２０，８００ｇ）で１５分間行う。上清を除去し、沈渣を水２０μＬに溶解する前に、ロータリーエバポレーターを用いて真空下で沈渣を乾燥させる（すなわち、［インビトロ転写産物］理論値＝６２５ｎｇ／μＬ）。
【０１０２】
これらの異なる処理後に回収した官能化インビトロ転写産物の量を決定するために、各最終溶液１．２μｌを、２６０ｎｍでのＵＶ分光測定法により分析する（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  １００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）。インビトロ転写産物のＣｙ３官能化率（１００個のヌクレオシド当たりのＣｙ３分子の％）を知るために、分析を５５０ｎｍでも行う。この値はまたＤｏＬ（色素数）という名称で知られており、以下の式：ＤｏＬ（％）＝１００×（３４０×［Ｃｙ３］）／（１０００×［ＲＮＡ］）で計算される。この式の詳細は、Ｋｒｅａｔｅｃｈ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、オランダ）により市販されているＣｙ３−ＵＬＳキット参照番号ＥＡ−０２３用のプロトコルに記載されている。以下の表４は、異なる濃度の分子Ｃｙ３  ＩＡ  Ｍｅ（１３）によるＩＶＴの官能化後のＤｏＬ値を記載している。
2014504282.tif 000023
【０１０３】
ＲＮＡ  Ｎａｎｏ  ６０００チップを用いた、Ｂｉｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ）キャピラリー電気泳動装置による分析により、断片化および蛍光ＲＮＡのプロファイルを得ること、ならびに必ず断片の大部分が２５〜２００塩基の間であるようにすることが可能になる。
この後、蛍光転写産物のガラススライド上に固定化したプローブとのハイブリダイゼーションを検出するために、特定の量の官能化ＩＶＴをＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ）ＤＮＡチップ上に沈着させる。このために、本発明者らは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のキット：「ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｈｕｍａｎ  ＧＥ  ８ｘ６０Ｋ  Ｋｉｔ  参照番号Ｇ４８５１Ａ」または「Ｗｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｋｉｔ、４ｘ４４Ｋ  参照番号Ｇ４１１２Ｆ」に記載されているプロトコルに従う。手短に言えば、官能化ＩＶＴ  １．６５μｇをハイブリダイゼーション緩衝液１１０μＬに溶解し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢＭＸ  １ガラススライドチップ上に沈着させる。このチップは、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘのための特別注文製であり、６０個の塩基を有するオリゴヌクレオチドの形態で３５２個の遺伝子に相当する配列を含む。これらの遺伝子は、異なるフォーマットで、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘにより販売されており、実施例６および７に記載するＵ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  ＤＮＡチップ上で見られる遺伝子の選択に相当する。同様に、ここでは、ヒト細胞中での極めて低い、低い、中間のおよび高い発現を有する遺伝子の選択が見られる。
ハイブリダイゼーションは、１０ｒｐｍの回転速度で１７時間、６５℃でＡｇｉｌｅｎｔ装置（参照番号Ｇ２５４５Ａ）で行った。
過剰の官能化されたハイブリダイズしていない転写産物を洗浄した後、Ｃｙ３の検出に適したフィルターを備えるＴＥＣＡＮ  ＬＳ  ２００スキャナー（Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、スイス）で蛍光スポットを測定する。
得られた原画像は図１３で見え、再処理および測定した蛍光強度の遺伝子発現頻度とのマッチング後、図１４に見えるヒストグラムをプロットすることが可能である。この後者は、陰性対照ならびにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップ上の強度レベルにより分類される４つのグループの配列（極めて低い、低い、中間のおよび高い）すなわち、基準法、について観察されるスポットの中央強度に相当する。
結果および結論：陰性対照は、官能化されていないインビトロ転写産物について得られた中央強度に相当する。これは、約２０ＲＦＵである、すなわち、完全に許容できる結果は、「基礎」に相当する。「極めて低い発現」クラスの配列のシグナル強度は、基礎に相当するものより大きくない。同じ観察がＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップの基準法についても現れるので、これは首尾一貫した結果である。それにもかかわらず、低い存在の配列がよく検出され、他のグループの配列についての結果は実施例８のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップで得られるものに等しい。
ＤｏＬの増加はシグナル動態を改善しない。そのため、１．６％超のＤｏＬでインビトロ転写産物を標識することは有用ではない。結論として、これらの条件下で標識Ｃｙ３−ＩＡ  Ｍｅ（１３）により得られる０．８％のＤｏＬは、チップで優れた結果を得るのに満足なものである。
したがって、これらのチップは、化合物Ｃｙ３−ＩＡ  Ｍｅ（１３）で官能化したインビトロ転写産物の特異的ハイブリダイゼーションを示している。これらはまた、蛍光ストレプトアビジン分子を用いることなく、分子１３で官能化したＲＮＡ鎖を直接検出することが可能であることを示している。
蛍光性にされたＲＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを検出する際の、目的の分子と結合したイサト酸無水物の有用性および有効性がもう一度示されている。
【０１０４】
（実施例１０）
アルカリホスファターゼの作用に供し、次いで、Ｃｙ３−ＩＡ  Ｍｅ  １３と反応させた全ＲＮＡのパネルの官能化率の増加の実証
目的：本発明者らは、酢酸亜鉛溶液により部分的に断片化したＲＮＡ鎖のパネルが、アルカリホスファターゼによる予備的処理があった場合に、Ｃｙ３−ＩＡ  Ｍｅ  １３分子との反応性増加に遭遇することを示している。
動作モード：ＲＮＡ鎖のパネルをＭＡＱＣ  ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  参照番号：＃７４０００）とする。この全ＲＮＡ（リボソームおよびメッセンジャー）は、異なる起源：脳、乳房、Ｂリンパ球、子宮頸部、肝臓、脂肪肉腫、マクロファージ、皮膚、精巣、Ｔリンパ球の１０系統のヒト細胞から直接抽出する。
