(57)【要約】ホスト細胞を懸濁細胞培養に適合させるシステムおよび方法、ならびに、それによって生産される懸濁細胞株が開示される。該方法は、細胞塊が目に見えるようになるまで、実質的に希釈していない培養細胞を、表面領域に連続して再播種して、次に、細胞が凝集化した際に、細胞を懸濁培養システムへと移動させることを含む。【選択図】図３
2014504870.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスト細胞を懸濁細胞培養に適合させる方法であって、該方法が：
一種以上のホスト細胞を第一の細胞培養ディッシュにおいて増殖させ（前記第一の培養ディッシュは、表面領域を有する）；
前記ホスト細胞の増殖および維持を可能にする、増殖支持培地を使用し；
（ａ）前記増殖支持培地を取り除くこと；
（ｂ）前記細胞を前記培養ディッシュから解離すること；
（ｃ）前記細胞をインキュベートすること；
（ｄ）前記増殖支持培地中に前記細胞を再懸濁すること；
（ｅ）前記再懸濁した細胞を播種すること；
（ｆ）前記細胞が前記培養ディッシュに再接着するのに要する時間、前記細胞を増殖させること；
（ｇ）工程（ａ）〜（ｆ）を少なくとも一回繰り返すこと；
（ｈ）前記細胞を懸濁培養フラスコへ移すこと；
（ｉ）前記細胞を撹拌すること
を含む方法。
【請求項２】
前記ホスト細胞が、ＢＨＫ‐ＭまたはＨＥＫ‐２９３Ｔの少なくとも一種である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項２にしたがって生産する細胞株。
【請求項４】
前記ホスト細胞が、ＨＥＫ‐２９３細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
請求項４にしたがって生産される細胞株。
【請求項６】
懸濁細胞培養において、ポリペプチドおよびウイルスの少なくとも１つを生産する方法であって、該システムが、
請求項２にしたがって生産された、ＥＴ‐８０１を発現する細胞株を含む方法。
【請求項７】
請求項４にしたがって生産される、ＥＴ‐３を発現する細胞株を含む生成物を高収率で生産するためのシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本特許文書は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づいて、２０１１年１月５日に出願された米国特許仮出願番号第６１／４２９，９３１の出願日の利益を主張し、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
組み換えタンパク質ベースの生物医薬品の製造は、複雑で、労働力および資本集約的な試みである。現在、大部分のヒトタンパク質の製造に、哺乳類細胞が使用されている。哺乳類細胞は、典型的には、非修飾型（unmodified）原核生物および非修飾型（unmodified）単細胞真核生物が行うことができない広範な翻訳後修飾を含む。チャイニーズハムスター卵巣細胞やベビーハムスター腎細胞等の哺乳類細胞は、大部分のヒトタンパク質を忠実に生合成できるが、細菌細胞または酵母細胞によって得られるよりも、劇的に効率が低い。
【０００３】
現在市販される組み換えタンパク質の中でも、ｆＶＩＩＩは、最も製造効率が低く、単位質量当たりで、飛び抜けて最も高価である（図１）。組み換えｆＶＩＩＩは、先天的なＸ連鎖の出血性障害、つまり血友病Ａの患者にとって、主要な治療選択肢である。治療は、年間およそ＄１００，０００〜３００，０００の費用で、一週間に２〜３回の組み換えｆＶＩＩＩの静脈内点滴からなる（Bohn RL, Avorn J, Glynn RJ, Choodnovskiy I, Haschemeyer R, Aledort LM. Prophylactic use of factor VIII: an economic evaluation. Thromb Haemost. 1998;79(5):932-7、その全文が本明細書に組み込まれる）。結果として、治療へのアクセスは、世界中で血友病Ａ患者の３分の１未満に限られている。歴史的に、ｆＶＩＩＩの供給は不十分で、研究、開発および製造のコストが高いため、価格は依然として非常に高い。血友病Ａや、タンパク質補充療法によって治療できる他の単一遺伝子疾患のケアを改善するための１つの戦略は、より効率的な組み換えタンパク質の製造方法を開発するというものである。
【０００４】
最先端の組換えｈ‐ｆＶＩＩＩ生成物は、典型的には、大規模な発酵バイオリアクター内で、哺乳類細胞（例えば、ＢＨＫ‐２１またはチャイニーズハムスター卵巣細胞）によって生産される。（１）ＤＨＦＲ／メトトレキサート選択を使ったｈ‐ｆＶＩＩＩ導入遺伝子の増幅、（２）培養培地へのｆＶＩＩＩ安定剤の添加（例えば、ウシ／ヒトアルブミンまたはｖＷｆの共発現）、および（３）連続灌流発酵による細胞増殖／密度の最大化を含む、いくつかの技術が、組換えｈ‐ｆＶＩＩＩの生産を最大化するために使用され得る。ＦＶＩＩＩは、一連の濾過、免疫アフィニティー、サイズ排除、およびイオン交換クロマトグラフィーの工程を使って、馴化培養培地から精製し得る。さらなる安全性のために、ウイルス不活性化の手順が、精製プロトコールに組み込まれることがよくある。一度精製すると、大量のｆＶＩＩＩ材料は、安定剤とともに製剤してよく、パッケージングの前に、凍結乾燥してもよい。この標準的な製造プロセスは、Boedeker BG. Production processes of licensed recombinant factor VIII preparations. Semin Thromb Hemost. 2001;27(4):385-94に概説されており、その全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００５】
第一世代組み換えｆＶＩＩＩ生成物は、理論上、ウイルス混入の温床となり得るヒト血清アルブミンを使って安定化されていた。ウイルス混入のリスクを低減するべく、「動物生成物を含まない」とみなされる第二および第三世代ｆＶＩＩＩ生成物が現れ、代わりにスクロースおよび他の添加剤で安定化された。血漿由来生成品および第一世代生成品の両方に対して、より新しい世代の組換え生成品の安全性プロファイルが改善したという認識により、以前に治療した多くの患者および以前に治療していない大多数の患者とが、第二および第三世代ｆＶＩＩＩ生成物に移行した。この需要は、複合的なｆＶＩＩＩ生成物の不足を生じ、一時的にｆＶＩＩＩの供給を割り当てる戦略の実施につながった（Garber K. rFactor VIII deficit questioned. NatBiotechnol. 2000;18(11):1133、参照することによって本明細書に組み込まれる）。
【０００６】
いくつかの刊行物は、組換えヒトｆＶＩＩＩ生産の標準レベルは、＜１ｕｎｉｔ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙであると述べている（Kaufman RJ, Pipe SW, Tagliavacca L, Swaroop M, Moussalli M. Biosynthesis, assembly and secretion of coagulation factor VIII. Blood CoagulFibrinolysis. 1997;8 Suppl 2:S3-14.:S3-14、参照することによって本明細書に組み込まれる）。典型的には、最終的な組換えヒトｆＶＩＩＩ生成物は、タンパク質１ミリグラム当り４，０００〜１０，０００ｕｎｉｔで、特異的な活性を有し、７０ｋｇの成人の一回の治療の費用は、＄２，５００〜５，０００である。現在、その分配が潜在的世界市場の３分の１未満に限られるという事実にも拘わらず、ｆＶＩＩＩ生成物は、年間６０〜８０億ドルの市場となっている。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、生物医薬品製造における現在の情勢をグラフに表したものである。
【図２】図２は、ＢＨＫ‐Ｍ細胞の、ＢＨＫ‐Ｍｓ細胞への変換を表す。ＢＨＫ‐Ｍ細胞は、接着性ＢＨＫ‐Ｍ細胞の連続的再播種を伴う、特許出願中の方法を使って、懸濁に適合される。
【図３】図３は、無血清培地における、ＢＨＫ‐Ｍｓ細胞からの組み換えｆＶＩＩＩの発現を表す。
【図４】図４は、接着性ＨＥＫ‐２９３Ｔ細胞の懸濁への変換を表す。
【図５】図５は、懸濁に適合した細胞からの高レベルのｆＶＩＩＩ発現の証拠を示す図である。
【図６】図６は、最適化した栄養補給計画の結果を表すプロットである。
【図７】図７は、本明細書に開示される方法を使って懸濁に適合させたさらなるクローンの特徴を示すプロットである。
【図８】図８は、本明細書に開示される方法を使って懸濁に適合させたさらなるクローンの密度および生存率のグラフである。
【図９】図９は、本明細書に開示される方法を使って懸濁に適合させたクローンにおける、ｆＶＩＩＩ活性対密度のグラフである。
【図１０】図１０は、本明細書に開示される方法を使って懸濁に適合させた、ＧＦＰをトランスフェクトしたＧＦＰウイルス生産細胞のイメージを表す。
【図１１】図１１は、ＢＨＫ‐Ｍ（接着）およびＢＨＫ‐Ｍｓ（懸濁）培養プラットフォームからの組み換えＦＶＩＩＩ生産を比較するものである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
詳細な説明
