(57)【要約】  本発明は、ウイルスから目的のポリペプチド（例えば、抗体）を分離するための方法を提供する。いくつかの態様では、本方法は、目的のポリペプチドをプロテインＡ樹脂から、目的のポリペプチドと共溶出するウイルスの量を最少にする特定の範囲の伝導率値を有する溶出バッファーで溶出させることを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスから目的のポリペプチドを分離するための方法であって、目的のポリペプチドと樹脂に吸着されたウイルスを有するプロテインＡ樹脂に、約３．５〜約９．５ｍＳ／ｃｍの間の伝導率を有する溶出バッファーを適用することを含んでなり、前記樹脂からの目的のポリペプチドの溶出により、ウイルスの少なくとも一部から目的のポリペプチドが分離される、方法。
【請求項２】
プロテインＡ樹脂と結合することができる目的のポリペプチドを精製するための方法であって、
ａ．目的のポリペプチドとウイルスとを含んでなる溶液を、前記プロテインＡ樹脂に、目的のポリペプチドが前記プロテインＡ樹脂に結合するような条件下で適用すること；
ｂ．前記樹脂を洗浄バッファーで洗浄すること；および
ｃ．前記樹脂から目的のポリペプチドを、約３．５〜約９．５ｍＳ／ｃｍの間の伝導率を有する溶出バッファーで溶出させて、回収組成物を提供すること
を含んでなる、方法。
【請求項３】
プロテインＡ樹脂と結合することができる目的のポリペプチドを精製するための方法であって、
ａ．目的のポリペプチドとウイルスとを含んでなる溶液を、前記プロテインＡ樹脂に、目的のポリペプチドが前記プロテインＡ樹脂に結合するような条件下で適用すること；
ｂ．前記樹脂を洗浄バッファーで洗浄すること；
ｃ．前記樹脂から目的のポリペプチドを第一の溶出バッファーで溶出させて、回収組成物を提供すること；
ｄ．前記回収組成物中のウイルス量を測定すること；および
ｅ．工程（ｄ）のウイルス量が望ましいものよりも多ければ、工程（ｃ）で使用した第一の溶出バッファーよりも高い伝導率を有する第二の溶出バッファーを用いて工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返すこと
を含んでなる、方法。
【請求項４】
工程（ａ）〜（ｃ）が、前記回収組成物を用いて繰り返される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）〜（ｃ）が、プロテインＡ精製を受けていない目的のポリペプチドを含んでなる溶液を用いて繰り返される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記溶出バッファーの伝導率が、約５〜約６ｍＳ／ｃｍの間である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記溶出バッファーの伝導率が、約５〜約６ｍＳ／ｃｍの間である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記第二の溶出バッファーの伝導率が、約５〜約６ｍＳ／ｃｍの間である、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記溶出バッファーが硫酸ナトリウムを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶出バッファーが硫酸ナトリウムを含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記第二の溶出バッファーが硫酸ナトリウムを含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記回収組成物中のウイルス量が、工程（ａ）の溶液中のウイルス量の多くても１０４分の１である、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記回収組成物中のウイルス量が、工程（ａ）の溶液中のウイルス量の多くても１０４分の１である、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
前記回収組成物中のウイルス量が、工程（ａ）の溶液中のウイルス量の多くても１０５分の１である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記回収組成物中のウイルス量が、工程（ａ）の溶液中のウイルス量の多くても１０５分の１である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶出バッファーのｐＨが、約２．５〜約４の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶出バッファーのｐＨが、約２．５〜約４の間である、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記第二の溶出バッファーのｐＨが、約２．５〜約４の間である、請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
目的のポリペプチドが、抗体、抗体フラグメント、または抗体もしくは抗体フラグメントを含んでなる融合ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
目的のポリペプチドが、抗体、抗体フラグメント、または抗体もしくは抗体フラグメントを含んでなる融合ポリペプチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
目的のポリペプチドが、抗体、抗体フラグメント、または抗体もしくは抗体フラグメントを含んでなる融合ポリペプチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項２２】
前記ウイルスがレトロウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ウイルスがレトロウイルスである、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ウイルスがレトロウイルスである、請求項３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ウイルスが一本鎖ＤＮＡウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ウイルスが一本鎖ＤＮＡウイルスである、請求項２に記載の方法。
【請求項２７】
前記ウイルスが一本鎖ＤＮＡウイルスである、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスクリアランス（viral clearance）を高めるためにプロテインＡクロマトグラフィーを用いてポリペプチドを精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体などの目的のポリペプチドは、多くの場合、生細胞で生産される。目的のポリペプチドを発現する細胞株は複雑な培地で維持しなければならない。従って、目的のポリペプチドの精製には、その培地の要素、細胞成分およびその細胞株の他の副産物からのポリペプチドの分離が含まれる。
【０００３】
特に、ポリペプチドが動物またはヒト細胞株から生産される場合には、バイオテクノロジー産業がウイルスの混入を考慮することは避けられない。ウイルスは原料物質中に存在するかもしれず、ポリペプチド生産プロセスにより導入されるかもしれず、あるいは増殖培地に見られるかもしれない(Valdes, R. et al., J. Biotechnol. 96(3):251-8 (2002))。ウイルス性の不純物は最終的な生物学的製品から除去されるか、または不活化されることが重要である(U.S. Department of Health and Human Services, Guidance for industry: Q5A Viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell line of human or animal origin. 1998)。よって、治療用ポリペプチドなどのポリペプチド製品から夾雑ウイルスを除去するための改良された方法が必要である。
【発明の概要】
【０００４】
一般に、本発明は、プロテインＡクロマトグラフィーを用いて目的のポリペプチドから夾雑ウイルスを除去するための方法を提供する。このような一側面において、本発明は、ウイルスから目的のポリペプチドを分離するための方法を提供する。いくつかの態様では、本方法は、目的のポリペプチドとその樹脂に吸着されたウイルスを有するプロテインＡ樹脂に約３．０〜約１０ｍＳ／ｃｍの間の伝導率（conductivity）を有する溶出バッファーを適用することを含む。いくつかの態様では、本方法は、目的のポリペプチドとその樹脂に吸着されたウイルスを有するプロテインＡ樹脂に、硫酸塩（例えば、約５０または約１００ｍＭの硫酸ナトリウム）を含んでなる溶出バッファーを適用することを含む。いくつかの態様では、樹脂からの目的のポリペプチドの溶出により、ウイルスの少なくとも一部から目的のポリペプチドが分離される。
【０００５】
一側面において、本発明は、目的のポリペプチドを精製するための方法を提供する。いくつかの態様では、本方法は、目的のポリペプチドとウイルスを含んでなる溶液をプロテインＡ樹脂に、目的のポリペプチドがそのプロテインＡ樹脂に結合するような条件下で適用することを含む。いくつかの態様では、前記樹脂を洗浄バッファーで洗浄する。いくつかの態様では、前記洗浄工程は、樹脂から１以上の夾雑物を溶出する。いくつかの態様では、この洗浄工程は除かれる。いくつかの態様では、目的のポリペプチドを約３．０〜約１０ｍＳ／ｃｍの間の伝導率を有する溶出バッファーで樹脂から溶出させて、回収組成物を提供する。いくつかの態様では、目的のポリペプチドを硫酸塩（例えば、約５０または約１００ｍＭの硫酸ナトリウム）を含んでなる溶出バッファーで樹脂から溶出させて、回収組成物を提供する。
【０００６】
一側面において、本発明は、目的のポリペプチドを精製するための別法に関する。いくつかの態様では、本方法は、目的のポリペプチドとウイルスを含んでなる溶液をプロテインＡ樹脂に、目的のポリペプチドがプロテインＡ樹脂に結合するような条件下で適用することを含む。いくつかの態様では、前記樹脂を洗浄バッファーで洗浄する。いくつかの態様では、前記洗浄工程は、樹脂から１以上の夾雑物を溶出する。いくつかの態様では、この洗浄工程は除かれる。いくつかの態様では、目的のポリペプチドを第一の溶出バッファーで樹脂から溶出させて、回収組成物を提供する。いくつかの態様では、前記回収組成物中のウイルス量を測定する。いくつかの態様では、測定されたウイルス量が望ましいものよりも多ければ、前記方法を、第一の溶出バッファーよりも高い伝導率を有する第二の溶出バッファーを用いて繰り返す。いくつかの態様では、測定されたウイルス量が望ましいものよりも多ければ、前記方法を、第一の溶出バッファーよりも多い硫酸塩（例えば、硫酸ナトリウム）を含む第二の溶出バッファーを用いて繰り返す。いくつかの態様では、本方法を本方法の第一サイクルから得られた回収組成物を用いて繰り返して、回収組成物の純度を高める。いくつかの態様では、本方法をプロテインＡ精製を受けていない目的のポリペプチドを含んでなる溶液を用いて繰り返す。この溶液は本方法の第一サイクルで精製された溶液と同じであっても異なっていてもよい。
【０００７】
本発明の側面のいずれかのいくつかの態様では、回収組成物中のウイルス量は、樹脂に適用される溶液中のウイルス量の多くても約１０分の１、１０２分の１、１０３分の１、１０４分の１、１０５分の１、または１０６分の１のいずれかである。いくつかの態様では、回収組成物中のウイルス量は、樹脂に適用される溶液中のウイルス量の約１０２分の１〜約１０６分の１の間、例えば、約１０３分の１〜約１０６分の１、約１０４分の１〜約１０６分の１、または約１０４分の１〜約１０５分の１である。いくつかの態様では、２種類以上のウイルスの量が低減される。
【０００８】
本発明の側面のいずれかのいくつかの態様では、溶出バッファーの伝導率は、約３〜約３．５、約３．５〜約４、約４〜約４．５、約４．５〜約５、約５〜約５．５、約５．５〜約６、約６〜約６．５、約６．５〜約７、約７〜約７．５、約７．５〜約８、約８〜約８．５、約８．５〜約９、約９〜約９．５、または約９．５〜約１０ｍＳ／ｃｍの間である。いくつかの態様では、溶出バッファーの伝導率は、約３．０〜約１０ｍＳ／ｃｍ、例えば、約３．５〜約９．５、約４〜約７、または約５〜約６ｍＳ／ｃｍの間である。いくつかの態様では、溶出バッファーは、硫酸ナトリウム、例えば、約５０または約１００ｍＭの硫酸ナトリウムを含んでなる。いくつかの態様では、溶出バッファーは、クエン酸ナトリウム、例えば、約１５、２０、または２５ｍＭのいずれかのクエン酸ナトリウムを含んでなる。好ましい態様では、溶出バッファーは、クエン酸ナトリウムおよび硫酸ナトリウムを含んでなる。いくつかの態様では、溶出バッファーのｐＨは、約２〜約５．５、例えば、約２．５〜約４．５、または約３〜約４の間である。いくつかの態様では、溶出バッファーのｐＨは、約２〜約２．５、約２．５〜約３、約３．０〜約３．５、約３．５〜約４、約４〜約４．５、約４．５〜約５、または約５〜約５．５の間である。
【０００９】
本発明の側面のいずれかのいくつかの態様では、目的のポリペプチドは、抗体、抗体フラグメント、または抗体もしくは抗体フラグメントを含んでなる融合ポリペプチドを含んでなる。いくつかの態様では、ウイルスはプロテインＡ樹脂に吸着され、例えば、樹脂のプロテインＡ部分もしくは固相支持体部分と相互作用するウイルス、またはプロテインＡもしくは固相支持体と結合したウイルスである。いくつかの態様では、ウイルスは、目的のポリペプチドを生産するために使用された細胞などの哺乳動物細胞に感染するウイルスである。いくつかの態様では、ウイルスはレトロウイルスまたは一本鎖ＤＮＡウイルスである。いくつかの態様では、ウイルスはパルボウイルスである。
