(57)【要約】  本発明は、カチオン性ブックコポリマー及び核酸を含む複合体に関し、当該カチオン性ブロックコポリマーは、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロック、を含む少なくとも１つのトリブロック構造を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カチオン性ブロックコポリマーと核酸とを含む複合体であって、該カチオン性ブロックコポリマーは、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロック、を含む少なくとも１つのトリブロック構造を有する、複合体。
【請求項２】
前記カチオン性ブロックコポリマーの前記少なくともトリブロック構造が直鎖であり、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロックとを含み、該カチオン性ブロックは、各該２つの親水性ブロックの間に位置している、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
カチオン性ブロックが、約４０から約２００の重合されたモノマー残基ユニットを含む、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
前記カチオン性ブロックコポリマーの前記少なくともトリブロック構造が直鎖であり、１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロックとを含み、該親水性ブロックは、各該２つのカチオン性ブロックの間に位置している、請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
各カチオン性ブロックが、独立して、約２０から約１００の重合されたモノマー残基ユニットを含む、請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
前記トリブロック構造が、トリブロックＲＡＦＴポリマー構造である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項７】
前記カチオン性ブロックが、
２−アミノエチルメタクリレートハイドロクロライド、Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミドハイドロクロライド、Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド、Ｎ−［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチル］メタクリルアミド、２−Ｎ−モルホリノエチルアクリレート、２−Ｎ−モルホリノエチルメタクリレート、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルアクリレート、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、２−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）エチルメタクリレート、２−アクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロライド、メタアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロライド、２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）エチルメタクリレート、ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、２−（ジエチルアミノ）エチルスチレン、２−ビニルピリジン、及び４−ビニルピリジン
から選択される１つ以上の重合されたモノマー残基を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８】
前記核酸が、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ，二本鎖又は一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ＰｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ／小分子ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ／ｓｔＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ＳｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ＳｎＲＮＡ）リボザイム、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボヌクレアーゼ複合体、ヘアピン二本鎖ＲＮＡ（ヘアピンｄｓＲＮＡ）、空間的発現を媒介するｍｉＲＮＡ（ｓｄＲＮＡ）、ストレス応答ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）、細胞周期ＲＮＡ（ｃｃＲＮＡ）及び二本鎖又は一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項９】
４ｍＶから約４０ｍＶまでの範囲のゼータ電位を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１０】
核酸を細胞に送達する方法であって、
カチオン性ブロックコポリマーと核酸とを含む複合体を調製すること、及び
該複合体を該細胞へ導入すること
を含み、
該カチオン性ブロックコポリマーは、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロック、を含む少なくとも１つのトリブロック構造を有する、方法。
【請求項１１】
遺伝子発現をサイレンシングする方法であって、カチオン性ブロックコポリマーと、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される核酸とを含む複合体で、細胞をトランスフェクトすることを含み、
該カチオン性ブロックコポリマーが、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロック、を含む少なくとも１つのトリブロック構造を有する、方法。
【請求項１２】
核酸を酵素分解から保護する方法であって、
核酸をカチオン性ブロックコポリマーと複合体化することを含み、
該カチオン性ブロックコポリマーが、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロック、を含む少なくとも１つのトリブロック構造を有する、方法。
【請求項１３】
インビボで実施される場合の、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載される方法。
【請求項１４】
前記カチオン性ブロックコポリマーの前記少なくともトリブロック構造が直鎖であり、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロックを含み、該カチオン性ブロックが、各該２つの親水性ブロックの間に位置している、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記カチオン性ブロックコポリマーの前記少なくともトリブロック構造が直鎖であり、１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロックを含み、該親水性ブロックが、各該２つのカチオン性ブロックの間に位置している、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記トリブロック構造が、トリ−ブロックＲＡＦＴポリマー構造である、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記カチオン性ブロックが、２−アミノエチルメタクリレートハイドロクロライド、Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミドハイドロクロライド、Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド、Ｎ−［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチル］メタクリルアミド、２−Ｎ−モルホリノエチルアクリレート、２−Ｎ−モルホリノエチルメタクリレート、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルアクリレート、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、２−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）エチルメタクリレート、２−アクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロライド、メタアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロライド、２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）エチルメタクリレート、ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、２−（ジエチルアミノ）エチルスチレン、２−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン、から選択される１つ以上の重合されたモノマー残基を含む、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸が、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ，二本鎖又は一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ＰｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ／小分子ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ／ｓｔＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ＳｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ＳｎＲＮＡ）リボザイム、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボヌクレアーゼ複合体、ヘアピン二本鎖ＲＮＡ（ヘアピンｄｓＲＮＡ）、空間的発現を媒介するｍｉＲＮＡ（ｓｄＲＮＡ）、ストレス応答ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）、細胞周期ＲＮＡ（ｃｃＲＮＡ）及び二本鎖又は一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、から選択される、請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記複合体が、約４ｍＶから約４０ｍＶまでの範囲のゼータ電位を有する、請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸が、前記細胞において、ウイルス由来の遺伝子の発現をサンレンシングすることが可能である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
核酸を細胞に送達するための複合体の使用であって、該複合体が、カチオン性ブロックコポリマーと該核酸を含み、該カチオン性ブロックコポリマーが、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロック、を含む少なくとも１つのトリブロック構造を有する、使用。
【請求項２２】
遺伝子発現をサイレンシングするための複合体の使用であって、該複合体は、カチオン性ブロックコポリマーと、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される核酸とを含み、該カチオン性ブロックコポリマーは、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロック、を含む少なくとも１つのトリブロック構造を有する、使用。
【請求項２３】
酵素分解から核酸を保護することにおけるカチオン性ブロックコポリマーの使用であって、該カチオン性ブロックコポリマーが、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロック、を含む少なくとも１つのトリブロック構造を有する、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して、核酸複合体に関する。より詳細には、本発明は、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体、細胞に核酸を送達する方法におけるそのような複合体の使用、及び、遺伝子発現をサイレンシングする方法、に関する。本発明はさらに、酵素分解から核酸を保護する方法における当該カチオン性ポリマーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
かなりの研究の努力が、細胞に核酸を送達するための技術及び剤の開発に向けられてきた。例えば、遺伝子発現を制御し、したがって、遺伝性疾患、ウイルス感染及びガン等の状態の治療を促進する、特定の核酸配列を送達するための送達剤及び技術の開発にかなりの関心が存在する。
【０００３】
細胞に核酸をうまく送達するための重要なパラメーターには、核酸と複合体を形成する剤の使用が挙げられうる。当該剤は、典型的には、酵素分解から核酸を保護し及び／又は複合体化された核酸のトランスフェクションを促進しうる、核酸との安定な複合体を提供することが必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
細胞への核酸の送達を促進する核酸との複合体を形成するために、様々な剤が開発されてきた。例えば、脂質、リン酸カルシウム及びカチオン性  ポリマー剤が、トランスフェクション法において使用するのに適した核酸複合体の形成において、うまく採用されてきた。しかしながら、そのような剤及びそれらの使用には、多数の制限が課せられる。例えば、いくつかの剤は、様々な細胞タイプと適合性がない。さらに、いくつかの剤は、異なる核酸と複合体を形成するために及び／又は異なる細胞タイプとの使用に適用可能な得られる複合体のために、それらの使用を合わせるために、設計／改変されるためのその能力の点で、非常に限定されている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、細胞への核酸の送達を促進しえ、そのような改良された機能及び／又は現在の複合体の代替物を提供する、複合体を開発するための機会がまだ存在する。
【０００６】
発明の要旨
【０００７】
したがって、本発明は、カチオン性ブロックコポリマー及び核酸を含む複合体を提供し、当該カチオン性ブロックコポリマーは、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は１つの親水性ブロック及び２つのカチオン性ブロック、を含む、少なくとも１つのトリブロック構造を有する。
【０００８】
本発明による少なくとも１つのトリブロック構造を有するカチオン性ブロックコポリマーが、様々な核酸と安定な複合体を形成しえ、得られる複合体は、様々な細胞タイプへの核酸の改良されたトランスフェクションを提供することが、ここに見いだされた。複合体の形態である場合のカチオン性ブロックコポリマーは、酵素分解からの核酸の良好な保護を提供することも見いだされた。
【０００９】
そのブロックの特徴により、カチオン性ブロックコポリマー内の各ブロックは、所定の核酸との効率的な複合体化及び／又は所定の細胞タイプとの核酸の効率的なトランスフェクションを提供するように、有利に目的に合わせて設計されうる。カチオン性ブロックコポリマーはまた、選択した標的化された細胞タイプに複合体を指向する標的リガンドを導入するように、有利に目的に合わせて設計されうる。
【００１０】
特に、本発明により使用されるトリブロック構造を有するカチオン性ブロックコポリマーは、ジ−ブロック構造を有するカチオン性ブロックコポリマーと比較して、改良された核酸複合体安定性及びトランスフェクションを提供することが見出された。
【００１１】
一実施態様では、カチオン性ブロックコポリマーの少なくともトリブロック構造は、直鎖であり、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロックを含み、ここで、当該カチオン性ブロックは、各当該２つの親水性ブロックの間に配置されている。
【００１２】
別の実施態様では、カチオン性ブロックコポリマーの少なくともトリブロック構造は、直鎖であり、１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロックを含み、ここで、当該親水性ブロックは、各当該２つのカチオン性ブロックの間に配置されている。
【００１３】
更なる実施態様では、カチオン性コポリマーの少なくともトリブロック構造は、直鎖であり、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロックを含み、ここで、当該カチオン性ブロックは、各当該２つの親水性ブロックの間に配置され、直接結合されている。その場合、カチオン性ブロックコポリマーのトリブロック構造は、便宜上、Ａ−Ｂ−Ａトリブロック構造を有するように参照されえ、ここで、各Ａは、同じでも異なっていてもよく、親水性ブロックを示し、Ｂは、カチオン性ブロックを示す。
【００１４】
なお更なる実施態様では、カチオン性コポリマーの少なくともトリブロック構造は、直鎖であり、１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロックを含み、ここで、当該親水性ブロックは、各当該２つのカチオン性ブロックの間に配置され、直接結合されている。その場合、カチオン性ブロックコポリマーのトリブロック構造は、便宜上、Ｂ−Ａ−Ｂトリブロック構造を有するとして参照されえ、ここで、各Ｂは、同じでも異なっていてもよく、カチオン性ブロックを示し、Ａは、親水性ブロックを示す。
【００１５】
本発明はまた、核酸を細胞に送達する方法を提供し、当該方法は、以下を含む：
カチオン性ブロックコポリマー及び核酸を含む複合体を調製すること（当該カチオン性ブロックコポリマーは、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は、１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロック、を含む、少なくとも１つのトリブロック構造を有する）；並びに
当該細胞に当該複合体を導入すること。
【００１６】
一実施態様では、核酸は、遺伝子発現をサイレンシングするために、細胞へと送達される。
【００１７】
したがって、本発明はまた、遺伝子発現をサイレンシングする方法を提供し、当該方法は、カチオン性ブロックコポリマーとＤＮＡ及びＲＮＡから選択された核酸とを含む複合体で、細胞をトランスフェクトすることを含み、当該カチオン性ブロックコポリマーは、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は、１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロック、を含む、少なくとも１つのトリブロック構造を有する。
【００１８】
一実施態様では、ＤＮＡ及びＲＮＡは、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉｗｉ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ＲＮＡ）（ＰｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ／小分子ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ／ｓｔＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ＳｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ＳｎＲＮＡ）リボザイム、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボヌクレアーゼ型複合体、ヘアピン二本鎖ＲＮＡ（ヘアピンｄｓＲＮＡ）、空間的発現（ｓｐａｔｉａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）を媒介するｍｉＲＮＡ（ｓｄＲＮＡ）、ストレス応答ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）、細胞周期ＲＮＡ（ｃｃＲＮＡ）及び二本鎖又は一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、から選択される。
【００１９】
本発明により使用されるカチオン性ブロックコポリマーはまた、酵素分解に対する核酸の保護を付与することが見出された。
【００２０】
したがって、本発明はまた、酵素分解から核酸を保護する方法を提供し、当該方法は、核酸をカチオン性ブロックコポリマーと複合体化することを含み、当該カチオン性ブロックコポリマーは、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は、１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロック、を含む、少なくとも１つのトリブロック構造を有する。
【００２１】
細胞に核酸を送達するための複合体の使用も提供され、当該複合体は、カチオン性ブロックコポリマーと核酸とを含み、当該カチオン性ブロックコポリマーは、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は、親水性ブロックと２つのカチオン性ブロック、とを含む、少なくとも１つのトリブロック構造を有する。
【００２２】
細胞に核酸を送達する組成物の製造における複合体に使用を更に提供し、当該複合体は、カチオン性ブロックコポリマー及び核酸を含み、当該カチオン性ブロックコポリマーは、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は、１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロック、を含む、少なくとも１つのトリブロック構造を有する。
【００２３】
本発明はまた、遺伝子発現をサイレンシングするための複合体の使用を提供し、当該複合体は、カチオン性ブロックコポリマーと、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される核酸とを含み、当該カチオン性ブロックコポリマーは、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は、１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロック、を含む、少なくとも１つのトリブロック構造を有する。
【００２４】
本発明は更に、遺伝子発現をサイレンシングするための組成物の製造における複合体の使用を提供し、当該複合体は、カチオン性ブロックコポリマーと、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される核酸とを含み、当該カチオン性ブロックコポリマーは、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は、１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロック、を含む、少なくとも１つのトリブロック構造を有する。
【００２５】
一実施態様では、ＤＮＡ及びＲＮＡは、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ＰｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ／小分子ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ／ｓｔＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ＳｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ＳｎＲＮＡ）リボザイム、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボヌクレアーゼ型複合体、ヘアピン二本鎖ＲＮＡ（ヘアピンｄｓＲＮＡ）、空間的発現を媒介するｍｉＲＮＡ（ｓｄＲＮＡ）、ストレス応答ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）、細胞周期ＲＮＡ（ｃｃＲＮＡ）、及び二本鎖又は一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、から選択される。
【００２６】
本発明はまた、酵素分解から核酸を保護することにおけるカチオン性ブロックコポリマーの使用を提供し、当該カチオン性ブロックコポリマーは、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は、１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロック、を含む、少なくとも１つのトリブロック構造を有する。
【００２７】
本発明は更に、酵素分解から核酸を保護するための組成物の製造におけるカチオン性ブロックコポリマーの使用を提供し、当該カチオン性ブロックコポリマーは、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は、１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロック、を含む、少なくとも１つのトリブロック構造を有する。
【００２８】
本発明の更なる局面は、以下に及び発明の詳細な説明に表される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
図面の簡単な説明
本発明を、以下の非限定的図面を参照して本明細書中に記載する。ここで：
【００３０】
【図１】図１は、実施例１において調製したＡＢＡトリブロックコポリマーに曝したＣＨＯ−ＧＦＰ及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞の生存率を示す。
【図２】図２は、トリ−ブロックコポリマーとｓｉＲＮＡとの会合を、実施例１で調製したポリマーのシリーズについて、ポリマー：ｓｉＲＮＡ比（ｗ／ｗ）として、示す。また、対応するＮ／Ｐ比も示す。
【図３】図３は、Ｌ２０００ジＲＮＡサンプル又はポリマー／ジＲＮＡ複合体の平均ＥＧＦＰ（ＦＩＴＣ波長で測定した）蛍光の割合として示された、異なるｓｉＲＮＡ：ＲＡＦＴポリマー（実施例１で調製された）の組み合わせについての、ＣＨＯ−ＧＦＰ細胞においての遺伝子サイレンシングを示す。
【図４】図４は、Ｌ２０００サンプル又はポリマー／ジＲＮＡ複合体の平均ＥＧＦＰ（ＦＩＴＣ波長で測定した）蛍光についての、非サイレンシングｓｉＲＮＡの割合として示された、異なるｓｉＲＮＡ：４２２−３ポリマー（実施例１で調製した）濃度についての、ＣＨＯ−ＧＦＰ細胞においての遺伝子サイレンシングを示す。
【図５】図５は、  ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中のｓｉＲＮＡ／４２２−３ポリマー複合体の安定性を示す。（Ａ）ネイキッドなｓｉＲＮＡの安定性、（Ｂ）１００７−２：ｓｉＲＮＡ  ４：１、（Ｃ）１００７−２：ｓｉＲＮＡ  ４：１、（Ｄ）４２２−３：ｓｉＲＮＡ  ４：１及び（Ｅ）ＣＨＯ−ＧＦＰ  細胞におけるサイレンシングのために処置した複合体の生存率。
【図６】図６は更に、実施例６（ａ）で調製したトリブロックコポリマー及び実施例７（ｂ）で調製したジブロックコポリマーの細胞生存率を示す。
【図７】図７は、実施例６及び７で調製したブロックコポリマーのｓｉＲＮＡ取り込みを示すための電気泳動試験の結果を示す。ここで、ＪＧ２０Ａ、ＪＧ２０Ｂ、ＪＧ２０Ｃ、ＪＧ２０Ｄ、ＣＧ４０８Ａ、ＣＧ４０８Ｂは、それぞれ、１８９ＪＧ２０Ａ、１８９ＪＧ２０Ｂ、１８９ＪＧ２０Ｃ、１８９ＪＧ２０Ｄ、０４０８−Ａ、０４０８−Ｂへの参照である。
【図８】図８は、プレートリーダー（ａ）及びＦＡＣＳ（ｂ及びｃ）を使用して蛍光により測定した、トリブロックコポリマー（実施例６）及びジブロックコポリマー（実施例７）の相対的サイレンシング効果を示す。
【図９】図９は、電気泳動により示された、１００７−２（未標識）対１００７−２／ＰＦ（標識）の結合を示す。
