(57)【要約】  本発明は、セツキシマブを含む治療レジメンに対する抵抗性およびパニツムマブを含む治療レジメンに対する感受性と高度に相関するアミノ酸変化をもたらす、上皮成長因子受容体遺伝子における新規の識別された変異に関する。本発明は、このような変異を検出するためのペプチド配列、プライマーおよびプローブ、ならびにセツキシマブおよび／またはパニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答を予測するためのキットを含む。特に、本発明は、転移性結腸直腸癌および頭頸部癌に適用可能な治療レジメンに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１（ＴＫＩＩＲＮＲＧＥ）を含むペプチド配列。
【請求項２】
配列番号１をコードする配列を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号３（ｇｇｇａｃｃｔｃｃｇｇｔｃａｇａａａａ）および４（ｃｇｇｔｇａｃｔｔａｃｔｇｃａｇｃｔｇｔｔｔ）からなるプライマーのセット。
【請求項５】
配列番号５（ｃａｃｃｔｃｔｇｔｔｔｃｔｔａｔａａｔｔ）からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号６（ｃａｃｃｔｃｔｇｔｔｇｃｔｔａｔａａ）からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
請求項５に記載のオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項８】
請求項６に記載のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
請求項４に記載のプライマーのセットをさらに含む、請求項７または８に記載のキット。
【請求項１０】
ＫＲＡＳおよび／またはＰＩＫ３ＣＡおよび／またはＢＲＡＦ遺伝子における変異を検出するための試薬をさらに含む、請求項７ないし９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１】
セツキシマブおよび／またはパニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答の予測に使用するための、請求項７ないし１０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２】
対象が癌に罹患している、請求項１１に記載の使用のためのキット。
【請求項１３】
癌が、転移性結腸直腸癌および頭頸部癌からなる群から選択される、請求項１２に記載の使用のためのキット。
【請求項１４】
対象から得た試料中の配列番号８に対応するアミノ酸配列の４９２位におけるアルギニンの存在または非存在を識別するインビトロ方法であって、遺伝子型法、および／またはタンパク質シークエンシング法からなる群から選択される手段によって配列番号８の４９２位におけるアミノ酸を決定することを含む、方法。
【請求項１５】
セツキシマブおよび／またはパニツムマブを含む対象治療レジメンの応答を予測するインビトロ方法であって、ｉ）請求項１４の方法に記載の、対象から得た試料中の配列番号８に対応するアミノ酸配列の４９２位におけるアルギニンの存在または非存在を決定する工程と、ｉｉ）工程１）において識別されたアルギニンの存在を、セツキシマブを含む治療レジメンに対する対象の抵抗性と関連付ける工程、または工程ｉ）において識別されたアルギニンの非存在を、パニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答と関連付ける工程とを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノクローナル抗体治療に対する応答を決定するためのマーカーとしてのヒト上皮成長因子受容体遺伝子の変異を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
上皮成長因子受容体遺伝子（ＥＧＦＲ）は、４種の密接に関連した受容体チロシンキナーゼ：ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、ＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）およびＨｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）を含む、受容体の上皮成長因子ファミリー（ＥｒｂＢファミリー）に属する膜貫通チロシンキナーゼ受容体である。リガンドが結合すると、ＥＧＦＲは、アポトーシス、細胞成長、血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｎｓｉｓ）および転移などの重要な発癌性事象を調節する、細胞内シグナル伝達経路、主にＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫカスケードおよびＰＩ３ＫＡｋｔ経路を活性化する。ＥＧＦＲの異常活性化または過剰発現はいくつかの種類の癌において報告されている（すなわち、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  Ｊ、Ｂａｓｅｌｇａ  Ｊら、「Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ−２００６、Ｖｏｌ．３３、ｐｐ．：３６９−３８）。ＥＧＦＲ遺伝子における変異は肺癌で説明されている。このような変異の例は、例えばＬｙｎｃｈ  ＴＪら、「Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｏ  ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ」、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ−２００４、Ｖｏｌ．３５０、ｐｐ：２１２９−２１３９の文献、またはＰａｅｚ  ＪＧら、「ＥＧＦＲ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ  ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ−２００４、Ｖｏｌ．３０４、ｐｐ．：１４９７−５００、またはＰａｏ  Ｗら、「ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｒｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｆｒｏｍ「ｎｅｖｅｒ  ｓｍｏｋｅｒｓ」ａｎｄ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｓ  ｔｏ  ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ  ａｎｄ  ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ−２００４、Ｖｏｌ．１０１、ｐｐ．：１３３０６−１３３１１に開示されている。
【０００３】
転移性結腸直腸癌（ｍＣＲＣ）は、西洋の国々の世界において癌による死の２番目の主な原因である。
【０００４】
ＥＧＦＲに対して向けられた、モノクローナル抗体（ｍｏＡｂ）、例えばセツキシマブおよびパニツムマブに基づいた治療は、ｍＣＲＣを患っている患者に顕著な生存利益を与え、現在、これらの患者についての治療レジメン、すなわち単独でまたは他の抗腫瘍薬（ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｉｃ  ｄｒｕｇ）（複数可）と併用してのいずれかでの標準的な成分になっている。これらのｍｏＡｂのうちの１つである、セツキシマブ（アービタックス）はまた、白金ベースの化学療法剤と併用して、頭頸部癌としても指定されている頭頸部の扁平上皮細胞癌腫を患っている患者の治療のために示されている。
【０００５】
