(57)【要約】本願は、新規なペグインターフェロンλ1複合体(PEG-IFNλ1)、それらの製造方法、これら複合体を含む医薬組成物およびそれを製造する方法を開示する。これら複合体は、IFNλ1に比べて増大した血中半減期および持続時間を有しており、B型肝炎およびC型肝炎の処置において有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I:
【化１】
2014525939.tif 000020
[式中、
Rは、HまたはC1-3アルキルであり;
mは、1、2、3または4であり;
nは、400〜550の範囲で選択される正の整数であり;
Lは、C1-10アルキルまたはヘテロアルキルリンカーであり;
Xは、-O-、-NH-または-S-であり;そして、
IFNλ1は、インターフェロンλ1である]
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩を含有する、生理的に活性なPEG-IFNλ1複合体。
【請求項２】
RがHまたは-CH3であり、mが1であり、Lが-C(O)-であり、そしてXが-NH-である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
nが500〜550である、請求項１または２に記載の複合体。
【請求項４】
式:
【化２】
2014525939.tif 000021
（式中、INFλ1がSEQ ID2のインターフェロンλ1であり;
nが500〜550である）
で示される化合物を含有する、請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
該複合体が、IFNλ1と比べて長期化または延長された血清半減期および持続時間を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項６】
該PEGがIFNλ1のN末端でメチオニンに結合している、請求項１から５のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の複合体、ならびに医薬的に許容される担体および賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項８】
該医薬組成物がB型肝炎およびC型肝炎の処置に用いられる、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
結合反応:
【化３】
2014525939.tif 000022
（式中、PEG部分の分子量が約40 kDaであるように、nが500〜550の範囲で選択される正の整数である）
によって(α-メトキシ-ω-(4-ニトロフェノキシカルボニル))ポリオキシエチレン(PEG-pNC) 40 kDaをIFNλ1と共有結合させる工程;ならびに、該複合体を単離する工程を含む、請求項１に記載のヒト組換え複合体の製造方法。
【請求項１０】
式I:
【化４】
2014525939.tif 000023
[式中、
Rは、HまたはC1-3アルキルであり;
mは、1、2、3または4であり;
nは、400〜550の範囲で選択される正の整数であり;
Lは、C1-10アルキルまたはヘテロアルキルリンカーであり;
Xは、-O-、-NH-または-S-であり;そして、
IFNλ1は、インターフェロンλ1である]
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩を含有するPeg-IFNλ1複合体の製造方法であって:
IFNλ1のアミノ酸残基との共有結合を促進させるのに十分な条件下において、IFNλ1を予め活性化されたPegに接触させることを含む、該製造方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の製造方法により製造されたPEG-IFNλ1複合体。
【請求項１２】
癌細胞を請求項１から４のいずれか一項に記載の複合体と接触させることを含む、患者において癌細胞の増殖を抑制する方法であって、該複合体がIFNλ1に比べて長期化または延長された血清半減期および持続時間を有する、該方法。
【請求項１３】
治療上有効な量の請求項１に記載の複合体を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において増殖性疾患を処置する方法。
【請求項１４】
ウイルスに感染しているか、または感染する危険性がある患者を処置する方法であって、該処置を必要としている患者に、治療上有効な量の式I:
【化５】
2014525939.tif 000024
[式中、
Rは、HまたはC1-3アルキルであり;
mは、1、2、3または4であり;
nは、500〜550の範囲で選択される正の整数であり;
Lは、C1-10アルキルまたはヘテロアルキルリンカーであり;
Xは、-O-、-NH-または-S-であり;そして、
IFNλ1は、インターフェロンλ1である]
の複合体もしくはその医薬的に許容される塩;または該式Iの複合体を含有する医薬製剤を投与することを含む、該方法。
【請求項１５】
Rが-CH3であり、mが1であり、Lが-C(O)-であり、Xが-NH-であり、そして、IFNλ1がSEQ ID 2である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該ウイルス感染がC型肝炎ウイルスにより引き起こされるものであるか、あるいは該ウイルス感染によって進行性肝硬変が引き起こされる、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
該PEG-IFNλ1が、毎週、約0.5 μg/kg〜10.0 μg/kgの用量で投与される、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
さらに、リバビリンまたはビラミジンから選択されるヌクレオシドアナログを投与することを含む、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
該リバビリンが毎日5 mg/kg〜25 mg/kgの用量で投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該患者が、HCV耐性または難治性患者である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本願は、2011年8月25日に出願されたベトナム特許出願第VN1-2011-02222号の利益を主張し、引用によりその全般が本明細書に援用される。
【技術分野】
【０００２】
一実施態様において、本願は、組換えヒトインターフェロンλ1のペグ化誘導体(ペグインターフェロンλ1複合体またはPEG-IFNλ1)、それらの製造方法、これら複合体を含む医薬組成物およびその製造方法を開示する。
【背景技術】
【０００３】
C型肝炎ウイルス(HCV)は、世界中において主要な健康問題であって慢性肝疾患の主要な原因である。世界中で少なくとも1億8000万人がHCVに慢性的に感染していると推定される。ベトナムにおいては、人口におけるHCV感染者の割合は4〜9%である。HCVに急性感染した者の約55〜85%が慢性感染に移行し、これら慢性キャリアの5〜25%は25〜30年後に肝硬変を発症するリスクがあり、肝硬変である者のうち30%は10年以上にわたって肝代償不全のリスクがあり、そして、毎年1〜3%は肝癌を発症しうる。疫学調査によると、最終段階の肝硬変の患者の40%および肝細胞癌における60%で、HCVが原因となっている。
【０００４】
