(57)【要約】  本発明は、アプタマーを同定する方法であって、オリゴヌクレオチドの混合物をアプタマー標的構造と接触させるとともに、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を標的構造に結合させる工程と、アプタマー標的構造に結合したオリゴヌクレオチドを、アプタマー標的構造及びアプタマー標的構造に結合していないオリゴヌクレオチドから分離する工程と、アプタマー標的構造に結合した個々のオリゴヌクレオチドを物理的に分離して増幅するとともに、各々が主に１つのオリゴヌクレオチド型を含有する複数の物理的に分離されたアンプリコンを生成する工程と、物理的に分離されたアンプリコンの複数に対して特異的なマーカーを、マーキングされた各々のアンプリコンがアンプリコンの指定されたマーカーを用いて独自に識別され得るように指定する工程と、複数のマーキングされたアンプリコンのオリゴヌクレオチドをシークエンシングするとともに、シークエンシングプロセスを用いて試験された各々のアンプリコンについて、アンプリコンに特異的なマーカーを、アンプリコンのオリゴヌクレオチド型の配列に割り当てる工程と、アプタマー標的構造に対するオリゴヌクレオチド型の結合特性を分析するとともに、分析された結合特性を、アンプリコンの特異的なマーカー及びオリゴヌクレオチド型の配列に割り当てる工程とを含む、方法に関する。【選択図】図１
2014532396.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アプタマーを同定する方法であって、
オリゴヌクレオチドの混合物をアプタマー標的構造と接触させるとともに、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を該標的構造に結合させる工程と、
前記アプタマー標的構造に結合したオリゴヌクレオチドを、該アプタマー標的構造及び該アプタマー標的構造に結合していないオリゴヌクレオチドから分離する工程と、
前記アプタマー標的構造に結合した個々のオリゴヌクレオチドを空間的に分離して増幅するとともに、各々が主に１つのオリゴヌクレオチド型を含有する幾つかの空間的に分離されたアンプリコンを生成する工程と、
前記空間的に分離されたアンプリコンの複数に対して特異的なマーカーを、マーキングされた各々のアンプリコンがその特異的なマーカーに基づいて明確に識別可能であるように生じさせる工程と、
複数のマーキングされたアンプリコンのオリゴヌクレオチドをシークエンシングするとともに、該アンプリコンに特異的なマーカーを、該アンプリコンの前記オリゴヌクレオチド型の配列に割り当てる工程と、
前記アプタマー標的構造に対するオリゴヌクレオチド型の結合特性を分析するとともに、分析された結合特性を、前記アンプリコンの特異的なマーカー及び前記オリゴヌクレオチド型の配列に割り当てる工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
空間的に分離された増幅がエマルション中での増幅、デジタル増幅又は固相上での増幅である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記特異的なマーカーが位置配置又は光学的に、分光学的に若しくは放射能により検出可能なマーカーである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
１つ又は複数の第１の支持体内又は支持体上の局所的に分離された領域に前記アンプリコンを配置する工程であって、特異的な位置マーカーを各々のアンプリコンに対して特異的なマーカーとして生じさせる、前記アンプリコンのアレイを得る、工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
空間的に分離された増幅の前、その間又はその後に前記オリゴヌクレオチドを固相粒子に結合させる工程であって、１つのオリゴヌクレオチド型を有する１つのアンプリコンのみが結合する固相粒子を得る、工程を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
１つのオリゴヌクレオチド型を有するアンプリコンが結合する前記固相粒子を、前記アプタマー標的構造と接触させる工程と、
固相粒子に結合する前記アンプリコンのオリゴヌクレオチドに対する前記アプタマー標的構造の陽性結合事象又は陰性結合事象を検出する工程と、
陽性結合事象を検出することができる固相粒子を選択する工程と、
を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
結合特性の分析について前記アンプリコンのアレイを前記アプタマー標的構造と接触させる、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第２の支持体内又は支持体上に前記アンプリコンのアレイのコピー又は誘導体を生成する工程であって、特異的な位置マーカーを特異的なマーカーとして前記コピー又は前記誘導体の各々のアンプリコンに割り当てる、工程と、
前記アレイのコピー又は誘導体を結合特性の分析について前記アプタマー標的構造と接触させる工程と、
を含む、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の支持体が前記アンプリコンのオリゴヌクレオチドに対する結合アダプター、又は前記アンプリコンのオリゴヌクレオチドに対する結合特性を有し、前記コピーを、前記アンプリコンのヌクレオチドを前記結合アダプター又は結合特性によって前記支持体に結合させることによって生成する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
各々のオリゴヌクレオチドについて、他のオリゴヌクレオチドの増幅因子領域から分離された少なくとも１つの空間的に制限された増幅因子領域を設ける工程であって、前記結合アダプター又は結合特性を備える前記第２の支持体の表面が前記増幅因子領域に隣接する、工程と、
前記オリゴヌクレオチドを前記増幅因子領域内の増幅因子によって増幅する工程であって、該オリゴヌクレオチドのアンプリコンを生成する、工程と、
前記アンプリコンの一本鎖又は誘導体を前記結合アダプター又は結合特性によって前記第２の支持体に結合する工程であって、第２の支持体上の前記一本鎖の空間的配置が、該一本鎖が由来する前記アレイにおける前記アンプリコンの空間的配置に対応する、工程と、
前記一本鎖が結合した前記第２の支持体を前記アレイから除去する工程と、
を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記コピー又は誘導体と前記第２の支持体との結合を増幅と同時に行う、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記空間的に制限された増幅因子領域が、前記アレイを担持する前記第１の支持体内、又は前記コピー若しくは誘導体を担持する前記第２の支持体内のマイクロ構造又はナノ構造によって少なくとも部分的に規定される、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
各々のオリゴヌクレオチドについての少なくとも１つの空間的に制限された増幅因子領域の生成が、前記アレイを担持する前記第１の支持体内のそれぞれ割り当てられた別個の凹部に前記オリゴヌクレオチドを供給する工程と、前記増幅因子を該凹部に導入する工程と、該凹部を前記第２の支持体を用いて密封する工程とを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの空間的に制限された増幅因子領域の生成が、前記結合アダプターを配置する各々のオリゴヌクレオチドに割り当てられた少なくとも１つの凹部を前記第２の支持体に設ける工程と、前記増幅因子を該凹部に導入する工程と、前記オリゴヌクレオチドが前記増幅因子領域に曝露されるように前記第１の支持体を用いて前記凹部を密封する工程とを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記空間的に制限された増幅因子領域が２つの液体、液体及び気体の間の相境界、又は物理的障壁によって少なくとも部分的に分離される、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドを前記第１の支持体、前記第２の支持体及び／又はこれらの支持体のコピーから放出させることによって、１つ又は複数のオリゴヌクレオチド型を回収する工程を含む、請求項４〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の支持体、前記第２の支持体及び／又はこれらの支持体のコピーに結合するオリゴヌクレオチドの増幅によって付加的なオリゴヌクレオチドを作製する工程を含む、請求項４〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
アプタマー標的構造の様々な位置に結合するアプタマー結合対を同定する方法であって、請求項４〜１７のいずれか一項に記載の方法の工程を含み、付加的に、
ａ）請求項４〜１５のいずれか一項に記載の方法によって得られるアンプリコンのアレイ又はアンプリコンのアレイのコピーを前記アプタマー標的構造と接触させるとともに、該アプタマー標的構造を該アレイのアンプリコン／該アレイのコピーに含まれるオリゴヌクレオチドに結合させる工程と、
ｂ）ａ）で得られる前記アレイ又は該アレイのコピーをオリゴヌクレオチドの混合物と接触させるとともに、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を前記アレイに既に結合した前記アプタマー標的構造に結合させる工程と、
ｃ）ｂ）において前記アプタマー標的構造に結合していないオリゴヌクレオチドを溶出させる工程と、
ｄ）ｂ）において結合したオリゴヌクレオチドを前記アプタマー標的構造から除去する工程と、
ｅ）ｄ）で得られるオリゴヌクレオチドをシークエンシングするとともに、純粋な形態のオリゴヌクレオチド型を作製又は単離する工程と、
ｆ）請求項４〜１１のいずれか一項に記載の方法によって得られるアンプリコンのアレイ又はアンプリコンのアレイのコピーを前記アプタマー標的構造と接触させるとともに、該アプタマー標的構造を該アレイ／該アレイのコピーの増幅時に存在するオリゴヌクレオチドに結合させる工程と、
ｇ）ｆ）で得られるアレイ又はアレイのコピーをｅ）の純粋なオリゴヌクレオチド型と接触させるとともに、該オリゴヌクレオチドを前記アレイに既に結合した１つ又は複数のアプタマー標的構造に結合させる工程と、
ｈ）前記アレイ上のどのアプタマー標的構造（複数の場合もあり）に前記純粋なオリゴヌクレオチド型が結合しているかを分析するとともに、該標的構造をそれが結合した該アレイのオリゴヌクレオチド及び該アレイ内のその特異的な位置マーカーに割り当てる工程と、
ｉ）任意にｇ）及び工程ｈ）を１回又は複数回繰り返す工程と、
を含む、方法。
【請求項１９】
請求項４〜１８のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、各々が主に１つのオリゴヌクレオチド型を含有するアンプリコンのアレイ、又は各々が主に１つのオリゴヌクレオチド型を含有するアンプリコンのアレイのコピー若しくは誘導体であって、前記オリゴヌクレオチドがアプタマーである、アンプリコンのアレイ又はアンプリコンのアレイのコピー若しくは誘導体。
【請求項２０】
前記アプタマーが１つ又は複数の可変領域及びプライマー領域を含む、請求項１９に記載のアレイ。
【請求項２１】
アプタマー標的構造に対するアプタマーの結合特性の分析への請求項１９又は２０に記載のアレイの使用。
【請求項２２】
所定のアプタマー標的構造上の様々な位置に結合するアプタマー結合対の同定への請求項１９又は２０に記載のアレイの使用。
【請求項２３】
アプタマーを同定するデバイスであって、
オリゴヌクレオチドの混合物をアプタマー標的構造と接触させるとともに、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を該標的構造に結合させるデバイス、
前記アプタマー標的構造に結合したオリゴヌクレオチドを、該アプタマー標的構造及び該アプタマー標的構造に結合していないオリゴヌクレオチドから分離するデバイス、
前記アプタマー標的構造に結合した個々のオリゴヌクレオチドを空間的に分離して増幅するとともに、各々が好ましくは１つのオリゴヌクレオチド型を含有する複数の空間的に分離されたアンプリコンを得るデバイス、
前記空間的に分離されたアンプリコンの複数に対して特異的なマーカーを、マーキングされた各々のアンプリコンがその特異的なマーカーに基づいて明確に識別可能であるように生じさせるデバイス、
複数のマーキングされたアンプリコンのオリゴヌクレオチドをシークエンシングするデバイス、及びアンプリコンに特異的なマーカーを、該アンプリコンの前記オリゴヌクレオチド型の配列に割り当てるデバイス、
前記アプタマー標的構造に対するオリゴヌクレオチド型の結合特性を分析するとともに、分析された結合特性を、前記アンプリコンの特異的なマーカー及び前記オリゴヌクレオチド型の配列に割り当てるデバイス、
を含む、デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アプタマーを同定する方法、アプタマーのアレイ及びアプタマーを同定するデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
