(57)【要約】  本発明は、ＤＮＡ損傷に罹患しているか、又はその危険性がある患者の、すなわち、全ての種における加齢プロセスを防ぐか又は遅延させる、治療方法及び治療用組成物に関する。前記治療は患者に一酸化炭素を含む医薬組成物を投与することを含む。
2014525399.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における放射線照射により誘導されたＤＮＡ損傷を軽減する方法であって、
ＤＮＡ損傷レベルの放射線に暴露されるであろう、暴露されている、又は暴露された対象を同定すること、及び
対象に、対象における放射線照射により誘導されたＤＮＡ損傷を軽減するのに有効な量の一酸化炭素を含む医薬組成物を投与すること、
を含む、方法。
【請求項２】
対象が職業上、ＤＮＡ損傷レベルの放射線に暴露されるであろう、暴露されている、又は暴露されたものであり、前記職業が医療従事者、鉱山労働者、原子力労働者及び航空乗組員からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象が、核反応器又は核兵器からのＤＮＡ損傷レベルの放射線に暴露されるであろう、暴露されている、又は暴露されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記医薬組成物が、ＤＮＡ損傷レベルの放射線に暴露される前に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記医薬組成物が、ＤＮＡ損傷レベルの放射線に暴露される間に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記医薬組成物が、ＤＮＡ損傷レベルの放射線に暴露された後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記医薬組成物が、ＤＮＡ損傷レベルの放射線への暴露の前、間及び後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記医薬組成物がガス状形態であり、吸入によって患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記医薬組成物が液状形態であり、経口で患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記医薬組成物が患者の腹腔に直接投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記医薬組成物が、一酸化炭素放出化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記医薬組成物が、人工肺によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記医薬組成物が、体外膜ガス交換装置によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
患者に遺伝毒性処置を施す方法であって、
（ａ）患者に遺伝毒性処置を施す工程、及び
（ｂ）工程（ａ）の前、間、又は後に、患者の細胞を保護するのに有効な量の一酸化炭素を含む医薬組成物を投与する工程、
を含み、前記遺伝毒性処置は、放射線療法または温熱療法である、方法。
【請求項１５】
前記医薬組成物は工程（ａ）の前に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記医薬組成物は工程（ａ）の間に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記医薬組成物は工程（ａ）の後に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記医薬組成物は工程（ａ）の前、間、および後に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記遺伝毒性処置は、放射線療法である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記遺伝毒性処置は、温熱療法である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記医薬組成物は、ガス状形態であり、吸入によって患者に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記医薬組成物は、液状形態であり、経口で患者に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記医薬組成物は、患者の腹腔に直接投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記医薬組成物は、一酸化炭素放出化合物を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
前記医薬組成物は、人工肺によって投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
前記医薬組成物は、体外膜ガス交換装置によって投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２７】
患者におけるＤＮＡの年齢関連の損傷を改善する方法であって、
患者におけるＤＮＡの年齢関連の損傷を改善するために有効な量の一酸化炭素を含む医薬組成物を患者に投与することを含む、方法。
【請求項２８】
前記医薬組成物は、ガス状形態であり、吸入によって患者に投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記医薬組成物は液状形態であり、経口で患者に投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記医薬組成物は、患者の腹腔に直接投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記医薬組成物は、一酸化炭素放出化合物を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記医薬組成物は、人工肺によって投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記医薬組成物は、体外膜ガス交換装置によって投与される、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔優先権の主張〕
本出願は、2011年8月9日に出願された米国仮特許出願第61/521,566の利益を主張し、その全内容は、その全体が本明細書中に参考により組み込まれる。
〔連邦政府の支援による研究の陳述〕
本発明は、NIH R01GM088666-01及びAHA 10SDG2640091の助成番号の下の、米国政府の支援によってなされた。該政府は本発明に一定の権利を有する。
〔技術分野〕
本発明はＤＮＡ損傷の処置及び／又はＤＮＡ修復の簡便化に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ−１）はヘムの分解の第1段階を触媒する。ＨＯ−１は、ｂ型ヘム分子のα−メソ炭素架橋を酸化によって切断し、等モル量のビリベルジンIXa、一酸化炭素（ＣＯ）及び遊離鉄を生じる。続いて、ビリベルジンはビリベルジン還元酵素を経てビリルビンに変換され、遊離鉄はフェリチン（その産生は遊離鉄によって誘導される）に隔離される。
【０００３】
ＣＯは重要なシグナル分子として認識されている（Verma et al, Science 259:381-384, 1993）。一酸化炭素は、脳においてニューロンメッセンジャー分子として作用すること（Verma et al）、及び視床下部において神経内分泌調節因子として作用することが示唆されている（Pozzoli et al, Endocrinology 735:2314-2317, 1994）。一酸化窒素と同様に、ＣＯは平滑筋弛緩剤であり（Utz et al, Biochem Pharmacol. 47: 195-201, 1991; Christodoulides et al, Circulation 97:2306-9, 1995）、血小板凝集を阻害する（Mansouri et al., Thromb Haemost. 48:286-8, 1982）。低レベルのＣＯの吸入は、いくつかのモデルにおいて抗炎症作用を有することが示されている。
【０００４】
効果的なＤＮＡ損傷修復及びチェックポイント機構は、ゲノムＤＮＡの完全性を維持するための通常の細胞機能の重要な構成要素である（Garinis et al., Nat Cell Biol 10 (11), 1241 (2008); Lombard et al, Cell 120 (4), 497 (2005)）。ＤＮＡ傷害は、ＵＶ又は電離放射線並びに内因性代謝産物及び反応性酸素種（ＲＯＳ）を含む多くの化学物質に応答して誘導される。ＤＮＡの修復経路は、損傷した塩基の修復又は一本鎖ＤＮＡ切断（塩基除去修復）の修復、及び相同組み換え（homologous recombination:ＨＲ）若しくは非相同末端結合（non-homologous end-joining:ＮＨＥＪ）を含む二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）の修復が含まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Verma et al, Science 259:381-384, 1993
【非特許文献２】Pozzoli et al, Endocrinology 735:2314-2317, 1994
【非特許文献３】Utz et al, Biochem Pharmacol. 47: 195-201, 1991
【非特許文献４】Christodoulides et al, Circulation 97:2306-9, 1995
