(57)【要約】【課題】新規のヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）ムテインまたはそれらの変異体、ならびに核酸分子およびそれらの変異体が提供される。【解決手段】これらのムテインを生成させる方法のほか、動物の免疫系を刺激する方法もまた開示される。加えて、本発明は、本発明の核酸分子を含む組換え発現ベクターおよび発現ベクターが導入された宿主細胞も提供する。治療有効量の本発明のヒトＩＬ−２ムテインおよび薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物も包含される。ＩＬ−２ムテインは、がんの治療および免疫反応の刺激で用いるための医薬組成物において用いることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−２Ｒβに対する平衡解離定数が、野生型のヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）のものより小さい、ＩＬ−２Ｒβ結合タンパク質。
【請求項２】
ＩＬ−２ムテインである、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項３】
野生型のｈＩＬ−２に従い番号付けされた２４、６５、７４、８０、８１、８５、８６、８９、９２、および９３位における１または複数のアミノ酸置換からなる、請求項２に記載のムテイン。
【請求項４】
７４位がアルギニンである、請求項３に記載のムテイン。
【請求項５】
８５位がバリンである、請求項３に記載のムテイン。
【請求項６】
以下の置換：８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｉ、８９Ｉ、９２Ｆ、および９３Ｖを有する、請求項３に記載のムテイン。
【請求項７】
以下の置換：７４Ｓ、８０Ｌ、８１Ｔ、８５Ｖ、８６Ｉ、８９Ｉ、９２Ｆ、および９３Ｖを有する、請求項３に記載のムテイン。
【請求項８】
以下の置換：８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、８９Ｉ、９２Ｆ、および９３Ｖを有する、請求項３に記載のムテイン。
【請求項９】
前記ムテインが、ＩＬ−２ＲβとＩＬ−２Ｒγとの間の相互作用を阻害する、請求項２に記載の結合タンパク質。
【請求項１０】
野生型のｈＩＬ−２に従い番号付けされた１８、２２、２４、６５、７４、８０、８１、８５、８６、８９、９２、９３、および１２６位における１または複数のアミノ酸置換からなる、請求項９に記載のムテイン。
【請求項１１】
以下の置換：１８Ｒ、２２Ｅ、８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｉ、８９Ｉ、９２Ｆ、９３Ｖ、および１２６Ｔを有する、請求項１０に記載のムテイン。
【請求項１２】
以下の置換：１８Ｒ、２２Ｅ、７４Ｓ、８０Ｌ、８１Ｔ、８５Ｖ、８６Ｉ、８９Ｉ、９２Ｆ、９３Ｖ、および１２６Ｔを有する、請求項１０に記載のムテイン。
【請求項１３】
以下の置換：１８Ｒ、２２Ｅ、８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、８９Ｉ、９２Ｆ、９３Ｖ、および１２６Ｔを有する、請求項１０に記載のムテイン。
【請求項１４】
ヒトＩＬ−２を突然変異させ、これにより、第１世代のＩＬ−２ムテインを生成させる工程と、野生型のヒトＩＬ−２のものより小さい、インターロイキン２受容体βに対する平衡解離定数を有する第１世代のＩＬ−２ムテインを同定する工程と、同定された第１世代のＩＬ−２ムテインを突然変異させ、これにより、第２世代のＩＬ−２ムテインを生成させる工程と、野生型のＩＬ２と比較してより低い程度で、インターロイキン２受容体γに結合し、かつ／またはインターロイキン２受容体γを介してシグナル伝達する第２世代のＩＬ−２ムテインを同定し、これにより、ＩＬ−２結合タンパク質を生成させる工程と、を含む方法によって生成されるＩＬ−２結合タンパク質。
【請求項１５】
野生型ＩＬ−２と比べて低減したインターロイキン２受容体γへの結合を示す、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項１６】
野生型ＩＬ−２と比べて低減したインターロイキン２受容体γへの結合および／またはインターロイキン２受容体γを介するシグナル伝達を示す、請求項１または１５に記載の結合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]  本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた助成金第ＡＩ５１３２１号の下で、米国政府の助成によりなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]  インターロイキン２（IL-2）とは、正常な免疫反応をもたらすのに極めて重要な役割を果たす、活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞が主に生成させる多能性のサイトカインである。ＩＬ−２は、活性化したＴリンパ球の増殖(proliferaion）および増加(expansion）を促進し、Ｂ細胞成長を強化し、単球およびナチュラルキラー細胞を活性化する。ＩＬ−２が試験され、承認されたがん治療として用いられている（アルデスロイキン、Proleukin（登録商標））のは、これらの活性のためであった。
【０００３】
[0003]  真核細胞では、ヒトＩＬ−２が１５３アミノ酸の前駆体ポリペプチドとして合成され、そこから２０アミノ酸が除去されて成熟分泌ＩＬ−２を生成させる（Taniguchi、1983）。組換えヒトＩＬ−２は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Rosenberg、1984）、昆虫細胞（Smith、1985）、および哺乳動物ＣＯＳ細胞（Taniguchi、1983）において生成されている。
【０００４】
[0004]  ＩＬ−２は、３つの異なる受容体：インターロイキン２受容体アルファ（IL-2Rα; CD25）、インターロイキン２受容体ベータ（IL-2Rβ; CD122）、およびインターロイキン２受容体ガンマ（IL-2Rγ; CD132；共通ガンマ鎖）と相互作用することにより作用する。最初に同定された受容体はＩＬ−２Ｒαであった。ＩＬ−２Ｒαは、Ｔ細胞活性化の際に出現し、元はＴａｃ（Ｔ活性化の略記）抗原と称した５５ｋＤポリペプチド（p55）である。ＩＬ−２Ｒαは、約１０−８ＭのＫｄでＩＬ−２に結合し、また、「低アフィニティー」のＩＬ−２受容体としても知られる。ＩＬ−２の、ＩＬ−２Ｒαのみを発現する細胞への結合は、検出可能な生物学的反応もたらさない。
【０００５】
[0005]  ＩＬ−２Ｒβは、２つのシステイン／ＷＳＸＷＳモチーフを特徴とするＩ型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーである。ＩＬ−２Ｒβは、ＩＬ−２Ｒγと協調的に発現する。６４ｋＤのポリペプチドであるＩＬ−２Ｒγは、インターロイキン４およびインターロイキン７の受容体を含めたいくつかのサイトカイン受容体の間で共有されているため、共通γ鎖としても知られている。ＩＬ−２Ｒβγは、ＩＬ−１５に結合しうる同じシグナル伝達受容体複合体である。
【０００６】
[0006]  大半の細胞、例えば、休止Ｔ細胞は、ＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγを発現するのみなので、ＩＬ−２に対して非感受性である。抗原受容体を介してＴ細胞が活性化すると、ＩＬ−２Ｒαが急速に発現する。ＩＬ−２ＲαがＩＬ−２に結合すると、次いで、それはＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγを逐次的に会合させる（図１）。ＩＬ−２Ｒαβγ複合体によるＩＬ−２への結合は、Ｊａｋ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路を介するシグナル伝達およびＩＬ−２を介する成長刺激を結果としてもたらす。
【０００７】
[0007]  これまでのところ、マウスＩＬ−２についての解析は広範になされているが、ヒトＩＬ−２についてなされているのは、限定された構造／機能解析のみである（Zurawski, S. M.およびZurawski,（1989）Embo J S: 2583-90; Zurawski, S. Mら（1990）Embo J 9: 3899-905; Zurawski,G.（1991）. Trends Biotechnol 9: 250-7; Zurawski, S. M.およびZurawski, G.（1992）Embo J 11: 3905-10. Zurawskiら、EMBO J、12 5113-5119（1993））。一部のヒトＩＬ−２ムテインが、ヒトＰＨＡ  ｂｌａｓｔに対するそれらの活性について検査されている（Xuら、Eur. Cytokine Netw、6、237-244（1995））。ＢｕｃｈｌｉおよびＣｉａｒｄｅｌｌｉ、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ、３０７（２）：４１１−４１５、（１９９３）、Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｌ．ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：７７０９−７７１３（１９８８）、ならびに米国特許第５，６９６，２３４号（Zurawskiら）により、ヒトＩＬ−２ムテインの他の例がもたらされている。
【０００８】
[0008]  ＩＬ−２の抗新生物剤としての使用は、腫瘍反応に必要な用量に付随する深刻な毒性により制限されている。ＩＬ−２療法の主要な副作用は、血管漏出症候群（VLS）であり、これにより、血管内液が肺および肝臓に蓄積される結果として、肺浮腫および肝損傷がもたらされる。近年まで、ＶＬＳは、ＩＬ−２により活性化されたＮＫ細胞からの炎症促進性サイトカインの放出により引き起こされると考えられていた。しかし、近年の報告は、ＩＬ−２の肺内皮細胞への直接的な結合を指摘し、これをＶＬＳの原因と主張している（Kriegら、PNAS USA 107（26）11906-11911（2010））。原理的には、ＩＬ−２Ｒβに対するアフィニティーが高く、その活性がＣＤ２５の発現に依存しないＩＬ−２変異体であれば、臨床的有用性を改善し、毒性を低減できたであろう。
【０００９】
[0009]  臨床的に重要な１つのＩＬ−２ムテインは、８８位におけるアルギニンのアスパラギンへの置換（R88N）により野生型ＩＬ−２と異なるＢＡＹ  ５０−４７９８である（Steppanら（2006）J. Interferon and Cytokine Res.、26（3）: 171）。この修飾は、ＩＬ−２Ｒβγへの結合が比較的低減されたＩＬ−２ムテインを結果としてもたらすとされ、保有する毒性が野生型ＩＬ−２と比べて小さいと考えられている。しかし、臨床研究は、ＢＡＹ  ５０−４７９８を施される患者が、同様な程度のＩＬ−２介在性ＶＬＳを経過することを見出した。
【００１０】
[0010]  これらの理由で、固有の特性を示すＩＬ−２ムテインが必要とされることが明らかである。このようなムテインの潜在的な使用には、がん（直接療法および／または補助療法として）および免疫不全症（例えば、HIVおよび結核）の治療が含まれる。ＩＬ−２の他の潜在的な使用は、その免疫刺激活性に由来し、これには、がんの直接的な治療；ＨＩＶ患者またはヒトＳＣＩＤ患者などの免疫不全症の治療；結核などの感染性疾患の治療；「がんワクチン」戦略における補助剤としてのその使用；および標準的なワクチン接種プロトコール（例えば、年長者用）の増強など、免疫系刺激の適応に応じた使用が含まれる。例えば、ＶＬＳの軽減を示すＩＬ−２ムテインであれば有利であろう。
【００１１】
[0011]  本開示は、新規のＩＬ−２ムテインを提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
[0012]  ＩＬ−２は、免疫系に対して広範な効果を及ぼし、免疫の活性化およびホメオスタシスの両方を制御するのに極めて重要な役割を果たす。免疫系刺激剤として、ＩＬ−２は、がんおよび慢性ウイルス感染の治療において用いられている。ＩＬ−２の刺激効果はまた、自己免疫および移植拒絶を媒介し、被害も引き起こす。免疫の制御および免疫疾患におけるその手段的役割のために、品質を改善したＩＬ−２分子の同定は、なお活発な研究領域であり続けている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
[0013]  これらの目的のため、本開示は、ＩＬ−２がその同源の(cognate)受容体とどのように相互作用するのかについての洞察に基づき、新規のＩＬ−２組成物を提供する。大半の状況では、ＩＬ−２が、３つの異なる受容体：ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、およびＩＬ−２Ｒγを介して作用する。休止Ｔ細胞など、大半の細胞は、ＩＬ−２に対するアフィニティーが低いＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγのみを発現するので、ＩＬ−２に応答しない。刺激されると、休止Ｔ細胞は、比較的高アフィニティーのＩＬ−２受容体であるＩＬ−２Ｒαを発現する。ＩＬ−２のＩＬ−２Ｒαへの結合は、この受容体をＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγに逐次的に会合させ、Ｔ細胞の活性化をもたらす。
【００１４】
[0014]  ＩＬ−２を介する刺激が、ＩＬ−２Ｒαの会合をもはや必要としないように、ＩＬ−２のその受容体との相互作用についての構造解析に基づき、野生型ＩＬ−２と比較した場合に、ＩＬ−２Ｒβに対するアフィニティーを比較的増大させたＩＬ−２の突然変異体フォームを作製した。このような突然変異体は、強力なＩＬ−２シグナル伝達アゴニストである。
【００１５】
[0015]  したがって、一実施形態では、ＩＬ−２Ｒβに対する平衡解離定数が、野生型のヒトＩＬ−２のものより小さいＩＬ−２Ｒβ結合タンパク質が開示される。
【００１６】
[0016]  これらの新規の「スーパー」アゴニストＩＬ−２分子を出発点として用いて、ＩＬ−２Ｒβに結合することが可能であり、ＩＬ−２ＲβのＩＬ−２Ｒγとの相互作用および受容体のシグナル伝達を低減する「スーパー」アンタゴニストも作製した。
【００１７】
[0017]  他の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ結合タンパク質を生成させる方法であって、ヒトＩＬ−２を突然変異させ、これにより、第１世代のＩＬ−２ムテインを生成させる工程と、野生型のヒトＩＬ−２のものより小さいインターロイキン２受容体βに対する平衡解離定数を有する第１世代のＩＬ−２ムテインを同定する工程と、同定された第１世代のＩＬ−２ムテインを突然変異させ、これにより、第２世代のＩＬ−２ムテインを生成させる工程と、野生型のＩＬ２より低い程度でインターロイキン２受容体γに結合し、かつ／またはこれを介してシグナル伝達する第２世代のＩＬ−２ムテインを同定し、これにより、ＩＬ−２結合タンパク質を生成させる工程とを包含する方法が記載される。
【００１８】
[0018]  これらのＩＬ−２ムテインをまとめて、「スーパー２」と称する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】[0019]ＩＬ−２のその受容体との相互作用およびＴ細胞に対する効果についての概略図。ＩＬ−２に対するＩＬ−２Ｒαの結合は、ＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγの逐次的会合を結果としてもたらす。ＩＬ−２は、Ｔ細胞のクローン性増殖および分化を引き起こす。
【図２】[0020]ＩＬ−２ライブラリーのＦＡＣＳプロファイル。ヒトＩＬ−２遺伝子のエラープローンＰＣＲ産物を選択に供した。第１世代のＩＬ−２ライブラリーは、６ラウンドにわたる選択を介して生成させた。フィコエリトリン（PE）へと連結された四量体(tetrameric)のＩＬ−２Ｒβを用いて、ＩＬ−２ムテインを発現する酵母に結合させて、第１ラウンドを実施した（Ａ）。後続の選択ラウンドは、ＰＥで標識した単量体のＩＬ−２Ｒβを用いて達成した。（Ｂ）第２世代のＩＬ−２ライブラリーによる結果。
【図３】[0021]示されるＩＬ−２ムテインにおいて、野生型ＩＬ−２配列と比べて変化したアミノ酸残基を示す図である。また、各ムテインおよびＩＬ−２のＩＬ−２Ｒβに対する結合アフィニティーも示される。
【図４】[0022]ＩＬ−２ムテインのＣＤ２５−ナチュラルキラー細胞およびＣＤ２５＋ナチュラルキラー細胞に対する刺激効果。（Ａ）処置されたＣＤ２５−ＹＴ−１ナチュラルキラー細胞および（Ｂ）処置されたＣＤ２５＋ＹＴ−１ナチュラルキラー細胞において認められる、野生型ＩＬ−２ならびにＩＬ−２ムテインである６−６、Ｄ１０、およびＨ９の、ＳＴＡＴ５リン酸化に対する用量反応関係を示す図である。丸：野生型ＩＬ−２；四角：６−６；上向き三角：Ｈ９；下向き三角：Ｄ１０。