アプタマーは、所望の標的構造（標的とも称される）に対する結合特性についてオリゴヌクレオチドライブラリーから選択された合成オリゴヌクレオチドである。ＤＮＡアプタマーの開発はこれまで、標的に対して最良の結合特性を有する分子をおよそ１０１５個の異なる分子の複雑なライブラリーから選択するｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択手順に従って行われてきた。この方法はＳＥＬＥＸ（指数関数的増加によるリガンドの系統的展開；Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment）として知られており、該方法の原理は１９９０年に記載されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。ＳＥＬＥＸプロセスはアプタマー選択の多くの変法で用いられている（非特許文献４）。
【０００３】
ＤＮＡアプタマーを作製するＳＥＬＥＸプロセスは反復プロセスである。ＳＥＬＥＸプロセスは、およそ１０１５個の異なる配列の化学的に合成されたＤＮＡライブラリーから始められる。ライブラリーの個々のＤＮＡ分子は、例えば３’末端及び５’末端に長さ１８ヌクレオチド〜２１ヌクレオチドのライブラリーの各要素内の同じ特異的プライマー配列が隣接した、２０ヌクレオチド長〜８０ヌクレオチド長の配列領域を有する無作為化配列を有する。（選択）ラウンドとも称されるプロセスサイクルは、
標的に結合する工程と、
非結合ＤＮＡを除去する工程と、
結合ＤＮＡを標的から溶出する工程と、
ＰＣＲを用いて先に結合したＤＮＡを増幅する工程と、
関連ｓｓＤＮＡをＰＣＲ産物から抽出する工程と、
からなる。
【０００４】
先のラウンドの結果は、いずれの場合にも次のラウンドの出発物質となる。およそ６回〜２０回のラウンドの後、標的に対して高い親和性及び特異性を有する配列パターンを増加させるものとする。この展開プロセスの原動力は標的の特性、例えばその濃度、溶液の緩衝条件、温度、インキュベーション時間、非結合ＤＮＡの分離効率、陰性選択工程の導入等によって決まる選択条件である。アプタマーの親和性及び特異性は、選択ラウンドの過程で適合させることができる条件のストリンジェンシーによって異なる。アプタマーの機能性、すなわち標的に結合する能力は、その一次配列、好ましくは１００ヌクレオチド未満の核酸分子の長さ及び周囲条件によって異なる三次元構造によって確立される。アプタマーはステム、内部ループ、テトラループ、三連構造（triplicates）、シュードノット、ヘアピン構造、キッシング複合体又はＧ四重鎖（G-quadruplex）構造等の典型的な構造パターンを形成する。アプタマーは標的の存在下で適応立体配座変化を開始し、その三次元フォールディングにより標的に特異的な結合部位が形成される（誘導適合）。アプタマーと標的との結合は構造適合性、アプタマーの核酸ベースでの芳香環のスタッキング、荷電基と水素架橋結合との静電相互作用等の様々な分子間相互作用に基づく。
【０００５】
アプタマーは、広範な標的：無機小分子、ペプチド、タンパク質、炭水化物、抗生物質に対して開発されている。細胞及び生物全体、並びに標的混合物等の複雑な標的がアプタマー選択に使用されている。毒性の非免疫原性標的、例えば抗体産生に利用可能でない標的を使用してもよい。その選択及び配列分析の後、再現性が保証され、量が原則として制限されない化学的合成を用いてアプタマーを作製する。アプタマーの修飾は、例えばセンサー表面若しくはチップ表面への固定化、定量化又は安定性の改善のために簡単に行われる。アプタマーの結合は可逆的であり、変性したアプタマーは再生することができる。どちらもアプタマーの分析的使用にとって大きな利点である。アプタマーは結合挙動に関して抗体と非常に類似している。その特性の多くがアプタマーを重要な又は更には優れた抗体の代替物としている。これは主として可逆的な変性、はるかに良好な貯蔵安定性及びより高い化学的安定性によるものである。
【０００６】
ＳＥＬＥＸプロセスに加えて、他の２つのプロセスがアプタマー選択について知られている。Aptares社によるＭｏｎｏｌｅｘプロセスもオリゴヌクレオチドライブラリーから開始される。オリゴヌクレオチドライブラリーの親和性吸着の後、オリゴヌクレオチドの親和性選別を吸着床上で行い、親和性の異なるオリゴヌクレオチドを異なるプールへと分離する。これらのプールを各々増幅して、各々が或る特定の親和性を有するポリクローナルアプタマーのプールを得る。個々の（モノクローナル）アプタマーを得るために、ポリクローナルアプタマーのそれぞれのプールをクローニングし、シークエンシングする（http://www.aptares.net/html/technologie.html）。
【０００７】
Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒを作製する一プロセスが、NOXXON社によって医薬品としてのＲＮＡアプタマーの開発に用いられている。このプロセスを用いることで、Ｌ−リボースをＤ−リボースの代わりに糖成分として含有するＲＮＡリガンド、いわゆるＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒが開発された。核酸の糖−リン酸骨格へのＬ−リボースの組込みにより、Ｌ−ＲＮＡの三次元構造が対応するＤ−ＲＮＡの構造の鏡像のように振る舞う。Ｌ−ＲＮＡ分子はヌクレアーゼによる酵素的切断から保護されるため、対応するＤ−ＲＮＡよりもはるかに安定している。実際の標的構造の鏡像異性体に対するリガンドを、初めにｉｎ  ｖｉｔｒｏ展開を使用して選択する。これらのリガンドを見出し、クローニングし、シークエンシングし、特性化した後、対応するＬ−リボ核酸であるＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒを化学的に合成する。次いで、その実際の標的分子、更にはその鏡像異性体に対するリガンドの結合特性を試験することにより、Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒの親和性及び特異性に関する結論を導き出すことができる。
【０００８】
上述のように、標的に対して高い親和性及び特異性を有する配列パターンを、およそ６回〜２０回のラウンドによってＳＥＬＥＸプロセスにおいて増加させるものとする。次に、結合オリゴヌクレオチドを単離のために増加させたオリゴヌクレオチドプールからクローニングし、例えば大腸菌（E. coli）に形質転換する。その後、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）及び組み込まれた挿入断片（ＰＣＲ産物）の正確さに関する陽性形質転換体の検証、並びにｐＤＮＡの調製等の付加的な工程を行う。
【０００９】
この処理の欠点としては、ＳＥＬＥＸプロセスによる多大な労力に加えて、最大で２０回のＳＥＬＥＸラウンドを通して行うのに比較的時間がかかるということが挙げられる。最大２０回のＳＥＬＥＸラウンドの１回で選択条件が有利に選択されない場合、良好な結合物が失われ得る。先のプロセスにおけるクローニングの後、更にマーキングすべきアプタマーの選択を無作為に行うが、個々の良好な結合物が無作為に選択されず、更にマーキングされず、したがってアプタマーとして検出されないために同様に失われる可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ellington, A. D., Szostak, J. W., Nature346 (1990), 818-822
【非特許文献２】Tuerk, C., Gold,L., Science 249 (1990), 505-510
【非特許文献３】Robertson, D. L., Joyce, G. F., Nature 344 (1990), 467-468
【非特許文献４】Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B., Biomol. Eng. 24(2007), 381-403
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の一目的は、これらの欠点を有しない方法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この目的は、
オリゴヌクレオチドの混合物をアプタマー標的構造と接触させるとともに、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を標的構造に結合させることと、
アプタマー標的構造に結合したオリゴヌクレオチドを、アプタマー標的構造及びアプタマー標的構造に結合していないオリゴヌクレオチドから分離することと、
アプタマー標的構造に結合した個々のオリゴヌクレオチドを空間的に分離して増幅するとともに、各々が主に同一の配列を有するオリゴヌクレオチド型を含有する幾つかの空間的に分離されたアンプリコンを生成することと、
空間的に分離されたアンプリコンの複数に対して、好ましくは空間的に分離されたアンプリコンの全てに対して特異的な識別を、マーキングされた各々のアンプリコンがその特異的なマーカーに基づいて明確に識別可能であるように行うことと、
複数のマーキングされたアンプリコン、好ましくは全てのマーキングされたアンプリコンのオリゴヌクレオチドをシークエンシングするとともに、アンプリコン、好ましくはシークエンシングによって調査された各アンプリコンに特異的なマーカーを、アンプリコンのオリゴヌクレオチド型の配列に割り当てることと、
アプタマー標的構造に対するオリゴヌクレオチド型の結合特性を分析するとともに、分析された結合特性を、アンプリコンの特異的なマーカー及びオリゴヌクレオチド型の配列に割り当てることと、
を含む、アプタマーを同定及び／又は作製する方法によって達成される。
【００１３】
このアプタマーの同定／作製プロセスはＳＥＬＥＸプロセスよりもはるかに迅速に行われる。プロセスの複数回のラウンドを行う必要はなくなっており、簡単な選択を行うのに十分である。
【００１４】
これにより、結合オリゴヌクレオチドを、増加させたプールから単離するクローニングのＳＥＬＥＸプロセスによる多大な労力が排除される。クローニングの後、更に特性化すべきアプタマーを従来のプロセスでは無作為に選択するため、個々の良好な結合物が無作為に選択されず、更に特性化されず、したがってアプタマーとして検出されないために「失われる」可能性がある。しかしながら、本明細書に記載の新たなプロセスでは、結合オリゴヌクレオチドが全て高度に並行した手順で単離され、シークエンシングされ、分析される。アプタマーは、測定される親和性に基づきプロセスの終了時に最も高い親和性を有する結合物として選択される。この新規の方法ではしたがって、その設計に基づき収率の増大が達成され、それにより得られるアプタマーのより良好な評価が可能となる。
【００１５】
このプロセスを用いると、アプタマーをより短時間のうちに同定すると同時に、その配列及び標的に対する結合定数をプロセスにおいて決定することが可能である。このプロセスはＳＥＬＥＸプロセスの全ての利点をもたらすが、この場合、最初の選択工程（結合、非結合物の除去、標的からの結合物の溶出）後にプロセスを終了させ、結合アプタマーを同定することが可能性であり、既知のＳＥＬＥＸプロセスの工程に従って行うことができる。シークエンシングの準備の間であっても評価を行う付加的な結合及び選択工程の任意の使用のために、ＳＥＬＥＸプロセスよりもはるかに高い特異性が達成される可能性もある。
【００１６】
本発明及び／又は下記の特別な実施の形態を用いて達成することができる付加的な利点としては以下のものが挙げられる：
非常に多数の潜在的アプタマーの並行したシークエンシング及び結合特性の分析の可能性。下記の変形例を用いたシークエンシングは、最大で１０６個のオリゴヌクレオチドの並行した配列分析を可能にする。このため、最大で１０６個のオリゴヌクレオチドを一度に選択し、分析し、検証し、標的とのインキュベーションにおける親和性を比較することによってアプタマー群を最後に見出すことができる。
本明細書で用いられるような空間的に分離された増幅では、各々のオリゴヌクレオチドが個別に増幅される。先の増幅では、オリゴヌクレオチドが増幅において互いに対しても競合し、増幅効率の劣ったオリゴヌクレオチドが、その結合品質にかかわらず失われ得る。
【００１７】
概して、本明細書に挙げるプロセス工程は必ずしも上記の順序で行う必要はない。順序は合理的かつ技術的に実行可能である場合に変更され得る。特に、オリゴヌクレオチドの混合物を所定のアプタマー標的構造と接触させる工程ａ）、及びオリゴヌクレオチドの少なくとも一部を標的構造に結合するとともに、アプタマー標的構造に結合するオリゴヌクレオチドを分離する工程ｂ）の後に行う工程の順序を変更することが可能である。例えば以下の論考及び例示的な実施の形態から明らかなように、空間的に分離された増幅、特異的なマーカーの発生、シークエンシング、及びアプタマー標的構造の結合特性の分析を異なる時系列で行ってもよく、又はこれらの工程の幾つかを同時に行ってもよい。
【００１８】
ここで、上に列挙した工程を詳細に説明する。
【００１９】
「アプタマー」という用語は、標的構造又は標的分子（標的としても知られる）、例えばタンパク質、低分子量化合物、例えば有機物質、アミノ酸及び抗生物質、核酸、ウイルス粒子又は（微）生物、並びに導入部で言及したような付加的な標的に特異的に結合する短い一本鎖核酸オリゴマーを指す。アプタマー−標的結合は導入部で言及したように生じる。
【００２０】
本プロセスに使用される出発物質はオリゴヌクレオチドの混合物である。「混合物」という用語は、配列の異なる多数のオリゴヌクレオチドを指す。
【００２１】
オリゴヌクレオチドは１つ又は複数の可変領域、好ましくは内部可変領域を有するのが好ましい。さらに、プライマー領域も、好ましくはオリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端に存在し得る。１つ又は複数存在し得る内部可変領域は無作為化配列領域、例えば特に結合性ランダム配列であるか又はそれを有する領域である。内部可変領域の長さは例えば１０ヌクレオチド〜８０ヌクレオチド、好ましくは２０ヌクレオチド〜８０ヌクレオチド、より好ましくは４０ヌクレオチド〜８０ヌクレオチドであるが、これらの長さは例示として与えられるにすぎず、何ら限定するものではない。一定の配列を有する領域が２つの可変領域間に位置し得る。その非限定的な例は捕捉配列であり、下記により詳細に説明する。