官能化プロトコルは、実施例９に記載するものと同じとする、すなわち：
−  ＭＡＱＣ０  ＲＮＡ  １２μｇを、酢酸亜鉛溶液とインキュベートするまたはしない。
−  混合物をイソプロパノールで沈殿させる。
−  ７単位のアルカリホスファターゼ（Ｐ７９２３−２ＫＵ  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を混合物に添加し、リン酸化末端の加水分解を周囲温度で４時間進ませる。
−  次いで、総容積８０μｌのＮａＨＣＯ３緩衝液（１００ｍＭ／ＤＭＳＯ  ７５／２５  ｐＨ８〜８．５）中１５ｍＭの分子Ｃｙ３−ＩＡ  Ｍｅ  １３を混合物に添加する。この混合物を６５℃で１時間インキュベートする。
−  ＤｏＬを実施例９に記載するように測定する前に、混合物をもう一度イソプロパノールで、次いで、アセトンで２回沈殿させる。
【０１０５】
得られた値を以下の表５に示す。
2014504282.tif 000024
結果および結論：  アルカリホスファターゼによる処理があってもなくても、ＭＡＱＣ  ＲＮＡが切断されていない場合（項目１および２）、ＤｏＬ（官能化率に相当するものである）に差はない。
産生される３’リン酸末端は反応性ではないのでこれ以上官能化は存在し得ないため、切断のみの後、ＤｏＬは確実にさらには増加しない（項目３）。
対照的に、産生された３’リン酸末端の、１５分の切断およびアルカリホスファターゼによる加水分解の組合せは、ＤｏＬを１０６％増加させる（項目４）。従って、３’末端はジオール２’，３’の形態であるので、反応性は確実に増加する。
そのため、切断されたＲＮＡ断片をアルカリホスファターゼで処理することにより、官能化率を増加させることが可能であることが示されている。これはまた、分子内部の２’ヒドロキシルと比較してＲＮＡの末端ジオール２’，３’のはるかに大きい反応性を示す間接的証拠である。
【０１０６】
（実施例１１）化合物２４を介して官能化し、捕捉し、ジスルフィド結合を切断し、２７個の塩基を有するＯＤＮとの混合物中の２７個の塩基を有するＯＲＮを溶出する選択的方法の実証
目的：  本発明者らは、５Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４（ＳＳ）ＩＡ  Ｍｅ（２４）と反応するＯＲＮ／ＯＤＮ混合物から出発して、
−  ＯＲＮを選択的に官能化すること、
−  ストレプトアビジンコーティングされた磁性粒子を用いてＯＲＮを捕捉し、他の用途のためにＯＤＮを潜在的に回収すること、
−  固定化ＯＲＮと粒子との間のＳＳ結合を切断すること、および
−  ＯＤＮを含まないＯＲＮを選択的に溶出すること
が可能であることを示している。
動作モード：本発明者らは、水中６５０μＭ溶液の２７−ｍｅｒ  ＯＤＮ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ  参照番号２１４３８−ＤＮＡ  バッチ番号２１７７６７３、配列：５’−ＡＡＣ−ＣＧＣ−ＡＧＴ−ＧＡＣ−ＡＣＣ−ＣＴＣ−ＡＴＣ−ＡＴＴ−ＡＣＡ−３’）および水中９５２μＭ溶液の２７−ｍｅｒ  ＯＲＮ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ  参照番号２１４３７−ＲＮＡ  バッチ番号２１７７６７２、配列：５’−ＡＡＣ−ＣＧＣ−ＡＧＵ−ＧＡＣ−ＡＣＣ−ＣＵＣ−ＡＵＣ−ＡＵＵ−ＡＣＡ−３’）を有する。ＯＤＮ  １５．４μＬおよびＯＲＮ  １７．５μＬを混合し、超純水６７．１μＬで満たす。
ＨＰＬＣへの注入後、ＯＲＮおよびＯＤＮにそれぞれ相当する２６０ｎｍのＵＶピークの積分は、混合物が４４％ＯＲＮおよび５６％ＯＤＮを含むことを示している（注入１、ＨＰＬＣ条件第４番、図１５）。
官能化ステップ：混合物８０μＬ（８ｎｍｏｌ）を乾燥するまで蒸発させ、水１０μＬ、イサト酸無水物Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４（ＳＳ）ＩＡ  Ｍｅ（２４）；２．４ｍｍｏｌの４８０ｍＭ  ＤＭＦ中溶液５μＬ、および水中１Ｍ溶液のトリエチルアンモニウムアセタート緩衝液５μＬに溶解する。媒体を６５℃のオーブンに１時間入れる。
沈殿ステップ：次いで、媒体から残渣Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４（ＳＳ）ＩＡ  Ｍｅを除去するために、媒体を過塩素酸リチウムＬｉＣｌＯ４およびアセトンによる３回沈殿に供する：水中３ＭのＬｉＣｌＯ４溶液１８μＬおよび水２６２μＬを媒体に添加する。ボルテックス撹拌後、アセトン９００μＬを添加し、次いで、媒体をもう一度撹拌し、遠心分離する（周囲温度、１３，０００ｒｐｍで５分間）。次いで、上清を注意深く除去し、ＬｉＣｌＯ４溶液１８μＬおよび水２８２μＬで同じ方法を２度繰り返す。最後に、媒体を、撹拌および遠心分離する前にアセトン９００μＬで洗浄する。ロータリーエバポレーター中で乾燥する前に上清の大部分を注意深く除去する。
乾燥残渣を水１０μＬに溶解することから出発して、上記官能化および沈殿ステップを繰り返す。
次いで、ＯＲＮ／ＯＤＮ混合物を水３３μＬに溶解し、次いで、この溶液５μＬをＨＰＬＣに注入する（注入２、ＨＰＬＣ条件第４番、図１５）。
以下を２５０μＬ管中に連続的に導入する：
−  事前にＰＢＳ緩衝液（０．０１Ｍ  ＰＯ４−、０．００２７Ｍ  ＫＣｌ、０．１３７Ｍ  ＮａＣｌ、２５℃でｐＨ＝７．４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  参照番号、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）２００μＬで２回洗浄した、Ｍｅｒｃｋ  ＭａｇＰｒｅｐ−２５ストレプトアビジンコーティングした磁性粒子（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）２５０μｇ（すなわち、溶液５０μＬ）。
−  化合物Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４（ＳＳ）ＩＡ  Ｍｅ（２４）と反応したＰＢＳ  １０μＬおよび沈殿したＯＲＮ／ＯＤＮ混合物４．０μＬ。
−  媒体を周囲温度で１０分間穏やかな撹拌下で放置する。
【０１０７】
粒子の磁化後、上清を注意深く除去し、分画をＨＰＬＣに注入する（注入３、ＨＰＬＣ条件第４番、図１５）。次いで、粒子をＰＢＳ  ２００μＬで２回洗浄する。次いで、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）のＰＢＳ中１００ｍＭ溶液２０μＬを媒体に添加し、これを４０℃で穏やかな撹拌下で１時間放置する。
磁化後、上清をＨＰＬＣに注入する（注入４、ＨＰＬＣ条件第４番、図１５）。
結果および結論：