ｍｏＡｂは癌細胞で発現された異質の抗原に結合する。一旦結合すると、癌細胞は患者の免疫系による破壊のためにマークされる。癌細胞を標的化することに加えて、ｍｏＡｂは腫瘍成長に必要な他の細胞種類および分子に対して作用するように設計できる。例えば、抗体は成長因子を中和できるので、腫瘍増殖を阻害できる。殆んどどんな細胞外／細胞表面標的（癌細胞など）にも特異的なｍｏＡｂを作製することが可能である。要約すれば、ｍｏＡｂは、悪性腫瘍細胞を破壊し、特異的細胞受容体を遮断することにより腫瘍成長を防止するために使用できる。治療的ｍｏＡｂであるセツキシマブおよびパニツムマブはＥＧＦＲに結合し、ＥＧＦＲにより駆動される細胞内シグナル伝達経路（すなわち、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫカスケードおよびＰＩ３Ｋ−ａｋｔ経路）の活性化を防止する。
【０００６】
不幸にも、ｍＣＲＣを患っている全ての患者が、ｍｏＡｂを含む治療レジメンに応答するとは限らない。このような治療に対する、ｍＣＲＣを患っている患者の応答の欠如は一次性であり得、すなわち抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂ治療の開始以来、一次抵抗として知られている。さらに、抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂに対して最初に応答する全てのｍＣＲＣ患者は、二次抵抗、すなわち抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂに対する獲得抵抗を常に生じる。両方の場合、結果は治療の失敗に終わる。ｍＣＲＣ患者におけるこのような治療抵抗の獲得の一因となる機構はまだ完全には知られていない。抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂ治療に対する同じ抵抗（一次または二次）が頭頸部癌を患っている患者において観測されている。
【０００７】
ＫＲＡＳ（Ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２  Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログとしても知られている）は、ＥＧＦＲ下流エフェクター、および抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂに対する一次抵抗のマーカーである。ＫＲＡＳはｍＣＲＣ患者の治療の最適化に対して顕著に影響を与える。結腸直腸腫瘍の４０パーセントはＫＲＡＳ遺伝子における変異を保有し、これらの患者は抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂから利益を受けない。現在の臨床診療において、抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂ治療を考慮されている全てのｍＣＲＣ患者はＫＲＡＳ試験を受けるべきであり、ＫＲＡＳ変異が検出される場合、患者はセツキシマブまたはパニツムマブ治療から除外されるべきである。
【０００８】
それにも関わらず、野生型ＫＲＡＳ腫瘍を患っているｍＣＲＣ患者の一部はなお、抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂから利益を受けない。野生型ＫＲＡＳ患者における抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂに対する応答率は、Ａｍａｄｏら、「Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ＫＲＡＳ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ−２００８、Ｖｏｌ．２８、ｐｐ．：１６２６−１６３４から導かれているように、化学療法と併用された場合、約６０％であり、化学療法難治性患者において単独で投与された場合、２０％未満である。
【０００９】
ＢＲＡＦ（セリン／トレオニン−タンパク質キナーゼＢ−Ｒａｆ）およびＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ）などの他のＥＧＦＲ下流遺伝子の変異、ならびにＰＴＥＮ（ホスファターゼおよびテンシンホモログ）の発現の損失、および他のＥＧＦＲ調節タンパク質の変化を活性化することは、抗ＥＧＦＲ治療に対する応答のための潜在的候補として評価されているものの、今までのところ結論が出ていない。これらの遺伝子における変異と抗ＥＧＦＲ治療に対する応答との間の関連性に関する情報は、Ｄｅ  Ｒｏｏｃｋら、「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＫＲＡＳ，ＢＲＡＦ，ＮＲＡＳ，ａｎｄ  ＰＩＫ３ＣＡ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ｐｌｕｓ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ：ａ  ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ−２０１０、Ｖｏｌ．１１、ｐｐ．：７５３−７６２の文献、またはＬｏｕｐａｋｉｓら、「ＰＴＥＮ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ＫＲＡＳ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｎｅｆｉｔ  ｏｆ  ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ｐｌｕｓ  ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ−２００９、Ｖｏｌ．２７、ｐｐ．：２６２２−２６２９の文献から導くことができる。
【００１０】
今まで抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂに対する応答のマーカーとしてのＥＧＦＲの潜在的な役割を解明するために実施された研究は、結論が出ていない。免疫組織化学により検出されているＥＧＦＲタンパク質発現は、抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂに対する応答の信頼できる予測マーカーではない。しかしながら、抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂに対する応答の潜在的なバイオマーカーとしてＥＧＦＲ遺伝子コピー数を支持している証拠が増加している。最新の抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂに基づいた治療に対する応答とのＥＧＦＲ遺伝子におけるヌクレオチド変化の関連性に関して、特にＧｏｎｃａｌｖｅｓら、「Ａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ＥＧＦＲ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｅｅ−ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ｃｅｔｕｘｉｍａｂ−ｂａｓｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」、ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ−２００８、Ｖｏｌ．８、ｐｐ．：１６９は、ｍＣＲＣ患者におけるセツキシマブの利益と関連するアミノ酸置換Ｒ５２１Ｋを生じる、ＥＧＦＲ遺伝子の細胞外部分における多型を記載している。多型または単一のヌクレオチド多型は、２０１１年１月から、データベースＥｎｓｅｍｂｌ（ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）から検索できるバリエーションＣＭ９４２３１２として識別されているものである。それは、ＧｅｎＢａｎｋから２０１１年６月２６日に利用可能となった、ＮＭ＿００５２２８バージョン３として識別されたｍＲＮＡ配列における５２１位のＡＧＧ−ＡＡＧでのコドン変化に対応する。
【００１１】
