(57)【要約】【課題】【解決手段】人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその前駆体を生成する方法、該方法により得られる化合物、該化合物に関する使用及び組成物。該方法は、ａ）式５〜１０で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種のドナーを提供する工程、ｂ）ラクトース、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１種のアクセプターを提供する工程、ｃ）トランスグリコシダーゼ活性及び／又はグリコシンターゼ活性を含む少なくとも１種の酵素を提供する工程、ｄ）工程ａ）、ｂ）及びｃ）で得られた少なくとも１種のドナー、少なくとも１種のアクセプター及び少なくとも１種の酵素の混合物を調製する工程、及びｅ）工程ｄ）により調製された混合物を培養する工程を含む。【化１】2014513985.tif 000060【化２】2014513985.tif 000061【化３】2014513985.tif 000062【選択図】なし
2014513985.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むことを特徴とする、１種以上の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体若しくは前駆体を生成する方法。
ａ）式５〜１０で表される化合物及びその塩からなる群より選択される少なくとも１種のドナーを提供する工程、
【化１】
2014513985.tif 000044
（式中、Ｘはアジド、フルオロ、任意に置換されたフェノキシ、任意に置換されたピリジニルオキシ、Ａ基、Ｂ基、Ｃ基及びＤ基からなる群より選択される）
【化２】
2014513985.tif 000045
（式中、Ｒａは独立にＨ又はアルキルであるか、又は、２つの隣接するＲａ基は＝Ｃ（Ｒｂ）２基（式中、ＲｂはＨ又はアルキルである）で表わされ、
Ｒｃは独立にアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ及びジアルキルアミノからなる群より選択され、
ＲｄはＨ、アルキル及び−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅ（式中、ＲｅはＯＨ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、ジアルキルヒドラジノ又はトリアルキルヒドラジノである）からなる群より選択される）
ｂ）下記からなる群より選択される少なくとも１種のアクセプターを提供する工程、
・ラクトース
・下記式で表されるラクトース誘導体：
【化３】
2014513985.tif 000046
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
・ＬＮＴ：
【化４】
2014513985.tif 000047
・下記式で表されるＬＮＴ誘導体又はその塩
【化５】
2014513985.tif 000048
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
・ＬＮｎＴ
【化６】
2014513985.tif 000049
・下記式で表されるＬＮｎＴ誘導体又はその塩
【化７】
2014513985.tif 000050
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
ｃ）トランスグリコシダーゼ活性及び／又はグリコシンターゼ活性を含む、少なくとも１種の酵素を提供する工程、
ｄ）工程ａ）、ｂ）及びｃ）で得られた少なくとも１種のドナー、少なくとも１種のアクセプター及び少なくとも１種の酵素の混合物を調製する工程、
ｅ）工程ｄ）により調製された混合物を培養する工程、
ｆ）下記である場合に、工程ａ）〜ｃ）の少なくとも１つを繰り返し、その後、工程ｄ）及びｅ）を繰り返す工程。
ｆ−ａ）工程ａ）において式５で表される単一化合物が提供され、単一アクセプターが工程ｂ）により提供され、工程ｃ）において添加されるトランスグリコシダーゼ活性及び／又はグリコシンターゼ活性を含む酵素がトランス−フコシダーゼ及び／又はフコシンターゼ活性を有する酵素であり、単一ＨＭＯ又はその誘導体若しくは前駆体が工程ｅ）の結果として生成される場合、又は
ｆ−ｂ）工程ａ）において式６で表される単一化合物が提供され、単一アクセプターが工程ｂ）によって提供され、工程ｃ）において添加されるトランスグリコシダーゼ活性及び／又はグリコシンターゼ活性を含む酵素がトランス−シアリダーゼ活性を有する酵素であり、単一ＨＭＯ又はその誘導体若しくは前駆体が工程ｅ）の結果として生成される場合、又は
ｆ−ｃ）工程ａ）において式８で表される単一化合物が提供され、単一アクセプターが工程ｂ）によって提供され、工程ｃ）において添加されるトランスグリコシダーゼ活性及び／又はグリコシンターゼ活性を含む酵素がトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有する酵素であり、単一ＨＭＯ又はその誘導体若しくは前駆体が工程ｅ）の結果として生成される場合、
ｇ）任意に、工程ａ）〜ｃ）の少なくとも１つを繰り返し、その後、工程ｅ）又はｆ）により得られた混合物を以て、工程ｄ）及びｅ）を繰り返す工程、
ｈ）任意に、工程ｅ）、ｆ）又はｇ）の結果として得られた混合物を水素化分解反応させる工程。
【請求項２】
前記工程ｆ）が、前記工程ａ）〜ｃ）の少なくとも１つを繰り返す工程、
その後、前記工程ａ）において単一ドナーが提供される場合、前記工程ｂ）において単一アクセプターが提供される場合、トランスグリコシダーゼ活性及び／又はグリコシンターゼ活性を含む単一酵素が前記工程ｃ）で添加される場合、及び、単一ＨＭＯ又はその誘導体もしくは前駆体が前記工程ｅ）の結果として生成される場合に、前記工程ｄ）及びｅ）を繰り返す工程、を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程ｆ）が、前記工程ａ）〜ｃ）の少なくとも１つを繰り返す工程、
その後、単一ＨＭＯ又はその誘導体もしくは前駆体が前記工程ｅ）の結果として生成される場合に、前記工程ｄ）及びｅ）を繰り返す工程、を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記工程ａ）において、２、３、４、５、１〜５、３〜１０、５〜１０又は更に異なる種類のドナーが提供されることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記工程ｂ）において、２、３、４、５、１〜５、３〜１０、５〜１０又は更に異なる種類のアクセプターが提供されることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程ｃ）において、２、３、４、５、１〜５、３〜１０、５〜１０又は更に異なる種類の酵素が提供されることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物又は酵素が同時に又は連続的に添加されることを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ドナーが、式５〜８（式中、Ｘは任意に置換された４−ニトロフェノキシ基、Ａ基、Ｂ基、Ｃ基）で表される化合物、又は、化合物９及び１０から選択されたトランスグリコシダーゼの活性に依り選択され、及び／又は
前記ドナーが、式５〜８（式中、Ｘはアジド又はフルオロ）で表される化合物から選択されたグリコシンターゼの活性に依り選択されることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
万能ドナーが、Ｘが４−ニトロフェノキシ、２，４−ジニトロフェノキシ、２−クロロ−４−ニトロフェノキシ、２，５−ジメチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルオキシ、２−エチル−５−メチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルオキシ、５−エチル−２−メチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルオキシ、４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イルオキシ、４，６−ジエトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イルオキシ、又は、４−メチルウンベリフェリルオキシである式５〜８で表される化合物から選択されることを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記トランスグリコシダーゼ活性及び／又はグリコシンターゼ活性を含む少なくとも１種の酵素が、トランス−フコシダーゼ、トランス−フコシンターゼ、トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ及び／又はトランス−Ｎ−アセチルラクトアミニダーゼ活性、好ましくはα−トランス−フコシダーゼ、α−トランス−シアリダーゼ、β−トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ及び／又はβ−トランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性を含む酵素であることを特徴とする、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
培養により人乳オリゴ糖又はその誘導体若しくは前駆体、あるいは、人乳オリゴ糖又はその誘導体若しくは前駆体の混合物が得られ、得られる単一化合物が、以下に規定されるものであることを特徴とする、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
・一般式１で表される化合物及びその塩、
【化８】
2014513985.tif 000051
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基であり、
Ｒ１はフコシル又はＨであり、
Ｒ２はＮ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基から選択され、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基は、１以上のＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１以上のラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基を有してもよく、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ３はＨ、又は、１以上のＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１以上のラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基は１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよい）
・一般式２で表される化合物及びその塩、
【化９】
2014513985.tif 000052
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基であり、
Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ４は独立にそれぞれシアリル又はＨであり、
但し、前記Ｒ１又はＲ４基のうち少なくとも１つはＨではない）
・一般式３で表される化合物及びその塩、及び／又は
【化１０】
2014513985.tif 000053
（式中、Ｒ１はフコシル又はＨであり、
Ｒ２はＮ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基から選択され、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基は、１以上のＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１以上のラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基を有してもよく、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ３はＨ、又は、１以上のＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１以上のラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよい）
・一般式４で表される化合物及びその塩
【化１１】
2014513985.tif 000054
（式中、Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ４は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
但し、前記Ｒ１又はＲ４基のうち少なくとも１つはＨではない）
【請求項１２】
前記式１及び２で表される化合物が、更に下記一般式１ａ、１ｂ若しくは２又はその塩であり、前記式３及び４で表される化合物が、更に下記一般式３ａ、３ｂ若しくは４又はその塩であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【化１２】
2014513985.tif 000055
【化１３】
2014513985.tif 000056
（式中、Ｒ、Ｒ１及びＲ４は請求項１１に規定したとおりであり、
Ｒ２ａは１つのＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１つのラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ３はＨ、又は、ラクト−Ｎ−ビオシル基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ２ｂはシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−ビオシル基であり、
Ｒ３ｂはＨ、又は、１又は２つのＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１つのラクト−Ｎ−ビオシル基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよい）
【請求項１３】
・前記一般式１ａ又は３ａにおけるＲ２ａのグリコシル残基におけるＮ−アセチル−ラクトサミニル基が、別のＮ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している、
・一般式１ａ又は３ａにおけるＲ２ａのグリコシル残基におけるラクト−Ｎ−ビオシル基が、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している、
・一般式１ａ又は３ａにおけるＲ３ａのグリコシル残基におけるラクト−Ｎ−ビオシル基が、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している、
・一般式１ｂ又は３ｂにおけるＲ３ｂのグリコシル残基におけるＮ−アセチル−ラクトサミニル基が、別のＮ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３又は１−６グリコシド間結合で結合している、
・一般式１ｂ又は３ｂにおけるＲ３ｂのグリコシル残基におけるラクト−Ｎ−ビオシル基が、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合していることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記一般式１ａが、１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−ネオテトラオース、パラ−ラクト−Ｎ−ヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−オクタオース及びラクト−Ｎ−ネオオクタオースのＲ−グリコシドを表わし、前記一般式１ｂが、１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−オクタオース、イソ−ラクト−Ｎ−オクタオース、ラクト−Ｎ−デカオース及びラクト−Ｎ−ネオデカオースのＲ−グリコシドを表わし、前記一般式３ａが、１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−ネオテトラオース、パラ−ラクト−Ｎ−ヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−オクタオース及びラクト−Ｎ−ネオオクタオースを表わし、前記一般式３ｂが、１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−オクタオース、イソ−ラクト−Ｎ−オクタオース、ラクト−Ｎ−デカオース及びラクト−Ｎ−ネオデカオースを表わすことを特徴とする、請求項１１乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又はラクト−Ｎ−ビオシル基に結合しているフコシル残基が以下により結合しており、
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のガラクトースに１−２グリコシド間結合で、及び／又は
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のＮ−アセチル−グルコサミンに１−４グリコシド間結合で、及び／又は
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基のＮ−アセチル−グルコサミンに１−３グリコシド間結合で、
前記Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又はラクト−Ｎ−ビオシル基に結合しているシアリル残基が以下により結合していることを特徴とする、請求項１１乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のガラクトースに２−３グリコシド間結合で、及び／又は
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のＮ−アセチル−グルコサミンに２−６グリコシド間結合で、及び／又は
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基のガラクトースに２−６グリコシド間結合で。
【請求項１６】
前記化合物が、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、３’−シアリル−３−フコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ＬＮＦＰ−Ｉ、ＬＮＦＰ−ＩＩ、ＬＮＦＰ−ＩＩＩ、ＬＮＦＰ−Ｖ、ＬＳＴ−ａ、ＬＳＴ−ｂ、ＬＳＴ−ｃ、ＦＬＳＴ−ａ、ＦＬＳＴ−ｂ、ＦＬＳＴ−ｃ、ＬＮＤＦＨ−Ｉ、ＬＮＤＦＨ−ＩＩ、ＬＮＤＦＨ−ＩＩＩ、ＤＳ−ＬＮＴ、ＦＤＳ−ＬＮＴ  Ｉ及びＦＤＳ−ＬＮＴ  ＩＩのＲ−グリコシド、及びその塩からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１１乃至１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｒ−グリコシドが、ベータ−アノマーであり、好ましくはＲがベンジルであることを特徴とする、請求項１１乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物が、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、３’−シアリル−３−フコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ＬＮＦＰ−Ｉ、ＬＮＦＰ−ＩＩ、ＬＮＦＰ−ＩＩＩ、ＬＮＦＰ−Ｖ、ＬＳＴ−ａ、ＬＳＴ−ｂ、ＬＳＴ−ｃ、ＦＬＳＴ−ａ、ＦＬＳＴ−ｂ、ＦＬＳＴ−ｃ、ＬＮＤＦＨ−Ｉ、ＬＮＤＦＨ−ＩＩ、ＬＮＤＦＨ−ＩＩＩ、ＤＳ−ＬＮＴ、ＦＤＳ−ＬＮＴ  Ｉ及びＦＤＳ−ＬＮＴ  ＩＩ、及びその塩からなる群より選択ことを特徴とする、請求項１１乃至１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記培養工程で得られた化合物が、水素化分解反応されることを特徴とする、請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記培養又は水素化分解工程で得られた化合物が、続いて、好ましくは結晶化又は沈澱により精製されることを特徴とする、請求項１乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
更に前記工程ｅ）、ｆ）、ｇ）又はｈ）で得られた化合物を噴霧乾燥する工程を含むことを特徴とする、請求項１乃至２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
更に前記培養又は水素化分解工程で得られた化合物を、摂取製品に添加する工程を含み、該摂取製品が好ましくは医薬製剤又は栄養製剤の少なくとも１つであることを特徴とする、請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
更に前記培養又は水素化分解工程で得られた化合物に、医薬上許容しうる担体を添加する工程及び／又はをプレバイオティクスを添加する工程を含むことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
摂取製品、医薬組成物、栄養製剤又は栄養補助食品の調製への、請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の方法によって得られた又は得られる人乳オリゴ糖、誘導体又は前駆体の使用。
【請求項２５】
前記栄養製剤が、乳児用調製粉乳であることを特徴とする、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
下記一般式５’〜８’で表される化合物、
【化１４】
2014513985.tif 000057
（式中、Ｘ１はＡ基又はＢ基であり、
【化１５】
2014513985.tif 000058
（式中、Ｒａは独立にＨ又はアルキルであるか、又は、２つの隣接するＲａ基は＝Ｃ（Ｒｂ）２基（式中、ＲｂはＨ又はアルキルである）で表わされ、
Ｒｃは独立にアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ及びジアルキルアミノからなる群より選択される））
及び／又は、下記式のいずれかの化合物、又は、上記及び下記いずれかの化合物の塩。
【化１６】
2014513985.tif 000059
（式中、ＲｄはＨ、アルキル及び−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅ（式中、ＲｅはＯＨ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、ジアルキルヒドラジノ又はトリアルキルヒドラジノである）からなる群より選択される）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその前駆体の形成方法、及び、本発明の方法に好適に用いられる又は本発明の方法によって得られる化合物に関する。更に本発明はそのような化合物の使用及びそのような化合物を含む製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）は、近年多くの関心を集めている。とりわけ、分泌オリゴ糖を含むこれらの複合炭水化物の合成の商業化努力が著しく増加しているが、これは人体で生じる多くの生物学的プロセスにおいて人乳オリゴ糖が果たすその役割によるものである。そのような複合オリゴ糖の天然の乳源の代表的なものの一つは哺乳動物のミルクである。哺乳動物のミルクは最大（up to）１０％の炭水化物を含み、その中、通常は二糖、ラクトース（Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ）が代表的な成分である。また、母乳及び初乳はより少ない量の他の糖類（乳オリゴ糖と称される）を含有しており、これらのほぼ全てはラクトース単位を還元末端に有し、該ラクトース単位にはＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ、Ｆｕｃ及び／又はＮｅｕ５Ａｃ又はＮｅｕ５Ｇｃ残基が結合することができる（非特許文献１及び２）。
