(57)【要約】  細胞外マトリックス材料を滅菌及び脱細胞化する方法が開示される。開示される方法を用いて作製される細胞外マトリックス組成物もまた開示される。
2014533119.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の心臓内の、対象の心臓の心室と対象の動脈との間の環状領域に付着している不良な半月弁を交換するために半月弁を再生する方法であって、
対象の心臓からの不良半月弁を除去する工程と、
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料のシートであって、前記シートの上縁を含む上方部分及び前記シートの下縁を含む下方部分を有するシートを折り畳む工程と、ここで、折り畳んだ状態では、前記シートの前記上縁が前記シートの前記下縁から選択された距離、離れるように前記シートの前記下縁が前記シートの前記上縁に向かって折り畳まれており、
第一の側縁、第二の側縁、上方部分並びに第一の層及び第二の層を含む下方部分を有する折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物であって、前記下方部分の前記第一の層が前記ＥＣＭ材料のシートの前記折り畳まれた下方部分に対応するところのＥＣＭ材料の構成物を作製するために、折り畳まれた前記ＥＣＭ材料のシートを固定する工程と、ここで、前記第一の層は第一の付着位置及び第二の付着位置で前記第二の層に付着され、前記第一の付着点は前記第二の付着点から選択された距離、離れており、
前記折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物の前記第一の側縁が前記折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物の前記第二の側縁と実質的に整合するように、前記折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物を整列位置に配置する工程と、
前記整合位置にある前記折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物の前記第一の側縁を前記折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物の前記第二の側縁に固定して、内腔を含み、縦軸線を有するＥＣＭ材料の弁導管を作製する工程と、ここで、前記折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物の前記下方部分は、前記ＥＣＭ材料の弁導管の入口部分に対応し、前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記入口部分は、前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記内腔と流体連通する入口を画定し、前記折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物の前記下方部分の前記第一の層は、前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記内腔内に位置する内側層に対応し、前記折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物の前記下方部分の前記第二の層は、前記ＥＣＭ材料の弁導管の外壁を画定するために前記折り畳まれたＥＣＭ材料の前記上方部分と協働し、
前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記入口部分が前記環状領域の近傍に位置するように、前記対象の心臓の前記環状領域及び前記対象の前記動脈に、前記ＥＣＭ材料の弁導管を付着する工程と、
を含み、
前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記内側層は弁葉促進部分を含み、前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記外側層は洞促進部分を含み、前記対象の心臓の前記環状領域及び前記対象の動脈への前記ＥＣＭ材料の弁導管の付着の後に、前記内側層の前記弁葉促進部分は交換半月弁の三つの弁葉を再生し、前記外側層の洞促進部分は、前記交換半月弁の洞部分を再生するために、前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記内側層と融合する、
ことを特徴とする再生方法。
【請求項２】
前記第一の付着点及び前記第二の付着点が共通の平面内に実質的に配置され、前記共通の平面は前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記縦軸線に対して実質的に垂直である、請求項１に記載の再生方法。
【請求項３】
前記第一の付着点が、前記第一の側縁から第一の距離、離れ、前記第二の付着点が、前記第二の側縁から第二の距離、離れ、前記第一の距離及び前記第二の距離は、前記第一の付着点が前記第二の付着点から離れた前記選択された距離に実質的に等しい、請求２に記載の再生方法。
【請求項４】
前記折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物の前記第一の側縁を前記折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物の前記第二の側縁に固定する工程が、前記ＥＣＭ材料の弁導管にそって複数の縫合糸の縫い目を形成する工程である、請求項１に記載の再生方法。
【請求項５】
前記折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物の前記下方部分の前記第一の層がさらに、前記第一の側縁と前記第一の付着点の中間の第三の付着点で、前記折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物の前記下方部分の前記第二の層に付着され、前記第一、前記第二および前記第三の接着点が共通の平面内に実質的に配置され、前記共通の平面は前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記縦軸線に対して実質的に垂直である、請求項４に記載の再生方法。
【請求項６】
前記前記第三の接着点が前記第一の接着点から離れる前記距離は、前記第一の接着点が前記第二の接着点から離れる前記選択された距離と実質的に等しい、請求項５に記載の再生方法。
【請求項７】
前記折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物への前記折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物の前記第一の側縁の固定の後に、前記第三の付着点が前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記縫い目の近傍に位置するように、前記第三の付着点は前記第一の側縁の近傍に位置する、請求項５に記載の再生方法。
【請求項８】
前記折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物の前記下方部分の前記第一の層がさらに、前記第二の側縁と前記第二の付着点の中間の第四の付着点で、前記折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物の前記下方部分の前記第二の層に付着され、前記第一、前記第二、前記第三及び前記第四の接着点が前記共通の平面内に実質的に配置される、請求項５に記載の再生方法。
【請求項９】
前記前記第四の接着点が前記第二の接着点から離れる前記距離が、前記第一の接着点が前記第二の接着点から離れる前記選択された距離と実質的に等しい、請求項８に記載の再生方法。
【請求項１０】
前記折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物の前記第一の側縁を前記折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物の前記第二の側縁に固定した後に、前記第四の付着位置が前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記縫い目の近傍の位置するように、前記第四の付着位置が前記第二の側縁の近傍に配置される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記内側層がさらに交連促進部分を含み、前記対象の心臓の前記環状領域及び前記対象の前記動脈に前記ＥＣＭ材料の弁導管を付着した後に、前記内側層の前記交連促進部分が前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記外側層の少なくとも一部と融合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
対象の心臓内の半月弁を再生するための細胞外マトリクス（ＥＣＭ）材料の弁導管であって、請求項１に従って作製されたＥＣＭ材料の弁導管。
【請求項１３】
前記ＥＣＭ材料の弁導管が少なくとも一つの組織を含み、該少なくとも一つの各組織は各組織源に由来し、前記少なくとも一つの組織の各組織の前記組織源は、小腸粘膜下層、胃粘膜下層、大腸組織、膀胱粘膜下層、肝臓基底膜、心膜、心外膜、心内膜、心筋、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、心臓の弁（付着した血管をもつ場合又はもたない場合）、発育中の歯の根の周囲の組織、及び成長骨の周囲の組織からなる群から選択される、請求項１１に記載のＥＣＭ材料の弁導管。
【請求項１４】
対象の心臓内の、心臓の心室と対象の動脈との間の環状領域に付着している不良な半月弁を交換するために半月弁を再生する方法であって、
対象の心臓から不良な半月弁を除去する工程と、
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料の導管を反射位置に配置する工程と、ここで、前記ＥＣＭ材料の導管は、内腔を画定し、前記ＥＣＭ材料の導管の上端部からなる上方部分および前記ＥＣＭ材料の下端部からなる下方部分を有し、反射位置では、前記下端部が前記上端部から選択された距離、離れるように、前記ＥＣＭ材料の導管の前記下端部が、前記ＥＣＭ材料の導管の前記上端部に向けて、前記ＥＣＭ材料の前記内腔内で、内側へ反射され、
縦軸線を有し、内腔、入口部分及び出口部分を含むＥＣＭ材料の弁導管を作製するために、前記ＥＣＭ材料の導管を前記反射位置に固定する工程と、ここで、前記入口部分は、前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記内腔と連通する入口を画定し、外側層および前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記内腔内に位置する内側層を含み、前記入口部分の前記内側層は前記ＥＣＭ材料の弁導管の反射下端部に対応し、前記内側層は三カ所の接着点で前記外側層に接着し、前記三カ所の付着点は前記ＥＣＭ材料の弁導管の外側周囲にそって、実質的に等しく間隔が離され、前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記入口部分の前記外側層は、前記ＥＣＭ材料の弁導管の外壁を画定するために、前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記外側部分と協働し、
前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記入口部分が前記環状領域の近傍に位置するように、前記対象の心臓および前記対象の動脈に、前記ＥＣＭ材料の弁導管を付着する工程と、
を含み、
前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記内側層は弁葉促進部分を含み、前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記外側層は洞促進部分を含み、前記対象の心臓の前記環状領域及び前記対象の動脈への前記ＥＣＭ材料の弁導管の付着の後に、前記内側層の前記弁葉促進部分は交換半月弁の三つの弁葉を再生し、前記外側層の洞促進部分は、前記交換半月弁の洞部分を再生するために、前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記内側層と融合する、
ことを特徴とする再生方法。
【請求項１５】
前記三つの付着点が共通の平面内に実質的に配置され、前記共通の平面は前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記縦軸線に対して実質的に垂直である、請求項１４に記載の再生方法。
【請求項１６】
前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記内側層がさらに交連促進部分を含み、前記対象の心臓の前記環状領域及び前記対象の前記動脈に前記ＥＣＭ材料の弁導管を付着した後に、前記内側層の前記交連促進部分が前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記外側層の少なくとも一部を融合する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
患者の心臓内の半月弁を再生するための細胞外マトリクス（ＥＣＭ）材料の弁導管であって、請求項１４に従って作製されたＥＣＭ材料の弁導管。
【請求項１８】
前記ＥＣＭ材料の弁導管が少なくとも一つの組織を含み、該少なくとも一つの各組織は各組織源に由来し、前記少なくとも一つの組織の各組織の前記組織源は、小腸粘膜下層、胃粘膜下層、大腸組織、膀胱粘膜下層、肝臓基底膜、心膜、心外膜、心内膜、心筋、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、心臓の弁（付着した血管をもつ場合又はもたない場合）、発育中の歯の根の周囲の組織、及び成長骨の周囲の組織からなる群から選択される、請求項１７に記載のＥＣＭ材料の弁導管。
【請求項１９】
対象の心臓内の半月弁を再生するための細胞外マトリクス（ＥＣＭ）材料の弁導管であって、前記ＥＣＭ材料の導管は縦軸線を有し、内腔、入口部分及び出口部分を含み、前記出口部分は前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記内腔と連通する出口を画定し、前記入口部分は、前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記内腔と連通する入口を画定し、さらに外側層および前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記内腔内に位置する内側層を含み、前記入口部分の前記内側層は前記ＥＣＭ材料の前記内腔内へ内側へ反射され、前記内側層は、三カ所の付着で前記外側層に付着され、前記三カ所の付着点は前記ＥＣＭ材料の弁導管の外側周辺にそって、実質的に等しく間隔が離され、前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記入口部分の前記外側層は、前記ＥＣＭ材料の弁導管の外壁を画定するために、前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記外側部分と協働し、
前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記内側層は弁葉促進部分を含み、
前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記外側層は洞促進部分を含み、
前記対象の心臓の前記環状領域及び前記対象の動脈に、前記ＥＣＭ材料の前記入口部分が前記環状領域の近傍に位置するように前記ＥＣＭ材料の弁導管を付着した後に、前記内側層の前記弁葉促進部分は交換半月弁の三つの弁葉を再生し、前記外側層の洞促進部分は、前記交換半月弁の洞部分を再生するために、前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記内側層と融合する、
ことを特徴とするＥＣＭ材料の弁導管。
【請求項２０】
前記三つの付着点が共通の平面内に実質的に配置され、前記共通の平面は前記ＥＣＭ材料の弁導管の前記縦軸線に対して実質的に垂直である、請求項１９に記載の再生方法。
【請求項２１】
