(57)【要約】本発明は、試料中の基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ（広域スペクトルセファロスポリン加水分解性β−ラクタマーゼ）産生細菌の存在を検出するための方法であって、該方法が、ａ）酵素懸濁物を得るために被験試料に細胞溶解を行うステップ；及びｂ）ステップａ）で得られた酵素懸濁物の部分を試薬キットと反応させるステップを含み、該試薬キットが、セファロスポリン、アズトレオナム、及びセファマイシンから成る群より選択される基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ基質、ならびに反応混合物のｐＨが６．４から８．４の間に含まれるときに色が変化するｐＨ変色指示薬を含み、ここで、ステップｂ）の後の色の変化が、被験試料中に基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌が存在することを示す、方法に関する。本発明は、また、試薬キット、マイクロタイタープレート、及び被験試料中の基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生菌の存在を検出することにおけるそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌の存在を検出するための方法であって、該方法が、
ａ）酵素懸濁物を得るために被験試料に細胞溶解を行うステップ；及び
ｂ）ステップａ）で得られた酵素懸濁物の部分を試薬キットと反応させるステップ
を含み、該試薬キットが、
−  セファロスポリン、アズトレオナム及びセファマイシンから成る群より選択される基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ基質、ならびに
−  反応混合物のｐＨが６．４から８．４の間に含まれるときに色が変化するｐＨ変色指示薬
を含み、ここで、ステップｂ）の後の色の変化が、被験試料中に基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌が存在することを示す、方法。
【請求項２】
被験試料が、血液試料及び尿試料から成る群より選択される生物学的試料である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
カルバペネマーゼ産生細菌が、Acinetobacter、Aeromonas、Bacillus、Bacteriodes、Citrobacter、Enterobacter、Escherichia、Klebsiella、Morganella、Pandoreae、Proteus、Providencia、Pseudomonas、Ralstonia、Raoultella、Salmonella、Serratia、Shewanella、Shigella及びStrenotrophomonasから成る属より選択される、請求項１又は２のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
ステップｂ）における反応が、１５℃から４０℃の間、好ましくは２０℃から３７℃の間に含まれる温度で実施される、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
ステップｂ）における反応が、色の変化を観察するために十分な時間にわたり実施され、好ましくは色の変化が、５分から１２０分の間、好ましくは１０から６０分の間、より好ましくは２０から４０分の間に含まれる時間内で視覚的に観察される、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ａ）酵素懸濁物を得るために生物学的試料に細胞溶解を行うステップ；及び
ｂ）ステップａ）で得られた酵素懸濁物の部分を試薬キットと反応させるステップ
を含む方法であって、該試薬キットが、
−  基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ基質としてのセフォタキシム、及び
−  ｐＨ変色指示薬としてのフェノールレッド
を含み、ここで、ステップｂ）の後の赤から黄への色の変化が、生物学的試料中に基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌が存在することを示す、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
セファロスポリン、アズトレオナム及びセファマイシンから成る群より選択される基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ基質ならびにｐＨ変色指示薬を含む試薬キット。
【請求項８】
β−ラクタマーゼ阻害剤をさらに含む、請求項６又は７記載の試薬キット。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項記載の方法により試料中の基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌の存在を検出するための、請求項６〜８のいずれか一項記載の試薬キットの使用。
【請求項１０】
セファロスポリン、アズトレオナム、及びセファマイシンから成る群より選択される基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ基質を含むウェル又は一連のウェルを含むマイクロタイタープレート。
【請求項１１】
−  セファロスポリン、アズトレオナム及びセファマイシンから成る群より選択される基質特異性拡張型β−ラクタマーゼならびにAmblerクラスＡのβ−ラクタマーゼ阻害剤を含むウェル又は一連のウェル；
−  セファロスポリン、アズトレオナム及びセファマイシンから成る群より選択される基質特異性拡張型β−ラクタマーゼならびにAmblerクラスＢのβ−ラクタマーゼ阻害剤を含むウェル又は一連のウェル；
−  セファロスポリン、アズトレオナム、及びセファマイシンから成る群より選択される基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ基質ならびにAmblerクラスＣのβ−ラクタマーゼ阻害剤を含むウェル又は一連のウェル；ならびに
−  セファロスポリン、アズトレオナム及びセファマイシンから成る群より選択される基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ基質ならびにAmblerクラスＤのβ−ラクタマーゼ阻害剤を含むウェル又は一連のウェル
をさらに含む、請求項１０記載のマイクロタイタープレート。
【請求項１２】
各ウェルに少なくともｐＨ変色指示薬及び被験酵素懸濁物の部分が添加される、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法により試料中の基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌の存在を検出するための、及び／又は試料中に存在する特定クラスのＥＳＢＬを決定するための、請求項１１記載のマイクロタイタープレートの使用。
【請求項１３】
セファロスポリンが、セフォタキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフェピム、セフピロム及びアズトレオナムから成る群より選択され、好ましくはセフォタキシムであり、セファマイシンが、モキサラクタム及びセフォキシチンから成る群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法、請求項７〜９のいずれか一項記載の試薬キット及びその使用、ならびに請求項１０〜１２のいずれか一項記載のマイクロタイタープレート及びその使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、臨床試料中又は培養細菌から基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ（広域スペクトルセファロスポリンを加水分解するβ−ラクタマーゼ）の存在を検出するための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
