(57)【要約】非侵襲性出生前親子鑑定法を本明細書中に開示する。本方法は、擬父が胎児の実父であるか否かを決定するために擬父の遺伝的測定値および母親の遺伝的測定値と共に妊娠中の母親から採取した血漿に関して取得した遺伝的測定値を使用する。母体血漿中に見出された胎児ＤＮＡの遺伝子フィンガープリントを擬父の遺伝子フィンガープリントと比較することができるインフォマティクスベースの方法によってこれを行う。一局面において、本発明は、本発明の方法によって作成された、胎児の父性に関する報告書も提供する。
2014502845.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
擬父が、妊娠中の母親が懐胎している胎児の実父であるか否かを確証する方法であって、前記方法は：
前記擬父から遺伝物質を得る工程、
前記妊娠中の母親から血液サンプルを得る工程、
前記擬父由来の遺伝物質に関して複数の多型遺伝子座で遺伝子型測定値を取得する工程、
前記妊娠中の母親由来の遺伝物質から前記複数の多型遺伝子座で遺伝子型測定値を得る工程、
前記妊娠中の母親由来の血液サンプルを起源とするＤＮＡの混合サンプルに関して遺伝子型測定値を取得する工程であって、ＤＮＡの前記混合サンプルが胎児ＤＮＡおよび母体ＤＮＡを含む、工程、
前記擬父由来のＤＮＡから取得した遺伝子型測定値、前記妊娠中の母親から得た遺伝子型測定値、およびＤＮＡの前記混合サンプルに関して取得した遺伝子型測定値を使用して前記擬父が前記妊娠中の母親が懐胎している前記胎児の実父である確率をコンピュータにて決定する工程、ならびに
前記擬父が前記胎児の実父である、決定された確率を使用して、前記擬父が前記胎児の実父であるか否かを確証する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記多型遺伝子座が一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＮＡの前記混合サンプルが、前記妊娠中の母親由来の血液サンプルの血漿画分中の浮遊ＤＮＡに由来したＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＤＮＡの前記混合サンプルが、母体全血または有核細胞を含む母体血画分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
有核細胞を含む前記母体血画分が、胎児起源の細胞について富化されている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記決定する工程が、
前記擬父および前記胎児についての検定統計量を計算することであって、前記検定統計量が前記擬父と前記胎児との間の遺伝的類似度を示し、かつ前記検定統計量が、前記擬父由来のＤＮＡから取得した遺伝子型測定値、ＤＮＡの前記混合サンプルから取得した遺伝子型測定値、および前記妊娠中の母親由来のＤＮＡから得た遺伝子型測定値に基づく、計算すること；
各計算された検定統計量が前記胎児と非血縁の複数の個体由来の非血縁個体と前記胎児との間の遺伝的類似度を示す場合に前記胎児と遺伝的に非血縁の前記複数の個体についての検定統計量の分布を計算することであって、前記検定統計量が、前記非血縁個体由来のＤＮＡから取得した遺伝子型測定値、ＤＮＡの前記混合サンプルから取得した遺伝子型測定値、および前記妊娠中の母親由来のＤＮＡから得た遺伝子型測定値に基づく、計算すること；
前記擬父および前記胎児について計算した前記検定統計量が、前記複数の非血縁個体および前記胎児について計算した前記検定統計量の分布の一部である確率を計算すること；ならびに
前記擬父について計算した前記検定統計量が前記複数の非血縁個体および前記胎児について計算した前記検定統計量の分布の一部である確率を使用して前記擬父が前記胎児の実父である確率を決定すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
擬父が前記胎児の実父であるか否か確証する工程が、
前記擬父が前記胎児の実父である確率が上限閾値を超える場合に前記擬父が前記胎児と非血縁であるという仮説を棄却することによって前記擬父が前記胎児の実父であると確証すること；または
前記擬父が前記胎児の実父である確率が下限閾値未満である場合に前記擬父が前記胎児と非血縁であるという仮説を棄却しないことによって前記擬父が前記胎児の実父ではないと確証すること；または
尤度が前記下限閾値と前記上限閾値との間である場合または前記尤度が十分に高い信頼度で決定されなかった場合に擬父が前記胎児の実父であるか否か確証しないこと
をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記擬父が前記胎児の実父である確率を決定する工程が、
前記複数の多型遺伝子座内の各遺伝子座について対立遺伝子の集団内頻度を得ること；
胎児画分の下限から胎児画分の上限までの範囲におよぶＤＮＡの前記混合サンプルにおいて胎児ＤＮＡの潜在的画分のパーティションを作製すること；
前記パーティション中の前記潜在的胎児画分の各々について前記母親由来のＤＮＡから得た遺伝子型測定値、前記擬父由来のＤＮＡから取得した遺伝子型測定値、ＤＮＡの前記混合サンプルから取得した遺伝子型測定値を考慮して前記擬父が前記胎児の実父である確率を計算すること；
前記パーティション中の前記潜在的胎児画分の各々について前記擬父が前記胎児の実父である計算された確率を組み合わせることによって前記擬父が前記胎児の実父である確率を決定すること；
前記パーティション中の前記潜在的胎児画分の各々について前記母親由来のＤＮＡから取得した遺伝子型測定値、ＤＮＡの前記混合サンプルから取得した遺伝子型測定値、得られた前記対立遺伝子の集団内頻度を考慮して前記擬父が前記胎児の実父でない確率を計算すること；ならびに
前記パーティション中の前記潜在的胎児画分の各々について前記擬父が前記胎児の実父ではない計算された確率を組み合わせることによって前記擬父が前記胎児の実父でない確率を決定すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記擬父が前記胎児の実父である確率を計算することおよび前記擬父が前記胎児の実父でない確率を計算することが、
前記複数の多型遺伝子座のそれぞれについて、プラットフォーム応答モデル、パーティション中の前記潜在的胎児画分中の１つまたは複数の画分、前記母親についての複数の遺伝子座比、擬父についての複数の遺伝子座比、および前記胎児についての複数の遺伝子座比を使用して特定の遺伝子座で観察された配列データの尤度を計算すること；
前記パーティション中の全胎児画分、多型遺伝子座組中の前記母親の対立遺伝子比、多型遺伝子座組中の前記擬父の対立遺伝子比、および多型遺伝子座組中の前記胎児の対立遺伝子比に関して各多型遺伝子座での観察された前記配列データの尤度を組み合わせることによって前記擬父が実父である尤度を計算すること；
前記パーティション中の全胎児画分、多型遺伝子座組中の前記母親の対立遺伝子比、多型遺伝子座組についての集団内頻度、および多型遺伝子座組中の前記胎児の対立遺伝子比に関して各多型遺伝子座での観察された前記配列データの尤度を組み合わせることによって前記擬父が実父でない尤度を計算すること；
前記擬父が実父である尤度に基づいて前記擬父が実父である確率を計算すること；および
前記擬父が実父でない尤度に基づいて前記擬父が実父でない確率を計算すること
をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記擬父が実父である尤度に基づいて前記擬父が実父である確率を計算することを、最尤推定または最大事後技術を使用して行う、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
擬父が胎児の実父であるか否か確証する工程が、
前記擬父が前記胎児の実父である計算された確率が、前記擬父が実父でない計算された確率より有意に高い場合に前記擬父が実父であることを確証すること；または
前記擬父が実父である計算された確率が、前記擬父が実父でない計算された確率より有意に高い場合に前記擬父が前記胎児の実父でないことを確証すること
をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記多型遺伝子座が二染色体である尤度が高い染色体に対応する、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
胎児ＤＮＡの潜在的画分の前記パーティションがたった１つの胎児画分を含み、前記胎児画分が、定量ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、ターゲティングＰＣＲ、循環プローブ、他のＤＮＡ増幅法、ハイブリッド形成プローブによる捕捉、他の優先的富化方法、ＳＮＰマイクロアレイ、ＤＮＡマイクロアレイ、配列決定、他の多型対立遺伝子測定技術、他の非多型対立遺伝子測定技術、父親のゲノム中に存在するが母親のゲノム中に存在しない多型対立遺伝子の測定、父親のゲノム中に存在するが母親のゲノム中に存在しない非多型対立遺伝子の測定、Ｙ染色体に特異的な対立遺伝子の測定、父性遺伝した対立遺伝子の測定量と母性遺伝した対立遺伝子の測定量との比較、最尤推定値、最大事後技術、およびその組み合わせからなるリストから選択した技術によって決定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
潜在的胎児画分の前記パーティションがたった１つの胎児画分を含み、前記胎児画分が請求項２６に記載の方法を使用して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記擬父の遺伝物質を、血液、体細胞組織、精子、毛髪、口内サンプル、皮膚、他の法医学サンプル、およびその組み合わせからなる群から選択される組織から得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記擬父が前記胎児の実父であるか否かの確証された決定についての信頼度を計算する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ＤＮＡの前記混合サンプル中の胎児ＤＮＡ画分が、サイズ選択、ユニバーサルライゲーション媒介ＰＣＲ、伸長時間の短いＰＣＲ、他の富化方法、およびその組み合わせからなる群から選択される方法を使用して富化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記妊娠中の母親の遺伝物質から遺伝子型測定値を得る工程が、母体遺伝物質から本質的になる前記妊娠中の母親由来の遺伝物質のサンプルに関して遺伝子型測定値を取得することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記妊娠中の母親由来の遺伝物質から遺伝子型測定値を得る工程が、
ＤＮＡの前記混合サンプルに関して取得した遺伝子型測定値に由来する、どの遺伝子型測定値が前記妊娠中の母親由来の遺伝物質に起因する可能性が高いかを推測すること；および
前記母親由来の遺伝物質に起因すると推測された遺伝子型測定値を、得られた遺伝子型測定値として使用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
確証された父性決定に基づいて臨床決定を行う工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記臨床決定が中絶することである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
遺伝子型測定値を取得する工程を、パッドロックプローブ、分子反転プローブ、他の循環プローブ、遺伝子型決定マイクロアレイ、ＳＮＰ遺伝子型決定アッセイ、チップベースのマイクロアレイ、ビーズベースのマイクロアレイ、他のＳＮＰマイクロアレイ、他の遺伝子型決定法、サンガーＤＮＡ配列決定、ピロシーケンス、ハイスループット配列決定、循環プローブを使用したターゲティング配列決定、ハイブリッド形成プローブによる捕捉を使用したターゲティング配列決定、可逆的色素ターミネーター配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリッド形成による配列決定、他のＤＮＡ配列決定法、他のハイスループット遺伝子型決定プラットフォーム、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリッド形成（ＣＧＨ）、アレイＣＧＨ、ならびにこれらの複数または組み合わせからなる群から選択される技術またはテクノロジーを使用した遺伝物質の測定によって行う、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
遺伝子型測定値を取得する工程を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガンド媒介ＰＣＲ、縮重オリゴヌクレオチドプライマーＰＣＲ、ターゲティング増幅、ＰＣＲ、ミニＰＣＲ、ユニバーサルＰＣＲ増幅、多置換増幅（ＭＤＡ）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、対立遺伝子特異的増幅技術、線形増幅法、基質ＤＮＡのライゲーションおよびその後の別の増幅法、ブリッジ増幅、パッドロックプローブ、循環プローブ、ハイブリッド形成プローブによる捕捉、およびその組み合わせからなる群から選択される技術またはテクノロジーを使用して測定する前に増幅され、そして／または優先的に富化される遺伝物質に関して行う、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記胎児の確証された父性を含む報告書を作成する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の方法を使用して作成された、前記胎児の確証された父性を開示する報告書。
【請求項２６】
標的個体由来のＤＮＡおよび第２の個体由来のＤＮＡを含むＤＮＡの混合サンプル中に存在する前記標的個体由来のＤＮＡ画分を決定するための方法であって、前記方法は：
ＤＮＡの前記混合サンプルから複数の多型遺伝子座で遺伝子型測定値を取得する工程；
前記第２の個体から前記複数の多型遺伝子座で遺伝子型データを得る工程；ならびに
ＤＮＡの前記混合サンプル由来の遺伝子型測定値、前記第２の個体由来の遺伝子型データ、および確率推定技術を使用して前記混合サンプル中に存在する前記標的個体由来のＤＮＡ画分をコンピュータにて決定する工程
を含む、方法。
【請求項２７】
前記第２の個体から遺伝子型データを得る工程が、前記第２の個体由来のＤＮＡから本質的になるＤＮＡから遺伝的測定値を取得することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第２の個体から遺伝子型データを得る工程が、
ＤＮＡの前記混合サンプルに関して取得した遺伝子型測定値に由来する、どの遺伝子型測定値が前記第２の個体由来の遺伝物質に起因する可能性が高いかを推測すること；および
前記第２の個体由来の遺伝物質に起因すると推測された遺伝子型測定値を、得られた遺伝子型測定値として使用すること
を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
関連する個体の遺伝子型データを推測することが、遺伝子座で対立遺伝子の集団内頻度を使用することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的個体由来のＤＮＡの決定された画分を、ＤＮＡ画分の確率として表現する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記混合サンプルから取得した遺伝子型測定値が、前記混合サンプル中のＤＮＡの配列決定によって取得した遺伝子型測定値を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記混合サンプル中のＤＮＡを、ＤＮＡの前記混合サンプルから遺伝子型測定値を取得する前に前記複数の多型遺伝子座で優先的に富化させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記多型遺伝子座が一塩基多型を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記画分を決定する工程が、
ＤＮＡの前記混合サンプル中に存在する前記標的個体由来の複数のＤＮＡ画分の確率を決定すること；
前記複数の画分から最大確率を有する画分を選択することによって前記画分を決定すること
をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記画分を決定する工程が、
ＤＮＡの前記混合サンプル中に存在する前記標的個体由来の複数のＤＮＡ画分の確率を決定すること；
最も可能性の高い画分を決定するために最尤推定技術を使用すること；および
最も可能性が高いと決定された画分を選択することによって前記画分を決定すること
をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
前記標的個体が妊娠中の母親が懐胎している胎児であり、前記第２の個体が前記妊娠中の母親である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記多型遺伝子座で測定した遺伝子型データに関連するプラットフォームモデルを使用する工程；および
母系遺伝子型を子の遺伝子型と関連付けている表を使用する工程
をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記決定が、前記胎児の父親由来のＤＮＡに関して測定した複数の多型遺伝子座での遺伝子型測定値も使用する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記方法が前記胎児の父親由来の遺伝子型データを使用しない、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記方法がＹ染色体上の遺伝子座を使用しない、請求項２６に記載の方法。
【請求項４１】
請求項３６に記載の方法を使用して決定した胎児の確証された父性を開示する報告書。
【請求項４２】
請求項３６に記載の方法を使用して決定した胎児の倍数性の状態を開示する報告書。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１０年１２月２２日に出願された米国仮出願第６１／４２６，２０８号の利益を主張する。この出願は、２０１１年６月２３日に出願された米国仮出願第６１／５７１，２４８号、２０１１年１０月３日に出願された米国仮出願第６１／５４２，５０８号の利益を主張する２０１１年１１月１８日に出願された米国出願第１３／３００，２３５号の一部継続であり、かつ２０１０年５月１８日に出願された米国仮出願第６１／３９５，８５０号、２０１０年６月２１日に出願された米国仮出願第６１／３９８，１５９号、２０１１年２月９日に出願された米国仮出願第６１／４６２，９７２号、２０１１年３月２日に出願された米国仮出願第６１／４４８，５４７号および２０１１年４月１２日に出願された米国仮出願第６１／５１６，９９６号の利益を主張する２０１１年５月１８日に出願された米国出願第１３／１１０，６８５号の一部継続である。これら全ての出願の全容は、それらの教示に関して参考として本明細書に援用される。
【０００２】
分野
本開示は、一般に、非侵襲性出生前親子鑑定法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
親子関係が不明瞭であることは深刻な問題であり、実際の実父ではない男性が実父と考えられている子は４％と１０％との間と見積もられている。女性が妊娠したが、関係する個人の誰が実父であるか確信が持てない場合、胎児の正しい実父を決定するにはいくつかの選択肢が存在する。１つの方法は、出産まで待ち、子に遺伝的指紋法を行い、子のゲノムの遺伝子フィンガープリントを擬父のものと比較することである。しかし、母親は、しばしば、出生前に胎児の実父の正体を知ることを望んでいる。別の方法は、第１トリメスターに絨毛診断を行うか第２トリメスターに羊水穿刺を行い、回収した遺伝物質を使用して出生前に遺伝的指紋法を行うことである。しかし、これらの方法は侵襲性であり、流産リスクが高い。
【０００４】
胎児無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）およびインタクトな胎児細胞が母体の血液循環に入り得ることが最近発見されている。したがって、この胎児遺伝物質の分析により、非侵襲性出生前遺伝学的検査（ＮＩＰＧＤまたはＮＰＤ）を早期に行うことが可能である。胎児細胞に対してＮＩＰＧＤを実施する上での重要な課題は、母親の血液由来の胎児の細胞または核酸の同定および抽出作業である。母体血中の胎児細胞濃度は、妊娠の段階および胎児の状態に依存するが、母体血１ミリリットルあたり胎児細胞１〜４０個の範囲であるか、母体有核細胞１００，０００個あたり胎児細胞１個未満と見積もられている。現在の技術では母親の血液から少量の胎児細胞を単離することができるが、任意の量で純粋なものに胎児細胞を富化させることは困難である。この文脈での最も有効な技術はモノクローナル抗体の使用を含むが、胎児細胞を単離するために使用される他の技術には、密度遠心分離、成体赤血球の選択的溶解、およびＦＡＣＳが含まれる。胎児ｃｆＤＮＡに対してＮＩＰＧＤを実施する上での主な課題は、典型的には母体ｃｆＤＮＡと混合されるので、母系遺伝子型シグナルを明らかにする必要があり、それがｃｆＤＮＡの分析を妨げることである。胎児ＤＮＡ分析は、父親由来の遺伝子に特異的な配列とハイブリッド形成するようにデザインされたプライマーを使用したＰＣＲ増幅を使用して行われる。胎児遺伝物質のこれらの供給源は、非侵襲性出生前診断技術への道を開けるものである。
【０００５】
一旦胎児ＤＮＡが純粋な形態または混合物のいずれかで単離されると、胎児ＤＮＡを増幅することができる。全ゲノム増幅（ＷＧＡ）に利用可能な方法は多数存在する：ライゲーション媒介ＰＣＲ（ＬＭ−ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドプライマーＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）、および多置換増幅（ＭＤＡ）。ターゲティング増幅に利用可能な方法が多数存在する（ＰＣＲ、および循環プローブ（分子反転プローブ（ＭＩＰ）など）、およびパッドロックプローブが含まれる）。胎児ＤＮＡの優先的富化のために使用することができる他の方法（サイズ分離およびハイブリッド捕捉プローブなど）が存在する。
【０００６】
これらの文脈においてＤＮＡ増幅の使用において多数の困難が存在する。単一細胞ＤＮＡ、少数の細胞由来のＤＮＡ、または少量のＤＮＡのＰＣＲによる増幅は完全に失敗し得る。これは、しばしば、ＤＮＡの汚染、細胞、そのＤＮＡの喪失、または増幅反応中のＤＮＡの接近可能性に起因する。増幅およびマイクロアレイ分析による胎児ＤＮＡ測定で生じ得るエラーの他の原因には、ＰＣＲ中に特定のヌクレオチドが不正確にコピーされるＤＮＡポリメラーゼによって導入される転写エラーおよびアレイ上の不完全なハイブリッド形成に起因するマイクロアレイリードエラーが含まれる。別の問題は、ヘテロ接合細胞中の２つの対立遺伝子中のうちの１つの増幅の失敗として定義される対立遺伝子欠落（ａｌｌｅｌｅ  ｄｒｏｐ−ｏｕｔ）（ＡＤＯ）である。
【０００７】
遺伝子型決定データを提供する技術は多数存在する。いくつかの例には以下が含まれる。ＴＡＱＭＡＮは、ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹから製造され頒布されている固有の遺伝子型決定テクノロジーである。ＴＡＱＭＡＮは、目的の配列の増幅のためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する。ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸの５００ＫアレイおよびＩＬＬＵＭＩＮＡのＩＮＦＩＮＩＵＭシステムは、多数の位置で同時に特定のＤＮＡ配列の存在を検出する遺伝子型決定アレイである。ＩＬＬＵＭＩＮＡのＨＩＳＥＱおよびＭＩＳＥＱならびにＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹのＩＯＮ  ＴＯＲＲＥＮＴおよびＳＯＬＩＤプラットフォームにより、多数の個別のＤＮＡ配列を直接配列決定することが可能である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
概要
非侵襲性様式で懐胎している胎児の父性を決定するための方法を本明細書中に開示する。本明細書中に例示の態様によれば、１つの実施形態では、擬父が、妊娠中の母親が懐胎している胎児の実父であるか否かを確証する方法は、擬父から遺伝物質を得る工程、妊娠中の母親から血液サンプルを得る工程、擬父由来の遺伝物質に関して複数の多型遺伝子座で遺伝子型測定値を取得する工程、妊娠中の母親由来の遺伝物質から複数の多型遺伝子座で遺伝子型測定値を得る工程、妊娠中の母親由来の血液サンプルを起源とするＤＮＡの混合サンプルに関して遺伝子型測定値を取得する工程であって、ＤＮＡの混合サンプルが胎児ＤＮＡおよび母体ＤＮＡを含む、工程、擬父由来のＤＮＡから取得した遺伝子型測定値、妊娠中の母親から得た遺伝子型測定値、およびＤＮＡの混合サンプルに関して取得した遺伝子型測定値を使用して、擬父が、妊娠中の母親が懐胎している胎児の実父である確率をコンピュータにて決定する工程、ならびに擬父が胎児の実父である、決定された確率を使用して擬父が胎児の実父であるか否かを確証する工程を含む。
【０００９】
１つの実施形態では、多型遺伝子座は一塩基多型を含む。１つの実施形態では、ＤＮＡの混合サンプルは、妊娠中の母親由来の血液サンプルの血漿画分中の浮遊ＤＮＡに由来したＤＮＡを含む。１つの実施形態では、ＤＮＡの混合サンプルは、母体全血または有核細胞を含む母体血画分を含む。１つの実施形態では、有核細胞を含む母体血画分は、胎児起源の細胞が富化されている。
【００１０】
１つの実施形態では、擬父が実父であるか否かの決定が、擬父および胎児の検定統計量を計算することであって、検定統計量が擬父と胎児との間の遺伝的類似度を示し、検定統計量が、擬父由来のＤＮＡから取得した遺伝子型測定値、ＤＮＡの混合サンプルから取得した遺伝子型測定値、および妊娠中の母親由来のＤＮＡから得た遺伝子型測定値に基づく、計算すること、各計算された検定統計量が胎児と非血縁の複数の個体由来の非血縁個体と胎児との間の遺伝的類似度を示す場合に胎児と遺伝的に非血縁の複数の個体についての検定統計量の分布を計算することであって、検定統計量が、非血縁個体由来のＤＮＡから取得した遺伝子型測定値、ＤＮＡの混合サンプルから取得した遺伝子型測定値、および妊娠中の母親由来のＤＮＡから得た遺伝子型測定値に基づく、計算すること、擬父および胎児について計算した検定統計量が複数の非血縁個体および胎児について計算した検定統計量の分布の一部である確率を計算すること、ならびに擬父について計算した検定統計量が複数の非血縁個体および胎児について計算した検定統計量の分布の一部である確率を使用して擬父が胎児の実父である確率を決定することを含む。１つの実施形態では、擬父が胎児の実父であるか否か確証する工程は、擬父が胎児の実父である確率が上限閾値を超える場合に擬父が胎児と非血縁であるという仮説を棄却することによって擬父が胎児の実父であると確証すること、または擬父が胎児の実父である確率が下限閾値未満である場合に擬父が胎児と非血縁であるという仮説を棄却しないことによって擬父が胎児の実父ではないと確証すること、または尤度が下限閾値と上限閾値との間である場合または尤度が十分に高い信頼度で決定されなかった場合に擬父が胎児の実父であるか否か確証しないことも含む。
