(57)【要約】  逆相置換クロマトグラフィーによって混合物から有機化合物を分離するための方法であって、疎水性固定相を提供する工程；該疎水性固定相に、分離される有機化合物を含む混合物を適用する工程；非界面活性疎水性陽イオン性置換剤分子および約１０％重量％または以下の有機溶媒を含む水性組成物をそれに適用することにより、該疎水性固定相から該有機化合物を置換する工程；および該分離した有機化合物を含む該疎水性固定相から溶出した複数の画分を採集する工程を含み、ここで該非界面活性疎水性陽イオン性置換剤分子が、本開示で定義したとおりの一般式ＡまたはＢを有する疎水性陽イオンと対イオン、ＣＩを含む。  Ａ：［ＣＭ］［Ｃｌ］ｄ；  Ｂ：［ＣＭ−Ｒ＊−ＣＭ’］［Ｃｌ］ｄ
2014528585.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆相置換クロマトグラフィーによって混合物から有機化合物を分離するための方法であって、
疎水性固定相を提供する工程；
該疎水性固定相に、分離される有機化合物を含む混合物を適用する工程；
非界面活性疎水性陽イオン性置換剤分子および約１０重量％またはそれ以下の有機溶媒を含む水性組成物をそれに適用することにより、該疎水性固定相から該有機化合物を置換する工程；および
該分離した有機化合物を含む該疎水性固定相から溶出した複数の画分を採集する工程を含み、
ここで該非界面活性疎水性陽イオン性置換剤分子が、一般式ＡまたはＢ：
［ＣＭ］［Ｃｌ］ｄ      ［ＣＭ−Ｒ＊−ＣＭ’］［Ｃｌ］ｄ
Ａ                          Ｂ
を有する疎水性陽イオンおよび対イオンＣＩを含み、
ここで該一般式ＡおよびＢにおいて、ＣＭまたはＣＭ’のおのおのが、四級アンモニウム（Ｉ）、四級ホスホニウム（ＩＩ）、スルホニウム（ＩＩＩ）、スルホキソニウム（ＩＶ）、イミダゾリニウム（アミジニウム）（Ｖ）、グアニジニウム（ＶＩ）、イミダゾリウム（ＶＩＩ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリニウム（ＶＩＩＩ）、１，２，３，４−テトラヒドロキノリニウム（ＩＸ）、イソインドリニウム（Ｘ）、インドリニウム（ＸＩ）、ベンズイミダゾリウム（ＸＩＩ）、ピリジニウム（ＸＩＩＩａ，ＸＩＩＩｂ，ＸＩＩＩｃ，ＸＩＩＩｄ）、キノリニウム（ＸＩＶ）、イソキノリニウム（ＸＶ）、カルボキシレート（ＸＶＩ）、Ｎ−アシル−α−アミノ酸（ＸＶＩＩ）、スルホネート（ＸＶＩＩＩ）、硫酸モノエステル（ＸＩＸ）、リン酸モノエステル（ＸＸ）、リン酸ジエステル（ＸＸＩ）、ホスホン酸モノエステル（ＸＸＩＩ）、ホスホネート（ＸＸＩＩＩ）、テトラアリールボレート（ＸＸＩＶ）、ボロネート（ＸＸＶ）、ボロン酸エステル（ＸＸＶＩ）から選択される形式電荷を有する独立した疎水性化学部分であり；ここで、該化学部分（Ｉ）〜（ＸＸＶＩ）が、以下の化学構造を有し：
【化１】
2014528585.tif 000044
ここで該一般式Ｂにおいて、ＣＭおよびＣＭ’が、同じまたは反対の形式電荷を有する独立した荷電化学部分であり、そして二重結合化学部分Ｒ＊により互いに化学的に付着され、該二重連結化学部分Ｒ＊はＣＭ上の１つのＲ１、Ｒ２（存在するならば）、Ｒ３（存在するならば）またはＲ４（存在するならば）化学部分を置換し、かつＣＭ’上の１つのＲ１、Ｒ２（存在するならば）、Ｒ３（存在するならば）またはＲ４（存在するならば）化学部分を置換し；
ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各々が、式：
−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−ＡＲ１−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−ＡＲ２
によって独立して定義された直鎖状または分岐状化学部分であり、
Ｒ＊が、直接化学結合であるか、または式：
−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−ＡＲ１−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−
によって定義された二重連結直鎖状または分岐状化学部分であり、
そして、Ｒ５が、式
−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−ＡＲ２
により定義された直鎖状または分岐状化学部分であり；
ここで各ＡＲ１が独立して、二重連結メチレン部分（−ＣＸ１Ｘ２−、メタン由来）、二重連結フェニレン部分（−Ｃ６Ｇ４−、ベンゼン由来）、二重連結ナフチレン部分（−Ｃ１０Ｇ６−、ナフタレン由来）または二重連結ビフェニレン部分（−Ｃ１２Ｇ８−、ビフェニル由来）であり；
ここで各ＡＲ２が独立して、水素（−Ｈ）、フッ素（−Ｆ）、フェニル基（−Ｃ６Ｇ５）、ナフチル基（−Ｃ１０Ｇ７）またはビフェニル基（−Ｃ１２Ｇ９）であり；
ここで各Ｘ、Ｘ１およびＸ２が個々にかつ独立して、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌまたは−ＯＨであり；
ここで任意の−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−内または任意の−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−内または任意の−（ＣＸ１Ｘ２）ｐ−内の任意のメチレン部分（−ＣＸ１Ｘ２−）が個々にかつ独立して、独立したエーテル−酸素原子−Ｏ−、独立したチオエーテル−硫黄原子−Ｓ−、または独立したケトン−カルボニル基−Ｃ（Ｏ）−と、各エーテル−酸素原子、各チオエーテル−硫黄原子または各ケトン−カルボニル基がそれぞれの側で脂肪族炭素原子または芳香族炭素原子に結合されるように置換されてもよく；
ここで２以下のエーテル−酸素原子、２以下のチオエーテル−硫黄原子および２以下のケトン−カルボニル基が、任意の−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−または任意の−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−に置換されてもよく；
ここでｍｘが、エーテル−酸素原子、チオエーテル−硫黄原子およびケトン−カルボニル基と置換されている各−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−におけるメチレン基の総数であり、そしてｍｕが、エーテル−酸素原子、チオエーテル−硫黄原子およびケトン−カルボニル基と置換されている各−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−におけるメチレン基の総数であり；
ここでＧが個々にかつ独立して、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＨ３、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＦ３、−ＣＯ２Ｍｅ、−ＣＯ２ＮＨ２；−ＣＯ２ＮＨＭｅ、−ＣＯ２ＮＭｅ２の任意の組み合わせであり；
ここでＧ＊が個々にかつ独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｒ２、−ＯＨ、−ＯＲ２、−ＮＲ２Ｒ３、−ＣＦ３、−ＣＯ２Ｍｅ、−ＣＯ２ＮＨ２；−ＣＯ２ＮＨＭｅ、−ＣＯ２ＮＭｅ２の任意の組み合わせであり；
ここでＲ２、Ｒ３、およびＲ４の対が、Ｒ２／Ｒ３、Ｒ２／Ｒ４、Ｒ３／Ｒ４、Ｒ２’／Ｒ３’、Ｒ２’／Ｒ４’またはＲ３’／Ｒ４’が個々にかつ独立して、−（ＣＸ１Ｘ２）ｐ−（ここでｐ＝３、４、５または６）であるような単一化学部分を含んでもよく；
ここでｘ、ｒ、ｕ、ｓ、ｍｘ、ｍｕの各々の整数値が、各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ＊について独立して選択され、整数値ｒおよびｓは、含有され単離されたシス／トランスオレフィン（アルケン）基の総数＋含有される単純単環式構造の総数であり、そして０≦ｒ≦２および０≦ｓ≦２の範囲内にあり、数量ｘ＋ｕ−ｍｘ−ｍｕが０≦ｘ＋ｕ−ｍｘ−ｍｕ≦１１の範囲内にあり；
ここで少なくとも１つの芳香族化学部分、複素環芳香族化学部分、イミダゾリン化学部分、アミジン化学部分またはグアニジン化学部分がＡまたはＢのＣＭまたはＣＭ’内に含有され；
ここで各Ｒ化学部分についての基疎水性指数（ｎ）が、脂肪族炭素原子数＋オレフィン炭素原子数＋チオエーテル−硫黄原子数＋塩素原子数＋１／５×フッ素原子数＋１／２×エーテル−酸素原子数＋１／２×ケトン−炭素原子数＋１／２×芳香族炭素原子数の合計に数値的に等しく、６からヒドロキシル−酸素原子数（１を超える）を引いた数を超えるものであり；
ここで各［ＣＭ］または［ＣＭ−Ｒ＊−ＣＭ’］についての全体疎水性指数（Ｎ）が、脂肪族炭素原子数＋オレフィン炭素原子数＋チオエーテル−硫黄原子数＋塩素原子数＋１／５×フッ素原子数＋１／２×エーテル−酸素原子数＋１／２×ケトン−炭素原子数＋１／２×芳香族炭素原子数の合計に数値的に等しく、６からヒドロキシル−酸素原子数（１を超える）を引いた数を超えるものであり；
ここでＲ１およびＲ１’についての基疎水性指数（１ｎおよび１’ｎ）が、４．０＜１ｎ、１’ｎ＜１２．０の範囲内にあり、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ＊（存在する場合）についての基疎水性指数（２ｎ、２’ｎ、３ｎ、３’ｎ、５ｎ、５’ｎおよび＊ｎ）が、０．０≦２ｎ、２’ｎ、３ｎ、３’ｎ、５ｎ、５’ｎ、＊ｎ＜１２．０の範囲内にあり、そしてＲ４およびＲ４’（存在する場合）についての基疎水性指数（４ｎおよび４’ｎ）が、０．０≦４ｎ、４’ｎ≦５．０の範囲内にあり；
ここでｇの値によって割られた該全体疎水性指数（Ｎ）が、１０．０≦Ｎ／ｇ＜２４．０の範囲内にあり；
ここで、Ａにおいて、荷電部分、ＣＭが、正の形式荷電または負の形式荷電を持つときｇ＝１、そしてＢにおいて、ＣＭおよびＣＭ’が正の形式荷電を持つか、またはＣＭおよびＣＭ’が負の形式荷電を持つとき、ｇ＝２、そしてＢにおいてＣＭが正の形式荷電を持ち、かつＣＭ’が負の形式荷電を持つときｇ＝１であり；
ここで、環状化学部分について計算された基疎水性指数の数値は、同様に、該２つのそれぞれのＲ化学部分間で等しく割られ；
ここでＲ１は、１つのみのそのような化学部分がＣＭまたはＣＭ’に付着された場合、そのＲ化学部分として同定され；１より多くのそのような化学部分がＣＭまたはＣＭ’に付着した場合、Ｒ１は、基疎水性指数の最大値を持つＲ化学部分として同定され；ここでＲ４は、３より多くのそのような化学部分がＣＭまたはＣＭ’に付着した場合、基疎水性指数が最小値を持つＲ化学部分として同定され；そして
ここでＣＩは、非干渉性の逆に荷電した対イオンまたはそのような対イオンの混合物であり、ｄの値は０、正の整数、または正の分数であり、疎水性化合物全体の電気的中性が維持されている、
方法。
【請求項２】
前記非界面活性疎水性置換剤分子を含む水性組成物が、ｐＨ緩衝剤以外の添加された塩を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＭが一般式ＩまたはＩＩを有し：
【化２】
2014528585.tif 000045
ここで該一般式ＩまたはＩＩにおいて、Ｒ１がＣ８−Ｃ１１ヒドロカルビル部分であり、Ｒ２およびＲ３が独立してＣ１〜Ｃ４ヒドロカルビル部分またはベンジルであり、そしてＲ４がベンジル、ハロ置換ベンジル、４−アルキルベンジル、４−トリフルオロメチルベンジル、４−フェニルベンジル、４−アルコキシベンジル、４−アセトアミドベンジル、Ｈ２ＮＣ（Ｏ）ＣＨ２−、ＰｈＨＮＣ（Ｏ）ＣＨ２−、ジアルキル−ＮＣ（Ｏ）ＣＨ２−（ここでアルキルがＣ１〜Ｃ４である）から選択され、但し、ＣＭに存在するベンジル基は１つより多くない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＣＭが一般式ＩまたはＩＩを有し：
【化３】
2014528585.tif 000046
ここで該一般式ＩまたはＩＩにおいて、Ｒ１およびＲ２が独立してＣ４〜Ｃ８アルキルまたはシクロヘキシルであり、Ｒ３がＣ１〜Ｃ４アルキルであり、そしてＲ４がフェニル、２−、３−もしくは４−ハロフェニル、ベンジル、２−、３−もしくは４−ハロベンジル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジハロベンジル、２，４，６−もしくは３，４，５−トリハロベンジル、Ｃ６Ｈ５ＣＨ２ＣＨ２−または２−、３−もしくは４−トリフルオロメチルベンジルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
ＣＭが一般式ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸまたはＸＩを有し、Ｒ１がＣ５〜Ｃ１１アルキルであり、そしてＲ２がＣ１〜Ｃ８アルキルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
ＣＭが一般式ＩまたはＩＩを有し：
【化４】
2014528585.tif 000047
ここで該一般式ＩまたはＩＩにおいて、Ｒ１がＣ６〜Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ３が独立してＣ１〜Ｃ４アルキルであり、そしてＲ４がＰｈＣ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＦＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＣＦ３Ｃ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＣｌＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＢｒＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、ｄｌ−ＰｈＣ（Ｏ）ＣＨ（Ｐｈ）−、Ｐｈ（ＣＨ２）２−、Ｐｈ（ＣＨ２）３−、Ｐｈ（ＣＨ２）４−、ｄｌ−ＰｈＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、ｔ−ＰｈＣＨ＝ＣＨＣＨ２−、１−（ＣＨ２）ナフチレン、９−（ＣＨ２）アントラセン、２−、３−もしくは４−ＦＣ６Ｈ４ＣＨ２−またはベンジルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
ＣＭが一般式ＩまたはＩＩを有し：
【化５】
2014528585.tif 000048
ここで該一般式ＩまたはＩＩにおいて、Ｒ１がＣ６〜Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ３が一緒になって−（ＣＨ２）４−であり、そしてＲ４が、ＰｈＣ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＦＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＣＦ３Ｃ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＣｌＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＢｒＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、ｄｌ−ＰｈＣ（Ｏ）ＣＨ（Ｐｈ）−、Ｐｈ（ＣＨ２）２−、Ｐｈ（ＣＨ２）３−、Ｐｈ（ＣＨ２）４−、ｄｌ−ＰｈＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、ｔ−ＰｈＣＨ＝ＣＨＣＨ２−、２−、３−もしくは４−ＦＣ６Ｈ４ＣＨ２−、ベンジル、３−ＣｌＣ６Ｈ４ＣＨ２−、２，６−Ｆ２Ｃ６Ｈ３ＣＨ２−、３，５−Ｆ２Ｃ６Ｈ３ＣＨ２−、４−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４ＣＨ２−、４−ＣＨ３ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ２−、４−ＣＨ３ＯＣ６Ｈ４ＣＨ２−、（ＣＨ３）２ＮＣ（Ｏ）ＣＨ２−または（ＣＨ３ＣＨ２）２ＮＣ（Ｏ）ＣＨ２−である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
ＣＭが一般式ＩまたはＩＩを有し：
【化６】
2014528585.tif 000049
ここで該一般式ＩまたはＩＩにおいて、Ｒ１がＣ４〜Ｃ６アルキル、ベンジルまたは２−、３−もしくは４−ＦＣ６Ｈ４ＣＨ２−であり、Ｒ２およびＲ３が独立してＣ１〜Ｃ８アルキル、ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）２−、ＣＨ３ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−またはＣＨ３ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−であり、そしてＲ４が、Ｐｈ（ＣＨ２）４−、４−ＰｈＣ６Ｈ４ＣＨ２−、４−ＦＣ６Ｈ４ＣＨ２−、４−ＣＦ３Ｃ６Ｈ４ＣＨ２−、ＰｈＣ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＦＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＰｈＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＰｈＣ６Ｈ４ＣＨ２−、ナフチレン−１−ＣＨ２−、アントラセン−９−ＣＨ２−またはＰｈ（ＣＨ２）ｎ−（ここでｎ＝５〜８）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
ＣＭが一般式［（Ｒ１Ｒ２Ｒ３ＮＣＨ２）２Ｃ６Ｈ３Ｇ］２＋を有し、ここでＲ１がＣ４〜Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ３が独立してＣ１〜Ｃ６アルキルであるか、またはＲ２およびＲ３が一緒になって−（ＣＨ２）４−であり、そしてＧがＨまたはＦである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＭが一般式［Ｒ１Ｒ２Ｒ３ＮＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＮＲ１Ｒ２Ｒ３］２＋を有し、ここでＲ１がＣ４〜Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ３が独立してＣ１〜Ｃ６アルキルであるか、またはＲ２およびＲ３が一緒になって−（ＣＨ２）４−である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＭが一般式ＩＩＩまたはＩＶを有し：
【化７】
2014528585.tif 000050
ここで該一般式ＩＩＩまたはＩＶにおいて、Ｒ１がＣ８〜Ｃ１１アルキルまたは４，４’−ＣＨ３（ＣＨ２）４Ｃ６Ｈ４−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２−であり、Ｒ２がＣ１〜Ｃ６アルキルまたは４−ＦＣ６Ｈ４ＣＨ２−であり、そしてＲ３がＣ１〜Ｃ６アルキルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＭが一般式ＸＩＶまたはＸＶを有し：
【化８】
2014528585.tif 000051
ここで該一般式ＸＩＶまたはＸＶにおいて、Ｒ１がＣ８〜Ｃ１１アルキルであり、そして各ＧおよびＲ５は上に定義したとおりである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＭが一般式ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＩＩｃ、ＸＩＩＩｄまたはＸＩＩＩｅを有し：
【化９】
2014528585.tif 000052
ここで該一般式ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＩＩｃ、ＸＩＩＩｄまたはＸＩＩＩｅにおいて、Ｒ１がＣ８〜Ｃ１１アルキルまたはＣ８〜Ｃ１１  ４−フェニルであり、Ｒ２がＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルもしくはアルコキシ、２−ピリジル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル置換２−ピリジル、またはピロリジニルであり、そして各Ｇは上に定義したとおりである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＭが一般式ＶＩＩを有し：
【化１０】
2014528585.tif 000053
ここで該一般式ＶＩＩにおいて、Ｒ１がＣ５〜Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ５が独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルまたはフェニルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＭが一般式ＸＩＩを有し：
【化１１】
2014528585.tif 000054
