(57)【要約】【課題】組成物及び方法の提供【解決手段】ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む組成物が、頭頸部扁平上皮ガン（ＨＮＳＣＣ）の予防及び／又は治療のために開示される。ＰＥＧの有効量を投与することを含むＨＮＳＣＣの予防及び／又は治療のための方法もまた開示される。同様に開示されるものは、ＰＥＧを使用するＥＧＦＲの表面発現を抑制するための方法及び組成物である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の有効量を被験者に投与することを含む、被験者の頭頸部扁平上皮ガン（ＨＮＳＣＣ）を予防及び／又は治療する方法。
【請求項２】
前記ＰＥＧは局所的に投与される請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＥＧは標的組織に局所領域で投与される請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＮＳＣＣは、被験者の、唇、口腔（舌、口腔粘膜、歯茎、臼後三角、歯肉、口腔底部、硬口蓋を含む）、唾液腺、鼻腔（鼻咽頭を含む）、副鼻腔、咽頭（舌根、軟口蓋、口蓋弓及び扁桃窩のような中咽頭を含む）、下咽頭（梨状陥凹、咽頭側壁、後咽頭壁、咽頭輪状後部を含む）、及び喉頭（声門上部（例えば、仮声帯、披裂部、喉頭蓋、披裂喉頭蓋襞）、声門、声門下）の１つ以上に発症したものである請求項１ないし３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＨＮＳＣＣは、前記口腔（又はその解剖構造）に発症したものである請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記被験者は、ＨＮＳＣＣの寛解にある請求項１ないし５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記寛解は、完全又は一部である請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記方法は、ＨＮＳＣＣの再発を予防するためのものである請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＮＳＣＣは、局所進行性である請求項１ないし８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＨＮＳＣＣは、転移性である請求項１ないし９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
更に、１つ以上のＨＮＳＣＣガンを切除すること及び／又は除去することを含む請求項１ないし１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
以下の段階：
（ａ）１つ以上のＨＮＳＣＣガンを切除すること及び／又は除去すること；
（ｂ）ＰＥＧの有効量を投与すること
を含む請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
段階（ａ）が、段階（ｂ）の前に起こる請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
段階（ｂ）が、段階（ａ）の前に起こる請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＥＧは、１種以上の治療薬と共−投与される請求項１ないし１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療剤は、放射線治療及び／又は抗ガン剤である請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＥＧは、前記１種以上の治療薬と同時に投与される請求項１５又は１６記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＥＧは、前記１種以上の治療薬の投与前に投与される請求項１５又は１６記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＥＧは、前記１種以上の治療薬の投与後に投与される請求項１５又は１６記載の方法。
【請求項２０】
前記ＰＥＧは、前記１種以上の治療薬の最初の投与後で且つ前記１種以上の治療薬の２番目の投与前に投与される請求項１５又は１６記載の方法。
【請求項２１】
前記最初の投与の前記１種以上の治療薬は、前記２番目の投与の前記１種以上の治療薬と同じである請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記最初の投与の前記１種以上の治療薬は、前記２番目の投与の前記１種以上の治療薬と異なる請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記治療薬は、放射線治療である請求項１５ないし２２の何れか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記治療薬は、抗ガン剤である請求項１５ないし２２の何れか１項
に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗ガン剤は、抗−ＥＧＦＲ薬、抗−ＶＥＧＦＲ薬、抗−ＩＧＦ−１Ｒ薬、ｍＴＯＲ薬、白金製剤、タキサン類、葉酸代謝拮抗薬、フルオロウラシル、メトトレキセートからなる群より選択される請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記抗−ＥＧＦＲ薬は、セツキシマブのような抗−ＥＧＦＲ抗体である請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記被験者は、進行性ＨＮＳＣＣに対して感受性である請求項１ないし２６の何れか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記感受性の被験者は、タバコ（喫煙及び／又は噛みタバコ）、アルコール過量摂取、ビンロウ噛みの１つ以上の経歴を有する及び／又は１つ以上を同時使用する請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記被験者は、ＨＰＶに感染している及び／又は免疫不全である及び／又は進行性ＨＮＳＣＣの家族歴又は前歴を有する請求項２７又は２８記載の方法。
【請求項３０】
前記患者は、口腔白板症及び／又は口腔紅板症を発症している請求項２７ないし２９の何れか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記被験者は、哺乳類である請求項１ないし３０の何れか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記被験者は、ヒトである請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
請求項１ないし３２の何れか１項に記載の方法における使用のための組成物。
【請求項３４】
前記ＰＥＧは、範囲の下限が、１０００、２０００、３０００、４０００、６０００からなる群より選択され；及び範囲の上限が、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１２，０００、１５，０００、２０，０００からなる群より、独立して選択される範囲における平均分子量（例えば、重量平均分子量）を有する請求項３３記載の組成物。
【請求項３５】
前記下限は３０００又は４０００であり、前記上限は、５０００、６０００、７０００、８０００又は９０００から独立して選択される請求項３４記載の組成物。
【請求項３６】
前記ＰＥＧは、３３５０、４０００、８０００の重量平均分子量を有する請求項３４又は３５記載の組成物。
【請求項３７】
ＰＥＧの有効量を含む請求項３３ないし３６の何れか１項に記載の組成物。
【請求項３８】
ＰＥＧが唯一の治療効果のある成分である請求項３３ないし３６の何れか１項に記載の組成物。
【請求項３９】
請求項２５又は２６に記載の治療薬の１種以上の有効量を更に含む請求項３３ないし３７の何れか１項に記載の組成物。
【請求項４０】
少なくとも１種の電解質、１種以上の甘味料、１種以上の香味料、薬学的に許容可能なキャリア、からなる群より選択される少なくとも１種のビヒクルを更に含む請求項３３ないし３９の何れか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記組成物は、水性の溶液又は懸濁液（例えば、マウスウォッシュ）、乳液、ペースト（例えば、練り歯磨き）、クリーム、バルム（例えば、リップバーム）、軟膏、フォーム、スポンジ、ゲル、チューインガム、スプレー、ドロップ、トローチ、シロップ（例えば、粘性シロップ）、リンクタス、スラリー、フィルム（例えば、口腔内崩壊フィルム）、錠剤（例えば、口腔内崩壊錠）、カプセル、カプレット、口腔パッチ、顆粒、の形態で調製される請求項３３ないし４０の何れか１項に記載の組成物。
【請求項４２】
ＨＮＳＣＣの予防及び／又は治療のための薬剤の製造におけるＰＥＧの使用。
【請求項４３】
前記薬剤は、請求項３３ないし４１の何れか１項に記載の組成物である請求項４２記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、頭頸部扁平上皮ガン（ＨＮＳＣＣ）のような扁平上皮ガンの予防及び／又は治療に使用するための組成物に関する。本発明はまた、そのようなガンを予防及び／又は治療するための方法にも関する。本発明の他の観点、目的及び利点は、以下の記載から明らかとなる。
【背景技術】
【０００２】
頭頸部ガンは、２０１０年、米国において約７９００人の死亡を引き起こしたと見積られている（Ｐｆｉｓｔｅｒ等；Ｊ．Ｎａｔｌ，Ｃｏｍｐｒ．Ｃａｎｃ．Ｎｅｔｗ．２０１１年；９巻：５９６−６５０頁）。この疾患を進行させる通常の危険因子は、タバコの喫煙又は咀嚼、アルコールの消費、ビンロウの咀嚼及び／又はヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）の感染を含む。