【図５】[0023]ＩＬ−２ムテイン結合のＣＤ２５に対する非依存性。ＣＤ２５−ＹＴ−１ナチュラルキラー細胞およびＣＤ２５＋ＹＴ−１ナチュラルキラー細胞のＳＴＡＴ５リン酸化についての用量反応曲線。（Ａ）ＩＬ−２およびＩＬ−２（F42A）（丸、実線：野生型ＩＬ−２、ＣＤ２５＋細胞；四角、実線：ＩＬ−２  Ｆ４２Ａ、ＣＤ２５＋細胞；上向き三角、破線：野生型ＩＬ−２、ＣＤ２５−細胞；下向き三角、破線：ＩＬ−２  Ｆ４２Ａ、ＣＤ２５−細胞）。（Ｂ）Ｈ９およびＨ９（F42A）（丸、実線：野生型Ｈ９、ＣＤ２５＋細胞；四角、実線：Ｈ９  Ｆ４２Ａ、ＣＤ２５＋細胞；上向き三角、破線：Ｈ９、ＣＤ２５−細胞；下向き三角、破線：Ｈ９  Ｆ４２Ａ、ＣＤ２５−細胞）。Ｆ４２Ａ突然変異は、ＣＤ２５＋細胞に対する野生型ＩＬ−２の用量反応曲線を右側にシフトさせたが、ＣＤ２５−細胞に対しては観察可能な効果を及ぼさず、Ｈ９およびＨ９  Ｆ４２Ａについての用量反応曲線は、ＣＤ２５の発現に関わらず本質的に重なり合った。
【図６】[0024]ＣＤ２５  ＫＯ  Ｔ細胞刺激。開示されるＩＬ−２ムテインが、ＩＬ−２Ｒαの非存在下でＴ細胞を刺激する能力について調べた。ＣＤ２５ノックアウトマウスから単離したＴ細胞を、ＩＬ−２ムテインまたは野生型ＩＬ−２で刺激した。ＩＬ−２ムテインの用量反応曲線およびそれぞれのＥＣ５０が提示される。示される通り、被験ＩＬ−２ムテインの全ては、ＩＬ−２Ｒαの非存在下で、Ｔ細胞刺激を、野生型ＩＬ−２と比べて比較的増大させる結果をもたらした。
【図７】[0025]抗原経験のある(experienced)ヒトＣＤ４  Ｔ細胞刺激。開示されるＩＬ−２ムテインが抗原経験のあるＴ細胞刺激を誘導する相対能力を比較するＦＡＣＳ解析を示す。Ｔ細胞を２つの濃度（１０ｎｇ／ｍｌまたは１ｎｇ／ｍｌ）のＩＬ−２ムテインまたは野生型ＩＬ−２で刺激した。刺激されたＴ細胞の比率を、各ＦＡＣＳプロファイルに示す。
【図８】[0026]抗体依存性細胞毒性（ADCC）。ＩＬ−２ムテインであるＤ１０のナチュラルキラー細胞の機能に対する効果、とりわけ、自発的な抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用についてアッセイした。ナチュラルキラー細胞（エフェクター）およびＣｒ５１で標識した腫瘍細胞（標的）を、抗ＥＧＦＲ抗体であるセツキシマブを伴うかまたは伴わずに、野生型ＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインであるＤ１０の存在下で、５時間にわたり併せてインキュベートした。Ｄ１０によるＮＫ細胞の自発的細胞傷害作用に対する刺激は、高用量のＩＬ−２（＊ｐ＝０．００８、＊＊ｐ＝０．００１）を上回り、ＩＬ−２またはＤ１０による刺激を伴わない場合の自発的細胞傷害作用は最小限であった。さらに、Ｄ１０の添加は、セツキシマブ抗体のＡＤＣＣを増強した。
【図９】Ｄ１０の結晶構造。初期疎水性コア突然変異Ｌ８５Ｖにより、複数の疎水性コア残基および高アフィニティーのコンセンサス配列を標的とする第２世代のＩＬ−２ライブラリーをもたらした。Ｄ１０の結晶構造は、ヘリックスＣの上流に位置するループ領域において明確に規定された電子密度を含有した。
【図１０】新規のＩＬ−２ムテインは、ＩＬ−２と比べてＣＤ８＋Ｔ細胞刺激の増強を示すが、Ｔｒｅｇｓの刺激の増強は示さない。（Ａ）宿主のＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４４ｈｉｇｈメモリー表現型（MP）Ｔ細胞の全細胞カウントおよび（Ｂ）宿主ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＴ細胞（制御性Ｔ細胞）を、ＰＢＳ、ＩＬ−２  ２０μｇ、Ｈ９  ２０μｇ、またはＩＬ−２／抗ＩＬ−２モノクローナル抗体の複合体（IL-2/mAb）１．５μｇのいずれかを施されたマウスの脾臓において決定した。
【図１１】新規のＩＬ−２ムテインは、抗腫瘍反応の増強を示し、ＩＬ−２と比べて有害作用を低減する。肺浮腫（肺の湿潤重量）が、ＩＬ−２による処置後における有害な毒性作用の尺度として用いられ、乾燥前および乾燥後に肺を秤量することにより決定された（Ａ）。Ｐ値は、処置モダリティー間の比較を指す（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。（Ｂ）ＩＬ−２ムテインの抗腫瘍特性を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を用いて調べた。Ｃ５７Ｂ１／６マウス（群１つ当たりのマウスのｎ＝３〜４）に１０６個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を皮下注射した後、腫瘍小塊が目視可能および触知可能となったら（腫瘍細胞の注射後４〜５日目または約１５ｍｍ２の腫瘍サイズに対応することが典型的である）、ＰＢＳ、ＩＬ−２  ２０μｇ、Ｈ９  ２０μｇ、またはＩＬ−２  １．５μｇ／抗ＩＬ−２モノクローナル抗体の複合体（IL-2/mAb）を５日間にわたり毎日注射した。ｍｍ２（±SD）単位の平均腫瘍領域を、腫瘍接種後の時間と対比して示す。Ｐ値は、ＩＬ−２の他の処置モダリティーとの比較を指す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
[0027]  本明細書の以下および全体では、本開示をより容易に理解させるために、特定の用語および語句が定義される。
【００２１】
定義
[0028]本明細書で引用される全ての参考文献は、全体が示されたと仮定した場合と同様に、参照によりそれらの全体において組み込まれる。別段に規定しない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、「Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、３版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（New York、NY 2001）；Ｍａｒｃｈ、「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、５版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（New York、NY 2001）；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Cold Spring Harbor、NY 2001）は、当業者に、本開示で用いられる多くの用語への一般的な指針をもたらす。必要に応じ、市販のキットおよび試薬の使用を伴う手順は、別段に言及しない限り、一般に製造元により規定されたプロトコールおよび／またはパラメータに従い実行する。
【００２２】
[0029]  本明細書で用いられる「ＩＬ−２」とは、天然であれ、組換えであれ、野生型ＩＬ−２意味する。Ｆｕｊｉｔａら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８０、７４３７−７４４１（１９８３）に記載される通り、成熟ヒトＩＬ−２は、１３３アミノ酸の配列（Ｎ末端のさらなる２０アミノ酸からなるシグナルペプチドの分だけ短い）として生じる。ヒトＩＬ−２（配列番号１）のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号(accession locator)：ＮＰ＿０００５７７．２下に見出される。成熟ヒトＩＬ−２のアミノ酸配列を、配列番号２に示す。マウス（Mus musculus）ＩＬ−２のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：（配列番号３）下に見出される。成熟マウスＩＬ−２のアミノ酸配列を、配列番号４に示す。
【００２３】
【化１】
2014502967.tif 000003
【００２４】
[0030]  本明細書で用いられる「ＩＬ−２ムテイン」とは、インターロイキン２タンパク質に対して特異的な置換がなされているポリペプチドを意味する。例えば、図３は、１２のＩＬ−２ムテインおよびそれらの対応するＩＬ−２Ｒβに対する相対結合アフィニティーを開示する。ＩＬ−２ムテインはまた、天然のＩＬ−２ポリペプチド鎖のうちの１もしくは複数の部位または他の残基におけるアミノ酸の挿入、欠失、置換、および修飾も特徴とする。本開示に従い、任意のこのような挿入、欠失、置換、および修飾は、ＩＬ−２Ｒβへの結合活性を保持するＩＬ−２ムテインを結果としてもたらす。例示的なムテインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸の置換を包含しうる。
【００２５】
[0031]  ムテインはまた、ＩＬ−２の他の位置（すなわち、ムテインの二次構造または三次構造に対して及ぼす効果が最小限の位置）における保存的修飾および保存的置換も包含する。このような保存的置換には、Ｄａｙｈｏｆｆ、「Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、５（１９７８）、およびＡｒｇｏｓ、ＥＭＢＯ  Ｊ．、８：７７９−７８５（１９８９）により記載される保存的置換が含まれる。例えば、以下の群のうちの１つに属するアミノ酸は、保存的変化を表す:群Ｉ：ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇlｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；群ＩＩ：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；群ＩＩＩ：ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；群ＩＶ：ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；群Ｖ：ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ；および群ＶＩ：ａｓｐ、ｇｌｕ。
【００２６】
[0032]  「ＩＬ−２に従い番号付けされた」とは、そのアミノ酸が野生型ＩＬ−２の成熟配列において通常生じる位置を基準として選択されたアミノ酸を同定することを意味し、例えば、Ｒ８１とは、配列番号２において生じる８１位のアミノ酸であるアルギニンを指す。
【００２７】
[0033]  「ＩＬ−２Ｒαβγ受容体を有する細胞型」という用語は、この受容体型を有することが知られる細胞、すなわち、Ｔ細胞、活性化したＴ細胞、Ｂ細胞、活性化した単球、および活性化したＮＫ細胞を意味する。「ＩＬ−２Ｒβγ受容体を有する細胞型」という用語は、この受容体型を有することが知られる細胞、すなわち、Ｂ細胞、休止単球、および休止ＮＫ細胞を意味する。
【００２８】
[0034]  ポリペプチド配列またはＤＮＡ配列に関して本明細書で用いられる「同一性」という用語は、２つの分子間におけるサブユニット配列の同一性を指す。両方の分子におけるサブユニットの位置が、同じ単量体のサブユニット（すなわち、同じアミノ酸残基またはヌクレオチド）により占められていれば、その分子は、その位置において同一である。２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列の間の類似性とは、同一な位置の数の比例関数である。一般に、配列は、最高次のマッチが得られるように割り当てる。必要な場合、同一性は、公表されている技法およびＧＣＳプログラムパッケージ（Devereux ら、Nucleic Acids Res. 12:387、1984）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Atschulら、J. Molecular Biol. 215:403、1990）など、広く入手可能なコンピュータプログラムを用いて計算することができる。配列同一性は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ（1710 University Avenue、Madison、Wis. 53705）のＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐによる配列解析ソフトウェアパッケージなどの配列解析ソフトウェアをそのデフォルトのパラメータで用いて測定することができる。
【００２９】
[0035]  「ポリペプチド」、「タンパク質」、または「ペプチド」という用語は、その長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関わらず、アミノ酸残基の任意の鎖を指す。
【００３０】
[0036]  本開示の突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドが「実質的に純粋」である場合、それらは、対象のポリペプチド、例えば、突然変異体ＩＬ−２のアミノ酸配列を含有するポリペプチドの重量（乾燥重量）の少なくとも約６０％でありうる。例えば、ポリペプチドは、対象のポリペプチドの重量の少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％でありうる。純度は、任意の適切な標準的方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ解析を介して測定することができる。
【００３１】
[0037]  「作動可能に連結された」とは、対象のヌクレオチド配列（すなわち、IL-2ムテインをコードする配列）が、ヌクレオチド配列の発現（例えば、in vitroの転写／翻訳系における、または、ベクターを宿主細胞へと導入する場合は、宿主細胞における）を可能とする形で（１または複数の）制御配列に連結されていることを意味することが意図される。「制御配列」には、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれる。例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）、「Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（Academic Press、San Diego、Calif.）を参照されたい。制御配列には、多くの種類の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指示する配列、および特定の宿主細胞のみにおけるヌクレオチド配列の発現を指示する配列（例えば、組織特異的な制御配列）が含まれる。当業者には、発現ベクターのデザインが、形質転換される宿主細胞の選択、タンパク質の所望の発現レベルなどの因子に依存しうることが理解されるであろう。本発明の発現構築物を宿主細胞に導入し、これにより、本明細書で開示されるヒトＩＬ−２ムテインを生成させることもでき、その生物学的に活性な変異体を生成させることもできる。
【００３２】
[0038]  本明細書では、「宿主細胞」という用語と「組換え宿主細胞」という用語とが互換的に用いられる。このような用語は、特定の対象細胞を指すのみでなく、また、このような細胞の後代または潜在的な後代も指すことが理解される。後続の世代では、突然変異または環境的影響に起因して特定の修飾が生じうるため、このような後代は、実のところ、親細胞と同一でない場合もあるが、本明細書で用いられる用語の範囲内にやはり包含される。
【００３３】
[0039]  本明細書で用いられる「形質転換」という用語および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムによる共沈殿、ＤＥＡＥデキストランを介するトランスフェクション、リポフェクション、遺伝子銃、または電気穿孔を含めた、外来の核酸（例えば、DNA）を宿主細胞へと導入するための、当技術分野で認識される多様な技法を指すことが意図される。
【００３４】
[0040]  本明細書で用いられる「薬学的に許容可能な担体」という用語には、医薬投与に適合的な生理食塩液、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれるがこれらに限定されない。また、補助的な活性化合物（例えば、抗生剤）も組成物に組み込むことができる。
【００３５】
[0041]  本明細書で用いられる通り、本発明者らは、「がん」（または「がん性」）、「過剰増殖性」、および「新生物性」という用語を、自律的成長能（すなわち、急速な増殖を伴う細胞成長を特徴とする異常な状態（stateまたはcondition））を有する細胞を指すのに用いることができる。過剰増殖性疾患状態および新生物性疾患状態は、病的状態として（すなわち、疾患状態を特徴づけるかまたは構成する状態として）類別することもでき、非病的状態として（すなわち、正常状態からの逸脱ではあるが、疾患状態とは関連しない状態として）類別することもできる。この用語は、組織病理学的種類または侵襲性の段階に関わらず、がん成長または発がん過程、転移性組織、または悪性形質転換細胞、悪性形質転換組織、もしくは悪性形質転換器官の全ての種類を包含することを意味する。「病的過剰増殖性」細胞は、悪性腫瘍成長を特徴とする疾患状態において生じる。非病的過剰増殖性細胞の例は、創傷の修復と関連する細胞の増殖を包含する。「がん」または「新生物」という用語は、肺、乳房、甲状腺、リンパ節、およびリンパ組織、消化器官、および泌尿生殖路が罹患する悪性腫瘍を含めた、多様な器官系の悪性腫瘍を指すほか、一般に大半の結腸がん、腎細胞がん、前立腺がん、および／または精巣腫瘍、非小細胞肺がん、小腸がん、ならびに食道がんなどの悪性腫瘍を包含すると考えられる腺がんを指すのにも用いられる。
