(57)【要約】  血液試料分析のためのシステムおよび方法、さらに具体的には、白血球（ＷＢＣ）識別分析を実行するためのシステムおよび方法。蛍光染色および蛍光トリガー戦略を使ってＷＢＣを選別するシステムおよび方法。従って、不溶解赤血球（ＲＢＣ）および溶解ＲＢＣ断片からの干渉が、実質的に、除かれる。システムおよび方法は、また、脆いＷＢＣを含む試料のアッセイに適する、比較的穏やかなＷＢＣ薬剤の開発を可能とする。一実施形態では、システムおよび方法は、（ａ）血液測定装置の励起源に対応する発光スペクトルの専用の細胞膜透過性蛍光染料で血液試料を染色すること；（ｂ）蛍光トリガーを使って、血液試料からＷＢＣを選別すること；および（ｃ）（１）軸方向光損失、（２）中間角散乱、（３）９０°偏光側方散乱、（４）９０°偏光解消側方散乱、および（５）蛍光発光の測定値を使って識別分析を行うこと、を含む。【選択図】図１Ｅ
2014520251.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光染料で染色した血液試料の白血球（ＷＢＣ）識別分析を行うための血液分析器であって、
前記血液試料内の粒子を励起するように配置された励起源と；
（１）前記励起血液試料からの軸方向光損失を測定するように配置された軸方向光損失検出器、（２）前記励起血液試料からの中間角散乱を測定するように配置された中間角散乱検出器、（３）前記励起血液試料からの９０°偏光側方散乱を測定するように配置された偏光側方散乱検出器、（４）前記励起血液試料からの９０°偏光解消側方散乱を測定するように配置された偏光解消側方散乱検出器、および（５）前記励起血液試料からの蛍光発光を測定するように配置された蛍光検出器、を含む複数の検出器と；
（ａ）前記複数の検出器から（１）軸方向光損失、（２）中間角散乱、（３）９０°偏光側方散乱、（４）９０°偏光解消側方散乱、および（５）蛍光、の測定値を受け取り、ならびに
（ｂ）蛍光閾値を超える蛍光を発光する粒子に対し、前記５つ全ての測定値に基づき前記血液試料のＷＢＣ識別分析を行うように構成されたプロセッサ；
とを含む血液分析器。
【請求項２】
前記プロセッサが、前記蛍光閾値に満たない粒子を検討対象から外すために前記受け取った測定値を予備選別するようにさらに構成される、請求項１に記載の血液分析器。
【請求項３】
前記軸方向光損失検出器が、０°散乱での軸方向光損失を測定する、請求項１に記載の血液分析器。
【請求項４】
前記中間角散乱検出器が、約３°〜約１５°で光角度散乱を測定する、請求項１に記載の血液分析器。
【請求項５】
前記複数の検出器が、１つまたは複数の光電子増倍管を含む、請求項１に記載の血液分析器。
【請求項６】
前記励起源が、レーザーである、請求項１に記載の血液分析器。
【請求項７】
前記レーザーが、前記蛍光染料に対応する波長の光を発光するように構成される、請求項６に記載の血液分析器。
【請求項８】
前記蛍光染料が、前記励起源に対応するように選択され、前記蛍光染料が、細胞膜透過性で、核酸に結合する、請求項１に記載の血液分析器。
【請求項９】
前記血液試料をＷＢＣ試薬で希釈するためのインキュベーションサブシステムをさらに含む、請求項１に記載の血液分析器。
【請求項１０】
前記ＷＢＣ試薬が、蛍光染料および溶解薬剤を含む、請求項９に記載の血液分析器。
【請求項１１】
前記ＷＢＣ試薬が、（ａ）少なくとも１つの界面活性剤、（ｂ）少なくとも１つの緩衝液または少なくとも１つの塩、（ｃ）少なくとも１つの抗菌剤、および（ｄ）蛍光染料を含む、請求項９に記載の血液分析器。
【請求項１２】
前記インキュベーションサブシステムが、前記血液試料を前記ＷＢＣ試薬と共に、約２５秒未満の時間、インキュベートするように構成される、請求項９に記載の血液分析器。
【請求項１３】
前記インキュベーションサブシステムが、前記血液試料を前記ＷＢＣ試薬と共に、約１７秒未満の時間、インキュベートするように構成される、請求項９に記載の血液分析器。
【請求項１４】
前記インキュベーションサブシステムが、前記血液試料を前記ＷＢＣ試薬と共に、約９秒未満の時間、インキュベートするように構成される、請求項９に記載の血液分析器。
【請求項１５】
前記インキュベーションサブシステムが、前記血液試料を前記ＷＢＣ試薬と共に、約３０℃〜約５０℃の温度範囲でインキュベートするように構成される、請求項９に記載の血液分析器。
【請求項１６】
前記インキュベーションサブシステムが、前記血液試料を前記ＷＢＣ試薬と共に、約４０℃の温度でインキュベートするように構成される、請求項９に記載の血液分析器。
【請求項１７】
白血球（ＷＢＣ）識別分析を行うための血液分析器であって、
血液試料内の粒子を励起する手段；
前記血液試料内の励起粒子からの複数の光散乱シグナルを測定する手段；
前記血液試料内の励起粒子からの蛍光シグナルを測定する手段；
蛍光閾値に満たない粒子を検討対象から外すために前記励起粒子を選別する手段；および
前記選別手段を通過した粒子に対し、前記複数の光散乱シグナルおよび蛍光シグナルに基づき、ＷＢＣ識別分析を行う手段；
を含む血液分析器。
【請求項１８】
前記血液試料を、前記ＷＢＣ試薬と共に、約２５秒未満のインキュベーション時間、インキュベートする手段、をさらに含む、請求項１７に記載の血液分析器。
【請求項１９】
前記血液試料を、前記ＷＢＣ試薬と共に、約３０℃〜約５０℃の温度範囲でインキュベートする手段、をさらに含む、請求項１７に記載の血液分析器。
【請求項２０】
自動化血液分析器を使って白血球（ＷＢＣ）分析を行う方法であって、
（ａ）全血試料を、赤血球（ＲＢＣ）溶解薬剤およびＷＢＣ膜を透過し、ＷＢＣ核酸に結合する蛍光染料を含むＷＢＣ試薬で希釈すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の希釈血液試料を、約２５秒未満のインキュベーション時間、約３０℃〜約５０℃の温度範囲で、インキュベートすること；
（ｃ）ステップ（ｂ）でインキュベートした試料を血液分析器中のフローセルに送り届けること；
（ｄ）前記インキュベートした試料が前記フローセルを通過する間に、ステップ（ｃ）でインキュベートした試料を、励起源で励起すること；
