(57)【要約】  本発明は、インドキサカルブおよびデルタメトリンの組み合わせを含む抗寄生虫組成物ならびに動物に対する寄生虫昆虫侵入およびダニ侵入を防除する方法でのそれらの使用に関するものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
相乗的に有効な量で活性化合物としてインドキサカルブおよびデルタメトリンを含む殺寄生虫組み合わせ剤。
【請求項２】
インドキサカルブ／デルタメトリンの比が１〜１０から１０〜１である請求項１に記載の殺寄生虫組み合わせ剤。
【請求項３】
請求項１または２のいずれかに記載の組み合わせならびに医薬として許容される担体を含む殺寄生虫性組成物。
【請求項４】
処置を必要とする動物に対して、有効量の請求項１に記載の組み合わせを投与することを含む、動物に対する寄生性の昆虫およびダニ類と戦う方法。
【請求項５】
前記動物が寄生性の昆虫およびダニ類による侵入を受けている請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記動物の侵入が予防される請求項４に記載の方法。
【請求項７】
インドキサカルブおよびデルタメトリンを共通の製剤中で同時に一緒に、または別個の製剤で並行して投与する請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記インドキサカルブおよびデルタメトリンを共通の製剤で投与する請求項
７に記載の方法。
【請求項９】
前記動物がイヌである請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記共通の製剤が首輪である請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記インドキサカルブおよびデルタメトリンが２種類の別個の製剤中に含まれ、前記デルタメトリン含有製剤が、デルタメトリンを含浸させた首輪の形態のものである請求項４または９に記載の方法。
【請求項１２】
単一の組成物でまたは一緒に包装された別個の組成物でのインドキサカルブおよびデルタメトリンならびに動物への寄生性の昆虫およびダニ侵入の防除に関する説明書を含む、動物における昆虫および／またはダニ類と戦う上で有用なキット。
【請求項１３】
動物に対する寄生性の昆虫およびダニ類との戦いにおける請求項１の組み合わせの使用。
【請求項１４】
動物に対する寄生性ダニ類の防除のための製造物を製造するための請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
インドキサカルブおよびデルタメトリンが、並行投与のための２種類の別個の製剤中に含まれている請求項１３または１４に記載の使用。
【請求項１６】
インドキサカルブおよびデルタメトリンが共通の製剤中に含まれる請求項１３ないし１５のうちのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
前記共通の製剤が首輪である請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
インドキサカルブ／デルタメトリンの比が１〜１０から１０〜１である請求項１３ないし１７のうちのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
前記組み合わせを局所投与する請求項１２ないし１６のうちのいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
前記組み合わせをイヌに投与する請求項１２ないし１９のうちのいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、寄生性の昆虫およびダニ類の防除のための動物薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
デルタメトリン（（Ｓ）−α−シアノ−３−フェノキシベンジル−（１Ｒ，３Ｒ）−３−（２，２−ジブロモビニル）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキシレート）ＣＡＳ番号５２９１８−６３−５は、公知の農業用および動物用殺虫剤および殺ダニ剤であり、例えば動物薬製品ブトックス（Ｂｕｔｏｘ）（登録商標）、およびスカリボール（Ｓｃａｌｉｂｏｒ）（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）で市販されている。
【０００３】
インドキサカルブは公知の農業用殺虫剤である。米国特許第５，４６２，９３８号には、家庭、葉および土壌に生息する農業および非農業有害生物に対する効力を有するオキサジアジニルカルボキシアニリド化合物に関係する新規な殺節足動物の組成物および方法が開示されている。そこに開示されている化合物である（Ｓ）−７−クロロ−２，５−ジヒドロ−２−［［メトキシカルボニル）［４−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ］カルボニル］インデノ［１，２−ｅ］［１，３，４］オキサジアジン−４ａ（３Ｈ）−カルボン酸メチル；一般名：インドキサカルブ、またはＤＰＸ−ＫＮ１２８は「リスク軽減」農薬としてＥＰＡによって登録されており、インドキサカルブはそれの米国ＥＰＡ  ＰＣコード０６７７１０によって識別することができ、またはＣＡＳ番号１７３５８４−４４−６、インドキサカルブ自体はノミ類などの寄生性昆虫に対する優れた活性を有しているが、マダニ類などの寄生性ダニに対してはより限定された活性を有する。インドキサカルブは、アクチビル（Ａｃｔｉｖｙｌ）（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）として局所処理用の動物薬製品として市販されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第５，４６２，９３８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
驚くべきことに、インドキサカルブおよびデルタメトリンの組み合わせが、向上した殺ダニ活性を生じること、ならびにノミ類などの寄生性昆虫に対する優れた活性を継続的に維持することが認められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記によれば、本発明は、動物に対する寄生性ダニ類の防除のための製品の製造におけるインドキサカルブおよびデルタメトリンの組み合わせの使用を包含する。
【０００７】
従って、本発明は、相乗的に有効な量でインドキサカルブおよびデルタメトリンを活性化合物として含む殺寄生虫組み合わせ剤を提供する。
【０００８】
さらに、本発明は、特には、特にイヌに対して局所投与した場合に、動物に対する寄生性ダニ類の防除のために特に、恒温動物に対する寄生性の昆虫およびダニ類と戦うためのそのような組み合わせの使用に関するものである。
【０００９】
１実施形態において、並行投与のための２種類の別個の製剤に、インドキサカルブおよびデルタメトリンが含まれる。
【００１０】
１実施形態において、インドキサカルブおよびデルタメトリンが２種類の別個の製剤に含まれ、デルタメトリンを含む製剤はデルタメトリンを含浸させた首輪の形態である。
【００１１】
別の実施形態において、インドキサカルブおよびデルタメトリンが、共通の（単一の）製剤に含まれている。
【００１２】
１実施形態において、デルタメトリンおよびインドキサカルブが、両方の活性剤を含浸させた首輪の形態で共通の（単一の）製剤に含まれる。
【００１３】
１実施形態において、インドキサカルブのデルタメトリンに対する重量比は、１〜１０から１０〜１である。
【００１４】
他の実施形態において、インドキサカルブとデルタメトリンの間の重量比は、約１〜１０００から約１０００〜１、約１〜５００から約５００〜１、約１〜３００から約３００〜１、約１〜１００から約１００〜１、約１〜５０から５０〜１または約１〜２５から２５〜１、約１〜１０から１０〜１、約１〜５から５〜１、約１〜３から約３〜１、約１〜２．５から２．５〜１または約１〜１であることができる。
【００１５】
１実施形態において本発明は、上記組み合わせ剤および医薬として許容される担体を含む殺寄生虫性組成物に関するものである。
【００１６】
別の実施形態において本発明は、単一の組成物もしくは別個の中組成物中のインドキサカルブおよびデルタメトリンならびに動物に対する寄生性の昆虫およびダニの侵入の防除のための説明書を含む、動物における昆虫および／またはダニ類の寄生虫感染症の治療で有用なキットに関するものである。
【００１７】
さらに本発明は、処置を必要とする動物に有効な量の上記組み合わせを動物に対して投与することを含む、寄生虫による侵入に対して動物を保護する方法に関するものである。
【００１８】
さらに本発明は、処置を必要とする動物に有効な量の上記組み合わせを動物に対して投与することを含む寄生虫の侵入を受けた動物の処置方法であって、特には、インドキサカルブおよびデルタメトリンを共通の製剤で一緒に同時に、または同時もしくは連続して別個の製剤で投与する方法に関するものである。
【００１９】
下記において、本発明についてさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】
【図２】
【図３】
【発明を実施するための形態】
【００２１】
動物健康上の用途
本発明は、インドキサカルブおよびデルタメトリンの殺寄生虫組み合わせ剤を包含する。これら有効成分の組み合わせが、マダニ類およびダニ類などのダニ類に対する活性（防除）およびマダニ類およびノミ類に対する長期活性（防除）の開始を大幅に促進する相乗効果を生じることが認められている。インドキサカルブ単独ではマダニ類およびダニ類などのダニ類に対して限られた活性を有し、デルタメトリン単独ではノミ類などの寄生性昆虫に対して限定的かつ短い期間を有することから、これは予想外である。驚くべきことに、デルタメトリンと組み合わせたインドキサカルブが、これら寄生虫に対する殺虫活性を大幅に促進することが認められていることから、それは優れた防除を提供する。さらに、ノミ類などの寄生性昆虫に対する当該組み合わせの使用において、インドキサカルブ活性は、デルタメトリンによって陰性の影響を受けていない。
