(57)【要約】  本開示は抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。好ましくは、本開示に係る抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、５個までのアミノ酸の置換、欠失、または付加を有する配列番号１〜２８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するものである。本開示は更に、ＴＧＦベータシグナル伝達に関連する疾患、好ましくは、組織線維症、例えば肺線維症、例えば特発性肺線維症；肝線維症、例えば肝硬変および慢性肝炎；関節リウマチ；眼障害；皮膚の線維症、例えば皮膚のケロイド；デュピュイトラン拘縮；腎線維症、例えば腎炎および腎硬化症；創傷治癒；瘢痕化の軽減；および再狭窄等の血管病態の群から選択される疾患を処置するためのポリペプチドおよび医薬組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
５個までのアミノ酸の置換、欠失、または付加を任意の組合せで有する配列番号１〜３８、２０４、２０６、２０８、２１４、２３４、２３６、２３８、２４０、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、および２９１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含んでなる、抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項２】
５個までのアミノ酸の置換、欠失、または付加を任意の組合せで有する配列番号２３４または２３６に記載のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項３】
前記アミノ酸の置換、欠失、または付加が、ＣＤＲ３中にない、請求項１または２に記載の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項４】
前記アミノ酸の置換、欠失、または付加が、いずれのＣＤＲの中にもない、請求項１、２、または３に記載の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項５】
配列番号１〜３８、２０４、２０６、２０８、２１４、２３４、２３６、２３８、２４０、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、および２９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項６】
配列番号２３４または２３６のアミノ酸配列を含んでなる、請求項５に記載の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項７】
Ｃ末端アラニン残基を更に含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなる単離されたポリペプチドであって、ＴＧＦベータＲＩＩに結合する、単離されたポリペプチド。
【請求項９】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインの３９位のＲ、４８位のＩ、５３位のＤ、６１位のＮ、６１位のＲ、６１位のＫ、６４位のＲ、６４位のＦ、６４位のＤ、６４位のＥ、６４位のＭ、６４位のＹ、１０２位のＨ、または１０３位のＳの群から選択されるアミノ酸の少なくとも１つを更に含んでなり、前記位置は、Kabatのナンバリングの慣習に従う、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインまたは請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
６１位のＲまたはＫを含んでなる、請求項９に記載の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチド。
【請求項１１】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインの６１位のＮおよび６４位のＲ；６１位のＲおよび６４位のＥ；６１位のＲおよび６４位のＭ；６１位のＲおよび６４位のＦ；６１位のＲおよび６４位のＹ；並びに６１位のＲおよび６４位のＤの群から選択されるアミノ酸の組合せのいずれかを更に含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインまたは請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
４８位のイソロイシン残基を含んでなる、請求項９、１０、または１１に記載の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチド。
【請求項１３】
ヒトＴＧＦベータＲＩＩに結合する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチド。
【請求項１４】
マウスＴＧＦベータＲＩＩおよび／またはカニクイザルＴＧＦベータＲＩＩにも結合する、請求項１３に記載の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチド。
【請求項１５】
ＴＧＦベータ活性を中和する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチド。
【請求項１６】
ＴＧＦベータＲＩＩへのＴＧＦベータの結合を阻害する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項１８】
配列番号３９〜７６、２０３、２０５、２０７、２１２、２３３、２３５、２３７、２３９、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０の群から選択される少なくとも１つの核酸分子を含んでなる、請求項１６に記載の単離された核酸分子。
【請求項１９】
請求項１７または１８に記載の核酸分子を含んでなる、ベクター。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の核酸またはベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるポリペプチドを製造する方法であって、前記核酸またはベクターの発現に適した条件下に請求項２０に記載の宿主細胞を維持することにより、免疫グロブリン単一可変部を含んでなるポリペプチドを生成させることを含んでなる、方法。
【請求項２２】
医薬として使用するための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドを含んでなる、医薬組成物。
【請求項２４】
ＴＧＦベータシグナル伝達に関連する疾患を処置するための、請求項２２に記載の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインもしくはポリペプチドまたは請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ＴＧＦベータシグナル伝達に関連する疾患が、組織線維症、例えば肺線維症、例えば特発性肺線維症；肝線維症、例えば肝硬変および慢性肝炎；関節リウマチ；眼障害；皮膚の線維症、例えば皮膚のケロイド、およびデュピュイトラン拘縮；腎線維症、例えば腎炎および腎硬化症、創傷治癒；および再狭窄等の血管病態の群から選択される、請求項２４に記載の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、または医薬組成物。
【請求項２６】
組織線維症の処置において使用するためのまたは創傷治癒および／もしくは瘢痕化軽減において使用するための、請求項２２に記載の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、または医薬組成物。
【請求項２７】
前記疾患が、ケロイド疾患またはデュピュイトラン拘縮である、請求項２２、２４、または２５に記載の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項２８】
ＴＧＦベータシグナル伝達に関連する疾患を処置するための医薬の製造における、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗ＴＧＦベータＲＩＩ単一可変ドメインまたはポリペプチドの使用。
【請求項２９】
ヒト患者においてＴＧＦベータが媒介する病態を処置および／または防止する方法であって、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドを含んでなる組成物をヒト患者に投与するステップを含んでなる、方法。
【請求項３０】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗ＴＧＦベータＲＩＩ単一可変ドメインまたはポリペプチドと、前記単一可変ドメインまたはポリペプチドを皮膚に適用するためのデバイスとを含んでなる、キット。
【請求項３１】
前記デバイスが皮内送達デバイスである、請求項３０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
形質転換増殖因子−β（ＴＦＧベータ；ＴＧＦβ（ＴＧＦ−β）は、ＴＧＦ−ベータ受容体（ＴＧＦベータＲ；ＴＧＦβＲ（ＴＧＦ−βＲ））への結合を介して細胞へのシグナル伝達を媒介するシグナル伝達分子である。ＴＧＦベータシグナル伝達活性は、細胞の分化および増殖を制御し、その作用、すなわち細胞増殖促進因子、増殖抑制因子、または他の細胞機能の誘導因子としての性質は細胞型によって決まる（Roberts, et al., The transforming growth factor-betas, Peptide Growth Factors and Their Receptors, Part I, ed. by Sporn, M.B. & Roberts, A.B., Springer-Verlag, Berlin, 1990, p.419-472参照）。
【０００２】
ＴＧＦベータは幅広い種類の細胞型で生成され、その同族受容体は幅広い種類の器官および細胞で発現されている（Shi and Massague, Cell, Volume 113, Issue 6, 13 June 2003, Pages 685-700；Biol. Signals., Vol. 5, p.232, 1996 and Pulmonary Fibrosis, Vol. 80 of Lung Biology in Health and Disease Series, ed. by Phan, et al., p.627, Dekker, New York, 1995参照）。ＴＧＦ−ベータ受容体は３つのタイプに分類されることが確認されている、すなわちＴＧＦベータＲＩ（ＴＧＦβＲＩ）（Ｉ型ＴＧＦベータ受容体（Franzen et al., Cell, Vol. 75, No. 4, p. 681, 1993；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ１１６９５））、ＴＧＦベータＲＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）（ＩＩ型ＴＧＦベータ受容体（Herbert et al., Cell, Vol. 68, No. 4, p. 775, 1992；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ８５０７９））、およびＴＧＦベータＲＩＩＩ（ＩＩＩ型ＴＧＦベータ受容体（Lopez-Casillas, Cell, Vol. 67, No. 4, p. 785, 1991；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ０７５９４））である。ＴＧＦベータＲＩおよびＴＧＦベータＲＩＩがＴＧＦ−ベータのシグナル伝達に必須であることが示されている（Laiho et al., J. Biol. Chem., Vol. 265, p. 18518, 1990およびLaiho et al., J. Biol. Chem., Vol. 266, p. 9108, 1991）が、ＴＧＦベータＲＩＩＩは必須であるとは考えられていない。
【０００３】
ＴＧＦベータシグナル伝達は、ＴＧＦベータＲＩおよびＲＩＩの両方への結合に媒介される。リガンドが細胞外リガンド結合ドメインに結合すると、２つの受容体が一緒になることで、ＲＩＩはＲＩをリン酸化してＳｍａｄタンパク質のリン酸化を介してシグナル伝達カスケードを開始させることができるようになる（前述のShi and Massague参照）。
【０００４】
哺乳動物ではＴＧＦベータの３つのアイソフォーム、すなわちＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、およびＴＧＦベータ３が同定されている。各アイソフォームは多機能性であり、自己制御的フィードバック機構で作用して、発達プロセスの生物学的利用能（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）を制御し、組織恒常性を維持する（ten Dijke and Arthur, Nature Reviews, Molecular Cell Biology, Vol. 8, Nov. 2007, p. 857-869に概括されている）。ＴＦＧベータのレベルは、ＴＧＦベータの発現を介したおよびプロテオグリカン、すなわち細胞外マトリックス（ＥＣＭ）への結合を介した制御により調節される。
【０００５】
調節不全ＴＧＦベータシグナル伝達、例えば過剰なＴＧＦベータシグナル伝達および生物学的に利用可能なＴＧＦベータのレベルが高いことが、複数の病態、例えば、種々の組織の繊維症、例えば肺線維症および肝硬変、慢性肝炎、関節リウマチ、眼障害、血管再狭窄、皮膚のケロイド、並びに腎硬化症の発症に関わる。
【０００６】
したがって、特定の様式で、例えばＴＧＦ−ベータ受容体ＩＩへの結合を介してＴＧＦベータシグナル伝達をブロックするまたは妨げる化合物を提供することに対するニーズがある。そのような化合物は治療に用いることができる。
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。好ましくは、本開示に係る抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、１０ｐＭ〜５０ｎＭ、場合によっては１０ｐＭ〜１０ｎＭ、場合によっては１００ｐＭ〜１０ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）でＴＧＦベータＲＩＩに結合するものである。一つの実施態様では、抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、高親和性でＴＧＦベータＲＩＩに結合し（高効力）且つ１０ｐＭ〜５００ｐＭの平衡解離定数を有するものである。一つの実施態様では、抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、約１００ｐＭの親和性（ＫＤ）でＴＧＦベータＲＩＩに結合するものである。一つの実施態様では、抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、１００ｐＭ未満の親和性（ＫＤ）でＴＧＦベータＲＩＩに結合するものである。別の実施態様では、抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、中程度のアフィニティーでＴＧＦベータＲＩＩに結合し（低効力）、且つ５００ｐＭ〜５０ｎＭ、好ましくは５００ｐＭ〜１０ｎＭの平衡解離定数を有するものである。別の側面では、本開示は、抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなる単離されたポリペプチドを提供する。好ましくは、単離されたポリペプチドはヒトＴＧＦベータＲＩＩに結合する。別の実施態様では、単離されたポリペプチドは、マウス、イヌ、またはカニクイザル（ｃｙｎｏ）等のサルなどの異なる種に由来するＴＧＦベータＲＩＩにも結合する。好ましくは、単離されたポリペプチドは、マウスおよびヒトのＴＧＦベータＲＩＩの両方に結合する。ヒトと他の種のＴＧＦベータＲＩＩの間のそのような交差反応性は、動物疾患モデルおよびヒトにおける同じ抗体コンストラクトの使用を可能にする。
【０００８】
本開示の一つの側面では、配列番号１〜３８、２０４、２０６、２０８、２１４、２３４、２３６、２３８、２４０、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、および２８７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有し、５個までのアミノ酸変化を有する、抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインであって、各アミノ酸変化が、任意の組合せの、アミノ酸の置換、欠失、または付加、すなわち５個までのアミノ酸の置換、欠失、または付加である、抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインが提供される。特定の実施態様では、アミノ酸置換は保存的置換である。
【０００９】
一つの実施態様では、抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号２３４または２７９に記載されており且つ５個までのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を有し、各アミノ酸変化は、アミノ酸の置換、欠失、または付加である。特定の実施態様では、アミノ酸変化はＣＤＲ３内ではなく、より具体的にはＣＤＲ３およびＣＤＲ１、またはＣＤＲ３およびＣＤＲ２内ではなく、より具体的にはいずれのＣＤＲ内でもない。一つの実施態様では、抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは以下の配列のいずれか１つからなる：配列番号１〜３８、２０４、２０６、２０８、２１４、２３４、２３６、２３８、２４０、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、および２８７。一つの実施態様では、抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号２３４または２３６のアミノ酸配列からなる。
【００１０】
国際公開第２０１１０１２６０９号に開示されている如何なる特定の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン配列もカバーすることは意図されない。誤解を避けるために、国際公開第２０１１０１２６０９号に開示されている全配列は本発明の請求範囲から除外され得る。特に、国際公開第２０１１０１２６０９号に開示されているＤＯＭ２３ｈ−２７１（配列番号４）およびＤＯＭ−２３ｈ−４３９（配列番号１０）が請求から除外され得る。本明細書中の配列番号１９９または２０１に記載のアミノ酸配列からなる抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインが請求から除外され得る。
【００１１】
本発明に係る抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、１または複数の（例えば、１、２、３、４、または５個の）Ｃ末端アラニン残基を含んでなり得る。あるいは、抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、最大５アミノ酸長のＣ末端ペプチドを含んでなり得る。一つの実施態様では、Ｃ末端ペプチドは１、２、３、４、または５個のアミノ酸を含んでなる。
【００１２】
当業者は、本明細書に概略が述べられている種々の方法、例えばKabat (1987)、Chothia (1989)を参照して定義されるＣＤＲ配列、ＡｂＭ、またはｃｏｎｔａｃｔ法、またはこれらの方法の組合せを用いて、所定の単一可変ドメイン配列、例えば配列番号１〜３８、２０４、２０６、２０８、２１４、２３４、２３６、２３８、２４０、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、および２８７のいずれかに記載の配列を有する単一可変ドメイン配列から、その中にどのＣＤＲ配列が含まれるかを推定することができる。好ましくは、ＣＤＲ配列は本明細書に記載のKabatの方法を用いて決定される。一つの実施態様では、各配列のＣＤＲ配列は表１、２、９、および１３に記載のものである。
【００１３】
本発明の一つの側面では、本開示の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号１〜２８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して９０％または９０％を超える配列同一性を有する。
【００１４】
本発明の一つの側面では、本開示の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、２５個以下のアミノ酸変化を有する配列番号１〜２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。特定の実施態様では、本開示の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、２０以下、１５以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、または５以下のアミノ酸変化を有する配列番号１〜２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００１５】
本開示の一つの側面では、本開示の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、特に配列番号１〜３８、２０４、２０６、２０８、２１４、２３４、２３６、２３８、２４０、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、および２８７からなる群から選択されるアミノ酸配列と同一の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなる単離されたポリペプチドであって、ＴＧＦベータＲＩＩに結合する、単離ポリペプチドが提供される。
【００１６】
本開示の一つの側面では、配列番号３９〜６６の群から選択される少なくとも１つの核酸配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列によってコードされる単離されたポリペプチドであって、ＴＧＦベータＲＩＩに結合する、単離されたポリペプチドが提供される。
【００１７】
本開示のいずれかの側面に係る抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドは、以下のアミノ酸のいずれかを含んでなり得る：免疫グロブリン単一可変ドメインの３９位のＲ、４８位のＩ、５３位のＤ、６１位のＮ、６１位のＲ、６１位のＫ、６４位のＲ、６４位のＦ、６４位のＤ、６４位のＥ、６４位のＹ、１０２位のＨ、または１０３位のＳ。前記位置はkabatのナンバリングの慣習に従う。一つの実施態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドは、これらのアミノ酸の組合せを含んでなる。別の実施態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドは、６１位のＮおよび６４位のＲのアミノ酸を含んでなる。別の実施態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドは６１位のアミノ酸ＲまたはＫを含んでなる。一つの実施態様では、抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、６１および／または６４位の前述の残基のいずれか１つに加えて４８位のＩを含んでなる。これらの実施態様において、アミノ酸ナンバリングは、例えば配列番号１〜３８、２０４、２０６、２０８、２１４、２３４、２３６、２３８、２４０、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、および２８７中で与えられる配列によって例示される免疫グロブリン単一可変ドメインのものである。
【００１８】
本開示のいずれかの側面に係る抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドは、以下の群から選択されるアミノ酸の組合せのいずれかを含んでなり得る：免疫グロブリン単一可変ドメインの６１位のＮおよび６４位のＲ；６１位のＲおよび６４位のＥ；６１位のＲおよび６４位のＭ；６１位のＲおよび６４位のＦ；６１位のＲおよび６４位のＹ；並びに６１位のＲおよび６４位のＤ。一つの実施態様では、抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、前述の６１および６４位の残基の組合せのいずれかに加えて、４８位のＩを含んでなる。
【００１９】
別の側面では、ＴＧＦベータＲＩＩに対する結合特異性を有し、配列番号１〜２８の群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインのＴＧＦベータＲＩＩへの結合を阻害する、リガンドまたは結合部分が提供される。
【００２０】
本開示の別の側面では、本開示のいずれかの側面に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、またはリガンドを含んでなる融合タンパク質が提供される。
【００２１】
一つの実施態様では、本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンド、または融合タンパク質は、ＴＧＦベータ活性を中和するものである。好ましくは、本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドは、ＴＧＦベータＲＩＩへのＴＧＦベータの結合を阻害する。別の実施態様では、本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドは、ＴＧＦベータＲＩＩを介したＴＧＦベータシグナル伝達活性を阻害する。別の実施態様では、本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドは、ＴＧＦベータ活性、特にＴＧＦベータの細胞増殖活性および／または繊維形成活性を抑制する。好ましくは、ＴＧＦベータＲＩＩはヒトＴＧＦベータＲＩＩである。
【００２２】
一つの実施態様では、本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンド、または融合タンパク質は、１５マイクロモル（μＭ）でＴＧＦベータＲＩＩアゴニスト活性を有さない。
【００２３】
別の側面では、半減期延長部分を更に含んでなる本開示のいずれかの側面に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンド、または融合タンパク質が提供される。好ましくは、半減期延長部分は、ポリエチレングリコール部分、血清アルブミンもしくはその断片、トランスフェリン受容体もしくはそのトランスフェリン結合部分、またはインビボで半減期を延長するポリペプチドへの結合部位を含んでなる抗体もしくは抗体断片である。一つの実施態様では、半減期延長部分は、血清アルブミンまたは新生児Ｆｃ受容体への結合部位を含んでなる、抗体または抗体断片である。別の実施態様では、半減期延長部分はｄＡｂ、抗体、または抗体断片である。
【００２４】
別の側面では、本開示は、本開示のいずれかの側面に係る抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンド、または融合タンパク質を含んでなるポリペプチドをコードする単離されたまたは組換え型の核酸を提供する。
【００２５】
一つの実施態様では、単離されたまたは組換え型の核酸分子は、配列番号３９〜７６、２０３、２０５、２０７、２１２、２３３、２３５、２３７、２３９、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６に記載の配列を有する核酸分子のいずれかの群から選択される核酸分子を含んでなるまたはからなる。
【００２６】
一つの側面では、本開示は、単離されたまたは組換え型の核酸であって、核酸が、配列番号３９〜６６に記載の配列を有する核酸分子のいずれかのヌクレオチドと少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含んでなり、核酸が、ＴＧＦベータＲＩＩに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるポリペプチドをコードする、核酸を提供する。
【００２７】
別の側面では、本開示に係る核酸を含んでなるベクターが提供される。
【００２８】
別の側面では、本開示に係る核酸またはベクターを含んでなる宿主細胞が提供される。本開示の更に別の側面では、本開示に係る抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンド、または融合タンパク質を含んでなるポリペプチドを製造する方法であって、前記核酸またはベクターの発現に適した条件下で本開示に係る宿主細胞を維持することにより、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンド、または融合タンパク質を含んでなるポリペプチドを生成させることを含んでなる、方法が提供される。必要に応じて、方法は、ポリペプチドを単離し、必要に応じて単離されたポリペプチドよりも親和性（Ｋｄ）が向上したまたは標準的なアッセイにおけるＴＧＦベータ中和のＥＣ５０が向上したバリアント、例えば変異バリアントを生成するステップを更に含んでなる。細胞センサーアッセイ等のＴＧＦベータ活性の好適なアッセイが本明細書中の例えば実施例セクションに記載されている。
【００２９】
本開示の一つの側面では、本開示に係る抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンド、または融合タンパク質は、医薬として使用するためのものである。したがって、医薬として使用するための本開示に係る抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンド、または融合タンパク質を含んでなる組成物が提供される。
【００３０】
本開示の一つの側面では、特にＴＧＦベータシグナル伝達に関連する疾患の処置に使用するための、医薬の製造における本開示に係る抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンド、または融合タンパク質の使用が提供される。
【００３１】
好ましくは、本開示に係る抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンド、融合タンパク質、または組成物は、ＴＧＦベータシグナル伝達に関連する疾患を処置するためのものである。好ましくは、疾患は、組織の線維症、例えば特発性肺線維症を含む肺線維症；肝硬変および慢性肝炎を含む肝線維症；関節リウマチ；眼障害；皮膚のケロイドを含む皮膚の線維症；デュピュイトラン拘縮；腎炎および腎硬化症等の腎線維症；または再狭窄等の血管病態である。ＴＧＦベータシグナル伝達に関連する他の疾患としては、血管性疾患、例えば高血圧、子癇前症、Ｉ型遺伝性出血性毛細管拡張（ＨＨＴ１）、ＨＨＴ２、肺動脈高血圧症、大動脈瘤、マルファン症候群、家族性動脈瘤障害、ロイス・ディーツ症候群、動脈蛇行症候群（ＡＴＳ）が含まれる。ＴＧＦベータシグナル伝達に関連する他の疾患としては、筋骨格系の疾患、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび筋線維症が含まれる。ＴＧＦベータシグナル伝達に関連する更なる疾患としては、癌、例えば結腸癌、胃癌、および膵臓癌並びに神経膠腫およびＮＳＣＬＣが含まれる。更に、本開示は、腫瘍血管新生におけるＴＧＦベータシグナル伝達を調節することによって癌を標的化する方法を提供する。その他の疾患または病態としては、組織瘢痕化に関係するものが含まれる。その他の疾患としては、肺疾患、例えばＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）が含まれる。本開示に係る抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンド、融合タンパク質、または組成物は、創傷治癒におよび／または瘢痕形成を防止もしくは改善するために使用され得る。一つの側面では、本開示は、皮内送達用の抗ＴＧＦベータＲＩＩ単一可変ドメイン、リガンド、アンタゴニスト、組成物、または融合タンパク質を提供する。一つの側面では、本開示は、患者の皮膚送達用の抗ＴＧＦベータＲＩＩ単一可変ドメイン、リガンド、アンタゴニスト、または融合タンパク質を提供する。一つの側面では、本開示は、皮内送達用の医薬の製造における抗ＴＧＦベータＲＩＩ単一可変ドメイン、リガンド、アンタゴニスト、または融合タンパク質の使用を提供する。一つの側面では、本開示は、患者の皮膚送達用の医薬の製造における本開示に係る抗ＴＧＦベータＲＩＩ単一可変ドメイン、アンタゴニスト、または融合タンパク質の使用を提供する。
【００３２】
一つの実施態様では、可変ドメインは実質的に単量体である。特定の実施態様では、可変ドメインは、ＳＥＣ−ＭＡＬＳによる測定で溶液中で６５〜９８％単量体である。別の実施態様では、可変ドメインは、ＳＥＣ−ＭＡＬＳによる測定で溶液中で６５〜１００％、７０〜１００％、７５〜１００％、８０〜１００％、８５〜１００％、９０〜１００％、９５〜１００％単量体である。
【００３３】
別の実施態様では、本明細書に開示の可変ドメイン、リガンド、融合タンパク質、またはポリペプチドは、特に医薬組成物中にある時、以下の翻訳後修飾のいずれか１つ、組合せ、または全てを含まない：脱アミド化、酸化、またはグリコシル化。特定の実施態様では、本開示に係る可変ドメイン、リガンド、融合タンパク質、またはポリペプチドは脱アミド化しない。
【００３４】
好ましくは、組成物は、ヒトにおけるＴＧＦベータが媒介する病態の治療または予防のためのものである。
【００３５】
したがって、一つの実施態様では、皮膚の線維症、特にケロイド疾患またはデュピュイトラン拘縮を処置するための抗ＴＧＦベータＲＩＩ  ｄＡｂが提供される。好ましくは、抗ＴＧＦベータＲＩＩ  ｄＡｂは、好ましくはｍｙｃまたは他の精製タグ等のタグを有さない（すなわち、非タグ化）、皮内送達用の実質的に単量体のｄＡｂとして提供される。
【００３６】
一つの側面では、組成物は医薬組成物であり、薬学的に許容される担体、補形剤、または希釈剤を更に含んでなる。
【００３７】
別の側面では、ヒト患者におけるＴＧＦベータが媒介する病態を処置および／または防止する方法であって、本開示に係る抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、またはリガンドを含んでなる組成物を患者に投与することを含んでなる、方法が提供される。
【００３８】
別の側面では、本開示は、本開示に係る組成物を含む皮内送達デバイスを提供する。好ましくは、そのようなデバイスはマイクロニードルまたはマイクロニードルのコレクションである。
【００３９】
別の側面では、本明細書に開示の抗ＴＧＦベータＲＩＩ単一可変ドメインまたはポリペプチドと、前記単一可変ドメインまたはポリペプチドを皮膚に適用するための皮内送達デバイス等のデバイスとを含んでなるキットが提供される。
【発明の具体的説明】
【００４０】
本明細書中、明瞭且つ簡潔な明細書が書かれるように実施態様を参照して開示を説明した。本開示から離れずに実施態様の様々な組合せまたは分割が可能であると理解される。
【００４１】
特に断りのない限り、本明細書中で使用される全ての科学技術用語は、（例えば細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術、および生化学における）当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。分子的、遺伝学的、および生化学的方法（全般的には、参照により本明細書に援用するSambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.参照）および化学的方法の標準的な技術が用いられる。
【００４２】
免疫グロブリン：本発明において、「免疫グロブリン」とは、抗体分子の免疫グロブリンの折り畳み特性を保持しており、２つのβシートおよび典型的には保存されたジスルフィド結合を含む、ポリペプチドのファミリーを指す。
【００４３】
ドメイン：本発明において、「ドメイン」とは、タンパク質の残部とは独立してその三次構造を保持している折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般的に、ドメインは、タンパク質の個別の機能的特性を担い、多くの場合、タンパク質および／またはドメインの残部の機能を失わずに他のタンパク質に付加、除去、または移行することができる。単一抗体可変ドメインまたは免疫グロブリン単一可変ドメインとは、抗体可変ドメインの特徴的な配列を含んでなる折り畳まれたポリペプチドドメインを意味する。したがって、これには、完全抗体可変ドメインおよび改変可変ドメイン、例えば抗体可変ドメインに特徴的でない配列で１または複数のループが置換されたもの、あるいは切断されたまたはＮもしくはＣ末端延長部を含んでなる抗体可変ドメイン、および全長ドメインの結合活性および特異性を少なくとも一部保持している可変ドメインの折り畳まれた断片が含まれる。
【００４４】
免疫グロブリン単一可変ドメイン：「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という語句は、異なるまたは他のＶ領域またはドメインとは独立して抗原またはエピトープに特異的に結合する（すなわち一価の）抗体可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）または結合ドメインを指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合に必要でない（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインが追加的な可変ドメインとは独立して抗原に結合する）他の可変領域または可変ドメインとのフォーマット（例えば、ホモまたはヘテロ多量体）で存在し得る。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」とは、本発明で使用される場合、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」である。「単一抗体可変ドメイン」または「抗体単一可変ドメイン」とは、本発明で使用される場合、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、一つの実施態様ではヒト抗体可変ドメインであるが、げっ歯類（例えば、その全体を参照により本明細書に援用する国際公開第００／２９００４号に開示されている）、テンジクザメ、およびラクダ科動物ＶＨＨ  ｄＡｂ等の、他の種に由来する単一抗体可変ドメインも含む。ラクダ科動物ＶＨＨは、天然で軽鎖を欠いた重鎖抗体を生産するラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含む種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。ＶＨＨはヒト化され得る。
【００４５】
本開示の全ての側面において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、独立して、抗体重鎖および軽鎖単一可変ドメイン、例えばＶＨ、ＶＬ、およびＶＨＨから選択される。
【００４６】
本発明において、「抗体」とは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥまたは断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（Ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド架橋Ｆｖ、ｓｃＦｖ、閉構造多特異性抗体、ジスルフィド架橋ｓｃＦｖ、二特異性抗体）を指し、抗体を自然に産生する任意の種に由来するものであるかによらず、組換えＤＮＡ技術で作製されたものであるかによらず、例えば血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母、または細菌から単離されたものであるかによらない。
【００４７】
