(57)【要約】  本発明は、ペプチドカップリング反応により得られる反応混合物からペプチドを抽出する方法であって、  該反応混合物が、ペプチドと、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミドおよびN−メチル−2−ピロリドンからなる群から選択される極性非プロトン性溶媒とを含むこと；ならびに  該方法が、ａ）該反応混合物に、2−メチルテトラヒドロフランおよびトルエンからなる群から選択される有機溶媒１である成分ａ１）と、水である成分ａ２）と、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、アセトニトリル、テトラヒドロフランおよびn−ヘプタンからなる群から選択される有機溶媒２である成分ａ３）とを加えて、有機層および水層からなる二相系を得ることを含む工程、およびｂ）ペプチドを含む有機層と水層を分離することを含む工程を含むことを特徴とする方法に関する。  この抽出工程は、液相におけるペプチド調製方法に好ましく使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドカップリング反応により得られる反応混合物からペプチドを抽出する方法であって、
該反応混合物が、ペプチドと、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミドおよびN−メチル−2−ピロリドンからなる群から選択される極性非プロトン性溶媒とを含むこと；
該方法が、
ａ）該反応混合物に、2−メチルテトラヒドロフランおよびトルエンからなる群から選択される有機溶媒１である成分ａ１）と、水である成分ａ２）と、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、アセトニトリル、テトラヒドロフランおよびn−ヘプタンからなる群から選択される有機溶媒２である成分ａ３）とを加えて、有機層および水層からなる二相系を得ることを含む工程、および
ｂ）ペプチドを含む有機層と水層を分離することを含む工程
を含むこと；ならびに
工程ａ）で得られる該二相系の体積組成比が、
極性非プロトン性溶媒：有機溶媒１＝１：２０〜１：２、
極性非プロトン性溶媒：有機溶媒２＝１：５〜３０：１、および
極性非プロトン性溶媒：水＝１：２０〜１：２であること
を特徴とする方法。
【請求項２】
工程ａ）で得られる前記二相系の体積組成比が、
極性非プロトン性溶媒：有機溶媒１＝１：６〜１：３、
極性非プロトン性溶媒：有機溶媒２＝１：１〜４：１、および
極性非プロトン性溶媒：水＝１：５〜１：３であること
を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記極性非プロトン性溶媒が、N,N−ジメチルホルムアミドおよびN−メチル−2−ピロリドンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記有機溶媒１が、2−メチルテトラヒドロフランであることを特徴とする請求項１〜３の１項以上に記載の方法。
【請求項５】
前記有機溶媒２が、アセトニトリルおよびテトラヒドロフランからなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜４の１項以上に記載の方法。
【請求項６】
前記成分ａ２）が、塩化ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、硫酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウムおよびリン酸水素ナトリウムからなる群から選択される少なくとも１種の無機塩類を含むことを特徴とする請求項１〜５の１項以上に記載の方法。
【請求項７】
前記成分ａ２）のｐＨが５〜８であることを特徴とする請求項１〜６の１項以上に記載の方法。
【請求項８】
工程ｂ）の前に、工程ａ）で得られた前記二相系の濾過を行うことを特徴とする請求項１〜７の１項以上に記載の方法。
【請求項９】
工程ａ）および工程ｂ）を２０℃〜３０℃で行うことを特徴とする請求項１〜８の１項以上に記載の方法。
【請求項１０】
液相におけるペプチドの調製方法であって、
ａａ）カップリング試薬の存在下において、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミドおよびN−メチル−2−ピロリドンからなる群から選択される極性非プロトン性溶媒中でペプチドカップリング反応を行う工程；
ｂｂ）得られたペプチドを、請求項１〜９の１項以上に記載の方法によって抽出する工程；ならびに
ｃｃ）工程ｂｂ）において得られた有機層の少なくとも一部を蒸発させる工程
を含む方法。
【請求項１１】
前記カップリング試薬が、O−1H−ベンゾトリアゾールのウロニウム塩、O−1H−ベンゾトリアゾールのホスホニウム塩およびカルボジイミドカップリング試薬からなる群から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程ａａ）の前記ペプチドカップリング反応を、N,N−ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミンおよびN−メチルモルホリンからなる群から選択される第三級塩基の存在下で行うことを特徴とする請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
ｄｄ）工程ｃｃ）で得られた前記有機層と、アセトニトリル、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルおよびトルエンからなる群から選択される有機溶媒３とを混合する工程；
ｅｅ）前記ペプチドの少なくとも大部分を沈殿させる工程;ならびに
ｆｆ）沈殿させたペプチドを濾別する工程
をさらに含む請求項１０〜１２の１項以上に記載の方法。
【請求項１４】
前記ペプチドのＮ末端保護基がtert−ブチルオキシカルボニル保護基である場合、工程ｃｃ）で得られた前記有機層をトリフルオロ酢酸で処理することによって、tert−ブチルオキシカルボニル保護基を除去することを特徴とする請求項１０〜１２の１項以上に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドのＮ末端保護基がフルオレニル−9−メトキシカルボニル保護基である場合、工程ａａ）の前記ペプチドカップリング反応により得られた反応混合物をピペリジンで処理することによって、フルオレニル−9−メトキシカルボニル保護基を除去することを特徴とする請求項１０〜１２の１項以上に記載の方法。
【請求項１６】
前記ペプチドのＣ末端カルボン酸基が、2−クロロフェニルジフェニルメチルエステルまたはN−メチル−9H−キサンテン−9−アミドで保護されていることを特徴とする請求項１０〜１５の１項以上に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドカップリング反応により得られる反応混合物からペプチドを抽出する方法に関する。本発明の方法は液相ペプチド合成（LPPS）法において使用することが好ましい。反応混合物からペプチドを抽出する本発明の方法は、他のペプチド合成法においても使用することができ、たとえば固相ペプチド合成（SPPS）法により調製された合成ペプチドを切断した後、このペプチドを単離する際に使用することができる。また、本発明の方法は固相−液相ハイブリッドペプチド合成法においても使用することができる。さらに、本発明のペプチド抽出方法は、酵母や細菌などの自然源からペプチドを単離するために使用することができ、具体的には、組換え技術によって発現させたペプチドを単離するために使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
本願明細書においてアミノ酸およびペプチドの命名法は、他に記載がない限り“Nomenclature and symbolism for amino acids and peptides”, Pure & Appl. Chem. 1984, Vol. 56, No. 5, pp. 595-624の記載に従うものとする。
【０００３】
次の略語は他に記載がない限り以下に示す意味を有する。
ACN        アセトニトリル
Boc        tert−ブトキシカルボニル
Bsmoc      1,1−ジオキソベンゾ［b］チオフェン−2−イルメチルオキシカルボニル
Bzl        ベンジル
Cbz        ベンジルオキシカルボニル
DCC        N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
DCE        ジクロロエタン
DCM        ジクロロメタン
DCU        N,N’−ジシクロヘキシル尿素
DEA        ジエチルアミン
DIPE       ジイソプロピルエーテル
DIPEA      N,N−ジイソプロピルエチルアミン
DMA        N,N−ジメチルアセトアミド
DMF        N,N−ジメチルホルムアミド
DOE        実験計画法
EDC        1−エチル−3−（3−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
eq         当量
EtOAc      酢酸エチル
Fmoc       フルオレニル−9−メトキシカルボニル
h          時間
HOBt       1−ヒドロキシベンゾトリアゾール
HOBt・H2O  1−ヒドロキシベンゾトリアゾール1水和物
HPLS       高速液体クロマトグラフィー
LPPS       液相ペプチド合成
MeTHF      2−メチルテトラヒドロフラン
min        分
MS         質量分析
NMP        N−メチル−2−ピロリドン
OMe        メトキシ
OtBu       tert−ブトキシ
PG         保護基
PyBOP      ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ−トリス（ピロリジノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスファート
RM         反応混合物
SPPS       固相ペプチド合成
TAEA       トリス（2−アミノエチル）アミン
TBTU        O−（ベンゾトリアゾール−1−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート
tBu         tert−ブチル
TEA         トリエチルアミン
TFA         トリフルオロ酢酸
THF         テトラヒドロフラン
TLC         薄層クロマトグラフィー
TOTU        O−［シアノ（エトキシカルボニル）メチレンアミノ］−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート
Trt         トリチル
UV          紫外線
【０００４】
ペプチドの抽出方法は、通常、液相ペプチド合成（LPPS）、固相ペプチド合成（SPPS）、固相−液相ハイブリッドペプチド合成などの様々なペプチド合成法において使用される。
【０００５】
LPPSはペプチドの工業的大量生産に使用されることが特に多い。LPPSにおいては、通常、部分的に保護された２つのアミノ酸またはペプチド、すなわち、保護されていないＣ末端カルボン酸基を有するアミノ酸またはペプチドと、保護されていないＮ末端アミノ基を有するアミノ酸またはペプチドとをカップリングする。カップリング工程の終了後、得られたペプチドのＮ末端アミノ基またはＣ末端カルボン酸基の保護基（PG）を特異的に切断することによってＮ末端アミノ基またはＣ末端カルボン酸基を脱保護することができ、後続のカップリング工程を行うことができる。通常、LPPSは、残った保護基（PG）すべてを除去する包括的な脱保護工程を行うことによって完了する。
【０００６】
ペプチドの取り扱い、具体的にはLPPSにおける保護されていないＣ末端カルボン酸基および／または保護されていないＮ末端アミノ基を有するペプチドの取り扱いは往々にして困難である。これは、このようなペプチドが一般的な有機溶媒に溶解しにくいことが原因である。概して、一般的な有機溶媒に対するペプチドの溶解性はペプチド鎖が長くなればなるほど低下する。
【０００７】
ジクロロメタン（DCM）は適切な反応溶媒としてLPPSで一般的に使用されている。DCMは溶媒特性に優れ、沸点が低く、水との混和性が低いことから、DCMを用いることで反応混合物の後処理として水溶液による抽出を行うことが可能となる。しかしながら、DCMを工業規模で使用すると環境に悪影響を及ぼす恐れがあり、また、DCMは密度が大きいことから、水溶液を用いてDCM層を抽出しようとすると時間と費用を要するため、工業規模でのDCMの使用は通常限定的である。
【０００８】
さらに、最近開発された高効率なカップリング試薬、たとえば、ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ−トリス（ピロリジノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（PyBOP）やO−（ベンゾトリアゾール−1−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（TBTU）などはDCMに対する溶解性が低い。これらのカップリング試薬は大きなペプチド断片２つをカップリングする際に特に有利であり、このような大きなペプチド断片のカップリングに他のカップリング試薬を使用すると収率が低くなることが知られている。
【０００９】
さらに、ペプチドの多くは中性および塩基性条件下においてDCMには溶解しにくい一方、たとえばN,N−ジメチルホルムアミド（DMF）、N,N−ジメチルアセトアミド（DMA）、N−メチル−2−ピロリドン（NMP）などの極性非プロトン性溶媒にはよく溶解する。したがって、これらの極性非プロトン性溶媒は、従来よりLPPSの反応溶媒として単独またはテトラヒドロフラン（THF）などの極性の低い溶媒と混合して使用されている。
【００１０】
一方、LPPSに極性非プロトン性溶媒を使用することには多くの欠点がある。極性非プロトン性溶媒の沸点は高いため、反応混合物を蒸発濃縮することが難しい。さらに、極性非プロトン性溶媒は水と混和することから、反応混合物の後処理として水溶液による直接抽出を行うことは不可能である。
【００１１】
LPPSを工業規模で実施する場合、通常、各カップリング工程後に中間体ペプチドを直接沈殿させて、反応混合物から単離する。これによって、反応しなかった出発材料、副産物、過剰なカップリング試薬や塩基などの不純物から分離することができる。ペプチドカップリング反応の終了後、通常、反応混合物を貧溶媒（たとえばジエチルエーテルや水など）に添加することによってペプチドを沈殿させる。しかしながら、既知の問題として、反応混合物を貧溶媒に添加するとゲルが形成されることが知られている。
【００１２】
さらに、一般的に極性非プロトン性溶媒はペプチドの沈殿過程を阻害するため、ペプチドが粘着性のあるゴム状固形物として沈殿し、濾過および乾燥が難しくなる。場合によっては、沈殿したペプチドを濾過することができず、さらには沈殿したペプチドをフィルター上に移すことができないこともある。特に、工業規模でペプチドを沈殿させることは難しい場合が多く、多大な時間が必要とされ、濾過時間によってリードタイムが左右される。この問題は、沈殿工程において極性非プロトン性溶媒に対する貧溶媒の体積比を増加させることよって部分的に解決することができる。実際上、濾過可能な形態のペプチド沈殿物を得るためには適切な貧溶媒が大量に必要とされる。
【００１３】
さらに、ペプチド沈殿物中に残留する極性非プロトン性溶媒は、トリフルオロ酢酸（TFA）を用いた次の脱保護工程を阻害することが知られている。したがって、酸により切断可能な保護基（PG）、たとえば、tert−ブトキシカルボニル（Boc）、トリチル（Trt）、tert−ブチル（tBu）、tert−ブトキシ（OtBu）などを切断する前に、極性非プロトン性溶媒よりもさらに揮発性の高い溶媒でペプチド沈殿物を洗浄して、残留する極性非プロトン性溶媒を除去する工程がさらに必要とされる。
【００１４】
関連技術
WO2005/081711は、薬物−リンカー−リガンド結合体、薬物−リンカー化合物、およびがん、自己免疫疾患または感染症を治療するためのこれらの使用方法に関する。この特許文献では、酢酸エチル、ジクロロメタンおよびtBuOH/CHCl3混合物を使用した、ペプチドベースの薬剤の調製方法およびペプチドの抽出方法などが開示されている。
【００１５】
US5,869,454はアルギニンケト−アミド酵素阻害剤に関する。この特許文献では、このような阻害剤の合成および酢酸エチルによる抽出などが開示されている。
【００１６】
US2005/0165215はペプチドの合成方法および該合成方法におけるペプチドの単離方法に関する。この特許文献はさらにペプチドを大規模合成するための改良に関する。この特許文献においては、ペプチド抽出に適切な溶媒として、ジクロロプロパン、ジクロロエタン、ジクロロメタン、クロロホルム、クロロフルオロカーボン、クロロフルオロハイドロカーボン、これらの混合物などのハロゲン化有機溶媒が提案されている。好ましい溶媒はジクロロメタンである。