前記ＥＣＭ材料の弁導管が少なくとも一つの組織を含み、該少なくとも一つの各組織は各組織源に由来し、前記少なくとも一つの組織の各組織の前記組織源は、小腸粘膜下層、胃粘膜下層、大腸組織、膀胱粘膜下層、肝臓基底膜、心膜、心外膜、心内膜、心筋、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、心臓の弁（付着した血管をもつ場合又はもたない場合）、発育中の歯の根の周囲の組織、及び成長骨の周囲の組織からなる群から選択される、請求項１９に記載のＥＣＭ材料の弁導管。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年５月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／４９０，６９３号、２０１１年５月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／４９０，８７３号、２０１１年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／４９１，７２３号及び２０１２年５月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／６５０，９１１号の出願日の利益を主張し、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は、一般に、細胞外マトリックス材料の弁導管及び弁導管を作製する方法に関する。特に、本発明は、細胞外マトリックス材料のシート又は導管から弁導管を作製する方法、並びにその方法から得られた細胞外マトリックス材料の弁導管に関する。
【背景技術】
【０００３】
心臓外科医は近年、患者の心臓内の弁の再建を達成するために様々な技術を用いる。例えば、凍結保存された同種移植片、ウシ頚静脈移植片、ブタの弁、および自己心膜がすべて、そのような弁の再建手術に使用されてきた。しかしながら、これらの公知の技術はすべて、いくつかの重大な制限を受ける。具体的には、凍結保存された同種移植片は、時間の経過とともに石灰化し、失敗しやすく、高コストと同種移植片の低可用性は、発展途上国における同種移植の有用性を制限する。これらの移植片はまた、患者の抗ヒト抗体による抗原汚染の前に、将来の心臓移植と反応し、著しく拒絶する可能性を高める。頚静脈移植片は、広く利用可能であるが、大きさが狭い範囲内で唯一提供することができるが、頚静脈移植片は、望ましくない石灰化および動脈瘤性拡張化する傾向がある。同様に、ブタの弁は時間の経過とともに石灰化し、弁、特に小児の弁の完全性の著しい減少につながる。自己心膜は使用されているが、短期的な成功にとどまり、自己心膜を用いた手術は、したがって、典型的に複雑で時間がかかり、ほとんどの国で使用することに適ない。自己心膜は時間とともに石灰化し、患者が以前に心臓手術を受けたとき、患者自身の心膜は、交換弁材料として使用することができない。
【０００４】
さらに、弁膜再建手術において使用される公知の弁導管は、典型的に、例えば、移植片や弁部分から形成される。これらの弁導管が使用される前に、弁部分が移植片部分内に適切に固定されなければならない。この制限は、手術全体にかなりの複雑さと時間を課し、得られた弁導管の二部構造はデバイスの故障の原因となり得る。
【０００５】
さらに、基本的なレベルで、既知の弁導管は、自然の弁を再建するためではなく不良な弁を交換するために、使用されている。したがって、移植後、これらの弁導管は、生理学的および解剖学的に正しい交換弁の形成を達成することができない。
【０００６】
発展途上国では、コストや供給制約が弁再建手術の普及を制限する。したがって、発展途上国において、外科手術の間に容易に使用することができる、入手が容易で、低コストの弁交換材料が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、対象の心臓への移植に際して、自然な弁の弁葉や洞部分と同一又は実質的に同一である弁葉や洞部を含む交換用心臓弁の再建を促進するように構成されている心臓弁導管の必要性がある。経時的に、心臓弁導管の合成材料が検出できないような、自然の動脈内に統合され、一体化する、移植可能な心臓弁導管の必要性がさらにある。容易に入手可能な材料を使用して、迅速かつ効率的に構成でき、又は迅速な移植のため事前に構成された無菌、無細胞、さらに低コストの心臓弁導管の必要性がさらにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
対象の心臓内にある不良の半月弁を交換するために半月弁を再生するための方法が開示される。開示された一の方法では、不良な半月弁は、対象の心臓から除去される。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料のシートが、折り畳まれる（シートの下縁が、シートの上端から選択された距離、離れるように、シートの上端に向かって折り畳まれる）。ＥＣＭ材料のシートは、折り畳まれた状態で、第一の付着点及び第二の付着点で固定され、これにより折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物が作製される。折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物は、整列位置（折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物の第一の側縁が折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物の第二の側縁と実質的に整列された位置）に配置される。整列位置にある折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物で、第一の側縁は第二の側縁に固定され、これによりＥＣＭ材料の弁導管が作製される。
【０００９】
ＥＣＭ材料の弁導管は、内腔と、入口を画定し、内側層と外側層を有する入口部分と、出口を画定する出口部分を有する。入口部分の内側層は内腔内に配置さる一方、入口部の外側層は、ＥＣＭ材料の弁導管の外壁を画定するために、出口部分と協働する。ＥＣＭ材料の弁導管は、ＥＣＭ材料の弁導管の入口部分が環状領域の近傍に位置するように、対象の心臓の環状部分又は出口に、さらに対象の動脈に付着される。ＥＣＭ材料の弁導管の内側層は、弁葉を再生するために弁葉促進部分を有し、ＥＣＭ材料の弁導管の外側層は、交換半月弁の洞部分を再生するための洞促進構成を含む。記載される方法に従って作製され、使用されるＥＣＭ材料の弁導管もまた開示される。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態のそれら及び他の特徴は、添付の図面を参照する発明の詳細な説明においてより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ここで記述される細胞外マトリクスの例示シートを示す。
【図２】図２Ａは、ここで記述される折り畳たまれた状態の図１のシートの平面図である。図２Ｂは折りたたまれた状態のシートの斜視図である。
【図３】図３Ａは、図１〜図２Ｂのシートから作製された細胞外マトリクス材料弁導管の斜視図である。図３Ｂは、その細胞外マトリクス材料の平面図である。
【図４】図４は、図３Ａおよび図３Ｂに図示された細胞外マトリクス材料の弁導管の弁葉促進部分および洞促進部分の略示図である。
【図５】図５は記述する細胞外マトリクスの斜視図である。
【図６】図６Ａは、図５の細胞外マトリクス材料の弁導管の、下方から上方にみた斜視図である。図６Ｂはその細胞外マトリクス材料の弁導管の平面図である。
【図７】図７−図１１は、ヒツジの心臓の肺動脈弁を再生するための、細胞外マトリクス材料の弁導管の移植後三か月経過した再生肺動脈弁の写真であって、図７は再生肺動脈弁の右心室流出路の写真である。
【図８】図８は再生肺動脈弁の弁葉の写真である。
【図９】図９は、ヒツジの心臓の右心室から観察された再生肺動脈弁の写真である。
【図１０】図１０は再生肺動脈弁における弁葉形成の進展を示す写真である。
【図１１】図１１は再生肺動脈弁における洞形成の進展を示す写真である。
【図１２】図１２−図１４は、ここで記述される典型的な細胞外マトリクス材料の弁道導管を示す写真であって、図１２は水和前の典型的な細胞外マトリクス材料の弁導管を示す写真である。
【図１３】図１３は水和前の典型的な細胞外マトリクス材料の弁導管を示す写真である。
【図１４】図１４は水和後の典型的な細胞外マトリクス材料の弁導管を示す写真である。
【図１５】図１５−図２３は、ここで記述される概念を利用して実施された患者の調査研究に関連したスケッチおよび写真であって、図１５は患者の調査研究の間に患者に移植した弁導管を示す。
【図１６】図１６は患者の調査研究中に患者に移植した弁導管を示す。
【図１７】図１７は調査研究中に記録された心エコー図の写真である。
【図１８】図１８は調査研究中に記録された心エコー図の写真である。
【図１９】図１９は調査研究中に記録された心エコー図の写真である。
【図２０】図２０は調査研究中に記録された心エコー図の写真である。
【図２１】図２１は調査研究中に記録された心エコー図の写真である。
【図２２】図２２は調査研究中に記録された心エコー図の写真である。
【図２３】図２３は患者の調査研究中に患者に移植した弁導管を示す。
【図２４】図２４は、典型的な細胞外マトリクス材料の弁導管の構成の図で、縫い付けを行う縫い目許容範囲（ｓ）、弁葉の高さ（ｈｌ）、弁葉の幅（ｌｗ）およびＥＣＭシート幅（ｗ）を示す。
【図２５】図２５は、ここで記述される典型的な細胞外マトリクス材料の弁導管の術後に撮影されたドップラー・心エコー図の写真であり、図２５（ａ）は開放しているＥＣＭ材料の弁導管を示し、図２５（ｂ）は閉じているＥＣＭ材料の弁導管を示す。図２５（ｃ）は閉じたときのＥＣＭ材料の弁導管を放射方向に示す。
【図２６ａ】図２６は、ここで記述される典型的な細胞外マトリクス材料の弁導管の注入後のさまざまな時間での再生肺動脈弁の写真であって、図２６（ａ）は三か月後の再生を示す。
【図２６ｂ】図２６は、ここで記述される典型的な細胞外マトリクス材料の弁導管の注入後のさまざまな時間での再生肺動脈弁の写真であって、図２６（ｂ）は五ヶ月後の再生を示す。
【図２６ｃ】図２６は、ここで記述される典型的な細胞外マトリクス材料の弁導管の注入後のさまざまな時間での再生肺動脈弁の写真であって、図２６（ｃ）は六ヶ月後の再生を示す。
【図２６ｄ】図２６は、ここで記述される典型的な細胞外マトリクス材料の弁導管の注入後のさまざまな時間での再生肺動脈弁の写真であって、図２６（ｄ）は十二ヶ月後の再生を示す。
【図２７】図２７は、本明細書に記載の滅菌方法を含む様々な滅菌方法を受けて、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）組成物についてＤＮＡ含有量が測定された実験の結果を示す。図２７は滅菌後の各ＳＩＳのＤＮＡ含有量を示す。
【図２８】図２８は、本明細書に記載の滅菌方法を含む様々な滅菌方法を受けて、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）組成物についてＤＮＡ含有量が測定された実験の結果を示す。図２８は、生の、未処理のＳＩＳ組成物から除去されたＤＮＡの割合を示す。
【図２９】図２９は、本明細書に記載の滅菌方法を含む様々な滅菌方法を受けてＳＩＳ組成物について自然の増殖因子の含有量が測定された実験の結果を示す。図２９は、滅菌後の各ＳＩＳ組成物のｂＦＧＦ含有量を示す（サンプルの乾燥重量によって正規化）。
【図３０】図３０は、本明細書に記載の滅菌方法を含む様々な滅菌方法を受けてＳＩＳ組成物について自然の増殖因子の含有量が測定された実験の結果を示す。図３０は、滅菌後の各ＳＩＳ組成物の活性ＴＧＦベータ含有量を示す（サンプルの乾燥重量によって正規化）。
【図３１】図３１は、本明細書に記載のように、急速減圧中にｂＦＧＦがＳＩＳ組成物に組み込まれた実験の結果を示す。図３１は急速減圧後の各ＳＩＳ組成物についてのｂＦＧＦの含有量を示す（サンプルの乾燥重量によって正規化）。
【図３２】図３２は、本明細書に記載の滅菌方法を含む様々な滅菌方法を受けて、二層のＳＩＳ組成物の引張強度が測定された実験の結果を示す。図３２は、滅菌後の各ＳＩＳ組成物について測定された引張強度を示す。
【図３３】図３３は、本明細書に記載の滅菌及び脱細胞化方法を含む様々な滅菌及び／又は脱細胞化方法を受けて、ＳＩＳ組成物について自然の増殖因子の含有量が測定された実験の結果を示す。図３３は、滅菌及び／又は脱細胞化後の各ＳＩＳ組成物についてｂＦＧＦ酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す（サンプルの乾燥重量によって正規化）。
【図３４】図８は、様々な方法で処理された後のＳＩＳのＤＮＡ含有量を示す。ベースライン測定は生（ｒａｗ）である。次に組織は超臨界ＣＯ２にさらされ、その後ＤＮＡ及び細胞片のより一層の除去を容易にするために急速な減圧（ＲＤＰ）にさらされた。ＲＤＰ後、組織は滅菌のために過酢酸（ＰＡＡ）を用いて超臨界ＣＯ２内に置かれた。比較は、非滅菌又はエチレンオキシド（ＥＴＯ）滅菌処理されたＳＩＳに対して行われた。
【図３５】図９は、様々な方法で処理された後のＳＩＳからのＤＮＡの除去率を示す。ベースライン測定は生（ｒａｗ）である。次に組織は超臨界ＣＯ２にさらされ、その後ＤＮＡ及び細胞片のより一層の除去を容易にするために急速な減圧（ＲＤＰ）にさらされた。ＲＤＰ後、組織は滅菌のために過酢酸（ＰＡＡ）を用いて超臨界ＣＯ２内に置かれた。比較は、滅菌されない又はエチレンオキシド（ＥＴＯ）で滅菌処理されたＳＩＳに対して行われた。
【図３６】図３６は、様々な方法で処理された後のＳＩＳの可変の活性形質転換増殖因子（ＴＧＦベータ）含有量を示す。ベースライン測定は生（ｒａｗ）、または、未処理のＳＩＳを次いでトリトンＸ−１００（ＴＸ−１００）洗浄剤のみで処理したものである。次に組織は超臨界ＣＯ２にさらされ、その後ＤＮＡ及び細胞片のより一層の除去を容易にするために急速な減圧（ＲＤＰ）にさらされた。ＲＤＰ後、組織は滅菌のために過酢酸（ＰＡＡ）を用いて超臨界ＣＯ２  内に置かれた。比較は、非滅菌又はエチレンオキシド（ＥＴＯ）滅菌の処理されたＳＩＳに対して行われた。
【図３７】図３７は、様々な方法で処理された後のＳＩＳの可変の塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）含有量を示す。ベースライン測定は生（ｒａｗ）、または、未処理のＳＩＳを次いでトリトンＸ−１００（ＴＸ−１００）界面活性剤のみを用いて処理したものである。次に組織は、超臨界ＣＯ２にさらされ、その後ＤＮＡ及び細胞片のより一層の除去を容易にするために急速な減圧（ＲＤＰ）にさらされた。ＲＤＰ後、組織は滅菌のために過酢酸（ＰＡＡ）を用いて超臨界ＣＯ２  内に置かれた。比較は、非滅菌又はエチレンオキシド（ＥＴＯ）滅菌処理されたＳＩＳに対して行われた。
【図３８】図３８は、急速減圧によるＳＩＳへの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）含有量の追加を示す。ベースライン測定は生又は未処理のＳＩＳである。比較は、非滅菌又はエチレンオキシド（ＥＴＯ）滅菌処理されたＳＩＳに対して行われた。
【図３９】図３９は、人間の心臓の一部切り欠き図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、以下の詳細な説明、実施例、特許請求の範囲及びそれらの前後の記載を参照することによって、より速やかに理解されるであろう。しかしながら、本装置、システム及び／又は方法が開示され記載される前に、別に特定されない限り、本発明は開示された特定の装置、システム及び／又は方法に限定されるものではなく、従って当然に、様々であり得ることが理解されるべきである。また、本明細書の用語は、具体的な態様を記載する目的でのみ使用され、限定することを意図しないことが理解されるべきである。
【００１３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される、単数形の「一つの（“a”）」、「一つの（“an”）」及び「その（“the”）」は、文脈が明確に別に指示しない限り、複数形の指示物を含む。従って、例えば、一つの「付着点」の参照は、文脈が別に示さない限り、二つ以上のそのような付着点を含む場合がある。
【００１４】
本明細書において、範囲は「約」一つの具体的な値から、及び／又は「約」もう一つの具体的な値までのように表現され得る。そのような範囲が表現される場合、もう一つの態様では、一つの具体的な値から、及び／又は他の具体的な値までを含む。同様に、先行詞「約」を使用することにより、値が近似値として表現される場合、具体的な値がもう一つの態様を形成することが理解されるであろう。さらに、各々の範囲の端点が、他の端点に関係して、及び他の端点に独立して意義を有することが理解されよう。
【００１５】
