(57)【要約】  本発明は、免疫炎症性の肺疾患の処置における使用のための、ＳＴ２またはその一部を発現するために改変されている間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に関する。ここで、上記間葉系幹細胞は、ヒトの胚性幹細胞ではない。また、本発明は、上記間葉系幹細胞を含んでいる薬学的組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
気道の免疫炎症性疾患および肺疾患の処置における使用のための間葉系幹細胞（ＭＳＣ）であって、ｓＳＴ２またはその機能的なバリアントを発現するために遺伝学的に改変されており、ヒトの胚性幹細胞ではない、間葉系幹細胞。
【請求項２】
ｓＳＴ２またはその機能的なバリアントの発現をコードしている核酸を備えているベクターを含んでいる、気道の免疫炎症性疾患および肺疾患の処置における使用のための、請求項１に記載の間葉系幹細胞。
【請求項３】
上記気道の免疫炎症性疾患および肺疾患は、（１）急性の肺損傷、（２）慢性の気管支炎、肺気腫、気管支拡張症および細気管支炎を包含している慢性の閉塞性肺疾患、（３）急性の呼吸窮迫症候群、（４）喘息、（５）過敏性肺炎、ならびに（６）肺線維症から選択される、気道の免疫炎症性疾患および肺疾患の処置における使用のための、請求項１または２に記載の間葉系幹細胞。
【請求項４】
上記ＭＳＣは、単細胞懸濁物、単細胞マイクロ担体または単細胞球状体の形態である、気道の免疫炎症性疾患および肺疾患の処置における使用のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞。
【請求項５】
上記処置に使用される方法は、投与の非経口または肺の経路による上記幹細胞の投与を包含している、気道の免疫炎症性疾患および肺疾患の処置における使用のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞。
【請求項６】
上記非経口の投与は、静脈内、胸膜内または動脈内の経路を介する、気道の免疫炎症性疾患および肺疾患の処置における使用のための、請求項５に記載の間葉系幹細胞。
【請求項７】
上記ＭＳＣは脂肪組織から得られている、気道の免疫炎症性疾患および肺疾患の処置における使用のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞を含んでいる、気道の免疫炎症性疾患および肺疾患の処置における使用のための、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は、改変された幹細胞および治療的なその使用の分野に関する。
【０００２】
〔発明の背景〕
急性肺損傷（ＡＬＩ）および急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳとしても知られており、より重篤なＡＬＩの発現を示す）は、びまん性の細胞湿潤およびタンパク性の浮腫を伴う（Ware LB. The ARSD. NEJM 2000; 34: 660-1）。この事実は、肺の構造自体を変える液性および細胞性のメディエータの活性化をともなう明らかな炎症状態を反映しており、肺のガス交換に深刻な障害を引き起こす。ＡＬＩ／ＡＲＤＳは、肺内部の過程（細菌性もしくはウイルス性肺炎、呼吸、ガス吸入、肺移植における移植片機能不全、嚢胞性線維症・・・）および肺外部の過程（敗血症、すい炎、大量輸血など）の両方を原因とするが、より頻度高い原因は、細菌性の肺炎である。
【０００３】
ＡＬＩおよびＡＲＤＳによる死亡率および罹患率の低下に関して、対症的な看護、詳細には肺保護換気および体液保存戦略の改善によって、顕著な進歩を見せている。しかし、依然として死亡率および罹患率は、容認できないほど高い。実際に、米国において、ＡＬＩを原因とする死亡者数は、毎年７５，０００名にのぼり、入院日数は３６０万日におよぶ（Rubenfeld GO. Incidence and outcome of ALI. NEJM 2005; 353: 1685-93）。これらのデータは、ＡＬＩが公衆衛生に重大な影響を有していることを証明している。さらに、薬理療法は、結果の改善に成功していない。
【０００４】
本発明に関連する別の肺疾患は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。ＣＯＰＤは、Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease（ＧＯＬＤ）にしたがって、しばしば進行性であり、有害な粒子またはガスに対する肺の異常な炎症反応と関連する持続性の気流量の制限と規定されている（Rabe KF et al. GOLD executive summary. Am J Respir Crit Care Med 2007;176:532-555）。ＣＯＰＤの病因は、不可逆的な事象（例えば、上皮細胞のアポトーシス、ならびに末端の気室および肺の細胞外マトリクスのタンパク質分解）につながる炎症過程の増大によって特徴づけられる。興味深いことに、ＣＯＰＤの病因は肺外部に重大な影響をおよぼし、個体の患者の重篤化に寄与し得る。しかし、現実は、ＣＯＰＤは、類似の徴候を有している異種性の疾患の群であり、合併症（例えば、慢性気管支炎、肺気腫、喘息、気管支拡張症および細気管支炎）となり得る異種性の疾患過程を包含している。ＣＯＰＤの主要な原因は、たばこの煙（間接喫煙つまり受動喫煙が挙げられる）である。しかし、他のリスク要因としては、大気汚染、業務上受ける粉塵、および業務上受ける化学物質が挙げられる。ＣＯＰＤは、下気道感染の続発症として現われ得る。
【０００５】
ＣＯＰＤは疾病および死亡の主要原因の１である。ＣＯＰＤの流行およびＣＯＰＤによる死亡率は増加し続けており、今後も増加し続けると予測されている（Lopez AD et al. Chronic obstructive pulmonary disease: current burden and future projections. Eur Respir J 2006;27:397-412）。事実、２００５年には、８０００万人が中程度から重度のＣＯＰＤに罹患しており、３００万人以上がＣＯＰＤによって死亡している。この死亡者数は、全世界の死亡者数の５％に相当する（www.who.int）。世界保健機関による新たな２０３０年の予測によると、ＣＯＰＤは死亡原因の第３位になると予想されている（www.who.int）。さらに、ＣＯＰＤによる負担は上昇しており、世界中で保健医療の重荷になっている。
【０００６】
ＣＯＰＤの処置の対象は、肺機能の低下の加速を遅らせること、息切れおよびせきなどの症状を和らげること、日常の肺機能を向上させること、悪化を軽減すること、および生活の質を向上させることを包含している（Pauwels RA, Buist AS, Calverley PMA, Jenkins CR, Hurd SS, on behalf of the GOLD Scientific Committee. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease. NHLBI/WHO Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) workshop summary. Am J Respir Crit Care Med. 2001;163:1256-1276）。ＣＯＰＤを治療するために、多くの薬剤（例えば、気管支拡張薬およびステロイド）が利用可能である一方、疾患の進行を停止させる薬効を示した薬剤は一切ない。むしろ、利用可能な薬理療法は、本質的に対症的であり、現時点での薬物治療の対象は、症状を制御し続けることであり、ＣＯＰＤの悪化を防ぐことである。事実、喫煙によって引き起こされた肺気腫の場合、禁煙以外に具体的な治療法がないが、禁煙は、すでに罹患している疾患に対して部分的に有効なだけである。
【０００７】
本発明に関連するさらなる他の肺疾患は、喘息である。定義によると、喘息は、可逆性の気流量の制限を少なくとも部分的に伴う気道の異種起源の慢性炎症性疾患である。好ましくない健康状態は、喘鳴、呼吸困難、胸の圧迫感、および咳の繰返しの発症をもたらす（Global Initiative for Asthma (GINA)). Global strategy for asthma management and prevention. NIH publication number 95-3659a. Bethesda, National Institutes of Health, 1995）。喘息の定義は、４つのドメイン：可変性気道閉塞、気道炎症、気道過敏症、および下地になる疾患過程を特徴づけている症状を包含している。
【０００８】
おそらく、喘息の治療における最も重要な前進の１つは、症状の炎症性の要因が立証され、コルチコイドの吸引によって十分に治療されると明らかになったことだと言える。軽度の喘息を患い、コルチコステロイドを用いて処置されていない患者に対する初期病態の研究によって、気管支の粘膜における好酸球およびリンパ球の数が高いことが報告された。吸引によって高用量のコルチコステロイドを投与した後、これらの細胞数は大幅に減少し、全体的な肺機能が改善された（Djucanovic R, Wilson JW, Britten KM, Wilson SJ, Walls AF, Roche WR, Howarth PH, Holgate ST. Effect of an inhaled corticosteroid on airways inflammation and symptoms in asthma. Am Rev respir Dis 1992;256:669-674; Laitinen LA, Laitinen A, Haahtela T. A comparative study of the effects of an inhaled corticosteroid, budesonide, and a beta 2-agonist, terbutaline, on airways inflammation in newly diagnosed asthma: a randomized, double blind, parallel-group controlled trial. J Allergy Clin Immunol 1992;90:32-42）。
【０００９】
また、喘息の処置には、他の薬剤（例えば気管支拡張薬）が利用可能である。これらの処置はすべて、炎症を緩和させ得るが、完治させ得ない。さらに、炎症が緩和されているにもかかわらず、過剰応答を示す患者も存在した。このことは、喘息を治癒する効果が証明された薬剤は１つもないことを立証している。
【００１０】
本発明に関連するさらなる他の肺疾患は、過敏性肺炎である。過敏性肺炎は、それまでの感作の後に種々の抗原に対する免疫性の炎症反応の結果として生じる肺の柔組織の崩壊、および進行性の肺線維症の発生によって特徴づけられる病型である（Selman M. Hypersensitivity Pneumonitis: a multifaceted deceiving disorder. Clin Chest Med. 2004; 25: 531-547）。この疾患の進行は、肺線維症の発生が定着したことによる慢性的な呼吸器不全、またはいくつかの場合にこの要素に潜在的な重症状態を与える慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）につながる（Hanak V, Golbin JM, Ryu JH. Causes and presenting features in 85 consecutive patients with hypersensitivity pneumonitis. Mayo Clin Proc. 2007; 82: 812-816. Selman M, Chapela R, Raghu G. Hypersensitivity pneumonitis: clinical, manifestations, pathogenesis, diagnosis, and therapeutic strategies. Semin Respir Med. 1993; 14: 353-364）。事実、肺線維症は、肺線維症を患った患者の死亡率の予測因子（５年における２７％の死亡率および１２．８年の生存期間の中央値）であることが証明されている（Vourlekis JS, Schwarz MI, Cherniack RM, Curran-Everett D, Cool CD, Tuder RM, King TE, Brown KK. The effect of pulmonary fibrosis on survival in patients with hypersensitivity pneumonitis. Am J Med 2004; 116(10): 662-8.）。抗原の吸引後、気管支周辺の血管への分布を伴う単核浸潤物が形成される（Denis, M., Y. Cormier, and M. Laviolette. 1992. Murine hypersensitivity pneumonitis: a study of cellular infiltrates and cytokine production and its modulation by cyclosporin A. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 6: 68 -74. Denis, M., Y. Cormier, M. Laviolette, and E. Ghadirian. 