（ｅ）前記励起試料からの複数の光散乱シグナルおよび蛍光発光シグナルを収集すること；ならびに
（ｆ）ステップ（ｅ）で収集した全シグナルに基づいてＷＢＣ識別分析を行い、前記蛍光発光シグナルに基づき蛍光閾値に満たない前記希釈血液試料内の粒子を検討対象から外すこと；
を含む方法。
【請求項２１】
前記ＷＢＣ試薬が、（ａ）少なくとも１つの界面活性剤、（ｂ）少なくとも１つの緩衝液または少なくとも１つの塩、（ｃ）少なくとも１つの抗菌剤、および（ｄ）少なくとも１つの蛍光染料、を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記励起源が、約３５０ｎｍ〜約７００ｎｍの波長を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
蛍光発光が、帯域フィルターまたはロングパスフィルターを使って、約３６０ｎｍから約７５０ｎｍの波長で収集される、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、３５合衆国法典．§１１９（ｅ）に基づき、２０１１年５月４日出願の「白血球の分析方法（Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  Ｗｈｉｔｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ）」と題する米国特許仮出願第６１／４８２，５４１号の利益を主張する。この特許の全開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
また、本出願は、２０１２年４月２６日に出願の「有核赤血球分析システムおよび方法（ＮＵＣＬＥＡＴＥＤ  ＲＥＤ  （ＢＬＯＯＤ  ＣＥＬＬ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＳＹＳＴＥＭ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤ）」と題する出願番号第ｘｘ／ｘｘｘ、ｘｘｘ号（Ａｔｔｙ  Ｄｋｔ  Ｎｏ：ＡＤＤＶ−０１７（１１０４１ＵＳＯ１））；および２０１２年４月２６日出願の「好塩基球分析システムおよび方法（ＢＡＳＯＰＨＩＬ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＳＹＳＴＥＭ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤ）」と題する出願番号第ｘｘ／ｘｘｘ、ｘｘｘ号（Ａｔｔｙ  Ｄｋｔ  Ｎｏ：ＡＤＤＶ−０１８（１１０４２ＵＳＯ１））にも関連する。これらの特許の全開示は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、血液学検査システムおよび方法に関する。さらに具体的には、本発明は、血液試料を分析し、血液試料中の白血球（ＷＢＣ）およびＷＢＣ亜集団を同定、分類、および／または定量するシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
計数および分類を含む、正確で効率的なＷＢＣ分析のための血液アッセイの開発は、これまで難題であった。正確で効率的なアッセイの開発が困難な１つの理由は、試料の全血液細胞中のＷＢＣの比較的低い濃度（約０．１％〜０．２％）にある。ＷＢＣ分析のためのおよび堅固なＷＢＣ試薬を形成するための先進方法を設計する試みは、自動化血液分析器の領域の最優先課題の１つとして残されている。
【０００５】
典型的な例では、赤血球（ＲＢＣ）の溶解では、ＷＢＣおよびＷＢＣ亜集団の計数および分類の前に、ＲＢＣからの干渉を除き、ＷＢＣを濃縮することが必要である。さらに具体的には、正確で効率的なＷＢＣ分析では、（１）３０秒未満でＲＢＣの完全な溶解；（２）溶解後、ＲＢＣの大きな断片をより小さい小片へ破壊；および（３）ＷＢＣの残存、が正確な計数および適切な分類のために必要である。血液試料が、「不十分溶解」の場合、非溶解ＲＢＣは、たとえ非常に小さい濃度であっても、ＷＢＣ計数および識別分析を妨げる。同様に、溶解ＲＢＣのより大きな断片も、ＷＢＣ計数および識別分析を妨害する。実際、非溶解ＲＢＣおよび／または溶解ＲＢＣのより大きな断片をリンパ球（最小ＷＢＣ）から分離するのは困難である。血液試料が「過剰溶解」した場合は、ＷＢＣの細胞膜が過剰損傷し、ＷＢＣの分類に影響を及ぼす可能性がある。
【０００６】
一部の例では、ＷＢＣ分析の困難さは、２つの特殊タイプの試料；すなわち、溶解抵抗性赤血球（ｒｓｔＲＢＣ）含有試料、および脆いリンパ球含有試料、の存在により悪化する場合がある。ｒｓｔＲＢＣを含む試料の場合は、ＷＢＣ数およびリンパ球の割合は、真のリンパ球以外の粒子の存在によって、誤って「高」く報告され、結果的に、患者に対する不正確な診断および治療のリスクを引き起こす。脆いリンパ球を含む試料の場合には、傷害性リンパ球は、ＷＢＣ識別分析でそれらの特性を示すことができない。さらに、ＷＢＣの露出核は、有核赤血球（ｎＲＢＣ）として計数される可能性があり、アッセイによっては擬陽性のｎＲＢＣ数となり得る。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書で提供されるのは、血液試料を分析するシステムおよび方法であり、さらに具体的には、白血球（ＷＢＣ）識別分析を行うシステムおよび方法である。一般的に、開示システムおよび方法は、蛍光染色および蛍光トリガー戦略を使ってＷＢＣを選別する。従って、非溶解ＲＢＣ（例えば、ｒｓｔＲＢＣ）およびＲＢＣ断片からの干渉は、実質的あるいは完全に除かれ、それにより、ＷＢＣとＷＢＣ亜集団の正確な計数および識別を確実にする。システムおよび方法は、また、古い試料を含む脆いリンパ球（または他の脆いＷＢＣ）を含む試料のアッセイに適する比較的穏やかなＷＢＣ試薬の開発を可能とする。
【０００８】
一実施形態では、例えば、本明細書で開示のシステムおよび方法は、（ａ）発光スペクトルが血液測定装置の励起源に対応する専用の細胞膜透過性蛍光染料で血液試料を染色すること；（ｂ）蛍光トリガーを使って、血液試料からＷＢＣを選別すること；および（ｃ）（１）軸方向光損失、（２）中間角散乱、（３）９０°偏光側方散乱、（４）９０°偏光解消側方散乱、および（５）蛍光発光、の測定値の組み合わせを使って、識別分析を行うこと、を含む。