本明細書で使用される、用語「任意」又は「任意で」は、続いて記載される事象又は状況が起こっても起こらなくてもよいことを意味し、その記載は、その事象又は状況が起こる事例と起こらない事例とを含む。
【００１６】
本明細書で使用される用語「又は」は、具体的な一覧の任意の一つの要素を意味し、また、その一覧の要素の任意の組み合わせを含む。
【００１７】
別に明確に記載されない限り、本明細書に説明される方法又は態様は、その工程を特定の順序で行うことを要するものと解釈されることを全く意図するものではない。従って、方法に係る請求項が特許請求の範囲において、または発明の詳細な説明において、工程が特定の順序に限定されるべきであると特に記載しない場合、いかなる点においても、順序を暗示することを全く意図するものではない。このことは、本明細書に記載された、ステップの配列又は動作フローに関するロジックの事柄、文法的構成や句読点から派生する平易な意味、または、態様の数又はタイプを含む、解釈についての任意のあり得る非明示の原則に適用できる。
【００１８】
排他的な用語等を使用することなく、特許請求の範囲の「含む」という用語は、任意の付加的な要素を含むことを許容する。そのことは、所定の数の要素が特許請求の範囲に列挙されているかどうかに関わらず、また、特徴の追加が特許請求の範囲に説明される要素の本質を変質させると見なされ得るかどうかに関わらない。本明細書において特に定義されるときを除いて、本明細書に使用される全ての技術的及び科学的な用語は、特許請求の範囲の妥当性を維持しながら、可能な限り広範な一般に理解される意味を与えられるべきである。
【００１９】
本明細書で使用される、「対象」は個体であり、以下に限定されないが、哺乳動物（例えば、ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長類、ウシ、ネコ、モルモット又は齧歯類）、魚、鳥、爬虫類又は両生類を含む。用語は、特定の年齢または性別を示さない。よって、成体及び新生児の対象、並びに胎児は、男性か女性かに関わらず、網羅されることが意図されている。「患者」は、疾患または疾病に苦しむ対象である。用語「患者」は、ヒトおよび家畜対象を含む。本明細書で使用される、用語「患者」と「対象」は、交互に使用され得る。
【００２０】
本明細書で使用される、用語「周辺」は、閉じた平坦な形状により画成される境界の周囲又は長さを指す。任意であるが、本明細書で使用されているように、「周辺」は閉じた平坦な円の周囲に対応することができる。しかし、「周辺」は、限定でなく例示的な楕円形、四角形、矩形、台形又は非対称的な閉じた平坦形状といった閉じた平坦形状の周囲に対応することができることも意図する。例えば、本明細書で使用されているように、導管の外側「周辺」は、導管の縦軸にそった特定の位置での導管の外側表面により画成される閉じた平坦形状の周囲に対応する。
【００２１】
本明細書で使用される、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも８０％となるように少なくとも８０％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を説明することを意図したものである。本明細書に記載のいくつかの実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９０％となるように少なくとも９０％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載された他の実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９５％となるように少なくとも９５％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載された他の実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９６％となるように少なくとも９６％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載されたさらに他の実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９７％となるように少なくとも９７％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載されたさらなる実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９８％となるように少なくとも９８％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。本明細書に記載されたまたさらなる実施態様では、用語「無細胞」は、細胞及び／又は細胞の残余物なしで細胞外マトリックス組成物が少なくとも９９％となるように少なくとも９９％脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。このように、本明細書で使われる、用語「無細胞」は、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％及びそれらの値の間に入る任意の割合のレベルに脱細胞化された細胞外マトリックス組成物を指す場合がある。
【００２２】
本明細書で使用される、用語「添加物」は、本明細書に開示される滅菌された、無細胞ＥＣＭ組成物に所定の特質を与えるために、開示されるＥＣＭ材料に選択的に組み入れられ得る材料を指す。そのような添加物は、限定でなく例示的に、増殖因子、サイトカイン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、細胞及び例えば、スタチン系薬剤、副腎皮質ステロイド、抗不整脈薬、非ステロイド性抗炎症薬、他の抗炎症化合物等の薬剤、ナノ粒子及び金属化合物を含む場合がある。
【００２３】
本明細書で使用される、用語「同時に」は、事象が同時に及び／又は重複して起こることを指すとともに、事象が互いに前後約３０分以内に順次的に起こることを指す。従って、第１の事象が起こり、そして第２の事象が第１の事象と同時に起こった場合、または、第１の事象の前後３０分以内に起こった場合、第２の事象が第１の事象と同時に起こったという言う場合がある。例えば、第１の方法のステップが実施され場合、第１の方法のステップの五分後に実施される第２の方法のステップは、第１の方法ステップと「同時に」行われると言う場合がある。同様に、第２の方法ステップが第３の方法ステップを行う１０分前に行われた場合、第２の方法ステップが第３の方法ステップと「同時に」行われたと言う場合がある。
【００２４】
本明細書で使用される、用語「超臨界」は、材料がその臨界温度及び臨界圧力以上に保持されているときの材料の流体状態を指す。材料がその臨界温度及び臨界圧力以上に保持されているとき、典型的に気体及び液体の両方の機能特性を有し、超臨界流体として機能すると言われる。従って、例えば、二酸化炭素がその臨界温度（３１．１℃）及びその臨界圧力（１，０７１ｐｓｉ）以上に保持される場合、それは超臨界二酸化炭素流体としてふるまい、例えば、流体の密度を有しながら気体の拡散特性を示し得る。
【００２５】
ここで開示されるのは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料から作製された弁導管である。一実施態様において、ＥＣＭ材料の弁導管は、対象物の心臓内の肺動脈弁、大動脈弁のような半月（三尖）弁を再生する。これらの態様で、ＥＣＭ材料の弁導管は、対象物の心臓内の欠陥のある半月弁を置き換えるための半月状の弁を再生する。このような欠陥のある半月弁が、対象物の心臓の心房と対象物の動脈との間の環状領域に付着されることが意図される。本明細書で使用される、用語「環状領域」は、対象物の心臓内の心房と対象物の動脈との間にある環の本来の位置の近傍にある対象物の心臓の一部を指す。環が対象物の心臓内に位置するとき、環状領域は、その環と共にその環の近傍の心筋を含む。環が、対象物の心臓から除去されるとき、環状領域は、対象物の心臓内の環があった位置の近傍の心筋を含む。
【００２６】
実施態様において、開示のＥＣＭ材の弁導管は、限定でなく例示的であるが、粘膜層及び構成要素、粘膜下層及び構成要素、筋層及び構成要素、及び／又は基底膜層及び構成要素等の任意の公知のＥＣＭ構成要素又は材料を含む場合がある。開示のＥＣＭ材の弁導管は、限定でなく例示的であるが、胃組織（例えば、胃粘膜下層（ＳＳ））、小腸組織（例えば、小腸粘膜下層（ＳＩＳ））、大腸組織、膀胱組織（例えば、膀胱粘膜下層（ＵＢＳ））、肝臓組織（例えば、肝臓基底膜（ＬＢＭ））、心臓組織（例えば、心嚢）、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、心臓の弁（付着した血管をもつ場合又はもたない場合）、発育中の歯の根の周囲の組織、成長骨の周囲の組織等の任意の哺乳動物組織由来から得られるＥＣＭ材料を含み得ることが企図される。さらに、開示のＥＣＭ材の弁導管は、限定でなく例示的であるが、ヒト、ウシ、ブタ、イヌ、ヒツジ、ネコ、ウマ、齧歯類等を含む一つ以上の哺乳動物のＥＣＭ構成要素又は材料由来から得られるＥＣＭ材料を含み得ることが企図される。従って、開示のＥＣＭ材の弁導管は、限定でなく例示的であるが、二つ以上のウシ、二つ以上のブタ、二つ以上のイヌ又は二つ以上のヒツジ等の二つ以上の同種の哺乳動物由来のＥＣＭ構成要素又は材料を含み得ることが企図される。さらに、開示の滅菌された、無細胞のＥＣＭ組成物は、限定でなく例示的に、ブタとウシ、ブタとイヌ、ブタとヒツジ、または、ウシとヒツジ等の二つ以上の異種の哺乳動物由来のＥＣＭ構成要素又は材料を含み得ることが企図される。さらに、開示のＥＣＭ材の弁導管は、限定でなく例示的であるが、ブタとウシ、ブタとイヌ、ブタとヒツジ、又はウシとヒツジといった二つ以上の異なる哺乳動物由来のＥＣＭ構成要素又は材料を含み得ることが企図される。またさらに、開示のＥＣＭ材の弁導管は、限定でなく例示的であるが、第１の哺乳動物由来のＳＩＳ等の第１の組織由来から得られるＥＣＭ構成要素又は材料、並びに、限定でなく例示的であるが、第２の哺乳動物由来のＳＳ等の第２の組織由来から得られるＥＣＭ構成要素又は材料を含み得ることが企図される。
【００２７】
一態様では図３Ａないし図４及び図６Ａないし６Ｂに示されているように、開示されたＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０は、縦軸線４１、１４１を有し、内腔４２、１４２、入口部分４４、１４４及び出口部分５６、１５６を含むことができる。この態様では、内腔４２、１４２は内径を有し得ることが企図される。任意ではあるが、内腔４２、１４２の内径は、ＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の縦軸線４１、１４１に沿って実質的に一定にすることができる。例示的な態様において、内腔４２、１４２の内径は、約１５ｍｍから約３０ｍｍの範囲とすることができることが企図される。他の態様では、ＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０は、約２０ｍｍから約４０ｍｍの範囲、好適には約２２ｍｍから約３４ｍｍの範囲の縦方向の長さを有することができることが企図される。
【００２８】
別の態様では、出口部分５６、１５６は、開示されたＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の内腔４２、１４２と連通する出口５８、１５８を画成することができる。他の態様では、入口部分４４、１４４は、開示されたＥＣＭ材料の弁導管４２、１４２の内腔４２、１４２と連通する入口４６、１４６を画成し、ＥＣＭ材料の弁導管の内腔内に位置決めされた外側層と内側層４８、１４８を含むことができる。この態様では、入口部分４４、１４４の内側層４８、１４８及び外側層が単一で、連続的な構造であること（ここで、内側層が、ＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の内腔４２、１４２内ないで内側に示されている）ができることが企図されている。従って、内側層４８、１４８及び外側層の単一でかつ連続的な構成のために、内側層および外側層は、ＥＣＭ材料の弁導管４０、１４６に近接し、互いに固定される必要はないことが意図されている。
【００２９】
更に他の態様では、開示されたＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の入口部分４４、１４４の内側層４８、１４８は、複数の付着点３４、１３４、例えば二つ又は三つの付着点でＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の入口部分４４、１４４の外側層に付着され得る。この態様では、複数の付着点３４、１３４がＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の複数の周辺にそって実質的に等間隔となることできることが企図される。さらに、 複数の付着点３４、１３４がＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の縦軸線４１、１４１に実質的に垂直な共通平面内に実質的に配置され得ることが企図される。別の態様では、出口部分５６、１５６の内側層４８、１４８が、限定でなく例示的に、非吸収性縫合糸、吸収性縫合糸、外科用ペースト、外科用接着剤、ステープルなどを含む従来の外科用付着手段を使用して、複数の付着点３４、１３４で、複数の外側層に付着され得る。この態様において、非吸収性縫合糸が内側層４８、１４８を外側層に固定するために使用されたとき、各縫合糸の結び目は、外側層が内側層とノットの間に位置するように、外壁に接して配置され、それによって、結び目は内腔４２、１４２内に伸長せず、続くＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の移植を確実にすることが企図される。
例示的な態様において、内側層及び外側層４８、１４８は、十字縫合パターンを使用して互いに固定することができる。さらに別の態様では、開示されたＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の入口部分の外側層は、ＥＣＭ材料の弁導管の外壁５２、１５２を画成するためにＥＣＭ材料の弁導管の出口部分と協調することができる。
【００３０】
他の態様において、図３Ｂ及び図４に示されているように、開示されたＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の入口部分４４、１４４の内側層４８、１４８は弁葉促進部分５０、１５０を含むことができる。この態様では、ＥＣＭ材料の弁導管の入口部分４４、１４４が対象の心臓の環状領域に近接して配置されるように、対象の心臓の環状領域及び対象の動脈へのＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の付着に続き、内側層４８、１４８の弁葉促進部分５０、１５０が、交換半月弁の三つの弁葉を再生するように構成することができることが企図される。例示的な態様において、内側層４８、１４８の各弁葉促進部分５０、１５０は軸線方向の長さを有することができる。これらの態様において、弁葉促進部５０、１５０の縦軸線の長さは、任意ではあるが、弁導管の壁から伸長する再生された弁葉の細長い長さで測定して、交換半月弁の再建された弁葉の長さより長いか又は等しくできることが企図される。例えば、弁葉促進部分５０、１５０の軸線方向の長さと再建された弁葉の長さとの比が、１．０：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２．０：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５：１、２．６：１、２．７：１、２．８：１、２．９：１、３．０：１、３．１：１、３．２：１、３．３：１、３．４：１、３．５：１、３．６：１、３．７：１、３．８：１、３．９：１、４．０：１であること、及びこれらの値の間の値となることができることが企図される。他の任意の態様において、弁葉促進部分５０、１５０の長手方向の長さが、交換半月弁の再建された弁葉の長さよりも短くすることができることが企図される。
【００３１】
別の態様では、図３Ｂに示されているように、開示されたＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の外壁５２、１５２（すなわち、入口部分４４、１４４の外側層）の少なくとも一部が、洞促進部分５４、１５４を含むことができることが企図される。この態様では、環状領域及び動脈へのＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０の付着に続いて、ＥＣＭ材料の弁導管の外壁５２、１５２の洞促進部分５４、１５４が交換半月弁の洞部を再建するために、ＥＣＭ材料の弁導管の内側層４８、１４８と融合するように構成され得ることが企図される。