【非特許文献５】Mansouri et al., Thromb Haemost. 48:286-8, 1982
【非特許文献６】Garinis et al., Nat Cell Biol 10 (11), 1241 2008
【非特許文献７】Lombard et al, Cell 120 (4), 497 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＣＯの投与が、ＤＮＡ損傷レベルの放射線に暴露されたことによってでもよい、細胞におけるＤＮＡ損傷の進展を防ぐこと（及びＤＮＡ修復を促進すること）ができるという発見に、一部基づく。本明細書に記載された方法は、例えば核反応器又は核兵器による、放射線治療（例えば外部ビーム放射線療法（例えばＸ線及び／又はガンマ線）又は放射性医薬化合物）による、又は放射性物質による、例えば放射線に暴露された、暴露されたと思われる、又は暴露される、対象の処置等に有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本開示は、患者に対する、例えば遺伝毒性の化学療法剤の投与、放射線治療及び温熱療法である遺伝毒性処置の適用方法を特色とする。前記方法は患者への遺伝毒性処置を施すことを含み、遺伝毒性処置の施行の前、間、および／または後に、患者に一酸化炭素を含む医薬組成物を患者の細胞を防御するため及び／又は患者のＤＮＡ損傷を軽減するのに有効な量を投与することを含む。
【０００８】
一つの態様では、対象における放射線誘導ＤＮＡ損傷を軽減する方法が提供される。これらの方法は、ＤＮＡ損傷レベルの放射線に、暴露するであろう、暴露されている、又は暴露された対象の同定を含み、対象における放射線誘導ＤＮＡ損傷を軽減するのに有効な量の一酸化炭素を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
【０００９】
一つの実施形態では、対象は、彼らの職業において、ＤＮＡ損傷レベルの放射線に暴露されるであろう、暴露されている、又は暴露されたものであり、前記職業は、医療従事者、鉱山労働者、原子力労働者及び航空乗組員からなる群より選択される。一つの実施形態では、対象は、核反応器又は核兵器からのＤＮＡ損傷レベルの放射線に暴露されるであろう、暴露されている、又は暴露されたものである。
【００１０】
一つの実施形態では、ＤＮＡ損傷レベルの放射線に暴露される前、間、及び／又は後に前記医薬組成物が投与される。
【００１１】
一つの実施形態では、前記医薬組成物は、ガス状形態であり、吸入によって患者に投与される。一つの実施形態では、前記医薬組成物は液状形態であり、経口で患者に投与される。一つの実施形態では、前記医薬組成物は患者の腹腔に直接投与される。一つの実施形態では、前記医薬組成物は、一酸化炭素放出化合物を含む。一つの実施形態では、前記医薬組成物は人工肺によって投与される。一つの実施形態では、前記医薬組成物は、体外膜ガス交換装置によって投与される。
【００１２】
他の一つの態様では、患者に遺伝毒性処置を施す方法を特色とする。前記方法は、（ａ）患者に遺伝毒性処置を施す工程、及び（ｂ）工程（ａ）の前、間、又は後に、患者の細胞を保護するのに有効な量の一酸化炭素を含む医薬組成物を投与する工程を含み、ここで、前記遺伝毒性処置は、放射線療法または温熱療法である。
【００１３】
一つの実施形態では、前記医薬組成物は工程（ａ）の前、間、および／または後に投与される。一つの実施形態では、前記医薬組成物は、ガス状形態であり、吸入によって患者に投与される。一つの実施形態では、前記医薬組成物は液状形態であり、経口で患者に投与される。一つの実施形態では、前記医薬組成物は患者の腹腔に直接投与される。一つの実施形態では、前記医薬組成物は、一酸化炭素放出化合物を含む。一つの実施形態では、前記医薬組成物は人工肺によって投与される。一つの実施形態では、前記医薬組成物は、体外膜ガス交換装置によって投与される。
【００１４】
さらに他の態様では、患者におけるＤＮＡの年齢関連の損傷を改善する方法が提供される。前記方法は患者におけるＤＮＡの年齢関連の損傷を改善するために有効な量の一酸化炭素を含む医薬組成物を患者に投与することを含む。
【００１５】
一つの実施形態では、前記医薬組成物は、ガス状形態であり、吸入によって患者に投与される。一つの実施形態では、前記医薬組成物は液状形態であり、経口で患者に投与される。一つの実施形態では、前記医薬組成物は患者の腹腔に直接投与される。一つの実施形態では、前記医薬組成物は、一酸化炭素放出化合物を含む。一つの実施形態では、前記医薬組成物は人工肺によって投与される。一つの実施形態では、前記医薬組成物は、体外膜ガス交換装置によって投与される。
【００１６】
対象または患者はヒト又は非ヒトの動物であってもよい。例えば、前記患者はいかなる哺乳類、例えばヒト、他の霊長類、例えばブタ、マウス及びラットのようなげっ歯類、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ及びヤギであってもよい。ＤＮＡ損傷は、いかなる多くの要因の結果であってもよく、又はいかなる多くの要因のためにＤＮＡ損傷のリスクが考えられる人であってもよい。前記医薬組成物はいかなる形態であってもよく、例えばガス状又は液状形態である。
【００１７】
前記医薬組成物は、ガス及び／又は液体を患者に投与するための当分野で知られているいかなる方法で患者に投与されてもよく、例えば、吸入、ガス注入、点滴、注射及び／又は摂取を介してである。本発明の一つの実施形態では、前記医薬組成物は吸入によって患者に投与される。他の実施形態では、前記医薬組成物は経口で患者に投与される。さらに他の実施形態では、前記医薬組成物は患者の腹腔に直接投与される。さらに他の実施形態では、前記医薬組成物は人工肺によって又は体外膜ガス交換装置によって投与される。
【００１８】
本開示は患者におけるＤＮＡ損傷を処置、防御、又はそのリスクを軽減することも特徴としている。前記方法はＤＮＡ損傷を罹患している又はそのリスクがあると診断された患者（例えば、ＤＮＡ損傷を罹患している又はそのリスクがあると診断された患者）の同定、及び前記患者に、患者のＤＮＡ損傷を処置するのに有効な量の一酸化炭素を含む医薬組成物を投与することを含む。
【００１９】
本開示は、患者における老化または細胞老化（セネッセンス）を阻害または軽減する方法も特徴とする。前記方法は、老化または細胞老化を阻害または軽減する必要のある患者を同定し、有効量の一酸化炭素を含む医薬組成物を患者に投与することを含む。
【００２０】
他の一つの実施態様では、前記方法はさらに少なくとも一つの、以下の処置を患者に施すことを含む：患者内でのＨＯ−１又はフェリチンの誘導；患者内での組み換えＨＯ−１又はフェリチンの発現；及びＨＯ−１，ビリルビン、ビリベルジン又はアポフェリチン、鉄、デフェロキサミン、又は鉄デキストランを含む医薬組成物を患者に投与すること。ＤＮＡ損傷を処置又は予防するための医薬の調製におけるＣＯ及びいかなる上に列挙された剤の使用も意図される。
【００２１】
他の一つの実施形態において、本発明は、患者におけるＤＮＡ損傷の処置又は予防の方法であって、ＤＮＡ損傷に罹患している、又はそのリスクのある患者（例えば、ＤＮＡ損傷を罹患している又はそのリスクがあると診断された患者）を同定し、一酸化炭素を含む加圧されたガスを含む容器を提供し、加圧されたガスを容器から放出して一酸化炭素を含む雰囲気を形成し、前記雰囲気に患者を暴露することを含み、ここで、前記雰囲気中の一酸化炭素の量は、患者のＤＮＡ損傷を処置するのに十分な量である、方法を特徴とする。
【００２２】
ＤＮＡ損傷の処置又は予防において用いるための、例えばガス状又は液状医薬である医薬の調製におけるＣＯの使用もまた意図される。
【００２３】
ＤＮＡ損傷の処置又は予防のための医薬の製造におけるＣＯの使用もまた本発明の範囲内である。本明細書に記載された方法により、前記医薬はＤＮＡ損傷に罹患している又はそのリスクのある患者におけるＤＮＡ損傷を処置するための方法において用いることができる。前記医薬は本明細書に記載されたいかなる形態であってもよく、例えば液体、固体（ＣＯ放出化合物錠、浣腸等）又はガス状ＣＯ組成物であってもよい。
【００２４】
特に定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。好ましい方法及び材料は以下に記載されているが、本明細書に記載されたものに類似するまたは均等の方法及び材料は本発明の実施または試験において用いてもよい。全ての刊行物、特許出願、特許及び本明細書に記載の他の参考文献は、その全体が参考として組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配する。材料、方法及び実施例は単に例示的なもので、限定されることを意図していない。
【００２５】
本発明の一つ以上の実施形態の詳細は以下に明らかにされている。本発明の他の特徴、目的及び有利な点は明細書の記載及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１Ａ〜Ｃはhmoxl-/-マウスからの組織におけるＨ２ＡＸγのレベルを示す三図のパネルである。Ａ〜Ｂ：野生型（Hmoxl+/+）及びHmoxl-/-のマウスの膵臓、肺、肝臓、脾臓におけるＨ２ＡＸγの免疫組織化学的分析。Ｃ：野生型（+/+）、Hmoxl-/+（+/-）及びHmoxl-/-（-/-）マウスの脾臓溶解物におけるＨ２ＡＸγ及びＨＯ−１に対する抗体とのイムノブロット。代表的なウエスタンブロットは２つの実験外に示されている。
【図２Ａ】ＨＯ−１が欠損するとＤＮＡ損傷への応答においてＨ２ＡＸγ活性が変化することを表す一連の三図の一つである。Hmoxl+/+及びHmoxl-/-マウスから単離し、カンプトテシン（１μｇ／ｍｌ）又はドキソルビシン（１０μｇ／ｍｌ）で１時間処理し、抗Ｈ２ＡＸγ抗体で１時間染色した繊維芽細胞を示す写真のパネルである。スケールバー：２５μｍ。