【００２２】
上記に記載のように、本発明は、インドキサカルブおよびデルタメトリンの組み合わせならびにノミ類などの寄生性昆虫に対するインドキサカルブの活性に対する有害効果を生じることなく向上した殺ダニ活性を提供する上で有効な濃度でのインドキサカルブおよびデルタメトリンの組み合わせを含む組成物の使用に関するものである。インドキサカルブおよびデルタメトリンのいずれもナトリウムチャンネル遮断剤および／または調節剤系殺虫剤であるが、それらが昆虫のナトリウムチャンネルを変える方法は異なっている。
【００２３】
インドキサカルブについての系統的化学名は、（Ｓ）−メチル７−クロロ−２，５−ジヒドロ−２−［［（メトキシカルボニル）［４−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ］カルボニル］インデノ［１，２−ｅ］［１，３，４］オキサジアジン−４ａ（３Ｈ）−カルボキシレートである。インドキサカルブは、ナトリウムチャンネル上のある部位への結合ならびに神経機能障害、摂食停止、麻痺および死亡を生じる神経細胞へのナトリウムイオン流の遮断によって殺す。インドキサカルブは前駆殺虫剤であり、それは最初に代謝されて毒性となるべきものである。農薬活性エナンチオマーＤＰＸ−ＫＮ１２８は、主として摂取後に昆虫の腸内およびその付近の酵素によって急速に分解されて、さらにより殺虫活性の高い代謝物であるＩＮ−ＪＴ３３３となり、それは文献においてＤＣＪＷまたは（７−クロロ−２，５−ジヒドロ−２−［［［４−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ］カルボニル］インデノ−［１，２−ｅ］［１，３，４］オキサジアジン−４ａ（３Ｈ）−カルボン酸メチル）とも称される。その変換を完了させる上で、エステラーゼまたはアミダーゼが必要である。ＩＮ−ＪＴ３３３はナトリウムチャンネル遮断においてインドキサカルブより有効であることで、親化合物より高い毒性となる。
【００２４】
デルタメトリンなどのＩＩ型ピレスロイド類は、ナトリウムチャンネル活性化ゲートのゲーティング効果を遅延させるα−シアノ基を有する。これによってナトリウムに対する神経の長期浸透性が生じ、感覚器官、感覚神経および筋肉における一連の反復神経シグナルが生じる。
【００２５】
驚くべきことに、インドキサカルブおよびデルタメトリンの組み合わせによって、寄生性昆虫、例えばノミ類に対するインドキサカルブの活性を維持しながら、向上した殺ダニ活性が得られる。当該二種類の化合物を最初に投与して、デルタメトリン単独より早いダニ類殺害を生じさせ、次に再度、デルタメトリン単独の効果が低下し始める有効処置期間終了後に再度投与すると、前記向上した活性は最も顕著である。
【００２６】
本発明の組成物は、シラミ、ハエ類およびノミ類、マダニ類およびダニ類および他の感受性昆虫の前提防除（ｐｒｅｍｉｓｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として、動物での寄生性ダニ類および寄生性昆虫、特にマダニ類、ダニ類およびシラミ、ハエ類およびノミ類の防除にも特に好適である。
【００２７】
「動物」という用語は、ヒトなどの全ての恒温動物を含むものである。
【００２８】
本明細書において「防除」または「防除する」という用語は、好ましくは少なくとも８０％が数日以内に、そして好ましくは投与から２日以内に死亡する程度まで昆虫およびダニ類を殺すことで、昆虫およびダニ類を無害化することを意味する。その好ましい実施形態では、処理標的に昆虫および／またはダニ類を寄生させる。本発明の実施において、当該組成物をいずれか簡便な方法で投与することができる。
【００２９】
本明細書で使用される「戦う」という用語は、動物またはそれの直接の環境にすでに存在する昆虫およびダニ類を防除し、ならびにそのような寄生虫による動物の実質的侵入を防止することを意味する。「実質的」侵入とは、宿主動物が侵入の症状を示すものである。
【００３０】
インドキサカルブおよびデルタメトリンを別個の製剤で個別に投与する場合、それらは並行して投与される。「並行」とは、有効成分を同時点で、すなわち同時に投与できることを意味する。
【００３１】
インドキサカルブおよびデルタメトリンは、順次、すなわち相次いで投与しても良く、すなわち、宿主生命において、それらがいくら遅くとも一定の期間にわたり一緒に存在するようにして、所望の効果を生じるようにすることができる。
【００３２】
組み合わせという用語は、一緒にまたは別個であるが並行して、２種類の有効成分を投与する使用法を意味する。
【００３３】
１実施形態では、有効成分を同時に投与する。１実施形態では、インドキサカルブおよびデルタメトリンの組み合わせが、単一の製剤に両方の化合物を含む単一製剤として提供される。
【００３４】
本発明による組成物を形成するためには、有効成分を本当の混合物として製剤中に存在させることができるが、それらは別個の製剤で個別に投与することもでき、宿主生命の体表または体内にある時にのみ混合物を形成するようにしても良い。
【００３５】
活性化合物の投与は、直接または好適な製剤の形態で行う。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態において、本発明の組み合わせを含む組成物を皮膚投与／局所投与する。
【００３７】
このための代表的組成物には、ポアオン、スポットオン、液浸、噴霧、ムース、シャンプー、粉末製剤、ゲル、ヒドロゲル、ローション、液剤、クリーム、軟膏、ダスト粉、包帯、泡剤、フィルム、皮膚貼付剤、首輪、耳標、メダリオン、絆創膏などがある。耳に組成物を直接投与することで、耳ダニ類を防除することができる。インドキサカルブを含む有用な局所組成物は、米国特許公開２０１０００９９６６８に開示されている。Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈによって販売されている局所製剤（ＡＣＴＩＶＹＬ（登録商標））は購入することができる。
【００３８】
別の好ましい実施形態では、局所投与は、首輪、メダリオン、耳標、身体部分で固定するためのバンド、ならびに接着性の帯片およびホイルなどの化合物を含む成形品の形態で行う。
【００３９】
そのような一つの実施形態は、別個の組成物中にまたは同一組成物中で一緒にデルタメトリンおよびインドキサカルブの徐放を提供するポリマー製の首輪、耳標および他の固体組成物を利用する。他のポリマーを用いることができるが、好ましい組成物は多くの場合、比較的高レベルの溶媒和可塑剤と組み合わせたポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）または他のビニルポリマーを含む。使用される可塑剤の量は多くの場合、乾燥および流動性混合物をなおも維持しながら可能な最大量である。別個に、有効成分を、米国特許第５，４３７，８６９号に記載のように、リン酸トリフェニル（ＴＰＰ）などの固体有効成分担体と混合する。
【００４０】
注意すべきものは、塩化ビニル、酢酸ビニル、アクリレートなどのビニルモノマーのポリマーおよびコポリマーである。そのようなポリマーは米国特許第３，３１８，７６９号および３，８５２，４１６号に記載されており、本発明での使用に好適である。そのような本発明のポリマー有害生物防除システムで使用される溶媒和可塑剤は多くの場合、ポリマー有害生物防除システムで従来用いられる液体可塑剤である。これらには、フタル酸ジオクチルなどのフタル酸エステル類、アジピン酸ジオクチルなどのアジピン酸エステルなどがある。デルタメトリンおよび／またはインドキサカルブのリン酸フェニルに対する至適比率は、活性剤の放出速度を測定することで通常の実験によって容易に求められる。
【００４１】
注意すべきものは、デルタメトリンおよび／またはインドキサカルブおよびリン酸トリフェニルが組成物に少なくとも１：１で組み込まれた組成物、またはデルタメトリンの濃度の少なくとも２倍もしくは数倍のモル濃度で組み込まれており、ポリマー基材がビニルポリマーもしくはコポリマーである組成物である。
【００４２】
４％デルタメトリン単独を含む首輪などの１例が、Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈによって商標名ＳＣＡＬＩＢＯＲ（登録商標）下に販売されている。
【００４３】
製剤の１例を以下に示してある。
【００４４】
【表１】
2014517014.tif 000003
本発明の１実施形態において、有効成分を別個の製剤としてまたは一緒に同時投与した時に、相乗的結果が得られる。
【００４５】
本発明による組成物はさらに、医薬としてまたは動物薬として許容される担体を含む。動物薬として許容される担体内に含まれていても良い成分もしくは化合物の例には、溶媒、結晶化阻害薬、抗酸化剤、補助剤、共溶媒、着色剤、界面活性剤、オイル類、光安定剤、粘着付与剤、懸濁剤、推進剤、増量剤および香味促進剤もしくはマスク剤などがある。そのような担体は、液体、固体または半固体であることができる。当該組成物は従来のように、「Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（２０版、２０００）（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載のような当業界で公知の生理的に許容される製剤賦形剤をさらに含む。そのような成分、担体および賦形剤はいずれも、使用される量で実質的に医薬としてもしくは動物薬として純粋かつ無毒性でなければならず、有効成分と適合性でなければならない。
【００４６】
「寄生性の昆虫およびダニ」という用語は、一般に動物に侵入もしくは感染する昆虫およびダニ害虫などの外寄生生物を指す。そのような外寄生生物の例には、シラミ、ノミ類、蚊類、ダニ類、マダニ類、咬みつきもしくは迷惑ハエ類の卵、幼虫、蛹、若虫および成体段階などがある。特に重要なものは、双翅目（蚊科など）、ノミ類およびマダニ類の成体段階である。