【００３２】
他の態様において、図３Ｂ及び図４に示されているように、開示されたＥＣＭ材料の弁導管４０、１４４の入口部分４４、１４４の内側層４８、１４８が、さらに交連促進部５１、１５１を含み得ることが企図される。この態様では、環状領域及び動脈へのＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０付着に続いて、交連促進部５１、１５１が外壁５２、１５２（例えば、入口部分４４、１４４の外側層）の少なくとも一部と融合するように構成され得ることが意図される。したがって、内側層４８、１４８及び外壁５２、１５２の連続性が、内側層と外壁とが交換半月弁の再建の促進に際して協働することを可能にするが企図される。
【００３３】
任意であるが、ＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０多積層構造をもつことができる。例示的な態様において、ＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０は共に積層された２から１０層を含むことができる。例示的な態様において、ＥＣＭ材料の弁導管は、４プライ（４層）の多積層構造とすることができる。このような多積層構造がＥＣＭ材料の弁導管の構造的な完全性を高めることができることが企図される。
【００３４】
ＥＣＭ材料のシートからＥＣＭ材料の弁導管を形成する方法
例示的な態様において、開示されたＥＣＭ材料の弁導管はＥＣＭ材料のシートから形成することができる。これらの態様において、ＥＣＭ材料のシートは、限定でなく例示的に、粘膜層及びコンポーネント、粘膜下層及びコンポーネント、筋層及びコンポーネント、及び/又は基底膜層及びコンポーネントを含む公知のＥＣＭコンポーネント又は材料を含むことができる。任意に、ＥＣＭ材料のシートは、従来の方法により製造される多積層構造を有することができる。開示されたＥＣＭ材料の弁導管は、制限ではなく例示的に、胃組織（例えば、胃粘膜下層（ＳＳ））、小腸組織（例えば、小腸粘膜下層（ＳＩＳ））、大腸組織、膀胱組織（例えば、膀胱粘膜下層（ＵＢＳ））、肝臓組織（例えば、肝臓基底膜（ＬＢＭ））、心臓組織（例えば、心嚢）、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、心臓の弁（付着した血管をもつ場合又はもたない場合）、発育中の歯の根の周囲の組織、成長骨の周囲の組織等の任意の哺乳動物組織から得られるＥＣＭ材料を含み得ることが企図される。さらなる態様において、ＥＣＭ材料のシートは、約０．０２ｍｍから約３ｍｍの範囲の厚さを有することができる。ＥＣＭ材料のシートは、シートの所望の折り畳み及び対象の心臓内に、開示されたＥＣＭ材料の弁導管の所望の付着に適した任意の長さを有することができることが企図される。
【００３５】
一態様では、図１−４に示されているように、ＥＣＭ材料のシート１０から開示されたＥＣＭ材料の弁導管４０を形成する方法が折り畳まれた状態にＥＣＭ材料のシートを位置決めすることを含むことができる。この態様において、ＥＣＭ材料１０のシートが、そのシートの上縁１４からなる上方部分１２及びそのシートの下縁１８からなる底部分１６を含むことができることが企図される。さらに、折り畳まれた状態で、ＥＣＭ材料のシート１０の下縁１８が、シートの上縁14から選択された距離２０、離れ、それによって縫合カフが形成され得ることが意図されている。一態様では、折り畳み状態では、上縁１８が上縁１４から離された、選択された距離２０が、約０ｍｍから約１５０ｍｍの範囲とすることができる。この態様では、選択された距離２０が、対象の動脈へのＥＣＭ材料の弁導管４０の所望の結合を可能にする任意の距離とすることができることが企図される。例示的な態様において、選択された距離２０は、約１０ｍｍとすることができる。
【００３６】
図２Ａ及び図２Ｂに示されているように、別の態様で、開示されたＥＣＭ材料の弁導管を作製する方法は、折り畳まれた状態で、ＥＣＭ材料のシート１０を固定することを含み、これにより折り畳まれたＥＣＭ材料の構成を形成できることが企図される。この態様において、折り畳まれたEＥＣＭ材料構成物は、上方部分２２、下方部分２４、第一の側縁２６及び第二の側縁２８を有することができる。一態様では、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の下方部分２４は、第一の層３０及び第二の層３２を含むことができる。この態様では、下方部分２４の第一の層３０は、ＥＣＭ材料のシート１０の折り返しされた底部分１６に対応することができる。さらなる態様において、図２Ａ及び図２Ｂに示されているように、折り畳まれたＥＣＭ材料構築物の下方部分２４の第一の層３０は、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の下方部分２４の第二の層３２に、第一の付着点３４ａ及び第二の付着点３４ｂのところで付着させることができる。この態様において、第一の付着点３４Ａａは、選択された距離３６、第二の付着点３４ｂから離し得ることが企図される。第一の付着点３４aが第二の付着点３４bから離される、選択された距離３６が、ＥＣＭ材料のシート１０の幅３７の約１／４から１／２の間とすることができることが企図される。したがって、第一の付着点３４aが第二の付着点３４bから離される、選択された距離３６が、約５ｍｍから約７５ｍｍの間とすることができることが企図される。例示的な態様において、第一の付着点３４aが第二の付着点３４bから離される、選択された距離３６が、ＥＣＭ材料のシート１０の幅３７の約１／３とすることができることが企図される。さらなる態様では、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の下方部分２４の第一の層３０が、制限ではなく例示的に、非吸収性縫合糸、吸収性縫合糸、外科用ペースト、外科用接着剤、ステープルなどを含む従来の外科用付着手段を用いて、下方部分の第二の層３２に付着され得ることが企図されている。この態様では、非吸収性縫合糸が第一の層３０を第二の層３２に固定するために使用されるとき、各縫合糸の結び目が、第二の層が第二の層と結び目との間に位置するように、第二の層と接触して位置し得ることが企図される。例示的な態様において、第一および第二の層３０、３２は、十字縫合パターンを使用して互いに固定することができる。
【００３７】
別の態様では、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の下方部分２４の第一の層３０は、任意であるが、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の下方部分の第二の層３２に、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の第一の側縁２６と第一の付着点３４ａとの中間の第三の付着点３４ｃのところで付着されてよい。この態様では、第三の付着点３４ｃが第一の付着点３４ａから離れた距離３８ａが、第一の付着点が第二の付着点３４ｂから離れた選択された距離３６と実質的に等しくできることが企図される。さらに、第三の付着点３４ｃが、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の第一の側縁２６から、約１ｍｍから２ｍｍの範囲、より好適には約１．５ｍｍの選択された距離、離され得ることが企図される。
【００３８】
さらに、別の態様では、折り畳まれたＥＣＭ材料の構成物の下方部分２４の第一の層３０は任意であるが、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の下方部分の第二の層３２に、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の第二の側縁２８と第二の付着点３４ａとの中間の第四の付着点３４ｄのところで付着されてよい。この態様では、第四の付着点３４ｄが第二の付着点３４ｂから離れた距離３８ｂが、第一の付着点３４ａが第二の付着点から離れた選択された距離３６と実質的に等しくできることが企図される。さらに、第四の付着点３４ｄが、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の第二の側縁２８から、約１ｍｍから２ｍｍの範囲、より好適には約１．５ｍｍの選択された距離、離され得ることが企図される。
【００３９】
さらなる態様において、図３Ａに示されているように、開示されたＥＣＭ材料の弁導管を製作する方法は、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物を、整列した位置に位置決めする工程を含む。この態様では、整列した位置では、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の第一の側縁２６が、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の第二の側縁２８と実質的に整列することができることが意図されている。例示的な態様では、第一及び第二の側縁が互いに実質的に隣接するまで、第一の側縁部２６及び第二の側縁２８が、巻かれ又は他の方法で互いに向かって進められる位置が整列した位置であり得ることが企図されている。これらの態様において、下方部分24の第二の層３２及び折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の上方部分２２が、協働して、実質的に円筒形のＥＣＭ材料の構成物を画成するように、第一の側縁２６及び第二の側縁２８が互いに向かって進められ、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の下方部分の第一の層が、実質的に円筒状のＥＣＭ材料構成物内にあってその周辺から伸張する。任意であるが、整列された位置が、第一及び第二の側縁２６、２８が重なり合う位置に対応し得ることが企図される。整列された位置が、第一及び第二の側縁がＥＣＭ材料の弁導管の内腔４２に対して裏返された位置に対応し得ることが企図される。
【００４０】
さらなる態様において、図３Ａ及び図３Ｂに示されているように、整列された位置にある折り畳まれたＥＣＭ材料構成物では、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の第一の側縁２６は、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の第二の側縁２８に固定でき、これにより内腔４２を含み、縦軸４１を有するＥＣＭ材料の弁導管４０が作製される。この態様において、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の第一の側縁２６及び第二の側縁２８が固定され、第一の側縁26および第二の側縁28が内腔４２に対して裏返され、結果ＥＣＭ材料の弁導管４０が形成され得ることが企図される。例示的な態様において、第一および第二の付着点３４aは、３４ｂは、ＥＣＭ材料の弁導管４０の縦軸線４１に実質的に直交する共通平面内に実質的に位置することができる。これらの態様では、さらに、第三の付着点３４ｃ及び/又は第四の付着点３４ｄ（存在する場合）が、共通平面内に位置する得ることが企図される。さらなる態様において、第1の側縁２６が、限定でなく例示的に、非吸収性縫合糸、吸収性縫合糸、外科用ペースト、外科的接着剤、ステープルなどを含む従来の外科用付着手段を用いて第二の側縁２８に固定され得ることが企図される。例示的な実施態様において、第二の側縁に第一の側縁を固定するために使用される手段が、ＥＣＭ材料の弁導管の縦軸方向の長さに沿って縫い目６０を形成することが企図される。この態様において、二つの付着点３４が、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の第一の層３０をＥＣＭ材料構成物の第二の層３２に付着するために使用されてきたときに、例示的な構成であるが、第一及び第二の付着点から実質的に放射状に等しく離れ得る第三の付着点として、縫い目６０は機能し得ることが企図される。代替的に、三つ又は四つの付着点３４が、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の第一の層３０を折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の第二の層３２に付着するために使用された場合、第三及び第四の付着点３４ｃ、３４ｄが第一及び第二の側縁２６、２８の近傍に位置できて、第一の側縁が第二の側縁にここで記述してように固定された後に、縫い目６０が第三及び/又は第4の付着点に近傍に位置し得ることが企図される。例示的な態様において、図３に示されているように、縫い目６０は、 ＥＣＭ材料の弁導管４０の縦軸線４１に沿って離間した複数の縫合糸６２から形成することができる。他の例示的な態様では、縫い目６０は、限定でなく例示的に、連続した６−０ポリプロピレン縫合糸のような連続して縫合糸を含むことができる。
【００４１】
一態様において、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の下方部分２４は、ＥＣＭ材料の弁導管４０の入口部分４４に対応することができる。この態様では、 ＥＣＭ材料の弁導管４０の入口部分４４は、 ＥＣＭ材料の弁導管の内腔４２と流体連通する入口４６を画定することができる。別の態様では、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の下方部分２４の第一の層３０は、 ＥＣＭ材料の弁導管４０の内腔４２内に位置した内側層４８に対応することができる。さらに別の態様では、折り畳まれたＥＣＭ材料構成の下方部分２４の第二の層３２は、 ＥＣＭ材料の弁導管４０の外壁５２を画定するために折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の上方部分２２と協働することができる。さらに別の態様では、折り畳まれたＥＣＭ材料構成物の上方部分２２は、 ＥＣＭ材料の弁導管４０の出口５６に対応することができる。この態様では、ＥＣＭ材料弁導管40の出口部分５６はＥＣＭ材料の弁導管の内腔４２と流体連通する出口５８を定義することができる。
【００４２】
ＥＣＭ材料管からＥＣＭ材料の弁導管を作製する方法
例示的な態様において、図５ないし図６Ｂに示されているように、開示されたＥＣＭ材料弁１４０がＥＣＭ材料管１００から作製することができる。これらの態様において、 ＥＣＭ材料管１００は、限定ではなく例示的に、粘膜層及び構成要素、粘膜下層及び構成要素、筋層及び構成要素、及び／又は基底膜層及び構成要素等の任意の公知のＥＣＭ構成要素又は材料を含むことができる。任意であるが、 ＥＣＭ材料の導管１００は、従来の方法により製造される多層積層構造を有することができる。開示されたＥＣＭ材料の弁導管は、制限ではなく例示的に、胃組織（例えば、胃粘膜下層（ＳＳ））、小腸組織（例えば、小腸粘膜下層（ＳＩＳ））、大腸組織、膀胱組織（例えば、膀胱粘膜下層（ＵＢＳ））、肝臓組織（例えば、肝臓基底膜（ＬＢＭ））、心臓組織（例えば、心嚢）、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、心臓の弁（付着した血管をもつ場合又はもたない場合）、発育中の歯の根の周囲の組織、成長骨の周囲の組織等の任意の哺乳動物組織から得られるＥＣＭ材料を含み得ることが企図される。一態様において、ＥＣＭ材料の弁導管１４０を作成する使用されるＥＣＭ材料の導管１００は、限定ではなく例示的に、哺乳動物の小腸の無傷な内腔部分のような哺乳動物組織を切除することから得ることができる。この態様では、哺乳動物組織の無傷な部分の選択された層が切除後に除去され得ることが企図される。
【００４３】
さらなる態様において、開示されたＥＣＮ材料の弁導管１４０が、公知のインビトロ法を使用して産生されるＥＣＭから作製され得ることが企図される。例えば、開示されたＥＣＭ材料の導管１００は、インビトロ法で使用して円筒形の心棒の外側表面上で細胞を成長させることによって形成することができる。心棒の外表面上の細胞の成長が、1つ以上のＥＣＭ材料の製造をもたらし得ることが企図される。
【００４４】
