(57)【要約】本発明は、２種類のＩｓｐＧ酵素に加えイソプレン合成酵素を利用するよう、組み換えにより遺伝子操作を行った細胞を用い、イソプレンを生産するための組成物及び方法を提供する。
2014504497.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレン生産能をもつ組み換え細胞であって、（ｉ）第１の種の第１の１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−２リン酸合成酵素（ＩｓｐＧ）ポリペプチドをコードしている核酸、（ｉｉ）第２の種の第２のＩｓｐＧポリペプチドをコードしている核酸、ここで、第２の種は第１の種とは異なる（ｉｉｉ）ＤＸＰ経路に関係する酵素を少なくとも１つコードしている核酸、及び（ｉｖ）イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている核酸、により形質転換されている、組み換え細胞。
【請求項２】
前記第１のＩｓｐＧポリペプチドがＴ．エロンガタスのＩｓｐＧポリペプチドである、請求項１に記載の組み換え細胞。
【請求項３】
前記第２のＩｓｐＧポリペプチドが大腸菌ＩｓｐＧポリペプチドである、請求項１に記載の組み換え細胞。
【請求項４】
鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチドをコードしている核酸を更に含む、請求項１に記載の組み換え細胞。
【請求項５】
前記鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチドが、フェレドキシン及びフラボドキシンから選択される、請求項４に記載の組み換え細胞。
【請求項６】
ＤＸＰ経路関連性ポリペプチドをコードしている核酸を更に含む、請求項１に記載の組み換え細胞。
【請求項７】
前記ＤＸＰ経路関連性ポリペプチドがシャペロンタンパク質である、請求項６に記載の組み換え細胞。
【請求項８】
前記細胞が、イソペンテニル−二リン酸δ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドをコードしている少なくとも１つの異種核酸、又はＩＤＩポリペプチドをコードしている内在性の核酸の少なくとも１つのコピーを更に含む、請求項１に記載の組み換え細胞。
【請求項９】
前記細胞が、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている少なくとも１つの異種核酸、又はＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている内在性の核酸の少なくとも１つのコピーを更に含む、請求項１に記載の組み換え細胞。
【請求項１０】
前記細胞が、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている少なくとも１つの異種核酸、又はＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている内在性の核酸の少なくとも１つのコピーを更に含む、請求項８に記載の組み換え細胞。
【請求項１１】
前記イソプレン合成酵素ポリペプチドが、植物イソプレン合成酵素ポリペプチドである、請求項１に記載の組み換え細胞。
【請求項１２】
前記イソプレン合成酵素ポリペプチドが、クズ属又はハコヤナギ属、あるいは交雑種のウラジロハコヤナギｘヤマナラシ由来のポリペプチドである、請求項１１に記載の組み換え細胞。
【請求項１３】
前記イソプレン合成酵素ポリペプチドが、プエラリア・モンタナ又はクズ、ポプルス・トレムイドス、ウラジロハコヤナギ、セイヨウハコヤナギ、及びコットンウッドからなる群から選択される、請求項１１に記載の組み換え細胞。
【請求項１４】
前記植物イソプレン合成酵素ポリペプチドがクズイソプレン合成酵素ポリペプチドである、請求項１１に記載の組み換え細胞。
【請求項１５】
前記細胞がバクテリア細胞、藻類細胞、真菌細胞、又は酵母細胞である、請求項１に記載の組み換え細胞。
【請求項１６】
前記細胞がバクテリア細胞である、請求項１５に記載の組み換え細胞。
【請求項１７】
前記バクテリア細胞がグラム陽性バクテリア細胞、又はグラム陰性バクテリア細胞である、請求項１６に記載のバクテリア細胞。
【請求項１８】
前記バクテリア細胞が、大腸菌、Ｐ．シトレア、枯草菌、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレービス、Ｂ．ステアロサーモフィルス、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．クラウシイ、Ｂ．ハロデュランス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サークランス、Ｂ．ロータス、卒倒病菌、Ｓ．アルブス、Ｓ．リビダンス、Ｓ．コエリカラー、Ｓ．グリセウス、シュードモナス属、及びＰ．アルカリゲネス細胞からなる群から選択される、請求項１７に記載のバクテリア細胞。
【請求項１９】
前記バクテリア細胞が大腸菌細胞である、請求項１８に記載のバクテリア細胞。
【請求項２０】
前記ＤＸＰ経路に関係するその他の酵素が、ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＭＣＴ、ＣＭＫ、ＭＣＳ、ＨＤＲ（ＩｓｐＨ）、及びＩＤＩからなる群から選択される、請求項１に記載の組み換え細胞。
【請求項２１】
前記ＤＸＰ経路に関係するその他の酵素が、ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＨＤＲ（ＩｓｐＨ）、及びＩＤＩからなる群から選択される、請求項２０に記載の組み換え細胞。
【請求項２２】
請求項１に記載の組み換え細胞を含む細胞培養物であって、イソプレンを少なくとも約８．４ｇ／Ｌ生産する、細胞培養物。
【請求項２３】
請求項１０に記載の組み換え細胞を含む細胞培養物であって、イソプレンを少なくとも約８．４ｇ／Ｌ生産する、細胞培養物。
【請求項２４】
イソプレン生産法であって、（ａ）イソプレン生産に好適な条件下で請求項１に記載の組み換え細胞を培養する工程、並びに（ｂ）イソプレンを生産させる工程、を含む、方法。
【請求項２５】
前記イソプレンを回収する工程を更に含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記組み換え細胞が約８．４ｇ／Ｌ超のイソプレンを生産する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
イソプレン生産法であって、（ａ）イソプレン生産に好適な条件下で請求項１０に記載の組み換え細胞を培養する工程、並びに（ｂ）イソプレンを生産させる工程、を含む、方法。
【請求項２８】
前記イソプレンを回収する工程を更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記組み換え細胞が約８．４ｇ／Ｌ超のイソプレンを生産する、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本開示は、米国特許出願第６１／４２６，５０５号（２０１０年１２月２２日出願）の優先権を主張し、その内容は、参照により全体が本開示に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、概して、２種類のＩｓｐＧ酵素を用いることで、組み換え細胞によるイソプレン生産を増大させるための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、各種合成ポリマー、特に合成ゴムの重要な出発物質である。イソプレンは、様々な微生物、植物、及び動物種によって天然に生成される。特に、イソプレンの生合成に関しては、メバロン酸（ＭＶＡ）経路と非メバロン酸（ＤＸＰ）経路の２つの経路が同定されている。しかしながら、天然に生じる生物から得られるイソプレンの収率は商業的には魅力的でない。イソプレンの重合により、約８００，０００トン／年（７２５，７４４トン／年）のｃｉｓ−ポリイソプレンが製造されており、このポリイソプレンのほとんどがタイヤ及びゴム産業で使用されている。また、履物、機械製品、医療用品、スポーツ用品、及びラテックスなどのその他の製品では、共重合させたイソプレンが合成エラストマーとして使用されている。
【０００４】
現在、タイヤ及びゴム産業は、天然ゴム及び合成ゴムの使用に基づいている。天然ゴムは、アフリカの熱帯雨林のゴムノキ又は植物の乳状液から得られる。合成ゴムは主にブタジエンポリマーをベースとしている。これらのポリマーに関係して、ブタジエンは、エチレン及びプロピレンの製造時に副産物として得られる。
【０００５】
イソプレンは石油の分留によって得ることもできるが、この材料精製は高価であり、時間がかかる。石油分解生成物中のＣ５留分から生成されるイソプレン量はほんの約１５％にすぎない。したがって、より経済的なイソプレン製造法が必要とされている。具体的には、着実な商業的工程において、速度、力価、及び純度に対する要求を十分に満たすイソプレン製造法が望ましい。出発物質が安価であるイソプレンの製造系も同様に望ましい。本開示には、これらの要求を満たし、かつ更なる利益を提供する発明を記載する。
【０００６】
本明細書で引用されているすべての刊行物、特許出願及び特許は、個々の刊行物、特許出願又は特許のそれぞれが特定的に及び個々に参照により組み込まれるよう示されているように、参照により本明細書に組み込まれる。特に、本明細書に引用されているすべての刊行物は、本発明に関連して使用され得る組成物及び方法を、説明及び開示する目的で参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、特に、２種類の１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸合成酵素（ＨＤＳ又はＩｓｐＧ）ＩｓｐＧ酵素及び／又はＤＸＰ経路に含まれるその他の核酸及びポリペプチド、鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行う核酸及びポリペプチド、並びにイソプレン合成酵素の核酸及びポリペプチドを用いることで、イソプレン生産量を増大させる組成物及び方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様では、本発明は、イソプレンを生産することのできる組み換え細胞を提供し、細胞は、（ｉ）第１の種の第１の１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸合成酵素（ＩｓｐＧ）ポリペプチドをコードしている異種核酸、又はＩｓｐＧポリペプチドをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピー、（ｉｉ）第２の種の第２のＩｓｐＧポリペプチドをコードしている異種核酸、又はＩｓｐＧポリペプチドをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピー、ここで、第２の種は第１の種とは異なる、（ｉｉｉ）ＤＸＰ経路に関係するその他の酵素を少なくとも１つのコードしている異種核酸、並びに（ｉｖ）イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている核酸を含む。他の態様では、本発明は、イソプレンを生産することのできる組み換え細胞を提供し、細胞は、（ｉ）第１の種の第１の１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸合成酵素（ＩｓｐＧ）ポリペプチドをコードしている核酸、（ｉｉ）第２の種の第２のＩｓｐＧポリペプチドをコードしている核酸、ここで、第２の種は第１の種とは異なる、（ｉｉｉ）ＤＸＰ経路に含まれる酵素を少なくとも１つコードしている核酸、並びに（ｉｖ）イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている核酸、により形質転換している。これらの態様の任意のものでは、第１のＩｓｐＧはＴ．ロンガタス（T. longatus）に由来する。他の態様では、第２のＩｓｐＧは大腸菌に由来する。一部の態様では、ＤＸＰ経路に含まれるその他の酵素はＤＸＳ、ＤＸＲ、ＭＣＴ、ＣＭＫ、ＭＣＳ、ＨＤＲ（ＩｓｐＨ）、及びＩＤＩからなる群から選択される。一部の態様では、ＤＸＰ経路に含まれるその他の酵素は、ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＨＤＲ（ＩｓｐＨ）、及びＩＤＩのうちのいずれか１種以上であり得る。
【０００９】
本明細書における任意の態様では、組み換え細胞は、鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチドをコードしている異種核酸、あるいは鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチドをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピーを更に含む。一部の態様では、鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチドは、フェレドキソン（ferredoxons）及びフラボドキシンから選択される。
【００１０】
本明細書における任意の態様では、組み換え細胞は、ＤＸＰ経路関連性ポリペプチドをコードしている異種核酸（例えば、ＤＸＰパートナータンパク質）又はＤＸＰ経路関連性ポリペプチドをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピー（例えば、ＤＸＰパートナータンパク質）を更に含む。特定の態様では、ＤＸＰ経路関連性ポリペプチドは、周知のタンパク質フォールディング及び／又はリフォールディング機能を示す酵素、並びに鉄硫黄クラスターの送達、維持、及び／又は機能修復に関与する酵素、などを包含するシャペロンから選択される。
【００１１】
本明細書における任意の態様では、組み換え細胞は、イソペンテニル−二リン酸δ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、又はＩＤＩポリペプチドをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピーを更に含む。
【００１２】
本明細書における任意の態様では、組み換え細胞は、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、又はＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピーを更に含む。
【００１３】
本明細書における任意の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、植物イソプレン合成酵素ポリペプチドである。本明細書における任意の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素である。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、クズ属又はハコヤナギ属、あるいは交雑種のウラジロハコヤナギｘヤマナラシ由来のポリペプチドである。他の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）又はクズ、ポプルス・トレムイドス（Populus tremuloides）、ウラジロハコヤナギ、セイヨウハコヤナギ、及びコットンウッドからなる群から選択される。他の態様では、植物イソプレン合成酵素ポリペプチドは、クズイソプレン合成酵素ポリペプチドである。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、天然型イソプレン合成酵素ポリペプチドである。他の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、非天然型イソプレン合成酵素ポリペプチドである。他の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、国際公開第２００９／０４１５８１号、米国特許第２０１０／０００３７１６号、国際公開第２０１０／０１２４１４６号、又は米国特許第１３／２８３，５６４号に開示される通りのイソプレン合成酵素変異体（variant又はmutant）である。
【００１４】
本明細書における任意の態様では、組み換え細胞は、バクテリア細胞、藻類細胞、真菌細胞、又は酵母細胞である。一部の態様では、組み換え細胞はバクテリア細胞である。一部の態様では、バクテリア細胞はグラム陽性バクテリア細胞又はグラム陰性バクテリア細胞である。一部の態様では、バクテリア細胞は大腸菌である。他の態様では、バクテリア細胞は、大腸菌、Ｐ．シトレア、枯草菌、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレービス、Ｂ．ステアロサーモフィルス、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．クラウシイ、Ｂ．ハロデュランス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サークランス、Ｂ．ロータス、卒倒病菌、Ｓ．アルブス、Ｓ．リビダンス、Ｓ．コエリカラー、Ｓ．グリセウス、シュードモナス属、及びＰ．アルカリゲネス細胞からなる群から選択される。本明細書における任意の態様では、核酸は、１種又は複数種のプラスミド上に存在させることができる。
【００１５】
他の態様では、本発明は、本開示の任意の組み換え細胞を含む細胞培養物も提供し、細胞培養物は、少なくとも約８．４ｇ／Ｌのイソプレンを生産することができる。
【００１６】
他の態様では、本発明は、イソプレンの生産方法も提供し、方法は、（ａ）イソプレン生産に好適な条件下で本開示の任意の組み換え細胞を培養する工程、並びに（ｂ）イソプレンを生産させる工程、を含む。一部の態様では、方法は、イソプレンを回収する工程を更に含む。他の態様では、組み換え細胞は、約８．４ｇ／Ｌ超のイソプレンを生産する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Ｐｔａｃ  Ａｎａｂａｅｎａ  ｉｓｐＨ−Ｔ  ｅｌｏｎｇ  ｉｓｐＧ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｓｐＡ  ｔｅｒｍ／ｐＥＷＬ４５４のプラスミドマップ。ｋａｎ−カナマイシン耐性マーカー；ｐ１５Ａ  ｏｒｉ−プラスミドの複製起点；ＲＢＳ−リボソーム結合部位。Ｔａｃプロモーター、ａｓｐＡターミネーター、並びにＩｓｐＨ及びＩｓｐＧ系構成要素をコードしている遺伝子の位置をマップ上に示す；Ａｎａｂａｅｎａ  ｉｓｐＨは４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エニル二リン酸レダクターゼ（ＩｓｐＨ）をコードし、Ｔ  ｅｌｏｎｇ  ｇｃｐＥは１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸合成酵素（ＩｓｐＧ）をコードし、Ｔ  ｅｌｏｎｇ  ｐｅｔＦはフェレドキシン（Ｆｄ）をコードし、及びＴ  ｅｌｏｎｇ  ｐｅｔＨはフェレドキシン−ＮＡＤＰ＋酸化還元酵素（Ｆｐｒ）をコードする。
【図２】ＲＥＭ  Ｆ２＿１８を１５Ｌスケールで発酵させた場合のイソプレン力価対時間のグラフ。
【図３】イソプレンに関係するＭＶＡ及びＤＸＰ代謝経路（Ｆ．Ｂｏｕｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４４：３５７〜４２９，２００５に基づく）。以下の説明には、当該経路の各ポリペプチドの代替名、及び示されるポリペプチドの活性を測定するためのアッセイを開示した参考文献が含まれる（これらの参考文献をいずれも参照によりその全容にわたって本明細書に援用する）。メバロン酸経路：ＡＡＣＴ；アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＭｖａＥ、ＥＣ  ２．３．１．９．アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：２１１６〜２１２２，２００２；ＨＭＧＳ；Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ＣｏＡ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＭｖａＳ、ＥＣ  ２．３．３．１０．アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４０６５〜４０７０，２００２；ＨＭＧＲ；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素、ＭｖａＥ、ＥＣ  １．１．１．３４．アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：２１１６〜２１２２，２００２；ＭＶＫ；メバロン酸キナーゼ、ＥＲＧ１２、ＥＣ  ２．７．１．３６．アッセイ：Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ  １９：９〜１４，１９９１．ＰＭＫ；ホスホメバロン酸キナーゼ、ＥＲＧ８、ＥＣ  ２．７．４．２、アッセイ：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：６２０〜６３１，１９９１；ＤＰＭＤＣ；ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、ＭＶＤ１、ＥＣ  ４．１．１．３３．アッセイ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１３３５５〜１３３６２，１９９４；ＩＤＩ；イソペンテニル−二リン酸δ−イソメラーゼ、ＩＤＩ１、ＥＣ  ５．３．３．２．アッセイ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１９１６９〜１９１７５，１９８９．ＤＸＰ経路：ＤＸＳ；１−デオキシキシルロース−５−リン酸合成酵素、ｄｘｓ、ＥＣ  ２．２．１．７．アッセイ：ＰＮＡＳ  ９４：１２８５７〜６２，１９９７；ＤＸＲ；１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ、ｄｘｒ、ＥＣ  ２．２．１．７．アッセイ：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：４４４６〜４４５７，２００２；ＭＣＴ；４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール合成酵素、ＩｓｐＤ、ＥＣ  ２．７．７．６０．アッセイ：ＰＮＡＳ  ９７：６４５１〜６４５６，２０００；ＣＭＫ；４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ、ＩｓｐＥ、ＥＣ  ２．７．１．１４８．アッセイ：ＰＮＡＳ  ９７：１０６２〜１０６７，２０００；ＭＣＳ；２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸合成酵素、ＩｓｐＦ、ＥＣ  ４．６．１．１２．アッセイ：ＰＮＡＳ  ９６：１１７５８〜１１７６３，１９９９；ＨＤＳ；１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸合成酵素、ｉｓｐＧ、ＥＣ  １．１７．４．３．アッセイ：Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７０：９１６８〜９１７４，２００５；ＨＤＲ；１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸還元酵素、ＩｓｐＨ、ＥＣ  １．１７．１．２．アッセイ：ＪＡＣＳ  １２６：１２８４７〜１２８５５，２００４。
