(57)【要約】  本発明はｉｎ  ｖｉｔｒｏの３次元器官型細胞共培養物に関する。本発明の培養物は、腫瘍細胞と相違するマトリクス細胞のマトリクス内に３次元的に配置された腫瘍細胞を含み、前記共培養物は基底膜を含まない。前記培養物は、がんの研究に対して、抗腫瘍剤の有効性の試験に対して、及び、候補薬剤のハイスループットスクリーニングに対して有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける３次元器官型細胞共培養物であって、前記共培養物は、腫瘍細胞と相違するマトリクス細胞のマトリクス内に３次元的に配置された腫瘍細胞を含み、基底膜を含まないことを特徴とする、共培養物。
【請求項２】
請求項１に記載の共培養物であって、該共培養物はさらに半透性支持体及び液体培養培地を含み、
ａ）前記共培養物は気相に面する支持体の第１表面に配置され、
ｂ）前記支持体の第２表面は前記液体培養培地に面し、及び、接触し、並びに、
ｃ）前記液体培養培地は表面張力及び／又は毛細管現象の効力によって前記支持体及び前記培養物に接触して保持されることを特徴とする、共培養物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の共培養物であって、前記腫瘍細胞は、少なくとも５個の細胞の凝集物の形態で存在することを特徴とする、共培養物。
【請求項４】
３次元器官型細胞共培養物を調製する方法であって、
ａ）腫瘍細胞を含む第１細胞懸濁液及び前記腫瘍細胞と相違するマトリクス細胞を含む第２細胞懸濁液を提供するステップと、
ｂ）液体懸濁液培地に懸濁された混合細胞を提供するために前記第１及び第２の細胞懸濁液を混ぜ合わせるステップと、
ｃ）前記混合細胞を濃縮（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）及び／又は圧縮（ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ）させるステップと、
ｄ）気相に面する半透性支持体の第１表面でステップ（ｃ）から得られた前記混合細胞をインキュベーションするステップであって、前記インキュベーション中に前記支持体の第２表面が液体培養培地に面し、及び、接触し、並びに、前記液体は表面張力及び／又は毛細管現象の効力によって前記支持体及び前記混合細胞に接触して保持されるステップとを含むことを特徴とする、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記ステップ（ｄ）のインキュベーション中に、前記腫瘍細胞がマトリクス細胞によって形成されるマトリクス内に配置され、３次元的に増殖する（ｇｒｏｗ）ことを特徴とする、方法。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の方法であって、前記第１及び／又は第２の細胞懸濁液の提供は、固体組織供給源からの細胞の解離を含むことを特徴とする、方法。
【請求項７】
請求項４ないし６のいずれかに記載の方法であって、インキュベーション前の前記混合細胞はマトリクスと、マトリクス：腫瘍細胞比が１００：１ないし１０：１の腫瘍細胞とを含むことを特徴とする、方法。
【請求項８】
請求項４ないし７のいずれかに記載の方法であって、前記混合細胞は、毛細管現象、蒸発、遠心分離、グラビテイション（ｇｒａｖｉｔａｔｉｏｎ）、静水圧の応用、揚水（ｐｕｍｐｉｎｇ）、吸引（ｓｕｃｔｉｏｎ）又は吸引（ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）によってステップ（ｃ）において圧縮されることを特徴とする、方法。
【請求項９】
請求項４ないし８のいずれかに記載の方法であって、ステップ（ｃ）は、前記混合細胞の遠心分離と上清の液体懸濁液培地の除去を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記混合細胞は、ステップ（ｃ）の前記遠心分離と前記上清の液体懸濁液の除去後にステップ（ｄ）の支持体に置かれることを特徴とする、方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、前記混合細胞は前記遠心分離によってステップ（ｄ）の支持体に置かれることを特徴とする、方法。
【請求項１２】
請求項４ないし１１のいずれかに記載の方法であって、ステップ（ｄ）は、前記細胞は前記支持体でさらに圧縮されることを含むことを特徴とする、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記さらなる圧縮は、蒸発及び／又は毛細管現象によることを特徴とする、方法。
【請求項１４】
請求項４ないし１３のいずれかの方法であって、前記ステップ（ｄ）の毛細管現象が、さらに前記混合細胞を圧縮することを特徴とする、方法。
【請求項１５】
請求項４ないし７のいずれかに記載の方法であって、ステップ（ｄ）の前記毛細管現象が、ステップ（ｃ）の前記混合細胞を圧縮することを特徴とする、方法。
【請求項１６】
いずれかの前記の請求項に記載の方法であって、前記方法はさらに前記器官型細胞共培養物を冷凍保存するステップを含むことを特徴とする、方法。
【請求項１７】
請求項２若しくは３に記載の共培養物又は請求項４ないし１６のいずれかに記載の共培養物であって、前記支持体の前記第２表面は前記第１表面の対側であることを特徴とする、共培養物。
【請求項１８】
請求項１ないし３のいずれか若しくは１７に記載の共培養物又は請求項４ないし１７のいずれかに記載の方法であって、前記マトリクス細胞は非がん性細胞であることを特徴とする、共培養物又は方法。
【請求項１９】
請求項１ないし３若しくは１７ないし１８のいずれかに記載の共培養物又は請求項４ないし１８のいずれかに記載の方法であって、前記マトリクス細胞は１種以上の細胞種を含むことを特徴とする、共培養物又は方法。
【請求項２０】
請求項１ないし３若しくは１７ないし１８のいずれかに記載の共培養物又は請求項４ないし１８のいずれかに記載の方法であって、前記マトリクス細胞は単一の細胞種からなることを特徴とする、共培養物又は方法。
【請求項２１】
請求項１ないし３若しくは１７ないし２０のいずれかに記載の共培養物又は請求項４ないし２０のいずれかに記載の方法であって、前記腫瘍細胞は遺伝子操作されていないことを特徴とする、共培養物又は方法。
【請求項２２】
請求項１ないし３若しくは１７ないし２１のいずれかに記載の共培養物又は請求項４ないし２１のいずれかに記載の方法であって、前記腫瘍細胞及び／又はマトリクス細胞は哺乳類由来であることを特徴とする、共培養物又は方法。
【請求項２３】
請求項１ないし３若しくは１７ないし２２のいずれかに記載の共培養物又は請求項４ないし２２のいずれかに記載の方法であって、前記腫瘍細胞及び／又はマトリクス細胞はヒト由来であることを特徴とする、共培養物又は方法。
【請求項２４】
請求項１ないし３若しくは１７ないし２３のいずれかに記載の共培養物又は請求項４ないし２３のいずれかに記載の方法であって、前記マトリクス細胞は、幹細胞か、１次細胞か、間質細胞か、又は、生検、死体の組織、細胞株由来の哺乳類若しくはヒト組織、中枢神経系、脳、骨髄、血液、脾臓、網膜、胸腺、心臓、乳腺、肝臓、膵臓、甲状腺、骨格筋、腎臓、肺、腸、卵巣、膀胱、精巣、子宮、若しくは、結合組織から選択される供給源に由来の細胞かを含むことを特徴とする、共培養物又は方法。
【請求項２５】
請求項１ないし３若しくは１７ないし２４のいずれかに記載の共培養物又は請求項４ないし２４のいずれかに記載の方法であって、前記腫瘍細胞はがん幹細胞であることを特徴とする、共培養物又は方法。
【請求項２６】
請求項１ないし３若しくは１７ないし２５のいずれかに記載の共培養物又は請求項４ないし２５のいずれかに記載の方法であって、前記腫瘍細胞は、幹細胞、膵臓、血液、頸部、大腸、腸、腎臓、脳、乳腺、卵巣、前立腺、皮膚、肝臓、肺又は脾臓由来であることを特徴とする、共培養物又は方法。
【請求項２７】
請求項２、３若しくは１７ないし２６のいずれかに記載の共培養物又は請求項４ないし２６のいずれかに記載の方法であって、前記支持体は親水性ＰＴＦＥ、ＰＥＴ又は酸化アルミニウムを含むことを特徴とする、共培養物又は方法。
【請求項２８】
請求項２、３若しくは１７ないし２７のいずれかに記載の共培養物又は請求項４ないし２７のいずれかに記載の方法であって、前記支持体は光学的に透明であることを特徴とする、共培養物又は方法。
【請求項２９】
請求項２、３若しくは１７ないし２８のいずれかに記載の共培養物又は請求項４ないし２８のいずれかに記載の方法であって、前記支持体は、前記共培養物の前記支持体への接着を促進する材料で被覆されていることを特徴とする、共培養物又は方法。
【請求項３０】
請求項２、３若しくは１７ないし２９のいずれかに記載の共培養物又は請求項４ないし２９のいずれかに記載の方法であって、前記支持体を被覆する前記材料は、コラーゲン、ラミニン又はフィブロネクチンより選択されることを特徴とする、共培養物又は方法。
【請求項３１】
請求項４ないし３０のいずれかに記載の方法によって得られることを特徴とする、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの３次元器官型細胞共培養物。
【請求項３２】
抗がん剤をスクリーニングするための方法であって、該方法は請求項１ないし３又は１７ないし３１のいずれかに記載の共培養物を試験物質に接触させることを含み、前記共培養物の前記腫瘍細胞の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、生存能力又は遊走に対する前記試験物質の阻害効果が抗がん剤候補であることを示すことを特徴とする、方法。
【請求項３３】
請求項１ないし３又は１７ないし３１のいずれかに記載の共培養物の、抗がん剤をスクリーニングするための方法における使用。
【請求項３４】
請求項１ないし３又は１７ないし３１のいずれかに記載の共培養物の、がんバイオマーカー及び／又はがん薬剤標的を同定及び／又は検証する方法における使用。
【請求項３５】
請求項１ないし３又は１７ないし３１のいずれかに記載の１つ又は２つ以上の共培養物を含むことを特徴とする、アッセイキット。
【請求項３６】
請求項１ないし３又は１７ないし３１のいずれかに記載の１つ又は２つ以上の共培養物を含むことを特徴とする、化合物をスクリーニングするための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞及び組織培養に関する。特に、本発明は、腫瘍細胞と、かかる腫瘍細胞と相違する細胞とを含む、共培養物、すなわち混合細胞培養に関する。本発明の共培養物は３次元（３Ｄ）器官型培養物である。本発明は、解離細胞の凝集による共培養物の構成に関する。本発明の共培養物の腫瘍細胞は、例えば、１次腫瘍組織又は腫瘍細胞株を含む腫瘍細胞のいずれかの供給源から得られる。また、本発明の培養物を調製する方法が提供される。本発明の培養は、がん、がん治療及びがん診断の研究に有用である。例えば、本発明の培養物は、抗がん剤のスクリーニング方法、及び、抗がん剤の有効性を試験する方法に有用である。本発明の方法及び培養物は、ハイスループット型での活用に非常に適している。
【背景技術】
【０００２】
積極的治療プロトコールにもかかわらず、多くの種類のがんの予後は、まだ極めて不良である。新たな治療計画の同定が緊急に必要とされる。しかし、製薬業界の大きな課題は、化合物をプロファイルするための関連モデルシステムの開発を残している。例えば、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）は最も一般的で、最も進行性（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）の種類のヒトの原発性脳腫瘍であるけれども、ＧＭＢ用の満足できるモデルシステムは今日まで全く利用可能ではない。これや他の種類の重要なヒトのがんに対して、腫瘍内で関連する生理学的状態をより忠実に再現でき、抗がん剤の選抜の予測値を改善する腫瘍モデルを提供するために、腫瘍細胞を培養するための新たなアプローチを緊急に開発する必要がある。
【０００３】
現在の確立された実施によると、如何にさまざまながんが発達するかのメカニズムを研究するためや、新しい治療の有効性を試験するために不死化腫瘍細胞株が広く用いられている。抗がん化学療法に潜在的関連性のある化合物の１次スクリーニングは、２次元（２Ｄ）の培養条件で、「認定された」ＮＣＩパネルから確立され、よく特徴付けられた６０種類の腫瘍細胞株を殺すか、若しくは増殖を阻害する能力に現在基づいている（非特許文献１）。２次元の単一培養物は１種類の腫瘍細胞を有し、９６ウェルプレートで１ウェルあたり約２０，０００細胞個に標準操作手順を用いて増殖され、その後、２４時間薬剤の非存在下で前培養される。その後、試験薬剤が添加され、４８時間培養される。このインキュベーション終了時、スルホローダミンＢが前記細胞のタンパク質レベルをアッセイするために用いられる。この標準アッセイは、今日までに８５，０００種類以上の化合物をスクリーニングするために用いられて来た。２Ｄ培養で有効だったもののうち、ごく一部だけが臨床で成功している。大多数の新規の抗がん剤は、従来のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでの抗腫瘍活性の証拠にもかかわらず、臨床で失敗する。
【０００４】
腫瘍増殖用ｉｎ  ｖｉｖｏモデルが開発されて来た（非特許文献１）。しかし、これらのモデルは高価で、時間を要し、生きている動物の実験を必要とする。しばしば、モデルは皮下であり、したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏでのセッティングにもかかわらず、腫瘍が生じた器官で腫瘍が発達できない。また、かかるモデルは、ハイスループット型の方法での使用に適切ではない。
【０００５】