現在、慢性C型肝炎の処置に対して選択される療法はα-インターフェロン(AI)である。AIは、症例の約70%においてHCVに持続的に応答することができるが、これらインターフェロンは（ペグインターフェロンαの場合でさえも）多くの副作用を引き起こす。これらの副作用によってしばしば処置が制限され、患者の処置が不完全なままになり得る。副作用には、インフルエンザ様症候群および血液学的な影響（例えば、サラセミアおよび貧血）が含まれる。
インターフェロンは、現在、多くのウイルス性疾患（例えば、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、尖圭コンジローマ、らい腫型ハンセン病、慢性白血病およびAIDS）の処置のために用いられている。AIはまた、悪性腫瘍の縮小、ならびにカポジ肉腫、メラノーマ、および腎細胞癌の処置において有効である。さらに、AIはウシおよび他の家畜における疾患の予防および処置に適用できる。例えば、AIは、口蹄疫およびブタ繁殖・呼吸障害症候群の予防および処置で用いられるワクチンの活性を増強する。
【０００５】
AIは、組織培養培地で培養されたヒト細胞株またはドナー由来の白血球から製造されている。しかしながら、これらの方法は時間がかかり、労働集約的であり、費用がかかり、大規模製造に適していない。さらに、細胞株からの感染病原体によって引き起こされる敗血症のリスクが存在する。
組換えDNA技術の開発によって、我々は今では、微生物にAI遺伝子を導入して大量のインターフェロンを製造することができる。しかし、これらの方法はまた、主に発現の工程および大規模タンパク質製造の工程においていくらかの利点と困難を提示している。
【０００６】
IL-29は、ヘリカルサイトカインファミリーのメンバーであって、III型インターフェロンである。また、インターフェロンλ1(IFNλ1)としても知られており、IL-28（他のIII型インターフェロン）とアミノ酸配列において高い類似性を有している。IL-28およびIL-29(IFNλ1)は、最近、新しいサイトカインファミリー（I型インターフェロン(IFN)（共通の一連の遺伝子の発現を駆動する同一のJak/Statシグナル経路）を共有する）のメンバーとして記載された。それに応じて、IFNλと命名されている。IFNλは、I型IFNといくつかの共通の特徴:抗ウイルス活性、抗増殖活性およびin vivo抗腫瘍活性を示す。しかしながら、重要なことに、IFNλは別々の膜受容体（IFNLR1およびIL10R2から成る）に結合する。
【０００７】
ほとんどの生物製剤（biological）の治療用途の主なデメリットは、非経口（例えば、静脈内(i.v.)、皮下(s.c.)、筋肉内(i.m.)など）で投与されることである。このことは、患者への送達に痛みと不快感が伴うことを意味する。さらに、通常それらは半減期が非常に短いことから、生物製剤は、薬物の治療的な血清もしくは血漿濃度を維持するために患者に高頻度で投与される必要がある。自己投与できない注射は、クリニックおよび熟練の医療従事者を頻繁に訪問する必要があるため、該療法は不便で高額なものとなる。慢性のB型およびC型肝炎の処置で用いられるヒトインターフェロンαの2つの組換え型であるインターフェロンα-2a(Roferon, Roche)およびインターフェロンα-2b(Intron A, Schering A G)は血清半減期が12時間未満(非特許文献１)であるため、3回/週投与する必要がある。また、多発性硬化症(MS)の患者を処置するためにはインターフェロンβ-1b(Betaseron)の反復注射が必要とされる。
【０００８】
体内での薬物の閾値レベルを維持するための方法であって、上記のような高頻度で高用量の注射の必要性を克服する、大きな成功を収めて広く認められた1つの方法は、治療用タンパク質（therapeutic protein）をポリマー（例えば、ポリエチレングリコール(PEGまたはPeg)）と結合させることによってそのin vivo半減期を増大させることである。長鎖のPEG分子は、水溶液中においてペグ化薬物分子の周囲に保護遮蔽（protective shield）を作ることによってタンパク質薬物の免疫原性を低下させる一方でプロテアーゼの作用からそれらを保護するだけでなく、それらはさらにその流体力学的体積を増大させることによって薬物の循環半減期を増大させることを促進する（それによって腎糸球体ネットワークの濾過機構からのその損失が減少する）。タンパク質分子からのそれらの分離後、いずれの構造変化も伴わずにPEG部分が除かれ、また、それらのクリアランスはそれらの分子量に比例している。
【０００９】
通常、まずPEG部分を活性化させ、次いで該活性化されたPEG物質をタンパク質のアミノ酸の側鎖（例えば、該タンパク質上のリジン残基および/またはN末端アミノ基）と反応させることにより、PEG部分をタンパク質に結合させる。最も頻繁に用いられるPEGは単官能基PEGである。なぜなら、この部分は架橋結合および凝集に抵抗性であるからである。その一例がDavisらによって特許文献１に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第4,179,337号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】McHutchison, et al., Engl. J. Med. 1998, 339, 1485-1492; Glue, et al., Clin. Pharmacol. Ther. 2000, 68, 556-567
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
発明の概要:
ペグインターフェロンλ1(PEG-IFNλ1)は、ヒト組換えIFNλ1のペグ化誘導体(ポリエチレングリコールがIFNλ1に結合しており、「複合体」とも称される)であり、成人患者での慢性C型肝炎の処置において有用である。PEG-IFNλ1は、患者の体内への注入後、細胞外酵素の作用を回避し、腎臓での濾過に抵抗することにより、循環中のその半減期が延びる。すなわち、該複合体は、対応する非PEG複合IFNλ1と比較して、顕著に改善された安定性、より良好な溶解性、ならびに増大された循環半減期および血漿滞留時間を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
インターフェロンλ1(IFNλ1、Zcyto21またはIL-28A)は当分野において公知である（例えば、米国特許第7,038,032号、6,927,040号、7,135,170号、7,157,559号および7,351,689号;ならびに国際公開 WO 05/097165、WO 07/012,033、WO 07/013,944およびWO 07/041,713から;その全ては引用によりその全般が本明細書に援用される）。
【００１４】
一実施態様において、本願は新規のPEG-IFNλ1複合体を開示する。一態様において、本願の複合体は直線状PEG鎖構造を有する。未修飾のIFNλ1(すなわち、PEGまたはmPEGと結合していないIFNλ1)と比較すると、これら複合体は循環半減期および血漿中の持続性が増大している。水溶性のPEGには、ポリエチレングリコール(PEG)、モノメトキシ-PEG(mPEG)、モノ-C1-10アルコキシ-PEGおよびモノ-C1-3アルコキシ-PEGが含まれる。用いてもよいこれらのPEGは約600〜60,000の分子量であってよく、例えば、約10 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、50 kDaおよび60 kDaであるものが含まれる。一態様において、本複合体で用いられるPEGは40 kDaの分子量のmPEGである。