【０００９】
本明細書に組み込まれる添付図は、明細書の一部を構成する。図は更に、本説明と一緒に、提示システムおよび方法の原理を説明しているため、当業者はこのシステムと方法を作成し、使用できる。図中、類似の参照番号は、同一か、または機能的に類似の要素を示している。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】溶解後のＷＢＣ、およびＲＢＣの残渣を示す全血試料のヒストグラムであり、軸方向光損失シグナルの測定を示すヒストグラムである。
【図１Ｂ】溶解後のＷＢＣ、およびＲＢＣの残渣を示す全血試料のヒストグラムであり、中間角散乱の測定を示すヒストグラムである。
【図１Ｃ】溶解後のＷＢＣ、およびＲＢＣの残渣を示す全血試料のヒストグラムであり、９０°偏光側方散乱の測定を示すヒストグラムである。
【図１Ｄ】溶解後のＷＢＣ、およびＲＢＣの残渣を示す全血試料のヒストグラムであり、９０°偏光解消側方散乱の測定を示すヒストグラムである。
【図１Ｅ】溶解後のＷＢＣ、およびＲＢＣの残渣を示す全血試料のヒストグラムであり、蛍光の測定を示すヒストグラムである。
【図２】検討対象からＲＢＣの断片を除外するための蛍光トリガーの使用を示すサイトグラムである。
【図３】検討対象からＲＢＣの断片を除外するための蛍光トリガーの使用を示す別のサイトグラムである。
【図４】血液測定器を示す模式図である。
【図５Ａ】５分類ＷＢＣ識別分析のサイトグラムを示し、軸方向光損失対中間角散乱を示すサイトグラムである。
【図５Ｂ】５分類ＷＢＣ識別分析のサイトグラムを示し、９０°偏光側方散乱対軸方向光損失を示すサイトグラムである。
【図５Ｃ】５分類ＷＢＣ識別分析のサイトグラムを示し、９０°偏光側方散乱対中間角散乱を示すサイトグラムである。
【図５Ｄ】５分類ＷＢＣ識別分析のサイトグラムを示し、９０°偏光解消側方散乱対軸方向光損失を示すサイトグラムである。
【図５Ｅ】５分類ＷＢＣ識別分析のサイトグラムを示し、９０°偏光解消側方散乱対中間角散乱を示すサイトグラムである。
【図５Ｆ】５分類ＷＢＣ識別分析のサイトグラムを示し、９０°偏光解消側方散乱対９０°偏光側方散乱．
【図５Ｇ】５分類ＷＢＣ識別分析のサイトグラムを示し、蛍光対軸方向光損失を示すサイトグラムである。
【図５Ｈ】５分類ＷＢＣ識別分析のサイトグラムを示し、蛍光対中間角散乱を示すサイトグラムである。
【図５Ｉ】５分類ＷＢＣ識別分析のサイトグラムを示し、蛍光対９０°偏光側方散乱を示すサイトグラムである。
【図５Ｊ】５分類ＷＢＣ識別分析のサイトグラムを示し、蛍光対９０°偏光解消側方散乱を示すサイトグラムである。
【図６Ａ】従来法を使用した、溶解抵抗性ＲＢＣ含有全血試料の分析を示すサイトグラムである。
【図６Ｂ】提示された実施形態に従って、蛍光トリガー血液分析器による軸方向光損失対中間角散乱を示すサイトグラムである。
【図７Ａ】従来法を使用した、古い全血試料の分析を示すサイトグラムである。
【図７Ｂ】提示された実施形態に従って、蛍光トリガー血液分析器による軸方向光損失対中間角散乱を示すサイトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本明細書では、血液試料を分析するシステムおよび方法を提供し、さらに具体的には、白血球（ＷＢＣ）識別分析を行い、ＷＢＣおよびＷＢＣ亜集団の同定、分類、および計数を行うシステムおよび方法を提供する。一般的に、開示システムおよび方法は、蛍光染色および蛍光トリガー戦略を使ってＷＢＣを選別する。従って、不溶解の赤血球（ＲＢＣ）、例えば、溶解抵抗性赤血球（ｒｓｔＲＢＣ）、およびＲＢＣ断片からの干渉は、実質的に除去される。開示システムおよび方法は、それにより、ＷＢＣおよびＷＢＣ亜集団の正確な計数および識別を確実にする。また、システムおよび方法は、古い試料を含む脆いリンパ球（または他の脆いＷＢＣ）を含む試料のアッセイに適する比較的穏やかなＷＢＣ試薬の開発を可能とする。
【００１２】
一実施形態では、例えば、本明細書で開示のシステムおよび方法は、（ａ）発光スペクトルが血液測定装置の励起源に対応する専用の細胞膜透過性蛍光染料で血液試料を染色すること；（ｂ）蛍光トリガーを使って、血液試料からＷＢＣを選別すること；および（ｃ）（１）軸方向光損失、（２）中間角散乱、（３）９０°偏光側方散乱、（４）９０°偏光解消側方散乱、および（５）蛍光発光、の測定値の組み合わせを使って、識別分析を行うこと、を含む。
【００１３】
本明細書で使われる表現の「蛍光情報」は、血液分析器の蛍光チャネルから集められたデータを意味する。本明細書で使われる表現の「蛍光チャネル」は、試料から発光された蛍光の量の測定のために適切な波長バンド用に設定された検出装置、例えば、光電子増倍管を意味する。
【００１４】
（１）蛍光染料の使用
ＷＢＣは、その核中に比較的高い濃度のＤＮＡを含む。しかし、成熟ＲＢＣはＤＮＡを含まない。従って、蛍光染料は、２つのクラスの血液細胞；すなわち、核酸を含む血液細胞と核酸を含まない血液細胞を識別するように選択される。染料の目的は、生細胞中に容易に侵入し、高親和性でＤＮＡと結合し、染料が適切な光源により励起されること、適切なストークスシフトを有する強力な蛍光を発光することである。可視バンド中の染料のピーク吸収は、染料を正確に励起し、最適な結果を得るために、実質的に光源の波長に一致する（光源の波長の５０ｎｍ以内、より好ましくは、光源の波長の２５ｎｍ以内で）。
【００１５】