注入１では、４４％ＯＲＮ（ＲＴ＝３分）および５６％ＯＤＮ（ＲＴ＝４分）を含む初期混合物を観察することができる。
注入２では、９〜２２分の間に位置する集団のために事実上消失し、アシル化されビオチン化されたＯＲＮに相当するので、初期ＯＲＮのみがＢｉｏｔＰＥＧ４（ＳＳ）ＩＡ  Ｍｅにより官能化された（９５％）ことが観察される。対照的に、ＯＤＮはまだ存在しており反応しなかったことに留意する。
注入３は、上清がＯＤＮを主に含み、官能化ＲＮＡはほぼ完全に捕捉されたことを示している。この場合特異的捕捉収率は３７％と推定されるが、ストレプトアビジンコーティングされた磁性粒子のさらなる添加により、このビオチン化ＲＮＡの全体を捕捉することが可能になることが明らかである。
最後に、注入４では、ＯＲＮおよびＯＤＮに相当するピークの完全な消失が観察される。アシル化されビオチン化されたＯＲＮに相当する集団（ＲＴ＝９〜３２分）もまた、ジスルフィド結合（ＳＳ）の切断およびそのためビオチン部分の喪失に相当するものに由来する主に４．５〜１８分の間の保持時間を有する集団により消失した。注入２に関して、集団の幅はＯＲＮ上のランダム官能化に由来する。これは、異なる保持時間を有する多数の付加物の形成を誘導する。全体で、ＯＲＮは、最初に関与する量に対して１８％の収率で、担体から遊離した。この収率を最適化するために官能化率を調節することが可能である。
兆候として、最適化条件では、官能化／捕捉／溶出工程からの収率は約５０％である。
注入４で示されるように、アントラニル酸ＳＨ基によるビオチン化ＲＮＡの全加水分解を、ヌクレアーゼＰ１およびアルカリホスファターゼによる完全加水分解に供した。次いで、本発明者らは、４種の天然リボヌクレオシドに加えて、全混合物の５％のレベルでヌクレオシド付加物およびヌクレオチドアントラニル酸ＳＨを観察することが可能であることを示した。デオキシリボヌクレオシドまたはヌクレオチドは少しも観察されなかった。
【０１０８】
この実験は、官能化／捕捉／切断／溶出工程の特異性、およびそれゆえ、ＯＲＮ／ＯＤＮ混合物から出発して、これらの化合物に行うべき使用に従ってこれらの化合物のあるものまたは他のものを選択的にふるい分ける可能性を確認している。放出されたアシル化ＲＮＡは、全加水分解により示されるように、ＲＮＡを含まない。
【０１０９】
（実施例１２）化合物５Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４（ＳＳ）ＩＡ  Ｍｅ（２４）と反応する１０８３個のヌクレオチドを有するＨＩＶ  ＷＴ（野生型）転写産物を官能化、捕捉、切断および溶出する選択的方法の実証
目的：この実施例では、本発明者らは、
・化合物５Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４（ＳＳ）ＩＡ  Ｍｅ（２４）により増幅可能なＲＮＡ鎖の集団（１０８３個のヌクレオチドを有するＨＩＶ  ＷＴ転写産物）を選択的に官能化すること、
・ストレプトアビジンコーティングした磁性粒子を用いてこの集団を選択的に捕捉すること、
・固定化ＲＮＡと粒子を接続している結合を化学的かつ特異的に切断すること、
・図１６に記載するような方法に供したＨＩＶ転写産物ＲＮＡを選択的に溶出すること
が可能であることを示している。
動作モード：本発明者らは、その部分配列（挿入ｐＧ３０）がｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＨＩＶキット（Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ  ＥａｓｙＱ（登録商標）  ＨＩＶ−１  ｖ２．０、参照番号２８５０３３、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｍａｒｃｙ  ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ、フランス）にある、１０８３個のヌクレオチドを有するＨＩＶ転写産物ＲＮＡを有する。
３．２７＊１０１２コピー／μＬ（１．９４μｇ／μＬ）のこの転写産物の水溶液を内部で製造する。
官能化：以下の試薬を、以下の表６に示すように５本の２５０μＬポリプロピレン「ＰＣＲ」管に導入する：
2014504282.tif 000025
【０１１０】
表６の実験の各々について、反応混合物の総容積は４μＬであり、最終ＴＥＡＡｃ濃度は２５０ｍＭである。実験番号１は対照として働く。
充填した管をサーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）により６５℃で１時間インキュベートする。
Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ  ｅａｓｙＭＡＧキットによる過剰の５Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４（ＳＳ）ＩＡ  Ｍｅ（２４）ビオチン化試薬の除去：
このステップは、ＲＮＡと反応しなかった過剰の５Ｂｉｏｔ  ＰＥＧ４（ＳＳ）ＩＡ  Ｍｅ（２４）を除去することに存する。
ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ製のＮｕｃｌｉｓｅｎｓ  ｅａｓｙＭＡＧ抽出キットを用いてこれを行う。
インキュベーション後、官能化試料を抽出緩衝液１（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  参照番号：２８０１３１、バッチＺ０１２ＥＢ１ＥＢ）１００μＬに溶解し、事前にオートクレーブした１．５ｍＬポリプロピレン管に移す。次いで、撹拌および軽い遠心分離の前に、８００μＬの量のこの同じ緩衝液を添加する。次いで、５０μＬの容積（すなわち、１ｍｇ）のｅａｓｙＭＡＧ磁性シリカ粒子（ＭａｇＳｉｌ、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  参照番号：２８０１３３  バッチＺ０１１ＥＡ１ＭＳ）を各試料に添加する。
【０１１１】
穏やかなボルテックス撹拌下周囲温度で１０分間のインキュベーション後、管を磁気ラックに置き、上清を除去する。撹拌、軽い遠心分離、磁化および上清の除去前に、抽出緩衝液１  ５００μＬを添加する。次いで、計画的に各添加の間に撹拌、軽い遠心分離、磁化および上清の除去をしながら、抽出緩衝液２（参照番号：２８０１３１、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、フランス）９００μＬ、抽出緩衝液２  ５００μＬおよび抽出緩衝液３（参照番号：２８０１３２、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、フランス）５００μＬを連続的に添加する。最後に、抽出緩衝液３  ２０μＬを添加し、管を７０℃のサーモミキサーに５分間（１４００ｒｐｍ撹拌）入れる。