【図２Ｂ】ＨＯ−１が欠損するとＤＮＡ損傷への応答においてＨ２ＡＸγ活性が変化することを表す一連の三図の一つである。ドキソルビシンで処理したHmoxl+/+、Hmoxl-/+、及びHmoxl-/-繊維芽細胞の溶解物におけるＨ２ＡＸγのイムノブロット解析。代表的な図はＢに示されている。データは少なくとも２つの独立の実験を代表している。*ｐ＜0.05；Hmoxl+/+繊維芽細胞における対照に対する４時間。#ｐ＜0.05；Hmoxl-/-対Hmoxl+/+。
【図２Ｃ】ＨＯ−１が欠損するとＤＮＡ損傷への応答においてＨ２ＡＸγ活性が変化することを表す一連の三図の一つである。ドキソルビシンで処理したHmoxl+/+、Hmoxl-/+、及びHmoxl-/-繊維芽細胞の溶解物におけるＨ２ＡＸγのイムノブロット解析。定量はＣに示される。データは少なくとも２つの独立の実験を代表している。*ｐ＜0.05；Hmoxl+/+繊維芽細胞における対照に対する４時間。#ｐ＜0.05；Hmoxl-/-対Hmoxl+/+。
【図３】図３Ａ〜ＤはＨＯ−１非存在下でのＤＮＡ修復シグナリングを示すイムノブロットのパネルである。Ａ〜Ｂ：カンプトテシンで処理した、安定したＨＯ−１ノックダウン（mirHO-1）のＨＥＫ２９３細胞及びコントロール細胞。Ｃ：ドキソルビシンで処理した、ＨＥＫmirHO1及びコントロール細胞におけるイムノブロット解析。Ｄ：１０Ｇｙの g照射及び照射後５分〜１時間後に採取した、HEK293mirHO-1及びコントロール細胞の溶解物におけるP-ATM, P-Brcal, P-H2AX, P-p53に対する抗体のイムノブロット解析。データは３回反復の２つの独立した実験を代表する。
【図４】図４Ａ〜ＧはＨＯ−１／ＣＯ誘導のＨＲ−媒介ＤＮＡ修復を示す図のパネルである。Ａ：ウエスタンブロットで測定したＨＯ−１レベルを示す顕微鏡写真。Ｂ〜Ｄ：蛍光顕微鏡（Ｂ）及びフローサイトメトリー（Ｃ〜Ｄ）で測定したＧＦＰ陽性Ｕ２０Ｓ−ＳＣＲレポーター細胞の数を示す顕微鏡写真及びグラフ。データは２回反復の少なくとも５実験を代表する。データ±ＳＤを示す。ｐ＜0.05；ＣＯ対空気。スケールバー：２５μｍ。Ｅ〜Ｇ：蛍光顕微鏡（Ｅ）又はフローサイトメトリー（Ｆ〜Ｇ）で測定した、ＧＦＰ陽性細胞のレベルを示す写真及びグラフ。代表データが示されており、データは３つの独立した実験を代表する。平均±ＳＤ。スケールバー：２５μｍ。
【図５】図５Ａ〜Ｆは、ＣＯがＤＮＡ修復シグナリングの活性化を誘発することを示す一連の図である。Ａ〜Ｂ：ＣＯで処理されたＰＣ３及びＨＥＫ細胞の溶解物中のP-Brcal, P-ATM(A)及びP-ATR(B)に対する抗体とのイムノブロット。データは３つの独立した実験を代表する。Ｃ〜Ｄ：フローサイトメトリーで測定したＧＦＰ陽性細胞のレベルを示すグラフ。*ｐ＜0.05  ＣＯ対空気；#ｐ＜0.05  ＣＯ+ＣＧＫ７３３対ＣＯ。Ｅ：フローサイトメトリーで測定したＧＦＰ陽性細胞のレベルを示す棒グラフ。*ｐ＜0.05  ＣＯ対空気；**ｐ＜0.01  ＣＯ+ＫＵ55933対ＣＯ；（-）トランスフェクトされていない細胞。Ｆ：フローサイトメトリーで測定したＧＦＰ陽性細胞のレベルを示す棒グラフ。データは２回反復の３つの実験を代表する。*ｐ＜0.05  ＨＯ−１対Ｃ，#ｐ＜0.05  ＨＯ−１+ＣＧＫ７３３対ＨＯ−１。
【図６Ａ】図６Ａ〜ＦはＣＯがドキソルビシンで処理したマウスの組織においてＤＮＡ損傷をブロックすることを示す顕微鏡写真及び棒グラフのパネルである。Ａ：結腸における、Ｈ２ＡＸγに対する抗体とのイムノブロットの一連の顕微鏡写真。結腸及び腎臓については倍率２０倍；脾臓、肝臓、肺については倍率４０倍；#ｐ＜0.05  ドキソルビシン対対照；*ｐ＜0.05  ＣＯ+ドキソルビシン対空気+ドキソルビシン；**ｐ＜0.001  ＣＯ+ドキソルビシン対空気+ドキソルビシン。
【図６Ｂ】腎臓における、Ｈ２ＡＸγに対する抗体とのイムノブロットの一連の顕微鏡写真。
【図６Ｃ】肺における、Ｈ２ＡＸγに対する抗体とのイムノブロットの一連の顕微鏡写真。
【図６Ｄ】肝臓における、Ｈ２ＡＸγに対する抗体とのイムノブロットの一連の顕微鏡写真。
【図６Ｅ】脾臓における、Ｈ２ＡＸγに対する抗体とのイムノブロットの一連の顕微鏡写真。
【図６Ｆ】組織中のＨ２ＡＸγ染色の定量を示す棒グラフ。対照（空気又はＣＯ）、n＝３、ドキソルビシン±ＣＯ、n＝５．ＦＯＶ当たりのＨ２ＡＸγ陽性細胞の数の平均値±ＳＤが示されている。
【図７】図７Ａ〜Ｇは、ＣＯが組織における致死量の放射線照射による誘導損傷を減少させることを示す一連の写真及びグラフである。Ａ〜Ｂ：１０Ｇｙで放射線照射されたマウスからの組織中のＨＯ−１に対する抗体でのイムノブロット（Ａ）及び免疫組織化学（Ｂ）。照射後１及び3日後の肝臓及び脾臓をＢに示す。Ｃ〜Ｄ：致死量の放射線照射の１時間前に空気又はＣＯで、及び１１日間毎日ＣＯで予め処理したマウスの脾臓及び腸におけるＰ−Ｈ２ＡＸの免疫組織化学分析。代表的な写真はＣに示されており、Ｈ２ＡＸｇ陽性細胞の数の計測はＤに示されている。n＝３〜４ビュー／部分；ｎ＝３〜４マウス／群。Ｅ〜Ｆ：放射線照射の１時間前にＣＯ／空気で処理し、致死的に放射線照射したマウスの単核血液細胞におけるＰ−ＡＴＭ及びＰ−ｐ５３の免疫蛍光染色。代表的写真及び視野毎の陽性細胞の数の計測が表されている。ｎ＝３〜４／群。Ｇ：Ｈ２ａｘ-/-及びＨ２ａｘ+/+マウスから野生型レシピエントへの境界骨髄移植後の生存マウスを示すグラフ。ｎ＝５〜１０／群
【図８】老化（セネッセンス）の容量としての、ゼブラフィッシュ胚におけるβ‐ガラクトシダーゼ活性を示す棒グラフ。
【図９】図９Ａ〜Ｂは、インビボでのＳＩＲＴ１（９Ａ）及びＴＥＲＴ（９Ｂ）のＣＯ暴露による遺伝子発現増加を示す一連の二本の棒グラフである。
【図１０】肺におけるテロメラーゼ、腸におけるトポイソメラーゼの発現の変化を示す棒グラフである。結果は少なくとも３マウス／群の平均値±ＳＤを表す。*ｐ＜0.05。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、ＣＯの投与が、ＤＮＡ損傷を改善するという発見に、一部基づく。
【００２８】
本明細書における用語「一酸化炭素」（又は「ＣＯ」）は、液状に圧縮され、水性溶液中に溶解される、その気体状態での分子の一酸化炭素を記載している。本明細書を通して用いられている用語「一酸化炭素組成物」及び「一酸化炭素を含む医薬組成物」は、気体、固体、又は液体の組成物であって、患者及び／又は器官に、経口、静脈内、皮下、筋肉内及び局所等の経路で投与することができる一酸化炭素を含んでいる。当業者であれば例えば気体、液体又は気体及び液体等の、どの形態の医薬組成物が、与えられた用途のために好ましいかが分かるであろう。
【００２９】
本明細書において用いられる用語「有効な量」及び「処置に有効な」は、意図された効果又は生理的な結果を起こすための投与の経緯の中で効果的な期間（急性または慢性投与及び定期的又は連続投与を含む）用いられる一酸化炭素の量または濃度をいう。本発明で用いるための有効な量の一酸化炭素は、例えばＤＮＡ損傷を予防する量、ＤＮＡ損傷のリスクを減らす量、ＤＮＡ損傷の症状を軽減する量、遺伝毒性処置の結果を改善する量、寿命を延長する量、寿命を増加する量及び／又は加齢を予防する量である。
【００３０】
気体については、一酸化炭素の有効な量は一般的に、約0.0000001重量％〜約0.3重量％の範囲に該当し、例えば0.0001重量％〜約0.25重量％、好ましくは少なくとも約0.001重量％、例えば少なくとも0.005重量％、0.010重量％、0.02重量％、0.025重量％、0.03重量％、0.04重量％、0.05重量％、0.06重量％、0.08重量％、0.10重量％、0.15重量％、0.20重量％、0.22重量％、0.24重量％の一酸化炭素である。好ましい範囲には例えば、0.001重量％〜約0.24重量％、約0.005重量％〜約0.22重量％、約0.005重量％〜約0.05重量％、約0.010重量％〜約0.20重量％、約0.02重量％〜約0.15重量％、約0.025重量％〜約0.10重量％、又は0.03重量％〜約0.08重量％、又は約0.04重量％〜約0.06重量％が含まれる。ＣＯの液体の溶液については、有効な量は一般的にＣＯ約0.0001〜約0.0044ｇ／液体100ｇの範囲に該当し、例えば少なくともＣＯ0001、0.0002、0.0004、0.0006、0.0008、0.0010、0.0013、0.0014、0.0015、0.0016、0.0018、0.0020、0.0021、0.0022、0.0024、0.0026、0.0028、0.0030、0.0032、0.0035、0.0037、0.0040、又は0.0042ｇ／水性溶液100ｇである。好ましい範囲には、例えばＣＯ約0.0010〜約00030ｇ／液体100ｇ、ＣＯ約0.0015〜約0.0026ｇ／液体100ｇ、又はＣＯ約0.0018〜約0.0024ｇ／液体100ｇである。当業者は応用に応じてこれらの範囲外の量も用いることができることが分かるであろう。当業者は気体として与えられた場合に体内で同じ用量になるＣＯ−ＲＭ又はＣＯ−Ｈｂ由来のＣＯの量を投与することができることも分かるであろう。
【００３１】
本明細書を通して、「対象」及び「患者」の用語は交換可能に用いられ、本発明の方法による処置が施される動物、ヒト又は非ヒトを表す。本発明は獣医への応用も意図している。該用語は哺乳類、例えばヒト、その他の霊長類、ブタ、マウス及びラットのようなげっ歯類、ウサギ、ギニアピッグ、ハムスター、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ及びヤギを含むがそれらに限定されない。本明細書で用いられる「処置」の用語は、患者における例えばＤＮＡ損傷等の、徴候の遅延、状態の効果の阻害または軽減を表す。
【００３２】
「ＤＮＡ損傷」の用語は当分野で認識されている用語であり、本明細書において、例えば損傷された（酸化、アルキル化、加水分解、付加、又は交差結合された）塩基、単鎖ＤＮＡ破壊及び二本鎖ＤＮＡ破壊）等の、ＤＮＡに対する化学的変化をいう。
【００３３】