選択蛍光染料は、好ましくは、１）核酸に結合できる、２）ＷＢＣの細胞膜に侵入できる、３）光源にさらした場合、選択波長で励起可能である、４）光源による励起時、蛍光を発光する、および、５）生体安定性で、体液に可溶である。染料は、アクリジンオレンジ、ＳＹＢＲ１１、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎシリーズ染料、ヨウ化ヘキシジウム、ＳＹＴＯ１１、ＳＹＴＯ１２、ＳＹＴＯ１３、ＳＹＴＯ１４、ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ２１、ＳＹＴＯ  ＲＮＡ  Ｓｅｌｅｃｔ、ＳＹＴＯ２４、ＳＹＴＯ２５およびこれらのいずれかの等価物、からなる群から選択できる。染料を使って、ＷＢＣを「活性化（ａｃｔｉｖａｔｅ）」し、血液分析器中で形成された蛍光トリガーに基づいて、非溶解ＲＢＣおよびＲＢＣの断片を「選別除去する（ｓｃｒｅｅｎ  ｏｕｔ）」。染料は、典型的な例では、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。種々の染料が利用可能であるが、選択染料は、通常、血液分析器の励起源と対になり、ただ１つの専用の染料を使って、同定、定量、および／または分析する対象の全ＷＢＣ亜集団の染色および蛍光発光の励起を行う。従って、ただ１つの（すなわち、専用の）染料を使って、すべてのＷＢＣ亜集団を一気に同定、定量、および分析できる。
【００１６】
一実施形態では、蛍光染料は、１、０００ｘ１０３ＷＢＣ／μｌまで染色および活性化を実行できるのに十分な量の、１）少なくとも１つの界面活性剤、２）少なくとも１つの緩衝液、３）少なくとも１つの塩、および／または４）少なくとも１つの抗菌剤と組み合わせたＷＢＣ試薬で提供される。少なくとも１つの界面活性剤、例えば、「トリトン」Ｘ−１００またはサポニンを使って、ＲＢＣの膜を破壊し、ＲＢＣの断片の寸法を小さくする。少なくとも１つの界面活性剤は、典型的な例では、約０．００１％〜約５％の濃度で存在する。少なくとも１つの抗菌剤、例えば、「ＴＲＩＡＤＩＮＥ」または「ＰＲＯＣＬＩＮ」ファミリー由来のもの、を使って、試薬の微生物による汚染を防ぐ。少なくとも１つの抗菌剤の濃度は、必要な保存可能期間の間、試薬を保存するのに充分な濃度である。少なくとも１つの緩衝液、例えば、燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）または４−（２−ヒドロキシエチル）−ｌ−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を使って、ＲＢＣおよび貯蔵ＷＢＣの溶解を制御するために、反応混合物のｐＨを調節する。少なくとも１つの緩衝液は、典型的な例では、約０．０１％〜約３％の濃度で存在する。ｐＨは、典型的な例では、約３〜約１２の範囲である。少なくとも１つの塩、例えば、ＮａＣｌまたはＮａ２ＳＯ４を使って、浸透圧を調節し、溶解の効果を高める、および／またはＷＢＣ残存を最適化する。少なくとも１つの塩は、約０．０１％〜約３％の濃度で存在してもよい。特定の場合では、少なくとも１つの緩衝液は、少なくとも１つの塩としての役割を果たすことができ、または少なくとも１つの塩は、少なくとも１つの緩衝液としての役割を果たすことができる。一般的に、低い浸透圧、または低張性を使って、ＲＢＣの溶解を加速する。浸透圧は、典型的な例では、約２０〜約２５０ｍＯｓｍの範囲である。
【００１７】
ＲＢＣの溶解は、血液試料およびＷＢＣ試薬を約３５容量部の試薬に対し、血液試料およびＷＢＣ試薬を約１容量部の試料の比率で混合後、室温を超える温度（例えば、約３０℃〜約５０℃の間、例えば、約４０℃）で、比較的短い時間で（例えば、約２５秒未満で、約１７秒未満で、または約９秒未満ででも）起こさせることができる。分析用データを複数の光学的チャネルおよび少なくとも１つの蛍光チャネルで集める。
【００１８】
図１Ａ〜Ｅは、収集した光学的情報のヒストグラムおよび蛍光情報のヒストグラムによる、非溶解ＲＢＣおよびＲＢＣ断片からの真のＷＢＣの分離を示す。図１Ａは、軸方向光損失（ＡＬＬ）の測定を示す。図ＩＢのヒストグラムは、中間角散乱（ＩＡＳ）の測定を示す。図１Ｃのヒストグラムは、９０°偏光側方散乱（ＰＳＳ）の測定を示す。図ＩＤのヒストグラムは、９０°偏光解消側方散乱（ＤＳＳ）の測定を示す。図ＩＥのヒストグラムは、蛍光（ＦＬ１）の測定を示す。これらのヒストグラムで、水平軸は、検出チャネルの値（またはチャンネルの名前、すなわち、ＡＬＬ、ＩＡＳ、ＰＳＳ、ＤＳＳまたはＦＬ１）を示す。垂直軸は、血液試料の成分のカウント数を示す。これらのヒストグラムで、線１００はＲＢＣの残渣、および線２００はＷＢＣを示している。本明細書で使われる「ＲＢＣの残渣」は、「ＲＢＣの断片」と同義である。図ＩＥを図１Ａ〜１Ｄと比べるとわかるように、いずれの光学的チャネルの場合より２つのグループの粒子（すなわち、ＷＢＣおよびＲＢＣの残渣）の間で、蛍光情報の極めて良好な分離を示し、それにより、下記の分析を促進する。
【００１９】
（２）蛍光トリガーの使用
血液細胞は、光源による蛍光染料の励起時に異なる大きさの蛍光シグナルを発光する。蛍光シグナルの大きさの差異は、細胞内の核酸、すなわち、ＤＮＡの量から生じる。ＤＮＡの量が大きくなればなるほど、高い蛍光シグナルの可能性が大きくなる。また、細胞膜の浸透、染料の寸法、染料およびＤＮＡの間の結合動力学、染料およびＤＮＡの間の親和性、ならびに他の因子の効力は、蛍光シグナルに影響する。成熟ＲＢＣは、最小の蛍光シグナルを発光する。理由は、成熟ＲＢＣ内にはＤＮＡがないからである。有核赤血球（ｎＲＢＣ）は、非常に強力な蛍光シグナルを放出する。理由は、ｎＲＢＣの核内にＤＮＡがあるからのみでなく、ｎＲＢＣの膜が溶解工程の間に破壊されているために染色がより容易であるからである。非溶解ＲＢＣまたはＲＢＣ断片は、蛍光を発光しないが、非常に弱い自己蛍光を発光できる。図ＩＥに関して示すように、非常に強い蛍光シグナルを発する細胞は、核を有する細胞、すなわち、ＷＢＣ（および、存在する場合はｎＲＢＣ）である。
【００２０】