溶出液をＮａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−３３００（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）で測定し、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒによりＡｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  Ｎａｎｏ  ６０００チップ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ）上に注入してその電気泳動プロファイルを監視する。
捕捉：  前もってＰＢＳ  １×（０．０１Ｍ  ＰＯ４−、０．００２７Ｍ  ＫＣｌ、０．１３７Ｍ  ＮａＣｌ、２５℃でｐＨ＝７．４、ＳＩＧＭＡ  参照番号４４１７）２００μＬで２回洗浄したＭａｇＰｒｅｐ−２５ストレプトアビジン粒子（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｄｓｔａｄｔ、ドイツ）１００μｇ（溶液２０μＬ）を５本の新たな２５０μＬ（ＰＣＲ型）ポリプロピレン管に導入する。これに、官能化されていないＲＮＡの非特異的吸着を制限するために、ＰＢＳ  ４×＋０．４％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の溶液５μＬおよび次いでｅａｓｙＭＡＧシリカによる精製から出る溶出液１５μＬを添加する。
【０１１２】
管の各々を周囲温度で１０分間低速（ボルテックス）で撹拌する。管をＤｙｎａｌ  ＭＰＣ  ９６００磁化ラック（Ｄｙｎａｌ、ノルウェー）に置き、上清をＮａｎｏｄｒｏｐアッセイ（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）のために、および捕捉率を測定するためのＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ６０００（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ）中への導入のために注意深くサンプリングする。
溶出：先行するステップに使用した管の内容物をＰＢＳ  ４×＋０．４％ＳＤＳ溶液１００μＬで洗浄し、次いで、ＰＢＳ  １×（０．０１Ｍ  ＰＯ４−、０．００２７Ｍ  ＫＣｌ、０．１３７Ｍ  ＮａＣｌ、２５℃でｐＨ＝７．４、ＳＩＧＭＡ  参照番号４４１７）の溶液１００μＬで２回洗浄する。磁化後に上清を注意深く除去し、ＰＢＳ  １×  ｐＨ７．４（ＳＩＧＭＡ  参照番号４４１７）中１００ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）８μＬを管の各々に添加する。次いで、管を分離し、サーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）に４０℃で１時間（３００ｒｐｍ撹拌）入れる。最後に、管を磁化ラックに置き、溶出収率を測定するためにＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒに注入するために上清をサンプリングする。
【０１１３】
結果：
官能化：
異なる濃度のＢｉｏｔＰＥＧ４（ＳＳ）ＩＡ  Ｍｅ（２４）によるＲＮＡの官能化後、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒにより与えられる電気泳動図上に、官能化されていない対照ＲＮＡと比較して、官能化ＲＮＡの右側へのシフトならびにピークの増大が観察される。これは、ＲＮＡの質量の増加およびそのため図１７または図１８に示すように（ここでは、ラインＬは核酸の大きさのスケールに相当し、ライン１、２、３、４および５はそれぞれ１５、３０、６０、１２０または１８０ｍＭの分子２４で官能化された転写産物に相当する）修飾された移動プロファイルをもたらすアントラニル酸残基の存在により説明される。ＲＮＡが官能化されるほど、これはより右または上にシフトし、このことは官能化率の増加を表す。
捕捉：
異なる濃度のＢｉｏｔＰＥＧ４（ＳＳ）ＩＡ  Ｍｅ（２４）による官能化ＲＮＡ転写産物の補捉後、図１９の電気泳動図に示すように、ＲＮＡは対照の上清中、および実験番号２（１５ｍＭ  ＢｉｏｔＰＥＧ４（ＳＳ）ＩＡ  Ｍｅ（２４）による官能化）の上清中に極めて少量で検出されるのみである。これは、ＲＮＡが十分にビオチン化されると、ＲＮＡが完全に捕捉されることを示している。実験１の対照はビオチン化されていないので、ＲＮＡは捕捉されていない。
【０１１４】
溶出：
先行するステップで固定化した転写産物の溶出後、予想通り対照を除いて、試料全てでＲＮＡが有意に検出される。対照は官能化も捕捉もされなかったので、溶出しない。同時に、粒子上に吸着されるビオチン化されていないＲＮＡによる非特異的溶出はないことが示されている。溶出するＲＮＡの量は、図２０に示すように官能化率に依存する。こうして溶出したＲＮＡは官能化ＲＮＡよりも短い保持時間を有し、これはＳＳ結合の切断のためであり、これにより分子の分子量を減少させることが可能になることに留意する。
【０１１５】
方法およびその異なるステップの各々のそれぞれの収率を以下の表７に要約する：
2014504282.tif 000026
濃度の全てはＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒで得られる蛍光シグナルを積分することにより測定した。捕捉率は、ＭａｇＰｒｅｐ−２５  Ｍｅｒｃｋ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ粒子上に固定化したＲＮＡの量（上清中のＲＮＡを分析することにより評価する）と官能化および沈殿後に回収されるＲＮＡの量との間の比として定義される。
溶出率は、ステップの各々の収率および全体収率から差し引く。
異なる濃度のＢｉｏｔＰＥＧ４（ＳＳ）ＩＡ  Ｍｅについて１０％〜１８％の間の全体収率が得られるが、Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ  ｅａｓｙＭＡＧキットでの精製後には３０％〜３５％の間の物質が回収されることを理解する。３０ｍＭ以上のＢｉｏｔＰＥＧ４（ＳＳ）ＩＡ  Ｍｅ（２４）濃度から出発して、捕捉はＭａｇＰｒｅｐ−２５  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ粒子（Ｍｅｒｃｋ）１００μｇを含む合計である。
【０１１６】
官能化されていないＲＮＡ（対照）のＭａｇＰｒｅｐ−２５  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ粒子上への非特異的吸着は６％であるが、このＲＮＡは洗浄中に除去され、ＤＴＴ  １００ｍＭによる処理中には溶出しない。
類似の結果を有する濃度の各々については、操作を再現した。