出願人は、以前は接着性生産培養システム（例えば、ローラーボトルが挙げられるが、これに限定されない）に限られていた、哺乳類細胞株を懸濁細胞培養に適合させる新規な方法を開示する。また、出願人は、組み換えタンパク質の懸濁培養における（公知のシステムおよび方法に比して）増大した生産性を示す、ＢＨＫ‐ＭＳ‐３１０、ＢＨＫ‐ＭＳ‐Ｐ１４およびＳＣ‐２９３Ｔと呼ばれる新規の細胞株を開示する。さらに、出願人は、懸濁細胞ウイルス生産のための新規な方法および細胞株を開示する。開示される方法、システム、および細胞株はすべて、無血清の、血液タンパク質を含まない懸濁培養環境に適合可能であり、かつ、適合している。
【０００９】
我々の知見の新規性および重要性は、過小評価できない。入手不可能であるか、または、深刻で一見してどうにもならない製造上の困難さによって、供給が恐ろしく限られている、ヒト（および動物）の健康および福祉には不可欠な生物学的治療法が数多く存在する。いくつかの場合において、これらのタンパク質を生産するための最適な細胞株は、接着細胞生産に限定され得る。接着細胞生産は、他の方法（例えば、懸濁細胞培養が挙げられるが、これに限定されない）よりも効率が低く、拡張性が低く、さもなければ、大規模な工業的生物学的製造（biomanufacturing）には望ましくないかもしれない。したがって、従来接着性の細胞株（例えば、公知の方法によっては、以前は適合しにくかった接着細胞株が挙げられるが、これに限定されない）を懸濁細胞培養に適合できることは、顕著な成果である。さらに、開示される方法およびシステムは、接着細胞を懸濁細胞培養に適合させるために、これまで成功して使用されている方法に対しても、新規の代替方法である。
【００１０】
組換えヒトｆＶＩＩＩは、製造が困難なことで有名な、生物学的治療薬の一例である。
【００１１】
現在、市販されている組換えヒトｆＶＩＩＩ生成物は、他の組換え生物学的治療薬（モノクローナル抗体等、ただし、これに限定されない）よりも１００〜１０００倍低いレベルで商業的に生産されている。低収率なｆＶＩＩＩ発現は、製品価格および供給安定性に強い影響を有する。実際に、組み換えｆＶＩＩＩは、グラムあたり＄１０，０００，０００という薬剤価格で、世界での年間総生産量が０．５キログラム未満という、あらゆる主要な生物学的医薬品の中で、最高の小売価格および最低の年間生産量となっている。
【００１２】
低いｆＶＩＩＩ発現効率の１つの結果として、世界中の血友病Ａ患者の３分の１未満の患者が、ｆＶＩＩＩを入手できるようになっている。治療が受けられない人々にとって、血友病Ａは、平均的に十代のうちに死亡するという、致命的な疾患を意味する。
【００１３】
ｆＶＩＩＩ等の生物学的治療薬が呈する製造上の困難さに対処するべく、製造システムの要素（例えば、コンストラクト、発現ベクター、細胞株、細胞培養条件など、ただし、これらに限定されない）を最適化し得る。説明のために、出願人は、１細胞につき、ヒトｆＶＩＩＩよりも効率的に生合成される新規の組み換えｆＶＩＩＩのコンストラクトの特徴を明らかにし、特許化した（米国特許第７，６３５，７６３号（その全文が参照することによって本明細書に組み込まれる）参照。また、Spencer HT, Denning G, Gautney RE, Dropulic B, Roy AJ, Baranyi L, et al. Lentiviral Vector Platform for Production of Bioengineered Recombinant Coagulation Factor VIII. Mol Ther. 2010（その全文が本明細書に組み込まれる）も参照のこと）。本明細書に開示する概念実証実験において、ＥＴ‐８０１として使用した組み換えｆＶＩＩＩ分子に言及する。ＥＴ‐８０１は、米国特許第７，６３５，７６３号の配列番号１９と少なくとも約９３％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００１４】
細胞株に着目すると、組み換えｆＶＩＩＩ（ＥＴ‐８０１を含む、ただしこれに限定されない）の生産について、ＢＨＫ‐Ｍ細胞株が、その他の一般的に使用される哺乳類細胞株、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＤＧ４４、またはＢＨＫ‐２１細胞株を、生産性で上回る（out produce）ことを見出した。しかしながら、ＢＨＫ‐Ｍは、接着条件下での増殖にだけ許容的な親細胞株（ＡＴＣＣ ＰＴＡ-４５０６）に由来する。本明細書において開示するように、ＢＨＫ‐Ｍ細胞を懸濁細胞培養に適合させることは、その生産効率と、拡張性と、大規模な生物学的製造のプロセスにおける有用性とが高め得る。
【００１５】
出願人は、接着細胞株を、生物学的治療薬（単純なまたは複雑な生物学的治療薬であり得る）のための懸濁細胞ベースの生物学的製造プラットフォームに適合させる方法を、本明細書において開示する。出願人は、複雑な生物学的治療薬を（現在知られているシステムに比べて）高収率で生産するために最適化した方法およびシステム；懸濁細胞培養における組み換えタンパク質の（現在知られているシステムと比べ）向上した生産；および、懸濁細胞培養におけるウイルスの生産も開示する。さらに、出願人は、生成物およびウイルスを高収率で生産するための細胞株を開示する。
【００１６】
本明細書に開示される新規のシステムおよび方法は、開示されるデータによって実証されるように、公知のシステムに対して、並外れたパフォーマンスを示した。例えば、出願人は、このシステム、方法および細胞株が、公知の方法より少なくとも５％、最大１０００％多いことがあり得る、驚くべき、かつ並外れた程度で、現在公知である製造方法を、生産性で上回ることを実証する。
【００１７】
実施例は、新規のシステムおよび方法が、ｆＶＩＩＩの製造能力と、拡張性をさらに増大すること、および、増大し得ることを実証するが、該新規な方法、システムおよび細胞株は、他のタンパク質の生産量、製造能力および拡張性を増大するためにも適用し得ることが（ＧＦＰで実証した内容から）明らかである。出願人は、代替的な組換え生物医薬品（例えば、凝固因子ＩＸおよびＶＩＩａが挙げられるが、これらに限定されない）を製造するために、出願人および他者が、このプラットフォームを使用するであろうこと、および、使用可能であることを予期する。
【００１８】
さらに、出願人は、ベビーハムスター腎臓由来の（ＢＨＫ‐Ｍ）細胞株（本明細書においては、ＢＨＫ‐Ｍｓと呼ぶ）およびＨＥＫ‐２９３Ｔ細胞株で、当該方法の適用に成功したことを本明細書において実証するが、この新規な方法、システムはまた、その他の細胞株（以前に懸濁培養に適していたか否かに拘わらず）の生産量、製造能力および拡張性を増大するためにも適用し得る。開示される方法およびシステムは、最大２か月および／または無期限に、懸濁培養システム（例えば、血清および血液成分のない生産培地を利用する培養システムが挙げられるがこれらに限定するものではない）において維持し得る懸濁細胞株をもたらす。
【００１９】
１つの変更形態において、ホスト細胞を懸濁培養に適合させる方法およびシステムは：
ａ．１種以上の接着ホスト細胞を、（例えば、増殖支持培地中で）第一の培養ディッシュ（例えば、表面を有する培養ディッシュ）上で培養すること；
ｂ．コンフルエンシーのレベルまで、例えば、２０％〜１００％、３０％〜１００％、４０％〜１００％、５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％、８０％〜１００％、および／または１００％コンフルエンシーまで（ただしこれらに限定されない）細胞を培養すること；
ｃ．培養ディッシュから細胞を解離すること；
ｄ．増殖支持培地中に細胞を再懸濁すること；
ｅ．培養ディッシュ上に再播種し、増殖支持培地中で細胞を培養すること；
ｆ．細胞が塊を形成するまで、工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返すこと；
ｇ．例えば、スピナーまたは振とうフラスコなど（これらに限定されない）の、懸濁培養へ細胞を移すこと；
ｈ．細胞を撹拌（例えば、振とうすることや攪拌することが挙げられるが、これらに限定されない）すること
を含む方法によって実行し得る。
【００２０】
他の変更形態においては、ホスト細胞を懸濁細胞培養に適合させる方法およびシステムは、以下の工程にしたがって実行し得る：
ａ．１種以上のホスト細胞を、増殖を支持する表面を有する第一の培養ディッシュ上で増殖させる；
ｂ．コンフルエンシーのレベルに達するまで、培養ディッシュ上でホスト細胞を増殖させる（例えば、該ホスト細胞は、約６０％〜約１００％のコンフルエンシーに達するまで培養ディッシュ上で増殖し得る）；
ｃ．ホスト細胞がコンフルエンシーのレベルに到達した際に、増殖支持培地を細胞から取り除く；
ｄ．任意で、例えば、緩衝液（例えば、等張緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水または他の何らかの緩衝液）で細胞を洗浄する；
ｅ．細胞を培養ディッシュから解離する（例えば、有効量の細胞解離溶液を細胞に添加するか（例えば、トリプシンまたはＥＤＴＡ）、機械的に解離するか（例えば、セルスクレーパー、ピペットなど）、または、他の任意の機械的、化学的、酵素的、もしくはその他の方法による解離が挙げられるが、これらに限定されない）；
ｆ．増殖を支持する条件下（例えば、約３７℃および５％ＣＯ２が挙げられるが、これに限定されない）で、細胞が培養ディッシュから解離するまで細胞をインキュベートする；