抗体フォーマット：一つの実施態様では、本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、またはリガンドは任意の抗体フォーマットで提供され得る。本発明において、「抗体フォーマット」とは、１または複数の抗体可変ドメインが抗原特異的な結合を構造に付与するように組み込まれ得る任意の好適なポリペプチド構造を指す。種々の好適な抗体フォーマットが当該技術分野で公知であり、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、上記のいずれかの抗原結合性断片（例えば、Ｆｖ断片（例えば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（Ａｂ’）２断片）、単一抗体可変ドメイン（例えば、ｄＡｂ、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）、および上記のいずれかの改変バージョン（例えば、ポリエチレングリコールもしくは他の好適なポリマーまたはヒト化ＶＨＨの共有結合により改変されている）が挙げられる。一つの実施態様では、別の抗体フォーマットとして、好適なタンパク質足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）または骨格上に本開示に係る任意の分子のＣＤＲをグラフトできる代替的足場、例えばアフィボディ、ＳｐＡ足場、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、アビマー（例えば、米国特許出願公開第２００５／００５３９７３、同第２００５／００８９９３２号、同第２００５／０１６４３０１号参照）、またはＥＧＦドメインが含まれる。更に、リガンドは、本明細書に記載されているように、二価（ヘテロ二価）であっても多価（ヘテロ多価）であってもよい。別の実施態様では、「普遍的フレームワーク」が用いられ得、ここで「普遍的フレームワーク」とは、Kabat(“Sequences of Proteins of Immunological Interest”, US Department of Health and Human Services）により定義されるように配列中で保存されている抗体の領域に対応するまたはChothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917に定義されるようにヒト生殖系列免疫グロブリンのレパートリーもしくは構造に対応する単一抗体フレームワーク配列を指す。本開示は、超可変領域のみの変更を介して事実上あらゆる結合特異性を誘導できることが見出されている単一フレームワークまたはそのようなフレームワークのセットの使用を提供する。
【００４８】
本開示全体を通して記載される本発明の実施態様中、本開示のペプチドまたはリガンド中で抗ＴＧＦベータＲＩＩ「ｄＡｂ」を使用する代わりに、当業者は、ＴＧＦベータＲＩＩに結合する本開示のｄＡｂのＣＤＲの１つ以上または３つ全てを含んでなるポリペプチドまたはドメイン（例えば、アフィボディ、ＳｐＡ足場、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、またはＥＧＦドメイン等の好適なタンパク質足場または骨格にグラフトされたＣＤＲ）を使用できると考えられる。したがって、本開示は全体的に、ｄＡｂの代わりにそのようなドメインを用いたポリペプチドの開示を提供すると解釈されるべきである。この点で、参照によりその開示を援用する国際公開第２００８０９６１５８号を参照されたい。
【００４９】
一つの実施態様では、抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは、任意の好適な免疫グロブリン可変ドメインであり、場合によって、ヒト可変ドメインであり、またはヒトフレームワーク領域（例えば、ＤＰ４７またはＤＰＫ９フレームワーク領域）を含んでなるもしくはこれに由来する可変ドメインである。
【００５０】
抗原：本発明において、「抗原」とは、本開示に係る結合ドメインによって結合される分子である。典型的には、抗原は、抗体リガンドに結合され、インビボで抗体反応を惹起することができる。これは、例えばポリペプチド、タンパク質、核酸等の分子であり得る。
【００５１】
エピトープ：「エピトープ」とは、慣例的に免疫グロブリンＶＨ／ＶＬ対によって結合される構造単位である。エピトープは、抗体の最小結合部位を定義するものであり、したがって、抗体の特異性の標的を表す。単一ドメイン抗体の場合、エピトープは、単離された状態の可変ドメインに結合される構造単位を表す。
【００５２】
結合：典型的には、特異的結合は、５０ナノモル以下、場合によっては２５０ピコモル以下の解離定数（Ｋｄ）により示される。抗原またはエピトープに対する抗原結合タンパク質の特異的結合は、好適なアッセイ、例えばスキャッチャード分析および／または競合結合測定法、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡおよびサンドイッチ競合アッセイ、並びにその種々の変更例によって測定することができる。
【００５３】
結合親和性：結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）およびＢＩＡＣＯＲＥ（商標）（Karlsson et al., 1991）を用いて、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システム（ウプサラ、スウェーデン）を用いて、必要に応じて測定される。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システムは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、Welford K. 1991, Opt. Quant. Elect. 23:1; Morton and Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268）を用いて生体分子相互作用をリアルタイムで監視し、３００ｎｍまで離れた表面の屈折率変化により生じるガラス支持体上の金薄膜表面での光の共鳴角度の変化を検出できる表面プラズモン共鳴を用いる。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析では、便利なことに、会合速度定数、解離速度定数、平衡解離定数、および親和性定数が得られる。結合親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）表面プラズモン共鳴システム（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）社）を用いて会合および解離速度定数を評価することにより得られる。メーカー（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））の取扱説明書に従い、バイオセンサーチップを作動させて標的を共有結合させる。次いで、標的を希釈し、チップに注入して、固定化材料の応答単位でシグナルを得る。応答単位（ＲＵ）で表されるシグナルは固定化材料の質量に比例するので、これは、マトリックス上の固定化標的密度の範囲を表す。解離データを一部位モデルに当てはめてｋｏｆｆ±ｓ．ｄ．（測定の標準偏差）を得る。各解離曲線に関して擬一次速度定数（Ｋｄ）を算出し、タンパク質濃度に対してプロットして、ｋｏｎ±ｓ．ｅ．（当てはめの標準誤差）を得る。結合の平衡解離定数（Ｋｄ）は、ＳＰＲ測定値からｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算される。
【００５４】
本開示の別の側面は、ヒトＴＧＦベータＲＩＩに特異的に結合する抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一つの実施態様では、可変ドメインは、約５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ以下、場合によっては約９、８、７、６、または５ｎＭ以下、場合によっては約４ｎＭ以下、約３ｎＭ以下、約２ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、場合によっては約５００ｐＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でヒトＴＧＦベータＲＩＩに結合する。好ましくは、可変ドメインの平衡解離定数が約５０ｎＭ〜５００ｐＭである場合、これは肺等の目的の組織への局所投与に特に好ましい。この実施態様では、高濃度のそのような「中親和性」の結合物質が有効な治療薬として提供され得る。別の実施態様では、可変ドメインは、約５００ｐＭ以下、場合によって約４５０ｐＭ、４００ｐＭ、３５０ｐＭ、３００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ以下、場合によって約４０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でヒトＴＧＦベータＲＩＩに結合する。好ましくは、可変ドメインの解離定数が約５００ｐＭ〜１０ｐＭである場合、これは、目的の任意の１つの組織における量が有効な治療を与えるのに十分であるような全身投与に特に適している。この実施態様では、低濃度のそのような「高親和性」結合物質が有効な治療薬として提供され得る。
【００５５】
一つの実施態様では、本開示の単一可変ドメインは、ヒトＴＧＦベータＲＩＩと別の種のＴＧＦベータＲＩＩ、例えばマウスＴＧＦベータＲＩＩとの間で交差反応性を示す。この実施態様では、可変ドメインはヒトおよびマウスのＴＧＦベータＲＩＩに特異的に結合する。薬剤開発では通常、薬物をヒトで試験する前にマウス系におけるリード薬物候補の試験が必要であるので、これは特に有用である。ヒトおよびマウスの種に結合できる薬物を提供することにより、これらの系における結果を試験し、同じ薬物を用いたデータを並べて比較することが可能になる。これにより、マウスＴＧＦベータＲＩＩに対して働く薬物およびヒトＴＧＦベータＲＩＩに対して働く別個の薬物を発見する必要があるという厄介な問題が回避され、同一でない薬物を用いたヒトおよびマウスにおける結果を比較する必要も回避される。イヌまたはカニクイザル等のサルなどの疾患モデルで用いられる他の種間の交差反応性も予測される。
【００５６】
必要に応じて、免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくともマウスＴＧＦベータＲＩＩに対する結合親和性とヒトＴＧＦベータＲＩＩに対する結合親和性の差は１０倍以下、５０倍以下、または１００倍以下である。
【００５７】
ＣＤＲ：本明細書に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｄＡｂ）は相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を含む。ＣＤＲおよびフレームワーク（ＦＲ）領域の位置並びにナンバリングシステムはKabat et al.（Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)）に定義されている。本明細書に開示されているＶＨ（ＣＤＲＨ１等）およびＶＬ（ＣＤＲＬ１等）（Ｖκ）  ｄＡｂのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）のアミノ酸配列は、周知のKabatのアミノ酸ナンバリングシステムおよびＣＤＲの定義に基づいて当業者に容易に明らかになる。配列可変性に基づく最も一般的に使用される方法であるＫａｂａｔのナンバリングシステムによれば、重鎖ＣＤＲ−Ｈ３は種々の長さを有し、挿入は、Ｋまでの文字を用いて残基Ｈ１００およびＨ１０１の間でナンバリングされる（すなわち、Ｈ１００、Ｈ１００Ａ．．．Ｈ１００Ｋ、Ｈ１０１）。あるいは、ＣＤＲは、Chothiaのシステム（構造的ループ領域の位置に基づく）（(Chothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p877-883）を用いるか、ＡｂＭ法（ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの折衷案）に従うか、Ｃｏｎｔａｃｔ法（結晶構造および抗原との接触残基の予測に基づく）に従い、以下のように決定することができる。ＣＤＲの好適な決定方法についてはhttp://www.bioinf.org.uk/abs/を参照されたい。
【００５８】
各残基がナンバリングされた後、以下のＣＤＲ定義を適用することができる：
Kabat：
ＣＤＲ  Ｈ１：３１〜３５／３５Ａ／３５Ｂ
ＣＤＲ  Ｈ２：５０〜６５
ＣＤＲ  Ｈ３：９５〜１０２
ＣＤＲ  Ｌ１：２４〜３４
ＣＤＲ  Ｌ２：５０〜５６
ＣＤＲ  Ｌ３：８９〜９７
Chothia：
ＣＤＲ  Ｈ１：２６〜３２
ＣＤＲ  Ｈ２：５２〜５６
ＣＤＲ  Ｈ３：９５〜１０２
ＣＤＲ  Ｌ１：２４〜３４
ＣＤＲ  Ｌ２：５０〜５６
ＣＤＲ  Ｌ３：８９〜９７
AbM：
（Kabatナンバリング使用）：              （Chothiaナンバリング使用）：
ＣＤＲ  Ｈ１：２６〜３５／３５Ａ／３５Ｂ        ２６〜３５
ＣＤＲ  Ｈ２：５０〜５８                            −
ＣＤＲ  Ｈ３：９５〜１０２                          −
ＣＤＲ  Ｌ１：２４〜３４                            −
ＣＤＲ  Ｌ２：５０〜５６                            −
ＣＤＲ  Ｌ３：８９〜９７                            −
Contact：
（Kabatナンバリング使用）：              （Chothiaナンバリング使用）：
ＣＤＲ  Ｈ１：３０〜３５／３５Ａ／３５Ｂ        ３０〜３５
ＣＤＲ  Ｈ２：４７〜５８                            −
ＣＤＲ  Ｈ３：９３〜１０１                          −
ＣＤＲ  Ｌ１：３０〜３６                            −
ＣＤＲ  Ｌ２：４６〜５５                            −
ＣＤＲ  Ｌ３：８９〜９６                            −
（「−」はＫａｂａｔと同じナンバリングを意味する）
【００５９】
したがって、当業者は、本明細書に概説する種々の方法を用いて、与えられた単一可変ドメイン配列、例えば配列番号１〜３８、２０４、２０６、２０８、２１４、２３４、２３６、２３８、２４０、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、および２８７のいずれかに記載された配列を有するものから、それらの中にどのＣＤＲ配列が含まれているかを推定することができる。例えば、与えられた単一可変ドメイン配列（例えば配列番号１）から、当業者は、上記のＣＤＲ定義法のいずれか１つまたは組合せを用いて、その中に含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を決定することができる。ＫａｂａｔのＣＤＲ定義を用いる場合、当業者は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列がそれぞれ配列番号７７、１１３、および１４９に記載のものであると決定することができる。好ましくは、ＣＤＲ配列は、本明細書に記載のＫａｂａｔの方法を用いて決定される。一つの実施態様では、各配列のＣＤＲ配列は表１、２、９、および１３に記載のものである。一つの実施態様では、ＣＤＲ１配列は、配列番号７７〜１１２、２４１、２４４、２４７、および２５０から選択されるＣＤＲ１配列である。一つの実施態様では、ＣＤＲ２配列は、配列番号１１３〜１４８、２４２、２４５、２４８、および２５１から選択されるＣＤＲ２配列である。一つの実施態様では、ＣＤＲ３配列は、配列番号１４９〜１８４、２４３、２４６、２４９、および２５２から選択されるＣＤＲ３配列である。
【００６０】
ＣＤＲバリアントまたはバリアント結合単位は、少なくとも１つのアミノ酸で改変されたアミノ酸配列を含み得、前記改変は、アミノ酸配列の化学的または部分的変化（例えば１０アミノ酸以下）であり、この改変は、バリアントが非改変配列の生物学的特徴を保持するのを許す。例えば、バリアントは、ＴＧＦベータＲＩＩに特異的に結合する機能的バリアントである。ＣＤＲアミノ酸配列の部分的変化は、１〜数個のアミノ酸の欠失もしくは置換または１〜数個のアミノ酸の付加もしくは挿入またはその組合せによるものであり得る（例えば１０アミノ酸以下）。ＣＤＲバリアントまたは結合単位バリアントは、アミノ酸配列中に１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸の置換、付加、または欠失を任意の組合せで含み得る。ＣＤＲバリアントまたは結合ユニットバリアントは、アミノ酸配列中に１、２、または３個のアミノ酸の置換、挿入、または欠失を任意の組合せで含み得る。アミノ酸残基の置換は保存的置換、例えば１つの疎水性アミノ酸による別の疎水性アミノ酸の置換であり得る。例えば、ロイシンがバリンまたはイソロイシンで置換され得る。
【００６１】
ＴＧＦベータＲＩＩ：本発明において、「ＴＧＦベータＲＩＩ」（ＩＩ型形質転換増殖因子ベータ受容体；ＴＧＦβＲＩＩ）とは、天然または内因性の哺乳動物ＴＧＦベータＲＩＩタンパク質および対応する天然または内因性の哺乳動物ＴＧＦベータＲＩＩタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質（例えば、組換えタンパク質、合成（すなわち、合成有機化学の方法を用いて製造された）タンパク質）を指す。したがって、本明細書中で定義されるように、この用語は、成熟ＴＧＦベータＲＩＩタンパク質、多型またはアレルバリアント、およびＴＧＦベータＲＩＩのその他のアイソフォーム、並びに上記の改変または非改変形態（例えば、脂質付加、糖化）を含む。天然または内因性のＴＧＦベータＲＩＩには、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類）中で自然に生じる野生型タンパク質、例えば成熟ＴＧＦベータＲＩＩ、多型、またはアレルバリアント並びにその他のアイソフォームおよび変異体形態が含まれる。そのようなタンパク質は、例えばＴＧＦベータＲＩＩを天然に発現している供給源から回収または単離することができる。これらのタンパク質および対応する天然または内因性ＴＧＦベータＲＩＩと同じアミノ酸配列を有するタンパク質は、対応する哺乳動物の名称で言及される。例えば、対応する哺乳動物がヒトである場合、タンパク質はヒトＴＧＦベータＲＩＩと命名される。ヒトＴＧＦベータＲＩＩは、例えばLin, et al., Cell 1992, Vol. 68(4), p.775-785およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ８５０７９に記載されている。
【００６２】
ヒトＴＧＦベータＲＩＩは、約１５９アミノ酸の細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、シグナル伝達のためのタンパク質キナーゼドメインを含んでなる細胞質ドメインとを有する５６７アミノ酸からなる膜貫通受容体である。
【００６３】
本発明において「ＴＧＦベータＲＩＩ」はＴＧＦベータＲＩＩの一部または断片も包含する。一つの実施態様では、そのような一部または断片には、ＴＧＦベータＲＩＩの細胞外ドメインまたはその一部が含まれる。
【００６４】
免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンド、融合タンパク質等に関連した「抗ＴＧＦベータＲＩＩ」とは、ＴＧＦベータＲＩＩを認識してこれに結合する部分を意味する。一つの実施態様では、「抗ＴＧＦベータＲＩＩ」はタンパク質ＴＧＦベータＲＩＩおよび好ましくはヒトＴＧＦベータＲＩＩを特異的に認識し且つ／またはこれに特異的に結合する。別の実施態様では、本開示に係る抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインはマウスＴＧＦベータＲＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２９５７５；例えばMassague et al., Cell 69 (7), 1067-1070 (1992)に記載）にも結合する。
【００６５】
「ＴＧＦベータ」はＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、およびＴＧＦベータ３等のアイソフォームを含む。
【００６６】
ＴＧＦベータはＴＧＦベータＲＩＩに結合し、ＴＧＦベータＲＩとの複合体の状態でシグナル伝達経路を開始させる。したがって、ＴＧＦベータ活性およびＴＧＦベータ活性の阻害または中和は、ＴＧＦベータシグナル伝達のアウトプットを測定する任意のアッセイにより測定することができる。ＴＧＦベータシグナル伝達は、例えばItoh, et al., Eur. J. Biochem 2000, Vol. 267, p.6954；Dennler, et al., Journal of Leucocyte Biol. 2002, 71(5), p. 731-40に概括されている。したがって、ＴＧＦベータ活性は、当業者に知られた複数の異なるアッセイで試験することができる。「阻害」または「中和」とは、本開示の免疫グロブリン単一可変ドメインの存在下において、そのような免疫グロブリン単一可変ドメイン非存在下のＴＧＦベータ活性と比べてＴＧＦベータの生物学的活性が完全または部分的に低減することを意味する。
【００６７】
一つの実施態様では、ＴＧＦベータ活性の阻害または中和はＩＬ−１１放出アッセイで試験される。この実施態様では、本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメインの能力を、ヒトＴＧＦベータ１（ＴＧＦベータ１；ＴＧＦ−β１）で刺激されるＡ５４９細胞等の細胞からのＩＬ−１１放出を阻害する能力について試験する。ＴＧＦベータ１（ＴＧＦ−β１）はＴＧＦベータＲＩＩ（ＴＧＦ−βＲＩＩ）に直接結合して、ＴＧＦベータＲＩ／ＲＩＩ（ＴＧＦ−βＲＩ／ＩＩ）複合体の構築を誘導する。ＴＧＦベータＲＩ（ＴＧＦ−βＲＩ）はリン酸化され、Ｓｍａｄ４経路を含む複数の経路を介してシグナルを伝達することができる。Ｓｍａｄ４経路が活性化される結果、ＩＬ−１１が放出される。ＩＬ−１１は細胞上清中に分泌され、次いで比色ＥＬＩＳＡにより測定される。Ｒ＆Ｄシステムズ社により供給されているＨｕｍａｎ  ＩＬ−１１  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡアッセイキット（ｒｅｆ．Ｄ１１００）等の好適なＩＬ−１１放出アッセイが本明細書に記載されている。
【００６８】
別の実施態様では、ＴＧＦベータ活性は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ルシフェラーゼアッセイにおいてＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞でＴＧＦベータにより誘導されるＣＡＧＡ−ルシフェラーゼの発現を本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメインが阻害する能力についてアッセイで試験される。ＣＡＧＡボックスと名付けられたＴＧＦベータ応答性配列モチーフがヒトＰＡＩ−１プロモーター中に３コピー存在し、Ｓｍａｄ３および４タンパク質に特異的に結合する。マルチコピーのＣＡＧＡボックスをルシフェラーゼレポーターコンストラクト中にクローニングすると、レポーターシステムでトランスフェクトされた細胞にＴＧＦベータ応答性が付与される。好適なアッセイの１つは、本明細書に記載されており、［ＣＡＧＡ］１２−ルシフェラーゼレポーターコンストラクトで安定的にトランスフェクトされたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（マウス骨芽細胞）を用いる。（Dennler, et al., (1998) EMBO J. 17, 3091-3100）。
【００６９】
その他の好適なアッセイとしては、ヒトＳＢＥベータ−ラクタマーゼ細胞アッセイ（インビトロジェン（登録商標）社、細胞センサーアッセイ）が含まれる。好適なアッセイの例が本明細書中に記載されている。
【００７０】
好ましくは、本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンド、または融合タンパク質自体はＴＧＦベータＲＩＩ受容体シグナル伝達を活性化しない。したがって、一つの実施態様では、本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンド、または融合タンパク質は１０μＭでアゴニスト活性を有さない。アゴニスト活性は、ＴＧＦベータ非存在下で本明細書に記載されているＴＧＦベータＲＩＩアッセイで目的の化合物を試験することにより測定することができる。ＴＧＦベータが存在しない場合、ＴＧＦベータＲＩＩシグナル伝達を検出することにより目的の化合物のアゴニスト活性が検出される。
【００７１】
相同性：本明細書に開示されている配列と類似または相同な配列（例えば、少なくとも約７０％の配列同一性）も本開示の一部である。いくつかの実施態様では、アミノ酸レベルでの配列同一性は、約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上であり得る。核酸レベルでは、配列同一性は約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上であり得る。あるいは、選択的ハイブリダイゼーション条件（例えば、超高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件）下で核酸セグメントがその鎖の相補体にハイブリダイズする場合、実質的同一性が存在する。核酸は、細胞全体中、細胞可溶化物中、または一部精製されたもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。
【００７２】
本発明において、「低ストリンジェンシー」、「中ストリンジェンシー」、「高ストリンジェンシー」、または「超高ストリンジェンシー」条件という用語は、核酸のハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を説明している。ハイブリダイゼーション反応を行うための手引きは、全体を参照により本明細書に援用するCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見出すことができる。この参考文献には水性および非水性の方法が記載されており、いずれを用いることもできる。本明細書中で言及される特異的ハイブリダイゼーション条件は以下の通りである：（１）低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件：約４５℃で、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、次いで少なくとも５０℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で２回洗浄（洗浄温度は低ストリンジェンシー条件では５５℃まで上昇させることができる）；（２）中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件：約４５℃で、６×ＳＳＣ、次いで、６０℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回以上洗浄；（３）高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件：約４５℃で、６×ＳＳＣ中、次いで、６５℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回以上洗浄；および必要に応じて（４）超高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件：６５℃で、０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、次いで、６５℃、０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで１回以上洗浄。超高ストリンジェンシー条件（４）が好ましい条件であり、特に断りのない限り使用されるべき条件である。
【００７３】
２つの配列間の「相同性」、「配列同一性」、または「類似性」（これらの用語は本明細書中で交換可能に使用される）の計算は以下のように行う。配列を最適な比較を目的として整列させる（例えば、最適なアラインメントのために第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップが導入され得、比較目的のために非相同配列は無視され得る）。一つの実施態様では、比較目的のために整列される参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも約３０％、場合によって少なくとも約４０％、場合によって少なくとも約５０％、場合によって少なくとも約６０％、場合によって少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、その位置で分子は同一である（本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」はアミノ酸または核酸の「同一性」と等価である）。２つの配列間の同一性パーセントは、配列が共有する同一な位置の数の関数であり、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要のあるギャップの数および各ギャップの長さが考慮される。
【００７４】
本明細書で定義されるように、アミノ酸およびヌクレオチドの配列アラインメントおよび相同性、類似性、または同一性は、必要に応じて、アルゴリズムＢＬＡＳＴ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅをデフォルトのパラメーターで用いて作製および決定される（Tatusova, T. A. et al.., FEMS Microbiol Lett, 174:187-188 (1999)）。あるいは、パラメーターをデフォルト値に設定したＢＬＡＳＴアルゴリズム（バージョン２．０）を配列アラインメントに用いる。ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）は、プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘで用いられる発見的サーチプログラムである。これらのプログラムはKarlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6):2264-8の統計的方法を用いてそれらの結果に有意性を与える。
【００７５】
リガンド：本発明において、「リガンド」という用語は、ＴＧＦベータＲＩＩへの結合特異性を有する結合部位を有する少なくとも１つのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質部分を含んでなる化合物を指す。リガンドは「結合部分」とも呼ばれ得る。
【００７６】
本開示に係るリガンドまたは結合部位は、場合により、異なる結合特異性を有する免疫グロブリン可変ドメインを含んでなり、標的化合物への結合部位を一緒に形成する可変ドメイン対を含まない（すなわち、ＴＧＦベータＲＩＩへの結合部位を一緒に形成する免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含まない）。場合により、標的への結合特異性を有する結合部位を有する各ドメインは、所望の標的（例えばＴＧＦベータＲＩＩ）への結合特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、免疫グロブリン単一重鎖可変ドメイン（例えば、ＶＨ、ＶＨＨ）、免疫グロブリン単一軽鎖可変ドメイン（例えば、ＶＬ））である。
【００７７】
したがって、「リガンド」は、各免疫グロブリン単一可変ドメインが異なる標的に結合する２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるポリペプチドを包含する。リガンドはまた、本明細書に記載されるように、好適なフォーマット、例えば抗体フォーマット（例えば、ＩｇＧ様フォーマット、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（Ａｂ’）２）または好適なタンパク質足場もしくは骨格、例えばアフィボディ、ＳｐＡ足場、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、ＥＧＦドメイン、アビマーで異なる標的に結合する少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメインまたは単一可変ドメインのＣＤＲ配列を含んでなるポリペプチド並びに二重および多重特異性リガンドを包含する。
【００７８】
標的（例えば、ＴＧＦベータＲＩＩ）への結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチドドメインは、所望の標的への結合部位を含んでなるタンパク質ドメインであってもよく、例えば、タンパク質ドメインは、アフィボディ、ＳｐＡドメイン、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、アビマーから選択される（例えば、米国特許出願公開第２００５／００５３９７３号、同第２００５／００８９９３２号、同第２００５／０１６４３０１号参照）。所望であれば、「リガンド」は、それぞれ独立してペプチド、ポリペプチド、タンパク質部分、または非ペプチド性部分（例えば、ポリアルキレングリコール、脂質、炭水化物）であり得る１または複数の追加的部分を更に含んでなり得る。例えば、リガンドは、本明細書に記載の半減期延長部分（例えば、ポリアルキレングリコール部分；アルブミン、アルブミン断片、またはアルブミンバリアントを含んでなる部分；トランスフェリン、トランスフェリン断片、またはトランスフェリンバリアントを含んでなる部分；アルブミンに結合する部分、新生児Ｆｃ受容体に結合する部分）を更に含んでなり得る。
【００７９】
競合する：本発明において、「競合する」という用語は、第１の標的（例えば、ＴＧＦベータＲＩＩ）とその同族標的結合ドメイン（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）との結合が、前記同族標的に特異的な第２の結合ドメイン（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）の存在下で阻害されることを意味する。例えば、結合の阻害は、標的へのその親和性または結合力を低減するような例えば結合ドメインの物理的ブロックによりまたは結合ドメインの構造もしくは環境の変化により立体的になされ得る。第１および第２の結合ドメイン間の競合を測定するための競合ＥＬＩＳＡおよび競合ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）実験の実施方法の詳細については、国際公開第２００６０３８０２７号を参照されたい。その詳細を、本開示で用いるための明確な開示を提供するために参照により本明細書に援用する。本開示は、配列番号１〜３８の単一可変ドメインのいずれか１つと競合する抗原結合タンパク質、特に単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンド、および融合タンパク質を含む。特定の実施態様では、配列番号１〜３８の単一可変ドメインのいずれか１つと競合し、ＴＧＦベータＲＩＩに対するＫＤが５０ｎＭ以下である、ＴＧＦベータＲＩＩ結合タンパク質が提供される。特定の実施態様では、ＫＤは１０ｐＭ〜５０ｎＭである。特定の実施態様では、ＫＤは１０ｐＭ〜１０ｎＭである。特定の実施態様では、ＫＤは１００ｐＭ〜１０ｎＭである。特定の実施態様では、ＫＤは約１００ｐＭである。
【００８０】
ＴＧＦベータシグナル伝達：好ましくは、本開示の単一可変ドメイン、ポリペプチド、またはリガンドは、ＴＧＦベータＲＩＩを介したＴＧＦベータシグナル伝達を中和することができる。「中和する」とは、ＴＧＦベータの存在がＴＧＦベータＲＩＩシグナル伝達に対して中立的な影響を有するように、ＴＧＦベータの正常なシグナル伝達効果がブロックされることを意味する。中和効果を測定するための好適な方法には、本明細書に記載のＴＧＦベータシグナル伝達用のアッセイが含まれる。一つの実施態様では、中和は、ＴＧＦベータシグナル伝達アッセイにおけるＴＦＧベータ活性の阻害率として観察される。一つの実施態様では、単一可変ドメインまたはポリペプチドは、ＴＧＦベータＲＩＩの細胞外ドメインに結合することにより、ＴＧＦベータがＴＧＦベータＲＩＩの細胞外ドメインに結合するのを阻害／ブロックする。好ましくは、単一可変ドメインまたはポリペプチドは、生物学的に利用可能なＴＧＦベータが過剰にあり、単一可変ドメインまたはポリペプチドがＴＧＦベータとその同族受容体ＴＧＦベータＲＩＩとの結合を阻害することにより生物学的に利用可能なＴＧＦベータのシグナル伝達活性を阻害する役目をする時、有用である。
【００８１】
本発明において、「ＴＧＦベータＲＩＩのアンタゴニスト」または「抗ＴＧＦベータＲＩＩアンタゴニスト」等の用語は、ＴＧＦベータＲＩＩに結合してＴＧＦベータＲＩＩの機能（１または複数）を阻害できる作用物質（例えば、分子、化合物）を指す。例えば、ＴＧＦベータＲＩＩのアンタゴニストは、ＴＧＦベータＲＩＩへのＴＧＦベータの結合および／またはＴＧＦベータＲＩＩを介したシグナル伝達を阻害することができる。したがって、ＴＧＦベータが媒介するプロセスおよび細胞応答をＴＧＦベータＲＩＩのアンタゴニストで阻害することができる。
【００８２】
一つの実施態様では、ＴＧＦベータＲＩＩに結合するリガンド（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）は、≦約１０μＭ、≦約１μＭ、≦約１００ｎＭ、≦約５０ｎＭ、≦約１０ｎＭ、≦約５ｎＭ、≦約１ｎＭ、≦約５００ｐＭ、≦約３００ｐＭ、≦約１００ｐＭ、または≦約１０ｐＭの阻害濃度５０（ＩＣ５０）でＴＧＦベータＲＩＩ受容体へのＴＧＦベータの結合を阻害する。特定の実施態様では、本開示の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインのＩＣ５０は１５μＭ以下である。ＩＣ５０は、必要に応じて、インビトロＴＧＦベータ受容体結合アッセイまたは細胞アッセイ、例えば本明細書に記載のアッセイを用いて決定される。
【００８３】
リガンド（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）は、場合により、好適なインビトロアッセイにおいて、≦約１０μＭ、≦約１μＭ、≦約１００ｎＭ、≦約５０ｎＭ、≦約１０ｎＭ、≦約５ｎＭ、≦約１ｎＭ、≦約５００ｐＭ、≦約３００ｐＭ、≦約１００ｐＭ、≦約１０ｐＭ、≦約１ｐＭ、≦約５００ｆＭ、≦約３００ｆＭ、≦約１００ｆＭ、≦約１０ｆＭの中和用量５０（ＮＤ５０）で、ＴＧＦベータＲＩＩに誘導される機能を阻害することも予期される。特定の実施態様では、本開示の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインは４０％を超えるＴＧＦ−βの中和を達成する。
【００８４】
「二重特異性リガンド」：一つの実施態様では、本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、またはリガンドは、第１の抗原またはエピトープ結合部位（例えば、第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン）と第２の抗原またはエピトープ結合部位（例えば、第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン）とを含んでなるリガンドを指す「二重特異性リガンド」の一部であり得、ここで結合部位または可変ドメインは、単一特異性免疫グロブリンが通常結合しない２つの抗原（例えば、異なる抗原または２コピーの同じ抗原）または同じ抗原上の２つのエピトープに結合することができる。例えば、２つのエピトープは、同じ抗原上であってもよいが、同じエピトープではないか、単一特異性リガンドによって結合されるのに十分な近さでない。一つの実施態様では、本開示に係る二重特異性リガンドは、異なる特異性を有する結合部位または可変ドメインで構成され、同じ特異性を有する相互に相補的な可変ドメイン対（すなわち、ＶＨ／ＶＬ対）を含まない（すなわち、単位結合部位を形成しない）。
【００８５】
一つの実施態様では、「二重特異性リガンド」はＴＧＦベータＲＩＩおよび別の標的分子に結合し得る。例えば、別の標的分子は組織特異的標的分子であり得、その結果、本開示の二重特異性リガンドは、本開示に係る抗ＴＧＦベータＲＩＩポリペプチドまたは免疫グロブリン単一可変ドメインを目的の組織に標的化すること可能にする。そのような組織としては、肺、肝臓等が含まれる。
【００８６】
多重特異性ｄＡｂ多量体も提供される。これは、本開示の任意の側面に係る抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインおよびそれぞれが異なる標的（例えば、ＴＧＦベータＲＩＩ以外の標的）に結合する１または複数の単一可変ドメインを含んでなるｄＡｂ多量体を含む。一つの実施態様では、二特異性ｄＡｂ多量体、例えば、本開示の任意の側面に係る１または複数の抗ＴＧＦベータＲＩＩ免疫グロブリン単一可変ドメインと第２の異なる標的に結合する１または複数のｄＡｂとを含んでなるｄａｂ多量体が提供される。一つの実施態様では、三重特異性ｄＡｂ多量体が提供される。
【００８７】
本開示のリガンド（例えば、ポリペプチド、ｄＡｂ、およびアンタゴニスト）は、第２の免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合した第１の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む融合タンパク質としてフォーマット化され得る。所望であれば、そのようなフォーマットは半減期延長部分を更に含んでなってよい。例えば、リガンドは、血清アルブミンに結合する免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合した第２の免疫グロブリン単一可変ドメインに直接融合した第１の免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなり得る。
【００８８】
一般的に、標的への結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチドドメインの配向およびリガンドがリンカーを含むかどうかは設計上の選択の問題である。しかし、いくつかの配向は、リンカーの有無に関わらず、他の配向より良好な結合特性を提供し得る。全ての配向（例えば、ｄＡｂ１−リンカー−ｄＡｂ２；ｄＡｂ２−リンカー−ｄＡｂ１）が本開示に包含され、所望の結合特性を提供する配向を含むリガンドをスクリーニングにより容易に同定することができる。