結論：ＨＩＶ転写産物ＲＮＡは、異なる濃度の化合物ＢｉｏｔＰＥＧ４（ＳＳ）ＩＡ  Ｍｅ（２４）で官能化され、Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ  ｅａｓｙＭＡＧ（登録商標）キットで精製され、ＭａｇＰｒｅｐ−２５（Ｍｅｒｃｋ）  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ磁性粒子に選択的に捕捉され、ジスルフィド結合を切断することにより溶出した。
官能化されたＲＮＡのみがＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏチップ）で検出される。
最大１８％までの出発ＲＮＡがこの方法によりうまく抽出された。
これは、ＲＮＡの特異的官能化および磁性粒子上への捕捉後の溶出を行うことが可能であることを明確に示している。
【０１１７】
（実施例１３）化合物ＢｉｏｔＰＥＧ４（ＳＳ）ＩＡＭｅ（２４）で選択的に官能化し、ストレプトアビジンコーティングされた磁性粒子により捕捉され、１００ｍＭ  ＤＴＴ溶液で溶出したＨＩＶ転写産物のＮＡＳＢＡ増幅
目的：本発明者らは、実施例１２で調製した転写産物をその後増幅反応中に増幅することができることを示している。この場合、これはＮＡＳＢＡ増幅技術であるが、これはＰＣＲ、ＴＭＡ、３ＳＲなどの他の技術で行うことができる。本発明者らはまた、ＲＮＡ上のアントラニル酸残基の存在が増幅を妨げないことを示している。
動作モード：先行する実施例１２では、ＷＴ  ＨＩＶ転写産物４μｇ（１０８３個のヌクレオチド、内部生産、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘバッチ８４１４７０３０１、Ｃ＝３．２７Ｅ１２コピー  μｌ）を異なる濃度の化合物（２４）（０ｍＭ、１５ｍＭ、３０ｍＭ、１２０ｍＭ、１８０ｍＭ、すなわち、表６の実験番号１〜７）でビオチン化した。次いで、図１６に示すように、この転写産物をＭｅｒｃｋ  ＭａｇＰｒｅｐ  ２５  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ磁性粒子上に捕捉し、次いで、すすいだ後、ジスルフィド結合（ＳＳ）を切断し、−ＳＨアントラニル酸基を有する転写産物を溶出するために、粒子を４０℃でＰＢＳ  １×  ｐＨ７中１００ｍＭ  ＤＴＴ処理に１時間供した。本発明者らは、これらの転写産物をＮＡＳＢＡ技術により増幅することができることを評価した。この評価は、官能化されていない「裸の」ＨＩＶ＿ＷＴ転写産物範囲との比較として行った。
【０１１８】
増幅は、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ  ＥａｓｙＱ装置（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、フランス）およびＮｕｃｌｉＳＥＮＳ  ＥａｓｙＱ  ＨＩＶ−１  Ｖ２．０キット（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、フランス、参照番号２８５０３３、バッチ０９１２２１０６）により行う。使用するソフトウェアは、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ  ＥａｓｙＱ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒとし、プロトコルはＱＬ１−６０  １．０（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、フランス）とする。
実施例１２に記載するような化合物２４による官能化、捕捉および１００ｍＭ  ＤＴＴ  ８μＬへの溶出後、表７の実験番号２〜５の転写産物を、ＡＧＩＬＥＮＴ  ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ）を用いてＲＮＡ  ６０００  ＮＡＮＯチップで分析し、以下の濃度：１５μｌ中１０００コピー、１００コピー、５０コピー、１０コピー、１コピー、０コピーに希釈した。３６０コピーに希釈したＨＩＶ＿ＩＣ転写産物（ＷＴ（野生型）転写産物と同じ増幅配列の内部対照であるが、別の発蛍光団を保有する分子標識により検出される）を１５μｌ容積まで添加し、増幅が起こるウェルの全てに存在するようにする。この転写産物は、増幅の補正動作を監視するのに役立つ。試験を３回行う。実験番号１は、官能化されなかった（０ｍＭの化合物（２４））がそれにもかかわらず、官能化、捕捉および溶出プロトコルの全ステップを受けた転写産物に相当する。そのため、これは、官能化されていない転写産物の非特異的吸着および溶出を制御するものである。この試料に含まれるＲＮＡの量はｂｉｏＡｎａｌｙｚｅｒの検出閾値よりも低いので、これをＮＡＳＢＡ増幅により分析する。以下の表８は、実験番号１〜５の各転写産物の溶出液の分析値を示している（総容積＝８μｌ）。
【０１１９】
2014504282.tif 000027
６個のＡｃｃｕｓｐｈｅｒｅｓ  ＥＮＺ  ＩＩ（ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ  ＥａｓｙＱ  ＨＩＶ−１  Ｖ２．０キット、参照番号２８５０３３、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、フランス）を１．５ｍｌポリプロピレン管中に沈着させる。２７０μＬの容積のＥＮＺｄｉｌ  Ｈ（ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ  ＥａｓｙＱ  ＨＩＶ−１  Ｖ２．０キット、参照番号２８５０３３、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、フランス）をＡｃｃｕｓｐｈｅｒｅｓ上に添加し、それらが完全に溶解するよう１５分経過させる。１２個のＡｃｃｕｓｐｈｅｒｅｓ  ＰＲＭ  Ｈ（ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ  ＥａｓｙＱ  ＨＩＶ−１  Ｖ２．０キット、参照番号２８５０３３、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、フランス）を１．５ｍｌポリプロピレン管中に沈着させる。ＰＲＭｄｉ  １Ｈ  １０８０μＬ（ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ  ＥａｓｙＱ  ＨＩＶ−１  Ｖ２．０キット、参照番号２８５０３３、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、フランス）をこれらのＡｃｃｕｓｐｈｅｒｅｓ上に添加し、Ａｃｃｕｓｐｈｅｒｅｓが完全に溶解するまで混合物を直ちにボルテックス撹拌する。２本の管（混合ＥＮＺ  ＩＩおよび混合ＰＲＭ  Ｈ）において完全に溶解した後、これらの混合物をベンチトップ遠心分離機で遠心分離する。
【０１２０】
