(57)【要約】  本発明は、粘膜免疫システムの調節のための組成物及び方法を特徴とする。前記組成物は、プロバイオティック有機体、ラクトバチルスパラカゼイCBA L74(国際寄託受託番号LMG P-24778)によって発酵する食品を含む。又は、前記組成物は、L.パラカゼイCBA L74及び生理学的に受容可能な担体を含み得る。一部の実施形態において、L.パラカゼイCBA L74は、非複製型であり得る。前記組成物は、免疫システムの未成熟、感染又は疾患に関する胃腸障害を有していたり、危険性のある対象体に投与され得る。
2014516589.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロバイオティックバクテリア、ラクトバチルスパラカゼイCBA L74、国際寄託受託番号LMG P-24778によって発酵した発酵食品を含む組成物。
【請求項２】
前記食品は、乳製品又はシリアル製品である請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記乳製品は、ミルク、ヨーグルト、凝乳、チーズ又は幼児用調製乳である請求項2に記載の組成物。
【請求項４】
前記シリアル製品は、米、小麦、オート麦、大麦、トウモロコシ、ライ麦、モロコシ、キビ又はライ小麦である請求項2に記載の組成物。
【請求項５】
前記食品は乾燥した請求項1〜4の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記乾燥した食品は、再水和される請求項1〜5の何れか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記再水和される乾燥食品は、免疫調節能を有する請求項6に記載の組成物。
【請求項８】
前記プロバイオティックバクテリアは、非複製型である請求項1〜7の何れか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記食品は、乾燥重量のグラム当たりのプロバイオティックバクテリアの約1×102cfu/g〜約1012cfu/gを含む請求項1〜8の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
プロバイオティックバクテリア、ラクトバチルスパラカゼイCBA L74、国際寄託受託番号LMG P-24778、及び生理学的に受容可能な担体を含む組成物。
【請求項１１】
前記生理学的に受容可能な担体は、食品である請求項10に記載の組成物。
【請求項１２】
前記食品は、乳製品又はシリアル製品である請求項11に記載の組成物。
【請求項１３】
前記乳製品は、ミルク、ヨーグルト、凝乳、チーズ又は幼児用調製乳である請求項12に記載の組成物。
【請求項１４】
前記シリアル製品は、米、小麦、オート麦、大麦、トウモロコシ、ライ麦、モロコシ、キビ又はライ小麦である請求項12に記載の組成物。
【請求項１５】
前記食品は乾燥した請求項10〜14の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記乾燥した食品は、再水和される請求項10〜15の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記再水和される乾燥食品は、免疫調節能を有する請求項16に記載の組成物。
【請求項１８】
前記プロバイオティックバクテリアは、非複製型である請求項10〜17の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記食品は、乾燥重量のグラム当たりのプロバイオティックバクテリアの約1×102cfu/g〜約1012cfu/gを含む請求項10〜18の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記生理学的に受容可能な担体は、薬剤的に受容可能な担体である請求項10に記載の組成物。
【請求項２１】
前記薬剤的に受容可能な担体は、脂質系又は重合体系コロイドを含む請求項20に記載の組成物。
【請求項２２】
前記コロイドは、リポソーム、ヒドロゲル、微粒子、ナノ粒子又はブロック共重合体ミセルである請求項21に記載の組成物。
【請求項２３】
前記重合体系コロイドは、カプセルである請求項21に記載の組成物。
【請求項２４】
前記プロバイオティックバクテリアは、非複製型である請求項20〜23の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記プロバイオティックバクテリアは、乾燥重量の約1×102cfu/g〜約1×1012cfu/gの単位用量形態からなる請求項20〜24の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物は、経口投与用として製剤化される請求項20〜25の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
a)食品を提供する段階と、
b)プロバイオティックバクテリア、ラクトバチルスパラカゼイCBA L74、国際寄託受託番号LMG P-24778の有効量及び必要に応じて、共接種物と食品とを組み合わせて混合物を形成する段階と、
c)発酵するのに十分な温度と時間で、前記混合物を培養する段階とを含む栄養組成物を形成する方法。
【請求項２８】
前記食品は、乳製品又はシリアル製品である請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
前記プロバイオティックバクテリアの量は、約1×106cfu/ml〜約5×106cfu/mlである請求項27又は28に記載の方法。
【請求項３０】
前記共接種物は、サーモフィルス菌である請求項27〜29の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記共接種物の量は、約1×104cfu/ml〜約1×105cfu/mlである請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記培養段階は、混合物におけるプロバイオティックバクテリアの濃度が約1×108cfu/ml〜約1×1010cfu/mlに到達するまで持続する請求項27〜31の何れか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記栄養組成物を乾燥する段階を更に含む請求項27〜32の何れか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記乾燥段階は、噴霧乾燥である請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
前記栄養組成物は、1つ以上のさらなる食品と更に組み合わせられる請求項27〜34の何れか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記追加の食品は、乳製品、シリアル製品、野菜系製品、果物系製品又はタンパク質系製品を含む請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
前記果物系製品は、トマト製品を含む請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
a)免疫システムの調節が必要な対象体を確認する段階と、
b)プロバイオティックバクテリア、ラクトバチルスパラカゼイCBA L74、国際寄託受託番号LMG P-24778によって発酵した食品を含む組成物の有効量を投与する段階とを含む対象体における免疫システムを調節する方法。
【請求項３９】
前記食品は、請求項1〜19の何れか一項に記載の食品を含む請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記対象体は、幼児である請求項38又は39に記載の方法。
【請求項４１】
a)胃腸障害の危険性のある対象体を確認する段階と、
b)プロバイオティックバクテリア、ラクトバチルスパラカゼイCBA L74、国際寄託受託番号LMG P-24778によって発酵した食品を含む組成物の有効量を投与する段階とを含む胃腸障害に発展する危険性のある対象体を治療する方法。
【請求項４２】
前記食品は、請求項1〜19の何れか一項に記載の食品を含む請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記胃腸障害は、粘膜免疫システムの欠乏、食物アレルギー、下痢関連の障害、バクテリア又はウイルス感染、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、クローン病、セリアック病又は壊死性腸炎である請求項41に記載の方法。
【請求項４４】
前記粘膜免疫システムの欠乏は、未成熟な免疫システムである請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
前記対象体は、幼児である請求項41〜44の何れか一項に記載の方法。
【請求項４６】
a)胃腸障害を有する対象体を確認する段階と、
b)プロバイオティックバクテリア、ラクトバチルスパラカゼイCBA L74、国際寄託受託番号LMG P-24778によって発酵した食品を含む組成物の有効量を投与する段階とを含む胃腸障害を有する対象体を治療する方法。
【請求項４７】
前記食品は、請求項1〜19の何れか一項に記載の食品を含む請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
前記胃腸障害は、粘膜免疫システムの欠乏、食物アレルギー、下痢関連の障害、バクテリア又はウイルス感染、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、クローン病、セリアック病又は壊死性腸炎である請求項46に記載の方法。
【請求項４９】
前記粘膜免疫システムの欠乏は、未成熟な免疫システムである請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
前記対象体は、幼児である請求項46〜49の何れか一項に記載の方法。
【請求項５１】
a)胃腸障害を有する対象体を確認する段階と、
b)プロバイオティックバクテリア、ラクトバチルスパラカゼイCBA L74、国際寄託受託番号LMG P-24778を含む薬剤組成物の有効量を投与する段階とを含む胃腸障害を有する対象体を治療する方法。
【請求項５２】
前記薬剤組成物は、請求項20〜26の何れか一項に記載の組成物を含む請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
前記胃腸障害は、粘膜免疫システムの欠乏、食物アレルギー、下痢関連の障害、バクテリア又はウイルス感染、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、クローン病、セリアック病又は壊死性腸炎である請求項51に記載の方法。
【請求項５４】
前記粘膜免疫システムの欠乏は、未成熟な免疫システムである請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
前記対象体は、幼児である請求項51〜54の何れか一項に記載の方法。
【請求項５６】
胃腸障害治療のための食品を製造するためのプロバイオティックバクテリア、ラクトバチルスパラカゼイCBA L74、国際寄託受託番号LMG P-24778の用途。
【請求項５７】
前記食品は、請求項1〜19の何れか一項に記載の食品を含む請求項56に記載の用途。
【請求項５８】
前記胃腸障害は、粘膜免疫システムの欠乏、食物アレルギー、下痢関連の障害、バクテリア又はウイルス感染、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、クローン病、セリアック病又は壊死性腸炎である請求項56又は57に記載の用途。
【請求項５９】
前記粘膜免疫システムの欠乏は、未成熟な免疫システムである請求項58に記載の用途。
【請求項６０】
前記対象体は、幼児である請求項56〜59の何れか一項に記載の用途。
【請求項６１】
胃腸障害治療のための薬剤を製造するためのプロバイオティックバクテリア、ラクトバチルスパラカゼイCBA L74、国際寄託受託番号LMG P-24778の用途。
【請求項６２】
前記薬剤組成物は、請求項20〜26の何れか一項に記載の組成物を含む請求項61に記載の用途。
【請求項６３】
前記胃腸障害は、粘膜免疫システムの欠乏、食物アレルギー、下痢関連の障害、バクテリア又はウイルス感染、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、クローン病、セリアック病又は壊死性腸炎である請求項61に記載の用途。
【請求項６４】
前記粘膜免疫システムの欠乏は、未成熟な免疫システムである請求項63に記載の用途。
【請求項６５】
前記対象体は、幼児である請求項61〜64の何れか一項に記載の用途。
【請求項６６】
請求項27〜37の何れか一項に記載の方法によって形成される栄養組成物。
【請求項６７】
プロバイオティックバクテリア、ラクトバチルスパラカゼイCBA L74、国際寄託受託番号LMG P-24778によって発酵した食品を含む栄養組成物の測定量と、包装材、使用説明書を含むパッケージインサート、殺菌液体、注入器及び殺菌容器からなる群より選択された1つ以上のアイテムを含むキット。
【請求項６８】
ラクトバチルスパラカゼイCBA L74、国際寄託受託番号LMG P-24778を含む薬剤組成物の測定量と、包装材、使用説明書を含むパッケージインサート、殺菌液体及び殺菌容器からなる群より選択された1つ以上のアイテムを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロバイオティック有機体、プロバイオティック有機体で製造された食品及びプロバイオティック有機体を含む薬剤組成物に関するものである。これらの組成物は、粘膜免疫システムを刺激し、粘膜免疫システムの未成熟に関する障害治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
