(57)【要約】  複数の少なくとも部分的に融合した層として形成される加工肉製品を提供し、各層は、少なくとも部分的に融合した、非ヒト筋細胞を含む多細胞体を含み、加工肉は食用である。また、互いに接着および/または密着した複数の非ヒト筋細胞を含む多細胞体も提供し、多細胞体は栄養素透過性の支持基板上に隣接して配置され、培養中維持され、多細胞体を少なくとも部分的に融合させて、加工肉の形成に使用する実質的に平面の層を形成する。さらに、本明細書は前記層を用いた加工肉の形成方法を記載する。【選択図】図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
加工肉製品であって、
ボリュームのある本体を含み；
本体は複数の積層された平面層を含み、層は少なくとも部分的に融合しており、各平面層は複数の少なくとも部分的に融合した、非ヒト筋細胞を含む多細胞体を含み；
本体はいかなる血管も含まず、さらに、加工肉製品は食用で摂食するためものである、前記加工肉製品。
【請求項２】
本体のボリュームが１０ｃｍ３より大きい、請求項１に記載の加工肉。
【請求項３】
肉製品の中間領域内の平面層では、加工肉の外側の層より前に細胞死が起こる、請求項１に記載の加工肉。
【請求項４】
本体が１０層より多くの層を含む、請求項１に記載の加工肉。
【請求項５】
各平面層は、複数の少なくとも部分的に融合した、非ヒト筋細胞と非ヒト内皮細胞を含む多細胞体を含む、請求項１に記載の加工肉。
【請求項６】
本体の積層された平面層が完全に融合した、請求項１に記載の加工肉。
【請求項７】
筋細胞が、哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類、甲殻類、軟体動物または頭足類由来である、請求項１に記載の加工肉。
【請求項８】
前記筋細胞が骨格筋細胞である、請求項１に記載の加工肉。
【請求項９】
前記筋細胞が心筋細胞である、請求項１に記載の加工肉。
【請求項１０】
前記筋細胞が平滑筋細胞である、請求項１に記載の加工肉。
【請求項１１】
前記筋細胞が整列している、請求項１に記載の加工肉。
【請求項１２】
複数の積層された層を含むボリュームを含み、各層は複数の少なくとも部分的に融合した、非ヒト筋細胞を含む多細胞体を含み、各層における多細胞体は互いに隣接して配置され；
加工肉は食用で摂食するためものである、加工肉。
【請求項１３】
ボリュームが１０ｃｍ３より大きい、請求項１２に記載の加工肉。
【請求項１４】
ボリュームはいかなる血管も含まない、請求項１２に記載の加工肉。
【請求項１５】
前記各層は、栄養素を拡散させて、培養中に前記非ヒト筋細胞の維持と増殖が充分行われるように調整した厚さを有する、請求項１２に記載の加工肉。
【請求項１６】
前記各層の厚さが、約１００μｍ〜約１０００μｍである、請求項１２に記載の加工肉。
【請求項１７】
食用加工肉製品の形成方法であって、
複数の多細胞体を平面に隣接して配置することにより複数の平面層を形成する工程、ここで、各多細胞体は複数の密着した非ヒト筋細胞を含み；
少なくとも各層内の複数の多細胞体が融合し始めるまで各平面層を培養する工程；
複数の層を積層して、加工肉の層状ボリュームを形成する工程；および
少なくとも積層が融合し始めるまでボリュームを培養する工程を含む、方法。
【請求項１８】
少なくとも細胞が互いに密着するまで複数の非ヒト筋細胞と非ヒト内皮細胞を培養することにより、複数の多細胞体を調製する工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
積層には、平面基板上の層の上に平面層を連続的に積層することが含まれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
加工肉ボリュームを冷凍する工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
各平面層を培養する工程には、機械的、電気的または電気機械的な力を加えて、各層における筋細胞をエクササイズさせる工程が含まれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
積層には、約１０層より多くの層を積層することが含まれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
加工肉の形成方法であって、
互いに密着した複数の非ヒト筋細胞を含む複数の多細胞体を調製する工程；
平面支持基板上に隣接して一つより多くの多細胞体を置く工程；
前記多細胞体を融合させて第一の層を形成する工程；
第一の層上に少なくとも一つの付加層を置く工程；および
前記層を融合させて加工肉ボリュームを形成する工程；を含み、
加工肉は食用である、方法。
【請求項２４】
前記加工肉ボリュームを冷凍する工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
複数の多細胞体を調製する工程には、互いに密着した複数の非ヒト筋細胞を含む複数の細長い多細胞体を調製する工程と、互いに密着した複数の非ヒト筋細胞を含む複数の実質的に球状の多細胞体を調製する工程が含まれ；さらに、一つより多くの多細胞体を置く工程には、平面支持基板上に隣接して、一つより多くの細長い多細胞体と一つより多くの実質的に球状の多細胞体を置く工程が含まれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記細長い多細胞体の長さは、約１ｍｍ〜約１０ｃｍの範囲である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
複数の多細胞体を調製する工程には、互いに密着した複数の非ヒト筋細胞を含む複数の実質的に球状の多細胞体を調製する工程が含まれ；さらに一つより多くの多細胞体を置く工程には、支持基板上に隣接して、一つより多くの実質的に球状の多細胞体を置く工程が含まれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
平面支持基板は液体および栄養素を透過可能であり、細胞培地を多細胞体の表面全てに接触させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記多細胞体が、拡散することで培養中に前記非ヒト筋細胞と非ヒト内皮細胞の維持と増殖が充分行われるように調整した直径を持つ、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記多細胞体の直径は、約１００μｍ〜約５００μｍである、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年７月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／５１１,９４８号の利益を主張するものであり、該仮特許は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、人体の成長および維持のために必要な栄養素である。水を除けば、タンパク質は身体に最も多く含まれる分子である。アメリカおよびカナダの食事摂取基準のガイドラインによれば、欠乏症を避けるためには、１９〜７０歳の女性は１日に４６グラムのタンパク質を摂る必要があり、１９〜７０歳の男性は１日に５６グラムのタンパク質を摂る必要がある。しかし、この提言は、疾病にかかっておらず、ほとんど動かない生活をしている人のためになされたものである。タンパク質の欠乏により、クワシオルコルのような疾病の蔓延を招くばかりか、知能の減退や精神遅滞を引き起こす可能性もある。タンパク質の欠乏は、途上国、特に戦争、飢饉、人口過剰の影響を受けている国では深刻な問題である。肉のような動物由来のタンパク質は、全ての必須アミノ酸を適切な比率で完全に相補するものとなることが多い。
【０００３】
肉から得られる栄養面での恩恵は、関連している可能性がある環境の悪化によって制限される。家畜による大きな影響−環境問題とその解決策（Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ’ｓ  Ｌｏｎｇ  Ｓｈａｄｏｗ−Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｏｎｓ）という表題が付けられた、ｔｈｅ  Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ、Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅによる２００６年の報告によれば、畜産業は世界の環境悪化の最も大きな要因の一つであり、食糧として動物を飼育する現在の慣習が、大気・水質汚染、土地の劣化、気候変動および生物学的多様性の喪失を幅広く引き起こしている。肉や他の動物由来のタンパク源の生産と消費はまた、熱帯雨林の開墾や種の絶滅とも関連づけられている。従って、生きている動物から生産する肉の代替品を求める要望に応えたいというニーズがある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ａ  ２００６  ｒｅｐｏｒｔ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ，  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ，  ｅｎｔｉｔｌｅｄ  Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ’ｓ  Ｌｏｎｇ  Ｓｈａｄｏｗ−Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｏｎｓ
【発明の概要】
【０００５】
生体組織工学の技術は、家畜の飼育による環境悪化とは関係しない、食用動物タンパク源を生産する新たなチャンスをもたらしている。生体組織工学は、工学と生命科学の原理を適用して、組織機能または臓器全体を修復、維持あるいは改善する生物学的代用品の開発を目指す学術分野であると定義づけられてきた。Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ，  Ｖａｃａｎｔｉ  ＪＰ，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０（５１１０）：９２０−９２６  （Ｍａｙ  １９９３）。生体組織工学の技術を適用して生物の栄養上のニーズを満たせる可能性があるにも関わらず、食用肉を生産するための、科学的根拠に基づき、工業的に実施可能な工程は開発されておらず、加工食用肉（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｃｏｍｅｓｔｉｂｌｅ  ｍｅａｔ）製品を入手することはできない。
【０００６】
本明細書で開示するのは、加工肉（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｅａｔ）製品、前記肉の製造に使用する複数の多細胞体を含む層、および該加工肉製品の製造方法である。第一の態様では、各層が非ヒト筋細胞を含み、加工肉は食用で摂食するためものである、複数の層を含む加工肉を開示する。
【０００７】
本明細書はまた、加工肉製品について記載しており、該肉製品はボリュームのある本体を含み、本体は複数の積層された平面層を含み、層は少なくとも部分的に融合しており、各平面層は複数の少なくとも部分的に融合した、筋細胞を含む非ヒト多細胞体を含み；さらには、本体はいかなる血管も含まず、加工肉製品は食用で摂食するためものである。
【０００８】
本体のボリューム（ｖｏｌｕｍｅ）は、いくつかの最小ボリュームより大きくてもよい（例えば、いかなる中間ボリュームも含み、０.１ｃｍ３より大きい、１ｃｍ３より大きい、１０ｃｍ３より大きい、５０ｃｍ３より大きい、１００ｃｍ３より大きい、５００ｃｍ３より大きい、１０００ｃｍ３より大きい等）。
【０００９】
ボリュームまたは肉を調べることで加工肉の層状の性質が現れてもよい。例えば、筋細胞が層により異なる方向を向いている平面層を肉が有していてもよい。いくつかの変形においては、細胞が死滅した領域を見ることにより加工肉の層状構造が明らかに分かってもよい。例えば、肉製品の中間領域内の平面層では、加工肉の外側の層より前に細胞死が起きてもよい。より詳細に後述するように、連続的に「より深部の」層は、培地中の新鮮な栄養素からさらに隔てられるため、融合した（または部分的に融合した）平面層を相互に上に連続的に積層し、積層された層を融合させることで加工肉を形成することにより、細胞死が起きる領域ができてもよい。このことにより、ボリュームの端からさらに深部の（層状となって平面層を形成してもよい）層では、より新しく作られた層より前に細胞死が起こるという細胞死のパターンができてもよい。細胞死が起こるタイミングの層状パターンは、当分野で公知の、核断片化や他の代謝マーカーといった細胞死進行のマーカーを調べることにより可視化してもよい。例えば、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）を使用してもよい。平面層は、他の非ヒト細胞型も付加的に含む多細胞体から形成されてもよい。例えば、加工肉ボリュームの各平面層は、非ヒト筋細胞と、非ヒト内皮細胞、非ヒト線維芽細胞および／または非ヒト脂肪細胞等の一つ以上を含む、複数の少なくとも部分的に融合した多細胞体を含んでもよい。
