(57)【要約】  β‐β架橋が好まれる熱安定性酸素担体含有医薬組成物の調製方法を提供する。本発明の方法を用いることで、特定用途に適合されたヘモグロビン酸素担体が生成できるよう、得られる分子の酸素親和性を制御することができる。より低い酸素親和性を有する架橋ヘモグロビンは素早く組織を酸素化する必要がある用途（例えば、出血性ショック）に有用であり、より高い酸素親和性を有する架橋ヘモグロビンはよりゆっくり酸素化を要する用途に有用である（例えば、がん補助治療）。β‐β架橋を４０〜６０％より高く有し、腎損傷及び血管収縮を発生させずに哺乳類に対して用いるのに好適な高度精製及び熱安定性架橋非高分子四量体型ヘモグロビンを生成する。望ましくない二量体型ヘモグロビン、非架橋四量体型ヘモグロビン、及び血漿タンパク質不純物を効果的に除去するように、高温短時間（ＨＴＳＴ）熱処理工程を行う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高度精製及び熱安定性酸素担体含有医薬組成物の調製方法であって、酸素担体含有医薬組成物は、ヘモグロビンを含み、前記ヘモグロビンはβ‐β架橋を４０％より多く有する非高分子架橋四量体型ヘモグロビンからなり、前記方法は、
ａ）少なくとも赤血球及び血漿を含む哺乳類全血を用意することと、
ｂ）前記哺乳類全血の血漿から赤血球を分離することと、
ｃ）前記血漿から分離された前記赤血球をろ過してろ過された赤血球分画を取得することと、
ｄ）前記ろ過された赤血球分画を洗浄して血漿タンパク質不純物を除去することで、結果的に洗浄後赤血球を得ることと、
ｅ）前記洗浄後赤血球を破壊して破壊後赤血球の溶解物を含む溶液を生成することと、
ｆ）ろ過を行って前記溶解物から不要残余分の少なくとも一部を除去することと、
ｇ）前記溶解物から第１ヘモグロビン溶液を抽出することと、
ｈ）少なくとも１回の精製処理を行い、１つ以上のウイルス、不要残余分、又はタンパク質不純物を除去することと、
ｉ）フマル酸ビス−３，５−ジブロモサリチルで前記第１ヘモグロビン溶液を架橋して、少なくともβ‐β架橋を４０％有する非高分子架橋四量体型ヘモグロビンである架橋ヘモグロビンを酸素化環境下にて形成することと、
ｊ）残存薬液を除去することと、
ｋ）前記架橋ヘモグロビンを脱酸素化環境下で熱処理して、結果的に得られる熱安定性架橋四量体型ヘモグロビンが、検知できない濃度の二量体しか有さず、少なくとも４０％のβ‐β架橋を有する非高分子架橋四量体型ヘモグロビンからなり、実質的に同様の条件で計測された同一種の自然ヘモグロビンの酸素親和性よりも高い酸素親和性を有するように、残基非安定化／非架橋ヘモグロビン、二量体型ヘモグロビン、及び任意のその他のタンパク質不純物を変性及び沈殿化させることと、
ｌ）遠心分離又はろ過によって沈殿物を除去して透明溶液を生成することと、
ｍ）前記精製された熱安定性架橋四量体型ヘモグロビンを薬学的に許容可能な担体に添加することとを含む、調製方法。
【請求項２】
前記熱処理の工程は、およそ７０℃〜９５℃にて３０秒〜３時間行われその直後に冷却される高温短時間（ＨＴＳＴ）プロセスであり、前記冷却直後にＮ−アセチルシステインを０．２〜０．４％の量で添加する、請求項１に記載の高度精製及び熱安定性酸素担体含有医薬組成物の調製方法。
【請求項３】
前記全血がウシ全血であって、前記β‐β架橋が５０％より高く、ｐ５０値がおよそ２３ｍｍＨｇよりも低い、請求項１に記載の高度精製及び熱安定性酸素担体含有医薬組成物の調製方法。
【請求項４】
前記全血がウシ全血であって、前記β‐β架橋が６０％より高く、ｐ５０値がおよそ２３ｍｍＨｇよりも低い、請求項１に記載の高度精製及び熱安定性酸素担体含有医薬組成物の調製方法。
【請求項５】
前記精製がクロマトグラフィーを用いて行われ、前記クロマトグラフィーは陽イオン交換カラム又は陰イオン交換カラムを１つ以上用いることを含む、請求項１に記載の高度精製及び熱安定性酸素担体含有医薬組成物の調製方法。
【請求項６】
前記クロマトグラフィーのカラムが１つ以上のＤＥＡＥ、ＣＭ及び／又はヒドロキシアパタイトカラムである、請求項５に記載の高度精製及び熱安定性酸素担体含有医薬組成物の調製方法。
【請求項７】
前記全血がヒト血液である、請求項１に記載の高度精製及び熱安定性酸素担体含有医薬組成物の調製方法。
【請求項８】
前記全血がブタ血液、ウマ血液、又はイヌ血液である、請求項１に記載の高度精製及び熱安定性酸素担体含有医薬組成物の調製方法。
【請求項９】
ヘモグロビン溶液がおよそ２年間の貯蔵期間を有するように、前記ヘモグロビン溶液を低酸素透過性パッケージにパッケージングすることをさらに含む、請求項１に記載の高度精製及び熱安定性酸素担体含有医薬組成物の調製方法。
【請求項１０】
ヘモグロビンを含む高度精製及び熱安定性酸素担体含有医薬組成物であって、前記ヘモグロビンが、請求項１の方法で調製された、β‐β架橋を４０％より多く有する非高分子架橋四量体型ヘモグロビンからなる、組成物。
【請求項１１】
ヘモグロビンを含む高度精製及び熱安定性酸素担体含有医薬組成物であって、前記ヘモグロビンが、請求項４の方法で調製された、β‐β架橋を６０％より多く有する非高分子架橋四量体型ヘモグロビンからなる、組成物。
【請求項１２】
前記組成物が生体内又は生体外で投与される、組織を酸素化するための、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が生体内又は生体外で投与される、組織を酸素化するための、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
高度精製及び熱安定性酸素担体含有医薬組成物の調製方法であって、酸素担体含有医薬組成物はヘモグロビンを含み、前記ヘモグロビンがβ‐β架橋を５０％より多く有する非高分子架橋四量体型ヘモグロビンからなり、前記方法は、
ａ）少なくとも赤血球及び血漿を含む哺乳類全血を用意することと、
ｂ）前記哺乳類全血の血漿から赤血球を分離することと、
ｃ）前記血漿から分離された前記赤血球をろ過してろ過された赤血球分画を取得することと、
ｄ）前記ろ過された赤血球分画を洗浄して血漿タンパク質不純物を除去することで、結果的に洗浄後赤血球を得ることと、
ｅ）前記洗浄後赤血球を破壊して破壊後赤血球の溶解物を含む溶液を生成することと、
ｆ）ろ過を行って前記溶解物から不要残余分の少なくとも一部を除去することと、
ｇ）前記溶解物から第１ヘモグロビン溶液を抽出することと、
ｈ）少なくとも１回の精製処理を行い、１つ以上のウイルス、不要残余分、又はタンパク質不純物を除去することと、
ｉ）フマル酸ビス−３，５−ジブロモサリチルで前記第１ヘモグロビン溶液を架橋して、少なくともβ‐β架橋を５０％有する非高分子架橋四量体型ヘモグロビンである架橋ヘモグロビンを酸素化環境下にて形成することと、
ｊ）残存薬液を除去することと、
ｋ）前記架橋ヘモグロビンを脱酸素化環境下で熱処理して、結果的に得られる熱安定性架橋四量体型ヘモグロビンが、検知できない濃度の二量体しか有さず、少なくとも５０％のβ‐β架橋を有する非高分子架橋四量体型ヘモグロビンからなり、実質的に同様の条件で計測された同一種の自然ヘモグロビンの酸素親和性よりも高い酸素親和性を有するように、残基非安定化／非架橋ヘモグロビン、二量体型ヘモグロビン、及び任意のその他のタンパク質不純物を変性及び沈殿化させることと、
ｌ）遠心分離又はろ過によって沈殿物を除去して透明溶液を生成することと、
ｍ）前記精製された熱安定性架橋四量体型ヘモグロビンを薬学的に許容可能な担体に添加することとを含む、調製方法。
【請求項１５】
前記全血がウシ全血であり、前記架橋四量体型ウシヘモグロビンの酸素親和性がおよそ３８〜５０ｍｍＨｇのｐ５０値を有する、請求項１４に記載の高度精製及び熱安定性酸素担体含有医薬組成物の調製方法。
【請求項１６】
ヘモグロビン溶液がおよそ２年間の貯蔵期間を有するように、前記ヘモグロビン溶液を低酸素透過性パッケージにパッケージングすることをさらに含む、請求項１４に記載の高度精製及び熱安定性酸素担体含有医薬組成物の調製方法。
【請求項１７】