【０００３】
頭頸部扁平上皮ガンは、米国における全てのガンの約３パーセントの割合を占める。ここで使用される、用語“ＨＮＳＣＣ”は、扁平上皮細胞（皮膚、目、種々の内部器官の表面及び中空器官の内層及び幾つかの腺の導管を形成する、薄く、平坦な細胞）に発症するあらゆる頭頸部のガンを含む。
【０００４】
ＨＮＳＣＣは、高い死亡率及び罹患率と関連付けられている。この攻撃性の上皮性悪性腫瘍は、口腔、中咽頭及び咽頭を含む上気道消化管の粘膜内層に影響を及ぼす。
【０００５】
治療処置の後でさえ、患者は、通常、頭頸部位又は肺部位である、進行性の新規な二次ガンの増大した生涯リスクを依然として有する。進行性ＨＮＳＣＣの早期の危険因子は、口腔白板症であるが、一方、生存者の約３０％が二次悪性腫瘍を発症する。
【０００６】
“領域ガン化”としても既知である、先行する前ガン状態のガン領域の結果として、原発性ガンの再発を経験していないこれらの患者でさえ、二次悪性腫瘍を発症する高いリスクを有する。
【０００７】
例えば、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、レチノイン酸、β−カロテンによるＨＮＳＣＣの化学予防は、今日まで、最小限の効力を提示したが、それは毒性を伴う。豊富な治療選択にも関わらず、ＨＮＳＣＣの５年生存率は、最近の４０ないし５０年に亘って、大きく進展していない。更に、疾患重症度及びそれに続く根治的外科管理の結果として、ＨＮＳＣＣ患者は、容貌、発話、嚥下及び呼吸における衰弱性の変化に起因して生活の質が悪化する。
【０００８】
このように、この疾患の予防及び／又は治療を改善するための要求が依然として存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｐｆｉｓｔｅｒ等；Ｊ．Ｎａｔｌ，Ｃｏｍｐｒ．Ｃａｎｃ．Ｎｅｔｗ．２０１１年；９巻：５９６−６５０頁
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、少なくとも１部分において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がＨＮＳＣＣにおいて抗増殖活性を示すことを見出したことに基づく。
本発明に従って、被験者における扁平上皮ガン、特にＨＮＳＣＣを予防及び／又は治療するための方法が提供されるが、該方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の有効量を被験者に投与することを含む。そのような方法における使用のための組成物もまた提供される。
【００１１】
別の態様において、本発明は、ＰＥＧの有効量を被験者に投与することを含む、被験者におけるＨＮＳＣＣを予防及び／又は治療するための方法を提供するが、ここで、該方法における使用のために適当なＰＥＧは、好ましくは、約１０００ダルトンと２０，０００ダルトンの間、好ましくは、約２０００ダルトンと９，０００ダルトンの間、より好ましくは、約３０００ダルトンと８，０００ダルトンの間、最も好ましくは、約３３５０、４０００又は８，０００の平均分子量を有する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、本発明の種々の観点及び態様において記載されるＨＮＳＣＣの予防及び／又は治療における使用のための組成物を提供するが、該組成物は、ＰＥＧの有効量を（例えば、唯一の治療効果のある成分として）含む。該組成物は、ここに記載したような平均分子量を有するＰＥＧを含み得る。
【００１３】
１態様において、本発明は、ＰＥＧの有効量を前記被験者に局所的に投与することを含む、被験者におけるＨＮＳＣＣを予防及び／又は治療するための方法を提供する。そのような方法における使用のための組成物もまた、提供される。
【００１４】
別の態様に従って、本発明は、ＰＥＧの有効量を、ＨＮＳＣＣを発症した被験者の領域及び／又は前ガン状態の領域及び／又は口腔白板症に局所領域で投与することを含む、被験者におけるＨＮＳＣＣの開始及び／又は増殖を減少又は抑制するための方法を提供する。そのような方法における使用のための組成物もまた、提供される。
別の態様に従って、本発明は、ＰＥＧの有効量を前記被験者に局所領域で投与することを含む、被験者におけるＨＮＳＣＣを予防及び／又は治療するための方法を提供する。そのような方法における使用のための組成物もまた、提供される。
【００１５】
本発明は更に、ＨＮＳＣＣを発症した被験者における該疾患の予防及び／又は治療における局所領域の使用のための組成物を提供するが、ここで、該組成物はＰＥＧの有効量を含む。
本発明の１態様において、ＰＥＧの有効量が１日に１ないし５回、好ましくは、１日に２ないし４回、より好ましくは１日に３回、被験者に投与される、被験者におけるＨＮＳＣＣを予防及び／又は治療するための方法が更に考慮される。
【００１６】
１態様において、本発明は、被験者の、唇、口腔（舌、口腔粘膜、歯茎、臼後三角、歯肉、口腔底部、硬口蓋を含む）、唾液腺、鼻腔（鼻咽頭を含む）、副鼻腔、咽頭（舌根、軟口蓋、口蓋弓及び扁桃窩のような中咽頭を含む）、下咽頭（梨状陥凹、咽頭側壁、後咽頭壁、咽頭輪状後部を含む）、及び喉頭（声門上部（例えば、仮声帯、披裂部、喉頭蓋、披裂喉頭蓋襞）、声門、声門下）の１つ以上において、ＰＥＧの有効量を前記被験者に投与することを含む、被験者の頭頸部におけるＨＮＳＣＣの増殖を減少又は抑制するための方法を提供する。
【００１７】
本発明は更に、前記ＨＮＳＣＣが、被験者の、唇、口腔（舌、口腔粘膜、歯茎、臼後三角、歯肉、口腔底部、硬口蓋を含む）、唾液腺、鼻腔（鼻咽頭を含む）、副鼻腔、咽頭（舌根、軟口蓋、口蓋弓及び扁桃窩のような中咽頭を含む）、下咽頭（梨状陥凹、咽頭側壁、後咽頭壁、咽頭輪状後部を含む）、及び喉頭（声門上部（例えば、仮声帯、披裂部、喉頭蓋、披裂喉頭蓋襞）、声門、声門下）の１つ以上に発症している、本発明の種々の観点及び態様に記載される被験者のＨＮＳＣＣを予防及び／又は治療するための方法を提供す
るが、該方法は前記被験者の発症領域に、ＰＥＧの有効量を投与することを含む。そのような方法における使用のための組成物もまた、提供される。
【００１８】
本発明の好ましい態様は、ＰＥＧの有効量を口腔に投与する（例えば、局所領域で投与する）ことを含む、前記ＨＮＳＣＣが、口腔（又はその解剖構造）に発症している被験者のＨＮＳＣＣを予防及び／又は治療するための方法である。そのような方法における使用のための組成物もまた、提供される。
【００１９】
更なる態様に従って、本発明は、被験者の頭頸部の扁平上皮細胞における上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の表面発現及び／又は該受容体のリン酸化を減少又は阻害するための方法を提供するが、該方法は、ＰＥＧの有効量を前記被験者に投与することを含む。そのような方法における使用のための組成物もまた、提供される。
【００２０】
別の態様において、本発明は、被験者におけるＨＮＳＣＣを予防及び／又は治療するための方法であって、該方法は１種以上の更なる治療薬の有効量と共にＰＥＧの有効量を前記被験者に共−投与することを含む方法を含む。ＰＥＧの有効量を含み、更に１種以上の更なる治療薬を任意に含む、そのような方法における使用のための組成物もまた提供される。
【００２１】
本発明の別の観点において、被験者におけるＨＮＳＣＣを予防及び／又は治療するための方法であって、該方法は
（ａ）抗−ＥＧＦＲ薬（例えば、セツキシマブのような抗−ＥＧＦＲ抗体）のような治療薬の有効量；
（ｂ）ＰＥＧの有効量
を前記被験者に投与することを含む方法が提供される。
【００２２】
本発明のこの観点の幾つかの態様において、段階（ａ）は段階（ｂ）の前に起きる。本発明のこの観点の他の態様において、段階（ａ）は段階（ｂ）の後に起きる。本発明のこの観点の更なる態様において、段階（ａ）と段階（ｂ）は、同時に起きる。
【００２３】
本発明の別の態様において、ＨＮＳＣＣの寛解にある被験者におけるＨＮＳＣＣを予防及び／又は治療するための方法であって、該方法は、ＰＥＧの有効量を前記被験者に投与することを含む方法が提供される。該被験者は、一部又は完全寛解であり得る。そのような方法における使用のための組成物もまた提供される。
【００２４】
本発明の別の態様において、その疾患の寛解にある被験者におけるＨＮＳＣＣの再発を改善（例えば予防）するための方法であって、該方法は、ＰＥＧの有効量を前記被験者に投与することを含む方法が提供される。そのような方法における使用のための組成物もまた提供される。
【００２５】
本発明の別の態様において、被験者における転移性のＨＮＳＣＣを予防及び／又は治療するための方法であって、該方法は、ＰＥＧの有効量を前記被験者に投与することを含む方法が提供される。そのような方法における使用のための組成物もまた提供される。
【００２６】
本発明の別の態様において、被験者における局所進行性であるＨＮＳＣＣを予防及び／又は治療するための方法であって、該方法は、ＰＥＧの有効量を前記被験者に投与することを含む方法が提供される。そのような方法における使用のための組成物もまた提供される。
【００２７】
本発明の別の観点において、被験者における扁平上皮ガンを退縮するための方法であっ
て、該方法は、ＰＥＧの有効量を投与することを含む方法が提供される。ここに記載されるような、そのような方法における使用のための組成物もまた提供される。本発明のこの観点の幾つかの態様において、扁平上皮ガンはＨＮＳＣＣである。好ましくは、扁平上皮ガンはＥＧＦＲを過剰発現している。扁平上皮ガンのＥＧＦＲ発現状態は、ここに記載されるような標準的な方法、技術及びキットに従って決定され得る。
【００２８】
本発明のこの観点の態様において、方法は更に、（ｂ）扁平上皮ガンを切除すること及び／又は除去すること及び／又は治療剤の有効量を投与することを含む。本発明のこの態様において、段階（ｂ）は、段階（ａ）の後に起こり得る。扁平上皮ガンを退縮することにより、本発明は、後の治療手段の結果として生じる被験者に対する心的傷害の程度又は治療に関連する有害事象を減少し得る。