【００３６】
[0042]  「がん腫」という用語は、当技術分野で認知されており、呼吸器系がん、消化器系がん、泌尿生殖器系がん、精巣がん、乳がん、前立腺がん、内分泌系がん、および黒色腫を含めた、上皮組織または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。「腺がん」とは、腺組織に由来するか、または腫瘍細胞が、認識可能な腺構造を形成するがん腫を指す。
【００３７】
[0043]  本明細書で用いられる、「造血系の新生物性障害」という用語は、造血系由来の、例えば、骨髄系、リンパ系、もしくは赤血球系、またはこれらの前駆体細胞から生じる過形成性／新生物性細胞を伴う疾患を包含する。分化が低度な急性白血病（例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病）から生じる疾患であることが好ましい。さらなる例示的な骨髄障害には、急性前骨髄性白血病（APML）、急性骨髄性白血病（AML）、および慢性骨髄性白血病（CML）（Vaickus、L.（1991）Crit Rev. in Oncol.／Hemotol. 11 :267-97において総説されている）が含まれるがこれらに限定されず；リンパ性悪性腫瘍には、Ｂ細胞系列のＡＬＬおよびＴ細胞系列のＡＬＬを包含する急性リンパ芽球性白血病（ALL）、慢性リンパ性白血病（CLL）、前リンパ球性白血病（PLL）、有毛細胞白血病（HLL）、およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症（WM）が含まれるがこれらに限定されない。悪性リンパ腫のさらなるフォームには、非ホジキンリンパ腫およびそれらの変種、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人性Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）、皮膚性Ｔ細胞リンパ腫（CTCL）、大型顆粒リンパ球白血病（LGF）、ホジキン病、およびリード−シュテルンベルク病が含まれるがこれらに限定されない。
【００３８】
ＩＬ−２ムテイン
[0044]  多様な実施形態では、本開示は、実質的に精製されうるが必ずしも精製されていないＩＬ−２ポリペプチドであって、ＩＬ−２の生物学的活性のうちの１または複数（例えば、細胞増殖の刺激）を果たし、野生型ＩＬ−２のアゴニストとして機能しうる、ＩＬ−２ポリペプチドを提供する。ＩＬ−２は、抗原により活性化したＴ細胞の増殖およびＮＫ細胞の刺激を誘導する、Ｔ細胞成長因子として特徴づけられている。
【００３９】
[0045]  また、野生型ＩＬ−２のアンタゴニストとして機能しうる、すなわち、ＩＬ−２の生物学的活性を防止するＩＬ−２ポリペプチドも、記載されている。
【００４０】
[0046]  例示的な突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドは、配列番号２により表されるポリペプチドがＩＬ−２Ｒβに結合するアフィニティーより高いアフィニティーでＩＬ−２Ｒβに結合する、配列番号２と少なくとも約８０％同一なアミノ酸配列を包含する。例えば、突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドは、野生型ＩＬ−２と比べて少なくとも１つの突然変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失、付加、または置換）を有することが可能であり、野生型ＩＬ−２より高いアフィニティーでＩＬ−２Ｒβに結合する。
【００４１】
[0047]  例示的な突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドはまた、配列番号２と少なくとも約８０％同一であり、配列番号２により表されるポリペプチドがＩＬ−２Ｒγに結合するアフィニティーより低いアフィニティーでＩＬ−２受容体γ（IL-2Rγ）に結合するアミノ酸配列も包含しうる。例えば、突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドは、野生型ＩＬ−２と比べて少なくとも１つの突然変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失、付加、または置換）を有することが可能であり、野生型ＩＬ−２より低いアフィニティーでＩＬ−２Ｒγに結合する。
【００４２】
[0048]  例示的な突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドは、野生型ＩＬ−２と少なくとも約５０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８７％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一でありうる。突然変異は、アミノ酸残基の数または内容の変化からなりうる。例えば、突然変異体のＩＬ−２は、野生型ＩＬ−２より多数のアミノ酸残基を有する場合もあり、少数のアミノ酸残基を有する場合もある。代替的に、または加えて、例示的な突然変異体のポリペプチドは、野生型ＩＬ−２に存在する１または複数のアミノ酸残基の置換を含有しうる。多様な実施形態では、突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドが、単一のアミノ酸残基の添加、欠失、または置換、例えば、６９位における残基の置換により野生型ＩＬ−２と異なりうる。同様に、例示的な突然変異体のポリペプチドは、２つのアミノ酸残基、例えば、配列番号２の２４、６５、７４、８０、８１、８５、８６、８９、９２、および９３位における残基の置換により野生型と異なりうる。
【００４３】
[0049]  例示を目的として述べると、配列番号２の基準アミノ酸配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を包含するポリペプチドは、配列番号２の基準アミノ酸の最大５カ所にわたる変更の組入れを除き、基準配列と同一な配列を包含するポリペプチドである。例えば、基準配列におけるアミノ酸残基のうちの最大５％を欠失させるかまたは別のアミノ酸で置換することもでき、基準配列における全アミノ酸残基のうちの最大５％の数のアミノ酸を基準配列へと挿入することもできる。これらの基準配列の変更は、基準アミノ酸配列のアミノ（Ｎ）末端の位置またはカルボキシ（Ｃ）末端の位置に施すこともでき、これらの末端の位置の間のいずれかに、基準配列の残基間に個別に散在させて施すこともでき、基準配列内の１または複数の連続する群に施すこともできる。
【００４４】
[0050]  置換されるアミノ酸残基（１または複数の）は、以下の群:グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン内の置換を包含することが典型的な保存的置換でありうるが、必ずしも保存的置換ではない。これらの突然変異は、ＩＬ−２Ｒβおよび／またはＩＬ−２Ｒγに接触するアミノ酸残基における突然変異でありうる。
【００４５】
[0051]  より具体的に述べると、突然変異（（１または複数の）付加または（１または複数の）欠失に関して保存的であれ、非保存的であれ）は、１または複数の位置に施すことができる。例えば、突然変異は、Ｉ２４Ｖ、Ｐ６５Ｈ、Ｑ７４Ｒ、Ｑ７４Ｈ、Ｑ７４Ｎ、Ｑ７４Ｓ、Ｌ８０Ｆ、Ｌ８０Ｖ、Ｒ８１Ｉ、Ｒ８１Ｔ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ８９Ｖ、Ｉ９２Ｆ、Ｖ９３Ｉでありうる。例示的なＩＬ−２ムテイン領域の配列は、以下の通りである:５−１：配列番号５；５−２：配列番号６；６−６：配列番号７；Ａ２：配列番号８；Ｂ１：配列番号９；Ｂ１１：配列番号１０；Ｃ５：配列番号１１；Ｄ１０：配列番号１２；Ｅ１０：配列番号１３；Ｇ８：配列番号１４；Ｈ４：配列番号１５;およびＨ９：配列番号１６。
【００４６】
【化２−１】
2014502967.tif 000004
【００４７】
【化２−２】
2014502967.tif 000005
【００４８】
[0052]  アフィニティーに関して、本明細書では、ＩＬ−２Ｒβに、野生型ＩＬ−２ポリペプチドより少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％以上高いアフィニティーで結合する例示的な突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドが開示される。野生型ＩＬ−２ポリペプチドは、ＩＬ−２Ｒβに約２８０ｎＭのＫｄで結合する。開示される例示的な突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドの結合アフィニティーはまた、ＩＬ−２Ｒβに対して野生型ＩＬ−２より１．２、１．４、１．５、２、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、２５０倍またはそれ以上の倍率のアフィニティーとしても表すことができる。
【００４９】
[0053]  代替的に、または加えて、例示的な突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドは、Ｔ細胞増殖アッセイにおける効力を野生型ＩＬ−２と比べて増大させることが可能であった。突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドがＩＬ−２Ｒβに結合する能力は、本明細書で記載される細胞結合アッセイおよび細胞増殖アッセイを含めた多数のアッセイを介して評価することができる。
【００５０】
[0054]  例示的な突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドは、突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドに対する一過性の曝露後の長時間にわたり受容体／リガンド複合体からのシグナル伝達が存続するように、野生型ＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβ受容体サブユニットからの解離速度の低下を示す能力を有しうる。
【００５１】
[0055]  本開示ではまた、その相互作用が、野生型ＩＬ−２と比べて約２％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約５０％、約７５％、約９０％、約９５％またはそれ以上低減されるように、ＩＬ−２ＲβのＩＬ−２Ｒγとの会合を破壊する突然変異体のポリペプチドも提供される。
【００５２】
[0056]  また、ＩＬ−２Ｒβに対するアフィニティーの増大、およびＩＬ−２ＲβのＩＬ−２Ｒγとの相互作用の破壊の両方の特性を保有する例示的な突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドも開示される。
【００５３】
[0057]  以下でさらに記載される通り、本開示では、酵母表面ディスプレイを用いて、野生型ＩＬ−２と比べると、ＩＬ−２Ｒβに対する結合アフィニティーが増大し、かつ／またはＩＬ−２Ｒγに対する結合アフィニティーが減小した、突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドの例示的なクラスが提供される。
【００５４】
ＩＬ−２ムテインの野生型ＩＬ−２との構造的比較 
ＩＬ−２ムテイン、発現ベクター、および宿主細胞の組換え発現
[0058]  多様な実施形態では、本発明を実施するのに用いられるポリペプチドが、合成であるか、または組換え核酸分子の発現を介して生成する。キメラ（例えば、少なくとも突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドおよび異種ポリペプチドを含有する融合タンパク質）である場合、ポリペプチドは、突然変異体ＩＬ−２の全部または一部をコードする１つの配列、および異種ポリペプチドの全部または一部をコードする第２の配列を含有するハイブリッドの核酸分子によりコードされうる。例えば、突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドは、ヘキサヒスチジンタグと融合させて、細菌により発現されるタンパク質の精製を容易にすることもでき、ヘマグルチニンタグと融合させて、真核細胞により発現されるタンパク質の精製を容易にすることもできる。
【００５５】
[0059]  ＩＬ−２ムテインをコードするＤＮＡ配列を構築し、これらの配列を適切に形質転換された宿主により発現する方法には、ＰＣＲ支援突然変異誘発法の使用が含まれるがこれらに限定されない。また、ＩＬ−２ポリペプチドに対するアミノ酸残基の欠失または付加からなる突然変異も、標準的な組換え法により作製することができる。欠失または付加の場合、ＩＬ−２をコードする核酸分子を、任意選択により、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化させる。結果として得られるフラグメントは、直接発現させることもでき、例えば、それを第２のフラグメントへとライゲーションすることによりさらに操作することもできる。核酸分子の２つの末端が互いに重複する相補的なヌクレオシドを含有する場合に、ライゲーションは容易となりうるが、また、平滑末端のフラグメントもライゲーションすることができる。また、ＰＣＲにより生成させた核酸も、多様な突然変異体の配列を生成させるのに用いることができる。
【００５６】
[0060]  完全なアミノ酸配列を用いて、逆翻訳された遺伝子を構築することができる。ＩＬ−２ムテインをコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードする複数の低分子オリゴヌクレオチドを合成し、次いで、ライゲーションすることができる。個別のオリゴヌクレオチドは、相補的なアセンブリーのための５’突出または３’突出を含有することが典型的である
【００５７】
[0061]  組換え分子生物学法により変化させた核酸分子の発現を介して突然変異体のポリペプチドを生成させることに加えて、突然変異体のポリペプチドは、化学合成することもできる。化学合成されたポリペプチドは、当業者が日常的に生成させているものである。
【００５８】
[0062]  アセンブリングしたら（合成、部位指向的突然変異誘発、または別の方法を介して）、ＩＬ−２ムテインをコードするＤＮＡ配列を、所望の形質転換宿主におけるＩＬ−２ムテインの発現に適する発現ベクターおよび作動的に連結された発現制御配列へと挿入する。適正なアセンブリーは、ヌクレオチドの配列決定、制限マッピング、および適切な宿主における生物学的に活性なポリペプチドの発現により確認することができる。当技術分野でよく知られている通り、宿主においてトランスフェクトされた遺伝子の高発現レベルを得るためには、この遺伝子を、選択された発現宿主において機能的な、転写および翻訳の発現制御配列に作動的に連結しなければならない。
【００５９】
[0063]  ＩＬ−２ムテインをコードするＤＮＡ配列はまた、部位指向的突然変異誘発、化学合成、または他の方法のいずれにより調製したのであれ、シグナル配列をコードするＤＮＡ配列も包含しうる。存在する場合、このようなシグナル配列は、ＩＬ−２ムテインを発現させるために選択される細胞により認識される配列である。それは、原核細胞のシグナル配列である場合もあり、真核細胞のシグナル配列である場合もあり、２つの組合せの場合もある。それはまた、天然ＩＬ−２のシグナル配列でもありうる。シグナル配列の組入れは、それがなされる組換え細胞からＩＬ−２ムテインを分泌させることが望まれるかどうかに依存する。選択される細胞が原核細胞である場合、ＤＮＡ配列がシグナル配列をコードしないことが一般に好ましい。選択される細胞が真核細胞である場合は、シグナル配列をコードすることが一般に好ましく、野生型ＩＬ−２のシグナル配列を用いることが最も好ましい。
【００６０】
ＩＬ−２ムテイン融合タンパク質
[0064]  上記で言及した通り、例示的な突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドは、突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドおよび異種ポリペプチド（すなわち、IL-2またはその突然変異体でないポリペプチド）（例えば、米国特許第６，４５１，３０８号を参照されたい）を包含する融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドとして調製することができる。例示的な異種ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、キメラポリペプチドの循環半減期を延長することが可能であり、したがって、突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドの特性をさらに増強することが可能である。多様な実施形態では、循環半減期を延長するポリペプチドが、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミンの場合もあり、ＩｇＧの重鎖可変領域を欠く抗体のＩｇＧサブクラスのＦｃ領域の場合もある。例示的なＦｃ領域は、補体の結合およびＦｃ受容体の結合を阻害する突然変異を包含する場合もあり、溶解性の場合もある、すなわち、補体に結合する場合もあり、抗体依存性補体溶解（ADCC；１９９４年１２月１２日に出願されたＵＳＳＮ０８／３５５，５０２）などの別の機構を介して細胞を溶解させる場合もある。