非特許文献２及び非特許文献３は、腫瘍細胞と他の細胞との共培養に関する。これらの方法では、腫瘍が半固形培地での結節の形成が促進される。前記結節は細胞からがん細胞間で接触する細胞まで形成し、それらが形成するので、他の細胞種は前記結節に取り込まれる。これはｉｎ  ｖｉｖｏの状態の典型ではなく、このｉｎ  ｖｉｖｏの状態において、存在する非腫瘍細胞のマトリクス内で腫瘍は形成する。また、結節の中心は、それらが増殖するにつれて、無酸素状態になりやすい。したがって、これらの培養の使用も、それらが非常に頻繁に再形成されなければならないため、限定される。さらに、異なった細胞種は各継代に取り込まれる場合があり、各継代は、これらの培養間で望ましくないレベルの変動をもたらす。
【０００６】
Ｒｉｄｋｙら（非特許文献４）は、特定の種類の上皮腫瘍細胞の培養を記載し、組換え技術によって形質転換された上皮細胞は基底膜調製物の片側で培養され、前記基底膜調製物の他の片側には線維芽細胞層を有することを記載する。このモデルは、特定の上皮状態に限定され、上皮細胞の組換え形質転換と、基底膜調製物のそれぞれの側面での、形質転換細胞と線維芽細胞との特別な空間的配置とに依存する。
【０００７】
本発明者らは、幅広い範囲の生理学的に関連のある器官型腫瘍モデルを提供する、腫瘍細胞を培養する新規の汎用的な方法を開発した。本発明の腫瘍細胞培養は、現在利用可能な細胞培養の多くの欠点を克服する驚くべき特性を有する。本発明の器官型腫瘍細胞培養は、確実な、再現可能な、迅速な、及び、安価な、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験の代わりになるものを提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Damia, G., Maurizio D,Incalci, (2009) European Journal of Cancer, 45, 2768-2781
【非特許文献２】Rygaard J, PovlsenCO., Acta Pathology Microbiol. Scand, 1969, 77, 758-760
【非特許文献３】Beaupain, R., (1999) Methods in Cell Sciences, 21: 25-30
【非特許文献４】Starzecら、(2003), Biology of Cells, 95, 257-264
【非特許文献５】Ridkyら、(2010) Nature Medicine 16(12):1450-1455
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明の詳細
発明の概要
本発明は、腫瘍細胞培養物、より特に、腫瘍細胞と相違するマトリクス細胞のマトリクス内に３次元的に配置された腫瘍細胞を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏの３次元器官型細胞共培養物を提供する。
【００１０】
本発明による共培養物は、薄片又は一片の器官又は固形組織か、若しくは固形組織からの接着細胞のいずれかの他の試料を含まない。むしろ、本発明の共培養物は、解離細胞の凝集によって、すなわち、解離した形態の浮遊状態の細胞から形成される。培養物を形成する前記細胞が接着細胞（例えば、接着細胞培養、又は、組織又は器官の試料又は薄片）を含む供給源から生じる場合、当初接着した（凝集した）細胞は、本発明の共培養物の形成前に解離される（分散される）。本発明によると、解離細胞は共培養物の形成の間に凝集する。特に、細胞懸濁液から共培養した細胞の濃縮（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）及び／又は圧縮（ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ）の後に、細胞は凝集する。したがって、本発明の共培養物は「凝集」又は「再凝集」共培養物と称される場合がある。
【００１１】
本発明の共培養物は、半透性支持体及び液体培養培地を含んでもよく、ａ）前記共培養物は気相に面している支持体の第１表面に配置され、ｂ）前記支持体の第２表面は前記液体培養培地に面し、及び、接触し、並びに、ｃ）前記液体培養培地は、表面張力及び／又は毛細管現象の効力によって前記支持体及び前記培養物に接触して保持される。
【００１２】
したがって、前記培養は気液界面で前記支持体に置かれる場合がある。気相は、細胞培養物に対して一般的に使用されるいずれかの気相又は組成物、例えば、空気であってもよい。したがって、前記気液界面は、空気液体界面であってもよい。
【００１３】
また、本発明は、３次元器官型細胞共培養物を調製する方法を提供し、該方法は、ａ）腫瘍細胞を含む第１細胞懸濁液及び前記腫瘍細胞と相違するマトリクス細胞を含む第２細胞懸濁液を提供するステップと、ｂ）液体懸濁培地に懸濁された混合細胞を提供するために、前記第１及び第２の細胞懸濁液を組み合せるステップと、ｃ）前記混合細胞を濃縮及び／又は圧縮するステップと、ｄ）気相に面する半透性支持体の第１表面でステップ（ｃ）から得られた前記混合細胞をインキュベーションするステップであって、前記インキュベーション中に前記支持体の第２表面が液体培養培地に面し、及び、接触し、並びに、前記液体は表面張力及び／又は毛細管現象の効力によって前記支持体及び前記混合細胞に接触して保持されるステップとを含む。
【００１４】
本発明の共培養物及び方法の好ましい実施態様では、前記支持体の第２表面は、第１表面の反対側にある。
【００１５】
本発明の特性及び利点
前記マトリクス細胞は、腫瘍細胞が増殖する器官型環境を形成する。「器官型培養」という用語は、培養中の細胞が、該細胞が由来する器官の生化学的及び生理学的な特性をできる限り近く再現する方法で連合することを示す。「共培養」では、少なくとも相違する２種類の細胞が一緒に培養される。共培養細胞は、相違する供給源に由来してもよいが、ｉｎ  ｖｉｖｏの状態を再現するために一緒に付随していても良い。共培養物は、全ての細胞の種類から生じ、共培養物の中の細胞間の相互作用から生じる特性を有する。
【００１６】
本発明者らは、本発明によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ３Ｄ器官型腫瘍細胞培養物を提供するために、マトリクス細胞の３Ｄ器官型培養が培養中に腫瘍細胞を増殖し、維持できるという予期しない発見をした。腫瘍細胞増殖用の足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）又はマトリクスが、培養期間に主に非腫瘍細胞それ自体によって提供される。驚くべきことに、解離したマトリクス細胞と解離した腫瘍細胞との両方は、一旦、本発明の方法に従って混合されると、本発明の器官型共培養物を形成するために再編成する。かかる器官型腫瘍細胞培養物のかかる形成は以前に示されていなかった。
【００１７】
本発明の共培養物のメリットは、腫瘍細胞と、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍の増殖と病態に関連する他の細胞種との相互作用が可能なことである。本発明のマトリクス細胞は、腫瘍細胞に対して生理学的に関連する環境を提供する。圧縮されたマトリクス細胞は、経時的に３Ｄ機能的柔組織複合体に自発的に再編成する。例えば、濃縮された脳細胞は、インタクト（ｉｎｔａｃｔ）な中枢神経系領域の多くの適切なシナプス回路、生理機能、及び、神経伝達物質受容体分布が存在する、組織様構造の形成をもたらす。本発明者らは、培養での神経細胞の機能的な活性が、脳及び器官型薄切培養での対応物に類似するということを発見した。
【００１８】
したがって、従前のモデル、特に２Ｄ培養と違って、本発明の共培養物は細胞間相互作用の生理学的な３次元ネットワークを可能にする。さらに、前記ネットワークは腫瘍細胞間の相互作用に限定されない。腫瘍細胞と周囲の非腫瘍細胞との間の、ｉｎ  ｖｉｖｏのかかる相互作用は、さまざまな理由で重要である。
【００１９】
本発明の共培養物は、腫瘍の生理学的な環境に寄与するさまざまな細胞間のシグナル伝達を可能にする。これは、成長因子、サイトカイン、ケモカイン及びマトリクス分解酵素を含むシグナルが、細胞死をもたらし、したがって、関連のある治療標的であるシグナル伝達経路での陽性又は陰性のいずれかの効果を有してもよいという特別なメリットである。
【００２０】
本発明の共培養物における細胞の３次元環境は、細胞外マトリクスの自然形成を可能にする。これは、細胞外マトリクスが細胞の挙動の重要な調節因子であり、抗がん剤に応答するため、メリットである。また、かかる３次元環境で増殖した腫瘍細胞は、２Ｄ単層で増殖した細胞よりも臨床で観察される形態に、より酷似する形態を有する。従来の２Ｄ培養、又は、異なる細胞種の３次元ネットワークを欠いている培養では、細胞外マトリクスが存在しないか、若しくはｉｎ  ｖｉｖｏで見られるものと相違する場合がある。
【００２１】
本発明による共培養した細胞によって自然に形成された細胞外マトリクスは、細胞培養に添加される場合がある人工又は簡略化したタンパク質マトリクス又は足場よりも優れている。かかる外因性のマトリクス又は足場は、ｉｎ  ｖｉｖｏ組織マトリクスに対する不完全な代替のみを提供できる。例えば、コラーゲン単体は線維の緩いネットワークのみを産生する一方、結合組織は、細孔のサイズ及び線維の厚さの不均質な構造を有する。マトリクスタンパク質を用いる方法は、高価及び変動性と、前記マトリクスの調製に対して時間を消費する操作とのデメリットを一般的に被る。また、細胞抽出物の増殖マトリクスは、前記抽出物は可変であり、ｉｎ  ｖｉｖｏで見られるものの典型である細胞間相互作用を提供しないというデメリットを有する。これらのデメリットは、本発明によって回避される全てであり、本発明では共培養した細胞が適切なマトリクスそのものを提供する。
【００２２】
本発明は、かなり高速で、割安で、全ての器官の培養、又は、器官及び組織の薄片の器官型培養でより柔軟な、生理学的に関係する環境で腫瘍細胞を培養する方法を提供し、今日までｉｎ  ｖｉｖｏの生理学的条件をより近く再現している唯一の十分な方法である。さらに、本発明の方法は、材料の入手可能性において、器官及び組織の薄切培養よりもほとんど限定されていない。
【００２３】
また、前記培養に適用された潜在的な抗がん剤が、ちょうどｉｎ  ｖｉｖｏの環境のような緊密にパッキングされた３次元柔組織に浸透するために必要とされるため、本発明の共培養で達成できる細胞の緊密な３次元パッキングは重要である。
【００２４】
本発明の共培養モデルは、腫瘍がｉｎ  ｖｉｖｏで動く方法の重要な態様を忠実に再現していることが示された。例えば、腫瘍細胞は周辺の細胞マトリクスを通って遊走する。また、本発明者らは、腫瘍細胞は、腫瘍細胞が２Ｄシステムで行うような単層での増殖よりもむしろ、関連するｉｎ  ｖｉｖｏ状態によく似ている器官型共培養物内で腫瘍様の凝集を形成するという驚くべき発見をした。したがって、重要なことには、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの器官型共培養物において、腫瘍がｉｎ  ｖｉｖｏで生じる組織から生じるマトリクス内で腫瘍様の構造を作ることができることを示した。
【００２５】
前記腫瘍細胞を取り囲んでいるマトリクス又は間質からの特定の細胞は、抗がん剤に対して腫瘍細胞を保護するように作用するというメリットを提供する。本発明の共培養物は、他の細胞のかかる影響、及び、薬物治療期間の腫瘍の細胞環境を再現できる。したがって、本発明の共培養物は、活性が周囲の細胞マトリクスによって影響され得る化合物の検討を可能にするというメリットを提供する。例えば、脳腫瘍に関連する例は、抗腫瘍化合物としてのタキソールの有効性を一部無効するように働くアストロサイトの保護効果である。皮膚では、マクロファージが腫瘍細胞に保護効果を与える場合がある。かかる細胞は、マトリクス細胞として本発明の共培養物に取り込まれる場合がある。
【００２６】
本発明の方法及び共培養物は、多くの異なる細胞種に適応可能であり、両方の異なる腫瘍種を本明細書で記載の実施例に適応可能であり、相違するマトリクス細胞種及びマトリクス組織に適応可能である。本発明の方法及び共培養物は、原則として、いずれかの種類の腫瘍細胞を培養するために用いられる場合があり、いずれかの組織種を具現化するために適応され得る。本発明の方法及び共培養物は、（マトリクス細胞として本明細書に言及される）さまざまな他の細胞種と共培養されるべき特定の腫瘍細胞に対して柔軟性を提供する。本発明は、前記腫瘍細胞と一緒に共培養物で取り込まれるべき関心のあるいずれかの細胞を与える。前記腫瘍細胞が増殖するマトリクスの組成物及び特性は、目的にかなって選択され、制御され得る。また、本発明の共培養物は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍の特性及び抗がん剤の有効性に影響する場合があり、そして、非腫瘍細胞及び腫瘍細胞との相互作用の存在が原因で生じる、さらなる因子の再現及び検討を可能にする。１つの例は、いくつかの化合物、例えば、ＴＭＺ（テモゾラマイド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ））の有効性に影響する場合がある細胞間及び細胞内のｐＨである。もう１つの因子は、酸素透過及びガス交換であり、ｉｎ  ｖｉｖｏの組織と比較して組織培養にしばしば限定される場合がある。しかし、本発明は、本発明による共培養物が気液界面に位置づけられるとき、優れた酸素透過及びガス交換を可能にする。
【００２７】
したがって、腫瘍細胞のそれらの環境との相互作用の効果が定義された手段で考慮され、研究されるとき、本発明の共培養物は、ｉｎ  ｖｉｖｏの状態により関連のある薬効データを得ることができる。したがって、本発明は、薬効に影響する因子をより理解するのに扉を開く。
【００２８】
腫瘍細胞及びマトリクス細胞の遺伝子型は患者間で変化してもよく、本発明の共培養物はこの変化の影響を個別のアッセイで研究できるような柔軟性も提供する。
【００２９】
また、本発明の共培養物において研究者が選択した腫瘍細胞及び非腫瘍細胞の両方の存在が、候補抗がん剤の有効性及び毒性の両方を同時に検討できるようにする。
【００３０】