グラム陰性細菌は、院内感染及び市中感染の重要な原因であり、Escherichia coliが最も重要なヒト病原体である。多剤耐性腸内細菌科（Escherichia coli、Klebsiella pneumonia、Proteus mirabilis、Serratia marscescens、Enterobacter sppなど）、Pseudomonas sp.及びA. baumanniiは、多くの場合に限られた治療選択肢に結び付く。それらの多剤耐性単離株は、主として、セフォタキシム、及び／もしくはセフタジジム、及び／もしくはセフェピムなどの広域スペクトルセファロスポリン、ならびに／又はアズトレオナムに対して拡張型活性を有するβ−ラクタマーゼを発現する。それらの基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生菌は、日常的な抗生物質感受性試験を使用して検出することが困難なおそれがあり、最初はいくつかの広域スペクトルセファロスポリン分子に感受性に見えるおそれがある。基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌の不正確な同定及び／又は同定の遅れは、付随する不適切な抗菌療法選択及び治療の失敗を招いた。したがって、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生菌の迅速で最適な検出は、臨床状況で第一に重要である。
【０００３】
β−ラクタマーゼは、通例、二つの異なる一般スキーム、すなわちAmblerの分子分類及びBush-Jacoby-Medeirosの機能分類にしたがって分類される。Amblerのスキームは、β−ラクタマーゼを酵素のタンパク質相同性に応じて四つのクラスに分類するものであり、クラスＡ、Ｃ及びＤのβ−ラクタマーゼはセリン−β−ラクタマーゼであって、クラスＢの酵素はメタロβ−ラクタマーゼである。２番目の分類は、酵素の機能的性質に基づくBush-Jacoby-Medeirosの機能スキームである。用語「基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）は、１９８０年代にBush-Jacoby-Medeirosの機能スキームで群２ｂｅに分類された、オキシイミノセファロスポリンを加水分解することができるＴＥＭ及びＳＨＶ派生体に本来適用された。それらの酵素はAmblerクラスＡ群のβ−ラクタマーゼに属し、それらの活性は、タゾバクタム、クラブラン酸及びスルバクタムなどのクラスＡ阻害剤によって阻害される。７００種を超える異なるβ−ラクタマーゼが記載されており、その多くが広域スペクトルセファロスポリンを加水分解し、各タイプのAmbler群酵素に属する。加えて、それらの基質特異性拡張型酵素のいくつかは、セファロスポリンだけでなく、最も広域な活性スペクトルを有するβ−ラクタムであるカルバペネムも加水分解することができる。
【０００４】
したがって、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼは、以下のように各Amblerクラスの酵素に群分けすることができる。
【０００５】
１−  AmblerクラスＡ酵素；クラブラン酸、タゾバクタム及びスルバクタムによって阻害される。これらの酵素（ＥＳＢＬ）は、大部分はＳＨＶ、ＴＥＭ及びＣＴＸ−Ｍ群である。ＳＨＶ及びＴＥＭ ＥＳＢＬＳは、大部分が院内感染源として腸内細菌科（K. pneumoniae、Enterobacter sp.）から報告された一方、ＣＴＸ−Ｍは市中の患者にとっても大きな脅威になりつつある。それらは、アジアなどの世界のある地域におけるE. coli単離株の最大６０〜８０％から同定されうる。それらは、E. coliによる主感染源である尿路感染からだけでなく、肺炎及び敗血症などのずっと重症の感染症からも同定される。ＣＴＸ−Ｍ酵素は、大部分は腸内細菌科から伝達性プラスミド上に同定される。加えて、ＫＰＣ酵素などのそのクラスの少数の酵素は、カルバペネムを加水分解することができる。
【０００６】
２−  AmblerクラスＢ酵素。これらの酵素は、カルバペネムを加水分解する全ての追加的な性質を有し、クラブラン酸、タゾバクタム及びスルバクタムによってではなく、亜鉛キレート剤（ＥＤＴＡ）の添加によって阻害される。これらのメタロβ−ラクタマーゼは、大部分は腸内細菌科、Pseudomonas aeruginosa及びAcinetobacter baumanniiなどの院内病原体から同定される。それらは、大部分がＩＭＰ、ＶＩＭ、及びＮＤＭタイプである。
【０００７】
３−  AmblerクラスＣ酵素又は一般に「セファロスポリナーゼ」として知られている酵素は、広域スペクトルセファロスポリンを様々な程度まで加水分解する。それらの活性は、クロキサシリン及び他のメチシリン関連分子によって、ならびにボロン酸によって阻害される。それらは、多数の腸内細菌種（Enterobacter sp、Serratia、Citrobacter freundiiなど）、Pseudomonas aeruginosa、及びAcinetobacter baumanniiから同定される。これらの染色体コード型酵素は、それらの野生型細菌種に低レベルで発現され、それらの種がなぜ多くの広域スペクトルセファロスポリン（特にセフタジジム）に感受性のままであるかを説明している。それらの酵素は高レベルに発現されると、それらのセファロスポリンに対する獲得耐性表現型を付与する。加えて、それらのセファロスポリナーゼ遺伝子は、多数の他の腸内細菌種（E. coli、K. pneumonia、P. mirabilis、Salmonella）のプラスミド上に同定することができるので、獲得されたセファロスポリン耐性の形質の説明がつく。臨床的に見た場合、獲得プラスミド介在性セファロスポリナーゼは、同じ単離株中に付随しうるＣＴＸ−Ｍよりも頻度が低い。
【０００８】
４−  セファロスポリンを加水分解する拡張型能力を有するAmblerクラスＤ酵素は、大部分がPseudomonas aeruginosaから報告されている（ＯＸＡ−１０派生体）。それらの活性は、クラブラン酸、スルバクタム及びタゾバクタムによっても、ＥＤＴＡによっても阻害されない。
【０００９】
任意の臨床環境（救急治療設備、長期治療設備、市中におけるＥＳＢＬの重要性を考慮して、検出はそれらのＥＳＢＬに焦点を合わされた。
【００１０】
少なくとも全ての臨床的に重大なE. coli及びK. pneumoniaeは、ＥＳＢＬについてスクリーニングを受けるべきであると推奨されている。セフポドキシムについてＭＩＣ≧８mg/L又はセフタジジム、セフォタキシム、セフトリアキソン、又はアズトレオナムに対してＭＩＣ≧２mg/Lのそれらの菌種は、表現型同定試験を使用して検討すべきであると推奨されている。それらの表現型試験では、単独又はクラスＡのβ−ラクタマーゼ阻害剤と併用したセフォタキシム、セフタジジムなどに対する感受性が比較される。その目的のために最初、ダブルディスク法（double disk synergy test）が提案された。この試験は、セフォタキシム（３０μg）を含有するディスク及びアモキシシリン／クラブラン酸塩（それぞれ２０μg／１０μg）を含有するディスクを３０mm間隔（中心から中心まで）で載せた寒天プレート上で行われる。セフォタキシムディスク周囲の阻止帯がアモキシシリン／クラブラン酸塩ディスク方向に拡張すると、ＥＳＢＬの産生を示す。他のオキシイミノ−β−ラクタム（セフトリアキソン、セフタジジム、又はアズトレオナム）を含有するディスクを、セフォタキシムディスクの代用にすることができる。「Etest（登録商標）」技法も、ＥＳＢＬの検出のために使用される。この技法は、多数の微生物の抗菌感受性を決定するための定量技法である。このシステムは、予め定義された抗生物質勾配を含み、寒天培地上で一晩インキュベーションして試験したときに、微生物に対する異なる抗菌剤の最小阻止濃度（ＭＩＣ）をmg/L単位で決定するためにその勾配が使用される。ＥＳＢＬの検出の場合、E-testストリップの片面にセフタジジムの濃度勾配を、反対側にセフタジジムの濃度勾配及び一定濃度のクラブラン酸塩を含浸させることができる。セフォタキシム／クラブラン酸塩又はセフェピムクラブラン酸塩を含浸させた類似のストリップが開発されている。クラブラン酸塩の存在下で被験薬のＭＩＣ値が３分の１未満になることが観察されたとき、EtestのＥＳＢＬの結果は陽性と解釈される。ダブルディスク法及びE-testの感度及び特異性は、８０〜９５％と極めて良好である。
【００１１】
細菌の同定及び感受性試験のための自動化法は、ＥＳＢＬ産生生物の検出に使用される。BD Phoenixシステム（Becton-Dickinson）は、その専門ソフトウェアを使用して、クラブラン酸塩の存在下又は不在下でセフタジジム、セフォタキシム、セフトリアキソン及びセフポドキシムに対する成長応答を解釈する。同様に、Vitek2システム（bioMerieux）は、セフタジジム及びセフォタキシムを単独及びクラブラン酸と共に含有するカードを使用する。セフタジジム及びセフォタキシムにβ−ラクタマーゼ阻害剤を加えたものは、MicroScan Walkaway-96システム（Dade Behring）にも使用される。これらのシステムの性能は多様であり、検討される種により異なり、特異性（５０％〜８０％）よりもずっと高い感度（８０％〜９９％）を有する。
【００１２】