【図１０】図１０は、標識された（１００７−２ＰＦ）及び未標識の（１００７−２）ＲＡＦＴ  ポリマーによる、ＣＨＯ−ＧＦＰのサイレンシングを示す。
【図１１】図１１は、ＣＨＯ及びＨｕｈ−ＧＦＰ細胞によるＲＡＦＴポリマー粒子の細胞取り込みを示す：ポリマーを、細胞の固定の２時間前に添加した。ポリマーシグナルは赤であり、ＤＡＰＩは、核（青）を染色し、ＧＦＰ（緑）は、細胞の輪郭を描いている。
【図１２】図１２は、は、ニワトリ胚における、６時間（Ａ）及び２４時間（Ｂ）での、（実施例１０で調製した）１００７−２／ＰＦ及びｓｉ２２複合体の取り込みを示す。ポリマー±ｓｉ２２を、１０日目の有胚のニワトリ卵の尿膜腔液中に注入し、３７℃で６又は２４時間インキュベートした。尿膜を取り除き、４％のパラホルムアルデヒドで２時間固定した。次いで、膜を、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で１時間透過処理し、ＤＡＰＩで２０分間染色して、核を可視化した。
【図１３】図１３は、ニワトリ胚における１００７−２に対する、ニワトリ胚（Ａ及びＢ）ＩＦＮ応答における１００７−２の毒性を示す。ポリマー±ｓｉ２２を、１０日目の有胚のニワトリ卵の尿膜腔液中に注入し、３７℃で６又は２４時間インキュベートした。尿膜を取り除き、全ＲＮＡを精製し、ＧＡＰＤＨと比較したＩＦＮα及びβについてのｑＲＴ−ＰＣＲに供した。結果は、１グループあたり５つのニワトリ胚  ±  ＳＥＭを示す。統計  ＊ＰＢＳに比較して、Ｐ  ＜０．０５。Ｏｎｅ  ｗａｙ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅｓ  ＡＮＯＶＡを、パラメトリックＴｕｋｅｙポスト分析（Ｃ、Ｄ及びＥ）を用いて行った。
【図１４】図１４は、ニワトリ胚におけるインフルエンザウイルス阻害を示す。ポリマー±相対的ｓｉＲＮＡを、１０日目の有胚のニワトリ卵の尿膜腔液中に注入し、２４時間インキュベートした。５００ｐｆｕのＰＲ８を、各胚の尿膜腔液中に注入し、３７℃で更に４８時間インキュベートした。尿膜腔液を回収し、ＴＣＩＤ５０を行った。結果は、１グループあたり５つのニワトリ胚±ＳＥＭを示す。統計  ＰＢＳに比較して＊Ｐ＜０．０５  １００７−２／ｓｉ２２に比較してΔ＜０．０５。Ｏｎｅ  ｗａｙ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅｓ  ＡＮＯＶＡ、パラメトリック、Ｔｕｋｅｙポスト分析。
【図１５】図１５は、ボロン酸（サンプルＢＣ６−１）を含むＲＡＦＴポリマー、及び、ボロン酸部分（ＢＣ１４）にガラクトースが複合体化したＲＡＦＴポリマー、による、ＣＨＯ−ＧＦＰのサイレンシングを示す。
【図１６】図１６は、電気泳動により示される異なるブロックコポリマー長を有する、３つのＡＢＡトリ−ブロックコポリマーのポリマーとのｓｉＲＮＡ結合を示している。当該図もまた、各ポリマーとの異なるモル比でのｓｉＲＮＡの結合を示す。
【図１７】図１７は、異なるモル比（Ｎ：Ｐ）のｓｉＲＮＡ及びポリマー複合体の細胞生存率  （トップパネル）並びにＣＨＯ−ＧＦＰサイレンシング（ボトルパネル）を示す。
【００３１】
いくつかの図は、色の表現又は実態を含んでいる。図の着色したバージョンは、要求があれば、入手可能である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
この明細書及び続く特許請求の範囲の全体にわたって、文脈がそうではないことを必要としなければ、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等のバリエーションは、述べられた整数又は工程或いは整数又は工程の群を含むことを意味するが、いずれのその他の整数又は工程或いは整数又は工程の群も排除することを意味するものではないと理解されるものではない。
【００３３】
この明細書における任意の先行刊行物（又はそれに由来する情報）における又は知られている任意の事項に対する参照は、先行刊行物（又はそれに由来する情報）、又はこの明細書が関連する努力の当該分野で慣用の一般知識の部分が、公知の事項を形成することの了解、承認、いずれの形でも示唆するものと解されるものではなく、解されるべきものでもない。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示していなければ、複数の局面を包含することが意図される。したがって、例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への参照には、一つの細胞及び２つ以上の細胞が包含され、「剤（ａｎ  ａｇｅｎｔ）」への参照には、１つの剤、及び２つ以上の剤が包含されるなど。
【００３５】
本発明は、カチオン性ブロックコポリマー及び核酸を含む複合体を提供する。本明細書中で使用される用語「複合体」は、カチオン性ブロックコポリマー及び核酸のイオン結合による会合を意味する。当該イオン結合は、カチオン性ブロックコポリマー及び核酸に関連する反対に荷電されたイオン間の静電引力に由来する。カチオン性ブロックコポリマーは、正電荷を提供し、したがって、核酸は、負電荷を提供することが理解される。
【００３６】
複合体を形成するために使用されうる、カチオン性ブロックコポリマーと核酸との比に関する特段の制限はない。一実施態様では、カチオン性ブロックコポリマーと核酸とのモル比は、１：１から１５：１まで、又は１：１から１０：１まで、又は２：１から１０：１まで、又は３：１から１０：１まで、又は４：１から１０：１まで、の範囲である。別の実施態様では、カチオン性ブロックコポリマーと核酸とのモル比は、２：１から７：１までの範囲である。
【００３７】
当業者は、カチオン性ブロックコポリマー及び核酸の電荷密度（ゼータ電位により示される）は、カチオン性ブロックコポリマーと核酸との比とともに、得られる複合体の全体の電荷／中性の状態に影響を与えることを理解する。
【００３８】
一実施態様では、複合体は、正のゼータ電位を有する。更なる実施態様では、複合体は、０ｍＶ超から約５０ｍＶまで、例えば、約４ｍＶ、５ｍＶ、６ｍＶ、７ｍＶ、８ｍＶ、９ｍＶ若しくは１０ｍＶから約４０ｍＶまで、又は、約１０ｍＶから約４０ｍＶまで、又は、約１５ｍＶから約３０ｍＶまで、又は、約２０ｍＶから約３０ｍＶまでの範囲の正のゼータ電位を有する。
【００３９】
本発明による複合体のゼータ電位は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒにより測定されるものである。当該ゼータ電位は、電場における粒子の移動度（電気泳動移動度（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｅｒｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ））及びサンプル中の粒子サイズの分布の測定から、計算される。
【００４０】
本明細書中で使用される用語「核酸」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、オリゴヌクレオチド（二本鎖又は一本鎖）、ＲＮＡ（センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ＰｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ＳｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ＳｎＲＮＡ））、リボザイム、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボヌクレアーゼ型複合体及び本明細書中で記載されるような他のそのような分子を包含する、核酸分子を示す。疑義を避けるために、用語「核酸」は、非天然の改変された形態及び天然の形態を包含する。
【００４１】
いくつかの実施態様では、核酸分子は、約８から約８０までの核酸塩基（すなわち、約８から約８０までの連続して連結された核酸）を含む。当業者は、本発明が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、又は８０核酸塩基長の核酸分子を具現化することを理解する。
【００４２】
用語「核酸」はまた、オリゴヌクレオチドアナログ、キメラ、ハイブリッド及びミメティック形態等の他のファミリーの化合物を包含する。
【００４３】
キメラオリゴマー化合物はまた、２つ以上の核酸分子（オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドアナログ、オリゴヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドミメティックを含むが、これらに限定されない。）複合体構造として形成されうる。慣用的に使用されるキメラ化合物には、ハイブリッド、ヘミマー、ギャップマー、エクステンデッドギャップマー（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｇａｐｍｅｒ）、インバーテッドギャップマー（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｇａｐｍｅｒ）及びブロックマー（ここで、様々な点改変又は領域が、ネイティブ又は改変ＤＮＡ及びＲＮＡタイプユニット並びに／又はミメティックタイプサブユニット（例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ及びその他等）から選択される。）が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなハイブリッド構造の調製は、例えば、米国特許第５，０１３，８３０号明細書、同第５，１４９，７９７号明細書、同第５，２２０，００７号明細書、同第５，２５６，７７５号明細書、同第５，３６６，８７８号明細書、同第５，４０３，７１１号明細書、同第５，４９１，１３３号明細書、同第５，５６５，３５０号明細書、同第５，６２３，０６５号明細書、同第５，６５２，３５５号明細書、同第５，６５２，３５６号明細書、及び同第５，７００，９２２に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書中に援用される。
【００４４】
ＲＮＡ及びＤＮＡアプタマーもまた考えられる。アプタマーは、旧来のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成以外の相互作用を介して、非−核酸又は核酸分子に対して特異的結合親和性を有する核酸分子である。アプタマーは、例えば、米国特許第５，４７５，０９６号明細書、同第５，２７０，１６３号明細書、同第５，５８９，３３２号明細書、同第５，５８９，３３２号明細書、及び同第５，７４１，６７９号明細書に記載されている。ますます多くの数のそれらの非−核酸標的を認識するＤＮＡ及びＲＮＡアプタマーが開発されてきており、キャラクタライズされてきている（例えば、Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６４：  ７６３−７９７．１９９５；  Ｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，  ３（６）：  ２６５−２７３，  １９９８参照）。
【００４５】
更なる改変は、核酸分子になされうるし、核酸塩基の位置、糖の位置から選択される終端の一つに、又は、ヌクレオシド間連結に、結合する共役基を包含しうる。
【００４６】
本発明により使用されるカチオン性ブロックコポリマーは、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は１つの親水性ブロック及び２つのカチオン性ブロック、を含む、少なくとも１つのトリブロック構造を有する。その最も単純な形態では、当該カチオン性ブロックコポリマーは、１つのトリ−ブロックコポリマーでありうる。しかしながら、当該トリ−ブロックコポリマーは、より高次のブロックコポリマー（例えば、テトラ−、ペンタ−、又はヘキサ−等のブロックコポリマーの部分を形成しうる。
【００４７】
「カチオン性ブロック」を含むカチオン性ブロックコポリマーにより、正味の正電荷を示す当該コポリマー構造内の識別可能なブロックが意味される。
【００４８】
「親水性ブロック」を含むカチオン性ブロックコポリマーにより、正味の親水性特性を示す当該コポリマー構造内の識別可能なブロックが意味される。
【００４９】
一実施態様では、カチオン性ブロックコポリマーの少なくともトリブロック構造は、直鎖であり、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロックを含みえ、ここで、当該カチオン性ブロックは、各２つの親水性ブロックの間に配置されている。
【００５０】
別の実施態様では、カチオン性ブロックコポリマーの少なくともトリブロック構造は、直鎖であり、１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロックを含み、ここで、当該親水性ブロックは、各２つのカチオン性ブロックの間に配置されている。
【００５１】
更なる実施態様では、カチオン性  コポリマーの少なくともトリブロック構造は、直鎖であり、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロックを含み、ここで、当該カチオン性ブロックは、各２つの親水性ブロックの間に配置され、直接結合されている。その場合、カチオン性ブロックコポリマーのトリブロック構造は、簡便には、Ａ−Ｂ−Ａトリブロック構造を有するように示されえ、ここで、各Ａは、同じでも異なっていてもよく、親水性ブロックを示し、Ｂは、カチオン性ブロックを示す。
【００５２】
なお更なる実施態様では、カチオン性コポリマーの少なくともトリブロック構造は、直鎖であり、１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロックを含み、ここで、当該親水性ブロックは、各２つのカチオン性ブロックの間に配置され、直接結合されている。その場合、カチオン性ブロックコポリマーのトリブロック構造は、簡便には、Ｂ−Ａ−Ｂトリブロック構造を有するように示されえ、ここで、各Ｂは、同じでも異なっていてもよく、カチオン性ブロックを示し、Ａは、親水性ブロックを示す。
【００５３】
存在する場合、２つのカチオン性ブロックのそれぞれ、又は、２つの親水性ブロックのそれぞれは、同じでも異なっていてもよい。
【００５４】
カチオン性ブロックコポリマーのトリブロック構造中の各ブロックは、ホモポリマーブロック又はコポリマーブロックでありうる。トリブロック構造のブロックがコポリマーである場合、当該コポリマーは、グラジエントコポリマー或いはランダム又は統計コポリマーでありうる。
【００５５】
どのようにカチオン性ブロックコポリマーを調製するかに依存して、トリブロック構造内の少なくとも１つのブロックは、連結基（それは、例えば、カチオン性ブロックコポリマーを形成するためのモノマーの重合を促進するための部分の残基であり得る。）を含みうる。その場合、カチオン性ブロックコポリマーのトリブロック構造は、例えば、Ａ−Ｂ−Ｌ−Ｂ−Ａとして表されえ、ここで、各Ａは、独立して、２つの親水性ブロックを示し、Ｂ−Ｌ−Ｂは、カチオン性ブロックを示す。
【００５６】
また、どのようにカチオン性ブロックコポリマーを調製するかに依存して、２つの親水性ブロックの一方又は両方（或いは、２つのカチオン性ブロック一方又は両方）は、カチオン性ブロックコポリマーを形成するためのモノマーの重合を促進するために使用された部分の末端残基を含みうる。例えば、カチオン性ブロックコポリマーのトリブロック構造は、Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｌ−Ｂ−Ａ−Ｘとして表されえ、ここで、Ａ、Ｂ及びＬは、上で直接的に定義したとおりであり、Ｘは、カチオン性ブロックコポリマーを形成するためのモノマーの重合を促進するために使用された部分の残基である。各Ｘは、同じでも異なっていてもよい。
【００５７】
カチオン性ブロックコポリマーを形成するためのモノマーの重合を促進するために使用される部分の残基であることにより、Ｘ及びＬは、一般的には、それら自体では、重合性ではない。トリブロック構造内のそのようなＸ及びＬ残基の存在にかかわらず、当業者は、構造「−Ｂ−Ｌ−Ｂ−」は、ブロック「−Ｂ−」と等価に考えられることを理解する。同様に、構造「Ｘ−Ａ−」は、ブロック「Ａ−」と等価に考えられる。例えば、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）剤が、カチオン性ブロックコポリマーを形成するためのモノマーの重合を促進するために使用される場合、カチオン性又は親水性ブロック（単数又は複数）は、ＲＡＦＴ剤の残基を含みうる。これは、これは、本発明に従う使用のためのカチオン性ブロックコポリマーを形成するために使用されうる見本となるＲＡＦＴ剤を参照して、スキーム１に下記される。
【００５８】
【化１】
2014520506.tif 000002
【００５９】
スキーム１を参照すると、図示された特定のＲＡＦＴ剤がコンポーネントＸ（×２）及びＬを含むことがみられうる。カチオン性ブロックを形成するためのモノマーと各２つの親水性ブロックとの重合を促進するためにＲＡＦＴ剤を使用することにより、得られるカチオン性ブロックコポリマーは、コンポーネントＸ−Ａ（×２）及びＢ−Ｌ−Ｂを含むことがみられえ、これは、次に、トリブロック構造Ａ−Ｂ−Ａ（ここで、Ａ及びＢは、本明細書中で規定したとおりである。）と等価であると考えられる。
【００６０】
親水性ブロック（単数又は複数）及びカチオン性ブロック（単数又は複数）は、一般的に、複数のモノマーユニット重合された残基（すなわち、重合されたモノマー残基ユニット）を含む。親水性ブロック（単数又は複数）及びカチオン性ブロック（単数又は複数）を形作る重合されたモノマー残基ユニットはまた、モノマー反復ユニットとして又は単に反復ユニットとして、当該分野で示されうる。ブロックを形成するために使用されるモノマーに関する更なる詳細を、以下に概説する。
【００６１】
カチオン性ブロックは、約５から約２００まで、又は約４０から約２００まで、又は約８０から約２００までの、重合されたモノマー残基ユニットを含みうる。カチオン性ブロックコポリマーが２つのカチオン性ブロックを含む場合、各カチオン性ブロックは、独立して、約５から約１００まで、又は約２０から約１００まで、又は約４０から約１００までの、重合されたモノマー残基ユニットを含みうる。独立して又はまとめると、カチオン性ブロック（単数又は複数）は、正味の正電荷を示す。一般的には、少なくとも約１０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも９０％、又はすべての、カチオン性ブロックを形作る重合されたモノマー残基ユニットは、正電荷を含む。
【００６２】
一実施態様では、カチオン性ブロックは、約５から約２００まで、又は約４０から約２００まで、又は約８０から約２００までの、それぞれが正電荷を含む重合されたモノマー残基ユニットを含む。
【００６３】
カチオン性ブロックコポリマーが、２つのカチオン性ブロックを含む場合、各カチオン性ブロックは、独立して、約５から約１００まで、又は約２０から約１００まで、又は約４０から約１００までの、それぞれが正電荷を含む重合されたモノマー残基ユニットを含む。
【００６４】
独立して又はまとめるとカチオン性ブロック（単数又は複数）は、核酸との複合体形成を促進するのに十分な電荷密度を含むことが理解される。
【００６５】
親水性ブロックは、約５から約２００まで、又は約３０から約２００まで、又は約４０から約１８０まで、又は約５０から約１８０まで、又は約６０から約１８０までの、重合されたモノマー残基ユニットを含みうる。カチオン性ブロックコポリマーが、２つの親水性ブロックを含む場合、各親水性ブロックは、独立して、約５から約１００まで、又は約１５から約１００まで、又は約２０から約９０まで、又は約２５から約９０まで、又は約３０から約９０までの、親水性の重合されたモノマー残基ユニットを含みうる。独立して又はまとめると親水性ブロック（単数又は複数）は、正味の親水性特性を示す。
【００６６】
一般的には、少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約９０％、又は約１００％の、親水性ブロックを形成する重合されたモノマー残基ユニットは、親水性モノマー残基ユニットである。
【００６７】
一実施態様では、親水性ブロックは、約５から約２００まで、又は約３０から約２００まで、又は約４０から約１８０まで、又は約５０から約１８０まで、又は約６０から約１８０までの、親水性の重合されたモノマー残基ユニットを含む。
【００６８】
カチオン性ブロックコポリマーが２つの親水性ブロックを含む場合、各親水性ブロックは、独立して、約５から約１００まで、又は約１５から約１００まで、又は約２０から約９０まで、又は約２５から約９０まで、又は約３０から約９０までの、親水性の重合されたモノマー残基ユニットを含みうる。
【００６９】
親水性及び疎水性等の用語は、一般的に、当該分野において、別のコンポーネントに対するあるコンポーネント間の相互作用（例えば、誘引性又は反発的な相互作用、又は溶解特性）を伝達するために使用され、別のコンポーネントに対する特定のコンポーネントの特性を量的に規定するためには使用されない。
【００７０】
例えば、親水性コンポーネントは、水等の水性媒体によってより湿りやすいか溶媒和されやすく、一方で、疎水性コンポーネントは、水等の水性媒体によってより湿りにくいか溶媒和されにくい。
【００７１】
本発明の文脈において、親水性ブロックは、生物学的流体（例えば、血液、血漿、血清、尿、唾液、乳、精液、膣液、滑液、リンパ液、羊水、汗及び涙）を含む水性媒体、並びに、植物から産生される水性溶液（例えば、滲出液及び排水液、木部、師部、樹脂、及び花蜜を含む。）に溶解性を示すポリマーブロックを意味することが意図される。
【００７２】
親水性ブロック（単数又は複数）は、一般的には、得られるカチオン性ブロックコポリマーが水性媒体に可溶性になるように、選択される。
【００７３】
カチオン性ブロック（単数又は複数）もまた、それが水性媒体に可溶性であるように親水性特性を示しうる。
【００７４】
カチオン性ブロックコポリマーは、一般的には、負電荷を有するモノマー残基ユニットを含まない。換言すれば、カチオン性ブロックコポリマーは、一般的には、両性ポリマーではない。
【００７５】
「正」又は「負」電荷への本明細書中における参照は、それぞれ、ブロックコポリマー又は核酸の一部分又は官能基が正又は負の電荷を示すことを意味することが意図される。当該部分又は官能基は、もちろん、最初は、中性状態で、引き続いて、荷電した状態に変換されうる。従って、当該官能基又は部分は、固有に、電荷を有しうるか、荷電した状態に、例えば求電子剤を添加又は除去することにより、変換可能でありえる。換言すれば、正荷電の場合、当該官能基又は部分は、四級アンモニウム官能基又は部分等の固有の電荷を有しうるか、或いは、当該官能基又は部分自体は中性でありうるが、例えば、三級アンモニウムカチオンのｐＨ依存的形成又は三級アミン基の四級化を介して、カチオンを形成するように荷電可能でありうる。負荷電の場合、当該官能基又は部分は、例えば、負荷電を提供する有機酸塩を含みうるか、或いは、当該官能基又は部分は、中性でありうる有機酸を含みうるが、例えば、酸性プロトンｐＨ依存的除去を介して、アニオンを形成するように荷電可能でありうる。
【００７６】
一実施態様では、カチオン性ブロックは、中性状態であり、続いて、正荷電した状態に変換されうる、官能基又は部分を含むモノマーを用いて、調製されうる。例えば、当該モノマーは、三級アミン官能基（これは、カチオン性ブロックを形成するために重合され際、正荷電された状態に四級化される。）を含みうる。
【００７７】
当業者は、荷電された状態において、カチオン性ブロックコポリマー自体に関連するカチオン、又は、核酸自体に関連するアニオンが、それに関連する適切なカウンターイオンを有することを理解する。
【００７８】
本発明による複合体を形成するために、静電引力及び複合体の形成を促進するために、カチオン性ブロック（単数又は複数）は、もちろん、正電荷を含まなければいけないし、核酸は、もちろん、負電荷を含まなければならない。
【００７９】
核酸分子上の正味の負電荷は、一般的には、負に荷電した核酸自体に由来する（例えば、リン酸基由来）。
【００８０】
カチオン性ブロックコポリマーは、正電荷を提供し、したがって、核酸は、負電荷を提供する。したがって、核酸分子になされる任意の改変（単数又は複数）は、カチオン性ブロックコポリマーとのイオン結合を介して、複合体を形成するのを可能とする程度まで、正味の負電荷を保持するべきであることが理解される。
【００８１】
カチオン性ブロックコポリマー及び核酸を含む複合体は、カチオン性ポリマー／核酸複合体を調製するための公知の技術を用いて調製されうる。例えば、水に懸濁される必要な量のポリマーは、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）等のｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｍｅｄｉａを含む容器に導入しうる。次いで、必要な量の核酸を、この溶液に導入し、得られる混合物を、複合体を形成するために、適切な時間量ボルテックスする。
【００８２】
核酸は、市販で得られうるし、又は当該分野で周知の技術を用いて調製又は単離されうる。
【００８３】
カチオン性ブロックコポリマーは、任意の適切な手段によって調製されうる。
【００８４】
一実施態様では、カチオン性ブロックコポリマーは、エチレン性不飽和モノマーの重合によって、調製される。エチレン性不飽和モノマーの重合は、好ましくは、リビング重合技術を用いて行われる。
【００８５】
リビング重合は、一般的には、不可逆的連鎖停止が実質的にない連鎖重合の一形態であると、当該分野で考えられている。リビング重合の重要な特徴は、モノマー及び重合をサポートする反応条件が提供されている間、ポリマー鎖が伸長し続けることである。リビング重合により調製されるポリマー鎖は、有利には、好に規定された分子構造、所定の分子量、及び狭い分子量分布又は低多分散を示しうる。
【００８６】
リビング重合の例には、イオン重合及び制御ラジカル重合（ＣＲＰ）が挙げられる。ＣＲＰの例には、イニファーター重合、安定遊離ラジカル媒介重合（ＳＦＲＰ）、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、及び可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
リビング重合を行うための、装置、条件、及び試薬は、当業者に周知である。
【００８８】
エチレン性不飽和モノマーを、リビング重合技術により重合する場合、一般的に、いわゆるリビング重合剤を使用することが必要とされる。「リビング重合剤」とは、リビングポリマー鎖（すなわち、リビング重合技術に従い形成されるポリマー鎖）を形成するように、１つ以上のエチレン性不飽和モノマーのリビング重合に、関与し制御又は媒介しうる化合物を意味する。
【００８９】
リビング重合剤としては、イオン重合及びＣＲＰから選択されるリビング重合を促進するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
本発明の一実施態様では、カチオン性ブロックコポリマーは、イオン重合により調製される。
【００９１】
リビングイオン重合は、動的連鎖担体がイオン又はイオン対である付加重合の一形態である。当該重合は、アニオン性又はカチオン性の動的連鎖担体を介して、進行する。換言すれば、伝搬する種は、負又は正のいずれかの電荷を有し、それ自体、それぞれに、関連するカウンターカチオン又はカウンターアニオンも存在する。例えば、アニオン重合の場合、リビング重合剤はＩ−Ｍ＋として表されえ、ここで、Ｉは、有機アニオン（例えば、置換されていてもよいアルキルアニオン）を表し、Ｍは、関連するカウンターカチオンを表す。或いは、リビングカチオン性重合の場合、リビング重合剤は、Ｉ＋Ｍ−として表されえ、ここで、Ｉは、有機カチオン（例えば、置換されていてもよいアルキルカチオン）を表し、Ｍは、関連するカウンターアニオンを表す。アニオン性及びカチオン性のリビング重合を行うための適切な試剤は、当業者に周知であり、非プロトン酸（例えば、アンモニウムトリクロライド、三フッ化ホウ素）、プロトン（ブレンステッド）酸、安定なカルベニウムイオン塩、有機金属化合物（例えば、Ｎ−ブチルリチウム、クミルカリウム）及びＺｉｅｇｌｅｒ−Ｎａｔｔａ触媒（例えば、トリエチルアンモニウム及びチタニウムテトラクロライド）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
本発明の一実施態様では、カチオン性ブロックコポリマーは、ＣＲＰにより調製される。
【００９３】
本発明の更なる実施態様では、カチオン性ブロックコポリマーは、イニファーター重合により調製される。
【００９４】
イニファーター重合は、ＣＲＰの一周知形態であり、一般的には、スキーム２に下記するメカニズムによって進むと理解されている。
【００９５】
【化２】
2014520506.tif 000003
【００９６】