【００１５】
一実施態様において、式I:
【化１】
2014525939.tif 000002
（式中、RはHまたはC1-3アルキルであり;mは1、2、3または4であり;nは400〜550の範囲で選択された正の整数であり;LはC1-10アルキルまたはヘテロアルキルリンカーであり;Xは-O-、-NH-または-S-であり;そして、IFNλ1はインターフェロンλ1である）で示される化合物またはその医薬的に許容される塩を含有する、生理的に活性なPEG-IFNλ1複合体を提供する。一態様において、インターフェロンλ1はヒト組換えインターフェロンである。別の態様において、該IFNλ1は天然または組換えタンパク質であってよい。別の態様において、該IFNλ1は、組織、タンパク質合成、または天然の細胞もしくは組換え細胞を用いた細胞培養といった供給源由来のヒトタンパク質である。さらに別の態様において、IFNλ1はヒト組換えタンパク質である。別の態様において、式Iの複合体インターフェロンλ1はSEQ ID 2である。一実施態様において、PEG鎖は、IFNλ1の第1級アミノ基（例えば、リジン）またはN末端上でアミド結合を介してIFNλ1に結合している。
【００１６】
ヘテロアルキルは、該C1-10アルキルの炭素のうちの少なくとも1個は-O-、-C(=O)-、-NH-またはそれらの組み合わせにより置換されているC1-10アルキルと定義される。該組み合わせとしては、例えば、-OC(=O)-、-C(=O)O-、-NHC(=O)-、-C(=O)NH-などが挙げられる。一態様において、nは約500〜550である。別の態様において、nは約420、520または455である。別の態様において、該Peg基の分子量は約35 kDa〜45 kDaであるかまたは約40 kDaである。上記の別の態様において、mは1または2である。C1-10アルキルまたはヘテロアルキルは直線状または分枝状のアルキルまたはヘテロアルキル基であってよい。一態様において、該C1-10アルキル基は-C(O)-基である。一実施態様において、mは1であって、L-X-は式:
【化２】
2014525939.tif 000003
からなる群から選択される。
【００１７】
上記複合体の一態様において、mは2であって、L-X-は式:
【化３】
2014525939.tif 000004
である。
【００１８】
上記複合体の別の態様において、2個のPEG基（PEG、アルキル-PEGまたはm-PEG）は、上記式の2個のホルムアミド基(すなわち、-C(O)NH-)に結合している。別の態様において、Xは-NH-または-O-であって、mは2である。別の態様において、該リンカーは2個のPEG基に結合している。別の態様において、Xは-NH-であって、該リンカーに結合している基はIFNλ1上のリジンの残基である。一態様において、該リンカーに結合している-NH-基(すなわち、アミノ基)はヒスチジンの残基である。別の態様において、Xは-O-であって、該リンカーに結合している基はIFNλ1上のセリンの残基由来であってよい。上記式の1つのバリエーションにおいて、Rは-CH3である。別の態様において、該リンカーはIFNλ1上のリジン、セリン、ヒスチジンまたはそれらの混合物に結合している。別の態様において、該リンカーは、IFNλ1上のリジン、セリン、ヒスチジンまたはそれらの混合物の残基の位置異性体に結合している。該複合体の別の態様において、RはHまたは-CH3であり、mは1であり、Lは-C(O)-であり、そして、Xは-NH-である。別の態様において、nは500〜550である。
【００１９】
別の態様において、該複合体(Nanogen PEG-IFNλ1)は、式II:
【化４】
2014525939.tif 000005
（式中、INFλ1はインターフェロンλ1であり;そして、nは500〜550である）の化合物を含有する。一態様において、nはPEG構造中の多数のエチレングリコールユニットであり、PEG部分の分子量が約40 kDaであるようにいくつかの数から選択される正の整数であり、そして、INFλ1はインターフェロンλ1である。上記の別の実施態様において、該複合体は、IFNλ1と比較して長期化または延長された血清半減期および持続時間を有する。該複合体の別の態様において、該PEGはIFNλ1のN末端にてメチオニンに結合している。さらに別の態様において、該複合体はB型肝炎およびC型肝炎の処置において有効である。
【００２０】
別の実施態様において、上記で開示されたヒト組換え複合体の製造方法を提供し、該方法は、以下:
【化５】
2014525939.tif 000006
（式中、nはPEG部分の分子量が約40 kDaであるように選択される正の整数である）の通りの結合反応によって(α-メトキシ-ω-(4-ニトロフェノキシカルボニル))ポリオキシエチレン(PEG-pNC)（40 kDa）をIFNλ1と共有結合させる工程;ならびに、複合体を単離する工程を含む。一態様において、nは約500〜550である。
【００２１】
別の実施態様において、上記の複合体ならびに医薬的に許容される担体および賦形剤を含む医薬組成物を提供する。また、通常の医薬製剤は、本願の複合体を含有する組成物を用いて製造され得る。該製剤は、当分野で公知の医薬的に許容される担体と一緒に治療上有効な量の該複合体を含有する組成物を含んでよい。必要に応じて、例えば、アジュバント、希釈剤、保存剤および/または可溶化剤を用いてもよい。該複合体を含有する医薬組成物は、例えば米国特許第4,496,537号に記載されるように、様々なバッファー(例えば、Tris-HCl、アセテート、ホスフェート)の希釈剤（広範なpHおよびイオン強度を有する）、担体(例えば、ヒト血清アルブミン)、可溶化剤(例えば、ポリオキシエチレンソルビタンまたはTWEEN（登録商標）、ポリソルベート)、および保存剤(例えば、チメロサール（thimerosol）、ベンジルアルコール)を含んでよい。一態様において、該医薬組成物は注射剤用の無菌の凍結乾燥粉末として製剤化される。別の態様において、該組成物は医薬的に許容されるビヒクル（生理食塩水、緩衝生理食塩水および5%ブドウ糖液を含む）の組み合わせを含有する。別の態様において、該医薬組成物はバイアルまたは予め充填されたシリンジ中の注入用液剤として製剤化される。上記の一態様において、該医薬組成物はB型肝炎およびC型肝炎の処置に用いられる。医薬製剤および該製剤を製造するための方法は当分野において周知であり、例えば、“Remington, The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. 19th ed. 1995”中に開示されている。
【００２２】
別の実施態様において、式I:
【化６】
2014525939.tif 000007
（式中、RはHまたはC1-3アルキルであり;mは1、2、3または4であり;nは400〜550の範囲で選択される正の整数であり;LはC1-10アルキルまたはヘテロアルキルリンカーであり;Xは-O-、-NH-または-S-であり;そして、IFNλ1はインターフェロンλ1である）で示される化合物またはその医薬的に許容される塩を含有するPeg-IFNλ1複合体を製造するための方法であって、IFNλ1のアミノ酸残基との共有結合を促進するのに十分な条件下においてIFNλ1を予め活性化させたPegと接触させることを含む方法を提供する。一実施態様において、本明細書に記載の方法により製造されたPEG-IFNλ1複合体を提供する。一態様において、IFNλ1上でのPEGもしくはmPEGの共有結合を促進させるのに十分な条件下においてIFNλ1を十分な量の活性化されたPEGもしくはmPEGと接触させることを含む、上記の複合体を製造する方法を開示する。別の態様において、活性化されたmPEGはmPEG-pNCである。別の態様において、活性化されたmPEGはIFNλ1のN末端のメチオニン上で結合する。別の態様において、該mPEGは約40 kDaの分子量を有する。別の態様において、活性化されたオキシカルボニル剤はモノ-またはジ-活性化剤である。