【０００３】
これまでに少なくとも１１５の人乳のオリゴ糖の構造が判明しており、質量スペクトル（ＭＳ）データは、人乳又は初乳におけるほぼ１３０のオリゴ糖の存在を示唆している（非特許文献３）。更に、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）は、多糖（サイズ排除クロマトグラフィーが示すように５０を超える単糖残基からなる）も人乳に存在することを示唆している。したがって、１３０をかなり超える異なる糖類がおそらく人乳に存在する（非特許文献４及び５も参照）。
【０００４】
構造が判明している１１５の人乳オリゴ糖は、それらのコア構造に基づき１３のシリーズに分けることができる。そのような１３のコア構造を下記表１に例示する。
【０００５】
【表１】
2014513985.tif 000003
【０００６】
Ｕｒａｓｈｉｍａらが発見したように（非特許文献２及び５も参照）、多くの種類のオリゴ糖は、Ｎｅｕ５Ａｃβ２−３／２−６残基をＧａｌ又はＧｌｃＮＡｃに添加、及びＦｕｃα１−２／１−３／１−４をＧａｌ、ＧｌｃＮＡｃ又はコアユニットの還元Ｇｌｃに添加することで構築される。人乳オリゴ糖の主な構造的特徴は、タイプＩユニット（Ｇａｌ（β１−３）ＧｌｃＮＡｃを含むオリゴ糖、及びタイプＩＩユニット（Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ）を含むオリゴ糖の存在であり、タイプＩを含むオリゴ糖が、タイプＩＩユニットを含むオリゴ糖よりも優勢である。これまでに調査された他の種の乳オリゴ糖の多くはタイプＩＩを発現し、タイプＩユニットを発現しない。
【０００７】
しかし、人乳及び初乳における多種多様なオリゴ糖及び他の種との違いのため、好適な食品（特に調整粉乳）の代替（人乳オリゴ糖の全ての領域の少なくとも一部）を調製することは、かなり難しい。更に、免疫システムの成熟及び免疫調整物質としての予後使用において認められている重要性は、可能な免疫調整物質としての重要性を強調する。
【０００８】
したがって、人乳における様々な複合オリゴ糖に可能な限り似させる又は再生することができる複合オリゴ糖及びその混合物を調製する技術において差し迫った必要がある。
【０００９】
これに対して、有機化学合成を介して、及び、その立体選択性のため酵素的手段を介して個々のＨＭＯを生成するための多くの試みが行われてきた。この２０年ぐらいは酵素的手段について多く調べられてきた。
【００１０】
特に、生物系において、ルロアール型グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴｓ，ＥＣ２．４．１．−）及びグリコシダーゼ（グリコシドヒドロラーゼとも称される：ＧＨｓ，ＥＣ３．２．１．−）が主な２つの炭水化物処理酵素のクラスを構成し、それらはＨＭＯの製造に利用してもよい。いずれの酵素のクラスも、グリコシル基をドナーからアクセプターに転移して、その結果オリゴ糖が生成されるように作用する。しかし、産業プロセスにおける合成にグリコシルトランスフェラーゼを使用することは、発現及び溶解性の問題による望ましい酵素の入手可能性及び活性化ドナー糖の高コストによって限定されている。これらのヌクレオチドドナーは典型的には生体内原位置で（in situ）生じられるが、このプロセスは更に酵素を必要とする（非特許文献６参照）。グリコシルトランスフェラーゼに対して、グリコシダーゼは広範囲のドナー基質を有し、通常、単糖、オリゴ糖又は／及び操作された基質が採用される（すなわち、様々な官能基を有する基質）。これらはしばしば様々な炭水化物及び非炭水化物アクセプターに対して活性を示す。グリコシルトランスフェラーゼと比べたグリコシダーゼを使用する他の利点は、そのロバスト性及び入手可能性である。
【００１１】
生体内において、グリコシダーゼは通常、生成物における立体化学的配置の維持又は転化でグリコシド結合の加水分解を触媒する。生体外において、これらは、トランスグリコシル化又は逆加水分解（すなわち縮合）で新しいグリコシド結合の形成を触媒することができる。動力学的に制御された反応下で、これらの酵素（典型的に、グリコシダーゼを維持）は、よいアノマー脱離基（例えば、ニトロフェニルグリコシド）で活性化されたグリコシルドナーを用いたグリコシド結合の形成に用いることができる。これに対して、熱力学的に制御された逆加水分解は、高濃度の遊離糖を用いる。しかし、合成方向における適切なグリコシダーゼの利用には相当な関心が払われているが、最適な条件としてまだ難しく、反応を望ましい方向に進め、生成物の加水分解を避けられる好適な基質が見つからなくてはならない。
【００１２】
このボトルネックを克服し、グリコシダーゼをよりオリゴ糖合成に好適にする別のアプローチが、修飾された酵素（変異体）を供給することによって最近開発された。したがって、この２０年間、合理的又はコンビナトリアル技術に基づくプロテインエンジニアリングが、改善されたトランスグリコシル化の活性及び効率で、生体触媒を生じさせるのに非常に力があるということが証明されてきた。
【００１３】
非特許文献７において、アルカリゲネス属からのｐ−ニトロフェニルフコシド、ラクトース及びα−フコシダーゼを用いたＦｕｃα１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの合成が報告されている。非特許文献８において、フッ化フコシル、ラクトース及び１，２−α−Ｌ−フコシンターゼを用いた２’−フコシルラクトースの合成が開示されている。クルーズトリパノソーマに由来する組換えトランスシアリダーゼを採用したｐ−ニトロフェニルシアロシドによるラクトースのシアリル化が非特許文献９に開示されている。ガラクトシルオリゴ糖のベンジルグリコシドのトランスシアリル化が特許文献１に開示されている。オーレオバクテリウム属Ｌ−１０１に由来するラクト−Ｎ−ビオシダーゼを用いたｐ−ニトロフェニルラクト−Ｎ−バイオサイドによるラクトースのＬＮＴへの直接転換が非特許文献１０に報告されている。しかし、多くの基本的な人乳オリゴ糖構造又はその前駆体のための有機化学合成又は酵素ベースの合成が出版されているが、そのような合成方法はまだ天然由来のオリゴ糖又はその誘導体の複合混合物を調製できない。個々に設計された単一ＨＭＯの合成に基づいたそのような混合物の調製は、更に費用がかかり、多種多様な天然由来のＨＭＯに似ていないかもしれない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／００７５８８
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Messer and Urashima, 2002, Trends Glycosci. Glycotech, 14, 153−176
【非特許文献２】Urashima et al., Advanced Dairy Chemistry, Volume 3： Lactose, Water, Salts and Minor Constituents, 2009, pp. 295−349
【非特許文献３】Newburg and Neubauer, 1995, Carbohydrates in milks： Analysis, quantities and significance. In： Handbook of Milk Composition (R.G.Jensen, ed.), pp. 273−249, Academic Press, San Diego, USA
【非特許文献４】Urashima et al., Advanced Dairy Chemistry, Volume 3： Lactose, Water, Salts and Minor Constituents, 2009, pp. 295−349
【非特許文献５】TADASU URASHIMA et al, MILK OLIGOSACCHARIDES, Nova Biomedical Books, New York, 2011, ISBN： 978−1−61122−831−1
【非特許文献６】Hanson, S., et al., Trends Biochem Sci, 2004. 29(12)： p. 656−63
【非特許文献７】Murata et al. Carbohydr. Res. 320, 192 (1999)
【非特許文献８】Wada et al. FEBS Lett. 582, 3739 (2008)
【非特許文献９】Neubacher et al. Org. Biomol. Chem. 3, 1551 (2005)
【非特許文献１０】Murata et al. Glycoconj. J. 16, 189 (1999)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、本発明の課題は、従来の方法よりも多い種類の人乳オリゴ糖を提供することができる方法、好ましくは費用効率の高い方法であり、好ましくは産業的規模の方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
以下の図面は本発明を更に説明するものであって、本発明の対象を限定するものではない。
【図１】図１は、現在知られている人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）の１３のコア構造を表す。
【図２】図２は、ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミニルドナー及びラクト−Ｎ−ビオシルドナーと、酵素β−１，３−トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ、β−１，３−トランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ及びβ−１，６−トランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼを用いたＨＭＯの合成の例を表す。
【図３】図３は、ベンジル３’’’−Ｏ−シアリル−β−ＬＮｎＴのＮＭＲスペクトラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
第１のアスペクトによれば、本発明は１種以上の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体若しくは前駆体を生じさせる（すなわち１種以上の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体若しくは前駆体を生成する）方法を提供し、該方法は以下の工程を含む。
ａ）万能ドナーとして式５〜１０で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物及びその塩を提供する工程、
【００１９】
【化１】
2014513985.tif 000004
【００２０】
（式中、Ｘはアジド、フルオロ、任意に置換されたフェノキシ、任意に置換されたピリジニルオキシ、Ａ基、Ｂ基、Ｃ基及びＤ基からなる群より選択される）
【００２１】
【化２】
2014513985.tif 000005
【００２２】
（式中、Ｒａは独立にＨ又はアルキルであるか、又は、２つの隣接するＲａ基は＝Ｃ（Ｒｂ）２基（式中、ＲｂはＨ又はアルキルである）で表わされ、
Ｒｃは独立にアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ及びジアルキルアミノからなる群より選択され、
ＲｄはＨ、アルキル及び−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅ（式中、ＲｅはＯＨ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、ジアルキルヒドラジノ又はトリアルキルヒドラジノである）からなる群より選択される）
【００２３】
ｂ）アクセプターとして下記からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を提供する工程、
・ラクトース、
・下記式で表されるラクトース誘導体、
【００２４】
【化３】
2014513985.tif 000006
【００２５】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
【００２６】
・ＬＮＴ、
【００２７】
【化４】
2014513985.tif 000007
【００２８】
・下記式で表されるＬＮＴ誘導体又はその塩、
【００２９】
【化５】
2014513985.tif 000008
【００３０】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
【００３１】
・ＬＮｎＴ、
【００３２】
【化６】
2014513985.tif 000009
【００３３】
・下記式で表されるＬＮｎＴ誘導体又はその塩
【００３４】
【化７】
2014513985.tif 000010
【００３５】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
【００３６】
ｃ）トランスグリコシダーゼ活性及び／又はグリコシンターゼ活性を含む、少なくとも１種の酵素を提供する工程、
ｄ）工程ａ）、ｂ）及びｃ）で得られたドナー、アクセプター及び酵素の混合物を調製する工程、
ｅ）工程ｄ）により調製された混合物を培養する工程、
ｆ）任意に、工程ｅ）により得られた混合物を以て、いずれの工程ａ）〜ｅ）を繰り返す工程
ｇ）任意に、工程ｅ）又はｆ）の結果として得られた混合物を水素化分解反応させる工程。
【００３７】
第１のアスペクトの好ましい形態によれば、本発明は１種以上の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体若しくは前駆体を生じさせる（すなわち１種以上の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体若しくは前駆体を生成する）方法を提供し、該方法は以下の工程を含む。
ａ）万能ドナーとして式５〜１０で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその塩を提供する工程、
ｂ）アクセプターとして下記からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を提供する工程、
・ラクトース、
・下記式で表されるラクトース誘導体、
【００３８】
【化８】
2014513985.tif 000011
【００３９】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
【００４０】
・ＬＮＴ、
【００４１】
【化９】
2014513985.tif 000012
【００４２】
・下記式で表されるＬＮＴ誘導体又はその塩、
【００４３】
【化１０】
2014513985.tif 000013
【００４４】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
【００４５】
・ＬＮｎＴ、
【００４６】
【化１１】
2014513985.tif 000014
【００４７】
・下記式で表されるＬＮｎＴ誘導体
【００４８】
【化１２】
2014513985.tif 000015
【００４９】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
【００５０】
ｃ）トランスグリコシダーゼ活性及び／又はグリコシンターゼ活性を含む、少なくとも１種の酵素を提供する工程、
ｄ）工程ａ）、ｂ）及びｃ）で得られたドナー、アクセプター及び酵素の混合物を調製する工程、
ｅ）工程ｄ）により調製された混合物を培養する工程、
ｆ）任意に、下記である場合に、工程ａ）〜ｃ）の少なくとも１つを繰り返し、その後、工程ｄ）及びｅ）を繰り返す工程。
ｆ−ａ）式５で表される単一化合物が工程ａ）における万能ドナーとして提供され、単一アクセプターが工程ｂ）により提供され、工程ｃ）において添加されるトランスグリコシダーゼ活性及び／又はグリコシンターゼ活性を含む酵素がトランス−フコシダーゼ及び／又はフコシンターゼ活性を有する酵素であり、単一ＨＭＯ又はその誘導体若しくは前駆体が工程ｅ）の結果として生成される場合、又は
ｆ−ｂ）式６で表される単一化合物が工程ａ）における万能ドナーとして提供され、単一アクセプターが工程ｂ）によって提供され、工程ｃ）において添加されるトランスグリコシダーゼ活性及び／又はグリコシンターゼ活性を含む酵素がトランス−シアリダーゼ活性を有する酵素であり、単一ＨＭＯ又はその誘導体若しくは前駆体が工程ｅ）の結果として生成される場合、又は
ｆ−ｃ）式８で表される単一化合物が工程ａ）における万能ドナーとして提供され、単一アクセプターが工程ｂ）によって提供され、工程ｃ）において添加されるトランスグリコシダーゼ活性及び／又はグリコシンターゼ活性を含む酵素がトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有する酵素であり、単一ＨＭＯ又はその誘導体若しくは前駆体が工程ｅ）の結果として生成される場合、
ｇ）任意に、工程ａ）〜ｃ）の少なくとも１つを繰り返し、その後、工程ｅ）又はｆ）により得られた混合物を以て、工程ｄ）及びｅ）を繰り返す工程、
ｈ）任意に、工程ｅ）、ｆ）又はｇ）の結果として得られた混合物を水素化分解反応させる工程。
【００５１】
好適には、前記工程ｆ）が行われるのは、工程ａ）において単一ドナーが提供される場合、工程ｂ）において単一アクセプターが提供される場合、工程ｃ）で提供される酵素がトランスグリコシダーゼ活性及び／又はグリコシンターゼ活性を含む単一酵素である場合、及び、単一ＨＭＯ又はその誘導体もしくは前駆体が工程ｅ）の結果として生成される場合である。
【００５２】
第１のアスペクトのより好ましい形態によれば、本発明は１種以上の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体若しくは前駆体を生じさせる（すなわち１種以上の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体若しくは前駆体を生成する）方法を提供し、該方法は以下の工程を含む。
ａ）万能ドナーとして上記式５〜１０で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその塩を提供する工程、
ｂ）アクセプターとして下記からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を提供する工程、
・ラクトース、
・下記式で表されるラクトース誘導体、
【００５３】
【化１３】
2014513985.tif 000016
【００５４】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
【００５５】
・ＬＮＴ：
【００５６】
【化１４】
2014513985.tif 000017
【００５７】
・下記式で表されるＬＮＴ誘導体又はその塩
【００５８】
【化１５】
2014513985.tif 000018
【００５９】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
【００６０】
・ＬＮｎＴ：
【００６１】
【化１６】
2014513985.tif 000019
【００６２】
・下記式で表されるＬＮｎＴ誘導体
【００６３】
【化１７】
2014513985.tif 000020
【００６４】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基である）
【００６５】
ｃ）トランスグリコシダーゼ活性及び／又はグリコシンターゼ活性を含む、少なくとも１種の酵素を提供する工程、
ｄ）工程ａ）、ｂ）及びｃ）で得られたドナー、アクセプター及び酵素の混合物を調製する工程、
ｅ）工程ｄ）により調製された混合物を培養する工程、
ｆ）任意に、工程ｅ）の結果としてＨＭＯ又はその誘導体もしくは前駆体が１種だけ生成された場合に、工程ａ）〜ｃ）の少なくとも１つを繰り返し、その後、工程ｄ）及びｅ）を繰り返す工程、
ｇ）任意に、工程ａ）〜ｃ）の少なくとも１つを繰り返し、その後、工程ｅ）又はｆ）により得られた混合物を以て、工程ｄ）及びｅ）を繰り返す工程、
ｈ）任意に、工程ｅ）、ｆ）又はｇ）の結果として得られた混合物を水素化分解反応させる工程。
【００６６】
上記好ましい及びより好ましい形態によれば、第１の培養サイクル後、生成物（ＨＭＯ又はＨＭＯ誘導体又はＨＭＯ前駆体）が１種だけ形成された場合には、更に少なくとも１回の培養サイクルが必要である。ここで、ラクトースはＨＭＯとして考えていない。このケースは、工程ａ）及びｂ）において提供されるいくつかのドナー−アクセプターペアに起こり得る。このシチュエーションは、単一生成物が培養工程中に形成され、培養工程後に出発原料（すなわち、本発明の方法の工程ａ）及びｂ）で提供される化合物）が反応混合物に残っている場合を含む。工程ａ）〜ｃ）の少なくとも１つを繰り返し、その後、工程ｄ）及び工程ｅ）を繰り返す時、工程ａ）により提供される少なくとも１種の化合物は、第１のサイクルで提供されるものと異なることが好ましく、工程ｂ）により提供される少なくとも１種の化合物は、第１のサイクルで提供されるものと異なることが好ましく、工程ｃ）により提供される少なくとも１種の酵素は、第１のサイクルで提供されるものと異なることが好ましいが、工程ａ）〜ｃ）の少なくとも１つは、最初のサイクルで行われるものと異なるものでなければならない。
【００６７】
本発明において、用語「水素化分解によって除去可能な基」は、炭素−ヘテロ原子単結合が水素により開裂又は「溶解」が行われる基を意味する。ヘテロ原子は様々であってよいが、通常は酸素、窒素又は硫黄である。水素化分解は、保護基化学の中でも例外であり、水を溶媒として使用することができる。水素化分解自体は、非常に穏やかな条件下で副生成物の生成を防いで、ほぼ量的にオリゴ糖骨格からＯ−ベンジル／置換Ｏ−ベンジル部分を除去するのに好適な、強力な脱保護プロセスである。また、複合合成経路における最終デブロッキング方法として、反応の完了に必要な試薬は触媒量のみであること、及び、反応からもっぱらトルエン又は置換トルエン誘導体が副生成物として得られることが水素化分解の利点である。トルエン及び置換トルエン誘導体のいずれも数トンの規模でも、水溶性オリゴ糖産物から蒸発及び／又は抽出過程を介して容易に除去することができる。水素化分解に好適な基としてはベンジル、ジフェニルメチル（ベンズヒドリル）、１−ナフチルメチル、２−ナフチルメチル又はトリフェニルメチル（トリチル）基が挙げられ、それらはそれぞれ、アルキル、アルコキシ、フェニル、アミノ、アシルアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ニトロ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジアルキルカルバモイル、アジド、ハロゲンアルキル又はハロゲンから選択される１以上の基で任意に置換されてもよい。そのような置換基が存在する場合、１または複数の芳香環上にあることが好ましい。特に好ましい保護基は、任意にアルキル又はハロゲンから選択された１以上の基で置換されたベンジルである。更に、該保護基は非置換ベンジル、４−クロロベンジル及び４−メチルベンジルから選択されることがより好ましい。これらの特に好ましい及びより好ましい保護基は、水素化分解の副生成物がもっぱらトルエン又は置換トルエンという利点を有する。そのような副生成物は数トンの規模でも、水溶性オリゴ糖産物から蒸発及び／又は抽出過程を介して容易に除去することができる。水素化分解は、触媒量のパラジウム、ラネーニッケル、又は水素化分解で用いられるその他の適切な金属触媒を添加し、その結果ＯＨ基を再生することで行うことができる。このようなタイプの基は当業者によく知られており議論されている（例えば、P.G.M. Wuts and T.W. Greene： Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons (2007)参照）。
【００６８】
更に、用語「ＨＭＯ前駆体」は、残基Ｒで修飾され、グリコシド結合でグリコシドが形成されたＨＭＯのＲ−グリコシドを意味する。
【００６９】
更に、用語「ＨＭＯ誘導体」は、構造化ＨＭＯ及びそのＲ−グリコシドに似ているオリゴ糖、好ましくは一般式１、２、３及び４で表される誘導体を意味する。
【００７０】
さらに、本発明中の用語「フコシル」については、α−グリコシド間結合でコアオリゴ糖に結合しているＬ−フコピラノシル基を意味する。
【００７１】
【化１８】
2014513985.tif 000021
【００７２】
本発明中の「Ｎ−アセチル−ラクトサミニル」基は、β結合で結合したＮ−アセチル−ラクトサミン（LacNAc、Galpβ1−4GlcNAcp）のグリコシル残基を意味する。
【００７３】
【化１９】
2014513985.tif 000022
【００７４】
さらに、本発明中の用語「ラクト−Ｎ−ビオシル」基は、β結合で結合したラクト−Ｎ−二炭糖（LNB、Galpβ1−3GlcNAcp）のグリコシル残基を意味する。