【００１０】
一般的に、該加工肉は、他の加工組織の形態でみられるような充填体は含まない。例えば、足場材料（ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ）として機能する充填体（例えば、支持構造物）は必要なく、充填体は最終的な食用製品にとって有害となりうる。充填体としては、多細胞体からの細胞の移動や内殖を抑え、細胞を接着させない生体適合性材料を挙げることができる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８,１４３.０５５号を参照。
【００１１】
「食用」という用語は、本明細書では、食用の、または、ヒトあるいは非ヒト動物が食べるのに適切な、という意味である。「摂食するための」という語句は、本明細書では、ヒトまたは非ヒト動物が経口的に消費するのに適切で、そのように調整していることを意味する。いくつかの実施形態では、加工肉の各層は、さらに非ヒト内皮細胞を含む。いくつかの実施形態では、加工肉の各層は、さらに非ヒト脂肪細胞を含む。いくつかの実施形態では、各層は、さらに非ヒト線維芽細胞を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示する加工肉は、複数の層を含み、各層は非ヒト筋細胞を含み、各層は拡散することで培養中に非ヒト筋細胞の維持と増殖が充分行われるように調整した厚さにより特徴づけられる。様々な実施形態では、加工肉は複数の層を含み、各層の厚さは、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００μｍである。測定可能な値について言及する際に本明細書で使用される「約」という用語は、示された値または範囲の＋／−２％、＋／−５％または＋／−１０％以内であることを意味してもよい。いくつかの実施形態では、各層の厚さは、約１００μｍ〜約１０００μｍである。さらなる実施形態では、各層の厚さは、約１５０μｍ〜約９００μｍである。さらに他の実施形態では、各層の厚さは、約２００μｍ〜約８００μｍである。さらに他の実施形態では、各層の厚さは、約２５０μｍ〜約７００μｍである。さらに他の実施形態では、各層の厚さは、約３００μｍ〜約６００μｍである。様々な実施形態では、加工肉は２、３、４、５、６、７、８、９または１０の層を含む。他の様々な実施形態では、加工肉は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００の層を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示する加工肉は、約２〜約１００の層を含む。さらなる実施形態では、加工肉は、約２０〜約８０の層を含む。さらに他の実施形態では、加工肉は、約４０〜約６０の層を含む。いくつかの実施形態では、各層は、直径が約１００、２００、３００、４００、５００μｍの多細胞体を含む。いくつかの実施形態では、前記多細胞体の直径は約１００μｍ〜約５００μｍである。さらなる実施形態では、前記多細胞体の直径は約２００μｍ〜約４００μｍである。さらなる実施形態では、前記多細胞体の直径は約２００μｍ〜約３００μｍである。さらに他の実施形態では、前記多細胞体の直径は約２５０μｍ〜約４００μｍである。さらに他の実施形態では、前記多細胞体の直径は約３００μｍ〜約４００μｍである。一般的に、多細胞体の直径とは、横断面の中間点を通り、多細胞体の断面の片側から反対側まで、細長い多細胞体を貫通して伸ばした最長の線の長さをいう。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示する加工肉は、実質的に６０〜８０パーセントの液体、１４〜３５パーセントのタンパク質、１〜２５パーセントの脂肪、１〜５パーセントの炭水化物および１〜５パーセントのその他の物質という組成により特徴づけられる。さらなる実施形態では、加工肉は実質的に、タンパク質、脂肪、炭水化物等のパーセントに関して、牛肉、子牛の肉、豚肉、鶏肉または魚と同様の組成を有する。いくつかの実施形態では、加工肉は複数の層を含み、各層は非ヒト筋細胞と非ヒト内皮細胞を含み、各層はバイオプリントされる。様々な実施形態では、本明細書で開示する加工肉は複数の層を含み、各層は筋細胞を含み、内皮細胞、脂肪細胞および／または線維芽細胞の一つ以上を含んでもよく、細胞は、それらに限定されるものではないが、哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類、甲殻類、軟体動物および頭足類またはそれらの組み合わせを含む原料由来である。いくつかの実施形態では、加工肉は骨格筋細胞である非ヒト筋細胞を含む。いくつかの実施形態では、筋細胞は心筋細胞である。いくつかの実施形態では、筋細胞は平滑筋細胞である。その他の実施形態では、筋細胞は骨格、心、平滑筋細胞の組み合わせである。いくつかの実施形態では、加工肉は、微小血管内皮細胞である内皮細胞を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示する加工肉は、約１９：１〜約３：１の非ヒト筋細胞と非ヒト内皮細胞の比率により特徴づけられる。いくつかの実施形態では、非ヒト内皮細胞は、加工肉の総細胞数の約５％〜約１５％を占める。いくつかの実施形態では、加工肉は未分化の筋細胞および／または未分化の内皮細胞を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、筋細胞は互いに整列している。さらなる実施形態では、筋細胞は肉の層に対して整列している。様々な実施形態では、本明細書で開示する加工肉は、肉の栄養価、肉の料理としての魅力または非ヒト細胞の増殖特性を高める一つ以上の物質をさらに含む。いくつかの実施形態では、加工肉は一つ以上の栄養補助剤をさらに含む。さらなる実施形態では、栄養補助剤はビタミン、ミネラル、繊維、脂肪酸およびアミノ酸から選択される。いくつかの実施形態では、加工肉は一つ以上の風味材料および／または着色剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、加工肉は、基質タンパク質、プロテオグリカン、抗酸化剤、パーフルオロカーボンおよび増殖因子の一つ以上をさらに含む。いくつかの実施形態では、加工肉はヒトが消費するのに適している。その他の実施形態では、加工肉は非ヒト動物が消費するのに適している。さらに他の実施形態では、加工肉はヒトと非ヒト動物の両方が消費するのに適している。
【００１３】
また別の態様では、本明細書で開示するのは、複数の非ヒト生筋細胞を含む複数の多細胞体であり、細胞は互いに接着および/または密着(cohere)しており；多細胞体は支持基板上に隣接して配置され、加工食用肉の形成に使用する実質的に平面の層を形成する。ある実施形態では、多細胞体は実質的に球の形状である。ある実施形態では、多細胞体は実質的に円筒状である。いくつかの実施形態では、多細胞体は実質的に断面が円形である。いくつかの実施形態では、多細胞体は、正方形、長方形、三角形またはその他の非円形の断面形状を持つ細長い形状である。いくつかの実施形態では、多細胞体は細長くない円筒形状または立方体状である。「隣接した」という用語は、本明細書で多細胞体の配置について言及する際には、支持基板に対して水平あるいは垂直に、接触して、かつ、上に、下に、または隣に、ということを意味する。
【００１４】
また別の態様では、本明細書で開示するのは、複数の非ヒト生筋細胞を含む複数の多細胞体であり、細胞は互いに接着および/または密着しており；多細胞体は支持基板上に隣接して配置され、培養中維持され、多細胞体を融合させて、加工食用肉の形成に使用する実質的に平面の層を形成する。
【００１５】
また別の態様では、本明細書で開示するのは、複数の非ヒト生筋細胞を含む複数の多細胞体であり、細胞は互いに接着および/または密着しており；多細胞体は支持基板上に隣接して配置され、培養中維持され、多細胞体を融合させて、加工食用肉の形成に使用する実質的に平面の層を形成し；支持基板は液体および栄養素を透過可能であり、細胞培地を前記層の表面全てに接触させる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示する加工層は、非ヒト内皮細胞および／または非ヒト脂肪細胞をさらに含む。いくつかの実施形態では、層は非ヒト線維芽細胞をさらに含む。いくつかの実施形態では、加工層は、約１９：１〜約３：１の非ヒト筋細胞と非ヒト内皮細胞の比率により特徴づけられる。いくつかの実施形態では、非ヒト内皮細胞は、総細胞数の約５％〜約１５％を占める。いくつかの実施形態では、本明細書で開示する加工層は、拡散することで培養中に前記非ヒト筋細胞と非ヒト内皮細胞の維持と増殖が充分行われるように調整した厚さにより特徴づけられる。様々な実施形態では、加工層の厚さは、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００μｍである。いくつかの実施形態では、層の厚さは、約１００μｍ〜約１０００μｍである。さらなる実施形態では、層の厚さは、約１５０μｍ〜約９００μｍである。さらに他の実施形態では、層の厚さは、約２００μｍ〜約８００μｍである。さらに他の実施形態では、層の厚さは、約２５０μｍ〜約７００μｍである。さらに他の実施形態では、層の厚さは、約３００μｍ〜約６００μｍである。様々な実施形態では、本明細書で開示する加工層は、栄養価、料理としての魅力または増殖特性を高める一つ以上の物質をさらに含む。いくつかの実施形態では、加工層は、基質タンパク質、プロテオグリカン、抗酸化剤、パーフルオロカーボンおよび増殖因子の一つ以上をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞が互いに接着および/または密着している、複数の非ヒト生筋細胞および非ヒト生内皮細胞を含む複数の多細胞体は、支持基板上に隣接して配置され、加工食用肉の形成に使用する実質的に平面の層を形成し、層はバイオプリントされる。いくつかの実施形態では、各層は、直径が約１００、２００、３００、４００、５００μｍの多細胞体を含む。いくつかの実施形態では、前記多細胞体の直径は、約１００μｍ〜約５００μｍである。さらなる実施形態では、前記多細胞体の直径は、約２００μｍ〜約４００μｍである。さらなる実施形態では、前記多細胞体の直径は、約２００μｍ〜約３００μｍである。さらに他の実施形態では、前記多細胞体の直径は、約２５０μｍ〜約４００μｍである。さらに他の実施形態では、前記多細胞体の直径は、約３００μｍ〜約４００μｍである。
【００１６】
本明細書はまた、食用加工肉製品の形成方法を記載しており、該方法は、複数の平面層を形成する工程、ここで、各層は、複数の多細胞体を平面に隣接して配置することにより形成され、さらに、各多細胞体は複数の密着した非ヒト筋細胞を含み；少なくとも各層内の複数の多細胞体が融合し始めるまで各平面層を培養する工程；複数の層を積層して、加工肉の層状ボリュームを形成する工程；および、少なくとも積層が融合し始めるまでボリュームを培養する工程を含む。
【００１７】
いくつかの変形においては、該方法はまた、少なくとも細胞が互いに密着するまで複数の非ヒト筋細胞と非ヒト内皮細胞を培養することにより、複数の多細胞体を調製する工程を含んでもよい。上述した通り、その他のいかなる適切な非ヒト細胞型が、層を形成する多細胞体のいくつかまたは全ての一部として含まれていてもよく、内皮細胞および／または脂肪細胞および／または線維芽細胞が例として挙げられる。
【００１８】
加工肉製品の形成中、層を他の層の上に個別に、または、まとめて積層して、加工肉ボリュームを製造してもよい。いくつかの変形においては、各連続する層は、隣接した一つまたは複数の層に対して異なる方向を向いている。例えば、それらを積層する際に、新しい層をボリューム中の他の層に対して回転させてもよい。いくつかの変形においては、積層する際に、各層を他の層に対して約９０°回転させる。
【００１９】
本明細書に記載するいかなる加工肉においても、形成する際に、層はエクササイズ（ｅｘｅｒｃｉｓｅ）されてもよい。より詳細に後述するように、層をエクササイジング（ｅｘｅｒｃｉｓｉｎｇ）することにより細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の形成を増進してもよい。このことを、形成する際に層内の細胞（例えば、筋細胞）に当てはめてもよい。従って、加工肉の形成方法のいくつかの変形は、機械的、電気的または電気機械的な力を加えて、各層における筋細胞をエクササイズさせる工程を含んでもよい。
【００２０】
上述の通り、いかなる適切な数の層が含まれていてもよい。例えば、層を積層する工程は、約１０層より多くの層、約５０層より多くの層、約１００層より多くの層等を積層する工程を含んでいてもよい。
【００２１】