【００１１】
１つの実施形態では、擬父が胎児の実父である確率を決定する工程は、複数の多型遺伝子座内の各遺伝子座について対立遺伝子の集団内頻度を得ること、胎児画分の下限から胎児画分の上限までの範囲のＤＮＡの混合サンプルにおいて胎児ＤＮＡの潜在的画分のパーティションを作製すること、パーティション中の潜在的胎児画分の各々について母親由来のＤＮＡから得た遺伝子型測定値、擬父由来のＤＮＡから取得した遺伝子型測定値、ＤＮＡの混合サンプルから取得した遺伝子型測定値を考慮して擬父が胎児の実父である確率を計算すること、パーティション中の潜在的胎児画分の各々について擬父が胎児の実父である計算された確率を組み合わせることによって擬父が胎児の実父である確率を決定すること、パーティション中の潜在的胎児画分の各々について母親由来のＤＮＡから取得した遺伝子型測定値、ＤＮＡの混合サンプルから取得した遺伝子型測定値、得られた対立遺伝子集団内頻度を考慮して擬父が胎児の実父でない確率を計算すること、ならびにパーティション中の潜在的胎児画分の各々について擬父が胎児の実父ではない計算された確率を組み合わせることによって擬父が胎児の実父でない確率を決定することを含む。
【００１２】
１つの実施形態では、擬父が胎児の実父である確率を計算することおよび擬父が胎児の実父でない確率を計算することは、複数の多型遺伝子座のそれぞれについて、プラットフォーム応答モデル、パーティション中の潜在的胎児画分中の１つまたは複数の画分、母親についての複数の遺伝子座比、擬父についての複数の遺伝子座比、および胎児についての複数の遺伝子座比を使用して特定の遺伝子座で観察された配列データの尤度を計算すること、パーティション中の全胎児画分、多型遺伝子座組中の母親の対立遺伝子比、多型遺伝子座組中の擬父の対立遺伝子比、および多型遺伝子座組中の胎児の対立遺伝子比に関して各多型遺伝子座での認められた配列の尤度を組み合わせることによって擬父が実父である尤度を計算すること、パーティション中の全胎児画分、多型遺伝子座組中の母親の対立遺伝子比、多型遺伝子座組についての集団内頻度、および多型遺伝子座組中の胎児の対立遺伝子比に関して各多型遺伝子座での認められた配列の尤度を組み合わせることによって擬父が実父でない尤度を計算すること、擬父が実父である尤度に基づいて擬父が実父である確率を計算すること、ならびに擬父が実父でない尤度に基づいて擬父が実父でない確率を計算することも含むことができる。
【００１３】
１つの実施形態では、擬父が実父である尤度に基づいて擬父が実父である確率の計算を、最尤推定または最大事後技術（ｍａｘｉｍｕｍ  ａ  ｐｏｓｔｅｒｉｏｒｉ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を使用して行う。１つの実施形態では、擬父が胎児の実父であるか否か確証する工程は、擬父が胎児の実父である計算された確率が、擬父が実父でない計算された確率より有意に高い場合に擬父が実父であることを確証すること、または擬父が実父である計算された確率が、擬父が実父でない計算された確率より有意に高い場合に擬父が胎児の実父でないことを確証することも含むことができる。１つの実施形態では、多型遺伝子座は、二染色体である尤度が高い染色体に対応する。
【００１４】
１つの実施形態では、胎児ＤＮＡの潜在的画分のパーティションはたった１つの胎児画分を含み、胎児画分は、定量ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、ターゲティングＰＣＲ、循環プローブ、他のＤＮＡ増幅法、ハイブリッド形成プローブによる捕捉、他の優先的富化方法、ＳＮＰマイクロアレイ、ＤＮＡマイクロアレイ、配列決定、他の多型対立遺伝子測定技術、他の非多型対立遺伝子測定技術、父親のゲノム中に存在するが母親のゲノム中に存在しない多型対立遺伝子の測定、父親のゲノム中に存在するが母親のゲノム中に存在しない非多型対立遺伝子の測定、Ｙ染色体に特異的な対立遺伝子の測定、父性遺伝した対立遺伝子の測定量と母性遺伝した対立遺伝子の測定量との比較、最尤推定値、最大事後技術、およびその組み合わせからなるリストから選択した技術によって決定される。１つの実施形態では、潜在的胎児画分のパーティションがたった１つの胎児画分を含み、胎児画分が請求項２６に記載の方法を使用して決定される、請求項１に記載の方法。
【００１５】
１つの実施形態では、擬父の遺伝物質を、血液、体細胞組織、精子、毛髪、口内サンプル、皮膚、他の法医学サンプル、およびその組み合わせからなる群から選択される組織から得る。１つの実施形態では、擬父が胎児の実父であるか否かの確証された決定についての信頼度を計算する。１つの実施形態では、ＤＮＡの混合サンプル中の胎児ＤＮＡ画分は、サイズ選択、ユニバーサルライゲーション媒介ＰＣＲ、伸長時間の短いＰＣＲ、他の富化方法、およびその組み合わせからなる群から選択される方法を使用して富化されている。
【００１６】
１つの実施形態では、妊娠中の母親の遺伝物質から遺伝子型測定値を得る工程は、母体遺伝物質から本質的になる妊娠中の母親由来の遺伝物質のサンプルに関して遺伝子型測定値を取得することを含むことができる。１つの実施形態では、妊娠中の母親由来の遺伝物質から遺伝子型測定値を得る工程は、ＤＮＡの混合サンプルに関して取得した遺伝子型測定値に由来する、どの遺伝子型測定値が妊娠中の母親由来の遺伝物質に起因する可能性が高いかを推測すること、および母親由来の遺伝物質に起因すると推測された遺伝子型測定値を得られた遺伝子型測定値として使用することを含むことができる。１つの実施形態では、本方法は、確証された父性決定に基づいて臨床決定を行う工程も含むことができる。１つの実施形態では、臨床決定は中絶することである。
【００１７】
１つの実施形態では、遺伝子型測定値の取得を、パッドロックプローブ、分子反転プローブ、他の循環プローブ、遺伝子型決定マイクロアレイ、ＳＮＰ遺伝子型決定アッセイ、チップベースのマイクロアレイ、ビーズベースのマイクロアレイ、他のＳＮＰマイクロアレイ、他の遺伝子型決定法、サンガーＤＮＡ配列決定、ピロシーケンス、ハイスループット配列決定、循環プローブを使用したターゲティング配列決定、ハイブリッド形成プローブによる捕捉を使用したターゲティング配列決定、可逆的色素ターミネーター配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリッド形成による配列決定、他のＤＮＡ配列決定法、他のハイスループット遺伝子型決定プラットフォーム、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリッド形成（ＣＧＨ）、アレイＣＧＨ、ならびにこれらの複数または組み合わせからなる群から選択される技術またはテクノロジーを使用した遺伝物質の測定によって行うことができる。
【００１８】
１つの実施形態では、遺伝子型測定値を取得する工程を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガンド媒介ＰＣＲ、縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）オリゴヌクレオチドプライマーＰＣＲ、ターゲティング増幅、ＰＣＲ、ミニＰＣＲ、ユニバーサルＰＣＲ増幅、多置換増幅（ＭＤＡ）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、対立遺伝子特異的増幅技術、線形増幅法、基質ＤＮＡのライゲーションおよびその後の別の増幅法、ブリッジ増幅、パッドロックプローブ、循環プローブ、ハイブリッド形成プローブによる捕捉、およびその組み合わせからなる群から選択される技術またはテクノロジーを使用して測定する前に増幅され、そして／または優先的に富化される遺伝物質に関して行うことができる。
【００１９】
１つの実施形態では、本方法は、確証された胎児の父性を含む報告書を作成する工程も含むことができる。１つの実施形態では、本発明は、本明細書中に記載の方法を使用して作成した胎児の確証された父親を開示する報告書を含むことができる。
【００２０】
標的個体を起源とするＤＮＡ画分が、標的個体由来のＤＮＡを含み且つ少なくとも１人の別の個体由来のＤＮＡも含むＤＮＡ混合物中に存在することを決定するための方法を本明細書中に開示する。本明細書中に例示の態様によれば、１つの実施形態では、標的個体由来のＤＮＡおよび第２の個体由来のＤＮＡを含むＤＮＡの混合サンプル中に存在する標的個体由来のＤＮＡ画分を決定するための方法が、ＤＮＡの混合サンプルから複数の多型遺伝子座で遺伝子型測定値を取得する工程、第２の個体から複数の多型遺伝子座で遺伝子型データを得る工程、およびＤＮＡの混合サンプル由来の遺伝子型測定値、第２の個体由来の遺伝子型データ、および確率推定技術を使用して混合サンプル中に存在する標的個体由来のＤＮＡ画分をコンピュータにて決定する工程を含むことができる。
【００２１】
１つの実施形態では、第２の個体から遺伝子型データを得る工程は、第２の個体由来のＤＮＡから本質的になるＤＮＡから遺伝的測定値を取得することを含む。１つの実施形態では、第２の個体から遺伝子型データを得る工程は、ＤＮＡの混合サンプルに関して取得した遺伝子型測定値に由来する、どの遺伝子型測定値が第２の個体由来の遺伝物質に起因する可能性が高いかを推測すること、および第２の個体由来の遺伝物質に起因すると推測された遺伝子型測定値を得られた遺伝子型測定値として使用することを含むことができる。
【００２２】
１つの実施形態では、関連する個体の遺伝子型データの推測は、遺伝子座で対立遺伝子の集団内頻度を使用することも含むことができる。１つの実施形態では、標的個体由来のＤＮＡの決定された画分を、ＤＮＡ画分の確率として示す。１つの実施形態では、混合サンプルから取得した遺伝子型測定値は、混合サンプル中のＤＮＡの配列決定によって取得した遺伝子型測定値を含む。１つの実施形態では、混合サンプル中のＤＮＡを、ＤＮＡの混合サンプルから遺伝子型測定値を取得する前に複数の多型遺伝子座で優先的に富化させる。１つの実施形態では、多型遺伝子座は一塩基多型を含む。
【００２３】
１つの実施形態では、画分を決定する工程が、ＤＮＡの混合サンプル中に存在する標的個体由来の複数のＤＮＡ画分の確率を決定すること、複数の画分から最大確率を有する画分を選択することによって画分を決定することも含むことができる。１つの実施形態では、画分を決定する工程が、ＤＮＡの混合サンプル中に存在する標的個体由来の複数のＤＮＡ画分の確率を決定すること、最も可能性の高い画分を決定するために最尤推定技術を使用すること、および最も可能性が高いと決定された画分の選択によって画分を決定することも含むことができる。
【００２４】
１つの実施形態では、標的個体は妊娠中の母親が懐胎している胎児であり、第２の個体は妊娠中の母親である。１つの実施形態では、本方法はまた、多型遺伝子座で測定した遺伝子型データに関連するプラットフォームモデルを使用する工程、および母系遺伝子型を子の遺伝子型と関連付けている表を使用する工程を含むことができる。１つの実施形態では、決定は、胎児の父親由来のＤＮＡに関して測定した複数の多型遺伝子座での遺伝子型測定値も使用する。１つの実施形態では、本方法は胎児の父親由来の遺伝子型データを使用しない。１つの実施形態では、本方法はＹ染色体上の遺伝子座を使用しない。１つの実施形態では、本発明は、母体血漿中に存在する胎児ＤＮＡ画分の決定のための本明細書中に開示の方法を使用して決定した胎児の確証された父性を開示する報告書を含むことができる。１つの実施形態では、本発明は、母体血漿中に存在する胎児ＤＮＡ画分の決定のための本明細書中に開示の方法を使用して決定した胎児の倍数性の状態を開示する報告書を含むことができる。
【００２５】
本明細書中に開示の実施形態は、添付の図面を参照してさらに説明されるであろう。いくつかの図面を通して類似の構造を類似の数値で示す。示した図面は必ずしも一定の縮小比・拡大比ではなく、それよりも、一般に、本明細書中に開示の実施形態の原理を例示する際に強調している。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、母体血漿に関して測定した２つのぺアレンタルコンテクスト由来の対立遺伝子強度の分布を示す。
【図２】図２は、２００人の非血縁の男性および実父についての父性に関連する検定統計量の分布を示す。
【図３】図３は、２００人の非血縁の男性および実父についての２つの強度比の分布を示す。各グラフは異なる入力チャネルに対応する。
【図４】図４は、３つの場合についての胎児遺伝子型測定値と親の遺伝子型測定値との間の相関比についての累積分布頻度（ｃｄｆ）曲線を示す。
【図５】図５は、３つの場合についての胎児遺伝子型測定値と親の遺伝子型測定値との間の相関比のヒストグラムを示す。
【図６】図６は、８００人の非血縁の男性についての検定統計量の理想的なガウス分布と比較した３５サンプルについての親子鑑定統計量のヒストグラムを示す。
【図７】図７は、父性排除を開示する報告書の例を示す。
【図８】図８は、父性包含を開示する報告書の例を示す。
【図９】図９は、中間の結果を開示する報告書の例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
上記で特定した図面は本明細書中に開示の実施形態を記載しているが、考察に記載のように他の実施形態も意図される。本開示は、説明のための例示的実施形態を示し、本発明を制限しない。当業者は、本明細書中に開示の実施形態の原理の範囲および精神の範囲内で多数の他の修正形態および実施形態を考案することができる。
【００２８】
詳細な説明
本明細書中に例示の態様によれば、擬父が、妊娠中の母親が懐胎している胎児の実父であるか否かを決定するための方法を提供する。１つの実施形態では、本方法は、擬父から遺伝物質を得る工程および妊娠中の母親から血液サンプルを得る工程を含む。１つの実施形態では、本方法は、擬父および妊娠中の母親の遺伝子型測定値を取得する工程および妊娠中の母親の血漿中に見出された浮遊ＤＮＡ（ｆｆＤＮＡ、すなわち、ｃｆＤＮＡ）に関して遺伝子型測定値を取得する工程を含むことができる。１つの実施形態では、本方法は、胎児の母親および擬父のＳＮＰ組の遺伝子型データを得る工程、標的個体由来のＤＮＡを含み、且つ標的個体の母親由来のＤＮＡも含む混合サンプルに関してＳＮＰ組の遺伝子型測定値を取得する工程を含む。１つの実施形態では、本方法は、擬父が、妊娠中の母親が懐胎している胎児の実父である確率をコンピュータにて決定するために遺伝子型測定値を使用する工程を含むことができる。１つの実施形態では、本方法は、擬父が胎児の実父であった場合に胎児／母体ＤＮＡ混合物の遺伝子型測定値についての予想される対立遺伝子分布を決定するために妊娠中の母親および擬父の遺伝子型データを使用する工程を含むことができる。１つの実施形態では、本方法は、擬父が胎児の実父でない場合に胎児／母体ＤＮＡ混合物の遺伝子型測定値についての予想される対立遺伝子分布を決定するために妊娠中の母親の遺伝子型データおよび父親でないことが公知の複数の個体の遺伝子型データを使用する工程を含むことができる。１つの実施形態では、本方法は、予想される対立遺伝子分布および実際の母体血漿ＤＮＡ測定値を考慮して擬父が胎児の実父である確率を計算する工程を含むことができる。１つの実施形態では、方法に概説した一連の工程により、妊娠中の母親および擬父の遺伝物質が変換されて出生前且つ非侵襲性様式で懐胎している胎児の実父の正しい正体が得られ、そして決定される。１つの実施形態では、擬父が実父である尤度の決定は、複数の非血縁個体を使用して作成された対立遺伝子分布から父親が排除される尤度が閾値を超える場合に擬父を実父としてコールするか実父として確証する工程を含む。１つの実施形態では、擬父が実父である尤度の決定が、複数の非血縁個体を使用して作成された対立遺伝子分布から擬父が排除される尤度が閾値未満である場合に擬父を実父としてコールしない工程を含む。１つの実施形態では、最初に擬父が実際に子の父親であると仮定する事によって父性決定を行い、擬父が正しくない場合は子の遺伝子型がこれらの予測に適合せず、最初の仮定は誤りであると見なされる。しかし、子の遺伝子型が予測に適合する場合、仮定は正しいと見なされる。したがって、親子鑑定は、認められたｆｆＤＮＡが擬父の遺伝子型によって予想される子の遺伝子型にどの程度よく当てはまるかを考慮する。１つの実施形態では、父性決定を記述している電子的または物理的な報告書を作成することができる。
【００２９】
１つの実施形態では、母体血中に見出された浮遊ＤＮＡ（ｆｆＤＮＡ）の遺伝的測定値ならびに母親および擬父由来の遺伝子型情報を使用して父性決定を行う。一般的な方法を、種々のプラットフォーム（ＳＮＰマイクロアレイ、非標的化ハイスループット配列決定、またはターゲティング配列決定など）を使用したｆｆＤＮＡの測定値に適用することができる。本明細書中に開示の方法は、浮遊胎児ＤＮＡが母体血漿中で低くさらに未知の濃度で見出され、且つ検出が困難であるという事実に取り組む。親子鑑定は、ｆｆＤＮＡ測定値および擬父の遺伝子型に基づいてｆｆＤＮＡ測定値が擬父によって得られた可能性の程度を評価する工程を含むことができる。測定プラットフォームと無関係に、試験は、多型の位置で測定した遺伝子型に基づき得る。いくつかの実施形態では、各多型遺伝子座での潜在的な対立遺伝子を、ＡおよびＢ、ならびに、任意選択的に、Ｃ、Ｄ、および／またはＥなどに一般化することができる。
【００３０】
１つの実施形態では、この方法は、複数の遺伝子座由来の対立遺伝子測定データを使用する工程を含む。１つの実施形態では、遺伝子座は多型である。１つの実施形態では、いくつかまたはほとんどの遺伝子座が多型である。１つの実施形態では、多型遺伝子座は一塩基多型（ＳＮＰ）である。１つの実施形態では、いくつかまたはほとんどの多型遺伝子座がヘテロ接合性である。１つの実施形態では、試験に先立ってどの遺伝子座がヘテロ接合性であるかを決定する必要はない。
【００３１】
１つの実施形態では、本明細書中に開示の方法は、多型遺伝子座組由来の各多型遺伝子座で元のＤＮＡサンプル中に存在する相対的対立遺伝子頻度を保つ選択的富化技術を使用する。いくつかの実施形態では、増幅および／または選択的富化技術は、ＰＣＲ技術（ミニＰＣＲまたはライゲーション媒介ＰＣＲなど）、ハイブリッド形成によるフラグメント捕捉、または循環プローブ（分子反転プローブなど）を含むことができる。いくつかの実施形態では、増幅方法または選択的富化方法は、標的配列への正確なハイブリッド形成の際に、ヌクレオチドプローブの３’末端または５’末端が少数のヌクレオチドによって対立遺伝子の多型部位から分離されるＰＣＲプライマーまたは他のプローブを使用する工程を含むことができる。１つの実施形態では、ハイブリッド形成領域が多型部位とハイブリッド形成するようにデザインされているプローブを排除する。これらの実施形態は、サンプルが単一の個体由来の純粋なゲノムサンプルまたは個体の混合物であるかに無関係に各多型遺伝子座でサンプルの元の対立遺伝子頻度をよりよく保つという点でターゲティング増幅および／または選択的富化を含む他の方法よりも改良されている。
【００３２】
１つの実施形態では、本明細書中に開示の方法は、ＤＮＡ増幅後にハイスループット配列決定して各標的遺伝子座で対立遺伝子頻度を決定するために高効率の高度に多重化されたターゲティングＰＣＲを使用する。高度に多重化されたターゲティングＰＣＲを高効率様式で行うことが可能な１つの技術は、相互にハイブリッド形成する可能性が低いプライマーをデザインする工程を含む。ＰＣＲプローブを、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも５０，０００、または少なくとも１００，０００個の潜在的プライマー対の間（すなわち、プライマーとサンプルＤＮＡとの間）に潜在的に有害な相互作用（すなわち、意図しない相互作用）の熱力学モデルを作製し、次いで、プール中の他のデザイン（すなわち、サンプルＤＮＡ）と不適合なデザインを排除するモデルを使用することによって選択することができる。高度に多重化されたターゲティングＰＣＲを高効率様式で行うことが可能な別の技術は、ターゲティングＰＣＲへの部分的または完全なネスト化アプローチを使用することである。これらのアプローチの１つまたは組み合わせの使用により、単一プール中に少なくとも３００、少なくとも８００、少なくとも１，２００、少なくとも４，０００、または少なくとも１０，０００個のプライマーが多重化され、それにより、得られた増幅ＤＮＡは配列決定した場合にターゲティングされた遺伝子座にマッピングされる大部分のＤＮＡ分子を含む。これらのアプローチの１つまたは組み合わせの使用により、単一プール中の多数のプライマーが多重化され、それにより、得られた増幅ＤＮＡは、標的遺伝子座にマッピングされる５０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９８％超、または９９％超のＤＮＡ分子を含む。
【００３３】
１つの実施形態では、本明細書中に開示の方法は、最尤推定（ＭＬＥ）技術を使用して認められた対立遺伝子測定値の分布が父性包含または父性排除を示すかどうかを決定する工程を含む。最尤推定技術の使用は、有意により高い精度で決定されるであろうという点で、単一仮説棄却技術（ｓｉｎｇｌｅ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を使用する方法と異なり、且つこれらの方法より改良されている。１つの理由は、単一仮説棄却技術が対立仮説に関する情報を含まないことである。別の理由は、最尤技術によって各個別のサンプルについて最適カットオフ閾値が決定可能であることである。別の理由は、最尤技術の使用によって各父性決定の信頼度が計算可能なことである。各決定についての信頼度の計算が可能なことにより、実施者はどのコールが正確であり、且つ誤りである可能性がより高いかを知ることが可能である。いくつかの実施形態では、広範な種々の方法を最尤推定技術と組み合わせて倍数性コールの精度を向上させることができる。１つの実施形態では、本明細書中に開示の方法は、混合サンプル中の胎児ＤＮＡ画分を推定し、この推定を使用して父性コール（決定）および父性コールの信頼度の両方を計算する工程を含む。
【００３４】
１つの実施形態では、本方法は、第１の個体についての複数の多型遺伝子座での遺伝子型測定値およびＤＮＡ混合物についての複数の多型遺伝子座での遺伝子型測定値を考慮して第１の個体と第２の個体との間の血縁関係の程度を示す検定統計量を計算する工程を含み、ここで、ＤＮＡ混合物が第２の個体および血縁個体由来のＤＮＡを含む。１つの実施形態では、第１の個体は擬父であり、第２の個体は懐胎している胎児であり、血縁個体は胎児の母親である。検定統計量を、胎児、母親、および胎児と非血縁であることが公知の複数の個体について計算し、それにより、非血縁個体の計量の分布を得ることができる。胎児、母親、および擬父についての検定統計量を計算することもできる。単一仮説棄却検定を使用して、擬父の遺伝子型データを使用して計算した検定統計量が非血縁個体の遺伝子型データを使用して計算した検定統計量の分布の一部であるかどうかを決定することができる。擬父の遺伝子型データを使用して計算した検定統計量が非血縁個体の遺伝子型データを使用して計算した検定統計量の分布の一部であることが見出された場合、父性を排除することができる（すなわち、擬父を胎児と血縁関係にないと決定することができる）。擬父の遺伝子型データを使用して計算した検定統計量が非血縁個体の遺伝子型データを使用して計算した検定統計量の分布の一部でないと見出された場合、父性に含めることができる（すなわち、擬父を胎児と血縁関係にあると決定することができる）。
【００３５】
１つの実施形態では、父性決定は、２つの可能な仮説（擬父が胎児の実父であるという仮説および擬父が胎児の実父でないという仮説）を考慮して測定された遺伝子型データの確率を決定する工程を含む。次いで、確率をデータを考慮して各仮説について計算することができ、父性を、２つの各仮説の尤度に基づいて確証することができる。決定には、母体血漿に関して取得した遺伝的測定値、擬父由来のＤＮＡに関して取得した遺伝的測定値、および任意選択的に母親の遺伝子型データを使用することができる。１つの実施形態では、母親の遺伝子型データを、母体血漿に関して取得した遺伝子型測定値から推測することができる。１つの実施形態では、確率を、潜在的胎児画分の範囲のパーティションを使用して決定することができる。胎児画分の範囲は、概して、０．０１％〜９９．９％であり得、メッシュは１０％〜１％、１％〜０．１％、および０．１％未満の範囲の増分を有し得る。１つの実施形態では、潜在的胎児画分のパーティションは２％〜３０％であり得、増分は約１％である。１つの実施形態では、メッシュは連続的であり得、尤度を組み合わせよりもむしろ範囲にわたって統合することができる。１つの実施形態では、胎児画分を任意の適切な方法を使用して決定することができる場合、確率をたった１つの胎児画分を使用して決定することができる。メッシュ中の潜在的胎児画分の各々について、２つの仮説を考慮してデータの確率を計算することができる。擬父が実父であるという仮説について、擬父の遺伝子型を確率計算で使用することができる一方で、擬父が実父でないという仮説について、集団ベースの対立遺伝子頻度データを確率計算でさらに使用することができる。１つの実施形態では、仮説を考慮したデータの尤度の計算でペアレントコンテクスト（ｐａｒｅｎｔ  ｃｏｎｔｅｘｔ）およびプラットフォームモデルを使用することができる。１つの実施形態では、尤度を、パーティション中の全胎児画分、全母親遺伝子型、および全父親遺伝子型にわたって組み合わせることができる。１つの実施形態では、親遺伝子型は確率的であり得（例えば、所与のＳＮＰで）、親は遺伝子型ＧＴ（見込み９９％）、ＧＧ（見込み０．５％）、およびＴＴ（見込み０．５％）を有することができ、別の実施形態では、親遺伝子型は１つの値を取ることができる（例えば、所与のＳＮＰで、親は遺伝子型ＧＴを有する）。いくつかの実施形態では、用語確率および尤度は、一般的な用語において見られるように交換可能であり得る。他の実施形態では、２つの用語は交換不可能であり、統計学の当業者が読み取るようにこれらの用語を読み取ることができる。
【００３６】