【００４７】
その組み合わせは、寄生性昆虫、特にはノミ目（ノミ類）およびコナダニ（マダニ類およびダニ類）に対して特に有効である。スナバエ類および蚊類などの咬みつき害虫が想到される。驚くべきことに、当該組み合わせは、イヌのマダニ類、特にはクリイロコイタマダニに特に有効であることが認められている。インドキサカルブがマダニ類およびダニ類などのダニ類に対してほとんど活性を持たないことから、その結果は予想外であるが、デルタメトリンとそれとの組み合わせによって、これら寄生虫に対してかなり高い活性が得られる。さらに、ノミ類などの寄生性昆虫に対するインドキサカルブの顕著な活性は低下しない。
【００４８】
本発明による組成物はさらに、組み合わせの製造や効力を妨害しない忌避剤および昆虫成長調節剤（例えば、ピリプロキシフェン、メトプレン）などの他の有効成分をさらに含むことができる。
【００４９】
別の実施形態において、本発明は、動物への寄生性の昆虫およびダニの侵入の防除のための動物薬の製造におけるインドキサカルブおよびデルタメトリンの組み合わせの使用に関するものである。１実施形態において、当該組み合わせは、相乗量のインドキサカルブおよびデルタメトリンを含む。
【００５０】
予防的または治療的に有効量の上記で定義の組み合わせの施用または投与によって、寄生性昆虫またはダニ類の侵入からの動物の保護を得ることができる。
【００５１】
本発明の組み合わせは、それぞれ次の目および種の寄生性昆虫およびダニ類：ノミ類（ノミ目）、例えばネコノミ（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｆｅｌｉｓ）、イヌノミ（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｃａｎｉｓ）、ケオプスネズミノミ（Ｘｅｎｏｐｓｙｌｌａ  ｃｈｅｏｐｉｓ）、ヒトノミ（Ｐｕｌｅｘ  ｉｒｒｉｔａｎｓ）、スナノミ（Ｔｕｎｇａ  ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、およびヨーロッパネズミノミ（Ｎｏｓｏｐｓｙｌｌｕｓ  ｆａｓｃｉａｔｕｓ）、ハエ類、蚊類（双翅目）、例えばネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）、キンイロヤブカ（Ａｅｄｅｓ  ｖｅｘａｎｓ）、メキシコミバエ（Ａｎａｓｔｒｅｐｈａ  ｌｕｄｅｎｓ）、ハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｍａｃｕｌｉｐｅｎｎｉｓ）、アノフェレス・クルシアンス（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｃｒｕｃｉａｎｓ）、アノフェレス・アルビマナス（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ａｌｂｉｍａｎｕｓ）、ガンビアハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ）、アノフェレス・フリーボルニ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｆｒｅｅｂｏｒｎｉ）、アノフェレス・ロイコスフィラス（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｌｅｕｃｏｓｐｈｙｒｕｓ）、コガタハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｍｉｎｉｍｕｓ）、アノフェレス・クアドリマキュラータス（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｑｕａｄｒｉｍａｃｕｌａｔｕｓ）、ホホアカクロバエ（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ  ｖｉｃｉｎａ）、クリソミア・ベッジアナ（Ｃｈｒｙｓｏｍｙａ  ｂｅｚｚｉａｎａ）、クリソミア・ホミニボラキス（Ｃｈｒｙｓｏｍｙａ  ｈｏｍｉｎｉｖｏｒａｘ）、クリソミア・マセラリア（Ｃｈｒｙｓｏｍｙａ  ｍａｃｅｌｌａｒｉａ）、クリソプス・ディスカリス（Ｃｈｒｙｓｏｐｓ  ｄｉｓｃａｌｉｓ）、クリソプス・シラセア（Ｃｈｒｙｓｏｐｓ  ｓｉｌａｃｅａ）、クリソプス・アトランティクス（Ｃｈｒｙｓｏｐｓ  ａｔｌａｎｔｉｃｕｓ）、コクリオミイア・ホミニボラックス（Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ  ｈｏｍｉｎｉｖｏｒａｘ）、コルジルオビア・アントロポファガ（Ｃｏｒｄｙｌｏｂｉａ  ａｎｔｈｒｏｐｏｐｈａｇａ）、クリコイデス・フレンス（Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ  ｆｕｒｅｎｓ）、クレックス・ピピエンス（Ｃｕｌｅｘ  ｐｉｐｉｅｎｓ）、クレックス・ニゲリパルプス（Ｃｕｌｅｘ  ｎｉｇｒｉｐａｌｐｕｓ）、ネッタイイエカ（Ｃｕｌｅｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ）、クレックス・タルサリス（Ｃｕｌｅｘ  ｔａｒｓａｌｉｓ）、クリセタ・イノルナタ（Ｃｕｌｉｓｅｔａ  ｉｎｏｒｎａｔａ）、クリセタ・メラヌラ（Ｃｕｌｉｓｅｔａ  ｍｅｌａｎｕｒａ）、ヒトヒフバエ（Ｄｅｒｍａｔｏｂｉａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、ヒメイエバエ（Ｆａｎｎｉａ  ｃａｎｉｃｕｌａｒｉｓ）、ガステロフィルス・インテスチナリス（Ｇａｓｔｅｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、グロッシナ・モルシタンス（Ｇｌｏｓｓｉｎａ  ｍｏｒｓｉｔａｎｓ）、グロシナ・パルパリス（Ｇｌｏｓｓｉｎａ  ｐａｌｐａｌｉｓ）、グロシナ・ファスシペス（Ｇｌｏｓｓｉｎａ  ｆｕｓｃｉｐｅｓ）、グロシナ・タキノイデス（Ｇｌｏｓｓｉｎａ  ｔａｃｈｉｎｏｉｄｅｓ）、ノサシバエ（Ｈａｅｍａｔｏｂｉａ  ｉｒｒｉｔａｎｓ）、ハプロジプロシス・エクエストリス（Ｈａｐｌｏｄｉｐｌｏｓｉｓ  ｅｑｕｅｓｔｒｉｓ）、ヒッペラテス（Ｈｉｐｐｅｌａｔｅｓ）種、ヒポデルマ・リネアタ（Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ  ｌｉｎｅａｔａ）、レプトコノプス・トレンス（Ｌｅｐｔｏｃｏｎｏｐｓ  ｔｏｒｒｅｎｓ）、ルシリア・カプリナ（Ｌｕｃｉｌｉａ  ｃａｐｒｉｎａ）、ヒツジキンバエ（Ｌｕｃｉｌｉａ  ｃｕｐｒｉｎａ）、ヒロズキンバエ（Ｌｕｃｉｌｉａ  ｓｅｒｉｃａｔａ）、リコリア・ペクトラリス（Ｌｙｃｏｒｉａ  ｐｅｃｔｏｒａｌｉｓ）、マンソニア（Ｍａｎｓｏｎｉａ）種、イエバエ（Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、オオイエバエ（Ｍｕｓｃｉｎａ  ｓｔａｂｕｌａｎｓ）、ヒツジバエ（Ｏｅｓｔｒｕｓ  ｏｖｉｓ）、フレボトームス・アルゲンチペス（Ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｕｓ  ａｒｇｅｎｔｉｐｅｓ）、ソロフォラ・コロンビアエ（Ｐｓｏｒｏｐｈｏｒａ  ｃｏｌｕｍｂｉａｅ）、ソロフォラ・ディスコロール（Ｐｓｏｒｏｐｈｏｒａ  ｄｉｓｃｏｌｏｒ）、プロシムリウム・ミクスタム（Ｐｒｏｓｉｍｕｌｉｕｍ  ｍｉｘｔｕｍ）、サルコファガ・ヘモロイダリス（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ  ｈａｅｍｏｒｒｈｏｉｄａｌｉｓ）、サルコファガ（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ）種、シムリウム・ウィッタツム（Ｓｉｍｕｌｉｕｍ  ｖｉｔｔａｔｕｍ）、サシバエ（Ｓｔｏｍｏｘｙｓ  ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ）、タバヌス・ボビヌス（Ｔａｂａｎｕｓ  ｂｏｖｉｎｕｓ）、タバヌス・アトラタス（Ｔａｂａｎｕｓ  ａｔｒａｔｕｓ）、タバヌス・リネオラ（Ｔａｂａｎｕｓ  ｌｉｎｅｏｌａ）、およびタバヌス・シミリス（Ｔａｂａｎｕｓ  ｓｉｍｉｌｉｓ）、シラミ（シラミ目）、例えばアタマジラミ（Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ  ｈｕｍａｎｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ）、コロモジラミ（Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ  ｈｕｍａｎｕｓ  ｃｏｒｐｏｒｉｓ）、ケジラミ（Ｐｔｈｉｒｕｓ  ｐｕｂｉｓ）、ウシジラミ（Ｈａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ  ｅｕｒｙｓｔｅｒｎｕｓ）、ブタジラミ（Ｈａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ  ｓｕｉｓ）、ウシホソジラミ（Ｌｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ  ｖｉｔｕｌｉ）、ウシハジラミ（Ｂｏｖｉｃｏｌａ  ｂｏｖｉｓ）、ニワトリハジラミ（Ｍｅｎｏｐｏｎ  ｇａｌｌｉｎａｅ）、ニワトリオオハジラミ（Ｍｅｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｓｔｒａｍｉｎｅｕｓ）およびケブカウシジラミ（Ｓｏｌｅｎｏｐｏｔｅｓ  ｃａｐｉｌｌａｔｕｓ）；マダニ類および寄生性ダニ類（パラシチホルメス（Ｐａｒａｓｉｔｉｆｏｒｍｅｓ））：マダニ類（マダニ科）、例えばイキソデス・リシヌス（Ｉｘｏｄｅｓ  