ｇ．有効量の増殖支持培地中に細胞を再懸濁する；
ｈ．再懸濁した細胞を、新しい培養ディッシュ（例えば、第一の培養ディッシュと同じ表面面積を有する培養ディッシュ、あるいは、またはそれに加えて、第一の培養ディッシュより大きいか、または小さい表面面積を有する培養ディッシュが挙げられるが、これらに限定されない）に播種する；
ｉ．増殖を支持する条件下（例えば、約３７℃および５％ＣＯ２が挙げられるが、これに限定されない）で、約１〜約２４時間、または約１〜約４８時間、細胞を増殖させる；
ｊ．工程（ｃ）〜（ｉ）を、少なくとも約１回、または、細胞が目に見える塊を形成するまで（例えば、目に見える塊の例については、図２（「１０日目」と印をつけたスライド）、ならびに、図４（例えば、図４（ｅ）および４（ｆ））を参照）、繰り返す；
ｋ．細胞を懸濁培養（例えば、スピナーまたは振とうフラスコが挙げられるが、これらに限定されない）へ移す；
ｌ．細胞を撹拌（例えば、振とうすることや攪拌することが挙げられるが、これらに限定されない）する。
【００２１】
ホスト細胞は、いかなるタイプの哺乳類細胞であってよく、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ‐Ｍ、ＢＨＫ‐２１、ＨＥＫ‐２９３Ｔ、マウス骨髄腫、および、当該技術分野において知られるその他多くの中でも、形質転換した初代細胞株、ハイブリドーマ、正常２倍体細胞、および、一次組織のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養に由来する細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。これまでに懸濁細胞培養に適合性であることが示された、いかなる哺乳類細胞も、開示される方法において使用し得る。より重要なことに、該方法は、以前は懸濁培養に適合しなかったため、接着増殖に限定されていた、ＢＨＫ‐Ｍ等（ただしこれには限定されない）の細胞株の適合に成功したことを示す。
【００２２】
哺乳類細胞は、対象となる組換えポリペプチドおよび／または組換えウイルスを発現する遺伝子組み換え哺乳類細胞、あるいは、対象となる組換えポリペプチドおよび／または組換えウイルスを発現する修飾された哺乳類細胞であってよい。例えば、哺乳類細胞株（例えば、ＢＨＫ‐Ｍｓ）の遺伝子組み換えは、他の方法の中でも、エレクトロポレーション、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー、およびレンチウイルスベクターを介した形質導入を使って実行してよい。遺伝子組換えは、懸濁へ適合させる前に、または懸濁へ適合させた後に、ホスト細胞に施してよい。懸濁に適合させる前に細胞を修飾することは、最適なクローンをより確実に選べるといういくつかの利点がある。
【００２３】
増殖支持培地とは、真核細胞の増殖および維持を可能にし、以下のカテゴリーのうち、１つ以上を提供しうる栄養溶液であり得る：（１）培地の浸透圧に寄与する塩（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等）；（２）グルコース等（ただしこれに限定されない）の糖質の形態であり得るエネルギー源；（３）いくつかの、またはすべての必須アミノ酸であり得るアミノ酸；（４）ビタミンおよび／またはその他の有機化合物；ならびに（５）非常に低い濃度（例えば、マイクロモラーの範囲）で必要となり得る、例えば、無機化合物などの、微量元素。増殖支持溶液は、任意で、以下のカテゴリーの任意のものから１種以上の成分が補充され得る：（１）動物の血清；（２）ホルモンおよびその他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリンおよび上皮成長因子等）；ならびに（３）植物、イーストおよび／または組織の加水分解物（そのタンパク質加水分解物を含む）。
【００２４】
それらに加えて、またはそれらの代わりに、増殖支持培地は、無血清培地、化学的に定義された培地、または動物由来成分を含まない培地であってよい。化学的に定義された培地は、すべての成分が公知の化学的構造を有する、培地である。化学的に定義された培地は、例えば、シグマ社およびＧｉｂｃｏ社等の商業的供給業者から入手可能である。本明細書に提供される条件下で、細胞の増殖および維持を支持する、いかなる増殖支持培地も使用し得る。当業者は、好適に、特定の培養に適切な培地、および、その他の培養の変更物を選択できるであろう（例えば、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる、Mather J. P. et. Al. (1999) “Culture media, animal cells, large scale production,” Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparateion, Vol. 2:777-785を参照。）。
【００２５】
細胞の解離は、多くの公知の方法（例えば、有効量の細胞解離溶液（例えば、トリプシンまたはＥＤＴＡ）を細胞に添加すること、機械的に解離すること（例えば、セルスクレーパー、ピペットなど）、または、その他のあらゆる機械的、化学的、酵素的方法、もしくはその他の方法が挙げられるが、これらに限定されない）で達成し得る。
【００２６】
細胞解離酵素は、カオトロピック剤もしくは酵素、または両方を含んでよい。洗浄工程は、任意で削除してよいし、または、プロトコールのいくつかのラウンドで実行し、その他では実行しなくてよい。洗浄工程が、形成している細胞塊を壊してしまうことがあり、これを中止するか、または恐らく省略してよいことを考慮して、洗浄工程の妥当性は、ケースバイケースで容易に決定する。
【００２７】
細胞がそれぞれの解離工程間で増殖する時間は、開始時の接着細胞株の性質によって異なり得る。重要な要因は、細胞が目に見える塊を形成するまで（例えば、目に見える塊の例については、図２（「１０日目」と印をつけたスライド）、ならびに、図４（例えば、図４（ｅ）および４（ｆ））を参照）、細胞を解離させ、再懸濁することである。
【００２８】
以下の実施例は、１００〜１０００ｍｌのスピナーフラスコ規模でＢＨＫ‐Ｍｓ細胞およびＨＥＫ‐２９３Ｔ細胞から得られた、接着細胞株の懸濁への適合、また、例示的なシステムにおいて、増殖および生産の特性の向上とを達成するためのシステムおよび方法の使用を支持するデータを説明し、提供するものである。実施例は、例示的であることを意図し、本発明の範囲を限定しない。
【００２９】
実施例１
第一の実施例において、前記方法の例示的な変更形態を提供する。また、接着細胞株を懸濁に適合させて、例示的なシステムにおいて増殖および生産の向上を達成するための方法の使用を説明するデータを提供する。この非限定的な例において、例示的なホスト細胞は、ＥＴ‐８０１を発現するＢＨＫ‐Ｍ細胞（親細胞株（ＡＴＣＣ ＰＴＡ‐４５０６）由来）由来であり、これは、１００〜１０００ｍｌのスピナーフラスコスケールで懸濁へ適合する際に、ＢＨＫ‐Ｍｓと呼ぶ。本実施例において、ＥＴ‐８０１を発現するＢＨＫ‐Ｍｓ細胞を、開示される方法にしたがって、懸濁液において増殖させる。結果として生じるｆＶＩＩＩ生産を測定し、接着細胞ベースのｆＶＩＩＩ生産と比較する。
【００３０】
ホスト細胞を、ＥＴ‐８０１生産のための新規のレンチウイルス発現システムを使って生成した（その全体が参照することによって本明細書に組み込まれ、以下、「Spencer 2010」と呼ぶ、Spencer HT, Denning G, Gautney RE, Dropulic B, Roy AJ, Baranyi L, et al. Lentiviral Vector Platform for Production of Bioengineered Recombinant Coagulation Factor VIII. Mol Ther. 2010）。この例示的な実験のために、平均で１６０ｕｎｉｔｓ／１０６細胞／２４ｈｒというレベルで組み換えｆＶＩＩＩ（ＥＴ‐８０１）を発現するＢＨＫ‐Ｍクローン（３−１０と名付けた）を得た。この予備実験において、小規模な製造工程を実行することによって、クローン３−１０（その全体が参照することによって本明細書に組み込まれる、Spencer 2011に記載される手順にしたがって作製した）を懸濁に適合させる新規のシステムおよび方法を使った、並外れたなタンパク質生産結果について説明する。
【００３１】