ＤＮＡ損傷の原因となる剤は、例えば、紫外線、電離放射線（Ｘ線、ガンマ線、アルファ粒子）、老化、老化関連障害（例えばハッチンソン・ギルフォード早老症候群、ウェルナー症候群、コケイン症候群、又は色素性乾皮症）及び遺伝毒性又は変異原性物質、例えば活性酸素種、塩基アナログ、脱アミノ化剤（例えば亜硝酸）、インターカレート剤（エチジウムブロマイド）、アルキル化剤（例えばエチルニトロソ尿素）、アルカロイド（例えばビンカアルカロイド）、臭素、アジ化ナトリウム、ソラレン及びベンゼンを含む。癌治療に用いられる典型的な遺伝毒性物質は、ブスルファン、ベンダムスチン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、デシタビン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロミド、及びトポテカンを含む。
【００３４】
いくつかの場合、ＤＮＡ損傷からの、又はその危険性がある対象または罹患している患者は、例えば急性被爆線量で少なくとも又は約0.1Ｇｙ、例えば少なくとも又は約0.2Ｇｙ、少なくとも又は約0.5Ｇｙ、少なくとも又は約1Ｇｙ、少なくとも又は約2Ｇｙ、少なくとも又は約4Ｇｙ、少なくとも又は約5Ｇｙ、少なくとも又は約6Ｇｙ、少なくとも又は約7Ｇｙ、少なくとも又は約8Ｇｙ、少なくとも又は約10Ｇｙ、少なくとも又は約20Ｇｙ、少なくとも又は約30Ｇｙ、少なくとも又は約40Ｇｙ、少なくとも又は約50Ｇｙ、少なくとも又は約100Ｇｙの電離放射線に暴露されているか、暴露される可能性が高い。いくつかの場合、患者は、例えば少なくとも又は約0.1Ｇｙ、例えば少なくとも又は約0.2Ｇｙ、少なくとも又は約0.5Ｇｙ、少なくとも又は約1Ｇｙ、少なくとも又は約2Ｇｙ、少なくとも又は約4Ｇｙ、少なくとも又は約5Ｇｙ、少なくとも又は約6Ｇｙ、少なくとも又は約7Ｇｙ、少なくとも又は約8Ｇｙ、少なくとも又は約10Ｇｙ、少なくとも又は約20Ｇｙ、少なくとも又は約30Ｇｙ、少なくとも又は約40Ｇｙ、少なくとも又は約50Ｇｙ、少なくとも又は約100ＧｙのＤＮＡ損傷レベルの放射線に暴露されるであろうか、暴露されているか、暴露されていたかである。患者は例えば医療従事者、鉱山労働者、原子力従事者、及び航空会社の乗務員等、彼らの職業を通じて、核反応器、例えば戦争中の核兵器及び又はテロ行為からのＤＮＡ損傷レベルの放射線に、暴露されてもよい。医薬組成物は対象がＤＮＡ損傷レベルの放射線照射に暴露される前、暴露されている間、及び／又は暴露された後に、投与されてもよい。
【００３５】
いくつかの場合では、ＤＮＡ損傷の患者又はその危険性のある患者は、火傷を患っている。ＤＮＡ損傷の患者又はその危険性のある患者は、例えば遺伝毒性物質での化学療法、放射線治療、又は温熱療法等の一つ以上の遺伝毒性処置を施されている者であってもよい。ＤＮＡ損傷の患者又はその危険性のある患者は、有害な遺伝子欠損又は突然変異を有していてもよい。いくつかの場合、本方法は患者における年齢関連のＤＮＡへの損傷を改善する。
【００３６】
いくつかの場合、加齢は未修復ＤＮＡ損傷の蓄積の結果である。ＤＮＡに対する年齢関連の損傷は異常構造を有するＤＮＡ変化という結果になる。ミトコンドリア及び核のＤＮＡ損傷は加齢に貢献するかもしれず、核ＤＮＡはこの解析の主たる対象である。核ＤＮＡの損傷は間接的に（アポトーシスまたは細胞セネッセンスの増加により）又は直接的に（細胞機能障害の増加により）老化に貢献し得る。
【００３７】
ヒトでは、ＤＮＡ損傷は頻繁に起こり、ＤＮＡ修復プロセスは補償するように進化してきた。平均では、1時間に各細胞でおよそ800、又は1日約19,200のＤＮＡ損傷が起こる。いずれの細胞においても、いくらかのＤＮＡ損傷は修復プロセスの作用にもかかわらず残る。未修復のＤＮＡ損傷の蓄積はある種の細胞、特に能、骨格、及び心筋におけるそれらのように、ＤＮＡ複製に関連した修復メカニズムに頼ることができない、非複製細胞又は複製の遅い細胞にとってはより一般的である。高齢の患者、例えば少なくとも又は約３０歳、少なくとも又は約３５歳、少なくとも又は約４０歳、少なくとも又は約４５歳、少なくとも又は約５０歳、少なくとも又は約５５歳、少なくとも又は約６０歳、少なくとも又は約６５歳、少なくとも又は約７０歳、少なくとも又は約７５歳、少なくとも又は約８０歳の患者は、一般的にＤＮＡに対する年齢関連の損傷がより蓄積されており、ＤＮＡに対する年齢関連損傷を軽減する処置の恩恵を受けることができる。
【００３８】
熟練した実践者は患者はこの分野で知られた任意の方法でＤＮＡ損傷の患者であるか又はその危険性があると医者に診断され得ることが分かるだろう。ＤＮＡ損傷を発症する危険性があると考えられる個体群は特に本発明の恩恵を受けられるであろう、なぜなら第一に、ＤＮＡ損傷のいかなる証拠がある前に、予防的治療を開始することができるからである。「危険性のある」個体群は、例えば環境的に、職業上、又は治療上、遺伝毒性剤に暴露される対象を含む。熟練した実践者は、患者は医者の診断によってＤＮＡ損傷の危険性が高いと決定されてもよいことが分かるであろう。
【００３９】
ＤＮＡ損傷の処置に有効な量のＣＯは、ＤＮＡ損傷に罹患している、又は、ＤＮＡ損傷に関連する状態である、又は、患者がＤＮＡ損傷を発症するであろう見込みの増大に関連する何らかの危険性の要因（例えばその患者が遺伝毒性物質に最近暴露されたか、暴露されているか、又は暴露されるであろうという）を有すると診断された日に患者に投与することができる。患者はＣＯを、10ppm〜1000ppm、例えば約100ppm〜約800ppm、約150ppm〜約600ppm、又は約200ppm〜約500ppmの範囲の濃度で吸入することができる。好ましい濃度には、約30ppm、約50ppm、約75ppm、約100ppm、約125ppm、約200ppm、約250ppm、約500ppm、約750ppm、又は約1000ppmが含まれる。患者には間欠的または連続的にＣＯを投与することができる。ＣＯは約１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１８又は２０日又は２０日以上、例えば１、２、３、５、又は６か月間、或いは患者がＤＮＡ損傷の症状を示さなくなるまで、若しくは患者がＤＮＡ損傷の危険性があると診断されなくなるまで、患者に投与することができる。ある一日において、ＣＯは丸一日連続的に投与してもよく、間欠的に、例えば（高濃度品を用いて）一日一吹き、又は１日２３時間まで、例えば一日２０、１５、１２、１０、６、３又は２時間まで投与することができる。投与されるＣＯの用量は時間、投与濃度及び患者の体重に基づいてmg/kgに数学的に換算することができる。
【００４０】
もし患者が（例えば医者によって事前に処方されていたので）遺伝毒性薬による処置を希望している場合は、患者をその薬の投与の前、間、及び／又は後にＣＯ（例えば気体状ＣＯ組成物）で処置することができる。例えば、間欠的に又は連続的に、その薬が投与される０〜２０日前（及び複数投与が与えられる場合は各個別の投与の前）から、例えば投与前の少なくとも３０分、例えば約１、２、３、５、７、又は１０時間又は約１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、又は２０日あるいは２０日以上前からＣＯを患者に投与し始めることができる。代替的に、又は加えて、ＣＯを当該薬の投与と一緒に同時に患者に投与することができる。代替的に、又は加えて、ＣＯは当該薬の投与の後に、例えば投与の直後に開始して、そして続けて間欠的に又は連続的に約１、２、３、５、７又は１０時間、或いは約１、２、５、８、１０、２０、３０、５０、又は６０日、あるいは医者がＣＯの投与がもはや必要ではないと決定するまで（例えば、遺伝毒性物質が体から除去されたか、又はもはやＤＮＡ損傷を引き起こすことがなくなった後）患者に投与することができる。
【００４１】
ＣＯの投与はさらにUS7,238,469;US7,678,390; US7,687,079; US7,981,448; US7,364,757; US2004/0258772; US2004/0052866; US2004/0228930;及びUS2004/0131703に記載されており、それらのそれぞれは、その全体が、参照によりここに取り込まれる。
【００４２】
〔ガス状組成物の調製〕
一酸化炭素組成物はガス状一酸化炭素組成物であってもよい。本発明の方法で有用な、圧縮された又は加圧されたガスは、商業的供給源から、圧縮ガスを貯蔵するために適したいかなる種類の容器でも、得ることができる。例えば、圧縮または加圧されたガスは、医学的用途のために、酸素のような圧縮ガスを供給する任意の供給源から得ることができる。本明細書で用いられる用語「医療グレード」ガスは、本明細書で規定する患者に投与するのに適したガスをいう。本発明の方法で用いられるＣＯを含む加圧ガスは、ＮＯ及びＯ２を除いて、所望の最終組成物（例えばＣＯ，Ｈｅ，ＮＯ，ＣＯ２，Ｏ２，Ｎ２）が同じ容器に入っているように供給されてもよい。場合により、本発明の方法は個々のガスが入った複数の容器を使って実施されてもよい。例えば、他のガスと一緒に又は他のガスなしに、一酸化炭素が入った単一の容器が供給されてもよく、その内容物は、場合により部屋の空気、又は酸素、窒素、二酸化炭素、圧縮空気若しくは他の任意の好ましいガス若しくはそれらの混合物が入った容器の内容物と混合されてもよい。
【００４３】
本発明による、患者に投与されるガス状組成物は０重量％〜約79重量％の窒素、約21重量％〜約100重量％の酸素、約0.0000001重量％〜約0.3重量％（約1ppb又は0.001ppm〜約3,000ppm）の一酸化炭素を含む。好ましくは、ガス状組成物中の窒素の量は約79重量％であり、酸素の量は約21重量％であり、一酸化炭素の量は約0.0001重量％〜約0.25重量％であり、好ましくは少なくとも約0.001重量％、例えば少なくとも約0.005重量％、0.010重量％、0.02重量％、0.025重量％、0.03重量％、0.04重量％、0.05重量％、0.06重量％、0.08重量％、0.10重量％、0.15重量％、0.20重量％、0.22重量％、又は0.24重量％である。一酸化炭素の好ましい範囲には、約0.005重量％〜約0.24重量％、約0.01重量％〜約0.22重量％、約0.015重量％〜約0.20重量％、約0.08重量％〜約0.20重量％、及び約0.02重量％5〜約0.1重量％が含まれる。注意すべきなのは、適用に応じて、一酸化炭素濃度が0.3％より高い（例えば１％以上の）ガス状の一酸化炭素組成物が短期間（例えば一または数呼吸）用いられてもよいことである。
