(57)【要約】  本発明は、異種移植のためのドナー組織として膵島を使用するために膵島を最適化する目的で、離乳前の哺乳動物由来の膵島細胞の成熟を促進する方法に関する。本発明の方法は、ドナー動物から膵臓を摘出し、膵島全体をインスリン産生状態に保持しながら、膵臓組織を完全な膵島のサイズより大きな断片にする。本発明の方法はさらに、消化された組織を、培養された膵島のグルコース応答性を強化する新規な成熟培地において漸進的に培養し、移植手順に使用するために十分にグルコース応答性である膵島を選択する。
2014528725.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）離乳前の哺乳動物から膵臓を摘出するステップと、
ｂ）膵島全体をインスリン産生状態に保持しながら、該膵臓組織を完全な膵島のサイズより大きな断片にするステップと、
ｃ）該組織断片をプロテアーゼ溶液中で消化して、該膵島を囲む外分泌組織のみを該膵島から部分的に分離するステップと、
ｄ）該消化された組織を第１の成熟培地において培養するステップと、
ｅ）該消化された組織を第２の成熟培地において培養するステップと、
ｆ）該培養された膵島のグルコース応答性を決定するステップと、
ｇ）グルコース応答性膵島を選択するステップと
を含む、離乳前の哺乳動物由来の膵島細胞の成熟を促進する方法。
【請求項２】
前記離乳前の哺乳動物が仔ブタである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の成熟培地が、
ａ）動物起源の未確定の成分、ｂ）抗酸化化合物、ｃ）ベータ細胞によるグルコース依存性インスリン分泌を強化する成分、ｄ）ビタミンＢ誘導体、ｆ）ビタミンＥ誘導体、ｇ）ヘパリン、ｈ）塩基性膵トリプシン阻害剤、ｉ）セリンプロテアーゼ阻害剤及びｊ）デオキシリボヌクレアーゼ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の成熟培地が、
ａ）動物起源の未確定の成分、ｂ）抗酸化化合物、ｃ）ベータ細胞によるグルコース依存性インスリン分泌を強化する成分、ｄ）ビタミンＢ誘導体、ｆ）ビタミンＥ誘導体、ｇ）ヘパリン、ｈ）塩基性膵トリプシン阻害剤、ｉ）セリンプロテアーゼ阻害剤及びｊ）デオキシリボヌクレアーゼを含み、該セリンプロテアーゼ阻害剤及びデオキシリボヌクレアーゼ成分の濃度が、前記第１の成熟培地中のそれらの濃度の半分以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記動物起源の未確定の成分がブタ血清である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗酸化化合物がグルタチオンである、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項７】
前記ベータ細胞によるグルコース依存性インスリン分泌を強化する成分が、Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ（商標）、インスリン、インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ）ホルモン又はこれらの組み合わせである、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項８】
前記ビタミンＢ誘導体がニコチンアミドである、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項９】
前記ビタミンＥ誘導体が、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項１０】
前記塩基性膵トリプシン阻害剤がアプロチニンである、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項１１】
前記セリンプロテアーゼ阻害剤がＰｅｆａｂｌｏｃ（商標）である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項１２】
前記デオキシリボヌクレアーゼがドルナーゼアルファである、請求項３又は４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
２０１１年９月２８日に提出された米国特許出願第６１／５４０，２８８号及び米国特許出願第６１／５４０，２９３号の優先権を主張するものであり、これらの全開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、未熟なランゲルハンス膵島を単離、培養して、成熟させる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病は、多数の共通する特徴を有する症候群であり、その最も明確な特徴は血糖の上昇である。最も一般的な糖尿病の４種の型は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、２型糖尿病、二次性糖尿病及び妊娠性糖尿病である。Ｔ１Ｄは、主に小児期に発症し、無処置の際の高血糖症により特徴付けられる、インスリン枯渇疾患である。Ｔ２Ｄは、インスリン非感受性であることに加えて膵臓のインスリン分泌がそのインスリン非感受性を補うことができないことを合わせ持った疾患である。二次性糖尿病は、内分泌系に対する損傷、例えば、膵損傷、肝硬変、内分泌的障害、又は特定の抗ウイルス療法若しくは抗精神病療法に続いて発症する。妊娠性糖尿病は妊娠の合併症として発症する。
【０００４】
身体におけるインスリンの唯一の供給源は、膵臓のランゲルハンス島（以下、「膵島」という）に存在するベータ細胞である。膵島は、膵臓の全体積のおよそ約２％を構成する、内分泌細胞の細胞構造的に独特な集合体である。インスリン産生ベータ細胞に加えて、膵島はグルカゴンを産生するアルファ細胞、ソマトスタチンを産生するデルタ細胞、膵臓ポリペプチドを産生するＰＰ細胞及びグレリンを産生するイプシロン細胞も含有する。それと伴に、膵島の細胞は内分泌機能を制御し、代謝障害の治療は多くの場合膵島の外分泌機能の回復又は調節を伴う。これらの治療の１つは膵島の同種移植であり、この治療によりＴ１Ｄを数か月から数年の間部分的又は完全に治癒することができる。しかし、その治療的利用は、臨床的に認められたヒト膵島のただひとつの供給源である膵臓ドナーの不足のため限定されている（Scharp Dら、(1990) Diabetes. 39: 515-518; Wier GCら、(1997) Diabetes 1997; 46:1247; Shapiro AMら、(2000) N Engl J Med 2000; 343:2303;及びIchii Hら、(2009) J Hepatobiliary Pancreat Surg. 16(2):101-12. Epub 2008 Dec 26。
【０００５】
ヒト膵島の供給不足に対する救済策候補は、免疫応答保護バリアにカプセル化された非ヒト膵島の異種移植である。図１及び（Orive Gら、(2003) Nat Med . 9:104; Duvivier-Kali VFら、(2001) Diabetes. 50:1698;及びSchneider Sら、(2005) Diabetes 54: 687）を参照されたい。特に、ブタの膵島はサイズ及び生理機能がヒトの膵島と似ており、ヒトとブタとのインスリンの分子構造はほとんど同一であり、ヒト糖尿病の治療において、ブタインスリンが安全に使用されてきた長い歴史があるため、ブタは、膵島の適切な供給源である。ブタは、産子数が多く、比較的取扱いが容易であるというさらなる有利性ももたらす。