【００２３】
別の実施態様において、癌細胞を上記の複合体と接触させることを含む、患者において癌細胞の増殖を阻害する方法を提供し、ここで、該複合体はIFNλ1と比較して長期化または延長された血清半減期および持続時間を有する。一態様において、本願の複合体は、対応する非複合IFNλ1の血清半減期の2倍、3倍、5倍、8倍、または10倍以上延長された血清半減期を有する。
【００２４】
別の実施態様において、治療上有効な量の上記複合体を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の増殖性疾患を処置する方法を提供する。一実施態様において、該複合体を、インターフェロン感受性の症状、あるいはインターフェロンベースの療法に対してポジティブにまたは優位に応答する症状を処置するために用いてもよい。一態様において、該複合体を用いた処置は、結果として、インターフェロンを用いた通常の処置に比べて副作用を十分に低下させ、あるいは排除する。
【００２５】
一態様において、本願の複合体を用いて処置することができる症状の例としては、限定はされないが、細胞増殖疾患、具体的には癌(例えば、ヘアリーセル白血病、カポジ肉腫、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、基底細胞癌および悪性メラノーマ、卵巣癌、ならびに皮膚T細胞リンパ腫)、および様々な感染症が挙げられる。別の態様において、該複合体を用いて、インターフェロン感受性ウイルスの複製を阻害することによって恩恵を受ける症状を処置してもよい。本願の複合体を用いて処置してもよいウイルス感染としては、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、他の非A/非B型肝炎、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、単純ヘルペス、ヒトヘルペスウイルス6型(HHV-6)、乳頭腫、ポックスウイルス、ピコルナウイルス（picomavirus）、アデノウイルス、ライノウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス1型および2型(HTLV-1/-2)、ヒトロタウイルス、狂犬病、レトロウイルス（ヒト免疫不全ウイルス(HIV)を含む）、脳炎、ならびに呼吸器ウイルス感染が挙げられる。
【００２６】
別の実施態様において、ウイルス感染症に感染しているかまたは感染するリスクのある患者を処置する方法であって、該患者に治療上有効な量の式I:
【化７】
2014525939.tif 000008
（式中、RはHまたはC1-3アルキルであり;mは1、2、3または4であり;nは500〜550の範囲で選択される正の整数であり;LはC1-10アルキルまたはヘテロアルキルリンカーであり;Xは-O-、-NH-または-S-であり;そして、IFNλ1はインターフェロンλ1である）の複合体またはその医薬的に許容される塩、あるいは該式Iの複合体を含有する医薬製剤を投与することを含む該方法を提供する。一態様において、該式Iの複合体インターフェロンλ1はSEQ ID 2である。一態様において、哺乳動物はヒトである。該方法の別の態様において、該ウイルス感染症はC型肝炎ウイルスによって引き起こされるか、あるいは該ウイルス感染症によって進行性（advance）肝硬変が引き起こされる。特定の態様において、該患者はHCV耐性もしくは抵抗性患者である。上記方法の別の態様において、該PEG-IFNλ1は毎週約0.5 μg/kg〜10.0 μg/kgの用量で投与される。該方法の一態様において、該PEG-IFNλ1は毎週約2.5 μg/kgの用量で投与される。別の態様において、該PEG-IFNλ1は約8週間〜約52週間投与される。別の態様において、該PEG-IFNλ1は約12週間、約16週間、約20週間、または約24週間投与される。別の態様において、該PEG-IFNλ1は患者が血清中にHCV RNAを有しないと判断されるまで投与される。別の態様において、該方法は好中球数、血小板数またはヘモグロビン濃度の顕著な低下をもたらさないので、該複合体を投与することによって、標準的なPEG-INF-α療法以上に顕著に改善される。上記方法のさらに別の態様において、該方法はさらに、リバビリンまたはビラミジンから選択されるヌクレオシドアナログの投与を含む。該方法の別の態様において、該リバビリンは毎日5 mg/kg〜25 mg/kg;または毎日15 mg/kg〜25 mg/kgの用量で経口投与される。一態様において、該リバビリンは約10 mg/kg〜30 mg/kg（1日1回もしくは2回）、または約15 mg/kg（1日1回もしくは2回）の用量で投与される。上記の一態様において、該複合体は非経口投与される。
【００２７】
一実施態様において、1週間あたり約200 μgの用量のPEG-IFNλ1複合体を1日あたり約300 mgのテノホビル(フマル酸テノホビルジソプロキシル)と組み合わせて用いて、HBVを処置してもよい。この処置において、ほとんどの患者は約30日にわたる約4回の注射後にHBVが存在しないと判断される。これらの状態下において、該HBVは抑制されていることがわかっており、HBsAg(ウイルス表面抗原)が放出され、それが免疫システムの引き金となってこの抗原に対する抗体が産生され、結果として該特定の処置の最適なエンドポイントがもたらされる。該処置は、本明細書に記載の通り、患者の最初のウイルス量に応じて約12週間〜24週間継続されうる。
【００２８】
定義:
「アルキル」は、直線状または分枝状の、飽和または不飽和の、炭素原子の鎖を有する脂肪族ラジカルであって、適宜、酸素原子で置換されている(例えば、C1アルキルは-C(O)-であってよい)か、窒素原子で置換されている(例えば、C1アルキルは-C(NH)-であってよい)か、または硫黄原子(例えば、C2アルキルは-CH2C(S)-であってよい)で置換されている脂肪族ラジカルを意味する。CXアルキルおよびCX-Yアルキル（例えば、C1-10アルキルまたはC1-6アルキル）が典型的に用いられ、ここで、XおよびYは鎖中の炭素原子の数を示す。例えば、C1-6アルキルには、1〜6個の炭素を有するアルキル(例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ビニル、イソプロペニル、1-ブテニル、エチニル、1-プロピニルなど)が含まれる。
【００２９】
「ヘテロアルキル」または「ヘテロアルキレン」は、炭素原子間に酸素、窒素または硫黄原子を有していてよいアルキルである。該ヘテロアルキル基の例としては、-C(O)NH-、-OC(O)-、-CH2CH2C(O)-NH-、-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-NH-CH2-CH2-、-CH2-S-CH2-CH2-および-CH2O-CH2-CH3などが挙げられる。
【００３０】
「PEG-IFNλ1」中にあるような用語「PEG」は、当分野で用いられるポリエチレングリコールを意味し、他に特別の定めのない限り、一般的にアルキル-PEG（例えばmPEG(メトキシ-ポリエチレングリコール)およびPEGの両方を含む。
【００３１】