腸内上皮は、宿主に有害又は有益になり得る異物に絶えず露出される。その結果として、腸管免疫システムは、1)腸内病原菌又は毒素によって誘導される防御的免疫反応、及び2)食物抗原及び一般に腸内に生息する1014個の共生有益微生物に対する免疫反応回避の間の繊細な均衡にぶつかる。防御反応又は耐性反応のうち何れか一方の崩壊は、例えば、感染、炎症、食物アレルギー、食物過敏症、炎症性腸疾患、クローン病、セリアック病、歯周疾患、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症(atherosclerosis)及び結腸癌を含む広範囲な障害をもたらし得る。
【０００３】
腸管免疫システムを含む免疫調整ネットワークは、老化によって変化する。前記ネットワークは、ヒト新生児で不十分に発達し、生涯の最初の数年に亘って次第に確立する。免疫システムの未成熟は、幼児及び小児における感染及び食物関連障害の有病率(prevalence)で役割を果たす。逆に、新たな攻撃(challenge)に反応する腸管免疫システムの性能は、老人において減少する。
【０００４】
胃腸障害、例えば、感染、炎症障害、及び食物アレルギー、食物不耐性(food intolerance)又は食物過敏症のような食物関連障害は、子供と成人にとって健康と生活の質に有意な影響を与える。伝染性胃腸炎(Infectious gastroenteritis)は、最も多く見られる小児胃腸障害である。約10億のエピソードが毎年世界中で発生し、5歳未満の子供のうち、開発途上国で最も多く見られる。伝染性胃腸炎の世界的な死亡率は、毎年平均300万〜600万の子供である。米国で、毎年2500万〜3500万の新たなケースが発生し、300〜400人の死傷者を出す。また、米国における伝染性胃腸炎は、10億ドルを超える費用で、約20万の入院及び150万の外来患者の訪問をもたらす。さらに、アレルギー等の食物関連障害は、子供と成人の健康に相当な影響を与える。食物アレルギーの症状は、アレルギーの重症度に応じて多様であり、口と唇の周辺での軽いヒリヒリ感から生命を脅かす過敏症まで多様である。食物アレルギーが米国で人口の1〜10％に影響を与えていると推定される。疾病管理本部(The Center for Disease Control)は、2007年に18歳未満の約300万の子供(3.9％)が去る12ヶ月間に食物又は消化性アレルギー(digestive allergy)を経験したと報告されたことを見つけた。一部の子供たちにおいて、食物アレルギーは、年齢と共に深刻でなくなるが、他の一部には生涯の心配事として残る。幼い時期にアレルギーを患った幼児は、「アレルギーマーチ(allergic march)」に発展し得る。例えば、幼い児期に乳牛のミルクに深刻なアレルギー反応を有する多数の個人は、幼年期後に喘息の発生に対する危険がある。食物アレルギーの有病率は、世界的に増加する兆候(indication)がある。
【０００５】
病因学にかかわらず、胃腸障害は、子供の健康に悪影響を与えるだけでなく、家庭経済学、社会的相互作用及び学校と父兄の職場出席率にも深刻な影響を与える。特に、胃腸障害を患ったり、その危険性のある個人に対し、胃腸の健康を増進させる治療戦略が継続して必要である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、発酵食品を含む組成物を提供し、その食品はプロバイオティックバクテリア、ラクトバチルスパラカゼイCBA L74(Lactobacillus paracasei CBA L74)、国際寄託受託番号LMG P-24778によって発酵したものである。前記食品は、乳製品又はシリアル製品であり得る。また、プロバイオティックバクテリア、ラクトバチルスパラカゼイCBA L74、国際寄託受託番号LMG P-24778及び生理学的に受容可能な担体を含む組成物を提供する。生理学的に受容可能な担体は、食品又は薬剤学的担体であり得る。また、栄養組成物を形成する方法を提供し、その方法は、食品を提供する段階と、プロバイオティックバクテリア、ラクトバチルスパラカゼイCBA L74、国際寄託受託番号LMG P-24778の有効量及び必要に応じて共接種物(co-inoculum)と食品を組み合わせて混合物を形成する段階と、発酵するのに十分な温度と時間の間、前記混合物を培養する段階とを含む。栄養組成物は乾燥していてもよい。栄養組成物は、1つ以上のさらなる食品と組み合わされてもよい。本明細書に説明されている組成物及び方法のうち何れかで、ラクトバチルスパラカゼイCBA L74細胞は、非複製型にする処理が行われ得る。組成物におけるラクトバチルスパラカゼイCBA L74の濃度は、例えば、栄養組成物又は薬剤組成物等の目的とする用途によって変更され得る。有用な範囲は、乾燥重量の、グラム当たり約1×1012コロニー形成単位(「cfu/g」：colony-forming units per gram)〜グラム当たり約1×1012コロニー形成単位の等価物を含む。
【０００７】
また、胃腸障害に発展する危険性のある対象体を治療する方法を提供し、その方法は、胃腸障害の危険性のある対象体を確認する段階とプロバイオティックバクテリア、ラクトバチルスパラカゼイCBA L74、国際寄託受託番号LMG P-24778によって発酵する食品を含む組成物の有効量を投与する段階とを含む。胃腸障害は、粘膜免疫システムの欠乏、例えば、未成熟な免疫システム、食物アレルギー、下痢関連の障害、バクテリア又はウイルス感染、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、クローン病、壊死性腸炎又は老化、特に胃腸系の老化であり得る。
【０００８】
また、胃腸障害を有する対象体を治療する方法を提供する。その方法は、胃腸障害を有する対象体を確認する段階とプロバイオティックバクテリア、ラクトバチルスパラカゼイCBA L74、国際寄託受託番号LMG P-24778によって発酵した食品を含む組成物の有効量を投与する段階とを含む。一部の実施形態において、その方法は、胃腸障害を有する対象体を確認する段階と、プロバイオティックバクテリア、ラクトバチルスパラカゼイCBA L74、国際寄託受託番号LMG P-24778を含む薬剤組成物の有効量を投与する段階とを含む。胃腸障害は、粘膜免疫システムの欠乏、例えば、未成熟な免疫システム、食物アレルギー、下痢関連の障害、バクテリア又はウイルス感染、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、クローン病、又は壊死性腸炎であり得る。
【０００９】
さらに、対象体において免疫システムを調節する方法を提供する。その方法は、免疫システムの調節が必要な対象体を確認する段階及びプロバイオティックバクテリア、ラクトバチルスパラカゼイCBA L74、国際寄託受託番号LMG P-24778によって発酵した食品を含む組成物の有効量を投与する段階を含む。
【００１０】
また、製造品を提供する。これらは、プロバイオティックバクテリア、ラクトバチルスパラカゼイCBA L74、国際寄託受託番号LMG P-24778によって発酵した発酵食品を含む栄養組成物の測定量と、包装材料、使用説明書を含むパッケージインサート(package insert)、殺菌液体、及び殺菌容器からなる群より選択された1つ以上のアイテムを含むキットを含み得る。一部の実施形態において、キットは、ラクトバチルスパラカゼイCBA L74、国際寄託受託番号LMG P-24778を含む薬剤組成物の測定量と、包装材料、使用説明書を含むパッケージインサート、殺菌液体、及び殺菌容器からなる群より選択された1つ以上のアイテムを含み得る。
【００１１】
本発明の1つ以上の実施形態の詳細は、以下の添付の図面と説明で記述される。本発明のその他の特徴、目的及び利点は、説明と図面及び請求項によって明確になるであろう。
【００１２】
本発明の特徴及び利点は、同一の番号が同一の部分を指す以下の図面と共に、後述する本発明の好ましい実施形態の詳細な説明によって開示され明確になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】DC細胞の表現型に対するL.パラカゼイCBA L74の効果の分析を示す表である。
【図２ａ】L.パラカゼイCBA L74に露出したCaco2と共培養されたDCにおいて、IL-10の生成を示すグラフである。
【図２ｂ】L.パラカゼイCBA L74に露出したCaco2と共培養されたDCにおいて、IL-12の生成を示すグラフである。
【図３】Caco2細胞と共培養されたDCに露出したT細胞の増殖を示すグラフである。
【図４】L.パラカゼイCBA L74が補充されたマウスの腸粘膜におけるIL-1βの生成を示すグラフである。
【図５】L.パラカゼイCBA L74が補充されたマウスの腸粘膜におけるIL-4の生成を示すグラフである。
【図６】L.パラカゼイCBA L74が補充されたマウスの腸粘膜におけるIgAの生成を示すグラフである。
【図７】L.パラカゼイCBA L74が補充されたマウスの腸粘膜におけるTLR2、TLR4及びTLR9のレベル分析を示すグラフである。
【図８】L.パラカゼイCBA L74が補充されたマウスの腸粘膜におけるPPARγのレベル分析を示すグラフである。
【図９ａ】L.パラカゼイCBA L74が補充されたマウスにおける血清IL-1βのレベルを示すグラフである。
【図９ｂ】L.パラカゼイCBA L74が補充されたマウスにおける血清IL-4のレベルを示すグラフである。
【図１０】L.パラカゼイCBA L74が補充されたマウスにおけるDC表現型に対するL.パラカゼイCBA L74の効果分析を示す表である。
【図１１ａ】L.パラカゼイCBA L74が補充されたマウスにおける腸内のCD4+リンパ球の表現型を示すグラフである。
【図１１ｂ】L.パラカゼイCBA L74が補充されたマウスにおける腸内のCD8+リンパ球の表現型を示すグラフである。
【図１２】L.パラカゼイCBA L74によって発酵したミルクが補充されたマウスの腸粘膜におけるIL-10の生成を示すグラフである。
【図１３】L.パラカゼイCBA L74によって発酵したミルクが補充されたマウスの腸粘膜におけるIL-1βの生成を示すグラフである。
【図１４】L.パラカゼイCBA L74によって発酵したミルクが補充されたマウスの腸粘膜におけるIgAの生成を示すグラフである。
【図１５】L.パラカゼイCBA L74によって発酵したミルクが補充されたマウスの腸粘膜におけるTLR2、TLR4、TLR9及びPPARγのレベルの分析を示すグラフである。
【図１６】L.パラカゼイCBAによって発酵したミルクが補充されたマウスの腸粘膜におけるpNF-κB及びIKBαのレベルの分析を示すグラフである。
【図１７】L.パラカゼイCBAによって発酵したミルクが補充されたマウスにおけるDC細胞の表現型に対するL.パラカゼイCBA L74の効果の分析を示すグラフである。
【図１８】L.パラカゼイCBAによって発酵したミルクが補充されたマウスにおけるLPS又はCpGに露出後のDC細胞表現型に対するL.パラカゼイCBA L74の効果の分析を示すグラフである。
【図１９】L.パラカゼイCBA L74によって発酵したミルクが補充されたマウスにおける腸内のCD4+リンパ球の表現型を示すグラフである。
【図２０】L.パラカゼイCBA L74によって発酵したミルクが補充されたマウスにおける腸内のCD8+リンパ球表現型を示すグラフである。
【図２１】L.パラカゼイCBA L74によって発酵したミルクが補充されたマウスにおける回腸粘膜(ileal mucosa)の組織学的評価を示すグラフである。
【図２２】L.パラカゼイCBA L74によって発酵した米が補充されたマウスの腸粘膜におけるIL-1β及びIL-4の生成を示すグラフである。
【図２３】L.パラカゼイCBA L74によって発酵した米が補充されたマウスの腸粘膜におけるIL-10の生成を示すグラフである。
【図２４】L.パラカゼイCBA L74によって発酵した米が補充されたマウスの腸粘膜におけるTLR2及びTLR4のレベルの分析を示す図面である。
【図２５ａ】L.パラカゼイCBA L74によって発酵した米が補充されたマウスの腸粘膜におけるPPARγのレベルの分析を示す図面である。
【図２５ｂ】L.パラカゼイCBA L74によって発酵した米が補充されたマウスの腸粘膜におけるpNF-κB及びIKBαのレベルの分析を示す図面である。
【図２６】L.パラカゼイCBA L74によって発酵した米が補充されたマウスにおけるDC表現型に対するL.パラカゼイCBA L74の効果の分析を示す表である。
【図２７】L.パラカゼイCBA L74によって発酵した米が補充されたマウスにおけるLPS又はCpGに露出後のDC表現型に対するL.パラカゼイCBA L74の効果の分析を示す表である。
【図２８】L.パラカゼイCBA L74によって発酵した米が補充されたマウスにおける腸内のCD4+リンパ球表現型を示すグラフである。
【図２９】L.パラカゼイCBA L74によって発酵した米が補充されたマウスにおける腸内のCD8+リンパ球表現型を示すグラフである。
【図３０】ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)が存在するときのヒトMoDCにおけるIL-10の生成に対するL.パラカゼイCBA L74細胞及び細胞上清液の効果の分析を示すグラフである。
【図３１】ネズミチフス菌が存在するときのヒトMoDCにおけるIL-12p70の生成に対するL.パラカゼイCBA L74細胞及び細胞上清液の効果の分析を示すグラフである。