ＰＣＲに基づく技法及び他の分子的技法もＥＳＢＬ遺伝子の同定を助ける場合があるが、それらの技法には時間及び費用がかかる。それらのＰＣＲに基づく技法は、感受性試験及び表現型同定の前に臨床試料から細菌を単離する必要がある。したがって、それらの結果を得ることができるのは、臨床試料の入手から良くても４８時間後である。それらは普通、日常的な検査では行われず、疫学目的に限られる。
【００１３】
ＥＳＢＬ産生腸内細菌に感染した患者が、ＥＳＢＬを産生しない病原体に感染した患者よりも転帰が不良であるので、これらのＥＳＢＬ産生菌を可能な限り早く検出することが重要である。
【００１４】
臨床微生物学の分野において基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ（特にＥＳＢＬ）産生菌の検出を容易にするために、本出願人は、簡便な酸比色技法に基づく新規な方法を開発した。この方法は、広域セファロスポリン基質のβ−ラクタム環を加水分解することによって、その酵素がカルボキシル基を生成し、それが今度は培地を酸性化するという概念に基づく。次に、この加水分解に起因する酸度が、ｐＨ変色指示薬の色の変化によって確認される。
【００１５】
この方法は、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生菌を非産生菌と区別することを助ける。
【００１６】
解釈可能な結果が非常に短時間で得られ、このことは、産生菌の処置を計画する上で重要である。この方法は、上述の表現型技法を用いる必要を排除する。
【００１７】
この方法は、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生菌、特にＥＳＢＬ産生菌の、迅速で信頼性のある、手ごろな価格の検出のための一解決策を提供する。この方法は、また、工業化工程に送られうることにより、検査技師にあまり大きな作業量を追加せずに世界中の任意の臨床微生物検査室で実施することができる。この方法は、コロニーの段階に成長した細菌に使用できるだけでなく、臨床試料で直接使用することができる。
【００１８】
そのうえ疫学分野において、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ遺伝子の同定のためにＰＣＲによって試験し、配列決定すべき株を迅速に選択したい場合、この方法の使用がさらに役立ちうる。
【００１９】
発明の概要
本発明は、試料中の拡張型β−ラクタマーゼの存在を検出するための方法であって、該方法が、
ａ）酵素懸濁物を得るために被験試料に細胞溶解を行うステップ；及び
ｂ）ステップａ）で得られた酵素懸濁物の部分を試薬キットと反応させるステップ
を含み、該試薬キットが、
−  基質として広域スペクトルセファロスポリン又はアズトレオナム（aztreonm）、及び
−  反応混合物のｐＨが６．４から８．４の間に含まれるときに色が変化するｐＨ変色指示薬
を含み、ここで、
ステップｂ）の後の色の変化が、被験試料中にＥＳＢＬ又は非ＥＳＢＬ基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌が存在することを示す、方法に関する。
【００２０】
本発明は、また、広域スペクトルセファロスポリン又はアズトレオナム又はセファロスポリン及びセファマイシンから成る群より選択されるセファロスポリナーゼ基質と、ｐＨ変色指示薬とを含む試薬キット、ならびに被験試料中のＥＳＢＬ及び／又は非ＥＳＢＬ基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌の存在を検出することにおけるその使用に関する。
【００２１】
本発明は、また、セファロスポリン又はアズトレオナムから成る群より選択されるカルバペネマーゼ基質を含むウェル又は一連のウェルを含むマイクロタイタープレート、被験試料中のＥＳＢＬ及び／又は非ＥＳＢＬ基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌の存在を検出することにおけるその使用、ならびに被験試料中に存在する特定クラスの基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌を最終的に決定することにおけるその使用に関する。
【００２２】
発明の詳細な説明
定義：
本明細書に使用されるような「被験試料」は、ＥＳＢＬ又は非ＥＳＢＬ基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌を含有しうる、任意の液体又は固体被験物質を意味する。典型的には、細菌コロニーはそのような物質から単離されうる。好ましい「被験試料」は生物学的試料である。
【００２３】
本明細書に使用されるような「生物学的試料」は、対象から得られた任意の生物学的試料を意味する。そのような「生物学的試料」の例には、液体、組織、細胞試料などが挙げられる。好ましい「生物学的試料」は、全血、血清、血漿又は尿である。
【００２４】
本明細書に使用されるような「対象」は、げっ歯類、ネコ、イヌ、及び霊長類などの哺乳類を示す。好ましくは、本発明による「対象」はヒトである。
【００２５】
本明細書に使用されるような「ｐＨ変色指示薬」は、溶液／培地のｐＨを視覚的に決定できるように溶液に少量添加されるハロクロミー性化学化合物である。指示薬は、ｐＨに応じて溶液／培地の色を変化させる。
【００２６】
本明細書に使用されるような「酵素懸濁物」は、細胞溶解のステップ（本発明による方法のステップａ））が被験試料の細胞内に存在する酵素の遊離を助けることにより「酵素懸濁物」が得られることを意味する。
【００２７】
本明細書に使用されるような「部分」は、本発明によるステップａ）で得られた酵素懸濁物の全て又は一部を、ステップｂ）で試薬キットと反応させるために採取することを意味する。典型的には、本発明による「部分」は、酵素懸濁物の一部である。好ましくは、本発明による「部分」は、１０μL〜５０μLである。
【００２８】
本明細書に使用されるような「キット」は、いくつかの異なる構成要素を本発明の方法に別々、同時又は連続的に使用するために組み合わせ製品として含む製品である。好ましくは、それらの構成要素は、セファロスポリン及びアズトレオナムから成る群より選択されるＥＳＢＬ又は非ＥＳＢＬ基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌基質、ｐＨ変色指示薬、及び場合によりＥＳＢＬ阻害剤である。
【００２９】
検出方法：
既述のように、ＥＳＢＬ及び非ＥＳＢＬ基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌の早期検出は、それらの蔓延を防止し、抗生物質療法を迅速に適用して重症感染を処置するために臨床微生物学の分野における重要問題になりつつある。
【００３０】
この問題の一解決策として、本出願人は任意の種類の基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌性産生菌を検出するための迅速で信頼性のある、手ごろな価格の方法を開発した。
【００３１】
したがって本発明は、試料中のＥＳＢＬ及び／又は非ＥＳＢＬ基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌の存在を検出するための方法であって、該方法が、
ａ）酵素懸濁物を得るために被験試料に細胞溶解を行うステップ；及び
ｂ）ステップａ）で得られた酵素懸濁物の部分を試薬キットと反応させるステップを含み、該試薬キットが、
−  セファロスポリン及びアズトレオナムから成る群より選択される基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌、ならびに
−  反応混合物のｐＨが６．４から８．４の間に含まれるときに色が変化するｐＨ変色指示薬
を含み、ここで、
ステップｂ）の後の色の変化が、被験試料中に基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌が存在することを示す、方法に関する。
【００３２】
本発明の方法は、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌の基質によってβ−ラクタムを加水分解し、それがカルボキシル基を生成することによって、それが今度は培地、特に非緩衝化培地を酸性化するという概念に基づく。次に、この加水分解に起因する酸度が、ｐＨ変色指示薬の色の変化によって確認される。色の変化は、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌の存在を示す。
【００３３】