【００４４】
一酸化炭素ガスを含む雰囲気を作り出すために、ガス状一酸化炭素組成物を用いてもよい。例えば、一酸化炭素ガスを含む加圧ガスが入った容器を提供し、チャンバー又は空間にその容器から前記加圧ガスを放出して前記チャンバー又は空間内部に一酸化炭素ガスを含む雰囲気を形成することによって、適当なレベルの一酸化炭素ガスを含む雰囲気を作り出すことができる。あるいは、ガスを、究極的には呼吸マスクや呼吸チューブのような装置内に放出し、それによって一酸化炭素ガスを含む雰囲気を呼吸マスク又は呼吸チューブ内に作り出すことができ、患者を確実に、有効なレベルの一酸化炭素に暴露された部屋の唯一の人とすることができる。
【００４５】
ある雰囲気中の一酸化炭素レベルは当分野で既知のいかなる方法で測定又はモニターしてもよい。そのような方法には、電気化学的検出、ガスクロマトグラフィ、放射線同位元素カウンティング、赤外線吸収、比色分析、選択膜に基づく電気化学的方法（例えばSunderman et al, Clin. Chem. 28:2026-2032, 1982; Ingi et al, Neuron 16:835-842, 1996を参照）が含まれる。ppm以下レベルの一酸化炭素レベルは、例えば、ガスクロマトグラフィ及び放射性同位元素カウンティングによって検出することができる。また、ppm以下のレンジの一酸化炭素レベルは生物組織中で中赤外ガスセンサーによって測定することができる（例えばMorimoto et al, Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol 280:H482-H488, 2001を参照）。一酸化炭素センサ及びガス検出装置は多くの商業的供給源から広く入手することができる。
【００４６】
〔液状組成物の調製〕
一酸化炭素組成物は、液状一酸化炭素組成物であってもよい。液体は、当分野で既知の、ガスを液体中に溶解するようにさせる、いかなる方法によって、一酸化炭素組成物にしてもよい。例えば、液体をいわゆる「ＣＯ２インキュベータ」中に置き、好ましくは二酸化炭素でバランスがとられた一酸化炭素の連続的な流れの中に、前記液体中に所望の濃度の一酸化炭素が届くまで、暴露することができる。他の例として、一酸化炭素ガスを「バブル」にして、前記液体中で所望の一酸化炭素濃度に達するまで直接前記液体中に一酸化炭素ガスを入れることができる。与えられた水性溶液中に溶解することができる一酸化炭素の量は、温度を低下させることによって増加することができる。さらに他の例として、（例えば、体外人工肺のような装置を使用して）適当な液体を、一酸化炭素を含む雰囲気中に通された、ガス溶解を可能にする管材料中に通してもよい。一酸化炭素を液体中に溶かすことで液状一酸化炭素組成物が作られる。
【００４７】
活動物への導入を意図した、そのような液状組成物は、動物に導入される時にちょうど又は約３７℃であろう。
【００４８】
液体は当業者に患者に投与するのに適していると知られているいかなる液体であってもよい（例えばOxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press (1994)を参照）。一般的に、液体は水性溶液であろう。溶液の例には、リン酸緩衝生理食塩水(PBS), Celsior（登録商標）、 Perfadex（登録商標）、 コリンズ液、クエン酸溶液、及び ウィスコンシン大学 (UW) 溶液 (Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press (1994))が含まれる。本発明の一実施形態において、液体はリンゲル溶液、例えば、乳酸化リンゲル溶液、又は患者に注入して使用することができる他の液体である。他の実施形態において、液体は血液、例えば全血を含む。
【００４９】
任意の好ましい液体は、ガス溶解器を介して設定濃度の一酸化炭素に飽和させてもよい。あるいは、設定レベルの一酸化炭素に品質管理された、事前に作成された溶液を用いてもよい。投与量の正確な制御は、一酸化炭素分析装置に接続されたガス透過性であって液体不透過性の幕を用いた測定を介して達成することができる。溶液は所望の有効濃度に飽和させ、それらのレベルに維持することができる。
【００５０】
〔一酸化炭素組成物での患者の処置〕
患者は、当分野で既知の、ガス及び／又は液体を患者に投与する任意の方法によって、一酸化炭素組成物で処置することができる。一酸化炭素組成物は、ＤＮＡ損傷であると診断された、又はその危険性があると判断された患者に投与することができる。本発明は、液状又はガス状一酸化炭素組成物の（例えば、吸入及び／又は摂取による）患者への全身投与、及び前記組成物の（例えば、腹腔内に導入することによる）患者への局所投与を意図している。
【００５１】
〔一酸化炭素の全身送達〕
ガス状一酸化炭素組成物は、例えば、ＤＮＡ損傷であると診断された、又はその危険性があると判断された患者に、全身的に送達することができる。ガス状一酸化炭素組成物は一般的に口または鼻の通路を通じて吸入により肺に局所投与され、そこで一酸化炭素は容易に患者の血流中に吸収される。治療用のガス状組成物中に用いられる活性成分（ＣＯ）の濃度は、一酸化炭素の吸収速度、分配速度、不活性化率、（一般的に呼吸による）排出速度並びに当業者に既知の要素に依存する。さらに理解すべきことは、特定の対象についての、具体的な用量計画は、個別の必要性及び前記組成物を投与する人間又は投与を監督する人間の専門的な判断に基づいて時間をかけて調節すべきであり、本明細書で述べられた濃度範囲は例示にすぎず、請求項の組成物の範囲や実践を限定しようとするものではないことである。患者の最適な処置を確実にするために、処置をモニターしてＣＯ用量を調節することができる。本発明は、例えば患者におけるＤＮＡ損傷の重症度又は持続性に応じて、一酸化炭素の、急性、亜急性、及び慢性的な投与を意図する。一酸化炭素は、症状を処置し、意図された薬理学的又は生物学的な効果を奏するのに十分な時間（無期限を含む）、患者に送達することができる。
【００５２】
以下は、ガス状一酸化炭素組成物を患者に投与するのに用いることができるいくつかの方法及び装置の例である。
【００５３】
〔人工呼吸器〕
医療グレードの一酸化炭素（濃度は様々であり得る）は、圧縮ガスの標準的なタンクに入れられた空気又は酸素含有ガスとの混合物（例えばＯ２２１％、Ｎ２７９％）で購入することができる。それは非反応性であり、本発明の方法に求められる濃度は、可燃性範囲（空気中で10％）より十分に低い。病院の設定では、ガスはおそらくベッドサイドに送達され、そこでブレンダーで酸素または室内空気と混合されて、所望のｐｐｍ（百万分の１）濃度になる。患者は、患者の快適性や必要性に応じた流速に設定されている人工呼吸器を通してガス混合物を吸入するであろう。これは肺グラフィックス（すなわち、呼吸数、一回換気量など）により決定される。患者が、所望の量の一酸化炭素よりも多く不必要に接受するのを増資するフェイルセーフ機構を送達システム中に設計してもよい。（１）静脈血中で測定することができるカルボキシヘモグロビン（ＣＯＨｂ）、及び（２）人工呼吸器のサイドポートから集められた呼気一酸化炭素を研究することによって、患者の一酸化炭素レベルをモニターすることができる。一酸化炭素暴露は、患者の健康状態及びマーカーの基準に基づいて調節することができる。必要であれば、一酸化炭素は１００％のＯ２吸入に切り替えることによって患者から洗い流すことができる。一酸化炭素は代謝されない；すなわち、ＣＯ２に変換されるごく少量のパーセンテージを除いて、吸入されたものは最終的には吐き出される。一酸化炭素は、重大な低酸素状態にならずに一酸化炭素を治療的に送達するために、任意のレベルのＯ２と混合することができる。
【００５４】
〔フェイスマスク及びテント〕
一酸化炭素ガス混合物は上記のように調製することができ、フェイスマスク又はテントを利用して、患者による受動的な吸入が可能となる。吸入される濃度は変更することができ、単に100％Ｏ２に切り替えることによって洗い流すことができる。一酸化炭素レベルのモニタリングはマスク又はテントにおいてまたはその近傍で、過度に高い一酸化炭素濃度の吸入を防ぐフェイルセーフ機構と共に行われる。
【００５５】
〔ポータブル吸入器〕
圧縮一酸化炭素は携帯吸入装置にパッケージされ、計算された用量で吸入されてもよく、例えば病院診療ではない受信者の断続的な処置が可能となる。容器には異なる濃度の一酸化炭素をパッケージすることができる。装置は、適切に希釈されたＣＯの、開閉バルブ付きの小さなタンク（例えば５ｋｇ未満）及び患者が標準的な処方又は必要に応じてＣＯを吸うことができるチューブのような簡単なものであってもよい。
【００５６】
〔静脈内人工肺〕
Ｏ２送達及びＣＯ２除去のために設計された人工肺（血液中のガス交換のためのカテーテル装置）を一酸化炭素送達のために用いることができる。移植されると、カテーテルは大動脈の一つに常駐し、全身送達又は局所部位のための所定の濃度で一酸化炭素を送達することができる。送達は、その処置の部位における短時間での高濃度一酸化炭素の局所送達であってもよく（この高濃度は血流の中で急速に希釈される）、低濃度の一酸化炭素への比較的長い暴露であってもよい（Hattler et al., Artif. Organs 18(11):806-812 (1994); and Golob et al, ASAIO J., 47(5):432-437 (2001)を参照）。
【００５７】
〔常圧チャンバー〕
ある例では、患者全体を一酸化炭素に暴露することが好ましい場合がある。患者は、一酸化炭素を満たした気密チャンバー（患者が危険にならないレベルまたは傍観者が暴露される危険性のない許容可能な危険性のレベル）の中にいるであろう。暴露が完了すると、チャンバーは空気（例えば21％Ｏ２，79％Ｎ２）でフラッシュしてもよく、試料を一酸化炭素分析器で分析して、患者に暴露システムからの退出を許す前に一酸化炭素が残留していないことを確実にすることができる。