1992. T cells in hypersensitivity pneumonitis: effects of in vivo depletion of T cells in a mouse model. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 6: 183 -189）。上記単核浸潤物は、肺胞マクロファージおよびＴ細胞によって支配的に構成されている。Ｔｈ２サイトカインは、線維芽細胞増殖およびコラーゲン産生を活性化することによって、線維症過程を促進する（Mitaka K, Miyazaki Y, Yasui M, Furuie M, Miyake S, Inase N, Yoshizawa Y. Th2-biased Immune responses are important in a murine model of chronic hypersentivity pneumonitis. Int Arch Allergy Immunol 2011; 154: 264-74）。一部の著者は、診断から３．２〜５年の平均余命を有している深刻な存在である特発性肺線維症において説明されている（Kishi M, Miyazaki Y, Jinta T, Furusawa H, Ohtani Y, Inase N, Yoshizawa Y. Pathogenesis of cBFL in common IPF Correlation of IP-10/TARC ratio with histological patterns. Thorax 2008; 63: 810-6）通り、過敏性肺炎の患者における通常の間質性肺炎の病変におけるＴＨ２型の免疫反応について説明している（Idiopathic Pulmonary Fibrosis: Diagnosis and treatment. International Consensus Statement. Am J Respir Crit Care Med. 2000;161.646-64; Fernandez Perez ER, Daniels CE, Schroeder DR, St Sauver J, Hartman TE, Bartholmai BJ, Yi ES, Ryu JH. Incidence, prevalence, and clinical course of idiophatic pulmonary fibrosis: a population-based study. Chest 2010;137(1):129-37）。
【００１１】
このように、以上を鑑みると、気道の免疫炎症性疾患および肺疾患の治療のために、新たなより有効な治療法を開発する必要がある。本発明の発明者は、驚くべきことに、ＩＬ−３３誘引受容体ｓＳＴ２を過剰発現するために、改変されているヒトの間葉系幹細胞が、急性および慢性の気道の免疫炎症性疾患および肺疾患を緩和し得ることを発見した。
【００１２】
ＩＬ−３３は、内皮細胞および上皮細胞の損傷時に放出されるアラーミン（alarmin）としての機能について示唆されている。最近では、ＩＬ−３３は、先天性の気道炎症に重要な役割を果たすことが確認されている。しかし、その作用機序はいまだに明確ではない。実際、ＩＬ−３３が炎症誘導性である（Oboki et al. (2011) Allergy Asthma Immunol. Res. 3: 81-88）のか、または炎症状態に対して保護的役割を発揮する（Miller et al. (2010) Circ. Res. 107: 650-8; Alves-Filho et al. (2010) Nat. Med. 16: 708-12）のかについて総意は得られていない。一方で、敗血症（広範な炎症および多臓器不全を生じさせる全身性の細菌感染）から回復しなかった個体は、回復した個体と比べてｓＳＴ２が著しく多かった。本発明の発明者らは、本明細書において、ｈＭＳＣ（ヒト間葉系幹細胞）ならびに抗炎症性誘引受容体ｓＳＴ２の遺伝子導入による過剰発現の、免疫調節および抗炎症の本来的な特性の、局所的および継続的な作用の組合せが、相乗的に作用し、急性および慢性の気道の免疫炎症性疾患および肺疾患の病理的事象を緩和し得ることを証明している。
【００１３】
本発明の発明者は、証明しているか、または示している。
−ＡＳＣ（成体幹細胞）は、肺に対する向性を有している（一般的な安全性、ならびに気道および肺の疾患に対する治療効果の観点から良好である）こと。
−継続的なｓＳＴ２製造場としてＡＳＣを用いることによる（継続的なｓＳＴ２の過剰発現および局所的肺環境への分泌を介した）、選択的および持続的（局所的）なｓＳＴ２の送達。
−ＡＳＣの本来的な免疫調節特性、およびＩＬ−３３誘引受容体としてのｓＳＴ２の抗炎症作用の組合せによる、急性肺損傷（ＡＬＩ）に対する相乗的な利益。
−細胞媒介性の獲得免疫反応の全体にわたる両方の調節作用（なかでも抗炎症性因子（例えば、ＣＯＸ−２、ＩＤＯ、およびＴＧＦ−ｂｅｔａ）を誘導可能であると証明しているＡＳＣの免疫作用）におよぶ我々の細胞療法戦略の抗炎症性の局所的な顕著な作用。この作用は、遺伝学的な改変によってこれらの細胞において過剰発現させた、ＩＬ−３３誘引受容体として作用するｓＳＴ２と組み合わせられている。このサイトカインは、先天性の免疫を増幅する重要な増幅因子として示されている（Oboki et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107: 18581-6）。したがって、我々のアプローチによれば、これまでに開示も示唆も一切なされていない適応免疫および先天性免疫の両方の制御を行う。完全な免疫反応は、ＡＬＩおよびに肺に関連する他の病態において生じる炎症性過程の全体の開始および進行を担っており、気道傷害の原因である。
【００１４】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、いくつかの源（骨髄、臍帯血、胎盤および脂肪組織）から単離可能な多能性の成体幹細胞であり、広範な数の細胞に分化する能力を有している。ＭＳＣは、内皮および上皮の浸透性を制御し、修復を促進し得るいくつかの成長因子を放出する。また。ＭＳＣは、炎症の重症度を弱めることができる抗炎症性サイトカインを放出する。さらに、ＭＳＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単核細胞、好中球およびマクロファージに対する作用によって、先天性免疫および適応免疫を調節し得る。
【００１５】
前臨床的に試験基づいて、ＭＳＣは、臓器損傷の重症度を低減させ、回復を高める（Matthay MA et al. Chest 2010; 138: 965-972）。いくつかの実験的な試験は、ＭＳＣが、臨床的障害（心筋梗塞、糖尿病、肝不全、急性腎不全および敗血症が挙げられる）における潜在的な治療用途を有していることを示している。
【００１６】
一方、最近の調査（Smith DE. IL-33: a tissue derived cytokine pathway involved in allergic inflammation and asthma. Clin Exp Allergy. 2010 Feb;40(2):200-8）では、ＩＬ３３は、喘息およびアレルギーの炎症に寄与する主要なサイトカインの１つであると示されている。さらに、実験の証拠および臨床的な観察は、ＳＴ２を免疫性の炎症性過程（例えば喘息）と関連づけている（Sweet MJ, et al. A novel pathway regulating lipopolysaccharide-induced shock by ST2/T1 via inhibition of Toll-like receptor 4 expression. J Immunol. 2001;166(11):6633-9）。さらに、肺炎症の異なるモデルを用いることによって、ＩＬ３３は、Ｔｈ２細胞に媒介される免疫反応の減衰に関するｓＳＴ２の役割について仮定されている（Hayakawa H, et al. Soluble ST2 blocks interleukin-33 signaling in allergic airway inflammation. J Biol Chem. 2007 Sep 7;282(36):26369-80）。ｓＳＴ２は、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３）の産生の負の制御因子として作用し、ＩＬ−３３を介したシグナル伝達に拮抗することおよびＮＦ−ｋａｐｐａＢの活性化を抑制することによって、喘息の炎症反応を誘発する。
【００１７】
以上に鑑みて、本発明の目的は、気道の免疫炎症性疾患および肺疾患の治療に用いるために操作された間葉系幹細胞に基づいた新たな治療法を提供することによってある。
【００１８】
本発明の第２の目的は、気道の免疫炎症性疾患および肺疾患の治療に用いるための間葉系幹細胞に基づいた薬学的組成物を提供することによってある。
【００１９】
〔図面の簡単な説明〕
図１．インビボｈＡＳＣ（ヒト成体幹細胞）移植研究のための実験計画。ＢａｌＢ/ｃマウスは、経鼻注入によってＬＰＳまたはＰＢＳを最初に受け、ＰＢＳ、ＥＧＦＰを過剰発現する遺伝学的に改変されたｈＡＳＣ（ｈＡＳＣ）、またはｓＳＴ２およびＥＧＦＰの両方を過剰発現する遺伝学的に改変されたｈＡＳＣ（ｈＡＳＣ−ｓＳＴ２）を、６時間後に静脈注射した。マウスを、治療効果を評価するために、最初の病原性攻撃の４８時間後に屠殺した。
【００２０】
図２．ｓＳＴ２を過剰発現する遺伝学的に改変されたｈＡＳＣの生成および機能的な特性。（Ａ）使用されたｐＷＰＴｓＳＴ２ＦＬＡＧ２ＡＥＧＦＰ（ｐＷＰＴ−ｓＳＴ２−ＥＧＦＰ）レンチウイルスベクターの概略的なプロウイルス構造。生じた２シストロン性の転写物は、Ｃ末端ＦＬＡＧタグ付きのマウスｓＳＴ２遺伝子をコードしている配列に続いて、第２のシストロンから同時翻訳切断を媒介するピコルナウイルス由来の２Ａ配列、およびＥＧＦＰレポータ遺伝子を、５’から３’の方向に含んでいる。（Ｂ）左の画像：ｐＷＰＴ−ｓＳＴ２−ＥＧＦＰを形質導入されたｈＡＳＣは、両方の導入遺伝子（ｓＳｔ２およびＥＧＦＰ）を発現する。ウェスタンブロットによって細胞抽出物において評価されたｓＳＴ２およびＥＧＦＰのタンパク質発現。ＭＯＩ＝２０においてコントロール対照物のｐＷＰＴ−ＥＧＦＰを用いて形質導入されたｈＡＳＣにはない、ＭＯＩ＝２０においてｐＷＰＴ−ｓＳＴ２−ＥＧＦＰを用いて形質導入されたｈＡＳＣ（レーン２）における特異的な６４ｋＤのｓＳＴ２−ＦＬＡＧバンドの検出。反対に、レポータＥＧＦＰタンパク質は、ｐＷＰＴ−ｓＳＴ２−ＥＧＦＰ形質導入ｈＡＳＣ、およびｐＷＰＴ−ＥＧＦＰ形質導入ｈＡＳＣの両方において検出された。内因性のチューブリン発現は、レーン間における匹敵するタンパク質の充填量を立証した。中央の画像：形質導入されていないｈＡＳＣからの自己蛍光シグナル（明るい輪郭）に対するＥＧＦＰ陽性のｈＡＳＣ（暗い輪郭）のパーセンテージとして導入効率を示している、ｐＷＰＴ−ｓＳＴ２−ＥＧＦＰを用いて（ＭＯＩ＝２０）形質導入されたｈＡＳＣからのフローサイトメトリーの代表的なヒストグラム。右の画像：ｐＷＰＴ−ｓＳＴ２−ＥＧＦＰを用いて（ＭＯＩ＝２０）形質導入されたｈＡＳＣからの、蛍光顕微鏡（倍率２０×）によるＥＧＦＰ発現。下方の画像：細胞培養上清においてＥＬＩＳＡによって評価されたｓＳＴ２タンパク質の発現。マウスｓＳＴ２レベルは、示されているＭＯＩにおけるレンチウイルスの形質導入の４８時間後に、回収された上清から評価された。白い柱、ｐＷＰＴ−ｓＳＴ２−ＥＧＦＰを用いて形質導入されたｈＡＳＣ；灰色の柱、ｐＷＰＴ−ＥＧＦＰを用いて形質導入されたｈＡＳＣ。ＬＰＳ（１０ｕｇ／ｍｌ）を用いて４８時間にわたって誘導されたＮＩＨ３Ｔ３マウスの線維芽細胞上清のｓＳＴ２レベルを比較のために決定した（黒い柱）。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表わされている。
【００２１】
図３．ｐＷＰＴ−ｓＳＴ２−ＥＧＦＰ形質導入ｈＡＳＣから分泌されたｓＳＴ２−ＦＬＡＧは、Ｐ８１５肥満細胞腫細胞によるＩＬ３３−Ｔ１／ＳＴ２媒介性のＩＬ−６の産生に干渉する。刺激の前に、ｐＷＰＴ−ＥＧＦＰ形質導入ｈＡＳＣ（ＳＮ−ＥＧＦＰ）の培養上清、またはｐＷＰＴ−ｓＳＴ２−ＥＧＦＰ形質導入ｈＡＳＣ（ＳＮ−ｓＳＴ２）の異なる希釈率における培養上清（希釈なし、１：２、および１：４）と、ＩＬ−３３（１ｎｇ／ｍｌ）を、３７℃において１５分にわたって共インキュベートした。生じた混合物を４８時間にわたってＰ８１５細胞に追加し、誘導されたＩＬ−６レベルを、対応する培養上清においてＥＬＩＳＡによって評価した。コントロールサンプルは、未処理のＰ８１５上清（基底）、誘導なし（ＩＬ−３３なし）、ＳＮ−ＥＧＦＰ処理した上清またはＳＮ−ｓＳＴ２処理した上清を含んでいた。示されている結果は、３つの独立した実験からの３つ１組の測定を含んでいる平均値±ＳＤとして表されている。
【００２２】
