(57)【要約】  本開示は、鞘翅目有害生物における標的のコード配列および転写された非コード配列に対するＲＮＡ干渉を介する阻害により鞘翅目有害生物を防除するための核酸分子およびそれらを用いる方法に関する。本開示はまた、鞘翅目有害生物の防除に有用な核酸分子を発現させるトランスジェニック植物体を作製する方法、ならびにこれにより得られる植物細胞および植物体にも関する。
2014504863.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２；配列番号２の相補体；配列番号５；配列番号５の相補体；配列番号６；配列番号６の相補体；配列番号７；配列番号７の相補体；配列番号８；配列番号８の相補体；配列番号１１２；配列番号１１２の相補体；配列番号１１３；配列番号１１３の相補体；配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号２、５〜８、１１２、および／または１１３のうちのいずれかを含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列；配列番号２、５〜８、１１２、および／または１１３のうちのいずれかを含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の相補体；配列番号２、５〜８、１１２、および／または１１３のうちのいずれかを含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列；配列番号２、５〜８、１１２、および／または１１３のうちのいずれかを含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の相補体；配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；ならびに配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１の全部または一部；配列番号１の相補体の全部または一部；配列番号３；配列番号３の相補体；配列番号４；配列番号４の相補体；配列番号１、３、または４のうちのいずれかの少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号１、３、または４のうちのいずれかの少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号１、３、または４のうちのいずれかを含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列；配列番号１、３、または４のうちのいずれかを含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の相補体；配列番号１、３、または４のうちのいずれかを含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列；配列番号１、３、または４のうちのいずれかを含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の相補体；配列番号１、３、または４のうちのいずれかを含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号１、３、または４のうちのいずれかを含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号１、３、または４のうちのいずれかを含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；および配列番号１、３、または４のうちのいずれかを含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
少なくとも１つのヌクレオチド配列が、異種プロモーターに作動可能に連結された、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号５０、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、および配列番号１３１からなる群から選択される、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
少なくとも約５０ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
少なくとも約１００ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
少なくとも約１００ヌクレオチドの長さである、請求項６に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、植物体の形質転換ベクター。
【請求項９】
ディアブロティカ（Diabrotica）属生物が、セイヨウトウモロコシ根虫（D. v. virgifera LeConte）；ノーザンコーンルートワーム（D. barberi Smith and Lawrence）；サザンコーンルートワーム（D. u. howardi）；メキシカンコーンルートワーム（D. v. zeae）；Ｄ．バルテアータ（D. balteata LeConte）；Ｄ．ｕ．テネラ（D. u. tenella）；およびジュウイチホシウリハムシ（D. u. undecimpunctata Mannerheim）からなる群から選択される、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
リボ核酸（ＲＮＡ）分子である、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子である、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号１３６を含む、請求項１１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１１に記載の単離ポリヌクレオチドの発現から生成させる二本鎖リボ核酸分子。
【請求項１４】
請求項１２に記載の単離ポリヌクレオチドの発現から生成させる二本鎖リボ核酸分子。
【請求項１５】
ポリヌクレオチド配列を鞘翅目有害生物と接触させることにより、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド配列と特異的に相補的な内因性のヌクレオチド配列の発現を阻害する、請求項１３に記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項１６】
前記リボヌクレオチド分子を鞘翅目有害生物と接触させることにより、鞘翅目有害生物を死滅させるか、またはこれらの成長、生殖、および／もしくは摂食を阻害する、請求項１５に記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項１７】
第１のポリヌクレオチド配列、第２のポリヌクレオチド配列、および第３のポリヌクレオチド配列を含み、第１のポリヌクレオチド配列が、請求項１に記載のポリヌクレオチドを含み、第３のポリヌクレオチド配列が、第２のポリヌクレオチド配列を介して第１のポリヌクレオチド配列に連結され、第３のポリヌクレオチド配列が、実質的に第１のポリヌクレオチド配列の逆相補体であり、リボ核酸へと転写されるとき、第１のポリヌクレオチド配列と第３のポリヌクレオチド配列とがハイブリダイズして二本鎖リボヌクレオチド分子を形成するようになる、請求項１３に記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項１８】
第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１３６を含む、請求項１７に記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項１９】
約５０〜約３００ヌクレオチドの間の長さの二本鎖リボ核酸分子および一本鎖リボ核酸分子からなる群から選択される、請求項１０に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２０】
約５０〜約３００ヌクレオチドの間の長さの二本鎖リボ核酸分子および一本鎖リボ核酸分子からなる群から選択される、請求項１１に記載の単離ポリヌクレオチドの発現から生成させるリボ核酸分子。
【請求項２１】
少なくとも１つのヌクレオチド配列が、植物細胞において機能的な異種プロモーターに作動可能に連結された、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチドを含む植物体の形質転換ベクター。
【請求項２２】
請求項１に記載の単離ポリヌクレオチドで形質転換された細胞。
【請求項２３】
原核細胞である、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
真核細胞である、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２５】
植物細胞である、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
請求項１に記載の単離ポリヌクレオチドで形質転換された植物体。
【請求項２７】
単離ポリヌクレオチドを含む、請求項２６に記載の植物体の種子。
【請求項２８】
少なくとも１つのヌクレオチド配列を、二本鎖リボ核酸分子としてその中で発現させる、請求項２６に記載の植物体。
【請求項２９】
トウモロコシ（Zea mays）細胞である、請求項２５に記載の細胞。
【請求項３０】
トウモロコシ（Zea mays）である、請求項２６に記載の植物体。
【請求項３１】
少なくとも１つのヌクレオチド配列を、植物体においてリボ核酸分子として発現させ、鞘翅目有害生物が植物体の一部を摂取すると、リボ核酸分子が、少なくとも１つのヌクレオチド配列と特異的に相補的な内因性の鞘翅目有害生物のヌクレオチド配列の発現を阻害する、請求項２６に記載の植物体。
【請求項３２】
配列番号２；配列番号２の相補体；配列番号５；配列番号５の相補体；配列番号６；配列番号６の相補体；配列番号７；配列番号７の相補体；配列番号８；配列番号８の相補体；配列番号１１２；配列番号１１２の相補体；配列番号１１３；配列番号１１３の相補体；配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号２、５〜８、１１２、および／または１１３のうちのいずれかを含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列；配列番号２、５〜８、１１２、および／または１１３のうちのいずれかを含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の相補体；配列番号２、５〜８、１１２、および／または１１３のうちのいずれかを含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列；配列番号２、５〜８、１１２、および／または１１３のうちのいずれかを含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の相補体；配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；ならびに配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択される複数のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３３】
ヌクレオチド配列の各々が、植物細胞において機能的な異種プロモーターに作動可能に連結された、請求項３２に記載の単離ポリヌクレオチドを含む植物体の形質転換ベクター。
【請求項３４】
請求項３２に記載の単離ポリヌクレオチドで形質転換された細胞。
【請求項３５】
請求項３２に記載の単離ポリヌクレオチドで形質転換された植物体。
【請求項３６】
複数のヌクレオチド配列を、二本鎖リボ核酸分子として植物細胞内で発現させる、請求項３５に記載の植物体。
【請求項３７】
トウモロコシ（Zea mays）細胞である、請求項３４に記載の細胞。
【請求項３８】
トウモロコシ（Zea mays）である、請求項３６に記載の植物体。
【請求項３９】
鞘翅目有害生物がディアブロティカ（Diabrotica）属種である、請求項３１に記載の植物体。
【請求項４０】
鞘翅目有害生物が、セイヨウトウモロコシ根虫（D. virgifera virgifera LeConte）、ノーザンコーンルートワーム（D. barberi Smith and Lawrence）、メキシカンコーンルートワーム（D. virgifera zeae Krysan and Smith）、サザンコーンルートワーム（D. undecimpunctata howardi Barber）、Ｄ．バルテアータ（D. balteata LeConte）、Ｄ．ウンデキンプンクタタテネラ（D. undecimpunctata tenella）、およびジュウイチホシウリハムシ（D. undecimpunctata undecimpunctata Mannerheim）からなる群から選択される、請求項３９に記載の植物体。
【請求項４１】
請求項３０に記載の植物体から生成させる作物生成物であって、検出可能量の、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチドを含む作物生成物。
【請求項４２】
鞘翅目有害生物の集団を防除する方法であって、鞘翅目有害生物と接触させると鞘翅目有害生物における生物学的機能を阻害するように機能する二本鎖リボ核酸分子を含む作用物質を施すステップを含み、作用物質が、配列番号２；配列番号２の相補体；配列番号２の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号２の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号２を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列；配列番号２を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の相補体；配列番号２を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列；配列番号２を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の相補体；配列番号２を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号２を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号２を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；および配列番号２を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項４３】
鞘翅目有害生物の集団を防除する方法であって、鞘翅目有害生物と接触させると、鞘翅目有害生物における生物学的機能を阻害するように機能する、第１のポリヌクレオチド配列および第２のポリヌクレオチド配列を含む作用物質を施すステップを含み、第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号２の約１９〜約３０の連続ヌクレオチドに対する約９０％〜約１００％の配列同一性を呈示する領域を含み、第１のポリヌクレオチド配列が、第２のポリヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする方法。
【請求項４４】
第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号１を含むディアブロティカ（Diabrotica）属遺伝子；液胞ＡＴＰアーゼのＨサブユニット；およびＲｈｏ１低分子ＧＴＰ結合タンパク質からなる群から選択される鞘翅目有害生物遺伝子の約１９〜約３０の連続ヌクレオチドに対する約９０％〜約１００％の配列同一性を呈示する領域をさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
鞘翅目有害生物の集団を防除する方法であって、
配列番号２；配列番号２の相補体；配列番号２の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号２の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号２を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列；配列番号２を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の相補体；配列番号２を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列；配列番号２を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の相補体；配列番号２を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号２を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号２を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；および配列番号２を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む形質転換された植物細胞を、鞘翅目有害生物の宿主植物体に施すステップを含み、ポリヌクレオチドを発現させて、集団に属する鞘翅目有害生物と接触させると鞘翅目有害生物における標的配列の発現を阻害するように機能し、鞘翅目有害生物または鞘翅目有害生物の集団の成長の、形質転換された植物細胞を欠く同じ種の宿主植物体における成長と比べた減殺を結果としてもたらすリボ核酸分子を生成させる方法。
【請求項４６】
リボ核酸分子が二本鎖リボ核酸分子である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
鞘翅目有害生物の集団が、形質転換された植物細胞を欠く同じ種の宿主植物体に発生する鞘翅目有害生物の集団と比べて低減される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
植物体における植物鞘翅目有害生物の発生を防除する方法であって、鞘翅目有害生物の食餌中に、配列番号２；配列番号２の相補体；配列番号２の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号２の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号２を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列；配列番号２を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の相補体；配列番号２を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列；配列番号２を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の相補体；配列番号２を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号２を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号２を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；および配列番号２を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを施すステップを含む方法。
【請求項４９】
食餌が、ポリヌクレオチドを発現させるように形質転換された植物細胞を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
穀物トウモロコシの収率を改善する方法であって、
配列番号２；配列番号２の相補体；配列番号２の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号２の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号２を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列；配列番号２を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の相補体；配列番号２を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列；配列番号２を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の相補体；配列番号２を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号２を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号２を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；および配列番号２を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドをトウモロコシ植物体へと導入して、トランスジェニックのトウモロコシ植物体を生成させるステップと；
トウモロコシ植物体を栽培して、少なくとも１つのヌクレオチド配列を発現させるステップと
を含み、少なくとも１つのヌクレオチド配列の発現により、鞘翅目有害生物の感染または成長および鞘翅目有害生物の感染に起因する収率の損失を阻害する方法。
【請求項５１】
少なくとも１つのヌクレオチド配列の発現により、トウモロコシ植物体の一部に接触した鞘翅目有害生物における、少なくとも第１の標的遺伝子を抑制するＲＮＡ分子を生成させる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
トランスジェニック植物細胞を生成させる方法であって、
植物細胞を、プロモーターおよび転写終結配列に作動的に連結されたポリヌクレオチドであって、配列番号２；配列番号２の相補体；配列番号２の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号２の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号２を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列；配列番号２を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の相補体；配列番号２を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列；配列番号２を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の相補体；配列番号２を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号２を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号２を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；および配列番号２を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換するステップと、
形質転換された植物細胞を、複数の形質転換された植物細胞を含む植物細胞培養物を生じさせるのに十分な条件下で培養するステップと；
少なくとも１つのヌクレオチド配列をそれらのゲノムへと組み込んだ形質転換植物細胞を選択するステップと；
形質転換された植物細胞を、少なくとも１つのヌクレオチド配列によりコードされるリボ核酸分子の発現についてスクリーニングするステップと；
ｄｓＲＮＡを発現させる植物細胞を選択するステップと
を含む方法。
【請求項５３】
鞘翅目有害生物抵抗性のトランスジェニック植物体を生成させる方法であって、
請求項５２に記載の方法を介して生成させたトランスジェニック植物細胞をもたらすステップと；
トランスジェニック植物体をトランスジェニック植物細胞から再生させるステップと
を含み、少なくとも１つのヌクレオチド配列によりコードされるリボ核酸分子の発現が、形質転換された植物体に接触する鞘翅目有害生物における標的遺伝子の発現をモジュレートするのに十分な方法。
【請求項５４】
配列番号２；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号１１２；配列番号１１３；および配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含み、ディアブロティカ（Diabrotica）属遺伝子の少なくとも１９の連続ヌクレオチドを有する断片からなる群から選択される基準ポリヌクレオチドと実質的に相同な少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む単離核酸。
【請求項５５】
ポリヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドと少なくとも８０％同一な、請求項５４に記載の単離核酸。
【請求項５６】
ポリヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドと少なくとも９０％同一な、請求項５４に記載の単離核酸。
【請求項５７】
ポリヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドと少なくとも９５％同一な、請求項５４に記載の単離核酸。
【請求項５８】
配列番号２が、中程度の厳密性の条件下で少なくとも１つのポリヌクレオチドとハイブリダイズする、請求項５４に記載の単離核酸。
【請求項５９】
配列番号２が、高度な厳密性の条件下で少なくとも１つのポリヌクレオチドとハイブリダイズする、請求項５４に記載の単離核酸。
【請求項６０】
請求項５４に記載の単離核酸を含む、植物細胞、植物組織、植物部分、または植物体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、「液胞ＡＴＰアーゼのＣサブユニットを標的とし、鞘翅目有害生物に対する抵抗性を付与する核酸分子」について、２０１０年１２月３０日に出願された米国特許仮出願第６１／４２８，６０８号の出願日の利益を主張する。
【０００２】
本発明は一般に、鞘翅目有害生物により引き起こされる植物の虫害に対する遺伝子的防除に関する。具体的な実施形態では、本発明は、標的のコード配列および非コード配列の同定、ならびに鞘翅目有害生物の細胞における標的のコード配列および非コード配列の発現を転写後に抑制または阻害して、植物保護効果をもたらすための組換えＤＮＡ法の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
セイヨウトウモロコシ根虫（western corn rootworm（ＷＣＲ）、Diabrotica virgifera virgifera LeConte）は、北米で最も破壊的なコーンルートワーム種のうちの１つであり、米国中西部のトウモロコシ栽培地域において特別の懸案事項である。ノーザンコーンルートワーム（northern corn rootworm（ＮＣＲ）、Diabrotica barberi Smith and Lawrence）は、ＷＣＲと同じ範囲の大半に共棲する、密接な近縁種である。北米には、重要な有害生物である、ディアブロティカ（Diabrotica）属の他のいくつかの類縁の亜種：メキシカンコーンルートワーム（Mexican corn rootworm（ＭＣＲ）、D. virgifera zeae Krysan and Smith）；サザンコーンルートワーム（southern corn rootworm（ＳＣＲ）、D. undecimpunctata howardi Barber）；Ｄ．バルテアータ（D. balteata LeConte）；Ｄ．ウンデキンプンクタタテネラ（D. undecimpunctata tenella）；およびジュウイチホシウリハムシ（D. u. undecimpunctata Mannerheim）が存在する。現在、米国農務省は、コーンルートワームが、８億ドルの収穫の損失および２億ドルの処置費用を包含する、毎年１０億ドルの歳入の損失を引き起こしていると推定している。
【０００４】
ＷＣＲおよびＮＣＲのいずれも、夏季の間に、土壌中に卵として産み落とされる。害虫は、冬季を通じて卵段階にとどまる。卵は楕円形、白色で、０．００４インチ未満の長さである。幼虫は５月下旬または６月上旬に孵化し、卵が孵化する正確なタイミングは、温度差および場所に起因して年により変化する。新たに孵化した幼虫は、長さが０．１２５インチ未満の白色の蠕虫である。孵化した幼虫は、トウモロコシの根を常食とし始める。コーンルートワームは、３幼虫齢を過ごす。数週間にわたる摂食の後、幼虫は蛹段階へと脱皮する。コーンルートワームは、土壌中で蛹となり、次いで、７月および８月に成虫として土壌から出現する。成虫の根切り虫は、約０．２５インチの長さである。
【０００５】
コーンルートワームの幼虫は、トウモロコシおよび他のいくつかのイネ科植物種において発育を完了する。キンエノコログサにおいて成育した幼虫は、後に出現すると、成虫としての頭蓋サイズが、トウモロコシにおいて成育した幼虫より小さい（Ellsburyら（2005）、Environ. Entomol. 34: 627〜34）。ＷＣＲの成虫は、トウモロコシ穂毛、花粉、および露出した穂の先端における穀粒を常食とする。ＷＣＲの成虫が、トウモロコシの生殖組織が存在する前に出現する場合は、葉組織を常食とする場合があり、これにより植物の成長を遅延させ、場合によっては宿主植物体を死滅させる。しかし、成虫は、それらが摂取可能となれば、好ましい穂毛および花粉へと速やかに移行する。ＮＣＲの成虫もまた、トウモロコシ植物体の生殖組織を常食とするが、対照的にトウモロコシの葉を常食とすることはまれである。
【０００６】
トウモロコシにおける根切り虫による虫害の大半は、幼虫の摂食により引き起こされる。新たに孵化した根切り虫はまず、トウモロコシの微細な根毛を常食とし、根の先端へと潜伏する。幼虫は、大きく成長するにつれて、一次根を常食とし、これらに潜伏する。コーンルートワームが大量に存在すると、幼虫による摂食の結果として、トウモロコシの茎の基部に至る根の全てが根切りされることが多い。重度の根の損傷は、根が水および栄養物を植物体へと輸送する能力を損ない、植物の成長を減殺し、穀物の生成を結果として低減し、これにより、全体の収率を大幅に減少させることが多い。重度の根の損傷はまた、収穫をより困難とし、収率をさらに減少させる、トウモロコシ植物体の倒伏を結果としてもたらすことも多い。さらに、成虫がトウモロコシの生殖組織を常食とすれば、穂の先端における穂切りが結果としてもたらされうる。この「穂毛刈り」は、花粉飛散時には十分に重度であり、受粉が妨げられる可能性がある。
【０００７】
コーンルートワームの防除は、輪作、化学殺虫剤、バイオ殺虫剤（例えば、胞子を形成するグラム陽性菌、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis））、またはこれらの組合せを介して試みることができる。輪作には、耕地の使用に望ましくない制限を課する著明な欠点がある。さらに、一部の根切り虫種の産卵はダイズ圃場で生じる場合があり、これにより、トウモロコシおよびダイズによりなされる輪作の有効性が減殺される。
【０００８】
化学殺虫剤が、コーンルートワームの防除を達成するための、依存比重が最も大きい戦略である。しかし、化学殺虫剤の使用は、コーンルートワームの防除戦略として不完全であり、化学殺虫剤の費用が、殺虫剤の使用にもかかわらず生じうる根切り虫による虫害の費用に加わる場合、米国では、コーンルートワームのために、毎年１０億ドル超が失われる可能性がある。幼虫の大集団、多雨、および殺虫剤（複数可）の不適切な適用の全てが、コーンルートワームの不十分な防除を結果としてもたらしうる。さらに、殺虫剤の持続的使用は、殺虫剤抵抗性の根切り虫株を選択する可能性があるほか、それらの多くによる非標的種に対する毒性のために著明な環境的懸案事項も惹起しうる。
【０００９】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、標的遺伝子配列の全て、またはその十分なサイズの任意の部分に対して特異的な、干渉性のＲＮＡ（ｉＲＮＡ）分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）が、標的遺伝子配列によりコードされるｍＲＮＡの分解を結果としてもたらす、内因性の細胞内経路を利用する過程である。近年、多数の種および実験系、例えば、Ｃ．エレガンス（C. elegans）、植物、昆虫胚、および組織培養物中の細胞において遺伝子「ノックダウン」を実施するのに、ＲＮＡｉが用いられている。例えば、Fireら（1998）、Nature 391: 806〜11；Martinezら（2002）、Cell 110: 563〜74；McManusおよびSharp（2002）、Nature Rev. Genetics 3: 737〜47を参照されたい。
【００１０】
ＲＮＡｉは、ＤＩＣＥＲタンパク質複合体を包含する内因性の経路を介して、ｍＲＮＡの分解を達成する。ＤＩＣＥＲは、長鎖のｄｓＲＮＡ分子を、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と称する約２０ヌクレオチドの短鎖断片へと切断する。ｓｉＲＮＡは、パッセンジャー鎖およびガイド鎖という２つの一本鎖ＲＮＡへと巻き戻される。パッセンジャー鎖は分解され、ガイド鎖は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へと組み込まれる。阻害性マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子も、ＲＩＳＣへと同様に組み込まれうる。ガイド鎖がｍＲＮＡ分子の相補的な配列に特異的に結合し、ＲＩＳＣ複合体の触媒成分であるＡｒｇｏｎａｕｔｅによる切断を誘導すると、転写後遺伝子サイレンシングが生じる。この過程は、植物、線虫、および一部の昆虫など、一部の真核生物では、最初は限定された濃度のｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡであるが、生物内で全身に拡散することが知られている。
【００１１】
ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡと相補的な転写物だけが、切断および分解され、したがって、ｍＲＮＡの発現のノックダウンは、配列特異的である。植物では、いくつかの機能的なＤＩＣＥＲ遺伝子群が存在する。ＲＮＡｉの遺伝子サイレンシング効果は、数日間にわたり持続し、実験条件下では、標的とされた転写物のアバンダンスを９０％以上減少させることが可能であり、結果として対応するタンパク質レベルを低減する。
【００１２】
米国特許第７，６１２，１９４号、ならびに米国特許公開第ＵＳ２００７／００５０８６０号、同第ＵＳ２０１０／０１９２２６５号、および同第ＵＳ２０１１／０１５４５４５号は、セイヨウトウモロコシ根虫（D. v. virgifera LeConte）の蛹から単離された、９１１２の発現配列タグ（ＥＳＴ）配列のライブラリーについて開示する。米国特許第７，６１２，１９４号および米国特許公開第ＵＳ２００７／００５０８６０号では、植物細胞においてアンチセンスＲＮＡを発現させるために、プロモーターに、これらの文献で開示されている、セイヨウトウモロコシ根虫（D. v. virgifera）の液胞型Ｈ＋−ＡＴＰアーゼ（Ｖ−ＡＴＰアーゼ）のいくつかの特定の部分的な配列のうちの１つと相補的な核酸分子を、作動可能に連結することが示唆されている。米国特許公開第ＵＳ２０１０／０１９２２６５号は、植物細胞においてアンチセンスＲＮＡを発現させるために、プロモーターを、機能が知られておらず開示されていないセイヨウトウモロコシ根虫（D. v. virgifera）遺伝子の特定の部分的な配列（この部分的な配列は、Ｃ．エレガンス（C. elegans）におけるＣ５６Ｃ１０．３遺伝子産物と５８％同一であると述べられている）と相補的な核酸分子に作動可能に連結することを示唆している。米国特許公開第ＵＳ２０１１／０１５４５４５号は、植物細胞においてアンチセンスＲＮＡを発現させるために、プロモーターを、セイヨウトウモロコシ根虫（D. v. virgifera）コートマーβサブユニット遺伝子の２つの特定の部分的な配列と相補的な核酸分子に作動可能に連結することを示唆している。さらに、米国特許第７，９４３，８１９号は、セイヨウトウモロコシ根虫（D. v. virgifera LeConte）の幼虫、蛹、および切開された小成虫から単離された、９０６の発現配列タグ（ＥＳＴ）配列のライブラリーについて開示し、植物細胞において二本鎖ＲＮＡを発現させるために、プロモーターを、セイヨウトウモロコシ根虫（D. v. virgifera）の帯電した多小胞体タンパク質４ｂ遺伝子の特定の部分的な配列と相補的な核酸分子に作動可能に連結することを示唆している。
【００１３】
米国特許第７，６１２，１９４号、ならびに米国特許公開第ＵＳ２００７／００５０８６０号、同第ＵＳ２０１０／０１９２２６５号、および同第ＵＳ２０１１／０１５４５４５号は、Ｖ−ＡＴＰアーゼのいくつかの特定の部分的な配列、および機能が知られていない遺伝子の特定の部分的な配列以外、ＲＮＡ干渉についてこれらの文献において列挙された９０００を超える配列のうちのいずれの特定の配列を用いるためのさらなる示唆も提供していない。さらに、米国特許第７，６１２，１９４号、ならびに米国特許公開第ＵＳ２００７／００５０８６０号、および同第ＵＳ２０１０／０１９２２６５号、および同第ＵＳ２０１１／０１５４５４５号のうちのいずれも、提供される９０００を超える配列のうちの他のいずれの配列が、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとして用いた場合に、コーンルートワーム種において致死性であるか、またはなお他の形で有用であるかについての指針を提供していない。米国特許第７，９４３，８１９号は、帯電した多小胞体タンパク質４ｂ遺伝子の特定の部分的な配列以外、ＲＮＡ干渉についてこの文献において列挙された、９００を超える配列のうちのいずれの特定の配列を用いるための示唆も提供していない。さらに、米国特許第７，９４３，８１９号は、提供された９００を超える配列のうちの他のいずれの配列が、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとして用いた場合に、コーンルートワーム種において致死性であるか、またはなお他の形で有用であるかについての指針を提供していない。
【００１４】