【図４】ＲＥＭ  Ｆ２＿１８及びＲＥＭ  Ｈ８−１２を各１５Ｌスケールで発酵させた場合のイソプレン力価対時間のグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、特に、イソプレン生産が増大するよう２種類のＩｓｐｇ酵素、ＤＸＰ経路に関係する酵素、及びイソプレン合成酵素ポリペプチドを設計した組み換え細胞を用い、イソプレン生産量を増大させた系、組成物、及び方法を提供する。
【００１９】
用語の定義
特に記載がない限り、本明細書に使用するすべての技術的及び科学的用語の意味は、本発明が属する当業者に一般的に理解される意味と同様の意味である。当業者に対しては、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、並びにＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））を、本発明で使用する数多くの用語についての一般的な辞書として提示する。本発明は、記述されている特定の方法論、プロトコル、及び試薬に限定されるものではなく、これらは変更し得るものであることが理解されるべきである。当業者は、本明細書に記述されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料が、本発明の実践又は試験にも使用することができることについても、理解するであろう。本明細書に提供される見出しは様々な態様又は本発明の態様を制限するものではなく、全体として、本明細書に参照として用いることのできるものである。
【００２０】
本明細書で使用するとき、用語「イソプレン」又は「２−メチル−１，３−ブタジエン」（ＣＡＳ＃  ７８−７９−５）は、３，３−ジメチルアリールピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）からピロリン酸を除去することにより直接的に及び最終的に得られる、揮発性Ｃ５生成物を指し、生成には、１つ以上のイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）分子と１つ以上のＤＭＡＰＰ分子とを結合させるか、又は重合させる工程は含まない。用語「イソプレン」は、一般的にはその生産方法により制限されることを意図するものではない。
【００２１】
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」には、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド断片、及び融合ポリペプチドが含まれる。
【００２２】
本明細書で使用するとき、「単離ポリペプチド」は、２、５、１０、２０、又は５０個以上の異なるポリペプチドのライブラリなどといった、ポリペプチドのライブラリの一部を意味するものではなく、天然に生じる少なくとも１つの成分から分離されたポリペプチドを意味する。例えば、ポリペプチドをコードしている組み換え核酸を発現させることで単離ポリペプチドを得ることができる。単離されたタンパク質は非天然に生じたポリペプチドであってもよい。
【００２３】
「異種ポリペプチド」は、宿主細胞と異なる生物、種、又は株由来の核酸配列によりコードされるポリペプチドを意味する。一部の態様では、異種ポリペプチドは、同様の宿主細胞に天然に見られる野生型ポリペプチドと同一ではない。
【００２４】
本明細書で使用するとき、「核酸」は、共有結合により単鎖又は二本鎖のいずれかの形態で連結している、２つ以上のデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドを指す。
【００２５】
「組換え核酸」とは、対象とする核酸が由来する生物において天然に存在するゲノムにおいて、対象とする核酸に隣接する１つ以上の核酸（例えば遺伝子）を含まない、対象とする核酸のことを意味する。したがって、この用語には、例えば、ベクターに組み込まれた、プラスミド又はウィルスに自己複製的に組み込まれた、原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた、又は他の配列とは独立して別個の分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、又はＰＣＲにより生産された若しくは制限エンドヌクレアーゼによる消化により生産されたｃＤＮＡ断片）として存在する、組み換えＤＮＡが包含される場合によっては、組換え核酸は天然には存在しないポリペプチドをコードした核酸である。
【００２６】
「異種核酸」は、宿主細胞と異なる生物、種又は株由来の核酸配列を意味する。一部の態様では、異種核酸は、同様の宿主細胞に天然に見られる野生型核酸と同一ではない。
【００２７】
本明細書で使用するとき、句「ＤＸＰ経路関連性の各種核酸及びポリペプチド」又は「ＤＸＰ経路関連性の核酸又はポリペプチド」は、ＤＸＰ経路のポリペプチド又は核酸と直接的に又は間接的に相互作用する、核酸又はポリペプチドを指し、このような核酸又はポリペプチドとしては、限定するものではないが、テルペン合成酵素（例えば、オシメン合成酵素、ファルネセン合成酵素、及びアーテミシニン（artemesinin）合成酵素）などの、任意の核酸又はポリペプチドが挙げられる。
【００２８】
本明細書に用いるのに、別途明確に示されている場合を除き、単数形「ａ」、「ａｎ」などは、１つ以上を指す。
【００２９】
本明細書において値又はパラメータに付く「約（about）」には、その値又はパラメータ自体を目的とする態様を含む（及び説明する）。例えば、「Ｘについて」という記述には、「Ｘ」の記述が含まれる。数値範囲は、その範囲を定義する数値を含む。
【００３０】
本明細書に記述される本発明の態様及び態様は、態様及び態様「を含む（comprising）」、態様及び態様「からなる（consisting）」、及び態様及び態様「から本質的になる（consisting essentially of）」を含むことが理解される。
【００３１】
イソプレン生産能を持つ組み換え細胞
本開示において詳細に記載され、更に例示される通り、イソプレンを生産することのできる組み換え細胞は、イソプレン生産が増大するよう遺伝子操作することができる。本開示に記載する通り、イソプレン生産の増大は、（ｉ）第１の種の第１のヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸合成酵素（ＩｓｐＧ）ポリペプチドをコードしている異種核酸、又はＩｓｐＧポリペプチドをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピー、（ｉｉ）第２の種の第２のＩｓｐＧポリペプチドをコードしている異種核酸、又はＩｓｐＧポリペプチドをコードしている内在性の核酸の１つ以上のコピー、ここで、第２の種は第１の種とは異なる、（ｉｉｉ）ＤＸＰ経路に関係するその他の酵素を少なくとも１つのコードしている異種核酸、並びに（ｉｖ）イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている核酸、を含み、イソプレンを生産することのできる組み換え細胞によりなすことができる。一態様では、第１の種の第１のＩｓｐＧポリペプチドは大腸菌由来である。他の態様では、第２の種の第２のＩｓｐＧポリペプチドはＴ．エロンガタスＩｓｐＧ由来である。
【００３２】
ＩｓｐＧ酵素及び系
ＩｓｐＧ酵素はＤＸＰ経路下流の一部をなす。ＩｓｐＧ核酸は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェート（ＭＥ−ＣＰＰ又はｃＭＥＰＰ）を（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イル−二リン酸（ＨＭＢＰＰ又はＨＤＭＡＰＰ）へと変換する１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸合成酵素（ＩｓｐＧ）又はＨＤＳポリペプチドをコードしている。
【００３３】
イソプレノイド生合成用に、ＤＸＰ経路を利用するよう遺伝子操作を施した一部の組み換え細胞（例えば、ＢＬ２１大腸菌株）のもつＩｓｐＧ活性は、グルコース由来のイソプレンの高収率での生産を支持するにはあまりにも低い。したがって、イソプレンを商業生産する際、これらの組み換え細胞では、必要とされている商業レベルでのイソプレンの生産には不十分である。したがって、本発明は、ＩｓｐＧポリペプチド活性を増加させることでイソプレン生産を増大させる組成物及び方法を提供する。
【００３４】
ＩｓｐＧポリペプチド活性を増加させる際の１つの選択肢は、大腸菌の内在性ＩｓｐＧ系の発現を増大させるというものである。本開示の系、組み換え細胞組成物、及び方法は、２種類のＩｓｐＧポリペプチドをコードしている核酸を過剰発現させることで、ＩｓｐＧポリペプチド活性、及びそれに続くイソプレン生産を向上させるという、異なるアプローチを用いるものである。一態様では、２種類のＩｓｐＧポリペプチドは、大腸菌及びＴ．エロンガタスＩｓｐＧポリペプチドである。一部の態様では、ＩｓｐＧポリペプチドは、異種核酸によりコードされる。他の態様では、ＩｓｐＧポリペプチドは、宿主細胞（例えば、大腸菌）に導入された内在性核酸の１つ以上のコピーによりコードされる。これらの態様のいずれかにおいて、核酸は、１種又は複数種のプラスミドにより宿主細胞（例えば、大腸菌）に導入することができる。他の態様では、核酸は、宿主細胞（例えば、大腸菌）の染色体に組み込むことで、宿主細胞に導入することができる。当業者であれば、組み込みは宿主細胞にとって機能上必須ではない位置に行うべきであることを認識するであろう。例えば、バクテリア細胞（例えば、大腸菌細胞）では、複製起点（又は染色体に含まれる何らかのその他の必須領域）に組み込みを行うことで、バクテリアの増殖が不能になる可能性がある。したがって、宿主生物の染色体中の必須領域に組み込みが生じないよう注意すべきである。
【００３５】
大腸菌ＩｓｐＧ系としては、限定するものではないが、酵素ＩｓｐＧ（ｉｓｐＧ遺伝子によりコード）、及び必須のフラボドキシン酸化還元パートナーのＦｌｄＡ（ｆｌｄＡ遺伝子によりコード）が挙げられる。
【００３６】
Ｔ．エロンガタスＩｓｐＧ系としては、限定するものではないが、酵素ＩｓｐＧ（ｇｃｐＥ遺伝子によりコード）、及び必須のフェレドキシン酸化還元パートナーのＦｄ（ｐｅｔＦ遺伝子によりコード）、並びに非必須のフェレドキシン−ＮＡＤＰ（＋）酸化還元酵素の酸化還元パートナーＦｐｒ（ｐｅｔＨ遺伝子によりコード）が挙げられる。
【００３７】
一部の例において、Ｔ．エロンガタスＩｓｐＧの活性がＦｄ補因子によるものであることが判明している場合、Ｆｐｒ活性は、大腸菌内でＴ．エロンガタスＩｓｐＧを機能させるのに必須ではない。大腸菌のｆｐｒ遺伝子は非必須であり、大腸菌内でのＴ．エロンガタスＩｓｐＧ活性は、Ｔ．エロンガタスＦｄの同時発現に依存する。
【００３８】
理論に束縛されるものではないが、大腸菌ＩｓｐＧ系及びＴ．エロンガタスＩｓｐＧ系は、最終的に触媒として機能するのに必要とされる電子を、一部のフラボドキシン／フェレドキシン−ＮＡＤＰ（＋）酸化還元酵素の活性により、ＮＡＤＰＨから得るもののと考えられる。フラボドキシン／フェレドキシン−ＮＡＤＰ（＋）酸化還元酵素活性を有する酵素は、ＩｓｐＧ活性に必須であるフラボドキシン及びフェレドキシンの補因子に必要とされる電子伝達に関し機能することがインビトロで実証されているものの、これらの還元酵素のインビボでの生理学的な関連性は示されていないことから、予測不能である。
【００３９】
代表的なポリペプチド及び核酸
上記の通り、本発明の組み換え細胞、及びその子孫細胞には、２種類のＩｓｐＧ酵素、イソプレン合成酵素、及びＤＸＰ経路のその他の１種以上のポリペプチドを有するよう遺伝子操作を行う。一部の態様では、細胞には、鉄−硫黄クラスタ相互作用を行う各種酸化還元ポリペプチド及び核酸、ＭＶＡ経路のポリペプチド及び核酸、ＤＸＰ経路関連性ポリペプチド（例えば、ＤＸＰのパートナータンパク質）及び核酸、ＰＧＬポリペプチド及び核酸、並びにＩＤＩポリペプチド及び核酸を更に含有させることができる。
【００４０】
ポリペプチドには、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド断片、及び融合ポリペプチドが含まれる。一部の態様では、融合ポリペプチドは、第１ポリペプチド（例えば、鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド、ＤＸＰ経路関連性ポリペプチド（例えば、ＤＸＰパートナータンパク質）、イソプレン合成酵素ポリペプチド、及びＩＤＩポリペプチド、又はこれらの触媒活性を有する断片）の一部又はすべてと、所望により、第２ポリペプチド（例えば、融合ポリペプチドの精製又は検出を促進する、Ｈｉｓタグなどのペプチド）の一部又はすべてを含有する。一部の態様では、融合ポリペプチドは、ＤＸＰ経路のポリペプチドに関係する２つ以上の活性を有する。
【００４１】
特定の態様では、核酸は、鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行う核酸、ＩｓｐＧ核酸、ＤＸＰ経路に含まれる核酸、ＤＸＰ経路関連性核酸（例えば、ＤＸＰパートナータンパク質）、イソプレン合成酵素核酸、又はＩＤＩ核酸のいずれかの断片、又は完全な核酸配列を含む。一部の態様では、この核酸は、鉄−硫黄クラスタ相互作用を行う酸化還元に関係する核酸、ＩｓｐＧ、ＤＸＰ経路に含まれる核酸、ＤＸＰ経路関連性核酸、イソプレン合成酵素核酸、又はＩＤＩ核酸に由来し、かつ少なくとも約５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、又は８００以上が隣接するヌクレオチドを含有する。一部の態様では、核酸は、ＩｓｐＧ核酸、鉄−硫黄クラスタ相互作用を行う酸化還元に関与する核酸、ＤＸＰ経路に含まれる核酸、ＤＸＰ経路関連性核酸、イソプレン合成酵素核酸、又はＩＤＩ核酸の野生型配列（すなわち、天然に生じる配列）に対して１つ以上の変異を有する。一部の態様では、核酸は、ＩｓｐＧ核酸、鉄−硫黄クラスタ相互作用を行う酸化還元に関係する核酸、ＤＸＰ経路に含まれる核酸、ＤＸＰ経路関連性核酸、イソプレン合成酵素核酸、又はＩＤＩ核酸の、転写又は翻訳を増大させる変異（例えば、サイレント変異）を１つ以上有する。一部の態様では、核酸は、ＩｓｐＧポリペプチド、鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド、ＤＸＰ経路関連性ポリペプチド、イソプレン合成酵素ポリペプチド、又はＩＤＩポリペプチド、のいずれかをコードしている核酸の縮重変異体（degenerate valiant）である。
【００４２】
代表的なイソプレン合成酵素、及びＤＸＰ経路のポリペプチド及び核酸の受託番号は、国際公開第２００９／０７６６７６号の添付文書１に掲載されており、かつ更に本開示に詳述する。
【００４３】
代表的な鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチド及び核酸
鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチドは、イソプレノイド生合成に関係するＤＸＰ経路で重要な役割を果たす。鉄−硫黄クラスタ相互作用を行う代表的な酸化還元ポリペプチドとしては、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチドが示す活性を少なくとも１つ有する融合ポリペプチドが挙げられる。ポリペプチドが、鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチド活性を有するかどうかは、メトロニダゾール［１−（２−ヒドロキシエチル）−２−メチル−５−ニトロイミダゾール］の還元速度を測定するヒドロゲナーゼ結合アッセイを用いる標準法を使用して判断することができる（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，９３：２１６〜２２２（１９７９））。
【００４４】
鉄−硫黄クラスタ相互作用を行う代表的な酸化還元ポリペプチドの核酸は、ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチドに関係する活性を少なくとも１つ有する融合ポリペプチド断片をコードしている核酸を含有している。鉄−硫黄クラスタ相互作用を行う代表的な酸化還元ポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【００４５】
鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチドは、鉄−硫黄クラスターを含有しているポリペプチドに電子を伝達し得るポリペプチドである。鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチドとしては、限定するものではないが、フラボドキシン（例えば、フラボドキシンＩ）、フラボドキシン還元酵素、フェレドキシン（例えば、フェレドキシンＩ）、フェレドキシン−ＮＡＤＰ＋酸化還元酵素、及びこれらをコードしている遺伝子又はポリペプチド（例えば、ｆｐｒ又はｆｌｄＡ）が挙げられる。例えば、ＤＸＰ経路のポリペプチドＨＤＳ（ＧｃｐＥ）は、［４Ｆｅ−４Ｓ］２＋中心を保持する金属酵素であり、フラボドキシン／フラボドキシン還元酵素の存在下で、［４Ｆｅ−４Ｓ］２＋中心の還元により、２段階の連続的な１電子伝達を介在し、ｃＭＥＰＰのＨＭＢＰＰへの還元を触媒する（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５４１：１１５〜１２０（２００３）を参照されたい）。同様にして、ＤＸＰ経路のポリペプチドＨＤＲ（ＬｙｔＢ）も、フラボドキシン／フラボドキシン還元酵素／ＮＡＤＰＨ系の存在下で、２段階の連続的な１電子伝達を介在し、ＨＭＢＰＰのＩＰＰ又はＤＭＡＰＰへの還元を触媒するＦｅ／Ｓタンパク質である。例えば、Ｓｅｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４１：４３３７〜４３３９（２００２）；Ｗｏｌｆｆ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５４１：１１５〜１２０（２００３））を参照されたい。
【００４６】
フラボドキシンは電子伝達能を有するタンパク質であり、補欠分子族のフラビンモノヌクレオチドを含有している。エシェリキア・コライ（大腸菌）においては、フラボドキシンはｆｌｄＡ遺伝子によりコードされており、ＦＡＤ含有タンパク質のＮＡＤＰＨ：フェレドキシン酸化還元酵素により還元を受け、イソプレノイド生合成に関し、ＤＸＰ経路において重要な役割を果たす（例えば、Ｋｉａ−Ｊｏｏ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５７９：３８０２〜３８０６，２００５を参照されたい）。
【００４７】
フェレドキシンは電子伝達能をもち、鉄及び不安定な硫黄を等量ずつ含有するタンパク質であり、イソプレノイド生合成に関し、ＤＸＰ経路において重要な役割を果たす。例えば、植物及びラン藻由来のＨＤＳは、フラボドキシン依存性の酵素よりもフェレドキシンを示す（Ｓｅｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，５８０（６）：１５４７〜５２（２００６））。
【００４８】
Ｆｐｒは、フラボドキシン／フェレドキシンＮＡＤＰＨ−酸化還元酵素をコードしており、ＦｌｄＡによりＮＡＤＰＨからＨＤＳ及びＨＤＲへと必須電子を伝達して、触媒として機能する（Ｌ．Ａ．Ｆｕｒｇｅｒｓｏｎ，Ｔｈｅ  Ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｔｏ  Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １３，２００６の報告書で確認される）。
【００４９】
代表的なＤＸＰ経路のポリペプチド及び核酸
ＤＸＰ経路の代表的なポリペプチドとしては、限定するものではないが、次の任意のポリペプチド：ＤＸＳポリペプチド、ＤＸＲポリペプチド、ＭＣＴポリペプチド、ＣＭＫポリペプチド、ＭＣＳポリペプチド、ＨＤＳポリペプチド、ＨＤＲポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＤＸＰ経路のポリペプチドに関係する活性を１つ又は２つ以上有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）、が挙げられる。特に、ＤＸＰ経路のポリペプチドとしては、ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが挙げられる。代表的なＤＸＰ経路に関する核酸としては、ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。代表的なＤＸＰ経路のポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【００５０】
特に、ＤＸＳポリペプチドは、ピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸を１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【００５１】