図４．攻撃なしのマウスおよびエンドトキシン攻撃したＡＬＩマウスへのｈＡＳＣ生体分布の、非侵襲性のインビボ画像化。マウスの静脈内に注入されたＬＶ−Ｔ２Ａ形質導入ｈＡＳＣ（１×１０６細胞／マウス）によって生成されたｆＬｕｃ活性の結果としての生体発光シグナル。（Ａ）生体発光の代表的なグラフィック画像を、コントロールのＰＢＳ注入マウス（左パネル）およびＬＰＳ注入マウス（右パネル）の両方において、ｈＡＳＣ投与の０．５時間後および４８時間後に録画した。画像の隣にある色つきの目盛（光子／ｓ／ｃｍ２／ｓｒにおいて表されている）は、シグナル強度を示しており、赤色および青色は、最高および最低のシグナルをそれぞれ表している。（Ｂ）インビボｆＬｕｃ活性の定量化の棒グラフ。光子束（ｐｈ／ｓ）の値を、録画された画像（上記）から求め、バックグラウンドの減算の後に、ｈＡＳＣ接種後の経過時間に対してプロットした。＊ｐ＜０．０５、ＬＰＳ  対  ＰＢＳ（１群につきｎ＝１０匹のマウス）。（Ｃ）１群につき代表的な４匹の動物からの肺において検出されたエクスビボ生体発光シグナルを示しているグラフィック画像。
【００２３】
図５．マウスＡＬＩモデルにおける肺内のホーミング後のｈＡＳＣの活性化状態。（Ａ）ｈＡＳＣ処理マウスの肺組織における増殖マーカー遺伝子ヒトＫｉ６７、ならびにｈＡＳＣ活性化遺伝子ＩＤＯ、ＣＯＸ−２およびＴＧＦ−βの相対的なｍＲＮＡ発現を、TaqMan RT-qPCRによって決定した。データは、ＬＰＳ誘導されたｈＡＳＣ処理マウス（ＬＰＳ／ｈＡＳＣ）からの示されている遺伝子の、ＰＢＳ注入したｈＡＳＣ処理マウス（ＰＢＳ／ｈＡＳＣ）からの同じ遺伝子に対する誘導倍率として表されている（ｎ＝３）。（Ｂ）ＬＰＳ誘導（ＬＰＳ／ｈＡＳＣ）またはＰＢＳ注入（ＰＢＳ／ｈＡＳＣ）の４８時間後におけるｈＡＳＣ処理マウスからの、ヒトＫｉ−６７を染色した肺組織の代表的な免疫組織化学画像（上段パネル）。対応するコントロールとして、ＬＰＳ注入した未処理マウスおよびＰＢＳ注入した未処理マウスからの、ヒトＫｉ−６７を染色した肺組織の対応するコントロール画像（下段パネル）。矢印は陽性染色を指している。倍率、×２００。
【００２４】
図６．エンドトキシンに誘導されるＡＬＩモデルにおける炎症誘導性ＩＬ−３３／ＳＴ２／ＴＬＲ４シグナル伝達の関与。マウスＩＬ−３３（１群につきｎ＝３〜５）、ＴＬＲ−４（１群につきｎ＝６〜８）、ＩＦＮ−  （１群につきｎ＝４〜５）、およびＩＬ−１０（１群につきｎ＝４〜５）の相対的ｍＲＮＡの発現を、（Ａ）ＬＰＳ注入またはＰＢＳ注入の４８時間後に、TaqMan RT-qPCRによって肺組織において測定した。データは、ＬＰＳ攻撃した未処理マウス（ＬＰＳ／ＰＢＳ）またはＬＰＳ攻撃したｈＡＳＣ処理マウス（ＬＰＳ／ｈＡＳＣおよびＰＳ／ｈＡＳＣ−ｓＳＴ２）からの示されている遺伝子（黒い柱）の、と、ＰＢＳ注入した未処理マウス（ＰＢＳ／ＰＢＳ）からの同じ遺伝子（白い柱）に対する誘導倍率として示されている。（Ｂ）ＰＢＳ注入したコントロール（ＰＢＳ／ＰＢＳ）（白い柱）、ＬＰＳ攻撃した未処理マウス（ＬＰＳ／ＰＢＳ）、ＬＰＳ攻撃したｈＡＳＣ処理マウス（ＬＰＳ／ｈＡＳＣ）、およびＬＰＳ攻撃したｈＡＳＣ−ｓＳＴ２処理マウス（ＬＰＳ／ｈＡＳＣ−ｓＳＴ２）（複数の黒い柱）（１群につきｎ＝８〜９）からの血清ＩＬ−３３レベルを、「材料および方法」に示されるようにＥＬＩＳＡによって決定した（＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１、＊＊＊  ｐ＜０．００１（ＬＰＳ／ＰＢＳ群と比べた）；ｎｓ、有意差なし）。
【００２５】
図７．マウスｓＳＴ２−ＦＬＡＧおよびＥＧＦＰの両方を過剰発する、ｐＷＰＴ−ｓＳＴ２−ＥＧＦＰを形質導入したｈＡＳＣの、エンドトキシンによって損傷した肺におおける免疫組織化学的な局在。ＬＰＳ誘導したｈＡＳＣ処理マウス（ＬＰＳ／ｈＡＳＣ）（上段パネル）およびＬＰＳ誘導したｈＡＳＣ−ＳＴ２処理マウス（ＬＰＳ／ｈＡＳＣ−ｓＳＴ２）（下段パネル）の、ＬＰＳ注入の４８時間後における代表的な肺の切片画像。矢印は、ｓＳｔ２−ＦＬＡＧを過剰発現しているｈＡＳＣ（Ａ）、およびＥＧＦＰを過剰発現しているｈＡＳＣ（Ｂ）の褐色に標識された検出を示す。倍率×４００。
【００２６】
図８．マウスにおけるＬＰＳによって誘導した肺の炎症後におけるＢＡＬＦタンパク質レベル、細胞の総数および好中球数。ＢＡＬＦにおけるタンパク質の総蓄積（Ａ）、気室における炎症細胞の数（Ｂ）、および好中球の数（Ｃ）によって測定された血管漏出を、ＬＰＳ／ＰＢＳ注入の４８時間後に決定した。ＰＢＳ／ＰＢＳ、ＰＢＳ注入した未処理マウス；ＰＢＳ／ｈＡＳＣ、ＰＢＳ注入したｈＡＳＣ処理マウス；ＬＰＳ／ＰＢＳ、ＬＰＳ誘導した未処理マウス；ＬＰＳ／ｈＡＳＣ、ＬＰＳ誘導したｈＡＳＣ処理マウス；ＬＰＳ／ｈＡＳＣ−ＳＴ２、ＬＰＳ誘導したｈＡＳＣ−ｓＳＴ２処理マウス（ＰＢＳ注入した群、ｎ＝６〜８；ＬＰＳ誘導した群、ｎ＝８〜１６）（＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１、＊＊＊  ｐ＜０．００１（ＬＰＳ／ＰＢＳ群に対する））。
【００２７】
図９．ＬＰＳに誘導された肺炎症後のマウスにおける炎症誘導性サイトカイン／ケモカインのＢＡＬＦレベル。炎症誘導性サイトカインであるＴＮＦ−α（Ａ）およびＩＬ−６（Ｂ）、ならびにケモカインであるＭＩＰ−２（Ｃ）のレベルを、特異的なＥＬＩＳＡによってＬＰＳ／ＰＢＳ注入の４８時間後に測定した。ＰＢＳ／ＰＢＳ、ＰＢＳ注入した未処理マウス；ＰＢＳ／ｈＡＳＣ、ＰＢＳ注入したｈＡＳＣ処理マウス；ＬＰＳ／ＰＢＳ、ＬＰＳ誘導した未処理マウス；ＬＰＳ／ｈＡＳＣ、ＬＰＳ誘導したｈＡＳＣ処理マウス；ＬＰＳ／ｈＡＳＣ−ＳＴ２、ＬＰＳ誘導したｈＡＳＣ−ｓＳＴ２処理マウス（１群につきｎ＝５〜７）（＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１、＊＊＊  ｐ＜０．００１（ＬＰＳ／ＰＢＳ群に対する））。
【００２８】
図１０．マウスＡＬＩモデルにおける肺の組織病理学。ＬＰＳ誘導したマウスの肺損傷に対するｈＡＳＣおよびｈＡＳＣ−ｓＳＴ２の治療可能性の組織学的な評価。コントロールのＰＢＳ注入した未処理マウス（ＰＢＳ）、ＬＰＳ誘導した未処理マウス（ＬＰＳ）、ＬＰＳ誘導したｈＡＳＣ処理マウス（ＬＰＳ／ｈＡＳＣ）、ＬＰＳ誘導したｈＡＳＣ−ｓＳＴ２処理マウス（ＬＰＳ／ｈＡＳＣ−ｓＳＴ２）からのヘマトキシリンおよびエオシン染色した肺切片の、低倍率（上段パネル；×２００）および高倍率（下段パネル；×４００）の代表的な画像。
【００２９】
図１１．吸引脂肪物由来のｈＡＳＣの表現型および多分化能の特徴。（Ａ）本研究に使用されたｈＡＳＣ上の細胞表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２９、ＣＤ４４およびＣＤ９０のフローサイトメトリー分析。白いヒストグラムは、対応するアイソタイプコントロール（灰色のヒストグラム）に対する、表面マーカーのそれぞれを用いて染色されたｈＡＳＣポピュレーションを表している。示されている値は、示されているマーカーについての陽性細胞のパーセンテージを数値化している。（Ｂ）ｈＡＳＣポピュレーション（継代４）を、２１日にわたって脂肪細胞分化に誘導し、Oil Red染色によって可視化するか（左パネル）、または２１日にわたって骨細胞分化に誘導し、Alizarin Red 染色によって可視化した（中央パネル）。分化期間終了時に誘導なしのコンフルエントなｈＡＳＣは、未分化細胞の典型的な線維芽細胞様の外観を示した（右パネル）。バーは倍率×２０を示す。
【００３０】
図１２．マウスＡＬＩモデルにおける肺損傷の機構パラメータ。肺機能を、強制振動手法および定位相モデルを用いて、ＰＢＳ／ＬＰＳ注入の４８時間後に決定した。（Ａ）肺組織の湿潤化；（Ｂ）肺組織エラスタンス。ＰＢＳ／ＰＢＳ、ＰＢＳ注入した未処理マウス；ＰＢＳ／ｈＡＳＣ、ＰＢＳ注入したｈＡＳＣ処理マウス；ＬＰＳ／ＰＢＳ、ＬＰＳ注入した未処理マウス；ＬＰＳ／ｈＡＳＣ、、ＬＰＳ誘導したｈＡＳＣ処理マウス；ＬＰＳ／ｈＡＳＣ−ｓＳＴ２、ＬＰＳ誘導したｈＡＳＣ−ｓＳＴ２処理マウス（１群につきｎ＝５〜８）。
【００３１】
〔発明の説明〕
第１の様態において、本発明は、気道の免疫炎症性疾患および肺疾患の処置における使用のための、ｓＳＴ２またはその一部を発現させるために遺伝学的に改変されている間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に関し、当該間葉系幹細胞はヒトの胚性幹細胞ではない。ｓＳＴ２のアミノ酸配列は、Ｔ１／ＳＴ２の可溶性ドメインまたは細胞外ドメインとして当該分野に周知であり、配列番号１の１〜３２８残基（ヒト）、配列番号３の１〜３３７残基（マウス）の通りに明確にされており、それぞれGenBank Accession No. NP_003847.2 and GenBank Accession No. NP_034873.2によって分類されている。本明細書においてｓＳＴ２に言及するとき、「そのバリアント」は、野生型ｓＳＴ２の機能的な活性を維持している哺乳類のｓＳＴ２の任意のバリアント（断片、類似物または誘導体）を意味する。そのようなバリアントとしては、例えば、天然のｓＳＴ２遺伝子の天然に存在する対立遺伝子バリアントによってコードされているポリペプチド（すなわち、天然に存在する哺乳類のｓＳＴ２ポリペプチドをコードしている天然に存在する核酸）、天然のｓＳＴ２遺伝子の選択的スプライシングを受けた形態によってコードされているポリペプチド、天然のｓＳＴ２遺伝子の相同物または相同分子種によってコードされているポリペプチド、ならびに天然のｓＳＴ２遺伝子の天然に存在しないバリアントによってコードされているポリペプチドが挙げられる。
【００３２】
本発明に係るｓＳＴ２バリアントは、１つ以上のアミノ酸において天然のｓＳＴ２と異なっており、野生型ｓＳＴ２の機能的な活性を保持しているペプチド配列を有している。このようなバリアントのペプチド配列は、ｓＳＴ２バリアントにおける１つ以上のアミノ酸を欠失、付加または置換を特徴とし得る。アミノ酸の挿入は約１〜４０の連続したアミノ酸であることが好ましく、アミノ酸の欠失は約１〜１０の連続したアミノ酸であることが好ましい。バリアントｓＳＴ２ポリペプチドは、天然のｓＳＴ２の機能的な活性を実質的に維持している。好ましいｓＳＴ２ポリペプチドバリアントは、サイレント変化または保存的な変化を特徴とする、本発明の範囲内にある核酸分子を発現させることによって作製され得る。特定のモチーフおよび／またはドメインの１つ以上、または任意のサイズと対応するｓＳＴ２ポリペプチド断片は、本発明の範囲に包含されている。ｓＳＴ２の単離されたペプチジル部分は、ｓＳＴ２の組換えペプチドをコードしている核酸の対応する断片から生成されたｓＳＴ２の組換えペプチドをスクリーニングすることによって入手され得る。
【００３３】
例えば、本発明のｓＳＴ２ポリペプチドは、断片の重複なしで所望の長さの断片に任意に分けられ得、所望の長さの重複する断片に好ましく分けられ得る。上記断片は、組換えによって生成され得、天然のｓＳＴ２ポリペプチドのアゴニストとして機能し得るそれらのペプチジル断片を同定するために試験され得る。
【００３４】
ｓＳＴ２ポリペプチドのバリアントは、ｓＳＴ２ポリペプチドの組換え体を包含し得る。本発明において好ましい組換えポリペプチドは、上記ｓＳＴ２ポリペプチドに加えて、哺乳類のｓＳＴ２ポリペプチドをコードしている遺伝子の核酸配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有している核酸によってコードされている。これらのポリペプチドは、野生型ｓＳＴ２の機能的な活性を等しく維持している。
【００３５】
ｓＳＴ２ポリペプチドバリアントは、天然のｓＳＴ２ポリペプチドの機能的な活性を構造的に発現している、タンパク質のアゴニストの形態を包含し得る。他のｓＳＴ２ポリペプチドバリアントは、例えばプロテアーゼの標的配列を変化させる変異に起因するような、タンパク質分解性の切断に耐性であるバリアントを包含し得る。ペプチドのアミノ酸配列における変化が、天然のｓＳＴ２ポリペプチドの１つ以上の機能的な活性を有しているバリアントをもたらすかどうかは、バリアントの機能的な活性を、天然のｓＳＴ２の機能的な活性と比較することによって容易に決定され得る。
【００３６】
本発明に係るＭＳＣは、ｓＳＴ２またはｓＳＴ２のバリアントをコードしている核酸を用いて遺伝学的に改変され得る。上記核酸は、天然または非天然の核酸であり得、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態（例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡ）であり得る。ＤＮＡは、二重鎖または一本鎖であり得、一本鎖である場合、コード（センス）鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。GenBank Accession No. NM_003856.2およびGenBank Accession No. NM_010743.2によってそれぞれ分類されている配列番号２の２３１〜１２１７ヌクレオチド（ヒト）および配列番号４の３３１〜１３４４ヌクレオチド（マウス）を含んでいるｓＳＴ２遺伝子のヌクレオチド配列と実質的に類似であり得る。また、ｓＳＴ２の核酸コード配列は、遺伝子コードの重複または縮退の結果として配列番号１（ヒト）または配列番号３（マウス）と同じポリペプチドをコードしている異なるコード配列であり得る。
【００３７】
本発明の範囲にあるｓＳＴ２をコードしている他の核酸分子は、天然のｓＳＴ２遺伝子のバリアント（例えば、天然のｓＳＴ２ポリペプチドの断片、相同物および誘導体をコードしているバリアント）である。このようなバリアントは、例えば天然のｓＳＴ２遺伝子の天然に存在する対立遺伝子バリアント、天然のｓＳＴ２遺伝子の相同物もしくは相同分子種、または天然のｓＳＴ２遺伝子の天然に存在しないバリアントなどである。これらのバリアントは、１つ以上の塩基において天然のｓＳＴ２遺伝子と異なるヌクレオチド配列を有する。例えば、そのようなバリアントのヌクレオチド配列は、天然のｓＳＴ２遺伝子におけるヌクレオチドの１つ以上の欠失、付加または置換を特徴とし得る。核酸の挿入は約１〜４０の連続したヌクレオチドであることが好ましく、核酸の欠失は約１〜１０の連続したヌクレオチドであることが好ましい。