スキーム２を参照すると、イニファーター剤ＡＢは、化学的、熱的、光化学的に、解離して、反応性ラジカル種Ａ及び一般的に比較的安定なラジカル種Ｂを産生する（対称的なイニファーターの場合、ラジカル種Ｂは、ラジカル種Ａと同じである。）（工程ａ）。ラジカル種Ａは、モノマーＭの重合を開始しえ（工程ｂにおいて）、ラジカル種Ｂとカップリングして不活化されうる（工程ｃにおいて）。イニファーターへの伝達（工程ｄにおいて）及び／又は休止状態のポリマーへの伝達（工程ｅにおいて）、その後、終了（工程ｆにおいて）は、イニファーター化学を特徴付ける。適切なイニファーター剤は、当業者に周知であるが、ジチオカーボネート、ジスルフィド、及びチウラムジスルフィド化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
本発明の更なる実施態様では、カチオン性ブロックコポリマーは、ＳＦＲＰにより調製される。
【００９８】
その名前に示唆されるように、このモードのラジカル重合は、スキーム３に下記するように、安定なラジカル種の産生を含む。
【００９９】
【化３】
2014520506.tif 000004
【０１００】
スキーム３を参照すると、ＳＦＲＰ剤ＣＤは、解離して、活性ラジカル種Ｃ及び安定ラジカル種Ｄを産生する。活性ラジカル種Ｃは、モノマーＭと反応して、これにより、伝搬鎖が安定なラジカル種Ｄと組み変わりうる。イニファーター剤とは異なり、ＳＦＲＰ剤は、伝達工程を提供しない。ＳＦＲＰを行うための適切な試剤は、当業者に周知であり、フェノキシ及びニトロキシラジカルを産生しうる部分が挙げられるが、これらに限定されない。試剤がニトロキシラジカルを産生する場合、重合技術は、ニトロキシ媒介重合（ＮＭＰ）としてより一般に知られている。
【０１０１】
フェノキシラジカルを産生しうるＳＦＲＰの例には２及び６位が、バルキーな基（例えば、ｔｅｒｔ−アルキル（例えば、ｔ−ブチル）、フェニル又はジメチルベンジル）により置換され、４位が、アルキル、アルキルオキシ、アリール、又はアリールオキシ基により又はヘテロ原子含有基（例えば、Ｓ、Ｎ又はＯ）（例えば、ジメチルアミノ又はジフェニルアミノ基）により置換されていてもよいフェノキシ基を含むものが挙げられる。そのようなフェノキシ基含有試剤のチオフェノキシアナログも意図される。
【０１０２】
ニトロキシラジカルを産生しうるＳＦＲＰ剤としては、置換基Ｒ１Ｒ２Ｎ−Ｏ−（ここで、Ｒ１及びＲ２は、三級アルキル基であるか、又は、Ｒ１及びＲ２はＮ原子と一緒に、環構造を形成し、好ましくは、三級分岐をＮ原子に対してα位に有する。）が挙げられる。そのようなニトロキシ置換基の例としては、２，２，５，５−テトラアルキルピロリジンオキシル、並びに、５員ヘテロ環式環が脂環式又は芳香族の環に縮合したもの、ヒンダード脂環式ジアルキルアミノキシル及びイミノキシル置換基が挙げられる。ＳＦＲＰで使用される一般的ニトロキシ置換基は、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシである。
【０１０３】
本発明の別の実施態様では、カチオン性ブロックコポリマーは、ＡＴＲＰにより調製される。
【０１０４】
ＡＴＲＰは、一般的には、ハロゲン原子等の移動可能な原子又は基を、伝搬ポリマー鎖に移動することにより、可逆的に伝搬ラジカルを不活化し、それにより、スキーム４に下記するように金属触媒の酸化状態を還元するための、遷移金属触媒を用いる。
【０１０５】
【化４】
2014520506.tif 000005
【０１０６】
スキーム４を参照すると、移動可能な基又は原子（Ｘ、例えば、ハライド、シアネート、チオシアネート又はアジド）を、有機化合物（Ｅ−Ｘ）から、酸化数（ｎ）を有する遷移金属触媒（Ｍｔ、例えば、銅、鉄、パラジウム、コバルト、レニウム、ロージウム、ルテニウム、モリブデン、ニオビウム、又はニッケル）に移動し、そのとき、モノマー（Ｍ）を用いた重合を開始するラジカル種が形成される。このプロセスの一部として、金属複合体が参加される（Ｍｔｎ＋１Ｘ）。同様の反応順序が、次いで、伝搬ポリマー鎖と休止状態のＸ末端キャップされたポリマー鎖との間で、確立される。
【０１０７】
本発明の更なる実施態様では、カチオン性ブロックコポリマーは、ＲＡＦＴ重合により、調製される。
【０１０８】
ＲＡＦＴ重合は、当該分野で周知であり、スキーム５に概説するメカニズムを介して動作すると考えられている。
【０１０９】
【化５】
2014520506.tif 000006
【０１１０】
スキーム５を参照すると、ＲＡＦＴ重合は、ＲＡＦＴ剤（１）と伝搬ラジカルとの反応を含む初期反応順序（ａ）を介して進むと考えられる。形成された不安定な中間ラジカル種（２）は、断裂して、ＲＡＦＴ剤由来のラジカル（Ｒ）とともに、一時的に不活化された休止状態のポリマー種（３）を形成する。このラジカルは、次いで、モノマー（Ｍ）の重合を促進しえ、それにより、重合が再開されうる。伝搬ポリマー鎖は、次いで、休止状態のポリマー種（３）と反応して、反応順序（ａ）と同様の反応順序（ｂ）を促進しうる。したがって、不安定な中間ラジカル（４）が形成され、続いて、断裂して、更なる鎖の伸長が可能なラジカルとともに、休眠状態のポリマー種を再び形成する。
【０１１１】
ＲＡＦＴ重合により形成されるポリマーを、簡便に、ＲＡＦＴポリマーとして参照しうる。重合のメカニズムのおかげで、そのようなポリマーは、モノマーの重合を促進したＲＡＦＴ剤の残基を含む。
【０１１２】
本発明により使用するために適したＲＡＦＴ剤は、チオカルボニルチオ基（これは、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−で表される二価の部分である。）を含む。ＲＡＦＴ剤の例は、Ｍｏａｄ  Ｇ．；  Ｒｉｚｚａｒｄｏ，  Ｅ；  Ｔｈａｎｇ  Ｓ，  Ｈ．  Ｐｏｌｙｍｅｒ  ２００８，  ４９，  １０７９−１１３１及びＡｕｓｔ．  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００５，  ５８，  ３７９−４１０；  Ａｕｓｔ．  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００６，  ５９，  ６６９−６９２；  Ａｕｓｔ．  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００９，  ６２，  １４０２−１４７２  （参照により、これらのすべての内容が、本明細書中に援用される）に記載されており、キサンチン、ジチオエステル、ジチオカーバメート及びトリチオカーボネート化合物が包含される。
【０１１３】
本発明により使用するために適したＲＡＦＴ剤は、一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）により示されうる：
【０１１４】
【化６】
2014520506.tif 000007
【０１１５】
ここで、Ｚ及びＲは、基であり、Ｒ＊及びＺ＊は、それぞれ、ｘ価及びｙ価の基であり、これらは、当該剤が、１つ以上のエチレン性不飽和モノマーの重合におけるＲＡＦＴ剤として機能しうるように、独立して選択され；ｘは、１以上の整数であり；ｙは２以上の整数である。
【０１１６】
１つ以上のエチレン性不飽和重合モノマーの重合においてＲＡＦＴ剤として機能するために、当業者は、Ｒ及びＲ＊は、典型的には、採用する重合条件下でフリーラジカル遊離基として機能し、かつ更に、フリーラジカル遊離基として、重合を司会する能力を有する、置換されていてもよい有機基であることを理解する。当業者はまた、Ｚ及びＺ＊は、典型的には、重合が過度に遅延されない程度まで、ＲＡＦＴ付加ラジカルの断裂速度を遅くすることなしに、フリーラジカル付加に対して、適切な高反応性のＣ＝Ｓ部分をＲＡＦＴ剤中に与えるように機能する、置換されていてもよい有機基であることを理解する。
【０１１７】
式（Ｉ）において、Ｒ＊は、ｘ価の基であり、ｘは１以上の整数である。したがって、Ｒ＊は、一価、二価、三価の基でありえるか、又はより高い価数を有しうる。例えば、Ｒ＊は、Ｃ２０アルキル鎖でありえ、式（Ｉ）に記載されたＲＡＦＴ剤の残りは、鎖からの複数の置換基ペンダントとして示されうる。一般的に、ｘは、１から約２０まで、例えば約２から約１０まで、又は１から約５までの範囲の整数である。一実施態様では、ｘ＝２である。
【０１１８】
同様に、式（ＩＩ）において、Ｚ＊は、ｙ価の基であり、ｙは、２以上の整数である。したがって、Ｚ＊は、二価、三価でありうるか、又はより高い価数を有しうる。一般的に、ｙは、２から約２０まで、例えば約２から約１０まで、又は２から約５までの範囲の整数である。
【０１１９】
本発明により使用されるＲＡＦＴ剤におけるＲの例には、置換されていてもよい、本発明により使用されるＲＡＦＴ剤におけるＲ＊の場合には、ｘ価の形態の置換されていてもよい、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、アシルチオ、カルボシクリルチオ、ヘテロシクリルチオ、ヘテロアリールチオ、アルキルアルケニル、アルキルアルキニル、アルキルアリール、アルキルアシル、アルキルカルボシクリル、アルキルヘテロシクリル、アルキルヘテロアリール、アルキルオキシアルキル、アルケニルオキシアルキル、アルキニルオキシアルキル、アリールオキシアルキル、アルキルアシルオキシ、アルキルカルボシクリルオキシ、アルキルヘテロシクリルオキシ、アルキルヘテロアリールオキシ、アルキルチオアルキル、アルケニルチオアルキル、アルキニルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルアシルチオ、アルキルカルボシクリルチオ、アルキルヘテロシクリルチオ、アルキルヘテロアリールチオ、アルキルアルケニルアルキル、アルキルアルキニルアルキル、アルキルアリールアルキル、アルキルアシルアルキル、アリールアルキルアリール、アリールアルケニルアリール、アリールアルキニルアリール、アリールアシルアリール、アリールアシル、アリールカルボシクリル、アリールヘテロシクリル、アリールヘテロアリール、アルケニルオキシアリール、アルキニルオキシアリール、アリールオキシアリール、アルキルチオアリール、アルケニルチオアリール、アルキニルチオアリール、アリールチオアリール、アリールアシルチオ、アリールカルボシクリルチオ、アリールヘテロシクリルチオ、アリールヘテロアリールチオ、及びポリマー鎖、が挙げられる。
【０１２０】
いずれの疑義も回避するために、本明細書中における「置換されていてもよい」アルキル、アルケニルなどへの参照は、アルキル及びアルケニル等の各基が、置換されていてもよいことを意味することが意図される。
【０１２１】
本発明により使用されるＲＡＦＴ剤におけるＲの例にも、置換されていてもよい、本発明により使用されるＲＡＦＴ剤におけるＲ＊の場合には、ｘ価の形態の置換されていてもよい、アルキル；飽和、不飽和又は芳香族炭素環式又はヘテロ環式環；アルキルチオ；ジアルキルアミノ；有機金属種；及びポリマー鎖、が挙げられる。
【０１２２】
本発明により使用されるＲＡＦＴ剤におけるＲの更に具体的な例には、置換されていてもよい、本発明により使用されるＲＡＦＴ剤におけるＲ＊の場合には、ｘ価の形態の、置換されていてもよい、Ｃ１−Ｃ１８アルキル、Ｃ２−Ｃ１８アルケニル、Ｃ２−Ｃ１８アルキニル、Ｃ６−Ｃ１８アリール、Ｃ１−Ｃ１８アシル、Ｃ３−Ｃ１８カルボシクリル、Ｃ２−Ｃ１８ヘテロシクリル、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロアリール、Ｃ１−Ｃ１８アルキルチオ、Ｃ２−Ｃ１８アルケニルチオ、Ｃ２−Ｃ１８アルキニルチオ、Ｃ６−Ｃ１８アリールチオ、Ｃ１−Ｃ１８アシルチオ、Ｃ３−Ｃ１８カルボシクリルチオ、Ｃ２−Ｃ１８ヘテロシクリルチオ、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロアリールチオ、Ｃ３−Ｃ１８アルキルアルケニル、Ｃ３−Ｃ１８アルキルアルキニル、Ｃ７−Ｃ２４アルキルアリール、Ｃ２−Ｃ１８アルキルアシル、Ｃ４−Ｃ１８アルキルカルボシクリル、Ｃ３−Ｃ１８アルキルヘテロシクリル、Ｃ４−Ｃ１８アルキルヘテロアリール、Ｃ２−Ｃ１８アルキルオキシアルキル、Ｃ３−Ｃ１８アルケニルオキシアルキル、Ｃ３−Ｃ１８アルキニルオキシアルキル、Ｃ７−Ｃ２４アリールオキシアルキル、Ｃ２−Ｃ１８アルキルアシルオキシ、Ｃ２−Ｃ１８アルキルチオアルキル、Ｃ３−Ｃ１８アルケニルチオアルキル、Ｃ３−Ｃ１８アルキニルチオアルキル、Ｃ７−Ｃ２４アリールチオアルキル、Ｃ２−Ｃ１８アルキルアシルチオ、Ｃ４−Ｃ１８アルキルカルボシクリルチオ、Ｃ３−Ｃ１８アルキルヘテロシクリルチオ、Ｃ４−Ｃ１８アルキルヘテロアリールチオ、Ｃ４−Ｃ１８アルキルアルケニルアルキル、Ｃ４−Ｃ１８アルキルアルキニルアルキル、Ｃ８−Ｃ２４アルキルアリールアルキル、Ｃ３−Ｃ１８アルキルアシルアルキル、Ｃ１３−Ｃ２４アリールアルキルアリール、Ｃ１４−Ｃ２４アリールアルケニルアリール、Ｃ１４−Ｃ２４アリールアルキニルアリール、Ｃ１３−Ｃ２４アリールアシルアリール、Ｃ７−Ｃ１８アリールアシル、Ｃ９−Ｃ１８アリールカルボシクリル、Ｃ８−Ｃ１８アリールヘテロシクリル、Ｃ９−Ｃ１８アリールヘテロアリール、Ｃ８−Ｃ１８アルケニルオキシアリール、Ｃ８−Ｃ１８アルキニルオキシアリール、Ｃ１２−Ｃ２４アリールオキシアリール、アルキルチオアリール、Ｃ８−Ｃ１８アルケニルチオアリール、Ｃ８−Ｃ１８アルキニルチオアリール、Ｃ１２−Ｃ２４アリールチオアリール、Ｃ７−Ｃ１８アリールアシルチオ、Ｃ９−Ｃ１８アリールカルボシクリルチオ、Ｃ８−Ｃ１８アリールヘテロシクリルチオ、Ｃ９−Ｃ１８アリールヘテロアリールチオ、及び約５００〜約８０，０００の範囲の、例えば約５００〜約３０，０００の範囲の、数平均分子量を有するポリマー鎖、が挙げられる。
【０１２３】
ポリマー鎖の更に具体的な例には、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ｎ−ブチルアクリレート）、ポリ（ｔｅｒｔ−ブチルアクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（ビニルアセテート）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリスチレン−ブロック−ポリ（ｔｅｒｔ−ブチルアクリレート）、ポリスチレン−ブロック−ポリ（アクリル酸）、ポリ（パラ−アセトキシスチレン）（ｐｏｌｙ（ｐａｒａ−ａｃｅｔｏｘｙｓｔｒｙｅｎｅ））、ポリ（パラ−ヒドロキシスチレン）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリ（ヒドロキシエチルアクリレート）、ポリ（オリゴエチレングリコールアクリレート）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ポリ（メチルメタクリレート）−ブロック−ポリ（スチレン）、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（メチルメタクリレート、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、及びポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリスチレン−ブロック−ポリ（アクリル酸）が挙げられる。
【０１２４】
本発明により使用されるＲＡＦＴ剤におけるＲが、そして本発明により使用されるＲＡＦＴ剤におけるＲ＊の場合には、ｘ価の形態の、置換されていてもよいポリマー鎖を包含する場合、当該ポリマー鎖は、任意の適切な重合プロセス（例えば、ラジカル、イオン、配位、逐次又は縮合の重合）により形成されうる。
【０１２５】
ポリマー鎖を含むリビング重合剤は、一般的には当該分野において「マクロ」リビング重合剤として参照される。そのような「マクロ」リビング重合剤は、簡便には、１つ以上のエチレン性不飽和重合モノマーを、所定のリビング重合剤の制御下で、重合することにより、調製されうる。
【０１２６】
一実施態様では、当該ポリマー鎖は、エチレン性不飽和モノマーを、ＲＡＦＴ剤の制御下で、重合することにより調製される。
【０１２７】
本発明により使用されるＲＡＦＴ剤におけるＺの例には、置換されていてもよい、本発明により使用されるＲＡＦＴ剤におけるＺ＊の場合には、ｙ価の形態の置換されていてもよい：Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アルキル、アリール、アシル、アミノ、カルボシクリル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、アシルオキシ、アシルアミノ、カルボシクリルオキシ、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロアリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、アシルチオ、カルボシクリルチオ、ヘテロシクリルチオ、ヘテロアリールチオ、アルキルアリール、アルキルアシル、アルキルカルボシクリル、アルキルヘテロシクリル、アルキルヘテロアリール、アルキルオキシアルキル、アリールオキシアルキル、アルキルアシルオキシ、アルキルカルボシクリルオキシ、アルキルヘテロシクリルオキシ、アルキルヘテロアリールオキシ、アルキルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルアシルチオ、アルキルカルボシクリルチオ、アルキルヘテロシクリルチオ、アルキルヘテロアリールチオ、アルキルアリールアルキル、アルキルアシルアルキル、アリールアルキルアリール、アリールアシルアリール、アリールアシル、アリールカルボシクリル、アリールヘテロシクリル、アリールヘテロアリール、アリールオキシアリール、アリールアシルオキシ、アリールカルボシクリルオキシ、アリールヘテロシクリルオキシ、アリールヘテロアリールオキシ、アルキルチオアリール、アリールチオアリール、アリールアシルチオ、アリールカルボシクリルチオ、アリールヘテロシクリルチオ、アリールヘテロアリールチオ、ジアルキルオキシ−、ジヘテロシクリルオキシ−又はジアリールオキシ−ホスフィニル、ジアルキル−、ジヘテロシクリル−又はジアリール−ホスフィニル、シアノ（すなわち、−ＣＮ）、及び−Ｓ−Ｒ（ここで、Ｒは、式（ＩＩ）の点で規定したとおりである。）が挙げられる。
【０１２８】
本発明により使用されるＲＡＦＴ剤におけるＺの更に具体的な例には、置換されていてもよい、本発明により使用されるＲＡＦＴ剤におけるＺ＊の場合には、ｙ価の形態の置換されていてもよい：Ｆ、Ｃｌ、Ｃ１−Ｃ１８アルキル、Ｃ６−Ｃ１８アリール、Ｃ１−Ｃ１８アシル、アミノ、Ｃ３−Ｃ１８カルボシクリル、Ｃ２−Ｃ１８ヘテロシクリル、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロアリール、Ｃ１−Ｃ１８アルキルオキシ、Ｃ６−Ｃ１８アリールオキシ、Ｃ１−Ｃ１８アシルオキシ、Ｃ３−Ｃ１８カルボシクリルオキシ、Ｃ２−Ｃ１８ヘテロシクリルオキシ、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロアリールオキシ、Ｃ１−Ｃ１８アルキルチオ、Ｃ６−Ｃ１８アリールチオ、Ｃ１−Ｃ１８アシルチオ、Ｃ３−Ｃ１８カルボシクリルチオ、Ｃ２−Ｃ１８ヘテロシクリルチオ、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロアリールチオ、Ｃ７−Ｃ２４アルキルアリール、Ｃ２−Ｃ１８アルキルアシル、Ｃ４−Ｃ１８アルキルカルボシクリル、Ｃ３−Ｃ１８アルキルヘテロシクリル、Ｃ４−Ｃ１８アルキルヘテロアリール、Ｃ２−Ｃ１８アルキルオキシアルキル、Ｃ７−Ｃ２４アリールオキシアルキル、Ｃ２−Ｃ１８アルキルアシルオキシ、Ｃ４−Ｃ１８アルキルカルボシクリルオキシ、Ｃ３−Ｃ１８アルキルヘテロシクリルオキシ、Ｃ４−Ｃ１８アルキルヘテロアリールオキシ、Ｃ２−Ｃ１８アルキルチオアルキル、Ｃ７−Ｃ２４アリールチオアルキル、Ｃ２−Ｃ１８アルキルアシルチオ、Ｃ４−Ｃ１８アルキルカルボシクリルチオ、Ｃ３−Ｃ１８アルキルヘテロシクリルチオ、Ｃ４−Ｃ１８アルキルヘテロアリールチオ、Ｃ８−Ｃ２４アルキルアリールアルキル、Ｃ３−Ｃ１８アルキルアシルアルキル、Ｃ１３−Ｃ２４アリールアルキルアリール、Ｃ１３−Ｃ２４アリールアシルアリール、Ｃ７−Ｃ１８アリールアシル、Ｃ９−Ｃ１８アリールカルボシクリル、Ｃ８−Ｃ１８アリールヘテロシクリル、Ｃ９−Ｃ１８アリールヘテロアリール、Ｃ１２−Ｃ２４アリールオキシアリール、Ｃ７−Ｃ１８アリールアシルオキシ、Ｃ９−Ｃ１８アリールカルボシクリルオキシ、Ｃ８−Ｃ１８アリールヘテロシクリルオキシ、Ｃ９−Ｃ１８アリールヘテロアリールオキシ、Ｃ７−Ｃ１８アルキルチオアリール、Ｃ１２−Ｃ２４アリールチオアリール、Ｃ７−Ｃ１８アリールアシルチオ、Ｃ９−Ｃ１８アリールカルボシクリルチオ、Ｃ８−Ｃ１８アリールヘテロシクリルチオ、Ｃ９−Ｃ１８アリールヘテロアリールチオ、ジアルキルオキシ−、ジヘテロシクリルオキシ−又はジアリールオキシ−ホスフィニル（すなわち、−Ｐ（＝Ｏ）ＯＲｋ２）、ジアルキル−、ジヘテロシクリル−又はジアリール−ホスフィニル（すなわち、−Ｐ（＝Ｏ）Ｒｋ２）（ここで、Ｒｋは、置換されていてもよいＣ１−Ｃ１８アルキル、置換されていてもよいＣ６−Ｃ１８アリール、置換されていてもよいＣ２−Ｃ１８ヘテロシクリル、及び置換されていてもよいＣ７−Ｃ２４アルキルアリールから選択される。）、シアノ（すなわち、−ＣＮ）、及び−Ｓ−Ｒ（ここで、Ｒは、式（ＩＩ）の点で規定したとおりである。）が挙げられる。
【０１２９】
一実施態様では、本発明により使用されるＲＡＦＴ剤は、トリチオカーボネートＲＡＦＴ剤であり、Ｚ又はＺ＊は、置換されていてもよいアルキルチオ基である。
【０１３０】
本発明による使用に適切なマクロＲＡＦＴ剤は、市販で（例えば、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈカタログ（ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）に記載されるものを参照）、入手されうる。
【０１３１】
本発明により使用されうる他のＲＡＦＴ剤には、ＷＯ２０１０８３５６９及びＢｅｎａｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  （４２），  ９３８４−９３８６，  ２００９（これらの全体が、参照により本明細書中に援用される）に記載されているものが挙げられる。
【０１３２】
一実施態様では、カチオン性ブロックコポリマーの少なくとも１つのトリブロック構造は、ＲＡＦＴ重合により形成される。その場合、当該少なくとも１つのトリブロック構造は、簡便には、トリ−ブロックＲＡＦＴポリマー構造として参照されうる。
【０１３３】
したがって、本発明はまた、カチオン性ブロックコポリマーと核酸を含む複合体を提供し、当該カチオン性ブロックコポリマーは、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック又は１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロックを含む、少なくとも１つのトリ−ブロックＲＡＦＴポリマー構造を有する。
【０１３４】
各アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、カルボシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びポリマー鎖部分からＺ、Ｚ＊、Ｒ及びＲ＊が選択されうる本明細書中のリストにおいて規定する基は、置換されていてもよい。いずれの疑義をも回避するため、所定のＺ、Ｚ＊、Ｒ及びＲ＊が２つ以上のそのような部分（例えば、アルキルアリール）を含む場合、そのような部分のそれぞれは、１つ、２つ、３つ又はそれ以上の本明細書中で規定したような任意の置換基で置換されていてもよい。
【０１３５】
Ｚ、Ｚ＊、Ｒ及びＲ＊が選択されうる本明細書中のリストにおいて規定する基は、所定のＺ、Ｚ＊、Ｒ又はＲ＊が、２つ以上のサブグループ（例えば、［グループＡ］［グループＢ］）を含む場合、サブグループの順序は、それらが例示された順序に限定されることを意図するものではない。したがって、［グループＡ］［グループＢ］（例えば、アルキルアリール）として規定された２つのサブグループを有するＺ、Ｚ＊、Ｒ又はＲ＊は、［グループＢ］［グループＡ］（例えば、アリールアルキル）として規定された２つのサブグループを有するＺ、Ｚ＊、Ｒ又はＲ＊への参照であることも意味する。
【０１３６】
Ｚ、Ｚ＊、Ｒ又はＲ＊は、分岐及び／又は置換されていてもよい。Ｚ、Ｚ＊、Ｒ又はＲ＊が、置換されていてもよいアルキル部分を含む場合、任意の置換基には、アルキル鎖における−ＣＨ２−基が−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲａ−、−Ｃ（Ｏ）−（すなわち、カルボニル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（すなわち、エステル）、及び−Ｃ（Ｏ）ＮＲａ−（すなわち、アミド）から選択される基で置き換えられる場合が挙げられえ、ここで、Ｒａは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、カルボシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリールアルキル及びアシルから選択されうる。
【０１３７】
ｘ価、ｙ価、多価又は二価「形態の．．．．」への本明細書中の参照は、特定された基がｘ価、ｙ価、多価又は二価の基であることをそれぞれ意味することが意図される。例えば、ｘ又はｙが２である場合、特定された基は、二価の基であることが意図される。その場合、二価のアルキル基は、実質的に、アルキレン基（例えば、−ＣＨ２−）である。同様に、基アルキルアリールの二価形態は、例えば、−（Ｃ６Ｈ４）−ＣＨ２−により表されうるし、二価のアルキルアリールアルキル基は、例えば、−ＣＨ２−（Ｃ６Ｈ４）−ＣＨ２−により表されうるし、二価のアルキルオキシ基は、例えば、−ＣＨ２−Ｏ−により表されうるし、二価のアルキルオキシアルキル基は、例えば、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−により表されうる。用語「置換されていてもよい」が、そのようなｘ価、ｙ価、多価又は二価の基と組みあわせて使用され、その基は、本明細書中に記載されるように、置換されていても置換されていなくてもよく、縮合していてもよい。ｘ価、ｙ価、多価、二価の基が、２つ以上のサブグループ（例えば、［グループＡ］［グループＢ］［グループＣ］（例えば、アルキルアリールアルキル）を含む場合、実行可能であれば、１つ以上のそのようなサブグループは、置換されていてもよい。当業者は、より高次の形態を提供することにおいて、この原理をどのように適用するかを理解する。
【０１３８】
カチオン性ブロックコポリマーは、一般的には、エチレン性不飽和モノマーの重合により調製されうる。エチレン性不飽和モノマーの共重合性（ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｉｓａｂｉｌｉｔｙ）を決定する要因は、当該分野でよく記載されている。例えば、Ｇｒｅｅｎｌｅｅ，  Ｒ．  Ｚ．，  ｉｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｂｒａｎｄｕｐ，  Ｊ，  ａｎｄ  Ｉｍｍｅｒｇｕｔ．  Ｅ．  Ｈ．  Ｅｄｓ）  Ｗｉｌｅｙ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９，  ｐ  ＩＩ／５３を参照のこと。
【０１３９】
カチオン性ブロックコポリマーを調製するために使用されうるエチレン性不飽和モノマーの適切な例には、式（ＩＩＩ）のものが挙げられる：
【０１４０】
【化７】
2014520506.tif 000008
【０１４１】
ここで、Ｕ及びＷは、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｒ１、−ＣＯＲ１、−ＣＳＲ１、−ＣＳＯＲ１、−ＣＯＳＲ１、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＲ１、−ＣＯＮＲ１２、水素、ハロゲン及び置換されていてもよいＣ１−Ｃ４アルキルから独立して選択されるか、又はＵ及びＷは一緒に、それ自体置換されていてもよい、ラクトン、無水物、又はイミド環を形成し、ここで、当該任意の置換基は、ヒドロキシ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｒ１、−ＣＯＲ１、−ＣＳＲ１、−ＣＳＯＲ１、−ＣＯＳＲ１、−ＣＮ、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＲ１、−ＣＯＮＲ１２、−ＯＲ１、−ＳＲ１、−Ｏ２ＣＲ１、−ＳＣＯＲ１、及び−ＯＣＳＲ１から独立して選択され；
Ｖは、水素、Ｒ１、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｒ１、−ＣＯＲ１、−ＣＳＲ１、−ＣＳＯＲ１、−ＣＯＳＲ１、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＲ１、−ＣＯＮＲ１２、−ＯＲ１、−ＳＲ１、−Ｏ２ＣＲ１、−ＳＣＯＲ１、及び−ＯＣＳＲ１から選択され、
ここで、当該又は各Ｒ１は、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、置換されていてもよいヘテロアリールアルキル、置換されていてもよいアルキルアリール、置換されていてもよいアルキルヘテロアリール、及び置換されていてもよいポリマー鎖から独立して選択される。
【０１４２】