一態様では、および図５ないし図６Ｂに示されているように、ＥＣＭ材料の導管１００から開示されたＥＣＭ材料の弁導管１４０を作製する方法が、反射した位置にＥＣＭ材料の導管を位置づけることを含むことができる。この態様では、ＥＣＭ材料の導管１００が、内腔１０２を画定し、頂部分１０４及び底部分１０８を有し得ることが企図される。さらに、ＥＣＭ材料の導管１００の頂部分１０４がＥＣＭ材料の導管の頂部１０６を含み、ＥＣＭ材料の導管の底部分１０８がＥＣＭ材料の導管の底部１１０を含み得ることが企図される。さらなる態様において、ＥＣＭ材料の導管１００を反射の位置に位置づける工程が、ＥＣＭ材料の導管の内腔１０２内のＥＣＭ材料の導管の底部１１０をＥＣＭ材料の導管の頂部１０６へと鬱側に反射させる工程を含み得ることが企図される。さらに、反射の位置で、ＥＣＭ材料の導管100の底部１１０がＥＣＭ材料の導管の頂部１０６から選択された距離１１２、離され得ることが企図される。一態様では、折り畳み状態で、底部１１０が頂部１０６から離される選択された距離１１２が、約０ｍｍから約１５０ｍｍの範囲とし得ることが企図される。この態様では、選択された距離１１２が、対象の動脈にＥＣＭ材料の弁導管１４０を所望に付着させることを可能にする距離とし得ることが企図される。
【００４５】
別の態様では、開示されたＥＣＭ材料の弁導管を作製する方法は、ＥＣＭ材料の導管１００を反射の位置に固定する工程を含み、これによりＥＣＭ材料の弁導管１４０が作製される。この態様では、ＥＣＭ材料の弁導管１４０は、内腔１４２、入口部分１４４及び出口部分１５６を含み、縦軸線１４１及び外周辺を有することができる。一態様において、出口部分１５６は、開示されたＥＣＭ材料の弁導管１４０の内腔１４２と連通する出口１５８を画定することができる。さらなる態様において、入口部分１４４は、開示されたＥＣＭ材料の弁導管１４０の内腔１４２と連通する入口１４６を画定することができ、外側層と、ＥＣＭ材料の導管の内腔内に位置する内側層１４８を含むことができる。この態様では、ＥＣＭ材料の弁導管１４０の入口部分１４４の内側層１４８が、ＥＣＭ材料の導管１００の反射底部分１１０に対応し得ることが企図される。さらなる態様では、内側層1１４８は、三つの付着点１３４において外側層に付着することができる。この態様では、 三つの付着点１３４がＥＣＭ原料の弁導管１４０の外周辺にそって、実質的に均等に離間し得ることが企図される。例えば、三つの付着点１３４が、ＥＣＭ材料の弁導管１４０の外周辺に沿って約５ｍｍから約７５ｍｍの範囲の距離、隣接する付着点から離間され得ることが企図される。さらに、三つの付着点１３４が、ＥＣＭ材料の弁導管１４０の縦軸線１４１に実質的に直交する共通平面内に実質的に位置し得ることが企図される。さらに別の態様では、ＥＣＭ材料の弁導管１００の入口部分１４４の外側層は、 ＥＣＭ材料の弁導管の外壁１５２を画定するために、ＥＣＭ材料の弁導管の出口部分１５６と協働することができる。
【００４６】
さらなる態様では、開示されたＥＣＭ材料の弁導管を作製する方法は、公知の方法を用いてＥＣＭ材料の弁導管を凍結乾燥することを含むことができる。さらなる態様において、開示されたＥＣＭ材料の弁導管が凍結乾燥されたとき、ＥＣＭ材料の弁導管を作製する方法は、さらに、公知の方法を用いてＥＣＭ材料の弁導管を水和させることを含むことができる。この態様では、凍結乾燥されたＥＣＭ材料の弁導管が、約５分ないし約３０分の範囲の期間、滅菌水、生理食塩水又は平衡塩類溶液中で水和され得ることが意図される。
【００４７】
例示的な態様において、本明細書に記載されたＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０が、公知の方法を使用して又は本明細書の開示のとおりに、滅菌され及び/又は脱細胞化され得ることが企図される。これらの態様において、このような滅菌及び/又は脱細胞化工程は、従来対象内へのＥＣＭ材料の弁導管の移植前における、ＥＣＭ材料の弁導管を構成するどの段階でも行うことができる。一態様において、本明細書に記載のＥＣＭ材料の弁導管４０、１４０がエチレンオキサイドガスを用いて滅菌し得ることが企図される。
【００４８】
一態様において、開示されたＥＣＭ材料の弁導管は、無菌で無細胞のＥＣＭ組成物を含むことができる。例示的な態様において、このような無菌で、無細胞のＥＣＭ組成物は、単離されたＥＣＭ材料を同時に殺菌し及び脱細胞化することにより作製することができる。
特に、以下の方法で開示されているように、単離されたＥＣＭ材料の所望の滅菌及び脱細胞化は、組織の組成の自然の特性が維持され、ＥＣＭ材料が滅菌及び無細胞描画されるように、同時に起こり得る。
【００４９】
ＥＣＭ弁導管で使用するためのＥＣＭ組成物の滅菌／脱細胞
本明細書に記載されているように、開示された方法は、単離されたＥＣＭ材料の急速減圧を利用して、ＥＣＭ材料を無細胞にする。このＥＣＭ材料の急速減圧は、以前から公知の方法で適用される減圧速度よりも非常に高速の減圧速度で起こる。本明細書に記載されるように、ＥＣＭ材料を無細胞にすることに加えて、ＥＣＭ材料の急速な減圧はまた、ＥＣＭ材料への所望の滅菌剤および添加剤の組み込みを強化するために使用することができる。さらには、ＥＣＭ材料の急速減圧が、以前から公知の脱細胞化方法と比較して、自然の成長因子の保持を向上させつつ、 ＥＣＭ材料を無細胞にし得ることが企図される。さらに、ＥＣＭ材料の急速な減圧が、以前から公知の脱細胞化法と比較して、 ＥＣＭ材料の引張強度の保持を改善するために使用され得ることが意図される。
【００５０】
開示された方法は、ＥＣＭ組成物の機械的強度及び生体栄養特性を著しく弱めていないばかりでなく、本方法は、ＥＣＭ組成物を脱細胞化する際、さらにＥＣＭ組成物への種々の添加剤の取り込みを強化する際に、より効果的となる。したがって、開示された滅菌脱細胞化の方法は、より脱細胞化されたＥＣＭ組成物を提供し、当業者には知られたＥＣＭ組成物よりも多くの添加剤を組み込み、次いで送達するより優れた能力を有する。さらに、開示された滅菌及び脱細胞化方法は、より多量及び／又は高濃度の保持された自然の成長因子を有し、そして当業者には滅菌され、脱細胞化された公知のＥＣＭ組成物よりも強い引張強度を有するＥＣＭ組成物を提供する。
【００５１】
任意に、開示のＥＣＭ材料の弁導管のＥＣＭ材料は、限定でなく例示的に、NovaSterilis社に譲渡された米国特許第７，１０８，８３２号（該特許は参照b文献としてその全体が本明細書に明示的に組み込まれる）に記載されたシステム等の公知の滅菌システムを使用して滅菌することができることが企図される。従って、いくつかの態様では、開示の方法を実施するために使用されるシステムは、標準の圧縮保存シリンダ及びブースター（例えば、ハスケルブースターＡＧＴ７／３０）と連動して使用される標準のエアコンプレッサを含む場合がある。他の態様では、エアコンプレッサ及びブースターは、単一のコンプレッサに置き替えることができる。実施態様において、圧縮保存シリンダは、二酸化炭素を受け入れるように構成される場合があり、ブースターは、二酸化炭素ブースターであり得る。
【００５２】
システムはさらに入口ポートを含む場合があり、それによってリザーバに収容された一つ以上の添加物を弁及び添加物ラインを通じて反応容器に加えることができる。本明細書で使用される、用語「反応容器」は、本明細書に開示されるように、ＥＣＭ材料を受け入れ、ＥＣＭ材料を一つ以上の滅菌剤及び添加物に曝露することができるように構成された内部空間を有する任意の容器を指す。実施態様において、反応容器は、限定されないが、バスケット、バケツ、外筒、箱、パウチ及びその他の公知の容器とすることができる。反応容器は再シール可能であり得ることが企図される。一つの態様では、反応容器は、ＥＣＭ材料が充填されるシリンジであり得ることが企図される。
【００５３】
限定でなく例示的に、二酸化炭素等の選択された一次滅菌剤が、弁及び供給ラインを介してヘッダーラインから反応容器に導入され得ることが企図される。さらに、限定でなく例示的に、０．５μｍフィルタ等のフィルタが、容器から材料が漏れるのを防ぐために、供給ラインに設けられ得ることが企図される。実施態様では、圧力計が、圧力を視覚的に監視することができるように、ヘッダーラインの遮断弁の下流に設けられる場合がある。逆止弁が、ブースター内への逆方向の流体流れを防ぐために、弁の上流のヘッダーラインに設けられる場合がある。ヘッダーラインに存在する過圧状態を防止するために、圧力逃がし弁が任意で設けられ得る。
【００５４】
一つの態様では、反応容器の減圧は、出口ライン及び反応容器と連通する弁を用いて達成され得る。この態様において、減圧された流体は、供給ラインを介して容器から出て、フィルタユニットにより濾過され、その後セパレータに案内され、二酸化炭素等の濾過された流体が排出ラインを介して排出され得ることが企図される。さらに、上流の構成要素の流体を単離できるように、弁が装置の様々なラインに組み込まれ得ることが企図される。
【００５５】
一つの実施態様において、反応容器は、限定でなく例示的に、３１６ゲージステンレス鋼等のステンレス鋼を含む場合がある。もう一つの実施態様において、反応容器は、実験室規模又は工業規模のいずれかで、滅菌される材料を収容するのに十分な全内部体積を有する場合がある。例えば、反応容器は、約８インチの長さ、約２．５インチの内径及び約６００ｍＬの内部体積を有する場合があることが企図される。更に他の態様において、反応容器は、振動器、温度制御ユニット、インペラと磁気駆動部とを含む機械的攪拌システムを含む場合がある。一つの任意の態様では、反応容器は、３１６ゲージのステンレス鋼を含むバスケットを収容し得ることが企図される。この態様では、バスケットは滅菌される材料を保持し、さらにインペラを保護し、所定の方法で一次滅菌剤を案内するように構成される場合があることが企図される。
【００５６】
反応容器は、飛沫や乱流による材料の損失なしに、また、逆拡散を介して圧力ラインを汚染することなしに、一定圧力又は継続的な加圧及び減圧（圧力サイクル）条件下で動作させ得ることが企図される。さらに、システム内の弁は、反応容器をシステムの他の構成要素から容易に分離及び除去することを可能にし得る場合があることが企図される。一つの態様では、反応容器の内部空間へアクセスできるようにするために、減圧時に反応容器の頂部を除去することができる。
【００５７】
任意に、システムは、ユーザが反応容器内の温度を調整可能に制御できるようにする温度制御ユニットを含む場合がある。
【００５８】
使用時には、開示された装置を本明細書に開示されるように、滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物を作製する方法に採用する場合がある。しかしながら、開示の装置は単に例示であって、開示の方法のステップを実行することが可能な任意の装置が、滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物を作製するために採用され得ることが理解される。従って特許請求の範囲に係る方法は、特定の装置に限定されるものでは全くない。
【００５９】
コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）の有意な低減が、開示の方法に従い、一次滅菌剤を使用し滅菌温度及び圧力条件に単離されたＥＣＭ材料をさらすことにより、達成され得ることが企図される。任意に、一次滅菌剤は、所望の滅菌を達成するために、1つ以上の二次滅菌剤と組み合わせることができることが企図される。任意に、さらに、選択された添加物が、得られるＥＣＭ組成物に所望の特性を与えるためにＥＣＭ材料に組み込まれ得ることが企図される。またさらに、開示の方法は、対象の体内に移植するための滅菌された無細胞ＥＣＭ組成物を作製するために採用され得ることが企図される。
【００６０】
本明細書に記載のように、開示の方法は、ＥＣＭ材料を無細胞にするために、単離されたＥＣＭ材料の急速な減圧を利用する。ＥＣＭ材料のこの急速な減圧は、従来公知の方法で適用される減圧速度よりも有意に高い減圧速度で起こる。本明細書に記載のようにＥＣＭ材料を無細胞にすることに加えて、ＥＣＭ材料の急速な減圧はまた、ＥＣＭ材料へ所望の滅菌剤及び添加物を組み込むことを強化するために使用することができる。さらに、ＥＣＭ材料の急速な減圧は、従来公知の脱細胞化方法と比較して、自然の増殖因子の保持率を向上させながら、ＥＣＭ材料を無細胞にすることができることが企図される。またさらに、ＥＣＭ材料の急速な減圧は、従来公知の脱細胞化方法と比較して、ＥＣＭ材料の引張強度の保持率を向上させるために使用することができることが企図される。
【００６１】
開示の方法は、ＥＣＭ組成物の機械的強度及び生体栄養特性（bioptric properties）を著しく弱めることがないだけではなく、本方法は、ＥＣＭ組成物を脱細胞化し、並びに、ＥＣＭ組成物に様々な添加物を組み入れる性能を強化することに、より有効である。従って、開示の滅菌及び脱細胞化方法は、当技術分野で公知のＥＣＭ組成物に比べて、より脱細胞化された、並びに、より多くの添加物を組み込み、その後送達するより高い性能を有するＥＣＭ組成物を提供する。さらに、開示の滅菌及び脱細胞化方法は、当技術分野で公知である滅菌され脱細胞化されたＥＣＭ組成物に比べて、より多い量及び／又はより高い濃度の保持された自然の増殖因子を有し、より高い引張り強度を有するＥＣＭ組成物を提供する。
【００６２】
実施態様において、一次滅菌剤は、その臨界圧力及び臨界温度条件にある、または、それに近い条件にある二酸化炭素とすることができる。しかしながら、例えば、ＥＣＭ材料の自然の特性を妨げない気体、液体又は粉末の滅菌剤を含む任意の従来の滅菌剤が一次滅菌剤として使用され得ることが企図される。
【００６３】
一つの実施態様において、開示される滅菌プロセスは、一次滅菌剤として二酸化炭素を用いて、約１，０００〜約３，５００ｐｓｉの範囲にある圧力及び約２５℃〜約６０℃の範囲にある温度で実施され得る。より好適に、超臨界二酸化炭素が使用される場合、滅菌プロセスは、１，０７１ｐｓｉ以上の圧力及び３１．１℃以上の温度で、一次滅菌剤として二酸化炭素を使用し得ることが企図される。この態様では、滅菌されるＥＣＭ材料は、そのような圧力および温度条件又はそれに近い条件にある二酸化炭素に、約１０分ないし約２４時間にかけて、より好ましくは、約１５分ないし約１８時間にかけて、最も好ましくは、約２０分ないし約１２時間にかけてさらされる場合がある。好適に、開示のシステム及び方法に用いられる二酸化炭素は純粋であるか、または代替的に、二酸化炭素の滅菌特性を損なわない他のガスを微量のみ含むものであり得る。以下のさらなる検討を簡単にするために、用語「超臨界二酸化炭素」が使用されるが、そのような用語は、前述のような圧力及び温度範囲内にある二酸化炭素に限定されず、開示の方法の実施に十分に採用され得ることが理解されよう。開示された圧力及び温度範囲内で、二酸化炭素は気体、液体、流体又はプラズマ形態でＥＣＭ材料に与えられ得ることが企図される。
【００６４】
いくつかの態様で、開示の方法で用いる二次滅菌剤は、限定でなく例示的に、過酸化物及び／又はカルボン酸等の化学滅菌剤を含み得る。好ましいカルボン酸は、アルカンカルボン酸及び／又はアルカン過カルボン酸を含み、それらは各々任意に、α位の炭素のところで、ハロゲン、酸素、窒素グループ等の1つ以上の電子求引性置換分と置き換えられ得る。開示の方法の実施に使用される化学滅菌剤の実施例の種類は、限定でなく例示的に、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、酢酸（ＡｃＡ）、過酢酸（ＰＡＡ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及びそれらの混合物を含む。一つの実施態様において、化学滅菌剤は、酢酸、過酸化水素及び過酢酸を含む混合物であるSporeclenz（商標）滅菌剤を含み得る。
【００６５】
二次滅菌剤は、一次滅菌剤の全体積を基準に、滅菌の強化に有効な少なくとも約０．００１ｖｏｌ％以上の量で用いることができることが企図される。さらに、二次滅菌剤の量は、用いられる特定の二次滅菌剤に依存する場合があることが企図される。従って、例えば、過酢酸は約０．００５ｖｏｌ％以上の比較的少量であり、一方で酢酸は、約１．０ｖｏｌ％以上の量で用いられる場合があることが企図される。従って、二次滅菌剤の濃度は、約０．００１ｖｏｌ％ないし約２．０ｖｏｌ％の範囲にあり、典型的に、限定でなく例示的な超臨界二酸化炭素等の開示された一次滅菌剤と組み合わせて、滅菌強化作用を達成するために、本明細書に開示のように使用され得ることが企図される。
【００６６】