コーンルートワームのＤＮＡと相補的な配列の圧倒的大多数（前出などの配列）は、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとして用いた場合に、コーンルートワーム種において致死性ではない。例えば、Baumら（2007）は、ＲＮＡｉを介していくつかのＷＣＲ遺伝子標的を阻害する効果について説明している。これらの著者らは、彼らが調べた２６の標的遺伝子のうちの８遺伝子は、５２０ｎｇ／ｃｍ２を超える極めて高度なｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）濃度でも、鞘翅目有害生物の実験的に著明な死滅をもたらすことが可能でないことを報告した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本明細書では、例えば、セイヨウトウモロコシ根虫（D. v. virgifera LeConte（western corn rootworm：「ＷＣＲ」））；ノーザンコーンルートワーム（D. barberi Smith and Lawrence（northern corn rootworm：「ＮＣＲ」））；サザンコーンルートワーム（D. u. howardi Barber（southern corn rootworm：「ＳＣＲ」））；メキシカンコーンルートワーム（D. v. zeae Krysan and Smith（Mexican corn rootworm：「ＭＣＲ」））；Ｄ．バルテアータ（D. balteata LeConte）；Ｄ．ｕ．テネラ（D. u. tenella）；およびジュウイチホシウリハムシ（D. u. undecimpunctata Mannerheim）を含めた鞘翅目有害生物を防除するための核酸分子（例えば、標的遺伝子、ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｈｐＲＮＡ）、およびそれらを用いる方法が開示される。具体例では、鞘翅目有害生物における１または複数の天然の核酸配列の少なくとも一部と相同でありうる例示的な核酸分子が開示される。
【００１６】
これらの例およびさらなる例では、天然の核酸配列は、標的遺伝子であって、その産物が、例えば、かつ、限定せずに述べると、代謝過程に関与する場合もあり、生殖過程に関与する場合もあり、幼虫の発育に関与する場合もある、標的遺伝子でありうる。一部の例では、標的遺伝子の発現に対する、それと相同な配列を含む核酸分子による翻訳後阻害は、鞘翅目有害生物において致死性の場合もあり、成長および／または生殖の減殺を結果としてもたらす場合もある。具体例では、Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ４７１８５＿Ｃａｆ１１８０；Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ１２２９＿ＶａｔｐａｓｅＣ；Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ１３１９＿ＶａｔｐａｓｅＨ；およびＣｏｎｔｉｇ＿０１＿Ｒｈｏ１＿１−１９１＿ＣＤＣ４２からなるリストから選択される少なくとも１つの遺伝子を、転写後サイレンシングのための標的遺伝子として選択することができる。特定の例では、翻訳後阻害に有用な標的遺伝子が、本明細書でＤ＿ｖｉｒ＿ｃ１２２９＿ＶａｔｐａｓｅＣ（配列番号２）と称するヌクレオチド配列またはその相同体を含む、液胞ＡＴＰアーゼのＣサブユニットである。したがって、本明細書では、Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ１２２９＿ＶａｔｐａｓｅＣ（配列番号２）の配列、その相補体、およびこれらのいずれかの特定の新規の断片を含む単離核酸分子が開示される。
【００１７】
また、標的遺伝子産物（例えば、Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ４７１８５＿Ｃａｆ１１８０；Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ１２２９＿ＶａｔｐａｓｅＣ；Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ１３１９＿ＶａｔｐａｓｅＨ；およびＣｏｎｔｉｇ＿０１＿Ｒｈｏ１＿１−１９１＿ＣＤＣ４２からなる群から選択される遺伝子の産物）内のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子も開示される。特定の例では、核酸分子が、本明細書でＤ＿ｖｉｒ＿ｃ１２２９＿ＶａｔｐａｓｅＣ（配列番号２）と称するヌクレオチド配列またはその相同体を含む、液胞ＡＴＰアーゼのＣサブユニットの遺伝子によりコードされるポリペプチド内のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。標的遺伝子産物内のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列を含む核酸分子もさらに開示される。
【００１８】
また、鞘翅目有害生物の標的遺伝子、例えば、Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ４７１８５＿Ｃａｆ１１８０；Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ１２２９＿ＶａｔｐａｓｅＣ；Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ１３１９＿ＶａｔｐａｓｅＨ；および／またはＣｏｎｔｉｇ＿０１＿Ｒｈｏ１＿１−１９１＿ＣＤＣ４２の全部または一部と相補的なｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｈｐＲＮＡ）分子を生成させるのに用いられうるｃＤＮＡ配列も開示される。具体的な実施形態では、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／またはｈｐＲＮＡを、植物または細菌などの遺伝子改変生物を介して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生成させることができる。具体例では、Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ１２２９＿ＶａｔｐａｓｅＣ、またはその特定の新規の断片と相補的なｉＲＮＡ分子を生成させるのに用いうるｃＤＮＡ分子が開示される。
【００１９】
鞘翅目有害生物において不可欠な遺伝子の発現を阻害する手段、および鞘翅目有害生物に対する抵抗性を植物体にもたらす手段もさらに開示される。鞘翅目有害生物において不可欠な遺伝子の発現を阻害する手段は、配列番号７、８、１０、１１、４９、５０、８６、８７、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１のうちのいずれか、またはその相補体からなる一本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖ＲＮＡ分子である。鞘翅目有害生物に対する抵抗性を植物体にもたらす手段は、プロモーターに作動可能に連結された、鞘翅目有害生物において不可欠な遺伝子の発現を阻害する手段をコードする核酸配列を含むＤＮＡ分子であって、トウモロコシ植物体のゲノムへと組み込むことが可能なＤＮＡ分子である。
【００２０】
鞘翅目有害生物の集団を防除する方法であって、鞘翅目有害生物により取り込まれると、鞘翅目有害生物における生物学的機能を阻害するように機能するｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｈｐＲＮＡ）分子を鞘翅目有害生物に施すステップを含み、ｉＲＮＡ分子が、配列番号１；配列番号１の相補体；配列番号２；配列番号２の相補体；配列番号３；配列番号３の相補体；配列番号４；配列番号４の相補体；配列番号１〜４のうちのいずれかの全部または一部を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コード配列；配列番号１〜４のうちのいずれかの全部または一部を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の相補体；配列番号１〜４のうちのいずれかの全部または一部を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列；および配列番号１〜４のうちのいずれかの全部または一部を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の相補体からなる群から選択されるヌクレオチド配列の全部または一部を含む方法が開示される。
【００２１】
具体例では、鞘翅目有害生物の集団を防除する方法であって、鞘翅目有害生物により取り込まれると、鞘翅目有害生物における生物学的機能を阻害するように機能するｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｈｐＲＮＡ）分子を鞘翅目有害生物に施すステップを含み、ｉＲＮＡ分子が、配列番号１の全部または一部；配列番号１の全部または一部の相補体；配列番号２；配列番号２の相補体；配列番号３；配列番号３の相補体；配列番号４；配列番号４の相補体；配列番号５の全部または一部；配列番号５の相補体の全部または一部；配列番号６の全部または一部；配列番号６の相補体の全部または一部；配列番号７；配列番号７の相補体；配列番号８；配列番号８の相補体；配列番号１１２；配列番号１１２の相補体；配列番号１１３；配列番号１１３の相補体；配列番号１を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コード配列の全部または一部；配列番号１を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の相補体の全部または一部；配列番号１を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の全部または一部；および配列番号１を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の相補体の全部または一部からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む方法が開示される。
【００２２】
本明細書ではまた、食餌ベースのアッセイにおいて、またはｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／もしくはｈｐＲＮＡを発現させる遺伝子改変された植物細胞において、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／またはｈｐＲＮＡを、鞘翅目有害生物に施しうる方法も開示される。これらの例およびさらなる例では、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／またはｈｐＲＮＡを、鞘翅目有害生物の幼虫に摂取させることができる。次いで、本発明のｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／またはｈｐＲＮＡを摂取させる結果として、幼虫においてＲＮＡｉをもたらすことができ、これにより、鞘翅目有害生物の生存能力に不可欠な遺伝子のサイレンシングを結果としてもたらし、最終的には幼虫の死滅をもたらすことができる。したがって、鞘翅目有害生物の防除に有用な、例示的な核酸配列（複数可）を含む核酸分子を鞘翅目有害生物に施す方法が開示される。具体例では、本発明の核酸分子を用いることにより防除される鞘翅目有害生物がＷＣＲまたはＮＣＲでありうる。
【００２３】
前出の特色および他の特色は、付属の図を参照して記載されている、以下のいくつかの実施形態についての詳細な説明から一層明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ｄｓＲＮＡを生成させるための特異的な鋳型をもたらすのに用いた、戦略の図解を包含する図である。
【図２】例示的な核酸分子で処理した鞘翅目有害生物の成長阻害についての変動図を包含する図である。
【図３】例示的な核酸分子で処理した鞘翅目有害生物の死滅についての変動図を包含する図である。
【図４】例示的な核酸分子で処理した鞘翅目有害生物の成長阻害についてのさらなる変動図を包含する図である。
【図５】特定の本発明の核酸分子中に存在しうるいくつかのヌクレオチド配列の模式図を包含する図である。表示される「（配列）」とは、任意の長さおよび特定の配列を有する、図解されるヌクレオチド配列の領域、例えば、かつ、限定せずに述べると、配列番号１〜４のうちの１つの連続セグメントを指す。図解されるヌクレオチド配列の斜字体の領域は、任意選択である。
【配列表フリーテキスト】
【００２５】
付属の配列表に列挙される核酸配列を、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２において規定される、ヌクレオチド塩基についての標準的な文字による略記法を用いて示す。各核酸配列のうちの１つの鎖だけを示すが、相補鎖および逆相補鎖も、提示される鎖への任意の参照を介して包含されるものと理解される。付属の配列表では、以下が成り立つ。
【００２６】
配列番号１は、一部の場所でＤ＿ｖｉｒ＿ｃ４７１８５＿Ｃａｆ１１８０、またはＣａｆ１−１８０と称する、例示的なディアブロティカ（Diabrotica）属のｃＤＮＡ配列を示す。
【００２７】
配列番号２は、一部の場所でＤ＿ｖｉｒ＿ｃ１２２９＿ＶａｔｐａｓｅＣ、またはＶａｔｐａｓｅＣと称する、例示的なディアブロティカ（Diabrotica）属のｃＤＮＡ配列を示す。
【００２８】
配列番号３は、一部の場所でＤ＿ｖｉｒ＿ｃ１３１９＿ＶａｔｐａｓｅＨ、またはＶａｔｐａｓｅＨと称する、例示的なディアブロティカ（Diabrotica）属のｃＤＮＡ配列を示す。
【００２９】
配列番号４は、一部の場所でＣｏｎｔｉｇ＿０１＿Ｒｈｏ１＿１−１９１＿ＣＤＣ４２、またはＲｈｏ１と称する、例示的なディアブロティカ（Diabrotica）属のｃＤＮＡ配列を示す。
【００３０】
配列番号５〜８は、ディアブロティカ（Diabrotica）属の液胞ＡＴＰアーゼのＣサブユニットのｃＤＮＡの例示的な不連続断片を示す。
【００３１】
配列番号９〜１１は、ディアブロティカ（Diabrotica）属の液胞ＡＴＰアーゼのＨサブユニットのｃＤＮＡの例示的な不連続断片を示す。
【００３２】
配列番号１２は、Ｔ７ファージのプロモーター配列を示す。
【００３３】
配列番号１３〜３８は、ＰＣＲを介して、例示的な標的遺伝子のコード領域の一部を増幅するのに用いられるプライマーを示す。
【００３４】
配列番号３９〜４８は、ヘアピンＲＮＡを合成するための、Ｃａｆ１−１８０およびＶａｔｐａｓｅＣの遺伝子領域を増幅するのに用いられるプライマーを示す。
【００３５】
配列番号４９は、トウモロコシのコンセンサス配列を含有する変化形１の発現ベクターのためのＳＴ−ＬＳ１イントロン（配列番号１３６）を含有する、Ｃａｆ１−１８０ヘアピンＲＮＡを形成するＤＮＡ配列を示す。
【００３６】
配列番号５０は、トウモロコシのコンセンサス配列を含有する変化形１のｈｐＲＮＡの発現ベクターのためのＳＴ−ＬＳ１イントロン（配列番号１３６）を含有する、ＶａｔｐａｓｅＣヘアピンＲＮＡを形成するＤＮＡ配列を示す。
【００３７】
配列番号５１は、アネキシン領域１のＤＮＡ配列を示す。
【００３８】
配列番号５２は、アネキシン領域２のＤＮＡ配列を示す。
【００３９】
配列番号５３は、βスペクトリン２領域１のＤＮＡ配列を示す。
【００４０】
配列番号５４は、βスペクトリン２領域２のＤＮＡ配列を示す。
【００４１】
配列番号５５は、ｍｔＲＰ−Ｌ４領域１のＤＮＡ配列を示す。
【００４２】
配列番号５６は、ｍｔＲＰ−Ｌ４領域２のＤＮＡ配列を示す。
【００４３】
配列番号５７は、ＹＦＰをコードするＤＮＡ配列を示す。
【００４４】
配列番号５８〜８５は、ｄｓＲＮＡを合成するために、アネキシン、βスペクトリン２、ｍｔＲＰ−Ｌ４、およびＹＦＰの遺伝子領域を増幅するのに用いられるプライマーを示す。
【００４５】
配列番号８６は、ｄｓＲＮＡ分子の合成のための鋳型として用いた、Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ４７１８５＿Ｃａｆ１−１８０  ｃＤＮＡの例示的な２６０ｂｐの増幅断片を示す。
【００４６】
配列番号８７〜９０は、ディアブロティカ（Diabrotica）属のＲｈｏ１  ｃＤＮＡの例示的な不連続断片を示す。
【００４７】
配列番号９１は、トウモロコシのコンセンサス配列を含有する変化形１の発現ベクターのための、イントロンを挟む任意選択のクローニング部位を包含するＳＴ−ＬＳ１イントロン（配列番号１３６）を含有する、Ｃａｆ１−１８０ヘアピンＲＮＡを形成する例示的なＤＮＡ配列を示す。
【００４８】
配列番号９２は、トウモロコシのコンセンサス配列を含有しない変化形２の発現ベクターのためのＳＴ−ＬＳ１イントロン（配列番号１３６）を含有する、Ｃａｆ１−１８０ヘアピンＲＮＡを形成する例示的なＤＮＡ配列を示す。
【００４９】
配列番号９３は、トウモロコシのコンセンサス配列を含有する変化形１のｈｐＲＮＡ発現ベクターのための、イントロンを挟む任意選択のクローニング部位を包含するＳＴ−ＬＳ１イントロン（配列番号１３６）を含有する、ＶａｔｐａｓｅＣヘアピンＲＮＡを形成する例示的なＤＮＡ配列を示す。
【００５０】
配列番号９４は、トウモロコシのコンセンサス配列を含有しない変化形２のｈｐＲＮＡ発現ベクターのためのＳＴ−ＬＳ１イントロン（配列番号１３６）を含有する、ＶａｔｐａｓｅＣヘアピンＲＮＡを形成する例示的なＤＮＡ配列を示す。
【００５１】
配列番号９５は、変化形３の発現ベクターのためのＳＴ−ＬＳ１イントロン（配列番号１３６）を含有する、Ｃａｆ１−１８０  ＤＮＡのセンス鎖の例示的なセグメントを示す。
【００５２】
配列番号９６は、変化形３の発現ベクターのための、Ｃａｆ１−１８０  ＤＮＡアンチセンス鎖の例示的なセグメントを示す。
【００５３】
配列番号９７は、変化形３の発現ベクターのためのＳＴ−ＬＳ１イントロン（配列番号１３６）を含有する、Ｃａｆ１−１８０ヘアピンＲＮＡを形成する例示的なＤＮＡ配列を示す。
【００５４】
配列番号９８は、変化形３の発現ベクターのためのＳＴ−ＬＳ１イントロン（配列番号１３６）を含有する、ＶａｔｐａｓｅＣ  ＤＮＡのセンス鎖の例示的なセグメントを示す。
【００５５】
配列番号９９は、変化形３の発現ベクターのための、ＶａｔｐａｓｅＣ  ＤＮＡアンチセンス鎖の例示的なセグメントを示す。
【００５６】
配列番号１００は、変化形３の発現ベクターのためのＳＴ−ＬＳ１イントロン（配列番号１３６）を含有する、ＶａｔｐａｓｅＣヘアピンＲＮＡを形成する例示的なＤＮＡ配列を示す。
【００５７】
配列番号１０１は、変化形４の発現ベクターのためのＳＴ−ＬＳ１イントロン（配列番号１３６）を含有する、ＶａｔｐａｓｅＣ  ＤＮＡのセンス鎖の例示的なセグメントを示す。
【００５８】
配列番号１０２は、変化形４の発現ベクターのための、ＶａｔｐａｓｅＣ  ＤＮＡアンチセンス鎖の例示的なセグメントを示す。
【００５９】
配列番号１０３は、変化形４の発現ベクターのためのＳＴ−ＬＳ１イントロン（配列番号１３６）を含有する、ＶａｔｐａｓｅＣヘアピンＲＮＡを形成する例示的なＤＮＡ配列を示す。
【００６０】
配列番号１０４は、変化形１の発現ベクターのためのＳＴ−ＬＳ１イントロン（配列番号１３６）を含有する、ＶａｔｐａｓｅＨ  ＤＮＡのセンス鎖の例示的なセグメントを示す。
【００６１】
配列番号１０５は、変化形１の発現ベクターのための、ＶａｔｐａｓｅＨ  ＤＮＡアンチセンス鎖の例示的なセグメントを示す。
【００６２】
配列番号１０６は、変化形１の発現ベクターのためのＳＴ−ＬＳ１イントロン（配列番号１３６）を含有する、ＶａｔｐａｓｅＨヘアピンＲＮＡを形成する例示的なＤＮＡ配列を示す。
【００６３】
配列番号１０７は、変化形１の発現ベクターのためのＳＴ−ＬＳ１イントロン（配列番号１３６）を含有する、Ｒｈｏ１  ＤＮＡのセンス鎖の例示的なセグメントを示す。
【００６４】
配列番号１０８は、変化形１の発現ベクターのための、Ｒｈｏ１  ＤＮＡアンチセンス鎖の例示的なセグメントを示す。
【００６５】
配列番号１０９は、変化形１の発現ベクターのためのＳＴ−ＬＳ１イントロン（配列番号１３６）を含有する、Ｒｈｏ１ヘアピンＲＮＡを形成する例示的なＤＮＡ配列を示す。
【００６６】
配列番号１１０は、給餌バイオアッセイにおいてｄｓＲＮＡを合成するための鋳型をもたらすのに用いられる、Ｃａｆ−１８０  ＤＮＡの例示的なセグメントを示す。
【００６７】
配列番号１１１は、給餌バイオアッセイにおいてｄｓＲＮＡを合成するための鋳型をもたらすのに用いられる、ＶａｔｐａｓｅＣ領域１  ＤＮＡの例示的なセグメントを示す。
【００６８】
配列番号１１２は、給餌バイオアッセイにおいてｄｓＲＮＡを合成するための鋳型をもたらすのに用いられる、ＶａｔｐａｓｅＣ領域１（短鎖）ＤＮＡの例示的なセグメントを示す。
【００６９】
配列番号１１３は、給餌バイオアッセイにおいてｄｓＲＮＡを合成するための鋳型をもたらすのに用いられる、ＶａｔｐａｓｅＣ領域２  ＤＮＡの例示的なセグメントを示す。
【００７０】
配列番号１１４は、給餌バイオアッセイにおいてｄｓＲＮＡを合成するための鋳型をもたらすのに用いられる、ＶａｔｐａｓｅＨ領域１  ＤＮＡの例示的なセグメントを示す。
【００７１】
配列番号１１５は、給餌バイオアッセイにおいてｄｓＲＮＡを合成するための鋳型をもたらすのに用いられる、ＶａｔｐａｓｅＨ領域２  ＤＮＡの例示的なセグメントを示す。
【００７２】
配列番号１１６は、給餌バイオアッセイにおいてｄｓＲＮＡを合成するための鋳型をもたらすのに用いられる、Ｒｈｏ１  ＤＮＡの例示的なセグメントを示す。
【００７３】
配列番号１１７は、給餌バイオアッセイにおいてｄｓＲＮＡとして用いられる、例示的なＶａｔｐａｓｅＣ  ＲＮＡのセンス鎖（「ＶａｔｐａｓｅＣ５’−１５」）を示す。
【００７４】
配列番号１１８は、給餌バイオアッセイにおいてｄｓＲＮＡとして用いられる、さらなる例示的なＶａｔｐａｓｅＣ  ＲＮＡのセンス鎖（「ＶａｔｐａｓｅＣ５’−２５」）を示す。
【００７５】
配列番号１１９は、給餌バイオアッセイにおいてｄｓＲＮＡとして用いられる、さらなる例示的なＶａｔｐａｓｅＣ  ＲＮＡのセンス鎖（「ＶａｔｐａｓｅＣ３’−１５」）を示す。
【００７６】
配列番号１２０は、給餌バイオアッセイにおいてｄｓＲＮＡとして用いられる、さらなる例示的なＶａｔｐａｓｅＣ  ＲＮＡのセンス鎖（「ＶａｔｐａｓｅＣ３’−２５」）を示す。
【００７７】
配列番号１２１〜１２６は、ｄｓＲＮＡを合成するための鋳型としての、ディアブロティカ（Diabrotica）属のＶａｔｐａｓｅＣ遺伝子の一部を増幅するのに用いられるプライマーを示す。
【００７８】
配列番号１２７は、給餌バイオアッセイにおいてｄｓＲＮＡの鋳型として用いられる例示的なＶａｔｐａｓｅＣのセンス鎖（「ＶａｔｐａｓｅＣ５’−５０」）を示す。
【００７９】
配列番号１２８は、給餌バイオアッセイにおいてｄｓＲＮＡの鋳型として用いられる例示的なＶａｔｐａｓｅＣのセンス鎖（「ＶａｔｐａｓｅＣ５’−１００」）を示す。
【００８０】
配列番号１２９は、給餌バイオアッセイにおいてｄｓＲＮＡの鋳型として用いられる例示的なＶａｔｐａｓｅＣのセンス鎖（「ＶａｔｐａｓｅＣ−１７４」）を示す。
【００８１】
配列番号１３０は、給餌バイオアッセイにおいてｄｓＲＮＡの鋳型として用いられる例示的なＶａｔｐａｓｅＣのセンス鎖（「ＶａｔｐａｓｅＣ３’−５０」）を示す。
【００８２】
配列番号１３１は、給餌バイオアッセイにおいてｄｓＲＮＡとして用いられる例示的なＶａｔｐａｓｅＣのセンス鎖（「ＶａｔｐａｓｅＣ３’−１００」）を示す。
【００８３】
配列番号１３２〜１３５は、トランスジェニックトウモロコシの分子解析に用いられるプライマーを示す。
【００８４】
配列番号１３６は、一部の実施形態ではヘアピンＲＮＡを形成するのに有用でありうるＳＴ−ＬＳ１イントロンを示す。
【００８５】
配列番号１３７〜１３８は、ディアブロティカ（Diabrotica）属のＲｈｏ１  ｃＤＮＡの例示的な不連続断片を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
Ｉ．いくつかの実施形態の概観
本明細書では、鞘翅目有害生物の発生を遺伝子的に防除するための方法および組成物が開示される。また、鞘翅目有害生物の集団のＲＮＡｉを介する防除のための標的遺伝子として用いられる、鞘翅目有害生物の生活環に不可欠な１または複数の遺伝子を同定する方法も提供される。成長、生存、発育、および／または生殖に不可欠な１または複数の標的遺伝子を抑制するために、ｄｓＲＮＡ分子をコードするＤＮＡプラスミドベクターをデザインすることができる。一部の実施形態では、鞘翅目有害生物における標的遺伝子のコード配列または非コード配列と相補的な核酸分子を介する、標的遺伝子の発現の転写後抑制または標的遺伝子の阻害のための方法が提供される。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、鞘翅目有害生物に、標的遺伝子のコード配列または非コード配列と相補的な核酸分子の全部または一部から転写される、１または複数のｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／またはｈｐＲＮＡ分子を摂取させ、これにより、植物保護効果をもたらすことができる。
【００８７】
したがって、一部の実施形態は、標的遺伝子産物の発現に対する配列特異的な阻害を伴い、標的遺伝子（複数可）のコード配列および／または非コード配列と相補的なｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡを用いて、鞘翅目有害生物の少なくとも部分的な防除を達成する。例えば、配列番号１〜８、５０、９３、９４、９８〜１０３、１１１〜１１３、および１２７〜１３１のうちの１つに示されるヌクレオチド配列およびその断片を含む、単離および精製された核酸分子のセットが開示される。一部の実施形態では、安定化させたｄｓＲＮＡ分子（例えば、配列番号１１７〜１２０）を、これらの配列もしくはそれらの断片、またはこれらの配列のうちの１つを含む遺伝子から、標的遺伝子の転写後サイレンシングまたは阻害のために発現させることができる。特定の実施形態では、単離および精製された核酸分子が、配列番号２および／または配列番号５および６のいずれかの全部または一部を含む。
【００８８】
一部の実施形態は、そのゲノム内に少なくとも１つのｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）分子をコードする少なくとも１つの組換えＤＮＡ配列を有する組換え宿主細胞（例えば、植物細胞）を伴う。具体的な実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子（複数可）を発現させ、鞘翅目有害生物に摂取させて、鞘翅目有害生物における標的遺伝子の発現を転写後サイレンシングさせるかまたは阻害することができる。組換えＤＮＡ配列は、例えば、配列番号１〜８、５０、９３、９４、９８〜１０３、１１１〜１１３、および１２７〜１３１のうちのいずれか、配列番号１〜８、５０、９３、９４、９８〜１０３、１１１〜１１３、および１２７〜１３１のうちのいずれかの断片、もしくは配列番号１〜８、５０、９３、９４、９８〜１０３、１１１〜１１３、および１２７〜１３１のうちの１つを含む遺伝子の部分的な配列、またはこれらの相補体を含みうる。
【００８９】
具体的な実施形態は、そのゲノム内に、配列番号２および／または配列番号５および６のいずれかの全部または一部を含む、少なくとも１つのｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）分子をコードする組換えＤＮＡ配列を有する組換え宿主細胞を伴う。鞘翅目有害生物に摂取させると、ｉＲＮＡ分子（複数可）は、鞘翅目有害生物における、配列番号２、５〜８、１１２、および１１３を含む標的液胞ＡＴＰアーゼのＣサブユニット遺伝子の発現をサイレンシングさせるかまたは阻害し、これにより、鞘翅目有害生物における成長、発育、生殖、および／または摂食の停止を結果としてもたらすことができる。
【００９０】
一部の実施形態では、そのゲノム内に少なくとも１つのｄｓＲＮＡ分子をコードする少なくとも１つの組換えＤＮＡ配列を有する組換え宿主細胞が、形質転換された植物細胞でありうる。一部の実施形態は、このような形質転換された植物細胞を含むトランスジェニック植物体を伴う。このようなトランスジェニック植物体に加えて、それらの各々が組換えＤＮＡ配列（複数可）を含む、任意のトランスジェニック植物世代の後代植物体、トランスジェニック種子、およびトランスジェニック植物生成物の全てが提供される。具体的な実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子を、トランスジェニック植物細胞において発現させることができる。したがって、これらの実施形態および他の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子を、トランスジェニック植物細胞から単離することができる。具体的な実施形態では、トランスジェニック植物が、トウモロコシ（corn（Zea mays））、ダイズ（soybean（Glycine max））、およびイネ（Poaceae）科の植物を含む群から選択される植物である。
【００９１】
一部の実施形態は、鞘翅目有害生物の細胞における標的遺伝子の発現をモジュレートする方法を伴う。これらの実施形態および他の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供することができる。具体的な実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を、プロモーターに作動的に連結することができ、また、転写終結配列にも作動的に連結することができる。具体的な実施形態では、鞘翅目有害生物の細胞における標的遺伝子の発現をモジュレートする方法は、（ａ）植物細胞を、ｄｓＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換するステップと；（ｂ）形質転換された植物細胞を、複数の形質転換された植物細胞を含む植物細胞培養物を生じさせるのに十分な条件下で培養するステップと；（ｃ）ベクターをそのゲノムへと組み込んだ形質転換植物細胞を選択するステップと；（ｄ）選択された形質転換植物細胞が、ベクターのヌクレオチド配列によりコードされるｄｓＲＮＡ分子を含むことを決定するステップとを含みうる。植物は、そのゲノムにベクターを組み込み、ベクターのヌクレオチド配列によりコードされるｄｓＲＮＡ分子を含む植物細胞から再生させることができる。
【００９２】
したがって、また、そのゲノムに組み込んだｄｓＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を有するベクターを含むトランスジェニック植物体であって、ベクターのヌクレオチド配列によりコードされるｄｓＲＮＡ分子を含むトランスジェニック植物体も開示される。具体的な実施形態では、植物におけるｄｓＲＮＡ分子の発現が、例えば、形質転換された植物体、植物体の一部（例えば、根）、または植物細胞の摂食を介して、形質転換された植物体または植物細胞に接触する鞘翅目有害生物の細胞における標的遺伝子の発現をモジュレートするのに十分である。本明細書で開示されるトランスジェニック植物体は、鞘翅目有害生物の発生に対する抵抗性および／または増強した耐性を提示しうる。特定のトランスジェニック植物体は、ＷＣＲ；ＮＣＲ；ＳＣＲ；ＭＣＲ；Ｄ．バルテアータ（D. balteata LeConte）；Ｄ．ｕ．テネラ（D. u. tenella）；およびジュウイチホシウリハムシ（D. u. undecimpunctata Mannerheim）からなる群から選択される、１または複数の鞘翅目有害生物に対する抵抗性および／または増強した耐性を提示しうる。
【００９３】
本明細書ではまた、ｉＲＮＡ分子などの防除剤を、鞘翅目有害生物へと送達する方法も開示される。このような防除剤は、鞘翅目有害生物が、摂食するか、成長するか、または宿主に対して他の形で虫害を引き起こす能力の障害を、直接的または間接的に引き起こしうる。一部の実施形態では、鞘翅目有害生物における少なくとも１つの標的遺伝子を抑制する安定化ｄｓＲＮＡ分子を鞘翅目有害生物へと送達し、これにより、鞘翅目有害生物による植物の虫害を軽減するかまたは消失させることを含む方法が提供される。一部の実施形態では、鞘翅目有害生物における標的遺伝子の発現を阻害する方法が、鞘翅目有害生物における成長、発育、生殖、および／または摂食の停止を結果としてもたらしうる。一部の実施形態では、方法は、最終的に鞘翅目有害生物の死滅を結果としてもたらしうる。
【００９４】
一部の実施形態では、本発明のｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）分子を含む組成物（例えば、局所組成物）であって、植物、動物、および／または植物環境もしくは動物環境において用いられて鞘翅目有害生物の発生の消失または低減を達成する組成物が提供される。具体的な実施形態では、組成物は、鞘翅目有害生物へと施される栄養組成物または食餌供給源でありうる。一部の実施形態は、栄養組成物または食餌供給源を鞘翅目有害生物に摂食可能とするステップを含む。ｉＲＮＡ分子を含む組成物の摂取は、鞘翅目有害生物の１または複数の細胞を介する分子の取込みを結果としてもたらすことが可能であり、鞘翅目有害生物の細胞（複数可）における少なくとも１つの標的遺伝子の発現の阻害を結果としてもたらしうる。本発明のｉＲＮＡ分子を含む１または複数の組成物を鞘翅目有害生物の宿主に施すことにより、鞘翅目有害生物が存在する任意の宿主組織または環境において、鞘翅目有害生物による植物体もしくは植物細胞の摂取、または植物体もしくは植物細胞に対する虫害を制限するかまたは消失させることができる。
【００９５】
本明細書で開示される組成物および方法を、鞘翅目有害生物による虫害を防除するための他の方法および組成物と組み合わせて併せて用いることができる。例えば、植物を鞘翅目有害生物から保護するための、本明細書で説明されるｉＲＮＡ分子は、１または複数の、鞘翅目有害生物に対して効果的な化学的薬剤、鞘翅目有害生物に対して効果的なバイオ殺虫剤、輪作、または本発明のＲＮＡｉを介する方法およびＲＮＡｉ組成物の特色とは異なる特色を呈示する組換え遺伝子法（例えば、植物における、鞘翅目有害生物に有害なタンパク質（例えば、Ｂｔトキシン）の組換え生成）の使用をさらに含む方法において用いることができる。
【００９６】
ＩＩ．略記法
ｄｓＲＮＡ          二本鎖リボ核酸
ＧＩ                成長阻害
ＮＣＢＩ            Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｇＤＮＡ            ゲノムＤＮＡ
ｉＲＮＡ            阻害的リボ核酸
ＯＲＦ              オープンリーディングフレーム
ＲＮＡｉ            リボ核酸干渉
ｍｉＲＮＡ          阻害性マイクロリボ核酸
ｓｉＲＮＡ          低分子阻害性リボ核酸
ｈｐＲＮＡ          ヘアピンリボ核酸
ＵＴＲ              非翻訳領域
ＷＣＲ            セイヨウトウモロコシ根虫（western corn rootworm（Diabrotica virgifera virgifera LeConte））
ＮＣＲ            ノーザンコーンルートワーム（northern corn rootworm（Diabrotica barberi Smith and Lawrence））
ＭＣＲ            メキシカンコーンルートワーム（Mexican corn rootworm（Diabrotica virgifera zeae Krysan and Smith））
ＰＣＲ              ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＩＳＣ            ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体
ＳＣＲ          サザンコーンルートワーム（southern corn rootworm（Diabrotica undecimpunctata howardi Barber））
【００９７】
ＩＩＩ．用語
後続する記載および表では、多数の用語を用いる。このような用語により与えられる範囲を含め、本明細書および特許請求の範囲の明確で一貫した理解をもたらすために、以下の定義が提供される。
【００９８】
鞘翅目有害生物：本明細書で用いられる「鞘翅目有害生物」という用語は、ディアブロティカ（Diabrotica）属の害虫であって、トウモロコシおよび他のイネ科の植物を常食とする害虫を指す。具体例では、鞘翅目有害生物が、セイヨウトウモロコシ根虫（D. v. virgifera LeConte）（ＷＣＲ）；ノーザンコーンルートワーム（D. barberi Smith and Lawrence）（ＮＣＲ）；サザンコーンルートワーム（D. u. howardi）（ＳＣＲ）；メキシカンコーンルートワーム（D. v. zeae）（ＭＣＲ）；Ｄ．バルテアータ（D. balteata LeConte）；Ｄ．ｕ．テネラ（D. u. tenella）；およびジュウイチホシウリハムシ（D. u. undecimpunctata Mannerheim）を含むリストから選択される。
【００９９】
接触（生物との）：核酸分子に関して本明細書で用いられる、生物（例えば、鞘翅目有害生物）「との接触」または生物（例えば、鞘翅目有害生物）「による取込み」という用語は、核酸分子の生物への内部化を包含し、例えば、かつ、限定せずに述べると、これには、生物による分子の摂取（例えば、摂食を介する）；生物を、核酸分子を含む組成物と接触させること；および、生物を、核酸分子を含む溶液により浸漬することが含まれる。
【０１００】
コンティグ：本明細書で用いられる「コンティグ」という用語は、単一の遺伝子供給源に由来する、重複するＤＮＡセグメントのセットから再構築されたＤＮＡ配列を指す。
【０１０１】
トウモロコシ植物体：本明細書で用いられる「トウモロコシ植物体」という用語は、種であるトウモロコシ（Zea mays（maize））の植物体を指す。
【０１０２】
発現：本明細書で用いられる、コード配列（例えば、遺伝子またはトランス遺伝子）の「発現」とは、核酸転写単位のコードされる情報（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含めた）が、タンパク質の合成を包含することが多い、細胞の作動的部分、非作動的部分、または構造的部分へと転換される過程を指す。遺伝子発現は、外部シグナル、例えば、細胞、組織、または生物の、遺伝子発現を増大または減少させる作用物質への曝露の影響を受ける場合がある。遺伝子の発現はまた、ＤＮＡ→ＲＮＡ→タンパク質の経路のいずれの地点においても調節されうる。遺伝子発現の調節は、例えば、転写、翻訳、ＲＮＡの輸送およびプロセシング、ｍＲＮＡなどの中間的分子の分解、または、それらが作製された後における特異的なタンパク質分子の活性化、不活化、局在化、もしくは分解に作用する制御を介して生じる場合もあり、これらの組合せを介して生じる場合もある。遺伝子発現は、限定せずに述べると、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、もしくはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるタンパク質活性アッセイ（複数可）が含まれる、当技術分野で知られる任意の方法により、ＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで測定することができる。
【０１０３】