当該又は各Ｒ１はまた、置換されていてもよいＣ１−Ｃ２２アルキル、置換されていてもよいＣ２−Ｃ２２アルケニル、置換されていてもよいＣ２−Ｃ２２アルキニル、置換されていてもよいＣ６−Ｃ１８アリール、置換されていてもよいＣ３−Ｃ１８ヘテロアリール、置換されていてもよいＣ３−Ｃ１８カルボシクリル、置換されていてもよいＣ２−Ｃ１８ヘテロシクリル、置換されていてもよいＣ７−Ｃ２４アリールアルキル、置換されていてもよいＣ４−Ｃ１８ヘテロアリールアルキル、置換されていてもよいＣ７−Ｃ２４アルキルアリール、置換されていてもよいＣ４−Ｃ１８アルキルヘテロアリール、及び置換されていてもよいポリマー鎖から独立して選択されうる。
【０１４３】
Ｒ１についての任意の置換基の例には、それらの塩及び誘導体を包含する、アルキレンオキシジル（エポキシ）、ヒドロキシ、アルコキシ、アシル、アシルオキシ、ホルミル、アルキルカルボニル、カルボキシ、スルホン酸、アルコキシ−又はアリールオキシ−カルボニル、イソシアネート、シアノ、シリル、ハロ、アミン（一級、二級及び三級）から選択されるものが挙げられる。
【０１４４】
一実施態様では、Ｒ１は、ポリマー鎖である。ポリマー鎖の例には、ポリアルキレンオキシド、ポリアリーレンエーテル及びポリアルキレンエーテルから選択されるものが挙げられる。
【０１４５】
一実施態様では、Ｒ１は、アミン置換されたＣ１−Ｃ６アルキル及び置換されていてもよいポリマー鎖から独立して選択されうる。
【０１４６】
式（ＩＩＩ）のモノマーの例には、マレイン酸無水物、Ｎ−アルキルマレイミド、Ｎ−アリールマレイミド、ジアルキルフマレート及びシクロポリ重合性モノマー、アクリレート及びメタクリレートのエステル、アクリル酸及びメタクリル酸、スチレン、スチレン系化合物（ｓｔｙｒｅｎｉｃｓ）、メタクリルアミド、及びメタクリロニトリル、これらモノマーの混合物、これらモノマーと他のモノマーとの混合物が挙げられる。
【０１４７】
式（ＩＩＩ）のモノマーの他の例には、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、プロピルメタクリレート（すべての異性体）、ブチルメタクリレート（すべての異性体）、２−エチルヘキシルメタクリレート、イソボルニルメタクリレート、メタクリル酸、ベンジルメタクリレート、フェニルメタクリレート、オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート、メタクリロニトリル、アルファ−メチルスチレン、メチルアクリレート、エチルアクリレート、プロピルアクリレート（すべての異性体）、ブチルアクリレート（すべての異性体）、２−エチルヘキシルアクリレート、イソボルニルアクリレート、アクリル酸、ベンジルアクリレート、フェニルアクリレート、アクリロニトリル、スチレン；グリシジルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート（すべての異性体）、ヒドロキシブチルメタクリレート（すべての異性体）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、トリエチレングリコールメタクリレート、イタコン酸無水物、イタコン酸、グリシジルアクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート（すべての異性体）、ヒドロキシブチルアクリレート（すべての異性体）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアクリレート、トリエチレングリコールアクリレート、メタクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルメタクリルアミド、Ｎ−ｎ−ブチルメタクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、Ｎ−エチロールメタクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−エチロールアクリルアミド、ビニル安息香酸（すべての異性体）、ジエチルアミノスチレン（すべての異性体）、アルファ−メチルビニル安息香酸（すべての異性体）、ジエチルアミノアルファ−メチルスチレン（すべての異性体）、ｐ−ビニルベンゼンスルホン酸、ｐ−ビニルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩、トリメトキシシリルプロピルメタクリレート、トリエトキシシリルプロピルメタクリレート、トリブトキシシリルプロピルメタクリレート、ジメトキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジエトキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジブトキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジイソプロポキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジメトキシシリルプロピルメタクリレート、ジエトキシシリルプロピルメタクリレート、ジブトキシシリルプロピルメタクリレート、ジイソプロポキシシリルプロピルメタクリレート、トリメトキシシリルプロピルアクリレート、トリエトキシシリルプロピルアクリレート、トリブトキシシリルプロピルアクリレート、ジメトキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジエトキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジブトキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジイソプロポキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジメトキシシリルプロピルアクリレート、ジエトキシシリルプロピルアクリレート、ジブトキシシリルプロピルアクリレート、ジイソプロポキシシリルプロピルアクリレート、ビニルアセテート、ビニルブチレート、ビニルベンゾエート、ビニルクロライド、ビニルフルオリド、ビニルブロミド、Ｎ−フェニルマレイミド、Ｎ−ブチルマレイミド、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルカルバゾール、ブタジエン、エチレン及びクロロプレンから選択される官能性メタクリレート、アクリレート及びスチレンが挙げられる。この表は、排他的なものではない。
【０１４８】
カチオン性ブロックコポリマーを調製するために称されうるモノマーのタイプを議論する場合、モノマーが、特徴において親水性又は疎水性であることへの参照が簡便でありうる。例えば、トリブロック構造の２つの親水性ブロックのそれぞれが、一般的には、親水性モノマーを含むモノマー組成物を重合することによって調製される。
【０１４９】
指針のみとして、疎水性エチレン性不飽和モノマーの例には、スチレン、アルファ−メチルスチレン、ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、アミルメタクリレート、ヘキシルメタクリレート、ラウリルメタクリレート、ステアリールメタクリレート、エチルヘキシルメタクリレート、クロチルメタクリレート、シンナミルメタクリレート、オレイルメタクリレート、リシノレイルメタクリレート、コレステリルメタクリレート、コレステリルアクリレート、ビニルブチレート、ビニルｔｅｒｔ−ブチレート、ビニルステアレート及びビニルラウレートが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５０】
指針のみとして、親水性エチレン性不飽和モノマーの例には、アクリル酸、メタクリル酸、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、オリゴ（アルキレンラウリル）メチルエーテル（メタ）アクリレート（ＯＡＧ（Ｍ）Ａ）、アクリルアミド及びメタクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド及びＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシプロピルメタクリルアミド、４−アクリロイルモルホリン、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、ホスホリルコリンメタクリレート及びＮ−ビニルピロリドンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５１】
親水性エチレン性不飽和モノマーＯＡＧ（Ｍ）Ａの場合、アルキレン部分は、一般的には、Ｃ２−Ｃ６、例えばＣ２又はＣ３のアルキレン部分である。当業者は、「（アルキレングリコール）」と関連する「オリゴ」命名法は、複数のアルキレングリコールユニットの存在を示すことを理解する。一般的に、ＯＡＧ（Ｍ）Ａのオリゴコンポーネントは、約２ｔ〜約２００、例えば約２〜約１００、又は約２から約５０まで、又は約２から約２０までの、アルキレングリコール反復ユニットを含む。
【０１５２】
指針のみとして、カチオン性ブロックコポリマーのカチオン性ブロックを調製するのに使用されうるエチレン性不飽和モノマーの例には、２−アミノエチルメタクリレートヒドロクロライド、Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミドヒドロクロライド、Ｎ−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド、Ｎ−［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチル］メタクリルアミド、２−Ｎ−モルホリノエチルアクリレート、２−Ｎ−モルホリノエチルメタクリレート、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルアクリレート、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、２−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）エチルメタクリレート、２−アクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロライド（２−Ａｃｒｙｌｏｘｙｙｅｔｈｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メタクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロライド、２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）エチルメタクリレート、ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、２−（ジエチルアミノ）エチルスチレン、２−ビニルピリジン、及び４−ビニルピリジンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５３】
フリーラジカル重合技術を、カチオン性ブロックコポリマーを形成するための１つ以上のエチレン性不飽和モノマーの重合に使用する場合、当該重合は、通常、フリーラジカルの供給源からの開始を必要とする。
【０１５４】
開始ラジカルの供給源は、フリーラジカルを産生する任意の適切な手段（例えば、適切な化合物（単数又は複数）（パーオキシド、パーオキシエステル、又はアゾ化合物等の熱的開始剤））の熱的に誘導された均等開裂、モノマーからの自発的な産生（例えば、スチレン）、酸化還元開始系、光化学開始系又は高エネルギー照射（例えば、電子線、Ｘ−又はガンマ−照射））により、提供されうる。
【０１５５】
熱的開始剤は、一般的に、重合の温度において適切な半減期を有するように選択される。これらの開始剤には、以下の化合物の１つ以上が挙げられうる：
２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）、２，２’−アゾビス（２−シアノブタン）、ジメチル２，２’−アゾビス（イソブチレート）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）、２−（ｔ−ブチルアゾ）−２−シアノプロパン、２，２’−アゾビス｛２−メチル−Ｎ−［１，１−ビス（ヒドロキシメチル）−２−ヒドロキシエチル］プロピオンアミド｝、２，２’−アゾビス［２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロピオンアミド］、２，２’−アゾビス（Ｎ，Ｎ’−ジメチレンイソ酪酸アミジン）ジヒドロクロライド、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロライド、２，２’−アゾビス（Ｎ，Ｎ’−ジメチレンイソ酪酸アミジン）、２，２’−アゾビス｛２−メチル−Ｎ−［１，１−ビス（ヒドロキシメチル）−２−ヒドロキシエチル］プロピオンアミド｝、２，２’−アゾビス｛２−メチル−Ｎ−［１，１−ビス（ヒドロキシメチル）−２−エチル］プロピオンアミド｝、２，２’−アゾビス［２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロピオンアミド］、２，２’−アゾビス（イソ酪酸アミド）二水和物、２，２’−アゾビス（２，２，４−トリメチルペンタン）、２，２’−アゾビス（２−メチルプロパン）、ｔ−ブチルパーオキシアセテート、ｔ−ブチルパーオキシベンゾエート、ｔ−ブチルパーオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルパーオキシイソブチレート、ｔ−アミルパーオキシピバレート、ｔ−ブチルパーオキシピバレート、ジイソプロピルパーオキシジカルボネート、ジシクロヘキシルパーオキシジカルボネート、ジクミルパーオキシド、ジベンゾイルパーオキシド、ジラウロイルパーオキシド、カリウムパーオキシジスルフェート、アンモニウムパーオキシジスルフェート、ジ−ｔ−ブチル次亜硝酸塩、ジクミル次亜硝酸塩。このリストは排他的ではない。
【０１５６】
光化学開始剤系は、一般的に、重合の条件下で、ラジカル産生の適切な量子収量を有するように選択される。例には、ベンゾイン誘導体、ベンゾフェノン、アシルホスフィンオキシド、及びフォトレドックス系が挙げられる。
【０１５７】
酸化還元開始剤系は、一般的に、重合の条件下でラジカル産生の適切な割合を有するように選択され；これらの開始システムには、以下の酸化剤及び還元剤の組み合わせが挙げられうるがこれらに限定されない：
酸化剤：カリウム、パーオキシジスルフェート、過酸化水素、ｔ−ブチルヒドロパーオキシド．
還元剤：鉄（ＩＩ）、チタン（ＩＩＩ）、チオ亜硫酸カリウム、二亜硫酸カリウム。
【０１５８】
他の適切な開始系は、一般に入手可能なテキストに記載されている。例えば、Ｍｏａｄ  ａｎｄ  Ｓｏｌｏｍｏｎ  “Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ”，  Ｐｅｒｇａｍｏｎ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  １９９５，  ｐｐ  ５３−９５を参照のこと。
【０１５９】
親水性媒体に更に容易に溶媒和される開始剤には、４，４−アゾビス（シアノ吉草酸）、２，２’−アゾビス｛２−メチル−Ｎ−［１，１−ビス（ヒドロキシメチル）−２−ヒドロキシエチル］プロピオンアミド｝、２，２’−アゾビス［２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロピオンアミド］、２，２’−アゾビス（Ｎ，Ｎ’−ジメチレンイソ酪酸アミジン）、２，２’−アゾビス（Ｎ，Ｎ’−ジメチレンイソ酪酸アミジン）ジヒドロクロライド、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロライド、２，２’−アゾビス｛２−メチル−Ｎ−［１，１−ビス（ヒドロキシメチル）−２−エチル］プロピオンアミド｝、２，２’−アゾビス［２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロピオンアミド］、２，２’−アゾビス（イソ酪酸アミド）二水和物、及びそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６０】
疎水性媒体に更に容易に溶媒和される開始剤には、周知の物質である２，２’−アゾビスイソブチロニトリルにより例示されるアゾ化合物が挙げられる。他の適切な開始剤化合物には、アシルパーオキシドクラス（例えば、アセチル及びベンゾイルのパーオキシド）並びにアルキルパーオキシド（例えば、クミル及びｔ−ブチルのパーオキシド）が挙げられる。ヒドロパーオキシド（例えば、ｔ−ブチル及びクミルのヒドロパーオキシドもまた、広く使用される。
【０１６１】
一実施態様では、カチオン性ブロックコポリマーは、ビス−トリチオカーボネートＲＡＦＴ剤を用いるフリーラジカル重合により調製される。その場合、ＲＡＦＴ剤は、カチオン性ブロックを提供するモノマーを含むモノマー組成物を最初に重合することに使用される。例えば、当該モノマー組成物は、アミン置換された（メタ）アクリレート（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアルキル（メタ）アクリレート）を含みうる。当該重合は、カチオン性ブロックに引き続いて変換されるブロックを含むテレケリックマクロＲＡＦＴ剤を提供する。次いで、第２の重合工程が行われ、それにより、テレケリックマクロＲＡＦＴ剤は、２つの親水性ブロックのそれぞれを提供するために、親水性モノマーを含むモノマー組成物を重合するために使用される。例えば、当該モノマー組成物は、オリゴ（アルキレングリコール）メチルエーテル（メタ）アクリレート（例えば、オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテル（メタ）アクリレート）を含みうる。２つの親水性ブロックのそれぞれを形成するように重合された当該モノマー組成物はまた、コポリマー親水性ブロックを提供するために、２つ以上の異なるモノマーの混合物を含みうる。例えば、２つの親水性ブロックのそれぞれを形成するように重合された当該モノマー組成物は、オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテル（メタ）アクリレートとＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレートとの混合物を含みうる。
【０１６２】
この実施態様によれば、得られるポリマーは、Ａ−Ｂ−Ａトリブロック構造を有する。その重合された形態において、Ａブロックは、カチオン性ブロックコポリマーの荷電されたカチオン性ブロックを得るために、更なる工程で引き続いて四級化される三級アミノ基を有するモノマー残基ユニットを含む。得られるカチオン性ブロックコポリマーは、一般式（ＩＶ）で以下に示されるような構造を有する：
【０１６３】
【化８】
2014520506.tif 000009
【０１６４】
ここで、Ｚ、Ｂ、Ａ及びＲ＊は、本明細書中で規定したとおりである。
【０１６５】
本発明はまた、核酸を細胞に送達する方法を提供し、当該方法は、カチオン性ブロックコポリマーと核酸を含む複合体を調製すること（当該カチオン性ブロックコポリマーは、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロックとを含む少なくとも１つのトリブロック構造を有する。）、当該複合体を当該細胞に導入すること、を含む。当該方法は、インビボ、エキソビボ又はインビトロで行われうる。
【０１６６】
本発明は更に、その必要がある対象に、治療有効量の本明細書中に記載したような本発明による核酸複合体を投与することを含む、遺伝子治療の方法を提供する。
【０１６７】
遺伝子治療としてのＤＮＡ対及び媒介する組換えの関連性は、研究されるとき（例えば、遺伝子疾患（例えば、嚢胞性線維症、血友病、及び鎌状赤血球貧血及びベータ−サラセミア等のグロビノパチー）の関連で）、明らかである。例えば、標的遺伝子が遺伝子障害の原因である変異を含む場合には、核酸を対象の細胞（単数又は複数）中に導入することが、異常な標的遺伝子のＤＮＡ配列を正常に回復するための突然変異性修復を促進するために有用でありうる。或いは、対象の細胞（単数又は複数）に導入された核酸は、そうでなければ疾患状態において抑制されているかサイレントな遺伝子の発現を導きうる。そのような核酸は、それら自体、サイレントな又は抑制された遺伝子をコードしうるか、又はそうでなければ抑制された又はサイレントな標的遺伝子の転写及び／又は翻訳を活性化しうる。
【０１６８】
本発明の方法を用いて治療されるべき疾患又は状態は、遺伝子治療により治療可能な任意の疾患又は状態でありえ、使用されるべき遺伝的物質（すなわち、核酸）の選択は、特定の疾患又は状態に明確に依存することが、当業者により理解されるだろう。治療されうる疾患又は状態には、ガン（例えば、骨髄障害）、サラセミア、嚢胞性線維症、難聴、視覚障害（例えば、Ｌｅｂｅｒ先天黒内障）、糖尿病、Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ病、Ｘ連鎖重症複合免疫不全及び心疾患が挙げられるが、これらに限定されない。或いは、遺伝子治療は、非内在性遺伝子（例えば、バイオルミネッセンスのための遺伝子）を導入したり、又は、内在性遺伝子をノックアウトする遺伝子を導入したり（例えば、ＲＮＡ干渉）するために使用されうる。
【０１６９】
核酸の性質は、治療又は予防すべき疾患又は状態に一定に依存することも、当業者により理解されるだろう。例えば、少なくとも一部が、線維性細胞外マトリックス物質（例えば、タイプＩＩコラーゲン）の蓄積に起因する疾患又は状態は、本発明の核酸複合体を対象に（標的化又は非標的化アプローチで）送達することにより、治療又は予防しえ、ここで、当該核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、細胞外マトリックス物質をコードする遺伝子をサイレンシング可能である。いくつかの実施態様では、疾患又は状態は、感染性疾患、炎症性疾患、又はガンである。
【０１７０】
本発明による核酸複合体の細胞への送達をインビボで行う場合、核酸複合体は、状況下に適切である任意の投与経路により、細胞に導入されうる。例えば、全身送達が意図される場合、当該複合体は、静脈内、皮下、筋肉内、経口などで投与されうる。或いは、当該複合体は、特定の細胞又は細胞タイプに、当業者に公知の手段により、標的化されうる。標的化は、例えば、核酸分子が、非ガン性細胞に対して受容可能でなく毒性である場合又はそうでなければ非常に高投薬量を必要とする場合に、がん細胞に標的化するため等の様々な理由により望ましくありうる。標的化送達は、受容体媒介標的化を含むがこれに限定されない当業者に公知の任意の手段により、又は、標的細胞（単数又は複数）を含む組織に直接的に核酸複合体を投与することにより、達成されうる。
【０１７１】
受容体媒介標的化は、例えば、核酸分子をタンパク質リガンドに（例えば、ポリリジン）を介して、コンジュゲートすることにより達成されうる。リガンドは、典型的には、標的細胞／組織タイプの表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択される。これらのリガンド−核酸コンジュゲートは、本発明によるカチオン性ブロックコポリマーと複合体化されて、所望により全身投与（例えば、静脈内）されうる（ここで、受容体結合が生じる場合、これらは、標的細胞／組織へ指向する。）。
【０１７２】
一実施態様では、本発明により核酸を細胞に送達する方法は、エキソビボで行われる。例えば、細胞を対象から単離し、エキソビボで、本発明の核酸複合体を導入して、外因性の核酸を含む細胞を産生する。当該細胞は、治療されるべき対象から又は同系宿主から単離しうる。当該細胞を、次いで、治療又は予防のために、対象内に（又は、同系レシピエント）に再導入し戻す。いくつかの実施態様では、細胞は、造血前駆細胞又は幹細胞でありうる。
【０１７３】
一実施態様では、核酸は、遺伝子発現をサイレンシングする（又は抑制する）ために、細胞に送達される。いくつかの実施態様では、遺伝子発現は、翻訳効率を減少させるか又は伝令安定性を減少させるか、或いはこれらの効果の組み合わせにより、サイレンシングされる。いくつかの実施態様では、プロセッシングされていないＲＮＡのスプライシングが、非機能的又は活性がより低いタンパク質の産生を導く標的の目標である。
【０１７４】
例えば、本発明の方法は、ウイルスの複製を減少するために使用されうる。そのような実施態様では、核酸は、細胞におけるウイルス由来の遺伝子の発現のサイレンシングが可能である（又はサイレンシングのために）選択される。
【０１７５】
いくつかの実施態様では、遺伝子発現は、細胞に、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＤＮＡオリゴヌクレオチド  （二本鎖又は一本鎖）が挙げられるがこれらに限定されないＤＮＡ分子を導入することによりサイレンシングされる。
【０１７６】
いくつかの実施態様では、遺伝子発現は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によりサイレンシングされる。本発明を特定の理論や作用態様に限定するものではないが、「ＲＮＡ干渉」は、典型的には、ｍＲＮＡを分解又はそうでなければｍＲＮＡの翻訳を防止する（例えば、配列特異的様式で）ことに基づく遺伝子発現のサイレンシングのメカニズムを記載する。外因性干渉ＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分解又はｍＲＮＡ翻訳抑制のいずれかを導きうることが、当業者により理解されるだろう。いくつかの実施態様では、ＲＮＡ干渉は、非センス媒介崩壊を導く１つ以上の未成熟なストップコドンを導入するように、リーディングフレームを改変することによって達成される。
【０１７７】
ＲＮＡｉは、標的ｍＲＮＡ分解を介して、遺伝子発現における配列特異的減少を導く二本鎖（センス及びアンチセンス）ＲＮＡが関与する遺伝子サイレンシングのプロセスを含む。ＲＮＡｉは、典型的には、短鎖二本鎖ｓｉＲＮＡ又は一本鎖マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）により媒介される。いくつかの実施態様では、いずれか又はこれらの分子からのＲＮＡの鎖が、相補ＲＮＡを標的とし翻訳を抑制するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として参照される複合体を形成したときに、ＲＮＡｉは開始される。当該プロセスは、研究目的及び治療用途目的に探求されうる（例えば、Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  １２（３）：  ２１７−２７，  ２００５を参照）。
【０１７８】
ＲＮＡ様特性を有する他のオリゴヌクレオチドもまた記載されており、多くの更に異なるタイプのＲＮＡｉが開発されうる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エキソン使用を改変し、プレＲＮＡスプライシングを調節するために使用されている（例えば、Ｍａｄｏｃｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  １２：  １０１３−１０２２，  ２００５及びＡａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ．，  ８：  ４３，  ２００７参照）。アンチセンス及びｉＲＮＡ化合物は、目的の標的遺伝子のＤＮＡ又はＲＮＡに特異的にハイブリダイズするＲＮＡ若しくはＲＮＡ様又はＤＮＡ若しくはＤＮＡ様分子である、二本鎖又は一本鎖オリゴヌクレオチドでありうる。
【０１７９】
本発明の文脈において使用するのに適したＲＮＡ分子の例には、以下のものが挙げられるがこれらに限定されない：
【０１８０】
（ｉ）  長鎖二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）−これらは、一般的に、それら自身のベクターにより各々別々に転写されるセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖のハイブリダイゼーションの結果として、産生される。そのような二本鎖分子は、典型的には、ヘアピンループにより特徴付けられない。これらの分子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二本鎖を産生するために、Ｄｉｃｅｒ等の酵素により開裂されることが必要である。この開裂事象は、好ましくは、ｄｓＲＮＡが転写される細胞において生じる。
【０１８１】
（ｉｉ）  ヘアピン二本鎖ＲＮＡ（ヘアピンｄｓＲＮＡ）−これらの分子は、ステム−ループ配置を示し、一般的に、イントロン等のヌクレオチドスペーサー領域により分離された逆方向反復配列を有するコンストラクトの転写の結果である。これらの分子は、一般的に、開裂されるべきヘアピンループと、ｓｉＲＮＡを産生するために酵素Ｄｉｃｅｒにより開裂されるべき結果としての直鎖二本鎖分子との両方を必要とするより長いＲＮＡ分子のものである。このタイプの分子は、単一ベクターにより発現可能な利点を有する。
【０１８２】