【００１７】
C. H. Schneiderら（Int. J. Peptide Protein Res. 1980, 15, pp. 411-419）は、中間体の精製を液液抽出（二相法）により行う溶液中のペプチド合成方法を報告している。ペプチド抽出用溶媒としてジクロロメタンが使用されている。
【００１８】
J. W. van Nispen（Pure and Appl. Chem. 1987, Vol. 59, No. 3, pp. 331-344）は、（ポリ）ペプチドの合成および分析に関して概説している。この文献においては、ペプチド成分の最適な分離条件を見つけるために、様々な特性を有する溶媒を多様に組み合わせることが可能であることが教示されている。この目的を達成するためにいわゆるCraig装置が一般的に使用されており、この装置では、下相を固定し、上相を移動させることによって多段階的に分配が行われる。
【００１９】
US2010/0184952には、Fmoc基で保護されたアミノ酸化合物をアミンと反応させることにより脱保護して得られる反応混合物からジベンゾフルベンおよび／またはジベンゾフルベンアミン付加体を淘汰する方法であって、該反応混合物を、炭素数５以上の炭化水素溶媒および該炭化水素溶媒に混和しない極性有機溶媒（但し、アミド系有機溶媒を除く）中で攪拌、分層させ、ジベンゾフルベンおよび／またはジベンゾフルベンアミン付加体が溶解した炭化水素溶媒層を除去する工程を含むことを特徴とする方法が開示されている。この方法においては、アミノ酸エステルまたはペプチドは極性有機溶媒中に移行する。かかる極性有機溶媒としては、アセトニトリル、メタノール、アセトン等またはそれらの混合溶媒が挙げられ、アセトニトリルまたはメタノールが好ましい。
【００２０】
L. A. Carpinoら（Organic Process Research & Development 2003, 7, pp. 28-37）は、高速かつ連続した液相ペプチド合成を報告している。この文献の方法ではトリス（2−アミノエチル）アミンの存在下でペプチド断片のFmoc保護基およびBsmoc保護基の脱保護が行われており、この方法は短ペプチドのグラム単位での高速かつ連続した液相合成および比較的長い（22mer）断片（hPTH 13-34）の合成に使用できることが確認されている。後者の合成の場合、粗生成物の純度は固相法により得られた試料よりも有意に高いことが報告されている。Bsmocを用いたこの方法では、カップリング−脱保護サイクル毎に伸長される部分的に脱保護されたペプチドをシリカゲルショートカラムに通して濾過を行う新たな技法を取り入れることによって最適化がなされている。
【００２１】
しかしながら、L. A. Carpinoらによって報告された方法にはいくつかの制約がある。すなわち、この方法は反応溶媒としてDCMを使用しているため、DCMに対して難溶性を示すペプチドの調製に使用することはできない。さらに、高価なトリス（2−アミノエチル）アミン（TAEA）を大量に使用することから、このことによっても工業規模でこの方法を利用することが難しくなっている。
【００２２】
したがって、特に工業規模での生産を目的とした、ペプチドを調製するための時間効果および費用効果の高い合成方法が強く求められている。このような方法は、LPPSにおけるDCMの使用およびDMF、DMA、NMPなどの極性非プロトン性溶媒の使用により生じる問題点を解決できるものでなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
驚くべきことに本発明者らは、構造的に多様なペプチドの多くが、2−メチルテトラヒドロフランおよびトルエンからなる群（この群を「有機溶媒１」と呼ぶ）から選択される有機溶媒と、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、アセトニトリル、n−ヘプタンおよびテトラヒドロフランからなる群（この群を「有機溶媒２」と呼ぶ）から選択される有機溶媒との組み合わせに対して優れた溶解性を示すことを見出した。具体的には、有機溶媒１と有機溶媒２との組み合わせに対するペプチドの溶解性は、有機溶媒１単独に対するものよりも顕著に高い。さらに本発明者らは、有機溶媒１と有機溶媒２との組み合わせおよび水を含む二相系において、一般的な極性非プロトン性溶媒の大部分は水層に移行することを見出した。
【００２４】
したがって、有機溶媒１と有機溶媒２との組み合わせおよび水を含む系は、極性非プロトン性溶媒を含む混合物からのペプチドの抽出に非常に適している。本発明の一実施形態では、ペプチドを含む得られた有機層を部分的に蒸発させ、次いで適切な貧溶媒（この群を「有機溶媒３」と呼ぶ）を添加することにより、有機層中に溶解しているペプチドを沈殿させる。ペプチドを沈殿させる際には極性非プロトン性溶媒は実質的に含まれていないため、得られたペプチドを容易に濾過することができる。本発明の抽出方法を使用することによって、ペプチドの濾過に必要とされる時間を大幅に短縮することができる。したがって、本発明の抽出方法を使用することによって、極性非プロトン性溶媒を使用することにより生じるLPPSの問題点を見事に解決することができる。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明は、ペプチドカップリング反応により得られる反応混合物からペプチドを抽出する方法であって、
該反応混合物が、ペプチドと、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミドおよびN−メチル−2−ピロリドンからなる群から選択される極性非プロトン性溶媒とを含むこと；
該方法が、
ａ）該反応混合物に、2−メチルテトラヒドロフランおよびトルエンからなる群から選択される有機溶媒１である成分ａ１）と、水である成分ａ２）と、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、アセトニトリル、テトラヒドロフランおよびn−ヘプタンからなる群から選択される有機溶媒２である成分ａ３）とを加えて、有機層および水層からなる二相系を得ることを含む工程、および
ｂ）ペプチドを含む有機層と水層を分離することを含む工程
を含むこと；ならびに
工程ａ）で得られる該二相系の体積組成比が、
極性非プロトン性溶媒：有機溶媒１＝１：２０〜１：２、
極性非プロトン性溶媒：有機溶媒２＝１：５〜３０：１、および
極性非プロトン性溶媒：水＝１：２０〜１：２であること
を特徴とする方法に関する。
【００２６】
好ましい実施形態において、工程ａ）で得られる二相系の体積組成比は、
極性非プロトン性溶媒：有機溶媒１＝１：６〜１：３、
極性非プロトン性溶媒：有機溶媒２＝１：１〜４：１、
極性非プロトン性溶媒：水＝１：５〜１：３、および
有機溶媒１：有機溶媒２＝１０：１〜２：１である。
【００２７】
特に好ましい実施形態では、極性非プロトン性溶媒はN,N−ジメチルホルムアミドまたはN−メチル−2−ピロリドンである。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態では、有機溶媒１は2−メチルテトラヒドロフランである。
【００２９】
本発明の好ましい一実施形態では、ペプチドの抽出毎にペプチドの沈殿操作は行わない。すなわち、ペプチドの１つまたは複数の保護基を切断して、これにより得られた部分的に保護されていないペプチドを抽出し、このペプチドを含む有機層を次のペプチドカップリング反応に使用する。したがって、本発明によって、工業規模でのペプチドの調製に適した連続的LPPSを行うための効率的な合成方法が提供される。
【００３０】
本発明の連続的LPPSは、後述する実施例において説明されるような、保護基としてBoc、FmocおよびBzlを使用したペプチド合成に非常に適している。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】NMP/MeTHF/水からなる三成分混合物の有機層中NMP含有量（g/L）を示すコンター図である（●は実験に使用した混合物の組成を示し、「2x」は２サンプルずつ調製したものを示す）。
【図２】NMP/MeTHF/水からなる三成分混合物の有機層の体積（mL）を示すコンター図である（●は実験に使用した混合物の組成を示し、「2x」は2サンプルずつ調製したものを示す）。
【図３】NMP/MeTHF/NaCl溶液からなる三成分混合物の有機層中NMP含有量（g/L）を示すコンター図である（●は実験に使用した混合物の組成を示し、「2x」は2サンプルずつ調製したものを示す）。
【図４】NMP/MeTHF/NaCl溶液からなる三成分混合物の有機層の体積（mL）を示すコンター図である（●は実験に使用した混合物の組成を示し、「2x」は2サンプルずつ調製したものを示す）。
【図５】MeTHF/NMP/水系の相対組成の関数として求められた、水中ペンタペプチドH-Leu-Trp(Boc)-Val-Asn(Trt)-Ser(tBu)-NH2の抽出収率を示すコンター図である（●は実験に使用した混合物の組成を示し、「3x」は３サンプルずつ調製したものを示す）。
【図６】NMP/MeTHF/THF/水系の組成の関数として示される、有機層中のNMP濃度の依存性を示すグラフである。
【図７】ペプチドBoc-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu-OBzlのBoc保護基の除去速度に対する残留DMFの影響を示すグラフである。  試験No.１：Boc-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu-OBzlはDCMを用いた抽出により単離した。  試験No.３：Boc-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu-OBzlはEtOAcを用いた抽出により単離した。  試験No.５：Boc-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu-OBzlはMeTHFを用いた抽出により単離した。
【図８】本発明の方法によって単離したペプチドBoc-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu(OBzl)の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
抽出方法
本発明は、ペプチドカップリング反応により得られる反応混合物からペプチドを抽出する方法であって、
該反応混合物が、ペプチドと、DMF、DMAおよびNMPからなる群から選択される極性非プロトン性溶媒とを含むこと；ならびに
該方法が、
ａ）2−メチルテトラヒドロフランおよびトルエンからなる群から選択される有機溶媒１である成分ａ１）と、水である成分ａ２）と、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、アセトニトリル、テトラヒドロフランおよびn−ヘプタンからなる群から選択される有機溶媒２である成分ａ３）とを加えて、有機層および水層からなる二相系を得ることを含む工程、および
ｂ）ペプチドを含む有機層と水層を分離することを含む工程
を含むこと
を特徴とする方法に関する。
【００３３】
成分ａ１）、成分ａ２）および成分ａ３）は混合してもよく、この混合はどのような順序で行ってもよい。本発明の抽出方法においてペプチドが沈殿しない限り、これらのうち２つの成分または３つの成分すべてを前もって混合してから、これら３成分を添加することもできる。
【００３４】
極性非プロトン性溶媒を含む混合物は、ペプチドカップリング反応により得られる粗反応混合物であることが好ましい。界面活性剤として作用する化合物がこの混合物に含まれていると本発明の抽出方法における相分離を阻害しうるため、この混合物はこのような化合物を全く含まないことが好ましい。特に好ましい実施形態では、この混合物はカチオン性界面活性剤や非イオン性界面活性剤などの従来技術において公知の界面活性剤を含んでいない。
【００３５】
ペプチドおよび極性非プロトン性溶媒を含む混合物への成分ａ１）、成分ａ２）および成分ａ３）の添加は、本発明の抽出方法においてペプチドが沈殿しない限り、どのような順序で行ってもよい。たとえば、ペプチドおよび極性非プロトン性溶媒を含む混合物と、有機溶媒１とを混合し、ここに水を加え、最後に有機溶媒２を加えることができる。また、ペプチドおよび極性非プロトン性溶媒を含む混合物を水に加えた後に、有機溶媒１および有機溶媒２を添加することもできる。
【００３６】
本発明の特に好ましい実施形態では、ペプチドおよび極性非プロトン性溶媒を含む混合物と、有機溶媒１および有機溶媒２とを混合するが、有機溶媒１および有機溶媒２はいずれを先に添加してもよい。次いで水を加える。
【００３７】
添加される水（成分ａ２））は、塩類（たとえば無機塩類）などの溶存成分を含んでいてもよいと理解される。
【００３８】
得られた二相系は激しく攪拌することが好ましい。得られた二相系の攪拌は、抽出操作に一般的に用いられかつ当技術分野において公知の混合機を使用して行うことができる。たとえば、バッチ抽出を行う場合にはジェットミキサーまたは攪拌ミキサーを使用して二相系を攪拌することができる。
【００３９】
抽出操作に適した機器は、主として本発明の抽出方法を実施する規模および抽出温度に応じて選択される。また、本発明の抽出方法はバッチ抽出法または連続抽出法を使用して行うことができる。ペプチドに最適な抽出を達成するために、必要に応じて本発明の抽出方法を複数回繰り返すことも可能である。
【００４０】
攪拌を行った後、相分離させて、２つの液体層（有機層および水層）を形成させることが好ましい。有機層は水層よりも密度が小さい。相分離は沈降管を使用してまたは遠心分離によって生じさせてもよい。相分離に必要とされる時間は、本発明の抽出方法を実施する規模および使用する機器に左右される。相分離に必要とされる時間は１時間未満であることが好ましく、１０分未満であることがより好ましく、１分未満であることが特に好ましい。
【００４１】
相分離が生じた後、ペプチドは主として有機層に含まれており、有機層には有機溶媒１および有機溶媒２がさらに含まれている。ペプチドを含む上層の有機層は水層と分離されている。本発明の抽出方法を実施後、ペプチド全体の９０重量％より多くのペプチドが有機層に含まれ、１０重量％未満が水層に含まれることが好ましい。本発明の抽出方法を実施後、ペプチド全体の９８重量％より多くのペプチドが有機層に含まれ、２重量％未満が水層に含まれることがさらにより好ましい。本発明の抽出方法を実施後、ペプチド全体の９９重量％より多くのペプチドが有機層に含まれ、１重量％未満が水層に含まれることが特に好ましい。
【００４２】
本発明の抽出方法によって、ペプチドカップリング反応により得られる粗反応混合物からペプチドを効率的に抽出することができる。有機層に対する極性非プロトン性溶媒の溶解性は水層に対するものよりも大幅に低い。したがって、抽出を行った後、ペプチドを含む有機層は極性非プロトン性溶媒をわずかな量しか含まない。
【００４３】
本発明の抽出方法を実施後、極性非プロトン性溶媒全体の１５体積％未満が有機層に含まれ、極性非プロトン性溶媒全体の８５体積％より多くの極性非プロトン性溶媒が水層に含まれることが好ましい。さらに、本発明の抽出方法を実施後、極性非プロトン性溶媒全体の５体積％未満が有機層に含まれ、極性非プロトン性溶媒全体の９５体積％より多くの極性非プロトン性溶媒が水層に含まれることがより好ましい。本発明の抽出方法を実施後、極性非プロトン性溶媒全体の２体積％未満が有機層に含まれ、極性非プロトン性溶媒全体の９８体積％より多くの極性非プロトン性溶媒が水層に含まれることが特により好ましい。この条件を達成するために繰り返し抽出が必要となる場合がある。
【００４４】
重要なことには、本発明による抽出方法は、極性非プロトン性溶媒の大部分からペプチドを分離できるだけでなく、カップリング試薬（尿素、テトラフルオロホウ酸塩など）に由来する塩および副産物からもペプチドを分離することができる。ペプチドカップリング反応により得られる粗反応混合物にn−ヘプタンまたはジエチルエーテルなどの疎水性貧溶媒を添加してペプチドを直接沈殿させた場合、塩および副産物は通常除去することができない。さらに、これらの塩および副産物は、ペプチドの後処理に使用されるクロマトグラフィーカラムの性能を低下させることが知られている。調製したペプチドを医薬品有効成分として使用する場合、カラムクロマトグラフィーによりさらに精製することが必須とされる。
【００４５】
したがって、ペプチドを沈殿させた後、必要に応じてカラムクロマトグラフィーで精製してもよい。ペプチドを医薬品有効成分として使用する場合、このような精製工程をさらに追加する。したがって、本発明による抽出方法は、反応混合物から直接沈殿させる方法よりも高純度のペプチドを単離することができる。
【００４６】
本発明の抽出方法により得られる二相系の組成は、有機層と水層の間における、ペプチドおよび極性非プロトン性溶媒の分配係数に大きな影響を及ぼす。以下において比率は体積／体積比で示す。
【００４７】