遺伝物質：本明細書で用いられる「遺伝物質」という用語は、全ての遺伝子、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸分子を包含する。
【０１０４】
阻害：コード配列（例えば、遺伝子）に対する効果について記載するのに用いる場合に本明細書で用いられる「阻害」という用語は、コード配列から転写されるｍＲＮＡおよび／またはコード配列のペプチド産物、ポリペプチド産物、もしくはタンパク質産物の細胞内レベルの測定可能な低下を指す。一部の例では、発現をほぼ消失させるように、コード配列の発現を阻害することができる。「特異的な阻害」とは、特異的な阻害が達成される細胞における他のコード配列（例えば、遺伝子）の発現に結果的に影響を及ぼすことのない、標的コード配列の阻害を指す。
【０１０５】
単離された：「単離された」生物学的成分（核酸またはタンパク質などの）は、この成分が自然発生する（naturally occurs）生物の細胞における他の生物学的成分、すなわち、他の染色体内ＤＮＡおよび染色体内ＲＮＡならびに染色体外ＤＮＡおよび染色体外ＲＮＡならびにタンパク質から実質的に分離されているか、これらとは別に生成しているか、またはこれらとは隔絶して精製されている。「単離された」核酸分子およびタンパク質は、標準的な精製法を介して精製される核酸分子およびタンパク質を包含する。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現を介して調製される核酸およびタンパク質のほか、化学合成される核酸分子、タンパク質、およびペプチドも包含する。
【０１０６】
核酸分子：本明細書で用いられる「核酸分子」という用語は、ヌクレオチドのポリマー形態を指す場合があり、これは、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方、ならびに上記の合成形態および混合ポリマーを包含しうる。ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態を指す場合がある。本明細書で用いられる「核酸分子」は、「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義である。別段に指定しない限り、核酸分子は、通常少なくとも１０塩基の長さである。核酸分子のヌクレオチド配列は、慣例により、分子の５’端から３’端へと読み取られる。ヌクレオチド配列の「相補体」とは、ヌクレオチド配列のヌクレオ塩基による塩基対（すなわち、Ａ−Ｔ／Ｕ、およびＧ−Ｃ）を形成する、ヌクレオ塩基の５’側から３’側への配列を指す。核酸配列の「逆相補体」とは、ヌクレオチド配列のヌクレオ塩基による塩基対を形成する、ヌクレオ塩基の３’側から５’側への配列を指す。
【０１０７】
「核酸分子」は、ＤＮＡの一本鎖形態および二本鎖形態；ＲＮＡの一本鎖形態；ならびにＲＮＡの二本鎖形態（ｄｓＲＮＡ）を包含する。「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」という用語は、個別の一本鎖または二重鎖としての核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を指す。「リボ核酸」（ＲＮＡ）という用語は、ｉＲＮＡ（阻害的ＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｈｐＲＮＡ（ヘアピンＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）（対応するアシル化アミノ酸により帯電している場合であれ、帯電していない場合であれ）、およびｃＲＮＡ（相補的ＲＮＡ）を包含する。「デオキシリボ核酸」（ＤＮＡ）という用語は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド体を包含する。「核酸セグメント」および「ヌクレオチド配列セグメント」、またはより一般に「セグメント」という用語は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードしたかまたはコードするように適合させうる、ゲノム配列、リボソームＲＮＡ配列、転移ＲＮＡ配列、メッセンジャーＲＮＡ配列、オペロン配列、および操作された低分子ヌクレオチド配列の全てを包含する機能的な用語として当業者により理解されるであろう。
【０１０８】
オリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチドとは、短鎖の核酸ポリマーである。オリゴヌクレオチドは、より長い核酸セグメントを切断することにより形成することもでき、個別のヌクレオチド前駆体を重合化することにより形成することもできる。自動式合成器は、数百塩基対の長さまでのオリゴヌクレオチドの合成を可能とする。オリゴヌクレオチドは、相補的なヌクレオチド配列に結合しうるため、ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのプローブとして用いることができる。ＤＮＡからなるオリゴヌクレオチド（オリゴデオキシリボヌクレオチド）は、ＤＮＡ配列およびＲＮＡ（ｃＤＮＡへと逆転写される）配列を増幅するための技法であるＰＣＲにおいて用いることができる。ＰＣＲでは、オリゴヌクレオチドを典型的に「プライマー」と称し、ＤＮＡポリメラーゼにオリゴヌクレオチドを伸長させ、相補鎖を複製させる。
【０１０９】
核酸分子は、天然ヌクレオチド結合および／または非天然ヌクレオチド結合を介して併せて連結された、天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドの一方または両方を包含しうる。核酸分子は、化学的または生化学的に修飾される場合もあり、当業者に容易に理解される通り、非天然ヌクレオチド塩基または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有する場合もある。例えば、このような修飾には、標識、メチル化、天然ヌクレオチドのうちの１または複数の類似体による置換、ヌクレオチド間修飾（例えば、非帯電結合：例えば、リン酸メチル結合、ホスホトリエステル結合、ホスホロアミデート結合、カルバメート結合など；帯電結合：例えば、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合など；懸垂部分：例えば、ペプチド；挿入剤：例えば、アクリジン、ソラーレンなど；キレート化剤；アルキル化剤；および修飾された結合：例えば、αアノマー核酸など）が含まれる。「核酸分子」という用語はまた、一本鎖立体構成、二本鎖立体構成、部分的二重鎖立体構成、三重鎖立体構成、ヘアピン状立体構成、環状立体構成、およびパッドロック状立体構成を含めた任意の位相的立体構成も包含する。
【０１１０】
ＤＮＡに関して本明細書で用いられる「コード配列」、「構造的ヌクレオチド配列」、または「構造的核酸分子」という用語は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、転写およびｍＲＮＡを介して、ポリペプチドへと最終的に翻訳されるヌクレオチド配列を指す。ＲＮＡに関する「コード配列」という用語は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へと翻訳されるヌクレオチド配列を指す。コード配列の境界は、５’末端における翻訳開始コドンおよび３’末端における翻訳停止コドンにより決定される。コード配列には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＥＳＴ、および組換えヌクレオチド配列が含まれるがこれらに限定されない。
【０１１１】
ゲノム：本明細書で用いられる「ゲノム」という用語は、細胞の核内で見出される染色体ＤＮＡを指し、また、細胞の細胞内成分中に見出される細胞小器官ＤＮＡも指す。本発明の一部の実施形態では、ＤＮＡ分子が植物細胞のゲノム内に組み込まれるように、ＤＮＡ分子を植物細胞に導入することができる。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、ＤＮＡ分子を、植物細胞の核ＤＮＡへと組み込むこともでき、植物細胞の葉緑体ＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡへと組み込むこともできる。細菌に適用される場合の「ゲノム」という用語は、細菌細胞内の染色体およびプラスミドの両方を指す。本発明の一部の実施形態では、ＤＮＡ分子が細菌のゲノム内に組み込まれるように、ＤＮＡ分子を細菌に導入することができる。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、ＤＮＡ分子が、染色体に組み込まれる場合もあり、安定的プラスミドとして配置される場合もあり、安定的プラスミド内に配置される場合もある。
【０１１２】
配列同一性：２つの核酸配列またはポリペプチド配列の文脈において本明細書で用いられる「配列同一性」または「同一性」という用語は、指定された比較域にわたる対応が最大となるようにアラインした場合に同じである２つの配列における残基を指す。
【０１１３】
本明細書で用いられる「配列同一性の百分率」という用語は、比較域にわたり最適にアラインされた２つの配列（例えば、核酸配列）を比較することにより決定された値を指す場合があり、比較域内の配列の一部は、２つの配列の最適のアライメントのための基準配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる。同一なヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両方の配列において生じる位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較域内の位置の総数で除し、結果に１００を乗じ、配列同一性の百分率を得ることにより、百分率を計算する。基準配列と比較して全ての位置において同一な配列を、基準配列と１００％同一であるといい、この逆もまた成り立つ。
【０１１４】
当技術分野では、配列を比較のためにアラインする方法がよく知られている。例えば、SmithおよびWaterman（1981）、Adv. Appl. Math. 2: 482；NeedlemanおよびWunsch（1970）、J. Mol. Biol. 48: 443；PearsonおよびLipman（1988）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444；HigginsおよびSharp（1988）、Gene 73: 237〜44；HigginsおよびSharp（1989）、CABIOS 5: 151〜3；Corpetら（1988）、Nucleic Acids Res. 16: 10881〜90；Huangら（1992）、Comp. Appl. Biosci. 8: 155〜65；Pearsonら（1994）、Methods Mol. Biol. 24: 307〜31；Tatianaら（1999）、FEMS Microbiol. Lett. 174: 247〜50において、多様なプログラムおよびアライメントアルゴリズムが記載されている。配列アライメント法および相同性の計算についての詳細な検討は、例えば、Altschulら（1990）、J. Mol. Biol. 215: 403〜10において見出すことができる。
【０１１５】
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）によるＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標）；Altschulら（1990））は、いくつかの配列解析プログラムとの関連で用いるために、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）およびインターネット上を含めたいくつかの供給源から入手可能である。このプログラムを用いてどのようにして配列同一性を決定するかについての説明は、インターネット上のＢＬＡＳＴ（商標）についての「ヘルプ」セクション下で入手可能である。核酸配列を比較するためには、デフォルトのパラメータに設定されたデフォルトのＢＬＯＳＵＭ６２行列を用いて、ＢＬＡＳＴ（商標）（ＢＬＡＳＴｎ）プログラムの「ＢＬＡＳＴ２配列」関数を使用することができる。この方法を介して評価する場合、基準配列に対する類似性がさらに大きな核酸配列は、同一性百分率の増大を示す。
【０１１６】
特異的にハイブリダイズ可能な／特異的に相補的な：本明細書で用いられる「特異的にハイブリダイズ可能な」および「特異的に相補的な」という用語は、核酸分子と標的核酸分子との間で安定的で特異的な結合が生じるように、十分な程度の相補性を示す用語である。２つの核酸分子間におけるハイブリダイゼーションは、２つの核酸分子の核酸配列間におけるアンチパラレルアライメントの形成を伴う。次いで、２つの分子は、向かい合う鎖における対応する塩基と水素結合を形成して、十分に安定であれば当技術分野でよく知られる方法を用いて検出可能な二重鎖分子を形成することが可能である。核酸分子は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的配列と１００％相補的である必要はない。しかし、ハイブリダイゼーションが特異的であるために存在しなければならない配列相補性の大きさは、用いられるハイブリダイゼーション条件の関数である。
【０１１７】
結果として特定の程度の厳密性をもたらすハイブリダイゼーション条件は、選択したハイブリダイゼーション法の性質ならびにハイブリダイズさせる核酸配列の組成および長さに応じて変化する。洗浄回数および洗浄緩衝液の組成もまた厳密性に影響を及ぼすが、一般に、ハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（とりわけＮａ＋濃度および／またはＭｇ＋＋濃度）が、ハイブリダイゼーションの厳密性を決定する。当業者には、特定の程度の厳密性を達成するのに要請されるハイブリダイゼーション条件に関する計算が知られており、例えば、Sambrookら（編）、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、2版、1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989、9および11章；ならびにHamesおよびHiggins（編）、Nucleic Acid Hybridization、IRL Press、Oxford、1985において論じられている。核酸ハイブリダイゼーションに関するさらに詳細な指示および指針は、例えば、Tijssen、「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays」、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization  with Nucleic Acid Probes、I部、2章、Elsevier、NY、1993；およびAusubelら編、Current Protocols in Molecular Biology、2章、Greene Publishing and Wiley-Interscience、NY、1995において見出すことができる。
【０１１８】
本明細書で用いられる「厳密な条件」は、ハイブリダイゼーション分子と標的核酸分子内の相同な配列との間のミスマッチが２０％未満である場合に限りハイブリダイゼーションが生じる条件を包含する。「厳密な条件」は、さらなる特定のレベルの厳密性も包含する。したがって、本明細書で用いられる「中程度の厳密性」条件とは、配列のミスマッチが２０％を超える分子はハイブリダイズしない条件であり；「高度な厳密性」の条件とは、ミスマッチが１０％を超える配列はハイブリダイズしない条件であり；「極めて高度な厳密性」の条件とは、ミスマッチが５％を超える配列はハイブリダイズしない条件である。
【０１１９】
以下は、代表的で、非限定的なハイブリダイゼーション条件である。
【０１２０】
高度な厳密性の条件（少なくとも９０％の配列同一性を共有する配列を検出する）：５×のＳＳＣ緩衝液中６５℃で１６時間にわたるハイブリダイゼーション；２×のＳＳＣ緩衝液中室温で１５分間ずつ２回にわたる洗浄；０．５×のＳＳＣ緩衝液中６５℃で２０分間ずつ２回にわたる洗浄。
【０１２１】
中程度の厳密性の条件（少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列を検出する）：５×〜６×のＳＳＣ緩衝液中６５〜７０℃で１６〜２０時間にわたるハイブリダイゼーション；２×のＳＳＣ緩衝液中室温で５〜２０分間ずつ２回にわたる洗浄；１×のＳＳＣ緩衝液中５５〜７０℃で３０分間ずつ２回にわたる洗浄。
【０１２２】
厳密でない制御条件（少なくとも５０％の配列同一性を共有する配列がハイブリダイズする）：６×のＳＳＣ緩衝液中室温〜５５℃で１６〜２０時間にわたるハイブリダイゼーション；２×〜３×のＳＳＣ緩衝液中室温〜５５℃で２０〜３０分間ずつ少なくとも２回にわたる洗浄。
【０１２３】
連続核酸配列に関して本明細書で用いられる「実質的に相同な」または「実質的な相同性」という用語は、厳密な条件下で基準核酸配列とハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を指す。例えば、配列番号１〜６のうちのいずれかの基準核酸配列と実質的に相同な核酸配列とは、厳密な条件（例えば、前出で示した中程度の厳密性の条件）下で、配列番号１〜６のうちのいずれかの基準核酸配列とハイブリダイズする核酸配列である。実質的に相同な配列は、少なくとも８０％の配列同一性を有しうる。例えば、実質的に相同な配列は、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％  約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％；および約１００％など、約８０％〜１００％の配列同一性を有しうる。実質的な相同性の特性は、特異的なハイブリダイゼーションと密接に関連する。例えば、特異的結合が所望される条件下で、例えば、厳密なハイブリダイゼーション条件下で核酸の非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が認められる場合、核酸分子は特異的にハイブリダイズ可能である。
【０１２４】
本明細書で用いられる「オルソログ」という用語は、一般的なヌクレオチドの祖先配列から生じ、２つ以上の種において同じ機能を保持しうる、２つ以上の種における遺伝子を指す。
【０１２５】
５’→３’方向で読み取られる配列の全てのヌクレオチドが、３’→５’方向で読み取られる場合の他の配列の全てのヌクレオチドと相補的である場合、本明細書で用いられる２つの核酸配列による分子は、「完全な相補性」を呈示するという。基準ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列は、基準ヌクレオチド配列の逆相補体配列と同一な配列を呈示する。当技術分野では、これらの用語および説明が十分に定義されており、当業者により容易に理解される。
【０１２６】
作動可能に連結された：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係にある場合、第１のヌクレオチド配列は、第２の核酸配列と作動可能に連結されている。組換えにより生成させる場合、作動可能に連結した核酸配列は一般に連続であり、２つのタンパク質コード領域を接合することが必要な場合は、同じリーディングフレームにおいて（例えば、ポリシストロニックのＯＲＦにおいて）連続である。しかし、作動可能に連結するのに、核酸が連続である必要はない。
【０１２７】
制御配列およびコード配列に言及して用いられる場合の「作動可能に連結された」という用語は、調節配列が、連結されたコード配列の発現に影響を及ぼすことを意味する。「調節配列」または「制御エレメント」とは、転写のタイミングおよびレベル／量、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、エンハンサー、ステムループ構造、リプレッサー結合配列、終結配列、ポリアデニル化認識配列などを包含しうる。特定の調節配列は、それと作動可能に連結されたコード配列の上流および／または下流に配置することができる。また、コード配列に作動可能に連結された特定の調節配列は、二本鎖核酸分子の関連する相補鎖に配置することもできる。
【０１２８】
プロモーター：本明細書で用いられる「プロモーター」という用語は、転写の開始点から上流に位置することが可能であり、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与しうるＤＮＡの領域を指す。プロモーターは、細胞において発現させるためのコード配列に作動可能に連結することもでき、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結し、これを、細胞において発現させるためのコード配列に作動可能に連結することもできる。「植物プロモーター」とは、植物細胞における転写を誘発することが可能なプロモーターでありうる。発生制御（developmental control）下にあるプロモーターの例には、葉、根、種子、線維、木部導管、仮道管、または厚膜組織など、特定の組織における転写を優先的に誘発するプロモーターが含まれる。このようなプロモーターは、「組織に好ましい」と言われる。特定の組織だけにおける転写を誘発するプロモーターは、「組織特異的」と言われる。「細胞型特異的」プロモーターは、主に、１または複数の器官の特定の細胞型、例えば、根または葉の維管束細胞における発現を駆動する。「誘導的」プロモーターは、環境制御下にありうるプロモーターの場合がある。誘導的プロモーターを介する転写を誘発しうる環境条件の例には、嫌気的条件および光の存在が含まれる。組織特異的プロモーター、組織に好ましいプロモーター、細胞型特異的プロモーター、および誘導的プロモーターは、「非構成的」プロモーターのクラスを構成する。「構成的」プロモーターとは、大半の環境条件の下で、または大半の細胞型もしくは組織型において活性でありうるプロモーターである。
【０１２９】
本発明の一部の実施形態では、任意の誘導的プロモーターを用いることができる。Wardら（1993）、Plant Mol. Biol. 22: 361〜366を参照されたい。誘導的プロモーターにより、誘導作用物質に応答する転写速度を増大させる。例示的な誘導的プロモーターには、銅に応答するＡＣＥＩ系に由来するプロモーター；ベンゼンスルホンアミド系除草剤用解毒剤に応答するトウモロコシに由来するＩｎ２遺伝子；Ｔｎ１０に由来するＴｅｔリプレッサー；およびその転写活性がグルココルチコステロイドホルモンにより誘導されうるステロイドホルモン遺伝子に由来する誘導的プロモーターが含まれるがこれらに限定されない（Schenaら（1991）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 0421）。
【０１３０】
例示的な構成的プロモーターには、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）に由来する３５Ｓプロモーターなどの植物ウイルスに由来するプロモーター；コメアクチン遺伝子に由来するプロモーター；ユビキチンプロモーター；ｐＥＭＵ；ＭＡＳ；トウモロコシＨ３ヒストンプロモーター；およびセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＬＳ３構造遺伝子に対して５’側のＸｂａ１／ＮｃｏＩ断片（または前記のＸｂａ１／ＮｃｏＩ断片に対するヌクレオチド配列の類似性）であるＡＬＳプロモーターが含まれるがこれらに限定されない（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／３０５３０号）。
【０１３１】
加えて、本発明の一部の実施形態では、任意の組織特異的プロモーターまたは組織に好ましいプロモーターも利用することができる。組織特異的プロモーターに作動可能に連結されたコード配列を含む核酸分子で形質転換された植物体は、もっぱらまたは優先的に特異的な組織においてコード配列の産物を生成させるができる。例示的な組織特異的プロモーターまたは組織に好ましいプロモーターには、ファゼオリン遺伝子に由来するプロモーターなど、根に好ましいプロモーター；ｃａｂまたはルビスコに由来するプロモーターなど、葉特異的プロモーターおよび光誘導プロモーター；ＬＡＴ５２に由来するプロモーターなど、葯特異的プロモーター；Ｚｍ１３に由来するプロモーターなど、花粉特異的プロモーター；およびａｐｇに由来するプロモーターなど、小胞子に好ましいプロモーターが含まれるがこれらに限定されない。
【０１３２】
形質転換：本明細書で用いられる「形質転換」または「形質導入」という用語は、１または複数の核酸分子の細胞への導入を指す。核酸分子が、核酸分子の細胞内ゲノムへの組込みを介して、またはエピソームの複製を介して、細胞により安定的に複製されている場合、細胞は、細胞へと形質導入された核酸分子により「形質転換されている」。本明細書で用いられる「形質転換」という用語は、核酸分子をこのような細胞へと導入しうる全ての技法を包含する。例にはウイルスベクターによるトランスフェクション；プラスミドベクターによる形質転換；電気穿孔（Frommら（1986）、Nature 319: 791〜3）；リポフェクション（Felgnerら（1987）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、84: 7413〜7）；マイクロインジェクション（Muellerら（1978）、Cell 15: 579〜85）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）属を介する導入（Fraleyら（1983）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA80: 4803〜7）；直接的なＤＮＡの取込み；およびパーティクルガン（Kleinら（1987）、Nature 327: 70）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１３３】
トランス遺伝子：外因性の核酸配列である。一部の例では、トランス遺伝子が、鞘翅目有害生物において見出される核酸分子と相補的なヌクレオチド配列を含むｄｓＲＮＡ分子の一方または両方の鎖をコードする配列でありうる。さらなる例では、トランス遺伝子がアンチセンスの核酸配列の場合があり、アンチセンスの核酸配列の発現が、標的核酸配列の発現を阻害する。なおさらなる例では、トランス遺伝子が、遺伝子配列（例えば、除草剤抵抗性遺伝子）の場合もあり、工業的または薬学的に有用な化合物をコードする遺伝子の場合もあり、所望の農業形質をコードする遺伝子の場合もある。これらの例および他の例では、トランス遺伝子が、トランス遺伝子のコード配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーター）を含有しうる。
【０１３４】
ベクター：例えば、形質転換された細胞を生成させるために細胞へと導入される核酸分子である。ベクターは、複製起点など、それが宿主細胞においてを複製することを可能とする核酸配列を包含する。ベクターの例には、外因性ＤＮＡを細胞へと送入するプラスミド；コスミド；バクテリオファージ；またはウイルスが含まれるがこれらに限定されない。ベクターはまた、１もしくは複数の遺伝子、アンチセンス配列、および／または選択マーカー遺伝子、ならびに当技術分野で知られている他の遺伝子エレメントも包含する。ベクターは、細胞に形質導入する場合もあり、細胞を形質転換する場合もあり、細胞に感染させる場合もあり、これにより、ベクターがコードする核酸分子および／またはタンパク質を細胞に発現させる。場合によって、ベクターは、核酸分子の細胞への導入を達成する一助となる物質（例えば、リポソーム、タンパク質コーティングなど）も包含する。
【０１３５】
収率：同時に、かつ、同じ条件の下で栽培する同じ栽培地において、基準品種の収率と比べて約１００％以上で安定化している収率である。具体的な実施形態では、「収率の改善」または「収率を改善する」とは、同時に、かつ、同じ条件の下で栽培する穀物に対して有害な、著明な密度の鞘翅目有害生物を含有する同じ栽培地における基準品種の収率と比べて１０５％〜１１５％以上で収率を安定化させた栽培品種を意味する。
【０１３６】
特別に示されるかまたは示唆されない限り、「ある（a）」、「ある（an）」、および「その」という用語は、本明細書で用いられる「少なくとも１つの」を意味する。
【０１３７】
別段に特別に説明されない限り、本明細書で用いられる全ての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。分子生物学における一般的な用語の定義は、例えば、Lewin B.、Genes V、Oxford University Press、1994（ISBN 0-19-854287-9）；Kendrewら（編）、The Encyclopedia of Molecular Biology、Blackwell Science Ltd.、1994（ISBN 0-632-02182-9）；およびMeyers R.A.（編）、Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers, Inc.、1995（ISBN 1-56081-569-8）において見出される。別段に言及しない限り、全ての百分率は重量により、全ての溶媒の混合物の比率は容量による。全ての温度は、摂氏度による。
【０１３８】
ＩＶ．鞘翅目有害生物の配列を含む核酸分子
Ａ．概観
本明細書では、鞘翅目有害生物の防除に有用な核酸分子が記載される。記載される核酸分子には、標的配列（例えば、天然遺伝子および非コード配列）、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｐＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡが含まれる。例えば、一部の実施形態では、鞘翅目有害生物における１または複数の天然の核酸配列の全部または一部と特異的に相補的でありうるｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／またはｈｐＲＮＡ分子が記載される。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、天然の核酸配列（複数可）が、１または複数の標的遺伝子であることが可能であり、例えば、かつ、限定せずに述べると、その産物は、代謝過程に関与する場合もあり、生殖過程に関与する場合もあり、幼虫の発育に関与する場合もある。本明細書で説明される核酸分子は、この核酸分子が特異的に相補的である少なくとも１つの天然の核酸配列を含む細胞に導入されると、細胞においてＲＮＡｉを誘発し、結果的に天然の核酸配列（複数可）の発現を低減する場合もあり、これを消失させる場合もある。一部の例では、それと特異的に相補的な配列を含む核酸分子による標的遺伝子の発現の低減または消失は、鞘翅目有害生物において致死性の場合もあり、成長および／または生殖の減殺を結果としてもたらす場合もある。
【０１３９】
一部の実施形態では、鞘翅目有害生物における少なくとも１つの標的遺伝子であって、Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ４７１８５＿Ｃａｆ１１８０（配列番号１）；Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ１２２９＿ＶａｔｐａｓｅＣ（配列番号２）；Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ１３１９＿ＶａｔｐａｓｅＨ（配列番号３）；およびＣｏｎｔｉｇ＿０１＿Ｒｈｏ１＿１−１９１＿ＣＤＣ４２（配列番号４）を含むリストから選択されるヌクレオチド配列を含む標的遺伝子を選択することができる。特定の例では、鞘翅目有害生物における標的遺伝子であって、液胞ＡＴＰアーゼのＣサブユニットをコードし、配列番号２を含む、標的遺伝子が選択される。
【０１４０】
一部の実施形態では、標的遺伝子は、Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ４７１８５＿Ｃａｆ１１８０（配列番号１）；Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ１２２９＿ＶａｔｐａｓｅＣ（配列番号２）；Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ１３１９＿ＶａｔｐａｓｅＨ（配列番号３）；およびＣｏｎｔｉｇ＿０１＿Ｒｈｏ１＿１−１９１＿ＣＤＣ４２（配列番号４）のうちの１つによるタンパク質産物のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一な（例えば、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、または１００％同一な）連続アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子でありうる。標的遺伝子は、鞘翅目有害生物における任意の核酸配列であって、その転写後阻害が、鞘翅目有害生物に対して有害効果を及ぼすか、または鞘翅目有害生物からの保護利益を植物にもたらす核酸配列でありうる。具体例では、標的遺伝子が、配列番号２のタンパク質産物のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるか、約９０％同一であるか、約９５％同一であるか、約９６％同一であるか、約９７％同一であるか、約９８％同一であるか、約９９％同一であるか、約１００％同一であるか、または１００％同一な連続アミノ酸配列を含む液胞ＡＴＰアーゼのＣサブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子である。
【０１４１】
本発明により、その発現が、鞘翅目有害生物におけるコード配列によりコードされる天然のＲＮＡ分子の全部または一部と特異的に相補的なヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子を結果としてもたらすヌクレオチド配列が提供される。一部の実施形態では、発現させたＲＮＡ分子を鞘翅目有害生物に摂取させた後、鞘翅目有害生物の細胞におけるコード配列を下方制御することができる。具体的な実施形態では、鞘翅目有害生物の細胞におけるコード配列の下方制御は、鞘翅目有害生物の成長、生存能力、増殖、および／または生殖に対する有害効果を結果としてもたらしうる。
【０１４２】
一部の実施形態では、標的配列は、５’ＵＴＲなど、転写された非コードＲＮＡ配列；３’ＵＴＲ；スプライシングされたリーダー配列；イントロン配列；アウトロン配列（例えば、トランススプライシングにおいてその後修飾される５’ＵＴＲ  ＲＮＡ）；ドナトロン配列（例えば、トランススプライシングのためのドナー配列を提供するのに要請される非コードＲＮＡ）；および標的鞘翅目有害生物遺伝子の他の転写された非コードＲＮＡを包含する。このような配列は、モノシストロニック遺伝子およびポリシストロニック遺伝子のいずれにも由来しうる。
【０１４３】
したがって、本明細書ではまた、一部の実施形態との関連で、鞘翅目有害生物における標的配列の全部または一部と特異的に相補的な少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｈｐＲＮＡ）も説明される。一部の実施形態では、ｉＲＮＡ分子は、複数の標的配列の全部または一部、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の標的配列と相補的なヌクレオチド配列（複数可）を含みうる。具体的な実施形態では、ｉＲＮＡ分子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて生成させることもでき、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて植物または細菌などの遺伝子改変生物によって生成させることもできる。また、鞘翅目有害生物における標的配列の全部または一部と特異的に相補的なｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、および／またはｈｐＲＮＡ分子を生成させるのに用いられうるｃＤＮＡ配列も開示される。特定の宿主標的の安定的形質転換を達成するのに用いられる組換えＤＮＡ構築物もさらに記載される。形質転換された宿主標的は、組換えＤＮＡ構築物から有効レベルのｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、および／またはｈｐＲＮＡ分子を発現させうる。したがってまた、植物細胞において機能的な異種プロモーターに作動可能に連結された少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む植物体の形質転換ベクターであって、ヌクレオチド配列（複数可）の発現が、鞘翅目有害生物における標的配列の全部または一部と特異的に相補的なヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子を結果としてもたらすベクターも記載される。
【０１４４】
一部の実施形態では、鞘翅目有害生物の防除に有用な核酸分子には、ディアブロティカ（Diabrotica）属から単離される天然の核酸配列であるＤ＿ｖｉｒ＿ｃ１２２９＿ＶａｔｐａｓｅＣ（配列番号２）；発現させると、Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ１２２９＿ＶａｔｐａｓｅＣ（配列番号２）によりコードされる天然のＲＮＡ分子と特異的に相補的なヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子を結果としてもたらすヌクレオチド配列；Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ１２２９＿ＶａｔｐａｓｅＣ（配列番号２）と特異的に相補的な少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｈｐＲＮＡ）；Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ１２２９＿ＶａｔｐａｓｅＣ（配列番号２）と特異的に相補的なｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、および／またはｈｐＲＮＡ分子を生成させるのに用いられうるｃＤＮＡ配列；ならびに特定の宿主標的の安定的形質転換を達成するのに用いられる組換えＤＮＡ構築物であって、形質転換された宿主標的が前出の核酸分子のうちの１または複数を含む組換えＤＮＡ構築物が含まれうる。
【０１４５】