【０００６】
移植に使用するための成熟ブタ膵島、すなわち、完全に機能性の膵島の単離は、現在、市場サイズの成体ブタか又は若齢の成体ブタをドナー動物として使用することによってのみ実施されている。しかし、若齢の成体ブタ及び市場重量の成体ブタから膵島を単離することには、沢山の人手を要し、ブタを適切なサイズに育てるために必要な物資を含む、多大な量の設備及び供給物を必要とする。成体ブタ膵島の最終的な収率は、本来的に脆弱であり、品種、膵臓の質などの因子、及び膵島を囲む膵臓組織の大多数（およそ９８％）が酵素的に高度に活性な外分泌組織であり、従来の膵島単離手順が開始されると即座に膵島を破壊し始めるという事実に影響を受ける。実際に、このような因子は、膵島の脆弱性を悪化させ、膵島の単離、保存及び培養中に膵島の顕著な断片化（すなわち、それらの細胞構造の破壊）を引き起こす（Socci Cら、(1989) Horm. Metab. Res. 25(Suppl. 1):32-35; Kirchof Nら、(1994) Transplant. Proc. 26:616-617; Van Deijnen JHMら、(1992) Cell Tissue Res. 267:139-146;及びMarchetti Pら、(1992) Diab. Nutr. Metab. 5(Suppl. 1): 151-154）。結論として、膵臓当たりの膵島収率は、膵臓当たりの本来的な膵島数に基づく理論的収率よりかなり低い。Ｈ＆Ｅにより染色された組織試料により、若齢のブタの膵臓はさほど密ではなく、成体ブタの膵臓に見出される明確に区画された膵島とは対照的に、充分に区画された膵島構造を有さない、広範に散在したインスリン陽性細胞を有することが明らかにされた。図２を参照されたい。
【０００７】
新生児及び胎児の豚もまた、膵島ドナーとして使用できるかもしれない。これらの膵島供給源がもたらす有利性は、これらの発達段階の膵臓は未熟であり、したがって、膵島単離手順中に膵島を損傷する外分泌組織をあまり含有しないことである。しかし、これらの膵島供給源を使用することでの未成熟性に関連する不利益、例えば、膵島の不明瞭な膵島境界及びこれらの段階の膵島の構造的か弱さも存在する。とはいえ、新生児及び胎児の膵臓から未熟な膵島を単離することは可能である（Korsgran Oら、(1988) Transplantation 1988;45:509-14; Latif ZAら、(1988) Transplantation. 45(4):827-830; 1988;及び Ricordi Cら、(1990) Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat. 27(3):185-95）。しかし、これらの未熟な膵島は、膵島の単離後少なくとも２週間は、グルコースに応答してインスリンを分泌することはできず、グルコース応答性になるには、宿主に移植後２から３ヶ月もかかるだろう。（Korsgran Oら、(1988) Transplantation 1988;45:509-14）。したがって、新生児及び胎児のブタ組織からの膵島は、膵島のグルコース応答性が変動し、膵島が成熟するまで長い時間がかかるため、臨床的には望ましくない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
少なくとも上記で要約した理由のため問題がある従来の膵島移植手法の代替として、本発明は、高収率の応答性膵島(islet equivalents)（すなわち、移植前にグルコース応答性である膵島）を生じる、再生可能で費用対効果が高く且つ拡張可能な(scalable)、膵島を単離し培養する方法（本明細書において「本発明の方法」とする）を本明細書に記載する。したがって、本発明の方法は、膵島移植物のインスリン分泌機能を移植前に確認可能であるため、情報に基づくインスリン投与量の決定が可能である。
［課題を解決するための手段］
本発明は、異種移植のためのドナー組織として膵島を使用するために膵島を最適化する目的で、離乳前(pre-weaned)の哺乳動物由来の膵島細胞の成熟を促進する方法に関する。さまざまな実施形態において、ドナー動物は仔ブタである。本発明の方法は、ドナー動物から膵臓を摘出し、膵島全体をインスリン産生状態を維持しながら、膵臓組織を完全な膵島のサイズより大きな断片にする。本発明の方法はさらに、得られた組織断片を、膵島細胞又は膵島の細胞構造に多大な損傷を引き起こすことなく、膵島を囲む外分泌組織を穏やかに分離するようにプロテアーゼ溶液中で消化する。本発明の方法はさらに、消化された組織を、培養された膵島のグルコース応答性を強化する新規な成熟培地において段階的に培養し、移植手順で使用するのに十分にグルコース応答性である膵島を選択する。本発明のさまざまな実施形態において、成熟培地は、ａ）動物起源の未確定の成分、ｂ）抗酸化化合物、ｃ）ベータ細胞によるグルコース依存性インスリン分泌を強化する成分、ｄ）ビタミンＢ誘導体、ｆ）ビタミンＥ誘導体、ｇ）ヘパリン、ｈ）塩基性膵トリプシン阻害剤、ｉ）セリンプロテアーゼ阻害剤及びｊ）デオキシリボヌクレアーゼを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、若齢ブタの膵臓の切片化、組織切片のコラゲナーゼ混合物による処理及び異種移植のための膵島の処理を含む、膵島細胞単離手順のフローチャートである。
【００１０】
【図２】図２は、成体ブタの膵臓対若齢ブタの膵臓の組織学的比較を例示する。組織試料を、市場取引重量の成体又は若齢のブタ（１５日齢）のいずれかに由来する膵臓の脾臓端から採取した。膵臓試料を固定し、ヘマトキシリン及びエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）又は抗インスリン及びヘマトキシリン（インスリン）のいずれかを用いて染色した。成体の膵臓は、完全な膵島の形成及び全体に密な細胞集団（核の容量がより密である）を示し、一方、若齢ブタの膵臓は、目に見える完全な膵島の形成はなく、成体ブタの膵臓と比較した場合、組織化されていないインスリン及びグルカゴンの染色を示した。すべての画像は、×２０拡大で撮影され、スケール＝１００μｍであった。
【００１１】
【図３】図３は、成熟培養期間にわたる膵島（応答性膵島を含む）の数、純度、生存能力及び機能の変化を示す。膵島の試料を、膵島成熟中、消化後０、１、３、５、７、９及び１４日目に分析用に採取した。膵島の組織試料を、ジチゾン（ＤＴＺ）で染色し、応答性膵島及び膵島の純度を同定するか、又はフルオレセイン二酢酸／ヨウ化プロピジウム（ＦＤＡ／ＰＩ）染色し細胞の生存能力を決定するかのいずれかを行った。応答性膵島（Ａ）は、陽性ＤＴＺ染色の百分率として計算した。膵島の純度（Ｂ、灰色線）は、未染色組織の百分率として計算し、膵島の生存能力（Ｂ、黒線）は、生存百分率（緑）／死亡百分率（赤）として計算した。膵島の機能（Ｃ）に関して、１００膵島を、３７℃において５％ＣＯ２で１時間、２．８ｍＭのグルコース中、次いで２８ｍＭのグルコース中、次いで２８ｍＭのグルコース＋ＩＢＭＸ中、その後、２．８ｍＭのグルコース中でインキュベートした。試料を、インスリン放出に関して、標準ブタインスリンＥＬＩＳＡを使用して分析した。（Ｄ）において、培養５日後にＦＤＡ／ＰＩで染色した膵島試料の画像は、周囲組織が主に細胞死により特徴付けられ、一方、膵島の内部コンパートメントが依然として生存していることを示している。結果は、平均±ＳＥＭ／膵臓（ｎ＝６、２重測定）として表示している。