当該分野で公知のいくつかの方法では、胎児画分を、父系遺伝子型上に排他的に見出される遺伝子座（例えば、Ｙ染色体上に排他的に見出される遺伝子座）またはＲｈｅｓｕｓ−Ｄ遺伝子で取得した測定値を使用して決定する。不運なことに、これらの方法は、胎児が男性であること（遺伝子座がＹ染色体上に排他的に見出される場合）または遺伝子が父系遺伝子型上に存在し、且つ母系遺伝子型中に存在しない場合に遺伝子または遺伝子組をＤＮＡ測定前に同定することができることのいずれかが必要である。さらに困難なことは、親子鑑定法の文脈において、擬父が実父であるか否か分からず、それ故、Ｙ染色体特異的遺伝子座を例外として、どの遺伝子座が父親上に存在することができ、且つ母親上に存在できないのかを決定することは不可能である。したがって、親子鑑定法の文脈において、胎児が女性である場合に胎児画分を決定することは現在のところ不可能であり、胎児が男性である場合、胎児画分をＹ染色体特異的遺伝子座の使用によって決定することが唯一可能である。１つの実施形態では、母体ＤＮＡおよび胎児ＤＮＡを含むＤＮＡ混合物中に存在する胎児ＤＮＡ画分を決定するための方法を本明細書中に開示する。１つの実施形態では、本方法は、常染色体由来の遺伝子型測定値を使用して母体ＤＮＡおよび胎児ＤＮＡを含むＤＮＡ混合物中に存在する胎児ＤＮＡの胎児画分を決定することができる。１つの実施形態では、本方法は、胎児の性別と無関係に母体ＤＮＡおよび胎児ＤＮＡを含むＤＮＡ混合物中に存在する胎児ＤＮＡの胎児画分を決定することができる。１つの実施形態では、本方法は、母親および擬父のどの遺伝子を有し得るかに無関係に母体ＤＮＡおよび胎児ＤＮＡを含むＤＮＡ混合物中に存在する胎児ＤＮＡの胎児画分を決定することができる。本方法は、胎児が男性であることも、父親に存在し、且つ母親に存在しない遺伝子座を同定することができることも必要としない。本方法は、父系遺伝子型が既知である必要がない。本方法は、胎児ＤＮＡおよび母体ＤＮＡの両方の混合物を含む母体血漿中のＤＮＡに関して取得した測定値から推測することができるので、母系遺伝子型が既知である必要がない。
【００３７】
１つの実施形態では、多型（ｐｏｌｙｍｐｒｏｈｉｃ）遺伝子座の分布を、二項分布を使用してモデリングすることができる。１つの実施形態では、多型遺伝子座の分布を、ベータ二項分布を使用してモデリングすることができる。対立遺伝子分布のモデルとしてベータ二項分布を使用することにより、他の分布を使用した場合よりも対立遺伝子の測定値を正確にモデリングすることができる可能性が高い。これにより、より正確な父性決定が可能である。
【００３８】
１つの実施形態では、本明細書中に開示の方法は、データはノイズが多く、各測定値への確率の関連付けによるエラーを含む傾向を考慮する。関連付けられた確率的推定と共に測定データを使用して得られた仮説の組から正確な仮説を選択するための最尤技術の使用により、不正確な測定値を考慮に入れず、且つ正確な測定値が計算で使用されて父性決定が行われる可能性が高くなる。より正確にするために、この方法は、父性決定に関する不正確に測定されたデータの影響を体系的に軽減する。これは、全データを等しく正確であると仮定する方法または範囲外のデータを計算値から任意で排除して父性決定するための方法より改善されている。１つの実施形態では、個別のＳＮＰに、ＳＮＰの質および観察されたリード深度（ｄｅｐｔｈ  ｏｆ  ｒｅａｄ）に基づいて予想される測定値の分散によって重みを付ける。これによって得られた統計量の精度を向上させることができ、それにより、特に境界例で父性コールの精度を有意に向上させることができる。
【００３９】
本明細書中に記載の方法は、少量のＤＮＡが利用可能であるか胎児ＤＮＡの割合が低いサンプルに関して使用した場合に特に有利である。これは、少量のＤＮＡしか利用可能でない場合に起こり得る、相応のより高い対立遺伝子欠落率および／または胎児ＤＮＡおよび母体ＤＮＡの混合サンプル中で胎児ＤＮＡの割合が低い場合の相応のより高い胎児対立遺伝子欠落率に起因する。高い対立遺伝子欠落率（標的個体について大部分の対立遺伝子が測定されなかったことを意味する）により、胎児画分が不正確に計算され、不正確な父性決定がなされる。本明細書中に記載の方法により、混合物中の胎児ＤＮＡであるＤＮＡ分子の割合が４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、８％未満、６％未満、４％未満、およびさらに３％未満である場合に倍数性を正確に決定可能である。
【００４０】
１つの実施形態では、個体のＤＮＡを血縁個体のＤＮＡと混合する場合の測定値に基づいて個体の父性を決定することが可能である。１つの実施形態では、ＤＮＡ混合物は母体血漿中に見出される浮遊ＤＮＡであり、これは既知の遺伝子型を有する母親由来のＤＮＡを含み得、未知の遺伝子型を有する胎児のＤＮＡと混合され得る。次いで、胎児の父性を、実際の測定値を調査し、そして観察されたデータを考慮して父性の尤度を決定することによって決定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の方法を、ＤＮＡ存在量が非常に少ない状況（１個または数個の細胞（典型的には、１０細胞未満、２０細胞未満、４０細胞未満、１００細胞未満、またはＤＮＡと同量）を利用可能な法医学的状況など）で使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の方法を、ＤＮＡが高度に断片化された状況（血漿中に見出されるｆｆＤＮＡなど）で使用することができる。これらの実施形態では、本明細書中に開示の方法は、他のＤＮＡに汚染されていない少量のＤＮＡから父性コールを取得するのに役立つが、少量のＤＮＡでは父性コールは非常に困難である。これらの方法の一部として使用される遺伝的測定値を、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む任意のサンプル（例えば、血液、血漿、体液、尿、毛髪、涙、唾液、組織、皮膚、爪、卵割球、胚、羊水、絨毛膜絨毛サンプル、糞便、胆汁、リンパ液、頸管粘液、精液、または核酸を含む他の細胞もしくは材料であるがこれらに限定されない）に関して取得することができる。１つの実施形態では、本明細書中に開示の方法を、核酸検出法（配列決定、マイクロアレイ、ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、または核酸測定のために使用される他の方法など）を使用して行うことができる。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の方法は、処理済みサンプルに関して取得したＤＮＡ測定値から複数の多型遺伝子座で対立遺伝子比をコンピュータにて計算する工程を含む。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の方法は、本開示中に記載の他の改善点の任意の組み合わせと共に処理済みサンプルに関して取得したＤＮＡ測定値から複数の多型遺伝子座で対立遺伝子比または対立遺伝子分布をコンピュータにて計算する工程を含む。
【００４１】
これらの点のさらなる考察を、本明細書中の他の場所に見出すことができる。
【００４２】
非侵襲性出生前親子鑑定法（ＮＰＰＴ）
非侵襲性出生前親子鑑定法の過程は、多数の工程を含む。工程のいくつかは、（１）胎児から遺伝物質を得る工程；（２）ｅｘ  ｖｉｖｏで混合サンプル中に存在し得る胎児の遺伝物質を富化する工程；（３）ｅｘ  ｖｉｖｏで遺伝物質を増幅する工程；（４）ｅｘ  ｖｉｖｏで遺伝物質中の特異的遺伝子座を優先的に富化する工程；（５）ｅｘ  ｖｉｖｏで遺伝物質を測定する工程；および（６）遺伝子型データをコンピュータにてｅｘ  ｖｉｖｏで分析する工程を含むことができる。これらの６つおよび他の関連する工程の実施を軽減する方法を本明細書中に記載する。方法の工程のうち少なくともいくつかを、身体に直接適用しない。１つの実施形態では、本開示は、身体から単離および分離された組織および他の生体材料に適用される処置方法および診断方法に関する。方法の工程のうち少なくともいくつかを、コンピュータにて実行する。
【００４３】
本開示のいくつかの実施形態により、臨床家は胎児の遺伝物質の採取によって新生児の健康に危険が及ばず、且つ母親が侵襲性手順を受ける必要がないような非侵襲性様式で母親が懐胎している胎児の遺伝的状態、特に別の個体との生物学的関係を決定することが可能である。
【００４４】
現代の技術的進歩により、ハイスループット配列決定および遺伝子型決定アレイなどの方法を使用して遺伝子サンプルから大量の遺伝情報を測定することが可能になっている。本明細書中に開示の方法により、臨床家は、大量のデータをより有利に活用でき、且つ胎児の遺伝上の正体をより正確に診断できる。１つの実施形態では、インフォマティクスベースの方法により、当該分野で現在公知の方法よりも正確に父性を決定することができる。多数の実施形態の詳細を以下に示す。異なる実施形態は、上記工程の異なる組み合わせを含むことができる。異なる工程の異なる実施形態の種々の組み合わせを交換可能に使用することができる。
【００４５】
１つの実施形態では、血液サンプルを妊娠中の母親から採取し、母体起源のＤＮＡおよび胎児起源のＤＮＡの両方の混合物を含む母親の血液の血漿中の浮遊ＤＮＡを単離し、これを使用して胎児の倍数性の状態を決定する。１つの実施形態では、本明細書中に開示の方法は、対立遺伝子比および／または対立遺伝子分布が富化の際に合理的に一貫したままである方法での多型対立遺伝子に対応するＤＮＡ混合物中のＤＮＡ配列の優先的富化を含む。１つの実施形態では、本方法は、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）を使用して単離したＤＮＡを増幅する工程を含む。１つの実施形態では、本明細書中に開示の方法は、高い割合の得られた分子が標的遺伝子座に対応するようなターゲティングＰＣＲベースの増幅を含む。１つの実施形態では、本明細書中に開示の方法は、母体起源のＤＮＡおよび胎児起源のＤＮＡの両方を含むＤＮＡ混合物を配列決定する工程を含む。１つの実施形態では、本方法は、核酸配列を検出するためにデザインしたマイクロアレイ（ＳＮＰアレイなど）を使用して増幅ＤＮＡを測定する工程を含む。１つの実施形態では、本明細書中に開示の方法は、測定された対立遺伝子分布を使用して母親が懐胎している胎児の父性を決定する工程を含む。１つの実施形態では、本明細書中に開示の方法は、決定された父性の状態を臨床家に報告する工程を含む。１つの実施形態では、本明細書中に開示の方法は、臨床行動を取る（例えば、追跡侵襲性試験（絨毛診断または羊水穿刺など）、子の誕生の準備、または胎児の選択的中絶を行う）工程を含む。
【００４６】
本出願は、米国特許出願第１１／６０３，４０６号（２００６年１１月２８日出願）（米国特許出願公開第２００７０１８４４６７号）；米国特許出願第１２／０７６，３４８号（２００８年３月１７日出願）（米国特許出願公開第２００８０２４３３９８号）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０９／５２７３０（２００９年８月４日出願）（ＰＣＴ公開番号：ＷＯ／２０１０／０１７２１４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１０／０５０８２４（２０１０年９月３０日出願）（ＰＣＴ公開番号：ＷＯ／２０１１／０４１４８５）、米国特許出願第１３／１１０，６８５号（２０１１年５月１８日出願）、および米国特許出願第１３／３００，２３５号（２０１１年１１月１８日出願）を参照している。本出願で使用したいくつかの語彙は、これらの文献中で既出の語彙を有し得る。本明細書中に記載のいくつかの概念は、これらの文献中に見出される概念を考慮してより深く理解することができる。
【００４７】
浮遊胎児ＤＮＡを含む母体血のスクリーニング
本明細書中に記載の方法を使用して、小児、胎児、または他の標的個体が別の個体と遺伝的に関連するかどうかを決定するのを補助することができる。いくつかの実施形態では、標的個体の遺伝物質が別の個体由来の一定量の遺伝物質の存在下で見出される場合にこれを行うことができる。１つの実施形態では、本方法を使用して、父親および任意選択的に母親由来の遺伝子サンプルと共に母体血中に見出される浮遊胎児ＤＮＡを使用して胎児が擬父と遺伝的に関連するかどうかを決定するのを補助することができる。１つの実施形態では、胎児は、胎児が胎児を懐胎している母親と遺伝的に関連しないような卵子ドナー由来の卵子に由来し得る。１つの実施形態では、本方法は、標的ＤＮＡ量が非標的ＤＮＡと任意の比率である場合に適用可能である。例えば、標的ＤＮＡは、存在するＤＮＡのうち０．０００００１％と９９．９９９９９９％との間のいずれかを構成し得る。１つの実施形態では、非標的夾雑ＤＮＡは複数の個体に起因し得る。これは、関連のある非標的個体の数人または全員に由来する遺伝子データが既知である場合、または前記血縁個体由来の遺伝子サンプルが利用可能である場合に有利である。１つの実施形態では、本明細書中に開示の方法を使用して、胎児ＤＮＡを含む母体血由来の胎児の遺伝子型データを決定することができる。妊娠中の女性の子宮内に複数の胎児が存在する場合、または、他の夾雑ＤＮＡが、例えば、他の既に生まれている同胞由来のサンプル中に存在し得る場合にこの方法を使用することができる。
【００４８】
この技術は、胎盤絨毛を介して母体循環系へのアクセスが増加する胎児血球の現象を利用することができる。通常、非常に少数の胎児細胞のみがこの様式で母体循環系に入る（胎児−母体出血についてのクライハウアー・ベトケ試験で陽性になるほど十分でない）。胎児細胞を選別し、特定のＤＮＡ配列を調査するための種々の技術（しかし、侵襲性手順が本質的に有するリスクの無い）によって分析することができる。この技術はまた、問題の胎盤組織が胎児と同一の遺伝子型のＤＮＡを含む場合に胎盤組織のアポトーシス後のＤＮＡ放出によって母体循環系へのアクセスが増加する浮遊胎児ＤＮＡの現象を使用することができる。母体血漿中に見出される浮遊ＤＮＡは、３０〜４０％胎児ＤＮＡもの高比率で胎児ＤＮＡを含むことが示されている。
【００４９】
１つの実施形態では、妊娠中の女性から採血することができる。研究により、母体血が母体起源の浮遊ＤＮＡに加えて少量の胎児由来の浮遊ＤＮＡを含み得ることが示されている。さらに、典型的には核ＤＮＡを含まない母体起源の多数の血球に加えて、胎児起源のＤＮＡを含む有核胎児血球も存在し得る。胎児ＤＮＡを単離するか胎児ＤＮＡ中に富化された画分を作製するための当該分野で公知の方法が多数存在する。例えば、クロマトグラフィは、胎児ＤＮＡ中で富化される一定の画分を作製することを示している。
【００５０】
一旦比較的非侵襲的な様式で採取され、母体ＤＮＡに比例するかその元の比率で富化された一定量の胎児ＤＮＡ（細胞ＤＮＡまたは浮遊ＤＮＡのいずれか）を含む母体血、血漿、または他の流体のサンプルが得られると、前記サンプル中に見出されたＤＮＡを遺伝子型決定することができる。いくつかの実施形態では、静脈（例えば、尺側皮静脈（ｂａｓｉｌｉｃａ  ｖｅｉｎ））から採血するための針を使用して、採血することができる。本明細書中に記載の方法を使用して、胎児の遺伝子型データを決定することができる。例えば、本方法を使用して１つ以上の染色体で倍数性の状態を決定することができ、本方法を使用して１つのＳＮＰまたはＳＮＰ組の正体（挿入、欠失、および転座が含まれる）を決定することができる。本方法を使用して１つ以上のハプロタイプ（１つ以上の遺伝子型の特徴の元の親が含まれる）を決定することができる。本方法を使用して胎児と（ａｎ）別の個体との間の血縁関係の程度を決定することもできる。
【００５１】
この方法は任意の遺伝子型決定法および／または配列決定法（ＩＬＬＵＭＩＮＡ  ＩＮＦＩＮＩＵＭ  ＡＲＲＡＹプラットフォーム、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ  ＧＥＮＥＣＨＩＰ、ＩＬＬＵＭＩＮＡゲノム分析器、またはＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＧＩＥＳのＳＯＬＩＤ  ＳＹＳＴＥＭなど）のために使用することができる任意の核酸をこれらから測定した遺伝子型データと共に使用して行うことに留意のこと。これには、血漿由来の抽出された浮遊ＤＮＡまたはその増幅物（例えば、全ゲノム増幅、ＰＣＲ）；他の細胞型（例えば、全血由来のヒトリンパ球）由来のゲノムＤＮＡまたはその増幅物が含まれる。ＤＮＡ調製のために、これらのプラットフォームのうちの１つに適切なゲノムＤＮＡを生成する任意の抽出方法または精製方法も行うであろう。この方法は、ＲＮＡサンプルを使用して等しく首尾よく行うことができる。１つの実施形態では、サンプルの保存を、分解を最小にする方法で行うことができる（例えば、氷点下、約−２０℃、または低温）。
【００５２】
ペアレンタルサポート（Ｐａｒｅｎｔａｌ  Ｓｕｐｐｏｒｔ）
いくつかの実施形態を、ＰＡＲＥＮＴＡＬ  ＳＵＰＰＯＲＴＴＭ（ＰＳ）法（その実施形態は、米国特許出願第１１／６０３，４０６号（米国特許出願公開第２００７０１８４４６７号）、米国特許出願第１２／０７６，３４８号（米国特許出願公開第２００８０２４３３９８号）、米国特許出願第１３／１１０，６８５号、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０９／５２７３０号（ＰＣＴ公開番号：ＷＯ／２０１０／０１７２１４）、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１０／０５０８２４号（ＰＣＴ公開番号：ＷＯ／２０１１／０４１４８５）、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３７０１８号（ＰＣＴ公開番号：ＷＯ／２０１１／１４６６３２）、およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／６１５０６号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている）と組み合わせて使用することができる。ＰＡＲＥＮＴＡＬ  ＳＵＰＰＯＲＴＴＭは、遺伝子データを分析するために使用することができるインフォマティクスベースのアプローチである。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の方法を、ＰＡＲＥＮＴＡＬ  ＳＵＰＰＯＲＴＴＭ法の一部と見なすことができる。いくつかの実施形態では、ＰＡＲＥＮＴＡＬ  ＳＵＰＰＯＲＴＴＭ法は、特に疾患関連対立遺伝子、他の目的の対立遺伝子、標的個体中の１つまたは複数の染色体の倍数性の状態、および／または別の個体と標的個体との関係の範囲を決定するための標的個体、その個体由来の１つまたは少数の細胞、または標的個体由来のＤＮＡおよび１人または複数の他の個体由来のＤＮＡからなるＤＮＡ混合物の遺伝子データを高い精度で決定するために使用することができる方法の収集物である。ＰＡＲＥＮＴＡＬ  ＳＵＰＰＯＲＴＴＭは、これらの方法のいずれかをいうことができる。ＰＡＲＥＮＴＡＬ  ＳＵＰＰＯＲＴＴＭは、インフォマティクスベースの方法の一例である。
【００５３】
ＰＡＲＥＮＴＡＬ  ＳＵＰＰＯＲＴＴＭ法は、既知の親の遺伝子データ（すなわち、母親および／または父親のハプロタイプおよび／または二倍体遺伝子データ）を、減数分裂機構および標的ＤＮＡの不完全な測定、ならびにおそらく１人以上の血縁個体の知識と共に、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにて、複数の対立遺伝子での遺伝子型、および／または胚または任意の標的細胞の父性状態、ならびに重要な遺伝子座の位置での標的ＤＮＡを高信頼度で再構築するための集団ベースの交差頻度と共に使用する。ＰＡＲＥＮＴＡＬ  ＳＵＰＰＯＲＴＴＭ法は、異なる状況についてどの遺伝子データを予想することができるかという仮説を立て、認められた遺伝子データを考慮して各状況の尤度を計算し、それにより、どの状況が最も可能性が高いかを決定するために減数分裂機構の知識および標的ＤＮＡの不完全な測定と共に既知の親遺伝子データ（すなわち、母親および／または父親のハプロタイプおよび／または二倍体遺伝子データ）を使用する。いくつかの実施形態では、問題の状況には、標的個体が目的の疾患関連ハプロタイプを有するかどうか、標的個体が目的の表現型関連ハプロタイプを遺伝しているかどうか、標的個体が１つ以上の異数体染色体を有するかどうか、および／または標的個体が目的の個体に関連するかどうか、および関係がどの程度であり得るかが含まれ得る。ＰＡＲＥＮＴＡＬ  ＳＵＰＰＯＲＴＴＭ法により、ノイズの多い遺伝子データが除去される。ＰＡＲＥＮＴＡＬ  ＳＵＰＰＯＲＴＴＭは、特に、標的個体由来の遺伝物質がほんのわずかしか利用可能でない場合（例えば、ＮＰＤまたはＮＰＰＴ）および遺伝子型の直接測定が別の個体由来の夾雑ＤＮＡシグナルに起因して本質的にノイズが多い場合に特に適切であり得る。ＰＡＲＥＮＴＡＬ  ＳＵＰＰＯＲＴＴＭ法は、従来の順序付けられていない二倍体測定値を対立遺伝子の欠落、混入、可変増幅バイアス、および他のエラーの比率が高いことによって特徴づけることができるにもかかわらず、染色体セグメントのコピー数と共に胚上に高度に正確な順序付けた二倍体対立遺伝子配列を再構築することができる。本方法は、根底にある遺伝子モデルおよび根底にある測定エラーモデルの両方を使用することができる。遺伝子モデルは、各ＳＮＰでの対立遺伝子の確率およびＳＮＰ間での交差確率の両方を決定することができる。対立遺伝子の確率を親から得たデータに基づいて各ＳＮＰでモデリングすることができ、国際ＨａｐＭａｐ計画によって開発されたＨａｐＭａｐデータベースから得たデータに基づいてＳＮＰ間の交差確率をモデリングすることができる。根底にある適切な遺伝子モデルおよび測定エラーモデルを考慮して、計算効率を修正して最大事後（ＭＡＰ）推定を使用して、胚内の各ＳＮＰでの正確で順序付けた対立遺伝子値を推定することができる。
【００５４】
定義
一塩基多型（ＳＮＰ）は、同種の２メンバーのゲノム間で異なり得る単一のヌクレオチドをいう。この用語の使用には、各バリアントが起こる頻度に対するいかなる制限も意味すべきではない。
【００５５】
配列は、ＤＮＡ配列または遺伝子配列をいう。配列は、個体中のＤＮＡ分子またはＤＮＡ鎖の物理的な一次構造をいうことができる。配列は、ＤＮＡ分子中に見出されるヌクレオチド配列またはＤＮＡ分子に対する相補鎖をいうことができる。配列は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでのその表示としてＤＮＡ分子中に含まれる情報をいうことができる。
【００５６】
遺伝子座は、個体のＤＮＡ上の特定の目的領域をいう。この領域は、ＳＮＰ（潜在的な挿入もしくは欠失部位、またはいくつかの他の関連する遺伝的変異の部位）をいうことができる。疾患関連ＳＮＰはまた、疾患関連遺伝子座をいうことができる。
【００５７】
多型対立遺伝子（「多型遺伝子座」ともいう）は、遺伝子型が所与の種内の個体間で変動する対立遺伝子または遺伝子座をいう。多型対立遺伝子のいくつかの例には、一塩基多型、ＳＴＲ多型、欠失、重複、および逆位が含まれる。
【００５８】
多型部位は、個体間で異なる多型領域中で見出される特異的ヌクレオチドをいう。
【００５９】
対立遺伝子は、特定の遺伝子座を占める遺伝子をいう。
【００６０】
遺伝子データ（「遺伝子型データ」ともいう）は、１以上の個体のゲノムの態様を記載したデータをいう。遺伝子データは、１つの遺伝子座または１組の遺伝子座、配列の一部もしくは全体、染色体の一部もしくは全体、またはゲノム全体をいうことができる。遺伝子データは、１つまたは複数のヌクレオチドの正体をいうことができる。遺伝子データは、一組の連続ヌクレオチド、またはゲノム中の異なる位置由来のヌクレオチド、またはその組み合わせをいうことができる。遺伝子型データは典型的にはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにあるが、配列中の物理的ヌクレオチドを化学的にコード化された遺伝子データと見なすことも可能である。遺伝子型データは、「個体上にある」、「個体に属する」、「個体にある」、「個体に由来する」、または「個体上にある」ということができる。遺伝子型データは、遺伝子型決定プラットフォームからの出力測定値をいうことができる。この測定値は遺伝物質に関して取得される。
【００６１】
遺伝物質（「遺伝子サンプル」ともいう）は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む１以上の個体由来の物質（組織または血液など）をいう。
【００６２】
信頼度は、コールされたＳＮＰ、対立遺伝子、対立遺伝子組、倍数性コール、または父性コールが正確である統計的尤度をいう。
【００６３】
異数性は、誤った数の染色体が細胞内に存在する状態をいう。ヒト体細胞の場合、異数性は、細胞が２２対の常染色体および１対の性染色体を含まない場合をいうことができる。ヒト配偶子の場合、異数性は、細胞が２３組の各染色体の一方を含まない場合をいうことができる。単染色体型の場合、異数性は、２つを超えるか２つ未満の相同であるが同一でない染色体コピーが存在する場合、または同一の親を起源とする２つの染色体コピーが存在する場合をいうことができる。
【００６４】
染色体は、単一の染色体コピー（正常な体細胞中では４６本存在する単一のＤＮＡ分子を意味する）をいうことができる。例として「母体由来１８番染色体」が挙げられる。染色体はまた、染色体型をいうことができ、正常なヒト体細胞中に２３組存在する。例には「１８番染色体」が挙げられる。
【００６５】
モノソミーは、細胞が１つの染色体型のみを含む状態をいう。
【００６６】
ダイソミーは、細胞が２つの染色体型を含む状態をいう。
【００６７】
片親性ダイソミーは、細胞が２つの染色体型を含み、且つ両染色体が片方の親を起源とする状態をいう。
【００６８】
トリソミーは、細胞が３つの染色体型を含む状態をいう。
【００６９】
遺伝物質の状態、または簡潔に「遺伝的状態」は、ＤＮＡ上のＳＮＰ組の正体、遺伝物質の相特定された（ｐｈａｓｅｄ）ハプロタイプ、またはＤＮＡ配列（挿入、欠失、反復、および変異が含まれる）をいうことができる。これは、１つ以上の染色体、染色体セグメント、または染色体セグメント組の倍数性の状態をいうこともできる。
【００７０】
父性の確証または「父性の決定」は、擬父が懐胎している胎児の実父であるか否かの確証もしくは決定または擬父が胎児の実父である尤度の決定または確証をいう。
【００７１】
父性決定は、擬父が胎児の実父であるか否かの決定をいう。父性決定は、父性の確証、コール、または決定の結果である。
【００７２】
父性は、個体の実父の正体をいう。
【００７３】
父性包含は、擬父が胎児の実父であることの確証をいう。
【００７４】
父性排除は、擬父が胎児の実父ではないことの確証をいう。
【００７５】
擬父は、胎児との親子関係が問題となっている男性をいう。
【００７６】
個体の実父は、遺伝物質が個体によって遺伝された男性をいう。
【００７７】
対立遺伝子比は、サンプルまたは個体中に存在する多型遺伝子座での各対立遺伝子の量の間の比をいう。サンプルを配列決定によって測定する場合、対立遺伝子比は、遺伝子座での各対立遺伝子をマッピングする配列リード比をいうことができる。サンプルを強度ベースの測定法によって測定する場合、対立遺伝子比は、前記測定法によって推定された遺伝子座に存在する各対立遺伝子の量の比をいうことができる。
【００７８】