【００２９】
本発明の別の観点において、
（ａ）１つ以上のＨＮＳＣＣガンを切除すること及び／又は除去すること；
（ｂ）ＰＥＧの有効量を被験者に投与すること
を含む被験者におけるＨＮＳＣＣを予防及び／又は治療するための方法が提供される。
本発明のこの観点の１態様において、段階（ａ）は、段階（ｂ）の前に起こる。別の態様において、段階（ｂ）は、段階（ａ）の前に起こる。
【００３０】
本発明は更に、ＨＮＳＣＣの治療及び／又は予防のための薬剤、例えば、ここに記載される組成物の製造におけるＰＥＧの有効量の使用を提供する。
本発明は更に、ＨＮＳＣＣのような扁平上皮ガンを退縮するための薬剤、例えば、ここに記載される組成物の製造におけるＰＥＧの有効量の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＨＮＳＣＣのモデルである、ビトロにおけるＳＣＣ−２５細胞中のＰＥＧ８０００の増殖抑制活性を示すグラフである。ＳＣＣ−２５細胞は、９６−ウェルプレートに播種され、その後、２４時間ＰＥＧ８０００の異なる濃度（０．６２ｍＭ（０．５％ｗ／ｖ）ないし１２．５ｍＭ（１０％ｗ／ｖ））で処理された。細胞増殖における変化（細胞数）が、標準的なＷＳＴ−１アッセイ（Ｒｏｃｈｅ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，インディアナポリス、インディアナ州）を使用することによりアッセイされた。実験は、３測定のためにトリプリケートで実施された。データは、ビヒクル単独と比較した平均±Ｓ．Ｄ．；＋ｐ＜０．０５、★ｐ＜０．０１として表した。
【図２】ＳＣＣ−９及びＳＣＣ−２５細胞における膜（表面）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）発現のレベルにおけるＰＥＧ３３５０又は８０００の効果を示すグラフである。ＳＣＣ−９及びＳＣＣ−２５細胞はＰＥＧ３３５０の５％ｗ／ｖ溶液又はＰＥＧ８０００の５％ｗ／ｖ溶液で処理された。細胞はトリプシン処理され、ＥＧＦＲの表面発現のために染色され、フローサイトメトリー分析に付された。。実験は、３測定のためにトリプリケートで実施された。データは、対応する対照と比較した平均±Ｓ．Ｄ．；Xｐ＜０．０１、*ｐ＜０．００１として表した。
【図３】頭頸部扁平上皮ガンのラット４−ニトロキノリン１−オキシド（４ＮＱＯ）モデルにおける腫瘍進行の阻害におけるＰＧ−８０００のビボにおける局所投与の結果を示すグラフである。このビボモデルを発症させるために、ラットは、４ＮＱＯ（２０ｐｐｍ）−添加水への自由なアクセスを許された。１４週後、ラットは通常の水に切り替えられ、無作為にＰＥＧ群又はビヒクル処理対照群に半々に分けられた。ラットは、１０％ＰＥＧ８０００の日毎（３ないし４分）の局所適用又は口腔（舌、口腔底部／天井部）中のＰＢＳ（ビヒクル対照）の何れかを受けた。ラットは１４週後に安楽死された；舌が切除され、腫瘍数（図３上パネル）及び腫瘍体積（図３下パネル）の両方を評価する、腫瘍組織量の顕微鏡評価に付された。データは平均±Ｓ．Ｄ．として表した。
【図４】４ＮＱＯ単独（上パネル、左から右）又は４ＮＱＯとＰＥＧ８０００の両方（下部パネル、左から右）に曝露した動物の口蓋及び舌を比較する一連の写真である。写真は、図３で表現されたビヒクルで処理されたラットと比較して、ＰＥＧ８０００で処理された組織における減少した腫瘍体積を反映する。
【図５】前ガン状態の上皮細胞過剰増殖におけるＰＥＧ８０００の口腔局所適用の効果を示す、４ＮＱＯ処理ラットの舌の免疫組織化学的に染色された切片の一連の写真である。口腔／舌組織の組織病理学的な等級付けを評価するために、ホルマリン固定及びＨ＆Ｅ染色試料を病理学的評価に付した。示されるように（上パネル）、４ＮＱＯ−処理ラットからのＨ＆Ｅ染色切片は、ＰＥＧ８０００処理ラットにおいて正常化された軽度から中等度の上皮異形成の多数の局所領域を示した。４ＮＱＯ−処理ラットの舌／口腔領域中の粘膜増殖におけるＰＥＧ８０００適用の効果を更に研究するために、組織切片を、明確に定義された増殖のマーカーである、核抗原Ｋｉ６７の免疫組織化学的分析に付した（下パネル）。示されるように、発ガン性物質の無い対照と比較して、４ＮＱＯ−処理は、対照と比べて増加したＫｉ６７−標識細胞の数／光場（ｐ＜０．０１）により示される舌粘膜における増殖を増加させた。しかしながら、発ガン性物質−開始ラットがＰＥＧ−８０００の局所適用に付された場合、４ＮＱＯ群に比して、Ｋｉ−６７陽性細胞の数における減少が観察された（ｐ＜０．０１）。発ガン性物質処理群において、対照と比較した場合、重層扁平舌上皮の基底層直上の区画において、細胞のより高いパーセンテージがＫｉ−６７陽性であることが観察された。ＰＥＧ８０００処理は、基底層直上の区画におけるＫｉ−６７陽性細胞の数を減少するが、大半が対照群で見られるような基底層を生じる制限的発現である。
【図６】ＥＧＦＲの発現におけるＰＥＧ８０００の局所適用の効果を示す顕微鏡写真である。対照からのホルマリンで固定された舌切片（発ガン性物質で処理されていない）及びＰＥＧ８０００で処理されたか又は処理されていない４ＮＱＯ−ラットは、ＥＧＦＲ発現の免疫組織化学的評価に付された。示されるように、４ＮＱＯラットの舌粘膜における基本ＥＧＦＲ発現は、対照（非−発ガン性物質処理）ラットのそれよりも明確に高かった（ｐ＜０．００００１）。４ＮＱＯ−ラットは、ＥＧＦＲ発現の免疫組織化学的評価に付された。示されるように、４ＮＱＯラットに対するＰＥＧ８０００の局所適用は、しかしながら、ＰＥＧ−未処理４ＮＱＯラットと比較して、ＥＧＦＲの発現において明確な減少を引き起こした（ｐ＜０．００５）。対照及び４ＮＱＯ−ＰＥＧ切片は、僅かにＥＧＦＲ染色されたか又はＥＧＦＲ染色されなかったが、一方、４ＮＱＯ切片は、極度にＥＧＦＲ染色された。
【図７】、
【図８】及び
【図９】ＳＣＣ−２５細胞における異なるＰＥＧ配合物（ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００及びＰＥＧ８０００）により減少された細胞増殖及びＥＧＦＲ発現を示すグラフである。細胞は、９６−ウェルプレート（ＷＳＴ−１アッセイ）又は６０ｍｍの培養皿（ＥＧＦＲ及びＰＣＮＡ発現）の何れかに播種された。細胞は、２４時間、ＰＥＧ３３５０（図７）、ＰＥＧ４０００（図８）及びＰＥＧ８０００（図９）で個別に処理された。細胞増殖は、ＷＳＴ−１アッセイ及びウエスタンブロット法による細胞増殖マーカーである増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の測定の両方により決定された。ＥＧＦＲ発現もまた、ウエスタンブロット法により決定された。全ての実験はトリプリケートで実施された。ＷＳＴ−１アッセイのために、各実験は１２測定を行ったが、一方、ＥＧＦＲ及びＰＣＮＡ測定のために、各々３測定が存在した。データは、各バイオマーカー（ＷＳＴ−１、ＥＧＦＲ及びＰＣＮＡ）のための対照（ＰＥＧ処理されていない）の平均パーセント±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；*ｐ＜０．０５及びXｐ＜０．０００１として表された。
【図１０】ＳＣＣ−９細胞における異なるＰＥＧ配合物（ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００及びＰＥＧ８０００）によるＥＧＦＲの表面発現の阻害を示すグラフである。これらの研究のために、ＳＣＣ−９細胞は、２４時間１０％ｗ／ｖＰＥＧで処理され、表面ＥＧＦＲの発現を決定するために、フローサイトメトリー分析に付された。ヒストグラムが、ＥＧＦＲの表面発現のための対照（ＰＥＧ処理されていない）のパーセントとして表された。実験は、各４測定を伴うトリプリケートで実施された。データは、対照（ＰＥＧ処理されていない）の平均パーセント±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；*ｐ＜０．０００１として表された。
【図１１】及び
【図１２】ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）（−）細胞及びＨＰＶ（＋）細胞の増殖及びＥＧＦＲ発現におけるＰＥＧ８０００の効果を示すグラフである。ＥＧＦＲ発現及び増殖におけるＰＥＧ８０００の効果におけるＨＰＶ状態の役割を研究するために、ＨＰＶ（−）ＯＫＦ６細胞（図１１）又はＨＰＶ（＋）ＨＯＫ細胞（図１２）が、異なる濃度のＰＥＧ８０００で２４時間処理された。細胞増殖は、ＷＳＴ−１アッセイ及びウエスタンブロット法による細胞増殖マーカーであるＰＣＮＡの測定の両方により決定された。ＥＧＦＲ発現もまた、ウエスタンブロット法により決定された。全ての実験はトリプリケートで実施された。ＷＳＴ−１アッセイのために、各実験は１２測定を行ったが、一方、ＥＧＦＲ及びＰＣＮＡ測定のために、各々３測定が存在した。データは、各バイオマーカー（ＷＳＴ−１、ＥＧＦＲ及びＰＣＮＡ）のための対照（ＰＥＧ処理されていない）の平均パーセント±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；*ｐ＜０．０５及びXｐ＜０．０００１として表された。
【図１３】、
【図１４】及び
【図１５】腫瘍増殖の退縮におけるＰＥＧの効果を研究するために、局所モデルを利用したが、ここで約１００万個のＳＣＣ−２５細胞が、無胸腺マウスの舌領域の近くに直接埋め込まれた。２週間後、マウスは、無作為に各１２匹の動物の２群に分けられ、Ｑ−チップを用いる１０％ＰＥＧ８０００又はＰＢＳの日毎の口腔局所適用に付された。マウスは処理後１９ないし２０日に安楽死され、腫瘍が切除され、重さが量られた。ＰＥＧ−８０００は、対照と比較して、腫瘍質量において明らかな減少を引き起こした（２９．８％；*ｐ＜０．０５、図１３）。また、評価されたものは、舌領域における、Ｋｉ−６７増殖マーカー及びＥＧＦＲ免疫染色であった。ＰＥＧ８０００は、対照と比較して、ＰＥＧ−処理群における増殖指標（３１．５％；*ｐ＜０．００２、図１４）及びＥＧＦＲ染色（４２．４％；*ｐ＜０．００５、図１５）を明らかに減少した。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表された。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