さらに、文献ＷＯ２００８／８８８６０もまた、ＥＧＦＲ遺伝子における多型Ｒ４９７Ｋを有する転移性もしくは非転移性消化管新生物または悪性腫瘍を患っている患者は、単剤抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂに基づいた治療（例えばセツキシマブまたはパニツムマブ）に対して応答性を示す可能性があることを開示している。この変異は、Ｇｏｎｃａｌｖｅｓら（上掲）により開示されているものと同じであるが、古くからの名称で識別されている。最後に、文献ＷＯ２００５０８５４７３２は、患者における癌を治療するためのＥＧＦＲを標的とする治療剤の有効性を減少させる、ＥＧＦＲタンパク質の過剰発現を誘導する、ＥＧＦＲ遺伝子の調節領域における１２個の多型の関連性を開示している。
【００１２】
要約すれば、最新技術に含まれる文献に示された結果は結論が出ていないだけでなく、依然として抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂに基づいた治療から利益を受けていない野生型ＫＲＡＳ腫瘍を患っている一部のｍＣＲＣ患者について、完全には明らかにしてもいない。
【００１３】
上記のことを考慮して、したがって、ｍＣＲＣを患っている患者における抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂ治療に対する抵抗性のさらなる予測バイオマーカーを識別する必要がある。
【発明の概要】
【００１４】
本発明者らは、癌治療に使用されるいくつかのｍｏＡｂによる治療に対する抵抗性と相関するＥＧＦＲの細胞外ドメイン（ドメインＩＩＩ）における変異を識別した。特に、本発明は、ＥＧＦＲタンパク質の４９２位におけるアルギニンアミノ酸置換によるセリンの驚くべき識別に基づく。変異タンパク質は配列番号１０と本明細書で識別したアミノ酸配列を有する。野生型タンパク質は配列番号８のアミノ酸配列を有する。変異は本明細書でＳ４９２Ｒと示される。
【００１５】
変異を有する個体はセツキシマブによる治療に対する抵抗性を示したので、このような治療的アプローチに有用性を与え、他の薬物ストラテジーを実施できるようにする。
【００１６】
したがって、本発明の第１の態様は、配列番号１（ＴＫＩＩＲＮＲＧＥ）を含むペプチド配列に関する。このアミノ酸配列は、４９２位におけるセリンがアルギニンにより置換されている、配列番号８のアミノ酸配列に対応する、ＥＧＦＲを体系化している全アミノ酸配列に由来する断片である。
【００１７】
有利には、配列番号１を含む変異ペプチドはさらに、癌治療に使用するために関連のあるセツキシマブ以外の抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂに対しても感受性がある。特にそれは、転移性結腸直腸癌（ｍＣＲＣ）の治療および頭頸部癌に対する化学療法に有用なｍｏＡｂに対して感受性がある。
【００１８】
第２の態様において、本発明は配列番号１をコードする配列を含むオリゴヌクレオチドを目的とする。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、配列番号３（ｇｇｇａｃｃｔｃｃｇｇｔｃａｇａａａａ）および４（ｃｇｇｔｇａｃｔｔａｃｔｇｃａｇｃｔｇｔｔｔ）からなるプライマーのセットである。
【００２０】
このプライマーのセットは、本発明の変異を生じるヌクレオチド変化が位置するＥＧＦＲコード領域の部分を含むゲノム領域を増幅させることを可能にする。したがって、それらは本発明者らにより識別される新規アミノ酸変異に関連する。
【００２１】
特に、本発明は、ＥＧＦＲタンパク質の４９２位におけるアルギニンアミノ酸置換によるセリン（本明細書でＳ４９２Ｒと示される変異）の驚くべき識別に基づく。このアミノ酸変化は、ＥＧＦＲ遺伝子のｍＲＮＡバリアント１の１７２２位におけるヌクレオチド変化Ｃ→Ａ（本明細書でＣ１７２２Ａとしても示される）の結果である。本発明のアミノ酸変化はまた、ＥＧＦＲ遺伝子のｍＲＮＡバリアント１のヌクレオチド１７２０位におけるヌクレオチド変化Ａ→Ｇ（本明細書でＡ１７２０Ｇとしても示される）の結果であり得る。最後に、本発明のアミノ酸変異はまた、ＥＧＦＲ遺伝子のｍＲＮＡバリアント１における以下のヌクレオチド（複数可）変化：１７２２位におけるＣ→Ｃ（本明細書でＣ１７２２Ｇとしても示される）、１７２０位におけるＡ→Ｃおよび１７２２位におけるＣ→Ｔ（本明細書でＡ１７２０Ｃ／Ｃ１７２２Ｔとしても示される）、１７２０位におけるＡ→Ｃ（本明細書でＡ１７２０Ｃとしても示される）、ならびに１７２０位におけるＡ→Ｃおよび１７２２位におけるＣ→Ｇ（本明細書でＡ１７２０Ｃ／Ｃ１７２２Ｇとしても示される）の各々の結果であり得る。
【００２２】
本発明の別の態様は、配列番号５（ｃａｃｃｔｃｔｇｔｔｔｃｔｔａｔａａｔｔ）からなるオリゴヌクレオチドである。
【００２３】
配列番号５のこのオリゴヌクレオチドは、本発明の変異を生じるヌクレオチド変化が位置するＥＧＦＲコード領域の変異領域に対して相補的である。したがって、それは、変異を有するヌクレオチド配列の断片とハイブリダイズする。それは、上記に開示した１７２２および／または１７２０位におけるヌクレオチド変化Ｃ→Ａを検出することを可能にする。
【００２４】
既に上記に示したように、上記のヌクレオチド変化の各々は、ＥＧＦＲ遺伝子のｍＲＮＡ、転写バリアント１配列（ＥＲＢＢ１、ＰＩＧ６１、プロトオンコジーンｃ−ＥｒｂＢ−１、トリ赤芽球性白血病ウイルス（ｖ−ｅｒｂ−ｂ）オンコジーンホモログ受容体チロシン−タンパク質キナーゼｅｒｂＢ−１、またはＨＥＲ１としても示される）を指す。ＥＧＦＲ遺伝子のｍＲＮＡ、転写バリアント１の配列は、配列番号７（または２０１１年６月２６日に利用可能となったＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５２２８．３）ならびにその任意のバリアントに対応するものであり、前記バリアントはＥＧＦＲタンパク質をコードする。ＥＧＦＲタンパク質は、そのＥＧＦＲタンパク質の基本構造を維持する配列番号８（２０１１年７月１７日のＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５２１９．２バージョン）またはその任意のバリアントに対応する。
【００２５】
また、本発明の別の態様は、配列番号６（ｃａｃｃｔｃｔｇｔｔｇｃｔｔａｔａａ）からなるオリゴヌクレオチドである。
【００２６】
配列番号６のこのオリゴヌクレオチドは、（変異が存在する場合）識別される変異が位置するＥＧＦＲコード領域の野生型領域に対して相補的である。
【００２７】
両方のオリゴヌクレオチドは、セリン変化によりアルギニンをもたらす変異の存在または非存在の検出を可能にする適切なプローブである。
【００２８】
本発明の別の態様は、以前に定義し、配列番号５に対応するオリゴヌクレオチドを含むキットである。
【００２９】
有利には、このキットは、変異ＥＧＲＦコード領域に対して相補的なプローブを含むので、容易かつ迅速な方法でＳ４９２Ｒ変異の存在を検出するのに有効なツールである。
【００３０】
また、本発明の別の態様は、セツキシマブおよび／またはパニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答の予測に使用するための上記に定義したキットである。
【００３１】
さらに、本発明はまた、対象から得た試料中の配列番号８に対応するアミノ酸配列の４９２位におけるアルギニンの存在または非存在を識別するインビトロ方法であって、遺伝子型法、および／またはタンパク質シークエンシング法からなる群から選択される手段により配列番号８の４９２位におけるアミノ酸を決定することを含む、方法にも関する。本発明のインビトロ方法は、配列番号１（ＴＫＩＩＲＮＲＧＥ）を含むペプチド配列を識別することを可能にする。
【００３２】
最後に、本発明の別の態様は、セツキシマブおよび／またはパニツムマブを含む対象の治療レジメンの応答を予測するインビトロ方法であって、ｉ）上記に開示した方法に定義したように、対象から得た試料中の配列番号８に対応するアミノ酸配列の４９２位におけるアルギニンの存在または非存在を決定する工程と、ｉｉ）工程ｉ）で識別したアルギニンの存在を、セツキシマブを含む治療レジメンに対する対象の抵抗性と関連付ける工程、または工程ｉ）で識別したアルギニンの非存在を、パニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答と関連付ける工程とを含む、方法である。
【００３３】