対立遺伝子分布または「対立遺伝子数分布」は、遺伝子座組中の各遺伝子座について存在する各対立遺伝子の相対的な量をいう。対立遺伝子分布は、個体、サンプル、またはサンプルに関して取得した測定値組をいうことができる。配列決定の文脈では、対立遺伝子分布は、多型遺伝子座組中の各対立遺伝子の特定の対立遺伝子にマッピングされるリード数または可能性のあるリード数をいう。対立遺伝子測定値を、確率的に処理することができるか（すなわち、所与の対立遺伝子が所与の配列リードについて存在する尤度が０と１との間の分数である）、二進法で処理することができる（すなわち、任意の所与のリードを正確に特定の対立遺伝子のゼロまたは１コピーであると見なす）。
【００７９】
対立遺伝子バイアスは、ヘテロ接合性遺伝子座での対立遺伝子の測定比が元のＤＮＡサンプル中に存在した比と異なる程度をいう。特定の遺伝子座での対立遺伝子バイアス度は、その遺伝子座での元のＤＮＡサンプル中の対立遺伝子の比で割った測定時にその遺伝子座で認められた対立遺伝子比に等しい。対立遺伝子バイアスを１を超えると定義することができる。したがって、対立遺伝子バイアス度の計算が値ｘ（１未満である）を返す場合、対立遺伝子バイアス度を１／ｘと言い換えることができる。対立遺伝子バイアスは、増幅バイアス、精製バイアス、または異なる対立遺伝子に異なって影響を及ぼすいくつかの他の現象に起因し得る。
【００８０】
プライマー（「ＰＣＲプローブ」ともいう）は、単一のＤＮＡ分子（ＤＮＡオリゴマー）またはＤＮＡ分子が同一であるか同一に近いＤＮＡ分子の収集物（ＤＮＡオリゴマー）をいう。プライマーは、ターゲティングされた多型遺伝子座とハイブリッド形成するようにデザインされた領域を含み、ＰＣＲ増幅するようにデザインされたプライミング配列を含むことができる。プライマーは、分子バーコードを含むこともできる。プライマーは、各個別の分子で異なるランダム領域を含むことができる。
【００８１】
ハイブリッド捕捉プローブは、種々の方法（ＰＣＲまたは直接合成など）によって生成され、サンプル中の特異的標的ＤＮＡ配列の１つの鎖に相補的であることが意図される、おそらく修飾された任意の核酸配列をいう。外因性ハイブリッド捕捉プローブを調製したサンプルに添加し、変性（ｄｅａｎｔｕｒｅ）再アニーリングプロセスによってハイブリッド形成させて外因性−内因性フラグメントの二重鎖を形成することができる。次いで、これらの二重鎖を、種々の手段によってサンプルから物理的に分離することができる。
【００８２】
配列リードは、クローン配列決定法を使用して測定したヌクレオチド塩基配列を示すデータをいう。クローン配列決定は、１つの元のＤＮＡ分子の単一クローン、クローン、またはクラスターを示す配列データを作成することができる。配列リードは、配列の各塩基の位置でクオリティスコアと関連付けてヌクレオチドが正確にコールされている確率も示すことができる。
【００８３】
配列リードのマッピングは、特定の生物のゲノム配列中の配列リードの元の位置の決定プロセスである。配列リード起源の位置は、リード配列のヌクレオチド配列およびゲノム配列の類似性に基づく。
【００８４】
ホモ接合性は、対応する染色体遺伝子座で類似の対立遺伝子を有することをいう。
【００８５】
ヘテロ接合性は、対応する染色体遺伝子座で異なる対立遺伝子を有することをいう。
【００８６】
ヘテロ接合性率は、所与の遺伝子座でヘテロ接合性対立遺伝子を有する集団中の個体の比率をいう。ヘテロ接合性率は、個体またはＤＮＡサンプル中の所与の遺伝子座での予想されるか測定された対立遺伝子比もいうことができる。
【００８７】
ハプロタイプは、典型的には同一染色体上にともに遺伝する複数の遺伝子座での対立遺伝子の組み合わせをいう。ハプロタイプは、所与の遺伝子座組間に起こった組み換え事象数に応じてわずか２つの遺伝子座または染色体全体をいうことができる。ハプロタイプは、統計的に関連する単一の染色分体上の一塩基多型（ＳＮＰ）組をいうこともできる。
【００８８】
ハプロタイプデータ（「相特定データ」または「順序付けた遺伝子データ」ともいう）は、二倍体ゲノムまたは多倍数体ゲノム中の単一の染色体（すなわち、二倍体ゲノム中の分離した母系または父系染色体コピーのいずれか）由来のデータをいう。
【００８９】
相特定は、順序付けられていない二倍体（または多倍数体）遺伝子データを考慮した個体のハプロタイプ遺伝子データの決定作業をいう。これは、１つの染色体上で見出された対立遺伝子組について１つの対立遺伝子での２つの遺伝子のどちらが個体中の２つの相同染色体のそれぞれに関連するかを決定する作業をいうことができる。
【００９０】
相特定データは、１つ以上のハプロタイプが決定されている遺伝子データをいう。
【００９１】
胎児は、「胎児に由来すること」または「胎児と遺伝的に類似する胎盤領域に由来すること」をいう。妊娠中の女性では、胎盤のいくつかの部分が胎児と遺伝的に類似しており、母体血中に見出される浮遊胎児ＤＮＡは胎児と適合する遺伝子型を有する胎盤部分を起源としたかもしれない。
【００９２】
胎児起源のＤＮＡは、その遺伝子型が胎児の遺伝子型と本質的に等価である本来は細胞の一部であったＤＮＡをいう。胎児中の染色体の半分における遺伝情報が胎児の母親から遺伝され、いくつかの実施形態では、胎児細胞に由来するこれらの母体から遺伝した染色体由来のＤＮＡを、「胎児起源」であり、「母体起源」でないと見なすことに留意のこと。
【００９３】
母体起源のＤＮＡは、その遺伝子型が母親の遺伝子型と本質的に等価である本来は細胞の一部であったＤＮＡをいう。
【００９４】
子は、胚、卵割球、または胎児をいうことができる。本明細書中に開示の実施形態では、記載の概念は、生まれた子、胎児、胚、または胚由来の細胞組である個体に等しく十分に適用することに留意のこと。用語子の使用は、子と呼ばれる個体が親の遺伝的子孫であることを暗示することを単純に意味し得る。
【００９５】
親は、個体の遺伝的母親または父親をいう。個体は、典型的には、両親（母親および父親）を有するが、これは、必ずしも遺伝的または染色体のキメラ現象などにおいて事実ではない。
【００９６】
母親は、個体の実母をいうことができ、そして／または、発育している個体を保持している女性をいうことができる。
【００９７】
ペアレンタルコンテクスト（ｐａｒｅｎｔａｌ  ｃｏｎｔｅｘｔ）は、標的の両親の一方または両方についての２つの関連する各染色体上の所与のＳＮＰの遺伝的状態をいう。
【００９８】
母体血漿は、妊娠中の女性由来の血液の血漿部分をいう。
【００９９】
臨床決定は、個体の健康または生存に影響をおよぼす転帰を有する行動を取るか取らないための任意の決定をいう。出生前親子鑑定法の文脈では、臨床決定は、胎児を中絶するか中絶しないかの決定をいうことができる。臨床決定は、さらなる試験を行うか、子の誕生の準備をするための行動を取るための決定もいうことができる。
【０１００】
診断ボックスは、本明細書中に開示の方法の１つまたは複数の態様を実施するようにデザインされた機械または機械の組み合わせをいう。１つの実施形態では、診断ボックスを、患者管理地点に配置することができる。１つの実施形態では、診断ボックスは、ターゲティング増幅後に配列決定を行うことができる。１つの実施形態では、診断ボックスは、単独または技術者の助けを借りて機能することができる。
【０１０１】
インフォマティクスベースの方法または「インフォマティクスベースのアプローチ」は、大量のデータを解明するために統計学に重度に依拠する方法をいう。出生前診断の文脈では、これは、例えば、分子アレイまたは配列決定からの大量の遺伝子データを考慮して状態を物理的に直接測定することによるよりもむしろ最も可能性の高い状態を統計的に推測することによって１つ以上の染色体での倍数性の状態または１つ以上の対立遺伝子での対立遺伝子の状態を決定するようにデザインされた方法をいう。本開示の１つの実施形態では、インフォマティクスベースの技術は、本特許中に開示されている技術であり得る。本開示の１つの実施形態では、これはＰＡＲＥＮＴＡＬ  ＳＵＰＰＯＲＴＴＭであり得る。
【０１０２】
１つまたは複数の遺伝子座に対応するＤＮＡの優先的富化または１つまたは複数の遺伝子座でのＤＮＡの優先的富化は、遺伝子座に対応する富化後ＤＮＡ混合物中のＤＮＡ分子の比率が遺伝子座に対応する富化前ＤＮＡ混合物中のＤＮＡ分子の比率より高い任意の方法をいう。本方法は、遺伝子座に対応するＤＮＡ分子の選択的増幅を含むことができる。本方法は、遺伝子座に対応しないＤＮＡ分子を除去する工程を含むことができる。
【０１０３】
増幅は、ＤＮＡ分子のコピー数を増加させる方法をいう。
【０１０４】
選択的増幅は、特定のＤＮＡ分子またはＤＮＡの特定の領域に対応するＤＮＡ分子のコピー数を増加させる方法をいうことができる。これは、ターゲティングされないＤＮＡ分子または領域を増加させるよりも多数の特定のターゲティングされたＤＮＡ分子またはＤＮＡのターゲティングされた領域のコピー数を増加させる方法もいうことができる。選択的増幅は、優先的富化方法であり得る。
【０１０５】
ユニバーサルプライミング配列は、例えば、ライゲーション、ＰＣＲ、またはライゲーション媒介ＰＣＲによって標的ＤＮＡ分子集団に付加することができるＤＮＡ配列をいう。一旦標的分子集団に添加されると、ユニバーサルプライミング配列に特異的なプライマーを使用して、１対の増幅プライマーを使用して標的集団を増幅することができる。ユニバーサルプライミング配列は、典型的には、標的配列に関連しない。
【０１０６】
ユニバーサルアダプターまたは「ライゲーションアダプター」または「ライブラリータグ」は、標的二本鎖ＤＮＡ分子集団の５’末端および３’末端に共有結合することができるユニバーサルプライミング配列を含むＤＮＡ分子である。アダプターの添加により、ＰＣＲ増幅が起こり得る標的集団の５’末端および３’末端に対するユニバーサルプライミング配列が得られ、それにより、単一の増幅プライマー対を使用して標的集団から全分子を増幅することができる。
【０１０７】
ターゲティングは、ＤＮＡ混合物中の遺伝子座組に対応するＤＮＡ分子を選択的に増幅するかそうでなければ優先的に富化するために使用される方法をいう。
【０１０８】
仮説は、擬父が胎児の実父であるか擬父が胎児の実父でない可能性をいう。
【０１０９】
決定、確証、および計算を交換可能に使用することができる。
【０１１０】
ペアレンタルコンテクスト
ペアレンタルコンテクストは、標的の両親のうちの１人または両方についての２つの関連する各染色体上の所与の対立遺伝子の遺伝的状態をいう。１つの実施形態では、ペアレンタルコンテクストは標的の対立遺伝子の状態をいわず、むしろ、親の対立遺伝子の状態をいうことに留意のこと。所与のＳＮＰについてのペアレンタルコンテクストは、４塩基対（２つの父系および２つの母系）からなり得る。これらの塩基対は、同一または相互に異なり得る。ペアレンタルコンテクストは、典型的には、「ｍ１ｍ２｜ｆ１ｆ２」（式中、ｍ１およびｍ２は２つの母系染色体上の所与のＳＮＰの遺伝的状態であり、ｆ１およびｆ２は２つの父系染色体上の所与のＳＮＰの遺伝的状態である）と記載される。いくつかの実施形態では、ペアレンタルコンテクストを、「ｆ１ｆ２｜ｍ１ｍ２」と記載することができる。下付き文字「１」および「２」が第１および第２の染色体の所与の対立遺伝子での遺伝子型をいうことに留意のこと。染色体を「１」とラベリングし、「２」とラベリングする選択は任意であり得ることにも留意のこと。
【０１１１】
この開示では、ＡおよびＢは、塩基対の正体を一般に示すためにしばしば使用されることに留意のこと。ＡまたはＢは、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、Ａ（アデニン）、またはＴ（チミン）を同様に十分に示すことができる。例えば、所与のＳＮＰベースの対立遺伝子で、母親の遺伝子型が１つの染色体上のそのＳＮＰでＴであり、且つ相同染色体上のそのＳＮＰでＧであり、対立遺伝子での父親の遺伝子型が両相同染色体上のそのＳＮＰでＧである場合、標的個体の対立遺伝子がＡＢ｜ＢＢのペアレンタルコンテクストを有するということができ、対立遺伝子がＡＢ｜ＡＡのペアレンタルコンテクストを有するともいうことができる。理論上は、任意の４つの可能なヌクレオチドが所与の対立遺伝子で起こり得、したがって、例えば、所与の対立遺伝子で母親が遺伝子型ＡＴを有し、父親が遺伝子型ＧＣを有することが可能であることに留意のこと。しかし、経験的データは、ほとんどの場合、４つの可能な塩基対のうちのたった２つが所与の対立遺伝子で認められることを示す。例えば、単一の縦列反復を使用する場合、２つを超える、４つを超える、さらに１０を超えるペアレンタルコンテクストを有することが可能である。この開示では、考察によりたった２つの可能な塩基対が所与の対立遺伝子で認められるであろうと仮定されるが、この仮定が保持されない場合を考慮するために本明細書中に開示の実施形態を修正することができる。
【０１１２】
「ペアレンタルコンテクスト」は、同一のペアレンタルコンテクストを有する標的ＳＮＰの組またはサブセットをいうことができる。例えば、標的個体の所与の染色体上に１０００個の対立遺伝子が測定された場合、コンテクストＡＡ｜ＢＢは１，０００個の対立遺伝子群中の全ての対立遺伝子組をいうことができ、ここで、標的の母親の遺伝子型がホモ接合性であった場合、標的の父親の遺伝子型はホモ接合性であるが、母系遺伝子型および父系遺伝子型がその遺伝子座で類似していない。親のデータが相特定されていない場合（従って、ＡＢ＝ＢＡ）、以下の９つの可能なペアレンタルコンテクストが存在する：ＡＡ｜ＡＡ、ＡＡ｜ＡＢ、ＡＡ｜ＢＢ、ＡＢ｜ＡＡ、ＡＢ｜ＡＢ、ＡＢ｜ＢＢ、ＢＢ｜ＡＡ、ＢＢ｜ＡＢ、およびＢＢ｜ＢＢ。親のデータが相特定されている場合（したがって、ＡＢ≠ＢＡ）、以下の１６個の異なる可能なペアレンタルコンテクストが存在する：ＡＡ｜ＡＡ、ＡＡ｜ＡＢ、ＡＡ｜ＢＡ、ＡＡ｜ＢＢ、ＡＢ｜ＡＡ、ＡＢ｜ＡＢ、ＡＢ｜ＢＡ、ＡＢ｜ＢＢ、ＢＡ｜ＡＡ、ＢＡ｜ＡＢ、ＢＡ｜ＢＡ、ＢＡ｜ＢＢ、ＢＢ｜ＡＡ、ＢＢ｜ＡＢ、ＢＢ｜ＢＡ、およびＢＢ｜ＢＢ。染色体上のあらゆるＳＮＰ対立遺伝子（性染色体上のいくつかのＳＮＰを除く）は、これらのペアレンタルコンテクストのうちの１つを有する。一方の親についてのペアレンタルコンテクストがヘテロ接合性であるＳＮＰ組を、ヘテロ接合性コンテクストということができる。
【０１１３】
本明細書中に開示の実施形態の異なる実施
標的個体の父性の決定方法を本明細書中に開示する。標的個体は、卵割球、胚、または胎児であり得る。本開示のいくつかの実施形態では、個体の父性の決定方法は、本明細書中に記載の任意の工程およびその組み合わせを含むことができる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、胎児の父性の決定で使用すべき遺伝物質の供給源は、母体血から単離した胎児細胞（有核胎児赤血球など）であり得る。本方法は、妊娠中の母親から血液サンプルを得る工程を含むことができる。本開示のいくつかの実施形態では、胎児の父性の決定で使用すべき遺伝物質は母体血漿由来の浮遊ＤＮＡであり得、ここで、浮遊ＤＮＡは胎児ＤＮＡおよび母体ＤＮＡの混合物から構成され得る。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、胎児の遺伝物質の供給源は、母体血から単離した胎児細胞（有核胎児赤血球など）であり得る。本方法は、妊娠中の母親から血液サンプルを得る工程を含むことができる。本方法は、特定の色の組み合わせが有核赤血球と固有に関連し、且つ類似の色の組み合わせが母体血中に存在するいかなる他の細胞とも関連しないという考えに基づいて視覚的技術を使用して胎児赤血球を単離する工程を含むことができる。有核赤血球に関連する色の組み合わせには、核周辺のヘモグロビンの赤色（この色を染色によってより明確にすることができる）および染色することができる核物質の色（例えば、青色）が含まれ得る。母体血由来の細胞の単離およびスライド上への塗り広げ、およびその後の赤色（ヘモグロビン由来）および青色（核物質由来）の両方が認められるポイントの同定により、有核赤血球の位置を同定することができるかもしれない。次いで、マイクロマニピュレーターを使用してこれらの有核赤血球を抽出し、遺伝子型決定技術および／または配列決定技術を使用して細胞中の遺伝物質の遺伝子型の態様を測定することができる。
【０１１６】
１つの実施形態では、胎児ヘモグロビンの存在下且つ母体ヘモグロビンの非存在下のみで蛍光を発する色素で有核赤血球を染色することができ、それにより、有核赤血球が母親または胎児のいずれかに由来するというあいまいさを排除することができる。本開示のいくつかの実施形態は、核物質の染色、または他の方法でのマーキングを含むことができる。本開示のいくつかの実施形態は、胎児細胞特異的抗体を使用した胎児核物質の特異的マーキングを含むことができる。
【０１１７】
母体血から胎児細胞を単離するか、母体血から胎児ＤＮＡを単離するか、母体遺伝物質の存在下で胎児遺伝物質サンプルを富化するための他の方法が多数存在する。いくつかのこれらの方法は本明細書中に列挙されているが、これは網羅的なリストであることを意図しない。便宜上、ここにいくつかの適切な技術を列挙する：蛍光的にまたはその他の方法でタグ付けした抗体、サイズ排除クロマトグラフィ、磁気的にまたは他の方法で標識したアフィニティタグ、後成的相違（特異的対立遺伝子での母体細胞と胎児細胞との間のメチル化の相違など）、密度勾配遠心分離後のＣＤ４５／１４枯渇およびＣＤ４５／１４陰性細胞からのＣＤ７１−ポジティブ選択、異なる重量オスモル濃度を使用した単一または二重パーコール勾配、またはガラクトース特異的レクチン法の使用。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、遺伝子サンプルを、調製、単離、および／または精製することができる。いくつかの実施形態では、サンプルを遠心分離して種々の層を分離することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡの調製は、増幅、分離、クロマトグラフィによる精製、電気泳動による精製、濾過、液液分離、単離、沈殿、選択的濃縮、選択的増幅、ターゲティング増幅、または当該分野で公知であるか本明細書中に記載の任意の多数の他の技術を含むことができる。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本開示の方法はＤＮＡの増幅を含むことができる。ＤＮＡの増幅（少量の遺伝物質を類似の遺伝子データセットを含むより大量の遺伝物質に変換するプロセス）を、広範な種々の方法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれるが、これに限定されない）によって行うことができる。１つのＤＮＡ増幅方法は全ゲノム増幅（ＷＧＡ）である。ＷＧＡに利用可能な方法は多数存在する：ライゲーション媒介ＰＣＲ（ＬＭ−ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドプライマーＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）、および多置換増幅（ＭＤＡ）。ＬＭ−ＰＣＲでは、アダプターと呼ばれる短いＤＮＡ配列をＤＮＡの平滑末端にライゲーションする。これらのアダプターは、ユニバーサル増幅配列（ＰＣＲによるＤＮＡの増幅のために使用される）を含む。ＤＯＰ−ＰＣＲでは、ユニバーサル増幅配列も含むランダムプライマーをアニーリングおよびＰＣＲの第１のラウンドで使用する。次いで、ＰＣＲの第２のラウンドを使用して、ユニバーサルプライマー配列をさらに使用して配列を増幅する。ＭＤＡはΦ−２９ポリメラーゼを使用する。このポリメラーゼは、ＤＮＡを複製する高加工性の非特異的酵素であり、単細胞分析のために使用されている。単細胞全ゲノム増幅は、多年にわたり、種々の適用で首尾よく使用されている。ＤＮＡサンプル由来のＤＮＡの他の増幅方法が存在する。ＤＮＡ増幅により、最初のＤＮＡサンプルが、配列組が類似するがはるかに大量のＤＮＡサンプルに変換される。いくつかの場合、増幅は必要ないかもしれない。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡを、ユニバーサル増幅（ＷＧＡまたはＭＤＡなど）を使用して増幅することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡを、ターゲティング増幅（例えば、ターゲティングＰＣＲを使用する）または循環プローブによって増幅することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡを、ターゲティング増幅法または望ましくないＤＮＡから所望のＤＮＡが全部または一部分離される方法（ハイブリッド形成アプローチによる捕捉など）を使用して優先的に富化することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡを、ユニバーサル増幅法と選択的富化方法との組み合わせの使用によって増幅することができる。いくつかのこれらの方法のより完全な記載を、本明細書中の他の場所に見出すことができる。
【０１２１】
標的個体および／または血縁個体の遺伝子データを、遺伝子型決定マイクロアレイおよびハイスループット配列決定が含まれるが、これらに限定されない群から採用されるツールおよび技術を使用した適切な遺伝物質の測定によって分子の状態から電子状態に変換することができる。いくつかのハイスループット配列決定法には、サンガーＤＮＡ配列決定、ピロシーケンス、ＩＬＬＵＭＩＮＡ  ＳＯＬＥＸＡプラットフォーム、ＩＬＬＵＭＩＮＡゲノム分析器、またはＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭ  ４５４配列決定プラットフォーム、ＨＥＬＩＣＯＳ  ＴＲＵＥ一分子配列決定プラットフォーム、ＨＡＬＣＹＯＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ電子顕微鏡配列決定法、または任意の他の配列決定法が含まれる。全てのこれらの方法は、ＤＮＡサンプル中に保存された遺伝子データを遺伝子データセットに物理的に変換し、このデータセットは典型的には処理途中で記憶装置に保存される。
【０１２２】
関連する個体の遺伝子データを、個体のバルクの二倍体組織、個体由来の１つ以上の二倍体細胞、個体由来の１つ以上のハプロイド細胞、標的個体由来の１つ以上の卵割球、個体に関して見出される細胞外遺伝物質、母体血中に見出される個体由来の細胞外遺伝物質、母体血中に見出される個体由来の細胞、血縁個体由来の配偶子から作製された１つ以上の胚、かかる胚から採取した１つ以上の卵割球、血縁個体に関して見出された細胞外遺伝物質、血縁個体を起源としていることが公知の遺伝物質、およびその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない群から選択される物質の分析によって測定することができる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、擬父が胎児の実父である尤度を計算することができる。いくつかの実施形態では、父性決定を使用して、臨床決定を行うことができる。次いで、この知識（典型的には、事柄（ｍａｔｔｅｒ）の物理的配列として記憶装置に保存される）を報告書に変換することができる。次いで、報告書にしたがって行動することができる。例えば、中絶すると臨床決定することができる。あるいは、妊娠を継続すると臨床決定することができる。
【０１２４】
本開示の１つの実施形態では、任意の本明細書中に記載の方法を、複数の標的が同一の標的個体に由来する（例えば、同一の妊娠中の母親から複数の採血を行う）ように修正することができる。複数の遺伝的測定値は標的遺伝子型を決定することができるより多数のデータを提供し得るので、これにより、モデルの精度を改善することができる。１つの実施形態では、１つの標的遺伝子データセットは報告された一次データとして役立ち、他は一次標的遺伝子データを二重チェックするためのデータとして役立った。１つの実施形態では、複数の遺伝子データセット（それぞれ標的個体から採取された遺伝物質から測定）を並行して考慮し、したがって、両標的遺伝子データセットは胎児の父性を決定するのを補助するのに役立つ。
【０１２５】
１つの実施形態では、本方法を、親子鑑定法の目的で使用することができる。例えば、母親由来の、および遺伝的父親であるかもしれないかもしくは遺伝的父親ではないかもしれない男性由来のＳＮＰベースの遺伝子型情報および混合サンプル由来の測定された遺伝子型情報を考慮して、男性の遺伝子型情報が懐胎している胎児の実際の遺伝的父親を実際に示すかどうかを決定することが可能である。これを行うための簡潔な方法は、母親がＡＡであり、潜在的父親がＡＢまたはＢＢであるコンテクストを簡潔に調査することである。これらの場合、父親の寄与はそれぞれ半分（ＡＡ｜ＡＢ）または常時（ＡＡ｜ＢＢ）を認められると予想することができる。予想されるＡＤＯを考慮して、認められた胎児ＳＮＰが潜在的父親のＳＮＰと相関するかどうかを決定することは容易である。他の父性決定方法を、本明細書中の他の場所に記載している。
【０１２６】
本開示の１つの実施形態では、妊娠中の母親は、男性が、彼女の胎児の実父であるか否かを決定したい。妊娠中の母親は医師にかかり、妊娠中の母親の血液サンプルを提供し、妊娠中の母親と夫は口腔スワブ由来の彼ら自身のＤＮＡサンプルを提供する。研究者は、親ＤＮＡを増幅するためのＭＤＡプロトコールおよび多数のＳＮＰでの親の遺伝子データを測定するためのＩＬＬＵＭＩＮＡ  ＩＮＦＩＮＩＵＭアレイを使用して親ＤＮＡの遺伝子型を決定する。次いで、研究者は、血液を遠心沈殿し、血漿を採取し、サイズ排除クロマトグラフィを使用して浮遊ＤＮＡサンプルを単離する。あるいは、研究者は、１つ以上の蛍光抗体（胎児ヘモグロビンに特異的なものなど）を使用して有核胎児赤血球を単離する。次いで、研究者は、単離または富化した胎児遺伝物質を採取し、各オリゴヌクレオチドの２つの末端が標的対立遺伝子のいずれか側の隣接配列に対応するように適切にデザインされた７０ｍｅｒオリゴヌクレオチドのライブラリーを適切に使用して胎児遺伝物質を増幅する。ポリメラーゼ、リガーゼ、および適切な試薬の添加の際に、オリゴヌクレオチドはギャップ充填環状化を受けて所望の対立遺伝子が捕捉される。エキソヌクレアーゼを添加し、熱失活させ、産物をＰＣＲ増幅用のテンプレートとして直接使用した。ＰＣＲ産物をＩＬＬＵＭＩＮＡゲノム分析器で配列決定した。配列のリードをＰＡＲＥＮＴＡＬ  ＳＵＰＰＯＲＴＴＭ法の入力として使用し、次いで、胎児の倍数性の状態を予想した。本方法によって擬父が胎児の実父でないことが決定され、決定の信頼度は９９．９８％と計算される。父性決定および決定の信頼度の両方を開示する報告書を作成する。
【０１２７】