【００１２】
表の簡単な説明
表１は、組織培養での１４日間にわたる膵島成熟を特徴付けるデータを報告する。膵島を、部分的に酵素的に解離させ、組織培養（３７℃、５％ＣＯ２）で１４日にわたって成熟させた。膵島試料を、酵素消化後、培養３日、７日及び１４日後に直接採取し、ジチゾン（ＤＴＺ）で染色し、膵島の数（膵島カウント）を定量化し、「膵島当量」（すなわち、染色された膵島の未染色の膵島に対する百分率）を決定した。膵島サイズの百分率を、標準１０×１０のアイピースグラティキュールを装備した標準双眼実体顕微鏡を使用して決定した（×２５拡大、ｎ＝膵臓の数）。結果は、平均±ＳＥＭとして表示した。
【００１３】
表２は、組織培養における膵島の成熟過程での、さまざまな時点における膵島の細胞構成を特徴付けるデータを報告する。膵島の試料を、成熟中、０、３、７及び１１日目に解離させ、Ｃ−ペプチド、グルカゴン又はアミラーゼのいずれかを染色し、フローサイトメトリーを使用して分析した。結果を、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３として示し、三重測定で実施した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
本発明は、異種移植のためのドナー組織として使用可能なグルコース応答性の成熟膵島への、膵島のｅｘ  ｖｉｖｏ成熟を促進する方法に関する。本発明の方法が、若齢の哺乳動物の膵臓から摘出された膵島を単離し、処理するものであることは本明細書において理解されるはずである。例えば、さまざまな実施形態において、本発明の方法は、誕生から離乳（すなわち、もはや授乳中でない）の間の任意の発達段階にある哺乳動物の膵臓から摘出された膵島を単離する。本発明の方法において離乳前のドナーブタを使用することの論理的根拠は、離乳後のブタによる固形食の摂取が膵臓の外分泌組織による消化酵素の産生を活性化し、このことが動物からの膵臓の摘出及び処理において膵島を損傷することである。したがって、このような論理的根拠を念頭に置くと、通常離乳に関連する年齢であるが、固形食の摂取をまだ始めていない動物のドナー膵臓の使用を可能にする、本発明の方法の実施形態も存在する。
【００１５】
さまざまな実施形態において、本発明の方法は、若齢ブタ、すなわち仔ブタから得られるドナー膵臓を使用する。通常、このような若齢ブタは約３０日齢以下である。例えば、本発明の方法は、一部の実施形態において、約１４から約２２日齢の仔ブタから膵島を単離し、培養するが、他の実施形態においては、若齢仔ブタ膵島ドナーは、約１８から約２８日齢であってよい。
【００１６】
上述のように、本発明の方法では、ドナー膵臓組織から膵島を単離し、処理する。「膵島」という用語は、本発明において使用する場合、ランゲルハンス島の形態学的及び組織学的な特徴を有すると当業者により認識される任意の細胞構造を含み、あまり組織化されていないベータ細胞を含む細胞集合体も含むと理解される。本明細書に開示する膵島は、これらが異種移植の成功に関連する特定の形態学的特徴を所有し、細胞が、グルコース応答性に関連する膵島様構造を維持しているため、少なくとも一部においては有利である。
【００１７】
さまざまな実施形態において、本発明の方法では、哺乳動物の膵臓を外科的に摘出し、これは非膵臓組織（例えば、脂肪など）の切り取りを含む。一般に、１０から１５の膵臓を収集し、その後組織処理のために合わせる。膵臓組織の処理は、膵島の細胞配列及び構造を乱さないようにしながら、組織をおおよそ完全な膵島のサイズの切片にする技法の使用を伴う。普通、膵臓組織の切片化は、冷蔵条件(chilled conditions)下で実施する。さまざまな実施形態において、切片化は、はさみ及びブレンダーの技術(scissors and blender technology)を使用することによって実施する。さまざまな実施形態において、膵臓組織を、最長約０．１ｍｍから約１０ｍｍの小片に切片化する。特定の他の実施形態において、膵臓組織切片は、最長径約０．５から約１．０ｍｍである。概して、膵臓の摘出から細分化ステップの完了までにかかる時間は、約２０分以下である。しかし、本発明の方法のさまざまな実施形態において、膵臓の摘出から細断ステップの完了までにかかる時間は、２０分を超える、例えば３０又は４０分ほどのことがある。
【００１８】
本発明の方法はさらに、切片化、すなわち細断化された膵臓組織を酵素的に消化して、非膵島組織から膵島を分離する。概して、本発明の方法は、細分化された膵臓組織と低用量の好ましくは無菌のコラゲナーゼ溶液とを接触させる。本発明の方法のさまざまな実施形態において、コラゲナーゼ溶液は、クロストリジウム・ヒストリチカム（Ｃｌｏｓｔｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の約６０％の精製クラスＩ（Ｃ１）及び約４０％の精製クラスＩＩ（Ｃ２）コラゲナーゼを含ませることができる。さまざまな他の実施形態において、コラゲナーゼ溶液はまた、Ｃ１及びＣ２コラゲナーゼに加えて他の型のプロテアーゼを含んでもよい。例えば、コラゲナーゼ溶液はさらに、Ｃ．ヒストリチカムコラゲナーゼクラス３（Ｃ３）、Ｃ．ヒストリチカムコラゲナーゼクラス４（Ｃ４）、クロストリパイン、サーモリシン（ｔｈｅｎｎａｌｙｓｉｎ）、トリプシン、キモトリプシン若しくはエラスターゼ又はこれらの任意の組み合わせ、例えば、Ｌｉｂｅｒａｓｅ（登録商標）及びＢｌｅｎｄｚｙｍｅ（登録商標）として市販されているプロテアーゼの組み合わせなどを含んでもよい。切片化膵臓組織の酵素消化は全般に、３７℃、４０〜７０ｒｐｍで穏やかに回転させながら膵島から膵島を囲む大部分の腺房間質組織が分離するまで実施する。さまざまな実施形態において、本発明の方法は、膵島細胞から周囲腺房組織が分離した後も同じ反応条件下で追加の期間消化反応を続け、膵島のコラーゲンマトリックスをより完全に消化させる。追加のコラゲナーゼ消化期間の時間の長さは限定されないが、当業者が、膵島を過剰に損傷せずに、膵島と無関係である組織の除去に必要と判断する限り行ってよい。概して、発生期の膵島構造は、離乳前の発達段階において、容易に破壊し得る未発達なコラーゲンマトリックスを有することを特徴とするので、本発明の方法では発生期の膵島構造の維持を助けるためにコラゲナーゼ消化をできるだけ短くする。
【００１９】
本発明の方法では、膵臓組織のコラーゲン消化を、血清若しくはアルブミンのいずれか又は両方を補充した氷冷緩衝化塩溶液を加えることによって停止させる。さまざまな実施形態において、本発明の方法は、コラゲナーゼ消化反応を、ＨＥＰＥＳ及び１０％ウシ胎児血清（ＢＳＡ）を添加したハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）を、反応混合物に加えることによって停止させる。コラゲナーゼ消化の停止後、消化された膵臓組織を、金属メッシュ漏斗を介してろ過し、残屑及び望ましくない大型の組織断片を除去する。さまざまな実施形態において、本発明の方法は、５００μｍの金属メッシュ漏斗を使用して、５００μｍより大きな組織断片を除去する。