【００１０】
本明細書に記載の種々の態様の特性の１つ、いくつか、または総てを組み合わせて本発明の他の態様を形成することができると理解される。本発明のこれらのおよびその他の側面を以下にさらに詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１Ａは、種々の溶出バッファー伝導率を用いたプロテインＡ溶出プールにおけるマウス微小ウイルス（ＭＭＶ）のクリアランスを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、種々の溶出バッファー伝導率を用いたプロテインＡ溶出プールにおける異種指向性マウス白血病ウイルス（ＸＭｕＬＶ）のクリアランスを示す。
【発明の具体的説明】
【００１２】
本発明は、ウイルスのクリアランスを高めるためにプロテインＡクロマトグラフィーを用いて目的のポリペプチドを精製する方法に関する。ウイルスは、ポリペプチドの生産に使用する細胞株、培養培地、または目的のポリペプチドの生産中に導入される可能性がある(U.S. Department of Health and Human Services, Guidance for industry: Q5A Viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell line of human or animal origin. 1998)。ポリペプチドサンプルをプロテインＡカラムに適用すると、大部分の夾雑ウイルスは、結合せずにプロテインＡカラムを通り抜ける。しかしながら、一部のウイルスはカラム上に留まる。驚くことに、プロテインＡクロマトグラフィー中のウイルスのクリアランスは、溶出バッファーの伝導率を約１ｍＳ／ｃｍから約６ｍＳ／ｃｍに高めることによって最大４ｌｏｇ増加した（表１）。この溶出バッファー伝導率の上昇は、プロテインＡカラムからの目的のポリペプチドの溶出に影響を及ぼさなかった。
【００１３】
特定の理論に縛られるものではないが、溶出バッファー中の塩は、ウイルスとプロテインＡカラムの間の相互作用（例えば、ウイルスの疎水性部分とプロテインＡカラムの間の相互作用）を促進し得る。これらの相互作用（例えば、疎水性相互作用またはその他の非特異的相互作用）のために、ウイルスはカラムに長く結合した状態に留まり、一方、目的のポリペプチドはカラムから溶出する。所望により、溶出バッファーの伝導率は、目的のポリペプチドと共溶出するウイルスの量をさらに低減するために至適化することができる。
【００１４】
【表１】
2014525460.tif 000002
表１は伝導率値の指定範囲を示す。各実験の実際の伝導率値は図１Ａおよび図１Ｂに示す。
【００１５】
例示的精製方法
ウイルスクリアランスを高めるために、約３．０〜約１０ｍＳ／ｃｍの間の伝導率を有する溶出バッファーを標準的プロテインＡクロマトグラフィー法（例えば、米国特許第７，８４７，０７１号および同第４，８０１，６８７号；ならびに米国特許出願公開第２０１０／０１３５９８７号に記載されているもの）で使用することができる。
【００１６】
いくつかの態様では、本精製方法は、目的のポリペプチドを樹脂に適用する前にプロテインＡ樹脂を平衡化することを含む。例えば、プロテインＡ樹脂に平衡化バッファーを適用して目的のポリペプチド（および夾雑ウイルス）を含有する溶液向けの樹脂を準備することができる。いくつかの態様では、バッファーは、弱酸とその共役塩基、または弱塩基とその共役酸などのｐＨ変化に耐える水溶液である。平衡化バッファーの例示的バッファー成分としては、リン酸ナトリウム、トリス、およびグリシン／グリシン酸塩が挙げられる。このバッファー成分の例示的濃度としては、約１５ｍＭ〜約３００ｍＭ、例えば、約２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、または２５０ｍＭのいずれかが挙げられる。さらに、所望により平衡化バッファーに塩を含めてもよい。例示的塩としては、酸と塩基の相互作用により形成されるもの、例えば、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、または硫酸ナトリウムが挙げられる。例示的塩濃度としては、約１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、または４００ｍＭのいずれかが挙げられる。所望により、ＥＤＴＡ（例えば、約５または１０ｍＭのＥＤＴＡ）を平衡化バッファーに含めてもよい。いくつかの態様では、平衡化バッファーは約５．０〜約９．０、例えば約５．１〜約５．７の間、または約５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、６．０、７．０、８．０、または９．０のいずれかのｐＨを有する。例示的平衡化バッファーは、米国特許第７，８４７，０７１号に見出すことができる。別の例示的平衡化バッファーとしては、２５ｍＭトリス、２５ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．１がある。いくつかの態様では、この平衡化工程は除かれる。
【００１７】
いくつかの態様では、目的のポリペプチド（および夾雑ウイルス）を含有する溶液をプロテインＡ樹脂に、目的のポリペプチドがプロテインＡ樹脂に結合するような条件下で適用する。いくつかの態様では、プロテインＡ樹脂が洗浄される。いくつかの態様では、樹脂を洗浄するために平衡化バッファーが使用される。いくつかの態様では、樹脂を洗浄するために、平衡化バッファーとは異なる洗浄バッファーが使用される。いくつかの態様では、２種類以上の異なる洗浄バッファーが使用される。いくつかの態様では、この洗浄工程は、１以上の夾雑物、例えば樹脂に非特異的に結合される夾雑物を樹脂から溶出させる。好ましくは、この洗浄工程は、有意な量の目的ポリペプチドを樹脂から溶出させない。例示的洗浄バッファーとしては、上記の平衡化バッファーが挙げられる。いくつかの態様では、洗浄バッファーは、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０などの洗剤も含む。いくつかの態様では、この洗浄工程は除かれる。
【００１８】
いくつかの態様では、目的のポリペプチドは、約３．０〜約１０ｍＳ／ｃｍの間の伝導率を有する溶出バッファーで樹脂から溶出される。いくつかの態様では、溶出バッファーは、目的のポリペプチドのＦｃ領域とプロテインＡ樹脂の間の特異的相互作用分断するバッファー溶液である。種々の態様では、溶出バッファーの伝導率は、約３〜約３．５、約３．５〜約４、約４〜約４．５、約４．５〜約５、約５〜約５．５、約５．５〜約６、約６〜約６．５、約６．５〜約７、約７〜約７．５、約７．５〜約８、約８〜約８．５、約８．５〜約９、約９〜約９．５、または約９．５〜約１０ｍＳ／ｃｍの間である。いくつかの態様では、溶出バッファーの伝導率は、約３．０〜約１０ｍＳ／ｃｍ、例えば約３．５〜約９．５、約４〜約７、または約５〜約６ｍＳ／ｃｍの間である。いくつかの態様では、溶出バッファーの伝導率は、約５または約６ｍＳ／ｃｍである。溶出バッファーの伝導率は、Ｍｅｔｒｏｈｍモデル７１２伝導率計に関して以下に記載されるものなどの標準的方法を用いて測定することができる。いくつかの態様では、溶出バッファーのｐＨは、約２〜約５．５、例えば約２．５〜約４．５、または約３〜約４の間である。いくつかの態様では、溶出バッファーのｐＨは、約２〜約２．５、約２．５〜約３、約３．０〜約３．５、約３．５〜約４、約４〜約４．５、約４．５〜約５、または約５〜約５．５の間である。いくつかの態様では、溶出バッファーのｐＨは、約３．０、３．２、３．５、または４．０のいずれかである。
【００１９】
溶出バッファーの例示的バッファー成分としては、リン酸ナトリウム、トリス、グリシン／グリシン酸塩、クエン酸、酢酸、リン酸、アルギニン塩酸塩、クエン酸ナトリウム、グリシン塩酸塩、および酢酸ナトリウムバッファーが挙げられる。このバッファー成分の例示的濃度としては、約１５ｍＭ〜約３００ｍＭ、例えば、約２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、または２５０ｍＭのいずれかが挙げられる。いくつかの態様では、溶出バッファーは、クエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム）、例えば、約１５、２０、または２５ｍＭのいずれかのクエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム）を含んでなる。さらに、所望により、溶出バッファーに塩を含めてもよい。例示的塩としては、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、または硫酸ナトリウムが挙げられる。例示的塩濃度としては、約１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、または４００ｍＭのいずれかが挙げられる。いくつかの態様では、溶出バッファーは、硫酸塩（例えば、硫酸ナトリウム）、例えば、約５０または約１００ｍＭの硫酸塩（例えば、硫酸ナトリウム）を含んでなる。いくつかの態様では、溶出バッファーは、クエン酸ナトリウムおよび硫酸ナトリウムを含んでなる。
【００２０】
目的のポリペプチドが樹脂から溶出された後、所望により、プロテインＡ樹脂をその最初の結合能に戻すために再生または洗浄バッファーを使用することができる。例示的再生／洗浄バッファーとしては、０．１Ｍリン酸、ｐＨ１．５；１％リン酸；６Ｍグアニジン、ｐＨ７．０；６Ｍ尿素、ｐＨ７．０；および５０ｍＭ水酸化ナトリウム、０．５Ｍ硫酸ナトリウム(Lute, S. et al, J. Chromatogr A. 26: 1205(1-2): 17-25, 2008)が挙げられる。
【００２１】
再生／洗浄後、所望により保存バッファーがプロテインＡ樹脂に適用される。保存バッファーは、次の使用まで樹脂内に留まる。例示的保存バッファーとしては、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、２％ベンジルアルコール、ｐＨ５または５．２が挙げられる。
【００２２】
これらの精製方法に関して、プロテインＡ樹脂は好ましくはカラムに組み込まれる(Liu, H. et al., MAbs. 2(5):480-99, 2010)。あるいは、容器内の樹脂に最初の混合物を加え、混合し、樹脂を分離し（例えば）、液相を除去し、洗浄し、再び遠心分離し、溶出バッファーを加え、再び遠心分離し、溶出液を除去することによるなどのバッチ精製を行ってもよい。ハイブリッド法が採用される場合もあり、バッチ法で結合を行った後、目的のポリペプチドが結合した樹脂をカラムに充填し、そのカラムに対して洗浄および溶出を行う。
【００２３】
例示的プロテインＡ樹脂
本発明の精製法にはいずれの標準的プロテインＡ樹脂を用いてもよい。プロテインＡは、Ｆｃ領域を含むポリペプチドの精製に慣用される。プロテインＡは、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureas)由来の４１ｋＤａの細胞表面タンパク質であり、抗体のＦｃ領域と高い親和性で結合する。プロテインＡは安定であり、高塩条件で使用可能である。天然型のプロテインＡの他、タンパク質分解(proteolytic degration)に対する安定性が高められた、またはアルカリ性溶液に対する耐性が改良された遺伝的改変型のプロテインＡが利用可能である（米国特許出願公開第２００５／０２８２２９４号）。アフィニティークロマトグラフィーで使用するためには、プロテインＡは好ましくは、ガラス、シリカ、アガロース、または有機ポリマーなどの固相支持体上に固定化される。
【００２４】
多くの市販のプロテインＡ樹脂がある。プロテインＡ樹脂製品の例としては、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．によるＰｒｏＳｅｐ  ｖＡおよびＰｒｏｓｅｐ  ｖＡ  Ｕｌｔｒａ；ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅプロテインＡメディアおよびＨｉ−Ｔｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ  ＦＦ；Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なＳｔｒｅａｍｌｉｎｅＴＭおよびＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭ；Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓによるＰｏｒｏｓ  ＡおよびＭａｂＣａｐｔｕｒｅが挙げられる。他のプロテインＡ樹脂を提供するその他の会社としては、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔおよびＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃがある。
【００２５】
例示的目的ポリペプチド