（ｉｉｉ）  低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）−これらは、合成的に産生されうるか、又は、それ自身のプロモーター及び４−５チミジン転写終了部位によりそれぞれ特徴付けられるタンデムセンス及びアンチセンス鎖を含むベクターの、プロモーターに基づく発現により、組換え的に発現されうる。これは、２つの別々の転写物（これは引き続いてアニールする）の産生を可能とする。いくつかの実施態様では、これらの転写物は、２０〜２５ヌクレオチド長のオーダーを有しうる。したがって、これらの分子は、ＲＮＡ干渉経路においてそれらの機能を可能にするための更なる開裂を必要としない。
【０１８３】
（ｉｖ）  ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）−これらの分子もまた、「小分子ヘアピンＲＮＡ」として公知であり、典型的には、ｓｉＲＮＡ分子と同様の長さであるが、これらは、ＲＮＡ分子の逆方向反復配列を含む点が異なっており、当該逆方向反復は、ヌクレオチドスペーサーにより分離されている。ヘアピン（ループ）領域の開列の後、機能的ｓｉＲＮＡ分子が産生される。
【０１８４】
（ｖ）  ミクロＲＮＡ／小分子ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ／ｓｔＲＮＡ）−ｍｉＲＮＡ及びｓｔＲＮＡは、一般的に、天然の内因的に発現される分子を示すと理解されている。したがって、ｍｉＲＮＡの活性を模倣することを意図する分子の設計及び投与が、合成的に産生された又は組換え的に発現されたｓｉＲＮＡ分子の形をとるが、それにもかかわらず、本発明は、本質的に同一のＲＮＡ配列及び全体構造を示すおかげで、ｍｉＲＮＡ、プリｍｉＲＮＡ又はプレｍｉＲＮＡ分子を模倣することが意図されるオリゴヌクレオチドの設計及び発現まで及ぶ。そのような組換え的に産生された分子は、ｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡのいずれかとして参照されうる。
【０１８５】
（ｖｉ）  空間的発現を媒介するｍｉＲＮＡ（ｓｄＲＮＡ）、ストレス応答（ｓｒＲＮＡ）又は細胞周期（ｃｃＲＮＡ）。
【０１８６】
（ｖｉｉ）  内因的に発現されるｍｉＲＮＡ若しくはｓｔＲＮＡ又は外因的に導入されたｓｉＲＮＡにハイブリダイズし機能するのを防止するように設計されたＲＮＡオリゴヌクレオチド。いくつかの実施態様では、これらの分子は、ＲＮＡ干渉メカニズムを引き起こすようには設計されず、むしろ、細胞内環境に存在するｍｉＲＮＡ及び／又はｓｉＲＮＡ分子によるこの経路のアップレギュレーションを防止することが理解されるだろう。それらがハイブリダイズするｍｉＲＮＡに対するそれらの影響の点で、これらは、更に古典的なアンチセンス阻害を反映している。
【０１８７】
「ＲＮＡオリゴヌクレオチド」への参照は、二本鎖又は一本鎖であり、標的遺伝子の発現をサイレンシングするのに向けられたＲＮＡ干渉メカニズムをいずれか誘導可能である、ＲＮＡ核酸分子への参照として理解されるべきである。この点で、対象オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉メカニズムを直接調節することが可能でありうるか、または、それは、（ｉ）ヘアピン領域の切除を必要とするヘアピン二本鎖ＲＮＡ、（ｉｉ）ダイサーによる切断を必要とするより長い二本鎖ＲＮＡ分子、又は（ｉｉｉ）同様に切断を必要とするプレｍｉＲＮＡ等のプリカーサー分子の特徴であるような更なるプロセッシングを必要としうる。対象オリゴヌクレオチドは、二本鎖（ＲＮＡ干渉をもたらす点で典型的であるような）であっても、一本鎖（内因的に発現された遺伝子に結合するのに適したＲＮＡオリゴヌクレオチドを産生することのみをしようとするものの場合でありうるような）であってもよい。
【０１８８】
他の実施態様では、核酸分子は、翻訳の開始（スプライスドナー部位又はスプライスアクセプター部位でのスプライシング）を抑制する。他の実施態様では、スプライシングの改変は、リーディングフレームを改変し、転写の非センス媒介分解を開始する。
【０１８９】
本発明による使用及び任意の所定の状況に最も適切な核酸分子を当業者は決定しうることが理解される。例えば、ＲＮＡ分子は、その標的核酸配列と１００％の相同性を示すことが好ましいが、ＲＮＡ分子は、配列特異的様式でＲＮＡ干渉応答を誘導するのに十分なハイブリダイゼーションが可能な程度まで、ある程度のミスマッチを示しうる。したがって、ＲＮＡ分子は、標的核酸配列と、少なくとも７０％の配列相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性及び更により好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列相同性を含むことが好ましい。
【０１９０】
本発明による使用に適した核酸分子の設計に関する別の例では、分子の特定の構造及び長さ（例えば、それが、ｄｓＲＮＡ、ヘアピンｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、プリｍｉＲＮＡ又は本明細書中で記載したような任意の他の形態の形態をとるかどうか）を決定するのは、当業者の技術の範囲内である。例えば、一般的に、ステム−ループＲＮＡ構造（例えば、ヘアピンｄｓＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ）は、典型的には、遺伝子スプライシングを達成する点で、例えば、二本鎖ＤＮＡ（これは、センス及びアンチセンスＲＮＡ鎖を別々にコードする２つのコンストラクトを利用して産生される。）よりも、効率的であることが理解される。更に、介在するスペーサー領域の性質及び長さは、所定のステム−ループＲＮＡ分子の機能性に影響しうる。更に別の例では、長いｄｓＲＮＡ（これは、Ｄｉｃｅｒ等の酵素による切断を必要とする。）又は短いｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ）の選択は、特定の細胞環境の状況で、インターフェロン応答が生じうる（これは、短いｄｓＲＮＡ分子を利用する場合よりも長いｄｓＲＮＡを使用する場合のより顕著なリスクである。）というリスクが存在する場合に、明白でありうる。なお更に別の例では、一本鎖又は二本鎖の核酸分子を使用することが必要とされるかどうかはまた、求める機能的結果に依存する。例えば、アンチセンス分子を有する内因的に発現されたｍｉＲＮＡを標的とする程度までは、一般的に、対象ｍｉＲＮＡに具体的にハイブリダイズするのに適した一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計することが理解されるだろう。ＲＮＡ干渉を誘導するのが求められる程度までは、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子が必要でありうる。いくつかの実施態様では、これは、更なる切断を受ける長いｄｓＲＮＡ分子、又はｓｉＲＮＡとして設計されうる。
【０１９１】
用語「遺伝子」は、その最も広い意味で使用され、遺伝子のエキソンに対応するｃＤＮＡを包含する。「遺伝子」への本明細書中での参照はまた、以下のものが包含される：転写及び／又は翻訳の制御配列及び／又はコード領域及び／又は非翻訳配列（すなわち、イントロン、５’−及び３’−非翻訳配列）からなる古典的なゲノム遺伝子；或いは
遺伝子のコード領域（すなわち、エキソン）、プレｍＲＮＡ、並びに５’−及び３’−非翻訳配列に対応する、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ分子。
【０１９２】
「発現」への参照は、遺伝子発現への広い参照であり、プレ翻訳への転写及び翻訳を介した（プレ転写からの）遺伝子又は核酸分子からタンパク質又はＲＮＡを産生するプロセスにおける任意のステージを包含する。
【０１９３】
本明細書中で使用される「細胞」には、真核細胞（例えば、動物細胞、植物細胞、及び真菌又は原生生物の細胞）、並びに、原核細胞（例えば、細菌）が挙げられる。一実施態様では、当該細胞は、ヒト細胞である。
【０１９４】
本明細書中で使用される用語「対象」は、動物又はヒトのいずれかの対象を意味する。「動物」により、霊長類、家畜動物（ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、及びヤギを含む）、愛玩動物（イヌ、ネコ、ウサギ、及びモルモットを含む）、捕獲性の野生動物（動物園の環境で一般的にみられるものを含む）、及び水生動物（淡水及び海水の動物（例えば、魚及び甲殻類）を含む）が意味される。実験動物（例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット及びハムスター）も、これらは簡便な実験系を提供するので、意図される。いくつかの実施態様では、当該対象は、ヒト対象である。
【０１９５】
複合体又は組成物の対象への「投与」により、対象に移動されうる又は移動される剤又は組成物を示すことが意図される。投与の態様に特に限定は存在しないが、これは、経口、非経口（皮下、皮内、筋肉内、静脈内、髄腔内、及び脊髄内を含む）、吸入（噴霧を含む）、直腸及び膣の態様の経路による。
【０１９６】
理論により束縛又は制限されるものではないが、本発明の複合体は、ＲＮＡｓｅ及び／又はＤＮＡｓｅ等の控訴による分解から、核酸分子を保護することが見出されている。したがって、本発明はまた、核酸を酵素分解から保護する方法を提供し、当該方法は、核酸をカチオン性ブロックコポリマーと複合体化することを含み、当該カチオン性ブロックコポリマーは、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は、１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロック、を含む、少なくとも１つのトリブロック構造を有する。
【０１９７】
核酸を細胞に送達するための複合体の使用も提供され、当該複合体は、カチオン性ブロックコポリマーと当該核酸とを含み、当該カチオン性ブロックコポリマーは、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は、１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロック、を含む、少なくとも１つのトリブロック構造を有する。
【０１９８】
本発明は更に、遺伝子発現をサイレンシングするための複合体の使用を提供し、当該複合体は、カチオン性ブロックコポリマーと、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される核酸とを含み、当該カチオン性ブロックコポリマーは、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は、１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロック、を含む、少なくとも１つのトリブロック構造を有する。
【０１９９】
一実施態様では、当該ＤＮＡ及びＲＮＡは、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍＲＮＡｓ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ＰｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ／小分子ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ／ｓｔＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ＳｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ＳｎＲＮＡ）リボザイム、アプタマー、ＤＮＡザイム、リボヌクレアーゼ複合体、ヘアピン二本鎖ＲＮＡ（ヘアピンｄｓＲＮＡ）、空間的発現を媒介するｍｉＲＮＡ（ｓｄＲＮＡ）、ストレス応答ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）、細胞周期ＲＮＡ（ｃｃＲＮＡ）及び二本鎖又は一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドから選択される。
【０２００】
理論により束縛又は制限されるものではないが、本発明の複合体は、ＲＮＡｓｅ及び／又はＤＮＡｓｅ等の酵素による分解から核酸分子を保護することが見出された。したがって、本発明は、核酸を酵素分解から保護することにおけるカチオン性ブロックコポリマーの使用を提供し、当該カチオン性ブロックコポリマーは、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は、１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロック、を含む、少なくとも１つのトリブロック構造を有する。
【０２０１】
本発明による複合体はまた、核酸を細胞に送達するための及び／又は遺伝子発現をサイレンシングするための、医薬組成物等の組成物の製造に使用されうる。
【０２０２】
したがって、本発明はまた、核酸を細胞に送達するための組成物の製造における複合体の使用を提供し、当該複合体は、カチオン性ブロックコポリマーと当該核酸とを含み、当該カチオン性ブロックコポリマーは、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は、１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロック、を含む、少なくとも１つのトリブロック構造を有する。
【０２０３】
本発明は更に、遺伝子発現をサイレンシングするための組成物の製造における複合体の使用を提供し、当該複合体は、カチオン性ブロックコポリマーと、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される核酸とを含み、当該カチオン性ブロックコポリマーは、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は、１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロック、を含む、少なくとも１つのトリブロック構造を有する。
【０２０４】
カチオン性ブロックコポリマーはまた、核酸を酵素分解から保護することにおいて使用されえ、当該カチオン性ブロックコポリマーは、１つのカチオン性ブロックと２つの親水性ブロック、又は、１つの親水性ブロックと２つのカチオン性ブロック、を含む、少なくとも１つのトリブロック構造を有する。そのような実施態様では、当該カチオン性ブロックコポリマーは、安定化剤として機能するとみられうる。
【０２０５】
本発明はまた、本発明の核酸複合体を含む、医薬組成物等の組成物に関する。いくつかの実施態様では、当該組成物は、本発明核酸複合体と、１つ以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤及び／又は賦形剤を含む。
【０２０６】
本発明の組成物において、核酸複合体は、典型的には、有効量で投与するように処方される。本明細書中で使用される核酸複合体の用語「有効量」及び「治療有効量」は、典型的には、少なくとも１つの統計学的に有意な数の対象において、所望の治療的又は予防的効果を、治療単位において、提供するのに十分な複合体の量を意味する。所望でない効果（例えば、副作用）が、時々、所望の効果とともに現れるが、故に、実行者は、典型的には、適切な「有効量」は何かを決定することにおいて、可能性のあるリスクに対する可能性のある利益のバランスをとるだろう。必要な正確な量はまた、対象の種、年齢及び一般的状態、投与の態様等に依存して、対象間において変化する。したがって、正確な「有効量」を特定するのはできないかもしれない。しかしながら、任意の個々の場合における適切な「有効量」は、慣用の実験のみを使用して、当業者により決定されうる。
【０２０７】
いくつかの実施態様では、ヒト対象への有効量は、約０．１ｎｇ／ｋｇ体重／一用量〜１ｇ／ｋｇ体重／一用量の範囲にある。いくつかの実施態様では、当該範囲は、約１μｇ〜１ｇ、約１ｍｇ〜１ｇ、１ｍｇ〜５００ｍｇ、１ｍｇ〜２５０ｍｇ、１ｍｇ〜５０ｍｇ、又は１μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ体重／一用量である。投薬レジメンは、状況の緊急性に適するように調節され、最適な治療的又は予防的用量を生じるように調節されうる。例えば、数回の用量が、一日ごと、一週間ごと、一ヶ月ごと、又は適切な他の時間間隔で、提供されうる。したがって、トランスフェクションに十分な時間及び条件は、治療的又は予防的有効量を特定することができる医師等の当業者により、決定されうる。
【０２０８】
「薬学的に受容可能な」担体、賦形剤、希釈剤により、生物学的でなくさもなくば望ましくないことがない物質；すなわち、いずれの又は実質的な副作用を引き起こすことなく本発明の複合体とともに、対象に投与されうる物質、から構成される薬学的ビヒクルが意味される。担体には、賦形剤及び他の添加剤（例えば、希釈剤、崩壊剤、着色剤、湿潤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、保存剤など）が挙げられうる。
【０２０９】
本発明の局面は、感染性疾患、炎症性疾患、又はガンについて、対象を治療する方法を包含し、当該方法は、対象に、本発明による複合体を、又は本発明による薬学的組成物を対象に、投与することを含む。
【０２１０】
本発明によるカチオン性ブロックコポリマーは、トランスフェクション剤として機能するのみではなく、送達剤及び安定化剤としても機能することが、有利にも見出された。
【０２１１】
本明細書中で使用される用語「アルキル」（単独又は化合物の単語のいずれかで使用される）は、直鎖、分岐又は環状アルキル、好ましくはＣ１−２０アルキル（例えば、Ｃ１−１０又はＣ１−６）を示す。直鎖又は分岐鎖アルキルの例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、１，２−ジメチルプロピル、１，１−ジメチル−プロピル、ヘキシル、４−メチルペンチル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、１，２，２−トリメチルプロピル、１，１，２−トリメチルプロピル、ヘプチル、５−メチルヘキシル、１−メチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、３，３−ジメチルペンチル、４，４−ジメチルペンチル、１，２−ジメチルペンチル、１，３−ジメチルペンチル、１，４−ジメチル−ペンチル、１，２，３−トリメチルブチル、１，１，２−トリメチルブチル、１，１，３−トリメチルブチル、オクチル、６−メチルヘプチル、１−メチルヘプチル、１，１，３，３−テトラメチルブチル、ノニル、１−、２−、３−、４−、５−、６−又は７−メチルオクチル、１−、２−、３−、４−又は５−エチルヘプチル、１−、２−又は３−プロピルヘキシル、デシル、１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−及び８−メチルノニル、１−、２−、３−、４−、５−又は６−エチルオクチル、１−、２−、３−又は４−プロピルヘプチル、ウンデシル、１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−、８−又は９−メチルデシル、１−、２−、３−、４−、５−、６−又は７−エチルノニル、１−、２−、３−、４−又は５−プロピルオクチル、１−、２−又は３−ブチルヘプチル、１−ペンチルヘキシル、ドデシル、１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−、８−、９−又は１０−メチルウンデシル、１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−又は８−エチルデシル、１−、２−、３−、４−、５−又は６−プロピルノニル、１−、２−、３−又は４−ブチルオクチル、１−２−ペンチルヘプチルなどが挙げられる。環状アルキルの例には、モノ−又はポリ環状アルキル基、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシルなどが挙げられる。アルキル基が一般的に「プロピル」、ブチル」等と参照される場合、これは、適切な場合に、直鎖、分岐及び環状異性体のいずれも、参照されうることが理解される。アルキル基は、１つ以上の任意の本明細書中に定義されるような置換基により、置換されていてもよい。
【０２１２】
本明細書中で使用される用語「アルケニル」は、上で定義したような、エチレン性モノ−、ジ−又はポリ不飽和アルキル若しくはシクロアルキル基、好ましくは、Ｃ２−２０アルケニル（例えば、Ｃ２−１０又はＣ２−６）を含む、少なくとも１つの炭素間二重結合を含む直鎖、分岐又は環状の炭化水素残基から形成される基を示す。アルケニルの例には、ビニル、アリル、１−メチルビニル、ブテニル、イソ−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−ペンテニル、シクロペンテニル、１−メチル−シクロペンテニル、１−ヘキセニル、３−ヘキセニル、シクロヘキセニル、１−ヘプテニル、３−ヘプテニル、１−オクテニル、シクロオクテニル、１−ノネニル、２−ノネニル、３−ノネニル、１−デセニル、３−デセニル、１，３−ブタジエニル、１，４−ペンタジエニル、１，３−シクロペンタジエニル、１，３−ヘキサジエニル、１，４−ヘキサジエニル、１，３−シクロヘキサジエニル、１，４−シクロヘキサジエニル、１，３−シクロヘプタジエニル、１，３，５−シクロヘプタトリエニル及び１，３，５，７−シクロオクタテトラエニルが挙げられる。アルケニル基は、１つ以上の本明細書中で定義したような任意の置換基で置換されていてもよい。
【０２１３】
本明細書中で使用される用語「アルキニル」は、上で定義したような、エチレン性モノ−、ジ−又はポリ不飽和アルキル又はシクロアルキル基を含む、少なくとも１つの炭素間三重を含む、直鎖、分岐又は環状炭化水素残基から形成される基を示す。炭素原子数の数が規定されていなければ、用語は、好ましくはＣ２−２０アルキニル（例えば、Ｃ２−１０又はＣ２−６）を示す。例には、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、及びブチニル異性体、及びペンチニル異性体が挙げられる。アルキニル基は、１つ以上の本明細書中で規定したような任意の置換基により、置換されていてもよい。
【０２１４】
用語「ハロゲン」（「ハロ」）は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素（フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード）を示す。
【０２１５】
用語「アリール」（又は「カルボアリール」）は、芳香族炭化水素環系（例えば、Ｃ６−２４又はＣ６−１８）の単環、多環、結合した、及び縮合した残基のいずれかを示す。アリールの例には、フェニル、ビフェニル、ターフェニル、クォーターフェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、アントラセニル、ジヒドロアントラセニル、ベンズアントラセニル、ジベンズアントラセニル、フェナントレニル、フルオレニル、ピレニル、イデニル、アズレニル、クリセニルが挙げられる。好ましいアリールには、フェニル及びナフチルが挙げられる。アリール基は、１つ以上の本明細書中で規定したような任意の置換基で置換されていても置換されていなくてもよい。用語「アリーレン」は、アリールの二価の形態を示すことが意図される。
【０２１６】
用語「カルボシクリル」は、非芳香族単環式、多環式、縮合、結合炭化水素残基（好ましくはＣ３−２０（例えば、Ｃ３−１０又はＣ３−８）のいずれも包含する。環は、飽和（例えば、シクロアルキル）していても、１つ以上の二重結合（シクロアルケニル）及び／又は１つ上の三重結合（シクロアルキニル）を有していてもよい。特に好ましいカルボシクリル部分は、５−６員又は９−１０員環系である。適切な例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロオクテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキサジエニル、シクロオクタテトラエニル、インダニル、デカリニル、及びインデニルが挙げられる。カルボシクリル基は、１つ以上の本明細書中で規定されたような任意の置換基で置換されていてもよい。用語「カルボシクリレン」は、カルボシクリルの二価の形態を示す。
【０２１７】
その最も広い意味で本明細書中で使用される用語「ヘテロ原子」又は「ヘテロ」は、環状有機基の一員でありうる炭素原子以外の任意の原子を示す。ヘテロ原子の特定の例には、窒素、酸素、イオウ、リン、ホウ素、ケイ素、セレン、テルル、より好ましくは、窒素、酸素及びイオウが挙げられる。
【０２１８】
単独又は化合物の単語で使用される場合用語「ヘテロシクリル」は、１つ以上の炭素原子が、非芳香族残基を提供するように、ヘテロ原子により置き換えられた単環式、多環式、縮合、結合、炭化水素残基（好ましくは、Ｃ３−２０（例えば、Ｃ３−１０又はＣ３−８）のいずれをも包含する。適切なヘテロ原子には、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ及びＳｅ、特に、Ｏ、Ｎ及びＳが挙げられる。２つ以上の炭素原子が置き換えられている場合、これは、２つ以上の同じヘテロ原子により又は異なるヘテロ原子によるものでありうる。ヘテロシクリル基は、飽和又は部分的に不飽和（すなわち、１つ以上の二重結合を有する。）でありうる。特に好ましいヘテロシクリルは、５−６及び９−１０員のヘテロシクリルである、ヘテロシクリル基の適切な例には、アジリジニル、オキシラニル、チイラニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、２Ｈ−ピロリル、ピロリジニル、ピロリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、インドリニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、チオモルホリニル、ジオキサニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピロリル、テトラヒドロチオフェニル、ピラゾリニル、ジオキサラニル、チアゾリジニル、イソキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、ジヒドロピラニル、オキサジニル、チアジニル、チオモルホリニル、オキサチアニル、ジチアニル、トリオキサニル、チアジアジニル、ジチアジニル、トリチアニル、アゼピニル、オキセピニル、チエピニル、インデニル、インダニル、３Ｈ−インドリル、イソインドリニル、４Ｈ−キノラジニル、クロメニル、クロマニル、イソクロマニル、ピラニル及びジヒドロピラニルが挙げられうる。ヘテロシクリル基は、１つ以上の本明細書中で規定したような置換基により置換されていてもよい。用語「ヘテロシクリレン」は、ヘテロシクリルの三価の形態を示すことが意図される。
【０２１９】
用語「ヘテロアリール」は、単環式、多環式、縮合又は結合炭化水素残基のいずれをも包含し、ここで、１つ以上の炭素原子が、芳香族残基を提供するように、ヘテロ原子により置き換えられている。好ましいヘテロアリールは、３〜２０個の環原子（例えば、３〜１０個）を有する。特に好ましいヘテロアリールは、５−６及び９−１０員の二環式環系である。適切なヘテロ原子には、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ及びＳｅ、特にＯ、Ｎ及びＳが挙げられる。２つ以上の炭素原子が置き換えられている場合、これは、２つ以上の同じヘテロ原子によるものであるか、異なる２つのヘテロ原子によるものでありうる。ヘテロアリール基の適切な例には、ピリジル、ピロリル、チエニル、イミダゾリニル、フラニル、ベンゾチエニル、イゾベンゾチエニル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、インドリル、イソインドリル、ピラゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリジニル、キノリル、イソキノリル、フタラジニル、１，５−ナフチリジニル、キノザリニル、キナゾリニル、キノリニル、オキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、トリアゾリル、オキサジアゾリル、オキサトリアゾリル、トリアジニル、及びフラザニルが挙げられうる。ヘテロアリール基は、１つ以上の本明細書中で規定したような任意の置換基で置換されていてもよい。用語「ヘテロアリーレン」は、ヘテロアリールの二価の形態を示すことが意図される。
【０２２０】