足場依存的ＢＨＫ‐Ｍ細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で、１００ｍｍ×２０ｍｍの細胞培養処理ディッシュ（コーニング社＃４３０１６７）上で、容量で１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、インビトロジェン社＃１００８２）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（インビトロジェン社＃３５０５０）および１％ペニシリン‐ストレプトマイシン（インビトロジェン社＃１５１４０）を補充した１０ｍＬのアドバンストダルベッコ変法イーグル培地／Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ‐１２、インビトロジェン社＃１２６３４）中で、増殖させた（本明細書中以下、ＤＭＥＭ ＣｏｍｐｌｅｔｅまたはＤＭＥＭ：Ｆ１２ Ｃｏｍｐｌｅｔｅと呼ぶ）。細胞が１００％コンフルエンシーに増殖した際に、ＤＭＥＭ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ培地を取り除き、細胞を一度３ｍＬの（１×）ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ｄＰＢＳ、インビトロジェン社＃１４１９０）で洗浄し、５００μＬのＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（インビトロジェン社＃１２６０５）を、ディッシュ全体に均一に添加し、ディッシュを３７℃および５％ＣＯ２で５分間インキュベートした。インキュベーション時間後、細胞を、５ｍＬのＤＭＥＭ Ｃｏｍｐｌｅｔｅで穏やかに再懸濁し、全細胞（実質的な希釈または分割なし）を、２５ｍＬのＤＭＥＭ Ｃｏｍｐｌｅｔｅを追加した、初めのディッシュと表面面積が同じ新しいディッシュに移し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で、一晩、増殖を続けさせた。細胞密度が上昇し、細胞が単層で定着するためのディッシュ上の表面面積がなくなることによって、細胞が三次元構造を形成し始めるまで、このプレーティングプロセスを４日間、毎日繰り返した（図２参照）。
【００３２】
この時点で、細胞を懸濁培養に移した。追加で１．２５ｍＬのＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ‐６８（１０％の溶液、インビトロジェン社２４０４０）を補充した１２０ｍＬのＤＭＥＭ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅで満たした１２５ｍＬのスピナーフラスコ（コーニング社＃３１５２）を用意した。細胞をｄＰＢＳで洗浄し、ＴｒｙｐＬＥで培養ディッシュから分離し、インキュベートし、前述のように慎重に再懸濁し、次いで、前述のスピナーフラスコに移し、３７℃および５％ＣＯ２のインキュベーター内で６０ｒｐｍの撹拌状態を保った。死亡細胞をトリパンブルー（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社＃０７０５０）で着色することによって細胞生存率を毎日測定した。３日に一度、残留培地の８０ｍＬを取り除き、８５０μＬのＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ‐６８を補充した、８５ｍＬの新鮮なＤＭＥＭ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅと入れ替えることによって、フラスコ内の培地を交換した。
【００３３】
この予備実験において、接着性ＢＨＫ‐Ｍ細胞の連続的な再播種を伴う、開示される方法を使って、ＢＨＫ‐Ｍ細胞を懸濁に適合できることを実証した。１０日間の連続した再播種で、３７℃、湿度９５％、５％ＣＯ２で培養しながら、細胞は、高度に凝集した状態を採用し、それらの増殖は、組織培養容器内の表面接着スペースに依存しなくなる。この時点で、細胞を振とうまたはスピナーフラスコに入れ替え、適度な回転（６０〜７５ｒｐｍ）を加えて同一の培養条件下で維持する。１〜２日間の懸濁培養中に、細胞は、倍加時間２４〜４８時間で増殖し始める。この時点で、細胞は懸濁培養に適合し、「ＢＨＫ‐Ｍｓ」細胞と呼ばれ、血清を含む培地、または無血清培地において、実験的に決定した２ヵ月（無期限もあり得る）を超える期間維持できる。
【００３４】
図２は、上記に開示した実験的方法によるＢＨＫ‐Ｍ細胞のＢＨＫ‐Ｍｓ細胞への変換を視覚的に表す。ＢＨＫ‐Ｍ細胞を、接着性ＢＨＫ‐Ｍ細胞の連続した再播種を伴う、開示される方法を使って、懸濁に適合させる。１０日間の連続した再播種にわたって、細胞は、（図２に見られるような）高度な凝集状態となり、それらの増殖は、組織培養容器内の表面接着スペースに依存しなくなる。この時点で、細胞は、適度に回転（６０〜７５ｒｐｍ）するよう設定した振とうまたはスピナーフラスコに撒くことができる。１〜２日間の懸濁培養中に、細胞は、倍加時間２４〜４８時間で増殖し始める。
【００３５】
本実験的変更形態において、結果として生じるＢＨＫ‐Ｍｓクローン３−１０は、１リットル規模で、４０日間を超える強くかつ持続的な増殖を示した。無血清生産期において、およそ１，０００，０００ｕｎｉｔｓのｆＶＩＩＩを該システムから回収した。これは、何ら大幅な最適化なくして、工業的組換えヒトｆＶＩＩＩ生産システムに対して、およそ５０倍向上したことを表す。
【００３６】
図３は、開示される方法によって生成されるＢＨＫ‐Ｍｓ細胞から、組み換えｆＶＩＩＩの発現を結果として生じる、５０倍の向上を実証する。Ｃｏｍｐｌｅｔｅ培地の交換を毎日行い、各回収物のｆＶＩＩＩ活性濃度を、一段階の凝固アッセイによって決定した。水平な線は、開示される方法による、ＥＴ‐８０１についての、無血清での平均ｆＶＩＩＩ生産レベルを表す（線の上の「ＥＴ‐８０１」で示す）。ｈｆＶＩＩＩで示す水平な線は、組換えヒト（ｈ）第ＶＩＩＩ因子について、公表されている生産レベルの平均を表す。
【００３７】
生じる細胞株は、その製造および使用方法が上記に十分に記載されており、ＢＨＫ‐ＭＳ‐３１０と呼ばれ、発明者および／または受託者に連絡することによって入手可能である。この細胞株は、向上した生産量、懸濁培養において増殖する能力、その親細胞株を超える向上したウイルスを生産する能力を提供する。
【００３８】
実施例２
第二の実施例において、懸濁へ適合させるシステムおよび方法、ならびに例示的なシステム、ＨＥＫ−２９３Ｔ接着細胞において、向上した増殖特性を達成するためのシステムおよび方法の使用を説明する、方法およびデータの例示的な変更形態を提供する。本実施例において、指定された条件下で、開示される方法の変更形態にしたがって、ＨＥＫ‐２９３Ｔ細胞を懸濁に適合させる。以下の方法で生じる細胞株は、ＨＥＫ‐ＳＣ‐２９３Ｔと呼ばれる。ＨＥＫ‐ＳＣ‐２９３Ｔ細胞株は、向上した生産量、懸濁培養において増殖する能力、その親細胞株を超える向上したウイルスを生産する能力を提供する。
【００３９】
本実施例による方法は以下の通りである：
ａ．冷凍の無処置のＨＥＫ‐２９３Ｔ接着細胞株から開始する；
ｂ．３７℃、５％ＣＯ２で、コーニング社の１０ｃｍディッシュにおいて、１０ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ-１２  ｃｏｍｐｌｅｔｅ（５％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％ＦＢＳを含む）中で溶解する；
ｃ．１０ｃｍディッシュにおいて、ＤＭＥＭ／Ｆ-１２  ｃｏｍｌｅｔｅ等の、有効量の増殖支持培地中で、コンフルエントになるまで細胞を増殖させる（１〜２日間）；
ｄ．プレートの表面に実質的に接着していない塊が形成されるまで、以下の工程を毎日繰り返すことによって、細胞を凝集させる：
ｉ．すべての培地を取り除く、
ｉｉ．細胞をＰＢＳで洗浄する（この工程は任意であり、最初の数サイクル後、中止した）、
ｉｉｉ．７００μＬのＴｒｙｐＬＥ（トリプシン類似体、インビトロジェン社＃１２６０５）を加える、
ｉｖ．３７℃、５％ＣＯ２で５分間インキュベートする、
ｖ．細胞密度に応じてＤＭＥＭ／Ｆ-１２  ｃｏｍｐｌｅｔｅの量を増やして、塊を破壊しないように努めながら、新しい１０ｃｍディッシュに全細胞を慎重に移す、
ｖｉ．３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする、
ｖｉｉ．細胞が塊を形成するまで、（ｉ）から（ｖｉ）の工程を繰り返す、
ｖｉｉｉ．細胞が塊を形成した後、１％（Ｖ／Ｖ）  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ‐６８を補充した５０ｍＬの培地（この場合、ＤＭＥＭ／Ｆ‐１２  ｃｏｍｐｌｅｔｅ）を含む１２５ｍＬのスピナーフラスコ（コーニング社＃３１５２）に細胞を移す、
ｉｘ．適度に回転させながら（６０ｒｐｍ）、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。
ｅ．毎日の培地交換は、細胞を４００Ｇで５〜１０分間ペレットにすること、使用した培地を取り除くこと、全細胞を１％（Ｖ／Ｖ）  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ‐６８を補充した１００ｍＬの培地で再懸濁することからなる。適度に回転させながら（６０ｒｐｍ）、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。
ｆ．ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡアッセイ）キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃２３２２５、キットプロトコール参照。その全体が本明細書に組み込まれる。）を使って、ＲＬＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｚ３０５１）で溶解させた一定量の凝集細胞のタンパク質レベルを、既知の細胞密度の非凝集細胞でのタンパク質レベルの標準曲線と比較することによって、細胞密度を測定する。
【００４０】