【００７５】
【化２０】
2014513985.tif 000023
【００７６】
本発明中の用語「シアリル」は、α結合で結合したシアル酸（Ｎ−アセチル−ノイラミン酸、Neu5Ac）のグリコシル残基を意味する。
【００７７】
【化２１】
2014513985.tif 000024
【００７８】
さらに、本発明中の用語「１以上のＮ−アセチル−ラクトサミニル及び／又は１以上のラクト−Ｎ−ビオシル単位を含むグリコシル残基」は、好ましくはグリコシド間結合で互いに結合した前記単位を含む直鎖又は分岐鎖構造を意味する。
【００７９】
用語「任意に置換されたフェノキシ」は、ニトロ、ハロゲン、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノ、フォルミル、カルボキシル及びアルコキシカルボニルから選択された１又は２つの基で任意に置換されたフェノキシ基、又は、オルト位の２つの置換基がメチレンジオキシ基を形成しているものを意味する。好ましい置換基は、ニトロ（好ましくは２−及び／又は４−位）、ハロゲン（好ましくはフルオロ及びクロロ）である。特に好ましい置換したフェノキシ基は、４−ニトロフェノキシ、２，４−ジニトロフェノキシ、２−クロロ−４−ニトロフェノキシ、２−フルオロ−４−ニトロフェノキシ、３−フルオロ−４−ニトロフェノキシ、２−ヒドロキシメチル−４−ニトロフェノキシ、３−ヒドロキシメチル−４−ニトロフェノキシ、２−フォルミル−４−ニトロフェノキシ、２−カルボキシ−４−ニトロフェノキシ、２−メトキシカルボニル−４−ニトロフェノキシ、５−フルオロ−２−ニトロフェノキシ、４−メトキシカルボニル−２−ニトロフェノキシ、４−カルボキシ−２−ニトロフェノキシ、２−アミノフェノキシ及び３，４−メチレンジオキシ−フェノキシから選択される。
【００８０】
用語「任意に置換されたピリジニルオキシ」は、ニトロ、ハロゲン、アルキル及びアルコキシから選択された１又は２つの基で任意に置換されたピリジニルオキシ（より好ましくは２−又は４−ピリジニルオキシ基）を意味する。特に、ピリジニルオキシ基は、４−ピリジニルオキシ、２−ピリジニルオキシ、３−ニトロ−２−ピリジニルオキシ及び３−メトキシ−２−ピリジニルオキシから選択される。
【００８１】
好ましい及びより好ましい形態を含む第１のアスペクトの工程ａ）によれば、少なくとも１種のアクセプターが提供され、好ましい及びより好ましい形態を含む第１のアスペクトの工程ｂ）によれば、少なくとも１種の万能ドナーが提供される。本発明において、用語「ドナー」は、化学反応（例えば求核又は求電子置換反応）における特定の部分を、更なる化合物（好ましくはアクセプター）に提供する又は転移する化合物として理解される。特に好ましくは、「万能ドナー」は、化学反応（例えば求核又は求電子置換反応）における特定の部分を、更なる化合物（好ましくはアクセプター）に提供する又は転移する化合物（ドナーは、ＨＭＯの調製のための天然型ドナーに限定されず、生成物として天然型ＨＭＯ及び／又は非天然型ＨＭＯに至ってもよいものである）として理解される。そのような万能ドナーは上述したものが好ましい。同様に、用語「アクセプター」は、化学反応（例えば求核又は求電子置換反応）における特定の部分を、更なる化合物（好ましくは上記定義した万能ドナー）から受容する化合物として理解される。そのようなアクセプターは上述したものが好ましい。
【００８２】
好ましい及び特に好ましい形態を含む第１のアスペクトの工程ａ）における万能ドナーとして人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）の調製に用いる化合物は、好ましくは本発明の方法中に用いられる酵素に依って置換基が選択される式５〜８で表される化合物から選択されることが好ましい。好ましくは、ドナーはそのトランスグリコシダーゼ活性に依って、Ｘが任意に置換された４−ニトロフェノキシ、Ａ基、Ｂ基、Ｃ基である式５〜８で表される化合物、又は、式９又は１０で表される化合物から選択される。同様に、好ましくは、ドナーはそのグリコシンターゼ活性に依って、Ｘがアジド又はフルオロである式５〜８で表される化合物から選択される。いずれの選択もそれぞれ独立に又は合わせて行われてもよい。
【００８３】
更に、好ましい及び特に好ましい形態を含む第１のアスペクトの工程ａ）における万能ドナーとして人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）の調製に用いる化合物は、Ｘが４−ニトロフェノキシ、２，４−ジニトロフェノキシ、２−クロロ−４−ニトロフェノキシ、２，５−ジメチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルオキシ、２−エチル−５−メチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルオキシ、５−エチル−２−メチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルオキシ、４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イルオキシ、４，６−ジエトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イルオキシ、又は、４−メチルウンベリフェリルオキシである式５〜８で表される化合物から選択されることが好ましい。
【００８４】
本発明の人乳オリゴ糖(ＨＭＯ)を生じさせる方法の工程ｃ）において、トランスグリコシダーゼ活性及び／又はグリコシンターゼ活性を含む少なくとも１種の酵素が提供される。
【００８５】
好ましい及びより好ましい形態を含む人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を生じさせる第１のアスペクトの工程ｃ）において好適な酵素は、典型的には、トランスグリコシダーゼ活性及び／又はグリコシンターゼ活性を含む少なくとも１種の酵素を含み、好ましくは例えば、フコシダーゼ、トランス−フコシダーゼ又はフコシンターゼ活性、シアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）又はトランス−シアリダーゼ（トランスノイラミニダーゼ）活性、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ又はトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性及び／又はＮ−アセチルラクトアミニダーゼ又はトランス−Ｎ−アセチルラクトアミニダーゼ活性を有する酵素、又は、そのような活性を有するいずれの更なる酵素から選択される酵素である。より好ましくは、好ましい及びより好ましい形態を含む人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を生じさせる第１のアスペクトの工程ｄ）において好適な酵素は、野生型若しくは変異グリコシダーゼ又はトランスグリコシダーゼ、好ましくはフコシダーゼ、トランス−フコシダーゼ若しくはフコシンターゼ活性、シアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）若しくはトランス−シアリダーゼ（トランスノイラミニダーゼ）活性、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ若しくはトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性及び／又はＮ−アセチルラクトアミニダーゼ若しくはトランス−Ｎ−アセチルラクトアミニダーゼ活性を有する野生型若しくは変異グリコシダーゼ又はトランスグリコシダーゼ、又は好ましくはα−トランス−フコシダーゼ、α−トランス−シアリダーゼ、β−トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ及び／又はβ−トランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性を有する野生型若しくは変異グリコシダーゼ又はトランスグリコシダーゼを含む群より選択される。
【００８６】
好ましい及びより好ましい形態を含む人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を生じさせる第１のアスペクトの工程ｃ）において好適な酵素は、更に、少なくとも１種の上記酵素（例えば、トランスグリコシダーゼ活性及び／又はグリコシンターゼ活性を有する酵素、好ましくはフコシダーゼ、トランス−フコシダーゼ若しくはフコシンターゼ活性、シアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）若しくはトランス−シアリダーゼ（トランスノイラミニダーゼ）活性、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ若しくはトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性及び／又はＮ−アセチルラクトアミニダーゼ若しくはトランス−Ｎ−アセチルラクトアミニダーゼ活性を有する酵素、又は好ましくはα−トランス−フコシダーゼ、α−トランス−シアリダーゼ、β−トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ及び／又はβ−トランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性を有するもの、又はそのような活性を有する更にいずれの酵素）を発現する又は分泌する、当業者に知られているいずれの属から選択されてもよい。更により好ましくは、好ましい及びより好ましい形態を含む人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を生じさせる第１のアスペクトの工程ｃ）において好適な酵素は、桿菌、ビフィドバクテリウム、ラクトバチルス、リューコノストック、乳酸球菌、連鎖球菌、ストレプトミセス、スルホロブス、テルモトガ又はトリパノソーマから選択される非病原性バクテリアから選択してもよい。
【００８７】
より好ましくは、好ましい及びより好ましい形態を含む人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を生じさせる第１のアスペクトの工程ｃ）において好適なそのような酵素は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＮＣＩＭＢ４１１７１、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＮＣＩＭＢ４１１７１、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＰＲＬ２０１０、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＰＲＬ２０１０、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＳ１７、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＳ１７、ビフィドバクテリウム・デンティウムＢｄ１、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７、ビフィドバクテリウム・ロンガムサブスピーシーズ・ロンガムＪＤＭ３０１、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＪＣＭ１２２２、ラクトバチルス・カゼイＢＬ２３、ストレプトマイセス属、スルフォロブス・ソルファタリクスＰ２、テルモトガ・マリチマＭＳＢ８及びクルーズトリパノソーマなどの非病原性バクテリア・バシラス・サーキュランス又は乳酸バクテリアを含む群より選択される。
【００８８】
上記文脈において特に好ましい微生物、特にグリコシダーゼ／トランスグリコシダーゼ／グリコシンターゼをターゲットとしたものは乳酸バクテリアを含む。乳酸バクテリア、特にビフィドバクテリウム属に属する非病原性バクテリアは、人乳オリゴ糖を認めることができるα−２，３／６シアリダーゼ（ＧＨ３３）、α−１，２／３／４フコシダーゼ（ＧＨ２９及びＧＨ９５）、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ（ＧＨ２０）、β−ガラクトシダーゼ（ＧＨ２）及びβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（ＧＨ２０）を含む一連のグリコシダーゼを含む。ビフィドバクテリア菌株に依って、これらのグリコシダーゼは細胞内又は外酵素である。
【００８９】
乳酸バクテリアに由来するグリコシダーゼ及び／又はグリコシンターゼの使用についての更なるアスペクトは、そのようなバクテリアの産業的重要性に関する。なぜなら、それらはＧＲＡＳ（米国食品医薬品局の認可）資格を有するからである。別のより好ましいアスペクトによれば、トランス−フコシダーゼ、トランス−シアリダーゼ、トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ及び／又はトランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性、好ましくはα−トランス−フコシダーゼ、α−トランス−シアリダーゼ、β−トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ及び／又はβ−トランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性を示すグリコシダーゼ及び／又はグリコシンターゼは、野生型又は操作されたグリコシダーゼである。最も好ましくは、野生型グリコシダーゼは、グリコシダーゼが合理的エンジニアリング又は／及び定方向進化によってトランスグリコシダーゼに転換される乳酸バクテリアからなる群より選択される。乳酸バクテリアからなる群より選択されるグリコシダーゼ及び／又はグリコシンターゼは、最も好ましくは、ビフィドバクテリウム、ラクトバチルス、乳酸球菌、連鎖球菌又はリューコノストック属に由来するグリコシダーゼである。ビフィドバクテリウム属から選択されるグリコシダーゼは、最も好ましくは、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ロンガムサブスピーシーズ・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム及びビフィドバクテリウム・カテヌラータムに由来するグリコシダーゼである。
【００９０】
更に、スルフォロブス・ソルファタリクス及びテルモトガ・マリチマなどの好熱生物に由来する操作されたフコシダーゼは、近年開発されており、本発明の方法において用いてもよい。これらの熱安定性グリコシダーゼは、産業的活用に相当な可能性を有している。なぜなら、これらは上昇した温度でバイオテクノロジーのプロセスに用い、それによりプロセスを促進し、汚染のリスクを避け、反応で用いる化合物の溶解性を高めることができる。
【００９１】
別のより好ましい形態によれば、トランス−フコシダーゼ、トランス−シアリダーゼ、トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ及び／又はトランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性、好ましくはα−トランス−フコシダーゼ、α−トランス−シアリダーゼ、β−トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ及び／又はβ−トランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性を示すグリコシダーゼ及び／又はグリコシンターゼ酵素は、野生型又は操作されたグリコシダーゼである。最も好ましくは、野生型グリコシダーゼは、合理的エンジニアリング又は／及び定方向進化によりグリコシダーゼがトランスグリコシダーゼに転換された好熱生物からなる群より選択される。好熱生物から選択されたα−Ｌ−フコシダーゼは、最も好ましくは、テルモトガ・マリチマ及びスルフォロブス・ソルファタリクスに由来するα−Ｌ−フコシダーゼである。
【００９２】
好ましくは、前記トランスグリコシダーゼ活性及び／又はグリコシンターゼ活性を含む少なくとも１種の酵素は、フコシダーゼ、トランス−フコシダーゼ又はフコシンターゼ活性を発現する酵素から選択することができ、好ましくは以下に記載するものである。本発明において、フコシダーゼ、トランス−フコシダーゼ又はフコシンターゼ活性、より好ましくはα−トランス−フコシダーゼ活性を有する酵素は、好ましくはフコシダーゼ全般から選択され、より好ましくはα−Ｌ−フコシダーゼ（例えばＥＣ３．２．１．３８及び３．２．１．５１に分類されるα−Ｌ−フコシダーゼ）から選択される。α−Ｌ−フコシダーゼは哺乳動物、植物、菌類及びバクテリアなど生体において存在する。これらの酵素は、ＣＡＺＹ命名法（http：／／www.cazy.or）が規定するグリコシドヒドロラーゼのファミリー２９及び９５（ＧＨ２９及びＧＨ９５）に属する。ＧＨ２９のフコシダーゼは保持酵素である（３Ｄ構造：（β／α）８）。一方、ＧＨ９５のフコシダーゼは転化酵素である（３Ｄ構造：（α／α）６）。ＧＨ２９ファミリーの基質特異性は広いが、ＧＨ９５ファミリーの基質特異性はα１，２−結合フコシル残基に限定される。ＧＨ２９ファミリーは２つのサブファミリーに分かれるようである。典型的には１つのサブファミリーはα１，３−及びα１，４−フルコシル結合に対して限定的な特異性を有する。更なるサブファミリーのメンバーはより広い特異性を有し、全てのα−フコシル結合を対象にしている。α−Ｌ−フコシダーゼは一般的にグリカンの末端フコシル残基を加水分解する。これらの酵素は、トランスフコシル化活性を有するため、本発明の方法において用いることができ、好ましくは速度論的に制御された条件下で、フコシル化反応の触媒としても働くことができる。
【００９３】
また、本発明において採用してもよいフコシダーゼは、操作されたフコシダーゼを含んでもよい。そのような操作されたフコシダーゼは好ましくは操作されたα−Ｌ−フコシダーゼ、好ましくは上述したフコシダーゼに由来する操作されたフコシダーゼ、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダムに由来する操作されたα−１，２−Ｌ−フコシンターゼ、スルフォロブス・ソルファタリクス及びテルモトガ・マリチマに由来するα−Ｌ−フコシンターゼ等を含んでもよい。そのような操作されたフコシダーゼは、アクセプター依存性位置選択性を示し、生成物の加水分解活性が欠けている。更に、操作されたフコシダーゼは好ましくは、定方向進化によって近年有効なα−Ｌ−トランス−フコシダーゼに転換されたテルモトガ・マリチマからのα−Ｌ−フコシダーゼが含まれる（参照：Osanjo, G., et al., Directed evolution of the alpha−L−fucosidase from Thermotoga maritima into an alpha−L−trans−fucosidase. Biochemistry, 2007, 46(4)： p. 1022−33）。
【００９４】
更により好ましくは、前記フコシダーゼ及び／又はトランス−フコシダーゼ及び／又はフコシンターゼ活性を有する少なくとも１種の酵素は、テルモトガ・マリチマＭＳＢ８、スルフォロブス・ソルファタリクスＰ２、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＪＣＭ１２２２、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＰＲＬ２０１０、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＳ１７、ビフィドバクテリウム・ロンガムスピーシーズ・ロンガムＪＤＭ３０１、ビフィドバクテリウム・デンティウムＢｄ１又はラクトバチルス・カゼイＢＬ２３などに由来するα−Ｌ−フコシダーゼから選択されてもよい。
【００９５】
更により好ましくは、前記フコシダーゼ及び／又はトランス−フコシダーゼ及び／又はフコシンターゼ活性を有する少なくとも１種の酵素は、以下の寄託番号で規定されるα−Ｌ−フコシダーゼから選択されてもよい：ｇｉ｜４９８０８０６（テルモトガ・マリチマＭＳＢ８、配列番号：１）、ｇｉ｜１３８１６４６４（スルフォロブス・ソルファタリクスＰ２、配列番号：２）、ｇｉ｜３４４５１９７３（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４、配列番号：３）、ｇｉ｜２４２３４５１５５（ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ＪＣＭ１２５４、配列番号：４）、ｇｉ｜２１３５２４６４７（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス、ＡＴＣＣ１５６９７、配列番号：５）、ｇｉ｜２１３５２２６２９（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７）、ｇｉ｜２１３５２２７９９（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７）、ｇｉ｜２１３５２４６４６（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７）、ｇｉ｜３２０４５７２２７（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＪＣＭ１２２２）、ｇｉ｜３２０４５７４０８（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＪＣＭ１２２２）、ｇｉ｜３２０４５９３６９（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＪＣＭ１２２２）、ｇｉ｜３２０４５９３６８（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＪＣＭ１２２２）、ｇｉ｜３１０８６７０３９（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＰＲＬ２０１０）、ｇｉ｜３１０８６５９５３（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＰＲＬ２０１０）、ｇｉ｜３０９２５０６７２（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＳ１７）、ｇｉ｜３０９２５１７７４（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＳ１７）、ｇｉ｜２９６１８２９２７（ビフィドバクテリウム・ロンガムサブスピーシーズ・ロンガムＪＤＭ３０１）、ｇｉ｜２９６１８２９２８（ビフィドバクテリウム・ロンガムサブスピーシーズ・ロンガムＪＤＭ３０１）、ｇｉ｜２８３１０３６０３（ビフィドバクテリウム・デンティウムＢｄ１）、ｇｉ｜１９０７１３１０９（ラクトバチルス・カゼイＢＬ２３、配列番号：６）、ｇｉ｜１９０７１３８７１（ラクトバチルス・カゼイＢＬ２３、配列番号：７）、ｇｉ｜１９０７１３９７８（ラクトバチルス・カゼイＢＬ２３、配列番号：８）など。または、アミノ酸レベルで全体の野生型配列と比較して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、同様により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９５％又は更に９７％、９８％若しくは９９％で上述したフコシダーゼ及び／又はトランス−フコシダーゼ活性を有する酵素配列の１つと配列同一性を発現する配列から選択されてもよい。
【００９６】
特に好ましいフコシダーゼ／トランス−フコシダーゼ／フコシンターゼ活性を有するα−Ｌ−フコシダーゼを、下記表２に列挙する。
【００９７】
【表２】
2014513985.tif 000025
【００９８】
同様に好ましくは、前記トランスグリコシダーゼ活性及び／又はグリコシンターゼ活性を含む少なくとも１種の酵素は、シアリダーゼ又はトランス−シアリダーゼ活性を発現する酵素、好ましくは以下に述べるものから選択してもよい。本発明において、シアリダーゼ又はトランス−シアリダーゼ活性を有する酵素は、好ましくは、以下のシアリダーゼ又はトランス−シアリダーゼ、例えばＧＨ３３ファミリーに分類されるシアリダーゼ（ＥＣ３．２．１．１８）及びトランス−シアリダーゼ（ＥＣ２．４．１．−）から選択される。これらは保持酵素である。シアリダーゼ及びトランス−シアリダーゼは広く自然に分布している。これらは特に様々なウイルスファミリー及びバクテリア、並びに、原生動物、いくつかの無脊椎動物及び哺乳動物に見つけられる。これらの酵素は生化学的性質（例えば、反応速度、結合親和性又は基質選択性）が異なる。にもかかわらず、これらは保存ドメイン及び構造的類似性を有する。トランス−シアリダーゼはシアリダーゼとは異なり、なぜなら、シアル酸（好ましくはα−２，３−結合シアル酸）をドナー分子からアクセプター誘導体へ（好ましくはβ−グリコシド間結合で末端ガラクトース部分である）転移させることができる。この転移の結果、シアル酸とアクセプターとの間にα−グリコシド結合が形成される。しかしながら、好適なアクセプターがない場合は、トランス−シアリダーゼがシアル酸を加水分解する。