ヘモグロビンを含む高度精製及び熱安定性酸素担体含有医薬組成物であって、前記ヘモグロビンが、請求項１４の方法で調製された、β‐β架橋を５０％より多く有する非高分子架橋四量体型ヘモグロビンからなる、組成物。
【請求項１８】
ヘモグロビンを含む高度精製及び熱安定性酸素担体含有医薬組成物であって、前記ヘモグロビンが、請求項１５の方法で調製された、β‐β架橋を６０％より多く有する非高分子架橋四量体型ヘモグロビンからなる、組成物。
【請求項１９】
前記組成物が生体内又は生体外で投与される、組織を酸素化するための、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物が生体内又は生体外で投与される、組織を酸素化するための、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記熱処理の工程は、およそ７０℃〜９５℃にて３０秒〜３時間行われその直後に冷却される高温短時間（ＨＴＳＴ）プロセスであり、前記冷却直後にＮ−アセチルシステインを０．０２５〜０．４％の量で添加する、請求項１に記載の高度精製及び熱安定性酸素担体含有医薬組成物の調製方法。
【請求項２２】
前記熱処理の工程は、およそ７０℃〜９５℃にて３０秒〜３時間行われその直後に冷却される高温短時間（ＨＴＳＴ）プロセスであり、前記冷却直後にＮ−アセチルシステインを０．０２５〜０．２％の量で添加する、請求項１に記載の高度精製及び熱安定性酸素担体含有医薬組成物の調製方法。
【請求項２３】
高度精製及び熱安定性酸素担体含有医薬組成物の調製方法であって、酸素担体含有医薬組成物はヘモグロビンを含み、前記ヘモグロビンはβ‐β架橋を４０％より多く有する非高分子架橋四量体型ヘモグロビンからなり、前記方法は、
ａ）少なくとも赤血球及び血漿を含む哺乳類全血を用意することと、
ｂ）前記哺乳類全血の血漿から赤血球を分離することと、
ｃ）前記血漿から分離された前記赤血球をろ過してろ過された赤血球分画を取得することと、
ｄ）前記ろ過された赤血球分画を洗浄して血漿タンパク質不純物を除去することで、結果的に洗浄後赤血球を得ることと、
ｅ）前記洗浄後赤血球を破壊して破壊後赤血球の溶解物を含む溶液を生成することと、
ｆ）ろ過を行って前記溶解物から不要残余分の少なくとも一部を除去することと、
ｇ）前記溶解物から第１ヘモグロビン溶液を抽出することと、
ｈ）少なくとも１回の精製処理を行い、１つ以上のウイルス、不要残余分、又はタンパク質不純物を除去することと、
ｉ）フマル酸ビス−３，５−ジブロモサリチルで前記第１ヘモグロビン溶液を架橋して、少なくともβ‐β架橋を４０％有する非高分子架橋四量体型ヘモグロビンである架橋ヘモグロビンを酸素化環境下にて形成することと、
ｊ）残存薬液を除去することと、
ｋ）前記架橋ヘモグロビンを脱酸素化環境下で熱処理して、結果的に得られる熱安定性架橋四量体型ヘモグロビンが、検知できない濃度の二量体しか有さず、少なくとも４０％のβ‐β架橋を有する非高分子架橋四量体型ヘモグロビンからなり、実質的に同様の条件で計測された同一種の自然ヘモグロビンの酸素親和性よりも高い酸素親和性を有するように、残基非安定化／非架橋ヘモグロビン、二量体型ヘモグロビン、及び任意のその他のタンパク質不純物を変性及び沈殿化させることと、
１）得られた前記熱安定性架橋ヘモグロビンを冷却することと、
ｍ）Ｎ−アセチルシステインを０．０２５％〜０．４％添加することと、
ｎ）遠心分離又はろ過によって沈殿物を除去して透明溶液を生成することと、
ｏ）前記精製された熱安定性架橋四量体型ヘモグロビンを薬学的に許容可能な担体に添加することとを含む、調製方法。
【請求項２４】
前記熱処理の工程は、およそ７０℃〜９５℃にて３０秒〜３時間行われその直後に冷却される高温短時間（ＨＴＳＴ）プロセスであり、前記冷却直後にＮ−アセチルシステインを０．０２５〜０．４％の量で添加する、請求項１４に記載の高度精製及び熱安定性酸素担体含有医薬組成物の調製方法。
【請求項２５】
前記熱処理の工程は、およそ７０℃〜９５℃にて３０秒〜３時間行われその直後に冷却される高温短時間（ＨＴＳＴ）プロセスであり、前記冷却直後にＮ−アセチルシステインを０．０２５〜０．２％の量で添加する、請求項１４に記載の高度精製及び熱安定性酸素担体含有医薬組成物の調製方法。
【請求項２６】
前記熱処理の工程が、およそ７０℃〜９５℃にて３０秒〜３時間行われその直後に冷却される高温短時間（ＨＴＳＴ）プロセスであり、前記冷却直後にＮ−アセチルシステインを０．２〜０．４％の量で添加する、請求項１４に記載の調製方法。
【請求項２７】
高度精製及び熱安定性酸素担体含有医薬組成物の調製方法であって、酸素担体含有医薬組成物はヘモグロビンを含み、前記ヘモグロビンはβ‐β架橋を５０％より多く有する非高分子架橋四量体型ヘモグロビンからなり、前記方法は、
ａ）少なくとも赤血球及び血漿を含む哺乳類全血を用意することと、
ｂ）前記哺乳類全血の血漿から赤血球を分離することと、
ｃ）前記血漿から分離された前記赤血球をろ過してろ過された赤血球分画を取得することと、
ｄ）前記ろ過された赤血球分画を洗浄して血漿タンパク質不純物を除去することで、結果的に洗浄後赤血球を得ることと、
ｅ）前記洗浄後赤血球を破壊して破壊後赤血球の溶解物を含む溶液を生成することと、
ｆ）ろ過を行って前記溶解物から不要残余分の少なくとも一部を除去することと、
ｇ）前記溶解物から第１ヘモグロビン溶液を抽出することと、
ｈ）少なくとも１回の精製処理を行い、１つ以上のウイルス、不要残余分、又はタンパク質不純物を除去することと、
ｉ）フマル酸ビス−３，５−ジブロモサリチルで前記第１ヘモグロビン溶液を架橋して、少なくともβ‐β架橋を５０％有する非高分子架橋四量体型ヘモグロビンである架橋ヘモグロビンを酸素化環境下にて形成することと、
ｊ）残存薬液を除去することと、
ｋ）前記架橋ヘモグロビンを脱酸素化環境下で熱処理して、結果的に得られる熱安定性架橋四量体型ヘモグロビンが、検知できない濃度の二量体しか有さず、少なくとも５０％のβ‐β架橋を有する非高分子架橋四量体型ヘモグロビンからなり、実質的に同様の条件で計測された同一種の自然ヘモグロビンの酸素親和性よりも高い酸素親和性を有するように、残基非安定化／非架橋ヘモグロビン、二量体型ヘモグロビン、及び任意のその他のタンパク質不純物を変性及び沈殿化させることと、
１）得られた前記熱安定性架橋ヘモグロビンを冷却することと、
ｍ）Ｎ−アセチルシステインを０．０２５％〜０．４％添加することと、
ｎ）遠心分離又はろ過によって沈殿物を除去して透明溶液を生成することと、
ｏ）前記精製された熱安定性架橋四量体型ヘモグロビンを薬学的に許容可能な担体に添加することとを含む、調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（著作権通知／許可）
【０００２】
この特許文献の開示の一部には著作権保護を受ける内容が含まれている。特許・商標庁の特許ファイル又は記録に記載されるとおりの特許文献又は特許開示に対し、著作権者はいかなる人による複製に対しても異議はないものとするが、その他のいかなる著作権は保護される。以下の通知は、以下記載の工程、実験、及びデータ並びに添付図面に適用される。著作権（ｃ）２０１１年、ビリオン・キング・インターナショナル・リミテッド、無断転載禁ず。
【０００３】
（関連文献の引用）
【０００４】
本出願は、その開示される全てを引用により参照する、米国仮出願第６１／５２９，２７９号（２０１１年８月３１日出願）、米国一部継続出願第１３／２２５，７９７号（２０１１年９月６日出願）、及び米国一部継続出願第１３／２７５，３６６号（２０１１年１０月１８日出願、現米国特許第８，１０６，０１１号）に対して優先権を主張する。
【０００５】
本発明は、β‐β架橋が好まれる熱安定性酸素担体含有医薬組成物の調製方法に関する。本発明の方法を用いることで、特定用途に適合されたヘモグロビン酸素担体が生成できるよう、得られる分子の酸素親和性を制御することができる。より低い酸素親和性を有する架橋ヘモグロビンは素早く組織を酸素化する必要がある用途（例えば、出血性ショック）に有用であり、より高い酸素親和性を有する架橋ヘモグロビンはよりゆっくり酸素化を要する用途に有用である（例えば、がん補助治療）。