【００２０】
上述のように、本発明の方法は、膵島の成熟を促進する。より詳細には、本発明の方法は、少なくとも２相、回復相及び成熟相に分けられた組織培養期間を含む。これらの相は、順序（すなわち、回復相が成熟相に先立つ）及び特定の培養培地原料の濃度の変動により区別される。膵島を培養する回復相は、上記のコラゲナーゼ消化反応が実施された後で開始し、通常約４８時間継続する。膵島を培養する成熟相は回復相の後に開始し、通常約６から８日継続する。本明細書において、「細胞培養」、「膵島培養」及び「培養」という用語は、人工のｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境において細胞を維持することを指す。「膵島」及び「膵島培養」という用語は、個別の膵島細胞、例えばベータ細胞並びに膵島に含有される全細胞の総称を意味する。「細胞培養培地」、「培養培地」、「培地配合物」又は単純に「培地」（各例での複数形「培地(media)」を含む）という語句は、細胞、すなわち膵島を培養する(cultivate)栄養溶液を指し、交換可能に使用することができる。
【００２１】
本発明の方法の回復相は、上記のように、コラゲナーゼ消化され、ろ過された膵臓組織の組織培養の最初の４８時間に関する。回復期間中、膵臓組織は、本明細書において「回復成熟培地」又は「初期成熟培地」と称される特殊な培地において培養される。概して、回復成熟培地は、ａ）ブタ血清又は動物の胚、器官若しくは腺由来の抽出物などの未確定の成分、ｂ）抗酸化化合物、ｃ）ベータ細胞によるグルコース依存性インスリン分泌を強化する成分、ｄ）ビタミンＢ誘導体、ｅ）ビタミンＥ誘導体、ｆ）ヘパリン、ｇ）塩基性膵臓トリプシン阻害剤、ｈ）セリンプロテアーゼ阻害剤、並びにｉ）デオキシリボヌクレアーゼを追加で含む基礎培地である。
【００２２】
概して、基礎培地は、膵島細胞成熟に適合する、任意の単一の基礎培地溶液又は基礎培地溶液の組み合わせとすることができる。例えば、基礎培地は、限定するものではないが、ＢＭＥ培地（Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 89, 363 (1965)）、ＢＧＪｂ培地（Exp. Cell Res., 25, 41 (1961)）、ＣＭＲＬ１０６６培地（N.Y. Academy of Science, 5, 303 (1957)）、グラスゴーＭＥＭ培地（Virology, 16, 147 (1962））、改変ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地（J. National Cancer Inst., 49, 1705 (1972)）、ＩＭＤＭ培地（In Vitro, 9, 6 (1970））、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地（Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950））、イーグルＭＥＭ培地（Science, 130, 432 (1959)）、アルファＭＥＭ培地（Nature New Biology, 230, 310 (1971））、ダルベッコＭＥＭ培地（Virology, 8, 396 (1959)）、ハム培地（Exp. Cell Res., 29, 515 (1963); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53, 288 (1965)）、ＲＰＭＩ１６４０培地（J. A. M. A., 199, 519 (1967））、フィッシャー培地（Methods in Med. Res., 10 (1964)）、マッコイ培地（Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 100, 115 (1959)）、ウイリアムＥ培地（Exp. Cell Res., 69, 106 (1971); Exp. Cell Res., 89, 139 (1974)）、これらの混合培地などから選択することができる。本発明のさまざまな実施形態において、回復成熟培地の基礎培地はハムＦ−１２であり、一方他の実施形態において、基礎培地はＭｅｄｉｕｍ１９９である。さらに他の実施形態において、回復成熟培地の基礎培地は、ハムＦ−１２及びＭｅｄｉｕｍ１９９培地の混合物である。例えば、回復成熟培地組成物は、１：１０から１０：１までから選択された比率で混合されたハムＦ−１２及びＭｅｄｉｕｍ１９９培地を含む。
【００２３】
回復成熟培地の未確定の成分に関して、１〜２０％ｖ／ｖの濃度のブタ血清が、未確定の成分として最も一般的に使用されるが、動物の胚、器官又は腺由来の抽出物（０．５〜１０％ｖ／ｖ）もまた使用される。新生児の仔ウシ、ウマ及びヒトを含む他の血清又はアルブミン供給源もまた日常的に使用される。培養培地に補充される抽出物を調製するために使用されている器官又は腺としては、顎下腺（Cohen (1961) J. Biol. Chem. 237: 1555-1565）、下垂体（Peehl and Ham (1980) In Vitro 16: 516-525; 米国特許第４，６７３，６４９号を参照されたい）、視床下部（Maciagら、(1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5674-5678; Gilchrestら、(1984) J. Cell. Physiol. 120: 377-383)及び脳（Maciag, ら(1981) Science 211: 1452-1454）が挙げられる。これらのタイプの化学的に未確定の添加物は、細胞培養培地においていくつかの有用な機能を果たす（Lambertら、(1985) In: Animal Cell Biotechnology, Vol. 1, Spierら、Eds., Academic Press, New York, pp. 85-122 (1985)を参照されたい）。例えば、これらの添加物は、（１）不安定又は不水溶性の栄養に対する担体又はキレート剤を提供する、（２）毒性部分に結合し、中和する、（３）ホルモン及び成長因子、プロテアーゼ阻害剤、及び必須の、多くの場合未同定又は未確定の低分子量栄養を提供する、並びに（４）物理的ストレス及び損傷から細胞を保護する。したがって、血清又は器官／腺の抽出物は、比較的低コストの添加物として一般的に使用され、動物細胞の培養に最適な培養培地を提供する。
【００２４】
回復成熟培地の抗酸化化合物成分に関して、この成分は、反応性酸素種、例えば遊離のラジカル及び過酸化物により引き起こされる、重要な細胞成分に対する損傷を防止するために機能する。さまざまな実施形態において、抗酸化成分はグルタチオンである。回復成熟培地中に存在するグルタチオンの量は変動し得るが、概して、０．００２５〜０．１２５％（ｗ／ｖ）の範囲内に収まる濃度で存在する。
【００２５】