極性非プロトン性溶媒：有機溶媒１の体積比は、１：２０〜１：２の範囲であることが好ましい。この体積比は１：１０〜１：２の範囲であることが好ましく、１：６〜１：３の範囲であることが特に好ましい。
【００４８】
有機溶媒１と有機溶媒２との組み合わせに対するペプチドの溶解性は、有機溶媒１単独に対するものよりも高いことが確認されている。したがって、使用する有機溶媒２の量が十分に多い場合、本発明の抽出方法において得られる有機層に対するペプチドの溶解性はとりわけ高い。極性非プロトン性溶媒：有機溶媒２の体積比は１：５〜３０：１の範囲であることが好ましい。この体積比は１：３〜１０：１の範囲であることが好ましく、１：１〜４：１の範囲であることが特に好ましい。
【００４９】
有機溶媒１：有機溶媒２の体積比は５０：１〜１：１の範囲であることが好ましい。この体積比は２０：１〜２：１の範囲であることが好ましく、１０：１〜２：１の範囲であることが特に好ましい。
【００５０】
極性非プロトン性溶媒：水の体積比は、本発明の抽出方法の効率および水層に対するペプチドの溶解性に大きな影響を及ぼす。具体的には、二相系における極性非プロトン性溶媒：水の体積比が１：２より高い場合、たとえば、水層に含まれる極性非プロトン性溶媒が３４体積％よりも多い場合、水層へのペプチドの溶解性はかなり高くなる。したがって、極性非プロトン性溶媒：水の体積比は１：２０〜１：２の範囲であることが好ましい。この体積比は１：１０〜１：３の範囲であることが好ましく、１：５〜１：３の範囲であることが特に好ましい。
【００５１】
ペプチドを含む混合物中の極性非プロトン性溶媒は、DMFおよびNMPからなる群から選択されることが好ましい。
【００５２】
有機溶媒１が2−メチルテトラヒドロフランである場合、有機溶媒１と有機溶媒２との組み合わせは本発明のペプチド抽出方法に特に適していることが判明している。したがって、本発明の抽出方法に使用される有機溶媒１は2−メチルテトラヒドロフランであることが好ましい。2−メチルテトラヒドロフランは容易に再利用可能で、環境に配慮した溶媒であり、様々な農業副産物より得ることができる。したがって、本発明は環境に配慮したペプチド抽出方法を提供する。
【００５３】
有機溶媒２が、酢酸エチル（EtOAc）、酢酸イソプロピル、アセトニトリル（ACN）、n−ヘプタンおよびテトラヒドロフラン（THF）からなる群、より好ましくはEtOAc、酢酸イソプロピル、ACNおよびTHFからなる群、特に好ましくはACNおよびTHFからなる群から選択される場合、有機溶媒１と有機溶媒２との組み合わせに対するペプチドの溶解性は特に高い。したがって、本発明のペプチド抽出方法の特に好ましい実施形態においては、有機溶媒２はACNおよびTHFからなる群から選択される。
【００５４】
本発明のペプチド抽出方法において使用される成分ａ２）は、水のみからなっていてもよい。しかしながら、成分ａ２）が少なくとも１種の無機塩類をさらに含んでいる場合、成分ａ２）と有機溶媒１との混和性および成分ａ２）と有機溶媒２との混和性、すなわち水層へのペプチドの溶解性を大幅に低下させることができる。さらに、成分ａ２）が少なくとも１種の無機塩類を含んでいる場合、有機層中の水の含有量は低下する。
【００５５】
好ましい一実施形態においては、成分ａ２）は、塩化ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、硫酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウムおよびリン酸水素ナトリウムからなる群から選択される少なくとも１種の無機塩類を含んでいる。別の実施形態では、成分ａ２）は酸などの他の化合物をさらに含む。
【００５６】
具体的には、成分ａ２）は、ｐＨ２〜１１の範囲において、緩衝剤として作用しない無機塩類を含んでいてもよい。そのような無機塩類を添加すると、水層へのペプチドの溶解性を低下させることができ、本発明の抽出方法において相分離に必要とされる時間を短縮させることができる。たとえば、成分ａ２）は塩化ナトリウムまたは硫酸ナトリウムを含んでいてもよい。成分ａ２）中に含まれる無機塩類の濃度は、１〜２０重量％の範囲であることが好ましく、５〜１５重量％の範囲であることがより好ましい。塩化ナトリウムのような塩は二相分離を促進するために使用され、緩衝剤として作用する塩は水層中の酸または塩基を選択的に抽出するために使用される。
【００５７】
成分ａ２）のｐＨは、水層へのペプチドの溶解性およびいくつかの不純物の溶解性に大きな影響を及ぼす。さらに、成分ａ２）のｐＨは、ペプチドの化学的安定性およびその保護基（PG）の化学的安定性に応じて選択される。本発明の抽出方法において、ペプチドカップリング反応に使用した第三級塩基の大部分が水層中に含まれるように、成分ａ２）のｐＨは２〜１１の範囲であることが好ましく、５〜８の範囲であることが特に好ましい。成分ａ２）のｐＨは、酸または塩基を添加することによって、かつ／または緩衝剤を使用することによって調整することができる。
【００５８】
成分ａ２）のｐＨの調整に使用することができる酸は、成分ａ２）に含まれる該酸が本発明のペプチド抽出方法を阻害せず、かつペプチドの分解を引き起こさないものであれば特に限定されず自由に選択することができる。たとえば、硫酸、塩酸、リン酸、トリフルオロ酢酸およびクエン酸などのブレンステッド酸をこの目的のために使用することができる。
【００５９】
成分ａ２）のｐＨの調整に使用することができる塩基は、成分ａ２）に含まれる該塩基が本発明のペプチド抽出方法を阻害せず、かつペプチドの分解を引き起こさないものであれば特に限定されず自由に選択することができる。たとえば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよび水酸化リチウムなどのアルカリ金属の水酸化物は、成分ａ２）のｐＨを調整するのに適している。
【００６０】
本発明の抽出方法において水層のｐＨが所望の範囲内に維持されるように、成分ａ２）は緩衝剤を含むことが好ましい。緩衝剤は、塩化アンモニウム、硫酸水素ナトリウム、硫酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムおよびリン酸ナトリウムからなる群から選択されることが好ましい。成分ａ２）に含まれる緩衝剤の濃度は、１〜１０重量％の範囲が好ましく、３〜８重量％の範囲がさらにより好ましい。
【００６１】
必要に応じて、ペプチドを含む得られた有機層はさらに水溶液で少なくとも１回洗浄してもよい。この目的に使用する水溶液のｐＨは２〜１１の範囲であることが好ましい。
【００６２】
ペプチドカップリング反応の条件および使用する試薬によっては、有機層は、遊離の第１級、第２級または第３級アミノ基を有する化合物、たとえば保護されていないＮ末端アミノ基を有するペプチドまたは第三級塩基を不純物として含みうる。このような場合、ｐＨ２〜７の水溶液で有機層を洗浄することが好ましい。
【００６３】
また、有機層が、遊離のカルボン酸基を有する化合物、たとえば保護されていないＣ末端カルボン酸基を有するペプチドを含む場合もある。このような場合は、ｐＨ７〜１１の水溶液で有機層を洗浄することが好ましい。
【００６４】
本発明のペプチド抽出方法を実施するのに好ましい温度（以下「抽出温度」と呼ぶ）は、使用する溶媒の選択およびペプチドの特性に左右される。抽出温度は、使用する溶媒の混和性、ならびに有機層および水層に対するペプチドの溶解性に大きな影響を及ぼす。したがって、本発明の抽出方法において二相系が形成され、かつ有機層に対するペプチドの溶解性が十分に高くなるように抽出温度を選択する。本発明のペプチド抽出方法は、０〜６０℃の抽出温度において行うことが好ましい。抽出温度は２０〜３０℃の範囲であることが特に好ましい。
【００６５】
ペプチドカップリング反応の条件および使用するカップリング試薬によっては、本発明の抽出方法を実施する前および／または実施している最中に固形物が形成されることがある。たとえば、カルボジイミドをカップリング試薬として使用する場合がこれに当てはまる。このため、ペプチドおよび極性非プロトン性溶媒を含む混合物と、有機溶媒１と、有機溶媒２と、成分２）とを混合することにより得られる二相系の濾過が必要となる場合がある。したがって、本発明の一実施形態では、ペプチドを含む有機層を分離する前に二相系の濾過を行う。
【００６６】
本発明の抽出方法によって抽出されるペプチドはどのようなペプチドであってもよい。本発明の抽出方法によって抽出されるペプチドは１００個以下のアミノ酸残基を含むことが好ましく、５０個以下のアミノ酸残基を含むことがより好ましく、２０個以下のアミノ酸残基を含むことが最も好ましい。該ペプチドのアミノ酸は、D−α−アミノ酸および／またはL−α−アミノ酸、β−アミノ酸であってもよく、少なくとも１個の第１級および／または第２級アミノ基と少なくとも１個のカルボン酸基とを含む他の有機化合物であってもよい。アミノ酸はα−アミノ酸であることが好ましく、L−α−アミノ酸であることがさらにより好ましく、これらの中でもタンパク質を構成するアミノ酸が特に好ましい。
【００６７】
ペプチドの調製
本発明の別の態様は、液相におけるペプチドの調製方法であって、
ａａ）カップリング試薬および必要に応じて第三級塩基の存在下において、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミドおよびN−メチル−2−ピロリドンからなる群から選択される極性非プロトン性溶媒中でペプチドカップリング反応を行う工程;
ｂｂ）得られたペプチドを上記の方法によって抽出する工程;ならびに
ｃｃ）工程ｂｂ）において得られた有機層の少なくとも一部を蒸発させる工程
を含む方法に関する。
【００６８】
工程ａａ）のペプチドカップリング反応のための出発材料として、部分的に保護された２つのアミノ酸の組み合わせ、部分的に保護された２つのペプチドの組み合わせ、または部分的に保護されたアミノ酸１つと部分的に保護されたペプチド１つの組み合わせが使用される。
【００６９】
本発明による液相ペプチド調製方法は、液相ペプチド合成（LPPS）に非常に適している。本発明の一実施形態では、工程ａａ）のペプチドカップリング反応において、SPPSにより調製され部分的に保護された２つのペプチドの組み合わせが使用される。したがって、本発明の方法はペプチド断片のカップリングを行うことができ、SPPSと組み合わせて使用することができる。
【００７０】
工程ａａ）のペプチドカップリング反応は、ペプチドカップリング反応に通常用いられる慣用の反応条件および試薬を使用して行う。
【００７１】
ペプチドカップリング反応は、極性非プロトン性溶媒中において１以上のカップリング試薬を使用することにより従来実施されており、好ましくは１以上のカップリング添加剤の存在下、好ましくは１以上の第三級塩基の存在下で実施される。
【００７２】
ペプチドカップリング反応に使用されるカップリング試薬は、ペプチドカップリング反応条件下において極性非プロトン性溶媒と反応しないものであり、かつ活性カルボン酸基に隣接した立体中心のエピマー化が実質的に起こらないものが選択される。したがって、カップリング試薬としては、O−1H−ベンゾトリアゾールのホスホニウム塩またはウロニウム塩およびカルボジイミドカップリング試薬が好ましい。
【００７３】
上記ホスホニウム塩およびウロニウム塩は、BOP（ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスファート）、PyBOP（ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート）、HBTU（O−（1H−ベンゾトリアゾール−1−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート）、HCTU（O−（1H−6−クロロ−ベンゾトリアゾール−1−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート）、TCTU（O−（1H−6−クロロベンゾトリアゾール−1−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート）、HATU（O−（7−アザベンゾトリアゾール−1−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート）、TATU（O−（7−アザベンゾトリアゾール−1−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート）、TBTU（O−（ベンゾトリアゾール−1−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート）、TOTU（O−［シアノ（エトキシカルボニル）メチレンアミノ］−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート）、HAPyU（O−（ベンゾトリアゾール−1−イル）オキシビス−（ピロリジノ）−ウロニウムヘキサフルオロホスファート）、PyAOP（ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート）、COMU（1−［（1−（シアノ−2−エトキシ−2−オキソエチリデンアミノオキシ）−ジメチルアミノ−モルホリノメチレン）］−メタンアミニウムヘキサフルオロホスファート）、PyClock（6−クロロ−ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート）、PyOxP（O−［（1−シアノ−2−エトキシ−2−オキソエチリデン）アミノ］−オキシトリ（ピロリジン−1−イル）−ホスホニウムヘキサフルオロホスファート）、およびPyOxB（O−［（1−シアノ−2−エトキシ−2−オキソエチリデン）アミノ］−オキシトリ（ピロリジン−1−イル）−ホスホニウムテトラフルオロボラート）からなる群から選択されることが好ましい。
【００７４】
ホスホニウムカップリング試薬またはウロニウムカップリング試薬から選択される好ましいカップリング試薬はTBTU、TOTUおよびPyBOPである。
【００７５】
カルボジイミドカップリング試薬は、ジイソプロピル−カルボジイミド（DIC）、ジシクロヘキシル−カルボジイミド（DCC）、および水溶性カルボジイミド（WSCDI）（たとえば1−エチル−3−（3−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（EDC）など）からなる群から選択されることが好ましい。
【００７６】
水溶性カルボジイミドはカルボジイミドカップリング試薬として特に好ましく、水溶性カルボジイミドのうちEDCが最も好ましい。
【００７７】
ペプチドカップリング反応で使用される第三級塩基は、ペプチドおよびカップリング試薬と適合することが好ましく、本発明の抽出方法を阻害するような界面活性剤としての作用を持たないことが好ましい。
【００７８】
ペプチドカップリング反応で使用される第三級塩基の共役酸のｐＫａは７．５〜１５が好ましく、７．５〜１０がより好ましい。第三級塩基は、N,N−ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）およびトリエチルアミン（TEA）などのトリアルキルアミン、N,N−ジエチルアニリンなどのN,N−ジ−C1-4アルキルアニリン、コリジン（2,4,6−トリメチルピリジン）などの2,4,6−トリ−C1-4アルキルピリジン、ならびにN−メチルモルホリンなどのN−C1-4アルキルモルホリン（C1-4アルキルはそれぞれ独立して同一でも異なっていてもよい直鎖または分岐鎖C1-4アルキル）からなる群から選択されることが好ましい。ペプチドカップリング反応に使用される第三級塩基として、DIPEA、TEAおよびN−メチルモルホリンが特に好ましい。
【００７９】
カップリング添加剤は、活性化エステルを形成する求核性ヒドロキシ化合物であることが好ましく、この化合物は酸性求核性N−ヒドロキシ基（Nはイミド、またはN−アシルもしくはN−アリール置換トリアゼノである）を有していることがより好ましく、トリアゼノ型カップリング添加剤は、N−ヒドロキシベンゾトリアゾール誘導体（もしくは1−ヒドロキシベンゾトリアゾール誘導体）またはN−ヒドロキシベンゾトリアジン誘導体であることが好ましい。このようなカップリング添加剤はWO94/07910およびEP 0 410 182に記載されている。
【００８０】
好ましいカップリング添加剤は、N−ヒドロキシスクシンイミド（HOSu）、6−クロロ−1−ヒドロキシベンゾトリアゾール（Cl-HOBt）、N−ヒドロキシ−3,4−ジヒドロ−4−オキソ−1,2,3−ベンゾトリアジン（HOOBt）、1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール（HOAt）、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）およびエチル−2−シアノ−2−ヒドロキシイミノアセタート（CHA）からなる群から選択される。CHAはOXYMAPURE（登録商標）の商品名で入手可能である。CHAは、ベンゾトリアゾールベースのカップリング添加剤と比較して活性カルボン酸の立体中心のエピマー化をより抑制することから、効果的なカップリング添加剤であることが判明している。さらに、CHAはたとえばHOBtまたはCl-HOBtよりも爆発性が低いため取り扱いが容易であり、また、カップリング反応の進行を反応混合物の色変化によって視覚的にモニタリングすることができるというさらなる利点を有する。カップリング添加剤としてHOBtをペプチドカップリング反応に使用することが好ましい。