【００６１】
[0065]  「Ｆｃ領域」とは、パパインによるＩｇＧの消化を介して生成する、ＩｇＧのＣ末端ドメインと相同な天然または合成のポリペプチドでありうる。ＩｇＧ  Ｆｃの分子量は、約５０ｋＤａである。突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドは、Ｆｃ領域の全体、またはそれがその一部であるキメラポリペプチドの循環半減期を延長する能力を保持する小部分を包含しうる。加えて、全長のＦｃ領域またはフラグメント化されたＦｃ領域は、野生型分子の変異体でもありうる。すなわち、それらは、ポリペプチドの機能に影響を及ぼす場合もあり、及ぼさない場合もある、突然変異を含有することが可能であり、以下でさらに記載される通り、天然の活性が全ての場合に必要または所望なわけではない。
【００６２】
[0066]  Ｆｃ領域は、「溶解性」の場合もあり、「非溶解性」の場合もあるが、非溶解性であることが典型的である。非溶解性のＦｃ領域は、高アフィニティーのＦｃ受容体結合部位およびＣ’１ｑ結合部位を欠くことが典型的である。マウスＩｇＧ  Ｆｃの、高アフィニティーのＦｃ受容体結合部位は、ＩｇＧ  Ｆｃの２３５位にＬｅｕ残基を包含する。したがって、Ｆｃ受容体結合部位は、Ｌｅｕ２３５を突然変異させるかまたは欠失させることにより破壊することができる。例えば、Ｌｅｕ２３５のＧｌｕによる置換は、Ｆｃ領域が高アフィニティーのＦｃ受容体に結合する能力を阻害する。マウスＣ‘１ｑ結合部位は、ＩｇＧのＧｌｕ３１８残基、Ｌｙｓ３２０残基、およびＬｙｓ３２２残基を突然変異させるかまたは欠失させることにより機能的に破壊することができる。例えば、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、およびＬｙｓ３２２をＡｌａ残基で置換すると、ＩｇＧ１のＦｃは、抗体依存性細胞補体溶解を指示することが可能でなくなる。これに対して、溶解性のＩｇＧ  Ｆｃ領域は、高アフィニティーのＦｃ受容体結合部位およびＣ’１ｑ結合部位を有する。高アフィニティーのＦｃ受容体結合部位は、ＩｇＧ  Ｆｃの２３５位においてＬｅｕ残基を包含し、Ｃ’１ｑ結合部位は、ＩｇＧ１のＧｌｕ３１８残基、Ｌｙｓ３２０残基、およびＬｙｓ３２２残基を包含する。溶解性ＩｇＧ  Ｆｃは、これらの部位において野生型残基または保存的アミノ酸置換を有する。溶解性ＩｇＧ  Ｆｃは、細胞を抗体依存性細胞毒性または補体誘導性細胞溶解（CDC）の標的としうる。また、ヒトＩｇＧに適する突然変異も知られる（例えば、Morrisonら、The Immunologist 2:119-124、1994;およびBrekkeら、The Immunologist 2: 125、1994を参照されたい）。
【００６３】
[0067]  他の実施形態では、キメラポリペプチドは、突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドおよびＦＬＡＧ配列などの抗原性タグとして機能するポリペプチドを包含しうる。ＦＬＡＧ配列は、本明細書で説明される、ビオチニル化されて高度に特異的な抗ＦＬＡＧ抗体により認識される（また、Blanarら、Science 256:1014、1992; LeClairら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8145、1992も参照されたい）。一部の実施形態では、キメラポリペプチドが、Ｃ末端のｃ−ｍｙｃエピトープタグをさらに含む。
【００６４】
[0068]  他の実施形態では、キメラポリペプチドが、突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドおよびＡｇａ２ｐアグルチニンのサブユニット（例えば、BoderおよびWittrup、Nature Biotechnol. 15:553-7、1997を参照されたい）など、突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドの発現を増強するかまたは細胞内局在化を指示するように機能する異種ポリペプチドを包含する。
【００６５】
[0069]  他の実施形態では、突然変異体のＩＬ−２および抗体またはその抗原結合部分を含めたキメラポリペプチドを生成させることができる。キメラタンパク質の抗体成分または抗原結合成分は、ターゲティング部分として用いられうる。例えば、それを用いて、キメラタンパク質を細胞または標的分子の特定のサブセットへと局在化させることができる。サイトカイン−抗体キメラポリペプチドを生成させる方法は、例えば、米国特許第６，６１７，１３５号に記載されている。
【００６６】
突然変異体のＩＬ−２をコードする核酸分子
[0070]  一部の実施形態では、上記の突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドなど、単独の、またはキメラポリペプチドの一部としての突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドは、核酸分子を発現させることにより得ることができる。突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドが、それらの野生型ＩＬ−２ポリペプチドとの同一性との関係で記載しうるのと全く同様に、それらをコードする核酸分子も、野生型ＩＬ−２をコードする核酸分子との一定の同一性を必然的に有する。例えば、突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドをコードする核酸分子は、野生型ＩＬ−２をコードする核酸（例えば、配列番号２）と少なくとも５０％、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、および最も好ましくは少なくとも９５％（例えば、９９％）同一でありうる。成熟ＩＬ−２およびそのシグナル配列をコードする核酸配列は、配列番号１７に見出される。
【００６７】
[0071]  提供される核酸分子は、天然配列を含有する場合もあり、遺伝子コードの縮重性に起因して天然の配列と異なるが同じポリペプチドをコードする配列を含有する場合もある。これらの核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡ（例えば、ゲノムDNA、cDNA、またはホスホルアミダイトベースの合成を介して生成させる合成DNAなどの合成DNA）からなる場合もあり、これらの核酸の種類のうちのヌクレオシドの組合せまたは修飾からなる場合もある。加えて、核酸分子は、二本鎖の場合もあり、一本鎖（すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖）の場合もある。
【００６８】
[0072]  核酸分子は、ポリペプチドをコードする配列に限定されず、これにはまた、コード配列（例えば、IL-2のコード配列）の上流または下流に位置する非コード配列の一部または全部も包含されうる。分子生物学法の当業者は、核酸分子を単離する日常的な手順に精通している。核酸分子は、例えば、ゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで処理することにより生成させることもでき、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施することにより生成させることもできる。核酸分子がリボ核酸（RNA）である場合、分子は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける転写を介して生成させることができる。
【００６９】
[0073]  本開示の例示的な単離核酸分子は、天然状態ではそれ自体として見出されないフラグメントを包含しうる。したがって、本開示は、核酸配列（例えば、突然変異体のIL-2をコードする配列）をベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター）へと組み込む場合もあり、異種細胞のゲノム（または天然の染色体位置以外の位置における同種細胞のゲノム）へと組み込む場合もある組換え分子など、組換え分子を包含する。
【００７０】
[0074]  上記の通り、本発明の突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドは、キメラポリペプチドの一部として存在しうる。上記の異種ポリペプチドに加えて、またはこの代わりに、本発明の核酸分子は、「マーカー」または「レポーター」をコードする配列も含有しうる。マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子の例には、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、アデノシンデアミナーゼ（ADA）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（neor、G418r）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（HPH）、チミジンキナーゼ（TK）、lacz（β−ガラクトシダーゼをコードする）、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（XGPRT）が含まれる。本発明の実施と関連する標準的な手順の多くと同様に、当業者は、さらなる有用な試薬、例えば、マーカーまたはレポーターの機能をもたらしうるさらなる配列について承知しているであろう。
【００７１】
[0075]  本発明の核酸分子は、突然変異を、哺乳動物の細胞など、任意の生物学的細胞から得られる、ＩＬ−２をコードするＤＮＡへと導入することにより得ることができる。したがって、本発明の核酸（およびそれらがコードするポリペプチド）は、マウス、ラット、モルモット、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、サル、ヒヒ、イヌ、またはネコの核酸でありうる。一実施形態では、核酸分子がヒトの核酸分子である。
【００７２】
突然変異体のＩＬ−２遺伝子産物の発現
[0076]  上記の核酸分子は、例えば、それを形質導入した細胞における核酸分子の発現を指示することが可能なベクター内に含有させることができる。したがって、発現ベクターは、突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドに加えて、突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドをコードする核酸分子も含有し、これらのベクターでトランスフェクトした細胞も、好ましい実施形態のうちにある。
【００７３】
[0077]  当然ながら、全てのベクターおよび発現制御配列が同等に良好に機能して、本明細書で説明されるＤＮＡ配列を発現するわけではないことを理解されたい。また、全ての宿主が、同じ発現系と共に同等に良好に機能するわけでもない。しかし、当業者は、過度の実験なしに、これらのベクター、発現制御配列、および宿主の中で選択を行うことができる。例えば、ベクターの選択では、その中でベクターを複製しなければならないため、宿主についても考慮しなければならない。また、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、および抗生剤マーカーなど、ベクターによりコードされる他の任意のタンパク質の発現についても考慮すべきである。例えば、用いうるベクターには、ＩＬ−２ムテインをコードするＤＮＡのコピー数を増幅させるベクターが含まれる。当技術分野では、このような増幅可能なベクターがよく知られている。それらには、例えば、ＤＨＦＲ増幅（例えば、Kaufman、米国特許第４，４７０，４６１号; KaufmanおよびSharp、「Construction of a Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis of Signals Utilized for Efficient Expression」、Mol. Cell. Biol.、2、1304-19頁（1982）を参照されたい）、またはグルタミンシンテターゼ（「GS」）増幅（例えば、米国特許第５，１２２，４６４号および欧州出願公開第３３８，８４１号を参照されたい）を介して増幅することが可能なベクターが含まれる。
【００７４】
[0078]  一部の実施形態では、本開示のヒトＩＬ−２ムテインが、ベクター、好ましくは発現ベクターから発現する。ベクターは、宿主細胞における自律的複製に有用であるか、または宿主細胞へと導入されると宿主細胞のゲノムへと組み込むことができ、これにより、宿主のゲノムと共に複製される（例えば、非エピソーム性の哺乳動物ベクター）。発現ベクターは、それらが作動可能に連結されたコード配列の発現を指示することが可能である。一般に、組換えＤＮＡ法において有用な発現ベクターは、プラスミド（ベクター）のフォームであることが多い。しかし、また、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）など、発現ベクターの他のフォームも包含される。
【００７５】
[0079]  例示的な組換え発現ベクターは、発現に用いられる宿主細胞に基づき選択される１または複数の制御配列であって、発現する核酸配列に作動可能に連結された制御配列を包含しうる。
【００７６】
[0080]  発現構築物またはベクターは、原核宿主細胞または真核宿主細胞におけるＩＬ−２ムテインまたはその変異体の発現用にデザインすることができる。
【００７７】
[0081]ベクターのＤＮＡは、従来の形質転換法を介して原核細胞へと導入することもでき、トランスフェクション法を介して真核細胞へと導入することもできる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Plainview、N.Y.）、および他の標準的な分子生物学法についての実験室用マニュアルにおいて見出すことができる。
【００７８】
[0082]  原核生物におけるタンパク質の発現は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーターを含有するベクターにより実行することが極めて多い。Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質の発現を最大化する戦略は、例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ（１９９０）「Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（Academic Press、San Diego、Calif.）、１１９−１２８頁；およびＷａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８に見出すことができる。細胞に由来するＩＬ−２ムテインまたはその変異体を増殖させるか、採取するか、破壊するか、または抽出する過程は、例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６０４，３７７号；同第４，７３８，９２７号；同第４，６５６，１３２号；同第４，５６９，７９０号；同第４，７４８，２３４号；同第４，５３０，７８７号；同第４，５７２，７９８号；同第４，７４８，２３４号；および同第４，９３１，５４３号に実質的に記載されている。
【００７９】
[0083]  一部の実施形態では、組換えＩＬ−２ムテインまたは生物学的に活性なその変異体はまた、酵母細胞またはヒト細胞などの真核生物においても作製することができる。適切な真核宿主細胞には、昆虫細胞（培養昆虫細胞（例えば、Sf9細胞）においてタンパク質を発現するのに利用可能なバキュロウイルスベクターの例には、pAcシリーズ（Smithら（1983）Mol. Cell Biol. 3:2156-2165）およびpVLシリーズ（LucklowおよびSummers（1989）Virology 170:31-39）が含まれる）；酵母細胞（酵母であるS. cerenvisiaeにおける発現用のベクターの例には、pYepSecl（Baldariら（1987）EMBO J. 6:229-234）、pMFa（KurjanおよびHerskowitz（1982）Cell 30:933-943）、pJRY88（Schultzら（1987）Gene 54: 113-123）、pYES2（Invitrogen Corporation、San Diego、Calif.）、およびpPicZ（Invitrogen Corporation、San Diego、Calif.）が含まれる）；または哺乳動物細胞（哺乳動物用の発現ベクターには、pCDM8（Seed（1987）Nature 329:840）およびpMT2PC（Kaufmanら（1987）EMBO J. 6: 187: 195）が含まれる）が含まれる。適切な哺乳動物細胞には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）またはＣＯＳ細胞が含まれる。哺乳動物細胞では、発現ベクターの制御機能が、ウイルス制御エレメントによりもたらされることが多い。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびサルウイルス４０に由来する。原核細胞および真核細胞のいずれにも適する他の発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、１６および１７章（2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Plainview、N.Y.）を参照されたい。Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）、「Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（Academic Press、San Diego、Calif）も参照されたい。