本発明の組成物
本発明の組成物は、以下に更に詳細に記載されるように、その唯一の治療効果のある成分としてＰＥＧの有効量を含み得るか又は１種以上の治療薬（特に、抗ガン剤）を含み得る。用語“ポリエチレングリコール”（ＰＥＧ）は、エチレンオキシドのポリマーを言及する、別名、ポリ（オキシエチレン）又はポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）としても既知である。本発明で使用されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、典型的には、一般式、Ｈ−（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＨを有するが、しかし、末端がキャップされた構造及びエチレンオキシド以外に少量のアルキレンオキシド単位を含むポリオキシエチレンのような他のポリエチレングリコール化合物を使用し得る。
【００３３】
本発明の組成物中に使用されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、範囲の下限が、１０００、２０００、３０００、４０００、６０００からなる群より選択され；及び範囲の上限が、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１２，０００、１５，０００、２０，０００からなる群より、独立して選択されるところの範囲における、平均分子量（例えば、重量平均分子量）を有し得る。好ましい範囲は、下限が３０００又は４０００であり、上限が５０００、６０００、７０００、８０００又は９０００から独立して選択されるところの範囲である。
【００３４】
例えば、ＰＥＧは、幾つかの国内又は地域の薬局方において規定されるような、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００又はＰＥＧ８０００であり得る。幾つかの国内又は地域の薬局方において承認されている適当なＰＥＧの更なる例は、マクロゴール類、例えば、マクロゴール３３５０、マクロゴール４０００、マクロゴール８０００を含む。好ましくは、ＰＥＧは、被験者に局所投与される場合、殆ど全身的に吸収されない。
【００３５】
本発明の組成物は、更に、別の治療薬（以下参照）及び１種以上の添加物のような他の成分を含み得る。添加物の例は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウムのような硫酸塩のような１種以上の電解質を含む。１態様において、本発明の組成物は、塩化ナトリウム及び塩化カリウム及び任意に重炭酸ナトリウムを含む。本発明の組成物は、１種以上の甘味料（例えば、アスパルテーム、アセスルファムカリウム（アセスルファム Ｋ）、スクラロース及びサッカリン並びにそれらの組合せ）及び１種以上の香味料（例えば、オレンジ、レモン−ライム、レモン、シトラス、チョコレート、トロピカルフルーツ、アロエ  ベラ、茶、ストロベリー、グレープフルーツ、ブラックカラント、パイナップル及びバニラ）を含み得る。組成物は、アスコルビン酸塩及び／又はクエン酸塩を更に含み得る。本発明の組成物は、保存料及び、許容可能なガレノスプラクティス（ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｇａｌｅｎｉｃ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）として知られ及び呼ばれる、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キャリア、キレート剤及び不活性ガス等他の添加物のような他の添加物を更に含み得る。好ましくは、キャリアは薬学的に許容可能なキャリアである。キャリアは、従来使用される如何なるものでもあり得、ＰＥＧ及び／又は他の治療薬（存在する場合）との溶解性及び反応性の欠如のような物理化学的考察によってのみ及び投与経路によってのみ限定される。薬学的に許容可能なキャリアは、当業者に周知であり、容易に入手可能である。該薬学的に許容可能なキャリアが、活性薬剤に対して不活性であるものであり且つ使用条件下で有害な副作用又は毒性を有さないものであることが好ましい。
【００３６】
本発明の組成物は、種々の配合物中に存在し得る。例えば、本発明の組成物は、水溶液又は懸濁液（例えば、マウスウォッシュ）、乳濁液、ペースト（例えば、練り歯磨き）、クリーム、バーム（例えば、リップバーム）、軟膏、フォーム、塗剤（ｐａｉｎｔ）、スポンジ、ジェル、チューインガム、噴霧剤、ドロップ（ｌｏｚｅｎｇｅ）、トローチ、シロップ（例えば、増粘シロップ）、リンクタス、スラリー、フィルム（例えば、口腔内崩壊フィルム）、錠剤（例えば、口腔内崩壊錠）、カプセル（例えば、液体ゲルカプセル）、顆粒、カプレット、口腔パッチの形態で調製され得る。本発明の組成物の特に好ましい配合物は、溶液、リンクタス及び塗剤（ｐａｉｎｔ）を含む。
【００３７】
本発明の組成物の使用目的に依存して、ある配合物が特に適切であり得る。例えば、本発明の組成物を唇に投与することを望む場合、該組成物はリップバーム又はクリームとして調製され得る。該組成物を口腔粘膜の領域に投与することを望む場合、マウスウォッシュ、噴霧剤又はドロップが特に適当であり得る。配合物がマウスウォッシュである場合、それは嚥下又は喀出の前にうがいされるか又は口の周りを旋回され得る。本発明の組成物は、特に、鼻腔、口腔又は中咽頭投与のためのエアロゾル配合物として調製され得る。本発明の組成物はまた、ネブライザー又はアトマイザーにおけるような非加圧の配合物としても調製され得る。幾つかの態様において、本発明の組成物は、当業者において周知の配合物形態である、リンクタス配合物であり得る。この形態は、ＰＥＧと標的組織（例えば、咽頭及び／又は喉頭粘膜）との間の接触時間の増加を支援し得、また、これらの解剖学的部位におけるＨＮＳＣＣの予防及び／又は治療において特に適当であり得る。
【００３８】
１態様において、本発明の組成物は、被験者に局所的に投与される。局所投与とは、本発明との関連で、本発明の組成物の被験者の身体の表面への適用を言及する。局所投与は、被験者の内部表面、例えば、口腔粘膜への適用を含む。本発明の組成物は、標的領域（例えば、ガン腫）及びその局所領域中に投与され得る（時々、ここ及び該技術分野において“局所領域投与（ｌｏｃｏｒｅｇｉｏｎａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）”として言及される）。典型的には、本発明の組成物は、被験者の身体の表面で接近可能であるガン腫、例えば、唇、舌、口腔粘膜（例えば、口腔底部／天井部）、鼻腔、咽頭、喉頭及びそれらの解剖学的部位に発症した表面が露出したＨＮＳＣＣの領域に適用される。局所投与は、本発明の組成物の経口投与を含み得る。例えば、局所投与は、本発明の組成物を
嚥下することを含み得る。従って、組成物は咽頭を介して胃へ移行するため、本発明の組成物とガン腫（存在する場合）の表面露出領域との間の接触が可能となる。
【００３９】
治療的に用いられるＰＥＧの有効量は、例えば、療法及び治療目的（例えば、予防又は治療又は両方）、投与経路、年齢、体重、治療又は療法を受ける被験者の状態（例えば、被験者の一般状態を決定することによる）、ガン腫（存在する場合）の病期及び／又は悪性度（例えば、ＴＮＭスコア）、被験者に対して提供されている、あらゆる予備又は補助療法、並びに、被験者における、本発明の組成物を伴う療法に対する以前の応答（適当ならば）に依存するだろう。ＰＥＧの有効量は、少なくとも部分的に、標的組織（例えば、ＨＮＳＣＣガン）のＥＧＦＲ表面発現における所望の減少により決定され得る。ＰＥＧの有効量は、本発明に従って、標的組織において、ＰＥＧと接触する前に観察された発現と比べて、少なくとも３０％（又はそのくらい）、例えば、少なくとも４０％のＥＧＦＲ発現の減少をもたらし得る。
【００４０】
ガン腫のような標的組織におけるＥＧＦＲ表面発現の減少は、ＰＥＧと標的組織との間の接触時間により影響され得る。一般に、標的組織におけるＥＧＦＲ表面発現における、より大きな減少は、増加された接触時間で観察され得る。例えば、ＰＥＧと標的組織との間の接触時間は、５秒ないし１０分、例えば、２ないし３分のような、１ないし５分であり得る。ＰＥＧの有効量は、従って、それに応じて漸増し得る。
【００４１】
ＥＧＦＲ減少の程度は、ここの実施例に記載された方法を使用して決定され得る。特に、ＥＧＦＲ減少の程度は、以下に記載されるようなフローサイトメトリーを使用して決定され得る。
【００４２】
標的組織のＥＧＦＲ発現状態は、標準的な方法及びキット（例えば、ＥＧＦＲ  ｐｈａｒｍＤｘ（登録商標）、デンマーク国、グロストルップのＤａｋｏ  Ｄｅｎｍａｒｋ  Ａ／Ｓより入手可能）を使用して決定され得る。
【００４３】
ＨＮＳＣＣの予防における使用のためのＰＥＧの有効量は、ＨＮＳＣＣの治療における使用のためのＰＥＧの有効量とは異なり得る。１態様において、予防の設定において、治療の設定において典型的に使用されるよりも少ない量のＰＥＧが必要とされる。ＰＥＧは既に医療分野において広範に使用され、良好な耐容性を示すため、重篤な有害事象は、低度であると考えられる。本発明は、ＰＥＧが濃度依存的な様式でビトロにおけるＨＮＳＣＣ細胞の増殖を阻害することを可能とすることを提示するため、それは、当業者が上記の考察に従ってＰＥＧの有効量を決定する範囲内にある。
【００４４】
本発明の組成物は、ＰＥＧの有効量を含み得る。例えば、本発明の水溶液（例えば、マウスウォッシュ）は、７．５％ｗ／ｖ以上（例えば、１０％ｗ／ｖ以上）のＰＥＧを含み得る。ＰＥＧの有効量を含む本発明の組成物は、１日当たり１回以上、例えば、１日当たり２回、１日当たり３回、４回又は５回投与され得る。本発明の組成物を用いる療法の持続は、部分的に、上記の考察に依存する。そのような考察は、主治医又はヘルスケアの専門家の範囲内にある。