本発明による培養は、器官の特性を数週間又は数カ月示すことができる。したがって、本発明による共培養物は、例えば、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも１０日間、少なくとも１４日間、少なくとも１７日間、又は、少なくとも２１日間、器官の特性を持続する、すなわち示す場合がある。１つの例では、本発明者らは５週間培養した。したがって、本発明による共培養物は、例えば６−５６日間、例えば７−、８−、９−、１０−、１４−、２１−、２８−、３５−、４２−、４９−５６日間、例えば７−４９又は１４−４９日間、例えば２８−４２日間、器官の特性を持続する、すなわち示す場合がある。当業者は、また、培養が持続する時間の長さは、用いた腫瘍細胞の凝集に依存すると理解する。
【００３１】
本発明の共培養物及び方法は、難儀で、調製に時間を消費する特別な細胞外タンパク質の足場を必要としないので、本発明の多様な器官型共培養物が大規模に同時に調製される場合がある。本発明の共培養物は、再現可能な手段で製造し、維持しやすい。したがって、ハイスループット型での使用に適している。これは本明細書に開示された方法全て、例えば抗がん剤候補のスクリーニング方法に適応する。
【００３２】
化合物が臨床で上手くいきそうな開発サイクルの早い段階で認識されるように、本発明の共培養物を用いる薬物のスクリーニングは顕著な金銭的利益を有する。本モデルの構造安定性（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）及び操作の容易性が、かかる評価を以前に可能であるよりもより迅速に行うことができるようにする。２次元の腫瘍単層培養で以前に機能しなかった化合物は、かかる薬物がｉｎ  ｖｉｖｏの状況をより近く示すモデルで、どのように効くかの適切な評価が行える本発明の３Ｄ共培養物で有効性を再試験することができる。また、治療のいくつかの組み合わせが相乗効果を有する場合に、薬効を確立するために新しい及び／又は確立した薬剤の組み合わせを簡単に、そして効率的に試験することができる。
【００３３】
細胞外の生物学的な足場及びマトリクスからの独立性
本発明の共培養物は、半透性支持体の１つの表面で調製され、増殖されるが、上述のように、本発明の方法及び共培養物は、外因性の足場又は細胞外マトリクスタンパク質を必要としない。
【００３４】
したがって、好ましい実施態様によると、本発明の共培養物及び方法は、コラーゲンを含む無細胞の足場などの、外因性又は前もって形成された無細胞のタンパク質の足場の使用を含まない、すなわち伴わない。かかる前もって形成された又は外因性の無細胞のタンパク質の足場の例は、基底膜（例えば、基底膜を含む不活性化した真皮）を含む又は由来の基底膜又は足場を含む。当業者が理解するように、基底膜は細胞外線維のシートである。生理学的背景では、それは上皮又は内皮の下に横たわる。インタクトな基底膜は、基底板（ｂａｓａｌ  ｌａｍｉｎａ）及び網状板（ｒｅｔｉｃｕｌａｒ  ｌａｍｉｎａ）の２種類のラミナからなる。前記基底板はＶＩＩ型コラーゲンを含む。前記網状板は微小繊維（フィブリリン）を含む。
【００３５】
本発明の好ましい実施態様では、共培養物は基底膜又は派生物、これらの構成要素又は変化物（ｖａｒｉａｎｔ）を含まない。他の好ましい実施態様では、共培養物は、前もって形成された無細胞のタンパク質の足場を全く含まない。
【００３６】
好ましくは、本発明の方法では、細胞外の足場のタンパク質は、第１又は第２の細胞懸濁液か、若しくはそれらの混合物（混合細胞の懸濁液）のいずれにも全く添加されない。好ましくは、本発明の方法では、特定の実施態様では、前記半透性支持体が、共培養物の前記支持体への接着を促進する材料で被覆される場合があることを除いては、細胞外の足場のタンパク質はその調製中に前記共培養物に全く添加されない。同様に、本発明の共培養物は、好ましくは、特定の実施態様では、前記半透性支持体が、共培養物の接着を前記支持体に促進する材料で被覆される場合があることを除いては、前もって形成された無細胞のタンパク質の足場を全く含まない。本発明の特定の実施態様では、前記半透性支持体が、共培養物の前記支持体への接着を促進する材料で被覆される場合があるが、前記共培養物は基底膜か、若しくはいずれかの派生物、これらの構成要素又は変化物を含まない。共培養物の前記支持体への接着を促進する被覆材料は、例えば、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン又はマトリゲルから選択される場合がある。前記半透性支持体それ自体は、細胞外の足場のタンパク質を含まない。
【００３７】
好ましくは、共培養物の腫瘍細胞を取り囲んでいるマトリクスに含まれる細胞外のマトリクスのタンパク質のみが、前記共培養物の細胞によって分泌され得る細胞外のマトリクスのタンパク質である。好ましくは、前記培養は、基底膜の天然又は人工の基底膜又はいずれかの派生物か、若しくは基底膜からの無細胞のタンパク質を含まない。
【００３８】
本明細書で、（特に、例えば外因性の細胞外マトリクスタンパク質又は無細胞のタンパク質の足場がないことに関する）全ての記述は、前記半透性支持体が、共培養物の接着を前記支持体に促進する材料、例えばコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン又はマトリゲルで被覆される場合があるにもかかわらず記載される。
【００３９】
特定の実施態様では、本発明の方法及び培養物は、必要に応じて、前記半透性支持体のいずれかの被覆に加えて、外因性の細胞外マトリクスタンパク質又は無細胞のタンパク質の足場などの上記のようないずれかの構成要素を取り込むことが可能である。
【００４０】
本発明の共培養物でのマトリクス及び腫瘍細胞
本発明によると、マトリクス細胞は、腫瘍細胞が最初に均一に播種されるマトリクスを提供する。したがって、本発明によると、腫瘍細胞はマトリクス細胞のマトリクス内に３次元に配置される。前記腫瘍細胞はマトリクス内で培養される。前記腫瘍細胞は、いくつかの実施態様ではマトリクスを通って遊走する場合がある。
【００４１】
好ましくは、前記腫瘍細胞は腫瘍様の凝集を形成する。かかる凝集は、マトリクス内に一般的に形成され、例えば、マトリクス内に３次元に配置される。当業者が理解するように、腫瘍様の凝集は、例えば、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、又は、少なくとも５０個の腫瘍細胞を含んでもよい。例えば、前記腫瘍細胞は少なくとも１０個の細胞の凝集の形態で存在してもよい。他の実施態様では、前記腫瘍細胞は少なくとも１５個の細胞の凝集の形態で存在してもよい。
【００４２】
もう１つの実施態様では、前記腫瘍細胞は細胞マトリクス中で増殖するが、凝集しない。用いられた腫瘍細胞種に応じて、前記細胞は、細胞マトリクスの至る所で凝集を形成するか、若しくは播種される場合がある。また、これは、前記細胞マトリクスを形成するために用いられた細胞種によって影響される場合がある。特定の実施態様では、前記腫瘍細胞は凝集を形成しないが、むしろ細胞マトリクスの末梢に遊走する。これは、例えば、ラット脳細胞で増殖した哺乳類の卵巣がん細胞について観察されている。
【００４３】
本発明の方法及び共培養物で用いられた細胞
一般
本発明の器官型共培養物は、多種多様の細胞、多種多様の器官及び組織から調製できる。工程で用いられる細胞の性質は、必要とされる器官型腫瘍共培養物に依存する。
【００４４】
前記共培養物を調製するための方法で用いられた細胞は解離細胞である。つまり、前記腫瘍細胞及び前記マトリクス細胞の両方は、培養の形成の前に解離される。「解離される」とは、前記細胞は、懸濁液中で凝集されず、細胞間接着を受けず、そして、個別化されることを意味する。前記共培養物を調製するための方法で用いられた細胞は、例えば、解離１次細胞、又は、組織培養、例えば細胞株、例えば腫瘍細胞株からの解離細胞の場合がある。「１次細胞」とは、生物の器官又は組織から直接的に単離された細胞をいう。
【００４５】
（腫瘍及びマトリクス細胞として）本発明の共培養物で用いるための細胞は、器官の特定の領域から得られてもよい。例えば、供給源の器官が脳である場合、前記細胞は海馬又は大脳皮質から得られてもよい。器官が心臓である場合、前記細胞は心筋から得られてもよい。
【００４６】
好ましくは、本発明で用いられる前記細胞（マトリクス及び／又は腫瘍細胞）は哺乳類由来である。好ましい実施態様では、前記細胞はヒト由来である。
【００４７】
本発明の方法及び共培養物で用いられる細胞（例えば、腫瘍細胞）は、幹細胞の場合がある。本明細書で用いられる「幹細胞」という用語とは、少なくとも多能性であり、したがって、１種類以上の系統に分化を誘導されることができる細胞をいう。いくつかの幹細胞は、多数の細胞系統に分化可能である。幹細胞は、例えば、生体幹細胞、（例えば非ヒト哺乳類、例えば非ヒト霊長類、げっ歯類又はマウスからの）胚生殖細胞、又は、（例えば非ヒト哺乳類、例えば非ヒト霊長類、げっ歯類又はマウスからの）胚幹細胞の場合がある。胚幹細胞は、原則として、いずれかの細胞種に分化できる。胚幹細胞が用いられる場合に、胚幹細胞は、法的及び倫理的問題が対処されることを条件として、ヒト胚幹細胞を用いることができる。胚幹細胞、例えばヒト胚幹細胞は、存在する非幹細胞株、例えば、ＮＩＨヒト胚幹細胞登記簿（Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）に表示された細胞株から得られる場合がある。また、幹細胞は腫瘍で発見されている。かかる腫瘍幹細胞（また、がん幹細胞と称される）は、本発明による器官型共培養物を作製するために、単離し、腫瘍細胞として用いられることができる。
【００４８】
前記細胞は遺伝子操作される場合があり、例えば、前記細胞はトランスジェニック動物、例えばトランスジェニック非ヒト哺乳類から生じる場合がある。
【００４９】
マトリクス細胞
本発明によると、マトリクス細胞は本発明の腫瘍細胞と相違する細胞を含む。マトリクス細胞は本発明の腫瘍細胞と相違する少なくとも１種類の細胞種を含む。
【００５０】
前記マトリクス細胞は単一の細胞種からなってもよく、又は、１種類以上の細胞種を含んでもよい。例えば、前記マトリクス細胞は、少なくとも２種類の相違する細胞種か、若しくは３、４、５、６、７、８、９又は１０種類の細胞種を含んでもよい。特定の好ましい実施態様では、マトリクス細胞は組織型の腫瘍に存在する細胞種に属する。（例えば、腫瘍侵襲性、又は、腫瘍への相違する周囲の細胞マトリクスの影響を調べるための）他の実施態様では、前記マトリクス及び腫瘍細胞は、相違する起源に属してもよく、又は、代表的な相違する組織型又は器官となってもよい。原則として、マトリクス細胞を含んでもよく、又は、前記マトリクス細胞の組成は、関心のある組織型又は器官に存在する、代表的ないずれか又は全ての細胞種（例えば、組織型の腫瘍細胞）で代表されてもよい。
【００５１】
前記マトリクス細胞は、１次組織由来か、細胞又は組織培養又は細胞株由来かの細胞を含んでもよい。マトリクス細胞は非がん性の場合がある。また、前記マトリクス細胞はがん性の場合があり、不死化細胞を含む場合がある。つまり、前記マトリクス細胞は、前記マトリクス細胞が本発明の共培養物の腫瘍細胞と相違することを条件として、いくつかの実施態様では、がん性細胞又は腫瘍細胞を含む場合もある。好ましくは、前記マトリクス細胞は、非がん性細胞、例えば非腫瘍細胞を含む。好ましい実施態様では、マトリクス細胞は非がん性細胞からなる。
【００５２】
前記マトリクス細胞は、いずれの細胞、組織又は器官の種類に属してもよい。前記マトリクス細胞は、幹細胞、１次細胞、間質細胞、又は、動物組織、ヒト生検材料、ヒト死体組織、細胞株及びヒト幹細胞由来のヒト組織、中枢神経系、脳、脊髄、骨髄、血液（例えば単球）、脾臓、網膜、胸腺、心臓、乳腺、肝臓、膵臓、甲状腺、骨格筋、腎臓、肺、腸、卵巣、膀胱、精巣、子宮、及び、結合組織から選択される供給源由来の細胞を含む場合がある。
【００５３】
腫瘍細胞
同様に、前記腫瘍細胞は、いずれの細胞、組織又は器官の種類に属してもよい。特に、前記腫瘍細胞は、前記マトリクス細胞について上記のいずれかの種類に属してもよい。前記腫瘍細胞は、細胞株由来か、若しくは１次がん細胞由来であってもよい。また、前記腫瘍細胞は、がん幹細胞の場合がある。好ましくは、前記腫瘍細胞は、幹細胞、膵臓、血液、頸部、大腸、腸、腎臓、脳、乳腺、卵巣、前立腺、皮膚、肝臓、肺、及び、脾臓の腫瘍から選択されるか、若しくは由来であってもよい。
【００５４】
本発明の方法の態様
好ましくは、本発明の方法ステップ（ｄ）における気相に面している半透性支持体の表面上での混合細胞のインキュベーション中に、前記腫瘍細胞は、前記マトリクス細胞によって形成されたマトリクス内に３次元に配置されて増殖する。
【００５５】
本発明の方法によると、第１及び第２の細胞懸濁液での細胞が解離細胞である。
【００５６】
本発明の方法は、第１及び／又は第２の細胞懸濁液を提供するためのステップを含んでもよく、前記ステップは固形組織の供給源から解離している（すなわち、分散している）細胞を含む。つまり、第１及び／又は第２の細胞懸濁液は、解離した（すなわち、分散した）細胞を含む。固形組織の供給源は、例えば、生物（すなわち被験体）から得られた組織試料であってもよく、又は、固形組織培養であってもよい。
【００５７】
器官から解離細胞を単離する方法は従来技術として知られる。解離細胞は、組織の機械的又は酵素的解離、又は、機械的及び酵素的解離によって、関心のある器官から単離されてもよい。例えば、前記解離細胞は、カルシウム及びマグネシウムを含まないタンパク質分解酵素トリプシン０．２５％（ｗ／ｗ）ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）を用いる器官の解離によって得られることがある。酵素的解離を止めるためのトリプシン阻害剤の添加後、前記細胞は、解離していない細胞を底に落とすようにするために懸濁液中で簡単にインキュベーションされ、懸濁液中に解離細胞を残してもよい。また、前記細胞は、粉砕することによって機械的に解離され、穴のサイズを小さくしながら滑らかなガラスピペットを使って組織片の吸引が繰り返され、得られた細胞は、セルストレイナー（ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒ）を使ってデブリ（ｄｅｂｒｉｓ）と分離することができ、結果として生じた細胞懸濁液は、酵素で解離した組織について準備される。
