(57)【要約】自己免疫疾患を処置する方法が提供される。前記方法は、インターロイキン１５受容体（ＩＬ‐１５Ｒ）アゴニストの、自己免疫疾患の症状を改善するための有効な量での投与を含む。本発明はまた、エキソビボでのＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞の増加およびＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞の投与により自己免疫疾患を処置する方法も含む。ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞を含む組成物も提供される。抗原に対する免疫反応を刺激するための方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患を処置するための方法であって、
かかる処置を必要とする対象に、インターロイキン１５受容体（ＩＬ‐１５Ｒ）アゴニストを、自己免疫疾患の症状を改善するために有効な量で投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、慢性移植片対宿主病、関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、乾癬、炎症性腸疾患、シェーグレン症候群、グレーブス病、クローン病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、過粘稠度症候群、原因不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症、ＰＯＥＭＳ症候群、ミエローマ、マクログロブリン血症および寒冷擬集素病からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
自己免疫疾患が自己抗原に対する抗体を伴い、かつ、対象が自己抗原に対する抗体を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アゴニストが、配列番号１（ＩＬ‐１５）のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含み、かつ、ＩＬ‐１５Ｒに結合するＩＬ‐１５ポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
アゴニストが、抗ＩＬ‐１５Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
アゴニストが、ＧＳリンカーを介して可溶性ＩＬ‐１５受容体アルファ鎖に結合したＩＬ‐１５のヘテロ複合体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
対象における自己免疫疾患を処置するための方法であって、
ａ．かかる処置を必要とする対象からＴ細胞を単離すること（ここで単離されたＴ細胞は多数のＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｈｅｌｉｏｓ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞を含む）
ｂ．単離された細胞を、ＩＬ‐１５およびＩＬ‐２１を含む培養培地中、コンカナバリンＡで活性化され、かつ照射された同系ＣＤ４Ｔ細胞の存在下で、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｈｅｌｉｏｓ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞の数が少なくとも５％増加するまで生育させ、それによって、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｈｅｌｉｏｓ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞で富化された細胞集団を製造すること、
ｃ．対象に、該細胞集団からのＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｈｅｌｉｏｓ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞を、自己免疫疾患の症状を改善するのに有効な量で投与すること
を含む、前記方法。
【請求項８】
ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｈｅｌｉｏｓ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞がＫｉｒ＋である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＣＤ８＋Ｔ細胞が対象から単離されたものである、請求項７または請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞集団からのＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｈｅｌｉｏｓ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞またはＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞が、静脈内注射によって投与される、請求項７または請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
単離された細胞を、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｈｅｌｉｏｓ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞の数またはＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞の数が少なくとも１０％増加するまで生育させる、請求項７または請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞またはＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋Ｈｅｌｉｏｓ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞で富化された細胞集団が、非ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞または、非ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋Ｈｅｌｉｏｓ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞の集団を除去することによってさらに富化される、請求項７または請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
対象における自己免疫疾患を処置するための方法であって、
ａ．かかる処置を必要とする対象からＴ細胞を単離すること（ここで、単離されたＴ細胞は多数のＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞を含む）、
ｂ．単離された細胞を、ＩＬ‐１５およびＩＬ‐２１を含む培養培地中、コンカナバリンＡで活性化され、かつ照射された同系ＣＤ４Ｔ細胞の存在下で、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞の数が少なくとも５％増加するまで生育させ、それによって、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞で富化された細胞集団を製造すること、
ｃ．対象に、該細胞集団からのＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞を、自己免疫疾患の症状を改善するのに有効な量で投与すること
を含む、前記方法。
【請求項１４】
ＣＤ８＋Ｔ細胞が対象から単離されたものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞集団からのＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞が、静脈内注射によって投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
単離された細胞を、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞の数が少なくとも１０％増加するまで生育させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞で富化された細胞集団が、非ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞の集団を除去することによってさらに富化される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＤ８＋細胞を含む組成物であって、該組成物におけるＣＤ８＋細胞の少なくとも５％がＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｈｅｌｉｏｓ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞である、前記組成物。
【請求項１９】
ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｈｅｌｉｏｓ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞がＫｉｒ＋である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
ＣＤ８＋細胞を含む組成物であって、該組成物におけるＣＤ８＋細胞の少なくとも５％がＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞である、前記組成物。
【請求項２１】
組成物におけるＣＤ８＋細胞の少なくとも１０％がＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｈｅｌｉｏｓ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞またはＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞である、請求項１８または１９に記載の組成物。
【請求項２２】
組成物におけるＣＤ８＋細胞の少なくとも１０％がＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の組成物と、薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物。
【請求項２４】
免疫抑制剤をさらに含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
抗原に対する免疫反応を刺激するための方法であって、
前記抗原を有し、かつ、前記抗原に対する免疫刺激を必要とする対象に、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞の増殖および／または活性を阻害する剤を、対象において前記抗原に対する免疫反応を刺激するのに有効な量で投与することを含み、ここで、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞がＨｅｌｉｏｓ＋および／またはＫｉｒ＋である、前記方法。
【請求項２６】
対象が病原体による感染を有し、該病原体が抗原を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
対象ががんを有し、該がんが抗原を含み、および該抗原が腫瘍抗原である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
抗原がワクチンにて対象に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
剤が抗ＩＬ‐１５抗体である、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞がＫｉｒ＋であり、剤がＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞に結合する抗体である、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞がＨｅｌｉｏｓ＋であり、剤がＨｅｌｉｏｓの発現および／または活性を阻害する、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
抗体が、
ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞上に存在する第１の表面マーカーに結合する第１の抗原結合ドメイン、および
ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞上に存在する第２の表面マーカーに結合する第２の抗原結合ドメイン
を含む二重特異性抗体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞上にある第１および第２の表面マーカーが、ＣＤ４４、ＣＤ１２２、ＫｉｒおよびＣＤ８からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
剤が抗ＣＤ８抗体である、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
剤が、
ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞上に存在する第１の表面抗原に結合する第１の抗体の最適下用量、および
ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞上に存在する第２の表面抗原に結合する第２の抗体の最適下用量、
を含む組成物であり、ここで、第１の表面抗原は第２の表面抗原とは異なる、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
第１の抗体が、ＣＤ４４、ＣＤ１２２、ＫｉｒおよびＣＤ８からなる群から選択される抗原に結合し、第２の抗体が、ＣＤ４４、ＣＤ１２２、ＫｉｒおよびＣＤ８からなる群から選択される抗原に結合する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
抗体が抗Ｋｉｒ抗体である、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１０年１０月２２日に出願された米国特許仮出願第６１／４０５，６９６号に対して、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府の支援を受けた研究
この発明は、NIH Grant AI 037562に基づく政府支援により行われた。したがって、政府はこの発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
病原体に対する保護免疫の誘導と自己寛容の維持との間のバランスを達成することは、適応免疫系の中心的な特徴である。胸腺でのネガティブセレクションは、自己ペプチドＭＨＣ産物に対して高い親和性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する大部分のクローンを排除するが、このプロセスは不完全である。自己ペプチド−ＭＨＣ複合体に反応する成熟した末梢Ｔ細胞のかなりのフラクションは、炎症刺激の状況で、エフェクター細胞に分化することがある（Bouneaud et al., 2000、Goldrath and Bevan, 1999、Slifka et al., 2003）。
【０００３】
このプロセスは、細胞の除去（ＡＩＣＤ）または不活化をもたらす不完全なまたは不良なＴＣＲシグナリングによって制限されるが（Martin et al., 1999、Kearney et al., 1994）、これらの細胞内在性のメカニズムは、自己免疫障害の発症を防ぐために十分でないことがある（Anderton et al., 2001、Panoutsakopoulou et al., 2001）。自己寛容が、エフェクターＴ細胞と、制御性または抑制性細胞との間の阻害性の相互作用にも依存するという証拠が増えている（Littman and Rudensky, 2010）。しかしながら、自己抗体形成の発症および自己免疫疾患を阻害するように遺伝的にプログラムされた制御性Ｔ細胞は明らかにされていなかった。狼瘡および関節リウマチなどの自己免疫疾患の重篤性および幅広さのために、かかる疾患の効果的な処置に対して大きな必要性がある。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、一部の側面において、自己寛容の維持および自己免疫疾患の予防に不可欠なＣＤ８＋制御性Ｔ細胞の亜集団の発見に関する。一部の側面において、本発明は自己免疫疾患を処置するための方法を含む。該方法は、かかる処置を必要とする対象に、自己免疫疾患の症状を改善するために有効な量でインターロイキン１５受容体（ＩＬ‐１５Ｒ）アゴニストを投与することを含む。一部の態様において、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、慢性移植片対宿主病、関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、乾癬、炎症性腸疾患、シェーグレン症候群、グレーブス病、クローン病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、過粘稠度症候群、原因不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症、ＰＯＥＭＳ症候群、ミエローマ、マクログロブリン血症および寒冷擬集素病からなる群から選択される。
【０００５】
一部の態様において、自己免疫疾患は自己抗原に対する抗体を含み、対象は自己抗原に対する抗体を有する。一部の態様において、ＩＬ‐１５Ｒアゴニストは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含み、かつ、ＩＬ‐１５Ｒに結合するＩＬ‐１５ポリペプチドである。一部の態様において、該アゴニストは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含むＩＬ‐１５ポリペプチドである。一部の態様において、該アゴニストは配列番号１を含むＩＬ‐１５ポリペプチドである。一部の態様において、該アゴニストは、抗ＩＬ‐１５Ｒ抗体または、その抗原結合フラグメントである。別の態様において、該アゴニストは、ＧＳリンカーを介して可溶性ＩＬ‐１５受容体アルファ鎖に結合したＩＬ‐１５のヘテロ複合体である。
【０００６】
本発明の一側面によると、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞を用いて、対象において自己免疫疾患を処置する方法が提供される。該方法は、かかる処置を必要とする対象からＴ細胞を単離すること（ここで、単離されたＴ細胞は多数のＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞を含む）、単離された細胞を、ＩＬ‐１５およびＩＬ‐２１を含む培養培地中、コンカナバリンＡで活性化され、かつ照射された同系ＣＤ４Ｔ細胞の存在下で、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞の数が少なくとも５％増加するまで生育させ、それによって、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞で富化された細胞集団を製造すること、および、対象に、該細胞集団からのＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞を、自己免疫疾患の症状を改善するのに有効な量で投与することを含む。前記細胞集団からのＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞は、対象に投与する前に、培養培地から分離される。
【０００７】
一部の態様において、ＣＤ８＋Ｔ細胞は対象から単離されたものである。前記細胞集団からのＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞は、静脈内注射によって投与されてよい。一部の態様において、単離された細胞は、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞の数が少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％増加するまで生育させる。ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞が富化された細胞集団は、非ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞の集団を除去することでさらに富化される。一部の態様においては、細胞集団からのＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞の一部が対象に投与される。一部の態様においては、細胞集団からのすべてのＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞が対象に投与される。
【０００８】
本発明の一部の側面によると、ＣＤ８＋細胞を含む組成物（ここで、組成物におけるＣＤ８＋細胞の少なくとも５％がＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞である）が提供される。一部の態様において、組成物におけるＣＤ８＋細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％は、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞である。本発明は、一部の態様において、ＣＤ８＋細胞の組成物（ここで、組成物におけるＣＤ８＋細胞の少なくとも５％はＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞である）と、薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物を含む。一部の態様において、医薬組成物は、免疫抑制剤をさらに含む。
【０００９】
本発明の一部の側面によると、抗原に対する免疫反応を刺激するための方法が提供される。この方法は、抗原を有し、かつ、抗原に対する免疫刺激を必要とする対象に、ＣＤ４４＋ＣＤ1２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞の増殖および／または活性を阻害する剤を、対象において抗原に対する免疫反応を刺激するのに有効な量で投与することを含む。一部の態様において、対象は病原体による感染を有し、該病原体は抗原を含む。一部の態様において、対象はがんを有し、該がんは抗原を含み、該抗原は腫瘍抗原である。抗原は、対象にワクチンにて投与されてよい。
【００１０】
ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞の増殖および／または活性を阻害する剤は、抗ＩＬ‐１５抗体、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞に結合する抗体、抗ＣＤ８抗体、または抗Ｋｉｒ抗体であってもよい。一部の態様において、抗体は、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞上に存在する第１の表面マーカーに結合する第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞上にある第２の表面マーカーに結合する第２の抗原結合ドメインとを含む、二重特異性抗体である。ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞上の第１および第２の表面マーカーは、ＣＤ４４、ＣＤ１２２、ＫｉｒおよびＣＤ８からなる群から選択されてよい。
【００１１】
一部の態様において、剤は、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞上に存在する第１の表面抗原に結合する第１の抗体の最適下（sub-optimal）用量と、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞上に存在する第２の表面抗原に結合する第２の抗体の最適下用量とを含む組成物（ここで、第１の表面抗原は第２の表面抗原とは異なる）である。第１の抗体は、ＣＤ４４、ＣＤ１２２、ＫｉｒおよびＣＤ８からなる群から選択される抗原に結合し、第２の抗体は、ＣＤ４４、ＣＤ１２２、ＫｉｒおよびＣＤ８からなる群から選択される抗原に結合する。
【００１２】
本発明のそれぞれの態様および側面は、独立して実行され得るか、または組み合され得る。また、本明細書で使用される表現および用語は説明のためであり、限定するものとして見なされるべきではない。本明細書における「包括する」、「含む」、または「有する」「含有する」、「包含する」、およびそれらの変形表現の使用は、その後にリストされる項目およびそれらの均等物ならびに追加の項目を包含することを意味する。
【００１３】
本発明のこれらおよび他の側面、ならびに様々な利点および有用性は、詳細な説明を参照することで明らかとなる。本発明のそれぞれの側面は、理解されるとおり、様々な態様を包含し得る。この出願において同定されるすべての文書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１は、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋ＣＤ８Ｔ細胞によるＡｂ反応のＱａ‐１依存性の抑制を示した図である。図１Ａは、ナイーブおよびＫＬＨ／ＣＦＡで免疫された（ｄ８）ＷＴまたはＩＬ  １５−／−マウスからのＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋ＣＤ８Ｔ細胞のパーセンテージおよび数を示す。ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞でゲーティングした後のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【００１５】
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｒａｇ２−／−マウスへのＢ、ＣＤ４およびＣＤ８細胞の移植後のＡｂ反応を示す。２×１０６個のＷＴナイーブＢ細胞を、Ｂ６．Ｑａ‐１（ＷＴ）またはＢ６．Ｑａ‐１（Ｄ２２７Ｋ）マウスからの１×１０６個のＣＤ２５＋除去ＣＤ４細胞とともにＲａｇ２−／−宿主に移植した。ＫＬＨ／ＣＦＡで免疫したＷＴ  Ｂ６マウスから単離したＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋またはＣＤ４４＋ＣＤ１２２−ＣＤ８＋Ｔ細胞も、これらのＲａｇ２−／−マウスに、レシピエントがＣＦＡ中の１００μｇのＮＰ１９‐ＫＬＨで腹腔内免疫される前に移植した。１０日目に、マウスに、ＩＦＡ中の５０μｇのＮＰ１９‐ＫＬＨで腹腔内チャレンジを行い、ＮＰ特異的Ａｂ反応を、７日後にＥＬＩＳＡで測定した。図１Ｃは、ＣＤ８Ｔｒｅｇによる不良な阻害が自己抗体の生成につながることを示す。Ｒａｇ２レシピエントで生成された抗サイログロブリンおよび抗インスリンＡｂを、５０日目にＥＬＩＳＡで測定した。
【００１６】