従って、本明細書で提示のシステムおよび方法は、ＷＢＣを集め、分析するための蛍光トリガーを使用する。例えば、通常、ＲＢＣ由来シグナルおよびＷＢＣ由来のシグナルの間に設定される蛍光トリガーを使って、ＷＢＣ由来シグナルをその後の分析のために別に集めることができる。ＦＬ１トリガーを使用する２つの例を図２と図３に示す。図２は、いずれのＲＢＣ断片（核不含粒子）も除き、核含有イベント（例えば、ＷＢＣおよび／またはｎＲＢＣ）を収集するための蛍光トリガーの使用を示すサイトグラムである。蛍光染料は、アクリジンオレンジで、蛍光染料の濃度は、３μｇ／ｍＬであった。蛍光の光電子増倍管の電圧は３５０ボルトに設定された。図３は、いずれのＲＢＣ断片（核不含粒子）も除き、核含有イベント（例えば、ＷＢＣおよび／またはｎＲＢＣ）を収集するための蛍光トリガーの使用を示すサイトグラムである。蛍光染料は、アクリジンオレンジで、蛍光染料の濃度は、０．０３μｇ／ｍＬであった。蛍光の光電子増倍管の電圧は５００ボルトに設定された。アクリジンオレンジ染色（大きく異なる染料濃度、すなわち、図２の３μｇ／ｍＬｉｎおよび図３の０．０３μｇ／ｍＬを使う場合であっても）および適切に設定されたＦＬ１トリガーを使うＷＢＣアッセイでは、ＦＬ１トリガーを越えるイベントのみが、核含有イベント（例えば、ＷＢＣおよび／または存在する場合、ｎＲＢＣ）であり、従って、その後の分析のために、捕捉される。
【００２１】
（３）分析用の複数の光学的チャネルおよび少なくとも１つの蛍光チャネルの使用
一実施形態では、ＷＢＣ識別分析は、蛍光情報を強化した多角偏光散乱分離技術（ＭＡＰＳＳ）を使って行われる。フローセルを通過する各血液細胞による光散乱を検出するには、少なくとも１つのフォトダイオード、または少なくとも１つの光電子増倍管、または少なくとも１つのフォトダイオードおよび少なくとも１つの光電子増倍管の両方が、必要である。２つ以上のフォトダイオードを使って、約０°散乱を測定するＡＬＬシグナル、および、低角（例えば、約３°〜約１５°）散乱を測定するＩＡＳシグナルを測定する。２つ以上の光電子増倍管を使って、９０°ＰＳＳシグナルおよび９０°ＤＳＳシグナルを検出する。適切な波長範囲内のＦＬ１測定のためには、光源の波長の選択に応じて、追加の光電子増倍管が必要である。システムで捕捉された各イベントは、このように、複数の特性情報、例えば、ＡＬＬ、ＩＡＳ（１つまたは複数のチャネル）、ＰＳＳ、ＤＳＳ、および蛍光（１つまたは複数のチャネル）を示す。これらの検出チャネル由来の情報を使って、さらなる血液細胞の分析を行う。
【００２２】
図４は、血液分析に適する装置（フローサイトメトリーを含む）の照射および検出光学系を模式図で示す。図４を参照して、装置１０は、光源１２、ビームを曲げるための前面ミラー１４および背面ミラー１６、第１の円柱状レンズ２０および第２の円柱状レンズ２２を含むビーム拡大器モジュール１８、焦点レンズ２４、ビーム微調整器２６、フローセル２８、前方散乱レンズ３０、ブルズアイ検出器３２、第１の光電子増倍管３４、第２の光電子増倍管３６、および第３の光電子増倍管３８、を含む。ブルズアイ検出器３２は、０°光散乱用内側検出器３２ａおよび７°光散乱用外側検出器３２ｂを持つ。
【００２３】
以下の考察では、光源は、好ましくは、レーザーである。しかし、他の光源、例えば、ランプ（例えば、水銀、キセノン）も使用可能である。光源１２は、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡから市販されている垂直偏光空冷Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  Ｃｕｂｅ  ｌａｓｅｒ、であってもよい。３５０ｎｍ〜７００ｎｍの範囲の波長のレーザーを使用できる。レーザー用操作条件は、「ＣＥＬＬ−ＤＹＮ」自動化血液分析器で現在使っているものと実質的に類似である。
【００２４】
フローセル、レンズ、焦点レンズ、ビーム微調整機構およびレーザー焦点レンズに関する追加の詳細は、米国特許第５，６３１，１６５号で見つけることができる。この特許は参照により、特に、カラム４１、行３２からカラム４３、行１１までが、本明細書に組み込まれる。図２の前方光路システムは、球形平凸レンズ３０およびレンズの後焦点面に位置する２素子フォトダイオード検出器３２を含む。この構成では、２素子フォトダイオード検出器３２内の各点は、フローセル２８を通過する細胞由来の特定の光収集角度に位置づけられる。検出器３２は、軸方向光損失（ＡＬＬ）および中間角前方散乱（ＩＡＳ）を検出できるブルズアイ検出器であってもよい。米国特許第５，６３１，１６５号は、カラム４３、行１２〜５２に、この検出器の種々の代替装置について記載している。
【００２５】
第１の光電子増倍管３４（ＰＭＴ１）は、偏光解消側方散乱（ＤＳＳ）を測定する。第２の光電子増倍管３６（ＰＭＴ２）は、偏光側方散乱（ＰＳＳ）を測定し、第３の光電子増倍管３８（ＰＭＴ３）は、選択蛍光染料および採用光源に応じて、４４０ｎｍ〜６８０ｎｍの蛍光発光を測定する。光電子増倍管は、波長の広い範囲で蛍光シグナルを集め、シグナル強度を強くする。側方散乱および蛍光発光は、効率的に必要な波長で伝達および反射し効率的な検出を可能とする二色性ビームスプリッター４０および４２により、これらの光電子増倍管の方に向けられる。米国特許第５，６３１，１６５号は、カラム４３、行５３からカラム４４、行４に、光電子増倍管に関して種々の追加の詳細について記載している。
【００２６】
液浸集光（ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）システムを使って蛍光を測定する場合、感度は、光電子増倍管３４、３６、および３８で高められる。液浸集光システムは、第１のレンズ３０を、屈折率整合層を使ってフローセル２８に光学的に結合させ、広い角度にわたって光の収集を可能とするものである。米国特許第５，６３１，１６５号は、カラム４４、行５〜３１で、この光学系の種々の追加の詳細について記載している。
【００２７】
集光レンズ４４は、高解像度顕微鏡で使われる回折限界画像処理に対し充分な収差補正を有する光学的レンズシステムである。米国特許第５，６３１，１６５号は、カラム４４、行３２〜６０で、この光学系の種々の追加の詳細について記載している。
【００２８】
図４の他の部品、すなわち、スリット４６、視野レンズ４８、および第２のスリット５０の機能は、米国特許第５，６３１，１６５号のカラム４４、行６３〜カラム４５、行２６に記載されている。光電子増倍管の光路中に挿入され、検出光の波長もしくは偏光または波長と偏光の両方を変える光学フィルター５２または５６および偏光子５２または５６についても、米国特許第５，６３１，１６５号のカラム４４、行６３〜カラム４５、行２６に記載されている。本明細書での使用に適する光学的フィルターには、帯域フィルターおよびロングパスフィルターが含まれる。