「治療上有効な量」とは、処置した症状における臨床的に有意な変化（例えば、ウイルス量もしくは免疫機能における臨床的に有意な変化、罹患率の有意な減少、または組織学的スコアの有意な増大、あるいはそれらの組み合わせ）をもたらすのに十分なPEG-IFNλ1複合体の量である。
【００３２】
本明細書で用いる「処置」または「処置すること」は、治療的処置および予防的手段を言う。処置が必要な患者には、既にC型肝炎ウイルスに感染している患者、ならびにC型肝炎を予防すべき者が含まれる。
【００３３】
上記方法の一態様において、該複合体は注射または点滴によって投与される。別の態様において、該複合体は、静脈内、筋肉内、皮下、皮内または腹腔内投与される。別の態様において、該複合体は、0.5 μg/kg未満、0.5〜1.0 μg/kg、1.0〜1.5 μg/kg、1.5〜2.0 μg/kg、2.0〜2.5 μg/kg、2.5〜3.0 μg/kg、3.0〜3.5 μg/kg、3.5〜4.0 μg/kg、4.0〜4.5 μg/kg、4.5〜5.0 μg/kg、5.0〜5.5 μg/kg、5.5〜6.0 μg/kg、6.0〜6.5 μg/kg、6.5〜7.0 μg/kg、7.0〜7.5 μg/kg、7.5〜8.0 μg/kg、8.0〜8.5 μg/kg、8.5〜9.0 μg/kg、9.0〜9.5 μg/kg、9.5〜10.0 μg/kg、または10.0 μg/kg以上から選択される投与量で患者に投与される。別の態様において、該複合体は、約60〜80 μg、80〜100 μg、100〜120 μg、120〜140 μg、140〜160 μg、160〜180 μg、180〜200 μg、200〜220 μg、220〜240 μg、240〜260 μg、260〜280 μg、または約280〜300 μgの一定用量で投与される。一実施態様において、該複合体は、連続12週間、200 μgで皮下投与される。
【００３４】
別の実施態様において、上記複合体ならびに医薬的に許容される担体および賦形剤を含有する医薬組成物を提供する。別の態様において、該医薬組成物はB型肝炎およびC型肝炎の処置に用いられる。別の実施態様において、該複合体と医薬的に許容される担体および賦形剤を混合することを含む、上記複合体を含有する医薬組成物の製造方法を提供する。
【００３５】
本願の複合体は、IFNλ1と同様の効果または活性を有する。例えば、該複合体は抗増殖薬、抗ウイルス薬、または抗腫瘍薬として用いられうる。具体的には、本願の複合体はB型肝炎およびC型肝炎の処置において有効であり、それらはIFNλ1よりも長い血中持続時間を有する。一実施態様において、本願の複合体を含有する医薬組成物は、無菌の注射剤用凍結乾燥粉末としてか、またはバイアル中もしくは予め充填されたシリンジ中の注入用液剤として製造される。これらの医薬組成物は、該複合体を適切な医薬的に許容される担体および賦形剤と混合することにより製剤化されうる。
【００３６】
別の実施態様において、本願は、ヒト組換えPEG-IFNλ1複合体の製造方法を提供する。まず、ヒト組換えIFNλ1を大腸菌における組換えDNA技術により製造し、次いで、ペグ化剤(例えば、α-メトキシ-ω-(4-ニトロフェノキシカルボニル))ポリオキシエチレン(PEG-pNC)）と反応させてPEG-IFNλ1を製造する。一態様において、PEG-IFNλ1は、IFNλ1に結合している線状鎖PEG 40 kDaである。この生成物は、患者の体内に注入後、細胞外酵素の作用および腎臓での濾過を回避し、それによりその血清半減期が延びる。
【００３７】
該複合体を形成するための(α-メトキシ-ω-(4-ニトロフェノキシカルボニル))ポリオキシエチレン(PEG-pNC) 40 kDaおよびIFNλ1間のペグ化反応を以下に示す。一態様において、-NH2基は該インターフェロンλ1分子上のN末端のメチオニン残基である。別の態様において、該-NH2基はインターフェロンλ1分子サイト上のリジン残基のアミンである。
【化８】
2014525939.tif 000009
【００３８】
一実施態様において、本願の複合体は、インターフェロンλ1と予め活性化させたPEGを共有結合させることにより製造されうる。一実施態様において、PEGヒドロキシル基を連結基で置換することによりPEGを活性化させて、カップリング剤、または活性化されたPEG剤（すなわち(α-メトキシ-ω-(4-ニトロフェノキシカルボニル))ポリオキシエチレン(PEG-pNC)）を得てもよい。一実施態様において、該PEG-IFNλ1複合体は、IFNλ1の製造および該IFNλ1のペグ化により製造されうる。該複合生成物を精製およびアッセイする方法も開示する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図1は、配列を合成して発現ベクターpNanogen 1-IL29に導入した後の、ヒト組換えIFNλ1の製造に用いた核酸配列(SEQ ID 1)を例示する。
【００４０】
【図２】図2は、Nanogen Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd製のヒト組換えIFNλ1の代表的なアミノ酸配列(SEQ ID 2)である。
【００４１】
【図３】図3は、ヒトIFNλ1(インターロイキン-29)をコードする遺伝子を含むプラスミド pNanogen 1-IL29を例示する。
【００４２】
【図４】図4は、プラスミド pNanogen 1-IL29の解析結果を示す。
【００４３】
【図５】図5は、IFNλ1の製造に用いたpNanogen 1-IL29を有する大腸菌の能力を調べるための電気泳動プロセスの結果を例示する。
【００４４】
【図６】図6は、タンパク質をリフォールディングした後の塩フェーズ（salt phase）の代表的なスペクトルおよびSDS-PAGE電気泳動である。図6、7、8および9のスペクトルは、全てクーマシーブルー染色である。
【００４５】
【図７】図7は、カチオン1フェーズ後のスペクトルおよびSDS-PAGE電気泳動を例示する。
【００４６】
【図８】図8は、カチオン2フェーズ後のスペクトルおよびSDS-PAGE電気泳動を例示する。
【００４７】
【図９】図9は、ゲル濾過フェーズ後のスペクトルおよびSDS-PAGE電気泳動を例示する。
【００４８】
【図１０】図10は、ペグインターフェロンλ1の精製プロセスのスペクトルおよびSDS-PAGE電気泳動を例示する。
【００４９】
【図１１】図11は、IFNλ1およびPEG-IFNλ1の同定結果を例示する。
【００５０】
【図１２】図12は、Nanogen Pharmaceutical Co., Ltd製PEG-IFNλ1のMaldi-Tof質量スペクトルを例示する。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
（発明の詳細な説明）
一実施態様において、本願は、IFNλ1をコードする遺伝子を含む組換え菌株の製造、IFNλ1の大規模もしくは工業製造、IFNλ1のペグ化反応、製造したPEG-IFNλ1の精製、およびPEG-IFNλ1のアッセイのための方法を提供する。
【００５２】
一実施態様において、本願は、国立バイオテクノロジー情報センターから入手可能な公表された配列に基づくIFNλ1をコードする遺伝子の人工合成(該コード化遺伝子を、大腸菌での工業生産プロセスに適合するように改変した)、遺伝子導入ベクターの作製、これらベクターの菌への導入、ならびにIFNλ1を最も産生した菌株の選別を開示する。
【００５３】