【図２】図２は、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｌｙ４９＋ＣＤ８Ｔ細胞が、Ｑａ‐１拘束性の抑制活性の原因であることを示した図である。図２Ａ：ＷＴ  Ｂ６マウスをＣＦＡ中の１００μｇのＫＬＨで腹腔内免疫し、１０日後にＣＤ４４、ＣＤ１２２、Ｌｙ４９サブタイプ、ＣＤ８およびＣＤ６２Ｌの表面発現を分析した。数字は、それぞれの表面タンパク質を発現する細胞のパーセンテージである。図２Ｂは、Ｂ、ＣＤ４およびＣＤ８細胞のＲａｇ２−／−宿主への移植後のＡｂ反応を示す。２×１０６個のＷＴナイーブＢ細胞を、Ｂ６．Ｑａ‐１（ＷＴ）またはＢ６．Ｑａ‐１（Ｄ２２７Ｋ）マウスからの０．５×１０６個のＣＤ２５＋除去ＣＤ４細胞とともにＲａｇ２−／−マウスに移植した。ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｌｙ４９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＫＬＨ／ＣＦＡで免疫したＷＴ  Ｂ６マウスから単離し、０．１５×１０６個の細胞を、Ｒａｇ２−／−宿主に移植した。細胞移植後すぐに、Ｒａｇ２−／−レシピエントを、ＣＦＡ中の１００μｇのＮＰ１９‐ＫＬＨで腹腔内免疫した。１０日目に、マウスに、ＩＦＡ中の５０μｇのＮＰ１９‐ＫＬＨで腹腔内チャレンジを行い、高親和性ＮＰ特異的Ａｂ反応を、チャレンジの７日後にＥＬＩＳＡで測定した。
【００１７】
【図３】図３は、Ｂ６‐Ｙａａマウスにおける、ＴＦＨおよびＧＣ  Ｂ細胞の増殖を示す。齢適合（２ヶ月および８ヶ月）のＷＴ  Ｂ６およびＢ６‐Ｙａａマウスからの脾臓細胞を、ＴＦＨ細胞についてはＣＤ４、ＩＣＯＳおよびＣＤ２００抗体、および、ＧＣ  Ｂ細胞についてはＢ２２０、ＩｇＭおよびＦａｓ抗体で染色した。ＴＦＨおよびＧＣ  Ｂ細胞の絶対数を、右のパネルに示す。
【００１８】
【図４】図４は、Ｂ６‐ＹａａマウスからのＣＤ８＋Ｔ細胞による、Ａｂ反応抑制の低下を示した図である。ＷＴナイーブＢ細胞を、Ｑａ‐１（ＷＴ）またはＱａ‐１（Ｄ２２７Ｋ）マウスからのＣＤ２５＋除去ＣＤ４細胞とともにＲａｇ２−／−宿主に移植した。ＫＬＨ／ＣＦＡで免疫したＷＴまたはＢ６‐Ｙａａマウスから単離し、ＦＡＣＳでソートしたＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋ＣＤ８Ｔ細胞を、Ｒａｇ２−／−宿主に移植した。細胞移植後すぐに、Ｒａｇ２−／−レシピエントを、ＣＦＡ中の１００μｇのＮＰ１９‐ＫＬＨで腹腔内免疫し、２０日後にＩＦＡ中の５０μｇのＮＰ１９‐ＫＬＨで再度腹腔内免疫した。
【００１９】
【図５】図５は、ＣＤ４４＋ＩＣＯＳＬ＋ＣＤ８Ｔ細胞による抑制活性を示した図である。Ｂ、ＣＤ４およびＣＤ８細胞のＲａｇ２−／−宿主への移植後のＡｂ反応である。２×１０６個のＷＴナイーブＢ細胞を、Ｂ６．Ｑａ‐１（ＷＴ）またはＢ６．Ｑａ‐１（Ｄ２２７Ｋ）マウスからの、０．５×１０６個のＣＤ２５＋除去ＣＤ４細胞とともにＲａｇ２−／−マウスに移植した。ＣＤ４４＋ＩＣＯＳＬ＋ＣＤ８Ｔ細胞は、ＫＬＨ／ＣＦＡで免疫したＷＴ  Ｂ６マウスの脾臓細胞から、ＦＡＣＳによりソートした。０．１５×１０６個のソートしたＣＤ４４＋ＩＣＯＳＬ＋ＣＤ８細胞を、Ｒａｇ２−／−宿主に移植した。細胞移植後すぐに、Ｒａｇ２−／−レシピエントを、ＣＦＡ中の１００μｇのＮＰ１９‐ＫＬＨで腹腔内免疫した。１０日目に、マウスに、ＩＦＡ中の５０μｇのＮＰ１９‐ＫＬＨで腹腔内チャレンジを行い、高親和性ＮＰ特異的Ａｂ反応を、チャレンジの７日後にＥＬＩＳＡで測定した。
【００２０】
【図６】図６は、ヒトＩＬ‐１５のアミノ酸配列（配列番号１、ＮＣＢＩ参照配列：NP_000576.1）を示した図である。
【００２１】
【図７】図７は、２×１０５個のＧＭ−ＣＳＦ−照射（３５００ラド）Ｂ１６細胞によるワクチン接種が、ＷＴ  Ｂ６マウスと比べ、Ｑａ‐１（Ｄ２２７Ｋ）ノックインマウスへのＢ１６腫瘍接種後の生存を増大させたことを示す。
【００２２】
【図８Ａ】図８は、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｌｙ４９＋ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ細胞の遺伝子特性を示した図である。図８Ａは、遺伝子マイクロアレイ解析による、Ｌｙ４９＋およびＬｙ４９−ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋ＣＤ８Ｔ細胞間の遺伝子発現プロファイルの比較を示す。Ｂ６  ＷＴマウスは、ＣＦＡ中のＫＬＨで腹腔内免疫され、免疫の７日後に脾臓からＬｙ４９＋およびＬｙ４９−ＣＤ８＋Ｔ細胞を精製した。遺伝子発現は、Affymetrixマイクロアレイシステムを使用して解析し、示差的遺伝子発現は、Multiplot解析プログラムにより評価した。Ｌｙ４９−細胞に比べ、Ｌｙ４９＋細胞では、１２５遺伝子がアップレギュレートされ、４２遺伝子がダウンレギュレートされていた。
【００２３】
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＲＴ‐ＰＣＲによるＨｅｌｉｏｓ発現の検証を示す：遺伝子マイクロアレイ解析で、Ｌｙ４９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞において、５．３倍のＨｅｌｉｏｓ発現の増加が観察された。Ｌｙ４９＋およびＬｙ４９−ＣＤ８Ｔ細胞から調製した無関係のｃＤＮＡを、Ｌｙ４９＋ＣＤ８Ｔ細胞におけるＨｅｌｉｏｓ発現の増加をＲＴ‐ＰＣＲにより検証するために使用した。図８Ｃは、Ｌｙ４９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞において自然受容体が強くアップレギュレートされていることを示す：記憶型Ｌｙ４９−ＣＤ８Ｔ細胞と比較した、Ｌｙ４９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の遺伝子発現プロファイリングにより、ＮＫ細胞で通常発現している受容体が、Ｌｙ４９＋Ｔ細胞においてｍＲＮＡレベルで顕著にアップレギュレートされることが明らかとなった。
【００２４】
【図９Ａ−Ｂ】図９は、Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｌｙ４９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型特性を示した図である。図９Ａでは、Ｌｙ４９＋ＣＤ８Ｔ細胞のＦＡＣＳ解析により、Ｈｅｌｉｏｓが５０％のＬｙ４９＋ＣＤ８Ｔ細胞で発現していることが明らかとなった。Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｌｙ４９＋ＣＤ８Ｔ細胞は、標的細胞の細胞接触依存性の認識に機能的な重要性を有し得る、より高いレベルのインテグリン発現（ＶＬＡ‐２およびＶＬＡ‐４）も示す。図９Ｂは、Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｌｙ４９＋ＣＤ８Ｔ細胞の発達のためのＩＬ‐１５の必要性を示す：ＩＬ‐１５欠損マウスは、Ｌｙ４９＋ＣＤ８Ｔ細胞の劇的な減少を示す（ＷＴではＣＤ４４＋Ｃｄ１２２＋ＣＤ８Ｔ細胞の１８．９％であるのに対し、Ｉｌ‐１５−／−マウスではＣＤ４４＋ＣＤ１２＋ＣＤ８Ｔ細胞の３％）。Ｉｌ‐１５−／−マウスからのＬｙ４９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞はＨｅｌｉｏｓを発現しないが、これはＨｅｌｉｏｓ＋Ｌｙ４９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の発達がＩＬ‐１５依存性であることを示している。
【００２５】
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＩＬ‐１５応答性と、Ｌｙ４９発現のレベルとの間の相関を示す：Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｌｙ４９＋ＣＤ８Ｔ細胞は、最もＩＬ‐１５に感受性のＣＤ８Ｔ細胞に属する可能性がある。対応するＨｅｌｉｏｓ−Ｌｙ４９＋ＣＤ８Ｔ細胞と比べ、Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｌｙ４９＋ＣＤ８Ｔ細胞は、より高レベルのＣＤ１２２およびＬｙ４９を発現する。インビトロでのＬｙ４９＋ＣＤ８Ｔ細胞の刺激は、Ｌｙ４９＋発現がＩＬ‐１５刺激の強さと密接に関係していることを示す。Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｌｙ４９＋ＣＤ８Ｔ細胞の極端な反応性は、細胞培養において微小量のＩＬ‐１５を用いるＣＤ８＋制御性Ｔ細胞のインビトロでの増加に活用することができる。
【００２６】
【図９Ｄ】図９Ｄは、Ｈｅｌｉｏｓ欠損マウスが、Ｌｙ４９ｈｉＣＤ８Ｔ細胞を欠くことを示す：我々は、Ｒａｇ２−／−マウスがＨｅｌｉｏｓ  ＷＴまたはＨｅｌｉｏｓ  ＫＯ  ＢＭ細胞で再構成される骨髄（ＢＭ）キメラを作出した。ＷＴ  ＢＭ細胞により作出されるＢＭキメラは、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋およびＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｌｙ４９＋ＣＤ８Ｔ細胞を発達させるが、それらの頻度はＷＴ  Ｂ６マウスに類似している。しかしながら、Ｈｅｌｉｏｓ  ＫＯ  ＢＭキメラは、増加したＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋ＣＤ８Ｔ細胞およびＬｙ４９＋ＣＤ８Ｔ細胞の劇的な減少を示す。Ｈｅｌｉｏｓ発現のＦＡＣＳ解析は、Ｈｅｌｉｏｓ  ＫＯ遺伝子型を確認する。
【００２７】
【図９Ｅ】図９Ｅは、Ｈｅｌｉｏｓ  ＫＯ  ＢＭ細胞のレシピエントにおける、活性化されたＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の増加を示す：Ｈｅｌｉｏｓ  ＷＴおよびＫＯ  ＢＭからの脾臓細胞のＦＡＣＳ解析により、Ｈｅｌｉｏｓ  ＫＯ  ＢＭキメラは、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌｌｏ）の約２倍の増加、および活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌｌｏ）の約６倍の増加を有することが明らかとなった。
【００２８】
【図９Ｆ】図９Ｆは、Ｈｅｌｉｏｓ欠損ＣＤ８＋Ｔ細胞の損なわれた抑制活性を示す：Ｒａｇ２−／−マウスに、ＷＴ  Ｂ６マウスからのＢ細胞、ＷＴ  Ｂ６マウスからのＣＤ２５除去ＣＤ４＋Ｔ細胞、および、Ｈｅｌｉｏｓ  ＷＴおよびＫＯのＢＭキメラから精製したＬｙ４９＋ＣＤ８Ｔ細胞を移植した。Ｈｅｌｉｏｓ  ＷＴおよびＫＯのＢＭキメラは、ＣＤ８調製の７日前に、ＣＦＡ中のＫＬＨで腹腔内免疫した。Ｒａｇ２−／−宿主は、細胞移植後すぐに、ＮＰ１９‐ＫＬＨ／ＣＦＡで腹腔内免疫した。ＷＴ  Ｌｙ４９＋ＣＤ８Ｔ細胞を受けたＲａｇ２−／−宿主は、抗ＮＰ  Ａｂ反応の効果的な抑制を示すが、Ｈｅｌｉｏｓ  ＫＯ  Ｌｙ４９＋ＣＤ８Ｔ細胞レシピエントは、ＣＤ８Ｔ細胞を受けなかったＲａｇ２−／−マウスと同様のレベルの抗ＮＰ  Ａｂ反応を示す。
【００２９】
【図１０Ａ−Ｃ】図１０は、自己免疫疾患（ＣＩＡモデル）におけるＣＤ８Ｔｒｅｇを介した免疫療法を示した図である。図１０Ａは、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇの注入によるＣＩＡの予防を示す：ＷＴ  Ｂ６マウスの脾臓細胞から、ＷＴ  Ｂ細胞およびＣＤ２５除去ＣＤ４細胞をソートした。Ｌｙ４９＋およびＬｙ４９−ＣＤ８Ｔ細胞は、脾臓およびリンパ節からソートする。コラーゲンタイプＩＩ細胞をＲａｇ２−／−Ｐｒｆｌ−／−マウスに移植した後、０日に関節炎を誘導し、２１日に追加免疫した。ＣＤ８Ｔｒｅｇを、２１日および、加えて３５日に注入した。ＣＩＡの進行をモニターした。ソートされたＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｌｙ４９＋またはＬｙ４９−ＣＤ８細胞を、２ｎｇ／ｍｌのＩＬ‐１５／ＩＬ‐１５Ｒα複合体の存在下で１週間培養した。図１０Ｂでは、Ｒａｇ２−／−Ｐｒｆｌ−／−マウスに、Ｂ、ＣＤ４およびインビトロで増加させたＣＤ８Ｔ細胞を移植し（０、２１および３５日）、ＣＩＡの進行をモニターした。図１０Ｃは、ＣＤ８Ｔｒｅｇの治療応用を示す：インビトロで増加させた１．５×１０５個のＬｙ４９＋ＣＤ８Ｔ細胞を、３．５の平均スコアで関節炎を発症したＢ６マウスに、０日および１８日に移植した。５日から１７日まで２日毎に、０．７５ｍｇ／ｋｇのメソトレキセート（ＭＴＸ）を与えた。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
一側面において、本発明は、自己寛容の維持および自己免疫疾患の予防に対して不可欠なＣＤ８＋制御性Ｔ細胞の亜集団の発見に関する。これらのＣＤ８Ｔ細胞は、免疫を活性化するよりはむしろ抑制するようにプログラムされており、免疫反応の不可欠な制御的要素であり、かつ、自己寛容を保証するものである。
【００３１】
特殊化した（specialized）制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋濾胞性ヘルパーＴ細胞（ＴＦＨ）の活性を、ＴＦＨ細胞の表面に発現するクラスＩ  ＭＨＣペプチドＱａ‐１（ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ‐Ｅ）のマウスホモログ）の認識を介して選択的に抑制し、自己抗体反応を弱める。これらのＣＤ８＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の表面表現型の分析は、これらが高いレベルのＣＤ４４およびＣＤ１２２、比較的低いレベルのＣＸＣＲ５およびＩＣＯＳＬを発現し、Ｋｉｒ受容体（免疫グロブリン様キラー細胞抑制受容体、マウスではＬｙ４９と称される）も発現することを示した。マウスＬｙ４９＋およびＬｙ４９−ＣＤ８Ｔ細胞から調製したｃＤＮＡによるＤＮＡマイクロアレイはまた、ＣＤ８制御性Ｔ細胞の発達および機能にとって重要な遺伝子に対する有力な主要転写因子として、転写因子Ｈｅｌｉｏｓを同定した。