【００３８】
構造に明確な変化を示すｓＳＴ２ポリペプチドバリアントは、コードされているポリペプチドにおいてより少ない保存的変更を生じさせるヌクレオチド置換をもたらすことによって生成され得る。このようなヌクレオチド置換の例としては、（ａ）ポリペプチドのバックボーン構造；（ｂ）ポリペプチドの電荷もしくは疎水性；または（ｃ）アミノ酸側鎖のかさに変化を生じさせる置換が挙げられる。タンパク質の特性に最大の変化を生じさせると予想されるヌクレオチド置換は、コドンに非保存的な変化を生じさせる置換である。ポリペプチド構造における重要な変化を生じさせる可能性の高いコドン変化の例としては、（ａ）疎水性残基（例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンまたはアラニン）への（による）、親水性残基（例えば、セリンまたはスレオニン）の置換（ｂ）任意の他の残基への（による）、システインもしくはプロリンの置換、（ｃ）負に帯電している残基（例えば、グルタミンまたはアスパラギン）への（による）、正に帯電している側鎖を有している残基（例えば、リシン、アルギニンまたはヒスチジン）の置換、または（ｄ）側鎖を有さない残基（例えばグリシン）への（による）、かさ高い側鎖を有している残基（例えば、フェニルアラニン）の置換を生じさせるコドン変化が挙げられる。
【００３９】
本発明の範囲にある、天然のｓＳＴ２遺伝子の天然に存在する対立遺伝子バリアントは、天然のｓＳＴ２ポリペプチドと構造的な類似性を有しているポリペプチドをコードしており、野生型ｓＳＴ２の機能的な活性を維持しており、天然のｓＳＴ２遺伝子と少なくとも約７０％の配列同一性を有している、哺乳類の組織から単離された核酸である。本発明の範囲にある天然のｓＳＴ２遺伝子の相同物は、天然のｓＳＴ２ポリペプチドと構造的な類似性を有しているポリペプチドをコードしており、天然の遺伝子と少なくとも約７０％の配列同一性を有している、他の種から単離された核酸である。公開および／または私有の核酸データベースは、天然のｓＳＴ２遺伝子に対する高い割合（例えば７０％以上）の配列同一性を有している他の核酸分子を同定するために、検索され得る。
【００４０】
天然に存在しないｓＴ２遺伝子バリアントは、天然のｓＳＴ２ポリペプチドと構造的な類似性を有しているポリペプチドをコードしており、天然のｓＳＴ２遺伝子と少なくとも約７０％の配列同一性を有しており、天然に存在していない（つまり人工的に生成されている）、野生型ｓＳＴ２の機能的な活性を維持している核酸である。天然に存在しないｓＳＴ２遺伝子バリアントの例としては、天然のｓＳＴ２タンパク質の断片をコードしているバリアント、天然のｓＳＴ２遺伝子とハイブリダイズするバリアント（すなわちストリンジェントな条件における天然のｓＳＴ２遺伝子の相補物）、および、天然のｓＳＴ２遺伝子と少なくとも６５％の配列同一性を共有するバリアント（すなわち天然のｓＳＴ２遺伝子の相補物）が挙げられる。
【００４１】
本発明の範囲にある天然のｓＳＴ２遺伝子の断片をコードしている核酸は、天然のｓＳＴ２ポリペプチドのアミノ酸残基をコードしており、したがって野生型ｓＳＴ２の機能的な活性を維持している核酸である。天然のｓＳＴ２ポリペプチドの断片をコードしている核酸をコードしているか、または当該核酸とハイブリダイズするより短いオリゴヌクレオチドは、プローブ、プライマーまたはアンチセンス分子として使用され得る。また、天然のｓＳＴ２ポリペプチドの断片をコードしている核酸をコードしていか、または当該核酸とハイブリダイズするより長いポリヌクレオチドは、本発明の種々の様態に使用され得る。天然のｓＳＴ２の断片をコードしている核酸は、天然のｓＳＴ２遺伝子の全長またはそのバリアントの酵素消化（例えば、制限酵素を用いる）または化学的な分解によって生成され得る。
【００４２】
また、ストリンジェントな条件において上述の核酸のいずれか１つとハイブリダイズする核酸は、本発明に使用され得る。例えば、そのような核酸は、低いストリンジェンシーの条件、中程度のストリンジェンシーの条件、または高いストリンジェンシーの条件において上述の核酸のいずれか１つとハイブリダイズする、本発明の範囲にある核酸である。また、ｓＳＴ２融合タンパク質をコードしている核酸分子は、本発明に使用され得る。そのような核酸は、適切な標的細胞に導入されると、ｓＳＴ２融合タンパク質を発現するコンストラクト（例えば発現ベクター）を準備することによって作製され得る。例えば、そのようなコンストラクトは、適切な発現系におけるコンストラクトの発現が融合タンパク質を生じるように、構造物に融合されているｓＳＴ２タンパク質をコードしている第１のポリヌクレオチドを、他のタンパク質をコードしている第２のポリヌクレオチドと連結することによって、生成され得る。また、ｓＳＴ２融合タンパク質をコードしている上記核酸分子は、ｓＳＴ２および最適化された輸送シグナルからなるカルボキシ末端またはアミノ末端の融合タンパク質をコードしている分子であり得る。輸送シグナルは、間葉系幹細胞からのその放出を向上させ得、追跡可能性を向上させ得る（ＧＦＰレポータ、ＦＬＡＧまたは他のタグ・・・）。
【００４３】
ｓＳＴ２を過剰発現させるために使用される核酸は、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを向上させるために、その塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格をにおいて修飾され得える。本発明の範囲にある核酸は、ペプチドなどの付加された基（例えばインビボにおける標的細胞受容体を標的化するための）、または細胞膜を越える輸送もしくはハイブリダイゼーションによって引き起こされる切断を促進する因子をさらに含み得る。この目的のために、上記核酸は、他の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションによって引き起こされる架橋の因子、輸送因子、ハイブリダイゼーションによって引き起こされる切断の因子など）と抱合され得る。
【００４４】
ｓＳＴ２は、例えばＭＳＣ、ＭＡＰＳおよび／または他の幹細胞を培養している間に、ｓＳＴ２の発現を促進する因子を幹細胞に導入することによって、ＭＳＣから過剰発現され得る。上記因子は、細胞内への導入および細胞内の複製が可能な組換え核酸コンストラクト（典型的にＤＮＡコンストラクト）に組み込まれている、本発明に係る上述の天然または合成の核酸（外因性の遺伝材料）を含み得る。そのようなコンストラクトは、ポリペプチドをコードしている配列の、所定の標的細胞における転写および翻訳が可能な複製系および配列を含んでいることが好ましい。また、他の因子は、幹細胞からのｓＳＴ２の発現を促進するために、ＭＳＣに導入され得る。例えば、ｓＳＴ２をコードしている遺伝子の転写を向上させる因子、ｓＳＴ２をコードしているｍＲＮＡの翻訳を向上させる媒体、および／またはｓＳＴ２をコードしているｍＲＮＡの分解を低減させる因子は、ｓＳＴ２レベルを増加させるために使用され得る。細胞内の遺伝子からの転写の速度を上昇させることは、ｓＳＴ２をコードしている遺伝子の上流に外因性のプロモータを導入することによって達成され得る。また、異種遺伝子の発現を促進するエンハンサエレメントが、使用され得る。
【００４５】
ＭＳＣに因子を導入する好ましい方法は、遺伝子療法を用いることに関連する。
【００４６】
遺伝子療法は、インビボ、エクスビボまたはインビトロにおいて細胞から治療生成物を発現させるための遺伝子導入を指す。本発明に係る遺伝子療法は、インビボ、エクスビボおよび／またはインビトロにおいてＭＳＣからｓＳＴ２を発現させるために使用され得る。遺伝子療法の一方法は、ｓＳＴ２をコードしているヌクレオチドを含むベクターを利用する。「ベクター」（ときに遺伝子送達または遺伝子導入の「伝達手段」と呼ばれる）は、インビトロまたはインビボにおいて標的細胞に送達されるポリヌクレオチドを含んでいる巨大分子または分子の複合体を指す。送達されるポリヌクレオチドは、遺伝子療法における所定のコード配列を含み得る。したがって、本発明のＭＳＣは、ｓＳＴ２の発現をコードしている核酸、または野生型ｓＳＴ２の機能的な活性を有しているそのバリアントを備えているベクターを含み得る。ベクターとしては、ｓＳＴ２タンパク質またはｓＳＴ２タンパク質融合物の発現レベルを向上させ得る、標的細胞に対するポリヌクレオチドの送達を媒介可能な、非ウイルスベクター（プラスミド・・・）、ウイルス（レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴、アデノウイルス）、リポソームおよび他の脂質含有複合体、ならびに他の巨大分子複合体が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００４７】
ベクターは、遺伝子送達および／または遺伝子発現をさらに調節する構成要素もしくは機能性、または標的細胞に有益な特性をもたらす構成要素もしくは機能性を含み得る。
上記構成要素としては、例えば、細胞に対する結合または標的化に影響する構成要素（細胞種特異的または組織特異的な結合を媒介する構成要素が挙げられる）、細胞によるベクター核酸の取り込みに影響する構成要素、取り込み後の細胞内におけるポリヌクレオチドの局在に影響する構成要素（例えば、核局在化を媒介する因子）、およびポリヌクレオチドの発現に影響する構成要素が挙げられる。また、このような構成要素としては、ベクターによって送達された核酸を取り込み、当該拡散を発現している細胞の検出または選択に使用され得る検出可能なマーカーおよび／または選択可能なマーカーといったマーカーが挙げられる。このような構成要素は、ベクターの本来の性質としてもたらされ得る（例えば、結合および取り込みを媒介する構成要素または機能性を有している特定のウイルスベクターの利用）か、またはベクターは、そのような機能性をもたらすために修飾され得る。選択可能なマーカーは、陽性、陰性または二機能性であり得る。陽性の選択可能なマーカーは、マーカーを有している細胞の選択を可能にし、陰性の選択可能なマーカーは、マーカーを有している細胞が選択的に排除されることを可能にする。このような種々のマーカー遺伝子は、二機能性の（すなわち陽性／陰性の）マーカーを挙げて説明されている（例えば、（Lupton, S.、国際公開第９２／０８７９６号、公開日：１９９２年５月２９日、およびLupton, S.、 国際公開第９４／２８１４３号、 公開日：１９９４年１２月８日など）を参照）。このようなマーカー遺伝子は、遺伝子療法の背景において有利であり得る制御の、追加の手段を提供し得る。このような広範なベクターは、当該分野に周知であり、一般的に入手可能である。
【００４８】
本発明に使用され得るベクターとしては、本発明に係るポリヌクレオチドをＭＳＣに送達し得る、ウイルスベクター、脂質に基づくベクター、および他のベクターが挙げられる。上記ベクターは、標的化ベクター、特にＭＳＣと選択的に結合する標的化ベクターであり得る。本発明に使用される好ましいウイルスベクターは、標的細胞に対して低い毒性を示し、治療有用量のｓＳＴ２の生成を誘導するベクターである。
【００４９】
ＭＳＣを遺伝学的に改変するために使用可能なウイルスベクターの一例としては、レトロウイルスが挙げられる。ＭＳＣを遺伝学的に改変するためのレトロウイルスの使用については、米国特許第５，５９１，６２５号に開示されている。レトロウイルスの構造および生活環は、以下の（ｉ）および（ｉｉ）のために、遺伝子導入の伝達手段として理想的な適性をレトロウイルスに与えている。（ｉ）レトロウイルスの構造遺伝子のコード配列の大部分が除去され、その末端反復配列（ＬＴＲ）領域内のレトロウイルス制御配列の制御下に転写される所定の（複数の）遺伝子によって置き換えられ、および（ｉｉ）レトロウイルスは、宿主ゲノムに組み込むＤＮＡ中間体を介して複製する。組込みの部位が宿主ゲノムについてランダムであると思われるが、プロウイルスは、低いコピー数において決まった構造に組み込む。
【００５０】
レトロウイルスはＲＮＡウイルスであり得る（すなわちウイルスゲノムはＲＮＡである）。しかし、このゲノムＲＮＡは、感染細胞の染色体ＤＮＡに非常に効率的に組み込まれるＤＮＡ中間体に逆転写される。この組み込まれたＤＮＡ中間体をプロウイルスと呼ぶ。レトロウイルスゲノムおよびプロウイルスＤＮＡは、２本の末端反復配列（ＬＴＲ）によってフランキングされているｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖの３種類の遺伝子を有している。ｇａｇ遺伝子は、内部構造（ヌクレオカプシド）タンパク質をコードしており、ｐｏｌ遺伝子はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）をコードしており、ｅｎｖ遺伝子はウイルスのエンベロープ糖タンパク質をコードしている。５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促進する役割を担っている。
【００５１】