セツキシマブおよび／またはパニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答を予測するインビトロ方法の実施は、対象にとって、より適切な治療を適合する利点を示し、時間の無駄となる、誤ったまたは十分に有用でない治療アプローチを回避し、このことは、特に対象が癌に罹患している場合、対象および治療の成功にとって不可欠な態様である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】実施例３に関連し、野生型ＥＧＦＲ（ｗｔＥＧＦＲ）およびＳ４９２Ｒ  ＥＧＦＲと相互作用するセツキシマブおよびパニツムマブの相互作用を示す、直接結合アッセイのグラフである。ＷＴ−ＥＣＤ−Ｆｃは細胞外ドメインＦｃ（結晶化可能断片）を意味し、Ｓ４９２Ｒ−ＥＣＤ−Ｆｃは細胞外ドメインＦｃ（結晶化可能断片）を意味し、［Ａｂ］（ｎｇ／ｍｌ）は試験した抗体濃度（ナノグラム／ミリリットル）であり、ＯＤ４５０／６２０ｎｍは吸光度である。
【図２Ａ】ＥＧＦＲドメインＩＩＩとセツキシマブとの間の相互作用の構造モデリングであり、両方の分子の界面における本発明の変異の位置（ＥＧＦＲタンパク質の４９２位におけるアルギニン）を確認している図である。
【図２Ｂ】実施例３に関連し、セツキシマブまたはパニツムマブの存在下で培養した野生型ＥＧＦＲ（ｗｔＥＧＦＲ）およびＳ４９２Ｒ  ＥＧＦＲ変異体を過剰発現している全てのおよびリン酸化ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８における；本明細書でｐＥＧＦＲと命名した）ＮＩＨ３Ｔ３細胞溶解物のウェスタンブロット分析の図である。Ｔｕｂはチューブリンを意味する。
【図２Ｃ】実施例３に関連し、セツキシマブおよびパニツムマブで免疫化した、野生型ＥＧＦＲ（ｗｔＥＧＦＲ）およびＳ４９２Ｒ  ＥＧＦＲを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞の溶解物の全てのＥＧＦＲのウェスタンブロット分析の図である。Ｅは空、ＳＮは上清、ＩＰは免疫沈降物を意味し、Ｉは入力を意味する。
【図２Ｄ】実施例３に関連し、一次抗体としてセツキシマブまたはパニツムマブとインキュベートし、ヒトＩｇＧに対して向けられたフィコエリトリン（ｐｈｉｃｏｅｒｉｔｒｉｎ）とコンジュゲートした二次抗体を使用した野生型ＥＧＦＲ（ｗｔＥＧＦＲ）およびＳ４９２Ｒ  ＥＧＦＲ変異体を過剰発現するトリプシン処理したＮＩＨ３Ｔ３のフローサイトメトリー結合分析の図である。Ｃは計数を意味し、ＦＬ２Ｈは、フィコエリトリン（ＰＥ）蛍光を検出するために使用される５８５±２１の帯域通過を有する蛍光検出の第２のチャネルにおける最大信号強度を示し、Ｅは空を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
概して、説明、実施例および特許請求の範囲に使用される場合、以下の単語または語句は示した定義を有する。
【００３６】
最新技術においておよびまた、本明細書に使用される「治療レジメン」という用語は、前癌病変、癌または癌転移の成長を防止、遅延、停止または反転することを目的とする任意の治療を指す。それは、化学療法、放射線療法、免疫療法、モノクローナル抗体療法または他の方法を含む。
【００３７】
「応答」とは、限定されないが、腫瘍サイズまたは疾患もしくは疾患進行の証拠の測定可能な減少、安定した疾患、無生存の進行の増加もしくは延長、または毒性の減少から選択される、臨床もしくは非臨床のいずれかの任意の種類の改善と理解される。
【００３８】
「無生存の進行」とは、癌が成長しない、治療の間および後の時間の長さを示す。無生存の進行は、患者が完全な応答または部分的な応答を経験している時間の量、ならびに患者が安定した疾患を経験している時間の量を含む。
【００３９】
治療に対する「完全な応答」とは、腫瘍および疾患の全ての証拠が消失している、査定できるが、測定できない疾患を有している患者を定義する。
【００４０】
治療に対する「部分的な応答」とは、完全な応答より少ない応答をしている患者を定義する。
【００４１】
「遺伝子型法」という表現は、遺伝子型を決定するのに適切な全てのこれらの方法論およびプロセスを含み、またはそれは、所与の位置におけるヌクレオチドを識別することと同じである。前記方法論の例は、サンガーシークエンシング、パイロシークエンシング、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、変性高圧液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）、対立遺伝子特異的プライマー伸長（ＡＳＰＥ）、ＤＮＡバイオチップ／マイクロアレイおよび動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）を包含する。
【００４２】
「タンパク質シークエンシング法」に関しては、タンパク質のアミノ酸配列、ならびにタンパク質が取る構造およびタンパク質が任意の非ペプチド分子と複合する程度を決定することを可能にする任意の技術と理解される。アミノ酸組成の決定はアミノ酸の加水分解または分離により実施されてもよい。公知の技術には、サンガーシークエンシング、エドマン分解および質量分光測定が含まれる。
【００４３】
既に上記で説明したように、最新技術による教示は、一方で、対応するタンパク質の過剰発現を生じるＥＧＦＲ遺伝子の調節領域の変異が患者における癌を治療するためのＥＧＦＲ標的治療剤の減少した効果と関連していることを示唆している（ＷＯ２００５／８５４７３２を参照のこと）が、また、ＥＧＦＲ遺伝子のコード領域におけるヌクレオチド変化が、転移性もしくは非転移性消化管新生物または悪性腫瘍を患っている患者における単剤の抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂに基づいた治療に対する応答性と関連していることを示唆している（ＷＯ２００８／８８８６０を参照のこと）。これらは、さらに、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子のコード領域において識別されたヌクレオチド変化の効果を少なくともインビトロで分析し、それによりＥＧＦＲタンパク質に影響を与えることがさらに確認されていないという矛盾した結果である。したがって、ＷＯ２００８／８８８６０において識別されたヌクレオチド変化が応答性を引き起こす変異であるのか、または反対に、そのヌクレオチド変化との連鎖不均衡における、および別の遺伝子に位置する別の変異が応答性を引き起こすのかどうかは明確ではない。
【００４４】
最新技術において開示されている見解と対照的に、本発明はＥＧＦＲ遺伝子のコード領域における新規変異に基づく。本発明の新規変異は、ｍＣＲＣおよび／または頭頸部癌（扁平上皮細胞癌腫）を患っている患者のｍｏＡｂに基づいた治療に対する応答を予測するのに有用である。
【００４５】
上記に既に示したように、開示されたヌクレオチド変化の各々は配列番号８に対応するタンパク質配列の４９２位においてアルギニンへのセリンの置換をもたらす。
【００４６】
セリン４９２は、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン（ドメインＩＩＩとしても知られている）内に位置する。アルギニンは大きい側鎖を有するアミノ酸であるのに対して、セリンは極性アミノ酸である。したがって、本発明は、ＥＧＦＲタンパク質の４９２位に位置するアミノ酸（すなわちセリン）の大きいアミノ酸（例えばアルギニン）による置換が、ＥＧＦＲへのｍＡｂセツキシマブの結合に干渉するという見解に基づく。換言すれば、セツキシマブに結合するＥＧＦＲのエピトープに位置する本発明のアミノ酸変化はセツキシマブ−ＥＧＦＲ相互作用を特異的に妨害する。
【００４７】
さらに、およびなおいっそう驚くことに、セツキシマブ抵抗性を生じる本発明のアミノ酸変化は、別のｍｏＡｂ、すなわち、転移性結腸直腸癌（ｍＣＲＣ）の癌治療のために広範に使用されているｍｏＡｂであるパニツムマブのＥＧＦＲ結合に影響を与えない。
【００４８】
したがって、本発明は、ｍＣＲＣを罹患している患者に適当な治療を選択する方法であって、その適当な治療は、有効量のセツキシマブおよび／またはパニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｂａｂ）の投与を含む、方法を提供する。
【００４９】
配列番号１を含む単離ペプチドは、癌治療の分野において大きな関心があるＥＧＦＲタンパク質の変異形態の検出をもたらす重要な産物である。タンパク質のこの変異形態はまた、配列番号１をコードする配列を含むオリゴヌクレオチドの形態で検出可能である。