本発明の方法を用いて精製可能な例示的目的ポリペプチドには、プロテインＡ樹脂と結合することができるいずれのポリペプチドも含まれる。「ポリペプチド」とは、長さ、翻訳後調節、または機能とは無関係に、２以上のアミノ酸のいずれの配列も意味する。「タンパク質」および「ポリペプチド」は本明細書では互換的に使用される。いくつかの態様では、ポリペプチドは、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化など）またはその任意の修飾（例えば、ペグ化など）などの１以上の修飾を有する。ポリペプチドは、１以上の非天然アミノ酸（例えば、側鎖修飾を有するアミノ酸）を含み得る。種々の態様では、ポリペプチドは、少なくとも約５０、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００のいずれか、またはそれを超えるアミノ酸を有する。いくつかの態様では、ポリペプチドは、約５０〜約６００個のアミノ酸、例えば、約１００〜約５００個のアミノ酸、約１５０〜約４００個のアミノ酸、約１５０〜約３００個のアミノ酸、または約１７５〜約２００個のアミノ酸を含む。
【００２６】
いくつかの態様では、ポリペプチドは、プロテインＡと相互作用する免疫グロブリン分子のＦｃ領域に由来するアミノ酸を含むＣＨ２／ＣＨ３領域を含む。いくつかの態様では、ＣＨ２／ＣＨ３領域は、完全なＣＨ２領域と、その後に完全なＣＨ３領域を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドは、免疫グロブリンの全Ｆｃ領域を含む。ＣＨ２／ＣＨ３領域を含むポリペプチドの例としては、抗体、抗体フラグメント、イムノアドヘシン(Ashkenazi and Chamow, METHODS: A companion to Methods in Enzymology, 8: 104-115, 1995)およびＣＨ２／ＣＨ３領域と融合したまたは結合した目的のポリペプチドを含んでなる融合ポリペプチドが挙げられる。
【００２７】
本明細書において用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原と特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を意味する。従って、抗体という用語は、完全な抗体分子だけでなく、抗体フラグメントならびに抗体および抗体フラグメントの変異体（誘導体を含む）も包含する。用語「抗体」により表される分子の例としては、限定されるものではないが、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆｖ、およびＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含んでなる、あるいはからなるフラグメントが挙げられる。本明細書において用語「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、抗体のＶＬドメインと連結した抗体のＶＨドメインを含んでなるポリペプチドを意味する。これらの抗体は、異種ポリペプチド、検出可能な標識、またはその他の分子をさらに含んでなってもよい。
【００２８】
例示的抗体としては、限定されるものではないが、モノクローナル、多重特異性、ヒト化、ヒトまたはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、細胞内で製造された抗体（すなわち、イントラボディー）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のいずれのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであってもよい。一態様では、免疫グロブリンはＩｇＧ１アイソタイプである。別の態様では、免疫グロブリンはＩｇＧ４アイソタイプである。免疫グロブリンは重鎖および軽鎖の両方を有してもよい。ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ重鎖のアレイとκまたはλ型の軽鎖の対としてもよい。別の態様では、抗体は、異種ポリペプチドと融合したＦａｂフラグメントを含んでなる。
【００２９】
本明細書において用語「抗体フラグメント」は、抗体（その抗体フラグメントまたは変異体を含んでなる、あるいはからなるｓｃＦｖまたはＦａｂなどの分子を含む）の、少なくとも約５、１０、２５、５０、１００、１５０、または２００個のいずれかの連続するアミノ酸のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを意味する。
【００３０】
基本抗体構成単位は、四量体を含んでなることが知られている。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同じ対から構成され、各対は１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識を担う約１００〜１１０またはそれを超えるアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能を担う定常領域を規定する。ヒト軽鎖はκおよびλ軽鎖として分類される。重鎖はμ、δ、γ、α、またはεとして分類され、それぞれ抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして定義する。一般に、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))参照。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗結合部位を形成する。従って、完全なＩｇＧ抗体は２つの結合部位を有する。二機能性または二重特異性抗体の場合以外は、２つの結合部位は同じである。
【００３１】
これらの鎖は総て、比較的保存されているフレームワーク領域（ＦＲ）が相補性決定領域またはＣＤＲと呼ばれる３つの超可変領域により連結されているという同じ一般構造を示す。各対の重鎖および軽鎖に由来するＣＤＲはフレームワーク領域により整列され、特異的エピトープとの結合を可能とする。軽鎖および重鎖とも、Ｎ末端からＣ末端方向に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含んでなる。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))またはChothia & Lesk J Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al, Nature 342:878-883 (1989)の定義に従う。
【００３２】
二重特異性または二機能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対と２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含む様々な方法によって作製することができる。例えば、Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al, J Immunol. 148: 1547 1553 (1992)参照。さらに、二重特異性抗体は、「ダイアボディー」(Holliger et al, "'Diabodies': small bivalent and bispecific antibody fragments" PNAS USA 90:6444-6448 (1993))または「ジャヌシン」(Traunecker et al, "Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells" EMBO J 10:3655-3659 (1991) and Traunecker et al, "Janusin: new molecular design for bispecific reagents" Int J Cancer Suppl 7:51-52 (1992))として形成してもよい。
【００３３】
例示的目的ポリペプチドは、限定されるものではないが、ポリマー、異種ポリペプチド、マーカー配列、診断薬および／または治療薬を含む分子に組換え的に融合されたまたは化学的に結合された（共有結合および非共有結合の両方を含む）抗体（その抗体フラグメントまたは変異体を含む）を包含する。さらに、例示的ポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセスによって、または当技術分野で周知であり、本明細書でさらに述べられる化学修飾技術によって修飾された抗体（その抗体フラグメントまたは変異体を含む）を包含する。
【００３４】
特定の態様では、抗体は化学的に修飾される。この化学的修飾は、その分子の溶解度、安定性および循環時間の増大、または免疫原性の低減などの付加的利点を提供し得る。誘導体化のための化学部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどの水溶性ポリマーから選択され得る。これらの抗体はその分子内のランダムな位置で修飾されてもよいし、またはその分子内の所定の位置で修飾されてもよく、１つ、２つ、３つ、またはそれを超える付加化学部分を含んでもよい。
【００３５】
ポリマーはいずれの分子量のものでもよく、分岐型であってもまたは非分岐型であってもよい。ポリエチレングリコールの場合、取り扱いおよび製造が容易なように、好ましい分子量は約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａの間である（用語「約」は、ポリエチレングリコールの調製において、一部の分子が、示された分子量よりも大きいか、やや小さいことを示す）。所望の治療プロフィール（例えば、持続放出期間、効果、生物活性に対してであれば、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または欠如および治療用ポリペプチドまたは類似体に対するそのポリエチレングリコールの他の既知の効果）に応じて他のサイズを使用してもよい。例えば、ポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、または１００，０００ｋＤａのいずれかの平均分子量を有してよい。
【００３６】
上記に示したように、ポリエチレングリコールは分岐構造を有してよい。分岐ポリエチレングリコールは、例えば、米国特許第５，６４３，５７５号；Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-12 (1996); Vorobjev et al, Nucleosides Nucleotides 75:2745-2750 (1999);およびCaliceti et al, Bioconjug. Chem. 70:638-646 (1999)に記載されている。
【００３７】
ポリエチレングリコール分子（または他の化学部分）は、抗体の機能的または抗原性ドメインに対する効果を考慮して抗体と結合させるであろう。当業者に利用可能な結合方法がいくつかある（例えば、ＥＰ０４０１３８４ＰＥＧとＧ−ＣＳＦの結合、Malik et al, Exp. Hematol. 20: 1028-1035 (1992)（塩化トレシルを用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告）もまた参照。例えば、ポリエチレングリコールは、遊離アミノ基またはカルボキシル基などの反応性基を介してアミノ酸残基群と共有結合し得る。反応性基は、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合し得る基である。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基としてはリシン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ；遊離カルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられる。スルフヒドリル基もまた、ポリエチレングリコール分子を結合するための反応性基として使用可能である。治療目的として好ましいのは、アミノ基、例えば、Ｎ末端またはリシン基での結合である。
【００３８】
上記で示唆されるように、ポリエチレングリコールはいくつかのアミノ酸残基のうちいずれかとの結合を介して抗体と結合させることができる。例えば、ポリエチレングリコールは、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン残基との共有結合を介してポリペプチドと結合させることができる。ポリペプチドの特定のアミノ酸残基（例えば、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン）に、またはポリペプチドの２種類以上のアミノ酸残基（例えば、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびそれらの組合せ）にポリエチレングリコールを結合させるために、１以上の反応化学を用いてもよい。
【００３９】
具体的には、Ｎ末端において化学的に修飾された抗体が望ましいと思われる。ポリエチレングリコールを例に取れば、様々なポリエチレングリコール分子（分子量、分岐などによる）から、反応混合物中のポリエチレングリコール分子とポリペプチド分子の割合、実施するペグ化反応のタイプ、および選択されたＮ末端ペグ化ポリペプチドの入手方法を選択することができる。Ｎ末端ペグ化調製物の入手方法（すなわち、必要であれば、他のモノペグ化部分からのこの部分の分離）は、ペグ化ポリペプチド分子の集団からのＮ末端ペグ化材料の精製によるものであってよい。Ｎ末端修飾で化学的に修飾された選択的ポリペプチドは、特定のポリペプチドにおける誘導体化に利用可能な異なるタイプの第一級アミノ基の異なる反応性（Ｎ末端に対してはリシン）を利用する還元的アルキル化により達成することができる。適当な反応条件下で、Ｎ末端における抗体の、カルボニル基含有ポリマーでの実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【００４０】