ｒｉｃｉｎｕｓ）、イキソデス・スカプラリス（Ｉｘｏｄｅｓ  ｓｃａｐｕｌａｒｉｓ）、イキソデス・ホロシクラス（Ｉｘｏｄｅｓ  ｈｏｌｏｃｙｃｌｕｓ）、西部クロアシマダニ（Ｉｘｏｄｅｓ  ｐａｃｉｆｉｃｕｓ）、リピセファルス・サングイネウス（Ｒｈｉｐｈｉｃｅｐｈａｌｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ）、デルマセントル・アンデルソニ（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ａｎｄｅｒｓｏｎｉ）、アメリカイヌカクダニ（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、アンブリオンマ・アメリカヌム（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）、アンブリオンマ・マクラタム（Ａｍｂｒｙｏｍｍａ  ｍａｃｕｌａｔｕｍ）、オルニトドルス・ヘルムシ（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｕｓ  ｈｅｒｍｓｉ）、オルニトドルス・ツリカタ（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｕｓ  ｔｕｒｉｃａｔａ）、ならびに寄生ダニ（中気門亜目）、例えば、イエダニ（Ｏｒｎｉｔｈｏｎｙｓｓｕｓ  ｂａｃｏｔｉ）およびワクモ（Ｄｅｒｍａｎｙｓｓｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｅ）、ケダニ亜目（Ａｃｔｉｎｅｄｉｄａ）（前気門亜目）およびコナダニ亜目（Ａｃａｒｉｄｉｄａ）（無気門亜目）、例えば、アカラピス（Ａｃａｒａｐｉｓ）種、チェイレティエラ（Ｃｈｅｙｌｅｔｉｅｌｌａ）種、オルニトチェイレティラ（Ｏｒｎｉｔｈｏｃｈｅｙｌｅｔｉａ）種、ミオビア（Ｍｙｏｂｉａ）種、ソレルガテス（Ｐｓｏｒｅｒｇａｔｅｓ）種、ニキビダニ（Ｄｅｍｏｄｅｘ）種、ツツガムシ（Ｔｒｏｍｂｉｃｕｌａ）種、リストロホラス（Ｌｉｓｔｒｏｐｈｏｒｕｓ）種、コナダニ（Ａｃａｒｕｓ）種、ケナガコナダニ（Ｔｙｒｏｐｈａｇｕｓ）種、ゴミコナダニ（Ｃａｌｏｇｌｙｐｈｕｓ）種、ハイポデクテス（Ｈｙｐｏｄｅｃｔｅｓ）種、プテロリクス（Ｐｔｅｒｏｌｉｃｈｕｓ）種、キュウセンヒゼンダニ（Ｐｓｏｒｏｐｔｅｓ）種、ショクヒヒゼンダニ（Ｃｈｏｒｉｏｐｔｅｓ）種、ミミヒゼンダニ（Ｏｔｏｄｅｃｔｅｓ）種、ヒゼンダニ（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ）種、ショウセンコウヒゼンダニ（Ｎｏｔｏｅｄｒｅｓ）種、トリヒゼンダニ（Ｋｎｅｍｉｄｏｃｏｐｔｅｓ）種、サイトジテス（Ｃｙｔｏｄｉｔｅｓ）種、およびラミノシオプテス（Ｌａｍｉｎｏｓｉｏｐｔｅｓ）種、虫（異翅目（Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒｉｄａ））：トコジラミ（Ｃｉｍｅｘ  ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ）、ネッタイトコジラミ（Ｃｉｍｅｘ  ｈｅｍｉｐｔｅｒｕｓ）、レジュヴァイアス・セニリス（Ｒｅｄｕｖｉｕｓ  ｓｅｎｉｌｉｓ）、サシガメ（Ｔｒｉａｔｏｍａ）種、ロドニウス（Ｒｈｏｄｎｉｕｓ）種、パンストロンギルス（Ｐａｎｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）種およびアリラス・クリタツス（Ａｒｉｌｕｓ  ｃｒｉｔａｔｕｓ）、シラミ亜目（Ａｎｏｐｌｕｒｉｄａ）、例えば、ケモノジラミ（Ｈａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ）種、ケモノホソジラミ（Ｌｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ）種、ヒトジラミ（Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ）種、ケジラミ（Ｐｈｔｉｒｕｓ）種およびソレノポテス（Ｓｏｌｅｎｏｐｏｔｅｓ）種、食毛目（Ｍａｌｌｏｐｈａｇｉｄａ）（アルンブリセリナ（Ａｒｎｂｌｙｃｅｒｉｎａ）亜目およびイスクノセリナ（Ｉｓｃｈｎｏｃｅｒｉｎａ）亜目）、例えば、トリメノポン（Ｔｒｉｍｅｎｏｐｏｎ）種、メノポン（Ｍｅｎｏｐｏｎ）種、トリノトン（Ｔｒｉｎｏｔｏｎ）種、ボビコラ（Ｂｏｖｉｃｏｌａ）種、ウェルニッキエラ（Ｗｅｒｎｅｃｋｉｅｌｌａ）種、レピケントロン（Ｌｅｐｉｋｅｎｔｒｏｎ）種、ハジラミ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｃｔｅｓ）種、およびフェリコラ種（Ｆｅｌｉｃｏｌａ）と戦う上で特に有用である。
【００５２】
その投与は、継続的であるか季節的であることができ、予防的および治療的の両方で行うことができる。
【００５３】
本発明はまた、動物での寄生虫と戦うための殺寄生虫的に有効量のインドキサカルブおよびデルタメトリンならびに許容される担体を含む組成物に関するものでもある。
【００５４】
本発明はまた、寄生虫による侵入および感染に対して動物を治療、防除、予防および保護する方法であって、殺寄生虫的に有効量の本発明の組み合わせまたはそれを含む組成物を、その動物に投与または施用することを含む方法も提供する。
【００５５】
本発明はまた、殺寄生虫的に有効量の本発明の組み合わせまたはそれを含む組成物を含む、寄生虫による侵入および感染に対して動物を治療、防除、予防および保護するための組成物の製造方法をも提供する。
【００５６】
本発明はまた、宿主動物に対する病原的結果を有する寄生虫病の治療および予防を意図した治療目摘記を有するそのような使用に関するものでもある。
【００５７】
インドキサカルブとのデルタメトリンの間の重量比は、約１〜１０００から約１０００〜１、約１〜５００から約５００〜１、約１〜３００から約３００〜１、約１〜１００から約１００〜１、約１〜５０から５０〜１または約１〜２５から２５〜１、約１〜１０から１０〜１、約１〜５から５〜１、約１〜３から約３〜１、約１〜２．５から２．５〜１または約１〜１であることができる。
【００５８】
本発明の別の態様は、動物における昆虫および／またはダニ類の寄生虫感染症の治療で有用なキットであって、動物での寄生性昆虫およびダニの侵入の防除のための単一の組成物もしくは別個の組成物でのインドキサカルブおよびデルタメトリンならびに説明書を含むキットである。
【００５９】
概して、本発明による組成物は、昆虫もしくはダニ害虫侵入を有する全ての種類の動物に投与することができる。製剤を投与を受ける者は、家畜動物、例えばヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギまたは家禽；実験室試験動物、例えばモルモット、ラットもしくはマウス；またはコンパニオン・アニマル、例えばイヌ、ネコ、ウサギ、フェレットもしくはウマであることができる。本発明による組成物は、コンパニオン・アニマル、例えばイヌ、ネコもしくはフェレットでの使用に特に好適である。
【００６０】
ゴキブリ防除
実施例で説明するように、インドキサカルブおよびデルタメトリンは、ゴキブリ神経細胞に投与した時に相乗効果を示す。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態は、ゴキブリ防除が必要であるか必要であると予想される場所、例えば害虫が侵入した構造、害虫侵入が予想される構造、またはこれらの構造に隣接する場所にインドキサカルブおよびデルタメトリンからなる農薬上有効量の組成物を投与することでゴキブリを防除する方法である。
【００６２】
本発明の別の実施形態は、ゴキブリ防除が必要であるか必要であると予想される場所に相乗的に有効量のインドキサカルブおよび相乗的に有効量のデルタメトリンを一緒にまたは順次、いずれかの順序で投与することを含むゴキブリの防除方法であって、インドキサカルブおよびデルタメトリンの投与重量比が約１〜１０００から約１０００〜１、約１〜５００から約５００〜１、約１〜３００から約３００〜１、約１〜１００から約１００〜１、約１〜５０から５０〜１または約１〜２５から２５〜１、約１〜１０から１０〜１、約１〜５から５〜１、約１〜３から約３〜１、約１〜２．５から２．５〜１または約１〜１であることができる防除方法である。
【００６３】
本発明の方法は、ワモンゴキブリおよびチャバネゴキブリなど（これらに限定されるものではない）のゴキブリ類の防除において特に有用である。
【００６４】
インドキサカルブおよびデルタメトリンの組み合わせの相乗的に有効量は、気象条件、土壌条件、施用形態、施用のタイミングなどに応じて変動し得る。
【００６５】
この本発明の方法は、多くの形態で農薬有効成分（ａｉ）を用いることができ、多くの場合、最も簡便には、使用直前に液体形態で調製される。そのような組成物の調製の一つの方法は、他の添加剤を含むかそれを含まない市販の形態での有効成分を、使用者が多量の水中で一緒に混和する「タンク混合」と称される。
【００６６】
使用直前のタンク混合に加えて、本発明の組成物は、使用前に水その他の希釈剤で希釈するより濃縮された一次組成物に製剤することができる。施用前に水系媒体中に分配されるか分配することができるそのような農薬製剤の例も、本発明の範囲に包含されるものであり、例えば、比較的粒径が大きい粒剤（例えば、８/１６または４/８ＵＳメッシュ）、マイクロエマルション、フロアブル剤、乳剤、水和剤、水溶性もしくは水分散性粒剤、粉末ダスト剤、カプセル懸濁液、乳化性粒剤、水系乳濁液、液剤またはこれらの組み合わせであり、それらはゴキブリおよび／またはクモの防除が望まれる区画への所望の施用形態に応じて用いられる。これらの製剤は、２種類の農薬を合計で０．１重量％、０．２重量％もしくは０．５重量％という少量から９５重量％以上という多量まで含むことができる。そのような組成物は、有効成分に加えて界面活性剤を含むことができ、そのような組成物の例を下記で挙げる。