典型的には、ブロスが被験株（被験試料から得られた）と共に植菌され、回転振盪機上でインキュベーションされる。次に、培養物が遠心分離され、ペレットが溶解緩衝液中に再懸濁され、ボルテックスで撹拌され、さらにインキュベーションされる（同様に、固体培地上に成長した細菌コロニーを使用して、当業者に公知の直接溶解プロトコールを適用することができる）。十分なインキュベーション後に、懸濁物（すなわち酵素懸濁物）が遠心分離され、上清が除去され、氷上に置かれる。この上清の小部分が、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌基質及びｐＨ変色指示薬を含む試薬キットと混合される。試薬キット及び被験酵素懸濁物から構成される混合物は、色の変化が観察されるような温度及び十分な時間でさらにインキュベーションされる。色の変化は、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌の存在を示す。
【００３４】
色の変化は、インキュベーションの開始から早ければ５分後に得ることができる。大部分の場合、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生菌について明白な色の変化を得るために、３０分のインキュベーション時間で十分である。
【００３５】
典型的には、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌の同定のためにＰＣＲによって試験し、配列決定すべき株を迅速に選択したい場合、この方法の使用がさらに役立ちうる。結果として、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌の存在がこの方法により決定された後、当業者に公知の他の同定技法を使用してさらに酵素を特徴づけることができる。
【００３６】
典型的には、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌が本発明の方法によって検出された後、この基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌の活性をさらに利用して、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌の活性に対して耐性の、新規な阻害剤又は新規な分子を発見又は評価することができる。後者の場合、評価されるべき新規な分子を、試薬キットに入っている基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ基質分子の代用にすることができる。
【００３７】
典型的には、本発明による方法は、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌から成る群より選択される任意の基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌を検出するために使用することができる。好ましくは、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌は、臨床的に重要な細菌から成る群より、なおいっそう好ましくは臨床的に重要なグラム陰性細菌から成る群より選択される。
【００３８】
本明細書に使用されるような「臨床的に重要な」細菌は、院内感染及び市中感染に関与する細菌を意味する。
【００３９】
典型的には、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌は、Acinetobacter、Aeromonas、Bacillus、Bacteriodes、Citrobacter、Enterobacter、Escherichia、Klebsiella、Morganella、Pandoreae、Proteus、Providencia、Pseudomonas、Ralstonia、Raoultella、Salmonella、Serratia、Shewanella、Shigella及びStrenotrophomonasから成る属より選択される。
【００４０】
典型的には、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌は、Acinetobacter baumannii、Aeromonas junii、Bacillus cereus、Bacteroides fragilis、Citrobacter amalonaticus、Citrobacter freundii、Citrobacter youngae、Enterobacter aerogenes、Enterobacter asburiae、Enterobacter cloacae、Escherichia coli、Klebsiella oxytoca、Klebsiella pneumoniae、Morganella morganii、Pandoraea pnomenusa、Proteus mirabilis、Proteus rettgeri、Proteus vulgaris、Providencia stuartii、Pseudomonas aeruginosa、Salmonella enterica、Serratia marcescens、Shigella flexneri、Stenotrophomonas maltophilia、Ralstonia picketti及びShewanella algaeから成る群より選択される。
【００４１】
本発明によると、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌は、好ましくはAcinetobacter、Enterobacter、Escherichia、Klebsiella、Pseudomonasから成る属より選択され、なおいっそう好ましくはAcinetobacter baumannii、Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae及びPseudomonas aeruginosaから成る群より選択される。
【００４２】
本発明により本明細書に使用されるような基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ基質は、セファロスポリン、アズトレオナム、及びセファマイシンから成る群より選択される基質である。
【００４３】
典型的には、セファロスポリンは、セフォタキシム、セフタジジム、セフトリアキソン、セフェピム、セフピロム及びアズトレオナムから成る群より選択される。
【００４４】
典型的には、セファマイシンは、モキサラクタム及びセフォキシチンから成る群より選択される。セファマイシンは、特にいくつかの種類の非ＥＳＢＬ基質特異性拡張型β−ラクタマーゼの検出にとっての関心対象である。
【００４５】
好ましくは、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ基質はセフォタキシムである。
【００４６】
典型的には、試薬キットに使用されるβ−ラクタマーゼ基質の濃度は、０．１mg/mlから１０mg/mlの間、より好ましくは１mg/mlから５mg/mlの間、なおいっそう好ましくは３mg/mlから４mg/mlの間に含まれる。
【００４７】
本発明によると、反応混合物のｐＨが６．４から８．４の間、好ましくは６．６から７．５の間に含まれるとき、ｐＨ変色指示薬は色が変化する。
【００４８】
典型的には、試薬キットに使用されるｐＨ変色指示薬の濃度は、０．０１％から１％の間、より好ましくは０．０３から０．０８％の間、なおいっそう好ましくは０．０５％から０．０６％の間に含まれる。
【００４９】
典型的には、当業者は、この加水分解反応に適切なｐＨ変色指示薬を選択することができる。本発明に使用されうるｐＨ指示薬の一覧表は、the CRC Handbook of Chemistry and Physics: A Ready-reference Book of Chemical and Physical Data, 91st Revised ed. (June 1st2010), CRC Press Inc.から見出すことができる。例えば、本発明に使用されるｐＨ変色指示薬は、６，８−ジニトロ−２，４−（１Ｈ）キナゾリンジオン（ｐＨ：６．４〜８．０）、ブライトイエロー（ｐＨ：６．６〜７．８）、フェノールレッド（ｐＨ：６．６〜８．０）及びニュートラルレッド（ｐＨ：６．８〜８．０）から成る群より選択することができる。
【００５０】
好ましくは、本発明に使用されるｐＨ変色指示薬はフェノールレッドであり、それが使用される場合、赤から黄への色の変化は、被験試料中にＥＳＢＬ又は非ＥＳＢＬ基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌が存在することを示す。
【００５１】
典型的には、ステップｂ）での反応は、色の変化を観察するために十分な時間にわたり実施される。好ましくは色の変化は、５分から１２０分の間、好ましくは１０から６０分の間、より好ましくは２０から４０分の間に含まれる時間内に視覚的に観察される。又は、色の変化の確認は、例えば光度計を使用することによって自動化することができる。
【００５２】
典型的には、ステップｂ）での反応は、１５℃から４０℃の間、好ましくは１８℃から３７℃の間、より好ましくは２０℃から３７℃の間に含まれる温度で実施される。