ＤＸＲポリペプチドは、１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＤＸＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＲポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【００５２】
ＭＣＴポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）を４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＭＥＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＭＣＴポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【００５３】
ＣＭＫポリペプチドは、４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）を２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＣＤＰ−ＭＥを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＣＭＫポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【００５４】
ＭＣＳポリペプチドは、２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェート（ＭＥ−ＣＰＰ又はｃＭＥＰＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＣＤＰ−ＭＥＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＭＣＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【００５５】
ＨＤＳポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェートを（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イルジホスフェート（ＨＭＢＰＰ又はＨＤＭＡＰＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＭＥ−ＣＰＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＨＤＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【００５６】
ＨＤＲポリペプチドは、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブト−２−エン−１−イル二リン酸（ＨＭＢＰＰ又はＨＤＭＡＰＰ）を、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）とジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換する。一実施形態では、ＨＤＲポリペプチドのコードには、ｉｓｐＨ遺伝子を使用することができる。ＩｓｐＨは、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸還元酵素、４Ｆｅ−４Ｓタンパク質、ＬｙｔＢ、ＥＣＫ００３０、ＪＷ００２７、ｌｙｔＢ、ｙａａＥ、並びにｂ００２９としても知られている。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボで、ポリペプチドがＨＭＢＰＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＨＤＲポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【００５７】
ＩＤＩポリペプチドは、イソペンテニルジホスフェートをジメチルアリールジホスフェートへと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボで、ポリペプチドがイソペンテニルジホスフェートを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＩＤＩポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【００５８】
ＤＸＰ経路に関連する代表的なポリペプチド及び核酸
ＤＸＰ経路に関連する各種ポリペプチド（例えば、ＤＸＰパートナータンパク質）、及びこれらのポリペプチドをコードしている核酸を、イソプレン合成酵素、ＤＸＰ経路のポリペプチド、及び／又はＭＶＡ経路のポリペプチドのうちのいずれか１種以上と組み合わせて使用することができる。一実施形態では、シャペロンを使用することができる。シャペロンは、タンパク質のフォールディング及びアンフォールディングを促進するものであり、この活性はタンパク質が適切な立体構造を獲得するのに必要とされる。この部類のシャペロンは、タンパク質の３次元構造の生成及び修復、タンパク質の機能性の獲得及び維持作用に関与する。このような酵素の例としては、大腸菌シャペロンのＤｎａＫ及びＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳなどの特性が、よく解析されている（Ｂｕｋａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９２：３５１〜３６６（１９９８））。シャペロンは、酵素の触媒作用に必要とされる補因子の送達、維持、修復を促進する。一実施形態では、このようなシャペロンは、鉄硫黄クラスター補因子の機能に関与する酵素シャペロンであってよい。大腸菌内での鉄硫黄クラスターの送達、維持、及び修復に関与させることのできるシャペロンの非限定例としては、ｉｓｃＲのオペロン遺伝子のｈｒｃＡ、ｈｒｃＢ、及びｉｓｃＡに加えｅｒｐＡ、並びに大腸菌のその他のＡ型キャリアタンパク質が挙げられる（Ｔｏｋｕｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３０：６３〜７１（２００１）；Ｌｏｉｓｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０４（３４）：１３６２６〜１３６３１（２００７）；Ｖｉｎｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬＯＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５（５）：１〜１６  ｏｆ  ｅ１０００４９７（２００９））。他の実施形態では、ｉｓｃＳ遺伝子を使用することができる。新規の鉄硫黄クラスターの生合成における機能が良好に解析されているのに加え、損傷を受けた鉄硫黄クラスターの修復に関与し、先に挙げたようなシャペロンの例として、ｉｓｃＳ遺伝子を挙げることができる（Ｄｊａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（４３）：４４５９０〜４４５９９（２００４）。同様にして、大腸菌のｙｔｆＥによりコードされるＲｉｃタンパク質、及びｆｔｎによりコードされるフェリチンＡは、鉄硫黄クラスターの修復に関与するその他のシャペロンの更なる例として挙げられる（Ｊｕｓｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ，２２：９９〜１０８（２００９）；Ｊｕｓｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８２（１４）：１０３５２〜１０３５９（２００７）；Ｂｉｔｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ，２１：６９３〜７０３（２００８）。
【００５９】
代表的なイソプレン合成酵素ポリペプチド及び核酸
上記の通り、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ジメチルアリールジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンへと変換する。代表的なイソプレン合成酵素の核酸としては、イソプレン合成酵素ポリペプチドの活性を少なくとも１種有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。代表的なイソプレン合成酵素ポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【００６０】
本発明の一部の態様では、本開示の組成物又は方法のいずれかに記載の組み換え細胞は、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸、又はイソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドを更に含む。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは内在性ポリペプチドである。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている内在性核酸は、常時発現型プロモーターに制御可能なように連結される。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている内在性核酸は、誘導型プロモーターに制御可能なように連結される。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている内在性核酸は、高発現型プロモーターに制御可能なように連結される。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている内在性の核酸を１つ以上（例えば、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている内在性の核酸の２、３、又は４つ以上のコピー）を使用する。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比べ、内在性イソプレン合成酵素経路のポリペプチドが過剰発現するよう設計する。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている内在性核酸は、低発現型プロモーターに制御可能なように連結される。
【００６１】
一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは異種ポリペプチドである。一部の態様では、細胞は、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸のコピーを１つ以上含む。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸は、常時発現型プロモーターに制御可能なように連結される。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸は、誘導型プロモーターに制御可能なように連結される。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸は、高発現型プロモーターに制御可能なように連結される。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸は、低発現型プロモーターに制御可能なように連結される。
【００６２】
イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞で安定的に発現させることができる。イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている核酸は、更にベクターに組み込むこともできる。
【００６３】
一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸は、マメ科、例えば、マメ亜科（Faboideae）由来のものである。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、クズ属又はハコヤナギ属、又はウラジロハコヤナギｘヤマナラシなどの交雑種由来のポリペプチドである。特定の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸は、プエラリア・モンタナ（クズ）（Ｓｈａｒｋｅｙら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３７：７００〜７１２，２００５）、プエラリア・ロバタ（Pueraria lobata）、ポプラ（ウラジロハコヤナギ、セイヨウハコヤナギ、コットンウッド、又はウラジロハコヤナギｘトレムラ（ＣＡＣ３５６９６）Ｍｉｌｌｅｒら、Ｐｌａｎｔａ  ２１３：４８３〜４８７，２００１）、アスペン（ヤマナラシなど）Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ  ２７０（２２）：１３０１０〜１３１６，１９９５）、又はヨーロッパナラ（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｒｏｂｕｒ）（Ｚｉｍｍｅｒら、国際特許出願公開第９８／０２５５０号）に由来するポリペプチド又は核酸である。好適なイソプレン合成酵素としては、限定するものではないが、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ３４１４３１、ＡＹ３１６６９１、ＡＹ２７９３７９、ＡＪ４５７０７０、及びＡＹ１８２２４１として識別されるものが挙げられる。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸は、ヨーロッパナラから天然に生じるポリペプチド又は核酸ではない（すなわち、イソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸は、ヨーロッパナラから天然に生じるポリペプチド又は核酸以外のイソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸である）。一部の態様では、イソプレン合成酵素核酸又はポリペプチドは、ポプラから天然に生じるポリペプチド又は核酸である。一部の態様では、イソプレン合成酵素核酸又はポリペプチドは、ポプラから天然に生じるポリペプチド又は核酸ではない。
【００６４】
一部の態様では、イソプレン合成酵素核酸又はポリペプチドは、天然に生じるポリペプチド又は核酸である（例えば、ハコヤナギ属から天然に生じるポリペプチド又は核酸）。一部の態様では、イソプレン合成酵素核酸又はポリペプチドは、野生型又は天然に生じるポリペプチド又は核酸ではない。一部の態様では、イソプレン合成酵素核酸又はポリペプチドは、野生型又は天然に生じるポリペプチド又は核酸の変異体である（例えば、ハコヤナギ属の野生型又は天然に生じるポリペプチド又は核酸の変異体）。
【００６５】
一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは変異体である。イソプレン合成酵素の変異体は、酵素活性が改良されているなどして、活性が改良されているものであり得る。一部の態様では、イソプレン合成酵素変異体は、安定性（例えば、熱安定性）が改良されている、及び／又は溶解性が改良されているなどして、その他の特性が改良されている。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、野生型又は天然型イソプレン合成酵素の変異体である。一部の態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレン合成酵素と比較して触媒活性が向上しているなど、活性が向上している。活性（例えば、触媒活性）の向上は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％のうちのいずれかの程度であり得る。一部の態様では、触媒活性などの活性の向上は、少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、又は１００倍のいずれかである。一部の態様では、触媒活性などの活性の向上は、約１０％〜約１００倍である（例えば、約２０％〜約１００倍、約５０％〜約５０倍、約１倍〜約２５倍、約２倍〜約２０倍、又は約５倍〜約２０倍）。一部の態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレン合成酵素と比較して可溶性が向上している。可溶性の向上は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％のうちのいずれかの程度であり得る。可溶性の向上は、少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、又は１００倍のうちのいずれかの程度であり得る。一部の態様では、溶解性の向上は、約１０％〜約１００倍のうちのいずれかの程度であり得る（例えば、約２０％〜約１００倍、約５０％〜約５０倍、約１倍〜約２５倍、約２倍〜約２０倍、又は約５倍〜約２０倍）。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、天然型イソプレン合成酵素変異体であり、かつ天然型イソプレン合成酵素と比較して安定性が向上している（熱安定性など）。
【００６６】
一部の態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレン合成酵素の活性の、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％の活性を有する。変異体は、野生型又は天然型イソプレン合成酵素との配列類似性を保有し得る。一部の態様では、野生型又は天然型イソプレン合成酵素の変異体は、野生型又は天然型イソプレン合成酵素のアミノ酸配列と、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％のうちのいずれかの程度で配列相同性を有する。一部の態様では、野生型又は天然型イソプレン合成酵素の変異体は、野生型又は天然型イソプレン合成酵素のアミノ酸配列と、約７０％〜約９９．９％、約７５％〜約９９％、約８０％〜約９８％、約８５％〜約９７％、又は約９０％〜約９５％のうちのいずれかの程度で配列相同性を有する。
【００６７】
一部の態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレン合成酵素内に変異を持つ。一部の態様では、変異体は、少なくとも１箇所にアミノ酸置換、少なくとも１箇所にアミノ酸挿入、及び／又は少なくとも１箇所にアミノ酸欠失を有する。一部の態様では、変異体は、少なくとも１箇所にアミノ酸置換を有する。一部の態様では、変異体と、野生型又は天然型イソプレン合成酵素との間で異なっているアミノ酸残基の数は、１以上であってよく、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、又は５０以上のアミノ酸残基が異なっていてよい。天然型イソプレン合成酵素としては、植物由来の任意のイソプレン合成酵素を挙げることができ、例えば、クズイソプレン合成酵素、ポプライソプレン合成酵素、ヨーロッパナライソプレン合成酵素、及びヤナギイソプレン合成酵素が挙げられる。一部の態様では、変異体は、ウラジロハコヤナギ由来のイソプレン合成酵素の変異体である。一部の態様では、ウラジロハコヤナギ由来のイソプレン合成酵素変異体は、少なくとも一箇所にアミノ酸置換、少なくとも１箇所にアミノ酸挿入、及び／又は少なくとも１箇所にアミノ酸欠失を有する。一部の態様では、変異体は、トランケート型のウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素である。一部の態様では、変異体（例えば、ウラジロハコヤナギ由来のイソプレン合成酵素の変異体）をコードしている核酸は、コドンを最適化させたものである（例えば、異種イソプレン合成酵素を発現させる宿主細胞に基づきコドンを最適化している）。
【００６８】
本開示のイソプレン合成酵素ポリペプチドは、国際公開第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／１２４１４６号、米国特許出願公開第２０１０／００８６９７８号、米国特許出願第１３／２８３，５６４号、及び国際公開／米国特許出願公開第２０１１／０５８１８８号に記載のいずれかのイソプレン合成酵素又はイソプレン合成酵素変異体であってよい。これらの文献に記載される、イソプレン合成酵素及びイソプレン合成酵素変異体に関係するすべての内容を、参照により、本開示に明示的に援用する。好適なイソプレン合成酵素としては、限定するものではないが、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ３４１４３１、ＡＹ３１６６９１、ＡＹ２７９３７９、ＡＪ４５７０７０、及びＡＹ１８２２４１として識別されるものが挙げられる。本開示のイソプレン合成酵素をコードしている微生物の製造法を含む組成物又は方法のうちのいずれか１つに使用することのできるイソプレン合成酵素の種類は、国際公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、同第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／０３１０６２号、同第２０１０／０３１０６８号、同第２０１０／０３１０７６号、同第２０１０／０１３０７７号、同第２０１０／０３１０７９号、同第２０１０／１４８１５０号、同第２０１０／１２４１４６号、同第２０１０／０７８４５７号、及び同第２０１０／１４８２５６号にも記載されている。これらの文献に記載される、イソプレン合成酵素及びイソプレン合成酵素変異体に関係するすべての内容を、参照により、本開示に明示的に援用する。
【００６９】
本開示のプロモーターのうちのいずれか（例えば、本開示に記載され、本開示の実施例において識別される、誘導型プロモーター及び常時発現型プロモーターなどのプロモーター）を使用して、本開示のいずれかのイソプレン合成酵素の発現を駆動させることができる。
【００７０】
インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボで、ポリペプチドがＤＭＡＰＰをイソプレンへと変換する能力を測定して、ポリペプチドがイソプレン合成酵素ポリペプチド活性を有するか否かを判定する際には、標準法を使用できる。代表的なアッセイでは、細胞抽出物は、実施例１に記載の通りの振とうフラスコによる培養法において株（例えば、本明細書に記載の大腸菌／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ株）を増殖させることにより調製する。誘導の完了後、約１０ｍＬの細胞培養物に７０００×ｇで１０分間遠心沈降を行いペレット化し、グリセロールは加えずに５ｍＬ  ＰＥＢに再懸濁する。標準法を用いフレンチプレスにより細胞を溶解させる。あるいは、−８０℃での凍結及び解凍後に細胞をリゾチーム（Ｒｅａｄｙ−Ｌｙｓｅリゾチーム溶液；ＥｐｉＣｅｎｔｒｅ）で処理する。
【００７１】
例えば、Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３０１０〜１３０１６，１９９５及びこの文献中で参照される文献に記載の通りに、細胞抽出物中のイソプレン合成酵素ポリペプチド活性を測定することができる。これらの文献に記載される内容を、特にイソプレン合成酵素ポリペプチド活性用のアッセイに関し、それぞれ参照により、本開示に明示的に援用する。ＤＭＡＰＰ（Ｓｉｇｍａ）を窒素流下で濃縮し、乾燥し、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ８．２）を用い１００ｍＭに再水和し、−２０℃で保存する。このアッセイを実施するため、１Ｍ  ＭｇＣｌ２（５μＬ）、１ｍＭ（２５０μｇ／ｍＬ）ＤＭＡＰＰ、植物抽出緩衝液（ＰＥＢ）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％グリセロール、及び２ｍＭ  ＤＴＴ）（６５μＬ）を、金属製スクリューキャップと、テフロンコートされたシリコン隔壁とを備えた、２０ｍＬヘッドスペースバイアル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内で２５μＬの細胞抽出液に加え、振盪しながら３７℃で１５分培養した。２００μＬの２５０ｍＭ  ＥＤＴＡを加えて反応をクエンチさせ、ＧＣ／ＭＳにより定量することができる。
【００７２】
代表的なＭＶＡ経路ポリペプチド及び核酸
本発明の一部の態様では、本開示の組成物又は方法のいずれかに関し記載する細胞は、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている核酸を含む。一部の態様では、ＭＶＡ経路のポリペプチドは内在性ポリペプチドである。一部の態様では、細胞は、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている内在性核酸のコピーを更に１つ以上含む。一部の態様では、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、常時発現型プロモーターに制御可能なように連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、常時発現型プロモーターに制御可能なように連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、強力なプロモーターに制御可能なように連結される。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性ＭＶＡ経路のポリペプチドが過剰発現するよう設計する。
【００７３】
一部の態様では、ＭＶＡ経路のポリペプチドは異種ポリペプチドである。一部の態様では、細胞は、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている異種核酸のコピーを１つ以上含む。一部の態様では、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている異種核酸は、常時発現型プロモーターに制御可能なように連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている異種核酸は、強力なプロモーター（strong promoter）に制御可能なように連結される。
【００７４】
代表的なＭＶＡ経路のポリペプチドとしては、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）ポリペプチド、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素（アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡを利用する）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）ポリペプチド、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチド、ジホスホメバロン酸（diphosphomevalonte）デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）ポリペプチド、イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）ポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＭＶＡ経路ポリペプチドの活性を２つ以上有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）が挙げられる。特に、ＭＶＡ経路のポリペプチドとしては、ＭＶＡ経路に含まれるポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが挙げられる。ＭＶＡ経路の代表的な核酸としては、ＭＶＡ経路に含まれるポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。ＭＶＡ経路の代表的なポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。更に、イソプレンの生産を増大させるような、ＭＶＡ経路のポリペプチド変異体も、良好に使用することができる。
【００７５】
特定の態様では、ＭＶＡ経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸は異種核酸である。他の態様では、ＭＶＡ経路の１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸は、内在性の核酸の複製である。本開示における任意の態様では、１つ以上のＭＶＡ経路のポリペプチドは、（ａ）２分子のアセチル−ＣｏＡを縮合させてアセトアセチル−ＣｏＡ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）を生成する酵素、又はマロニル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを合成し得る酵素（アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素）、（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡと縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを生成する酵素（例えば、ＨＭＧシンターゼ）、（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素、（ｄ）メバロン酸をしてリン酸化してメバロン酸５−リン酸を生成する酵素、（ｅ）メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する酵素、（ｆ）メバロン酸５−リン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素、並びに（ｇ）イソペンテニルピロリン酸をジメチルアリールジホスフェートへと変換する酵素、から選択できる。本開示における任意の態様では、１つ以上のＭＶＡ経路のポリペプチドは、（ａ）アセトアセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡと縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを生成する酵素（例えば、ＨＭＧシンターゼ）、（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸へと変換する酵素、（ｃ）メバロン酸リン酸をメバロン酸５−リン酸に変換する酵素、（ｄ）メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する酵素、並びに（ｅ）メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素、から選択される。
【００７６】
使用することのできる、ＭＶＡ経路のポリペプチド及び／又はＤＸＰ経路のポリペプチドの種類、並びにＭＶＡ経路のポリペプチド及び／又はＤＸＰ経路のポリペプチドをコードしている微生物（例えば、大腸菌）の作成方法は、国際公開第２００９／０７６６７６号にも記載される。
【００７７】
当業者であれば、イソプレン合成酵素又は及びＭＶＡ経路の１つ以上のポリペプチド、及び／又はＤＸＰ経路の１つ以上のポリペプチドの発現の最適化に適したプロモーターを容易に選別し、及び／又は使用することができる。同様にして、当業者であれば、イソプレン合成酵素又は及びＭＶＡ経路の１つ以上のポリペプチド、及び／又はＤＸＰ経路のポリペプチドの発現の最適化に適したベクター（又は輸送ビヒクル）を容易に選別し、及び／又は使用することができる。一部の態様では、ベクターには選択マーカーを含有させる。選択可能なマーカーの例としては、これらに限定されるものではないが、抗生物質耐性核酸（例えば、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、フェロマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン又はクロラムフェニコール）、及び／又は宿主細胞に栄養的な利点などの代謝的な利点を与える核酸が挙げられる。一部の態様では、イソプレン合成酵素又はＭＶＡ経路に関係する核酸を、細胞染色体に組み込むものの、選択マーカーは組み込まない。
【００７８】
代表的な生物資源
鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行う核酸、ＤＸＰ経路に関係する核酸、ＤＸＰ経路関連性核酸、イソプレン合成酵素核酸、又はＩＤＩ核酸（及びそれらをコードするポリペプチド）は、鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行う核酸、ＤＸＰ経路に関係する核酸、ＤＸＰ経路関連性核酸、イソプレン合成酵素核酸、及び／又はＩＤＩ核酸を天然に含む任意の生物より得ることができる。上記のように、イソプレンは、バクテリア、酵母、植物及び動物などの様々な生物により天然に生成される。生物は、イソプレンを生成するためのＭＶＡ経路、ＤＸＰ経路、又はＭＶＡ及びＤＸＰ経路の両方を有している（図３）。したがって、ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＭＣＴ、ＣＭＫ、ＭＣＳ、ＨＤＳ、又はＨＤＲ核酸は、例えば、ＤＸＰ経路を有する、又はＭＶＡ経路及びＤＸＰ経路をいずれも有する、任意の生物から得ることができる。ＩＤＩ及びイソプレン合成酵素の核酸は、例えば、ＭＶＡ経路、ＤＸＰ経路、又はＭＶＡとＤＸＰ経路の両方を含有する任意の生物から得ることができる。
【００７９】
一部の態様では、鉄−硫黄クラスタ相互作用を行う酸化還元に関係する核酸、ＤＸＰ経路に含まれる核酸、ＤＸＰ経路関連性核酸、イソプレン合成酵素核酸、又はＩＤＩ核酸の核酸配列は、以降の任意の生物により天然において生産される核酸配列と同一である。一部の態様では、鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド、ＤＸＰ経路関連性ポリペプチド、イソプレン合成酵素ポリペプチド、又はＩＤＩポリペプチドのアミノ酸配列は、以降の任意の生物により天然において生産される核酸配列と同一である。一部の態様では、鉄−硫黄クラスタ相互作用を行う酸化還元に関係する核酸、ＤＸＰ経路に含まれる核酸、ＤＸＰ経路関連性核酸、イソプレン合成酵素核酸、又はＩＤＩ核酸、又はこれらの核酸によりコードされるポリペプチドは、本明細書に記載の任意の生物から誘導される変異核酸又はポリペプチドである。本明細書で使用するとき、「から誘導される」は、核酸又はポリペプチド源に１つ以上の変異が導入されることを意味する。例えば、「植物ポリペプチドから誘導された」ポリペプチドは、対象とするポリペプチドが、野生型植物のポリペプチド配列（すなわち、天然に生じる配列）に１つ以上の変異を導入することで得られたポリペプチドであることを意味する。
【００８０】
一部の態様では、生物資源は真菌であり、例えば、Ａ．オリゼ及びＡ．ニガーなどのアスペルギルス属、Ｓ．セレビシエなどのサッカロミセス属、Ｓ．ポンベなどのシゾサッカロミセス属、並びにＴ．リーゼイなどのトリコデルマ属である。一部の態様では、生物資源は糸状真菌細胞である。用語「糸状菌」は、真菌のうち糸状形態をとるものすべてを指す（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．（１９６２），Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。これらの真菌は、キチン、セルロース、及びその他の複合多糖からなる細胞壁を有する栄養菌糸を示すことを特徴とする。糸状菌は、酵母とは、形態学的に、生理学的に、及び遺伝学的に異なる。糸状菌の栄養生長は菌糸の伸展によるものであり、炭素の異化は絶対好気性である。親細胞が糸状菌である場合、細胞は、限定するものではないが、トリコデルマ属（例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、これまでＴ．ロンギブラキアタム（T. longibrachiatum）として分類されていたヒポクレア・ジェコリナ（Hypocrea jecorina）の無性形態、トリコデルマ・ビリデ、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum））（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：４６〜５３，１９８４；ＡＴＣＣ番号５６７６５及びＡＴＣＣ番号２６９２１）、ペニシリウム属、ヒュミコラ種（Humicola sp.）（例えば、Ｈ．インソレンス（H. insolens）、Ｈ．ラヌギノス（H. lanuginose）、又はＨ．グリセア（H. grisea））、クリソスポリウム属（Chrysosporium sp.）（例えば、Ｃ．ラックノウエンス（C. lucknowense））、グリオクラジウム属（Gliocladium sp.）、アスペルギルス属（例えば、Ａ．オリゼ、Ａ．ニガー、ショウユコウジカビ、Ａ．ニデュランス、又はアワモリコウジカビ）（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：７３８０７４３，１９９３  ａｎｄ  Ｇｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ  ４１：８９〜９８，２００２）、フザリウム属（例えば、Ｆ．ロゼウム、Ｆ．グラミニウム（F. graminum）、Ｆ．セレアリス（F. cerealis）、Ｆ．オキシスポラム、又はＦ．ベネナタム（F. venenatum））、ニューロスポラ属（例えば、Ｎ．クラッサ）、ヒポクレア属（Hypocrea sp.）、ムコール属（例えば、Ｍ．ミエヘイ（M. miehei））、リゾプス属及びエメリセラ属（同様に、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．２２８：２１〜２６，１９８５を参照されたい）に属する。用語「トリコデルマ」又は「トリコデルマ属」又は「トリコデルマｓｐｐ．」は、従来又は現在リコデルマとして分類されている任意の真菌属を指す。
【００８１】
一部の態様では、真菌は、Ａ．ニデュランス、アワモリコウジカビ、Ａ．オリゼ、アスペルギルス・アクレタス（A. aculeatus）、Ａ．ニガー、Ａ．ジャポニクス（A. japonicus）、Ｔ．リーゼイ、Ｔ．ビリデ（T. viride）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）又はＦ．ソラニ（F. solani）である。アスペルギルス株は、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：７３８〜７４３，１９９３、及びＧｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  ４１：８９〜９８，２００２に公開されている。これらの文献に記載される内容を、特に真菌に関し、それぞれ参照により、本開示に明示的に援用する。特定の態様では、真菌はＴ．リーゼイなどのトリコデルマ株である。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）株は既知であり、非限定的な例としては、受諾番号１３６３１、受諾番号２６９２１、受諾番号５６７６４、受諾番号５６７６５、受諾番号５６７６７、及びＮＲＲＬ  １５７０９が挙げられる。これらの文献に記載される内容を、特にＴ．リーゼイ株に関し、それぞれ参照により、本開示に明示的に援用する。一部の態様では、宿主株は、ＲＬ−Ｐ３７の誘導体である。ＲＬ−Ｐ３７については、Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：４６〜５３，１９８４に記載されている。
【００８２】
一部の態様では、生物資源は酵母であり、例えば、酵母菌属、シゾサッカロミセス属、ピキア属又はカンジダ属である。
【００８３】
一部の態様では、生物資源は、例えば、Ｂ．リケニフォルミス（B. lichenformis）又は枯草菌などのバチルス株、Ｐ．シトレアなどのパントエア株、Ｐ．アルカリゲネスなどのシュードモナス株、Ｓ．リビダンス又はＳ．ルビギノーサス（S. rubiginosus）などのストレプトミセス株、Ｔ．エロンガタスなどのサーモシネココッカス株、Ｓ．メリロティなどのシノリゾビウム株、Ｈ．ピロリなどのヘリコバクター株、Ａ．トゥメファシエンスなどのアグロバクテリウム株、Ｄ．ラジオデュランスなどのデイノコッカス株、Ｌ．モノサイトゲネスなどのリステリア株、Ｌ．ｓｐｐ．などのラクトバチルス株、又は大腸菌などのエシュリキア株などといったバクテリアである。
【００８４】
本明細書で使用するとき、「バチルス（Bacillus）」属としては、当業者に既知の「バチルス（Bacillus）属」のすべての種を包含し、限定するものではないが、例えば、枯草菌、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレービス、Ｂ．ステアロサーモフィルス、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．クラウシイ、Ｂ．ハロデュランス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サークランス、Ｂ．ロータス、及び卒倒病菌が挙げられる。バチルス属は分類上の再編成を受け続けるものと認識される。したがって、属には、これまでに再分類された種、限定するものではないが、現在では「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス」と命名されているＢ．ステアロサーモフィルスなどの生物を包含するものと意図される。酸素存在下での、耐久性の高い内生胞子の形成は、バチルス属を定義する特性であると考慮されるものの、この特性は、現在、アリシクロバチルス、アムピバチルス、アネウリニバチルス、アノキシバチルス、ブレビバチルス、フィロバチルス、グラシリバチルス、ハロバチルス、パエニバチルス、サリバチルス、サーモバチルス、ウレイバチルス、及びバルジバチルスと命名されている属にも当てはまる。
【００８５】
一部の態様では、生物資源はグラム陽性細菌である。非限定的な例としては、ストレプトミセス株（例えば、Ｓ．リビダンス、Ｓ．コエリカラー、又はＳ．グリセウス）、バチルス株、リステリア株（例えば、Ｌ．モノサイトゲネス）又はラクトバチルス株（例えば、Ｌ．ｓｐｐ）が挙げられる。一部の態様では、生物資源は、大腸菌、シュードモナス属、又はＨ．ピロリなどのグラム陰性細菌である。
【００８６】
一部の態様では、生物資源は植物であり、例えば、マメ科（Fabaceae）、例えばマメ亜科（Faboideae）などの植物である。一部の態様では、生物資源は葛、ポプラ（ウラジロハコヤナギｘトレムラＣＡＣ３５６９６）、アスペン（ヤマナラシなど）、クエルクス・ロブール（Quercus robur）、アラビドプシス（Ａ．タリアナ（A. thaliana））、又はゼア（トウモロコシなど）である。
【００８７】
一部の態様では、微生物源は、藻類、例えば緑藻、紅藻、灰色藻、クロララクニオン藻、ミドリムシ目、クロミスタ、又は渦鞭毛藻類である。
【００８８】
一部の態様では、生物資源は、形態に基づき次の群：クロオコッカス、プレウロカプサ、ユレモ、ネンジュモ、又はスティゴネマのいずれかに分類される、ラン藻である。一部の態様では、ラン藻はサーモシネココッカス・エロンガタス（Thermosynechococcus elongatus）である。
【００８９】
代表的な宿主細胞
鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド、ＤＸＰ経路関連性ポリペプチド、ＭＶＡ経路のポリペプチド、ＭＶＡ経路関連性ポリペプチド、イソプレン合成酵素ポリペプチド、又はＩＤＩポリペプチドを発現させ、本開示の方法でイソプレンを生産するにあたって各種宿主細胞を使用できる。代表的な宿主細胞としては、「代表的な生物資源」の見出しで前項において列記した生物のいずれかに由来する細胞が挙げられる。宿主細胞は、イソプレンを天然に生成する細胞であっても、イソプレンを天然には生成しない細胞であってもよい。一部の態様では、宿主細胞は、ＤＸＰ経路及びイソプレン合成酵素により天然にイソプレンを生産する細胞であり、並びにＤＸＰ経路の１種以上のポリペプチド、及び鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチドを加えることで、この経路によるイソプレンの生産性が向上する。一部の態様では、宿主細胞は、ＤＸＰ経路及びイソプレン合成酵素により天然にイソプレンを生産する細胞であり、ＤＸＰ経路に含まれる１種以上のポリペプチド、鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行う核酸、及びＩＤＩを加えることで、この経路によるイソプレンの生産性が向上する。
【００９０】
したがって、当業者であれば、具体的な宿主株における遺伝子発現を最適化する特性の配列を含有するよう、発現ベクターを設計できることを認識するであろう。このような最適化配列としては、限定するものではないが、複製起点、プロモーター、及びエンハンサーが挙げられる。本明細書で参照するベクター及び配列は例示目的で記載され、本発明の範囲を狭めることを意味するものではない。
【００９１】
鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド、ＤＸＰ経路関連性ポリペプチド、ＭＶＡ経路のポリペプチド、ＭＶＡ経路関連性ポリペプチド、イソプレン合成酵素ポリペプチド、又はＩＤＩポリペプチドを発現させ、本開示の方法でイソプレンを生産するにあたって、異種遺伝子を発現させるのに使用することのできる、任意の細胞又は子孫細胞を使用できる。一部の実施形態では、宿主細胞は、グラム陽性細菌である。非限定的な例としては、ストレプトミセス株（例えば、Ｓ．リビダンス、Ｓ．コエリカラー、又はＳ．グリセウス）、バチルス株、リステリア株（例えば、Ｌ．モノサイトゲネス）又はラクトバチルス株（例えば、Ｌ．ｓｐｐ）が挙げられる。一部の実施形態では、生物資源は、大腸菌、シュードモナス属、又はＨ．ピロリなどのグラム陰性細菌である。特定の実施形態では、１種以上の、鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド、ＤＸＰ経路関連性ポリペプチド、ＭＶＡ経路のポリペプチド、ＭＶＡ経路関連性ポリペプチド、イソプレン合成酵素ポリペプチド、又はＩＤＩポリペプチドを発現させ、本開示の方法でイソプレンを生産するにあたって大腸菌宿主細胞を使用できる。
【００９２】
グラム陽性又はグラム陰性細菌などの細菌細胞を使用して、上記の異種遺伝子のうち任意のものを発現させることができる。具体的には、Ｐ．シトレア、枯草菌、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレービス、Ｂ．ステアロサーモフィルス、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．クラウシイ、Ｂ．ハロデュランス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サークランス、Ｂ．ロータス、卒倒病菌、Ｓ．アルブス、Ｓ．リビダンス、Ｓ．コエリカラー、Ｓ．グリセウス、シュードモナス属、及びＰ．アルカリゲネス細胞のうちのいずれかである。
【００９３】
本発明の組成物及び方法には、数多くの種類の嫌気生細胞を宿主細胞として使用することができる。本発明の一態様では、本明細書に記載の任意の組成物又は方法に関し記載される細胞は、絶対嫌気性細胞及びその子孫細胞である。絶対嫌気性菌は、典型的には、条件下に酸素が存在する場合には良好に増殖しない。絶対嫌気性菌が低濃度の酸素に対しある程度の耐性を示す場合には、少量の酸素が存在してもよいことは理解されるであろう。一態様では、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン、及びイソプレノイドを生産するよう遺伝子操作を行った絶対嫌気性菌を、本明細書に記載のいずれかの方法及び／又は組成物用の宿主細胞として提供し、実質的に無酸素条件下で増殖させることができる。この場合、存在する酸素量は嫌気性菌の増殖、維持、及び／又は発酵に有害なものではない。
【００９４】
本発明の他の態様では、本明細書に記載の組成物又は方法のいずれかにおいて記載され及び／又は使用される宿主細胞は、通性嫌気性細胞及びその子孫細胞である。酸素が存在する場合、通性嫌気性菌は、好気呼吸により（例えば、ＴＣＡサイクルを利用するなどして）細胞ＡＴＰを生成し得る。しかしながら、通性嫌気性菌も、酸素の非存在下で増殖させることができる。絶対嫌気性菌とは対照的に、通性嫌気性菌はより多量の酸素の存在下で死滅し、又は増殖性が乏しくなる。したがって、一態様では、通性嫌気性菌は、本明細書で提供される組成物及び／又は方法のいずれかにおいて、宿主細胞として使用でき、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン、及びイソプレノイドを生成するよう遺伝子操作を行うことができる。通性嫌気性宿主細胞は、実質的に無酸素（存在する酸素量が、増殖、嫌気性菌の維持、及び／又は発酵に有害なものではないことを意味する）条件下で増殖させることができ、あるいは酸素がより多量に存在している場合にも増殖することができる。
【００９５】
宿主細胞は、糸状真菌細胞及びその子孫細胞であってもよい。（例えば、Ｂｅｒｋａ  ＆  Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ，（１９８９），７（２）：１２７〜１５４を参照されたい）。一部の態様では、糸状菌細胞はトリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、Ｔ．ビリデ、Ｔ．コニンギ、Ｔ．ハルジアナム、ペニシリウム属、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、ヒュミコラ・ラヌギノス（H. lanuginose）、Ｈ．グリセア、クリソスポリウム属、Ｃ．ラックノウエンス、グリオクラジウム属、アスペルギルス属、例えば、Ａ．オリゼ、Ａ．ニガー、ショウユコウジカビ、Ａ．ジャポニクス、Ａ．ニデュランス、又はアワモリコウジカビ、フザリウム属、例えばＦ．ロゼウム、Ｆ．グラミニウム、Ｆ．セレアリス、Ｆ．オキシスポラム、又はＦ．ベネナタム、ニューロスポラ属、例えば、Ｎ．クラッサ、ヒポクレア属、ムコール属、例えば、Ｍ．ミエヘイ、リゾプス属又はエメリセラ属のいずれか由来のものであってよい。一部の態様では、真菌は、Ａ．ニデュランス、アワモリコウジカビ、Ａ．オリゼ、Ａ．アクレタス（A. aculeatus）、Ａ．ニガー、ショウユコウジカビ、Ｔ．リーゼイ、Ｔ．ビリデ、Ｆ．オキシスポラム、又はＦ．ソラニである。特定の実施形態では、本明細書で使用するためのプラスミド又はプラスミド配列には、米国特許出願公開第２０１１／００４５５６３号に記載のものが包含される。
【００９６】
宿主細胞は、酵母菌属、シゾサッカロミセス属、ピキア属、又はカンジダ属などの酵母であってもよい。一部の態様では、酵母菌属は、出芽酵母である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，（１９９２），８（６）：４２３〜４８８を参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書で使用するプラスミド又はプラスミド配列には、米国特許第７，６５９，０９７号、及び米国特許出願公開第２０１１／００４５５６３号に記載のものが包含される。
【００９７】
宿主細胞は、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類、ミドリムシ類、クロミスタ類、又は渦鞭毛藻類などの藻類であってもよい。（例えば、Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ＆  Ｗａｒｍｂｒｏｄｔ，「Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｇｉ，Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｙｅａｓｔ，」（１９９３），Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ，Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤを参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書で使用するためのプラスミド又はプラスミド配列には、米国特許出願公開第２０１１／００４５５６３号に記載のものが包含される。一部の態様では、宿主細胞は、形態学に基づく次の群：クロロコックム（Chlorococcales）、プレウロカプサ、ユレモ、ネンジュモ、又はスティゴネマ（例えば、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，（２０１０）１２（１）：７０〜７９を参照されたい）のいずれかに分類されるラン藻である。特定の実施形態では、本明細書で使用するプラスミド又はプラスミド配列には、米国特許出願公開第２０１０／０２９７７４９号、同第２００９／０２８２５４５号、及び国際公開第２０１１／０３４８６３号に記載のものが包含される。
【００９８】
代表的な形質転換方法
ＩｓｐＧ核酸、鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行う核酸、ＤＸＰ経路に関係する核酸、ＤＸＰ経路関連性核酸、イソプレン合成酵素核酸、又はＩＤＩ核酸、又はこれらの核酸を含むベクターを、当業者に知られる標準法を用い宿主細胞（例えば、本明細書に記載の大腸菌細胞、藻類細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、又はバクテリア細胞）に導入することができる。導入された核酸は、染色体ＤＮＡに組み込むことができ、又は染色体外の複製配列として維持することができる。
【００９９】
その他の宿主細胞変異
特定の実施形態では、本明細書に記載の組み換え細胞は、ＭＶＡ経路の１つ以上のポリペプチドを更に含み、本発明は、ＭＶＡ経路に取り込まれる炭素量を増加させるような、特定の宿主細胞変異を更に企図する。他の実施形態では、本発明は、ＤＸＰ経路に取り込まれる炭素量を増加させるような、特定の宿主細胞変異を企図する。他の実施形態では、本発明は、ＤＸＰ経路及びＭＶＡ経路に取り込まれる炭素量を増加させるような、特定の宿主細胞変異を企図する。炭素取り込み量を増加させることにより、イソプレン生産量を増加させることができる。特定の実施形態では、本開示に記載する組み換え細胞には、メバロン酸生産に向けた炭素取り込み量を増加させるよう遺伝子操作を行うこともでき、その際、（ａ）クエン酸合成酵素、（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ、（ｃ）酢酸キナーゼ、（ｄ）乳酸脱水素酵素、（ｅ）ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素、及び（ｆ）ピルビン酸脱水素酵素からなる群から選択される１つ以上の酵素活性が調節される。
【０１００】
クエン酸合成酵素による経路
クエン酸合成酵素は、オキサロ酢酸とアセチル−ＣｏＡを縮合させることによるクエン酸（トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路の代謝生成物）の生成を触媒する（Ｎｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．１９８３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２：５２４３〜５２４９；Ｂｈａｙａｎａ，Ｖ．ａｎｄ  Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ，Ｈ．１９８４．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：２９００〜２９０５）（図５）。大腸菌では、ｇｌｔＡによりコードされたこの酵素は、二量体サブユニットの三量体様の挙動を示す。六量体の形成により、酵素はＮＡＤＨによりアロステリックに制御されるようになる。この酵素は、これまでに広く研究されている（Ｗｉｅｇａｎｄ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．１９８６．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１５：９７〜１１７；Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．１９８７．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｓｙｍｐ．５４：８３〜９２；Ｓｔｏｃｋｅｌｌ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３５４３５〜４３；Ｍａｕｒｕｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４２：５５５５〜５５６５）。ＮＡＤＨによるアロステリック阻害を回避するにあたって、これまでに、枯草菌ＮＡＤＨ−感受性クエン酸合成酵素による置き換え、又はこの酵素の添加が検討されている（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：１０７１〜１０８１；Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｍｅｔ．Ｅｎｇ．７：２２９〜２３９）。
【０１０１】
クエン酸合成酵素による触媒反応は、メバロン酸経路の第一工程を触媒し、同様にアセチル−ＣｏＡを基質として使用するチオラーゼと直接的に競合する（Ｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：２１１６〜２１２２）。したがって、当業者は、クエン酸合成酵素の発現を調節して（例えば、酵素活性を減少させて）、より多量の炭素がメバロン酸経路に取り込まれるようにすることで、メバロン酸及びイソプレンの最終的な生産量を増加させることができる。クエン酸合成酵素活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下させる。一部の態様では、クエン酸合成酵素に関係する内在性遺伝子の活性を減少させることにより、クエン酸合成酵素の活性を調節する。この調節は、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸合成酵素をコードしている導入遺伝子により、あるいは枯草菌から誘導したＮＡＤＨ非感受性クエン酸合成酵素をコードしている導入遺伝子により、内在性クエン酸合成酵素遺伝子の染色体を置換することで実施できる。クエン酸合成酵素の活性は、内在性クエン酸合成酵素遺伝子のプロモーターを、常時低発現型の合成プロモーターと置き換えることによっても調節（例えば、低下させる）できる。クエン酸合成酵素の活性を低下させることで、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素の取り込みを、クエン酸合成酵素の発現を低下させていない微生物と比較して増加させることができる。
【０１０２】
ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの関与する経路
ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．１９６９．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９１：５５０〜５５８）は、アセチル−ＣｏＡとアセチルリン酸（アセチル−Ｐ）との可逆性の変換を触媒するのに対し、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）（Ｋａｋｕｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：９１６〜９２２）は、アセチル−Ｐを利用して酢酸を生成する。これらの遺伝子は、大腸菌においてオペロンとして転写され得る。これらの遺伝子は共に、ＡＴＰの放出により酢酸の異化を触媒する。したがって、当業者は、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（例えば、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子）及び／又は酢酸キナーゼ遺伝子（例えば、内在性酢酸キナーゼ遺伝子）の活性を減弱させて、利用可能なアセチルＣｏ−Ａを増加させることができる。減弱させる手法の一つとしては、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）及び／又は酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）の欠失が挙げられる。この欠失は、クロラムフェニコールカセットにより片方又はいずれもの遺伝子を置き換え、その後カセットを除去することで導入される。酢酸は多様な理由により大腸菌により生成される（Ｗｏｌｆｅ，Ａ．２００５．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６９：１２〜５０）。理論に束縛されるものではないが、ａｃｋＡ−ｐｔａはアセチル−ＣｏＡを消費することから、これらの遺伝子を欠失させると、炭素は酢酸へと変換されなくなり、メバロン酸又はイソプレンの収率が増加することになる。
【０１０３】
一部の態様では、組み換え微生物は、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して、酢酸の生成量が減少している。酢酸生成量の減少は、当業者に既知の所定のアッセイ法により測定できる。酢酸の生成量は、分子的な操作を行なっていない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％減少する。
【０１０４】
ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）及び／又は酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）の活性は、酵素に関係する他の分子的操作によっても低下させることができる。酵素活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下させる。
【０１０５】
一部の場合では、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性生合成経路への炭素原子の取り込みが増加する。
【０１０６】
乳酸脱水素酵素の関与する経路
大腸菌では、Ｄ−乳酸は、乳酸脱水素酵素（ｌｄｈＡ−図５）により、ピルビン酸から生成される（Ｂｕｎｃｈ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４３：１８７〜１９５）。乳酸の生成はＮＡＤＨの酸化によりなされるため、乳酸は、酸素制限下で、かつ還元当量のすべてを収容できない場合に生成されることになる。したがって、乳酸の生成は、炭素消費の原因となり得る。そのため、当業者は、酵素の活性を低下させるなどといったように、乳酸脱水素酵素の活性を調節して、メバロン酸生産（及びイソプレン）時の炭素の取り込みを改良することができる。
【０１０７】
したがって、一態様では、乳酸脱水素酵素の活性は、内在性乳酸脱水素酵素遺伝子の活性を減弱させることで調節できる。このような減弱は、内在性乳酸脱水素酵素遺伝子の欠失により実施できる。当業者に知られている、乳酸脱水素酵素遺伝子の活性を減弱させる他の手法も使用できる。乳酸脱水素酵素の関与する経路を操作することで、組み換え微生物の生成する乳酸量は、内在性乳酸脱水素酵素遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して、減少することになる。乳酸の生成量の減少は、当業者に知られている所定のアッセイ法により測定できる。乳酸の生成量は、分子的な操作を行なっていない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％減少する。
【０１０８】
乳酸脱水素酵素の活性は、酵素に関係するその他の分子操作により低下させることもできる。酵素活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％減少させる。
【０１０９】
したがって、一部の場合では、内在性乳酸脱水素酵素遺伝子の活性を減弱させることで、内在性乳酸脱水素酵素の遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素の取り込みが増加する。
【０１１０】
リンゴ酸酵素の関与する経路
リンゴ酸酵素（大腸菌ではｓｆｃＡ及びｍａｅＢ）は、次式に従いリンゴ酸のピルビン酸への変換を触媒する（ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を用いる）アナプレロティックな酵素である：
【０１１１】
【化１】
2014504497.tif 000003
【０１１２】
したがって、この酵素の２種の基質は（Ｓ）−リンゴ酸及びＮＡＤ（Ｐ）＋であり、これらにより３種の生成物、すなわち、ピルビン酸、ＣＯ２、及びＮＡＤＰＨが生成される。
【０１１３】
ＮＡＤＰ−依存性のリンゴ酸酵素（ｍａｅＢ−図５）（Ｉｗｉｋｕｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９７９．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８５：１３５５〜１３６５）は、１）ＴＣＡサイクルの炭素原子を、アセチル−ＣｏＡの直接的な前駆体であり、それ自身がメバロン酸経路の直接的な前駆体であるピルビン酸に戻し、かつ２）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素反応で使用することのできる過剰量のＮＡＤＰＨを生成する（Ｏｈ，ＭＫ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１３１７５〜１３１８３；Ｂｏｌｏｇｎａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｂａｃｔ．１８９：５９３７〜５９４６）ことにより、メバロン酸及びイソプレンの収率を増加させる手助けとなり得る。