【００３２】
Ｈｅｌｉｏｓは、ジンクフィンガー調節因子のイカロス（Ｉｋａｒｏｓ）ファミリーの一員である。Ｈｅｌｉｏｓは、Ｔ細胞発達の初期段階で高く発現し、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞のサブセット（≒７０％）でも発現される。しかしながら、Ｈｅｌｉｏｓの発現は、ＦｏｘＰ３の発現に依存しない。成熟Ｂ細胞、樹状細胞およびミエロイド細胞は、Ｈｅｌｉｏｓを発現しない。ＣＤ８Ｔ細胞プールにおけるＨｅｌｉｏｓ発現および機能は報告されていない。本発明者らは、Ｈｅｌｉｏｓが、ＣＤ８Ｔ細胞プール内のＬｙ４９＋ＣＤ８制御性Ｔ細胞によって専ら発現され、Ｌｙ４９＋Ｔ細胞におけるこの転写因子の発現が、その抑制的な機能に関係することを示した。Ｈｅｌｉｏｓタンパク質およびｍＲＮＡの存在は、抗体を用いたＨｅｌｉｏｓの細胞内染色、および定量的ＰＣＲによって検出することができる（Expression of Helios, an Ikaros Transcription Factor Family Member, Differentiates Thymic-Derived from Peripherally Induced Foxp3+ T Regulatory Cells; Thornton et al. J Immunol 2010 184:3433-3441）。
【００３３】
細胞内でのＨｅｌｉｏｓ発現は、例えば、一定量の細胞を、Ｈｅｌｉｏｓタンパク質またはｍＲＮＡの存在について試験することによって検出することができる。Ｈｅｌｉｏｓタンパク質の発現は、例えば、表面マーカーＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ１２２およびＬｙ４９（ヒトにおけるＫＩＲ）で、マウスからの脾臓細胞（またはヒトからのＰＢＭＣ）を染色することによって検出することができる。次いで、細胞を固定バッファー（リン酸緩衝食塩水中の４％パラホルムアルデヒド）で固定し、透過バッファー（リン酸緩衝食塩水中の０．１％サポニンおよび０．００９％アジ化ナトリウム）で洗浄する。その後の透過バッファー中での抗Ｈｅｌｉｏｓ抗体による染色により、このサブセットのＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＨｅｌｉｏｓの発現（％として）を検出することができ、マウスおよびヒトにおけるＨｅｌｉｏｓ＋ＣＤ８細胞により発現される付加的表面マーカーを明らかにすることができる。
【００３４】
それらの表面におけるＣＤ１２２の発現は、発達および機能の両方についてのＩＬ‐１５への依存性と一致する。ＣＤ８細胞によるクラスＩ  ＭＨＣ受容体Ｌｙ４９の発現は、ＩＬ‐１５に対する増強された応答性にも関係していた（Coles et al., 2000、Judge et al., 2002、Anfossi et al., 2004）。ＣＤ８Ｔ細胞の３〜５％を占めるＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋Ｈｅｌｉｏｓ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、このＴ細胞サブセットにおける、実質的にすべてのＱａ‐１拘束性の抑制活性の原因である。
【００３５】
特殊化した制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、本発明に従い、自己免疫疾患を処置することに使用される。ここで用いる場合、特殊化した制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｈｅｌｉｏｓ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞、および／またはＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞を含む。
【００３６】
本発明の側面は、かかる処置を必要とする対象からＴ細胞を単離すること、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｈｅｌｉｏｓ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞の集団が、数のうえで少なくとも５％増加するように、コンカナバリンＡで活性化され、かつ照射された同系ＣＤ４Ｔ細胞の存在の下、ＩＬ‐１５およびＩＬ‐２１で富化された培養培地で細胞を生育させること、それによって、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｈｅｌｉｏｓ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞で富化された細胞集団を製造すること、により自己免疫疾患を処置する方法を含む。次いで、前記集団からのＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｈｅｌｉｏｓ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞は、自己免疫疾患の症状を改善するのに有効な量で対象に投与される。一部の態様において、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｈｅｌｉｏｓ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞はＫｉｒも発現し、前記集団からのＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞は、自己免疫疾患の症状を改善するのに十分な量でヒト対象に投与することができる。
【００３７】
一部の態様において、対象から単離されたＴ細胞は、単離された細胞を培養培地中で生育させる前に、ＣＤ８＋細胞について富化される。一部の態様において、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、それらを培養培地中で生育させる前に単離される。本明細書で用いる場合、「単離される」という用語は、対象からＴ細胞を含むサンプルを採取すること、および、さらに他の非Ｔ細胞からＴ細胞を分離することを指す。一部の態様において、細胞は、１０％ＦＣＳ、β−メルカプトエタノール、１Ｍピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓバッファー、２ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、５０単位／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ培地で生育させる。一部の態様において、単離された細胞は、単離された細胞における特殊化した制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団が数のうえで少なくとも５％、１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、または、少なくとも２００％まで増加するまで生育させる。
【００３８】
一部の態様において、単離されたＴ細胞を生育させた後、特殊化した制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｈｅｌｉｏｓ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞およびＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞以外の１または２以上の細胞種を除去することにより、さらに富化される。一部の態様において、特殊化した制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、静脈内注射により対象に投与される。特殊化した制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、対象への投与前に、培養培地から分離される。特殊化した制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、自己免疫疾患の症状を改善するのに有効な量で対象に投与される。
【００３９】
一部の態様において、特殊化した制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、自己免疫薬剤と組み合せて投与される。かかる薬剤の非限定例は、メソトレキセート、シクロホスファミド、イムラン（アザチオプリン）、シクロスポリン、およびプレドニゾンおよびメチルプレドニゾロンなどのステロイド化合物を含む。
【００４０】
特殊化した制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、抑制活性の活性化をＩＬ‐１５に依存している。したがって、本発明の複数の側面は、自己免疫疾患の症状を改善するのに有効な量でインターロイキン１５受容体（ＩＬ‐１５Ｒ）アゴニストを用いて、特殊化した制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を増強することにより、自己免疫疾患を処置する方法を含む。
【００４１】
一部の態様において、自己免疫疾患の処置を必要とする対象は、自己免疫疾患を有すると同定された対象であり、すなわち、当該対象は、医師により（例えば、当該技術分野で周知の方法を用いて）自己免疫疾患を有すると診断されている。一部の態様において、処置を必要とする対象は、自己免疫疾患を有する疑い、または発症する疑いのある対象、例えば、自己免疫疾患を示唆する１または２以上の症状を呈している対象などである。一部の態様において、自己免疫疾患を有する疑いのある対象は、自己抗体の異常な力価を示すことがある。自己抗体の異常な力価を有する対象は、自己免疫疾患の少なくとも１つの他の症状を有することがあり、または自己免疫疾患に関係する他の症状を有しないことがある。「処置を必要とする対象」という用語は、かつて自己免疫疾患を有していたが、症状が改善した者をさらに含む。
【００４２】
対象は、動物、典型的には、哺乳動物である。一側面において、対象は、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、またはげっ歯動物である。重要な態様において、対象はヒトである。ヒトとマウスは、多くの場合同様に称される、同様のＴ細胞マーカーを共有することが理解される。例えば、ヒトおよびマウスの両方は、ＣＤ４４、ＣＤ１２２およびＣＤ８を有する。本発明の主題にとって重要な１つのマーカーの場合、名称は異なる。マウスにおけるマーカーＬｙ４９は、ヒトではＫｉｒ（免疫グロブリン様キラー細胞抑制受容体）と称される。特許請求の範囲および明細書がヒトの処置に言及し、マーカーおよび抗体が論じられる範囲において、マーカーはヒトのものであり、抗体はヒトマーカーに結合するものとする。
【００４３】
本明細書で用いる場合、化合物は、ＩＬ‐１５にように、それがＩＬ‐１５Ｒに結合し、特殊化した制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖／活性化を誘導する場合、ＩＬ‐１５Ｒアゴニストである。一部の態様においては、アゴニストは、本来の（native）ＩＬ‐１５によって誘導されるレベルと同様か、またはそれより高いレベルの生物学的反応を誘導する。一部のアゴニストは、いっそう高いレベルの生物学的反応を誘導する（スーパーアゴニスト）。ＩＬ‐１５Ｒアゴニストは、典型的には、本来のＩＬ‐１５のものと同様の、ＩＬ‐１５受容体アルファおよび／またはＩＬ‐１５受容体ベータ／ガンマに対する結合のための親和性を有する。
【００４４】
かかるアゴニストの例は、配列番号１（ＩＬ‐１５）のアミノ酸配列を有するＩＬ‐１５ポリペプチド、および配列番号１（ＩＬ‐１５）のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一の配列を含むポリペプチド、アゴニスト的抗ＩＬ‐１５Ｒ抗体、またはその抗原結合フラグメント、ＧＳリンカーを介して可溶性ＩＬ‐１５受容体アルファ鎖（スシドメイン）に結合したＩＬ‐１５のヘテロ複合体（組換えＩＬ‐１５／ＩＬ‐１５ＲＡ複合体）（例えば、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる米国出願No.12/090,930を参照）を含むが、これらに限定されない。いずれの態様においても、ＩＬ‐１５Ｒは、ヒトＩＬ‐１５Ｒであってよく、ＩＬ‐１５Ｒ受容体アゴニストはヒトＩＬ‐１５Ｒのアゴニストである。
【００４５】
ヒトＩＬ‐１５のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列：NP_000576.1（配列番号１）により表される。ＩＬ‐１５ポリペプチドは、ＩＬ‐１５のフラグメント、例えば、配列番号１のポリペプチドからリーダー配列のタンパク質分解による切断により得られる、ＩＬ‐１５の成熟型として以前キャラクタライズされた配列番号１のアミノ酸４９〜１６２なども含み、ＩＬ‐１５の生物学的活性を保持する他のフラグメントは、ＩＬ‐１５という用語に包含される。１または２以上の置換アミノ酸を有するＩＬ‐１５の誘導体または変異体を含む、ＩＬ‐１５の生物学的活性を示すＩＬ‐１５アナログも、ＩＬ‐１５Ｒアゴニストという用語の意味に含まれる。例示的なアナログは、参照により本明細書に組み込まれる米国出願No.11/639,877、米国特許No.5,552,303およびBernard et al, J. Biol. Chem. 279:24313-24322, 2004に記載されている。ＩＬ‐１５の用語は、ヒト以外の種、例えば、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、ブタ、ウマ、ウシ、イヌ等のＩＬ‐１５も包含する。