【００８０】
[0084]  本開示のヒトＩＬ−２ムテインをコードする配列は、対象の宿主細胞における発現について最適化することができる。配列のＧ−Ｃ含量は、宿主細胞において発現させた既知の遺伝子を参照することにより計算した、所与の細胞の宿主について平均したレベルに調整することができる。当技術分野では、コドンを最適化する方法が十分に知られている。コード配列内のコドンのうちの約１％、約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、または最大１００％が、特定の宿主細胞における発現について最適化されるように、ＩＬ−２ムテインのコード配列内のコドンを最適化して、宿主細胞における発現を増強することができる。
【００８１】
[0085]  使用に適するベクターには、細菌において用いられるＴ７ベースのベクター（例えば、Rosenbergら、Gene 56: 125、1987を参照されたい）、哺乳動物細胞において用いられるｐＭＳＸＮＤ発現ベクター（LeeおよびNathans、J. Biol. Chem. 263:3521、1988）、および昆虫細胞において用いられるバキュロウイルス由来のベクター（例えば、Clontech、Palo Alto、Calif.製の発現ベクターであるpBacPAK9）が含まれる。
【００８２】
[0086]  一部の実施形態では、このようなベクターにおいて対象のポリペプチドをコードする核酸挿入配列を、例えば、発現が求められる細胞型に基づき選択されるプロモーターに作動可能に連結することができる。
【００８３】
[0087]  発現制御配列の選択ではまた、多様な因子についても考慮するべきである。これらには、例えば、配列の相対強度、その制御可能性、および本発明のＩＬ−２ムテインをコードする実際のＤＮＡ配列との、とりわけ、潜在的な二次構造に関するその適合性が含まれる。宿主は、選択されたベクターとのそれらの適合性、本発明のＤＮＡ配列によりコードされる産物の毒性、それらの分泌特徴、それらがポリペプチドを適正にフォールドする能力、それらのフラグメント化または培養の要件、およびＤＮＡ配列によりコードされる産物の精製の容易さを考慮することにより選択すべきである。
【００８４】
[0088]  これらのパラメータのうちで、当業者は、フラグメント化により、または大スケールの動物培養物において、例えば、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ  ７細胞を用いて所望のＤＮＡ配列を発現する、多様なベクター／発現制御配列／宿主の組合せを選択することができる。
【００８５】
[0089]  一部の実施形態では、発現制御配列および発現ベクターの選択が、宿主の選択に依存する。多種多様な発現宿主／ベクターの組合せを使用することができる。真核宿主に有用な発現ベクターには、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、およびサイトメガロウイルスに由来する発現制御配列を伴うベクターが含まれる。細菌宿主に有用な発現ベクターには、ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲＩ、ｐＥＲ３２ｚ、ｐＭＢ９、およびそれらの派生体を含めたＥ．ｃｏｌｉに由来するプラスミドなど、既知の細菌プラスミド、ＲＰ４など、宿主範囲の広いプラスミド、ファージＤＮＡ、例えば、ファージラムダの多数の派生体、例えば、ＮＭ９８９、ならびにＭ１３および繊維状一本鎖ＤＮＡファージなど、他のＤＮＡファージが含まれる。酵母細胞に有用な発現ベクターには、２μプラスミドおよびその派生体が含まれる。昆虫細胞に有用なベクターには、ｐＶＬ  ９４１およびｐＦａｓｔＢａｃ（商標）１（GibcoBRL、Gaithersburg、Md.）が含まれる（Cateら、「Isolation Of The Bovine And Human Genes For Mullerian Inhibiting Substance And Expression Of The Human Gene In Animal Cells」、Cell、45、685-98頁（1986））。
【００８６】
[0090]  加えて、これらのベクターでは、多種多様な発現制御配列のうちのいずれかも用いることができる。このような有用な発現制御配列は、前出の発現ベクターの構造遺伝子と関連する発現制御配列を包含する。有用な発現制御配列の例には、例えば、ＳＶ４０ウイルスまたはアデノウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターであるｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、またはＴＲＣ系、ラムダファージの主要なオペレーター領域およびプロモーター領域、例えば、ＰＬ、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素のプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター、例えば、ＰｈｏＡ、酵母接合系のプロモーター、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーター、ならびに原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られる他の配列、ならびにこれらの多様な組合せが含まれる。
【００８７】
[0091]  Ｔ７プロモーターは、細菌において用いることができ、ポリヘドリンプロモーターは、昆虫細胞において用いることができ、サイトメガロウイルスプロモーターまたはメタロチオネインプロモーターは、哺乳動物細胞において用いることができる。高等真核生物の場合はまた、組織特異的プロモーターおよび細胞型特異的プロモーターも広く入手可能である。これらのプロモーターは、それらが体内の所与の組織または細胞型における核酸分子の発現を指示する能力のためにそのように名づけられている。当業者は、核酸の発現を指示するのに用いうる多数のプロモーターおよび他の制御エレメントについて十分に承知している。
【００８８】
[0092]  挿入された核酸分子の転写を容易にする配列に加えて、ベクターは、複製起点および選択マーカーをコードする他の遺伝子も含有しうる。例えば、ネオマイシン耐性（neor）遺伝子は、それが発現する細胞にＧ４１８耐性を付与し、したがって、トランスフェクトされた細胞の表現型の選択を可能とする。当業者は、所与の制御エレメントまたは選択マーカーが特定の実験の文脈において用いるのに適切であるかどうかを容易に決定することができる。
【００８９】
[0093]  本発明において用いうるウイルスベクターには、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴のベクター、ヘルペスウイルスベクター、サルウイルス４０（SV40）ベクター、およびウシパピローマウイルスベクターが含まれる（例えば、Gluzman（編）、「Eukaryotic Viral Vectors」、CSH Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.を参照されたい）。
【００９０】
[0094]  突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドをコードする核酸分子を含有および発現する原核細胞または真核細胞もまた、本発明の特色である。本発明の細胞は、トランスフェクトした細胞、すなわち、核酸分子、例えば、突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドをコードする核酸分子を組換えＤＮＡ法を介して導入した細胞である。また、このような細胞の後代も、本発明の範囲内にあると考えられる。
【００９１】
[0095]  発現系の正確な構成要素は、それほど重要ではない。例えば、突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドは、細菌であるＥ．ｃｏｌｉなどの原核宿主において生成させることもでき、昆虫細胞（例えば、Sf21細胞）または哺乳動物細胞（例えば、COS細胞、NIH 3T3細胞、またはHeLa細胞）などの真核宿主において生成させることもできる。これらの細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Manassas、Va.）を含めた多くの供給源から入手可能である。発現系の選択では、構成要素が互いに適合的であることのみが重要である。当業者は、このような決定を下すことが可能である。さらに、発現系を選択するのに指針を必要とする場合、当業者は、Ａｕｓｕｂｅｌら（「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley and Sons、New York、N.Y.、1993）およびＰｏｕｗｅｌｓら（「Cloning Vectors: A Laboratory Manual」、1985、増補版1987）を参考にすることができる。
【００９２】
[0096]  発現させたポリペプチドは、日常的な生化学的手順を用いて発現系から精製し、例えば、本明細書で記載される療法剤として用いることができる。
【００９３】
[0097]  一部の実施形態では、得られるＩＬ−２ムテインを、ムテインを生成させるのに用いられる宿主生物に応じてグリコシル化または非グリコシル化させる。宿主として細菌を選択する場合は、生成させるＩＬ−２ムテインを非グリコシル化させる。他方、真核細胞は、おそらく天然のＩＬ−２がグリコシル化するのとは別の形ではあるが、ＩＬ−２ムテインをグリコシル化させる。形質転換された宿主を介して生成するＩＬ−２ムテインは、任意の適切な方法により精製することができる。ＩＬ−２を精製するための多様な方法が知られている。例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、２巻、Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｂｅｎ  Ｍ．Ｄｕｎｎ、Ｈｉｄｄｅ  Ｌ．Ｐｌｏｅｈｇ、Ｄａｖｉｄ  Ｗ．Ｓｐｅｉｃｈｅｒ、Ｐａｕｌ  Ｔ．Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ編、ユニット６．５（著作権：1997、John Wiley and Sons、Inc.）を参照されたい。ＩＬ−２ムテインは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生成させる封入体から単離することもでき、カチオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、および／または逆相液体クロマトグラフィーを用いて所与のムテインを生成させる哺乳動物培養物または酵母培養物に由来する条件付け培地から単離することもできる。
【００９４】
[0098]  ＩＬ−２ムテインをコードするＤＮＡ配列を構築する別の例示的な方法は、化学合成を介する。これには、記載される特性を示すＩＬ−２ムテインをコードするタンパク質配列の、化学的手段による直接的なペプチド合成が含まれる。この方法は、ＩＬ−２のＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、および／またはＩＬ−２Ｒγとの相互作用に影響を及ぼす位置において、天然のアミノ酸および非天然のアミノ酸の両方を組み込みうる。代替的に、所望のＩＬ−２ムテインをコードする遺伝子は、オリゴヌクレオチド合成機を用いる化学的手段を介して合成することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、所望のＩＬ−２ムテインのアミノ酸配列に基づきデザインし、組換えムテインを生成させる宿主細胞において好適なコドンを優先的に選択する。この点で、遺伝子コードは縮重であること（アミノ酸は複数のコドンによりコードされうること）が十分に認識されている。例えば、Ｐｈｅ（Ｆ）は、２つのコドンであるＴＩＣまたはＴＴＴによりコードされ、Ｔｙｒ（Ｙ）は、ＴＡＣまたはＴＡＴによりコードされ、ｈｉｓ（Ｈ）は、ＣＡＣまたはＣＡＴによりコードされる。Ｔｒｐ（Ｗ）は、単一のコドンであるＴＧＧによりコードされる。したがって、特定のＩＬ−２ムテインをコードする所与のＤＮＡ配列について、そのＩＬ−２ムテインをコードする多くの縮重のＤＮＡ配列が存在することが理解される。例えば、図２に示されるムテイン５−２に好ましいＤＮＡ配列に加えて、示されるＩＬ−２ムテインをコードする多くの縮重のＤＮＡ配列が存在することが理解される。これらの縮重のＤＮＡ配列も、本開示の範囲内にあると考えられる。したがって、本発明の文脈における「その縮重の変異体」とは、特定のムテインをコードし、これにより、その発現を可能とする全てのＤＮＡ配列を意味する。
【００９５】
[0099]  ＩＬ−２ムテインの生物学的活性は、当技術分野で知られる任意の適切な方法を介してアッセイすることができる。このようなアッセイには、ＰＨＡ−ｂｌａｓｔ増殖およびＮＫ細胞増殖が含まれる。
【００９６】
治療法
[00100]  一部の実施形態では、突然変異体ＩＬ−２のポリペプチドおよび／またはそれらを発現する核酸を対象に投与して、アポトーシス過程または分化過程の異常と関連する障害を治療する（例えば、能動的免疫または受動的免疫を生成させることにより、例えば、がんなどの細胞増殖障害または細胞分化障害を治療する）ことができる。このような疾患の治療において、開示されるＩＬ−２ムテインは、血管漏出症候群の軽減などの有利な特性を保有する。
【００９７】
[00101]  細胞増殖障害および／または細胞分化障害の例には、がん（例えば、がん腫、肉腫、転移性障害、または造血系の新生物性障害、例えば、白血病）が含まれる。転移性腫瘍は、前立腺、結腸、肺、乳房、および肝臓の腫瘍が含まれるがこれらに限定されない、多数の原発性腫瘍型から生じうる。本発明の組成物（例えば、突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドおよび／またはそれらをコードする核酸分子）はまた、ウイルス感染（例えば、AIDSインフルエンザ）を有する患者にも投与することができる。
【００９８】
[00102]  突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドを用いて、腎がんもしくは黒色腫、または任意のウイルス疾患を含めた任意の種類のがんを有するか、これを有することが疑われるか、またはこれを発症する危険性が高い可能性がある患者を治療することができる。例示的ながん腫には、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸、および卵巣の組織から形成されるがん腫が含まれる。この用語また、がん腫性組織および肉腫性組織からなる悪性腫瘍を包含するがん肉腫も包含する。
【００９９】
[00103]  増殖性障害のさらなる例には、造血系の新生物性障害が含まれる。
【０１００】
[00104]他の増殖性障害および／または分化障害の例には、皮膚障害が含まれる。皮膚障害は、真皮層、表皮層、または皮下層における細胞もしくは細胞群または層群の活性異常を伴う場合もあり、真皮−表皮間接合部における異常を伴う場合もある。例えば、皮膚障害は、ケラチン生成細胞（例えば、基底層および基底層直上の過剰増殖性ケラチン生成細胞）、メラニン生成細胞、ランゲルハンス細胞、メルケル細胞、免疫細胞、および表皮層、例えば、基底層（stratum basale（stratum germinativum））、有棘層、顆粒層、透明層、または角質層のうちの１または複数において見出される他の細胞の活性異常を伴いうる。他の実施形態では、障害が真皮細胞、例えば、真皮層、例えば、乳頭層または網状層において見出される、真皮内皮細胞、真皮線維芽細胞、真皮免疫細胞（例えば、マスト細胞またはマクロファージ）の活性異常を伴いうる。
【０１０１】
[00105]  皮膚障害の例には、乾癬、乾癬性関節炎、皮膚炎（湿疹）、例えば、剥脱性皮膚炎、またはアトピー性皮膚炎、毛孔性紅色粃糠疹、バラ色粃糠疹、類乾癬、苔癬状粃糠疹、扁平苔癬、光沢苔癬、魚鱗癬様紅皮症、角皮症、皮膚疾患、円形脱毛症、壊疽性膿皮症、尋常性白斑、類天疱瘡（例えば、眼部瘢痕性類天疱瘡または水疱性類天疱瘡）、蕁麻疹、汗孔角化症、関節包を満たす上皮関連細胞の過剰増殖および炎症を伴う関節リウマチ；脂漏性皮膚炎および日光皮膚炎などの皮膚炎；脂漏性角化症、老人性角化症、光線角化症、光誘起角化症、および毛包性角化症などの角化症；尋常性ざ瘡；ケロイドおよびケロイド形成に対する予防；母斑；疣贅、コンジローマまたは尖圭コンジローマ、および性病疣などのヒトパピローマウイルス（HPV）感染を含めた疣；白板症；扁平苔癬；および角膜炎が含まれる。皮膚障害は、皮膚炎、例えば、アトピー性皮膚炎またはアレルギー性皮膚炎の場合もあり、乾癬の場合もある。