一実施態様において、IFNλ1の工業製造プロセスは以下の工程:初期材料の発酵、粗タンパク質溶液の収集、ならびにIFNλ1タンパク質の精製を含む。代表的なプロセスにおいて、該発酵プロセスは栄養培地を含む10リットルの発酵タンクにおいて実施されてもよく、ラクトースによってIFNλ1の産生を誘導した。得られたバイオマスを分離し、精製した。IFNλ1を集め、以下:タンパク質のリフォールディング、タンパク質の分離（例えば、イオン交換クロマトグラフィー(カチオン1およびカチオン2)によって）、ならびにゲルでのタンパク質の精製を含む多くの工程によって精製した。
【００５４】
一実施態様において、ペグ化プロセスは、線状鎖(α-メトキシ-ω-(4-ニトロフェノキシカルボニル))ポリオキシエチレン(PEG-pNC-, 分子量40 kDa)とIFNλ1との間の反応を含む。得られた複合体生成物を、クロマトグラフィー（例えば、HPLCシステムを使用）により精製し、質および純度を試験してもよい。
【００５５】
本願は、以下の実施例を参照することにより十分に理解されるであろう（該実施例は単なる例示にすぎず、特許請求の範囲を制限するものではないと見なされる）。
【実施例】
【００５６】
実施例:
実施例1:ヒト組換えインターフェロンλ1(IFNλ1)をコードする遺伝子を有する大腸菌株の製造方法
【００５７】
NCBIまたは他のデータベースから入手可能なタンパク質配列データに基づいて、該IFNλ1をコードする遺伝子を人工的に合成した。本明細書に記載の新規方法は、従来の方法と同等の正確性のまま、遺伝子を単離するために要する時間を減らす。Nanogen Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd.においてIFNλ1を製造するために用いられた核酸配列を図1に示し、該タンパク質のアミノ酸配列を図2に示す。
【００５８】
発現ベクター pNanogen-IL29(T7転写プロモーター領域、IFNλ1導入遺伝子、T7逆プライミング部位、T7転写ターミネーター、f1複製起点、カナマイシン耐性遺伝子、およびpUC複製起点を含有する)は、該タンパク質の高発現を可能にするため、そして大量のIFNλ1の工業生産のために発酵を促進させるように、特別に設計された。図3、4は、ベクターpNanogen 1-IL29の作製方法を示す。
【００５９】
その後、ベクターpNanogen 1-IL29を、プロモーターT7の発現に適した大腸菌株に移した。この株は、遺伝子型F- ompT hsdSB (rB-mB-)gal dcm (DE3)を有する。該IFNλ1遺伝子を有する株はE.Coli-pNanogen1-IL29と称される。それは発酵によって1リットルあたり100 mg以上のIFNλ1を産生する能力を有しており(図5参照)、それを原菌株バンクに導入した。
【００６０】
実施例2:ヒト組換えIFNλ1を製造するための大腸菌の発酵プロセス
【００６１】
栄養培地を含む140 Lの発酵タンク中において、37±0.5℃、空気圧 0.5 m3/h、pH 7.0±0.2、撹拌速度 300 rpmで、発酵プロセスを行った（H3PO4またはNH4OHを加えることにより該pHを6.8-7.2間に維持した）。8時間(この間に大腸菌は、細胞が最も効率的に増殖する時である対数期において増殖した)後、該温度を30±0.5℃まで冷却し、該撹拌速度を200 rpmまで低下させて、IFNλ1の産生のためのプロセスを開始させた。該発酵プロセスを4時間後に停止させ、該冷たい生成物を6000 rpmで遠心分離して、バイオマスを得た。
【００６２】
該バイオマスを、細胞溶解溶液(1 gの湿潤バイオマスあたり12 mlの溶液)中で、均質化装置中で均質化することにより破壊した。該温度を、4℃で1時間維持した後、該細胞を超音波装置によって2回破壊した。得られた懸濁液を、6000 rpmで30分間遠心分離してペレットを得た。次いで、該ペレットを封入体洗浄バッファー(1gの湿潤バイオマスあたり12 mlのバッファー)で洗浄し、得られた懸濁液を4℃で1時間維持した後、13,000 rpmで30分間2回遠心分離してペレットを得た。該ペレットを2M 尿素溶液に溶解させ、氷冷で1時間インキュベートした後、該懸濁液を13,000 rpmで30分間遠心分離してペレットを得た。該ペレットを洗浄溶液に溶解させ、13,000 rpmで30分間遠心分離した結果、ペレットを得た。次いで、該ペレットを6M グアニジン溶液に溶解させ、該懸濁液を氷冷で12-16時間維持し、13,000 rpmで30分間遠心分離した。タンパク質を含む溶液を回収して、次の工程で精製した。
【００６３】
IFNλ1を分離するために用いた培養培地および溶液の成分を表1に示す。
表1
【表１】
2014525939.tif 000010
【００６４】
実施例3:ヒト組換えIFNλ1の精製プロセス
【００６５】
IFNλ1を、封入体をリフォールディング溶液(25mM トリスバッファー、1mM EDTA、1.2M グアニジン、pH 8.2)中に溶解させる（該封入体の最終濃度が500 μg/mlであるように）ことによって、リフォールディングさせた。次いで、該混合液を2-8℃で16-24時間維持した。得られた混合液を脱塩した後、Sephadex G25 カラムでの精製工程で処理した。該塩交換バッファー（salt exchange buffer）はリン酸バッファー(10mM, pH 8.0)であった。工程「カチオン1」において、該脱塩された混合液を、Sephadex G25 カラム(このカラムは、CM-Sepharose FF ゲルで予め充填されており、10mM リン酸バッファー pH 8.0において平衡化されている)にロードし、生成物を10mM リン酸ナトリウム + 0.5M NaCl pH 8.0を用いて溶出した。得られたタンパク質溶液を脱塩し、上記の通りクロマトグラフィー処理した(工程「カチオン2」)。その後、該タンパク質溶液をゲルカラムによって濾過して、生成物としてヒト組換えIFNλ1を95%以上の純度で得た(図5、6、7、8および9中のスペクトルおよび電気泳動結果を参照)。
【００６６】
実施例4:複合体製造のためのペグ化プロセス
【００６７】
50mM ホウ酸ナトリウム-ホスフェート pH 8.0中の5 mg/ml ヒト組換えIFNλ1(MW〜20.1 kDa)の溶液に、(α-メトキシ-ω-(4-ニトロフェノキシカルボニル))ポリオキシエチレン(PEG-pNC)(MW〜40 kDa)を、PEG-pNC:IFNλ1 約3:1のモル比で加えた。該反応混合液を2-4℃で20時間維持した。該反応を、30%w/w酢酸溶液を用いて、pHを4.0に調整することにより停止させた。その後、得られた混合液を水で5倍に希釈した。
【００６８】
一般的な例示的プロセスにおいて、活性化PEGまたはm-PEG試薬のIFNλ1への結合反応についての反応条件にはさらに、IFNλ1に対しておよそ等モル〜比較的小さいモル過剰量の活性化PEGもしくはm-PEGを用いて該反応を行うことが含まれる。一つのバリエーションにおいて、該結合は、約1〜10倍のモル過剰量か;約1.5〜7倍のモル過剰量か;または約1.75〜5倍のモル過剰量で行われる。一つのバリエーションにおいて、該結合反応はおよそ室温かまたは約20-25℃で行われ得る。該結合反応を約1〜10時間、1〜5時間、1〜3時間、または約1〜2時間進行させた後、該反応をクエンチにより終了させてもよい。ある場合には、該反応条件によってPEG-IFNλ1位置異性体がもたらされる。一態様において、各異性体は、本明細書に記載のアミノ酸残基を介してIFNλ1に結合した単独のPEG-リンカーユニットを含む。1個以上のPEG-リンカーユニットがIFNλ1に結合しているある特定の場合においては、必要に応じて、得られた組成物（これらの複合体を含む）を用いてもよいか、あるいは標準的な精製方法を用いたクロマトグラフィー（限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを含む）により分離してもよい。一態様において、該複合体の分離および精製に用いる精製方法は、本明細書に記載のカチオン交換クロマトグラフィーである。