一つの態様では、滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物の製造方法は、哺乳動物由来の選択された組織を採取する工程と、選択された組織を滅菌生理食塩水又は当業者には知られている他の生体適合性の液体（限定でなく例示的に、リンガー液又は生体平衡塩類溶液）中ですすぐ工程を含む場合がある。この態様において、選択された組織は、限定でなく例示的に、胃組織（例えば、胃粘膜下層（ＳＳ））、小腸組織（例えば、小腸粘膜下層（ＳＩＳ））、大腸組織、膀胱組織（例えば、膀胱粘膜下層（ＵＢＳ））、肝臓組織（例えば、肝臓基底膜（ＬＢＭ））、心臓組織（例えば、心嚢、心外膜、心内膜、心筋）、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、心臓弁（それらに付着する血管があるもの又はないもの）、発育中の歯の根の周囲の組織、成長骨の周囲の組織であり得る。もう一つの態様において、本方法は、選択された組織を約１２〜約３６時間、より好ましくは、約１８〜約３０時間、最も好ましくは、約２２〜約２６時間の範囲にある期間、凍結する工程を含む場合がある。例えば、選択された組織が凍結される期間は、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間及び前述の値の間に入る時間の任意の他の期間であり得ることが企図される。追加の態様において、本方法は、冷低張トリス緩衝液中で選択された組織を解凍する工程を含む場合がある。任意に、この態様では、本方法は、選択された組織を氷上の冷低張トリス緩衝液中で、５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて解凍する工程を含む場合がある。実施態様では、選択された組織を凍結及び解凍する工程は、６回まで周期的に繰り返すことができることが企図される。
【００６７】
もう一つの態様において、本方法は、選択された組織由来のＥＣＭ材料を単離する工程を含む場合がある。この態様において、ＥＣＭ材料は、限定でなく例示的に、胃組織（例えば、胃粘膜下層（ＳＳ））、小腸組織（例えば、小腸粘膜下層（ＳＩＳ））、大腸組織、膀胱組織（例えば、膀胱粘膜下層（ＵＢＳ））、肝臓組織（例えば、肝臓基底膜（ＬＢＭ））、心臓組織（例えば、心嚢、心外膜、心内膜、心筋）、肺組織、腎臓組織、膵臓組織、前立腺組織、中皮組織、胎児組織、胎盤、尿管、静脈、動脈、心臓弁（それらに付着する血管があるもの又はないもの）、発育中の歯の根の周囲の組織及び成長骨の周囲の組織等の公知の細胞外マトリックス構成要素を含む任意の材料とすることができる。一つの実施例の限定しない態様において、ＥＣＭ材料を単離する工程は、哺乳動物組織からＳＩＳを単離する工程を含む場合がある。この態様では、本方法は、小腸の壁を該小腸の長手方向の軸に実質的に平行な経路に沿って切開する工程と、切開の経路に沿って小腸を開き、小腸を表面上で平らにする開き工程と、滅菌生理食塩水又は他の生体適合性の流体で小腸をすすぐ工程と、小腸のＳＩＳを周囲の平滑筋層及び漿膜層、並びに粘膜から機械的に取り、粘膜下層及び基底膜層を原則として残す、取り工程とを含み得る。しかしながら、ＥＣＭ材料は、米国特許第４，９０２，５０８号、米国特許第５，２７５，８２６号、米国特許第５，２８１，４２２号、米国特許第５，５５４，３８９号、米国特許第６，５７９，５３８号、米国特許第６，９３３，３２６号、米国特許第７，０３３，６１１号、Voytik-Harbin等 の“Identification of Extractable Growth Factors from Small Intestinal Submucosa” J. Cell. Biochem.  Vol. 67 pp. 478-491 (1997)、Hodde等の“Virus Safety of a Porcine-Derived Medical Device: Evaluation of a Viral Inactivation Method” Biotech. & Bioeng. Vol. 79 No. 2 pp. 21 1-216 (2001)、Badylak他 “The Extracellular Matrix as a Scaffold for Tissue Reconstruction” Cell & Developmental Biology Vol. 13 pp. 377-383 (2002)、Robinson他 “Extracelular Matrix Scaffold for Cardiac Repair” Circulation Vol. 112 pp. I-135-I-143 (2005)、Hodde他 “Effects of Sterilization on an Extracellular Matrix Scaffold: Part I. Composition and Matrix Architecture” J. Mater. Sci.: Mater. Med. Vol. 18 pp. 537-543 (2007)、並びに、Hodde他“Effects of Sterilization on an Extracellular Matrix Scaffold: Part II. Bioactivity and Matrix Interaction” J. Mater. Sci. Mater. Med. Vol. 18 pp. 545-550 (2007)（各々が参照文献としてその全体が本明細書に明示的に組み込まれる）に記載されたものを含む任意の従来技術を使用して単離され得ることが企図される。
【００６８】
さらなる態様において、本方法は、単離されたＥＣＭ材料を、０．５〜１％のトリトンＸ−１００／０．５〜１％のデオキシコール酸内で、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Lonza Walkerville社）の５ｍＭのＥＤＴＡを用いて２４〜４８時間インキュベートする工程を含む場合がある。この態様では、胃粘膜下層（ＳＳ）、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）及び膀胱粘膜下層（ＵＢＳ）等の平坦なＥＣＭ材料又はシート状のＥＣＭ材料は、延伸された形態でインキュベートされ得ることが企図される。さらに、尿管、動脈、静脈及び管状のＳＩＳ等のＥＣＭ材料の導管又は他の内腔を有するＥＣＭ材料は、浸漬を通じて、並びに蠕動ポンプを使用することにより、様々な開示された溶液を用いて灌流され得る。
【００６９】
さらなる態様では、インキュベーション後に、本方法は、ＥＣＭ材料をＤＰＢＳですすぐ工程を含む場合がある。この態様で、ＥＣＭ材料をすすぐ工程は、１回、２回、３回、４回、５回又は６回を含む６回までＥＣＭ材料をすすぐこと（各々のすすぎは約３０分間持続する）を含み得ることが企図される。一つの実施態様では、ＥＣＭ材料をすすぐ工程は、ＥＣＭ材料を３回すすぐ（各すすぎは約３０分持続する）ことを含み得ることが企図される。
【００７０】
任意で、実施態様において、本方法はさらに、第２のインキュベーション手順を含む場合がある。これらの態様において、第２のインキュベーション手順は、ＥＣＭ材料を、１０〜５０μｇ／ｍＬのＲＮアーゼ／０．２〜０．５μｇ／ｍＬのＤＮアーゼを含有する等張トリス緩衝液内で５ｍＭのＥＤＴＡを用いてインキュベートする工程を含み得る。等張トリス緩衝液中でＥＣＭ材料をインキュベートする工程は、人体の温度に実質的に対応する約３７℃の温度で行われ得ることが企図される。さらに、等張トリス緩衝液中でＥＣＭ材料をインキュベートする工程は、約３０分ないし約２４時間にかけて、より好ましくは約1時間ないし約１８時間にかけて、最も好ましくは約２時間ないし約１２時間にかけての期間、行われ得ることが企図される。さらなる態様において、第２のインキュベーション手順は、さらに、ＤＰＢＳでＥＣＭ材料をすすぐ工程を含む場合がある。この態様では、ＥＣＭ材料をすすぐ工程は、ＥＣＭ材料を３回すすぐ（各すすぎが約３０分間持続する）ことを含み得ることが企図される。
【００７１】
またもう一つの態様では、第２のインキュベーション手順が行われるか否かに関わらず、本方法はＥＣＭ材料を、約１℃〜約１０℃、より好適に約２℃〜約６℃、最も好適に約３℃〜約５℃の範囲にある温度で保存する工程を含む場合がある。実施態様において、ＥＣＭ材料は４℃で保存される場合がある。
【００７２】
さらなる態様において、本方法は、ＥＣＭ材料を反応容器の内部空間に導入する工程を含む場合がある。任意に、この態様では、リザーバからの1つ以上の二次滅菌剤が、ＥＣＭ材料とともに反応容器の内部空間に加えられ得る。これらの態様では、リザーバからの1つ以上の二次滅菌剤は、ＥＣＭ材料の導入の前後に、またはＥＣＭ材料の導入と同時に反応容器の内部空間に加えられ得る。さらに、温度制御ユニットが、反応容器の内部空間内に所望の温度を作り出すように選択的に調整され得ることが企図される。さらなる態様において、本方法は、反応容器内の圧力と保存シリンダ内の圧力を平衡にする工程を含む場合がある。例えば、この態様では、反応容器内の圧力と保存シリンダ内の圧力が大気圧と実質的に等しい場合があることが企図される。さらに別の態様では、装置内の圧力を平衡にした後に、本方法は、反応容器のインペラを活動化させるために磁気駆動部を動作させる工程を含む場合がある。またさらなる態様では、本方法は、反応容器内が所望の圧力に達するまで、反応容器に保存シリンダから一次滅菌剤を選択的に導入する工程を含む場合がある。この態様では、反応容器に一次滅菌剤を選択的に導入する工程は、反応容器への一次滅菌剤の流れ込みを増大させるために、エアコンプレッサとブースターとを選択的に活動化させることを含み得ることが企図される。実施態様において、エアコンプレッサ及びブースターは、限定でなく例示的に、超臨界二酸化炭素を作製するのに必要な圧力及び温度等の超臨界圧力及び温度を、約２０分から約６０分の範囲にある時間間隔の間、ＥＣＭ材料に施すように活動化される場合がある。
【００７３】
さらに、他の態様において、本発明は、反応容器の圧力を急速に減少させる工程を含む場合がある。この態様では、限定でなく例示的に、超臨界二酸化炭素のような、所定の量の主要な殺菌剤が、減圧ラインを通して反応容器から放出され得る。主要な殺菌剤が、反応容器内の圧力を減少させることにより、反応容器に連結された弁の開放により反応容器から放出され得ることが企図される。本明細書で使用される、用語「急速減圧」は、４００ｐｓｉ／分以上の速度での反応容器の減圧を指す。例えば、反応容器は、約２．９ＭＰａ／分ないし約１８．０ＭＰａ／分（約４００ｐｓｉ／分ないし約２，６００ｐｓｉ／分）、より好適に、約５．０ＭＰａ／分ないし約１０．０ＭＰａ／分（約７００ｐｓｉ／分ないし約１，５００ｐｓｉ／分）、最も好適に、約７．０ＭＰａ／分ないし約８．０ＭＰａ／分（約１，０００ｐｓｉ／分ないし約１，２００ｐｓｉ／分）の範囲にある減圧速度で減圧され得ることが企図される。従って、これらの急速な減圧は、米国特許第７，１０８，８３２号に開示された３００ｐｓｉ／分の減圧速度よりも著しく大きい。いかなる特定の理論に拘束されることなく、開示の急速な減圧速度は、ＥＣＭ材料で達成される脱細胞化のレベルを増加させると考えられる。例えば、開示のＥＣＭ材料の急速な減圧は、結果として約９６％を超える（９６．１％、９６．２％、９６．３％、９６．４％、９６．５％、９６．６％、９６．７％、９６．８％、９６．９％、９７．０％、９７．１％、９７．２％、９７．３％、９７．４％、９７．５％、９７．６％、９７．７％、９７．８％、９７．９％、９８．０％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、１００．０％等）ＥＣＭ材料の脱細胞化のレベルをもたらす場合がある。
【００７４】
実施態様において、本方法はさらに、ＥＣＭ材料に1つ以上の添加物を組み込む工程を含む場合がある。これらの態様では、1つ以上の添加物は、粉末又は液体の形態のいずれかで提供され得ることが企図される。一つの任意の態様において、1つ以上の添加物を組み込む工程は、反応容器を急速に減圧する工程の間に、反応容器に1つ以上の添加物を導入することを含む場合がある。この態様では、1つ以上の添加物の導入は、従来の発泡プロセスとして特徴づけられる場合があることが企図される。別の任意の態様において、1つ以上の添加剤を組み込む工程は、反応容器を急速に減圧する工程後、反応容器内に１つ以上の添加物を導入することを含む場合がある。この態様では、１つ以上の添加物は、反応容器の急速な減圧がＥＣＭ材料を増大及び／又は伸長させた後にＥＣＭ材料に添加され、それによってＥＣＭ材料への添加物の浸透を向上させることができることが企図される。さらに、実施態様において、１つ以上の添加物は、反応容器の急速減圧の後、約３０分以内にＥＣＭ材料に添加され得ることが企図される。さらなる任意の態様において、１つ以上の添加物を組み込む工程は、反応容器を急速減圧する工程の間にもその工程の後にも、反応容器中に１つ以上の添加物を導入することを含む場合がある。この態様では、１つ以上の添加物が速い方法及び遅い、拡張された方法の両方で反応容器内に放出され得ることが企図される。またさらなる任意の態様において、１つ以上の添加物を組み込む工程は、反応容器を急速に減圧する工程の前に、反応容器中に１つ以上の添加物を導入することを含む場合がある。
【００７５】
開示の添加物は、結果として生成される滅菌された無細胞のＥＣＭ組成物に選択された特性を付与するために、ＥＣＭ材料に組み込まれ得る。このように、１つ以上の添加物は、本明細書に記載のように、ＥＣＭ材料の処理中に失われるＥＣＭ材料の構成要素を置換又は補完するように選択され得ることが企図される。例えば、以下に記載されるように、１つ以上の添加物は、増殖因子、サイトカイン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、薬物又は細胞を含む場合がある。さらに、１つ以上の添加物が、ＥＣＭ材料に非自然の構成要素を組み込むように選択され得ることが企図される。例えば、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、幹細胞、血管新生サイトカイン及び抗炎症性サイトカインを補充するための増殖因子を含む場合がある。またさらに、１つ以上の添加物は、スタチン、副腎皮質ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、抗炎症化合物、抗不整脈剤等の薬剤であり得ることが企図される。またさらに、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、銀ナノ粒子、金ナノ粒子、白金ナノ粒子、イリジウムナノ粒子、ロジウムナノ粒子、パラジウムナノ粒子、銅ナノ粒子、亜鉛ナノ粒子及びその他金属ナノ粒子等のナノ粒子であり得ることが企図される。またさらに、１つ以上の添加物は、金属化合物であり得ることが企図される。１つの実施態様において、１つ以上の添加物は、得られるＥＣＭ組成物を対象の体内に移植した後に、対象の免疫反応を薬学的に抑制するように選択することができる。
【００７６】
一つの態様において、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、形質転換増殖因子ベータ−１、−２、−３（ＴＧＦ−β−１、−２、−３）、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）（塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）としても知られる）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）及び形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）を含む１つ以上の増殖因子を含む場合がある。
【００７７】
他の態様において、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、幹細胞因子、ストロマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−１０、インターロイキン−１３、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、アンフィレグリン、トロンボスポンジン１、トロンボスポンジン２、トロンボスポンジン３、トロンボスポンジン４、トロンボスポンジン５及びアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を含む１つ以上のサイトカインを含む場合がある。
【００７８】
追加の態様において、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ベータグリカン、シンデカン、デコリン、アグリカン、バイグリカン、フィブロモジュリン、ケラトカン、ルミカン、エピフィカン、パールカン、アグリン、テスティカン、シンデカン、グリピカン、セルグリシン、セレクチン、レクチカン、ベルシカン、ニューロカン及びブレビカンを含む１つ以上のプロテオグリカンを含む場合がある。
【００７９】
さらなる態様において、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）及びコンドロイチン硫酸Ａを含む1つ以上のグリコサミノグリカンを含む場合がある。