【００５８】
また、腫瘍細胞懸濁液は、フラスコ内で所望の腫瘍細胞株を培養すること、及び、その後、接着細胞のトリプシン処理か、非接着細胞のデカンテーションかのいずれかによって前記細胞を採取することによって調製されてもよい。また、生検材料からの腫瘍細胞が用いられてもよい。ここで、前記細胞はトリプシン処理及び／又は粉砕によって分散されてもよい。その後、除去された細胞は懸濁培地で洗浄され、その後、計測され、遠心分離によって圧縮される。その後、腫瘍細胞の得られたペレットは、細胞の割合の単純計算を可能にするのにマトリクス細胞と同一濃度に懸濁培地で再懸濁される。
【００５９】
生細胞は剛体として行動しないが、実質的に非濃縮体（ｉｎｃｏｍｐｒｅｓｓｉｂｌｅ  ｂｏｄｉｅｓ）として行動する。生細胞は変形し、お互いに接着するためにそれらの表面を適応させるが、それらが液体を失わない場合には、それらの容積は実質的に一定のままである。十分な圧縮力が適用される場合には１００％緊密にパッキングが達成され、すなわち、前記細胞は、隣接細胞の細胞膜と接触し、全ての細胞膜で完全に緊密にパッキングされる。１００％緊密なパッキングは、細胞が液体を失わない段階に細胞を加圧することなく、特定の細胞サイズについての単位体積あたりの最大数の細胞である。その培養を含む構成要素間での緊密なパッキングの平均割合は、少なくとも約１０％、より好ましくは５％である場合、細胞の培養は器官型培養として機能することが発見された。解離細胞は、緊密なパッキングの好ましい割合を達成するために、いずれかの既知の方法によって圧縮されてもよい。適用される圧縮力（ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒｃｅ）は、細胞損傷を起すことなしに、所望なレベルの緊密なパッキングを達成するために、細胞を緊密な接触に十分に加えられるべきである。好ましくは、前記解離細胞に適用される圧縮力は、前記細胞への損傷を回避するために、細胞あたり２ｘ１０−３ダイン未満であり、より好ましくは細胞あたり１０−５ダインから、細胞あたり５ｘ１０−４ダインまでである。
【００６０】
細胞懸濁液を調製するために、前記細胞は、グラビテイション（ｇｒａｖｉｔａｔｉｏｎ）、流体力又は静水力（ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｃ  ｆｏｒｃｅｓ）によって圧縮されてもよい。好ましくは、前記細胞は、遠心分離によって適用される重力場によって濃縮される。また、前記細胞は吸引によって圧縮される。また、圧縮の１つ以上のメカニズムの組み合わせが用いられてもよい。例えば、前記細胞は遠心分離し、その後、実質的に吸引することによって圧縮されてもよい。前記細胞はグラビテイションによって沈降可能にされてもよい。遠心分離は、高速なほど好ましく、培地中で無酸素条件のために細胞損傷のリスクがない。得られたペレットは、例えば、上清をデカンテーションすることによって上清から単離される。前記ペレットは、所望の細胞濃度に適切な液体培養培地で再懸濁されてもよい。腫瘍細胞の懸濁液は、標準的な手順を用いる類似の手段で調製できる。その後、両方の培養での細胞は、混合物は腫瘍細胞に対して非腫瘍細胞の所望の割合で調製できるため、測定できる。
【００６１】
前記細胞が遠心分離によって圧縮される場合、好ましくは、懸濁液中の細胞は、細胞あたり１０−５ダインから、細胞あたり５ｘ１０−４ダインまでの好ましい範囲で力を適用する１００−５００ｇでの遠心分離によって圧縮される。
【００６２】
前記細胞は個別に圧縮されてもよい。前記ペレットは、細胞の所望の割合を提供するために、個別に培地で再懸濁されてもよい。その後、腫瘍細胞懸濁液（第１細胞懸濁液）マトリクス、及び、マトリクス細胞懸濁液（第２細胞懸濁液）が、必要とされる量で組み合され、支持体上に配置される。代替的には、混合された細胞懸濁液は、前記支持体上に配置される前に、特定の密度で再凝集するためにわずかに遠心分離されてもよい。
【００６３】
インキュベーション前の腫瘍細胞に対するマトリクス細胞の割合は特に限定されず、当業者が適切な細胞の割合を容易に決定できる。多くの実施態様では、インキュベーション前に、混合される細胞懸濁液は、０．００１％ないし９９．９９９％の腫瘍細胞に対する９９．９９９％ないし０．００１％のマトリクス細胞の割合で細胞を含む。代替的には、大部分の実施態様では、腫瘍細胞に対するマトリクス細胞の割合は、１０４から１０−４までの範囲として表現される場合がある。好ましくは、細胞の割合は、９９．５％から７０％までのマトリクス細胞及び０．５％から３０％までの腫瘍細胞であり、９９％から８０％までのマトリクス細胞及び１％から２０％までの腫瘍細胞であり、９９％から９０％までのマトリクス細胞及び１％から１０％までの腫瘍細胞であり、又は、９８％から９２％までのマトリクス細胞及び２％から８％までの腫瘍細胞である。代替的には、腫瘍細胞に対するマトリクス細胞の好ましい割合は、２００：１から２：１まで、又は、１００：１から１０：１まで、又は、５０：１から１０：１までの範囲として表現される場合がある。好ましい実施態様によると、インキュベーション前の混合される細胞は、１００：１から１０：１までのマトリクス：腫瘍の細胞割合でのマトリクス細胞及び腫瘍細胞を含む。マトリクス細胞の割合は、例えば２５：１から１５：１まで、例えば２２：１から１８：１まで、例えば２１：１から１９：１まで、例えば５％の腫瘍細胞に対して９５％のマトリクス細胞の範囲であってもよい。
【００６４】
本発明の方法において、混合された細胞は、（例えば、本発明のステップ（Ｃ）において）いずれかの適切な方法、例えば、毛細管現象、蒸発乾燥、遠心分離、グラビテイション、吸引（ｓｕｃｔｉｏｎ）又は吸引（ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）によって圧縮及び／又は濃縮されてもよい。
【００６５】
いくつかの実施態様では、ステップ（Ｃ）は、混合された細胞の遠心分離と、上清の液体懸濁培地の除去とを含む。いくつかの実施態様では、混合された細胞は、ステップ（Ｃ）での遠心分離及び上清液体懸濁培地の除去後に、ステップ（ｄ）の支持体に配置されてもよい。また、混合された細胞は、遠心分離によってステップ（ｄ）の支持体に配置されてもよい。かかる遠心分離は、ステップ（Ｃ）で用いられるのと同一の遠心分離の場合がある。
【００６６】
好ましい実施態様では、ステップ（ｄ）は前記支持体で前記細胞をさらに圧縮できるようにすることを含む。前記支持体でのさらなる圧縮は、例えば、蒸発乾燥及び／又は毛細管現象による場合がある。例えば、ステップ（ｄ）の前記毛細管現象は、前記混合された細胞をさらに圧縮してもよい。また、ステップ（ｄ）の毛細管現象は、ステップ（Ｃ）の混合された細胞を圧縮及び／又は濃縮してもよい。
【００６７】
つまり、混合された細胞の圧縮は、第２表面（例えば、前記支持体の反対側）で毛細管現象によって保持される液体培地によって与えられる毛細管力によって達成されてもよい。前記毛細管現象は、本発明の方法の混合された細胞が懸濁される液体懸濁液培地の体積、つまり器官型共培養物の液体体積を減少させ、つまり前記細胞を緊密な接触の状態にする場合がある。
【００６８】
前記細胞が吸引（ｓｕｃｔｉｏｎ）又は吸引（ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）によって濃縮及び／又は圧縮される場合、腫瘍細胞及び非腫瘍細胞を含む混合細胞懸濁液は、支持体の第１面（表面）、及び、前記支持体の第２（例えば反対）面（表面）に適用される吸引部に配置されてもよい。これは、前記混合された細胞の濃縮及び／又は圧縮をもたらす場合がある。細胞が配置される支持体は、前記支持体の反対面上の細胞の圧縮で、支持体の１つの面に適用される吸引部を効率的になるように適合されてもよい。
【００６９】
また、混合された細胞は、前記支持体を通じて流量を駆動することによって流体力を細胞に適用するポンプの作用によって圧縮されてもよい。その後、前記ポンプは、圧縮されるべき前記混合された細胞として前記支持体の同一面に配置される。
【００７０】
単一の細胞種又は単一の器官から器官型培養を調製する方法がＷＯ２００６／１３６９５３に記載され、その内容が引用によって本明細書によって取り込まれる。
【００７１】
当業者が理解するように、本発明の共培養物のインキュベーションは、前記細胞種に対して適切な温度、湿度及びＣＯ２の標準的な条件下で行われてもよい。例えば、前記インキュベーションは、２０−４２°Ｃ、例えば、２２−４１、２６−４０、３０−４０、３２−３９、３４−３９又は３６−３８°Ｃ、又は、３０−３７°Ｃ、又は３２−３７又は３４−３７°Ｃで実行されてもよい。好ましくは、前記インキュベーションは３４−３８°Ｃ、例えば３７°Ｃで実行される。
【００７２】
また、本発明の方法は、供給源から細胞を得るステップを含む場合がある。前記供給源は組織又は器官の試料の場合がある。また、前記供給源は被験体、例えば、ヒト及び／又は非ヒト被験体、例えばヒト及び／又は非ヒト哺乳類の場合がある。所望な組織又は器官の試料は、例えば、屠殺された哺乳類、術中の生検材料又は死体の材料から得られてもよい。
【００７３】
本発明の方法は、さらに、器官型共培養物を低温保存するステップを含んでもよい。低温保存は、培養物の蓄積及び貯蔵をスクリーニングの目的で用いられるようにする。典型的には、前記低温保存は液体窒素の温度で凍結することによって達成される。
【００７４】
本発明は、本明細書で説明される方法によって得ることができるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの３次元器官型細胞共培養物を提供する。
【００７５】
培地
都合のよいことには、本発明に従って用いられた培地は、液体の形態、例えば、液体懸濁培地又は液体培養培地の場合がある。好ましくは、本発明による培養培地は、共培養される細胞種全ての増殖を支持する完全増殖培地を含む。最も適切な培地は、培養での細胞が生じる器官（又は器官）に依存して変わってもよい。好ましくは、培地は、器官型増殖に必要な栄養を提供する。脳組織用の適切な液体培地の例が、例えば、Ｓｔｏｐｐｉｎｉ  Ｌ．ら（１９９１）及びＭｕｌｌｅｒら（２００１）で記載される。他の器官用の他の適切な培地は発表されるか、若しくはそれらの器官から生じる細胞の培養から得ることができる。用いるべき適切な培養培地は、当業者の知識の範囲内である。用いられる増殖条件及び培地は、通常は、腫瘍細胞が培地組成によって影響されないように、マトリクス細胞によって好ましいものである。
【００７６】
本発明による半透性支持体及びその使用
いずれかの適切な支持体は、支持体が半透性であることを条件として、混合された細胞の共培養物を増殖するために用いられてもよい。したがって、前記支持体は浸透性又は半浸透性である。支持体は半透性膜の場合がある。
【００７７】
好ましくは、前記半透性支持体は、親水性ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン；デュポン商標テフロン（登録商標））、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）又は酸化アルミニウム（例えば、アノポア（商標）、ワットマン社）を含む。また、前記支持体は、ＰＴＦＥ、ＰＥＴ又は酸化アルミニウムからなる場合がある。前記支持体は、いくつかの実施態様では光学的に透明な場合がある。これは、対物レンズを有する顕微鏡を使用し、表面の片側から細胞を見えるようにすることができる。
【００７８】
前記支持体は、接着を促進する材料で被覆されてもよい。前記被覆は、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン又はマトリゲルで被覆される。好ましくは、前記支持体は生体分子で形成されず、細胞又は無細胞の足場は、接着被覆を除いて、細胞外足場タンパク質又は細胞外マトリクスタンパク質を含まない。本発明の好ましい実施態様では、前記支持体は基底膜を含まない。好ましくは、前記支持体は、天然又は非天然の基底膜を含まない。好ましくは、前記支持体は、基底膜を含む又は由来のいずれの足場も含まない。
【００７９】
本発明の方法によると、共培養物は、気相に面している第１支持体に配置され、前記支持体の第２表面が面し、液体培養培地と接触する。前記液体培養培地は前記支持体と接触し、表面張力及び／又は毛細管の理由で培養物と接触して保持される。したがって、好ましくは、前記支持体は、前記支持体を透過するための液体培地についての顕著な多孔性を有し、反対の表面で共培養物に至る。好ましくは、液体培養培地は、前記支持体と接触し、表面張力及び／又は毛細管の理由で培養物と接触して保持される。前記支持体の共培養物は、液体培養培地に入れられず、むしろ培養培地の薄い膜によってのみ被覆される。これは、培地と共培養物との間でよりよいガス交換を可能にする。
【００８０】
遺伝子操作
前記マトリクス細胞及び／又は腫瘍細胞は、遺伝子操作されてもよい。例えば、前記マトリクス細胞及び／又は腫瘍細胞はトランスジェニック、又は、別の方法で遺伝子操作された動物（例えば、非ヒト哺乳類、非ヒト霊長類、げっ歯類又はマウス）由来の場合がある。トランスジェニック又は別の方法で遺伝子操作された動物は組換えゲノムを有する。天然で起こるよりもむしろ、意図的な改変が行われた。
【００８１】
一般的に、共培養物の腫瘍又はマトリクス細胞のいずれかは、遺伝子操作される場合がある。つまり、それらは組換え体の場合がある。ここで、「遺伝子操作」及び「組換え」という用語は互換的に用いられてもよい。
【００８２】
特定の好ましい実施態様では、腫瘍細胞は遺伝子操作される。前記腫瘍細胞は遺伝子操作によってトランスフォーメーションされていてもよく、すなわち、がん性の特性が遺伝子操作によって腫瘍細胞に授けられてもよい。代替的又は付加的に、腫瘍細胞は、がん性の特性を腫瘍細胞に授ける遺伝的特性に加えて遺伝子変化を含むように、前記腫瘍細胞は相違する態様で設計されてもよい。例えば、前記腫瘍細胞は、レポーター遺伝子又は耐性遺伝子を運ぶために遺伝子操作されてもよい。特定の好ましい実施態様では、したがって、腫瘍細胞はレポーターシステムで標識される。