これらの実施形態およびさらなる実施形態では、鞘翅目有害生物を防除するのに有用な核酸分子に、配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属の液胞ＡＴＰアーゼのＣサブユニットの断片；発現させると、配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、天然のディアブロティカ（Diabrotica）属のＲＮＡ分子と特異的に相補的なヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子を結果としてもたらすヌクレオチド配列；配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部と特異的に相補的な少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｈｐＲＮＡ）；配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部と特異的に相補的なｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、および／またはｈｐＲＮＡ分子を生成させるのに用いられうるｃＤＮＡ配列；ならびに特定の宿主標的の安定的形質転換を達成するのに用いられる組換えＤＮＡ構築物であって、形質転換された宿主標的が前出の核酸分子のうちの１または複数を含む組換えＤＮＡ構築物が含まれうる。
【０１４６】
これらの実施形態およびさらなる実施形態では、鞘翅目有害生物の防除に有用なさらなる核酸分子には、Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ４７１８５＿Ｃａｆｌ１８０（配列番号１）；Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ１３１９＿ＶａｔｐａｓｅＨ（液胞ＡＴＰアーゼのＨサブユニット）（配列番号３）；およびＣｏｎｔｉｇ＿０１＿Ｒｈｏ１＿１−１９１＿ＣＤＣ４２（Ｒｈｏ１低分子ＧＴＰ結合タンパク質）（配列番号４）；発現させると、Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ４７１８５＿Ｃａｆｌ１８０（配列番号１）によりコードされる天然のＲＮＡ分子と特異的に相補的なヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子を結果としてもたらすヌクレオチド配列；Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ１３１９＿ＶａｔｐａｓｅＨ（配列番号３）；またはＣｏｎｔｉｇ＿０１＿Ｒｈｏ１＿１−１９１＿ＣＤＣ４２（配列番号４）；Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ４７１８５＿Ｃａｆｌ１８０（配列番号１）と特異的に相補的な少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｈｐＲＮＡ）；Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ１３１９＿ＶａｔｐａｓｅＨ（配列番号３）；またはＣｏｎｔｉｇ＿０１＿Ｒｈｏ１＿１−１９１＿ＣＤＣ４２（配列番号４）；Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ４７１８５＿Ｃａｆｌ１８０（配列番号１）と特異的に相補的なｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、および／もしくはｈｐＲＮＡ分子を生成させるのに用いられうるｃＤＮＡ配列；Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ１３１９＿ＶａｔｐａｓｅＨ（配列番号３）；またはＣｏｎｔｉｇ＿０１＿Ｒｈｏ１＿１−１９１＿ＣＤＣ４２（配列番号４）；ならびに特定の宿主標的の安定的形質転換を達成するのに用いられる組換えＤＮＡ構築物であって、形質転換された宿主標的が前出の核酸分子のうちの１もしくは複数を含む組換えＤＮＡ構築物が含まれうる。
【０１４７】
Ｂ．核酸分子
本発明はとりわけ、鞘翅目有害生物の細胞、組織、または器官における標的遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｈｐＲＮＡ）分子；および細胞または微生物においてｉＲＮＡ分子として発現して、鞘翅目有害生物の細胞、組織、または器官における標的遺伝子の発現を阻害することが可能なＤＮＡ分子を提供する。
【０１４８】
本発明の一部の実施形態は、配列番号２；配列番号２の相補体；配列番号５；配列番号５の相補体；配列番号６；配列番号６の相補体；配列番号７；配列番号７の相補体；配列番号８；配列番号８の相補体；配列番号１１２；配列番号１１２の相補体；配列番号１１３；配列番号１１３の相補体；配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号２、５〜８、１１２、および／または１１３のうちのいずれかを含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コード配列；配列番号２、５〜８、１１２、および／または１１３のうちのいずれかを含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の相補体；配列番号２、５〜８、１１２、および／または１１３のうちのいずれかを含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列；配列番号２、５〜８、１１２、および／または１１３のうちのいずれかを含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の相補体；配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；ならびに配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択される、少なくとも１つの（例えば、１つ、２つ、３つ以上の）ヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を提供する。具体的な実施形態では、単離核酸配列の、鞘翅目有害生物との接触または鞘翅目有害生物による取込みが、鞘翅目有害生物の成長、発育、生殖、および／または摂食を阻害する。
【０１４９】
一部の実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列番号１の全部または一部；配列番号１の相補体の全部または一部；配列番号３；配列番号３の相補体；配列番号４；配列番号４の相補体；配列番号１、３、または４のうちのいずれかの少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号１、３、または４のうちのいずれかの少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号１、３、または４のうちのいずれかを含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コード配列；配列番号１、３、または４のうちのいずれかを含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の相補体；配列番号１、３、または４のうちのいずれかを含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列；配列番号１、３、または４のうちのいずれかを含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の相補体；配列番号１、３、または４のうちのいずれかを含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号１、３、または４のうちのいずれかを含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号１、３、または４のうちのいずれかを含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；および配列番号１、３、または４のうちのいずれかを含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択される、少なくとも１つの（例えば、１つ、２つ、３つ以上の）ヌクレオチド配列をさらに含みうる。具体的な実施形態では、単離核酸配列の、鞘翅目有害生物との接触または鞘翅目有害生物による取込みが、鞘翅目有害生物の成長、発育、生殖、および／または摂食を阻害する。
【０１５０】
一部の実施形態では、本発明の核酸分子は、細胞または微生物においてｉＲＮＡ分子として発現して、鞘翅目有害生物の細胞、組織、または器官における標的遺伝子の発現を阻害することが可能な、少なくとも１つの（例えば、１つ、２つ、３つ以上の）ＤＮＡ配列を含みうる。このようなＤＮＡ配列（複数可）は、ＤＮＡ分子を含む細胞において、コードされるｄｓＲＮＡ分子（複数可）の転写を誘発または増強するように機能するプロモーター配列に作動可能に連結することができる。一実施形態では、少なくとも１つの（例えば、１つ、２つ、３つ以上の）ＤＮＡ配列が、配列番号２に由来しうる。配列番号２の派生体は、配列番号２の断片を包含する。一部の実施形態では、配列番号２の断片が、例えば、配列番号５および６のうちのいずれかの少なくとも約１９の連続ヌクレオチド、または前出のうちのいずれかの相補体を含みうる。したがって、配列番号２の断片は、例えば、配列番号２の１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０の連続ヌクレオチド、またはそれらの相補体を含むことが可能であり、配列番号５および６のうちのいずれかの全部もしくは一部、またはそれらの相補体を含みうる。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、配列番号２の断片が、例えば、配列番号２の約１９を超える連続ヌクレオチド、またはそれらの相補体を含みうる。したがって、配列番号２の断片は、例えば、配列番号２の１９、２０、２１、約２５（例えば、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、および２９）、約３０、約４０（例えば、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、および４５）、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００以上の連続ヌクレオチド、またはそれらの相補体、ならびに配列番号５および６のいずれかの全部または一部、またはそれらの相補体を含みうる。
【０１５１】
具体的な実施形態では、細胞または微生物においてｉＲＮＡ分子として発現して、鞘翅目有害生物の細胞、組織、または器官における標的遺伝子の発現を阻害することが可能な、少なくとも１つのＤＮＡ配列は、配列番号１、３、または４を含む群から選択されるヌクレオチド配列に由来するＤＮＡ配列（複数可）をさらに含みうる。配列番号１、３、または４を含む群から選択されるヌクレオチド配列の派生体は、配列番号１、３、または４のうちの１または複数の断片を包含する。一部の実施形態では、配列番号１、３、または４のうちの１または複数の断片が、例えば、配列番号１、３、または４のうちのいずれかの少なくとも約１９の連続ヌクレオチド、またはそれらの相補体を含みうる。したがって、配列番号１、３、または４のうちの１または複数の断片は、例えば、配列番号１、３、または４の配列のうちのいずれかの１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の連続ヌクレオチド、またはそれらの相補体を含みうる。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、配列番号１、３、または４のうちの１または複数の断片が、例えば、配列番号１、３、または４のうちのいずれかの約１９を超える連続ヌクレオチド、またはそれらの相補体を含みうる。したがって、配列番号１、３、または４のうちの１または複数の断片は、例えば、配列番号１、３、または４のうちのいずれかの１９、２０、２１、約２５（例えば、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、および２９）、約３０、約４０（例えば、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、および４５）、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００以上の連続ヌクレオチド、またはそれらの相補体を含みうる。
【０１５２】
一部の実施形態は、部分的または完全に安定化させたｄｓＲＮＡ分子を、鞘翅目有害生物へと導入して、鞘翅目有害生物の細胞、組織、または器官における標的遺伝子の発現を阻害することを含む。ｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｈｐＲＮＡ）として発現し、鞘翅目有害生物に取り込まれると、配列番号１〜４のうちのいずれかの１または複数の断片を含む核酸配列は、死滅、成長阻害、性比の変化、同腹子数の低減、感染の停止、および／または鞘翅目有害生物による摂食の停止のうちの１または複数を引き起こしうる。例えば、一部の実施形態では、鞘翅目有害生物の標的遺伝子配列と実質的に相同であり、配列番号２、または配列番号５および６のいずれかの全部または一部を含む、約１９〜約３００ヌクレオチドを包含するヌクレオチド配列を含むｄｓＲＮＡ分子が提供される。配列番号２、または配列番号５および６のいずれかの全部または一部と実質的に相同な少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むｄｓＲＮＡ分子の具体的な例は、限定せずに述べると、少なくとも１９、２０、２１、約２５（例えば、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、および２９）、約３０、約４０（例えば、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、および４５）、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００以上のヌクレオチドの長さでありうる。このようなｄｓＲＮＡ分子は、配列番号１、３、および／または４の１または複数の断片をさらに含みうる。このようなｄｓＲＮＡ分子の発現は、例えば、ｄｓＲＮＡ分子を取り込む鞘翅目有害生物において死滅をもたらしうる。
【０１５３】
特定の実施形態では、本発明により提供されるｄｓＲＮＡ分子が、配列番号２を含む標的遺伝子と相補的なヌクレオチド配列、および／または配列番号５および６のいずれかの全部または一部と相補的なヌクレオチド配列を含み、鞘翅目有害生物におけるその標的遺伝子の阻害が、鞘翅目有害生物の成長、発育、または他の生物学的機能に不可欠な、タンパク質作用物質またはヌクレオチド配列作用物質の低減または除去を結果としてもたらす。選択されたヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号５および６のいずれかの全部または一部を含む配列番号２に示されるヌクレオチド配列の連続断片、または前出のいずれかの相補体に対する約８０％〜約１００％の配列同一性を呈示しうる。例えば、選択されたヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号５および６のいずれかの全部または一部を含む配列番号２に示されるヌクレオチド配列の連続断片、または前出のいずれかの相補体に対する約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％  約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％、または約１００％の配列同一性を呈示しうる。具体的な実施形態では、本発明により提供されるｄｓＲＮＡ分子は、配列番号１、３、および４のうちの１つを含む標的遺伝子と相補的な１または複数のヌクレオチド配列をさらに含むことが可能であり、鞘翅目有害生物におけるその標的遺伝子の阻害が、鞘翅目有害生物の成長、発育、または他の生物学的機能に不可欠な、タンパク質作用物質またはヌクレオチド配列作用物質の低減または除去を結果としてもたらす。
【０１５４】
一部の実施形態では、細胞または微生物においてｉＲＮＡ分子として発現して、標的遺伝子の発現を阻害することが可能なＤＮＡ分子が、１または複数の標的の鞘翅目有害生物種において見出される、天然の核酸配列の全部または一部と特異的に相補的な単一のヌクレオチド配列を含む場合もあり、このＤＮＡ分子が、複数のこのような特異的に相補的な配列からキメラとして構築される場合もある。
【０１５５】
一部の実施形態では、核酸分子は、「スペーサー配列」により隔てられる第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含みうる。スペーサー配列とは、これが所望される場合に、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間の二次構造の形成を容易にするヌクレオチドの任意の配列を含む領域でありうる。一実施形態では、スペーサー配列は、ｍＲＮＡのセンスまたはアンチセンスコード配列の一部である。スペーサー配列は代替的に、核酸分子へと共有結合的に連結することが可能なヌクレオチドまたはそれらの相同体の任意の組合せを含みうる。
【０１５６】
例えば、一部の実施形態では、ＤＮＡ分子は、１または複数の異なるＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含むことが可能であり、異なるＲＮＡ分子の各々が、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含み、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列が互いと相補的である。第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列とは、ＲＮＡ分子内でスペーサー配列を介して接続することができる。スペーサー配列は、第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列の一部を構成しうる。第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子の発現は、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列の特異的なハイブリダイゼーションを介して、本発明のｄｓＲＮＡ分子の形成をもたらしうる。第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列は、鞘翅目有害生物に固有の核酸配列（例えば、標的遺伝子、または転写される非コード配列）、その派生体、またはそれと相補的な配列と実質的に同一でありうる。
【０１５７】
ｄｓＲＮＡ核酸分子は、重合化したリボヌクレオチド配列の二本鎖を含み、リン酸−糖骨格またはヌクレオシドに対する修飾を包含しうる。ＲＮＡ構造における修飾は、特異的な阻害を可能とするように調整することができる。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子を生成させうるような遍在的な酵素過程を介して、ｄｓＲＮＡ分子を修飾することができる。この酵素過程では、真核生物におけるＤＩＣＥＲなどのＲＮアーゼＩＩＩ酵素を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて利用することができる。Elbashirら（2001）、Nature 411: 494〜8；ならびにHamiltonおよびBaulcombe（1999）、Science 286（5441）: 950〜2を参照されたい。ＤＩＣＥＲまたは機能的に同等なＲＮアーゼＩＩＩ酵素は、大型のｄｓＲＮＡ鎖および／またはｈｐＲＮＡ分子を、それらの各々が約１９〜２５ヌクレオチドの長さである小型のオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）へと切断する。これらの酵素を介して生成するｓｉＲＮＡ分子は、２〜３ヌクレオチドの３’突出、ならびに５’側のリン酸末端および３’側のヒドロキシル末端を有する。ＲＮアーゼＩＩＩ酵素を介して生成するｓｉＲＮＡ分子は、細胞内で一本鎖ＲＮＡへと巻き戻されて分離される。次いで、ｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子から転写されるＲＮＡ配列と特異的にハイブリダイズされ、その後、いずれのＲＮＡ分子も、固有の細胞内ＲＮＡ分解機構を介して分解される。この過程は、標的生物において標的遺伝子によりコードされるＲＮＡ配列の効果的な分解または除去を結果としてもたらしうる。帰結は、標的とされた遺伝子の転写後サイレンシングである。一部の実施形態では、内因性のＲＮアーゼＩＩＩ酵素を介して異種核酸分子から生成したｓｉＲＮＡ分子が、鞘翅目有害生物における標的遺伝子の下方制御を効率的に媒介しうる。
【０１５８】
一部の実施形態では、本発明の核酸分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける分子間ハイブリダイゼーションを介してｄｓＲＮＡ分子を形成することが可能な、一本鎖ＲＮＡ分子へと転写されうる少なくとも１つの非天然ヌクレオチド配列を包含しうる。このようなｄｓＲＮＡ配列は、典型的に自己組織化し、鞘翅目有害生物の栄養供給源中に施されて、標的遺伝子の転写後阻害を達成することができる。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、本発明の核酸分子は、それらの各々が鞘翅目有害生物における異なる標的遺伝子と特異的に相補的な２つの異なる非天然ヌクレオチド配列を含みうる。このような核酸分子が、ｄｓＲＮＡ分子として鞘翅目有害生物へと施されると、このｄｓＲＮＡ分子は、鞘翅目有害生物における少なくとも２つの異なる標的遺伝子の発現を阻害する。
【０１５９】
Ｃ．核酸分子の獲得
鞘翅目有害生物における多様な天然配列は、ｉＲＮＡなどの本発明の核酸分子およびｉＲＮＡをコードするＤＮＡ分子をデザインするための標的配列として用いることができる。しかし、天然配列の選択は、単純な過程ではない。鞘翅目有害生物における少数の天然配列だけが、効果的な標的となる。例えば、本発明の核酸分子により特定の天然配列を効果的に下方制御しうるかどうか、または特定の天然配列の下方制御が鞘翅目有害生物の成長、生存能力、増殖、および／もしくは生殖に対して妨害的効果を及ぼすかどうかを確実に予測することはできない。ＥＳＴなど、鞘翅目有害生物から単離される大半の鞘翅目有害生物の天然配列（例えば、米国特許第７，６１２，１９４号および米国特許第７，９４３，８１９号で列挙される天然配列）は、ＷＣＲまたはＮＣＲなどの鞘翅目有害生物の成長、生存能力、増殖、および／または生殖に対して妨害的効果を及ぼさない。鞘翅目有害生物に対して妨害的効果を及ぼしうる天然配列のうちのいずれを、宿主植物体におけるこのような天然配列と相補的な核酸分子を発現させる組換え法において用い、宿主植物体に害をもたらすことなく、摂食されると鞘翅目有害生物に対する妨害的効果をもたらしうるのかも予測できない。
【０１６０】
一部の実施形態では、本発明の核酸分子（例えば、鞘翅目有害生物の宿主植物体に施されるｄｓＲＮＡ分子）を、代謝的または異化的な生化学経路、細胞分裂、生殖、エネルギー代謝、消化、寄生などに関与するアミノ酸配列など、鞘翅目有害生物の生存に不可欠なタンパク質またはタンパク質の一部をコードするｃＤＮＡ配列を標的とするように選択する。本明細書で記載される通り、その少なくとも１つのセグメントが、標的病原体の細胞内で生成するＲＮＡの少なくとも実質的に同一なセグメントと特異的に相補的な１または複数のｄｓＲＮＡを含有する組成物を標的生物が摂取すると、標的の死滅または他の阻害が結果としてもたらされうる。鞘翅目有害生物に由来するＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチド配列は、鞘翅目有害生物による発生に対して抵抗性の植物細胞を構築するのに用いることができる。鞘翅目有害生物の宿主植物体（例えば、トウモロコシ（Z. mays）またはダイズ（G. max））は、例えば、本明細書で提供される鞘翅目有害生物に由来するヌクレオチド配列のうちの１または複数を含有するように形質転換することができる。宿主へと形質転換されたヌクレオチド配列は、形質転換された宿主における細胞内または生物学的流体中のｄｓＲＮＡ配列へと形成される１または複数のＲＮＡをコードし、したがって、鞘翅目有害生物がトランスジェニック宿主と栄養関係を形成する場合／形成するときにｄｓＲＮＡを摂取可能とすることが可能である。これは、鞘翅目有害生物の細胞における１または複数の遺伝子の発現の抑制、および死滅またはその成長もしくは発育の阻害を結果としてもたらしうる。
【０１６１】
したがって、一部の実施形態では、本質的に鞘翅目有害生物の成長、発育、および生殖に関与する遺伝子を標的とする。本発明において用いられる他の標的遺伝子には、例えば、鞘翅目有害生物の生存能力、運動、移動、成長、発育、感染性、摂食部位の確立、および生殖において重要な役割を果たす標的遺伝子が含まれる。したがって、標的遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子の場合もあり、転写因子の場合もある。加えて、本発明において用いられる鞘翅目有害生物の天然ヌクレオチド配列はまた、その機能が当業者に知られており、そのヌクレオチド配列が標的である鞘翅目有害生物のゲノムにおける標的遺伝子と特異的にハイブリダイズ可能な植物遺伝子、ウイルス遺伝子、細菌遺伝子、または害虫遺伝子の相同体（例えば、オルソログ）にも由来しうる。当業者には、ハイブリダイゼーションを介して知られているヌクレオチド配列を伴う遺伝子の相同体を同定する方法が知られている。
【０１６２】
一部の実施形態では、本発明は、ｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｈｐＲＮＡ）分子を生成させるためのヌクレオチド配列を含む核酸分子を得る方法を提供する。このような一実施形態は、（ａ）鞘翅目有害生物におけるｄｓＲＮＡを介する遺伝子抑制に際して、１または複数の標的遺伝子を、それらの発現、機能、および表現型について解析するステップと；（ｂ）ｃＤＮＡライブラリーまたはｇＤＮＡライブラリーを、ｄｓＲＮＡを介する抑制解析における成長表現型または発育表現型の変化（例えば、低減）を提示する、標的とされる鞘翅目有害生物に由来するヌクレオチド配列またはその相同体の全部または一部を含むプローブでプロービングするステップと；（ｃ）プローブと特異的にハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定するステップと；（ｄ）ステップ（ｂ）で同定されたＤＮＡクローンを単離するステップと；（ｅ）ステップ（ｄ）で単離されたクローンを含むｃＤＮＡ断片またはｇＤＮＡ断片を配列決定するステップであって、配列決定された核酸分子により、ＲＮＡ配列またはその相同体の全部または実質的部分が転写されるステップと；（ｆ）遺伝子配列の全部もしくは実質的部分、またはｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡもしくはｈｐＲＮＡもしくはｍＲＮＡもしくはｄｓＲＮＡを化学合成するステップとを含む。
【０１６３】
さらなる実施形態では、ｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｈｐＲＮＡ）分子の実質的部分を生成させるヌクレオチド配列を含む核酸断片を得る方法は、（ａ）標的とされる鞘翅目有害生物に由来する天然のヌクレオチド配列の一部と特異的に相補的な第１のオリゴヌクレオチドプライマーおよび第２のオリゴヌクレオチドプライマーを合成するステップと；（ｂ）ステップ（ａ）の第１のオリゴヌクレオチドプライマーおよび第２のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるクローニングベクター中に存在するｃＤＮＡ挿入配列またはｇＤＮＡ挿入配列を増幅するステップであって、増幅された核酸分子により、ｓｉＲＮＡ分子またはｍｉＲＮＡ分子またはｈｐＲＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子またはｄｓＲＮＡ分子の実質的部分が転写されるステップとを包含する。
【０１６４】
本発明の核酸は、多数の手法を介して単離することもでき、増幅することもでき、生成させることもできる。例えば、ｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｈｐＲＮＡ）分子は、ｇＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーまたはその一部に由来する標的核酸配列（例えば、標的遺伝子または転写される標的の非コード配列）のＰＣＲ増幅を介して得ることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、標的生物から抽出することができ、当業者に知られる方法を用いて、これから核酸ライブラリーを調製することができる。標的生物から生成させたｇＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーは、ＰＣＲ増幅および標的遺伝子の配列決定に用いることができる。確認されたＰＣＲ産物を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける転写のための鋳型として用いて、最小限のプロモーターによりセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを生成させることができる。代替的に、核酸分子は、ホスホルアミダイト化学反応などの標準的な化学反応を用いる自動式ＤＮＡ合成器（例えば、Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）製の３９２型または３９４型のＤＮＡ／ＲＮＡ合成器）の使用を含めた、多数の技法（例えば、Ozakiら（1992）、Nucleic Acids Research、20: 5205〜5214；およびAgrawalら（1990）、Nucleic Acids Research、18: 5419〜5423を参照されたい）のうちのいずれかを介して合成することができる。例えば、Beaucageら（1992）、Tetrahedron、48: 2223〜2311；米国特許第４，９８０，４６０号、同第４，７２５，６７７号、同第４，４１５，７３２号、同第４，４５８，０６６号、および同第４，９７３，６７９号を参照されたい。また、ホスホロチオエート、ホスホロアミデートなどの非天然骨格基を結果としてもたらす代替的な化学反応も使用することができる。
【０１６５】
当業者は、本発明のＲＮＡ分子、ｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、またはｈｐＲＮＡ分子を、手作業による反応を介して化学的または酵素的に生成させることもでき、自動式反応を介して化学的または酵素的に生成させることもでき、ＲＮＡ分子、ｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、またはｈｐＲＮＡ分子をコードする配列を含む核酸分子を含むｉｎ  ｖｉｖｏの細胞において生成させることもできる。ＲＮＡはまた、部分的な有機合成を介して生成させることもでき、完全な有機合成を介して生成させることもできる（任意の修飾リボヌクレオチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける酵素的合成を介して導入することもでき、有機合成を介して導入することもできる）。ＲＮＡ分子は、細胞内のＲＮＡポリメラーゼにより合成することもでき、バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）により合成することもできる。当技術分野では、ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現に有用な発現構築物が知られている。例えば、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９７／３２０１６号；ならびに米国特許第５，５９３，８７４号、同第５，６９８，４２５号、同第５，７１２，１３５号、同第５，７８９，２１４号、および同第５，８０４，６９３号を参照されたい。化学合成されるか、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける酵素的合成を介して合成されるＲＮＡ分子は、細胞へと導入する前に精製することができる。例えば、ＲＮＡ分子は、溶媒もしくは樹脂による抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー、またはこれらの組合せを介して混合物から精製することができる。代替的に、化学合成されるか、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける酵素的合成を介して合成されるＲＮＡ分子を、例えば、試料の加工に起因する喪失を回避するために、精製を伴わないかまたは精製を最小限として用いることもできる。ＲＮＡ分子は、保管のために乾燥させることもでき、水溶液中に溶解させることもできる。溶液は、ｄｓＲＮＡ分子二重鎖のアニーリングおよび／または安定化を促進する緩衝剤または塩を含有しうる。
【０１６６】
実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子を、単一の自己相補的ＲＮＡ鎖を介して形成することもでき、２つの相補的ＲＮＡ鎖から形成することもできる。ｄｓＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏで合成することもでき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することもできる。細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで１つまたは２つのＲＮＡ鎖の転写を媒介することもでき、クローニングされたＲＮＡポリメラーゼは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写を媒介するのに用いることもできる。鞘翅目有害生物における標的遺伝子の転写後阻害は、宿主の器官型、組織型、または細胞型における特異的な転写を介して（例えば、組織特異的なプロモーターを用いることにより）宿主の標的とすることもでき；宿主における環境状態の刺激を介して（例えば、感染、ストレス、温度、および／または化学的誘導剤に応答する誘導的プロモーターを用いることにより）宿主の標的とすることもでき；かつ／または宿主の発達段階または年齢において転写を操作することにより（例えば、発達段階特異的なプロモーターを用いることにより）宿主の標的とすることもできる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写される場合であれ、ｉｎ  ｖｉｖｏで転写される場合であれ、ｄｓＲＮＡ分子を形成するＲＮＡ鎖は、ポリアデニル化される場合もされない場合もあり、細胞の翻訳装置を介してポリペプチドへと翻訳されることが可能な場合も可能でない場合もある。
【０１６７】
Ｄ．組換えベクターおよび宿主細胞の形質転換
一部の実施形態では、本発明また、細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、または植物細胞）へと導入されるＤＮＡ分子であって、ＲＮＡへと発現し、鞘翅目有害生物により摂取されると、鞘翅目有害生物の細胞、組織、または器官における標的遺伝子の抑制を達成するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子も提供する。したがって、一部の実施形態は、植物細胞においてｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｈｐＲＮＡ）分子として発現して、鞘翅目有害生物における標的遺伝子の発現を阻害することが可能な核酸配列を含む組換え核酸分子を提供する。発現を誘発または増強するために、このような組換え核酸分子は、１または複数の調節配列を含むことが可能であり、これらの調節配列は、ｉＲＮＡとして発現することが可能な核酸配列に作動可能に連結することができる。植物において遺伝子抑制分子を発現させる方法は知られており、本発明のヌクレオチド配列を発現させるのに用いることができる。例えば、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ０６０７３７２７号；および米国特許公開第２００６／０２００８７８Ａ１号を参照されたい。
【０１６８】
具体的な実施形態では、本発明の組換えＤＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含みうる。このような組換えＤＮＡ分子は、摂取されると、鞘翅目有害生物の細胞における内因性の標的遺伝子（複数可）の発現を阻害することが可能なｄｓＲＮＡ分子をコードしうる。多くの実施形態では、転写されるｄｓＲＮＡ分子は、安定化形態で、例えば、ヘアピン構造およびステムループ構造として施すことができる。
【０１６９】
これらの実施形態およびさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のうちの１つの鎖を、配列番号２；配列番号２の相補体；配列番号５；配列番号５の相補体；配列番号６；配列番号６の相補体；配列番号７；配列番号７の相補体；配列番号８；配列番号８の相補体；配列番号１１２；配列番号１１２の相補体；配列番号１１３；配列番号１１３の相補体；配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号２、５〜８、１１２、および／または１１３のうちのいずれかを含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コード配列；配列番号２、５〜８、１１２、および／または１１３のうちのいずれかを含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の相補体；配列番号２、５〜８、１１２、および／または１１３のうちのいずれかを含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列；配列番号２、５〜８、１１２、および／または１１３のうちのいずれかを含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の相補体；配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；ならびに配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部を含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択されるヌクレオチド配列と実質的に相同なヌクレオチド配列から転写させることにより形成することができる。
【０１７０】