【００８１】
本発明の好ましい実施形態では、ペプチドカップリング反応における試薬の組み合わせは、TBTU/HOBt/DIPEA、PyBOP/TEA、EDC/HOBtおよびEDC/HOBt/DIPEAからなる群から選択される。
【００８２】
ペプチドカップリング反応の反応溶媒は、DMF、DMA、NMPおよびこれらの混合物からなる群から選択される。ペプチドカップリング反応に使用するのに特に好ましい反応溶媒は、DMFおよびNMPからなる群から選択される。
【００８３】
反応溶媒は実質的に水を含まないことが好ましい。反応溶媒中の水の含有量は１重量％未満であることが好ましく、０．１重量％未満であることがより好ましく、０．０１重量％未満であることがさらにより好ましく、０．００１重量％未満であることが特に好ましい。溶媒中の水の含有量は、従来技術において公知の標準試験法ASTM E203-8に従いカールフィッシャー滴定法によって決定することができる。
【００８４】
ペプチドカップリング反応の反応溶媒は、第１級アミン、第２級アミン、カルボン酸および脂肪族アルコールからなる群から選択される不純物を実質的に含まないことが好ましい。準化学量論量または化学量論量で使用されるいずれの出発材料においても、ペプチドカップリング反応中にこれらの不純物との望ましくない反応を起こす割合が１ｍｏｌ％未満であれば、ペプチドカップリング反応の反応溶媒はこれらの不純物を実質的に含まないと見なされる。
【００８５】
適切な反応温度は、使用するカップリング試薬およびペプチドの安定性に応じて選択される。ペプチドカップリング反応を行う反応温度は、−１５℃〜５０℃であることが好ましく、−１０℃〜３０℃であることがより好ましく、０℃〜２５℃であることがさらに好ましい。
【００８６】
ペプチドカップリング反応は大気圧において行うことが好ましい。しかしながら、大気圧よりも高いまたはわずかに低い圧力下でペプチドカップリング反応を行うことも可能である。
【００８７】
ペプチドカップリング反応は周囲雰囲気下で行うことが好ましい。しかしながら、窒素およびアルゴンなどの保護ガス雰囲気下も好ましい。
【００８８】
本願において「反応時間」は、反応による変換が実質的に完了するのに必要とされる時間を指す。準化学量論量または化学量論量で使用される出発材料の量が最初の量の５ｍｏｌ％未満、好ましくは最初の量の２ｍｏｌ％未満に減少すれば、反応による変換が実質的に完了したと見なされる。反応の進行は当技術分野で公知の分析法を用いてモニタリングすることができ、たとえば、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析、薄層クロマトグラフィー（TLC）、質量分析（MS）またはHPLC-MSを用いることができ、この目的に対してはHPLCが特に好ましい。
【００８９】
ペプチドカップリング反応の反応時間は１５分〜２０時間の範囲であることが好ましく、３０分〜５時間の範囲がより好ましく、３０分〜２時間の範囲がさらにより好ましい。
【００９０】
ペプチドカップリング反応の反応条件の説明における「部」は、ペプチドカップリング反応の出発材料として使用されるペプチドおよび／またはアミノ酸の総重量に対する割合を意味する。反応溶媒の使用量は、１〜３０部が好ましく、５〜１０部がより好ましい。
【００９１】
カップリング試薬の使用量は、反応性Ｃ末端カルボン酸基に対して０．９〜５モル当量が好ましく、１〜１．５モル当量がより好ましい。
【００９２】
カップリング添加剤の使用量は、カップリング試薬に対して０．１〜５モル当量が好ましく、０．５〜１．５モル当量がより好ましい。
【００９３】
第三級塩基の使用量は、カップリング試薬に対して１〜１０モル当量が好ましく、２〜３モル当量がより好ましい。
【００９４】
本発明の液相ペプチド調製方法により、あらゆるペプチドを得ることができる。
【００９５】
本発明の液相ペプチド調製方法により得られるペプチドは、１００個以下のアミノ酸残基を含むことが好ましく、５０個以下のアミノ酸残基を含むことがより好ましく、２０個以下のアミノ酸残基を含むことが最も好ましい。該ペプチドのアミノ酸は、D−α−アミノ酸、L−α−アミノ酸、またはβ−アミノ酸であってもよく、少なくとも１個の第１級および／または第２級アミノ基と少なくとも１個のカルボン酸基とを含む他の有機化合物であってもよい。本発明の液相ペプチド調製方法により得られるペプチドのアミノ酸はα−アミノ酸であることが好ましく、L−α−アミノ酸であることがさらにより好ましく、これらの中でもタンパク質を構成するアミノ酸が特に好ましい。
【００９６】
抽出工程の後、ペプチドを含む有機層を部分的に蒸発させることが好ましい。したがって、本願において、このようにして得られた有機層を「部分的に蒸発させた有機層」と呼ぶ。部分的な蒸発を行う温度は特に限定されないが、有機溶媒１と有機溶媒２との混合物の特性およびペプチドの熱安定性に左右される。有機層の部分的な蒸発は３０〜５０℃の温度で行うことが好ましい。必要に応じて、有機層の部分的な蒸発は２０〜１０００ｍｂａｒ（２０〜１０００ｈＰａ）の減圧下で行う。当業者であれば、有機層の部分的な蒸発を行う圧力は蒸発操作を行う所望の温度に応じて調整することが好ましいことは理解できるであろう。
【００９７】
有機溶媒１および有機溶媒２は十分な揮発性を有するため、ペプチドを含む有機層の部分的な蒸発は容易に実施することができる。
【００９８】
本発明の一実施形態では、ペプチドを含む有機層を直接、蒸発乾固させ、残った残渣を有機溶媒１でも有機溶媒２でもない溶媒中に溶解する。しかしながら、ペプチドを含む有機層がMeTHFおよびTHFからなる群から選択される溶媒を６０体積％よりも多く含んでいる場合、安全上の理由により完全に蒸発乾固させないことが好ましい。その代わり、ペプチドを含む有機層を部分的に蒸発させ、トルエンを添加してから蒸発乾固を行うことが可能である。
【００９９】
有機層中に含まれる有機溶媒の少なくとも１つが水との共沸混合物を形成するため、ペプチドを含む有機層中に微量に存在する水は有機層を部分的に蒸発させる工程において効果的に除去される。有機溶媒１が2−メチルテトラヒドロフランである場合、有機層を部分的に蒸発させる工程において有機層中の微量の水の除去は特に効果的に行われる。
【０１００】
好ましい一実施形態では、部分的に蒸発させた有機層と有機溶媒３とを混合することによってペプチドの大部分が沈殿する。
【０１０１】
本発明の別の好ましい実施形態では、ペプチドを含む有機層を蒸発乾固させ、残った残渣を有機溶媒１でも有機溶媒２でもない溶媒中に溶解する。次いで、得られた溶液を有機溶媒３と混合することによってペプチドを沈殿させる。
【０１０２】
部分的に蒸発させた有機層：ペプチドを沈殿させるために使用される有機溶媒３の体積比は、沈殿工程の完全性および沈殿させたペプチドの特性に大きな影響を及ぼす。以下において比率は体積／体積比で示す。
【０１０３】
部分的に蒸発させた有機層：有機溶媒３の体積比は、１：２０〜１：１の範囲であることが好ましい。この体積比は１：１２〜１：２の範囲であることが好ましく、１：６〜１：３の範囲であることが特に好ましい。
【０１０４】
有機溶媒３は、大気圧における沸点が１６０℃未満の有機溶媒から選択されることが好ましい。有機溶媒３に対するペプチドの溶解性は、有機溶媒１に対する溶解性および／または有機溶媒１と有機溶媒２との混合物に対する溶解性よりも低いことが好ましい。有機溶媒３は、アセトニトリル、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、n−ヘプタンおよびトルエンからなる群から選択されることが好ましく、アセトニトリル、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルおよびトルエンからなる群から選択されることがより好ましく、ジイソプロピルエーテルおよびトルエンからなる群から選択されることが特に好ましい。最も好ましい実施形態では、有機溶媒３はジイソプロピルエーテルである。
【０１０５】
ペプチドを含む部分的に蒸発させた有機層は極性非プロトン性溶媒を実質的に含んでいないため、ペプチドの沈殿に必要とされる有機溶媒３の量は、ペプチドカップリング反応により得られる粗反応混合物を使用する従来の沈殿工程において使用される量よりも顕著に少ない。さらに、従来の沈殿工程とは異なり、ペプチドは粘着性を有さない固形物として沈殿する。
【０１０６】
沈殿工程において、部分的に蒸発させた有機層中に含まれるペプチドの少なくとも８０重量％が固形物として沈殿することが好ましい。部分的に蒸発させた有機層中に含まれるペプチドの少なくとも９０重量％が固形物として沈殿することがより好ましい。部分的に蒸発させた有機層中に含まれるペプチドの少なくとも９５重量％が固形物として沈殿することがさらにより好ましい。部分的に蒸発させた有機層中に含まれるペプチドの少なくとも９８重量％が固形物として沈殿することが特に好ましい。
【０１０７】
沈殿工程を行う温度（この温度を以下「沈殿温度」と呼ぶ）は、部分的に蒸発させた有機層の組成、有機溶媒３の選択およびペプチドの特性に左右される。
【０１０８】
沈殿温度は、ペプチドの沈殿の完全性および沈殿したペプチドの物理的特性に大きな影響を及ぼす。沈殿工程は−１０〜６０℃の沈殿温度で行うことが好ましく、−１０〜３０℃の沈殿温度で行うことがさらにより好ましい。しかしながら、沈殿温度は−１０〜０℃の範囲であることが特に好ましい。
【０１０９】
ペプチドを含む部分的に蒸発させた有機層は極性非プロトン性溶媒を実質的に含んでいないため、沈殿したペプチドは容易に濾別することができる。したがって、濾過工程に必要とされる時間は大幅に短縮される。沈殿したペプチドは、濾別し減圧下で乾燥させることが好ましい。
【０１１０】
しかしながら、沈殿したペプチドを遠心分離により分離することも可能である。
【０１１１】
所望であれば、濾過により回収した濾液を再度部分的に蒸発させてから沈殿工程に付することができ、このようにして第２バッチのペプチド沈殿物を回収することができる。
【０１１２】
本発明の別の実施形態では、ペプチドを含む部分的に蒸発させた有機層を、ペプチドの１つまたは複数の保護基（PG）を切断する試薬で直接処理する。ペプチドを含む部分的に蒸発させた有機層は極性非プロトン性溶媒を実質的に含んでいないため、ペプチドの１つまたは複数のPGを切断する試薬は特に限定されず自由に選択することができる。たとえば、ペプチドを含む部分的に蒸発させた有機層を酸分解試薬で処理することができ、この処理においては酸分解試薬と極性非プロトン性溶媒との間の望ましくない反応も保護基の切断の抑制も起こらない。ペプチドのＮ末端PGがtert−ブトキシカルボニル（Boc）基である場合、本発明のこの実施形態は特に好ましい。
【０１１３】
本発明の別の実施形態では、部分的に蒸発させた有機層をジスルフィド架橋形成などの他の反応を行うために使用する。
【０１１４】
本発明の別の実施形態では、ペプチドの1つまたは複数のPGを切断する試薬を、ペプチドカップリング反応により得られる反応混合物に直接添加する。標的とするPGの切断の完了後、得られたペプチドを反応混合物から抽出する。ペプチドのＮ末端PGがフルオレニル−9−メトキシカルボニル（Fmoc）基である場合、本発明のこの実施形態は特に好適である。
【０１１５】
特定の一実施形態では、PG切断後のペプチドをMeTHFまたはMeTHFと有機溶媒２との混合物で抽出する。これは、NMPまたはDMFを含まない溶液中に保持することが難しいFmoc保護ペプチドに対して通常行われる。Fmocの切断後、このようなペプチドはMeTHFを含む有機層中に抽出することができる。
【０１１６】
Bocで保護したペプチドの場合は上記とは逆に、Bocを切断するためにはNMPおよびDMFを除去しなければならない。このようなペプチドは通常、＞５体積％のTFAの存在下でトルエン、酢酸エチルまたはヘプタンに溶解する。
【０１１７】
本発明のさらに別の実施形態では、ペプチドを含む有機層を上述のように蒸発乾固し、残った残渣を有機溶媒１でも有機溶媒２でもない溶媒に溶解させ、次いでペプチドの１つまたは複数のPGを切断する試薬を加える。
【０１１８】
保護基
アミノ酸もしくはペプチドの側鎖官能基の保護、またはアミノ酸もしくはペプチドのＮ末端アミノ基またはＣ末端カルボン酸基の保護のために本発明において使用される保護基（PG）は、以下の４つの異なる群に分類される。
１．塩基性の切断条件下で切断可能なPG（以下「塩基型PG」と呼ぶ）
２．強酸性の切断条件下で切断可能であるが、弱酸性の切断条件下では切断不可能なPG（以下「強力型PG」と呼ぶ）
３．弱酸性の切断条件下で切断可能なPG（以下「弱力型PG」と呼ぶ）
４．還元性の切断条件下で切断可能なPG（以下「還元型PG」と呼ぶ）
５．鹸化性の切断条件下で切断可能なPG（以下「鹸化型PG」と呼ぶ）
【０１１９】
本発明の液相ペプチド調製方法において、従来の方法に従って使用されるPG、ならびにPGを切断するための典型的な反応条件、パラメータおよび試薬は当技術分野において公知であり、たとえば、T. W. Greene, P. G. M. Wuts “Greene's Protective Groups in Organic Synthesis” John Wiley & Sons, Inc., 2006;またはP. Lloyd-Williams, F. Albericio, E. Giralt, “Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins” CRC: Boca Raton, Florida, 1997に記載されている。
【０１２０】
塩基性の切断条件は、塩基性切断溶液によるペプチドの処理を含む。塩基性切断溶液は、塩基性試薬および溶媒からなることが好ましい。本発明において使用される塩基性試薬は第２級アミンが好ましく、ジエチルアミン（DEA）、ピペリジン、4−（アミノメチル）ピペリジン、トリス（2−アミノエチル）アミン（TAEA）、モルホリン、ジシクロヘキシルアミン、1,3−シクロヘキサンビス（メチルアミン）−ピペラジン、1,8−ジアザビシクロ［5.4.0］ウンデカ−7−エンおよびこれらの混合物からなる群から選択されることがより好ましい。本発明の液相ペプチド調製方法に使用される塩基性試薬は、DEA、TAEAおよびピペリジンからなる群から選択されることがさらにより好ましい。
【０１２１】
塩基性切断溶液は添加剤をさらに含んでもよく、該添加剤は、6−クロロ−1−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール、1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール、エチル−2−シアノ−2−ヒドロキシイミノアセタートおよびこれらの混合物からなる群から選択されることが好ましい。
【０１２２】
塩基性切断溶液の溶媒は、ペプチドカップリング反応に使用された極性非プロトン性溶媒と同一であることが好ましい。したがって、塩基性切断溶液の溶媒は、DMF、DMAおよびNMPからなる群から選択されることが好ましい。別法として、ペプチドカップリング反応後の反応混合物からペプチドを抽出する方法によって得られたペプチド含有有機層を上述のように蒸発乾固して、残った残渣を、DMF、DMA、ピリジン、NMP、ACNおよびこれらの混合物からなる群から選択される溶媒のいずれか１つに溶解し、次いで塩基性切断溶液で処理することもできる。実施例１に記載のように、Fmoc切断反応の反応混合物溶液中にペプチドを保持するためにDMFまたはNMPが必要とされる場合がある。
【０１２３】
塩基性、強酸性、弱酸性、または還元性の切断条件に関する説明において「部」および「重量％」は、それぞれの切断条件に対応する群のPGを有するペプチドの重量に対する割合を意味する。たとえば、「５部の塩基性切断溶液を使用する」は、塩基型PGを有するペプチド１ｇの処理に塩基性切断溶液５ｇを使用することを意味する。
【０１２４】
塩基性切断溶液の使用量は５〜２０部が好ましく、５〜１５部がより好ましい。塩基性試薬の量は、塩基性切断溶液の総重量に対して１〜３０重量％の範囲であることが好ましく、１０〜２５重量％の範囲であることがより好ましく、１５〜２０重量％の範囲であることがさらにより好ましい。
【０１２５】
本発明において定義されているように、強酸性の切断条件は強酸性切断溶液によるペプチドの処理を含む。強酸性切断溶液は酸分解試薬を含む。酸分解試薬は、TFA、塩酸（HCl）、塩酸（HCl）水溶液、フッ化水素酸（HF）溶液およびトリフルオロメタンスルホン酸などのブレンステッド酸；トリフルオロボラート・ジエチルエーテル付加物およびトリメチルシリルブロミドなどのルイス酸；ならびにこれらの混合物からなる群から選択されることが好ましい。
【０１２６】
強酸性切断溶液は、ジチオトレイトール、エタンジチオール、硫化ジメチル、トリイソプロピルシラン、トリエチルシラン、1,3−ジメトキシベンゼン、フェノール、アニソール、p−クレゾールおよびこれらの混合物からなる群から選択される１以上の捕捉剤を含むことが好ましい。強酸性切断溶液は水、溶媒またはこれらの混合物をさらに含んでいてもよく、この溶媒は強力な切断条件下において安定性を示す溶媒である。