【００９９】
上述した第１のトランス−シアリダーゼ酵素はクルーズトリパノソーマ（シャガス病を引き起こす原生動物）に見られた。このトランス−シアリダーゼ（ＴｃＴＳ）は広く調査されてきた。それ以降、トランス−シアリダーゼはトリパノソーマ・ブルーセイ・ガンビエンス、トリパノソーマ・ブルーセイ・ローデシエンス、トリパノソーマ・ブルーセイ・ブルーセイ及びコンゴトリパノソーマなどのいくつかの他のトリパノソーマタイプで検知されている。更に、トランス−シアリダーゼの存在がエンドトリパヌムタイプ、ジフテリア菌、そして更にヒト血漿にも示されている。
【０１００】
シアリダーゼは２つの異なるサブグループ（エンド−及びエキソ−シアリダーゼ）に分類することができる。エンド−シアリダーゼは高分子内のシアル酸結合を加水分解し、一方、エキソ−シアリダーゼは末端シアル酸結合を攻撃して、糖タンパク質、グリコペプチド、ガングリオシド、オリゴ糖及び多糖を脱シアリル化する。近年、ビフィドバクテリウム・ビフィダム及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスからのシアリダーゼが確認され、クローンが作製され、特徴付けられた。これらのシアリダーゼは開裂することができ、そのためα−２，３−及びα−２，６−結合のシアロシドを認めることができる。ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス由来のシアリダーゼは一貫してα−２，６−結合を選択し、一方、ビフィドバクテリウム・ビフィダム由来のシアリダーゼは一貫してα−２，３−結合を選択する。また、これらの酵素はそのトランス−シアリダーゼ活性のためシアリル化反応の触媒として働くことができ、そのため本発明の方法において用いることができる（好ましくは反応速度が制御された条件下において）。
【０１０１】
また、本発明において採用してもよいシアリダーゼは、操作されたシアリダーゼを含んでもよい。配列及び構造の比較に基づき、トリパノソーマ・ランゲリからのシアリダーゼは６つの位置で変異していてもよく、その結果の突然変異体は、著しいレベルのトランス−シアリダーゼ活性を示すことができる（参照：Paris, G., et al., A sialidase mutant displaying trans-sialidase activity. J Mol Biol, 2005. 345(4)： p. 923−34）。
【０１０２】
更により好ましくは，前記シアリダーゼ及び／又はトランス−シアリダーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素は、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＳ１７、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＰＲＬ２０１０、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＮＣＩＭＢ４１１７１、クルーズトリパノソーマなどに由来するシアリダーゼ又はトランス−シアリダーゼから選択してもよい。
【０１０３】
更により好ましくは、前記シアリダーゼ及び／又はトランス−シアリダーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素は、以下の寄託番号で規定されるシアリダーゼ又はトランス−シアリダーゼから選択されてもよい：ｇｉ｜２１３５２４６５９（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７、配列番号：９）、ｇｉ｜２１３５２３００６ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７、配列番号：１０）、ｓｉａｂ２（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４）、更にビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４からのシアリダーゼ又はトランス−シアリダーゼ）、ｇｉ｜３０９２５２１９１（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＳ１７、配列番号：１１）、ｇｉ｜３０９２５２１９０（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＳ１７、配列番号：１２）、ｇｉ｜３１０８６７４３７（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＰＲＬ２０１０、配列番号：１３）、ｇｉ｜３１０８６７４３８（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＰＲＬ２０１０、配列番号：１４）、ｇｉ｜２２４２８３４８４（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＮＣＩＭＢ４１１７１）、ｇｉ｜３１３１４０６３８（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＮＣＩＭＢ４１１７１）、ｇｉ｜４７２５２６９０（クルーズトリパノソーマ、配列番号：１５）、ｇｉ｜４３２４８５（クルーズトリパノソーマ、配列番号：１６）、ｇｉ｜３４３９５７９９８（コンゴトリパノソーマ、配列番号：２０）、ｇｉ｜３４３９５８００４（コンゴトリパノソーマ、配列番号：２１）など。または、アミノ酸レベルで全体の野生型配列と比較して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、同様により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％及び最も好ましくは少なくとも９５％又は更に９７％、９８％若しくは９９％で上述したシアリダーゼ及び／又はトランス−シアリダーゼ活性を有する酵素配列の１つと配列同一性を発現する配列から選択されてもよい。
【０１０４】
特に好ましいシアリダーゼ／トランス−シアリダーゼ活性を有するシアリダーゼを、下記表３に列挙する。
【０１０５】
【表３】
2014513985.tif 000026
【０１０６】
加えて、前記トランスグリコシダーゼ活性及び／又はグリコシンターゼ活性を含む少なくとも１種の酵素は、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ又はトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を発現する酵素、好ましくは以下に述べるものから選択してもよい。本発明において、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ又はトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有する酵素は、好ましくは、以下のラクト−Ｎ−ビオシダーゼ又はトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ、例えばＧＨ２０ファミリーに分類されるラクト−Ｎ−ビオシダーゼ（ＥＣ３．２．１．１４０）から選択される。ラクト−Ｎ−ビオシダーゼは典型的には保持機構を経る。ストレプトミセス及びビフィドバクテリウム・ビフィダム由来の２種のラクト−Ｎ−ビオシダーゼのみがこれまでに開示され特徴づけられてきており、本発明においてラクト−Ｎ−ビオシダーゼ又はトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼとして用いてもよい（参照：Sano, M., K. Hayakawa, and I. Kato, Proc Natl Acad Sci U S A, 1992. 89(18)： p. 8512−6; Sano, M., K. Hayakawa, and I. Kato, J Biol Chem, 1993. 268(25)： p. 18560−6; Wada, J., et al., Appl Environ Microbiol, 2008. 74(13)： p. 3996−4004.）。ラクト−Ｎ−ビオシダーゼは、β−Ｄ−Ｇａｌ−（１→３）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→３）−β−Ｄ−Ｇａｌ−（１→Ｒ）構造を有するオリゴ糖の非還元末端由来の末端ラクト−Ｎ−ビオシル残基（β−Ｄ−Ｇａｌ−（１→３）−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ）を特異的に加水分解する。また、Wada et al.（上記）及びMurata et al.(Glycoconj. J. 16, 189 (1999)）は、アクセプター（例えば様々な１−アルカノール及びラクトース）と共にドナー基質（例えばラクト−Ｎ−テトラオース及びｐＮＰ−β−ＬＮＢ）を培養することによって、ビフィドバクテリウム・ビフィダム及びオーレオバクテリウム属Ｌ−１０１それぞれに由来するラクト−Ｎ−ビオシダーゼの、トランスグリコシル化を触媒する能力を示した。
【０１０７】
更により好ましくは、前記ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ又はトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＰＲＬ２０１０、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＮＣＩＭＢ４１１７１、オーレオバクテリウム属Ｌ−１０１、又はストレプトマイセス属などに由来するラクト−Ｎ−ビオシダーゼ又はトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼから選択されてもよい。
【０１０８】
更により好ましくは、前記ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ又はトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素は、以下の寄託番号で規定されるラクト−Ｎ−ビオシダーゼ又はトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼから選択されてもよい：ｇｉ｜１６７３６９７３８（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４、配列番号：１７）、ｇｉ｜４０９６８１２（ストレプトマイセス属、配列番号：１８）、ｇｉ｜３１０８６７１０３（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＰＲＬ２０１０）、ｇｉ｜３１３１４０９８５（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＮＣＩＭＢ４１１７１）など。または、アミノ酸レベルで全体の野生型配列と比較して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、同様により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９５％又は更に９７％、９８％若しくは９９％で上述したラクト−Ｎ−ビオシダーゼ又はトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有する酵素配列の１つと配列同一性を発現する配列から選択されてもよい。
【０１０９】
特に好ましいラクト−Ｎ−ビオシダーゼ又はトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有するラクト−Ｎ−ビオシダーゼを、下記表４に列挙する。
【０１１０】
【表４】
2014513985.tif 000027
【０１１１】
更に、前記トランスグリコシダーゼ活性及び／又はグリコシンターゼ活性を含む少なくとも１種の酵素は好ましくは、Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ又はトランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性を発現する酵素、好ましくは以下に述べるものから選択してもよい。本発明において、Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ又はトランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性を有する酵素は、好ましくは、以下のＮ−アセチルラクトサミニダーゼ又はトランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ、例えばＧＨ２０ファミリーに分類されるラクト−Ｎ−ビオシダーゼ（ＥＣ３．２．１．１４０）から選択される。特に好ましくは、バシラス・サーキュランス由来のキチナーゼ、より好ましくはｇｉ｜１４２６８８（配列番号：１９）として寄託されているバシラス・サーキュランスＷＬ−１２由来のキチナーゼＡ１をＮ−アセチルラクトサミニダーゼ又はトランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼとして用いてもよい。または、アミノ酸レベルで全体の野生型配列と比較して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、同様により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９５％又は更に９７％、９８％若しくは９９％で上述したＮ−アセチルラクトサミニダーゼ又はトランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性を有する酵素配列の１つと配列同一性を発現する配列から選択されてもよい。特に、Ｓｈｏｄａらは、バチルス・サーキュランスＷＬ−１２由来のキチナーゼＡ１がＮ−アセチルラクトサミンをβ−１，６グリコシド結合でＮ−アセチルラクトサミンの１，２−オキサゾリン誘導体を用いて転移させることができることを示している（参照：Shoda, S.−i., et al., Cellulose, 2006. 13(4)： p. 477−484.)。
【０１１２】
特に好ましいＮ−アセチルラクトサミニダーゼ又はトランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼを、下記表５に列挙する。
【０１１３】
【表５】
2014513985.tif 000028
【０１１４】
上述したように、上記トランスグリコシダーゼ及び／又はグリコシンターゼ活性を含むタンパク質は、トランスグリコシダーゼ及び／又はグリコシンターゼ活性を含む操作されたタンパク質を含んでもよい。特にトランスフコシダーゼ、トランスシアリダーゼ、トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ及び／又はトランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性、好ましくはα−トランスフコシダーゼ、α−トランスシアリダーゼ、β−トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ及び／又はβ−トランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性を示す野生型又は変異グリコシダーゼは、本発明においてそのようなオリゴ糖の製造に用いることができる。そのような酵素の調製は、好ましくは特定部位の突然変異誘発アプローチ又は定方向進化を介して行われる。
【０１１５】
合理的エンジニアリングにおいて、新規の変異酵素（突然変異体）は、特定部位の突然変異誘発アプローチを介して、好ましくは点突然変異の導入により産生される。この技術は一般的に静的３Ｄタンパク質構造への依存を必要とする。前記突然変異は、通常、酵素の活性部位に影響を及ぼし、酵素はそのトランスグリコシル化生成物を分解する能力を失うが、合成する能力は維持する。好ましい戦略は、非求核残基による触媒的求核試薬の置換からなる。この修飾の結果として、トランスグリコシル化に必要な反応性ホスト−ゲスト錯体形成のための適切な環境がないため、不活性突然変異体又はトランスグリコシル化活性の低い変異酵素が形成される。しかしながら、グリコシル酵素中間体を模倣するグリコシルドナーに比べ活性の高いグリコシル（例えばグリコシルフルオリド）の存在下においては、突然変異酵素は、グリコシル部分を適切なアクセプターへ効率的に転移して、アノマー立体化学が反転したグリコシドを生じさせることができる。そのような突然変異体グリコシダーゼはグリコシンターゼと呼ばれており、これらの開発は、合成のためのグリコシダーゼの使用における主要な発展の１つを表す。原理的には、グリコシンターゼの概念は、全ての成長ホルモン（ＧＨ）特異性に適用することができ、最大（up to）９５％の高い収率で様々なオリゴ糖を合成する可能性を有する酵素の大きな区画（panel）を提供する。
【０１１６】
第２の好ましい技術は定方向進化と呼ばれている。この戦略は選択されたグリコシダーゼの遺伝子に適用されたランダム変異導入法を含み、グリコシダーゼを発現する遺伝学的に多様な遺伝子のライブラリが創られる。配列の多様性は公知の方法で生み出すことができる。最も好ましいのは、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応（ｅｐＣＲ）方法である。このジーンライブラリはわずかに変異した特性を持つ組換え変異体の産生に好適な微生物（大腸菌又は出芽酵母など）に挿入されてもよい。改良された酵素を発現するクローンは、迅速かつ信頼できるスクリーニング法で同定され、選択され、突然変異プロセスの次のラウンドに持ち込まれる。繰り返される突然変異、組み換え及び選択のサイクルは、所望の活性及び／又は特異性を有する突然変異体が得られるまで続けられる。これまでに、グリコシンターゼを含むグリコシダーゼのための異なる高スループットのスクリーニング手法が開発されてきた。これらのアプローチを適用して、効果的な操作されたトランスグリコシダーゼ（新規でより効率的なグリコシンターゼを含む）を産生し、単離することができた。テルモトガ・マリチマ由来のα−Ｌ−フコシダーゼが近年、効率的なα−Ｌ−トランスフコシダーゼに定方向進化によって転換されてきた。得られた酵素のトランスフェラーゼ／加水分解の比は、天然型酵素の３０倍も高かった（参照：Osanjo, G., et al., Biochemistry, 2007. 46(4)： p. 1022−33）。
【０１１７】
また、上述したトランスグリコシダーゼ及び／又はグリコシンターゼ活性を含むタンパク質は、これらのタンパク質配列のフラグメント又は変異体を含んでもよい。そのようなフラグメント又は変異体は典型的には、アミノ酸レベルで全体の野生型配列と比較して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、同様により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９５％又は更に９７％、９８％若しくは９９％で上記タンパク質配列の１つと配列同一性を有する配列を含む。
【０１１８】
また、本発明において、タンパク質又はペプチドの「フラグメント」は本明細書に規定したタンパク質又はペプチドの配列を含んでもよく、それはそのアミノ酸配列に関して、オリジナル（天然型）のタンパク質のアミノ酸配列と比べてＮ−末端で、Ｃ−末端で、及び／又は配列内で切断されている。したがって、そのような切断は、アミノ酸レベルで生じても、準じて核酸レベルで生じてもよい。したがって、そのような上述したフラグメントの配列同一性は好ましくは、上述したタンパク質又はペプチド全体、又は、そのようなタンパク質又はペプチドの（コードする）核酸分子全体を意味する。同様に、本発明において、核酸の「フラグメント」は、本明細書で規定する核酸の配列を含み、それはその核酸分子に関して、オリジナル（天然型）の核酸分子の核酸分子と比べて５’−，３’−及び／又は配列内で切断されている。したがって、本明細書に規定されたそのようなフラグメントに関する配列同一性は、好ましくは、本明細書に規定されたように核酸全体を意味する。
【０１１９】
本発明において規定するタンパク質又はペプチドの「変異体」(例えば、本明細書で規定した核酸でエンコードされているように）は、アポリメリックキャリアカーゴ複合体（apolymeric carrier cargo compleｘ）の核酸分子でエンコードされてもよい。これにより、１以上の置換、挿入及び／又は欠失させたアミノ酸など１以上の突然変異においてオリジナルの配列とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドが産生されてもよい。好ましくは、これらのフラグメント及び／又は変異体は、完全長の天然型タンパク質と比べて同じ生物的機能又は特異活性を有する（例えば、特異抗原特性）。
【０１２０】
また、本発明において規定するタンパク質又はペプチドの「変異体」（例えば、本明細書で規定した核酸でエンコードされているように）は、天然型の（すなわち非変異の生理的な）配列と比較して保存的なアミノ酸置換を含んでもよい。これらのアミノ酸配列、及び、特にそれらのエンコードするヌクレオチド配列も、本明細書で規定する変異体に含まれる。同じクラスに由来するアミノ酸が互いに交換した置換を保存的な（conservative）置換と呼ぶ。特に、これらは、脂肪族側鎖、正又は負帯電側鎖、側鎖の芳香族基を有するアミノ酸、又は、例えば、ヒドロキシル官能基を有する側鎖など側鎖が水素結合を形成することができるアミノ酸である。これは、例えば、極性側鎖を有するアミノ酸が、別の同様に極性側鎖を有するアミノ酸で置換される、又は、例えば、疎水性側鎖を有するアミノ酸が別の同様に疎水性側鎖を有するアミノ酸で置換される（例えば、トレオニン（セリン）によりセリン（トレオニン）又はイソロイシン（ロイシン）によりロイシン（イソロイシン））ことを意味する。挿入及び置換は可能であり、特に３次元構造に修飾を引き起こさない又は結合領域に影響を与えない配列の位置で可能である。挿入又は欠失による３次元構造への修飾は、ＣＤスペクトル（円二色性スペクトル）を用いて容易に決定することができる（Urry, 1985, Absorption, Circular Dichroism and ORD of Polypeptides, in： Modern Physical Methods in Biochemistry, Neuberger et al. (ed.), Elsevier, Amsterdam）。
【０１２１】
更に、本発明において規定するタンパク質又はペプチドの変異体はまた、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列それぞれの変化に至ることなく、遺伝子コードの変性に従い核酸のヌクレオチドが交換されている配列を含んでもよい（すなわち、上記意味の範囲内で１以上の突然変異においてアミノ酸配列又はその少なくとも一部がオリジナルの配列と異ならなくてもよい）。
【０１２２】
２つの配列（例えば、本明細書において規定する複数の核酸配列又はアミノ酸配列、好ましくは本明細書において規定するポリマー担体の核酸配列によりエンコードされたアミノ酸配列、又は、アミノ酸配列自体）が同一であるパーセンテージを決定するには、その後に互いに比較するために配列を配置することができる。したがって、例えば、第１の配列の位置は、第２の配列の対応する位置と比較することができる。第１の配列のある位置が第２の配列における位置と同じ成分で占められている場合には、２つの配列はこの位置において同一である。そうでない場合は、この位置においてこれらの配列は異なる。第１の配列と比較して、第２の配列に挿入が生じている場合、第１の配列にギャップを挿入して更なる配置を可能にすることができる。第１の配列と比較して、第２の配列に欠失が生じている場合、第２の配列にギャップを挿入して更なる配置を可能にすることができる。そして、２つの配列が同一であるパーセンテージは、同一の位置の数を、１つの配列のみで占められている位置を含む位置の合計数で除した関数である。２つの配列が同一であるパーセンテージは、数学的アルゴリズムを用いて決定することができる。これに限定されないが、用いることができる数学的アルゴリズムの好ましい例は、Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90：5873−5877又はAltschul et al. (1997), Nucleic Acids Res., 25：3389−3402のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムはBLASTプログラムに組み込まれている。本発明の配列とある程度同一である配列は、このプログラムによって同定することができる。