上記に示すように、抗体のペグ化は、いずれの数の手段によって達成されてもよい。例えば、ポリエチレングリコールは、直接的にまたは介在リンカーにより抗体と結合させることができる。ポリエチレングリコールをポリペプチドと結合させるためのリンカーのない系は、Delgado et al., Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. :249-304 (1992); Francis et al., Intern. J. ofHematol. 55: 1-18 (1998);米国特許第４，００２，５３１号;米国特許第５，３４９，０５２号;ＷＯ９５／０６０５８；およびＷＯ９８／３２４６６に記載されている。
【００４１】
ポリエチレングリコールを介在リンカーを用いずに抗体のアミノ酸残基に直接結合させるための１つの系では、塩化トレシル（ＣｌＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３）を用いたモノメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）の修飾により生産されるトレシル化ＭＰＥＧを使用する。ポリペプチドとトレシル化ＭＰＥＧを反応させた際、ポリエチレングリコールはポリペプチドのアミン基と直接結合される。いくつかの態様では、ポリペプチド−ポリエチレングリコール結合体は、抗体を２，２，２−トリフルオロエタン(trifluoreothane)スルホニル基を有するポリエチレングリコール分子と反応させることにより生産される。
【００４２】
ポリエチレングリコールはまた、いくつかの異なる介在リンカーを用いてポリペプチドと結合させることもできる。例えば、米国特許第５，６１２，４６０号は、ポリエチレングリコールとポリペプチドを連結するためのウレタンリンカーを開示している。ポリエチレングリコールがリンカーによりポリペプチドに結合されているポリペプチド−ポリエチレングリコール結合体は、ポリペプチドをＭＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート、１，１’−カルボニルジイミダゾールで活性化されたＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロペンチルカーボネート、ＭＰＥＧ−ｐニトロフェノールカーボネートおよび種々のＭＰＥＧ−スクシネート誘導体などの化合物と反応させることにより生産することもできる。いくつかのさらなるポリエチレングリコール誘導体およびポリエチレングリコールをポリペプチドに結合させるための反応化学はＷＯ９８／３２４６６に記載されている。
【００４３】
所望により各抗体に結合されるポリエチレングリコール部分の数（すなわち、置換度）は様々であり得る。例えば、ペグ化抗体は、平均１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０、またはそれを超えるポリエチレングリコール分子と連結させることができる。同様に、平均置換度は、ポリペプチド１分子当たりポリエチレングリコール部分１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２〜１４、１３〜１５、１４〜１６、１５〜１７、１６〜１８、１７〜１９、または１８〜２０の範囲内である。置換度を決定するための方法は、例えば、Delgado et al., Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. :249-304 (1992)に記載されている。
【００４４】
他の例示的抗体（その抗体フラグメントまたは変異体を含む）は、異種ポリペプチド（例えば、抗体または抗体ドメインに無関連のポリペプチド）またはその一部に組換え的に融合され、または化学的に結合（共有結合および非共有結合の両方を含む）されて融合ポリペプチドを生成する。融合は必ずしも直接である必要はなく、リンカー配列を介してなされてもよい。例えば、抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかにおいて、特定の細胞表面抗原に特異的であるかまたは特定の細胞表面受容体と結合する抗原と結合する抗体に異種ポリペプチドを融合させるかまたは結合させることにより、異種ポリペプチドを特定の細胞種（例えば、癌細胞）にターゲティングするために使用することができる。例示的抗体はまた、限定されるものではないが、組換えヒト血清アルブミン（例えば、１９９９年３月２日発行の米国特許第５，８７６，９６９号、欧州特許第０４１３６２２号、および１９９８年６月１６日発行の米国特許第５，７６６，８８３号）を含むアルブミンと融合させてキメラポリペプチドを得てもよい。一態様では、抗体（そのフラグメントまたは変異体を含む）を、ヒト血清アルブミンのアミノ酸残基を含んでなる、あるいはからなるポリペプチドフラグメントと融合させる。一態様では、抗体（そのフラグメントまたは変異体）を、成熟型ヒト血清アルブミン（すなわち、欧州特許第０３２２０９４号の図１および２に示されるようなヒト血清アルブミンのアミノ酸１〜５８５）と融合させる。
【００４５】
さらに、米国特許第７，５２１，４２４号に記載されるように、アルブミン融合ポリペプチドのアルブミンポリペプチド部分に相当する血清アルブミンポリペプチドのフラグメントは、全長ポリペプチドならびに参照ポリペプチド（すなわち、血清アルブミン、またはアルブミン融合ポリペプチドの血清アルブミン部分）のアミノ酸配列のアミノ末端から１以上の残基が欠失されたポリペプチドを含む。
【００４６】
さらに、米国特許第７，５２１，４２４号に記載されるように、例示的ポリペプチドは、アルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分（例えば、血清アルブミンまたはアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分）に相当するアルブミンタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ末端から１以上の残基が欠失されたポリペプチドを含む。
【００４７】
例示的抗体（そのフラグメントまたは変異体を含む）は、異種ポリペプチド（例えば、ヒト血清アルブミンポリペプチド）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合させることができる。異種ポリペプチドは、抗体の重鎖または軽鎖定常ドメインと融合させてもよい。一態様では、異種ポリペプチドはＣＨ１またはＣκドメインと融合させる。別の態様では、異種ポリペプチドはＣＨ１ドメインと融合させる。一態様では、異種ポリペプチドは、ヒト血清アルブミンに由来する。このような融合ポリペプチドは、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて半減期を延長させ得る。異種ポリペプチドと融合または結合された抗体はまた、当技術分野で公知の方法を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏイムノアッセイにおいても使用可能である。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２１２３２；ＥＰ４３９，０９５；Naramura et al, Immunol. Lett. 39:91-99 (1994);米国特許第５，４７４，９８１号; Gillies et al, PNAS 89: 1428-1432 (1992); Fell et al, J. Immunol. 146:2446-2452 (1991)参照。
【００４８】
例示的ポリペプチドは、抗体フラグメントに融合または結合された異種ポリペプチドを含んでなる、あるいはからなる組成物をさらに含む。例えば、異種ポリペプチドはＦａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、またはその一部と融合または結合させてよい。ポリペプチドを抗体部分と融合または結合させるための方法は当技術分野で公知である。例えば、米国特許第５，３５６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２，９４６号；ＥＰ３０７，４３４；ＥＰ３６７，１６６；ＰＣＴ公開ＷＯ９６／０４３８８；ＷＯ９１／０６５７０；Ashkenazi et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539 (1991); Zheng et al, J. Immunol. 154:5590-5600 (1995);およびVil et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11357- 11341 (1992)参照。
【００４９】
さらなる融合ポリペプチドは、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（まとめて「ＤＮＡシャッフリング」と呼ばれる）の技術によって作製することができる。ＤＮＡシャッフリングは、抗体（その抗体フラグメントまたは変異体を含んでなる、あるいはからなる分子を含む）の活性を調節するために使用することができ、このような方法は活性が変更された抗体（例えば、親和性がより高く、解離速度がより低い抗体）を作製するために使用することができる。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３０，７２１号；同第５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，４５８号、ならびにPatten et al, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-35 (1997); Harayama, Trends Biotechnol. 16(2):76-82 (1998); Hansson, et al, J. Mol. Biol. 287:265-76 (1999);およびLorenzo and Blasco, Biotechniques 24(2):308-13 (1998)参照。一態様では、抗体をコードするポリヌクレオチドは、組換え前にエラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入またはその他の方法によるランダム突然変異誘発を施すことによって変更してもよい。
【００５０】
例示的ポリペプチドとしては、診断薬または治療薬と結合された抗体（その抗体フラグメントまたは変異体を含む）をさらに包含する。抗体は、例えば所与の治療計画の有効性を決定するための臨床検査手順の一部として例えば腫瘍の発生または進行のモニタリングまたは予後を行うために診断的に使用することができる。検出は、抗体を検出可能な物質とカップリングさせることによって助けることができる。検出可能な物質の例としては、限定されるものではないが、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽電子放射断層撮影法および非放射性常磁性金属イオンを用いる陽電子放射金属が挙げられる。検出可能な物質は抗体に直接的にまたは当技術分野で公知の技術を用いて中間体（例えば、当技術分野で公知のリンカーなど）を介してカップリングまたは結合させることができる。例えば、診断薬として使用するための抗体と結合させることができる金属イオンに関しては、米国特許第４，７４１，９００号を参照。好適な酵素の例としては、限定されるものではないが、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；好適な補欠分子族複合体の例としては、限定されるものではないが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；好適な蛍光物質の例としては、限定されるものではないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、限定されるものではないが、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；また、好適な放射性物質の例としては、限定されるものではないが、ヨウ素（１２１Ｉ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１５ｍＩｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３５Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、および９７Ｒｕが挙げられる。
【００５１】