また別の態様では、本明細書で開示するのは加工肉の形成方法であり、複数の非ヒト生筋細胞を含む複数の多細胞体を調製する工程、ここで、細胞は互いに接着および/または密着しており；一つより多くの多細胞体を支持基板上に隣接して置く工程；前記多細胞体を融合させて層を形成する工程；その層の上に隣接して一つより多くの層を置く工程；前記層を融合させて加工肉を形成する工程；および、場合により、前記肉を冷凍する工程を含み、但し、加工肉は食用で摂食するためものである。いくつかの実施形態では、本明細書で開示するのは、加工肉の形成方法であり、複数の非ヒト筋細胞を含む複数の多細胞体を調製する工程、ここで、細胞は互いに接着および/または密着しており；一つより多くの多細胞体を支持基板上に隣接して置く工程；前記多細胞体を融合させて層を形成する工程；第一の層の上に隣接して一つより多くの層を置く工程；および、前記層を融合させて加工肉を形成する工程を含み、但し、加工肉は食用である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、さらに前記肉を冷凍する工程を含む。
【００２２】
また別の態様では、本明細書で開示するのは加工肉の形成方法であり、複数の非ヒト生筋細胞を含む複数の細長い多細胞体を調製する工程、ここで、細胞は互いに接着および/または密着しており；複数の非ヒト生筋細胞を含む複数の実質的に球状の多細胞体を調製する工程、ここで、細胞は互いに接着および/または密着しており；一つより多くの細長い多細胞体と一つより多くの実質的に球状の多細胞体を支持基板上に隣接して置く工程；前記多細胞体を融合させて層を形成する工程；一つより多くの層を第一の層の上に隣接して置く（例えば、積層する）工程；前記層を融合させて加工肉を形成する工程；および、場合により、前記肉を冷凍する工程を含み、但し、加工肉は食用で摂食するためものである。いくつかの実施形態では、本明細書で開示するのは加工肉の形成方法であり、複数の非ヒト筋細胞を含む複数の細長い多細胞体を調製する工程、ここで、細胞は互いに接着および/または密着しており；複数の非ヒト筋細胞を含む複数の実質的に球状の多細胞体を調製する工程、ここで、細胞は互いに接着および/または密着しており；一つより多くの細長い多細胞体と一つより多くの実質的に球状の多細胞体を支持基板上に隣接して置く工程；前記多細胞体を融合させて層を形成する工程；第一の層の上に隣接して一つより多くの層を置く工程；および、前記層を融合させて加工肉ボリュームを形成する工程を含み、但し、加工肉は食用で摂食するためものである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する方法は、前記肉を冷凍する工程をさらに含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、細長い多細胞体と実質的に球状の多細胞体の比率は、約０：１００、１：１００、２：１００、３：１００、４：１００、５：１００、６：１００、７：１００、８：１００、９：１００、１：１０、１１：１００、１２：１００、１３：１００、１４：１００、１５：１００、１６：１００、１７：１００、１８：１００、１９：１００、１：５、２１：１００、２２：１００、２３：１００、２４：１００、２５：１００、２６：１００、２７：１００、２８：１００、２９：１００、３：１０、３１：１００、３２：１００、３３：１００、３４：１００、３５：１００、３６：１００、３７：１００、３８：１００、３９：１００、２：５、４１：１００、４２：１００、４３：１００、４４：１００、４５：１００、４６：１００、４７：１００、４８：１００、４９：１００、１：２、５１：１００、５２：１００、５３：１００、５４：１００、５５：１００、５６：１００、５７：１００、５８：１００、５９：１００、３：５、６１：１００、６２：１００、６３：１００、６４：１００、６５：１００、６６：１００、６７：１００、６８：１００、６９：１００、７：１０、７１：１００、７２：１００、７３：１００、７４：１００、７５：１００、７６：１００、７７：１００、７８：１００、７９：１００、４：５、８１：１００、８２：１００、８３：１００、８４：１００、８５：１００、８６：１００、８７：１００、８８：１００、８９：１００、９：１０、９１：１００、９２：１００、９３：１００、９４：１００、９５：１００、９６：１００、９７：１００、９８：１００、９９：１００または１：１である。いくつかの実施形態では、実質的に球状の多細胞体と細長い多細胞体の比率は、約０：１００、１：１００、２：１００、３：１００、４：１００、５：１００、６：１００、７：１００、８：１００、９：１００、１：１０、１１：１００、１２：１００、１３：１００、１４：１００、１５：１００、１６：１００、１７：１００、１８：１００、１９：１００、１：５、２１：１００、２２：１００、２３：１００、２４：１００、２５：１００、２６：１００、２７：１００、２８：１００、２９：１００、３：１０、３１：１００、３２：１００、３３：１００、３４：１００、３５：１００、３６：１００、３７：１００、３８：１００、３９：１００、２：５、４１：１００、４２：１００、４３：１００、４４：１００、４５：１００、４６：１００、４７：１００、４８：１００、４９：１００、１：２、５１：１００、５２：１００、５３：１００、５４：１００、５５：１００、５６：１００、５７：１００、５８：１００、５９：１００、３：５、６１：１００、６２：１００、６３：１００、６４：１００、６５：１００、６６：１００、６７：１００、６８：１００、６９：１００、７：１０、７１：１００、７２：１００、７３：１００、７４：１００、７５：１００、７６：１００、７７：１００、７８：１００、７９：１００、４：５、８１：１００、８２：１００、８３：１００、８４：１００、８５：１００、８６：１００、８７：１００、８８：１００、８９：１００、９：１０、９１：１００、９２：１００、９３：１００、９４：１００、９５：１００、９６：１００、９７：１００、９８：１００、９９：１００または１：１である。
【００２４】
また別の態様では、本明細書で開示するのは加工肉の形成方法であり、複数の非ヒト生筋細胞を含む複数の実質的に球状の多細胞体を調製する工程、ここで、細胞は互いに接着および/または密着しており；一つより多くの実質的に球状の多細胞体を支持基板上に隣接して置く工程；前記実質的に球状の多細胞体を融合させて層を形成する工程；第一の層の上に隣接して一つより多くの層を置く工程；層を融合させて加工肉ボリュームを形成する工程；および、場合により、前記肉を冷凍する工程を含み、但し、加工肉は食用で摂食するためものである。いくつかの実施形態では、本明細書で開示するのは加工肉の形成方法であり、複数の非ヒト筋細胞を含む複数の実質的に球状の多細胞体を調製する工程、ここで、細胞は互いに接着および/または密着しており；一つより多くの実質的に球状の多細胞体を支持基板上に隣接して置く工程；前記実質的に球状の多細胞体を融合させて層を形成する工程；第一の層の上に隣接して一つより多くの層を置く工程；および、前記層を融合させて加工肉ボリュームを形成する工程を含み、但し、加工肉は食用である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する方法は、前記肉を冷凍する工程をさらに含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示する加工肉の形成方法は、複数の非ヒト生筋細胞を含む複数の多細胞体を調製する工程を含み、細胞は互いに接着および/または密着しており、多細胞体は非ヒト生脂肪細胞および／または非ヒト生内皮細胞をさらに含む。いくつかの実施形態では、多細胞体は非ヒト生線維芽細胞をさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示する加工肉の形成方法は、一つより多くの多細胞体を支持基板上に隣接して置く工程を含み、多細胞体は水平に隣接して、および／または垂直に隣接して置かれる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示する加工肉の形成方法は、一つより多くの層を支持基板上に隣接して置く工程を含み、層は水平に隣接して、および／または垂直に隣接して置かれる。いくつかの実施形態では、支持基板は液体および栄養素を透過可能であり、細胞培地を前記多細胞体および／または層の表面全てに接触させる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示する加工肉の形成方法は、多細胞体を融合させて層を形成する工程を含み、多細胞体は細胞培養環境で融合して層を形成する。いくつかの実施形態では、多細胞体の融合を約２時間〜約３６時間行う。いくつかの実施形態では、該方法は、層を融合させて加工肉を形成する工程を含み、層は細胞培養環境で融合して加工肉を形成する。いくつかの実施形態では、層の形成を約２時間〜約３６時間行う。いくつかの実施形態では、非ヒト筋細胞と非ヒト内皮細胞の細長い多細胞体の長さが異なる。様々な実施形態では、細長い多細胞体の長さは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｍｍである。様々な実施形態では、細長い多細胞体の長さは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｃｍである。いくつかの実施形態では、細長い多細胞体の長さは、約１ｍｍ〜約１０ｃｍの範囲である。さらなる実施形態では、細長い多細胞体の長さは、約１ｃｍ〜約８ｃｍの範囲である。さらに他の実施形態では、細長い多細胞体の長さは、約２ｃｍ〜約６ｃｍの範囲である。いくつかの実施形態では、本明細書で開示する加工肉の形成方法は、支持基板上に隣接して一つより多くの層を置く工程および層を融合させて加工肉を形成する工程を含む。様々な実施形態では、肉は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００の層を含む。いくつかの実施形態では、肉は、約１０〜約１００の層を含む。さらなる実施形態では、肉は、約２０〜約８０の層を含む。さらに他の実施形態では、肉は、約４０〜約６０の層を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示する加工肉の形成方法は、複数の非ヒト生筋細胞を含む複数の多細胞体を調製する工程を含み、細胞は互いに接着および/または密着しており、多細胞体は、拡散することで培養中に非ヒト筋細胞と非ヒト内皮細胞の維持と増殖が充分行われるように調整した直径を持つ。様々な実施形態では、多細胞体の直径は、約１００、２００、３００、４００または５００μｍである。いくつかの実施形態では、多細胞体の直径は、約１００μｍ〜約５００μｍである。さらなる実施形態では、多細胞体の直径は、約２００μｍ〜約４００μｍである。いくつかの実施形態では、該直径は実質的に棒状または球状の多細胞体に適用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示する加工肉の形成方法は、複数の非ヒト生筋細胞を含む複数の多細胞体を調製する工程を含み、細胞は互いに接着および/または密着しており、多細胞体はバイオプリントされる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、多細胞体の限定されない例を示し、この例においては、多細胞体１の幅Ｗ１は高さＨ１とほぼ等しく、長さＬ１は幅Ｗ１または高さＨ１より実質的に長い。
【図２】図２は、実質的に球状の多細胞体の限定されない例を示し、この例においては、実質的に球状の多細胞体２の幅Ｗ１は高さＨ１とほぼ等しい。
【図３】図３は、多細胞体の限定されない例を示し、この例においては、多細胞体１は支持基板３上にある。
【図４】図４は、実質的に球状の多細胞体の限定されない例を示し、この例においては、実質的に球状の多細胞体２は支持基板３上にある。
【図５】図５は、図１〜４に示す多細胞体を作製する一つの方法の限定されない例を示し、この例においては、混合した細胞ペレット４を毛細管チューブ５に移す方法である。
【図６】図６は、複数の多細胞体の限定されない例を示し、この例においては、融合できるように、複数の多細胞体１は支持基板３上に隣接して置かれている。
【図７】図７は、複数の実質的に球状の多細胞体の限定されない例を示し、この例においては、融合できるように、複数の実質的に球状の多細胞体２は支持基板３上に隣接して置かれている。
【図８】図８は、複数の多細胞体を含む層を作製する一つの方法の限定されない例を示し、この例においては、毛細管チューブ５を含む圧力操作機械式押し出し機から多細胞体６を支持基板３上に押し出す方法である。
【図９】図９は、加工肉を作製する一つの方法の限定されない例を示し、この例においては、複数の多細胞体７、８を含む一つより多くの層を支持基板３上に隣接して置く方法である。
【図１０】図１０は、加工肉を作製する一つの方法の限定されない例を示し、この例においては、複数の多細胞体９と複数の実質的に球状の多細胞体１０を含む一つより多くの層を支持基板３上に隣接して置く方法である。
【図１１】図１１は、加工肉を作製する一つの方法の限定されない例を示し、この例においては、一つより多くの層を積層する方法であり、第一の層の次の層は下の層に対して９０度回転している。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
従来の材料と方法を用いて作製される加工組織製品は、内部の細胞に栄養を与えるガスおよび栄養素の拡散可能距離が短いことから、サイズに限界がある。また、既存の手法は、加工製品を大量生産するための適切な速度と処理能力を提供できていない。その結果、肉製品の生産に使われる既存の組織工学方法では、訴求力のない薄いシートとペーストが、商業的に実現不能な規模でしか生産できない。
【００２８】