【００２９】
光電子増倍管３４、３６、および３８は、側方散乱（軸が入射レーザービームにおよそ直角である円錐体中で散乱された光）または蛍光（入射レーザービームの波長とは違う波長での細胞からの光発光）を検出する。
【００３０】
米国特許第５，６３１，１６５号の選択された部分は、上記で参照しているが、米国特許第５，６３１，１６５号は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３１】
図５Ａ〜Ｊは、強化された５分類ＷＢＣ識別分析の例を示す。好中球（ＮＥ）、リンパ球（ＬＹ）、単球（ＭＯ）、好酸球（ＥＯ）および好塩基球（ＢＡ）を、ＭＡＰＳＳ技術およびＦＬ１チャネルを使って分離した。図５Ａのサイトグラムは、ＡＬＬ対ＩＡＳを示す。図５Ｂのサイトグラムは、９０°ＰＳＳ対ＡＬＬを示す。図５Ｃのサイトグラムは、９０°ＰＳＳ対ＩＡＳを示す。図５Ｄのサイトグラムは、９０°ＤＳＳ対ＡＬＬを示す。図５Ｅのサイトグラムは、９０°ＤＳＳ対ＩＡＳを示す。図５Ｆのサイトグラムは、９０°ＤＳＳ対９０°ＰＳＳを示す。図５Ｇのサイトグラムは、ＦＬ１対ＡＬＬを示す。図５Ｈのサイトグラムは、ＦＬ１対ＩＡＳを示す。図５Ｉのサイトグラムは、ＦＬ１対９０°ＰＳＳを示す。図５Ｊのサイトグラムは、ＦＬ１対９０°ＤＳＳを示す。
【００３２】
４つの従来のＭＡＰＳＳチャネル（ＡＬＬ、ＩＡＳ、ＰＳＳ、ＤＳＳ）から収集された情報に加えて、ＦＬ１チャネルが細胞亜集団をさらに識別する（図５Ｇ〜５Ｊ）。アクリジンオレンジがＷＢＣ選別用染料として使われる場合では、好塩基球は、他のＷＢＣ亜集団、すなわち、好中球、好酸球、およびリンパ球、に比べて、比較的低いＦＬ１シグナルを示し、単球は、比較的高いＦＬ１シグナルを示す。サイトグラムでは、ドット５１０は、好中球を表し、ドット５２０は好酸球を表し、ドット５３０はリンパ球を表し、ドット５４０は好塩基球を表し、さらに、ドット５５０は単球を表す。全ての光学的特性および蛍光特性からの組み合わされた定量情報は、ＷＢＣ含有血液試料に対する強化された、より信頼性の高い識別分析を提供する。
【００３３】
図６Ａは、従来の方法を使ったｒｓｔＲＢＣを含む全血試料の分析を示すサイトグラムである。図６Ａは、市販の「ＣＥＬＬ−ＤＹＮ」Ｓａｐｐｈｉｒｅ（登録商標）血液分析器を使ったＡＬＬ対ＩＡＳのサイトグラムを示す。図６Ｂは、ＦＬ１トリガー強化血液分析器を使ったＡＬＬ対ＩＡＳを示すサイトグラムである。全血試料は、図６Ａで分析したものと同じとした。蛍光染料、アクリジンオレンジの濃度は、３μｇ／ｍＬであった。結果は、本明細書記載の方法は、以前述べた２つの最も難易度の高いケースに対し、正確で効率的であることを示す。従来の方法では、非溶解ＲＢＣ、すなわち、サイトグラムの左側下方に現れるイベントは、リンパ球であると認識され、それにより、より多い数のＷＢＣ、およびより高い割合のリンパ球という結果になっていた。図６Ｂは、ｒｓｔＲＢＣを含む試料の本明細書記載の方法によるＷＢＣ分析結果を示す。本明細書記載の方法では、ＲＢＣまたはＲＢＣの残渣が認識されなかったので、ＷＢＣの分析は、正確であった。
【００３４】
図７Ａは、より多くの脆いＷＢＣを含む古い（２８時間過ぎたもの）全血試料の従来の方法を使った分析を示すサイトグラムである。図７Ａは、「ＣＥＬＬ−ＤＹＮ」Ｓａｐｐｈｉｒｅ（登録商標）血液分析器を使ったＡＬＬ対ＩＡＳを示すサイトグラムである。図７Ｂは、ＦＬ１トリガー強化血液分析器を使ったＡＬＬ対ＩＡＳを示すサイトグラムである。全血試料は、図７Ａで分析したものと同じとした。蛍光染料、アクリジンオレンジの濃度は、３μｇ／ｍＬであった。
【００３５】
本明細書記載の方法は、血液分析器に対するＷＢＣ分析を強化する。本明細書記載の方法は、より正確なＷＢＣ計数およびより正確なＷＢＣ亜集団の分類を提供する。理由は、非溶解ＲＢＣおよびＲＢＣ断片化の干渉が、実質的に除去されるためである。蛍光の使用は、ＷＢＣの識別分析を改善するためのさらなる情報を与える。本明細書記載の方法は、ｒｓｔＲＢＣを有する試料および脆いＷＢＣを有する試料を分析する場合に、従来の方法に対し利点を示す。
【００３６】
追加の実施形態
一実施形態では、蛍光染料で染色した血液試料のＷＢＣ識別分析を行う血液分析器を提供する。分析器は、血液試料内の粒子を励起するように配置された励起源を含む。分析器は、（１）励起血液試料から軸方向光損失を測定するように配置された軸方向光損失検出器、（２）励起血液試料から中間角散乱を測定するように配置された中間角散乱検出器、（３）励起血液試料から９０°偏光側方散乱を測定するように配置された偏光側方散乱検出器（４）励起血液試料から９０°偏光解消側方散乱を測定するように配置された偏光解消側方散乱検出器、および（５）励起血液試料から発光された蛍光を測定するように配置された蛍光検出器を含む複数の検出器をさらに含む。分析器は、複数の検出器から（１）軸方向光損失、（２）中間角散乱、（３）９０°偏光側方散乱、（４）９０°偏光解消側方散乱、および（５）蛍光、の測定値を受けるように構成されたプロセッサをさらに含む。プロセッサは、また、蛍光閾値を超える蛍光を発光する粒子に対し、５つの測定値に基づいて、血液試料のＷＢＣ識別分析を行うように構成されている。プロセッサは、受け取った測定値を予備選別し、蛍光閾値に満たない粒子を検討対象から外すようにさらに構成されてもよい。軸方向光損失検出器は、０°散乱での軸方向光損失を測定してもよい。中間角散乱検出器は、約３°〜約１５°で光角度散乱を測定してもよい。複数の検出器は、１つまたは複数の光電子増倍管を含んでもよい。励起源は、蛍光染料に対応する波長で発光するように構成されたレーザーであってもよい。あるいは、蛍光染料が、励起源に対応するように選択されてもよい。蛍光染料は、細胞膜透過性で、核酸結合性であってもよい。
【００３７】