５’ＬＴＲに隣接するのは、ゲノムの逆転写に必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）、および粒子内にウイルスＲＮＡの効率的なカプシド形成を行うために必要な配列（Ｐｓｉ部位）である（Mulligan, R. C., In: Experimental Manipulation of Gene Expression, M. Inouye (ed). Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 81: 6349-6353 (1984)）。
【００５２】
組換え遺伝子を含んでいるウイルス粒子を生成するためには、パッケージングの「補助」をもたらす細胞株を生成する必要がある。これを達成するには、例えば、レトロウイルス構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをコードしているプラスミドは、従来のリン酸カルシウム媒介性のＤＮＡトランスフェクションによって、形質転換されていない組織の細胞株に導入される（Wigler, et al., Cell 11:223 (1977)）。これらのプラスミドを含んでいる細胞は、「パッケージング細胞株」と呼ばれる。これらのパッケージング細胞株は、そのまま維持され得るか、または複製不能なレトロウイルスベクターが、細胞のゲノムに導入され得る。後者の場合、上記ベクターコンストラクトによって生成されたゲノムＲＮＡは、パッケージング株の構造的に発現されているレトロウイルス構造タンパク質と結合し、培養培地へのレトロウイルス粒子の放出をもたらす。レトロウイルスの構造遺伝子配列を含んでいる安定した細胞株は、レトロウイルスの「プロデューサ細胞株」である。
【００５３】
遺伝子は、レトロウイルスベクターを使ってＭＳＣに導入され得るため、当該遺伝子は、レトロウイルスベクターの制御の「下にあり」（当該制御を受け）得る。このような場合、所定の遺伝子は、レトロウイルスプロモータから転写されている。プロモータは、ＲＮＡ合成を開始するＲＮＡポリメラーゼ分子によって認識される特定のヌクレオチド配列である。代替的に、所定の遺伝材料の転写を担う追加のプロモータ因子を（組換えレトロウイルスに組み込まれたプロモータに加えて）有しているレトロウイルスベクターを使用し得る。例えば、外的な要因またはきっかけによって調節される追加のプロモータが存在するコンストラクトを使って、外的な要因またはきっかけを活性化させることにより、ＭＳＣによって生成されるポリペプチドのレベルを制御し得る。例えば、熱ショックタンパク質は、プロモータが温度によって制御される遺伝子によってコードされているタンパク質である。金属含有タンパク質メタロチオネインをコードしている遺伝子のプロモータは、カドミウム（Ｃｄ＋＋）イオンに反応する。また、外的なきっかけに影響されたこのプロモータまたは別のプロモータの組込みは、改変されている前駆細胞によるポリペプチドの生成を調節し得る。
【００５４】
ＭＳＣを遺伝学的に改変するか、または変更するために使用され得るレトロウイルス以外のベクターは、例えばアデノウイルス（Ａｄ）由来またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来であり得る。
【００５５】
ヒトウイルスおよび非ヒトウイルスのベクターの両方を使用し得るが、組換えウイルスベクターは、ヒトにおいて複製欠損であることが好ましい。上記ベクターがアデノウイルスである場合、上記ベクターは、ｓＳＴ２をコードしている遺伝子と作動可能に連結されているプロモータを有しているポリヌクレオチドを含んでおり、ヒトにおいて複製欠損であることが好ましい。
【００５６】
アデノウイルスベクターは、標的細胞において高効率の遺伝子発現が可能であり、相対的に大きな程度の異種（非ウイルス性）ＤＮＡを容れ得る。組換えアデノウイルスの好ましい形態は、「ガットレス（gutless）」、「高い受容能力」または「ヘルパー依存型」のアデノウイルスベクターである。このようなベクターは、例えば（１）ウイルスをコードしている配列（ウイルスタンパク質をコードしている配列）のすべてもしくは大部分の欠失、（２）ウイルスＤＮＡの複製に必要な配列である逆方向末端反復（ＩＴＲ）、（３）２８〜３２ｋｂまでの「外因性」または「異種」の配列（例えば、ｓＳＴ２をコードしている配列）、および（４）ウイルスゲノムを感染性カプシドにパッケージングするために必要な、ウイルスＤＮＡパッケージング配列を特徴としている。具体的に、上皮細胞、内皮細胞または間葉系細胞については、このような組換えアデノウイルスベクターのバリアントは、ｓＳＴ２遺伝子と作動可能に連結されている組織特異的な（例えば、ＭＳＣ）エンハンサーおよびプロモータを含んでいることが好ましい。
【００５７】
ＡＡＶに基づくベクターは、標的細胞の形質導入の高い効率を示し、部位特異的に標的ゲノムに組み込み得るので、有利である。組換えＡＡＶベクターの使用については、Tal, J., J. Biomed. Sci. 7:279-291, 2000 and Monahan and Samulski, Gene Therapy 7:24-30, 2000に詳細に記載されている。好ましいＡＡＶベクターは、ｓＳＴ２核酸と作動可能に連結されている組織特異的プロモータまたは細胞特異的プロモータを含んでいる少なくとも１つのカセットにフランキングしている、一対のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含んでいる。ＩＴＲ、プロモータおよびｓＳＴ２遺伝子を含んでいるＡＡＶベクターのＤＮＡ配列は、標的ゲノムに組み込まれ得る。
【００５８】
本発明にしたがって使用され得る他のウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に基づくベクターを包含している。１つ以上の最初期遺伝子（ＩＥ）を欠失したＨＳＶベクターは、一般的に非細胞傷害性であり、標的細胞において潜伏時と同様の状態を持続し、効率的な標的細胞の形質導入をもたらすので、有利である。組換えＨＳＶベクターは、約３０ｋｂの異種核酸を組み込むことができる。好ましいＨＳＶベクターは、（１）Ｉ型のＨＳＶから改変されているベクター、（２）ＩＥ遺伝子が欠失しているベクター、および（３）ｓＳＴ２核酸と作動可能に連結されている組織特異的（例えば、上皮、内皮）プロモータを含んでいるベクターある。また、ＨＳＶアンプリコンベクターは、本発明の種々の方法において有用である。一般的に、ＨＳＶアンプリコンベクターは、約１５ｋｂの長さを有しており、複製およびパッケージング配列のウイルスの開始点を有している。
【００５９】
また、アルファウイルスに基づくベクター（例えば、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）およびシンドビスウイルス（ＳＩＮ）などから作製されたベクター）は、本発明に使用され得る。アルファウイルスの使用については、Lundstrom, K., Intervirology 43:247-257, 2000 and Perri et al., Journal of Virology 74:9802-9807, 2000に記載されている。アルファウイルスベクターは、レプリコンとして一般的に知られる形態において構築される。レプリコンは、（１）ＲＮＡの複製に必要なアルファウイルス遺伝因子および（２）例えばｓＳＴ２核酸をコードしている異種核酸を含み得る。アルファウイルスレプリコン内において、上記異種核酸は、組織特異的プロモータまたは組織特異的エンハンサーと作動可能に連結されてもよい。
【００６０】
複製欠損の組換えアルファウイルスベクターは、高レベルの異種（治療）遺伝子の発現が可能であり、標的細胞の広い範囲に感染し得るので、好適である。アルファウイルスのレプリコンは、同族の結合パートナーを発現する標的細胞と選択的に結合することを可能にする機能的な異種のリガンドまたは結合ドメインをそのビリオン表面に提示することによって、特定の細胞種（例えば、ＭＳＣ）を標的にし得る。アルファウイルスレプリコンは、潜伏、およびしたがって、標的細胞における長期にわたる異種核酸の発現を確立し得る。また、レプリコンは、標的細胞において異種核酸の一過性の発現を示し得る。アルファウイルスベクターまたはアルファウイルスレプリコンは、細胞壊死性ではないことが好ましい。
【００６１】
本発明の方法に適合する多くのウイルスベクターにおいて、２つ以上のプロモータは、当該ベクターによって２つ以上の異種遺伝子の発現を可能にするために、当該ベクターに含められ得る。ベクターは、シグナルペプチドをコードしている配列、または標的細胞からのｓＳＴ２遺伝子産物の発現を促進する他の部分をさらに含み得る。
【００６２】
２つのウイルスベクター系の有利な特性を組み合わせるために、ハイブリッドウイルスベクターは、ｓＳＴ２核酸をＭＳＣに送達するために使用され得る。ハイブリッドベクターの構築に関する標準的な手法は、当業者に周知である。そのような手法は、例えば、Sambrook, et al., In Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y.、または組換えＤＮＡ手法を説明している任意の多くの研究室の手引きみ見られ得る。細胞の形質導入には、ＡＡＶおよびアデノウイルスＩＴＲの組合せを含んだアデノウイルスカプシドにおける二重鎖ＡＡＶゲノムを用いてもよい。別の変形例においては、ＡＡＶベクターは、「ガットレス」、「ヘルパー依存型」または「高い受容能力」のアデノウイルスベクターに位置付けられ得る。アデノウイルス／ＡＡＶのハイブリッドベクターは、Lieber et al., J. Virol. 73:9314-9324, 1999に記載されている。レトロウイルス／アデノウイルスのハイブリッドベクターは、Zheng et al., Nature Biotechnol. 18: 176-186, 2000に記載されている。アデノウイルス内に含まれているレトロウイルスゲノムは、標的細胞ゲノム内に組み込み可能であり、安定的なｓＳＴ２遺伝子の発現をもたらし得る。
【００６３】
ｓＳＴ２遺伝子の発現およびベクターのクローニングを容易にする他のヌクレオチド配列因子が、さらに考慮される。例えば、プロモータの上流におけるエンハンサー、またはコード領域の下流におけるターミネータの存在は、発現を促進し得る。
【００６４】
また、ウイルスベクターに基づく方法に加え、非ウイルス性の方法は、ｓＳＴ２遺伝子を標的細胞に導入するために使用され得る。Nishikawa and Huang, Human Gene Ther. 12:861-870, 2001には、非ウイルス性の遺伝子送達方法のレビューが示されている。本発明に係る好ましい非ウイルス性の遺伝子送達方法は、ｓＳＴ２核酸を細胞に導入するためにプラスミドＤＮＡを使用する。プラスミドに基づく遺伝子送達方法は、当該技術に周知である。合成の遺伝子導入分子は、プラスミドＤＮＡとともに多分子凝集体を形成するために、設計され得る。これらの凝集体は、ＭＳＣと結合するために設計され得る。
【００６５】
カチオン性の両親媒物質（リポポリアミンおよびカチオン性脂質が挙げられる）は、ＭＳＣに対して受容体非依存的なｓＳＴ２核酸の導入をもたらすために、使用され得る。さらに、あらかじめ形成されているカチオン性リポソームまたはカチオン性脂質は、細胞形質移入複合体を生成するために、プラスミドＤＮＡと混合され得る。
カチオン性脂質の調製に関する方法は、Felgner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 772:126-139, 1995およびLasic and Templeton, Adv. Drug Delivery Rev. 20:221-266, 1996を参照し得る。また、遺伝子送達に関して、ＤＮＡは、両親媒のカチオン性ペプチドと結合され得る（Fominaya et al., J. Gene Med. 2:455-464, 2000）。
【００６６】
ウイルスおよび非ウイルスに基づく成分の両方をともなう方法は、本発明に従って使用され得る。例えば、治療用の遺伝子送達のためのエプスタイン  バーウイルス（ＥＢＶ）に基づくプラスミドは、Cui et al., Gene Therapy 8:1508-1513, 2001に記載されている。さらに、アデノウイルスと連結したＤＮＡ／リガンド／ポリカチオン付加物は、Curiel, D. T., Nat. Immun. 13:141-164, 1994に記載されている。
【００６７】
ｓＳＴ２の発現をコードしている核酸を含んでいるベクターは、培養培地への直接的な供給によって、エクスビボまたはインビトロにおいて培養されたＭＳＣに導入され得る。送達の調製物は、必要に応じて、薬学的に許容可能な担体（例えば生理食塩水）を含み得る。また、他の薬学的な担体、製剤および投与形態は、本発明に従って使用され得る。
【００６８】
本発明に従って治療される気道の免疫炎症性疾患および肺疾患は、（１）急性の肺損傷、（２）慢性の気管支炎、肺気腫、気管支拡張症および細気管支炎を包含している慢性の閉塞性肺疾患、（３）急性の呼吸窮迫症候群、（４）喘息、（５）過敏性肺炎、ならびに（６）肺線維症から選択される。適切な場合、上記疾患、傷害または症候群は、急性および慢性の病理状態の両方を包含している。
【００６９】
特定の実施形態において、本明細書に開示されているＭＳＣは、単細胞懸濁物、単細胞マイクロ担体または単細胞球状体の形態である。特定の実施形態において、気道の免疫炎症性疾患および肺疾患の、本発明のＭＳＣを用いた処置に用いられる方法は、非経口経路または肺経路による上記幹細胞の投与を包含している。
【００７０】
上記非経口の投与は、静脈内、胸膜内または動脈内の経路を介することが好ましい。非経口投与形態の例としては、滅菌の水性溶液（例えば、水性のプロピレングリコール溶液またはブドウ糖溶液）のＭＳＣの溶液剤または懸濁剤が挙げられる。このような投与形態は、必要に応じて緩衝化され得る。