ここで該一般式ＸＩＩにおいて、Ｒ１がＣ５〜Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ５が独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルまたはフェニルであり、そしてＧは上に定義したとおりである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
ＣＭが一般式ＸＸＩＶまたはＸＸＶを有し：
【化１２】
2014528585.tif 000055
ここで該一般式ＸＸＩＶにおいて、Ｒ１がフェニル、４−ＥｔＣ６Ｈ４−、４−ｎＰｒＣ６Ｈ４−、４−ｎＢｕＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＯＣ６Ｈ４−、４−ＦＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＯＣ６Ｈ４−、４−ＥｔＣ６Ｈ４−、４−ＣｌＣ６Ｈ４−、またはＣ６Ｆ５−であり；そしてＲ２、Ｒ３およびＲ４の各々が独立してフェニル、４−ＦＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＯＣ６Ｈ４−、４−ＥｔＣ６Ｈ４−、４−ＣｌＣ６Ｈ４−またはＣ６Ｆ５−であり；そして
ここで該一般式ＸＸＶにおいて、Ｒ１が４−（４−ｎＢｕＣ６Ｈ４）Ｃ６Ｈ４−または４−（４−ｎＢｕＣ６Ｈ４）−３−ＣｌＣ６Ｈ３−である、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ＣＭが、４−Ｒ１Ｃ６Ｈ４ＳＯ３Ｈ、５−Ｒ１−２−ＨＯ−Ｃ６Ｈ３ＳＯ３Ｈ、４−Ｒ１−Ｃ６Ｈ４−Ｃ６Ｈ３Ｘ−４’−ＳＯ３Ｈ、および４−Ｒ１−Ｃ６Ｈ４−Ｃ６Ｈ３Ｘ−３’−ＳＯ３Ｈから選択される一般式を有し、ここで、Ｒ１はＣＨ３（ＣＨ２）ｎであり、ここでｎ＝４〜１０そしてＸがＨまたはＯＨである、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ＣＭが一般式ＸＶＩＩＩまたはＸＸＩＩＩを有し：
【化１３】
2014528585.tif 000056
ここで該一般式ＸＶＩＩＩにおいておよび該一般式ＸＸＩＩＩにおいて、Ｒ１がＣ６Ｈ５（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎ＝５〜１１である、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ＣＭが、５−Ｒ１−２−ＨＯ−Ｃ６Ｈ３ＣＯ２ＨおよびＲ１Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｃ６Ｈ５）ＣＯ２Ｈから選択される一般式を有し、ここでＲ１がＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎ＝４〜１０である、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ＣＭが一般式４−Ｒ１Ｃ６Ｈ４ＰＯ３Ｈ２を有し、ここでＲ１がＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎ＝４〜１０である、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ＣＩが、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、ＯＨ−、Ｆ−、ＯＣＨ３−、ｄ，ｌ−ＨＯＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＯ２−、ＨＯＣＨ２ＣＯ２−、ＨＣＯ２−、ＣＨ３ＣＯ２−、ＣＨＦ２ＣＯ２−、ＣＨＣｌ２Ｃｏ２−、ＣＨＢｒ２ＣＯ２−、Ｃ２Ｈ５ＣＯ２−、Ｃ２Ｆ５ＣＯ２−、ｎＣ３Ｈ７ＣＯ２−、ｎＣ３Ｆ７ＣＯ２−、ＣＦ３ＣＯ２−、ＣＣｌ３ＣＯ２−、ＣＢｒ３ＣＯ２−、ＮＯ３−、ＣｌＯ４−、ＢＦ４−、ＰＦ６−、ＨＳＯ４−、ＨＣＯ３−、Ｈ２ＰＯ４−、ＣＨ３ＯＣＯ２−、ＣＨ３ＯＳＯ３−、ＣＨ３ＳＯ３−、Ｃ２Ｈ５ＳＯ３−、ＮＣＳ−、ＣＦ３ＳＯ３−、Ｈ２ＰＯ３−、ＣＨ３ＰＯ３Ｈ−、ＨＰＯ３２−、ＣＨ３ＰＯ３２−、ＣＯ３２−、ＳＯ４２−、ＨＰＯ４２−、ＰＯ４３−から選択される非干渉性陰イオンまたは非干渉性陰イオンの混合物である、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
ＣＩが、アルカリ金属イオン（Ｌｉ＋，Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋，Ｃｓ＋）、アルカリ土類金属イオン（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋，Ｓｒ２＋，Ｂａ２＋）、２価遷移金属イオン（Ｍｎ２＋，Ｚｎ２＋）、およびＮＨ４＋の群から選択される非干渉性の無機陽イオンまたはそのような非干渉性陽イオンの混合物であり；ここで、ＣＩは、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基および／またはＣ２〜Ｃ４のヒドロキシアルキル基を含んでいてもよい、プロトン化された１級アミン（１＋）、プロトン化された２級アミン（１＋）、プロトン化された３級アミン（１＋）、プロトン化されたジアミン（２＋）、４級アンモニウムイオン（１＋）、スルホニウムイオン（１＋）、スルホキソニウムイオン（１＋）、フォスフォニウムイオン（１＋）、ビス−４級アンモニウムイオン（２＋）の群から選択される，非干渉性の有機陽イオンまたはそのような非干渉性陽イオンの混合物である、請求項１６から２０のいずれか１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
置換クロマトグラフィー（ＤＣ）は、カラムクロマトグラフィーの明確に定義された３つの型―溶出、置換、フロンタルの１つである。ＤＣは、主に分取方法であるが、また、詰められた、「口径の狭い」、またはキャピラリーカラムを用いて、「マイクロ分取」ＤＣを用いて分析にも適用できる。
【０００２】
置換クロマトグラフィーは、適する、高純度な置換剤分子が利用可能であれば、４つの一般的なクロマトグラフ法のどれを用いても実行される。ＤＣは、（ａ）イオン交換クロマトグラフィー（陽イオン置換、陰イオン置換）、（ｂ）疎水性クロマトグラフィー（逆相、疎水的相互世用、疎水的電荷誘導、チオフィリック）、（ｃ）親水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を含む順相クロマトグラフィー、（ｄ）固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）において使われる。
【０００３】
最適化されたＤＣを用いて、同時に、高純度（高分解能）、高回収（高収量）および高カラム処理量（高容量）が得られる。後者は、過負荷分取溶出クロマトグラフィーよりもずっと高い。ほとんどの場合、これらの利点は、ＤＣの欠点（流速が遅い、実行時間が長い、高純度の置換物が必要等の）を補って余りある。
【０００４】
置換クロマトグラフィーは、（ａ）適用可能なクロマトグラフィー方法、（ｂ）適切な寸法を有する適したクロマトグラフィーカラム、（ｃ）適当な移動相条件、（ｄ）適した置換剤分子および（ｅ）適切に設定されたLC機器とともに適した操作プロトコールを選ぶことで実行される。最初は、適した「弱い置換移動相（キャリア）」が選ばれ、カラムは適当な流速で平衡化される。キャリアは、有用なｐＨ値に調整されたｐＨ緩衝性の化合物をを含有してもよい。最適な置換流速は、ときどきより速いが、典型的には３５〜１０５ｃｍ／時間で、遅い傾向にある。適切な量の試料溶液が試料負荷流速でカラムにロードされる。試料溶液は、試料または置換剤分子が荷電していれば、適切なレベルのイオンペア試薬とともにキャリア内で精製されるべき物質を含んでいる。典型的な試料負荷は、操作破過容量の５０〜８０％である。次に、キャリア溶液中で、適切な濃度の、適した置換剤化合物から調製された置換移動相（置換剤緩衝液）が、置換剤の破過が観察されるまで、置換流速でカラムにポンプで押される。精製された試料は、置換剤の破過フロントの前にカラムから取れる。カラムからの画分は集められ、内容と純度について別々に分析される。最後に、置換剤は「置換剤除去溶液」を用いてカラムから除かれ、次いでカラムはきれいにされ、保存または次の使用のために最初の状態に再生される。
【０００５】
いくつかの点で、溶出クロマトグラフィーとは異なるが、置換クロマトグラフィーは理解が容易で、実施も容易である。ＤＣにおいて、試料は、移動相によりカラムから「溶出される」というよりも、カラムから置換剤により「置換される」。カラムの生産物がオンラインでモニターされると（例えば、ＵＶ吸収、ｐＨ、または伝導度を介して）、「置換列」は「溶出クロマトグラム」よりも得られる。置換列は、クロマトグラムの溶媒分離「溶出ピーク」よりも、サイドバイサイドの「置換バンド」から構成される。置換バンドが固定相を飽和するまで十分に大きければ、台形の「飽和バンド」が形成される。置換バンドが固定相を飽和するほど十分大きくなければ、小さな、三角形の「非飽和バンド」が形成される。飽和バンドの高さは、操作のポイントの結合等温線により決定される。この台形のバンドまたは三角のバンドの面積は、成分の量に比例する。
【０００６】
疎水性クロマトグラフィーは、ほとんど排他的に、ユニークな水の溶媒和特性に依存する。溶媒和特性は、高度に構造化され、自己会合し、水素結合した液体に由来する。伝統的な逆相クロマトグラフィーの固定相（非荷電のC18カラム）にとって、結合は通常は、しばしば好ましくないエンタルピー（＋ΔH）を乗り越える必要があるエントロピー（＋TΔS）によりドライブされる。それゆえ、クロマトグラファーでよく使われる温度範囲（１０〜７０℃）にわたって、分析物の結合と置換剤の結合がしばしば温度増加とともにより強くなる。疎水性クロマトグラフィーのもう１つの有用な特徴は、水ベースの溶媒の自己水素結合の構造と強さとの両方を修飾する添加剤の使用である。これらの添加剤としては以下が挙げられる：塩（NaCl、K2HPO4、（NH4）2SO4）、有機溶媒（MeCN、Mesh、EtOH）と極性有機分子（尿素、オリゴーエチレングリコール）をクロマトグラフィー緩衝液に含む。
【０００７】
疎水性置換クロマトグラフィーは、キラル分析物、キラル置換剤およびキラルクロマトグラフィーのマトリックスを使用して実行することができる。これらの条件下で、アキラルな置換剤を使用してもよいが、キラル置換剤のラセミ体混合物は使用できない。ラセミ体のキラル分析物はまた、アキラルなクロマトグラフィーカラムとアキラルな置換剤を用いて精製することができる。この場合、ジアステレオマーを含む不純物は、目的のラセミ混合物から除去されるが、エナンチオマーのキラル分割はない。キラルクロマトグラフィーマトリックス、移動相およびアキラルな置換剤の適切な選択により、エナンチオマーはルーチンに分取的に分割される（分離される）。具体的な状況に応じて、キラルな固定相でエナンチオマーを置換分離する場合、良いエナンチオマー的に純粋なキラル置換剤が、良いアキラルな置換剤に対して性能上の利点を有し得る。
【０００８】
有用な分取的疎水性置換クロマトグラフィーの開発は、適した高純度の置換剤分子が利用できないことにより妨げられてきた。我々は、ここで、様々な形式の疎水性置換クロマトグラフィーにおいて有用である、新しい置換剤分子とそれらの使用方法を説明する。
【０００９】
疎水性置換剤分子は、それらが効果的に機能するために、化学的および物理的特性のユニークな組合せを持つ必要がある。いくつかの可溶な疎水性分子は、置換剤として機能するが、限られた少ない機能のみがよく機能する。この書類に記載の分子の多くは、十分に機能する置換剤に必要とされる要求を満たす。
【００１０】
有用な逆相の分取置換クロマトグラフィーの開発は、適した高純度の置換剤分子が利用できないことにより妨げられてきた。例えば、米国特許第６，２３９，２６２号は、低分子量界面活性化合物を置換剤として用いる様々な逆相液体クロマトグラフィーシステムを記載している。米国特許第６，２３９，２６２号は、疎水性部分と結合し、置換剤として使用される開示された界面活性化合物を形成し得る、極端に広い範囲の可能な荷電部分を開示するが、開示された置換剤の界面活性特性を軽減するために高い比率の有機溶媒を含む必要があることを開示している。そのような高い比率の有機溶媒の存在は、顕著にプロセスを変え、逆相疎水性置換クロマトグラフィーの利点を損なう。それに加えて、界面活性置換化合物が米国特許第６，２３９，２６２号に開示されているが、十分機能せず、「精製された」生産物に顕著なレベルの不純物が含まれ得る、相対的に低い品質の置換列になる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
有用な分取的疎水性置換クロマトグラフィーの開発は、適した高純度の置換剤分子が利用できないことにより妨げられてきた。我々は、ここで、様々な形式の疎水性置換クロマトグラフィーにおいて有用である、新しい置換剤分子とそれらの使用方法を説明する。それは、疎水性置換クロマトグラフィーの様々な形式で有用である。
多くの商業的な、小さい陽イオン性分子は、単に疎水性固定相に十分結合しない。しかし一方で、十分よく結合する多くの巨大な陽イオン分子は、十分な溶解性を欠くか、または、低い解像度、分析物の低いカラム容量および望まれない泡立ちにつながる界面活性剤問題に悩まされる。我々は、適切にデザインされたとき、多くの中間サイズの陽イオン分子が、適当なUV吸収を含む、ユニークな組合せの化学的、物理的特性を持ち、それらが疎水性置換剤として効果的に機能することを見出した。置換剤として機能できるが、制限された少ない機能でのみよく機能する、いくつかの可溶性陽イオン疎水性分子が存在することは十分真実である。この文書に記載された多くの分子は、確立された置換プロトコルに従って使用された場合に、よく機能する置換剤のための必要な要求を満たす。
【００１２】
我々は、疎水性置換クロマトグラフィーにおける良好な置換剤挙動に必要な化学的特性および物理的特性の組合せを独特に有する、塩または両性イオンのいずれかの荷電疎水性有機化合物のクラスを発見し、そして開発した。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって、本発明は、１つの実施形態では、逆相置換クロマトグラフィーによって混合物から有機化合物を分離するための方法に関し、この方法は、
疎水性固定相を提供する工程；
該疎水性固定相に、分離される有機化合物を含む混合物を適用する工程；
非界面活性疎水性陽イオン性置換剤分子および約１０重量％またはそれ以下の有機溶媒を含む水性組成物をそれに適用することにより、該疎水性固定相から該有機化合物を置換する工程；および
該分離した有機化合物を含む該疎水性固定相から溶出した複数の画分を採集する工程を含み、
ここで該非界面活性疎水性陽イオン性置換剤分子が、一般式ＡまたはＢ：
［ＣＭ］［ＣＩ］ｄ      ［ＣＭ−Ｒ＊−ＣＭ’］［ＣＩ］ｄ
Ａ                      Ｂ
を有する疎水性陽イオンおよび対イオン、ＣＩを含み、
ここで該一般式ＡおよびＢにおいて、ＣＭまたはＣＭ’のおのおのが、四級アンモニウム（Ｉ）、四級ホスホニウム（ＩＩ）、スルホニウム（ＩＩＩ）、スルホキソニウム（ＩＶ）、イミダゾリニウム（アミジニウム）（Ｖ）、グアニジニウム（ＶＩ）、イミダゾリウム（ＶＩＩ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリニウム（ＶＩＩＩ）、１，２，３，４−テトラヒドロキノリニウム（ＩＸ）、イソインドリニウム（Ｘ）、インドリニウム（ＸＩ）、ベンズイミダゾリウム（ＸＩＩ）、ピリジニウム（ＸＩＩＩａ，ＸＩＩＩｂ，ＸＩＩＩｃ，ＸＩＩＩｄ）、キノリニウム（ＸＩＶ）、イソキノリニウム（ＸＶ）、カルボキシレート（ＸＶＩ）、Ｎ−アシル−α−アミノ酸（ＸＶＩＩ）、スルホネート（ＸＶＩＩＩ）、硫酸モノエステル（ＸＩＸ）、リン酸モノエステル（ＸＸ）、リン酸ジエステル（ＸＸＩ）、ホスホン酸モノエステル（ＸＸＩＩ）、ホスホネート（ＸＸＩＩＩ）、テトラアリールボレート（ＸＸＩＶ）、ボロネート（ＸＸＶ）、ボロン酸エステル（ＸＸＶＩ）から選択される形式電荷を有する独立した疎水性化学部分であり；ここで、化学部分（Ｉ）〜（ＸＸＶＩ）が、以下の化学構造を有し：
【００１４】
【化１】
2014528585.tif 000003
【００１５】
ここで一般式Ｂにおいて、ＣＭおよびＣＭ’は、同じかまたは反対の形式電荷を有する独立した荷電化学部分であり；そして二重結合化学部分Ｒ＊により互いに化学的に付着され、該二重連結化学部分Ｒ＊はＣＭ上の１つのＲ１、Ｒ２（存在するならば）、Ｒ３（存在するならば）またはＲ４（存在するならば）化学部分を置換し、かつＣＭ’上の１つのＲ１、Ｒ２（存在するならば）、Ｒ３（存在するならば）またはＲ４（存在するならば）化学部分を置換し；
ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の各々が、式：
−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−ＡＲ１−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−ＡＲ２
によって独立して定義された直鎖状または分岐状化学部分であり、
Ｒ＊が、直接化学結合であるか、または式：
−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−ＡＲ１−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−
によって定義された二重連結直鎖状または分岐状化学部分であり
そして、Ｒ５が、式
−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−ＡＲ２
により定義された直鎖状または分岐状化学部分であり；
ここで各ＡＲ１が独立して、二重連結メチレン部分（−ＣＸ１Ｘ２−、メタン由来）、二重連結フェニレン部分（−Ｃ６Ｇ４−、ベンゼン由来）、二重連結ナフチレン部分（−Ｃ１０Ｇ６−、ナフタレン由来）または二重連結ビフェニレン部分（−Ｃ１２Ｇ８−、ビフェニル由来）であり；
ここでＡＲ２が独立して、水素（−Ｈ）、フッ素（−Ｆ）、フェニル基（−Ｃ６Ｇ５）、ナフチル基（−Ｃ１０Ｇ７）またはビフェニル基（−Ｃ１２Ｇ９）であり；
ここで各Ｘ、Ｘ１およびＸ２が個々にかつ独立して、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌまたは−ＯＨであり；
ここで任意の−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−内または任意の−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−内または任意の−（ＣＸ１Ｘ２）ｐ−内の任意のメチレン部分（−ＣＸ１Ｘ２−）が個々にかつ独立して、独立したエーテル−酸素原子−Ｏ−、独立したチオエーテル−硫黄原子−Ｓ−、または独立したケトン−カルボニル基−Ｃ（Ｏ）−と、各エーテル−酸素原子、各チオエーテル−硫黄原子または各ケトン−カルボニル基がそれぞれの側で脂肪族炭素原子または芳香族炭素原子に結合されるように置換されてもよく；
ここで２以下のエーテル−酸素原子、２以下のチオエーテル−硫黄原子および２以下のケトン−カルボニル基が、任意の−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−または任意の−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−に置換されてもよく；
ここでｍｘが、エーテル−酸素原子、チオエーテル−硫黄原子およびケトン−カルボニル基と置換されている各−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−におけるメチレン基の総数であり、そしてｍｕが、エーテル−酸素原子、チオエーテル−硫黄原子およびケトン−カルボニル基と置換されている各−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−におけるメチレン基の総数であり；
ここでＧが個々にかつ独立して、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＨ３、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＦ３、−ＣＯ２Ｍｅ、−ＣＯ２ＮＨ２；−ＣＯ２ＮＨＭｅ、−ＣＯ２ＮＭｅ２の任意の組み合わせであり；
ここでＧ＊が個々にかつ独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｒ２、−ＯＨ、−ＯＲ２、−ＮＲ２Ｒ３、−ＣＦ３、−ＣＯ２Ｍｅ、−ＣＯ２ＮＨ２；−ＣＯ２ＮＨＭｅ、−ＣＯ２ＮＭｅ２の任意の組み合わせであり；
ここでＲ２、Ｒ３、およびＲ４の対が、Ｒ２／Ｒ３、Ｒ２／Ｒ４、Ｒ３／Ｒ４、Ｒ２’／Ｒ３’、Ｒ２’／Ｒ４’またはＲ３’／Ｒ４’が個々にかつ独立して、−（ＣＸ１Ｘ２）ｐ−（ここでｐ＝３、４、５または６）であるような単一化学部分を含んでもよく；
ここでｘ、ｒ、ｕ、ｓ、ｍｘ、ｍｕの各々の整数値が、各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ＊について独立して選択され、整数値ｒおよびｓは、含有され単離されたシス／トランスオレフィン（アルケン）基の総数＋含有される単純単環式構造の総数であり、そして０≦ｒ≦２および０≦ｓ≦２の範囲内にあり、数量ｘ＋ｕ−ｍｘ−ｍｕが０≦ｘ＋ｕ−ｍｘ−ｍｕ≦１１の範囲内にあり；