【図３２】ネズミチフス菌が存在するときのヒトMoDCにおけるIL-10の生成に対するL.パラカゼイCBA L74発酵ミルクの効果、及びネズミチフス菌が存在するときのヒトMoDCにおけるIL-10の生成に対するL.パラカゼイCBA L74の不活性化の効果の分析を示すグラフである。
【図３３】ネズミチフス菌が存在するときのヒトMoDCにおけるIL-12p70の生成に対するL.パラカゼイCBA L74発酵ミルクの効果、及びネズミチフス菌が存在するときのヒトMoDCにおけるIL-12p70の生成に対するL.パラカゼイCBA L74の不活性化の効果の分析を示すグラフである。
【図３４】ネズミチフス菌が存在するときの腸組織の体外移殖片のモデルにおけるIL-1β、TNF-α及びIL-10に対するL.パラカゼイCBA L74発酵米の効果の分析を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、部分的に、プロバイオティック有機体のラクトバチルスパラカゼイ、菌株CBA L74によって発酵した食物が免疫調節の特性を有し得るという発明者の発見に基づく。かかる菌株は発明者によって分離され、ベルギーのヘント所在のBelgian Coordinated Collections of Micro-organisms(BCCM) Laboratorium voor Microbiologie(LMG)で2008年9月9日に、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下で寄託された。国際寄託機関(International Depositary Authority)によって付与された受託番号は、LMG P-24778である。可読性のために、全ての場合に「受託番号LMG P-24778」フレーズを繰り返すことはない。L.パラカゼイ、菌株CBA L74を指した場合、受託番号LMG P-24778を有する寄託された菌株を指すと理解すべきである。
【００１５】
本発明の組成物は、プロバイオティック有機体、L.パラカゼイCBA L74を含む。世界保健機関は、「適正な量で投与したとき、宿主に健康上の利得を与える生微生物」としてプロバイオティックを定義している。一部の実施形態において、L.パラカゼイCBA L74について、例えば、熱、乾燥、γ-放射線、又はuv-放射線への露出により、非複製型にする処理を行うことができる。非複製型のL.パラカゼイCBA L74は、死細胞又は細胞分裂をできないようにした生細胞であり得る。非複製型のL.パラカゼイCBA L74は、無傷細胞(intact cell)、或いは、部分的又は完全に溶菌された細胞であり得る。一部の実施形態において、非複製型細胞は、無傷細胞と溶菌された細胞の混合を含み得る。
【００１６】
L.パラカゼイCBA L74を含むか、これにより発酵した組成物の投与によって発生する所定の出来事が理解されると信じるが、本発明の組成物は、任意の特定の細胞メカニズムに影響することで作用することに限定されない。本発明者の作用仮説は、プロバイオティック有機体又はプロバイオティック有機体で発酵した組成物が粘膜でバクテリアの転移及びバクテリア産物に対し増加した障壁を提供し、潜在的な病原菌を競合的に除外させ、微生物産物への宿主の反応を修正し、病原菌の成長を抑制する方法で経腸栄養(enteral nutrition)を向上させることができるというものである。非複製型のプロバイオティック有機体を含む組成物の有益な効果は、例えば、発酵中に生成された代謝産物から、例えば、乳酸、酪酸又は酢酸のような有機酸を得ることができる。或いは又は更に、微生物のDNA、例えば、ビメチル化CpGジヌクレオチド、バクテリア細胞壁の破片及びタンパク質、炭水化物、脂質のような他の準細胞(sub-cellular)のバクテリア成分は、粘膜免疫システムに対する免疫調節効果を発揮し得る。
【００１７】
本発明者は、試験管内(in vitro)及び(in vivo)生体内の分析において、分離されたL.パラカゼイCBA L74が炎症誘発マーカー及び抗炎症マーカー(pro- and anti-inflammatory marker)のレベルを調節したということを見つけた。更に、免疫調節効果は、L.パラカゼイCBA L74によって発酵した食物の投与以降に観察された。かかる免疫調節効果は、例えば、発酵食物が熱により処理され、L.パラカゼイCBA L74を非複製型にしたときにも確認された。よって、本発明は、腸管免疫システムを刺激するのに用いられ得る組成物と方法を特徴とする。前記組成物は、L.パラカゼイCBA L74によって発酵した食品を含み得る。食品は、L.パラカゼイCBA L74による発酵に好適な広範囲な食物の何れかであり得る。一部の実施形態において、前記組成物は、分離されたL.パラカゼイCBA L74及び生理学的担体を含み得る。担体は食品であり得るが、本発明はこれに限らず、一部の実施形態で担体は薬理学的担体であってもよい。また、前記組成物を製造して使用する方法を提供する。本発明の方法は、L.パラカゼイCBA L74を含む組成物を製造する方法、L.パラカゼイCBA L74によって食品を発酵する方法、及び対象体において免疫調節反応を発生するよう組成物を投与する方法を含む。組成物は、未成熟な免疫システムを有する対象体、胃腸障害の危険性のある対象体、又は胃腸障害を有する対象体に投与され得る。前記方法は、ヒト対象体、例えば、幼児及び子供に、又は獣医学で使用され得る。対象体(ヒト又は非ヒト)にかかわらず、本方法の何れかは、対象体を確認する段階を含む。例えば、前記方法は、対象体が治療を必要とするか否かを決定する段階を含み得る。
【００１８】
＜組成物＞
発酵食物
本発明の組成物は、栄養組成物、即ち、プロバイオティック有機体、L.パラカゼイCBA L74によって発酵した食品を含む。L.パラカゼイCBA L74による発酵に好適な任意の食品が使用されてもよい。食品は、乳製品、例えば、ミルク又は乳系製品(milk-based product)であり得る。例示された乳源は、制限なく、牛、羊、ヤギ、ヤク、水牛、馬、ロバ、トナカイ及びラクダを含む。乳源にかかわらず、ミルク又はミルク製品は、L.パラカゼイCBA L74による発酵に好適な任意の形態であり得る。例えば、ミルクは、全乳、又は乳脂肪の一部又は全部を除去する工程を経たミルク、例えば、2％のミルク、1％のミルク又は無脂肪ミルクである。或いは又は更に、ミルクは事前に低温殺菌及び/又は均質化、乾燥及び還元され、濃縮又は蒸留され得る。また、カゼイン、乳清タンパク質(whey protein)又はラクトースを含有するミルク製品の一部が使用されてもよい。一部の実施形態において、ミルク製品は、約1％〜約30％還元された脱脂粉乳、例えば、約2％、約5％、約7％、約9％、約10％、約12％、約15％、約20％、約25％、約30％還元された脱脂粉乳である。発酵前に、ミルク製品は、a)炭水化物(例えば、デキストロース又は澱粉のような二糖類)；b)脂質；c)ビタミン及びd)ミネラルの1つ以上と組み合わせ可能である。例えば、脱脂粉乳は、約2％、例えば、約0.25％、約0.50％、約0.75％、約1.0％、約1.5％又は約2.0％でデキストロースと組み合わされてもよい。
【００１９】
食品は、シリアル製品、例えば、米、小麦、オート麦、大麦、トウモロコシ、ライ麦、モロコシ、キビ又はライ小麦(triticale)であり得る。シリアル製品は、全粒(whole grain)、又は小麦粉に製粉され得る。食品は、1種のシリアル又は2種以上のシリアルの混合物、例えば、オート麦粉と麦芽大麦粉の混合物であり得る。シリアル製品は、ヒトの消費に好適な等級及び形態であったり、家畜による消費に好適な製品であり得る。一般的に、シリアル製品は発酵前に水和される。シリアルの濃度は多様であり得るが、有用な範囲は、約5％〜約50％重量/体積、例えば、約8％重量/体積、約10％重量/体積、約12％重量/体積、約15％重量/体積、約18％重量/体積、約20％重量/体積、約22％重量/体積、約25％重量/体積、約30％重量/体積、約35％重量/体積、約40％重量/体積、約45％重量/体積又は約50％重量/体積を含む。例示された濃度は、15％重量/体積の米、又は18.5％重量/体積のオート麦粉と、5％重量/体積の麦芽大麦粉の混合を含む。水和されたシリアルのpHは、消費に好適な任意の酸を使用して調整されてもよい。酸は、例えば、有機酸であり得る。有用な有機酸は、酢酸、クエン酸、乳酸、アジピン酸、リンゴ酸及び酒石酸を含む。2種以上の酸の任意の組み合わせを使用し得る。一部の実施形態において、pHはクエン酸を使用して約4.0に調整されてもよい。
【００２０】
また、食品は、野菜又は果物製品、例えば、ジュース、ピューレ、濃縮液、ペースト、ソース、ピクルス又はケチャップであり得る。例示された野菜及び果物は、制限なく、スカッシュ、例えば、ズッキーニ、イエロースカッシュ、 ウィンタースカッシュ、カボチャ；ジャガイモ、アスパラガス、ブロッコリー、芽キャベツ、豆、例えば、サヤマメ、ワックス・ビーン、ライマメ、ソラマメ、大豆、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、キュウリ、コールラビ、ニラネギ、春タマネギ(scallions)、タマネギ、 シュガーピー(sugar peas)、イングリッシュピー(English peas)、コショウ、カブ、ルタバガ(rutabagas)、トマト、リンゴ、ナシ、モモ、スモモ、イチゴ、ラズベリー、ブラックベリー、ブルーベリー、コケモモ(lingonberries)、ボイセンベリー、グーズベリー、ブドウ、スグリ(currants)、オレンジ、レモン、グレープフルーツ、バナナ、マンゴー、キウイ及びスターフルーツを含む。
【００２１】
また、食品は、穀物類(大麦、オート麦もしくはスペルト「ミルク」)、殻果類(tree nuts)(アーモンド、カシュー、ココナッツ、ヘーゼルナッツもしくはクルミ「ミルク」)、マメ科植物類(大豆(soy)、ピーナッツ、エンドウマメもしくはルピン「ミルク」)もしくは種子類(キヌア、ゴマの種もしくはヒマワリの種「ミルク」)からなる「ミルク」であり得る。
【００２２】
また、動物性タンパク質、例えば、肉類、例えば、ソーセージ、乾燥肉類、魚及び乾燥魚の製品を含む食品が考慮される。
【００２３】
使用される食品の種類にかかわらず、製品は、L.パラカゼイCBA L74と組み合わせられ、発酵が発生するのに好適な時間と温度で培養される。本技術分野で公知となっている任意の標準発酵方法が使用されてもよい。具体的な発酵条件は、例えば、食品の種類、食品の濃度、使用される機器、サンプルの体積、L.パラカゼイCBA L74接種物の初期濃度、共接種物の存在可否、発酵食物の官能特性、及び発酵食物の使用目的を含む多くの因子によって多様である。
【００２４】
生菌バクテリア及び/又は真菌類及び/又は感染性ウイルスのレベルを減少又は除去するために、機器及び基質(即ち、発酵する食品)は、L.パラカゼイCBA L74で接種する前に殺菌される。機器は、標準方法を使用するか、製造者の指示に従って殺菌され得る。基質の殺菌に対する具体的な方法の選択は、部分的に、殺菌方法に対する基質の安定性によって変わるであろう。例えば、基質は、蒸気と圧力、例えば、オートクレーブ(autoclaving)による殺菌、加熱と冷却の繰り返しの循環(例えば、チンダル間欠滅菌法(tyndallization))、高圧への露出(例えば、超高圧処理(pascalization))、限外ろ過、又は放射線(例えば、ガンマ線、x線、e線、及び/又は紫外線(10nm〜320nmの波長、例えば、50nm〜320nm、100nm〜320nm、150nm〜320nm、180nm〜320nm、又は200nm〜300nm)への露出)によって殺菌され得る。基質の分画物(aliquots)は処理した後除去され、バクテリア性及び/又は真菌性汚染物質の不存在を確認するために、好適な培地に塗抹され得る。基質を高温露出によって殺菌させると、L.パラカゼイCBA L74の接種前に少なくとも37℃に冷却させなければならない。
【００２５】
基質は、例えば、接種前に短時間で、水性培地に再懸濁されている新たな液体培養又はフリーズドライ培養から標準方法によってL.パラカゼイCBA L74で接種され得る。一般的に、L.パラカゼイCBA L74は、基質の約0.5×106〜約1×106cfu/mlの濃度、例えば、約1×106cfu/ml、約2×106cfu/ml、約5×106cfu/ml、7×106cfu/ml、8×106cfu/mlで添加される。培養はバクテリアと基質の相対的に均一な分布をなすように十分に攪拌されなければならないが、L.パラカゼイCBA L74が嫌気性バクテリアであるので、過度な攪拌はよくない。例えば、5リットルの培養は、約150rpmで攪拌されてもよい。発酵温度は、一般に37℃である。多様なパラメータ、例えば、pH、O2の分圧、攪拌速度、温度、気体混合、発泡レベル及び基質の濃度は、発酵の間に観測され、適度に調整され得る。L.パラカゼイCBA L74の生長は、標準的な微生物学的方法を使用して観測され得る。L.パラカゼイCBA L74の濃度が約108/mlと約109/mlの間になるまで発酵を実施する。基質及び他の条件に応じて、接種後の約10〜約30時間、例えば、約12時間、約15時間、約18時間、約24時間、約30時間内にこの濃度に到達できる。
【００２６】
基質のサンプルは、標準的な微生物学的方法を使用し、品質保証のために、発酵前、発酵途中及び発酵後に分析され得る。例示される方法は、L.パラカゼイCBA L74のためのロゴサ寒天(Rogosa agar)上での生長、好気性生物のための標準寒天(PCA；plate count agar)上での生長、大腸菌(coliforms)のためのマッコンキー寒天(McConkay agar)上での生長、クロストリジウム(Clostridia)のための強化クロストリジウム寒天(RCM；reinforced clostridial agar)上での生長を含むが、これに限定されない。コロニー計数以外に、コロニー形態が観察でき、参照サンプルと比較できる。