図４（ａ）〜４（ｆ）は、写真資料によって、この実験的変更形態における、新規の開示される方法の成功を実証している。図４（ａ）は、開始時の材料であるコンフルエントな接着ＨＥＫ‐２９３Ｔ細胞を示す。図４（ｂ）は、１〜２日目の連続再播種を示し、この期間で、細胞密度および細胞の重層の増大が観察された。図４（ｃ）は、２〜３日目の継続した連続再播種を示し、この期間で、より多くの細胞の重層が観察された。図４（ｄ）は、３〜４日目の連続再播種を示し、この期間で、細胞凝集塊が、接着細胞の単層上で増殖し始めた。図４（ｅ）は、４〜５日目の連続再播種を示し、この期間で、細胞凝集塊は、より大きく増殖し始めた。図４（ｆ）は、５〜８日目の再播種を示し、この期間で、細胞凝集塊が足場非依存的になった。
【００４１】
細胞の一部（通常、〜８０％）の再懸濁だけをしながら、毎日、工程（ｅ）（例えば、ペレット工程）を繰り返すことによって、該培養は無限に維持し得る。
【００４２】
本実施例２による細胞は、それらを懸濁に適合させた後、トランスフェクトした。
【００４３】
上記の方法は、多くの接着細胞株から懸濁細胞株を生産するために使用し得るが、その生産および使用の方法が上記に十分に記載されており、上述の特定のパラメーターを有するこの特定の実施例から生じる細胞株は、ＨＥＫ-ＳＣ‐２９３Ｔとよばれ、発明者および／または受託者に連絡することによって入手できる。この細胞株は、向上した生産量、懸濁培養において増殖する能力、その親細胞株を超える向上したウイルスを生産する能力を提供する。
【００４４】
実施例３
第三の実施例において、開示される方法から生じる細胞株の、組換えウイルスを生産する能力を説明する方法およびデータ例示的変更形態を提供する。力価測定のための形質導入は、公知の方法によって、または、Spencer 2011（その全体が参照することによって本明細書に組み込まれる）に記載される通りに実施してよい。
【００４５】
さらなる変更形態において、例えば、本明細書に開示される方法にしたがって、対象となるウイルスで細胞株を形質導入することによる、高収率なウイルス生産のための方法および細胞株（ＨＥＫ‐ＳＣ‐２９３Ｔと呼ばれ、その生産および使用方法は、十分に本明細書に開示され、他の手段の中でも、発明者および受託者に連絡することによって入手できる）を開示する。以下の実施例は、開示される方法にしたがって懸濁に適合させた細胞からの第三世代のレンチウイルスの生産および濃縮を例示している。例えば、容器の大きさおよびすべての量の適用は、当然、変更してよいし、製造規模を拡大または縮小するべく調節してよい。当該方法は、以下の工程によって実証されうる：
ａ．トランスフェクション用の細胞を播種する：
ｉ．５０ｍＬのＣｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＭＥＭ：Ｆ１２中に、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（例えば、ＢＣＡアッセイによって決定したもの）のＨＥＫ‐ＳＣ‐２９３Ｔ懸濁細胞を含む、新たなフラスコで開始する。
ｉｉ．３７℃、５％ＣＯ２、６０ｒｐｍで細胞をインキュベートする。
ｂ．トランスフェクション（１日目）：
ｉ．１５ｍｌのコニカルチューブに、全量のプラスミドＤＮＡ（以下の表１参照）を、最終容量５ｍｌで、例えば、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）または同様の製品に混合する。フィルター（例えば、０．２２μｍのフィルター）で新たな１５ｍｌのコニカルチューブへと濾過滅菌する。
【００４６】
【表１】
2014504870.tif 000003
【００４７】
ｉｉ．別個の１５ｍｌのコニカルチューブにおいて、１４４μｌの１０ｍｇ／ｍｌのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（ＰＥＩ算出については、以下の表２参照）と、５ｍｌの、例えば、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）または同様の製品とを混合する。フィルター（例えば、０．２２μｍのフィルター）で、新しい１５ｍｌのコニカルチューブ内へと濾過滅菌する。
【００４８】
【表２】
2014504870.tif 000004
【００４９】
ｉｉｉ．プラスミドＤＮＡとＰＥＩ混合物とを混合し、室温で２０分間インキュベートする。
ｉｖ．懸濁細胞（例えば、ＨＥＫ‐２９３Ｔ懸濁細胞）を、５０ｍｌのコニカルチューブ内に、１５００ｒｐｍで１０分間で、ペレットにして、馴化培地を捨てる。
ｖ．ペレットにする間、ＤＮＡ／ＰＥＩの混合物を５０ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ：Ｆ１２  ｃｏｍｐｌｅｔｅ（１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Stretomycin）を含まない）に加え、最終容量が〜６０ｍｌになるようにして、確実に混合物を均質とするべく、徹底的に混合する。
ｖｉ．スピナーフラスコ内で、フラスコからの培地を使って、懸濁細胞（例えば、ＨＥＫ‐２９３Ｔ懸濁細胞）を再懸濁する。
ｖｉｉ．６０ｒｐｍで、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターでインキュベートすることによって、細胞を一晩トランスフェクトする。
ｃ．トランスフェクション後（２日目）：
ｉ．先に概要を述べたように、トランスフェクトした懸濁細胞をペレットにし、細胞からトランスフェクション培地を慎重にデカントし、５０ｍｌのＤＭＥＭ：Ｆ１２  ｃｏｍｐｌｅｔｅで交換する。
ｉｉ．細胞を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養し続ける。
ｄ．ウイルス収集／回収（３日目および４日目）：
ｉ．例えば、蛍光顕微鏡下でＧＦＰ細胞をチェックするなどして、トランスフェクションの証拠について、細胞の状態を調べる。ｆＶＩＩＩについては、例えば、培地の凝固時間をチェックしてよい。
ｉｉ．細胞が所望の生成物を発現していることを示す証拠が示された場合、以下の通り、処理を進める：
１．細胞を１，５００ｒｐｍ、１０分間でペレットにする（例えば、細胞残屑を取り除くため）。
２．ウイルスを含む培地を無菌の遠心ボトルにデカントで移し、懸濁細胞（例えば、ＨＥＫ‐２９３Ｔ懸濁細胞）を５０ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ：Ｆ１２  ｃｏｍｐｌｅｔｅが入ったスピナーフラスコ内へ再度播種して戻し、６０ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターにおいて、細胞を培養し続ける。
３．ウイルスを含んだ培地を、フィルター（例えば、０．４５ｍｍのフィルターが挙げられるが、これに限定されない）でろ過し、ウイルス濃縮の準備ができるまで、４℃で（最大約４日間）貯蔵する。
４．上記に概説した工程を繰り返すことによって、２日間収集する。
ｉｉｉ．任意で、ウイルスを濃縮、再懸濁および貯蔵する。
ｉｖ．以下の表は、機能的なウイルスを生産するため、開示される方法にしたがって、懸濁に適合させた細胞株の能力を表し、これは、Spencer 2011に記載されるような、形質導入したＢＨＫ‐Ｍ細胞のｑＰＣＲ導入遺伝子コピー数分析によって測定される。収集したウイルスを、連続した日のウイルス収集により分割し、非濃縮ウイルスを含む培地の平均力価を、それぞれの日について算出した。次に、濃縮力価の推定値を、非濃縮力価を濃縮率で乗算することによって算出した：
【００５０】
【表３】
2014504870.tif 000005
【００５１】
実施例４
以下の実施例および関連データは、開示される方法にしたがって懸濁に適合させた細胞からの高レベルのｆＶＩＩＩ発現をさらに実証する。以下の実施例は例示を目的とするだけで、本開示を特定の規模または量などに限定することを意図していない。
【００５２】
ＥＴ‐８０１を発現するＢＨＫ‐Ｍクローン（３−１０と呼ばれる）を、本明細書に開示される方法にしたがって、無血清懸濁培養に適合させ、ＢＨＫ‐Ｍｓ細胞と称される細胞になる。ＢＨＫ‐Ｍクローンを、１リットル規模で３０日間、拡大および増殖させて、ｆＶＩＩＩ濃度を測定し、図５にプロットした。それぞれのデータポイントは、１リットルの培地の全回収からのｆＶＩＩＩ濃度を表す。細胞生存率の変化は観察されず、これらの条件下での細胞の生存は限定されないことが示唆された。トータルで、１，０００，０００ｕｎｉｔｓを超えるｆＶＩＩＩ活性を、この製造工程において収集した。開始時の材料における高濃度のＥＴ‐８０１により、一つの陽イオン交換クラマトグラフィーの手順を使って高度に精製された材料を得ることが初めて可能となった。およそ４．９ｍｇの高度に精製されたＥＴ‐８０１を８３０倍の精製度で単離した。チロシン、トリプトファンおよびシステインの予測含有量に基づいて、２８０ｎｍで２５４，９５５Ｍ‐１ｃｍ‐１のモル吸光係数を使って、最終的な材料が、３，０００ｕｎｉｔｓ／ｎｍｏｌまたは１７，７００ｕｎｉｔｓ／ｍｇの比活性度を有すると計算した。
【００５３】