【００４６】
自身の抗原（または自己抗原）は、それに対して対象が望まない免疫反応を起こす、対象の自己産生構成物である。「自己抗体」は、１または２以上の対象自身の構成物または自身の抗原に結合する、対象によって産生される抗体である。「自己免疫疾患」の用語は、患者の免疫反応が患者自身の構成物に向けられ、望まない、そしてしばしばひどい消耗性の状態（condition）をもたらす、疾患状況および状態を指す。本明細書で用いる場合、「自己免疫疾患」は自己免疫状態、症候群等をさらに含むものとする。
【００４７】
自己免疫疾患の例は、全身性エリテマトーデス、慢性移植片対宿主病、関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、乾癬、炎症性腸疾患、シェーグレン症候群、グレーブス病、クローン病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、過粘稠度症候群、原因不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症、ＰＯＥＭＳ症候群、ミエローマ、マクログロブリン血症および寒冷擬集素病を含むが、これらに限定されない。一部の態様において、自己免疫疾患は、自身の抗原に対する抗体を伴い、対象は自身の抗原に対する抗体を有する。
【００４８】
特殊化した制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＩＬ‐１５Ｒアゴニストは、有効な量で投与される。有効な量は、医学的に所望の結果をもたらすのに十分な用量であり、当業者によって、ルーチンの方法を用いて決定され得る。一部の態様において、有効な量は、処置されている状態においてあらゆる改善をもたらす量である。一部の態様において、有効な量は、自己免疫疾患のタイプおよび程度、または処置されている状態、および／または１または２以上の追加の治療剤の使用に依存し得る。しかしながら、当業者は、例えば、インビトロおよび／またはインビボ試験、および／または化合物投与量の他の知識に基づいて、使用する治療剤の適切な用量および範囲を決定することができる。
【００４９】
対象に投与される場合、治療剤の有効な量は、当然のことながら、処置されている特定の疾患、疾患の重篤度、年齢、健康状態、サイズおよび体重を含む個々の患者のパラメーター、併用処置、処置の頻度および投与の方式に依存する。それらの要因は、当業者によく知られており、ルーチン程度の実験で対応することができる。一部の態様においては、最大用量、すなわち、正当な医学的判断に従った最大安全用量が用いられる。
【００５０】
自己免疫疾患の処置において、有効な量は、疾患の進行を遅延させる、疾患の進行を停止させる、または、疾患の進行を逆転させる量である。有効な量は、自己免疫疾患に関係する１または２以上の症状を遅延させる、低減する、阻止する、改善する、または逆転させるのに必要な量を含む。一部の態様において、かかる用語は、１または２以上の関節の腫脹の低減または、自己免疫障害に関係する痛み、疲労および／または発熱の低減を指す。一部の態様において、かかる用語は、自己免疫疾患に関係する循環自己抗体レベルの低減を指す。一部の態様において、かかる用語は、ヒトのＰＡＳＩスコアの低減を指す。一部の態様において、かかる用語は、ヒトの総合評価スコアの改善を指す。
【００５１】
化合物の有効な量は、典型的には、１日または数日の間の１回または２回以上の投与で、約０．００１ｍｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇの範囲である（当然のことながら、上記で論じた投与の方式および要因に依存する）。
【００５２】
治療剤の実際の投与量レベルは、特定の患者、組成物および投与方式に対し、所望の治療反応を達成するのに有効な量を得るために変えることができる。選択される投与量レベルは、特定の化合物の活性、投与の経路、処置される組織および処置される患者の以前の病歴に依存する。しかしながら、所望の治療成果を達成するのに必要とされるよりも低いレベルで、化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで、徐々に投与量を増加させることは、当該技術分野の技能の範囲内である。
【００５３】
本発明の一部の側面によると、組成物が提供される。組成物は、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞を含み、ここで、組成物中のＣＤ８＋細胞の少なくとも５％は、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞である。一部の態様において、組成物中のＣＤ８＋細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％は、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞である。本発明の一部の側面によると、ＣＤ８＋細胞の組成物（ここで、組成物中のＣＤ８＋細胞の少なくとも５％はＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞である）と、薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物が提供される。一部の態様において、医薬組成物は、免疫抑制薬剤を含む。免疫抑制薬剤の例は、非ステロイド抗炎症剤、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、抗ＣＤ４抗体およびラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
【００５４】
本発明の一部の側面は、抗原に対する免疫反応を刺激するための方法を含む。前記方法には、抗原を有し、かつ抗原に対する免疫刺激を必要とする対象に、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞の増殖および／または活性を阻害する剤を、対象における抗原に対する免疫反応を刺激するのに有効な量で投与することを含む。
【００５５】
一部の態様において、対象は病原体による感染を有し、病原体は抗原を含む。本明細書で用いる場合、「感染」とは、疾患を引き起こす能力を有する生物による対象の身体への侵入を指す。かかる生物は、限定されないが、ウイルス、バクテリア、菌類および寄生生物を含む。
【００５６】
ウイルスの例は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ‐１およびＨＩＶ‐２）、ヒトＴリンパ好性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ‐Ｉ）、ヒトＴリンパ好性ウイルスＩＩ型（ＨＴＬＶ‐ＩＩ）、単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ‐１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ‐２）、ヒトパピローマウイルス（様々な型）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ＣおよびＤ型肝炎ウイルス、エプスタイン‐バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルスおよび伝染性軟属腫ウイルスを含むが、これらに限定されない。
【００５７】
バクテリアの例は、Pasteurella species、Staphylococci species、Streptococcus species、Escherichia coli、Pseudomonas species、およびSalmonella speciesを含むが、これらに限定されない。感染性バクテリアの具体的な例は、Helicobacter pyloris、Borelia burgdorferi、Legionella pneumophilia、Mycobacteria sps（例えばM. tuberculosis、M. avium、M. intracellular、M. kansaii、M. gordonae）、Staphylococcus aureus、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis、Listeria monocytogenes、Streptococcus pyogenes（Group A Streptococcus）、Streptococcus agalactiae（Group B Streptococcus）、Streptococcus（viridans group）、Streptococcus faecalis、Streptococcus bovis、Streptococcus（anaerobic sps.）、Streptococcus pneumoniae、病原性 Campylobacter sp.、Enterococcus sp.、Haemophilus influenzae、Bacillus antracis、corynebacterium diphtheriae、corynebacterium sp.、Erysipelothrix rhusiopathiae、Clostridium perfringens、Clostridium tetani、Enterobacter aerogenes、Klebsiella pneumoniae、Pasturella multocida、Bacteroides sp.、Fusobacterium nucleatum、Streptobacillus moniliformis、Treponema palladium、Treponema pertenue、Leptospira、Rickettsia、およびActinomyces israeliiを含むが、これらに限定されない。
【００５８】
菌類の例は、Cryptococcus neoformans、Histoplasma capsulatum、Coccidioides immitis、Blastomyces dermatitidis、Chlamydia trachomatis、Candida albicansを含むが、これらに限定されない。他の感染性生物（すなわち、原生生物）は、Plasmodium falciparum、Plasmodium malariae、Plasmodium ovale、およびPlasmodium vivaxなどのPlasmodium spp.およびToxoplasma gondiiを含む。血液感染性および／または組織寄生生物は、Plasmodium spp.、Babesia microti、Babesia divergens、Leishmania tropica、Leishmania spp.、Leishmania braziliensis、Leishmania donovani、Trypanosoma gambiense、およびTrypanosoma rhodesiense（アフリカ睡眠病）、Trypanosoma cruzi（シャーガス病）およびToxoplasma gondiiを含む。
【００５９】
寄生生物の例は、Plasmodium spp.、Babesia microti, Babesia divergens、Leishmania tropica、Leishmania spp.、Leishmania braziliensis、Leishmania donovani、Trypanosoma gambienseおよび60 Trypanosoma rhodesiense（アフリカ睡眠病）、Trypanosoma cruzi（シャーガス病）、およびToxoplasma gondiiを含むが、これらに限定されない。
【００６０】
一部の態様において、対象はがんを有し、がんは抗原を含み、抗原は腫瘍抗原である。がんはいずれのがんであってもよい。がんは、胆管がん、骨がん、脳およびＣＮＳがん、乳がん、子宮頸がん、絨毛癌、大腸がん、結合組織がん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、胃がん、ホジキンリンパ腫、上皮内腫瘍、喉頭がん、リンパ腫、肝臓がん、肺がん、メラノーマ、神経芽細胞腫、口腔がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、直腸がん、肉腫、皮膚がん、精巣がん、甲状腺がん、および腎臓がんを含むが、これらに限定されない。
【００６１】
腫瘍抗原は、いずれの腫瘍抗原であってもよい。例えば、腫瘍抗原は、ヒト上皮細胞ムチン（Ｍｕｃ‐１、乳がん細胞および膵臓がん細胞上に存在するＭｕｃ‐１糖タンパク質の２０アミノ酸コアリピート）、Ｈａ‐ｒａｓがん遺伝子産物、ｐ５３、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ｒａｆがん遺伝子産物、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＴＦ、ｓＴｎ、ＭＡＧＥ‐１、ＭＡＧＥ‐３、チロシナーゼ、ｇｐ７５、Ｍｅｌａｎ‐Ａ／Ｍａｒｔ１、ｇｐ１００、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＥＢＶ‐ＬＭＰ１＆２、ＨＰＶ‐Ｆ４、６、７、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＯ１７‐１Ａ、ＧＡ７３３、ｇｐ７２、Ｐ５３、ｒａｓがん遺伝子産物、ＨＰＶ  Ｅ７およびメラノーマガングリオシドであってもよいが、これらに限定されない。
【００６２】
一部の態様において、抗原は、ワクチンにて対象に投与される。この投与は、感染または腫瘍の存在による対象における抗原の存在を補充することができる。ワクチンは、対象への抗原の初めての導入を含んでもよい。本明細書で用いる場合、「ワクチン」は、無害な形で抗原を含む生物または物質を意味する。ワクチンは、組換えワクチンであっても、または非組換えワクチンであってもよい。ワクチンは、例えば、解毒されているが、依然その主要な免疫原性決定因子を保持する毒素として定義されるトキソイドの形態、または腸チフス、コレラおよびポリオなどの死菌の形態、または生存しているが非病原性の病原体の形態の弱毒化生物の形態をとってもよく、または、それはかかる生物によりコードされる抗原でもよく、または、それは死腫瘍細胞、または腫瘍細胞上に存在する抗原であってもよい。