【００２７】
一部の実施形態において、共接種物は発酵開始を助けるために、L.パラカゼイCBA L74と共に添加され得る。ミルク製品の発酵に有効な共接種物は制限がなく、例えば、サーモフィルス菌(Streptococcus thermophilus)、ラクトバチルス パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス サリバリウス(Lactobacillus salivarious)、ラクトバチルス ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス ラクチス(Lactobacillus lactis)、ラクトバチルス デルブリュッキー(Lactobacillus delbrueckii)、亜種ブルガリクス(subsp. Bulgaricus)、ラクトバチルス アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス ブレビス(Lactobacillus brevis)、又はロイコノストック メセンテロイデス (Leuconostoc mesenteroides)を含む。一般的に、共接種物の濃度は、L.パラカゼイCBA L74の濃度よりも低く、例えば、約1×104/ml〜1×105/mlであろう。S.サーモフィルス(S. thermophilus)の最終濃度は、約0.5×108/ml〜約2.5×108/mlの範囲であり得る。
【００２８】
食品
L.パラカゼイCBA L74の好適な濃度に到達すると、発酵食物は用途のために更に加工され得る。一部の実施形態において、発酵食物のpHは、NaOH又はKOHを添加することで、例えば、約3.0〜中性付近まで、例えば、6.5まで調整され得る。一部の実施形態において、発酵食物は乾燥され得る。発酵食品は、発酵食物の免疫調節の特性を保持できる本技術分野に公知となっている任意の方法によって乾燥され得る。例示される乾燥方法は、噴霧乾燥、フリーズドライ、例えば、凍結乾燥(lyophilization)、又はドラム乾燥(drum-drying)を含む。発酵食品の最終含水量(water content)は多様であってもよいが、約1％と約10％以上の間であり得る。一部の実施形態において、乾燥過程は、L.パラカゼイCBA L74の非複製型を作ることができる。
【００２９】
乾燥し発酵食物は使用前に水和され得る。水和に使用された液体の量に応じて、発酵食品はL.パラカゼイCBA L74の約102及び1012cfu/mlの等価物を含有してもよい。乾燥したL.パラカゼイCBA L74はコロニーを形成しないので、乾燥段階の前に発酵食物に存在していた生菌の数によって計算されると理解できる。一部の実施形態において、発酵食品は乾燥重量の約107〜約1012cfu/gの等価物、例えば、約 5×107cfu/g、約1×108cfu/g、約5×108cfu/g、約1×109cfu/g、約5×109cfu/g、約1×1010cfu/g、約5×1010cfu/g、約1×1011cfu/g、約5×1011cfu/gを含んでもよい。
【００３０】
本発明の方法によって製造された2つ以上の発酵食品は、投与前に組み合わされてもよい。例えば、発酵乳製品は、発酵したシリアル製品と組み合わされてもよい。或いは、発酵食品は、他の食品、例えば、無発酵食品又は他のバクテリア菌株を用いて発酵した食品と組み合わせられる。発酵食物の免疫調節の特性が保持される限り、任意の組み合わせが使用され得る。例示される食品には制限がなく、乳製品、例えば、ミルク、ヨーグルト、凝乳、チーズ及びチーズ系製品、発酵乳、乳系発酵製品、乳系粉末、幼児用調製乳、乳系離乳食、 アイスクリーム、 ジェラート、プディング、スープ、ソース、ピューレ、又はドレッシング、老人用栄養学的フォーミュラ(nutritional formula)；シリアル製品、例えば、パブラム(pablum)、シリアル系離乳食、オートミール、穀粉(farina)、セモリナ、ポレンタ、パスタ、ビスケット、クラッカー、エネルギーバー；野菜製品、例えば、ピューレ、野菜系離乳食、キュウリ、キャベツ、ニンジン、豆、コショウ、又はレリッシュ(relish)を含む野菜の漬け物；果物製品、例えば、果物系離乳食、トマト製品、ピューレ、ソース、ペースト、ケチャップ、果物ピューレ：又はタンパク質系製品、例えば、マメ科植物類、ソーセージ、ランチミート(lunch meats)、ホットドッグ、又は肉のピューレが挙げられる。一部の実施形態において、発酵食物は、ペット用飼料又は動物飼料と組み合わされてもよい。 
【００３１】
一部の実施形態において、組成物は、全て又は実質的に全てのL.パラカゼイCBA L74細胞が除去されているL.パラカゼイCBA L74発酵物(fermentate)を含み得る。生長培地から細胞を分離する方法は、本技術分野でよく知られており、物理的な方法、例えば、細胞ペレット及び培養上清液を生成する遠心分離、ろ過、限外ろ過、タンジェンシャルフローろ過、一般フローろ過(normal flow filtration)又は逆浸透圧で行うことができる。或いは又は更に、分離方法はリガンド系であり得、例えば、L.パラカゼイCBA L74に特異的に結合する抗体を含む。抗体は、磁性ビード(magnetic bead)のような固体支持体に結合できる。
【００３２】
分離したL.パラカゼイCBA L74
一部の実施形態において、本発明の組成物は、菌を成長させる培地から部分的又は実質的に分離したL.パラカゼイCBA L74を含む。L.パラカゼイCBA L74は、例えば、熱処理等によって不活性化された非複製型、又は生であり得る。細胞は、細胞生存力を維持する条件下で、凍結乾燥又はフリーズドライされ得る。凍結乾燥の方法は、本技術分野でよく知られている。
【００３３】
生理学的担体
一部の実施形態において、本発明の組成物は、生理学的に受容可能な担体と組み合わせて、分離したL.パラカゼイCBA L74を含んでもよい。L.パラカゼイCBA L74は、例えば、熱処理等によって不活性化された非複製型、又は生であり得る。服用量は多様であり得るが、乾燥重量の約102〜約1012cfu/gの等価物、例えば、1×102cfu/g、5×102cfu/g、1×103cfu/g、5×103cfu/g、1×104cfu/g、5×104cfu/g、1×105cfu/g、5×105cfu/g、1×106cfu/g、5×106cfu/g、1×107cfu/g、5×107cfu/g、1×108cfu/g、5×108cfu/g、1×109cfu/g、5×109cfu/g、1×1010cfu/g、5×1010cfu/g、1×1011cfu/g、5×1011cfu/g、1×1012cfu/gの範囲であり得る。
【００３４】
生理学的に受容可能な担体は、食物又は食品であり得る。分離したL.パラカゼイCBA L74は、包装又は加工する前に食物又は食品に添加され得る。或いは又は更に、分離したL.パラカゼイCBA L74は、消費される前に食物又は食品に添加され得る。例えば、分離されたL.パラカゼイCBA L74は、上述の食物又は食品の何れかと組み合わせられ得る。食品は、発酵食品又は無発酵食品であり得る。例えば、分離したL.パラカゼイCBA L74は、無発酵の乳製品又はシリアル製品に添加され得る。一部の実施形態において、L.パラカゼイCBA L74は、乾燥重量の約107〜約1012cfu/gの等価物、例えば、約5×107cfu/g、約 1×108cfu/g、約 5×108cfu/g、約 1×109cfu/g、約 5×109cfu/g、約 1×1010cfu/g、約 5×1010cfu/g、約 1×1011cfu/g、約 5×1011cfu/gを含むように食物又は食品に添加され得る。
【００３５】
薬剤学的担体
また、組成物は、薬剤的に受容可能な担体を含む。「薬剤的に受容可能な」(又は「薬理的に受容可能な」)という用語は、動物又はヒトに適切に投与する際、副作用、アレルギー反応又はその他有害反応をもたらさない分子実体及び組成物を指す。本明細書で使用される用語「薬剤的に受容可能な担体」は、薬剤的に受容可能な物質に対する媒質として使用できるあらゆる溶媒、分散媒、塗布剤、抗菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝剤、賦形剤(excipient)、バインダー、潤滑剤、ゲル、界面活性剤等を含む。
【００３６】
また、本発明は、1つ以上の薬剤的に受容可能な担体と組み合わせて、本明細書で説明したL.パラカゼイCBA L74を有効成分として含有する薬剤組成物を含む。一部の実施形態において、L.パラカゼイCBA L74は、薬剤的に受容可能な担体と組み合わされる前又は後に、従来の殺菌技術を使用して殺菌され得る。本発明の組成物を形成する際、L.パラカゼイCBA L74は、一般に賦形剤と混合されたり、賦形剤によって希釈されたり、又は、例えば、カプセル、錠剤、サシェ(sachet)、紙、又はその他容器の形態でこのような担体に封入される。賦形剤が希釈剤として機能する場合、固体、半固体、又は液状材料(例えば、生理食塩水)であり得、有効成分のための運搬体、担体又は媒質として作用する。従って、組成物は、錠剤、丸薬(pill)、粉剤、ロゼンジ(lozenge)、サシェ、 カシェー剤(cachet)、エリキシル剤、懸濁液、乳液、溶液、シロップ、エアロゾル(固体又は液体媒質)、軟膏、ソフト及びハードゼラチンカプセル、座薬、滅菌注射液及び滅菌密封粉剤の形態であり得る。本技術分野で公知となっているように、希釈剤の種類は、目的とする投与の経路によって多様であり得る。結果的に生じる組成物は、防腐剤のような添加剤を含み得る。賦形剤又は担体は、投与方式及び経路に基づいて選択される。好適な薬剤学的担体のみならず、薬学製剤用の薬剤必需品は、この分野で公知の参照文献であるRemington’s Pharmaceutical Sciences(E. W. Martin)及びUSP/NF(米国薬局方-国民医薬品集(United States Pharmacopeia and the National Formulary))に記載されている。好適な賦形剤の一部の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アラビアゴム(gum acacia)、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント(tragacanth)、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、及びメチルセルロースが挙げられる。製剤は、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイル等の潤滑剤；湿潤剤；乳化及び懸濁剤；メチル及びプロピルヒドロキシベンゾエート等の保存剤；甘味剤；及び着香剤をさらに含み得る。薬剤組成物は、本技術分野で公知の方法を採用することで、患者への投与後、有効成分の早期、持続又は遅延放出を提供するために製剤化され得る。
【００３７】
本方法において用いられる薬剤的に受容可能な組成物は、経口デリバリーのためにL.パラカゼイCBA L74がコロイドに含まれたものを含み、標準技術によって製造され得る。L.パラカゼイCBA L74は、粉砕(gringing)又は微粉(pulverizing)することで、乾燥・圧縮され、経口投与用カプセルの中に挿入され得る。一部の実施形態において、L.パラカゼイCBA L74は、1つ以上の賦形剤、例えば、崩壊剤(disintegrant)、充填剤(filler)、滑沢剤(glidant)、又は保存剤と組み合わせられ得る。好適なカプセルは、ハードシェルカプセル又はソフトシェルカプセルを含む。任意の脂質系又は重合体系コロイドがカプセルを形成するために用いられてもよい。コロイド製造に有用な例示されるポリマーは、ゼラチン、カラギーナン(carrageenan)等の植物性多糖類又はその誘導体、澱粉及びセルロースの変形した形態、例えば、ハイプロメロース(hypromellose)が挙げられる。必要に応じて、カプセルの硬度を減らすために、例えば、グリセリン及び/又はソルビトール等の可塑剤、着色剤、保存剤、崩壊剤、潤滑剤及び表面処理剤等、その他の成分をゲル化剤溶液に添加してもよい。一部の実施形態において、カプセルはゼラチンを含まない。他の実施形態において、カプセルは植物性多糖類又はその誘導体を含まない。
【００３８】
獲得される原料又は方法にかかわらず、本発明のL.パラカゼイCBA L74は、その用途に応じて製剤化され得る。これらの組成物は、薬剤技術分野に公知の方法で製造でき、局所又は全身治療が好ましいかどうか及び治療される部位に応じて、多様な経路によって投与され得る。投与は、経口又は局所(眼球を含み、鼻腔、膣及び直腸デリバリーを含む粘膜に)であってもよい。一部の実施形態において、投与は、肺(例えば、ネブライザー(nebulizer)等による粉末又はエアロゾルの吸入(inhalation)又は送気(insufflation)による；気管内、鼻腔内、上皮及び経皮)又は眼球であればよい。眼球デリバリーの方法としては、局所投与(点眼)、結膜下、眼球周囲もしくは硝子体内注射、又は結膜嚢に外科的に配置されたバルーンカテーテル(balloon catheter)もしくは眼球挿入物による導入が挙げられる。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射もしくは注入；又は頭蓋内、例えば、脊髄腔内もしくは脳室内投与が挙げられる。非経口投与は、単回服用量の形態とすることができ、或いは、例えば、連続的灌流ポンプによるものであってもよい。局所投与用薬剤組成物及び剤形は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、ドロップ、座薬、スプレー、液剤、粉末等が挙げられる。従来の薬剤学的担体、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤等が必要又は好ましいものであり得る。