【００６９】
ある特定の条件において、該IFNλ1上の結合部位は反応媒体のpHに影響されうる。該結合プロセスの特定のpHの改変によってある特定の好ましい結合部位がもたらされる。例えば、ある特定の条件下において、塩基性のpH値（例えば、pH 7.5以上、8.0以上、8.5以上、または9.0以上）での結合は、IFNλ1のリジン基への結合に有利に働く。
【００７０】
上記の方法において、該ペグ化試薬（例えばPEG-pNC）は、PEGおよびIFNλ1間にカルバメートリンカーを形成する。上記のプロセスにおいて用いてもよいさらなるペグ化試薬としては、米国特許第5,122,614号に開示されている通り、オキシカルボニル-オキシ-N-ジカルボキシイミド(例えば、スクシンイミジルカーボネート、スクシンイミジルスクシネート)、パラ-ニトロアリールカーボネート、パラ-ニトロフェニルカーボネート、カルボニル ジ-イミダゾール、ベンゾトリアゾールカーボネート、ピリジルカーボネート、N-スクシンイミド、N-フタルイミド、N-グルタルイミド、およびN-テトラヒドロフタルイミドが挙げられる。複合体を形成するために用いてもよい代表的な活性化PEGまたはmPEG成分としては、PEG-2,4,6-トリクロロ-S-トリアジン、mPEG-2,4,6-トリクロロ-S-トリアジン、PEG-N-スクシンイミジルグルタレート、mPEG-N-スクシンイミジルグルタレート、PEG-N-スクシンイミジルスクシネートおよびmPEG-N-スクシンイミジルスクシネートが挙げられる。
【００７１】
実施例の代表的な化合物:
【００７２】
下記の表は、本明細書に記載の選択した実施例の化合物の概要を示す:
【化９】
2014525939.tif 000011
【表２】
2014525939.tif 000012
【表３】
2014525939.tif 000013
【表４】
2014525939.tif 000014
【００７３】
上記表中の式Iaの複合体の精製のためのプロセスは、本明細書に記載の方法を用いて行われる。得られたPEG-IFNλ1は約95%以上の純度を有する。ゲル濾過フェーズ後の該複合体のスペクトルおよびSDS-PAGE電気泳動を図9に例示する。該複合体の精製プロセスのスペクトルおよびSDS-PAGE電気泳動を図10に例示する。該複合体は、Hep-2C細胞上で抗ウイルスEMC活性（約10-50 ng/mlの範囲のED50である）を有する。ED50(ng/ml)での上記表中の式Iaの複合体の抗ウイルス活性は、約25.00〜28.00;平均(ng/ml) 約1.0〜約30.0;SD 約0.1〜約1.0およびRSD 約3.0〜7.0である。
【００７４】
上記の表中の式Iaの複合体は、200 μg(毎週 皮下注射) + リバビリン 15 mg/kg(毎日)で患者に投与される。最初の4週で、全ての患者がHCV RNAを有しない(血清中にウイルスが存在しない)と判定される。該処置プロトコールを12週間継続する。12週の処置および12週のフォローアップの後、全ての患者が完全なウイルス抑制の主要エンドポイントに達する。
【００７５】
実施例5:PEG-IFNλ1の精製
【００７６】
PEG-IFNλ1、急冷した試薬および未修飾のIFNλ1を含む溶液を、カチオンカラム(該カラムを、Sepharose CMゲルで予め充填し、10mM リン酸ナトリウム pH 6.0中で平衡化した)で精製し、10mM リン酸ナトリウム、0.5M NaCl（pH 6.0）溶液で溶出した。タンパク質を含む溶出した画分を10mM リン酸ナトリウム（pH 6.0）溶液を用いて保存バッファーに移した。次いで、この生成物を無菌濾過プロセスで処理し、-20℃で保存した。
【００７７】
図10は、IFNλ1の精製プロセスのスペクトルおよびSDS-PAGE電気泳動を示す。得られたPEG-IFNλ1は、95%以上の純度であって、Hep-2C細胞における抗ウイルスEMC活性はED50約10-50 ng/mlであった(実施例6参照)。
【００７８】
実施例6:IFNλ1およびPEG-IFNλ1の抗ウイルス活性の検討
【００７９】
該検討は、Ankらの研究(J Virol. 2006 May; 80(9):4501-9)に従って、EMCウイルスモデルおよびHep-2C細胞における抗ウイルス活性に基づいた。該実験は3ロット(IL290010111、IL290020311およびIL290030411)を用いて行った。該結果から、Nanogen製のインターフェロンλ1の抗ウイルス活性(ED50 約1-5 ng/ml)はSheppardら(Nat Immunol. 2003 Jan; 4(1):63-8)の研究結果と同等であることが示された(表2参照)。
【００８０】
PEG-IFNλ1の抗ウイルス活性をIFNλ1と比較した。該実験を、5ロット(PIL290010111、PIL290020211、PIL290030311、PIL290040411、PIL290050511)を用いて行った。全てのロットにおいて同様の結果が得られ、ED50 約10-50 ng/mlであった(表3参照)。
【００８１】
処置前の患者の臨床情報:
【００８２】
この処置群の全ての患者は、慢性HCVであると診断され、リバビリン(15 mg/kg)と組み合わせてペガシス(ペグインターフェロンα2a)およびペグイントロン(ペグインターフェロンα2b)で6か月以上にわたって予め処置されている（HCV RNAの1 log以上の減少は見られなかった）。  HCV RNA ＞500,000 IU/ml 血清;HCV遺伝子型1-6;患者数（quantity）150;年齢26-78歳;平均年齢52歳;一部の患者は高フェリチン、低血小板(＜50,000/ml)、低Hb.  ほとんどの患者は、HCVに慢性的に感染していることが原因で、線維化の程度（Fibro scale）がF4である高度の線維症（1以上の高いAST/ALT比（肝線維化の指標））を有している。一部の患者は糖尿病に対するインスリン治療中であった。処置群中の50歳以上の全ての患者は高血圧症である。
【００８３】
処置レジメン:
【００８４】
Peglamda(PEG-IFNλ1) 200 μg(毎週 皮下注射) + リバビリン 15 mg/kg(毎日).  最初の4週で、全ての患者はHCV RNAを有しない(血清中にウイルスが存在しない)と判定された。該処置を12週間続けた。
【００８５】
結果:全ての患者が、12週の処置および12週のフォローアップ後に、完全なウイルス抑制の主要なエンドポイントに達した。
表2:Nanogen製インターフェロンλ1(PEG-IFNλ1)の抗ウイルス活性
【表５】
2014525939.tif 000015
表3:Nanogen製PEG-IFNλ1の抗ウイルス活性
【表６】
2014525939.tif 000016
【００８６】
HCV耐性患者に対する療法:
【００８７】
標準的な療法（例えば、ペガシス（登録商標）(ペグインターフェロンα-2a)とリバビリンの組み合わせ）を用いて予め処置された50以上の患者は、効果を示さないことが分かった。ノンレスポンダー患者（AASLDが提供するHCV治療のガイドラインにより、24週間の治療で血清からのHCV RNAのクリアランスを示さない患者として定義される）およびヌルレスポンダー患者（12週でHCV RNAが2 log未満まで低下しない患者と定義される）を、本願のPEG-IFNλ1を用いた処置群に割り当てた。
【００８８】