【背景技術】
【０００６】
ヘモグロビンは、ほとんどの脊椎動物の脈管系と組織との間の気体交換において重要な役割を果たす。呼吸器系から血液循環によって体細胞へ酸素を運び、また体細胞から代謝老廃物である二酸化炭素を運び、呼吸器系にて二酸化炭素を吐き出させる。ヘモグロビンにこのような酸素運搬特性があるため、生体外及び生体内において安定化可能であれば有力な酸素供給源として用いることができる。
【０００７】
自然発生するヘモグロビンは、赤血球内に存在する間は一般的に安定している四量体である。しかしながら、自然発生のヘモグロビンを赤血球から取り出すと、血漿内にて不安定になり、２つのα−β二量体に分離する。これらの二量体はそれぞれおよそ３２ｋＤａの分子量を有する。これらの二量体は、腎臓を通過し排泄されると相当の腎損傷を引き起こす可能性がある。四量体結合の崩壊はさらに、循環における機能的ヘモグロビンの持続性にマイナスの影響を与える。
【０００８】
これらの問題を解決するべく、ヘモグロビン処理における最近の発展により、高分子ヘモグロビンを形成する四量体間の分子間結合だけでなく、四量体内にて分子内結合を生成する様々な架橋技術を組み入れている。従来技術では、ヘモグロビンの循環半減期を増加させるには高分子ヘモグロビンが好ましい形であると開示している。しかしながら、本発明者らが判断したように、血液循環においては、高分子ヘモグロビンがより容易にメトヘモグロビンに変換される。メトヘモグロビンは酸素と結合することができないため、組織を酸素化することができない。したがって、従来技術で教示される、高分子ヘモグロビンを形成させる架橋には問題である。高分子ヘモグロビンを同時に形成させることなく、安定した四量体を作成するための分子内架橋を可能とする技術が求められている。
【０００９】
従来技術におけるヘモグロビンを安定化させるための試みのさらなる問題として、容認できない高い割合で二量体ユニット（又は、患者に投与されると二量体型ヘモグロビンに素早く分離する非架橋四量体型ヘモグロビン）が含まれる四量体型ヘモグロビンが生成されることが挙げられる。二量体が存在することで、哺乳類に投与するには不十分なヘモグロビン組成物とみなされる。ヘモグロビンの二量体型は、哺乳類の体に深刻な腎損傷を引き起こす可能性がある。この腎損傷は死をもたらすほど深刻になる場合もある。したがって、当該技術分野において、最終生成物において検出感度以下の二量体型しか含まない安定した四量体型ヘモグロビンを生成する必要がある。
【００１０】
従来のヘモグロビン製品における他の問題点として、投与後に急に血圧が上昇することが挙げられる。ヘモグロビン酸素担体を生成した際における血管収縮事例が過去に記録されている。したがって、当該技術において、哺乳類に投与されたときに血管収縮及び高血圧を引き起こさないヘモグロビンを生成する方法が求められている。
【００１１】
安定したヘモグロビンを生成するための従来の試みに関する他の問題点として、哺乳類に対してアレルギー作用を引き起こす可能性のある、免疫グロブリンＧなどのタンパク質不純物の存在が挙げられる。したがって、当該技術において、タンパク質不純物を含まない安定した四量体型ヘモグロビンを生成する方法が求められる。
【００１２】
上記問題に加えて、当該技術において、二量体及びリン脂質を含まず、工業規模での製造が可能な安定した四量体型ヘモグロビンが求められている。
【００１３】
ヘモグロビン酸素担体は広範囲にわたる医療用途に用いることができる。その医療用途によって、異なるレベルの酸素親和性が好まれる。例えば、低酸素親和性を有するヘモグロビン分子は、高酸素親和性を有するヘモグロビン分子よりも容易に目的組織に酸素を運ぶことができる。したがって、架橋四量体型ヘモグロビンの酸素親和性を制御するのが好ましい。これにより、当該技術において、正確なレベルの酸素結合を有する架橋四量体型ヘモグロビンを生成する架橋の種類及び架橋の条件を制御することが求められる。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、深刻な腎損傷や血管への悪影響、及び死を含む深刻な有害事象を引き起こさない、哺乳類に対する使用に適した非高分子熱安定性精製架橋四量体型ヘモグロビンの処理方法を提供する。本発明は、二量体型ヘモグロビン、非架橋四量体型ヘモグロビン、リン脂質及びタンパク質不純物を除去する。本発明はまた、四量体における架橋の種類（例えば、四量体におけるβ‐β架橋、α‐α架橋、α‐β架橋の量）、四量体の四次構造、及び架橋条件を制御することで、得られる架橋四量体の酸素親和性を制御する技術を提供する。より素早く組織の酸素化を必要とする用途（例えば、出血性ショック）では低い酸素親和性を有する架橋ヘモグロビンが有用であり、低速度での酸素化を必要とする用途（例えば、がん補助治療）では高い酸素親和性を有する架橋ヘモグロビンが有用である。さらに、本発明は、（１）正確及び制御された低張溶解を行う即時細胞溶解装置、（２）フロースルーカラムクロマトグラフィー、（３）精製処理にてヘモグロビン溶液を熱処理して、望ましくない不安定なヘモグロビンの二量体並びに免疫グロブリンＧなどのタンパク質不純物を除去し、腎損傷、血管への悪影響、並びにその他有害反応を避ける高温短時間（ＨＴＳＴ）装置、及び（４）最終生成物への酸素混入を避ける気密注入バッグパッケージングを用いる。
【００１５】
本方法は、少なくとも赤血球及び血漿を含む哺乳類の全血の出発物質を有する。哺乳類の全血の血漿から赤血球を取り出してろ過することで、ろ過赤血球分画を得る。ろ過された赤血球分画は洗浄され、血漿タンパク質不純物が除去される。洗浄された赤血球は、即時細胞溶解装置にて、白血球を溶解することなく赤血球を溶解するために十分な時間、制御された低張溶解によって破壊する。溶解物の残余不要物質の少なくとも一部を除去するためにろ過を行う。溶解物から第１ヘモグロビン溶液を抽出する。
【００１６】
ヘモグロビン溶液に対しては、１つ以上の限外濾過及び／又はクロマトグラフィーなどの精製処理を行う。
【００１７】
精製ヘモグロビンをビス−３，５−ジブロモサリシルフマラート（ＤＢＳＦ）で架橋し、高分子ヘモグロビンを形成することなく熱安定性架橋ヘモグロビンを形成する。得られた非高分子架橋四量体型ヘモグロビンの分子量は６０−７０ｋＤａである。本明細書に用いられる「非高分子」とは、ＰＥＧなどの他のヘモグロビン分子又は他の非ヘモグロビン分子と分子間架橋されていない四量体型ヘモグロビンを示す。ヘモグロビン源、ヘモグロビンの四次構造及び架橋条件によって、β‐β架橋の割合の高い四量体型生成物を生成することができる。さらに、得られる分子の酸素親和性を特定用途に適合したヘモグロビン酸素担体が生成できるように制御することができる。
【００１８】
この手順の後に、架橋ヘモグロビンを熱処理し、残余非架橋四量体型ヘモグロビンや、例えば二量体ヘモグロビンといった非安定化ヘモグロビン、及び他のタンパク質不純物を除去する。熱処理の前に、メトヘモグロビンの形成を防止するために、濃度がおよそ０．２％のＮ−アセチルシステインを任意に架橋四量体型ヘモグロビンに添加する。熱処理及び冷却の直後に、メトヘモグロビンの形成をさらに防止するために、任意で濃度がおよそ０．０２５％〜０．４％のＮ−アセチルシステインを添加する。熱処理は、およそ７０℃〜９５℃の間で３０秒〜３時間行い、続いて２５℃まで冷却する高温短時間処置であることが好ましい。熱処理中に形成された沈殿物は遠心分離又はろ過で除去する。
【００１９】
続いて、二量体、リン脂質、及びタンパク質不純物のない、熱安定性、非高分子架橋四量体型ヘモグロビンを薬学的に許容可能な担体に添加する。
【００２０】
その後、熱安定性架橋四量体型ヘモグロビンを処方し、オーダーメイド及び気密ポリエチレン、エチレンビニルアセテート、及びエチレンビニルアルコール（ＰＥ、ＥＶＡ、ＥＶＯＨ）注入バッグにパッケージングする。パッケージングによって、結果として不活性メトヘモグロビンの生成を引き起こす酸素混入を防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の方法の概要を図示するフローチャートである。