【００２２】
プライマー領域は増幅、好ましくはＰＣＲ増幅のプライマー結合部位として働く。代替的又は付加的には、下に更に記載されるように、プライマーはオリゴヌクレオチドを固相、例えばプレート、ビーズ、チップ又は他の基質に結合する働きをし得る。さらに、蛍光分子、ビオチン標識、酵素等の付加的な修飾をプロセスの前、その間又はその後にプライマーを介して導入してもよい。
【００２３】
出発物質、すなわち出発オリゴヌクレオチドの混合物は、ライブラリー、出発ライブラリー、オリゴヌクレオチドライブラリー又は結合性ランダムライブラリーとも称される。上記の構造を有するオリゴヌクレオチドは商業供給者に発注することができる。ライブラリーの変動は例えばおよそ１０１５個の異なる分子である。
【００２４】
オリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ＲＮＡ、修飾ｓｓＤＮＡ若しくは修飾ＲＮＡ又は合成核酸様分子（例えばＰＮＡ）であり得る。プロセスにおいては、オリゴヌクレオチドに相補的な鎖が個々のプロセス工程、特に増幅工程で存在する。増幅の終了後に、オリゴヌクレオチド及びその相補鎖がアンプリコンに存在し、これを使用して標的結合の更なる調査に所望されるｓｓＤＮＡを得ることができる。標的結合の調査については、オリゴヌクレオチド一本鎖、特にｓｓＤＮＡを調査する。
【００２５】
本方法は、特に天然核酸及び人工核酸、特にＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒ、合成ＤＮＡ様分子（ＰＮＡ）等での使用にも好適である。Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒの原理は上で説明した。
【００２６】
オリゴヌクレオチドをアプタマー標的構造と接触させることで、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を標的構造に結合し、アプタマー標的構造に結合するオリゴヌクレオチドをアプタマー標的構造及びアプタマー標的構造に結合していないオリゴヌクレオチドから分離することを、特に従来技術で既知のＳＥＬＥＸプロセスから既に知られているような任意の様々な方法で達成することができる。幾つかの変形例を下記に例として提示するが、これはプロセスを何ら限定するものではない。
【００２７】
例えば、標的を固相に結合し、溶解オリゴヌクレオチドと接触させることができ、潜在的アプタマーであるオリゴヌクレオチドの一部が標的に結合する。固相は、標的に結合していないオリゴヌクレオチドを液相から容易に分離させない特性を有し得る。例えば、固相は磁気的、例えば磁性粒子（磁性ビーズ）の形態であり得る。ＳＥＬＥＸプロセスから既に知られているように、標的結合オリゴヌクレオチドを溶出工程において固相及び標的から溶出することができる。
【００２８】
別の変形例では、いわゆる捕捉配列を、好ましくは磁性粒子の形態の固相に結合する。出発ライブラリーからの一本鎖オリゴヌクレオチドの固相への結合は、捕捉配列によって達成される。捕捉配列は、出発ライブラリーの一本鎖オリゴヌクレオチド内の領域に相補的である。捕捉配列によって、捕捉配列とオリゴヌクレオチドとの間の可逆的結合が生じる。次いで、標的を溶液中に遊離形態で存在させ、潜在的アプタマーであるオリゴヌクレオチドへの結合に利用可能とする。標的特異的オリゴヌクレオチドは捕捉配列の規定の二次元構造又は三次元構造を形成することによって連結し、標的とともに溶液中に見ることができる。次いで、非標的特異的オリゴヌクレオチドが結合したままの固相を、これらのオリゴヌクレオチドとともに分離することができる。
【００２９】
付加的な変形例としては、ＳＥＬＥＸプロセスの様々な改良に用いられる結合方法、例えば全細胞とオリゴヌクレオチドライブラリーとを結合し、続いて遠心分離を用いて非結合物を分離し、熱を用いて結合物を溶出させることが挙げられる。ＳＥＬＥＸプロセスの概要は、Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B.(2007), SELEX &#8211; a(r)evolutionary method to generate high affinity nucleic acid ligands, Biomolecular Engineering 24, 381-403に示される。
【００３０】
標的が固相に結合する場合、固相に対する陰性選択、すなわち上記のプロセス工程前に標的が結合していない固相に対する選択が生じ得る。
【００３１】
他の非特異的分子を用いた選択を上記のプロセス工程前に行ってもよい。同様に、関連するが不要な標的分子を用いて対抗選択を行い、選択前に対応する結合物をオリゴヌクレオチドライブラリーから枯渇させることができる。
【００３２】
空間的に分離された増幅
「個々のオリゴヌクレオチドの空間的に分離された増幅」という用語は以下の意味を有する：単一オリゴヌクレオチドが或る特定の配列を有するオリゴヌクレオチドである。全てのオリゴヌクレオチドを、個々のオリゴヌクレオチドが各々互いに空間的に分離されて増幅され、得られるアンプリコンも他の全てのアンプリコンから空間的に分離されたままであるように増幅する。したがって、個々のアンプリコンの混合は起こらない。
【００３３】
ここでのアンプリコンは、或る特定の配列を有する単一オリゴヌクレオチドの増幅によって得られる複数のオリゴヌクレオチドを含む。各々のアンプリコンは主に大半が増幅因子及び条件に応じて、又は排他的に若しくはほぼ排他的に出発分子（マトリックス）として使用される単一オリゴヌクレオチドと適合する配列を有するオリゴヌクレオチド型を含有する。このため、「型」という用語はオリゴヌクレオチドの配列を指す。型は或る特定の配列によってマーキングされる。増幅工程の後、アンプリコンはオリゴヌクレオチドに相補的な鎖を含有する。温度、ｐＨ、塩含量等の外部条件に応じて二本鎖も存在する。同一の配列を有する或る特定のオリゴヌクレオチド型に加えて、増幅の複製エラー又は人工モノマーの付加及び組込みによって形成される異なる配列を有するオリゴヌクレオチド及び対応する相補鎖が存在し得る。しかしながら、本明細書における「アンプリコン」という用語は、例えばシークエンシング目的で又はオリゴヌクレオチドの標的結合の調査のためにオリゴヌクレオチドの相補鎖が除去された産物についても使用される。この意味で、「アンプリコン」という用語は、主に、排他的に又はほぼ排他的に同一の配列を有するオリゴヌクレオチド型を含むか又はそれからなる複数の一本鎖オリゴヌクレオチドを指す場合もある。
【００３４】
任意の既知の増幅プロセスを空間的に分離された増幅に用いることができるが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が好ましい。
【００３５】
空間的に分離された増幅は特に、完全に遮断されていても又は遮断されていなくてもよい空間的に制限された領域で行われる。かかる制限された領域は、特に相境界、例えば固体状態構造及び流体又は流体−流体相境界又は流体−気相によって生じ得る。例としては、例えば空間的に制限されたキャビティ、或る特定の方向への拡散を促進し、他の方向への拡散を妨げる空間画定、例えば或る特定の方向への拡散を促進及び／又は制限するカラム若しくは溝の配置、多孔構造又は分子構造、例えばヒドロゲル、エーロゲル又はポリマー表面が挙げられる。秩序的又は無秩序なナノ構造又は分子構造、例えばポリマー分岐、デンドリマー、粒子アレイ、フィルター膜及び脂質膜（球形又は平面）も空間的に制限された領域を実現するのに可能である。同様に、対応する空間的に分離された領域は、拡散を或る特定の領域に制限するか又は表面に結合したＤＮＡを維持する力及び場又は相境界と場／力との組合せ、例えば電場によって生じ得る。
【００３６】
好ましい実施の形態では、空間的に分離された増幅はエマルション中での増幅、デジタル増幅、キャビティ内での増幅又は固相上での増幅、特にエマルションＰＣＲ、デジタルＰＣＲ又は固相上でのＰＣＲである。
【００３７】
無作為に分配されたアンプリコンが固相表面、例えば平面の表面上に得られる固相上での増幅プロセス（固相増幅）は従来技術から既知である。オリゴヌクレオチドが相補的な配列に結合し、それが好適な結合配列を用いて塩基対合により固相表面に結合する。相補的な配列は特にＰＣＲのプライマー配列である。オリゴヌクレオチドの増幅用のフォワードプライマー及びリバースプライマーを固相表面に共有結合するのが好ましい。ＰＣＲに必要とされる増幅因子を添加する。プライマーと鋳型との比率及びＰＣＲの期間により、固相表面上の得られるアンプリコンの密度が決まる。かかるプロセスにより、空間的に分離されたアンプリコンが結果として固相表面上に得られる。ガラスプレートが固相として使用されることが多い。固相増幅は、例えばL. Metzker et al., Nature Reviews,Genetics, Vol. 11, 2010, 31-46及びそれに引用される固相増幅に関する文献、例えばM.Fedurco et al., Nucleic Acids Res. 34, e22 (2006)に記載されている。
【００３８】
固相増幅の既知の変形例は、例えばＳＯＬＥＸＡシークエンサーでIlluminaにより利用可能ないわゆる「ブリッジ増幅」である。増幅対象のオリゴヌクレオチドに好適なフォワードプライマー及びリバースプライマーを固相表面に共有結合する。表面に結合した後、オリゴヌクレオチドの増幅を行う。新たに生成した相補鎖は表面に共有結合し、その非結合末端上に別の結合部位を有する。次いで、これが表面上の適合プライマーに更に結合し、別の増幅を開始することができ、これにより一方の末端に結合し、他方の遊離末端にオリジナルの結合配列を有する新たなオリゴヌクレオチド鎖が生成する。一方の末端に固定されて結合し、他方の末端で表面に一時的に結合する指数関数的に増加した新たな鎖が生成する。増幅において、鎖が一方の末端に強固に（共有）結合し、他方の末端に緩く（非共有）結合することにより、ブリッジとしても知られる分子「アーク（arc）」が生成する。この点で、米国特許第６，３００，０７０号は概してブリッジ増幅を記載し、Abrams et al., Diagnostic and Gene Detection Ch. (1997), 171-189はシークエンシングへのブリッジ増幅の使用を記載している。このプロセスは増幅反応後に相補鎖を除去し、シークエンシングを行った後、シークエンシング後の標的への結合の測定を行うことによって拡大することができる。
【００３９】
或る特定のプライマー配列が結合する市販の系を固相上での増幅に使用する場合、これらのプライマー配列に適合し、及び／又はこれらのプライマーに適合する結合部位を有するオリゴヌクレオチドを本発明によるプロセスに使用するのが好ましい。これが当てはまらない場合、固相上のプライマーに適合するいわゆるアダプターを用いたライゲーション工程を行う。任意に、オリゴヌクレオチドをそれに応じて末端位置での増幅により伸長してもよいが、これが結合特性に影響を与える場合もある。したがって、オリゴヌクレオチドのフランキング配列が市販のシークエンシングプロセスのプライマー配列に適合しているのが好ましい。
【００４０】
エマルション中での増幅は、好ましくは油中水型エマルションをベースとして使用するエマルションＰＣＲであるのが好ましい。水相の液滴はマイクロリアクターとして働く。これらの油中水型エマルションの濃度は、理想的な場合では、正確に１つのオリゴヌクレオチドが水相の各々の液滴に封入されるように選択する。加えて、プライマー及びポリメラーゼ等のＰＣＲに必要とされる増幅因子が水相中に含まれる。ＰＣＲを行った後、水相の液滴が油相中に存在し、それらが互いに分離するために空間的に分離されたアンプリコンが得られる。水相の各々の液滴は１つのオリゴヌクレオチド型及び相補鎖を含有するのが好ましい。かかるエマルションＰＣＲの変形例は、例えばM. Nakano et al., Journal of Biotechnology 102 (2003), 117-124及びWilliams et al.,Nature Methods, Vol. 3, No. 7 (2006), 545-550によって記載されている。
【００４１】
本発明の一実施の形態では、オリゴヌクレオチドが空間的に分離された増幅の前、その間又はその後に固相粒子に結合し、１つのオリゴヌクレオチド型が各々に結合した１つのアンプリコンのみを有する固相粒子が得られる。増幅されたオリゴヌクレオチド若しくは相補鎖又はその両方が粒子に任意に共有結合することができる。
【００４２】