【００４５】
治療薬
ＰＥＧの有効量を含む本発明の組成物は、ＨＮＳＣＣの予防及び／又は治療のために１種以上の治療薬と併用して使用し得る。例えば、本発明の組成物は、１種以上の治療薬と共投与され得る。用語“共投与”は、ＨＮＳＣＣを予防及び／又は治療するための、１種以上の治療薬を伴う本発明の組成物の協調投与を意味する。そのような本発明の組成物と１種以上の治療薬との間の協調投与は、同時、逐次又は別個であり得る。
【００４６】
本発明の組成物と共に使用し得る治療剤の例は、放射線治療及び抗ガン剤を含む。用語“抗ガン剤”は、扁平上皮ガン、特に頭頸部の扁平上皮ガンのようなガン細胞において、ガンの開始及び／又は増殖を阻害及び／又は細胞死（例えば、アポトーシスによる）を促進することが可能な治療剤を意味する。そのような治療剤は、そのような使用のために、国内又は地域の薬局方により承認された治療剤を含む。
【００４７】
抗ガン剤の例は、ＥＧＦＲ発現及び／又は機能を標的とする剤（例えば、ＥＧＦＲの機能的なシグナル伝達を阻害することによる）を含み、ここでは“抗−ＥＧＦＲ薬”として参照される。抗−ＥＧＦＲ薬の例は、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツマブ（ｚａｌｕｔｕｍａｂ）、ニモツズマブのような抗−ＥＧＦＲ抗体を含む。他の抗−ＥＧＦＲ薬は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ＢＩＢＷ−２９９２を含む。
【００４８】
抗ガン剤の例は、ＶＥＧＦＲ発現及び／又は機能を標的とする剤（“抗−ＶＥＧＦＲ薬”）を含む。抗−ＶＥＧＦＲ薬の例は、ベバシズマブ、ソラフェニブ、スニチニブ、バンデタニブを含む。
【００４９】
抗ガン剤の例は、ＩＧＦ−１Ｒ発現及び／又は機能を標的とする剤（“抗−ＩＧＦ−１Ｒ薬”）を含む。抗−ＩＧＦ−１Ｒ薬の例は、フィギツムマブ（ｆｉｇｉｔｕｍｕｍａｂ）及びシクスツムマブ（ｃｉｘｔｕｍｕｍａｂ）を含む。
【００５０】
抗ガン剤の例は、ラパマイシンの哺乳類標的を阻害する剤（“ｍＴＯＲ薬”）を含む。そのようなｍＴＯＲ薬の例は、テムシロリムス、エベロリムスを含む。
【００５１】
抗ガン剤の更なる例は、シスプラチン及びカルボプラチンのような白金製剤；パクリタキセル及びドセタキセルのようなタキサン類；ペメトレキセドのような葉酸代謝拮抗薬；フルオロウラシル、メトトレキサートを含む。
他の抗ガン剤の例は、ダサチニブ、ロナファルニブ及びボルテゾミブを含む。
【００５２】
幾つかの態様において、本発明の組成物は、上述のような１種以上の抗ガン剤の有効量と一緒に（例えば、緊密な物理混合物において）ＰＥＧの有効量を含む。好ましくは、ＰＥＧは、抗ガン剤と結合していない。この明細書の読者は、上述の１種以上の抗ガン剤と一緒のＰＥＧの各組み合わせが本発明の態様として、個別に及び具体的に考慮されると想定し得る。
【００５３】
１種以上の治療薬の有効量が、必ずしもＰＥＧの有効量と同じ質量を必要としないことは明白になる。放射線治療との関連において、用語“有効量”を考慮した場合、適切な用量単位（例えば、グレイ（ｇｙ）又はラド）が配備されるべきであることもまた、明白になる。
【００５４】
本発明の他の態様において、任意の使用説明書を伴って、上述したような１種以上の抗ガン剤の少なくとも１つの組成物を伴う本発明の組成物を含むキットが提供される。
【００５５】
治療方法及びそのような方法における使用のための組成物
本発明は、ＰＥＧの有効量を投与することを含む、被験者におけるＨＮＳＣＣを予防及び／又は治療する方法を提供する。本発明はまた、被験者におけるＨＮＳＣＣの予防及び／又は治療における使用のための組成物も提供する。
【００５６】
本発明の組成物及び治療方法は、特に、表面ＥＧＦＲが過剰発現したＨＮＳＣＣのような扁平上皮ガンの治療における使用であり得る。被験者における扁平上皮ガンのＥＧＦＲの発現状態は、標準方法及びキット（例えば、ＥＧＦＲ  ｐｈａｒｍＤｘ（登録商標）、
デンマーク国、グロストラップのＤａｋｏ  Ｄｅｎｍａｒｋ  Ａ／Ｓより入手可能）に従って決定し得る。
【００５７】
１態様において、本方法は、ＨＮＳＣＣを予防するためのものである。別の態様において、本方法は、ＨＮＳＣＣを治療するためのものである。更なる態様において、本方法は、ＨＮＳＣＣを予防及び治療するためのものである。
【００５８】
同義語“予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）”及び“予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）”並びにそれらの文法的変異は、ＨＮＳＣＣ（又は、場合により、食道のガンであり得る）の発生を阻害すること及び／又は上皮の前ガン病変（口腔白板病のような）及び／又は早期ガンの後期ガンへの進展を阻害することを意味する。
幾つかの態様において、本発明の予防方法は、ＨＮＳＣＣの陽性診断に先立って行われる。
【００５９】
用語“治療（ｔｒｅａｔ）”及びその文法的変異は、ＨＮＳＣＣ（又は、場合により、食道のガンであり得る）の増殖を阻害すること及び／又はＨＮＳＣＣ（又は、場合により、食道のガンであり得る）における細胞死を促進することを意味する。幾つかの態様において、治療は“回復（ｃｕｒｅ）”を含むが、用語回復は、必ずしも悪性度に関連する健康の完全な復元を意味するものではない。当業者は、治療が様々な程度の治療効果を有し得、また、そのようなものも用語“治療”に含まれると認識する。
【００６０】
本発明は更に、本発明の組成物を被験者に投与することを含む、ＨＮＳＣＣの寛解にある被験者におけるその疾患を予防するための方法を提供する。寛解は完全又は一部であり得る。そのような方法における使用のための組成物もまた提供される。
【００６１】
本発明は更に、本発明の組成物を被験者に投与することを含む、被験者の局所進行性及び／又は転移性であるＨＮＳＣＣを治療するための方法を提供する。
【００６２】
本発明の別の態様において、本発明の組成物を被験者に投与することを含む、進行性ＨＮＳＣＣに対して感受性である被験者のＨＮＳＣＣを予防及び／又は治療するための方法が提供される。そのような被験者は、タバコ（喫煙及び／又は噛みタバコ）、アルコール過量摂取、ビンロウ噛みの経歴を有する及び／又は同時使用する被験者を含む。そのような被験者は、ＨＰＶ（特に血清型ＨＰＶ  １６）に感染している及び／又は免疫不全である及び／又は進行性ＨＮＳＣＣの（又はＨＮＳＣＣにかかりやすい）家族歴又は前歴を有する被験者を含む。本発明は更に、本発明の組成物を被験者に投与することを含む、ＨＰＶ陰性である被験者のＨＮＳＣＣを予防及び／又は治療するための方法を提供する。そのような方法における使用のための組成物もまた提供される。
【００６３】
別の態様において、本発明の組成物を被験者に投与することを含む、口腔白板症及び／又は口腔紅板症を発症している被験者のＨＮＳＣＣを予防するための方法が提供される。そのような方法における使用のための組成物もまた提供される。
【００６４】
別の態様において、本発明の組成物を被験者に投与することを含む、上気道消化管の上皮に対して前ガン状態の変化を発症している被験者のＨＮＳＣＣを予防するための方法が提供される。前ガン状態の変化は、“領域ガン化”の結果として生じ得る。領域ガン化は、変形のために上皮を用意する変化（それは、多発性であり得、互いに独立し得る）に上皮が従う過程を言及する。これらの変化は、上皮血管系に対する微妙な変化、上皮に対する細胞形成異常及び他の分子変化において明らかであり得る。この態様は、ＨＮＳＣＣの前歴を有する（又はＨＮＳＣＣにかかりやすい）被験者のＨＮＳＣＣの予防において特に適切であり得る。
【００６５】
本発明の別の観点において、被験者におけるＨＮＳＣＣのような扁平上皮ガンを予防及び／又は治療するための方法であって、該方法は、
（ａ）前記被験者に放射線治療及び／又は抗ガン剤、例えば、抗−ＥＧＦＲ薬（例えば、セツキシマブのような抗−ＥＧＦＲ抗体）のような治療薬の有効量を投与すること；
（ｂ）前記被験者にＰＥＧの有効量を投与すること
を含むところの方法が提供される。
【００６６】
本発明のこの観点の１態様において、段階（ｂ）及び段階（ａ）は、同時に起こる。別の態様において、段階（ｂ）が、段階（ａ）の後に起こる。別の態様において段階（ｂ）が、段階（ａ）の前に起こる。本発明のこの観点の別の態様において、本方法は更に、（ｃ）治療剤、例えば、放射線治療及び／又は抗ガン剤、例えば、抗−ＥＧＦＲ薬（例えば、セツキシマブのような抗−ＥＧＦＲ抗体）の有効量を投与すること；の段階を含む。この態様において、段階（ｂ）は、段階（ａ）の後で且つ段階（ｃ）の前に起こり得る。従って、ＰＥＧの有効量は他の治療剤、特に、放射線及び／又は抗ガン剤を用いる治療のサイクルの間に投与され得る。段階（ａ）及び段階（ｃ）の治療剤は、必ずしも同じである必要はない。段階（ａ）及び段階（ｃ）の治療剤が同じである場合、段階（ａ）及び段階（ｃ）に従う薬量は、必ずしも同じである必要はない。
【００６７】
本発明の別の観点において、ＰＥＧの有効量は、ＨＮＳＣＣガンの切除及び／又は除去に関連して被験者のＨＮＳＣＣを治療するために使用され得る。従って、以下の段階：
（ａ）少なくとも１つのＨＮＳＣＣガンを切除すること及び／又は除去すること；
（ｂ）ＰＥＧの有効量を投与すること
を含む、被験者のＨＮＳＣＣを治療するための方法が提供される。
【００６８】
段階（ａ）は、段階（ｂ）の前又は段階（ｂ）の後の何れかで起こり得る。本発明のこの観点の幾つかの態様において、更に、ここに記載されるような治療剤の有効量を投与する段階を含む段階（ｃ）が存在し得る。段階（ｃ）は、段階（ａ）の後で且つ段階（ｂ）の前、後又は同時に起こり得る。
【００６９】