血液分析器は、血液試料をＷＢＣ試薬で希釈するためのインキュベーションサブシステムをさらに含んでもよい。ＷＢＣ試薬には、蛍光染料および１つまたは複数の溶解薬剤を含むことができる。あるいは、ＷＢＣ試薬は、（ａ）少なくとも１つの界面活性剤、（ｂ）少なくとも１つの緩衝液または少なくとも１つの塩、（ｃ）少なくとも１つの抗菌剤、および（ｄ）蛍光染料を含んでもよい。インキュベーションサブシステムは、約２５秒未満、約１７秒未満、または約９秒未満の時間、ＷＢＣ試薬と共に血液試料をインキュベートするように構成してもよい。また、インキュベーションサブシステムは、約３０℃〜約５０℃の範囲の温度、例えば、約４０℃の温度で、血液試料をＷＢＣ試薬と共に、インキュベートするように構成してもよい。
【００３８】
別の実施形態では、蛍光染料で染色した血液試料のＷＢＣ識別分析を行う方法が提供される。方法は、血液試料内の粒子を励起するように励起源を配置することを含む。方法は、励起血液試料から（１）軸方向光損失、（２）中間角散乱、（３）９０°偏光側方散乱、（４）９０°偏光解消側方散乱、および（５）蛍光を測定するように複数の検出器を配置することをさらに含む。方法は、（１）軸方向光損失、（２）中間角散乱、（３）９０°偏光側方散乱、（４）９０°偏光解消側方散乱、および（５）蛍光の測定値を複数の検出器から受けるようにプロセッサを構成することをさらに含む。方法は、また、蛍光閾値を超える蛍光を発光する粒子に対し、５つ全ての測定値に基づいて、血液試料のＷＢＣ識別分析を行うようにプロセッサを構成することを含む。方法は、受け取った測定値を予備選別して、蛍光閾値に満たない粒子を検討対象から外すようにプロセッサを構成することをさらに含んでもよい。軸方向光損失検出器は、０°散乱で軸方向光損失を測定してもよい。中間角散乱検出器は、約３°〜約１５°で光角度散乱を測定してもよい。複数の検出器が、１つまたは複数の光電子増倍管を含んでもよい。方法は、また、励起源を蛍光染料に対応する波長で発光するように構成することを含んでもよい。あるいは、蛍光染料は、励起源に対応するように選択されてもよい。蛍光染料は、細胞膜透過性で、核酸結合性であってもよい。
【００３９】
方法は、血液試料をＷＢＣ試薬で希釈するためのインキュベーションサブシステムをさらに含んでもよい。ＷＢＣ試薬には、蛍光染料および溶解薬剤を含むことができる。あるいは、ＷＢＣ試薬は、（ａ）少なくとも１つの界面活性剤、（ｂ）少なくとも１つの緩衝液または少なくとも１つの塩、（ｃ）少なくとも１つの抗菌剤、および（ｄ）蛍光染料を含んでもよい。インキュベーションサブシステムは、約２５秒未満、約１７秒未満、および／または約９秒未満の時間、ＷＢＣ試薬と共に血液試料をインキュベートするように構成してもよい。また、インキュベーションサブシステムは、約３０℃〜約５０℃の範囲の温度、例えば、約４０℃の温度で、血液試料をＷＢＣ試薬と共に、インキュベートするように構成してもよい。
【００４０】
別の実施形態では、ＷＢＣ識別分析を行うための血液分析器が提供され、この方法は、（１）血液分析器のフローセルを通過する間に血液試料を励起するレーザー光源を配置することを含む血液試料内の粒子を励起する手段、またはその等価物；（２）複数の検出器（上記で考察したような）を含む血液試料内の励起粒子からの複数の光散乱シグナルを測定する手段、またはその等価物；（３）蛍光検出器（上記で考察したような）を含む血液試料内の励起粒子からの蛍光シグナルを測定する手段、またはその等価物；（４）蛍光トリガーを使って構成されるプロセッサ（上記で考察したような）を含む、蛍光閾値に満たない粒子を検討対象から外すための励起粒子を選別する手段、またはその等価物；および（５）ＷＢＣ識別を行うように構成されたプロセッサ（上記で考察したような）を含む、選別手段を通過した粒子に対し、複数の光散乱シグナルおよび蛍光シグナルに基づいて、ＷＢＣ識別分析を行うための手段、またはその等価物、を含む。血液分析器は、インキュベーションサブシステム（上記で考察したような）を含む、血液試料をＷＢＣ試薬と共に、約２５秒未満のインキュベーション時間、インキュベートする手段、またはその等価物をさらに含んでもよい。血液分析器は、インキュベーションサブシステム（上記で考察したような）を含む、血液試料をＷＢＣ試薬と共に、約３０℃〜約５０℃の範囲の温度でインキュベートする手段、またはその等価物をさらに含んでもよい。
【００４１】
別の実施形態では、自動化血液分析器を使ったＷＢＣ分析を行う方法が提供される。方法は、（ａ）有核赤血球を含む全血液試料を少なくとも１つの白血球試薬で希釈すること；（ｂ）ステップ（ａ）の希釈試料を、選択温度範囲内で赤血球を溶解するのに充分な時間インキュベートし、有核赤血球の核を少なくとも１つの白血球試薬に露出させ、少なくとも１つの蛍光染料に有核赤血球の核を染色させることを可能とし、白血球を残存させること；（ｃ）インキュベートしたステップ（ｂ）の試料をフローセルに連続的に送り出すこと、；（ｄ）インキュベートした試料がフローセルを通過する間に、インキュベートした試料を光源で励起すること；（ｅ）複数の光学的散乱シグナルおよび少なくとも１つの蛍光発光シグナルを同時に収集すること；および（ｆ）ステップ（ｅ）で集めた光学的情報および蛍光情報を使って、有核赤血球を識別し、定量化すること、のための手段およびこれらのステップを含む。別の実施形態では、自動化血液分析器を使ったＷＢＣ分析を行う方法が提供される。方法は、（ａ）ＲＢＣ溶解試薬およびＷＢＣ膜を透過し、ＷＢＣ核酸に結合する蛍光染料を含むＷＢＣ試薬で全血試料を希釈すること；（ｂ）ステップ（ａ）で希釈した血液試料を約２５秒未満のインキュベーション時間、約３０℃〜約５０℃の温度範囲でインキュベートすること；（ｃ）ステップ（ｂ）からのインキュベートした試料を血液分析器のフローセルに送り届けること；（ｄ）インキュベートした試料がフローセルを通過する間に、ステップ（ｃ）からのインキュベートした試料を励起源で励起すること；（ｅ）励起試料からの複数の光散乱シグナルおよび蛍光発光シグナルを収集すること；および（ｆ）ステップ（ｅ）で収集した全シグナルに基づいてＷＢＣ識別を行い、蛍光発光シグナルに基づき蛍光閾値に満たない希釈血液試料内の粒子を検討対象から外すこと、を含む。ＷＢＣ試薬は、（ａ）少なくとも１つの界面活性剤、（ｂ）少なくとも１つの緩衝液または少なくとも１つの塩、（ｃ）少なくとも１つの抗菌剤、および（ｄ）少なくとも１つの蛍光染料を含んでもよい。励起源は、約３５０ｎｍ〜約７００ｎｍの波長であってもよい。蛍光発光は、帯域フィルターまたはロングパスフィルターを使って、約３６０ｎｍ〜約７５０ｎｍの波長で収集されてもよい。