別の実施形態では、妊娠している女性は男性が彼女の胎児の実父であるか否かを知りたい。産科医は、母親および父親から採血する。血液を研究所に送り、ここで技術者が母体サンプルを遠心分離して血漿およびバフィーコートを単離する。バフィーコートおよび父系血液サンプル中のＤＮＡを増幅によって変換し、増幅された遺伝物質中にコードされた遺伝子データを、遺伝物質を高処理シークエンサーにかけることによって分子的に保存された遺伝子データを電子的に保存された遺伝子データにさらに変換して親遺伝子型を測定する。血漿サンプルを、５０００−ｐｌｅｘヘミネスト化ターゲティングＰＣＲ法を使用して遺伝子座組で優先的に富化する。ＤＮＡフラグメント混合物を、配列決定に適切なＤＮＡライブラリー中に調製する。次いで、ＤＮＡを、ハイスループット配列決定法（例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡ  ＧＡＩＩｘゲノム分析器）を使用して配列決定する。配列決定により、ＤＮＡ中に分子的にコードされた情報がコンピュータハードウェア中に電子的にコードされた情報に変換される。本明細書中に開示されている実施形態を含むインフォマティクスベースの技術（ＰＡＲＥＮＴＡＬ  ＳＵＰＰＯＲＴＴＭなど）を使用して、胎児の父性を決定することができる。これは、富化サンプルに関して取得されたＤＮＡ測定値から複数の多型遺伝子座での対立遺伝子数をコンピュータにて計算する工程および男性が妊娠中の母親の胎児の実父である尤度を決定する工程を含むことができる。擬父が胎児の実父である確率は９９．９９９９％であると決定され、父性決定の信頼度は９９．９９％と計算される。報告書を印刷するか、妊娠中の女性の産科医に電子的に送付し、決定を女性に伝達する。女性、女性の夫、および医師は報告について検討する。
【０１２８】
１つの実施形態では、母親および父親の生の遺伝物質を、増幅によって配列が類似するがより大量のＤＮＡに変換する。次いで、遺伝子型決定法により、核酸によってコードされる遺伝子型データを遺伝的測定値に変換し、これを記憶装置（上記の記憶装置など）に物理的および／または電子的に保存することができる。ＰＡＲＥＮＴＡＬ  ＳＵＰＰＯＲＴＴＭアルゴリズムを構成する関連アルゴリズム（その関連部分が本明細書中に詳細に考察されている）を、プログラム言語を使用してコンピュータプログラムに変換する。次いで、ビットおよびバイトで物理的にコード化する（生の測定データを示すパターンで配列）代わりにコンピュータハードウェア上のコンピュータプログラムの実行により、データを胎児の父性の高信頼度の決定を示すパターンに変換されるようになる。この変換の詳細は、データ自体ならびに本明細書中に記載の方法を実行するために使用されるコンピュータ言語およびハードウェアシステムに依存するであろう。次いで、高品質の胎児の父性決定を示すように物理的に構成されたデータを報告書に変換し、この報告書を医療関係者に送付することができる。この変換を、プリンタまたはコンピュータディスプレイを使用して行うことができる。報告書は、紙または他の適切な媒体の印刷された複写物であり得るか、あるいは電子的なものであり得る。電子的報告書の場合、報告書を送信することができ、医療関係者によってアクセス可能なコンピュータ上の場所に記憶装置に物理的に保存することができ、読み出すことができるようにスクリーン上に表示することもできる。画面表示の場合、データを、表示装置上でピクセルに物理的に変換することによって可読様式に変換することができる。リン光スクリーンで物理的に輝く電子によって（光子を放出または吸収する基板の前に存在し得るスクリーン上の特定のピクセルセットの透過性を物理的に変化させる電荷の変化によって）変換を行うことができる。液晶中の分子のナノスケールの方向を、特定のピクセルセットで、例えば、ネマチック相からコレステリック相またはスメクチック相まで変化させることによってこの変換を行うことができる。電流によって有意義なパターンで配置した複数の発光ダイオードから得た特定のピクセルセットから光子を発生させることによってこの変換を行うことができる。この変換を、情報表示のために使用される任意の他の方法（コンピュータスクリーンなど）またはいくつかの他の出力デバイスもしくは情報伝達方法によって行うことができる。次いで、医療関係者は、報告書中のデータを行動に移すように報告書にしたがって行動することができる。行動は妊娠を継続するか、中断することであり得る。後者は、懐胎している胎児を中絶することである。あるいは、一組の遺伝子型測定値を医師による妊娠中の患者の処置を補助する報告書に変換することができる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の方法を、在胎期間の非常に早い時期（例えば、４週もの早期、５週もの早期、６週もの早期、７週もの早期、８週もの早期、９週もの早期、１０週もの早期、１１週もの早期、および１２週もの早期）に使用することができる。
【０１３０】
本明細書中に開示の任意の実施形態を、デジタル電子回路、集積回路、特別設計されたＡＳＩＣ（特定用途向けＩＣ）、コンピュータハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア、またはその組み合わせで実施することができる。本明細書中に開示の実施形態の装置を、プログラム可能プロセッサによる実行のための機械読取り可能記憶装置で明確に具体化されるコンピュータプログラム製品で実施することができ、本明細書中に開示の実施形態の方法工程を、入力データを操作して出力させることによって本明細書中に開示の実施形態の関数を実行するための命令プログラムを実行するプログラム可能プロセッサによって実行することができる。本明細書中に開示の実施形態を、記憶システム、少なくとも１つの入力デバイス、および少なくとも１つの出力デバイスからデータおよび命令を受信し、データおよび命令を送信するように接続された専用または汎用であり得るプログラム可能システム（少なくとも１つのプログラム可能プロセッサを含む）上で実行可能および／または解釈可能な１つ以上のコンピュータプログラムで有利に実行することができる。各コンピュータプログラムを、必要に応じて高レベル手続き型もしくはオブジェクト指向プログラム言語またはアセンブリ言語もしくは機械言語で実行することができ、任意の場合、言語はコンパイラ型言語またはインタープリタ型言語であり得る。コンピュータプログラムを、任意の形態（スタンドアロンプログラム、またはモジュール、コンポーネント、サブルーチン、もしくはコンピュータ環境下での使用に適切な他のユニットが含まれる）で配置することができる。コンピュータプログラムを、１つのサイトにおいて１つのコンピュータまたは複数のコンピュータで実行または解釈するか、あるいは複数のサイトにわたり分配し、通信ネットワークによって相互接続されるように配置することができる。
【０１３１】
本明細書中で使用する場合、コンピュータ可読記憶媒体は、物理的または有形の記憶装置（信号とは対照的に）をいい、コンピュータ可読命令、データ構造、プログラムモジュール、または他のデータなどの情報の有形の記憶のための任意の方法およびテクノロジーで実行される揮発性または不揮発性の取り外し可能な媒体および取り外し不可能な媒体が含まれるが、これらに限定されない。コンピュータ可読記憶媒体には、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリもしくは他のソリッドステートメモリテクノロジー、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、もしくは他の光記憶装置、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶装置もしくは他の磁気記憶装置、または所望の情報またはデータまたは命令を有形に記憶するために使用することができ、且つコンピュータまたはプロセッサによってアクセスすることができる任意の他の物理的媒体もしくは物質媒体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３２】
ターゲティングされた富化および配列決定
標的遺伝子座組でＤＮＡサンプルを富化し、その後に非侵襲性出生前対立遺伝子コールまたは倍数性コール方法の一部として配列決定するための技術の使用により、多数の予想外の利点を得ることができる。本開示のいくつかの実施形態では、本方法は、インフォマティクスベースの方法（ＰＡＲＥＮＴＡＬ  ＳＵＰＰＯＲＴＴＭ（ＰＳ）など）と共に使用するための遺伝子データを測定する工程を含む。いくつかの実施形態の最終結果は、胚または胎児の行動可能な遺伝子データである。具体化される方法の一部として個体および／または血縁個体の遺伝子データを測定するために使用することができる方法は多数存在する。１つの実施形態では、ターゲティングされた対立遺伝子組の濃度を富化する方法（１つ以上の以下の工程を含む方法：遺伝物質のターゲティング増幅、遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドプローブの添加、特定のＤＮＡ鎖のライゲーション、所望のＤＮＡ組の単離、望ましくない反応成分の除去、ハイブリッド形成による一定のＤＮＡ配列の検出、およびＤＮＡ配列決定法による１つまたは複数のＤＮＡ鎖の配列の検出）を本明細書中に開示する。いくつかの場合、ＤＮＡ鎖は標的遺伝物質をいうことができ、いくつかの場合、ＤＮＡ鎖はプライマーをいうことができ、いくつかの場合、ＤＮＡ鎖は合成配列またはその組み合わせをいうことができる。これらの工程を、多数の異なる順序で行うことができる。高度に変動する分子生物学上の性質を考慮して、一般に、種々の状況においてどの方法およびどの工程の組み合わせが不十分、十分、または最良に行われるか明らかでない。
【０１３３】
例えば、ターゲティング増幅前のＤＮＡのユニバーサル増幅工程により、いくつかの利点（妨害リスクの除去および対立遺伝子バイアスの軽減など）を得ることができる。ＤＮＡをオリゴヌクレオチドプローブと混合することができ、このプローブは、標的配列の２つの隣接領域のいずれかの側の１つとハイブリッド形成することができる。ハイブリッド形成後、プローブの末端を、ポリメラーゼ、ライゲーションのための手段、およびプローブの環状化に必要な任意の試薬の添加によって連結することができる。環状化後、エキソヌクレアーゼを添加して非環状化遺伝物質に消化し、その後に環状化プローブを検出することができる。ＤＮＡをＰＣＲプライマーと混合することができ、このプライマーは標的配列の２つの隣接領域のいずれかの側の１つとハイブリッド形成することができる。ハイブリッド形成後、プローブの末端を、ポリメラーゼ、ライゲーションのための手段、およびＰＣＲ増幅の完了に必要な任意の試薬の添加によって連結することができる。増幅または非増幅ＤＮＡを、遺伝子座組をターゲティングするハイブリッド捕捉プローブによってターゲティングすることができ、ハイブリッド形成後、プローブを局在化させ、混合物から分離して標的配列が富化されたＤＮＡ混合物を得ることができる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、標的遺伝物質の検出を、多重様式で行うことができる。並行して検出することができる遺伝子標的配列数は、１〜１０、１０〜１００、１００〜１０００、１０００〜１００００、１００００〜１０００００、１０００００〜１００００００、または１００００００〜１０００００００個の範囲であり得る。先行技術は、首尾の良い多重ＰＣＲ反応（約５０または１００プライマーまでのプールを含む）の開示を含むことに留意のこと。プールあたり１００プライマー超を多重化する以前の試みは、プライマー−二量体形成などの望ましくない副反応を伴う重大な問題をもたらした。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、この方法を使用して、単一の細胞、少数の細胞、２〜５個の細胞、６〜１０個の細胞、１０〜２０個の細胞、２０〜５０個の細胞、５０〜１００個の細胞、１００〜１０００個の細胞、または少量の細胞外ＤＮＡ（例えば、１〜１０ピコグラム、１０〜１００ピコグラム、１００ピコグラム〜１ナノグラム、１〜１０ナノグラム、１０〜１００ナノグラム、または１００ナノグラム〜１マイクログラム）を遺伝子型決定することができる。
【０１３６】
一定の遺伝子座をターゲティングし、その後に対立遺伝子コールまたは倍数性コールのための方法の一部として配列決定するための方法の使用により、多数の予想外の利点を得ることができる。ＤＮＡをターゲティングすることができるか、優先的に富化することができるいくつかの方法には、循環プローブ、連結反転プローブ（ＬＩＰ、ＭＩＰ）、ハイブリッド形成法（ＳＵＲＥＳＥＬＥＣＴなど）による捕捉、およびターゲティングＰＣＲまたはライゲーション媒介ＰＣＲ増幅ストラテジーの使用が含まれる。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、インフォマティクスベースの方法（ＰＡＲＥＮＴＡＬ  ＳＵＰＰＯＲＴＴＭ（ＰＳ）など）と使用するための遺伝子データを測定する工程を含む。ＰＡＲＥＮＴＡＬ  ＳＵＰＰＯＲＴＴＭは、遺伝子データを操作するためのインフォマティクスベースのアプローチであり、その態様を本明細書中に記載している。いくつかの実施形態の最終結果は、胚または胎児の行動可能な遺伝子データおよびその後の行動可能なデータに基づいた臨床決定である。ＰＳ法の背後にあるアルゴリズムは、標的個体（しばしば、胚または胎児）の測定遺伝子データおよび血縁個体由来の測定遺伝子データを取り、標的個体の遺伝的状態がわかるように精度を向上させることができる。１つの実施形態では、測定遺伝子データを、出生前遺伝子診断中に父性決定を行う状況下で使用する。上記状況下で個体および／または血縁個体の遺伝子データを測定するために使用することができる方法は多数存在する。異なる方法は多数の工程を含み、これらの方法は、しばしば、遺伝物質の増幅、オリゴヌクレオチドプローブの添加、特定のＤＮＡ鎖のライゲーション、所望のＤＮＡ組の単離、望ましくない反応成分の除去、ハイブリッド形成による一定のＤＮＡ配列の検出、ＤＮＡ配列決定法による１つまたは複数のＤＮＡ鎖の配列の検出を含む。いくつかの場合、ＤＮＡ鎖は標的遺伝物質をいうことができ、いくつかの場合、ＤＮＡ鎖はプライマーをいうことができ、いくつかの場合、ＤＮＡ鎖は合成配列またはその組み合わせをいうことができる。これらの工程を、多数の異なる順序で行うことができる。高度に変動する分子生物学上の性質を考慮して、一般に、種々の状況においてどの方法およびどの工程の組み合わせが不十分、十分、または最良に行われるか明らかでない。
【０１３８】
本開示のいくつかの実施形態は、「連結反転プローブ」（ＬＩＰ）（以前に文献中に記載されている）の使用を含む。ＬＩＰは、環状ＤＮＡ分子の作製を含むテクノロジーを含むことを意味する一般名称である。ここで、このテクノロジーは、適切なポリメラーゼおよび／またはリガーゼ、および適切な条件、緩衝液および他の試薬の添加によってターゲティングされた対立遺伝子にわたってのＤＮＡの相補的な反転領域が完成し、ターゲティングされた対立遺伝子中で見出された情報を捕捉するＤＮＡの環状ループが作製されるように、プローブがターゲティングされた対立遺伝子いずれかのサイドのターゲティングされたＤＮＡ領域にハイブリッド形成するようにデザインされている。ＬＩＰはまた、前環状化プローブ、前循環プローブ、または循環プローブと呼ばれ得る。ＬＩＰプローブは、５０ヌクレオチド長と５００ヌクレオチド長との間、１つの実施形態では、７０ヌクレオチド長と１００ヌクレオチド長との間の線状ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの実施形態では、ＬＩＰプローブは、本明細書中に記載の長さより長くても短くても良い。本開示の他の実施形態は、ＬＩＰテクノロジーの異なる形態（パッドロックプローブおよび分子反転プローブ（ＭＩＰ）など）を含む。
【０１３９】
配列決定のために特定の位置をターゲティングする１つの方法は、プローブを合成することである。この方法は、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼの添加によって３’末端から伸長し、標的分子に相補的な一本鎖プローブへの塩基の添加（ギャップ充填）およびその後の新規の３’末端の元のプローブの５’末端へのライゲーションによって環状ＤＮＡ分子が得られ、次いでこの環状ＤＮＡ分子をバックグラウンドＤＮＡから単離することができるようにプローブの３’および５’末端がターゲティングされた領域に隣接し、且つそのいずれかのサイド上の位置で反転様式にて標的ＤＮＡにアニーリングする。プローブ末端を、目的のターゲティングされた領域に隣接するようにデザインする。このアプローチの１つの態様を一般にＭＩＰＳと呼び、充填された配列の性質を決定するためにアレイテクノロジーと併せて使用されている。
【０１４０】
ライゲーション媒介ＰＣＲは、ＤＮＡ混合物中の１つまたは複数の遺伝子座の増幅によってＤＮＡサンプルを優先的に富化するために使用されるＰＣＲ法であり、この方法は、１組のプライマー対を得る工程であって、この対中の各プライマーが標的特異的配列および非標的配列を含み、標的特異的配列が標的領域（多型部位から上流のものおよび下流のもの）にアニーリングするようにデザインされる、工程、上流プライマーの３’末端と下流プライマーの５’末端との間の一本鎖領域に標的分子に相補的なヌクレオチドを充填するための上流プライマーの３’末端由来のＤＮＡの重合；上流プライマーの最後の重合した塩基の下流プライマーの隣接する５’塩基へのライゲーション、ならびに上流プライマーの５’末端および下流プライマーの３’末端に含まれる非標的配列を使用した重合およびライゲーションした分子のみの増幅を含む。個別の標的に対するプライマー対を、同一反応物中で混合することができる。非標的配列は、首尾よく重合およびライゲーションしている全プライマー対を単一の増幅プライマー対を使用して増幅することができるようなユニバーサル配列として役立つ。
【０１４１】
１つの実施形態では、ＤＮＡサンプルを、ハイブリッド形成アプローチによる捕捉を使用して優先的に富化することができる。市販のハイブリッド形成テクノロジーによる捕捉のいくつかの例には、ＡＧＩＬＥＮＴのＳＵＲＥＳＥＬＥＣＴおよびＩＬＬＵＭＩＮＡのＴＲＵＳＥＱが含まれる。ハイブリッド形成による捕捉では、所望のターゲティングされた配列に相補的であるかほとんど相補的であるオリゴヌクレオチド組により、ＤＮＡ混合物とハイブリッド形成し、次いで混合物から物理的に分離する。一旦所望の配列がターゲティングオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成すると、ターゲティングオリゴヌクレオチドの物理的除去の影響は、ターゲティングされた配列も除去することである。一旦ハイブリッド形成されたオリゴが除去されると、オリゴをその融点を超える温度に加熱することができ、オリゴを増幅することができる。ターゲティングオリゴヌクレオチドを物理的に除去するためのいくつかの方法は、固体支持体（例えば、磁性ビーズ）またはチップへのターゲティングオリゴの共有結合による。ターゲティングオリゴヌクレオチドを物理的に除去する別の方法は、別の分子部分に強い親和性を有する分子部分へのターゲティングオリゴヌクレオチドの共有結合による。かかる分子対の例はビオチンおよびストレプトアビジンであり、ＳＵＲＥＳＥＬＥＣＴなどで使用される。したがって、ターゲティングされた配列をビオチン分子に共有結合することができ、ハイブリッド形成後、ストレプトアビジンを付加した固体支持体を使用して、ターゲティングされた配列とハイブリッド形成するビオチン化オリゴヌクレオチドをプルダウンすることができる。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、ＰＣＲを使用して、ゲノムの特定の位置をターゲティングすることができる。血漿サンプルでは、元のＤＮＡは高度に断片化されている（典型的には、５００ｂｐ未満、平均長は２００ｂｐ未満）。ＰＣＲでは、増幅を可能にするために順方向および逆方向プライマーの両方が同一フラグメントにアニーリングされなければならない。したがって、フラグメントが短い場合、ＰＣＲアッセイは、比較的短い領域も増幅しなければならない。ＰＣＲアッセイを数多く行うことができるが、異なるＰＣＲアッセイ間の相互作用によって約１００アッセイを超えて多重化するのは困難となる。種々の複雑な分子アプローチを使用して多重レベルを増加させることができるが、依然として反応あたり１００、おそらく２００、もしかすると５００未満のアッセイに制限され得る。大量のＤＮＡを有するサンプルを、複数の部分反応に分割し、次いで、配列決定前に再度組み合わせることができる。ＤＮＡ分子の全サンプルまたはいくつかの部分集団のいずれかが制限されるサンプルについて、サンプルの分割によって統計ノイズが導入されるであろう。１つの実施形態では、少量または制限された量のＤＮＡは、１０ｐｇ未満、１０ｐｇと１００ｐｇとの間、１００ｐｇと１ｎｇとの間、１ｎｇと１０ｎｇとの間、または１０ｎｇと１００ｎｇとの間の量をいうことができる。この方法は複数のプールへの分割を含む他の方法により導入された統計ノイズに関連する深刻な問題が生じ得る少量のＤＮＡにおいて特に有用である一方で、この方法によって任意のＤＮＡ量のサンプルに関して行う場合にバイアスを最小にする利点が依然として得られることに留意のこと。これらの状況下で、普遍的な前増幅工程を使用して、全サンプル量を増加させることができる。理想的には、この前増幅工程は対立遺伝子分布をかなり変化させるべきではない。
【０１４３】
一般に、サンプルの複数の（ｎ）標的（５０超、１００超、５００超、または１，０００超）のターゲティング配列決定を行うために、１つまたは少数の各標的を増幅する多数の並行反応にサンプルを分割することができる。これはＰＣＲマルチウェルプレート中で行われているか、ＦＬＵＩＤＩＧＭアクセスアレイ（微小流体チップ中のサンプルあたり４８反応）またはＲＡＩＮ  ＤＡＮＣＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹによるドロップレットＰＣＲ（１００〜数千の標的）などの市販のプラットフォームで行うことができる。不運なことに、各ウェル中のゲノムの各領域の１コピーが存在することを保証するにはしばしばゲノムコピーが十分でないので、これらのスプリット・アンド・プール法は、限られた量のＤＮＡを有するサンプルでは問題がある。多型遺伝子座をターゲティングする場合にこれは特に重大な問題であり、分割およびプールによって導入された確率的ノイズによって元のＤＮＡサンプル中に存在した対立遺伝子の部分について非常に精度が悪い測定値をもたらすので、多型遺伝子座で相対的比率の対立遺伝子が必要である。制限された量のＤＮＡしか利用できない場合に適用可能な多数のＰＣＲ反応物を有効且つ効率的に増幅する方法を本明細書中に記載する。１つの実施形態では、本方法を、単一細胞、体液、ＤＮＡ混合物（母体血漿、生検、環境サンプル、および／または法医学サンプル中に見出される浮遊ＤＮＡなど）の分析のために適用することができる。
【０１４４】
１つの実施形態では、ターゲティング配列決定は、１つ、複数、または全ての以下の工程を含むことができる。ａ）ＤＮＡフラグメントの両末端上のアダプター配列を使用してライブラリーを作製し、普遍的に増幅させる工程。ｂ）ライブラリー増幅後に複数の反応物に分割する工程。ｃ）標的あたり１つの標的特異的「順方向」プライマーおよび１つのタグ特異的プライマーを使用して選択された標的を約１００−ｐｌｅｘ、約１０００−ｐｌｅｘ、または約１０，０００−ｐｌｅｘ増幅する工程。ｄ）「逆方向」標的特異的プライマーおよび第１ラウンドで標的特異的順方向プライマーの一部として導入したユニバーサルタグに特異的な１つ（または１つ以上）のプライマーを使用してこの産物から第２の増幅を行う工程。ｅ）産物を複数のアリコートに分画し、各反応物中の標的のサブプールを増幅する工程（例えば、５０〜５００−ｐｌｅｘであるが、これをシングルプレックスまで減少させて使用することができる）。ｆ）並行サブプール反応物の産物をプールする工程。これらの増幅中、プライマーは、産物を配列決定することができるような配列決定適合タグ（部分または全長）を保有することができる。
【０１４５】
１つの実施形態では、元の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）サンプルの全部または一部の増幅によってその後の工程において潜在的損失を軽減することが可能である。下流手順に利用可能な量に増加させるサンプル中の全遺伝物質を増幅するための種々の方法が可能である。１つの実施形態では、ライゲーション媒介ＰＣＲ（ＬＭ−ＰＣＲ）ＤＮＡフラグメントを、１つの個別のアダプター、２つの個別のアダプター、または多数の個別のアダプターのいずれかのライゲーション後のＰＣＲによって増幅する。１つの実施形態では、多置換増幅（ＭＤＡ）Φ−２９ポリメラーゼを使用して、全ＤＮＡを等温的に増幅する。ＤＯＰ−ＰＣＲおよび変形形態では、ランダムプライミングを使用して、原材料ＤＮＡを増幅する。各方法は、一定の特徴（全ての示したゲノム領域にわたる増幅の均一性、元のＤＮＡの捕捉および増幅の効率、およびフラグメント長の関数としての増幅パフォーマンスなど）を有する。
【０１４６】
伝統的なＰＣＲアッセイデザインにより個別の胎児分子が有意に喪失するが、この喪失をミニＰＣＲアッセイと呼ばれる非常に短いＰＣＲアッセイのデザインによって大いに減少させることができる。母体血清中の胎児ｃｆＤＮＡは高度に断片化されており、フラグメントサイズは、平均約１６０ｂｐ、標準偏差約１５ｂｐ、最小サイズ約１００ｂｐ、および最大サイズ約２２０ｂｐにてほぼガウス様式で分布している。ターゲティングされた多型に関するフラグメントの開始位置および終結位置の分布は、必ずしもランダムではないが、個別の標的間および集合的に全標的間で広く変動し、１つの特定の標的遺伝子座の多型部位はその遺伝子座を起源とする種々のフラグメントの間の出発点から終結点までの任意の位置を占め得る。用語ミニＰＣＲがさらなる制限または限定を受けずに通常のＰＣＲを等しく十分にいうことができることに留意のこと。
【０１４７】
ＰＣＲ中、増幅は、順方向および逆方向のプライマー部位の両方を含むテンプレートＤＮＡフラグメントからのみ生じるであろう。胎児ｃｆＤＮＡフラグメントが短いので、両プライマー部位の尤度（順方向および逆方向のプライマー部位の両方を含む長さＬの胎児フラグメントの尤度を示す）は、フラグメントの長さに対するアンプリコンの長さの比である。理想的な条件下で、アンプリコンが４５、５０、５５、６０、６５、または７０ｂｐであるアッセイは、それぞれ約７２％、６９％、６６％、６３％、５９％、または５６％の利用可能なテンプレートフラグメント分子から首尾よく増幅するであろう。アンプリコン長は、順方向プライミング部位の５’末端と逆方向プライミング部位の５’末端との間の距離である。当業者が典型的に使用する長さより短いアンプリコン長により、短い配列リードのみを必要として所望の多型遺伝子座をより効率的に測定することができる。１つの実施形態では、アンプリコンの実質的な画分は、１００ｂｐ未満、９０ｂｐ未満、８０ｂｐ未満、７０ｂｐ未満、６５ｂｐ未満、６０ｂｐ未満、５５ｂｐ未満、５０ｂｐ未満、または４５ｂｐ未満であるべきである。
【０１４８】
先行技術で公知の方法では、短いアッセイが必要でなく、プライマー長、アニーリング特性、および順方向プライマーと逆方向プライマーとの間の距離の制限によって短いアッセイがプライマーデザインをかなり制限するので、短いアッセイ（本明細書中に記載のアッセイなど）は通常避けられることに留意のこと。
【０１４９】