この実施の形態は、例えば固相粒子を油中水型等の二相系に加えて使用することができるエマルションＰＣＲの変形例と組み合わせてもよい。このエマルションＰＣＲの変形例では、オリゴヌクレオチドが相補的な配列に結合し、これが好適な結合配列を介して固相粒子の表面に結合する。オリゴヌクレオチドはＰＣＲ増幅因子及び固相粒子（ビーズとしても知られる）とともに水相中に混合し、その後油に乳化することにより、油中の水及び粒子のエマルションが形成される。この油中水型エマルションについては、理想的な場合では、正確に１つのＤＮＡ鎖及び正確に１つの粒子が各々の水滴に封入されるように濃度を選択する。プライマー又はプライマー対（フォワード及びリバース）が粒子の表面に共有結合する。１つのプライマー（フォワード又はリバース）のみが結合する場合、他のプライマーは水相中に溶解している。プライマー対が存在する場合、増幅は上記のブリッジ増幅によって進行する。ビーズ上でのブリッジ増幅の場合、プライマー及びプライマーによって共有結合する鎖（オリゴヌクレオチド、相補鎖）の一方が反応後に再度任意に放出される。結果として、いずれの場合にも粒子全体が増幅によってオリジナルのオリゴヌクレオチドのコピーでカバーされ得る。増幅後、オリゴヌクレオチド若しくは相補鎖又はその両方が任意に表面に共有結合し得る。非共有結合したオリゴヌクレオチド又は非共有結合した相補鎖は、好適な周囲条件（塩含量、温度等）によって液相へと移行し、共有結合したオリゴヌクレオチド又は共有結合した相補鎖は一本鎖として粒子上に留まる。好ましい実施の形態では、複数のオリゴヌクレオチドが増幅及び相補鎖の除去後に粒子に共有結合する。この特別なＰＣＲでは、正確に１つのオリゴヌクレオチドを増幅することが可能であり、それが小ポリマービーズ上へ何度も「コピーされる」。このため、エマルションＰＣＲの終了時に、各々が別のオリゴヌクレオチドの無数の同一のコピーを担持する無数のビーズが存在する。固相粒子（ビーズ）を含むエマルション重合及び増幅は、L. Metzker et al., Nature Reviews,Genetics, Vol. 11, 2010, 31-46及びそれに引用される文献、例えばD. Dressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2003), 100,8817-8822、並びにF. Diehl et al., Nature Methods (2006),Vol. 3, No. 7, 551-559によって記載されている。
【００４３】
エマルション中での増幅用の市販の系を或る特定のプライマー配列が結合する粒子とともに使用する場合、これらのプライマー配列に適合し、及び／又はこれらのプライマーに適合する結合部位を有するオリゴヌクレオチドを本発明による方法に使用するのが好ましい。これが当てはまらない場合、市販の系のプライマーに適合するいわゆるアダプターを用いたライゲーション工程を行うか、又はヌクレオチドをＰＣＲ中のプライマーの好適な選択によって直接適合させてもよい。この場合、これらのプライマーは市販の系及びオリゴヌクレオチドライブラリーに相補的な又は同一の配列を含有する。
【００４４】
デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）においては、オリゴヌクレオチドを多数の空間的に分離された増幅領域上で分配し、ＰＣＲを各々の領域で別個に行う。理想的な場合では、領域は単一のオリゴヌクレオチドのみを含有するか（１に対応する）、又はオリゴヌクレオチドを含有しない（０に対応する）。ＰＣＲを行った後、領域はしたがって或る特定のオリゴヌクレオチドのアンプリコンを含有するか、又はアンプリコンを含有しない。例えば個々のオリゴヌクレオチドを別個の領域で単離する場合、ピコウェルプレート、マイクロウェルプレート、小型キャビティのキャピラリー若しくはアレイ、又は核酸結合表面を使用することができる。上記のようなエマルション中でのＰＣＲはデジタルＰＣＲとみなされる場合もある。デジタルＰＣＲを行う手順は、例えば米国特許第６，１４３，４９６号、H. Nagal et al., Anal. Chem. 73,2001, pp. 1043-1047、F. Shen et al., Lab Chip, 2010, Vol. 10(20), pp. 2666-2672、B. G. Zimmermann et al., Prenat. Diagn., 2008, Vol. 28(12), pp. 1087-1093、Y. Gong et al., Lab Chip, 2010, Vol. 10(18), pp. 2334-2337、S. Lindstrom et al., Lab Chip, 2009, Vol. 9(24), pp. 3465-3471、J. S. Marcus et al., Anal. Chem., 2006, Vol. 78(3), pp. 956-958に記載されている。デジタルＰＣＲを行う方法及び手段は例えばFluidigm社から市販されている。
【００４５】
特異的なマーカーの発生
各々の空間的に分離されたアンプリコンに基づいて明確に識別可能な特異的なマーカーが生じる。同定は原則として考え得る任意の方法で行うことができ、特に光学的に検出することができるアンプリコンの空間的位置又は配列に基づく、特に光学的、分光学的、放射能による又は電子的な方法（例えばバーコード又はＲＦＩＤチップを用いる）である。一変形例では、アンプリコンは特異的なマーカー、例えば付加的なＤＮＡ配列、質量分析タグ又は同位体標識を備える。アンプリコンが支持体、例えば上記のような固相粒子に結合する場合、マーカー又は標識が支持体又はその位置に存在するのが好ましい。アンプリコンを担持する支持体がマーキング及び／又は標識されていることから、結合したアンプリコンもしたがって同様にマーキングされている。決定的ではないが可能なマーカーとしては、バーコード、カラーコード、サイズ、形状、空間的位置又は配置、質量分析タグ、同位体標識、ＤＮＡ標識が挙げられる。
【００４６】
別の変形例では、アンプリコンは様々な位置に配置され、その位置が明確なマーカー、例えばナンバリング又は位置座標を担持する。一実施の形態では、この方法は、アンプリコンを１つ又は複数の第１の支持体内又は支持体上の局所的に分離された領域に配置し、特異的な位置マーカーが特異的なマーカーとして各々のアンプリコンに割り当てられたアンプリコンのアレイを得ることを含む。この実施の形態では、オリゴヌクレオチドのシークエンシングはアレイの複数のアンプリコンにおいて行われる。アンプリコンに含まれるオリゴヌクレオチド型の配列を、アレイ内のアンプリコンの特異的な位置マーカーに割り当てる。アプタマー標的構造の結合特性の分析において、アンプリコンに含まれるオリゴヌクレオチド型の配列及びアンプリコンの特異的な位置マーカーを、陽性結合事象又は陰性結合事象に割り当てる。支持体の例としては、プレート、チップ、ピコウェルプレート、ゲル、マイクロアレイ、いわゆるポロニー（polonies）（文献：http://en.wikipedia.org/wiki/Polony）、ブリッジ増幅、油中の水滴の空間的配置、例えばチューブ（真珠の数珠のように液滴が並ぶ）、又はマイクロ流体チップ若しくは表面（構造を有する及び有しない）のマイクロ／ピコキャビティ群のピコウェルプレートが挙げられる。
【００４７】
支持体内又は支持体上の様々な位置のアンプリコンの配置を増幅方法と組み合わせることができる。固相上での増幅では、固相は既に支持体であってもよく、アンプリコンは支持体上の様々な位置に規則的又は不規則なパターンで配置される。デジタルＰＣＲの場合、アンプリコンはそれぞれのキャビティノ内壁又はキャビティ内に存在する核酸結合表面に既に結合していてもよく、空間的標識としてのキャビティの配置によって配列への割当てが可能となる。
【００４８】
エマルションＰＣＲの場合、アンプリコンは例えば水相の液滴中に溶解形態で存在するか、又は上記のように水滴中に存在する固相粒子に結合し得る。アンプリコンが溶解した液滴は平坦な支持体上に分配され、固定化され得る。液滴は、例えば所与の空間的配置で支持体上に配置されるように、それぞれの位置で親水性コーティングによって支持体の表面に付加することができる。例えば、支持体は親水性スポットの規則的なパターンを有し得る。液滴は支持体上の油相によって互いに分離し得る。
【００４９】
液滴は支持体のキャビティ、特にマイクロウェルプレート、ナノウェルプレート若しくはピコウェルプレート又はシークエンサーチップにも導入することができる。増幅したＤＮＡがチップ上に結合したエマルション系は、Q. Ge et al., Molecules 2008, 13, 3057-3068に記載されている。
【００５０】
特に有利な実施の形態では、アンプリコンは例えば上記のエマルションＰＣＲにより固相粒子の表面上に存在し、アンプリコンを有する固相粒子（ビーズ）は１つ又は複数の固体支持体内又は支持体上の局所的に分離された領域に配置され、アンプリコンのアレイが得られる。ビーズはゲル、プレート又は他の一部の平坦な支持体の中又は上に配置され、好ましくは例えば化学的架橋によって化学的官能基を有する表面上に固定化される。特に好ましい実施の形態では、ビーズは例えば遠心分離によってマイクロウェルプレート若しくはピコウェルプレート又はシークエンサーチップのキャビティ内に配置される。ビーズ及びキャビティの寸法は、正確に１つのビーズがキャビティに収まるように調整されるのが好ましい。
【００５１】
シークエンシング
上述のように、各々のアンプリコンは主に若しくは大半が増幅因子及び増幅条件に応じて、又はほぼ排他的に出発分子（マトリックス）として使用される単一オリゴヌクレオチドの配列に対応する同一の配列を有する１つのオリゴヌクレオチド型を含有する。いわゆるシークエンシング法が、アンプリコン内のオリゴヌクレオチドの配列の解読に用いられる。シークエンシング機器には、初めにオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、特にそれにより得られるＤＮＡを捕捉し、それらを複製した後、それらを出力して、ビルディングブロックのブロックを構成する様々な反応工程及び技法が用いられる。選択されたシークエンシング法の反応化学を用いて、続いて個々のキャビティの各々についてそれが含有するオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を算出することが可能である。
【００５２】
本発明による方法では、オリゴヌクレオチドを空間的に分離され、特異的にマーキングされたアンプリコン内でシークエンシングする。アンプリコン内のオリゴヌクレオチド型の配列は、アンプリコンの特異的なマーカーに割り当てられる。
【００５３】
アンプリコンに含まれるオリゴヌクレオチドに相補的な鎖をシークエンシング前に除去し、これらの相補鎖を除去した産物（本発明の目的上、これもアンプリコンと称される）を得るのが好ましい。
【００５４】
相補鎖は当業者に既知の様々な方法によって除去することができる。上記のようなビーズを用いたエマルションＰＣＲ又は固相ＰＣＲの場合、ビーズ及び／又は表面は例えば１つのプライマーしか有さず、他のプライマーは溶液中に添加される。このため、アプタマー−標的への陽性結合によって先に得られたオリゴヌクレオチド鎖又は相補鎖は、任意にＰＣＲによって直接表面に固定される。結合系、例えばストレプトアビジン担持ビーズ及びビオチンを有するプライマーによって他の可能性が利用可能である。次いで、変性条件下で洗浄し、不要な相補鎖を単に溶解させることによって一本鎖を生成することができる。オリゴヌクレオチド鎖はビーズ又は表面に共有結合したままであり、失われることはない。好適な方法としては、高濃度塩緩衝液、ＳＳＣ緩衝液、希釈水酸化ナトリウム溶液での洗浄及び／又は加熱が挙げられる。
【００５５】
本発明によるプロセスでは、アンプリコンが１つ又は複数の固体支持体（「鋳型」とも称される）の中又は上の局所的に分離された領域に配置されるシークエンシング技法が用いられる。この点で、この態様に関する上記の開示を参照されたい。支持体上の各々のアンプリコン配置は別個にシークエンシングされる。
【００５６】
かかるシークエンシング技法は、本明細書中及び関連文献において「次世代のシークエンシング技法」又はＮＧＳ（次世代シークエンシング）とも称される。ＮＧＳシークエンシング技法は様々なプラットホームに基づき得るが、その一部が例えばRoche社（Ｒｏｃｈｅ／４５４）及びIllumina/Solexa社からＳｏｌｉｄ及びＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔとして市販されている。ＮＧＳ技法の概要はL. Metzker et al., Nature Reviews,Genetics, Vol. 11, 2010, 31-46に見ることができる。
【００５７】
RocheによってＧＳ  ＦＬＸ  ４５４系に用いられているようなＮＧＳ技術は、とりわけWheeler,D. A. et al., Nature 452 (2008), 872、Shendure, J., Ji,H., Nature Biotechnology 26(2008), 1135-1145、米国特許第７，２４４，５５９号、米国特許第７，３２３，３０５号、米国特許第７，３３５，７６２号、米国特許第７，６３８，２７６号に記載されている技法に基づく。Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔの技術は、同じアンプリコンの増幅及びポジションニング系に基づくが、生化学的反応の選択に電界効果トランジスタを使用するものである（J. M. Rothberg, Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays；公開日：２００９年５月２１日；公開番号：米国特許出願公開第２００９／０１２７５８９号）。しかしながら、これら２つの技術のアンプリコンの配置形状は同一の原理に基づくため、各々が長さおよそ５００塩基対の最大で１０６個のＤＮＡ配列の高度に並行したシークエンシングが可能となり、より短い配列の長さも可能である。この技法では、或る特定のオリゴヌクレオチドのマーキングされたアンプリコンが表面に結合するビーズがシークエンサーチップに導入される。チップは、各々が正確に１つのビーズが各キャビティに収まるのに十分な大きさの無数の小さなキャビティを含有する。次いで、チップをシークエンシング反応の全ての酵素を含有するより小さなビーズで満たす。しかしながら、これは不可欠ではなく、シークエンシング技法自体の好ましい実施の形態である。その後行われるシークエンシングでは、４５４  ＦＬＸ系を用いて光シグナルを生成し、ＤＮＡ塩基を組み込むＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔの場合には電荷をＨ＋イオンによって生成する。シグナルを各々のキャビティ、ひいては各々のビーズについて並行して記録し、その後ＤＮＡ配列へと変換することができる。このため、単一のＮＧＳチップによって最大で１０億又はそれ以上の塩基対を検出することが可能である。シークエンシングの原理及びシークエンシングで行われるプロセスは、M. Ronaghi, Genome Res. (2001), 11, 3-11及びM.Margulies et al., Nature (2005), Vol. 437, 376-380によって説明されている。