ＥＴ‐８０１の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価し、組換えＢＤＤヒトｆＶＩＩＩと比較した。トロンビンによる開裂に感受性である少量の単鎖材料が存在した。主要な混入物は観察されなかった。精製したＥＴ‐８０１を、グリコシル化、ｖＷｆとの相互作用、トロンビンによる活性化後の活性崩壊について評価した。トロンビンおよびエンドグリコシダーゼＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いたＥＴ‐８０１の処理により、Ａ1およびＡ３‐Ｃ１‐Ｃ２（軽鎖）タンパク質断片について、Ｍｒに変化が生じた。ＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理の後、Ａ２領域のＭｒに変化は観察されなかった。これらのデータは、組換えＢＤＤヒトｆＶＩＩＩおよびＢＤＤブタｆＶＩＩＩについて先に記述された（その全体が参照することによって本明細書に組み込まれる、Doering et al. Journal of Biological Chemistry. 2004. 279(8): 6546 - 6552）ものと一致する、ＥＴ‐８０１のグリコシル化パターンを示唆している。
【００５４】
生産したＥＴ‐８０１のｉｎ ｖｉｖｏでの機能を確認するために、血友病Ａマウスに、生理食塩水、または、２９０ｕｎｉｔｓ／ｋｇの用量（通常のマウスのレベル近くまで、血中ｆＶＩＩＩ活性を回復させるように、実験的に決定した）のＥＴ‐８０１のいずれかを注入した。生理食塩水またはＥＴ‐８０１の投与に続いて、マウスを、尾切断を使って、止血誘発実験（hemostatic challenge）に供し、４０分間にわたって、全失血を判定した。生理食塩水だけを注射された血友病Ａマウスは、平均２９．６ｍｇ／ｇ体重の失血があった。対照的に、ＥＴ‐８０１を注入されたマウスは、０．１ｍｇ／ｇ体重の失血を示し、これは、コントロールよりも有意に少なかった（Ｐ＝０．０２９）。
【００５５】
上記の方法は、数多くの接着細胞株から懸濁細胞株を生産するために使用し得るが、その生産および使用の方法が上記に十分に記載されており、上述の特定のパラメーターを有するこの特定の実施例から生じる細胞株は、ＢＨＫ−ＭＳ−３１０−ＥＴ８０１とよばれ、発明者および／または受託者に連絡することによって入手できる。この細胞株は、向上した生産量、懸濁培養において増殖する能力、およびその親細胞株を超える向上したウイルスを生産する能力を提供する。
【００５６】
実施例５
以下の実施例および関連データは、最適化した栄養供給計画の、細胞密度に対する効果を説明する。本実施例において、上記の実施例において説明されるような、２４〜４８時間毎の代わりに、１２時間毎に、新鮮な培地を懸濁細胞に再供給した。１２時間の栄養供給計画を使って、図６に示すように、より高い細胞密度を達成し、維持し得ることを実証する。
【００５７】
実施例６
以下のデータは、Ｐ１４と呼ばれる、懸濁に適合させたさらなるＢＨＫ‐Ｍクローンの特徴を明らかにし、該クローンは、組み換えｆＶＩＩＩ導入遺伝子をコードする、哺乳動物発現プラスミドのポリマー促進トランスフェクション、レンチウイルスベクターを使った連続形質導入によって遺伝的に修飾されたものであり、その生産物は、本明細書においてＥＴ‐３と呼ばれる（ＥＴ‐３は、米国特許第７，６３５，７６３号の配列番号１９と、少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドである）。
【００５８】
上述の特定のパラメーターを有する、この特定の実施例の結果として生じる細胞株は、その生産および使用の方法が上記の実施例において、Spencer 2011の方法とあわせて十分に記載されているが、ＢＨＫ‐ＭＳ‐Ｐ１４と呼ばれ、発明者および／または譲受人に連絡することによって入手できる。この細胞株は、向上した生産量、懸濁培養において増殖する能力、およびその親細胞株を超える向上したウイルスを生産する能力を提供する。
【００５９】
図７は、培養密度の関数としてのｆＶＩＩＩの活性（ＥＴ‐３）を図示している。
【００６０】
図８は、ＢＨＫ‐ＭＳ‐Ｐ１４懸濁培養の長期の増殖および安定性を図示している。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイを使って、全タンパク質レベルを測定し、既知のＢＨＫタンパク質／細胞の基準とそれらを比較することによって、密度を決定した。
【００６１】
図９は、Ｐ１４クローンが、血液由来または組換えアルブミンを補充した無血清または化学的に定義された培地を含むが、これらに限定されない、様々な培地で、効率的なｆＶＩＩＩ生産が可能であることを図示している。
【００６２】
実施例７
本実施例において、この方法にしたがって懸濁に適合させた細胞が、組み換えｆＶＩＩＩ分子以外の、外来導入遺伝子を発現するように遺伝的に修飾し得ることを実証する。例えば、ＧＦＰが挙げられる。
【００６３】
開示される方法によるＢＨＫ‐Ｍｓ細胞の有用性を実証するべく、それらが、例えば、多様な組み換えタンパク質を発現するように、容易に遺伝的に修飾できることを示す。したがって、標準的なトランスフェクション条件下で、カチオン性ポリマーＰＥＩを使った、ＢＨＫ‐Ｍｓ遺伝子組み換えの効率を説明する。図１０は、ＰＥＩと、レポーターとして緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコード化するプラスミドとを使用した、ＨＥＫ‐ＳＣ‐２９３Ｔ懸濁細胞の顕著な遺伝子組み換えを表す。図１０は、開示される方法にしたがって懸濁に適合させた、ＧＦＰがトランスフェクトされた、ＧＦＰを生産するＨＥＫ‐２９３Ｔである。
【００６４】
実施例８
以下は、試験的な生産について開示される方法の提案された変更形態である。例えば、試験的な生産について、開示される方法によって懸濁に適合させた接着細胞株、例えば、ＥＴ‐８０１を発現するＢＨＫ‐Ｍｓクローンは、例えば、１０リットルのＢＨＫ‐Ｍｓ生産培地を含む５０リットルのバイオリアクター（例えば、Ｘｃｅｌｌｅｘ）に（ただし、これに限定されない）、スケールアップし得る。５〜１０リットルの馴化培地を毎日回収し、ろ過によって浄化し、−８０℃で凍結し得る。ＥＴ‐８０１は、出願人が開発し、先に記載した新規のシングルステップのイオン交換クロマトグラフィープロトコール（その全体が本明細書に組み込まれる、Spencer HT, Denning G, Gautney RE, Dropulic B, Roy AJ, Baranyi L, et al. Lentiviral Vector Platform for Production of Bioengineered Recombinant Coagulation Factor VIII. Mol Ther. 2011）を使って、馴化培地から精製し得る。上述の通り、工業的な完全長組換えヒトｆＶＩＩＩの精製は、精製における他の生物学的産物（例えば、抗ヒトｆＶＩＩＩモノクローナル免疫グロブリン）の存在によって、検証プロセスを複雑にしかねない免疫アフィニティの工程を伴い得る。Spencer 2011において記載した精製工程の使用は、製造コストの低減と、したがって、商品のコストの低下をももたらし得る。先に記載したように（Spencer HT, Denning G, Gautney RE, Dropulic B, Roy AJ, Baranyi L, et al. Lentiviral Vector Platform for Production of Bioengineered Recombinant Coagulation Factor VIII. Mol Ther. 2011）、および、以下に記載するように、ｆＶＩＩＩ製剤は、純度、プロセシング、比活性度、およびトロンビン活性化後の崩壊キネティクスに関して分析され得る。
【００６５】
新規性に関するさらなる検討
実施例および開示にしたがって、接着細胞を懸濁培養に適合させる方法を実証する。また、開示される方法によって生産される新規の細胞株を開示し、開示される方法にしたがって生産される懸濁細胞株のより優れた生産能力を実証する。驚くべきかつ際立った生産結果をさらに説明するために、本明細書に開示される結果を、現在の市場において得られる、主要な市場のｆＶＩＩＩメーカーによる結果と比較しうる。規模および生産性の比較に関して、バクスター社は、２００６年１月に、バクスター社の第三世代の組換えｈ‐ｆＶＩＩＩ製品であるＡＤＶＡＴＥＴＭの累計売上が、２００３〜２００４年におけるＦＤＡおよび欧州委員会（European Commission）による認可以来、１０億ｕｎｉｔｓ（およそ１００グラム）を超えたと発表した。図１が表すように、各工業的組み換えｆＶＩＩＩ製品の推定年間生産量は、１００〜２００グラムである。
【００６６】
これに比べて、出願人の例示的な試験的規模のｆＶＩＩＩの生産工程は、ＢＨＫ‐Ｍｓクローン３−１０を１リットルのスピナーフラスコに播種することによって行うことができ、例えば、およそ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度（ただしこれに限定されない）まで、培養し得る。その後、培養物全体を、１０リットルのＢＨＫ‐Ｍｓ生産培地を含む５０リットルのバイオリアクター（例えば、Ｘｃｅｌｌｅｒｘ）に播種するために使用してよい。生産期における２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの予測細胞密度に基づいて、一日のＥＴ‐８０１生産を、以下の計算を使って推定する：
【００６７】
【数１】
2014504870.tif 000006
【００６８】