【００８９】
本開示に係るポリペプチドおよびｄＡｂ、例えばｄＡｂ単量体、二量体、および三量体は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの一方または両方と必要に応じてヒンジ領域とを含んでなる抗体Ｆｃ領域に連結することができる。例えば、単一ヌクレオチド配列としてＦｃ領域に連結されたリガンドをコードするベクターを用いてそのようなポリペプチドを調製することができる。一つの実施態様では、ｄＡｂ−Ｆｃ融合体が提供される。
【００９０】
本開示は更に、前述のｄＡｂ単量体の二量体、三量体、および多量体を提供する。
【００９１】
標的：本発明において、「標的」という語句は、結合部位を有するポリペプチドドメインが結合できる生物学的分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物）を指す。標的は、例えば、細胞内標的（例えば、細胞内タンパク質標的）、可溶性標的（例えば、分泌型）、または細胞表面標的（例えば、膜タンパク質、受容体タンパク質）であり得る。一つの実施態様では、標的はＴＧＦベータＲＩＩである。別の実施態様では、標的はＴＧＦベータＲＩＩ細胞外ドメインである。
【００９２】
相補的：本発明において、「相補的」とは、２つの免疫グロブリンドメインが、同族の対または群を形成する構造のファミリーに属するか、そのようなファミリーに由来し、その特徴を保持している場合を指す。例えば、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインは相補的であり、２つのＶＨドメインは相補的でなく、２つのＶＬドメインは相補的でない。相補的ドメインは、Ｔ細胞受容体のＶαおよびＶβ（またはγおよびδ）ドメイン等、免疫グロブリンスーパーファミリーのその他のメンバー中に見出され得る。そうなるように設計されない限りエピトープに結合しないタンパク質足場を基礎にしたドメイン等の人工的ドメインは非相補的である。同様に、（例えば）免疫グロブリンドメインおよびフィブロネクチンドメインを基礎にした２つのドメインも相補的でない。
【００９３】
「親和性」および「結合力（ａｖｉｄｉｔｙ）」は結合相互作用の強度を説明する専門用語である。本開示のリガンドに関して、結合力とは、細胞上の標的（例えば、第１の標的と第２の標的）とリガンドとの間の結合の全体的強度を指す。結合力は、個々の標的に対する個々の親和性の和より大きい。
【００９４】
核酸分子、ベクター、および宿主細胞：本開示は、本明細書に記載のリガンド（単一可変ドメイン、融合タンパク質、ポリペプチド、二重特異性リガンド、および多重特異性リガンド）をコードする単離および／または組換え核酸分子も提供する。
【００９５】
本明細書中において「単離（された）」として言及される核酸は、（例えば、それが細胞中にまたはライブラリー等の核酸混合物中に存在する場合）その供給起源のゲノムＤＮＡまたは細胞ＲＮＡの核酸から分離された核酸であり、本明細書に記載の方法または他の好適な方法で得られた核酸、例えば本質的に純粋な核酸、化学合成により、生物学的方法と化学的方法との組合せにより生成された核酸、および単離された組換え核酸を含む（例えば、Daugherty, B.L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471 2476 (1991)；Lewis, A.P. and J.S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)参照）。
【００９６】
本明細書中において「組換え」として言及される核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／または制限酵素を用いたベクターへのクローニング等の人為的組換え法に基づく方法で作製された核酸等の、組換えＤＮＡ技術により生成された核酸である。
【００９７】
特定の実施態様では、単離および／または組換え核酸は、本明細書に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、またはリガンドをコードするヌクレオチド配列を含んでなり、前記リガンドは、本明細書に開示のＴＧＦベータＲＩＩに結合するｄＡｂのアミノ酸配列（例えば、配列番号１〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列）と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。ヌクレオチド配列同一性は、選択された抗ＴＧＦベータＲＩＩ  ｄＡｂをコードするヌクレオチド配列の全長に関して決定され得る。一つの実施態様では、核酸配列は、配列番号３９〜６６のいずれか１つと少なくとも８０％同一の核酸配列を含んでなるまたはからなる。一つの実施態様では、核酸配列は配列番号３９〜７６のいずれか１つの核酸配列を含んでなるまたはからなる。
【００９８】
本開示の一つの実施態様は、例えば細菌、哺乳動物、または酵母細胞中での発現に最適化された、本明細書に開示のポリペプチドおよび可変ドメインをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列も提供する。
【００９９】
本開示は、本開示の組換え核酸分子を含んでなるベクターも提供する。特定の実施態様では、ベクターは、本開示の組合え核酸に作動可能に連結された１または複数の発現調節エレメントまたは配列を含んでなる発現ベクターである。本開示は、本開示の組換え核酸分子またはベクターを含んでなる組換え宿主細胞も提供する。好適なベクター（例えば、プラスミド、ファージミド）、発現調節エレメント、宿主細胞、および本開示の組換え宿主細胞の作製方法は当該技術分野で周知であり、本明細書中で更に例を記載する。
【０１００】
好適な発現ベクターは、複数の構成要素、例えば複製起源、選択マーカー遺伝子、１もしくは複数の発現調節エレメント、例えば転写調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）、および／または１もしくは複数の翻訳シグナル、シグナル配列、またはリーダー配列等を含み得る。発現調節エレメントおよびシグナル配列は、存在する場合、ベクターまたは他の供給源により提供され得る。例えば、抗体鎖をコードするクローニングされた核酸の転写および／または翻訳調節配列を直接的発現に用いることができる。
【０１０１】
所望の宿主細胞中における発現のためにプロモーターが提供されてよい。プロモーターは構成的であってもよく、誘導性であってもよい。例えば、プロモーターは、核酸の転写を方向付けるように、抗体、抗体鎖、またはその一部をコードする核酸に作動可能に連結され得る。原核宿主用（例えば、大腸菌用のlac、tac、Ｔ３、Ｔ７プロモーター）および真核宿主用（例えば、サルウイルス４０初期または後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター）の種々の好適なプロモーターが利用可能である。
【０１０２】
更に、発現ベクターは典型的には、ベクターを保有する宿主細胞の選択のための選択マーカーと、複製可能な発現ベクターの場合は複製起源とを含んでなる。抗生物質または薬物に対する耐性を付与する生成物をコードする遺伝子が一般的な選択的マーカーであり、原核細胞（例えば、ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、テトラサイクリン耐性用のＴｅｔ遺伝子）および真核細胞（例えば、ネオマイシン（Ｇ４１８またはジェネテシン）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸）、アンピシリン、またはハイグロマイシン耐性遺伝子）で使用され得る。ジヒドロ葉酸還元酵素マーカー遺伝子は、種々の宿主中でメトトレキサートによる選択を可能にする。宿主の栄養要求性マーカーの遺伝子産物をコードする遺伝子（例えば、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３）がしばしば酵母における選択マーカーとして使用される。ウイルスベクター（例えば、バキュロウイルス）またはファージベクター、および宿主細胞のゲノム中に組み込まれることができるベクター、例えばレトロウイルスベクターの使用も予期される。哺乳動物細胞および原核細胞（大腸菌）、昆虫細胞（Drosophila Schnieder  Ｓ２細胞、Ｓｆ９）、および酵母（P. methanolica、P. pastoris、S. cerevisiae）中での発現に好適な発現ベクターは当該技術分野で周知である。
【０１０３】
好適な宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌、枯草菌、および／またはその他の好適な細菌等の細菌細胞；真核細胞、例えば真菌または酵母細胞（例えば、Pichia pastoris、Aspergillus sp.、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Neurospora crassa）、またはその他の下等真核細胞、および高等真核生物の細胞、例えば昆虫（例えば、Drosophila Schnieder Ｓ２細胞、Ｓｆ９昆虫細胞（国際公開第９４／２６０８７号（O'Connor））、哺乳動物（例えば、ＣＯＳ細胞、例えばＣＯＳ−１（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１６５０）およびＣＯＳ−７（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１６５１）、ＣＨＯ（例えば、ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−９０９６、ＣＨＯ  ＤＧ４４（Urlaub, G. and Chasin, LA., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77(7):4216-4220 (1980)））、２９３（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５７３）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＣＬ−２）、ＣＶ１（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＣＬ−７０）、ＷＯＰ（Dailey, L., et al., J. Virol., 54:739-749 (1985)、３Ｔ３、２９３Ｔ（Pear, W. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:8392-8396 (1993)）、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０、ＨｕＴ７８細胞等、または植物（例えば、タバコ）の細胞であり得る（例えば、Ausubel, F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993)参照）。 いくつかの実施態様では、宿主細胞は、単離された宿主細胞であり、多細胞生物（例えば植物または動物）の一部ではない。特定の実施態様では、宿主細胞は非ヒト宿主細胞である。
【０１０４】
本開示は、本開示のリガンド（例えば、二重特異性リガンド、多重特異性リガンド）を生成する方法であって、本開示の組換え核酸を含んでなる組換え宿主細胞を、組換え核酸の発現に適した条件下に維持することにより、組換え核酸が発現され、リガンドが生成されることを含んでなる、方法も提供する。いくつかの実施態様では、方法は、リガンドを単離することを更に含んでなる。
【０１０５】
本開示の実施態様に応用可能な開示の詳細について、国際公開第２００７０８５１５号１６１頁２４行目〜１８９頁１０行目を参照する。この開示を、本開示の本文中に明示的に現れ且つ本開示の実施態様に関連する場合のように参照により本明細書に援用し、請求項中に組み込まれる開示の明示的裏付けを提供する。これは、「免疫グロブリンベースのリガンドの調製」、「ライブラリーベクターシステム」、「ライブラリー構築」、「単一可変ドメインの組合せ」、「リガンドの特徴解析」、「リガンドの構造」、「骨格」、「タンパク質足場」、「リガンド構築に使用するための足場」、「基準配列の多様化」、および「治療および診断用の組成物および使用」の詳細並びに「作動可能に連結された」、「ナイーブ」、「防止」、「抑制」、「処置」、「アレルギー性疾患」、「Ｔｈ２により媒介される疾患」、「治療有効用量」、および「有効な」の定義を提供する国際公開第２００７０８５１５号１６１頁２４行目〜１８９頁１０行目に示される開示を含む。
【０１０６】
「半減期」という語句は、例えば天然の機序によるリガンドの分解および／またはリガンドのクリアランスもしくは隔離により、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、またはリガンドの血清濃度がインビボで５０％低減するのにかかる時間を指す。本開示のリガンドは、分解および／またはクリアランスもしくは隔離に対して抵抗性の分子に結合することにより、インビボで安定化されてその半減期が延長され得る。典型的には、そのような分子は、それ自体がインビボで長い半減期を有する天然のタンパク質である。リガンドの半減期は、半減期延長分子に特異的でない同様なリガンドよりも長い期間その機能的活性がインビボで存続する場合、延長されている。したがって、ＨＳＡおよび標的分子に特異的なリガンドと、ＨＳＡに対する特異性はない（すなわちＨＳＡに結合しない）が別の分子には結合する同じリガンドとを比較する。典型的には、半減期は１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれ以上延長される。半減期の２×、３×、４×、５×、１０×、２０×、３０×、４０×、５０×、またはそれ以上の延長が可能である。あるいは、またはそれに加えて、半減期の３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、１００×、１５０×までの延長が可能である。
【０１０７】
フォーマット：半減期延長は、免疫グロブリン、具体的には抗体、最も具体的には小サイズの抗体断片のインビボ適用に有用であり得る。そのような断片（Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ）は一般的に、体から急速にクリアランスされる。本開示に係るｄＡｂ、ポリペプチド、またはリガンドは、インビボでの半減期が延びることにより体内でのリガンドの機能的活性の持続時間が長くなるように適合され得る。
【０１０８】
薬物動態分析およびリガンド半減期決定の方法は当業者に周知である。詳細はKenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996)に見出すことができる。更に、薬物動態パラメーター、例えばｔアルファおよびｔベータ半減期並びに曲線下面積（ＡＵＣ）を記載している“Pharmacokinetics”, M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982)も参照する。
【０１０９】
半減期（ｔ１／２アルファおよびｔ１／２ベータ）およびＡＵＣは、時間に対するリガンド血清濃度の曲線から決定することができる。例えばＷＩＮＮＯＮＬＩＮ（商標）分析パッケージ（ファーサイト社（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．）、マウンテンビュー、ＣＡ９４０４０、米国から入手可能）を用いて曲線をモデル化することができる。第１相（アルファ相）では、幾分排除されつつ主に患者内でリガンドが分布される。第２相（ベータ相）は、リガンドが分布されて、リガンドが患者から排除されるにつれて血清濃度が低減していく最終相である。ｔアルファ半減期は第１相の半減期であり、ｔベータ半減期は第２相の半減期である。したがって、一つの実施態様では、本開示は、ｔα半減期の範囲が１５分以上である本開示に係るリガンドまたはリガンドを含んでなる組成物を提供する。一つの実施態様では、範囲の下端は３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１１時間、または１２時間である。更に、またはそれに代えて、本開示に係るリガンドまたは組成物のｔα半減期の範囲は１２時間まで（１２時間を含む）である。一つの実施態様では、範囲の上端は１１、１０、９、８、７、６、または５時間である。好適な範囲の例は１〜６時間、２〜５時間、または３〜４時間である。
【０１１０】
一つの実施態様では、本開示は、ｔβ半減期の範囲が約２．５時間以上である本開示に係るリガンド（ポリペプチド、ｄＡｂ、またはアンタゴニスト）またはリガンドを含んでなる組成物を提供する。一つの実施態様では、範囲の下端は約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約１０時間、約１１時間、または約１２時間である。更に、あるいはそれに代えて、本開示に係るリガンドまたは組成物のｔβ半減期の範囲は２１日まで（２１日を含む）である。一つの実施態様では、範囲の上端は約１２時間、約２４時間、約２日、約３日、約５日、約１０日、約１５日、または約２０日である。一つの実施態様では、本開示のリガンドまたは組成物のｔβ半減期の範囲は約１２〜約６０時間である。別の実施態様では、これは約１２〜約４８時間である。更に別の実施態様では、これは約１２〜約２６時間である。
【０１１１】
上記基準に加えて、またはそれに代えて、本開示は、ＡＵＣ値（曲線下面積）の範囲が約１ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌである、本開示に係るリガンドまたはリガンドを含んでなる組成物を提供する。一つの実施態様では、範囲の下端は約５、約１０、約１５、約２０、約３０、約１００、約２００、または約３００ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌである。更に、またはそれに代えて、本開示に係るリガンドまたは組成物のＡＵＣの範囲は約６００ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌまでである。一つの実施態様では、範囲の上端は約５００、約４００、約３００、約２００、約１５０、約１００、約７５、または約５０ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌである。一つの実施態様では、本開示に係るリガンドのＡＵＣの範囲は以下からなる群から選択される：約１５〜約１５０ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ、約１５〜約１００ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ、約１５〜約７５ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ、および約１５〜約５０ｍｇ・ｍｉｎ／ｍｌ。
【０１１２】
本開示のポリペプチドおよびｄＡｂ並びにこれらを含んでなるアンタゴニストは、例えばＰＥＧ基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体もしくは少なくともそのトランスフェリン結合部分、抗体Ｆｃ領域の付加によりまたは抗体ドメインへのコンジュゲーションにより、より大きな流体力学的サイズを有するようにフォーマット化され得る。例えば、抗体のより大きな抗原結合性断片としてまたは抗体としてフォーマット化された（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（Ａｂ’）２、ＩｇＧ、ｓｃＦｖとしてフォーマット化された）ポリペプチド、ｄＡｂ、およびアンタゴニスト。
【０１１３】
本発明において、「流体力学的サイズ」とは、水溶液中での分子の拡散に基づく分子（例えば、タンパク質分子、リガンド）の見かけのサイズを指す。溶液中でのタンパク質の拡散または運動を処理してタンパク質の見かけのサイズを得ることができ、このサイズはタンパク質粒子の「ストークス半径」または「流体力学的半径」として与えられる。タンパク質の「流体力学的サイズ」は、質量および形状（コンホメーション）の両方によって決まり、同じ分子量の２つのタンパク質が、タンパク質の全体的コンホメーションに基づいて異なる流体力学的サイズを有し得る。
【０１１４】
本開示のリガンド（例えば、ｄＡｂ単量体および多量体）の流体力学的サイズは、当該技術分野で周知の方法を用いて決定することができる。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いてリガンドの流体力学的サイズを決定することができる。リガンドの流体力学的サイズを決定するための好適なゲル濾過マトリックス、例えば架橋アガロースマトリックスは周知であり、容易に入手可能である。
【０１１５】
リガンドフォーマットのサイズ（例えば、ｄＡｂ単量体に結合したＰＥＧ部分のサイズ）は、所望の用途によって異なり得る。例えば、リガンドが循環を離れて末梢組織中に入ることが意図される場合、リガンドの流体力学的サイズを小さく維持して血流からの滲出を促進することが望ましい。あるいは、より長い期間リガンドが全身循環中に留まることが望ましい場合、例えばＩｇ様タンパク質としてフォーマット化することにより、リガンドのサイズを大きくしてもよい。
【０１１６】
インビボでの半減期を延長させる抗原またはエピトープの標的化による半減期延長：リガンドの流体力学的サイズおよびその血清半減期は、本開示のＴＧＦベータＲＩＩ結合ポリペプチド、ｄＡｂ、またはリガンドを、本明細書に記載のインビボ半減期を延長させる抗原またはエピトープに結合する結合ドメイン（例えば、抗体または抗体断片）とコンジュゲートまたは会合させることによっても延長され得る。例えば、ＴＧＦベータＲＩＩ結合性物質（例えば、ポリペプチド）を、抗血清アルブミンまたは抗新生児Ｆｃ受容体抗体もしくは抗体断片、例えば、抗ＳＡまたは抗新生児Ｆｃ受容体ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、もしくはｓｃＦｖと、あるいは抗ＳＡアフィボディ、抗新生児Ｆｃ受容体アフィボディ、または抗ＳＡアビマー、あるいはＣＴＬＡ−４、リポカリン、ＳｐＡ、アフィボディ、アビマー、ＧｒｏＥｌ、およびフィブロネクチンからなる群から選択される（これらに限定されるものではない）足場を含んでなる抗ＳＡ結合ドメイン（これらの結合ドメインの開示については国際公開第２００８０９６１５８号を参照されたい。これらのドメインおよびその配列は参照により本明細書に援用され、本文の開示の一部を形成する）とコンジュゲートまたは連結することができる。コンジュゲートとは、血清アルブミンに結合する結合ドメイン等の結合ドメインに結合（共有結合または非共有結合）した本開示のポリペプチド、ｄＡｂ、またはアンタゴニストを含んでなる組成物を指す。
【０１１７】
典型的には、インビボでの血清半減期を延長させるポリペプチドは、インビボで自然に生じ、生物（例えばヒト）から不要な材料を除去する内因的機序による分解または除去に抵抗するポリペプチドである。例えば、インビボでの血清半減期を延長させるポリペプチドは、細胞外マトリックスに由来するタンパク質、血液中に見出されるタンパク質、血液脳関門でもしくは神経組織中に見出されるタンパク質、腎臓、肝臓、肺、心臓、皮膚、もしくは骨に局在するタンパク質、ストレスタンパク質、疾患特異的タンパク質、またはＦｃ輸送に関わるタンパク質から選択され得る。好適なポリペプチドは例えば国際公開第２００８／０９６１５８号に記載されている。
【０１１８】
このようなアプローチは、目的の組織への本開示に係る単一可変ドメイン、ポリペプチド、またはリガンドの標的化された送達にも利用することができる。一つの実施態様では、本開示に係る高親和性単一可変ドメインの標的化送達が提供される。
【０１１９】
血清アルブミンに結合するｄＡｂ：一つの実施態様では、本開示は、ＴＧＦベータＲＩＩに結合するポリペプチドまたはアンタゴニスト（例えば、抗ＴＧＦベータＲＩＩ  ｄＡｂ（第１のｄＡｂ）を含んでなる二重特異性リガンド）および血清アルブミン（ＳＡ）に結合する第２のｄＡｂ、ＳＡに結合する第２のｄＡｂを提供する。二重特異性リガンドの詳細は国際公開第０３００２６０９号、同第０４００３０１９号、同第２００８０９６１５８号、および同第０４０５８８２１号に見出される。
【０１２０】
リガンドおよびアンタゴニストの特定の実施態様では、ｄＡｂはヒト血清アルブミンに結合し、国際公開第２００４００３０１９号に開示されているｄＡｂ配列のいずれか（その配列およびその核酸対応物は参照により本明細書に援用され、本文の開示の一部を形成する）、国際公開第２００７０８０３９２号に開示されているｄＡｂ配列のいずれか（その配列およびその核酸対応物は参照により本明細書に援用され、本文の開示の一部を形成する）、国際公開第２００８０９６１５８号に開示されているｄＡｂ配列のいずれか（その配列およびその核酸対応物は参照により本明細書に援用され、本文の開示の一部を形成する）からなる群から選択されるｄＡｂとアルブミンへの結合について競合する。
【０１２１】
特定の実施態様では、ｄＡｂは、ヒト血清アルブミンに結合し、国際公開第２００４００３０１９号、同第２００７０８０３９２号、または同第２００８０９６１５８号のいずれかに記載のｄＡｂのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。例えば、ヒト血清アルブミンに結合するｄＡｂは、これらのｄＡｂのいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり得る。特定の実施態様では、ｄＡｂは、ヒト血清アルブミンに結合し、これらのｄＡｂのいずれかのアミノ酸配列のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。
【０１２２】
更に具体的な実施態様では、ｄＡｂは、ヒト血清アルブミンに結合するＶκ  ｄＡｂである。更に具体的な実施態様では、ｄＡｂは、ヒト血清アルブミンに結合するＶＨ  ｄＡｂである。
【０１２３】
血清アルブミンに結合する好適なラクダ科動物ＶＨＨとしては、国際公開第２００４０４１８６２号（Ablynx N.V.）および国際公開第２００７０８０３９２号に開示のものが含まれる（これらのＶＨＨ配列およびその核酸対応物は、参照により本明細書に援用され、本文の開示の一部を形成する）。特定の実施態様では、ラクダ科動物ＶＨＨは、ヒト血清アルブミンに結合し、国際公開第２００７０８０３９２号に開示の配列または配列番号５１８〜５３４のいずれか（これらの配列番号は国際公開第２００７０８０３９２号または同第２００４０４１８６２号に記載のものに対応する）と少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。
【０１２４】
別の実施態様では、アンタゴニストまたはリガンドは、ＴＧＦベータＲＩＩ（例えば，ヒトＴＧＦベータＲＩＩ）に特異的な結合部分を含んでなり、この部分は、国際公開第２００８０９６１５８号に記載の非免疫グロブリン配列を含んでなる（これらの結合部分、その作製および（例えば、多様なライブラリーからの）選択の方法、並びにその配列の開示は、参照により本明細書に援用され、本文の開示の一部を形成する）。
【０１２５】
半減期延長部分（例えば、アルブミン）へのコンジュゲーション：一つの実施態様では、（１または複数の）半減期延長部分（例えば、アルブミン、トランスフェリンならびにその断片およびアナログ）が、本開示のＴＧＦベータＲＩＩ結合ポリペプチド、ｄＡｂ、またはアンタゴニストにコンジュゲートまたは会合する。ＴＧＦベータＲＩＩ結合フォーマットで使用するための好適なアルブミン、アルブミン断片、またはアルブミンバリアントの例は、その開示が参照により本明細書に援用され本文の開示の一部を形成する国際公開第２００５０７７０４２号に記載されている。
【０１２６】
ＴＧＦベータＲＩＩ結合性フォーマットで使用するための好適なアルブミン、断片、およびアナログの更なる例は、その開示が参照により本明細書に援用され本文の開示の一部を形成する国際公開第０３０７６５６７号に記載されている。
【０１２７】
（１または複数の）半減期延長部分（例えば、アルブミン、トランスフェリン並びにその断片およびアナログ）が、本開示のＴＧＦベータＲＩＩ結合性ポリペプチド、ｄＡｂ、およびアンタゴニストのフォーマット化に使用される場合、これは、任意の好適な方法を用いて、例えば融合タンパク質をコードする単一ヌクレオチドコンストラクトを用いて例えばＴＧＦベータＲＩＩ結合部分（例えば、抗ＴＧＦベータＲＩＩ  ｄＡｂ）に直接融合させることにより、コンジュゲート化され得、融合タンパク質は、ＴＧＦベータＲＩＩ結合部分のＮまたはＣ末端に位置する半減期延長部分を有する単一ポリペプチド鎖としてコードされる。あるいは、コンジュゲーションは、部分間のペプチドリンカー、例えば国際公開第０３０７６５６７または同第２００４００３０１９号に記載のペプチドリンカーを用いて実現することができる（これらのリンカーの開示を参照により本明細書に援用して、本開示での使用のための例を提供する）。
【０１２８】
ＰＥＧへのコンジュゲーション：別の実施態様では、半減期延長部分はポリエチレングリコール部分である。一つの実施態様では、アンタゴニストは、ポリエチレングリコール部分に連結した本開示の単一可変ドメインを含んでなる（場合によって、からなる）（場合により、前記部分は、サイズが約２０〜約５０ｋＤａ、場合により約４０ｋＤａの線状または分岐状ＰＥＧである）。ｄＡｂおよび結合性部分のペグ化の更なる詳細について、国際公開第０４０８１０２６号が参照される。一つの実施態様では、アンタゴニストは、ｄＡｂ単量体が本開示に係る単一可変ドメインである、ＰＥＧに連結したｄＡｂ単量体からなる。
【０１２９】
別の実施態様では、本開示に係る単一可変ドメイン、リガンド、またはポリペプチドは、毒素部分または毒素に連結され得る。
【０１３０】
プロテアーゼ耐性：本開示に係る単一可変ドメイン、ポリペプチド、またはリガンドは、プロテアーゼ分解に対するそれらの耐性が向上するように改変され得る。本発明において、「プロテアーゼ分解に耐性」であるペプチドまたはポリペプチド（例えば、ドメイン抗体（ｄＡｂ））は、プロテアーゼ活性に適した条件下でプロテアーゼとインキュベートした時にプロテアーゼに実質的に分解されない。ポリペプチド（例えば、ｄＡｂ）が実質的に分解されないとは、プロテアーゼ活性に適した温度、例えば３７または５０℃でプロテアーゼと約１時間インキュベートした後、プロテアーゼにより分解されるタンパク質が約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１４％以下、約１３％以下、約１２％以下、約１１％以下、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、または実質的にないことである。タンパク質分解の評価は、任意の好適な方法、例えば本明細書に記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは機能的アッセイ（例えば、リガンド結合）によって行うことができる。
【０１３１】
プロテアーゼ耐性が上昇したｄＡｂの作製方法は、例えば国際公開第２００８１４９１４３号に開示されている。一つの実施態様では、本開示に係る単一可変ドメイン、ポリペプチド、またはリガンドは、ロイコザイム（ｌｅｕｃｏｚｙｍｅ）および／またはトリプシンによる分解に耐性である。本開示のポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメイン、およびリガンドは以下の１または複数に対して耐性であり得る：セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ）、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、エラスターゼ、ロイコザイム、パンクレアチン、トロンビン、プラスミン、カテプシン（例えば、カテプシンＧ）、プロテイナーゼ（例えば、プロテイナーゼ１、プロテイナーゼ２、プロテイナーゼ３）、サーモリシン、キモシン、エンテロペプチダーゼ、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ９、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３）、カルパイン、フィカイン、クロストリパイン、アクチニダイン、ブロメライン、およびセパラーゼ。特定の実施態様では、プロテアーゼはトリプシン、エラスターゼ、またはロイコザイムである。プロテアーゼは、生物学的抽出物、生物学的ホモジネート、または生物学的調製物によっても提供され得る。本明細書に開示のポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメイン、およびリガンドは、前記ポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメイン、およびリガンドが肺プロテアーゼに耐性となるように、肺プロテアーゼの存在下で選択され得る。一つの実施態様では、プロテアーゼは、痰、粘液（例えば、胃粘液、鼻粘液、気管支粘液）、気管支肺胞洗浄、肺ホモジネート、肺抽出物、膵臓抽出物、胃液、唾液中に見られるプロテアーゼである。一つの実施態様では、プロテアーゼは眼および／または涙中に見られるものである。そのような眼中に見られるプロテアーゼの例としては、カスパーゼ、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ、ディスインテグリン、トロンボスポンジンモチーフを有するメタロプロテイナーゼ（例えば、ＡＤＡＭ：ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）およびＡＤＡＭ、プロテオソーム、組織プラスミノーゲン活性化因子、セクレターゼ、カテプシンＢおよびＤ、シスタチンＣ、セリンプロテアーゼＰＲＳＳ１、ユビキチンプロテオソーム経路（ＵＰＰ）が含まれる。一つの実施態様では、プロテアーゼは非細菌プロテアーゼである。一つの実施態様では、プロテアーゼは動物、例えば哺乳動物、例えばヒトのプロテアーゼである。一つの実施態様では、プロテアーゼは消化管プロテアーゼまたは肺組織プロテアーゼ、例えば、ヒトで見出される消化管プロテアーゼまたは肺組織プロテアーゼである。ここで列挙したこのようなプロテアーゼは、例えばライブラリーのレパートリーをプロテアーゼに曝す等の国際公開第２００８１４９１４３号に記載の方法でも使用することができる。
【０１３２】
安定性：本開示の一つの側面では、本開示のポリペプチド、単一可変ドメイン、ｄＡｂ、リガンド、組成物、または製剤は、Ｂｒｉｔｔｏｎ  ＲｏｂｉｎｓｏｎまたはＰＢＳバッファー中、３７〜５０℃で１４日間のインキュベーション後（１ｍｇ／ｍｌのポリペプチドまたは可変ドメイン濃度）に実質的に安定である。一つの実施態様では、ポリペプチド、アンタゴニスト、または可変ドメイン等の少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％が、３７℃でのそのようなインキュベーション後に凝集しないままである。一つの実施態様では、ポリペプチドまたは可変ドメインの少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％が、３７℃でのそのようなインキュベーション後に単量体のままである。
【０１３３】
一つの実施態様では、ポリペプチド、アンタゴニスト、または可変ドメインの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％が、５０℃でのそのようなインキュベーション後に凝集しないままである。一つの実施態様では、ポリペプチドまたは可変ドメインの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％が５０℃でのそのようなインキュベーション後に単量体のままである。一つの実施態様では、このようなインキュベーションのいずれの後でも、ポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニストの凝集が見られない。一つの実施態様では、ポリペプチドまたは可変ドメインのｐＩは、Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎバッファー中１ｍｇ／ｍｌのポリペプチドまたは可変ドメイン濃度で３７℃のインキュベーション後、変化していないまたは実質的に変化していない。本開示の一つの側面では、本開示のポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニスト、組成物、または製剤は、ｐＨ７〜７．５（例えばｐＨ７または７．５）のＢｒｉｔｔｏｎ−ＲｏｂｉｎｓｏｎバッファーまたはＰＢＳ中４℃で７日間のインキュベーション（ポリペプチドまたは可変ドメインの濃度１００ｍｇ／ｍｌ）後、実質的に安定である。一つの実施態様では、ポリペプチド、アンタゴニスト、または可変ドメインの少なくとも９５、９５．５、９６、９６．５、９７、９７．５、９８、９８．５、９９、または９９．５％がこのようなインキュベーション後に凝集していないままである。一つの実施態様では、ポリペプチドまたは可変ドメインの少なくとも９５、９５．５、９６、９６．５、９７、９７．５、９８、９８．５、９９、または９９．５％がこのようなインキュベーション後に単量体のままである。一つの実施態様では、このようなインキュベーションのいずれの後でもポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニストの凝集は見られない。
【０１３４】
本開示の一つの側面では、本開示のポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニスト、組成物、または製剤は、例えばジェットネブライザー、例えばパリ・ＬＣプラスカップ中で、例えば室温、２０℃、または３７℃で１時間の（例えば、４０ｍｇ／ｍｌのポリペプチドまたは可変ドメイン濃度で）噴霧化後、実質的に安定である。一つの実施態様では、ポリペプチド、アンタゴニスト、または可変ドメインの少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５．５、９６、９６．５、９７、９７．５、９８、９８．５、９９、または９９．５％がこのような噴霧化後に凝集しないままである。一つの実施態様では、ポリペプチドまたは可変ドメインの少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５．５、９６、９６．５、９７、９７．５、９８、９８．５、９９、または９９．５％がこのような噴霧化後に単量体のままである。一つの実施態様では、このような噴霧化のいずれの後にも、ポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニストの凝集は見られない。
【０１３５】
単量体形態：一つの実施態様では、本開示のｄＡｂは主に単量体であると特定される。好ましくは、本開示は（実質的に）純粋な単量体を提供する。一つの実施態様では、ｄＡｂは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％純粋な、または１００％純粋な単量体である。ｄＡｂが溶液中で単量体であるか、より高次のオリゴマーを形成しているかを決定するために、これらはＳＥＣ−ＭＡＬＬＳで分析され得る。ＳＥＣ  ＭＡＬＬＳ（分子ふるいクロマトグラフィーおよび多角度レーザー光散乱）は、溶液中の巨大分子の特徴解析を行うための非侵襲性の技術であり、当業者に周知である。簡潔に述べると、タンパク質（ダルベッコＰＢＳバッファー中１ｍｇ／ｍＬの濃度）を分子ふるいクロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫ３０００；Ｓ２００）によりそれらの流体力学的特性に従って分離する。分離後、多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）検出器を用いて、タンパク質が光を散乱させる性質を測定する。タンパク質が検出器を通過する間に散乱される光の強度を角度の関数として測定する。この測定と、屈折率（ＲＩ）検出器を用いて決定されたタンパク質濃度から、適切な式（分析ソフトウェアＡｓｔｒａ  ｖ．  ５．３．４．１２の積分部分）を用いてモル質量を計算することができる。
【０１３６】
治療的使用：本開示は、ＴＧＦベータシグナル伝達に関連する疾患を処置、抑制、または防止するための方法を提供する。一つの実施態様では、そのような疾患は、調節不全になったＴＧＦベータシグナル伝達により、またはＴＧＦベータの過剰発現により、または生物学的に利用可能なＴＧＦベータのレベルが高いことにより生じ得るか、それらが一因であり得る。ＴＧＦベータシグナル伝達に関連する疾患としては、種々の組織の線維症に関連する疾患、例えば肺線維症、例えば特発性肺線維症（ＩＰＦ）および他の間質性肺疾患、例えば急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、肝臓の線維症、例えば肝硬変および慢性肝炎、関節リウマチ、眼障害、再狭窄等の血管病態、皮膚の線維症、例えば創傷治癒後の皮膚のケロイドおよび瘢痕化、およびデュピュイトラン拘縮、並びに腎臓、例えば腎炎、腎線維症、および腎硬化症、または血管病態、例えば再狭窄が含まれる。ＴＧＦベータシグナル伝達に関連するその他の疾患として、血管性疾患、例えば高血圧、子癇前症、Ｉ型遺伝性出血性毛細管拡張（ＨＨＴ１）、ＨＨＴ２、肺動脈高血圧症、大動脈瘤、マルファン症候群、家族性動脈瘤障害、ロイス・ディーツ症候群、動脈蛇行症候群（ＡＴＳ）が含まれる。ＴＧＦベータシグナル伝達に関連するその他の疾患として、筋骨格系の疾患、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび筋線維症が含まれる。ＴＧＦベータシグナル伝達に関連する更なる疾患として、癌、例えば結腸癌、胃癌、および膵臓癌、並びに神経膠腫およびＮＳＣＬＣが含まれる。更に、本開示は、例えば腫瘍血管新生におけるＴＧＦベータシグナル伝達を調節することによりまたは癌間質の処置により、癌を標的化する方法を提供する。その他の疾患または病態として、組織瘢痕化に関連するものが含まれる。その他の疾患として、肺疾患、例えばＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、肝疾患、例えば肝不全（例えば、ウイルス性肝炎、アルコール、肥満、自己免疫性、代謝性、閉塞性）、腎臓疾患、例えば腎不全（例えば、糖尿病、高血圧）、肥大型心筋症、移植片拒絶（肺／肝臓／腎臓）、並びに肥厚性瘢痕化およびケロイド瘢痕化が含まれる。