【００５８】
ビーズベースのＮＧＳ系の代替手段としては、ブリッジ増幅を用いる系も挙げられる（例えばSolexa）。これらのプロセスでは、オリゴヌクレオチドはランダム分布で表面に結合し、１０５コピーのオリジナルのオリゴヌクレオチドが数回各々の結合部位の周囲に形成されるように増幅される。これらの個々の増幅領域は、通常はオリジナルのオリゴヌクレオチドの周囲に円形パターンで配置される。Illuminaによるシークエンシングの実施の形態では、この空間的配置は種々の蛍光ヌクレオチドを組み込むことによって分析される（米国特許出願公開第１２８７８６８７号、Nucleic Acid Sequencing System and Method）。しかしながら、この特別な配置の分析も４５４  ＦＬＸ系又はＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ系の検出原理を用いて行い、それから配列を導き出すことができる。米国特許第６，３００，０７０号、並びにL. Metzker et al., Nature Reviews,Genetics, Vol. 11, 2010, 32-46及びAbrams et al.,Diagnostic and Gene Detection Ch. (1997), 171-189の論考を参照されたい。加えて、このシークエンサー設計では、ＤＮＡ配列を種々の蛍光標識オリゴヌクレオチドのライゲーションによって決定することが多い。ここでオリゴヌクレオチドライブラリーを、このシークエンシングに利用することができ、後続のオリゴヌクレオチド／アプタマーの結合測定に利用可能となるように選択してもよい。
【００５９】
結合特性の分析
最後に、マーキングされたアンプリコンのオリゴヌクレオチド型のアプタマー標的構造への結合特性の分析を行う。したがって、アンプリコンに含まれるオリゴヌクレオチド型の配列を有するオリゴヌクレオチドをアプタマー標的構造と接触させる。プロセスの一変形例では、空間的に分離されたアンプリコンをアプタマー標的構造と接触させてもよい。必ずしもアンプリコン自体及びそれに含まれるオリゴヌクレオチドをアプタマー標的構造と接触させる必要はない。「オリゴヌクレオチド型の結合特性の分析」という表現は、或る特定のオリゴヌクレオチド型と同じ配列を有し、したがってその型に帰属するが、マーキングされたアンプリコン中に既に存在しないオリゴヌクレオチドの分析も含む。例えば、下記の特別な実施の形態に記載されているようにオリゴヌクレオチドのコピーを生成し、分析することができる。このため、「オリゴヌクレオチド型の結合特性の分析」という表現は、特にアンプリコン内のオリゴヌクレオチドをアプタマー標的構造と接触させ、及び／又はオリゴヌクレオチドのコピーをアプタマー標的構造と接触させることも含む。
【００６０】
「分析された結合特性をアンプリコンの特異的なマーカーに割り当てる」という表現は、アンプリコンに対する分析したオリゴヌクレオチド型の関係性を確立し、その型をそのマーカーを用いて見出すことを意味する。そのオリゴヌクレオチド型の配列はシークエンシングから分かり、結果として１つのオリゴヌクレオチド型、その配列及び対応するアンプリコンのマーカーへの結合特性の割当てが行われる。
【００６１】
結合特性は、選択された規定の尺度の測定値に基づいて分類することができる。分類は定性的及び／又は定量的であり得る。例えば、分析したオリゴヌクレオチドを最高のシグナルから最低までランク付けすることができる。定性的分類は例えば非親和性から非常に高い親和性まで様々であり得る。さらに、品質レベルの差別化も１つ又は複数の規定の限界値に基づいて可能である。結合特性は、とりわけ下記のような蛍光測定及びＲＩｆＳ測定における相対単位の強度として表すことができる。
【００６２】
この方法は、アプタマー又は潜在的アプタマーの特性化、同定、作製及び／又は選択を目的としてオリゴヌクレオチドを分析する方法とも称され得る。
【００６３】
結合特性の分析中又は分析後に、オリゴヌクレオチドをアプタマーとして同定する。同定は、一例として上に記載のように分類に基づいて行うことができる。同定されるオリゴヌクレオチドは、標的構造に対して結合特性を有するもの又は結合事象が確認可能であるものであるのが好ましい。
【００６４】
この方法は、アプタマーとして同定されるオリゴヌクレオチドを分析対象の全てのオリゴヌクレオチドから選択する選択工程を含み得る。
【００６５】
アプタマーとして同定されるオリゴヌクレオチドは、任意に単離するか又は新たに合成することができる。
【００６６】
一変形例では、結合特性の分析は特に、
ｉ）陽性結合事象又は陰性結合事象を、アンプリコン及びアンプリコンに含まれるオリゴヌクレオチド型の配列の特異的なマーカーに割り当てることと、
ｉｉ）陽性結合事象が検出されるオリゴヌクレオチドを、標的構造のアプタマーとして同定することと、
を含み得る。
【００６７】
陽性結合事象は、結合が存在しないベースシグナル及び／又は陰性対照と比較した或る特定の検出可能なシグナルの差異として定義することができる。加えて、シグナルレベルを超えた差別化も可能である。
【００６８】
結合特性の分析の前に、好ましくはアンプリコン中に存在し、オリゴヌクレオチドに相補的な相補鎖を除去するのが好ましい。この工程は、上記のようにシークエンシング前に相補鎖が既に除去されている場合には不要である。
【００６９】
結合特性の分析は、アプタマーに対する従来技術から既知の任意の方法を用いて、特に標的に対するアプタマーの親和性を決定する方法を用いて行うことができる。
【００７０】
アプタマーの標的への結合事象は従来技術、特にリガンド間の親和性測定から既知の様々な従来の方法を用いて検出することができる。アプタマーを標的と接触させると、アプタマーの標的への結合によりアプタマー−標的複合体が生じる。結合及び／又は結合事象は視覚的に、光学的に、光子的に、電子的に、音響的に、光音響的に、重量により、電気化学的に、電気光学的に、分光光度的に、酵素的に又はそうでなければ化学的に、生化学的に若しくは物理的に検出することができる。
【００７１】
複合体は、例えば複合体パートナーと標識物質との直接的又は間接的なカップリング後に、指示薬反応における標識によって可視化することができる。使用されるアプタマー又は標的は標識を備え得る。好ましい標識は視覚的に、光学的に、光子的に、電子的に、音響的に、光音響的に、電気化学的に、電気光学的に、分光光度的に、酵素的に、若しくはそうでなければ物理的に、化学的に若しくは生化学的に検出可能であるか、又は重量によるものである。この方法の一実施の形態では、標識は発光、ＵＶ／ＶＩＳ分光法、又は酵素的に、電気化学的に若しくは放射能により検出される。
【００７２】
発光は光の放出に関する。本発明による方法では、例えばフォトルミネセンス、化学発光及び生物発光を標識の検出に用いる。蛍光のフォトルミネセンスでは、光子の吸収により励起が生じる。フルオロフォアの例としては、アプタマーと共有結合し得る、ビスベンズイミダゾール、フルオレセイン、アクリジンオレンジ、Ｃｙ５、Ｃｙ３又はヨウ化プロピジウム、テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（ＴＲ）、ローダミン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素（様々な企業による様々な波長の蛍光色素を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。分析は視覚的に、又は対応する測定装置を用いて、例えばマルチラベルカウンター、蛍光顕微鏡で、又はフロースルーサイトメトリーによって、例えば細胞蛍光光度計（cytofluorimeter）で行われる。化学発光は化学反応の結果としての可視光の放出を表す。生物発光は酵素反応、例えばルシフェラーゼ酵素によって触媒される酸化還元反応の結果としての可視光の放出を指す。
【００７３】
他の標識物質は触媒、コロイド金属粒子、例えば金ナノ粒子、コロイド非金属粒子、量子ドット、有機ポリマー、ラテックス粒子、又はシグナル発生物質を含むリポソームである。コロイド粒子は比色分析によって検出することができる。
【００７４】
酵素反応が、検出可能な基質又は産物の消費又は形成を特徴とする酵素を標識として使用することもでき、限定されるものではないが光学的検出又は電気化学的検出を用いてもよい。例えば基質を着色産物へと変換する酵素、好ましくはペルオキシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアルカリホスファターゼを標識物質として用いて検出を行うことができる。例えば、無色の基質Ｘ−Ｇａｌがβ−ガラクトシダーゼの活性によって変換されて青色の産物が形成され、その着色を視覚的に検出する。
【００７５】
この検出はアプタマーを標識する放射性同位体、好ましくは３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ、とりわけ好ましくは３２Ｐ、３３Ｐ又は１２５Ｉによっても達成することができる。シンチレーション計数では、放射活性物質で標識したアプタマー−標的複合体によって放出される放射線を間接的に測定する。シンチレーター物質は放射線によって励起する。基底状態への遷移において、励起エネルギーが再度閃光として放出され、これが光電子増倍管によって増幅され、計数される。
【００７６】
アプタマーは例えば標識、例えば酵素複合体を有し得る抗体又はストレプトアビジンが結合するジゴキシゲニン又はビオチンによっても標識することができる。先の抗体と酵素との共有結合（共役）は様々な既知の方法によって達成され得る。抗体結合の検出は放射性同位体、好ましくは１２５Ｉを使用するＲＩＡ（放射免疫測定法）において放射能によって、又はフルオロフォア、好ましくはフルオレセイン若しくはＦＩＴＣを使用するＦＩＡ（蛍光免疫測定法）において蛍光によって行うこともできる。
【００７７】
とりわけ有利な実施の形態では、いわゆる画像化反射型干渉分光法（imaging reflectometric interferencespectroscopy）（以下、ｉＲＩｆＳと称する）に基づく無標識検出方法を結合事象の検出に用いる。この方法は、表面への分子の付加を薄層での干渉に基づく干渉パターンの変化によって検出することができるということに基づく。この方法は結合動態の測定にも用いることができる。この方法の原理は、C. Hanel et al., Analytical and Bioanalytical Chemistry 372 (2002), 91-100、J. Piehleret al., Analytical Biochemistry 249(1997), 94-102及び米国特許出願公開第２０１０２９７６７１号に記載されている。ｉＲＩｆＳ法を用いると、マイクロアレイ上でリアルタイムに標識を用いずに結合反応の選択を行うことが可能である。本発明では、高度に並行した結合事象の分析及び結合定数の決定を行うことができる。ｉＲＩｆＳを用いると、相互作用が標的分子と個々の各アンプリコンとの間で起こるか否か、また起こる場合は、その強さ及びその動態パラメーターをリアルタイムで確認することが可能である。アレイ上の全てのアプタマーの結合動態及び親和性定数を並行して決定することができる。さらに、標的親和性の並行調査を様々な条件（温度、ｐＨ、塩含量等）下で行うことができ、特異性の調査を行うことができ、アレイ上の最大で１０６個のアンプリコンを同時に分析することができる。
【００７８】
付加的な特別な実施の形態及び変形例、並びに上記の方法への追加を下記に詳述する。
【００７９】
アンプリコンに含まれるオリゴヌクレオチド型の配列を有するオリゴヌクレオチドとアプタマー標的構造との接触は、下記の様々な方法で行うことができる。
【００８０】
この方法の一実施の形態では、アンプリコンのアレイを上記のアプタマー標的構造と接触させる。例えばＤＮＡチップ、マイクロタイタープレート又はマイクロウェルプレートの別個のキャビティに配置されるアンプリコンを、アプタマー標的構造を含有する液体とインキュベートすることができる。
【００８１】
アレイのコピー及び誘導体の作製
別の実施の形態では、この方法は、
第２の支持体内又は支持体上にアンプリコンのアレイのコピー又は誘導体を生成することであって、それにより特異的な位置マーカーを特異的なマーカーとしてコピー又は誘導体の各々のアンプリコンに割り当てることと、
アレイのコピー又は誘導体をアプタマー標的構造と接触させることと、
を含む。
【００８２】
この実施の形態では、オリゴヌクレオチド若しくはアンプリコン、又はオリゴヌクレオチド若しくはアンプリコンの誘導体が、第１の支持体、例えばシークエンサーチップの中又は上のアンプリコンアレイ（以下、「アレイ」とも称される）から第２の支持体上に直接コピーされ、アレイ構造、ひいてはアレイのアンプリコンの特異的な位置マーカーが保存される。このため、コピー又は誘導体上のアンプリコンに割り当てられる特異的な位置マーカーは、モデルとなるアレイ内のアンプリコンの特異的な位置マーカーに基づく。コピー上の位置情報はオリジナル上の各々の位置配置に明確に割り当てることができ、逆もまた同様である。