上述のように、回復成熟培地は、ベータ細胞によるグルコース依存性インスリン分泌を強化する成分を含む。さまざまな実施形態において、この成分は、インスリン分泌のそれらのグルコース依存性刺激を介して強力な血糖調節作用を示す、合成又は天然のペプチドホルモンである。このようなペプチドの例としては、限定するものではないが、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）及びグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）並びにこれらのペプチドの模倣体及びアナログが挙げられる。本発明のさまざまな実施形態において、回復成熟培地は、ＧＬＰ−１模倣体、Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ（商標）（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｎａｐａ、ＣＡにより製造されたエキセンジン−４の合成型）を、ベータ細胞の成熟を促進するために十分な濃度で含む。本発明の他の実施形態において、ベータ細胞によるグルコース依存性インスリン分泌を強化する成分は、インスリン又はインスリン誘導体である。インスリンは、任意の種、例えばヒト、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ又はネズミに由来してよく、合成のインスリン又はインスリンアナログであってよい。「インスリンアナログ」などの用語は本明細書において交換可能に使用され、上で定義された「インスリン」の任意の形態を包含することが意図され、ポリペプチド鎖内の１若しくは複数のアミノ酸が、代替のアミノ酸に置き換えられ、及び／又は１若しくは複数のアミノ酸が欠失され、又は１若しくは複数の追加のアミノ酸がポリペプチド鎖若しくはアミノ酸配列に付加され、天然のインスリンの少なくとも１つの機能、例えば血糖値の低下を依然として有するものである。特定の実施形態において、回復成熟培地は、インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ）ホルモンを含むことができる。さらに他の実施形態において、ベータ細胞によるグルコース依存性インスリン分泌を強化する回復成熟培地の成分は、前述の因子の任意の組み合わせであってよい。
【００２６】
ビタミンＢ及びＥファミリーの誘導体もまた、回復成熟培地に加えられ、特定のエネルギー形成成分に役立ち、酸化ストレス又は損傷を減少させる。ビタミンＢの誘導体はいずれも適切であるが、ビタミンＢ誘導体の例としては、限定するものではないが、ニコチンアミド、ニコチンアミドアナログ、ニコチンアミド若しくはニコチンアミドアナログの誘導体又はニコチンアミド若しくはニコチンアミドアナログの代謝産物が挙げられる。さまざまな実施形態において、ビタミンｂ誘導体は、回復成熟培地中に０．０２〜０．１２％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で存在する。本発明の回復成熟培地に加えることができるビタミンＥの誘導体は、当業者に公知の任意のビタミンＥ誘導体であってよく、限定するものではないが、ビタミンＥ（α−トコフェロール）、α−コハク酸トコフェロール、α−リン酸トコフェロール、Ｔｒｏｌｏｘ（商標）（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）及びビタミンＥそれ自体、並びにこれらの任意の組み合わせが挙げられる。さまざまな実施形態において、回復成熟培地のビタミンＥ誘導体成分は、１．０×１０−４〜５×１０−４％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で存在する。
【００２７】
回復成熟培地の塩基性膵トリプシン阻害剤成分に関して、適切な阻害剤は、限定するものではないが、管腔で分泌されるプロテーゼの阻害剤、例えば、アプロチニン、ボウマン・バーク（Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ）阻害剤、ダイズトリプシン阻害剤、鶏オボムコイド、鶏オボインヒビター、ヒト膵トリプシン阻害剤、カモスタットメシル酸塩、フラボノイド阻害剤、アンチパイン、ロイペプチン、ｐ−アミノベンズアミジン、ＡＥＢＳＦ、ＴＬＣＫ、ＡＰＭＳＦ、ＤＦＰ、ＰＭＳＦ、ポリ（アクリレート）誘導体、キモスタチン、ベンジルオキシカルボニル−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＣＨＯ、ＦＫ−４４８、糖ビフェニルボロン酸複合体、ベータ−フェニルプロピオナート、エラスタチナール、メトキシスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−クロロメチルケトン（ＭＰＣＭＫ）、ＥＤＴＡ及びキトサン−ＥＤＴＡコンジュゲートが挙げられる。適切なプロテアーゼ阻害剤としてはさらに、膜結合プロテアーゼの阻害剤、例えば、アミノ酸、ジ−及びトリペプチド、アマスタチン、ベスタチン、ピューロマイシン、バシトラシン、ホスフィン酸ジペプチドアナログ、アルファ−アミノボロン酸誘導体、Ｎａ−グリコラート、１，１０−フェナントロリン、アシビシン、Ｌ−セリン−ボラート、チオルファン及びホスホラミドンが挙げられる。さまざまな実施形態において、回復成熟培地の塩基性膵トリプシン阻害剤成分は、約２０から５００ｍＭの濃度で存在する。
【００２８】
上述のように、回復成熟培地はヘパリンを含んでよい。通常、ヘパリンはヘパリンナトリウムの形態で培地に加えられる。さまざまな実施形態において、本発明の回復成熟培地のヘパリン成分は、ヘパラン硫酸を、ヘパリンの代わりに、又はヘパリンとの組み合わせて存在させ得る。
【００２９】
上述のように、回復成熟培地は、セリンプロテアーゼ阻害剤成分を含んでよい。さまざまな実施形態において、セリンプロテアーゼ阻害剤は、上記の膵島単離手順のコラゲナーゼ消化ステップ中に活性化され得る、ドナー膵臓（単数又は複数）の内因性酵素の活性化を阻害するものである。Rose NLら、(2003) Transplantation 75(4):462-466を参照されたく、これは本明細書に組み込まれる。さまざまな実施形態において、本発明の回復成熟培地は、プロテアーゼ阻害剤であるＰｅｆａｂｌｏｃ（商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を含む。さまざまな他の実施形態において、回復成熟培地のセリンプロテアーゼ阻害剤成分は、０．２から０．７ｍＭの範囲の濃度で存在する。
【００３０】
本発明の回復成熟培地ＤＮａｓｅ成分に関して、この成分は培地中に存在して、細胞が死亡して、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が放出された場合に起きる傾向がある細胞の集塊を防ぐ。適切なＤＮａｓｅの例としては、ＤＮａｓのＤＮａｓｅ  Ｉ並びにＤＮａｓｅ  ＩＩ形態が挙げられ、ヒト、ウシ及びブタのＤＮａｓｅを含む、任意の哺乳動物供給源に由来するこれらの酵素の組み換え形態を含む。さまざまな実施形態において、回復成熟培地のＤＮａｓｅ成分は、ドルナーゼアルファ、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）として市販されている、ＤＮａｓｅ  Ｉの組み換えヒト形態である。さまざまな他の実施形態において、回復成熟培地のＤＮａｓｅ成分は、２００から４００ｍＭの範囲の濃度で存在してよい。
【００３１】