いくつかの態様では、抗体（その抗体フラグメントまたは変異体を含んでなる、あるいはからなるｓｃＦｖまたはその他の分子を含む）は、細胞毒素（例えば、細胞増殖抑制剤もしくは細胞破壊剤）、治療薬または放射性金属イオン（例えば、α放射体、例えば、２１３Ｂｉ、またはその他の放射性同位元素、例えば、１０３Ｐｄ、１３５Ｘｅ、１３１Ｉ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、３５Ｓ、９０Ｙ、１５３Ｓｍ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、９０Ｙ、１１７Ｔｉｎ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅもしくは１６６Ｈｏ）といった治療用成分にカップリングまたは結合させる。特定の態様では、抗体またはそのフラグメントを、限定されるものではないが、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、１６６Ｈｏ、および１５３Ｓｍを含む放射性金属イオンをポリペプチドに配位させる大環状キレーターと結合させる。特定の態様では、大環状キレーターは、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ''，Ｎ''’−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。他の特定の態様では、ＤＯＴＡを、リンカー分子を介して抗体またはそのフラグメントと結合させる。ＤＯＴＡとポリペプチドを結合させるために有用なリンカー分子の例は一般に当技術分野で公知であり；例えば、DeNardo et al., Clin Cancer Res. 4(10):2483-90, 1998; Peterson et al., Bioconjug. Chem. 10(4):553-7, 1999;およびZimmerman et al, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50, 1999参照。
【００５２】
細胞毒素または細胞傷害性薬剤には、細胞に有害ないずれの薬剤も含まれる。例としては、限定されるものではないが、パクリタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン(dihydroxy anthracin dione)、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮアーゼ、ならびにピューロマイシンおよびそのフラグメント、変異体または同族体が挙げられる。治療薬としては、限定されるものではないが、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド(cyclothosphamide)、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧称ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧称、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。
【００５３】
当技術分野で公知の技術は、抗体を標識するために適用可能である。このような技術としては、限定されるものではないが、二価性結合剤（例えば、米国特許第５，７５６，０６５号；同第５，７１４，７１１号；同第５，６９６，２３９号；同第５，６５２，３７１号；同第５，５０５，９３１号；同第５，４８９，４２５号；同第５，４３５，９９０号；同第５，４２８，１３９号；同第５，３４２，６０４号；同第５，２７４，１１９号；同第４，９９４，５６０号および同第５，８０８，００３号）および直接カップリング反応（例えば、Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈｌｏｒａｍｉｎｅ−Ｔ反応）が挙げられる。
【００５４】
治療薬または薬物成分（drug moiety）は、従来の化学治療薬に限定されると解釈されるべきでない。例えば、薬物成分は、所望の生物活性を有するポリペプチドであり得る。このようなポリペプチドとしては、限定されるものではないが、例えば、アブリン、リシンＡ、アルファトキシン、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素、サポリン、モモルジン、ゲロニン、ブタクサ抗ウイルスタンパク質、α−サルシンおよびコレラ毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス薬、例えば、ＴＮＦ−アルファ（ＴＮＦ−α）、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ  Ｉ（ＷＯ９７／３５８９９）、ＡＩＭ  ＩＩ（ＷＯ９７／３４９１１）、Ｆａｓリガンド(Takahashi et al, Int. Immunol, 6: 1567-1574 (1994))、ＶＥＧＩ（ＷＯ９９／２３１０５）、血栓症薬または抗血管新生薬、例えば、アンギオスタチンまたはエンドスタチンなどのタンパク質；または例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、もしくは他の増殖因子などの生物反応修飾物質が挙げられる。
【００５５】
治療用成分を抗体に結合させるための技術は周知である。この結合は抗体が精製される前または精製された後に行うことができる。例えば、Arnon et al, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al, "Antibodies For Drug Delivery", Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)およびThorpe et al, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58 (1982)参照。
【００５６】
あるいは、Ｓｅｇａｌにより米国特許第４，６７６，９８０号に記載されているように、抗体を第二の抗体と結合させて抗体ヘテロコンジュゲートを形成することもできる。
【００５７】
あるいは、抗体を、所望により、限定されるものではないが、例えば、Ｎ結合またはＯ結合糖鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング、アミノ酸主鎖への化学部分の結合、Ｎ結合またはＯ結合糖鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または欠失を含む翻訳後修飾により修飾してもよい。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、トランスファー−ＲＮＡを介したポリペプチドへのアミノ酸付加、例えば、アルギニン化、およびユビキチン化が挙げられる（例えば、Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al, Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al, Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992)参照）。所与の抗体のいくつかの部位に同じタイプの修飾が同程度または異なる程度で存在してよいと考えられる。また、所与の抗体が多くのタイプの修飾を含んでもよい。
【００５８】
抗体を生産する例示的方法
本明細書に記載の精製方法に使用するための抗体は、以下の抗体生産方法のいずれかなど、任意の標準的方法を用いて生産することができる。
【００５９】
ファージディスプレー法では、機能的抗体ドメインを、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子の表面に提示させる。特に、ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を、動物ｃＤＮＡライブラリー（例えば、リンパ系組織のヒトまたはマウスｃＤＮＡライブラリー）または合成ｃＤＮＡライブラリーから増幅させる。ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡをＰＣＲによりｓｃＦｖリンカーによって連結し、ファージミドベクター（例えば、ｐ  ＣＡＮＴＡＢ６またはｐＣｏｍｂ  ３  ＨＳＳ）にクローニングする。このベクターを大腸菌にエレクトロポレーションにより導入し、その大腸菌にヘルパーファージを感染させる。これらの方法に使用するファージは一般に、ｆｄおよびＭ１３を含む線維状ファージであり、ＶＨおよびＶＬドメインは通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組換え的に融合される。対象抗原と結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原で、例えば、標識された抗原または固相表面もしくはビーズに結合または捕捉された抗原を用いて選択または同定することができる。抗体を作製するために使用することができるファージディスプレー法の例としては、限定されるものではないが、Brinkman et al, J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al, J. Immunol. Methods 184: 177-186 (1995); Kettleborough et al, Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al, Gene 187 9-18 (1997); Burton et al, Advances in Immunology 57: 191-280(1994);ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８７１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；Ｗ０９７／１３８４４；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，７１７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３５，７４３号および同第５，９６９，１０８号に記載されているものが挙げられる。
【００６０】
抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ親和性成熟などのいくつかの使用では、１以上のＶＨおよびＶＬドメインをファージディスプレーライブラリーで一本鎖抗体またはＦａｂフラグメントとして発現させることが有利であり得る。例えば、ファージディスプレーライブラリーを用いて、ＶＨおよびＶＬドメインをコードするｃＤＮＡをあり得るあらゆる組合せで発現させることができ、これにより、親和性の改良または解離速度の改良などの好ましい結合特性を有するＶＨ／ＶＬ組合せの選択が可能となる。さらに、ＶＨおよびＶＬセグメント（ＶＨおよびＶＬドメインのＣＤＲ領域など）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで突然変異させることもできる。ファージディスプレーライブラリーにおける「突然変異」ＣＤＲを有するＶＨおよびＶＬドメインの発現により、親和性の改良または解離速度の改良などの好ましい結合特性を有するＶＨ／ＶＬ組合せの選択が可能となる。抗体（抗体フラグメントまたは変異体を含む）は当技術分野で公知の任意の方法によって生産することができる。例えば、抗体はハイブリドーマ細胞株以外の細胞株で発現させることができると考えられる。特定の抗体のｃＤＮＡまたはゲノムクローンをコードする配列を、例えば、好適な哺乳動物または非哺乳動物宿主細胞の形質転換またはファージディスプレーライブラリーの作製に使用することができる。さらに、抗体は化学的に合成してもよく、または組換え発現系の使用によって生産してもよい。
【００６１】
抗体を生産するための１つの方法は、ＶＨおよび／またはＶＬドメインをクローニングすることであろう。ハイブリドーマ細胞株からＶＨおよびＶＬドメインを単離するために、ＶＨまたはＶＬヌクレオチド配列と相補的なＰＣＲプライマーを用いて、ハイブリドーマ細胞株から単離された全ＲＮＡに含まれるＶＨおよびＶＬ配列を増幅することができる。次に、ＰＣＲ産物を、例えば、ＰＣＲ反応に使用される多くのＤＮＡポリメラーゼによりＰＣＲ産物の５’および３’末端に付加される、突き出た単一のアデニンヌクレオチドと相補的な５’および３’単一ＴヌクレオチドオーバーハングからなるＰＣＲ産物クローニング部位を有するベクターを用いてクローニングすることができる。その後、ＶＨおよびＶＬドメインの配列を当技術分野で公知の従来法を用いて決定することができる。あるいは、ＶＨおよびＶＬドメインは、完全ｓｃＦｖ（すなわち、ＶＨドメイン、リンカーおよびＶＬドメイン）を増幅するように設計されたベクター特異的プライマーを用いて増幅してもよい。
【００６２】
クローニングされたＶＨおよびＶＬ遺伝子は、１以上の好適な発現ベクターに置いてもよい。非限定例として、ＶＨまたはＶＬヌクレオチド配列、制限部位、および制限部位を保護するためのフランキング配列を含むＰＣＲプライマーを用いてＶＨまたはＶＬ配列を増幅してもよい。当業者に公知のクローニング技術を用い、ＰＣＲにより増幅されたＶＨドメインを、ＶＨドメインとしては適当な免疫グロブリン定常領域、例えば、ヒトＩｇＧｌまたはＩｇＧ４定常領域、ならびにκおよびλＶＬドメインとしてはヒトκまたはλ定常領域をそれぞれ発現するベクターにクローニングすることができる。好ましくは、ＶＨまたはＶＬドメインを発現するためのベクターは、選択された発現系で重鎖および軽鎖の発現を指示するために好適なプロモーター、分泌シグナル、免疫グロブリン可変ドメインのためのクローニング部位、免疫グロブリン定常ドメイン、およびネオマイシンなどの選択マーカーを含んでなる。また、ＶＨおよびＶＬドメインを、必要な定常領域を発現する単一のベクターにクローニングしてもよい。次に、これらの重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを細胞株に同時にトランスフェクトして、当業者に公知の技術を用い、全長抗体、例えばＩｇＧを発現する安定または一時的細胞株を作出する（例えば、Guo et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 82:925-31 (1997)およびAmes et al., J. Immunol. Methods 184: 177-86 (1995)参照）。