したがって、３０日間の生産工程の過程において、およそ６０，０００，０００ｕｎｉｔｓのｆＶＩＩＩ活性を含む３００リットルの馴化培地が収集されるであろうと予期される。先に決定した比活性度１７，７００ｕｎｉｔｓ／ミリグラム（Spencer 2011）をもって、生産量が３グラムを超えると予期される。
【００６９】
実証したように、一回の３０日間の１Ｌの工程で、１，０００，０００ｕｎｉｔｓを超えるｆＶＩＩＩを収集した。生物学的製造規模にまで規模を拡大すると（例えば、バイエル社は、１０台以上の２００Ｌのバイオリアクターを同時に、任意の所与の時間で稼働させる）、本開示にしたがって生産した細胞は、一回の３０日間の１０００Ｌの工程で１０億ｕｎｉｔｓを生産できることが明らかである。言い換えれば、バイエル社が、その広範な製造能力およびスタッフで、達成するのに３年近くかかったものが、出願人の方法では、３０日間の１０００Ｌの工程で達成できる。
【００７０】
したがって、本明細書に開示される方法、システムおよび細胞株は、非常に必要とされている生物学的治療薬（ｆＶＩＩＩ等、ただしこれに限定されない）のコストを大幅に低減し、供給性を増大することを約束する。さらなる例として、バイエル社は、そのバークレーの拠点において、ｆＶＩＩＩ生成物であるＫＯＧＥＮＡＴＥ  ＦＳを１ロット製造するのに、１０００人を超える人がおよそ２５０日間かかると言明した。これは、２００グラムの生成物を表す。出願人が開示する方法では、はるかに多くの生成物を、より短い時間で、より少ないリソースを使って生産することができる。例えば、ｆＶＩＩＩの推定年間生産量は、１００〜２００グラムである。出願人は、ラボラトリー規模で、非常に限られたリソースを用いて、３０日間で、該ｆＶＩＩＩの推定年間生産量の１０分の１を超える量を生産できることを実証した。
【００７１】
図１１は、２つの製造計画を表しており、一つは、ＥＴ‐８０１のローラーボトル生産に基づき、他方は、単一槽バイオリアクターに基づく。これは、組み換えタンパク質製造における懸濁細胞増殖の利点を強調している。控え目な推定に基づいて、ＢＨＫ‐Ｍｓベースの製造は、ＢＨＫ‐Ｍベースのローラーボトル製造の２倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、または、１００倍も上回って生産量を増大し得る。この主要な進歩によって、組み換えタンパク質の医薬品市場への技術的および経済的な参入障壁を克服し、現在は入手できない血友病Ａ患者の三分の二へ、第ＶＩＩＩ因子の供給を増加し得る。
【００７２】
ｆＶＩＩＩ生成物の特徴を明らかにするための例示的な実験的プロトコールの開示
ＢＨＫ‐Ｍｓで生合成したＥＴ‐８０１の精製および生化学的分析：組換えＥＴ‐８０１は、他の技術の中でも、最近の記載（Spencer 2011）のように、一工程のイオン交換クロマトグラフィーの手順を使って精製し得る。ＦＶＩＩＩを含んだ分画は、例えば、一段階の凝固アッセイ、および、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）後の銀染色によって（ただしこれらに限定されない）、同定し得る。ＥＴ‐８０１の比活性度は、例えば、チロシン、トリプトファンおよびシステインの予測含有量、および２８０ｎｍでの吸光度から決定されるモル吸光係数を使って、算出し得る（Pace CN, Vajdos F, Fee L, Grimsley G, Gray T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci. 1995;4(11):2411-23）。
【００７３】
最終的な材料の比活性度は、例えば、２８０ｎｍで０．０８未満の吸光度、または２０未満の活性指数（activation quotient）を示すあらゆる分画を除き、ｆＶＩＩＩのピーク分画の比活性度の加重平均数と定義され得る。ＥＴ‐８０１製剤の純度は、複数の生化学／物理的技術を使って評価し得る。例として、純度およびプロセシングを評価するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色法を使用してよい。予備データに基づいて、＞９５％の精製したタンパク質材料が、ＰＡＣＥ／フーリン細胞内のプロセシングに特徴的なヘテロ二量体の（重鎖／軽鎖）形態で存在することを予期する。ヒト、ブタ、およびヒト／ブタハイブリッドのｆＶＩＩＩの調製において典型的に観察される、プロセシングされていない少量の単鎖材料も観察しうる（参照することによって本明細書に組み込まれる、Spencer HT, Denning G, Gautney RE, Dropulic B, Roy AJ, Baranyi L, et al. Lentiviral Vector Platform for Production of Bioengineered Recombinant Coagulation Factor VIII. Mol Ther. 2011.; Doering C, Parker ET, Healey JF, Craddock HN, Barrow RT, Lollar P. Expression and characterization of recombinant murine factor VIII. Thromb Haemost. 2002;88(3):450-8.; Doering CB, Parker ET, Healey JF, Craddock HN, Barrow RT, Lollar P. Expression and Characterization of Recombinant Murine Factor VIII. ThrombHaemost. 2002;88(3):450-8.; Doering CB, Healey JF, Parker ET, Barrow RT, Lollar P. Identification of porcine coagulation factor VIII domains responsible for high level expression via enhanced secretion. J Biol Chem. 2004;279(8):6546-52）。
【００７４】
ＥＴ‐８０１はまた、ヘテロ三量体ｆＶＩＩＩａを表す、Ａ１、Ａ２およびＡ３‐Ｃ１‐Ｃ２のバンドのみの完全な活性化と、存在とを確認するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前にトロンビンとインキュベートし得る。ＥＴ‐８０１製剤は、ペプチドマスフィンガープリンティングにより特徴を明らかにし得る（例えば、参照することによって本明細書に組み込まれる、Mann M, Hendrickson RC, Pandey A. Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry. Annu Rev Biochem. 2001;70:437-73を参照）。簡潔には、タンパク質製剤は消化してもよく、ペプチド分子イオンの質量を決定し、ペプチドマススペクトルをもたらしてもよい。次いで、より確実な同定を、選択されたペプチドイオンのタンデム質量分析を実行することによって、達成しうる。得られたデータは、ＥＴ‐８０１のアイデンティティを検証し、製剤中に含まれる潜在的な混入物を同定し、存在する翻訳後修飾の特徴を明らかにするために使用し得る。
【００７５】
高分子量のｆＶＩＩＩ凝集塊の形成は、ｆＶＩＩＩ精製に併発し（complication）得る（参照することによって本明細書に組み込まれる、Grillo AO, Edwards KL, Kashi RS, Shipley KM, Hu L, Besman MJ, et al. Conformational origin of the aggregation of recombinant human factor VIII. Biochemistry. 2001;40(2):586-95）。他の方法の中でも、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、大きなｆＶＩＩＩ凝集塊の存在について、ＥＴ‐８０１製剤を分析するために使用し得る。
【００７６】
トロンビン活性化後の活性化したＥＴ‐８０１の安定化：組換えヒトＥＴ‐８０１、ブタＥＴ‐８０１、様々なヒト／ブタハイブリッドＶＩＩＩコンストラクトおよびマウスｆＶＩＩＩの特徴を明らかにするための先に記載されたプロトコールを使って、Ａ２サブユニット解離率について、精製したＥＴ‐８０１を検査し得る（参照することによって本明細書に組み込まれる、Doering CB, Parker ET, Healey JF, Craddock HN, Barrow RT, Lollar P. Expression and Characterization of Recombinant Murine Factor VIII. ThrombHaemost. 2002;88(3):450-8.; Doering CB, Healey JF, Parker ET, Barrow RT, Lollar P. Identification of porcine coagulation factor VIII domains responsible for high level expression via enhanced secretion. J Biol Chem. 2004;279(8):6546-52.; Doering CB, Healey JF, Parker ET, Barrow RT, Lollar P. High-level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII. JBiolChem. 2002;277(41):38345-9.; Parker ET, Doering CB, Lollar P. A1 subunit- mediated regulation of thrombin-activated factor VIII A2 subunit dissociation. J Biol Chem. 2006）。