【００５０】
好ましい実施形態において、配列番号１をコードするオリゴヌクレオチドは、配列番号２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群から選択される核酸配列を含む。全てのこれらの配列は、式（Ｉ）：
ｃｃａａａａｔｔａｔａＸＹＺａａｃａｇａｇｇｔｇａ（Ｉ）
（式中、ヌクレオチドＸＹＺは、ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡおよびＣＧＧからなる群から選択されるヌクレオチドの組み合わせである）
に定義される一般的配列により概略的に表すことができる。
【００５１】
本発明に開示されるＥＧＦＲ遺伝子におけるヌクレオチド変化の検出は好ましくは、以下の方法により実施される：配列番号９に対応する標的ＤＮＡ配列の増幅後、変異プローブ（配列番号５）および野生型プローブ（配列番号６）を使用してアンプリコンが分析される。配列番号９は、２０１１年６月１９日に利用可能となったＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＧ＿００７７２６、バージョン１（ＮＧ＿００７７２６．１）に対応する。
【００５２】
好ましい実施形態において、変異プローブは配列番号５に対応するものであるのに対して、野生型プローブは配列番号６に対応するものであり、これらのプローブは、５’末端において６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）および標識ＶＩＣ（登録商標）を用いて、ならびに３’末端における非蛍光性の蛍光エクスティンター（ｅｘｔｉｎｔｏｒ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｙ）を含むマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）を用いて標識される。概略的に、プローブは以下の通りである：
野生型プローブ（標識された配列番号６）：
ＶＩＣ−５’−ＣＡＣＣＴＣＴＧＴＴＧＣＴＴＡＴＡＡ−３’−ＭＧＢ
変異特異的プローブ（標識された配列番号５）：
ＦＡＭ−５’−ＣＡＣＣＴＣＴＧＴＴＴＣＴＴＡＴＡＡＴＴ−３’−ＭＧＢ
【００５３】
プローブはまた、ＥＧＦＲ遺伝子の標的断片と以前にハイブリダイズされたものと同じものの特異的検出を可能にする他の適切な標識を含んでもよい。他の標識の例には、化学発光標識、放射性同位体標識、比色分析標識などが含まれる。
【００５４】
出願人が知っている限りでは、本発明の変異を生じるヌクレオチド変化が位置するＥＧＦＲゲノム領域の特定の部分は、最新技術において関心が示されていない。なぜなら、産業上の利用可能性がある変異はその領域において識別されていないからである。したがって、最新技術は、前記ゲノム領域をハイブリダイズし、増幅するプライマーは開示されていない。
【００５５】
したがって、本発明の変異を生じるヌクレオチド変化が位置するＥＧＦＲコード領域の部分を含むゲノム領域を増幅させるために特異的に設計した本発明に開示される新規プライマーは、本発明者らによって識別された新規アミノ酸変異と明確に関連付けられる。
【００５６】
増幅のために使用した好ましいプライマーは、配列番号３および配列番号４に対応するものである。これらのプライマーは、それぞれ、ＥＧＦＲ遺伝子、配列番号９（２０１１年６月１９日に利用可能となったＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＧ＿００７７２６、バージョン１（ＮＧ＿００７７２６．１）に対応する）のゲノム配列のヌクレオチド位置１４６３１８〜１４６２９７、および１４６２５３〜１４６２７１に位置する。
【００５７】
これらの方法は、本発明のヌクレオチド変化を識別するために使用される技術により限定されない。対象のヌクレオチド変化の検出に適した当該技術分野において公知の任意の技術が、本発明の方法に使用されてもよい。適切な技術には、限定されないが、増幅反応が含まれる。好ましい実施形態において、使用される増幅技術は、ポリメラーゼ連鎖反応である。より好ましい実施形態において、ＰＣＲはリアルタイムＰＣＲである。増幅条件は必要に応じて、当業者により容易に調整され得る。本発明の方法に適した増幅条件の例は実施例のセクションに提供されている。
【００５８】
代替として、対象の変異は、対象の領域に存在するコドンまたはアミノ酸の情報を与える、サンガーシークエンシングなどのシークエンシング反応により検出される。変異を検出するための適切な方法の例は、サンガーシークエンシング、パイロシークエンシング、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、変性高圧液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）を包含する。
【００５９】
したがって、対象から得た試料中の配列番号８に対応するアミノ酸配列の４９２位におけるアルギニンの存在または非存在を識別するための本発明のインビトロ方法は、好ましくは遺伝子型決定法を使用して実施される。別の好ましい実施形態において、配列番号８に対応するアミノ酸配列の４９２位におけるアルギニンの存在または非存在は、タンパク質シークエンシング法によりタンパク質レベルで実施される。
【００６０】
本発明によるキットの好ましい実施形態において、キットは、配列番号５（ｃａｃｃｔｃｔｇｔｔｔｃｔｔａｔａａｔｔ）からなるオリゴヌクレオチドおよびさらに配列番号６（ｃａｃｃｔｃｔｇｔｔｇｃｔｔａｔａａ）からなるオリゴヌクレオチドを含む。
【００６１】
より好ましい実施形態において、キットは、ＫＲＡＳおよび／またはＰＩＫ３ＣＡおよび／またはＢＲＡＦ遺伝子における変異を検出するための試薬をさらに含む。
【００６２】
上記に明らかにしたように、これらの遺伝子は、ｍｏＡｂ（ＫＲＡＳ）を用いた癌（すなわちｍＣＲＣ）の治療に対する抵抗性に関連するか、またはそれらは、薬物標的治療に対する潜在的候補として評価されるＥＧＦＲ調節タンパク質（ＰＩＫ３ＣＡおよびＢＲＡＦ）を体系化する。
【００６３】
それで、さらにより好ましい実施形態において、キットはまた、Ｋａｒａｐｅｔｉｓら、「Ｋ−ｒａｓ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｂｅｎｅｆｉｔ  ｆｒｏｍ  Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ」、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ−２００８、Ｖｏｌ．３５９、ｐｐ．：１７５７−１７６５により定義されているＧ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖからなる群から選択されるＫＲＡＳにおける変異を検出するためのツールおよび手段（試薬）を含む。全てのこれらの変異は、２０１１年７月２４からＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４９７６．２（ＧＴＰａｓｅ  ＫＲａｓアイソフォームｂ前駆体と命名された）および２０１１年７月２４日からＮＰ＿２０３５２４．１（ＧＴＰａｓｅ  ＫＲａｓアイソフォームａ前駆体と命名された）と識別されたＫ−ｒａｓのタンパク質配列のコドン１２および１３に位置する。
【００６４】
別の好ましい実施形態において、キットはまた、２０１１年７月１７日からＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００６２０９．２を有するＰＩＫ３ＣＡタンパク質を体系化するＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のエクソン９および２０の変異、および／または２０１１年７月２４日からＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４３２４．２と識別されたＢＲＡＦのタンパク質配列のコドン６００に位置するＶ６００Ｅ変異を検出するためのツールおよび手段（試薬）を含む。
【００６５】
セツキシマブおよび／またはパニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答の予測に使用するための本発明のキットは、好ましい実施形態において、転移性結腸直腸癌および頭頸部癌からなる群から選択される癌に対する対象の応答を予測するためのものである。好ましくは、キットは転移性結腸直腸癌の場合の応答を予測するためである。