【図２】本発明の方法において用いられる即時細胞溶解装置を図示する概略図である。
【図３】（ａ）非加熱処理架橋四量体型ヘモグロビン、及び（ｂ）９０℃の熱処理を４５秒〜２分間、又は８０℃の熱処理を３０分間行った熱安定性架橋四量体型ヘモグロビンの高速液体クロマトグラフィー分析を示す図である。
【図４】フロースルーカラムクロマトグラフィーの溶出プロファイルである。ヘモグロビン溶液はフロースルー分画に含まれる。
【図５】工業規模での運用に適用するための、限外濾過を行うフロースルーＣＭカラムクロマトグラフィーシステムの概略図である。
【図６】ＨＴＳＴ熱処理工程に用いられる装置の概略図である。
【図７】ＨＴＳＴ処理装置における温度プロファイル、及び本発明のシステムにて不安定化四量体（二量体）を８５℃及び９０℃で取り出すのに要した時間を示す。
【図８】本発明の熱安定性架橋四量体型ヘモグロビンの注入バッグの概略図である。
【図９】ＤＢＳＦ脱酸素化環境下での反応の前（破線）及び後（実線）におけるウシヘモグロビンのα並びにβグロビン鎖の逆位相ＨＰＬＣクロマトグラムを図示する。
【図１０】ＤＢＳＦ脱酸素化状態下における（Ａ）自然ウシヘモグロビン及び（Ｂ）ヘモグロビン架橋の１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図示する。
【図１１】マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）分析によって生成された二量体型タンパク質バンド（Ｂ６）からのトリプシン消化ペプチドのペプチドマスフィンガープリントを図示する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
ヘモグロビンは、哺乳類及びその他動物の血液の赤血球に含まれる、鉄含有酸素運搬タンパク質である。ヘモグロビンはタンパク質の三次及び四次構造の両方の特徴を示す。ヘモグロビンにおけるほとんどのアミノ酸が、短い非ヘリックス部によって接続されたαヘリックスを形成する。水素結合によってヘモグロビン内のヘリックス部が安定し、分子内で引力が発生し各ポリペプチド鎖が特定の形に折り畳まれる。ヘモグロビン分子は４つの球状のタンパク質サブユニットから構築される。各サブユニットはポリペプチド鎖からなり、一組のαヘリックス構造セグメントに配置され、包埋されたヘム基を有する「ミオグロビンフォールド」配置に接続される。
【００２３】
ヘム基は、ポルフィリンで知られる、複素環に保持される鉄原子からなる。鉄原子は一面に並ぶ環の中心で４つ全ての窒素原子と均一に結合する。続いて、酸素がポルフィリン環の中央でその面に垂直に鉄と結合することができる。したがって、１つのヘモグロビン分子は４つ酸素分子と化合する容量を有する。
【００２４】
哺乳類において、最も一般的なヘモグロビンの種類は四量体である。ヒトの場合、ヘモグロビンＡと呼ばれ、それぞれ１４１及び１４６アミノ酸残基からなる２つのα及び２つのβ非共有結合サブユニットからなり、α２β２で表される。α及びβサブユニットの大きさ及び構造は非常に似通っている。各サブユニットは約１６ｋＤａの分子量を有し、四量体の合計分子量は約６５ｋＤａになる。４つのポリペプチド鎖は、塩橋、水素結合、及び疎水性相互作用によって結合されている。ウシヘモグロビンの構造はヒトヘモグロビンと似ている（α鎖において９０．１４％同一性を有し、β鎖において８４．３５％同一性を有する）。その違いとは、ウシヘモグロビン内の２つのスルフヒドリル基がβＣｙｓ９３に位置するのに対し、ヒトヘモグロビン内のスルフヒドリルがそれぞれαＣｙｓ１０４、βＣｙｓ９３及びβＣｙｓ１１２に位置することである。ヒトヘモグロビンは、そのアミノ酸配列を比較すると、ウシ、イヌ、ブタ、及びウマヘモグロビンと高い類似性を有する。
【００２５】
赤血球内の自然発生ヘモグロビンでは、α鎖と対応するβ鎖との関連は非常に強く、生理的条件下で解離することはない。しかしながら、１つのαβ二量体と別のαβ二量体とのつながりは、赤血球外では結構弱い。その結合は、それぞれおよそ３２ｋＤａの２つのαβ二量体に分かれる傾向がある。これらの好ましくない二量体は腎臓でろ過されて排泄され得るだけの小ささを有するため、結果として潜在的に腎損傷及び血管内保持時間の実質的な減少を引き起こす。
【００２６】
したがって、有効性及び安全性の両面から、赤血球外で使用されるヘモグロビンを安定させる必要がある。安定化ヘモグロビンを生成する方法の概要を以下に記載する。本発明の方法の概要を図１のフローチャートに示す。
【００２７】
最初に、赤血球から採取するヘモグロビンの源として、全血源を選択する。ヒト、ウシ、ブタ、ウマ、及びイヌ全血を含むがこれに限られず、哺乳類の全血が選択可能である。赤血球を血漿から分離し、ろ過し、洗浄して、血漿タンパク質不純物を除去する。
【００２８】
赤血球からヘモグロビンを遊離するべく、細胞膜を溶解する。赤血球の溶解に様々な技術を用いることができるが、本発明では工業規模での製造に適した量で正確に制御可能なように、低張条件下での溶解を用いる。そのために、図２に示す即時細胞溶解装置を用いて赤血球を溶解する。低張溶解によって、ヘモグロビン及び不要残余分を含む溶解物の溶液を生成する。工業規模での製造を可能にするために、白血球又はその他の細胞を溶解することなく、赤血球のみが溶解されるように溶解を制御する。１つの実施形態において、即時細胞溶解装置の大きさは、赤血球が装置を横切るのに２〜３０秒かかるように、又は赤血球が溶解するのに必要な時間で設定され、好ましくは３０秒かかるように決められる。即時細胞溶解装置はスタティックミキサを備えている。低張液としては、脱イオン化蒸留水を用いる。もちろんのこと、異なる塩分濃度を有する低張液を用いると赤血球の溶解に必要な時間も異なってくると理解される。制御された溶解手順によって白血球や細胞類ではなく赤血球のみを溶解するため、白血球やその他細胞類からの有害タンパク質、リン脂質やＤＮＡの放出を最小限にとどめることができる。３０秒直後、すなわち、即時細胞溶解装置のスタティックミキサ部分を赤血球含有溶液が横切った直後に、低張液を加える。得られたヘモグロビンは、他の溶解方法を用いて得られるヘモグロビンよりも高い純度を有し、不要ＤＮＡやリン脂質などの混入物の量も少ない。白血球やリン脂質の不純物からの好ましくない核酸は、それぞれポリメラーゼ連鎖反応法（検出限界＝６４ｐｇ）及び高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ、検出限界＝１μｇ／ｍｌ）を行ってもヘモグロビン溶液からは検出されなかった。
【００２９】
本方法のこの段階で、ヘモグロビン溶液は様々なタンパク質やその他不純物を除去するために精製される。この精製は、限外濾過、クロマトグラフィー、又は１つ以上の限外濾過及び／又はクロマトグラフィーの組み合わせで行われてもよい。例示的な実施形態では、２回にわたって限外濾過が行われた。１回はフロースルーカラムクロマトグラフィーの前に、ヘモグロビンより分子量の大きい不純物を除去するために行い、もう1回はフロースルーカラムクロマトグラフィーの後に、ヘモグロビンより分子量が小さい不純物を除去するために行われた。後者の限外濾過はヘモグロビンを濃縮する。いくつかの実施形態では、最初の限外濾過では１００ｋＤａフィルタを用いて、２つめの限外濾過では３０ｋＤａのフィルタを用いた。
【００３０】