単独又は化合物の単語においてのいずれかの用語「アシル」は、部分Ｃ＝Ｏ（カルボン酸、エステル又はアミドではない）を含む基を示す。好ましいアシルには、Ｃ（Ｏ）−Ｒｅ（ここで、Ｒｅは水素又はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、又はヘテロシクリル残基である）が挙げられる。アシルの例には、ホルミル、直鎖又は分岐アルカノイル（例えばＣ１−２０）、例えば、アセチル、プロパノイル、ブタノイル、２−メチルプロパノイル、ペンタノイル、２，２−ジメチルプロパノイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイル、ノナノイル、デカノイル、ウンデカノイル、ドデカノイル、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル、ヘプタデカノイル、オクタデカノイル、ノナデカノイル及びイコサノイル；シクロアルキルカルボニル、例えば、シクロプロピルカルボニル  シクロブチルカルボニル、シクロペンチルカルボニル及びシクロヘキシルカルボニル；アロイル、例えば、ベンゾイル、トルオイル及びナフトイル；アラルカノイル、例えば、フェニルアルカノイル（例えば、フェニルアセチル、フェニルプロパノイル、フェニルブタノイル、フェニルイソブチリル、フェニルペンタノイル及びフェニルヘキサノイル）及びナフチルアルカノイル（例えば、ナフチルアセチル、ナフチルプロパノイル及びナフチルブタノイル］；アラルケノイル、例えば、フェニルアルケノイル（例えば、フェニルプロペノイル、フェニルブテノイル、フェニルメタクリロイル、フェニルペンテノイル及びフェニルヘキセノイル及びナフチルアルケノイル（例えば、ナフチルプロペノイル、ナフチルブテノイル及びナフチルペンテノイル）；アリールオキシアルカノイル、例えば、フェノキシアセチル及びフェノキシプロピオニル；アリールチオカルバモイル、例えば、フェニルチオカルバモイル；アリールグリオキシロイル、例えば、フェニルグリオキシロイル及びナフチルグリオキシロイル；アリールスルホニル、例えば、フェニルスルホニル及びナフチルスルホニル（ｎａｐｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）；ヘテロ環式カルボニル；ヘテロ環式アルカノイル、例えば、チエニルアセチル、チエニルプロパノイル、チエニルブタノイル、チエニルペンタノイル、チエニルヘキサノイル、チアゾリルアセチル、チアジアゾリルアセチル及びテトラゾリルアセチル；ヘテロ環式アルケノイル、例えば、ヘテロ環式プロペノイル、ヘテロ環式ブテノイル、ヘテロ環式ペンテノイル及びヘテロ環式ヘキセノイル；及びヘテロ環式グリオキシロイル、例えば、チアゾリルグリオキシロイル（ｔｈｉａｚｏｌｙｇｌｙｏｘｙｌｏｙｌ）及びチエニルグリオキシロイル、が挙げられる。Ｒｅ残基は、本明細書中に記載したように置換されていてもよい。
【０２２１】
用語「スルホキシド」（単独又は化合物の単語においてのいずれかで）は、基−Ｓ（Ｏ）Ｒｆ（ここで、Ｒｆは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、及びアラルキルから選択される。）を示す。好ましいＲｆの例には、Ｃ１−２０アルキル、フェニル及びベンジルが挙げられる。
【０２２２】
用語「スルホニル」（単独又は化合物の単語におけるいずれかで）は、基Ｓ（Ｏ）２−Ｒｆ（ここで、Ｒｆは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル及びアラルキルから選択される。）を示す。好ましいＲｆの例には、Ｃ１−２０アルキル、フェニル及びベンジルが挙げられる。
【０２２３】
用語「スルホンアミド」（単独又は化合物の単語におけるいずれかで）は、基Ｓ（Ｏ）ＮＲｆＲｆ（ここで、各Ｒｆは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル及びアラルキルから独立して選択される。）を示す。好ましいＲｆの例には、Ｃ１−２０アルキル、フェニル及びベンジルが挙げられる。一実施態様では、少なくとも１つのＲｆは水素である。別の実施態様では、両方のＲｆは水素である。
【０２２４】
用語「アミノ」は、当該分野で理解されるようにその最も広い意味で本明細書中で使用され、式ＮＲａＲｂの基（ここで、Ｒａ及びＲｂは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、カルボシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリールアルキル及びアシルから任意に独立して選択されうる。）を包含する。Ｒａ及びＲｂはまた、それらが結合する窒素原子と一緒になって、単環式又は多環式系（例えば、３−１０員環、特に５−６及び９−１０員系）も形成しうる。「アミノ」の例には、ＮＨ２、ＮＨアルキル（例えば、Ｃ１−２０アルキル）、ＮＨアリール（例えば、ＮＨフェニル）、ＮＨアラルキル（例えば、ＮＨベンジル）、ＮＨアシル（例えば、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−２０アルキル、ＮＨＣ（Ｏ）フェニル）、Ｎアルキルアルキル（ここで、各アルキル（例えば、Ｃ１−２０）は同じでも異なっていてもよい）及び５又は６員環（１つ以上の同じ又は異なるヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ及びＳ）を含んでいてもよい。）が挙げられる。
【０２２５】
用語「アミド」は、当該分野で理解されるようにその最も広い意味で本明細書中で使用され、式Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂを有する基（ここで、Ｒ及びＲｂは、上で定義したとおりである。）を包含する。アミドの例には、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＮＨアルキル（例えば、Ｃ１−２０アルキル）、Ｃ（Ｏ）ＮＨアリール（例えば、Ｃ（Ｏ）ＮＨフェニル）、Ｃ（Ｏ）ＮＨアラルキル（例えば、Ｃ（Ｏ）ＮＨベンジル）、Ｃ（Ｏ）ＮＨアシル（例えば、Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−２０アルキル、Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｏ）フェニル）、Ｃ（Ｏ）Ｎアルキルアルキル（ここで、各アルキル（例えば、Ｃ１−２０）は同一でも異なっていてもよい。）及び５又は６員環（１つ以上の同じ又は異なるヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ及びＳ）を含んでいてもよい。）が挙げられる。
【０２２６】
用語「カルボキシエステル」は、当該分野で使用されるようにその最も広い意味で本明細書中で使用され、式ＣＯ２Ｒｇを有する基（ここで、Ｒｇは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、カルボシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アラルキル、及びアシルを含む群から選択されうる。）を包含する。カルボキシエステルの例には、ＣＯ２Ｃ１−２０アルキル、ＣＯ２アリール（例えば、ＣＯ２フェニル）、ＣＯ２アラルキル（例えば、ＣＯ２ベンジル）が挙げられる。
【０２２７】
本明細書中で使用される用語「アリールオキシ」は、酸素ブリッジを介して結合した「アリール」基を示す。アリールオキシ置換基の例には、フェノキシ、ビフェニルオキシ、ナフチルオキシなどが挙げられる。
【０２２８】
本明細書中で使用される用語「アシルオキシ」は、次に酸素原子を介して結合した「アシル」基を示す。「アシルオキシ」の例には、ヘキシルカルボニルオキシ（ヘプタノイルオキシ）、シクロペンチルカルボニルオキシ、ベンゾイルオキシ、４−クロロベンゾイルオキシ、デシルカルボニルオキシ（ウンデカノイルオキシ）、プロピルカルボニルオキシ（ブタノイルオキシ）、オクチルカルボニルオキシ（ノナノイルオキシ）、ビフェニルカルボニルオキシ（例えば、４−フェニルベンゾイルオキシ）、ナフチルカルボニルオキシ（例えば、１−ナフトイルオキシ）などが挙げられる。
【０２２９】
本明細書中で使用される用語「アルキルオキシカルボニル」は、カルボニル基を介して結合した「アルキルオキシ」基を示す。「アルキルオキシカルボニル」基の例には、ブチルホルメート、ｓｅｃ−ブチルホルメート、ヘキシルホルメート、オクチルホルメート、デシルホルメート、シクロペンチルホルメートなどが挙げられる。
【０２３０】
本明細書中で使用される用語「アリールアルキル」は、芳香族環で置換された直鎖又は分岐鎖アルカンから形成される基を示す。アリールアルキルの例には、フェニルメチル（ベンジル）、フェニルエチル及びフェニルプロピルが挙げられる。
【０２３１】
本明細書中で使用される用語「アルキルアリール」は、直鎖又は分岐アルカンで置換されたアリール基から形成される基を示す。アルキルアリールの例には、メチルフェニル及びイソプロピルフェニルが挙げられる。
【０２３２】
この明細書において、「置換されていてもよい」は、１つ、２つ、３つ、又はより多くの有機又は無機の基で、基が、置換又は縮合（縮合多環式基を形成するように）されていてもいなくてもよいことを意味するように解され、有機又は無機の基は、以下から選ばれるものが含まれる：アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボシクリル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アシル、アラルキル、アルカリール、アルクヘテロシクリル、アルクヘテロアリール、アルクカルボシクリル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルケニル、ハロアルキニル、ハロアリール、ハロカルボシクリル、ハロヘテロシクリル、ハロヘテロアリール、ハロアシル、ハロアラルキル（ｈａｒｏａｒｙａｌｋｙｌ）、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアルキニル、ヒドロキシカルボシクリル、ヒドロキシアリール、ヒドロキシヘテロシクリル、ヒドロキシヘテロアリール、ヒドロキシアシル、ヒドロキシアラルキル、アルコキシアルキル、アルコキシアルケニル、アルコキシアルキニル、アルコキシカルボシクリル、アルコキシアリール、アルコキシヘテロシクリル、アルコキシヘテロアリール、アルコキシアシル、アルコキシアラルキル、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、カルボシクリルオキシ、アラルキルオキシ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アシルオキシ、ハロアルコキシ、ハロアルケニルオキシ、ハロアルキニルオキシ、ハロアリールオキシ、ハロカルボシクリルオキシ、ハロアラルキルオキシ、ハロヘテロアリールオキシ、ハロヘテロシクリルオキシ、ハロアシルオキシ、ニトロ、ニトロアルキル、ニトロアルケニル、ニトロアルキニル、ニトロアリール、ニトロヘテロシクリル、ニトロヘテロアリール（ｎｉｔｒｏｈｅｔｅｒｏａｙｌ）、ニトロカルボシクリル、ニトロアシル、ニトロアラルキル、アミノ（ＮＨ２）、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、アラルキルアミノ、ジアラルキルアミノ、アシルアミノ、ジアシルアミノ、ヘテロシクリルアミノ（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌａｍｉｎｏ）、ヘテロアリールアミノ、カルボキシ、カルボキシエステル、アミド、アルキルスルホニルオキシ、アリールスルフェニルオキシ、アルキルスルフェニル、アリールスルフェニル、チオ、アルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、アラルキルチオ、カルボシクリルチオ、ヘテロシクリルチオ、ヘテロアリールチオ、アシルチオ、スルホキシド、スルホニル、スルホンアミド、アミノアルキル、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミノカルボシクリル、アミノアリール、アミノヘテロシクリル、アミノヘテロアリール、アミノアシル、アミノアラルキル、チオアルキル、チオアルケニル、チオアルキニル、チオカルボシクリル、チオアリール、チオヘテロシクリル、チオヘテロアリール、チオアシル、チオアラルキル、カルボキシアルキル、カルボキシアルケニル、カルボキシアルキニル、カルボキシカルボシクリル、カルボキシアリール、カルボキシヘテロシクリル、カルボキシヘテロアリール、カルボキシアシル、カルボキシアラルキル、カルボキシエステルアルキル、カルボキシエステルアルケニル、カルボキシエステルアルキニル、カルボキシエステルカルボシクリル、カルボキシエステルアリール、カルボキシエステルヘテロシクリル、カルボキシエステルヘテロアリール、カルボキシエステルアシル、カルボキシエステルアラルキル、アミドアルキル、アミドアルケニル、アミドアルキニル、アミドカルボシクリル、アミドアリール、アミドヘテロシクリル、アミドヘテロアリール、アミドアシル、アミドアラルキル、ホルミルアルキル、ホルミルアルケニル、ホルミルアルキニル、ホルミルカルボシクリル、ホルミルアリール、ホルミルヘテロシクリル、ホルミルヘテロアリール、ホルミルアシル、ホルミルアラルキル、アシルアルキル、アシルアルケニル、アシルアルキニル、アシルカルボシクリル、アシルアリール、アシルヘテロシクリル、アシルヘテロアリール、アシルアシル、アシルアラルキル、スルホキシドアルキル、スルホキシドアルケニル、スルホキシドアルキニル、スルホキシドカルボシクリル、スルホキシドアリール、スルホキシドヘテロシクリル、スルホキシドヘテロアリール、スルホキシドアシル、スルホキシドアラルキル、スルホニルアルキル、スルホニルアルケニル、スルホニルアルキニル、スルホニルカルボシクリル、スルホニルアリール、スルホニルヘテロシクリル、スルホニルヘテロアリール、スルホニルアシル、スルホニルアラルキル、スルホンアミドアルキル、スルホンアミドアルケニル、スルホンアミドアルキニル、スルホンアミドカルボシクリル、スルホンアミドアリール、スルホンアミドヘテロシクリル、スルホンアミドヘテロアリール、スルホンアミドアシル、スルホンアミドアラルキル、ニトロアルキル、ニトロアルケニル、ニトロアルキニル、ニトロカルボシクリル、ニトロアリール、ニトロヘテロシクリル、ニトロヘテロアリール、ニトロアシル、ニトロアラルキル、シアノ、スルフェート、ホスフェート、トリアリールメチル、トリアリールアミノ、オキサジアゾール、及びカルバゾール基。任意の置換はまた、鎖又は環における−ＣＨ２−基が、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲａ−、−Ｃ（Ｏ）−（すなわち、カルボニル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（すなわち、エステル）、及び−Ｃ（Ｏ）ＮＲａ−（すなわち、アミド）（ここで、Ｒａは上で定義したとおりである。）から選択される基により置き換えられる場合も示すと解されうる。
【０２３３】
好ましい任意の置換基には、アルキル、（例えば、Ｃ１−６アルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル又はシクロヘキシル）、ヒドロキシアルキル（例えば、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル）、アルコキシアルキル（例えば、メトキシメチル、メトキシエチル、メトキシプロピル、エトキシメチル、エトキシエチル、エトキシプロピルなど）  アルコキシ（例えば、Ｃ１−６アルコキシ、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、シクロプロポキシ、シクロブトキシ）、ハロ、トリフルオロメチル、トリクロロメチル、トリブロモメチル、ヒドロキシ、フェニル（これ自体、例えば、Ｃ１−６アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロＣ１−６アルキル、シアノ、ニトロＯＣ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、及びアミノにより更に置換されていてもよい。）、ベンジル（ここで、ベンジル自体、例えば、Ｃ１−６アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロＣ１−６アルキル、シアノ、ニトロ  ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、及びアミノによりさらに置換されていてもよい。）、フェノキシ（ここで、フェニル自体、例えば、Ｃ１−６アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロＣ１−６アルキル、シアノ、ニトロ  ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、及びアミノにより更に置換されていてもよい）、ベンジルオキシ（ここで、ベンジル自体、例えば、Ｃ１−６アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロＣ１−６アルキル、シアノ、ニトロ  ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、及びアミノにより更に置換されていてもよい）、アミノ、アルキルアミノ（例えば、Ｃ１−６アルキル、例えばメチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノなど）、ジアルキルアミノ（例えば、Ｃ１−６アルキル、例えば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ）、アシルアミノ（例えば、ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３）、フェニルアミノ（ここで、フェニル自体、例えば、Ｃ１−６アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロＣ１−６アルキル、シアノ、ニトロ  ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、及びアミノにより更に置換されていてもよい。）、ニトロ、ホルミル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル、例えば、アセチル）、Ｏ−Ｃ（Ｏ）−アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル、例えば、アセチルオキシ）、ベンゾイル（ここで、フェニル基自体、例えば、Ｃ１−６アルキル、ハロ、ヒドロキシ  ヒドロキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロＣ１−６アルキル、シアノ、ニトロ  ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル及びアミノにより更に置換されていてもよい。）；Ｃ＝Ｏ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル、例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル）、ＣＯ２フェニル（ここで、フェニル自体、例えば、Ｃ１−６アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシルＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロＣ１−６アルキル、シアノ、ニトロ  ＯＣ��Ｏ）Ｃ１−６アルキル、及びアミノにより更に置換されていてもよい。）、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨフェニル（ここで、フェニル自体、例えば、Ｃ１−６アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシルＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロＣ１−６アルキル、シアノ、ニトロ  ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル及びアミノにより更に置換されていてもよい）、ＣＯＮＨベンジル（ここで、ベンジル自体、Ｃ１−６アルキル、ハロ、ヒドロキシヒドロキシルＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロＣ１−６アルキル、シアノ、ニトロ  ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、及びアミノにより更に置換されていてもよい。）、ＣＯＮＨアルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル、例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルアミド）  ＣＯＮＨジアルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル）  アミノアルキル（例えば、ＨＮＣ１−６アルキル−、Ｃ１−６アルキルＨＮ−Ｃ１−６アルキル−及び（Ｃ１−６アルキル）２Ｎ−Ｃ１−６アルキル−）、チオアルキル（例えば、ＨＳＣ１−６アルキル−）、カルボキシアルキル（例えば、ＨＯ２ＣＣ１−６アルキル−）、カルボキシエステルアルキル（例えば、Ｃ１−６アルキルＯ２ＣＣ１−６アルキル−）、アミドアルキル（例えば、Ｈ２Ｎ（Ｏ）ＣＣ１−６アルキル−、Ｈ（Ｃ１−６アルキル）Ｎ（Ｏ）ＣＣ１−６アルキル−）、ホルミルアルキル（例えば、ＯＨＣＣ１−６アルキル−）、アシルアルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル（Ｏ）ＣＣ１−６アルキル−）、ニトロアルキル（例えば、Ｏ２ＮＣ１−６アルキル−）、スルホキシドアルキル（例えば、Ｒ（Ｏ）ＳＣ１−６アルキル、例えば、Ｃ１−６アルキル（Ｏ）ＳＣ１−６アルキル−）、スルホニルアルキル（例えば、Ｒ（Ｏ）２ＳＣ１−６アルキル−、例えば、Ｃ１−６アルキル（Ｏ）２ＳＣ１−６アルキル−）、スルホンアミドアルキル（例えば、２ＨＲＮ（Ｏ）ＳＣ１−６アルキル、Ｈ（Ｃ１−６アルキル）Ｎ（Ｏ）ＳＣ１−６アルキル−）、トリアリールメチル、トリアリールアミノ、オキサジアゾール、及びカルバゾールによるＣＨ２の置き換えが、挙げられる。
【０２３４】
ここで、本発明を、以下の非限定的実施例を参照して記載する。
【実施例】
【０２３５】
実施例１
原料
Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及びオリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（ＯＥＧＭＡ４７５、Ｍｎおよそ４７５ｇｍｏｌ−１）モノマーは、Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、ヒドロキノン又はヒドロキノンモノメチルエーテル用の阻害剤除去剤（Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下、使用前に３０分間撹拌することによって精製した。ビス−ＲＡＦＴ剤、４−シアノ−４−（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）ペンタノイルオキシ）ブチル４−シアノ−４−（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）ペンタノエート（Ｉ）を、以下に記載する手順に従って調製した。１，１’−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）（ＶＡＺＯ−８８）開始剤（ＤｕＰｏｎｔ）を受け取ったまま使用した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（ＡＲグレード、Ｍｅｒｃｋ）を、使用前少なくとも１５分間窒素パージ（ｓｐａｒｇｉｎｇ）することにより、脱気した。ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ｎ−ヘプタン、ジイソプロピルエーテル、ヨウ化メチル及びメタノール及び他の化学薬品は、市販の試薬であり、更に精製することなく使用した。
【０２３６】
方法
ビス−ＲＡＦＴ剤：４−シアノ−４（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）ペンタノイルオキシ）ブチル４−シアノ−４−（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）ペンタノエート：Ｃ４２Ｈ７２Ｎ２Ｏ４Ｓ６；ＭＷ８６１．４２
【０２３７】
【化９】
2014520506.tif 000010
【０２３８】
ジクロロメタン（６０ｍＬ）及びＤＭＡＰ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン、触媒量）中の、（Ｓ）−４−シアノ−４−（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）ペンタン酸（８．１ｇ、２０．１ｍｍｏｌ）、１，４−ブタンジオール（０．９ｇ、１０ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド、４．９５ｇ、２４．０ｍｍｏｌ）を、１時間室温で撹拌させた。溶媒の除去後、粗反応混合物を、酢酸エチル：ｎ−ヘキサン  ２：５（ｖ／ｖ）を溶出液として用いたシリカゲルカラムのカラムクロマトグラフィーにより、精製して、表題生成物（６．２ｇ、収率７２％）を黄色オイルとして得、これを冷蔵庫で固化した。プロトン核磁気共鳴（１Ｈ  ＮＭＲ）（ＣＤＣｌ３）（ｐｐｍ）  ０．８９  （ｔ，  ６Ｈ，  ２×ＣＨ３）；  １．２７  （ｂｒ  ｓ，  ３６Ｈ）；  １．７２  （ｍ，  ４Ｈ）；  １．９０  （ｓ，  ６Ｈ，  ２×ＣＨ３）；  ２．４０−２．８０  （ｍ，  ８Ｈ，  ２×ＣＨ２ＣＨ２）；  ３．３８  （ｔ，  ４Ｈ，  ２×ＣＨ２Ｓ）；  ４．１５  （ｔ，  ４Ｈ，  ２×ＣＨ２Ｏ）．
【０２３９】
工程１：ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＤＭＡＥＭＡ）テレケリックマクロＲＡＦＴ剤の合成及びキャラクタリゼーション：
典型的な重合実験においては、７８６ｍｇのＤＭＡＥＭＡモノマー（５．００×１０−３ｍｏｌ）、０．６６ｍｇのＶＡＺＯ−８８開始剤（２．７０×１０−６ｍｏｌ）、及び５３．８４ｍｇのビス−ＲＡＦＴ剤（６．２５×１０−５ｍｏｌ）及び６２１ｍｇのＤＭＦ（８．４９×１０−３ｍｏｌ）を、以下のように、自動パラレル合成装置（Ｃｈｅｍｓｐｅｅｄ  Ｓｗｉｎｇ−ＳＬＴ）の１３ｍＬのガラス反応容器中で、一緒に混合した。ＤＭＡＥＭＡ（モノマー）に溶解したＶＡＺＯ−８８（開始剤）及びＤＭＦに溶解したビス−ＲＡＦＴ剤のストック溶液を調製し、使用前少なくとも１５分間窒素パージすることにより脱気した。これらのストック溶液を、その自動化された液体ハンドリングシステムを用いて、上記の試薬量を達するために、パラレル合成装置の反応容器の１つに、添加して合わせた。反応容器中ですぐに、パラレル合成装置において、反応混合物を、−９０℃と−１０℃との間の（各サイクル２分間、１０ｍｂａｒの減圧）３回の冷凍−ポンプ−解凍サイクルに供した。
【０２４０】
その後、反応混合物を９０℃まで１２．５時間加熱した。達成されたモノマーからポリマーへの変換は、ＰＤＭＡＥＭＡポリマーの反復ユニットの−ＣＨ２プロトンに関するδ３．９−４．２ｐｐｍ領域のピークのものと、ＤＭＡＥＭＡモノマーの−ＣＨ２プロトンに対応するδ４．２−４．３ｐｐｍ領域の共鳴ピークの積分を比較することにより、プロトン核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）（重水素クロロホルム（ＣＤＣｌ３）中）により決定されたように、９２％であった。次いで、変換を、以下の等式を用いて計算した：％モノマー変換＝［Ｉ３．９／（Ｉ４．３＋Ｉ３．９）］×１００；ここで、Ｉ４．３及びＩ３．９は、ＤＭＡＥＭＡモノマーの及びＰＤＭＡＥＭＡポリマーのそれぞれの−ＣＨ２プロトンについての整数値である。ポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は、ポリスチレン標準に対するゲルパーミッションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により決定されるように、１８６３７Ｄａ（１．１７の多分散指数（ＰＤＩ））であった。
【０２４１】
工程２：ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート−ブロック−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート−ブロック−オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート）（Ｐ（ＯＥＧＭＡ４７５−ｂ−ＤＭＡＥＭＡ−ｂ−ＯＥＧＭＡ４７５）の合成及びキャラクタリゼーション：
【０２４２】
ＡＢＡトリブロックコポリマーを調製するために２つの方法を用いた。最初の方法（方法Ａ）においては、工程１の最後の生成物を、ＯＥＧＭＡ４７５と共重合するために直接用いた。この方法では、存在する未反応のＤＭＡＥＭＡが、準トリブロックコポリマーを産生するＯＥＧＭＡ４７５とランダムに共重合される。二番目の方法（方法Ｂ）では、第２のモノマーを共重合する前に、未反応のＤＭＡＥＭＡを完全に除去した。この場合、産生されるトリブロックコポリマーは、それぞれＤＭＡＥＡＭ及びＯＥＧＭＡ４７５の純粋なホモポリマーブロックを有する。