【０１１４】
そのため、リンゴ酸酵素の活性及び／又は発現を増加させるなどして調節することにより下流でのメバロン酸又はイソプレン生産に関係する開始基質（ピルビン酸又はアセチル−ＣｏＡ）がより多く得られる。ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素遺伝子は、内在性遺伝子であってよい。非限定的な手法の１つとしては、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素の内在性遺伝子プロモーターを、常時発現型の合成発現プロモーターにより置き換えるというものが挙げられる。酵素活性を増加させる手法のその他の非限定例としては、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素ポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を用いるものが挙げられる。当業者は、容易に利用可能な分子生物学手技を用い、発酵又は培養する際に、ｍａｅＢ  ＲＮＡの発現をモニターすることができる。
【０１１５】
したがって、一部の実施形態では、組み換え微生物は、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素遺伝子の発現を増加させていない微生物と比較して、ピルビン酸の生産量が増加する。一部の態様では、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素遺伝子の活性を増加させることで、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素遺伝子の発現を増加させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素原子の取り込みが増加する。
【０１１６】
ピルビン酸生成量の増加は、当業者に既知の所定のアッセイ法により測定できる。ピルビン酸の生産量は、分子的な操作を行なっていない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％増加する。
【０１１７】
リンゴ酸酵素の活性は、酵素に関係するその他の分子操作により増加させることもできる。酵素活性を増加させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で増加させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％増加させる。
【０１１８】
ピルビン酸脱水素酵素複合体の関与する経路
ピルビン酸のアセチル−ＣｏＡへの脱炭酸を触媒するピルビン酸脱水素酵素複合体は、遺伝子ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、及びｌｐｄＡによりコードされるタンパク質から構成される。これらの遺伝子の転写は、複数の制御因子により制御される。したがって、当業者は、ピルビン酸脱水素酵素複合体の活性を調節して、アセチル−ＣｏＡを増加することができる。調節により、ピルビン酸脱水素酵素複合体の活性及び／又は発現（例えば、常時発現）を増加させることができる。このような調節は、異なる手法により、例えば、ＰＬ．６（ａａｔｔｃａｔａｔａａａａａａｃａｔａｃａｇａｔａａｃｃａｔｃｔｇｃｇｇｔｇａｔａａａｔｔａｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｔｔｇａｃａｔａａａｔａｃｃａｃｔｇｇｃｇｇｔｇａｔａｃｔｇａｇｃａｃａｔｃａｇｃａｇｇａｃｇｃａｃｔｇａｃｃａｃｃａｔｇａａｇｇｔｇ−ラムダプロモーター、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＣ＿００１４１６）などの強力な常時発現型プロモーターをオペロンの前に配置することにより、あるいは常時発現型合成プロモーターを１種以上用いることにより行うことができる。
【０１１９】
したがって、一態様では、ピルビン酸脱水素酵素の活性は、（ａ）ピルビン酸脱水素酵素（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポリルアセチル基転移酵素、及び（ｃ）ジヒドロリポリル脱水素酵素から構成されるピルビン酸脱水素酵素複合体に関係する、１種以上の遺伝子の活性を増加させることで調節する。これらの遺伝子のうちの任意の１つ、２つ、又は３つを操作して、ピルビン酸脱水素酵素の活性を増加させることができることは理解される。他の態様では、以降に更に説明するように、ピルビン酸脱水素酵素複合体の活性は、内在性ピルビン酸脱水素酵素複合体のリプレッサー遺伝子の活性を減弱させることで調節できる。内在性ピルビン酸脱水素酵素複合体のリプレッサーの活性は、内在性ピルビン酸脱水素酵素複合体リプレッサー遺伝子を欠失させることにより減弱させることができる。
【０１２０】
一部の場合では、ピルビン酸脱水素酵素複合体に関係する遺伝子の１つ以上は内在性遺伝子である。ピルビン酸脱水素酵素複合体の活性を増加させるその他の方法としては、微生物に、（ａ）ピルビン酸脱水素酵素（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポリルアセチル基転移酵素、及び（ｃ）ジヒドロリポリル脱水素酵素からなる群に由来するポリペプチを１つ以上コードしている異種核酸を１つ以上導入することによるものが挙げられる。
【０１２１】
これらの方法のうち任意のものを用いることで、ピルビン酸脱水素酵素活性の調節されていない微生物と比較して、組み換え微生物によるアセチルＣｏ−Ａの生産量を増加させることができる。ピルビン酸脱水素酵素の活性を調節することで、ピルビン酸脱水素酵素の発現を調節していない微生物と比較して、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素原子の取り込みを増加させることができる。
【０１２２】
変異の組み合わせ
本開示の酵素及び／又は酵素経路の何れかに関し、本開示の酵素及び／又は酵素経路の任意の組み合わせ（これらのうち２、３、４、５、又は６の組み合わせ）を調節する分子的操作は、明確に企図されることは理解される。組み合わせの引用を容易にするために、クエン酸合成酵素（ｇｌｔＡ）はＡと記載し、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａＢ）はＢと記載し、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）はＣと記載し、乳酸脱水素酵素（ｌｄｈＡ）はＤと記載し、リンゴ酸酵素（ｓｆｃＡ又はｍａｅＢ）はＥと記載し、かつピルビン酸脱炭酸酵素（ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、及び／又はｌｐｄＡ）はＦと記載する。上記の通り、ピルビン酸脱炭酸酵素複合体のａｃｅＥ、ａｃｅＦ、及び／又はｌｐｄＡ酵素を単独で使用して、又は３つの酵素のうち２つを、又は３つ酵素のうち３つを使用して、ピルビン酸脱炭酸酵素の活性を増加させることができる。
【０１２３】
したがって、酵素Ａ〜Ｆのうちの任意の２つの組み合わせに関し、使用することのできる非限定的な組み合わせとしては：ＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＢＦ、ＣＤ、ＣＥ、ＣＦ、ＤＥ、ＤＦ、及びＥＦが挙げられる。酵素Ａ〜Ｆのうちの任意の３つの組み合わせに関し、使用することのできる非限定的な組み合わせとしては：ＡＢＣ、ＡＢＤ、ＡＢＥ、ＡＢＦ、ＢＣＤ、ＢＣＥ、ＢＣＦ、ＣＤＥ、ＣＤＦ、ＤＥＦ、ＡＣＤ、ＡＣＥ、ＡＣＦ、ＡＤＥ、ＡＤＦ、ＡＥＦ、ＢＤＥ、ＢＤＦ、ＢＥＦ、及びＣＥＦが挙げられる。酵素Ａ〜Ｆのうちの任意の４つの組み合わせに関し、使用することのできる非限定的な組み合わせとしては：ＡＢＣＤ、ＡＢＣＥ、ＡＢＣＦ、ＡＢＤＥ、ＡＢＤＦ、ＡＢＥＦ、ＢＣＤＥ、ＢＣＤＦ、ＣＤＥＦ、ＡＣＤＥ、ＡＣＤＦ、ＡＣＥＦ、ＢＣＥＦ、ＢＤＥＦ、及びＡＤＥＦが挙げられる。酵素Ａ〜Ｆのうちの任意の５つの組み合わせに関し、使用することのできる非限定的な組み合わせとしては：ＡＢＣＤＥ、ＡＢＣＤＦ、ＡＢＤＥＦ、ＢＣＤＥＦ、ＡＣＤＥＦ、及びＡＢＣＥＦが挙げられる。他の態様では、６つの酵素の組み合わせ：ＡＢＣＤＥＦが使用される。
【０１２４】
したがって、本開示に記載する通りの組み換え微生物は、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルの活性条件下で増殖しない微生物と比較して、メバロン酸生産を増加させることができ、（ａ）クエン酸合成酵素、（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼ、（ｃ）乳酸脱水素酵素、（ｄ）リンゴ酸酵素、並びに（ｅ）ピルビン酸脱炭酸酵素複合体からなる群の１つ以上の酵素の活性を調節することで、組み換え微生物における代謝性炭素の取り込みがメバロン酸の生産に指向する。
【０１２５】
生産性増加に関係する他の制御因子及び要素
他の分子的操作を使用して、メバロン酸及び／又はイソプレン生産に指向する炭素取り込みを増加させることができる。このような方法のうちの１つは、メバロン酸経路に合流する経路に対する負の制御効果を減少させ、低下させるか、又は除去するものである。例えば、一部の場合では、遺伝子ａｃｅＥＦ−ｌｐｄＡはオペロンであり、ｐｄｈＲの上流に遺伝子を４つ有する。ｐｄｈＲは、このオペロンの転写に対する負の制御因子である。ｐｄｈＲは、ピルビン酸の非存在下で標的プロモーターに結合し、転写を抑制する。この制御因子は同様の手法でｎｄｈ及びｃｙｏＡＢＣＤも制御する（Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８９：５５３４〜５５４１）。一態様では、ｐｄｈＲ制御因子の欠失によりピルビン酸の供給を改善させることで、メバロン酸及びイソプレンを生産させる。
【０１２６】
他の態様では、メバロン酸及び／又はイソプレンの生産を改良させるために、ＰＧＬを欠損している微生物（各種大腸菌株など）に６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）を導入し、使用することができる。ＰＧＬは、染色体への組み込み、又はプラスミドなどの染色体外のビヒクルを用い、導入することができる。
【０１２７】
代表的な細胞培養培地及び培養条件
代表的な細胞培養培地及び培養条件「培養液中の細胞」とは、細胞が１回以上の細胞分裂を行うことのできる溶液（例えば細胞培地）中に、２つ以上の細胞が含まれていることを意味する。「培養液中の細胞」には、植物組織に分化した細胞を有する生きた多細胞植物の一部をなす植物細胞は含まれない。様々な態様では、細胞培養は、少なくとも、又は約１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００、若しくはこれよりも多い細胞を含む。
【０１２８】
宿主細胞を培養する際には、国際公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、同第２００９／１３２２２０号に記載の炭素源を使用することができる。一態様では、本発明の組み換え細胞は、次の試薬を用い、１５Ｌスケールのフェドバッチ培養で増殖させることができる。
【０１２９】
１０００Ｘ微量金属溶液（１Ｌあたり）：クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を容量までメスアップし、０．２２マイクロメートル径のフィルタによりろ過滅菌した。
【０１３０】
ビタミン溶液（１Ｌあたり）：塩酸チアミン（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、Ｄ−パントテン酸（４．８ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨ  ３．０に調整し、次に溶液を容量までメスアップし、０．２２マイクロメートル径のフィルタによりろ過滅菌した。
【０１３１】
マクロ塩溶液（１Ｌあたり）：ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、容量までメスアップし、孔径０．２２マイクロメートルのフィルタでろ過滅菌した。
【０１３２】
供給溶液（ｋｇあたり）：グルコース（０．５７ｋｇ）、脱イオン水（０．３８ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、及び１００％  Ｆｏａｍｂｌａｓｔ（１０ｇ）。すべての成分を共に混合し、オートクレーブ処理した。溶液を２５℃にまで放冷させた後、マクロ塩溶液（１１．１ｍＬ）、１０００Ｘ微量金属溶液（１．６ｍＬ）、ビタミン溶液（１３．１ｍＬ）及び３５０ｇ／Ｌ酵母エキス溶液（５．４ｍＬ）（０．２２マイクロメートル径でろ過滅菌）を加えた。
【０１３３】
リン酸溶液（１Ｌあたり）：ＫＨ２ＰＯ４（６８ｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（６８ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、容量までメスアップし、３０分オートクレーブ処理した。
【０１３４】
本開示のいずれかの組み換え細胞を培養するのに使用することのできる、他の方法及び成分を実施例に記載する。細菌培地の維持及び増殖に適した材料及び方法は、当該技術分野では周知のものである。代表的な手法は、国際公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、及び同第２００９／１３２２２０号、並びにＭａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）又はＢｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．に見ることができる。一部の態様では、細胞を、宿主細胞に挿入した核酸によりコードされる、一方又は両方のＩｓｐＧ酵素、１つ以上のイソプレン合成酵素ポリペプチド、鉄−硫黄クラスタ相互作用により酸化還元を行うポリペプチド、ＤＸＰ経路のポリペプチド、ＤＸＰ経路関連性ポリペプチド、あるいはＩＤＩポリペプチド、を発現させる条件下で、培養培地において培養する。
【０１３５】
細胞増殖に伴い生産されるイソプレンの脱共役方法例
本発明の組み換え細胞は、細胞増殖に伴い生産されるイソプレンを脱共役させるような手法で増殖させることができる。原料を使用する際、原料由来の炭素が、細胞の増殖及び維持よりもイソプレンへの変換に使用されることが望ましい。一部の態様では、低〜中ＯＤ６００に細胞を増殖させ、次にイソプレンの生産を開始させるか、生産を増大させるかする。このストラテジーにより、イソプレンの大部分をイソプレンへと変換させることができる。当業者は、国際公開第２０１０／００３００７号に記載の教示に従い、本発明の組み換え細胞を増殖させることができる。
【０１３６】
一部の態様では、イソプレンは静止期でのみ生産される。一部の態様では、イソプレンは増殖期と静止期の両方で生産される。一部の態様では、イソプレンは増殖期でのみ生産される。一部の態様では、本明細書に記載の各種酵素及びポリペプチドをコードしている核酸を、プロモーター、あるいは増殖期よりも静止期でより活性になる要素の制御下に置く。例えば、１つ以上の、イソプレン合成酵素核酸、鉄−硫黄クラスタ相互作用を行う酸化還元に関与する核酸、ＤＸＰ経路に含まれる核酸、ＤＸＰ経路関連性核酸、ＩｓｐＧ酵素、及び／又はＩＤＩ核酸を、ＲｐｏＳなどの静止期のσ因子の制御下に置くこともできる。一部の態様では、１つ以上の、イソプレン合成酵素核酸、鉄−硫黄クラスタ相互作用による酸化還元に関与する核酸、ＤＸＰ経路に含まれる核酸、ＤＸＰ経路関連性核酸、ＩｓｐＧ酵素、及び／又はＩＤＩ核酸を、静止期に誘導可能なプロモーター、例えば、静止期に制御因子による活性化に応答して誘導可能になるプロモーターなどの制御下に置く。
【０１３７】
安全な取り扱い範囲内でのイソプレン生産
本開示の組み換え細胞を用いるイソプレン生産は、商業設備の設計及び構成を単純化し、取り扱いの安全性を非常に向上させ、引火の可能性を制限することで、引火性に照らして安全に取り扱える範囲内で実施することができる。詳細には、イソプレン生産に最適な範囲は、安全域内の範囲であり、すなわち、イソプレンの濃度範囲が不燃性の範囲内に収まる範囲である。このようなものの一態様では、本発明は、イソプレンの濃度範囲が不燃性の範囲内に収まる（イソプレン濃度が可燃濃度外である）、イソプレン生産法を特徴とする。安全に取り扱える範囲内とは、国際公開第２０１０／００３００７号に記載されており、この開示に記載される範囲は、参照により具体的に援用される。
【０１３８】
代表的なイソプレン生産法
本発明は、特に、２種類のＩｓｐＧ酵素、ＤＸＰ経路に関係する１つ以上の酵素、及び１つ以上のイソプレン合成酵素を、所望により、鉄−硫黄クラスタ相互作用による酸化還元に関係する遺伝子又はポリペプチド、及びＩＤＩ遺伝子及びポリペプチドと組み合わせて用い、培養細胞のイソプレン生産を増大させる、組成物及び方法を提供する。一部の態様では、組み換え細胞によるイソプレンの累積生産力価（総量）は、約約１、２、３、４、５、６、７、８、８．４、９、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、１７５、又は２００ｇ／Ｌ発酵液以上である。一部の態様では、上限は、約１、２、３、４、５、６、７、８、８．４、９、１０、２５、５０，７５、１００、１５０、１７５、又は２００ｇ／Ｌ発酵液である。
【０１３９】
イソプレン生産に関係する各種測定値（例えば、イソプレン比生産性、発酵槽内での瞬間イソプレン生産速度など）は、国際公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、及び同第２００９／１３２２２０号に記載の通りに測定できる。
【０１４０】
一部の態様では、イソプレン組成物は、組成物に含まれるすべてのＣ５炭化水素の総重量と比較して約９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、又は９９．９８％以上の、又は１００％のイソプレンを含む。一部の態様では、組成物に含まれるイソプレンの検出器反応は、組成物に含まれるすべてのＣ５炭化水素についての検出器反応と比較して、約９９．９０、９９．９１、９９．９２、９９．９３、９９．９４、９９．９５、９９．９６、９９．９７、９９．９８、又は９９．９９％以上、又は１００％である。一部の態様では、イソプレン組成物は、組成物に含まれるすべてのＣ５炭化水素の総重量と比較して、約９９．９０〜約９９．９２、約９９．９２〜約９９．９４、約９９．９４〜約９９．９６、約９９．９６〜約９９．９８、約９９．９８〜１００％のイソプレンを含む。
【０１４１】
一部の態様では、イソプレン組成物は、イソプレン以外の炭化水素（例えば、１，３−シクロペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、３−メチル−ｌ−ブチン、ペンタ−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペンタ−３−エン−１−イン、又はｃｉｓ−ペンタ−３−エン−１−インなど）を、組成物に含まれるすべてのＣ５炭化水素の総重量と比較して、約０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、又は０．００００１％以下で含む。一部の態様では、組成物に含まれる、イソプレン以外のＣ５炭化水素についての検出器反応は、組成物に含まれるすべてのＣ５炭化水素についての検出器反応と比較して、約０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、又は０．００００１％以上である。一部の態様では、組成物に含まれる、１，３−シクロペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、３−メチル−ｌ−ブチン、ペンタ−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペンタ−３−エン−１−イン、又はｃｉｓ−ペンタ−３−エン−１−インについての検出器反応は、組成物に含まれるすべてのＣ５炭化水素についての検出器反応と比較して、約０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、又は０．００００１％以下である。一部の態様では、イソプレン組成物は、イソプレン以外のＣ５炭化水素（１，３−シクロペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、３−メチル−ｌ−ブチン、ペンタ−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペンタ−３−エン−１−イン、又はｃｉｓ−ペンタ−３−エン−１−インなど）を、組成物に含まれるすべてのＣ５炭化水素の総重量の約０．０２〜約０．０４％、約０．０４〜約０．０６％、約０．０６〜０．０８％、約０．０８〜０．１０％、又は約０．１０〜約０．１２％で含む。
【０１４２】
一部の態様では、イソプレン組成物は、イソプレンの重合を阻害する任意の化合物を、約５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、又は０．００５ｕｇ／Ｌ以下で含む。一部の態様では、イソプレン組成物は、イソプレンの重合を阻害する任意の化合物を、約０．００５〜約５０ｕｇ／Ｌ（例えば、約０．０１〜約１０、約０．０１〜約５、約０．０１〜約１、約０．０１〜約０．５、又は約０．０１〜約０．００５ｕｇ／Ｌなど）含む。一部の態様では、イソプレン組成物は、イソプレン以外の炭化水素（１，３−シクロペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、３−メチル−ｌ−ブチン、ペンタ−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペンタ−３−エン−１−イン、又はｃｉｓ−ペンタ−３−エン−１−インなど）を約５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、又は０．００５ｕｇ／Ｌ以下で含む。一部の態様では、イソプレン組成物は、イソプレン以外の炭化水素を、約０．００５〜約５０ｕｇ／Ｌ（例えば、約０．０１〜約１０、約０．０１〜約５、約０．０１〜約１、約０．０１〜約０．５、又は約０．０１〜約０．００５ｕｇ／Ｌ）含む。一部の態様では、イソプレン組成物は、タンパク質又は脂肪酸（天然において天然ゴムと関連付けられるタンパク質又は脂肪酸など）を、約５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、又は０．００５ｕｇ／Ｌ以下で含む。