【００５３】
分子研究に基づき、ＥＳＢＬ及び非ＥＳＢＬ基質特異性拡張型β−ラクタマーゼは、さらに、Ambler分類により、
AmblerクラスＡ酵素（「ＥＳＢＬ」）
AmblerクラスＢ酵素（メタロ−β−ラクタマーゼ）
AmblerクラスＣ酵素（「セファロスポリナーゼ」）
AmblerクラスＤ酵素（「オキサシリナーゼ」）
の４種類に分類することができる。
【００５４】
典型的には、ブロスが被験株（被験試料から得られた）と共に植菌され、回転振盪機上でインキュベーションされる。次に、培養物が遠心分離され、ペレットが溶解緩衝液中に再懸濁され、ボルテックスで撹拌され、さらにインキュベーションされる。十分なインキュベーション後に、懸濁物（すなわち酵素懸濁物）が遠心分離され、上清が除去され、氷上に置かれる。この上清の小部分が、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ基質及びｐＨ変色指示薬を含む試薬キットと混合される。試薬キット及び被験酵素懸濁物から構成される混合物は、色の変化が観察されるような温度及び十分な時間でさらにインキュベーションされる。色の変化は、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌の存在を示す。色の変化は、インキュベーションの開始から早ければ５分後に得ることができる。大部分の場合、少なくともＥＳＢＬ産生菌について明白な色変化を得るために、３０分のインキュベーション時間で十分である。
【００５５】
好ましい一態様では、生物学的試料中の基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ−産生細菌の存在を検出するための方法であって、該方法が、
ａ）酵素懸濁物を得るために生物学的試料に細胞溶解を行うステップ；及び
ｂ）ステップａ）で得られた酵素懸濁物の部分を試薬キットと反応させるステップ
を含み、該試薬キットが、
−  基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ基質としてのセフォタキシム、及び
−  ｐＨ変色指示薬としてのフェノールレッド
を含み、ここで、
ステップｂ）の後の赤から黄への色の変化が、生物学的試料中に基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌が存在することを示す、方法が提供される。
【００５６】
一態様によると、AmblerクラスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄのβ−ラクタマーゼかどうか、被験試料中に存在する基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌のクラスを特異的に同定するためにβ−ラクタマーゼ阻害剤を使用することができる。
【００５７】
典型的には、β−ラクタマーゼ阻害剤は、一つのクラスのβ−ラクタマーゼに単一特異性でありうる。例えば、β−ラクタマーゼ阻害剤は、AmblerクラスＡのβ−ラクタマーゼについて、クラブラン酸、タゾバクタム、スルバクタム、及びアミノフェニルボロン酸から成る群より選択され、AmblerクラスＣのβ−ラクタマーゼについてＭ群ペニシリンから成る群より選択される。
【００５８】
好ましい一態様では、AmblerクラスＡのβ−ラクタマーゼに対する単一特異性阻害剤はタゾバクタムである。
【００５９】
好ましい一態様では、AmblerクラスＢのβ−ラクタマーゼに対する単一特異性β−ラクタマーゼ阻害剤は、多かれ少なかれ亜鉛枯渇に関連するＥＤＴＡである。
【００６０】
好ましい一態様では、AmblerクラスＣのβ−ラクタマーゼに対する単一特異性β−ラクタマーゼ阻害剤は、クロキサシリン又はオキサシリンである。
【００６１】
典型的には、カルバペネマーゼ阻害剤は、一つよりも多いクラスの酵素に対して二特異性の場合があり、例えばAmblerクラスＡ及びＤのカルバペネマーゼに対して二特異性のＮＸＬ−１０４などである。
【００６２】
典型的には、AmblerクラスＡのβ−ラクタマーゼに対する単一特異性β−ラクタマーゼ阻害剤（例えばタゾバクタムなど）の濃度は、０．１mg/mlから１０mg/ml、より好ましくは１mg/mlから５mg/mlの間、なおいっそう好ましくは２mg/mlから４mg/mlの間に含まれる。
【００６３】
典型的には、AmblerクラスＢのカルバペネマーゼに対する単一特異性カルバペネマーゼ阻害剤（例えばＥＤＴＡなど）の濃度は、０．００１Ｍから０．５Ｍの間、より好ましくは０．００１Ｍから０．０１Ｍの間に含まれ、なおいっそう好ましくは０．００５Ｍである。
【００６４】
典型的には、AmblerクラスＣのβ−ラクタマーゼに対する単一特異性β−ラクタマーゼ阻害剤（例えばクロキサシリン及びオキサシリンなど）の濃度は、０．１mg/mlから１０mg/mlの間、より好ましくは１mg/mlから５mg/mlの間、なおいっそう好ましくは２mg/mlから４mg/mlの間に含まれる。
【００６５】
典型的には、AmblerクラスＡ及びＤのβ−ラクタマーゼに対する二特異性β−ラクタマーゼ阻害剤（例えばＮＸＬ−１０４など）の濃度は、０．０５mg/mlから１０mg/mlの間、より好ましくは１mg/mlから８mg/mlの間、なおいっそう好ましくは３mg/Lから５mg/mlの間に含まれる。
【００６６】
典型的には、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼのクラスを同定するために、９６ウェルマイクロタイタープレートを使用してそのプレートを４区画に分けることができる。第１の区画では、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌の存在を、本発明の方法により既述のように検出することができる。第２の区画では、AmblerクラスＡのＥＳＢＬを、クラスＡのβ−ラクタマーゼに対するβ−ラクタマーゼ阻害剤を添加することによって検出することができる。第３の区画では、AmblerクラスＢのメタロ−β−ラクタマーゼを、クラスＢのβ−ラクタマーゼに対するβ−ラクタマーゼ阻害剤を添加することによって検出することができる。第４の区画では、AmblerクラスＣのセファロスポリナーゼを、クラスＣのβ−ラクタマーゼに対するβ−ラクタマーゼ阻害剤を添加することによって検出することができる。最終的に第５の区画では、AmblerクラスＤのβ−ラクタマーゼを、クラスＤのカルバペネマーゼに対するβ−ラクタマーゼ阻害剤を添加することによって検出することができる。次に当業者は、使用されたβ−ラクタマーゼ阻害剤に応じて、被験試料中に存在する特定のAmblerクラス（一つ又は複数）の基質特異性拡張型β−ラクタマーゼを簡単な推理により定めることができる。
【００６７】
典型的には、β−ラクタマーゼ阻害剤は、試薬キット自体の一部でありうることから、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ基質及びｐＨ変色指示薬と同時に添加することができる。
【００６８】
又は、β−ラクタマーゼ阻害剤は、試薬キットと別々でありうることから、試薬キット及び／又は被験試料（酵素懸濁物の部分）と同時又は連続的に添加することができる。
【００６９】
本発明による方法を４区画の全てで、すなわちβ−ラクタマーゼ阻害剤の存在下又は不在下で行った後、上記方法を行った後に得られた結果と、β−ラクタマーゼ阻害剤をさらに添加して同じ方法を行った後に得られた結果との間で比較を成り立たせる。
【００７０】
試薬キット：
本発明の別の局面によると、セファロスポリン、アズトレオナム及びセファマイシンから成る群より選択される基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌基質ならびにｐＨ変色指示薬を含む試薬キットが提供される。
【００７１】
本発明の一態様によると、試薬キットは、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ基質及びｐＨ変色指示薬を含みうる。
【００７２】
本発明の一態様によると、試薬キットは、さらにβ−ラクタマーゼ阻害剤を含みうる。したがって試薬キットは、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ基質、ｐＨ変色指示薬及びβ−ラクタマーゼ阻害剤を含みうる。
【００７３】
基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ基質、ｐＨ変色指示薬及び基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ阻害剤は、本特許出願に既に定義された通りである。
【００７４】
典型的には、試薬キットは、本発明の方法により試料中の基質特異性拡張型β−ラクタマーゼの存在を検出するために使用される。
【００７５】