本発明のこの観点の幾つかの態様において、ＰＥＧの有効量は、外科的な切除／除去の部位及び局所領域で投与され得る（例えば、局所領域投与）。本発明の幾つかの態様において、ＰＥＧの有効量は、ＨＮＳＣＣを発症している疑いがある頭頸部の病変に投与され得る（例えば、局所領域投与）。
【００７０】
本発明は更に、ＨＮＳＣＣの多様な治療のための方法（それは、ＨＮＳＣＣを治療するための少なくとも２種の異なるモダリティ、例えば、外科手術、放射線療法、化学療法を含む治療である）であって、該方法がＰＥＧの有効量を投与することを含むところの方法を提供する。
【００７１】
別の態様に従って、本発明は、被験者にＰＥＧの有効量を投与することによる、被験者の頭頸部の扁平上皮細胞におけるＥＧＦＲ発現及び／又はリン酸化を減少又は阻害するための方法を提供する。用量及び使用期間は、希望するＥＧＦＲ発現又はリン酸化の減少の量に依存する。好ましくは、本発明の態様に従って、ＰＥＧは少なくとも１ないし１４日間被験者に投与されるが、しかしながら、ＰＥＧは、より長い期間、又は扁平上皮細胞組織におけるＥＧＦＲの発現及び／又はリン酸化の減少が達成されるまで投与され得る。
【００７２】
本発明の観点に従って、被験者にＰＥＧの有効量を投与することを含む、被験者における食道のガンを予防及び／又は治療するための方法が提供される。そのような方法における使用のための上記したような組成物もまた提供される。
【００７３】
本発明の更なる観点に従って、ＰＥＧの有効量を投与することを含む、ＨＮＳＣＣのような扁平上皮ガンを発症している被験者における全身腫瘍組織量（即ち、腫瘍数及び容積）を減少するための方法が提供される。そのような方法における使用のための組成物もまた提供される。
【００７４】
本発明の方法で言及する被験者は、あらゆる被験者であり得る。好ましくは、被験者は、哺乳類である。ここで使用されるように、用語“哺乳類”は、マウス及びハムスターのようなネズミ目の哺乳類及びウサギのようなウサギ目の哺乳類を含むがこれらに限定されないあらゆる哺乳類を言及する。哺乳類が、Ｆｅｌｉｎｅｓ（猫）及びＣａｎｉｎｅｓ（犬）を含む食肉目からのものであるのが好ましい。哺乳類が、Ｂｏｖｉｎｅｓ（牛）及びＳｗｉｎｅｓ（豚）を含む偶蹄目又はＥｑｕｉｎｅｓ（馬）を含む奇蹄目からのものであるのがより好ましい。哺乳類が、霊長目、Ｃｅｂｏｉｄｓ（サル）又はＳｉｍｏｉｄｓ（サル）或いは類人猿（ヒト及びサル）であるのが最も好ましい。特に好ましい哺乳類は、男性のヒトのようなヒトである。
【実施例】
【００７５】
例示
以下の実施例は本発明を更に説明するが、決してその範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
動物実験及び腫瘍誘導
全ての動物プロトコルは、ノースショア  ユニバーシティー  ヘルスシステムの所内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ
Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により精査されて承認された。
【００７６】
４ＮＱＯ頭頸部扁平上皮ガンモデル
２４匹の雌性のフィッシャーラット（Ｆ  ３４４；１５０−２００ｇ；Ｈａｒｌａｎ、インディアナポリス、インディアナ州）を、温度と湿度が調節された環境（２５℃、湿度６０％及び１２時間の光／１日周期）中、１プラスチックケージに３匹で飼育した。１６匹の動物は、ラットの餌及び４−ニトロキノリン１−オキシド（４ＮＱＯ；２０ｐｐｍ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、セントルイス、ミズーリ州）が添加された飲料水が不断利用で提供された。新たに製造された４ＮＱＯ補強水が、１週間に２回補充された着色（淡い不透明色）ボトルでラットに与えられた。残りの８匹のラットは、清浄な飲料水が提供された（対照群）。１４週後、４ＮＱＯ添加水は、通常の水に置き換えられ、ラットは無作為に２つの治療群に分けられた。第一の群（８ラット）は、口腔内にＰＥＧ−８０００の日毎の局所適用を受けた。これは、クロテンのブラシを使用してラットの口腔の口腔底部／天井部上に、少なくとも２ないし３分間、生理食塩水中の１０％ｗ／ｖＰＥＧの溶液を塗布することにより達成された（＃４）。対照としての機能を果たす、第二の群（８ラット）は、生理食塩水のみが塗布された。この投薬計画（レジュメ）は追加の１４週間継続された。ラットは、突出した舌及び口腔におけるあらゆる総計の形態学的変化の存在を周期的に検査された。１４週の終わりに、動物は制御されたＣＯ2曝露／両側の開胸術下で安楽死された。解剖で、ラットの舌が切除され、巨視的な腫瘍評価に付された。舌部分が薄く切られ、ホルマリン固定され、パラフィン包埋され、区分され、組織学的及び免疫組織化学的処理に付された。
【００７７】
解剖したラットの舌は、顕性腫瘍の存在のために試験された。各舌における腫瘍（＞０．２ｃｍ）の総数が数えられ、腫瘍容積（サイズ）が、式、幅×長さ×高さ×π／６に従って測定された（Ｔｏｍａｙｋｏ  Ｍ．Ｍ．及びＲｅｙｎｏｌｄｓ  Ｃ．Ｐ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２４巻：１４８−１５４頁（１９８９年））。非病変の舌組織における上皮異型及び異形成の存在のための組織学的評価が、
ヘマトキシリン及びエオシンを用いる染色の後に実施された。
【００７８】
頭頸部局所扁平上皮ガンモデル
この異種移植モデルにおいて、局所的な腫瘍の成長を模倣するために、扁平上皮細胞（ＳＣＣ  ２５）が、口腔内の解剖学的発生部位の近くに直接移植された。このモデルは、腫瘍成長の退縮におけるＰＥＧの効果を研究することを可能とする。Ｂ−細胞欠損無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（ＭＡ）から調達した。ＳＣＣ−２５細胞［ＤＭＥＭ  Ｆ１２媒体５０μＬ中の１×１０6個の細胞（ＡＴＣＣ）］がマウスの舌上部中に直接注入された。２週間後、腫瘍が出現し始めた場合、マウスを各１２匹の動物の２群へ無作為に分け、Ｑ−チップを使用する１０％ｗ／ｖのＰＥＧ８０００（〜１００μＬ）又はＰＢＳの１日１回の口腔局所適用に付された。マウスは、１９ないし２０日間で安楽死され、ＣＯ2曝露／両側の開胸術下で後処理され、腫瘍が切除され、計量された。腫瘍及び舌組織は、ヘマトキシリン及びエオシンを用いる染色の前に、ホルマリン固定され、パラフィン包埋／装着された。組織病理学的評価が腫瘍の扁平上皮の性質を確認した。同様に評価されたものは、舌部位の免疫染色による増殖マーカーＫｉ−６７及びＥＧＦＲであった。
【００７９】
免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析
組織切片は、増殖マーカーＫｉ−６７及びＥＧＦＲの発現におけるＰＥＧ  ８０００の効果を決定するために、ＩＨＣ分析に付された。４ミクロンのパラフィン包埋切片がＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ+スライド（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア州）上に装着され、最初に５５ないし６０℃で１時間焼成することにより脱パラフィン化し、その後、キシレン中で２回の５分間洗浄に付された。組織切片はその後、エタノール洗浄の段階的な系列において水和された。エピトープ賦活化は、組織スライドを、抗原脱マスキング溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で加圧マイクロ波加熱（ＮｏｒｄｉｃＷａｒｅ，ミネアポリス、ミネソタ州）に付すことにより達成された。内因性の過酸化物活性は、１０分間メタノール中の３％Ｈ2Ｏ2で処理することによりクエンチされ、非特異的な結合は、室温で２時間５％ウマ血清で組織切片を培養することにより阻止された。切片はその後、一次抗体である抗−Ｋｉ−６７（ＲＢ−９０４３−Ｐ、１：３００  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＵＫ）及び抗−ＥＧＦＲ（ＳＣ−０３、１：２００  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、サンタクルーズ、カルフォルニア州）で４℃で４時間、続いて適当なビオチン化二次抗体で培養された。ＰＢＳ洗浄を繰り返した後、抗原−抗体複合体は、色原体（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）として３，３‘−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を使用するＶｅｃｔａｓｔａｔｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で検出された。陰性対照のために、切片は一次抗体の非存在下で処理された。標本はギルヘマトキシリン溶液中で対比染色され、飽和炭酸リチウム（１ｇ／１００ｍＬ）中の２０秒間洗浄により青色安定化された。免疫組織化学（ＩＨＣ）は、治療計画の予備知識を有さない病理学者によりスコア化された。判定量的なスケールが基底扁平上皮細胞の免疫反応性を評価するために使用された。染色の程度は、０，陰性染色；１＋，＜１０％反応性、２＋  １０−５０％反応性、及び３＋  ＞５０％陽性の反応性として、等級化及びスコア化された。
【００８０】
細胞培養
ＳＣＣ−２５及びＳＣＣ−９細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、ロックビル、メリーランド州）は、４００ｎｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ／Ａｒｄｒｉｃｈ）、１０％ｖ／ｖのＦＢＳ（ＡＴＣＣ）及び０．５％ｖ／ｖのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（ＡＴＣＣ）が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ−１２媒体（２．５ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム及び１２００ｍｇ／Ｌ  重炭酸ナトリウムを含む）中で培養された。ＯＫＦ−６（ＨＰＶ−）及びＨ