【０１３７】
「線維症」は、組織の異常増殖、瘢痕化、および／または硬化を生じさせるコラーゲン等の細胞外マトリックス構成要素の過剰な沈着によるものである。
【０１３８】
「皮膚線維症」：皮膚の線維症は、病因が異なっていても（特に皮膚線維芽細胞の）結合組織代謝の調節不全が共通する種々のヒト障害を包含する。皮膚繊維症の具体例としては、ケロイド疾患、肥厚性瘢痕（ＨＳ）、および強皮症が含まれる。ケロイド疾患および肥厚性瘢痕は、同じ病態のサブグループではないが、どちらも創傷治癒後の瘢痕化の結果であり、ケロイドは元の創傷部位を超えて広がるが、肥厚性瘢痕は元の創傷の周辺部分に限定される。しかし、強皮症は、複数の器官の線維症を生じる全身病態である全身性硬化症における皮膚の線維症を指し使用される。一つの実施態様では、本明細書に開示の可変ドメイン、リガンド、融合タンパク質、またはポリペプチドはケロイド疾患、肥厚性瘢痕、または強皮症を防止または処置するために使用される。
【０１３９】
「ケロイド」は、遺伝的に影響されやすい個体で異常な創傷治癒プロセスの結果形成される、皮膚傷害部位における繊維の異常増殖であり、通常の瘢痕と異なり、退縮（ｒｅｇｒｅｓｓ）しない。「ケロイド疾患」は、濃く色素化した皮膚を有する患者で主に観察され、悪性になることがない、ヒトに特有の良性の皮膚繊維増殖性腫瘍である。
【０１４０】
「デュピュイトラン拘縮」とは、手掌の皮膚の下における瘢痕組織の局所的形成である。瘢痕は、指を引っ張って握るための腱を通常覆っている組織（筋膜）に蓄積する。デュピュイトラン拘縮が進行するにつれて、より多くの筋膜が肥厚および短小化し、手掌に向かって指が曲がって完全に伸ばす（まっすぐにする）ことができない手の屈曲拘縮が生じ、極端な場合には手を使用できなくなる。
【０１４１】
瘢痕化は、体内の組織または器官への手術、傷害、または外傷後に生じる。これは細胞外マトリックスを生成して失われた正常組織を置き換える修復メカニズムの結果である。皮膚は、最も頻繁に傷害を受ける組織であり、この傷害により皮膚の瘢痕化が生じ、その結果、以下を含む有害事象が起こり得る：機能の喪失；拘縮；および、罹病者に心理的影響を与え得る美的損傷（ｐｏｏｒ  ｅａｓｔｈｅｔｉｃｓ）。瘢痕は、「創傷治癒の最終産物により生じる、皮膚構造の正常な構造および機能の肉眼で見える障害」として定義することができる（Fergusson et al., 1996）。現在、瘢痕化を効果的に防止または改善する治療法はない。
【０１４２】
肺線維症へのＴＧＦベータの関与が観察されている（Wynn et al., J. Pathology 2008, 214, p.199-210；Sime et al. J. Clinical Immunology 1997, Vol.100, p. 768-776）。不明な肺傷害によるＴｈ２サイトカインの生成増大およびＴｈ１サイトカインの生成低減へのシフトが観察されている。ＴＧＦベータの過剰発現は、血管新生、線維芽細胞活性化、ＥＭＣの沈着、および線維形成を刺激する。モデル動物（例えば、ＴＧＦベータ過剰発現、ＳＭＡＤ３  ＫＯ、ＴＧＦベータＲシグナル伝達の阻害）は、ＴＧＦベータが肺線維症の発症に重要なメディエーターであることを示している。
【０１４３】
「特発性肺線維症（ＩＰＦ）」は、原因不明の肺間質における繊維性組織の異常なおよび過剰な沈着を生じさせる慢性および進行性の疾患である。米国での年間発症率は、１００，０００人に約１０〜２０症例である。有病率は年齢と共に急激に上昇して７５歳以上では１７５症例／１００，０００人に達し、通常は５０〜７０歳で発症する。５年生存率は２０％で、平均生存率は２．８年である。症状としては、乾性咳および進行性息切れ、胸部ｘ線またはＨＲＣＴの異常、ならびに肺容積減少が含まれる。現行の処置には、コルチコステロイド（プレドニゾン）、免疫抑制薬（シクロホスファミド）、または移植が含まれるが、現在利用可能な治療はいずれも有効性が証明されていない。一つの実施態様では、本開示の単一可変ドメインまたはポリペプチドはＩＰＦの処置を提供する。
【０１４４】
好ましくは、特発性肺線維症（ＩＰＦ）の上首尾な（ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ）処置は、肺線維芽細胞増殖の低減、肺線維芽細胞アポトーシスの増加、過剰な細胞外マトリックスの合成および沈着の低減、細胞外マトリックスの破壊および再構築の増加のいずれかを示すか、進行中の組織傷害に対するある程度の保護および正常な組織病理の回復を示す。
【０１４５】
好ましくは、上首尾な処置は疾患の進行を遅らせる。
【０１４６】
ＩＰＦの処置の有効性は、ブレオマイシン誘発肺線維症モデルで実証することができる。一つの実施態様では、本開示の免疫グロブリン単一可変ドメインは、モデルマウスにおいて有効性を試験できるようにマウスＴＧＦベータＲＩＩと交差反応する。
【０１４７】
ＴＧＦベータは、眼組織中の細胞挙動の調節に重要な細胞シグナル伝達分子である。創傷治癒に関連し得、視力および眼組織の恒常性の障害につながり得る、眼組織における線維性疾患の病因に、ＴＧＦベータの過剰活性化が関係付けられている（例えばSaika, Laboratory Investigation (2006), 86, 106-115に概括されている）。
【０１４８】
したがって、一つの実施態様では、ＴＧＦベータシグナル伝達に関連する疾患には、眼組織の線維性疾患等の眼障害が含まれる。眼の線維性疾患は角膜、結膜、水晶体、または網膜で起こり得る。眼障害としては、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜剥離および網膜線維症の後の障害、糖尿病性網膜症、緑内障（例えば開放隅角緑内障、閉塞隅角緑内障、先天性緑内障、および偽落屑症候群）、水晶体における創傷治癒反応（例えば化学的熱傷または熱的熱傷の後）、またはスティーブンス・ジョンソン症候群、および白内障手術後の合併症が含まれる。ＴＧＦベータは白内障の発症にも関与している（Wormstone et al. Exp Eye Res; 83 1238-1245, 2006）。多くの眼障害が手術後の線維症の結果として起こる。更に、ＴＧＦベータ２（形質転換増殖因子β２）の過剰活性は、緑内障濾過手術後に眼の中および周囲で瘢痕化を生じさせると考えられている。ＴＧＦベータ２は、角膜、網膜、結膜、および小柱網を含む眼組織の病的瘢痕化に関与する主なアイソフォームである。小柱網の瘢痕化または線維症は、眼内圧および緑内障発症リスクの上昇を招く正常な眼房水流出経路の閉塞を生じさせ得る。ＴＧＦベータ２は、緑内障疾患の前臨床モデルにおける病理学的作用物質であることが示されている。ＴＧＦベータ２レベルが緑内障患者では上昇しており、ＴＧＦベータ−２によるｈｕＴＭ細胞のインビトロ処置はＥＣＭ調節タンパク質（ＭＭＰ−２、ＰＡＩ−Ｉ）の表現型変化およびアップレギュレーションをもたらす（Lutjen-Drecol (2005), Experimental Eye Research, Vol. 81, Issue 1, pages 1-4；Liton (2005), Biochemical and Biophysical Research Communications Vol. 337, issue 4, p.1229-1236；Fuchshofer et al (2003), Experimental Eye Research, Vol. 77, issue 6, p. 757-765; Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) conference poster #1631 2009）。更に、眼におけるＴＧＦベータの過剰発現は、マウスで緑内障様の病態を生じさせ（ARVO conference poster #5108 2009）、ＡＡＶを用いたＴＧＦベータ−２の送達が緑内障のモデルラットにおける網膜神経節細胞の損失を抑制することが示されている（ARVO conference poster #5510 2009）。更に近年になって、培養ヒト視神経乳頭星状細胞における酸化的ストレス誘導がＴＧＦベータ２分泌を増加させることが示されている（Yu et al (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50: 1707-1717）。これらは全て、ＴＧＦベータ２レベルの低減が、緑内障で見られる特徴的な視神経乳頭の変化を最小限に抑え得ることを示している。しかし、ＴＧＦベータは、免疫抑制的役割を有することも知られており、したがって、いくつかの点で保護的であり得るので、緑内障等の慢性的な眼の病態の処置において、ＴＧＦベータ２の完全なノックダウンよりは上昇レベルの低減が好まれ得る。したがって、本開示に係るｄＡｂおよび組成物等を用いて処置され得る疾患には緑内障濾過手術後の瘢痕化が包含される。
【０１４９】
したがって、一つの側面では、ＴＧＦベータシグナル伝達、特に調節不全ＴＧＦベータシグナル伝達に関連する疾患を処置、抑制、または防止する方法であって、治療に有効な用量または量の本開示に係るポリペプチド、融合タンパク質、単一可変ドメイン、アンタゴニスト、または組成物をそれを必要とする哺乳動物に投与することを含んでなる方法が提供される。
【０１５０】
別の側面では、本開示は、医薬として使用するための本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、リガンド、または融合タンパク質を提供する。好適な医薬は、本明細書に記載されているようにフォーマット化された本開示に係る免疫グロブリン単一可変ドメイン等を含んでなり得る。
【０１５１】
好ましくは、医薬は医薬組成物である。本開示の別の側面では、本開示に係るポリペプチド、単一可変ドメイン、リガンド、組成物、またはアンタゴニストと、生理学的または薬学的に許容される担体、希釈剤、または補形剤とを含んでなる組成物（例えば、医薬組成物）が提供される。一つの実施態様では、組成物は送達用の賦形剤を含んでなる。特定の実施態様では、ポリペプチド、融合タンパク質、単一可変ドメイン、アンタゴニスト、または組成物は、肺送達によって、例えば吸入（例えば、気管支内、鼻腔内、または経口吸入、滴剤等による鼻腔内）によって、または全身送達（例えば、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、皮下、腟、または直腸投与）によって投与される。別の実施態様では、本開示に係るポリペプチド、単一可変ドメイン、リガンド、融合タンパク質、または組成物は、例えば、点眼薬、微粒子ポリマー系、ゲル、またはインプラントとして局所投与により、あるいは例えば硝子体液への眼内注射により、眼に投与される。送達は眼の特定の領域（例えば眼の表面）、または涙管もしくは涙腺、または眼の前眼房もしくは後眼房（例えば硝子体液）に標的化され得る。これは、免疫グロブリン単一可変ドメイン、組成物等が眼の浸透促進剤（例えばカプリン酸ナトリウム）と共にまたは増粘剤（例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ））と共に眼に送達される場合にも有用であり得る。別の実施態様では、ポリペプチド、融合タンパク質、単一可変ドメイン、アンタゴニスト、または組成物は、皮膚の表面への局所的送達によりおよび／または皮膚内の領域への送達（例えば皮内送達）により、皮膚に投与される。
【０１５２】
送達のためには体の最も到達し易い器官であるが、皮膚の最外側の障壁である角質層（ＳＣ）は、薬物送達の速度を制限する障壁として働く。従来より、より深い皮膚層中の作用部位への薬物送達を可能にするためには、ＳＣを回避するための皮内注射が必要であった。しかし、送達は他の経皮送達アプローチでも実現され得る。以下を含む製剤化方法が送達に利用され得る：ＳＣの脂質構造を変化させる化学的賦活薬；濾胞通過輸送を可能にするペプチドファシリテーター；およびリポソーム、ニオソーム、エソソーム、トランスファーソーム等の粒子中へのキャプシド化（これらは、脂質の局所的流動化および持続的効果を得るための持効性製剤（ｄｅｐｏｔ）の形成を助けると考えられる）。皮膚を横切る小電位の印加を含むイオントフォレーシスが局所的な薬物送達に使用されてきた。イオントフォレーシスは、電気移動法および電気浸透によりそれぞれ荷電分子および中性分子の送達の両方を可能にする。マイクロニードルを用いて皮膚にミクロンサイズのチャネルを作ってＳＣを乗り越えることにより、このチャネルを介してタンパク質を更に下側の表皮に通過させることができる。マイクロニードルは大まかに中実および中空のマイクロニードルに分類することができる。中実マイクロニードルは、薬物投与前にＳＣを破壊するために使用され得、針から薬物が溶解して送達されるようにコーティングされていてもよく、針がその場で溶解して薬物が放出されるように可溶性であってもよい。中空マイクロニードルは、薬物物質の液剤の注入を可能にする。エレクトロポレーションは、イオントフォレーシスと異なり、皮膚の浸透性を変化させて薬物の浸透を促進するために、＞５０Ｖのより高い電圧を必要とする。熱アブレーションおよび高周波アブレーション法は、ＳＣの局所的な加熱および焼灼によりＳＣの破壊を可能にする。熱アブレーションでは、これは、短時間高温を加えることにより起こり、高周波アブレーションでは高周波を用いて皮膚上で微小電極を振動させて局所的な加熱を生じさせることにより起こる。ＳＣの破壊は、レーザーアブレーション、低周波超音波の印加（ソノフォレーシス）、および高速を利用して薬物にＳＣを通過させる噴射式注射器を用いて達成することもできる。
【０１５３】
更に、本開示は、本開示に係るポリペプチド、単一可変ドメイン、組成物、リガンド、またはアンタゴニストを用いて疾患を処置する方法を提供する。一つの実施態様では、疾患は、ケロイド疾患またはデュピュイトラン拘縮等の組織線維症である。
【０１５４】
本開示の一つの側面では、ポリペプチド、単一可変ドメイン、リガンド、組成物、またはアンタゴニストは、ヒトにおけるＴＧＦベータシグナル伝達に関連する疾患または病態を治療および／または予防するために提供される。別の側面では、ヒトにおけるＴＧＦベータシグナル伝達に関連する疾患または病態を治療または予防するための医薬の製造における、ポリペプチド、単一可変ドメイン、組成物、またはアンタゴニストの使用が提供される。別の側面では、ヒト患者におけるＴＧＦベータシグナル伝達に関連する疾患または病態を処置および／または防止する方法であって、ポリペプチド、単一可変ドメイン、組成物、またはアンタゴニストを患者に投与することを含んでなる方法が提供される。本開示は更に、治療有効量の本開示のリガンド（例えば、アンタゴニストまたは単一可変ドメイン）をそれを必要とする対象に投与することを含んでなる治療方法に関する。
【０１５５】
別の実施態様では、本開示は、治療有効量の本開示のリガンド（例えば、アンタゴニストまたは単一可変ドメイン）をそれを必要とする対象に投与することを含んでなる、特発性肺線維症の処置方法に関する。
【０１５６】
本開示は更に、本開示の組成物（例えば、医薬組成物）を含んでなる薬物送達デバイスに関する。いくつかの実施態様では、薬物送達デバイスは、複数の治療有効用量のリガンドを含んでなる。
【０１５７】
別の実施態様では、薬物送達デバイスは、非経口送達デバイス、静脈内送達デバイス、筋肉内送達デバイス、腹腔内送達デバイス、経皮または皮内送達デバイス、肺送達デバイス、動脈内送達デバイス、くも膜下腔内送達デバイス、関節内送達デバイス、皮下送達デバイス、鼻腔内送達デバイス、眼送達デバイス、腟送達デバイス、直腸送達デバイス、シリンジ、経皮送達デバイス、皮内送達デバイス、カプセル、錠剤、ネブライザー、吸入器、アトマイザー、エアゾール器（ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｒ）、噴霧器（ｍｉｓｔｅｒ）、乾燥粉末吸入器、定量吸入器、定量スプレーヤー（ｍｅｔｅｒｅｄ  ｄｏｓｅ  ｓｐｒａｙｅｒ）、定量噴霧器（ｍｅｔｅｒｅｄ  ｄｏｓｅ  ｍｉｓｔｅｒ）、定量アトマイザー、およびカテーテルからなる群から選択される。一つの実施態様では、薬物送達デバイスは経皮または皮内送達デバイスである。
【０１５８】
好ましくは、本開示は、本開示に係るポリペプチド、単一可変ドメイン、組成物、またはアンタゴニストを含む肺送達デバイスを提供する。デバイスは、吸入器または鼻腔内投与デバイスであり得る。好ましくは、肺送達デバイスは、治療有効用量の本開示に係るリガンド等の送達を可能にする。
【０１５９】
別の実施態様では、本開示は、本開示に係るポリペプチド、単一可変ドメイン、組成物、またはアンタゴニストを含む眼送達デバイスを提供する。好ましくは、眼送達デバイスは、治療有効用量の本開示に係るリガンド等の送達を可能にする。
【０１６０】
本発明において、「用量（ｄｏｓｅ）」という用語は、全部を１度で（単位用量）または所定の時間間隔の２回以上の投与で、対象に投与されるリガンドの量を指す。例えば、用量は、（例えば、単回投与または２回以上の投与により）１日（２４時間）（１日量）、２日、１週間、２週間、３週間、または１ヶ月以上にわたって対象に投与されるリガンド（例えば、ＴＧＦベータＲＩＩに結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるリガンド）の量を指し得る。投薬の間隔は任意の所望の時間であり得る。特定の実施態様では、本発明の単一可変ドメインまたはポリペプチドは、週１回、２週間に１回、または７〜１０日に１回、例えば７、８、９、または１０日に１回、注射により、特に皮内送達により、皮膚中に投与される。
【０１６１】
一つの実施態様では、本開示の単一可変ドメインは、ｄＡｂ単量体として提供され、場合によりフォーマット化されていなくてもよく（例えば、ペグ化または半減期延長されていない）、ＰＥＧに連結されてなくてもよく；場合により乾燥粉末製剤として提供され、場合により吸入による患者への送達（例えば、肺送達）用に提供され、場合により肺病態（例えば、特発性肺線維症）を処置および／または防止するために提供される。
【０１６２】
本開示のリガンドは複数の利点を提供する。例えば、本明細書に記載されているように、所望のインビボ血清半減期を有するようにリガンドを調整することができる。ドメイン抗体は従来の抗体よりはるかに小さく、従来の抗体より優れた組織浸透が実現されるように投与することができる。したがって、ｄＡｂおよびｄＡｂを含んでなるリガンドは、ＴＧＦベータシグナル伝達媒介疾患等の疾患を処置するために投与された場合、従来の抗体にはない利点を提供する。特に、特発性肺線維症を処置するための本開示のｄＡｂの肺送達は、ＴＧＦベータシグナル伝達阻害剤の特異的局所送達を可能にする。好ましくは、ＴＧＦベータＲＩＩに特異的に結合してこれを阻害する非フォーマット化ｄＡｂ単量体は、肺送達を介して肺に吸収されるよう十分小さいである。
【０１６３】
本開示のリガンドに同様に適用可能な関連するアッセイ、フォーマット化、および実験の詳細を提供するために国際公開第２００７０８５８１５号の例を参照により本明細書に援用する。
【０１６４】
本明細書中で引用される全ての公開物、例えば、限定されるものではないが特許および特許出願を、全体が記載されたのと同じように、本明細書に援用する。
【０１６５】
説明のみを目的として、以下に実施例を用いて開示を更に記載する。
【実施例】
【０１６６】
実施例１：ＴＧＦベータＲＩＩに結合するｄＡｂの選択
マウスＴＧＦベータＲＩＩに結合するｄＡｂの選択
ナイーブ選択：抗体単一可変ドメインを提示するファージライブラリーである４Ｇおよび６Ｇナイーブファージライブラリーを用いた。４ＧはＧＡＳ１リーダー配列（国際公開第２００５０９３０７４号参照）から発現された抗体単一可変ドメインを提示し、６Ｇはそれに加熱／冷却による前選択が加わっている（国際公開第０４１０１７９０号参照）。マウスおよびヒトの組換えＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃキメラタンパク質に対してＶＨおよびＶＫライブラリーのプール（４Ｇ  Ｈ１１〜１９および６Ｇ  ＶＨ２〜４（ＶＨ  ｄＡｂ）並びに４Ｇ  κ１、４Ｇ  κ２、および６Ｇ  κ（Ｖκ  ｄＡｂ）として同定）をパニングすることにより、ＤＯＭ２３リードが単離された。これらのキメラタンパク質は、ヒト胚性腎細胞系列（ＨＥＫ−Ｆ）中でヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合させたヒトＩＩ型ＴＧＦ−β受容体の細胞外ドメインのアミノ酸残基２４〜１５９をコードするＤＮＡ配列（Lin, et al., 1992, Cell 68:775-785）を発現させることにより作製した。
【０１６７】
ＥＺ−ＬＩＮＫ（商標）  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ試薬（ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ）、ロックフォード、米国）を用いて、組換えマウスおよびヒトＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃキメラタンパク質をビオチン化した（Henderikx, et al., 2002, Selection of antibodies against biotinylated antigens. Antibody Phage Display: Methods and protocols, Ed. O'Brien and Atkin, Humana Pres）。ファージライブラリーを６つの群にプールした：４Ｇ  κ１およびκ２、６Ｇ  κ、４Ｇ  Ｈ１１〜１３、４Ｇ  Ｈ１４〜１６、４Ｇ  Ｈ１７〜１９、および６Ｇ  ＶＨ２〜４。ライブラリー１つ当たり１×１０１１ファージをプールした。
【０１６８】
１０μＭヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片（ヒトミエローマ血漿ＩｇＧに由来する天然ＩｇＧ  Ｆｃ断片；カルビオケム社、カリフォルニア、米国、カタログ番号４０１１０４）を添加した２％ＭＡＲＶＥＬ（商標）ミルクパウダーを含むリン酸緩衝食塩水（ＭＰＢＳ）で１時間ファージのブロッキングを行った。２００ｎＭビオチン化マウスＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃを、ブロッキングしたファージおよびＦｃ断片混合物と室温で１時間インキュベートし、次いでストレプトアビジンＤＹＮＡｂｅａｄｓ（商標）（ダイナル（Ｄｙｎａｌ）社、英国）で５分間捕捉した。ビーズを１ｍｌのリン酸緩衝食塩水／０．１％ＴＷＥＥＮ（商標）（ＰＢＳＴ）で７回洗浄し、次いで１ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。ビオチン化マウスＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃが結合したファージを、１ｍｇ／ｍｌのトリプシンを含むＰＢＳ５００μｌ中で１０分間溶離させ、次いで、これを用いて１．７５ｍｌの対数期大腸菌ＴＧ１に３０分間感染させた。１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを添加した２×ＴＹＥ（Ｔｒｙｐｔｏｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ）寒天プレートに細胞をプレーティングした。その後の選択ラウンドで、細胞をプレートから掻き取り、５０ｍｌの２×ＴＹ（Ｔｒｙｐｔｏｎ  Ｙｅａｓｔ）＋１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン培養液に接種し、３７度で一晩増殖させてファージを増幅させた。
【０１６９】
一晩培養物を４５６６ｇで１０分間遠心することにより、増幅したファージを回収した。増幅したファージを含む上清４０ｍｌを、１０ｍｌのＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ｖ／ｗＰＥＧ８０００＋２．５Ｍ  ＮａＣｌ）に加え、氷上で４５〜６０分間インキュベートした。サンプルを４５６６ｇで３０分間遠心して、沈殿したファージをペレット状にした。上清を捨て、ファージペレットを２ｍｌの１５ｖ／ｖ％グリセロール／ＰＢＳに再懸濁した。ファージサンプルを２ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、ｇで１０分間遠心することにより、残りの細菌細胞片を全て除去した。このファージを、第２ラウンドの選択のインプットファージとして用いた。第２ラウンドの選択は、約１×１０１０のファージを加え、２００ｎＭヒトＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃまたは２０ｎＭマウスＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃのいずれかを選択に用いたこと以外は第１ラウンドに記載した通りに行った。
【０１７０】
第２ラウンドのアウトプットを、ｆｄ−ファージベクターｐＤＯＭ４からｐＤＯＭ１０にクローニングした。ベクターｐＤＯＭ４はｆｄファージベクターの派生物であり、ｇｅｎｅ  ＩＩＩシグナルペプチド配列が、酵母糖脂質固定表面タンパク質（ＧＡＳ）シグナルペプチドに置換されている。更に、リーダー配列とｇｅｎｅ  ＩＩＩとの間にｃ−ｍｙｃタグを含み、これは遺伝子ＩＩＩをインフレームで戻す。このリーダー配列はファージディスプレイベクター中および他の原核発現ベクター中の両方で良く機能し、普遍的に使用することができる。ｐＤＯＭ１０は、ｄＡｂの可溶性発現のために設計されたプラスミドベクターである。これは、ｐＵＣ１１９ベクターをベースにしており、発現はＬａｃＺプロモーターの制御下にある。上清中へのｄＡｂの発現は、ｄＡｂ遺伝子を普遍的ＧＡＳリーダーシグナルペプチド（国際公開第２００５０９３０７４号参照）にＮ末端で融合させることにより実現された。更に、ｄＡｂのＣ末端にＦＬＡＧタグを付加した。
【０１７１】
ＱＩＡＰＲＥＰ（商標）  Ｓｐｉｎ  ＭＩＮＩＰＲＥＰ（商標）キットをメーカーの取扱説明書（カタログ番号２７１０４、キアゲン社）に従って用いて、選択されたｄＡｂ提示ｆｄファージに感染した細胞からｐＤＯＭ４  ＤＮＡを単離することにより、ｄＡｂ遺伝子のサブクローニングを行った。ビオチン化オリゴヌクレオチドＤＯＭ５７（５’ＴＴＧＣＡＧＧＣＧＴＧＧＣＡＡＣＡＧＣＧ−３’（配列番号１９７）およびＤＯＭ６（５’−ＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣ−３’（配列番号１９８））を用いたＰＣＲによりＤＮＡを増幅し、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化したｐＤＯＭ１０とライゲーションした。ライゲーション産物をエレクトロポレーションにより大腸菌ＨＢ２１５１細胞に形質転換し、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを添加したＴＹＥプレート（Ｔｒｙｐｔｏｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ）（ＴＹＥ−ｃａｒｂ）にプレーティングした。個々のクローンを選び、９６ウェルプレート中で、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを添加した一晩発現自己誘導培地（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ａｕｔｏ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ；高レベルタンパク質発現系、ノバジェン社）中で発現させ、３０℃または３７℃で振盪しながら増殖させた。次いで、これらの発現プレートを１８００ｇで１０分間遠心した。マウスおよび／またはヒトＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃに結合したｄＡｂクローンを、ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡＣＯＲＥ（商標）（ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ（商標）社）による選別またはＭＳＤ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）結合アッセイによる選別により同定した。ＥＬＩＳＡでは、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）イムノプレート（ヌンク社、デンマーク）をヒトまたはマウスＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃで４℃にて一晩コーティングした。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した後、１％ＴＷＥＥＮ（商標）を含むＰＢＳ（１％ＴＰＢＳ）を用いて室温で１時間ブロッキングした。ブロッキングを除去し、１％ＴＰＢＳおよびｄＡｂ上清の１：１混合物を室温で１時間加えた。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、検出抗体（モノクローナル抗ＦＬＡＧ  Ｍ２−ペルオキシダーゼ抗体、シグマアルドリッチ社、英国）を加え、室温で１時間インキュベートした。発色基質（ＳＵＲＥＢＬＵＥ（商標）  １−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ溶液、ＫＰＬ社、メリーランド、米国）でプレートを現像し、４５０ｎＭで光学濃度（ＯＤ）を測定した。ＯＤ４５０は結合した検出抗体の量に比例する。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）では、上清をＨＢＳ−ＥＰバッファーで１：１希釈し、ビオチン化ヒトおよびマウスＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃ（メーカーの推奨に従い１５００Ｒｕビオチン化ｈＲＩＩ−Ｆｃおよび１５５０Ｒｕビオチン化ｍＲＩＩ−ＦｃでコーティングされたＳＡチップ）への結合についてＢＩＡＣＯＲＥ（商標）を用いてスクリーニングした（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）社、ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ（商標）社）。サンプルを流速５０μｌ／ｍｉｎでＢＩＡＣＯＲＥ（商標）にかけた。
【０１７２】
ナイーブヒト選択およびスクリーニング
ヒトＴＧＦベータＲＩＩに結合するｄＡｂの選択
第１および第２ラウンドでそれぞれ１５０および１５ｎＭのビオチン化ヒトＴＧＦｂＲＩＩ／Ｆｃを用いたこと以外はマウスＴＧＦｂＲＩＩに記載したように、ナイーブ選択を行った。１．５ｎＭビオチン化ヒトＴＧＦｂＲＩＩ／Ｆｃを用いて第２ラウンドと同じ方法で第３ラウンドを行った。
【０１７３】
第３ラウンドのアウトプットを、ｆｄ−ファージベクターｐＤＯＭ４からｐＤＯＭ１０にクローニングした。ＱＩＡＰＲＥＰ（商標）  Ｓｐｉｎ  ＭＩＤＩＰＲＥＰ（商標）キット（カタログ番号２７１０４、キアゲン社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、選択されたｄＡｂ提示ｆｄファージに感染した細胞からｐＤＯＭ４  ＤＮＡを単離することにより、ｄＡｂ遺伝子のサブクローニングを行った。プラスミドＤＮＡをＳａｌＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｄＡｂ遺伝子インサートを、ＳａｌＩ、ＮｏｔＩ、およびＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化したｐＤＯＭ１０とライゲーションさせた。ライゲーション産物をエレクトロポレーションで大腸菌ＨＢ２１５１細胞に形質転換し、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを添加したＴＹＥプレート（Ｔｒｙｐｔｏｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ）（ＴＹＥ−ｃａｒｂ）にプレーティングした。個々のクローンを選び、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを添加した１ｍｌ／ウェルの一晩発現自己誘導培地（ノバジェン社）を入れた９６ウェルプレート中、２５０ｒｐｍ、３０℃、７２時間で発現させた。次いで、これらのプレートを１８００ｇで１０分間遠心した。蛍光偏光濃度測定アッセイと組み合わせたＴＧＦｂＲＩＩ  ＭＳＤ結合アッセイで抗原結合について可溶性ｄＡｂ上清をスクリーニングした。ヒトＴＧＦｂＲＩＩ結合物質の数は多く、更なる特徴解析に進めるにはクローンが多すぎた。そこで、クローンのサブセットをシークエンスし、固有の配列のものを更に特徴解析した。
【０１７４】
ＴＧＦβＲＩＩ  ＭＳＤ結合アッセイ
このアッセイを用いて、抗ＴＧＦｂＲＩＩ  ｄＡｂの結合活性を決定した。ＴＧＦｂＲＩＩ−Ｆｃ抗原をＭＳＤプレート上にコーティングした後、ブロッキングして非特異的結合を防いだ。可溶性ＦＬＡＧタグ化ｄＡｂを含む段階希釈した上清を加えた。インキュベーション後、プレートを洗浄し、ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃに特異的に結合したｄＡｂのみがプレートに結合したまま残った。ルテニウム化抗ＦＬＡＧタグ化抗体およびＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて結合ｄＡｂを検出した。上清希釈物中のｄＡｂ濃度を蛍光偏光濃度測定アッセイで決定した場合、濃度結合曲線をプロットした。
【０１７５】
０．５μｌ／ウェルの、６０μｇ／ｍｌのヒトＴＧＦｂＲＩＩ−Ｆｃ、６０μｇ／ｍｌのマウスＴＧＦｂＲＩＩ−Ｆｃ、または６０μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号１１０−ＨＧ）のいずれかを、３８４ウェルＭＳＤ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄプレート（メソスケールディスカバリー社）にスポットした。プレートを室温で最低４時間、最長で一晩、風乾した。５０μｌ／ウェルの５％ＭＡＲＶＥＬ（商標）を含むトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）＋０．１％ＴＷＥＥＮ（商標）２０中、室温で１時間または４℃で一晩、プレートのブロッキングを行った。プレートをはじいてウェルからブロッキング試薬を除去した。ｄＡｂ上清の１：３希釈系列を２×ＴＹ培地中に調製した。ｄＡｂをｐＤＯＭ１０発現ベクター中で発現させ、ｄＡｂタンパク質をＦＬＡＧ融合タンパク質として発現させた。ブロッキング試薬を除去し、１０μｌ／ウェルの希釈ｄＡｂ上清を、ブロッキングしたＭＳＤプレートに移した。ｄＡｂ上清を４点曲線または１１点曲線としてスクリーニングした。希釈ｄＡｂ上清に加えて、各プレートに２つの対照を含めた。対照の１つはＴＧＦｂＲＩＩ結合特異性のない低対照（０％結合に標準化）であり、もう１つはＴＧＦｂＲＩＩ結合特異性が高い高対照（１００％結合に標準化）である（データ示さず）。
【０１７６】
プレートをｄＡｂ上清および対照サンプルと室温で１時間インキュベートした後、５０μｌ／ウェルのＴＢＳ＋０．１％ＴＷＥＥＮ（商標）で３回洗浄した。１５μｌ／ウェルのルテニウム化抗ＦＬＡＧ抗体をプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。メーカーの取扱説明書（メソスケールディスカバリー社、カタログ番号Ｒ９１ＢＮ−１）に従い、抗ＦＬＡＧ抗体（抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体、シグマ社、英国、カタログ番号Ｆ３１６５）をルテニウムＩＩトリス−ビピリジンＮ−ヒドロキシスクシンイミドとコンジュゲートさせた。マウス抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ抗体対照ウェルを除く全てのウェルにルテニウム化抗ＦＬＡＧ抗体を加えた。代わりに、１５μｌ／ウェルの抗マウスＭＳＤタグ（メソスケールディスカバリー社、カタログ番号Ｒ３１ＡＣ−１）を加えた。抗マウスＭＳＤタグは、２％ＭＡＲＶＥＬ（商標）を含むＴＢＳ＋０．１％ＴＷＥＥＮ（商標）２０中に終濃度７５０ｎｇ／ｍｌで希釈した。プレートを室温で１時間インキュベートし、５０μｌ／ウェルのＴＢＳ＋０．１％ＴＷＥＥＮ（商標）で３回洗浄した。３５μｌの１×ＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（メソスケールディスカバリー社）を各ウェルに加え、プレートをＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  ６０００リーダー（メソスケールディスカバリー社）で読み取った。
【０１７７】
ＸＣ５０  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｂａｓｅを用いてデータを分析した。全てのデータは各プレートの高または低対照ウェルの平均に対して標準化し、低対照を０％結合、高対照を１００％結合に標準化した。標準化したデータに４パラメーターの曲線当てはめを適用し、上清中のｄＡｂの蛍光偏光濃度測定アッセイを用いて算出したｄＡｂ濃度を用いて濃度結合曲線にプロットした。
【０１７８】
用いた４パラメーター当てはめは以下の通りであった：
【０１７９】
【数１】
2014504866.tif 000002
〔式中、ａは最小値、ｂは傾き（Ｈｉｌｌ  ｓｌｏｐｅ）、ｃはＸＣ５０、ｄは最大値である〕。
【０１８０】
上清中のｄＡｂの蛍光偏光濃度測定アッセイ
このアッセイは、上清中に発現された可溶性ＦＬＡＧタグ化ｄＡｂの濃度を決定することができる。蛍光標識されたＦＬＡＧペプチドを抗ＦＬＡＧ抗体と混合した。蛍光分子を波長５３１ｎＭの偏光で励起し、放射された偏光を波長５９５ｎＭで読み取った。ＦＬＡＧタグ化ｄＡｂを加えると、抗ＦＬＡＧ抗体から蛍光ペプチドが外れ、発光シグナルの偏光が減少した。既知濃度の精製ＦＬＡＧタグ化ＶＨダミーｄＡｂの標準曲線を作製し、上清中の可溶性ｄＡｂの濃度を逆算するために用いた。濃度データを結合活性データと合わせ、ｄＡｂ上清の濃度結合曲線をプロットできるようにした。
【０１８１】
ｄＡｂ上清を２×ＴＹ培地に１：２で段階希釈し（１：２、１：４、１：８、および１：１６）、次いでリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に１：１０希釈した。希釈した上清を黒色３８４ウェルプレートに移した。精製ＶＨ  Ｄｕｍｍｙ  ｄＡｂを、１０ｖ／ｖ％  ２×ＴＹ培地を含むＰＢＳ中に１：１．７で段階希釈することにより標準曲線を作製した。最高ｄＡｂ濃度は１０μＭとし、合計１６の希釈物を用いた。各希釈物５μｌを３８４ウェルプレートに移した。ｃ末端でＣｙ３ｂで標識された５ｎＭ  ＦＬＡＧペプチドと、１００ｍＭ抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体（シグマ社、カタログ番号Ｆ３１６５）と、０．４ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）との混合物を含む２ｍＭ  ＣＨＡＰｓバッファーを調製した。混合物５μｌを希釈ｄＡｂを含むウェル（上清および標準曲線ウェルの両方）に移した。プレートを１０００ｒｐｍ（２１６ｇ）で１分間遠心した後、暗黒下、室温で１５分間インキュベートした。以下のフィルターを取り付けたＥＮＶＩＳＩＯＮ（商標）リーダー（パーキンエルマー社）でプレートを読み取った：
励起フィルター：ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ  ＦＰ  ５３１
発光フィルター１：ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ  ＦＰ  Ｐ  ｐｏｌ  ５９５
発光フィルター２：ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ  ＦＰ  Ｐ  ｐｏｌ  ５９５
ミラー：ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ  ＦＰ  Ｄｕａｌ  Ｅｎｈ
【０１８２】
標準曲線をプロットし、上清中の可溶性ｄＡｂの濃度逆算に用いた。
【０１８３】
ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）、およびＭＳＤ結合アッセイで同定されたマウスおよびヒトＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃ結合性ｄＡｂを、３０℃で４８〜７２時間、一晩発現自己誘導培地（ＯＮＥＸ（商標）、ノバジェン社）中で発現させた。培養物を遠心（４，６００ｇで３０分間）し、上清を、ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（商標）−プロテインＡビーズ（アマシャムバイオサイエンス社、ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ（商標）社、英国；結合能：ビーズ１ｍｌ当たりｄＡｂ５ｍｇ）と、４℃で一晩または室温で少なくとも１時間のいずれかでインキュベートした。ビーズをクロマトグラフィーカラムに充填し、１×または２×ＰＢＳのいずれかで洗浄し、次いで１０または１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）（シグマ社、英国）で洗浄した。結合したｄＡｂを０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）で溶出させ、１Ｍトリス（ｐＨ８．０）で中和した。ｄＡｂの２８０ｎｍのＯＤを測定し、ｄＡｂのアミノ酸組成から計算される消衰係数を用いてタンパク質濃度を決定した。