したがって、本明細書に開示する食用肉製品、層、多細胞体、およびその製造方法の目的の１つは、商業的に実現可能で訴求力のある肉製品を提供することである。別の目的は、確実、正確に、かつ再現性をもって商業レベルの規模を拡大する、処理能力の高い方法を提供することである。本明細書に開示する食用肉製品、層、多細胞体、およびその製造方法の利点として挙げられるのは、限定はされないが、特に複数の細胞型の場合に、パターン形成の精密制御を維持しながら、再現性があり、処理能力が高く、かつ容易に拡張可能な方法で特製組織を生産し、その結果、訴求力のある風味、質感、厚さ、および外観を有する加工肉製品を取得できる。
【００２９】
本明細書において、複数の層を含んでなる加工肉を、種々の実施形態で開示する。この場合、各層は非ヒト筋細胞を含み、加工肉は食用であり経口摂取用である。また、本明細書において、複数の生きた非ヒト筋細胞を含んでなる複数の多細胞体を、種々の実施形態で開示する。この場合、細胞は互いに接着および／または密着し；多細胞体が支持基板上に隣接して並べられて、加工食用肉の形成用に実質的に平坦な層を形成する。
【００３０】
加えて、本明細書において、複数の生きた非ヒト筋細胞を含んでなる複数の多細胞体を、種々の実施形態で開示するが、この場合、細胞は互いに接着および／または密着し；多細胞体が支持基板上に隣接して並べられて培養下で維持され、これにより、多細胞体が融合して、加工食用肉の形成用に実質的に平坦な層を形成することが可能になる。
【００３１】
加えて、本明細書において、複数の生きた非ヒト筋細胞を含んでなる複数の多細胞体を、種々の実施形態で開示するが、この場合、細胞は互いに接着および／または密着し；多細胞体が支持基板上に隣接して並べられて培養下で維持され、これにより、多細胞体が融合して、加工食用肉の形成用に実質的に平坦な層を形成することが可能になり；支持基板は流体と栄養素に対して浸透性であるため、細胞培養液が上記の層のすべての表面に接触することが可能になる。
【００３２】
加えて、本明細書において、加工肉を形成する方法を種々の実施形態で開示する。本方法は、ａ）互いに接着および／または密着している複数の生きた非ヒト筋細胞を含んでなる複数の多細胞体を調製することと；ｂ）支持基板上に隣接して複数の多細胞体を配置することと；ｃ）上記の多細胞体を融合させて層を形成することと；ｄ）複数の層を互いに隣接して積み重ねることと；ｅ）上記複数の層を融合させて加工肉を形成することと；ｆ）随意に、上記の加工肉を冷凍することと、を含む。ただし、この加工肉は食用であり経口摂取用である。加えて、本明細書において、加工肉を形成する方法を種々の実施形態で開示するが、本方法は、ａ）互いに接着および／または密着している複数の非ヒト筋細胞を含んでなる複数の多細胞体を調製することと；ｂ）支持基板上に隣接して複数の多細胞体を配置することと；ｃ）上記の多細胞体を融合して層を形成することと；ｄ）第１層の上に隣接して複数の層を配置することと；ｅ）上記の層を融合して加工肉を形成することと、を含み；この加工肉は食用である。いくつかの実施形態では、上記方法はさらに、上記の加工肉を冷凍することを含む。
【００３３】
加えて、本明細書において、加工肉を形成する方法を種々の実施形態で開示するが、本方法は、ａ）互いに接着および／または密着している複数の生きた非ヒト筋細胞を含んでなる、複数の細長い多細胞体および／または複数の実質的に球形の多細胞体を調製することと；ｂ）支持基板上に隣接して、複数の細長い多細胞体および複数の実質的に球形の多細胞体を配置することと；ｃ）上記の多細胞体を融合させて層を形成することと；ｄ）複数の層を支持基板上に隣接して互いに積み重ねることと；ｅ）上記複数の層を融合させて加工肉を形成することと；ｆ）随意に、上記の加工肉を冷凍することと、を含む。ただし、この加工肉は食用であり経口摂取用である。加えて、本明細書において、加工肉を形成する方法を種々の実施形態で開示するが、本方法は、ａ）互いに接着および／または密着している複数の非ヒト筋細胞を含んでなる、複数の細長い多細胞体および／または複数の実質的に球形の多細胞体を調製することと；ｂ）支持基板上に隣接して、複数の細長い多細胞体および複数の実質的に球形の多細胞体を配置することと；ｃ）上記の多細胞体を融合して層を形成することと；ｄ）複数の層を支持基板上に隣接して互いに積み重ねることと；ｅ）上記複数の層を融合して、あるボリュームの加工肉を形成することと、を含む。ただし、この加工肉は食用である。いくつかの実施形態では、上記方法は、複数の細長い多細胞体と複数の実質的に球形の多細胞体を、様々な比率で、支持基板上に隣接して配置することを含む。いくつかの実施形態では、上記方法はさらに、上記の加工肉を冷凍することを含む。
【００３４】
加えて、本明細書において、加工肉を形成する方法を種々の実施形態で開示するが、本方法は、ａ）互いに接着および／または密着している複数の生きた非ヒト筋細胞を含む複数の実質的に球形の多細胞体を調製することと；ｂ）支持基板上に複数の実質的に球形の多細胞体を隣接して配置することと；ｃ）上記の実質的に球形の多細胞体を融合させて層を形成することと；ｄ）複数の層を互いに隣接して支持基板上に積み重ねることと；ｅ）上記複数の層を融合させて加工肉を形成することと；ｆ）上記の肉を随意に冷凍することと、を含む。ただし、この加工肉は食用であり、経口摂取用である。加えて、本明細書において、加工肉を形成する方法を種々の実施形態で開示するが、本方法は、ａ）互いに接着および／または密着している複数の非ヒト筋細胞を含む複数の実質的に球形の多細胞体を調製することと；ｂ）支持基板上に複数の実質的に球形の多細胞体を隣接して配置することと；ｃ）上記の実質的に球形の多細胞体を融合して層を形成することと；ｄ）複数の層を互いに隣接して支持基板上に積み重ねることと；ｅ）上記複数の層を融合して加工肉を形成することと、を含む。ただし、この加工肉は食用であり、経口摂取用である。いくつかの実施形態では、上記方法はさらに、上記の肉を冷凍することを含む。  
【００３５】
古典的な組織工学の根底にある基本的な考え方は、生細胞を、生体適合性で最終的には生分解性の足場に播種し、次いで、初期細胞集団が組織へと拡張するようにバイオリアクターで細胞系を培養することである。古典的な組織工学は、特に肉製品の生産に応用する場合に、いくつかの短所を有する。第一に、細胞を播種するプロセスは概して、細胞溶液を足場と接触させることを伴うため、細胞が足場の小孔、繊維、その他の微細構造内に捕捉される。このプロセスは、足場内の細胞の配置および細胞同士の配置に関して実質的に不規則である。したがって、細胞または細胞集合体が計画通りまたは事前決定通りに配置またはパターン形成された三次元構築物を生産する上で、播種された足場は、直接的には有用にならない。第二に、所与の細胞型に最適な生体適合材料でできた足場を選択することは問題が多く、試行錯誤を経て達成されることが多い。的確な生体適合材料を利用できたとしても、高い細胞密度を達成する上で足場が邪魔になることがある。さらに、足場を用いた組織工学は、簡単、確実に産業レベルの規模を拡大することができない。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ラピッドプロトタイピング（高速試作）技術を利用した方法を用いて、加工肉製品、層、および多細胞体を作製する。この方法は、三次元出力デバイス（例えばバイオプリンター）により、多細胞体（例えば円柱体、球状体）および生体適合性の支持構造物（例えばアガロースでできた支持構造物）を、コンピューター援用により自動的に三次元に堆積することをベースにする。本明細書に記載の層および肉製品を指すときに使用する「加工」（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）という用語は、通常は「人により作製または準備された」を意味する。加工肉の一例として、多細胞体および／または層を配列または配置し、コンピューター援用デバイス（例えばバイオプリンター）を用いて、コンピュータースクリプトに従って加工肉製品を形成することが挙げられる。さらなる実施形態では、コンピュータースクリプトは、例えば、１つ以上のコンピュータープログラム、コンピューターアプリケーション、またはコンピューターモジュールである。さらなる別の実施形態では、初期形態形成における自己組織化現象に類似した、プリント後の多細胞体の融合を通じて、三次元の組織構造物を形成する。
【００３７】
他の加工組織と異なり、本明細書に記載の加工肉は、少なくとも部分的に融合した多細胞体の二次元平面シートの層を積み重ねることにより形成される。したがって、本明細書に記載の加工肉をさらに大きなボリュームで形成する方法は、同時に三次元パターンを形成することを必要とせず、二次元の複数の層を（平行して）培養することで実施でき、その後、この複数の層を三次元のアセンブリに組み立てるか、または後に積み重ね可能な下位アセンブリに組み立てることができる。本明細書に記載の加工肉を形成するこの有利な方法により、足場形成や三次元支持構造物（例えばフィラー体）を必要とせずに、目的のボリュームの加工肉を形成し得る。さらに、厚さが比較的薄い状態で平行して二次元層を形成できるので、（例えば、構成要素である多細胞体を融合して層を形成しながら）培養中に培養液から平坦な層へと栄養素を拡散することが可能になる。構成要素である層を積み重ねて目的のボリュームを形成した後で初めて、栄養素の拡散が制限されて細胞死が生じ得る。
【００３８】
このように、支持基板上に多細胞体を並べて三次元構造物を作製する方法として、手動配置、バイオプリンター等の自動式のコンピューター援用機器による位置決めを含め、いくつかの方法が利用可能であり、有用であり得るが、これらの方法は必要ではない。バイオプリンター技術を用いて多細胞体を出力する利点の例として、多細胞体を高速、正確に、かつ再現性をもって配置して、多細胞体および／または各種組成の層の計画通りまたは事前決定通りの配向またはパターンを示す構築物を作製することが挙げられる。他の利点として、ヒドロゲルを併用する細胞のプリントを主眼とした他の固体自由形状造形ベースの堆積方法に関連することの多い細胞損傷を最小化しながら、高い細胞密度を保証できることが挙げられる。
【００３９】
本明細書に開示する実施形態には、加工肉を製造または作製する方法が含まれ、ビジネスモデルも含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する手法および方法のスピードとスケーラビリティを利用して、食用の加工肉製品を生産する産業施設および／または商業施設を設計、建築、および運用する。さらなる実施形態では、例えば、ヒト向けの食品、ヒト向け食品の構成要素もしくは成分、ヒト以外の動物向けの食品、またはヒト以外の動物向け食品の構成要素もしくは成分として、加工肉製品を生産し、梱包し、冷凍し、保存し、流通させ、発売し、宣伝し、販売する。
【００４０】
細胞
多くの自己接着細胞型を用いて、本明細書に記載の多細胞体、層、および加工肉を形成できる。いくつかの実施形態では、従来の肉製品に似るように加工肉製品を設計し、従来の肉製品に見られる細胞型に近似するように細胞型を選択する。さらなる実施形態では、加工肉製品、層、および多細胞体は、非ヒト筋細胞を含む。加工肉製品、層、および多細胞体は、非ヒト筋細胞、および／または内皮細胞、および／または脂肪細胞、および／または線維芽細胞を含む。
【００４１】
概して、本明細書に記載の加工肉は、血管がなく、神経の衰弱もないという点で、自然食肉および他の加工肉と異なっていてよい。１つ以上の多細胞体の構成要素として内皮細胞が含まれる異型においても、加工肉は、血液を運搬する能力のある血管を含まない。したがって、本明細書に記載の方法でボリュームの大きい加工肉を形成する場合でも、血管を一切有さなくてよい。さらに、本明細書に記載の加工肉は、神経成分（例えば軸索、樹状突起、神経細胞体）なしで増殖できるため、このような神経成分が欠けていてよい。
【００４２】
ヒトは、伝統的に動物の数種類の筋組織を摂食している。したがって、いくつかの実施形態では、筋細胞は骨格筋細胞である。いくつかの実施形態では、筋細胞は心筋細胞である。いくつかの実施形態では、筋細胞は平滑筋細胞である。いくつかの実施形態では、内皮細胞は微小血管内皮細胞である。
【００４３】
他の実施形態では、加工肉製品は、とりわけ神経細胞、結合組織（骨、軟骨、造骨細胞と軟骨細胞に分化する細胞、およびリンパ組織を含む）、上皮細胞（腔、血管、チャネルの内膜を形成する内皮細胞、外分泌上皮細胞、上皮吸収細胞、角質化上皮細胞、および細胞外マトリクス分泌細胞を含む）、および未分化細胞（例えば胚細胞、幹細胞、その他の前駆細胞）を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、多細胞体の形成に使われる細胞は、生きた動物から取得し、初代細胞株として培養する。例えば、さらなる実施形態では、バイオプシーにより細胞を取得し、エキソビボで培養する。他の実施形態では、商業供給源から細胞を取得する。
【００４５】