【０１２３】
好ましい及びより好ましい形態を含む第１のアスペクトの工程ｃ）で添加されるタンパク質は、遊離した形態で提供されてもよいし、或いは、表面に結合又は固定化されていてもよい。この特定の場合においては、工程ａ）、ｂ）及びｃ）の順序は反転されることが好ましい。表面への結合又は固定化は、例えば、静電結合、ファンデルワールス結合、共有結合等により行ってもよい。更に、表面への結合又は固定化は、共有結合リンカーまたは架橋剤、又は、タンパク質の精製について当業者に知られているタグを用いて行ってもよい。そのようなタグは、とりわけ例えば、アフィニティータグまたはクロマトグラフィータグを含む。アフィニティータグは、例えば、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、または連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐ）タグを含むことができる。ポリ（Ｈｉｓ）タグは、広く使用されているタンパク質タグであり、金属マトリックスに結合する。クロマトグラフィータグは、特定の分離技術にわたって異なる分析を得るために、タンパク質のクロマトグラフィー特性を改変するために使用され、例えば、ＦＬＡＧ−タグなどのポリアニオン性アミノ酸ベースのタグを含む。前記表面は、バイオリアクターまたは任意の適切な反応チャンバーの表面であってもよい。
【０１２４】
工程ｄ）によれば、工程ａ）、ｂ）及びｃ）によって提供される物質から混合物を調製する。好ましくは、このような工程ｄ）による混合物は、工程ａ）で規定した１、２、３、４、５、１〜５、３〜１０、５〜１０又は更に異なる種類のドナー、工程ｂ）で規定した１、２、３、４、５、１〜５、３〜１０、５〜１０又は更に異なる種類のアクセプター、及び１、２、３、４、５、２〜５、２〜１０、２〜２０、５〜１０又は更に異なる種類のトランスグリコシダーゼ活性及び／又はグリコシンターゼ活性を含む酵素の混合物を表す。
【０１２５】
好ましい及びより好ましい形態を含む第１のアスペクトの人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）の生成のための更なる工程ｅ）において、工程ａ）で規定される少なくとも１種の化合物、工程ｂ）で規定される少なくとも１種の化合物及び工程ｃ）で添加される少なくとも１種の酵素を含む混合物（これらが一緒に工程ｄ）の混合物を形成する）は培養され、本明細書で記載したように前記トランスグリコシダーゼ活性及び／又はグリコシンターゼ活性を含む少なくとも１種の酵素を用いて酵素的手段を介して人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体を形成することができる。そのような培養によって、有利に多様な異なるＨＭＯを生成することができる。そのような多様な異なるＨＭＯの生成は、工程ｃ）で提供される種々の活性を有する酵素の使用に基づき、また、工程ａ）及びｂ）により様々な万能ドナー及びアクセプターの使用にも基づく（好ましくは工程ｄ）に既に記載されている混合物として）。このアプローチを利用して、本発明の方法は有利に本発明の方法によってシンプルにコスト効率よく得ることができるオリゴ糖の数及びタイプのバリエーションが可能である。酵素の使用によって更に様々なＨＭＯの調製を、立体選択的方法で行うことができる。様々な人乳オリゴ糖又はその誘導体の混合物を得るのによく知られた手法で、分子の所望の位置で新しい結合を形成することなどによるグリコシル部分（例えば、シアリル部分、フコシル部分、Ｎ−アセチルラクトサミニル部分又はラクト−Ｎ−ビオシル部分）の転移によってＨＭＯの生成が生じることが好ましい。
【０１２６】
好ましい及びより好ましい形態を含む第１のアスペクトの工程ｅ）による培養は、１ｍＵ／ｌ〜１，０００Ｕ／ｌ、好ましくは１０ｍＵ／ｌ〜１００Ｕ／ｌの濃度の酵素（各酵素の濃度）で、例えばグリコトランスフェラーゼではグリコース含有複合炭水化物の生成が３７℃、１分で行われることが好ましい。ここで、規定の抽出物から始まり、１μｍｏｌの規定のタンパク質のための特定の生成物を形成可能な活量（activity）を１ユニット（Ｕ）と定義する。本明細書で規定する各酵素の活性はその天然由来の又は操作された基質に対して評価することができる。
【０１２７】
好ましい及びより好ましい形態を含む第１のアスペクトの工程ｅ）による培養は、本発明の方法の工程ｄ）により得られた混合物、及び任意に水、リン酸塩緩衝剤、カーボネイト緩衝剤、アセテート緩衝剤、ボレート緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤及びトリスバッファー又はこれらの組み合わせ等の緩衝剤、メタノール及びエタノールなどのアルコール、エチルアセテートなどのエステル、アセトンなどのケトン、アセトアミドなどのアミド等を含む反応媒体（好ましくは水性媒体）において行われてもよい。
【０１２８】
更に、好ましい及びより好ましい形態を含む第１のアスペクトの工程ｅ）による培養は、上述した反応媒体で行うことができ、必要に応じて任意に界面活性剤又は有機溶媒を加えても良い。本発明の可能性のある生成物として本発明で規定する複合炭水化物の形成を促進することができるいずれの界面活性剤も、界面活性剤として用いることができる。例えば、ポリオキシエチレンオクタデシルアミン（例えば、Ｎｙｍｅｅｎ  Ｓ−２１５、日油株式会社製）などの非イオン性界面活性剤、セチルトリメチル臭化アンモニウム及びアルキルジメチルベンジル塩化アンモニウム（例えば、日油株式会社製のカチオンＦ２−４０Ｅ）などのカチオン性界面活性剤、及び、ラウロイルサルコシン酸などのアニオン性界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば、日油株式会社製の第三級アミンＦＢ）などの第三級アミンが挙げられる。これらは単独又は２種以上を混合して用いてもよい。界面活性剤は通常、０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いることができる。有機溶媒としては、キシレン、トルエン、脂肪酸アルコール、アセトン及び酢酸エチルなどが挙げられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いることができる。
【０１２９】
好ましい及びより好ましい形態を含む第１のアスペクトの工程ｅ）による培養は、更に上述した反応媒体で行うことができ、好ましくはｐＨ３〜１０、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜８である。
【０１３０】
好ましい及びより好ましい形態を含む第１のアスペクトの工程ｅ）による培養は、更に、約０℃〜約１００℃、好ましくは約１０〜約５０℃、例えば約２０℃から約５０℃で行ってもよい。必要に応じて無機塩類（例えばＭｎＣｌ２及びＭｇＣｌ２）を反応媒体に加えてもよい。
【０１３１】
本発明の方法の工程ｅ）による培養は、バイオリアクター中で行ってもよい。バイオリアクターは、連続モードまたは不連続モードのいずれかに適していることが好ましい。
【０１３２】
好ましい及びより好ましい形態を含む第１のアスペクトの工程ｅ）による培養は、連続モードまたは不連続モードで行われてもよい。連続モードで行う場合、本発明の方法は、好ましくは全ての成分（酵素を含む）の濃度を所定レベルに維持しながら化合物及び／又は必要であれば酵素の連続流を提供する（好ましくは反応混合物に反応の抽出物を連続的に供給する、及び反応混合物から生成物を連続的に除去することによって提供する）。連続モードで使用する酵素は、遊離形態で又は表面に結合若しくは固定化されて加えられてもよい。
【０１３３】
本発明の第１のアスペクトに関して、ドナー及び／又はアクセプター及び／又は酵素の添加は任意の工程ｆ）にしたがって繰り返してもよい。特に好ましくは、工程ａ）〜ｄ）のいずれも繰り返してもよく、工程ｅ）により得られた混合物で繰り返すことが好ましい。そのような混合物は、好ましくは本明細書に規定した工程ａ）の少なくとも１種の化合物と、本明細書に規定した工程ｂ）の少なくとも１種の化合物と、本明細書に規定した工程ｃ）の少なくとも１種の酵素との混合物である。このような段階的な手順は、複数のラウンド内において制御可能な方法による規定の１セットの化合物の合理的な生成を可能にする。また、特定の成分の合理的な除外を提供することができる。そのような種々の化合物を得るためには、化合物及び／又は酵素は、同時に又は連続的に添加してもよく、より好ましくは化合物及び／又は酵素は、一工程で同時に及び／又は異なる複数の工程で連続的に添加してもよい。
【０１３４】
あるいは、本明細書に規定した工程ａ）の少なくとも１種の化合物と、本明細書に規定した工程ｂ）の少なくとも１種の化合物と、本明細書に規定した工程ｃ）の少なくとも１種の酵素との混合物は、１以上の工程を繰り返すことなく、一工程で培養してもよい。このような手続きにより、最大の種類の可能な生成物に至ることがあるため、特定の状況において好ましい場合がある。
【０１３５】
第１のアスペクトの好ましい及びより好ましい形態に関して、上述したように工程ｅ）後に１種のＨＭＯ又はＨＭＯ誘導体又はその前駆体のみが形成された場合には、少なくとも更に１回の培養サイクルｆ）が必要である。特に好ましくは、工程ａ）〜ｃ）の少なくとも１つが繰り返され、工程ｅ）により得られた混合物で繰り返すことが好ましい。工程ａ）〜ｃ）のいずれかを繰り返す時、工程ａ）により添加された少なくとも１種の化合物は好ましくは第１のサイクルで提供されたものと異なるものであり、工程ｂ）により添加された少なくとも１種の化合物は好ましくは第１のサイクルで提供されたものと異なるものであり、工程ｃ）により添加される少なくとも１種の酵素は好ましくは第１のサイクルで提供されたものと異なるものである。
【０１３６】
当業者は、第１の培養工程後に１種のＨＭＯ又はＨＭＯ誘導体又はその前駆体のみが形成されたか、及び、目標達成のために少なくとも更に１回の培養サイクル必要かを調べて決定することができる。可能な場合には、特定のドナー、特定のアクセプター及び特定の酵素の選択は、１種のみの生成物につながり、例えば、式６で表されるシアル酸ドナー（例えばｐＮＰシアル酸）、ラクトース又はベンジルラクトシドなどのアクセプター、２−３−α−選択的トランス−シアリダーゼ酵素を含む系の培養は、高い確率で１種の生成物（すなわち３−シアリルラクトース（ラクトースから）又は３−シアリルラクトースベンジルグリコシド（ベンジルラクトシドから））を形成する結果となる。１種を超えるドナー及び／又は１種を超えるアクセプター及び／又は１種を超える酵素が、１回の培養サイクルでＨＭＯ、ＨＭＯ誘導体又はＨＭＯ前駆体の生成に用いられる場合には、１種を超える生成物が形成されることが予想される。同様に、用いるグリコシダーゼ及び／又はグリコシンターゼ酵素がより少ない（レギオ）選択性を有する場合には、１種のアクセプターのみが提供されたとしても、酵素はグリコシル部分をアクセプターの様々な部分に転移させることができるため、１種を超える生成物が形成されることが予想される。更に、通則によれば、ドナーとアクセプターの比は、生成物の多様性に大きなインパクトを有する。ドナー−アクセプターの比が高いほど、１ドナー−１アクセプターの系において１種を超える生成物を得る確率が高くなる。当業者は、１以上の生成物が形成されたかが分かるための質的及び量的に検知及びモニターする方法のレパートリーを有する（例えば、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、ＧＣ、ＧＣ−ＭＳ、電気泳動等）。
【０１３７】
更に、第１のアスペクトの好ましい及びより好ましい形態に関して、アクセプター及び／又はドナー及び／又は酵素の添加は、任意の工程ｇ）にしたがって繰り返してもよい。そのような混合物は、好ましくは本明細書に規定した工程ａ）の少なくとも１種の化合物と、本明細書に規定した工程ｂ）の少なくとも１種の化合物と、本明細書に規定した工程ｃ）の少なくとも１種の酵素との混合物である。少なくとも工程ａ）〜ｃ）の１つ、そして工程ｄ）及び工程ｅ）を繰り返す場合には、工程ａ）により提供される少なくとも１種の化合物は好ましくはその前のサイクルで提供されたものと異なるものであり、工程ｂ）により提供される少なくとも１種の化合物は好ましくはその前のサイクルで提供されたものと異なるものであり、工程ｃ）により提供される少なくとも１種の酵素は好ましくは前のサイクルで提供されたものと異なるものである。このような段階的な手続きは、制御可能な方法で複数のラウンド内で規定の一連の化合物の合理的な生成を可能にする。また、特定の成分の合理的な除外を提供することができる。そのような種々の化合物を得るためには、化合物及び／又は酵素は、同時に又は連続的に添加してもよく、好ましくは化合物及び／又は酵素は、一工程で同時に及び／又は異なる複数の工程で連続的に添加してもよい。
【０１３８】
あるいは、本明細書に規定した工程ａ）の少なくとも１種の化合物と、本明細書に規定した工程ｂ）の少なくとも１種の化合物と、本明細書に規定した工程ｃ）の少なくとも１種の酵素との混合物は、１以上の工程を繰り返すことなく、一工程で培養してもよい。このような手続きにより、最大の種類の可能な生成物に至ることがあるため、特定の状況において好ましい場合がある。
【０１３９】
本明細書に規定する本発明の方法は、好ましくは、工程ｃ）により酵素を添加する時、及び、混合物を培養する時（工程ｅ））、工程ａ）で提供される万能ドナー及び工程ｂ）で提供されるアクセプターに基づいて化合物の生成に至る。これらの工程の任意の又は必須の繰り返し、及び任意の水素化分解反応を上述したように行ってもよい。好ましくは、本明細書に開示した本発明の方法は、単一人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体若しくは前駆体、あるいは、２種以上の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はその誘導体若しくは前駆体を含む多様な混合物をもたらす。その単一化合物は、以下に規定されるものであってもよい：
・一般式１で表される化合物及びその塩、
【０１４０】
【化２２】
2014513985.tif 000029
【０１４１】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基であり、
Ｒ１はフコシル又はＨであり、
Ｒ２はＮ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基から選択され、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基は、１以上のＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１以上のラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基を有してもよく、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ３はＨ、又は、１以上のＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１以上のラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよい）
【０１４２】
・一般式２で表される化合物及びその塩、
【０１４３】
【化２３】
2014513985.tif 000030
【０１４４】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基であり、
Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ４は独立にそれぞれシアリル又はＨであり、
但し、前記Ｒ１又はＲ４基のうち少なくとも１つはＨではない）
【０１４５】
・一般式３で表される化合物及びその塩、及び／又は
【０１４６】
【化２４】
2014513985.tif 000031
【０１４７】
（式中、Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ２はＮ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基から選択され、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基は、１以上のＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１以上のラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基を有してもよく、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ３はＨ、又は、１以上のＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１以上のラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよい）
【０１４８】
・一般式４で表される化合物及びその塩
【０１４９】
【化２５】
2014513985.tif 000032
【０１５０】
（式中、Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ４は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
但し、前記Ｒ１又はＲ４基のうち少なくとも１つはＨではない）
【０１５１】
更により好ましくは、本発明の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を生成する方法は、好ましくは培養する工程ｅ）及び／又は工程ｆ）若しくはｇ）による繰り返しの後、上述したように単一人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）、あるいは、２種以上の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）誘導体を含む混合物をもたらし、式１及び２で表される化合物は更に下記一般式１ａ、１ｂ又は２、及びその塩で表される。
【０１５２】
【化２６】
2014513985.tif 000033
【０１５３】
（式中、Ｒ、Ｒ１及びＲ４は上述したとおりであり、
Ｒ２ａは１つのＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１つのラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ３はＨ、又は、ラクト−Ｎ−ビオシル基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ２ｂはシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−ビオシル基であり、
Ｒ３ｂはＨ、又は、１又は２つのＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１つのラクト−Ｎ−ビオシル基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよい）
【０１５４】
特に好ましくは、上述した本発明の生成する方法により得られた化合物は、その結合及び修飾に特徴を有する。好ましくは、培養する工程ｅ）及び／又は工程ｆ）若しくはｇ）による繰り返しの後に本発明の方法により得られる化合物、好ましくは下記一般式１ａ及び１ｂで表される化合物は、以下の特徴を有する：
・一般式１ａにおけるＲ２ａのグリコシル残基におけるＮ−アセチル−ラクトサミニル基が、別のＮ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している、
・一般式１ａにおけるＲ２ａのグリコシル残基におけるラクト−Ｎ−ビオシル基が、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している、
・一般式１ａにおけるＲ３ａのグリコシル残基におけるラクト−Ｎ−ビオシル基が、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している、
・一般式１ｂにおけるＲ３ｂのグリコシル残基におけるＮ−アセチル−ラクトサミニル基が、別のＮ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３又は１−６グリコシド間結合で結合している、
・一般式１ｂにおけるＲ３ｂのグリコシル残基におけるラクト−Ｎ−ビオシル基が、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している。
【０１５５】
好ましくは、本発明の方法により、培養工程ｅ）及び／又は工程ｆ）及びｇ）による繰り返しの後に得られる化合物は、一般式１ａが、１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−ネオテトラオース、パラ−ラクト−Ｎ−ヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−オクタオース及びラクト−Ｎ−ネオオクタオースのＲ−グリコシドを表わし、一般式１ｂが、１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−オクタオース、イソ−ラクト−Ｎ−オクタオース、ラクト−Ｎ−デカオース及びラクト−Ｎ−ネオデカオースのＲ−グリコシドを表わすことを特徴とする。
【０１５６】
好ましくは、培養工程ｅ）及び／又は工程ｆ）若しくはｇ）による工程の繰り返しの後に本発明の方法により得られる化合物は、以下の特徴を有する：
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又はラクト−Ｎ−ビオシル基に結合しているフコシル残基が以下により結合している：
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のガラクトースが１−２グリコシド間結合で、及び／又は
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のＮ−アセチル−グルコサミンが１−４グリコシド間結合で、及び／又は
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基のＮ−アセチル−グルコサミンが１−３グリコシド間結合で、
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又はラクト−Ｎ−ビオシル基に結合しているシアリル残基が以下により結合している：
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のガラクトースが２−３グリコシド間結合で、及び／又は
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のＮ−アセチル−グルコサミンが２−６グリコシド間結合で、及び／又は
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基のガラクトースが２−６グリコシド間結合で。
【０１５７】
更に好ましいアスペクトによれば、本発明の方法により得られる化合物、好ましくは式１若しくは２、又は、一般下位式（general subformulae）１ａ、１ｂ又は２で表される化合物は、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、３’−シアリル−３−フコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ＬＮＦＰ−Ｉ、ＬＮＦＰ−ＩＩ、ＬＮＦＰ−ＩＩＩ、ＬＮＦＰ−Ｖ、ＬＳＴ−ａ、ＬＳＴ−ｂ、ＬＳＴ−ｃ、ＦＬＳＴ−ａ、ＦＬＳＴ−ｂ、ＦＬＳＴ−ｃ、ＬＮＤＦＨ−Ｉ、ＬＮＤＦＨ−ＩＩ、ＬＮＤＦＨ−ＩＩＩ、ＤＳ−ＬＮＴ、ＦＤＳ−ＬＮＴ  Ｉ及びＦＤＳ−ＬＮＴ  ＩＩのＲ−グリコシド、またはその塩からなる群より選択することができる。これらの化合物のコア構造を下記表６に示す。Ｒ−グリコシドはアルファ又はベータ−アノマーであってもよい。好ましくは、該Ｒ−グリコシドはベータ−アノマーである。
【０１５８】
【表６】
2014513985.tif 000034
【０１５９】
最も好ましくは、本発明のＨＭＯを生成する方法により得られる化合物、好ましくは式１若しくは２、又は、一般下位式１ａ、１ｂ若しくは２で表される化合物は、Ｒがベンジルである化合物又はその塩から選択されてもよい。
【０１６０】