栓で密閉した０．２ｍｌの８ウェルのウェルストリップ中でＮＡＳＢＡ増幅を行う。各濃度（１０００〜１コピーの間）の転写産物の混合物１５μＬ容積を各ウェルの底に沈着させる。ＰＲＭ  Ｈ混合物２０μＬを添加する。栓のないウェルストリップは、ＮＡＳＢＡ  ＲＮＡプロトコルに従って、６５℃で２分間（ＲＮＡの変性）、次いで４１℃で２分間（増幅温度）、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ  ＥａｓｙＱ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、フランス）上に沈着させる。この時間中、ＥＮＺ  ＩＩ混合物５μＬをウェルストリップの栓の中に沈着させる。次いで、ウェルストリップに栓をし、ベンチトップ遠心分離機で遠心分離し、次いで、３秒間撹拌し、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ  ＥａｓｙＱ装置（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、フランス）のラック上に沈着させる前に、もう一度ベンチトップ遠心分離機で遠心分離する。並行して、同じ操作を１０００〜１コピーの官能化されていないＨＩＶ＿ＷＴ転写産物の範囲で行う。次いで、増幅を開始する。６０分後、結果を．ｘｍｌ形式でエクスポートし、図２１で見られるような、Ｔ２アルゴリズムによりＳｐｏｔＦｉｒｅソフトウェア（Ｔｉｂｃｏ  Ｓｏｆｔａｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＵＳＡ）を用いて分析する。
【０１２１】
結果および結論：
表８に示すように、吸着および非特異的溶出を示す対照試料（実験番号１）は事実上全く転写産物を含まず、平均して、実験番号２〜５に相当する試料よりも１００万倍少ない転写産物しか含まないことを留意する。そのため、化合物（２４）と反応しなかったが同じステップに従ったＲＮＡ転写産物は１００万倍低い濃度で溶出するに過ぎないので、化合物（２４）と反応したＨＩＶ転写産物の官能化、捕捉、切断および溶出の方法はＲＮＡ特異的方法であると言うことができる。そのため、これは、図２１で観察されるＮＡＳＢＡ増幅反応が、実施例１２に記載の方法により官能化され、捕捉され、溶出したＨＩＶ＿ＷＴ転写産物から起こるのみであり得るという証拠である。
本発明者らは、１０００〜１コピーの転写産物の範囲を行うのに必要な濃度に希釈した溶出緩衝液（ＰＢＳ  １×  ｐＨ７およびＤＴＴ  １００ｍＭ）がＮＡＳＢＡ増幅を阻害しないことを示す、予想による全点における３６０コピーを有する内部対照の増幅を観察する（図示せず）。
図２１は、異なる濃度（１５、３０、１２０および１８０ｍＭ）の分子（２４）で官能化し、ストレプトアビジンコーティングされた磁性粒子上に捕捉し、次いで、ＤＴＴによる化学的切断により溶出し、ＮＡＳＢＡにより増幅したＨＩＶ転写産物の範囲（１０００、１００、５０、１０および１コピー）の重ね合わせを示している。ビオチン化されていない転写産物の範囲との比較を行う。
【０１２２】
１５および３０ｍＭの濃度については、ＮＡＳＢＡ増幅は影響を受けていない。対照的に、１２０ｍＭから本発明者らは増幅の阻害の始まりを観察し、これは増幅の開始のますます多くの実質的な時間停止を有する１８０ｍＭの標識濃度で確認される。これは、ＲＮＡが官能化されるほど、アントラニル酸単位がハイブリダイゼーションおよび／またはポリメラーゼ伸長工程を妨げるという事実により説明される。
ＮＡＳＢＡ増幅法は、一般的に続くが、以下の表９に示すように、官能化試薬（２４）の濃度が増加すると、検出される転写産物の最小量で増加が観察される。
2014504282.tif 000028
【０１２３】
そのため、高濃度でさえ官能化が可能であっても、増幅の阻害を避けるためにＲＮＡの官能化を緩和するのがよい。本発明の一実施形態では、５０ｍＭの化合物（２４）は、発明者らがこの実施例で有する条件に使用する好ましい上限のままである。
これは、ＲＮＡを酵素的重合反応により増幅することができるのを維持しながら、官能化、捕捉および溶出の工程に供することができることを示している。
さらなる所見として、強力な官能化率も有利であることに留意すべきである。したがって、この状況により、ＤＮＡの増幅に影響を及ぼすことなくＲＮＡの増幅を阻害することが可能になる。これは、ＲＮＡにより汚染された溶液を除染するためのアプローチに用途を見出すことができる。
【０１２４】
（実施例１４）ＨＩＶ  ＲＮＡ転写産物およびゲノムＤＮＡの混合物を含む溶液からのＨＩＶ  ＲＮＡ転写産物の選択的抽出
目的：本発明者らは、ＲＮＡおよびＤＮＡの混合物を含む生物学的溶液のＤＮＡ濃縮の概念を示している。本発明者らは、この概念を３種の異なる生物学的ＲＮＡモデルで試験しており、本発明者らは、
・化合物２４でＲＮＡを官能化する、
・ストレプトアビジンコーティングされた磁性粒子を用いて選択的に捕捉する、および
・切断する／溶出する（実施例１２に記載するように）
選択的工程により、２０／８０の初期ＲＮＡ／ＤＮＡ比から平均で９０／１０の最終ＲＮＡ／ＤＮＡ比に行くことが可能になることを示している。
動作モード：
この実施例に用いる核酸は以下の通りである：
・１１５０ｎｇ／μｌの基準全ＲＮＡ（Ｈｕｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ、ＭＡＱＣ−Ａ  ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ  参照番号７４００００（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ）。
・１．９４μｇ／μｌのＨＩＶ転写産物（いわゆる野生型またはＷＴ）。
・１．７６μｇ／μｌの子ウシ胸腺ｇＤＮＡ、ＳＩＧＭＡ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）、参照番号Ｄ４７６４−５ＵＮ。
・実施例１２に記載するように、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ（Ｍａｒｃｙ  ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ、フランス）製のＮｕｃｌｉｓｅｎｓ  ＥａｓｙＭａｇ（登録商標）抽出キットを用いて、血液２００μＬの抽出後に得られるＥａｓｙＭａｇ（登録商標）溶出液（１２％ＲＮＡ／８８％ＤＮＡを含む４３７ｎｇ／μｌ）。
【０１２５】
１−  官能化：
以下の試薬をそれぞれ３本の０．２ｍｌプラスチック管に導入する（以下の表１０）：
2014504282.tif 000029
各場合で、最終ＴＥＡＡｃ濃度は２５０ｍＭであり、化合物２４の最終濃度は１．５ｍＭである。
３本の管を加熱ラック上６５℃で１時間インキュベートする。
２−  イソプロパノール／酢酸沈殿による過剰の化合物２４の除去：