【００３９】
組成物は、単位服用量の形態で製剤化でき、それぞれの服用量は、例えば、一日服用量当たり、L.パラカゼイCBA L74の約0.005ｍｇ〜約2000ｍｇを含む。「単位服用量の形態」という用語は、ヒト対象体及びその他哺乳類に対する単一の服用量であって、好適な物理的個別単位をいい、それぞれの単位は、好適な薬剤用賦形剤と組み合わせて好ましい治療効果をもたらすように計算された活性物質の所定量を含む。錠剤等の固体組成物を製造するために、主要な有効成分は薬剤用賦形剤と混合され、本発明の化合物の均質混合物を含む固体予備処方(preformulation)組成物を形成する。これらの予備処方組成物が均質であるとした場合、有効成分は一般に組成物全体に亘って均一に分散され、組成物が錠剤、丸薬及びカプセル等の同等に有効な単位服用量の形態で容易に分割できる。次いで、かかる固体予備処方は、例えば、本発明のL.パラカゼイCBA L74の約0.005ｍｇ〜約1000ｍｇを含む前記タイプの単位服用量の形態に分割される。
【００４０】
組成物は、単位服用量の形態で製剤化でき、それぞれの服用量は、例えば、有効成分の約0.1ｍｇ〜約50ｍｇ、約0.1ｍｇ〜約40ｍｇ、約0.1ｍｇ〜約20ｍｇ、約0.1ｍｇ〜約10ｍｇ、約0.2ｍｇ〜約20ｍｇ、約0.3ｍｇ〜約15ｍｇ、約0.4ｍｇ〜約10ｍｇ、約0.5ｍｇ〜約1ｍｇ；約0.5ｍｇ〜約100ｍｇ、約0.5ｍｇ〜約50ｍｇ、約0.5ｍｇ〜約30ｍｇ、約0.5ｍｇ〜約20ｍｇ、約0.5ｍｇ〜約10ｍｇ、約0.5ｍｇ〜約5ｍｇ；約1ｍｇ〜約50ｍｇ、約1ｍｇ〜約30ｍｇ、約1ｍｇ〜約20ｍｇ、約1ｍｇ〜約10ｍｇ、約1ｍｇ〜約5ｍｇ；約5ｍｇ〜約50ｍｇ、約5ｍｇ〜約20ｍｇ、約5ｍｇ〜約10ｍｇ；約10ｍｇ〜約100ｍｇ、約20ｍｇ〜約200ｍｇ、約30ｍｇ〜約150ｍｇ、約40ｍｇ〜約100ｍｇ、約50ｍｇ〜約100ｍｇを含む。
【００４１】
一部の実施形態において、本発明の錠剤又は丸薬はコーティングされ得るか、そうでなければ、持続性作用の利点を与える服用量の形態を提供するよう配合され得る。例えば、錠剤又は丸薬は内側服用量及び外側服用量の成分を含むことができ、後者は前者を覆う外皮の形態である。胃腸内での分解を防ぐ役割を果たす腸溶性層(enteric layer)によって2つの成分は分離でき、内側成分が損傷なく十二指腸に到達するようにしたり、放出を遅延させるようにできる。多様な物質がこのような腸溶性層又はコーティングのために使用でき、かかる物質は、重合体性酸、及び重合体性酸とシェラック(shellac)、セチルアルコール及び酢酸セルロース等の物質との混合物を含む。
【００４２】
本発明の組成物が経口投与又は注射による投与のために混入できる液体形態は、水溶液、好適に香味されたシロップ、水性又は油性懸濁液、及び綿実油、ゴマ油、ココナッツオイル、又はピーナッツオイル等の食用オイルで香味された乳液のみならず、エリキシル剤及び類似の薬剤運搬体も含む。
【００４３】
薬剤組成物における本発明の組成物の比率又は濃度は、服用量、化学的特性(例えば、疎水性)及び投与経路を含む多数の因子によって変動し得る。例えば、本発明のL.パラカゼイCBA L74は、経口投与のために、約0.005ｍｇ〜約1000ｍｇを含むカプセルで提供され得る。或いは又は更に、服用量は、乾燥重量のcfu/gで表され得る。服用量は多様であり得るが、乾燥重量の約102〜約1012cfu/gの等価物、例えば、1×102cfu/g、5×102cfu/g、1×103cfu/g、5×103cfu/g、1×104cfu/g、5×104cfu/g、1×105cfu/g、5×105cfu/g、1×106cfu/g、5×106cfu/g、1×107cfu/g、5×107cfu/g、1×108cfu/g、5×108cfu/g、1×109cfu/g、5×109cfu/g、1×1010cfu/g、5×1010cfu/g、1×1011cfu/g、5×1011cfu/g、1×1012cfu/gの範囲であり得る。
【００４４】
＜使用方法＞
本明細書に記載の組成物は、一般的且つ多様に粘膜免疫システムにおける免疫調節反応の刺激に有用である。かかる刺激が有益な対象体は、粘膜免疫システムの欠乏を有する者、例えば、幼児又は小児のように未成熟な免疫システムを有する者、老人のように低下した免疫システムを有する者、免疫抑制薬服用、放射線療法又は化学療法中の患者、アレルギー又は自己免疫疾患による過活性免疫システムを有する者及び胃腸障害を患う者を含む。胃腸障害は、ウイルス、例えば、ロタウイルス(rotavirus)；病原性バクテリア、例えば、サルモネラ(Salmonella)、エルシニア(Yersinia)、シゲラ(Shigella)、リステリア (Listeria)、クロストリジウム (Clostridium)、E.コーライ(E. coli)、E.サカザキ(E. sakazaki)、H.ピロリ(H. pylori)；又は病原性原生動物、例えば、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)、クリプトスポリジウム種 (Cryptosporidium spp.)、 カンピロバクター種(Campylobacter spp.)による感染を含み得る。また、胃腸障害は、例えば、食物アレルギー、食物過敏症、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、嚢炎(pouchitis)、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、壊死性腸炎、及び老化、特に胃腸系の老化を含み得る。
【００４５】
対象体は、臨床的に有益な結果が起こるたびに、効果的に治療される。これは、例えば、粘膜免疫システムの欠乏に関する症状の完全な解決、粘膜免疫システムの欠乏に関する症状の重症度の減少、又は粘膜免疫システムの欠乏に関する症状進行の減速を意味し得る。これらの方法は、a)粘膜免疫システムの欠乏を有する対象体(例えば、患者、及びより具体的にヒト患者)を確認する段階と、b)薬理学的に受容可能な担体にL.パラカゼイCBA L74を含む任意の発酵食品又は組成物等の、本明細書に記載のL.パラカゼイCBA L74を含む組成物を対象体に提供する段階とを更に含むことができる。粘膜免疫システムの欠乏に関する症状の完全な解決、粘膜免疫システムに関する症状の重症度の減少、又は粘膜免疫システムの欠乏に関する症状進行の減速をもたらす対象体に提供されるかかる組成物の量は、治療的有効量として見なされる。また、本発明は、結果予測のみならず、服用量及び日程管理を最適化するための観測段階を含んでもよい。
【００４６】
本明細書に記載の方法は、広範囲な種、例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類(例えば、サル)、馬、豚、牛又はその他家畜、犬、猫又はその他哺乳類、ペット、ラット(rat)、マウス(mice)、又はその他実験用動物等に適用できる。本明細書に記載の組成物は、治療的組成物及び療法で有用であり、又は、本明細書に記載されたような条件(例えば、未成熟、老化、感染、食物アレルギー、炎症又は自己免疫疾患に基づく粘膜免疫システムの欠乏)の治療に使用される薬剤の製造に有用である。
【００４７】
本明細書に記載の栄養組成物は、対象体の通常の一日の食餌の一部として経口で投与できる。食物組成物は、子供と大人ともに栄養支持体として投与されてもよい。薬剤として製剤化される場合、組成物は、標的細胞への次のデリバリーのために宿主体の任意の部位に投与され得る。組成物は、制限なく、哺乳類の脳、脳脊髄液、関節、鼻粘膜(nasal mucosa)、血液、肺、腸、筋肉組織、皮膚又は腹膜腔に送達され得る。送達経路の観点で、組成物は、静脈内、頭蓋内、腹腔内、筋肉内、皮下、筋肉内、直腸内、膣内、脊髄腔内、気管内、真皮内、もしくは経皮注射により、経口もしくは鼻腔投与により、もしくは経時による順次灌流によって投与できる。他の実施例において、組成物のエアロゾル製剤は、吸入によって宿主に付与され得る。
【００４８】
組成物が食品又は薬剤として製剤化されるか否かにかかわらず、必要な服用量は、投与経路、製剤の特性、対象体の状態、例えば、免疫システムの未成熟又は胃腸障害、対象体のサイズ、重さ、表面積、年齢及び性別、投与されている他の薬及び主治臨床医の判断に応じて変わるであろう。好適な服用量は、0.01〜1,000ｍｇ／ｋｇの範囲である。一部の一般的な服用量の範囲は、一日当たり、体重の約1μg/kg〜約1g/kgである。一部の実施形態において、服用量の範囲は、一日当たり、体重の約0.01ｍｇ／ｋｇ〜約100ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態において、服用量は、例えば、1ｍｇ／ｋｇ、2ｍｇ／ｋｇ、5ｍｇ／ｋｇ、10ｍｇ／ｋｇ、20ｍｇ／ｋｇ、50ｍｇ／ｋｇ又は100ｍｇ／ｋｇであり得る。服用量は、疾患又は障害のタイプ及び進行の度合い、特定患者の全体的な健康状態、選択された化合物の相対的な生物学的有効性、賦形剤の剤形、及びその投与経路のような変数に応じて変わるであろう。
【００４９】
有効服用量は、試験管内又は動物モデル試験系で導出された用量反応曲線から外挿できる。例えば、末梢血単核細胞(PBMCs; peripheral blood mononuclear cells)によるサイトカイン生成の試験管内分析は、炎症誘発及び抗炎症反応、例えば、それぞれIL-1β、IL-12、IL-4、TNF-α、又はIL-10の分泌を分析するのに有用であり得る。また、組成物は、動物モデルにおける効果、例えば、IgA生成、パイエル板(Peyer’s patch)の体外移植片によるサイトカイン生成、及び樹状細胞とT細胞反応について分析され得る。
【００５０】
細胞的標的の多様性及び多様な投与経路の相違する効率を勘案すると、必要な服用量において大幅な変動が予想される。これらの服用量レベルの変動は、本技術分野で公知となっているように、最適化のための一般的な実証的標準を使用して調整され得る。投与は、単回又は多回(例えば、2又は3、4、6、8、10、20、50、100、150又はそれ以上)であり得る。好適な送達運搬体(例えば、重合体性微粒子又は移植可能装置)内に化合物をカプセル化(Encapsulation)することは、送達の効率を増加させ得る。
【００５１】
本明細書で提供された任意の組成物による治療は、短ければ一日から、長ければ宿主の寿命(例えば、数年)まで任意の長さで持続され得る。例えば、組成物は、1週間に1回(例えば、4週間〜数ヶ月もしくは数年間)；1ヶ月に1回(例えば、3〜12ヶ月もしくは数年間)；又は5年、10年或いはそれ以上の期間の間、1年に1回投与され得る。また、治療の頻度は可変的であるということに留意する。例えば、本組成物は、毎日、毎週、毎月又は毎年1回(又は2回、3回等)投与され得る。組成物を食品として製剤化する場合、例えば、組成物を毎日毎食時に投与し得る。
【００５２】
本技術分野で公知となった任意の方法は、具体的な反応を誘導するか否かを決定するのに使用され得る。特定の疾患状態の度合いを評価できる臨床的方法が、反応を誘導するか否かを決定するのに使用され得る。例えば、対象体は、症状緩和、例えば、疝痛(colic)、下痢、便秘、吐気、嘔吐、上腹部痛、痙攣、胸焼け、腹部膨満、鼓腸(flatulence)又は失禁(incontinence)の緩和について観測され得る。或いは又は更に、血清マーカー、撮像技術、例えば、超音波、X線、及び内視鏡法が使用され得る。
【００５３】
また、組成物は、他の治療技法と組み合わせて投与されてもよい。他の治療技法は、特定の障害に応じて変動し得るが、例えば、止痢剤、嘔吐抑制剤、抗コリン性剤、抗炎症剤、抗生剤、抗ヒスタミン剤及びその他食餌性治療、例えば、低アレルギー性(hypoallergenic)の幼児用調製乳が挙げられる。2つ以上の治療剤の同時投与は、製剤が治療効果を発揮する時間周期の間に重複投与さえすれば、同時又は同一の経路で投与されなければならないというわけではない。他の日又は他の週に投与するというような同時又は順次の投与が考慮される。
【００５４】
＜製造品＞
また、本明細書に記載の組成物は、使用説明書と共にキットで組立可能である。従って、包装された製品(例えば、本明細書に記載の1つ以上のL.パラカゼイCBA L74組成物を含み、濃縮されたり使用可能な濃度で保管、積載又は販売用に包装された容器)、並びに本発明の少なくとも1つの化合物及び使用説明書を含むキットは、本発明の範疇内にある。包装された製品又はキットの何れかにおいて、L.パラカゼイCBA L74組成物は、非複製型からなるL.パラカゼイCBA L74を含み得る。例えば、キットは、L.パラカゼイCBA L74によって発酵した1つ以上の食品を含む栄養組成物の測定量を含み得る。使用説明書は、任意の好適な媒体によって伝達され得る。例えば、これらは、1言語以上のペーパーインサート(paper insert)上に印刷されたり、聴覚的又は視覚的(例えば、コンパクトディスク上に)に供給され得る。包装材料は、例えば、薬瓶(vial)、パケット(packet)、容器が挙げられる。一部の実施形態において、キットは、上記形態のうち何れかにおいて、包装材及び使用説明書と共に生理学的に受容可能な担体内にL.パラカゼイCBA L74を含む組成物の測定量を含み得る。一部の実施形態において、キットは、目的とする用途に好適に、1つ以上のL.パラカゼイCBA L74組成物、例えば、L.パラカゼイCBA L74と薬剤学的担体、及び好適な安定化剤、担体分子、着香料等のうち1つ以上を含有する容器を含み得る。製品は、1つ以上のL.パラカゼイCBA L74組成物を含有する容器(例えば、薬瓶、かめ(jar)、瓶、バッグ等)を含み得る。更に、製造品は、予防又は治療を要する状態を治療又は観測するために、例えば、包装材、使用説明書、注入器、緩衝剤又はその他コントロール試薬を更に含んでもよい。また、製品は、説明文(例えば、製品の用途を説明する印刷ラベル又はインサート又はその他媒体(例えば、オーディオ又はビデオテープ))を含んでもよい。説明文は、容器と結合でき(例えば、容器に付着される)、投与されるべき化合物が投与される方法(例えば、投与の頻度及び経路)、それに対する指示、及びその他用途を説明し得る。キットの成分は、即時の使用に好適であってもよい。化合物は、投与(例えば、服用量の適正単位で存在)のために準備可能であり、薬剤的に受容可能な補助剤、担体又はその他希釈剤及び/又は更なる治療剤を含んでもよい。本発明はキットを含むが、キットは濃縮製剤及び/又は使用前に希釈を要する材料を含む。或いは、化合物は、希釈剤及び希釈のための説明書と共に濃縮された形態で提供され得る。キットの成分は即時の使用に好適であってもよい。本発明はキットを含むが、キットは濃縮製剤及び/又は使用前に希釈を要する材料を含む。