多重ＰＣＲは、全標的が増幅される１ラウンドのＰＣＲを含むことができるか、１ラウンドのＰＣＲおよびその後の１ラウンド以上のネスト化ＰＣＲまたはネスト化ＰＣＲのいくつかの異形を含むことができる。ネスト化ＰＣＲは、少なくとも１つの塩基対によって前のラウンドで使用したプライマーに内部的に結合する１つ以上の新規のプライマーを使用したその後の１ラウンドまたは複数のラウンドのＰＣＲ増幅からなる。ネスト化ＰＣＲは、その後の反応において正確な内部配列を有する前のラウンド由来の増幅産物のみの増幅によって偽増幅標的数を減少させる。偽増幅標的の減少により、特に配列決定で得ることができる有用な測定値数が改善される。ネスト化ＰＣＲは、典型的には、前のプライマー結合部位の完全に内部にプライマーをデザインすることが必要であり、増幅に必要な最小ＤＮＡセグメントが必然的に増加する。ＤＮＡが高度に断片化されたサンプル（母体血漿ｃｆＤＮＡなど）について、より大きなアッセイサイズにより、測定値を得ることができる個別のｃｆＤＮＡ分子数が減少する。１つの実施形態では、この影響を相殺するために、第２ラウンドのプライマーの一方または両方が第１の結合部位と重複していくつかの塩基を内部的に伸長させ、それにより、総アッセイサイズの増加を最小にしながらさらなる特異性を達成する部分的ネスト化アプローチを使用することができる。
【０１５０】
１つの実施形態では、ＰＣＲアッセイの多重プールを、１つ以上の染色体上のヘテロ接合性のＳＮＰまたは他の多型遺伝子座もしくは非多型遺伝子座が潜在的に増幅されるようにデザインし、これらのアッセイを単一の反応で使用してＤＮＡを増幅する。ＰＣＲアッセイ数は、５０ＰＣＲアッセイと２００ＰＣＲアッセイとの間、２００ＰＣＲアッセイと１，０００ＰＣＲアッセイとの間、１，０００ＰＣＲアッセイと５，０００ＰＣＲアッセイとの間、または５，０００ＰＣＲアッセイと２０，０００ＰＣＲアッセイとの間（それぞれ、５０〜２００−ｐｌｅｘ、２００〜１，０００−ｐｌｅｘ、１，０００〜５，０００−ｐｌｅｘ、５，０００〜２０，０００−ｐｌｅｘ、２０，０００−ｐｌｅｘ超）であり得る。
【０１５１】
１つの実施形態では、順方向プライマーおよび逆方向プライマーがハイスループット配列決定装置（ＩＬＬＵＭＩＮＡのＨＩＳＥＱ、ＧＡＩＩＸ、またはＭＩＳＥＱなど）によって必要とされる順方向配列および逆方向配列に対応するテールを有するように、１００−ｐｌｅｘ〜５００−ｐｌｅｘ、５００−ｐｌｅｘ〜１，０００−ｐｌｅｘ、１，０００−ｐｌｅｘ〜２，０００−ｐｌｅｘ、２，０００−ｐｌｅｘ〜５，０００−ｐｌｅｘ、５，０００−ｐｌｅｘ〜１０，０００−ｐｌｅｘ、１０，０００−ｐｌｅｘ〜２０，０００−ｐｌｅｘ、２０，０００−ｐｌｅｘ〜５０，０００−ｐｌｅｘ、または５０，０００−ｐｌｅｘ〜１００，０００−ｐｌｅｘのＰＣＲアッセイプールを作製する。さらに、ヌクレオチドバーコード配列をアンプリコンに付加してハイスループット配列決定装置の単一レーンで複数のサンプルの多重配列決定を可能にするために、その後のＰＣＲにおけるプライミング部位として使用することができるさらなる配列を配列決定テールの５’側に含める。１つの実施形態では、逆方向プライマーがハイスループット配列決定装置によって必要とされる逆方向配列に対応するテールを有するように、１０，０００−ｐｌｅｘＰＣＲアッセイプールを作製する。最初の１０，０００−ｐｌｅｘアッセイを使用した増幅後、その後のＰＣＲ増幅を、全標的のための部分ネスト化順方向プライマー（例えば、６塩基ネスト化）および第１ラウンドに含まれる逆方向配列決定テールに対応する逆方向プライマーを有する別の１０，０００−ｐｌｅｘプールを使用して行うことができる。たった１つの標的特異的プライマーおよびユニバーサルプライマーを使用した部分ネスト化増幅のこのその後のラウンドは、必要なアッセイサイズが制限されるが（サンプリングノイズが減少する）、偽アンプリコン数が大きく減少する。タグが最終アンプリコンの一部であるように、配列決定タグを、添付のライゲーションアダプターに付加し、そして／またはＰＣＲプローブの一部として付加することができる。
【０１５２】
胎児画分は試験の成績に影響をおよぼす。より少ない胎児画分を含むサンプルに関して正確な父性を決定することはより困難である。母体血漿中に見出されるＤＮＡの胎児画分を富化する方法は多数存在する。胎児画分を、既に考察されている前述のＬＭ−ＰＣＲ法および長い母系フラグメントのターゲティングされた除去によって増加させることができる。実施形態では、サイズ選択技術を使用してより長いフラグメントを除去する。１つの実施形態では、標的遺伝子座の多重ＰＣＲ増幅前に、さらなる多重ＰＣＲ反応を行なって、その後の多重ＰＣＲでターゲティングされる遺伝子座に対応する長くて大部分が母系のフラグメントを選択的に除去することができる。無細胞胎児ＤＮＡフラグメント間で存在すると予想されるよりも多型からの距離が長い部位にアニーリングするようにさらなるプライマーをデザインする。これらのプライマーを、標的多型遺伝子座の多重ＰＣＲ前に１サイクルの多重ＰＣＲ反応で使用することができる。これらの遠位プライマーを、タグ付きＤＮＡ片を選択的に認識することができる分子または部分でタグ付けする。１つの実施形態では、これらのＤＮＡ分子を、１サイクルのＰＣＲ後にこれらのプライマーを含む新規に形成された二本鎖ＤＮＡを除去可能なビオチン分子で共有結合的に修飾することができる。その第１ラウンド中に形成された二本鎖ＤＮＡは、母体起源である可能性が高い。ハイブリッド材料の除去を、磁性ストレプトアビジンビーズの使用によって行うことができる。等しく十分に機能し得る他のタグ付け方法が存在する。１つの実施形態では、サイズ選択方法を使用して、より短いＤＮＡ鎖（例えば、約８００ｂｐ未満、約５００ｂｐ未満、または約３００ｂｐ未満の鎖）についてサンプルを富化することができる。次いで、短いフラグメントの増幅を従来通り進めることができる。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、単一細胞、１コピー未満の標的ゲノムからなるＤＮＡサンプル、少量のＤＮＡ、混合物起源のＤＮＡ（例えば、妊娠血漿：胎盤ＤＮＡおよび母体ＤＮＡ；癌患者の血漿および腫瘍：健康なＤＮＡと癌ＤＮＡとの混合物、移植など）、他の体液、細胞培養物、培養上清、法医学的ＤＮＡサンプル、古代ＤＮＡサンプル（例えば、琥珀中に捕捉された昆虫）、他のＤＮＡサンプル、およびその組み合わせを起源とし得る。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の方法を使用して、ＳＮＰ、単一縦列反復（ＳＴＲ）、コピー数、ヌクレオチドメチル化、ｍＲＮＡレベル、他のタイプのＲＮＡ発現レベル、他の遺伝的および／または後成的特徴を増幅および／または検出することができる。本明細書中に記載のミニＰＣＲ法を、次世代配列決定と共に使用することができる。この方法を、他の下流の方法（マイクロアレイ、デジタルＰＣＲによる計数、リアルタイムＰＣＲ、質量分析など）と共に使用することができる。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載のミニＰＣＲ増幅法を、少数集団の正確な定量法の一部として使用することができる。本方法を、スパイクキャリブレータを使用した絶対的定量のために使用することができる。本方法を、超深度配列決定（ｖｅｒｙ  ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）による変異／微量対立遺伝子定量のために使用することができ、本方法を高多重化様式で行うことができる。本方法を、ヒト、動物、植物、または他の生物における血族または祖先の標準的な親子鑑定および同一性試験のために使用することができる。本方法を、法医学試験のために使用することができる。本方法を、任意の材料種（例えば、羊水およびＣＶＳ、精子、受胎産物（ＰＯＣ））に関する迅速な遺伝子型決定およびコピー数分析（ＣＮ）のために使用することができる。本方法を、単細胞分析（胚から生検したサンプルに関する遺伝子型決定など）のために使用することができる。本方法を、ｍｉｎ−ＰＣＲを使用したターゲティング配列決定による迅速な胚分析（１日未満、１日、または２日以内の生検）のために使用することができる。
【０１５６】
高多重化ＰＣＲにより、しばしば、非生産的な副反応に起因する産物ＤＮＡ（プライマー二量体形成など）が非常に高比率で産生され得る。１つの実施形態では、非生産的な副反応を引き起こす可能性が最も高い特定のプライマーをプライマーライブラリーから除去して、ゲノムにマッピングする増幅ＤＮＡがより高い比率で得られるプライマーライブラリーを得ることができる。問題の多いプライマー（すなわち、二量体を形成する（ｆｉｒｍ）可能性が特に高いプライマー）の除去工程により、配列決定によるその後の分析を非常に高いＰＣＲ多重レベルで予想外に行うことができた。プライマー二量体および／または他の有害な産物によってパフォーマンスが有意に低下する配列決定などのシステムでは、他の記載の多重化の１０倍超、５０倍超、および１００倍超の多重化が達成された。これは過剰なプライマー二量体があまり結果に影響を及ぼさないプローブベースの検出方法（例えば、マイクロアレイ、ＴａｑＭａｎ、ＰＣＲなど）と反対であることに留意のこと。配列決定のための多重化ＰＣＲが同一ウェル中の約１００アッセイに制限されると当該分野で一般的に考えられていることにも留意のこと。
【０１５７】
非マッピングプライマー二量体または他のプライマー有害産物の量を最小にするライブラリー用プライマーの選択方法は多数存在する。経験的データは、少数の「悪い」プライマーが大量の非マッピングプライマー二量体副反応を担うことを示す。これらの「悪い」プライマーの除去により、ターゲティングされた遺伝子座にマッピングされる配列リードの比率を増加させることができる。「悪い」プライマーの１つの同定方法は、ターゲティング増幅によって増幅されたＤＮＡの配列決定データを調査することである。最高頻度で認められるプライマー二量体を除去して、ゲノムにマッピングしない副産物ＤＮＡが得られる可能性が有意に低いプライマーライブラリーを得ることができる。種々のプライマー組み合わせの結合エネルギーを計算することができる公的に利用可能なプログラムも存在し、最高の結合エネルギーを有するプライマーの組み合わせの除去により、ゲノムにマッピングされない副産物ＤＮＡが得られる可能性が有意に低いプライマーライブラリーも得られる。
【０１５８】
どのＰＣＲプローブが二量体を形成する可能性が高いかを決定する他の方法が存在することに留意のこと。１つの実施形態では、非最適化プライマー組を使用して増幅したＤＮＡプールの分析は、問題の多いプライマーを決定するのに十分であり得る。例えば、配列決定を使用して分析を行うことができ、最多数で存在する二量体は、二量体を形成する可能性が最も高いと決定され、除去することができる。
【０１５９】
標的位置を選択するために、疑われるプライマー対デザインのプールから開始し、プライマー対間の潜在的な有害相互作用の熱力学モデルを作製し、このモデルを使用してプール中の他のデザインと不適合のデザインを排除することができる。
【０１６０】
ＰＣＲの実施時に可能なワークフローが多数存在する。本明細書中に開示の方法に典型的ないくつかのワークフローを記載する。本明細書中に概説した工程は、他の可能な工程を排除することを意味せず、本明細書中に記載の任意の工程が適切に機能するための方法に必要であることも含意しない。多数のパラメータの変形形態または他の修正形態が文献中で公知であり、本発明の本質に影響を及ぼすことなくこれらを実施することができる。１つの特に一般化されたワークフローを以下に示し、その後に可能な多数の変形形態を示す。変形形態は、典型的には、可能な二次ＰＣＲ反応（例えば、実施可能な異なるネスト化型）（工程３）をいう。変形形態を本明細書中に明確に記載するものと異なる回数または異なる順序で行うことができることに留意することが重要である。
【０１６１】
１．サンプル中のＤＮＡは、ライゲーションアダプター（しばしば、ライブラリータグまたはライゲーションアダプタータグ（ＬＴ）という）を有することができ、ライゲーションアダプターがユニバーサルプライミング配列を含む場合に付着され、その後にユニバーサル増幅する。１つの実施形態では、断片化後に配列決定ライブラリーを作製するようにデザインされた標準的プロトコールを使用してこれを行うことができる。１つの実施形態では、ＤＮＡサンプルを平滑末端化することができ、次いで、Ａを３’末端に付加することができる。Ｔオーバーハングを有するＹアダプターを付加してライゲーションすることができる。いくつかの実施形態では、ＡまたはＴオーバーハング以外の他の粘着末端を使用することができる。いくつかの実施形態では、他のアダプター（例えば、ループ状ライゲーションアダプター）を付加することができる。いくつかの実施形態では、アダプターは、ＰＣＲ増幅用にデザインされたタグを有することができる。
【０１６２】
２．特異的標的増幅（ＳＴＡ）：数百から数千、数千から数万、さらに数十万の標的の前増幅を１つの反応で多重化することができる。ＳＴＡは、典型的には、１０〜３０サイクル行うが、５〜４０サイクル、２〜５０サイクル、さらに１〜１００サイクルで行うことができる。プライマーに、例えば、より簡潔なワークフローのためまたは大部分の二量体の配列決定を回避するためにテールを付けることができる。典型的には、同一タグを保有する両プライマーの二量体が効率的に増幅または配列決定されないであろうということに留意のこと。いくつかの実施形態では、１サイクルと１０サイクルとの間のＰＣＲを行うことができ、いくつかの実施形態では、１０サイクルと２０サイクルとの間のＰＣＲを行うことができ、いくつかの実施形態では、２０サイクルと３０サイクルとの間のＰＣＲを行うことができ、いくつかの実施形態では、３０サイクルと４０サイクルとの間のＰＣＲを行うことができ、いくつかの実施形態では、４０サイクル超のＰＣＲを行うことができる。増幅は、線形的増幅であり得る。ＰＣＲのサイクル数を、最適なリード深度（ＤＯＲ）プロフィールが得られるように最適化することができる。異なるＤＯＲプロフィールは、異なる目的のために望ましいかもしれない。いくつかの実施形態では、全アッセイ間のリードのより均一な分布が望ましい。ＤＯＲがいくつかのアッセイに小さすぎる場合、確率的ノイズはデータが非常に有用であるのには高すぎ得る一方で、リード深度が非常に高い場合、それぞれのさらなるリードの最低限の有用性が比較的小さい。
【０１６３】
プライマーテールは、普遍的にタグ付けされたライブラリーからの断片化ＤＮＡの検出を改良することができる。ライブラリータグおよびプライマー−テールが相同配列を含む場合、ハイブリッド形成を改良することができ（例えば、融点（ＴＭ）が低下する）、プライマー標的配列の一部のみがサンプルＤＮＡフラグメント中に存在する場合にプライマーを伸長させることができる。いくつかの実施形態では、１３個以上の標的特異的塩基対を使用することができる。いくつかの実施形態では、１０〜１２個の標的特異的塩基対を使用することができる。いくつかの実施形態では、８〜９個の標的特異的塩基対を使用することができる。いくつかの実施形態では、６〜７個の標的特異的塩基対を使用することができる。いくつかの実施形態では、ＳＴＡを、前増幅ＤＮＡに対して行うことができる（例えば、ＭＤＡ、ＲＣＡ、他の全ゲノム増幅、またはアダプター媒介ユニバーサルＰＣＲ）。いくつかの実施形態では、ＳＴＡを、例えば、サイズ選択、標的捕捉、定方向分解（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）によって一定の配列および集団が富化または枯渇されたサンプルに対して行うことができる。
【０１６４】
３．いくつかの実施形態では、特異性を増大させて望ましくない産物を減少させるための二次多重ＰＣＲまたはプライマー伸長反応を行うことが可能である。例えば、全ネスト化、セミネスト化、ヘミネスト化、および／またはより小さなアッセイプールの並行反応への細分は全て、特異性を増大させるために使用することができる技術である。実験により、サンプルの３つの４００−ｐｌｅｘ反応への分割によって厳密に同一のプライマーを使用した１つの１，２００−ｐｌｅｘ反応よりも特異性が高い産物ＤＮＡが得られることが示されている。同様に、実験により、サンプルの４つの２，４００−ｐｌｅｘ反応への分割によって厳密に同一のプライマーを使用した１つの９，６００−ｐｌｅｘ反応よりも特異性が高い産物ＤＮＡが得られることが示されている。１つの実施形態では、同一方向または反対方向の標的特異的プライマーおよびタグ特異的プライマーを使用することが可能である。
【０１６５】
４．いくつかの実施形態では、タグ特異的プライマーを使用したＳＴＡ反応および「ユニバーサル増幅」（すなわち、多数または全ての前増幅標的およびタグ付き標的を増幅するため）によって産生されたＤＮＡサンプルを増幅することが可能である（希釈、精製またはその他の方法）。プライマーは、さらなる機能的配列（例えば、バーコード）またはハイスループット配列決定プラットフォームでの配列決定に必要な全長アダプター配列を含むことができる。
【０１６６】
これらの方法を任意のＤＮＡサンプルの分析のために使用することができ、これらの方法は、ＤＮＡサンプルが特に小さい場合またはＤＮＡが１人を超える個体を起源とする（母体血漿の場合など）ＤＮＡサンプルである場合に特に有用である。これらの方法を、ＤＮＡサンプル（単一または少量の細胞、ゲノムＤＮＡ、血漿ＤＮＡ、増幅血漿ライブラリー、増幅アポトーシス性上清ライブラリー、または他のＤＮＡの混合サンプルなど）に関して使用することができる。１つの実施形態では、これらの方法を、異なる遺伝子構成の細胞が癌または移植片などを有する単一の個体中に存在し得る場合に使用することができる。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、多重ＰＣＲ増幅は、種々のネスト化プロトコール型（例えば、セミネスト化ミニＰＣＲ、全ネスト化ミニＰＣＲ、ヘミネスト化ミニＰＣＲ、三重ヘミネスト化ミニＰＣＲ、片側ネスト化ミニＰＣＲ、片側ミニＰＣＲ、または逆セミネスト化ミニＰＣＲ）を使用する工程を含むことができる。
【０１６８】
診断ボックス
１つの実施形態では、本開示は、本開示中に記載の方法の態様を部分的または完全に実施することができる診断ボックスを含む。１つの実施形態では、診断ボックスを、医師のオフィス、病院検査室、または患者管理地点に合理的に近い任意の適切な場所に配置することができる。ボックスは全自動様式で方法の態様を行うことができるか、ボックスは、１つまたは多数の工程を技術者によって手作業で完了する必要があり得る。１つの実施形態では、ボックスは、母体血漿に関して測定した遺伝子型データを分析することができる。１つの実施形態では、ボックスを、診断ボックスを使用して測定した遺伝子型データを外部計算施設に送信するための手段に連結することができ、次いで、外部計算施設にて遺伝子型データを分析し、おそらく報告書も作成することができる。診断ボックスは、水性または液体のサンプルを一方の容器から他方の容器に移すことができるロボットユニットを含むことができる。診断ボックスは、多数の試薬（固体および液体の両方）を含むことができる。診断ボックスは高処理シークエンサーを含むことができる。診断ボックスはコンピュータを含むことができる。
【０１６９】
プライマーキット
いくつかの実施形態では、本開示に記載の方法を達成するようにデザインされた複数のプライマーを含むキットを処方することができる。プライマーは、本明細書中に開示の外側の順方向プライマーおよび逆方向プライマー、内側の順方向プライマーおよび逆方向プライマーであり得る。これらのプライマーは、プライマーデザインの項目に開示のキット内の他のプライマーに対する結合親和性が低いようにデザインされているプライマーであり得る。これらのプライマーは、関連する項目に記載のハイブリッド捕捉プローブまたは前環状化プローブまたはそのいくつかの組み合わせであり得る。１つの実施形態では、本明細書中に開示の方法と共に使用するようにデザインされた懐胎している胎児中の標的染色体の倍数性の状態を決定するためのキットを処方することができる。このキットは、複数の内側の順方向プライマーおよび任意選択的に複数の内側の逆方向プライマー、および任意選択的に外側の順方向プライマーおよび外側の逆方向プライマーを含み、各プライマーは、標的染色体および任意選択的にさらなる染色体上の多型部位のうちの１つからすぐ上流側および／または下流側のＤＮＡ領域とハイブリッド形成するようにデザインされている。１つの実施形態では、プライマーキットを、本明細書中の他の場所に記載の診断ボックスと組み合わせて使用することができる。
【０１７０】
最尤推定値
表現型または遺伝子型（例えば、染色体異常、病状、または父親との関係）の有無を検出するための当該分野で公知の多数の方法は、条件に直接関連するか相関する計量が測定される単一仮説棄却検定を含む。ここで、計量が所与の閾値の一方のサイドにある場合に条件は存在すると決定される一方で、計量が閾値の他方のサイドにある場合に条件は存在しないと決定される。単一仮説棄却検定は、帰無仮説と対立仮説との間の決定時に帰無仮説分布のみに注目する。交互分布を考慮せずに、観察データを考慮して各仮説の尤度を推定することができない。したがって、コールの信頼度を計算出来ない。それ故、単一仮説棄却検定を使用して、特定の場合に関連する信頼度を推定せずにイエスまたはノーの回答を得る。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の方法は、最尤法を使用して表現型または遺伝子型（例えば、染色体異常、病状、または父性関係）の有無を検出することができる。これは、条件の有無をコールするための閾値をそれぞれの場合に適切なように調整することができるので、単一仮説棄却技術を使用した方法より実質的に改良されている。これは、母体血漿中に見出される浮遊ＤＮＡ中に存在する胎児ＤＮＡおよび母体ＤＮＡの混合物から利用可能な遺伝子データから懐胎している胎児の父性を決定することを目的とする診断技術に特に関連する。最尤推定法は、各仮説に関連する対立遺伝子分布を使用して各仮説を必要条件とするデータの尤度を推定することができる。次いで、これらの条件確率を、仮説コールおよび信頼度に変換することができる。同様に、最大事後推定法は、最尤推定値と同一の条件確率を使用するが、最良の仮説を選択し、信頼度を決定した場合に集団事前確率を組み合わせる。
【０１７２】
したがって、最尤推定値（ＭＬＥ）技術または密接に関連する最大事後（ＭＡＰ）技術の使用によって２つの利点が得られる。第１に正確なコールの機会が増大し、各コールについての信頼度も計算される。１つの実施形態では、最大確率を有する仮説に対応する父性コールの選択を、最尤推定値または最大事後推定値を使用して行う。１つの実施形態では、単一仮説棄却技術を使用する当該分野で公知の任意の方法を使用し、ＭＬＥまたはＭＡＰ技術を使用するように再構築する工程を含む懐胎している胎児の父性の決定方法を開示する。
【０１７３】
父性の決定方法
ｆｆＤＮＡは、典型的には、母体ＤＮＡとの混合物中に低画分で存在する。１つの実施形態では、母親は遺伝子型が既知であるか、母系遺伝子型を測定または推測することができる。典型的には、母体血漿中に見出される胎児ＤＮＡ画分は２％と２０％との間であるが、異なる条件では、この百分率は約０．０１％〜約５０％の範囲であり得る。１つの実施形態では、マイクロアレイまたは対立遺伝子ごとに強度データを与える他の技術を使用して母体血漿を測定することができる。１つの実施形態では、配列決定を使用して母体血漿中に含まれるＤＮＡを測定することができる。これらの場合、特定の対立遺伝子での対立遺伝子強度測定値または配列リード数は、母体シグナルと胎児シグナルとの和である。子のＤＮＡの母親ＤＮＡに対する混合比をｒ：１と仮定すると、遺伝子座での対立遺伝子の相対数は、母親由来の２対立遺伝子および子由来の２ｒ対立遺伝子からなる。いくつかの実施形態では、遺伝子座は一塩基多型を含む。表１は、情報価値のあるペアレントコンテクストの選択のための混合物中の各対立遺伝子の相対数を示す。
【０１７４】
【表１】
2014502845.tif 000003
情報価値のある上記４つのコンテクストの選択が情報価値があり得る全てのコンテクストを含むことを意味しないことに留意のこと。コンテクストの任意の組み合わせを使用することができ、任意のコンテクストの遺伝子型測定値中で見出すことができる情報がかなり存在する。
【０１７５】
子由来の対立遺伝子の欠落率が有意である場合でさえ、対立遺伝子が存在するシグナルと対立遺伝子が存在しないシグナルとの間の相違が明確であり得る。例えば、コンテクスト対ＢＢ｜ＢＢおよびＢＢ｜ＡＡにおけるＳＮＰ由来のＡ対立遺伝子の測定値ならびにコンテクスト対ＡＡ｜ＡＡおよびＡＡ｜ＢＢにおけるＳＮＰ由来のＢ対立遺伝子の測定値を考慮する。それぞれの場合、子の対立遺伝子がどこで欠落していようとも、第１のコンテクスト中にシグナルは存在しないはずであり、第２のコンテクスト中にシグナルが存在するはずである。しかし、擬父が正しくない場合、時折両コンテクスト中にシグナルが存在するであろう。したがって、ＳＮＰ測定値の分布は、擬父が正確かそうでないかに応じて異なるはずである。
【０１７６】
この相違は、典型的には、分布の高シグナル末端でより観察可能であろう。なぜならこれらは子由来のＤＮＡ寄与の尤度がより高いＳＮＰだからであろう。この相違を、ＳＮＰ測定値の分布の高パーセンタイル値の比較によって認めることができる。可能なパーセンタイル法の例は、ニアレストランク、クローゼストランク間の線形補間、および重み付きパーセンタイルである。
【０１７７】
例えば、全染色体由来のコンテクストＢＢ｜ＢＢにおけるＡ対立遺伝子のＳＮＰ測定値組をＸ１と定義し、コンテクストＢＢ｜ＡＡにおけるＡ対立遺伝子の測定値組をＸ２と定義する。擬父が正確な場合、Ｘ１の９９パーセンタイル値はＸ２の９９パーセンタイル値より有意に低いであろう。擬父が正しくない場合、２つの分布の９９パーセンタイル値は相互に近いであろう。任意のパーセンタイル（例えば、９５パーセンタイル、９０パーセンタイル、８５パーセンタイル、または８０パーセンタイル）を同様に十分に使用することができることに留意のこと。１つの実施形態では、特定の測定チャネルについて、Ｘ１をシグナルを持たないコンテクスト由来の測定値と定義することができ、Ｘ２を母親および父親が共にホモ接合性であり、且つ父親の対立遺伝子のみがシグナルを提供する（子を介して遺伝）コンテクスト由来の測定値と定義することができる。
【０１７８】
ｐ１をＸ１データの９９（または９５、９０など）パーセンタイルと定義し、ｐ２をＸ２データの９９（または９５、９０など）パーセンタイルと定義する。検定統計量ｔをｐ１／ｐ２と定義する。値の相違を示すｐ１およびｐ２の他の関数を等しく充分に使用することができることに留意のこと。値ｔは、サンプル中の子ＤＮＡの存在量（未知）に応じて変化するであろう。したがって、ｔの分類閾値を事前的に計算することができない。
【０１７９】
単一サンプルの検定統計量ｔを、以下の手順を使用して父親が分からない多数の個体の遺伝子型から得た分布と比較することができる。巨大な非血縁個体組由来の遺伝子型が利用可能であると仮定する。
【０１８０】
１．各非血縁個体について、父親であると仮定し、検定統計量ｔ値を計算する。
【０１８１】