フロースルーカラムクロマトグラフィーは、免疫グロブリンＧ、アルブミン及び炭酸脱水酵素などの、精製ヘモグロビン溶液の中のタンパク質不純物を除去するために用いられる。いくつかの実施形態では、カラムクロマトグラフィーを、市販されているＤＥＡＥカラム、ＣＭカラム、ヒドロキシアパタイトカラムなどのイオン交換カラムを１つ又は組み合わせて行う。典型的なカラムクロマトグラフィーのｐＨは、６〜８．５である。１つの実施形態では、フロースルーＣＭカラムクロマトグラフィー工程を行うことでタンパク質不純物をｐＨ８．０で除去している。カラムクロマトグラフィーからの溶出後のサンプルに残るタンパク質不純物及びリン脂質を検出するために酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）法及びＨＰＬＣ法を行う。この独自のフロースルーカラムクロマトグラフィー分離は、工業規模での製造における継続的な分離機構を可能にする。ＥＬＩＳＡの結果では、溶出されたヘモグロビンにおけるこれらの不純物の量が実質的に低いことを示す（免疫グロブリンＧ：４４．３ｎｇ／ｍｌ、アルブミン：２０．３７ｎｇ／ｍｌ、炭酸脱水酵素：８１．２μｇ／ｍｌ）。異なる種類のカラム及び異なるｐＨ値を用いたタンパク質不純物除去結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
2014525441.tif 000002
【００３２】
カラムクロマトグラフィー処理の後に、ＤＢＳＦを用いてヘモグロビンを架橋する。条件は、β‐βサブユニット間での架橋が好まれ、得られる生成物が５０％より多くのβ‐β架橋を得るように選択される。脱酸素化状態下での架橋では、得られるヘモグロビンが実質的に同様の条件下にて計測された同種の自然ヘモグロビンに比べて低い酸素親和性及び高いｐ５０の値を有する。例えば、ウシヘモグロビンでは、自然ウシヘモグロビンは約２３−２９ｍｍＨｇでｐ５０の値を有する。本発明にて脱酸素化状態下で形成された架橋ウシヘモグロビンは、約３８−５０ｍｍＨｇでｐ５０の値を有する。低い酸素親和性を有することは、その四量体がより高い酸素親和性を有する材料よりも容易に酸素を対象に「外す」ことができることを意味する。酸素化条件下でのウシヘモグロビンの架橋では、約２３−２９ｍｍＨｇでｐ５０の値を有する自然ウシヘモグロビンと比べて、より高い酸素親和性を有する材料は、およそ２３ｍｍＨｇ低いｐ５０の値で形成される。素早い酸素化が求められる場合に低い酸素親和性を有する組成物が用いられる。例えば、大量の失血による組織低酸素症（例えば、出血性ショック）が挙げられる。高い酸素親和性を有する組成物は、よりゆっくり酸素運搬されることが望ましい、がん治療における酸素化補助療法において有用である。
【００３３】
ヒトヘモグロビンの場合、脱酸素化状態下での架橋では典型的に、より低い酸素親和性を有する、すなわち、自然ヒトヘモグロビンより少なくとも２倍ほど酸素親和性が減少したα‐α架橋ヘモグロビンが大部分で生成される。酸素化条件下での架橋は、同条件下の自然ヒトヘモグロビン（およそ２３−３０ｍｍＨｇにてｐ５０の値を有する）に比べて、より高い酸素親和性（すなわち、およそ２３ｍｍＨｇより低いｐ５０）を有するβ‐β架橋ヘモグロビンの生成を好む傾向がある。
【００３４】
好ましくは０．１ｐｐｍ未満の溶解酸素レベルの脱酸素化架橋条件では、３〜１６時間の間、雰囲気温度（１５〜２５℃）にて、ヘモグロビン対ＤＢＳＦの分子比は１：２．５〜１：４．０、ｐＨは約８−１０、好ましくは約ｐＨ８．６〜９．２に保たれる。得られる架橋ヘモグロビンは分子量が６０〜７０ｋＤａの四量体型ヘモグロビンであり、高分子ヘモグロビンが存在していないことを示している。ＤＢＳＦ反応の歩留まりは高く、＞９９％であり、最終生成物の二量体濃度は低い。任意に、本方法は様々な従来の方法で用いられるような、架橋前にヘモグロビンと反応させるためのヨードアセトアミドなどのスルフヒドリル処置試薬を必要としない。酸素化条件での架橋では、酸素化環境（例えば空気，ｐＯ２は約１４９ｍｍＨｇであり、純Ｏ２，ｐＯ２はほぼ７６０ｍｍＨｇである）を使用する以外は、他の条件は実質的に同一である。
【００３５】
ウシヘモグロビンの場合、β‐β架橋が５０％より多く、脱酸素化状態下での架橋の場合は６０％より多いのが好ましい（０．１ｐｐｍ溶解酸素レベル未満）。酸素化条件下でのウシヘモグロビン架橋ではβ‐β架橋もまた好ましく、典型的には４０％β‐β架橋より高いレベルが好ましい。
【００３６】
ヒトヘモグロビンの場合、酸素化条件下での架橋はβ‐β架橋を好む。
【００３７】
架橋後、生理的緩衝剤であるリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が架橋液と入れ替えられ、接線流ろ過によって残存薬液を除去する。
【００３８】
架橋後、本発明は架橋四量体型ヘモグロビン溶液に熱処理工程（高温短時間、ＨＴＳＴ）を施す。熱処理は脱酸素化環境で行われる。熱処理の前に、任意でＮ−アセチルシステインを加えてメトヘモグロビン（不活性ヘモグロビン）の生成を防止する。熱処理工程後、溶液を冷却し、低いメトヘモグロビンレベルを保つようにＮ−アセチルシステインを任意で加える。もしＮ−アセチルシステインが熱処理の前と後の両方で加えられた場合、熱処理の前に加える量はおよそ０．２％であり、熱処理後に加える量はおよそ０．０２５％〜０．４％である。しかしながら、Ｎ−アセチルシステインを熱処理にしか加えない場合は、その添加量は０．０２５％−０．４％になる。１つの実施形態では、熱処理後に加えられるＮ−アセチルシステイン量は０．２％−０．４％である。別の実施形態では、熱処理後に加えられたＮ−アセチルシステインは０．０２５％−０．２％である。
【００３９】
いくつかの実施形態では、架橋四量体型ヘモグロビン溶液は脱酸素化環境下（０．１ｐｐｍ溶解酸素レベル未満）において、５０℃〜９５℃の温度範囲で０．５分〜１０時間加熱される。いくつかの実施形態では、架橋四量体型ヘモグロビン溶液を７０℃〜９５℃の温度範囲内で３０秒〜３時間加熱する。いくつかの好ましい実施形態では、架橋四量体型ヘモグロビン溶液を８０℃以下で３０分間加熱する。さらに他の好ましい実施形態では、架橋ヘモグロビン溶液を９０℃で３０秒〜３分加熱し、素早くおよそ２５℃までおよそ１５〜３０秒で冷却して、上記のようにＮ−アセチルシステインを任意で加える。
【００４０】
ＨＴＳＴ熱処理工程の結果を分析するには、熱処理工程後の二量体の量を検知するＨＰＬＣ分析法を用いる。ＨＰＬＣ分析用の移動相は塩化マグネシウム（０．７５Ｍ）を含み、二量体（非安定化四量体）と熱安定性架橋四量体型ヘモグロビンとを分ける。ヘモグロビンが二量体に分離するのを促進するには、塩化マグネシウムは同じイオン強度を有する塩化ナトリウムよりもおよそ３０倍効果的である。熱処理工程はまた、架橋四量体型ヘモグロビンに不要なタンパク質不純物を劇的に除去する変性工程としても働く（免疫グロブリンＧは検知できず、アルブミンは９６．１５％の減少、炭酸脱水酵素は９９．９９％の減少）。酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）を行い、サンプル内のタンパク質不純物を検知する。したがって、精製された熱安定性架橋四量体型ヘモグロビン溶液は検知できない程度の二量体（検出限界未満：０．０４３％）及び免疫グロブリンＧしか含まれておらず、アルブミン（０．０２μｇ／ｍｌ）及び炭酸脱水酵素（０．０１４μｇ／ｍｌ）も非常に少ない量である。図３に、ＨＰＬＣシステムにおいてヘモグロビンの二量体型が検知できなかったことを示す。表２にＨＴＳＴ熱処理工程によるタンパク質不純物及び二量体除去に関する実験結果を示す。このＨＴＳＴ熱処理工程は、不安定性四量体（例えば、非架橋四量体）及び二量体から熱安定性架橋四量体を選択的に分離することを可能とする。
【００４１】
【表２】
2014525441.tif 000003
【００４２】
脱酸素化環境下での架橋ヘモグロビンの熱処理工程の後、熱安定性架橋四量体型ヘモグロビンは続いて製剤処方及びパッケージングされる。本発明は、脱酸素化環境下における熱安定性架橋四量体型ヘモグロビン溶液の気密パッケージング工程を記載する。本発明の熱安定性架橋四量体型ヘモグロビンは、脱酸素化条件において保管される場合は２年以上安定したままである。
【００４３】