典型的には特定のβ−ラクタマーゼ阻害剤が試薬キット中に存在するとき、対応する特定クラスのβ−ラクタマーゼをAmblerクラスＡ、Ｂ、Ｃ又はＤかどうか決定することができる。
【００７６】
マイクロタイタープレート：
本発明の別の局面によると、セファロスポリン、アズトレオナム及びセファマイシンから成る群より選択される、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ及びセファロスポリナーゼの基質を含むウェル又は一連のウェルを含むマイクロタイタープレートが提供される。
【００７７】
典型的には、マイクロタイタープレートは、さらに
−  セファロスポリン、アズトレオナム及びセファマイシンから成る群より選択される基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ基質と、AmblerクラスＡのβ−ラクタマーゼ阻害剤とを含むウェル又は一連のウェル；
−  セファロスポリン、アズトレオナム及びセファマイシンから成る群より選択される基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ基質とAmblerクラスＢのβ−ラクタマーゼ阻害剤とを含むウェル又は一連のウェル；
−  セファロスポリン、アズトレオナム及びセファマイシンから成る群より選択される基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ基質とAmblerクラスＣのβ−ラクタマーゼ阻害剤とを含むウェル又は一連のウェル；ならびに
−  セファロスポリン、アズトレオナム及びセファマイシンから成る群より選択される基質特異性拡張型β−ラクタマーゼと、AmblerクラスＤのβ−ラクタマーゼ阻害剤とを含むウェル又は一連のウェル
を含みうる。
【００７８】
マイクロタイタープレートは、また、アッセイ及び被験試料との比較をされうる対照ウェル又は一連の対照ウェルを含みうる。
【００７９】
典型的には、マイクロタイタープレートは９６ウェルマイクロタイタープレートである。
【００８０】
マイクロタイタープレート以外の装置をこの目的に使用してもよい。例えば、試薬キット（すなわち基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ基質及びｐＨ変色指示薬）が組み入れられたブロッティングペーパーを使用してもよい。ブロッティングペーパーに酵素懸濁物を添加すると、ペーパーが色を変えるか否かを観察することができる。同様に、プラスチックギャラリーを使用してもよい。実際に、試薬キットをこれらのプラスチックギャラリーに内蔵させ、次にこれらのギャラリー内に酵素懸濁物を添加すると、色の変化があるかどうか観察することができる。
【００８１】
本発明の方法が行われるために、ｐＨ変色指示薬及び被験酵素懸濁物の部分が、マイクロタイタープレートの各ウェルに添加される。結果として、本発明の方法により被験試料中の基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ−産生細菌の存在を検出するためのマイクロタイタープレートの使用が提供され、それによって各ウェルに少なくともｐＨ変色指示薬及び被験酵素懸濁物の部分が添加される。マイクロタイタープレートは、被験試料中に存在する特定クラスの基質特異性拡張型β−ラクタマーゼを決定するために特によく適している。
【００８２】
典型的には、ｐＨ変色指示薬が安定であるならば、マイクロタイタープレートのウェル又は一連のウェルは、本発明の方法を行う前に、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ基質と共に、又は基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ及びβ−ラクタマーゼ阻害剤と共にｐＨ変色指示薬も含みうる。又は、ｐＨ変色指示薬が安定でないならば、それは後でウェル又は一連のウェルに添加されうる。
【００８３】
基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ基質、ｐＨ変色指示薬及びβ−ラクタマーゼ阻害剤は、本特許出願に既に定義した通りである。
【００８４】
一態様によると、例えば基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ基質及びβ−ラクタマーゼ阻害剤（存在する場合）などの構成要素のいくつかは、マイクロタイタープレートの固体表面に直接結合させることができる。この場合、残りの構成要素（すなわちｐＨ変色指示薬）は、被験試料と共に、マイクロタイタープレート中の表面結合型基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ基質及び表面結合型β−ラクタマーゼ阻害剤（存在する場合）に添加される。
【００８５】
一態様によると、マイクロタイタープレート及び本発明の方法を行うために使用される各要素は、個別の容器内に封入することができ、様々な容器の全ては、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生細菌を被験試料から見出すことができるかどうかを観察するための説明書と共に１個のパッケージ内に入れることができる。
【００８６】
以下の図面及び実施例を考慮して、本発明をさらに例証する。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】ＥＳＢＬ産生菌の検出方法の結果を示す図である。ＥＳＢＬ産生菌（Ａ欄）は以下の通りである：E. coli FOR CTX-M-15（１）、E. coli GUE CTX-M-1（２）、E. coli DEV CTX-M-3（３）、E. coli GAL CTX-M-14（４）、K. pneumoniae ISS CTX-M-14（５）、K. pneumoniae DOU CTX-M-15（６）、E. cloacea MAZ CTX-M-15（７）、E. coli SHV-2a（８）、E. coli SHV-12（９）、E. coli TEM-52（１０）。非ＥＳＢＬ産生菌（Ｂ欄）は以下の通りである：E. coli BG 1106 6175野生型（１）、E. coli BG 1106 6207野生型（２）、E. coli BG 1106 6301野生型（３）、S. enterica BG 1106 6187野生型（４）、K. oxytoca BG 1106 6141野生型（５）、K. pneumoniae BG 1106 7725野生型（６）、K. pneumoniae BN 1113 0227野生型（７）、E. coli MAC BG 1106 7257ペニシリナーゼ（８）、E. coli BG 1106 5898ペニシリナーゼ（９）、E. coli BN 1113 0228ペニシリナーゼ（１０）、E. coli BN 1113 0231ペニシリナーゼ（１１）、E. cloacae BG 1106 7746野生型（１２）、C. freundii BG 1106 7767野生型（１３）、E. aerogenes BN 1113 0225野生型（１４）、M. morganii BG 1106 5902野生型（１５）、E. cloacae BG 1106 7725野生型（１６）。
【図２】血液培養物からのＥＳＢＬ産生菌の直接検出についての結果（Ａ欄）及び戦略（Ｂ欄）である。試験を二つの陽性血液培養物に適用し（Ａ欄）、β−ラクタマーゼ含有物の確認同定を２４〜３６時間後に得た。試験の使用は、ＥＳＢＬ産生菌の早期検出及び十分な治療を可能にした（Ｂ欄）。
【００８８】
実施例
実施例１  −  本発明による方法（酸比色試験）
β−ラクタマーゼ非産生菌６株、基質特異性拡張型活性を有さないペニシリナーゼ産生菌７株、低レベルセファロスポリナーゼ産生菌５株、ＥＳＢＬ産生菌１３株、基質特異性拡張型クラスＤ酵素産生菌２株、（Ｆ）プラスミドコード型セファロスポリナーゼ産生菌３株、（Ｇ）染色体セファロスポリナーゼ過剰産生菌６株、ならびに（Ｈ）本出願人の菌株コレクション及び全世界起源のクラスＢ酵素産生菌２株を本研究に含めた（表１）。
【００８９】
これらの菌株に本発明の方法を以下のように受けさせた。
【００９０】
予めトリプティカーゼソイ寒天上に成長させた細菌株１回使用相当量１０μlを２０mMトリスＨＣＬ＋２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００＋０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０溶解緩衝液中に再懸濁し、１分間ボルテックスで撹拌し、室温で３０分間さらにインキュベーションした。この細菌懸濁液を１０，０００ｇにて４℃で５分間遠心分離し、上清を取り出し、氷上に置いた。この懸濁液（すなわち酵素懸濁液）５０μlを９６ウェルトレイのウェル内で、セフォタキシム３mg及びフェノールレッド溶液（ｐＨ７．５）から調製された溶液（すなわち試薬キット）１mlのうち５０μlと混合した。