【実施例】
【００５５】
実施例1：L.パラカゼイCBA L74の分離及び同定
相違する濃度の米粉又は小麦粉を含む水性懸濁液を発酵させる性能について、相違するラクトバチリ(Lactobacilli)菌株を分析した。L.パラカゼイCBA L74は、低いpH値及び高いCFU数に基づいて、更に分析するために選択された。この菌株は、ベルギーのヘント所在のBelgian Coordinated Collections of Micro-organisms(BCCM) Laboratorium voor Microbiologie(LMG)で2008年9月9日に、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下で寄託された。国際寄託機関によって付与された受託番号は、LMG P-24778である。
【００５６】
実施例2：L.パラカゼイCBA L74の発酵ミルクの製造
条件：
・基質：9％で還元された脱脂粉乳、0.25％で添加されたデキストロース
・基質の熱処理：3秒間UHT-135℃又は等価F0
・共接種物：ラクトバチルスパラカゼイCBA L74の5×106
サーモフィルス菌(発酵の開始に)の5×104
・発酵温度：37℃
・発酵時間：15時間
・発酵中のpH：調節無し
・発酵の終了時にNaOH溶液でpH6.5に調節
・インレット(inlet)温度190℃及びアウトレット(outlet)温度90℃で噴霧乾燥
・分析：サーモフィルス菌及びラクトバチルスパラカゼイCBA L74を測定するために、発酵物に対して細胞計数
塗抹(plating)：ラクトバチリ選択性培地(LBS：Lactobacilli selective agar)がラクトバチルスパラカゼイCBA L74の検出に使用された。L-M17寒天培地がサーモフィルス菌の計数に使用された。2つの菌株は、37℃にて嫌気性で培養された。標準寒天(PCA)が汚染物質の検出に使用され、30℃にて好気性で培養された。
【００５７】
発酵：L.パラカゼイCBA L74及びS.サーモフィルス(S.thermophilus)1773の共接種物は、新たな培養物として添加された。発酵は、L.パラカゼイCBA L74の濃度108cfu/mLまで15時間実施された。初期のpHは6.6であった。発酵終了時のpHは5.1であった。pHは2.5NのNaOHを添加することで6.5に調節された。L.パラカゼイCBA L74の初期濃度は5×106cfu/mlで、最終濃度は108cfu/ml以上であった。サーモフィルス菌の初期濃度は5×104cfu/mlで、最終濃度は1×108cfu/mlであった。PCA上での初期のバクテリア総数は、TO及び接種前のミルクにおいて0で、15時間の発酵期間後、計数するには少なすぎるコロニー(TFTC: too few colonies to count)は、5×104cfu/mlで、最終濃度は1×108cfu/mlであった。
【００５８】
乾燥：発酵物はインレット温度190℃及びアウトレット温度90℃で乾燥された。噴霧乾燥後の粉末の水分含量は4.87％であった。
【００５９】
実施例3：L.パラカゼイCBA L74の発酵オート麦及び大麦粉の製造
オート麦粉185g及び麦芽大麦粉9.25gを用いて、18.5％(w/vol)のオート麦粉＋5％(w/w)の麦芽大麦粉の1リットルの溶液を製造した。粉と水の混合物は、0.5Mのクエン酸でpH4,00に調節された。発酵器は、オートクレーブによって殺菌された。次いで、粉＋水＋クエン酸の混合物を発酵器に添加した。
【００６０】
混合物は、30分間80℃で熱処理されてから、37℃に冷却された。3つの異なる発酵条件の設定で実験した。全ての発酵は、対数増殖期(log phase growth)の終了と一致する16時間後に終了した。
【００６１】
実験＃1：L.パラカゼイCBA L74は、最終濃度2.3×106cfu/mlで熱処理されたシリアル溶液に添加され、37℃で攪拌(agitation)し培養された。16時間後、MRSでの平板計数は7.6×108UFC/ml(乳酸バクテリア)で、PCA、MC及びSBで測定された汚染物質は、1000UFC/ml未満であった。最終のpHは3.8であった。20時間後のMRSでの平板計数は1.2×108UFC/ml(乳酸バクテリア)で、汚染物質はなかった。24時間後のMRSでの平板計数は 5×108UFC/ml(乳酸バクテリア)で、汚染物質はなかった。16時間後に対数期が終了するので、16時間で発酵を中断するのが好ましかった。
【００６２】
実験＃2(pH安定化) この発酵は、2NのNaOHを用いてpHを4に保持することで実施された。L.パラカゼイCBA L74は、最終濃度2.1×106cfu/mlで熱処理されたシリアル溶液に添加され、37℃で攪拌し培養された。16時間後のMRSでの平板計数は7,5×108UFC/ml(乳酸バクテリア)で、PCA、MC及びSBで測定された汚染物質は、1000UFC/ml未満であった。
【００６３】
実験＃3(pH安定化) この発酵は、2NのNaOHを用いてpHを4に保持することで実施された。L.パラカゼイCBA L74は、最終濃度5.1×106cfu/mlで熱処理されたシリアル溶液に添加され、37℃で攪拌し培養された。16時間後のMRSでの平板計数は2.1×109UFC/ml(乳酸バクテリア)で、PCA、MC及びSBで測定された汚染物質は、1000UFC/ml未満であった。
【００６４】
実施例4：L.パラカゼイCBA L74の発酵米及び小麦粉の製造
米150g及び水900mlを組み合わせることで、米15％重量/体積の1リットルの溶液を製造した。混合物は室温で製造され、1000-1300rpmで数分間振ることで混合させた。米の混合物は、150〜600rpmで振りながら、70℃で機器内側で混合物の加熱処理、20〜30分当たり70℃で飢餓(starvation)処理、30〜37℃で冷却処理、20〜30分当たり30〜37℃で飢餓処理、70℃で加熱処理、20〜30分当たり70℃で飢餓処理、発酵温度(37℃)で冷却処理することで、チンダル間欠滅菌法によって処理された。
【００６５】
フリーズドライのサンプルから最終濃度1×106cfu/mlでL.パラカゼイCBA L74を添加した。プリーズドライのサンプルは、水で再懸濁され、37℃で短く培養し、バクテリアを活性化させた。接種後、混合物を300-600rpmで少しの間振ることで均質化させ、発酵の間、溶液を150rpmで振った。発酵はpO2<15％で24時間37℃で実施された。分画物は、接種(TO)時、16時間(T16)、18時間(T18)、21時間(T21)及び24時間(T24)に収集された。発酵後、シリアルは連続的な混合とともに、50℃に加熱された。次いで、加熱されたシリアルは、T airin80℃、T airout 210℃で噴霧乾燥された。最終の水分含量は6％であった。
【００６６】
L.パラカゼイCBA L74の定量化のためにロゴサ寒天(＋バンコマイシン12microgr/ml)上で(37℃で48時間)、総好気性菌のためにPCA上で(37℃で24時間)、腸内細菌(coliform)のためにMcConkay寒天上で、及びクロストリジウム属細菌(Clostridia)のためにRCM寒天上でサンプルを分析した。
【００６７】
この発酵の結果は、以下の通りである。
接種(L.パラカゼイCBA L74)：1×106(+/-1/2log)cfu/ml(機器上で)
24時間発酵後のL.パラカゼイCBA L74の濃度： 1×108(+/-1/2log)cfu/ml
接種前のPCA上における汚染物質：<104cfu/ml
接種前のMcConkay上における汚染物質：<104cfu/ml
接種前のRCM上における汚染物質：<10cfu/ml
接種後のPCA上における汚染物質：<104cfu/ml
24時間発酵後のPCA上における汚染物質：<104cfu/ml
接種物添加前のpH：6(+/-0.20)
16〜18時間におけるpH：3.70(+/-0.20)
24時間におけるpH：3.60(+/-0.20)。
【００６８】
実施例5：Caco2細胞の共培養システムでの樹状細胞に対するL.パラカゼイCBA L74の効果
腸内上皮細胞(Caco2細胞)及びヒト樹状細胞(DC：dendritic cell)の共培養において、生及び複製型のL.パラカゼイCBA L74の効果を分析した。Caco2細胞は、トランスウェル膜(transwell membrane)上に接種され、約3週間後、経上皮抵抗(trans-epithelial resistance)が適正な時、96時間の間、L.パラカゼイCBA L74を補充した。ヒトDCは、末梢血液単核球から分化し、共培養チャンバーの基底区画に接種された。経上皮抵抗は、実験の間一定に保持された。
【００６９】
DC表現型を特徴化するために、細胞蛍光分析(cytofluorimetric analysis)によって共刺激分子(co-stimulatory molecule)(CD80及びCD86)、MHC-II及び接着分子(CD40)のDC細胞表面の発現を観測した。L.パラカゼイCBA L74に露出した腸内上皮細胞と共培養されたDCによって生成されるサイトカインプロファイルを測定するために、培養培地を収集し、ELISAによってIL-10及びIL-12p70を定量化した。T細胞の増殖を促進するためにDCに影響するL.パラカゼイCBA L74に露出したCaco2細胞の性能を証明するために、FACS分析を行い、リンパ球培養物と混合した。
【００７０】
図1での表に示すように、24時間の間に生の又は不活性化された(熱的不活性化)L.パラカゼイCBA L74とCaco2細胞の培養は、共培養された樹状細胞の表現型を変形した。また、L.パラカゼイCBA L74の存在は、DC表現型におけるLPS-媒介変化を調節した。
【００７１】
次いで、L.パラカゼイ(生の又は不活性化された)に調節されたCaco2細胞と共培養されたDCから放出されたサイトカインを定量化した。図2aに示すように、生の又は不活性化されたL.パラカゼイCBA L74に露出したCaco2と共培養されたDCは、IL-10の生成において、統計上、有意な増加を示した。LPSの不在時、IL-12の生成において有意な増加を観察できなかった(図2b)。しかし、DCは、向上したIL-12の生成によってLPS攻撃(challenge)に反応する性能を保持し、これは、L.パラカゼイCBA L74への露出が病原菌に反応するDCの全般的な性能に影響を与えないことを示唆する。
【００７２】
次いで、T細胞の性能を調節して混合されたリンパ球反応を増殖するために、L.パラカゼイが補充された培地の存在下で培養されたCaco2細胞に露出したDCの性能を証明するために、機能的分析を行った。図3に示すように、T細胞の増殖を変形させるために、Caco2細胞と共培養されたDCの性能において有意な差を観察できなかった。
【００７３】
統合すると、試験管内データは、生の又は熱的に不活性化されたL.パラカゼイCBA L74が、DC等の他の免疫細胞の活性を順次調節する腸内上皮細胞によって生成される環境に影響し得るということを示す。全般的な状況は、Caco2の調節培地に露出したDCが活性マーカーの発現を減少させ、IL-12の生成を向上させることにより、LPSに反応する性能を保持すると共に、IL-10のような抗炎症サイトカインを生成するということを示す。
【００７４】
実施例6：全腸粘膜における形態学、サイトカイン発現及び先天的免疫に対するL.パラカゼイCBA L74の効果
マウスに食餌補充物としてL.パラカゼイCBA L74(生の又は熱的不活性化)を投与することで、生体内の効果を実験した。補充の2週間後、動物を犠牲にして、全腸粘膜を分析した。
【００７５】
粘膜形態学：パラフィン包埋した回腸部のヘマトキシリン及びエオシン染色を行った。補充物は、腸内構造に有意な影響を与えなかったり、炎症細胞の浸透をもたらさなかった。
【００７６】
サイトカイン及びIgAの発現：次いで、L.パラカゼイCBA L74(生の又は熱的不活性化)の投与が腸粘膜での抗炎症及び炎症誘発サイトカインのレベルに影響するか否かを測定した。図4に示すように、生の又は不活性化されたL.パラカゼイCBA L74の投与は、マウスの腸粘膜で強力な炎症誘発媒介体、IL-1βのレベルを有意に減少させた。また、図5に示すように、生の又は不活性化されたL.パラカゼイCBA L74の投与後、基底粘膜IL-4のレベルにおける減少を観察した。最後に、粘膜IgAのレベルに対する異なる療法補充の効果を測定した。L.パラカゼイCBA L74で食餌補充の2週間後に動物を犠牲にし、腸粘膜を収集し均質化した。次いで、全IgAはELISAによって測定され、その値は全粘膜タンパク質に標準化された。図6に示すように、加熱殺菌されたL.パラカゼイCBA L74が粘膜IgAを有意に増加させた。