【００６３】
抗原は、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖類、多糖結合体、多糖類および他の分子のペプチドおよび非ペプチド模倣物、低分子、脂質、糖脂質、炭水化物、ウイルスおよびウイルス抽出物および寄生生物などの多細胞生物およびアレルゲン（例えば、米国特許No.7576066参照）を含むが、これらに限定されない。
【００６４】
特殊化した制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および／または活性を阻害する剤は、抗ＩＬ‐１５抗体、または特殊化した制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞に結合する抗体を含むが、これらに限定されない。剤は、抗ＣＤ８抗体、またはＫｉｒに対する抗体であってもよい。一部の態様において、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞に結合する抗体は、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞上に存在する第１の表面マーカーに結合する第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞上に存在する第２の表面マーカーに結合する第２の抗原結合ドメインとを含む、二重特異性抗体である。ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞上の第１および第２の表面マーカーは、ＣＤ４４、ＣＤ１２２、ＫｉｒおよびＣＤ８を含むが、これらに限定されない。
【００６５】
一部の態様において、剤は、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞上に存在する第１の表面抗原に結合する第１の抗体の最適下量と、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞上に存在する第２の表面抗原に結合する第２の抗体の最適下量とを含む組成物（ここで、第１の表面抗原は第２の表面抗原とは異なる）である。第１の抗体は、ＣＤ４４、ＣＤ１２２、ＫｉｒおよびＣＤ８からなる群から選択される抗原に結合し、第２の抗体は、ＣＤ４４、ＣＤ１２２、ＫｉｒおよびＣＤ８からなる群から選択される抗原に結合する。
【００６６】
一部の態様において、特殊化した制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および／または活性を阻害する剤は、細胞におけるＨｅｌｉｏｓの発現レベルおよび／または活性を低減する剤である。Ｈｅｌｉｏｓのレベルおよび／または活性を阻害する剤は、Ｈｅｌｉｏｓに結合し、その活性（例えば、ＤＮＡ結合活性、核内移行活性、ホモまたはヘテロ二量体化活性、または転写活性化活性）を阻害するＨｅｌｉｏｓ結合タンパク質、Ｈｅｌｉｏｓタンパク質に特異的に結合する抗体（例えば、Ｈｅｌｉｏｓの、ＤＮＡまたは別の転写因子に結合する能力、核に移行する能力、またはＤＮＡに結合する能力を妨げる抗体）、例えば、Ｈｅｌｉｏｓ結合パートナー（例えば、ＤＮＡまたは別の転写因子（例えば、ＩｋａｒｏｓまたはＡｉｏｌｏｓ因子））に結合するが、Ｈｅｌｉｏｓの活性（例えば核内移行活性または転写活性化活性）を妨げる、突然変異した不活性Ｈｅｌｉｏｓまたはそのフラグメント、細胞のＨｅｌｉｏｓ核酸配列（例えばｍＲＮＡ）に結合し、タンパク質の発現を阻害し得るＨｅｌｉｏｓ核酸分子（例えばアンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ）、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子発現を減少させる剤（例えば、Ｈｅｌｉｏｓのプロモーターに結合し、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子発現を減少させる低分子）の１または２以上であってよい。
【００６７】
一部の態様において、剤は、毒素に結合した、特殊化した制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞上に存在するマーカーの１つを認識する剤である。ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞上に存在するマーカーの１つを認識する剤は、マーカーの１つに特異的なリガンド、またはマーカーの１つに対する抗体であってよい。毒素の例は、生物毒素、化学毒素、合成毒素および放射性核種を含むが、これらに限定されない。放射性核種は、ベータ放出金属放射性核種、アルファ放射体およびガンマ放射体からなる群から選択され得る。放射性核種の例は、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３０Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｉ、１３５Ｉ、１２８Ｂａ、１３Ｎ、１５Ｏ、および１８Ｆを含むが、これらに限定されない。
【００６８】
本明細書で使用される場合、抗体の最適下量は、単独で使用した場合には、特殊化した制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を阻害して状態を処置するのに有効なおよび／または最適な量ではないが、第２の抗体を組み合わせて使用した場合に、状態を処置するために特殊化した制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を阻害して状態を処置するのに有効なおよび／または最適となる量である。最適下用量の治療剤の使用は、それにより、抗体のあらゆる可能な副作用の低下が可能となるため、有用である。
【００６９】
特殊化した制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および／または活性を阻害する剤は、対象における抗原に対する免疫反応を刺激するのに有効な量で投与される。本明細書で用いる「有効な量」の用語は、免疫学的反応と、対応する治療効果とをもたらすのに十分な剤の量を指す。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、一般的な状態、処置されている状態の重篤度および具体的な剤、投与の方式等に依存して、対象ごとに異なる。任意の個々の場合における適切な「有効な」量は、ルーチンの実験を用いて、当業者により決定され得る。
【００７０】
医薬製剤および化合物は、任意の適した経路により対象に投与される。例えば、組成物は経口的に（舌下を含む）、直腸に、非経口的に、嚢内に、膣内に、腹腔内に、局所および経皮的に（粉末、軟膏剤または滴下剤により）、頬側または経鼻的に投与することができる。本発明の医薬製剤は、薬学的に許容し得る担体を含んでも、その中に希釈されてもよい。本明細書に用いる場合、「薬学的に許容し得る担体」の用語は、ヒト、またはイヌ、ネコもしくはウマなどの他の哺乳動物への投与に適した１または２以上の適合性の賦形剤、希釈剤などの物質を意味する。
【００７１】
「担体」という用語は、有効成分が適用を促進するために組み合わせられる、天然もしくは合成の、有機成分または無機成分を意味する。担体は、所望の薬学的な有効性または安定性を実質的に損なう相互作用がないような様式で、本発明の製剤と混合することができ、かつ相互に混合することができる。経口剤形、皮下剤形、静脈内剤形、筋肉内剤形などの剤形に適した担体は、RemingtonのPharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Paにおいて見出すことができる。
【００７２】
本発明は次の例によりさらに説明されるが、それは決してさらに限定するものとして解釈されるべきではない。この出願の全体にわたって引用される参考文献（参照文献、登録特許、公開された特許出願および同時係属特許出願を含む）のすべての全体の内容は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
【００７３】
例
材料および方法
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）、Ｒａｇ２−／−、ＩＬ‐１５−／−およびＢ６．Ｑａ‐１（Ｄ２２７Ｋ）マウス（１１世代戻し交配したもの）は、病原体フリーの条件で飼育した。すべての実験は、連邦法およびダナ・ファーバー癌研究所の動物管理使用委員会により承認された施設内ガイドラインに従って行った。
【００７４】
試薬およびフローサイトメトリー
単細胞懸濁液を調製し、免疫蛍光分析のために暗所で４℃にて維持し、氷冷ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中の２％のウシ胎仔血清、０．１％のＮａＮ３）で洗浄し、それぞれの抗体とともに３０分間インキュベートし、分析前にＦＡＣＳバッファーで洗浄した。抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗Ｂ２２０、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ６２Ｌ、抗Ｆａｓ、抗ＩＣＯＳ、抗ＩｇＭ、抗ＣＤ２００（BD Bioscience）または抗ＣＤ８β、抗Ｌｙ４９Ｃ／Ｉ／Ｆ／Ｈ、抗Ｌｙ４９Ａ、Ｌｙ‐４９Ｇ２、Ｌｙ４９Ｃ／Ｉ、Ｌｙ４９Ｄ、Ｌｙ４９Ｆ、Ｌｙ４９Ｈ（eBioscience）を用いた後に、FACSCanto（BD Biosciences）および FlowJo software（TriStar）を用いて細胞の分析を行った。
【００７５】
細胞精製および養子移植
ナイーブＢ細胞は、Ｑａ‐１  ＷＴおよび変異型マウス（BD Bioscience）の脾臓から単離した。ナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞は、Ｑａ‐１  ＷＴおよび変異マウスの脾臓から、ＣＤ４細胞富化キット（BD Bioscience）およびビオチン化抗ＣＤ２５Ａｂを用いて精製した。Ｂ細胞およびＣＤ４細胞の純度は＞９５％であった。免疫ＣＤ８細胞を生成するために、ＷＴ  Ｂ６マウスを、ＣＦＡ中の１００μｇのＫＬＨで腹腔免疫し、７〜１０日後に脾臓ＣＤ８細胞を得（BD Bioscience）、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｌｙ４９＋ＣＤ８Ｔ細胞についてソートした。これらの細胞を、Ｒａｇ２−／−レシピエントに静脈内移植した。細胞移植後すぐに、Ｒａｇ２−／−マウスをＣＦＡ中の１００μｇのＮＰ１９‐ＫＬＨで腹腔内免疫し、ＩＦＡ中の５０μｇのＮＰ１９‐ＫＬＨで再度腹腔内免疫した。
【００７６】
ＥＬＩＳＡ
ＮＰ特異的抗体を検出するために、ＥＬＩＳＡプレートを、０．５μｇ／ｍｌのＮＰ４‐ＢＳＡまたは１μｇ／ｍｌのＮＰ２３‐ＢＳＡ（Biosearch Technologies）でコートし、ＣＦＡ中のＮＰ１９‐ＫＬＨによる免疫およびＩＦＡ中のＮＰ１９‐ＫＬＨによる再免疫の１４日後に採取した血清を、スタンダードとして用いた。この免疫血清を１：４０００希釈したものを、１００単位／ｍｌとして定義した。全ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａは、ビオチン化抗マウスＩｇＧ、ＩｇＧ１または、ＩｇＧ２ａとともにプレートをインキュベートした後、スレトプトアジビン‐ペルオキシダーゼにより検出した。自己抗体の検出については、ブタサイログロブリン（Sigma）および、ブタインスリン（Sigma）を、関連Ａｂを検出するのに用いた。
【００７７】
統計
統計分析は、２条件の比較についてはウィルコクソン‐マン‐ホイットニー順位和検定を、２条件を超える比較についてはクラスカル‐ワリス検定を用いて行った。Ｐ値＜０．０５を統計学的に有意であるとみなした（＊＝＜０．０５、＊＊＝＜０．０１、＊＊＊＝＜０．００１）。
【００７８】
結果
ＣＤ８＋Ｔｒｅｇは抑制活性の獲得に関してＩＬ‐１５に依存している
ＣＤ４４＋ＣＤ８＋細胞は、ＣＤ１２２＋ＩＬ‐１５依存性画分およびＣＤ１２２−ＩＬ‐１５非依存性画分で構成される（図１Ａ）。ＷＴおよびＩＬ‐１５−／−マウスからのＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋細胞の分析は、ＷＴマウスが、ＩＬ‐１５−／−マウスに比べて、５倍多いＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋細胞を示すことを明らかにした。ＣＦＡ中のＫＬＨによるＷＴマウスの免疫は、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の≒５０％の増加を誘導したが、ＩＬ‐１５−／−マウスでは、検出可能な増加を誘導しなかった（図１）。ＩＬ‐１５−／−マウスのＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋ＣＤ８Ｔ細胞の残り集団のさらなる分析は、それらの細胞が、顕著に低いレベルのＣＤ１２２を発現することを示した（図１Ａ、左パネル）。
【００７９】