【００７７】
例えば、ＥＴ‐８０１は、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０２のＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ２で、１、２０、５０または１００ｎＭに希釈し、１００ｎＭのトロンビンで３０秒間活性化し得る。ＦＶＩＩＩ活性は、時間の関数として、発色アッセイによって測定し得る。これらの条件下で、ｆＶＩＩＩは、３０秒以内に完全に活性化し、アッセイにおける活性の減少は、ｆＶＩＩＩａの崩壊に完全に起因する（参照することによって本明細書に組み込まれる、Fay PJ, Smudzin TM. Characterization of the interaction between the A2 subunit and A1/A3-C1-C2 dimer in human factor VIIIa. JBiolChem. 1992;267(19):13246-50.; Lollar P, Parker CG. pH-dependent denaturation of thrombin-activated porcine factor VIII. JBiolChem. 1990;265(3):1688-92.; Lollar P, Parker ET. Structural basis for the decreased procoagulant activity of human factor VIII compared to the porcine homolog. JBiolChem. 1991;266(19):12481-6.; Lollar P, Parker ET, Fay PJ. Coagulant properties of hybrid human/porcine factor VIII molecules. JBiolChem. 1992;267(33):23652-7）。
【００７８】
血友病ＡのマウスモデルにおけるＥＴ‐８０１の有効性の決定：尾切断後のＥ１６血友病Ａマウスの死亡率または失血を低減させるｆＶＩＩＩの能力を評価するための有効性モデルを開発した（Parker ET, Lollar P. A quantitative measure of the efficacy of factor VIII in hemophilia A mice. Thromb Haemost. 2003;89(3):480-5。参照することによって本明細書に組み込まれる）。このモデルにおいて、尾切断の前にｆＶＩＩＩを接種しない限り、血友病Ａマウスの死亡率は、９０％を超える。この方法は、５０％の生存率（ＥＤ５０）を生じる推定用量を測定することによって、ブタ血漿由来ｆＶＩＩＩと比較した、組換えｐ−ＶＩＩＩの有効性を決定するために使用し得る。この方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＥＴ‐８０１についてのＥＤ５０を決定するために使用し得る。簡潔にいうと、Ｅ１６血友病Ａマウスは、最初に、１．５ｍｇ／ｋｇのドロペリドール／７５ｍｇ／ｋｇのケタミンの麻酔液の腹腔内投与を受けてよい。次に、尾静脈を膨張させるため、６０ワットのランプ下でマウスを３分間温め得る。二重盲検設計で、様々な量のＥＴ‐８０１、ＢＤＤ  ｐ−ｆＶＩＩＩ、ＢＤＤ  ｈ−ｆＶＩＩＩ、または生理食塩水を尾静脈へ静脈内投与する。注入後の１５分後、マウスを５０ｍｌの拘束コニカルチューブ内に配置し、尾の遠位１ｃｍを切断し、３７℃のウォーターバスで維持した７．５ｍｌの１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１３×１００ｍｍの試験管内に断端を配置する。生存マウスの体重を、２、４、６および２４時間で測った。急性失血の定量的代替測定として、体重の減少が、二次的有効性変数として使用されるであろう。ＥＤ５０は、上げ下げ法（参照することによって本明細書に組み込まれる、Dixon WJ. Staircase bioassay: the up-and-down method. Neurosci Biobehav Rev. 1991;15(1):47-50）を使って決定し得る。死亡率データ等の全か無かの反応における標準偏差は、プロビット解析を使って概算できる。
【００７９】
結論
要約すれば、開示される方法によって懸濁に適合した細胞（例えば、ＢＨＫ‐Ｍｓ細胞およびＨＥＫ‐２９３Ｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されない）は、生物学的治療薬の製造、およびウイルス生産において、顕著な技術的進歩を示す。
【００８０】
ＥＴ‐８０１は、罹患した患者の治療に対する主要な障壁（すなわち、ｆＶＩＩＩ生成物のコスト）を克服するための、血友病Ａ治療の開発における、新規の生成物である。出願人の予備データに基づいて、現在市販されているｈ‐ｆＶＩＩＩ製品について達成されているレベルよりも、著しく高い生産レベルで、重要な生物学的治療薬（ＥＴ‐８０１等、ただしこれに限定されない）を得るために使用し得る方法、システム、および細胞株を本明細書に開示し、特許請求する。高発現のｆＶＩＩＩ成分、レンチウイルスによる遺伝子導入および遺伝子発現、ならびに、製造用ＢＨＫ‐Ｍｓ細胞プラットフォームの利用を組み合わせた技術的進歩は、ＥＴ‐８０１を、現在のｆＶＩＩＩ製品よりも低いコストで市販し、従って、その後に減少する補助金のヘルスケアコストによって経済的な利点を提供しつつ、血友病Ａ患者のより良いサポートを可能にするであろう。
【００８１】
本明細書に開示される方法が、様々な接着細胞株を懸濁培養へと変えるために、一般的に使用し得ることを上記に実証した。出願人は、結果として生じる細胞株が、親および／または接着細胞株を超える、生成物の増大した生産量という特徴を有することを説明する。また、出願人は、開示される方法によってつくられる三種の特定の細胞株、ＢＨＫ‐ＭＳ−３１０、ＢＨＫ‐ＭＳ−Ｐ１４、およびＨＥＫ-ＳＣ‐２９３Ｔを開示し、特徴を明らかにする。また、上記に十分に特徴を明らかにされた、これらの細胞株それぞれは、他の場所の中でも、発明者および／または受託者に連絡することによって、入手可能である。
【００８２】
いくつかの理由により、開示される方法は、公知の方法に対して新規である。接着哺乳類細胞株から懸濁細胞を調製する公知の方法は、主に、マイクロビーズ、マイクロキャリア、および他の同様な装置の使用に依存する。さらに、血清枯渇によって、いくつかの哺乳類細胞株が懸濁へと形質転換し得ることが報告されている。開示される方法から生じる懸濁細胞株は、凝集した状態を示す（凝集した状態の視覚的な例については、図２（「１０日目」と印がついたスライド）、および、図４（例えば、図４（ｅ）および４（ｆ））を参照のこと）。現時点で公知の単細胞懸濁液に対して、凝集した細胞懸濁液のいくつかの利点の特徴を本明細書において明らかにする。
【００８３】
さらに、本明細書に開示される方法は、マイクロビーズおよび／または血清枯渇を使った方法より、はるかに短い時間および少ない材料を要する。開示した方法による細胞の新規の特性が、順次の血清枯渇工程（例えば、１０％、次いで、８％、次いで、４％など、０％に到達するまで、例えば、順次、減量した血清を含む培地へと細胞を移す）を要さずに、血清を含む培地から無血清培地へと直接継代可能であることを実証した。血清枯渇の必要性を取り払うことは、時間およびリソースを節約する、新規の、驚くべき利点である。さらに、マイクロビーズおよびマイクロキャリアは非常に高価であり、それ故、マイクロビーズおよび／またはマイクロキャリアに依存しない当該方法は、他の利点の中でも、マイクロキャリアおよび／またはマイクロビーズを必要とする方法に対して、コストを減少させる。
【００８４】
本発明の前述の記載によって、当業者が、現時点において、その最良の形態と考えられるものを製造し、使用することが可能である一方で、当業者は、本明細書における特定の例示的な実施形態および方法の変更、組み合わせ、および同等物が存在することを理解し、把握するであろう。したがって、本発明は、上述の実施形態および方法によって限定されるべきでなく、特許請求される本発明の範囲内および趣旨内のすべての実施形態および方法によって限定されるべきである。
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図２】
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【図４】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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