【００５８】
〔液状ＣＯ組成物の全身送達〕
本発明は、一酸化炭素を含む水性溶液を患者への全身投与、例えば、経口送達及び／又は患者への、例えば静脈内、動脈内、腹腔内、及び／又は皮下的な注入のために作り出してもよいことを意図する。例えば、ＣＯ飽和リンガー溶液のような液状ＣＯ組成物をＤＮＡ損傷に罹患している又はその危険性のある患者に注入することができる。代替的に、又は加えて、ＣＯ部分的又は完全飽和全（又は部分）血を患者に注入することができる。ＣＯはＣＯ−ＲＭ又はＣＯ飽和Ｈｂ（人工の、例えばペグ化又は非ペグ化；ＣＯで飽和され患者に注入することのできるＨｎのいかなる製剤でもよい）として投与されてもよい。
【００５９】
本発明はガス状ＣＯ組成物又は液状ＣＯ組成物の用量を送達することができる薬剤を利用することができること（例えば、ＣＯ−放出ガム、クリーム、軟膏、トローチ剤、またはパッチ）をも意図する
【００６０】
〔一酸化炭素による組織の局所処置〕
代替的に、又は加えて、一酸化炭素組成物は、ＤＮＡ損傷を改善するために、器官又はその任意の部分に、直接適用することができる。ガス状組成物を、患者に直接ガスを吹き込むための当技術分野で公知の任意の方法によって患者の器官に適用することができる。例えば、二酸化炭素のようなガスは、腹腔鏡処置中の検査を容易にするために、患者の腹腔内に通気されることが多い（例えばOxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press (1994)参照）。当業者は、同様の手順を、患者の臓器に直接一酸化炭素組成物を投与するために使用することができることを理解するであろう。
【００６１】
水性一酸化炭素組成物も、ＤＮＡ損傷を改善するために、患者の器官に局所的に投与することができる。水性形態の組成物は当分野で既知の、患者へ液体を投与する任意の方法で投与することができる。ガス状組成物と同様に、水性組成物は器官に直接適用することができる。例えば、溶解されたＣＯを含む生理食塩水等の液体は腹腔鏡処置の間に患者の腹腔内に注射することができる。当業者は、同様の手法が液状一酸化炭素を直接患者の器官に投与するために用いることができることを理解するであろう。また、器官やその部分を液状一酸化炭素組成物でフラッシングすることによって、インサイチュ暴露を行うことができる（Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press (1994)参照）。
【００６２】
〔ヘムオキシゲナーゼ−１の使用、他の化合物、及びＤＮＡ損傷のための他の処置〕
本発明は、ＣＯの投与と組み合わせたヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）の発現誘導も意図している。例えば、ＨＯ−１はＤＮＡ損傷に罹患している患者又はその危険性のある患者で誘導され得る。本明細書で用いられる、用語「誘導（された）」は、細胞自身のタンパク質をコードする内因性の（例えば、非組み換えの）遺伝子を用いて、単離された細胞あるいは組織、器官又は動物の細胞において、ＨＯ−１等のタンパク質の産生の増加が引き起こされることを意味する。
【００６３】
ＨＯ−１は当分野で既知の任意の方法によって患者中で誘導することができる。例えば、ＨＯ−１の産生はヘミン／ヘムアルギネートによって、鉄プロトポルフィリンによって、又はコバルトプロトポルフィリンによって誘導することができる。重金属、サイトカイン、ホルモン、ＮＯ、ＣＯＣｌ２、エンドトキシン、及び熱ショックを含む種々の非ヘム剤もまた、強力なＨＯ−１発現誘導剤である（Choi et al, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15:9-19, 1996; Maines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37:517-554, 1997; 及び Tenhunen et al, J. Lab. Clin. Med. 75:410-421, 1970）。ＨＯ−１は、過酸化水素、グルタチオン枯渇剤、ＵＶ照射、エンドトキシン及び高酸素含む、酸化ストレスを起こす種々の剤によっても高度に誘導される（Choi et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15:9-19, 1996; Maines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37:517-554, 1997; 及び Keyse et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:99-103, 1989）。「ＨＯ−１の誘導剤を含む医薬組成物」は、例えばＮＯ、ヘミン、鉄プロトポルフィリン、及び／又はコバルトプロトポルフィリンのうような、例えば上記の任意の剤を含む、患者においてＨＯ−１を誘導することができる任意の剤を含む医薬組成物を意味する。
【００６４】
細胞中のＨＯ−１発現は遺伝子移入によって増加させることができる。本発明書において、用語「発現（された）」は、外因的に投与された遺伝子（例えば組換え遺伝子）を用いて、単離された細胞あるいは組織、器官又は動物の細胞において、ＨＯ−１又はフェリチン等のタンパク質の産生の増加が引き起こされることを意味する。ＨＯ−１又はフェリチンは、いかなる免疫反応も最小にするため、好ましくは同種（例えば、ヒト、マウス、ラット等）のものである。発現は構成的プロモーター（例えば、サイトメガロウイルスプロモーター）又は組織特異的プロモーター（例えば乳腺細胞のための乳清プロモーター又は肝臓細胞のためのアルブミンプロモーター）によってドライブすることができる。
ＨＯ−１又はフェリチンをコードする適切な遺伝子治療用ベクター（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（AAV）、pox（ワクシニア）ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、マウス微小ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス−１、及びレンチウイルス）が、経口、吸入又は注射によって、ＤＮＡ損傷に罹患しているか、又はその危険性のある患者に投与される。同様に、ＨＯ−１又はアポフェリチンをコードするプラスミドベクターを、例えば裸のＤＮＡとして、リポソーム中、又は微小粒子中で、投与することができる。
【００６５】
また、外因性のＨＯ−１タンパク質を、当分野で既知の任意の方法で患者に直接投与してもよい。外因性のＨＯ−１タンパク質は、上記患者におけるＨＯ−１の誘導又は発現に加えて、又は代替として、直接投与してもよい。ＨＯ−1タンパク質は例えばリポソーム中で、及び／又は例えばＴＡＴ融合タンパク質のような融合タンパク質として、直接患者に投与することができる（例えばBecker-Hapak et al, Methods 24:247-256,2001を参照）。
【００６６】
代替として、又は加えて、ＤＮＡ損傷の予防または治療のために、ＨＯ−１による任意の代謝産物、例えばビリルビン、胆緑素、鉄及び／又はフェリチンをＣＯと連携して患者に投与することができる。また、本発明は、フェリチン以外の鉄結合分子、例えばデスフェリオキサミン（ＤＦＯ）、鉄デキストラン、及び／又はアポフェリチンを患者に投与し得ることを意図する。なおもまた、本発明は、これらの産物の分解を触媒する酵素（例えばビリベルジン還元酵素）を阻害して望ましい効果を作る／増強することができることを意図する。上記のいずれかを、例えば経口、静脈内、腹腔内又は直接投与によって、投与することができる。
【００６７】
本発明は、その化合物が投与された後に体内にＣＯを放出する化合物（例えばＣＯ−放出化合物、例えば光活性化ＣＯ−放出化合物）、例えば二マンガンデカカルボニル、トリカルボニルジクロロルテニウム（ＩＩ）二量体、及び塩化メチレン（例えば、400〜600mg/kgの用量、例えば500mg/kgで）を、カルボキシヘモグロビン及びＣＯ−供与ヘモグロビンの代用品として、本発明の方法で用いることができる。US2003/0064114, US2003/0068387, 及びUS2007/0207217参照。
【００６８】
上記は例えば経口、腹腔内、静脈内、又は動脈内投与並びに局所（舌下及び坐剤を含む）並びに肺へのエアロゾルによって、任意の方法で患者に投与することができる。任意の上記化合物を、局所的に、及び／又は全身的に、及び任意の組み合わせで、患者に投与することができる。
【００６９】
本発明は、さらに、例えば遺伝毒性物質の投与の中止または軽減等の、ＤＮＡ損傷を治療するための他の既知の方法又は化合物と組み合わせて、患者にＣＯを投与することによる、ＤＮＡ損傷の治療／予防を意図する。
【００７０】
本発明は、以下の実施例によって部分的に説明されるが、いかなる方法によっても本発明を制限するものととらえてはならない。
【実施例１】
【００７１】
〔インビボでＨＯ−１が欠如するとγ−Ｈ２ＡＸ  foci（病巣）が蓄積する〕
ＤＮＡ損傷及び修復シグナル伝達におけるＨＯ−１の役割を評価するため、進行中の慢性ＤＮＡ損傷のマーカーであるγ−Ｈ２ＡＸ染色の免疫組織化学解析を、Ｈｍｏｘｌ-/-マウスから採取した種々の組織について行った。野生型動物の脾臓及び肺ではγ−Ｈ２ＡＸは低いレベルで観察され、腎臓及び肝臓ではほぼ検出不可能な発現が観察された（図１Ａ−Ｂ）。対照的に、Ｈｍｏｘｌ-/-動物では野生型対照に比べて統計学的に有意なより多くのγ−Ｈ２ＡＸ  fociがあった（図１Ａ〜Ｃ）。視野（２０倍、ｎ＝３〜４、場のｎ＝５〜１０  ３〜４マウスから）当たりのＨ２ＡＸγ fociの数の定量をＡに示す。代表的な写真をＢに示す。*p=0.03、**p<0.001。スケール：100μｍ。これらのデータはＨｍｏｘｌ-/-細胞は破壊されたＤＮＡを効率的に修復することができないことか、又は、Ｈｍｏｘｌ-/-マウスの組織における強力な酸化ストレスにより、ＤＮＡ損傷が加速されることを示唆した。