ｄｓＲＮＡ分子の１つの鎖はまた、配列番号１；配列番号１の相補体；配列番号３；配列番号３の相補体；配列番号４；配列番号４の相補体；配列番号１、３、または４のうちのいずれかの少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号１、３、または４のうちのいずれかの少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号１、３、または４のうちのいずれかを含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コード配列；配列番号１、３、または４のうちのいずれかを含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の相補体；配列番号１、３、または４のうちのいずれかを含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列；配列番号１、３、または４のうちのいずれかを含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の相補体；配列番号１、３、または４のうちのいずれかを含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号１、３、または４のうちのいずれかを含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号１、３、または４のうちのいずれかを含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；および配列番号１、３、または４のうちのいずれかを含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択されるヌクレオチド配列と実質的に相同なヌクレオチド配列からの転写を介しても形成することができる。
【０１７１】
具体的な実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子をコードする組換えＤＮＡ分子は、少なくとも１つのプロモーターと比べて、一方のヌクレオチド配列がセンス配向性であり、他方のヌクレオチド配列がアンチセンス配向性であり、センスヌクレオチド配列とアンチセンスヌクレオチド配列とが約５〜約１０００ヌクレオチドのスペーサー配列を介して連結または接続されるようにコード配列が配置された、少なくとも２つのヌクレオチド配列を含みうる。スペーサー配列は、センス配列とアンチセンス配列との間でループを形成しうる。センスヌクレオチド配列またはアンチセンスヌクレオチド配列は、標的遺伝子（例えば、配列番号１〜４のうちの１つを含む遺伝子）またはその断片のヌクレオチド配列と実質的に相同でありうる。しかし、一部の実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、スペーサー配列を伴わないｄｓＲＮＡ分子をコードしうる。実施形態では、センスコード配列とアンチセンスコード配列の長さが異なりうる。
【０１７２】
鞘翅目有害生物に対する有害効果または鞘翅目有害生物に関する植物保護効果を有するものとして同定された配列は、本発明の組換え核酸分子内に適切な発現カセットを創出することにより、発現させるｄｓＲＮＡ分子へと容易に組み込むことができる。例えば、このような配列は、標的遺伝子配列（例えば、配列番号２、および配列番号５および／または６のいずれかの全部または一部を含む配列）に対応する第１のセグメントを取り込み；この配列を第１のセグメントと相同または相補的ではない第２のセグメントのスペーサー領域へと連結し；これを第３のセグメントであって、その少なくとも一部が第１のセグメントと実質的に相補的な第３のセグメントへと連結することによりステムループ構造を伴うヘアピンとして発現させることができる。このような構築物は、第１のセグメントの第３のセグメントとのハイブリダイゼーションを介してステムループ構造を形成し、ループ構造形態が第２のセグメントを含む。例えば、米国特許公開第ＵＳ２００２／００４８８１４号および同第ＵＳ２００３／００１８９９３号；ならびに国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０１５５０号および同第ＷＯ９８／０５７７０号を参照されたい。ｄｓＲＮＡ分子は、例えば、ｓｉＲＮＡ生成の増強をもたらすか、またはメチル化を低減して、ｄｓＲＮＡヘアピンプロモーターの転写に関わる遺伝子サイレンシングを阻止するさらなる植物用発現カセットにおいて、例えば、標的とされる遺伝子の断片を共発現させることにより、鞘翅目有害生物の天然配列を標的とするｓｉＲＮＡの生成を増強する、ステムループ構造（例えば、ヘアピン）などの二本鎖構造の形態で生成させることができる。
【０１７３】
本発明の実施形態は、鞘翅目有害生物を阻害するレベルで１または複数のｉＲＮＡ分子の発現を達成するための、本発明の組換え核酸分子の植物への導入（すなわち、形質転換）を包含する。例えば、組換えＤＮＡ分子は、直鎖状プラスミドまたは閉じた環状プラスミドなどのベクターでありうる。ベクター系は、宿主のゲノムへと導入されるＤＮＡの全体を併せて含有する、単一のベクターまたはプラスミドの場合もあり、２つ以上のベクターまたはプラスミドの場合もある。加えて、ベクターは、発現ベクターでありうる。例えば、本発明の核酸配列は、１または複数の宿主において連結されたコード配列または他のＤＮＡ配列の発現を駆動するように機能する適切なプロモーターの制御下で、ベクターへと適切に挿入される。多くのベクターがこの目的で利用可能であり、適切なベクターの選択は、ベクターへと挿入される核酸のサイズおよびベクターで形質転換される特定の宿主細胞に主に依存する。各ベクターは、その機能（例えば、ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）およびそれが適合可能な特定の宿主細胞に応じて多様な成分を含有する。
【０１７４】
例えば、鞘翅目有害生物に対する抵抗性をトランスジェニック植物体に付与するために、組換えＤＮＡを、組換え植物体の組織内または体液中のｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子を形成するＲＮＡ分子）へと転写させることができる。ｉＲＮＡ分子は、宿主植物体種を常食としうる鞘翅目有害生物において転写される、対応するヌクレオチド配列と実質的に相同であり、これと特異的にハイブリダイズ可能な、ヌクレオチド配列を含みうる。鞘翅目有害生物は、例えば、ｉＲＮＡ分子を含むトランスジェニック宿主植物体の細胞または体液を摂取することにより、トランスジェニック宿主植物体の細胞において転写されるｉＲＮＡ分子に接触しうる。したがって、トランスジェニック宿主植物体に発生する鞘翅目有害生物におけるｉＲＮＡ分子を介して、標的遺伝子の発現が抑制される。一部の実施形態では、標的である鞘翅目有害生物における標的遺伝子の発現を抑制する結果として、有害生物に対して抵抗性の植物を得ることができる。
【０１７５】
本発明の組換え核酸分子で形質転換された植物細胞と栄養関係にある鞘翅目有害生物へのｉＲＮＡ分子の送達を可能とするためには、植物細胞におけるｉＲＮＡ分子の発現（すなわち、転写）が要請される。したがって、組換え核酸分子は、核酸分子が増幅される細菌細胞、または核酸分子が発現する植物細胞などの宿主細胞において機能する異種プロモーター配列など、１または複数の調節配列に作動可能に連結された本発明のヌクレオチド配列を含みうる。
【０１７６】
本発明の核酸分子において用いるのに適するプロモーターには、それらの全てが当技術分野でよく知られる、誘導的プロモーター、ウイルスプロモーター、合成プロモーター、または構成的プロモーターが含まれる。このようなプロモーターについて記載する非限定的な例には、米国特許第６，４３７，２１７号（トウモロコシＲＳ８１プロモーター）；同第５，６４１，８７６号（コメアクチンプロモーター）；同第６，４２６，４４６号（トウモロコシＲＳ３２４プロモーター）；同第６，４２９，３６２号（トウモロコシＰＲ−１プロモーター）；同第６，２３２，５２６号（トウモロコシＡ３プロモーター）；同第６，１７７，６１１号（トウモロコシの構成的プロモーター）；同第５，３２２，９３８号、同第５，３５２，６０５号、同第５，３５９，１４２号、および同第５，５３０，１９６号（３５Ｓプロモーター）；同第６，４３３，２５２号（トウモロコシＬ３オレオシンプロモーター）；同第６，４２９，３５７号（コメアクチン２プロモーター、およびコメアクチン２イントロン）；同第６，２９４，７１４号（光誘導的プロモーター）；同第６，１４０，０７８号（塩誘導的プロモーター）；同第６，２５２，１３８号（病原体誘導的プロモーター）；同第６，１７５，０６０号（リン欠損誘導的プロモーター）；同第６，３８８，１７０号（双方向性プロモーター）；同第６，６３５，８０６号（γ−コイキシンプロモーター）；ならびに米国特許出願第０９／７５７，０８９号（トウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロモーター）が含まれる。さらなるプロモーターには、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター（Ebertら（1987）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84（16）: 5745〜9）およびオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（これらのいずれもが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の腫瘍誘導性プラスミドにおいて保有される）；カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓプロモーターなどのカリモウイルスプロモーター（Lawtonら（1987）、Plant Mol. Biol. 9: 315〜24）；ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（Odellら（1985）、Nature 313: 810〜2；フィグウォートモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Walkerら（1987）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84（19）: 6624〜8）；スクロースシンターゼプロモーター（YangおよびRussell（1990）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4144〜8）；Ｒ遺伝子複合体プロモーター（Chandlerら（1989）、Plant Cell 1: 1175〜83）；クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーター；ＣａＭＶ３５Ｓ（米国特許第５，３２２，９３８号、同第５，３５２，６０５号、同第５，３５９，１４２号、および同第５，５３０，１９６号）；ＦＭＶ３５Ｓ（米国特許第６，０５１，７５３号および同第５，３７８，６１９号）；ＰＣ１ＳＶプロモーター（米国特許第５，８５０，０１９号）；ＳＣＰ１プロモーター（米国特許第６，６７７，５０３号）；ならびにＡＧＲｔｕ．ｎｏｓプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｖ０００８７号；Depickerら（1982）、J. Mol. Appl. Genet. 1: 561〜73；Bevanら（1983）、Nature 304: 184〜7）が含まれる。
【０１７７】
具体的な実施形態では、本発明の核酸分子は、根特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターを含む。根特異的プロモーターは、もっぱら根組織におけるかまたは優先的に根組織における作動可能に連結された配列の発現を駆動する。当技術分野では、根特異的プロモーターの例が知られている。例えば、米国特許第５，１１０，７３２号；同第５，４５９，２５２号；および同第５，８３７，８４８号；ならびにOppermanら（1994）、Science 263: 221〜3；およびHirelら（1992）、Plant Mol. Biol. 20: 207〜18を参照されたい。一部の実施形態では、本発明による、鞘翅目有害生物を防除するためのヌクレオチド配列または断片は、２つの根特異的プロモーターであって、トランスジェニック植物細胞において作動可能であり、そこにおいて発現して、その後、前出で記載したｄｓＲＮＡ分子を形成しうるトランスジェニック植物細胞においてＲＮＡ分子を生成させるプロモーターの間でクローニングすることができる。植物組織において発現するｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子の発現の抑制を達成するように、鞘翅目有害生物に摂取させる。
【０１７８】
場合によって、対象の核酸分子に作動可能に連結されうるさらなる調節配列は、プロモーター配列と、翻訳リーダー配列として機能するコード配列との間に配置される５’ＵＴＲを包含する。翻訳リーダー配列は、完全にプロセシングされたｍＲＮＡに存在し、一次転写物のプロセシングおよび／またはＲＮＡの安定性に影響を及ぼしうる。翻訳リーダー配列の例には、トウモロコシ熱ショックタンパク質リーダーおよびペチュニア熱ショックタンパク質リーダー（米国特許第５，３６２，８６５号）、植物ウイルスコートタンパク質リーダー、植物ルビスコリーダー、ならびに他のリーダーが含まれる。例えば、TurnerおよびFoster（1995）、Molecular Biotech. 3（3）: 225〜36を参照されたい。５’ＵＴＲの非限定的な例には、ＧｍＨｓｐ（米国特許第５，６５９，１２２号）；ＰｈＤｎａＫ（米国特許第５，３６２，８６５号）；ＡｔＡｎｔ１；ＴＥＶ（CarringtonおよびFreed（1990）、J. Virol. 64: 1590〜7）；およびＡＧＲｔｕｎｏｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｖ０００８７号；およびBevanら（1983）、Nature 304: 184〜7）が含まれる。
【０１７９】
場合によって、対象の核酸分子に作動可能に連結されうるさらなる調節配列はまた、３’側非翻訳配列、３’側転写終結領域、またはポリアデニル化領域も包含する。これらは、ヌクレオチド配列の下流に配置される遺伝子エレメントであり、ポリアデニル化シグナルおよび／または転写もしくはｍＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼすことが可能な他の調節シグナルをもたらすポリヌクレオチドを包含する。ポリアデニル化シグナルは、植物においてポリアデニル酸ヌクレオチドのｍＲＮＡ前駆体の３’端への付加を引き起こすように機能する。ポリアデニル化配列は、多様な植物遺伝子に由来する場合もあり、Ｔ−ＤＮＡ遺伝子に由来する場合もある。３’側転写終結領域の非限定的な例は、ノパリンシンターゼの３’側領域（ｎｏｓ３’；Fraleyら（1983）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803〜7）である。Ingelbrechtら、（1989）、Plant Cell 1: 671〜80では、異なる３’側非翻訳領域の使用例が提供されている。ポリアデニル化シグナルの非限定的な例には、エンドウ（Pisum sativum）ＲｂｃＳ２遺伝子（Ｐｓ．ＲｂｃＳ２−Ｅ９；Coruzziら（1984）、EMBO J. 3: 1671〜9）およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｅ０１３１２号）に由来するポリアデニル化シグナルが含まれる。
【０１８０】
一部の実施形態は、１または複数の本発明のヌクレオチド配列に作動的に連結された上記の調節配列のうちの少なくとも１つを含む単離および精製されたＤＮＡ分子を含む植物体の形質転換ベクターを包含しうる。発現させると、１または複数のヌクレオチド配列は、鞘翅目有害生物における天然のＲＮＡ分子の全部または一部と特異的に相補的なヌクレオチド配列を含む、１または複数のＲＮＡ分子を結果としてもたらす。したがって、ヌクレオチド配列（複数可）は、標的とされる鞘翅目有害生物のＲＮＡ転写物に存在するリボヌクレオチド配列の全部または一部をコードするセグメントを含む場合があり、標的とされる鞘翅目有害生物の転写物の全部または一部の逆反復配列を含みうる。植物体の形質転換ベクターは、複数の標的配列と特異的に相補的な配列を含有する場合があり、したがって、標的である鞘翅目有害生物の１または複数の集団または種の細胞において、２つ以上の遺伝子の発現を阻害する複数のｄｓＲＮＡの生成を可能とする。異なる遺伝子に存在するヌクレオチド配列と特異的に相補的なヌクレオチド配列のセグメントは、トランスジェニック植物体において発現させるための単一の複合核酸分子へと組み合わせることができる。このようなセグメントは、連続の場合もあり、スペーサー配列により隔てられる場合もある。
【０１８１】
一部の実施形態では、本発明の少なくとも１つのヌクレオチド配列を既に含有する本発明のプラスミドは、少なくとも１つの元のヌクレオチド配列と同じ調節エレメントに作動可能に連結されたさらなるヌクレオチド配列（複数可）を、同じプラスミドに逐次的に挿入することにより修飾することができる。一部の実施形態では、核酸分子を、複数の標的遺伝子を阻害するようにデザインすることができる。一部の実施形態では、阻害される複数の遺伝子を、同じ鞘翅目有害生物種から得ることができ、これにより、核酸分子の有効性を増強することができる。他の実施形態では、遺伝子を、異なる鞘翅目有害生物に由来させることができ、これにより、作用物質（複数可）が効果的となる鞘翅目有害生物の範囲を拡張することができる。複数の遺伝子が、抑制または発現および抑制の組合せの標的とされ、ポリシストロニックのＤＮＡエレメントを作製することができる。
【０１８２】
本発明の組換え核酸分子またはベクターは、植物細胞などの形質転換細胞に選択可能な表現型を付与する選択マーカーを含みうる。選択マーカーはまた、本発明の組換え核酸分子を含む植物体または植物細胞を選択するのにも用いることができる。マーカーは、バイオサイド抵抗性、抗生剤抵抗性（例えば、カナマイシン、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８）、ブレオマイシン、ハイグロマイシンなど）をコードする場合もあり、除草剤抵抗性（例えば、グリホセートなど）をコードする場合もある。選択マーカーの例には、カナマイシン抵抗性をコードし、カナマイシン、Ｇ４１８などを用いて選択されうるｎｅｏ遺伝子；ビアラホス抵抗性をコードするｂａｒ遺伝子；グリホセート抵抗性をコードする、突然変異体のＥＰＳＰシンターゼ遺伝子；ブロモキシニルに対する抵抗性を付与するニトリラーゼ遺伝子；イミダゾリノン抵抗性またはスルホニルウレア抵抗性を付与する、突然変異体のアセト乳酸シンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）；およびメトトレキサート抵抗性のＤＨＦＲ遺伝子が含まれるがこれらに限定されない。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン、スペクチノマイシン、リファンピシン、ストレプトマイシン、およびテトラサイクリンなどに対する抵抗性を付与する複数の選択マーカーが利用可能である。このような選択マーカーの例は、例えば、米国特許第５，５５０，３１８号；同第５，６３３，４３５号；同第５，７８０，７０８号；および同第６，１１８，０４７号において例示されている。
【０１８３】
本発明の組換え核酸分子またはベクターはまた、スクリーンマーカーも包含する。スクリーンマーカーを用いて、発現をモニタリングすることができる。例示的なスクリーンマーカーには、多様な発色基質が知られている酵素をコードするβ−グルクロニダーゼ遺伝子またはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）（Jeffersonら（1987）、Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387〜405）；植物組織におけるアントシアニン色素（赤色）の生成を制御する産物をコードするＲ遺伝子座遺伝子（Dellaportaら（1988）、「Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac」、18th Stadler Genetics Symposium、P. GustafsonおよびR. Appels編（New York: Plenum）、263〜82ページ）；β−ラクタマーゼ遺伝子（Sutcliffeら（1978）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3737〜41）；多様な発色基質が知られている酵素をコードする遺伝子（例えば、ＰＡＤＡＣ、発色性セファロスポリン）；ルシフェラーゼ遺伝子（Owら（1986）、Science 234: 856〜9）；発色性カテコールを転換しうるカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子（Zukowskiら（1983）、Gene 46（2〜3）: 247〜55）；アミラーゼ遺伝子（Ikatuら（1990）、Bio/Technol. 8: 241〜2）；チロシンをＤＯＰＡおよび凝縮してメラニンへとなるドパキノンへと酸化することが可能な酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Katzら（1983）、J. Gen. Microbiol. 129: 2703〜14）；ならびにα−ガラクトシダーゼが含まれる。
【０１８４】
一部の実施形態では、前出で記載した組換え核酸分子を、トランスジェニック植物体を創出し、植物において異種核酸を発現させて、鞘翅目有害生物に対する易感染性の低減を呈示するトランスジェニック植物体を調製する方法において用いることができる。植物体の形質転換ベクターは、例えば、ｉＲＮＡ分子をコードする核酸分子を、植物体の形質転換ベクターへと挿入し、これらのベクターを植物へと導入することにより調製することができる。
【０１８５】
宿主細胞を形質転換する適切な方法には、プロトプラストの形質転換（例えば、米国特許第５，５０８，１８４号を参照されたい）を介する方法、乾燥／阻害を介するＤＮＡの取込み（例えば、Potrykusら（1985）、Mol. Gen. Genet. 199: 183〜8を参照されたい）を介する方法、電気穿孔（例えば、米国特許第５，３８４，２５３号を参照されたい）を介する方法、炭化ケイ素繊維による撹拌（例えば、米国特許第５，３０２，５２３号および同第５，４６４，７６５号を参照されたい）を介する方法、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属を介する形質転換（例えば、米国特許第５，５６３，０５５号；同第５，５９１，６１６号；同第５，６９３，５１２号；同第５，８２４，８７７号；同第５，９８１，８４０号；および同第６，３８４，３０１号を参照されたい）を介する方法、およびＤＮＡでコーティングした粒子の加速化（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号；同第５，５５０，３１８号；同第５，５３８，８８０号；同第６，１６０，２０８号；同第６，３９９，８６１号；および同第６，４０３，８６５号を参照されたい）を介する方法など、ＤＮＡを細胞へと導入しうる任意の方法が含まれる。トウモロコシを形質転換するのに特に有用な技法は、例えば、米国特許第７，０６０，８７６号および同第５，５９１，６１６号；ならびに国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／０６７２２号において記載されている。これらの技法などの技法を適用することにより、事実上任意の種の細胞を安定的に形質転換することができる。一部の実施形態では、形質転換するＤＮＡを、宿主細胞のゲノムへと組み込む。多細胞種の場合、トランスジェニック細胞を、トランスジェニック生物内へと再生させることができる。これらの技法のうちのいずれかを用いて、例えば、トランスジェニック植物体のゲノムにおいて１または複数のｉＲＮＡ分子をコードする、１または複数の核酸配列を含むトランスジェニック植物体を生成させることができる。
【０１８６】
発現ベクターを植物へと導入するのに最も広く利用される方法は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属による天然の形質転換系に基づく。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞を遺伝子的に形質転換する植物病原性の土壌細菌である。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）のＴｉプラスミドおよびＲｉプラスミドは、それぞれ、植物の遺伝子形質転換の一因となる遺伝子を保有する。Ｔｉ（腫瘍誘導）プラスミドは、Ｔ−ＤＮＡとして知られ、形質転換される植物へと導入される、大型のセグメントを含有する。Ｔｉプラスミドの別のセグメントであるｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡ導入の一因となる。Ｔ−ＤＮＡ領域は、末端の反復配列により境界づけられている。改変バイナリーベクターでは、腫瘍誘導遺伝子が欠失しており、Ｔ−ＤＮＡの境界配列により境界づけられる外来のＤＮＡを導入するのに、ｖｉｒ領域の機能を利用する。Ｔ領域はまた、トランスジェニック植物体およびトランスジェニック細胞を効率的に回収するための選択マーカー、ならびに核酸をコードするｄｓＲＮＡなど、導入するための配列の挿入のための複数のクローニング部位も含有する。
【０１８７】
したがって、一部の実施形態では、植物体の形質転換ベクターは、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）のＴｉプラスミド（例えば、米国特許第４，５３６，４７５号、同第４，６９３，９７７号、同第４，８８６，９３７号、および同第５，５０１，９６７号；ならびに欧州特許第ＥＰ０１２２７９１号を参照されたい）、またはＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）のＲｉプラスミドに由来する。さらなる植物体の形質転換ベクターには、例えば、かつ、限定せずに述べると、Herrera-Estrellaら（1983）、Nature 303: 209〜13；Bevanら（1983）、Nature 304: 184〜7；Kleeら（1985）、Bio/Technol. 3: 637〜42；および欧州特許第ＥＰ０１２０５１６号により記載されたベクター、ならびに前出のうちのいずれかに由来するベクターが含まれる。植物と天然で相互作用するシノリゾビウム（Sinorhizobium）属、リゾビウム（Rhizobium）属、およびメソリゾビウム（Mesorhizobium）属など、他の細菌を改変して、多数の多様な植物への遺伝子導入を媒介することができる。これらの植物関連共生細菌は、ディスアームドＴｉプラスミドおよび適切なバイナリーベクターの両方を取り込むことにより、遺伝子導入にコンピテントとすることができる。
【０１８８】
外因性ＤＮＡをレシピエント細胞へと供給した後は一般に、さらなる培養および植物体の再生のため、形質転換された細胞を同定する。形質転換された細胞を同定する能力を改善するために、形質転換細胞を生成させるのに用いた形質転換ベクターと共に、既に示した選択マーカー遺伝子またはスクリーンマーカー遺伝子を利用することを所望することができる。選択マーカーを用いる場合は、潜在的に形質転換された細胞集団内で、細胞を１または複数の選択性作用物質へと曝露することにより、形質転換された細胞を同定する。スクリーンマーカーを用いる場合は、細胞を、所望されるマーカー遺伝子形質についてスクリーニングすることができる。
【０１８９】
選択性作用物質への曝露後に生存する細胞、またはスクリーニングアッセイにおいて陽性のスコアをもたらした細胞は、植物体の再生を支援する培地中で培養することができる。一部の実施形態では、任意の適切な植物組織の培養培地（例えば、ＭＳ培地およびＮ６培地）を、増殖制御因子などのさらなる物質を組み入れることにより改変することができる。組織は、植物再生の試みを開始するのに十分な組織が利用可能となるまで、増殖制御因子を伴う基本培地上で維持することもでき、手作業による選択ラウンドを繰り返した後で、組織の形態が再生に適切となるまで（例えば、少なくとも２週間）増殖制御因子を伴う基本培地上で維持し、次いで、シュート形成に資する培地へと移すこともできる。培養物は、十分なシュートの形成が生じるまで定期的に移す。シュートが形成されたら、それらを根の形成に資する培地へと移す。十分な根が形成されたら、さらに成長および成熟させるために植物を土壌へと移すことができる。
【０１９０】
再生しつつある植物体における対象の核酸分子（例えば、鞘翅目有害生物における標的遺伝子の発現を阻害する１または複数のｉＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列）の存在を確認するために、多様なアッセイを実施することができる。このようなアッセイには、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、ＰＣＲ、ならびに核酸の配列決定などの分子生物学的アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよび／またはウェスタンブロット）を介するかまたは酵素的機能を介する、タンパク質産物の存在の検出などの生化学アッセイ；葉アッセイまたは根アッセイなどの植物部分アッセイ；ならびに再生させる植物体の全体についての表現型の解析が含まれる。
【０１９１】
例えば、組込みイベントは、例えば、対象の核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ増幅を介して解析することができる。ＰＣＲによる遺伝子型決定には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ゲノムへと組み込まれた対象の核酸分子を含有すると予測される宿主植物体の単離カルス組織に由来するゲノムＤＮＡを増幅した後の、ＰＣＲ増幅産物の標準的なクローニングおよび配列解析が含まれるがこれらに限定されないと理解される。ＰＣＲによる遺伝子型決定法は、十分に記載されており（例えば、Rios, G.ら（2002）、Plant J. 32: 243〜53）、任意の植物種（例えば、トウモロコシ（Z. mays）またはダイズ（G. max））または細胞培養物を包含する組織型に由来するゲノムＤＮＡに適用することができる。
【０１９２】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）属に依存する形質転換法を用いて形成されたトランスジェニック植物体は、典型的に１つの染色体へと挿入された単一の組換えＤＮＡ配列を含有する。単一の組換えＤＮＡ配列は、「トランスジェニックイベント」または「組込みイベント」と称する。このようなトランスジェニック植物体は、挿入される外因性配列に対して半接合である。一部の実施形態では、それ自体に対して外因性である単一の遺伝子配列を含有する独立の分離個体であるトランスジェニック植物体、例えば、Ｆ０の植物体を接触体交配（自家受粉）させてＦ１種子を生成させることにより、トランス遺伝子に関してホモ接合のトランスジェニック植物体を得ることができる。生成したＦ１の種子の４分の１は、トランス遺伝子に関してホモ接合である。発芽しつつあるＦ１の種子は、典型的には、ヘテロ接合体とホモ接合体との識別を可能とするＳＮＰアッセイまたは熱増幅アッセイ（すなわち、接合性アッセイ）を用いてヘテロ接合性について調べうる植物体を結果としてもたらす。
【０１９３】
具体的な実施形態では、植物細胞において、鞘翅目有害生物に対する阻害効果を及ぼす、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の異なるｉＲＮＡ分子を生成させる。ｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、異なる形質転換イベントに導入される複数の核酸配列から発現させることもでき、単一の形質転換イベントに導入される単一の核酸配列から発現させることもできる。一部の実施形態では、複数のｉＲＮＡ分子を、単一のプロモーターの制御下で発現させる。他の実施形態では、複数のｉＲＮＡ分子を、複数のプロモーターの制御下で発現させる。複数の核酸配列であって、それらの各々が、鞘翅目有害生物の同じ種の異なる集団、または鞘翅目有害生物の異なる種における、１または複数の鞘翅目有害生物内の異なる遺伝子座（例えば、配列番号２および配列番号１、３、および４のうちの１または複数により規定される遺伝子座）と相同である、複数の核酸配列を含む単一のｉＲＮＡ分子を発現させることができる。
【０１９４】
組換え核酸分子による植物の直接的な形質転換に加えて、少なくとも１つのトランスジェニックイベントを有する第１の植物を、このようなイベントを欠く第２の植物と交配することにより、トランスジェニック植物体を調製することもできる。例えば、ｉＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を、形質転換に適する第１の植物系列に導入して、トランスジェニック植物体を生成させ、このトランスジェニック植物体を、第２の植物系列と交配して、ｉＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を、第２の植物系列の遺伝子バックグラウンドへと遺伝子移入することができる。
【０１９５】
本発明の一部の実施形態はまた、本発明のヌクレオチド配列のうちの１または複数を含有する組換え植物体または種子から生成させる、本発明の配列のうちの１または複数を含有する作物生成物も包含する。本発明の配列のうちの１または複数を含有する作物生成物には、植物の粗挽き粉、油、粉末粒もしくは全粒、または種子、あるいは組換え植物体の任意の粗挽き粉、油、または粉末粒もしくは全粒を含む任意の食餌生成物、あるいは本発明の配列のうちの１または複数を含有する種子が含まれることを意図するがこれらに限定されない。本明細書で想定される１または複数の作物または作物生成物における本発明の配列のうちの１または複数の検出は、事実上、この作物または作物生成物が、ｄｓＲＮＡを介する遺伝子抑制法を用いて植物病害を防除する目的で、本発明のヌクレオチド配列のうちの１または複数を発現させるようにデザインしたトランスジェニック植物体からなることの証拠である。
【０１９６】
一部の態様には、形質転換された植物細胞に由来するトランスジェニック植物体に生成させた種子および作物生成物が包含され、種子または作物生成物は、検出可能量の本発明の核酸配列を含む。一部の実施形態では、このような作物生成物は、例えば、トランスジェニック植物体を得、それらから食餌（foodまたはfeed）を調製することにより生成させることができる。例えば、かつ、限定せずに述べると、本発明の核酸配列のうちの１または複数を含む作物生成物には、植物の粗挽き粉、油、粉末粒もしくは全粒、または種子、および組換え植物体の任意の粗挽き粉、油、または粉末粒もしくは全粒を含む任意の食餌生成物、あるいは本発明の核酸配列のうちの１または複数を含む種子が含まれる。１または複数の作物または作物生成物における本発明の配列のうちの１または複数の検出は、事実上、作物または作物生成物が、鞘翅目有害生物を防除する目的で、本発明のｉＲＮＡ分子のうちの１または複数を発現させるようにデザインしたトランスジェニック植物体からなることの証拠である。
【０１９７】
一部の実施形態では、本発明の核酸分子を含むトランスジェニック植物体または種子はまた、限定せずに述べると、配列番号１〜４により規定される遺伝子座以外の、鞘翅目有害生物における遺伝子座を標的とするｉＲＮＡ分子が転写されるトランスジェニックイベント；鞘翅目有害生物以外の生物（例えば、植物寄生性の線虫）における遺伝子を標的とするｉＲＮＡ分子が転写されるトランスジェニックイベント；殺虫性タンパク質（例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）の殺虫性タンパク質）をコードする遺伝子；除草剤耐性遺伝子（例えば、グリホセートに対する耐性をもたらす遺伝子）；および収率の増大、脂肪酸代謝の変化、または細胞質雄性不稔性の回復など、トランスジェニック植物体における所望の表現型に寄与する遺伝子を含めた、そのゲノムにおける少なくとも１つの他のトランスジェニックイベントも包含しうる。具体的な実施形態では、本発明のｉＲＮＡ分子をコードする配列を、植物における病害防除形質および他の害虫防除形質と組み合わせて、植物病害および虫害の防除を増強するのに所望される形質を達成することができる。顕著な作用方式を使用する害虫防除形質を組み合わせることにより、例えば、圃場において形質（複数可）に対する抵抗性が生じる可能性が低減されるために、単一の防除形質を保有する植物を上回る優れた耐久性により保護されたトランスジェニック植物体をもたらすことができる。
【０１９８】
Ｖ．鞘翅目有害生物における標的遺伝子の抑制
Ａ．概観
本発明の一部の実施形態では、鞘翅目有害生物の防除に有用な少なくとも１つの核酸分子であって、鞘翅目有害生物におけるＲＮＡｉを介する遺伝子サイレンシングをもたらす核酸分子を鞘翅目有害生物へと施すことができる。具体的な実施形態では、ｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｈｐＲＮＡ）を、鞘翅目宿主へと施すことができる。一部の実施形態では、鞘翅目有害生物の防除に有用な核酸分子を、この核酸分子を鞘翅目有害生物と接触させることにより鞘翅目有害生物へと施すことができる。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、鞘翅目有害生物の防除に有用な核酸分子を、鞘翅目有害生物への給餌基質、例えば、栄養組成物で提供することができる。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、鞘翅目有害生物の防除に有用な核酸分子を、鞘翅目有害生物に摂取させる核酸分子を含む植物物質の摂取を介して施すことができる。特定の実施形態では、核酸分子が、例えば、組換え核酸配列を含むベクターによる植物細胞の形質転換および形質転換された植物細胞からの植物物質または全植物体の再生を介して植物物質へと導入された組換え核酸配列の発現を経て植物物質中に存在する。
【０１９９】
Ｂ．ＲＮＡｉを介する標的遺伝子の抑制
実施形態では、本発明は、例えば、標的配列と特異的に相補的なヌクレオチド配列を含む、少なくとも１つの鎖を含むｉＲＮＡ分子をデザインすることにより、鞘翅目有害生物（例えば、ＷＣＲまたはＮＣＲ）のゲノムおよび／またはｃＤＮＡライブラリーにおいて不可欠な天然のヌクレオチド配列（例えば、不可欠な遺伝子）を標的とするようにデザインしうるｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｈｐＲＮＡ）を提供する。このようにデザインされたｉＲＮＡ分子の配列は、標的配列と同一な場合もあり、ｉＲＮＡ分子とその標的配列との特異的なハイブリダイゼーションを阻止しないミスマッチを組み込む場合もある。
【０２００】
本発明のｉＲＮＡ分子は、鞘翅目有害生物において遺伝子を抑制し、これにより、植物（例えば、ｉＲＮＡ分子を含み、保護される形質転換植物）において有害生物により引き起こされる虫害のレベルまたは発生率を低減する方法において用いることができる。本明細書で用いられる「遺伝子抑制」という用語は、発現の転写後阻害および転写の抑制を包含する、遺伝子またはコード配列からのタンパク質の発現の低減を含め、ｍＲＮＡへの遺伝子転写およびその後におけるｍＲＮＡの翻訳の結果として生成したタンパク質のレベルを低減するよく知られた方法のうちのいずれかを指す。転写後阻害は、遺伝子から転写されたｍＲＮＡまたは抑制の標的とされたコード配列の全部または一部と、抑制に用いられる対応するｉＲＮＡ分子との間の特異的な相同性を介する。かつ、転写後阻害は、細胞においてリボソームに結合可能なｍＲＮＡ量の実質的で測定可能な低減を指す。