【００６３】
当技術分野で公知の任意の方法により、抗体をコードするポリヌクレオチドを得、それらのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。ＶＨドメイン、ＶＬドメインおよびそのＣＤＲのアミノ酸配列が既知であれば、これらの抗体をコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で周知の方法を用いて決定することができ、すなわち、特定のアミノ酸をコードすることが知られているヌクレオチドコドンが、抗体をコードする核酸を生成するように組み立てられる。抗体をコードするこのようなポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから組み立てられてもよく（例えば、Kutmeier et al., BioTechniques 17:242 (1994)に記載の通り）、これには、簡単に述べれば、抗体をコードする配列の一部を含むオーバーラッピングオリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、その後の連結されたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅が含まれる。
【００６４】
あるいは、抗体（その抗体フラグメントまたは変異体を含んでなる、あるいはからなる分子を含む）をコードするポリヌクレオチドは好適な供給源の核酸から作製してもよい。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが利用できないが、その抗体分子の配列が既知である場合には、免疫グロブリンをコードする核酸を化学的に合成することもできるし、または好適な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または、例えばハイブリドーマ細胞またはエプスタイン・バーウイルスで形質転換されたＢ細胞株から作製されたｃＤＮＡライブラリー、または抗体を発現する任意の組織または細胞から単離された核酸、好ましくは、ポリＡ＋  ＲＮＡ）から、配列の３’末端および５’末端とハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅により、または例えば抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンを同定するための特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いたクローニングにより得ることもできる。ＰＣＲにより生成された増幅核酸を、次に、当技術分野で周知の任意の方法を用いて複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。
【００６５】
抗体（その抗体フラグメントまたは変異体を含んでなる、あるいはからなる分子を含む）のヌクレオチド配列が決定されれば、抗体のヌクレオチド配列は、例えばアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を作り出すための異なるアミノ酸配列を有する抗体を作出するために、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲなど、ヌクレオチド配列の操作のための当技術分野で周知の方法を用いて操作することができる（例えば、Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYおよびAusubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY参照）。
【００６６】
特定の態様では、重鎖および軽鎖のＶＨおよびＶＬドメインのうち１以上、またはそのフラグメントもしくは変異体を、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術を用いて抗体フレームワーク領域内に挿入する。特定の態様では、重鎖および軽鎖のＣＤＲのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれを超えるもの、またはそのフラグメントもしくは変異体を、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術を用いて抗体のフレームワーク領域内に挿入する。フレームワーク領域は、天然型またはコンセンサス抗体フレームワーク領域、好ましくは、ヒト抗体フレームワーク領域であり得る（例えば、ヒト抗体フレームワーク領域のリストについては、Chothia et al, J. Mol. Biol. 278: 457-479 (1998)を参照）。好ましくは、１以上のアミノ酸置換を有する抗体または抗体フラグメントの変異体をコードするポリヌクレオチドはフレームワーク領域内に作製することができ、好ましくは、これらのアミノ酸置換は、抗体のその抗原に対する結合に有意な影響を及ぼさない。さらに、このような方法は、鎖内ジスルフィド結合に関与する１以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を作り出して、１以上の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子、または抗体フラグメントもしくは変異体を作出するために使用することができる。ポリヌクレオチドに対する他の変更も当業者の範囲内にある。
【００６７】
いくつかの態様では、モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術を用いて作製される(Kohler et al., Nature 256:495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 571-681 (1981); Green et al., Nature Genetics 7: 13-21 (1994))。簡単に述べれば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅＴＭマウスを目的のポリペプチドで免疫すればよい。免疫誘導後、このようなマウスの脾細胞を抽出し、好適な骨髄腫細胞株と融合させる。いずれの好適な骨髄腫細胞株も本発明に従って使用可能であるが、ＡＴＣＣＴＭから入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２０）を使用するのが好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地で選択的維持した後、Wands et al., (Gastroenterology 80:225-232 (1981))により記載されているように、限界希釈によってクローニングする。このような選択から得られたハイブリドーマ細胞に、次に、抗体を分泌するクローンを同定するためのアッセイを行う。
【００６８】
ヒトにおける抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ使用およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出アッセイを含むいくつかの使用では、ヒトまたはキメラ抗体を使用することが好ましい場合がある。ヒト患者の治療的処置には、完全ヒト抗体が特に望ましい。いくつかの態様では、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅＴＭ株を用いてヒト抗体を生産する。Green et al., Nature Genetics 7: 13-21 (1994)参照。また、米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；ならびにＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３５、ＷＯ９８／２４８９３、Ｗ０９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３５７３５、およびＷＯ９１／１０７４１も参照。
【００６９】
キメラ抗体は、ヒト抗体に由来する可変領域と非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリン定常領域またはその逆を有する抗体など、抗体の異なる部分が異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。キメラ抗体を生産するための方法は当技術分野で公知である。例えば、Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125: 191-202 (1989); 米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７号参照。ヒト種由来の１以上のＣＤＲと非ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域（例えば、マウス、イヌまたはネコ免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域）（またはその逆）を含んでなるキメラ抗体は、例えば、ＣＤＲグラフト（ＥＰ２３９，４００；ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング(veneering)またはリサーフェイシング(resurfacing)（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al, Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska et al, PNAS 91 :969-973 (1994)）、およびチェーンシャッフリング（米国特許第５，５６５，３５２号）を含む、当技術分野で公知の様々な技術を用いて作製することができる。多くの場合、抗原結合を変更、好ましくは改良するために、フレームワーク領域内のフレームワーク残基がＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換される。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を特定するためのＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデリングおよび特定の位置の希少なフレームワーク残基を特定するための配列比較によって特定される（例えば、Queen et al, 米国特許第５，５８５，０８９号; Riechmann et al, Nature 352:323 (1988)参照）。
【００７０】
イントラボディーは、組換え核酸分子から発現され、細胞内に保持される（例えば、細胞質、小胞体、または周辺質に保持される）ように操作された抗体、多くの場合、ｓｃＦｖである。イントラボディーは、例えば、イントラボディーが結合するポリペプチドの機能を除去するために使用可能である。イントラボディーの発現は、イントラボディーを含んでなる核酸発現ベクターで誘導プロモーターを使用することによって調節することもできる。例示的イントラボディーは、Chen et al, Hum. Gene Ther. 5:595-601 (1994); Marasco, W.A., Gene Ther. 4: 11-15 (1997); Rondon and Marasco, Annu. Rev. Microbiol. 57 :257-283 (1997); Proba et al, J. Mol. Biol. 275:245-253 (1998); Cohen et al, Oncogene 77:2445-2456 (1998); Ohage and Steipe, J. Mol. Biol. 291: 1119-1128 (1999); Ohage et al, J. Mol. Biol. 291: 1129-1134 (1999); Wirtz and Steipe, Protein Sci. 5:2245-2250 (1999); Zhu et al, J. Immunol. Methods 257:207-222 (1999);およびその中に引用されている参照文献に開示および総説されているものなどの当技術分野で公知の方法を用いて生産することができる。
【００７１】
目的のポリペプチドを生産するための例示的発現系
本発明の方法を用いて精製することができる目的のポリペプチドを生産するためには標準的発現系を使用することができる。これらの方法は一般に、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を含む。ベクターは抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでよく（例えば、ＷＯ８６／０５８０７；ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号参照）、抗体の可変ドメインを、完全な重鎖、完全な軽鎖、または完全な重鎖および軽鎖の両方の発現のためのこのようなベクターにクローニングすることができる。