本明細書に開示する加工肉製品、ならびに、この加工肉の作製に使われる複数の多細胞体を含む層は、食用であり、ヒト、ヒト以外の動物のいずれか一方または両方に消費されることが意図されている。いくつかの実施形態では、加工肉製品はヒト用の食品である。他の実施形態では、加工肉製品は動物用飼料であり、例えば家畜用飼料、水産養殖用飼料、または家庭内ペット用飼料である。したがって、当業者であれば、本明細書で提供される開示を踏まえて、多数の供給源から得られる非ヒト細胞が、これらの製品の生産用として、および本明細書に開示される方法を用いた生産用として適切であることを認識するであろう。種々の実施形態において、多細胞体、多細胞体を含む層、および加工肉製品は、非ヒト細胞を含み、この非ヒト細胞は、非限定的な例として哺乳動物、鳥類、爬虫類、魚類、甲殻類、軟体類、頭足類、昆虫、節足動物以外の無脊椎動物、およびこれらの組み合わせに由来する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、適切な細胞は、アンテロープ、クマ、ビーバー、バイソン、イノシシ、ラクダ、カリブー、ウシ、シカ、ゾウ、エルク、キツネ、キリン、ヤギ、ノウサギ、ウマ、アイベックス、カンガルー、ライオン、ラマ、ムース、ペッカリー、ブタ、ウサギ、アザラシ、ヒツジ、リス、トラ、クジラ、ヤク、シマウマ等の哺乳動物、またはこれらの組み合わせに由来する。いくつかの実施形態では、適切な細胞は、ニワトリ、アヒル、エミュー、ガチョウ、ライチョウ、ダチョウ、キジ、ハト、ウズラ、シチメンチョウ等の鳥類、またはこれらの組み合わせに由来する。いくつかの実施形態では、適切な細胞は、カメ、ヘビ、クロコダイル、アリゲーター等の爬虫類、またはこれらの組み合わせに由来する。いくつかの実施形態では、適切な細胞は、カタクチイワシ、バス、ナマズ、コイ、タラ、ウナギ、ヒラメ、フグ、ハタ、ハドック、オヒョウ、ニシン、サバ、マヒマヒ、マカジキ、オレンジラフィー、スズキ、カワカマス、ポラック、サケ、イワシ、サメ、フエダイ、ソール、メカジキ、テラピア、マス、マグロ、ウォールアイ等の魚類、またはこれらの組み合わせに由来する。いくつかの実施形態では、適切な細胞は、カニ、ザリガニ、ロブスター、プローン、シュリンプ等の甲殻類、またはこれらの組み合わせに由来する。いくつかの実施形態では、適切な細胞は、アワビ、二枚貝、ホラガイ、ムールガイ、カキ、ホタテガイ、カタツムリ等の軟体類、またはこれらの組み合わせに由来する。いくつかの実施形態では、適切な細胞は、コウイカ、タコ、ヤリイカ等の頭足類、またはこれらの組み合わせに由来する。いくつかの実施形態では、適切な細胞は、アリ、ミツバチ、カブトムシ、チョウ、ゴキブリ、コオロギ、イトトンボ、トンボ、ハサミムシ、ノミ、ハエ、バッタ、カマキリ、カゲロウ、ガ、セイヨウシミ、シロアリ、スズメバチ等の昆虫、またはこれらの組み合わせに由来する。いくつかの実施形態では、適切な細胞は、扁形動物、条虫、吸虫、線虫、回虫、鉤虫、環形動物（例えばミミズ、多毛虫等）等の、節足動物以外の無脊椎動物（例えば蠕虫）、またはこれらの組み合わせに由来する。
【００４７】
多細胞体
本明細書において、互い接着および／または密着している複数の非ヒト生細胞を含む多細胞体を開示する。また、本明細書において、互いに接着および／または密着している複数の生きた非ヒト筋細胞を含む複数の多細胞体を調製することと；支持基板上に隣接して複数の多細胞体を配置することと；この複数の多細胞体を融合させて、加工肉形成用の実質的に平坦な層を形成することと；を含む方法を開示する。いくつかの実施形態では、多細胞体は、互いに接着および／または密着している複数の細胞を含んでなり、この複数の細胞は、所望の三次元形状をなし、組織工学等の生体工学プロセス中の容易な操作および取扱いを可能にする粘弾性粘稠性および十分な完全性を有する。いくつかの実施形態では、十分な完全性とは、後続の取扱い中、多細胞体が、その物理形状（剛性ではなく、粘弾性粘稠性を有する形状）を保持し、かつ細胞の生命力を維持できることを意味する。
【００４８】
いくつかの実施形態では、多細胞体は同種細胞性である。いくつかの実施形態では、多細胞体は異種細胞性である。同種細胞性の多細胞体では、複数の生細胞は、単一細胞型の複数の生細胞を含む。同種細胞性の多細胞体中の生細胞の実質的に全部が、実質的に単一細胞型の細胞である。これに対して、異種細胞性の多細胞体は、複数の細胞型の有意な数の細胞を含む。異種細胞性の多細胞体中の生細胞は、融合プロセス中、選別されないままの状態であってよく、または「選別」（例えば自己組織化）して、加工組織のための特定の内部構造を形成できる。この細胞選別は、差次接着仮説（ＤＡＨ）の予測に一致している。ＤＡＨは、細胞集団の液体に似た挙動を、構成要素である細胞間の接着性および密着性の相互作用により生じる組織表面張力および界面張力の観点から説明したものである。概して、細胞は、細胞の接着強度の差に基づいて選別することができる。例えば、異種細胞性の多細胞体の内部に選別される細胞型は、概して、多細胞体の外側に選別される細胞と比べて、接着強度が高い（したがって表面張力が高い）。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される多細胞体は、複数の細胞に加えて、１つ以上の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分、または１つ以上のＥＣＭ成分の１つ以上の派生物も含む。例えば、多細胞体は種々のＥＣＭタンパク質を含有してよく、その非限定的な例には、ゼラチン、フィブリノーゲン、フィブリン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、およびプロテオグリカンが含まれる。多細胞体の形成に使われる細胞ペーストに、ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の派生物を添加することができる。細胞ペーストに添加するＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の派生物は、動物源から精製でき、また、当技術分野で公知の組換え方法により作製することもできる。あるいは、多細胞体中の細胞から、ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の派生物を自然に分泌することもできる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、多細胞体は組織培養液を含む。さらなる実施形態では、組織培養液は生理学的に適合する任意の培養液であってよく、通常は、当技術分野で知られるように、関係する細胞型に従って組織培養液を選択する。場合によっては、適切な組織培養液は、例えば、糖、アミノ酸等の基礎栄養素、増殖因子、（汚染を最小化するための）抗生物質等を含む。
【００５１】
多細胞体中の細胞の接着および／または密着は、多細胞体が平面上で自らを支えながら三次元形状を保持可能にするに足る、適切に十分な強度を有する。例えば、場合によっては、平らな基板上で自らを支える多細胞体は、いくらかの軽微な変形を（例えば、多細胞体が表面と接する場所で）示してよいが、多細胞体の幅の少なくとも半分の高さを保持し、場合によっては、多細胞体の幅とほぼ等しい高さを保持するに足る、十分な密着力を有する。いくつかの実施形態では、２つ以上の多細胞体を、互いに隣り合わせて平らな基板上に並べて配置し、多細胞体の側面の下の作業面上に空間を形成する。例えば図３と図４を参照のこと。複数の多細胞体を互いに積み重ねた構築物の形で多細胞体を組み立てる場合、多細胞体中の細胞の密着力は、多細胞体が、類似のサイズと形状を有する少なくとも１つの多細胞体の重量を支えるに足る、十分な強度を有する。例えば図９と図１０を参照のこと。さらなる別の実施形態では、多細胞体中の細胞の接着力および／または密着力は、器具（例えばキャピラリーマイクロピペット）で多細胞体を拾い上げることを可能にするに足る、適切に十分な強度も有する。
【００５２】
当業者であれば、本明細書に提供される開示を踏まえて、サイズおよび形状の異なる多細胞体が、本明細書に提供される実施形態の範囲に含まれることを認識するであろう。いくつかの実施形態では、多細胞体は実質的に円柱形であり、実質的に円形の断面を有する。例えば、多細胞体は、種々の実施形態において、断面が正方形、長方形、三角形、または他の非円形の細長い形状（例えば円柱形状）を有する。同様に、多細胞体は、種々の実施形態において、概ね球形、細長でない円柱形、または立方体形状を有する。
【００５３】
種々の実施形態において、多細胞体の直径は、約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００μｍ、または、これらの値の間の定量可能な増分値である。いくつかの実施形態では、多細胞体は、酸素および／または栄養素が多細胞体の中心部分に拡散できないことに起因する細胞壊死を制限するように形状構成される。例えば、多細胞体は、多細胞体の外面から約２５０μｍを越える位置には多細胞体内の生細胞が存在しないように適切に形状構成され、より好適には、多細胞体の外面から約２００μｍを越える位置には多細胞体内の生細胞が存在しないように適切に形状構成される。
【００５４】
いくつかの実施形態では、複数の多細胞体の長さが異なる。他の実施形態では、複数の多細胞体の長さは実質的にほぼ同じである。種々の実施形態において、多細胞体の長さは、約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、もしくは１０ｍｍ、または、これらの値の間の定量可能な増分値である。他の種々の実施形態において、多細胞体の長さは、約１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、もしくは１０ｃｍ、または、これらの値の間の定量可能な増分値である。いくつかの実施形態では、加工肉製品の形状および／またはサイズが、従来の肉製品、例えば一切れのベーコン、ハンバーガーパテ、魚の切り身、鶏の胸肉、またはステーキの形状および／またはサイズと近似するように、多細胞体の長さを選択する。
【００５５】
図１を参照すると、いくつかの実施形態において、多細胞体１は実質的に円柱形であり、幅Ｗ１と高さＨ１がほぼ等しく、実質的に円形の断面を有する。さらなる実施形態では、多細胞体１は、長さＬ１の細長い形状である。さらなる別の実施形態では、Ｗ１とＨ１は好適には約３００〜約６００μｍであり、Ｌ１は好適には約２ｃｍ〜約６ｃｍである。
【００５６】
図２を参照すると、いくつかの実施形態において、多細胞体２は実質的に球形であり、幅Ｗ１は高さＨ１とほぼ等しい。さらなる実施形態では、Ｗ１とＨ１は好適には約３００〜約６００μｍである。
【００５７】
層
本明細書に開示される加工肉は、複数の層を含む。いくつかの実施形態では、１つの層は、互いに接着および／または密着している複数の非ヒト生細胞を含んでなる複数の多細胞体を含む。また、本明細書において、多細胞体を支持基板上に隣接して配置するステップと、多細胞体を融合させて、加工食用肉製品の形成用に実質的に平坦な層を形成するステップと、を含む方法を開示する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の手法を用いて各層をバイオプリントする。
【００５８】
いくつかの実施形態では、１つの層は、同種細胞性の多細胞体を含む。他の実施形態では、１つの層は、異質細胞性の多細胞体を含む。さらに別の実施形態では、１つの層は、同種細胞性、異質細胞性の両方の多細胞体を含む。さらなる実施形態では、１つの層は非ヒト筋細胞を含む。さらなる別の実施形態では、１つの層は、非ヒト筋細胞、非ヒト内皮細胞、ならびに脂肪細胞および／または線維芽細胞を含む。さらなる別の実施形態では、１つの層は、非ヒト筋細胞、非ヒト内皮細胞、および、本明細書に開示される他の細胞型を含む。
【００５９】
非ヒト筋細胞と非ヒト内皮細胞の両方を含む実施形態では、１つの層は、非ヒト筋細胞と非ヒト内皮細胞を、約３０：１、２９：１、２８：１、２７：１、２６：１、２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、および１：１の比率、またはこれらの値の間の増分の比率で含んでよい。いくつかの実施形態では、１つの層は、非ヒト筋細胞と非ヒト内皮細胞を約１９：１〜約３：１の比率で含む。種々の実施形態において、１つの層は、細胞集団全体の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、および２５％、またはこれらの値の間の増分値を構成する非ヒト内皮細胞を含む。いくつかの実施形態では、１つの層は、細胞集団全体の約５％〜約１５％を構成する非ヒト内皮細胞を含む。さらなる実施形態では、内皮細胞の存在は、本明細書で詳述される内皮組織形成（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）に寄与する。
【００６０】
種々の実施形態において、各層の厚さは、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３０００、４０００、もしくは５０００μｍ、または、これらの値の間の定量可能な増分値である。いくつかの実施形態では、培養下の各層内の実質的に全部の細胞の維持と増殖を十分に支援する拡散を可能にするように、各層の厚さを選択する。
【００６１】