【００６６】
セツキシマブおよび／またはパニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答を予測するインビトロ方法の好ましい実施形態において、対象はセツキシマブを含む治療レジメンで既に治療されている。
【００６７】
別の好ましい実施形態において、予測するインビトロ方法は癌に罹患している対象に適用可能である。好ましくは、癌は転移性結腸直腸癌および頭頸部癌からなる群から選択される。
【００６８】
セツキシマブおよび／またはパニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答を予測するインビトロ方法は、癌に罹患している対象に特に適している。特に好ましい癌は、転移性結腸直腸癌および頭頸部癌からなる群から選択される。
【００６９】
本発明は、癌、好ましくはｍＣＲＣまたは頭頸部癌に罹患している対象を治療する方法であって、ｉ）本発明のＳ４９２Ｒ  ＥＧＦＲ変異体の存在を決定すること、およびｉｉ）変異が存在しない場合、セツキシマブ、もしくはその組成物、または変異が存在する場合、パニツムマブ、もしくはその組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法をさらに提供する。
【００７０】
抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂである、セツキシマブおよびパニツムマブは、組成物として単独で、または化学療法薬などの他の化合物を含む治療レジメンにおいて投与されてもよい。
【００７１】
抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂである、セツキシマブおよびパニツムマブ、またはそれらの組成物は、癌（ｍＣＲＣまたは頭頸部）を治療するのに有効な量で、および例えば薬学的に許容可能な担体を含む任意の適切な製剤で投与または送達される。製剤は１つまたは複数の保存剤および／または安定剤をさらに含んでもよい。
【００７２】
セツキシマブおよび／またはパニツムマブを含む治療レジメンに対する対象の応答を予測するインビトロ方法は、本発明のＥＧＦＲ遺伝子におけるヌクレオチド変化が検出され得る腫瘍を含む試料中で実施される。ｍＣＲＣの場合、源から得た試料を直接使用してもよい、または前処理後の試料を使用してもよい。試料は前記腫瘍に隣接する正常組織をさらに含んでもよい。したがって、ｍＣＲＣの場合、試料は原発性結腸直腸癌生検またはその転移の生検から選択される。換言すれば、試料は、原発性腫瘍および転移を含む、結腸直腸癌試料由来の生検であってもよい。好ましい実施形態において、転移は肝組織にある。
【００７３】
対象には、限定されないが、ヒトまたは非ヒト哺乳動物を含む、任意の哺乳動物が含まれる。好ましくは、対象はヒトである。
【００７４】
本発明のＳ４９２Ｒ変異を有する患者は、無生存の進行の任意の適切な臨床もしくは準臨床の増加または延長により測定されるように、セツキシマブを含まない治療レジメンに対する応答を示すようである。
【００７５】
好ましい実施形態において、治療レジメンは、セツキシマブ単独であるか、またはイリノテカン、オキサリプラチンおよび／または５−フルオロウラシル（５−ＦＵまたは５ＦＵ）に基づいた化学療法レジメンとの併用である。好ましい実施形態において、治療レジメンはパニツムマブ単独であるか、またはイリノテカン、オキサリプラチンおよび／または５−フルオロウラシルに基づいた化学療法レジメンとの併用である。
【００７６】
説明および特許請求の範囲全体を通して、「含む」という用語およびその用語の変形は、他の技術的特徴、付加物、成分、または工程を除外することを意図していない。さらに、「含む」という用語およびその変形は「からなる」という表現を包含する。本発明のさらなる目的、利点および特徴は、説明を精査すれば当業者に明らかになるであろう、または本発明の実施により習得できる。以下の実施例および図面は例示の目的で提供され、それらは本発明を限定することを意図するものではない。さらに、本発明は本明細書に記載される特定のおよび好ましい実施形態の全ての可能な組み合わせを含む。
【実施例１】
【００７７】
腫瘍試料および患者
腫瘍被検査物はｍＣＲＣ患者の診断の間に、または外科手術から得た。生検は最も入手しやすい悪性病変（原発性腫瘍または転移のいずれか）から得た。
【００７８】
必要な場合、セツキシマブに基づいた治療に対する初期の応答後に腫瘍再成長（疾患進行）を示した患者由来の腫瘍病変の生検を採取した。一致した正常組織由来の被検査物を対照として得た。
【００７９】
ＫＲＡＳ（コドン１２および１３）、ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）のＤＮＡ抽出および変異分析を、Ｍｏｎｔａｇｕｔら、「Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−１（ＭＫＰ−１）ｉｍｐａｉｒｓ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａｎｔｉ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ」、Ｂｒ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ−２０１０、Ｖｏｌ．１０２、ｐｐ．：１１３７−１１４４による文献の変異分析において以前に記載されているように実施した。
【００８０】
ＰＩＫ３ＣＡの変異分析を、Ｄｅ  Ｒｏｏｃｋら、「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＫＲＡＳ，ＢＲＡＦ，ＮＲＡＳ，ａｎｄ  ＰＩＫ３ＣＡ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ｐｌｕｓ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ：ａ  ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ−２０１０、Ｖｏｌ．１１、ｐｐ．：７５３−７６２の手順に開示されているように、ＤｘＳ  ＰＩ３Ｋ変異試験キット（ＤｘＳ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）と同様に実施した。
【００８１】
ＥＧＦＲの増幅を、Ｐａｏら、「Ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｔｏ  ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ  ｏｒ  ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＥＧＦＲ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ」、ＰｌｏＳ  Ｍｅｄ  ２００５；２：ｅ７３において以前に記載されているように、ＬＳＩ  ＥＧＦＲ／ＣＥＰ７プローブ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｃ．、Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ、ＩＬ）を使用して蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により評価した。
【００８２】