本発明の方法の更に特定のアスペクトによれば、本発明の方法により得られる化合物、好ましくは式１若しくは２、又は、一般下位式１ａ、１ｂ若しくは２、又は、一般下位式１ａ、１ｂ若しくは２のいずれかで表される化合物は、任意に、工程ｅ）による培養及び／又は工程ｆ）による更なる繰り返しに続き、水素化分解反応させてもよく、その結果、一般式３及び４で表されるＨＭＯが形成される。
【０１６１】
同様に好ましくは、本発明の人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を生成する方法は、好ましくは培養する工程ｅ）及び／又は工程ｆ）若しくはｇ）による繰り返しの後、上述した人乳オリゴ糖をもたらし、式３及び４で表される化合物は、更に一般式３ａ、３ｂ又は４及びその塩で表される。
【０１６２】
【化２７】
2014513985.tif 000035
【０１６３】
（式中、Ｒ１及びＲ４は上述したとおりであり、
Ｒ２ａは１つのＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１つのラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ３はＨ、又は、ラクト−Ｎ−ビオシル基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ２ｂはシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−ビオシル基であり、
Ｒ３ｂはＨ、又は、１又は２つのＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１つのラクト−Ｎ−ビオシル基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよい）
【０１６４】
特に好ましくは、上述した本発明の生成する方法により得られた化合物は、その結合及び修飾に特徴を有する。好ましくは、本発明の方法により、培養する工程ｅ）及び／又は工程ｆ）若しくはｇ）による繰り返しの後に得られる化合物、好ましくは一般式３ａ又は３ｂで表される化合物は、以下の特徴を有する：
・一般式３ａにおけるＲ２ａのグリコシル残基におけるＮ−アセチル−ラクトサミニル基が、別のＮ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している、
・一般式３ａにおけるＲ２ａのグリコシル残基におけるラクト−Ｎ−ビオシル基が、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している、
・一般式３ａにおけるＲ３ａのグリコシル残基におけるラクト−Ｎ−ビオシル基が、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している、
・一般式３ｂにおけるＲ３ｂのグリコシル残基におけるＮ−アセチル−ラクトサミニル基が、別のＮ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３又は１−６グリコシド間結合で結合している、
・一般式３ｂにおけるＲ３ｂのグリコシル残基におけるラクト−Ｎ−ビオシル基が、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している。
【０１６５】
好ましくは、本発明の方法により、培養工程ｅ）及び／又は工程ｆ）若しくはｇ）による繰り返しの後に得られる化合物は、一般式３ａが、１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−ネオテトラオース、パラ−ラクト−Ｎ−ヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−オクタオース及びラクト−Ｎ−ネオオクタオースを表わし、一般式３ｂが、１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−オクタオース、イソ−ラクト−Ｎ−オクタオース、ラクト−Ｎ−デカオース及びラクト−Ｎ−ネオデカオースを表わすことを特徴とする。
【０１６６】
好ましくは、本発明の方法により、培養工程ｅ）及び／又は工程ｆ）若しくはｇ）による繰り返しの後に得られる化合物は、以下の特徴を有する：
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又はラクト−Ｎ−ビオシル基に結合しているフコシル残基が以下により結合している：
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のガラクトースに１−２グリコシド間結合で、及び／又は
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のＮ−アセチル−グルコサミンに１−４グリコシド間結合で、及び／又は
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基のＮ−アセチル−グルコサミンに１−３グリコシド間結合で、
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又はラクト−Ｎ−ビオシル基に結合しているシアリル残基が以下により結合している：
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のガラクトースに２−３グリコシド間結合で、及び／又は
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のＮ−アセチル−グルコサミンに２−６グリコシド間結合で、及び／又は
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基のガラクトースに２−６グリコシド間結合で。
【０１６７】
更に好ましいアスペクトによれば、本発明のＨＭＯを生じさせる方法により得られる化合物、好ましくは一般下位式３ａ、３ｂ又は４で表される化合物は、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、３’−シアリル−３−フコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ＬＮＦＰ−Ｉ、ＬＮＦＰ−ＩＩ、ＬＮＦＰ−ＩＩＩ、ＬＮＦＰ−Ｖ、ＬＳＴ−ａ、ＬＳＴ−ｂ、ＬＳＴ−ｃ、ＦＬＳＴ−ａ、ＦＬＳＴ−ｂ、ＦＬＳＴ−ｃ、ＬＮＤＦＨ−Ｉ、ＬＮＤＦＨ−ＩＩ、ＬＮＤＦＨ−ＩＩＩ、ＤＳ−ＬＮＴ、ＦＤＳ−ＬＮＴ  Ｉ及びＦＤＳ−ＬＮＴ  ＩＩ、またはその塩からなる群より選択することができる。これらの化合物のコア構造を表６に示す。
【０１６８】
同様に好ましくは、培養する工程ｅ）及び／又は工程ｆ）若しくはｇ）による繰り返しの後、本発明の方法により得られる化合物は、上述したトランスグリコシダーゼ活性及び／又はグリコシンターゼ活性を含む少なくとも１種の酵素の活性に依って得られる。そのような酵素は、本発明の方法を用いてＨＭＯを生成する間に行われる望ましい結合又は修飾に依って選択してもよい。
【０１６９】
上述した野生型又は操作されたフコシダーゼを本発明において使用することができ、トランスフコシダーゼ活性を表すこと、及びα，１−２、α，１−３及び／又はα，１−４レギオ選択性を示すことが、本発明においてターゲットとしていることである。そのような野生型又は操作されたフコシダーゼは、好ましくはトランスフコシダーゼ活性を表し、フコシル残基の以下への転移を触媒する：
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のガラクトースへα，１−２グリコシド間結合で、及び／又は
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のＮ−アセチル−グルコサミンへα，１−４グリコシド間結合で、及び／又は
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基のＮ−アセチル−グルコサミンへα，１−３グリコシド間結合で。
【０１７０】
そのような結合は、野生型又は操作されたフコシダーゼを用いる場合には、本発明の方法、及び本発明の化合物において非常に好ましい。
【０１７１】
更に、上述した野生型又は操作されたシアリダーゼは本発明に用いることができ、トランス−シアリダーゼ活性を表し、α，２−３及び／又はα，２−６レギオ選択性を示す。そのような結合が好ましくは本発明においてターゲットとしている。そのような野生型又は操作されたシアリダーゼは、好ましくはトランス−シアリダーゼ活性を表し、シアリル残基の以下への転移を触媒する：
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のガラクトースへα，２−３グリコシド間結合で、及び／又は
・ラクト−Ｎ−ビオシル基のＮ−アセチル−グルコサミンへα，２−６グリコシド間結合で、及び／又は
・Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基のガラクトースへα，２−６グリコシド間結合で。
【０１７２】
そのような結合は、野生型又は操作されたシアリダーゼを用いる場合には、本発明の方法、及び本発明の化合物において非常に好ましい。
【０１７３】
更に、トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を表し、β，１−３レギオ選択性を示す、上述した野生型又は操作されたラクト−Ｎ−ビオシダーゼを本発明において用いてもよい。そのような野生型又は操作されたラクト−Ｎ−ビオシダーゼは、好ましくはトランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を表し、ラクト−Ｎ−ビオシル残基のＮ−アセチル−ラクトサミニル基への１−３グリコシド間結合による転移を触媒し、本発明はこれをターゲットとする。そのような結合は、野生型又は操作されたラクト−Ｎ−ビオシダーゼを用いる場合には、本発明の方法、及び本発明の化合物において非常に好ましい。
【０１７４】
最後に、上述した野生型又は操作されたグリコシダーゼは本発明に用いることができ、トランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性を表し、β，１−３及び／又はβ，１−６レギオ選択性を示し、本発明はこれをターゲットとする。そのような野生型又は操作されたグリコシダーゼは好ましくはトランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ活性を表し、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基の別のＮ−アセチル−ラクトサミニル基への１−３又は１−６グリコシド間結合による転移を触媒する。そのような結合は、野生型又は操作されたＮ−アセチルラクトサミニダーゼを用いる場合には、本発明の方法、及び本発明の化合物において非常に好ましい。
【０１７５】
本発明の方法の更に特定のアスペクトによれば、本発明の方法により得られる化合物、好ましくは式１、２、３若しくは４、又は、一般下位式１ａ、１ｂ若しくは２、又は、一般下位式３ａ、３ｂ若しくは４のいずれかで表される化合物は、好ましくは結晶化又は沈澱により、任意に精製反応させてもよい。
【０１７６】
本発明の方法の更に特定のアスペクトによれば、本発明の方法により得られる化合物、好ましくは式１、２、３若しくは４、又は、一般下位式１ａ、１ｂ若しくは２、又は、一般下位式３ａ、３ｂ若しくは４のいずれかで表される化合物は、任意に噴霧乾燥させてもよい。
【０１７７】
更に特定のアスペクトにおいて、本発明の方法により得られる化合物は、１以上の天然由来のＨＭＯ  Ｒ−グリコシド、好ましくは式１若しくは２、又は、一般下位式１ａ、１ｂ若しくは２で表される化合物、又は、１以上の天然由来のＨＭＯ、好ましくは一般式３若しくは４、又は、一般下位式３ａ、３ｂ若しくは４で表される化合物であってもよい。天然型ＨＭＯはTADASU URASHIMA et al, MILK OLIGOSACCHARIDES, Nova Biomedical Books, New York, 2011, ISBN： 978−1−61122−831−1, Table 4 in pp. 14−25に列挙されている。
【０１７８】
更に最も特定のアスペクトにおいて、本発明の方法により得られる化合物は、ベンジルで誘導化されているＨＭＯであってもよい。
【０１７９】
更に本発明の方法の特定のアスペクトにおいて、本発明の方法により得られる化合物、好ましくは式１若しくは２、又は、一般下位式１ａ、１ｂ若しくは２のいずれかで表される単一化合物又は２種以上の化合物の混合物は、任意に、水素化分解反応されてもよく、その結果、一般式３及び４で表される単一ＨＭＯ又は２種以上のＨＭＯの混合物が形成される。
【０１８０】
任意の水素化分解の工程によれば、工程ｅ）、ｆ）又はｇ）後の式１若しくは２、又は、一般下位式１ａ、１ｂ若しくは２のいずれかで表される単一化合物又は２種以上の化合物の混合物は、例えば、本明細書に開示しているように水素化分解反応させてもよい。本発明において、任意の水素化分解の工程は、好ましくは天然由来の裸のＨＭＯ（例えば上述した式で表れている）を得るため、及び、好ましくはベンジル基など可能性のある保護基を除去するために行われる。
【０１８１】
触媒水素化分解は、通常、プロトン性溶媒又はプロトン性溶媒の混合液中で発生する。プロトン性溶媒は、水、酢酸またはＣ１−Ｃ６アルコールからなる群より選択することができる。１以上のプロトン性溶媒と、該プロトン性溶媒と部分的あるいは完全な混和性を有する１以上の適切な非プロトン性有機溶媒の混合液も使用することができる（例えば、ＴＨＦ、ジオキサン、酢酸エチル、アセトン等）。水、１以上のＣ１−Ｃ６アルコール、又はそれらの混合液は、溶媒系として好ましく用いられる。炭水化物誘導体を含有する溶液は適切ないかなる濃度であってもよく、炭水化物誘導体と選択した溶媒との懸濁液もまた使用することができる。反応混合液は１０〜１００℃の温度範囲内、好ましくは２０〜５０℃で、１〜５０バールの絶対圧（１００〜５０００ｋＰａ）の水素雰囲気下、触媒の存在下で反応が完了するまで撹拌する。該触媒としては、例えば、パラジウム、ラネーニッケル、又はその他の適切な金属触媒が挙げられ、好ましくはチャコール担持パラジウム又はパラジウムブラックが挙げられる。また、水素がシクロヘキセン、シクロヘキサジエン、ギ酸又はギ酸アンモニウムからその場（in situ）で発生する場合は、移動水素化分解も行うことができる。また、有機又は無機塩基又は酸及び／又は塩基性又は酸性イオン交換樹脂を添加し、水素化分解の反応速度を向上することも可能である。ハロゲン置換基が前駆体の置換ベンジル部分上に存在する、及び／又は、マンノサミン塩基の形成が望ましい場合、塩基性物質を用いることが特に好ましい。好ましい有機塩基としてはトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、アンモニア、カルバミン酸アンモニウム、及びジエチルアミン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。マンノサミン塩が目的生成物である場合には、有機又は無機酸が共溶媒又は添加剤として好ましく用いられる。好ましい酸としてはギ酸、酢酸、プロピオン酸、クロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、ＨＣｌ、ＨＢｒ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。上述した条件により簡易で、便利でデリケートな溶媒の除去が可能であり、純度の高いＨＭＯの混合物又はブレンドが得られる。
【０１８２】
したがって、本発明の更なるアスペクトは、単一化合物又は２種以上の化合物の混合物の提供に関し、該化合物は一般式１及びその塩、又は、一般式２及びその塩で表される。
【０１８３】
【化２８】
2014513985.tif 000036
【０１８４】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基であり、
Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ２はＮ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基から選択され、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基は、１以上のＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１以上のラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基を有してもよく、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ３はＨ、又は、１以上のＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１以上のラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
但し、単独で提供される場合には前記化合物はＬＮｎＴ  Ｒ−グリコシド又はＬＮＴベンジルグリコシドではない）
【０１８５】
【化２９】
2014513985.tif 000037
【０１８６】
（式中、Ｒは水素化分解により除去可能な基であり、
Ｒ１は独立にそれぞれフコシル又はＨであり、
Ｒ４は独立にそれぞれシアリル又はＨであり、
但し、前記Ｒ１又はＲ４基のうち少なくとも１つはＨではなく、単独で提供される場合には前記化合物は３’−シアリルラクトースベンジルグリコシドナトリウム塩又は６’−シアリルラクトース  Ｒ−グリコシドではない）
【０１８７】
更により好ましくは、本発明は、単一人乳オリゴ糖誘導体、又は、２種以上の人乳オリゴ糖(ＨＭＯ)誘導体を含む多様な混合物の提供に関し、上記一般式１及び２で表される化合物は更に、一般式１ａ、１ｂ又は２及びその塩で表される。
【０１８８】
【化３０】
2014513985.tif 000038
【０１８９】
（式中、Ｒ、Ｒ１及びＲ４は上述したとおりであり、
Ｒ２ａは１つのＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１つのラクト−Ｎ−ビオシル基を含むグリコシル残基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ３ａはＨ、又は、ラクト−Ｎ−ビオシル基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよく、
Ｒ２ｂはシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−ビオシル基であり、
Ｒ３ｂはＨ、又は、１又は２つのＮ−アセチル−ラクトサミニル基及び／又は１つのラクト−Ｎ−ビオシル基で任意に置換されたＮ−アセチル−ラクトサミニル基であり、該Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基及びラクト−Ｎ−ビオシル基はそれぞれ１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で置換されてもよい）
【０１９０】
特に好ましくは、上述した化合物は、その結合及び修飾に特徴を有する。好ましくは、一般式１ａ及び１ｂで表される化合物は、以下の特徴を有する：
・一般式１ａにおけるＲ２ａのグリコシル残基におけるＮ−アセチル−ラクトサミニル基が、別のＮ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している、
・一般式１ａにおけるＲ２ａのグリコシル残基におけるラクト−Ｎ−ビオシル基が、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している、
・一般式１ａにおけるＲ３ａのグリコシル残基におけるラクト−Ｎ−ビオシル基が、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している、
・一般式１ｂにおけるＲ３ｂのグリコシル残基におけるＮ−アセチル−ラクトサミニル基が、別のＮ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３又は１−６グリコシド間結合で結合している、
・一般式１ｂにおけるＲ３ｂのグリコシル残基におけるラクト−Ｎ−ビオシル基が、Ｎ−アセチル−ラクトサミニル基に１−３グリコシド間結合で結合している。
【０１９１】
好ましくは、一般式１ａで表される化合物は、１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−ネオテトラオース、パラ−ラクト−Ｎ−ヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−オクタオース及びラクト−Ｎ−ネオオクタオースのＲ−グリコシドを表し、一般式１ｂで表される化合物は、１以上のシアリル残基及び／又はフコシル残基で任意に置換されたラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−オクタオース、イソ−ラクト−Ｎ−オクタオース、ラクト−Ｎ−デカオース及びラクト−Ｎ−ネオデカオースのＲ−グリコシドを表す。
【０１９２】
更に好ましいアスペクトによれば、上述した化合物は、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、３’−シアリル−３−フコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ＬＮＦＰ−Ｉ、ＬＮＦＰ−ＩＩ、ＬＮＦＰ−ＩＩＩ、ＬＮＦＰ−Ｖ、ＬＳＴ−ａ、ＬＳＴ−ｂ、ＬＳＴ−ｃ、ＦＬＳＴ−ａ、ＦＬＳＴ−ｂ、ＦＬＳＴ−ｃ、ＬＮＤＦＨ−Ｉ、ＬＮＤＦＨ−ＩＩ、ＬＮＤＦＨ−ＩＩＩ、ＤＳ−ＬＮＴ、ＦＤＳ−ＬＮＴ  Ｉ及びＦＤＳ−ＬＮＴ  ＩＩのＲ−グリコシド、またはその塩からなる群より選択することができる。前記Ｒ−グリコシドはアルファ又はベータ−アノマーであってもよい。好ましくは、該Ｒ−グリコシドはベータ−アノマーであり、より好ましくは、Ｒはベンジルである。
【０１９３】
更なる形態によれば、本発明の方法は更に、好ましくは本明細書に記載されているように、培養工程又は水素化分解工程後に得られた化合物を摂取製品（consumable product）に添加する工程を含む。摂取製品は、好ましくは医薬製剤又は栄養製剤の少なくとも１つであり、好ましくは液体又は固体である。他の形態によれば、本発明の方法は更に、培養工程で得られた化合物に、医薬上許容しうる担体を添加する工程、及び／又は、プレバイオティクスを添加する工程を含む。
【０１９４】
第２のアスペクトによれば、本発明はまた、本明細書に開示した本発明の方法により得られた又は得られる化合物、特に上述したＨＭＯの混合物を提供する。
【０１９５】
第２のアスペクトの更なる形態によれば、本発明は、本明細書に開示した本発明の方法により得られた又は得られる化合物（好ましくは化合物の混合物、より好ましくはＨＭＯの混合物）を提供する。本発明において、本明細書に開示した本発明の方法により得られた又は得られる化合物の混合物は、上述したように、少なくとも２〜１０、２〜１０、２〜２０、２〜２０、２〜１００、２〜２００種の、或いは更に多くの異なる化合物の混合物であることが好ましい。そのような化合物は、限定されることなく、式１、２、３若しくは４、又は、部分式（subformulae）のいずれに規定した化合物、又は、上述した選択肢から選択することができる。
【０１９６】
第３のアスペクトによれば、本発明は、また、本発明において例えばアクセプターとして利用することができる化合物、及び、本発明のＨＭＯを生じさせる方法で得られる化合物を提供する。
【０１９７】
また、本発明は、ここで定義する化合物の塩を提供する又は利用する。そのような塩は、好ましくは塩の形態で少なくとも１つのシアリル残基を含有する一般式１〜４又はその部分式で表される化合物の塩から選択される（一般式１〜４又はその下位式（subformulae）に含まれるシアリル化オリゴ糖の負電荷を有する酸残基と、１以上のカチオンとからなる、いかなる化学量論比の結合イオン対）。本明細書の文脈で用いられているカチオンは、正電荷を有する原子又は分子である。該カチオンは無機カチオンでも有機カチオンでもよい。好ましい無機カチオンにはアンモニウムイオン、アルカリ金属、アルカリ土類金属及び遷移金属イオンがある。より好ましくはＮａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋、Ｆｅ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋及びＣｕ２＋であり、最も好ましくはＫ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋、Ｆｅ２＋及びＺｎ２＋である。正に帯電した塩基性有機化合物は関連性のある有機カチオンであってもよい。このような正電荷を帯びたカウンターパートは、好ましくはジエチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、イミダゾール、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ベンジルアミン、エチレンジアミン、メグルミン、ピロリジン、コリン、トリス−（ヒドロキシメチル）−メチルアミン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピロリジン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペリジン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン又はＬ−リジン単位を有するオリゴペプチド、又はＮ末端上に遊離アミノ基を有するオリゴペプチド等が挙げられ、これらはすべてプロトン化されたものである。このような塩の形成は安定性、添加剤との適合性、溶解性及び結晶形性能等の複合分子全般の性質の改変に用いることができる。