【００４２】
さらに別の実施形態では、自動化血液分析器を使ったＷＢＣの計数および分類方法が提供される。この方法は、（ａ）全血試料を少なくとも１つのＷＢＣ試薬で希釈する；（ｂ）ステップ（ａ）の希釈試料を、充分な時間、選択された温度範囲内で、インキュベートしてＲＢＣを溶解し、ＷＢＣを残存させ、少なくとも１つの蛍光染料のＷＢＣ細胞膜の透過およびＷＢＣの核内の核酸への結合を可能とする；（ｃ）ステップ（ｂ）からのインキュベートした試料を、フローセルに連続的に送り出す；（ｄ）インキュベートした試料がフローセルを通過する間に、ステップ（ｃ）からのインキュベートした試料を光源を使って励起する；（ｅ）複数の光学散乱シグナルおよび少なくとも１つの蛍光発光シグナルを同時に収集する；および（ｆ）ステップ（ｅ）で集めたシグナルを使って、ＷＢＣを識別および定量する、ステップを含む。実施形態の特徴は、限定されないが、（１）ＲＢＣを溶解する工程の間に、所与の血液試料中のＷＢＣおよび他の核含有細胞中の核酸に結合し、これを染色し、さらに、所与の光源、例えば、適切な波長のレーザービームからのフォトンによる励起時に、蛍光発光を誘導するための少なくとも１つの蛍光染料の使用；（２）強力な蛍光（例えば、ＷＢＣおよび他の核含有細胞を含むイベント）を発光するイベントを分離し、集める蛍光トリガーの使用；（３）各細胞集団を特定し、追加の情報を明らかにするために、データを集め、集められたデータを分析するための複数の光学チャネルおよび少なくとも１つの蛍光用チャネルの使用、を含む。
【００４３】
さらに別の実施形態では、本明細書で開示のシステムおよび方法は、（ａ）発光スペクトルが血液測定装置の励起源に対応する、専用の細胞膜透過性蛍光染料で血液試料を染色すること；（ｂ）血液試料中のＷＢＣを選別するために蛍光トリガーを使用すること；および（ｃ）識別分析を行うために測定の組み合わせを使用すること、を含む。測定の組み合わせは、軸方向光損失、中間角散乱、９０°偏光側方散乱、９０°偏光解消側方散乱、１つまたは複数の蛍光発光測定値、多重リング中間角散乱（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ａｎｇｌｅ  ｓｃａｔｔｅｒ）、およびこれらの内のいずれかの組み合わせまたは等価物、からなる群より選択される１つまたは複数の測定を含んでもよい。
【００４４】
一実施形態では、本発明は、本明細書記載の機能性を実行できる１つまたは複数のコンピュータシステムに関する。例えば、本明細書で考察の方法／分析ステップのいずれかは、１つまたは複数のプロセッサ、データ通信インフラ（例えば、コミュニケーションバス、クロスオーバ・バー（ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒｂａｒ）、またはネットワーク）、ディスプレイインターフェイス、および／または保存またはメモリユニットを有するコンピュータシステムに実装可能である。保存またはメモリユニットは、実行時、プロセッサに１つまたは複数の本明細書記載の機能を実行させる命令（例えば、制御ロジックまたはソフトウェア）を含むコンピュータ可読保存メディアを含んでもよい。用語の「コンピュータ可読保存メディア」、「コンピュータプログラムメディア」、および「コンピュータ使用可能メディア」は、通常、メディア、例えば、リムーバブル保存ドライブ、リムーバブル保存ユニット、コミュニケーションインターフェイスを介して送信されたデータ、および／またはハードディスクドライブに組み込まれたハードディスクの意味に使われる。このようなコンピュータプログラム製品は、コンピュータソフトウェア、インストラクション、および／またはデータをコンピュータシステムに提供し、これが、さらに、コンピュータシステムを、一般目的コンピュータから本明細書記載の特定の機能を実行するようにプログラムされた特殊目的コンピュータに変換する役割をする。必要に応じ、プロセッサ、関連部品、ならびに等価システムおよびサブシステムは、選択操作および機能を実行する「ための手段（ｍｅａｎｓ  ｆｏｒ）」の例としての機能を果たす。このような選択操作および機能を実行する「ための手段」もまた、一般目的コンピュータを、前記選択操作および機能を実行するようにプログラムされた特殊目的コンピュータに変換する機能を果たす。
【００４５】
結び
本発明の前述説明は、例示および説明のために提示するものである。全てを網羅するものではなく、また本発明を開示形態に厳密に限定する意図もない。上記教示を考慮すると、他の修正および変更が可能であろう。実施形態は、本発明の原理および実際の適用を最良に説明するために、また、それにより他の当業者が種々の実施形態で、および意図した特定の用途に適合するように種々の修正した形態で、本発明を最良に利用できるようにするために、選択、説明するものである。添付の請求項は、等価構造、成分、方法、および手段を含む他の代替の本発明の実施形態を含むように解釈されるべきであることが意図されている。
【００４６】
上記詳細説明は、１つまたは複数の代表的実施形態を説明する付随する図を参照する。
他の実施形態が可能である。本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、記載された実施形態に対し修正を行うことができる。従って、詳細説明は、制限を意味しない。さらに、発明の概要および要約セクションは、発明者に意図された１つまたは複数の本発明の、全てではない、代表的実施形態を説明するものであり、従って、本発明および添付請求項を何ら制限する意図はない。
【図１Ａ】
2014520251.tif 000003
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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