回復成熟培地はさらに、抗生物質又は抗生物質の組み合わせを場合により含んでよい。理想的には、本発明の培地に含むことが検討される抗生物質は、広範囲の温度において安定であり、タンパク質により不活性化されたり、膵島の成長又は成熟に干渉する仕方でタンパク質部分を阻害することがない。本発明のさまざまな実施形態において、回復成熟培地は、硫酸ゲンタマイシンを、組織培養に使用される標準的濃度、例えば０．００２５％（ｗ／ｖ）で含む。
【００３２】
上述のように、本発明の方法は、少なくとも２相、回復相及び成熟相に分けられた組織培養期間を含む。成熟相は一般に、４８時間の回復相の直後に開始し、膵島培養の回復成熟培地を「成熟培地」と、すなわち「第２の成熟培地」として交換するステップを伴う。成熟培地は、成熟培地が半量のセリンプロテアーゼ阻害剤及びデオキシリボヌクレアーゼ成分を含有することを除き、回復成熟培地と同一の組成を有する。本発明の方法は、５０％の成熟培地を、ベータ細胞成熟期間中少なくとも４８時間ごとに交換する。各４８時間の時点で、膵島の数をカウントし、生存能力を検査する。さまざまな実施形態において、本発明の方法は、膵島カウント（ＩＣ）及び膵島当量（islet equivalence）（ＩＥ）を、培養液のアリコートをジチゾン（ＤＴＺ）により染色することによって決定する。ジチゾン（ＤＴＺ）は膵島のベータ細胞中に存在する亜鉛イオンと結合することで、膵島を赤色に染色する。より詳細な実施形態において、本発明の方法は、膵臓組織培養液の１００μｌのアリコートを取り、該アリコートを１ｍｌのＤＴＺと混合する。共焦点顕微鏡法又はフローサイトメトリー法のいずれかによるＤＴＺ染色細胞の分析により、成熟ベータ細胞を同定する。したがって、ＤＴＺ染色は、膵島中の成熟ベータ細胞の割合を決定することを可能にする。さまざまな実施形態において、本発明の方法は、膵臓組織１グラム当たり約１×１０２以上のＩＥ／を得る。例えば、本発明の方法は、限定するものではないが、５×１０２、１×１０３、５×１０３、１×１０４、５×１０４のＩＥ／グラム膵臓組織又はこの範囲内の任意のＩＥ収量を得ることができる。例としては、特定の実施形態において、本発明の方法の収量は、膵島単離後８日目の処理に先立ち収集された膵臓１グラム当たり６．４×１０３ＩＥのことがある。
【００３３】
ベータ細胞成熟期間中の膵島培養液の生存能力は、一般に、膵島培養液のアリコートを、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）又はＮｅｗｐｏｒｔ  Ｇｒｅｅｎのいずれかで染色し、その後、染色細胞を、共焦点顕微鏡法又はマイクロプレートリーダーを使用するいずれかにより分析することで、本発明の方法によって決定することができる。さまざまな実施形態において、本発明の方法は、膵島単離後７日目において８０％を超える細胞生存能力を得る。例えば、膵島単離後７日目における膵島培養液の細胞生存能力は、限定するものではないが、８５％、９０％、９５％、１００％又は膵島単離後７日目における細胞生存能力のこの範囲内の任意の百分率であり得る。特定の実施形態において、細胞生存能力は、例えば、生存能力を評価するＦＤＡ及びＰＩ法に従って、膵島単離後７日目において、９８％を超えることができる。特定の他の実施形態において、細胞生存能力は、生存能力評価のＮｅｗｐｏｒｔ  Ｇｒｅｅｎ法に従って、膵島単離後７日目において、９０％を超えることができる。
【００３４】
ベータ細胞の重要な機能の１つは、血糖値に従ってそのインスリン分泌を調節することである。その機能を念頭に、膵島培養液のグルコース応答性を、この目的に適切であることが当業者に知られている任意の方法を使用することにより、本発明の方法の成熟期間にわたってモニターすることができる。例えば、グルコース刺激性インスリン放出（ＧＳＩＲ）アッセイを使用して、本明細書に記載のベータ細胞成熟方法の任意の段階における膵島の機能を評価することができる。より具体的には、標準ＧＳＩＲアッセイは、膵島培養液から得られたおよそ１００から１５０の間の膵島細胞を、以下の順番の溶液中で、個々のグルコース溶液インキュベーションの間にＰＢＳを用いて２回のＰＢＳ洗浄を行いながら、一定時間、一般には１時間インキュベートする。このアッセイでは、次いで細胞により分泌されたインスリンの量を検出する：１）低グルコース溶液（２．８ｍＭグルコース）、２）高グルコース溶液（２８ｍＭグルコース）、３）３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、５０μＭ）をさらに含有する高グルコース溶液（２８ｍＭグルコース）及び４）低グルコース溶液（２．８ｍＭグルコース）。
【００３５】
その後、このインスリン放出データを使用して、高グルコース条件下でベータ細胞により分泌されたインスリン対低グルコース条件下でベータ細胞により分泌されたインスリン量の比に基づき、刺激指数（ＳＩ）を計算する。最大ＳＩ（ＭＸ）は、高グルコース＋ＩＢＭＸ条件下で分泌されたインスリンの量を、単なる高グルコース条件下で分泌されたインスリンの量で割って、計算することができる。
【００３６】
分泌されたインスリンを検出するために、上記の各グルコース刺激ステップ後、培地をプレートから別々に吸引し、遠心し、回収する。上清をインスリン分析のために回収し、当分野において公知であり、本発明の方法におけるこの目的に適切な、インスリン検出のための任意の方法によりインスリン含有量を決定するまで、−２０℃において保存する。さまざまな実施形態において、本発明のＧＳＩＲアッセイは、放射免疫測定（ＲＩＡ）によりインスリンを検出し、一方他の実施形態において、このアッセイは、標準酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）をインスリンの検出に使用する。
【００３７】
概して、本発明の方法により単離された膵島は、それらの単離直後はグルコース応答性であり、この段階において多くのベータ細胞は未熟である。ベータ細胞が、本発明の方法の下で成熟した場合、グルコース応答性の逐次増加を観察することができる。さまざまな実施形態において、本発明の方法は、膵島培養液のＳＩを時間と共に増加する。特定の実施形態において、ＳＩの増加は、ベータ細胞成熟プロセス中の時点間で約５％以下のこともあるが、他の実施形態において、ＳＩ増加の百分率は５％から２００％の範囲と成り得る。例えば、いくつかの実施形態において、ＳＩは単離時点で約１．３であり、単離後３日目において１．７であり、単離後７日目において約２．６のことがある。
【００３８】
上述のように、本発明の方法のベータ細胞成熟プロセス中、培養された膵島はある発達変化を受け、このことは分化された膵臓細胞のさまざまな表現型及び遺伝型指標の提示で立証される。実際に、膵臓細胞の集団を同定するために使用可能な多数の細胞マーカーが存在する。これらの指標又はマーカーの変化は、培養された膵島の成熟に関連すると考えられている。これらの変化は、特に、アポトーシス細胞の割合の減少、ベータ細胞成熟の細胞マーカーの発現及び膵島のサイズの増大である。
【００３９】