ここで少なくとも１つの芳香族化学部分、複素環芳香族化学部分、イミダゾリン化学部分、アミジン化学部分またはグアニジン化学部分がＡまたはＢのＣＭまたはＣＭ’内に含有され；
ここで各Ｒ化学部分についての基疎水性指数（ｎ）が、脂肪族炭素原子数＋オレフィン炭素原子数＋チオエーテル−硫黄原子数＋塩素原子数＋１／５×フッ素原子数＋１／２×エーテル−酸素原子数＋１／２×ケトン−炭素原子数＋１／２×芳香族炭素原子数の合計に数値的に等しく、６からヒドロキシル−酸素原子数（１を超える）を引いた数を超えるものであり；
ここで各［ＣＭ］または［ＣＭ−Ｒ＊−ＣＭ’］についての全体疎水性指数（Ｎ）が、脂肪族炭素原子数＋オレフィン炭素原子数＋チオエーテル−硫黄原子数＋塩素原子数＋１／５×フッ素原子数＋１／２×エーテル−酸素原子数＋１／２×ケトン−炭素原子数＋１／２×芳香族炭素原子数の合計に数値的に等しく、６からヒドロキシル−酸素原子数（１を超える）を引いた数を超えるものであり；
ここでＲ１およびＲ１’についての基疎水性指数（１ｎおよび１’ｎ）が、４．０＜１ｎ、１’ｎ＜１２．０の範囲内にあり、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ＊（存在する場合）についての基疎水性指数（２ｎ、２’ｎ、３ｎ、３’ｎ、５ｎ、５’ｎおよび＊ｎ）が、０．０≦２ｎ、２’ｎ、３ｎ、３’ｎ、５ｎ、５’ｎ、＊ｎ＜１２．０の範囲内にあり、そしてＲ４およびＲ４’（存在する場合）についての基疎水性指数（４ｎおよび４’ｎ）が、０．０≦４ｎ、４’ｎ≦５．０の範囲内にあり；
ここでｇの値によって割られた該全体疎水性指数（Ｎ）が、１０．０≦Ｎ／ｇ＜２４．０の範囲内にあり；
ここで、Ａにおいて、荷電部分、ＣＭが、正の形式荷電または負の形式荷電を持つときｇ＝１、そしてＢにおいて、ＣＭおよびＣＭ’が正の形式荷電を持つか、またはＣＭおよびＣＭ’が負の形式荷電を持つとき、ｇ＝２、そしてＢにおいてＣＭが正の形式荷電を持ち、かつＣＭ’が負の形式荷電を持つとき、ｇ＝１であり；
ここで、環状化学部分について計算された基疎水性指数の数値は、該２つのそれぞれのＲ化学部分間で等しく割られるものであり；
ここでＲ１は、１つのみのそのような化学部分がＣＭまたはＣＭ’に付着された場合、そのＲ化学部分として同定され；１より多くのそのような化学部分がＣＭまたはＣＭ’に付着した場合、Ｒ１は、基疎水性指数の最大値を持つＲ化学部分として同定され；ここでＲ４は、３より多くのそのような化学部分がＣＭまたはＣＭ’に付着した場合、基疎水性指数が最小値を持つＲ化学部分として同定され；そして
ここでＣＩは、非干渉性の逆に荷電した対イオンまたはそのような対イオンの混合物であり、そしてｄの値は０、正の整数、または正の分数であり、疎水性化合物全体の電気的中性が維持されている。
【００１６】
１つの実施形態では、非界面活性疎水性置換剤分子を含む水性組成物は、ｐＨ緩衝剤以外の添加塩を含まない。
【００１７】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＩまたはＩＩを有し：
【００１８】
【化２】
2014528585.tif 000004
【００１９】
ここで該一般式ＩまたはＩＩにおいて、Ｒ１がＣ８〜Ｃ１１ヒドロカルビル部分であり、Ｒ２およびＲ３が独立してＣ１〜Ｃ４ヒドロカルビル部分またはベンジルであり、そしてＲ４がベンジル、ハロ置換ベンジル、４−アルキルベンジル、４−トリフルオロメチルベンジル、４−フェニルベンジル、４−アルコキシベンジル、４−アセトアミドベンジル、Ｈ２ＮＣ（Ｏ）ＣＨ２−、ＰｈＨＮＣ（Ｏ）ＣＨ２−、ジアルキル−ＮＣ（Ｏ）ＣＨ２−（ここでアルキルがＣ１〜Ｃ４である）から選択され、但し、ＣＭに存在するベンジル基は１以下である。
【００２０】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＩまたはＩＩを有し：
【００２１】
【化３】
2014528585.tif 000005
【００２２】
ここで該一般式ＩまたはＩＩにおいて、Ｒ１およびＲ２が独立してＣ４〜Ｃ８アルキルまたはシクロヘキシルであり、Ｒ３がＣ１〜Ｃ４アルキルであり、そしてＲ４がフェニル、２−、３−もしくは４−ハロフェニル、ベンジル、２−、３−もしくは４−ハロベンジル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−もしくは３，５−ジハロベンジル、２，４，６−もしくは３，４，５−トリハロベンジル、Ｃ６Ｈ５ＣＨ２ＣＨ２−または２−、３−もしくは４−トリフルオロメチルベンジルである。
【００２３】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸまたはＸＩを有し、Ｒ１がＣ５〜Ｃ１１アルキルであり、そしてＲ２がＣ１〜Ｃ８アルキルである。
【００２４】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＩまたはＩＩを有し：
【００２５】
【化４】
2014528585.tif 000006
【００２６】
ここで該一般式ＩまたはＩＩにおいて、Ｒ１がＣ６〜Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ３が独立してＣ１〜Ｃ４アルキルであり、そしてＲ４がＰｈＣ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＦＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＣＦ３Ｃ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＣｌＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＢｒＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、ｄｌ−ＰｈＣ（Ｏ）ＣＨ（Ｐｈ）−、Ｐｈ（ＣＨ２）２−、Ｐｈ（ＣＨ２）３−、Ｐｈ（ＣＨ２）４−、ｄｌ−ＰｈＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、ｔ−ＰｈＣＨ＝ＣＨＣＨ２−、１−（ＣＨ２）ナフチレン、９−（ＣＨ２）アントラセン、２−、３−もしくは４−ＦＣ６Ｈ４ＣＨ２−またはベンジルである。
【００２７】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＩまたはＩＩを有し：
【００２８】
【化５】
2014528585.tif 000007
【００２９】
ここで、一般式ＩまたはＩＩにおいて、Ｒ１がＣ６〜Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ３が一緒になって−（ＣＨ２）４−であり、そしてＲ４が、ＰｈＣ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＦＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＣＦ３Ｃ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＣｌＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＢｒＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、ｄｌ−ＰｈＣ（Ｏ）ＣＨ（Ｐｈ）−、Ｐｈ（ＣＨ２）２−、Ｐｈ（ＣＨ２）３−、Ｐｈ（ＣＨ２）４−、ｄｌ−ＰｈＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、ｔ−ＰｈＣＨ＝ＣＨＣＨ２−、２−、３−もしくは４−ＦＣ６Ｈ４ＣＨ２−、ベンジル、３−ＣｌＣ６Ｈ４ＣＨ２−、２，６−Ｆ２Ｃ６Ｈ３ＣＨ２−、３，５−Ｆ２Ｃ６Ｈ３ＣＨ２−、４−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４ＣＨ２−、４−ＣＨ３ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ２−、４−ＣＨ３ＯＣ６Ｈ４２−、（ＣＨ３）２ＮＣ（Ｏ）ＣＨ２−または（ＣＨ３ＣＨ２）２ＮＣ（Ｏ）ＣＨ２−である。
【００３０】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＩまたはＩＩを有し：
【００３１】
【化６】
2014528585.tif 000008
【００３２】
ここで該一般式ＩまたはＩＩにおいて、Ｒ１がＣ４〜Ｃ６アルキル、ベンジルまたは２−、３−もしくは４−ＦＣ６Ｈ４ＣＨ２−であり、Ｒ２およびＲ３が独立してＣ１〜Ｃ８アルキル、ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）２−、ＣＨ３ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−またはＣＨ３ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−であり、そしてＲ４が、Ｐｈ（ＣＨ２）４−、４−ＰｈＣ６Ｈ４ＣＨ２−、４−ＦＣ６Ｈ４ＣＨ２−、４−ＣＦ３Ｃ６Ｈ４ＣＨ２−、ＰｈＣ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＦＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＰｈＣ６Ｈ４Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、４−ＰｈＣ６Ｈ４ＣＨ２−、ナフチレン−１−ＣＨ２−、アントラセン−９−ＣＨ２−またはＰｈ（ＣＨ２）ｎ−（ここでｎ＝５〜８）である。
【００３３】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式［（Ｒ１Ｒ２Ｒ３ＮＣＨ２）２Ｃ６Ｈ３Ｇ］２＋を有し、ここでＲ１がＣ４〜Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ３が独立してＣ１〜Ｃ６アルキルであるか、またはＲ２およびＲ３が一緒になって−（ＣＨ２）４−であり、そしてＧがＨまたはＦである。
【００３４】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式［Ｒ１Ｒ２Ｒ３ＮＣＨ２Ｃ６Ｈ４−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＮＲ１Ｒ２Ｒ３］２＋を有し、ここでＲ１がＣ４〜Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ３が独立してＣ１〜Ｃ６アルキルであるか、またはＲ２およびＲ３が一緒になって−（ＣＨ２）４−である。
【００３５】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＩＩＩまたはＩＶを有し：
【００３６】
【化７】
2014528585.tif 000009
【００３７】
ここで該一般式ＩＩＩまたはＩＶにおいて、Ｒ１がＣ８〜Ｃ１１アルキルまたは４，４’−ＣＨ３（ＣＨ２）４Ｃ６Ｈ４−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２−であり、Ｒ２がＣ１〜Ｃ６アルキルまたは４−ＦＣ６Ｈ４ＣＨ２−であり、そしてＲ３がＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【００３８】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＸＩＶまたはＸＶを有し：
ここで該一般式ＸＩＶまたはＸＶにおいて、Ｒ１がＣ８〜Ｃ１１アルキルであり、そして各ＧおよびＲ５は上に定義したとおりである。
【００３９】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＩＩｃ、ＸＩＩＩｄまたはＸＩＩＩｅを有し：
【００４０】
【化８】
2014528585.tif 000010
【００４１】
ここで該一般式ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＩＩｃ、ＸＩＩＩｄまたはＸＩＩＩｅにおいて、Ｒ１がＣ８〜Ｃ１１アルキルまたはＣ８〜Ｃ１１  ４−フェニルであり、Ｒ２がＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルもしくはアルコキシ、２−ピリジル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル置換２−ピリジル、またはピロリジニルであり、そして各Ｇは上に定義したとおりである。
【００４２】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＶＩＩを有し：
【００４３】
【化９】
2014528585.tif 000011
【００４４】
ここで該一般式ＶＩＩにおいて、Ｒ１がＣ５〜Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ５が独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルまたはフェニルである。
【００４５】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＸＩＩを有し：
【００４６】
【化１０】
2014528585.tif 000012
【００４７】
ここで該一般式ＸＩＩにおいて、Ｒ１がＣ５〜Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ５が独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルまたはフェニルであり、そしてＧは上に定義したとおりである。
【００４８】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＸＸＩＶまたはＸＸＶを有し：
【００４９】
【化１１】
2014528585.tif 000013
【００５０】
ここで該一般式ＸＸＩＶにおいて、Ｒ１がフェニル、４−ＥｔＣ６Ｈ４−、４−ｎＰｒＣ６Ｈ４−、４−ｎＢｕＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＯＣ６Ｈ４−、４−ＦＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＯＣ６Ｈ４−、４−ＥｔＣ６Ｈ４−、４−ＣｌＣ６Ｈ４−、またはＣ６Ｆ５−であり；そしてＲ２、Ｒ３およびＲ４の各々が独立してフェニル、４−ＦＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＯＣ６Ｈ４−、４−ＥｔＣ６Ｈ４−、４−ＣｌＣ６Ｈ４−またはＣ６Ｆ５−であり；そして
ここで該一般式ＸＸＶにおいて、Ｒ１が４−（４−ｎＢｕＣ６Ｈ４）Ｃ６Ｈ４−または４−（４−ｎＢｕＣ６Ｈ４）−３−ＣｌＣ６Ｈ３−である。
【００５１】
１つの実施形態では、ＣＭは、４−Ｒ１Ｃ６Ｈ４ＳＯ３Ｈ、５−Ｒ１−２−ＨＯ−Ｃ６Ｈ３ＳＯ３Ｈ、４−Ｒ１−Ｃ６Ｈ４−Ｃ６Ｈ３Ｘ−４’−ＳＯ３Ｈ、および４−Ｒ１−Ｃ６Ｈ４−Ｃ６Ｈ３Ｘ−３’−ＳＯ３Ｈから選択される一般式を有し、ここでＲ１はＣＨ３（ＣＨ２）ｎであり、ここでｎ＝４〜１０そしてＸがＨまたはＯＨである。
【００５２】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＸＶＩＩＩまたはＸＸＩＩＩを有し：
【００５３】
【化１２】
2014528585.tif 000014
【００５４】
ここで該一般式ＸＶＩＩＩにおいておよび該一般式ＸＸＩＩＩにおいて、Ｒ１がＣ６Ｈ５（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎ＝５〜１１である。
【００５５】
１つの実施形態では、ＣＭは、５−Ｒ１−２−ＨＯ−Ｃ６Ｈ３ＣＯ２ＨおよびＲ１Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｃ６Ｈ５）ＣＯ２Ｈから選択される一般式を有し、ここでＲ１がＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎ＝４〜１０である。
【００５６】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式４−Ｒ１Ｃ６Ｈ４ＰＯ３Ｈ２を有し、ここでＲ１がＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎ＝４〜１０である。
【００５７】
１つの実施形態では、ＣＩは、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、ＯＨ−、Ｆ−、ＯＣＨ３−、ｄ，ｌ−ＨＯＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＯ２−、ＨＯＣＨ２ＣＯ２−、ＨＣＯ２−、ＣＨ３ＣＯ２−、ＣＨＦ２ＣＯ２−、ＣＨＣｌ２ＣＯ２−、ＣＨＢｒ２ＣＯ２−、Ｃ２Ｈ５ＣＯ２−、Ｃ２Ｆ５ＣＯ２−、ｎＣ３Ｈ７ＣＯ２−、ｎＣ３Ｆ７ＣＯ２−、ＣＦ３ＣＯ２−、ＣＣｌ３ＣＯ２−、ＣＢｒ３ＣＯ２−、ＮＯ３−、ＣｌＯ４−、ＢＦ４−、ＰＦ６−、ＨＳＯ４−、ＨＣＯ３−、Ｈ２ＰＯ４−、ＣＨ３ＯＣＯ２−、ＣＨＯＳＯ３−、ＣＨ３ＳＯ３−、Ｃ２Ｈ５ＳＯ３−、ＮＣＳ−、ＣＦ３ＳＯ３−、Ｈ２ＰＯ３−、ＣＨ３ＰＯ３Ｈ−、ＨＰＯ３２−、ＣＨ３ＰＯ３２−、ＣＯ３２−、ＳＯ４２−、ＨＰＯ４２−、ＰＯ４３−から選択される非干渉性陰イオンまたは非干渉性陰イオンの混合物である。
【００５８】
１つの実施形態では、ＣＩが、アルカリ金属イオン（Ｌｉ＋，Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋，Ｃｓ＋）、アルカリ土類金属イオン（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋，Ｓｒ２＋，Ｂａ２＋）、２価遷移金属イオン（Ｍｎ２＋，Ｚｎ２＋）、およびＮＨ４＋の群から選択される非干渉性の無機陽イオンまたはそのような非干渉性陽イオンの混合物であり；ここで、ＣＩは、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基および／またはＣ２〜Ｃ４のヒドロキシアルキル基を含んでいてもよい、プロトン化された１級アミン（１＋）、プロトン化された２級アミン（１＋）、プロトン化された３級アミン（１＋）、プロトン化されたジアミン（２＋）、４級アンモニウムイオン（１＋）、スルホニウムイオン（１＋）、スルホキソニウムイオン（１＋）、フォスフォニウムイオン（１＋）、ビス−４級アンモニウムイオン（２＋）の群から選択される，非干渉性の有機陽イオンまたはそのような非干渉性陽イオンの混合物である。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１ｂ】図１ｂは、本発明の典型的な実施形態に従う置換クロマトグラフィープロセスについてフラクション番号（ｘ−軸）対おのおののフラクション中のおのおのの成分の濃度（ｍｇ／ｍＬ）をプロットした置換データのフラクション分析である。
【図２】図２は、本発明の典型的な実施形態に従う置換クロマトグラフィープロセスについてフラクション番号（ｘ−軸）対おのおののフラクション中のおのおのの成分の濃度（ｍｇ／ｍＬ）をプロットした置換データのフラクション分析である。
【図３】図３は、本発明の典型的な実施形態に従う置換クロマトグラフィープロセスについてフラクション番号（ｘ−軸）対おのおののフラクション中のおのおのの成分の濃度（ｍｇ／ｍＬ）をプロットした置換データのフラクション分析である。
【図４】図４は、本発明の典型的な実施形態に従う置換クロマトグラフィープロセスについてフラクション番号（ｘ−軸）対おのおののフラクション中のおのおのの成分の濃度（ｍｇ／ｍＬ）をプロットした置換データのフラクション分析である。
【図５】図５は、本発明の典型的な実施形態に従う置換クロマトグラフィープロセスについてフラクション番号（ｘ−軸）対おのおののフラクション中のおのおのの成分の濃度（ｍｇ／ｍＬ）をプロットした置換データのフラクション分析である。
【図６ｂ（ａ）Ａ】図６ｂ（ａ）Ａは、本発明の例示の実施形態に従う置換クロマトグラフィー方法について、時間（ｘ−軸）対相対吸光単位（ｙ−軸）をプロットする粗合成ペプチドの精製に関する置換トレースである。
【図６ｂ（ａ）Ｂ】図６ｂ（ａ）Ｂは、本発明の典型的な実施形態に従う置換クロマトグラフィープロセスについてフラクション番号（ｘ−軸）対おのおののフラクション中のおのおのの成分の濃度（ｍｇ／ｍＬ）をプロットした置換データのフラクション分析である。
【図７】図７は、本発明の典型的な実施形態に従う置換クロマトグラフィープロセスについてフラクション番号（ｘ−軸）対おのおののフラクション中のおのおのの成分の濃度（ｍｇ／ｍＬ）をプロットした置換データのフラクション分析である。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本明細書中において使用されるように、本発明に従って用いられる陽イオン性非界面活性置換剤化合物に関して、「非界面活性」とは、そのように記載された化合物が、本発明による置換クロマトグラフィー方法で用いられる化合物の濃度より大きい臨界ミセル濃度（「ＣＭＣ」）を有することを意味する。１つの実施形態では、非界面活性置換剤化合物の濃度は、ＣＭＣに影響し得る有機溶媒、塩、または他の薬剤の非存在下、水中にあるその化合物についてのＣＭＣの約８０％未満である。１つの実施形態では、非界面活性置換剤化合物の濃度は、ＣＭＣに影響し得る有機溶媒、塩、または他の薬剤の非存在下、水中にあるその化合物についてのＣＭＣの約６０％未満である。１つの実施形態では、非界面活性置換剤化合物の濃度は、ＣＭＣに影響し得る有機溶媒、塩、または他の薬剤の非存在下、水中にあるその化合物についてのＣＭＣの約５０％未満である。