ＯＫ（ＨＰＶ＋）細胞は、ケラチノサイト−ＳＦＭ媒体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養された。ＰＥＧの効果を評価するために、これらの細胞は、以下の実施例で記載されたように、２４時間ＰＥＧ又はビヒクル（ＰＢＳ）の種々の配合物で処理された。細胞は、細胞増殖（ＷＳＴ−１）が評価されるか又はウエスタンブロット及び／又はフローサイトメトリー分析に付された。
【００８１】
ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット法が標準的な技術を用いて適用された。即ち、タンパク質３０μｇは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付され、二フッ化ポリビニリデン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）に移され、５％ブロット（５％ミルク、ＴＢＳ緩衝液中の０．０５％ツイーン）でブロックされ、及び、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ、ＳＣ−５６、１：１０００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＳＣ−０３、１：７５０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対する特異抗体が標準的な技術を用いて調べられた。電子写真は、増強された化学発光（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で現像された。画像はＵＶＰ  Ｂｉｏ−ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓを介して取得され、Ｌａｂｗｏｒｋｓ  ４．６  ソフトウェア（ＵＶＰ、ＬＬＣ、アップランド、カルフォルニア州）を用いて解析された。タンパク質負荷における均一性は、抗−β−アクチン（ＳＣ−１６１５  ＨＲＰ、１：２０００  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で膜を調べた後、正規化することにより達成された。
【００８２】
細胞増殖アッセイ（ＷＳＴ−１）
細胞数は、製造業者の説明書（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、インディアナポリス、インディアナ州、米国）に従って、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１（４−［３−（ヨードフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリオ］−１，３−ベンゼン二硫酸塩）のホルマザンへの開裂を測定することにより評価された。即ち、細胞は、１００μＬの最終容積において、９６−ウェルプレート中で育成され、その後、３７℃で３０分間、湿度５％のＣＯ2培養器中、１０μＬのＷＳＴ−１試薬で培養された。テトラゾリウム塩のホルマザンへの変換は、４４０ｎｍの吸光度で分光光学的に決定された（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、サニーベール、カルフォルニア州、米国）。
【００８３】
フローサイトメトリー分析
以下の技術はＰＥＧで処理されたＳＣＣ−２５及びＳＣＣ−９細胞におけるＥＧＦＲの表面発現を測定するために利用された。細胞（６０−７０％コンフルエント）は上記のようにしてＰＥＧで処理され、その後３０分間４％の緩衝化されたホルムアルデヒド中で固定された。細胞はＰＢＳ（ｐＨ７．４；２％ウシ胎児血清、０．２％ウシ血清アルブミン及び０．０２％アジ化ナトリウムを含む）中で２回洗浄され、続いて、室温で１時間、抗−ＥＧＦＲクローン５２８（１：２００；Ｄｒ．Ｈ．Ｂａｎｄより快く提供された）で培養された。ＰＢＳ中で洗浄した後、細胞は、４０分間二次抗体Ａｌｅｘａ  ４８８  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌ１−標識  抗−マウス（ＳＣ−１２０ＡＦ  ４８８、１：２００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で培養された。細胞は、続いてＰＢＳ中で洗浄され、フローサイトメトリー分析（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）に付された。
【００８４】
統計解析
データはスチューデントt-検定により解析され、平均±Ｓ．Ｄ．又はＳＥＭとして表示された。差異はｐ＜０．０５で有意であると考慮された、
【００８５】
実施例１
この実施例はＰＥＧがビトロにおいて扁平上皮ガン細胞における細胞増殖を阻害するこ
とを提示する。
ＨＮＳＣＣにおけるＰＥＧの抗増殖活性を提示するために、ＳＣＣ−２５細胞（２，０００細胞／ウェル）が９６−ウェルプレート中に播種され、その後、異なる濃度のＰＥＧ８０００［０．６２ｍＭ（０．５％ｗ／ｖ）ないし１２．５ｍＭ（１０％ｗ／ｖ）］で処理された。２４時間後、細胞増殖（細胞数における変化）がＷＳＴ−１アッセイを用いてアッセイされた。図１に示されるように、ＳＣＣ−２５の細胞増殖において、用量依存的な減少が存在した（＋ｐ＜０．０５、★ｐ＜０．００１、ビヒクル単独との比較）。成長における最大の減少（４３％減少）が１０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ８０００（最大濃度の試験）で得られたため、これをビボ実験のために使用する用量とした。ＰＥＧを用いるＳＣＣ−２５細胞の存在及び前処理は、有意に細胞増殖を減少した。
【００８６】
実施例２
この実施例は、ＰＥＧの異なる配合物が、ビトロにおいてＳＣＣ−９及びＳＣＣ−２５細胞におけるＥＧＦＲ発現を阻害することを提示する。
これらの研究において、ＳＣＣ−９及びＳＣＣ−２５細胞における膜（即ち、表面）ＥＧＦＲ発現の程度におけるＰＥＧの効果が評価された。６つの実験群が設定された。ＳＣＣ−９及びＳＣＣ−２５細胞の両方が無処理である対照群、ＰＥＧ３３５０の５％ｗ／ｖ溶液で処理されたＳＣＣ−９及びＳＣＣ−２５細胞の群及びＰＥＧ８０００の５％ｗ／ｖ溶液で処理されたＳＣＣ−９及びＳＣＣ−２５細胞の群。２４時間後、細胞はトリプシン処理され、ＥＧＦＲの膜（即ち、表面）発現のためのフローサイトメトリー分析（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）に付された。結果は、両ＰＥＧ群が、ＳＣＣ−９及びＳＣＣ−２５細胞の両方において、有意に膜（即ち、表面）ＥＧＦＲ発現の量を減少したことを示した（図２）。
【００８７】
実施例３
この実施例は、ＰＧ８０００の投与が、扁平上皮細胞ガンのラット４ＮＱＯモデルにおいて腫瘍進行を阻害することを提示する。
これらの研究に使用した、ラット４ＮＱＯ−誘発口腔発ガンモデルは、ヒトの頭頸部ガンに、組織病理学的に匹敵する数多くの特徴を有する。飲料水中の４ＮＱＯの全身投与による、このモデルは、様々な前ガン性及び腫瘍性の領域を創出し、数多くの化学発ガン抑制研究において使用されてきた。４−ＮＱＯ処理（飲料水中２０ｐｐｍ）の１４週後、ラットは無作為に２群に分けられ、追加の連続する１４週の間、（ａ）ビヒクル（ＰＢＳ）又は（ｂ）ＰＥＧ−８０００（１０％ｗ／ｖ）の何れかの日毎の口腔局所適用（３−４分までの間クロテンのブラシ＃４を使用してラットの口腔の口腔底部／天井部に塗布する）を受けた。解剖で、舌全体、咽頭及び食道が除去された。この研究で使用された発ガンの全投薬計画（レジュメ）は、ラットの全体的な健康において衰弱させる効果は全く有さなかった。図３で示されるように、解剖（発ガン処理の終了後１４週）で、４ＮＱＯ処理ラットは、舌を起源とする数多くの大きな形態学的に離散した領域又は腫瘍を示した（ｐ＜０．０５、対照と比べて）。対照的に、４ＮＱＯ処理後１４週の間のＰＥＧ−８０００の口腔局所適用に付されたラットは、有意により小さな腫瘍及びより少ない腫瘍数／腫瘍を有するラットを示した（図３Ｂ；ｐ＜０．０１対照と比べて）。解剖における２群を比較する写真が、図４において提供される。ＰＥＧ８０００は、有意に全身腫瘍組織量（腫瘍数及び腫瘍容積の両方）を減少させた。これらの結果は、ＰＥＧ８０００がこのモデルにおけるガンの開始及び／又は進行の遅延において有効であることを意味する。
【００８８】
実施例４
この実施例は、どのようにＰＥＧ８０００が上皮細胞過剰増殖を阻害するかを表現するものである。
実施例３の４ＮＱＯ処理ラットからの舌上皮の顕微鏡評価は、少数の軽度から中程度の上皮異形成の局所領域を明らかにした。
更に、以前このモデルで報告したように４ＮＱＯ処理ラットの舌上皮において正常化された細胞過剰増殖が存在した（図５上パネル）。広範性の細胞増殖の正確な時間的及び空間的な制御は、前ガン性のガン発生の重要な初期の特性であり、よって、ＰＥＧの化学発ガン抑制の有効性を評価するための重要な標的であり得る。発ガン性物質で処理されたラットにおけるＰＥＧ８０００の抗増殖性の役割を理解するために、増殖の明確に定義されたマーカーである、Ｋｉ−６７の免疫組織化学的発現が試験された。Ｋｉ−６７で標識された上皮細胞の数（光場当り）は、発ガン性物質の無い対照群と比較して４ＮＱＯ群において有意に高かった（それぞれ３０＋８対１４＋６；ｐ＜０．０１、データ未提示）。しかしながら、発ガン性物質−開始ラットがＰＥＧ８０００の局所適用に付された場合、Ｋｉ−６７陽性ラットの数における有意な減少（１７＋４対３０＋８；ｐ＜０．０１）が観察された（データ未提示）。この研究のために、総計１０００の上皮細胞が、４００×倍で６ないし７場において評価され、全ての値が標識率のために使用された。発ガン性物質処理群において、対照と比較した場合、重層扁平舌上皮の基底層直上の区画において、細胞のより高いパーセンテージがＫｉ−６７陽性であることが観察された。ＰＥＧ８０００処理は、基底層直上の区画におけるＫｉ−６７細胞の数を減少する；残りのＫｉ−６７細胞は、大半が対照群で見られるような基底層に制限された（図５  下パネル）。これらの結果は、ＰＥＧの口腔局所適用が４ＮＱＯ−誘発の口腔発ガンの間、上皮過剰増殖を阻害することを示す。