【００８３】
前記マトリクス及び／又は腫瘍細胞は、器官型培養に配置する前に遺伝子操作することができる。例えば、遺伝子操作は、それらの細胞の解離懸濁液上で実行される。一般的に、１種類以上の導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）が、適切なベクターでトランスフェクション又は形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）によって導入される。また、ｓｉＲＮＡを発現するベクターが導入されてもよい。
【００８４】
前記共培養物での前記細胞の遺伝子操作は本モデル応用の多くの態様に適用でき、例えば、薬剤標的又はバイオマーカーの発現を変調するために前記細胞は遺伝的に改変されてもよい。バイオマーカーは分子マーカーであり、特定のレベル又は特定の分子形態での存在が病的状態の存在を示す。薬剤標的は、疾病過程に作用するために変調できる分子種、すなわち薬物が作用する分子である。創薬では、薬剤標的の機能の性質又はレベルを変化させることが、疾患の転帰で肯定的な影響を有さなければならず、標的は改変の影響を受けやすい分子種となるべきである。多くの場合には、薬剤標的についての情報は遺伝子その他の生物学的研究から得られ、それらの標的と相互作用することが知られる化合物の分類が利用可能である。しばしば、生物系でそれらのバイオマーカー及び薬剤標的のレベルを変調すること、及び、生物学的影響を研究することが望ましい。時折、使用可能な薬物の組み合わせは、複数の細胞種及び／又は隣接の細胞種で、同一の標的で作用するか、若しくは多くの相違する標的で作用できる。
【００８５】
また、腫瘍細胞は、細胞を視覚的に追跡できるようにする蛍光マーカー等の視覚的マーカーを発現するために遺伝的に変えられてもよい。これは、腫瘍細胞をライブイメージング（ｌｉｖｅ  ｉｍａｇｉｎｇ）中に瞬時に同定できるようにする。
【００８６】
クローン化した遺伝子を発現するための技術と、クローン化した又は内在性の遺伝子の発現を除去するための技術とは公知技術である。これらの技術は、本発明の方法で用いられる細胞で薬剤標的又はバイオマーカー等のマーカーの発現を増加又は減少するために用いられてもよい。例えば、薬剤標的の発現は、前記細胞が圧縮され、器官型培養が調製される前に、選択した解離細胞で変調されてもよい。単一の解離細胞はより容易に操作できるため、このアプローチは、最終的な器官型培養で薬剤標的の発現を変化させるための試みよりもより効率的である。
【００８７】
クローン化した又は内在性の遺伝子の発現を増加するための技法は、細胞の発現系を採用する形態で異種のＤＮＡの導入に基づき、多くの相違するアプローチが当業者に周知である。いくつかの場合には、裸のＤＮＡが脂溶性のトランスフェクション試薬とともに用いられる場合があり、前記ＤＮＡは、発現されるべき遺伝子と同一線上の（ｃｏ−ｌｉｎｅａｒ）強力なプロモーターと、導入したＤＮＡの細胞質性の再現を可能にする複製開始点とを含む。別の場合には、ウイルスベクターが、ＤＮＡの導入の効率性を増加するために用いられてもよい。同様に、遺伝子発現を除去するための方法が当業者に周知であり、前記方法は、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、及び、２本鎖ＲＮＡ干渉を含む。いくつかの場合には、裸の核酸が用いられてもよい。別の場合には、特に、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を使用するためには、発現ベクターは、自己集合性のへパリン形態で分子を発現するために用いられる場合がある。また、それらが細胞の外側から内側まで輸送を促す実体に付与されることを条件として、タンパク質が細胞に直接的に導入できることが示されている。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＴａｔタンパク質はかかる実体の１つであり、トランスフェクションされるべきタンパク質はＨＩＶ−Ｔａｔとの融合タンパク質として提供され、細胞に導入されてもよい（Ｂｅｃｋｅｒ−Ｈａｐａｋ  Ｍ．ら、２００１）。
【００８８】
また、上記のように、前記マトリクス細胞をトランスフォーメーション又はトランスフェクションする代わりに、本発明の方法で用いられる器官由来細胞がトランスジェニック動物由来であってもよいことは当業者に明らかである。例えば、前記器官由来細胞は、蛍光マーカー等の視覚的マーカーを発現するトランスジェニック動物、特定の薬剤標的又はバイオマーカーの発現が増加又は減少しているトランスジェニック動物由来であってもよい。
【００８９】
本発明の共培養物及び方法の特定の好ましい実施態様では、腫瘍細胞は遺伝子操作されていない。例えば、前記腫瘍細胞は、遺伝子操作のステップなしにトランスフォーメーションした第１腫瘍細胞、又は、がん細胞株に由来する場合がある。いくつかの実施態様では、前記マトリクス細胞は遺伝子操作されていない。いくつかの実施態様では、前記腫瘍細胞又は前記マトリクス細胞のいずれも遺伝子操作されていない。
【００９０】
本発明の適用、使用、キット及び装置
また、本発明の共培養物は抗がん剤をスクリーニングする方法で用いられてもよい。したがって、本発明は試験薬剤と本発明の共培養物とを接触することを含む方法を提供し、ここで、共培養物の腫瘍細胞の成長、増殖、生存能力、生存、又は、遊走における試験薬剤の阻害効果は前記試験薬剤が候補抗がん剤であるということを示す。
【００９１】
また、本発明は、がんマーカー及び／又はがん薬剤標的を同定及び／又は検証する方法での本発明の共培養物の使用を提供する。
【００９２】
また、かかるスクリーニング、同定又は検証の方法は、本明細書に記載された方法に応じる共培養物の調製を含む。
【００９３】
本明細書に記載された共培養物及び方法が、例えば、抗がん化合物のスクリーニング（又は２次スクリーニング）用のハイスループット型で用いられてもよい。
【００９４】
本発明のさらなる態様では、本発明による１種類以上の共培養物を含むアッセイキットが提供される。
【００９５】
本発明のもう１つの態様では、本発明による１種類以上の共培養物を含む化合物をスクリーニングするための装置が提供される。
【００９６】
本明細書に記載された方法での使用に適合できる適切な装置は、ＷＯ２００６／１３４４３２に記載され、その内容が全体として引用により本明細書に取り込まれる。前記装置は、本発明による１種類以上の培養物を含んでもよい。前記装置は、１つの開口端と、本明細書に記載された共培養物を調製する方法に従って共培養物が増殖できる半透性支持体（例えば、多孔性膜）によって閉ざされた１つの端とを有する培地導管（ｍｅｄｉｕｍ  ｃｏｎｄｕｉｔ）を有してもよい。本明細書で記載されたように、共培養物が気相に面する場合があり、本発明の共培養物は、前記支持体の第１表面上に配置される場合があり、前記培地導管は前記支持体の第２表面上に位置づけられる場合がある。前記培地導管は、共培養物に栄養を供給するため、液体培養培地とともに供給されてもよい（すなわち含んでもよい）。前記液体培養培地は、表面張力及び／又は毛細管現象によって前記支持体及び前記共培養物と接触し、前記培地導管で保持される場合がある。
【００９７】
各培養物は、個別の表面又は大きな表面の個別の部分で維持され、個別に育てられてもよい。前記装置は、装置１つあたり複数の並列共培養物、好ましくは、装置１つあたり２個、４個、８個、１６個、２４個、９６個、３８４個、１５３６個以上の並列培養を提供するために適合されてもよく、又は、個別の共培養物を扱っているそれぞれの、複数の装置、好ましくは、２個、４個、８個、１６個、２４個、９６個、３８４個、１５３６個の装置が並列で用いられてもよい。
【００９８】
また、１種類以上の共培養物は、将来の抗がん化合物の有効性を試験する等のがん研究でさまざまな因子を試験するためのアッセイキットに取り込まれることができる。
【００９９】
本発明の共培養物、装置又はアッセイキットは、本発明の共培養物で電気生理学的パラメーター又は細胞代謝等の生理学的又は環境的パラメーター、及び、特に細胞の生存能力又は生存のいずれかの指標をモニターするための手段でさらに含んでもよい。かかる手段は、例えば共培養物の成長又は維持の間、又は、本明細書に記載されたスクリーニング、同定又は検証の間、例えば候補抗がん剤のスクリーニング又は試験の間に細胞環境をモニターできるようにする。
【０１００】
本発明の共培養物で生理学的又は環境的パラメーターをモニターする手段は、電気生理学的パラメーター又は応答（例えば電極）と、バイオセンサーとを測定する手段を含む。
【０１０１】
バイオセンサーは共培養物内の細胞代謝及び細胞外環境をモニターしてもよい。例えば、１種類以上のバイオセンサーが、本発明の共培養物で、１種類以上の代謝パラメーター及び／又は代謝産物をモニターしてもよい。代謝パラメーター及び／又は代謝産物は細胞内又は細胞外であってもよい。例えば、バイオセンサーは、乳糖、ブドウ糖、グルタミン及びｐＨから選択される少なくとも１種類の代謝パラメーター又は代謝産物をモニターする場合がある。またバイオセンサーは、細胞の生存能力又は生存の指標をモニターしてもよい。細胞の生存能力又は生存の指標は本技術分野で一般的に知られている。例えば、バイオセンサーは細胞の生存の指標として乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）をモニターしてもよい。
【０１０２】
したがって、共培養物は、腫瘍細胞が非腫瘍細胞マトリクスにおいて増殖するように、腫瘍細胞の環境で生理学的変化をモニターするためか、若しくは腫瘍細胞の成長、構造、生存能力又は生存への細胞環境を操作する効果をモニターするために用いられる。また、凝集体の形成及び細胞の遊走は、もちろんモニターされる。また、ガス貫通及び／又はガス交換は、例えば酸素圧がモニターされる。培養物が薄いとき、培養での低酸素状態の変化程度の効果を研究するために培養を通じて前記酸素圧を操作することができる。腫瘍内での低酸素状態の程度は、腫瘍形成、浸潤及び増殖における重要な因子となることが知られている。
【０１０３】
本発明の共培養物は、使用、維持及び操作のためにシンプルである。本明細書に記載されたモニター及び測定は、リアルタイムで行われてもよい。また、本明細書に記載されたモニター及び測定は、侵襲的手段なしで行われる場合がある。したがって、共培養物は、損傷することなしにイメージングすることによって経時的にモニターすることができる。
【０１０４】
本発明の共培養物モデルは経時的に材料を採取しやすくする。単一のバッチの培養からの試料は、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質と、免疫組織化学的分析のために数週間にわたって採取できる。組織採取が各時点で動物の屠殺を一般的に必要とする場合に、これは異種移植を超えるメリットである。したがって、本発明は、動物実験を減少、改良及び置換することができ、したがって、大規模な研究が必要な場合に費用を減少でき、倫理的配慮を最小限にできる。
【０１０５】
本発明の共培養物のさらなる適用は、より詳細に細胞間相互作用又は薬剤治療に関係する経路を調べるための能力である。本発明者らは、腫瘍が、同一腫瘍細胞株の赤色及び緑色を呈する細胞を用いて、脳細胞の同一の共培養物にてそれらを等量で混合することによって、組織内で細胞のクローン性増殖とは対象的に腫瘍細胞の遊走によって発達することを本明細書で示した（実施例５を参照せよ。）。前記細胞はクローン的に増殖している場合には、前記細胞は多くの単一に着色した凝集を産生するであろう。しかし、凝集体は最初の播種と比較して数少ないということ、及び、赤色と緑色の両方の細胞が結果として生じる凝集体に存在することが観察された。この観察は、マトリクス細胞からの細胞シグナルに応答するマトリクス内の細胞の遊走を強く示唆する。これらの遊走に関係する経路は、遊走での阻害効果がどのようなものかを見るために解析できる。例えば、かかる解析は、関心のある細胞過程を阻害するためのＲＮＡｉ又は他の特別な阻害化合物を用いて実施されてもよい。ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質解析の一般的に既知の方法が、遺伝子が細胞と腫瘍の相互作用の間に発現することを示すために用いられる。本発明の共培養物は、力強く、そして操作しやすく、したがって、全てのこれらの解析の方法に非常に適している。
【０１０６】
細胞シグナルへの応答は、細胞の正常な機能に依存する。いくつかの場合には、かかるシグナルに応答する細胞は、神経細胞の軸索突起等の細胞突起の伸長に伴って応答する場合がある。他の場合には、前記細胞は、細胞、すなわち前記シグナルを産生している細胞の方向か、若しくは細胞から遠ざかる方向のいずれかに培養物を介して細胞運動をもたらす細胞過程に伴って応答する場合がある。代替的に、応答した細胞は、それらが別の過程を経る細胞分裂又は細胞分裂の阻害に伴って応答する場合がある。また、応答する細胞が、１次シグナルに最初に応答しない細胞に２次応答をもたらす別のシグナルを産生することによって応答する場合がある。このようにして、細胞の数、機能及び分布のさまざまな変化が、培養物の器官型性状を反映して、培養期間中に培養物で生じる場合がある。
【０１０７】
本発明の共培養物は、第１腫瘍細胞がそれらが生じる組織のマトリクス細胞で行動し、相互作用する方法、及び、それらが転移する組織のマトリクス細胞で行動し、相互作用をどのようにするかを研究するために用いられる場合がある。転移は、１種類の組織で発達する腫瘍が遊走し、別の組織種に浸潤する過程である。例えば乳がんは乳房組織で発達するが、他の器官、例えば脳に転移できる。本発明の共培養物での細胞、特に腫瘍細胞の行動及び特徴の違いは、転移過程に重要な見識を提供する。
【０１０８】