ＥＧＦＲ  Ｓ４９２Ｒの分析を直接シークエンシングにより実施した。簡潔に述べると、変異領域を含有するＥＧＦＲエクソン１２の領域を、以下の条件：１０分間９５℃；９５℃、１分、６０℃、１’３０’’および７２℃１分の４０サイクル；ならびに７２℃で１０分の最後の伸長でＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ  Ｖｅｒｉｔｉサーマルサイクラーにおいてプライマー５’−ＴＴＧＣＡＧＴＣＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣ−３’（直接プライマーまたは配列番号１１）および５’−ＴＴＡＡＡＴＧＧＧＡＡＴＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＴＡＴＴ−３’（リバースプライマーまたは配列番号１２）を用いて増幅させた。製造業者の指示書に従ってＢｉｇＤｙｅ  ｖ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いてシークエンシングを実施し、３５００Ｄｘ  Ｇｅｎｅｔｉｃアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。ＳｅｑＳｃａｐｅソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して配列データファイルを分析し、独立したＰＣＲを用いて全ての変異を確認した。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７５００  ＦＡＳＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、３７．５ｎＭの各プローブおよび３７．５ｎＭの各プライマーを使用したＴａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＤＮＡのＰＣＲ増幅のリアルタイムモニタリングを行った。全ての決定はアッセイ内変動（ｉｎｔｒａ−ａｓｓａｙ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を最小化するために二連で実施した。
【実施例２】
【００８３】
Ｓ４９２Ｒ  ＥＧＦＲ変異およびセツキシマブに対する一次抵抗
セツキシマブ（アービタックス）およびパニツムマブ（ベクチビックス）はＨｏｓｐｉｔａｌ  ｄｅｌ  Ｍａｒ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｙから得、両方のモノクローナル抗体はすぐに使えた。ゲフィチニブはＳｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）から得、ＤＭＳＯに溶解し、アリコートし、−２０℃で保存した。精製したＥＧＦ組換えタンパク質はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入し、ＰＢＳ０，１％ＢＳＡに溶解し、アリコートし、−２０℃で保存した。
【００８４】
ＥＧＦＲ細胞外ドメインを配列決定し、セツキシマブに基づいた治療を施す前に、原発性腫瘍被検査物におけるＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ変異状態を８３人の転移性結腸直腸癌の患者から分析した。ひとまとめにして、これらの患者をセツキシマブを与える前に他の治療レジメンを用いて十分に前処置した。８２パーセントの患者において、セツキシマブをイリノテカンと併用して与えた。顕著に、対応するＥＧＦＲタンパク質（配列番号８）におけるＳ４９２Ｒアミノ酸変化を生じる、配列番号７のヌクレオチド１７２２に対応する位置におけるＣ→Ａヌクレオチド変化を、２人の患者の被検査物において検出した。両方の腫瘍はＫＲＡＳ、ＢＲＡＦおよびＰＩＫ３ＣＡ野生型であり、ＥＧＦＲ遺伝子増幅を示さなかった。Ｓ４９２Ｒ  ＥＧＦＲ変異は、前記患者に利用可能な一致した正常組織において検出しなかった。
【実施例３】
【００８５】
Ｓ４９２Ｒ  ＥＧＦＲ変異の存在およびセツキシマブに対する抵抗性
本発明のＳ４９２Ｒ  ＥＧＦＲ変異がセツキシマブに対する観測された抵抗性の原因であったかどうかを確立するために、完全長の野生型ＥＧＦＲおよびＳ４９２Ｒ  ＥＧＦＲ変異を、検出可能な内因性ＥＧＦＲ発現を欠いている培養したＮＩＨ３Ｔ３マウス胎児線維芽細胞株において異所的に発現させた。
【００８６】
ＥＧＦＲを、トランスフェクト細胞においてセツキシマブまたはパニツムマブの存在下でその天然リガンドＥＧＦで刺激した。野生型ＥＧＦＲ細胞において、セツキシマブおよびパニツムマブの両方はＥＧＦＲ活性化を阻害したのに対して、Ｓ４９２Ｒ変異を有する細胞において、セツキシマブではなく、パニツムマブがＥＧＦ誘導性のＥＧＦＲ活性化を効果的に遮断した（図２Ｂ）。
【００８７】
これらの結論は図２Ｂにおけるアッセイから導かれた。その図２Ｂは、セツキシマブまたはパニツムマブの存在下で培養した野生型ＥＧＦＲ（ｗｔ  ＥＧＦＲ）およびＳ４９２  ＥＧＦＲ変異体を過剰発現する、全ておよびリン酸化ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８において；本明細書でｐＥＧＦＲと命名した）ＮＩＨ３Ｔ３細胞溶解物のウェスタンブロット分析である。野生型ＥＧＦＲ（ｗｔ  ＥＧＦＲ）およびＳ４９２Ｒ  ＥＧＦＲ変異体を過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞をセツキシマブまたはパニツムマブ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で培養し、２時間後に細胞を１５分間、ＥＧＦ１０μｇ／ｍＬで刺激した。細胞溶解物を全ておよびリン酸化ＥＧＦＲ（配列番号８由来のＴｙｒ１０６８）のウェスタンブロット分析に供して、受容体の活性化を決定した。セツキシマブは、このｍｏＡｂを用いてアッセイを実施した場合、ｐＥＧＦＲに対応するバンドで観測されるように、Ｓ４９２Ｒ  ＥＧＦＲ変異細胞においてリガンド誘導性の活性化を元に戻すことができなかった。
【００８８】
溶解物を回収するために、細胞をＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液であるノニデットＰ−４０緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ＝７．４）５０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、１％ＮＰ４０、ＥＤＴＡ  ５ｍＭ、ＮａＦ  ５ｍＭ、Ｎａ３ＶＯ４  ２ｍＭ、ＰＭＳＦ  １ｍＭ、ロイペプチン５μｇ／ｍＬおよびアプロチニン５μｇ／ｍＬ）中でこすり落とした。４℃で３０分間振盪した後、試料を１３２００ｒｐｍにて３０分間遠心分離し、上清をアリコートし、使用するまで−２０℃で保存した。試料（３０μｇ／レーン）をＳＤＳ−ページに供し、ナイロン膜に移した。シグナル検出のために西洋ワサビペルオキシダーゼがコンジュゲートした二次抗体を使用して標準的な手順に従ってウェスタンブロッティングを実施した。膜の増強した化学発光処理、およびその後のＸ線フィルムへの曝露後に標的タンパク質を視覚化した。以下の抗体は以下の記載した製造業者から購入した：ホスホＥＧＦＲ（Ｙ１０６８またはＴｙｒ１０６８）、ＥＧＦＲはＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）から得た。
【００８９】
さらに、フローサイトメトリーならびに生化学的結合アッセイおよび免疫沈降により、野生型ＥＧＦＲを発現する細胞において、セツキシマブおよびパニツムマブの両方はＥＧＦＲに結合できたが、Ｓ４９２Ｒ  ＥＧＦＲを発現する細胞において、パニツムマブはＥＧＦＲに結合できたのに対して、セツキシマブ−ＥＧＦＲ結合は検出されなかったことが示された（図１、図２Ｃおよび２Ｄを参照のこと）。
【００９０】
図１は、直接結合アッセイによりインビトロで野生型ＥＧＦＲおよびＳ４９２Ｒ  ＥＧＦＲ変異体と相互作用するセツキシマブおよびパニツムマブの能力を示す。
【００９１】
上記に示すように、Ｓ４９２Ｒ  ＥＧＦＲがセツキシマブへの結合に直接影響を与えることをさらに検証するためにこのアッセイを実施した。野生型ＥＧＦＲおよびＳ４９２Ｒ変異体の細胞外ドメイン（ＥＣ）の精製した組換え形態を使用して、インビトロでの生化学結合研究を実施した（図１）。
【００９２】