各試験の容積の全体をオートクレーブした１．５ｍｌプラスチック管に移す。各管の容積を超純水で１００μｌにする。３Ｍ酢酸ナトリウム３０μＬ（ｐＨ＝５．６）、次いでイソプロパノール７０μＬ（Ｓｉｇｍａ  参照番号３４９５９（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ））を添加する。管の全てをボルテックス効果により撹拌し、次いで、＋４℃、１４，０００ＲＰＭで３０分間遠心分離を行う。遠心分離の終わりに、テーパーのついたチップを用いて上清を除去する。沈渣を７０％エタノール５０μＬですすぎ、次いで、＋４℃、１４，０００ＲＰＭで１５分間遠心分離を行う。遠心分離後、管をひっくり返すことにより上清を除去する。次いで、管に含まれる沈渣をロータリーエバポレーターで１０分間乾燥させる。沈渣を超純水２０μＬに溶解する。各管の上清中の回収された核酸を、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ装置、参照番号Ｑ３２８５７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＲＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  ５〜１００ｎｇ、参照番号Ｑ３２８５５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびＱｕａｎｔ−ｉＴ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  ０．２〜１００ｎｇ、参照番号Ｑ３２８５４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて分析する。これらの分析キットにより、混合物中のＲＮＡ／ＤＮＡ比を決定することが可能になる。
【０１２６】
３−  ストレプトアビジンコーティングされた磁性粒子上への核酸の捕捉：
各管中の核酸の実質的な量を考慮して、超純水６０μＬを添加する。このステップのための最適条件（すなわち、磁性粒子４０μｇが核酸２μｇを完全に捕捉すること）を達成するために、各試験についての核酸の捕捉を５本の異なる管（容積を５本の管に分配）で行う。各試験について、５本の０．２ｍｌプラスチック管を用い、この中にＭａｇＰｒｅｐ  Ｐ−２５  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＭＥＲＣＫ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）８μｌ（４０μｇに相当する）を添加する。テーパーのついたチップおよび磁気分離用のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＭＰＣ  ９６００  Ｄｙｎａｌ磁石（Ｃａｒｌｓｂａｄ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、粒子をＰＢＳ  １×＋ＳＤＳ０．１％  ８０μＬで２回洗浄する。いったん粒子を洗浄したら、ステップ２で調製した精製核酸１５μＬおよびＰＢＳ  ４×＋ＳＤＳ０．４％  ５μＬを各沈渣上に添加する。管を周囲温度で穏やかに撹拌しながら（最小速度でボルテックススターラー）１０分間インキュベートする。１０分後、磁石およびテーパーのついたチップを用いた磁気分離後に上清を吸い取る。この上清を前のようにＱｕｂｉｔ（登録商標）Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒで分析する。
【０１２７】
４−  官能化ＲＮＡの溶出：
官能化核酸が固定化されているストレプトアビジン磁性粒子の沈渣を６５℃（加熱ラック）で５分間ＰＢＳ  １×／ＳＤＳ  ０．１％  ８０μＬで洗浄する。ボルテックス撹拌を行い、５分後、磁石およびテーパーのついたチップを用いた磁気分離後に洗浄緩衝液を吸い取る。この操作を２回繰り返す。沈渣の最後の洗浄をＰＢＳ  １×  ２０μｌで行う。次いで、各試験に相当する５種の沈渣を単一管中で混合する。次いで、各試験について容積をＰＢＳ  １×  １００μｌとする。ボルテックス撹拌を行い、次いで、磁石およびテーパーのついたチップを用いた磁気分離後に上清を吸い取る。ＤＴＴ  １００ｍＭ／ＰＢＳ  １×  ８μｌを各沈渣上に添加する。ボルテックス撹拌を行い、４０℃、３００ＲＰＭで１時間インキュベーションを行う。１時間後、磁石およびテーパーのついたチップを用いた磁気分離後に上清を吸い取る。この上清を前のようにＱｕｂｉｔ（登録商標）Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）装置により分析する。
【０１２８】
結果および結論：
１−  結果：
溶出液のＱｕｂｉｔ（登録商標）Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒによる分析により、前記のような工程の各ステップで存在する核酸を定量化することが可能になる。
【０１２９】
得られた測定値から、ＲＮＡおよびＤＮＡ抽出収率、次いで、異なる条件下で行われたいくつかの試験の比較を行うことを可能にするＳとして知られている選択指数を計算することが可能である：
2014504282.tif 000030
【０１３０】
以下の表１１は、得られた測定値および行われた計算から作成される。
2014504282.tif 000031
得られた結果は、３種の生物学的モデルで類似である。１１〜２０％のＲＮＡを平均で含むＤＮＡおよびＲＮＡの混合物から、また動作モードに記載する実験条件の下で、混合物を最大８６〜９１％までのＲＮＡに濃縮することが可能である。選択性はどの場合にも１よりはるかに大きい。
【０１３１】
２−  結論：
化合物２４によるＲＮＡの選択的官能化、ストレプトアビジンコーティングされた磁性粒子を用いた選択的捕捉、および切断／溶出の工程（実施例１２に記載するような）後のＲＮＡ濃縮の概念は、３種の異なる生物学的モデルで示される。どの場合でも、ＲＮＡ溶液の極めて有意な濃縮が明らかに示される。本発明の出願に記載する技術は、本発明者らの知る限りでは、ＤＮＡ／ＲＮＡ混合物中のＲＮＡを選択的に選別するこの動作を行うことを可能にする唯一のものである。
【０１３２】
（実施例１５）ＨＩＶ  ＲＮＡ転写産物およびゲノムＤＮＡの混合物を含む溶液からのゲノムＤＮＡの選択的抽出
目的：
本発明者らは、ＲＮＡおよびＤＮＡの混合物を含む生物学的溶液のＤＮＡ濃縮の概念を示している。１４／８６の初期ＲＮＡ／ＤＮＡ比がこの工程の後で０／１００に等しくなるので、本発明者らは、
・化合物２４でＲＮＡを官能化し、
・次いで、ストレプトアビジンコーティングされた磁性粒子を用いて、官能化されたＲＮＡを選択的に捕捉する
選択的工程により、ＲＮＡを含まない上清を得ることが可能になることを示している。
動作モード：
この実施例に用いる核酸は以下の通りである：
・ＨＩＶ＿ＷＴ転写産物、１．９４μｇ／μｌ。子ウシ胸腺ｇＤＮＡ、ＳＩＧＭＡ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）、参照番号Ｄ４７６４−５ＵＮ、１．７６μｇ／μｌ。