本発明の共培養物モデルは、腫瘍の縮小又は腫瘍細胞の死で有効となる化合物又は治療計画を試験するために用いることができる。腫瘍がモデル内で形成した後に腫瘍の縮小をモニターすることができるか、若しくは腫瘍細胞数を低下するのに有効な化合物を試験することができる。これらの試験は、単一の化合物で、又は、相乗効果が生じる場合がある一連の化合物での治療で行うことができる。相違する濃度及び相違する組み合わせの多数の化合物が迅速に試験できる。また、細胞間相互作用は、試験すべき非腫瘍マトリクス細胞での化合物の毒性の同時研究を可能にする。前記マトリクス細胞と前記腫瘍細胞との相互作用は、がん患者で発見されることをよりはっきりと示すモデルで化合物を試験することを可能にする。この種類のアッセイは２Ｄ又は３Ｄのいずれかの腫瘍細胞の単一培養に対して有効であるにもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｖｏで有効ではない化合物を除去するだけではなく、単一培養で有効ではないにもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｖｏで有効な化合物を示すこともできる。また、化合物の添加前に腫瘍細胞を凝集するようにして腫瘍退縮に対して有する効果を見るために化合物を試験できる。これは、外科的に切除できる腫瘍の治療で重要である。
【０１０９】
疾患状態又は、対応する非疾患状態を表す器官型培養でのタンパク質及び脂質等のさまざまな分子分類のスクリーニングはバイオマーカーの同定のために用いられる場合がある。現在、検証されたバイオマーカーは、疾患状態の担体の同定と、正常な方向への進展のモニターとの両方のために用いられ、薬剤等の利用計画によって役立てられる場合がある。臨床試験での使用に対するバイオマーカーの検証のために、候補バイオマーカーと疾患状態との間の統計学的有意な連鎖の確立のために必要である。本発明の器官型培養物は、それらが器官の機能及び生理機能を再現する事実のために、バイオマーカーの発見及び検証に理想的に適しており、それらがハイスループットアッセイに適用できるため、本発明の方法によって迅速かつ容易に産生される。したがって、本発明の器官型培養は、バイオマーカーの同定及び検証に対して現在用いられている全ての動物よりも、非常により迅速かつ安価に用いることができる。
【０１１０】
腫瘍細胞の共培養物は、バイオマーカー及び／又は薬剤標的（例えば、がんバイオマーカー及び／又はがん薬剤標的）を同定及び／又は検証のために用いることができる。バイオマーカー及び／又は薬剤標的を同定するアッセイは、転写プロファイル、プロテオミクス、質量分析、ゲル電気泳動、ガスクロマトグラフィー及び当業者に既知の分子プロファイルに対する他の方法を含む。サロゲートマーカーは、疾患状態の存在又は進行の評価のために用いることができるが、疾患の臨床転帰を直接的に測定しないバイオマーカーの一部である。これらのサロゲートマーカーが薬剤治療と相関する応答を示す場合に、それらは薬物動態学的マーカーとして言及される。本発明の器官型腫瘍共培養物は、他のバイオマーカーと同じように、例えば、がんの研究で前記薬物動態学的マーカーを同定及び検証するために用いられる場合がある。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１ａ】図１ａは本発明による共培養物を産生する方法の概略図である。解離されたマトリクス細胞の懸濁液が調製され、例えば、前記マトリクス細胞に腫瘍細胞を添加することによって腫瘍細胞と混合される。混合された細胞は、前記細胞を毛細管現象によって圧縮されるようにする気液界面で支持体上に配置される。
【図１ｂ】図１ｂは、播種後２０日の、解離した脳細胞から調製した器官型培養物の横断面図である。ベータ−チューブリン（緑色）及びＧＦＡＰ（赤色）の抗体が神経細胞及びアストロ細胞のそれぞれを検出するために用いられる。核は、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール）染色によって青色に標識された。
【図１ｃ】脳細胞培養産物はコリンアセチルトランスフェラーゼに対して陽性である（ＣｈＡＴ；図１ｃ）。
【図１ｄ】脳細胞培養産物はアストロ細胞に対して陽性である（ＧＦＡＰ；図１ｄ）。
【図１ｅ】脳細胞培養産物は神経細胞に対して陽性である（ベータ−チューブリン（βＴｕｂｕｌｉｎ）；図１ｅ）。
【図１ｆ】図１ｆはＧＦＡＰ及びベータ−チューブリン（βＴｕｂｕｌｉｎ）の検出の重ね合わせ図を示す。
【図１ｇ】図１ｇは、自発的及び誘発の電気活性が１４ＤＩＶ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの日数）で最適活性にて共培養物で観察され得ることを示す。
【図２】図２は、ラット脳細胞マトリクスで腫瘍細胞の相違する濃度（１％、５％及び１０％）での調製後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの日数（ＤＩＶ）０及びＤＩＶ４でのラット脳細胞マトリクスで細胞株ＬＮ−１８からのヒト腫瘍細胞の増殖を示す顕微鏡写真である。ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を発現する腫瘍細胞が、前記顕微鏡写真で白色で示され、ＤＩＶ４までに９０％のラット脳細胞に対して１０％の腫瘍細胞で、腫瘍細胞の凝集又は塊が形成されていることを見ることができる。塊形成は低濃度では見られない。
【図３ａ】図３ａは、共培養物の調製後のＤＩＶ１、ＤＩＶ３及びＤＩＶ１４でのラット脳細胞マトリクスでのＬＮ−１８腫瘍細胞の増殖を示す顕微鏡写真である。腫瘍細胞がＧＦＰを発現し、前記脳細胞マトリクス中で白色で示される。前記腫瘍細胞はＤＩＶ３でいくつかの凝集を示し、ＤＩＶ１４で凝集したままである。
【図３ｂ】ｅＧＦＰで標識されたＧＬ−１５細胞が、本発明による脳細胞マトリクスを有する共培養物で増殖した。
【図３ｃ】ｅＧＦＰで標識されたＡ１７２細胞が、本発明による脳細胞マトリクスを有する共培養物で増殖した。
【図３ｄ】ｅＧＦＰで標識されたＵ８７細胞が、本発明による脳細胞マトリクスを有する共培養物で増殖した。
【図４ａ】図４ａは、共培養物の調製後３日目でのラット脳細胞マトリクスでのＳＫＯＶ３ヒト卵巣腫瘍細胞の増殖を示す顕微鏡写真である。前記ＳＫＯＶ３細胞はＧＦＰを発現し、前記脳細胞マトリクスで白色で示される。前記細胞は器官型共培養物の末梢で濃縮される。
【図４ｂ】図４ｂは、１、３及び７日目での相違するマトリクス細胞でのＳＫＯＶ３細胞の増殖を示す。前記細胞は、ラット脳細胞マトリクス（黒棒）で増殖するよりも線維芽細胞及び内皮細胞（白棒）でより大きな割合で増殖する。
【図５】図５は、調製後１及び２日目でのラット脳細胞マトリクスでの腫瘍幹細胞の増殖を示す顕微鏡写真である。前記細胞は前記マトリクス内で分化され、形成された突起を示す。
【図６ａ】図６ａは、本発明に従って調製された３Ｄ器官型腫瘍共培養物と比較して、腫瘍細胞のみの２Ｄ単層培養でのテモゾロマイド（ＴＭＺ）の効果の違いを示すグラフである。図６ａの結果は、処理されていない対照細胞と比較して、３Ｄ器官型腫瘍共培養物（図６ｂ）での腫瘍細胞数の減少期間中に２Ｄ培養で１０μＭまでのレベルの化合物への応答がほとんどないことを示す。
【図６ｂ】図６ｂは、本発明に従って調製された３Ｄ器官型腫瘍共培養物と比較して、腫瘍細胞のみの２Ｄ単層培養でのテモゾロマイド（ＴＭＺ）の効果の違いを示すグラフである。一方、３Ｄモデルでは、ＩＣ５０（前記細胞数が半分にされるＴＭＺの濃度）は５μＭ未満に見える（図６ｂ）。
【図７ａ】図７ａ及び７ｂは、本発明に従って調製された３Ｄ器官型腫瘍共培養物と比較して、腫瘍細胞のみの２Ｄ単層培養でのパクリタキセル（タキソール）の効果の違いを示すグラフである。図７ａは、ほとんどゼロまでの細胞数の減少が２Ｄ培養において２０ｎＭのタキソール濃度で達成されることを見ることができる。
【図７ｂ】図７ａ及び７ｂは、本発明に従って調製された３Ｄ器官型腫瘍共培養物と比較して、腫瘍細胞のみの２Ｄ単層培養でのパクリタキセル（タキソール）の効果の違いを示すグラフである。図７ｂは、３Ｄモデルでは、ＩＣ５０（前記細胞数が半分にされるタキソールの濃度）は約２５ｎＭであると見ることができる。
【図８ａ】図８は、本発明に従って調製された３Ｄ器官型腫瘍共培養物（図８ｂ）と比較して、腫瘍細胞のみの２Ｄ単層培養（図８ａ）でのシトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）の効果の違いを示すグラフである。
【図８ｂ】図８は、本発明に従って調製された３Ｄ器官型腫瘍共培養物（図８ｂ）と比較して、腫瘍細胞のみの２Ｄ単層培養（図８ａ）でのシトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）の効果の違いを示すグラフである。
【図９ａ】図９は、共培養物及び腫瘍細胞凝集が確立されるときの、本発明の腫瘍共培養物に適用されたときの播種時（ａ及びｂ）、又は、細胞播種後３日目（ｃ及びｄ）のいずれかのタキソール及びテモゾロマイドの効果を示すグラフである。
【図９ｂ】図９は、共培養物及び腫瘍細胞凝集が確立されるときの、本発明の腫瘍共培養物に適用されたときの播種時（ａ及びｂ）、又は、細胞播種後３日目（ｃ及びｄ）のいずれかのタキソール及びテモゾロマイドの効果を示すグラフである。
【図９ｃ】図９は、共培養物及び腫瘍細胞凝集が確立されるときの、本発明の腫瘍共培養物に適用されたときの播種時（ａ及びｂ）、又は、細胞播種後３日目（ｃ及びｄ）のいずれかのタキソール及びテモゾロマイドの効果を示すグラフである。
【図９ｄ】図９は、共培養物及び腫瘍細胞凝集が確立されるときの、本発明の腫瘍共培養物に適用されたときの播種時（ａ及びｂ）、又は、細胞播種後３日目（ｃ及びｄ）のいずれかのタキソール及びテモゾロマイドの効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１１２】
本発明の実施態様は、以下の実施例の例示のみを目的として現在記載される。
【実施例１】
【０１１３】
ヒト腫瘍細胞の調製
ヒト膠芽腫腫瘍細胞株、ＬＮ−１８（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ２６１０）が培養され、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミド、又は、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現するプラスミドのいずれかがトランスフェクションされた。細胞は、ウェル１つあたり１ｘ１０５個の細胞で６ウェルプレート上で培養され、配置され、一晩増殖され、７５％までのコンフルエントであることが確認された。前記細胞は、製造者のプロトコールに従って、ジーンジュース（Ｇｅｎｅ  Ｊｕｉｃｅ）（ノバジェン、カタログ番号＃  ７０９６７−ＥＡ）を用いてｐＥＧＦＰ−Ｎ３（ＢＤバイオサイエンス、カタログ番号＃  ６０８０−１）がトランスフェクションされた。トランスフェクション後２４時間で、前記細胞は、ジェネティシン（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号＃１０１３１−０１９）で選択され、選択された細胞の集団が実験で用いられた。選択された細胞の集団は、トランスフェクションされた細胞の集団を維持するための臨時の選択で延長された時間にわたって培養された。腫瘍細胞による蛍光タンパク質の発現は、増殖及び形態学的変化に対して前記腫瘍細胞を観察可能にする。トランスフェクションされた腫瘍細胞（ＬＮ−１８）は、フラスコからそれらを除去するためにトリプシン／ＥＤＴＡ（シグマ＃Ｔ４２９９）で処理され、培養培地に再懸濁された。生存能力のある細胞は、トリパンブルー排除を用いて計測された。懸濁液は１０００ｒｐｍ／３分で遠心分離され、結果として生じる細胞ペレットが５０，０００細胞／μｌで再懸濁された。
【実施例２】
【０１１４】
単離されたラット大脳皮質からのラット脳細胞の調製
器官型培養物は、単離したラット大脳皮質から解離細胞を調製することによって作製された。Ｐ０ウィスターラットが屠殺され、脳が除去された。大脳皮質はペトリ皿で解剖され、小片に切断され、冷ＥＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号＃  ２４０１０）に入れられた。その後、組織片は非常に穏やかに粉砕された。結果として生じる細胞懸濁液が、５０ｍＬのファルコンチューブに取り付けられている１００μｍのメッシュフィルターによって濾過された。前記懸濁液は１０００ｒｐｍ／３分で遠心分離された。生存能力のある細胞は、トリパンブルー排除を用いて計測され、細胞ペレットが５０，０００細胞／μｌで再懸濁された。
【実施例３】
【０１１５】
解離した脳細胞からの３Ｄ器官型培養の確立
解離したラットの脳の大脳皮質は、気液界面の半多孔性膜上で再凝集できるようにされた（図１の右手部分を参照せよ。）。ラット胚から新たに解離された脳細胞が、培地上に配置された親水性のＰＦＴＥ膜上に配置され、２０日間増殖できるようにされた。細胞塊の横断面が、神経細胞（ベータ−チューブリン）及び活性化したアストロサイト（グリア細胞繊維性酸性タンパク質、ＧＦＡＰ）に対するマーカーを用いる免疫蛍光のために処理された。図１ｂで示されるように、染色は、神経細胞及びアストロサイトの両方がかかる３Ｄ培養で存在すること、及び、生理学的な構造が保存されることを示した（図１ｄ、ｅ、ｆも参照せよ。）。その後、コリン作動性神経細胞及び神経末端は、コリンアセチルトランスフェラーゼに対する抗体を用いて可視化された（ＣｈＡＴ；図１ｃ）。予測通り、ＣｈＡＴ染色は、全脳の共培養物の至る所に分布され、前記神経末端で特に豊富であった。接続を確立している成熟神経細胞の存在が、電気生理学的パラメーターの測定によってさらに検討された。脳の共培養物の播種後４週間まで、自発的及び誘発の電気活性が、実験開始後１４日間最適活性で観察された（図１ｄ）。かかる電気信号の伝播は、一群の相互接続した神経細胞に特有である。
【実施例４】
【０１１６】
解離したマトリクス及び腫瘍細胞からの３Ｄ器官型共培養物の調製