【０１２７】
強酸性切断溶液の溶媒は、ペプチドを含む部分的に蒸発させた有機層に含まれる溶媒と同一であることが好ましい。したがって、強酸性切断溶液の溶媒は、有機溶媒１と有機溶媒２との組み合わせである。別法として、ペプチドを含む有機層を上述のように蒸発乾固し、残った残渣をACN、トルエン、DCM、TFAおよびこれらの混合物からなる群から選択される溶媒のいずれか１つに溶解することもできる。有機溶媒１および有機溶媒２は十分な揮発性を有するため、有機層は容易に蒸発させることができる。
【０１２８】
強酸性切断溶液の使用量は、１０〜３０部が好ましく、１５〜２５部がより好ましく、１９〜２１部がさらにより好ましい。酸分解試薬の量は強酸性切断溶液の総重量に対して３０〜３５０重量％の範囲であることが好ましく、５０〜３００重量％の範囲であることがより好ましく、７０〜２５０重量％の範囲であることがさらにより好ましく、１００〜２００重量％の範囲であることが特に好ましい。捕捉剤の総使用量は強酸性切断溶液の総重量に対して１〜２５重量％であることが好ましく、５〜１５重量％であることがより好ましい。
【０１２９】
本発明による弱酸性の切断条件は、弱酸性切断溶液によるペプチドの処理を含む。弱酸性切断溶液は酸分解試薬を含む。酸分解試薬は、TFA、トリフルオロエタノール、塩酸（HCl）、酢酸（AcOH）、これらの混合物、および／またはこれらの含水混合物などのブレンステッド酸からなる群から選択されることが好ましい。
【０１３０】
弱酸性切断溶液は水、溶媒またはこれらの混合物をさらに含んでいてもよく、この溶媒は弱い切断条件下において安定性を示す溶媒である。弱酸性切断溶液の溶媒は、ペプチドを含む部分的に蒸発させた有機層に含まれる溶媒と同一であることが好ましい。したがって、弱酸性切断溶液の溶媒は、有機溶媒１と有機溶媒２との組み合わせである。別法として、ペプチドを含む有機層を上述のように蒸発乾固し、残った残渣をACN、トルエン、DCM、TFAおよびこれらの混合物からなる群から選択される溶媒のいずれか１つに溶解することもできる。
【０１３１】
弱酸性切断溶液の使用量は４〜２０部が好ましく、５〜１０部がより好ましい。酸分解試薬の量は、弱酸性切断溶液の総重量に対して０．０１〜５重量％の範囲であることが好ましく、０．１〜５重量％の範囲であることがより好ましく、０．１５〜３重量％の範囲であることがさらにより好ましい。
【０１３２】
本発明の一実施形態において使用される還元性の切断条件は、還元性切断用混合物によるペプチドの処理を含む。還元性切断用混合物は触媒、還元剤および溶媒を含む。
【０１３３】
還元性の切断条件に使用される触媒は、Pd(0)の誘導体、Pd(II)の誘導体および金属パラジウム含有触媒からなる群から選択され、Pd[PPh3]4、PdCl2[PPh3]2、Pd(OAc)2およびパラジウム−炭素（Pd/C）からなる群から選択されることがより好ましい。Pd/Cが特に好ましい。
【０１３４】
還元剤は、Bu4N+BH4-；NH3BH3；Me2NHBH3；tBu-NH2BH3；Me3NBH3；HCOOH/DIPEA；PhSO2H、tolSO2Naまたはi-BuSO2Naを含むスルフィン酸；これらの混合物；ならびに水素分子からなる群から選択されることが好ましく、tolSO2Naまたは水素分子であることがより好ましい。
【０１３５】
還元性の切断条件下で使用される溶媒は、ペプチドを含む部分的に蒸発させた有機層に含まれる溶媒と同一であること、すなわち、有機溶媒１と有機溶媒２との組み合わせであることが好ましい。別法として、ペプチドを含む有機層を上述のように蒸発乾固し、残った残渣をNMP、DMF、DMA、ピリジン、ACNおよびこれらの混合物からなる群から選択される溶媒のいずれか１つ、より好ましくはNMP、DMFまたはこれらの混合物に溶解することもできる。還元性の切断条件下で使用されるこれらの溶媒に対してペプチドが溶解性を示し、このような溶媒中に溶解することが好ましい。
【０１３６】
還元性切断溶液の使用量は４〜２０部が好ましく、５〜１０部がより好ましい。
【０１３７】
鹸化性の切断条件は、鹸化性切断溶液によるペプチドの処理を含む。鹸化性切断溶液は、鹸化試薬および溶媒からなることが好ましい。本発明において使用される鹸化試薬は、アルカリ金属の水酸化物またはアルカリ土類金属の水酸化物であることが好ましく、水酸化ナトリウム、水酸化リチウムおよび水酸化カリウムからなる群から選択されることがより好ましい。本発明の液相ペプチド調製方法において使用される鹸化試薬は、水酸化ナトリウムであることがさらにより好ましい。
【０１３８】
鹸化性切断溶液の溶媒は、THF、MeTHF、エタノール、メタノールおよびジオキサンからなる群から選択される溶媒と水との混合物を含むことが好ましい。
【０１３９】
本発明によれば、塩基型PGは強酸性の切断条件下および弱酸性の切断条件下では切断できない。塩基型PGは、強酸性の切断条件下、弱い切断条件下、および還元性の切断条件下では切断できないことが好ましい。
【０１４０】
「強力型PG」は、弱酸性の切断条件下および塩基性の切断条件下では切断できない保護基であると理解される。強力型PGは、弱酸性の切断条件下、塩基性の切断条件下、および還元性の切断条件下では切断できないことが好ましい。Bzlのような強酸性PGは通常、水素化によって切断される。通常、ペプチドの包括的な脱保護は非常に温和な条件下における水素化によって行われる。
【０１４１】
弱力型PGは塩基性の切断条件下では切断できないが、強酸性の切断条件下では切断可能である。好ましくは、弱力型PGは塩基性の切断条件下および還元性の切断条件下では切断できないが、強酸性の切断条件下では切断可能である。
【０１４２】
本発明の一実施形態によれば、塩基型PGはFmocであることが好ましい。強力型PGは、Boc、tBu、OtBuおよびCbzからなる群から選択されることが好ましい。弱力型PGはTrtおよび2−クロロフェニルジフェニルメチル基からなる群から選択されることが好ましい。還元型PGは、Bzl、N−メチル−9H−キサンテン−9−アミノ基およびCbzからなる群から選択されることが好ましい。鹸化型PGはOMeであることが好ましい。
【０１４３】
本発明の液相ペプチド調製方法においては、次のペプチドカップリング反応を行う前に、ペプチドのＮ末端PGを脱保護反応により除去する。本発明によれば、Ｎ末端PGはFmocまたはBocであることが好ましい。
【０１４４】
本発明の一実施形態において、Fmocは塩基性条件下で容易に除去することができるため、LPPSにおけるＮ末端PGとして非常に好ましい。さらに、ペプチドのＮ末端PGとしてFmocを使用すると、orthogonal systemにおいて側鎖PGと適合する。「orthogonal system」は、G. BaranayおよびR. B. Merrifield （JACS, 1977, 99, 22, pp. 7363-7365）によって定義されている。
【０１４５】
本発明のさらに別の実施形態では、Bocは液相ペプチド調製方法に使用されるペプチドのＮ末端PGとして非常に好ましい。その除去は強酸性条件下で行うことができる。さらに、Ｎ末端PGとしてBocを使用した場合も、orthogonal systemにおいて側鎖PGと適合する。
【０１４６】
本発明によれば、ペプチドのＣ末端PGは最終的な脱保護工程で除去される。
【０１４７】
Ｃ末端PGとして、OtBu、Blz、OMe、NH2、2−クロロフェニル−ジフェニルメチルエステルまたはN−メチル−9H−キサンテン−9−アミドが好ましい。
【０１４８】
本発明の一実施形態において、Bzlは上記の還元性切断条件下で容易に除去することができるため、液相ペプチド調製方法におけるＣ末端PGとして非常に好ましい。さらに、Ｃ末端PGとしてBzlを使用するとorthogonal systemにおいて側鎖PGと適合する。
【０１４９】
本発明の別の実施形態では、液相ペプチド調製方法のＣ末端PGとしてOtBuが使用される。その除去は上記の強酸性切断条件下で行うことができる。さらに、Ｃ末端PGとしてOtBuを使用した場合も、orthogonal systemにおいて側鎖PGと適合する。
【０１５０】
本発明の別の実施形態では、液相ペプチド調製方法のＣ末端PGとしてOMeが使用される。OMeは鹸化によって容易に切断することができ、ペプチドのＮ末端PGがBocである場合において特に有用である。
【０１５１】
本発明のさらに別の実施形態では、疎水性PGをペプチドのＣ末端に使用することによって有機層へのペプチドの溶解性をさらに高めることができる。この目的のために、弱酸性条件下で切断可能な弱力型PGを用いてペプチドのＣ末端カルボン酸基を保護してもよい。このような弱力型PGとして2−クロロフェニルジフェニルメチルエステルおよびN−メチル−9H−キサンテン−9−アミドなどが挙げられる。これらのPGはペプチド断片の合成に特に有用であり、得られたペプチド断片はconvergent法によるペプチド合成に使用することができる。また、これらのＣ末端カルボン酸保護基（PG）は別の重要な利点を有する。すなわち、これらのＣ末端カルボン酸保護基（PG）は弱酸性条件下で切断されるため、convergent合成法においてペプチド断片として使用する保護されたペプチドをSPPSの代わりに液相合成を用いて合成することができる。実際に、2−クロロフェニルジフェニルメチルエステルおよびN−メチル−9H−キサンテン−9−アミドは、保護されたペプチド断片を合成する目的でSPPS用樹脂のリンカーとして使用される化学官能基である。
【０１５２】
本発明によれば、液相ペプチド調製方法によって得られたペプチドのアミノ酸側鎖のヒドロキシ基、アミノ基、チオ基およびカルボン酸基を適切なPGで保護することによって望ましくない副反応を回避することが望ましい。さらに、側鎖にPGを使用することによって、通常、極性非プロトン性溶媒に対するペプチドの溶解性、ならびに有機溶媒１および／または有機溶媒１と有機溶媒２との組み合わせに対するペプチドの溶解性が向上する。
【０１５３】
通常、側鎖のPGは、液相ペプチド調製方法におけるＮ末端アミノ基の脱保護工程中に除去されないものが選択される。したがって、Ｎ末端アミノ基またはＣ末端カルボン酸基のPGと側鎖のPGは通常異なるものであり、これらのPGはorthogonal systemにおいて適合することが好ましい。
【０１５４】
本発明によれば、好ましい側鎖基はtBu、Trt、Boc、OtBuおよびCbzである。
【０１５５】
液相ペプチド調製方法によって目的とするペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列が得られれば、Ｎ末端のPG、Ｃ末端のPGおよび側鎖のPGを除去して、保護されていない目的のペプチドを得ることが好ましい。この工程を「包括的な脱保護」と呼ぶ。液相ペプチド調製方法においては、PGの特性に応じて上記の弱酸性、強酸性、または還元性の切断条件下で包括的な脱保護を行えるようなPGを選択することが好ましい。
【０１５６】
側鎖のPGは通常LPPSが完了するまで保持される。包括的な脱保護は、使用された種々の側鎖PGに適用可能な条件下で実施することができる。異なる種類の側鎖PGを選択した場合、これらのPGを連続的に切断してもよく、これはたとえば分岐ペプチドを合成する場合に行われる。同時に切断可能な側鎖PGを選択すると有利であり、これに加えて、LPPSによって調製したペプチドのＮ末端PGまたはＣ末端PGも同時に切断できる側鎖PGを選択するとさらに有利である。
【０１５７】
本発明の一実施形態では、部分的に蒸発させた有機層中のペプチドのＮ末端PGを直接除去することができる。したがって、この場合、有機溶媒３を使用してペプチドを沈殿させる必要がなく、中間体ペプチドを単離することなくたとえば連続的LPPSとして本発明のLPPSを実施することができる。
【０１５８】
ペプチドのＮ末端PGの特性に応じて、この工程に適切な切断条件を選択することができる。
【０１５９】
ペプチドのＮ末端PGが上述したような強力型PGまたは弱力型PGである場合、ペプチドを含む有機層をTFAまたはHClで処理することが好ましい。ペプチドを含む有機層は極性非プロトン性溶媒を実質的に含んでいないため、ペプチドのＮ末端PGの除去は、TFAまたはHClと極性非プロトン性溶媒との間の望ましくない反応によって抑制されない。本発明の一実施形態においては、ペプチドのＮ末端PGはBoc基である。
【０１６０】
ペプチドのＮ末端PGが上述したような塩基型PGである場合、従来技術において知られているように有機塩基を使用してペプチドを脱保護することができる。この目的のために、ペプチドカップリング反応により得られた反応混合物を、DEA、TAEAおよびピペリジンからなる群から選択される塩基性試薬で直接処理し、次いで保護されていないＮ末端を有するペプチドを反応混合物から抽出することが好ましい。別法では、ペプチドを含む有機層を塩基性試薬で処理する。さらに別法として、ペプチドを含む有機層を上述のように蒸発乾固し、残った残渣をDMF、DMA、ピリジン、NMPおよびこれらの混合物からなる群から選択される溶媒のいずれか１つに溶解し、次いで塩基性試薬で処理することもできる。
【０１６１】
本発明の好ましい一実施形態においては、ペプチドのＮ末端PGはフルオレニル−9−メトキシカルボニル（Fmoc）基である。ペプチドのFmoc基の切断にはジベンゾフルベンの形成が伴う。塩基性試薬としてDEAまたはピペリジンを使用し、塩基性切断溶液の溶媒がアセトニトリルである場合、保護されていないＮ末端を有するペプチドを含む得られた溶液をたとえばn−ヘプタンなどの炭化水素で洗浄することによりジベンゾフルベンを実質的に除去する。Fmoc基を切断するための塩基性試薬としてTAEAを使用した場合、得られた溶液は本発明の抽出方法で処理する。したがって、後続のペプチドカップリング反応を行う前に、保護されていないＮ末端を有するペプチドを含む溶液からはジベンゾフルベンが実質的に除去されている。
【０１６２】
ペプチドのＮ末端PGの切断後、保護されていないＮ末端を有するペプチドを含む溶液を少なくとも部分的に蒸発させ、次のペプチドカップリング反応あるいは包括的な脱保護工程に使用することができる。
【０１６３】
したがって、本発明は、一般的に用いられるSPPS法と比べて多くの利点を有する連続的LPPS法を提供する。
【０１６４】
本発明の連続的LPPSの場合、ペプチドカップリング反応および脱保護反応における反応混合物中の試薬の濃度はSPPSの場合よりも高い。結果として、反応時間はより短くなり、より少ない容量のバッチ式反応器を使用して所定量の目的とするペプチドを合成することができる。本発明の連続的LPPSによるペプチド合成に必要とされる総時間は、SPPSを使用して合成を行う場合に必要とされる総時間とほぼ同じである。したがって、本発明の連続的LPPSを使用することによって作業コストを節約できる。
【０１６５】
本発明のLPPSのペプチドカップリング反応において必要とされる、保護されていないＣ末端カルボン酸基を有するアミノ酸またはペプチドの過剰量（１．１〜１．２当量）は、対応するSPPSのペプチドカップリング反応におけるアミノ酸またはペプチドの過剰量（１．５当量以上）よりも少ない。さらに、SPPSにおいては各ペプチドカップリング工程の後に樹脂をすすぐため大量の溶媒が必要とされる。したがって、SPPSに必要とされる溶媒の量は本発明の連続的LPPSよりも顕著に多い。したがって、SPPSを使用した場合と比較して、本発明の連続的LPPSを使用した場合は材料費を大幅に節約できる。
【０１６６】
上記に加えて、本発明の連続的LPPS法のスケールアップは、対応するSPPS法のスケールアップよりも容易であることが知られており、本発明の連続的LPPSによって調製された目的のペプチドは、SPPSによって調製された同一のペプチドよりも純度が高い。
【０１６７】
要約すると、本発明の連続的LPPSは、従来技術において公知の他のペプチド合成方法よりも多くの利点を備えており、工業規模におけるペプチドの調製に特に有用である。
【実施例】
【０１６８】
以下の実施例により本発明の代表的な実施形態を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【０１６９】
他に記載がない限り実験はすべて室温（２０±３℃）および大気圧（１０１３±５０ｋＰａ）で行った。
【０１７０】
方法の説明
Ａ）HPLC分析
HPLC法Ａにおける検出はUVフォトダイオードアレイ検出器を用いて行った。
工程１  試料調製：
移動相Ａ：0.1体積％TFAを含む水
移動相Ｂ：0.085体積％TFAを含むACN
工程２  クロマトグラフィーの条件：
MIH-009-3TG9法
カラム：            Phenomenex Luna C8（2）5μm 250×4.6mm
オーブン温度：      40℃
流速：              1.50mL/分
検出器波長：        215nm
グラジエント時間：  30分
グラジエント組成：  22〜52％Ｂ（15分）→52〜82％Ｂ（5分）→82〜98％Ｂ（5分）→98％Ｂ（5分）
MIH-009-2TG11法
カラム：            Purospher Star RP18 55×4mm
オーブン温度：      40℃
流速：              2.0mL/分
検出器波長：        215nm