【００７７】
先天的免疫：トール様受容体(Toll-like Receptor)2、4及び9のレベルに対する食餌補充の効果を分析した。これらの受容体は、保存されたバクテリア構造の認識に関与し、よって、微生物の保存構造に対し、免疫及び非免疫細胞の反応度を調節するのに重要な役割を果たす。図7に示すように、生の又は不活性化されたL.パラカゼイCBA L74での食餌補充は、TLR2及びTLR4のタンパク質発現のレベルを増加させた。また、粘膜におけるPPARγのレベルに対する食餌補充の効果を分析した。図8に示すように、生のL.パラカゼイCBA L74は、PPARγのレベルを有意に増加させた。
【００７８】
実施例7：循環するサイトカインのレベルに対するL.パラカゼイCBA L74の効果
食餌補充物が、循環するサイトカインのレベルを変化させることができるか否かを評価するために、血清での抗炎症及び炎症誘発サイトカインのレベルに対する菌株(生の又は不活性化された)の食餌性投与の効果を測定した。図9a及び9bに示すように、生のL.パラカゼイCBA L74は、IL-1βにおける統計上の有意な減少及び循環するIL-4における弱小な増加をそれぞれ誘導した。
【００７９】
実施例8：樹状細胞及びT-リンパ球活性に対するL.パラカゼイCBA L74の効果
次に、粘膜関連の免疫システムの活性に関する免疫細胞、即ち、樹状細胞及びリンパ球に対するL.パラカゼイCBA L74の食餌補充の影響に注目した。パイエル板(PP)内のDC表現型は、これらの細胞が抗原の運命を確立するのに重要であり、後天性免疫反応の特性を決定する環境に寄与するため、PP内のDCの表現型を評価した。
【００８０】
図10の表に示すように、L.パラカゼイCBA L74の補充(生の又は不活性化)は、MHCII発現を上方調節(up-regulation)させるのに対し、共刺激分子CD80及び接着分子CD40の発現を減少させた。これらのデータは、L.パラカゼイCBA L74を補充した動物におけるDCがT細胞との相互作用及び免疫反応を増加させる準備が足りないように見えるが、抗原を処理し提示する性能は保持されるということを示した。
【００８１】
次いで、炎症誘発刺激剤(例えば、バクテリア性LPS及びCpG)に対するDCの反応性を変化させる、L.パラカゼイCBA L74の食餌補充の性能を測定した。対照群マウス由来のDCのLPS又はCpGへの露出は、対照群DCにおけるCD80の強い上方調節を誘導した。熱的に不活性化されたL.パラカゼイCBA L74DCの補充は、炎症誘発刺激に対する反応性を変化させなかった。生菌の補充は、LPS及びCpG誘導のCD80の上方調節を有意に減少させた。
【００８２】
最後に、L.パラカゼイCBA L74(生の又は不活性化)の食餌補充が、Th1又はTh2表現型に対する腸内のT-リンパ球(CD4+及びCD8+の何れか)の極性形成(polarization)に影響するか否かを調査した。この研究のために、パイエル板を強力な非特異的刺激体であるPHAに露出させ、リンパ球の極性形成をIL-4及びIFN-γに対するイントラカイン染色(intrakine staining)によって評価した。図11aに示すように、CD4+リンパ球におけるPHA(「基底状態」)の欠如において、IL-4及びIFNはほぼ等価状態であった。細胞の約10-12％がこれらサイトカインに対して陽性であった。図11bに示すように、基底状態にあるCD8+リンパ球について、IFN発現細胞よりもIL-4が若干優勢であった。CD4+又はCD8+リンパ球に対するPHAの露出は、IL-4及びIFN-γに対する細胞内染色において強い増加をもたらし、IFN-γの生成が更に優勢であった。
【００８３】
CD4+細胞において、生のL.パラカゼイCBA L74の食餌補充は、基底状態においてIFN-γのレベルを増加させた。PHA露出後に補充された群(図11a)の中では、反応において有意な差がなかった。CD8+リンパ球において、不活性化されたL.パラカゼイCBA L74の経口補充は、IFN-γ生成よりもIL-4の生成刺激によるTh2プロファイルを選好した(図11b)。抗炎症プロファイルは、PHAに対する鈍い反応によって更に支持される。また、生のL.パラカゼイCBA L74が補充されたマウスから分離されたCD8+リンパ球でも、確然としなかったものの、類似する傾向が明らかであった。
【００８４】
実施例9：腸粘膜における免疫システムマーカーに対するL.パラカゼイCBA L74によって発酵したミルクの効果
マウスは、1)対照群(PBS)；2)脱脂乳(無発酵)；3)L.パラカゼイCBA L74 (1×108cfu/ml)で発酵した脱脂乳；4)S. サーモフィルス(6.7×106cfu/ml)で発酵した脱脂乳；5)L.パラカゼイCBA L74(1x108cfu/ml)及びS.サーモフィルス(1.18×107cfu/ml)で発酵した脱脂乳；6)L.パラカゼイCBA L74(1.9×109cfu/die)及びS.サーモフィルス(2.2×108cfu/ml)で発酵した脱脂乳の何れかで、2週間、1日2回補充された。処理の終了時に動物を犠牲にし、腸粘膜及びパイエル板は、以下で説明されるように、分析のために収集され処理された。
【００８５】
腸粘膜におけるサイトカインのレベル。図12に示すように、L.パラカゼイCBA L74で発酵した脱脂乳の補充は、腸粘膜におけるIL-10レベルの有意な増加をもたらした。S.サーモフィルスで発酵した脱脂乳の投与は、対照群に比べ若干の減少をもたらした。高用量の2つの菌株で発酵したミルクの投与は、粘膜のIL-10において2.1倍の増加を誘導した。L.パラカゼイCBA L74で発酵した脱脂乳の補充は、このサイトカインの粘膜レベルを少し増加させたが、前記の如何なる処理も粘膜のIL-1βに対する如何なる有意な効果も有さなかった。
【００８６】
腸粘膜におけるミエロペルオキシダーゼ(Myeloperoxidase)の活性。ミエロペルオキシダーゼ(MPO)の活性は、腸粘膜均質液で分析された。無発酵又は相違するバクテリアで発酵したミルクの投与は、無発酵ミルクを得た動物の粘膜で観察されたMPO活性がわずかに増加したが、ミエロペルオキシダーゼ活性において、統計上、有機な差を誘発しなかった。
【００８７】
腸粘膜におけるIgAのレベル。図14に示すように、無発酵脱脂乳の補充物は、腸粘膜IgAにおいて有意な増加をもたらした。この増加は、L.パラカゼイCBA L74又はS.サーモフィルス単独によって発酵した脱脂乳を補充した動物では観察されなかった。高用量の2種の菌株で発酵したミルクの投与は、粘膜IgAの増加を誘発した。
【００８８】
腸粘膜におけるTLR2. TLR4. TLR9及びPPARγのレベル。次に、先天的免疫システムの主要受容体の粘膜レベルを全血(WB)によって測定した。図15に示すように、如何なる処理もTLR4受容体の発現に対する有意な効果がなかった。無発酵ミルクは、TLR2での若干の(modest)増加をもたらした。低い投与量でL.パラカゼイCBA L74又はS.サーモフィルス単独で、又は組み合わせて発酵した脱脂乳の投与は、この効果を防止した。また、ミルク単独に比べ、高用量の2つの菌株で発酵したミルクを得たマウスでTLR2の若干の増加が明らかであった。脱脂乳の単独投与は、TLR9のレベルに対する至大な影響を与えるのに対し、2つの菌株で発酵したミルクの投与は、対照群に比べ粘膜レベルを回復させた。図15に示すように、無発酵ミルクそのものの投与は、粘膜PPARγの強い増加をもたらした。L.パラカゼイCBA L74で発酵した脱脂乳及び2つの菌株で発酵した低い投与量のミルクが補充されたマウスで同様の効果が明らかであった。
【００８９】
腸粘膜におけるpNF-κB及びIKBのレベル。腸内の炎症及び上皮細胞の生存に関する主要転写因子、NF-κBの活性状態を測定した。図16に示すように、活性化されたNF-κB(pNF-κB)は、対照群、正常粘膜で検出可能であった。異なる処理の後に、L.パラカゼイCBA L74又はS.サーモフィルス単独により発酵した脱脂乳で処理されたマウスの粘膜におけるpNF-κBのレベルは、若干の増加のみを観察したのに対し、2つの菌株で発酵した脱脂乳を得たマウスにおいて、pNF-κBは対照群と類似した。pNF-κBの増加は、NF-κBの抑制性サブユニットであるIKBの消滅と並行され、L.パラカゼイCBA L74又はS.サーモフィルス単独により発酵した脱脂乳が補充されたマウスの粘膜では検出されなかった。2つの菌株で発酵した脱脂乳を得たマウスは、対照群と類似するIkBレベルを示した。
【００９０】
実施例10：腸粘膜における樹状細胞表現型に対するL.パラカゼイCBA L74によって発酵したミルクの効果
パイエル板から抽出された樹状細胞の表現型。腸内DCの表現型に対する食餌補充の効果を実験した。この分析の結果は図17に示す。低い投与量及び高い投与量で、 L.パラカゼイ単独のみならず、L.パラカゼイ及びS.サーモフィラスで発酵したミルクの投与は、対照群のマウスに比べ、CD80及びCD86の発現において、統計上有意な減少をもたらしたのに対し(*は、対照群に比べp<0.05を意味する)、全般的なHLAII及びCD40のレベルは安定に保持された。図17でのデータは、それぞれ相違する3回の実験の平均値±標準誤差(mean±S.E.)として表現される。
【００９１】
LPS/CpGに露出した樹状細胞の反応。炎症誘発刺激剤(例えば、バクテリア性LPS及びCpG)に対するDCの反応性を変化させる食餌補充の性能を測定した。図18に示すように、対照群動物由来の分離されたDCをLPS及びCpGに対して露出したとき、CD80の発現において有意な増加をもたらした(*は、対照群マウス由来の無刺激DCに比べp<0.05を意味する)。無発酵ミルクを得たマウス由来の精製されたDCにおいて類似する効果が観察された(°は、無発酵ミルクで処理されたマウス由来の無刺激DCに比べp<0.05を意味する)。L.パラカゼイCBA L74単独によって発酵した脱脂乳の投与は、CpG誘導のCD80の上方調節には効果が少なかったが、無発酵ミルクで処理されたマウスでLPSの媒介効果を完全に抑制した。S.サーモフィラス単独によって発酵した脱脂乳は、LPS及びCpG効果を抑制し、CD80の発現を減少させた。最終的に、2つの菌株によって発酵した脱脂乳の投与は、LPS及びCpG誘導のCD80の上方調節を抑制し、基底レベルでのCD80の発現を保持した。図18でのデータは、それぞれ相違する3回の実験の平均値±標準誤差として表現される。
【００９２】
実施例11：腸粘膜におけるT-リンパ球表現型に対するL.パラカゼイCBA L74によって発酵したミルクの効果
PHAに露出した腸内のリンパ球CD4+及びCD8+の反応。ミルク(発酵又は無発酵)の食餌補充がTh1又はTh2表現型に対する腸内のT-リンパ球(CD4+及びCD8+)の極性形成に影響するか否かを調査した。パイエル板由来のリンパ球は、PHAに露出してから、細胞内のIL-4及びIFN-γに対する染色によってリンパ球の極性形成を評価した。
【００９３】
図19に示すように、PHAへの露出は、マウス由来のCD4+リンパ球におけるIL4及びIFN-γの生成を有意に増加させた(*は、対照群マウス由来の無刺激リンパ球に比べp<0.05を意味する)。無発酵又は発酵したミルクで処理されたマウスでは、このような誘導は観察されなかった。無発酵ミルクを補充した後、CD4+リンパ球は、対照群動物に比べIL4及びIFN-γの増加した基底レベルを示した(°は、対照群マウス由来の無刺激リンパ球に比べp<0.05を意味する)。これらのデータは、発酵ミルクの補充が非特異的活性化を抑制し、基底レベルにおいて、IL4及びIFN-γの生成を保持したことを示した。
【００９４】
図20に示すように、対照群マウス由来のCD8+腸内リンパ球におけるPHAへの露出は、IL4及びIFN-γの生成を増加させた(*は、対照群マウス由来の無刺激リンパ球に比べp<0.05を意味する)。無発酵又は発酵したミルクで処理されたマウスでは、このような誘導は観察されなかった。高い投与量でL.パラカゼイ及びS.サーモフィルスによって発酵したミルクの投与は、IL4の基底生成を減少させ、PHAで刺激した後、IL4及びIFN-γのレベルは対照群マウス由来の刺激されたリンパ球に比べ減少した(§はp<0.05を意味する)。
【００９５】
実施例12：腸粘膜組織学に対するL.パラカゼイCBA L74によって発酵したミルクの効果
腸粘膜で増殖する細胞の分布を測定するために、細胞分裂することで発現された抗原、Ki67の発現の免疫組織化学的分析(Immunohistochemcal analysis)を行った。対照群マウスにおいて、腸陰窩(intestinal crypts)で免疫反応性が明確であったのに対し、絨毛(villi)上では染色されなかった。無発酵ミルクを得たマウス由来の組織において、抗原の異所性発現(ectopic expression)はなかったが、陰窩でより強い発現があった。互いに異なる種類の発酵したミルクを得たマウスにおいて、類似する染色パターンを観察した。異なる実験群の回腸粘膜の組織学的評価を行った。本研究の結果を図21に示した。無発酵ミルクの投与が腸内絨毛の数と長さを減少させるのに対し、腸内形態は多様な形態の発酵ミルクを得た動物で保持された。
【００９６】
実施例13：腸粘膜における免疫システムマーカーに対するL.パラカゼイCBA L74によって発酵した米の効果