本発明の方法のベータ細胞成熟期間中のアポトーシスレベルの変化は、市販のアポトーシス検出キットの使用を含む、この目的に適切であることが当業者に知られている任意の方法を使用して決定することができる。膵島培養液中のアポトーシス検出のための他の例示的方法としては、カルボシアニン核酸染色に基づく技術、例えばＹＯ−ＰＲＯ（登録商標）−１  Ｉｏｄｉｄｅ及びＶｙｂｒａｎｔ（登録商標）Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔｓ（双方ともＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手）が挙げられる。概して、膵島は、ベータ細胞成熟プロセスの間アポトーシスの漸進的減少を、主に膵島の外側腺房細胞層において起こす。さまざまな実施形態において、アポトーシスを起こす膵島細胞部分は、ベータ細胞成熟プロセスの過程で１０倍以上減少させることができる。例えば、単離後３日目におけるアポトーシス膵島細胞部分は約２２．５％であり、その後単離後８日までに、約４．２％に減少させることができる。
【００４０】
ベータ細胞成熟の細胞マーカーは、この目的に適切であることが当業者に知られている任意の方法を使用して決定することができる。例えば、膵島細胞マーカー検出の標準的方法の１つは、フローサイトメトリーである。簡潔には、ろ過された（例えば、７０μｍのフィルター）、ディスパーゼにより解離された膵島細胞懸濁液を、インスリン（ベータ細胞に特異的）、グルカゴン（アルファ細胞に特異的）、ソマトスタチン（ｓｏｍａｔｏｓｔａｉｎ）（デルタ細胞に特異的）、膵臓ポリペプチド（ｐｐ）（ｐｐ産生細胞に特異的）及びアミラーゼ（腺房組織に特異的）に特異的な抗体を用いて免疫組織学的に染色することができる。本発明のさまざまな実施形態において、アミラーゼが陽性に染色される膵島細胞（すなわち腺房細胞）の割合は減少し、一方、インスリンが陽性に染色される膵島細胞（すなわちベータ細胞）の割合は時間と共に増加する。特定の実施形態において、単離後２日目対７日目におけるアミラーゼ陽性細胞の割合は、それぞれ約７５％から１０％、例えば約６５％から約２５％に減少する。逆に言えば、特定の実施形態において、単離後２日目対７日目におけるインスリン陽性細胞の割合は、それぞれ約２５％から約８５％、例えば約４２％から約７０％に増加し得る。
【００４１】
膵島細胞の形態及び構造は、この目的に適切であることが当業者に公知の任意の方法を使用して決定することができる。概して、標準ヘマトキシリン及びエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）の膵島の染色により、それらの細胞構成及び構造的特徴が明らかにされる。上述のように、膵島の直径は、機能性（すなわち、グルコース応答性）に正に相関する。その点において、本発明の方法は、過半数を大きく上回る膵島が直径５０μｍを超える、単離後８日目の培養液をもたらすことができる。例えば、さまざまな実施形態において、本発明の方法により、約９０％以上の膵島の直径が、５０μｍから１５０μｍまでである膵島培養液が得られる。
【実施例】
【００４２】
（例１）膵島の摘出及び単離
【００４３】
離乳した仔ブタを、未熟膵島のドナー供給源として使用した。典型的な膵島調製手順により、１０匹の１４から２６日齢のヨークシャー種の仔ブタを使用した。膵臓を、迅速な外科的入手、すなわち５分未満により仔ブタから摘出し、その後、氷冷Ｏｒｇａｎ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｅｌｌｇｒｏ）中に置いた。合計の冷却虚血時間は、２０分に制限した。収集した膵臓をプールし、下記のように切片化した。冷蔵(chilled)しながら、膵臓を、周囲の脂肪及びリンパ組織に関してトリミングし、その後、組織切片が全体に直径０．５ｍｍから１．０ｍｍになるまで細かく刻んだ。切片化方法は、標準のはさみ及びブレンダー技術を使用して実施し、膵臓組織を細分化した。細分化組織を、低用量のＣｌｚｙｍｅコラゲナーゼＭＡ／ＢＰプロテアーゼ酵素混合物（７５〜２５０ｍｇ／膵臓、ＶｉｔａＣｙｔｅ  ＬＬＣ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）に加え、３７℃において消化させ、周囲腺房組織の大部分が、未熟膵島から穏やかに分離するまで、穏やかに回転振とう（４０〜６０ｒｍｐ）した。膵臓組織を、その後さらに１５０分間、同じ条件下で消化させた。消化反応の終わりに、ＨＥＰＥＳ及び１０％ＢＳＡを補充した１００〜１５０ｍｌの冷ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）を、組織−コラゲナーゼ混合物に加え、消化反応を停止させた。膵島のコラーゲンマトリックスは単離時点では未発達であり、容易に崩壊するので、発生期の膵島構造の維持を助けるために、消化時間はできるだけ短くした。消化された組織を、５００μｍの金属メッシュ漏斗を介してろ過し、直径５００μｍより大きな未消化組織を除去し、残った未熟膵島は、全体的に直径５０μｍから５００μｍの間であった。次いで、膵島を、それらを成熟させる組織培養条件に供した。簡潔には、膵島の培養を２相：ｉ）回復相及びｉｉ）成熟相に分けた。回復相は膵島の外科的単離後４８時間に関し、成熟相は回復相の終わりから異種移植される日内である、膵島がグルコース応答性であるように充分に成熟した時点までの期間に関し、通常は約８日間である。これらの培養相は、下記の実施例において記載する。
【００４４】
（例２）単離膵島の回復
【００４５】
単離後最初の４８時間に関して、膵島クラスタを、回復成熟培地と呼ばれる新規な組織培養培地において培養した。回復成熟培地の調製の第１ステップは、ハムＦ−１２及びＭｅｄｉｕｍ１９９成分が、１：１の比で存在する、ハムＦ−１２／Ｍｅｄｉｕｍ１９９基礎培地（Ｆ−１２／１９９培地）を得るステップを伴った。これらの研究において、Ｆ−１２／１９９培地を、ハムＦ−１２及びＭｅｄｉｕｍ１９９粉末（双方ともＣｅｌｌｇｒｏ，Ｉｎｃ．から購入した）を、ＩＳＯ９００１：２０００及びｃＧＭＰガイドライン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を満たした滅菌水に、重量／体積（ｗ／ｖ）濃度がそれぞれ０．８１５％（すなわち、１Ｌの水中８．１５ｇ）で加えることによって調製した。次いで、Ｆ−１２／１９９培地に、：５．５％（ｗ／ｖ）ブタ血清（Ｌａｍｐｉｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｐｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）；２．５×１０−３％（ｗ／ｖ）硫酸ゲンタマイシン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；０．０６２％（ｗ／ｖ）グルタチオントリペプチド（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；０．６％（ｗ／ｖ）インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ）ホルモン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．、ＬＬＣ、Ｓｔ．Ｌｏｕｓ、ＭＯ）；０．０２９％（ｗ／ｖ）Ｌ−グルタミン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；０．０２４４％（ｗ／ｖ）６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（Ｔｒｏｌｏｘ（商標）、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；４．