【００６７】
当該農薬組成物は、水混和性溶媒に溶かした農薬を含み、分散剤を加えた分散性溶液の形態であることができる。あるいは、それは、分散剤と組み合わせた微粉砕粉末の形態で農薬を含むことができ、水と十分に混和して、ペーストもしくはクリームを得ることができ、それは所望に応じて、水中油型の乳濁液に加えて、水／油乳濁液中の２種類の農薬の分散剤を得ることができる。
【００６８】
あるいは、前記農薬組成物は、水その他の分散剤中で容易に分散可能な水溶性もしくは水分散性粒剤の形態であることができる。水溶性もしくは水分散性粒剤は通常、担体の吸収性に応じて約５％から８０％の農薬を含むように調製され、通常は分散を促進するために湿展剤、分散剤もしくは乳化剤も含み、保存剤を含むことができる。水溶性もしくは水分散性粒剤に代表的な担体には、フラー土、自然粘土、シリカ、および他の非常に吸収性が高く容易に湿る無機希釈剤などがある。例えば、有用な水溶性もしくは水分散性粒剤製剤は、２６．７１部の農薬、３０．９０部の硫酸アンモニウム、３０．８９部の陸成粘土、１０．００部の分散剤としてのリグノ硫酸ナトリウム、１．００部の湿展剤としてのコハク酸ナトリウムジオクチルおよび０．５０部の保存剤としてのクエン酸を含む。混合物を粉砕し、水で希釈してペーストを形成し、そのペーストの押出および乾燥を行って造粒する。
【００６９】
使用可能な他の選択肢は、タルク、自然粘土、珪藻土などの微粉砕固体、クルミ殻および綿実粉などの粉末；ならびに農薬用の分散剤および担体として作用する他の有機および無機固体と農薬の自由流動性混合物であるダスト剤である。これらの微粉砕固体は、約５０ミクロン未満の平均粒径を有する。本発明で有用な代表的なダスト製剤は、１．０部未満の農薬化合物および９９．０部のタルクを含むものである。
【００７０】
水その他の分散剤中に容易に分散する微粉砕粒子の形態での水和剤も本発明の農薬組成物に有用な製剤である。水和剤は最終的に、乾燥ダスト剤として、または水その他の液体中の乳濁液として、有害生物防除が必要な場所に施用される。水和剤用の代表的な担体には、フラー土、カオリン粘土、シリカ、および他の高度に吸収性で容易に湿る無機希釈剤などがある。水和剤は、担体の吸収性に応じて約５％から８０％の農薬を含むように調製され、通常は分散を促進するために少量の湿展剤、分散剤もしくは乳化剤も含む。例えば、有用な水和剤製剤は、８０．０部の農薬化合物、１７．９部のパルメット（Ｐａｌｍｅｔｔｏ）粘土、ならびに湿展剤としての１．０部のリグノ硫酸ナトリウムおよび０．３部のスルホン化脂肪族ポリエステルを含む。追加の湿展剤および／またはオイルをタンクミックスに加えることで、標的場所での分散を促進することが非常に多い。
【００７１】
本発明の実施で用いられる農薬組成物に有用な他の製剤は、水その他の分散剤中に分散可能な均質液体組成物である乳剤（ＥＣ）であり、完全に農薬化合物および液体もしくは固体乳化剤からなることができ、またはキシレン、高沸点芳香族ナフサ、イソホロンまたは他の非揮発性有機溶媒などの液体担体も含むことができる。農薬用途の場合、これらの濃厚剤を水その他の液体担体に分散させ、処理すべき区画に噴霧剤として施用する。農薬化合物の重量パーセントは、組成物を施用する方法に応じて変動し得るものであるが、組成物全体の０．５％から９５％の農薬化合物を含む。
【００７２】
フロアブル製剤も用いることができる。農薬化合物を液体担体、通常は水中に懸濁させること以外は、これらはＥＣと同様である。ＥＣなどのフロアブル剤は少量の界面活性剤を含むことができ、代表的には組成物全体の０．５重量％から９５重量％、代表的には１０重量％から５０重量％の範囲で農薬化合物を含む。例えば、有用なフロアブル製剤は、２２．０部の農薬化合物、２．６部のエトキシル化/プロポキシル化ブロックコポリマー界面活性剤、０．４部のリン酸エステル系界面活性剤、０．８部の増粘剤、６．０部の凍結防止剤、０．１の消泡剤、０．０５部の抗細菌剤および４４．０部の蒸留水を含む。農薬使用の場合、フロアブル剤は、水その他の液体媒体で希釈することができ、通常は処理区画に噴霧剤として施用される。
【００７３】
他の有用な製剤には、水、トウモロコシ油、灯油、プロピレングリコールその他の好適な溶媒などの比較的非揮発性の溶媒中の農薬化合物の懸濁液などがある。
【００７４】
これら農薬組成物のさらに別の有用な製剤には、アセトン、アルキル化ナフタレン類、キシレンその他の溶媒などの所望の濃度で完全に可溶性である溶媒中の農薬の単純な溶液などがある。農薬を低沸点分散剤溶媒担体の揮発性の結果として微粉砕型で分散させた加圧噴霧剤、代表的にはエアロゾルも使用可能である。
【００７５】
本発明の農薬組成物に有用な別の製剤は、米国特許第５，４３７，８６９号に記載の、または餌中の徐放製剤である。
【００７６】
環境によっては、２種類の製剤を組み合わせることが望ましい場合があり、例えば一方の農薬化合物は乳剤として使用され、第２の農薬化合物はこの乳剤中に粉剤として分散される。
【００７７】
従来の方法による所望の場所への直接施用のための組成物中の活性農薬（単独の活性成分として使用する場合）の濃度は、好ましくは組成物の０．００１重量％から１０重量％、特別には０．００５重量％から５重量％の範囲内であるが、４０％以下を含むより濃厚な組成物が望ましい場合がある。
【００７８】
本発明の組成物で用いることができる代表的な湿展剤、分散剤または乳化剤には、スルホン酸および硫酸アルキルおよびアルキルアリールならびにそれらのナトリウム塩；アルキルアリールポリエーテルアルコール類；硫酸化高級アルコール類；ポリエチレンオキサイド類；スルホン化動物オイルおよび植物オイル；スルホン化石油；多価アルコール類の脂肪酸エステルおよびそのようなエステルのエチレンオキサイド付加生成物；および長鎖メルカプタンおよびエチレンオキサイドの付加生成物などがあるが、それらに限定されるものではない。多くの他の種類の有用な界面活性剤は市販されている。使用される場合、界面活性剤は通常、組成物の１重量％から１５重量％を構成する。
【００７９】
下記の実施例によって本発明をさらに説明するが、本発明はそれらに原手宇されるものではなく、これら実施例において、別段の断りがない限り、全ての部およびパーセントは重量基準である。
【実施例】
【００８０】
実施例１
本試験の目的は、６ヶ月の期間にわたるイヌに対して皮膚投与されるインドキサカルブおよびデルタメトリンの併用での相対的なノミおよびマダニ防除を確認することにあった。この組み合わせを、インドキサカルブ単独およびデルタメトリン単独と比較した。
【００８１】
ＳＣＡＬＩＢＯＲ（登録商標）首輪を、製品パンフレットにある説明に従ってイヌに装着した。インドキサカルブの局所製剤を、下記の用量表に従って群３および４のイヌに投与した。
【００８２】
表１
【００８３】
【表２】
2014517014.tif 000004
４％デルタメトリン含浸首輪（ＳＣＡＬＩＢＯＲ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）を用いて、高い持続的効力で６ヶ月までにわたりスナバエ類（サシチョウバエ種）、蚊類（イエカ類）およびマダニ類の咬みつきからイヌを保護する。ノミ類に対する首輪の直接効力は不十分であることが知られている。この試験は、イヌに対するネコノミ（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｆｅｌｉｓ）ノミ類およびクリイロコイタマダニ（Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ）マダニ類の長期防除のための製剤「ＡＣ」として米国特許公開２０１０００９９６６８に記載のインドキサカルブスポットオン（Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  ＨｅａｌｔｈによってＡＣＴＩＶＹＬ（商標名）として販売）および４％デルタメトリン含浸首輪の同時使用の効力および安全性を評価するよう設計したものである。
【００８４】
当該試験は、それぞれイヌ８頭の四群で実施した。
【００８５】
・群１：陰性対照。
【００８６】
・群２：第０日に、Ｓｃａｌｉｂｏｒ（登録商標）首輪をイヌに装着した。
【００８７】
・群３：第０日、３０日、６０日、９０日、１２０日、１５０日および１８０日に、インドキサカルブの局所製剤をイヌに投与した（６ヶ月にわたり月１回）。
【００８８】
・群４：第０日に、イヌにＳｃａｌｉｂｏｒ（登録商標）首輪（４％デルタメトリン）を装着し、第０日、３０日、６０日、９０日、１２０日、１５０日および１８０日にインドキサカルブの局所製剤で処理した（６ヶ月にわたり月１回）。
【００８９】
処理（第０日）の２日前、次に試験を通じて各種日数で、イヌにノミ１００匹およびマダニ５０匹を実験的に付けた。
【００９０】
表２：試験手順
【００９１】
【表３】
2014517014.tif 000005
製品効果を計算する方法
下記式に従って各評価日に、各処理群についてマダニ類およびノミ類に対する効力を計算した。記録されたマダニおよびノミのカウントが小さく、ゼロでもあったことから、マダニおよびノミのカウントが正規分布に従わない可能性があることが予想された。従って、主要効力計算を算術平均ではなく幾何平均に基づくものとすることを決定した。それらの計算は、マダニまたはノミ（カウント＋１）データの幾何平均に基づいた。次に、その結果から１を引いて、各処理群の幾何平均に意味のある値を得た。しかしながら、算術平均に基づく効力計算も報告した。
【００９２】
マダニ類に対する効力パーセントを下記のように計算した。
【００９３】
効力（％）＝１００×（Ｇｍｃ−Ｇｍｔ）／Ｇｍｃ
式中、
Ｇｍｃ＝特定の時間点での対照群（群１）におけるイヌでの生存マダニ類（カテゴリー１−３）の幾何平均または算術平均数。
【００９４】
Ｇｍｔ＝特定時間点での処理群（群２、３および４）におけるイヌでの生存マダニ類（カテゴリー１−３；直接＋２日効力）および死亡した付着充血マダニ類（カテゴリー６；残り＞＋２日効力）の幾何平均または算術平均数。
【００９５】