【００６１】
１つの実施形態では、本発明に従って用いられる非界面活性陽イオン性疎水性置換剤分子を含む水性組成物は、以下の１つまたは２つもしくはそれ以上の組み合わせによって、不利な界面活性特性を示さない：（１）そのＣＭＣより低い濃度で陽イオン性非界面活性置換剤化合物が存在する；（２）ｇの値で割った各［ＣＭ］または［ＣＭ−Ｒ＊−ＣＭ’］についての全体疎水性指数（Ｎ）が１０≦Ｎ／ｇ＜２４の範囲内にある；（３）各Ｒ１についての基疎水性指数（１ｎ）が、４＜１ｎ＜１２の範囲内にあり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ＊（存在する場合）の各々についての基疎水性指数（２ｎ、３ｎ、５ｎおよび＊ｎ）が、０≦２ｎ、３ｎ、５ｎ、＊ｎ＜１２の範囲内にあり、そして各Ｒ４（存在する場合）についての基疎水性指数（４ｎ）が、０≦４ｎ≦５の範囲内にある；（４）組成物が約５容量％またはそれ以上より多くの有機溶媒を含有する。
【００６２】
本明細書中において使用されるように、「低い有機溶媒含量」とは、例えば、本発明に従う陽イオン性非界面活性置換剤化合物を含む水性「キャリア」組成物中で、約２５容量％未満の有機溶媒含量を一般にいう。１つの実施形態では、水性「キャリア」組成物の有機溶媒含量は、約２０容量％未満の任意の有機溶媒を含有する。１つの実施形態では、水性「キャリア」組成物の有機溶媒含量は、約１５容量％未満の任意の有機溶媒を含有する。１つの実施形態では、水性「キャリア」組成物の有機溶媒含量は、約１０容量％未満の任意の有機溶媒を含有する。１つの実施形態では、水性「キャリア」組成物の有機溶媒含量は、約５容量％未満の任意の有機溶媒を含有する。１つの実施形態では、水性「キャリア」組成物は、有機溶媒を含有しない。
【００６３】
１つの実施形態では、有機溶媒は、メタノール（ＣＨ３ＯＨまたはＭｅＯＨ）、エタノール（Ｃ２Ｈ５ＯＨまたはＥｔＯＨ）またはアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮまたはＭｅＣＮ）の１つまたは２つもしくはそれ以上の混合物である。１つの実施形態では、水性「キャリア」組成物は、適切な有機溶媒の混合物を含有する。１つの実施形態では、水性「キャリア」組成物は、有機溶媒を含有しない。
【００６４】
疎水性置換クロマトグラフィーは、キラル分析物、キラル置換剤およびキラルクロマトグラフィーマトリックスを用いて実施され得る。これらの条件下では、アキラル置換剤を用いてもよいが、キラル置換剤のラセミ混合物は用いることができない。ラセミキラル分析物はまた、アキラルクロマトグラフィーカラムおよびアキラル置換剤を用いて精製され得る。この場合、不純物（ジアステレオマーを含む）が目的のラセミ化合物から取り除かれるが、エナンチオマーのキラル分割はない。
【００６５】
本明細書中に記載の陽イオン性置換剤のいくつかは、４つの異なる基が付着した四級窒素を有し、したがって固有にキラルである；例えば、以下の表Ｖ〜ＩＸ中のラセミ置換剤化合物４３〜４５、５０〜５３、５８〜５９、６４〜６６参照。さらに、陽イオン性置換剤のいくつかは、アキラル窒素原子に付着した１つのキラル基を含有する；例えば、ｌ−フェニルアラニンに由来する鏡像異性的に純粋な置換剤化合物６７と共にラセミ置換剤化合物２０３および２０６参照。キラルクロマトグラフィーマトリックス、移動相およびアキラル置換剤の適切な選択と共に、エナンチオマーは、規定通りに分取的に分割（分離）される。特定の環境に依存して、良好な鏡像異性的に純粋なキラル置換剤は、キラル固定相上でエナンチオマーの置換分離を実施する際に、良好なアキラル置換剤を超える性能の利点を有し得る。
【００６６】
（有用ｐＨ範囲）−一般式ＡまたはＢを有する種々のクラスの陽イオン性疎水性置換剤は、荷電部分の化学的性質に依存して異なる有用ｐＨ範囲を有する。脱プロトン化可能な陽イオン基を含有する陽イオン性疎水性置換剤は、実際のｐＫａ値を１〜２単位またはそれ以上下回るｐＨにて操作されるべきである。プロトン化可能な陰イオン基を含有する陽イオン性疎水性置換剤は、実際のｐＫａ値を１〜２単位またはそれ以上上回るｐＨにて操作されるべきである。
・オニウム基−一般に、四級アンモニウム、四級ホスホニウム、三級スルホニウム、三級スルホキシウムおよび関連陽イオン基（例えば、ピリジニウム、イミダゾリウム、グアニジウム）は、広範な有用ｐＨ範囲（１〜１１またはより大きい）を有する。なぜなら、これらの基は、通常の条件下で、脱プロトン化可能なＮ−Ｈ、Ｓ−ＨまたはＰ−Ｈ部分を有しないためである。
・アミンおよびグアニジン基−三級脂肪族アミン（ｐＫａ約９．５）および関連置換グアニジン（ｐＫａ約１３．５）（脱プロトン化可能なＮ−Ｈ部分を有する）は、実際のｐＫａ値を１〜２単位またはそれ以上下回るｐＨにて操作された場合に有用な陽イオン基である。
【００６７】
（置換剤結合強度）−置換剤は、試料の全成分よりも強く、または少なくとも目的の主要成分全てよりも強く、カラムに結合すべきである。確かな経験則は、試料質量のわずか１〜４％が、置換剤よりも強く結合するものである。
【００６８】
最適な置換剤は、強すぎずかつ弱すぎずに固定相に結合すべきである。適切な結合強度は、目的の分析物および付随する結合等温線に依存する。通常、広範な結合強度を有する広範な置換剤が、種々の異なるカラムおよび精製されるべき分析物に必要とされる。置換剤の結合が強すぎると、得られる性能は不十分である（例えば、分解能がより低い、分析物結合能がより低い、置換剤の除去が困難、およびサイクル時間がより長い）。置換剤の結合が弱すぎると、置換剤の下に置換された分析物の「テーリング」が過度に多い不十分な置換列が生じ得るか、または部分的な置換のみもしくは全く置換がないものとなり得る。
【００６９】
適切な結合強度を有する置換剤を選択する際に助けとなる便利な経験上の方法は、置換実験に用いられるものと同様のカラムおよび移動相を用いて、可能な置換剤および分析物の単純グラジエント溶出クロマトグラフィーを実施することである。第一のスクリーンでは、置換剤は、６０分グラジエントで目的の分析物よりも５〜１５分遅く溶出するべきである。理想的には、１つの分析物および分析物混合物の等温線を測定するものであるが、これは、時間を要し、しばしば非実用的である。それは、早期に結合等温線において動作するので、この経験上の方法は完全ではないが、さらなるＤＣ至適化のための便利な出発点を提供する。
【００７０】
（使用可能な結合等温線）−適切な結合強度とは別に、有用な疎水性置換剤は、特定の他の有用な特徴を持つ結合等温線を有する必要がある。
【００７１】
（１）置換剤および分析物分子についての単峰性で上に凸の等温線（ラングミュア型等温挙動）は、イソタクチック置換列の規則的な形成を促進し、そして方法の最適化プロセスを簡略化する。これは、多くの陽イオン性置換剤分子の有用な特性である。これに対し、多くの他の非荷電疎水性置換剤分子（非双性イオン）（例えば、芳香族アルコール（例えば、置換フェノール、ナフトール、ヒドロキシビフェニル）、脂肪酸アルコール（例えば、１−ドデカノール、１，２−ドデカンジオール）および非荷電脂肪酸カルボン酸（例えば、ミリスチン酸））の結合等温線は、低濃度で正常に挙動し、次いで高濃度では二峰性になり、再度上昇する（ＢＥＴ型等温挙動）。この結合挙動は、しばしば、各層が異なる結合特徴を有する多層の疎水性置換剤の堆積から生じる。この結合挙動は、置換プロセスおよびその有用な実行を大いに複雑化させる。
【００７２】
（２）ＤＣにおけるクロマトグラフィー結果もまた、置換剤分子が液中で自己会合を受けた場合に複雑である。濃度が増大するにつれて、置換剤の自己会合を伴う問題がより悪くなる。また、陽イオン性疎水性置換剤の荷電した基は、水溶液中の自己会合の問題を防ぐ。
【００７３】
（３）より高い非線形結合領域で置換剤の等温線と生成物および／または不純物の等温線が交叉する場合に、さらなる複雑化もまた生じる。この挙動は、置換順序の反転、置換バンド間の重なり領域の拡張、および共置換を伴う問題を生じる。この場合、置換剤濃度をわずかに変動することで、置換列に大きな変化を生じ、それにより方法の最適化を非常に困難なものとし得る。
【００７４】
我々は、適切に設計した陽イオン性置換剤分子に適切な対イオンおよび少量の有用な有機溶媒を補充することで、ラングミュア型結合挙動および有用範囲の結合強度を有する効果的な疎水性置換剤のファミリーを提供することを見出した。
【００７５】
（陽イオン置換剤のためのイオン対形成陰イオン）−それらの全ての多くの利点を以て、陽イオン疎水性置換剤分子は、さらに１つの要求がある：よいイオン対を形成する陰イオン、ＣＩの選択である。イオン対形成陰イオンは、置換剤の結合等温線および置換剤の機能と有用性に顕著な影響を与える。イオン対形成剤の濃度は、イオン対形成陰イオンの適量のＫ＋、ＮＨ４＋、プロトン化アミン塩またはイオン対形成陽イオンのＣｌ−／ＨＣＯ２−塩を付加することにより、独立して調整される。陽イオン疎水性置換剤のイオン対形成対陰イオンの特性は、その置換特性に強く影響する。少数の陰イオンが液中イオン対形成に関与し得、そしてほぼ全ての陰イオンが、疎水性クロマトグラフィーマトリックス上で吸着状態にてイオン対形成に関与する。置換剤および分析物にとって同じイオン対形成剤が、良好なクロマトグラフィー分解能のために用いられるべきである。有用なイオン対形成対イオンは、通常、一荷電である。それらの高い溶媒和エネルギーのために、通常、二価イオン（ＳＯ４２−）および三価イオン（ＰＯ４３−）はより有用ではないが、いくつかの特殊な場合においては用いられ得る。この一般的な規則に対する例外は、１つの有機イオン中で離れて位置する複数の一荷電部分（例えば、−Ｏ３Ｓ（ＣＨ２）４ＳＯ３−）である。
【００７６】
より大きな疎水性特徴を有する陰イオンは、結合強度を増大しかつ溶解度を減少させる傾向にある。さらに、疎水性置換剤塩を用いる場合、ＤＣの分解能は、陰イオンそれ自体が過度に疎水性または過度に親水性であれば減少し得る。典型的には、陰イオンの中間の疎水性／親水性特徴が最良の結果を与えるが、これは、精製される分子に依存して変動する。各精製について最適な対イオンは、実験的に決定されるべきである。例えば、ＣＨ３ＣＯ２−対イオンを有する疎水性四級アンモニウム置換剤は良好な溶解度および並の分解能を与え、そしてＣＦ３ＣＯ２−を有するものは、並であるが許容可能な溶解度および良好な分解能を与え、そしてＣＣｌ３ＣＯ２−を有するものは、不十分な溶解度および並の分解能を与える。揮発性のイオン対形成剤は減圧下で好都合に除去されるが、他方非揮発性のものは他の手段（例えば、ダイアフィルトレーション、沈降または結晶化）によって容易に除去される。表Ｉは、有用な単価イオン対形成陰イオンの部分リストを示す。陰イオンイオン対形成剤を用いる場合、操作ｐＨは、それぞれの酸のｐＫａを１〜２ｐＨ単位またはそれ以上上回るべきである。このガイドラインに対する顕著な例外は、同時にイオン対形成剤およびｐＨ緩衝剤の両方として作用するトリフルオロ酢酸である。
【００７７】
【表１】
2014528585.tif 000015
【００７８】
混合陰イオンはしばしばクロマトグラフィー分解能の損失を生じるので、一般には回避されるべきである。しかし、混合陰イオンが用いられ得る場合の１つの条件セットがある；すなわち、（ａ）目的の陰イオンが存在する他の陰イオンよりも有意に強いイオン対形成特性を有し、かつ（ｂ）目的の陰イオンが試料負荷混合物中および置換剤緩衝剤中で化学量論的に過度に存在する場合である。
【００７９】
最も一般的に用いられるイオン対形成陰イオンは、ギ酸塩、酢酸塩、塩化物、臭化物、およびトリフルオロ酢酸塩である。より低いイオン対形成強度のため、ギ酸塩および酢酸塩は、良好な分解能を得るために慎重な最適化を要する。臭化物およびトリフルオロ酢酸塩は、ペプチドおよび小さなタンパク質について最良の結果を与えると思われる。一般に、良好なクロマトグラフィー結果は、イオン対形成陰イオンとして塩化物および臭化物を用いて得られ得るが、２つの特別な注意が払われるべきである。（１）酸性条件下で、クロマトグラフィー溶液は、ガス状のＨＣｌまたはＨＢｒの損失のために、ヘリウムパージによっても真空脱ガスによっても脱気することができず、それによりｐＨを変更し、そして陰イオンの濃度を変更し得る。この問題は、クロマトグラフィー溶液を調製するために、脱気蒸留水を用い、そしてために密閉容器中に溶液を保存して空気の再吸着を予防することにより克服される。（２）塩化物および臭化物は、ステンレス鋼ＨＰＬＣ装置を腐食する可能性があるが、ＰＥＥＫ、テフロン（登録商標）、セラミック、ガラス、およびチタンからなる装置は安全である。主要な問題は、低ｐＨにて空気（酸素）により引き起こされるステンレス鋼のハロゲン化物触媒腐食である。ＨＰＬＣ溶液が適切に脱酸素されれば、ステンレス鋼のハロゲン化物促進腐食は、大きく減少する。
【００８０】
（溶解度）−「疎水性クロマトグラフィー」またはより適切には「疎溶媒性クロマトグラフィー」において、主溶媒成分が水である場合、可能な疎水性置換剤分子はしばしば限られた溶解度を有する。疎水性分子は、疎水性分子に付着した「親水基」（荷電イオン基、親水性対イオン、極性基、または水素結合供与体もしくは受容体として機能する基）が存在しない限り、通常、感知され得る程度にまでは水中に溶解しない。芳香族分子は、パイ電子が弱水素結合受容体として作用する特有の様式のために、特有の様式にて水と相互作用する。さらに、芳香族分子は、水溶液中で直面するパイスタッキングに関与し得る。これらの小さいが重要な効果は、シクロヘキサン（約１０μＭ）およびトランスデカリン（＜１μＭ）と比較してベンゼン（９ｍＭ）およびナフタレン（２００μＭ）のより高い水中溶解度に、および非水酸化アレーンと比較したフェノール（９６０ｍＭ）およびβ−ナフトール（７ｍＭ）のより高い溶解度に反映される。有用な置換剤分子の分子構造は、水中または低有機溶媒含量の水中で妥当な溶解度（１０〜５０ｍＭ）を促進すべきであり、なお同時に、それが固定相に強く結合するのに十分に疎水性であるべきである。一般に、荷電置換剤分子は、荷電した種（特に対イオン）の増大した溶媒和エネルギーのために、中性のものよりも良好な溶解度特性を有する。それは、中性双性イオン性分子が良好な置換剤として挙動するために、物理的特性および化学的特性の特有の平衡を必要とする。陽イオン疎水性置換剤は特有の溶解特性を示す。
【００８１】
一般的にいえば、不十分な置換剤溶解度を補うたために有機溶媒のレベルを増大することが、有用な結果を生じることはまれであることに留意することが重要である。最良のクロマトグラフィー結果は、０〜２５％の有機溶媒、またはより好ましくは２〜１５％の有機溶媒で得られる。いくつかの場合では、移動相のより高い有機溶媒含量（２５〜７５％）が用いられ得るが、通常容量および分解能がしばしば悪くなる。
【００８２】
（還元産物・置換剤会合）−疎水性置換クロマトグラフィーの１つの潜在的な問題は、液中の疎水性分析物と疎水性置換剤との起こりうる会合である。これは、分解能の顕著な損失およびコンタミネーションを生じ得る。固定相上の吸着した状態での置換剤−分析物会合もまた生じ得るが、適量の適したイオン対形成剤が存在する場合はそれほど問題ではない。この問題を取り扱う良好な方法は、同じ電荷を有する荷電した分析物および荷電した疎水性置換剤を用いることである。
【００８３】
（置換剤自己会合およびミセル形成）−化学的構造特徴および物理的特徴が貢献するいくつかの場合において、陽イオン性疎水性分子が自己会合し、液中でミセルおよびミセル様の自己会合構造を形成し得る。この状況は、ＤＣの分解能の損失ならびに置換剤溶液の望ましくない発泡を生じ得る。液中の置換剤は、種々の化学平衡によって相関される種々の形態におかれる。さらに、ミセルは疎水性分析物分子のためのキャリアとして作用し、それらの分子を種々の形態で液中に存在させ得る。この望ましくない現象は濃度依存性であり、そして少量の適切な有機溶媒（例えば、メタノール、エタノールまたはアセトニトリル）の添加によって有効に阻害される。適切に設計された陽イオン性置換剤分子はミセル形成を増強することなく、良好な置換結果を与える。したがって、Ｒ基のＲ１〜Ｒ３について１２．０を下回る基疎水性指数を維持することは、望ましくない界面活性の問題を低減させる。
【００８４】
（高純度−置換剤中の不純物）−置換剤は、十分な純度を有するべきである。分取クロマトグラフィーの目的は、目的の成分から不純物を除去することである。置換物自体による所望の化合物のコンタミネーションはまれに問題であるが、置換剤溶液中の「早期置換」不純物によるコンタミネーションは、不純物の量およびそれらの結合特性に依存して、いくつかの場合に問題となり得る。したがって、良好な置換剤は、早期置換不純物をほとんどまたは全く含まないものであるべきである。
【００８５】
（適切なＵＶ吸光度）−ＤＣ実験を通して置換剤の位置および量を追跡して、置換剤ブレークスルー曲線を監視しそしてカラム再生手順の間に置換剤を除去するために、紫外線吸収が中度である置換剤を有することが有用である。高吸収は必要ではなく、また高濃度の置換剤および分析物のために好ましくない。一般に、無色の置換剤が好ましく、これは、低吸光度の戦略的に位置づけられたウインドウを有するＵＶスペクトルを有し、それにより分析物がある周波数で追跡され、そして置換剤が他の頻度でモニタリングされ得る。
【００８６】
（製造容易性および費用）−化学合成、生産および製造の便利で対費用効果のある方法は、有用な置換剤を生じるためおよび妥当な費用のために重要である。さらに、精製（特に、非クロマトグラフィー精製）のための実用的な方法が、対費用効果的に純度要求を達成するために必要である。
【００８７】
（化学的安定性、低毒性および長期品質保持期間）−他の所望の化学的特性および物理的特性全ての中でも、有用な置換剤分子は、化学的に安定であるべきである。それは、分析物分子に対して不活性であり、かつ水、一般有機溶媒、穏やかな塩基、穏やかな酸、および酸素（空気）に対して化学的に安定(非反応性)であるべきである。それは、典型的な使用および保存条件下で光安定性でありかつ熱的に安定であり、そして、妥当な品質保持期間を有するべきである。置換剤分子は、視覚的に無色であるがなお、必要レベルのUV吸光度を有することが非常に好ましい。有用な置換剤分子はまた、作業者の保護のためだけでなく、置換剤と接触し得る生物学的および薬物試料の保護のために、低毒性である必要がある。
【００８８】
（適切なクロマトグラフィーカラム）：逆相カラムの最も一般的なタイプはオクタデシル被覆シリカであるが、多くの疎水性の固定相がＤＣにおける有用性を見出している（表ＩＩＩ参照）。最終的には、固定相の最良の選択は、研究下の各システムについて実験的に決定される。
【００８９】
【表２】
2014528585.tif 000016
【００９０】
置換クロマトグラフィーにおけるより良好な結果は、より良好な回収および収率を与える十分に充填されたカラム長さが長いほど得られる。表ＩＶは、カラム寸法および初期流速の初期選択のためのガイドを提供する。
【００９１】
【表３】
2014528585.tif 000017
【００９２】
適切なカラム長さが良好な結果にとって重要である。それは、置換列を十分にはっきりさせて良好な分解能を与えるのに十分な長さであるべきである。なお、過度に長いカラムは分離時間を不要に増大させるので、しばしばベッドの充填が不十分となり、そして分解能を低下させ得る。多くの場合、２つの十分に充填されたカラムを末端間接合し得、良好なクロマトグラフィー結果を有し得る。小さな分子（ＭＷ＜３ＫＤａ）を用いる相当の実験が、最適なカラム長は、５μｍ粒子について１５〜４５ｃｍの範囲内および１０μｍ粒子について２０〜６０ｃｍの範囲内にあることを示している。８０〜１００Åの孔径を有する多孔性粒子が伝統薬および小さなペプチドに適しており、１２０〜１５０Åが、中程度および大きなオリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドに適しており、そして３００〜５００Åが、ほとんどのタンパク質およびＤＮＡに適している。非孔質粒子が用いられ得るが、負荷容量は有意に減少する。
【００９３】
円筒カラムにおいて、流れの軸に対して垂直であるように平面のフローフロントを樹立することが重要である。一旦最適化されたプロトコルが小さなカラムで展開されれば、大量の試料を精製するまでスケールアップすることは、置換クロマトグラフィーにおいては単純かつ容易である。最短の許容可能なカラム長が見出された後、スケールアップは単に、一定の線形流速を維持しながらカラム直径を増大させることにより達成される。適切な改変と共に、置換クロマトグラフィーは、半径流カラムと共に、および軸流モノリスカラムと共に用いられ得る。置換クロマトグラフィーの原理は、分析用および分取用の薄層クロマトグラフィーにおいて適用され得る。
【００９４】
（成功した置換クロマトグラフィー実験の実行）
有機化合物、伝統薬およびペプチドの置換クロマトグラフィーは長年にわたって実施されているが、並から不十分な結果がしばしば得られる。良好な置換剤、良好なカラムおよび良好な操作プロトコルにより、優れた再現性および顕著に良好なクロマトグラフィー性能に至る。