種々の実施形態において、複数の層に含まれる層の数は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、もしくは５００、またはこれらの数の間の増分値である。いくつかの実施形態では、得られる加工肉製品の厚さが、従来の肉製品、例えば一切れのベーコン、ハンバーガーパテ、魚の切り身、鶏の胸肉、またはステーキの厚さと近似するように、層の数を選択する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、従来の肉製品に似るように加工層を設計し、従来の肉製品に見られるものに近似するように設計パラメーター（例えば細胞型、添加物、サイズ、形状等）を選択する。さらなる実施形態では、層は、従来の肉製品と実質的に類似する栄養組成を特徴とする。さらなる別の実施形態では、層は、実質的に、水性流体６０〜８０％、タンパク質１４〜３５％、脂肪１〜２５％、炭水化物１〜５％、および他の物質１〜５％の栄養組成を特徴とする。いくつかの実施形態では、加工層または内皮組織形成された肉の筋細胞は、整列している。いくつかの実施形態では、当技術分野で公知の電場印加により、筋細胞が整列している。いくつかの実施形態では、当技術分野で公知の機械的刺激、例えば基層の周期的な伸張と弛緩により、筋細胞が整列している。さらなる実施形態では、整列した（例えば電気配向および機械配向した）筋細胞は、動物の多くの筋組織に見られるように、互いに実質的に同一の配向を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される多細胞体の層を、電気的および／または機械的な刺激に曝して、筋肉細胞の生理的配列の形成を促進する。
【００６３】
添加物
いくつかの実施形態では、加工肉製品、加工層、および／または多細胞体は、１つ以上の栄養補助剤を含む。さらなる実施形態では、１つ以上の栄養補助剤は、ビタミン、ミネラル、繊維、脂肪酸、およびアミノ酸から選ばれる。いくつかの実施形態では、商業的訴求力（例えば外観、味覚、色、匂い等）を高めるため、加工肉製品、層、および／または多細胞体は、１つ以上の添加物を含む。さらなる実施形態では、加工肉製品、層、および／または多細胞体は、１つ以上の香味剤、１つ以上の着色剤、および／または１つ以上の着臭剤を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、加工肉製品、加工層、および／または多細胞体は、マトリクスタンパク質、プロテオグリカン、抗酸化剤、パーフルオロカーボン、および増殖因子のうちの１つ以上を含む。本明細書で使用する「増殖因子」という用語は、細胞により産生され、その細胞自身および／または他の様々な近隣細胞もしくは遠隔細胞に影響を及ぼし得るタンパク質、ポリペプチド、またはポリペプチド複合体（サイトカインを含む）を指す。増殖因子は、通常、発生に伴い、または多数の生理的刺激もしくは環境刺激に応答して、特定の細胞型の増殖および／または分化に影響を及ぼす。全部でなく一部の増殖因子は、ホルモンである。代表的な増殖因子は、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）を含む）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）（ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢを含む）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３を含む）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＩＬ−８等である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、加工肉製品、加工層、および／または多細胞体は、当技術分野で公知の１つ以上の食品保存剤を含む。いくつかの実施形態では、食品保存剤は抗菌保存剤であり、抗菌保存剤の非限定的な例として、プロピオン酸カルシウム、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、亜硫酸塩（例えば二酸化硫黄、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸水素カリウム等）、およびエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、食品保存剤は酸化防止保存剤であり、酸化防止保存剤の非限定的な例として、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）およびブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）が挙げられる。
【００６６】
支持基板
本明細書において、加工食用肉の形成用に実質的に平坦な層を形成するための、支持基板上に隣接して配列される複数の多細胞層を、いくつかの実施形態で開示する。また、本明細書において、支持基板上に隣接して複数の多細胞体を並べて実質的に平坦な層を形成することと、単一の支持基板上に隣接して複数の層を配置することと、これらの層を融合させて加工肉を形成することと、を含む方法を、いくつかの実施形態で開示する。例えば、複数の異なる基板上に、上記のように複数の層を同時に形成し、多細胞体が十分に融合して除去可能になった時点で、それぞれの基板から層を除去し、複数の層を互いに積み重ねるか、または単一の基板上に重ねてよい。
【００６７】
概して、各層は非ヒト筋細胞を含む。このような構築物の中心部分にある細胞は、通常は酸素と栄養素が拡散により供給されるが、ガスと栄養素は通常、三次元細胞構築物の内部約２００〜３００ミクロンまで拡散する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される多細胞体は、培養下の上記非ヒト筋細胞の維持と増殖を十分に支援するために拡散できるように適合した直径を有する。その結果、さらなる実施形態では、本明細書に開示される層は、培養下の上記非ヒト筋細胞の維持と増殖を十分に支援するために拡散できるように適合した厚さを有する。
【００６９】
拡散を促進し増強するため、いくつかの実施形態では、支持基板は、流体、ガス、および栄養素に対して透過性であり、例えば増殖、成熟、および融合の間、細胞培養液が多細胞体および／または層の全表面に接触することを可能にする。種々の実施形態において、支持基板は、天然生体適合材料、合成生体適合材料、およびこれらの組み合わせから作られる。いくつかの実施形態では、天然生体適合材料には、非限定的な例として、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、および他の細胞外マトリクスが含まれる。いくつかの実施形態では、合成生体適合材料には、非限定的な例として、ヒドロキシアパタイト、アルギン酸塩、アガロース、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、およびこれらのコポリマーが含まれる。いくつかの実施形態では、支持基板は固体である。いくつかの実施形態では、支持基板は半固体である。さらなる実施形態では、支持基板は、固体支持要素と半固体支持要素の組み合わせである。
【００７０】
いくつかの実施形態では、支持基板は、非透過面、例えば細胞培養環境の一部分（例えばペトリ皿、細胞培養フラスコ等）またはバイオリアクターより上に上昇または隆起している。さらなる別の実施形態では、上昇した支持基板により、細胞培養液の循環がさらに促進され、多細胞体および／または層の全表面との接触が増強される。
【００７１】
多細胞体を形成する方法
本明細書に記載の特性を持つ多細胞体は、様々な方法で作製できる。いくつかの実施形態では、複数の生細胞を含有し、または所望の細胞密度と粘度を有する細胞ペーストから、多細胞体を製作することができる。さらなる実施形態では、細胞ペーストを所望の形状にして、成熟（例えばインキュベーション）を通じて多細胞体を形成できる。特定の実施形態では、複数の生細胞を含む細胞ペーストを所望の形状（例えば円柱、球形等）に成形することにより、多細胞体を作製する。さらなる実施形態では、細胞ペーストを制御環境内でインキュベートして、細胞同士を接着および／または密着させることにより、多細胞体を形成する。別の特定の実施形態では、複数の生細胞を含む細胞ペーストを、細胞ペーストを三次元形状に保持するデバイス内で成形することにより、多細胞体を作製する。さらなる実施形態では、細胞ペーストを三次元形状に保持しながら、十分な時間をかけて制御環境内で細胞ペーストをインキュベートして、本明細書に記載のように、平面上で自身を支えるのに十分な密着力を持つ細胞体を作製する。
【００７２】
種々の実施形態において、（Ａ）細胞または（１つ以上の細胞型の）細胞集合体と細胞培養液を（例えば所定の比率で）混合して細胞懸濁液を得ることと、（Ｂ）この細胞懸濁液を圧縮して、所望の細胞密度と粘度を有する細胞ペーストを作製することにより、細胞ペーストが得られる。種々の実施形態において、いくつかの方法により圧縮が達成される。例えば、細胞培養から得られた特定の細胞懸濁液を濃縮することにより、細胞ペーストに必要な所望の細胞濃度（密度）、粘度、および粘稠度を達成できる。特定の実施形態では、細胞培養から得た比較的希薄な細胞懸濁液を所定時間だけ遠心分離して、型で成形できるペレット状の細胞濃度を達成する。タンジェンシャルフローろ過（「ＴＦＦ」）も、細胞を濃縮または圧縮する適切な方法である。いくつかの実施形態では、化合物を細胞懸濁液と組み合わせることにより、必要とされる押し出し特性を与える。適切な化合物の非限定的な例として、コラーゲン、ヒドロゲル、マトリゲル、ナノ繊維、自己組織化ナノ繊維、ゼラチン、フィブリノーゲン等が挙げられる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、複数の生細胞と組織培養液を混合して、生細胞を（例えば遠心分離で）圧縮することにより、細胞ペーストを作製する。また、ＥＣＭ成分（複数可）（またはＥＣＭ成分（複数可）の派生物（複数可））を含有する１つ以上の生理的に許容可能な緩衝液中で細胞ペレットを再懸濁することにより、１つ以上のＥＣＭ成分（またはＥＣＭ成分の派生物）を随意に含めて、得られた細胞懸濁液を再び遠心分離して細胞ペーストを形成する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、その後の処理のために要求される細胞ペーストの細胞密度は、細胞型によって異なり得る。さらなる実施形態では、細胞間の相互作用によって細胞ペーストの特性が決定し、細胞型が異なれば、細胞密度と細胞間相互作用の間の関係も異なる。さらなる別の実施形態では、細胞を前処理して細胞間相互作用を増加させた後、細胞ペーストを成形してよい。例えば、細胞ペーストを成形する前に細胞間相互作用を増強する目的で、遠心分離後、遠心チューブ内で細胞をインキュベートしてよい。
【００７５】
種々の実施形態において、多くの方法を用いて細胞ペーストを成形できる。例えば、ある特定の実施形態では、（例えば濃縮／圧縮の後に）細胞ペーストを手作業で型により成形するか加圧成形して、所望の形状を達成する。さらなる例として、マイクロピペットのような予め形成された器具（例えばキャピラリーピペット）に細胞ペーストを取り込み（例えば吸引し）、この器具の内面に一致した形状にすることができる。マイクロピペット（例えばキャピラリーピペット）の断面形状は、円形、正方形、長方形、三角形、または他の非円形の断面形状のいずれかである。いくつかの実施形態では、プラスチック型枠、金型、ゲル型枠等の予め形成された型に投入することにより、細胞ペーストを成形する。いくつかの実施形態では、遠心鋳造法または連続鋳造法を用いて細胞ペーストを成形する。
【００７６】
図５を参照すると、ある特定の例では、成形作業は、細胞ペースト４を成形デバイス５（例えばキャピラリーピペット）内に保持して、成形デバイス内で部分的に細胞が互いに接着および／または密着できるようにすることを含む。さらなる例では、細胞ペーストを成形デバイス内に吸引し、成熟期間（本明細書ではインキュベーション期間ともいう）中、細胞ペーストを成形デバイス内に保持して、細胞が少なくとも部分的に互いに接着および／または密着できるようにすることができる。いくつかの実施形態では、成形デバイス（例えばキャピラリーピペット）は、多細胞体を三次元構築物内に自動的に配置するように作動できるバイオプリンターまたは類似装置の、プリンティングヘッドの一部である。ただし、細胞が成形デバイス（キャピラリーピペット等）に留まることのできる時間は限りがあるので、細胞の生存能が影響を受けるまでに細胞がアクセスできる酸素および／または栄養素は、よくても一定限度でしかない。
【００７７】
いくつかの実施形態では、部分的に接着および／または密着した細胞ペーストを、成形デバイス（例えばキャピラリーピペット）から第２の形成デバイス（例えば型）に移す。第２の成形デバイスでは、細胞ペーストが追加の成熟期間中に第２の成形デバイスに保持されている間、栄養素および酸素を細胞に供給することができる。細胞に栄養素と酸素を供給できる適切な成形デバイスの一例は、複数の多細胞体（例えば、実質的に同一の多細胞体）を作製するための型である。さらなる例では、このような型は生体適合性の基板を含み、この基板は、基板への細胞の移入と内方成長に耐性がある材料であって、基板への細胞の接着に耐性のある材料で作られている。種々の実施形態において、この基板は、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）、（ＰＴＦＥ）、ステンレス鋼、アガロース、ポリエチレングリコール、ガラス、金属、プラスチック、またはゲル材料（例えばアガロースゲルもしくは他のヒドロゲル）、および類似の材料で適切に製造することができる。いくつかの実施形態では、型も、（例えば組織培養液を型の上部に配分することにより）組織培養液を細胞ペーストに供給できるように適切に形状構成される。