【０１８４】
抗ヒトおよび抗マウスＴＧＦＲＩＩ  ｄＡｂナイーブリードのアミノ酸および核酸配列を以下に示す。
【０１８５】
ＤＯＭ２３ｈ  ８０２  アミノ酸配列（配列番号１）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＥＧＴＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＬＡＡＧＳＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＫＲＱＥＲＤＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０１８６】
ＤＯＭ２３ｈ  ８０２  核酸配列（配列番号３９）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＧＴＧＡＧＧＧＧＡＣＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＴＴＴＧＧＣＴＧＣＴＧＧＴＴＣＴＡＡＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＡＡＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＣＧＧＧＡＴＧＧＧＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０１８７】
ＤＯＭ２３ｈ  ８０３  アミノ酸配列（配列番号２）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＡＧＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＮＲＤＧＴＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＨＤＤＧＨＧＮＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０１８８】
ＤＯＭ２３ｈ  ８０３  核酸配列（配列番号４０）
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【０１８９】
ＤＯＭ２３ｈ−８１３  アミノ酸配列（配列番号３）
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【０１９０】
ＤＯＭ２３ｈ−８１３  核酸配列（配列番号４１）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＡＴＧＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＴＧＧＴＣＡＴＡＣＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＧＡＡＣＡＧＧＡＴＧＴＴＡＡＧＧＧＧＴＣＧＴＣＴＴＣＧＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０１９１】
ＤＯＭ２３ｈ−８１５  アミノ酸配列（配列番号４）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＡＥＤＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＤＰＱＧＱＨＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＳＴＧＳＡＴＳＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０１９２】
ＤＯＭ２３ｈ−８１５  核酸配列（配列番号４２）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＴＧＡＴＣＣＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＴＣＴＡＣＴＧＧＧＴＣＴＧＣＴＡＣＧＴＣＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０１９３】
ＤＯＭ２３ｈ−８２８  アミノ酸配列（配列番号５）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＭＳＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＰＳＧＳＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＶＶＥＹＳＲＴＨＫＧＶＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０１９４】
ＤＯＭ２３ｈ−８２８  核酸配列（配列番号４３）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＴＧＡＧＴＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＴＴＣＴＣＣＧＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＣＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＡＡＧＧＧＴＧＴＧＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０１９５】
ＤＯＭ２３ｈ−８３０  アミノ酸配列（配列番号６）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＦＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＥＧＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＤＳＬＧＤＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＧＬＴＨＱＳＰＳＴＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０１９６】
ＤＯＭ２３ｈ−８３０  核酸配列（配列番号４４）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＴＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＧＧＧＧＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＧＴＧＡＴＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＧＧＧＣＴＴＡＣＧＣＡＴＣＡＧＴＣＴＣＣＧＡＧＴＡＣＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０１９７】
ＤＯＭ２３ｈ−８３１  アミノ酸配列（配列番号７）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＥＡＹＫＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＴＰＳＧＧＱＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＹＧＳＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０１９８】
ＤＯＭ２３ｈ−８３１  核酸配列（配列番号４５）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＧＧＣＧＴＡＴＡＡＧＡＴＧＡＣＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＴＡＴＡＴＴＡＣＧＣＣＧＴＣＴＧＧＴＧＧＴＣＡＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＴＡＴＧＧＴＴＣＧＡＧＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０１９９】
ＤＯＭ２３ｈ−８４０  アミノ酸配列（配列番号８）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＧＤＧＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＧＡＧＳＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＡＳＲＮＳＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２００】
ＤＯＭ２３ｈ−８４０  核酸配列（配列番号４６）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＧＧＧＡＴＧＧＴＣＧＴＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＴＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＧＴＴＣＧＧＡＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＧＣＧＴＣＧＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２０１】
ＤＯＭ２３ｈ−８４２  アミノ酸配列（配列番号９）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＳＥＭＡＷＡＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＬＩＲＲＮＧＮＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＶＴＫＤＲＳＶＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２０２】
ＤＯＭ２３ｈ−８４２  核酸配列（配列番号４７）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＧＡＴＡＧＴＧＡＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＧＣＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＣＴＴＡＴＴＣＧＧＣＧＴＡＡＴＧＧＴＡＡＴＧＣＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＧＴＴＡＣＧＡＡＧＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２０３】
ＤＯＭ２３ｈ−８４３  アミノ酸配列（配列番号１０）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＱＤＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＳＧＧＨＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＮＥＳＧＲＳＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２０４】
ＤＯＭ２３ｈ−８４３  核酸配列（配列番号４８）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＣＡＧＧＡＴＣＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＴＧＡＧＡＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＴＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＧＡＧＴＣＧＧＧＧＣＧＴＴＣＧＧＧＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２０５】
ＤＯＭ２３ｈ−８５０  アミノ酸配列（配列番号１１）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＡＡＲＭＷＷＡＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＡＤＩＧＮＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＳＧＳＥＤＨＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２０６】
ＤＯＭ２３ｈ−８５０  核酸配列（配列番号４９）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＧＣＧＧＣＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＣＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＣＧＧＡＴＡＴＴＧＧＴＡＡＴＡＣＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＴＣＴＧＧＴＴＣＧＧＡＧＧＡＴＣＡＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２０７】
ＤＯＭ２３ｈ−８５４  アミノ酸配列（配列番号１２）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＡＱＤＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＤＬＨＧＴＳＳＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２０８】
ＤＯＭ２３ｈ−８５４  核酸配列（配列番号５０）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＣＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＴＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧＣＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＴＴＧＣＡＴＧＧＴＡＣＴＡＧＴＴＣＴＴＴＧＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２０９】
ＤＯＭ２３ｈ−８５５  アミノ酸配列（配列番号１３）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＥＮＴＳＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＲＩＤＰＫＧＳＨＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＲＥＬＧＫＳＨＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２１０】
ＤＯＭ２３ｈ−８５５  核酸配列（配列番号５１）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＧＡＡＴＡＣＧＡＧＴＡＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＣＧＴＡＴＴＧＡＴＣＣＴＡＡＧＧＧＴＡＧＴＣＡＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＴＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＣＧＴＧＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＧＴＣＧＣＡＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２１１】
ＤＯＭ２３ｈ−８６５  アミノ酸配列（配列番号１４）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲＳＹＥＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＫＩＤＰＳＧＲＦＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＲＴＤＬＱＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２１２】
ＤＯＭ２３ｈ−８６５  核酸配列（配列番号５２）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＣＧＴＡＧＴＴＡＴＧＡＧＡＴＧＡＣＴＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＡＡＧＡＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＧＧＴＣＧＧＡＣＧＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２１３】
ＤＯＭ２３ｈ−８６６  アミノ酸配列（配列番号１５）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＷＭＲＷＡＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＴＰＫＧＤＨＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＥＳＬＨＮＥＲＶＫＨＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２１４】
ＤＯＭ２３ｈ−８６６  核酸配列（配列番号５３）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＴＣＧＡＡＴＴＡＴＴＧＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＧＣＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＴＡＴＡＴＴＡＣＴＣＣＴＡＡＧＧＧＴＧＡＴＣＡＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＧＡＡＴＣＧＣＴＴＣＡＴＡＡＴＧＡＧＣＧＴＧＴＴＡＡＧＣＡＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２１５】
ＤＯＭ２３ｈ−８７４  アミノ酸配列（配列番号１６）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＳＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＤＳＴＧＳＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＱＡＧＳＡＭＧＥＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２１６】
ＤＯＭ２３ｈ−８７４  核酸配列（配列番号５４）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＣＴＡＧＴＴＡＴＣＧＴＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＡＣＴＧＧＴＴＣＧＧＣＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＧＡＧＴＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＡＧＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２１７】
ＤＯＭ２３ｈ−８８３  アミノ酸配列（配列番号１７）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＶＮＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＤＫＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＨＧＬＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２１８】
ＤＯＭ２３ｈ−８８３  核酸配列（配列番号５５）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＴＣＧＴＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＴＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＡＴＡＡＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＴＧＧＧＣＴＧＴＣＧＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２１９】
ＤＯＭ２３ｈ−９０３  アミノ酸配列（配列番号１８）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＤＭＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＮＡＤＧＮＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＧＬＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２２０】
ＤＯＭ２３ｈ−９０３  核酸配列（配列番号５６）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＡＴＧＡＴＡＴＧＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＧＡＴＴＡＡＴＧＣＴＧＡＴＧＧＴＡＡＴＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＧＡＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２２１】
ＤＯＭ２３ｍ−４  アミノ酸配列（配列番号１９）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＴＹＧＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＷＩＥＫＴＧＮＫＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＡＧＲＨＩＫＶＲＳＲＤＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２２２】
ＤＯＭ２３ｍ−４  核酸配列（配列番号５７）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＣＧＡＣＴＴＡＴＧＧＴＡＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＴＧＧＡＴＴＧＡＧＡＡＧＡＣＧＧＧＴＡＡＴＡＡＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＧＣＧＧＧＧＡＧＧＣＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴＧＣＧＴＴＣＧＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２２３】
ＤＯＭ２３ｍ−２９  アミノ酸配列（配列番号２０）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＫＲＹＳＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＮＤＬＧＳＬＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＮＩＳＭＶＲＰＧＳＷＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２２４】
ＤＯＭ２３ｍ−２９  核酸配列（配列番号５８）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＡＧＡＧＧＴＡＴＴＣＴＡＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＧＡＴＣＴＧＧＧＴＡＧＴＴＴＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＴＴＡＧＴＡＴＧＧＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２２５】
ＤＯＭ２３ｍ−３２  アミノ酸配列（配列番号２１）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＦＥＹＰＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＳＧＤＧＱＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＨＴＧＴＶＲＨＬＥＴＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２２６】
ＤＯＭ２３ｍ−３２  核酸配列（配列番号５９）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＴＴＴＧＡＧＴＡＴＣＣＴＡＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＴＡＴＴＡＧＴＧＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＧＣＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＡＧＴＣＡＴＡＣＧＧＧＧＡＣＴＧＴＧＡＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２２７】
ＤＯＭ２３ｍ−６２  アミノ酸配列（配列番号２２）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＧＱＥＳＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＧＴＲＩＫＱＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２２８】
ＤＯＭ２３ｍ−６２  核酸配列（配列番号６０）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＡＧＧＡＧＡＧＴＡＴＧＴＡＴＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＴＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧＣＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＡＧＴＧＧＴＡＣＧＣＧＧＡＴＴＡＡＧＣＡＧＧＧＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２２９】
ＤＯＭ２３ｍ−７１  アミノ酸配列（配列番号２３）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＭＤＹＲＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＤＰＴＧＬＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＩＫＷＧＥＭＧＳＹＫＴＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２３０】
ＤＯＭ２３ｍ−７１  核酸配列（配列番号６１）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＴＧＧＡＴＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＡＴＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＧＧＡＴＴＧＡＴＣＣＴＡＣＴＧＧＴＴＴＧＣＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＡＴＴＡＡＧＴＧＧＧＧＧＧＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＴＴＡＴＡＡＧＡＣＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２３１】
ＤＯＭ２３ｍ−７２  アミノ酸配列（配列番号２４）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＭＤＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＭＩＲＥＤＧＧＫＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＡＲＶＰＹＲＲＧＨＲＤＮＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２３２】
ＤＯＭ２３ｍ−７２  核酸配列（配列番号６２）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＴＧＧＡＴＴＡＴＧＡＴＡＴＧＡＧＴＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＡＴＧＡＴＴＣＧＴＧＡＧＧＡＴＧＧＴＧＧＴＡＡＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＧＣＧＡＧＧＧＴＧＣＣＴＴＡＴＣＧＧＣＧＴＧＧＧＣＡＴＡＧＧＧＡＴＡＡＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２３３】
ＤＯＭ２３ｍ−８１  アミノ酸配列（配列番号２５）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＥＰＶＩＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＡＲＧＧＧＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＧＲＨＬＳＱＤＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２３４】
ＤＯＭ２３ｍ−８１  核酸配列（配列番号６３）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＧＣＣＧＧＴＴＡＴＴＡＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＴＧＡＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＡＴＣＴＴＡＧＴＣＡＧＧＡＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２３５】
ＤＯＭ２３ｍ−９９  アミノ酸配列（配列番号２６）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＲＹＲＭＭＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＤＰＡＧＭＬＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＲＬＡＳＲＳＨＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２３６】
ＤＯＭ２３ｍ−９９  核酸配列（配列番号６４）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＧＴＡＴＧＡＴＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＡＣＧＡＴＴＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＡＴＧＣＴＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＡＧＧＣＴＧＧＣＴＴＣＧＣＧＧＡＧＴＣＡＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２３７】
ＤＯＭ２３ｍ−１０１  アミノ酸配列（配列番号２７）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＥＹＤＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＲＩＲＳＤＧＶＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＲＡＫＮＧＷＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２３８】
ＤＯＭ２３ｍ−１０１  核酸配列（配列番号６５）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＣＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＴＣＴＧＡＧＴＡＴＧＡＴＡＴＧＧＣＴＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＴＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＣＧＧＡＴＴＣＧＴＴＣＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＡＡＧＡＡＴＧＧＴＴＧＧＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２３９】
ＤＯＭ２３ｈ−３５２  アミノ酸配列（配列番号２８）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＫＹＫＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＬＩＦＰＮＧＶＰＴＹＹＡＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＹＳＧＱＧＲＤＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２４０】
ＤＯＭ２３ｈ−３５２  核酸配列（配列番号６６）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＡＡＧＴＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＴＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＣＴＴＡＴＴＴＴＴＣＣＧＡＡＴＧＧＴＧＴＴＣＣＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＴＡＴＡＧＴＧＧＴＣＡＧＧＧＧＣＧＧＧＡＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２４１】
これらの抗ヒトおよび抗マウスＴＧＦＲＩＩ  ｄＡｂナイーブリードのKabatにより定義されるＣＤＲをそれぞれ以下の表１および２に示す。
【０２４２】
【表１】
2014504866.tif 000003
2014504866.tif 000004
【０２４３】
【表２】
2014504866.tif 000005
【０２４４】
実施例２：ＤＳＣ（示差走査熱量測定）−ナイーブクローン
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いてｄＡｂの熱安定性を決定した。ｄＡｂを終濃度１ｍｇ／ｍｌでＰＢＳ中に一晩透析した。透析バッファーを全サンプルの参照として用いた。ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ（商標）−ＭＩＣＲＯＣＡＬ（商標）ＶＰ−ＤＳＣキャピラリーセルマイクロ熱量計を用いて１８０℃／時間の加熱速度でＤＳＣ測定を行った。典型的なスキャンレンジは参照バッファーおよびタンパク質サンプルの両方で２０〜９０℃とした。これらの実験条件下でのタンパク質のリフォールディングの程度を評価するために各時点でリスキャンを行った。各タンパク質サンプルのスキャン後、５％ＤＥＣＯＮ（商標）（フィッシャーサイエンティフィック社）の水溶液でキャピラリーセルを洗浄し、次いでＰＢＳスキャンを行った。得られたデータトレースをＯｒｉｇｉｎ７．０ソフトウェアで分析した。参照バッファースキャンから得られたＤＳＣトレースをタンパク質サンプルスキャンから引いた。タンパク質サンプルの正確なモル濃度をデータ分析ルーチンに入力して、融解温度（Ｔｍ）、エンタルピー（ΔＨ）、およびファント・ホッフのエンタルピー（ΔＨｖ）の値を得た。データを非２状態モデル（ｎｏｎ−２−ｓｔａｔｅ  ｍｏｄｅｌ：Ｎ２Ｍ）に当てはめた。最良適合を１または２遷移事象のいずれかで得た。本特許に記載のｄＡｂに得られたＴｍ値は５２．１℃〜７３．３℃である。Ｔｍ値およびリフォールディングの割合を表３に示す。
【０２４５】
【表３】
2014504866.tif 000006
全ての分子が少なくとも５２℃まで加熱後に三次構造を維持する。
【０２４６】
実施例３：ＳＥＣ−ＭＡＬＳ（分子ふるいクロマトグラフィーおよび多角度レーザー光散乱）−ナイーブクローン
【０２４７】
溶液中でｄＡｂが単量体であるかより高次のオリゴマーを形成しているかを決定するために、これらをＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ（分子ふるいクロマトグラフィーおよび多角度レーザー光散乱）で分析した。（Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウェアにより制御される）オートサンプラーおよびＵＶ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣシステムをＷｙａｔｔ  Ｍｉｎｉ  Ｄａｗｎ  Ｔｒｅｏｓ（レーザー光散乱（ＬＳ）検出器）およびＷｙａｔｔ  Ｏｐｔｉｌａｂ  ｒＥＸ  ＤＲＩ（示差屈折率（ＲＩ）検出器）に連結した。検出器は以下の順で連結した：ＵＶ−ＬＳ−ＲＩ。ＲＩおよびＬＳ機器の両方を波長６５８ｎｍで作動させ、ＵＶシグナルを２８０ｎｍおよび２２０ｎｍでモニタリングした。ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ（商標）社製１０／３００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラムを用いた分子ふるいクロマトグラフィーにより、ドメイン抗体（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬの濃度で１００マイクロリットル注入）をそれらの流体力学的特性に従って分離した。移動相はＰＢＳおよび１０％エタノールとした。タンパク質が検出器を通過する際の散乱光の強度を角度の関数として測定した。この測定と、ＲＩ検出器を用いて決定されたタンパク質濃度とから、適切な式（分析ソフトウェアＡｓｔｒａ  ｖ．５．３．４．１４の積分部分）を用いてモル質量の計算が可能になった。本明細書に記載のｄＡｂは全て、単量体含有量が６５〜９８％であった。データを表４に示す。
【０２４８】
【表４】
2014504866.tif 000007
【０２４９】
表３および４に挙げた分子は、溶液状態（単量体含有量の傾向）および熱安定性に基づいて選択した。全ての分子が、６５％以上の単量体化傾向を示し、少なくとも５２℃まで、加熱後に三次構造を維持する。
【０２５０】
実施例４：ＴＧＦベータＲＩＩ阻害アッセイ（ナイーブクローン）
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ルシフェラーゼアッセイ−方法ｍ１：
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ルシフェラーゼアッセイは、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞中でＴＧＦβにより誘導されるＣＡＧＡ−ルシフェラーゼの発現をｄＡｂが阻害する能力を測定する。ＣＡＧＡボックスと名付けられた３コピーのＴＧＦβ応答性配列モチーフがヒトＰＡＩ−１プロモーター中に存在し、Ｓｍａｄ３および４タンパク質に特異的に結合する。マルチコピーのＣＡＧＡボックスをルシフェラーゼレポーターコンストラクト中にクローニングすることにより、レポーターシステムで形質移入された細胞にＴＧＦβ応答性が付与される。このアッセイは、［ＣＡＧＡ］１２−ルシフェラーゼレポーターコンストラクトが安定的に形質移入されたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（マウス骨芽細胞）を使用する（Dennler, et al. (1998) EMBO J. 17, 3091-3100）。