ノミ類に対する効力パーセントを下記のように計算した。
【００９６】
効力（％）＝１００×（ｍｃ−ｍｔ）／ｍｃ
式中、
ｍｃ＝対照群（群１）での生存ノミの幾何平均
ｍｔ＝処理群（群２、３および４）での生存ノミの幾何平均。
【００９７】
各種評価日についてのマダニおよびノミのカウントに関する記述統計（平均、最小値、最大値、標準偏差、ＣＶ％、幾何平均および中央値）を計算し、表作成した。
【００９８】
結果
マダニのカウント
５試験群における各種評価日での算術平均および幾何平均マダニカウントを表３にまとめてある。陰性対照群について記録された算術平均マダニカウントは、２０．９から３０．６の範囲であり、全ての評価日で活発なマダニによる攻撃があることを示している。
【００９９】
効力データ：クリイロコイタマダニ（Ｒ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ）
クリイロコイタマダニ（Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ  ）マダニ類に対する実験的動物薬製品で処理した群についての算術平均および幾何平均に基づく効力値（％）を、表３および図１にまとめてある。
【０１００】
幾何平均に基づく効力を一次とみなした。直接効力（＋２日）＞９０％を、群４のみについて記録した（９３．３％）。９０％を超える持続効力（＋１６日以降）を、＋１８４日まで群２（Ｓｃａｌｉｂｏｒ（登録商標）首輪）および群４（Ｓｃａｌｉｂｏｒ（登録商標）首輪およびインドキサカルブ）について記録した。しかしながら、群３（インドキサカルブ）については、クリイロコイタマダニ（Ｒ．  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ）マダニ類に対する直接および持続的な有効性は記録されなかった。
【０１０１】
ノミのカウント
５試験群における各種評価日についての算術および幾何平均ノミカウントが表５にある。陰性対照群について記録された算術平均ノミカウントは４３．３から８０．３の範囲であり、大半の算術平均カウントは＞ノミ５０匹であった。
【０１０２】
効力データ：ネコノミ（Ｃ．  ｆｅｌｉｓ）
（ネコノミ（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｆｅｌｉｓ））ノミ類に対する実験的動物薬製品で処理した群についての算術平均および幾何平均に基づく効力値（％）を表６にまとめてある。
【０１０３】
幾何平均に基づく効力を一次と見なした。群３（インドキサカルブ）および群４（Ｓｃａｌｉｂｏｒ（登録商標）首輪およびインドキサカルブ）について、直接効力（＋２日）＞９５％を記録した。＋１７７日まで、群３（インドキサカルブ）および群４（Ｓｃａｌｉｂｏｒ（登録商標）首輪およびインドキサカルブ）について、持続的効力（＋９日以降）＞９５％を記録した。＋６５日を除き、＋１７７日まで、群２（Ｓｃａｌｉｂｏｒ（登録商標）首輪）についてネコノミ（Ｃ．  ｆｅｌｉｓ）ノミ類に対する＜９５％効力を記録した。
【０１０４】
結論
インドキサカルブおよびデルタメトリンの組み合わせによって、デルタメトリン単独の場合と比較してマダニ類の殺虫が早くなった。その組み合わせにより、２日後までのマダニの死亡率は９３．３％であり、デルタメトリン単独では７６．９％であった。
【０１０５】
イヌに対する１回使い切りのＳｃａｌｉｂｏｒ（登録商標）首輪処理と組み合わせた月１回のインドキサカルブのスポットオン処理によって、存在するマダニ（クリイロコイタマダニ（Ｒ．  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ））およびノミ（ネコノミ（Ｃ．  ｆｅｌｉｓ））侵入に対する直接有効性９３．３％および９６．４％がそれぞれ得られた。
【０１０６】
インドキサカルブのスポットオンおよびＳｃａｌｉｂｏｒ（登録商標）首輪の組み合わせ処理によっても、マダニ類（クリイロコイタマダニ（Ｒ．  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ））およびノミ類（ネコノミ（Ｃ．  ｆｅｌｉｓ））に対する持続的有効性期間６ヶ月が得られた。しかしながら、併用投与しない上記の処理は、マダニ（Ｓｃａｌｉｂｏｒ（登録商標）首輪）またはノミ（インドキサカルブ）のみに有効であり、両方に有効ではなかった。
【０１０７】
処理に関係する副作用は認められなかった。
【０１０８】
表３：マダニのカウント
【０１０９】
【表４】
2014517014.tif 000006
表４：マダニ効力
【０１１０】
【表５】
2014517014.tif 000007
表５：ノミのカウント
【０１１１】
【表６】
2014517014.tif 000008
表６：ノミ効力
【０１１２】
【表７】
2014517014.tif 000009
実施例２
電気生理学試験
本試験の目的は、昆虫ニューロン標本に対するＤＣＪＷ（ＩＮ−ＪＴ３３３）、インドキサカルブの生理活性化代謝物、およびデルタメトリンの合わせた曝露の電気生理的効果を調べることにあった。
【０１１３】
ＤＣＪＷおよびデルタメトリンの両方がナトリウムチャンネル遮断薬および／または調節剤型殺虫剤であるが、それらが昆虫ナトリウムチャンネルを変える形態が異なる。薬理的相加性、相乗性または相互作用に関して、昆虫ニューロン標本に対するこの組み合わせの効果を調べるために本試験を実施した。
【０１１４】
昆虫において、親化合物インドキサカルブは加水分解酵素によって急速に生理活性化されて、Ｎ−脱カルボメトキシル化代謝物ＤＣＪＷ（ＩＮ−ＪＴ３３３）を生じ、それは鱗翅目（たばこスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ））幼虫運動神経標本におけるナトリウム依存性活動電位を遮断し、電圧依存性内向きナトリウム電流の用量依存性阻害を誘発することが知られている（Ｗｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８），  Ａｒｃｈ．  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ３７，  ９１−１０３；Ｌａｐｉｅｄ  ｅｔ．  ａｌ．，  ２００１；  Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５），  ＮｅｕｒｏＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ２６，  ４５５−４６５）。
【０１１５】
関連する加水分解酵素がこのイン・ビトロ系に存在しないことから、本試験ではＤＣＪＷを用いる。
【０１１６】
材料および方法
試験品目
ＤＣＪＷは、Ｅ．  Ｉ．  ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ  Ｄｅｌａｗａｒｅによって提供された。
【０１１７】
デルタメトリンは、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓ  Ｓ．Ａ．，  Ｒｕｅ  ｄｅ  Ｌｙｏｎｓ，  ２７４６０，  Ｉｇｏｖｉｌｌｅ，  Ｆｒａｎｃｅによって提供された。
【０１１８】
いずれの製品も環境温度で保存した。
【０１１９】
１２時間の明：１２時間の暗の光周期で２９℃に維持したストックコロニーから取った成体雄ゴキブリ（ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  Ａｍｅｒｉｃａｎａ））の腹部終神経節の背側正中線から単離された背側不対正中（ＤＵＭ）神経細胞体（Ｇｒｏｌｌｅａｕ  ａｎｄ  Ｌａｐｉｅｄ  （２０００），  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．，  ２０３，  １６３３−１６４８）で実験を行った。
【０１２０】
細胞単離
成体雄ゴキブリを、解剖皿上に背側を上にして固定した。背側クチクラ、腸およびいくつかの背側縦走筋を切除して、腹側神経索へのアクセスができるようにした。単対物双眼顕微鏡下に注意深く切開した腹部神経索およびそれの腹部終神経節（ＴＡＧ）を、通常の生理食塩水に入れた。酵素的消化およびＴＡＧの正中部の物理的分離を用いて無菌条件下に成体ＤＵＭ神経細胞体の単離を行った（Ｌａｐｉｅｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９），  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．，  １４４，  ５３５−５４９）。
【０１２１】
免疫−組織化学マッピングおよび電気生理学的記録と組み合わせたコバルト充填技術に基づいて、調べたＴＡＧ  ＤＵＭニューロンのほとんどが、比較的均一な細胞群を形成した（Ｌａｐｉｅｄ  ｅｔ  ａｌ．１９８９；Ｓｉｎａｋｅｖｉｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６），  Ｊ．  Ｃｏｍｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．，  ３６７，  １４７−１６３）。
【０１２２】
神経節を切除し、１．５ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ（Ｉ型、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｌａｋｅｗｏｏｄ，  ＮＪ）を補充したゴキブリ生理食塩水中で２９℃にて３５分間インキュベートした。酵素を十分に洗浄した後、先端熱加工パスツール・ピペットによって優しく繰り返し吸引することで、神経節を物理的に分離した。次に、単離したＤＵＭ神経細胞体を２９℃で２４時間維持してから、実験を行う。これらの条件下に、ＤＵＭ神経細胞体は、神経突起伸長を示さなかった。
【０１２３】
試験計画