本発明では、酸素担体含有医薬組成物は静脈内注射で投与されることを原則的に意図する。伝統的には、従来の製品は高酸素透過性を有する従来のポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）血液バッグ又はＳＴＥＲＩＣＯＮ血液バッグを用いるが、それでは酸素化条件下では素早く（数日以内に）不活性メトヘモグロビンに変化してしまうために製品の寿命を次第に短縮してしまう。
【００４４】
本発明で用いられるパッケージングは、熱安定性架橋四量体型ヘモグロビンを２年以上安定したまま保持することができる。ＥＶＡ／ＥＶＯＨ材料の多層パッケージングを用いて気体透過性を最小限にし、不活性メトヘモグロビンの形成を防止する。本発明の精製された熱安定性架橋四量体型ヘモグロビンに用いるために設計された１００ｍｌ容量の注入バッグは、厚さ０．４ｍｍを有し、酸素透過性が０．００６〜０．１３２ｃｍ３／１００インチ２（２４時間毎、室内環境下）である５層ＥＶＡ／ＥＶＯＨ積層材料からなる。この材料はクラスＶＩプラスチック（米国薬局方（ＵＳＰ）＜８８＞に定義されるとおり）であり、生体内生物学的反応性テスト及び物理化学テストを満たし、静脈内注射用途での注入バッグを生成するのに適している。この一次バッグは、不安定性を引き起こし、次第に治療性質に影響を与える長期酸素暴露から熱安定性架橋四量体型ヘモグロビン溶液を守るために特に有用である。
【００４５】
血液製品の二次保護として、潜在的な空気漏れや製品の脱酸素化状態を維持するためにアルミニウム包装を用いることが知られている。しかしながら、アルミニウム包装には気密性を損なわせるピンホールがある可能性があり、製品を不安定にさせる可能性がある。したがって、本発明は二次パッケージングとして酸素化を防ぎ、さらに光暴露をも防ぐアルミニウム包装パウチを用いる。包装パウチの組成はポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）を０．０１２ｍｍ、アルミニウム（Ａｌ）を０．００７ｍｍ、ナイロン（ＮＹ）を０．０１５ｍｍ、及びポリエチレン（ＰＥ）を０．１ｍｍ含有する。包装フィルムは厚さ０．１４ｍｍであり、酸素透過率が０．００６ｃｍ３／１００インチ２（２４時間毎、室内環境下）である。この二次パッケージングによってヘモグロビンの安定時間を延長し、製品貯蔵期間を延長させる。
【００４６】
本発明の方法は、熱安定性架橋四量体型ヘモグロビンの大規模工業製造に適用可能である。さらに、熱安定性架橋四量体型ヘモグロビンを医薬担体（例えば、カプセル状にて水、生理的緩衝剤）と組み合わせることで、哺乳類への使用に好適である。
【００４７】
本発明の酸素担体含有医薬組成物はがん治療、出血性ショックなどの酸素欠乏障害、及び低酸素量環境における心臓保存（例えば、心臓移植）における組織酸素化の改善に有用である。例示的な実施形態では、投与量は濃度範囲がおよそ０．２−１．３ｇ／ｋｇ、注入速度が１０ｍｌ／時間／ｋｇ（体重）未満であるように選択される。
【００４８】
酸素欠乏障害及び心臓保存の処置における使用では、本発明の、低い酸素親和性を有する酸素担体含有医薬組成物が対象臓器に酸素を提供する血液代用剤として作用する。低い酸素親和性を有する架橋ヘモグロビンはより素早い組織の酸素化を必要とする投与に有用である（例えば、出血性ショック及び生体外臓器保存）。
【００４９】
がん治療での投与の場合、本発明の、高い酸素親和性を有する酸素担体含有医薬組成物が腫瘍組織の酸素化を改善させる組織酸素化剤として作用し、これによって化学的及び放射線感度が向上する。高い酸素親和性を有するヘモグロビンは、よりゆっくり酸素化を必要とする投与に有用である（例えば、がん補助治療）。
【実施例】
【００５０】
以下の実施例を本発明の具体的な実施形態の例として示すが、この例示によって本発明の範囲を限定することはない。
【００５１】
（実施例１）
【００５２】
（方法の概要）
【００５３】
図１に本発明の方法のフローチャートの概略図を示す。凝固防止剤として３．８％（ｗ／ｖ）クエン酸三ナトリウム溶液を含む封入無菌容器／バッグにウシ全血を採取した。続いて、血液凝固を抑制するように、血液をすぐにクエン酸三ナトリウム溶液とよく混ぜた。アフェレーシスメカニズムを用いて、血漿やそのほかのより小さい血液細胞から赤血球（ＲＢＣ）を分離し、採取した。この手順にはγ線滅菌使い捨て遠心分離ボウル「細胞洗浄機」を用いた。ＲＢＣを、同量の０．９％（ｗ／ｖ塩化ナトリウム）生理食塩水で洗浄した。
【００５４】
洗浄後ＲＢＣを溶解し、ＲＢＣ細胞膜に低張性ショックを発生させることでヘモグロビンを放出させた。図２に図示する、ＲＢＣ溶解装置に特化した即時細胞溶解装置を、この目的のために用いた。ＲＢＣ溶解の後、１００ｋＤａ膜を用いた接線流限外濾過によってヘモグロビン分子を他のタンパク質から分離した。ろ液に含まれるヘモグロビンをフロースルーカラムクロマトグラフィー用に採取し、３０ｋＤａ膜を用いて１２−１４ｇ／ｄＬまで濃縮した。カラムクロマトグラフィーは、タンパク質不純物を除去するために行った。
【００５５】
濃縮されたヘモグロビン溶液は最初にＤＢＳＦと反応させて熱安定性架橋四量体型ヘモグロビン分子を形成した。続いて、最終処方及びパッケージングの前に９０℃で３０秒間、脱酸素化状態下で熱処理工程を行った。
【００５６】
（実施例２）
【００５７】
（時間及び制御低張溶解並びにろ過）
【００５８】
ウシ全血を新しく採取し、冷温条件下（２〜１０℃）で運搬された。細胞洗浄機を用いて、さらに０．６５μｍろ過を行って赤血球を血漿と分離した。０．９％生理食塩水で赤血球（ＲＢＣ）ろ液を洗浄した後、ろ液を低張溶解で破壊した。低張溶解は、図２に示す即時細胞溶解装置を用いて行った。即時細胞溶解装置は、細胞分解を補助するスタティックミキサを備えている。制御されたヘモグロビン濃度（１２−１４ｇ／ｄＬ）を有するＲＢＣ懸濁液を、４つ分量の精製水と混合し、ＲＢＣ細胞膜に低張性ショックを与えるようにした。低張性ショックの期間は不必要な白血球および血小板の溶解を避けるように制御した。低張液が即時細胞溶解装置のスタティックミキサ部分を２〜３０秒間、又は赤血球を溶解するのに十分な時間だけ、好ましくは３０秒間で通過する。ショックは、溶解物に高張バッファの１／１０の量を、溶解物がスタティックミキサから排出される時に混合することで、３０秒後に終了させた。用いられた高張液は、０．１Ｍリン酸塩緩衝液、７．４％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４であった。図２の即時細胞溶解装置は、溶解物を毎時５０〜１０００リットル生成することができ、好ましくは、継続的に少なくとも毎時３００リットル生成する。
【００５９】
ＲＢＣ溶解に続いて、赤血球の溶解物を０．２２μｍフィルタを用いてろ過してヘモグロビン溶液を得た。ポリメラーゼ連鎖反応（検出限界＝６４ｐｇ）法及びＨＰＬＣ（検出限界＝１μｇ／ｍｌ）法を行ったが、ヘモグロビン溶液からそれぞれ白血球からの核酸及びリン脂質不純物は検出されなかった。一回目の１００ｋＤａ限外濾過を行い、ヘモグロビンより高い分子量を有する不純物を除去した。続いてフロースルーカラムクロマトグラフィーを行い、さらにヘモグロビン溶液を精製した。続いて２回目の３０ｋＤａ限外濾過を行い、ヘモグロビンより分子量の低い不純物の除去し、濃縮させた。
【００６０】
（実施例３）
【００６１】
（ストローマフリーヘモグロビン溶液のウイルス排除調査）
【００６２】
本発明の製品の安全性を立証するために、（１）０．６５μｍ透析濾過工程及び（２）１００ｋＤａ限外濾過工程のウイルス除去性能を立証した。異なるモデルウイルス（脳心筋炎ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス及びウシパルボウイルス）を意図的にスパイクし、これらの２つの工程のダウンスケール版を行うことで証明した。この調査では、４種類のウイルス（表３を参照）を用いた。これらのウイルスは生物物理学上、及び構造上で異なり、物理及び化学の薬剤又は処置に対して異なる抵抗を示すものである。
【００６３】
【表３】
2014525441.tif 000004
【００６４】
検証方法は以下表４に概略的に示す。