【０２５１】
Ｓｍａｄ３／４経路を介したＴＧＦ−β１シグナル伝達をブロックする能力について可溶性ｄＡｂを調べた。
【０２５２】
表５中の方法ｍ１で見られるデータの作成に用いたプロトコールは以下の通りである。簡潔に述べると、１ウェル当たり２．５×１０４ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を含むアッセイ培地（ＲＰＭＩ培地（ギブコ社、インビトロジェン社、ペイズリー、英国）、１０％熱不活化ウシ胎児血清、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン）を組織培養９６ウェルプレート（ヌンク社）に加え、次いでｄＡｂおよびＴＧＦ−β１（終濃度１ｎｇ／ｍｌ）を加え、３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。ｄＡｂをＰＢＳ中に透析した後、アッセイにて調べた。ＢＲＩＧＨＴＧＬＯＷ（商標）ルシフェラーゼ試薬（プロメガ社、英国）をウェルに加え、室温で２分間インキュベートして細胞を溶解し、得られた発光をルミノメーター上で測定した。
【０２５３】
アッセイを複数回行い、平均値および最大阻害率範囲の値を得た。これらを表５に要約する。この方法を改変した。以下に記載する。
【０２５４】
改変ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ルシフェラーゼアッセイ−方法ｍ２
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を１．２５×１０４／ウェルで９６ウェルプレート（ヌンク社製１３６１０）の「プレート培地」（ＭＥＭ−アルファ＋リボヌクレオシド、＋デオキシリボヌクレオシド（インビトロジェン社、２２５７１）、５％活性炭処理ＦＣＳ（ペルビオサイエンスＵＫ社（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＫ  Ｌｔｄ）；ＳＨ３００６８．０３）、１／１００ピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社、１１３６０）、２５０μｇ／ｍｌのジェネテシン５０ｍｇ／ｍｌ（インビトロジェン社、１０１３１０２７）中に加え、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。細胞の培地を「アッセイ培地」（ＤＭＥＭ（インビトロジェン社、３１９６６０２１）、２５ｍＭヘペス（インビトロジェン社））と交換し、４×最終アッセイ濃度で精製ｄＡｂを含むＰＢＳを「アッセイ培地」中に滴定し、細胞プレートに加え、次いで４×ＥＣ８０でＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ社、２４０Ｂ）を加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。ＳＴＥＡＤＹＬＩＴＥ（商標）ルシフェラーゼ試薬（パーキンエルマー社、６０１６９８７）をウェルに加え、室温で３０分間インキュベートし、得られた発光をＥＮＶＩＳＩＯＮ（商標）プレートリーダー上で測定した。
【０２５５】
各ｄＡｂをアッセイ中で２連（ｉｎ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で滴定し、最大阻害率を決定した（ｎ＝２）。アッセイを複数回行い、平均値および最大阻害率の範囲の値を得た。これらを表５に要約する。アッセイＱＣパラメーターは適合しており、内部（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）小分子はマウスアッセイで１００〜９００ｎＭのＩＣ５０範囲を示していた。また、ロバストなＺ因子（ｚ  ｆａｃｔｏｒ）は０．４より大きく、ＴＧＦ−β  ＥＣ８０はアッセイに加えた濃度の６倍以内であった。
【０２５６】
Ａ５４９  ＩＬ−１１放出アッセイ−ｈ１
Ａ５４９インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）放出アッセイは、ヒトＴＧＦ−β１で刺激されるＡ５４９細胞からのＩＬ−１１放出をｄＡｂが阻害する能力を測定する。ＴＧＦ−β１はＴＧＦ−βＲＩＩに直接結合し、ＴＧＦ−βＲＩ／ＩＩ複合体の構築を誘導する。ＴＧＦ−βＲＩはリン酸化され、Ｓｍａｄ４経路等の複数の経路を介してシグナル伝達することができる。Ｓｍａｄ４経路が活性化されるとＩＬ−１１が放出される。ＩＬ−１１が細胞上清中に分泌され、次いで比色ＥＬＩＳＡで測定する。
【０２５７】
Ｓｍａｄ４経路を介したＴＧＦ−β１シグナル伝達をブロックする能力について可溶性ｄＡｂを試験した。簡潔に述べると、１ウェル当たり１×１０５個のＡ５４９細胞を含む「アッセイ培地」（ＤＭＥＭ高グルコース培地（ギブコ（ＴＭ）社、インビトロジェン社、ペイズリー、英国）、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＰＡＡ社、オーストリア）、１０ｍＭヘペス（シグマ社、英国）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＡＡ社、オーストリア））を、組織培養９６ウェルプレート（ヌンク社）に加え、次いでｄＡｂおよびＴＧＦ−β１（終濃度３ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄシステムズ社、アビンドン、英国）を加え、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。アッセイの前にｄＡｂをＰＢＳに透析した。Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１１  ＤＵＯＳＥＴ（商標）（Ｒ＆Ｄシステムズ社、アビンドン、英国）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、上清に放出されたＩＬ−１１の濃度を測定した。
【０２５８】
Ａ５４９  ＩＬ−１１放出アッセイは表５および６中でアッセイ方法ｈ１として記載されている。アッセイを複数回行って、平均値および最大阻害率の範囲の値を得た。これらを表５に要約する。アッセイＱＣパラメーターは適合しており、内部小分子はヒトアッセイで５０〜５００ｎＭのＩＣ５０範囲を示していた。
【０２５９】
ＳＢＥ−ｂｌａ  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞センサーアッセイ−ｈ２：
シグナル伝達分子のＳｍａｄファミリーのメンバーは、ＴＧＦ−βシグナルを細胞表面から核に伝達する細胞内経路の構成要素である。ＴＧＦ−β１はＴＧＦ−βＲＩＩに直接結合し、ＴＧＦ−βＲＩ／ＩＩ複合体の構築を誘導する。次いで、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３がＴＧＦ−βＲＩによってリン酸化され、その後、共ｓｍａｄファミリーメンバーであるＳｍａｄ４とヘテロマー複合体を形成する。これらの複合体は核に移動され、そこでＤＮＡに結合して遺伝子転写を調節する。
【０２６０】
細胞センサーＳＢＥ−ｂｌａ  ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞は、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞（インビトロジェン社、英国）中に安定的に組み込まれたＳｍａｄ結合配列（ＳＢＥ）の制御下にあるベータ−ラクタマーゼレポーター遺伝子を含む。細胞はＴＧＦ−βＩに応答性であり、Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達経路のアゴニスト／アンタゴニストの検出に用いることができる。
【０２６１】
英国インビトロジェン社（セルラインＫ１１０８）の最適化された方法に基づく以下の方法に従い、この経路を介したＴＧＦ−β１シグナル伝達をブロックする能力について可溶性ｄＡｂを試験した。
【０２６２】
増殖培地（ＤＭＥＭ高グルコース、インビトロジェン社、２１０６８０２８、１０％透析米国製ＦＢＳ（インビトロジェン社、２６４００−０４４）、０．１ｍＭ（１／１００）非必須アミノ酸（インビトロジェン社、１１１４０−０５０、２５ｍＭ（１／４０）ヘペスバッファー（シグマ社、Ｈ０８８７）、１ｍＭ（１／１００）ピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社、１１３６０−０７０）、１％ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）（２００ｍＭ、インビトロジェン社、３５０５００３８）、５μｇ／ｍｌのブラストサイジン（インビトロジェン社、Ｒ２１００１））中で少なくとも４継代増殖させて室内（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）で凍結（４×１０７／ｍｌ）した凍結細胞から直接アッセイを行った。細胞を２０，０００細胞／ウェルで細胞培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３７１２）中のプレート培地（上記同様、１％ＦＣＳを含み、ブラストサイジンを含まない）にプレーティングした。細胞を一晩インキュベートした後、精製ｄＡｂを「アッセイ培地」（ＤＭＥＭ（インビトロジェン社、３１９６６０２１）２５ｍＭヘペス（インビトロジェン社）で希釈し、４×最終アッセイ濃度で細胞に加えた。３７℃で１時間インキュベートした後、ＴＧＦ−β（Ｒ＆Ｄシステムズ社；２４０Ｂ）を４×ＥＣ８０で加え、更に５時間インキュベートした。ＬＩＶＥＢＬＡＺＥＲ（商標）基質（インビトロジェン社、Ｋ１０３０）をメーカーの取扱説明書通りに構成し、８倍体積で添加した。プレートを暗黒下、室温で１６時間インキュベートし、インビトロジェン社のプロトコールに従いＥＮＶＩＳＩＯＮ（商標）プレートリーダー上で読み取った。
【０２６３】
ＳＢＥ−ｂｌａ  ＨＥＫ  ＣＥＬＬＳＥＮＳＯＲ（商標）アッセイは表５および６中で方法ｈ２として記載している。アッセイ中、各ｄＡｂを２連で滴定し、ＩＣ５０を決定し、最大阻害率を決定した（ｎ＝２）。マウスアッセイでは完全な曲線を得ることが困難であったため、阻害率のみを表５に引用する。アッセイを複数回行い、平均値および値の範囲を得た。これらを表５および６に要約する。ｐＩ５０（ＩＣ５０の−ｌｏｇ）を用いて算術平均ＩＣ５０を計算し、平均ｐＩＣ５０からｌｏｇ標準偏差を加減して範囲を計算した後、ＩＣ５０に変形し直した。アッセイＱＣパラメーターは適合しており、内部小分子はヒトアッセイで５０〜５００ｎＭのＩＣ５０範囲を示していた。また、ロバストなＺ因子は０．４より大きく、ＴＧＦ−β  ＥＣ８０はアッセイに加えた濃度の６倍以内であった。
【０２６４】
結果を表５および６に示す。
【０２６５】
【表５】
2014504866.tif 000008
【０２６６】
【表６】
2014504866.tif 000009
【０２６７】
マウスクローンは複数のアッセイで４０％を超えるＴＧＦ−β中和を示したことに基づいて選択した。この唯一の例外はＤＯＭ２３ｍ−７２であった。クローンは良好な中和曲線も示した（データ示さず）。ヒトクローンは平均ＩＣ５０が１５μＭ未満であることに基づいて選択した。
【０２６８】
実施例５：ナイーブクローンのエラープローンな親和性成熟（実施例１より）
（前述の）好適な生物物理学的特徴を有し且つ活性であるとして同定されたｄＡｂの親和性を向上させるためにエラープローン（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）突然変異誘発を行った。
【０２６９】
ファージライブラリー構築：ＧＥＮＥＭＯＲＰＨ（商標）ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（ストラタジーン社、カタログ番号２００５５０）を用いて、ＤＯＭ２３ｈ−８４３、ＤＯＭ２３ｈ−８５０、ＤＯＭ２３ｈ−８５４、ＤＯＭ２３ｈ−８５５、ＤＯＭ２３ｈ−８６５、ＤＯＭ２３ｈ−８６６、ＤＯＭ２３ｈ−８７４、ＤＯＭ２３ｈ−８８３、ＤＯＭ２３ｈ−４３９、およびＤＯＭ２３ｈ−９０３のエラープローンライブラリーを作製した。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ並びにオリゴヌクレオチドＤＯＭ００８（５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ−３’（配列番号１８５））およびＤＯＭ００９（５’−ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’（配列番号１８６））を用いたＰＣＲ、次いでオリゴヌクレオチドＤＯＭ１７２（５’ＴＴＧＣＡＧＧＣＧＴＧＧＣＡＡＣＡＧＣＧ−３’（配列番号１８７））およびＤＯＭ１７３（５’−ＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣ−３’（配列番号１８８））並びにＭＵＴＡＺＹＭＥ（商標）  ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた希釈ＰＣＲ産物の再増幅により（メーカーの取扱説明書に従った）、標的ｄＡｂ遺伝子を増幅した。このＰＣＲ産物を、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチドＤＯＭ１７２およびＤＯＭ１７３で更に増幅することにより、ＤＮＡ産物の収率を上げた。ＰＣＲ産物をＳａｌＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。ストレプトアビジンビーズ（ダイナル・バイオテク社（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、英国）を用いて消化産物から未消化産物および消化末端を除去した。抗ヒトエラープローン選択では、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化したｐＤＯＭ４ファージベクター中に消化産物をライゲートし、大腸菌ＴＢ１細胞の形質転換に用いた。１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを添加した２×ＴＹ寒天上に形質転換細胞をプレーティングし、１×１０７形質転換体を超えるライブラリーサイズを得た。
【０２７０】
ヒトＴＧＦベータＲＩＩ特異的ｄＡｂのエラープローン選択：ＤＯＭ２３ｈ−８４３、ＤＯＭ２３ｈ−８５０、ＤＯＭ２３ｈ−８５４、ＤＯＭ２３ｈ−８５５、ＤＯＭ２３ｈ−８６５、ＤＯＭ２３ｈ−８６６、ＤＯＭ２３ｈ−８７４、ＤＯＭ２３ｈ−８８３、ＤＯＭ２３ｈ−９０３、およびＤＯＭ２３ｈ−４３９ライブラリーで３ラウンドの選択を行った。第１ラウンドは１ｎＭビオチン化ヒトＴＧＦベータＲＩＩ／Ｆｃ（Ｎ１３２４１−５７）を用いて行った。第２および３ラウンドでは２つの異なる方法を続けた：二量体ＴＧＦベータＲＩＩ／Ｆｃ形態の抗原を用いる方法１および可溶性単量体形態のＴＧＦベータＲＩＩを用いる方法２。方法１：１ｎＭビオチン化ヒトＴＧＦベータＲＩＩ／Ｆｃおよび１μＭ非ビオチン化ヒトＴＧＦベータＲＩＩ／Ｆｃ競争物質を用いて第２ラウンドを行った。１００ｐＭビオチン化ヒトＴＧＦベータＲＩＩ／Ｆｃおよび１μＭ非ビオチン化ヒトＴＧＦベータＲＩＩ／Ｆｃ（Ｎ１２７１７−４）を用いて第３ラウンドを行った。方法２：１ｎＭビオチン化ヒトＴＧＦベータＲＩＩおよび１μＭ非ビオチン化ヒトＴＧＦベータＲＩＩ競合物質を用いて第２ラウンドを行った。１００ｐＭビオチン化ヒトＴＧＦベータＲＩＩおよび１μＭ非ビオチン化ヒトＴＧＦベータＲＩＩ競合物質を用いて第３ラウンドを行った。
【０２７１】
第２および３ラウンドの選択アウトプットを前述したようにｐＤＯＭ１３ベクター中にサブクローニングした。個々のクローンを選び、９６ウェルプレート中、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを添加した０．５ｍｌ／ウェルの一晩発現自己誘導培地中で、８５０ｒｐｍ、３７℃、湿度９０％で２４時間発現させた。次いで、プレートを１８００ｇで１０分間遠心した。上清をＨＢＳ−ＥＰ中に１／５または１／２で希釈し、ビオチン化ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃ（メーカーの推奨に従い１０００Ｒｕビオチン化ｈＲＩＩ−ＦｃでコーティングされたＳＡチップ（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）社、ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ（商標）社））への結合についてＢＩＡＣＯＲＥ（商標）でスクリーニングした。サンプルを５０μｌ／ｍｉｎの流速でＢＩＡＣＯＲＥ（商標）にかけた。親クローンと比べて高いレゾナンスユニット（ＲＵ）または向上した解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）で結合したクローンを、一晩発現自己誘導培地５０ｍｌ中、３０℃で４８〜７２時間発現させ、４，６００ｇで３０分間遠心した。上清をＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ−プロテインＡビーズと一緒に４℃で一晩インキュベートした。次いで、ビーズを滴下カラムに充填し、５カラム体積の２×ＰＢＳで、次いで１ベッド体積の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で洗浄し、結合したｄＡｂを０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）で溶出し、１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。ｄＡｂの２８０ｎｍのＯＤを測定し、ｄＡｂのアミノ酸組成から算出した消衰係数を用いてタンパク質濃度を決定した。
【０２７２】
解離速度が向上したエラープローン選択のインビトロ分析：精製ｄＡｂを、ナイーブ選択と同じ試験、すなわちＢｉａｃｏｒｅ、ＳＢＥ−ｂｌａ  ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞センサーアッセイ（ｈ２）、ＤＳＣ、およびＳＥＣ−ＭＡＬＳに供した。親に比べて改善されたクローンの例を表６Ａに示す。ＩＣ５０値は実験数「ｎ」の平均値である。
【０２７３】
【表７】
2014504866.tif 000010
【０２７４】
親和性成熟配列
ＤＯＭ２３ｈ−８５５−２１  核酸配列（配列番号２０３）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＧＡＡＴＡＣＧＡＧＴＡＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＣＧＴＡＴＴＧＡＴＣＣＴＡＡＧＧＧＴＡＧＴＣＡＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＡＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＴＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＣＧＴＧＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＧＴＣＧＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２７５】
ＤＯＭ２３ｈ−８５５−２１  アミノ酸配列（配列番号２０４）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＥＮＴＳＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＲＩＤＰＫＧＳＨＴＹＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＲＥＬＧＫＳＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２７６】
ＤＯＭ２３ｈ−８４３−１３  核酸配列（配列番号２０５）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＣＡＧＧＡＴＣＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＴＧＡＧＡＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＴＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＴＣＡＧＡＡＴＡＡＧＴＣＧＧＧＧＣＧＴＴＣＧＧＧＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２７７】
ＤＯＭ２３ｈ−８４３−１３  アミノ酸配列（配列番号２０６）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＱＤＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＳＧＧＨＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＮＱＮＫＳＧＲＳＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２７８】
ＤＯＭ２３ｈ−４３９−２０  核酸配列（配列番号２０７）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＴＴＧＴＣＴＣＡＣＧＴＡＴＴＧＡＴＴＣＧＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＧＧＣＡＴＧＣＧＧＣＴＧＧＧＧＴＴＴＣＧＧＧＴＡＣＴＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２７９】
ＤＯＭ２３ｈ−４３９−２０  アミノ酸配列（配列番号２０８）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＧＴＥＱＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶＳＲＩＤＳＰＧＧＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＲＨＡＡＧＶＳＧＴＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２８０】
実施例６：ＤＯＭ２３ｈ−２７１−７系列の親和性成熟
ＤＯＭ２３ｈ−２７１  アミノ酸配列（配列番号１９９）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＥＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＰＩＧＮＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＩＰＧＲＫＷＴＡＮＳＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２８１】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１  核酸配列（配列番号２００）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＣＧＴＡＡＧＴＧＧＡＣＴＧＣＴＡＡＴＴＣＧＣＧＧＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２８２】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−７  アミノ酸配列（配列番号２０１）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＥＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＰＩＧＮＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＩＰＧＲＫＷＴＡＮＳＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２８３】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−７  核酸配列（配列番号２０２）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＣＧＴＡＡＧＴＧＧＡＣＴＧＣＴＡＡＴＴＣＧＣＧＧＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２８４】
以前の選択実験でファージライブラリーからドメイン抗体ＤＯＭ２３ｈ−２７１（配列番号１９９）が単離され、エラープローン親和性成熟後にバリアントＤＯＭ２３ｈ−２７１−７（配列番号２０１）が単離されており、いずれも国際公開第２０１１／０１２６０９号に記載されている。その結合キネティクス、配列、および生物物理学的挙動に基づいて、ＤＯＭ２３ｈ−２７１−７（配列番号２０１）を更なる親和性成熟に選択した。親和性成熟は、ディジェネレート突然変異誘発（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いてＣＤＲを再度多様化することにより行われ、ＤＮＡディスプレイまたはファージディスプレイを用いて向上したリードを同定した。ＣＤＲの再多様化のために２種類のライブラリーを構築した。これらをトリプレットまたはドープライブラリーと呼ぶ。トリプレットライブラリーを作製するために、各ＣＤＲをカバーするようにオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、各プライマー中、３つの位置が多様化されるように、３アミノ酸のコドンをＮＮＳコドンで置換した。複数のオリゴヌクレオチドを用いて、各ＣＤＲ内の全標的アミノ酸をカバーした：ＣＤＲ１には２つ、ＣＤＲ２には３つ、ＣＤＲ３には６つ。相補的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、各変異ＣＤＲを含む配列断片およびｄＡｂコード配列の残部をカバーする重複配列断片を増幅した。これらの断片を混合し、スプライス伸長重複ＰＣＲ（ｓｐｌｉｃｅ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｖｅｒｌａｐ  ＰＣＲ）により組み立てて、全長ｄＡｂコード配列を生成した。この生成物を、プライマーＤＯＭ１７２（配列番号１８７）およびＤＯＭ１７３（配列番号１８８）を用いてＰＣＲ増幅し、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、同様に切断した、ファージ選択用のｐＤＯＭ４（前述）中またはＤＮＡディスプレイ選択用のｐＩＥ２Ａ２（国際公開第２００６０１８６５０号に記載）中にライゲートした。本質的に国際公開第２００６０１８６５０号に記載されているように、同様な方法でドープライブラリーを構築した。単一のディジェネレートオリゴヌクレオチドプライマーを用いて各ＣＤＲ内の全変異をカバーした。各プライマー中、多様化すべきアミノ酸を、複数のアミノ酸を指定するディジェネレートコドンを用いて指定した。ＣＤＲ１中の５個のアミノ酸、ＣＤＲ２中の７個のアミノ酸、ＣＤＲ３中の１３個のアミノ酸を多様化した。プライマー中で以下のディジェネレートコ−ディングを用いた：「ａ」＝９１％Ａ＋３％Ｔ＋３％Ｇ＋３％Ｃ；「ｇ」＝９１％Ｇ＋３％Ｔ＋３％Ｃ＋３％Ａ；「ｃ」＝９１％Ｃ＋３％Ｔ＋３％Ｇ＋３％Ａ；「ｔ」＝９１％Ｔ＋３％Ａ＋３％Ｇ＋３％Ｃ；「Ｓ」=５０％Ｇおよび５０％Ｃ。大文字は１００％の指定ヌクレオチドを示す。使用したプライマーは以下の通りである：
２７１−７Ｒ１ｄｅｇ  ＣＤＲ１
（ＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴａｃＳｇａＳｔａｔａｇＳＡＴＧｔｇＳＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧ）（配列番号１８９）；
２７１−７Ｒ２ｄｅｇ  ＣＤＲ２
（ＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡｇｃＳＡＴＴｇａＳｃｃＳａｔＳｇｇＳａａＳｃｇＳＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧ）
（配列番号１９０）；
２７１−７Ｒ３ｄｅｇ  ＣＤＲ３：
（ＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡｃａＳａｔＳｃｃＳｇｇＳｃｇＳａａＳｔｇＳａｃＳｇｃＳａａＳｔｃＳｃｇＳｔｔＳＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧ）（配列番号１９１）。
【０２８５】
ディジェネレートライブラリープライマーはトリプレットプライマーと同じように用いた。各多様化ＣＤＲを別個に増幅し、次いで、スプライス伸長重複法を用いて親配列断片と組み合せた。ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用いて断片をｐＤＯＭ４およびｐＩＥ２Ａ２にサブクローニングした。
【０２８６】
ＤＮＡディスプレイ
本質的に国際公開第２００６０１８６５０号に記載されているようにｓｃＡｒｃ  ＤＮＡ結合タンパク質を用いたＤＮＡディスプレイおよびエマルション中でのインビトロ区画化（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｓａｔｉｏｎ）を用いて選択を行った。簡潔に述べると、ＴＧＦｂＲＩＩ−ＦＣ抗原を、５：１のモル比のビオチンおよびＥＺ−ＬＩＮＫ（商標）  Ｓｕｌｐｈｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンキット（サーモ社、＃２１３２７）を用いてビオチン化した。Ａｒｃオペレーター配列と多様化ｄＡｂライブラリーを含む発現カセットとを含むＤＮＡ断片を、フランキングプライマーを用いてｐＩＥ２Ａ２ベクターからＰＣＲ増幅した。生成物をｅＧｅｌ（インビトロジェン社）から精製して、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ中に１．７または０．８５ｎＭで希釈した。改善された結合物質の選択に、ドープおよびトリプレットライブラリーをわずかに異なる条件下で別個に処理した。トリプレットＣＤＲライブラリーを組み合わせて、プールされたＣＤＲ１、２、または３のライブラリーを得た。各タイプのライブラリーに選択を１０ラウンド行った。両方の方法で、２回の選択サイクル後、スプライス重複伸長ＰＣＲにより多様化ＣＤＲを増幅して組み換え、３つ全てのＣＤＲ中に変異を有する４番目のライブラリーを作製した。
【０２８７】
ドープライブラリーでは、５×１０８コピーのＤＮＡをＥＸＰＲＥＳＳＷＡＹ（商標）インビトロ翻訳ミックス（インビトロジェン社）５０μｌと混合した。各反応液は、１０．０μｌのＳＬＹＤ（商標）抽出物；１０．０μｌの２．５×反応バッファー；１２．５μｌの２×フィードバッファー；１．０μｌのメチオニン（７５ｍＭ）；１．２５μｌのアミノ酸ミックス（５０ｍＭ）；１５μｌのＨ２Ｏ；０．５μｌのＴ７ポリメラーゼ；０．２５μｌの抗ＨＡ  ｍＡｂ  ３Ｆ１０（ロシュ社、カタログ１  ８６７  ４２３）；および１．５μｌのグルタチオン（１００ｍＭ）（シグマ社）を含む。これを、４ｍｌガラスバイアル（ＣＨＲＯＭＡＣＯＬ（商標）  ４ＳＶ  Ｐ８３７）中の疎水相８００μｌ（４．５％ＳＰＡＮ（商標）−８０、（フルカ社（Ｆｌｕｋａ））＋０．５％トリトンＸ１００（シグマ社）を含む白色軽鉱油（Ｌｉｇｈｔ  ｗｈｉｔｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｏｉｌ；シグマ社））に加え、２０００ｒｐｍで４〜５分間撹拌した。チューブを密封し、３０℃で３時間インキュベートした。その後のステップは全て室温で行った。ＤＮＡ−タンパク質複合体を抽出するために、２００μｌのＣ＋バッファー（１０ｍＭトリス、０．１Ｍ  ＫＣｌ、０．０５％ＴＷＥＥＮ（商標）−２０、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）および５００μｌのヘキサンをバイアルに加え、混合し、マイクロチューブに移し、１３０００ｇで１分間遠心した。有機相を除去し、界面がほぼ透明になるまで８００μｌのヘキサンで更に３〜５回水相を再抽出した。最初の５ラウンドの選択では、ビオチン化ＴＧＦｂＲＩＩ−ＦＣをＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ＤＹＮＡｂｅａｄｓ（商標）（インビトロジェン社）に予め結合させて、抽出された複合体に加えて、４０、４０、１０、５、および５ｎＭの抗原（それぞれ第１、２、３、４、および５ラウンド）に相当する抗原濃度にした。選択１〜３にはＴ１ビーズを、選択４および５にはＣ１を用いた。３０分インキュベートした後、ビーズをＣ＋バッファーで３〜５回洗浄した。次いで、ビーズに結合したままのＤＮＡ複合体を、フランキングプライマーを用いたＰＣＲにより回収した。選択第６〜１０ラウンドを「可溶性」選択と呼び、抽出後の複合体にビオチン化ＴＧＦｂＲＩＩ−ＦＣを直接加えて濃度を５、５、４、５、および５ｎＭ（それぞれ第６、７、８、９、および１０ラウンド）にし、３０分間インキュベートして確実に結合させた。次いで、非ビオチン化ＴＧＦｂＲＩＩ−ＦＣを競合物質として７４、７５０、４００、２５０、および２５０ｎＭ（それぞれ、第６、７、８、９、および１０ラウンド）で加え、１５、１５、３０、３０、および３０分間（それぞれ、第６、７、８、９、および１０ラウンド）インキュベートした。第９および１０ラウンドでは、ヘキサン抽出に用いるＣ＋バッファー中に、ＡＲＣオペレーター配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチドを５０ｎＭで含めて、非複合体化ＤＮＡとエマルションから放出された過剰なタンパク質との間の交差反応を低減した。競合期間の後、１０μｌのＣ１  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ＤＹＮＡｂｅａｄｓ（商標）を加えた。１０分後、ビーズをＢｕｆｆｅｒ  Ｃ＋で５回洗浄し、前述したようにフランキングプライマーを用いたＰＣＲにより結合複合体を回収した。ＰＣＲ産物をｅＧｅｌ上で精製し、次の選択サイクルに用いた。１０回目の選択後、回収された生成物をＳａｌＩおよびＮｏｔＩ酵素で切断し、同様に切断した発現用のｐＤＯＭ１３にクローニングした。
【０２８８】
第１ラウンドの選択で１×１０９ＤＮＡコピー、その後５×１０８ＤＮＡコピーを用いたこと以外は同様な方法でトリプレットライブラリーの選択を行った。また、エマルション中でのタンパク質発現のためのインキュベーション時間は２時間に減らした。可溶性ビオチン化ＴＧＦｂＲＩＩ  ＦＣを、１０ラウンド全ての選択で、それぞれ２５、１０、５、５、５、５、２．５、２．５、２．５、２．５、２．５、２．５ｎＭで用いた。ビオチン化標的を、抽出した複合体と３０分間インキュベートした。選択第５〜１０ラウンドでは、Ｃ１  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ＤＹＮＡｂｅａｄｓ（商標）を添加するそれぞれ１５、３０、６０、６０、７５、および９０分前に、非ビオチン化ＴＧＦｂＲＩＩ−ＦＣ競合物質を終濃度２５０ｎＭで加えた。第５ラウンドの競合は室温であったが、第６ラウンドから競合温度を３０℃に上げた。Ａｒｃオペレーター囮オリゴを選択第１〜４ラウンドに含めて、欠損ＤＮＡの交差複合体化を低減した。
【０２８９】
選択後、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用いて、ｄＡｂをコードするインサートをＤＮＡディスプレイ発現カセットから切り出し、ｐＤＯＭ１３細菌発現ベクターにクローニングした。ｄＡｂをシークエンシングし、ＴＢ  ＯＮＥＸ（商標）培地中で発現させ、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）で上清をスクリーニングして、親と比べて解離速度が向上しているクローンを同定した。解離速度が向上したクローンを発現および精製し、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）により親和性について評価し、細胞センサーアッセイにより効力を評価した。望ましくない配列モチーフを含むキネティクス特性が不良なクローンまたは収率が非常に低いクローンは探求しなかった。更なる関心対象として３つが選択された。クローンＤＯＭ２３ｈ−２７１−２１（配列番号２９）およびＤＯＭ２３ｈ−２７１−２２（配列番号３０）がドープライブラリーの選択から単離された。クローンＤＯＭ２３ｈ−２７１−２７（配列番号３１）がトリプレットライブラリーの選択から単離された。ヒトＴＧＦｂＲＩＩ−ＦＣに対する選択されたクローンの親和性を表７に示す。
【０２９０】
【表８】
2014504866.tif 000011
【０２９１】
ファージディスプレイ：
別個のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３プールのトリプレットまたはドープライブラリーを、前述したようにファージ選択ラウンドに供した：ビオチン化ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃ抗原に対して、それぞれ濃度１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、および２０ｐＭの４ラウンドまたは２０ｐＭ抗原の後に２ｐＭ抗原を用いた２ラウンドの選択。ファージ選択で得られたインサートをｐＤＯＭ１０発現ベクターにクローニングし、親と比べて解離速度が向上した上清を更なる実験に選択した。ドメイン抗体を発現させ、前述したようにＢＩＡＣＯＲＥ（商標）  Ｔ１００上または細胞センサーアッセイ中で試験したヒトＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃ抗原に対する親和性および生物活性に基づいて精製した（データ示さず）。選択されたクローンのヒトＴＧＦｂＲＩＩ−ＦＣに対する親和性を表８に示す。
【０２９２】
【表９】
2014504866.tif 000012
【０２９３】
活性が向上されていた選択されたクローンの配列を決定した。全配列およびＣＤＲ配列を以下に示す。
【０２９４】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−２１  アミノ酸配列（配列番号２９）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＥＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＰＩＧＮＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＭＰＧＲＫＷＴＡＫＦＲＷＤＹＷＧＱＧＴＬＶＩＶＳＳ
【０２９５】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−２１  核酸配列（配列番号６７）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＧＧＧＣＣＧＧＡＡＧＴＧＧＡＣＧＧＣＣＡＡＧＴＴＣＣＧＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２９６】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−２２  アミノ酸配列（配列番号３０）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＥＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＰＩＧＮＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＭＰＧＱＫＷＭＡＫＳＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２９７】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−２２  核酸配列（配列番号６８）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＣＣＡＡＧＴＣＣＣＧＣＴＴＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０２９８】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−２７  アミノ酸配列（配列番号３１）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＥＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＰＩＧＱＫＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＩＰＧＲＫＷＴＡＮＳＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＩＶＳＳ
【０２９９】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−２７  核酸配列（配列番号６９）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＣＡＧＡＡＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＣＧＴＡＡＧＴＧＧＡＣＴＧＣＴＡＡＴＴＣＧＣＧＧＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０３００】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１０１  アミノ酸配列（配列番号３２）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＥＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＰＩＧＮＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＩＰＧＲＫＷＴＡＮＧＲＫＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０３０１】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１０１  核酸配列（配列番号７０）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＣＧＴＡＡＧＴＧＧＡＣＴＧＣＴＡＡＴＧＧＴＣＧＴＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０３０２】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１０２  アミノ酸配列（配列番号３３）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＴＦＴＥＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＰＩＧＨＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＩＰＧＲＫＷＴＡＮＳＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０３０３】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１０２  核酸配列（配列番号７１）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＣＡＴＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＣＧＴＡＡＧＴＧＧＡＣＴＧＣＴＡＡＴＴＣＧＣＧＧＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０３０４】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１０５  アミノ酸配列（配列番号３４）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＥＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＰＩＧＮＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＩＰＧＱＲＷＴＧＮＳＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０３０５】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１０５  核酸配列（配列番号７２）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＣＡＧＣＧＧＴＧＧＡＣＴＧＧＴＡＡＴＴＣＧＣＧＧＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０３０６】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１０６  アミノ酸配列（配列番号３５）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＥＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＰＩＧＮＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＦＰＧＲＫＷＴＡＮＳＲＳＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０３０７】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１０６  核酸配列（配列番号７３）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＴＴＴＣＣＧＧＧＧＣＧＴＡＡＧＴＧＧＡＣＴＧＣＴＡＡＴＴＣＧＣＧＧＴＣＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０３０８】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１１４  アミノ酸配列（配列番号３６）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＥＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＰＩＧＮＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＩＰＧＲＫＧＴＡＮＳＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０３０９】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１１４  核酸配列（配列番号７４）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＣＧＴＡＡＧＧＧＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＴＣＧＣＧＧＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０３１０】
【表１０】
2014504866.tif 000013
【０３１１】
結合キネティクスの遺伝学的方法−Ｔ１００
ＣＭ４チップ上の捕捉表面を用いてＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析を行った。抗ヒトＩｇＧを捕捉物質（ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）として用い、一級アミンカップリングによりＣＭ４バイオセンサーチップにカップリングした。ヒトＦｃに融合させた抗原分子をこの固定化表面上に２５０〜３００レゾナンスユニットのレベルで捕捉し、ランニングバッファーで希釈した所定濃度のドメイン抗体をこの捕捉表面上に通過させた。捕捉抗原表面にバッファーを注入して二重参照に用いた。各ドメイン抗体注入後に３Ｍ塩化マグネシウム溶液を用いて捕捉表面を再生した。再生は、捕捉された抗原は除去したが、その後のサイクルにおいて表面が抗原を捕捉する能力には有意に影響しなかった。全てのランは、ＨＢＳ−ＥＰバッファーをランニングバッファーとして用いて２５℃で行った。データはＢＩＡＣＯＲＥ（商標）  Ｔ１００で生成し、ソフトウェアに附属の１：１結合モデルに当てはめた。最高濃度で非特異的結合が見られた場合、この濃度の結合曲線を分析セットから除いた。
【０３１２】
ＣＤＲ３の更なる多様化
親和性が最高のＤＯＭ２３ｈ−２７１−７誘導体は９６および１００Ｂ位にメチオニンを有していた。９９、１００Ｄ、１００Ｅ、および１００Ｇ位に加えてこれらの位置をＮＮＫ突然変異誘発を用いて多様化して、置換が可能であるかどうかを決定した。ＤＯＭ２３ｈ−２７１−２２またはＤＯＭ２３ｈ−２７１−１０２を背景として選択した位置に多様性を導入するプライマーＰＥＰ−２６−Ｆを用いて前述のようにＮＮＫライブラリーを構築した。ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１０２は、ＤＯＭ２３ｈ−２７１−７よりも向上した親和性を付与する２７および５５位の変異を有している。
【０３１３】
ＰＥＰ−２６−Ｆ（配列番号２０９）
ＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＮＮＳＣＣＣＧＧＣＮＮＳＡＡＧＴＧＧＮＮＳＧＣＣＮＮＳＮＮＳＣＧＣＮＮＳＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣ
【０３１４】
ＤＮＡディスプレイライブラリーを構築し、濃度５ｎＭ、０．５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．１ｎＭ、および０．１ｎＭを連続ラウンドで用いて前述したようにビオチン化ｈＴＧＦｂＲＩＩ−ＦＣ上で選択した。選択第４〜６ラウンドでは、Ｃ１  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ＤＹＮＡｂｅａｄｓ（商標）を添加するそれぞれ６０、９０、および９０分前に非ビオチン化ＴＧＦｂＲＩＩ−ＦＣ競合物質を終濃度１００ｎＭで加えた。選択後、ｄＡｂインサートをプライマーＰｅｌＢ  ＮｃｏＶｈおよびＰＥＰ０１１でＰＣＲ増幅し、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、細菌発現ベクターｐＣ１０にクローニングした。
【０３１５】
ＰｅｌＢ  ＮｃｏＶｈ（配列番号２１０）  ＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧ
【０３１６】
ＰＥＰ０１１（配列番号２１１）  ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＴＴＡＧＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧ
【０３１７】
クローニングした生成物を発現させ、Ｂｉａｃｏｒｅでスクリーニングした。解離速度がＤＯＭ２３ｈ−２７１−２２と同様またはそれより優れているクローンをシークエンシングおよび精製し、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）で親和性について、細胞センサーアッセイで効力について評価した。望ましくない配列モチーフを含むキネティクス特性が不良なクローンまたは収率が非常に低いクローンは探求しなかった。ＤＯＭ２３ｈ−２７１−５０を更なる親和性成熟に選択した。
【０３１８】
ＤＯＭ−２７１−５０  核酸配列（配列番号２１２）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＣＡＴＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＧＣＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＴＧＧＣＴＣＧＣＣＣＧＧＧＧＣＣＧＣＴＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０３１９】
ＤＯＭ−２７１−５０  アミノ酸配列（配列番号２１３および重複エントリー配列番号２１４）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＴＦＴＥＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＰＩＧＨＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＡＰＧＥＫＷＬＡＲＧＲＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０３２０】
実施例７：ＴＧＦｂＲＩＩ  ｄＡｂ配列（ＤＯＭ２３ｈ−２７１系列）の６１および６４位への変異の導入
過去に種々のＴＧＦＲβＩＩ  ｄＡｂ系列中にＤ６１ＮおよびＫ６４Ｒ二重変異が導入され、効力を向上させることが示されている（国際公開第２０１１／０１２６０９号）。これらの変異をＴＧＦｂＲＩＩ  ｄＡｂ  ＤＯＭ２３ｈ−２７１系列に導入して、同様な効力向上が実現され得るかどうかを見た。この部位での別の変異を調べ、効力の更なる上昇が実現され得るかどうかを決定した。
【０３２１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた重複伸長法（Ho, et al., Gene 1989 77(1)）によりＤＯＭ２３ｈ−２７１（配列番号１９９）バックボーンに変異を導入した；相補的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、重複する末端または相補的な末端を有する２つのＤＮＡ断片を作製した。これらの断片を、重複末端をアニーリングさせるその後のアセンブリーＰＣＲで組み合わせ、各鎖の３’重複部を相補鎖の３’伸長のプライマーとし、得られた融合生成物をＰＣＲで更に増幅した。重複オリゴヌクレオチドプライマー中にヌクレオチド変化を導入することによりヌクレオチド配列の特異的変化を導入した。ＳＵＰＥＲＴＡＱ（商標）ポリメラーゼ（ＨＴ  バイオテクノロジー社（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた２つの別個のＰＣＲにより標的ｄＡｂ遺伝子断片を増幅した。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）を用いて親和性の向上が明確に測定できるように、ＴＧＦｂＲＩＩへの親和性が低いＤＯＭ２３ｈ−２７１を選択した。親和性選択を用いて結合親和性が向上した変異体を濃縮することを意図して、両方の位置を組み合わせて変異させるディジェネレートオリゴヌクレオチドを用いて６１および６４位の変異をコードした。ＮＲ変異は優勢であることが分かっているので、６１位に制限されたコドン（ＮＮＧ）を用いることにより、ライブラリー中でこの変異を避けた。このコドンは、１３アミノ酸をコードするが、アミノ酸Ｆ、Ｙ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、またはＤを含まない。遊離ＣｙｓはｄＡｂ内に好ましくなく、アスパラギンもこの部位に望ましくないので、５個の望ましいアミノ酸の組合せだけが除外された。６４位では、ＮＮＫコドンを用いて、可能な全範囲のアミノ酸を提供した。
【０３２２】
変異の導入に用いたオリゴヌクレオチド対は、ＰＥ００８（ｄＡｂ遺伝子の５’開始部に隣接：５’−ＴＴＧＣＡＧＧＣＧＴＧＧＣＡＡＣＡＧＣＧＴＣＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧ−３’）（配列番号１９２）および２７１−６１６４  Ｒ（５’−ＧＣＧＴＡＧＴＡＴＧＴＡＣＧＡＴＴＡＣＣＡＡＴＣＧＧ−３’）（配列番号１９３）並びに変異２７１−６１６４  ｄｅｇ−Ｆ（変異残基に下線：５’−ＧＧＴＡＡＴＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＮＮＧＴＣＣＧＴＧＮＮＫＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣ−３’）（配列番号１９４）およびＡＳ１３０９（ｄＡｂ遺伝子の３’末端に隣接：５’−ＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＡ−３’）（配列番号１９５）であった。プライマーを加えずにＳＵＰＥＲＴＡＱ（商標）  ＤＮＡ  ポリメラーゼを用いたアセンブリーＰＣＲで２つのＰＣＲ断片を組み換えた。次いで、フランキングプライマーＰＥ００８およびＡＳ１３０９をＰＣＲ反応に加えて、融合生成物を増幅した。変異ｄＡｂをＳａｌＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、同様に切断したｐＤＯＭ１３発現ベクター中にライゲートし、大腸菌ＨＢ２１５１細胞に形質転換した。同様にして、但しプライマー２７１−６１６４  ＮＲ−Ｆ（５’−ＧＧＴＡＡＴＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＴＧＣＧＣＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣ−３’）（配列番号１９６）を２７１−６１６４  ｄｅｇ−Ｆの代わりに用いて、Ｄ６１Ｎ、Ｋ６４Ｒ変異もＤＯＭ２３ｈ−２７１に導入した。変異ｄＡｂをシークエンシングにより同定した。６１および６４位に新規な変異の組合せを有する１２９個のクローンが同定された。但し、１１個はＰＣＲエラーによる更なる変異を有していた。これらを表１１に示す。注：親和性の上昇したクローンを下線で示す。更なる変異を有するクローンをアスタリスクで示す。
【０３２３】
変異の影響を調べるために、選択されたクローンをＴＢ  ＯＮＥＸ（商標）を含む９６ウェルプレート中で３０℃で７２時間または３７℃で２４時間発現させた。上清を遠心により清澄にし、０．２２μｍのフィルターで濾過した後、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）により解離速度を評価した。
【０３２４】
ＣＭ５チップ上の捕捉表面を用いてＢＩＡＣＯＲＥ（商標）  Ａ１００分析を行った。抗ヒトＩｇＧを捕捉物質として用い、一級アミンカップリングによりＣＭ５バイオセンサーチップにカップリングさせた。ヒトＦｃに融合させた抗原分子をこの固定化表面上で２００〜３００レゾナンスユニットのレベルで捕捉し、この捕捉表面に上清または精製ドメイン抗体を通過させた。捕捉抗原表面への培地またはバッファーの注入を二重参照に用いた。各フローセル上のプロテインＡスポットにより、注入された各サンプルにおけるドメイン抗体の存在を確認することができた。各ドメイン抗体注入後に３Ｍ塩化マグネシウム溶液で表面を再生した。再生は、捕捉された抗原を除去したが、その後のサイクルで表面が抗原を捕捉する能力に有意な影響を与えなかった。全てのランはＨＢＳ−ＥＰバッファーをランニングバッファーとして用いて２５℃で行った。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）  Ａ１００を用いてデータを生成し、その附属ソフトウェアで分析を行った。精製サンプルのキネティクスを１：１結合モデルに当てはめ、一方、１：１解離モデルを用いて並びに／または親分子と比較した各サンプルの結合レベルおよび安定性レベルを用いて、上清の解離速度を分析した。
【０３２５】
表１１に示すように、試験したクローン中、４６個が親ＤＯＭ２３ｈ−２７１  ｄＡｂと比較して向上した解離速度を有するとして同定された。変異Ｄ６１ＲおよびＤ６１Ｋは６４位の変異と関係なく結合を強化することが見出された。複数の組合せが元のＤ６１Ｎ、Ｋ６４Ｒ変異よりも優れていると考えられ、それらにはＲＥ、ＲＭ、ＲＦ、およびＲＹが含まれた。
【０３２６】
解離速度が向上した変異体選択物を精製し、完全なＢＩＡＣＯＲＥ（商標）  Ａ１００キネティクス分析に供して、それらの親和性を決定した（表１０）。ＳＹＰＲＯ（商標）  Ｏｒａｎｇｅ（インビトロジェン社）の存在下で融解曲線を作製することにより変異体の熱安定性も決定した。簡潔に述べると、ＳＹＰＲＯ（商標）  ＯｒａｎｇｅとＰＢＳの１：５００希釈物中に精製ｄＡｂを５０および１００μｇ／ｍｌで希釈し、Ｍｉｎｉ  ＯＰＴＩＣＯＮ（商標）  ＰＣＲ機（バイオラッド社）を用いて３０〜９０℃の融解曲線に供した。各濃度で主な正遷移のＴｍを決定し、これを用いて、比較のための融解温度の示標として１ｍｇ／ｍｌでの推定Ｔｍ値を計算した（表１０）。
【０３２７】
Ｔｍへの影響が少ない割に親和性向上が優れていた変異Ｄ６１Ｒ、Ｋ６４Ｄ、Ｄ６１Ｒ、およびＫ６４Ｆを選択した。これらの変異を、親和性成熟させたＤＯＭ２３ｈ−２７１の誘導体ＤＯＭ２３ｈ−２７１−２２（配列番号３０）に移して、ｄＡｂ  ＤＯＭ２３ｈ−２７１−３９（配列番号３７）およびＤＯＭ２３ｈ−２７１−４０（配列番号３８）を作製した。これらの変異は、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）でマウスＴＧＦｂＲＩＩＦＣとの交差反応性を含む親和性を上昇させることおよび細胞センサーアッセイで効力を上昇させることが見出された。しかし、変異はＤＳＣで測定されるＴｍを低下させることおよびＳＥＣ  ＭＡＬＬＳで測定されるＰＢＳ中でのｄａｂの凝集を増加させることも見出された。これらのアッセイは、ＳＥＣ  ＭＡＬＬＳのバッファーが０．４Ｍ  Ｎａｃｌ、０．１Ｍリン酸ナトリウム、および１０％イソプロパノール（ｐＨ７）であったこと以外は上記と同様に行った。これらの結果を表１２に要約する（ヒト細胞センサーアッセイおよびマウス３Ｔ３ルシフェラーゼアッセイについては平均値を記載する）。
【０３２８】
本実施例中で参照されているｄａｂの配列を以下に示す。
【０３２９】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−３９  アミノ酸配列（配列番号３７）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＥＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＰＩＧＮＲＴＹＹＡＲＳＶＤＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＭＰＧＱＫＷＭＡＫＳＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０３３０】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−３９  核酸配列（配列番号７５）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＣＧＣＴＣＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＣＣＡＡＧＴＣＣＣＧＣＴＴＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０３３１】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−４０  アミノ酸配列（配列番号３８）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＥＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＰＩＧＮＲＴＹＹＡＲＳＶＦＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＭＰＧＱＫＷＭＡＫＳＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０３３２】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−４０  核酸配列（配列番号７６）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＣＧＣＴＣＣＧＴＧＴＴＣＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＣＣＡＡＧＴＣＣＣＧＣＴＴＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０３３３】
【表１１】
2014504866.tif 000014
【０３３４】
【表１２】
2014504866.tif 000015
解離速度が向上したクローンを下線で表す。更なる変異を有するクローンをアスタリスクで表す。
【０３３５】
【表１３】
2014504866.tif 000016
【０３３６】
実施例８：系列ＤＯＭ２３ｈ−４３９−２０、ＤＯＭ２３ｈ−８４３−１３、ＤＯＭ２３ｈ−８５５−２１、およびＤＯＭ２３ｈ−２７１−５０のＣＤＲ多様化による親和性成熟
ドメイン抗体ＤＯＭ２３ｈ−８５５−２１（配列番号２０４）およびＤＯＭ２３ｈ−８４３−１３（配列番号２０６）は、実施例５に詳述されているようにそれぞれナイーブクローンＤＯＭ２３ｈ−８５５（配列番号１３）およびＤＯＭ２３ｈ−８４３（配列番号１０）に対して行ったエラープローン親和性成熟から単離された。ドメイン抗体ＤＯＭ２３ｈ−４３９は国際公開第２０１１／０１２６０９号に記載されている以前の選択実験でファージライブラリーから単離され、その後、実施例５に詳述されているようにエラープローン親和性成熟によりバリアントＤＯＭ２３ｈ−４３９−２０（配列番号２０８）が単離された。実施例６に詳述されているように、ＣＤＲ標的親和性成熟バリアントＤＯＭ２３ｈ−２７１−２２（配列番号３０）のＣＤＲ３の再多様化により、ドメイン抗体ＤＯＭ２３ｈ−２７１−５０（配列番号２１４）が作製された。ＤＯＭ２３ｈ−８５５−２１、ＤＯＭ２３ｈ−８４３−１３、ＤＯＭ２３ｈ−４３９−２０、およびＤＯＭ２３ｈ−２７１−５０全てを、それらの結合キネティクス、ＳＢＥ−ｂｌａ  ＨＥＫ  ２９３Ｔ  細胞センサーアッセイによる効力、配列、および生物物理学的挙動に基づいて更なる親和性成熟に選択した。ディジェネレート突然変異誘発を用いてＣＤＲを再多様化することにより親和性成熟を行い、ファージディスプレイを用いて、改善されたリードを同定した。ドープまたはＮＮＫライブラリーのいずれかの構築により、ＣＤＲに多様性を導入した。
【０３３７】
ＮＮＫライブラリーを用いてＤＯＭ２３ｈ−２７１−５０を親和性成熟させ（飽和突然変異誘発）、オリゴヌクレオチドプライマーの設計を、各ＣＤＲをカバーするように且つ各プライマー内で５アミノ酸のコドンがＮＮＫコドンで置換されて５つの位置が同時に多様化されるように行った。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを用いて、各ＣＤＲ内の全ての標的アミノ酸（ＣＤＲ１で１個、ＣＤＲ２で２個、ＣＤＲ３で３個）をカバーした。ＣＤＲ標的親和性成熟はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行われ、相補的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、各変異ＣＤＲを含む配列断片と、ｄＡｂコード配列の残部をカバーする重複配列断片とを増幅した。これらの断片を混合し、スプライス伸長ＰＣＲにより組み立てて全長ｄＡｂコード配列を生成した。この生成物を、プライマーＰｅｌＢ  ＮｃｏＶｈ（配列番号２１０）およびＰＥＰ０４４（５’−ＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＡＡＴＡＡＧＡＡＴＴＣＡ−３’配列番号２１５）を用いてＰＣＲ増幅し、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＮｏｔＩおよびＮｃｏＩで消化したｐＤＯＭ４−ｇｅｎｅ３−ｐｅｌＢハイブリッドベクターにライゲートした。ｐＤＯＭ４−ｇｅｎｅ３−ｐｅｌＢハイブリッドベクターは、前述したｐＤＯＭ４ベクターの改変バージョンであるが、ＧＡＳリーダー配列がｐｅｌＢ（ペクチン酸リアーゼＢ）シグナルペプチドで置換されるように改変されている。
【０３３８】
ドープライブラリーを用いてドメイン抗体ＤＯＭ２３ｈ−８５５−２１、ＤＯＭ２３ｈ−８４３−１３、およびＤＯＭ２３ｈ−４３９−２０を親和性成熟させた。ドープライブラリーは、本質的に前述および国際公開第２００６０１８６５０号に記載されているように構築した。単一ディジェネレートオリゴヌクレオチドプライマーを用いて各ＣＤＲ内の全変異をカバーした。各プライマー内で、複数のアミノ酸をコードするディジェネレートコドンで多様化対象のアミノ酸を指定した。以下のディジェネレートコーディングを用いた：「ａ」＝８５％Ａ＋５％Ｔ＋５％Ｇ＋５％Ｃ；「ｇ」＝８５％Ｇ＋５％Ｔ＋５％Ｃ＋５％Ａ；「ｃ」＝８５％Ｃ＋５％Ｔ＋５％Ｇ＋５％Ａ；「ｔ」＝８５％Ｔ＋５％Ａ＋５％Ｇ＋５％Ｃ；「Ｓ」＝５０％Ｇおよび５０％Ｃ。大文字は指定ヌクレオチド１００％を示す。ＤＯＭ２３ｈ−４３９−２０のドープライブラリーでは、ＣＤＲ１中の５個、ＣＤＲ２中の６個、ＣＤＲ３中の１１個のアミノ酸を多様化し、１００位にフェニアラニンを含ませた。ＤＯＭ２３ｈ−８５５−２１のドープライブラリーでは、ＣＤＲ１中の５個、ＣＤＲ２中の７個、およびＣＤＲ３中の８個のアミノ酸を多様化した。ＤＯＭ２３ｈ−８４３−１３のドープライブラリーでは、ＣＤＲ１中の５個、ＣＤＲ２中の６個、およびＣＤＲ３中の８個のアミノ酸を多様化し、ＣＤＲ３の前の９４位もコドンＶＲＫを導入することで多様化した。各ｄＡｂについて、４つのドープライブラリーを構築した。１つはＣＤＲ１を多様化するためのもの、１つはＣＤＲ２を多様化するためのもの、１つはＣＤＲ３を多様化するためのものであり、４番目では全ＣＤＲを多様化した。ディジェネレートライブラリープライマーはトリプレットプライマーと同様に用いた。各多様化ＣＤＲを別個に増幅し、次いで、スプライス伸長重複法により親配列断片と組み合わせ、プライマーＰｅｌＢ  ＮｃｏＶｈ（配列番号２１０）およびＤＯＭ１７３（配列番号１８８）を用いて全長産物を増幅した。ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩを用いてｐＤＯＭ４−ｇｅｎｅ３−ｐｅｌＢハイブリッドベクター中に断片をサブクローニングした。
【０３３９】
ディジェネレートプライマー配列：
【０３４０】
２３ｈ−４３９−２０  ＣＤＲＨ１（配列番号２１６）
５’−ＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴｇｇＳａｃＳｇａｇｃａｇＡＴＧｔｇｇＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧ−３’
【０３４１】
２３ｈ−４３９−２０  ＣＤＲＨ２（配列番号２１７）
５’−ＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＴＴＧＴＣＴＣＡｃｇＳＡＴＴｇａｔｔｃＳｃｃＳＧＧＴｇｇＳｃｇＳＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧ−３’
【０３４２】
２３ｈ−４３９−２０  ＣＤＲＨ３（配列番号２１８）
５’−ＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡｃｇＳｃａｔｇｃＳｇｃＳｇｇＳｇｔＳｔｃＳｇｇＳａｃＳｔａＹｔｔｔＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣ−３’
【０３４３】
２３ｈ−８４３−１３  ＣＤＲＨ１（配列番号２１９）
５’−ＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴｇａｔｃａｇｇａｔｃｇＳＡＴＧｔｇｇＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＧＧ−３’
【０３４４】
２３ｈ−８４３−１３  ＣＤＲＨ２（配列番号２２０）
５’−ＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡｇｃＳＡＴＴｇａｇｔｃＳｇｇＳＧＧＴｃａｔｃｇＳＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧ−３’
【０３４５】
２３ｈ−８４３−１３  ＣＤＲＨ３（配列番号２２１）
５’−ＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＶＲＫｃａｇａａｔａａｇｔｃＳｇｇＳｃｇＳｔｃＳｇｇＳＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡ−３’
【０３４６】
２３ｈ−８５５−２１  ＣＤＲＨ１（配列番号２２２）
５’−ＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴｇａｇａａｔａｃＳｔｃＳＡＴＧｇｇＳＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧ−３’
【０３４７】
２３ｈ−８５５−２１  ＣＤＲＨ２（配列番号２２３）
５’−ＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡｃｇＳＡＴＴｇａｔｃｃＳａａｇＧＧＴｔｃＳｃａｔＡＣＡＴＡＣＴＡＣａｃＳＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣ−３’
【０３４８】
２３ｈ−８５５−２１  ＣＤＲＨ３（配列番号２２４）
５’−ＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡｃａｇｃｇＳｇａｇｃｔＳｇｇＳａａｇｔｃＳｔａＹＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡ−３’
【０３４９】
Ｈ１−２７１−４３  Ｒ（配列番号２２５）
５’−ＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＡＴＧＮＮＫＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣ−３’
【０３５０】
Ｈ２ｐ１−２７１−４３Ｆ（配列番号２２６）
５’−ＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＮＮＫＡＴＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＧＴＮＮＫＣＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧ−３’
【０３５１】
Ｈ２ｐ２−２７１−４３  Ｆ（配列番号２２７）
５’−ＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＡＧＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧ−３’
【０３５２】
Ｈ３ｐ１−２７１−４３  Ｆ（配列番号２２８）
５’−ＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＣＣＧＴＧＧＧＣＣＧＣＴＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧ−３’
【０３５３】
Ｈ３ｐ２−２７１−４３  Ｆ（配列番号２２９）
５’−ＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＣＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＣＣＧＴＧＧＧＣＣＧＣＴＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧ−３’
【０３５４】
Ｈ３ｐ３−２７１−４３  Ｆ（配列番号２３０）
５’−ＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＡＧＴＧＧＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧ−３’
【０３５５】
ファージディスプレイ：
別個のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、並びに組み合わせたＣＤＲ１、２、および３のプールのＮＮＫまたはドープライブラリーを、ブロッキングステップに以下の変更を加えて実施例１と同様に、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、および０．１ｎＭ（それぞれ第１、２、３、４、５、および６ラウンド）のビオチン化単量体ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗原に対する少なくとも６ラウンドの選択に供した：上記の実施例１で加えたヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片を省略し、ブロッキングステップを最低２０分間行った。選択の第４および６ラウンドでは、標識抗原とのインキュベーションステップ後に１００ｎＭ非ビオチン化抗原と３０分間（第４および６ラウンド）インキュベートすることにより競合を導入した。ＤＯＭ  ２３ｈ−４３９−２０（ＣＤＲ１、ＣＤＲ３、および組合せのプ−ル）およびＤＯＭ  ２３ｈ−８５５−２１（ＣＤＲ３）では、第７ラウンドの選択を０．１ｎＭビオチン化単量体ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗原および１００ｎＭ競合物質に対して１２０分間または２０ｐＭビオチン化単量体ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗原および１００ｎＭ競合物質に対して３０分間行った。選択のラウンド間に、ファージ感染ＴＧ１細胞の一晩培養物を４０００ｇで３０分間遠心することによりファージを増幅した。増幅したファージを含む上清４０ｍｌを、１０ｍｌのＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０ｖ／ｖ％  ＰＥＧ８０００＋２．５Ｍ  ＮａＣｌ）に加え、氷上で６０分間インキュベートした。サンプルを４０００ｇで４０分間遠心して、沈殿したファージをペレット化した。上清を捨て、ファージペレットを１ｍｌの１５ｖ／ｖ％グリセロール／ＰＢＳに再懸濁した。ファージサンプルを２ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、１０分間遠心して、残った細菌細胞片を全て除去した。ファージ選択から得られた多様化したドメイン抗体Ｖｈ遺伝子を、プライマーＰＥＰ０１１ＶＨＳｔｏｐＮｏｔＩＲ（５’−ＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＴＴＣ−３’（配列番号２３１）およびＮｃｏ１  ＶＨ  Ｆ（５’−ＴＡＴＣＧＴＣＣＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧ−３’（配列番号２３２）を用いてＰＣＲ増幅し、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、同じくＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化したｐＣ１０ベクター中にライゲートした。ｐＣ１０は、ｄＡｂの可溶性発現用に設計された、強化されたＬａｃＺプロモーターで発現が制御されている、ｐＵＣ１１９ベクターをベースにしたプラスミドベクターである。ｄＡｂ遺伝子をＮ末端でｐｅｌＢシグナルペプチドに融合させることにより上清中へのｄＡｂの発現が可能になっている。ライゲーション産物を化学的にコンピテントな大腸菌ＨＢ２１５１細胞に形質転換し、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを添加した栄養寒天プレートにプレーティングした。個々のクローンを選び、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを添加した一晩発現自己誘導培地（高レベルタンパク質発現系、ノバジェン社）を含む９６ウェルプレート中で発現させ、２５０ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で６６時間または３７℃で２４時間増殖させた。次いで、発現プレートを３５００ｇで１５分間遠心し、上清を０．４５μフィルタープレート（ミリポア社）で濾過した。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）  Ｂ４０００上で、ヒトＴＧＦ−βＲＩＩおよびヒトＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃに対して、ドメイン抗体を含む上清をスクリーニングし、解離速度（Ｋｄ）を決定した（データ示さず）。メーカーの取扱説明書に従ってビオチン化抗原をＳＡチップ上で捕捉し、ＨＢＳ−ＥＰバッファーを用いて２５℃で分析を行った。サンプルを流速３０μｌ／ｍｉｎでＢＩＡＣＯＲＥ（商標）に流した。低ｐＨのグリシンを用いてチップを再生した。ソフトウェアに組み込まれている１：１解離モデルに解離期を当てはめることによりデータ（図示せず）を解離速度について分析し、更に上清をプロテインＡ結合について分析して発現レベルを推定した。親と比べて解離速度の向上したドメイン抗体を更なる研究に選択した。向上したクローンを、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび消泡剤（シグマ社）を添加した一晩発現自己誘導培地（ＯＮＥＸ（商標）、ノバジェン社）中で、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で４８〜７２時間発現させた。培養物を遠心し（４，２００ｒｐｍで４０分）、上清をＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（商標）プロテインＡビーズ（アマシャムバイオサイエンス社、ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ（商標）社、英国；結合能：ビーズ１ｍｌ当たりｄＡｂ５ｍｇ）と共に４℃または室温で少なくとも１時間インキュベートした。ビーズをクロマトグラフィーカラムに充填し、ＰＢＳで、次いで１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４、シグマ社、英国）で洗浄した。結合したｄＡｂを０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）で溶出し、１Ｍトリス−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）で中和した。ｄＡｂの２８０ｎｍのＯＤを測定し、ｄＡｂのアミノ酸組成から算出された消衰係数を用いてタンパク質濃度を決定した。親和性成熟ドメイン抗体をＢＩＡＣＯＲＥ（商標）  Ｔ２００（２つの好ましいｄＡｂのデータを実施例９に示す）およびＳＢＥ−ｂｌａ  ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞センサーアッセイ（２つの好ましいｄＡｂのデータを実施例１１に示す）で試験して、それらの親和性および抗力を決定した。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）並びに分子ふるいクロマトグラフィーおよび多角度レーザー光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）を用いて、熱安定性および溶液状態を含む生物物理学的性質を決定した（２つの好ましいｄＡｂのデータを実施例１０に示す）。