【０１９８】
第３のアスペクトの特定の形態によれば、本明細書に記載の化合物は、好ましくは、ＲがＨではない場合、更により好ましくは、Ｒがベンジルである場合に、例えば本明細書に開示されているように水素化分解反応させてもよい。このような水素化分解反応は、上述したように行われることが好ましい。好ましくは、Ｒは本明細書に規定したもので、上述したように水素化分解反応において開裂してもよい。
【０１９９】
第３のアスペクトの更なる形態において、本明細書に開示した本発明の方法により得られた又は得られる化合物若しくは化合物の混合物、より好ましくはＨＭＯの混合物、又は、本明細書に開示したいずれの更なる化合物は、摂取製品の調製、好ましくは医薬組成物、栄養製剤若しくは栄養補助食品の調製に用いることができる。本明細書に開示した本発明の方法により得られた又は得られる化合物若しくは化合物の混合物、より好ましくはＨＭＯの混合物は、特に新生児の免疫システムの向上及び成熟に効果的であり、インフルエンザなどウイルス感染の二次感染に対する予防効果がある。本明細書に開示した本発明の方法により得られた又は得られる化合物若しくは化合物の混合物、より好ましくはＨＭＯの混合物の、プレバイオティックとしての使用は、幼児の初期ビフィドジェニック腸内微生物（early bifidogenic intestinal microbiota）の発達の促進、開発リスク又は小児アレルギー及び／又はぜんそくの低減、及び、幼児の下痢などの病原体感染の防止及び治療における、ラクトバチルス及びビフィドバクテリウム属などのプロバイオティクスの有用な効果及び効率を促進する。
【０２００】
第４のアスペクトにおいて、本発明は、本明細書に開示した本発明の方法により得られた又は得られる化合物若しくは化合物の混合物、より好ましくはＨＭＯの混合物、及び好ましくは医薬上許容しうる担体を含む医薬組成物を提供する。「医薬上許容しうる担体」は、これらに限定されないが、添加剤、アジュバント、賦形剤、および希釈剤（水、ゼラチン、タルク、糖類、デンプン、アラビアゴム、植物ガム、植物油、ポリアルキレングリコール、香味剤、保存剤、安定剤、乳化剤、潤滑剤、着色剤、充填剤、湿潤剤など）が含まれる。適切な担体は、この分野の標準的な参考書であるRemington's Pharmaceutical Sciencesの最新版に記載されている。投与のための剤形は、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、点滴剤、カプセル剤、注射剤、液剤、エリキシル剤、抽出物およびチンキ剤を含む。
【０２０１】
第５のアスペクトにおいて、本明細書に開示した本発明の方法により得られた又は得られる化合物若しくは化合物の混合物、より好ましくはＨＭＯの混合物を含む、食品又は飲料などの栄養製剤（nutritional formulation）が提供される。また、栄養製剤は食用の微量栄養素、ビタミンおよびミネラルを含んでもよい。このような成分の量は、製剤が正常で健康な幼児、子供、大人、または特別なニーズを持つ者（例えば代謝障害に苦しむ者）での使用を意図しているかどうかによって異なる場合がある。微量栄養素は、例えば食用油、脂肪または脂肪酸（ヤシ油、大豆油、モノグリセリド、ジグリセリド、パームオレイン、ヒマワリ油、魚油、リノール酸、リノレン酸など）、炭水化物（グルコース、フルクトース、スクロース、マルトデキストリン、スターチ、加水分解コーンスターチ等）、及び、カゼイン、大豆、ホエー又はスキムミルク、またはこれらのタンパク質の加水分解物由来のタンパク質（他のソース由来のタンパク質（インタクト又は加水分解された）も使用することができる）を含む。ビタミン類は、ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、葉酸、イノシトール及びニコチン酸からなる群より選択することができる。栄養製剤は、以下のミネラル及び微量元素を含んでもよい：ＣＡ、Ｐ、Ｋ、Ｎａ、Ｃｌ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｓｅ、Ｃｒ又はＩ。
【０２０２】
第５のアスペクトの全般の形態によれば、上述した栄養製剤は更に、１以上のプロバイオティクス（例えば、ラクトバクテリア、ビフィドバクテリウム属）、フルクトオリゴ糖及びガラクトオリゴ糖などのプレバイオティクス、カゼイン、大豆、ホエー又はスキムミルク由来のタンパク質、ラクトース、サッカロース、マルトデキストリン、デンプンまたはそれらの混合物などの炭水化物、脂質（例えば、パームオレイン、ヒマワリ油、ヒマワリ油）、及び、日常の食物に不可欠なビタミン類及びミネラルを含んでもよい。また、プロバイオティクスは、好ましくは、個人（好ましくは幼児、子供及び／又は成人）において所望の効果を達成するのに十分な量で栄養製剤に含まれる。
【０２０３】
好ましい実施形態において、上記で定義した栄養製剤は、乳児用調製粉乳である。本発明の文脈において、「乳児用ミルク」は、好ましくは、生後４〜６ヶ月または生後４〜１２ヶ月の乳児の特定の栄養的使用に意図された、それだけで乳幼児の栄養的要求を満たす食品をいう。それは、例えば、１以上のプロバイオティクビフィドバクテリウム属、フルクトオリゴ糖およびガラクトオリゴ糖などのプレバイオティクス、カゼイン、大豆、ホエー又はスキムミルク由来のタンパク質、ラクトース、サッカロース、マルトデキストリン、デンプンまたはそれらの混合物などの炭水化物、脂質（例えば、パームオレイン、ヒマワリ油、ヒマワリ油）、及び、日常の食物に不可欠なビタミン類及びミネラルを含有することができる。
【０２０４】
第６のアスペクトにおいて、栄養補助食品を提供することができる。そのような栄養補助食品は、上記栄養食品のための上記成分を含む（例えば、本明細書に開示した本発明の方法により得られた又は得られる化合物若しくは化合物の混合物、より好ましくはＨＭＯの混合物、ビタミン、ミネラル、微量元素および他の微量栄養素など）。栄養補助食品は、例えば、錠剤、カプセル剤、トローチ又は液体の形態でであってもよい。該栄養補助食品は、これに限定されないが、結合剤、コーティング、乳化剤、可溶化剤、カプセル化剤、皮膜形成剤、吸着剤、担体、充填剤、分散剤、湿潤剤、ゲル化剤、ゲル形成剤などから選択される従来の添加剤を含んでもよい。
【０２０５】
好ましい実施形態によれば、栄養補助食品は、本明細書に開示した本発明の方法により得られた又は得られる化合物若しくは化合物の混合物、より好ましくはＨＭＯの混合物の投与としての消化性健康機能性食品であり、消化系の健康に有益な効果を提供する。消化性健康機能性食品は、好ましくは、本明細書に開示した本発明の方法により得られた又は得られる化合物若しくは化合物の混合物、より好ましくはＨＭＯの混合物を、錠剤、カプセル、粉末等の形態で生理学的機能要素又は成分として利用した、消化系の健康を促進し、維持することを意図して使用される加工食品である。栄養補助食品（dietary supplement）、栄養補助食品（nutraceutical）、設計された食品、または健康製品など種々の用語もまた、消化性健康機能性食品をさしている。
【０２０６】
更なるアスペクトにおいて、本明細書に開示した本発明の方法により得られた又は得られる化合物若しくは化合物の混合物、より好ましくはＨＭＯの混合物は、食品、飲料、飼料などの栄養製剤、好ましくは乳児用調製粉乳、栄養補助食品、消化性健康機能性食品、好ましくは上述したこれらのものの調製に用いてもよい。栄養製剤は通常の方法で調製することができる。
【０２０７】
本発明の他のアスペクトによれば、一般式５’〜８’で表される本発明に用いるグリコシルドナーが提供され、
【０２０８】
【化３１】
2014513985.tif 000039
【０２０９】
（式中、Ｘ１はＡ基又はＢ基であり、
【０２１０】
【化３２】
2014513985.tif 000040
【０２１１】
（式中、Ｒａは独立にＨ又はアルキルであるか、又は、２つの隣接するＲａ基は＝Ｃ（Ｒｂ）２基（式中、ＲｂはＨ又はアルキルである）で表わされ、
Ｒｃは独立にアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ及びジアルキルアミノからなる群より選択される））
【０２１２】
及び／又は、下記式のいずれかの化合物、又は、上記及び下記いずれかの化合物の塩が提供される。
【０２１３】
【化３３】
2014513985.tif 000041
【０２１４】
（式中、ＲｄはＨ、アルキル及び−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅ（式中、ＲｅはＯＨ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、ジアルキルヒドラジノ又はトリアルキルヒドラジノである）からなる群より選択される）
【０２１５】
好ましい化合物において、Ｘ１はＡ基（式中、Ｒａは独立にＨ又はＣ１−６アルキル、好ましくはＨ又はメチル）である。これらの化合物は、高い水溶性を有するためグリコシル化／トランスグリコシル化反応に特に有益なドナーであり、グリコシル化後の脱離基はＵＶ検出法により容易に検出することができ、脱離基Ｘ１は果実の自然な香りを有し、食品産業で使用するときに規制の障害を引き起こさない。
【０２１６】
本発明において、特に明示されていない限り、選択し及び形態の種々の特徴は、適している場合には互いに組み合わせてもよい。
【０２１７】
好ましい形態を参照して本発明を説明したが、当然のことながら、本発明の範囲内において様々な変形を行ってもよい。
【０２１８】
本明細書において、他に明記のない限り、単語「又は（or）」は、述べられた条件の一方又は両方が満たされる場合に真値を返す演算子という意味で用いられており、これと対照的なのは、複数ある条件の中の１つだけ満たすことを要する「排他的ＯＲ（eｘclusive or）」という演算子である。単語「を含む（comprising）」は「を含む（including）」という意味で用いられているのであって、「からなる（consisting of）」ではない。上記で認めた全ての従来の教示は本明細書に参照することにより組み込まれる。本明細書における先に発行された文献のいかなる認識も、該文献の教示が本明細書の時点におけるオーストラリア又は他国の共通の一般知識であるという自白又は表明として捉えるべきではない。
【実施例】
【０２１９】
（実施例１）
トランスグリコシル化反応の一般的な手順：
ｐＨ５．０〜９．０の培養緩衝液中、適切なグリコシルドナー（例えば、一般式５〜１０の誘導体）と、グリコシルアクセプター（１０ｍＭ〜１Ｍ）とを含む溶液を、組換えグリコシダーゼ、α−トランスグリコシダーゼ又はα−グリコシンターゼ（例えば、α−フコシダーゼ、α−トランスフコシダーゼ、α−フコシンターゼ、α−シアリダーゼ、α−トランスシアリダーゼ、β−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ、β−トランス−ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ、β−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ又はβ−トランス−Ｎ−アセチルラクトサミニダーゼ）を用いて培養した。２０〜７０℃で反応混合液を撹拌した。反応の様々な時間で複数のサンプルを採取し、ｐＨ１０の１Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液を添加して反応を停止し、生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は／及び液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）又は／及び液体クロマトグラフタンデム型質量分析計（ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ）で分析した。完了後、酵素を変性させ、遠心分離させた。得られた溶液を減圧下で蒸発させた。凍結乾燥後、乾燥残渣を水に溶解し、生成物を、水を用いてバイオジェル・クロマトグラフィーで（Ｐ−２  Ｂｉｏｇｅｌ、１６ｘ９００ｍｍ）、又は逆相クロマトグラフィーで精製した。
【０２２０】
以下の組換え酵素をトランスグリコシル化反応で使用及びテストした：
トランスフコシダーゼＰ２５  テルモトガ・マリチマ（配列番号１参照）より  突然変異体Ｇ２２６Ｓ  Ｙ２３７Ｈ  Ｔ２６４Ａ  Ｌ３２２Ｐ含有；
トランスフコシダーゼＭ３  テルモトガ・マリチマ（配列番号１参照）より  突然変異体Ｙ２３７Ｈ  Ｙ２６７Ｆ  Ｌ３２２Ｐ含有
トランスシアリダーゼ  クルーズトリパノソーマ（配列番号１５、１６）より
フコシダーゼＢｌｏｎ＿２３３６  ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス  ＡＴＣＣ  １５６９７（配列番号５）より
【０２２１】
Osanjo et al. Biochemistry 46, 1022 (2007), Sela et al. Appl. Environ. Microbiol. 78, 795 (2012), Agusti et al. Glycobiology 14, 659 (2004)及びNeubacher et al. Org. Biomol. Chem. 3, 1551 (2005)に報告されているように、これらのトランスグリコシダーゼが大腸菌に産生された。精製したトランスグリコシダーゼを−２０℃〜＋４℃で保管した。
【０２２２】
（実施例２）
ｐ−ニトロフェニルシアロシドドナーを用いたシアリル化
一般的な手順：２３℃で２４時間、脱気培養緩衝液中（１．０ｍｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍｇ  ＢＳＡ、０．０２％ＮａＮ３）、２−Ｏ−（ｐ−ニトロフェニル）−α−Ｄ−シアロシド（７５μｍｏｌ）及び適切なシアリルアクセプター（３５μｍｏｌ）を含む溶液を、クルーズトリパノソーマ由来の組換えトランスシアリダーゼ（８０μｌ、１．３ｍｇ／ｍｌ）を用いて培養した。反応を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（ブタノール／酢酸／水＝５：２：２）でモニタリングした。完了後、酵素を変性させ、遠心分離させ、その後、上澄み液を凍結乾燥した。乾燥残渣を水に溶解し、水を用いてバイオジェル・クロマトグラフィーで（Ｐ−２  Ｂｉｏｇｅｌ、１６ｘ９００ｍｍ）又は逆相クロマトグラフィーで精製した。収率は４５〜８５％の範囲にあった。
【０２２３】
４−クロロベンジル３’−Ｏ−シアリル−β−ラクトシド
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ［ｐｐｍ］＝７．４６−７．４２（ｍ，４Ｈ，Ｈ（ａ／ｂ）ａｒｏｍ）；４．９１（ｄ，１Ｈ，ＣＨ２ａ−Ｂｎ）；４．７４（ｄ，１Ｈ，ＣＨ２ｂ−Ｂｎ）；４．５５−４．５２（ｍ，２Ｈ，Ｈ−１／Ｈ−１’）；４．１１（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３’）；２．７６（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３’’ｅｑ）；２．０４（ｓ，３Ｈ，ＣＯＣＨ３）；１．８１（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３’’ａｘ）．
Ｊ（ａ，ｂ）−Ｂｎ＝１１．８；Ｊ２’，３’＝９．９；Ｊ３’，４’＝２．９；Ｊ３’’ａｘ，３’’ｅｑ＝１２．４；Ｊ３’’ａｘ，４’’＝１２．１；Ｊ３’’ｅｑ，４’’＝４．５Ｈｚ．
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ［ｐｐｍ］＝１３５．２，１３３．５（ｑｕａｒｔ．  Ｃａｒｏｍ）；１３０．２（ＣＨａ−ａｒｏｍ）；１２８．６（ＣＨｂ−ａｒｏｍ）；１０２．６（Ｃ−１’）；１０１．１（Ｃ−１）；５１．７（Ｃ−５’’）；３９．６（Ｃ−３’’）；２２．０（ＣＯＣＨ３）．
【０２２４】
４−メチルベンジル３’−Ｏ−シアリル−β−ラクトシド
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ［ｐｐｍ］＝７．３６（ｄ，２Ｈ，Ｈ−ａａｒｏｍ）；７．２８（ｄ，２Ｈ，Ｈ−ｂａｒｏｍ）；４．８９（ｄ，１Ｈ，ＣＨ２ａ−Ｂｎ）；４．７２（ｄ，１Ｈ，ＣＨ２ｂ−Ｂｎ）；４．５４−４．５２（ｍ，２Ｈ，Ｈ−１／Ｈ−１’）；４．１２（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３’）；２．７６（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３’’ｅｑ）；２．３５（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−Ｔｏｌ）；２．０４（ｓ，３Ｈ，ＣＯＣＨ３），１．８１（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３’’ａｘ）．
Ｊ（ａ，ｂ）ａｒｏｍ＝７．９；Ｊ（ａ，ｂ）−Ｂｎ＝１１．５；Ｊ２’，３’＝９．９；Ｊ３’，４’＝３．０；Ｊ３’’ａｘ，３’’ｅｑ＝１２．５；Ｊ３’’，４’’＝１２．２；Ｊ３’’ｅｑ，４’’＝４．６Ｈｚ．
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ［ｐｐｍ］＝１３８．８，１３３．４（ｑｕａｒｔ．  Ｃａｒｏｍ）；１２９．３（ＣＨａ−ａｒｏｍ）；１２９．０（ＣＨｂ−ａｒｏｍ）；１０２．６（Ｃ−１’）；１００．９（Ｃ−１）；９９．８（Ｃ−２’’），５１．７（Ｃ−５’’）；３９．６（Ｃ−３’’）；２２．０（ＣＯＣＨ３）；２０．２（ＣＨ３−Ｔｏｌ）．
【０２２５】
２−ナフチルメチル３’−Ｏ−シアリル−β−ラクトシド
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ［ｐｐｍ］＝７．９９−７．９７（ｍ，４Ｈ，Ｈ−ａｒｏｍ）；７．６２−７．５９（ｍ，３Ｈ，Ｈ−ａｒｏｍ）；５．１０（ｄ，１Ｈ，ＣＨ２ａ−Ｂｎ）；４．９５（ｄ，１Ｈ，ＣＨ２ｂ−Ｂｎ）；４．６０（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１）；４．５３（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１’）；４．１２（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３’）；２．７７（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３’’ｅｑ）；２．０４（ｓ，３Ｈ，ＣＯＣＨ３）；１．８１（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３’’ａｘ）．
Ｊ（ａ，ｂ）−Ｂｎ＝１１．９；Ｊ１，２＝８．０；Ｊ１’，２’＝７．９；Ｊ２’，３’＝９．９；Ｊ３’，４’＝３．０；Ｊ３’’ａｘ，３’’ｅｑ＝１２．５；Ｊ３’’ａｘ，４’’＝１２．１；Ｊ３’’ｅｑ，４’’＝４．６Ｈｚ．
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ［ｐｐｍ］＝１２８．３，１２７．９，１２７．７，１２７．６，１２６．６，１２６．５（ＣＨａｒｏｍ）；１０２．６（Ｃ−１’）；１０１．１（Ｃ−１）；５１．７（Ｃ−５’’）；２２．０（ＣＯＣＨ３）．
【０２２６】
３−フェニルベンジル３’−Ｏ−シアリル−β−ラクトシド
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ［ｐｐｍ］＝７．７５−７．４４（ｍ，９Ｈ，Ｈ−ａｒｏｍ）；４．９９（ｄ，１Ｈ，ＣＨ２ａ−Ｂｎ）；４．８２（ｄ，１Ｈ，ＣＨ２ｂ−Ｂｎ）；４．５７（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１）；４．５３（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１’）；４．１３（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３’）；２．７８（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３’’ｅｑ）；２．０５（ｓ，３Ｈ，ＣＯＣＨ３）；１．８２（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３’’ａｘ）．
Ｊ（ａ，ｂ）−Ｂｎ＝１１．８；Ｊ１，２＝８．０；Ｊ１’，２’＝７．９；Ｊ２’，３’＝９．９；Ｊ３’，４’＝３．１；Ｊ３’’ａｘ，３’’ｅｑ＝１２．５；Ｊ３’’ａｘ，４’’＝１２．０；Ｊ３’’ｅｑ，４’’＝４．６Ｈｚ．
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ［ｐｐｍ］＝１４０．９，１４０．３，１３７．５（ｑｕａｒｔ．  Ｃａｒｏｍ）；１２９．４，１２９．２，１２７．９，１２７．８，１２７．１，１２７．０，１２６．９，（ＣＨａｒｏｍ）；１０２．７（Ｃ−１’）；１０１．２（Ｃ−１）；９９．６（Ｃ−２’’）；５１．８（Ｃ−５’’）；３９．７（Ｃ−３’’）；２２．１（ＣＯＣＨ３）．
【０２２７】
ベンジル３’’’−Ｏ−シアリル−β−ＬＮｎＴ
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：図３参照
【０２２８】
（実施例３）
ｐ−ニトロフェニルシアロシドドナーを用いたシアリル化
一般的な手順：１５℃で、培養緩衝液中（０．５ｍｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．０）、２−Ｏ−（ｐ−ニトロフェニル）−α−Ｄ−シアロシド（４７〜５１ｍＭ）及びベンジルβ−ＬＮＴ（２４〜３７ｍＭ）を含む溶液を、クルーズトリパノソーマ由来の組換えトランスシアリダーゼ（２１〜１０８μｇ／ｍｌ）を用いて培養した。３、６及び２４時間後にサンプルを採取し（各５０μｌ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。シアリル−β−ＬＮＴベンジルグリコシドの形成が検知された（転換率６５〜９５％）。
【０２２９】
（実施例４）
ｐ−ニトロフェニルシアロシドドナーを用いたシアリル化
一般的な手順：１５℃で、培養緩衝液中（０．５ｍｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．０）、２−Ｏ−（ｐ−ニトロフェニル）−α−Ｄ−シアロシド（５０ｍＭ）及び３−ＦＬ（２５〜５０ｍＭ）を含む溶液を、クルーズトリパノソーマ由来の組換えトランスシアリダーゼ（２１〜１０８μｇ／ｍｌ）を用いて培養した。３、６及び２４時間後にサンプルを採取し（各５０μｌ）、ＴＬＣで量的分析を行った。シアリル−フコシル−ラクトースの形成が検知された（中程度の転換率）。
【０２３０】
（実施例５）
ｐ−ニトロフェニルシアロシドドナーを用いたシアリル化
一般的な手順：１５℃で、培養緩衝液中（０．５ｍｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．０）、２−Ｏ−（ｐ−ニトロフェニル）−α−Ｄ−シアロシド（５０ｍＭ）及びＬＮＴ（２５〜５０ｍＭ）を含む溶液を、クルーズトリパノソーマ由来の組換えトランスシアリダーゼ（２１〜１０８μｇ／ｍｌ）を用いて培養した。３、６及び２４時間後にサンプルを採取し（各５０μｌ）、ＴＬＣで量的分析を行った。シアリル−ＬＮＴの形成が検知された（高い転換率）。
【０２３１】
（実施例６）
以下のトランスフコシダーゼを用いたフコシル化：
Ｐ２５  テルモトガ・マリチマ（配列番号１参照）より  突然変異体Ｇ２２６Ｓ  Ｙ２３７Ｈ  Ｔ２６４Ａ  Ｌ３２２Ｐ含有；
Ｍ３  テルモトガ・マリチマ（配列番号１参照）より  突然変異体Ｙ２３７Ｈ  Ｙ２６７Ｆ  Ｌ３２２Ｐ含有。
【０２３２】