【００６５】
【表４】
2014525441.tif 000005
【００６６】
４つのウイルスにおける（１）０．６５μｍ透析濾過及び（２）１００ｋＤａ限外濾過の対数減少結果の概略を以下表５に示す。ＢＶＤＶ、ＢＰＶ、ＥＭＣＶ及びＰＲＶの４の全てのウイルスを、０．６５μｍ透析濾過及び１００ｋＤａ限外濾過で効果的に除去できた。
【００６７】
【表５】
2014525441.tif 000006
注釈：
≧  残基感染性が認められず
【００６８】
（実施例４）
【００６９】
（フロースルーカラムクロマトグラフィー）
【００７０】
ＣＭカラム（ＧＥヘルスケアより市販）を用いて、さらに任意のタンパク質不純物を除去した。開始緩衝液は２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、溶出緩衝液は２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）であった。ＣＭカラムを開始緩衝液で平衡化した後、タンパク質サンプルをカラムに充填した。結合されていないタンパク質不純物を、少なくとも５カラム分の量の開始緩衝液で洗浄した。溶出を８カラム量の２５％溶出緩衝液（０−０．５Ｍ  ＮａＣｌ）を用いて行った。溶出プロファイルは図４に示すとおりである。ヘモグロビン溶液はフロースルー分画に含まれる。フロースルー分画の純度はＥＬＩＳＡで分析した。結果は表６に示すとおりである。
【００７１】
【表６】
2014525441.tif 000007
【００７２】
ヘモグロビン溶液が（溶出液ではなく）フロースルーＣＭカラムクロマトグラフィーにｐＨ８で含まれるため、継続的な工業規模での運転に良いアプローチである。工業規模での運転において、最初の限外濾過セットアップをフロースルーＣＭカラムクロマトグラフィーシステムに直接接続し、フロースルーチューブを２回目の限外濾過セットアップに接続していてもよい。図５に工業プロセスでの構成の概略を示す。
【００７３】
（実施例５）
【００７４】
（熱安定性架橋四量体型ヘモグロビンの調製）
【００７５】
（５ａ）脱酸素条件下におけるＤＢＳＦとの架橋反応
【００７６】
架橋反応は、脱酸素条件下、すなわち、０．１ｐｐｍ未満の溶解酸素レベルにて行われた。ヘモグロビン溶液にＤＢＳＦを加えることで、高分子ヘモグロビンを生成することなく架橋四量体型ヘモグロビンを生成した。ＤＢＳＦ安定化手順を行うことで、ヘモグロビンの四量体型（６５ｋＤａ）を安定化させ、腎臓を通して排泄される二量体（３２ｋＤａ）に分離することを防止することができる。この実施形態では、ヘモグロビン対ＤＢＳＦの分子比が１：２．５であるものを用いており、ｐＨは８．６であった。このプロセスを雰囲気温度（１５−２５℃）にて３〜１６時間にわたって不活性窒素環境下で行うことで、ヘモグロビンが酸化して生理的に不活性（０．１ｐｐｍ未満の溶解酸素レベルで維持される）である鉄メトヘモグロビンが生成されることを防いだ。ＤＢＳＦ反応の完了具合は、ＨＰＬＣを用いて残基ＤＢＳＦを計測することで観察される。ＤＢＳＦ反応の歩留まりは高く、＞９９％である。β‐β架橋の生成はおよそ４０％である。
【００７７】
（５ｂ）ＨＴＳＴ熱処理工程
【００７８】
高温短時間（ＨＴＳＴ）処理装置を図６に示す。ＨＴＳＴ処理装置を用いた熱処理工程は架橋四量体型ヘモグロビンに対して行われる。この実施例において熱処理の条件は９０℃で３０秒〜３分間、好ましくは４５〜６０秒間であるが、上述のとおり他の条件を選択してもよく、装置を適宜変更してもよい。架橋ヘモグロビンを含み、任意で０．２％Ｎ−アセチルシステインを添加した溶液を、ＨＴＳＴ処理装置（ＨＴＳＴ熱交換器の第一部分を予熱し、９０℃に保たれる）に流量１．０リットル／分で供給した、装置の第一部分での滞留時間は４５〜６０秒間であり、続いて溶液を同一流量で２５℃に保たれた熱交換器の別の部分を通過させた。冷却に要する時間は１５〜３０秒であった。２５℃に冷却後、０．２％〜０．４％の濃度のＮ−アセチルシステインを直ちに加えた。熱処理装置のセットアップは工業運転用に容易に制御可能である。二量体量を含む温度プロファイルを図７に示す。ヘモグロビンが架橋されていないと、熱安定性を有することはなく、熱処理工程の後に沈殿物が生成される。沈殿物はその後、遠心分離又はろ過することで除去し、透明な溶液を得た。
【００７９】
以下の表７に、免疫グロブリンＧ、アルブミン、炭酸脱水酵素などのタンパク質不純物及び望ましくない非安定化四量体又は二量体が熱処理工程の後に除去されていることを示す。免疫グロブリンＧ、アルブミン及び炭酸脱水酵素の量はＥＬＩＳＡ法によって計測し、二量体の量はＨＰＬＣ法によって判定した。熱安定性架橋四量体型ヘモグロビンの純度はＨＴＳＴ熱処理工程後に非常に高く、９８．０〜１００％の範囲内であった。
【００８０】
【表７】
2014525441.tif 000008
【００８１】
（５ｃ）０．０２５〜０．２％ＮＡＣ添加によるメトヘモグロビン生成の防止
【００８２】
熱処理及び冷却の直後、約０．０２５〜０．２％の濃度のＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を架橋四量体型ヘモグロビンに添加し、メトヘモグロビンの形成を防いだ。異なる時間間隔で、メトヘモグロビンの割合を共同酸素測定法（Ｃｏ−ｏｘｉｍｅｔｒｙ法）で計測した。表８は、５カ月にわたるＮＡＣ添加後の架橋四量体型ヘモグロビンのメトヘモグロビンの割合を示している。表８に示す通り、熱処理後の架橋四量体型ヘモグロビンのメトヘモグロビンレベルは一定でありＮＡＣ添加後に非常に低く、１．８〜５．１％の範囲内であった。
【００８３】
【表８】
2014525441.tif 000009
【００８４】
（実施例６）
【００８５】
（パッケージング）
【００８６】
本発明の製品が脱酸素化状態下では安定しているため、製品のパッケージングがガス透過率を最小限に抑えられることが重要である。静脈内投与用にカスタムデザインされた１００ｍｌの注入バッグは、０．４ｍｍの厚さを有し、２４時間毎及び室内温度環境下における酸素透過度が０．００６〜０．１３２ｃｍ３／１００インチ２である５層ＥＶＡ／ＥＶＯＨラミネート材料からなる。この特定の材料はクラスＶＩプラスチック（ＵＳＰ＜８８＞に定義されるとおり）であり、生体内生物学的反応性試験及び物理化学試験を満たし、静脈内注射用途の容器を作成するのに適している（望まれる用途によって、この材料を用いて他の形態のパッケージングを形成してもよい）。一次パッケージングである注入バッグに加えて二次パッケージングであるアルミニウム包装パウチを適用することで、付加的バリアを提供し、光暴露及び酸素核酸を最小限に抑えることができる。パウチの層は、０．０１２ｍｍのポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、０．００７ｍｍのアルミニウム（Ａｌ）、０．０１５ｍｍのナイロン（ＮＹ）、及び０．１ｍｍのポリエチレン（ＰＥ）からなる。オーバーラップフィルムは厚さ０．１４ｍｍを有し、酸素透過率は２４時間毎及び室温環境下において０．００６ｃｍ３／１００インチ２であった。図８に注入バッグの概略図を示す。本発明に係る各注入バッグの酸素透過度は、２４時間毎及び室温環境下において０．００２５ｃｍ３である。
【００８７】
（実施例７）
【００８８】
（架橋ウシＨｂ（脱酸素化架橋条件）の特徴）
【００８９】
（７ａ）逆位相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるグロビン鎖の分離
【００９０】
自然ウシヘモグロビンのグロビン鎖及びＤＢＳＦ架橋ウシヘモグロビンの架橋グロビン鎖を、Ｓｈｅｌｔｏｎら（１９８４）によって明らかにされた勾配に少々改良を加えて用いてＶＹＤＡＣ  Ｃ４カラムで分解した。
（７ｂ）ＤＢＳＦ架橋ウシヘモグロビンのドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析
【００９１】