【００７１】
上記肺経由の投与は、実際に、例えばスプレー、ネブライザー、ヴェポライザー、鼻腔内注入または気管注入による、気道を介した局所的投与である。好ましい実施形態において、本発明に係るＭＳＣは脂肪組織から得られる。第２の様態において、本発明は、本発明の実施形態のいずれかに開示されているような間葉系幹細胞を含んでいる薬学的組成物に関する。
【００７２】
上記薬学的組成物は、従来の薬学的担体もしくは賦形剤、および有効成分としての本発明に係る間葉系細胞を含んでいる。薬学的組成物は、薬学的なまたは医薬用の薬剤、担体、アジュバントなどをさらに含み得る。
【００７３】
適切な薬学的担体としては、不活性な希釈剤またはフィラー、水および種々の有機溶剤が挙げられる。薬学的組成物は、追加の成分（調味剤、結合剤および賦形剤など）を必要に応じて含み得る。
【００７４】
また、本発明は、哺乳類の気道の免疫炎症性疾患および肺疾患を治療する方法に関する。当該方法は、本発明に係る遺伝学的に改変されたＭＳＣまたはそれを含んでいる薬学的組成物の治療有効量を、哺乳類（例えばヒト）に投与することを包含している。気道の免疫炎症性疾患および肺疾患としては、慢性閉塞性肺疾患（急性肺損傷、慢性気管支炎、肺気腫、気管支拡張症および細気管支炎が挙げられる）、急性呼吸窮迫症候群、喘息、過敏性肺炎および肺線維症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
「治療有効量」という表現は、（ｉ）特定の疾患、状態もしくは障害を処理するか、または（ｉｉ）当該特定の疾患、状態もしくは障害の症状の１つ以上を弱めるか、改善するか、もしくは除去する、遺伝学的に改変されている本発明に係るＭＳＣの量または薬学的組成物の量を、本明細書において意味する。以下の例は、本発明を例証しているが、それらは、本発明の範囲を限定することを意図されていない。
【００７６】
〔実験部分〕
材料および方法
（ｈＡＳＣの単離および性質決定）
緊要ではない脂肪吸引を受ける正常な成人女性から得られた処分されるヒトの脂肪組織を、他の文献（Moreno et al. (2011) Tissue Eng. 17: 275-87）に記載の通りに、研究所内倫理委員会の承認を受けて、ｈＡＳＣの源として用いた。簡単に言うと、手を加えていない脂肪吸引物（２００ｍｌ）を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて十分に洗浄し、０．０７５％のＩＩ型コラゲナーゼ（Invitrogen, Carlsbad, CA）を含んでいるＰＢＳにおいて、１時間にわたって３７℃においてインキュベートして、細胞外マトリクスを消化した。プロテアーゼ活性を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Invitrogen）を用いて失わせた。生じた懸濁液を、７０μｍナイロンフィルターに通してろ過し、遠心分離し、１５％のＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、１％のＬ−グルタミン、および２．５μｇ／ｍｌのアンホテリシン（すべてInvitrogenから得た）を含んでいるα−ＭＥＭ（Invitrogen）に再懸濁させ、３７℃の５％ＣＯ２雰囲気において、培養フラスコ（Corning Inc., Corning, NY）に一晩中播いた。翌日、細胞単層を、ＰＢＳを用いて再び洗浄して非接着細胞および細胞片を除去し、新しい培地と交換した。最後に、ｈＡＳＣを、８０％コンフルエントまで２日ごとに培養培地を交換しながら４〜５日にわたって増やし（継代０）、定期的な継代（１：２の分配比）を介して増幅させた。
【００７７】
０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン、１μＭのヒドロコルチゾン、および０．１ｍＭのインドメタシンを補ったイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）において、２１日にわたってｈＡＳＣを播種することによって、脂肪生成分化を誘導した。脂肪滴を含んでいる細胞を、Oil Red-Oによって可視化した。０．１μＭのデキサメタゾン、１０ｍＭのβ−グリセロールリン酸、および０．２ｍＭのアスコルビン酸を含んでいるＩＭＤＭにおいて、２１日にわたってｈＡＳＣを培養することによって、骨形成分化を誘導した。石灰化した細胞外マトリクスの堆積物を、基質の沈殿物はアリザリンレッド染色の後に可視化した。ｈＡＳＣの分化試薬のすべてを、Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）から得た。
【００７８】
異なる表面マーカーの発現レベルを評価するためのフローサイトメトリーを、これまでに説明されている（Moreno et al. 2011）通りに、CellQuestソフトウェアを用いたFACScanサイトメーターによって実施した。簡単に言うと、ｈＡＳＣ（継代４）を、トリプシン処理によって回収し、１％のウシ血清アルブミンおよび０．１％のアジ化ナトリウム（すべてsigma-Aldrichから得た）を含んでいるＰＢＳを用いて洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）と抱合されている、ＣＤ４４に対する抗体およびＣＤ２９に対する抗体（Immunostep, Salamanca, Spain）、ＣＤ９０に対する抗体（eBioscience, San 5 Diego, CA）、ＣＤ１４に対する抗体、ＨＬＡ−ＤＲに対する抗体およびＣＤ３４に対する抗体（BD Biosciences）を用いて染色した。蛍光アイソタイプの適合する対応するネガティブコントロール抗体は、バックグラウンド染色を決定した。
【００７９】
（ｓＳＴ２クローニング、レンチウイルスベクターおよびｈＡＳＣ導入）
マウスｓＳＴ２の全長ｃＤＮＡを、ＬＰＳ刺激したＮＩＨ  ３Ｔ３マウス胚線維芽細胞（ATCC CRL-1658）から回収されたｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅を介して得た。簡単に言うと、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を、１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、１％のＬ−グルタミンを補ったＤＭＥＭに播き、３７℃／５％ＣＯ２に維持した。  ＳＴ２発現を誘導するために、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ；Sigma-Aldrich）を用いて４８時間にわたって処理した。細胞を回収し、全ＲＮＡを、RNeasy kit（Qiagen, Hiden, Germany）を用いて単離した。精製されたＲＮＡを、DNAse Iを用いてさらに処理した。逆転写を、Omniscript RT kit（Qiagen）を用いて１μｇの全ＲＮＡに基づいて実施した。予想される１ｋｂのｓＳＴ２産物を、high-fidelity Easy-A thermostable DNA Polymerase（Stratagene, La Jolla, CA）、およびプライマー（ＳＴ２フォワード：5'-ATGATTGACAGACAGAGAAT-3'（配列番号５）およびＳＴ２リバース：5'-AGCAATGTGTGAGGGACACT-3'（配列番号６））を用いた、３５サイクル（９５℃における４秒間の変性；５５℃における１分間のアニーリング；７２℃における１分間の伸長）にわたるＰＣＲ増幅の後に、得た。ＰＣＲ産物を、pGEM-T easy vector（Promega, Madison, WI）にサブクローンし、プライマー（ｓｅｑＳＴ２  Ｆ：5'-CACAGGTCCTACTTGTTCATT-3'（配列番号７）およびｓｅｑＳＴ２  Ｒ：5'-GTTGGTTCCATTCTCCGCGT-3'（配列番号８））を用いた配列決定によって確認した。次に、ブタテッショウウイルス−１の２Ａ配列によって分離されている、ｓＳＴ２およびＥＧＦＰのｃＤＮＡ配列をコードしている２シストロン性のレンチウイルスベクター（Doherty et al. (1999) J. Gen. Virol. 80:1929-41）を構築した。さらに、ＦＬＡＧ配列タグを、内因性のタンパク質発現から組換え体を区別するために、ｓＳＴ２のＣ末端に導入した。
【００８０】
したがって、ｓＳＴ２ＰＣＲ産物を、プライマー（Ａｄｖ−ｓＳＴ２  Ｆおよび２Ａ−ＦＬＡＧ−ＳＴ２  Ｒ）を用いてさらに増幅し、酵母における相同性組換えによってアデノウイルスベクターｐＶＫ５０−ＣＡＵＦｉｂｅｒ２ＡＥＧＦＰ（Ramon Alemany, ICO, Barcelonaからの親切な寄贈）に挿入した。Ａｄｖ−ｓＳＴ２  Ｆ：
【００８１】
【化１】
2014533961.tif 000002
【００８２】
（配列番号９；なお、下線部は、アデノウイルスの繊維タンパク質をコードしているＤＮＡに属し、残りは、マウス由来のＳＴ２のＣ末端に属す）、および２ＦＬＡＧ配列を含んでいるＡ−ＦＬＡＧ−ＳＴ２  Ｒ：
【００８３】
【化２】
2014533961.tif 000003
【００８４】
（配列番号１０；なお、５’の隣の下線部は、ブタテスコウイルス−１の２Ａ配列に属し、中央部は、「ＦＬＡＧタグ」ペプチド配列（合成）に属し、３’の隣の下線部は、マウス由来のＳＴ２に属す）。ｓＳＴ２−ＦＬＡＧ−２Ａ−ＥＧＦＰコンストラクトを、特異な制限酵素認識部位（ＤＮＡ配列の５’末端にＢａｍＨＩおよびＤＮＡ配列の３’末端にＳａｌ  Ｉ）をそれぞれ組み込んだプライマー（ｐＷＰＴ−ＢａｍＨＩ−ＳＴ２  ＦおよびｐＷＰＴ−ＳａｌＩ−ＥＧＦＰ  Ｒ）を用いて生じたプラスミドからふたたび増幅した。ｐＷＰＴ−ＢａｍＨＩ−ＳＴ２  Ｆ：
【００８５】
【化３】
2014533961.tif 000004
【００８６】
（配列番号１１；なお、下線部は、レンチウイルスベクター配列ｐＷＰＴＥＧＦＰに属し、残りは、マウス由来のＳＴ２のＣ末端に属す）、およびｐＷＰＴ−ＳａｌＩ−ＥＧＦＰ  Ｒ：5'GGAATTCCCTCGAGGTCGACTTACTTGTACGCTCGTCCAT-3'（配列番号１２；下線部は、レンチウイルスベクター配列ｐＷＰＴ−ＥＧＦＰに属し、残りは、マウスのＳＴ２に属す）。最後に、２シストロン性のコンストラクトを、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩによって消化されたｐＷＰＴ−ＥＧＦＰレンチウイルスベクター（Didier Trono, Geneve, Switzerlandによって提供された）に導入し、ｐＷＰＴ−ｓＴ２ＦＬＡＧ２ＡＥＧＦＰを得た。ベクターｐＷＰＴｓＳＴ２ＦＬＡＧ２ＡＥＧＦＰおよびベクターｐＷＰＴ−ＥＧＦＰからのＶＳＶ−Ｇ−シュードタイプの（pseudotyped）高力価のレンチウイルス粒子を、これまでに説明されている（Moreno et al. (2009) Blood Cells Mol. Dis. 43: 214-20）通りに、ヒト胎児由来腎臓２９３Ｔ細胞に対する一過性の３重トランスフェクションによって生成した。
【００８７】
継代２〜３のｈＡＳＣを、１〜４０の範囲にある種々の感染多重度（ＭＯＩ）における上述のレンチウイルスベクター粒子を有している懸濁物において、形質導入した。１６時間後に培養培地を交換して、レンチウイルス粒子を除去した。形質導入から４８時間後に、ＥＧＦＰの発現を、フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡の両方によって分析し、マウスのｓＳＴ２タンパク質の発現を、製造者の取扱説明書にしたがって特異的なマウスのＴ１／ＳＴ２  ＥＬＩＳＡアッセイ（mdbioproducts, Zurich, Switzerland）によって評価した。インビボＡＬＩモデルアッセイの全体を通して投与されたｈＡＳＣを、最適化された２０のＭＯＩにおいて適切なレンチウイルスベクター粒子を用いて形質導入した。
【００８８】
（ウェスタン分析）
ｐＷＰＴ−ｓＳＴ２−ＥＧＦＰおよびｐＷＰＴ−ＥＧＦＰの両方を形質導入したｈＡＳＣを、５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５  １５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、２ｍＭのＥＧＴＡ、０．１％のＳＤＳ、０．５ｍＭのデオキシコール酸、１ｍＭのＰＭＳＦ、およびprotease inhibitor cocktail（Roche Diagnostics, IN）を含んでいる溶解緩衝液に、１０分にわたって氷上において再懸濁させた。細胞片を、１３０００×ｇ、１０分間の４℃における遠心分離によって除去し、タンパク質濃度を、ビシンコニン酸アッセイ（BCA Protein Assay Kit（Pierce, Rockford, IL））を用いて測定した。可溶性抽出物（各サンプルから５０μｇ）を、Leammliの法サンプル緩衝液に再懸濁させ、１５分にわたって９８℃において加熱した。サンプルを、ＳＤＳ／１０％のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分解し、Hybond-C Extraニトロセルロース膜（Amersham Biosciences）に転写させた。以下の一次抗体を検出に使用した：いずれもｏ／ｎの４℃においてインキュベートされる抗ＦＬＡＧマウスモノクローナル抗体Ｍ２（Sigma-Aldrich、１：１０００希釈）および抗ＧＦＰマウスモノクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA、１：１０００希釈）。室温において１時間にわたってインキュベートした抗チューブリンマウスモノクローナル抗体（Sigma-Aldrich、１：５０００希釈）を、標準化のために含めた。シグナルを、増強化学発光（ＥＣＬ）検出（Amersham Biosciences）によって可視化した。