【０１４３】
一部の態様では、イソプレン組成物は、αアセチレン、ピペリレン、アセトニトリル、又は１，３−シクロペンタジエンを、約１０、５、１、０．８、０．５、０．１、０．０５、０．０１、又は０．００５ｐｐｍ以下で含む。一部の態様では、イソプレン組成物は、硫黄又はアレンを、約５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、又は０．００５ｐｐｍで含む。一部の態様では、イソプレン組成物が含む総アセチレン（ペンチン−１、ブチン−２、２ＭＢ１−３イン、及び１−ペンチン−４インなど）は、約３０、２０、１５、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、又は０．００５ｐｐｍ以下である。一部の態様では、イソプレン組成物は、イソプレン二量体、例えば環状イソプレン二量体（例えば、イソプレン単位２つを二量体化させることで誘導された環状Ｃ１０化合物）を、約２０００、１０００、５００、２００、１００、５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、又は０．００５ｐｐｍ以下で含む。
【０１４４】
一部の態様では、組成物は、約２ｍｇ超、例えば約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００ｍｇ以上のイソプレンを含む。一部の態様では、組成物は、約２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｇ以上のイソプレンを含む。一部の態様では、組成物中のイソプレン量は、約２〜約５，０００ｍｇ、例えば、約２〜約１００ｍｇ、約１００〜約５００ｍｇ、約５００〜約１，０００ｍｇ、約１，０００〜約２，０００ｍｇ、又は約２，０００〜約５，０００ｍｇである。一部の態様では、組成物中のイソプレン量は、約２０〜約５，０００ｍｇ、約１００〜約５，０００ｍｇ、約２００〜約２，０００ｍｇ、約２００〜約１，０００ｍｇ、約３００〜約１，０００ｍｇ、又は約４００〜約１，０００ｍｇである。一部の態様では、組成物の揮発性有機画分のうち約２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は９５重量％がイソプレンである。
【０１４５】
代表的なイソプレン精製法
一部の態様では、本開示の任意の方法は、イソプレンを回収する工程を更に包含する。例えば、本発明の組成物及び方法により生産されるイソプレンは、ガス・ストリッピング、高機能分離膜による分離（membrane enhanced separation）、分画、吸着／脱着、浸透気化法、固相からのイソプレンの熱又は真空脱着、あるいは固相に対し固定化させた又は吸着させたイソプレンの溶媒による抽出（例えば、米国特許第４，７０３，００７号及び同第４，５７０，０２９号を参照されたい。これらの特許文献のそれぞれは参照により本開示に援用し、特にイソプレンの回収及び精製法に関し援用する。）などの標準法により回収することができる。一態様では、イソプレン吸着ストリッピングにより回収できる（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０１７８２６１号を参照されたい）。特定の態様では、イソプレンの回収には、アルコール（エタノール、メタノール、プロパノール、又はこれらの組み合わせなど）による抽出蒸留が使用される。一部の態様では、イソプレンの回収には、液体イソプレン（イソプレンの未希釈溶液又はイソプレンの溶媒希釈液など）の単離を包含する。ガス・ストリッピングには、連続的な様式で、発酵による放出気流からイソプレン蒸気を除去することを包含する。このような除去は、限定するものではないが、固相への吸着、液相への分配、又は直接濃縮（濃縮コイルへの暴露、又は加圧による凝縮など）などの、いくつかの異なる手法により実施できる。一部の態様では、蒸気の露点を上回る希釈イソプレン蒸気流の膜濃縮により、液体濃縮イソプレンが生じる。一部の態様では、イソプレンを加圧濃縮する。
【０１４６】
イソプレンの回収には、一工程又は複数工程を包含し得る。一部の態様では、発酵により生じた気体からのイソプレン蒸気の回収、及びイソプレンの液相への転換は同時に行う。例えば、放出される気体流から、イソプレンを直接液体へと凝縮させることができる。一部の態様では、発酵により生じた気体からのイソプレン蒸気の回収、及びイソプレンの液相への転換は連続的に行う。例えば、イソプレンを、固相に吸着させ、次に溶媒を用い固相から抽出することができる。一態様では、イソプレンは、米国特許出願第１２／９６９，４４０号（米国特許出願公開第２０１１／０１７８２６１号）に記載の通りに吸着ストリッピングを用い回収する。
【０１４７】
一部の態様では、本開示の任意の方法は、イソプレンの精製を更に包含する。例えば、本発明の組成物及び方法を用い生成したイソプレンを、標準法により精製することができる。精製とは、イソプレンを生成した際に存在している１種以上の成分から、イソプレンを分離する手法を指す。一部の態様では、イソプレンは実質的に純粋な液体として得られる。精製法の例としては（ｉ）抽出溶媒からの蒸留、及び（ｉｉ）クロマトグラフィーが挙げられる。本明細書で使用するとき、「精製イソプレン」は、イソプレンを生成した際に存在している１種以上の成分から分離したイソプレンを意味する。一部の態様では、イソプレンは少なくとも約２０重量％であり、イソプレンの生産時に存在する他の成分を含んでいない。各種態様では、イソプレンの純度は少なくとも約２５重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、又は９９重量％である。純度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ分析、又はＧＣ−ＭＳ分析等の任意の適切な方法で分析することができる。
【０１４８】
一部の態様では、イソプレン除去の際の１回以上の回収工程後に残存している気体相の少なくとも一部は、気体層をイソプレン生産用の細胞培養系（発酵槽など）に導入することでリサイクルされる。
【実施例】
【０１４９】
実施例は単に例示目的のものであり、したがって、決して本発明を限定することを意図するものではなく、本発明の上記の態様及び態様を記載し、詳述する。別途記載のない限り、温度は摂氏で表わされ、圧力は大気圧又は大気圧近傍である。前述の実施例及び発明を実施するための形態は、実例として提供されるものであり、制限を目的とするものではない。上記発明は一部の詳細において理解の明確化の目的のために例示及び実施例により説明したが、添付の請求項の趣旨又は範囲から離れることなくこれに一定の変更及び修正を加えることができることは、本発明の教示を考慮すれば当業者であれば容易に理解される。
【０１５０】
実施例１：Ｐｔａｃ  Ａｎａｂａｅｎａ  ｉｓｐＨ−Ｔ  ｅｌｏｎｇ  ｉｓｐＧ系のａｓｐＡ  ｔｅｒｍ／ｐＥＷＬ４５４の作成
Ｔ．エロンガタスのＩｓｐＧ系をＰｔａｃ  Ａｎａｂａｅｎａ  ｉｓｐＨ  ａｓｐＡ  ｔｅｒｍ／ｐＥＷＬ４５４にクローニングした。
【０１５１】
プラスミドＰｔａｃ−ｇｃｐＥ−ｐｅｔＦ−ｐｅｔＨ／ｐＫ１８４中に含まれる、ｇｃｐＥ−ｐｅｔＦ−ｐｅｔＨからなるＴ．エロンガスＩｓｐＧ系を含有するＤＮＡ配列については、これまでに公開されている（米国特許出願第１２／８１７，１３４号（米国特許出願公開第２０１１／００１４６７２号）、実施例９を参照されたい）。ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）、ＢａｍＨＩ、及びＰｓｔＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，ＭＡ）を用い、５’平滑末端化（ＢａｍＨＩにより切断）−３’  ＰｓｔＩ  ｇｃｐＥ−ｐｅｔＦ−ｐｅｔＨ断片を得た。製造元の示すプロトコルに従い、ＳｍａＩ並びにＰｓｔＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、ＭＡ）によりＰｔａｃ  Ａｎａｂａｅｎａ  ｉｓｐＨ  ａｓｐＡ  ｔｅｒｍ／ｐＥＷＬ４５４ベクターを消化した。ＳｍａＩ及びＰｓｔＩにより切断したＰｔａｃ  Ａｎａｂａｅｎａ  ｉｓｐＨ  ａｓｐＡ  ｔｅｒｍ／ｐＥＷＬ４５４  ＤＮＡを、５’平滑末端（ＢａｍＨＩにより切断）−ｇｃｐＥ−ｐｅｔＦ−ｐｅｔＨ−３’  ＰｓｔＩ断片を含有している最終消化産物と組み合わせ、Ｑｉａｇｅｎ  ＱｉａＱｕｉｃｋゲル抽出キットにより、ＤＮＡ混合物を洗浄した。洗浄したＤＮＡ断片のおよそ半量を、製造元の示すプロトコルに従いＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ）を用いライゲーションさせた。ライゲーションしたＤＮＡ試料を一部用い、米国特許出願第１２／８１７，１３４号（米国特許出願公開第２０１１／００１４６７２号）の実施例１１に開示されるＭＤ０９−２２０株を電気穿孔法により形質転換させた。Ｂｉｏ  Ｒａｄ遺伝子パルサーシステム（カタログ番号１６５−２０８９、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ）の０．１ｃｍキュベットと、製造元の示すプロトコルを用いた。５００ｕＭメバロン酸を加えたＬＢ培地で、３７℃で１時間形質転換体を回復させた後、ＬＢ寒天プレート（カナマイシン（５０ｕｇ／ｍＬ）添加、メバロン酸非添加）に播種した。対立遺伝子のｉｓｐＨを機能的に発現している形質転換体のみがコロニーを形成するものと予想された。カナマイシン耐性コロニーを選別し、次の通りにｇｃｐＥ−ｐｅｔＦ−ｐｅｔＨの挿入を検証した：
次の混合物を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による解析を行った：
０．５μＬテンプレート（コロニー細胞を約０．５ｕＬ容量）
１６．２５μＬ脱イオン水
０．２５μＬ  ｄＮＴＰ’ｓ（１００ｍＭ）
０．６２５μＬプライマー（１０ｕＭ）５’  ｔｏｐ  Ｔｅ  ｇｃｐＥ  ｓｅｑプライマー
０．６２５μＬプライマー（１０ｕＭ）５’  ＮｄｅＩ  Ｆ−Ｔ．ｅ．ｇｃｐＥ  ｐＥＴ−１５ｂ
０．６２５μＬプライマー（１０ｕＭ）３’  ｂｏｔｔｏｍ  Ｔｅ  ｇｃｐＥ  ｓｅｑプライマー
０．６２５μＬプライマー（１０ｕＭ）３’  ＢａｍＨＩ  Ｒ−Ｔ．ｅ．ｇｃｐＥ  ｐＥＴ−１５ｂ
５．０μＬ  ＨｅｒｃｕｌａｓｅＩＩ緩衝液
０．５μＬ  ＨｅｒｃｕｌａｓｅＩＩ  ｆｕｓｉｏｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＣＡ）
２５μＬ合計量
次のサイクルパラメートを用い、Ｂｉｏｍｅｔｒａ  Ｔ３０００  Ｃｏｍｂｉサーモサイクラー（Ｂｉｏｍｅｔｒａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によりＰＣＲ反応を実施した：９５℃×２分、（９５℃×３０秒、５５℃×３０秒、７２℃×１分）×２９サイクル、７２℃×５分、４℃で冷却。
【０１５２】
プライマー配列は次の通りのものであった：
５’  ｔｏｐ  Ｔｅ  ｇｃｐＥ  ｓｅｑプライマー：５’−ｃａｃｔｔｇａｇｔｔｔａｔａｃｇｃａｔｃ
３’  ｂｏｔｔｏｍ  Ｔｅ  ｇｃｐＥ  ｓｅｑプライマー：５’−ｇａｔｇｃｇｔａｔａａａｃｔｃａａｇｔｇ
５’  ＮｄｅＩ  Ｆ−Ｔ．ｅ．ｇｃｐＥ  ｐＥＴ−１５ｂ：５’−ｇｃｇｇｃａｇｃｃａｔａｔｇｃａａａｃｇｔｔｇｃｃａａｇｃｃｃａ
３’  ＢａｍＨＩ  Ｒ−Ｔ．ｅ．ｇｃｐＥ  ｐＥＴ−１５ｂ：５’−ｔａｇｃａｇｃｃｇｇａｔｃｃｔｔａｔｇｇａｔｃｔａｃｃｃａｔｃｔａｃｃ
得られたＰＣＲ断片を、１．２％  Ｅ−Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）で分離した。予想される大きさのＰＣＲ産物が観察されたコロニーを、ｇｃｐＥの導入がなされているものと見なし、以降の実験に使用した。
【０１５３】
ｇｃｐＥ断片が首尾よく増幅されたカナマイシン耐性コロニーを、カナマイシン（５０ｕｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ培地で一晩増殖させ、以降のプラスミド調製のため回収した。Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）を用い、プラスミドコンストラクトを単離した。プライマーＭ１３−６５（５’−ＡＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＴＡ）及びｐＳＥ３８０５（５’−ＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧ）を用い、対象とするプラスミド調製物を配列決定（Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈ、ＣＡ）し、更に、ｇｃｐＥ−ｐｅｔＦ−ｐｅｔＨ配列がＰｔａｃ  Ａｎａｂａｅｎａ  ｉｓｐＨ  ａｓｐＡ  ｔｅｒｍ／ｐＥＷＬ４５４に挿入されていることを確認した。これにより得られたプラスミドコンストラクトを、Ｐｔａｃ  Ａｎａｂａｅｎａ  ｉｓｐＨ−Ｔ  ｅｌｏｎｇ  ｉｓｐＧ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｓｐＡ  ｔｅｒｍ／ｐＥＷＬ４５４と呼ぶ（図１を参照されたい）。正確にＰｔａｃ  Ａｎａｂａｅｎａ  ｉｓｐＨ−Ｔ  ｅｌｏｎｇ  ｉｓｐＧ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｓｐＡ  ｔｅｒｍ／ｐＥＷＬ４５４クローンを同定し、ＲＥＭ  Ｉ６＿１７株と命名した。
【０１５４】
実施例２：ＲＥＭ  Ｆ２＿１８株によりＤＸＰから生成されるイソプレン量は増大している
Ｐｔａｃ  Ａｎａｂａｅｎａ  ｉｓｐＨ−Ｔ  ｅｌｏｎｇ  ｉｓｐＧ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｓｐＡ  ｔｅｒｍ／ｐＥＷＬ４５４によるＲＥＭ  Ｉ７＿１１の形質転換
親株ＲＥＭ  Ｉ７＿１１により生成されるイソプレン量はこれまでに公開されている（米国特許出願公開第１２／８１７，１３４号（米国特許出願第２０１１／００１４６７２号）、実施例２９）。ＲＥＭ  Ｉ７＿１１株は、ｆｌｄＡ及びＩｓｐＧをいずれもコードしているプラスミドを保有しており、ｆｌｄＡ及びＩｓｐＧの遺伝子座がＢＬ２１ゲノム内に存在しているのに加え、染色体にコードされている、ＤＸＰ経路に関係する遺伝子ｄｘｓ及びｄｘｒの発現が上昇している。電気穿孔法により、Ｐｔａｃ  Ａｎａｂａｅｎａ  ｉｓｐＨ−Ｔ  ｅｌｏｎｇ  ｉｓｐＧ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｓｐＡ  ｔｅｒｍ／ｐＥＷＬ４５４プラスミドを、ＲＥＭ  Ｉ７＿１１株に導入した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ遺伝子パルサーシステムを用い、０．１ｃｍキュベットを使用して電気穿孔法を実施した（カタログ番号１６５−２０８９）。製造元の推奨するプロトコルに従い、形質転換を実施した。ＬＢ培地を用い、形質転換体を３７℃で１時間回復させた後、スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）、及びカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有させたＬＢ寒天培地プレートへと播種した。得られた株をＲＥＭ  Ｆ２＿１８と命名した。
【０１５５】
実施例３：ＲＥＭ  Ｆ２＿１８の大規模発酵により８．４ｇ／Ｌイソプレン力価が生成される
ＤＸＰ経路及びイソプレン合成酵素を発現し、イソプレンを生産している大腸菌細胞を、次の試薬を用い、１５Ｌ規模のフェドバッチ培養で増殖させた。
【０１５６】
１０００Ｘ微量金属溶液（１Ｌあたり）：クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨ  ３．０に調整し、次に溶液を容量までメスアップし、孔径０．２２マイクロメートルのフィルタでろ過滅菌した。
【０１５７】
ビタミン溶液（１Ｌあたり）：塩酸チアミン（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、Ｄ−パントテン酸（４．８ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水にＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨ  ３．０に調整し、次に溶液を容量までメスアップし、０．２２マイクロメートル径のフィルタによりろ過滅菌した。
【０１５８】
マクロ塩溶液（１Ｌあたり）：ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、容量までメスアップし、孔径０．２２マイクロメートルのフィルタでろ過滅菌した。
【０１５９】
供給溶液（ｋｇあたり）：グルコース（０．５７ｋｇ）、脱イオン水（０．３８ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、及び１００％  Ｆｏａｍｂｌａｓｔ（１０ｇ）。すべての成分を共に混合し、オートクレーブ処理した。溶液を２５℃まで放冷させた後、マクロ塩溶液（１１．１ｍＬ）、１０００Ｘ微量金属溶液（１．６ｍＬ）、ビタミン溶液（１３．１ｍＬ）及び３５０ｇ／Ｌ酵母エキス溶液（０．２２マイクロメートル径フィルタによりろ過滅菌）（５．４ｍＬ）を加えた。
【０１６０】
リン酸溶液（１Ｌあたり）：ＫＨ２ＰＯ４（６８ｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（６８ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、容量までメスアップし、３０分オートクレーブ処理した。
【０１６１】
Ｆ２＿１８株を用い１５Ｌのバイオリアクタで発酵を実施した；大腸菌ＢＬ２１細胞は、ＤＸＰ経路の最初の２つの酵素（ＰＬ．６−ｄｘｓ及びＧＩ１．６−ｄｘｒ）、ＤＸＰ経路の最後の酵素（ＧＩ１．６−ｙＩＤＩ）、ＤＸＰ経路に含まれるその他の遺伝子（ＧＩ１．６−ｆｌｄＡ−ｉｓｐＧ／ｐＣＬ、ＰＴａｃ−Ａｎａｂａｅｎａ  ｉｓｐＨ−Ｔ．ｅｌｏｎｇ．ｇｃｐＥ−ｐｅｔＦ−ｐｅｔＨ  ａｓｐＡ  ｔｅｒｍ／ｐＥＷＬ４５４）、ＭＶＡ経路の下流（ＰＬ．２−ｍＫＫＤｙＩ）、ウラジロハコヤナギ由来のトランケート型イソプレン合成酵素（ｐＤＷ３３、米国特許出願公開第２０１１／００１４６７２号を参照されたい）、を過剰発現しており、かつ染色体ｐｇｌ遺伝子を復元させてあった（ｔ  ｙｂｇＳ：：Ｋａｎ又はｔ  ｙｂｇＳ：：ｆｒｔ）。この試験はｐＨ  ７．０、３４℃で実施した。トランケート型イソプレン合成酵素は、米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号にも記載されている。
【０１６２】
大腸菌を凍結させたバイアル瓶から解凍し、バイオリアクタ用のトリプトン−酵母エキス培地に接種した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度が１．０になるまで培養物を増殖させた後、培養物のうち５００ｍＬを１５Ｌバイオリアクタに接種し、初期槽容量を５Ｌにメスアップした。発酵のもととなるフラスコ及び発酵槽には、抗生物質のスペクチノマイシン及びカナマイシンをそれぞれ各５０ｕｇ／ｍＬ濃度で含有させた。
【０１６３】
バッチに含まれるグルコースが枯渇したら、０．３５ｇ／ｍｉｎでグルコース教区湯溶液の供給を始め、供給速度が２．７２ｇ／ｍｉｎに達するまで、供給速度を対数的に上昇させてグルコースの供給を行った。その後直ちに直線傾斜に切り替え発酵中供給を行った。６８時間の時点で供給速度は４．２２５ｇ／ｍｉｎ似まで上昇していた。６８時間におよぶ発酵中にバイオリアクタに供給したグルコースの総量は３．５ｋｇであった。
【０１６４】
二酸化炭素放出速度（ＣＥＲ）５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈにて、上記のリン酸溶液の供給を０．２１ｇ／ｍｉｎで開始し、供給開始から１６時間後に０．１１ｇ／ｍｉｎに低下させ、残りの発酵時間中この速度で供給を続けた。
【０１６５】
イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の１０ｍｇ／ｍＬ原液を用い誘導を実施した。開始時点で３ｍＬを添加した（２５ｕＭ）。以降、二酸化炭素放出速度（ＣＥＲ）が２５ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ（３ｍＬ）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ（６ｍＬ）、１００ｍｍｏｌ／Ｌｈ（６ｍＬ）、及び１５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ（３ｍＬ）になった時点で更に添加した。
【０１６６】
Ｈｉｄｅｎ質量分析計（Ｌｉｖｏｎｉａ、（Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＵＳＡ））を用い、バイオリアクタの放出ガス中のイソプレン濃度を測定した。装置の較正は、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｇａｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ（Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ））より供給されるイソプレン較正標準を用い行った。発酵過程にわたりイソプレン力価は増加し、６８時間で最大値８．４ｇ／Ｌに増加した（図２及び４）。
【０１６７】
イソプレン力価を算出するための等式：
∫（瞬間イソプレン生産速度（ｇ／Ｌ／ｈｒ））ｄｔ、ｔ＝０〜６８時間［＝］ｇ／Ｌ発酵液
プラスミドＰｔａｃ  Ａｎａｂａｅｎａ  ｉｓｐＨ−Ｔ  ｅｌｏｎｇ  ｉｓｐＧ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｓｐＡ  ｔｅｒｍ／ｐＥＷＬ４５４の配列