グラジエント時間：  15分
グラジエント組成：  2〜78％Ｂ（5分）→78〜98％Ｂ（10分）
MIH-009-RTTG1法
カラム：            Purospher Star RP18 55×4mm
オーブン温度：      40℃
流速：              2.0mL/分
検出器波長：        215nm
グラジエント時間：  15分
グラジエント組成：  2〜98％Ｂ（5分）→98％Ｂ（5分）
MIH-009-025TG3法
カラム：            XBridgeC18 5μ 150×4.6mm
オーブン温度：      40℃
流速：              1.5mL/分
検出器波長：        215nm
グラジエント時間：  20分
グラジエント組成：  2〜98％Ｂ（15分）→98％Ｂ（5分）
MIH-009-397TG15法
カラム：            Vydac 214TP5415 C4 250×4.6mm
オーブン温度：      40℃
流速：              1.5mL/分
検出器波長：        215nm
グラジエント時間：  2分
グラジエント組成：  33〜78％Ｂ（25分）
工程３  クロマトグラフィーによるプロファイル分析：
単離された生成物の組成はクロマトグラフィーにおける全てのピークの面積を測定することにより決定した。決定された予測生成物の純度は該生成物に対応するピーク面積（％）に一致する。
【０１７１】
１．装置および機器
ガスクロマトグラフ：  水素炎イオン化検出器およびオートインジェクターシステムを備え、データ収集ソフトウェアと接続したGC
分析用GCカラム：      溶融シリカカラム
長さ50m；内径0.53mm；固定相：CP SIL 8CB DF＝5.0μm
試薬：                 メタノール（分析等級）
【０１７２】
２．試料の調製
試験溶液および対照溶液
10mLのメスフラスコに試料400μLを正確に入れ、メタノールを標線まで加えた。
【０１７３】
３．クロマトグラフィーの条件
キャリアガス：        ヘリウム 30kPa
オーブン温度：        35℃（14分）→（5℃/分）→55℃（3分）→（5℃/分）→110℃（5分）→（10℃/分）→225℃（5分）
インジェクター温度：  225℃
検出器温度：          260℃
注入量：              1μL
注入方法：            スプリット
スプリット流量：      85mL/分
比率：                24
【０１７４】
濾過性の測定
沈殿したペプチドを含む混合物を、孔径20μmのフィルターを備えた直径2.7cmの濾過カラムに移した。20℃、圧力50mbarの条件で濾過を行った。流速およびケーキの高さを測定し、濾過係数Kを次式により求めた。
K＝母液量（mL）×ケーキの高さ（cm）／フィルターの面積（cm2）／圧力（bar）／濾過時間（分）
【０１７５】
実験計画法
実験計画法（DOE）はStat-Ease社のDOEソフトウェアパッケージDesign-Expert（登録商標）８を使用して行った。
【０１７６】
ａ）MeTHF/水系およびMeTHF/NaCl溶液系におけるNMPの抽出
この実施例では、有機層の体積および有機層中のNMP含有量が、NMP/MeTHF/水からなる二相系の組成およびNMP/MeTHF/NaCl溶液からなる二相系の組成によって変化することを示す。このような組成依存性は、全体量を一定に保ちながらNMPの体積分率、MeTHFの体積分率、および水中NaCl含有量を二次デザインモードで体系的に変化させた二相系を設計し、これを用いて検証した。水中NaCl含有量が及ぼす影響を調べるために、同じ一連の二相系を純水（表１ａ参照）または150g/LのNaCl溶液（表１ｂ参照）を用いて調製した。これらの二相系を攪拌後、計測容器中において相分離するまで静置し、有機層の体積を測定した。有機層中のNMP含有量はガスクロマトグラフィーで測定した。有機層の体積および有機層中のNMP含有量を、二相系組成全体に対するNMP、MeTHFおよび水の体積分率（これらの体積分率の和は１となる）の数学的関数として求めるための統計モデルを構築した。
【０１７７】
ａ）NaCl非存在下における有機層中NMP含有量Ln（g/L）は以下の二次混合物モデル（R2＝0.954）より求められる。
Ln（有機層中NMP）＝5.7*MeTHF体積分率-17.1*NMP体積分率-6.9* H2O体積分率+102.8*NMP体積分率*H2O体積分率
NMP/MeTHF/水からなる三成分混合物モデルを図１のコンター図に図示する。
【０１７８】
ｂ）NaCl非存在下における有機層の体積は以下の線形混合物モデル（R2＝0.992）より求められる。
有機層の体積（mL）＝22.6*MeTHF体積分率-10.4*NMP体積分率-4.7*H2O体積分率
NMP/MeTHF/水からなる三成分混合物モデルを図２のコンター図に図示する。
【０１７９】
【表１】
2014517022.tif 000002
【０１８０】
ｃ）150g/LのNaClを含む水溶液の存在下における有機層中NMP含有量Ln'（g/L）は以下の線形混合物モデル（R2＝0.958）より求められる。
Ln'（有機層中NMP）＝25.1*MeTHF体積分率+297.3*NMP体積分率-43.0*NaCl溶液体積分率
NMP/MeTHF/NaCl溶液からなる三成分混合物モデルを図３のコンター図に図示する。
【０１８１】
ｄ）150g/LのNaClを含む水溶液の存在下における有機層の体積は以下の線形混合物モデル（R2＝0.991）より求められる。
有機層の体積＝20.5*MeTHF体積分率-1.05*NMP体積分率-1.08*NaCl溶液体積分率
NMP/MeTHF/NaCl溶液からなる三成分混合物モデルを図４のコンター図に図示する。
【０１８２】
【表２】
2014517022.tif 000003
【０１８３】
ペプチドを含む有機層からNMPを効率的に除去するためには、有機層中のNMP含有量が十分に少ない量であることが望ましく、50g/L未満であることが好ましく、20g/L未満であることがより好ましい。このような条件は図１〜４に示す三成分混合物の図の下方部分に見られる。NaClの非存在下においては、NMPの体積分率が小さい場合に有機層中のNMP含有量が最小となりうる。一方、MeTHFの体積分率が小さければ小さいほど有機層の体積が減少する。したがって、目的のペプチドがMeTHFに対して非常に高い溶解性を示さない場合は、三成分図の左下隅に対応する条件のみを本発明のペプチド抽出方法に適用することができる。
【０１８４】
NaClの存在下においてはMeTHFと水の混和性が顕著に低下するため、有機層の体積は増加する。さらに、NaClの存在下においては水層の密度が増加するため、相分離がより早く生じる。
【０１８５】
したがって、NaClの存在下で本発明のペプチド抽出方法を実施することが一般的に好ましく、また、新鮮なNaCl溶液を用いて抽出を繰り返すことによってMeTHF層中のNMP含有量を非常に少ない量にまで減少させることが一般的に好ましいと結論付けることができる。
【０１８６】
ｂ）NMP/MeTHF/NaCl溶液系におけるH-Leu-Trp(Boc)-Val-Asn(Trt)-Ser(tBu)-NH2の抽出
ペンタペプチドH-Leu-Trp(Boc)-Val-Asn(Trt)-Ser(tBu)-NH2の抽出方法に対して中心複合実験計画法（DoE）を実施した。このペプチドの抽出収率として200mg/mL NMP溶液からの収率を測定した。MeTHFおよび水の相対体積、ならびに水中NaCl含有量は体系的に変化させた。各境界条件に対してそれぞれ１回の実験を行い、中心点に対しては３回の実験を行った。得られた結果を以下の表２に示す。
【０１８７】
【表３】
2014517022.tif 000004
【０１８８】
水：反応混合物（RM）の体積比および水中NaCl含有量の関数としてペプチドの抽出収率を計算することが可能な良い数学モデル（R2＝0.93）が得られた。ペプチドの抽出収率は次式により求めることができる。
抽出収率(%)＝0.77+0.089*(水/RM)+0.00059*NaCl(g/L)-0.00012*(水/RM)*NaCl(g/L)-0.0087(水/RM)2
このモデルは図５のコンター図に図示することができる。９９％を超える抽出収率を達成するためには、水：反応混合物の最小体積比が十分に大きくなくてはならない。しかしながら、この水：反応混合物の最小体積比は、水層中のNaCl含有量にも左右される。実際に、水層中のNaCl含有量が多ければ多いほどMeTHFと水層との混和性が低くなり、その結果、水層へのペプチドの溶解性は低くなる。水層にNaClが含まれていない場合、９９％を超える抽出収率を達成するためには水：反応混合物の体積比は４よりも大きくなくてはならない。一方、水層に150g/LのNaClが含まれている場合、水：反応混合物の比率は２．７で十分である。
【０１８９】
９９％を超える抽出収率を達成するのに必要な水：反応混合物の体積比は、次式より求められると考えられる。
水：反応混合物＞4-0.00974*NaCl（g/L）
一方、MeTHF：反応混合物の体積比＝２であると、９９％を超える抽出収率が常に達成される。
【０１９０】
ｃ）MeTHF/THF/NaCl溶液系におけるNMPの抽出
この実施例は、150g/LのNaClを含む水溶液、NMP、MeTHF、およびTHFからなる混合物に関する。具体的には、相分離後の有機層中のNMP含有量（g/L）と混合物の組成との間の依存性を調査した。この実施例の系にペプチドは含まれていなかった。
【０１９１】
MeTHF：NMPの体積比を３とし、NaCl溶液：NMPの体積比は２〜１０の範囲で変化させ、THF：NMPの体積比は０〜３の範囲で変化させた。この実験はこれらの４つの成分間の相互作用を説明することを目的としていたため、単独溶媒を使用して実験を行った。しかしながら、ペプチドが存在する場合はNMPの分配が変わる可能性があることには注意すべきである。得られた結果を図６に示す。
【０１９２】
図６に認められるように、THF：NMPの体積比が２未満の場合、水：NMPの体積比が小さくても有機層中のNMP含有量は10g/L〜20g/Lの範囲であった。NMP：MeTHF：THF：NaCl溶液の体積比＝１：３：２：５である場合、概して、NMPの９０％は水層に含まれる。しかしながら、THF：NMPの体積比が２よりも大きい場合、NMPの抽出収率は低くなる。
【０１９３】
しかしながら、体積比NMP：MeTHF：THF：NaCl溶液＝１：３：３：３の場合、水層へ除去されるNMPは全体の８０％であるものの、この条件でも多くのペプチドにおいて９９％を超える高い抽出収率を達成することができる。
【０１９４】
ｄ）MeTHF/THF/NaCl溶液系、EtOAc/THF/NaCl溶液系およびトルエン/THF/NaCl溶液系におけるNMPの抽出
MeTHF/THF混合溶媒およびトルエン/THF混合溶媒（本発明）の抽出性をEtOAc/THF混合溶媒（比較例）の抽出性と比較した。実験は150g/LのNaClを含む水溶液を用いて行った。この実施例の系にペプチドは含まれていなかった。
体積比は以下のとおりであった。
NMP：EtOAc：THF：NaCl溶液＝１：３：３：３
NMP：MeTHF：THF：NaCl溶液＝１：３：３：３
NMP：トルエン：THF：NaCl溶液＝１：３：３：３
水層中のNMP分率をGCによって測定した。実験結果を以下の表３に要約する。
【０１９５】
【表４】
2014517022.tif 000005
【０１９６】
上記の表３から明らかなように、MeTHF/THF混合溶媒またはトルエン/THF混合溶媒を用いて抽出を行うとEtOAc/THFを用いて抽出した場合よりも水層中のNMP分率が増加する。これに応じて、MeTHF/THFまたはトルエン/THFを用いて抽出した後の有機層中のNMP含有量は、EtOAc/THFを用いて抽出した場合よりも減少した。
【０１９７】
実施例１  H-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Pro-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-NH2の合成のための、保護基としてFmocを用いた連続的LPPSの使用
実施例１．１  LPPS
Fmoc-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-OH（0.5g、0.28mmol）、H-Pro-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-NH2（0.15g、0.32mmol）およびHOBt（0.044g、0.28mmol）を20℃においてNMP（2.5mL）中で混合した。混合物を室温で10分間攪拌して固形物をすべて溶解させ、0℃に冷却した。TBTU（0.093g、0.28mmol）、次いでDIPEA（46μL、0.28mmol）を加え、上記の温度で反応混合物を攪拌した。2時間後、反応が完了したことをHPLCにより確認した。反応の進行は、反応混合物から得た試料5μLをNMPで50倍に希釈し、上記のMIH-009-3TG9法に従って分析することによりモニタリングした。
【０１９８】
実施例１．２  Fmoc脱保護
実施例１．１に従って調製した溶液（4mL）にDEA（0.4mL、3.9mmol）を室温で加えた。Fmocの切断の完了をHPLCで確認した後、30℃、60mbarにおいてACN（3×1mL）と共蒸発させて揮発性物質を除去した。反応の進行は、反応混合物から得た試料5μLをNMPで50倍に希釈し、上記のMIH-009-3TG9法に従って分析することによりモニタリングした。
【０１９９】
実施例１．３  MeTHF/THFによる抽出および単離
実施例１．２に従って調製した溶液（4mL）を、100g/L NaClおよび25g/L Na2CO3を含む水溶液（20mL）、MeTHF（12mL）、ならびにTHF（8mL）と混合した。十分に混合して相分離（約4分間）させた後、下層の水層を除去した。100g/L NaClおよび25g/L Na2CO3を含む水溶液（20mL）ならびにTHF（8mL）を加えてペプチド溶液をさらにクリーンアップした。十分に混合して層を分離させた後、下層を除去した。残量が約4mLになるまで有機層を30℃、60mbarで蒸発させた。ACN（4×10mL）との共蒸発を4回行うことによってMeTHFおよびTHFを除去した。これにより、ペプチドが沈殿し始めた。共蒸発を4回行った後の残留物（4mL）にACN（10mL）およびDIPE（30mL）を加えることによってペプチドの沈殿を完了させた。固形物を濾別し、DIPE（3×10mL）で洗浄し、減圧下で乾燥させた。
【０２００】
この実施例においては、有機層の蒸発中にペプチドの沈殿が可能であること、および沈殿させたペプチドは容易に濾別できることが示された。DMFまたはNMPの存在下では、このようなペプチド沈殿物の形成は不可能であると考えられる。
【０２０１】
実施例２  Boc-His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-NH2の反応混合物からの抽出
Boc-His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-OH(6.94g、4.11mmol)、H-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-NH2（20g、4.32mmol）およびHOBt（0.63g、4.11mmol）を20℃においてNMP（210mL）中で混合した。混合物を室温で10分間攪拌して固形物をすべて溶解させ、0℃に冷却した。TOTU（2.7g、8.22mmol）、次いでDIPEA（6mL、42mmol）を加え、上記の温度で反応混合物を攪拌した。2時間後、反応が完了したことをHPLCにより確認した。反応の進行は、反応混合物から得た試料5μLをNMPで50倍に希釈し、上記のMIH-009-397TG15法に従って分析することによりモニタリングした。
【０２０２】
得られた反応混合物を等分し（試料量：5mL）、そのまま抽出試験No.１〜１７に使用した。これらの試験において、反応混合物試料（5mL）を表４に示す種々の有機溶媒と混合し、次いで20％NaCl水溶液15mLで抽出した。これらの試験における実験条件間で、相分離（二層分離）時間およびペプチドの抽出収率（有機層中のペプチドの割合）を比較した。
【０２０３】
試験No.１、２、７、８、１５〜１７では、速やかに（2分未満で）明瞭な二層に分離した。これら二層を分離し、各層に含まれるペプチド量をHPLCで測定した。
【０２０４】
試験No.３〜６および９〜１４では、抽出操作により不透明な混合物が生じた。数十分後（60分を経過してから）、系は分離し始めたが、ペプチドゲルの分厚い層が水層と有機層の間に形成された。これらの層は明瞭には分離しなかったが、120分経過後にデカンテーション容器から水層を除去した。有機層からのペプチドゲルの分離は実際的には不可能であった（密度差が小さすぎた）。ペプチドゲルおよび有機層をNMPに溶解し、ペプチド含有量をHPLCで測定した。したがって、表６に示すペプチドの抽出収率は、水層と有機層の間の実際の分配よりもペプチドゲルを挟んだ層分離の質を示している。