単離された神経細胞体を、電気生理学試験に用いた。各試験について、単一の細胞体をＤＣＪＷ（１０−７Ｍ）単独でまたはデルタメトリン（１０−５Ｍ）との組み合わせで処理した。合計数６種類の異なる単離細胞体（６連）を各実験に用いた。
【０１２４】
デルタメトリンおよびＤＣＪＷ（ＩＮ−ＪＴ３３３）、原液（それぞれ１００ｍＭおよび１０ｍＭ）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，  Ｆｒａｎｃｅ）中で調製した。最終希釈液は、最大０．１％ＤＭＳＯを含んでいた。これらの溶媒濃度は、ＤＵＭニューロンの電気的活動に対する効果を持たないことが認められた。
【０１２５】
ゴキブリ食塩水中で調製したデルタメトリンおよびＤＣＪＷを、短期培養に維持された単離細胞体上に重力潅注システムによって別個に投与した。
【０１２６】
既報のように（Ｌａｐｉｅｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１）、ＤＵＭニューロンで発現される電圧依存性ナトリウムチャンネルは、用量依存的にＤＣＪＷに対して感受性である。これらの結果によれば、第１の実験を行って、ピーク内向きナトリウム電流の５０％阻害を生じる濃度に非常に近い濃度１０−７ＭでのＤＣＪＷ単独の効果の時間経過を調べた。
【０１２７】
ピーク内向きナトリウム電流の５０％阻害を生じる濃度として、１０−５Ｍでデルタメトリンを投与した（Ｐｅｌｈａｔｅ  ａｎｄ  Ｓａｔｔｅｌｌｅ  （１９８２），  Ｊ．  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ２８，  ８８９−９０３）。
【０１２８】
実験手順
電気生理学的記録
実験は、室温で行った（２０℃）。
【０１２９】
全細胞記録設定でのパッチクランプ技術（電圧固定条件）を用いて、電圧依存性内向きナトリウム電流を記録した。
【０１３０】
パッチピペットを、ＰＰ−８３電極抜取器（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）を取り付けたホウケイ酸ガラスキャピラリー管（ＧＣ１５０Ｔ−１０；Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，  Ｅｄｅｎｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）から抜き取った。ピペットは、０．９から１．１Ｍの範囲の抵抗を有する（電圧固定モード）。常にピペットと潅流溶液との間の液間電位差を補正してから、ギガオームシール＞２ＧΩを形成した。
【０１３１】
Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ａ増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）でシグナルを記録した。プログラマブル刺激装置（ＳＭＰ３１０；Ｂｉｏｌｏｇｉｃ，  Ｃｌａｉｘ，  Ｆｒａｎｃｅ）または１２５ｋＨｚ  ｌａｂｍａｓｔｅｒ  ＤＭＡデータ獲得システム（ＴＬ−１；Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に接続されたソフトウェア制御ｐＣｌａｍｐ８．０．３を搭載したＩＢＭコンピュータによって、段階摘記電圧パルスを発生させた。
【０１３２】
電圧固定実験の場合、ナトリウム電流を記録するのに使用されるプロトコールについては、既に別途報告されている（Ｌａｐｉｅｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０），  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．，  １５１，  ３８７−４０３）。補償後にパッチクランプ増幅器設定から各実験について直列抵抗値を得て、１．５から３ＭＷで変動した。
【０１３３】
細胞を−９０ｍＶの保持電位で電圧固定し、３０ｍｓ脱分極試験パルス（別段の断りがある場合を除く）を保持電位から、周波数０．１Ｈｚで印加して（サンプリング周波数３０ｋＨｚ）、内向きナトリウム電流を記録した。電気生理学的シグナルを、後のオフライン解析のためのコンピュータのハードディスクに記憶させた。
【０１３４】
結果評価および統計解析
パッチクランプ技術を用いて、自発的電気活動の各種相に関与する全てのイオンチャンネルの特性決定を行うことが可能である。それらの相当する生理機能については明らかにされており（Ｇｒｏｌｌｅａｕ  ａｎｄ  Ｌａｐｉｅｄ，  ２０００）、それによって、所定の膜標的に対する特定の殺虫剤の作用機序を確認することができる。
【０１３５】
各時間点について、相対ナトリウム電流振幅を、平均＋平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す（表２）。調べる殺虫剤の効果を推算するには、定常状態記録条件に相当する２０分での電流振幅のみを考慮する。
【０１３６】
電流振幅で認められる阻害効果を、阻害パーセントに変換した（１００％は対照電流振幅に相当する。）。
【０１３７】
統計解析に関しては、データの正規分布（またはガウス分布）をｐ＜０．０５の有意性でのコルモゴルフ・スミルノフ検定（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉ，  Ｌａｈａ，  ａｎｄ  Ｒｏｙ（１９６７）．  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）およびＲソフトウェア（Ｒバージョン２．９．０ソフトウェア）を用いて検定した。検定統計量Ｄが表から得られた臨界値Ｄα（ｎ）より大きい場合は（Ｄα（ｎ＝６）＝０．５２１；およびｎ＝８：Ｄα（ｎ＝８）＝０．４５７）、正規分布に関する仮説は拒絶されるべきものとした。
【０１３８】
データの度数分布がガウス分布であった場合、ステュデントｔ検定を用いなければならなかった（パラメトリック統計法）。正規分布に関する仮説が拒絶された場合は、マンホイットニー検定検定を用いなければならなかった（ノンパラメトリック統計法）。
【０１３９】
デルタメトリンおよびＤＣＪＷの同時投与に加えて、５分間にわたるデルタメトリン（１０−５Ｍ）による細胞体の前処理後に、ＤＵＭニューロンに対する混合物ＤＣＪＷ（１０−７Ｍ）およびデルタメトリン（１０−５Ｍ）の効果を評価した。
【０１４０】
結果
電圧依存性ナトリウム電流に対するＤＣＪＷ単独およびデルタメトリンとの同時投与の効果
経時的実験を行って、単独で、デルタメトリン１０−５Ｍと組み合わせて調べたＤＣＪＷ（１０−７Ｍ）による内向きナトリウム電流振幅の低下を測定した。
【０１４１】
１０−７Ｍ  ＤＣＪＷの外部投与後のナトリウム電流振幅は、処置２０分後に５９．３％（ＳＥＭ８．２％）であった。
【０１４２】
従って、電流振幅の阻害パーセントは４０．７％であった。
【０１４３】
ナトリウム電流振幅についてのＤＣＪＷとデルタメトリンとの間の可能な相互作用を調べるため、ＤＣＪＷおよびデルタメトリンの混合物を調べた。
【０１４４】
２０分で測定した混合物の阻害効果は、ＤＣＪＷ単独投与で認められた阻害より大きかった。その組み合わせの内向きナトリウム電流振幅は２０．０％±８．４％であった。従って、阻害パーセントは８０．０％であった。
【０１４５】
全ての値が、コルモゴロフ・スミルノフの正規性検定を合格した。従って、調べたＤＣＪＷ単独と混合物の間の電流阻害の差を、ステュデントの対応のないｔ検定によって比較した（表４）。その差は統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
【０１４６】
デルタメトリンによる前処理後の電圧依存性ナトリウム電流に対するＤＣＪＷの効果
デルタメトリン（１０−５Ｍ）による５分間の前処理後に、経時的実験を繰り返した。ＤＣＪＷ（１０−７Ｍ）およびデルタメトリン（１０−５Ｍ）の混合物によっても、ナトリウム電流振幅の有意な低下を生じた。これらの条件下での相対ナトリウム電流平均およびＳＥＭは、１１．１％＋５．７％であった。
【０１４７】
阻害効果は、前処理せずに得た値と非常に類似してした。すなわち前処理しない場合の８０．０％に対して８８．９％であった。
【０１４８】
前処理値は、コルモゴロフ・スミルノフの正規性検定を合格しなかった。従って、ＤＣＪＷ単独とデルタメトリン前処理と組み合わせたＤＣＪＷとの間の電流阻害を、マンホイットニー検定を用いて比較した。その差は統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
【０１４９】
結論
上記で示した結果には、デルタメトリンをＤＣＪＷと併用投与した場合に、ＤＣＪＷで認められるＤＵＭニューロンナトリウム電流振幅の低下がかなり強まることを示している（相乗効果）。
【０１５０】
ＤＣＪＷおよびデルタメトリンの両方が、特に昆虫の内向きナトリウム電流の電気生理学的特性に影響する。しかしながら、標的内で影響を受ける部位（すなわち、ナトリウムチャンネル）が類似していないことから、これら２種類の殺虫剤の作用機序は非常に異なっている。
【０１５１】
ＤＣＪＷは、ピラゾリン系殺虫剤であるインドキサカルブの生理活性化された代謝物である。ピラゾリン系殺虫剤は、偽性麻痺を特徴とする昆虫における代表的な急性神経毒性症状を生じる。この神経毒性効果は、そのような殺虫剤による毒作用を受ける昆虫の神経系における自発活動が全くないことに関連する。神経作用が全くないことは、ＤＣＪＷが電圧依存性ナトリウムチャンネルを遮断することを示しており、それは活動電位の開始および伝達に関与する。
【０１５２】
デルタメトリンは、キクの除虫菊抽出物中に存在する天然ピレトリン類の合成構造誘導体を含むピレスロイド殺虫剤である。デルタメトリンは、ピレスロイドＩＩ型分子である。これらピレスロイド類は、活動電位の抑制を伴う膜脱分極を引き起こす。電圧固定条件下に、ＩＩ型ピレスロイド類は、ナトリウムチャンネルの非活性化を阻害する。
【０１５３】
理論に拘束されるものではないが、ＤＣＪＷ単独投与と比較したＤＣＪＷおよびデルタメトリンの混合物の存在下に認められる電位は、細胞内シグナル伝達経路の関与によるナトリウムチャンネルの生物物理的特性を調節することを示唆している。