【０２０１】
ｉＲＮＡ分子がｄｓＲＮＡ分子である実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子を、酵素であるＤＩＣＥＲにより、短鎖のｓｉＲＮＡ分子（約２０ヌクレオチドの長さである）へと切断することができる。ｄｓＲＮＡ分子に対するＤＩＣＥＲ活性を介して生成する二本鎖ｓｉＲＮＡ分子は、２つの一本鎖ｓｉＲＮＡ：「パッセンジャー鎖」および「ガイド鎖」へと分離することができる。パッセンジャー鎖は、分解することが可能であり、ガイド鎖は、ＲＩＳＣへと組み込むことができる。転写後阻害は、ガイド鎖の、ｍＲＮＡ分子の特異的に相補的な配列との特異的なハイブリダイゼーション、および酵素であるＡｒｇｏｎａｕｔｅ（ＲＩＳＣ複合体の触媒成分）を介するその後の切断を介して生じる。
【０２０２】
本発明の実施形態では、ｉＲＮＡ分子の任意の形態を用いることができる。当業者は、ｄｓＲＮＡ分子は典型的に、調製時およびｉＲＮＡ分子を細胞へと施すステップにおいて一本鎖ＲＮＡ分子より安定的であり、また、細胞においても典型的により安定的であることを理解するであろう。したがって、一部の実施形態では、例えば、ｓｉＲＮＡ分子およびｍｉＲＮＡ分子は同等に効果的でありうるが、ｄｓＲＮＡ分子は、その安定性のために選択することができる。
【０２０３】
具体的な実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、鞘翅目有害生物のゲノム内のヌクレオチド配列によりコードされる核酸分子と実質的に相同なｉＲＮＡ分子を生成させるように発現させうるヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて転写されたｉＲＮＡ分子が、ステムループ構造を含む安定化ｄｓＲＮＡ分子でありうる。翅目有害生物が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて転写されたｉＲＮＡ分子に接触した後は、鞘翅目有害生物における標的遺伝子（例えば、不可欠な遺伝子）の転写後阻害が生じうる。
【０２０４】
本発明の一部の実施形態では、ヌクレオチド配列の少なくとも１９の連続ヌクレオチドを含む核酸分子の発現を、鞘翅目有害生物における標的遺伝子を転写後阻害する方法であって、ヌクレオチド配列が配列番号２；配列番号２の相補体；配列番号２の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号２の少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号２を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コード配列；配列番号２を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の相補体；配列番号２を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列；配列番号２を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の相補体；配列番号２を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号２を含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号２を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；および配列番号２を含む天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択される方法において用いる。特定の実施形態では、核酸分子が、配列番号５〜８、１１２、および／または１１３のうちのいずれかの全部または一部（例えば、配列番号５および６のうちのいずれかの全部または一部）を含む。特定の実施形態では、前出のうちのいずれかと少なくとも８０％同一な（例えば、８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、および１００％同一な）核酸分子の発現を用いることができる。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、鞘翅目有害生物の少なくとも１つの細胞内に存在するＲＮＡ分子に特異的にハイブリダイズする核酸分子を発現させることができる。
【０２０５】
これらの実施形態およびさらなる実施形態では、ヌクレオチド配列の少なくとも１９の連続ヌクレオチドを含む、少なくとも１つのさらなる核酸分子の発現を、鞘翅目有害生物における標的遺伝子を転写後阻害する方法であって、ヌクレオチド配列が配列番号１；配列番号１の相補体；配列番号３；配列番号３の相補体；配列番号４；配列番号４の相補体；配列番号１、３、および４のうちのいずれかの少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号１、３、および４のうちのいずれかの少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号１、３、および４のうちのいずれかを含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コード配列；配列番号１、３、および４のうちのいずれかを含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の相補体；配列番号１、３、および４のうちのいずれかを含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列；配列番号１、３、および４のうちのいずれかを含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の相補体；配列番号１、３、および４のうちのいずれかを含むディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；配列番号１、３、および４のうちのいずれかを含む、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体；配列番号１、３、および４のうちのいずれかを含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片；および配列番号１、３、および４のうちのいずれかを含む、天然のＲＮＡ分子へと転写される、ディアブロティカ（Diabrotica）属生物の天然の非コード配列の、少なくとも１９の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択される方法において用いることができる。特定の実施形態では、前出のうちのいずれかと少なくとも８０％同一な（例えば、８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、および１００％同一な）核酸分子の発現を用いることができる。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、鞘翅目有害生物の少なくとも１つの細胞内に存在するＲＮＡ分子に特異的にハイブリダイズする核酸分子を発現させることができる。
【０２０６】
ＲＮＡｉによる転写後阻害系は、遺伝子の突然変異、株の多型、または進化的分岐に起因することが予測されうる、標的遺伝子における配列の変化を許容しうることが、本発明の一部の実施形態の重要な特色である。導入された核酸分子が、標的遺伝子の一次転写産物または完全にプロセシングされたｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズ可能である限りにおいて、導入された核酸分子は、標的遺伝子の一次転写産物または完全にプロセシングされたｍＲＮＡと絶対的に相同である必要はない場合がある。さらに、導入された核酸分子は、標的遺伝子の一次転写産物または完全にプロセシングされたｍＲＮＡと比べて全長核酸分子である必要はない場合がある。
【０２０７】
本発明のｉＲＮＡ法を用いる標的遺伝子の阻害は、配列特異的である、すなわち、ｉＲＮＡ分子（複数可）と実質的に相同なヌクレオチド配列を遺伝子阻害の標的とする。一部の実施形態では、標的遺伝子配列の一部と同一なヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子を阻害に用いることができる。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、標的遺伝子配列と比べて１カ所または複数カ所の挿入、欠失、および／または点突然変異を伴うヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子を用いることができる。具体的な実施形態では、ｉＲＮＡ分子と標的遺伝子の一部とは、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％、および１００％の配列同一性を共有しうる。代替的に、ｄｓＲＮＡ分子の二重鎖領域は、標的遺伝子転写物の一部と特異的にハイブリダイズ可能でもありうる。特異的にハイブリダイズ可能な分子では、より大きな相同性を呈示する全長未満の配列が、より長い、相同性の小さな配列を相殺する。標的遺伝子転写物の一部と同一なｄｓＲＮＡ分子の二重鎖領域のヌクレオチド配列の長さは、少なくとも約２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または少なくとも約１０００塩基でありうる。一部の実施形態では、２０〜１００ヌクレオチドを超える配列を用いることができる。具体的な実施形態では、約２００〜３００ヌクレオチドを超える配列を用いることができる。具体的な実施形態では、標的遺伝子のサイズに応じて、約５００〜１０００ヌクレオチドを超える配列を用いることができる。
【０２０８】
特定の実施形態では、著明な阻害が生じるように、鞘翅目有害生物における標的遺伝子の発現を、鞘翅目有害生物の細胞において、少なくとも１０％、少なくとも３３％、少なくとも５０％、または少なくとも８０％阻害することができる。著明な阻害とは、検出可能な表現型（例えば、成長の停止、摂食の停止、発育の停止、および害虫の死滅など）、または阻害される標的遺伝子に対応するＲＮＡおよび／または遺伝子産物の検出可能な減少を結果としてもたらす閾値を超えた阻害を指す。本発明の特定の実施形態では、鞘翅目有害生物の実質的に全ての細胞において阻害が生じるが、他の実施形態では、標的遺伝子を発現させる細胞のサブセットだけにおいて阻害が生じる。
【０２０９】
一部の実施形態では、転写の抑制は、「プロモーターのトランス抑制」と称する事象をもたらす、プロモーターのＤＮＡ配列またはその相補体に対する実質的な配列同一性を呈示するｄｓＲＮＡ分子の細胞における存在によって介在される。遺伝子抑制は、鞘翅目有害生物であって、例えば、ｄｓＲＮＡ分子を含有する植物物質を摂取するかまたはこれに接触することにより、このようなｄｓＲＮＡ分子を摂取するかまたはこれに接触しうる、鞘翅目有害生物における標的遺伝子に対して効果的でありうる。プロモーターのトランス抑制において用いられるｄｓＲＮＡ分子は、鞘翅目有害生物の細胞における１または複数の相同であるかまたは相補的な配列の発現を阻害または抑制するように、特別にデザインすることができる。植物細胞における遺伝子発現を制御する、アンチセンスに配向するかまたはセンスに配向したＲＮＡを介する転写後遺伝子抑制は、米国特許第５，１０７，０６５号；同第５，７５９，８２９号；同第５，２８３，１８４号；および同第５，２３１，０２０号において開示されている。
【０２１０】
Ｃ．鞘翅目有害生物へと施されたｉＲＮＡ分子の発現
鞘翅目有害生物におけるＲＮＡｉを介する遺伝子阻害のためのｉＲＮＡ分子の発現は、多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏフォーマットまたはｉｎ  ｖｉｖｏフォーマットのうちの任意の１つにより実施することができる。次いで、例えば、ｉＲＮＡ分子を有害生物と接触させることによりｉＲＮＡ分子を鞘翅目有害生物へと施すこともでき、有害生物にｉＲＮＡ分子を摂取させることによりこれを施すこともでき、ｉＲＮＡ分子を他の形で内部化することによりこれを施すこともできる。本発明の一部の実施形態は、鞘翅目有害生物の形質転換された宿主植物体、形質転換された植物細胞、および形質転換された植物体の後代を包含する。形質転換された植物細胞および形質転換された植物体を操作して、例えば、異種プロモーターの制御下で、ｉＲＮＡ分子のうちの１または複数を発現させて、有害生物からの保護効果をもたらすことができる。したがって、摂食時の鞘翅目有害生物にトランスジェニック植物体またはトランスジェニック植物細胞を摂取させると、有害生物に、トランスジェニック植物体またはトランスジェニック細胞において発現したｉＲＮＡ分子を摂取させることができる。本発明のヌクレオチド配列はまた、多種多様な原核生物および真核生物の微生物宿主に導入して、ｉＲＮＡ分子を生成させることもできる。「微生物」という用語は、細菌および真菌などの原核生物種および真核生物種を包含する。
【０２１１】
遺伝子発現のモジュレーションは、このような発現の部分的な抑制または完全な抑制を包含しうる。別の実施形態では、鞘翅目有害生物における遺伝子発現を抑制する方法が、有害生物の宿主の組織に、遺伝子抑制量の少なくとも１つのｄｓＲＮＡ分子であって、その少なくとも１つのセグメントが鞘翅目有害生物の細胞内のｍＲＮＡ配列と相補的な、本明細書で記載されるヌクレオチド配列から転写されるｄｓＲＮＡ分子を施すステップを含む。本発明に従う、病原性微生物が摂取する、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｈｐＲＮＡ分子など、その修飾形態を含めたｄｓＲＮＡ分子は、配列番号１〜４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子から転写されるＲＮＡ分子と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％同一でありうる。したがって、本発明のｄｓＲＮＡ分子を転写するための非天然ヌクレオチド配列および組換えＤＮＡ構築物が含まれるがこれらに限定されない、単離されて実質的に精製された核酸分子であって、鞘翅目有害生物へと導入されると、鞘翅目有害生物における内因性のコード配列または標的コード配列の発現を抑制または阻害する核酸分子が提供される。
【０２１２】
具体的な実施形態は、植物寄生性鞘翅目有害生物における１または複数の標的遺伝子の転写後阻害および植物寄生性鞘翅目有害生物集団の防除のためのｉＲＮＡ分子を送達するための送達系を提供する。一部の実施形態では、送達系が、宿主であるトランスジェニック植物細胞または宿主細胞において転写されるＲＮＡ分子を含む宿主細胞の内容物の摂取を含む。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、安定化させた本発明のｄｓＲＮＡ分子を転写する組換えＤＮＡ構築物を含有するトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物体を創出する。特定のｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むトランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物体を、組換えＤＮＡ法（当技術分野では、この基本的技法がよく知られている）を使用することにより生成させて、本発明のｉＲＮＡ分子（例えば、安定化させたｄｓＲＮＡ分子）をコードするヌクレオチド配列を含む植物体の形質転換ベクターを構築し；植物細胞または植物体を形質転換し；転写されたｉＲＮＡ分子を含有するトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物体を生成させることができる。
【０２１３】
鞘翅目有害生物に対する抵抗性をトランスジェニック植物体に付与するために、例えば、組換えＤＮＡ分子を、ｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、またはｈｐＲＮＡ分子などのｉＲＮＡ分子へと転写することができる。一部の実施形態では、組換えＤＮＡ分子から転写されるＲＮＡ分子は、組換え植物体の組織内または体液中にｄｓＲＮＡ分子を形成しうる。このようなｄｓＲＮＡ分子は、部分的に、宿主植物体に寄生しうる種類の鞘翅目有害生物内のＤＮＡ配列から転写される、対応するヌクレオチド配列と同一なヌクレオチド配列を含みうる。鞘翅目有害生物内の標的遺伝子の発現は、ｄｓＲＮＡ分子により抑制され、鞘翅目有害生物における標的遺伝子の発現の抑制は、鞘翅目有害生物に対して抵抗性であるトランスジェニック植物体を結果としてもたらす。ｄｓＲＮＡ分子のモジュレート効果は、有害生物において発現する多様な遺伝子であって、例えば、これらには細胞内代謝または細胞内形質転換の一因となる内因性の遺伝子が含まれ、これらには、ハウスキーピング遺伝子；転写因子；脱皮関連遺伝子；ならびに細胞内代謝または正常な成長および発育に関与するポリペプチドをコードする他の遺伝子が含まれる遺伝子に適用可能であることが示されている。
【０２１４】
一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるトランス遺伝子または発現構築物からの転写のために、調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、およびポリアデニル化シグナル）を用いて、１または複数のＲＮＡ鎖を転写させることができる。したがって、前出で示した通り、一部の実施形態では、ｉＲＮＡ分子を生成させるのに用いられるヌクレオチド配列を、植物の宿主細胞において機能的な１または複数のプロモーター配列に作動可能に連結することができる。プロモーターは、通常宿主ゲノム内に常在する内因性のプロモーターでありうる。作動可能に連結されたプロモーター配列の制御下にある本発明のヌクレオチド配列は、その転写および／または結果として得られる転写物の安定性に有利な影響を及ぼすさらなる配列でさらに挟むことができる。このような配列は、作動可能に連結されたプロモーターの上流、発現構築物の３’端の下流に配置することができ、プロモーターの上流および発現構築物の３’端の下流のいずれにおいても生じうる。
【０２１５】
一部の実施形態は、植物を常食とする鞘翅目有害生物により引き起こされる、宿主植物体（例えば、トウモロコシ植物体）に対する虫害を低減する方法であって、宿主植物体に、本発明の少なくとも１つの核酸分子を発現させる形質転換された植物細胞を施すステップを含み、核酸分子（複数可）が、鞘翅目有害生物により取り込まれると、鞘翅目有害生物における標的配列の発現を阻害するように機能し、この発現の阻害が、鞘翅目有害生物の死滅、成長の低減、および／または生殖の減殺を結果としてもたらし、これにより、鞘翅目有害生物により引き起こされる宿主植物体に対する虫害を低減する方法を提供する。一部の実施形態では、核酸分子（複数可）が、ｄｓＲＮＡ分子を含む。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、核酸分子（複数可）は、各々が鞘翅目有害生物の細胞内で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能な複数のヌクレオチド配列を含むｄｓＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態では、核酸分子（複数可）が、鞘翅目有害生物の細胞内で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能な１つのヌクレオチド配列からなる。
【０２１６】
一部の実施形態では、穀物トウモロコシの収率を増大させる方法であって、本発明の少なくとも１つの核酸分子をトウモロコシ植物体へと導入するステップと；トウモロコシ植物体を栽培して核酸配列を含むｉＲＮＡ分子を発現させるステップとを含み、核酸配列を含むｉＲＮＡ分子の発現が、鞘翅目有害生物の虫害および／または成長を阻害し、これにより、鞘翅目有害生物の発生に起因する収率の損失を軽減するかまたは消失させる方法が提供される。一部の実施形態では、ｉＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子である。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、核酸分子（複数可）は、各々が、鞘翅目有害生物の細胞内で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能な複数のヌクレオチド配列を含むｄｓＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態では、核酸分子（複数可）は、鞘翅目有害生物の細胞内で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能な１つのヌクレオチド配列からなる。
【０２１７】
一部の実施形態では、鞘翅目有害生物における標的遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、植物細胞を、本発明の少なくとも１つの核酸分子をコードする核酸配列であって、プロモーターおよび転写終結配列に作動的に連結されたヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換するステップと；形質転換された植物細胞を、複数の形質転換された植物細胞を包含する植物細胞培養物を生じさせるのに十分な条件下で培養するステップと；核酸分子をそれらのゲノムへと組み込んだ形質転換植物細胞を選択するステップと；形質転換された植物細胞を、組み込まれた核酸分子によりコードされるｉＲＮＡ分子の発現についてスクリーニングするステップと；ｉＲＮＡ分子を発現させるトランスジェニック植物細胞を選択するステップと；選択されたトランスジェニック植物細胞を鞘翅目有害生物に摂食させるステップとを含む方法が提供される。植物体はまた、組み込まれた核酸分子によりコードされるｉＲＮＡ分子を発現させる、形質転換された植物細胞から再生させることもできる。一部の実施形態では、ｉＲＮＡ分子がｄｓＲＮＡ分子である。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、核酸分子（複数可）は、各々が鞘翅目有害生物の細胞内で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能な複数のヌクレオチド配列を含むｄｓＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態では、核酸分子（複数可）は、鞘翅目有害生物の細胞内で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能な１つのヌクレオチド配列からなる。
【０２１８】
本発明のｉＲＮＡ分子は、植物細胞のゲノムへと組み込まれる組換え遺伝子からの発現産物として植物種（例えば、トウモロコシ）の種子内に組み込むこともでき、植え付ける前に種子に適用されるコーティングまたは種子の処置へと組み込まれるものとして植物種（例えば、トウモロコシ）の種子表面に組み込むこともできる。組換え遺伝子を含む植物細胞は、トランスジェニックイベントであると考えられる。また、ｉＲＮＡ分子を鞘翅目有害生物へと送達するための送達系も包含される。例えば、本発明のｉＲＮＡ分子 は、鞘翅目有害生物の細胞へと直接導入することができる。導入する方法には、ｉＲＮＡの鞘翅目有害生物の宿主に由来する植物組織との直接的な混合のほか、本発明のｉＲＮＡ分子を含む組成物の宿主植物体組織への適用も含まれる。例えば、ｉＲＮＡ分子を、植物表面へと噴霧することができる。代替的に、微生物を介してｉＲＮＡ分子を発現させ、微生物を植物表面へと適用することもでき、注射などの物理的手段を介して根または茎へと導入することもできる。また、前出で論じた通り、トランスジェニック植物体を遺伝子的に操作して、植物体に発生することが知られている鞘翅目有害生物を死滅させるのに十分な量で少なくとも１つのｉＲＮＡ分子を発現させることもできる。また、化学合成または酵素的合成を介して生成させたｉＲＮＡ分子を、一般的な農作業に見合った形で処方し、植物病害を防除するためのスプレー式の製品として用いることもできる。処方物は、葉面を効率的に覆うのに要請される適切な粘着剤および湿潤剤のほか、ｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）を紫外線損傷から保護するための紫外線保護剤を包含しうる。このような添加剤は、バイオ殺虫剤業界で一般に用いられており、当業者によく知られている。このような適用は、他のスプレー式の殺虫剤適用（生物学法ベースの適用または他の形の適用）と組み合わせて、植物の鞘翅目有害生物からの保護を増強することができる。
【０２１９】
本明細書で引用される刊行物、特許、および特許出願を含めた全ての参考文献は、それらが本開示の明示的な詳細と矛盾しない程度に参照により本明細書に組み込まれ、各参考文献が参照により組み込まれることが個別にかつ具体的に指示され、本明細書でその全体において示されたと仮定した場合と同じ程度にこのように組み込まれる。本明細書で論じられる参考文献は、本出願の出願日以前におけるそれらの開示だけを目的に提示される。本明細書におけるいずれの内容も、先行の発明のために、本発明者らがこのような開示に先行する権利が与えられていないことの容認としてみなされるべきではない。
【０２２０】
以下の実施例は、特定の具体的な特色および／または態様を例示するために提供される。これらの実施例は、本開示を、記載された特定の特色または態様に限定するものとしてみなすべきではない。
（実施例）
【実施例１】
【０２２１】
材料および方法
試料の調製およびバイオアッセイ
ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＮＡｉキット（ＡＭＢＩＯＮ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて、多数のｄｓＲＮＡ分子（Ｃａｆ１−１８０；液胞ＡＴＰアーゼ（ｖ−ＡＴＰアーゼ）サブユニットＣ領域１；ｖ−ＡＴＰアーゼサブユニットＣ領域２；ｖ−ＡＴＰアーゼサブユニットＨ領域１；ｖ−ＡＴＰアーゼサブユニットＨ領域２；およびＲｈｏ１を含めた）を合成および精製した。精製されたｄｓＲＮＡ分子はＴＥ緩衝液中で調製し、全てのバイオアッセイは、この緩衝液からなる対照処置であって、ＷＣＲの死滅または成長阻害についてのバックグラウンドの基準として用いられる対照処置を含有した。バイオアッセイ緩衝液中のｄｓＲＮＡ分子の濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）８０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いて測定した。
【０２２２】
新生虫の幼虫に人工の害虫用食餌を施すバイオアッセイにおいて、試料を害虫の活動性について調べた。ＷＣＲの卵は、Ｃｒｏｐ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＮ）から得た。
【０２２３】
害虫バイオアッセイ専用にデザインした１２８ウェルのプラスチック製トレー（Ｃ−Ｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｉｔｍａｎ、ＮＪ）によりバイオアッセイを実施した。各ウェルは、鞘翅目の害虫を成長させるためにデザインされた約１．０ｍＬの食餌を含有した。タンパク質試料のアリコート６０μＬずつを、各ウェル（４０μＬ／ｃｍ２）の１．５ｃｍ２の食餌表面へと、ピペットを介して送達した。ｄｓＲＮＡ試料の濃度は、ウェルの表面積１平方センチメートル当たりのｄｓＲＮＡ量（ｎｇ／ｃｍ２）として計算した。処理したトレーは、食餌表面の液体が蒸発するか、または食餌へと吸収されるまで、ドラフト内で保持した。
【０２２４】
孵化後数時間以内に、加湿したラクダ体毛ブラシで個別の幼虫を採取し、処理した食餌の上に置いた（ウェル１つ当たり１匹または２匹ずつの幼虫）。次いで、１２８ウェルのプラスチック製トレーの虫を群棲させたウェルを透明なプラスチック製の接着シートで密封し、換気してガスを交換させた。バイオアッセイトレーは、制御された環境条件（２８℃、相対湿度約４０％、１６：８［明期：暗期］）の下で９日間にわたり保持し、その後、各試料に曝露した害虫の総数、死滅した害虫の数、および生存する害虫の体重を記録した。各処置について、死滅百分率、平均生存時体重、および成長阻害を計算した。成長阻害は、平均生存時体重の減少として定義した。成長阻害（ＧＩ）は、以下の通りに計算した：
ＧＩ＝［１−（ＴＷＩＴ／ＴＮＩＴ）／（ＴＷＩＢＣ／ＴＮＩＢＣ）］
［式中、ＴＷＩＴは、処置時における生存害虫の全体重であり；ＴＮＩＴは、処置時における害虫の総数であり；ＴＷＩＢＣは、バックグラウンドの基準（緩衝液対照）時における生存害虫の全体重であり；ＴＮＩＢＣは、バックグラウンドの基準（緩衝液対照）時における害虫の総数である］。
【０２２５】
ＧＩ５０は、ＧＩ値が５０％となるときの食餌中の試料濃度となるように決定する。ＬＣ５０（５０％の致死濃度）は、被験害虫のうちの５０％が死滅するときの食餌中の試料濃度として記録する。ＪＭＰ（商標）ソフトウェア（ＳＡＳ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて、統計学的解析を行った。
【０２２６】
多連のバイオアッセイにより、試料の摂取は、コーンルートワーム幼虫に対する驚くべき、かつ、予測外の死滅および成長阻害を結果としてもたらすことが裏付けられた。
【実施例２】
【０２２７】
候補標的遺伝子の同定
初齢ＷＣＲ幼虫は、この成長段階におけるトランスジェニック昆虫抵抗法による防除であれば有利であるため、トランスクリプトーム解析のために選択した。
【０２２８】
約０．９ｇｍの初齢ＷＣＲ幼虫（セイヨウトウモロコシ根虫（Diabrotica virgifera virgifera LeConte）；孵化の４〜５日後、１６℃で保持した）の完全体から全ＲＮＡを単離し、以下のフェノール／ＴＲＩ  ＲＥＡＧＥＮＴ（登録商標）ベースの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ；型番：ＴＲ１１８）を用いて精製した。
【０２２９】
１０ｍＬのＴＲＩ  ＲＥＡＧＥＮＴ（登録商標）を伴う１５ｍＬのホモジナイザー内、室温で、均一な懸濁液が得られるまで幼虫をホモジナイズした。室温で５分間にわたるインキュベーション後、ホモジネートを１．５ｍＬのマイクロ遠心管（試験管１本当たり１ｍＬずつ）へと分注し、２００μＬのクロロホルムを添加し、混合物を１５秒間にわたり十分に振とうした。室温で１０分間にわたり静置して抽出を可能とした後、４℃、１２，０００×ｇの遠心分離を介して相を分離した。上相（約０．６ｍＬを構成する）を別の１．５ｍＬの滅菌試験管へと注意深く移し、室温の等容量（０．６ｍＬ）のイソプロパノールを添加した。室温で５〜１０分間にわたるインキュベーションの後、混合物を、１２，０００×ｇ（４℃または２５℃）で８分間にわたり遠心分離した。
【０２３０】
上清を注意深く除去および廃棄し、７５％のエタノールでボルテックスすることによりＲＮＡペレットを２回にわたり洗浄し、各回の洗浄の後、７，５００×ｇ（４℃または２５℃）で５分間にわたる遠心分離を介して回収した。エタノールを注意深く除去し、ペレットを３〜５分間にわたり通気乾燥させ、次いで、ヌクレアーゼを含まない滅菌水中で溶解させた。２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ）を測定することにより、ＲＮＡ濃度を決定した。約０．９ｇの幼虫からの典型的な抽出により、１ｍｇを超える全ＲＮＡがもたらされ、Ａ２６０／Ａ２８０比は１．９であった。こうして抽出されたＲＮＡは、さらにプロセシングするまで−８０℃で保管した。
【０２３１】
ＲＮＡの品質は、アリコートを、１％のアガロースゲル中で泳動させることにより決定した。アガロースゲル溶液は、オートクレーブ処理した１０×のＴＡＥ緩衝液（トリス酢酸ＥＤＴＡ；１×濃度とは、０．０４Ｍのトリス酢酸である）、オートクレーブ処理した容器内のＤＥＰＣ（ジエチルピロカルボネート）処理水で希釈した１ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩、ｐＨ８．０）を用いて作製した。１×のＴＡＥは、ランニングバッファーとして用いた。使用前に、ＲＮＡｓｅＡｗａｙ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により、電気泳動タンクおよびウェルフォーミングコームを洗浄した。２μＬのＲＮＡ試料を、８μＬのＴＥ緩衝液（ｐＨ７．０の１０ｍＭトリスＨＣｌ；１ｍＭのＥＤＴＡ）および１０μＬのＲＮＡ試料用緩衝液（Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標）；型番：７０６０６；ＥＭＤ４  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）と混合した。試料を７０℃で３分間にわたり加熱し、室温まで冷却し、ウェル１つ当たり５μＬずつを投入した（１μｇ〜２μｇのＲＮＡを含有する）。分子サイズ比較のために、市販のＲＮＡ分子量マーカーを、個別のウェル内で同時に泳動させた。ゲルは、６０ｖで２時間にわたり泳動させた。
【０２３２】
市販のサービスプロバイダー（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）を介して、ランダムプライミングを用いて、幼虫の全ＲＮＡから標準化されたｃＤＮＡライブラリーを調製した。
【０２３３】
標準化された幼虫のｃＤＮＡライブラリーを、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎにおいて、ＧＳ  ＦＬＸ  ４５４  Ｔｉｔａｎｉｕｍ（商標）シリーズの化学反応を介して、１／２のプレートスケールで配列決定した結果として、平均の読取り長を３４８ｂｐとする６００，０００超の読取りがもたらされた。３５０，０００の読取りを、５０，０００超のコンティグへと編成した。一般に公開されるプログラムであるＦＯＲＭＡＴＤＢ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）から入手可能である）を用いて、未編成の読取りおよびコンティグの両方を、ＢＬＡＳＴａｂｌｅデータベースへと変換した。
【０２３４】
ショウジョウバエ（Drosophila）属およびトリボリウム（Tribolium）属などの他の害虫における特定の遺伝子による致死性のＲＮＡｉ効果に関する情報を用いて、ＲＮＡｉの標的とするための候補遺伝子を選択した。これらの遺伝子は、鞘翅目の害虫における生存および成長に不可欠であると仮定された。選択された標的遺伝子の相同体を、以下で記載するトランスクリプトーム配列データベースにおいて同定した。ＰＣＲを介して標的遺伝子の全長配列または部分配列を増幅し、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を生成させるための鋳型を調製した。
【０２３５】
候補タンパク質のコード配列を用いるＴＢＬＡＳＴＮ検索は、ディアブロティカ（Diabrotica）属配列についての未編成の読取りまたは編成されたコンティグを含有するＢＬＡＳＴａｂｌｅデータベースに照らして行った。ディアブロティカ（Diabrotica）属配列への有意なヒット（コンティグの相同性についてｅ−２０を超え、未編成の配列読取りの相同性についてｅ−１０を超えると定義される）は、ＮＣＢＩ  ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ  ｄａｔａｂａｓｅに照らしてＢＬＡＳＴＸを用いて確認した。このＢＬＡＳＴＸ検索の結果により、ＴＢＬＡＳＴＮ検索において同定されたディアブロティカ（Diabrotica）属の相同体の候補遺伝子配列が、実際に、ディアブロティカ（Diabrotica）属の遺伝子を含むか、またはディアブロティカ（Diabrotica）属の配列において検索可能な、ディアブロティカ（Diabrotica）属以外の候補遺伝子配列への最良のヒットであることが確認された。大半の場合において、タンパク質をコードすると注記されたトリボリウム（Tribolium）属の候補遺伝子は、ディアブロティカ（Diabrotica）属のトランスクリプトーム配列における１または複数の配列との明白な配列相同性を示した。少数の場合において、ディアブロティカ（Diabrotica）属以外の候補遺伝子との相同性により選択されたディアブロティカ（Diabrotica）属のコンティグまたは未編成の配列読取りの一部は重複するが、コンティグの編成によりこれらの重複を接合することはできないことが明確であった。これらの場合には、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）ｖ４．９（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて、配列をより長いコンティグへと編成した。
【０２３６】
配列番号１〜４を含めた複数の候補標的遺伝子を、ＷＣＲにおいて鞘翅目有害生物の死滅または成長、発育、もしくは生殖の阻害をもたらしうる遺伝子として同定した。ディアブロティカ（Diabrotica）属の候補遺伝子相同体の配列の全長クローンまたは部分クローンを用いて、ｄｓＲＮＡを合成するためのＰＣＲ用単位複製配列を生成させた。
【０２３７】
配列番号１は、Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ４７１８５に対応し、これは、Ｃａｆ１−１８０の相同体であり、本明細書では、Ｃａｆ１−１８０と称する。ショウジョウバエ（Drosophila）属のＣａｆ１−１８０は、新たに合成されたＤＮＡおよびＣａｆ１−１８０へとヒストンを送達するときに機能することが示されている。ショウジョウバエ（Drosophila）属のＣａｆ１−１８０における機能喪失突然変異は、幼虫の成長および発育の停止、ならびに幼虫の死滅を引き起こすことが示されている（Klapholzら（2009）、Chromosoma 118（2）: 235〜48；Tylerら（2001）、Mol. Cell Biol. 21（19）: 6574〜84；Songら（2007）、Dev. Biol. 311（1）: 213〜22）。
【０２３８】
配列番号２は、Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ１２２９に対応し、これは、液胞ＡＴＰアーゼサブユニットＣの相同体であり、本明細書では、ＶａｔｐａｓｅＣと称する。配列番号５〜８は、ＶａｔｐａｓｅＣの不連続配列の断片である。
【０２３９】
配列番号３は、Ｄ＿ｖｉｒ＿ｃ１３１９に対応し、これは、液胞ＡＴＰアーゼサブユニットＨの相同体であり、本明細書では、ＶａｔｐａｓｅＨと称する。配列番号９〜１１は、ＶａｔｐａｓｅＨの不連続配列の断片である。
【０２４０】
ショウジョウバエ（Drosophila）属の液胞ＡＴＰアーゼは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に関与するマルチサブユニットのプロトン輸送体である（Vaccariら（2010）、Development 137（11）: 1825〜32）。ショウジョウバエ（Drosophila）属の液胞ＡＴＰアーゼサブユニットにおける機能喪失突然変異は、劣性の致死性突然変異であることが示されている（Allanら（2005）、Physiol. Genomics 22（2）: 128〜38；およびDaviesら（1996）、J. Biol. Chem. 271（48）: 30677〜84）。ＶＡＴＰａｓｅＣ（Ｖｈａ４４）およびＶＡＴＰａｓｅＨ（ＶｈａＳＦＤ）は、ショウジョウバエ（Drosophila）属の液胞ＡＴＰアーゼのサブユニットのうちの２つである。