【００７２】
ＨＯ−１の不存在によりＤＮＡ損傷の蓄積が加速されるか否かを解明するため、Ｈ２ＡＸのリン酸化で測定されるように（図２）、細胞を、ＤＳＢ又はＳＳＢをそれぞれ誘発する、ドキソルビシンまたはカンプトテシンで処理した。Ｈｍｏｘ+/+繊維芽細胞をドキソルビシンまたはカンプトテシンで処理すると、ヒストンＨ２ＡＸのリン酸化が強く増加し、複数のγ−Ｈ２ＡＸ  fociが形成された（図２Ａ〜Ｂ）。Ｈｍｏｘｌ-/-マウスからの繊維芽細胞も野生型のようにカンプトテシンに反応して同様のfociが見られた（図２Ａ）。しかし、カンプトテシンとは対照的に、ドキソルビシンで処理したＨｍｏｘｌ-/-繊維芽細胞はγ−Ｈ２ＡＸfociの形成もγ−Ｈ２ＡＸのリン酸化も、野生型では見られたにもかかわらず、試験のいずれの時点でも見られなかった（図２Ａ〜Ｃ）。代表的な写真を、少なくとも２回の独立した重複実験から示している。繊維芽細胞はドキソルビシン（10μg/ml）で２〜４時間処理した。これらのデータは、ＨＯ−１は特に、ＤＮＡトポイソメラーゼＩを標的にするカンプトテシンとは異なり、ドキソルビシンによって誘導されるＤＳＢに対するＤＮＡ修復反応を媒介することができることを示唆している。
【実施例２】
【００７３】
〔ＨＯ−１の不存在によりＤＮＡ修復シグナル伝達が減少する〕
ＨＯ−１との機能の減少及び増加の研究において、ＨＯ−１の直接的な効果を、ＤＮＡ損傷剤ドキソルビシン、カンプトテシン又は放射線照射に対する反応におけるシグナル伝達経路で試験した。ラージＴ抗原の存在により、ＨＥＫ２９３細胞はＨＯ−１を高い基礎レベルで発現する。ＨＥＫ２９３細胞はマイクロ適合shＲＮＡを形質導入して安定的にＨＯ−１を枯渇させた後、カンプトテシン、ドキソルビシン又は放射線照射に暴露した。安定的にＨＯ−１をノックダウンしたＨＥＫ２９３細胞（mirＨＯ−１）及びコントロール細胞をカンプトテシン（1μg/ml）で2分-2時間処理した。ＨＯ−１のレベル及びＤＮＡ修復シグナル伝達タンパク質の活性化はウエスタンブロットで測定した。期待された通り、カンプトテシンは野生型ＨＥＫ２９３細胞においてＨ２ＡＸのリン酸化を誘導し、これはＨＯ−１なしの細胞中で少し増強された（図３Ａ）。これらの発見はＨｍｏｘｌ-/-マウスからの組織において観察されたＨ２ＡＸのリン酸化と相関していた（図１）。
【００７４】
主要なＤＮＡ修復キナーゼ、ＡＴＲ及びＡＴＭ及びそれらの下流の標的のステータスをカンプトテシンで処理したＨＥＫ２９３細胞において評価した。ＡＴＲ、ＡＴＭ並びにp５３、Ｃｈｋ２及びＢｒｃａ1のリン酸化は、ＬＭＰ感染させたＨＥＫ２９３コントロール細胞中では、非形質移入のナイーブＨＥＫ２９３細胞に比べて、比較的無変化であった（図３Ｂ）。しかし、ＨＯ−１のノックダウンにより、ＡＴＭ、Ｂｒｃａ１、ＡＴＲ及びＣｈｋ２のリン酸化は有意に減少した（図３Ｂ）。重要なのは、p５３のリン酸化には有意な変化がなかったことであり、これはＨＯ−１が、遺伝毒性のストレス因子の存在下でのアポトーシスの調節又は細胞サイクルの進行よりもむしろＤＮＡ修復において特異的であり重要であるということを示唆している。
【００７５】
ドキソルビシンで処理したＨＥＫ２９３細胞も同様に応答しＡＴＭ、ｐ５３及びＨ２ＡＸのリン酸化が増加した（図３Ｃ）。ドキソルビシン（10μg/ml）で2分-2時間処理したＨＥＫmirＨＯ−１及びコントロール細胞を示す。これらの条件下でＨＯ−１をノックダウンすると、リン酸化されたＡＴＭが阻害され及びＢｒｃａ１の活性化が遅延した。ドキソルビシン不存在下でのコントロール又はmirＨＯ−１−形質移入ＨＥＫ２９３細胞中のＰ−ｐ５３又はγ−Ｈ２ＡＸでは有意な変化は観察されなかった。また、ＤＮＡへの放射線照射の影響を、照射（１０Ｇｙ）後のＨＯ−１の存在及び不存在下でのＨＥＫ細胞において調べた。ＡＴＭ、Ｂｒｃａ１、Ｈ２ＡＸ及びｐ５３のリン酸化レベルは、mirＨＯ−１ＨＥＫ細胞において、コントロールに比べて有意に減少し又は遅延していた（図３Ｄ）。mirＨＯ−１ＨＥＫ細胞では、ＨＲ−媒介ＤＮＡ修復に含まれる主要なＤＮＡ修復複合体の全レベルでは有意な変化はなかった。ＡｋｔはＰ−ｐ５３の免疫ブロットのためのローディングコントロールである。
【実施例３】
【００７６】
〔ＨＯ−１／ＣＯは二本鎖切断のＨＲ修復を容易にする〕
Ｈｍｏｘｌ-/-細胞がドキソルビシンに対する応答においてＨ２ＡＸγfoci形成の変化を示し、そしてmirＨＯ−１ＨＥＫ細胞がカンプトテシンに対する応答においてＤＮＡ修復につながる主要なシグナル伝達カスケードの活性化の減少を示したので、ドキソルビシン又はカンプトテシンによって誘導されるＤＳＢ修復（複製中の）において重要な、相同組換え−媒介ＤＮＡ修復におけるＨＯ−１の役割を評価した。これを試験するため、ＨＲ／ＳＣＲ（相同組換え/姉妹染色分体組換え）レポーターを含むＵ２ＯＳ細胞系統を前述のとおり（１２，１３）用いた。Ｉ−ＳｃｅＩ制限酵素を用いて二本鎖切断（ＤＳＢ）をＵ２ＯＳ細胞中のレポーターに導入した。Ｉ−ＳｃｅＩにより誘導された相同組換えの効率は遺伝子変換による野生型ＧＦＰの生成と相関していた。
【００７７】
ＤＳＢにおけるＨＯ−１の役割を試験するため、ＨＯ−１をＩ−ＳｃｅＩプラスミドと一緒にＵ２ＯＳ細胞中で一過性に過剰発現させ、形質移入の２４時間後にＧＦＰ陽性の細胞の数を試験した（図４Ａ）。Ｕ２ＯＳ−ＳＣＲレポーター細胞に、一過性にＳｃｅＩ及びＨＯ−１又はコントロールプラスミドで共トランスフェクションした。細胞にＨＯ−１構築物でトランスフェクションし、ＧＦＰ陽性細胞の量をトランスフェクション後４８時間で測定した。コントロール、非トランスフェクション並びにコントロールベクター導入の細胞はＧＦＰ陽性について低頻度を示し、修復の乏しさを示唆したのに対し（図４Ｆ−Ｄ）蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリーで評価したＨＯ−１過剰発現細胞では、ＧＦＰレベルについて有意に２倍の増加が観察された（図４Ｂ−Ｄ）。これらのデータはＤＳＢに対する反応中のＨＲの誘導におけるＨＯ−１の役割をサポートしている。ＨＯ−１と共に観察された効果の多くはその酵素的な産物ビリベルジン又はＣＯの一つ以上によって媒介される。したがって、ＤＳＢ及びＤＮＡ修復中のＨＲにおいて、ビリベルジン及びＣＯの役割を別々に試験した。ＳｃｅＩで２４時間トランスフェクションした後のＵ２ＯＳ−ＳＣＲリポーター細胞をＣＯ２５０（ppm）で２４時間処理した。ビリベルジン処理はＧＦＰ陽性細胞の数に対して影響を及ぼさなかったが、ＣＯ（２５０ppm）はＧＦＰ陽性細胞の数を増加させ（図４Ｅ−Ｇ）、ＨＯ−１が一部ＣＯを介してＤＮＡ修復経路を調節し、ＤＮＡ損傷に対する反応におけるＨＲを容易にしていることを示唆している。ＸＨＡＴＭ抵抗性コロニーの数によって測定されたＮＨＥＪ媒介ＤＮＡ修復ではＣＯの影響は観察されなかった。
【実施例４】
【００７８】
〔ＣＯ／ＨＯ−１で調節されたＤＮＡ修復反応はＡＴＭ／ＡＴＲ活性に依存している〕
ＰＣ３及びＨＥＫ細胞の溶解物をＣＯ（２５０ppm）で2分から1時間処理した。ＣＯによってＨＥＫ細胞中のＢｒｃａ１並びに上流のキナーゼＡＴＲ及びＡＴＭの急速なリン酸化が誘導され（図５Ａ−５Ｂ）、ＣＯが、定常的に酸化によるＤＮＡ損傷の危険下にある細胞中でＤＮＡ修復経路を誘導することを示唆している。したがって、２つの主要なＤＮＡ修復キナーゼ、ＡＴＭ及びＡＴＲが、ＣＯ又はＨＯ−１の存在下での加速されたＨＲに関与しているかどうかが調べられた。ＡＴＭ及びＡＴＲの選択的阻害剤であるＣＧＫ７３３、及びさらに選択的なＡＴＭの阻害剤であるＫＵ５５９３３がこの仮説を試験するために用いられた。ＣＯ（250ppm）で24時間処理する前に、Ｕ２ＯＳ−ＳＣＲレポーター細胞をＳｃｅＩで２４時間トランスフェクションした後、ＣＧＫ７３３（20μＭ）又はＤＭＳＯで1時間処理した。次の24時間ＣＯ（250ppm）での処理が適用される前に、Ｕ２ＯＳ−ＳＣＲレポーター細胞はＳｃｅＩで24時間及びＫＵ５５９３３（20μＭ）又はＤＭＳＯで1時間、共トランスフェクションされた。ＡＴＭ／ＡＴＲ又はＡＴＭ単独ではＣＯ媒介ＨＲが有意に減少した（図５Ｃ−Ｅ）。Ｕ２ＯＳ−ＳＣＲレポーター細胞をＳｃｅＩ及びＨＯ−１で24時間共トランスフェクションし、ＣＧＫ７３３を次の24時間適用した。ＨＯ−１の誘導は、他のベヒクルコントロールで観察されたようには、ＧＫ７３３の存在下でＨＲを増加させず（図５Ｆ）、損傷に続くＨＲ及びＤＮＡ修復の調節のために、ＡＴＲ及びＡＴＭが部分的にＣＯ／ＨＯ−１によって用いられていることを強く示唆している。
【実施例５】
【００７９】
〔ＣＯは化学療法又は放射線照射に応答してインビボでＤＮＡ損傷から保護する〕
インビトロで観察された効果に基づいて、ＣＯの有益な効果がマウスにおけるＤＮＡ損傷のインビボモデルで試験された。ヌードマウスを、確立されたＰＣ３腫瘍（2週間）とＣＯ（コントロール）又はドキソルビシン（8mg/kg,週2回,i.v.）±ＣＯ（毎日、1時間、250ppm）で処理した後、14日後に組織を採取した。ドキソルビシンは、ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の化学療法治療中の組織におけるDNA損傷を誘発するために使用された。Ｈ２ＡＸγfociの蓄積によって決定されたように、ドキソルビシンは、肺、肝臓、腎臓、大腸における大量のDNA損傷につながり、脾臓においては低い程度であり、ＨＯ−１の発現増加と関連していた（図６Ａ−Ｅ）。ＣＯは全ての器官においてＤＮＡ損傷の重症度を減少させた（図６Ａ−Ｆ）
【００８０】