【０１５４】
さらに、これら殺虫剤を同時に投与する場合、デルタメトリンとＤＣＪＷとの間の相乗的相互作用が直接認められる。この効果は、ＤＵＭ神経細胞体を試験対象のデルタメトリン単独で前処理した場合に得られた効果と非常に類似している。これによって、前処理を行って相乗効果を得ることが必要ないことが確認された。対照的に、そのような前処理は、ピレスロイド類と抗コリンエステラーゼ性化合物との間の相乗効果を得る上で必要である。
【０１５５】
実施例３
さらなる電気生理学的試験
本試験の目的は、ゴキブリ（ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  Ａｍｅｒｉｃａｎａ））ニューロン標本に対する、インドキサカルブのＮ−脱カルボメトキシル化代謝物、ＤＣＪＷ（ＩＮ−ＪＴ３３３）およびデルタメトリンの組み合わせ曝露の電気生理学的効果のさらなる特性決定を行うことにあった。
【０１５６】
特に、これらの実験は、パッチクランプ技術を用いて、ニューロン電圧依存性ナトリウムチャンネルに対するＤＣＪＷの最も有効な阻害効果を生じさせる上でのデルタメトリンとインドキサカルブの間の至適比率を求めることを目的とするものであった。
【０１５７】
試験の第２の部分は、デルタメトリンとメタフルミゾン（ＤＣＪＷの作用機序と非常に類似した作用機序を有すると予想されるセミカルバゾン系殺虫剤である）との間の可能な相互作用を調べることであった。これらの結果を、混合物デルタメトリン−ＤＣＪＷで得られた結果と比較した。
【０１５８】
デルタメトリンの濃度上昇（１０−７Ｍ、３．１０−７Ｍ、６．１０−７Ｍ、１０−６Ｍ、３．１０−６Ｍおよび１０−５Ｍ）と組み合わせて、ＤＣＪＷ（１０−７Ｍ）をこのモデルで調べた。
【０１５９】
第２段階で、ＤＣＪＷの濃度上昇（１０−１０Ｍ、１０−９Ｍ、３．１０−９Ｍ、１０−８Ｍ）と組み合わせて、デルタメトリン（３．１０．６Ｍ）を調べた。
【０１６０】
最後に、濃度上昇させたメタフルミゾン（１０−１０Ｍ、１０−９Ｍ、１０−８Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍおよび１０−５Ｍ）を、単独でまたはデルタメトリンと組み合わせて調べた。
【０１６１】
材料および方法
試験項目
実施例２に記載のようにＤＣＪＷおよびデルタメトリンを入手した。
【０１６２】
メタフルミゾン：（ＥＺ）−２０１２−（４−シアノフェニル）−１−（ａ，ａ，ａ−トリフルオロ−ｍ−トリル）エチリデン（ｔｏｌｙｐｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ）］−４−（トリフルオロメトキシ）カルバニロヒドラジドは試薬用であった。
【０１６３】
細胞単離
実施例２に記載の方法に従って細胞単離を行った。
【０１６４】
試験計画
６から９種類の異なる単離神経細胞体（試験数）について、各電気生理学的試験を行った。
【０１６５】
各試験について、下記の表７に記載のように、殺虫剤単独または２種類の化合物の同時組み合わせに細胞体を曝露した。
【０１６６】
表７：試験計画
【０１６７】
【表８】
2014517014.tif 000010
デルタメトリン、メタフルミゾンＥ／ＺおよびＤＣＪＷの原液（１００ｍＭおよび１０ｍＭ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，  Ｆｒａｎｃｅ）に溶かし、メタフルミゾンＥ／Ｚのように実施例２に記載の方法に従って希釈した。
【０１６８】
実験手順
電気生理学的記録
実施例２に記載の方法に従って、電気生理学的記録を行った。
【０１６９】
結果評価および統計解析
実施例２に示したように、パッチクランプ技術によって、自発電気活性の各種相に関与する全てのイオンチャンネルの特性決定が可能である。それらの相当する生理機能を明瞭に確認し、それによって、所定の膜標的に対する特定の殺虫剤の作用機序を調べることが容易となる。
【０１７０】
既報のように（Ｌａｐｉｅｄ  ｅｔ．  ａｌ．  （２００１），  Ｂｒｉｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  １３２，  ５８７−５９５；Ｌａｖｉａｌｌｅ−Ｄｅｆａｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）、ＤＵＭニューロンで発現される電圧依存性ナトリウムチャンネルは、用量依存的にＤＣＪＷに対して感受性である。これらの結果に基づいて、第１の実験を行って、ピーク内向きナトリウム電流の５０％阻害を生じる濃度に非常に近い濃度１０−７ＭでのＤＣＪＷ単独の効果の経時的経過を調べた。
【０１７１】
実施例２の場合のように、各時間点について、相対ナトリウム電流振幅を、平均＋平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。調べる殺虫剤の効果を推算するには、定常状態記録条件に相当する２０分での電流振幅のみを考慮する。
【０１７２】
ナトリウム電流振幅で認められる阻害効果を、阻害パーセントに変換した（１００％は対照電流振幅に相当する。）。
【０１７３】
統計解析に関しては、データの正規分布（またはガウス分布）をｐ＜０．０５の有意性でのコルモゴルフ・スミルノフ検定（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９６７）およびＲソフトウェア（Ｒバージョン２．９．０ソフトウェア）を用いて検定した。検定統計量Ｄが表から得られた臨界値Ｄα（ｎ）より大きい場合は（例えば、Ｄα（ｎ＝６）＝０．５２１）、正規分布に関する仮説は拒絶されるべきものとした。
【０１７４】
データのガウス分布については、一元配置ＡＮＯＶＡを用いなければならなかった（パラメトリック統計法）。正規分布に関する仮説が拒絶された場合は、マンホイットニー検定検定を用いなければならなかった（ノンパラメトリック統計法）。
【０１７５】
結果
ＤＣＪＷ効果の最大強化を得るのに必要なデルタメトリンの最小濃度の測定
１０−７ＭのＤＣＪＷと１０−７Ｍ、３．１０−７Ｍ、６．１０−７Ｍ、１０−６Ｍ、３．１０−６Ｍおよび１０−５Ｍのデルタメトリンとの同時投与後の対照電流（１００％）から測定された残留ナトリウム電流振幅のパーセントは、２０分の処理後に、それぞれ５４．２±４．０、５１．９±７．６、４０．３±７．６、２９．８±７．４、２３．３±６．７および２０．０±８．４％であった。片対数用量応答曲線を図２に示す。従って、電流振幅の阻害の相当する真のパーセントは、４５．８、４８．２、５９．７、７０．３、７６．７および８０．０％であった。全ての値が、コルモゴルフ・スミルノフ正規性検定を合格した。
【０１７６】
デルタメトリン効果の最大強化を得るのに必要なＤＣＪＷの最小濃度の測定
３．１０−６Ｍのデルタメトリンならびに１０−１０、１０−９、３．１０−９、１０−８および１０−７のＤＣＪＷの同時投与後の対照（１００％）から測定した残留ナトリウム電流振幅のパーセントは、処理２０分後でそれぞれ５６．４±６．１、５６．３±３．４、３８．４±５．９、２５．４±４．７および２３．３±６．７％であった。片対数用量応答曲線を図３に示してある。
【０１７７】
従って、電流振幅の阻害の相当する真のパーセントは、４３．６、４３．９、６１．６、７４．６および７６．７％であった。全ての値が、コルモゴルフ・スミルノフ正規性検定を合格した。
【０１７８】
ＤＣＪＷ単独、デルタメトリン単独および最も有効な比率のＤＣＪＷ／デルタメトリン混合物による処理から２０分後に記録されたナトリウム電流振幅の阻害のパーセントの比較
ＤＣＪＷ／デルタメトリンの最も有効な比率は、ＤＣＪＷ１０−８Ｍ／デルタメトリン３．１０−６Ｍであると測定された。
【０１７９】
単独で調べたＤＣＪＷ（１０−７Ｍ）、デルタメトリン（１０−５Ｍ）と混合物（デルタメトリン３．１０−６Ｍ、ＤＣＪＷ１０−８Ｍ）の間の電流阻害の差をＡＮＯＶＡによって比較した。１／１０のＤＣＪＷおよび１／３のデルタメトリンを含むこの混合物は、いずれかの薬剤単独より有意に有効であった。そうして、実施例２で認められた相乗的結果が確認された。
【０１８０】
デルタメトリンとメタフルミゾンＥ／Ｚの間の可能な相互作用の特性決定
各種濃度でのメタフルミゾンＥ／Ｚの浴投与を、単離したＤＵＭニューロンに行い、ナトリウム電流振幅の低下を生じた。各種濃度で認められた電流振幅における低下は統計的に有意ではなかったことから、その効果は用量依存的ではなかった。
【０１８１】
次に、本発明者らは、最も有効な濃度のデルタメトリン（３．１０−６Ｍ）と組み合わせたメタフルミゾンＥ／Ｚ（１０−８Ｍおよび１０−７Ｍ）の効果を調べた。調べたいずれの濃度でも、統計的有意差は認められなかった。
【０１８２】
結論
これらの結果を総合すると、デルタメトリンをＤＣＪＷと組み合わせた場合に、ナトリウム電流振幅に対して統計的に相乗的な効果があったことが示された。
【０１８３】
ＤＣＪＷ（１０−７Ｍで使用）の効果を強く高める上で必要な最小デルタメトリン濃度は、３．１０−６Ｍであると測定された。すなわち、その最小デルタメトリン濃度を用いた場合（すなわち、３．１０−６Ｍ）、ＤＣＪＷの最大効果は、デルタメトリンの非存在下と比較して、１／１０より低い濃度について得られた。理論に拘束されるものではないが、認められた片対数用量−応答曲線は、ＤＣＪＷ効力を上昇させるナトリウムチャンネルに対するデルタメトリンの陽性アロステリック効果を示唆している。
【０１８４】
メタフルミゾンＥ／Ｚ単独およびデルタメトリンと組み合わせたものの効果を調べるように、並行実験を計画した。メタフルミゾンおよびＤＣＪＷの類似の作用機序を考慮して驚くべきものである統計的に有意な効果を、本発明者らは認めなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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