【００８０】
またさらなる態様において、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、コラーゲン、エラスチン、ビトロネクチン、ベルシカン、ラミニン、フィブロネクチン、フィブリリン１、フィブリリン２、プラスミノーゲン、小ロイシンリッチタンパク質、細胞表面付随性タンパク質、細胞接着分子（ＣＡＭ）、マトリカイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、カドヘリン、免疫グロブリン、マルチプレキシン、細胞質領域―４４（ＣＤ−４４）、アミロイド前駆体タンパク質、テネシン、ナイドジェン／エンタクチン、フィビュリンI、フィビュリンII、インテグリン、膜通型分子及びオステオポンチンを含む１つ以上のタンパク質、ペプチド又は核酸を含む場合がある。
【００８１】
さらに別の態様において、１つ以上の添加物は、限定でなく例示的に、セリバスタチン（cerevastatin）、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン及びシンバスタチン、副腎皮質ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、抗炎症化合物、抗不整脈剤、抗菌剤、抗生物質等のスタチン系薬剤を含む１つ以上の薬剤を含む場合がある。
【００８２】
実施態様において、反応容器中に１つ以上の添加物を導入する工程は、１つ以上添加物が、リザーバから入口ポートに流れることができるようにバルブを開けることを含む場合がある。加圧の前に、１つ以上の添加物は、シールに先だって反応容器内に直接導入、及び／又は入口ポートを介して導入され得ることが企図される。
【００８３】
開示される反応容器の急速減圧及び再加圧は、１つ以上の添加物の添加のあるなしに関わらず、任意の所望の数のサイクルで繰り返され得ることが企図される。さらに、減圧と再加圧のサイクル、ならびに一次滅菌剤及び／又は二次殺菌剤及び／又は添加物の導入は、所望の圧力条件及びサイクルを達成するためにシステムの様々な弁を選択的に開く及び／又は閉じるように構成された制御器を介して自動的に制御され得ることが企図される。
【００８４】
いくつかの態様では、開示される方法は、さらに、反応容器の内容物を攪拌する工程を含む場合がある。これらの態様では、反応容器の内容物を攪拌する工程は、振動器を用いて反応容器の内容物を周期的に攪拌することを含み得ることが企図される。さらに、反応容器の攪拌は、断続的、継続的又は連続的であり得ることが企図される。実施態様において、反応容器の内容物を攪拌する工程は、一次滅菌剤を反応容器内に導入する工程中に起こる場合がある。反応容器の内容物の撹拌は、反応容器内の流体中の空隙を排除してＥＣＭ材料と滅菌剤及び／又は添加物とをより完全に接触させることにより、滅菌剤及び／又は添加物の物質移動を向上させ得ることが企図される。さらに、反応容器の内容物を攪拌する工程は、滅菌時間、温度、加圧／減圧サイクルを最適化するように攪拌の強度および持続時間を選択的に調整することを含み得ることが企図される。
【００８５】
さらなる態様において、ＥＣＭ材料の滅菌及び脱細胞化が完了した後、本方法はさらに、反応容器を減圧する工程及び攪拌翼（インペラ）の動作を停止するように磁気駆動部を非活動化させる工程を含む場合がある。最後に本方法は、結果として得られる、滅菌された無細胞ＥＣＭ組成物を反応容器の上部を通じて取り除くステップを含む場合がある。
【００８６】
ＥＣＭ材料の弁導管を使用した心臓弁
また、心臓弁を再生する方法が本明細書に開示される。例示的な態様において、対象の心臓内の不良な半月弁を交換するために半月弁を再生する方法が開示される。この態様において、図２４に示されているように、不良な半月弁が、対象の心臓の心室と対象の動脈との間の環状領域の環部に付着されていることが企図される。本明細書で使用される、用語「半月弁」は、対象の心臓内の肺動脈弁又は大動脈弁のいずれかを指す。不良な半月弁が肺動脈弁である場合に、不良な半月弁が、対象の心臓の右心室と対象の肺動脈との間の環状領域の環部に付着されていることが企図される。さらに、不良な半月弁が大動脈弁である場合に、不良な半月弁が、対象の心臓の左心室と対象の大動脈との間の環状領域の環部に付着されていることが企図される。
【００８７】
一態様において、半月弁を再生する開示された方法は、対象の心臓から不良な半月弁を除去し、環状領域を露出させることを含むことができる。この態様において、不良な半月弁を除去する工程が、必要に応じて、大動脈又は肺動脈のような、不良な半月弁に結合された動脈の部分を除去することを含み得ることが企図される。さらに、不良な半月弁を除去する工程が、必要に応じて、環状領域の環部を除去することを含み得ることが企図される。
【００８８】
不良な半月弁を除去する工程がさらに心肺バイパス上に対象物を配置することを含み得ることが企図される。さらに、不良な半月弁を除去する工程が、さらに対象の心臓を高速及び／又はまたはフィブリル化し、対象の心臓の切開を通しての不良な弁を露出することを含み得ることが企図される。代替的に、公知の方法を用いて経皮的に不良な弁にアクセスすることができる。
【００８９】
さらなる態様において、半月弁を再生する開示の方法は、本明細書に開示されるもののようなＥＣＭ材料の弁導管を移植することを含み得る。この態様において、明細書にさらに開示されているように、ＥＣＭ材料の弁導管は、内腔を画定し、入口部分と出口部分を有することができる。さらなる態様において、ＥＣＭ材料の弁導管を移植する工程は、ＥＣＭ材料の弁導管の入口部分を環状領域に固定し、入口部分が環状領域に近接して配置されるように、ＥＣＭ材料の弁導管の出口部分を対象の動脈に固定することを含み得る。この態様において、ＥＣＭ材料の弁導管が、限定でなく例示的に、非吸収性縫合糸、吸収性縫合糸、外科用ペースト、外科用接着剤、ステープルなどを含む従来の外科用付着手段を用いて環状領域及び／又は動脈に固定され得ることが企図される。任意選択的に、一態様において、ＥＣＭ材料の弁導管は、動脈に固定される前に、環状領域に固定することができる。この態様において、ＥＣＭ材料の弁導管が正しく環部に固定された後、ＥＣＭ材料の弁導管の長さが、動脈へのＥＣＭ材料の弁導管の適切な付着を行うために十分な組織を保持しながら、余分な長さを除去するために、必要に応じてトリミングされ得ることが企図される。代替的に、ＥＣＭ材料の弁導管は、環状領域に固定される前に、動脈に固定され得る。この態様において、ＥＣＭ材料の弁導管が適切に動脈に固定された後、ＥＣＭ材料の弁導管の長さが、環状領域へのＥＣＭ材料の弁導管の適切な付着を行うために十分な組織を保持しながら、余分な長さを除去するために、必要に応じてトリミングされ得ることが企図される。
【００９０】
例示的な態様において、一つ以上の綿撒糸が、環状領域及び／又は動脈へのＥＣＭ材料の弁導管の付着部分に近接した位置において、ＥＣＭ材料の弁導管の外壁に加えられ得ることが企図される。これらの態様において、綿撒糸がＥＣＭ材料の弁導管と環状領域及び／又は動脈との間の縫い目との直接接触からＥＣＭ材料の弁導管を遮蔽するように構成され、このことによりＥＣＭ材料の弁による縫合糸の切断のリスクが最小限に抑えられ、ＥＣＭ材料の弁導管の構造的完全性が提供され得ることが企図される。限定ではなく例示的に、Teflon（登録商標）製綿撒糸のような従来の綿撒糸がこれらの目的のために用いられ得ることが企図される。例示的な態様において、一つ以上の綿撒糸が少なくとも一つのＥＣＭ材料を含み得ることが企図される。1つまたは複数の綿撒糸が、任意の適切な形状及び寸法を有し得ることが企図される。しかしながら、例示的な態様において、綿撒糸が、約２ｍｍから約４ｍｍの範囲の長さ、約２ｍｍから約４ｍｍの範囲の幅を有する実質的に矩形のシートを含み得ることが企図される。
【００９１】
ＥＣＭ材料の弁導管が正しく環状領域及び動脈に固定された後、さらにＥＣＭ材料の弁導管の必要なトリミング又は造形が完了した後、対象の心臓は必要に応じて閉じることができ、対象の心臓は再起動させることができる。
【００９２】
抗凝固剤及び／又は抗血栓剤及び／又は治療法が、ＥＣＭ材料の弁導管が正しく環状領域及び動脈に固定される前、固定の最中、固定の後、対象に適用され得ることが企図される。これらの薬剤及び／又は治療法が、対象における再生弁の弁葉において血栓形成を防止し得ることが企図される。
【００９３】
さらなる態様において、図４に示されているように、開示されたＥＣＭ材料の弁導管の内側層は弁葉促進部分と交連促進部分を含むことができ、開示されたＥＣＭ材料の弁導管の外側層は洞促進部分を含むことができ。これらの態様において、弁葉促進部分が、環部の近傍の交換半月弁の複数の弁葉（すなわち、三つの弁葉）を再生し得ることが企図される。さらに、ＥＣＭ材料の弁導管の外側層の洞促進部分が交換半月弁の洞部を再生するためにＥＣＭ材料の弁導管の内側層と融合し得ることが企図される。さらに、ＥＣＭ材料の弁導管の交連促進部分が交換半月弁の交連を再生成するためにＥＣＭ材料の弁導管の外側層と融合し得ることが企図される。図７−１１は、本明細書に記載の方法に従って例示的なＥＣＭ材料の弁導管の移植後の肺動脈弁の再生を示す。
【００９４】
本明細書に開示されているとおり、ＥＣＭ材料の弁導管の移植後、移植されたＥＣＭ材料の弁導管が、交換半月弁を形成するために、ＥＣＭ材料を再造形する対象の幹細胞を引き込み得ることが企図される。幹細胞は、ＥＣＭ材料の弁導管の内側層及び支える動脈壁を交換半月弁の弁葉及び合わせ目に再造形し、ＥＣＭ材料の弁導管の外側層を交換半月弁の洞部分に再造形することができる。この再造形のプロセスの間、移植されたＥＣＭ材料の弁導管が通常の弁機能を提供し得ることが企図される。さらに、移植されたＥＣＭ材料の弁導管が徐々に分解され、正常な自然の組織への（すなわち、同一もしくは実質的に同一の）区別できない宿主組織と置き換えられ得ることが企図される。
【００９５】
実験例
以下の実施例は、当業者に、本明細書において特許請求される化合物、組成物、物品、装置及び／又は方法がどのように作製され、評価されるかという完全な開示及び説明を提供するように述べられるものであり、本発明の単に実施例であることが意図され、発明者らが発明とみなす範囲を限定することを意図するものではない。数値（例えば、量、温度等）に関して正確さを確保するための努力がなされているが、多少の誤差や偏差は考慮されるべきである。特に断らない限り、部は重量部であり、温度は℃又は雰囲気温度であり、圧力は大気圧又はその近傍である。
【００９６】
例１
本明細書に開示されているとおり、ＥＣＭ材料の弁導管が構成された。ヒツジが麻酔された。ヒツジの左胸が開放された後、ヒツジの心臓が露出された。羊は、肺動脈弁及び肺動脈の部分が切除されている間、羊をサポートするために心肺バイパスの上に配置された。その切除の間、肺動脈弁（弁葉を含む）及び肺動脈弁が固定された環部が除去された。加えて、肺動脈弁複合体から遠位置の肺動脈が数センチメートル、除去された。ＥＣＭ材料の弁導管は所定の位置に縫合され、入口部分は心臓に縫合され、出口部分は残りの肺動脈に縫合された。
【００９７】
図７−１４は、導管が動物に入れられて三ヶ月後の結果を示す。図７は、ＥＣＭ材料の弁導管が、どのように通常の肺動脈の外観をもつようになったかを示す。
図８は、遠位の肺動脈から見た再造形された弁葉を示す。図９は、心臓及び弁葉の心室側からみたＥＣＭ材料の弁導管の入口部分を示す。図１０は、縦方向に開いた導管および三つの弁葉を示す。図１１は、開いたＥＣＭ材料の弁導管および肺動脈から見た三つの弁葉を示す。
【００９８】
図１２−１４は、移植前の例示的なＥＣＭ材料の弁導管を示す。図１２は、閉じた状態の作られたＥＣＭ材料の弁導管を示すが、図１３は開いた状態のＥＣＭ材料の弁導管を示す。図１４は、移植前に滅菌水で水和された例示のＥＣＭ材料の弁導管を示す。
【００９９】
例２
図１５及び図１６に示されているように、心膜の大きな矩形パッチが、折り畳み及び縫合の工程を経て三尖導管を構築するために使用された。パッチは、適切なサイズの拡張器の上に転がされた。パッチは、拡張器の上で転がされた後、縫合糸がＥＣＭ導管を形成するために使用された。図２３に示されているこのＥＣＭ材料の導管は、患者に実施される先天的再建手順で右心室から肺への連続性に確立するために使用された。
【０１００】
移植材料は簡単に格納されたパケットになった乾燥シートであった。シートは７ｃｍＸ１０ｃｍの寸法をもっていた。シートは１０分間生理食塩水で調製された。
【０１０１】
患者は重度の大動脈弁狭窄症の原因となる二尖大動脈弁をもつ１２歳の女性だった。約１８カ月前に、逆行性バルーン弁形成術が実施されていた。その後、患者は厳しい進行性の左心室拡張と大動脈弁閉鎖不全を発症した。左室拡張末期寸法は６．２ｃｍであり、患者は呼吸困難症候性だった。
【０１０２】
患者が手術のために麻酔をかけ、掛け布で覆われ、ＥＣＭ材料の導管が１０分間生理食塩水で水和された後、最終的な導管の寸法を２０ｍｍとなるように、トリミングされた。導管の寸法は、術前の患者の肺動脈弁の大きさの心エコー測定と、２の弁Ｚコアを作成するために大きさを見積もることにより決定された。２０ｍｍの導管が、６５ｍｍＸ４５ｍｍの寸法をもつ長方形の心膜のパッチをトリミングすることによって作成された。符号１５が付されているが、パッチの長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）は、式によって決定された。
Ｌ＝Ｄ＊π：及び
Ｗ＝（２＊Ｄ）＋Ｃ
Ｄは導管の所望の直径であり、Ｃはカフ（患者の肺動脈に付着される導管の一部に対応する）の長さである。
【０１０３】
導管の調整後、各接合のための連続的した単一フィラメント縫合糸を使う完全基部の交換技術を用いるロス手術が実行された。手術は、二大静脈挿管及び１５から２０分毎の間欠逆行血液心停止法を使用し、３２°Ｃで実施された。近位の大動脈基部再建の後及び遠位の大動脈縫合線が完了される前に、連続的な単一フィラメント縫合糸を用いて、導管移植が実施された。遠位の導管の接合は、近位の導管の整合前に完了した。管吻合術前に完了した。両方の接合は、大動脈交差金具が除去される前に、連続した５−０プロレン縫合糸を用いて行われた。分岐肺動脈は、張力のない近位の接合を可能にし、近位に追加のパッチ材料の使用を避けるために広く動員された。導管は、５ｍｍの遠位のカフの延長部で作成された。交差金具が解除された後に、患者の心臓は、最小限の変力支援力とともに活動的な収縮性を取り戻した。
【０１０４】
手術が完了し、患者はバイパスから容易に分離された。患者の心機能及び止血は良好であった。彼女は目覚め、手術室で抜管された。彼女の回復は順調で、集中治療室で1日を過ごした後病棟に移った。術後五日、彼女には退院前に、完全な心エコー検査が実施された。この結果は図１７−１９に示されている。樹具と六日、彼女は良好な状態で退院した。
【０１０５】
最初の追跡の心エコー検査が、退院後、一月で得られた。これらの心エコー検査は、導管の狭窄又は不全を全く示さず、自家移植不全が軽度であり、左心室が良好な保存状態をもつことを示した。患者の心室の寸法は正常に戻った。患者はなんら症状を示さず、アスピリンとＡＣＥ阻害薬を取っていた。心エコー検査は、患者がニューヨーク心臓協会（NYHA）心不全分類１にあったことを示した。
【０１０６】
その後の追跡心エコー検査が、退院後、五ヶ月で得られた。これらの追跡心エコー検査の時点で、患者は、体重が増え、制限を受けない完全な身体活動に戻っていた。聴診において、収縮期も拡張期も心雑音が認められなかった。図２０−２２に示されている追跡心エコー図は、患者がＮＹＨＡ分類1に残っていることを示した。心エコー図はまた、患者が完全に正常な右及び左心室機能並びに正常導管機能を有していることが実証された。軽微な導管不全が観察され、弁葉の移動というものは、術後五日に記録された心エコー図になかった。導管内内のピークエコー速度は２ｍ／秒であり、色フローは乱流を示さなかった。左心室拡張末期径が４．０ｃｍと測定された。
【０１０７】
例３
図２４に示されたような例示的なＥＣＭ材料の弁導管の種々の測定値が以下の表1に示されている。
【表１】
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【０１０８】
例４
体外の機械的評価が、本明細書に記載されるように典型的なＥＣＭ材料の弁導管の縫い目上において、実行された。縫い目の最大引張破断力は、５２．１＋１４．１Ｎ（１１．７＋３．１６lbf）で、最小値及び最大値がそれぞれ３４．８Ｎ（７．８２lbf）及び７２．３Ｎ（１６．２４lbf）であることが分かった。本明細書に記載されているような典型的な4プライＥＣＭ材料の弁導管に対する引張力、ボールバースト及び縫合引き抜き力は、それぞれ１９．３５＋５．５１Ｎ（４．３５＋１．２４lbf）、１２６．６＋３０．２Ｎ（６６９９＋１５９８ｍｍＨｇ）、及び１１．１２＋２．０８Ｎ（２．５＋０．４７lbf）と決定された。これらの結果は、本明細書に記載のＥＣＭ材料の弁導管の構造的完全性が、右心の低圧環境下で肺動脈弁の力の要件を満たすのに十分以上であることを示している。