【０２４３】
方法Ａ
工程１からのポリマー溶液（ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＤＭＡＥＭＡ）ホモポリマー（テレケリックマクロＲＡＦＴ剤））を、以下のように自動パラレル合成装置（Ｃｈｅｍｓｐｅｅｄ  Ｓｗｉｎｇ−ＳＬＴ）の１３ｍＬのガラス反応容器中で、９５０ｍｇのＯＥＧＭＡ４７５（２．００×１０−３ｍｏｌ）及び０．６６ｍｇのＶＡＺＯ−８８開始剤（２．７０×１０−６ｍｏｌ）と混合した。ＯＥＧＭＡ４７５（モノマー）に溶解したＶＡＺＯ−８８（開始剤）及びＤＭＦ（溶媒）に溶解したテレケリックマクロＲＡＦＴ剤のストック溶液を、調製し、使用前少なくとも１５分間窒素パージすることにより脱気した。これらのストック溶液を、上記の試薬量を達するために、その自動液体ハンドリングシステムを用いて、パラレル合成装置の反応器の１つに添加し、合わせた。反応容器中ですぐに、反応混合物を、パラレル合成装置において、−９０℃と−１０℃との間の（各サイクル２分間の１０ｍｂａｒの吸引）３回の冷凍−ポンプ−解凍サイクルに供した。このアプローチから得られた物質は、準トリブロックコポリマー（工程１の残存モノマーが除去されていないので）として知られる高分子構造を有することが予測される。ポリマー４２２−３（表１参照）を、この方法に従い調製した。
【０２４４】
方法Ｂ
重合工程１から得られた反応混合物を、ＤＣＭで希釈し、ポリマーを、ｎ−ヘプタン中に混合物を滴下することによって調製した。析出したポリマーを溶液の残りからデカントした。この後者の手順を２回行った。最終工程では、ポリマーを、重量が一定になるまで、４０℃で減圧下乾燥した。乾燥したポリマー（ＰＤＭＡＥＭＡホモポリマー（テレケリックＲＡＦＴ剤））を、２６３８ｍｇのＤＭＦ（３．６１×１０−２ｍｏｌ）に再溶解した。ＯＥＧＭＡ４７５（モノマー）に溶解したＶＡＺＯ−８８（開始剤）をこの後者の溶液に添加し、準トリブロックコポリマーの合成について上記したものと同様の条件に曝した。このアプローチから得られた物質は、トリブロックコポリマー（工程１における重合の残存モノマーは、説明した析出手順により除去されたので）として知られる高分子構造を有することが予測される。ポリマー１１２５（表１参照）は、この方法を用いて調製した。
【０２４５】
工程２（方法Ａ及びＢ）におけるすべてのケースの反応混合物を、９０℃まで６時間加熱した。達成されたモノマーからポリマーへの変換は、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３中；ＤＭＡＥＭＡの重合について上で説明したのと同様の手順に従った）により決定されたように、７８％だった。
【０２４６】
トリブロックコポリマーの精製：工程２（方法Ａ及びＢ）後の重合された反応混合物を、ＤＣＭで希釈し、ポリマーを、ジイソプロピルエーテル中に混合物を滴下することによって、析出させた。析出したポリマーを、溶液の残りからデカントした。この後者の手順を２回行った。最後の工程では、ポリマーを重量が一定になるまで減圧下で乾燥した。ポリマー性物質の更なる精製を、３日間ＭｉｌｌｉＱ水に対して透析（３５００の分子量カットオフ、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｏｒ，  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｈｏｕｓｔｏｎ，  Ｔｘ）することにより、行った。透析後、ロータリーエバポレーター（Ｒｏｔｏｖａｐｏｒ  Ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）中で、ポリマー水溶液から水を除去した。
【０２４７】
四級化：ポリマーをＤＣＭに再溶解し、過量のヨウ化メチルをこの溶液に添加し、トリブロックコポリマーのＰＤＭＡＥＭＡブロック三級アミノ基の四級化を達成するために、２時間室温で撹拌した。最終工程では、ＤＣＭ及び過量のヨウ化メチルをロータリーエバポレーターで除去した。ポリマーを更に、４０℃で２４時間減圧下で乾燥した。
【０２４８】
異なるモノマー供給比率を用いるが同様の手順を使用することによって、カチオン性（ＰＤＭＡＥＭＡ）及び親水性（Ｐ（ＯＥＧＭＡ４７５））ブロックの両方の異なる長さを有するいくつかのトリブロックコポリマーを、調製した。ポリマーサンプル４２２−１  ４２２−２、１００７−１、１００７−２及び１００７−３は、工程２における方法Ａを用いて調製した（表１参照）。
【０２４９】
トリブロックコポリマーの一般的化学構造（Ａ）を以下に示す。一方、表１は、調製したブロックコポリマーのシリーズの分子量及びブロック長を要約している。
【０２５０】
【化１０】
2014520506.tif 000011
【０２５１】
【表１】
2014520506.tif 000012
【０２５２】
キャラクタリゼーション方法
ＧＰＣ測定を、ＣＭＢ−２０Ａコントローラーシステム、ＳＩＬ−２０Ａ  ＨＴオートサンプラー、ＬＣ−２０ＡＴタンデムポンプシステム、ＤＧＵ−２０Ａ脱気ユニット、ＣＴＯ−２０ＡＣカラムオーブン、ＲＤＩ−１０Ａ屈折率検出器、及び７０℃のＰＬ  Ｒａｐｉｄｅ（Ｖａｒｉａｎ）カラムを備え付けた、Ｓｈｉｍａｄｚｕシステム上で行った。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（２．１ｇＬ−１の塩化リチウム（ＬｉＣｌ）を含む）を、流速１ｍＬｍｉｎ−１で溶出液として用いた。報告した分子量は、ポリスチレン標準に対するものである。
【０２５３】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）スペクトルを、ＣＤＣｌ３中又は重水素オキシド（Ｄ２Ｏ）中のいずれかで、２５℃で、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖ４００スペクトロメーターを用いて記録した。
【０２５４】
異なる細胞株に対する、実施例１で調製したＲＡＦＴブロックコポリマーの毒性の評価
【０２５５】
材料
細胞：緑色蛍光タンパク質を構成的に発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−ＧＦＰ）（Ｋ．Ｗａｒｋ；ＣＳＩＲＯ  ＣＭＨＴ  オーストラリアから快く受託）を、１０％ウシ胎児血清、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．０１％ペニシリン、及び０．０１％ストレプトマイシンを補充したＭＥＭα改変物中で、５％  ＣＯ２、３７℃で増殖させ、１週間毎に２回サブクローニングした。
ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３）細胞を、１０％ウシ胎児血清、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭグルタミン、０．０１％ペニシリン、及び０．０１％ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０中で、５％  ＣＯ２、３７℃で増殖させ、１週間毎に２回サブクローニングした。
【０２５６】
毒性アッセイ：ＣＨＯ−ＧＦＰ及びＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェル組織培養プレートにおいて、１ウェルあたり３×１０４細胞で播種し、５％  ＣＯ２、３７℃で一晩増殖させた。
【０２５７】
ＲＡＦＴブロックコポリマーサンプルを、各サンプルについて、９６ウェル培養プレート中の３つのウェルに添加し、２００μｌ標準培地中で７２時間インキュベートした。製造業者の使用説明書にしたがってＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＵＳＡ）を用いて、毒性を測定した。要約すると、培地を除去し、１０％  Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ試薬を含有する１００μｌの標準培地と交換し、次いで、細胞を５％  ＣＯ２、３７℃で４時間インキュベートした。アッセイは、ＥＬ８０８吸光マイクロプレートリーダーで（ＢＩＯＴＥＫ，ＵＳＡ）５４０ｎｍ及び６２０ｎｍで解析した。細胞生存度を、５４０ｎｍ測定値から６２０ｎｍ測定値を差し引くことにより決定した。結果を、未処置細胞の百分率として提示する。図１は、ＣＨＯ−ＧＦＰ及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞で試験した場合のブロックコポリマーの細胞生存度の結果を示す。
【０２５８】
このポリマーの毒性を、ｓｉＲＮＡを会合させずに、２つの細胞株で調査した。ＣＨＯ−ＧＦＰ細胞は、速く増殖する頑強な（ｒｏｂｕｓｔ）細胞株であり、一方、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、トランスフェクションにより感受性である。様々な範囲のポリマー濃度を解析したところ、他の知見と同様に、分子が含んでいたＤＭＡＥＭＡ及びそれ故、正の荷電がより多いと、見かけ上より高い毒性が観察された（図２）。受容可能な毒性レベルを、ＣＨＯ−ＧＦＰ細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞の両方において６０％を超える細胞が生存することであるとみなした。同様のＤＭＡＥＭＡブロック長を有するＣＨＯ−ＧＦＰ細胞４２２−３及び１００７−２は、０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で毒性であり、０．０６２５ｍｇ／ｍｌでは非毒性になり、一方、４２２−１及び１００７−１は、０．２５ｍｇ／ｍｌを超えても非毒性であった。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、０．００５ｍｇ／ｍｌにて、４２２−１及び１００７−１は非毒性であったが、１１３の長さを超えるＤＭＡＥＭＡブロックを有する全てのポリマー（４２２−３、１００７−２及び１００７−３）は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では０．０５ｍｇ／ｍｌで毒性であった。０．０５ｍｇ／ｍｌは、６：１のポリマー対５０ｎＭ  ｓｉ２２のモル濃度比に対応する。これは、使用した標準的なサイレンシング濃度をＣＨＯ−ＧＦＰ細胞では非毒性にするが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では毒性にする。
【０２５９】
実施例３
合成ｓｉＲＮＡ及びＤＮＡオリゴヌクレオチド：抗ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ（ＵＳＡ）から入手した。抗ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ配列は、センス  ５’  ｇｃａａｇｃｕｇａｃｃｃｕｇａａｇｕｕｃａｕ  ３’（配列番号１）、及びアンチセンス  ５’ｇａａｃｕｕｃａｇｇｇｕｃａｇｃｕｕｇｃｃｇ  ３’（配列番号２）であり、ｓｉ２２と称される。
【０２６０】
抗ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ配列に対応するＤＮＡオリゴヌクレオチドを、Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ（Ｓｏｕｔｈ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入し、ｄｉ２２として識別した。等モル量のオリゴヌクレオチドを組み合わせることによりオリゴヌクレオチドをアニールさせ、９５℃へと１０分間加熱し、徐々に室温に冷却した。これらを、ｎｐサイレンシング効果を有するネガティブコントロールとして用いた。
【０２６１】
ポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体の形成：５０ｎＭ  ｓｉＲＮＡ又はｓｉＤＮＡに対するポリマー（表１を参照）のモル濃度比を算出した。ＯＰＴＩＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）のエッペンドルフチューブへの添加により、複合体を形成させた。水中に再懸濁されるポリマーの必要量を、チューブに添加し、混合物をボルテックスした。次いで、５０ｎＭのｓｉ２２又はｄｉ２２を、チューブに添加して、サンプルをボルテックスした。複合体化を室温で１時間継続させた。
【０２６２】
アガロースゲル電気泳動：ポリマーが５０ｎＭ  ｓｉＲＮＡに対して異なるモル濃度比にあるサンプルを、ＴＢＥ中の２％アガロースゲルで、１００Ｖにて４０分間電気泳動した。ｓｉＲＮＡを、カメラ付きＵＶトランスイルミネーターでゲルレッド（Ｊｏｍａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により可視化し、画像をＧｅｎｅＳｎａｐプログラム（Ｓｙｎｇｅｎｅ，ＵＳＡ）により記録した。
【０２６３】
以前の研究は、５０ｎＭのｓｉ２２が、アガロースゲルでの可視化に十分であること、及びコントロールであるリポフェクタミン２０００トランスフェクションによる、ＣＨＯ−ＧＦＰ細胞における８０％のＥＧＦＰシグナルの抑制（ｓｉｌｅｎｃｅ）に十分であることを示した（データ示さず）。したがって、この量のｓｉ２２を用いて、ポリマーがｓｉＲＮＡに結合し、ＣＨＯ−ＧＦＰ細胞におけるＥＧＦＰ発現を抑制する能力を決定した。１：１〜７：１までの範囲にわたるポリマー対ｓｉ２２のモル濃度比を、各ポリマーについて処方した。これは、毒性限界未満のポリマーレベルが使用されることを保証するためである。これらのサンプルを電気泳動に供し、ｓｉＲＮＡと会合する能力の差異を観察した（図２：４２２−３）。予測された２２ｎｔ移動からいかなる有意な程度にもゲルに進入し得ないｓｉＲＮＡのシフトにより、ｓｉＲＮＡの会合を決定した。５９を超えるＤＭＡＥＭＡ長を有する全ての準ＡＢＡトリブロックポリマーは、１：１又は２：１のモル濃度比にてｓｉＲＮＡに完全に結合することができた。３８という最短のＢブロック長を有する４２２−１は、有意な複合体形成を示す５：１のモル濃度比に対応する４：３のＮ／Ｐ比を必要とするｓｉＲＮＡと最小の親和性を有した。興味深いことに、ポリマーは、同じＮ／Ｐでさえも異なる結合親和性を示し、例えば、２．７のＮ／Ｐ比では、４２２−１は、ｓｉＲＮＡに完全に結合することができず、一方、他の準ＡＢＡトリブロックポリマーの大部分は、ｓｉＲＮＡに完全に結合することができた。
【０２６４】
ポリマーｓｉＲＮＡ複合体のサイズを、ＤＬＳにより決定した（実施例４を参照）。
【０２６５】
実施例４
動的光散乱（ＤＬＳ）及びゼータ電位測定：ｉ）６３２．８ｎｍで作動する２２ｍＷ  Ｈｅ−Ｎｅレーザーを備えるＭａｌｖｅｒｎ−Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＤＬＳ検出器、高い量子効率を有するアバランシェ（ａｖａｌａｎｃｈｅ）光ダイオード検出器、及びＡＬＶ／ＬＳＥ―５００３多重
【外１】
【０２６６】
2014520506.tif 000013
【０２６７】
デジタル相関器エレクトロニクスシステムを採用した動的光散乱実験を介して、ｓｉＲＮＡ／ブロックコポリマー複合体の水力学的直径（ＤＨ）を得た。サンプルを、３５００ｎＭのトータルｓｉＲＮＡ濃度で調製したところ、１．０のＮ／Ｐ比を維持しつつ、０．５ｍｇ／ｍＬという容量あたりの総質量（即ち、１ｍｌあたりブロックコポリマー質量＋ｓｉＲＮＡ質量）を含有していた。ダストを除去するため、ＤＬＳを介したキャラクタリゼーションの前に、サンプルを１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。全てのＤＨ測定を、２５℃にて三連で行い、複合体のサイズを、未複合体化ブロックコポリマー及び純粋なｓｉＲＮＡのものと比較した。
【０２６８】
Ｍａｌｖｅｒｎ−Ｚｅｔａｓｉｚｅｒにおける標準的なディスポーザブルゼータ電位フローセルにおける自動設定を用いて、ゼータ電位をＨＥＰＥＳ緩衝液中で測定した。電場中での粒子の移動度（電気泳動の移動度）及びサンプルにおける粒子サイズ分布の測定から、ゼータ電位を算出した。
【０２６９】
【表２】
2014520506.tif 000014
【０２７０】
注釈：＊ＤＬＳ測定は、２峰性の粒子サイズ分布を示したところ、報告した値は、粒子のほぼ９９％を構成したより小さなサイズ範囲についてのものである。他のフラクション中の粒子（およそ１％）は、９３〜２８０ｎｍの範囲内にある。
【０２７１】
実施例５
サイレンシングアッセイ
ＣＨＯ−ＧＦＰ細胞を、９６ウェル組織培養プレートにおいて三連で３×１０４細胞にて播種し、５％  ＣＯ２、３７℃で一晩増殖させた。ポジティブ及びネガティブコントロールのため、製造業者の使用説明書にしたがってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いて、ｓｉＲＮＡを細胞中にトランスフェクトした。リポフェクタミンは、現在まで広く使用され受け入れられているトランスフェクション試薬であり、これらのセットの実験における基準として働く。要約すると、５０ピコモルの関連ｓｉＲＮＡ（２５０ｎＭに対応する）を、１μｌのリポフェクタミン２０００と混合し（両方とも５０μｌ  ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）で希釈）、室温で２０分間インキュベートした。ｓｉＲＮＡ：リポフェクタミン混合物を細胞に添加し、４時間インキュベートした。細胞培地を交換し、７２時間インキュベートした。
【０２７２】
実施例１にしたがって調製したポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体について、細胞培地を除去し、１００μｌ  ＯＰＴＩ−ＭＥＭと交換した。１０μｌの容量にあるポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体を、１サンプルあたり３つのウェルの細胞に添加し、４時間インキュベートした。細胞培地を交換し、細胞を更に７２時間インキュベートした。
【０２７３】
細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン処理し、ＦＡＣＳ洗浄液（１％  ＦＢＳを有するＰＢＳ）で１回洗浄した。細胞を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  ＬＳＲＩＩでフローサイトメトリーに供し、ＥＧＦＰサイレンシングを、非サイレンシングｓｉＲＮＡ又はポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体の平均ＥＧＦＰ（ＦＩＴＣ波長で測定）蛍光の百分率として解析した。結果を、図３及び表３に要約する。
【０２７４】
【表３】
2014520506.tif 000015
【０２７５】
ａ）Ｎ／Ｐ比；ｂ）ｓｉＲＮＡ結合％；ｃ）サイレンシング効率％；ｄ）ポリマー濃度μｇ／ｍｌ。陰影は、ｓｉＲＮＡ無しでのポリマーの毒性濃度を示す。
【０２７６】
ＣＨＯ−ＧＦＰ細胞は、青色４０８ｎｍレーザーにより励起される場合に約５１８ｎｍに緑色シグナルを発する増強緑色蛍光タンパク質を遍在的に発現する。これは、蛍光顕微鏡分析及びフローサイトメトリーの両方により容易に検出される。したがって、ＥＧＦＰのサイレンシングは、フローサイトメトリープロットでの細胞集団のシフトにより、及び平均ＧＦＰ蛍光の減少により容易に決定される。様々な範囲のモル濃度比でのポリマーの添加は、８以上のＮ／Ｐ比に対応する３：１以上のモル濃度比にある４２２−３、１００７−２及び１００７−３が有意なレベルのサイレンシングを示すことができたことを示す（図３及び４）。１１２５のゼータ電位は、４２２−３のものよりも低い。
【０２７７】
リポフェクタミン２０００と等価なサイレンシングを与えるために必要とされる４２２−３サンプル中におけるｓｉＲＮＡの最小濃度を決定するため、リポフェクタミン２０００及び４２２−３を４：１の比率で用いて、希釈曲線を作成した。等価なサイレンシング、それ故、有意な効果を達成するために必要とされるｓｉＲＮＡの最小量は、１００ｎＭであった。
【０２７８】
実施例６
血清の安定性：ポリマーが血清プロテアーゼによる分解からｓｉＲＮＡを保護する能力を、必須増殖ホルモンを提供するために組織培養で一般に用いられるウシ胎児血清を用いて、インビトロで測定した。裸（ｎａｋｅｄ）のｓｉＲＮＡは、血清中では数時間以内に分解されるが、この結果は、ポリマー複合体に含まれるｓｉＲＮＡが３７℃で８８時間まで保護されたことを示す（図５）。次いで、残りのサンプルを、ＣＨＯ−ＧＦＰ細胞に添加して、ｓｉＲＮＡがインタクトであり、かつアクティブでさえあったかどうかを決定した。全てのポリマー複合体でサイレンシングが観察され、ＦＢＳ処理後に活性が僅かに減少した（図５Ｅ）。血清では、複合体のいかなる沈殿も観察されなかった。これはまた、関心事項である。正に荷電した分子は、血清タンパク質と会合し、溶液から沈殿を生じることが知られているためである（データ示さず）。
【０２７９】
実施例７
本実施例では、一連の準トリブロックコポリマーを調製して、毒性、ｓｉＲＮＡ取込み、及び遺伝子サイレンシングに対する、親水性ブロックＰＥＧＭＡ中に少量のカチオン性モノマーＤＭＡＥＭＡが含有されることの効果を系統的に評価した。
【０２８０】
実施例１に記載される方法を用いて、モノマーを精製し、ビス連鎖移動剤（ｂｉｓ  ｃｈａｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｇｅｎｔ）（Ｉ）を調製して本実施例におけるポリマーを合成した。
【０２８１】
工程１：ＰＤＭＡＥＭＡテレケリックマクロＲＡＦＴ剤の合成及びキャラクタリゼーション：
ＤＭＡＥＭＡモノマー（３．１５ｇ、２．００×１０−２ｍｏｌ）、ＶＡＺＯ−８８開始剤（２．６４ｍｇ、１．０８×１０−５ｍｏｌ）、ビスＲＡＦＴ剤（Ｉ）（ＤＭＦ中０．３２８ｇ／ｍＬのストック溶液の４８０μＬ、１．８×１０−７ｍｏｌ）、及びＤＭＦ（２．０２ｇ、２．７６×１０−２ｍｏｌ）を、ガラスバイアル中に分注し、全ての成分が溶解するまで混合した。次いで、反応混合物を、マグネチックスターラーを含むＹｏｕｎｇ容器中に移し、−７８℃と室温との間の３回凍結−ポンプ−解凍サイクルに供した。その後、反応混合物を１２．５時間で９０℃まで加熱した。ポリマー変換に対して得られたモノマーは、（実施例１、工程１において説明したとおり）１Ｈ−ＮＭＲにより測定したように、９１％であった。
【０２８２】
得られた反応混合物をＤＣＭで希釈し、ｎ−ヘプタン中にＤＣＭ混合物を滴下することにより、ポリマーを析出させた。上清をポリマー残渣からデカントし、この析出手法を更に２回行った。次いで、ポリマーを、恒量に達するまで、４０℃で減圧下で乾燥させた。ポリマーのＭｎは、ポリスチレン標準に対するＧＰＣにより決定したように、２３６３５Ｄａ（１．１５のＰＤＩ）であると見積もられた。
【０２８３】
工程２：ＤＭＡＥＭＡモノマーユニットがＰ（ＯＥＧＭＡ４７５）−ブロック中に変動的に取り込まれたＰ（ＯＥＧＭＡ４７５−ｂ−ＤＭＡＥＭＡ−ｂ−ＯＥＧＭＡ４７５）の合成及びキャラクタリゼーション
【０２８４】
ＤＭＡＥＭＡのそれらの量を異なるものにすることにより、４つのポリマー改変物を調製した。ＤＭＡＥＭＡモノマーユニットを、Ｐ（ＯＥＧＭＡ４７５）−ブロック中に、元のＤＭＡＥＭＡ前駆テレケリックマクロＲＡＦＴ剤合成に用いられたＤＭＡＥＭＡ出発材料に対して０、２、５、及び１０ｍｏｌ％のレベルで、取り込ませた。
【０２８５】
４つの改変物の各々の合成に共通の試薬溶液を調製した。乾燥ＰＤＭＡＥＭＡホモポリマー（テレケリックマクロＲＡＦＴ剤）（１．４０ｇ、１．４５×１０−２ｍｏｌ）をＤＭＦ（４．４３ｇ、２．０６×１０−２ｍｏｌ）中に再溶解し、この溶液にＯＥＧＭＡ４７５モノマー（１．７０ｇ、３．５８×１０−３ｍｏｌ）、ＤＭＦ中に溶解させたＶＡＺＯ−８８（開始剤）（０．１ｍｌの１．２ｍｇ／ｍＬ溶液、４．９０×１０−４ｍｏｌ）、及びトリオキサン（４５ｍｇ、５．００×１０−４ｍｏｌ）を添加した。この試薬溶液を全ての成分が溶解するまで撹拌し、４つのアリコートに分割した（４×１．８９５ｇ反応混合物）。ＤＭＦ中のＤＭＡＥＭＡモノマー（３９．４ｍｇ／ｍＬ）及びＤＭＦ溶媒を、表４に示される容量中に添加した。
【０２８６】
【表４】
2014520506.tif 000016
【０２８７】
全ての場合の反応混合物（Ａ〜Ｄ）を、６時間で９０℃まで加熱した。ポリマー変換に対して得られたモノマーを（１Ｈ−ＮＭＲにより）決定したように、各反応について８６〜８８％の範囲内にあった（ＣＤＣｌ３中；ＤＭＡＥＭＡの重合について上記で説明したのと同様の手法にしたがう）。Ｍｎ及びＰＤＩを、ＰＳ標準に対するＧＰＣにより決定した。これらのパラメーターの値を表５に示す。
【０２８８】
【表５】
2014520506.tif 000017
【０２８９】
トリブロックコポリマーの精製：工程１からの重合反応混合物（１９８ＪＧ１４Ａ〜Ｄ）を、ＤＣＭで別々に希釈し、混合物をジイソプロピルエーテル中に滴下することにより、各ポリマーを析出させた；析出したポリマーを、溶液の残りからデカントした。この後者の手法を２回行った。最終工程では、ポリマーを、恒量に達するまで、減圧下で乾燥させた。ポリマー材料のさらなる精製を、Ｍｉｌｉ−Ｑ水に対する３日間の透析（３５００の分子量カットオフ、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｏｒ，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｘ）により行った。透析後、ロータリーエバポレーターの使用により、水を水溶性ポリマー溶液から除去した。
【０２９０】
四級化：ポリマーをＤＣＭ中に再溶解させ、過量のヨウ化メチルを、以下の表６中で特定された容量において、これらの溶液中に添加した。準トリブロックコポリマー中に取り込まれたＤＭＡＥＭＡ基の三級アミノ基の四級化を達成するため、反応系を室温で２時間撹拌した。
【０２９１】
【表６】
2014520506.tif 000018
【０２９２】
溶媒及び過量のヨウ化メチルを、ロータリーエバポレーターにおいて除去し、ポリマーを減圧下で４０℃で２４時間乾燥した。
【０２９３】
コポリマーを、実施例１に記載されるように、ＧＰＣ及びＮＭＲによりキャラクタリゼーションし、結果を表７に要約した。
【０２９４】
【表７】
2014520506.tif 000019
【０２９５】
本実施例で調製したコポリマーは、予測されたものと同様の分子量を示した。これらのコポリマー中の中心的なカチオン性ブロックは、０〜１０％の範囲にあるＤＭＡＥＭＡモノマーユニットと、同一のブロック長及び０〜１０％の範囲にあるＤＭＡＥＭＡモノマーユニットを有する同様のＯＥＧＭＡ４７５ブロックを有する。ＤＡＥＭＡ含量が増加すると、ポリマー分子量はそれに応じて増加する。
【０２９６】
実施例８
この実施例は、実施例１（方法Ｂ）及び実施例６で調製したトリブロックコポリマーと比較するために、ＤＭＡＥＭＡ及びＯＥＧＭＡ４７５からのジブロックコポリマーの調製を記載する。
【０２９７】
実施例１に記載した手順をモノマーを精製するために使用し、以下に記載するように、連鎖移動剤（ＩＩ）を合成し、精製した。
【０２９８】
ＲＡＦＴ剤：４−シアノ−４−［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタン酸（ＩＩ）：Ｃ１９Ｈ３３ＮＯ２Ｓ３；ＭＷ４０３．１７
【０２９９】
【化１１】
2014520506.tif 000020
【０３００】
を、ＷＯ２００５／１１３４９３Ａ１に記載される手順に従って合成した。
【０３０１】
工程１：ＰＤＭＡＥＭＡマクロＲＡＦＴ剤の合成及びキャラクタリゼーション：
典型的な合成実験においては、２３５８．１５ｍｇのＤＭＡＥＭＡモノマー（１．５０×１０−２ｍｏｌ）、１．９８ｍｇのＶＡＺＯ−８８開始剤（８．１０×１０−６ｍｏｌ）、及び３２．７０ｍｇのＲＡＦＴ剤（８．１０×１０−５ｍｏｌ）、並びに４６９４．０５ｍｇのＤＭＦ（６．４２×１０−２ｍｏｌ）を、マグネチックスターラーを含むＹｏｕｎｇ容器中で、一緒に混合した。反応混合物を、少なくとも１５分間窒素ガスをパージすることにより脱気し、−７８℃と室温との間の３回の冷凍−ポンプ−解凍サイクルに供した。
【０３０２】
その後、反応混合物を、９０℃まで１時間加熱した。達成されたモノマーからポリマー変換は、１Ｈ−ＮＭＲ（実施例１、工程１で説明したように）により決定されたように、４４％だった。ポリマーのＭｎは、ポリスチレン標準に対するＧＰＣにより決定されたように、２０１８７Ｄａ（１．３２のＰＤＩ）だった。
【０３０３】
工程２：ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート−ブロック−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（Ｐ（ＯＥＧＭＡ４７５−ｂ−ＤＭＡＥＭＡ）の合成及びキャラクタリゼーション：
【０３０４】