【００７２】
発現ベクターは、従来の技術により宿主細胞に移入し、トランスフェクト細胞を次に従来の技術により培養して目的のポリペプチドを生産する。一態様では、抗体フラグメントの発現のために、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターを抗体フラグメントの発現のための宿主細胞で共発現させることができる。別の態様では、完全な抗体分子の発現のために、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターを、下記のように、完全な免疫グロブリン分子の発現のための宿主細胞で共発現させることができる。
【００７３】
目的のポリペプチドを発現させるために種々の宿主−発現ベクター系を使用することができる。このような宿主−発現系は、目的のコード配列が生産でき、その後精製できるビヒクルを表し、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされた際にｉｎ  ｓｉｔｕでポリペプチドを発現し得る細胞も表す。これらには、限定されるものではないが、抗体フラグメントまたはその変異体（一本鎖抗体）を発現するように操作されたバクテリオファージ粒子、ポリペプチドコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌(E. coli)、枯草菌(B. subtilis)）などの微生物；ポリペプチドコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス(Saccharomyces)、ピチア(Pichia)）；ポリペプチドコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた、またはポリペプチドコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換させた植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を保持する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、または３Ｔ３細胞）が挙げられる。いくつかの態様では、組換えポリペプチドの発現のために大腸菌(Escherichia coli)などの細菌細胞、または真核細胞が使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞と強力なプロモーターを有するベクターとの組合せは、ポリペプチドの有効な発現系である(Foecking et al., Gene 45: 101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990); Bebbington et al., Bio/Techniques 10: 169 (1992); Keen and Hale, Cytotechnology 18:207 (1996))。
【００７４】
細菌系では、いくつかの発現ベクターが、発現される目的のポリペプチドに意図される使用に応じて有利に選択することができる。例えば、目的のポリペプチドの医薬組成物の生成のために、大量のこのようなポリペプチドを生産すべき場合は、容易に精製される高レベルの融合ポリペプチド産物の発現を指示するベクターが望ましいものであり得る。このようなベクターとしては、限定されるものではないが、融合ポリペプチドが生産されるようにポリペプチドコード配列をｌａｃ  Ｚコード領域とインフレームでベクターに個々に連結させることができる大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８(Ruther et al., EMBO 1. 2:1791 (1983))；ｐＩＮベクター(Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989))などが挙げられる。ｐＧＥＸベクターはまた、外来ポリペプチドをグルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合ポリペプチドとして発現させるために使用することができる。一般に、このような融合ポリペプチドは可溶性であり、溶解細胞から、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合とその後の遊離グルタチオンの存在下での溶出により容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた目的遺伝子産物をＧＳＴ部分が放出可能なように、トロンビンまたは因子Ｘａプロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。
【００７５】
昆虫系では、キンウワバ科(Autographa californica)核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用することができる。ウイルスはヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞で増殖させる。抗体コード配列はこのウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。
【００７６】
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルスに基づく発現系が使用可能である。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合には、目的のポリペプチドコード配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三分節リーダー配列に連結させることができる。次に、このキメラ遺伝子をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への挿入により、生存力があり、感染宿主内で抗体分子を発現することができる組換えウイルスが得られる（例えば、Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359 (1984)参照）。挿入されたコード配列の効率的翻訳には特定の誘導シグナルも必要とされ得る。これらのシグナルはＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、開始コドンは、全挿入配列の翻訳を保証するためには、所望のコード配列のリーディングフレームと同位相としなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成両方の様々な起源であってよい。発現の効率は適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって向上させることができる（例えば、Bittner et al, Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)参照）。
【００７７】
さらに、挿入された配列の発現を調節する、または所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。ポリペプチド産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）はポリペプチドの機能に重要であり得る。種々の宿主細胞は、翻訳後プロセシングならびにポリペプチドおよび遺伝子産物の修飾の特徴的かつ特異的な機構を有する。適当な細胞株または宿主系は、発現される外来ポリペプチドの適正な修飾およびプロセシングを保証するように選択することができる。この目的で、一次転写産物の適正なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化の細胞機構を有する真核生物宿主細胞が使用可能である。このような哺乳動物宿主細胞としては、限定されるものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、特に、乳癌細胞株、例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２ＯおよびＴ４７Ｄ、ならびに正常乳腺細胞株、例えば、ＣＲＬ７Ｏ３ＯおよびＨｓＳ７８Ｂｓｔが挙げられる。
【００７８】
組換えポリペプチドの長期間、高収率生産のためには、安定発現が好ましい。例えば、ポリペプチドを安定発現する細胞株が操作可能である。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞は適当な発現制御エレメント（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されるＤＮＡ、および選択マーカーで形質転換させることができる。外来ＤＮＡの導入の後、操作細胞を富化培地で１〜２日間増殖させてよく、その後、選択培地に切り換える。組換えプラスミド内の選択マーカーは選択耐性を付与し、細胞はそれらの染色体にプラスミドを安定的に組み込み、増殖して増殖巣を形成することができ、これをクローニングし、拡大培養して細胞株とすることができる。この方法は有利には、目的のポリペプチドを発現する細胞株を操作するために使用することができる。このような操作細胞株は、目的のポリペプチドと直接的または間接的に相互作用する組成物のスクリーニングおよび評価に特に有用であり得る。
【００７９】
限定されるものではないが、それぞれｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞またはａｐｒｔ細胞で使用可能な単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler et al., Cell 11 :223 (1977))、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992))、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy et al., Cell 22:8 17 (1980))遺伝子を含むいくつかの選択系が使用可能である。また、以下の遺伝子：メトトレキサート耐性を付与するｄｈｆｒ(Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527 (1981))；ミコフェノール酸耐性を付与するｇｐｔ(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981))；アミノグリコシドＧ−４１８耐性を付与するｎｅｏ(Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993);およびMorgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); TIB TECH 11(5):155-2 15 (May, 1993))；およびハイグロマイシン耐性を付与するｈｙｇｒｏ(Santerre et al, Gene 30: 147 (1984))の選択の基礎として代謝拮抗物質耐性を使用することができる。所望の組換えクローンを選択するためには、組換えＤＮＡ技術の当技術分野で一般に公知の方法を慣例的に適用することができ、このような方法は例えば、Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990);およびChapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1 (1981)に記載されている。
【００８０】
目的のポリペプチドの発現レベルは、ベクター増幅により増強することができる（総説としては、Bebbington and Hentschel, "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells" DNA Cloning, Vol.3. (Academic Press, New York, 1987)参照）。ベクター系のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルの増大は、マーカー遺伝子のコピー数を増やす。増幅領域はポリペプチドのコード配列と会合されているので、ポリペプチドの生産も増大する(Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983))。
【００８１】
目的のポリペプチドが組換え発現されれば、それを本発明の方法により精製することができる。
【実施例】
【００８２】
本発明の単に例であることを意図し、従って、本発明を何ら限定すると考えられるものではない実施例もまた、上述の本発明の側面および態様を記載し、詳細に示す。特に断りのない限り、圧力は大気圧またはその付近である。前述の例および詳細な説明は、限定としてではなく例示として示される。本明細書に引用される刊行物、特許出願、特許、雑誌論文、またはその他の文献は、各個の刊行物、特許出願、特許、雑誌論文、またはその他の文献が、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされることが具体的かつ個々に示される場合と同様に、引用することにより本明細書の一部とされる。特に、本明細書に引用される総ての刊行物は、本発明とともに使用可能な組成物および方法論を記載および開示する目的で、引用することにより明示的に本明細書の一部とされる。以上の発明は理解を明瞭にするための説明および例としてある程度詳細に記載されているが、当業者には本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなくこれらにある種の変更および改変をなし得ることが容易に明らかになるであろう。