ｃｇａｔａａｇｃｔａｇｃｔｔｃａｃｇｃｔｇｃｃｇｃａａｇｃａｃｔｃａｇｇｇｃｇｃａａｇｇｇｃｔｇｃｔａａａｇｇａａｇｃｇｇａａｃａｃｇｔａｇａａａｇｃｃａｇｔｃｃｇｃａｇａａａｃｇｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｇｇａｔｇａａｔｇｔｃａｇｃｔａｃｔｇｇｇｃｔａｔｃｔｇｇａｃａａｇｇｇａａａａｃｇｃａａｇｃｇｃａａａｇａｇａａａｇｃａｇｇｔａｇｃｔｔｇｃａｇｔｇｇｇｃｔｔａｃａｔｇｇｃｇａｔａｇｃｔａｇａｃｔｇｇｇｃｇｇｔｔｔｔａｔｇｇａｃａｇｃａａｇｃｇａａｃｃｇｇａａｔｔｇｃｃａｇｃｔｇｇｇｇｃｇｃｃｃｔｃｔｇｇｔａａｇｇｔｔｇｇｇａａｇｃｃｃｔｇｃａａａｇｔａａａｃｔｇｇａｔｇｇｃｔｔｔｃｔｔｇｃｃｇｃｃａａｇｇａｔｃｔｇａｔｇｇｃｇｃａｇｇｇｇａｔｃａａｇａｔｃｔｇａｔｃａａｇａｇａｃａｇｇａｔｇａｇｇａｔｃｇｔｔｔｃｇｃａｔｇａｔｔｇａａｃａａｇａｔｇｇａｔｔｇｃａｃｇｃａｇｇｔｔｃｔｃｃｇｇｃｃｇｃｔｔｇｇｇｔｇｇａｇａｇｇｃｔａｔｔｃｇｇｃｔａｔｇａｃｔｇｇｇｃａｃａａｃａｇａｃａａｔｃｇｇｃｔｇｃｔｃｔｇａｔｇｃｃｇｃｃｇｔｇｔｔｃｃｇｇｃｔｇｔｃａｇｃｇｃａｇｇｇｇｃｇｃｃｃｇｇｔｔｃｔｔｔｔｔｇｔｃａａｇａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｃｇｇｔｇｃｃｃｔｇａａｔｇａａｃｔｃｃａａｇａｃｇａｇｇｃａｇｃｇｃｇｇｃｔａｔｃｇｔｇｇｃｔｇｇｃｃａｃｇａｃｇｇｇｃｇｔｔｃｃｔｔｇｃｇｃａｇｃｔｇｔｇｃｔｃｇａｃｇｔｔｇｔｃａｃｔｇａａｇｃｇｇｇａａｇｇｇａｃｔｇｇｃｔｇｃｔａｔｔｇｇｇｃｇａａｇｔｇｃｃｇｇｇｇｃａｇｇａｔｃｔｃｃｔｇｔｃａｔｃｔｃａｃｃｔｔｇｃｔｃｃｔｇｃｃｇａｇａａａｇｔａｔｃｃａｔｃａｔｇｇｃｔｇａｔｇｃａａｔｇｃｇｇｃｇｇｃｔｇｃａｔａｃｇｃｔｔｇａｔｃｃｇｇｃｔａｃｃｔｇｃｃｃａｔｔｃｇａｃｃａｃｃａａｇｃｇａａａｃａｔｃｇｃａｔｃｇａｇｃｇａｇｃａｃｇｔａｃｔｃｇｇａｔｇｇａａｇｃｃｇｇｔｃｔｔｇｔｃｇａｔｃａｇｇａｔｇａｔｃｔｇｇａｃｇａａｇａｇｃａｔｃａｇｇｇｇｃｔｃｇｃｇｃｃａｇｃｃｇａａｃｔｇｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｔｃａａｇｇｃｇｃｇｇａｔｇｃｃｃｇａｃｇｇｃｇａｇｇａｔｃｔｃｇｔｃｇｔｇａｃｃｃａｔｇｇｃｇａｔｇｃｃｔｇｃｔｔｇｃｃｇａａｔａｔｃａｔｇｇｔｇｇａａａａｔｇｇｃｃｇｃｔｔｔｔｃｔｇｇａｔｔｃａｔｃｇａｃｔｇｔｇｇｃｃｇｇｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｃｇｇａｃｃｇｃｔａｔｃａｇｇａｃａｔａｇｃｇｔｔｇｇｃｔａｃｃｃｇｔｇａｔａｔｔｇｃｔｇａａｇａｇｃｔｔｇｇｃｇｇｃｇａａｔｇｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｔｇｃｔｔｔａｃｇｇｔａｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｃｇａｔｔｃｇｃａｇｃｇｃａｔｃｇｃｃｔｔｃｔａｔｃｇｃｃｔｔｃｔｔｇａｃｇａｇｔｔｃｔｔｃｔｇａｇｃｇｇｇａｃｔｃｔｇｇｇｇｔｔｃｇｇａｔｇａｔａａｇｃｔｇｔｃａａａｃａｔｇａｇａａｔｔａｃａａｃｔｔａｔａｔｃｇｔａｔｇｇｇｇｃｔｇａｃｔｔｃａｇｇｔｇｃｔａｃａｔｔｔｇａａｇａｇａｔａａａｔｔｇｃａｃｔｇａａａｔｃｔａｇａａａｔａｔｔｔｔａｔｃｔｇａｔｔａａｔａａｇａｔｇａｔｃｔｔｃｔｔｇａｇａｔｃｇｔｔｔｔｇｇｔｃｔｇｃｇｃｇｔａａｔｃｔｃｔｔｇｃｔｃｔｇａａａａｃｇａａａａａａｃｃｇｃｃｔｔｇｃａｇｇｇｃｇｇｔｔｔｔｔｃｇａａｇｇｔｔｃｔｃｔｇａｇｃｔａｃｃａａｃｔｃｔｔｔｇａａｃｃｇａｇｇｔａａｃｔｇｇｃｔｔｇｇａｇｇａｇｃｇｃａｇｔｃａｃｃａａａａｃｔｔｇｔｃｃｔｔｔｃａｇｔｔｔａｇｃｃｔｔａａｃｃｇｇｃｇｃａｔｇａｃｔｔｃａａｇａｃｔａａｃｔｃｃｔｃｔａａａｔｃａａｔｔａｃｃａｇｔｇｇｃｔｇｃｔｇｃｃａｇｔｇｇｔｇｃｔｔｔｔｇｃａｔｇｔｃｔｔｔｃｃｇｇｇｔｔｇｇａｃｔｃａａｇａｃｇａｔａｇｔｔａｃｃｇｇａｔａａｇｇｃｇｃａｇｃｇｇｔｃｇｇａｃｔｇａａｃｇｇｇｇｇｇｔｔｃｇｔｇｃａｔａｃａｇｔｃｃａｇｃｔｔｇｇａｇｃｇａａｃｔｇｃｃｔａｃｃｃｇｇａａｃｔｇａｇｔｇｔｃａｇｇｃｇｔｇｇａａｔｇａｇａｃａａａｃｇｃｇｇｃｃａｔａａｃａｇｃｇｇａａｔｇａｃａｃｃｇｇｔａａａｃｃｇａａａｇｇｃａｇｇａａｃａｇｇａｇａｇｃｇｃａｃｇａｇｇｇａｇｃｃｇｃｃａｇｇｇｇｇａａａｃｇｃｃｔｇｇｔａｔｃｔｔｔａｔａｇｔｃｃｔｇｔｃｇｇｇｔｔｔｃｇｃｃａｃｃａｃｔｇａｔｔｔｇａｇｃｇｔｃａｇａｔｔｔｃｇｔｇａｔｇｃｔｔｇｔｃａｇｇｇｇｇｇｃｇｇａｇｃｃｔａｔｇｇａａａａａｃｇｇｃｔｔｔｇｃｃｔｃｃｔｇｃｇｔｔａｔｃｃｃｃｔｇａｔｔｃｔｇｔｇｇａｔａａｃｃｇｔａｔｔａｃｃｇｃｃｔｔｔｇａｇｔｇａｇｃｔｇａｔａｃｃｇｃｔｃｇｃｃｇｃａｇｃｃｇａａｃｇａｃｃｇａｇｃｇｃａｇｃｇａｇｔｃａｇｔｇａｇｃｇａｇｇａａｇｃｇｇａａｇａｇｃｇｃｃｃａａｔａｃｇｃａａａｃｃｇｃｃｔｃｔｃｃｃｃｇｃｇｃｇｔｔｇｇｃｃｇａｔｔｃａｔｔａａｔｇｃａｇｃｔｇｇｃａｃｇａｃａｇｇｔｔｔｃｃｃｇａｃｔｇｇａａａｇｇａａｔｔｃｔｇｔｔｇａｃａａｔｔａａｔｃａｔｃｇｇｃｔｃｇｔａｔａａｔｇｔｇｔｇｇａａｔｔｇｔｇａｇｃｇｇａｔａａｃａａｔｔｔｃａｃａｃａｇｇａａａｃａｇａｔｔａｃｇｇａｔｃｃｃｔｇｇａｇｔｔｔａａａｃａｔａｔｇｇａｔａｃｔａａａａｃｃｔｔｔａａａｃｇｔａｃｇｔｔｇｃａａｃａｃｔｃｃｇａａａａｃｔａｃａａｔｃｇｇａａａｇｇｇｔｔｃｇｇｔｃａｔｃａｇｇｃｇｇａｇｇｔｔｇｃａａｃｔｃａａｃｔｇｃａａｔｃａｇａａｔａｔｃａｇａｇｔｔｃｔｔｔｇａｔｔｃａｇｇａａａｔｃｃｇｃｇａｔｃｇｃａａｃｔａｃａｃｔｃｔｔｃａａｃｇｔｇｇｇｇａｔｇｔｃａｃｇａｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｃａｇｇｃａｔｔｔｇｇｃｔｔｃｔｇｃｔｇｇｇｇｔｇｔｔｇａａｃｇｔｇｃｇｇｔｃｇｃｇａｔｇｇｃｔｔａｔｇａｇａｃｃｃｇｇａａｇｃａｔｔｔｔｃｃａａｃｔｇａａｃｇｃａｔｃｔｇｇａｔｔａｃｃａａｃｇａａａｔｃａｔｔｃａｃａａｔｃｃｇａｇｃｇｔｃａａｃｃａｇｃｇｇａｔｇｃａｇｇａａａｔｇｃａａｇｔｇｇｇｃｔｔｔａｔａｃｃａｇｔａｇａｇｇｃｇｇｇｃａａｃａａｇｇａｔｔｔｔａｇｃｇｔａｇｔｃｇｇｃａａｔａａｔｇａｃｇｔｃｇｔｔａｔｃｃｔｇｃｃａｇｃｃｔｔｔｇｇｃｇｃｔｔｃｔｇｔｇｃａａｇａｇａｔｇｃａｇｃｔｔｔｔａｔｃｔｇａａａａａｇｇａｔｇｔａａａａｔａｇｔｔｇａｔａｃｃａｃａｔｇｔｃｃｇｔｇｇｇｔａｔｃａａａａｇｔｃｔｇｇａａｔａｃｃｇｔｇｇａａａａｇｃａｔａａａａａｇｇｇｇｇａｔｃａｔａｃｃｔｃｔａｔａａｔａｃａｔｇｇｃａａａｔａｔａａａｃａｃｇａａｇａａａｃｇａｔｔｇｃｃａｃａａｇｔｔｃｃｔｔｃｇｃｇｇｇｔａａａｔａｔｃｔｃａｔｃｇｔｃｃｔｔａａｃｃｔｔａａｇｇａａｇｃａｃａａｔａｃｇｔｔｇｃｔｇａｃｔａｃａｔｔｃｔｇｃａｔｇｇｇｇｇｔａａｔｃｇｔｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔａｃａｇａａａｔｔｔｇｃａａａａｇｃａｔｇｃｔｃｇｇｃｇｇｇｃｔｔｔｇａｃｃｃｃｇａｔａｇａｇａｔｃｔｔｇａａａｇａｇｔｔｇｇｃａｔｔｇｃｃａａｔｃａｇａｃａａｃａａｔｇｔｔｇａａａｇｇａｇａｇａｃｃｇａａｃａｇａｔｃｇｇｔａａａｃｔｔｔｔｔｇａａｃａｔａｃｃａｔｇｃｔｇｃａａａａａｔａｃｇｇａｃｃｃｇｔｇｇａｇｔｔａａａｔｃａａｃａｔｔｔｔｃａｇｔｃｃｔｔｃａａｔａｃａａｔｔｔｇｃｇａｃｇｃｔａｃｃｃａｇｇａａｃｇｇｃａｇｇａｃｇｃｃａｔｇｃｔｇｇａｇｃｔｇｇｔａｃａａｇａａａａｔｔｔｇｇａｃｃｔｃａｔｇａｔｃｇｔｇａｔｃｇｇａｇｇｔｔｔｔａａｔｔｃｔｔｃｃａａｃａｃａａｃａｃａｇｃｔｃｃａａｃａｇａｔｔａｇｃｃａｇｇａａｃｇｇｇｇｔｃｔｇｃｃｇｔｃｃｔａｔｃａｔａｔｔｇａｔｇｔａｇｔｔｇａｇｃｇｔａｔｔａａａａｇｃａｔａａａｃｔｃｇａｔａｇａｇｃａｃｃｇｇｃａｇｔｔａａａｃｇｇａｇａｇｔｔｇｇｔｃａｃｔａｃｇｇａａａａｔｔｇｇｃｔｇｃｃｔｇｃｇｇｇｃａａａａｔｔｇｔｃｇｔａｇｇｔｇｔａａｃａａｇｔｇｇｃｇｃｇａｇｔａｃａｃｃａｇａｔａａｇｇｔｇｇｔｔｇａａｇａｃｇｔｇａｔｃｇａａａａｇａｔｃｔｔｔｇｃｇｃｔｔａａａｇｃａａｃａｇｃｇｇｃｃｇｔｃｔｔｔｔａａｃｃｃｇａｔｃｃａｔｔｔｇａｇｇａｇｔａａｇｃｃａｔｇｃａａａｃｇｔｔｇｃｃａａｇｃｃｃａｇｔｔｃａａｇｃｔａｃａｃｃａａｃｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｔｇｔｔａｇａｃｇｃａａａａｃｃｃｇｃｃｃｇｇｔｔｃｃｇａｔａｇｇｃｔｃｃｇｔｔｇｔｔａｔｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｃａｔｃｃｃｇｔｇｇｃｔｇｔｔｃａｇｔｃａａｔｇａｔｔａａｃｇａａｇａｃａｃｔｃｔｇｇａｔａｔｃｇａａｇｇｔｔｃｔｇｔｔｇｃｔｇｃａａｔｔｃｇｇｃｇｃｔｔａｃａｃｇａｇａｔｃｇｇｔｔｇｃｇａｇａｔｃｇｔａｃｇｔｇｔｇａｃｔｇｔａｃｃｔｔｃａｔｔａｇｃａｃａｃｇｃｇａａａｇｃａａｔｇｇａａｇａｇａｔｔｃｇｇｇａｔｃｇｇｃｔｔｔａｔａａａａｃｇｔａｃａａａｃｃｇｇｔｃｃｃｃｔｔａｇｔｔｇｃｃｇａｃｇｔｇｃａｔｃａｔａａｃｇｇａａｔｇａａａａｔｃｇｃｇｔｔａｇａｇｇｔｔｇｃｃａａｇｔａｃｇｔｇｇａｃａａｔｇｔｇｃｇｃａｔｔａａｔｃｃｔｇｇａｔｔａｔａｃｇｔｇｔｔｔｇａｇａａｇｃｃａａａａｃｃａａａｔｃｇｃａｃｇｇａｇｔａｃａｃｔｃａａｇｃｔｇａａｔｔｔｇａｃｇａｇａｔｔｇｇｃｇｃｇａａａａｔｃｃｇｔｇａａａｃｇｔｔｇｇａａｃｃａｃｔｇｇｔａａｔｔｔｃａｃｔｇｃｇｇｇａｔｃａｇｇｇａａａｇｔｃｇａｔｇｃｇｃａｔｔｇｇｃｇｔｔａａｔｃａｔｇｇｃａｇｔｃｔｇｇｃｇｇａａｃｇｇａｔｇｃｔｇｔｔｔａｃｃｔａｔｇｇｃｇａｔａｃｃｃｃａｇａｇｇｇｔａｔｇｇｔａｇａｇａｇｔｇｃａｃｔｔｇａｇｔｔｔａｔａｃｇｃａｔｃｔｇｔｇａａａｇｔｃｔｃａａｃｔｔｃｔａｔａａｃｔｔａｇａａａｔｔｔｃｃｃｔｔａａａｇｃｔａｇｃｃｇｃｇｔｃｃｃｇｇｔｔａｔｇａｔａｇｃｃｇｃｃａａｔｃｇｇｃｔｔａｔｇｇｔｔａａｇｃｇｃａｔｇｇａｃｇａｇｃｔｇｇｇｔａｔｇｇａｔｔａｔｃｃｇｔｔｇｃａｔｃｔｃｇｇａｇｔｇａｃｔｇａｇｇｃａｇｇｔｇａｔｇｇｔｇａａｔａｔｇｇｃｃｇｔａｔｔａａａａｇｃａｃａｇｃａｇｇｃａｔｔｇｃａａｃａｃｔｇｃｔｇｇｃｇｇａａｇｇａａｔｔｇｇａｇａｃａｃａａｔｃｃｇｔｇｔｔｔｃａｔｔｇａｃｔｇａａｇｃｔｃｃｇｇａａａａｇｇａａａｔｃｃｃｃｇｔｇｔｇｃｔａｔｇｇｃａｔｃｃｔｔｃａａｇｃｃｃｔｃｇｇｔｃｔｃｃｇｃｃｇｃａｃｃａｔｇｇｔａｇａａｔａｔｇｔａｇｃｔｔｇｃｃｃｇｔｃｇｔｇｔｇｇｔｃｇｇａｃａｔｔｇｔｔｔａａｃｃｔｇｇａａｇａｇｇｔｔｃｔｇｃａｃａａｇｇｔｇａｇａｇａａｇｃｇａｃｔａａａｃａｃｃｔｇａｃｇｇｇａｃｔｇａａｔａｔｔｇｃｇｇｔｔａｔｇｇｇａｔｇｔａｔｔｇｔａａａｔｇｇａｃｃｔｇｇｃｇａａａｔｇｇｃｃｇａｔｇｃａｇａｃｔａｃｇｇｃｔａｔｇｔａｇｇｔａａａｃａｇｃｃｇｇｇａｔａｔａｔａａｇｔｃｔｔｔａｃｃｇｃｇｇｃｃｇｇｇａａｇａａｇｔｃａａｇａａａｇｔｇｃｃｃｇａｇｇｃｃｇａｇｇｇｃｇｔｔｇｃａｇｃｔｃｔｇｇｔｃｇａａｃｔｇａｔａａａａｇｃｇｇａｔｇｇｔａｇａｔｇｇｇｔａｇａｔｃｃａｔａａｇｔｇｇａｇｃｔｃｃｃｃｇｇｔａｃｃｇｔｇｇａｃｇａｇｇｔｔｔａａｔａｔｇｇｃｇａｃｇｔａｔａａａｇｔｃａｃａｃｔｇｇｔｃｃｇｔｃｃｇｇａｔｇｇｃａｇｃｇａａａｃｇａｃｃａｔｃｇａｔｇｔｔｃｃｇｇａｇｇａｃｇａａｔａｃａｔａｃｔｇｇａｔｇｔｃｇｃｃｇａａｇａａｃａａｇｇｔｃｔｇｇａｔｃｔｃｃｃｇｔｔｔｔｃｔｔｇｔｃｇｃｇｃｃｇｇｔｇｃｃｔｇｃｔｃｔａｃｃｔｇｔｇｃｔｇｇｃａａａｔｔｇｔｔｇｇａｇｇｇａｇａａｇｔｃｇａｔｃａａａｇｃｇａｃｃａｇａｇｃｔｔｃｔｔｇｇａｔｇａｃｇａｔｃａｇａｔｃｇａａａａａｇｇａｔｔｃｇｔｇｃｔｔａｃｔｔｇｔｇｔｇｇｃｃｔａｃｃｃｃｃｇｔｔｃｇｇａｃｔｇｃａａｇａｔｃｔｔｇａｃｇａａｃｃａａｇａｇｇａｇｇａｇｃｔｇｔａｃｔａａｇａｇｇｔｃｇａｃｇａｃｇｃａｔｇｃａｔｔａａｃａｇａｇｇｔｔａｇｔａｔｇｔａｔａａｔｇｃｃａｃｔａａｃｔｃｔｃｇｃｔｃａｃｇｔａｔｇｔｔｃｃｇｇｔａｃｇａａｇｔｔｇｔｇｇｇｇｃｔｇｃｇｃｃａａａｃｇｇｃｇｇａｇａｃｇｇａｇａａａａｃａａａｔｔａｃｇｃｇａｔｃａｇａａａｃｔｃｔｇｇｃｔｃｇｃａｇｔｔｃｔｔｔａａｔｇｔｇｃｃｔｔａｔｇａｃｃｇｃａｔｇａａｃｃａｇ
ｔｔｔａｔｇｃａｇｃａｇａｔｃａｃｔｃｇｇｔｇｇｇｇｃｇｇｔａａａａｔｔｇｔｃａｇｔａｔｔｃａｇｃｃｃｃｔｔａａｃｇｇａａｃｃｇｔｇｇｃｃｃｃａｃｔｔｇｃｔｇｃａａｃｃａｃｇｇａｇｃｃａｇｃｔｇｃｃａａｔａａｃｇｇａｇｃｔｇｃａｃｃｔｇｔｇａａａｇａａａａｇａａａｇｔｃｇａｔａｔａｃｃｇｇｔｃａａｃａｔｃｔａｃｃｇｔｃｃｃａａｔａａｔｃｃｃｔｇｃａｔａｇｇｔａａｇｇｔｔａｔｔａｇｃａａｃｇａｇｇａａｃｔｇｇｔｃｃｇｇｇａａｇｇｃｇｇｔｇａｇｇｇｔａｃｇｇｔｇａａａｃａｔａｔｔａｔｃｔｔｔｇａｔａｔａｔｃｇｇｇｇａｃｃｇａａｔｔａｃｇｔｔａｃｔｔｇｇａａｇｇｇｃａｇｔｃａａｔｃｇｇｔａｔｃａｔｔｃｃｃｇｃｇｇｇｃａｃｇｇａｃｇｃｇａａｃｇｇｔａａａｃｃａｃａｔａａｇｃｔｇｃｇｔｃｔｇｔａｔｔｃｃａｔｔｇｃｔｔｃｃａｃａａｇａｃａｔｇｇｔｇａｃｔｔｔｃａｇｇａｔｇａｃａａｇａｃｇｇｔｇｔｃｃｔｔａｔｇｃｇｔａｃｇｇａｇａｔｔａｇａａｔａｃａａａｇａｔａａａｇａｇａｃｃｇｇｇｇａｇａｃｃａｔｔｔａｔｇｇｃｇｔｇｔｇｃａｇｔｔｃｇｔａｔｃｔｔａａｔｃａｇｔｔａｃａｇｃｃｔｇｇａｇａｔｇａａｇｔｃａａａａｔｃａｃａｇｇｔｃｃｔｇｔｔｇｇｇａａａｇａａａｔｇｃｔｔｃｔｃｔｃｔｇａｃｇａｃｃｃａｇａａｇｃｇａｃｔａｔｔａｔｔａｔｇｃｔｇｇｃｔａｃｃｇｇｃａｃｔｇｇａａｔａｇｃｇｃｃａｔｔｔｃｇｇｇｃａｔｔｔｔｔａｔｇｇｃｇｇａｔｇｔｔｃａａａｇａｇａａｃａａｃｃｃｇｇａｔｔａｃｃａｇｔｔｃａａａｇｇｃｃｔｔｇｃｇｔｇｇｃｔｇｔｔｃｔｔｔｇｇｃｇｔｃｇｃｔｔａｔａｃｔｇｃｃａａｔａｔｃｃｔｇｔａｔａａｇｇａｃｇａｇｃｔｔｇａａｇｃｔａｔｃｃａａｇｃｃｃａｇｔａｔｃｃｃｇａｔｃａｔｔｔｔｃｇｇｔｔａａｃｃｔａｃｇｃｇａｔｔｔｃｃｃｇｔｇａａｃａａａａａａｃｃｃｃｇｇａｃｇｇａｇｇｇａａａａｔｇｔａｃａｔｃｃａｇｇｇｔｃｇｇａｔｃｇｃａｇａｇｃａｃｇｃｔｇａｔｇａａａｔｃｔｇｇｃａａｃｔｇｃｔｇｃａａａａｇａａａａａｃａｃｃｃａｃｇｔｇｔａｃａｔｇｔｇｔｇｇｃｃｔｇｃｇｔｇｇｇａｔｇｇａａｃｃｔｇｇａａｔａｇａｃｇａｇｇｃｃａｔｇａｃｃｇｃａｇｃｇｇｃｃｇｃｇａａａａａｃｇｇａｇｃｔｇａｃｔｇｇｃａｇｇａｇｔｔｔｃｔｇａａａｇｇｔａｃｇｃｔｇａａａａａｇｇａａｇｇｃａｇａｔｇｇｃａｔｇｔｃｇａａａｃｔｔａｔｔａａｃｔｇｃａｇｔａｃａａａｔａａａａａａｇｇｃａｃｇｔｃａｇａｔｇａｃｇｔｇｃｃｔｔｔｔｔｔｃｔｔｇａａｇｃｔｔｇｇｃａｃｔｇｇｃｃｇｔｃｇｔｔｔｔａｃａａｃｇｔｃｇｔｇａｃｔｇｇｇａａａａｃｃｃｔｇｇｃｇｔｔａｃｃｃａａｃｔｔａａｔｃｇｃｃｔｔｇｃａｇｃａｃａｔｃｃｃｃｃｔｔｔｃｇｃｃａｇｃｔｇｇｃｇｔａａｔａｇｃｇａａｇａｇｇｃｃｃｇｃａｃｃｇａｔｃｇｃｃｃｔｔｃｃｃａａｃａｇｔｔｇｃｇｃａｇｃｃｔｇａａｔｇｇｃｇａａｔｇｇｃｇ
実施例４：ＲＥＭ  Ｈ８＿１２の大規模発酵
大腸菌ＩｓｐＧ系をコードしているプラスミド（ＧＩ１．６−ｆｌｄＡ−ｉｓｐＧ／ｐＣＬ）をＴ．エロンガタスＩｓｐＧ系をコードしているプラスミド（ＰＴａｃ−ｇｃｐＥ−ｐｅｔＦ−ｐｅｔＨ／ｐＫ１８５）を組み合わせてＤＸＰ宿主株に導入する。比較可能な発酵工程を用い、１４Ｌスケールでのイソプレン生産に関し、大腸菌ＩｓｐＧ系のみを含有するＲＥＭ  Ｈ８＿１２株（対照）との比較を行う。理論に束縛されるものではないが、ＩｓｐＧ活性が対照株よりも増加し、ＩｓｐＨ活性には制限がかからなかった場合、大腸菌及びＴ．エロンガタスのＩｓｐＧ系を組み合わせた株により生産されるイソプレン力価は高くなる。
【０１６８】
対照株と同様の抗生物質耐性遺伝子を維持させ、かつ対照と匹敵する遺伝子コピー数を保持させつつ、更に、この特定のバックグラウンドで発現させる異種ＩｓｐＨ酵素を収容させるために、標準的な分子生物学的手法により、適切な発現コンストラクトを生成する。Ｔ．エロンガタスのＩｓｐＧ系をコードしている遺伝子を、追加の異種ＩｓｐＨ酵素をコードしている遺伝子を組み合わせ、ｐＫ１８４ベクター誘導体のｐＥＷＬ４５４に保有されているオペロンに導入する。この操作により、カナマイシン耐性のベクターコンストラクトＰＴａｃ−Ａｎａｂａｅｎａ  ｉｓｐＨ−Ｔ．ｅｌｏｎｇ  ＩｓｐＧ  ｓｙｓｔｅｍ／ｐＥＷＬ４５４が得られる。
【０１６９】
関連する試験株のＲＥＭ  Ｆ２＿１８は、次の遺伝子型を有する：ＢＬ２１  ｐｇｌ＋ＰＬ．２−ｌｏｗｅｒ  ＭＶＡ  ｐａｔｈｗａｙ  ＧＩ１．６−ｙＩＤＩ  ＰＬ．６−ｄｘｓ  ＧＩ１．６−ｄｘｒ＋ＧＩ１．６−ｆｌｄＡ−ｉｓｐＧ／ｐＣＬ（Ｓｐｅｃ  ５０）＋ＰＴａｃ−Ａｎａｂａｅｎａ  ｉｓｐＨ−Ｔ．ｅｌｏｎｇ  ＩｓｐＧ  ｓｙｓｔｅｍ／ｐＥＷＬ４５４（Ｋａｎ  ５０）＋ＰＴｒｃ−ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ａｌｂａ  ＩｓｐＳ／ｐＴｒｃ  Ｈｉｓ（Ｃａｒｂ  ５０）。対照株は、次の遺伝子型を有する：ＢＬ２１  ｐｇｌ＋ＰＬ．２−ｌｏｗｅｒ  ＭＶＡ  ｐａｔｈｗａｙ  ＧＩ１．６−ｙＩＤＩ  ＰＬ．６−ｄｘｓ  ＧＩ１．６−ｄｘｒ＋ＧＩ１．６−ｆｌｄＡ−ｉｓｐＧ／ｐＣＬ（Ｓｐｅｃ  ５０）＋ＰＴａｃ  Ａｎａｂａｅｎａ  ｉｓｐＨ／ｐＫ１８４（Ｋａｎ  ５０）＋ＰＴｒｃ−ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ａｌｂａ  ＩｓｐＳ／ｐＴｒｃ  Ｈｉｓ（Ｃａｒｂ  ５０）。
【０１７０】
実施例５：インビボ活性を増加させるためのＩｓｐＧ発現レベルの変更
大腸菌のＩｓｐＧ系の発現性を、既存の大腸菌ＩｓｐＧ系のイソプレン生産株（対照）の発現性よりも増加させる。２つの株を、イソプレンの生産性について比較する。理論に束縛されるものではないが、対照株と比較してＩｓｐＧ活性が増加し、ＩｓｐＨ活性に制限がかからなかった場合、大腸菌ＩｓｐＧ系株のもつイソプレン力価よりもイソプレン力価が高くなる。
【０１７１】
大腸菌ＩｓｐＧ系の発現を増大させる目的で、分子生物学的手法を用い、系の発現レベルを制御するプロモーター強度を増強することによるか（例えば、既存の常時高発現型ＧＩ１．６プロモーターを、より強力な常時発現型ＰＬ．６プロモーターに変更する）、あるいは既存の大腸菌ＩｓｐＧ系を高コピーベクター（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−５ベクター：ゲンタマイシン耐性遺伝子をコードしており、ＤＸＰ経路増強株に必要とされる他のベクターと適合する）に移すことによるかのいずれかにより、ｃｕｒｒｅｎｔベクターコンストラクト（ｐＣＬ系ベクター）からの大腸菌ＩｓｐＧ系の発現を増大させる。
【０１７２】
プロモーター強度を増加させた関連試験株は、次の遺伝子型を有する：ＢＬ２１  ｐｇｌ＋ＰＬ．２−ｌｏｗｅｒ  ＭＶＡ  ｐａｔｈｗａｙ  ＧＩ１．６−ｙＩＤＩ  ＰＬ．６−ｄｘｓ  ＧＩ１．６−ｄｘｒ＋ＰＬ．６−ｆｌｄＡ−ｉｓｐＧ／ｐＣＬ（Ｓｐｅｃ  ５０）＋ＰＴａｃ  Ａｎａｂａｅｎａ  ｉｓｐＨ／ｐＫ１８４（Ｋａｎ  ５０）＋ＰＴｒｃ−ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ａｌｂａ  ＩｓｐＳ／ｐＴｒｃ  Ｈｉｓ（Ｃａｒｂ  ５０）。ベクターコピー数を増加させた関連試験株は、次の遺伝子型を有する：ＢＬ２１  ｐｇｌ＋ＰＬ．２−ｌｏｗｅｒ  ＭＶＡ  ｐａｔｈｗａｙ  ＧＩ１．６−ｙ  ＩＤＩ  ＰＬ．６−ｄｘｓ  ＧＩ１．６−ｄｘｒ＋ＧＩ．６−ｆｌｄＡ−ｉｓｐＧ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−５（Ｇｅｎｔ  １０）＋ＰＴａｃ  Ａｎａｂａｅｎａ  ｉｓｐＨ／ｐＫ１８４（Ｋａｎ  ５０）＋ＰＴｒｃ−ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ａｌｂａ  ＩｓｐＳ／ｐＴｒｃ  Ｈｉｓ（Ｃａｒｂ  ５０）。ベクターコピー数を更に増加させた関連試験株（案）は、次の遺伝子型を有する：ＢＬ２１  ｐｇｌ＋ＰＬ．２−ｌｏｗｅｒ  ＭＶＡ  ｐａｔｈｗａｙ  ＧＩ１．６−ｙＩＤＩ  ＰＬ．６−ｄｘｓ  ＧＩ１．６−ｄｘｒ＋ＧＩ．６−ｆｌｄＡ−ｉｓｐＧ／ｐＣＬ（Ｓｐｅｃ  ５０）＋ＧＩ．６−ｆｌｄＡ−ｉｓｐＧ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−５（Ｇｅｎｔ  １０）＋ＰＴａｃ  Ａｎａｂａｅｎａ  ｉｓｐＨ／ｐＫ１８４（Ｋａｎ  ５０）＋ＰＴｒｃ−ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ａｌｂａ  ＩｓｐＳ／ｐＴｒｃ  Ｈｉｓ（Ｃａｒｂ  ５０）。対照株は、次の遺伝子型を有する：ＢＬ２１  ｐｇｌ＋ＰＬ．２−ｌｏｗｅｒ  ＭＶＡ  ｐａｔｈｗａｙ  ＧＩ１．６−ｙｉｄｉ  ＰＬ．６−ｄｘｓ  ＧＩ１．６−ｄｘｒ＋ＧＩ１．６−ｆｌｄＡ−ｉｓｐＧ／ｐＣＬ（Ｓｐｅｃ  ５０）＋ＰＴａｃ  Ａｎａｂａｅｎａ  ｉｓｐＨ／ｐＫ１８４（Ｋａｎ  ５０）＋ＰＴｒｃ−ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ａｌｂａ  ＩｓｐＳ／ｐＴｒｃ  Ｈｉｓ（Ｃａｒｂ  ５０）。
【０１７３】
理論に束縛されるものではないが、ＩｓｐＨ活性は制限されるものではなく、すなわち上記のように、大腸菌ＩｓｐＧ系及びＴ．エロンガタスＩｓｐＧ系のイソプレン生産株で示されるＩｓｐＨ活性には制限は見られなかった。イソプレン生産の律速となるＩｓｐＨの活性強度の不足を測定し、ＩｐｓＧ活性に関し示される何らかの影響を解釈する際には、当業者であれば、上記の表現型を探し、生化学解析に使用するであろう。ＩｐｓＨ活性の制限を示す指標が存在しない場合、イソプレン生産は、ＩｓｐＧ活性が改良されたことを反映しているものと捉えられる。ＩｓｐＧの発現レベルを免疫ブロットにより測定し、測定された活性に関連する発現レベルを確認することができる。
【図１】
2014504497.tif 000004
【図２】
2014504497.tif 000005
【図３】
2014504497.tif 000006
【図４】
2014504497.tif 000007
【国際調査報告】
2014504497.tif 000008
2014504497.tif 000009