【００９５】
（置換剤および濃度）−初期評価は、適切な結合強度を有する良好な汎用の陽イオン性置換剤を用いて実施される。陽イオン性置換剤は、陽イオン性、中性非イオン性および中性双性イオン性の分析物を精製するために用いられ得る。置換剤は、精製されるべき材料よりも強くカラムに結合するべきであるが、置換剤は、過度に強く結合すべきではない。典型的な置換剤濃度は、１０〜５０ｍＭの範囲内である。初めは、置換剤濃度は１０〜１５ｍＭに設定される。必要に応じて、ｐＨ緩衝剤およびイオン対形成陰イオンが置換剤溶液に添加される。置換剤溶液およびキャリア溶液は、置換剤の存在およびイオン対形成陰イオンのレベルを除いて、同一の組成（ｐＨを含む）を有するべきである。置換剤１４、１９８および３１８（以下）は、良好な汎用の陽イオン性置換剤の例である。方法の最適化の間に、それは、２０〜３０ｍＭまたはそれ以上まで置換剤濃度を増大させることが有用であり得る。
【００９６】
（イオン対形成剤の選択）−イオン対形成剤を用いないこと、有効でないイオン形成剤を用いること、混合されたイオン対形成剤を用いること、および良好なイオン対形成剤を不十分なレベルで用いることは、置換クロマトグラフィー実験において不十分なクロマトグラフィー性能となる主要原因のいくつかである。これは、一般に、疎水性置換クロマトグラフィーを行う人には認識されておらず、理解されていない。これは下の実施例８において十分証明されている。表Ｉは、疎水性クロマトグラフィーにとって有用である、有用な一価イオン対形成陰イオンのリストを含む。それらは、分析物または置換剤が荷電されている場合に必要である。荷電された分析物および置換剤について、結合等温線は、対イオンの化学的特性およびその濃度に強く依存する。中〜中強に強い結合特性を有するイオン対形成剤が、通常、使用するのに最良である。イオン対形成剤を用いて実験を開始するとき、イオン対形成陰イオンとして臭化物またはトリフルオロ酢酸塩（遊離酸またはＮＨ４＋塩）を試みる。分析物がイオン対形成陰イオンを必要とする場合、それは、通常、ＤＣ実験において陽イオン置換剤のためのイオン対形成陰イオンの選択を要求する。分析物および置換剤についてのイオン対形成陰イオンは同じであるべきである。
【００９７】
（イオン対形成剤の濃度）−先に述べたように、良好なイオン対形成剤を不十分なレベルで用いることは、置換クロマトグラフィー実験において不十分なクロマトグラフィー性能となる主要原因の１つである。試料溶液中のイオン対形成剤の適切な濃度（ＣＩＰＳ、ｍＭ）を算出する式を以下により示す：
ＣＩＰＳ＝Ｅｓ×Ｃｓ（ｍＭ）×Ｇｓ
【００９８】
ここでＥｓは試料についての過剰係数であり、Ｃｓは試料濃度（ｍＭ）であり、そしてＧｓは操作ｐＨでの試料の正味電荷の絶対値である。Ｅｓの最適値は、実験的に決定される必要があるパラメーターである。置換剤溶液中のイオン対形成剤の適切な濃度（ＣＩＰＤ、ｍＭ）を算出する式を以下により示す：
ＣＩＰＤ＝Ｅｄ×Ｃｄ（ｍＭ）×Ｇｄ
【００９９】
ここでＥｄは置換剤についての過剰係数であり、Ｃｄは置換剤濃度（ｍＭ）であり、そしてＧｄは操作ｐＨでの置換剤の正味電荷の絶対値である。Ｅｄの最適値は、実験的に決定される必要があるパラメーターである。少なくとも化学量論的な量のイオン対形成剤が溶液中に存在するべきであることが必須である（Ｅｓ≧１．０およびＥｄ≧１．０）。実際には、我々の経験上、Ｅｓは１．１〜１０．０の範囲内、より好ましくは１．２〜６．０の範囲内、よりなお好ましくは１．５〜４．５の範囲内にあるべきである。さらに、我々の経験上、Ｅｄは１．１〜１０．０の範囲内、より好ましくは１．２〜４．０の範囲内にあるべきである。クロマトグラフィー性能の重大な低下は、イオン対形成濃度が最適ではない、または低すぎる場合、すなわち、Ｅｓ＜１．０および／またはＥｄ＜１．０の場合に生じる。
【０１００】
（良いＲＰカラムの選択）−初期の逆相作業について、いくつかの良質のオクタデシル（シリカ）およびフェニルヘキシル（シリカ）カラムが評価されるべきである（４．６×２５０ｍｍの寸法で５μｍ球状粒子）。より大きな分取カラムへのスケールアップはこれからすることができ、比較的に容易である。重要な問題は、適切な孔径を選択することである。過度に大きいまたは過度に小さい孔を有するマトリックスはしばしば、容量を減少し、時に分解能を減少させる。上記の表ＩＩおよびＩＩＩ参照。
【０１０１】
（流速）−置換クロマトグラフィーは「準平衡技術」であるので、比較的に遅い流速がしばしば必要とされる。最適な流速は、分解能を損失することなく可能な限り最速の流速である。試料負荷の流速および置換流速はほぼ同じであり、ともに、３５〜１０５ｃｍ／時間の範囲内である。伝統薬、オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドについては７５ｃｍ／時間、またはタンパク質およびＤＮＡについては４０ｃｍ／時間で開始する。再生流速は、置換流速の２〜８倍であるべきである。逆相カラム上で高温にて薬、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドを精製する場合、より速い流速が用いられる。
【０１０２】
（温度）−逆相クロマトグラフィーおよび他の形態の疎水性クロマトグラフィーが＋ΔＨと共に＋ＴΔＳによって大きく駆動される場合、温度が高いほど、しばしば結合が強くなり、結合反応速度が速くなり、そして分解能の差異が明瞭となる。結果として、カラムの温度およびある程度は置換緩衝剤の温度が、バンド拡張を防ぐために慎重に制御されるべきである（＋／−０．５℃）。初期作業はしばしば２５℃にて実施され、次いで試料がそれに耐え、かつ有機溶媒の沸点が適切であれば、温度上昇（４５、６５℃）が試みられる。
【０１０３】
（有機溶媒の選択）−ほとんどの水混和性有機溶媒が機能するが、アセトニトリル、メタノールおよびエタノールが最も一般的に用いられる。いくつかのＤＣ精製は、有機溶媒をほとんどまたは全く用いずに実施される。これは、低塩および低有機溶媒を用いる非変性タンパク質の実際のＲＰＣ精製およびＨＩＣ精製を可能にする。有機溶媒を用いない操作は、揮発性の可燃性の溶媒に関連した安全性の問題がある場合にも有用であり得る。実験する場合、まず、ペプチド、低分子量有機薬物および小さなタンパク質についてアセトニトリル、または大きなタンパク質、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡについてメタノールを試みる。水中の試料の溶解度が許容可能であれば、キャリア緩衝剤、置換剤緩衝剤、および試料負荷溶液中３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ、４％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨまたは５％（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨで開始する；これらの３つの溶液中温有機溶媒含量は、同じであるべきである。有機溶媒含量は、各試料、カラム、および置換剤について最適化される必要がある重要なパラメーターである。汎用の操作のために、有機溶媒は、約１５容量％未満、より好ましくは約１０％未満、よりなお好ましくは約５容量％未満であるべきである。オクタデシルカラムを用いる場合、２〜３％アセトニトリル、３〜４％エタノールまたは４〜５％メタノールが、通常、マトリックスの最適な機能化のために必要とされる。フェニルヘキシルカラムおよびオクチルカラムは、通常、有機溶媒の非存在を許容し得る。
【０１０４】
（ｐＨおよびｐＨ緩衝剤の選択）−ｐＨ緩衝剤は、試料、置換剤、イオン対形成剤中、または固定相上にイオン化可能なプロトンが存在する場合、必要とされる。いくつかの試料は、特定のｐＨ範囲内でのみ安定である。いくつかの試料については、クロマトグラフィー分解能はｐＨ依存性が強い。一般には、陽イオン性試料は、陽イオン性置換剤および陽イオン性緩衝剤を用いて精製される。陽イオン性緩衝剤と関連した陰イオンは、イオン対形成陰イオンと同じであるべきである。いくつかの場合において、異なる陰イオンは、それが有意に弱い対形成特性を有する限り用いられ得る。同様に、陰イオン性ｐＨ緩衝剤は、それが、原則のイオン対形成陰イオンよりずっと弱いイオン対形成特性を有する場合用いられ得る；したがって、ギ酸および酢酸は、トリフルオロ酢酸塩がイオン対形成陰イオンである場合、ｐＨ緩衝剤として用いられ得る。明白な理由で、低ｐＫａ値を有する中性および陽イオン性のアミンが、有用なｐＨ緩衝剤である：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレン−ジアミン（５．９，ＴＭＥＤＡ）、Ｎ−エチルピペラジン（５．０、ＮＥＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルピペラジン（４．２、ＤＭＰ）、ジアゾビシクロオクタン（３．０、ＤＡＢＣＯ）。
【０１０５】
【表４】
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【０１０６】
（共置換）−数百もの成分および不純物を含む試料を用いて作業する場合、共置換が、ほとんど回避不能な現象である。ＤＣ実験が起こる結合等温線のどこででも、目的の主成分と共置換するいくつかの微量成分が存在すると思われるためである。幸いなことに、置換クロマトグラフィーにおける共置換は、分取溶出クロマトグラフィーにおける共溶出よりずっと深刻な問題ではない。共置換は、２つの条件下で生じる：（１）結合等温線が非常に類似しており、分解能が不十分である場合、および（２）結合等温線の操作領域近辺で結合等温線の交叉がある場合。幸いなことに、この問題を取り扱い簡単な方法がある：異なる条件下で第二のＤＣ実験を実施することであり、以下により結合等温線上の異なる点で操作することによる：
ａ．置換剤の濃度を変更する、
ｂ．異なる結合特性を有する異なる置換剤に変更する。
あるいは、等温線自体が、以下により変更され得る：
ｃ．クロマトグラフィーマトリックス（固定相）を変更する、
ｄ．有機溶媒の濃度を変更する、
ｅ．異なる有機溶媒に変更する、
ｆ．異なるイオン対形成剤に変更する、
ｇ．温度を変更する。
第二の「直交」ＩＰ−ＲＰ  ＤＣ工程は、典型的には、優れた収率（９０〜９５％）にて優れた純度（約９９．５％）を与える。
【０１０７】
（試料負荷の方法）−２つの方法のうち１つを用いて、試料注入バルブを介して試料をカラムに負荷する。試料は、ＤＣ実験が起こる結合等温線の同じ点で、前端クロマトグラフィー条件下にて負荷されるべきである。キャリアは、試料が負荷された後にはカラムを通過しない。方法１：試料負荷ポンプが用いられる；方法２：注入ループが用いられる。通常、部分ループ注入のみが用いられる。ループ内の試料は、まずキャリアによって、次いで置換剤溶液によって、カラム上のループ外へ流されるべきである。キャリアによって希釈された試料が負荷されないように、ループ容積の８５〜９５％以下がカラム上に負荷されるべきである。
【０１０８】
（カラム負荷）−ＤＣ実験は比較的高い負荷、典型的には、最大負荷容量の６０〜８０％の範囲内で実施される。操作カラム負荷容量は定数ではなく、むしろ結合等温線上でＤＣ実験が作用する場所に依存する。
【０１０９】
使用のために、カラム容量の全てが利用可能であるわけではない（以下の「例外」参照）。実際には、カラム容量の９０〜９８％のみが使用可能である。試料をカラムに負荷したら、置換剤緩衝剤をカラムにポンプ注入する。展開する３つの前端があり、各々が、異なる速度でカラム下方に移動する：（１）液体前端（Ｔ１、置換剤緩衝剤−置換剤）、（２）試料前端（Ｔ２）および（３）置換剤飽和前端自体（Ｔ３）。第一の前端は、第二の前端および第三の前端よりも速く移動して、使用可能なカラム容量を制限する。これは、第一の前端が、置換列（Ｔ２）が外へ出始める前にカラムから出て行くためである。これらの前端の実際の速度は、置換流速に直接依存する。これらの前端速度の割合α（Ｖｅｌ１／Ｖｅｌ２）を以下の式によって示す：
α＝Ｋｍ／（Ｒ×Ｃｄ）
ここでＫｍは、Ｃｄの置換剤濃度でのマトリックスの置換剤結合容量（ｍｇ置換剤／ｍＬ充填マトリックス）であり、Ｃｄは、置換剤緩衝剤中の置換剤濃度（ｍｇ置換剤／ｍＬ置換剤緩衝剤）であり、Ｒは、カラムの全容積に対するカラム中の液の容積の比（ｍＬ液／ｍＬｍ床容積）である。使用可能カラム容量の最大％は、以下により示される：
（１００×（α−１））／α。
以下の実施例１ｂと６ｂ（ａ）では、それぞれのα値は２２．２４および２１．４９であり、それぞれの最大カラム容量は９５．５％および９５．３％％である。Ｃｄが増大するにつれてＫｍもまた増大するが、等温線の非線形部の高い部分で操作する場合はそれほどでもないことに留意されたい。したがって、αが減少すると、使用可能カラム容積の最大％は減少する。
【０１１０】
例外―有意レベルの望ましくない早期置換不純物が試料中に存在する場合は、カラムを過剰に負荷し、置換剤流を開始させる前に試料負荷の間にこれらの不純物をあふれ出させることにより、１００％を超えてさえもカラムの使用可能容量を増大し得る。したがって、カラム負荷は、全試料に基づき最大が１０５％であり得るが、カラム負荷は、主要産物＋後置換不純物の量に基づき８０％のみでもあり得る。
【０１１１】
（試料溶液の濃度および容積）−負荷試料の濃度は重要な操作パラメーターである。最適試料負荷濃度（ｍｇ／ｍＬ）は、置換実験からの精製産物の出力濃度と同じである−置換列のプラトー領域。結合等温線、カラム結合容量および出力濃度は、初期は不明である。以下に示すような初期概算値を用いて試料溶液をカラムに負荷する最初の置換実験を単に実施する：
（１）作業を望む初期カラム負荷率を選定する、すなわち７５％。  
試料負荷時間＝置換剤ブレークスルー時間（Ｔ３−Ｔ１）×０．７５
＝（５８６分−２７０分）×０．７５＝２３７分（以下の実施例６ｂ（ａ）について）
（２）２つの方法のうち１つにより、試料の初期濃度を選定する：
（ａ）初期試料濃度（ｍｇ／ｍＬ）＝０．２５×置換剤濃度（ｍＭ）×処方重量（ｍｇ／μモル）＝０．１２×１０ｍＭ×１．７４６６ｍｇ／μモル＝２．１０ｍｇ／ｍＬ（以下の実施例６ｂ（ａ）について）
（ｂ）試料について概算カラム結合容量を選定する、すなわち５０ｍｇ試料／ｍＬマトリックス。置換剤流速および試料負荷流速が同じであるとする：
初期試料濃度（ｍｇ／ｍＬ）＝（カラム結合容量（ｍｇ／ｍＬｍ）×カラム容積（ｍＬｍ）／（（Ｔ２−Ｔ１）×試料流速（ｍＬ／分））
＝（５０ｍｇ／ｍＬｍ×４．１５５ｍＬｍ）／（（５８６分−２７０分）×０．２０８ｍＬ／分）＝３．１６ｍｇ／ｍＬ（以下の実施例６ｂ（ａ）について)。
【０１１２】
負荷試料を用いた最初のＤＣ実験が過負荷状態（＞１００％負荷）を生じる場合、試料濃度を半分にして実験を繰り返す。試料を用いる間の、最初の成功したＤＣ実験の結果から、実際の負荷濃度および実際のカラム負荷容量が容易に算出され、次いでこれらの値は第二のＤＣ実験のために試料濃度および負荷を調整するのに用いられる。
【０１１３】
（試料調製）−負荷試料溶液は、上記濃度および量にて調製される。ループの過充填または試料負荷ポンプおよび送達ラインのデッドボリュームの充填のために、十分過剰な溶液が必要とされる。ｐＨ、ｐＨ緩衝剤の量および有機溶媒の量は、キャリアおよび置換剤緩衝剤と同じである。試料をキャリアに溶解することでそのｐＨが変化するので、試料溶液のｐＨは、溶解後に再調整されなければならない。しかし、イオン対形成剤の量は異なっていてもよい。試料溶液に用いられるイオン対形成剤は、置換剤緩衝剤で用いるものと同じでなければならない。これに関して、試料のイオン対形成要件は、試料溶液中および置換剤溶液中でどのイオン対形成剤が用いられるかを決定づける。操作ｐＨでの形式化学電荷および主分析物の濃度に基づいて、イオン対形成剤またはイオン対形成塩の濃度の濃度が算出される。上記「イオン対形成剤の濃度」参照。
【０１１４】
試料の組成および履歴は既知であるべきである。試料が陰イオンを含有する場合、その化学的性質および量（濃度）もまた既知であるべきである。（ａ）陰イオンが存在しないことが明らかな場合、試料調製において調整はなされない。（ｂ）試料中の陰イオンがＤＣにおいて用いたイオン対形成陰イオンと同じである場合、試料溶液へのイオン対形成陰イオンの添加量は減らすべきである。（ｃ）試料中の陰イオンがＤＣにおいて用いたイオン対形成陰イオンよりも顕著に弱いイオン対形成特性を有する場合、その存在は無視される。（ｄ）試料中の陰イオンがＤＣにおいて用いたイオン対形成剤よりも強いイオン対形成特性を有する場合、進める前に、その陰イオンは交換または除去されるべきである。
【０１１５】
（画分採集）−置換クロマトグラフィーは、優れたクロマトグラフィー分解能を与える（特に、良好なＣ１８−逆相カラムを用いて最適化したプロトコルの場合）。しかし、分解能は、見るのが困難である。なぜなら、全てのバンドが、置換列では相次ぐバンドとして一緒にカラムから出てくるためである。小さな不純物の三角形バンドの多くは、３０秒未満の幅である（＜１００μＬ）。したがって、置換剤ブレークスルー時間が２５０分であり、かつ８０％試料負荷の実験では置換列は約２００分幅であり、画分採集プロセスの間にクロマトグラフィー分解能が失われないように、４００を超える画分が採取されなければならない。４００画分の分析は、実に啓発的であり興味深いが、困難な作業でもある。これは、オンラインのリアルタイム画分分析が有用である場合である。実際には、分解能を捨て、１００〜１３０のより大きな画分のみを採集する。この数の画分ですら分析は、多くの作業となる。
【０１１６】
分取ＤＣ実験を実施し、精製された主成分のみが目的である状況では、画分採集プロセスは、大いに簡素化される。種々の周波数（ＵＶ）で観察された置換列の形状に基づいて、目的の主バンドの始まりおよび終わりを判定し、次いで両領域において約１０画分を分析し、どの画分をプールするかを決定する。１００〜１３０画分の代わりに２０画分を分析するのは、より容易な作業である。
【０１１７】
（置換剤除去およびカラム再生）−置換剤は、いかなるｐＨ緩衝剤またはイオン対形成剤も用いることなく、５〜１０カラム容積の９５／５（ｖ／ｖ）エタノール−水または８０／１０／１０（ｖ／ｖ／ｖ）アセトニトリル−ｎプロパノール−水を用いて除去される。目的は、最短時間にてカラムから置換剤の９９．９％またはそれ以上より多くを効率的に除去することである。マトリックスが増大した背圧を許容する場合、カラム再生プロセスを加速するために流速が増大する（１００〜４００ｃｍ／時間）。置換剤の最大吸収（置換剤の指示書を参照）の近辺で置換剤除去を観察することは、再生プロセスがＵＶ検出によって注意深くモニタリングされて最適化されることを可能にする。
【０１１８】
（添加塩の効果）−水性溶媒中の塩は、溶解された疎水性分析物および疎水性置換剤にとってより適したものではない溶媒を生じ、疎水性クロマトグラフィーマトリックスに対してより強い結合を生じる。これは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の背後にある原理である。分析物の溶解度がこの塩溶液で十分である限り、塩の添加は、疎水性マトリックスへの分析物結合および選択性を調整するために良好な方法である。
【０１１９】
ある場合には、疎水性マトリックスに対する分析物結合は非常に弱く、塩の添加は、十分な分析物結合を得るために必要とされる。一般に用いられる塩溶液は、０．５〜２．５Ｍの、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、ＮａＣｌおよびＫＣｌである。種々の濃度での多くの異なる塩の下で、置換モードのＨＩＣは、タンパク質の有用なクロマトグラフィー分離について多くのオプションを提供する。
【０１２０】
（機器プロトコル）−実施例１のプロトコル例を参照（デュアルポンプ操作）。前の実験から残った置換剤は問題となる可能性があるので、ＨＰＬＣシステムおよびカラムが完全にクリーンであり、そして試料負荷直前に適切に平衡化されることを確実にするために、プロトコルは、ラインパージ操作、迅速カラム再生、および平衡操作を有する。これらのステップは、単に予防であり、常に必要ではない。プロトコルは、１つのプロトコルの間に以下を含む：（ａ）予備平衡化シークエンス、（ｂ）平衡化シークエンス、（ｃ）試料負荷シークエンス、（ｄ）置換シークエンスおよび（ｅ）再生シークエンス。システムにおけるデッドボリュームの問題を克服するために、カラムにポンプ注入する直前に、全ての負荷緩衝液、置換剤緩衝液および試料溶液が、システムを通じて廃液にパージされる。このように、カラムには、バルブ切り替え直後に無希釈溶液のシャープな前端が見られる。試料溶液は、中で気泡が生じないように脱気されるべきである。注入ループを用いる場合、それらは、約１０％過充填される必要がある。過充填は、さらなる使用のために採集され得る。全量ループ注入は用いられるべきではなく、部分ループ注入のみである。経験的に、ループチューブの内径に依存して、ループ容積の８５〜９５％のみが用いられ得ることが分かる。なぜなら、試料溶液は、流れる溶液と混合して、それを希釈するためである。ループ内の試料は、負荷緩衝剤によってカラムに流されるが、試料負荷プロセスの終わり頃には、流す溶液は置換剤緩衝剤に変更される。このことは、置換剤緩衝剤それ自体カラムに直接ポンプ注入される直前に、置換剤緩衝液がシステム全体にわたってパージされることを可能にする。再生プロセスの初期の間は、より遅い流速が用いられる。したがって、高背圧の問題が生じることはまれである。一度、ほとんどの置換剤が除去されると、より高速の流速が使用できる。一度、ほとんどの置換剤が除去されると、より高速の流速が使用できる。