【０１３３】
１−  官能化：
これら２種の核酸溶液を用いて、１４％／８６％  ＲＮＡ／ＤＮＡ混合物を以下の組成で調製する：ＨＩＶ  ＲＮＡ転写産物６．２μＬ（すなわち、１２μｇ）およびゲノムＤＮＡ  ２７．３μＬ（すなわち、４８μｇ）。以下の表１２による以下の試薬を０．２ｍｌプラスチック管に導入する。
2014504282.tif 000032
どの場合でも、ＴＥＡＡｃの最終濃度は２５０ｍＭであり、試験する化合物２４の最終濃度は０、１．５、１５、３０および６０ｍＭである。
５つの試験は、加熱ラック上６５℃で１時間インキュベートする。
【０１３４】
２−  ＥａｓｙＭＡＧ（登録商標）磁性シリカ上での精製による過剰の化合物２４の除去：
各管中の核酸の有意な量を考慮して、各試験のための精製を５本の１．５ｍｌプラスチック管で行う。そのため、実施例１２に記載するようにＥａｓｙＭａｇ（登録商標）精製プロトコル（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｍａｒｃｙ  ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ、フランス）に従って、各試験のために５回２．２μｌ（すなわち、核酸２μｇ）をサンプリングする。このため、「溶解緩衝液」９００μＬ（抽出緩衝液１、参照番号２８０１３０、バッチＺ０１２ＥＢ１ＥＢ、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を各管に添加する。ボルテックス効果による撹拌および短い遠心分離を行う。磁性シリカ粒子５０μＬ、すなわち、１ｍｇ（ＥａｓｙＭＡＧシリカ、参照番号ＰＲ３３３０７７、バッチＺ０１１ＭＡ１ＭＳ、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を添加する。ボルテックス効果による撹拌を直ちに行う。管を周囲温度および撹拌なしで１０分間インキュベートする。１０分後、ＤＹＮＡＬ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ磁石（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いた磁気分離後に上清を吸い取る。「溶解緩衝液」５００μＬを添加し、ボルテックス効果による撹拌、引き続いて、磁化および上清の除去を行う。洗浄緩衝液２（抽出緩衝液２、参照番号２８０１３１、バッチＺ０１１ＬＤ２ＥＢ、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）９００μｌを添加し、ボルテックス効果による撹拌、引き続いて、磁化および上清の除去を行う。洗浄緩衝液２  ５００μＬを添加し、ボルテックス撹拌、引き続いて、磁化および上清の除去を行う。洗浄緩衝液３（抽出緩衝液３、参照番号２８０１３２、バッチＺ０１１ＨＤ３ＥＢ、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）５００μｌを添加し、ボルテックス撹拌、引き続いて、遠心分離、磁化および上清の除去を行う。洗浄緩衝液３  ２０μＬを添加し、管を軽くたたくことにより混合を行い、１４００ｒｐｍで撹拌しながら、７０℃で５分間、加熱ラック中で溶出を行う。遠心分離、磁化および上清の除去を行う。上清中の回収した核酸を、実施例１４に記載するように、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒおよび対応するキットにより分析する。
【０１３５】
３−  ストレプトアビジンコーティングされた磁性粒子上への核酸の捕捉：
各試験について、５本の０．２ｍｌプラスチック管を用い、この中にＭａｇＰｒｅｐ  Ｐ−２５  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、バッチＦＡ００７９５０  ８４１、ＭＥＲＣＫ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）８μｌ（４０μｇに相当する）を添加する。テーパーのついたチップおよび磁気分離用のＤｙｎａｌ  ＭＰＣ  ９６００  磁石を用いて、粒子をＰＢＳ  １×＋ＳＤＳ  ０．１％  ８０μＬで２回洗浄する。いったん粒子を洗浄したら、精製（ステップ２）後に回収した上清１５μＬおよびＰＢＳ  ４×＋ＳＤＳ  ０．４％  ５μＬを各沈渣上に添加する。管を周囲温度で穏やかに撹拌しながら（最小速度でボルテックス）１０分間インキュベートする。１０分後、磁石およびテーパーのついたチップを用いた磁気分離後に上清を吸い取る。ＲＮＡ／ＤＮＡ比を決定するために、この上清をＱｕｂｉｔ（登録商標）Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒで分析する。
結果および結論：
１−  結果：
Ｑｕｂｉｔ（登録商標）Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒによる分析により、工程の各ステップで存在する核酸を定量化することが可能になる。得られたこれらの測定値から、各ステップのＤＮＡ／ＲＮＡ比を計算することが可能である。データを以下の表１３に記録する。
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約８５％のＤＮＡを含む混合物から、また１５ｍＭの化合物２４の使用から始めて、捕捉上清中のＤＮＡの１００％を分析することが可能である（ビオチン化ＲＮＡはストレプトアビジン磁性粒子上に選択的に捕捉されている）。
【０１３６】
２−  結論：
本発明者らは、この実施例により、イサト酸化合物２４により８０％ＤＮＡの存在下でＲＮＡを選択的にビオチン化すること、次いで、１００％ＤＮＡを含む上清を有するために、ストレプトアビジンコーティングされた磁性粒子でビオチン化ＲＮＡを固定化することが可能であることを示している。この技術は有利にＲＮＡｓｅに取って代わる。
【図１−２】
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【図３−４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−８】
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【図９−１０】
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【図１１−１２】
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【図１３−１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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