【０１０２】
[00106]  治療に適する患者はまた、乾癬を有する場合もある。「乾癬」という用語は、その医学的意味、すなわち、主に皮膚が罹患し、隆起性、肥厚性、落屑性、非瘢痕性の病変をもたらす疾患という意味を有することが意図される。病変は通常、重なり合い光沢のある落屑で覆われる、輪郭の鮮明な紅斑性丘疹である。落屑は、銀色がかっているか、わずかに乳白色であることが典型的である。爪の病変が高頻度で生じ、結果として陥凹、爪甲剥離、肥厚、および変色をもたらす。乾癬は、関節炎と関連する場合があり、麻痺性でありうる。ケラチン生成細胞の過剰増殖は、表皮炎症およびケラチン生成細胞の分化の減殺と共に乾癬性表皮過形成の重要な特色である。ケラチン生成細胞の過剰増殖を説明するのに、乾癬を特徴づける複数の機構が提起されている。乾癬の発症機序にはまた、細胞性免疫の障害も関与している。乾癬性障害の例には、慢性定常性乾癬、尋常性乾癬、発疹性（滴状）乾癬、乾癬性紅皮症、汎発性膿疱性乾癬（ツンブッシュ全身性膿疱性乾癬）、環状膿疱性乾癬、および限局性膿疱性乾癬が含まれる。
【０１０３】
[00107]  代替的に、または患者へと直接的に投与する方法に加えて、一部の実施形態では、突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドを、ｅｘ  ｖｉｖｏ法において用いることもできる。例えば、細胞（例えば、末梢血リンパ球、または患者から単離され、培養物中に静置されるかもしくは維持される精製されたリンパ球の集団）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養培地中で培養することができ、接触させる工程は、ＩＬ−２突然変異体を培養培地へと添加することから影響を受ける場合がある。培養工程は、細胞を他の薬剤で刺激または処理して、例えば、増殖を刺激するか、または対象の抗原（例えば、がん抗原またはウイルス抗原）に対して反応性である細胞集団を増殖させるさらなる工程を包含しうる。次いで、細胞を、それらを処理した後で患者へと投与する。
【０１０４】
医薬組成物および投与法 
[00108]  一部の実施形態では、突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドおよび核酸を、医薬組成物を含めた組成物へと組み込むことができる。このような組成物は、ポリペプチドまたは核酸分子および薬学的に許容可能な担体を包含することが典型的である。
【０１０５】
[00109]  医薬組成物は、その意図される投与経路に適合的となるように調合する。本発明の突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドは、経口でも施しうるが、非経口経路を介して投与する可能性の方が大きい。非経口投与経路の例には、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経皮（局所）投与、経粘膜投与、および直腸内投与が含まれる。非経口適用に用いられる溶液または懸濁液は、以下の成分を包含しうる：注射用水、生理食塩液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒など、滅菌の希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸などのキレート化剤；酢酸、クエン酸、またはリン酸などの緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなど、等張性を調整するための薬剤。ｐＨは、一塩基性リン酸ナトリウムおよび／もしくは二塩基性リン酸ナトリウム、塩酸、または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整する（例えば、約７．２〜７．８、例えば、７．５のpHまで）。非経口調製物は、アンプル、ディスポーザブルの注射器、またはガラスもしくはプラスチックで作製された複数回投与用のバイアルに封入することができる。
【０１０６】
[00110]  注射用に適する医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または滅菌分散液および滅菌注射用溶液もしくは滅菌注射用分散液を即席で調製するための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与では、適切な担体が、生理食塩液、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（BASF、Parsippany、N.J.）、またはリン酸緩衝生理食塩液（PBS）を包含する。全ての場合において、組成物は、滅菌であり、容易な注射針通過可能性が存在する程度まで流体であるものとする。担体は、製造条件下および保管条件下において安定であるものとし、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から防護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体のポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含有する、溶媒の場合もあり、分散媒の場合もある。例えば、レシチンなどのコーティングを用いることにより、分散液の場合には必要とする粒子サイズを維持することにより、および界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムを用いることにより、適正な流体性を維持することができる。微生物作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど、多様な抗菌剤および抗真菌剤により達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを包含することが好ましいであろう。注射用組成物の遅延吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組み入れることによりもたらすことができる。
【０１０７】
[00111]  滅菌注射用溶液は、適切な溶媒中に、必要とする量の活性化合物を、必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの１つまたは組合せと共に組み込んだ後、濾過による滅菌処理を施すことにより調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒と、上記で列挙した成分に由来する、必要とする他の成分とを含有する滅菌媒体へと組み込むことにより調製する。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、任意のさらなる所望の成分を有効成分に加えた粉末を、既に滅菌濾過したその溶液から生成させる、真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１０８】
[00112]  用いられる場合、経口組成物は一般に、不活性の希釈剤または可食性の担体を包含する。経口療法剤投与の目的では、活性化合物を賦形剤と共に組み込むことができ、錠剤、トローチ、またはカプセル、例えば、ゼラチンカプセルのフォームで用いる。経口組成物はまた、口内洗浄液として用いられる流体の担体を用いて調製することもできる。薬学的適合性の結合剤および／または補助剤物質を、組成物の一部として組み入れることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、性質が類似する以下の成分または化合物のうちのいずれかを含有しうる：結晶セルロース、トラガントガム、もしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ（商標）、もしくはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓ（商標）などの潤滑剤；コロイド状の二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香味剤などの芳香剤。
【０１０９】
[00113]  吸入投与の場合、突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドまたはそれらをコードする核酸は、適切な高圧ガス、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器もしくは分注器または噴霧器からのエアゾールスプレーのフォームで送達する。このような方法には、米国特許第６，４６８，７９８号において記載される方法が含まれる。
【０１１０】
[00114]  突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドまたは核酸の全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段も介しうる。経粘膜投与または経皮投与では、透過される障壁に適切な浸透剤を処方物中で用いる。当技術分野では、このような浸透剤が一般に知られており、これらには、例えば、経粘膜投与では、洗浄剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔内スプレーまたは坐剤の使用を介して達成することができる。経皮投与では、活性化合物を、当技術分野で一般に知られる軟膏（ointments、salves）、ゲル、またはクリームへと調合する。
【０１１１】
[00115]  一部の実施形態ではまた、化合物（突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドまたは核酸）を、坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなど、従来の坐剤ベースを伴う）または直腸内送達用の停留浣腸のフォームで調製することもできる。
【０１１２】
[00116]  一部の実施形態では、化合物（突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドまたは核酸）はまた、ＭｃＣａｆｆｒｅｙら（Nature 418:6893、2002）、Ｘｉａら（Nature Biotechnol. 20: 1006-1010、2002）、またはＰｕｔｎａｍ（Am. J. Health Syst. Pharm. 53: 151-160、1996; Am. J. Health Syst. Pharm. 53:325、1996に訂正掲載）において記載されている方法が含まれるがこれらに限定されない、当技術分野で知られる方法を用いるトランスフェクションまたは感染を介して投与することもできる。
【０１１３】
[00117]  一実施形態では、突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドまたは核酸を、インプラントおよびマイクロカプセル化された送達系を含めた制御放出処方物など、突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドを体内からの急速な消失から保護する担体と共に調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生体分解性ポリマー、生体適合性ポリマーを用いることができる。このような処方物は、標準的な技法を用いて調製することができる。材料もまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販されている。また、リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を感染させた細胞を標的とするリポソームを含めた）も、薬学的に許容可能な担体として用いることができる。例えば、米国特許第４，５２２，８１１号において記載される通り、これらは、当業者に知られる方法に従い調製することができる。
【０１１４】
[00118]  このような突然変異体のＩＬ−２ポリペプチドまたは核酸化合物の用量、毒性、および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団のうちの５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団のうちの５０％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物による標準的な薬学的手順を介して決定することができる。毒性作用と治療効果との用量比が治療指数であり、これは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物も用いうるが、非感染細胞への潜在的な損傷を最小化し、これにより、副作用を軽減するためには、罹患組織部位をこのような化合物の標的とする送達系をデザインするように注意を払うべきである。
【０１１５】
[00119]  細胞培養物によるアッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおいて用いられる用量の範囲を処方するのに用いることができる。このような化合物の用量は、毒性をほとんどまたは全く伴わないＥＤ５０を包含する循環濃度の範囲内にあることが好ましい。用量は、使用される剤形および使用される投与経路に応じてこの範囲内で変化させることができる。本明細書の方法で用いられる任意の化合物の場合、治療有効用量は、まず細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルにおいて処方して、細胞培養物中で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する被験化合物の濃度）を包含する循環血漿濃度の範囲を達成することができる。このような情報を用いてヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０１１６】
[00120]  本明細書で規定される治療有効量の突然変異体ＩＬ−２ポリペプチド（すなわち、有効用量）は、選択されるポリペプチドに依存する。例えば、患者体重１ｋｇ当たり約０．００１〜０．１ｍｇの範囲の単回投与量を投与することができるが、一部の実施形態では、約０．００５、０．０１、０．０５ｍｇ／ｋｇを投与することもできる。一部の実施形態では、６００，０００ＩＵ／ｋｇを投与する（ＩＵは、リンパ球増殖バイオアッセイを介して決定することができ、Ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  １ｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２（ｈｕｍａｎ）により確立された国際単位（ＩＵ）で表される）。この用量は、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）に処方された用量と同様でありうるが、これより少ないと予測される。組成物は、隔日１回を含め、毎日１回〜１または複数回〜毎週１または複数回投与することができる；当業者は、疾患もしくは障害の重症度、既往の治療、全般的な健康、および／または対象の年齢、ならびに存在する他の疾患が含まれるがこれらに限定されない特定の因子が、対象を有効に治療するのに必要とする用量およびタイミングに影響を及ぼしうることを理解するであろう。さらに、治療有効量の本発明の突然変異体ＩＬ−２ポリペプチドによる対象の治療は、単回の治療を包含する場合もあり、一連の治療を包含する場合もある。一実施形態では、組成物を８時間ごとに５日間にわたり投与した後、２〜１４日間、例えば、９日間の休薬期間に続いて、さらに８時間ごとに５日間にわたり投与する。
【０１１７】
[00121]  医薬組成物は、投与のための指示書と併せて、容器内、パック内、または分注器内に組み入れられる。
【実施例】
【０１１８】
[00122]  本発明は、非限定的な例として用いられる以下の研究においてさらに記載され、これらにより例示される。
【０１１９】
（実施例１）
酵母の表面におけるＩＬ−２の機能的発現