【０１２１】
（方法最適化）−全ての形態の分取クロマトグラフィーと同様、クロマトグラフィーの方法および手順の最適化が重要であるが、それは、いくらかの努力を要する。置換クロマトグラフィーの利益は、時間という代償を伴う。時間を要する要因は、方法最適化の間に最小化される。
・分離時間を考慮することなく、置換精製について最適に近い条件を決定する。
・置換剤濃度および試料負荷溶液の濃度を分解度が低下するまで増大する。
・置換流速および試料負荷流速を分解度が低下するまで増大する。
・前平衡シークエンスおよび置換剤除去／カラム再生シークエンスを短縮する。
【０１２２】
既存のプロトコルは方法の最適化の有用な開始点を提供するが、それらは、研究中の特定試料について改変を必要とする。試料プロトコル（実施例１）を以下に示すが、これは、時間を考慮することなく純度について最適化したものである。目的の試料の特定の物理的特性およびクロマトグラフィー特性に適応した方法最適化を実施することが重要である。最適化に際し、長い方法（６００〜８００分）がしばしば２００〜３００分に減少され得、またある場合には１００〜１５０分に減少され得る。
【０１２３】
置換モードで使用する疎水性クロマトグラフィーは、（ａ）高マトリックス生産性(マトリックスの寿命にわたるマトリックス１リットル当たりの産物のグラム）、（ｂ）高容積生産性(カラム容積１リットル当たりの産物のグラム)、（ｃ）高溶媒生産性(用いた溶媒１リットル当たりの産物のグラム)を有するが、（ｄ）並の時間生産性（時間単位当たりリットルあたりの産物のグラム）を有し得る。適切な方法最適化は、時間要因を軽減する。
【０１２４】
（適切に構成した機器）：小型分取ＨＰＬＣシステムについての典型的な機器構成を以下に示す。
・主ポンプ：ステンレス鋼、チタン、セラミック、ＰＥＥＫ；正確には０．０１〜１０ｍＬ／分  流速；３０００〜４５００ｐｓｉ圧。
・オプションのカラムバイパスバルブ：２ポジション６ポート切換バルブ（ステンレス鋼、ＰＥＥＫ）；カラムインラインまたはバイパスカラム。これは便宜オプションである。
・必要な試料注入バルブ：２ポジション６ポート注入バルブ（ステンレス鋼、ＰＥＥＫ）、注入ループまたは試料注入ポンプ用。
・注入ループ：２０〜４０ｍＬ注入ループ（ステンレス鋼、ＰＥＥＫ）。ループは過負荷（約１０％）されるべきである。部分ループ注入のみが用いられ、典型的には、ループ容積の８５〜９５％以上ではない。注入ループまたは試料ポンプのいずれか１つを用いる。
・試料ポンプ：これは、試料注入用の主ポンプと同様である。試料はポンプヘッドの流路と適合するものであるべきである。注入ループまたは試料ポンプのいずれか１つを用いる。
２ポンプ操作を用いる場合、２つのポンプの流速は、それらの流れが釣り合うように較正されるべきである。
・グラジエントミキサーは不要：置換クロマトグラフィーにおいてはグラジエントミキサーを回避または取り外す。
・ＵＶ検出器：多波長またはフォトダイオードアレイ検出器、２００〜４００ｎｍ周波数範囲、短光路低体積石英フローセルを有する（０．２〜２．０ｍｍ流路、＜１０μＬ体積流量）。
・オプションの電気伝導度検出器：ＵＶ検出器後のフローセル（０．１〜２０ｍＳ、＜１００μＬ体積流量）を有する電気伝導度検出器；置換流速＜５００μＬ／分にて分析のために画分を採集する場合、伝導度フローセルを回避する。
・画分採集器：１０μＬ〜１０ｍＬ／画分（時間または滴数による）
・カラム冷却器／加熱器：０〜１００℃＋／−０．５℃。カラムを周辺温度と実質的に異なる温度で操作する場合、緩衝剤溶液を加熱または冷却する配置を行う必要がある。
【実施例】
【０１２５】
実施例１ａ：実施例プロトコル。粗精製合成アンジオテンシンＩの置換クロマトグラフィー精製
（装置設定）：４つの溶媒ラインを備える単一の主ポンプ、４０ｍｌのループ付きの試料注入バルブ、カラムバイパスバルブ：
試料注入バルブ：  シングルチャネルのトグルロジックにより制御される６−ポートバルブ（Ｓ３＝０、バイパスループ、Ｓ３＝１ループ・インライン）
カラムバイパスバルブ：シングルチャネルのトグルロジックにより制御される６−ポートバルブ（Ｓ６＝０、カラムインライン、Ｓ６＝１  バイパスカラム）
カラム下流のＵＶフォトダイオードアレイ検出器（フローセル：０．５ｍｍ  パス長さ、１０μｌ容量）続いて電導度検出器（フローセル：１７０μｌ容量）。分析用に画分を採取した場合はバイパスされる伝導度セル。
負荷緩衝液＝Ａ−緩衝液（Ｓ１＝１、フローオン、Ｓ１＝０フローオフ）；置換剤緩衝液＝Ｂ―緩衝液（Ｓ２＝１、フローオン、Ｓ２＝０、フローオフ）；
置換剤除去緩衝液＝Ｃ−緩衝液（Ｓ４＝１、フローオン、Ｓ４＝０、フローオフ）；カラム保存緩衝液＝Ｄ−緩衝液（Ｓ５＝１、フローオン、Ｓ５＝０、フローオフ）
シークエンスが始まる前に、洗浄されたカラムを、カラム保存緩衝液を除去するために短時間Ａ―緩衝液でパージする。シリンジ内の約４４ｍｌの脱気試料溶液を試料注入ループに負荷し、空気がループに入るのを防ぐ。
カラム、最初のサンプルの詳細および負荷緩衝液／置換剤緩衝液／試料溶液の内容は実施例７ｂ参照。
置換除去緩衝液（Ｃ−緩衝液）＝１０％（ｖ／ｖ）１−プロパノール、アセトニトリル中の１０％（ｖ／ｖ）ＤＩ水。
カラム保存緩衝液（Ｄ−緩衝液）＝ギ酸（１５ｍＭ）およびギ酸アンモニウム（１５ｍＭ）を含む５０／５０（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水。
【０１２６】
【表５】
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【０１２７】
実施例１ｂ：置換剤１４を用いる粗精製アンジオテンシンＩの置換クロマトグラフィー精製−低濃度多量負荷（図１ｂ−分析を参照）
【０１２８】
（操作条件）：
出発ペプチド：脱塩粗精製合成アンジオテンシンＩ（８２．７％純度、ＦＷ約１．２９６ｍｇ／μモル、電荷＝＋４
カラム：ウォーターズＸブリッジＢＥＨ１３０、５μｍ、１３５Å、４．６×２５０ｍｍＳＳ、シリカ上のＣ１８
流速：負荷＝２０８μＬ／分；置換＝２０８μＬ／分
イオン対形成剤：トリフルオロ酢酸塩（CF3CO2-）
温度：２３℃
ｐＨ：２．０
置換剤緩衝液：  １０．０ｍＭ置換剤１４＋１２ｍＭ  CF3CO2H  ＤＩ水溶液  ３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ、ｐＨ＝２．０
ｗ／ＮＨ４ＯＨ
負荷緩衝液：１２ｍＭ  ＴＦＡ水溶液  ｗ／３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ、ｐＨ２．０  ｗ／ＮＨ４ＯＨ。
試料溶液：  ４．３８ｍｇ／ｍＬ  ペプチド水溶液  ３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮと２７ｍＭCF3CO2-を含む；ｐＨ＝２．０
ｗ／ＮＨ４ＯＨ
負荷量：  １５５．０ｍｇ、３５．４ｍＬ  ４０ｍＬループから；
負荷時間：１７０．１分（２．８４時間）
画分サイズ：４１６μＬ
【０１２９】
（結果）：
画分分析：画分は希釈（２０μＬ試料＋４０μＬ負荷緩衝液）され、２１５ｎｍにおける分析的溶出ＨＰＬＣにより分析された（２５μＬ注入）；計算は面積％に基づく。
全実行時間：    ８．４時間
結果物濃度：      ３．２９ｍｇ／ｍＬ
カラム負荷：最大容量の７１．２％
カラム容量：        約５２．４ｍｇペプチド／ｍＬマトリックス  ＠３．２９ｍｇペプチド／ｍＬ溶液
約１６７μモル置換剤／ｍＬマトリックス＠１０．０μモル置換剤／ｍＬ溶液
純度％：      ９９．１％    ９９．０％    ９８．８％    ９８．６％
収量％：      ８０％        ８５％        ９０％        ９５％
【０１３０】
コメント：  試料濃度／出力濃度＝１．３
試料中のＣＦ３ＣＯ２−量＝２．０倍当量
優れた結果が得られｒｕ。よい負荷（３７．３ｇ／Ｌ）、よい純度およびよい収量（＞９９％純度＠８０％収量；＞９８．５％純度＠９５％収量）の全てが、小さな「分析型」カラムを用いた本実施例で同時に得られる。これは、最適化した逆相置換クロマトグラフィーの威力を説明する。
【０１３１】
実施例２：置換剤１４を用いる粗精製アンジオテンシンＩの置換クロマトグラフィー−高濃度の少量負荷（図２−分析参照）
【０１３２】
操作条件：
出発ペプチド：脱塩粗精製合成アンジオテンシンＩ、８２．７％純度、ＦＷ約１．２９６ｍｇ／μモル、
電荷＝４＋
カラム：ウォーターズ  ＸブリッジＢＥＨ１３０、５μｍ、１３５Å、４．６×２５０ｍｍＳＳ、シリカ上のＣ１８
流速：  負荷＝２０８μＬ／分；置換＝２０８μＬ／分
イオン対形成剤：トリフルオロ酢酸塩（ＣＦ３ＣＯ２−）
温度：２３℃
ｐＨ：２．０
置換剤緩衝液：１０．０ｍＭ置換剤１４＋１２ｍＭ  ＣＦ３ＣＯ２Ｈ  ＤＩ水溶液  ｗ／３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ、ｐＨ＝２．０
ｗ／ＮＨ４ＯＨ
負荷緩衝液：  １２ｍＭ  ＴＦＡ水溶液  ｗ／３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ、ｐＨ＝２．０ｗ／ＮＨ４ＯＨ
試料溶液：  ２４．０ｍｇ／ｍＬペプチド水溶液  ｗ／３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮおよび１４０ｍＭＣＦ３ＣＯ２−；ｐＨ＝２．０
ｗ／ＮＨ４ＯＨ
負荷量：５ｍＬループ由来１０９．３ｍｇ、４．５６ｍＬ
負荷時間：２１．９分（０．３７時間）
画分サイズ：４５８μＬ
【０１３３】
（結果）：
画分分析：画分を希釈し（２０μＬ試料＋４０μＬ負荷緩衝液）２１５ｎｍにおける分析的溶出ＨＰＬＣにより分析された（２５μＬ注入）；計算は面積％に基づく。
全実行時間：５．９時間
出力濃度：３．３０ｍｇ／ｍＬ
カラム負荷：最大容量の５０．１％
カラム容量：約５２．５ｍｇペプチド／ｍＬ  マトリックス＠３．３０ｍｇペプチド／ｍＬ溶液
約１６７μモル置換剤／ｍＬ  マトリックス＠１０．０μモル置換剤／ｍＬ溶液
純度％：  ９９．１％  ９９．０％  ９８．９％  ９８．８％
収量％：  ８０％      ８５％      ９０％      ９５％
【０１３４】
コメント：  試料濃度／出力濃度＝７．３
試料中のＣＦ３ＣＯ２−量＝１．９倍当量。
中程度の負荷（２６．３ｇ／Ｌ）、小さな「分析型」カラムを用い、良い純度およびよい収量（＞９９％純度＠８５％収量；＞９８．５％純度＠９５％収量）を伴うよい結果が得られる。試料負荷時間が短縮（２．８４時間から０．３７時間）されたため全ランタイムは短縮される（５．９時間）。約７０％の試料負荷において同様の結果は、より低い純度であった（データ示さず）。そこで負荷パーセンテージは約５０％に減少される。このポイントでは純度レベルは改善される。これらのデータは、低いパーセントのカラム負荷により、あまりに高い濃度（７．３×）での試料を負荷することで起きる解像度の減少を効果的に補償できる。それゆえ、高純度と高収量を維持するにはトレードオフがある：（ａ）高いサンプル負荷と長い時間または低い試料負荷と短い時間。除去するのが容易な不純物を含むいくつかの試料にとっては、高い試料負荷とより短い時間は、なお高い純度と高い収量につながり得る。
【０１３５】
実施例３：置換剤４１３を使用する粗精製アンジオテンシンＩの置換クロマトグラフィー精製−「より低い結合等温線」を持つ異なる置換剤（図３−分析参照）
【０１３６】
操作条件：
出発ペプチド：脱塩した粗精製合成アンジオテンシンＩ、８２．７％純度、ＦＷ約１．２９６ｍｇ／μモル、電荷＝＋４
カラム：ウォーターズＸブリッジＢＥＨ１３０、５μｍ、１３５Å、４．６×２５０ｍｍＳＳ、シリカ上のＣ１８
流速：負荷＝２０８μＬ／分；置換＝２０８μＬ／分
イオン対形成剤：トリフルオロ酢酸塩（ＣＦ３ＣＯ２−）
温度：２３℃
ｐＨ：２．０
【０１３７】
置換剤緩衝液：１０．０ｍＭ置換剤４１３＋１２ｍＭ  ＣＦ３ＣＯ２Ｈ  ＤＩ水溶液  ｗ／３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ，ｐＨ＝２．０
ｗ／ＮＨ４ＯＨ
負荷緩衝液：１２ｍＭ  ＴＦＡ水溶液  ｗ／３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ，ｐＨ＝２．０ｗ／ＮＨ４ＯＨ
試料溶液：７．２７ｍｇ／ｍＬペプチド水溶液  ３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮおよび４３ｍＭＣＦ３ＣＯ２−；ｐＨ＝２．０
ｗ／ＮＨ４ＯＨ
負荷量：１６０．７ｍｇ、２２．１ｍＬ  ３０ｍＬループより
負荷時間：１０６．３分（１．７７時間）
画分サイズ：３１２μＬ
【０１３８】
結果：
画分分析：画分を希釈し（１０μＬ試料＋４０μＬ負荷緩衝液）、２１５ｎｍにおける分析的溶出ＨＰＬＣにより分析した（２５μＬ注入）；計算は面積％に基づく。
全実行時間：５．６時間
出力濃度：５．３８ｍｇ／ｍＬ
カラム負荷：最大容量の６６．７％
カラム容量：約５８．０ｍｇペプチド／ｍＬ  マトリックス＠５３．８ｍｇペプチド／ｍＬ溶液
約１１５μモル置換剤／ｍＬマトリックス＠１０．０μモル置換剤／ｍＬ溶液
純度％：  ９９．１％  ９９．０％  ９８．９％  ９８．８％
収量％：  ８０％      ８５％      ９０％      ９５％
【０１３９】
（コメント）：  試料濃度／出力濃度＝１．３
試料中のＣＦ３ＣＯ２−量＝１．９倍当量
小さな「分析型」カラムを用いて、よい負荷（３８．７ｇ／Ｌ）、よい純度およびよい収量（＞９９％純度＠８５％収量；＞９８．５％純度＠９５％収量）を伴う優れた結果が得られた。今度は、置換剤４１３の「低結合等温線」により引き起こされる、より高い試料負荷とより高い操作濃度のため、試料負荷時間と置換時間が短縮されたため、ランタイムは短縮される（５．６時間）。この例では、同じカラムと同じペプチドが使用されたが、置換剤は変更される（実施例１ｂと比較せよ）。これらの結果は、生産物と不純物の結合等温線上のより高いところで操作するとき、同様によい純度と収量が得られることを示す。１０ｍＭでカラムを飽和させるにはより少ない置換剤４１３が必要であるため（１１５対１６７μモル置換剤／ｍＬマトリックス）、ペプチドはより高い濃度（５．３８対３．１９ｍｇ／ｍＬ）でカラムから出てくる。そして実験は、ペプチド結合等温線上のより高いところで行われる（５８．０対５２．５ｍｇペプチド／ｍＬマトリックス）。
【０１４０】
実施例４：置換剤１４を使用する粗精製アンジオテンシンＩの置換クロマトグラフィー精製−異なる逆相カラム（図４−分析参照）
【０１４１】
（操作条件）：
出発ペプチド：脱塩した粗精製合成アンジオテンシンＩ、８２．７％純度、ＦＷ約１．２９６ｍｇ／μモル、電荷＝＋４
カラム：ヴァリアン／ポリマーラボス  ＰＬＲＰ-Ｓ、５μｍ、１００Å、４．６×２５０ｍｍＳＳ、非コート多孔質の
ポリスチレン／ジビニルベンゼン
流速：負荷＝２０８μＬ／分；置換＝２０８μＬ／分
イオン対形成剤：トリフルオロ酢酸塩（ＣＦ３ＣＯ２−）
温度：２３℃
ｐＨ：２．０
置換剤緩衝液：１０．０ｍＭ置換剤１４＋１２ｍＭ  ＣＦ３ＣＯ２Ｈ  ＤＩ水溶液  ｗ／３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ，ｐＨ＝２．０  ｗ／ＮＨ４ＯＨ
負荷緩衝液：１２ｍＭ  ＴＦＡ水溶液  ｗ／３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ，ｐＨ＝２．０  ｗ／ＮＨ４ＯＨ
試料溶液：３．５０ｍｇ／ｍＬペプチド水溶液  ３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮおよび２２ｍＭＣＦ３ＣＯ２−；ｐＨ＝２．０  ｗ／ＮＨ４ＯＨ
負荷量：１１６．０ｍｇ、３３．２ｍＬ  ４０ｍＬループより
負荷時間：１５９．４分（２．６６時間）
画分サイズ：４５８μＬ
【０１４２】
（結果）：
画分分析：画分を希釈し（３０μＬ試料＋２０μＬ負荷緩衝液）、２１５ｎｍにおける分析的溶出ＨＰＬＣにより分析した（２５μＬ注入）；計算は面積％に基づく。
全実行時間：９．７時間
出力濃度：１．８６ｍｇ／ｍＬ
カラム負荷：最大容量の７３．２％
カラム容量：約３８．１ｍｇペプチド／ｍＬ  マトリックス＠１．８６ｍｇペプチド／ｍＬ溶液
約２１２μモル置換剤／ｍＬマトリックス＠１０．０μモル置換剤／ｍＬ溶液
純度％：  ９８．２％  ９８．０％  ９７．８％  ９７．５％
収量％：  ６０％      ７５％      ８０％      ９０％
【０１４３】
（コメント）：  試料濃度／出力濃度＝２．０
試料中のＣＦ３ＣＯ２−量＝２．０倍当量
小さな「分析型」カラムを用い、少量から中程度の負荷（２７．９ｇ／Ｌ）、中程度の純度および妥当な収量（＞９７．５％純度＠９０％収量）と伴う良い結果が得られる。この実施例は、同じペプチドと同じ置換剤を用いて２つのカラムの対照比較を示すように設計される（実施例１ｂと比較せよ）。一般的に言って、ポリスチレンカラムの結果は良いが、シリカ上のＣ１８カラムのそれほどにはよくない。全ランタイムはやや長く、カラム結合容量はより少なく、最終純度はやや低い（９７．５％対９８．５〜９９．０％）。置換剤のタイプを調整することで、その濃度とイオン対形成剤（データ示さず）、全ランタイムは短縮され、結合容量は増加し、シリカ上のＣ１８カラムのそれに近づく。しかしながら、生産物の純度はポリスチレンカラム上のこのランとほぼ同じく大部分残る。これらの結果は一般的に分取的溶出クロマトグラフィーからのデータと一致する。それらは、ポリスチレンカラムは、シリカ上のＣ１８カラムに比べてクロマトグラフィー解像度が減少することを示唆する。
【０１４４】
実施例５：置換剤３１８を用いる粗精製α−メラノトロピンの置換クロマトグラフィー精製−異なるペプチドと異なる置換剤（図５−分析を参照）
【０１４５】
操作条件：
出発ペプチド：脱塩した粗精製合成α−メラノトロピン、８０．８％純度、ＦＷ約１．６６５ｍｇ／μモル、電荷＝＋３
カラム：ウォーターズＸブリッジＢＥＨ１３０、５μｍ、１３５Å、４．６×２５０ｍｍＳＳ、シリカ上のＣ１８
流速：負荷＝２０８μＬ／分；置換＝２０８μＬ／分
イオン対形成剤：トリフルオロ酢酸塩（ＣＦ３ＣＯ２−）
温度：２３℃
ｐＨ：２．０
置換剤緩衝液：１０．０ｍＭ  置換剤３１８＋１２ｍＭＣＦ３ＣＯ２Ｈ  ＤＩ水溶液  ｗ／３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ，ｐＨ＝２．０  ｗ／ＮＨ４ＯＨ
負荷緩衝液：１２ｍＭ  ＴＦＡ水溶液  ｗ／３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ，ｐＨ＝２．０  ｗ／ＮＨ４ＯＨ
試料溶液：９．０４ｍｇ／ｍＬペプチド水溶液  ３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮおよび３３ｍＭ  ＣＦ３ＣＯ２−；ｐＨ＝２．０  ｗ／ＮＨ４ＯＨ
負荷量：２１６．２ｍｇ、２３．９ｍＬ  ３０ｍＬループより
負荷時間：１１５．０分
画分サイズ：３１２μＬ
【０１４６】
（結果）：
画分分析：画分を希釈し（１０μＬ試料＋５０μＬ負荷緩衝液）、２１５ｎｍにおける分析的溶出ＨＰＬＣにより分析した（２５μＬ注入）；計算は面積％に基づく。
全実行時間：６．２時間
出力濃度：６．５２ｍｇ／ｍＬ
カラム負荷：最大容量の６６．７％
カラム容量：約７９．３ｍｇペプチド／ｍＬ  マトリックス＠６．５２ｍｇペプチド／ｍＬ溶液
約１２９μモル置換剤／ｍＬマトリックス＠１０．０μモル置換／ｍＬ溶液
純度％：  ９９．１％  ９９．０％  ９８．９％  ９８．８％
収量％：  ８０％      ８５％      ９０％      ９５％
【０１４７】
（コメント）：  試料濃度／出力濃度＝１．４
試料中のＣＦ３ＣＯ２−量＝２．０倍当量
小さな「分析型」カラムを用いて、よい負荷（５２．０ｇ／Ｌ）、よい純度およびよい収量（＞９９％純度＠８５％収量；＞９８．５％純度＠９５％収量）を伴う優れた結果が得られる。この実施例は、同じカラム（シリカ上Ｃ１８）上で異なるペプチドと異なる置換剤を用いて並べて比較（実施例１ｂ参照）したものを示すように設計されている。α−メラノトロピンは、より高い固有の結合容量を持ち、より少ない置換剤３１８がカラムを飽和するために必要である（１２９対１６７μモル置換剤／ｍＬ）。これらの要素は、両方共一緒に、ペプチドのより高い結合容量（７９．３対５２．４ｇペプチド／Ｌマトリックス）につながるが、置換列はきれいにシャープになり高い純度と高い収量の両方が得られる。
【０１４８】
実施例６ａ：実施例プロトコルおよび置換列。粗精製合成α−エンドルフィンの置換クロマトグラフィー精製
【０１４９】
装置設定：４つの溶媒ラインを備える主ポンプ（１）、２つの溶媒ラインを備える試料負荷ポンプ（２）、ポンプ選択バルブ
ポンプ選択バルブ：  シングルチャネルのトグルロジックにより制御される６ポートバルブ（Ｓ３＝０、ポンプ１からカラム−ポンプ２から廃棄、Ｓ３＝１  ポンプ１から廃棄―ポンプ２からカラム）。カラム下流のＵＶフォトダイオードアレイ検出器（フローセル：０．５ｍｍパス長さ、９  Ｌ容量）続いて電導度検出器（フローセル：１７０  Ｌ容量）。
負荷緩衝液＝ポンプ１上のＡ−ライン（Ｓ１＝１，フローオン、Ｓ１＝０フローオフ）；置換剤緩衝液＝ポンプ１上のＢ−ライン（Ｓ２＝１、フローオン、Ｓ２＝０、フローオフ）；置換剤除去緩衝液＝ポンプ１上のＣ−ライン（Ｓ４＝１、フローオン、Ｓ４＝０、フローオフ）；カラム保存緩衝液＝ポンプ１上のＤ−ライン（Ｓ５＝１，フローオン、Ｓ５＝０、フローオフ）；負荷緩衝液＝ポンプ２上のＡ−ライン（Ｓ６＝１、フローオン、Ｓ６＝０、フローオフ）：試料溶液＝ポンプ２上のＢ−ライン（Ｓ７＝１、フローオン、Ｓ７＝０、フローオフ）。