【０２４１】
配列番号４は、Ｃｏｎｔｉｇ＿０１＿Ｒｈｏ１＿１−１９１＿ＣＤＣ４２であり、本明細書ではＲｈｏ１と称する。ショウジョウバエ（Drosophila）属のＲｈｏ１は、アクチンフィラメントの編成および解体を制御するときに機能し、ショウジョウバエ（Drosophila）属のＲｈｏ１における機能喪失突然変異は、細胞内の成分運動、シナプスのリモデリング、幼虫の発育、およびストレスへの応答に著明な影響を及ぼす（Foxら（2005）、Development 132（21）: 4819〜31；Kadandaleら（2010）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107（23）: 10502〜7；Rosales-Nievesら（2006）、Nat. Cell Biol. 8（4）: 367〜76；MagieおよびParkhurst（2005）、Dev. Biol. 278（1）: 144〜54；ならびにXuら（2008）、Dev. Biol. 321（1）: 88〜100）。
【実施例３】
【０２４２】
標的遺伝子の増幅
ＰＣＲを介して、各標的遺伝子のコード領域の一部を増幅するためのプライマーをデザインした。表１を参照されたい。必要な場合は、Ｔ７ファージのプロモーター配列（ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ（配列番号１２））を、増幅されたセンス鎖またはアンチセンス鎖の５’端へと組み込んだ。表１を参照されたい。ＷＣＲからゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ反応を介してゲノムＤＮＡから天然の標的遺伝子配列の全部または一部を増幅するのにＰＣＲプライマーを用いた。
【０２４３】
【表１】
2014504863.tif 000003
【実施例４】
【０２４４】
ＲＮＡｉ構築物
ＰＣＲを介する鋳型の調製およびｄｓＲＮＡの合成
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてｄｓＲＮＡを生成させるための特異的な鋳型をもたらすのに用いた戦略を図１に示す。ｄｓＲＮＡの合成において用いることを意図する鋳型ＤＮＡは、表１のプライマー対およびＷＣＲの初齢幼虫から単離された全ＲＮＡから調製した第１鎖のｃＤＮＡを（ＰＣＲ鋳型として）用いるＰＣＲを介して調製した。選択された各標的遺伝子領域について、２つの個別のＰＣＲ増幅を実施した。第１のＰＣＲ増幅では、Ｔ７プロモーター配列を、増幅されたセンス鎖の５’端に導入した。第２の反応では、Ｔ７プロモーター配列を、アンチセンス鎖の５’端に組み込んだ。次いで、標的遺伝子の各領域についてＰＣＲ増幅した２つの断片をほぼ等量で混合し、ｄｓＲＮＡを生成させるための転写鋳型として混合物を用いた（図１）。製造元（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）の指示書に従い、Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＮＡｉキットを用いて、二本鎖ＲＮＡを合成および精製した。特定のプライマーにより増幅されるｄｓＲＮＡ鋳型の配列は、配列番号８６（Ｃａｆ１−１８０）；配列番号７および８（ＶａｔｐａｓｅＣ）；配列番号１０および１１（ＶａｔｐａｓｅＨ）；ならびに配列番号８７（Ｒｈｏ１）であった。ｄｓＲＮＡの濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）８０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いて測定した。
【０２４５】
植物体の形質転換ベクターの構築：方法１
標準的なＭｕｌｔｉＳｉｔｅ  Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）クローニング法を用いて、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）を介してトウモロコシ細胞を形質転換するためのヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）発現ベクターを構築した。形質転換の後でトウモロコシ細胞をスクリーニング／選択するのに利用する２つのマーカー遺伝子である、黄色蛍光タンパク質遺伝子（ＹＦＰ；Shaginら（2004）、Mol. Biol. Evol. 21（5）: 841〜50）および除草剤耐性遺伝子（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）；Wehrmannら（1996）、Nat. Biotechnol. 14（10）: 1274〜8）のために、個別のエントリーベクターを構築した。これらの各々の発現は、コメアクチン１プロモーター（ＯｓＡｃｔ１；米国特許第５，６４１，８７６号）のコピーにより制御した。トウモロコシペルオキシダーゼ５遺伝子に由来する３’側非翻訳領域を含む断片（ＺｍＰｅｒ５の３’ＵＴＲ  ｖ２；米国特許第６，６９９，９８４号）を用いて、遺伝子の転写を終結させた。
【０２４６】
また、ｈｐＲＮＡを生成させるためにデザインした第３の種類のエントリーベクターも、Ｃａｆ１−１８０遺伝子またはＶａｔｐａｓｅＣ遺伝子の断片を利用して構築した。表２に示されるプライマーを用いてヘアピンを合成するために、Ｃａｆ１−１８０およびＶａｔｐａｓｅＣの標的遺伝子領域を増幅した。標的遺伝子断片の２つのコピーであって、ＳＴ−ＬＳ１イントロン配列（Vancanneytら（1990）、Mol. Gen. Genet. 220（2）: 245〜50）により隔てられる２つの断片を、互いと向かい合う配向性で配置する（単一の転写単位内で）ことにより、ＲＮＡの一次転写物による分子間のヘアピン形成を促進した。ｍＲＮＡ一次転写物の生成は、トウモロコシユビキチン１プロモーター（米国特許第５，５１０，４７４号）のコピーにより駆動した。したがって、 ｍＲＮＡ一次転写物は、２つの遺伝子断片配列を、イントロン配列により隔てられる大型で互いに逆行する反復配列として含有する。トウモロコシリパーゼ遺伝子に由来する３’側非翻訳領域（ＺｍＬｉｐの３’ＵＴＲ；米国特許第７，１７９，９０２号）を含む断片を用いて、遺伝子の転写を終結させた。
【０２４７】
【表２】
2014504863.tif 000004
【０２４８】
配列番号４９は、Ｃａｆ１−１８０ヘアピン形成配列を提示し、配列番号５０は、ＶａｔｐａｓｅＣヘアピン形成配列を提示する。
【０２４９】
Ｃａｆ１−１８０およびＶａｔｐａｓｅＣの各々について、ｈｐＲＮＡの発現エントリーベクターの２つの変化形を構築した。エントリーベクターの第１の変化形では、トウモロコシのコンセンサス翻訳開始コンテキスト配列は、第１の標的遺伝子断片配列の５’端に隣接して「順行の」配向性で存在する（すなわち、プロモーターに対してセンスの配向性にある）、ｍＲＮＡの５’側非翻訳リーダー配列に存在した。第２の変化形では、トウモロコシのコンセンサス翻訳開始配列を除外した。
【０２５０】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ  ＩＩ  ＰＬＵＳ（商標）を用いて、３つのエントリーベクターおよびデスティネーションベクター（ｐＤＡＢ１０４１２４）により、標準的なＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え反応を実施した。完成したｈｐＲＮＡ発現ベクターでは、ｈｐＲＮＡカセットを、ＹＦＰ遺伝子発現カセットとＰＡＴ遺伝子発現カセットとで挟んだ。
【０２５１】
ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）を介して形質転換するための断片の精製は、ＹＦＰ／ｈｐＲＮＡ／ＰＡＴ発現ベクターＤＮＡを、Ｂｃｌ  Ｉ（Ｃａｆ１−１８０構築物の場合）またはＢｂｓ  Ｉに加えたＡｆｅ  Ｉ（ＶａｔｐａｓｅＣ構築物の場合）で消化して、ベクター骨格内に存在する細菌のスペクチノマイシン抵抗性遺伝子を除去した後、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を介して調製的スケールで達成した。
【０２５２】
植物体の形質転換ベクターの構築：方法２
ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）デスティネーションベクター：標準的な一部位ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）クローニング法を用いて、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）を介してトウモロコシ細胞を形質転換するためのヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）発現ベクターを構築した。２つのマーカー遺伝子を、デスティネーションベクター（ｐＤＡＢ１０８９１６と称する）へと組み込み、形質転換の後でトウモロコシ細胞をスクリーニングおよび選択するのに利用した。黄色蛍光タンパク質遺伝子（ＹＦＰ；Shaginら（2004）、Mol. Biol. Evol. 21（5）: 841〜50）を目視によるスクリーニングに用い、除草剤耐性遺伝子（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）；Wehrmannら（1996）、Nat. Biotechnol. 14（10）: 1274〜8）を形質転換細胞の選択に用いた。２つのマーカー遺伝子の各々の発現は、トウモロコシ条斑ウイルスコートタンパク質遺伝子の５’ＵＴＲの一部（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：Ｘ０１６３３）およびトウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子に由来するイントロン１（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：Ｘ０４０４９）から編成されたキメラ５’ＵＴＲ配列を含む、サトウキビ桿状バドナウイルス（ＳＣＢＶ）プロモーター（米国特許第６，４８９，４６２号）の個別のコピーにより制御した。トウモロコシリパーゼ遺伝子に由来する３’ＵＴＲ（ＺｍＬｉｐの３’ＵＴＲ；米国特許第７，１７９，９０２号）を含む断片およびジャガイモ（バレイショ（Solanum tuberosum））ＳｔＰｉｎＩＩの３’ＵＴＲに由来する３’ＵＴＲを含む断片（Anら（1989）、Plant Cell. 1: 115〜122）を用いて、それぞれＹＦＰ遺伝子およびＰＡＴ遺伝子の転写を終結させた。
【０２５３】
ｈｐＲＮＡを生成させるためにデザインした第１のエントリーベクターは、Ｃａｆ１−１８０  ｖ３のセンス配列（＋ＳＴ−ＬＳ１イントロン）（配列番号９５）を保有するＤＮＡ断片およびＣａｆ１−１８０  ｖ３アンチセンス配列（配列番号９６）を保有する断片を利用して構築した。これらの断片は、市販品の販売業者（ＤＮＡ２．０；Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）に個別に合成させた。合成断片は、標準的なクローニング法を介して適切な配向性で接合し、配列番号９７のヘアピン形成構築物を形成し、構築物をエントリーベクター内のプロモーターと３’ＵＴＲ配列との間でクローニングした。ｍＲＮＡ一次転写物の生成は、トウモロコシユビキチン１プロモーター（米国特許第５，５１０，４７４号）のコピーにより駆動する一方、トウモロコシペルオキシダーゼ５遺伝子に由来する３’側非翻訳領域（ＺｍＰｅｒ５の３’ＵＴＲ  ｖ２、米国特許第６，６９９，９８４号）を含む配列を用いて、標的遺伝子断片の転写を終結させた。標的遺伝子断片の２つのコピーであって、ＳＴ−ＬＳ１イントロン配列（Vancanneytら（1990）、Mol. Gen. Genet. 220（2）: 245〜50）により隔てられる２つの断片を、互いと向かい合う配向性で配置する（単一の転写単位内で）ことにより、ＲＮＡの一次転写物による分子間のヘアピン形成を促進した。したがって、 ｍＲＮＡ一次転写物は、２つの遺伝子断片配列を、イントロン配列により隔てられる大型で互いに逆行する反復配列として含有する。
【０２５４】
ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ製のＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ  ＩＩ  ＰＬＵＳ（商標）を用いて、構築したＣａｆ−１８０  ｖ３ヘアピンエントリーベクターおよびデスティネーションベクターであるｐＤＡＢ１０８９１６による標準的なＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え反応を実施した。完成したＣａｆ−１８０  ｖ３  ｈｐＲＮＡ発現ベクター（ｐＤＡＢ１０９８３０）では、ＹＦＰ遺伝子発現カセットを、ｈｐＲＮＡ発現カセットとＰＡＴ遺伝子発現カセットとで挟んだ。
【０２５５】
同様にして、標準的な一部位ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニング法を用いて、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）を介するトウモロコシ細胞の形質転換のための他のヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）発現ベクターを構築した。これらのさらなるベクターは、ＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ３、ＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ４、ＶａｔｐａｓｅＨ  ｖ１、およびＲｈｏ１  ｖ１のためのｈｐＲＮＡ構築物を含んだ。
【０２５６】
標準的なクローニング法により適切な配向性（配列番号１００）で接合した、ＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ３のセンス（＋ＳＴ−ＬＳ１イントロン）配列（配列番号９８）およびＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ３のアンチセンス配列（配列番号９９）を含む合成断片を利用して、ｈｐＲＮＡを生成させるためにデザインした第２のエントリーベクターを構築した。ＶａｐｔａｓｅＣ  ｖ３エントリーベクターを、デスティネーションベクター（ｐＤＡＢ１０８９１６）によるＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニングに用いて、ＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ３  ｈｐＲＮＡ発現ベクターであるｐＤＡＢ１０９８２８を構築した。
【０２５７】
標準的なクローニング法により適切な配向性（配列番号１０３）で接合した、ＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ４のセンス（＋ＳＴ−ＬＳ１イントロン）配列（配列番号１０１）およびＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ４のアンチセンス配列（配列番号１０２）を含む合成断片を利用して、ｈｐＲＮＡを生成させるためにデザインした第３のエントリーベクターを構築した。ＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ４エントリーベクターを、デスティネーションベクター（ｐＤＡＢ１０８９１６）によるＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニングに用いて、ＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ４  ｈｐＲＮＡ発現ベクターであるｐＤＡＢ１０９８３８を構築した。
【０２５８】
標準的なクローニング法により適切な配向性（配列番号１０６）で接合した、ＶａｔｐａｓｅＨ  ｖ１のセンス（＋ＳＴ−ＬＳ１イントロン）配列（配列番号１０４）およびＶａｔｐａｓｅ  Ｈ  ｖ１のアンチセンス配列（配列番号１０５）を含む合成断片を利用して、ｈｐＲＮＡを生成させるためにデザインした第４のエントリーベクターを構築した。ＶａｔｐａｓｅＨ  ｖ１エントリーベクターを、デスティネーションベクター（ｐＤＡＢ１０８９１６）によるＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニングに用いて、ＶａｔｐａｓｅＨ  ｖ１  ｈｐＲＮＡ発現ベクターであるｐＤＡＢ１０９８２９を構築した。
【０２５９】
標準的なクローニング法により適切な配向性（配列番号１０９）で接合した、Ｒｈｏ１  ｖ１のセンス（＋ＳＴ−ＬＳ１イントロン）配列（配列番号１０７）およびＲｈｏ１  ｖ１のアンチセンス配列（配列番号１０８）を含む合成断片を利用して、ｈｐＲＮＡを生成させるためにデザインした第５のエントリーベクターを構築した。Ｒｈｏ１  ｖ１エントリーベクターを、デスティネーションベクター（ｐＤＡＢ１０８９１６）によるＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニングに用いて、Ｒｈｏ１  ｖ１  ｈｐＲＮＡ発現ベクターであるｐＤＡＢ１０９８３４を構築した。
【０２６０】
ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）を介する形質転換は、精製された環状プラスミドＤＮＡを用いて達成した（実施例９）。
【０２６１】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）属のデスティネーションベクター：標準的なＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）クローニング法を用いて、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属を介するトウモロコシ胚形質転換のためのヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）発現ベクターを構築した。Ｃａｆ−１８０  ｖ３、ＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ３、ＶａｔｐａｓｅＨ  ｖ１、およびＲｈｏ１  ｖ１のｈｐＲＮＡを生成させるために上記で調製したエントリーベクターを、デスティネーションベクター（ｐＤＡＢ１０８９１５）をアグロバクテリウム（Agrobacterium）属による植物体の形質転換のためのバイナリーベクターとして構築するＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニングに用いた。Ｔ−ＤＮＡのレフトボーダーの反復配列とライトボーダーの反復配列との間には、上記のＳＣＢＶプロモーターの転写制御下でＡＡＤ１タンパク質（米国特許第７，８３８，７３３号）をコードする配列を含む植物選択マーカー／除草剤耐性遺伝子を組み入れる。ａａｄ１  ｍＲＮＡの転写終結およびポリアデニル化は、本質的に、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）受託番号：ｇｂ｜Ｌ３５９１３．１｜ＭＺＥＬＩＰＡＳＥの塩基９２１〜１２７７として、米国特許第７，１７９，９０２号において開示される、トウモロコシリパーゼの３’ＵＴＲを介して決定した。結果として得られるｈｐＲＮＡのバイナリー発現ベクターを、ｐＤＡＢ１０９８１７（Ｃａｆ−１８０  ｖ３のための）、ｐＤＡＢ１０９８１５（ＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ３のための）、ｐＤＡＢ１０９８１６（ＶａｔｐａｓｅＨ  ｖ１のための）、およびｐＤＡＢ１０９８２１（Ｒｈｏ１  ｖ１のための）と名付けた。
【０２６２】
トウモロコシを形質転換するため、２０１１年７月２９日に出願されたＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０４６０２８号において記載される通り、ｈｐＲＮＡのバイナリー発現ベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のディスアームド株であるＤＡｔ１３１９２へと導入した。
【実施例５】
【０２６３】
候補標的遺伝子のスクリーニング
実施例２において同定された標的遺伝子配列の一部は阻害するが全ては阻害しないようにデザインした合成ｄｓＲＮＡを食餌ベースのアッセイにおいてＷＣＲへと投与したところ、死滅および成長阻害を引き起こした。このアッセイにおいて、Ｃａｆ１−１８０、ＶａｔｐａｓｅＣ、ＶａｔｐａｓｅＨ、およびＲｈｏ１は、スクリーニングされた他のｄｓＲＮＡを上回る有効性の大幅な増大を呈示することが観察された。
【０２６４】
多連のバイオアッセイにより、Ｃａｆ１−１８０（配列番号１１０）によるｄｓＲＮＡ；ＶａｔｐａｓｅＣ領域１（配列番号１１１）によるｄｓＲＮＡ；ＶａｔｐａｓｅＣ領域１の短鎖（配列番号１１２）によるｄｓＲＮＡ；ＶａｔｐａｓｅＣ領域２（配列番号１１３）によるｄｓＲＮＡ；ＶａｔｐａｓｅＨ領域１（配列番号１１４）によるｄｓＲＮＡ；ＶａｔｐａｓｅＨ領域２（配列番号１１５）によるｄｓＲＮＡ；およびＲｈｏ１（配列番号１１６）によるｄｓＲＮＡへと転写された構築物の各々の摂取が、驚くべきことに、セイヨウトウモロコシ根虫の幼虫の頑健な死滅および成長阻害を結果としてもたらすことが裏付けられた。表３および４は、これらのｄｓＲＮＡに対する９日間にわたる曝露後における、ＷＣＲ幼虫に対する食餌ベースの給餌バイオアッセイの結果を示す。図２〜４は、例示的な核酸分子で処理した鞘翅目有害生物の死滅および成長阻害についての変動図を示す。
【０２６５】
【表３】
2014504863.tif 000005
【０２６６】
【表４】
2014504863.tif 000006
【０２６７】
ディアブロティカ（Diabrotica）属種の特定の遺伝子を、ＲＮＡｉを介する害虫の防除のために利用しうることが既に示唆されている。９０６の配列を開示する米国特許公開第２００７／０１２４８３６号、および９，１１２の配列を開示する米国特許第７，６１４，９２４号を参照されたい。しかし、ＲＮＡｉを介する害虫の防除に有用であることが示唆されている多くの遺伝子が、ディアブロティカ（Diabrotica）属を防除するのに有効でないことが決定された。また、Ｃａｆ１−１８０、ＶａｔｐａｓｅＣ、ＶａｔｐａｓｅＨ、およびＲｈｏ１の各々が、ＲＮＡｉを介する害虫の防除に有用であることが示唆されている他の遺伝子と比較して、ディアブロティカ（Diabrotica）属の驚くべき、かつ、予測外の優れた防除を提供することも決定された。
【０２６８】
米国特許第７，６１４，９２４号では、アネキシン、βスペクトリン２、およびｍｔＲＰ−Ｌ４の各々が、ＲＮＡｉを介する害虫の防除において有効であることが示唆された。配列番号５１は、アネキシン領域１のＤＮＡ配列であり、配列番号５２は、アネキシン領域２のＤＮＡ配列である。配列番号５３は、βスペクトリン２領域１のＤＮＡ配列であり、配列番号５４は、βスペクトリン２領域２のＤＮＡ配列である。配列番号５５は、ｍｔＲＰ−Ｌ４領域１のＤＮＡ配列であり、配列番号５６は、ｍｔＲＰ−Ｌ４領域２のＤＮＡ配列である。また、ＹＦＰ配列（配列番号５７）も、陰性対照として、ｄｓＲＮＡを生成させるのに用いた。
【０２６９】
実施例４の方法を介してｄｓＲＮＡを生成させるのに、これらの配列の各々を用い、ｄｓＲＮＡの各々を、上記の同じ食餌ベースのバイオアッセイ法を介して調べた。表５は、アネキシン、βスペクトリン２、およびｍｔＲＰ−Ｌ４によるｄｓＲＮＡ分子を生成させるのに用いたプライマーの配列を列挙する。表６は、これらのｄｓＲＮＡ分子に対する９日間にわたる曝露後における、ＷＣＲ幼虫に対する食餌ベースの給餌バイオアッセイの結果を示す。多連のバイオアッセイにより、これらのｄｓＲＮＡの摂取が、上記のセイヨウトウモロコシ根虫の幼虫の死滅および成長阻害を結果としてもたらさないことが裏付けられたが、これは、ＴＥ緩衝液、ＹＦＰ、または水の対照試料により見られることである。
【０２７０】
【表５】
2014504863.tif 000007
【０２７１】
【表６】
2014504863.tif 000008
【実施例６】
【０２７２】
配列の長さのＶａｔｐａｓｅＣ  ｄｓＲＮＡの有効性に対する効果
３４９〜５００ｂｐのサイズにわたる液胞ＡＴＰアーゼサブユニットＣ（ＶａｔｐａｓｅＣ）によるｄｓＲＮＡは、給餌アッセイにおいて、セイヨウトウモロコシ根虫の幼虫に対して活性であった（表３）。ｄｓＲＮＡ分子の有効性の長さへの依存性を決定するため、Ｖａｔｐａｓｅ  Ｃ  ｄｓＲＮＡの長さを変化させて調べた。配列は、ＶａｔｐａｓｅＣのコード配列（配列番号２）の１７４塩基対のセグメントのうち、５’末端の１５、２５、５０、および１００塩基、ならびに３’末端の１００、５０、２５、および１５塩基を表すように選択した。
【０２７３】
１５ｂｐおよび２５ｂｐの５’側および３’側のＶａｔｐａｓｅＣ配列を表すｄｓＲＮＡ断片は、市販品の販売業者（ＩＮＴＥＧＲＡＴＥＤ  ＤＮＡ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ；Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）に合成させた（表７）。５０ｂｐおよび１００ｂｐの５’側および３’側のｄｓＲＮＡ断片、ならびに全長１７４ｂｐのｄｓＲＮＡ断片を、表８に列挙されるプライマーを用いる、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）ＲＮＡｉキット（ＡＭＢＩＯＮ（登録商標）、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）の指示書に従い、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＣＲ増幅したＤＮＡ鋳型から生成させた。多様な長さのＤＮＡ鋳型を増幅するのに用いたプライマーの組合せを、表９に列挙する。
【０２７４】
【表７】
2014504863.tif 000009
【０２７５】
【表８】
2014504863.tif 000010
【０２７６】
【表９】
2014504863.tif 000011
【０２７７】
ＶａｔｐａｓｅＣによるｄｓＲＮＡ（すなわち、ＶａｔｐａｓｅＣ  ５’−１５、ＶａｔｐａｓｅＣ  ５’−２５、ＶａｔｐａｓｅＣ  ５’−５０、ＶａｔｐａｓｅＣ  ５’−１００、ＶａｔｐａｓｅＣ  ３’−１５、ＶａｔｐａｓｅＣ  ３’−２５、ＶａｔｐａｓｅＣ  ３’−５０、ＶａｔｐａｓｅＣ  ３’−１００、およびＶａｔｐａｓｅＣ−１７４）の各々を、セイヨウトウモロコシ根虫の幼虫による給餌アッセイを用いて、活性（致死性）について、単一用量（１０００ｎｇ／ｃｍ２）で調べた。表１０に示される通り、これらのｄｓＲＮＡ試料の活性（摂食の９日目における幼虫の死滅百分率により測定した）は異なる。１５ｂｐおよび２５ｂｐのＶａｔｐａｓｅＣによるｄｓＲＮＡ試料（５’側および３’側の両方）の摂食は、著明な幼虫の死滅を誘導しなかったが、これは、ＹＦＰによるｄｓＲＮＡを用いる陰性対照と同様の結果である。しかし、１００ｂｐの５’側および３’側のＶａｐｔａｓｅＣによるｄｓＲＮＡ、ならびに１７４ｂｐの５’側および３’側のＶａｐｔａｓｅＣによるｄｓＲＮＡのいずれもが、同様に予測外の高度な幼虫の死滅を結果としてもたらした。２つの５０ｂｐのｄｓＲＮＡ試料は、給餌アッセイにおいて異なる結果を示し、ＶａｔｐａｓｅＣ  ５’−５０  ｄｓＲＮＡ試料が、著明な幼虫の死滅を結果としてもたらさないが、著明な成長阻害を示したのに対し、ＶａｔｐａｓｅＣ  ３’−５０  ｄｓＲＮＡ試料は、１００ｂｐおよび１７４ｂｐのｄｓＲＮＡ試料により得られる値とほぼ同程度に高度なレベルである、ほぼ６０％の死滅を引き起こした（表１０）。
【０２７８】
さらに、ＶａｔｐａｓｅＣによるｄｓＲＮＡの活性を６つの被験用量（１．０、３．９、６２．５、２５０、および１０００ｎｇ／ｃｍ２）で決定し、相対ＬＣ５０値および相対ＧＩ５０値を得た（表１１）。ＶａｔｐａｓｅＣ  ３’−１００試料により得られるＬＣ５０値は３．０１ｎｇ／ｃｍ２であり、観察される最低値（すなわち、最高度の効能）であった。ＶａｔｐａｓｅＣ−１７４試料により得られるＬＣ５０値が９．８１ｎｇ／ｃｍ２であることは、特に注意される。トウモロコシ植物体においてＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ４ヘアピンを生成させるようにデザインした構築物は、温室栽培される植物により調べた場合の活性を示した（実施例１０；表１８）。このＶａｐｔａｓｅＣ  ｖ４配列の断片（１６６ｂｐ）が、本明細書で記載されるＶａｔｐａｓｅＣ−１７４配列とほぼ同一であり、本明細書で記載されるＶａｔｐａｓｅＣ−１７４配列は、１６６ｂｐのＶａｐｔａｓｅＣ  ｖ４配列の断片の５’端における８ｂｐ（ＡＴＧＡＣＴＧＡ）だけを欠く。
【０２７９】
【表１０】
2014504863.tif 000012
【０２８０】
【表１１】
2014504863.tif 000013
【実施例７】
【０２８１】
ｄｓＲＮＡ配列の変化のＶａｔｐａｓｅＣによるｄｓＲＮＡの有効性に対する効果
標的配列と完全に相補的なわけではない（例えば、標的のｍＲＮＡとの同一性が９５％にとどまる）ｄｓＲＮＡ分子も、鞘翅目有害生物を防除するのに効果的である。非相補的な塩基をＶａｔｐａｓｅＣによるｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖に導入した結果として、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間のミスマッチがもたらされた（かつ、結果的に、ｄｓＲＮＡとｉｎ  ｖｉｖｏにおける標的のｍＲＮＡとの間のミスマッチがもたらされた）。マッチが不完全なｄｓＲＮＡの、セイヨウトウモロコシ根虫の幼虫に対する殺虫活性への効果を、食餌バイオアッセイにより測定した。
【０２８２】
一度にＶａｔｐａｓｅＣによるｄｓＲＮＡをコードする２つのＤＮＡ鎖のうちの１つだけを突然変異させ、各突然変異部位に単一の非相補的なヌクレオチドを人工的に導入した。突然変異部位は、ＶａｔｐａｓｅＣによるｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡの突然変異鎖の全長に沿って２０ヌクレオチド間隔で恣意的に配置した。天然ヌクレオチドを置換するように選択したヌクレオチドの識別は、突然変異部位と向かい合う非突然変異鎖におけるヌクレオチドと相補体をなさない突然変異部位のいずれかの側における近位のヌクレオチドから行った。万一３つ以上のヌクレオチドが所与の位置において同じである場合は、天然のヌクレオチドを置換するのに、最も近接する異なるヌクレオチドを選択した。
【０２８３】
相補性が不完全であるが実質的に相同な２つのＶａｔｐａｓｅＣ（ｖ４）によるｄｓＲＮＡ（すなわち、ｖ４．１およびｖ４．２）をデザインし、生成させ、殺虫活性について調べた。いずれのｄｓＲＮＡも、１６６ｂｐのＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ４配列に加えて、各ＲＮＡ鎖の５’端にＴ７プロモーターを介する転写のアーチファクトである６つのヌクレオチド（ＧＧＧＡＧＡ）を含んだ。したがって、各ｄｓＲＮＡの全長は１７８ｂｐであった。
【０２８４】
非相補的な塩基をアンチセンス鎖へと導入して、ＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ４．１と実質的に相同なｄｓＲＮＡをデザインし、生成させた。このｄｓＲＮＡは、以下のステップにより達成した：（１）アンチセンス鎖配列を、２０ヌクレオチドごとに突然変異を導入するようにデザインした；（２）突然変異アンチセンス鎖のＤＮＡ配列または天然のセンス鎖ＤＮＡ配列（すなわち、突然変異を伴わない）を含むＤＮＡ断片を化学合成した（ＩＤＴ）；（３）突然変異アンチセンス鎖を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドとセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドとをアニーリングさせて、二本鎖分子を形成した；（３）５’末端のＴ７プロモーター配列を含むプライマーを使用するＰＣＲ増幅を用いて、Ｔ７プロモーター配列を両方の鎖の５’端へと組み込み、これにより、ｄｓＲＮＡを合成するのに十分な鋳型をもたらした；および（４）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用い、販売元の指示書に従いＡＭＢＩＯＮ（登録商標）ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）ＲＮＡｉキットを用いて、ｄｓＲＮＡ合成を達成した。
【０２８５】
センス鎖配列に２０塩基間隔で導入した突然変異を有する（しかし、天然のアンチセンス鎖配列を有する）、ＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ４．２と実質的に相同なｄｓＲＮＡを、上記の方法の適切な改変を介して得た。さらに、天然配列（すなわち、完全に相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖を有する）を含むＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ４  ｄｓＲＮＡを構築し、セイヨウトウモロコシ根虫の幼虫に対する食餌ベースの給餌アッセイ（既に記載した方法を用いて実施した）において、実質的に相同なｄｓＲＮＡであるＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ４．１およびｖ４．２との有効性の比較のための対照として用いた。
【０２８６】
７つの用量のこれらのｄｓＲＮＡ（０．２、１．０、３．９、１５．６、６２．５、２５０、および１０００ｎｇ／ｃｍ２）を、セイヨウトウモロコシ根虫の初齢幼虫による給餌バイオアッセイにおいて調べ、ＬＣ５０値およびＧＩ５０値を得た。アッセイは、２回にわたり個別に実施し、各回の実験を２連で行った。
【０２８７】
実質的に相同なＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ４．１（アンチセンス鎖がミスマッチする）ｄｓＲＮＡについて計算したＬＣ５０は、７８０．９ｎｇ／ｃｍ２であり、天然の（すなわち、突然変異させていない）ＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ４  ｄｓＲＮＡについて得られるＬＣ５０の７．９倍であった（表１２）。この結果は、ＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ４．１  ｄｓＲＮＡの１７８塩基のアンチセンス鎖は８つの突然変異塩基を含有したが、ｄｓＲＮＡを摂取した後に致死性の効果を誘導するのに十分な、標的である鞘翅目有害生物のｍＲＮＡ鎖との相同性が存在したことを示す。実質的に相同なＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ４．２（センス鎖がミスマッチする）ｄｓＲＮＡについて計算したＬＣ５０値は、８６８．６ｎｇ／ｃｍ２であり、これは、ＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ４．１により得られる値と同様であり、ＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ４  ｄｓＲＮＡについてのこれらのアッセイにおいて得られる値の８．８倍であった。これらの結果は、ｄｓＲＮＡのセンス鎖においてミスマッチを含む実質的に相同なｄｓＲＮＡが、ｄｓＲＮＡを摂取した後に致死性の効果を誘導するのに十分な、標的である鞘翅目有害生物のｍＲＮＡ鎖との相同性を保持することを裏付ける。これらの給餌アッセイでは、ＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ４．１  ｄｓＲＮＡおよびＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ４．２  ｄｓＲＮＡのＧＩ５０値が、天然の（すなわち、突然変異させていない）ＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ４  ｄｓＲＮＡについて計算した値より高値であることがさらに見出された（表１２）。したがって、ＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ４．１  ｄｓＲＮＡおよびＶａｔｐａｓｅＣ  ４．２  ｄｓＲＮＡは、鞘翅目有害生物により摂取されると、成長阻害の改善および死滅の改善のいずれを誘導することも可能であることがわかる。
【０２８８】
【表１２】
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【実施例８】
【０２８９】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）属を介する、殺虫性ヘアピンｄｓＲＮＡを含むトランスジェニックトウモロコシ組織の生成
穂の滅菌および胚の単離：未成熟のトウモロコシ胚を、温室において成長させ、自家受粉または近親受粉させて穂を生成させたトウモロコシ（Zea mays）の近交系であるＢ１０４植物体から得た。穂は、受粉の約９〜１２日後に採取した。実験日において、穂を次亜塩素酸ナトリウムの２０％溶液（６．１５％）中に浸漬することにより表面滅菌し、２０〜３０分間にわたり振とうした後、滅菌水中で３回にわたりすすいだ。滅菌の後、未成熟の接合胚（１．５〜２．４ｍｍ）を各穂から無菌的に切開し、液体の接種用培地（２．２ｇｍ／ＬのＭＳ用塩（Frameら、2011、前出）；１ＸのＩＳＵ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＳ  Ｖｉｔａｍｉｎｓ（Frameら（2011）、「Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos」、Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology、T. A. ThorpeおよびE. C. Yeung（編）、SPRINGER SCIENCE AND BUSINESS MEDIA, LLC.、327〜341ページ）；６８．４ｇｍ／Ｌのスクロース；３６ｇｍ／Ｌのグルコース；１１５ｍｇ／ＬのＬ−プロリン；１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール；および２００μＭのアセトシリンゴン（ＤＭＳＯ中で調製した）；ｐＨ５．４）を含有するマイクロ遠心分離管へと無作為的に分配した。所与の実験セットについて、プールされた穂に由来する胚を、各回の形質転換に用いた。