【００８３】
この実施の形態は、特にシークエンシングによりオリゴヌクレオチド配列の配置からのマイクロアレイのコピーを作製することを可能にする（例えば、ABIによるシークエンサーの粒子アレイ、又はRocheの４５４、又はIlluminaによるＳｏｌｅｘａのような平坦な表面）。
【００８４】
本発明によるコピーはオリジナルのオリゴヌクレオチドの１：１コピーであると考えることができ、誘導体はオリジナルのオリゴヌクレオチドの変化、例えばオリジナルのオリゴヌクレオチドの誘導体又はサブセットと考えることができる。
【００８５】
原則として、コピープロセスを何度も繰り返して、複数の同一のオリゴヌクレオチドマイクロアレイコピーを例えばシークエンサーチップから作製することができる。ここでオリジナルは保存される。この実施の形態については、広範な種々の試験を様々なコピーに対して行うことができ、必要に応じて新たなコピーを作製することができるため、アプタマーの同定及び多くの並行サンプルの分析が同様に容易になる。例えば、全てのアプタマーの結合動態及び親和性定数をアレイのコピーに対して並行して決定することができる。さらに、標的親和性の並行試験及び特異性の試験を様々な条件（温度、ｐＨ、塩含量等）下で行うことができる。特に、１つのコピーを、とりわけ作製されたアレイコピー上での全てのオリゴヌクレオチドの親和性分析を可能にする上で説明した無標識ｉＲＩｆＳ技法で分析する。
【００８６】
アレイのコピー又は誘導体をアプタマー標的構造と接触させる前に、コピー又は誘導体のアンプリコン中に存在し得るオリゴヌクレオチドに相補的な鎖を除去するのが好ましい。これは既知の方法によって行うことができ、その一部を「シークエンシング」セクションに挙げる。
【００８７】
この実施の形態では、第２の支持体は、特にオリゴヌクレオチドに対する結合アダプター又はオリゴヌクレオチドに対する結合特性を有し、結合アダプター又は結合特性によってアンプリコンのオリゴヌクレオチドを支持体に結合することによってコピー又は誘導体を生成する。結合アダプターは好ましくはオリゴヌクレオチド、最も好ましくはＰＣＲのプライマーの長さ及び機能を有するオリゴヌクレオチドである。結合アダプターは、オリゴヌクレオチド相補鎖の配列の一部に相補的であるか、及び／又はオリゴヌクレオチドと同一の配列を含有する配列を有するのが好ましい。第２の支持体に対して行われる増幅では、結合アダプターを伸長して、第２の支持体の表面に共有結合するオリゴヌクレオチド鎖を形成することができる。それにより生成するオリゴヌクレオチドは、オリジナルのオリゴヌクレオチドに同一又は相補的であり得る。結合アダプターは、オリゴヌクレオチド鎖の配列の一部に相補的な配列も有し得る。第２の支持体に対して行われる増幅では、結合アダプターを、第２の支持体の表面に共有結合するオリゴヌクレオチド相補鎖へと伸長させることができる。
【００８８】
この実施の形態では、生化学的情報又は配列の知識がなくともアンプリコンアレイをコピーすることが可能である。このため、シークエンシングプロセスの前、その間又はその後にオリゴヌクレオチドの配置のコピーをここで作製し、それにより配列の知識を有することなくアレイコピーを生成することが可能となる。コピーへの位置情報の割当てのみによりシークエンサー系の配列情報への割当てが可能となる必要がある。
【００８９】
このため、この実施の形態では、個々のオリゴヌクレオチドの配列の知識がなくとも上記のシークエンシングの前、その間又はその後に即座にアレイコピーを作製することが可能である。これにより、この実施の形態において作製されたコピーをシークエンシングして、コピーされたアンプリコン内のアプタマーの同一性を決定することが可能である。このため、原則としてアレイオリジナルと同じ工程を行うことができる。シークエンシングは、コピーの調製前、調製中又は調製後にオリジナル又はコピーを用いて行うことができる。
【００９０】
この実施の形態によると、コピー若しくは誘導体をシークエンシング若しくは増幅の前、その間若しくはその後に作製するか、又はコピーをシークエンシングについてオリジナルとすることができる。コピー又は誘導体の第２の支持体への結合は、同時に又は増幅後に起こるのが好ましい。コピー又は誘導体は、例えばIllumina社によるＳｏｌｅｘａ系を使用することによって増幅前に作製することができる。オリジナルのオリゴヌクレオチドの更なるアンプリコンは増幅の前、その間又はその後にここで生成された後、第２の支持体へと移行する。オリジナルのオリゴヌクレオチドに基づいて、相補的な及び同一のアンプリコンの両方が移行し得る。この第２の支持体は、例えばRocheによる４５４のシークエンサーチップであり得る。シークエンシング後にRocheによる４５４系を用いてコピーを作製し、続いてそれをＳｏｌｅｘａシークエンサーに送り、再度シークエンシングすることも考え得る。
【００９１】
この実施の形態の特別な変形例は、
結合アダプター又は結合特性を備える第２の支持体の表面が増幅因子領域に隣接するように、各々のオリゴヌクレオチドについて、他のオリゴヌクレオチドの増幅因子領域から分離された少なくとも１つの空間的に制限された増幅因子領域を設ける工程と、
オリゴヌクレオチドのアンプリコンを生成するのに、オリゴヌクレオチドを増幅因子領域内の増幅因子によって増幅する工程と、
第２の支持体上の一本鎖の空間的配置が、一本鎖が由来するアレイにおけるアンプリコンの空間的配置に対応するように、アンプリコンの一本鎖又はアンプリコンの誘導体を結合アダプター又は結合特性によって第２の支持体に結合する工程と、
一本鎖が結合した第２の支持体をアレイから除去する工程と、
を含む。
【００９２】
空間的に制限された増幅因子領域が、アレイを担持する第１の支持体内、又はコピー若しくは誘導体を担持する第２の支持体内のマイクロ構造又はナノ構造によって少なくとも部分的に規定され得る。
【００９３】
上記の実施の形態による増幅は、一般的なプロセスに基づく上記の空間的に分離された増幅と同一であり得る。この場合、空間的に分離された増幅は増幅因子領域において起こる。
【００９４】
上記の実施の形態による増幅は、一般的なプロセスに基づく上記の空間的に分離された増幅後に行われる付加的な（例えば第２の）増幅工程であってもよい。例えば、初期の空間的に分離された増幅及びオリゴヌクレオチド相補鎖の除去の後に複数の共有結合したオリゴヌクレオチドを担持するビーズを、増幅因子領域内の増幅因子と接触させ、増幅においてオリゴヌクレオチド相補鎖の合成をもたらすことが可能である。このため、上記の実施の形態による増幅は相補鎖の合成と同等であり得る。この場合、「オリゴヌクレオチドのアンプリコン」という表現は相補鎖を含む。プライマーの種々の選択によって、オリジナルのオリゴヌクレオチドと同一のオリゴヌクレオチドをアンプリコンとして生成することも可能である。
【００９５】
第２の支持体に結合するアンプリコンの一本鎖は、オリゴヌクレオチドの一本鎖及び／又はその相補鎖、好ましくは相補鎖であり得る。結合は、オリゴヌクレオチド一本鎖及び／又はその相補鎖の或る配列を有する結合アダプターへのハイブリダイゼーションによって起こるのが好ましい。
【００９６】
第２の支持体の表面の結合アダプターは、オリゴヌクレオチド相補鎖の配列の一部に相補的な配列を有するのが好ましい。相補鎖はハイブリダイゼーションによって結合アダプターに結合する。次いで、更なる増幅を結合アダプターがオリゴヌクレオチド鎖へと伸長する第２の支持体に対して行うのが好ましい。それにより、第２の支持体の表面に共有結合したオリゴヌクレオチドが得られる。この付加的な増幅工程は、第２の支持体の除去前又は除去後に行うことができる。必要でなくなった相補鎖は、既に言及した通常の方法（緩衝液での洗浄、加熱）によって除去することができる。
【００９７】
一変形例では、各々のオリゴヌクレオチドについての少なくとも１つの空間的に制限された増幅因子領域の生成は、アレイを担持する支持体内の別個に割り当てられた凹部にオリゴヌクレオチドを供給することと、増幅因子を凹部に導入することと、凹部を第２の支持体で密封することとを含む。例えば、第２の支持体は、マイクロウェルプレート又はピコウェルプレート等のキャビティを有する第１の支持体上に位置し、増幅対象のオリゴヌクレオチドがキャビティ内に見られる（例えば、上記のデジタルＰＣＲの場合）、平坦な支持体であり得る。第２の支持体はキャビティを閉鎖し、閉鎖された増幅因子領域を形成する。必要とされる増幅因子はキャビティ内に存在し、アンプリコンのコピーが増幅中に同時に第２の支持体上に形成されるのが好ましい。第２の支持体は平坦な支持体であってもよく、平面のアレイの形態のコピーをここで作製することができる。かかる手順は例えば国際公開第２０１０１００２６５号に記載されている。この一変形例では、或る特定の配列のオリゴヌクレオチドが表面に結合したビーズが、第１の支持体のキャビティ内及びキャビティを有する第１の支持体上に位置する平坦な支持体である第２の支持体に存在する。次に、増幅を行うと同時に、第２の支持体上でコピーを生成する。一実施の形態は、国際公開第２０１０１００２６５号の図１ａ〜図１ｄを参照して説明される。
【００９８】
別の変形例では、少なくとも１つの空間的に制限された増幅因子領域の生成は、結合アダプターを配置する各々のオリゴヌクレオチドに割り当てられた少なくとも１つの凹部を第２の支持体に設けることと、増幅因子を凹部に導入することと、オリゴヌクレオチドが増幅因子領域に曝露されるように第１の支持体を用いて凹部を密封することとを含む。一実施の形態は、国際公開第２０１０１００２６５号の図４ａ〜図４ｃを参照して説明される。
【００９９】
この実施の形態の別の変形例では、空間的に制限された増幅因子領域は２つの液体、液体及び気体の間の相境界、又は物理的境界によって少なくとも部分的に分離される。エマルションＰＣＲを参照して上で説明されるように、エマルション液滴を、各々の液滴が或る特定の配列のオリゴヌクレオチド及び増幅因子を含有するように第１の支持体上に設けることも考え得る。液滴は、例えば所与の空間的配置で支持体上に配置されるように、親水性コーティングによって第１の支持体の表面上のそれぞれの位置に付加することができる。例えば、支持体は規則的なパターンの親水性スポットを有し得る。第２の支持体を、好ましくは結合アダプターを有する表面の液滴と接触するように第１の支持体に押し付ける。液滴での増幅において、コピーが同時に第２の支持体上に作製される。一実施の形態は、国際公開第２０１０１００２６５号の図５ａ〜図５ｄを参照して説明される。
【０１００】
様々なコピー工程において、例えば着色コピーと同等の或る特定の標識又は配列を含有する化学的形態のアレイを修飾することが可能であり、黄色の成分のみがコピーされる。
【０１０１】
この実施の形態の付加的な態様は、国際公開第００２０１０１００２６５号（その開示は引用することにより完全に本明細書の一部をなす）に説明される。
【０１０２】
アレイコピーを用いた付加的なプロセス工程、回収及び選択
先の実施の形態の補足として、このプロセスは、オリゴヌクレオチドを第１の支持体、第２の支持体又はこれらの支持体のコピーから取り出すことによって、１つ又は複数のオリゴヌクレオチド型をコピーから回収することを含む。支持体のコピーとしては、上で既に論考したコピー方法を使用して第１の支持体内若しくは支持体上のアレイから得られる付加的なコピー、又は第２の支持体上のコピーから得られるコピーが挙げられる。しかしながら、好ましい実施の形態は第２の支持体、特に配列のＤＮＡコピーの使用を提供する。この実施の形態では、オリゴヌクレオチド又はそのアンプリコンを、空間分解能によって放出することができるように固定化する。第２の支持体上のコピーされたＤＮＡアレイでは、これはフォトリンカーを使用することによって実行することができ、そのオリゴヌクレオチドは部分的に結合するが、短波長レーザーを用いて放出することができる。このため、例えばｉＲＩｆＳを用いた結合分析の後、アプタマーを標的化されるようにレーザーを用いて放出させ、溶出することができる。溶出物はその後ＰＣＲ等の付加的な工程に即座に利用可能である。このため、アプタマーは直接増幅することができ、再度デノボ合成する必要はない。下により詳細に記載されるように、「エピトープビニング」がもたらされる場合、回収されたアプタマーは二次アプタマーとして試験することができ、それによりそのサンドイッチ構造の結合パートナーを直接同定することができる。
【０１０３】
複数のアプタマーが各々同時に放出される場合、このアプタマープールは、特にプールの変異と併せた付加的な選択工程（アプタマープールの標的への結合、非結合物の除去、標的からの結合物の溶出）の使用も可能にする。しかしながら、各々の配列をプールに添加しても、又は標的化されるように加えてもよい。このため、次の選択工程のアプタマープールに対して先のＳＥＬＥＸプロセスで可能であったよりも顕著に大きな影響が与えられる。
【０１０４】
先の実施の形態の更なる補足として、このプロセスは、第２の支持体に結合するコピーのオリゴヌクレオチドの増幅によって付加的なオリゴヌクレオチドを作製することも含む。コピーされたアレイは表面上に全てのアプタマーを担持する。コピー作製プロセスのために、ここでＰＣＲをアレイの表面上で行い、それにより次のラウンドのアプタマープールを得た後、更にこれを変異させることが可能である。ＰＣＲに好適なプライマーの選択によって、オリゴヌクレオチドのサブプールを得ることも可能である。
【０１０５】
先の実施の形態の別の補足として、コピープロセス中に形成されるアプタマーに関して可溶性の相補的ＤＮＡを回収し、それを増幅することが可能である。この場合も、シークエンシング中に導入される全てのアプタマーのプールが生成する。プライマーの好適な選択によって、アプタマーを標的化されるようにｓｓＤＮＡとして回収することが可能である。このプールはその後付加的なＳＥＬＥＸラウンドに利用可能であり、この場合も変異させることにより新たなライブラリーを生成することができる。