【０１５０】
シークエンスが始まる前に、洗浄されたカラムを、カラム保存緩衝液を除去するために短時間Ａ−緩衝液でパージする。
カラム、最初のサンプルの詳細および負荷緩衝液／置換剤緩衝液／試料溶液の内容の詳細は実施例１２ｂ参照。
置換剤除去緩衝液（Ｃ−緩衝液）＝１０％（ｖ／ｖ）１−プロパノール、アセトニトリル中の１０％（ｖ／ｖ）ＤＩ水
カラム保存緩衝液（Ｄ−緩衝液）＝ギ酸（１５ｍｍ）およびギ酸アンモニウム（１５ｍｍ）を含む５０／５０（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水。
【０１５１】
【表６】
2014528585.tif 000020
【０１５２】
実施例６ｂ：置換剤１９８を用いる粗精製合成α−エンドルフィンの置換クロマトグラフィー精製−より大きい粒子、より大きいカラムおよび低い初期純度（図６ｂ（ａ）Ａ−置換列、図６（ａ）Ｂ−分析）
【０１５３】
（操作条件）：
出発ペプチド：脱塩した粗精製合成α−エンドルフィン、６４．３％純度、ＦＷ約１．７４６ｍｇ／μモル、電荷＝＋２  全てシリカ上Ｃ１８
カラム：６ｂ（ａ）：ウォーターズＸブリッジＢＥＨ１３０、５μｍ、１３５Å、１０．０×２５０ｍｍＳＳ、シリカ上のＣ１８
６ｂ（ｂ）：ウォーターズＸブリッジＢＥＨ１３０、１０μｍ、１３５Å、１０．０×２５０ｍｍＳＳ、シリカ上のＣ１８
６ｂ（ｃ）：ウォーターズＸブリッジＢＥＨ１３０、１０μｍ、１３５Å、１０．０×５００（２×２５０）ｍｍＳＳ、シリカ上のＣ１８
流速：３つの全ての実験において負荷＝１０１６μＬ／分；置換＝９６１μＬ／分。
イオン対形成剤：トリフルオロ酢酸塩（ＣＦ３ＣＯ２−）
温度：２３℃
ｐＨ：２．０
置換剤緩衝液：１０．０ｍＭ置換剤１９８＋１２ｍＭ  ＣＦ３ＣＯ２Ｈ  ＤＩ水溶液  ｗ／３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ，ｐＨ＝２．０
負荷緩衝液：１２ｍＭ  ＴＦＡ水溶液  ｗ／３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ，ｐＨ＝２．０  ｗ／ＮＨ４ＯＨ
試料溶液：
（ａ）５．５９ｍｇ／ｍＬペプチド水溶液  ３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮおよび２６ｍＭＣＦ３ＣＯ２−；ｐＨ＝２．０
（ｂ）５．５９ｍｇ／ｍＬペプチド水溶液  ３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮおよび２６ｍＭＣＦ３ＣＯ２−；ｐＨ＝２．０
（ｃ）１１．１８ｍｇ／ｍＬペプチド水溶液  ３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮおよび５２ｍＭＣＦ３ＣＯ２−；ｐＨ＝２．０
負荷量：
（ａ）負荷ポンプから１１６４ｍｇ，２０８．３ｍＬ；負荷時間＝２０５．０分．
（ｂ）負荷ポンプから１１６４ｍｇ，２０８．３ｍＬ；負荷時間＝２０５．０分（３．４２時間）．
（ｃ）負荷ポンプから２３２９ｍｇ，２０８．３ｍＬ；負荷時間＝２０５．０分（３．４２時間）．
画分サイズ：（ａ）１．４９ｍＬ    （ｂ）１．４９ｍＬ    （ｃ）２．９８ｍＬ
【０１５４】
結果−６ｂ（ａ）：（図６ｂ（ａ）Ａおよび６ｂ（ａ）Ｂ参照）
画分分析：画分を希釈し（１０μＬ試料＋４０μＬ負荷緩衝液）、２１５ｎｍにおける分析的溶出ＨＰＬＣにより分析し（２５μＬ注入）；計算は面積％に基づく。
全実行時間：８．９時間
出力濃度：５．４７ｍｇ／ｍＬ
カラム負荷：最大容量の７０．５％
カラム容量：約８４．１ｍｇペプチド／ｍＬ  マトリックス＠５．４７ｍｇペプチド／ｍＬ溶液
約１６１μモル置換剤／ｍＬマトリックス＠１０．０μモル置換剤／ｍＬ溶液
純度％：  ９８．８％  ９８．７％  ９８．５％  ９８．２％
収量％：  ８０％      ８５％      ９０％      ９５％
【０１５５】
（結果−６ｂ（ｂ））（図面無）：
画分分析：画分を希釈し（１０μＬ試料＋４０μＬ負荷緩衝液）、２１５ｎｍにおける分析的溶出ＨＰＬＣにより分析した（２５μＬ注入）；計算は面積％に基づく。
全実行時間：９．１時間
出力濃度：５．２７ｍｇ／ｍＬ
カラム負荷：最大容量の７１．３％
カラム容量：約８３．２ｍｇペプチド／ｍＬ  マトリックス＠５．２７ｍｇペプチド／ｍＬ溶液
約１６５μモル置換剤／ｍＬマトリックス＠１０．０μモル置換剤／ｍＬ溶液
純度％：  ９８．２％  ９８．１％  ９７．９％  ９７．５％
収量％：  ８０％      ８５％      ９０％      ９５％
【０１５６】
（結果−６ｂ（ｃ））（図面無）：
画分分析：画分を希釈し（１０μＬ試料＋４０μＬ負荷緩衝液）、２１５ｎｍにおける分析的溶出ＨＰＬＣにより分析された（２５μＬ注入）；計算は面積％に基づく。
全実行時間：１４．５時間
出力濃度：５．４１ｍｇ／ｍＬ
カラム負荷：最大容量の７０．７％
カラム容量：約８３．７ｍｇペプチド／ｍＬ  マトリックス＠５．４１ｍｇペプチド／ｍＬ溶液
約１６２μモル置換剤／ｍＬマトリックス＠１０．０μモル置換剤／ｍＬ溶液
純度％：  ９８．８％  ９８．７％  ９８．５％  ９８．２％
収量％：  ８０％      ８５％      ９０％      ９５％
【０１５７】
（コメント）：  試料濃度／出力濃度＝１．０（６ｂ（ａ））；  １．１（６ｂ（ｂ））；２．１（６ｂ（ｃ））。
試料中のＣＦ３ＣＯ２−量＝４．０倍当量（６ｂ（ａ），６ｂ（ｃ）および
６ｂ（ｃ））
５μｍおよび１０μｍの粒子サイズの両方で、「半分取型」カラムを用いてよい負荷（５９．２〜５９．３ｇ／Ｌ）、高純度およびよい収量（＞９８．５％純度＠９０％収量）という、３回全てのランで優れた結果が得られる。負荷率（７０．５〜７１．３％）および出力濃度（５．２７〜５．４７ｍｇ／ｍＬ）は、均一で再現性がある。これらの実施例は、最適化された分取的置換クロマトグラフィーの威力と有用性を示す。（１）同じ逆相マトリックスを詰めた同じ長さの４．６ｍｍと１０．０ｍｍのＩＤカラム間で分取の分解能にはほとんど差が無い。（２）２５ｃｍのカラム長において、５μｍと１０μｍのマトリックスは両方ともよい結果を与える。１０μｍの材料は、わずかに低い純度（約０．６％）で示されたように若干劣った解像度を与える。（３）５０ｃｍカラム長においては、１０μｍのマトリックスが完全な解像度を取り戻す；簡単な計算により３０〜４０ｃｍのベッド長は十分長いことが示唆される。（４）置換クロマトグラフィー実験において、適切に末端間接着した２つのよく詰められたカラムは、効果的に機能する。（５）初期純度６０＋％の、ペプチド（α−エンドルフィン）の最良の集合純度（９８．８％）は、８０＋％の初期純度のペプチド（アンジオテンシンＩ、α−メラノトロピン）の最良の集合純度（９９．１％）よりあまり悪くない。（６）多くの場合、イオン対形成剤の１．５〜２．０倍当量が、よい結果を伴って試料負荷溶液に使用される。しかしながら、α−エンドルフィンにおいては、３．５〜４．０倍当量のＣＦ３ＣＯ２−で、顕著によりよい分解能が得られる。
【０１５８】
実施例７：置換剤１９８を用いる予備精製されたα−エンドルフィンの置換クロマトグラフィー精製−異なる結合等温線により純度が改善される（図７−分析参照）
【０１５９】
（操作条件）：
出発ペプチド：予備精製したα−エンドルフィン、９８．４％純度、ＦＷ約１．７４６ｍｇ／μモル、電荷＝＋２
カラム：ウォーターズＸブリッジＢＥＨ１３０、５μｍ、１３５Å、４．６×２５０ｍｍＳＳ、シリカ上Ｃ６Ｐｈ
流速：負荷＝２０８μＬ／分；置換＝２０８μＬ／分
イオン対形成剤：トリフルオロ酢酸塩（ＣＦ３ＣＯ２−）
温度：２３℃
ｐＨ：２．０
置換剤緩衝液：１０．０ｍＭ置換剤１９８＋１２ｍＭ  ＣＦ３ＣＯ２Ｈ  ＤＩ水溶液  ｗ／３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ，ｐＨ＝２．０  ｗ／ＮＨ４ＯＨ
負荷緩衝液：１２ｍＭ  ＴＦＡ水溶液  ｗ／３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ，ｐＨ＝２．０ｗ／ＮＨ４ＯＨ
試料溶液：５．２６ｍｇ／ｍＬペプチド水溶液  ３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮおよび２１ｍＭ  ＣＦ３ＣＯ２−；ｐＨ＝２．０  ｗ／ＮＨ４ＯＨ
負荷量：１５８．９ｍｇ、３０．２ｍＬ  ４０ｍＬループより
負荷時間：１４５．２．０分
画分サイズ：４３７μＬ
【０１６０】
（結果）：
画分分析：画分を希釈し（１５μＬ試料＋３５μＬ負荷緩衝液）、２１５ｎｍにおける分析的溶出ＨＰＬＣにより分析した（２５μＬ注入）；計算は面積％に基づく。
全実行時間：７．３時間
出力濃度：３．８５ｍｇ／ｍＬ
カラム負荷：最大容量の７１．１％
カラム容量：約５３．８ｍｇペプチド／ｍＬ  マトリックス＠３．８５ｍｇペプチド／ｍＬ溶液
約１４７μモル置換剤／ｍＬマトリックス＠１０．０μモル置換剤／ｍＬ溶液
純度％：  ９９．６％  ９９．６％  ９９．６％  ９９．５％
収量％：  ８０％      ８５％      ９０％      ９５％
【０１６１】
コメント：  試料濃度／出力濃度＝１．３
試料中のＣＦ３ＣＯ２−量＝３．６倍当量
小さな「分析型」カラムを用いて、よい負荷（３８．３ｇ／Ｌ）、優れた純度および優れた収量（＞９９．５％純度＠９５％収量）を伴う優れた結果が得られる。この実施例は、いかにして予備精製された試料を適した条件下で精製することが効果的に高純度ペプチドにつながるか、を示すために設計されている。（１）生産物の損失は最少（５−１０％）で、不純物の総量は、１．６％から０．４−０．５％に顕著に減少する。（２）不純物の減少は、カラムの分解能の改良ではなく、主に生産物と不純物の結合等温線を変えることにより引き起こされる。出発物質において、１．６％の不純物は１２のマイナーな不純物からなり、そのうち８つの不純物はこの精製の間に効果的に除去される。残りの４つの共置換成分のレベルは精製中に若干減少する。（３）これらの４つの残留不純物の共置換は、最終純度を制限する主要な要素であるから、この純度プロファイルは６０％回収から９５％回収まででほぼ不変である。（４）この精製の成功は、異なる結合等温線を持つフェニルヘキシルカラムの選択による。オクタデシル（Ｃ１８）カラム上で、同じ試料の同様な置換クロマトグラフィー精製を行う試みは、顕著な改善を生むことができなかった（データ示さず）。オクタデシルカラムは、最初のステップで原材料から試料を精製するために使用されるため、これは起こりうる。（５）これらの結果は、２つの連続した置換精製が、常に高純度ペプチドの高収量生産につながりうることを示す。
【０１６２】
実施例８：置換剤１４を用いる粗精製アンジオテンシンＩの置換クロマトグラフィー精製―異なるイオン対形成陰イオン、濃度および混合物を用いる
【０１６３】
実施例７の７つの実験の全ての操作条件は、置換剤のための対イオンおよびイオン対形成陰イオン（酸）の添加量を除き同じである。全ての場合において、操作ｐＨは同じ（ｐＨ＝２．０）である。分析仕事の量を減らすために、比較純度データは、中央の１５画分のプールに与えられる。共置換のレベルは、行われた置換実験において主要な置換バンドを通じてほぼ不変であるから、このプール方法からの分析データは代表的で比較可能な結果を与える。
（結果）：
【０１６４】
【表７】
2014528585.tif 000021
【０１６５】
（コメント）：
実験”Ｇ”を除きほとんどの条件下で一般的に良い結果が得られる。イオン対形成陰イオンの型、混合物およびレベルに関してこの研究からのクリアな結果がある。
【０１６６】
１．トリフルオロ酢酸塩のみ（Ａ）および臭化物のみ（Ｂ）の実験は同様な結果（０．９〜１．０％不純物）となる。一方、塩素のみ（Ｃ）実験用のそれらは、より高い不純物のレベル（１．４％不純物）を生む。それゆえ、トリフルオロ酢酸塩および臭化物は、塩化物よりもよりよいイオン対形成剤である。
【０１６７】
２．トリフルオロ酢酸塩−塩化物の混合物（Ｅ、Ｆ）実験は、トリフルオロ酢酸塩のみの実験同様、十分なトリフルオロ酢酸塩が存在する限り（０．９〜１．０％不純物）、ほぼ同じ不純物レベルを示す。これに対し、トリフルオロ酢酸塩−臭化物の混合物（Ｄ）実験は、より悪い結果を与える；不純物レベルは０．９％から１．９％に増加する。トリフルオロ酢酸塩のみ（Ａ）と臭化物のみ（Ｂ）の実験はよい結果を生じたが、陰イオンの混合物はよい結果を生じない。明らかに、同様の（しかし同じでない）イオン対形成強度の２つのイオン対形成陰イオンの混合物は、互いに干渉し、バンドの広がりとより高い不純物レベルという結果となる。イオン対形成強度が顕著に異なる２つのイオン対形成陰イオンの存在は、強い方の一つの優勢（それが十分存在する限り）という結果となり、より低い不純物レベルという結果となる。
【０１６８】
３．２つのイオン対形成剤が存在し（Ｃｌ−，ＣＦ３ＣＯ２−）、かつより強いものが、準化学量論的な量で存在する場合、最悪の結果（Ｇ）が得られる。これは、「ダブルバンド」の結果となり、置換剤と混合物の多くの成分とが２つのバンドとしてカラムから出る。最初のバンドは塩化物塩で２番目のバンドはトリフルオロ酢酸塩として出る。これは、顕著なバンドの広がりと、各々の２重バンドの成分の重なりにつながり、それにより、全体的な不純物レベルが０．９％から３．３％に増加する。不十分な量のトリフルオロ酢酸塩（より強いイオン対形成陰イオン）を添加すると、全くトリフルオロ酢酸塩を含まないよりもより悪い結果が生じる（３．３％不純物対１．４％不純物）。過剰当量の、より高いレベルのトリフルオロ酢酸を添加すると不純物レベルは再び低下する（３．３％から０．９％）。
【０１６９】
４．上の結果は置換剤緩衝液中のトリフルオロ酢酸塩（イオン対形成陰イオン）のそのレベルにのみ適用できることに留意のこと。十分なトリフルオロ酢酸塩が、試料負荷溶液中に存在した。試料溶液中のトリフルオロ酢酸塩が不足すると、不純物レベルがさらに高くなる（データ示さず）。
【０１７０】
（実施例９：ＨＰＬＣ分析）−
方法９ａ、９ｂ−陽イオンについての逆相：以下を用いて分析を実施した：Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｍｉｌｆｏｒｄ，  ＭＡ）グラジエントＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ９９６  ＰＤＡ検出器をＤｉｏｎｅｘ／ＥＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ，  ＭＡ）Ｃｏｒｏｎａ  Ｐｌｕｓ  ＣＡＤ検出器およびＷａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ１３０，  ５μｍ、１３５Å、４．６×２５０ｍｍ  ＳＳ，シリカ上Ｃ１８、逆相クロマトグラフィーカラム（Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ，  ＭＡ）と並列して備える）。
試料注入：２５μＬの約１ｍＭ試料溶液（Ａ緩衝剤中）
ＵＶ検出：２０８〜２２０ｎｍ（分析される化合物に依存）
流速：１．０ｍＬ／分。
Ａ緩衝剤：５％ＣＨ３ＣＮ（ｖ／ｖ）（ＨＰＬＣ級蒸留水中）＋０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸
Ｂ緩衝剤：５％Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）（ＨＰＬＣ級ＣＨ３ＣＮ中）０．１％（ｖ／ｖ）  トリフルオロ酢酸
調査グラジエント法：１００％Ａ                ０〜２分
１００％Ａから１００％Ｂ  ２〜６２分
１００％Ｂ                ６２〜７０分
分析グラジエント法：  １０％Ｂ                ０〜２分
１０％Ｂから５０％Ｂ    ２〜５７分
５０％Ｂから１００％Ｂ  ５７〜６２分
１００％Ｂ                ６２〜６７分
【０１７１】
方法９ｃ−ハロゲン化長鎖アルキルについての逆相：
試料注入：２５μＬの約１ｍＭ試料溶液（Ａ緩衝剤中）
ＵＶ検出：２００〜２２０ｎｍ（分析される化合物に依存）
流速：１．０ｍＬ／分。
Ａ緩衝剤：５％ＣＨ３ＣＮ（ｖ／ｖ）（ＨＰＬＣ級蒸留水中）＋０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸
Ｂ緩衝剤：５％Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）（ＨＰＬＣ級ＣＨ３ＣＮ中）０．１％（ｖ／ｖ）  トリフルオロ酢酸
グラジエント法：  ５０％Ａ／５０％Ｂ                    ０〜２分
５０％Ａ／５０％Ｂから１００％Ｂ      ２〜６２分
１００％Ｂ                            ６２〜７０分
【０１７２】
実施例１０：Ｎ−デシルピロリジン（ｆｗ＝２１１．３９）の調製
マントルヒーター、機械的攪拌機、５００ｍＬの添加漏斗、還流冷却器およびテフロン（登録商標）コートした熱電対の付いた２Ｌの４首丸底フラスコ中の５００ｍＬの攪拌中のアセトニトリルに、４２６．７ｇの新しく蒸留したピロリジン（６．０モル、ｆｗ＝７１．１２、約５００ｍＬ）を添加する。反応は、遅いＮ２パージを伴う窒素雰囲気下で行われる。４４２．４ｇの新しく蒸留した１−ブロモデカン（２．０モル、ｆｗ＝２２１．１９，約４１５ｍＬ）を、反応熱により反応温度が４５〜５５℃の範囲に維持される速度で、攪拌されている混合物に滴下する。これらの条件下で、ブロモデカン添加には約２時間が必要とされる。ブロモデカンが全て添加され、反応温度が４５℃以下に下がった後、攪拌反応混合物を８０℃に１時間加熱し、その後冷却する。反応混合物を、ブロモデカンが全て消費されたことを確実にするために、定期的にＨＰＬＣ（方法１０ｇ）によりモニターする。反応の間中、生産物の、より濃くない上層が形成され始める。それは、反応混合物が周囲温度に冷却されるにつれて容量が増加する。冷却に際し、反応温度が約５０℃に達すると、相分離を容易にし、臭化水素酸ピロリジンの結晶化を防ぐために、攪拌されている混合物に、１００ｍＬの蒸留水が少しづつ添加される。反応温度が３０℃以下になると、２Ｌの分液漏斗に移され、約３時間、完全に相を分離するために放置される。上層は漏斗の中に保持され、１．０Ｌの１０％ｗ／ｗＮａＯＨを蒸留水に溶かしたものを添加され、この混合物が完全に混合され、一晩放置される。相が分離され、上の生産物層は保持され、１．０Ｌの１％ｗ／ｗＮａＯＨを蒸留水に溶かしたものが添加され、混合物は完全に混合され、その後再度終夜放置される。相が分離され、上の生産物層は、８０ｇの無水硫酸マグネシウム粉末と共にビーカーに入れられる。粘稠な混合物は、手動で１５分間混合され、その後、細かい多孔性焼結ガラスフィルタを通される。一度、生産物が濾過されると、硫酸マグネシウムは、少量のｎ−ペンタンで洗浄され、その後濾過される。このペンタン溶液は、濾過された生産物と組み合わされ、ロータリーエバポレーターに入れられる。揮発性成分（ペンタン、残存アセトニトリル、ピロリジン、水）のほとんどは減圧下で除去される。ロータリーエバポレーターを用いて、粘稠な生産物は、終夜（１８時間）真空（約１０トル）下で攪拌され、加熱（７０℃、グリコール−水浴）され、一方で、揮発性物質は液体窒素温度でトラップされる。最後に、混合物は再び真空ライン（０．５トル、１００℃）で終夜攪拌され、加熱され、揮発性物質の最後の痕跡まで除去される。この方法は、純度９９．０〜９９．６％（ＧＣ，ＨＰＬＣ）の３９９ｇ（９４％）の淡黄色の粘稠な液体を生じる。この物質は、ほとんどの応用に十分な純度である。もし必要なら、この物質は蒸留（１１８〜１２２℃、３トル）され、無色の液体（９９．８％純度）の９０％の蒸留産物が得られる。
【０１７３】
これはクリーンな反応で、出発物質の２級アミンとアルキルハライドがそれら自身純粋であれば、純粋な生産物を生み出す。１級アルキルクロライドはこの反応では非常によく機能し、反応時間は完全な反応のためには少し延長する必要がある。この反応はまた様々なｎＣ５−ｎＣ１２ハロゲン化アルキルを用いつつ様々な２級アミンを用いてうまく実行される：５０％水性ジメチルアミン、Ｎ−メチルエチルアミン、ジエチルアミン、ジ−ｎ−プロピルアミン、ジ−ｎ−ブチルアミン、ピロリジン、ピペリジン、Ｎ−メチルベンジルアミン、Ｎ−エチルベンジルアミン、Ｎ−メチルアニリン。上の反応については、ジデシルピロリジニウムブロマイド副産物の生産を最少化するために、１：３の割合が選択される。遊離のアミンを再生させるために、使用済反応混合物に無機塩基（ＮａＯＨペレット、５０％水性ＮａＯＨ、ＬｉＯＨ、無水Ｎａ２ＣＯ３，Ｎａ３ＰＯ４）の添加後、蒸留して、それに続いて、アミンまたはアミン／溶媒混合物を回収することにより過剰の２級アミンが再生され、リサイクルされ得る。
【０１７４】
実施例１１：Ｎ−（４−フルオロベンジル）−Ｎ−デシルピロリジニウムクロライド（ｆｗ＝３５５．９７）の調製
【０１７５】