実施例１及び２で説明されたように調製されたトランスフェクションされた腫瘍細胞及びラット初代細胞は５０，０００細胞／μｌで細胞の懸濁液を形成するために一緒に混合された。５μＬのこの混合された細胞懸濁液が、６ウェルプレート（ＮＵＮＣ）における１ｍＬの大脳皮質培地（１０％  Ｈａｍｓ  Ｆ１２、２０％  ＦＣＳ、５％ウマ血清、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ  グルタミン含有ＤＭＥＭ）中に配置された０．４ミクロンのミリポアカルチャーインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｅｒｔ）（ミリポア、カタログ番号＃  ＰＩＣＭ０３５０）の上部に添加された。その後、プレートは３７°Ｃ、５％ＣＯ２でインキュベーションされた（図１ａ）。このインキュベーションの最初の数時間に、細胞は、半透膜支持体を介する毛細管現象により５μｌの細胞懸濁液から液体を除去することによって高密度培養物（ｄｅｎｓｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅ）を形成するために圧縮される（図１ａ）。
【実施例５】
【０１１７】
器官型共培養物でのマトリクス及び腫瘍細胞の濃度及び特徴の最適化
最適化は、それよりも、過度の低濃度によって細胞は腫瘍様の凝集を形成することができず、過度に迅速に凝集を形成し、過度な高濃度によって細胞の遊走過程が観察されない状態であることが望ましい。前記細胞は適切な濃度及び割合で混合されるとき、前記腫瘍は３−４日間にわたって形成され、ラット脳マトリクスの崩壊をもたらさない。
【０１１８】
前記ラット脳細胞は、毛細管現象での圧縮後に、組織を通じての最適な酸素透過、及び、小型の器官型構造の形成できように細胞数について最適化された。前記細胞は、１μｌあたり２５００、５０００、７５００及び１００００個の細胞の濃度で再懸濁され、５μｌのこれらの懸濁液が実施例４で説明されたように配置された。結果として生じる培養物は、培養物内で暗黒領域によって示される低酸素性障害の兆候及び小型の器官型の出現について顕微鏡的にモニターされる。それらの培養物の最適な細胞数は５０，０００細胞／μｌであり、５μｌが各培養で用いられた。ラット脳以外のマトリクス組織を用いて器官型共培養物を調製することは、必要に応じて、細胞数について、このようにして最適化を必要とすることが特筆されるべきである。
【０１１９】
ＬＮ−１８腫瘍細胞は、１、５及び１０％（全細胞数の％）の濃度で腫瘍形成能について試験された。１％では、前記細胞は（おそらく、ケモカイン濃度の薄い勾配のため）腫瘍様の塊に遊走するように見えない。５％の濃度では、前記細胞は約３−４日で塊を形成する。１０％の濃度では、塊形成はより迅速であり、塊はより小型であり、ラット脳マトリクスにいくつかの混乱をもたらす（図２）。塊形成は細胞株で変わる。いくつかの細胞株は、非常に迅速かつ強力に凝集し、いくつかはよりゆっくりと凝集し、前記塊は経時的に分散されやすい。したがって、用いられる各細胞株に対して腫瘍及びラット細胞の割合を最適化することが必要である。
【０１２０】
これらの最適化実験で用いる細胞は９５％のラット脳細胞及び５％のＬＮ−１８腫瘍細胞の割合で混合され、両方が１μｌあたり５００００細胞個で再懸濁される。
【実施例６】
【０１２１】
器官型共培養物でのラット脳及び腫瘍細胞の共培養物の形態
１つの実施態様では、最適濃度５％ないし９５％の腫瘍対ラット細胞を用いて器官型共培養物内でのＬＮ−１８腫瘍細胞の増殖が、１３日間にわたって顕微鏡的にモニターされた（図３）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの３日目（ＤＩＶ）までに、前記細胞は初代ラット組織で腫瘍様の凝集を形成した。これらの腫瘍様の凝集はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの１３日（ＤＩＶ）後にまだ存在した。
【０１２２】
さらなる実施態様では、ｅＧＦＰタンパク質をエンコードしているベクターを安定にトランスフェクションされたＬＮ１８細胞はラット脳マトリクス細胞内で増殖でき、１３日以上観察された。播種後１日で、個別のＬＮ１８−ｅＧＦＰ細胞は共培養物の至る所で拡散が観察された。３日後、ｅＧＦＰの陽性巣の数は減少した一方、前記巣（「細胞凝集」）のサイズは増大した。７日目では、ｅＧＦＰの陽性巣の数はわずかに減少しただけだったが、巣はサイズをさらに増大した。前記巣のサイズは８日目に最大に達した。取込み後の１４日間、前記細胞はさらに凝集された。前記凝集は少なくとも２５日目まで存在することが観察された。
【実施例７】
【０１２３】
さらなる膠芽腫細胞株との腫瘍共培養物の形成
類似の効果が膠芽腫細胞株ＧＬ１５、Ａ１７２（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６２０）及びＵ８７（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１４）で見られた。それぞれの細胞株はｅＧＦＰで標識され、３Ｄ器官型共培養物を形成するためにラット脳細胞と混合された。ｅＧＦＰシグナルによって示されるように、全ての脳由来の腫瘍細胞株は増殖し、ＬＮ１８細胞と非常に類似の手段で共培養物内で腫瘍細胞の集団を形成した（図３ｂ、ｃ及びｄ）。
【実施例８】
【０１２４】
ラット脳及びＬＮ−１８腫瘍細胞の共培養物での腫瘍細胞の遊走及び凝集の特徴
実験は、器官型共培養物中に腫瘍様の塊が細胞のクローン性増殖から発達したか、細胞マトリクスを介する細胞の遊走から発達したかを見るために実施された。ヒト脳腫瘍細胞株ＬＮ−１８は、ｅＧＦＰ又はＲＦＰのいずれかを細胞に導入するためにトランスフェクションされた。ＬＮ１８  ＲＦＰ発現細胞及びＬＮ１８  ｅＧＦＰ発現細胞が一緒に混合され、その後、解離されたラット大脳皮質細胞とともに９５％ラット脳細胞に対して５％  ＬＮ−１８の割合として混合され、以前に記載されたように小型の３Ｄ器官型共培養物を形成するために多孔性膜上に配置された。これらの培養物は１４日間にわたってモニターされた。共培養物に取り込まれた後２４時間で、前記細胞は緑色及び赤色の細胞の均質の混合物として出現する。取込み後４８時間と早期に、いくつかの細胞集団が形成され始めた。取込み後４日目で、細胞は、混合された赤色及び緑色の細胞の凝集を明瞭に形成した。赤色及び緑色の細胞が共局在するという事実は、単一の腫瘍細胞のクローン性増殖よりもむしろ腫瘍細胞同士の活性型クラスタリングを示す。したがって、前記細胞は腫瘍様の凝集を形成するために遊走するように見えた。その効果は細胞のクローン性増殖に起因する場合に、観察された赤色及び緑色の混合された腫瘍よりもむしろ個別の赤色及び緑色の腫瘍の発達が期待される。これは、前記細胞マトリクスが、ｉｎ  ｖｉｖｏの状況をより厳密に表す方法で腫瘍細胞間の相互作用を可能とする環境を提供するという証拠である。
【実施例９】
【０１２５】
器官型共培養物におけるラット脳細胞及び他の腫瘍の種類の共培養物の形態
ヒト卵巣がん細胞、ＳＫＯＶ３（ＡＴＣＣ＃  ＨＴＢ７７）は、ラット脳細胞マトリクスで腫瘍を形成しなかった（図４ａ）。これは、実施例４の膠芽腫細胞として記載されたようなラット脳細胞と、トランスフェクションされたＳＫＯＶ３−ＧＦＰ細胞とを混合することによって試験された。また、前記ＳＫＯＶ３細胞は疑似卵巣組織で凝集しないが、該細胞は両方のマトリクスで増殖する。
【０１２６】
内皮細胞（ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ  ２２９９）及びヒト線維芽細胞（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ＃  ＨＰＦ−ｃ  ＃１２３６０）が供給者によって設定された標準的な操作プロトコールに従って増殖され、前記細胞はトリプシン（シグマ＃Ｔ４２９９）でフラスコから除去され、その後、トリプシン阻害剤で中和された（シグマ＃Ｔ６４１４）。前記細胞懸濁液は１０００ｒｐｍ／３分で遠心分離された。生存能力のある細胞はトリパンブルー除去を用いて計測され、前記細胞ペレットは５０，０００細胞／μｌで再懸濁された。この細胞懸濁液は、実施例４に記載されたように、器官型共培養物の作製で、ラット脳組織を置換するために用いられた。また、これらの培養物は、これが前記細胞の接着を補助したとき、ラミニンで処理されたコンフェティ（ｃｏｎｆｅｔｔｉ）（支持膜に存在し、操作を容易にする小円の膜）で増殖した。これらの細胞は、初代非腫瘍細胞マトリクスの末梢で凝集する傾向にある。しかし、前記システムは、さらにこれらの細胞の増殖を解析できるようにし（図４ｂ）、代謝経路を詳細に解析できるようにする。固形腫瘍が形成されないときでさえ、モデルは膠芽腫腫瘍の種類以外の腫瘍の種類に適用することができることをこれは示す。さらに、経路及び薬剤感受性の解析が可能である。
【実施例１０】
【０１２７】
ラット脳細胞及び腫瘍幹細胞から形成された器官型共培養物
腫瘍幹細胞は生検材料から単離され（Ｗ．Ｇｒａｙからの贈り物）、前記細胞はフラスコで培養され、その後、前記細胞はレンチウイルスベクター、ｒＨＩＶ  ＰＰＴ−ＰＧＫ−ＧＦＰ−ＷＰＲＥ（ＶＳＶｇ）（Ｇｅｎｅｔｈｏｎ）で形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）された。１０μｌのベクター（〜２０ｘ１０６の感染性粒子）が２：１のＭＯＩを与えるために５０μｌの懸濁された幹細胞（〜１０ｘ１０６細胞）に添加され、その後、前記細胞は１週間培養され、ＧＦＰの発現がモニターされた。これらの形質導入された腫瘍幹細胞は、実施例４に記載されたように、器官型共培養物を作製するために腫瘍細胞株の代わりに用いられた。培養期間中、器官型共培養物では、前記細胞は分化し、突起を出した（図５）。
【実施例１１】
【０１２８】
器官型腫瘍共培養物の免疫組織学的試験
器官型共培養物は、マトリクス及び腫瘍細胞間の相互作用と、関連のある代謝経路との複合研究を可能にする免疫組織学的解析のために容易に調製される。前記器官型共培養物は採取され、４％パラホルムアルデヒド（シグマ＃Ｐ６１４８）で固定され、その後、０．００１％Ｔｗｅｅｎ（シグマ＃Ｐ５９２７）のトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（ＴＢＳ＿Ｔ）で３回洗浄された。非特異的結合部位は、５％正常ロバ血清で３０分間インキュベーションすることによってブロッキングされ、その後、ＴＢＳ−Ｔで５分間３回洗浄された。マウスで作製された１次抗体ＧＦＡＰ（シグマ＃Ｇ３８９３）１：２００がＴＢＳ−Ｔで希釈され、器官型共培養物に添加され、４°Ｃで一晩インキュベーションされた。ＴＢＳ−Ｔで５分間３回洗浄後、２次抗体アレクサフルオロヤギ抗マウス５６８（赤色）（インビトロジェン＃  Ａ１１０３１）＠  １ｉｎ  ５００が暗所にて室温で１時間添加された。器官型共培養物はＴＢＳ−Ｔで５分間３回洗浄され、その後、封入液（シグマ＃Ｆ４６８０）とともに顕微鏡スライドガラスに配置された。カバーガラスが最上部に配置され、マニキュア液で密封された。スライドはイメージングされるまで４°Ｃで暗所にて保存された。調製されたスライドは、付属のベクトンディッキンソン社製ＣＡＲＶ共焦点細胞イメージングシステムを有するオリンパス社製１Ｘ７０型顕微鏡でイメージングされた。
【実施例１２】
【０１２９】
本発明の共培養で活性型アストロサイトの特徴
多形性膠芽腫（ＧＢＭ）の典型的な特徴は、脳腫瘍の周辺での反応性アストログリオーシスの存在である。実施例４に記載されたように調製された本発明の培養物がヒト腫瘍のこの特性を再現できるかを決定するために、活性型アストロサイトのマーカーであるグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の発現がＧＦＡＰ抗体を用いてＧＢＭ／脳の共培養物で評価された。
【０１３０】
増加したＧＦＡＰの染色が腫瘍細胞塊の周辺又は内で特異的に観察でき、腫瘍細胞に近接しているアストロサイトが活性化されていることを示唆している。いくつかの化合物の作用がこれらのバイスタンダー細胞（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ  ｃｅｌｌｓ）の保護効果によって影響されるので、ＧＦＡＰ陽性細胞と腫瘍とのこの関係は生理学的に関連のある腫瘍モデルの製造に重要である。
【実施例１３】
【０１３１】
本発明の共培養物の５−ＡＬＡ染色
５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）は脳神経外科手術中に腫瘍組織を可視化するために用いることができる。このガイド方法の手術中の使用が脳腫瘍を患っている患者での腫瘍残存量を低下し、無進行生存を延ばす場合がある。実施例４で調製されたようにＧＢＭ（ＬＮ１８−ｅＧＦＰ）／脳の共培養物は、ヒト腫瘍でのように、５−ＡＬＡが腫瘍細胞を特異的に染色できるかどうかを見るために５−ＡＬＡで染色された。
【０１３２】
アミノレブリン酸塩酸塩（ＡＬＡ）（シグマ製品番号Ａ３７８５）は１０ｍｇ／ｍｌに水で溶解された。培養物とのインキュベーションに対して、１００μｇ／ｍｌの最終濃度を与えるために培地で十分に希釈され、２４時間培養物とインキュベーションされた。その後、培養物は免疫組織学的解析のために記載されたＣＡＲＶ共焦点システムを用いて顕微鏡的に試験された。
【０１３３】
図４ａで示されるように、強く特異的な５−ＡＬＡ染色は、直径約１００μｍ以上のＬＮ１８−ｅＧＦＰ集団で観察された。腫瘍は、腫瘍細胞によるＧＦＰの発現に起因する緑色を示し、５−ＡＬＡはこれらの細胞と共局在し、イメージングの際に赤色を示した。直径約１００μｍよりも小さい腫瘍細胞集団はより薄く染色され、スパース細胞（ｓｐａｒｓｅ  ｃｅｌｌｓ）は陰性のままである。
【０１３４】
前記５−ＡＬＡ染色の特徴は、ｉｎ  ｖｉｖｏで見られるような類似の反応を示す。本発明の共培養物がｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍の顕著な特徴を再現し、したがって、さらに２次元細胞単層培養を超えるこのシステムのメリットを強調するさらなる証拠を提供する。
【実施例１４】