これらのデータは、ＩＬ‐１５−／−ドナーからのＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の不良な抑制活性が、ＣＤ１２２＋ＣＤ４４＋ＣＤ８Ｔ細胞を生成できないことを反映している可能性を示すものである。ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋ＣＤ８細胞のＱａ‐１依存性の抑制活性を試験するために、我々は、ＷＴ  Ｂ６マウスからＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋ＣＤ８＋細胞（＞９８％の純度）または、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２−ＣＤ８＋細胞（＞９８％の純度）をソートし、Ｑａ‐１（ＷＴ）またはＱａ‐１（Ｄ２７７Ｋ）ドナーからの（ＣＤ２５−）ＣＤ４細胞およびＢ細胞とともに、それらをＲａｇ２−／−宿主に移植した。ＮＰ１９‐ＫＬＨでチャレンジ後、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２−細胞ではなく、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋ＣＤ８細胞のレシピエントは、ＮＰ特異的なＡｂ反応のＱａ‐１拘束性の抑制を示した（図１Ｂ）。対照的に、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２−ＣＤ８細胞は抑制しなかった。
【００８０】
高親和性Ａｂ反応の発生は、ＴＦＨ細胞による胚中心（ＧＣ）Ｂ細胞の活性化に依存する、正確に調整されたプロセスである。Ｑａ‐１のＤ２２７Ｋ変異体は、ＣＤ８＋ＴｒｅｇとＱａ‐１＋標的ＴＨ細胞との間の阻害性の相互作用を妨げる。この不良な相互作用は、多数のＣＤ８＋Ｔｒｅｇの存在下ですら、サイログロブリンおよびインスリンに対する強固な自己抗体反応を可能にする（図１Ｃ）。
【００８１】
ＣＤ８＋ＴｒｅｇによるＬｙ４９の発現
ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋ＣＤ８Ｔ細胞は、Ｌｙ４９の発現に応じて２つのサブセットに分けることができる。Ｌｙ４９＋ＣＤ８細胞は、インビトロにおいてＩＬ‐１５による活性化に対して特に敏感であり、インビボでの有効な発達および年齢依存性の増加についてはＣＤ４＋Ｔ細胞に依存する（Coles et al., 2000、Anfossi et al., 2004）。
【００８２】
ＫＬＨ／ＣＦＡによるＷＴ  Ｂ６マウスの免疫は、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋ＣＤ８Ｔ細胞の数を倍加させ、またそれらの細胞の≒２５％は、Ｌｙ４９も発現する。これらのＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｌｙ４９＋細胞はまた、ＣＤ８ααではなく、ＣＤ８αβ＋も発現し、高レベルのＣＤ６２Ｌも発現する。追加の分析は、Ｌｙ４９＋ＣＤ８サブセットが、次の阻害性受容体：Ｌｙ４９Ａ（２４．８％）、Ｌｙ４９Ｃ／Ｉ（１３．１％）、Ｌｙ４９Ｆ（９０％）およびＬｙ４９Ｇ２（３３％）を発現することを明らかにし、活性化させるＬｙ４９受容体（Ｌｙ４９Ｄ、Ｈ）はこれらの細胞によって検出できるレベルで発現していなかった（図２ａ）。
【００８３】
ソートされたＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｌｙ４９−ではなく、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｌｙ４９＋のＣＤ８Ｔ細胞は、Ｑａ‐１変異体（Ｄ２７７Ｋ）ＣＤ４Ｔ細胞ではなく、Ｑａ‐１  ＷＴ  ＣＤ４Ｔ細胞を効果的に抑制した。すなわち、抑制活性は、標的ＣＤ４細胞上のＱａ‐１の認識に依存した（図２ｂ）。これらの所見は、Ｌｙ４９発現によりＣＤ８＋Ｔｒｅｇを通常のＣＤ８＋記憶Ｔ細胞から区別できることを示すものであり、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇの発達がクラスＩ  ＭＨＣによるＬｙ４９の結合にある程度依存し得る可能性を開くものである。
【００８４】
Ｂ６‐Ｙａａにおける不良なＣＤ８Ｔｒｅｇ機能は、狼瘡様疾患の発症に寄与し得る
Ｑａ‐１リガンドのＣＤ８／ＴＣＲ複合体との相互作用を妨げる点突然変異（Lu et al., 2008）の発現は、ＴＦＨの無調節な増加と関係する、Ｂ６．Ｑａ‐１（Ｄ２２７Ｋ）マウスにおける狼瘡様自己免疫障害の発症をもたらす（Kim et al., 2010）。不良なＣＤ８＋Ｔｒｅｇ活性はまた、ＢＸＳＢ‐ＹａａマウスとＢ６．β２ｍ−／−マウスとの交雑種が狼瘡様疾患の急速な発病および強度（intensity）を示すという知見（Bubier et al., 2007）に基けば、ＢＸＳＢ‐Ｙａａマウスにおける疾患の病因に寄与している可能性がある。
【００８５】
ＳＢ／Ｌｅ系統に由来するＹ染色体座に主に起因するとされる、オスのＢＸＳＢ‐Ｙａａ自己免疫障害は、実際にＹ染色体上に転座した余分なＴＬＲ７のコピーを示す。このＹ染色体に連鎖したＴＬＲ７の余分なコピーは、多数の狼瘡になりやすい系統において疾患を悪化させ（Izui et al., 1988、Morel et al., 2000、Pisitkun et al., 2006）、非自己免疫性のＣ５７ＢＬ／６バックグラウンド（Ｂ６‐Ｙａａ）において疾患を促進する。Ｂ６‐Ｙａａマウスの予備分析は、２および８月齢マウスの両方が、Ｂ６．Ｑａ‐１（Ｄ２２７Ｋ）の表現型によく似た、脾臓におけるＴＦＨおよびＧＣ  Ｂ細胞のおよそ３倍の増加を有することを示した（図３）。我々は、Ｂ６‐Ｙａａマウスにおける自己免疫性の表現型がＣＤ８＋Ｔｒｅｇによる不良な制御に関係するかどうかを検討した。Ｂ６‐ＹａａマウスにおけるＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｌｙ４９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、ＫＬＨ／ＣＦＡ免疫の７日後のＢ６  ＷＴマウスにおいて見出された数の２倍であった（データは示してない）。
【００８６】
しかしながら、Ｒａｇ２−／−宿主への、Ｂ６（ＷＴ）ＣＤ４細胞およびＢ細胞に加え、Ｂ６‐ＹａａマウスからのＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋ＣＤ８＋Ｔｒｅｇの移植は、Ｂ６‐Ｙａａ  ＣＤ８Ｔｒｅｇが標的ＣＤ４Ｔ細胞を抑制できないことを明らかにした。ＷＴマウスからのＣＤ８細胞は、同じ実験において強い抑制を移したことから（図４）、この所見は、Ｂ６‐Ｙａａマウスにおける自己免疫に関係するＴＦＨ細胞の増加が、不良なＣＤ８Ｔｒｅｇ機能を反映している可能性を開くものである。
【００８７】
照射されたＢ１６−ＧＭ−ＣＳＦ形質導入細胞の最適下レベルによるワクチン接種は、不良なＣＤ８＋Ｔｒｅｇ活性を有するマウスにおいてＢ１６腫瘍接種後の生存を増大させた
Ｃ５７ＢＬ／６  Ｑａ‐１（Ｄ２２７Ｋ）ノックインマウスおよび野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対し、０日に２×１０５個のＧＭ−ＣＳＦ−照射（３５００ラド）Ｂ１６細胞で一方の脇腹に皮下でワクチン接種した。ワクチン接種の１週間後、マウスに、反対の脇腹に５×１０６個のＢ１６メラノーマ細胞を皮下接種した（Dranoff et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Apr 15;90(8):3539-43.、Sampson et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Sep 17;93(19):10399-404）。不良なＣＤ８＋Ｔｒｅｇ活性を有するＣ５７ＢＬ／６  Ｑａ‐１（Ｄ２２７Ｋ）ノックインマウスは、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスより長く生存した（図７）。
【００８８】
ＣＤ４＋濾胞性ヘルパーＴ細胞（ＴＦＨ）の活性を、ＴＦＨ細胞の表面に発現するＱａ‐１の認識を介して調節するようにプログラムされたＣＤ８＋Ｔ細胞の亜集団は、自己抗体反応を弱める（Kim et al., 2010、この全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。これらのＣＤ８＋制御性（Ｔｒｅｇ）細胞の表面表現型の以前の分析は、これらが、高いレベルのＣＤ４４およびＣＤ１２２、ならびに比較的低いレベルのＣＸＣＲ５およびＩＣＯＳＬを発現することを示した。それらの表面におけるＣＤ１２２の発現は、発達および機能の両方についてのＩＬ‐１５へのそれらの依存性（Kim et al., 2010）と一致する。制御性活性は、Ｋｉｒレセプターも発現するＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋ＣＤ８＋細胞の亜集団に付与される。ＣＤ８細胞によるクラスＩ  ＭＨＣ受容体Ｌｙ４９の発現は、ＩＬ‐１５に対する増強された応答性に関係していた（Coles et al., 2000、Judge et al., 2002、Anfossi et al., 2004）。これらの知見は、ＣＤ８Ｔ細胞の３〜５％を占めるＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｋｉｒ＋ＣＤ８Ｔ細胞が、このＴ細胞サブセットに付与される、実質的にすべてのＱａ‐１拘束性の抑制活性の原因であることを示している。
【００８９】
Ｑａ‐１リガンドのＣＤ８／ＴＣＲ複合体との相互作用を妨げる２２７位におけるアミノ酸置換変異（Ｄ→Ｋ）を発現するＱａ‐１ノックインマウスの分析は、ＴＦＨおよびＧＣ  Ｂ細胞の増加に関係する不良なＣＤ８＋Ｔｒｅｇ活性を明らかにした。これらの細胞異常は、組織特異的自己抗体、非リンパ系器官のリンパ球浸潤および重篤な糸球体腎炎といった、ＢＸＳＢ‐ＹａａおよびＣ５７ＢＬ／６‐Ｙａａマウスによって示される症候群に類似する一連の病理学的な変化を特徴とする狼瘡様自己免疫障害の発症と関連していた。
【００９０】
ＢＸＳＢ‐Ｙａａ疾患がβ２ｍに関連するクラスＩａ／Ｉｂタンパク質の欠如によって悪化するという知見（Kim et al., 2010）もまた、不良なＣＤ８＋Ｔｒｅｇ活性がＢＸＳＢ‐Ｙａａ疾患に寄与し得るという仮説に矛盾しない。我々は、Ｂ６‐Ｙａａマウスが、生後数カ月以内で増加した数のＴＦＨおよびＧＣ  Ｂ細胞を含んでおり、そしてこれらのマウスからのＣＤ８＋Ｔｒｅｇが、養子宿主におけるＷＴ  ＣＤ４Ｔ細胞を抑制できないことを見出す。ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞の発達の不良／異常は、この狼瘡マウスモデルにおける疾患の病因に寄与している可能性がある。
【００９１】
制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、自己寛容の維持およびＳＬＥ様自己免疫疾患の阻止にとって不可欠である。本明細書で提示するデータは、発達および機能についてのＩＬ‐１５サイトカインへのそれらの依存性を基にＣＤ８Ｔｒｅｇの表面表現型を確立する。結果は、ＣＤ８Ｔ細胞のＱａ‐１拘束性の抑制活性が、それらの表面にＣＤ４４、ＣＤ１２２およびＬｙ４９を発現する小さい亜集団に付与されることを明らかにした。加えて、我々は、Ｂ６．Ｙａａ自己免疫易発生マウスにおけるＳＬＥ様疾患の発症がＱａ‐１拘束性ＣＤ８Ｔｒｅｇの不良な制御活性に関係していることを見出した。
【００９２】
ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ‐Ｅ）のマウスホモログであるＱａ‐１は、意図的（deliberate）な免疫または感染後、自己または外来タンパク質に由来するペプチドに結合し、これを提示するβ２ミクログロブリンとヘテロダイマーを形成する（Lo et al., 1999、Lo et al., 2000、Sullivan et al., 2002）。Ｑａ‐１をコードするｍＲＮＡは多くの細胞種において検出できるが（Transy et al., 1987）、Ｑａ‐１−β２ミクログロブリンヘテロダイマーの表面発現は、正確な集合および輸送のための要件によって、活性化ＴおよびＢリンパ球および樹状細胞の表面に制限されている可能性がある（Sullivan et al., 2002、Soloski et al., 1995）。
【００９３】
ペプチドを含むＱａ‐１複合体は２つの広範なクラスの受容体を結合する。Ｑｄｍ（Ｑａ‐１決定修飾因子）と呼ばれる、ＭＨＣクラスＩａリーダー配列に由来するペプチドを含むＱａ‐１ヘテロダイマーは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＣＤ８Ｔ細胞の亜集団によって発現される非クローン性に分布するＣＤ９４‐ＮＫＧ２Ａ受容体に結合する。Ｑａ‐１／Ｑｄｍ‐ＮＫＧ２Ａ相互作用の機能的結果は、一般的にＮＫまたはＣＤ８の細胞溶解活性の阻害である（Moser et al., 2002）。Ｑａ‐１リガンドの第２のクラスは、増え続けるペプチドのリストを含むＱａ‐１−β２ミクログロブリンヘテロダイマーを含む（Tompkins et al., 1998、Lo et al., 2000、Jiang et al., 2003、Davies et al., 2003）。このＱａ‐１リガンドのセットとＣＤ８Ｔ細胞上のＴＣＲとの間の相互作用は、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇの誘導、集団の増加およびエフェクター細胞活性の発現を促進し得る。
【００９４】
Ｑａ‐１変異マウスの最近の分析は、自己免疫疾患の阻止におけるＣＤ８＋Ｔｒｅｇの不可欠な寄与を明らかにした。ＣＤ８＋Ｔｒｅｇの優先的な標的は、その表面に高い定常状態レベルのＱａ‐１を発現するＴＦＨのサブセットである。ＣＤ８Ｔｒｅｇと標的Ｑａ‐１＋濾胞性ヘルパーＴ細胞との間の阻害性の相互作用の遺伝的な妨害は、ＳＬＥ様自己免疫疾患の発症をもたらし、それはタンパク質またはウイルス抗原での刺激によって促進された（Kim et al., 2010）。パーフォリンおよびＩＬ‐１５は、ＣＤ８Ｔｒｅｇの完全な活性に必要であることが示されている。ＩＬ‐１５依存性トランス細胞傷害メカニズムは、活性化ＴＦＨ細胞によって発現される標準的なサイトカインであるＩＬ‐２１によって効果的に増強されることが示されている（Zeng et al., 2005）。
【００９５】