【００８９】
（ＩＬ−３３  −  ｓＳＴ２相互作用）
マウス肥満細胞腫細胞株Ｐ８１５（Gaby Palmer、Geneve, Switzerlandの寄贈）を、５％ＣＯ２雰囲気の３７℃における加湿インキュベーターにおいて、１０％のＦＢＳおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補ったDMEM High Glucose（Life Technologies）において培養した。
【００９０】
Ｐ８１５細胞を、１ウェルあたり２００００細胞の密度において、２００ｕｌの完全培養培地とともに９６ウェルプレートに播き、ＩＬ−３３（１ｎｇ／ｍｌ）を用いて刺激した。いくつかのウェルにおいて、ｈＡＳＣを形質導入した細胞からの上清を、刺激の１５分前に加えた。細胞上清におけるＩＬ−６レベルを、製造者の取扱説明書（Diaclone, Besancon Cedex, France）にしたがってＥＬＩＳＡによって評価した。
【００９１】
（ＬＰＳ誘導ＡＬＩのマウスモデルおよび試験計画）
マウスを扱うすべての手順は、Vall d’Hebron Research Institute（Barcelona, Spain）の動物実験倫理委員会によって調査され、承認された。１０〜１２周齢のオスのＢＡＬＢ／ｃマウス（Harlan, Horst, The Netherlands）を、２％のイソフルランを用いて麻酔し、５０μｌのＰＢＳに溶解させた８ｍｇ／ｋｇのＬＰＳ（E. coli  ０５５：Ｂ５）（Sigma-Aldrich）、または５０μｌのＰＢＳ単独の単回の鼻腔内注入によって、攻撃した。損傷の誘導の６時間後に、マウスは、ｈＡＳＣ、ｓＳＴ２を発現する改変ｈＡＳＣ（ｈＡＳＣ−ｓＳＴ２）（両方の場合に２００μｌのＰＢＳにおいて１×１０６細胞）または２００μｌのＰＢＳを、尾静脈注射によって受けた。すべてのマウスを、ＬＰＳ／ＰＢＳの注入の４８時間後に分析した（図１）。
【００９２】
使用したｈＡＳＣ−ｓＳＴ２の各バッチについて、ｓＳＴ２タンパク質の適切な発現レベルを、これまでの項に示されている通りに、ＥＬＩＳＡによって確認した。
【００９３】
（生体発光の画像化）
インビボ画像化のために、サイトメガロウイルスプロモータの制御下にホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）およびＥＧＦＰをコードしている２シストロン性のレンチウイルスベクター（ＬＶ−Ｔ２Ａ）を、レポータウイルス粒子を生成するために使用した（Ibrahimi et al. (2009) Hum. Gene Ther. 20: 845-60）。ｈＡＳＣを、２０のＭＯＩにおいて効率的に形質導入し、エンドトキシン攻撃の６時間後に、ＬＰＳまたはＰＢＳの注入マウスに静脈内投与（１×１０６細胞／マウス）した。マウスを、ルシフェラーゼを発現するｈＡＳＣ投与の３０分後および４８時間後に、IVIS（登録商標） Spectrum Imaging System（Caliper Life Science, MA, USA）において、撮影した。麻酔を、１．２５Ｌ／分の流量における１００％の酸素に３％のイソフルランを有している吸入チャンバにおいて実施し、０．５Ｌ／分における２．５％の上述の混合ガスを有しているIVISシステムに維持した。マウスに、ＰＢＳに溶解させたＤ−ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ）（Promega）を腹腔内投与した。
【００９４】
これまでの最適化アッセイにおいて、連続的な画像読み取りを、約３０分間までに２分おきに行って、Ｄ−ルシフェリン注射後の生体発光画像の取込みにとって最適な時間範囲（５〜１５分間）を決定した。各フレームは、グレースケールの画像上に重ね合わせられた疑似色画像として、生体発光シグナルを示している。肺による生体発光シグナリングを、積算された光子数／秒として測定した。画像データを、Living Image 4.1（Caliper Life Science）を用いて解析した。エクスビボ画像化のために、安楽死（９０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールの腹腔内注射による）直前に、マウスに、Ｄ−ルシフェリン（１５０ｍｇ/ｋｇ）を腹腔内注射した。剖検の直後に、マウスの肺を、３００ｕｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリンの入っている別々のウェルに個々に入れ、画像化した。２つの１分間の連続スキャンを入手し、肺を、解剖し、プレートに入れ、別々の肺葉に切片化した。これらをIVISにおいて１分にわたって画像化した。
【００９５】
（気管支肺胞洗浄、細胞計数およびタンパク質測定）
気管支肺胞洗浄（BAL）を、鼻腔内注入の４８時間後に、処理マウスにおいて実施した。肺を、０．７ｍｌの滅菌生理食塩水（０．９％のＮａＣｌ）を用いて室温においてインシチュに３回にわたって洗浄し、回収した液体を溜めた。細胞を、血球計数板を用いてカウントし（全細胞）、BAL液（BALF）を遠心分離した（１５００ｇ、１０分間）。上清を、さらなる分析まで凍結（−８０℃）させた。分化細胞のカウントのために、再懸濁させた細胞（１ｍｌ）の２５０μｌの分取物を、顕微鏡用スライドにおいて回転させ（１４００ｇ、６分間）（Cytospin 3,Shandon, TechGen, Zellik, Belgium）、風乾させ、染色した（Diff-Quick法）。各サンプルについて、１０００細胞を、マクロファージ、好中球およびリンパ球の数の評価のために分析した。タンパク質の総量を、BCAアッセイ（Pierce）によってBALFにおいて測定した。
【００９６】
（ＢＡＬＦおよび血漿中のサイトカイン／ケモカイン評価）
マウスのＴＮＦ−α、ＩＬ−６（いずれもDiaclone, Besancon Cedex, Franceから得た）、ＭＩＰ−２（IBL, Gunma, Japan）、およびＩＬ−３３（R&D Systems, Abingdon, UK）のレベルを、希釈なしのＢＡＬＦおよび血清（心臓穿刺によって引き出された血液から、２０００ｇにおいて３０分にわたって遠心分離された）において、製造者の取扱説明書にしたがって、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。
【００９７】
（組織病理学および免疫組織化学）
ＢＡＬを受けていないｈＡＳＣ処理したマウス、ｈＡＳＣ−ｓＳＴ２処理したマウス、およびＰＢＳ処理したマウスからの気管に、ＬＰＳ誘導の４８時間後にカニューレを挿入し、肺を、１ｍｌの４％のパラホルムアルデヒドを用いて肺の総容積までの膨張によって固定した。一晩の固定の後に、肺組織を、パラフィンに包埋し、３μｍ厚の切片に切り、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した。画像を、４０×の対物レンズを用いたOlympus BX41顕微鏡（Olympus Life Science Research GmbH, Munich, Germany）によって撮影した。形態学および炎症性の浸潤を決定するために、画像を、スライドの識別情報を知らない病理学者によって評価した。組織損傷の組織学的証拠を、American Thoracic Societyの肺損傷採点システム（Matute-Bello et al. (2011) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 44: 725-38）にしたがって評価した。
【００９８】
免疫組織化学について、ホルマリン固定した組織を、エタノール勾配を用いて脱水し、切り取り、パラフィンに包埋した。薄片化した５ｕｍ切片を、ポリＬリジン被覆したスライドガラスに乗せ、これまでに説明されている（Moreno et al (2011) Stem Cells Dev. In Press, DOI: 10.1089/scd.2010.0483）通りに、免疫染色した。簡単に言うと、切片を脱パラフィンし、ふたたび水和させた。免疫原性の回復を、１０ｍＭのｐＨ６．０のクエン酸塩緩衝液におけるスライドを電子レンジにおいて２０分にわたってインキュベートしながら、実施した。数回のＰＢＳ−Ｔ（０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えたＰＢＳ）による洗浄の後に、組織切片を、ＰＢＳ−Ｔに希釈された５％のヤギ血清における２時間の室温におけるインキュベーションによってブロッキングした。ＰＢＳＴ洗浄した切片を、ＰＢＳ−Ｔにおいて１：１００希釈したポリクローナルのウサギ抗Ｋｉ６７抗体（Invitrogen）とともに、４℃の加湿チャンバにおいて一晩インキュベートした。翌日、切片を、ＰＢＳにおけるビオチン抱合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Invitrogen）とともに、室温において１時間にわたってインキュベートし、内因性のペルオキシダーゼを、１０分にわたって暗所において３％のＨ２Ｏ２を用いてブロッキングした。最後に、切片を、ビオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼ−アビジン複合体（ImmunoPureR ABC Peroxidase Staining Kit; Pierce）とともにインキュベートした。最後に、断片を、ペルオキシダーゼ基質であるジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（DAB, Pierce）を用いて染色し、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。特異性のコントロールスライドを、非免疫ウサギＩｇＧ（１：１００希釈）（Abcam, Cambridge, UK）を一次抗体として用いて同じように染色した。
【００９９】
（ＲＮＡの単離および分析）
マウスの肺組織を、安楽死の直後に液体窒素において凍結させた。肺の全ＲＮＡを、RNeasy Mini kit（Qiagen）を用いて分離した。分離後に、ＲＮＡサンプルを、室温において６０分にわたってＤＮａｓｅ処理して、混入しているＤＮＡを除去した。ｈＡＳＣ処理マウスおよび未処理マウスの非のＲＮＡからの遺伝子発現分析を、逆転写に続いて、リアルタイム定量化TaqManポリメラーゼ連鎖反応（TaqMan RT-qPCR; PE Applied Biosystems, Foster City, CA）によって実施した。ハウスキーピング遺伝子としてのヒトのＫｉ６７、ＩＤＯ、ＴＧＦ−β、ＣＯＸ−２およびＧＵＳＢ、ならびにハウスキーピング対照物としてのマウスのＩＬ−３３、ＴＬＲ４、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−  およびＣｅｂｐａについての特異的なTaqMan遺伝子発現アッセイを、３つ１組において実施し、分光蛍光分析用のサーマルサイクラー（ABI PRISM 7300 Sequence Detector（PE Applied Biosystems））において分析した。データの定量化を、比較Ｃｔ法によって実施した。
【０１００】
（肺の機構評価）
ＬＰＳ媒介による気道損傷の誘導の２日後に、肺の機構を、FlexiVentベンチレータ（FlexiVent, SCIREQ, Montreal, PQ, Canada）を用いて分析した。簡単に言うと、マウスを、ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与によって深く麻酔し、気管形成し、１５０呼吸／分の頻度および２ｃｍ  Ｈ２Ｏの終末呼気陽圧における７ｍｌ／ｋｇの一回換気量をともなって、準正弦的に人工呼吸させた。一切の自発呼吸を避けるために、動物に、６ｍｇ／ｋｇのロクロニウムを腹腔内投与した。次に、強制振動摂動（forced oscillation perturbation）を適用した。この摂動において、人工呼吸器によって生成される広い８ｓｅｃバンドの周波数（０．５〜１９．７５Ｈｚ）は、機構パラメータ（例えば、気道特異的抵抗（Ｒｎ）、空気の慣性（Ｉ）、組織の減衰（抵抗）（Ｇ）、および組織の弾性（Ｈ））の記録を可能にする。計測の終点において、マウスを、９０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールの腹腔内投与によって屠殺した。続いて、気管支肺胞洗浄、血清および肺組織を、さらなる分析のために各マウスから回収した。
【０１０１】
（統計分析）
特に指定がない限り、データは、平均値±ＳＥＭ、または平均値を示すための線をともなった縦方向のドットプロットにおける個々の点として表されている。群の間における差異を、必要に応じて複数の比較のために調整されている一元配置分散分析（Bonferroni試験）を用いて評価した（GraphPad Prism 5.00; GraphPad Software Inc., San Diego, CA）。すべての場合に、ｐ値＜０．０５を、統計的有意とみなした。