【０１０９】
例５
典型的なＥＣＭ材料の弁導管について動物実験モデルで評価された。ＥＣＭ材料の弁導管は、本来の肺動脈弁を除去した後、肺動脈弁の位置に移植された。結果は、組織の再造形の前の手術の直後、また十二ヶ月までにおける、ＥＣＭ材料の弁導管に対し生理学的に正常な血行動態の結果を示している。十二月経過時に、ＥＣＭの大半は、動物の本来の組織に再造形された。十二ヶ月までの心エコー検査は、再生された弁に対し良い血行動態、弁葉の完全な接合、弁葉の逸脱のないことを示している（図２５）。
【０１１０】
肉眼検視及び組織学上の結果は、続く各時点に宿主組織による交換の増加が伴う弁の適切な再造形を示した。本来の弁と著しく類似して見える交換弁が交換された。図２６は、非GLP研究の一環として、ＥＣＭ材料の肺動脈の弁導管で移植されたヒツジからの三ヶ月、五ヶ月、六ヶ月後の外移植を示す。これらの画像は、前記ヒツジにおいて経時に生じている進行性の再造形を示す。図示のように、三ヶ月の時点（図２６（ａ）を参照）において、再造形は、既に弁輪で生じ、明らかに正常な弁組織を再生するために弁葉に延びている。十二ヶ月の時点（図２６（ｄ））で、弁葉は再造形され、本来の弁組織のように見える。
【０１１１】
三ヶ月、五ヶ月、六ヶ月および十二ヶ月後の外植されたＥＣＭ肺の弁導管のＨ＆Ｅ組織が分析された。細胞が前記弁を通って分配され、3ヶ月で小葉の先端に分配され、六ヶ月で再造形された組織は、海綿状で、線維をもつ本来の弁組織と似た三層構造を形成した。
【０１１２】
例６
開示された滅菌及び脱細胞化方法の実施例の適用において、選択された組織が採取され滅菌生理食塩水ですすがれた。その後選択された組織は、２４時間凍結された。凍結した組織は５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて氷上で冷低張トリス緩衝液中で解凍された。本明細書に記載されたように、細胞外マトリックス材料が次いで、各々の選択された組織から単離された。
【０１１３】
単離された細胞外マトリックス材料は、０．５〜１％のトリトンＸ−１００／０．５〜１％のデオキシコール酸内で、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（ロンザ・ウォーカーズビル社）の５ｍＭのＥＤＴＡを用いて、２４〜４８時間インキュベートされた。胃粘膜下層（ＳＳ）、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）、および膀胱粘膜下層（ＵＢＳ）等の平坦な細胞外マトリックス材料は、延伸された形態でインキュベートされた。尿管、動脈、静脈及び管状のＳＩＳ等の管状の細胞外マトリックス材料は、浸漬を通じ、また蠕動ポンプを用いて溶液で灌流された。
【０１１４】
インキュベーション後、各々の細胞外マトリックス材料は、ＤＰＢＳで三回すすがれた。ＤＰＢＳを使用した各々のすすぎは、３０分間持続した。その後いくつかの細胞外マトリックス材料が、２〜１２時間に渡って３７℃で、１０〜５０μｇ／ｍＬのＲＮＡｓｅ／０．２〜０．５μｇ／ｍＬのＤＮＡｓｅを含有する等張トリス緩衝液中で５ｍＭのＥＤＴＡを用いてインキュベートされた。該インキュベーションステップの後、細胞外マトリックス材料は、再びＤＰＢＳで三回すすがれた。ＤＰＢＳを用いた各々のすすぎは３０分間持続した。細胞外マトリックス材料は４℃で保存された。
【０１１５】
保存の４８時間以内に細胞外マトリックス材料は、本明細書で開示のように、超臨界二酸化炭素で２０ないし６０分間、３１．１℃以上の温度及び１，０７１ｐｓｉ以上の圧力で処理された。この滅菌の工程の後、細胞外マトリックス材料は、２．７ＭＰａ／１０秒（３９１．６ｐｓｉ／１０秒）の速度で１分１９秒間、急速に減圧された。この間に、細胞外マトリックス材料に適用された圧力は９．９ＭＰａから０．６９ＭＰａへ急速に減少した。
【０１１６】
細胞外マトリックス材料は、次いで、最終の滅菌を達成するために、３０分から６時間、本明細書に開示のように、超臨界二酸化炭素及び過酢酸（ＰＡＡ）内で処理された。この処理ステップでは、細胞外マトリックス材料に印加された圧力は９．９ＭＰａに増加した。得られた滅菌無細胞の細胞外マトリックス材料は、その後、流体の漏れを防止するためにプラスチック製のパウチ内にシールされたＴｙｖｅｋ（商標）（Ｅ．Ｉ． ｄｕ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ）のパウチに詰められた。
【０１１７】
表１は、ブタ尿管、ウシ心嚢及びブタ中皮の滅菌及び脱細胞化をまとめたものである。
【表２】
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【０１１８】
実施例７
ＥＣＭ材料サンプルのＤＮＡ含有量が、様々な滅菌及び脱細胞化技術を用いたそれぞれのＥＣＭ材料サンプルの脱細胞化の指標として測定された。測定されたＤＮＡ含有量は、ピコグリーン（ｐｉｃｏ ｇｒｅｅｎ）アッセイで評価され、ＤＮＡは蛍光ラベルでラベル付けされ、分光光度計で検出された。測定されたＤＮＡ含有量は、サンプルの乾燥重量で正規化された。ＤＮＡ含有量は、以下の、（１）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳ、（２）エチレンオキシド（ＥｔＯ）滅菌ＳＩＳ、（３）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示されたように、ＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２による６０分間の処理を通じて滅菌したもの、（４）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示されたようにＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２による２０分間の処理を通じて滅菌したもの、及び（５）生の、未処理のＳＩＳの処理群について測定、評価された。
【０１１９】
図２７は、乾燥重量で正規化されたそれぞれのサンプルの総ＤＮＡ含有量を示す。図２８は、生の、未処理のＳＩＳと比較した、各それぞれのサンプルから除去されたＤＮＡの割合を示す。これらの結果は、非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示のように、ＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２を用いた６０分間の処理を使用して滅菌することにより、生のＳＩＳに見られるＤＮＡの９６％を超えるものが除去されたことを示し、比較して、ＳＩＳがＥｔＯによって滅菌された場合は９４％のみ、ＳＩＳがいずれの方法でも滅菌されなかった場合は９３％のみであることを示した。
【０１２０】
実施例８
尿管が、強くない洗浄剤（ＤＰＢＳ内の５ｍＭのＥＤＴＡ内の０．５％トリトンＸ−１００／０．５％のデオキシコール酸ナトリウム）を用いて２４時間処理され、次いで、本明細書で開示されたように、ＤＰＢＳ内で三回すすがれた。この前処置の後に、尿管は、本明細書に開示されたように、急速減圧とＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２での処理とを利用して脱細胞化され滅菌された。ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色が、以下の処理の段階、すなわち、（Ａ）天然尿管、（Ｂ）前処理された尿管、（Ｃ）前処理された尿管に、本明細書に開示のように、急速減圧とＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２での処理を用いたものの１つのサンプル尿管のために調製された。これらの染色は、急速減圧によりＤＮＡ含有量が著しく低減されたことを示した。
【０１２１】
例９
ＥＣＭ材料サンプルの増殖因子の含有量が測定された。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）がＥＣＭ材料サンプルに対して実施され、それぞれのサンプルの、ｂＦＧＦ及び活性型のＴＧＦベータの含有量が定量化された。以下の処理群、（１）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳ、（２）エチレンオキシド（ＥｔＯ）滅菌ＳＩＳ、（３）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示のように、ＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２を用いた６０分間の処理を行った滅菌したもの、（４）凍結乾燥した非滅菌ＳＩＳを、本明細書に開示のように、ＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２を用いた２０分間の処理を行って滅菌したもの、及び（５）生の、未処理のＳＩＳが評価された。ｂＦＧＦ含有量及びＴＧＦベータ含有量の測定は、各それぞれのサンプルの乾燥重量で正規化された。それらの結果が図２９及び図３０に示されている。それらの結果は、ＥｔＯにさらしたことにより、両方の増殖因子の濃度が低下したことを示した。しかしながら、ＰＡＡ及び超臨界ＣＯ２を用いた滅菌では、増殖因子の濃度に影響はなかった。
【０１２２】
例１０
本明細書に開示された方法により、超臨界ＣＯ２が、一次滅菌剤及びＳＩＳシート内へｂＦＧＦを添加するための担体として使用された。まず、それぞれのＳＩＳシートは、ｂＦＧＦの様々な量に従ってＴｙｖｅｋ（商標）パウチに入れられた。パウチは９．６ＭＰａで６０分間超臨界ＣＯ２に曝露された。パウチは、７．２０ＭＰａ／分の速度で急速に減圧された。サンプルは、２０分間、超臨界ＣＯ２において１６ｍＬのＰＡＡ中で直接処理された。以下の処理群、（１）ｂＦＧＦ無添加、（２）５μＬのｂＦＧＦ添加、（３）１５μＬのｂＦＧＦ添加が評価された。各μＬのｂＦＧＦは０．１μｇのｂＦＧＦを含有した。従って、各ＳＩＳシートは約０．５ｇの重量であったため、５μＬ及び１５μＬの群について、ｂＦＧＦの最大濃度はそれぞれ、約４１７０ｐｇ／ｍｇの乾燥重量及び約１２，５００ｐｇ／ｍｇの乾燥重量だった。それぞれのサンプルの乾燥重量に関して測定されたそれらの群のｂＦＧＦの含有量が、図３１に示されている。これらの結果は、ｂＦＧＦの測定濃度が最大の濃度に達しなかったこと、及び１５μＬのｂＦＧＦを添加したサンプルは、５μＬのｂＦＧＦを添加したサンプル中のｂＦＧＦの測定濃度の３倍以上のｂＦＧＦの測定濃度を有しないことを示すものであった。
【０１２３】
例１１
二層のＳＩＳサンプルの引張強度が測定された。以下の処理群、（１）ＥｔＯ処理、（２）２０分間のＰＡＡ／超臨界ＣＯ２処理、（３）６０分間のＰＡＡ／超臨界ＣＯ２処理、及び（４）１２０分間のＰＡＡ／超臨界ＣＯ２処理、が評価された。張強度試験の結果が図６に示されている。これらの結果は、本明細書に開示されたように、ＰＡＡ／超臨界ＣＯ２で２０分間又は１２０分間処理されたＳＩＳのサンプルは、ＥｔＯで処理されたＳＩＳのサンプルよりも著しく強度が高いことを示すものであった。
【０１２４】
実施例１２
急速減圧は、表３（下記）に示されたＥＣＭ材料を記載の濃度及び記載の時間間隔で、強くない洗浄剤に浸漬又は灌流した後に使用された。組織は採取され、生理食塩水ですすがれた。組織は少なくとも２４時間凍結された。組織は５ｍＭのＥＤＴＡを用いて氷上の冷低張トリス緩衝液中で解凍された。重要なＥＣＭが単離された。平坦な組織（例えば、胃粘膜下層、小腸粘膜下層及び膀胱粘膜下層）について、組織は、組織の引張装置において伸展され、伸展された形態で、溶液中でインキュベートされた。管状の組織（例えば、尿管、動脈、静脈及び管状のＳＩＳ）について、組織は蠕動ポンプを使用して溶液により灌流され、インキュベーション中に浸漬された。組織は、ＤＰＢＳ内の５ｍＭのＥＤＴＡを用いて０．５％のトリトンＸ−１００／０．５％のデオキシコール酸内で、２〜２４時間インキュベートされた。組織はＤＰＢＳ内で、１回につき１５〜３０分間、３回すすがれた。組織は４℃で保存された。組織の保存の４８時間以内に、組織は超臨界ＣＯ２  内で２０〜１２０分間処理され、続いて急速に減圧（ＲＤＰ）された（圧力の減少は１分１９秒で９．９ＭＰａから０．６９ＭＰａ、２．７ＭＰａ／１０秒の減圧に対応）。
【表３】
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【０１２５】
結果は、超臨界ＣＯ２曝露後の急速減圧（ＳＣＣＯ２＋ＲＤＰ）が、ＥＣＭの増殖因子を維持しながら、細胞の残余物とＤＮＡの除去をしっかりと補助したことを示すものであった。
【０１２６】
例１３
様々なＥＣＭ組成物の増殖因子の含有量は、代表的な増殖因子として、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を用いて分析された。ｂＦＧＦは、それが自然のＥＣＭ組織によく見られる増殖因子であるため選択された。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）が、以下のサンプル、（１）未処理（生）のＳＩＳ、（２）界面活性剤浸漬（ＴＸ−デオキシ）のみの後のＳＩＳ、（３）ＴＸ−デオキシ及びＲＤＰ（ＳＣＣＯ２を含む）の後のＳＩＳ、（４）ＴＸ−デオキシ、ＲＤＰ及びＰＡＡ（滅菌のためにＰＡＡとともにＳＣＣＯ２）の後のＳＩＳ、（５）ＴＸ−デオキシ及びＰＡＡの後のＳＩＳ、（６）ＥｔＯで滅菌されたＳＩＳ（クックバイオテック社提供）、及び（７）非滅菌ＳＩＳ（クックバイオテック社提供）、のｂＦＧＦ含有量を測定するために使用された。
【０１２７】
これらの検討において、ＳＩＳが、ＲＤＰを用いて又は用いないで処理されたＥＣＭ組成物とクックバイオテック社提供のＳＩＳとを比較するために使用された。処理されたＳＩＳのいくつかはまた、脱細胞化の後、記載されたＳＣＣＯ２＋ＰＡＡ方法により滅菌された。それぞれのＥＣＭ組成物の測定された増殖因子の含有量が図２３に示されている。
【０１２８】
それらの結果は、ｂＦＧＦ含有量の維持において、急速減圧処理が他の脱細胞化処理よりも有効であり、残渣ＤＮＡ及び細胞片を除去するための追加のＲＤＰ処理は、ｂＦＧＦの小さい損失しか生じさせないことを示すものであった。比較して、ＰＡＡ滅菌プロセスは、ＲＤＰが行われないときでさえ、ほぼすべての残余のｂＦＧＦを除去するように思われた。さらに、急速減圧プロセスは、クックの脱細胞化方法に比べ、天然ＳＩＳ内のｂＦＧＦ含有量をより多く保存した。これらの結果から、ｂＦＧＦ含有量が減少した場合、増殖因子はすべて同じようにＥＣＭ組成物に結合しているので、すべての他の増殖因子の含有量も同様に減少したものと見なされる。
【０１２９】
本出願を通して様々な刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本発明が属する最先端の技術をより十分に説明するために、参照によりその全体が本出願に組み込まれる。
【０１３０】
当業者には、本発明の範囲又は思想から逸脱することなく様々な修正及び変形が本発明においてなされ得ることは明らかであろう。本発明の他の実施形態が、本明細書に開示された本発明の詳細な説明及び実施例を考慮することにより、当業者には明らかであろう。発明の詳細な説明及び実施例は単に例示的なものと見なされることが意図され、本発明の真の範囲および思想は以下の特許請求の範囲によって示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２４】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２５】
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【図２６ａ】
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【図２６ｂ】
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【図２６ｃ】
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【図２６ｄ】
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【図３９】
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【国際調査報告】
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