我々の分析は、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇは、阻害性のＬｙ４９受容体（Ｌｙ４９Ａ、Ｌｙ４９Ｇ２、Ｌｙ４９Ｃ／Ｉ、Ｌｙ４９Ｆ）、特にＬｙ４９Ｆを発現するが（図２Ａ）、活性化させる受容体は発現しないことを明らかにした。先の研究は、阻害性のＬｙ４９ファミリーメンバーを発現するＣＤ８Ｔ細胞は、年齢とともにＣＤ４依存性の増加を示めすが、ＳＴＡＴ１欠損が、このＬｙ４９＋ＣＤ８亜集団のサイズを低減することを示した（Coles et al., 2000、Anfossi et al., 2004）。Ｌｙ４９の結合はＣＤ８Ｔ細胞の活性化を阻害できるが（Coles et al., 2000）、阻害性Ｌｙ４９分子の発現はまた、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を低減し、それによりこの記憶集団を早期の除去から保護することができる（Ugolini et al., 2001、Young et al., 2001、Roger et al., 2001、Chwae et al., 2002、Gati et al., 2003）。これらの考察は、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇの表面上のＬｙ４９受容体の阻害性の発現は、初期活性化のレベルを制限し得るが、記憶プールおけるそれらの寿命を延ばし得ることを示している。
【００９６】
興味深いことに、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇによって発現される主要なＬｙ４９ファミリーメンバーであるＬｙ４９Ｆ受容体に結合するリガンドは同定されていない。通常のＭＨＣクラスＩ分子に対するＬｙ４９Ｆの結合活性の欠如は、このＬｙ４９ファミリーメンバーが非古典的なＭＨＣクラスＩ分子と相互作用し得るという憶測を呼んだ（Kronenberg JI 2010）。
【００９７】
ヒトＣＤ８Ｔ細胞はまた、マウスＬｙ４９に類似した阻害性のＫＩＲ受容体を発現する細胞の小サブセットを含む。Ｌｙ４９およびＫＩＲは、マウスおよびヒトのＭＨＣクラスＩをそれぞれ認識する。Ｌｙ４９タンパク質は、Ｃ型レクチン様ドメインをその細胞外ドメインに有するが、ヒトのＮＫ阻害性受容体としてのＫＩＲファミリーは、イムノグロブリンドメインを有する。両タンパク質とも、細胞質内免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）という構造的相同性を共有しており、これは、その各々のＫＩＲまたはＬｙ４９受容体によるＭＨＣクラスＩへの結合の際に、阻害性のシグナルを伝達する（Vivier and Anfossi, 2004）。
【００９８】
ＫＩＲ＋ＣＤ８＋αβ−ＴＣＲ＋Ｔ細胞は、記憶表現型を発現するが、一般的にＣＣＲ７および細胞表面ＣＤ２８／ＣＤ２７を発現しない（Mingari et al., 1996、Speiser et al., 1999、Anfossi et al., 2001）。興味深いことに、パーフォリンの細胞内発現は、正常成体からのＣＤ８＋Ｔ細胞プールの≒４〜５％を占めるＫＩＲ＋ヒトＣＤ８Ｔ細胞に限定されている（Anfossi et al., 2004）。以前の研究は、ＫＩＲ＋ＣＤ８αβ＋ＴＣＲ＋Ｔ細胞プール（全ＣＤ８＋Ｔ細胞の≒４〜５％）の小画分から単離されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞クローンがＨＬＡ‐Ｅ（Ｑａ‐１ｂのヒトホモログ）を認識することを示したが、これは、マウスにおけるＬｙ４９＋ＣＤ８Ｔ細胞がＱａ‐１依存性の免疫抑制を発揮するという我々の所見と一致する（Pietra et al., 2001、Moretta et al., 2003、Mestas and Hughes, 2004）。
【００９９】
ビーズ依存性富化（Kim et al., 2010）およびＦＡＣＳ依存性セルソーティング（図５）により、我々はＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋細胞がＣＸＣＲ５およびＩＣＯＳＬを発現することに気付いた。この表面表現型は、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇの抑制活性に寄与する可能性があるため興味深い。ＣＸＣＲ５の発現は、ＣＤ８＋ＴｒｅｇのＢ／ＣＤ４  Ｔ細胞濾胞へのナビゲーションを可能にすることができる一方、活性化した移入ＣＤ８ＴｒｅｇによるＩＣＯＳＬの発現は、濾胞の微細環境内でのＩＣＯＳＬ＋ＴＦＨ細胞とのその相互作用を増強することができる。
【０１００】
しかしながら、入手可能な抗体によるそれらの２つの表面タンパク質の検出は比較的非効率であるが、ＣＤ４４、ＣＤ１２２、およびＬｙ４９に特異的な抗体は、ＣＤ８Ｔｒｅｇの、雑多な（heterogeneous）細胞集団からの効率的な単離に好ましい。ＣＤ８＋細胞を、ＣＤ４４、ＣＤ１２２およびＬｙ４９の三つ組の発現を基にソートすることは、抑制の分子メカニズムのさらなる分析およびＢ６マウスにおけるこの制御性系統の遺伝子シグネチャーの定義づけを容易にする。
【０１０１】
雄性マウスにおけるＳＬＥの重篤度を高める遺伝的修飾因子Ｙａａは、ＢＸＳＢ雑種系統を生み出した、Ｃ５７ＢＬ／６メスとＳＢ／Ｌｅオスとの交雑種から最初に同定された。ＢＸＳＢ系統に加え、ＹａａのＹ染色体は、多くの狼瘡易発症性の系統において疾患を悪化させる（Kikuchi et al., 2005、Subramanian et al., 2006）。非自己免疫性のＢ６バックグラウンドへのＹａａの遺伝子移入（Ｂ６‐Ｙａａ）は、Ｙａａが、ループス腎炎を特徴とするＳＬＥ様疾患を８〜１２ヶ月齢に引き起こし得ることを明らかにした。末端器官の自己免疫疾患は８〜１２ヶ月までＢ６‐Ｙａａマウスにおいて発症しないが、我々は、生後２ヶ月までにＴＦＨおよびＧＣ  Ｂ細胞の増加が明らかであることを見出す（図５）。この早期の段階におけるＴＦＨおよびＧＣ  Ｂ細胞の蓄積は、ＣＤ８Ｔ細胞の不良な制御性活性に関係していた。活性化ＴＬＲ７ｈｉＤＣによるＣＤ８＋記憶細胞の慢性的な活性化は、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞よりむしろサイトカインを分泌するＣＤ８＋記憶細胞の発達を優先的に支持する可能性がある。
【０１０２】
Ｑａ‐１拘束性のＣＤ８制御性Ｔ細胞のＩＬ‐１５依存性は、ＣＤ１２２およびＫｉｒの共発現、および、ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｌｙ４９＋ＣＤ８細胞がＱａ‐１依存性の抑制活性を媒介することに反映されている。ＣＤ８Ｔｒｅｇと標的ＣＤ４Ｔ細胞との間の相互作用の妨害は、自己抗体生成およびＳＬＥ様疾患をもたらす。これらの所見は、ＣＤ８Ｔｒｅｇ活性の増強が自己免疫疾患の処置への新しいアプローチであることを示す。
【０１０３】
転写因子Ｈｅｌｉｏｓの発現は、Ｌｙ４９＋ＣＤ８Ｔｒｅｇの表現型および抑制活性を決定づける
Ｌｙ４９＋およびＬｙ４９−ＣＤ８＋Ｔ細胞から調製したｃＤＮＡによるＤＮＡマイクロアレイは、ＣＤ８Ｔｒｅｇの発達および機能にとって重要である遺伝子に対する有力な主要転写因子として転写因子Ｈｅｌｉｏｓを同定した。Ｈｅｌｉｏｓは、ジンクフィンガー調節因子のイカロスファミリーの一員である。Ｈｅｌｉｏｓは、Ｔ細胞発達の初期段階で高く発現し、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞のサブセット（≒７０％）でも発現される。しかしながら、Ｈｅｌｉｏｓの発現は、ＦｏｘＰ３の発現に依存しない。成熟Ｂ細胞、樹状細胞およびミエロイド細胞は、Ｈｅｌｉｏｓを発現しない。ＣＤ８Ｔ細胞プールにおけるＨｅｌｉｏｓの発現および機能は報告されていない。我々の分析は、Ｈｅｌｉｏｓが、ＣＤ８Ｔ細胞プール内のＬｙ４９＋ＣＤ８制御性Ｔ細胞によって専ら発現され、Ｌｙ４９＋Ｔ細胞におけるこの転写因子の発現が、その抑制的な機能に関係することを示す（図８）。
【０１０４】
Ｈｅｌｉｏｓを発現するＬｙ４９＋ＣＤ８Ｔ細胞の表現型キャラクタリゼーション
Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｌｙ４９＋マウスＣＤ８＋Ｔｒｅｇの追加のキャラクタリゼーションは、ヒトにおけるＫＩＲ＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞の将来の同定に対し役立つ。図９で実証するとおり、Ｈｅｌｉｏｓを発現するＬｙ４９＋ＣＤ８Ｔ細胞は、より高いレベルのＶＬＡ‐２およびＶＬＡ‐４（細胞‐細胞相互作用に関与するインテグリン）を発現する。加えて、ＩＬ‐１５ＫＯマウスは、Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｌｙ４９＋ＣＤ８細胞を欠くことから、Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｌｙ４９＋ＣＤ８Ｔ細胞の発達は、ＩＬ‐１５依存性である。決定的な転写因子であるＨｅｌｉｏｓの、マウスにおけるＣＤ８Ｔｒｅｇ活性に関する分析は、ヒトにおけるＣＤ８＋Ｔｒｅｇ細胞の同定およびその遺伝的性質の理解のためのもう１つの重要な因子を追加する。
【０１０５】
自己免疫疾患におけるＣＤ８Ｔｒｅｇを介した免疫治療：ＣＩＡモデル
器官特異的な自己免疫疾患に関係する病原性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、これらの標的ＣＤ４＋細胞によって発現されるＱａ‐１の、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇによる認識を介して効果的に抑制することができる。これらの自己免疫疾患モデルは、Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）および、通常のＴＨ１および／またはＴＨ１７型ＣＤ４細胞が病因的役割を果たすことが知られているコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）を含む。我々は、コラーゲン誘導関節炎モデルを用いて、自己免疫疾患の予防および処置におけるＣＤ８Ｔｒｅｇの有効性を試験した。疾患の発症は、記憶表現型ＣＤ８＋Ｔ細胞によってではなく、Ｑａ‐１拘束性ＣＤ８＋Ｔｒｅｇの注入によって遅延させることができる。
【０１０６】
インビトロでのＩＬ‐１５によるＣＤ８＋Ｔｒｅｇの刺激は、これらの細胞の強い増加ならびに表面表現型および機能活性の維持をもたらす。図１０では、インビトロで増加させたＣＤ８ＴｒｅｇがＣＩＡの発症を効果的に予防している。
【０１０７】
がんにおけるＣＤ８Ｔｒｅｇを介する免疫療法
ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ活性のブロックは、Ｂ１６メラノーマモデルにおける腫瘍免疫の増強をもたらした：ＧＭ−ＣＳＦ産生Ｂ１６メラノーマによるマウスへのワクチン接種は、ＷＴマウスにおける急速な腫瘍成長と比べ、Ｑａ‐１  Ｄ２２７Ｋマウスにおける腫瘍成長の進行を遅らせた。Ｑａ‐１  Ｄ２２７Ｋマウスにおける腫瘍成長の阻害は、腫瘍内へのＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の浸潤の数の増加と相関した。それ故、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ依存性抑制のブロックは、腫瘍環境におけるエフェクターＴ細胞の増強された増加および活性をもたらす。ＣＤ８＋Ｔｒｅｇを除去するために、９０％を超えるＬｙ４９＋ＣＤ８ＴｒｅｇによるＬｙ４９Ｆサブタイプの発現を利用することができる。実際に、予備データは、抗Ｌｙ４９Ｆ抗体によるＬｙ４９Ｆ＋細胞の除去が、Ｂ１６メラノーマモデルにおける抗腫瘍免疫を増強することを示している。この所見は、抗ＫＩＲ（Ｘ）抗体（ヒトにおけるＣＤ８Ｔ細胞の主要なＫＩＲサブタイプを標的にする抗体）の投与が、ヒトにおいてがんに対する免疫反応を増強するための実行可能な介入であることを示すものである。
【０１０８】
本発明は、この出願において、上記の説明に記載された、または図面で例示された構造の詳細および構成要素の配置に限定されない。本発明は、他の態様が可能であり、種々の方法で実施または実行することが可能である。また、本明細書で使用される表現および用語は説明のためであり、限定するものとして見なされるべきではない。本明細書における「包括する」、「含む」、または「有する」、「含有する」、「包含する」、およびそれらの変形表現の使用は、その後にリストされる項目およびそれらの均等物ならびに追加の項目を包含することを意味する。
【０１０９】
参考文献
【表１】
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【０１１０】
【表２】
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【０１１１】
【表３】
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【０１１２】
【表４】
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【０１１３】
【表５】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ−Ｃ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図９Ｃ−Ｄ】
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【図９Ｅ−Ｆ】
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【図１０Ａ−Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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