工程１における重合からの反応混合物をＤＣＭで希釈し、ポリマーを、ｎ−ヘプタン中に混合物を滴下することにより析出させた。析出したポリマーを溶液の残りからデカントした。この後者の手順を２回行った。最終工程では、重量が一定になるまで、ポリマーを４０℃で減圧下で乾燥した。４８７．２ｍｇの乾燥したポリマー（ＰＤＭＡＥＭＡホモポリマー（マクロＲＡＦＴ剤）、２．４１×１０−５ｍｏｌ）を、マグネチックスターラーを含むＹｏｕｎｇ容器中で、５６００ｍｇのＤＭＦ（７．６６×１０−２ｍｏｌ）に再溶解した。１９１０ｍｇのＯＥＧＭＡ４７５（モノマー、４．０２×１０−３ｍｏｌ）に溶解した１．３ｍｇのＶＡＺＯ−８８（開始剤、５．３０×１０−６ｍｏｌ）を、後者の溶液中に添加し、ＰＤＭＡＥＭＡマクロＲＡＦＴ剤の合成の場合について上記した脱気方法に曝した。その後、反応混合物を９０℃まで３時間加熱した。このアプローチから得られた物質は、ジブロックコポリマー（工程１における重合の残存モノマーを、説明した析出手順により除去したので）として知られている高分子構造を有することが予測される。ポリマー０４０８−Ａを、この方法を用いて調製した。２８６６ｍｇのＤＭＦ（３．９２×１０−２ｍｏｌ）に再溶解した３７９．３ｍｇの乾燥したポリマー（ＰＤＭＡＥＭＡホモポリマー（マクロＲＡＦＴ剤）、１．８７×１０−５ｍｏｌ）及び９５０ｍｇのＯＥＧＭＡ４７５（モノマー、２．００×１０−３ｍｏｌ）に溶解した０．６６ｍｇのＶＡＺＯ−８８（開始剤、２．７０×１０−６ｍｏｌ）を用いる以外、上記したのと同様の方法を用いて、ポリマーサンプル０４０８−Ｂを調製した。この後者の反応混合物を９０℃まで２時間加熱した。表８は、これらの後者の方法を用いて合成されたジブロックコポリマーの特性を要約している。
【０３０５】
ジブロックコポリマーの精製：両方の場合において、得られたブロックコポリマーの反応混合物を、ＤＣＭで希釈し、ポリマーを、ジイソプロピルエーテル中に混合物を滴下することによって、析出させた。析出したポリマーを溶液の残りからデカントした。この後者の手順を２回行った。最終工程では、重量が一定になるまで、ポリマーを減圧下で乾燥した。ポリマー性物質の更なる精製を、３日間ＭｉｌｉＱ水に対する透析（３５００の分子量カットオフ、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｏｒ，  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｈｏｕｓｔｏｎ，  Ｔｘ）により、行った。透析後、ロータリーエバポレーターにおいて、ポリマー水溶液から、水を除去した。
【０３０６】
四級化：ポリマーを、ＤＣＭに再溶解し、過量のヨウ化メチルをこの溶液中に添加し、ジブロックコポリマーのＰＤＭＡＥＭＡブロックの三級アミノ基の四級化を達成するために、室温で２時間撹拌した。最終工程では、ＤＣＭ及び過量のヨウ化メチルをロータリーエバポレーターで除去し、ポリマーを更に、４０℃で２４時間、減圧下で乾燥した。
【０３０７】
【表８】
2014520506.tif 000021
【０３０８】
実施例９
図６における細胞生存度（即ち、細胞毒性）の結果は、実施例７及び８で調製したトリ及びジブロックコポリマーの両方がｓｉＲＮＡに対するポリマーの調査濃度比以内において細胞に対していかなる有意な効果も有しなかったことを示す。ポリマーＴ２ＥＧは、非常に低い細胞生存度を有することが知られるポリマーであり、ポジティブコントロールとして用いた。これらの結果は、ポリマーが送達ビヒクルとして適切であることを確認するものであり、その点で、それらは広範な範囲の濃度で非毒性である。
【０３０９】
インビボ条件（即ち、血清中）におけるポリマー−ｓｉＲＮＡ複合体の安定性を、図７に示されるように、複合体のサイズ分解又はその欠落、及びそれらが電気泳動サイズ排除ゲルを通じて移動する様式により測定した。トリブロック系列中の全てのポリマーが、ｓｉＲＮＡに対する強力な結合を示した。なぜならば、これらの複合体は、使用した実験条件下では、乖離のいかなる兆候も示さなかったためである。しかしながら、ジブロックコポリマーは、特に０４０８Ａに対して、相対的に弱い結合を示し、更に結合は、ｓｉＲＮＡに対するポリマーのより低い比率を有する組成物について、より弱かった。
【０３１０】
トリブロック及びジブロック系列の両方における種々のコポリマーの相対的サイレンシング効率を図８で比較する。この図は、いかなる蛍光もないことから明らかであるように、トリブロックが遺伝子を抑制することを示す。
【０３１１】
これらの比較結果を纏めると、ジブロックが種々の細胞に対して非毒性であり、かついくつかのジブロックのみが良好な安定性を実証したが、トリブロックのみが遺伝子サイレンシングを示すことが実証された。
【０３１２】
実施例１０
ＰｏｌｙＦｌｕｏｒ（登録商標）５７０を用いたポリマーサンプル１００７−２の鎖伸長（１００７−２／ＰＦ）
Ｙｏｕｎｇ容器中で、１００７−２ポリマーのサンプル（実施例１から。詳細については表１参照）（１４７ｍｇ）、メタクリルオキシエチルチオカルバモイルローダミンＢ（ＰｏｌｙＦｌｕｏｒ（登録商標）５７０、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．）（６．８ｍｇ）、及びＡＩＢＮ（１．０ｍｇ）を、ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した。混合物を、高減圧下（３×１０−３Ｔｏｒｒ）、３回凍結−排出−回答サイクルにより、脱気し、次いで、６０℃で２１時間加熱した。溶媒（ＤＭＦ）を除去し、サンプルを、減圧下乾燥し、最終ポリマー１００７−２／ＰＦを定量的収率で得、化学構造を以下に示す。１００７−２／ＰＦの分子量は、ポリマーサンプルがすでに四級化されていることが、屈折率検出器により分子量の検出を不可能にしていることに起因して、ＧＰＣにより性格に決定することができない。最終的な純粋なポリマーを、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で３日間透析した後に、得た。透析後、水を凍結乾燥により、ポリマー水溶液から除去した。透析したポリマーを、以下のセクションに記載する手順に従い分析した。
【０３１３】
【化１２】
2014520506.tif 000022
【０３１４】
１００７−２／ＰＦの生物学的評価を、実施例２及び５に記載した試験プロトコールに従い行った。ｓｉＲＮＡ結合を、実施例２に記載した電気泳動実施例２により評価し、結果を図９に示す。ＣＨＯ−ＧＦＰのサイレンシングを、実施例５に記載した方法を用いることにより、評価した。図１０は、ＰｏｌｙＦｌｕｏｒでラベルした及びラベルしていないポリマーの相対的なサイレンシングを示している。標識したポリマー（１００７−２／ＰＦ）及びｓｉＲＮＡの細胞取り込みを、共焦点顕微鏡法により更に記載した。図１１は、ＣＨＯ−ＧＦＰ及びＨｕｈ−ＧＦＰ細胞による標識したポリマーの取り込みを示している。
【０３１５】
実施例１１
実施例１０で調製されたポリマー（１００７−２／ＰＦ）を、本実施例に記載される全ての生物学的評価のために用いた。
【０３１６】
インビボでのＩＦＮ応答：１０日商業齢（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｄａｙ）のニワトリ胚を、Ｃａｈｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａから入手した。ポリマー複合体を、１０日齢の胚形成ニワトリ卵子の尿膜腔中に注入した。この卵子を、３７℃で６〜２４時間インキュベートした。ＰＢＳ及び２ナノモルのｓｉ２２のみを卵子にコントロールとして注入した。尿膜及び肝臓を採取してその後ＲＮＡにし、４℃で保存した。ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ及びＳａｃｃｈｉ  １９８７）を用いて収集した。
【０３１７】
病理組織学及び尿膜取込み：
胚性ニワトリ肝臓を、２４時間でのＩＦＮ応答について研究した膜と同じ胚から入手した。肝臓を１０％緩衝化ホルマリン中で２４時間固定し、慣用的なＨ＆Ｅ染色のため、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの病理研究室に提出した。尿膜を４％パラホルムアルデヒド中で２時間固定した。次いで、膜をＰＢＳ及び０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で１時間透過処理し、ＤＡＰＩで２０分間染色して核を可視化した。
【０３１８】
逆転写及び定量的リアルタイムＰＣＲ：１マイクログラムの抽出ＲＮＡを、製造業者の使用説明書にしたがって、ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）で処理し、製造業者の使用説明書にしたがってｐｏｗｅｒ  Ｓｙｂｒｇｒｅｅｎ  ＲＮＡ  ｔｏ  ＣＴキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を用いて、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）実験を行い、サイトカイン発現レベルを測定した。全ての定量データを、ニワトリ又はヒトＧＡＰＤＨに対してノーマライズした。ＱＲＴ−ＰＣＲを、以下の条件下でＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、９６ウェルプレートＲＴ−ＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った：１サイクル  ５０℃で３分間、続いて９５℃で１０分間、４０サイクル  ９５℃で１５秒間、続いて６０℃で１分間。比較閾値サイクル（Ｃｔ）法を用いて、遺伝子発現の倍数変化を導いた。
【０３１９】
ニワトリｑＲＴ−ＰＣＲプライマー配列は、以前に公開されており（Ｋａｒｐａｌａ，Ｌｏｗｅｎｔｈａｌら  ２００８）、ヒトｑＲＴ−ＰＣＲプライマー配列を、ｑＰｒｉｍｅｒ  Ｄｅｐｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｄｅｐｏｔ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から入手した。プライマーを、Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ（Ｓｔｈ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から入手した。
【０３２０】
インビボでのＡ型インフルエンザ−ＰＲ８サイレンシング：１０日商業齢（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｄａｙ）のニワトリ胚を、ＡＡＨＬの小動物施設から入手した。ポリマー複合体を、１０日齢の胚形成ニワトリ卵子の尿膜腔中に注入した。この卵子を、３７℃で２４時間インキュベートした。ＰＢＳをコントロールとして注入した。Ｈ１Ｎ１インフルエンザＰＲ８ウイルスを、１００μｌ  ＰＢＳ中に希釈して５００ｐｆｕ／卵子にし、直後、１０日齢の胚形成ニワトリ卵子の尿膜腔中に注入した。この卵子を３７℃で４８時間インキュベートし、尿膜腔液を収集してウイルス力価を測定した。
【０３２１】
インフルエンザアッセイ：ＴＣＩＤ５０アッセイを、（Ｌｉａｎｇ，Ｍｏｚｄｚａｎｏｗｓｋａら  １９９４）に記載されるように行った。要約すると、組織培養上清、即ち、尿膜腔液を、１０倍希釈系列による細胞変性効果に対するエンドポイント希釈により、ＭＤＣＫ細胞に対するウイルス感染性について試験した。力価を、ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ±ＳＥＭとして表す。
【０３２２】
結果
インビボでの１００７−２／ＰＦ  ｓｉ２２複合体の取込み：これは、インフルエンザ感染の広範に使用されるモデルである。卵子中のインフルエンザの複製の主要部位は、尿膜である。我々は１００７−２  ｓｉＲＮＡ複合体を尿膜に送達できるかどうかを決定するため、１０日齢の胚形成ニワトリ卵子において、１００７−２／ＰＦを尿膜腔液中に注入した。このポリマーは、Ｐｏｌｙｆｌｕｏｒ  ５４０モノマーが伸長した１００７−２である。このモノマーは、５４０ｎｍレーザーにより励起される場合に蛍光を発し、５９０ｎｍで発光する。尿膜を６又は２４時間で取り出し、ポリマーを共焦点顕微鏡により可視化した。ポリマーは、６時間にて、尿膜中で静脈と連絡している細胞において明確に視認でき（図１２Ａ）、２４時間までに、膜の至るところに散在していた（図１２Ｂ）。これは、ＰＲ８ウイルスが注入された場合、ｓｉＲＮＡが大部分の膜細胞中に存在することを示す。
【０３２３】
インビボでの１００７−２の毒性：ポリマー単独又はポリマーｓｉ２２複合体を用いた前のインビトロ結果を、胚中への注入によりここで確認し、ＩＦＮα及びβ誘導ならびにＰＲ８サイレンシングについてアッセイした。平均して６時間で８倍のＩＦＮα誘導及び２４時間で５倍の誘導が、ポリマー単独処理胚において観察され、ポリマー／ｓｉ２２処理胚における５及び３倍と比較された（図１３Ａ）。この結果は、インビトロの知見を支持する。ＩＦＮαに対する同様のパターンが観察されたが、いかなる有意なＩＦＮβも尿膜では誘導されなかった（図１３Ｂ）。Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの病理研究室により行われた１群あたり３つの胚性ニワトリ肝臓での病理組織学は、２４時間で肝臓に対する損傷のいかなる臨床的兆候も存在しなかったことを示す。このことは、胚に対する最小の毒性を示す。代表的な図を示す（図１３Ｃ、Ｄ及びＥ）。
【０３２４】
インビボでの１００７−２に対するＰＲ８サイレンシング：尿膜におけるポリマーｓｉＲＮＡ複合体の取込みを、ウイルス感染時に、共焦点顕微鏡により観察した。予測されたように、ＰＢ１−２２５７をニワトリ胚に送達させた場合、ＰＢＳ処理胚と比較して、平均して２．５  ｌｏｇの減少が観察され、ポリマー／ｓｉ２２処理胚と比較した場合、ウイルス複製では、１．５  ｌｏｇの減少が観察された（図１４）。これは、ｓｉＲＮＡの胚への送達及び特異的なサイレンシングを示す。１  ｌｏｇの減少が、１００７−２単独で観察された；これはまた、インビトロ知見を支持し、ポリマーによるＩＦＮαの誘導が、非特異的ＩＦＮ誘導ウイルス複製を生じているかもしれないことを示す。生産性ウイルスの０．５  ｌｏｇの低下が、１００７−２／ｓｉＲＮＡで見受けられ、ウイルスにおけるこの減少はおそらく、この複合体で見受けられた僅かなＩＦＮα誘導に起因する。
【０３２５】
実施例１２
４−ビニルフェニルボロン酸（ＶＰＢＡ）又は４−ビニルフェニルボロン酸ピナコールエステル（ＶＰＢＡ−ＰＥ）を含むＡＢＡトリブロックコポリマー
この実施例では、親水性ブロックＰＯＥＧＭＡ４７５におけるボロン酸官能性を有するＲＡＦＴポリマーの、毒性、ｓｉＲＮＡ取り込み、細胞標的化及び遺伝子サイレンシングに対する効果を評価するために、ＰｏｌｙＦｌｕｏｒ（登録商標）５７０とともに４−ビニルフェニルボロン酸（ＶＰＢＡ）又は４−ビニルフェニルボロン酸ピナコールエステル（ＶＰＢＡ−ＰＥ）を含むＡＢＡトリブロックコポリマーを、調製した。
【０３２６】
この実施例では、これらのＡＢＡトリブロックコポリマーを合成するために、ビス−ＲＡＦＴ剤（Ｉ）を用いた。
【０３２７】
工程１：ミッドブロックＰＤＭＡＥＭＡテレケリックマクロＲＡＦＴ剤の合成：
ＤＭＡＥＭＡモノマー（７．８６ｇ、４．９９×１０−２ｍｏｌ）、ＶＡＺＯ−８８開始剤（６．６ｍｇ、２．６８×１０−５ｍｏｌ）、ビス−ＲＡＦＴ剤（Ｉ）（０．３５９ｇ、４．１７×１０−４ｍｏｌ）及びＤＭＦ（１２．３４ｇ、１６．８８×１０−２ｍｏｌ）をＹｏｕｎｇ容器中に移し、液体窒素温度と室温との間で３回凍結−ポンプ−解凍サイクルに供した。その後、反応混合物を、８０℃で１６時間加熱し、次いで、９０℃で更に１６時間加熱した。得られたモノマーからポリマーへの変換は、１Ｈ−ＮＭＲにより決定されたように９５％より大きかった。
【０３２８】
上記重合混合物をＤＣＭで希釈し、ポリマーをｎ−ヘプタン中にＤＣＭ混合物を滴下することにより、析出させた。上澄みをポリマー残基からデカントし、この析出手順を更に２回行った。次いで、ポリマーを恒量に達するまで、減圧下で乾燥した。ポリマーのＭｎは、ポリスチレン標準に対するＧＰＣ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを溶出液として用いる）により、１８，６３０Ｄａ（１．１のＰＤＩ）であると決定された。この分子量は、形成されたポリマーＰＤＭＡＥＭＡにおける１１０個のカチオン性ユニットに相当する。
【０３２９】
工程２：Ａブロックに、ＰｏｌｙＦｌｕｏｒ（登録商標）５７０とともにＶＰＢＡ又はＶＰＢＡ−ＰＥを含むＡＢＡトリブロックコポリマーの合成及びキャラクタリゼーション
３つのトリブロックコポリマーＰ［（ＯＥＧＭＡ４７５−ｃｏ−ＶＰＢＡ−ｃｏ−ＰｏｌｙＦｌｕｏｒ（登録商標）５７０）−ｂ−ＰＤＭＡＥＭＡ−ｂ−（ＯＥＧＭＡ４７５−ｃｏ−ＶＰＢＡ−ｃｏ−ＰｏｌｙＦｌｕｏｒ（登録商標）５７０）］、すなわち、サンプルＢＣ−１１；ＢＣ−１３−１及びＢＣ−１３−２を、様々な使用モル量のＯＥＧＭＡ４７５、ＶＰＢＡ及びＰｏｌｙＦｌｕｏｒ（登録商標）５７０をそれぞれ用いて合成し、Ｐ［（ＯＥＧＭＡ４７５−ｃｏ−（ＶＰＢＡ−ＰＥ）−ｃｏ−ＰｏｌｙＦｌｕｏｒ（登録商標）５７０）−ｂ−ＰＤＭＡＥＭＡ−ｂ−（ＯＥＧＭＡ４７５−ｃｏ−（ＶＰＢＡ−ＰＥ）−ｃｏ−ＰｏｌｙＦｌｕｏｒ（登録商標）５７０）］のトリブロックコポリマーも以下のように合成した。
【０３３０】
ＢＣ−１１の合成
工程１からの乾燥したＰＤＭＡＥＭＡテレケリックマクロＲＡＦＴ剤（０．５０８ｇ）を、ＤＭＦ（１４ｍＬ）に再溶解し、この溶液に、ＯＥＧＭＡ４７５モノマー（２．５０ｇ、５．２６３×１０−３ｍｏｌ）、４−ビニルフェニルボロン酸（ＶＰＢＡ、０．１６ｇ、１．０８１×１０−３ｍｏｌ）、ＡＩＢＮ開始剤（２．５ｍｇ、１．５２×１０−５ｍｏｌ）及びＰｏｌｙＦｌｕｏｒ（登録商標）５７０（２１ｍｇ、３．０７×１０−５ｍｏｌ））を添加した。次いで、この試薬溶液をガラスアンプルに移した。次いで、アンプル及びその内容物を、３回繰り返しの凍結−排出−解凍により脱気し、次いで、フレームをシールした。重合を６０℃で１６時間行った。溶媒（ＤＭＦ）を減圧下のロータリーエバポレーターで除去して、濃いスラリーを得た。
【０３３１】
上記重合混合物を、ジクロロメタンで希釈し、ポリマーを、ジイソプロピルエーテル中に当該混合物を添加することにより析出させた。析出したポリマーを溶液の残りからデカントした。未反応のおＯＥＧＭＡ４７５モノマーを完全に除去することを確実にするために、この手順を更に２回行った。最終工程では、ポリマーを恒量に達するまで、減圧下で乾燥して、１．２４ｇのポリマーサンプルＢＣ−１１を得た。ポリマーのＭｎは、ポリスチレン標準に対するＧＰＣ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを溶出液として用いる）により、８６，９００Ｄａ（１．５３のＰＤＩ）であると決定された。
【０３３２】
四級化：丸底フラスコにおいて、上記ポリマーＢＣ−１１（５１０ｍｇ）を、アセトニトリル（１０ｍＬ）に溶解し、過量のヨウ化メチルを（２ｍＬ）をこの溶液中に添加した。トリブロックコポリマー中に導入されたＤＭＡＥＭＡ基の三級アミンの四級化を達成するために、反応系を、室温で一晩撹拌した。溶媒（アセトニトリル）を除去して乾燥した後、四級化されたＡＢＡトリブロックポリマーを得、最終精製工程のＭｉｌｌｉ−Ｑ水に対して３日間の透析（３５００の分子量カットオフ、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｏｒ，  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｈｏｕｓｔｏｎ，  Ｔｘ）に供した。透析後、水を凍結乾燥機の使用によりポリマー水溶液から除去して、ポリマーサンプルのＢＣ−１２を得た。
【０３３３】
【化１３】
2014520506.tif 000023
【０３３４】
ＢＣ−１３−１及びＢＣ−１３−２の合成
これら２つのポリマーサンプルを、様々なモル量のＯＥＧＭＡ４７５及びＶＰＢＡ（以下の表を参照）を重合で使用したこと以外、ＢＣ−１１について上記したのと同様にして調製した。
【０３３５】
【表９】
2014520506.tif 000024
【０３３６】
これら２つのポリマーＢＣ−１３−１及びＢＣ−１３−２のＭｎは、ポリスチレン標準に対するＧＰＣ（溶出液としてＤＭＡｃ）により、それぞれ、９２，６００及び９８，９００であると決定された。
【０３３７】
ＢＣ−１４：４−ビニルフェニルボロン酸（ＶＰＢＡ）及びＤ−（＋）−ガラクトースを含むＡＢＡトリブロックコポリマー
１：１モル比の上記ポリマーサンプルＢＣ−１２（８８．７ｍｇ）及びＤ−（＋）−ガラクトース（３．８７ｍｇ）を、重水素ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）に室温で５日間溶解した。水（２ｍＬ）を添加し、得られたポリマーを透析に供して、いずれの未結合のガラクトースをも除去した。凍結乾燥機の後、最終ポリマーＢＣ−１４を得、そのプロトンＮＭＲ（Ｄ２Ｏ中）により、ガラクトース糖ピークの存在が明らかとなった。
【０３３８】
ＢＣ−６−１の合成
工程１からのＰＤＭＡＥＭＡテレケリックマクロＲＡＦＴ剤（０．５０８ｇ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）に再溶解し、この溶液に、ＯＥＧＭＡ４７５モノマー（２．５０ｇ、５．２６３×１０−３ｍｏｌ）、４−ビニルフェニルボロン酸ピナコールエステル＊（ＶＰＢＡ−ＰＥ、０．２５ｇ、１．０８７×１０−３ｍｏｌ）、ＡＩＢＮ開始剤（２．５ｍｇ、１．５２×１０−５ｍｏｌ）及びＰｏｌｙＦｌｕｏｒ（登録商標）５７０（２１ｍｇ、３．０７×１０−５ｍｏｌ））を添加した。次いで、この試薬溶液をガラスアンプル中に移した。次いで、アンプル及びその内容物を、３回繰り返しの凍結−排出−解凍サイクルにより脱気し、次いで、フレームをシールした。重合を、６０℃で１６時間行った。溶媒（ＤＭＦ）を減圧下のロータリーエバポレーターで除去して、シロップ状のポリマーを得た。
【０３３９】
上記重合混合物を、ジクロロメタンで希釈し、ポリマーを、ジイソプロピルエーテル中に当該混合物を滴下することにより析出させた。析出したポリマーを溶液の残りからデカントした。この手順を、未反応のＯＥＧＭＡ４７５モノマーを完全に除去することを確実にするために、更に２回行った。最終工程では、ポリマーを、恒量に達するまで減圧下で乾燥して、１．０８ｇのポリマーサンプルＢＣ−６−１を得た。ポリマーのＭｎは、ポリスチレン標準に対するＧＰＣ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを溶出液として用いる）により、４６，９００Ｄａ（１．３４のＰＤＩ）であると決定された。
【０３４０】
四級化：丸底フラスコにおいて、上記ポリマーＢＣ−６−１（２５ｍｇ）をアセトニトリル（５ｍＬ）に溶解し、過量のヨウ化メチル（１ｍＬ）を溶液中に添加した。トリブロックコポリマー中に導入されたＤＭＡＥＭＡ基の三級アミノ基の四級化を達成するために、反応系を一晩室温で撹拌した。溶媒（アセトニトリル）を除去して乾燥した後、四級化されたＡＢＡトリブロックポリマーを得、最終精製工程のＭｉｌｌｉ−Ｑ水に対する３日間の透析（３５００の分子量カットオフ、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｏｒ，  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｈｏｕｓｔｏｎ，  Ｔｘ）に供した。透析後、水を、凍結乾燥機の使用により、ポリマー水溶液から除去した。
【０３４１】
【化１４】
2014520506.tif 000025
【０３４２】
＊４−ビニルフェニルボロン酸ピナコールエステル（ＶＰＢＡ−ＰＥ）を、ｆｒｏｍ乾燥したモレキュラーシーブ（４Å）の存在下、室温で、ジクロロメタン中の、４−ビニルフェニルボロン酸（ＶＰＢＡ）及びピナコールから調製した。
【０３４３】
ポリマーＢＣ−６−１及びＢＣ−１４を、実施例５に記載した手順を用いて、ｓｉＲＮＡ  ＣＨＯ−ＧＦＰサイレンシングについて、評価した。図１５は、２つのポリマーサンプルによるＣＨＯ−ＧＦＰの相対的サイレンシングを示しており、結合したガラクトース（ＢＣ−１４）は、ガラクトースなしのサンプルと比較して、向上したＣＨＯ−ＧＦＰサイレンシングを、顕著に示した。
【０３４４】
実施例１３
ジスルフィド結合を有するビス−ＲＡＦＴ剤（ＩＩＩ）：（Ｓ）−（Ｒ）−１１−シアノ−１１−メチル−８−オキソ−１３−チオキソ−７−オキサ−３，４，１２，１４−テトラチアヘキサコシル４−シアノ−４−（（（ドデシルチオ）カルボノチオイル）チオ）ペンタノエート
【０３４５】
【化１５】
2014520506.tif 000026
【０３４６】
ジクロロメタン（１００ｍＬ）及びＤＭＡＰ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン、触媒量）中の、（Ｓ）−４−シアノ−４−（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）ペンタン酸（８．０６ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）、２−ヒドロキシエチルジスルフィド（１．５４ｇ、１０ｍｍｏｌ）、ＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド、２．７７ｇ、２２．０ｍｍｏｌ）を、室温で１時間撹拌させた。濾過して、ＤＩＣ−尿素副生成物を除去し、溶媒を除去した後に、９．２ｇの粗生成物が得られ、これを、酢酸エチル：ｎ−ヘキサン  １：４（ｖ／ｖ）を溶出液として用いたシリカゲルカラムのカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題生成物（ＩＩＩ）を黄色オイルとして得た（８．０ｇ、収率８６．５％）。プロトン核磁気共鳴（１Ｈ  ＮＭＲ）  （ＣＤＣｌ３）  （ｐｐｍ）  ０．８９  （ｔ，  ６Ｈ，  ２×ＣＨ３）；  １．２７  （ｂｒ  ｓ，  ３６Ｈ）；  １．６９  （ｍ，  ４Ｈ）；  １．８８  （ｓ，  ６Ｈ，  ２×ＣＨ３）；  ２．４０−２．８０  （ｍ，  ８Ｈ，  ２×ＣＨ２ＣＨ２）；  ２．９０  （ｔ，  ４Ｈ，  ＣＨ２Ｓ−ＳＣＨ２）；  ３．３０  （ｔ，  ４Ｈ，  ２×ＣＨ２Ｓ）；  ４．３５  （ｔ，  ４Ｈ，  ２×ＣＨ２Ｏ）．
【０３４７】
直鎖ＡＢＡトリブロックコポリマーＡＢＡ−Ｂ２Ｓ−５３／５５（ＬＮ２０１２／１ＴＬ１５）
【０３４８】
【化１６】
2014520506.tif 000027
【０３４９】
ＡＢＡ−Ｂ２Ｓ：Ｐ（ＯＥＧＭＡ４７５−ｂ−ＤＭＡＥＭＡ−ｂ−ＯＥＧＭＡ４７５）（ＬＮ２０１２／１ＴＬ１５）
【０３５０】
方法
工程１：ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＤＭＡＥＭＡ）テレケリックマクロＲＡＦＴ剤の合成及びキャラクタリゼーション
典型的な重合実験においては、ＤＭＡＥＭＡモノマー（５．９５５ｇ、３．７８８×１０−２ｍｏｌ）、ＶＡＺＯ−８８開始剤（２．９４８×１０−３ｇ、１．２０７×１０−５ｍｏｌ）、ビス−ＲＡＦＴ剤（ＩＩＩ）（０．２４０ｇ、２．４１３×１０−４ｍｏｌ）及びＤＭＦ（２６．８８５１ｇ、３．６７８×１０−１ｍｏｌ）を、Ｓｃｈｌｅｎｋフラスコ中に秤量した。溶液混合物を、４回凍結−排出−溶解サイクルで脱気し、９０℃で１７時間重合した。
【０３５１】
モノマーからポリマーへの変換は、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３中）により決定されたように、６９．６％だった。当該変換を、内部標準１，３，５−トリオキサンを重合溶液に５ｍｇ／１ｍＬの量で添加することにより、計算した。重合前後の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを比較し、５．１ｐｐｍのトリオキサンの−ＯＣＨ２環式の積分を、５．５−６ｐｐｍのモノマーのＣＨ２＝Ｃプロトンの積分のものと比較した。１Ｈ−ＮＭＲに基づき計算されたポリマーの分子量は、１７．２ｋＤａであった（１０９の重合度に相当する）。直鎖ポリスチレン標準に対してゲルパーミッションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により決定されたポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は、２２ｋＤａ（１．２３の分散性）であった。３つの異なるポリマーサンプルを、親水性ブロック（Ａ）及びカチオン性ブロック（Ｂ）のブロック長を変化させることにより、調製した。
【０３５２】
ポリマーを、実施例１に記載した手順を用いて四級化し、透析により精製した。
【０３５３】
透析されたポリマーサンプルを、実施例２及び５にそれぞれ記載した方法を使用して、ＣＨＯ−ＧＦＰ細胞の毒性及びサイレンシングについて評価した。ポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体は、図１６に示すモル比の範囲において安定であった。ｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体の細胞生存率及びポリマー複合体のＣＨＯ−ＧＦＰサイレンシングを、図１７に、それぞれ、上部及び下部に示す。
【図１４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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