[00123]  ＩＬ−２は既にバクテリオファージ上で提示されている（Buchliら、Arch. Biochem. Biophys. 339:79-84、1997）が、このかつての系は、指向的進化に適さず、したがって、ＩＬ−２Ｒのサブユニットに対する結合を改善したＩＬ−２の突然変異体を得るのには適切でない。これを克服するため、ＩＬ−２を、酵母細胞の表面で発現させた。ヒトＩＬ−２  ＤＮＡを、酵母用ディスプレイベクターであるｐＣＴ３０２へとクローニングした。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＢＹ１００株を、ｐＣＴ３０２＿ＩＬ−２ベクターで形質転換し、ＳＤ−ＣＡＡプレート上、３０℃で３日間にわたり増殖させた。ＩＬ−２酵母の個別のコロニーを、ＳＤ−ＣＡＡ中、３０℃で一晩にわたり増殖させ、次いで、２０℃で２日間にわたりＳＧＣＡＡに導入した。酵母を、四量体化されたビオチニル化ＩＬ−２Ｒβ、ビオチニル化γ、またはビオチニル化γの存在下におけるビオチニル化ＩＬ−２Ｒβで染色した。ＩＬ−２Ｒβおよびγの細胞外ドメインをＣ末端においてビオチニル化し、染色分取試薬として用いられるフィコエリトリンコンジュゲートストレプトアビジンに連結した。ＩＬ−２Ｒβの四量体は、２μΜのビオチニル化ＩＬ−２Ｒβを、氷上で１５分間にわたり４７０ｎＭのストレプトアビジン−フィコエリトリン（SA-PE、Invitrogen）と共にインキュベートすることにより形成した。これらの受容体の「四量体」は、単量体の細胞外ドメイン（ECD）によるＩＬ−２との低アフィニティーの相互作用のアビディティーを増強し、ライブラリーからのＩＬ−２変異体の最大限の回収を可能とした。溶体の野生型ＩＬ−２と同様に、ＩＬ−２Ｒβ単独に弱く結合する、酵母により提示されるＩＬ−２は、γ単独には全く結合せず、フローサイトメトリー（データは示さない）により見られる対角染色を介して証拠立てられる通り、ＩＬ−２Ｒβの存在下ではγに結合した。したがって、酵母により提示されるＩＬ−２は、可溶性のＩＬ−２と共に見られる、細胞上におけるヘテロ二量体の受容体複合体の協調的アセンブリーを再現する(recapitulate)ものであり、したがって、ライブラリーによる選択のためのプラットフォームとして適する。
【０１２０】
（実施例２）
ＩＬ−２突然変異体ライブラリーの構築およびスクリーニング 
[00124]  第１世代のｉｎ  ｖｉｔｒｏ戦略は、ＩＬ−２遺伝子全体のエラープローンＰＣＲライブラリーを創出することであった。第１世代の突然変異体ＩＬ−２ライブラリーは、以下の通りに構築した。野生型ヒトインターロイキン２（IL-2）を、製造元の指示書に従いＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（登録商標）ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットを用いるエラープローン突然変異誘発にかけた。エラープローンＰＣＲには、以下のプライマーを用いた：５’−ＧＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣ−３’（IL-2_errprone_for）および５’−ＧＣＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＴＣＣ−３’（IL-2_errprone_rev）。次いで、以下のプライマー：５’−ＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＣＴＡＧＣＧＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣ−３’および５’−ＡＣＡＣＴＧＴＴＧＴＴＡＴＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＣＡＡＧＴＣＴＴＣＴＴＣＧＧＡＧＡＴＡＡＧＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＴＣＣ−３’を用いて、エラープローンＰＣＲ反応の産物を増幅して、ＤＮＡ約１３０μｇを得た。酵母ディスプレイベクターであるｐＣＴ３０２を、制限酵素ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで二重消化し、ゲル精製した。ＩＬ−２  ＤＮＡおよびｐＣＴ３０２  ＤＮＡを併せて、エレクトロコンピテントのＥＢＹ１００酵母と５：１μｇの比で混合した。酵母を電気穿孔して、ライブラリーＤＮＡの酵母への移入を容易にした。この電気穿孔を約２０回にわたり繰り返し、最終ライブラリーサイズ１×１０８の形質転換体を得た。
【０１２１】
第１世代のＩＬ−２ライブラリーの選択：ライブラリーは、ＩＬ−２Ｒβに対する６回にわたる選択ラウンドにかけた（図２Ａ）。第１ラウンドでは、ライブラリーを、２μＭのビオチニル化されたＩＬ−２Ｒβを４７０ｎＭのストレプトアビジン−フィコエリトリンコンジュゲート（SAV-PE）と１５分間にわたり混合することにより形成した４７０ｎＭの四量体のＩＬ−２Ｒβで標識した。ライブラリーを、ＩＬ−２Ｒβと共に１．５時間にわたりインキュベートし、ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液（リン酸緩衝生理食塩液＋ウシ血清アルブミン）で洗浄し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  抗ＰＥ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓと共に４℃で２０分間にわたりインキュベートした。細胞を再度洗浄し、選択用の磁気カラムを流過させた。ＩＬ−２Ｒβの濃度（ラウンド２：１μＭ、ラウンド３：１μＭ、ラウンド４：３００ｎＭ、ラウンド５：３００ｎＭ、ラウンド６：１００ｎＭ、全て単量体のＩＬ−２Ｒβ）のみを変更して、この選択法をさらに５回にわたり反復することに成功した。選択が終了したら、ラウンド５およびラウンド６の酵母培養物をＳＤ−ＣＡＡプレート上に塗布したが、これにより、個別の酵母コロニーがもたらされた。結果として得られる１８の酵母コロニーを、５００ｎＭのＩＬ−２Ｒβへの結合について調べた。これらの１８の酵母コロニーから単離されたＩＬ−２  ＤＮＡを、配列決定した。これらの１８の酵母コロニーの間の、野生型ＩＬ−２の対応する残基と比べたアミノ酸の差違を、表１に示す。
【０１２２】
【表１】
2014502967.tif 000006
【０１２３】
第２世代のＩＬ−２ライブラリーのライブラリー構築:Ｌ８５Ｖを含有するクローンの比率が高いことに基づき、第２のＩＬ−２ライブラリーを、主に疎水性のコア残基に焦点を当てて構築した。Ｑ７４、Ｌ８０、Ｒ８１、Ｌ８５、Ｉ８６、Ｉ８９、Ｉ９２、Ｖ９３において突然変異を伴う部位指向的ＩＬ−２ライブラリーを構築した。Ｑ７４は、Ｈ／Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｒ／Ｓとして変化させた。Ｒ８１は、縮重のＮＮＫコドンを伴う２０アミノ酸の全てにおいて変化させた［配列中、Ｎは、アデニンヌクレオシド、チミンヌクレオシド、グアニンヌクレオシド、およびシトシンヌクレオシドの各々による２５％のミックスを表し、Ｋは、グアニンまたはチミンである］。残りの残基は、Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｖとして変化させた。ライブラリーは、以下のオリゴを用いるアセンブリーＰＣＲにより構築した。
【０１２４】
【化３】
2014502967.tif 000007
【０１２５】
部位指向的ＰＣＲは、以下のオリゴにより増幅した：
ＰＣＲ増幅オリゴ（５０ｂｐの相同性を包む）
【０１２６】
【化４】
2014502967.tif 000008
【０１２７】
ＰＣＲにより、ＤＮＡ  ４０μｇがもたらされ、これを二重消化されたｐＣＴ３０２およびエレクトロコンピテントのＥＢＹ１００酵母と混合し、第１世代のライブラリーの場合と同様に電気穿孔した。
【０１２８】
第２世代のＩＬ−２ライブラリーの選択：ライブラリーを、ＩＬ−２Ｒβに対する５回にわたる選択ラウンドにかけた（図２Ｂ）。この選択法は、用いられるＩＬ−２Ｒβの濃度に対する改変（ラウンド１：１μＭ、ラウンド２：１００ｎＭ、ラウンド３：３０ｎＭ、ラウンド４：３０ｎＭ、ラウンド５：１０ｎＭ、全て単量体のＩＬ−２Ｒβ）を伴うことを除き、第１世代のライブラリーの場合と全く同様に実施した。選択が終了したら、ラウンド４およびラウンド５の酵母培養物をＳＤ−ＣＡＡプレート上に塗布したが、これにより、個別の酵母コロニーがもたらされた。両方のラウンドに由来する４８の個別の酵母クローンを９６ウェルのブロックフォーマットで増殖させ、５ｎＭのＩＬ−２Ｒβ、次いで、ＳＡＶ−ＰＥで標識することによりスクリーニングした。スクリーンは、ＩＬ−２Ｒβに対する７つの高アフィニティー結合剤をもたらした。これらの７つの高アフィニティー結合剤の間の、野生型ＩＬ−２の対応する残基と比べたアミノ酸の差違を、ＩＬ−２Ｒβに対する結合アフィニティーと共に表２に示す。
【０１２９】
【表２】
2014502967.tif 000009
【０１３０】
（実施例３）
ＩＬ−２ムテインタンパク質の発現および精製
[00125]  ヒトＩＬ−２変異体（アミノ酸１〜１３３）、ＩＬ−２Ｒβ細胞外ドメイン（アミノ酸１〜２１４）、およびγｃ（アミノ酸３４〜２３２）を、Ｎ末端のｇｐ６７シグナル配列およびＣ末端のヘキサヒスチジンタグとインフレームでｐＡｃＧＰ６７−Ａベクター（BD Biosciences）へとクローニングし、バキュロウイルスによる発現系を用いて生成させた。バキュロウイルスの原液は、ＳＦ９００ＩＩ培地（Invitrogen）中で増殖させたＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Sf9）細胞におけるトランスフェクションおよび増幅により調製し、タンパク質の発現は、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（登録商標）昆虫  ＸＰＲＥＳＳ（商標）培地（Lonza）中で増殖させたＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（High Five（商標））細胞懸濁液中で実行した。タンパク質を発現させ、ニッケルアガロース（QIAGEN）を介する４８〜６０時間後のＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）上清から捕捉し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）および１５０ｍＭのＮａＣｌ中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００カラム（GE Healthcare）によるサイズ除外クロマトグラフィーを介して濃縮および精製した。ＳＰＲおよび細胞ベースのアッセイで用いられるＩＬ−２変異体は、完全にグリコシル化させて発現させた。ビオチニル化させた受容体の発現では、ＩＬ−２Ｒβおよびγｃを、Ｃ末端ビオチンアクセプターペプチド（BAP）（LNDIFEAQKIEWHE）およびヘキサヒスチジンタグと共にｐＡｃＧＰ６７−Ａベクターへとクローニングした。受容体タンパク質は、過剰なビオチン（１００ｕＭ）を伴うＢｉｒＡリガーゼと共に共発現させた。
【０１３１】
（実施例４）
ＣＤ２５−ナチュラルキラー（YT-1）細胞およびＣＤ２５＋ナチュラルキラー（YT-1）細胞の刺激
[00126]ＹＴ−１細胞およびＣＤ２５＋ＹＴ−１細胞を、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、最小限の非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、およびペニシリン−ストレプトマイシン（Gibco）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。ＣＤ２５＋ＹＴ−１細胞は、以下の通りに精製した：１×１０７個の細胞をＦＡＣＳ緩衝液（リン酸緩衝生理食塩液＋２％のウシ血清アルブミン）で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液１ｍＬ中、４℃で２０分間にわたり、ＰＥとコンジュゲートした抗ヒトＣＤ２５（１：２０; Biolegend、San Diego、CA）で染色した。染色された細胞を抗ＰＥ  ＩｇＧへと連結された常磁性マイクロビーズで標識し、製造元（Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、Germany）の指示書に従い、ＬＳ  ＭＡＣＳ（登録商標）分離カラムにより分離した。溶出させた細胞を、完全ＲＰＭＩ培地中に１×１０５個の細胞濃度で再懸濁させ、後続の実験のために増殖させた。細胞の濃縮は、Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６フローサイトメーターを用いて、ＦＬ−２チャネルによるフローサイトメトリーを介してモニタリングした。
【０１３２】
[00127]  ＹＴ−１細胞に対するＨ９、Ｄ１０、および６−６の用量反応関係は、フローサイトメトリーによりＳＴＡＴ５のリン酸化をアッセイすることにより決定した（図４ａおよび４ｂ）。ＣＤ２５＋ＹＴ−１細胞またはＣＤ２５−ＹＴ−１細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、９６ウェルプレート内のＦＡＣＳ緩衝液２００μＬ中に表示される濃度の野生型、６−６、Ｈ９、またはＤ１０と共に再懸濁させた。細胞を室温で２０分間にわたり刺激し、次いで、ホルムアルデヒドを１．５％まで添加することにより固定し、１０分間にわたりインキュベートした。氷上で２０分間にわたり、１００％の氷冷メタノールで細胞を透過処理した後、−８０℃で一晩にわたりインキュベーションした。固定されて透過処理された細胞を過剰なＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中で１：２０に希釈した、Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲート抗ＳＴＡＴ５  ｐＹ６９４（BD Biosciences、San Jose、CA）５０μＬと共に２０分間にわたりインキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で２回にわたり洗浄し、Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６フローサイトメーターのＦＬ−４チャネルを用いて細胞の平均蛍光発光を決定した。
【０１３３】
[00128]  ＩＬ−２の４２位におけるフェニルアラニンからアラニンへの十分に特徴づけられた突然変異（F42A）であって、ＣＤ２５への結合は消失させるが、ＩＬ−２ＲβまたはＩＬ−２Ｒγに結合するその能力には影響を及ぼさない突然変異（Mott、1995）を利用することにより、ＩＬ−２ムテイン（いわゆる「スーパー２」分子）のＣＤ２５非依存性についてさらに調べた。この突然変異はＨ９ムテインにも導入し、Ｈ９  Ｆ４２Ａを得た。ＩＬ−２、ＩＬ−２  Ｆ４２Ａ、Ｈ９、およびＨ９  Ｆ４２Ａによる、ＣＤ２５−ＹＴ−１細胞およびＣＤ２５＋ＹＴ−１細胞に対するＳＴＡＴ誘導の比較を実施した（図５）。ＩＬ−２  Ｆ４２Ａ突然変異は、ＣＤ２５＋細胞に対する野生型ＩＬ−２の用量反応曲線を約１ｌｏｇ右側にシフトさせたが、Ｆ４２Ａ突然変異は、ＣＤ２５−細胞におけるＳＴＡＴ誘導に対する観察可能な効果を及ぼさなかった（図５ａ）。これに対して、Ｈ９およびＨ９  Ｆ４２Ａについての用量反応曲線は、ＣＤ２５−細胞およびＣＤ２５＋細胞のいずれにおいても本質的に重なり合った。したがって、これらの実験は、ＩＬ−２ムテインが、見かけ上はＣＤ２５の存在から利益を受けないが、それらの活性は、ＣＤ２５のインターフェースを破壊する突然変異に対して非感受性であることを裏付ける。
【０１３４】
（実施例５）
ＣＤ２５−Ｔ細胞およびＣＤ２５＋Ｔ細胞刺激
[00129]ヒトおよびマウスのＣＤ４  Ｔ細胞を、ＢＡＬＢ／ＣマウスのＰＢＭＣ（Stanford Blood Bank）、脾臓、およびリンパ節から、それぞれ、抗体でコーティングされたＣＤ４  Ｔ細胞単離用磁気ビーズ（Stem Cell TechnologiesおよびMiltenyi Biotec）を用いて調製した。天然細胞刺激アッセイでは、細胞を即座に用いた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて「抗原経験のある(experienced)」Ｔ細胞世代を生成するために、１００ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ヒトにはOKT3であり、マウスには2C11である；eBiosciences）でプレートをコーティングする前に、ウェルを、ｐＨ９．６の重炭酸緩衝液中の二次抗体（Vector Labs）であらかじめコーティングした。Ｔ細胞を、可溶性の抗ＣＤ２８（ヒトにはCD28.2であり、マウスには37.51である；eBiosciences）と共に、ウェル１つ当たり０．１×１０６個の細胞で播種した。細胞を、刺激された完全なＴＣＲと共に３日間にわたり培養した後、条件付け培地中で２日間にわたり静置し(rest)、新鮮な培養培地中で２日間にわたり静置した。使用前に、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｍ（Cederlane）による遠心分離を介して生細胞を回収し、カウントした。
【０１３５】
[00130]  ＣＤ２５の発現が欠損するＴ細胞またはＣＤ２５を発現するＴ細胞に対するＩＬ−２ムテインの活性を評価した（図６）。野生型ＩＬ−２および６つのＩＬ−２ムテインの用量反応関係を、１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの範囲のタンパク質濃度におけるＳＴＡＴ５のリン酸化についてアッセイした。ＩＬ−２ムテインがＣＤ２５欠損Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５のリン酸化を刺激する能力は、それらのＩＬ−２Ｒβに対するアフィニティーと良好に相関した。ＩＬ−２ムテインによるＳＴＡＴ５のリン酸化の増大は、ＩＬ−２より２桁大きかった。