【００８９】
実施例５
この実施例は、発ガン性物質開始ラットの舌切片において、ＰＧ８０００がどのようにＥＧＦＲを下方制御するかを説明する。
実施例３におけるラットの舌は、切片化され、ＥＧＦＲに対する抗体で染色され、上記したようなＩＨＣ分析に付された。ＰＥＧ８０００を用いる処理は、切片で観察されるようにＥＧＦＲの発現を有意に減少した。図６で説明されるように、対照及び４ＮＱＯ−ＰＥＧ切片は、ＥＧＦＲ染色を殆ど又は全くされず、一方、４ＮＱＯ切片は、強くＥＧＦＲ染色された。この結果は、組織学的に、ＰＥＧを用いる処理が、ラット４ＮＱＯモデルにおけるＥＧＦＲ発現を下方制御するように見えることを示す。
【００９０】
実施例６
この実施例は、食道腫瘍の進行におけるＰＥＧ８０００の局所口腔適用の潜在的な化学発ガン抑制効果を説明する。
口腔発ガンにおける局所ＰＥＧ８０００適用の化学発ガン抑制の利点を研究するのに加えて、食道腫瘍の進行に対する２次的な保護もまた提供し得るか否かが評価された。このことは食道内へのＰＥＧの部分的な唾液洗浄に起因して期待され得る。この研究のために、頭頸部ガンの４−ＮＱＯ（４−ニトロキノリン１−オキシド）ラットモデルが実施例３、４及び５と同じように利用された。このモデルは食道腫瘍を開始するために既知である。食道は気管から非常に注意深く分離され、腫瘍計数に付された。結果は、腫瘍を有するラット当たりの食道腫瘍は４ＮＱＯ（ｎ＝６）における２．２から４ＮＱＯ−ＰＥＧ（ｎ＝５）群における１．５に減少した（〜３２％減少）。結果は統計学的な有意性を支持しなかった（ｐ＝０．２３９７−ウィルコクソン二標本検定；ｐ＝０．２２５−カイ二乗検定）が、ＰＥＧと食道の間の接触がより直接的な適応よりはむしろ部分的な唾液洗浄の結果であったところのこの結果は、それにもかかわらず、食道ガンの進行に対するＰＥＧの潜在的な保護効果を提示するものである。
【００９１】
実施例７
この実施例は、ＳＣＣ  ２５細胞の細胞増殖及びＥＧＦＲ発現における異なるＰＥＧ配合物の比較効果に関する。
細胞増殖及びＥＧＦＲ発現における異なるＰＥＧ配合物の比較効果を決定するために、扁平上皮ガン細胞（ＳＣＣ−２５）が９６ウェルプレート（ＷＳＴ−１アッセイ）又は６
０ｍｍの細胞培養皿（ウエスタンブロット法）の何れかに播種された。細胞はその後、０ないし１０％ｗ／ｖの濃度範囲を使用するＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００及びＰＥＧ８０００で２４時間処理された（それぞれ図７、８及び９）。培養は３７℃で２４時間、湿度５％のＣＯ2培養器中で行われた。細胞増殖（細胞数の変化）は、実施例１に記載したようなＷＳＴ−１アッセイを使用して又は増殖マーカーである増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）のためのウエスタンブロットを介してアッセイされた。ＥＧＦＲ発現もまたウエスタンブロット分析により評価された。結果は、使用された配合物に関係なく、ＰＥＧの濃度の増加に伴って細胞増殖及びＥＧＦＲ発現において直線的な減少を示した。
【００９２】
実施例８
この実施例はＳＣＣ９細胞のＥＧＦＲの表面発現における異なるＰＥＧ配合物の効果を説明する。
これらの研究は、扁平上皮ガンＳＣＣ−９細胞を使用するＥＧＦＲの表面発現における異なるＰＥＧ配合物の比較効果を決定するために行われた。ＳＣＣ−９細胞は、１０％ｗ／ｖＰＥＧ（ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００及びＰＥＧ８０００）で２４時間処理された。処理後、細胞はトリプシン処理され、ＥＧＦＲの膜（表面）発現のためにフローサイトメトリー分析に付された。結果は、試験された全てのＰＥＧ配合物で処理された細胞のＥＧＦＲの表面発現において高度に有意な減少を示した（図１０）。これらの結果は更に、ＰＥＧの抗−増殖性の性質が、抗−ＥＧＦＲ活性と関連し得るという仮説を支持する。
【００９３】
実施例９
この実施例は、病因学的に非均質なＨＮＳＣＣにおけるＰＥＧ８０００の効果に関する。
煙草及びアルコール摂取は、ＨＮＳＣＣの進行のための第一危険因子であるものの、危険性の高いヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を伴う感染症がＨＮＳＣＣの別のサブセットの進行に病因的に関連し得ることが近年提示されてきた。、病因学的に非均質な条件におけるＰＥＧの効果を研究するために、異なるＨＰＶ状態を有する細胞株を利用してＥＧＦＲの下方制御及び細胞増殖におけるＰＥＧの効果が研究された。これらの実験に使用された２種の細胞株は、ＨＰＶ陰性である前ガン状態のｈＴＥＲＴ−不死化細胞［ＨＰＶ（−）ＯＫＦ−６；図１１］及びＥ６を発現する前ガン状態のＨＰＶで形質転換された不死化されたヒト口腔ケラチン生成細胞（ＨＯＫ）［ＨＰＶ（＋）ＨＯＫ；図１２］であった。細胞は２４時間ＰＥＧ８０００の異なる濃度で処理され、実施例１及び７で議論されたような異なるバイオマーカー評価に付された。結果は、ＰＥＧ８０００が、ＨＰＶ（−）細胞において特異的に有意に細胞増殖（ＷＳＴ−１及びＰＣＮＡ）の減少並びにＥＧＦＲの下方制御において有効である（図１１）が、しかしＨＰＶ（＋）細胞においてはそうでない（図１２）ことを示す。ＨＰＶ状態としてのＨＰＶ（＋）サブセットにおけるＥＧＦＲのより低い発現が原因であり得るＰＥＧに対する反応差は、以前にＨＮＳＣＣにおいてＥＧＦＲに対して有意な反比例関係を有することが示されている。ＨＰＶ（＋）被験者の予後がＨＰＶ（−）被験者に比してより有利であり得るという示唆する証拠が存在する。これらの結果は、ＰＥＧが予後的にあまりよくないＨＰＶ（−）被験者のためのより良い戦略を提供し得ることを示す。
【００９４】
実施例１０
この実施例は、無胸腺マウスの同所性の腫瘍の進行におけるＰＥＧ８０００の局所適用の効果に関する。腫瘍成長の阻害におけるＰＥＧ８０００の効果を研究するために、同所性のモデルが利用されたが、ここで、扁平上皮ガン（ＳＣＣ−２５、約１００万個）が無胸腺マウス（免疫不全、Ｂ−細胞欠損）の舌領域の近傍に直接移植された。播種２週間後、マウスを無作為に２群に分け（各１２マウス）、Ｑ−チップを用いる１０％ｗ／ｖＰＥＧ８０００又はＰＢＳ（ビヒクル）の日毎の口腔局所適用に付された（２−３分）。治療期間の間、ＰＥＧ８０００は、対照と較べて体重において何ら有意な変化を引き起こさな
かった（データ未提示）。解剖（処理後１９−２０日）において、腫瘍は切除され秤量された。全ての腫瘍のための組織病理は、扁平上皮ガンに陽性であった。結果は、ＰＥＧ８０００適用が対照と比較して腫瘍質量において有意な減少を生じたことを示した（２９．８％；ｐ＜０．０５；図１３）。ＰＥＧが腫瘍退縮において抗増殖的及び抗−ＥＧＦＲの役割を有するかどうかを更に理解するために、マーカーＫｉ−６７及びＥＧＦＲのためのＩＨＣが実施され、ＰＧ８０００処理群の増殖指標（３１．５％；ｐ＜０．００２）及びＥＧＦＲ染色（４２．４％；ｐ＜０．００５）の両方において対照に比して有意な減少が観察された（それぞれ図１４及び１５）。これらの結果は、予防に加えて、ＰＥＧが、確立した腫瘍の退縮を引き起こすことができるように見えることを提示する。この効果は、細胞増殖及びＥＧＦＲ下方制御におけるその全体的な効果に由来し得る。これは、ＨＮＳＣＣ治療戦略を更に進展させることにおいて非常に重要なツールを提供する。
【００９５】
本発明の記載との関連で、用語“ａ”及び“ａｎ”及び“ｔｈｅ”及び類似の指示語（特に、以下に示す請求項との関連において）は、ここで他に指示されていないか又は文脈から明確に矛盾していない限り、単数及び複数の両方をカバーするものとと解釈される。用語“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”、“有する（ｈａｖｉｎｇ）”、“含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）”及び“含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）”は、他に記載されていない限り、制限が無い用語（即ち、“含むがそれに限定されないこと”を意味する）として解釈される。ここに記載される全ての方法は、ここで他に指示されていないか又は文脈から矛盾していない限り、あらゆる好適な順番で実施することができる。ここで提供されるあらゆる及び全ての実施例又は例示的な言葉（例えば、“のような（ｓｕｃｈ  ａｓ）”）の使用は、単に本発明を説明することだけを意図し、他に請求されていない限り、本発明の範囲における限定をもたらさない。本明細書中の言葉は全て、本発明の実施に必須なあらゆる非−請求の要素を示唆するものとして解釈されるべきでない。
【００９６】
本発明の好ましい態様は、本発明を実施するために本発明者等に既知の最良の形態を含んで、ここに記載される。それらの好ましい態様の変形物は、以前の記載を読むことで当業者に対して明白となり得る。本発明者等は、適当なものとしてそのような変形物を当業者が利用することを期待し及び本発明者等は、本発明を、ここに特異的に記載されたもの以外として実施することを意図する。従って、この発明は、準拠法により許可されるものとしてここに添付された請求項中に示された主題の全ての変更物及び同等物を含む。更に、それらの全ての可能な変形物における上記の要素のあらゆる組み合わせは、ここで他に指示されていないか又は文脈から明確に矛盾していない限り、本発明に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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