記載の処置プロトコールを用いてPEG-IFNλ1で4-12週または4-24週間処置した後、実質的に全ての患者を試験してHCV RNAネガティブであることを決定したか;あるいは、全ての患者は持続的なウイルス学的奏功（sustained virological response）(SVR)（最終処置用量の24週後にウイルスが検出されないと定義される）を有していた。
【００８９】
HCV耐性患者を用いた他の研究において、本明細書に記載の処置プロトコールは、HCV耐性患者集団の80%以上、85%以上、90%以上または95%以上に有効であることが分かった。従って、該PEG-IFNλ1を用いる処置方法は、HCV（現在の標準的な療法であるペグインターフェロンα-2aとリバビリンの併用に抵抗性である場合を含む）において有効であることを実証する。ペガシス（登録商標）とリバビリンとの組み合わせ療法に典型的に関連する重大な副作用は認められなかった。
【００９０】
実施例7:IFNλ1およびPEG-IFNλ1の同定
【００９１】
抗-IFNλ1抗体を用いたウエスタンブロット法を用いて、IFNλ1およびPEG-IFNλ1を同定した。SDS-PAGEゲルで分析した後のタンパク質溶液をニトロセルロース膜に転写し、抗-IFNλ1抗体を用いてプローブで探索した。抗体を、ペルオキシダーゼ結合タンパク質AおよびTMB基質を用いて検出した(図11参照)。
【００９２】
実施例8:PEG-IFNλ1の分子量
【００９３】
MALDI-TOFアッセイを適用してPEG-IFNλ1の分子量を決定した。該結果を図12に示す。本実施例において、Nanogen製PEG-IFNλ1は約62 kDaの分子量である。
【００９４】
実施例9:PEG-IFNλ1の純度
【００９５】
5ロット(PIL290010111、PIL290020211、PIL290030311、PIL290040411、PIL290050511)を用いて、SDS-PAGE電気泳動により、PEG-IFNλ1の純度を決定した。該電気泳動ゲルを、クマシーブルーで染色し、脱染し、次いでPhoretix software(TotalLab, England)を用いて解析した。全ての試験ロットは95%以上の純度を示した。
【００９６】
以下の試験は、上記で製造されたPEG-IFNλ1を用いる。
【００９７】
実施例10:PEG-IFNλ1の毒性
【００９８】
PEG-IFNλ1の急性毒性:PEG-IFNλ1の急性毒性を、スイスマウスおよびラットにおいて評価した。5週齢の健常なICRマウスおよびスプラーグドーリーラットを研究のために選んだ。該動物を2週間視診した。PEG-IFNλ1を、3つの異なる用量(高用量 3 mg/kg、中用量 0.3mg/kg、低用量 0.03 mg/kgおよびビヒクル処置(リン酸緩衝生理食塩水, pH 7.2))で皮下もしくは腹腔内注射により投与した。処置後14日目の臨床徴候、体重変化、および死亡数について動物を観察した。研究の終了時に、全ての動物を屠殺し、それらの組織および器官について異常がないか調べた。該結果を表4に要約する。
表4
【表７】
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(*): ANOVA, 1要因（single factor）, ビヒクル処置と比較, (p＞0.05)
1 異常なしを意味する
【００９９】
高用量でさえも、試験期間中、全ての動物が生存した。対照に比べて、処置動物における有意な体重変化は見られなかった。臨床徴候または器官異常は、試験動物のいずれの群においても観察されなかった。
【０１００】
これらの結果に基づくと、マウスおよびラットにおけるNanogen製PEG-IFNλ1の致死量(LD50)は3 mg/kg以上であった。PEG-IFNλ1の亜急性毒性:動物(5週齢のラット)に、PEG-IFNλ1を3つの異なる用量(高用量 3 mg/kg、中用量 0.3 mg/kg、低用量 0.03 mg/kg)で、皮下もしくは腹腔内注射により、1日1回4週間投与した。
【０１０１】
研究の間ずっと、該ラットを、Nanogen製PEG-IFNλ1の投与により引き起こされるいずれの臨床上および行動上の副作用について調べた。試験期間後、生存したラットを剖検および生化学分析のために屠殺した。また、血液サンプルを腹部動脈から採取して、血液検査を行った。
【０１０２】
試験方法および結果を表5に要約する。
表5
【表８】
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【０１０３】
研究の全期間において、いずれの群においても死亡は見られず、試験ラットから臨床徴候は認められなかった。試験ラットは、高用量の群でさえも、他の試験カテゴリーおよび分析において正常であった。従って該研究は、Nanogen製PEG-IFNλ1は、3 mg/kgの用量で繰り返して投与する場合、ラットにおいて毒作用を有しないことを示す。
【０１０４】
PEG-IFNλ1の免疫学的毒性:モルモットにおいて、Nanogen製PEG-IFNλ1の免疫学的潜在力を検討するための研究を行った。健常な雄ハートレイ系モルモット（体重300-500 g）に、PEG-IFNλ1を高用量(3 mg/kg)もしくは低用量(0.03 mg/kg)のいずれかで週に2回の3週間、ならびに対照としてオボアルブミンを注射した。最終感作後14日目、アナフィラキシー試験を、高用量のPEG-IFNλ1を静脈内注射することにより実施した。該研究には、フロイント完全アジュバント(FCA)に組み込んだPEG-IFNλ1が含まれた。感作されたモルモットを、高用量のPEG-IFNλ1の注射後の能動的全身性アナフィラキシー反応について観察した。適応症のリストをアナフィラキシー反応の徴候として用い、各試験動物においてそれらの出現をモニターした。
【０１０５】
表6は研究方法および結果を示す。
表6
【表９】
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(1) 1. 鼻を舐める, 鼻をこする;  2. 毛を逆立てる;
3. 努力性呼吸;  4.  くしゃみ, 咳;
5. 便の排出, 排尿;  6. 痙攣;  7. 衰弱;
8. 死亡.  -, ネガティブ ; +, ポジティブ
【０１０６】
該能動的全身性アナフィラキシー試験において、フロイント完全アジュバント(FCA)に組み込んだ高用量のPEG-IFNλ1(3 mg/kg)でわずかに感作されたモルモットは、アナフィラキシー反応のいくつかの徴候を示した。一方、低用量および高用量のPEG-IFNλ1(0.03および3 mg/kg)のみで感作されたモルモットはいずれのアナフィラキシー反応も示さなかった。Nanogen製PEG-IFNλ1およびネガティブ処置(PBS)を投与した後はモルモットは死亡しなかったが、オボアルブミン(ポジティブ処置)を投与した後は3匹のモルモットが死亡した。従って、Nanogen製PEG-IFNλ1は、その臨床用途において単独で投与する場合、全身性アレルギー反応を誘発しないと結論づけることができる。
【０１０７】
本発明の精神または範囲から逸脱することなく、本発明の化合物、組成物、および方法に対して様々な改変および変形を行うことができることが当業者には明らかであろう。従って本発明は、添付の特許請求の範囲およびそれらの同等物の範囲内に入るならば、該改変および変形を包含することを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年4月23日(2014.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2014525939.tif 000040