これらの実験は、L.パラカゼイCBA L74で発酵したシリアルの免疫調節(immuno-modulatory)特性を評価するために考案された。 研究は、1)無発酵米；2)発酵米(L.パラカゼイCBA L74による)1日当たり100ｍｇ(L.パラカゼイCBA L74の2×108cfu/Lに該当)、及び3)発酵米(L.パラカゼイCBA L74による)1日当たり500ｍｇ(L.パラカゼイCBA L74の109cfu/Lに該当)を2週間毎日胃内に投与することを含む。処理期間の間、マウスは疾病又は下痢の如何なる兆候も示さなかった。処理の終了時にマウスを犠牲にし、パイエル板(PP)は無菌状態で収集された。上皮細胞をCa2+がない状態でEDTAが追加されたHBSSで培養することでPPから抽出し、その後、組織は酵素消化(enzymatic digestion)処理した。単一細胞懸濁液を洗浄し、冷たいRMPIで再懸濁して次の実験に使用した。
【００９７】
先ず、全体の腸粘膜上に異なる食餌補充物の効果を試験した。最初に、パラフィン包埋した回腸部のヘマトキシリン及びエオシン染色を行った。実験に使用された如何なる食餌補充物も、腸内構造に優位な影響を与えなかったり、炎症細胞の浸透をもたらさなかった。
【００９８】
次いで、L.パラカゼイCBA L74発酵米の投与が腸粘膜における抗炎症及び炎症誘発サイトカインのレベルに影響するか否かを測定した。図22に示すように、米又は発酵米の投与は、粘膜IL-1β及びIL-4の両方を増加させた。高い投与量の発酵米の補充は、図23に示すように、IL-10における減少をもたらした。
【００９９】
次いで、粘膜IgAのレベルに対する異なる療法補充の効果を測定した。食餌補充の2週間後に動物を犠牲にし、腸粘膜を収集し均質化した。全IgAはELISAによって測定され、その値は全粘膜タンパク質に標準化された。如何なる補充物も粘膜IgAに有意な効果がなかった。
【０１００】
腸粘膜の先天的免疫に対する米又はL.パラカゼイCBA L74-発酵米の効果を分析した。図24に示すように、米及び発酵米(低い投与量)の食餌補充は、粘膜TLRに普通の(moderate)効果のみがあった。図25aに示すように、無発酵米の食餌補充は、粘膜PPARγのレベルを急激に増加させる。また、高い投与量の発酵米は、粘膜PPARγのレベルを増加させる。図25bに示すように、2週間の無発酵米の食餌補充は、粘膜におけるNF-κBの活性を減少させ、IKBを増加させる。低い投与量の発酵米の補充は、対照群に比べ効果がないのに対し、高い投与量は、無発酵米で観察されたものと類似する効果があった。
【０１０１】
また、血清における抗炎症及び炎症誘発サイトカインのレベルについて、食餌性投与の効果を測定した。米又は発酵米(低い投与量)の食餌補充は、血清IL-1β及びIL-4のレベルに影響を与えなかった。
【０１０２】
実施例14：腸粘膜における樹状細胞表現型に対するL.パラカゼイCBA L74によって発酵した米の効果
次に、粘膜関連の免疫システムの活性に関する免疫細胞、即ち、樹状細胞及びリンパ球に対する無発酵米又はL.パラカゼイCBA L74で発酵した米の食餌補充の影響に注目した。先ず、抗CD1(DC識別用)と、抗CD-80及びCD-86の何れか、MHC-II及びCD-40で単一細胞懸濁液を標識して、これらのリンパ系器官で腸内DCの活性及び成熟のレベルを測定した。図26の表に示すように、DC表現型について、高い投与量で発酵米の有意な効果が観察された。無発酵米の補充(これらの実験では2つの相違する投与量を使用)は効果がなかったのに対し、CD80、CD40及びMHC-IIのレベルに対する発酵米の効果は、100ｍｇ/ｄａｙで明らかで、500ｍｇ/ｄａｙで更に確然としていた。
【０１０３】
次に、炎症誘発刺激剤(例えば、バクテリア性LPS及びCpG)に対するDCの反応性を変化させる、米又はL.パラカゼイCBA L74発酵米の食餌補充の性能を測定した。図27の表に示すように、対照群マウス由来のDCのLPS又はCpGへの露出は、対照群DCにおけるCD80の上方調節を誘導した。無発酵米の補充は、炎症誘発刺激剤に対する反応性を変化させなかった。発酵米の実験投与量の補充は、LPS及びCpG誘導のCD80の上方調節を減少させた。
【０１０４】
実施例15：腸粘膜におけるT-リンパ球表現型に対するL.パラカゼイCBA L74によって発酵した米の効果
米又はL.パラカゼイCBA L74発酵米の食餌補充がTh1又はTh2表現型に対する腸内のT-リンパ球(CD4+及びCD8+)の極性形成に影響するか否かを調査した。パイエル板由来のリンパ球は、PHAに露出してから、IL-4及びIFN-γに対するイントラカイン染色によってリンパ球の極性形成を評価した。
【０１０５】
CD4+及びCD8+リンパ球に対するかかる実験の結果をそれぞれ図28及び図29に示した。図28に示すように、基底状態において、CD4+リンパ球でIL-4及びIFNγは、細胞の約10〜12％がこれらのサイトカインに対して陽性であるので、ほぼ同等であった。図29に示すように、CD8+で、基底状態において、IFNγ発現細胞よりもIL-4が若干優勢であった。PHAに対するCD4+又はCD8+リンパ球の露出は、IFNγ生成の優勢と共に、IL-4及びIFN-γに対する細胞内染色において強い増加をもたらした。
【０１０６】
無発酵米を得たマウスにおいて、基底状態でも、CD4+及びCD8+リンパ球に対するPHA刺激後でも、IL-4生成(Th2表現型)の優勢を観察した。しかし、IL-4の生成は、基底状態においてはIFNγ生成の残留と関係し、PHA刺激後で、反応において対照群細胞と比較して鈍かったが、このサイトカインの増加した発現を観察した。発酵米を得たマウスにおいて、基底状態では、百分率は対象群と比較して類似(CD4+に対して)、又はわずかに低かったが(CD8+に対して)、IL-4よりもIFNγ陽性細胞の優勢を観察した。PHA刺激後の細胞集団両方におけるサイトカイン反応は、対照群マウスに比べて鈍かったが、Th1表現型(IFNγ陽性細胞の優勢)が優勢であった。
【０１０７】
実施例16：ネズミチフス菌の存在下での単核球由来の樹状細胞(MoDC)におけるIL-10の生成に対するL.パラカゼイCBA L74の効果
バクテリア病原菌、ネズミチフス菌の存在下で、ヒトMoDCにおける抗炎症サイトカイン、IL-10の生成を誘導する、L.パラカゼイCBA L74細胞及びL.パラカゼイCBA L74細胞の上清液の性能を試験した。ヒトMoDCは、少なくとも4名、及び一部の場合は7名の提供者から獲得された。図30に示すように、ネズミチフス菌(「FB62」)、対照群のラクトバチルス菌株、L.パラカゼイ21060(「B21060」)及びL.パラカゼイCBA L74(「CBAL74」)細胞の全てがIL-10の生成を誘導した。逆に、ネズミチフス菌からの上清液(「sn fb62」)はIL-10の生成を誘導したが、ラクトバチリ、ラクトバチルス菌株、L.パラカゼイ 21060(「sn b21060」)及びL.パラカゼイCBA L74からの上清液(「sn cbal74」)は誘導しなかった。L.パラカゼイCBA L74上清液とネズミチフス菌の共培養(「sn cbal74+FB62」)は、ネズミチフス菌単独(「sn fb62+FB62」)よりも高いレベルでIL-10を誘導した。興味深いことに、MoDCがL.パラカゼイCBA L74の上清液で1時間だけ前処理されてから、洗浄されて上清液を除去しても(「1h sn cbal74 + FB62」)、類似する効果が観察された。
【０１０８】
実施例17：ネズミチフス菌の存在下での単核球由来の樹状細胞(MoDC)におけるIL-12p70の生成に対するL.パラカゼイCBA L74の効果
バクテリア病原菌、ネズミチフス菌の存在下で、ヒトMoDCにおける炎症誘発サイトカイン、IL-12p70の生成を誘導する、L.パラカゼイCBA L74細胞及びL.パラカゼイCBA L74細胞の上清液の性能を試験した。ヒトMoDCは、少なくとも4、名、及び一部の場合は7名の提供者から獲得した。かかる実験の結果を図31に示す。抗炎症サイトカインに対する実施例16で得られた結果とは逆に、ネズミチフス菌(「FB62」)が高いレベルのIL-12p70を誘導したのに対し、対照群のラクトバチルス菌株、L.パラカゼイ21060(「B21060」)及びL.パラカゼイCBA L74(「CBAL74」)細胞は、低いレベルのIL-12p70のみ誘導したことを発見した。また、ネズミチフス菌からの上清液(「sn fb62」)はIL-12p70の生成を誘導したが、ラクトバチルス菌株、L.パラカゼイ 21060(「sn b21060」)及びL.パラカゼイCBA L74からの上清液(「sn cbal74」)は誘導しなかった。L.パラカゼイCBA L74の上清液とネズミチフス菌の共培養(「sn cbal74+FB62」)は、IL-12p70の生成において顕著な減少をもたらした。MoDCがL.パラカゼイCBA L74の上清液で1時間だけ前処理されてから、洗浄されて上清液を除去しても(「1h sn cbal74 + FB62」)、この効果は観察された。 この減少は、対照群のラクトバチルス、L.パラカゼイ 21060(「1h sn b21060 + FB62」)に対して観察されたものを超えた。これらのデータは、L.パラカゼイCBA L74及びL.パラカゼイCBA L74由来の培養上清液両方がバクテリア病原菌、ネズミチフス菌によって誘導された炎症を緩和できる抗炎症特性を有することを示唆する。
【０１０９】
実施例18：ネズミチフス菌の存在下での単核球由来の樹状細胞(MoDC)におけるIL-10の生成に対するL.パラカゼイCBA L74発酵ミルクの効果
バクテリア病原菌、ネズミチフス菌の存在下で、ヒトMoDCにおける抗炎症サイトカイン、IL-10の生成を誘導する、L.パラカゼイCBA L74-発酵ミルクの性能を試験した。かかる実験の結果を図32に示す。不活性化されたMoDCは、一般にIL-10を生成しないが、L.パラカゼイCBA L74-発酵ミルクとMoDCの培養が用量依存的なIL-10の生成を誘導することを発見した(「matrice CBAL74 1.41gr/100ml」及び「matrice CBAL74 0.14gr/100ml」を参照)。このキャパシティは、ネズミチフス菌が存在する時も維持された(「matrice CBAL74 1.41gr/100ml+FB62」及び「matrice CBAL74 0.14gr/100ml+FB62」を参照)。
【０１１０】
また、図32は、熱(「6.3*106 CFU CBA74沸騰」)、パラホルムアルデヒド処理(「6.3*106 CFU CBA74 PFA」)又は凍結融解(「6.3*106 CFU CBA74 F&ampT」)によって活性化されるL.パラカゼイCBA L74がIL-10を誘導する性能を保持していたことを示す。
【０１１１】
L.パラカゼイCBA L74の培養培地について見たように、L.パラカゼイCBA L74-発酵ミルクは、ネズミチフス菌によって誘導されたIL-12p70の生成において有意な用量依存的な減少をもたらした(図33)。S.サーモフィルス-発酵ミルクは、ネズミチフス菌の存在下で、IL-12p70の生成における増加をもたらした。しかし、L.パラカゼイCBA L74によって発酵したミルクは、L.パラカゼイCBA L74の抗炎症特性と一致し、IL-12p70の生成を刺激しなかった。これらのデータは、炎症誘発種が更に存在するときも、L.パラカゼイCBA L74が抗炎症特性を保持していたということを示している。 
【０１１２】
実施例19：エンテロバクター・サカザキ(Enterobacter sakazaki)の存在下での単核球由来の樹状細胞(MoDC)におけるIL-10及びIL12p70の生成に対するL.パラカゼイCBA L74細胞の上清液の効果
バクテリア病原菌、エンテロバクター・サカザキの存在下で、ヒトMoDCにおける抗炎症サイトカイン、IL-10及び炎症誘発サイトカイン、IL-12p70の生成を誘導する、L.パラカゼイCBA L74細胞上清液の性能を試験した。E.サカザキの2つの菌株、N9及びN13を試験した。E.サカザキは、ヒトMoDCでIL-10及びIL-12p70両方の生成を誘導した。L.パラカゼイCBA L74細胞上清液の添加は、IL-10の増加及びIL-12p70の有意な減少をもたらした。
【０１１３】
実施例20：ネズミチフス菌の存在下での組織の体外移殖片のモデルにおけるサイトカイン生成に対するL.パラカゼイCBA L74発酵米の効果
マウスの腸上皮は、Abud(Exp. Cell Res. 303: 252-262(2005))に説明されているように、三次元的共培養システムを樹立して使用される。組織の体外移殖片を1大気圧で100％O2の存在下で24時間培養した。下部チャンバーは、ITS-X及びEGFに加えてhEC DMEM 1mlを含有した。上部チャンバーは、S.チフィムリウム、L.パラカゼイCBA L74の発酵米、又はS.チフィムリウム及びL.パラカゼイCBA L74の発酵米の組み合わせに加えて、200mlの媒質を含有した。上清液を収集し、IL-1β、TNF-α、及びIL-10のレベルをELISAによって分析した。図 33に示すように、発酵米の添加は、抗炎症サイトカイン、IL-10のレベルについて普通の(moderate)効果のみを有し、S.チフィムリウムの存在下で、炎症誘発サイトカイン、IL-1β及びTNF-αの生成を有意に減少させた。
【０１１４】
本発明は、本明細書で説明され図面で示す特定構造に限定されないだけでなく、特許請求の範囲内で任意の変形又は等価物を含むと理解されるべきである。
【図３０】
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【図３１】
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５ａ】
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【図２５ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【国際調査報告】
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