競合結合アッセイを以下のように実施した：ＥＦＧＲの野生型（ＷＴ）および変異体細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合する抗ＥＧＦＲ  Ａｂを競合サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて比較した。組換えＥＧＦＲ  ＥＣＤヒトＦｃ融合タンパク質（ＷＴ、ＷＴ−ＥＣＤ−Ｆｃ；または図１における変異体、Ｓ４９２Ｒ−ＥＣＤ−ＦＣ）をプラスチック表面上に一晩固定した。次いでプレートを、ＢＳＡを含有するＰＢＳで遮断した。抗ＥＧＦＲ  Ａｂおよび陰性対照ｈｕＩｇＧ  Ａｂを連続希釈し、一定濃度にて等体積のビオチン標識したパニツムマブまたはセツキシマブと混合し、混合物をプレート上に加えた。試料を２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）コンジュゲートを検出物として加えた。基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をプレートに加え、反応を酸で停止させた。プレートを２波長値（ＯＤ４５０／６２０ｎｍ）で読み取り、ＷＴおよび変異体ＥＣＤからのＡｂ競合結合の結果を比較した。
【００９３】
細胞に基づいたアッセイと一致して、生化学結合研究により、Ｓ４９２Ｒ  ＥＧＦＲ変異体が、パニツムマブではなく、セツキシマブへの結合を選択的に欠損することが確認された。ビオチン標識したセツキシマブの検出はＳ４９２Ｒ変異体を用いた実験において任意の抗ＥＧＦＲ  Ａｂ濃度にて観測されず、このことは結合が存在しないことを意味する。
【００９４】
このことはまた、非特異的ＩｇＧを陰性対照として使用した、１０μｇ／ｍｌのセツキシマブおよびパニツムマブで免疫化した後に、野生型ＥＧＦＲ（ｗｔＥＧＦＲ）およびＳ４９２Ｒ  ＥＧＦＲを発現するＮＩＨ３Ｔ３由来の細胞溶解物の免疫沈降アッセイの結果（図２Ｃ）からも結論が出された。図２Ｃに示すように、全てのＥＧＦＲのウェスタンブロット分析により、セツキシマブがＳ４９２Ｒ  ＥＧＦＲ変異体に結合し、沈殿させることができなかったことが確認された。細胞溶解物中のＥＧＦＲの存在を確認するために沈殿物の入力（Ｉ）および上清（ＳＮ）画分を対照として使用した。
【００９５】
最後に、上記の結果もまた、フローサイトメトリーにより確認した。図２Ｄは、セツキシマブおよびパニツムマブが野生型ＥＧＦＲ（ｗｔ  ＥＧＦＲ）を発現する細胞の６０％と相互作用できたのに対して、パニツムマブのみがＳ４９２Ｒ  ＥＧＦＲ変異を発現する細胞に結合できたことを示している。野生型ＥＧＦＲおよびＳ４９２Ｒ  ＥＧＦＲ変異体を過剰発現するトリプシン処理したＮＩＨ３Ｔ３細胞を、一次抗体として１μｇ／ｍｌのセツキシマブまたはパニツムマブとインキュベートした。ヒトＩｇＧに対して向けられるフィコエリトリンとコンジュゲートした二次抗体を使用してフローサイトメトリーにより結合を分析した。空ベクター（Ｅ）を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を陰性対照として使用した。ヒストグラムは両方の抗体により検出された細胞の百分率を示す。
【００９６】
フローサイトメトリーを以下のように実施した：
【００９７】
細胞周期分布分析のために、細胞を成長させ、２４時間、４８時間および７２時間、セツキシマブで処理した。処理後、細胞をトリプシン処理により収集し、冷ＰＢＳで２回洗浄し、７０％エタノールで一晩固定した。冷ＰＢＳで細胞を２回洗浄することによりエタノールを除去した。光から保護して４℃にて少なくとも４８時間の間、５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムおよび１００μｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅを含有するＰＢＳを用いてＤＮＡについて細胞を染色した。ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して細胞周期分布を測定した。ＥＧＦＲに対するセツキシマブおよびパニツムマブの結合を測定するために、トリプシン処理により細胞を収集し、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を氷上で１５分間、Ｆｃ遮断試薬（ＭＡＣＳ（登録商標））とインキュベートして、免疫グロブリンの非特異的Ｆｃ結合を遮断した。細胞を洗浄し、氷上で３０分間、ＥＧＦＲ結合を検出するためにモノクローナル抗体とインキュベートした。ヤギ抗ヒトＩｇＧγフィコエリトリンコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を二次抗体として使用した。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してＥＧＦＲ結合を分析した。
【実施例４】
【００９８】
セツキシマブに対する獲得（または二次治療）抵抗を実証する結腸直腸癌を患っている患者におけるＳ４９２Ｒ  ＥＧＦＲ変異の検出
セツキシマブに対する獲得抵抗の機構としてのこの変異の臨床的関連を評価するために、Ｓ４９２Ｒ  ＥＧＦＲ変異が、セツキシマブに対する初期応答後に疾患進行を経験している転移性結腸直腸癌を患っている患者において見出され得るかどうかを試験した。
【００９９】
セツキシマブ治療を与える前および治療の失敗後（治療後の被検査物）の１０人の患者からの対の腫瘍試料を分析した。全ての治療前の試料は、原発性ｍＣＲＣ由来の転移組織であった、被検査物が肝病変由来であった１つの場合を除いて、原発性結腸腫瘍由来であった。治療後の試料は、超音波誘導を用いた経皮的生検により得られた肝転移由来であった。ほとんどの患者は転移性疾患のための少なくとも１系統の化学療法を以前に受け、全ての場合においてイリノテカンまたはオキサリプラチンと共にセツキシマブが投与されていた。
【０１００】
（上記で詳述した）ＤＮＡシークエンス分析により、ＥＧＦＲタンパク質ならびにＫＲＡＳ、ＢＲＡＦおよびＰＩＫ３ＣＡの細胞外ドメイン領域の変異状態を評価した。ＥＧＦＲ遺伝子コピー数もまた、（実施例１で詳述した）ＦＩＳＨにより研究した。
【０１０１】
全ての治療前の生検は、ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦおよびＰＩＫ３ＣＡについて野生型であった。セツキシマブで治療した後の腫瘍試料は、既知のＫＲＡＳ、ＢＲＡＦまたはＰＩＫ３ＣＡ変異のいずれも保有していなかったが、Ｓ４９２Ｒ変異を２人の患者で識別した。特に、１人の患者において観測された変異は、配列番号７のヌクレオチド１７２０におけるヌクレオチド置換Ａ→Ｃ変化に関連していた。それはまた、ＥＧＦＲタンパク質（配列番号８）のアミノ酸４９２においてセリンからアルギニンへの置換を生じる。野生型配列のみを示した患者由来の正常細胞の配列決定により、Ｓ４９２Ｒ変異が体細胞変異であったことが示された。他の患者において観測された変異は、インビトロ研究におけるものと同様であった。
【０１０２】
Ｓ４９２Ｒ変異を有している２人の患者のうちの１人は、セツキシマブ（４００ｍｇ／ｍ２の開始用量、続いてその後２５０ｍｇ／ｍ２／週）＋１日目にオキサリプラチン８５ｍｇ／ｍ２＋ロイコボリン２００ｍｇ／ｍ２ならびに１および２日目に２２時間の間、４００ｍｇ／ｍ２ボーラスとして、続いて６００ｍｇ／ｍ２注入としてフルオロウラシルを用いて治療した。治療を開始してから３カ月後、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンにより、固形腫瘍における応答評価基準（ＲＥＣＩＳＴ）（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒら、「Ｎｅｗ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｕｒｓ：ｒｅｖｉｓｅｄ  ＲＥＣＩＳＴ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１）」、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００９、Ｖｏｌ．４５（２）：２２８−２４７）に従って部分的応答が示された。しかしながら、治療の１０カ月後、肝病変は明らかな進行を示し、新たな肝病変が現れた。セツキシマブ治療は停止し、次いで先在する肝病変由来の生検を分子分析のために得、それはＳ４９２Ｒ  ＥＧＦＲ変異を表した。次いで患者をイリノテカンに基づいた化学療法で治療したが、応答しなかった。次いで２週間毎の単剤のパニツムマブ６ｍｇ／Ｋｇによる治療を開始し、治療の２カ月後、ＣＴスキャンにより、５０％超の全ての肝病変の減少が示された。
【０１０３】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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