化学的遺伝毒性物質を伴う観察を支援するため、ＤＮＡ損傷の放射線照射モデルも用いた。内因性のＨＯ−１はＩＲ又はドキソルビシンに応答して早期に誘導され、その発現は脾臓、肝臓及び腎臓で２４〜７２時間維持続する（図７Ａ−Ｂ）。腎臓及び脾臓は放射線照射の後２時間で採取された。外因性のＣＯの役割を評価するため、マウスを致死量又は亜致死量の放射線照射及びその後の毎日１時間に先立って、ＣＯで１時間事前処理した。致死量の放射線照射（10Gy）及び毎日のＣＯ処理11日間の前に、マウスの脾臓及び小腸を空気又はＣＯ（250ppm）で１時間事前処理した。放射線照射したマウスの脾臓及び小腸において、Ｈ２ＡＸγfociの慢性的増加が観察された（図７Ｃ−Ｄ）。対照的に、ＣＯで処理したマウスでは持続的なＨ２ＡＸγfoci形成が有意に阻害され、空気で処理した動物では５０％の生存率だったのに対して、80％のマウスが１０日より長く生きるという、より長い生存率に対応していた（ｐ＝0.031*、ＣＯ対空気、n=6/グループ）。対照的に、空気コントロールに比べて、ＣＯで１時間処理した放射線照射された動物の末梢血単核細胞及び骨髄中のＰ−ｐ５３、Ｐ−Ｂｒｃａ１、Ｐ−ＡＴＭの強力な誘導及びＰ−Ｈ２ＡＸの早期の誘導があったことは、ＤＮＡ損傷の早期回復を示唆している（図７Ｅ−Ｆ）。放射線照射の２時間後に組織を採取した。ＤＮＡ修復でのＣＯの効果におけるＨ２ＡＸシグナル伝達の役割を評価するため、Ｈ２ａｘ-/-及びＨ２ａｘ+/+マウスから野生型の放射線照射されたレシピエントへのＢＭ細胞の辺縁骨髄移植が用いられた。マウスは致死量の放射線照射（10Gy）の前及びその後ＢＭを受けた後に、ＣＯで処理した。Ｈ２ＡＸがドナーＢＭ細胞中に欠如していたことによって、放射線に誘導された死に対するＣＯ−媒介保護が逆転したことは、ＣＯ媒介保護におけるＨ２ＡＸ経路の重要な役割を示唆する（図７Ｇ）
【実施例６】
【００８１】
〔材料及び方法〕
動物、放射線照射及びＣＯ処理
Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)から７〜９週令のオスのＣ５７ＢＬ／６マウスを購入した。マウスはＳＰＦ条件下で維持され、実験はＢＩＤＭＣのＩＡＣＵＣ（動物実験委員会）に承認された。マウスは１０Ｇｙ（致死量）又は５Ｇｙ（亜致死量）で放射線照射され、プロトコルはＢＩＤＭＣの放射線安全管理者及びＩＡＣＵＣの承認を得た。マウスは放射線照射の前にプレキシガラスチャンバー中で1時間ＣＯに暴露され、事後毎日1時間暴露された。
【００８２】
〔辺縁骨髄移植〕
マウスは致死量の放射線を照射し、放射線照射の直後に2.5mln細胞を静脈内に移植した。注射された骨髄の量は40％のマウスの回復に十分な量であった。
Taconic (Hudson, NY)から7週令のNu/nuマウスを購入した。これらのマウスは、マウスの右脇腹に注入されたPC3細胞の皮下腫瘍モデルの相補的な実験に使用された。ドキソルビシン（8mg/kg、シグマ）を静脈内に週2回与え、マウスは毎日ＣＯ（250ppmで1時間）に暴露した。処置の2週間後に組織を採取した。
【００８３】
〔細胞培養及び処置〕
Ｕ２Ｏ３  ＨＲ／ＳＣＲ細胞を10％ＦＢＳ及び抗生物質を含むＤＭＥＭ培地（Gibco, Invitrogen）中に維持した。ｐＰＨＷ１細胞（ＮＨＥＪモデル）を10％ＦＢＳ及び抗生物質を含むＤＭＥＭ培地中に維持した。マウス腎臓繊維芽細胞を成体Ｈｍｏｘｌ-/-及びＨｍｏｘｌ+/+マウスから得て10％ＦＢＳ及び抗生物質を補ったＤＭＥＭ培地で４〜７代培養した。ＨＥＫ２９３はＡＴＣＣから購入し、製造者のプロトコルにしたがって培養した。ＣＯインビトロ研究のために、細胞を９５％Ｎ２中の250ppmのＣＯ及び５％ＣＯ２に2分から24時間暴露した。細胞に10Gyの放射線を照射し、１回の暴露の後異なる時点で採取した。
【００８４】
〔shmirＲＮＡレトロウイルス媒介トランスフェクション〕
ヒトＨＯ−１のためのマイクロＲＮＡアダプター化されたshＲＮＡ（shＲＮＡmir）をOpen Biosystems(AL, USA)から購入した。shＲＮＡmir-ＨＯ−１はＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素でＭＳＣＶ−ＬＴＲmiＲ３０−ＰＩＧ（ＬＭＰ）ベクター（Open Biosystems）にサブクローニングした。ＬＭＰ−ｓｈＲＮＡＨＯ−１のためのレトロウイルス及びコントロールベクターを作成しＨＥＫ293細胞の形質導入に用いた。５μg／mlプロマイシン（シグマ）で２〜４週の選択によって安定したクローンを作成した。
【００８５】
〔ＨＲ／ＳＣＲレポーターアッセイ、フローサイトメトリー及び蛍光顕微鏡〕
前述のとおりＨＲ／ＳＣＲレポーターＵ２ＯＳ細胞を用いた。簡単には、ＧＦＰ+細胞をトランスフェクションの2日後にフローサイトメトリー（FACScan, BD Biosciences）及び蛍光顕微鏡で解析した。ＧＦＰ陽性細胞の画像はZeiss Apotome蛍光顕微鏡を用いてランダム視野でキャプチャーした。
【００８６】
〔統計学的解析〕
差異の有意性はp<0.05で有意で受け付けで、分散（ANOVA）またはスチューデントt-検定（SPSS社、シカゴ、IL）による分析を用いて決定した。生存分析のためにはログランクマンテルコックス検定を適用した。
【実施例７】
【００８７】
〔加齢及びセネッセンス（老化）における一酸化炭素〕
この実施例はヘムオキシゲナーゼ−1及びＣＯＲＭが、加齢のモデルであるゼブラフィッシュ胚におけるセネッセンス関連β−ガラクトシダーゼ染色を阻害することを明らかにする。
【００８８】
ゼブラフィッシュ胚におけるインビボセネッセンスのモデルが先に記載したように採用された（Koshimizu et al, 2011, Plos One, 6:el7688）。胚はＨＯ−１発現を阻害するためのモルホリノ又はコントロールベクターでトランスフェクションされた。別個の治療群においては、胚はＨＯ−１モルホリノでトランスフェクションされＣＯ放出分子（50μＭ；シグマ−アルドリッチ）で処理した。結果はＨＯ−１を欠く胚はβ−galの活性がより大きく、より大きい又はより早いセネッセンスを示し、ＣＯの投与によりこれが逆転されて陽性β-gal染色の通常のセネッセンス／加齢レベルにすることができ、セネッセンスの減速に向かう傾向であった。ゼブラフィッシュ胚におけるＨＯ−１に対するモルホリノでのＨＯ−１のノックダウンにより、コントロールモルホリノ又は非注射幼生に比較して、セネッセンス関連β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−gal）活性が誘導された（図８）。ＨＯ−１に対するモルホリノでの注射の後のＣＯＲＭの適用ではゼブラフィッシュ胚のセネッセンスの減速が観察された。これらのデータは、ＨＯ−１不存在下で加速される老化関連セネッセンスがＣＯの適用で逆転可能であることを示唆している。
【００８９】
マウスで行った他の実験セットでは、マウスはＣＯに1時間暴露され、24時間で、複数の組織を採取し、ＣＯで処理した動物は肺において抗加齢遺伝子ＳＩＲＴ１（サーチュイン;図９）及びＴＥＲＴ（テロメラーゼ逆転写酵素）の発現が増加されていることが発見された。これは肺がこのような高速の細胞回復を有するという重要な事実である。これらの遺伝子の発現の増加はセネッセンスの減少及び寿命の延長に関連している。
【実施例８】
【００９０】
〔ＤＮＡ修復におけるＣＯ〕
この実施例はＣＯへの暴露によってテロメラーゼ、トポイソメラーゼ、及びｐ１６の発現が増加し、ＤＮＡ損傷を減少させることを示す。
【００９１】
オスのＣ５７Ｂｌ／６マウスを吸入中の一酸化炭素250ppmに1時間暴露した。マウスはすぐに暴露チャンバーから除去し、肺及び小腸を採取し、ＲＮＡのために処理した。肺のテロメラーゼ及び小腸のトポイソメラーゼ（ＤＮＡの巻き戻しに関与する）及びｐ１６（細胞周期抑制因子）についてリアルタイムＰＣＲを行い、発現を空気暴露コントロールと比較した（図１０）。結果は少なくとも３マウス／群の平均±ＳＤを示す。*p<0.05。
【００９２】
〔他の実施形態〕
本発明のいくつかの実施形態を記載した。それにかかわらず、本発明の精神及び範囲を離れない種々の改変を施してもよいことが理解されるであろう。したがって、他の実施形態は以下の請求項の範囲内である。
【図２Ａ】
2014525399.tif 000003
【図２Ｂ】
2014525399.tif 000004
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2014525399.tif 000007
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2014525399.tif 000009
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2014525399.tif 000011
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2014525399.tif 000013
【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
2014525399.tif 000019
【図５Ｄ】
2014525399.tif 000020
【図５Ｅ】
2014525399.tif 000021
【図５Ｆ】
2014525399.tif 000022
【図６Ａ−６Ｅ】
2014525399.tif 000023
【図６Ｆ】
2014525399.tif 000024
【図７Ａ】
2014525399.tif 000025
【図７Ｂ】
2014525399.tif 000026
【図７Ｃ】
2014525399.tif 000027
【図７Ｄ】
2014525399.tif 000028
【図７Ｅ】
2014525399.tif 000029
【図７Ｆ】
2014525399.tif 000030
【図７Ｇ】
2014525399.tif 000031
【図８】
2014525399.tif 000032
【図９Ａ】
2014525399.tif 000033
【図９Ｂ】
2014525399.tif 000034
【図１】
2014525399.tif 000035
【図１０】
2014525399.tif 000036
【国際調査報告】
2014525399.tif 000037
2014525399.tif 000038
2014525399.tif 000039