２．Ｔｕを非血縁の男性由来のｔ測定値組とする。Ｔｕに分布を当てはめる。これは、帰無仮説下での特定のサンプルのｔの分布である。帰無仮説は、「遺伝子型がサンプル中に存在する子の父親に由来しない」である。分布Ｐｕ（ｔ）は、既知の分布（例えば、ガウス分布）への最大尤度フィットまたはモーメントフィット法、カーネル関数を使用するカーネル密度フィット（例えば、Ｇａｕｓｓｉａｎ、ｂｏｘ、ｔｒｉａｎｇｌｅなど）、または任意の他の適切な分布フィッティング法であり得る。
【０１８２】
３．擬父の遺伝子型を考慮し、対応する検定統計量ｔｃを計算する。
【０１８３】
４．真の父親は、非血縁個体よりｔ値が小さくなると予想される。ｔｃまたはより離れた値を生じる非血縁の父親の確率は、ｔｃで評価されたＰｕの累積密度関数である。したがって、帰無仮説棄却のｐ値を以下の式によって得る。
【０１８４】
【化１】
2014502845.tif 000004
ｐが有意性閾値α未満に低下する場合、擬父が非血縁個体である仮説を有意性αで棄却することができる。ｐがαを超える場合、帰無仮説を棄却できず、擬父はサンプル中に存在する子と非血縁であり得る。有意性閾値αは、非血縁個体を正確な父親に分類することができる確率を定義する。例えば、０．０１と等しい閾値αを使用して、１％の非血縁個体が正確な父親と同定され得る。
【０１８５】
ＡおよびＢ対立遺伝子チャネル由来のデータの組み合わせのための種々の方法を考慮することができる。例えば、２つの簡潔な方法は、全チャネル由来のｐ値が閾値未満であることを必要とすることまたは任意のチャネル由来のｐ値が閾値未満であることを必要とすることである。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、親子鑑定法は、子ＤＮＡが子由来のシグナルを持つか持たないＳＮＰを区別するのに充分な濃度で存在すると仮定する。充分な子ＤＮＡ濃度の非存在下で、予想される父性遺伝した対立遺伝子が母体血漿中に測定されないので、この方法は「不正確な父親」を報告することができる。１つの実施形態では、親子鑑定の適用前に充分な子ＤＮＡの存在を確認することができる方法を記載する。子の存在確認は、子ＤＮＡ濃度に比例するが、父親遺伝子型を必要としない検定統計量の計算に基づく。検定統計量が必要な閾値を超える場合、子ＤＮＡ濃度は親子鑑定を行うのに充分である。
【０１８７】
母親遺伝子型がＡＡであり、Ｂチャネルを測定するＳＮＰ組（合わせた全染色体由来）を考慮する。シグナルは子の遺伝子型がＢを含むＳＮＰのサブセットのみに対して予想されるが、これらのＳＮＰを父親遺伝子型を使用せずに事前的に同定することができず、利用できない。その代わりに、巨大なサンプル集団に基づいたＳＮＰ集団内頻度｛ｆｉ｝（ｆｉはＳＮＰｉの遺伝子型中のサンプル平均数Ｂｓである）を考慮する。母親遺伝子型がＡＡであるほとんどのＳＮＰのｆｉは０．５未満であろうが、これらのＳＮＰ上のｆｉ分布はほとんど１にまで及ぶことに留意のこと。２組のＳＮＰ（Ｓ１およびＳ２）（Ｓ１＝｛ｉ：ｆｉ＜ＴＬ｝およびＳ２＝｛ｉ：ｆｉ＞ＴＨ｝）を考慮する。閾値ＴＬおよびＴＨはＳ１中のＳＮＰがＢを有すると予想されることがほとんどなく、且つＳ２中の多数のＳＮＰがＢを有すると予想されるような組であり、各組は充分な集団を有する。１つの実施形態では、このアルゴリズムはＴＬ＝０．０５およびＴＨ＝０．７を使用する一方で、ＴＬおよびＴＨの他の値が等しく充分またはそれ以上に有効であり得る。ｙｉをＳＮＰｉ由来のＢチャネル測定値とする（Ｙ１＝｛ｙｉ：ｉ∈Ｓ１｝およびＹ２＝｛ｙｉ：ｉ∈Ｓ２｝）。Ｙ１およびＹ２の分布は非常に類似するであろう。なぜなら、両分布中のほとんどのＳＮＰがシグナルを持たないからであろう。しかし、Ｓ２中のいくつかの些細でない数のＳＮＰが子のシグナルを有すると予想され、Ｓ１中の非常に少数のＳＮＰが子のシグナルを有すると予想される。したがって、Ｙ２のテールはＹ１のテールより高い強度に及ぶはずである。ｐｔを１に近いパーセンタイル（例えば、９９パーセンタイル）とする。充分な子ＤＮＡの存在下で、Ｙ２のｐｔパーセンタイルは、Ｙ１のｐｔパーセンタイルより有意に高いはずである。したがって、検定統計量ｓを以下のように定義することができる。
ｓ＝パーセンタイル（Ｙ２；ｐｔ）−パーセンタイル（Ｙ１；ｐｔ）  。
【０１８８】
１つの実施形態では、検定統計量を、アレイ間の増幅相違の説明を試みる種々の方法によって正規化することができる。１つの実施形態では、染色体ごとに正規化することができる。１つの実施形態では、アレイごとに正規化することができる。１つの実施形態では、配列決定作業ごとに正規化することができる。
【０１８９】
以下の計算は、どのようにしてＳＮＰの概数および欠落率に基づいて閾値ＴＬおよびＴＨが特定の母体サンプル中の子ＤＮＡの影響を区別することができるのかを示す。表３は、以下に由来するいくつかのデータを示す。
【０１９０】
１つの実施形態では、本方法は、以下の仮定を含む。
・集団内頻度を、大集団データセット（例えば、５００人超の個体、１，０００人超の個体、５，０００人超の個体、または２０，０００人超の個体）から計算し、各コンテクスト中のＳＮＰ数は、例示の母親および父親に由来すること。
・母親がＡＡであり、父親がＢＢであるＳＮＰは存在しないこと（実際には、およそ８％の母親のＳＮＰがＡＡである）。
・父親がＢを有するＳＮＰが半分であることにより、子がＢになること。
・子の欠落率が９０％であること。
・子シグナルを用いた測定値は、子シグナルを用いない測定値より高いであろうということ。
【０１９１】
表３は、上記パラメータを使用した開示の方法を使用した特定の父性の場合に由来するいくつかのデータを示す。Ｓ１由来の９８パーセンタイル測定値は、子のシグナルが存在する任意のＳＮＰを含むと予想されない。Ｓ２由来の９８パーセンタイル測定値は、子のシグナルが存在する約５０個のＳＮＰを含むと予想される。２つの間の相違は、子のシグナル量を反映するはずである。
【０１９２】
【表３】
2014502845.tif 000005
図１は、３８週で採取した母体血漿サンプル由来のコンテクストＡＡ｜ＡＡおよびＡＡ｜ＢＢの対立遺伝子強度データの分布を示す。Ｂ対立遺伝子を測定する。ＡＡ｜ＢＢ分布はＡＡ｜ＡＡ分布より有意に高く広がり、これは、Ｂ対立遺伝子（子のゲノム中のみ存在する）がＡＡ｜ＢＢコンテクスト中に存在するがＡＡ｜ＡＡコンテクスト中に存在しないことに留意のこと。図２は、図１と同一の母体血漿サンプルに由来し、２００人の非血縁個体由来の遺伝子型を使用した対立遺伝子Ｂの検定統計量ｔの分布を示す。以下の２つの分布を示す（２つの曲線）：最尤ガウスフィットおよびカーネル分布。実父の値ｔｃを星印でマークする。ｐ値は、擬父が子と非血縁関係であるという帰無仮説について１０−７未満である。
【０１９３】
表４は、種々の妊娠段階での８つの母系血液サンプル由来の結果を示す。ｐ値を、正確な父親について各チャネル（Ａ対立遺伝子およびＢ対立遺伝子）から測定したデータに基づいて計算する。両チャネルｐ値が０．０１未満である必要がある場合、２つのサンプルは不正確に分類される。たった１つのチャネルが閾値を通過する必要がある場合、全サンプルは正確に分類される。比率の確認または排除のために多数の計量および閾値を使用することができる。例えば、カットオフｐ値０．０２、０．００５、０．００１、または０．００００１を使用することができる。同様に、チャネルｐ値の一方または両方が所与の閾値未満であることを要求することができるか、異なるチャネルｐ値について２つの異なる閾値を有し得る。
【０１９４】
【表４】
2014502845.tif 000006
表４は、正確な父親が非血縁個体である帰無仮説のＰ値を示す。各列は異なる母系血液サンプルに対応し、これは父系遺伝子サンプルに対応している。２００人の非血縁の男性に関して取得した遺伝子測定値をコントロールとして使用した。図３中の曲線は、２００人の非血縁の男性の強度比の分布を示し、星印は実父の強度比を示す。このデータは、妊娠１１週の母親から採血した場合に取られている。
【０１９５】
図４は、以下の３つの場合についての胎児遺伝子型測定値と親の遺伝子型測定値との間の相関比についての累積分布頻度（ｃｄｆ）曲線を示す：（１）妊娠中の母親および擬父の両方が胎児の生物学的な親である場合（「正確」、右端の曲線）、（２）妊娠中の母親が胎児の実母であるが、擬父が胎児の実父でない場合（「誤り１つ」、中央の曲線）、および（３）妊娠中の母親および擬父のいずれも胎児の生物学的な親ではない場合（「誤り２つ」、左端の曲線）。ｃｄｆ曲線は、単一細胞に関して測定したデータから計算した胚の遺伝子型データと０人、１人、または２人の仮定された親が実際に胎児の遺伝的親である場合の仮定した親の遺伝子型データとの間の相関比である。「正確」および「誤り２つ」のラベルが逆にされることに留意のこと。図５は、同一の３つの場合についてのヒストグラムを示す。ヒストグラムが片方および両方の親が不正確である１０００を超える場合で構成されていることに留意のこと。単一細胞に関して測定した胎児の遺伝子型データと０人、１人、または２人の仮定された親が実際に胎児の遺伝的親である場合の仮定した親の遺伝子型データとの間で測定した相関率のヒストグラム。
【０１９６】
本発明の親子鑑定法を使用した３５の父性の結果を図６に示す。妊娠期間が９〜４０週の妊娠中の女性から採取したサンプルに関して鑑定を行った。右側の赤色の曲線は、８００人の非血縁の男性についての親子鑑定法による統計量の正規化ガウス分布を示す。非血縁の男性の分布は各場合で異なっている。視覚化するためにここでは正規化分布を使用する。
【０１９７】
青色バーは、正確な父親（擬父）についての正規化検定統計量を示す。正確な父親が非血縁の男性と明らかに離れていることが明確である。正規化検定統計量は標準偏差にほぼ近似するので、下のグラフ上の「−５」が平均から約５標準偏差であることに留意のこと。したがって、このコホートにおける全ての仮定された父親が少なくとも９９．９９９９％の信頼度で正確な父親と確認された。
【０１９８】
本発明の１つの実施形態では、親ハプロタイプの知識を使用して、試験の精度を向上させることができる。例えば、染色体の所与のセグメントについて父親の２つのハプロタイプが既知である場合、欠落しない場合にＳＮＰが存在するという知識を使用して、欠落し得る場合についてどのＳＮＰが予想されるべきであるかを決定することができる。例えば、連鎖しており（すなわち、同一染色体上に密接して存在する）、母親および擬父のコンテクストがＡＡ｜ＡＢ、ＡＡ｜ＡＢ、ＡＡ｜ＢＡである３つのＳＮＰ組を想定する。２つの文字のうちの最初の文字が第１のハプロタイプ上の対立遺伝子を示し、第２の文字が第２のハプロタイプ上の対立遺伝子を示すので、親の遺伝子型が相特定されている場合、ＡＢ≠ＢＡであることに留意のこと。ここで、これら３つのＳＮＰについて、３つ全てについて有意なレベルのＢ対立遺伝子が測定されると想定する。この場合、擬父が正確な父親であるという見込みは低い、なぜなら、２つの父親のハプロタイプがＡ、Ａ、Ｂ、およびＢ、Ｂ、Ａである一方で、測定された胎児遺伝子型は３つ全てのＳＮＰでＢについて陽性であり、母親はＡにのみ寄与し得るからである。父親遺伝子型が相特定されていなかった場合、この測定値組を考慮してこの擬父を除外することはできないであろう。１つの実施形態では、１つ以上の精子に関して取得したハプロイド遺伝的測定値と共に二倍体ゲノムＤＮＡ測定値を考慮して父親ハプロタイプを決定することができる。１つを超える精子の使用により、ハプロタイプをより正確に決定することが可能であり、精子が形成された減数分裂の間に各染色体について交差が起こり得た回数をその位置と共に決定することも可能である。この親の相特定を達成する方法を、本明細書中の他の場所で参照した４つのＲａｂｉｎｏｗｉｔｚの特許出願により詳細に見出すことができる。
【０１９９】
１つの実施形態では、ＳＮＰ測定値を使用して排他的に父性決定を行い、単一縦列反復由来のデータを使用しない。１つの実施形態では、ＳＮＰ測定値およびＳＴＲ測定値の両方を使用して排他的に父性決定を行う。ＳＮＰデータを、ＳＮＰマイクロアレイを使用して測定することができるか、配列決定を使用して測定することができる。配列決定をターゲティングすることができないか、例えば多型遺伝子座組をターゲティングする循環プローブの使用によってターゲティングすることができるか、ハイブリッド形成技術による捕捉の使用によってターゲティングすることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子データを、以下の方法の組み合わせによって測定することができる。例えば、親遺伝子データをＳＮＰマイクロアレイに関して測定することができる一方で、母体血清から単離したＤＮＡを、捕捉ハイブリッド形成プローブを使用してＳＮＰマイクロアレイで見出されたＳＮＰと同一のＳＮＰをターゲティングする標的配列決定を使用して測定することができる。１つの実施形態では、以下のデータ型の組み合わせを使用して、擬父が胎児の実父であるか否かを決定することができる：ＳＮＰデータ、ＳＴＲデータ、交差データ、微小欠損データ、挿入データ、転座データ、または他の遺伝子データ。
【０２００】
１つの実施形態では、本方法は、胎児または他の標的個体の確立された父性を開示する報告書を作成する工程を含むことができる。１つの実施形態では、父性決定を伝達する目的で報告書を作成することができる。１つの実施形態では、報告書は、擬父が胎児の実父である確率を含むことができる。かかる報告書のいくつかの例を以下の図内に示す。図７は父性排除を開示する報告書の例であり、図８は父性包含を開示する報告書の例であり、図９は不確定の結果を示す報告書の例である。１つの実施形態では、報告書は、所与の胎児および母親に関する複数の非血縁個体についての父性関連計量の分布を含むグラフ（灰色の曲線として示す）ならびに擬父についての計量の表示（三角として示す）を含むことができる。非血縁の男性の分布は各場合で異なる。これら３つの報告書では、胎児および非血縁の男性についての実際の検定統計量の分布をここで使用している。１つの実施形態では、報告書はまた、擬父が非血縁個体の分布の一部である可能性がより高いという表示（例えば、図７）を含むことができる。したがって、擬父が胎児の実父でないことが確証される。ここで、三角がグラフの父性排除領域に存在するという事実はこれが父性排除であることを示す。１つの実施形態では、報告書はまた、擬父が非血縁個体についての父性計量の分布の一部ではない可能性がより高いという表示（例えば、図８）を含むことができ、擬父が胎児の実父であることが確証される。三角がグラフの父性包含領域中に存在するという事実はこれが父性包含であることを示す。１つの実施形態では、報告書はまた、測定値が不確定であるという表示（例えば、図９）を含むことができる。三角がグラフの「不確定の結果」領域中に存在するという事実は、胎児の父性の確証に関して結論づけられなかったことを示す。
【０２０１】
本発明の１つの実施形態では、擬父が胎児の実父であるか否かの決定を、単一縦列反復（ＳＴＲ）を使用しないで行う。本発明の１つの実施形態では、父性決定の精度を、親遺伝子型の相特定によって増大させる。本発明の１つの実施形態では、１人以上の親の遺伝子型を、その親に関連する１以上の個体由来の遺伝物質を使用して相を特定する。１つの実施形態では、親と血縁関係にある個体は、両親の父親、母親、同胞、息子、娘、兄弟、姉妹、叔母、叔父、双子、クローン、両親由来の配偶子、およびその組み合わせである。
【０２０２】
別の父性決定方法
１つの実施形態では、母体血漿および任意選択的に他の遺伝物質を、配列決定（例えば、高処理シークエンサー（ＩＬＬＵＭＩＮＡのＨＩＳＥＱもしくはＭＩＳＥＱまたはＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳのＩＯＮ  ＴＯＲＲＥＮＴなど）の使用）によって測定することができる。
【０２０３】
浮遊胎児ＤＮＡ濃度が充分である場合、非侵襲性親子鑑定法を母体血液サンプルに関して行うことができる。一般に、ほとんどの場合、母体血漿中の胎児ＤＮＡ画分は約２％と２０％との間であるが、その一部が在胎期間に依存して、０．０１％もの低さまたは４０％もの高さであり得る。この胎児画分の範囲がＳＮＰマイクロアレイを使用した単一仮説棄却法による親子鑑定法に充分であることが既に証明されている。ハイスループット配列決定は、母親および子の遺伝子型の組み合わせについての各ＳＮＰでの予想される測定値の応答を数学的にモデリングすることが可能なはるかに正確なプラットフォームである。１つの実施形態では、母体血漿および任意選択的に他の遺伝物質を、配列決定（例えば、高処理シークエンサー（ＩＬＬＵＭＩＮＡのＨＩＳＥＱもしくはＭＩＳＥＱまたはＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳのＩＯＮ  ＴＯＲＲＥＮＴなど）の使用）によって測定することができる。次いで、父性包含または父性排除の信頼度を、確率および／または推定理論の使用によって計算することができる。
【０２０４】
１つの実施形態では、親子鑑定法は以下を含むことができる。擬父について、以下の２つの異なる仮説に関して血漿由来の配列決定データの確率を計算することができる。（１）擬父が正確な（生物学的な）父親であること（Ｈｃ）、および（２）擬父が正確な（生物学的な）父親でないこと（Ｈｗ）。次いでより高い尤度または事後確率を有する仮説を選択する。１つの実施形態では、このアプローチを、血漿中の対立遺伝子比を配列決定されたＡおよびＢ対立遺伝子の認められた数に関連付けるプラットフォームモデルと組み合わせることができる。プラットフォームモデルが利用可能であるならば、各仮説についての各ＳＮＰの位置についての配列決定されたＡおよびＢ対立遺伝子の確率的尤度を導くことが可能である。
【０２０５】
１つの厄介な問題は、母体血漿中の胎児画分の量が個体とおよび経過時間との間で変化し得ることである。１つの実施形態では、本方法は、この可変性を説明することができる。この型の可変性に取り組む方法がいくつか存在する。１つの実施形態では、本方法は胎児画分を明確に推定することができ、別の実施形態では、本方法は、未知の量に事前確率を当てはめ、可能な値全体を統合することができる。１つの実施形態は、０からいくつかの閾値まで（例えば、４０％）の一様分布のままの事前確率を使用する。理論的には任意の事前確率が有効であり得る。１つの実施形態は、連続空間中または有限パーティション上のいずれかで種々の子画分の尤度を計算し、それぞれ範囲にわたって統合または合計する。
【０２０６】
胎児画分ｆを有する母体血漿および単一のＳＮＰ（血漿中に存在する期待される対立遺伝子比はｒである）（母系遺伝子型および胎児遺伝子型に基づく）を考慮する。１つの実施形態では、期待対立遺伝子比を、母体ＤＮＡおよび胎児ＤＮＡの組み合わせ中の期待Ａ対立遺伝子画分と定義する。母系遺伝子型ｇｍおよび子の遺伝子型ｇｃについて、同様に遺伝子型を対立遺伝子比として示されると仮定して、期待対立遺伝子比は式１によって得られる。
ｒ＝ｆｇｃ＋（１−ｆ）ｇｍ  （１）  。
【０２０７】
ＳＮＰでの観測は、各対立遺伝子が存在するマッピングリード数（ｎａおよびｎｂ）を含み、これを合計するとリード深度ｄになる。マッピングおよび対立遺伝子の観測が正確と見なすことができるように、品質管理手段をマッピング確率に適用していると仮定する。簡潔な観測尤度モデルは、対立遺伝子比ｒを有する巨大なプールから各ｄリードを独立して引くと仮定する二項分布である。式２はこのモデルを記載している。
【０２０８】
【化２】
2014502845.tif 000007
母系遺伝子型および胎児遺伝子型が全てＡまたは全てＢのいずれかである場合、血漿中の期待対立遺伝子比は０または１であり、Ｐｂｉｎｏは充分に定義されないであろう。さらに、予測できない対立遺伝子が時折実際に認められるので、これは望ましくない。二項分布モデルを多数の方法で拡大することができる。１つの実施形態では、少量の予測できない対立遺伝子が説明されるように修正対立遺伝子比
【０２０９】
【化３】
2014502845.tif 000008
を使用することが可能である。１つの実施形態では、各ＳＮＰ上に出現する予測できない対立遺伝子の比をモデリングするために学習用データを使用し、このモデルを使用して期待対立遺伝子比を補正することが可能である。期待対立遺伝子比が０でも１でもない場合、観測対立遺伝子比は、増幅バイアスまたは他の現象に起因して期待対立遺伝子比に変換することができない。次いで、対立遺伝子比を、期待対立遺伝子比に中心があるベータ分布としてモデリングすることができ、それにより、二項分布より高い分散を有するＰ（ｎａ，ｎｂ｜ｒ）についてのベータ二項分布が得られる。
【０２１０】
単一のＳＮＰでの応答についての一般的なプラットフォームモデルを、Ｆ（ａ，ｂ，ｇｃ，ｇｍ，ｆ）（３）または母系遺伝子型および胎児遺伝子型を考慮した観測確率ｎａ＝ａおよびｎｂ＝ｂ（これらは式１による胎児画分にも依存する）として定義することができる。
Ｆ（ａ，ｂ，ｇｃ，ｇｍ，ｆ）＝Ｐ（ｎａ＝ａ，ｎｂ＝ｂ｜ｇｃ，ｇｍ，ｆ）（３）  。
【０２１１】
ｇｃ，ｇｍ、およびｆの関数を必要条件とすることによって（例えば、（１）で定義したｒおよび（２）中の二項分布例を使用することによって）式（３）を簡潔にすることが可能であることに留意のこと。次いで、Ｆの式を以下のように記載することができる。
Ｆ（ａ，ｂ，ｇｃ，ｇｍ，ｆ）＝Ｐ（ｎａ＝ａ，ｎｂ＝ｂ｜ｇｃ，ｇｍ，ｆ）＝Ｐ（ｎａ＝ａ，ｎｂ＝ｂ｜ｒ（ｇｃ，ｇｍ，ｆ））（４）  。
【０２１２】
一般に、Ｆの関数形式は、二項分布、ベータ二項分布、多変量ポリア分布、学習用データから推定した経験分布、または上記で考察した類似の関数であり得る。１つの実施形態では、Ｆの関数形式は、問題の染色体上のコピー数についての仮説に応じて異なる形式を取る。
【０２１３】
胎児画分の計算方法
ＤＮＡの混合画分中に存在する胎児ＤＮＡ画分の決定は、非侵襲性出生前父性決定、倍数性コール、または対立遺伝子コールのための任意の方法の不可欠な部分であり得る。いくつかの実施形態では、混合サンプルの胎児画分を、母親の遺伝子型データ、父親の遺伝子型データ、ならびに母体ＤＮＡおよび胎児ＤＮＡの両方を含む混合サンプル由来の測定された遺伝子型データを使用して決定することができる。親子鑑定法の文脈で、また、倍数性コールの場合はより狭い範囲で、父親の正体は知られていないので、胎児の実父の遺伝子型データを使用できない。これらの場合では、胎児の実父の遺伝子型を必要としない胎児画分決定方法を有することが重要である。胎児画分を推定するためのいくつかの方法を本明細書中に記載している。これらの方法を、実父の遺伝子型が利用可能な場合、および利用可能でない場合に適切であるような一般的方法で記載する。
【０２１４】
特定の染色体について、Ｎ個のＳＮＰを調査すると想定すると、この想定のために以下のデータを有する。
・ＮＲ血漿配列の測定値組Ｓ＝（Ｓ１，…，ＳＮＲ）。１つの実施形態では、各ＳＮＰの対立遺伝子ＡおよびＢの（Ａ，Ｂ）数を有する場合、ｓをｓ＝（（ａ１，ｂ１），…，（ａＮ，ｂＮ））（ａｉはＳＮＰｉ上の数であり、ｂｉはＳＮＰｉ上のｂであり、
【０２１５】
【化４】
2014502845.tif 000009
）と記載する事ができる。
・親データは以下からなる。
○遺伝子型情報：母親Ｇｍ＝（Ｇｍ１，…，ＧｍＮ），父親Ｇｆ＝（Ｇｆ１，…，ＧｆＮ）（式中、Ｇｍｉ，Ｇｆｉ∈（ＡＡ，ＡＢ，ＢＢ））；および／または
○配列データ測定値：ＮＲＭ母親測定値ｓｍ＝（ｓｍ１，…，ｓｍｎｒ）、ＮＲＦ父親測定値Ｓｆ＝（Ｓｆ１，…，Ｓｆｎｒ）。上記単純化に類似して、各ＳＮＰ上に（Ａ，Ｂ）数を有する場合、Ｓｍ＝（（ａｍ１，ｂｍ１），…，（ａｍＮ，ｂｍＮ））、Ｓｆ＝（（ａｆ１，ｂｆ１），…，（ａｆＮ，ｂｆＮ））
集合的に、母親、父親、子のデータをＤ＝（Ｇｍ，Ｇｆ，Ｓｍ，Ｓｆ，Ｓ）と示すことができる。１つの実施形態では、両親由来の遺伝子型データを使用可能である。１つの実施形態では、母親にのみ由来する遺伝子型データを使用可能である。１つの実施形態では、父親にのみ由来する遺伝子型データを使用可能である。１つの実施形態では、いずれの親にも由来しない遺伝子型データを使用可能である。いくつかの実施形態では、母親の遺伝子型データを、混合サンプル中で測定された遺伝子型データから推測することができる。一般に、親データが望ましく、アルゴリズムの精度が向上するが、必要条件ではないことに留意のこと。
【０２１６】
子画分推定
【０２１７】
【化５】
2014502845.tif 000010
は、データを考慮した期待子画分である。
【０２１８】
【化６】
2014502845.tif 000011
１つの実施形態では、可能な子画分の間隔を細密に一定間隔を開けた点の集合Ｃに分割し、各点で計算を行い、上記式を以下の式に変えることができる。
【０２１９】
【化７】
2014502845.tif 000012
（Ｐ（ｆ｜Ｄ）は、データＤを考慮した特定の子画分ｆの尤度である）。以下のベイズの法則を使用してさらに導くことができる。
Ｐ（ｆ｜Ｄ）〜Ｐ（Ｄ｜ｆ）＊Ｐ（ｆ）
（式中、Ｐ（ｆ）は特定の子画分の事前重みである）。１つの実施形態では、これを、情報がない事前分布（一様分布）から導くことができ、これは集合Ｃ中の候補子画分間のスペーシングに比例し得る。
【０２２０】
Ｐ（Ｄ｜ｃｆｒ）は、関連する染色体に関する特定のコピー数下で導かれる特定の子画分を考慮した所与のデータの尤度である。１つの実施形態では、使用した染色体上のダイソミーを仮定することができる。全ＳＮＰに関するデータの尤度は、個別のＳＮＰに関するデータの尤度の積である。
【０２２１】
【化８】
2014502845.tif 000013
（式中、ｉは特定のＳＮＰを示す）。ＳＮＰｉについては、以下の式を有する。
【０２２２】
【化９】
2014502845.tif 000014
（式中、ｇｍは可能性のある真の母親遺伝子型であり、ｇｆは可能性のある真の父親遺伝子型であり、ｇｃは可能性のある子の遺伝子型であり、ｇｍ，ｇｆ，ｇｃ∈｛ＡＡ，ＡＢ，ＢＢ｝。
【０２２３】
Ｐ（ｇｍ｜ｉ）は、ＳＮＰｉでの既知の集団内頻度（ｐＡｉで示す）に基づいたＳＮＰｉに関する母親遺伝子型ｇｍの一般的な事前確率である。特に、
ｐ（ＡＡ｜ｐＡｉ）＝（ｐＡｉ）２，ｐ（ＡＢ｜ｐＡｉ）＝２（ｐＡｉ）＊（１−ｐＡｉ），ｐ（ＢＢ｜ｐＡｉ）＝（１−ｐＡｉ）２。
ｐ（ｆ｜ｉ）についても同様に、父親遺伝子型の確率である。
【０２２４】
親ｍ、ｆ、および想定した仮説Ｈを考慮した真の子の遺伝子型＝ｃが得られる確率をＰ（ｇｃ｜ｇｍ，ｇｆ，Ｈ）と示し、容易に計算することができる。例えば、ダイソミーについては、以下である。
【０２２５】
【表５】
2014502845.tif 000015
真の母親遺伝子型ｍ、真の父親遺伝子型ｆ、真の子の遺伝子型ｃ、コピー数についての仮説Ｈ、および子画分ｆを考慮したＳＮＰｉに関する所与のデータＤの確率をＰ（Ｄ｜ｇｍ，ｇｆ，ｇｃ，Ｈ，ｉ，ｆ）とする。これを、以下のように、母親、父親、および子のデータの確率に分解することができる。
Ｐ（Ｄ｜ｇｍ，ｇｆ，ｇｃ，Ｈ，ｆ，ｉ）＝Ｐ（ｓｍ｜ｇｍ，ｉ）Ｐ（Ｇｍ｜ｇｍ，ｉ）Ｐ（ｓｆ｜ｇｆ，ｉ）Ｐ（Ｇｆ｜ｇｆ，ｉ）Ｐ（ｓ｜ｇｍ，ｇｃ，Ｈ，ｆ，ｉ）  。
【０２２６】
イルミナ遺伝子型が正確と仮定した真の遺伝子型ｇｍと比較したＳＮＰｉでの母親イルミナ遺伝子型データｇｍｉの確率は、以下に示すように簡潔である。
【０２２７】
【化１０】
2014502845.tif 000016
１つの実施形態では、余分なノイズまたはバイアスが含まれないカウントＳｍｉ＝（ａｍｉ，ｂｍｉ）の場合のＳＮＰｉでの母親配列データの確率は、以下のように定義された二項確率である：