一般的な手順：６０℃で（ドナーとしてフッ化フコシルを用いる場合は例外で、培養は３５℃で行われた）、脱気培養緩衝液中（０．５ｍｌ、５０ｍＭ  クエン酸塩／リン酸塩、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）、フコシルドナー及びアクセプターの溶液を、トランスフコシダーゼを用いて培養した。２１時間後にサンプルを採取し、ＨＰＬＣにより転換を判定した。
【０２３３】
結果：
Ｐ２５突然変異体：
２００ｍＭ  ２，５−ジメチル−４−オキソ−３−フラニルα−Ｌ−フコピラノシド，２００ｍＭ  ラクトース，転換率：６％  ２’−ＦＬ
５００ｍＭ  ２，５−ジメチル−４−オキソ−３−フラニルα−Ｌ−フコピラノシド，５００ｍＭ  ラクトース，転換率：９％  ２’−ＦＬ
５００ｍＭ  ２，５−ジメチル−４−オキソ−３−フラニルα−Ｌ−フコピラノシド，１０００ｍＭ  ラクトース，転換率：２２％  ２’−ＦＬ
２００ｍＭ  ２，５−ジメチル−４−オキソ−３−フラニルα−Ｌ−フコピラノシド，２００ｍＭ  ＬＮＴ，転換率：１３％  フコシル化ＬＮＴ（フコシル化の位置は判定せず）
５００ｍＭ  ２，５−ジメチル−４−オキソ−３−フラニルα−Ｌ−フコピラノシド，５００ｍＭ  ＬＮＴ，転換率：１０％  フコシル化ＬＮＴ（フコシル化の位置は判定せず）
【０２３４】
Ｍ３突然変異体：
２００ｍＭ  ２，５−ジメチル−４−オキソ−３−フラニルα−Ｌ−フコピラノシド，２００ｍＭ  ラクトース，転換率：１９％  ２’−ＦＬ
５００ｍＭ  ２，５−ジメチル−４−オキソ−３−フラニルα−Ｌ−フコピラノシド，１０００ｍＭ  ラクトース，転換率：３５％  ２’−ＦＬ
２００ｍＭ  ２，５−ジメチル−４−オキソ−３−フラニルα−Ｌ−フコピラノシド，２００ｍＭ  ＬＮＴ，転換率：１９％  フコシル化ＬＮＴ（フコシル化の位置は判定せず）
５００ｍＭ  ２，５−ジメチル−４−オキソ−３−フラニルα−Ｌ−フコピラノシド，５００ｍＭ  ＬＮＴ，転換率：２０％  フコシル化ＬＮＴ（フコシル化の位置は判定せず）
２００ｍＭ  フッ化フコシル，２００ｍＭ  ＬＮＴ，転換率：１０％  フコシル化ＬＮＴ（フコシル化の位置は判定せず）．
【０２３５】
（実施例７）
ｐ−ニトロフェニルシアロシドドナーを用いた複数アクセプターのシアリル化
プロトコル：
ｐＨ７．０の培養緩衝液中（トリス−ＨＣｌ、１００ｍＭ）、ドナーとしてｐＮＰ−α−ＮｅｕＡｃ（１５０ｍＭ）と、アクセプターとして３−フコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース及びラクト−Ｎ−ネオテトラオース（各５０ｍＭ）とを含む溶液を、クルーズトリパノソーマに由来する組換えトランスシアリダーゼを用いて培養した。３０℃で２４時間、該反応混合液を撹拌した。（ＳＦＬ、ＬＳＴａ、ＬＳＴｄ用）参照標準を用いて、生成物をＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳで分析した。
検出された生成物：
３’−シアリル−３−フコシルラクトース、ＬＳＴａ：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、シアリル化ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＳＴｄ）：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、ジシアリル化ラクト−Ｎ−テトラオース及び／又はジシアリル化ラクト−Ｎ−ネオテトラオース
正確な分子量をＬＣ−ＭＳにより確認した（１２９０［Ｍ＋Ｈ］＋，１３０７［Ｍ＋ＮＨ４］＋，１３２８［Ｍ＋Ｋ］＋）
【０２３６】
（実施例８）
ｐ−ニトロフェニルシアロシドをドナーとして用いた複数アクセプターのシアリル化
プロトコル：
ｐＨ７．０の培養緩衝液中（トリス−ＨＣｌ、１００ｍＭ）、ドナーとしてｐＮＰ−α−ＮｅｕＡｃ（１００ｍＭ）と、アクセプターとしてラクト−Ｎ−テトラオース−β−ＯＢｎ及びラクト−Ｎ−ネオテトラオース−β−ＯＢｎ（各５０ｍＭ）とを含む溶液を、クルーズトリパノソーマに由来する組換えトランスシアリダーゼを用いて培養した。３０℃で３０分間、該反応混合液を撹拌した。生成物をＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳで分析した。
【０２３７】
（実施例９）
複数ドナー及び酵素を用いたＬＮＴのグリコシル化
プロトコル：
第１のサイクルにおいて、ｐＨ７．０の培養緩衝液中（ＫＨＰＯ４、１００ｍＭ）、ドナーとしてα−Ｌ−フッ化フコシル（２００ｍＭ）と、アクセプターとしてラクト−Ｎ−テトラオース（２００ｍＭ）とを含む溶液を、テルモトガ・マリチマに由来する組換えトランスフコシダーゼＭ３を用いて培養した。３０℃で２４時間、該反応混合液を撹拌した。
【０２３８】
第２のサイクルにおいて、得られた反応混合液のｐＨを７．０に調整し、２００ｍＭのα−Ｌ−フッ化フコシル及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７由来の組換えフコシダーゼＢｌｏｎ＿２３３６を加えた後、３０℃で更に３０分間、該溶液を培養した。
【０２３９】
第３のサイクルにおいて、得られた反応混合液のｐＨを７．０に調整し、５０ｍＭのｐＮＰ−α−ＮｅｕＡｃ及びクルーズトリパノソーマ由来の組換えトランスシアリダーゼを加えた後、３０℃で更に２４時間、該溶液を培養した。ｐＨ１０の１Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液を添加して反応を停止し、生成物をＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＳ及びＬＣ−ＭＳ−ＭＳで分析した。
【０２４０】
ＬＣ−ＭＳの条件：
機器：ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ２０００  ｔａｎｄｅｍ  ＭＳ
イオン化モード：ポジティブモードのエレクトロスプレー
スキャンタイプ：Ｑ１ＭＳ
サンプル挿入モード：ＨＰＬＣ
カラム：ＴＳＫ  Ｇｅｌ  ａｍｉｄｅ８０（Ｔｏｓｏｈ、３μｍ、１５０ｘ４．６ｍｍ）
溶離液：１０ｍＭ  ギ酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ＝６）−アセトニトリド：３０％／７０％
流速：１ｍｌ／分  注入量：５μｌ
【０２４１】
結果：
【０２４２】
【表７】
2014513985.tif 000042
【０２４３】
（実施例１０）
複数ドナー及び酵素を用いたＬＮｎＴのグリコシル化
プロトコル：
第１のサイクルにおいて、ｐＨ７．０の培養緩衝液中（ＫＨＰＯ４、１００ｍＭ）、ドナーとしてα−Ｌ−フッ化フコシル（２００ｍＭ）と、アクセプターとしてラクト−Ｎ−テトラオース（２００ｍＭ）とを含む溶液を、テルモトガ・マリチマに由来する組換えトランスフコシダーゼＭ３を用いて培養した。３０℃で２４時間、該反応混合液を撹拌した。
【０２４４】
第２のサイクルにおいて、得られた反応混合液のｐＨを７．０に調整し、２００ｍＭのα−Ｌ−フッ化フコシル及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７由来の組換えフコシダーゼＢｌｏｎ＿２３３６を加えた後、３０℃で更に３０分間、該溶液を培養した。
【０２４５】
第３のサイクルにおいて、得られた反応混合液のｐＨを７．０に調整し、５０ｍＭのｐＮＰ−α−ＮｅｕＡｃ及びクルーズトリパノソーマ由来の組換えトランスシアリダーゼを加えた後、３０℃で更に２４時間、該溶液を培養した。ｐＨ１０の１Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液を添加して反応を停止し、生成物をＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＳ及びＬＣ−ＭＳ−ＭＳで分析した。
【０２４６】
結果（ＨＰＬＣ条件：実施例９を参照）
【０２４７】
【表８】
2014513985.tif 000043
【０２４８】
（実施例１１）
フコシル化反応
一般的な手順：２３℃で２４時間、脱気培養緩衝液中（ｐＨ５．０〜９．０）、適切なフコシルドナー（例えば、ｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−フコピラノシド、α−Ｌ−フッ化フコシル、２，５−ジメチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルα−Ｌ−フコピラノシド又は２’−Ｏ−フコシルラクトース）と、アクセプター（１０〜５００ｍｍｏｌ、ドナー／アクセプター比は５：１〜１：５）とを含む溶液を、組換えα−フコシダーゼ、α−トランスフコシダーゼ又はα−フコシンターゼを用いて培養した。２０〜７０℃で２４時間、反応混合液を撹拌した。反応の様々な時間で複数のサンプルを採取し、ｐＨ１０の１Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液を添加して反応を停止し、生成物をＴＬＣ及び／又はＨＰＬＣで分析した。完了後、酵素を変性させ、遠心分離させた。得られた溶液を減圧下で蒸発させた。凍結乾燥後、乾燥残渣を水に溶解し、生成物を、水を用いてバイオジェル・クロマトグラフィーで（Ｐ−２  Ｂｉｏｇｅｌ、１６ｘ９００ｍｍ）、又は逆相クロマトグラフィーで精製した。収率は２．５〜８５％の範囲であった。
【０２４９】
トランスフコシル化反応において用いた及びテストした組換え酵素：
Ｐ２５  テルモトガ・マリチマ（配列番号１参照）より  突然変異体Ｇ２２６Ｓ  Ｙ２３７Ｈ  Ｔ２６４Ａ  Ｌ３２２Ｐ含有；
Ｍ３  テルモトガ・マリチマ（配列番号１参照）より  突然変異体Ｙ２３７Ｈ  Ｙ２６７Ｆ  Ｌ３２２Ｐ含有。
【０２５０】
G. Osanjo et al. Biochemistry 46, 1022 (2007)に報告されているように、これらのトランスフコシダーゼは大腸菌において産生された。精製されたトランスフコシダーゼＰ２５及びＭ３をそれぞれ−２０℃又は＋４℃で保管した。
【０２５１】
酵素に最適な緩衝液：５０ｍＭのクエン酸／リン酸ナトリウム緩衝液及び１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝５．５
最適な温度：６０℃（但し、α−Ｌ−フコシルフルオライドアクセプターについては、温度は３５℃）
【０２５２】
ＬＣ−ＭＳの条件：
機器：ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ２０００  ｔａｎｄｅｍ  ＭＳ
イオン化モード：ポジティブモードのエレクトロスプレー
スキャンタイプ：Ｑ１ＭＳ
サンプル挿入モード：ＨＰＬＣ
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＨＩＬＩＣ  ２５０ｘ４．６ｍｍ
流れ：イソクラティック（水−アセトニトリル  ２２：７８）
流速：１ｍｌ／分  注入量：５μｌ
【０２５３】
ａ）アクセプター：Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−Ｂｎ
ドナー：ｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−フコピラノシド、α−Ｌ−フコシルフルオライド又は２，５−ジメチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルα−Ｌ−フコピラノシド
生成物：Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−Ｂｎ（２’−Ｏ−フコシルラクトースから化学的手段により得た標準サンプルと比較して同定した）
特徴的な１Ｈ  ＮＭＲピーク（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：７．４１−７．２５（ｍ、５Ｈ、芳香族）、５．２０（ｄ、１Ｈ、Ｊ１”，２”＝２Ｈｚ、Ｈ−１”）、４．８２及び４．５９（ＡＢｑ、２Ｈ、Ｊｇｅｍ＝１２．３Ｈｚ、−ＣＨ２Ｐｈ）、４．３２（ｄ、１Ｈ、Ｊ１’，２’＝７．３１Ｈｚ、Ｈ−１’）、４．２８（ｄ、１Ｈ、Ｊ１，２＝７．７９Ｈｚ、Ｈ−１）、１．０５（ｄ、１Ｈ、Ｊ５”，６”＝６．４３Ｈｚ、Ｈ−６”）．
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１３７．９７、１２８．１５、１２８．１５、１２７．５８、１２７．５８及び１２７．４３（芳香族）、１０１．８６、１００．９４及び１００．２０（Ｃ−１、Ｃ−１’及びＣ−１”）、７７．６８、７６．７８、７５．３６、７５．３３、７４．７０、７３．７９、７３．４５、７１．６０、６９．７２、６９．６９、６８．７４、６８．２０、６６．３８、６０．２３及び５９．８１（Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−４、Ｃ−５、Ｃ−６、Ｃ−２’、Ｃ−３’、Ｃ−４’、Ｃ−５’、Ｃ−６’、Ｃ−２”、Ｃ−３”、Ｃ−４”、Ｃ−５”及びＣＨ２Ｐｈ）、１６．４７（Ｃ−６”）．
【０２５４】
ｂ）アクセプター：Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−ＣＨ２−（４−ＮＯ２−Ｐｈ）
ドナー：ｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−フコピラノシド又は２，５−ジメチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルα−Ｌ−フコピラノシド
生成物：Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−ＣＨ２−（４−ＮＯ２−Ｐｈ）（２’−Ｏ−フコシルラクトースから化学的手段により得た標準サンプルと比較して同定した）
特徴的な１Ｈ  ＮＭＲピーク（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：８．２０及び７．６８（各ｄ、４Ｈ、芳香族）、５．０４（ｄ、１Ｈ、Ｊ１”，２”＝２Ｈｚ、Ｈ−１”）、４．９７及び４．７６（ＡＢｑ、２Ｈ、Ｊｇｅｍ＝１２．３Ｈｚ、−ＣＨ２Ｐｈ）、４．４０（ｄ、１Ｈ、Ｊ１’，２’＝９．５３Ｈｚ、Ｈ−１’）、４．３２（ｄ、１Ｈ、Ｊ１，２＝８．０４Ｈｚ、Ｈ−１）、１．０４（ｄ、１Ｈ、Ｊ５”，６”＝６．４３Ｈｚ、Ｈ−６”）．
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１６２．３８、１４７．６８、１２７．９５、１２７．９５、１２３．３３及び１２３．３３（芳香族）、１０２．１８、１００．９５及び１００．１８（Ｃ−１、Ｃ−１’及びＣ−１”）、７７．６２、７６．７４、７５．３６、７５．３６、７４．６１、７３．７８、７３．４５、７１．５９、６９．６７、６８．７４、６８．６７、６８．２１、６６．３８、６０．２２及び５９．７７（Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−４、Ｃ−５、Ｃ−６、Ｃ−２’、Ｃ−３’、Ｃ−４’、Ｃ−５’、Ｃ−６’、Ｃ−２”、Ｃ−３”、Ｃ−４”、Ｃ−５”及びＣＨ２Ｐｈ）、１６．４５（Ｃ−６”）．
【０２５５】
ｃ）アクセプター：Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−Ｂｎ
ドナー：α−Ｌ−フッ化フコシル、２’−Ｏ−フコシルラクトース又は２，５−ジメチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルα−Ｌ−フコピラノシド
生成物：モノフコシル化Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−Ｂｎ
正確な分子量をＬＣ−ＭＳにより確認した（９４４［Ｍ＋Ｈ］＋，９６１［Ｍ＋ＮＨ４］＋，９６６［Ｍ＋Ｎａ］＋）
【０２５６】
ｄ）アクセプター：Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−Ｂｎ
ドナー：α−Ｌ−フッ化フコシル、２’−Ｏ−フコシルラクトース又は２，５−ジメチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルα−Ｌ−フコピラノシド
生成物：モノフコシル化Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−Ｂｎ
正確な分子量をＬＣ−ＭＳにより確認した（９４４［Ｍ＋Ｈ］＋，９６１［Ｍ＋ＮＨ４］＋，９６６［Ｍ＋Ｎａ］＋）
【０２５７】
（実施例１２）
アクセプター  ベンジル／置換ベンジルグリコシドの製造
Ａ）ベンジル／置換ベンジルラクトシド
Ａ１）一般的方法：室温で、ラクトース（５ｇ、１４．６ｍｍｏｌ）及びＴｓＯＨ・Ｈ２Ｏ（０．２ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を一度に、ＤＭＦ（２０ｍｌ）とベンズアルデヒドジメチルアセタール（５．５ｍｌ、３５．４ｍｍｏｌ、２．４当量）との混合液に加えた。該反応混合液を、防湿下、７０℃で１時間強撹拌した。冷却後、トリエチルアミン（０．１５ｍｌ）を加え、揮発性成分（ＭｅＯＨ、トリエチルアミン、残存ベンズアルデヒドジメチルアセタール）を真空で除去した。この反応混合液に、ベンジルブロミド誘導体（１．５当量；試薬が固体の場合、予め５〜１０ｍｌのＤＭＦに溶解したもの）を加え、該混合液を２０分間０℃で冷却した。更に冷却中、ＮａＨ（０．８ｇ、５５％鉱油分散液、１．３当量）を一度に加え、該混合液を冷却下、水素の形成が停止するまで撹拌し、その後室温で２〜３時間、撹拌した。メタノール（２ｍｌ）を注意深く加え、該反応混合液をさらに５分撹拌した。該反応混合液を、１００ｍｌのＤＣＭと１００ｍｌの水に分け、抽出した。水層は、１００ｍｌのＤＣＭで二回逆抽出した。混合有機相を蒸発させた、残留物を１００ｍｌのアセトニトリルに溶解し、１００ｍｌのヘキサンで抽出した。アセトニトリルを蒸留除去し、５０℃にて、残留物をイソプロパノール（１０ｍｌ）及びイソプロピルエーテル（５０ｍｌ）に得た。２〜１２時間、透明溶液を−２０℃まで冷却させた。得られた結晶をろ過して得て、ＴＢＭＥで二回洗浄し、乾燥させた。ＴＢＭＥ（約５０ｍｌ）及びエタノール（約２０ｍｌ）の混合液から再結晶化を行ってもよい。
【０２５８】
４−クロロベンジル４’，６’−Ｏ−ベンジリデン−β−ラクトシド
収量：１．７１ｇ
４−メチルベンジル４’，６’−Ｏ−ベンジリデン−β−ラクトシド
収量：３．２０ｇ
３−フェニルベンジル４’，６’−Ｏ−ベンジリデン−β−ラクトシド
収量：２．７０ｇ
２−ナフチルメチル４’，６’−Ｏ−ベンジリデン−β−ラクトシド
収量：１．７７ｇ
【０２５９】
Ｂ１）室温で、メタノール（１０ｍｌ）及び水（０．５ｍｌ）中の上記ベンジリデンアセタール（５００ｍｇ）のうちの１つの混合液に、ＴＦＡを加え、防湿下で該反応混合液を２〜４時間撹拌し、その後蒸発させた。残存する物質を、エタノールで３〜４回共蒸発させ、粗固体を得た。乾燥後、得られた粗固体を、メタノール（約１０〜３５ｍｌ）と水（約０〜２ｍＬ）との混合液から再結晶化してもよい。
【０２６０】
４−クロロベンジルβ−ラクトシド
収量：３３３ｍｇ
１３Ｃ−ＮＭＲ（７５．１ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ＝１３５．２５、１３３．６７、１３０．３０、１２８．７０、１０３．００、１０１．１３、７８．３９、７５．４４、７４．８９、７４．４９、７２．８８、７２．５８、７１．０３、７０．８３、６８．６２、６１．１１、６０．１３．
４−メチルベンジルβ−ラクトシド
収量：４３９ｍｇ
１３Ｃ−ＮＭＲ（７５．１ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ＝１３８．９１、１３３．５０、１２９．３７、１２９．０７、１０３．０１、１００．９６、７８．４３、７５．４４、７４．８７、７４．５２、７２．９０、７２．５９、７１．４７、７１．０３、６８．６３、６１．１１、６０．１７、２０．３４．
【０２６１】
３−フェニルベンジルβ−ラクトシド
収量：４３８ｍｇ
１３Ｃ−ＮＭＲ（７５．１ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ／ｄ４−ＭｅＯＨ／Ｄ２Ｏ  ８：１：１）：δ＝１４０．２９、１４０．２４、１３８．８８、１２９．１３、１２９．０２、１２７．６６、１２６．８８、１２６．８３、１２６．０３、１２５．９０、１０３．９５、１０２．０３、８０．７６、７５．６５、７５．０７、７５．００、７３．３４、７３．２８、７０．６６、６９．８１、６８．２７、６０．５６．
【０２６２】
２−ナフチルメチルβ−ラクトシド
収量：３７８ｍｇ
１３Ｃ−ＮＭＲ（７５．１ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ／ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ＝１３４．９６、１３３．２４、１３３．１２、１２８．５９、１２８．３１、１２８．０８、１２７．４６、１２６．９８、１２６．９０、１２６．７９、１０３．２６、１０１．５９、７８．８９、７５．６２、７５．０９、７４．８１、７３．１４、７２．８１、７１．３３、７１．１４、６８．７５、６１．２２、６０．３９．
【０２６３】
Ｂ）Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−Ｂｎ（１−Ｏ−ベンジル−β−ＬＮＴ）をA. Malleron et al. Carbohydr. Res. 341, 29 (2006)に従って、調製することができる。
Ｃ）  Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−Ｂｎ（１−Ｏ−ベンジル−β−ＬＮｎＴ）をＷＯ２０１１／１００９８０に従って、調製することができる。
【０２６４】
（実施例１３）
２，５−ジメチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルα−Ｌ−フコピラノシドの製造
ａ）２，３，４−トリ−Ｏ−（４−メトキシベンジル）−Ｌ−フコピラノーストリクロロアセトイミダート（α／β混合、ＮａＨの存在下、定量的収率で、８５ｍｍｏｌの２，３，４−トリ−Ｏ−（４−メトキシベンジル）−Ｌ−フコピラノース及びトリクロロアセトニトリルから調製）のジエチルエーテル（１００ｍｌ）液を、−１４℃の２，５−ジメチル−４−ヒドロキシ−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン（８５ｍｍｏｌ）及びＴＭＳ−トリフラート（１．２ｍｌ）のジエチルエーテル（２００ｍｌ）混合液に加えた。３時間後、冷却浴を外し、撹拌を１時間続けた。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３液（３ｘ１５０ｍｌ）及び塩水（１５０ｍｌ）で抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させた。得られたシロップをカラムクロマトグラフィーで精製し、２３．２７ｇの２，５−ジメチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イル２，３，４−トリ−Ｏ−（４−メトキシベンジル）−α−Ｌ−フコピラノシドを濃い黄色のシロップ状の１：１ジアステレオ異性体混合物として得た。
ＣＤＣｌ３における選択されたＮＭＲケミカルシフト：アノメリックプロトン：５．３２及び５．５７ｐｐｍ、Ｊ１，２＝３．４Ｈｚ
アノマー炭素：１１３．８１及び１１３．９５Ｈｚ
【０２６５】
ｂ）室温で６時間、Ｈ２下、上記生成物及びパラジウム木炭（１２．５ｇ）の酢酸エチル（１ｌ）懸濁液を撹拌した。触媒を濾過して、酢酸エチルで洗浄した。化合した濾液を蒸発して固体とし、酢酸エチルに懸濁し、５℃で一晩放置した。濾過して結晶物質を得て、乾燥した。母液をカラムクロマトグラフィーに供した。結合物（combined products）は、５．５０ｇの２，５−ジメチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルα−Ｌ−フコピラノシド（白色固体の１：１ジアステレオ異性体混合物）であった。
ＤＭＳＯ−ｄ６における選択されたＮＭＲケミカルシフト：アノメリックプロトン：５．０７及び５．５２ｐｐｍ、Ｊ１，２＝２．６Ｈｚ
アノマー炭素：１００．１９及び１０１．０３Ｈｚ
ガスクロマトグラフ（ＧＣ）による純度（シリル化後）：９８．９％。
【図１】
2014513985.tif 000063
【図２】
2014513985.tif 000064
【図３】
2014513985.tif 000065
【配列表】
2014513985000001.app
【国際調査報告】
2014513985.tif 000066
2014513985.tif 000067
2014513985.tif 000068
2014513985.tif 000069
2014513985.tif 000070