【０２９０】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）属の培養の開始：上記の実施例４におけるバイナリー形質転換ベクターを含有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）属のＤＡｔ１３１９２株のグリセロール原液を、適切な抗生剤を含有するＡＢ最小培地プレート（Watsonら（1975）、J. Bacteriol. 123: 255〜64）上に線状播種し、２０℃で３〜４日間にわたり増殖させた。単一のコロニーを各プレートから採取し、適切な抗生剤を含有するＹＥＰプレート（１０ｇｍ／Ｌの酵母抽出物；１０ｇｍ／ＬのＰｅｐｔｏｎｅ；および５ｇｍ／ＬのＮａＣｌ）へと線状播種し、２０℃で１〜２日間にわたりインキュベートした。
【０２９１】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）属の培養物および共培養：アグロバクテリウム（Agrobacterium）属のコロニーを、ＹＥＰプレートから採取し、５０ｍＬのディスポーザブルの試験管における１０ｍＬの接種用培地中に懸濁させ、分光光度計を用いて、細胞密度を０．２〜０．４のＯＤ５５０（５５０ｎｍで測定した光学密度）へと調整した。アグロバクテリウム（Agrobacterium）属の培養物を、１２５ｒｐｍ（室温）のロータリーシェーカー上でインキュベートする一方、胚の切開を実施した。未成熟の接合胚（滅菌したトウモロコシ穀粒から既に単離し、１ｍＬの接種用培地内に入れた）を接種用培地中で１回洗浄した。２ｍＬのアグロバクテリウム（Agrobacterium）属懸濁液を胚の各試験管へと添加し、試験管を、１０〜１５分間にわたりシェーカープラットフォーム上に置いた。胚を共培養用培地（４．３３ｇｍ／ＬのＭＳ用塩；１×のＩＳＵ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＳ  Ｖｉｔａｍｉｎｓ；３０ｇｍ／Ｌのスクロース；７００ｍｇ／ＬのＬ−プロリン；ＫＯＨ中３．３ｍｇ／ＬのＤｉｃａｍｂａ（３，６−ジクロロ−ｏ−アニス酸または３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸）；１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール；１００ｍｇ／Ｌのカゼインの酵素的加水分解物；１５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３；ＤＭＳＯ中に１００μＭのアセトシリンゴン；および３ｇｍ／ＬのＧＥＬＺＡＮ（商標）（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標））；ｐＨ５．８）へと移し、胚盤を上向きに方向づけ、２５℃、２４時間の光強度５０μＥｍ−２秒−１の明所下で３日間にわたりインキュベートした。
【０２９２】
カルスによる推定イベントの選択および再生：共培養期の後、胚を静置用培地（４．３３ｇｍ／ＬのＭＳ用塩；１×のＩＳＵ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＳ  Ｖｉｔａｍｉｎｓ；３０ｇｍ／Ｌのスクロース；７００ｍｇ／ＬのＬ−プロリン；ＫＯＨ中３．３ｍｇ／ＬのＤｉｃａｍｂａ；１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール；１００ｍｇ／Ｌのカゼインの酵素的加水分解物；１５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３；０．５ｇｍ／ＬのＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸一水和物；ＰＨＹＴＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ（登録商標）、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）；２５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリン；および２．３ｇｍ／ＬのＧＥＬＺＡＮ（商標）；ｐＨ５．８）へと移し、２５℃、２４時間の光強度５０μＥｍ−２秒−１の明所下で３日間にわたりインキュベートした。
【０２９３】
胚を選択用培地１（１００ｎＭのＲ−ハロキシホップ酸（０．０３６２ｍｇ／Ｌ）を伴う静置用培地（上記）からなる）へと移し、暗所または２８℃、２４時間の光強度５０μＥｍ−２秒−１の明所下で７〜１４日間にわたりインキュベートした。増殖しつつある胚発生カルスを選択用培地２（５００ｎＭのＲ−ハロキシホップ酸（０．１８１０ｍｇ／Ｌ）を伴う静置用培地（上記）からなる）へと移し、２８℃、２４時間の光強度５０μＥｍ−２秒−１の明所下で１４〜２１日間にわたりインキュベートした。この選択ステップは、トランスジェニックカルスがさらに増殖および分化することを可能とした。
【０２９４】
増殖しつつある胚発生カルスを、前再生用培地（４．３３ｇｍ／ＬのＭＳ用塩；１×のＩＳＵ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＳ  Ｖｉｔａｍｉｎｓ；４５ｇｍ／Ｌのスクロース；３５０ｍｇ／ＬのＬ−プロリン；１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール；５０ｍｇ／Ｌのカゼインの酵素的加水分解物；１．０ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３；０．２５ｇｍ／ＬのＭＥＳ；ＮａＯＨ中０．５ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸；エタノール中２．５ｍｇ／Ｌのアブシシン酸；１ｍｇ／Ｌの６−ベンジルアミノプリン；２５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリン；２．５ｇｍ／ＬのＧＥＬＺＡＮ（商標）；および５００ｎＭのＲ−ハロキシホップ酸；ｐＨ５．８）へと移し、２８℃、２４時間の光強度５０μＥｍ−２秒−１の明所下で７日間にわたり培養した。
【０２９５】
シュート様芽を伴う胚発生カルスを、再生用培地Ｉ（４．３３ｇｍ／ＬのＭＳ用塩；１×のＩＳＵ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＳ  Ｖｉｔａｍｉｎｓ；６０ｇｍ／Ｌのスクロース；１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール；１２５ｍｇ／Ｌのカルベニシリン；３．０ｇｍ／ＬのＧＥＬＺＡＮ（商標）；および５００ｎＭのＲ−ハロキシホップ酸；ｐＨ５．８）へと移し、２４時間の光強度５０μＥｍ−２秒−１の明所下で７日間にわたり培養した。
【０２９６】
一次根を伴う小型シュートを、ＰＨＹＴＡＴＲＡＹＳ（商標）（ＰＨＹＴＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ（登録商標））中のシュート／根用培地（４．３３ｇｍ／ＬのＭＳ用塩；１×のＩＳＵ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＳ  Ｖｉｔａｍｉｎｓ；３０ｇｍ／Ｌのスクロース；１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール；３．５ｇｍ／ＬのＧＥＬＺＡＮ（商標）；ｐＨ５．８）へと移し、２７℃、１６：８時間の光強度１４０〜１９０μＥｍ−２秒−１の明所：暗所下で７日間にわたりインキュベートした。推定トランスジェニック小植物体をトランス遺伝子のコピー数について解析し、土壌へと移した。
【０２９７】
種子の生成：植物体は、ＭＥＴＲＯ−ＭＩＸ（商標）３６０無土壌栽培用培地（ＳＵＮ  ＧＲＯ  ＨＯＲＴＩＣＵＬＴＵＲＥ；Ｂｅｌｌｅｖｕｅ、ＷＡ）へと移植し、栽培室で低温に馴らした。次いで、植物体を、ＳＵＮＳＨＩＮＥ  ＣＵＳＴＯＭ  ＢＬＥＮＤ（商標）１６０土壌混合物へと移植し、温室内で開花期へと発育させた。種子生成のための調節受粉を実施した。
【０２９８】
温室栽培される植物体についてのセイヨウトウモロコシ根虫バイオアッセイは、実施例１２で記載される方法を介して実施した。根評点が０．７５以上の植物体は、種子生成用の５ガロンの移植鉢へと速やかに移植した。移植植物体は、殺虫剤で処理して、さらなる根切り虫による虫害および温室における害虫の開放を阻止した。種子生成のために、Ｂ１０４植物体を、非トランスジェニックＢ１０４（花粉ドナー）植物体と異系交配させた。これらの植物体に生成させた種子は、Ｔ１およびその後の世代の植物体における評価のために取り置く。
【０２９９】
Ｃａｆ１−１８０  ｖ３ヘアピンｄｓＲＮＡ（実施例４；プラスミドｐＤＡＢ１０９８１７における構築物）をコードする植物用の発現構築物を含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）属のＤＡｔ１３１９２株を用いて、トランスジェニックのトウモロコシＢ１０４植物体を生成させた。これらの温室栽培されるトランスジェニック植物体についてのセイヨウトウモロコシ根虫バイオアッセイは、実施例１２で記載される方法を介して実施した。ＹＦＰを生成させるための遺伝子を含有するが、ｄｓＲＮＡを生成させるための遺伝子は含有しない同様のプラスミド（ｐＤＡＢ１０１５５６）で形質転換された植物体を陰性対照として用いた。これらのバイオアッセイの結果を、表１３に示す。
【０３００】
【表１３】
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【０３０１】
ＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ３ヘアピンｄｓＲＮＡ（実施例４；プラスミドｐＤＡＢ１０９８１５における構築物）をコードする植物用の発現構築物を含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）属のＤＡｔ１３１９２株を用いて、トランスジェニックのトウモロコシＢ１０４植物体を生成させた。これらの温室栽培されるトランスジェニック植物体についてのセイヨウトウモロコシ根虫バイオアッセイは、実施例１２で記載される方法を介して実施した。ＹＦＰを生成させるための遺伝子を含有するが、ｄｓＲＮＡを生成させるための遺伝子は含有しない同様のプラスミド（ｐＤＡＢ１０１５５６）で形質転換された植物体を陰性対照として用いた。これらのバイオアッセイの結果を、表１４に示す。
【０３０２】
【表１４】
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【０３０３】
ＶａｔｐａｓｅＨ  ｖ１ヘアピンｄｓＲＮＡ（実施例４；プラスミドｐＤＡＢ１０９８１６における構築物）をコードする植物用の発現構築物を含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）属のＤＡｔ１３１９２株を用いて、トランスジェニックのトウモロコシＢ１０４植物体を生成させた。これらの温室栽培される植物体についてのセイヨウトウモロコシ根虫バイオアッセイは、実施例１２で記載される方法を介して実施した。ＹＦＰを生成させるための遺伝子を含有するが、ｄｓＲＮＡを生成させるための遺伝子は含有しない同様のプラスミド（ｐＤＡＢ１０１５５６）で形質転換された植物体を陰性対照として用いた。これらのバイオアッセイの結果を、表１５に示す。
【０３０４】
【表１５】
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【実施例９】
【０３０５】
ＷＨＩＳＫＥＲＳを介する殺虫性Ｃａｆ１−１８０  ｖ３ヘアピンｄｓＲＮＡを含むトランスジェニックトウモロコシ組織の生成
植物ゲノムへと安定的に組み込んだキメラ遺伝子の発現を介して、１または複数の殺虫性ｄｓＲＮＡ分子（例えば、配列番号１〜４のうちの１つを含む遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ分子を含めた少なくとも１つのｄｓＲＮＡ分子）を生成させる植物体を生成させた。植物を形質転換するためのＤＮＡ分子は、実施例４において記載される通りに調製し、ＷＨＩＳＫＥＲＳを介する形質転換（米国特許第５，３０２，５２３号および同第５，４６４，７６５号；米国特許公開第２００８／０１８２３３２号；ならびにPetolinoおよびArnold（2009）、M. Paul Scott（編）、Methods in Molecular Biology: Transgenic Maize、526巻、Humana Press、NY、59〜67ページにおいて本質的に記載されている）により、Ｈｉ−ＩＩの懸濁細胞培養物中のトウモロコシ細胞へと送達した。
【０３０６】
植物細胞の形質転換および選択：標準的な無菌法を用いて、ＷＨＩＳＫＥＲＳを介する形質転換のための全ての手順を実施し、一般にPetolinoおよびArnold（2009）、前出により記載された方法に従った。３０ｍＬの沈殿した懸濁細胞に、７０ｍＬの条件付け培地（すなわち、細胞を増殖させた培地）を加えて、１７５ｍＬのＮＡＬＧＥＮＥ（商標）ディスポーザブル円錐形底遠心管（ＴＨＥＲＭＯ  ＦＩＳＨＥＲ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ；型番：３１４５−０１７５）内に５％のココナッツ水（ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；型番：Ｃ５９１５）を含有する２００ｍＬの新鮮なＨ９ＣＰ（４．３３ｇｍ／ＬのＭＳ  Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ（ＰＨＹＴＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ、型番：Ｍ５２４）；３０．０ｇｍ／Ｌのスクロース；１００．０ｍｇ／Ｌのミオイノシトール；２００ｍｇ／Ｌのカゼインの酵素的加水分解物；２．０ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸；２．０ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸；６９１ｍｇ／ＬのＬ−プロリン；２．０ｍｇ／Ｌのグリシン；０．５ｍｇ／ＬのチアミンＨＣｌ；０．５ｍｇ／ＬのピリドキシンＨＣｌ；０．０５ｍｇ／Ｌのニコチン酸；ｐＨ６．０）培地へと移すことにより、ＨｉＩＩトウモロコシ（Zea mays）の胚発生細胞懸濁液（Armstrongら（1991）、Maize Genet. Coop. Newslett. 65: 92〜3）を継代培養した。次いで、希釈した細胞を、暗所内２８℃、１２０ｒｐｍの回転半径を１インチとするジャイロロータリーシェーカー上の１Ｌの滅菌ディスポーザブル細胞培養フラスコにおいてインキュベートし、上記の通り３．５日ごとに細胞を継代培養した。
【０３０７】
継代培養の１日後、およびトランスフェクション手順の１８〜２４時間前に、３０ｍＬの沈殿細胞を含有する５０ｍＬのＨ９ＣＰ培地を、１Ｌの滅菌フラスコ内に１５０ｍＬの新鮮なＧＮ６培地（３．９９ｇｍ／Ｌの、ビタミンを伴うＣｈｕ  Ｎ６  Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ（ＰＨＹＴＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ、型番：Ｃ１６７）；３０ｇｍ／Ｌのスクロース；１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール；２ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸；ｐＨ６．０）へと添加し、培養物を、上記の通り、ジャイロロータリーシェーカー上でインキュベートした。
【０３０８】
ＧＮ６培地中で１８〜２４時間にわたるインキュベーションの後に、細胞懸濁液の全体を、無菌の１７５ｍＬのディスポーザブル円錐形底遠心管へと移し、細胞を１〜３分間にわたり沈殿させたところ、約４０ｍＬの細胞容量が得られた。使用済みの培地は注意深くデカントし、ピペットを介して残存する液体を除去して、水分を含んだ細胞塊を生成させた。細胞を、遠心管内に約１８０ｍＬの高浸透圧培地（ＧＮ６−ＳＭ；４５ｇｍ／Ｌのソルビトールおよび４５ｇｍ／Ｌのマンニトールを補充したＧＮ６培地）中に再懸濁させ、培養物を、室温（２３℃〜２５℃）で約３０分間にわたるが、４５分間を超えないように卓上用ロッカーシェーカー上に置いた。３０分間にわたる浸透圧処置の後、細胞を遠心管内で３〜５分間にわたり沈殿させた。次いで、ピペットを介し、細胞を攪乱しないように注意しながら液体を注意深く除去し、遠心管の５０ｍＬの目盛まで減量した。
【０３０９】
プラスミドＤＮＡをトウモロコシの懸濁培養細胞へと送達するために、適量のＧＮ６−ＳＭ培地を滅菌（オートクレーブ処理した）乾燥ウィスカーへと添加することにより、ＢＩＯＧＲＡＤＥ（商標）ＳＣ−９炭化ケイ素製ＷＨＩＳＫＥＲＳ（ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＣＯＭＰＯＩＴＥ  ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ、Ｇｒｅｅｒ、ＳＣ；ロット番号：９８１０１１−１０１）の５％ｗ／ｗ懸濁液５ｍＬを調製した。ｐＤＡＢ１０９８３０のＤＮＡ適量（実施例４）を、遠心管（典型的には４０ｍＬ細胞の８０μｇ／５０ｍＬ懸濁液）へと添加し、キャップで緊密に密栓し、遠心管を静かに旋回させて内容物を混合した。遠心管を、遠心管をしっかりと保持するように改変した市販の塗料ミキサー（ＲＥＤ  ＤＥＶＩＬ（商標）Ｍｏｄｅｌ  ５４００；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）にしっかりと固定し、１０〜２０秒間にわたり振とうした。培地の浸透圧を低減するために、約１５０ｍＬの新鮮な培地（ＧＮ６−ＳＭ：ＧＮ６；ｖ／ｖで２：１）で約２００ｍＬ最終容量まで希釈した後、細胞を、卓上用ロッカーシェーカー上、ＲＴで約１時間にわたりインキュベートした。
【０３１０】
次いで、トランスフェクトされた細胞を、約８．３ｍＬのアリコート中でピペットを介して、細胞を濾紙上に等分に分配するように注意しながら、７０ｍｍの滅菌ＷＨＡＴＭＡＮ（商標）＃４濾紙（ＴＨＥＲＭＯ  ＦＩＳＨＥＲ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）へと移した。フィルターは、１００×２０ｍｍのプラスチック製プレート内のＧＮ６寒天培地上に置き、次いで、暗所のプラスチック製ボックス内２８℃で７日間にわたりインキュベートした。
【０３１１】
形質転換の１週間後、細胞を保持する濾紙を、１００×２０ｍｍのプレート内１．０ｍｇ／Ｌのビアラホスを含有するＧＮ６−１Ｈ（２．５ｇｍ／ＬのＧＥＬＺＡＮ（商標）を補充したＧＮ６培地）固形寒天培地による新鮮なプレートへと移し、暗所内２８℃でインキュベートした。ビアラホスは、ＨＥＲＢＩＡＣＥ（登録商標）（活性成分２０％）（日本、東京、明治製菓株式会社）として提供されている。
【０３１２】
１週間後、各濾紙の細胞内容物を、３７℃〜４０℃の１５ｍＬのＧＮ６軟質アガロース培地（７．０ｇｍ／ＬのＳＥＡＰＬＡＱＵＥ（商標）Ａｇａｒｏｓｅ；ＬＯＮＺＡ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥを伴うＧＮ６培地）を含有する５０ｍＬの滅菌ディスポーザブル遠心管へと掻爬することにより、細胞を軟質寒天中に包埋し、施栓した遠心管を十分に振とうし、次いで、遠心管の内容物を、ＧＮ６１Ｈ固形寒天培地を含有する１００×２５ｍｍの４つのプラスチック製プレートへと等分に注入した。各プレートを撹拌して、表面を細胞懸濁液の均一層でコーティングし、固形化したら、プレートを暗所内２８℃でインキュベートした。
【０３１３】
インキュベーションの６〜１０週間後、十分に増殖して現出しつつあるコロニーを、ＧＮ６１Ｈ寒天培地を含有する新鮮なプレートへと移した。これらの候補形質転換コロニーを、選択培地上で２〜４週間にわたり増殖させ、質量約５０〜２００ｍｇの組織を有する安定的イベントを確立し、次いで、これを分子解析にかけた。
【０３１４】
候補イベントに由来するカルス細胞の０．１ｍＬパックの試料をサンプリングし、１．２ｍＬのＣＯＳＴＡＲ（商標）ポリプロピレンクラスター試験管（ＣＯＲＮＩＮＧ，ＩＮＣ．；Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に入れ、−８０℃で凍結させた。
【０３１５】
分子解析：カルス細胞イベントを、Ｐｅｒ５の３’ＵＴＲのリアルタイム定量的ＰＣＲを介して、全長転写物の相対発現について解析し、内部のトウモロコシ遺伝子（ＴＩＰ４１様タンパク質）に照らした比較によりコピー数を推定した。ＲＮｅａｓｙ（商標）９６キット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて、ＲＮＡを単離した。第１の洗浄（ＲＷ１）の後、「ＲＤＤ」緩衝液中のＱＩＡＧＥＮ  ＲＮアーゼ非含有ＤＮアーゼでカラムを処理した（キットにより示唆されている代替的プロトコールに従う）。実質的に製造元の推奨するプロトコールに従い、５μＬの変性ＲＮＡを伴う１０μＬの反応容量中のＨＩＧＨ  ＣＡＰＡＣＩＴＹ  ｃＤＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＫＩＴ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いて、第１の鎖のｃＤＮＡを調製した。ランダムプライマーとオリゴｄＴとを組み合わせた作業用原液を調製するために、プロトコールを若干改変して、１００μＭのＴ２０ＶＮオリゴヌクレオチド（ＩＤＴ）１０μＬの、ランダムプライマー原液ミックスの１ｍＬ試験管への添加を含めた。
【０３１６】
ｃＤＮＡを合成した後、ヌクレアーゼ非含有水で試料を１：３に希釈し、アッセイするまで−２０℃で保管した。１０μＬ反応容量中、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（商標）４８０（ＲＯＣＨＥ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）により、リアルタイムＰＣＲを実施した。全てのアッセイに、鋳型を伴わない（ミックスだけの）陰性対照を組み入れた。また、検量線のため、試料の交差汚染の基準となる供給源プレートには、ブランク（供給源ウェル内の水）も組み入れた。反応は、０．５μＭのＲＯＣＨＥ  ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ  ＰＲＯＢＥ（商標）、および１０μＭの標的遺伝子および基準遺伝子に対するプライマーにより行った。プライマー配列を表１６に示す。ＰＣＲ反応の条件は、以下の通りであった：（１）９５℃で１０分間にわたる標的の活性化；（２）４３サイクルにわたる（９５℃で１０秒間にわたる変性および６０℃における伸長）；（３）７２℃で１秒間にわたる捕捉；および（４）４０℃で１０秒間にわたる冷却。
【０３１７】
【表１６】
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【０３１８】
データ解析：データは、販売元の推奨に従い、Ｃｑ値を計算するための二次導関数最大値のアルゴリズムを用いる相対的定量化を介して、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ１．５を用いて解析した。発現を解析するため、２つの標的間におけるＣｑ値の差違の比較に依拠し、最適化されたＰＣＲ反応では、全てのサイクルにおいて産物は倍加するという仮定の下でベース値を２に選択するΔＣｔ法を用いて発現値を計算した（すなわち、２−（Ｃｑ  ＴＡＲＧＥＴ−Ｃｑ  ＲＥＦ））。
【０３１９】
トランスジェニック植物体の再生：ｉｎ  ｐｌａｎｔａにおける害虫バイオアッセイのために、一部の安定的に形質転換されたイベントを、植物体へと再生させた。
【０３２０】
選択過程の後、カルス培養物を、前再生用２８培地（ビタミンを伴う４．３３ｇｍ／ＬのＭＳ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ；３０．０ｇｍ／Ｌのスクロース；５ｍｇ／Ｌの６−ベンジルアミノプリン；２５μｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸；２．５ｇｍ／ＬのＧＥＬＺＡＮ（商標）；および１．０ｍｇ／Ｌのビアラホス）へと移した。移したカルス培養物は、持続的な白色蛍光（約５０μＥｍ−２秒−１）下、２８℃で７日間にわたりインキュベートした。
【０３２１】
再生させるため、培養物を、再生用培地３６（ビタミンを伴う４．３３ｇｍ／ＬのＭＳ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ；３０ｇｍ／Ｌのスクロース；２．５ｇｍ／ＬのＧＥＬＺＡＮ（商標）；および１．０ｍｇ／Ｌのビアラホス）へと移し、小植物体を生成させ、持続的な白色蛍光下、２８℃で最長３週間にわたり成長させた。小植物体が適切な成長段階に到達したら、それらを鉗子およびメスで摘出し、寒天を含有する２０×１００ｍｍの試験管へと移し、２日間にわたり明所に置いた。
【０３２２】
トランスジェニック植物体に固有の識別子を割り当て、環境制御チャンバー（昼間温度を約２８℃とし；夜間温度を２４℃とし；補充の照明による明期を１６：８とした）へと移した。トランスジェニック植物体を、試験管から３．５インチの移植鉢へと移植し、１〜２週間にわたり環境制御チャンバーに戻して、植物体を馴致する一助とした。次いで、トランスジェニック植物体を温室へと移し、害虫給餌バイオアッセイのために、ＲＯＯＴＲＡＩＮＥＲ（商標）１個当たり、イベント１例当たりの植物体１体で、小型の移植鉢からＲＯＯＴＲＡＩＮＥＲＳ（商標）（ＴＩＮＵＳ（商標）３５０−４型；ＳＰＥＮＣＥＲ−ＬＥＭＡＩＲＥ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ；Ａｃｈｅｓｏｎ、Ａｌｂｅｒｔａ、Ｃａｎａｄａ）へと移植した。ＲＯＯＴＴＲＡＩＮＥＲＳ（商標）への移植の約４日間後、Ｔ０の植物体は、害虫給餌バイオアッセイの準備ができていた。実施例１２に記載される方法を介して害虫給餌バイオアッセイを実施した。
【０３２３】
ヘアピンｄｓＲＮＡを生成させるトランス遺伝子の存在および発現は、ＷＣＲによる根切りの低減を結果としてもたらし、これは、ｄｓＲＮＡ転写物の高度な発現レベル（Ｐｅｒ５の３’ＵＴＲについての相対的ＰＣＲスコアリングにより測定した）を呈示する植物体において明らかであった。配列番号９７を含むＲＮＡｉヘアピンを含有し、相対発現レベルが内部のＴＩＰ４１様基準遺伝子の１６倍であるこれらのイベントについてのセイヨウトウモロコシ根虫バイオアッセイの結果を、表１７に示す。結果は、非トランスジェニックの被験対照植物体のうちのわずか３％と比較して、ＲＮＡｉトランスジェニック植物体のうちの３６％がＷＣＲによる虫害の低減を裏付けた驚くべき結果を示す。Ｔ０のトランスジェニックトウモロコシ植物体において生物学的応答は可変的であるが、トランスジェニック植物体は、非トランスジェニックの対照植物体と比較して、ＷＣＲによる根切りのかなりの低減を示した。
【０３２４】
【表１７】
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【実施例１０】
【０３２５】
ＷＨＩＳＫＥＲＳを介する殺虫性ＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ３ヘアピンｄｓＲＮＡおよび殺虫性ＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ４ヘアピンｄｓＲＮＡを含むトランスジェニックトウモロコシ組織の生成
プラスミドであるｐＤＡＢ１０９８２８およびｐＤＡＢ１０９８３８による形質転換（実施例４）を介して、ＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ３ヘアピンｄｓＲＮＡまたはＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ４ヘアピンｄｓＲＮＡを発現させるＨｉＩＩトウモロコシのトランスジェニック植物体をもたらすために、実施例９で記載した形質転換法を用いた。実施例９で記載したスクリーニング法に従い、分子スクリーニングを実施し、実施例１２で記載されるバイオアッセイ法に従い、セイヨウトウモロコシ根虫バイオアッセイを実施した。
【０３２６】
ヘアピンｄｓＲＮＡを生成させるトランス遺伝子の存在および発現は、ＷＣＲによる根切りの低減を結果としてもたらし、これは、ｄｓＲＮＡ転写物の高度な発現レベル（Ｐｅｒ５の３’ＵＴＲについての相対的ＰＣＲスコアリングにより測定した）を呈示する植物体において明らかであった。配列番号１００（ＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ３）または配列番号１０３（ＶａｔｐａｓｅＣ  ｖ４）を含むＲＮＡｉヘアピンを含有し、相対発現レベルが内部のＴＩＰ４１様基準遺伝子の２０倍であるこれらのイベントについてのセイヨウトウモロコシ根虫バイオアッセイの結果を、表１８に示す。結果は、非トランスジェニックの被験対照植物体のうちの０％と比較して、ＲＮＡｉトランスジェニック植物体のうちの４３％がＷＣＲによる虫害の低減を裏付けた驚くべき結果を示す。Ｔ０のトランスジェニックトウモロコシ植物体において生物学的応答は可変的であるが、トランスジェニック植物体のみが、ＷＣＲによる根切りのかなりの低減を示した。
【０３２７】
【表１８】
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【実施例１１】
【０３２８】
ＷＨＩＳＫＥＲＳを介する殺虫性ＶａｔｐａｓｅＨ  ｖ１ヘアピンｄｓＲＮＡを含むトランスジェニックトウモロコシ組織の生成
プラスミドであるｐＤＡＢ１０９８２９による形質転換（実施例４）を介して、ＶａｔｐａｓｅＨ  ｖ１ヘアピンｄｓＲＮＡを発現させるＨｉＩＩトウモロコシのトランスジェニック植物体をもたらすために、実施例９で記載した形質転換法を用いた。実施例９で記載したスクリーニング法に従い、分子スクリーニングを実施し、実施例１２で記載されるバイオアッセイ法に従い、セイヨウトウモロコシ根虫バイオアッセイを実施した。
【０３２９】
ヘアピンｄｓＲＮＡを生成させるトランス遺伝子の存在および発現は、ＷＣＲによる根切りの低減を結果としてもたらし、これは、ｄｓＲＮＡ転写物の高度な発現レベル（Ｐｅｒ５の３’ＵＴＲについての相対的ＰＣＲスコアリングにより測定した）を呈示する植物体において明らかであった。配列番号１０６を含むＲＮＡｉヘアピンを含有し、相対発現レベルが内部のＴＩＰ４１様基準遺伝子の１８倍であるこれらのイベントについてのセイヨウトウモロコシ根虫バイオアッセイの結果を、表１９に示す。結果は、非トランスジェニックの被験対照植物体のうちの０％と比較して、ＲＮＡｉトランスジェニック植物体のうちの６０％がＷＣＲによる虫害の低減を裏付けた驚くべき結果を示す。Ｔ０のトランスジェニックトウモロコシ植物体において生物学的応答は可変的であるが、トランスジェニック植物体のみが、ＷＣＲによる根切りのかなりの低減を示した。
【０３３０】
【表１９】
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【実施例１２】
【０３３１】
トランスジェニックトウモロコシについての害虫バイオアッセイ
セイヨウトウモロコシ根虫（ＷＣＲ：Diabrotica virgifera virgifera LeConte）の卵は、土壌中のものをＣｒｏｐ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＮ）から受領した。卵は、２８℃で１０〜１１日間にわたりインキュベートした。卵から土壌を洗い落とし、０．１５％の寒天溶液に入れ、濃度を、０．２５ｍＬのアリコート１つ当たりの卵約７５〜１００個へと調整した。孵化プレートを卵懸濁液のアリコートを伴うペトリディッシュ内で調製して、孵化速度をモニタリングした。
【０３３２】
トウモロコシ植物体の周囲の土壌に、ＷＣＲの卵１５０〜２００個を群棲させた。２週間にわたり害虫に摂食させ、その後、各植物体に「根評点」をつけた。グレーディングには、Ｎｏｄｅ−Ｉｎｊｕｒｙ  Ｓｃａｌｅを利用した（Olesonら（2005）、J. Econ. Entomol. 98（1）: 1〜8）。
【０３３３】
根評点が０．７５以上の植物体は、種子生成用の５ガロンの移植鉢へと速やかに移植した。移植植物体は、殺虫剤で処理して、さらなる根切り虫による虫害および温室における害虫の開放を阻止した。種子生成のために、ＨｉＩＩ植物体を、近交系のトウモロコシである５ＸＨ７５１（花粉ドナー）と異系交配させた。これらの植物体に生成させた種子は、Ｔ１およびその後の世代の植物体における評価のために取り置く。
【実施例１３】
【０３３４】
鞘翅目有害生物の配列を含むトランスジェニックトウモロコシ（Zea mays）
実施例８および９で記載した通りに、１０〜２０体のＴ０のトランスジェニックトウモロコシ（Zea mays）植物体を生成させる。さらに１０〜２０体の、配列番号１〜４に示されるＲＮＡｉ構築物のためのヘアピンｄｓＲＮＡを発現させる独立のＴ１トウモロコシ（Zea mays）系列を、コーンルートワーム攻撃のために得る。これらは、ＲＴ−ＰＣＲを介して確認する。場合によって、独立のＴ１系列から選択される全ＲＮＡを、ＲＮＡｉ構築物の各々におけるヘアピンカセットのｐｄｋイントロンに結合するようにデザインしたプライマーを伴うＲＴ−ＰＣＲに用いる。加えて、場合によって、ＲＮＡｉ構築物における各標的遺伝子に特異的なプライマーは、ｉｎ  ｐｌａｎｔａにおけるｓｉＲＮＡの生成に要請されるあらかじめプロセシングされたｍＲＮＡを増幅し、その生成を確認するのに用いる。各標的遺伝子に所望されるバンドの増幅により、各トランスジェニックトウモロコシ（Zea mays）におけるヘアピンＲＮＡの発現が確認される。その後、場合によって、標的遺伝子のｄｓＲＮＡヘアピンのｓｉＲＮＡへのプロセシングは、ＲＮＡブロットハイブリダイゼーションを用いて、独立のトランスジェニック系列において確認する。
【０３３５】
トランスジェニックのＲＮＡｉ系列と野生型トウモロコシ（Zea mays）との表現型の比較
鞘翅目有害生物のヘアピンｄｓＲＮＡを創出するために選択された標的遺伝子または標的配列は、任意の知られた植物遺伝子または植物配列との類似性を有さない。よって、これらの遺伝子または配列を標的とする構築物による（植物体全体にわたる）ＲＮＡｉの生成または活性化がトランスジェニック植物体に対して有害効果を及ぼすことは予測されない。しかし、トランスジェニック系列の発達および形態的特徴は、野生型の植物体のほか、空のヘアピンベクターで形質転換されたトランスジェニック系列の植物体と比較される。植物体の根、シュート、茎葉、および生殖特徴が比較される。トランスジェニック植物体および野生型植物体の根の長さおよび成長パターンには観察可能な差違が見られない。草高、葉の枚数およびサイズ、開花時期、花のサイズ、ならびに外観などの植物体のシュート特徴は同様である。一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび温室内の土壌中で培養した場合、トランスジェニック系列と標的ｉＲＮＡ分子の発現を伴わない系列とでは、観察可能な形態的差違が見られない。
【実施例１４】
【０３３６】
鞘翅目有害生物の配列およびさらなるＲＮＡｉ構築物を含むトランスジェニックトウモロコシ（Zea mays）
鞘翅目有害生物以外の生物を標的とするｉＲＮＡ分子へと転写されるそのゲノムにおける異種コード配列を含むトランスジェニックトウモロコシ（Zea mays）の植物体を、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属またはＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）を介する形質転換を介して形質転換して、１または複数の殺虫性ｄｓＲＮＡ分子（例えば、配列番号１〜４のうちの１つを含む遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ分子を含めた少なくとも１つのｄｓＲＮＡ分子）を生成させる。本質的に実施例４で記載される通りに調製される植物体の形質転換用のＤＮＡ分子の調製物を、鞘翅目有害生物以外の生物を標的とするｉＲＮＡ分子へと転写されるそのゲノムにおける異種コード配列を含むトランスジェニックトウモロコシ（Zea mays）の植物体から得られるＨｉ−ＩＩトウモロコシの懸濁細胞培養物へと送達する。
【実施例１５】
【０３３７】
鞘翅目有害生物抵抗性のトランスジェニック植物体
ｉｎ  ｐｌａｎｔａにおいて標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを送達し、その後、摂食を介してこれを鞘翅目有害生物に取り込ませる結果として、ＲＮＡを介する遺伝子サイレンシングによる標的遺伝子の下方制御がもたらされる。標的遺伝子の機能が重要であれば、鞘翅目有害生物の成長、発育、および生殖が影響を受け、ＷＣＲ、ＮＣＲ、ＳＣＲ、ＭＣＲ、Ｄ．バルテアータ（D. balteata LeConte）、Ｄ．ｕ．テネラ（D. u. tenella）、およびジュウイチホシウリハムシ（D. u. undecimpunctata Mannerheim）のうちの少なくとも１つの場合であれば、寄生、摂食、発育、および／もしくは生殖の成功に失敗することがもたらされるか、または発育の１もしくは複数の段階における鞘翅目有害生物の死滅がもたらされる。次いで、標的遺伝子の選択およびＲＮＡｉの成功裏の適用を用いて、鞘翅目有害生物を防除する。各ＲＮＡｉ構築物について１０〜２０体ずつの独立のＴ１トウモロコシ（Z. mays）トランスジェニック系列を、５〜１０連でコーンルートワーム種に攻撃させる。攻撃は、各コーンルートワーム種について２連ずつとする。ＲＮＡｉ系列のＴ１種子を発芽させ、抵抗性の植物を、発芽後１０〜１５日間にわたり改変Ｋｎｏｐ培地へと移す。野生型対照トウモロコシ（Z. mays）の種子も同時に発芽させ、コーンルートワーム感染に用いる。
【０３３８】
対照では、１または複数のＲＮＡｉ構築物を保有するトランスジェニックトウモロコシ（Z. mays）系列の場合より著明に多くの（＞５０％）コーンルートワームが生存する。ｉＲＮＡのアバンダンスは、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて、野生型植物体およびトランスジェニック植物体の根を常食とするコーンルートワームにおいて測定する。１または複数のＲＮＡｉ構築物を保有するトランスジェニックトウモロコシ（Z. mays）系列では、対照植物体より著明に多くのｉＲＮＡ分子が見出される。これらの結果は、トランスジェニック系列が標的遺伝子に対応するｓｉＲＮＡをプロセシングし、これらのｓｉＲＮＡが、摂食するコーンルートワームにより取込み可能であることを示す。より重要であるが、結果は、全ての標的遺伝子に対するＲＮＡｉを介する阻害が、標的であるコーンルートワームの成長、発育、および生存能力に影響を及ぼすことを示す。さらに、ミスマッチ配列を伴うＲＮＡｉ分子であって、標的遺伝子に対する配列同一性が８０％を超えるＲＮＡｉ分子は、野生型配列と同様の形でコーンルートワームに影響を及ぼす。ミスマッチ配列が天然配列と対合して、同じＲＮＡｉ構築物においてヘアピンｄｓＲＮＡを形成すれば、植物体によりプロセシングされた、摂食する鞘翅目有害生物の成長、発育、および生存能力に影響を及ぼすことが可能なｓｉＲＮＡが送達される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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