【００８３】
実施例１：抗体生産
以下の実施例は、例示的な大規模抗体生産法（米国特許第７，０６４，１８９号）を記載する。当業者ならば、下記のプロトコールに対する慣例の改変に気づくであろう。
【００８４】
細胞培養のスケールアップおよび抗体生産
細胞の解凍からスケールアップを経て生産リアクターまで、血清不含かつ動物源不含の増殖培地を使用する。この培地は使用まで２〜８℃で保存する。
【００８５】
ＭＣＢバイアルからの細胞の解凍
およそ１６×１０６細胞を水浴中、３７℃で解凍する。これらの細胞をＴ−２２５培養フラスコに移し、播種密度およそ３．０×１０５細胞／ｍＬで、およそ５０ｍＬのワーキングボリュームとした。この培養フラスコを次に、３７℃、５％ＣＯ２の加湿ＣＯ２インキュベーター内に４日間置く。
【００８６】
スピナーフラスコでの第一の培養拡大
前記培養物を５００ｍＬスピナーフラスコへ無菌的に拡大培養し、播種細胞密度およそ２．２×１０５細胞／ｍＬで、およそ３００ｍＬのワーキングボリュームとした。このスピナーフラスコを次に、３７℃、５％ＣＯ２の加湿ＣＯ２インキュベーター内のマグネチックスターラー上に４日間置いた。スピナーフラスコの振盪速度は８０ｒｐｍである。
【００８７】
この培養物を再び３０００ｍＬスピナーフラスコへ無菌的に拡大培養し、播種細胞密度およそ２．２×１０５細胞／ｍＬで、およそ１５００ｍＬのワーキングボリュームとした。このスピナーフラスコを次に、３７℃、５％ＣＯ２の加湿ＣＯ２インキュベーター内のマグネチックスターラー上に４日間置いた。これらのスピナーフラスコの振盪速度は８０ｒｐｍである。シードリアクターに播種を行うのに十分な量の細胞培養物が蓄積されれば、次の工程に進む。そうでない場合には、シードリアクターに播種を行うのに十分な量の細胞培養物が蓄積されるまで、合計３〜４倍の拡大となるように培養物を複数の３０００ｍＬスピナーフラスコへ無菌的に拡大培養する。
【００８８】
シード培養
シードリアクターは、２つの混合回転翼、溶存酸素探針、温度探針、ｐＨ探針、無菌サンプリングおよび添加システムを備えている。細胞培養プロセスの第一工程は、バイオリアクターへの培地の添加である。培地温度が３７±０．５℃に達した後、溶存酸素（ＤＯ）およびｐＨレベルをＮ２およびＣＯ２の添加によって安定化させて、溶存酸素濃度を空気飽和度３０±５％に引き下げ、ｐＨを７．２０±０．１０とする。振盪速度は８０ｒｐｍである。プールした細胞培養物を、無菌増殖培地を含有する１５Ｌシードリアクターに無菌的に移し、播種細胞密度およそ２．２×１０５細胞／ｍＬの培養物を得る。この培養プロセス中、温度は加熱ブランケットと冷却フィンガーにより維持し、酸素濃度はスパージャーと表面曝気により維持し、ｐＨはＣＯ２ガスを加えてｐＨを下げることにより制御する。培養期間は５〜６日である。バイオリアクターの空気口は疎水性の０．２μｍベントフィルターにより保護する。
【００８９】
生産培養
生産用バイオリアクターは、２つの混合回転翼、２つの溶存酸素探針、温度探針、２つのｐＨ探針、無菌サンプリングおよび添加システムを備えている。８０Ｌの増殖培地を１００Ｌの生産用バイオリアクターへ無菌的に移す。増殖培地の温度が３７±０．５℃に達した後、ＤＯおよびｐＨレベルをＮ２およびＣＯ２の添加によって安定化させて、溶存酸素濃度を空気飽和度３０±５％に引き下げ、ｐＨを７．２０±０．１０とする。振盪速度は４５ｒｐｍである。１５Ｌのシード培養物を生産用バイオリアクターへ無菌的に移し、播種細胞密度およそ２．２×１０５細胞／ｍＬの培養物を得る。この培養プロセス中、温度は熱交換器により維持し、酸素濃度はスパージャーおよび表面曝気により維持し、ｐＨはＣＯ２ガスを加えてｐＨを下げることにより制御する。播種３日後に、細胞密度がおよそ１．０×１０６細胞／ｍＬに達した際に、およそ６Ｌの流加培地を生産用バイオリアクター供給した。供給から５日後に、抗体を含有する生産培養物を採取した。
【００９０】
細胞上清の採取
流加細胞培養プロセスを用いた最終生産用バイオリアクターで最後の供給から５または６日後に細胞上清（例えば、抗体を発現する細胞の培養上清）を採取する。採取プロセスは、抗体濃度が少なくとも４００ｍｇ／Ｌに達した際に開始する。生産用バイオリアクターの細胞培養温度は採取時には１５℃に冷却され、回収中、その温度で維持される。細胞の除去および抗体の回収のために深層濾過プロセスを使用する。一連の濾過プロセスは、直列接続された孔径４．５μｍ、０．４μｍおよび０．２μｍのフィルターからなる。作動中、最大１５ｐｓｉのフィルター間圧力制御で一定流速１．００Ｌ／分を維持する。０．２μｍで濾過した培養上清をプロセスバッグ内に回収し、精製に移行する。
【００９１】
細胞上清の精製
上清は、本明細書に記載のプロテインＡクロマトグラフィー法を用いて精製することができる。所望により、プロテインＡクロマトグラフィー工程の前後で１以上の精製工程を実施することができる（米国特許第７，０６４，１８９号）。例えば、イオン交換、ゲル濾過、または疎水性電荷相互作用クロマトグラフィーが実施可能である。さらに、所望によりウイルス不活性化工程（低ｐＨでのインキュベーションなど）を行ってもよい（米国特許第７，０６４，１８９号）。
【００９２】
実施例２：プロテインＡクロマトグラフィー
目的のポリペプチドを精製するために以下の例示的プロテインＡクロマトグラフィー法を用いた。この方法は本明細書に記載のバッファーのいずれを用いて行ってもよい。
【００９３】
保存バッファー中に保存したプロテインＡ系アフィニティーカラムに、２カラム容量（ＣＶ）の平衡化バッファー、２ＣＶの洗浄バッファー、２ＣＶの溶出バッファー、および２ＣＶの再生バッファーを予備循環させた。これらのカラムを次に、４ＣＶの平衡化バッファー（３５０ｃｍ／時）で平衡化した。
【００９４】
目的のポリペプチドを含入する細胞培養上清をプロテインＡ系アフィニティーカラムにロードした後、４ＣＶの平衡化バッファーで洗浄し、次いで、３〜４ＣＶの洗浄バッファーで洗浄した。あるいは、カラムを５ＣＶの洗浄バッファーの一工程で洗浄した。目的のポリペプチドを３〜４ＣＶの溶出バッファーで溶出し、ＯＤ２８０から回収した。このプールのアリコートをさらなる分析まで≦−６５℃で保存した。
【００９５】
カラムを３ＣＶの再生バッファー、次いで３ＣＶの保存バッファーでストリッピングした。総ての工程を３５０ｃｍ／時で行った。ウイルスのクリアランスは、実施例４に記載の通りに測定した（表１および図１Ａおよび１Ｂ）。
【００９６】
実施例３：バッファー伝導率の測定
バッファー（溶出バッファーなど）の伝導率は、以下に記載されるものなどの標準的方法を用いて測定することができる。この実施例で使用する装置はＭｅｔｒｏｈｍモデル７１２伝導率計、伝導率電極およびＰｔ１００温度センサーを組み込んだ液浸セルを含んだ（Ｍｅｔｒｏｈｍ  ｐａｒｔ  ｎｏ．  ６．０９０８．１１０）。まず、主電源コードを伝導率計およびアウトレットに差し込み、電極を伝導率計の背面の適切なコンセントに差し込み、電源スイッチを入れるということを確実に行うことにより伝導率計をセットアップした。
【００９７】
次に、伝導率計を使用の少なくとも２４時間以内に標準化した。標準化を行うために、「ｒｅｆ．  ｔｅｍｐ．」を２０℃に設定し、「ＴＣ  ｃｏｎｓｔ．」を２．１％／℃に設定した。電極セル定数を記録した後、電極をＷＰＵまたはＷＦＩですすいだ。次に、電極を伝導率標準、例えば、１０，０００μＳ／ｃｍ伝導率の標準（Ｐ／Ｎ  ６０１９６）に浸漬した。標準化を開始するために、伝導率計を測定モードに設定し、伝導率標準からの適正な伝導率値および標準参照温度値を設定した。セル定数の較正を行い、その読み取り値を電極セル定数の読み取り値と比較した。標準化されたセル定数は探針定数の±０．０２ｃｍ−１であるべきである。標準化されたセル定数がこの範囲外であれば、標準化手順を繰り返し、必要があれば電極を交換した。
【００９８】
伝導率計を標準化した後、サンプルの測定を行った。伝導率計を測定モードに設定し、電極をＷＰＵまたはＷＦＩのいずれかですすいだ。次に、電極をサンプルに浸漬し、読み取り値が安定したところで値を記録した（図１Ａおよび１Ｂ）。
【００９９】
実施例４：ウイルスクリアランスの測定
ウイルスクリアランスの評価に関する総てのウイルス検査はＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅにて、同所の内部ＳＯＰ（ＳＯＰ  ＢＰＢＴ０９５７およびＳＯＰ  ＯＰＢＴ０９７９）に従って行った。あるいは、Lute, S. et al., J. Chromatogr A. 26:1205(1-2):17-25, 2008またはValdes et al., J. Biotechnology 96:251-258, 2002に記載されている方法など、任意の標準的方法を用いてウイルスクリアランスを測定してもよい。
【０１００】
サンプル調製
試験品はＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより受理された。総てのサンプルのｐＨが６〜８の範囲内であったので、抽出前に調整する必要はなかった。ロードサンプルは１：１０希釈し、溶出サンプルは希釈せずに試験した。サンプル抽出物はＱＩＡａｍｐ（商標）Ｖｉｒａｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて、キット手順の概略の通りに調製した。試験品サンプルは２反復で抽出した。
【０１０１】
陰性抽出対照は、キット手順に従ってヌクレアーゼ不含水を抽出することにより調製した。
【０１０２】
ＰＣＲ増幅
サンプルおよび対照に対し、それぞれ２０コピーのＸＭｕＬＶ  ＲＮＡ（４コピー／μｌ）または５０コピーのＭＭＶ  ＤＮＡ（１０コピー／μｌ）の検出を遂行するために最適化された条件で、異種指向性マウス白血病ウイルス（Ｘ−ＭｕＬＶ）ＲＮＡまたはマウス微小ウイルス（ＭＭＶ）ＤＮＡに特的なプライマーおよびプローブを用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲを行った。試験品サンプルにつき合計６回のＰＣＲ反応となるように、各２反復の試験品サンプルに対して３回のＰＣＲ反応を行った。陰性試験対照に対して全部で３データ点および陰性抽出対照に対して全部で３データ点を分析した（表１および図１Ａおよび１Ｂ）。
【０１０３】
実施例５：バルク原体の保存
所望により、精製された目的のポリペプチドに関して、下記のパラメーターのいずれを試験してもよい。バルク原体は、製品の出荷前に所望により２〜８℃（短期保存）または−４０℃以下（長期保存）で保存される。各バッチの採取時の未加工生産用バイオリアクター培養物の工程内試験および精製工程中の工程内試験を行う。精製に供給される材料の一貫性を保証するために、バイオリアクターを無菌的にサンプリングし、培養中の種々の時点で、培養物の細胞密度、生存力を試験し、栄養素の同定を行った。精製プロセスを段階ごとにモニタリングする。外観は、視覚的検査によって確認する。ポリペプチド濃度は、２８０ｎｍでの吸光度により測定する。材料のｐＨを確認する。純度は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより環員する。ＥＬＩＳＡを行って、抗体の、その抗原との結合能を確認してもよい。ポリペプチドの生物活性もモニタリングする。残存ＤＮＡ含量、内毒素レベル、およびバイオバーデン（ポリペプチド調製物中に存在する生きている生物体の数）を総てモニタリングし、標準許容レベル以下に維持する。さらに、オリゴ糖含量を分析してもよく、ペプチド配列を、Ｎ末端配列決定およびペプチドマッピングを用いて分析することもできる。ポリペプチド安定性の短期および長期試験を行ってもよい。
【０１０４】
記載されている特定の方法論、プロトコール、および試薬は変更可能であるので、本発明はこれらに限定されないと理解される。当業者ならば、本発明を実施または試験するために、本明細書に記載のものと類似または等価ないずれの方法および材料も使用可能であることを認識するであろう。以上の説明および実施例に特に記載されているもの以外でも本発明は実施可能であることは明らかである。上記の教示に照らして本発明の多くの改変および変形形態が可能であり、従って、それらは添付の特許請求の範囲内にある。
【０１０５】
本明細書に示される見出しは、本発明の種々の側面または態様を限定するものではなく、これらは参照によりそのまま本明細書に含まれ得る。
【０１０６】
本明細書で使用する場合、そうではないことが明示されない限り、用語「１つ("a", "an"など）」は１以上を意味する。
【０１０７】
本明細書において値またはパラメーターの「約」とは、その値またはパラメーター自体に向けられる具体例を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」という記載は、「Ｘ」の説明が含まれる。数的範囲には、その範囲を定義する数値が含まれる。
【０１０８】
本明細書に記載される発明の側面および態様は、側面および態様「を含んでなる」、「からなる」および「から本質的になる」場合を含むと理解される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【国際調査報告】
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