マントルヒーター、機械的攪拌機、５００ｍＬの添加漏斗、還流冷却器およびテフロン（登録商標）コートした熱電対の付いた２Ｌの４首丸底フラスコ中の７２０ｍＬの攪拌中のアセトニトリルに、３８０．５ｇの精製したＮ−デシルピロリジン（１．８モル、ｆｗ＝２１１．３９）を添加する。反応はゆっくりした窒素パージを伴う窒素雰囲気下で行われる。攪拌されている混合物は、５０℃に加熱され、２８９．１ｇの新しく蒸留された４−フルオロベンジル塩化物（２．０モル、ｆｗ＝１４４．５８）が約６０分間にわたって滴下される。反応混合物は、その後、約８０℃に８〜１２時間加熱され、原料のアミンが全て消費されたことを確認するために、定期的にＨＰＬＣ（方法１０ａ）によりモニターされる。反応混合物は室温まで冷却され、焼結ガラスを通して濾過され、ロータリーエバポレーターに入れられ、溶媒（アセトニトリル）を除去される。１．０Ｌのメチルｔブチルーエーテル（ＭＴＢＥ）が、粘着性の橙黄色の反応残渣に機械的に攪拌されながら少しづつ添加される。この混合物が溶媒に完全に懸濁されると、それはきれいな４Ｌのエルレンマイヤーフラスコに移され、追加量のＭＴＢＥ（１．９Ｌ）が攪拌を伴いゆっくりと添加される。混合物は、周囲温度に終夜放置され、大きな焼結ガラスフィルタを通して濾過され、ＭＴＢＥで２回洗浄され、その後生産物に乾燥したＮ２を通して乾燥される。この留意：結晶物質は非常に吸湿性で、急速に空気中から水分を吸収し、数分のうちに白い結晶が無色の液体のたまりになること。それゆえ、通常の濾過は困難で、乾燥箱内または乾燥Ｎ２または乾燥空気の覆いの下で行うべきである。生産物は最後に真空オーブン中で乾燥され（５５℃、２０トル、３時間、９５℃、２０トル、１５時間）、冷却され、Ｐ２Ｏ５の上の乾燥機内の密封容器に保存される。この方法は、９９％を超える純度を持つ約５７６ｇ（９０％）の白い結晶産物（プレートレット）を生じる。１．０℃／分の加熱速度で９０〜１４０℃の間で測定されると、ガラスキャピラリー中でシャープな融点が１３７〜１３８℃で測定される。この化合物は、異なる融点を持つ複数の多型結晶形で存在するようにみえる。アセトニトリル／ＭＴＢＥ由来のこの結晶化物質は、１２０℃またはそれ以下で溶融し、再結晶化し、約１３７℃で再融解する結晶を形成する。ゆっくり加熱すると、多型の熱による相互変換を促進するように見える。９０℃で十分長く（数日）寝かせると、物質はより高い融点形に変わる。みかけの融点は、少量の水分の存在下で顕著に低下する。
【０１７６】
再結晶化は、熱いＤＭＥ／ＭＴＢＥを用いて達成される。１００ｇの上記生産物は４５０ｇのペルオキシドを含まない、熱い（約７５℃）１，２ジメトキシエタン（ＤＭＥ）に溶解され、すぐに焼結されたガラスフィルタを通してきれいな１Ｌフィルターフラスコ中に濾過される。５５ｇの熱いＤＭＥが、フィルタを洗浄するために使用される。フィルターフラスコの腕は塞がれていて、フラスコ中の混合物は、約７５℃に加熱され、その後約５０℃に冷却される。約２７０ｇのＭＴＢＥが、その後、攪拌されている混合物に添加され、該混合物は再度５０℃に短時間加熱される。フラスコはその後覆われ、暖かい溶液は室温まで邪魔されずに冷却される。周囲温度で３時間以内におびただしい量の大きく白いプレートレットが溶液から結晶化する。最後に、結晶化を完全にするために、混合物は４℃に終夜（１５−１８時間）放置される。空気中の水分から防御するために適切な注意をして（上参照）、冷えた混合物は焼結ガラスフィルタを通して濾過され、ＭＴＢＥで２回洗浄され（周囲温度）、上述のようにフィルタ上で乾燥される。生産物は、真空オーブン中で再度終夜乾燥され、冷却され、Ｐ２Ｏ５上の乾燥機中で密封容器内に保存される。この手順は約７６ｇ（７６％）の白い結晶塩（ＨＰＬＣによる９９．７〜９９．９％純度）を生じる。濾液は相当量の純粋な生産物を含む。溶媒は完全に除去され、白い残渣は同じ方法で再度再結晶されるか、または次の生産物のバッチと再結晶化のために組み合わされる。再結晶化の全収率は８７〜９５％である。
【０１７７】
実施例１２：Ｎ−（４−フルオロベンジル）−Ｎ−デシルピロリジニウムヒドロキシド（ｆｗ＝３３７．５３）の調製
【０１７８】
１７８ｇの再結晶化したＮ−（４−フルオロベンジル）−Ｎ−デシルピロリジニウムクロライド（５００ｍモル、ｆｗ＝３５５．９７）は４５５ｍＬの脱気した脱イオン水にＣＯ２を含まないＮ２雰囲気下で、ポリプロピレンフラスコ中で溶解する。６１．４ｇの酸化銀（Ｉ）（２６５ｍモル、ｆｗ＝２３１．７４）が溶液に添加され、室温で４８時間、機械的なポリプロピレンのプロペラで活発に攪拌される。この混合物は、窒素ガスに覆われた中で、ポリプロピレンのブフナー漏斗中のポリプロピレンのフィルタ／フェルトを通して、ポリプロピレンの受け入れ用フラスコ中に濾過される。無色透明の溶液がロータリーエバポレーターに入れられ、真空下で３６〜４８時間水分が部分的に除去され、その間生産物（粘稠な液体）は外部の加熱浴を用いて約５０℃に保持される。酸塩基滴定（水酸化物）とＨＰＬＣ分析（陽イオン）は、最終溶液が約４１％の４級水酸化物を含むことを示し、原子吸光は残存するＣｌ−が２ｐｐｍ以下であることを示す。溶液は密封されたきれいなポリプロピレンの容器中で周囲温度で保存される。収量はほぼ定量的である。
【０１７９】
改変：この方法は一般的に、ここで記載したほとんどの４級アンモニウム塩化物／臭化物塩に適用できる。塩基感受性基（アルコール、アミド、エステル等）を有する化合物は、もちろん、水酸化物塩としてはしばしば不安定である。安定な４球アンモニウム塩はまた、イオン交換、電気分解または電気透析のような他の方法を用いて、水酸化物塩に変換される。
【０１８０】
実施例１３：Ｎ−（４−フルオロベンジル）−Ｎ−デシルピロリジニウムトリフルオロアセテート（ｆｗ＝４３３．５３）の調製
【０１８１】
（方法Ａ）３５．６ｇの精製され、再結晶化されたＮ−（４−フルオロベンジル）−Ｎ−デシルピロリジニウムクロライド（１００ｍモル、ｆｗ＝３５５．９７）が、１００ｍＬの分液漏斗に入れられ、その後３５．６ｇの脱気した脱イオン水が添加される。このフラスコは、透明な粘稠な溶液が形成されるまで振とうされる（約１．５Ｍ溶液）。１７．１ｇのトリフルオロ酢酸（１５０ｍモル、ｆｗ＝１１４．０２）が混合物に添加され、激しく混合される。直ちに２相が形成され、それから６０分後には完全に分離する。４級トリフルオロ酢酸塩は下層に含まれ、水、ＨＣｌおよび過剰のＣＦ３ＣＯ２Ｈは上層に存在する。相は分離され、下層の生成物は、残存する水、ＨＣｌおよびＣＦ３ＣＯ２Ｈを真空下で除去するためにロータリーエバポレーターに入れられる（湯浴温度＝５０℃、真空度＝２０トル）。この手順で、４０．８ｇ（９４％）の純粋な透明で粘性のある油（イオン性液体）が得られる。この物質は置換剤として使用するのに適している。４級陽イオンのＨＰＬＣ純度は実質的に出発物質と同一である。残存する塩素含有量は、約１モル％（塩化物滴定）であり、過剰のトリフルオロ酢酸塩は遊離のトリフルオロ酢酸として２〜５モル％（酸滴定）である。同じ重量の３０％（ｗ／ｗ）トリフルオロ酢酸水溶液を用いた２回目の抽出とそれに続く同じ手順は、残存するトリフルオロ酢酸と同じ量で同じ生成物を与えるが、塩化物含有量は＜０．１モル％に減少する。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩（約１２０ｍＭ）の純水への溶解性は塩化物塩（２．０Ｍ）の溶解性よりも低いが、それにもかかわらず、このＴＦＡ塩は置換剤として使用（１０〜５０ｍＭ）するのに十分に可用性である。
【０１８２】
（方法Ｂ）これは２相のジエチルエーテル−水抽出における分配挙動に基づく方法Ａの改変例である。４級塩化物塩は、強く水層に分配するが、４級トリフルオロ酢酸塩は強くエーテル層に分配する。５３．４ｇの精製され、再結晶化されたＮ−（４−フルオロベンジル）−Ｎ−デシルピロリジニウムクロライド（１５０ｍモル、ｆｗ＝３５５．９７）が、２５０ｍＬの分液漏斗に入れられ、５３．４ｇの脱気した脱イオン水がそれに続いて入れられる。このフラスコは、透明な粘性のある溶液が形成されるまで振とうされる（約１．５Ｍ溶液）。２５．６ｇのトリフルオロ酢酸（２２５ｍモル、ｆｗ＝１１４．０２）が混合物に添加され、混合物は激しく混合される。直ちに、生産物が下層にある２相が形成される。１１０ｍＬのペルオキシドを含まないジエチルエーテルが分液漏斗に添加され、この混合物は再び活発に混合される。２時間後、相は完全に分離し、生産物は上のエーテル相にある。下相は廃棄され、上相が保持される。５５ｍＬの１％トリフルオロ酢酸を含む蒸留水溶液が添加され、混合物は激しく混合され、相は再び分離される。再び、上相が保持され、無水硫酸マグネシウムで乾燥され、濾過され、ロータリーエバポレーターに入れられ、残存するＨＣｌ、トリフルオロ酢酸および水とともにエーテルが除去される。この手順により、５９．２ｇ（９１％）の純粋で透明な粘性のある油（イオン性液体）が得られる。この物質は置換剤として使用するのに適している。４級陽イオンのＨＰＬＣ純度は実質的に出発物質と同一である。残存する塩化物含有量は、＜０．１モル％（塩化物滴定）であり、遊離のトリフルオロ酢酸としての過剰のトリフルオロ酢酸塩は１〜３モル％（酸滴定）である。
【０１８３】
（方法Ｃ）３５．６ｇの精製され、再結晶化されたＮ−（４−フルオロベンジル）−Ｎ―デシルピロリジニウムクロライド（１００ｍモル、ｆｗ＝３５５．９７）は、２５０ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ中の７５ｍＬの蒸留水に溶解される。２３．１ｇのトリフルオロ酢酸銀（Ｉ）（１０５ｍモル、ｆｗ＝２２０．８８）および１００ｍＬのペルオキシドを含まないジエチルエーテルがこの溶液に添加され、室温で４８時間磁気的に激しく攪拌される。この混合物は、銀塩を除去するために濾過され、２つの液相は分離され、上の生産物相は乾燥されその後再度濾過される。エーテル溶液は残存する水とともにエーテルを除去するためにロータリーエバポレーターに入れられる。この手順によれば、４１．２ｇ（９５％）の純粋で透明な、粘性のある油（イオン性液体）が得られる。この物質は、置換剤として使用するのに適している。４級陽イオンのＨＰＬＣ純度は、出発物質のそれと実質的に同一である。残存する塩化物含有量は＜０．０１モル％である。
【０１８４】
（方法Ｄ）８４．６ｇのＮ−（４−フルオロベンジル）−Ｎ−デシルピロリジニウムヒドロキシド物溶液（１００ｍモル、３９．９％、ｆｗ＝３３７．５３）は、キャリブレーションされた１０００ｍＬの容積測定フラスコに入れられ、約８００ｍＬのＣＯ２を含まない蒸留水を添加され、混合される。すぐに、トリフルオロ酢酸塩（約１１．４ｇ、ｆｗ＝１１４．２）が、攪拌され、ｐＨをモニターしながら、注意深く滴下される。９５％の酸が添加されると、小さな酸の小滴が、緩衝なしのエンドポイント（ｐＨ５〜８）が達成されるまで一滴づつ添加される。追加のＣＯ２を含まない蒸留水が、容積が正確に１０００ｍＬになるまで添加される）。この１００ｍＭの原液は置換剤に使用するために適している。ギ酸塩、酢酸塩、臭化物、硝酸塩、ヨウ化物、メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩（トリフラート）、トリクロロ酢酸塩および過塩素酸塩を含む、広範囲の塩がこの方法を用いて容易に調製される。
【０１８５】
（方法Ｅ）８４．６ｇのＮ−（４−フルオロベンジル）−Ｎ−デシルピロリジニウムヒドロキシド溶液（１００ｍモル、３９．９％、ｆｗ＝３３７．５３）および１００ｍＬのペルオキシドを含まないジエチルエーテルが２５０ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ中に入れられる。すぐさま、この混合物は磁気的に激しく攪拌され、トリフルオロ酢酸（約１１．４ｇ、ｆｗ＝１１４．２）が注意深く、温度上昇が最少になるような添加速度で滴下される。室温混合物は２つの液相に分離し、上の生産物相は乾燥され、濾過され、エーテル溶液は、残存するトリフルオロ酢酸と水とともにエーテルを除去するためにロータリーエバポレーターに入れられる。この手順により、４２．０ｇ（９７％）の純粋で透明な粘性のある油（イオン性液体）が得られる。この物質は置換剤に使用するのに適している。４級陽イオンのＨＰＬＣ純度は出発物質と実質的に同一である。残存塩化物含有量は＜０．０１モル％である。
【０１８６】
（方法Ｆ）マントルヒーター、磁気的攪拌機、５０ｍＬの添加漏斗および還流冷却器の装着された２５０ｍＬの４首丸底フラスコ中の７５ｍＬの攪拌中のアセトニトリルに、３８．１ｇの精製されたＮ−デシルピロリジン（０．１８モル、ｆｗ＝２１１．３９）が添加される。この反応は窒素雰囲気下で行われる。攪拌混合物は約５０℃に暖められ、４４．４ｇの新しく蒸留された４−フルオロベンジルトリフルオロ酢酸４（０．２０モル、ｆｗ＝２２２．１４）が約６０分の時間にわたって滴下される。次いで、反応混合物は、その後還流条件下で約２４時間加熱され、出発アミンが全て消費されたかを確認するために定期的にＨＰＬＣによりモニターされる。反応混合物は室温に冷却され、焼結ガラスを通して濾過され、溶媒（アセトニトリル）を除去するためにロータリーエバポレーターに入れられる。１００ｍＬのｎ−ペンタンが黄色い反応残存物に、機械的に攪拌されながら少量づつ添加される。混合物が完全に溶媒と混合すると、上層は完全に除かれ捨てられる。油状生産物層に、過酸化物を含まないジエチルエーテルが等量添加され、完全に混合される。１００ｍＬのｎ−ペンタンが添加され、混合物は完全に混合され、落ち着くまで放置され、上層は分離され捨てられる。ジエチルエーテルとペンタンとを用いたこの倍散プロセスは、色と有機物の不純物をできるだけ多く除去するために、さらに２回繰り返される。最後に、混合物は、揮発性物質の最後の痕跡を除去するために、真空ライン（０．５トル、８０℃）上で終夜加熱される。この手順により、純度９８．５〜９９．０％（ＨＰＬＣ）の約５５ｇ（７１％）の淡黄色の油状物質が得られる。この油状物質はクロマトグラフィーを用いて容易に精製されるが、他の方法では精製が困難である。その理由は、この調製方法はほとんど好まれないからである。
【０１８７】
実施例１４：Ｎ，Ｎ−ジヘプチル−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリニウムブロマイド（ｆｗ＝４１０．４９）の調製
【０１８８】
磁気攪拌棒、マントルヒーター、２５０ｍＬの添加漏斗、還流冷却器およびテフロン（登録商標）コートした熱電対を備えた５００ｍＬの３首丸底フラスコ中の１２０ｍＬのアセトニトリルに、４８．０ｇの新規に蒸留した１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（３６０ｍモル、ｆｗ＝１３３．１９）および４９．１ｇのジイソプロピルエチルアミン（３８０ｍモル、ｆｗ＝１２９．２５）が添加される。反応は、ゆっくりしたＮ２パージを伴う窒素雰囲気下で行われる。攪拌中の混合物は５０℃に加熱され、１４３．３ｇの新規に蒸留された１−ブロモヘプタン（０．８０モル、ｆｗ＝１７９．１１）が約６０分の期間にわたって滴下される。次いで、反応混合物は、約８０℃に１０〜１２時間加熱され、出発アミンが全て消費されることを確認するためにＨＰＬＣで定期的にモニターされる。反応混合物は、室温まで冷却され、５０％の水酸化ナトリウム水溶液を強く攪拌されながら滴下される。水層のｐＨはｐＨ試験紙でモニターされる。混合物が十分塩基性（約２９ｇＮａＯＨ）になると、下の水相は除去され、有機溶液が濾過され、揮発性成分（アセトニトリル、水、ジイソプロピルエチルアミン）を真空下で部分的に除去するためにロータリーエバポレーターに入れられる。生産物が溶液から結晶し始めると、約３００ｍＬのジエチルエーテルが攪拌しながら少しづつ添加される。混合物は４℃で終夜放置される。冷えた混合物は、焼結ガラスを通して濾過され、固体はジエチルエーテルで洗浄され、フィルタ上で乾燥窒素を通すことで乾燥される。それは最後には真空オーブン（５０℃、２０トル）で終夜乾燥される。この粗生成物は、最少量の熱い（７０℃）アセトニトリルに溶解し、熱い溶液をすぐに焼結ガラスを通して濾過し、冷やすことにより再結晶化される。結晶化は室温に放置することで起こり、冷却しながらジエチルエーテルを添加することで完了する。生産物は、以前と同様に完成される。この手順により、＞９９％純度（ＨＰＬＣ）を持つ約１０２ｇ（６９％）の白い結晶生産物が得られる。
【０１８９】
実施例１５：３，５−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルデシルアンモニウムメチル）−１−フルオロベンゼンジブロマイド（ｆｗ＝６５２．６８）の調製
【０１９０】
マントルヒーター、機械的攪拌器、５００ｍＬの添加漏斗、還流冷却器およびテフロン（登録商標）コートされた熱電対を備えた２Ｌの４首丸底フラスコ中の１Ｌの攪拌されているアセトニトリルに、７７．９ｇの新規に蒸留されたＮ，Ｎ−ジメチルデシルアミン（４２０ｍモル、ｆｗ＝１８５．３６）が添加される。反応は窒素雰囲気下で、ゆっくりとＮ２パージしながら行われる。攪拌されている混合物は５０℃に加熱され、２００ｍＬのアセトニトリル中の５６．４ｇの新規に再結晶された３，５−ビス（ブロモメチル）−１−フルオロベンゼン５（２００ｍモル、ｆｗ＝２８１．９６）が約６０分の時間をかけて滴下され、この反応は穏やかに発熱する。反応混合物はその後、約８０℃で３〜５時間加熱され、次いで、すぐに熱いうちに焼結ガラスフィルタを通して２Ｌのきれいなフィルターフラスコに濾過される。室温への冷却に関して、おびただしい量の白い結晶が溶液中に形成される。生産物は室温に約３時間放置することで溶液から結晶化され、混合物は４℃で終夜放置される。冷えた混合物は焼結ガラスフィルタを通して濾過され、冷えたアセトニトリルで、その後ｎ−ペンタンで洗浄され、最後に生産物を通して乾燥Ｎ２を通すことで乾燥される。生産物は、最後に真空オーブン（５０℃、２０トル）で終夜乾燥され、冷却され、密封容器中で保存される。この手順により、約１２５ｇ（９６％）の白色、結晶生産物が得られる。それは熱アセトニトリル（生成物１グラムあたり９〜１０ｇ溶媒）から再結晶化され、１２０ｇの精製された生成物（９９．５〜９９．８％純度、ＨＰＬＣ）を生じる。
【０１９１】
【表８】
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【０１９２】
【表９】
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【０１９３】
【表１０】
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【０１９４】
【表１１】
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【０１９５】
【表１２】
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【０１９６】
【表１３】
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【０１９７】
【表１４】
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【０１９８】
【表１５】
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【０１９９】
【表１６】
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【０２００】
【表１７】
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【０２０１】
【表１８】
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【０２０２】
【表１９】
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【０２０３】
【表２０】
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【０２０４】
【表２１】
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【０２０５】
【表２２】
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【０２０６】
【表２３】
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【０２０７】
【表２４】
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【０２０８】
【表２５】
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【０２０９】
【表２６】
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【０２１０】
【表２７】
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【０２１１】
【表２８】
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【０２１２】
【表２９】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ｂ（ａ）Ａ】
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【図６ｂ（ａ）Ｂ】
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【図７】
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【国際調査報告】
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