【０３５６】
親和性成熟させたＤＯＭ２３ｈ−４３９−２０およびＤＯＭ２３ｈ−２７１−５０抗ヒトＴＧＦＲＩＩ  ｄＡｂのアミノ酸および核酸配列
【０３５７】
ＤＯＭ２３ｈ−４３９−２５  核酸配列（配列番号２３３）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＴＴＧＴＣＴＣＡＣＧＴＡＴＴＧＡＴＴＣＧＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＧＧＣＧＡＣＣＣＡＣＧＧＧＧＧＴＧＴＣＣＧＧＧＡＣＧＴＴＴＴＡＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０３５８】
ＤＯＭ２３ｈ−４３９−２５  アミノ酸配列（配列番号２３４）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＧＴＥＱＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶＳＲＩＤＳＰＧＧＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＲＲＰＴＧＶＳＧＴＦＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０３５９】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２３  核酸配列（配列番号２３５）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＣＡＴＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＧＣＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＴＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０３６０】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２３  アミノ酸配列（配列番号２３６）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＴＦＴＥＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＰＩＧＨＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＡＰＧＥＫＷＡＲＲＷＤＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０３６１】
ＤＯＭ２３ｈ−４３９−３５  核酸配列（配列番号２３７）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＧＧＡＣＣＧＡＴＣＡＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＴＴＧＴＣＴＣＡＣＧＣＡＴＴＧＡＴＴＣＣＣＣＣＧＧＴＧＧＧＣＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＧＧＣＡＧＣＣＧＧＣＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＧＧＧＡＡＧＴＡＣＧＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０３６２】
ＤＯＭ２３ｈ−４３９−３５  アミノ酸配列（配列番号２３８）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＧＴＤＱＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶＳＲＩＤＳＰＧＧＲＴＹＹＡＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＲＱＰＡＧＶＳＧＫＹＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０３６３】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２９  核酸配列（配列番号２３９）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＣＡＴＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＧＣＧＣＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＧＴＡＴＧＴＴＧＣＣＣＧＧＧＧＣＣＧＣＴＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
【０３６４】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２９  アミノ酸配列（配列番号２４０）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＴＦＴＥＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＰＩＧＨＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＡＰＮＱＲＹＶＡＲＧＲＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０３６５】
これらの抗ヒトＴＧＦＲＩＩ  ｄＡｂ親和性リードのKabatにより定義されるＣＤＲを表１３に示す。
【０３６６】
【表１４】
2014504866.tif 000017
【０３６７】
ＤＯＭ２３ｈ−４３９−２５およびＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２３ヌクレオチド配列の更なる改変
実施例７に記載のＤ６１ＮおよびＫ６４Ｒ変異を組み合わせてまたは別個にＤＯＭ２３ｈ−４３９−２５、ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２３、およびＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２９親和性成熟ｄＡｂに導入した。ＤＯＭ２３ｈ−４３９−２５およびＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２３ｄＡｂへのＶ４８Ｉ変異の導入についても、効力の向上を付与し得るかどうか調べた。試験成熟およびＣＤＲ標的親和性成熟のいずれの後でも、ＤＯＭ２３ｈ−４３９系列から得られた複数の向上ｄＡｂにおいて、kabat４８位での自然発生的変異が観察された。更に、kabat残基１１３のすぐ後ろにあるＶｈ領域のＣ末端のアラニンを、ＤＯＭ２３ｈ−４３９−２５、ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２３、およびＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２９並びに前述した変異を有するこれらのｄＡｂの全てのバリアントに付加した。本質的に実施例７と同様にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた重複伸長法によりＤＯＭ２３ｈ−４３９−２５（配列番号２３４）、ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２３（配列番号２３６）、およびＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２９（配列番号２４０）バックボーン中に変異を導入した。ヌクレオチド配列中の特異的変異は、重複オリゴヌクレオチドプライマー中にヌクレオチド変化を組み込むことにより導入し、Ｖｈ領域末端のアラニンの挿入は、kabat１１３位の後にアラニン残基が組み込まれるように設計した３’オリゴヌクレオチドを用いて実現した。
【０３６８】
以下のオリゴヌクレオチドを用いて変異を導入した（変異残基を下線で表す）。
【０３６９】
４３９  ４８Ｉ  ＳＤＭ  Ｆ（配列番号２５３）
５’−ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＣＡＣＧＴＡＴＴＧＡＴＴＣＧＣＣ−３’
【０３７０】
４３９  ６１Ｎ  ＳＤＭ  Ｆ（配列番号２５４）
５’−ＧＧＧＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧ−３’
【０３７１】
４３９  ６４Ｒ  ＳＤＭ  Ｆ（配列番号２５５）
５’−ＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＣＧＴＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣ−３’
【０３７２】
４３９  ６１Ｎ  ６４Ｒ  ＳＤＭ  Ｆ（配列番号２５６）
５’−ＧＧＧＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＴＧＣＧＴＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣ−３’
【０３７３】
２７１  ６１Ｎ  ＳＤＭ  Ｆ（配列番号２５７）
５’−ＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧ−３’
【０３７４】
２７１  ６４Ｒ  ＳＤＭ  Ｆ（配列番号２５８）
５’−ＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＣＧＴＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣ−３’
【０３７５】
２７１  ６１Ｎ  ６４Ｒ  ＳＤＭ  Ｆ（配列番号２５９）
５’−ＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＴＧＣＧＴＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣ−３’
【０３７６】
５６７  ＋Ａ  ｒｅｖ（ｄＡｂ  Ｖｈ遺伝子の３’末端に隣接）（配列番号２６０）
５’−ＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧＴＡＡＴＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＴＡ−３’
【０３７７】
２１−２３  Ｆｗｄ（ｄＡｂ  Ｖｈ遺伝子の５’末端に隣接）（配列番号２６１）
５’−ＡＴＡＡＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧ−３’
【０３７８】
変異の影響を調べるために、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび消泡剤（シグマ社）を添加したＴＢ  ＯＮＥＸ（商標）中、２５０ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で７２時間ｄＡｂを発現させた。前述と同様に、培養物を遠心し（４，２００ｒｐｍで４０分）、ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（商標）プロテインＡビーズ（アマシャムバイオサイエンス社、ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ（商標）社、英国）を用いてｄＡｂをアフィニティー精製した。ドメイン抗体バリアントの親和性および効力を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）  Ｔ２００（好ましいｄＡｂのデータを実施例９に示す）およびＳＢＥ−ｂｌａ  ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞センサーアッセイ（好ましいｄＡｂのデータを実施例１１に示す）により決定した。
【０３７９】
Ｃ末端アラニンおよびＤ６１Ｎ、Ｋ６４Ｒ、またはＶ４８Ｉ変異を含むように改変したＤＯＭ２３ｈ−４３９−２５（配列番号２３４）およびＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２３（配列番号２３６）抗ヒトＴＧＦＲＩＩ  ｄＡｂのアミノ酸および核酸配列を以下に示す。
【０３８０】
ＤＯＭ２３ｈ−４３９−４０（ＤＯＭ２３ｈ−４３９−２５＋Ｃ末端アラニン）核酸配列（配列番号２６２）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＴＴＧＴＣＴＣＡＣＧＴＡＴＴＧＡＴＴＣＧＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＧＧＣＧＡＣＣＣＡＣＧＧＧＧＧＴＧＴＣＣＧＧＧＡＣＧＴＴＴＴＡＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧ
【０３８１】
ＤＯＭ２３ｈ−４３９−４０（ＤＯＭ２３ｈ−４３９−２５＋Ｃ末端アラニン）アミノ酸配列（配列番号２６３）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＧＴＥＱＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶＳＲＩＤＳＰＧＧＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＲＲＰＴＧＶＳＧＴＦＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡ
【０３８２】
ＤＯＭ２３ｈ−４３９−４１（ＤＯＭ２３ｈ−４３９−２５＋Ｃ末端アラニン＋４８Ｉ）核酸配列（配列番号２６４）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＣＡＣＧＴＡＴＴＧＡＴＴＣＧＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＧＧＣＧＡＣＣＣＡＣＧＧＧＧＧＴＧＴＣＣＧＧＧＡＣＧＴＴＴＴＡＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧ
【０３８３】
ＤＯＭ２３ｈ−４３９−４１（ＤＯＭ２３ｈ−４３９−２５＋Ｃ末端アラニン＋４８Ｉ）アミノ酸配列（配列番号２６５）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＧＴＥＱＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＩＳＲＩＤＳＰＧＧＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＲＲＰＴＧＶＳＧＴＦＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡ
【０３８４】
ＤＯＭ２３ｈ−４３９−４２（ＤＯＭ２３ｈ−４３９−２５＋Ｃ末端アラニン＋６１Ｎ）核酸配列（配列番号２６６）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＴＴＧＴＣＴＣＡＣＧＴＡＴＴＧＡＴＴＣＧＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＧＧＣＧＡＣＣＣＡＣＧＧＧＧＧＴＧＴＣＣＧＧＧＡＣＧＴＴＴＴＡＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧ
【０３８５】
ＤＯＭ２３ｈ−４３９−４２（ＤＯＭ２３ｈ−４３９−２５＋Ｃ末端アラニン＋６１Ｎ）アミノ酸配列（配列番号２６７）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＧＴＥＱＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶＳＲＩＤＳＰＧＧＲＴＹＹＡＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＲＲＰＴＧＶＳＧＴＦＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡ
【０３８６】
ＤＯＭ２３ｈ−４３９−４３（ＤＯＭ２３ｈ−４３９−２５＋Ｃ末端アラニン＋６４Ｒ）核酸配列（配列番号２６８）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＴＴＧＴＣＴＣＡＣＧＴＡＴＴＧＡＴＴＣＧＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＣＧＴＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＧＧＣＧＡＣＣＣＡＣＧＧＧＧＧＴＧＴＣＣＧＧＧＡＣＧＴＴＴＴＡＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧ
【０３８７】
ＤＯＭ２３ｈ−４３９−４３（ＤＯＭ２３ｈ−４３９−２５＋Ｃ末端アラニン＋６４Ｒ）アミノ酸配列（配列番号２６９）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＧＴＥＱＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶＳＲＩＤＳＰＧＧＲＴＹＹＡＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＲＲＰＴＧＶＳＧＴＦＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡ
【０３８８】
ＤＯＭ２３ｈ−４３９−４４（ＤＯＭ２３ｈ−４３９−２５＋Ｃ末端アラニン＋６１Ｎ６４Ｒ）核酸配列（配列番号２７０）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＴＴＧＴＣＴＣＡＣＧＴＡＴＴＧＡＴＴＣＧＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＴＧＣＧＴＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＧＧＣＧＡＣＣＣＡＣＧＧＧＧＧＴＧＴＣＣＧＧＧＡＣＧＴＴＴＴＡＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧ
【０３８９】
ＤＯＭ２３ｈ−４３９−４４（ＤＯＭ２３ｈ−４３９−２５＋Ｃ末端アラニン＋６１Ｎ６４Ｒ）アミノ酸配列（配列番号２７１）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＧＴＥＱＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶＳＲＩＤＳＰＧＧＲＴＹＹＡＮＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＲＲＰＴＧＶＳＧＴＦＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡ
【０３９０】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１３０（ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２３＋Ｃ末端アラニン）核酸配列（配列番号２７２）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＣＡＴＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣCＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＧＣＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＴＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧ
【０３９１】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１３０（ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２３＋Ｃ末端アラニン）アミノ酸配列（配列番号２７３）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＴＦＴＥＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＰＩＧＨＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＡＰＧＥＫＷＡＲＲＷＤＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡ
【０３９２】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１３１（ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２３＋Ｃ末端アラニン＋６１Ｎ）核酸配列（配列番号２７４）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＣＡＴＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＧＣＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＴＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧ
【０３９３】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１３１（ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２３＋Ｃ末端アラニン＋６１Ｎ）アミノ酸配列（配列番号２７５）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＴＦＴＥＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＰＩＧＨＲＴＹＹＡＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＡＰＧＥＫＷＡＲＲＷＤＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡ
【０３９４】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１３２（ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２３＋Ｃ末端アラニン＋６４Ｒ）核酸配列（配列番号２７６）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＣＡＴＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＣＧＴＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＧＣＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＴＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧ
【０３９５】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１３２（ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２３＋Ｃ末端アラニン＋６４Ｒ）アミノ酸配列（配列番号２７７）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＴＦＴＥＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＰＩＧＨＲＴＹＹＡＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＡＰＧＥＫＷＡＲＲＷＤＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡ
【０３９６】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１３３（ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２３＋Ｃ末端アラニン＋６１Ｎ６４Ｒ）核酸配列（配列番号２７８）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＣＡＴＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＴＧＣＧＴＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣCＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＧＣＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＴＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧ
【０３９７】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１３３（ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２３＋Ｃ末端アラニン＋６１Ｎ６４Ｒ）アミノ酸配列（配列番号２７９）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＴＦＴＥＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＰＩＧＨＲＴＹＹＡＮＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＡＰＧＥＫＷＡＲＲＷＤＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡ
【０３９８】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１３４（ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２３＋Ｃ末端アラニン＋４８Ｉ）核酸配列（配列番号２８０）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＡＴＴＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＣＡＴＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＧＣＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＴＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧ
【０３９９】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１３４（ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２３＋Ｃ末端アラニン＋４８Ｉ）アミノ酸配列（配列番号２８１）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＴＦＴＥＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＳＡＩＥＰＩＧＨＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＡＰＧＥＫＷＡＲＲＷＤＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡ
【０４００】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１３５（ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２９＋Ｃ末端アラニン）核酸配列（配列番号２８２）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＣＡＴＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＧＣＧＣＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＧＴＡＴＧＴＴＧＣＣＣＧＧＧＧＣＣＧＣＴＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧ
【０４０１】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１３５（ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２９＋Ｃ末端アラニン）アミノ酸配列（配列番号２８３）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＴＦＴＥＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＰＩＧＨＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＡＰＮＱＲＹＶＡＲＧＲＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡ
【０４０２】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１３６（ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２９＋Ｃ末端アラニン＋６１Ｎ）核酸配列（配列番号２８４）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＣＡＴＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＧＣＧＣＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＧＴＡＴＧＴＴＧＣＣＣＧＧＧＧＣＣＧＣＴＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧ
【０４０３】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１３６（ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２９＋Ｃ末端アラニン＋６１Ｎ）アミノ酸配列（配列番号２８５）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＴＦＴＥＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＰＩＧＨＲＴＹＹＡＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＡＰＮＱＲＹＶＡＲＧＲＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡ
【０４０４】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１３７（ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２９＋Ｃ末端アラニン＋６１Ｎ６４Ｒ）核酸配列（配列番号２８６）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＣＡＴＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＴＧＣＧＴＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＡＧＧＣＧＣＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＧＴＡＴＧＴＴＧＣＣＣＧＧＧＧＣＣＧＣＴＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧ
【０４０５】
ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１３７（ＤＯＭ２３ｈ−２７１−１２９＋Ｃ末端アラニン＋６１Ｎ６４Ｒ）アミノ酸配列（配列番号２８７）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＴＦＴＥＹＲＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＥＰＩＧＨＲＴＹＹＡＮＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＡＰＮＱＲＹＶＡＲＧＲＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡ
【０４０６】
ＤＯＭ２３ｈ−４３９−４７（ＤＯＭ２３ｈ−４３９−４２＋４８Ｉ）核酸配列（配列番号２８８）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＣＡＣＧＴＡＴＴＧＡＴＴＣＧＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＣＧＧＣＧＡＣＣＣＡＣＧＧＧＧＧＴＧＴＣＣＧＧＧＡＣＧＴＴＴＴＡＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧ
【０４０７】
ＤＯＭ２３ｈ−４３９−４７（ＤＯＭ２３ｈ−４３９−４２＋４８Ｉ）アミノ酸配列（配列番号２８９）
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【０４０８】
ＤＯＭ２３ｈ−４３９−４８（ＤＯＭ２３ｈ−４３９−４４＋４８Ｉ）核酸配列（配列番号２９０）
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【０４０９】
ＤＯＭ２３ｈ−４３９−４８（ＤＯＭ２３ｈ−４３９−４４＋４８Ｉ）アミノ酸配列（配列番号２９１）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＧＴＥＱＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＩＳＲＩＤＳＰＧＧＲＴＹＹＡＮＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＲＲＰＴＧＶＳＧＴＦＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡ
【０４１０】
実施例９：親和性成熟ドメイン抗体のＢｉａｃｏｒｅ動態解析
抗ヒトＩｇＧをメーカーの取扱説明書に従い一級アミンカップリングでＢｉａｃｏｒｅ  ＣＭ４チップに固定化した。ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃ、カニクイザルＴＧＦ−βＲＩＩ／Ｆｃ、またはヒトＦｃ断片をこの表面上に捕捉した。１００、１０、および１ｎＭ（ＤＯＭ２３ｈ−４３９  ｄＡｂ）または１００、２５、および６．２５ｎＭ（ＤＯＭ２３ｈ−２７１  ｄＡｂ）の３つの濃度でドメイン抗体を２つの捕捉受容体上に通過させた。各ｄａｂの１００ｎＭ濃度だけをヒトＦｃ断片上に通過させて、細胞外ＴＧＦ−βＲＩＩドメインへの結合の特異性を確認した。捕捉抗原表面へのバッファーの注入を二重参照に用いた。各ドメイン抗体注入後、３Ｍ塩化マグネシウム溶液で捕捉表面を再生した。再生は、捕捉抗原を除去したがその後サイクルにおいて表面が抗原を捕捉する能力に有意な影響を与えなかった。全てのランは、ＨＢＳ−ＥＰバッファーをランニングバッファーとして用いて２５℃で行った。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）  Ｔ２００を用いてデータを生成し、ソフトウェア中の１：１結合モデルに当てはめた。試験したｄＡｂの結合キネティクスを表１４に示す。ＤＯＭ２３ｈ−２７１  ｄＡｂおよびＤＯＭ２３ｈ−４３９系列は別個の実験で流した。
【０４１１】
【表１５】
2014504866.tif 000018
【０４１２】
実施例１０：親和性成熟ｄＡｂの生物物理学的評価
示差走査熱量計（ＤＳＣ）を用いてｄＡｂの熱安定性を決定した。ｄＡｂをＰＢＳバッファー中に一晩透析し、終濃度１ｍｇ／ｍｌに調整した。透析バッファーを全サンプルに対する参照として用いた。キャピラリーセルマイクロ熱量計ＶＰ−ＤＳＣ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／Ｍｉｃｒｏｃａｌ）を用いて１８０℃／時間の加熱速度でＤＳＣを行った。典型的なスキャンレンジは参照バッファーおよびタンパク質サンプルの両方で２０〜９０℃とした。各参照バッファーおよびサンプル対の後、５％Ｄｅｃｏｎ（フィッシャーサイエンティフィック社）水溶液、次いでＰＢＳでキャピラリーセルを洗浄した。得られたデータトレースをＯｒｉｇｉｎ  ７．０ソフトウェアで分析した。参照バッファーから得られたＤＳＣトレースをサンプルトレースから引いた。サンプルの正確なモル濃度をデータ分析ルーチンに入力して、融解温度（Ｔｍ）、エンタルピー（ΔＨ）、およびファント・ホッフエンタルピー（ΔＨｖ）の値を得た。データを非２状態モデルに当てはめた。１または２遷移事象のいずれかで最良適合および依存性の値を得た。各サンプルのサーモグラムをゼロから積分することにより、開始アンフォールディング温度も決定された。次いで、この値をサンプルの４パーセントがアンフォールディングされる温度として求めた。
【０４１３】
【表１６】
2014504866.tif 000019
【０４１４】
分子するいクロマトグラフィーおよび多角度レーザー光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）による溶液状態の分析
ｄＡｂが溶液中で単量体であるのか、より高次のオリゴマーを形成しているのかを決定するために、これらをＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ（分子ふるいクロマトグラフィーおよび多角度レーザー光散乱）で分析した。（Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウェアで制御される）オートサンプラーおよびＵＶ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣシステムをＷｙａｔｔ  Ｍｉｎｉ  Ｄａｗｎ  Ｔｒｅｏｓ（レーザー光散乱（ＬＳ）検出器）およびＷｙａｔｔ  Ｏｐｔｉｌａｂ  ｒＥＸ  ＤＲＩ（示差屈折率（ＲＩ）検出器）に連結した。検出器は以下の順で連結した：ＵＶ−ＬＳ−ＲＩ。ＲＩおよびＬＳ機器の両方を波長６５８ｎｍで作動させ、ＵＶシグナルを２８０ｎｍおよび２２０ｎｍでモニタリングした。ＴＳＫ２０００カラムを用いた分子ふるいクロマトグラフィーにより、それらの流体力学的特性に従ってドメイン抗体を分離した（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬの濃度で５０マイクロリットル注入）。移動相は０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  ＮａＰＯ４、１５％ｎ−プロパノールである。タンパク質が検出器を通過する際の散乱光の強度を角度の関数として測定した。この測定と、ＲＩ検出器を用いて決定されたタンパク質濃度とから、適切な式（分析ソフトウェアＡｓｔｒａ  ｖ．５．３．４．１４の積分部分）を用いたモル質量の計算が可能になる。単量体の割合としての溶液状態を表１５に示す。
【０４１５】
【表１７】
2014504866.tif 000020
【０４１６】
実施例１１：ＳＢＥ−ｂｌａ  ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞センサーアッセイにおける親和性成熟ｄＡｂによるＴＧＦβ−ＲＩＩ阻害
アッセイは実施例４、アッセイｈ２に概説したのと全く同じように行った。
【０４１７】
アッセイを複数回行って、平均値および値の範囲を得た。これを表１６に要約する。ｌｏｇＩＣ５０を用いて算術平均ＩＣ５０を計算し、平均ＩＣ５０からｌｏｇ標準偏差を加減することにより範囲を計算し、次いでＩＣ５０に変形し直した。アッセイＱＣパラメーターは適合しており、ロバストなＺ因子は０．４より大きく、ＴＧＦ−β  ＥＣ８０はアッセイに加えた濃度の６倍以内であった。結果を表１６に示す。
【０４１８】
【表１８】
2014504866.tif 000021
【０４１９】
【表１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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