【０１０６】
先の実施の形態の更に別の補足として、アプタマーのサブプールをコピー又はコピープロセスの上清から得る。配列がシークエンシングにより既知であるため、好適なプライマーを標的化されるように用いて個々の配列パターンを増幅することが可能である。これはコピープロセスの上清及び生成されたＤＮＡアレイを使用することによって可能である。このため、初めにシークエンシングされたアプタマーの個々のサブプールを生成することができる。
【０１０７】
付加的な選択工程
本プロセスの別の実施の形態では、アンプリコンを固相粒子に結合し、プロセスは付加的に、
各々がそれに結合する１つのオリゴヌクレオチド型を含むアンプリコンを有する固相粒子を、アプタマー標的構造と接触させる工程と、
固相粒子に結合するアンプリコンのオリゴヌクレオチドに対するアプタマー標的構造の陽性結合事象又は陰性結合事象を確認する工程と、
陽性結合事象を確認することができる固相粒子を選択する工程と、
を含む。
【０１０８】
陽性結合事象を確認することができる選択された固相粒子は、１つ又は複数の固体支持体内又は固体支持体上の局所的に分離された領域に配置され、アンプリコンのアレイが得られる。「選択」という用語は、特に陽性結合事象を確認することができる固相粒子の他の固相粒子からの分離を意味する。
【０１０９】
しかしながら、固相粒子は上記のプロセス工程を行う前であっても固体支持体内又は固体支持体上に配置することができ、アレイを形成し得る。この場合、「選択」という用語は、特に下記のシークエンシングのような付加的なプロセス工程を、陽性結合事象を確認することができる固相粒子のみを用いて行うことを意味する。
【０１１０】
基本的なプロセスに基づいて上に説明したように、オリゴヌクレオチドの混合物をアプタマー標的構造と接触させ、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を標的構造に結合させる。アプタマー標的構造に結合するオリゴヌクレオチドを、次にアプタマー標的構造及びアプタマー標的構造に結合していないオリゴヌクレオチドから分離する。これは、標的が好ましくは固定化され、オリゴヌクレオチドが溶液中に存在するＳＥＬＥＸプロセスに類似する選択プロセスである。この選択のために、選択されたオリゴヌクレオチドから生成するアンプリコンが結合する各々の固相粒子（ビーズ）のＤＮＡが標的に対する親和性を有することが推定され得る。しかしながら、ＳＥＬＥＸ様選択におけるオリゴヌクレオチドを固定化された標的末端溶液に対して試験した場合、アプタマーのビーズへの結合によって親和性が変更されている。そうであるか否かを決定するには、ビーズを標的とともにインキュベートした後、陽性結合結果を検出することができるビーズが選択されることから、この実施の形態に含まれる付加的な選択工程（「実証選択」とも称される）が有利である。次に、シークエンシングの付加的なプロセス及び以下の工程では、この付加的な選択工程において標的にも結合するビーズのみが考慮される。
【０１１１】
この実施の形態を用いて、結合物の品質が改善され、非結合物が再度選別される。この任意の工程を用いて、既に選択されたアプタマーの親和性を再度選択、ひいては改善し、すなわち所望の方向に最適化することができる。初めに結合標的に対する遊離アプタマー、続いて遊離標的に対する結合アプタマーという起こり得る二重選択のために、それにより溶液中の固定化形態及び非結合形態の両方でその標的に結合するアプタマーのより高いヒット率を達成することができる。さらに、アプタマーが、固定化された標的及び溶液中に遊離して存在する標的の両方に結合することがよりよく確認される。
【０１１２】
実証選択の種々の実施の形態を想定することができ、その一部を下記に挙げる：
ビーズの蛍光に基づく親和性の簡単な推定を、蛍光標識標的を用いて行うことができる。これはＦＡＣＳ機器を用いて行うことができる（例えば蛍光活性化細胞選別）。次いで、ビーズを蛍光の異なるプールに分けることができ、これらのプールを続いて別個にシークエンシングし、結合能の異なるアプタマーを得ることができる。
標的を小磁性ビーズに固定化する場合、オリゴヌクレオチドを標的に結合させることができる。次いで、磁気分離を行うことができる。固定化された標的に結合するアンプリコンビーズのみが磁性ビーズと相互作用し、続いて分離される。異なる磁場強度での分離を用いてプールを親和性の異なる領域に形成してもよい。
加えて、例えば標的及び類似分子を使用し、続いて選択を同じ又は異なる親和性について行う競合的アプローチも考え得る。例えば、標的を緑色蛍光で標識し、類似分子を赤色蛍光で標識する場合、差別化は標的の結合のみ（緑色）、類似分子の結合のみ（赤色）及び両方の結合（黄色）のビーズ、ひいてはアプタマーとなり得る。
オン／オフ動態による選択も考え得る。これはビーズを短時間インキュベートした後、それらを即座に測定するか（速いオン動態が高い蛍光強度に不可欠である）、又は長時間高濃度でインキュベートし、非常に長時間激しく洗浄した後、測定する（遅いオフ動態が高い蛍光強度に不可欠である）ことによって行われる。
【０１１３】
アプタマー結合対の同定
本発明のプロセスにアプタマー対を同定する働きがある付加的な工程を補足することができる。したがって、本発明は、アプタマー標的構造の様々な位置に結合するアプタマー結合対を同定する方法であって、上記のプロセスの工程を含み、付加的に、
ａ）アンプリコンのアレイ又はアンプリコンのアレイのコピーをアプタマー標的構造と接触させるとともに、アプタマー標的構造をアレイのアンプリコン／アレイのコピーに含まれるオリゴヌクレオチドに結合させることと、
ｂ）工程ａ）で得られるアレイ又はアレイのコピーをオリゴヌクレオチドの混合物と接触させるとともに、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部をアレイに既に結合したアプタマー標的構造に結合させることと、
ｃ）工程ｂ）においてアプタマー標的構造に結合していないオリゴヌクレオチドを溶出させることと、
ｄ）工程ｂ）において結合したオリゴヌクレオチドをアプタマー標的構造から除去することと、
ｅ）工程ｄ）で得られるオリゴヌクレオチドをシークエンシングするとともに、純粋な形態のオリゴヌクレオチド型を作製又は単離することと、
ｆ）アンプリコンのアレイ又はアンプリコンのアレイのコピーをアプタマー標的構造と接触させるとともに、アプタマー標的構造をアレイ／アレイのコピーの増幅時に存在するオリゴヌクレオチドに結合させることと、
ｇ）工程ｆ）で得られるアレイ又は（or）アレイのコピーを工程ｅ）の純粋なオリゴヌクレオチド型と接触させるとともに、オリゴヌクレオチドをアレイに既に結合した１つ又は複数のアプタマー標的構造に結合させることと、
ｈ）アレイ上のどのアプタマー標的構造（複数の場合もあり）に純粋なオリゴヌクレオチド型が結合しているかを分析するとともに、標的構造をそれが結合したアレイのオリゴヌクレオチド及びアレイ内のその特異的な位置マーカーに割り当てることと、
ｉ）任意に工程ｇ）及び工程ｈ）を１回又は複数回繰り返すことと、
を含む、方法にも関する。
【０１１４】
この方法は「エピトープビニング」とも称される。アプタマーを用いたサンドイッチアッセイをこの方法で行う。標的の異なる官能基（「エピトープ」）に結合する２つのアプタマーを同定する。
【０１１５】
表面に潜在的に結合するアプタマーの全てを表すことによって、標的を異なる官能基に標的化されるように結合させるアプタマー対を発見することが可能である。これらのアプタマーを続いてサンドイッチアッセイに使用することができる。以前の方法ではこのように高度に並行した結合対の分析は可能ではなかった。
【０１１６】
工程ｂ）に使用されるオリゴヌクレオチドの混合物は、上記のアプタマーコピーから回収することによって得ることができる。
【０１１７】
上記のｉＲＩｆＳ技法を用いた結合のモニタリングは有利であるが、不可欠という訳ではない。したがって、アレイ（アプタマーを固定化した）又はそのコピーを初めに標的とともにインキュベートして、アプタマー−標的複合体を形成する。次いで、ｉＲＩｆＳを用いて全ての結合物を同定することができる。次に、アレイを好ましくは回収物からのアプタマープールでコーティングする。好適なプールのアプタマーは、遊離官能基が依然として存在するアプタマー−標的複合体の位置に二次アプタマーとして結合することができる。二次アプタマーの結合はｉＲＩｆＳによって決定することができる。次いで、表面を洗浄して非結合物を除去する。溶出工程では、二次アプタマーを続いて溶解し、再度シークエンシングに供する。これにより、一次アプタマーの配列及び二次アプタマーの配列が全て得られる。二次アプタマーのそれぞれの配列を個別に作製する。次いで、コピーされたアレイを再度標的とともにインキュベートし、二次アプタマーとともにインキュベートする。このため、各々の二次アプタマーに好適な適合する一次アプタマーを見出し、標的の結合パートナーをそれから導き出すことが可能である。ｉＲＩｆＳを用いると、動態又は挙動を様々な条件下で調査し、それにより所望の特性を有するアプタマー対を再度選択することも可能である。
【０１１８】
アレイ及びその使用、デバイス
別の態様では、本発明は、各々が１つのオリゴヌクレオチド型を含有する上記のアンプリコンのアレイ、又は上記の方法によって得ることができる、各々が１つのオリゴヌクレオチド型を含有するアンプリコンのアレイのコピー（ここでオリゴヌクレオチドはアプタマーである）に関する。特に、オリゴヌクレオチドは、本発明によるプロセスを参照して上に既に説明したように１つ又は複数の可変領域及び一次領域を有する。
【０１１９】
本発明の付加的な態様は、アプタマー標的構造に対するアプタマーの結合特性の分析、所定の標的構造に対するアプタマーの同定、又は所定のアプタマー標的構造の異なる位置に結合するアプタマー結合対の同定へのかかるアレイ又はかかるアレイのコピーの使用に関する。アプタマー及びアプタマー結合対を同定する方法は、本明細書において先に論考した。
【０１２０】
最後に、本発明は、アプタマーを作製するデバイスであって、
オリゴヌクレオチドの混合物をアプタマー標的構造と接触させるとともに、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を標的構造に結合させるユニット、
アプタマー標的構造に結合したオリゴヌクレオチドを、アプタマー標的構造及びアプタマー標的構造に結合していないオリゴヌクレオチドから分離するユニット、
アプタマー標的構造に結合した個々のオリゴヌクレオチドを空間的に分離して増幅するとともに、各々が好ましくは１つのオリゴヌクレオチド型を含有する複数の空間的に分離されたアンプリコンを得るユニット、
空間的に分離されたアンプリコンの複数に対して特異的なマーカーを、マーキングされた各々のアンプリコンがその特異的なマーカーに基づいて明確に識別可能であるように生じさせるユニット、
複数のマーキングされたアンプリコンのオリゴヌクレオチドをシークエンシングするユニット、及びアンプリコンに特異的なマーカーを、アンプリコンのオリゴヌクレオチド型の配列に割り当てるデバイス、
アプタマー標的構造に対するオリゴヌクレオチド型の結合特性を分析するとともに、分析された結合特性を、アンプリコンの特異的なマーカー及びオリゴヌクレオチド型の配列に割り当てるユニット、
を含む、デバイスにも関する。
【０１２１】
上記の全ての実施の形態及びプロセスの全ての補足工程を行うのに好適であるようにデバイスを設計することもでき、デバイスはかかる装置を有し得る。本発明によるプロセスの例示的な実施の形態は上に記載されている。本発明によるプロセス工程を実行する対応する装置及び／又はデバイスの例示的な実施の形態は、本明細書から導き出すことができ、又は当業者に明らかである。したがって、本発明によるデバイスが物理的実体、例えば様々なアレイ、支持体又は基質を必要に応じて位置決めするのに好適な取扱装置を有し得ることを更に説明する必要はない。さらに、それぞれの液体及び／又は作用物質を必要とされる位置に供給する好適な流体装置を設けてもよいことを更に説明する必要はない。さらに、対応する制御装置を本発明による方法を実行するデバイスを制御するために設けてもよいことが当業者に明らかである。本方法を行うのに必要とされる環境を生成する装置、例えば温度センサーを設けてもよい。
【０１２２】
本発明を例示的な実施形態に基づいて下記に説明する。
【発明を実施するための形態】
【０１２３】
１．方法の説明
好ましい方法の一例を図１を参照して下記に説明する。
【０１２４】
準備：オリゴヌクレオチドライブラリーの設計
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）に適合するオリゴヌクレオチドライブラリーを、好ましくは設計する。ライブラリーのプライマー領域をシークエンシング（ＮＧＳ）に適合するように選択し、標的結合ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを直接ＮＧＳによるシークエンシングプロセスに供する。このオリゴヌクレオチドライブラリーは、様々なプロセスに（例えば、様々な標的に対して）使用することができる。
【０１２５】
固定化された標的に対するアプタマーの選択
結合工程４においては、およそ１０１５個の異なるｓｓＤＮＡ分子からなるオリゴヌクレオチドライブラリー１を、標的ビーズ３に固定化した標的２と接触させる。個々のオリゴヌクレオチドをこのようにして標的分子、ひいては標的ビーズ３に結合することができる。次いで、標的分子に僅かしか又は全く結合していないオリゴヌクレオチド１’を洗浄工程５によって除去する。ＲＮＡオリゴヌクレオチドライブラリーを、ｓｓＤＮＡのオリゴヌクレオチドライブラリーの代替物として使用してもよい。
【０１２６】
結合したオリゴヌクレオチドの標的からの溶出