自然ウシヘモグロビン及びＤＢＳＦ架橋ウシヘモグロビン溶液を還元サンプルバッファー（６２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％（ｖ／ｖ）グリセリン、５％（ｖ／ｖ）メルカプトエタノール及び２．３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）と混合して調製し、１０分間、９５℃で加熱した。１５％アクリルアミドスラブゲルを用いてサンプル混合物を４％濃縮ゲルで分解した。電気泳動は、６０ｍＡの一定電流で行われた。電気泳動後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを０．１％（ｗ／ｖ）クマシーブルーＲ３５０、２０％（ｖ／ｖ）メタノール及び１０％（ｖ／ｖ）酢酸で染色した。ＤＢＳＦ架橋ウシヘモグロビンにおける架橋の様々な種類の割合を予測するために、Ｌｕｍｉ−Ａｎａｌｙｓｔ３．１ソフトウェアを用いてＢｌａｃｋ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔ（ＢＬＵ）で表される分解タンパク質バンドの強度を質量化した。
【００９２】
（７ｃ）還元グロビン鎖のトリプシン消化
【００９３】
主要架橋グロビン鎖に対応するタンパク質バンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切除し、立方体（１×１ｍｍ）に切り、１０％メタノール／１０％酢酸で脱染した。脱染ゲル立方体を２５ｍＭＮ  Ｈ４ＣＯ３内にて１０ｍＭ  ＤＴＴを用いて還元し、２５ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３内にて５５ｍＭヨードアセトアミドを用いて暗所で４５分間アルキル化し、続いて２５ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３内で３７℃にて一晩、２０ｎｇ／μｌ修飾トリプシンでゲル内消化した。トリプシン消化後、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル（ＡＣＮ）及び１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に拡散してトリプシン消化ペプチドを抽出した。
【００９４】
（７ｄ）マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量（ＭＳ）分析
【００９５】
タンパク質バンドから抽出されたトリプシン消化ペプチドを、マトリックス溶液（５０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡに飽和されたシアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸２ｍｇ／ｍｌ）１μｌを事前に滴下されているアンカーチップ（Ａｎｃｈｏｒｃｈｉｐ）プレートに滴下し、空気乾燥させた。乾燥後、サンプルスポットを１０ｍＭモノリン酸塩緩衝液で洗浄し、エタノール：アセトン：０．１％ＴＦＡ（６：３：１比）の溶液を用いて再結晶化させた。Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｕｔｏ  ｆｌｅｘ  ＩＩＩ（ブルカー・ダルトニクス社、ブレーメン、ドイツ）をリフレクトロンモードにて８００−３５００Ｄａのｍ／ｚ範囲内で作動させてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を行い、パラメータは以下のとおり設定された：ペプチドマスフィンガープリント（ＰＭＦ）用にイオン源を２５ｋＶ、及びＰＭＦ用にリフレクタを２６．３ｋＶ。Ｂｒｕｋｅｒペプチド混合較正基準を用いて外部較正を行った。Ｓ／Ｎ比が４を超えるピークをＦｌｅｘ−Ａｎａｌｙｓｉｓ（ブルカー・ダルトニクス社、ブレーメン、ドイツ）によって自動的にラベリングした。ＭＳデータをさらにＭＡＳＣＯＴ２．２．０４及びＢｉｏｔｏｏｌｓ２．１ソフトウェア（ブルカー・ダルトニクス社、ブレーメン、ドイツ）で分析し、ＮＣＢＩ非重複（ＮＣＢＩｎｒ）データベースにおいて哺乳類タンパク質に対してこれらのデータを検索した。以下のパラメータをデータベース検索で用いた。同位体質量精度：＜２５０ｐｐｍ、ｐａｒｅｎｔ  ｃｈａｒｇｅ：＋１、ｍｉｓｓｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ：１、ｆｉｘｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：システインのｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ、ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：メチオニンのｏｘｉｄａｔｉｏｎとした。
【００９６】
（７ｅ）液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化（ＬＣ−ＥＳＩ）タンデム質量（ＭＳ／ＭＳ）分析
【００９７】
タンパク質バンドからのトリプシン消化ペプチドのナノ−ＬＣ  ＭＳ／ＭＳ分析を、ＨＣＴ  Ｕｌｔｒａ  ＥＳＩ−イオントラップ型質量分析装置（ブルカー・ダルトニクス社、ブレーメン、ドイツ）に直接接続されたキャピラリーＨＰＬＣを用いて行った。ペプチド消化物をカラム注入前に０．１％ギ酸／２％ＡＣＮに溶解した。ペプチド分離には、Ｃ１８カラム（１５ｃｍ×７５ｎｍ、ＬＣ  ＰＡＣＫＩＮＧＳ社）を用いて４−９０％（０．００１％ギ酸及び８０％ＡＣＮ内に０．００１％ギ酸）の勾配を用いた。流量は２５℃で２５０ｎｇ／分であった。Ｃ１８カラムからの溶出液を、オンライン分析を行うためのリニアモードで動作されるＨＣＴ  Ｕｌｔｒａ  ＥＳＩ−イオントラップ型質量分析装置に投入した。イオントラップ型質量分析装置は、スプレー電圧が１３７Ｖ、加熱キャピラリー温度が１６０℃でナノソースを最適化された。イオントラップにおけるペプチドイオンの蓄積時間を２００ｍｓに設定し、ＭＳ／ＭＳ分析用に選択された質量電荷比は電荷状態１〜３で１００〜１８００Ｄａであった。
【００９８】
波長２２０ｎｍで観察されたＶＹＤＡＣ  Ｃ４カラムの逆位相ＨＰＬＣは、ＤＢＳＦ架橋ウシヘモグロビンにおけるα鎖及びβ鎖の間で発生する異なる種類の架橋を分離するために採用される。図９に、ＤＢＳＦを用いて架橋を行う前と後における、ウシヘモグロビンを用いて得られたクロマトパターンを示す。図９では、自然ウシヘモグロビンのα鎖がβ鎖に比べてより可動性を有する（破線で示すとおり）。これらの認識はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析で確認された。ＤＢＳＦとの反応の後、α鎖の大部分がそのままであるのに対してβ鎖は架橋される（実線で示すとおり）。ＤＢＳＦを用いた架橋の結果として、自然β鎖に比べてより高い疎水性を有する６つの主要グロビンピークが生成された。ＤＢＳＦ架橋ウシヘモグロビンにおける架橋グロビン鎖はまた、図１０に示すように、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分解された。主要架橋グロビン鎖（図１０におけるＢ６）はトリプシン消化され、続けてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析が行われ、図１１に示すように、ペプチドマスフィンガープリントに基づいてβグロビン鎖のみとして認識された。
【００９９】
上記発明を様々な実施形態にて説明したが、これらの実施形態はなんら限定するものではない。当業者であれば、数々の変化や変更を理解できるであろう。これらの変化や変更は以下の請求項の範囲に含まれると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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