【００７８】
特定の実施形態では、基板に複数の細長い溝を形成する。さらなる特定の実施形態では、各溝の深さは約５００ミクロン〜約１０００ミクロンであり、各溝の底部は半円状の断面形状を有する。底部が半円状であるのは、実質的に円形の断面形状を有する細長い円柱形の多細胞体を形成するためである。さらなる特定の実施形態では、溝の幅は、型で作製される多細胞体の幅よりわずかに大きいのが適切である。例えば、溝の幅は、約３００ミクロン〜約１０００ミクロンの範囲内にあるのが適切である。
【００７９】
このように、第２の成形デバイスを使用する実施形態では、部分的に接着および／または密着した細胞ペーストを、第１の成形デバイス（例えばキャピラリーピペット）から第２の成形デバイス（例えば型）に移す。さらなる実施形態では、部分的に接着および／または密着した細胞ペーストを、第１の成形デバイス（例えばキャピラリーピペット）により型の溝に移すことができる。さらなる別の実施形態では、成熟期間中、型を、型に保持された細胞ペーストと共に制御環境内でインキュベートして、細胞ペースト中の細胞を互いに接着および／または密着させて多細胞体を形成し、この成熟期間の後は、細胞の密着が十分強力になり、得られた多細胞体を器具（例えばキャピラリーピペット）で拾い上げることができる。さらなる別の実施形態では、キャピラリーピペットは、多細胞体を三次元構築物内に自動的に配置するように作動できるバイオプリンターまたは類似装置の、プリンティングヘッドの一部であるのが適切である。
【００８０】
いくつかの実施形態では、多細胞体の断面形状およびサイズは、第１成形デバイスの断面の形状およびサイズと実質的に対応し、さらに随意に、多細胞体の作製に使われる第２成形デバイスの形状およびサイズと対応し、当業者であれば、上述の断面形状、断面面積、直径、および長さを有する多細胞体を作製するのに適した断面形状、断面面積、直径、および長さを有する適切な成形デバイスを選択できるであろう。
【００８１】
本明細書で論じているように、多種多様な細胞型を用いて、本発明の実施形態の多細胞体を作製してよい。したがって、１つ以上の細胞型または細胞集合体（例えば、本明細書に列記されているすべての細胞型を含む）を出発材料として用いて、細胞ペーストを作製してよい。例えば、非ヒト筋細胞、内皮細胞、脂肪細胞、線維芽細胞等の細胞を随意に使用してよい。本明細書に記載の通り、多細胞体は、同種細胞性または異種細胞性である。同種細胞性の多細胞体を作製する場合、細胞ペーストが同種細胞性であることが適切である。すなわち、多細胞体は単一細胞型の複数の生細胞を含む。他方、異種細胞性の多細胞体を作製する場合、細胞ペーストは、複数の細胞型の有意な数の細胞を含むのが適切である（すなわち、細胞ペーストは異種細胞性となる）。異種細胞性の細胞ペーストを用いて多細胞体を作製する場合、成熟と密着のプロセス中、細胞の接着強度の差異に基づいて生細胞が「選別」されて、細胞の生理学的な高次構造が回復され得る。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の通り、複数の生細胞に加えて、１つ以上ＥＣＭ成分、または１つ以上のＥＣＭ成分の１つ以上の派生物（例えばゼラチン、フィブリノーゲン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、および／またはプロテオグリカン）を細胞ペーストに含めて、これらの物質を多細胞体に組み込むことができるのが適切である。さらなる実施形態では、ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の派生物を細胞ペーストに添加することにより、多細胞体内の細胞の密着が促進され得る。例えば、ゼラチンおよび／またはフィブリノーゲンが随意に細胞ペーストに添加される。より特定的には、１０〜３０％ゼラチン溶液と１０〜８０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン溶液を、随意に複数の生細胞と混合して、ゼラチンとフィブリノーゲンを含有する細胞懸濁液を形成する。
【００８３】
さらなる成熟プロセスを促進する方法として、種々の適切な方法がある。一実施形態では、細胞ペーストを約３７℃で一定時間（具体的な時間は細胞型に依存し得る）インキュベートすると、接着および／または密着を助長し得る。これに代替または追加して、因子および／またはイオンを含有する細胞培養液の存在下で細胞ペーストを保持すると、接着および／または密着を助長し得る。
【００８４】
支持基板上の多細胞体の配置による層の形成
支持基板上に多細胞体を配置して所望の三次元構造物（例えば実質的に平坦な層）を作製する方法として、いくつか適切な方法がある。例えば、いくつかの実施形態では、複数の多細胞体を、互いに接触するように手作業で配置するか、ピペット、ノズル、もしくは針から押し出すことにより所定位置に堆積させるか、またはバイオプリンター等の自動機械により接触するように位置付ける。
【００８５】
本明細書に記載の通り、いくつかの実施形態では、支持基板は、流体、ガス、および栄養素に対して透過性であり、配置中およびその後の融合中、細胞培養液が多細胞体および／または層の全表面に接触することを可能にする。本明細書にさらに記載される通り、いくつかの実施形態では、支持基板は、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、その他の細胞外マトリクス等の天然生体適合材料で作られる。いくつかの実施形態では、支持基板は、ヒドロキシアパタイト、アルギン酸塩、アガロース、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、およびこれらのコポリマー等の合成生体適合材料で作られる。いくつかの実施形態では、支持基板は固体である。いくつかの実施形態では、支持基板は半固体である。さらなる実施形態では、支持基板は、固体支持要素と半固体支持要素の組み合わせである。さらなる実施形態では、平坦な層の作製を促進するため、支持基板は平坦である。いくつかの実施形態では、支持基板は、非透過面、例えば細胞培養環境の一部分（例えばペトリ皿、細胞培養フラスコ等）またはバイオリアクターより上に上昇または隆起している。したがって、いくつかの実施形態では、透過性で隆起した支持基板は、早期細胞死の防止に寄与し、細胞増殖の強化に寄与し、多細胞体が融合して層を形成することを促進する。
【００８６】
本明細書に記載の通り、種々の実施形態において、多細胞体は多くの形状とサイズを有する。いくつかの実施形態では、多細胞体は細長く、円柱形である。例えば図１と図３を参照のこと。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する多細胞体は、長さおよび／または直径がほぼ同じである。他の実施形態では、本明細書に提供する多細胞体は、長さおよび／または直径が異なる。いくつかの実施形態では、多細胞体は実質的に球形である。例えば図２と図４を参照のこと。いくつかの実施形態では、層は、実質的にほぼ同じサイズの実質的に球形の多細胞体を含む。他の実施形態では、層は、サイズの異なる実質的に球形の多細胞体を含む。
【００８７】
図６を参照すると、いくつかの実施形態では、多細胞体１は、１つ以上の他の多細胞体に隣接し接触して、支持基板３上に水平方向に並べられて、実質的に平坦な層を形成する。
【００８８】
図７を参照すると、いくつかの実施形態では、実質的に球形の多細胞体２は、１つ以上の他の実質的に球形の多細胞体に隣接し接触して、支持基板３上に水平方向に並べられる。さらなる実施形態では、このプロセスを繰り返すことにより、実質的に球形の多細胞体からなるパターン（例えばグリッド）を構築して、実質的に平坦な層を形成する。
【００８９】
図８を参照すると、特定の実施形態において、多細胞体６を、１つ以上の他の多細胞体に水平方向に隣接し接触するように、キャピラリーピペット５等の器具を介して支持基板３上に配置する。さらなる実施形態では、多細胞体を、複数の他の多細胞体と平行になるように支持基板上に配置する。
【００９０】
図９を参照すると、いくつかの実施形態では、後続の一連の多細胞体８を、前の一連の多細胞体９に隣接し接触するように、支持基板３上に垂直方向に並べて、より厚い層を形成する。
【００９１】
他の実施形態では、形状とサイズの異なる複数の多細胞体を並べることにより、形状とサイズの異なる複数の層を形成する。いくつかの実施形態では、多様な形状、サイズ、密度、細胞組成、および／または添加物組成の複数の多細胞体が一層にまとめられて、得られる層の例えば外観、味覚、および質感に寄与する。
【００９２】
図１０を参照すると、いくつかの実施形態では、細長い多細胞体９が、実質的に球形の多細胞体１０に隣接し接触して、支持基板３上に並べられて、複雑な層を形成する。
【００９３】
層の組み立てが完了した後、いくつかの実施形態では、組織培養液を注いで構築物の上部を覆う。さらなる実施形態では、この組織培養液は、多細胞体間の空間に進入して、多細胞体内の細胞を補助する。三次元構築物内の多細胞体を互いに融合させ、加工食用肉の形成用に実質的に平坦な層を作製する。「融合する」、「融合した」、「融合」という語は、互いに接して隣接している多細胞体の細胞が、細胞表面タンパク質間の相互作用を通じて直接的に、または細胞と細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分もしくはＥＣＭ成分の派生物との相互作用を通じて間接的に、互いに接着および／または密着することを意味する。いくつかの実施形態では、多細胞体内の細胞が、それぞれの細胞特異的なＥＣＭ（例えばコラーゲン）を産生し、これにより、多細胞体および食用肉製品の機械的な完全性が得られる。いくつかの実施形態では、融合した層は完全に融合しており、多細胞体は、実質的に互いに接して隣接する。いくつかの実施形態では、融合した層は実質的に融合しているか部分的に融合しており、多細胞体の細胞は、層を無傷のまま移動可能および操作可能にするのに必要な程度に接着および／または密着している。
【００９４】
いくつかの実施形態では、多細胞体は、細胞培養環境（例えばペトリ皿、細胞培養フラスコ、バイオリアクター等）内で融合して層を形成する。さらなる実施形態では、多細胞体は、多細胞体に含まれる細胞型の増殖を促進するのに適切な条件を備えた環境内で融合して層を形成する。種々の実施形態において、融合は、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、および６０分、ならびにこれらの値の間の増分の時間にわたって発生する。他の種々の実施形態において、融合は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、および４８時間、ならびにこれらの値の間の増分の時間にわたって発生する。さらに他の実施形態では、融合は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、および１４日、ならびにこれらの値の間の増分の時間にわたって発生する。さらなる実施形態では、融合は、約２時間〜約３６時間にわたって発生する。いくつかの要因、例えば、非限定的な例として細胞型、細胞型の比率、培養条件、および添加物（増殖因子等）の有無が、融合の所要時間に影響する。
【００９５】
層の融合が完了した後、いくつかの実施形態では、層と支持基板を分離する。他の実施形態では、層の融合が実質的に完了するか部分的に完了した時点で層と支持基板を分離するが、この層の細胞は、層をばらばらに壊すことなく層の移動、操作、および積み重ねを可能にするのに必要な程度に、互いに接着および／または密着している。さらなる実施形態では、支持基板を融解、溶解、または分解するための標準の手順により、層と支持基板を分離する。さらなる別の実施形態では、例えば温度変化、光、または、層に悪影響を与えない他の刺激により、支持基板を溶解させる。特定の実施形態では、支持基板は可撓性材料で作られ、層から剥離される。
【００９６】
いくつかの実施形態では、分離した層はバイオリアクターに移され、さらに成熟する。いくつかの実施形態では、分離した層は、加工肉製品に組み込まれた後に成熟してさらに融合する。
【００９７】
他の実施形態では、層と支持基板は分離されない。さらなる実施形態では、支持基板は、構築された加工肉製品の梱包、冷凍、販売、または消費の前に、分解または生分解する。
【００９８】
支持基板上の層の配置による加工肉の形成
支持基板上に複数の層を並べて加工肉を作製する方法として、いくつか適切な方法がある。例えば、いくつかの実施形態では、層が互いに接触するように手作業で配置し、または、バイオプリンター等の自動のコンピューター援用機械によりコンピュータースクリプトに従って層を所定位置に堆積させる。さらなる実施形態では、実質的に平坦な層を積み重ねて加工肉を形成する。
【００９９】