残存する結合オリゴヌクレオチドをその標的結合、ひいては標的ビーズ３から好適な溶出工程６によって放出させる。
【０１２７】
エマルションＰＣＲを用いたオリゴヌクレオチドビーズの生成
溶出したオリゴヌクレオチド７をエマルションＰＣＲ９に供する。初めに、各々のオリゴヌクレオチドを正確に１つのビーズ１０へとコピーした後、再生する。或るビーズ１０はオリゴヌクレオチド７ａを担持し、別のビーズ１０はオリゴヌクレオチド７ｂを担持し、また別のビーズ１０はオリゴヌクレオチド７ｃを担持し、更に別のビーズ１０はオリゴヌクレオチド７ｄを担持する。ビーズは、全てのビーズについて同一であり、オリゴヌクレオチドが塩基対合によって結合する共有結合したアダプター配列（図示せず）を担持する。選択図では、２つのビーズ１０が、プールに数倍存在していたオリゴヌクレオチド７ｄを担持する。決定的要因は、各々のビーズ１０が或る特定のオリゴヌクレオチドのみを担持することである。油エマルションを使用して、いずれの場合にも１つのオリゴヌクレオチド鎖及び１つのビーズが封入される結果を達成する。ＰＣＲの後、各々のビーズが正確に１つのオリゴヌクレオチドの１０００万個のコピーを有し、本明細書に示す概要図では、各々のビーズ１０についてオリゴヌクレオチドの４個〜６個のコピーが存在する。オリゴヌクレオチドビーズ１０のプールが得られる。ＤＮＡはビーズ上に何度も複製することができる。ＲＮＡオリゴヌクレオチドライブラリーを使用した場合、逆転写酵素エマルションＰＣＲを行う。
【０１２８】
使用するビーズに応じて、任意にフォワードプライマー又はリバースプライマーをビーズ上に配置することができる。Rocheによる４５４の場合、これはシークエンサーアダプターＡ又はＢである。
【０１２９】
本明細書に示す実施形態では、任意の付加的な結合工程１１及び選択工程８（実証選択）を行う。結合工程１１においては、オリゴヌクレオチド７とともに溶解し、蛍光標識１２を担持する標的２をビーズ１０に添加する。標識された標的はオリゴヌクレオチドの一部のみ、すなわち本明細書で選択された概要図ではオリゴヌクレオチド７ｂ、７ｃ及び７ｄに結合するが、７ａには結合しない。選択工程８においては、オリゴヌクレオチド７ｂ、７ｃ及び７ｄ並びに結合標的２を有するビーズ１０を選択する。
【０１３０】
オリゴヌクレオチドビーズのシークエンシング
オリゴヌクレオチド７ｂ、７ｃ及び７ｄを有する選択されたオリゴヌクレオチドビーズを、次世代シークエンシングプロセスに送る。シークエンシングのために、充填工程１３において、ビーズを付加的なより小さいビーズ（図示せず）とともにピコウェルプレート１４（本明細書でチップと称する）のキャビティ１５に添加する。小さなビーズは、以下のシークエンシング工程１６においてＤＮＡビルディングブロックの組込みの際に光を発生する酵素系を担持する。光シグナルは組み込まれるＤＮＡビルディングブロックの数について定量的である。チップ１４はハニカムのように拡大して示される。各々のハニカムセルは、光ファイバー（図示せず、直径およそ４５μｍ）に連結し、オリゴヌクレオチドを有するビーズを含有するキャビティ１５を表す。結果として、これにより選択工程８において選択されたプールの全てのオリゴヌクレオチドの配列が得られる。
【０１３１】
この場合のハイスループットシークエンシング技法は、４５４シークエンサー（Roche）を用いる次世代シークエンシング技法である。代替的には、Illumina、Solexa、Solid、Ion Torrent、ABI等による他のシークエンサーを使用することができる。
【０１３２】
シークエンサーチップのオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチドアレイへのコピー
ＤＮＡからＤＮＡへのコピー技法を用いて、選択されたプールのオリゴヌクレオチドを、コピー工程１７においてアレイ２０の形態でシークエンサーチップから平坦な支持体１８へとコピーする。支持体１８上のアレイ２０は、シークエンシングした全てのオリゴヌクレオチド、すなわち本明細書では例えば７ｂ、７ｃ、７ｄを含有する。このため、最大で１０６個のスポット（１９として示す）を初めは二本鎖ＤＮＡで生成することが可能である。対応する後処理（workup）工程において、ｓｓＤＮＡを作製することにより、標的結合に対して機能的なＤＮＡを作製し、各々のスポット１９が、選択されたオリゴヌクレオチドの均一な配列を担持する。図２〜図５を参照してコピー工程を下記により詳細に説明する。
【０１３３】
得られるアレイの測定及び分析
次に、対応する標的に対するアレイ２０の全てのオリゴヌクレオチドの結合の分析を工程２１において行う。初めの概要については、例えば蛍光標的を用いて測定を行うことができる。次いで、結合アプタマーをその蛍光の増大によって同定することができる。
【０１３４】
好ましい実施形態では、概要に説明したｉＲＩｆＳ技法を用いて結合を検出する。この技法の性能は、C. Hanel et al., Analytical and Bioanalytical Chemistry 372 (2002), 91-100、J. Piehleret al., Analytical Biochemistry 249(1997), 94-102及び米国特許出願公開第２０１０２９７６７１号に記載されている。このため、標的分子と個々の各ＤＮＡスポットとの間の相互作用が存在するか否か及びその強さ及びその動態パラメーターを、リアルタイムで標識なしに確認することが可能である。アレイ上の全てのアプタマーの結合動態及び親和性定数を並行して決定する。さらに、標的親和性の並行試験を様々な条件（温度、ｐＨ、塩含量等）下で行い、アレイ上の最大で１０６個のＤＮＡスポットを同時に分析する特異性の試験を行うことができる。
【０１３５】
アプタマー配列の割当て
個々のオリゴヌクレオチドの親和性定数を比較して評価する。アプタマーは、標的に対する親和性が最も高いオリゴヌクレオチドである。ＤＮＡからＤＮＡへのコピー技法により、工程１７において、アプタマーアレイ２０のアプタマースポット１９がシークエンサーチップ１４と同じ位置に位置することが確実であるため、その配列はシークエンシング工程１６の結果から直接導き出すことができる。これにより結合と配列との間で明確な割当てをもたらすことができる。
【０１３６】
２．コピー工程
上記の例に用いられるコピー工程１７を、図２Ａ〜図２Ｄ、図３、図４及び図５を参照して付加的な例示的な実施形態ａ）及びｂ）に基づいてより詳細に説明する。
【０１３７】
例示的な実施形態ａ）（図２Ａ〜図２Ｄ、図３、図４）
同一の対象に対する参照番号は図１に使用するものと同じである。
【０１３８】
シークエンサーチップ１４は複数のマイクロキャビティ１５を有する。図３は、マイクロキャビティ１５を有するシークエンサーチップ１４（第１の支持体）の詳細の概略上面図を示す。マイクロキャビティは、例えば図３に示すように４４μｍの寸法を有し得る。このシークエンサーチップは、例えばRoche社による４５４シークエンサーのシークエンサーチップ（ＧＳ  ｔｉｔａｎｉｕｍ  ２００５及びＧＳ  ＦＬＸ  ｔｉｔａｎｉｕｍ  ２００８）であり得る。
【０１３９】
粒子１０は各々のキャビティ１５内に位置し、これらの粒子は各々１つのオリゴヌクレオチド７ｂ、７ｃ、７ｄ（図１参照）及び７ｅ（図１には図示せず）の各々の無数のコピーを有する。複数のコピーは、先の例に基づいて説明される空間的に分離された増幅であるエマルションＰＣＲによって得られる。図４は、オリゴヌクレオチド７ｂ、７ｃ、７ｄ、７ｅを有する粒子１０を導入するキャビティ１５を有するシークエンサーチップ１４の概略断面図を示す。
【０１４０】
図２〜図４に示す例示的な実施形態において、このチップをコピーの作製用の一次アレイとして使用する。キャビティ１５のオリゴヌクレオチドがそれらからコピーされる。この目的でキャビティは初めに増幅因子、例えばＰＣＲミックスで充填される。次いで、図２に示されるように、キャビティ１５を閉鎖し、増幅因子に適合する結合アダプターを担持する支持体１８（第２の支持体）が適用され、図２ｂにおいてスポット２２として概略的に示される。キャビティ１５がカバー１８で閉鎖された後、それにより空間的に制限された増幅領域２４が各々のサンプル、すなわちＤＮＡ鎖７ｂ、７ｃ、７ｄ、７ｅが結合した各々の粒子１０について生成し、この増幅領域が他のサンプルの増幅領域２４から分離される。結合アダプター２２はこれらの増幅領域２４に隣接する。この例では、結合アダプター２２は、相補鎖とハイブリダイズして、オリゴヌクレオチド７ｂ、７ｃ、７ｄ、７ｅを形成するプライマーである。これらのプライマー２２はＤＮＡポリメラーゼの結合部位でもある。図２ｂには、オリゴヌクレオチド７ｂ、７ｃ、７ｄ、７ｅの相補鎖７ｂ’、７ｃ’、７ｄ’、７ｅ’を作製する増幅工程（既に行われ、複数のオリゴヌクレオチドを有するビーズが得られる本明細書のエマルションＰＣＲ後の第２の増幅工程、上記を参照されたい）後の状態を既に示している。これらの相補鎖は図２ｂにおいて点線７として表される。相補鎖７ｂ’、７ｃ’、７ｄ’、７ｅ’はオリゴヌクレオチドのネガコピーを表す。
【０１４１】
次いで、オリゴヌクレオチドのネガコピー７ｂ’、７ｃ’、７ｄ’、７ｅ’を粒子１０から放出させるが、これは例えばシークエンサーチップ、ひいてはこれらが位置するキャビティを加熱することによって達成することができる。次に、放出されたコピー７ｂ’、７ｃ’、７ｄ’、７ｅ’を結合アダプター２２とハイブリダイズするが、これは例えばシークエンサーチップを冷却することによって支持することができる。結合アダプター２２、ひいては支持体１８へのコピー７ｂ’、７ｃ’、７ｄ’、７ｅ’の堆積の結果を図２ｃに示す。ネガコピーを支持体１８へと移動させるこの工程では、空間的に制限された増幅領域２４が各々のサンプルについて設けられ、増幅領域２４が互いに分離されるため、位置情報及び／又は記録が保存される。
【０１４２】
次に、ネガコピー７ｂ’、７ｃ’、７ｄ’、７ｅ’が結合する支持体１８をシークエンサーチップ１４から除去するが、これはシークエンサーチップ１４のキャビティ１５内のヌクレオチド７ｂ、７ｃ、７ｄ、７ｅのアレイのネガコピーを含有する。ネガコピー７ｂ’、７ｃ’、７ｄ’、７ｅ’を有する支持体１８を別の増幅工程に供して、プライマー２２を伸長することによって得られるポジコピー７ｂ、７ｃ、７ｄ、７ｅを再度得ることができる。かかる手順は以下の実施例ｂ）に記載されている。
【０１４３】
オリゴヌクレオチド７ｂ、７ｃ、７ｄ、７ｅを有する粒子１０はキャビティ１５内に残存するため、各々の粒子を再度新たな支持体を用いた新たなコピー操作の一次アレイとすることができる。このため、実質的に任意数のコピーを作製することが可能である。
【０１４４】
コピー操作後に付加的なコピーサイクルの一次アレイ（シークエンサーチップ１４）を再度調製するために、キャビティ内の増幅因子、例えばＰＣＲミックスを交換又は除去することができる。
【０１４５】
例示的な実施形態ｂ）（図５）
ビーズ１０は各々異なるが、同じ末端配列を有するオリゴヌクレオチドを担持する。このプロセスはオリゴヌクレオチド７ｂに基づいて示される。可溶性プライマー３０を含有するＰＣＲミックスでキャビティを充填し（ｂ）、アダプター分子２２（固定プライマー）を担持するカバー１８（第２の支持体）で閉鎖する（ｃ）。工程（ｄ）において、ＰＣＲミックス中の酵素により初めにビーズ上にオリゴヌクレオチド７ｂのネガコピー７ｂ’を生成し、このネガコピーを続いて加熱によって溶解する（ｅ）。ネガコピー７ｂ’はカバーの結合アダプター２２に冷却プロセスによって結合し（ｆ）、工程（ｇ）において酵素により固定されて結合したネガコピーのネガコピー７ｂ、すなわちオリジナルのオリゴヌクレオチド７ｂのポジコピー７ｂが生成する。プロセスの終了時に、カバー１８を除去すると、アレイ（ｉ）のコピー（ｈ）がカバー上に位置する。非共有結合ネガコピー７ｂ’、７ｃ’、７ｄ’、７ｅ’を洗浄工程（図示せず）において除去することができる。次に、支持体１８上のアレイのコピーを標的結合実験に使用する。
【０１４６】
オリジナル（ｉ）はプロセス中に消費されない。例えばプロセスを繰り返し、付加的なコピーを作製するために、これを洗浄し、再度ＰＣＲミックスで充填し、再利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】好ましい方法の一例を示す。
【図２】例示的な実施形態ａ）（図２Ａ〜図２Ｄ）
【図３】例示的な実施形態ａ）
【図４】例示的な実施形態ａ）
【図５】例示的な実施形態ｂ）
【符号の説明】
【０１４８】
２：標的
７：オリゴヌクレオチド
７ａ：オリゴヌクレオチド
７ｂ：オリゴヌクレオチド
７ｃ：オリゴヌクレオチド
７ｄ：オリゴヌクレオチド
８：選択工程
９：エマルションＰＣＲ
１０：ビーズ
１１：任意の付加的な結合工程
１２：蛍光標識
１３：充填工程
１４：ピコウェルプレート
１４：チップ
１５：キャビティ
１６：シークエンシング工程
１７：コピー工程
１８：支持体
２０：アレイ
２１：分析工程
２２：スポット
２２：結合アダプター
２２：プライマー
２２：アダプター分子
２４：増幅領域
３０：可溶性プライマー
【図１】
2014532396.tif 000003
【図２】
2014532396.tif 000004
【図３】
2014532396.tif 000005
【図４】
2014532396.tif 000006
【図５】
2014532396.tif 000007
【配列表】
2014532396000001.app
【国際調査報告】
2014532396.tif 000008
2014532396.tif 000009
2014532396.tif 000010
2014532396.tif 000011
2014532396.tif 000012
2014532396.tif 000013
2014532396.tif 000014
2014532396.tif 000015