【０１０２】
結果
（ｓＳＴ２を過剰発現しているｈＡＳＣの生成および性質決定）
増え続ける証拠は、先天的な気道炎症におけるＩＬ−３３の重要な役割を裏付けている。したがって、ＩＬ３３誘引受容体ｓＳＴ２のベクターおよび工場として、ｈＡＳＣを遺伝学的に改変することが、マウスＡＬＩモデルにおける移植によって追加または共働作用の治療的な利益を、それらに与え得るか否かを検討することを目的にした。完全な表現型の性質決定および機能的な性質決定を、脂肪吸引物から分離した接着性の線維芽様ｈＡＳＣについてまず実施した（Moreno et al. (2011) Tissue Eng. 17: 275-87および図１１）。次に、Ｃ末端ＦＬＡＧタグ付きのマウスｓＳＴ２  ｃＤＮＡおよびレポータＥＧＦＰ  ｃＤＮＡを５’→３’方向にフランキングしているピコルナウイルスの２Ａ配列を組み込んでいる２シストロン性のレンチウイルスベクターを設計した（図２Ａ）。上述のレンチウイルスベクターを用いたｈＡＳＣの形質導入は、マウスｓＳＴ２−ＦＬＡＧペプチドおよびレポータＥＧＦＰへの、ポリタンパク質の同時翻訳的な切断を、ウエスタンブロット分析によって、確認した。また、ＥＧＦＰレポータは、フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡検の両方によるｈＡＳＣの形質導入効率の可視化および推定を可能にした（図２Ｂ）。さらに、ＭＯＩの上昇は、ｈＡＳＣによる組換えマウスｓＳＴ２の産生および分泌の増強と相関した。したがって、２０のＭＯＩにおいて、８０±５％の形質導入効率、およびＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽胞のＬＰＳ処理によって誘導されるｓＳＴ２のレベルに匹敵する分泌されたｓＳＴ２のレベルに達した（図２Ｂ）。最適化されたこの２０のＭＯＩを、インビボ投与アッセイのすべてに使用しｓ多ｈＡＳＣの形質導入のために選択した。さらに、形質導入されたｈＡＳＣによって分泌された組換えマウスｓＳＴ２−ＦＬＡＧの機能性を評価した。ｓＳＴ２−ＦＬＡＧアンタゴニストは、Ｐ８１５マウス肥満細胞腫細胞におけるＩＬ−３３−Ｔ１／ＳＴ２シグナル伝達を、用量依存的に著しく妨害可能であり、炎症誘導性ＩＬ−６の誘導を低減させた（Moulin et al. (2007) Cytokine 40:216-225）（図３）。これまでに報告されている（Moreno et al. (2011) Tissue Eng Part C: Methods 17:275-287）通り、レンチウイルスベクター媒介性のｈＡＳＣの形質導入は、その表現型特性および機能的特性のいずれをも修飾し得なかった（データを示さず）。
【０１０３】
（マウスＡＬＩモデルにおける移植されたｈＡＳＣの挙動：ホーミングおよび活性化状態）
我々は、特定の実験計画にしたがってエンドトキシンＬＰＳの鼻腔内注入によって生成されたマウスＡＬＩモデルにおけるｈＡＳＣの静脈注射に続いて、異なる２つの時点におけるインビボにおけるｈＡＳＣの器官生体分布を評価する予備試験を実施した（図１）。２シストロン性のｆＬｕｃ−２Ａ−ＥＧＦＰ構造を用いた、レンチウイルスベクター媒介性のｈＡＳＣの形質導入は、生体発光の画像化による、注入されたｈＡＳＣの高感度な追跡を容易にした。移植を受けた動物の肺における、生体発光シグナルの排他的な存在は、によって、ＰＢＳまたはＬＰＳの注入にかかわらず、静脈注入されたｈＡＳＣの肺に対する向性を追認していた（図４Ａ）。逆に、移植の４８時間後に、顕著に増大したｈＡＳＣの存在は、ＰＢＳ注入したコントロールの肺と比べて、ＬＰＳ注入した肺において明らかであった（図４Ｂおよび４Ｃ）。ヒトＫｉ６７増殖マーカーの転写レベルが、ＬＰＳ注入マウスおよびＰＢＳ注入マウスの間において同等であった（図５Ａ）ので、この増加は、ｈＡＳＣの増殖に起因していない。
【０１０４】
一方、ＬＰＳに誘導された肺の炎症誘導性環境におけるｈＡＳＣの活性化は、主要な抗炎症転写物（例えば、ＩＤＯ、ＣＯＸ−２およびＴＧＦ−β）の上方制御によって明らかであった（図５Ａ）。さらに、注入されたｈＡＳＣからのヒトＫｉ６７タンパク質の免疫染色は、血管漏出および肺損傷の結果として、ＰＢＳ注入マウス由来の肺組織（少ない存在および限局的な分布）、およびＬＰＳ注入マウス由来の肺組織（より頻度高い存在および均一な分布）の間における、それらの細胞局在に顕著な差異を明らかにした。
【０１０５】
したがって、炎症誘導性の肺損傷は、マウスＡＬＩモデルにおいて、ｈＡＳＣのホーミングおよび活性化を促進するが、増殖を促進しないと考えられる。
【０１０６】
（ＬＰＳ誘導の急性の肺の炎症に対する、ｓＳＴ２を過剰発現しているｈＡＳＣの優れた治療効果）
エンドトキシンに誘導されるＡＬＩは、ＳＴ２  −  ＩＬ−３３の主軸およびＳＴ２  −  ＴＬＲ４の主軸によって制御され得ると示唆されている（Sweet et al. (2001) J. Immunol. 166: 6633-9; Yin et al. (2011) Int. Immunopharmacol. 11: 2112-2117; Lefrancais et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109:1673-1678; Zhao et al. (2012) Nat. Immunol. 13:651-658）。したがって、改変されていないｈＡＳＣまたはｓＳＴ２を過剰発現するｈＡＳＣが、ＳＴ２と関連する炎症誘導性メディエータ：ＩＬ−３３およびＴＬＲ−４、ならびに他の関連する炎症性サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０）の、ＬＰＳに傷害された肺における発現を調節し得るか否かできるかどうかを評価した。このようにして、ｈＡＳＣ処理は、ＬＰＳ注入マウスにおける上述の炎症誘導性メディエータ（ＩＬ−３３、ＴＬＲ−４、ＩＦＮ−γ）を、種々のレベルに低減させ得る上に、肺のホモジネートから単離されたｍＲＮＡに基づくＲＴ−ｑＰＣＲによって評価された通り、ｈＡＳＣ−ｓＳＴ２処理は、その転写誘導を防ぎ得るだけでなく、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０を誘導し得る（図６Ａ）。
【０１０７】
さらに、BALFでは検出不可能だが、炎症誘導性ＩＬ−３３の促進された産生の増加は、注入の４８時間後に、ＬＰＳを注入したマウスの血清において認められた。なお、ｈＡＳＣ−ｓＳＴ２処理マウスは、ＬＰＳによって媒介される循環ＩＬ−３３の過剰産生を抑制した（図６Ｂ）。
【０１０８】
以上の証拠を考慮して、ｓＳＴ２およびｈＡＳＣの抗炎症性作用および免疫調節作用を組み合わせることは、ＬＰＳ誘導性ＡＬＩのマウスモデルにおいて、ｈＡＳＣ単独を投与することより優れた治療効果を生じるか否かを解明することにした。
【０１０９】
ｓＳＴ２−ＦＬＡＧ導入遺伝子を過剰発現しているｈＡＳＣは、ｈＡＳＣを移植したマウス由来の、ＬＰＳに傷害されたコントロールの肺ではなく、ｈＡＳＣ−ｓＳＴ２を移植したすべてマウス由来の、ＬＰＳに傷害された肺に免疫局在化され、炎症を起こした肺の柔組織への、この抗炎症性誘引物の局所送達を明らかにした（図７）。さらに、移植された肺におけるｈＡＳＣの確実な存在は、レポータＥＧＦＰの発現によって確認された（図７）。巨視的に、ＬＰＳ注入され、ＰＢＳ処理されたマウスは、攻撃の４８時間後に、背を丸める外観、逆毛、発汗、減少した歩行運動および探査行動、ならびに外部刺激に対する低下した反応によって特徴づけられる内毒素血症の顕性症状を示した。対照的に、ＬＰＳを注入され、かつｈＡＳＣまたはｈＡＳＣ−ｓＳＴ２を用いて処理されたマウスは、上述の症状によって評価されるとき、より低い病気の度合いを示した。さらに、ＬＰＳ注入したマウスの全肺検査によって、さらにＰＢＳ処理されたマウスは、点状出血および壊死性の肺葉を示し、非常にわずかな形態学的変性または病変は、ｈＡＳＣ処理したマウスまたはｈＡＳＣ−ｓＳＴ２処理したマウスの肺に認められた。
【０１１０】
微視的に、ＰＢＳ注入したコントロールマウスと比べると、ＬＰＳ注入マウスは、肺における顕著な炎症誘導性の変性（例えば、肺血管漏出、浮腫、肺胞被覆液への免疫細胞の流出）を、エンドトキシン攻撃の４８時間後に起こした。特に、ｈＡＳＣ処理したマウスのＢＡＬＦにおける総タンパク含有量、免疫細胞数、および特に好中球数は、未処理のマウスにおいて観察されたそれらに対して、明らかに減少した。炎症誘導性のこれらのパラメータは、ｈＡＳＣ−ｓＳＴ２処理したマウスにおける、肺のｓＳＴ２の過剰発現によってさらに弱められた（図８）。
【０１１１】
炎症誘導性サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ６、ならびに好中球の化学遊走物質ＭＩＰ−２の両方のレベルは、エンドトキシン媒介性の肺炎症の病態生理学と積極的に関与していると知られている。注目すべきことに、認められたそれらのすべては、ＬＰＳ誘導された未処理のマウスに現われるそれらと比べると、ＬＰＳ誘導されたｈＡＳＣ−ｓＳＴ２処理したマウスのＢＡＬＦにおいて顕著に低下した。さらに、ＬＰＳ誘導後のｈＡＳＣ処置は、ＢＡＬＦサイトカイン／ケモカインの中間レベルを生じた（図９）。
【０１１２】
次に、ＬＰＳ誘導された未処理のマウスからの肺切片の組織病理学的な盲検試験（blinded examination）は、エンドトキシン攻撃の４８時間後に、多形核の白血球およびマクロファージからなる顕著な肺胞内炎症性浸潤物を示し、当該肺胞内炎症性浸潤物は、ＬＰＳ誘導されたｈＡＳＣ処理したマウスにおいてわずかに軽減された。加えて、ｈＡＳＣ−ｓＳＴ２処理は、ＬＰＳ攻撃したマウスに存在する免疫−炎症性の浸潤物を顕著に縮小させ、未攻撃のコントロールマウスからの外観に近い、改善された組織学的外観に導く（表１および図１０を参照）。
【０１１３】
最後に、肺損傷モデルは、急性の肺炎症の復帰を評価するために主に設計されたが、強制振動機構を通して、肺機能の観点から機構的なパラメータを定量化することも試みた。その結果、組織の湿潤化もしくはエネルギーの損失（Ｇ）および肺組織のエラスタンス（Ｈ）は、ＰＢＳ注入されたコントロールマウスと比べて、エンドトキシン攻撃の４８時間後に、ＬＰＳ誘導したマウスにおいて増大傾向にあった。対照的に、機構的なパラメータの両方は、ＬＰＳ誘導後にｈＡＳＣ処理したマウスおよびｈＡＳＣ−ｓＳＴ２処理したマウスの両方において、コントロールのレベルまで低下した（図１２）。
【０１１４】
【表１】
2014533961.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】インビボｈＡＳＣ（ヒト成体幹細胞）移植研究のための実験計画を示す図である。
【図２】ｓＳＴ２を過剰発現する遺伝学的に改変されたｈＡＳＣの生成および機能的な特性を示す図である。
【図３】ｐＷＰＴ−ｓＳＴ２−ＥＧＦＰ形質導入ｈＡＳＣから分泌されたｓＳＴ２−ＦＬＡＧは、Ｐ８１５肥満細胞腫細胞によるＩＬ３３−Ｔ１／ＳＴ２媒介性のＩＬ−６の産生に干渉することを示す図である。
【図４】攻撃なしのマウスおよびエンドトキシン攻撃したＡＬＩマウスへのｈＡＳＣ生体分布の、非侵襲性のインビボ画像化を示す図である。
【図５】マウスＡＬＩモデルにおける肺内のホーミング後のｈＡＳＣの活性化状態を示す図である。
【図６】エンドトキシンに誘導されるＡＬＩモデルにおける炎症誘導性ＩＬ−３３／ＳＴ２／ＴＬＲ４シグナル伝達の関与を示す図である。
【図７】マウスｓＳＴ２−ＦＬＡＧおよびＥＧＦＰの両方を過剰発する、ｐＷＰＴ−ｓＳＴ２−ＥＧＦＰを形質導入したｈＡＳＣの、エンドトキシンによって損傷した肺におおける免疫組織化学的な局在を示す図である。
【図８】マウスにおけるＬＰＳによって誘導した肺の炎症後におけるＢＡＬＦタンパク質レベル、細胞の総数および好中球数を示す図である。
【図９】ＬＰＳに誘導された肺炎症後のマウスにおける炎症誘導性サイトカイン／ケモカインのＢＡＬＦレベルを示す図である。
【図１０】マウスＡＬＩモデルにおける肺の組織病理学を示す図である。
【図１１】吸引脂肪物由来のｈＡＳＣの表現型および多分化能を示す図である。
【図１２】マウスＡＬＩモデルにおける肺損傷の機構パラメータを示す図である。
【図１】
2014533961.tif 000006
【図２】
2014533961.tif 000007
【図３】
2014533961.tif 000008
【図４】
2014533961.tif 000009
【図５】
2014533961.tif 000010
【図６】
2014533961.tif 000011
【図７Ａ】
2014533961.tif 000012
【図７Ｂ】
2014533961.tif 000013
【図８】
2014533961.tif 000014
【図９Ａ】
2014533961.tif 000015
【図９Ｂ】
2014533961.tif 000016
【図９Ｃ】
2014533961.tif 000017
【図１０】
2014533961.tif 000018
【図１１】
2014533961.tif 000019
【図１２】
2014533961.tif 000020
【配列表】
2014533961000001.app
【国際調査報告】
2014533961.tif 000021
2014533961.tif 000022
2014533961.tif 000023
2014533961.tif 000024
2014533961.tif 000025
2014533961.tif 000026
2014533961.tif 000027
2014533961.tif 000028