【０１３６】
[00131]  また、ＩＬ−２ムテインが、大量の完全ＩＬ−２受容体複合体であるＣＤ２５（IL-2Rα）、ＩＬ−２Ｒβ、およびγｃを発現する、抗原経験のあるヒトＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５のリン酸化を刺激する能力も評価した（図７）。ヒトＣＤ４  Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＴＣＲ刺激し、静置し、「抗原経験のある」ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔリンパ球を生成させた。１ｎｇ／ｍＬでは、ＳＴＡＴ５リン酸化の差違がほとんど観察されなかった。野生型を含めた各ＩＬ−２変異体により、細胞のうちの９０％超を刺激した。０．１ｎｇ／ｍＬでは、わずかな差違が観察された。野生型ＩＬ−２は、４８％のｐＳＴＡＴ５刺激を結果としてもたらし、ＩＬ−２ムテインは、６５〜７９％のｐＳＴＡＴ５刺激をもたらした。したがって、ＩＬ−２ムテインは、見かけ上は抗原経験のあるヒトＴ細胞を野生型ＩＬ−２より良好に刺激するが、増強は、ＣＤ２５を欠く細胞における場合ほど顕著ではない。
【０１３７】
（実施例６）
ＮＫ細胞による細胞傷害作用アッセイ
[00132]  ＥＧＦＲ（内皮成長因子受容体）を発現する扁平上皮がん細胞系（SCC6）と、ＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体であるセツキシマブとを用いて、Ｄ１０  ＩＬ−２ムテインの、ナチュラルキラー細胞の機能、とりわけ、自発的な抗体依存性細胞介在性細胞毒性（ADCC）に対する効果を評価した。ヒトＥＧＦＲ陽性扁平上皮細胞がん細胞系であるＳＣＣ６は、Ｊ．Ｓｕｎｗｏｏ研究室（Stanford、CA）から恵与された。ＳＣＣ６細胞系は、加熱により不活化した１０％のＦＣＳ（HyClone Laboratories）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（いずれもInvitrogen Life Technologies製）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Invitrogen Life Technologies）中で培養した。細胞は、５％ＣＯ２中３７℃の培養物中で接着させて増殖させた。セツキシマブ（マウスキメラ抗ヒト表皮成長因子受容体（EGFR）IgG1; IMC-C225; Erbitux（登録商標））は、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂから購入した。
【０１３８】
[00133]  クロム放出は、以下の通りに実施した：ＮＫ細胞は、約１×１０９個の細胞を含有する、健康なドナーによる白血球低減系（LRS）産物から単離した。ＮＫ細胞は、製造元の指示書に従いＮＫ細胞単離用ビーズ（Miltenyi Biotec）を用いる負磁気細胞分取を介して単離した。ＮＫ細胞を純度（CD3-CD56+フローサイトメトリーにより規定される＞９０％の純度）について評価した。ＳＣＣ６標的細胞を細胞１×１０６個当たり１５０μＣｉの５１Ｃｒで２時間にわたり標識した。培地単独中、セツキシマブ（１００ｐｇ／ｍＬ）中、ＩＬ−２（１０００ＩＵ／ｍＬ）中、ＩＬ−２  Ｄ１０（１ｐｇ／ｍＬ）中、ＩＬ−２  Ｄ１０（１０ｐｇ／ｍＬ）中、またはセツキシマブ（１００ｐｇ／ｍＬ）にＩＬ−２（１０００ＩＵ／ｍＬ）を加えた組合せ、セツキシマブ（１００ｐｇ／ｍＬ）にＩＬ−２  Ｄ１０（１ｐｇ／ｍＬ）を加えた組合せ、もしくはセツキシマブ（１００ｐｇ／ｍＬ）にＩＬ−２  Ｄ１０（１０ｐｇ／ｍＬ）を加えた組合せを含めた組合せ中に５１Ｃｒで標識したＳＣＣ６細胞と共に、エフェクター細胞:標的細胞比を０：１、１：１、および５：１で変化させて、精製されたＮＫ細胞を５時間にわたり培養した後に、溶解百分率を決定した。アッセイは、３連で実施した。精製されたＮＫ細胞を、５１Ｃｒで標識したＳＣＣ６細胞と共に、濃度を変化させるセツキシマブ、ＩＬ−２またはＩＬ−２  Ｄ１０の存在下または非存在下で培養した。Ｄ１０によるＮＫ細胞の自発的細胞傷害作用に対する刺激は、高用量のＩＬ−２（図8、*p=.008、**p=.001）を上回り、ＩＬ−２またはＤ１０による刺激を伴わない場合の自発的細胞傷害作用は最小限であった。セツキシマブに結合したＳＣＣ６のＡＤＣＣも、Ｄ１０による刺激を介して、高用量のＩＬ−２またはセツキシマブ単独と比較して同様に増大した（＊ｐ＝．０００５、＊＊ｐ＝．０００１）。とりわけ、Ｄ１０により、自発的な細胞毒性およびＡＤＣＣの両方の、高用量のＩＬ−２と比較して優越する機能的増強が、１：１を含め全てのエフェクター：標的比において生じた。
【０１３９】
（実施例７）
ＩＬ−２ムテインは、抑制型Ｔ細胞（Tregs）の刺激を比較的低下させながら、メモリー表現型増殖の増強を結果としてもたらす
[00134]  ＩＬ−２ムテインであるＨ９の、ＣＤ２５は低レベルで発現するがＩＬ−２Ｒβγは高レベルで発現するメモリー表現型ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に対する効力を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて評価した。Ｃ５７Ｂ１／６マウスに、ＰＢＳ、ＩＬ−２  ２０μｇ、Ｈ９  ２０μｇ、またはＩＬ−２／抗ＩＬ−２モノクローナル抗体の複合体１．５μｇを施し、脾臓のＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４４ｈｉｇｈメモリー表現型Ｔ細胞の全細胞カウントをフローサイトメトリーにより評価した。脾臓細胞の懸濁液を調製し、蛍光色素をコンジュゲートしたモノクローナル抗体で、ＣＤ３（クローン145-2C11、eBioscience）、ＣＤ４（クローンRM4-5、Caltag Laboratories）、ＣＤ８ａ（クローン53-6.7、BD Biosciences）、ＣＤ２５（クローンPC61、BD Biosciences）、ＣＤ４４（クローンIM7、eBioscience）、ＮＫ１．１（クローンPK136、BD Biosciences）、およびＴｈｙ１．１（クローンHIS51、eBioscience）を染色した。ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩフローサイトメーターを用いて少なくとも１００，０００個の生細胞を収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（TriStar, Inc.）を用いて解析した。図１０（Ａ）に示される通り、開示されるＩＬ−２ムテインによる処置は、他の処置モダリティーと比べて大幅な、メモリー表現型Ｔ細胞の増殖を結果としてもたらしたが、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＴ細胞である制御性Ｔ細胞の増殖は制限された（図１０（Ｂ））。
【０１４０】
（実施例８）
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＩＬ−２ムテインの毒性の低減 
[00135]  ＩＬ−２による処置は、急性肺浮腫などの重度の有害作用をもたらしうることが知られ、これは、現在のところＩＬ−２の有効な使用を阻止する制約となっている。したがって、開示されるＩＬ−２ムテインのＩＬ−２と比べた毒性を評価した（図１１Ａ）。Ｃ５７Ｂ１／６マウスに、ＰＢＳ、ＩＬ−２  ２０μｇ、Ｈ９  ２０μｇ、またはＩＬ−２／抗ＩＬ−２モノクローナル抗体の複合体１．５μｇによる毎日の腹腔内注射を、連続５日間にわたり施した。養子(adoptive)細胞移入の６日後、肺を摘出し、真空下５８℃で一晩にわたる乾燥の前および乾燥の後に秤量した。肺の湿潤重量は、初期の肺重量を脱水後の肺重量から減じることにより計算した。
【０１４１】
（実施例９）
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＩＬ−２ムテインの抗腫瘍活性の増大
[00136]  開示されるＩＬ−２ムテインの腫瘍細胞に対する効力をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて調べた。ＲＰＭＩ  １００μｌ中に１０６個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を、マウス（群１つ当たりのマウス３〜４匹）背部の真皮上層へと注射した。処置は、ＰＢＳ、ＩＬ−２  ２０μｇ、Ｈ９  ２０μｇ、またはＩＬ−２／抗ＩＬ−２モノクローナル抗体の複合体（IL-2/mAb）１．５μｇによる５回にわたる毎日の注射からなり、腫瘍小塊が約１５ｍｍ２のサイズではっきりと目視可能および触知可能となって１日後に開始した。図１１（Ｂ）で裏付けられる通り、開示されるＩＬ−２ムテインは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性の増強を結果としてもたらした。
【０１４２】
（実施例１０）
ＩＬ−２ムテインとＩＬ−２との構造比較
[00137]  表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によりＩＬ−２Ｒβに対するそれらの結合アフィニティーおよび反応速度を測定するために、ＩＬ−２ムテインのうちのいくつかを組換えにより発現させた。ＩＬ−２とＩＬ−２Ｒβとのアフィニティーは、ＫＤ＝２８０ｎＭであった。ＩＬ−２ムテインを、低アフィニティーのクラス、中程度のアフィニティーのクラス、および高アフィニティーのクラスへとクラスター分割した。低アフィニティーのＩＬ−２ムテイン（５−２および６−６）は、それぞれ、５０〜７０ｎＭのＫＤでＩＬ−２Ｒβに結合し、野生型ＩＬ−２の４〜６倍のアフィニティーの増分は、ほぼ完全にＬ８５Ｖ置換を介するものであった。第２の部位指向的ライブラリーから選択された、アフィニティーが中程度の突然変異体および高アフィニティーの突然変異体のＫＤは、それぞれ、１０〜１５ｎＭ（Ｃ５、Ｈ４）および１．２〜１．７ｎＭ（Ｂ１、Ｄ１０、Ｅ１０、Ｇ８、Ｈ９）であった。アフィニティーの増大は、オフ速度の低減により一様に明示され、高アフィニティーのＩＬ−２ムテインは、Ｌ８０Ｆ／Ｒ８１Ｄ／Ｌ８５Ｖ／Ｉ８６Ｖ／Ｉ９２Ｆのうちの無作為化された位置にコンセンサス配列を含有した。
【０１４３】
[00138]  ＩＬ−２ムテインの構造的帰結を理解するために、Ｄ１０ムテインのほか、ＩＬ−２Ｒβおよびγｃに結合したＤ１０の三元複合体を結晶化させた。Ｄ１０単独の構造では、６つの突然変異のうちの５つが、Ｂ−Ｃループ上およびＣヘリックスのコア内のＩＬ−２Ｒβに接触しない位置にクラスター化した。とりわけ、Ｂ−Ｃヘリックスのリンカー領域は、電子密度マップにおいて、この領域が部分的にまたは完全に無秩序的である他のＩＬ−２構造と比較して秩序立っている（図９）。Ｆ８０、Ｖ８５、およびＶ８６の置換基は、まとまって、ループを安定化させＣヘリックスを分子のコアへと「ピン止め」しヘリックスＢを充填する疎水性のクラスターへと崩れこんでいる(collapse into)と考えられる。Ｈ７４の突然変異およびＤ８１突然変異は、溶媒に曝露されており、したがって、それらの構造的役割はそれほど明らかではないが、Ａｓｐは、ヘリックスＣ構造にさらに寄与しうる、ヘリックスのよく知られたＮキャッピング残基である。６つのコンセンサス突然変異のうちの１つであるＩ９２Ｆのみが、受容体複合体におけるＩＬ−２Ｒβに接触する位置に置かれた。Ｐｈｅ９２は、ＣヘリックスとＡヘリックスとの間に深く挿入され、複合体のＩＬ−２Ｒβにより覆い隠された分子表面のうちの、Ｉｌｅ９２と比較した、さらなる１０Å２に寄与するに過ぎない。したがって、そのＩＬ−２Ｒβとの接触は、合計で約３００倍に及ぶＤ１０のアフィニティーの増分に対してわずかな寄与をなすに過ぎない可能性が高い。
【０１４４】
[00139]  また、Ｄ１０三元受容体複合体の低解像度（３．８Å）による構造も決定して、突然変異がＩＬ−２Ｒβ／γｃ受容体の結合形状を攪乱したかどうかを評価した。安定的なＤ１０とＩＬ−２Ｒβとの三元複合体を結晶化させ、ＣＤ２５の非存在下で精製した。Ｄ１０の三元複合体におけるＩＬ−２Ｒβ／γｃヘテロ二量体全体の骨格およびサイトカイン／ＩＬ−２Ｒβの接触方式は、既に報告されている四元アセンブリーの場合と本質的に同一である。したがって、スーパー２の効力の増大は、受容体二量体の骨格の構造変化に起因するものではなく、アフィニティーの増強に起因する可能性が高い。
【０１４５】
[00140]  上述で論じた通り、ＩＬ−２のＣヘリックスは、二元複合体および四元複合体のいずれにおいても見られる、ＩＬ−２Ｒαへの結合時に微細な再配置を受けると考えられる。これに対して、ＰＤＢデータベースにおいて、３つの野生型のリガンド結合していない構造を検査することにより、Ｃヘリックスの位置のばらつきが、このヘリックスにおけるＢ因子の、この分子の残りの部分と比べた増大と符合することが明らかとなる。Ｄ１０の構造の、リガンド結合していないＩＬ−２、および受容体複合体におけるＩＬ−２の構造との比較を企図した。Ｄ１０におけるＣヘリックスは、遊離フォームの場合より、２つの受容体に結合したＩＬ−２の立体構造において見られるＣヘリックスとより類似し、ヘリックスコアの上方および内部へのシフトを経ていることが観察された。
【０１４６】
[00141]  分子動力学（MD）シミュレーションを用いて、ＩＬ−２ムテインがＩＬ−２Ｒβに対する結合アフィニティーを増大させる機構を探査した。ＩＬ−２ムテインと対比した、ＩＬ−２の相対的な立体構造の可撓性を直接探索するために、原子レベルの詳密なマルコフ状態モデル（MSM）を構築した。このＭＳＭにおける状態は、原子論的シミュレーションから結果として得られる、急速に相互変換する立体構造の反応速度論的クラスター化に由来する。これらの準安定状態の各々は、系の構造および動態を最終的に決定する根底的な自由エネルギーランドスケープにおける局所的な極小値に対応する。ＭＳＭの解析は、ＩＬ−２ムテインがＩＬ−２より安定的であり、ＩＬ−２が、ＩＬ−２ムテインのほぼ２倍のクラスターをビジットすることを裏付ける。例えば、ＩＬ−２ムテインの最も密度の高い状態(most populated state)の平衡確率は、ＩＬ−２の約−０．０５と比較して約−０．２０である。ＩＬ−２ムテインでは、ヘリックスＢ、Ｂ−Ｃループ、およびヘリックスＣが、ＩＬ−２の場合と比較して硬直している。発生した突然変異は、Ｂ−Ｃループ内（H74、D81）、およびＢヘリックスとＣヘリックスとの充填インターフェース内（F80、V85、V86）に存在するので、いずれのヘリックス（ヘリックスCのみでなく）も突然変異から利益を受け、集合的な安定化を経る。Ｆ９２は、ヘリックスＣとヘリックスＡとの間の分子的楔として作用し、ヘリックスのよりＣ末端側の端部でさらなる安定化のための影響力として作用すると考えられる。ＭＤシミュレーションにより、スーパー２では、ヘリックスＢもまた安定化を経ていることが示唆されることは、ＩＬ−２の結晶構造の比較からは自明でなかったので驚きであった。ＩＬ−２Ｒαは、主にＢヘリックスおよびＤヘリックスの一部において、ＩＬ−２に結合する。ＭＤシミュレーションは、ＩＬ−２ＲαのＩＬ−２への結合は、ヘリックスＢを硬直させることが可能であり、この構造的安定化は、Ｂ−ＣループおよびヘリックスＣへと伝播しうる可能性を示唆する。原理的には、ＩＬ−２ムテインにおいて発生した突然変異の見かけの効果と同様である。
【０１４７】
[00142]  最も密度の高い立体構造を各タンパク質のシミュレーションから視覚化することにより、ヘリックスＣは、ＩＬ−２ムテインにおける場合よりＩＬ−２における場合にはるかに可撓性が大きいことが示され、また、ＩＬ−２ムテインにおける突然変異が、受容体結合様の立体構造を実際に安定化させることも示される。
【０１４８】
他の実施形態
[00143]  本発明をその詳細な記載と共に記載してきたが、前出の記載は、添付の特許請求の範囲により規定される、本発明の範囲を例示することを意図するものであり、これを限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。例えば、ＩＬ−２は、明細書の全体において言及されているが、当業者であれば、本明細書で記載される方法および組成物が、他のサイトカイン、例えば、この特性を伴う顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、またはＩＬ−１５にも同等に適用可能であることを理解するであろう。したがって、本発明はまた、それらのそれぞれの受容体に対する結合アフィニティーを野生型と比較して増大させた、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１５の突然変異体、ならびにこれらの突然変異体を同定する方法および用いる方法も包含する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年9月13日(2013.9.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014502967000001.app
【国際調査報告】
2014502967.tif 000021
2014502967.tif 000022
2014502967.tif 000023