【０２０５】
抽出試験No.１〜１７に使用した成分の体積比および観察結果を以下の表４に要約する。
【０２０６】
【表５】
2014517022.tif 000006
【０２０７】
試験No.４、６および１１においては、ペプチドは有機層にほとんど溶解せず、有機層と水層の間で徐々にゲルを形成した。
【０２０８】
結果
DCM単独による抽出（試験No.１および２）では、即座に相分離が起こり、ペプチドの抽出収率は高かった。しかしながら、実施例ｃ）（表３）および比較例３．１（表５）に示すように、DCM単独で抽出を行うと有機層中の極性非プロトン性溶媒の含有量が多くなってしまう。その結果、抽出したペプチドを沈殿させることが難しくなる。したがって、DCM単独によるペプチド抽出には重大な欠点がある。
【０２０９】
MeTHF単独による抽出（試験No.５および６）では、EtOAc単独による抽出（試験No.３および４）よりも高いペプチド抽出収率が得られた。
【０２１０】
MeTHF/ACN混合物の抽出性は試験No.１４〜１７において調査した。MeTHF単独による抽出（試験No.５および６）と比較して、試験No.１４〜１７における相分離時間は短く、ペプチド抽出収率は高かった。MeTHF/ACNを用いて抽出を行った結果（試験No.１４〜１７）とEtOAc/ACNを用いて抽出を行った結果（試験No.１０〜１３）を比較したところ、MeTHF/ACN混合物はEtOAc/ACN混合物よりも優れた抽出性を有することが明らかとなった。具体的には、MeTHF/ACN混合物を用いて抽出を行うと、相分離時間が短縮され、ペプチド抽出収率が高くなった。
【０２１１】
実施例３  ２つのペプチドのカップリングおよびBocの切断のための、中間体の沈殿工程を含まない連続的LPPSの使用：Boc-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr-Leu(OBzl)の調製
実施例３．１  Boc-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr-Leu(OBzl)
Boc-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-OH（3.5g、5.5mmol）およびH-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr-Leu(OBzl)（5.0g、5.5mmol）を20℃でDMF（25mL）中に溶解した。得られた混合物を-8℃に冷却し、次いでHOBt・H2O（0.88g、5.75mmol）およびEDC・HCl（1.21g、6.31mmol）を加え、反応の完了がHPLC測定により確認されるまで反応温度を-4〜-8℃の範囲に維持した。反応の進行は、反応混合物から得た試料5μLを酢酸：水（9：1）で50倍に希釈し、上記のMIH-009-2TG11法に従って分析することによりモニタリングした。
【０２１２】
上記で調製した反応混合物にMeTHF（90mL）を加え、以下のものにより順次抽出を行った。
１）20g/L NaClを含む水溶液（90mL）
２）20g/L NaClを含む水溶液（90mL）
３）20g/L NaClおよび50g/L NaHCO3を含む水溶液（90mL）
４）20g/L NaClおよび50g/L KHSO4を含む水溶液（90mL）
５）20g/L NaClを含む水溶液（90mL）
【０２１３】
次いで、有機層を減圧下30℃で蒸発させた。
【０２１４】
比較例３．１  Boc-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu-OBzlの抽出
Boc-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-OH（3.5g）、H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu-OBzl（5.0g）およびHOBt（0.88g）をDMF（20mL）中に溶解した。EDC・HCl（1.2g）およびTEA（1.5mL）を加えて-6〜0℃で攪拌しながら一晩かけてカップリング反応を行った。HPLC（MIH-009-2TG11法）により反応の完了を確認した。反応混合物を濾過して不溶性塩類を除去した。反応混合物から得た試料1mLを以下の表５に記載の有機溶媒と混合し、次いでNaCl（15％w/v）およびNa2CO3（2.5％w/v）からなる水溶液3mLによる抽出を行った。
【０２１５】
すべての抽出試験において、明瞭な二層への速やかな分離が観察された。有機層中のDMF含有量はGCによって決定した。
【０２１６】
【表６】
2014517022.tif 000007
【０２１７】
結果
DCM単独による抽出（試験No.１および２）およびEtOAc単独による抽出（試験No.３および４）と比較して、MeTHF単独による抽出（試験No.５および６）では有機層中のDMF含有量が少なかった。さらに、EtOAc/DCM混合物による抽出（試験No.７）およびEtOAc/THF混合物による抽出（試験No.１０）と比較して、MeTHFを含む溶媒混合物による抽出（試験No.８、９および１１）では有機層中のDMF含有量が少なかった。
【０２１８】
実施例３．２  Boc保護基の除去：H-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr-Leu(OBzl)
実施例３．１で得られた材料にトルエン（20mL）、フェノール（0.25g）およびTFA（16mL）を加えて15℃でBocの切断を行った。HPLCにより反応の完了を確認した後、減圧下30℃で反応混合物を蒸発させた。反応の進行は、反応混合物から得た試料5μLをACNで20倍に希釈し、上記のMIH-009-2TG11法に従って分析することによりモニタリングした。
【０２１９】
減圧下30℃でトルエン（2×20mL）と共蒸発させることによって揮発性物質をさらに除去した。蒸発残留物にMeTHF（50mL）を加え、20g/L NaClを含む水溶液（6×50mL）を用いて有機溶液からの抽出を6回行った。有機層を減圧下30℃で蒸発させた。
【０２２０】
比較例３．２  Boc保護基の除去に対する残留DMFの影響：H-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu-OBzl
比較例３．１の試験No.１、３および５で得られた材料を以下のようにさらに処理した。有機層を分離し、トルエンとの共蒸発を3回行うことによって溶媒を交換した（浴温＝40℃、圧力＝50mbar）。揮発性溶媒を完全に蒸発させた後、トルエン（4mL）およびフェノール（0.05g）を蒸発残留物に加えた。TFA（3.5mL）を加えることによってBocの切断を0℃で行った。この反応はHPLC（MIH-009-2TG11法）によりモニタリングした。
【０２２１】
得られた結果を表６に要約し図７のグラフに示す。
【０２２２】
【表７】
2014517022.tif 000008
【０２２３】
結果
比較例５．１で得られた材料中の微量のDMFは、Boc保護基の除去を著しく抑制する。したがって、DCMを用いて抽出した材料におけるBocの切断の進行は、EtOAcまたはMeTHFを用いて抽出した材料の場合と比較して顕著に遅かった。この実験においては、EtOAcを用いた抽出により得られた材料とMeTHFを用いた抽出により得られた材料との間では有意な差は見られなかった。
【０２２４】
実施例３．３  中間体の沈殿工程を含まないLPPSを使用した、Boc-Phe-OHとH-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr-Leu(OBzl)とのカップリング
Boc-Phe-OH（1.53g、5.8mmol）を20℃でDMF（25mL）中に溶解し、実施例３．２で得られた反応混合物に加えた。HOBt・H2O（0.89g、5.8mmol）およびEDC・HCl（1.2g、6.3mmol）を加え、反応混合物を5℃に冷却した。反応の完了がHPLCにより確認されるまで反応混合物をこの温度で維持した。反応の進行は、反応混合物から得た試料5μLを酢酸：水（9：1）で50倍に希釈し、上記のMIH-009-2TG11法に従って分析することによりモニタリングした。
【０２２５】
次いでMeTHF（90mL）を加え、以下のものにより反応混合物から順次抽出を行った。
１）50g/L NaClを含む水溶液（90mL）
２）50g/L NaClを含む水溶液（90mL）
３）20g/L NaClおよび50g/L NaHCO3を含む水溶液（90mL）
４）20g/L NaClおよび50g/L KHSO4を含む水溶液（90mL）
５）50g/L NaClを含む水溶液（90mL）
６）50g/L NaClを含む水溶液（90mL）
【０２２６】
次いで有機層を減圧下35℃で蒸発させた。
【０２２７】
次いで、NaCl水溶液による残留物からの抽出を6回でなく7回行ったこと以外は実施例３．２の方法と同様にして、得られた材料を処理した。
【０２２８】
実施例３．４  Boc-Ser(Bzl)-OHとH-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr-Leu(OBzl)とのカップリング
本明細書に記載の方法を使用して、実施例３．２に従って調製したH-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr-Leu(OBzl)ペプチドにBoc-Ser(Bzl)-OH（1.62g、5.5mmol）をカップリングした。
【０２２９】
ａ）抽出およびDIPE中における沈殿
Boc-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu(OBzl) 5gを含む実施例３．４で得られた反応混合物25mLを、100g/L NaClを含む水溶液（75mL）およびMeTHF（75mL）と混合した。十分に混合し相分離（約4分間）させた後、下層の水層を除去した。さらに、100g/L NaClを含む水溶液（3×75mL）を用いて上層の有機層からの抽出を3回行った。次いで有機層を単離し、残量が10mLになるまで30℃、60mbarで部分的に蒸発させた。0℃においてDIPE（250mL）を攪拌しながら、部分的に蒸発させた有機層を滴下することによってペプチドを沈殿させた。得られた混合物を、孔径20μmのフィルターを備えた直径2.7cmの濾過カラムに移した。50mbarの圧力下で濾過を行った。沈殿母液の全量（260mL）を濾過するのに3分45秒を要した。濾過後のケーキの高さは3.5cmであり、これより濾過係数（K）＝848が得られた。固形物を回収し減圧下で乾燥した。ペプチド4.5gを固形物として単離した。
【０２３０】
図８に、単離したペプチドの写真（40倍拡大）を示す。
【０２３１】
抽出工程により得られた水層および沈殿母液をHPLCで分析した。検出されたペプチドの量は、実施例３．４により得られた反応混合物25mLに含まれる総ペプチド量の0.5重量％未満であった。
【０２３２】
ｂ）比較例：沈殿母液へのDMF添加による影響
ペプチドの濾過を行う前にDMF（2.5mL）を沈殿混合物に加えたこと以外は上記ａ）と同様に抽出および沈殿操作を行った。固形沈殿は直ちにゴム状固形物を形成し、濾過を行うことはできなかった。
【０２３３】
ｃ）比較例：DIPE中における直接沈殿
0℃においてDIPE（250mL）を攪拌しながら、Boc-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu(OBzl) 5gを含む実施例３．４において得られた反応混合物25mLを滴下し、沈殿物を生じさせた。粘着性を有するゴム状固形物としてペプチド沈殿物が得られた。二層分離後、上清をポンプで吸引して第2バッチ用のDIPE（250mL）と交換した。得られた混合物を1時間攪拌して、粘着性を有するゴム状固形物の凝集を解砕させた。二層分離後、上清を第3バッチ用のDIPE（250mL）と再度交換した。混合物を再度1時間攪拌し、次いで濾過カラムに移した。しかしながら、固形物の大部分は沈殿容器に付着したまま粘着性ゴム状固形物の形態を保ち、移動させることは不可能であった。母液の濾過には2分30秒を要し、ケーキの高さは1.75cmであった。これより濾過係数（K）＝636が得られた。回収した固形物を減圧下で乾燥させた。
【０２３４】
ペプチド2.45gが単離された。
【０２３５】
ｄ）比較例：水中における直接沈殿
0℃において水（250mL）を攪拌しながら、Boc-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu(OBzl) 5gを含む実施例３．４において得られた反応混合物25mLを滴下し、沈殿物を生じさせた。非常に薄い沈殿物の層が得られ、次いでこれを濾過カラムに移した。濾過速度は非常に遅く（＜3mL/h）、濾過の最初の段階において多量の沈殿物がフィルターを通過し、約65分後には明らかなフィルターの閉塞が見られた。さらに、透明な沈殿上清は得られなかった。したがって、得られた沈殿物を回収することは不可能であった。
【０２３６】
実施例３．５  Boc-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr-Leu(OBzl)のBoc切断
トルエン（20mL）、フェノール（0.2g）およびTFA（16mL）の混合物に、Boc-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu(OBzl)（5g）を投入した。HPLCにより反応の完了を確認した後（反応物5μLをアセトニトリルで30倍に希釈し、HPLC MIH-009-2TG11法に従って分析した）、反応混合物を減圧下で蒸発させ、油状残渣を得た。さらに、トルエン（2×30mL）との共蒸発を2回行うことよって残留TFAを除去した。共蒸発後に得られた残留物にMeTHF（50mL）を加え、100g/L NaClを含む水溶液（3×50mL）を用いてこの混合物からの抽出を3回行った。得られた有機層を分離し、減圧下35℃で蒸発させた。
【０２３７】
実施例３．６  Boc-Gly-Gly-Gly-Gly-OHとH-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr-Leu(OBzl)とのカップリングおよび生成物の抽出
Boc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH（1.27g、2.8mmol）、H-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu(OBzl)（5.0g、2.7mmol）およびHOBt・H2O（0.43g、2.8mmol）を20℃でDMF（25mL）に溶解し、得られた溶液を上記の実施例３．５で得られた反応混合物に加えた。反応混合物の温度を6±2℃に調整し、EDC・HCl（0.6g、3.1mmol）を加えた。反応の完了がHPLCにより確認されるまで反応混合物をこの温度で維持した。反応の進行は、反応混合物から得た試料3μLを酢酸：水（9：1）で50倍に希釈し、上記のMIH-009-2TG11法に従って分析することによりモニタリングした。
【０２３８】
次いで、MeTHF（90mL）およびTHF（30mL）を加え、以下のものにより混合物から順次抽出を行った。
１）100g/L NaClを含む水溶液（100mL）
２）100g/L NaClおよび25g/L NaHCO3を含む水溶液（100mL）
３）100g/L NaClを含む水溶液（100mL）
４）100g/L NaClを含む水溶液（100mL）
【０２３９】
次いで、得られた有機層を減圧下35℃で蒸発させた。
【０２４０】
実施例３．７  Bocの切断
トルエン（20mL）、フェノール（0.2g）およびTFA（16mL）を、上記の実施例３．６で得られた蒸発残留物に加えた。HPLCにより反応の完了を確認した後（反応物5μLをアセトニトリルで30倍に希釈し、HPLC MIH-009-2TG11法に従って分析した）、反応混合物を減圧下で蒸発させ、油状残渣を得た。トルエン（2×3mL）との共蒸発を2回連続して行うことによって残留TFAを除去した。蒸発残留物にMeTHF（60mL）およびTHF（50mL）を加え、100g/L NaClを含む水溶液（3×100mL）を用いて、得られた溶液からの抽出を3回行った。得られた有機層を減圧下35℃で蒸発させた。
【０２４１】
実施例３．８  Boc-Gly-OHとH-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr-Leu(OBzl)とのカップリング
上記の実施例３．７で得られた蒸発残留物にDMF（25mL）を加えた。得られた混合物にBoc-Gly-OH（0.5g、2.8mmol）、HOBt・H2O（0.43g、2.8mmol）およびEDC・HCl（0.6g、3.1mmol）を6±2℃で加えた。反応の完了がHPLCにより確認されるまで反応混合物をこの温度で維持した。反応の進行は、反応混合物から得た試料3μLを酢酸：水（9：1）で50倍に希釈し、上記のMIH-009-2TG11法に従って分析することによりモニタリングした。
【０２４２】