種々の実施形態において、積み重ねる層の数は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、もしくは５００、またはこれらの値の間の増分の数である。いくつかの実施形態では、積み重ねる層の数は約１０〜約１００である。いくつかの実施形態では、積み重ねる層の数は約２０〜約８０である。いくつかの実施形態では、積み重ねる層の数は約４０〜約６０である。さらなる実施形態では、積み重ねを繰り返すことにより、カルパッチョ、一切れのベーコン、ハンバーガーパテ、魚の切り身、鶏の胸肉、ステーキ等の従来の肉製品を近似する厚さにする。種々の実施形態において、積み重ねられた層は、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ｍｍの厚さ、またはこれらの値の間の増分の厚さの加工肉製品を構成する。
【０１００】
いくつかの実施形態では、層は、多細胞体の配置、パターン、または配向により規定される配向を有する。さらなる実施形態では、各層は、支持基板および／または１つ以上の他の層に対する特定の配向をもって積み重ねられる。種々の実施形態において、支持基板および／または下の層に対する回転を含む配向をもって１つ以上の層が積み重ねられ、この回転の角度は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、および１８０度、またはこれらの値の間の増分値である。他の実施形態では、すべての層が実質的にほぼ同じように配向している。
【０１０１】
図１１を参照すると、特定の実施形態において、層は、層の形成に使われる多細胞体の平行配置により規定される配向を有する。さらなる特定の実施形態では、下の層に対して９０度の回転を含む配向をもって層を積み重ねて、加工肉を形成する。
【０１０２】
層の積み重ねが完了した後、いくつかの実施形態では、三次元構築物中の層を互いに融合させて、加工肉を作製する。いくつかの実施形態では、層は、組織培養環境（例えばペトリ皿、細胞培養フラスコ、バイオリアクター等）内で融合して加工肉を形成する。種々の実施形態において、融合は、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、および６０分、ならびにこれらの値の間の増分の時間にわたって発生する。他の種々の実施形態において、融合は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、および４８時間、ならびにこれらの値の間の増分の時間にわたって発生する。さらなる実施形態では、融合は、約２時間〜約３６時間にわたって発生する。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、積み重ねの完了後、ガス、流体、および栄養素が拡散等により構築物の内側部分に到達できなくなるため、多細胞体および層の細胞死が開始する。さらなる実施形態では、徐々に進む細胞死は、死後の生体組織に発生する自然の細胞死に類似している。いくつかの実施形態では、細胞死が徐々に進むと同時に、加工肉構築物の層が互いに融合する。いくつかの実施形態では、細胞死が徐々に進むと同時に、層を構成する多細胞体が互いに融合し続ける。さらなる実施形態では、構築物の過半数の細胞の死より前に、層同士の融合が完了するか実質的に完了する。さらなる実施形態では、構築物のすべての細胞の死より前に、層同士の融合が完了するか実質的に完了する。
【０１０４】
加工肉の組み立てが完了した後、いくつかの実施形態では、加工肉と支持基板を分離する。さらなる実施形態では、支持基板を融解、溶解、または分解するための標準の手順により、加工肉と支持基板を分離する。さらなる別の実施形態では、例えば温度変化、光、または、加工肉に悪影響を与えない他の刺激により、支持基板を溶解させる。特定の実施形態では、支持基板は可撓性材料で作られ、加工肉から剥離される。いくつかの実施形態では、分離した加工肉はバイオリアクターに移されてさらに成熟する。他の実施形態では、加工肉と支持基板は分離されない。さらなる実施形態では、支持基板は、販売または消費の前に、分解または生分解する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、加工肉は照射される。いくつかの実施形態では、加工肉は冷凍されて、流通、販売、および消費の前の腐敗または分解を防止する。いくつかの実施形態では、冷凍した加工肉は真空包装される。
【０１０６】
加工肉
本明細書において、加工肉製品がいくつかの実施形態で開示される。また、本明細書において、支持基板上に隣接して並べられて、加工肉の形成用に実質的に平坦な層を形成する複数の多細胞体も、種々の実施形態で開示される。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、加工肉製品は生鮮品である。他の実施形態では、加工肉製品は保存品である。さらなる実施形態では、加工肉は、例えば加熱調理、乾燥、燻製、缶詰、ピックリング、塩漬け、または冷凍により保存される。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、加工肉製品は、病原微生物を実質的に含まない。さらなる実施形態では、細胞調製、細胞培養、多細胞体調製、層調製、および加工肉調製の方法として、制御され実質的に無菌の方法を用いることにより、病原微生物を実質的に含まない製品がもたらされる。さらなる実施形態では、このような製品の追加的な利点は、有用性と安全性が高まることである。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、加工肉製品は成形される。さらなる実施形態では、例えば、加工肉の構築に使われる多細胞体および／または層の数、サイズ、および配列を制御することにより、加工肉を成形する。他の実施形態では、例えば、切断、加圧成形、型による成形、または打ち抜き加工により加工肉を成形する。いくつかの実施形態では、従来の肉製品、例えば一切れのベーコン、鎖状ソーセージ、ソーセージパテ、ハンバーガーパテ、ホットドッグ、魚の切り身、鶏の胸肉、棒状チキン、チキンナゲット、ミートローフ、ステーキ等に似るように肉製品の形状を選択する。他の実施形態では、加工肉製品は粉砕される。
【実施例】
【０１１０】
以下の例示的実施例は、本明細書に記載の実施形態を代表するものであり、限定することは何ら意図されていない。
【０１１１】
実施例１−支持基板の調製
２％アガロース溶液を調製するため、２ｇのＵｌｔｒａｐｕｒｅ  Ｌｏｗ  Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｐｏｉｎｔ（ＬＭＰ）アガロースを１００ｍＬの超純水／緩衝液（１：１、体積／体積）に溶かした。緩衝液は、随意にＰＢＳ（１×ダルベッコリン酸緩衝食塩水）またはＨＢＳＳ（１×ハンクス平衡塩類溶液）のどちらかである。温水（８０℃超）の入ったビーカーにアガロース溶液を入れ、アガロースが完全に溶けるまでホットプレート上に保持した。温度が３６℃超であり限り、アガロース溶液は液体のままである。３６℃を下回ると相転移が発生し、粘度が上昇して、最終的にアガロースがゲルを形成する。
【０１１２】
アガロース支持基板を調製するため、１０ｍＬの液体２％アガロース（温度＞４０℃）を１０ｃｍ径のペトリ皿に入れ、平らに広げて均一層を形成した。４℃の冷蔵庫内にアガロースを静置してゲルを形成させた。
【０１１３】
実施例２−ブタ大動脈平滑筋細胞の培養
単離した直後のブタ大動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）を、１０％ウシ胎仔血清（ハイクローンラボラトリーズ、ユタ州）、１０％ブタ血清（インビトロジェン）、Ｌ−アスコルビン酸、硫酸銅、ＨＥＰＥＳ、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グリシン、およびペニシリンＧを含有する低グルコースＤＭＥＭ中で増殖させた（上記栄養補助剤はすべてミズーリ州セントルイスのシグマから購入した）。０．５％ゼラチン（ブタ皮膚ゼラチン；シグマ）を塗布した皿（テクノプラスチックプロダクツ、ミズーリ州セントルイス）の上で細胞株を培養し、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中において３７℃で維持した。ＰＡＳＭＣを最高で７代目まで継代培養した後、多細胞体の形成に用いた。
【０１１４】
実施例３−多細胞球形体および多細胞円柱体の調製
細胞培養物をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、インビトロジェン）で２回洗浄し、０．１％トリプシン（インビトロジェン）で１０分間処理し、１５００ＲＰＭで５分間、遠心分離した。細胞を４ｍＬの細胞型特異的培養液で再懸濁させ、１０ｍＬの組織培養フラスコ（ベルコグラス、ニュージャージー州バインランド）内で、３７℃にて、５％ＣＯ２存在下で、旋回シェーカー（ニューブランズウィックサイエンティフィック、ニュージャージー州エジソン）上で１時間インキュベートして接着を回復させ、３５００ＲＰＭで遠心分離した。得られたペレットを３００μｍ径（サッターインスツルメント、カリフォルニア州）または５００μｍ径（ドラモンドサイエンティフックカンパニー、ペンシルベニア州ブルーモール）のキャピラリーマイクロピペットに移し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で１５分間インキュベートした。球形の多細胞体の場合、円柱状に押し出して均等断片にカットし、旋回シェーカー上で一晩かけて自然に丸めた。この手順により、マイクロピペットの直径に応じた、所定のサイズと細胞数を持つ一定の球形体が得られた。円柱形の多細胞体の場合、機械により円柱状に押し出し、バイオプリンターを用いて個別に調製された非粘着性のＴｅｆｌｏｎ（登録商標）またはアガロースの型枠に流し込んだ。型枠内で一晩かけて成熟した細胞円柱体は、堆積できるほど十分に密着していた。
【０１１５】
多細胞体を複数のカートリッジ（内径３００〜５００μｍのマイクロピペット）に入れてパッケージ化した。カートリッジをバイオプリンターに挿入し、プリントする構造物の形状をコード化したコンピュータースクリプトに従って、支持基板上に送達した。
【０１１６】
実施例４−加工肉の調製
実施例３に記載の通りに、円柱形の多細胞体を調製する。この多細胞体は異種細胞性であり、実施例２のＰＡＳＭＣと、ブタ冠動脈内皮細胞（ＰＣＡＥＣ、ジェンランティス、カリフォルニア州サンディエゴ、製品番号ＰＰ３０００５）で構成される。多細胞体中の内皮細胞に対する筋細胞の比率は、約６：１である。多細胞体の断面径は３００μｍであり、長さは２ｃｍ、３ｃｍ、４ｃｍ、または５ｃｍである。多細胞体を成熟させ、複数のカートリッジ（内径３００μｍのマイクロピペット）に入れてパッケージ化し、このカートリッジをバイオプリンターに挿入する。
【０１１７】
実施例１に記載の通りにアガロース支持基板を調製する。目の細かいメッシュ台座を用いて、大型ペトリ皿の底より上に支持基板を上昇させて、支持基板上に堆積した多細胞体および層のすべての表面に細胞培養液が接触できるようにする。
【０１１８】
コンピュータースクリプトの命令に従って、バイオプリンターが多細胞体を支持基板上に送達する。このスクリプトは、円柱形の多細胞体を配置し、幅約１０ｃｍ、長さ約１０ｃｍの実質的に正方形の単層を形成することをコード化したものである。複数の多細胞体が互いに平行に配置され、長さの異なる多細胞体が端から端まで配置されて、コード化された形状を形成する。
【０１１９】
層の上部を覆うように培養液を注ぎ、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気において、３７℃で、約１２時間かけて構築物を静置し部分的に融合させる。この時間中、多細胞体の細胞は、層をばらばらに壊すことなく層を移動可能および操作可能にするのに必要な程度に、接着および／または密着する。
【０１２０】
融合した層を支持基板から剥離し、積み重ねる。６５枚の層を積み重ねて加工肉を形成する。この加工肉の全体の幅と高さは約２ｃｍであり、長さと幅は約１０ｃｍである。各層は、真下の層に対して９０度回転している。積み重ねが完了すると、培養液が交換されないため酸素が欠乏し、これにより細胞死が開始する。積み重ねた層の内部で最初に酸素が欠乏するので、内部から細胞死が開始し、周囲の培養液の酸素が次第に欠乏するのに伴い、細胞死は徐々に外側の細胞に達する。細胞死と同時に、部分的に融合している層は融合を続行し、垂直方向にも融合し始める。細胞死が約２０時間を要する一方で、融合プロセスは約６時間を要するので、死後の構築物は完全に融合して、正方形のポークハンバーガーパテに似た形状になる。
【０１２１】
本明細書において、図と例を用いて加工肉とその製造方法をある程度詳しく記述したが、このような図と例は、単に明確に理解することを目的としたものに過ぎない。当業者であれば、本明細書の教示内容を踏まえて、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、ある変更および修正をこれらの図および例に加えてよいことを容易に認識するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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