Ｐ（Ｓｍ｜，ｉ）＝ＰＸ｜ｍ（ａｍｉ）（式中、Ｘ｜ｍ〜Ｂｉｎｏｍ（ｐｍ（Ａ），ａｍｉ＋ｂｍｉ））。ここで、ｐｍ（Ａ）を、以下のように定義する。
【０２２８】
【表６】
2014502845.tif 000017
類似の式を父親の確率に適用する。
【０２２９】
親データ、特に父親データを用いずに回答を得ることが可能であることに留意のこと。例えば、父親遺伝子型データＦが利用できない場合、Ｐ（Ｇｆ｜ｇｆ，ｉ）＝１を使用することができる。父親配列データＳｆが利用できない場合、Ｐ（Ｓｆ｜ｇｆ，ｉ）＝１を使用することができる。１つの実施形態では、異なる染色体由来の情報を、平均、加重平均、または類似関数を使用して収集する。
【０２３０】
胎児画分の別の計算方法
ＤＮＡ混合物中の胎児ＤＮＡ画分の別の決定方法を本明細書中に記載する。１つの実施形態では、親子鑑定、倍数性検定、または他の目的のための胎児画分ｆの最尤推定値のバージョンを、父性情報を使用せずに導くことができる。Ｓ０を母系遺伝子型０（ＡＡ）を有するＳＮＰ組と定義し、Ｓ０．５を母系遺伝子型０．５（ＡＢ）を有するＳＮＰ組と定義し、Ｓ１を母系遺伝子型１（ＢＢ）を有するＳＮＰ組と定義する。Ｓ０上の可能な胎児遺伝子型は０および０．５であり、それにより、可能な対立遺伝子比の組
【０２３１】
【化１１】
2014502845.tif 000018
が得られる。同様に、Ｒ０．５＝｛０．５−ｆ，０．５，０．５＋ｆ｝および
【０２３２】
【化１２】
2014502845.tif 000019
。Ｓ０、Ｓ０．５、およびＳ１組の全てまたは任意のサブセットを使用して、子画分推定値を導くことができる。
【０２３３】
Ｎａ０およびＮｂ０をＳ０中のＳＮＰの配列数によって形成されたベクトルと定義し、Ｎａ０．５およびＮｂ０．５を同様にＳ０．５について定義し、Ｎａ１およびＮｂ１を同様にＳ１について定義する。全母系遺伝子型組を使用したｆの最尤推定値
【０２３４】
【化１３】
2014502845.tif 000020
を、式４によって定義する。
【０２３５】
【化１４】
2014502845.tif 000021
各ＳＮＰでの対立遺伝子数がＳＮＰの血漿対立遺伝子比を必要条件として独立であると仮定すると、確率を、各組中のＳＮＰの積として示すことができる。
【０２３６】
【化１５】
2014502845.tif 000022
（式中、ｎａｓ、ｎｂｓは、ＳＮＰ上の数ｓである）。
【０２３７】
ｆへの従属性は、可能な対立遺伝子比Ｒ０（ｆ）、Ｒ０．５（ｆ）、およびＲ１（ｆ）の組による。ＳＮＰの確率Ｐ（ｎａｓ，ｎｂｓ｜ｆ）を、ｆを必要条件とした最尤遺伝子型の仮定によって近似することができる。合理的に高い胎児画分およびリード深度で、最尤遺伝子型の選択は、信頼度が高いであろう。例えば、１０％の胎児画分およびリード深度１，０００で、母親が遺伝子型０を有するＳＮＰを考慮する。期待対立遺伝子比は０％および５％であり、これらは、充分に高いリード深度で容易に区別可能であろう。推定した子の遺伝子型の式５への置換により、胎児画分推定値についての完全方程式（６）が得られる。
【０２３８】
【化１６】
2014502845.tif 000023
胎児画分は、範囲［０，１］内でなければならず、それにより、最適化を、制約付きの一次元探索によって容易に行うことができる。
【０２３９】
別の方法は、各ＳＮＰで可能な遺伝子型を合計することであろう。それにより、Ｓ０におけるＳＮＰのＰ（ｎａ，ｎｂ｜ｆ）について以下の式（７）が得られる。事前確率Ｐ（ｒ）を、Ｒ０（ｆ）にわたって一様と仮定することができるか、集団内頻度に基づき得る。Ｓ０．５およびＳ１群への拡大も自明である。
【０２４０】
【化１７】
2014502845.tif 000024
確率の誘導
信頼度を、２つの仮説Ｈｔｆ（すなわち、擬父が実父であること）およびＨｗｆ（すなわち、擬父が実父でないこと）のデータ尤度から計算することができる。目的は、Ｐ（Ｈ｜Ｄ）（すなわち、各仮説についてデータを考慮した仮説の確率）を計算し、どの仮説がより可能性が高いかを推測することである。１つの実施形態では、ベイズの法則：Ｐ（Ｈ｜Ｄ）〜Ｐ（Ｄ｜Ｈ）＊Ｐ（Ｈ）（式中、Ｐ（Ｈ）は仮説の事前重みであり、Ｐ（Ｄ｜Ｈ）は仮説を考慮した尤度である）を使用してこれを行うことができる。
【０２４１】
Ｐ（Ｄ｜Ｈ，ｆ）（すなわち、特定の子画分についての仮説を考慮したデータ尤度）を考慮する。子画分の分布が利用可能である場合、
【０２４２】
【化１８】
2014502845.tif 000025
さらに、
【０２４３】
【化１９】
2014502845.tif 000026
を導くことが可能である。
【０２４４】
Ｐ（ｆ｜Ｈ）が仮説から独立している（すなわち、Ｐ（ｆ｜Ｈ）＝Ｐ（ｆ））ことに留意のこと。なぜなら、子画分は擬父が実父であるか否かに関係なく同一であり、任意の妥当な事前確率Ｐ（ｆ）を選択することができる（例えば、０〜５０％子画分の一様事前分布）からである。１つの実施形態では、たった１つの子画分
【０２４５】
【化２０】
2014502845.tif 000027
を使用することが可能である。この場合、以下である。
【０２４６】
【化２１】
2014502845.tif 000028
尤度Ｐ（Ｄ｜Ｈ，ｆ）を考慮する。各仮説の尤度を、応答モデル、推定胎児画分、母親遺伝子型、擬父遺伝子型、対立遺伝子の集団内頻度、血漿対立遺伝子数、およびＳＮＰに基づいて導く。Ｄは前記で定義したデータを示すものとする。
【０２４７】
１つの実施形態では、各ＳＮＰでの観測が血漿対立遺伝子比を必要条件として独立しており、したがって、父性仮説の尤度はＳＮＰに関する尤度の積であると仮定する。
【０２４８】
【化２２】
2014502845.tif 000029
以下の式は、単一ＳＮＰｉおよび単一子画分ｆについての尤度をどのようにして導くことができるのかについて記載している。式８は任意の仮説Ｈの尤度の一般式である。次いで、この式はＨｔｆおよびＨｗｆの特定の場合に分解されるであろう。遺伝子型ｇｍ、ｇｔｆ、ｇｄｆ、およびｇｃが｛ＡＡ，ＡＢ，ＢＢ｝中の値を取り、｛０，０．５，１｝（式中、ＡＡ＝０、ＡＢ＝０．５、ＢＢ＝１）に変換されることに留意のこと。また、ｇｔｆは真の父親の遺伝子型を示し、ｇｄｆは父親について提供されたデータによって示される遺伝子型を示す。Ｈｔｆの場合、ｇｔｆおよびｇｄｆは等しい。
【０２４９】
【化２３】
2014502845.tif 000030
仮説Ｈｔｆの場合、擬父は実父であり、胎児遺伝子型は、母系遺伝子型および擬父遺伝子型から遺伝する。上記式は、以下に簡略化される。
【０２５０】
【化２４】
2014502845.tif 000031
、さらに
【０２５１】
【化２５】
2014502845.tif 000032
および
【０２５２】
【化２６】
2014502845.tif 000033
Ｈｗｆの場合、擬父は実父でない。真の父親遺伝子型の１つの推定値を、各ＳＮＰでの集団内頻度を使用して得ることができる。したがって、子遺伝子型の確率を、既知の母親遺伝子型および集団内頻度によって決定することができる（すなわち、データは実父の遺伝子型に関するさらなる情報を提供しない）。この場合、上記の式を、さらに簡略化せず、以下のように示す。
【０２５３】
【化２７】
2014502845.tif 000034
さらに、
【０２５４】
【化２８】
2014502845.tif 000035
（式中、ｇｔｆに関する唯一の情報が集団事前確率である）、および
【０２５５】
【化２９】
2014502845.tif 000036
尤度の両方の式Ｐ（Ｄ｜ｆ，Ｈ，ｉ）（すなわち、両方の仮説について）では、応答モデルＰ（ｓ｜ｇｍ，ｇｄｆ，ｇｃ，ｆ，Ｈ）が一般化される。具体例を、本明細書中の他の場所の一般的なプラットフォームモデルに関する考察中に記載している。応答モデルについてのいくつかの例には、二項分布、ベータ二項分布、多変量ポリア分布、学習用データから推定した経験分布、または上記で考察した類似の関数が含まれる。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、正確な父性に関する信頼度Ｃｐを、尤度Ｐ（Ｄ｜Ｈｔｆ）およびＰ（Ｄ｜Ｈｗｆ）から計算することができる。１つの実施形態では、この計算を、以下のベイズの法則を使用して計算することができる。
【０２５７】
【化３０】
2014502845.tif 000037
または、より具体的な場合について、ＳＮＰに関する２つの尤度の積として記載することができる。
【０２５８】
【化３１】
2014502845.tif 000038
別の実施形態では、信頼度を以下のように計算することができる。
【０２５９】
【化３２】
2014502845.tif 000039
他の妥当な尤度関数も可能である。
【実施例】
【０２６０】
実験の項
実験１
父性が確認されており、且つ在胎期間が６週間と２１週間との間の２１人の妊娠中の母親を登録した。参加者は、本発明者らのＩＲＢ認証研究プログラムの一部として血液を自主的に供与し、ＩＶＦセンター、ＯＢオフィス、および米国内の異なる場所の一般集団から採血した。母体血漿から単離した無細胞ＤＮＡ（ｆｆＤＮＡ）を母親および擬父由来のＤＮＡと共に増幅し、ＳＮＰアレイを使用して測定した。本明細書中に開示のインフォマティクス法を使用して、一組の５，０００人を超える非血縁個体から作成した基準分布に対して各擬父を比較することによって２１人の正確な父親および３６，４００人の不正確な父親について父性を排除または包含した。２１サンプルのうちの２０サンプルは、結果を返すのに充分な胎児ＤＮＡを有していた。２０人中２０人（１００％）の父性包含が正確であった。３６，３８２人中３６，３８２人の父性排除が正確であり（１００％）、１８人が中間の遺伝的類似性に起因して「コールなし」であった。ミスコールはなかった。
【０２６１】
集団は、出生前研究のために血液を供与した夫婦から構成されていた。女性は単胎妊娠しており、第１トリメスターまたは第２トリメスターにあり、父性が確認されていなければならなかった。血液サンプルを、白血球保存剤を含む無細胞血液チューブ（ＳＴＲＥＣＫ）を使用して女性から採取し、遺伝子サンプルを、血液（ＥＤＴＡ）または口内サンプルのいずれかとして父親から採取した。書面によるインフォームド・コンセントを全ての参加者から入手し、遺伝子サンプルをＩＲＢ承認研究に登録した患者から集めた。
【０２６２】
母親の血液を遠心分離して、バフィーコートと血清を単離した。母親および擬父のバフィーコート中のゲノムＤＮＡならびに母体血清中のＤＮＡを分析のために調製し、標準的プロトコールを使用してＩＬＬＵＭＩＮＡ  ＩＮＦＩＮＩＵＭ  ＣＹＴＯ１２  ＳＮＰアレイを運転した。簡潔に述べれば、製造者の説明書にしたがって血清ＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ循環核酸キットを使用して単離し、４５ｕｌ緩衝液中に溶出した。２０マイクロリットルの溶出液を、１ｘＮＥＢ  ４緩衝液、０．４２ｍＭのｄＮＴＰ、および２．５ＵのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ）中にて２０℃で３０分間、次いで７５℃で１５分間インキュベートする平滑末端化反応で使用した。３マイクロリットルのライゲーション混合物（０．５ｕｌの１０ｘＮＥＢ  ４、１ｕｌの１０ｍＭ  ＡＴＰ、１ｕｌのＴ４  ＰＮＫ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ）、０．５ｕｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ））を添加し、サンプルを、１６℃で２４時間、次いで７５℃で１５分間インキュベートした。サンプルを、母親および擬父のゲノムＤＮＡと共に標準的なＩＬＬＵＭＩＮＡ  ＩＮＦＩＮＩＵＭアッセイに移した。簡潔に述べれば、２４ｕｌのＤＮＡは全ゲノムであり、これを３７℃で２０〜２４時間増幅し、その後に断片化および沈殿を行った。次いで、沈殿物をハイブリッド形成緩衝液に再懸濁し、熱変性させ、ＴＥＣＡＮ  ＥＶＯを使用してＣｙｔｏ１２  ＳＮＰアレイに移した。アレイを４８℃で少なくとも１６時間インキュベートし、Ｘ染色し（ＩＮＦＩＮＩＵＭ  ＩＩ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）、ＴＥＣＡＮ  ＥＶＯ中で洗浄し、最後にスキャニングした。アレイ強度を、ＢＥＡＤＳＴＩＤＵＯ（ＩＬＬＵＭＩＮＡ）を使用して抽出した。
【０２６３】
開示のインフォマティクス法により、胎児と別の個体との間の遺伝的類似度を測定した検定統計量を得た。この検定統計量を、擬父と５，０００人を超える一組の非血縁個体の両方について計算した。次いで、単一仮説棄却検定により、擬父について計算した統計量を非血縁基準個体によって形成される分布から排除することができるかどうかを決定した。擬父を非血縁組から棄却することができる場合、父性包含となった。そうでなければ、父性は排除された。充分なＤＮＡを有する２０サンプルについて、親子鑑定を、２０人の正確な父親および１，８２０人の任意抽出した不正確な父親に対して行った。
【０２６４】
非血縁個体分布に関する擬父の検定統計量のｐ値が１０−４未満である場合、父性包含とコールした。これは、理論上、１０，０００人の非血縁個体のうちの１人以下が胎児に対して遺伝的類似性を示すと予想されることを意味する。ｐ値が１０−４と０．０２との間である場合、「コールなし」とコールした。胎児ＤＮＡが血漿ＤＮＡの２％未満を構成した場合に「不十分な胎児ＤＮＡ」のコールを行った。期待分布を得るために使用した非血縁個体組は、広範な種々の人種的背景由来の個体から構成され、父性包含または父性排除の決定を異なる人種の非血縁個体組（擬父が示す人種が含まれる）について再計算した。包含および排除の結果をアルゴリズムによって自動的に生成し、ヒトの介入は必要なかった。
【０２６５】
結論として、既知の父性の２１種の母体血サンプルを試験した。２１サンプルのうちの２０サンプルから結果が返された一方で、１サンプルが分析には胎児ＤＮＡが不十分であった。このサンプルは、在胎期間が８週の女性から採取されていた。２０サンプルのうちの２０サンプル（１００％）の結果について父性が正確に確認され、それぞれのｐ値は１０−４未満であった。充分な胎児画分を有する各２０サンプルを、１，８２０人の不正確な父親のランダム集合に対して試験し、合計で３６，４００個の個別の親子鑑定を行った。これらの分析のうちの３６，３８２個の結果が返された。３６，３８２個のうちの３６，３８２個（１００％）が正確に父性排除され、そのｐ値は１０−４超であった。３６，４００個のうちの１８個（０．０５％）が「コールなし」とコールされ、そのｐ値は１０−４と０．０２との間であった。不正確な父性排除も父性包含も認められなかった。
【０２６６】
２１サンプルのうちの９サンプルがＩＶＦ中の受精の制御によって父性が確認され、着床前遺伝子診断によって受精後に正確な父性が確認された。１２サンプルが、オハイオ州フェアフィールドのＤＮＡダイアグノーステイックスセンター社によって行った胎児／子ゲノムＤＮＡの独立した親子鑑定法によって父性が確認された。
【０２６７】
実験２
１つの実験では、４つの母体血漿サンプルを調製し、ヘミネスト化９，６００−ｐｌｅｘプロトコールを使用して増幅した。サンプルを以下の方法で調製した。１５ｍＬと４０ｍＬとの間の母体血を遠心分離して、バフィーコートと血漿を単離した。母体ＤＮＡ中のゲノムＤＮＡをバフィーコートから調製し、父系ＤＮＡを血液サンプルまたは唾液サンプルから調製した。母体血漿中の無細胞ＤＮＡを、製造者の説明書に従ってＱＩＡＧＥＮ循環核酸キットを使用して単離し、４５ｕＬのＴＥ緩衝液中に溶出した。ユニバーサルライゲーションアダプターを３５ｕＬの精製血漿ＤＮＡの各分子の末端に付着させ、ライブラリーを、アダプター特異的プライマーを使用して７サイクル増幅させた。ライブラリーを、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ  ＡＭＰＵＲＥビーズを使用して精製し、５０ｕｌの水に溶出した。
【０２６８】
３ｕｌのＤＮＡを、１５サイクルのＳＴＡ（最初のポリメラーゼ活性化のための９５℃で１０分間、次いで、１５サイクルの以下：９５℃で３０秒間；７２℃で１０秒間；６５℃で１分間；６０℃で８分間；６５℃で３分間および７２℃で３０秒間；ならびに７２℃で２分間の最終伸長）にて１４．５ｎＭプライマー濃度の９６００種の標的特異的タグ付き逆方向プライマーおよび５００ｎＭの１種のライブラリーアダプター特異的順方向プライマーを使用して増幅した。
【０２６９】
ヘミネスト化ＰＣＲプロトコールは、濃度１０００ｎＭの逆方向タグおよび濃度１６．６ｕｎＭの９６００種の各標的特異的順方向プライマーを使用した１５サイクルのＳＴＡ（最初のポリメラーゼ活性化のための９５℃で１０分間、次いで１５サイクルの以下：９５℃で３０秒間；６５℃で１分間；６０℃で５分間；６５℃で５分間および７２℃で３０秒間；ならびに７２℃で２分間の最終伸長）にわたる、第１のＳＴＡ産物の希釈物の第２の増幅を含んでいた。
【０２７０】
次いで、ＳＴＡ産物のアリコートを、１ｕＭのタグ特異的順方向プライマーおよびバーコード化逆方向プライマーを使用した１０サイクルにわたる標準的なＰＣＲによって増幅して、バーコード化した配列決定ライブラリーを生成した。各ライブラリーのアリコートを、異なるバーコードのライブラリーと混合し、スピンカラムを使用して精製した。
【０２７１】
この方法では、９，６００種のプライマーを単一ウェル反応で使用した。これらのプライマーを、染色体１、２、１３、１８、２１、Ｘ、およびＹ上に見出されたＳＮＰをターゲティングするようにデザインした。次いで、アンプリコンを、ＩＬＬＵＭＩＮＡ  ＧＡＩＩＸシークエンサーを使用して配列決定した。サンプルあたり、シークエンサーによっておよそ３９０万リードが得られ、３７０万リードがゲノムにマッピングされ（９４％）、これらのうちの２９０万リード（７４％）がターゲティングされたＳＮＰにマッピングされた（平均リード深度３４４およびリード深度メジアン２５５）。４サンプルについて胎児画分は、９．９％、１８．９％、１６．３％、および２１．２％であることが見出された。
【０２７２】
関連する母体および父系ゲノムＤＮＡサンプルを、セミネスト化９６００−ｐｌｅｘプロトコールを使用して増幅し、配列決定した。セミネスト化プロトコールは、９，６００種の外側順方向プライマーおよびタグ付き逆方向プライマーを７．３ｎＭにて最初のＳＴＡで適用する点が異なる。第２のＳＴＡおよびバーコード化ＰＣＲのサーマルサイクリング条件および構成は、ヘミネスト化プロトコールと同一であった。
【０２７３】
配列決定データを、本明細書中に開示のインフォマティクス法を使用して分析し、基準組由来の１０人の非血縁の男性組のそれぞれが、懐胎している各胎児の実父ではないと決定された。
【０２７４】
実験３
１つの実験では、４５組の細胞を、１，２００−ｐｌｅｘセミネスト化プロトコールを使用して増幅し、配列決定し、３つの染色体で倍数性決定を行った。この実験は、母体血から得た単一の胎児細胞または少量の子由来のＤＮＡが存在する法医学的サンプルに対する親子鑑定法の実施条件をシミュレートすることを意味することに留意のこと。１５種の個別の単一細胞および３種の細胞の３０組を全部で４５種反応のための４５種の個別の反応チューブ中にいれた。この４５種の反応について、各反応物はたった１つの細胞株由来の細胞を含んでいたが、異なる反応物は異なる細胞株由来の細胞を含んでいた。細胞を５ｕｌの洗浄緩衝液中に調製し、５ｕｌのＡＲＣＴＵＲＵＳ  ＰＩＣＯＰＵＲＥ溶解緩衝液（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）の添加および５６℃で２０分間、９５℃で１０分間のインキュベーションによって溶解した。
【０２７５】
単一／３細胞のＤＮＡを、２５サイクルのＳＴＡ（最初のポリメラーゼ活性化のための９５℃で１０分間、次いで、２５サイクルの以下：９５℃で３０秒間；７２℃で１０秒間；６５℃で１分間；６０℃で８分間；６５℃で３分間および７２℃で３０秒間；ならびに７２℃で２分間の最終伸長）にて５０ｎＭプライマー濃度の１２００種の標的特異的順方向プライマーおよびタグ付き逆方向プライマーを使用して増幅した。
【０２７６】
セミネスト化ＰＣＲプロトコールは、２０サイクルのＳＴＡ（最初のポリメラーゼ活性化のための９５℃で１０分間、次いで、１５サイクルの以下：９５℃で３０秒間；６５℃で１分間；６０℃で５分間；６５℃で５分間および７２℃で３０秒間；ならびに７２℃で２分間の最終伸長）にわたる、濃度１０００ｎＭの逆方向タグ特異的プライマーおよび濃度６０ｎＭの４００種の各標的特異的ネスト化順方向プライマーを使用した第１のＳＴＡ産物の希釈物の３つの並行する第２の増幅を含んでいた。３つの並行する４００−ｐｌｅｘ反応では、第１のＳＴＡで増幅された全部で１２００種の標的を増幅した。
【０２７７】
次いで、ＳＴＡ産物のアリコートを、１ｕＭのタグ特異的順方向プライマーおよびバーコード化逆方向プライマーを使用した１５サイクルにわたる標準的なＰＣＲによって増幅して、バーコード化した配列決定ライブラリーを生成した。各ライブラリーのアリコートを、異なるバーコードのライブラリーと混合し、スピンカラムを使用して精製した。
【０２７８】
この方法では、１，２００種のプライマーを単一細胞反応で使用した。これらのプライマーを、染色体１、２１、およびＸ上に見出されたＳＮＰをターゲティングするようにデザインした。次いで、アンプリコンを、ＩＬＬＵＭＩＮＡ  ＧＡＩＩＸシークエンサーを使用して配列決定した。サンプルあたり、シークエンサーによっておよそ３９０万リードが得られ、５０００億〜８０００億リードがゲノムにマッピングされた（サンプルあたり全リードの７４％〜９４％）。
【０２７９】
細胞株由来の関連する母体および父系ゲノムＤＮＡサンプルを、より少ないサイクルおよび１２００−ｐｌｅｘの第２のＳＴＡを使用した類似のプロトコールを使用した同一のセミネスト化１２００−ｐｌｅｘアッセイプールを使用して分析し、配列決定した。
【０２８０】
配列決定データを、本明細書中に開示のインフォマティクス法を使用して分析し、基準組由来の１０人の非血縁の男性組のそれぞれが、上記４５種の細胞のそれぞれについて標的個体の実父ではないと決定された。
【０２８１】
母体血中の過去の妊娠の子由来のＤＮＡ
非侵襲性出生前親子鑑定法の難しさの１つは、現在の妊娠由来の胎児細胞を過去の妊娠由来の胎児細胞と区別することである。先の妊娠由来の遺伝物質はしばらくして消失するであろうが決定的な証拠は示されていないと考える者もいる。本開示の１つの実施形態では、父性起源の母体血中に存在する胎児ＤＮＡ（すなわち、胎児が父親から受け継いだＤＮＡ）をＰＡＲＥＮＴＡＬ  ＳＵＰＰＯＲＴＴＭ（ＰＳ）法および父系ゲノムの知識を使用して決定することが可能である。この方法は、相特定された親の遺伝情報を利用することができる。祖父母の遺伝子データ（祖父由来の精子由来の測定された遺伝子データなど）、または他の出産した子由来の遺伝子データ、または流産サンプルを使用して、相特定されていない遺伝子型情報由来の親遺伝子型を相特定することが可能である。ＨａｐＭａｐベースの相特定または父系細胞のハプロタイプ決定（ｈａｐｌｏｔｙｐｉｎｇ）によって相特定されていない遺伝情報を相特定することもできる。首尾の良いハプロタイプ決定は、染色体が強く束ねられている有糸分裂期での細胞停止および別個の染色体を別個のウェルに入れるためのマイクロフルイディクスの使用によって実証されている。別の実施形態では、相特定された親のハプロタイプデータを使用して父親由来の１つを超えるホモログ（１人を超える子由来の遺伝物質が血液中に存在することを意味する）の存在を検出することが可能である。胎児中の正倍数体であると予想される染色体に注目することにより、胎児がトリソミーに罹患している可能性を除外することができる。また、胎児ＤＮＡが現在の父親に由来しないかどうかを決定することが可能であり、その場合、トリプル試験などの他の方法を使用して遺伝子異常を予想することができる。
【０２８２】
採血以外の方法を介して利用可能な胎児遺伝物質の他の供給源が存在し得る。母体血中で利用可能な胎児遺伝物質の場合、以下の２つの主なカテゴリーが存在する：（１）全胎児細胞（例えば、有核胎児赤血球または赤芽球）および（２）浮遊胎児ＤＮＡ。全胎児細胞の場合、過去の妊娠由来の子または胎児由来のＤＮＡを含む妊娠中の女性から細胞を単離することが可能なように胎児細胞が母体血中に長期間残存し得るという証拠が幾つか存在する。浮遊胎児ＤＮＡが約数週間のうちに系から排除されるという証拠も存在する。１つの困難は、どのようにして細胞中に含まれている遺伝物質を有する個体の正体を決定するか、すなわち、測定された遺伝物質が過去の妊娠由来の胎児に由来しないことを保証するかということである。本開示の１つの実施形態では、母体遺伝物質の知識を使用して、問題の遺伝物質が母体遺伝物質ではないことを保証することができる。この目的を達成するための方法は多数存在し、これらとしては、本明細書中または本明細書中で参照した任意の特許に記載のインフォマティクスベースの方法（ＰＡＲＥＮＴＡＬ  ＳＵＰＰＯＲＴＴＭなど）が含まれる。
【０２８３】
本開示の１つの実施形態では、妊娠中の母親から採血した血液を、浮遊胎児ＤＮＡを含む画分および有核赤血球を含む画分に分離することができる。浮遊ＤＮＡを任意選択的に富化することができ、ＤＮＡの遺伝子型情報を測定することができる。浮遊ＤＮＡ由来の測定した遺伝子型情報から、母系遺伝子型の知識を使用して、胎児遺伝子型の態様を決定することができる。これらの態様は、倍数性の状態および／または１組の対立遺伝子同一性ということができる。次いで、本明細書中の他の場所および他の参照特許（特に、本明細書中に記載の特許）に記載の方法を使用して、おそらくまたは可能な胎児起源の個別の有核細胞を遺伝子型決定することができる。母体ゲノムの知識により、任意の所与の単一血球が遺伝的に母系であるかどうかを決定することが可能であろう。そして、上記のように決定した胎児遺伝子型の態様により、単一の血球が現在懐胎している胎児に遺伝的に由来するかどうか決定することが可能であろう。本質的に、本開示のこの態様により、母親の遺伝子に関する知識およびおそらく他の血縁個体（父親など）由来の遺伝情報を母体血中に見出される浮遊ＤＮＡ由来の測定した遺伝情報と共に使用して、母体血中に見出される単離した有核細胞が、（ａ）遺伝的に母系であるか、（ｂ）遺伝的に現在懐胎している胎児に由来するか、または（ｃ）遺伝的に過去の妊娠由来の胎児に由来するかを決定することが可能である。
【０２８４】
本明細書中で引用された全ての特許、特許出願、および刊行された文献は、その全体が本明細書中で参考として援用される。いくつかの上記に開示された他の特徴および機能またはその代替物を望ましいように多くの他の異なる系または適用に組み合わせることができると認識されるであろう。種々の現在予見または予期されないその代替形態、修正形態、変形形態、または改良形態を、その後に当業者が実施することができ、これらの形態は、以下の特許請求の範囲に包含されることも意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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