【００９１】
本出願人が使用したフェノールレッド溶液は、濃フェノール溶液（ｐＨ８）（フェノールレッドの蒸留水への混合物（０．５％）から調製）２．２mlを採取し、それに本出願人が蒸留水１６．６mlを添加することによって調製した。次に、１Ｎ ＮａＯＨ溶液を滴下することによってｐＨ値を７．５に調整した。
【００９２】
試薬キットと被験酵素懸濁液の混合物を室温で１．５時間インキュベーションした。基質特異性拡張型β−ラクタマーゼを産生している、又は産生していない細菌株の懸濁物（陽性対照及び陰性対照）も、本発明の方法により試験した（表１）。基質特異性拡張型β−ラクタマーゼを産生している全ての被験株について、ウェルの色は赤から黄に変化する一方で、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼを産生しなかった単離株の細菌抽出物に対応するウェルは赤のままであった。赤から黄への色の変化は、ＣＴＸ−Ｍ−１５産生菌についてインキュベーション開始から早ければ１５分後に得られた。大部分の場合で、ＥＳＢＬ産生菌について明白な色の変化を得るために４０分のインキュベーション時間で十分であった（図１）。いくつかのＳＨＶ型ＥＳＢＬ産生菌などのいくつかの単離株では、色の変化がたとえまだ陽性であっても明白さが低下していた（図１）。試験は、どのウェルがＥＳＢＬ産生菌を含んでいたかを知らなかった者が盲検試験として行った。全ての試験を三つ組で行い、大いに再現性に富む結果を得た。
【００９３】
陽性血液培養からＥＳＢＬ産生菌を直接検出する戦略及び臨床有用性を図２に示す。
【００９４】
【表１】
2014533951.tif 000002
2014533951.tif 000003
【００９５】
参考文献
本出願を通じて、本発明が属する技術の現状を様々な参考文献が記載している。これらの参考文献の開示は、これによって本開示に参照により組み入れられる。
【表２】
2014533951.tif 000004
2014533951.tif 000005
【００９６】
実施例２：基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ産生腸内細菌科の迅速検出
要約
クラブラン酸阻害型基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）を産生している腸内細菌株は、世界中でますます報告されている。ＥＳＢＬ産生の従来検出は、依然として時間がかかる（２４〜４８時間）。したがって、腸内細菌科におけるＥＳＢＬの迅速同定のためにＥＳＢＬ ＮＤＰ（Nordmann/Dortet/Poirel）試験が開発された。この生化学試験は、タゾバクタム添加によって阻害されるセファロスポリン（セフォタキシム）の加水分解のin vitro検出に基づいていた。ＥＳＢＬ活性は、セフォタキシムの加水分解に起因するカルボキシル酸形成が原因のｐＨ指示薬（レッドフェノール）の色変化（赤から黄）がタゾバクタムの添加によって反転したことによって証明された（試験陽性）。ＮＤＰ迅速ＥＳＢＬ試験を培養株（ＥＳＢＬ産生菌２１５株及びＥＳＢＬ非産生菌４０株）に適用した。その感度及び特異性は、それぞれ９２．６％及び１００％であった。その感度は、ＣＴＸ−Ｍ産生菌の検出に優れていた（１００％）。セフォタキシムに感受性のままであった少ない株数のＥＳＢＬ産生菌（ｎ＝１６）は検出されなかった。添加済み血液培養物でもこの試験を評価し、この試験は、優れた感度及び特異性を示した（共に１００％）。試験は迅速（１時間未満）で費用効果が大きかった。この試験は、任意の医療設備で実施することができ、特に感染防除目的によく適合されている。
【００９７】
本明細書で本発明者らは、カルボキシル基を生成するセファロスポリン（セフォタキシム）のβ−ラクタム環の加水分解を、培地の酸性化により確認するように設計された技法に基づく新規な試験を提唱する。この方法は、９６ウェルマイクロタイタープレートを使用するが、単一のチューブにも適応可能である。この加水分解に起因する酸度は、ｐＨ指示薬（レッドフェノール）を使用して色の変化によって確認される。ＥＳＢＬ活性の阻害は、補足的なウェルにタゾバクタムを添加することによって証明される。本発明者らは、細菌コロニーに、又は血液培養物に直接適用されたこの方法が良好な感度及び特異性を有したことを実証した。
【００９８】
方法
菌株コレクション
ＥＳＢＬ ＮＤＰ（Nordmann/Dortet/Poirel）試験の性能を評価するために、合計２５５株を使用した。これらの株は、様々な臨床起源（血液培養、尿、喀痰など）由来であり、全世界起源である（表３Ａ、Ｂ及びＣ）。それらの株は、以前にそれらのβ−ラクタマーゼ含有物について分子レベルで特徴づけられたものである。この菌株コレクションは、臨床単離株から同定された最も一般的なＥＳＢＬ（ＣＴＸ−Ｍ、ＳＨＶ、ＴＥＭ、ＧＥＳ、及びＶＥＢ酵素）を表わすＥＳＢＬの産生菌（ｎ＝２１５）を含んでいた（表３Ａ及びＢ）。陰性対照（ｎ＝４０）は、基質特異性拡張型活性を有するβ−ラクタマーゼを産生しているが、その活性がクラブラン酸／タゾバクタムによって阻害されない株のいずれかから調製した（表３Ｃ）。陰性対照には、基質特異性の狭い活性を有するβ−ラクタマーゼを発現している株も含まれた（表３Ｃ）。
【００９９】
感受性試験
感受性試験は、ミュラーヒントン寒天プレートに３７℃でEtest（登録商標）（AB bioMerieux; Solna, Sweden）を使用してＭＩＣ値を決定することによって行い、２０１２年に最新版にされたＵＳガイドライン（ＣＬＳＩ）（２）に沿って結果を記録した。セフォタキシムについての限界点（breakpoint）は、感受性（Ｓ）≦１及び耐性（Ｒ）≧４μg/mlであり、セフタジジムについてはＳ≦４及びＲ≧１６μg/mlである。
【０１００】
培養株を使用したＥＳＢＬ ＮＤＰ試験
菌株をミュラーヒントン寒天（Biorad, Marnes-la-Coquette, France）で単離し、３７℃で１６〜２４時間インキュベーションしてから、以下のようにＮＤＰ迅速ＥＳＢＬ試験を行った。Microbeadチューブ（Ultraclean Microbial DNA isolation kit Bead Tubes, MO BIO Laboratories, Carlsbad, USA）に予め分注された２０mMトリスＨＣｌ溶解緩衝液１５０μl中に、被験株を植菌した較正済み１白金耳（10μl）を再懸濁した。ボルテックスアダプター（MO BIO Laboratories）を使用してMicrobeadチューブを室温で３０分間強く撹拌することによって細菌の機械的溶解を行った。この細菌懸濁物を１０，０００×ｇにて室温で５分間遠心分離した。９６ウェルトレイのウェル内で、ｐＨ７．８フェノールレッド溶液に入れた３mg精製セフォタキシムナトリウム塩（Sigma-Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier, France）から調製した溶液１mlのうち１００μlと上清３０μlを混合した。他のセフォタキシム濃度、他のβ−ラクタム分子（セフタジジム、セフトリアキソン、セフェピム、アズトレオナム）、及び他のｐＨ指示薬を試験したが、より明白な結果は得られなかった（データは示さず）。フェノールレッド溶液は、ｐＨ８の濃フェノール溶液（蒸留水への０．５％フェノールレッド混合物から調製）２mlを採取し、そこに蒸留水１６．６mlを添加することによって調製した。次に、１Ｎ ＮａＯＨ溶液を滴下することによってｐＨ値を７．８の値に調整した。フェノールレッド溶液と被験酵素懸濁物との混合物を３７℃で３０分間インキュベーションした。同様に、セフォタキシム及びタゾバクタム（４mg/ml）が入っているウェル内で培養抽出物を分析した。他の濃度のタゾバクタム及び他のβ−ラクタマーゼ阻害剤を試験したが、より明白な結果は得られなかった（データは示さず）。セフォタキシム単独が入っているウェルが赤から黄／橙色に変わり、タゾバクタムを補充したセフォタキシムが入っているウェルが赤のまま（色が不変）のとき、試験を陽性と見なした。この試験陽性の定義は、研究全体にわたり適用する。どれがＥＳＢＬ産生菌であるか知らなかった技術者が結果を盲検的に解釈した。
【０１０１】
添加済み血液培養物を使用したＥＳＢＬ ＮＤＰ試験