次いで、MeTHF（90mL）およびTHF（30mL）を加え、以下のものにより混合物から順次抽出を行った。
１）100g/L NaClを含む水溶液（100mL）
２）100g/L NaClおよび25g/L NaHCO3を含む水溶液（100mL）
３）100g/L NaClを含む水溶液（100mL）
４）100g/L NaClを含む水溶液（100mL）
５）100g/L NaClを含む水溶液（100mL）
【０２４３】
得られた有機層を減圧下35℃で蒸発させた。
【０２４４】
実施例４  Boc-MeLeu-OHとHCl・Ala-OMeとのカップリング
HCl・Ala-OMe（4.6g、33.1mmol）をDMF（35mL）中に20℃で溶解した。得られた溶液を-5℃に冷却し、Boc-MeLeu-OH（7.1g、28.8mmol）、HOBt（3.9g、0.29mmol）およびEDC・HCl（5.5g、28.8mmol）を加えた。反応混合物から得た試料5μLを酢酸含有メタノールで10倍に希釈し、上記のMIH-009-025TG3法に従って分析することにより反応をモニタリングし、反応の完了が確認されるまで反応混合物を-5℃で維持した。
【０２４５】
反応の完了後、MeTHF（130mL）を加え、混合物からの抽出を以下のように行った。
１）水（130mL）で１回
２）50g/L NaClを含む水溶液（40mL）で１回
３）10g/L KHSO4を含む水溶液（40mL）で３回
【０２４６】
次いで、有機層にn−ヘプタン（10mL）を加え、得られた有機層からの抽出を以下のように行った。
１）50g/L NaHCO3を含む水溶液（25mL）で１回
２）水（25mL）で１回
【０２４７】
次いで有機層を減圧下で蒸発させた。残留物にn−ヘプタン（140mL）を加え、減圧下で混合物を再度蒸発させて、ペプチドを結晶化させた。18時間後、固形物を濾別しn−ヘプタンで2回すすいだ。
【０２４８】
回収した生成物をn−ヘプタン（45mL）中に40℃で再度溶解し、一晩静置して再結晶化させた。
【０２４９】
HCl・H-Ala-OMeは非常に加水分解されやすいため、通常ある程度のHCl・H-Ala-OHを含んでいる。したがって、ペプチドカップリング反応後に単離した材料は通常、不純物としてBoc-MeLeu-Ala-Ala-OMeを含んでいる。一般に、２つの連続したAlaを配列中に有する不純物は、ペプチド合成が完了した後にクロマトグラフィーで除去することが難しいことが知られている。
【０２５０】
この実施例において実施した再結晶化によって、単離したペプチドに不純物として含まれているBoc-MeLeu-Ala-Ala-OMeの量を1.2mol％から0.2mol％へと減少させることが可能であった。なお、この再結晶化はDMFの非存在下においてのみ実施可能である。
【０２５１】
実施例５  中間体を沈殿させずに段階的にペプチドを組み立てるための連続的LPPSの使用：H-Pro-Ala-Gly-Phe-Ser(tBu)-キサンテンアミドの調製
実施例５．１  Fmoc-Phe-OHとH-Ser(tBu)-キサンテンアミドとのカップリング
H-Ser(tBu)-キサンテンアミド（2.5g、7.7mmol）およびFmoc-Phe-OH（3.0g、7.7mmol）をNMP（20mL）中に20℃で溶解した。TBTU（2.6g、8.1mmol）およびTEA（2mL）を加えた。反応の進行は、反応混合物から得た試料1μLをDMFで50倍に希釈し、上記のMIH-009-RTTG1法に従って分析することによりモニタリングした。
【０２５２】
反応の完了後、反応混合物にMeTHF（75mL）およびTHF（25mL）を加えた。100g/L NaClを含む水溶液（75mL）を用いて、得られた有機層からの抽出を行った。得られた混合物を激しく攪拌し、有機層を分離した後、有機層を減圧下で蒸発させた。蒸発残留物にアセトニトリル（100mL）を加えてペプチドを沈殿させた。得られた固形物を濾別し、減圧下で乾燥させた。
【０２５３】
実施例５．２  Fmoc-Phe-Ser(tBu)-キサンテンアミドのFmocの切断
実施例５．１において得られたFmoc-Phe-Ser(tBu)-キサンテンアミド（2g）を、NMP（15mL）とTAEA（2mL）の混合物中に溶解した。反応の完了を上記の実施例５．１に記載の方法で確認した後、反応混合物にMeTHF（100mL）およびTHF（100mL）を加えた。次いで抽出を以下のように行った。
１）100g/L NaHCO3を含む水溶液（30mL）で３回
２）10g/L KHSO4を含む水溶液（30mL）で５回
３）20g/L NaHCO3を含む水溶液（30mL）で５回
４）150g/L NaHCO3を含む水溶液（30mL）で２回
【０２５４】
NMP（30mL）を加え、得られた有機層を減圧下で蒸発させた。
【０２５５】
実施例５．３  Fmoc-Gly-OHとH-Phe-Ser(tBu)-キサンテンアミドとのカップリング
実施例５．２で得られた蒸発残留物にFmoc-Gly-OH（0.92g、3.1mmol）、TBTU（1.0g、3.1mmol）およびTEA（0.9mL）を加えた。反応の完了は上記の実施例５．１と同様にして確認した。
【０２５６】
実施例５．４  Fmoc-Gly-Phe-Ser(tBu)-キサンテンアミドのFmocの切断
実施例５．３で得られた反応混合物にTAEA（3mL）を加えた。反応の完了を上記の実施例５．１に記載の方法で確認した後、反応混合物にMeTHF（100mL）を加えた。次いで抽出を以下のように行った。
１）100g/L NaClを含む水溶液（100mL）で１回
２）100g/L NaClを含む水溶液（21mL）とNMP（3.7mL）との混合物で４回
３）200g/L NaClを含む水溶液（25mL）で１回
【０２５７】
NMP（30mL）を加え、得られた有機層を減圧下で蒸発させた。
【０２５８】
実施例５．５  Fmoc-Ala-OHとH-Gly-Phe-Ser(tBu)-キサンテンアミドとのカップリング
上記の実施例５．４で得られた蒸発残留物にFmoc-Ala-OH（0.97g、3.1mmol）、TBTU（1.0g、3.1mmol）およびTEA（0.8mL）を加えた。反応の完了は上記の実施例５．１と同様にして確認した。
【０２５９】
実施例５．６  Fmoc-Ala-Gly-Phe-Ser(tBu)-キサンテンアミドのFmocの切断
実施例５．５で得られたカップリング反応混合物にTAEA（3mL）を加えた。反応の完了を上記の実施例５．１に記載の方法によって確認した後、反応混合物にMeTHF（100mL）を加えた。次いで抽出を以下のように行った。
１）100g/L NaClを含む水溶液（100mL）で１回
２）100g/L NaClを含む水溶液（21mL）とNMP（4mL）との混合物で４回
３）200g/L NaClを含む水溶液（25mL）で１回
【０２６０】
NMP（30mL）を加え、得られた有機層を減圧下で蒸発させた。
【０２６１】
実施例５．７  Fmoc-Pro-OHとH-Ala-Gly-Phe-Ser(tBu)-キサンテンアミドとのカップリング
上記の実施例５．６で得られた蒸発残留物にFmoc-Pro-OH（1.05g、3.1mmol）、TBTU（1.0g、3.1mmol）およびTEA（0.8mL）を加えた。反応の完了は実施例５．１と同様にして確認した。
【０２６２】
実施例５．８  Fmoc-Pro-Ala-Gly-Phe-Ser(tBu)-キサンテンアミドのFmocの切断
実施例５．７で得られたカップリング反応混合物にTAEA（3mL）を加えた。反応の完了を上記の実施例５．１に記載の方法によって確認した後、反応混合物にMeTHF（100mL）を加えた。次いで抽出を以下のように行った。
１）100g/L NaClを含む水溶液（100mL）で１回
２）100g/L NaClを含む水溶液（42mL）とNMP（8mL）との混合物で４回
３）200g/L NaClを含む水溶液（25mL）で１回
【０２６３】
得られた有機層にACN（50mL）を加え、得られた混合物を減圧下で蒸発させた。これにより、ペプチドが沈殿し始めた。ACN（3×30mL）との共蒸発をさらに3回行った後、得られたペプチド固形物を濾別し減圧下で乾燥させた。
【０２６４】
比較例１  Sieber樹脂ならびに保護基としてFmocおよびt-Buを使用したH-Leu-Trp(Boc)-Val-Asn(Trt)-Ser(tBu)-NH2のSPPS
担持量0.61meq/gのSieber樹脂（2.3g）を使用して10mmolスケールのSPPSを手動で実施した。以下の表５に、このペプチド合成において使用した材料を示す。
【０２６５】
Sieber樹脂をDCM（20mL）中で18時間かけて膨潤させ、DMFで6回洗浄した。次いで、１つずつアミノ酸を組み込むための以下の操作を行い、樹脂上でペプチドを組み立てた。
１．Fmocの切断：ピペリジン/DMF混合物（15mL、v/v＝2/8）による15分間の処理を3回。
２．ペプチド−樹脂の洗浄：DMF（10mL）で6回。
３．アミノ酸カップリング：DMF（10mL）およびTEA（0.7mL）中における、PyBOP（2.1mmol）を用いたFmoc−アミノ酸（2.1mmol、1.5当量）のカップリング。反応の完了はKaiserテストで確認した。
４．ペプチド−樹脂の洗浄：DMF（10mL）で6回。
【０２６６】
最終的なFmocの切断後、樹脂をDMF（10mL）で8回洗浄し、次いでDCM（10mL）で6回洗浄した。DCM/TFA（v/v＝95/5）による10分間の処理を計4回繰り返してペプチドを樹脂から切り出した。得られた溶液を合わせ、減圧下で蒸発し、DIPE（20mL）中で沈殿させた。得られた固形物を減圧下で乾燥させた。
【０２６７】
H-Leu-Trp(Boc)-Val-Asn(Trt)-Ser(tBu)-NH2 605mg（総収率＝33％）が単離され、この生成物の純度は57％であった。
【０２６８】
以下の表７に、10mmolスケール合成における各数値をSPPSとLPPSとで比較した結果を示す。
【０２６９】
【表８】
2014517022.tif 000009
【０２７０】
要約すると、比較例１において調製した目的のペプチドの純度および収率は、本発明のペプチド調製方法により通常達成される数値よりも低かった。
【０２７１】
比較例２：Carpino法によるH-Leu-Trp(Boc)-Val-Asn(Trt)-Ser(tBu)-NH2の連続的LPPS
比較例２．１  Fmoc-Asn(Trt)-Ser(tBu)-NH2のLPPS
H-Ser(tBu)-NH2（2.0g、12.5mmol）およびFmoc-Asn(Trt)-OH（6.8g、11.3mmol）を20℃でDCM（50.0mL）に加えた。混合物を15分間攪拌して固形物を完全に溶解させ、10℃に冷却した。DCC（2.34g、11.3mmol）およびHOBt（1.74g、11.3mmol）を加えた。10℃で反応を行い、14時間後に反応が完了したことをHPLCにより確認した。反応の進行は、反応混合物から得た試料3μLをNMPで50倍に希釈し、上記のMIH-009-RTTG1法に従って分析することによりモニタリングした。
【０２７２】
比較例２．２  Fmoc保護基の除去およびAsn(Trt)-Ser(tBu)-NH2の単離
比較例２．１に従って調製した混合物にTAEA（25mL）を加え、反応混合物を室温で攪拌した。Fmocの切断の完了は実施例４．１と同様の方法を使用してHPLCにより確認した。
【０２７３】
DCUを6分かけて濾別した。得られた濾液をDCMで希釈して全量を250mLとし、次いで100g/LのNaH2PO4およびNa2HPO4を含む水溶液（pH5.5、100mL）による抽出を3回行った。
【０２７４】
比較例２．３  Fmoc-Val-OHとH-Asn(Trt)-Ser(tBu)-NH2とのカップリング
比較例２．２で得られた有機層を残量が80mLになるまで減圧下30℃で蒸発させた。
【０２７５】
Fmoc-Val-OH（3.85g、11.3mmol）、DCC（2.34g、11.3mmol）およびHOBt（1.74g、11.3mmol）を加えた。室温で反応を行った。18時間後、Fmoc-Val-OH（0.77g、2.3mmol）、DCC（0.47g、2.3mmol）およびDCM（25mL）を加えて反応を完了させた。反応の進行は、反応混合物から得た試料3μLをDMFで50倍に希釈し、上記のMIH-009-RTTG1法に従って分析することによりモニタリングした。
【０２７６】
比較例２．４  Fmoc保護基の除去：H-Val-Asn(Trt)-Ser(tBu)-NH2
比較例２．３で得られた反応混合物にTAEA（25mL）を加えてFmocを切断した。比較例２．３と同様の方法を使用してHPLCにより反応の完了を確認した。
【０２７７】
DCUを濾別し、DCM（2×25mL）で2回すすいだ。得られた濾液を合わせ、DCMで希釈して全量を200mLとした。この溶液からの抽出を、100g/LのNaH2PO4およびNa2HPO4を含む水溶液（pH5.5、3×100mL）を用いて3回行った。
【０２７８】
残量が100mLになるまで有機層を減圧下30℃で蒸発させた。
【０２７９】
比較例２．５  Fmoc-Trp(Boc)-OHとH-Val-Asn(Trt)-Ser(tBu)-NH2とのカップリング
比較例２．４で得られたペプチド溶液に、Fmoc-Trp(Boc)-OH（6.0g、11.3mmol）、DCC（2.34g、11.3mmol）およびHOBt（1.74g、11.3mmol）を加えた。カップリング反応を室温で行った。反応時間は18時間であった。比較例２．３と同様の方法を使用してHPLCにより反応の完了を確認した。
【０２８０】
比較例２．６  Fmoc保護基の除去：H-Trp(Boc)-Val-Asn(Trt)-Ser(tBu)-NH2
比較例２．５で得られた反応混合物にTAEA（25mL）を加えてFmocを切断した。比較例２．３と同様の方法を使用してHPLCにより反応の完了を確認した。
【０２８１】
DCUを濾別し、DCM（2×25mL）で2回すすいだ。得られた濾液を合わせ、DCMで希釈して全量を200mLとした。この溶液からの抽出を、100g/LのNaH2PO4およびNa2HPO4を含む水溶液（pH5.5、3×100mL）を用いて3回行った。
【０２８２】
抽出工程中に有機層が濁ったため、追加のDCMを有機層に加えた。これによって、体積は400mLになった。それにもかかわらず、抽出工程において溶解しなかった生成物が存在した。したがって、層分離は難しく、ある程度の生成物が水層に混じった。
【０２８３】
比較例２．７  LPPSによるFmoc-Leu-OHとH-Trp(Boc)-Val-Asn(Trt)-Ser(tBu)-NH2とのカップリング
比較例２．６で得られたペプチド溶液に、Fmoc-Leu-OH（4.0g、11.3mmol）、DCC（2.34g、11.3mmol）およびHOBt（1.74g、11.3mmol）を加えた。カップリング反応を室温で行った。反応時間は18時間であった。比較例２．３と同様の方法を使用してHPLCにより反応の完了を確認した。
【０２８４】
比較例２．８  Fmoc保護基の除去：H-Leu-Trp(Boc)-Val-Asn(Trt)-Ser(tBu)-NH2
比較例２．５で得られた反応混合物にTAEA（25mL）を加えてFmocを切断した。比較例２．３と同様の方法を使用してHPLCにより反応の完了を確認した。
【０２８５】
DCUを濾別し、DCM（2×25mL）で2回すすいだ。得られた濾液を合わせ、DCMで希釈して全量を200mLとした。得られた溶液からの抽出を、100g/L NaH2PO4およびNa2HPO4を含む水溶液（pH5.5、3×100mL）を用いて3回行った。
【０２８６】
抽出工程中に有機層が濁ったため、追加のDCMを有機層に加えた。これによって、体積は400mLになった。それにもかかわらず、抽出工程において溶解しなかった生成物が存在した。したがって、層分離は難しく、ある程度の生成物が水層に混じった。
【０２８７】
得られた有機層を減圧下30℃で蒸発させた。得られた油状残渣をn−ヘプタン（100mL）中に投入し沈殿を得た。得られた固形物を濾過することによって単離し、n−ヘプタン（3×10mL）で3回すすぎ、減圧下で乾燥させた。
【０２８８】
H-Leu-Trp(Boc)-Val-Asn(Trt)-Ser(tBu)-NH2 2.6g（収率＝31％）が単離され、この最終生成物の純度は49％であった。
【０２８９】
要約すると、Carpinoらによって報告された合成法にはいくつかの欠点が見られた。ペプチドH-Leu-Trp(Boc)-Val-Asn(Trt)-Ser(tBu)-NH2およびH-Trp(Boc)-Val-Asn(Trt)-Ser(tBu)-NH2のDCMに対する溶解性は十分なものではなかったため、抽出工程においてこれらのペプチドの相当量が有機層と水層の間の境界面に沈殿した。有機層の体積を400mLに増加させたにもかかわらず、単離された生成物は中程度の収率しか示さなかった。さらに、生じたDCUの濾別には多大な時間が必要とされることが示された。
【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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