【０１３５】
器官型腫瘍共培養物内でのｐＨの測定
悪性神経膠腫の周縁組織は代謝的に極めて活性が高く、高レベルの乳糖を産生し、腫瘍境界周辺の正常組織の細胞外空間を酸性化する。この特徴が本発明の腫瘍共培養物によって再現されるかどうかを確認するために、器官型ＧＢＭ／脳共培養物が、ｐＨ色素染色で干渉されないように、ｅＧＦＰを発現していないトランスフェクションされていないＬＮ１８腫瘍細胞が用いられる以外は、上記（例えば、実施例４）のように調製された。培養物は３日間インキュベーションされた。その後、挿入物は培養培地から除去され、滅菌ハンクス平衡塩液（ＨＢＳＳ）を含むウェルに配置された。最初の１５分間の洗浄後、ＨＢＳＳ及び１μｌの１０ｍＭ  ＢＣＥＣＦ酸（２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（及び−６）−カルボキシフルオレセイン、混合異性体）、蛍光放射がｐＨ感受性である色素を含むウェルに前記挿入物は移された。５１４ｎｍで励起されたとき、その蛍光極大は塩基性環境で６３０ｎｍ（緑色染色）であり、酸性のとき５７０ｎｍ（赤色染色）であり、すなわち、細胞のより酸性条件は赤色を示す一方、中性のｐＨでは緑色を示す。培養物は３０分間インキュベーションされ、その後、赤色（蛍光波長６１０）及び緑色（蛍光波長５２５）のスペクトルでのイメージングの前にＨＢＳＳで２回洗浄された。
【０１３６】
強酸性ｐＨ（赤色染色）が非標識腫瘍細胞の周りで検出された一方、脳共培養物の全体は塩基性（緑色染色）であった。ＬＮ１８細胞の非存在下では、酸性のｐＨは脳共培養物で検出されなかった。したがって、ＬＮ１８細胞は、脳共培養物で増殖するとき、それらの近傍の環境を酸性にする。また、これらのデータは、本発明の共培養物がｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍の重要な特性を再現することを示す。これらのｐＨ変化はいくつかの抗腫瘍化合物の活性化に対して重要な意味を有し、いくつかの試験化合物の臨床効果を決定するのに重要である。
【実施例１５】
【０１３７】
ＴＭＺに対する腫瘍細胞の応答の測定  腫瘍細胞の２Ｄ単層培養物と３Ｄ器官型腫瘍強培養物との比較
器官型共培養物は、抗腫瘍化合物に対する腫瘍細胞の応答の解析のために用いられた。膠芽腫の標準的なケアは、放射線治療の間及び後のテモゾロマイド（ＴＭＺ）化学療法を含む。ここで、本発明者らは、ＬＮ−１８−ＧＦＰ細胞の標準２Ｄ培養物と比較して、器官型共培養物でのＴＭＺ（シグマ＃Ｔ２５７７）治療の有効性を試験した。
【０１３８】
器官型共培養物は以前に記載されたように調製された。調製後２時間で、ＴＭＺがさまざまな濃度で培養培地に添加された。図６を参照せよ。培養物は、培養培地＋ＴＭＺで最大１４日間インキュベーションされ、化合物は培地が変化されるときに更新される。これは経時的にＴＭＺの効果をモニター可能にする。
【０１３９】
腫瘍細胞のみの単層培養（２Ｄ）に対して、器官型共培養物としてＴＭＺの同一濃度で処理した２時間後に、ＬＮ−１８＿ＧＦＰ細胞は、ウェル１つあたり１０４個細胞の濃度で２４ウェルプレートに配置された。また、対照器官型共培養物及び２Ｄ培養物は、ＴＭＺの添加後に、腫瘍細胞の正常な増殖と比較するためにモニターされた。蛍光解析のために、画像が、ソフトウェア一式のライカアプリケーションを用いるライカＤＭ１Ｌ顕微鏡で撮られた。収集された画像はＢＤ  ＩＰＬＡＢイメージングソフトウェアを用いて解析され、データはＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアを用いて解析された。誤差棒は、平均の標準誤差（ＳＥＭ）である。２４個の画像が各データポイントのために用いられた。
【０１４０】
ＴＭＺは、未処理の対照細胞と比較して、２Ｄモデルで腫瘍細胞の増殖をほとんど低下させないように見える。９日目まで激しく継続する細胞数の急速な上昇があり、その後、１３日目までに安定化し始めるとき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの日数が増加するので、前記細胞は３日目まで（平均％蛍光によって示される）数を大きく増加しない。１、５及び１０μＭのＴＭＺの濃度で、増殖曲線は、対照細胞のものと非常に類似した（図６ａ）。
【０１４１】
器官型共培養物（３Ｄ）では、（平均％蛍光によって示されたように）対照培養物よりも低い腫瘍細胞増殖の顕著な低下があった。全ての条件は３日目に細胞数の増加を示した。対照細胞、及び、１μＭのＴＭＺで処理された培養が、細胞数の増加を示すために継続された。５及び１０μＭの両方のＴＭＺで、前記細胞数は３日目からわずかに低下し（図６ｂ）、〜４μＭのＩＣ５０、すなわち４μＭで、約半分の細胞増殖が抑制された（５０％が減少するＩＣ５０阻害濃度）。
【０１４２】
これは実施例１４で観察されたｐＨの変化と関連付けることができる。薬剤のＴＭＺはｐＨ依存性の方法で活性分解産物に加水分解され、これは、腫瘍細胞が２Ｄシステムでの単離で培養されるとき、起こらない場合がある。
【実施例１６】
【０１４３】
タキソールに対する腫瘍細胞の応答の測定  腫瘍細胞の２Ｄ単層培養物と３Ｄ器官型腫瘍強培養物との比較
パクリタキセル（タキソール、シグマ＃Ｔ７４０２）は、単離された２Ｄ培養物で膠芽腫細胞株に対して毒性があると以前に示されたが、臨床試験で用いられるとき、パクリタキセルは効果がないことが証明された。実施例１４でのように同一の環境条件を用いて、本発明者らは、器官型培養（３Ｄ）及び腫瘍細胞のみの単層培養でタキソールの細胞毒性を比較した。
【０１４４】
腫瘍細胞のみの単層培養物（２Ｄ）では、対照培養物は２日目までにゆっくりと増殖し、その後、（平均％蛍光によって示されるように）８日間にわたってゆっくりと増加する。これは５ｎＭのタキソールで見られるが、細胞数において少ないが顕著な減少がある。２０及び５０ｎＭでは、実験中に細胞数の増加はない（図７ａ）。器官型共培養物（３Ｄ）では、２５、５０及び１００ｎＭの全てのタキソール濃度で（平均％蛍光によって示されるように）対照培養のものよりも細胞増殖の顕著な減少がある。しかし、１００ｎＭのタキソールのみが基本レベルよりも細胞数を減少し、ＩＣ５０は〜２５ｎＭであった（図７ｂ）。このＩＣ５０は２Ｄモデルで全ての細胞を完全に殺すために必要とされるよりもより高いレベルである。
【０１４５】
これは、おそらく、実施例１２に記載された器官型共培養物（３Ｄ）でのアストロサイトの補充及び活性化に起因する。アストロサイトの補充及び活性化はタキソールの作用から膠芽腫を保護するという証拠がある。
【実施例１７】
【０１４６】
シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）に対する腫瘍細胞の応答の測定：腫瘍細胞の２Ｄ単層培養物と３Ｄ器官型腫瘍共培養物の比較
また、本発明者らは、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、２Ｄ培養での膠芽腫細胞株の増殖を阻害し、臨床試験で失敗したことが知られるさらなる化合物を試験した。図８ａで示されるように、Ａｒａ−Ｃは２Ｄ培養で抗増殖活性を示した（ＡｒａＣについて１００ｎＭで増殖阻害）。ＧＢＭ／脳共培養物で用いられるとき、１μＭのＡｒａ−Ｃは腫瘍細胞の増殖を減少するために必要とされる。投与量は２Ｄ培養で必要な投与量を１０倍上回る（図８ｂ）。１０μＭで、ＧＢＭ細胞は効果的に殺された。
【実施例１８】
【０１４７】
さまざまな細胞株から形成された腫瘍でのタキソール又はテモゾロマイドの効果
その後、類似の測定が２Ｄ又は脳細胞マトリクスを用いる共培養物（３Ｄ）で増殖する３つの他の膠芽腫細胞株（ＧＬ−１５、Ａ１７２及びＵ８７）を用いて実施され、タキソール又はテモゾロマイドで処理された。増殖阻害ＩＣ５０は各細胞株で各化合物について決定され、その結果が表１にまとめられている。全体として、従来の２Ｄ培養と比較して、共培養物で増殖する細胞で６倍から２５倍までのタキソールの活性の低下が観察された。類似のことがＬＮ−１８細胞で観察され、テモゾロマイドの有効性は脳共培養物で２．５倍から１２倍まで増加された。したがって、本発明の共培養物は、さまざまな膠芽腫細胞株についての２Ｄ培養よりもより近く臨床的状況を反映する。
【０１４８】
【表１】
2014502847.tif 000002
【実施例１９】
【０１４９】
本発明のＧＢＭ／脳共培養物での腫瘍退縮の特徴付け
化学療法が、確立された腫瘍を有する患者に施され、効果が乏しい。テモゾロマイド又はタキソールが、本発明の共培養物で増殖する確立された膠芽腫で腫瘍退縮をもたらすことができるかどうかを検討するため、腫瘍細胞集団が既に存在するとき、本発明者らは、（上記のように）播種するＧＢＭ／脳共培養時又は３日後のいずれかに処理を開始した（図９）。上記で観察されたように、タキソール処理は実験の開始時に開始され、最初の３日間の腫瘍細胞の増殖率は低下した。２５ｎＭのタキソールで、細胞増殖は停止され、以前に観察されたように、１００ｎＭのタキソールが腫瘍集団の縮小を達成するために必要とされた。
【０１５０】
タキソール処理がＧＢＭ／脳共培共培養物養の播種後の３日目で開始されるとき、大きな腫瘍細胞集団が既に形成されているとき、２５ｎＭのタキソールは蛍光強度に全く影響しなかった一方、１００ｎＭ及び５０ｎＭは限界効果があった（図９ａ及びｃの比較）。効果的な腫瘍退縮を達成するために必要とされたタキソール濃度は、ヒト脳腫瘍で達成可能である濃度と比較して非常に高く、治療濃度域とかなりかけ離れている。興味深いことに、細胞播種時に用いられたときの２つの有効投与量（図６ｂ及び９ｂ）、５又は１０μＭのテモゾロマイドは、それらが腫瘍細胞増殖をわずかに減少させただけだったので、確立されたＧＢＭ／脳共培養物で乏しい活性だった（図９ｂ及び９ｄの比較）。したがって、また、腫瘍退縮に関して、本発明の共培養物の特性は臨床的状況を表現するものである。
【０１５１】
上記の実施例で与えられた実験データは本発明の３Ｄ器官型腫瘍共培養物の有利な特徴を示す。特に、これらの共培養物を用いて実施された抗腫瘍薬剤試験及び腫瘍退縮アッセイは、標準２Ｄモデルよりもｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍薬剤の作用をより近似して反映する。本発明の共培養物は現在の療法に強い耐性である腫瘍に対する研究を含めて、可能性のある抗がん剤の効果を研究するための予測値を高くするものである。
【０１５２】
参考文献
Beaupain, R., (1999) Methods in Cell Sciences, 21: 25-30
Becker-Hapak M. et al, (2001), Methods Vol24 pp247-56.
Damia, G., Maurizio D,Incalci, (2009) European Journal of Cancer, 45, 2768-2781
Kelland, L. R., (2004), European Journal of Cancer, 40, 827-836.
Muller et al (2001), Protocols for Neural Cell Culture, 3rd Ed. pp13-27, S. Fedoroffand A. Richardson eds, Humana Press, Inc., Totowa, NJ. Interface Organotypic HippocampalSlice Cultures.
Ridky et al. (2010) Nature Medicine 16(12):1450-1455)
Rygaard J, Povlsen CO., ActaPathology Microbiol. Scand, 1969, 77, 758-760
Starzec et al (2003), Biology of Cells, 95, 257-264
Stoppini L., et al, (1991), Neurosci Methods, Vol 37 pp173-82.
Vaira et al (2010), PNAS, 107:8352
van derKuip et al (2006) BMC Cancer, , 6:86
WO 2006/134432
WO 2006/136953
【図１ａ】
2014502847.tif 000003
【図１ｇ】
2014502847.tif 000004
【図４ｂ】
2014502847.tif 000005
【図６ａ】
2014502847.tif 000006
【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
2014502847.tif 000009
【図８ａ】
2014502847.tif 000010
【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
2014502847.tif 000013
【図９ｃ】
2014502847.tif 000014
【図９ｄ】
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【図１ｂ】
2014502847.tif 000016
【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
2014502847.tif 000019
【図１ｆ】
2014502847.tif 000020
【図２】
2014502847.tif 000021
【図３ａ】
2014502847.tif 000022
【図３ｂ】
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【図３ｃ】
2014502847.tif 000024
【図３ｄ】
2014502847.tif 000025
【図４ａ】
2014502847.tif 000026
【図５】
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【国際調査報告】
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