ＥＳＢＬ産生菌の迅速検出は、添加済み血液培養物から試み、その陽性は、BactAlert血液培養システム（bioMerieux）を使用して判定した。予備試験から、この自動化血液培養システムを使用した血液培養物の陽性は、約５×１０７〜約５×１０９CFU/mlの範囲の植菌量に対応することが示された。このBactAlertシステムで２４〜４８時間インキュベーション後にこの植菌量に到達した。菌株を無菌血液１０mlの存在下で血液培養システムに植菌した。血液培養物に添加するために使用された菌株のパネルには、非ＥＳＢＬ産生菌（ｎ＝２４）又はＥＳＢＬ産生菌（ｎ＝６４）のいずれかが含まれた（表４）。添加済み血液培養物を各菌株１×１０３ＣＦＵから調製し、２４〜４８時間インキュベーションしてから血液培養物の陽性をBactAlertシステムによって検出した。次に、添加済み血液培養物１５mlを無菌チューブに移し、１，５００×ｇで３分間遠心分離して、赤血球をペレットにした。上清を回収し、４，０００×ｇで１５分間遠心分離して、細菌をペレットにした。次に、細菌のペレットを蒸留水５００μlに再懸濁し、１．５mlチューブに移し、１５秒間徹底的にボルテックスで撹拌して、残りの赤血球を溶解させ細菌ペレットを洗浄した。１０，０００×ｇで５分間遠心分離後、細菌ペレットを２０mMトリスＨＣｌ溶解緩衝液１５０μl中に再懸濁し、ビーズチューブ(beadtube)中に分注した。
【０１０２】
次に、ＥＳＢＬ ＮＤＰ試験をこのペレットに上記のように適用した。実験は三つ組で系統的に行った。
【０１０３】
結果
ＥＳＢＬ ＮＤＰ試験及び細菌培養
ＮＤＰ迅速ＥＳＢＬ試験を使用して全てのＣＴＸ−Ｍ産生菌（ｎ＝１４７、表３Ａ）を試験すると、セフォタキシムの存在下でウェルの色は赤から黄に変化し、タゾバクタムを添加したとき赤のままであった。試験の感度は優れていた（１００％）。全ての場合で、これらの株についてのセフォタキシムのＭＩＣ値は高かった（＞８μg/ml）。非ＣＴＸ−Ｍ ＥＳＢＬ産生菌のうち試験した６８株中１７株（２５％）が検出できなかったので、この試験はこれらのＥＳＢＬ産生菌を検出するには感度が低かった（表３Ｂ）。その分子についての耐性限界点よりも低いセフォタキシムのＭＩＣ値を有した菌株で陰性の結果が観察された（少数のE. aerogenes単離株を除く）（表３Ｂ）。セフォタキシムを加水分解する全てのＥＳＢＬ産生単離株について（第１のウェルで色が赤から黄に変化）、タゾバクタムが入っている第２のウェルが赤のままであった（加水分解の阻害）ので、陽性の試験結果に対応した。その結果は、タゾバクタムによるＥＳＢＬ活性のin vitro阻害を示した。基質特異性拡張型活性を有するβ−ラクタマーゼを産生しなかった株から得られた細菌抽出物が入っているウェルのどれも、陽性試験結果とならなかった（表３）。セフォタキシムを加水分解するβ−ラクタマーゼ（過剰産生セファロスポリナーゼ）を産生している少数のＥＳＢＬ陰性株（表３Ｂ）は、セフォタキシムが入っているウェルで赤から黄への色の変化を示した。しかし、この色の変化は、タゾバクタムを補充されたセフォタキシムが入っているウェルでも観察され、これは、それらの酵素の加水分解活性がタゾバクタムによって阻害されず、よって陰性試験に対応することを示した（表３Ｃ）。ＥＳＢＬ ＮＤＰ試験の全体的な感度及び特異性は、それぞれ９２．６％及び１００％であった。ＥＳＢＬ ＮＤＰ試験は、ＥＳＢＬ産生菌と、他のメカニズムにより基質特異性拡張型セファロスポリンに耐性の菌株又は基質特異性拡張型セファロスポリンに感受性の（したがってＥＳＢＬを産生しない）菌株とを識別することができた（表３Ｃ）。顕著には、ＥＳＢＬ産生と、過剰産生された（染色体又はプラスミド介在性）ＡｍｐＣとを兼備する単離株は、陽性の結果を与えた。
【０１０４】
大部分のＣＴＸ−Ｍ産生菌について赤から黄への色変化を速やかに得た（インキュベーション開始から１〜５分後）。全般に、全てのＣＴＸ−Ｍ産生菌（ｎ＝１４７）について明白な色の変化を得るために１５分のインキュベーション時間で十分であった。しかし、全てのＥＳＢＬ産生菌について解釈可能な結果が常に３０分未満で得られた。
【０１０５】
ＥＳＢＬ ＮＤＰ試験及び血液培養
ＥＳＢＬ産生菌（ｎ＝６４）及び非ＥＳＢＬ産生菌（ｎ＝２４）を植菌した血液培養物から直接ＥＳＢＬ ＮＤＰ試験を使用した（表４）。この場合、試験の感度及び特異性は１００％であった。添加済み血液培養物を使用して結果を得るために必要な合計時間は２時間未満であった。
【０１０６】
考察
ＥＳＢＬ ＮＤＰ試験は複数の利点を兼ね備える。この試験は、安価、迅速、高感度及び特異的である。この試験は、現在世界中で同定されるＥＳＢＬの大部分を占めるＣＴＸ−Ｍ産生菌を検出するために特に有効である。いくつかのＥＳＢＬ産生菌、特にＴＥＭ及びＳＨＶ系列のＥＳＢＬ産生菌を検出できなかった理由は、まだ解明されていない。これは、セフォタキシムの弱い加水分解に、そしてまたセフォタキシムの低ＭＩＣ値に関係するＥＳＢＬの低レベル産生に起因するおそれがある。ＡｍｐＣを過剰産生しているがＥＳＢＬ陰性の全ての菌株は、陰性の結果を与えた。これは、二つの可能性に起因した；（ｉ）ＡｍｐＣによるセフォタキシムの加水分解がない（又は非常に少ない）ことが２個の赤色ウェルに繋がること、又は（ｉｉ）ＡｍｐＣの特性によりセフォタキシムの加水分解がクラブラン酸又はタゾバクタムによって阻害されないことが２個の黄／橙色ウェルに繋がること。特記すべきは、ＥＳＢＬ産生陽性で染色体コード型セファロスポリナーゼを過剰発現しているいくつかの単離株が試験された。それらの菌株の全てがＥＳＢＬの作用によりセフォタキシムの加水分解について陽性であったが、この加水分解はタゾバクタムによって十分に阻害され、陽性の結果を与えた。しかし、一部のＥＳＢＬ陽性でＡｍｐＣを過剰産生している単離株は、対応するＡｍｐＣがセフォタキシムを高レベルで加水分解すればタゾバクタムを加えたセフォタキシムについて陽性の結果を与えるおそれがあることを、本発明者らは除外することはできない（偽陰性の結果に繋がる）。
【０１０７】
関心が持たれることに、本発明者らは、血液培養物からＥＳＢＬ産生単離株を検出するためにこのアッセイを容易に実施することができることを示した。注目すべきは、迅速ＥＳＢＬ ＮＤＰ試験の全体的感度は、この血液培養プロトコールを使用したときにいっそう高かった（１００％に到達）。これらの結果は、純培養実験で回収された植菌量よりも血液培養実験から回収された植菌量の方が増加していたことで説明することができよう。
【０１０８】
この試験は、（ｉ）血液培養物中に成長した細菌及び／又は（ｉｉ）任意の抗生物質感受性試験の前に選択培地もしくは非選択培地上に成長した細菌コロニーからＥＳＢＬ産生菌を探索するために使用することができる。したがって、この試験は、ＥＳＢＬ産生菌（大部分はＣＴＸ−Ｍ）の高い発生率が見られる、多数のアジア諸国などの国に優れた適用を見出すことができる。この試験の使用は、ＥＳＢＬ産生単離株の迅速で正確な同定を通じてより良い抗菌管理を支援することによって、ＥＳＢＬ産生菌に感染した患者の転帰を大きく改善することができよう。興味深いことに、セフォタキシム加水分解陽性（セフォタキシム含有ウェルで赤から黄への色の変化）は、常に、ＥＳＢＬ又はプラスミド介在性セファロスポリナーゼのいずれかの発現及びセフォタキシムについて耐性限界点を超える高いＭＩＣ値に関連した（表３Ａ、Ｂ、Ｃ；表４）。陰性の結果が、低レベルβ−ラクタマーゼ活性に関連するポリン欠乏に起因する広域スペクトルセファロスポリン耐性株の存在を排除することができないものの、ＥＳＢＬ ＮＤＰ試験での陽性の結果は、感染患者の処置に広域スペクトルセファロスポリンを選択することを排除するために、及びカルバペネム含有方式を維持するために重要な臨床的意味を有しうる。
【０１０９】
ＥＳＢＬの検出は、衛生及び感染防除に特に有用であることが認められている。ＥＳＢＬ産生菌保有の迅速同定は、特にセファロスポリン耐性単離株が発色性スクリーニング培地を使用して得られたとき、適切な衛生対策を迅速に実施することを助けることができ、そのことは院内大流行の発生をさらに予防するであろう。それらのスクリーニング培地から成長したコロニーから直接ＥＳＢＬ ＮＤＰ試験を使用することは、表現型に基づく技法に比べてかなりの時間節約（少なくとも２４時間）を提供するであろう。これは、特に高リスク室（すなわち集中治療室など）における大発生の防止及び費用節約に、特に専門職員に起因する費用節約に重要な価値を有しうる。加えて、スクリーニング試験として使用されたＥＳＢＬ ＮＤＰ試験は、分子に基づく技法よりもずっと安価である。この特徴は、多くの開発途上国にとって最も重要である。
【０１１０】
ＥＳＢＬ ＮＤＰ試験は、中心的な臨床試験への患者の登録を促進することによって新規な抗生物質の開発も支援するであろう。ＥＳＢＬ ＮＤＰ試験からの結果で、ＰＣＲによってさらに試験され、かつ／又は分子レベルでの詳細な遺伝子同定のため配列決定にかけられるべき菌株を選択することができる。
【０１１１】
【表３】
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【０１１２】
【表４】
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【０１１３】
【表５】
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【０１１４】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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