２×１０−６％（ｗ／ｖ）Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｎａｐａ、ＣＡにより製造されたエキセンジン−４の合成型）、０．０６６％ヘパリン（１５０Ｕ／ｍｇヘパリンナトリウム、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；２１５ｍＭアプロチニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．、ＬＬＣ、Ｓｔ．Ｌｏｕｓ、ＭＯ）；０．５ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．、ＬＬＣ、Ｓｔ．Ｌｏｕｓ、ＭＯ）；４１７ｍＭ  Ｄｎａｓｅアルファ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｓ．Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）；及び培地のｐＨを７．２から７．５に維持するために十分量のＨＥＰＥＳ緩衝液（通常５ｍＭから２０ｍＭ）を補充した。膵島を、この回復成熟培地中で３７℃且つ５％ＣＯ２において、Ｔ−１７５の懸濁フラスコ中で、４０ｍｌの培養培地中８０〜１００μｌの組織の組織密度で培養した。
【００４６】
（例３）切除された膵島の成熟
【００４７】
回復成熟培地中で培養した４８時間後に、膵島を回復成熟培地から取り出し、２００×ｇで２分間遠心分離し、本明細書において単純に「成熟培地」と称される、回復成熟培地の改変型に再懸濁した。詳細には、回復成熟培地と成熟培地との差は、成熟培地が半量のＰｅｆａｂｌｏｃ（商標）及びＤＮａｓｅアルファを含むことである。膵島を、成熟培地中で膵島が完全に成熟するまで、約８から９日の期間培養し、その間、培地の５０％を４８時間ごとに交換した。膵島の完全成熟は、下記の実施例に記載の組織学的及び機能性分析に従って確定した。膵島が完全成熟に達した場合、「添加成熟培地」において長期間培養可能であり、添加成熟培地は、追加の５ｍＭ濃度のカルシウムを含有する成熟培地であった。この過剰なカルシウムは、膵島カプセルの崩壊の予防を助けるために必要であった。
【００４８】
（例４）膵島の生存能力、数及び成熟度
【００４９】
組織のアリコートを、４８時間ごとに培地交換の際に、膵島カウント、細胞生存能力及びベータ細胞の成熟度に関して評価した。本明細書において膵島カウント（ＩＣ）と称される培養液中の膵島の数及び本明細書において膵島当量（ＩＥ）と称される成熟ベータ細胞を含有する膵島の数を、膵島培養液の１００μｌアリコートを、１ｍｌのジチゾン（ＤＴＺ）というベータ細胞中に存在する亜鉛イオンに結合する赤色染料に加えることによって決定した（Latif ZAら、(1988) Transplantation 45(4):827-830; Ricordi Cら、(1990) Acta Diabetol Lat 27(3):185-95;及び Scharp DWら、(1984) World J Surg. 8(2):143-151）。ＤＴＺ染色を５分間進行させた後、この膵島を、×２５拡大で１０×１０アイピースグラティキュールを装備した標準双眼実体顕微鏡（Ｍａｘ  Ｅｒｂ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．、Ｓａｎｔａ  Ｙｎｅｚ、ＣＡ）で観察した。各膵島クラスタをカウントして、ＩＣを得た。陽性ＤＴＺ染色を使用して、成熟期間にわたる膵島純度の百分率を、検出された成熟ベータ細胞の存在に基づき決定した。より詳細には、純度のパーセントを、組織の各クラスタ内における陽性ＤＴＺ染色の量を未染色領域の量で割ることにより決定した。
【００５０】
細胞の生存能力パーセントを、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）又はＮｅｗｐｏｒｔ  Ｇｒｅｅｎ／ＰＩ染色のいずれかを使用し、次いでＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．）を使用した共焦点顕微鏡法により可視化し、生存能力をマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００、Ｍａｇｅｌｌａｎ  Ｖ７）により定量化することにより分析した（Iglesias Iら、(2008) Transplant Proc. 40(2):351-354; Lamb M, ら(2011) Transplant Proc. 43(9):3265-3266; 及び Lukowiak Bら、(2001) J Histochem Cytochem. 49(4):519-528）。
【００５１】
膵島の単離直後、膵島は平均して８．５％±１．１純粋であった。図３Ｂを参照されたい。培養７日後、膵島の純度は７８％±１．５に増加した。図３Ｂを参照されたい。ＤＴＺ陽性組織の割合は、組織培養中増加し（１２．６×１０３±１８３  ＩＥＱ（平均±ｓｅｍ）から培養７日後に３３．３×１０３±１３６（ｎ＝１０）、ｐ＜０．０５））、膵島の大部分は直径５０〜１５０μｍであった（７日後９４．５２±１１％）。表１及び図３Ａを参照されたい。
【００５２】
培養された膵島の完全成熟は、単離７日後までに起こり、直径３５０μｍを超える膵島は存在せず、膵島のおよそ９０％が５０μｍから１５０μｍの間であった。表１を参照されたい。生存能力は培養７日目において、＞９８％±０．０３（ＦＤＡ／ＰＩ）及び＞９０％±０．４（Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｇｒｅｅｎ）であった。図３Ｂを参照されたい。
【００５３】
【表１】
2014528725.tif 000003
【００５４】
（例）膵島機能
【００５５】
成熟プロセス中の膵島機能を、４８時間ごとにグルコース媒介性インスリン放出（ＧＳＩＲ）を評価することによって決定した。各時点において、膵島を、以下の順番の溶液中で、１時間インキュベートした：１）低グルコース（２．８ｍＭ）、２）高グルコース（２８ｍＭ）、３）高グルコース（２８ｍＭ）＋３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、５０μＭ）及び次いで４）低グルコース（２．８ｍＭ）。刺激指数（ＳＩ）を、高グルコース中で分泌されたインスリン／低グルコース中のインスリン量の比として計算した。最大刺激指数（ＭＸ）を、高グルコース＋ＩＢＭＸ中で分泌されたインスリン量を高グルコース中で分泌されたインスリン量で割って計算した。膵島は、それらの単離直後はグルコース応答性であった。グルコース応答性の逐次増加は、それぞれ培養３、５及び７日目に起こった。図３Ｃを参照されたい。膵島機能（すなわちＧＳＩＲ）は、組織培養の０日目（１．３±０．１）から７日目（２．６±０．２）のＳＩの値の増加により観察されるように、培養時間中に改善した。
【００５６】
（例）膵島におけるアポトーシス
【００５７】
膵島は、成熟プロセス中アポトーシスの段階的減少を主に膵島の外側腺房細胞層において起こした。図３（Ｄ）を参照されたい。全体として、膵島におけるアポトーシス細胞の部分は、３日目に２２．５％±１．０及び８日目に４．２％±０．５であった。
【００５８】
（例）膵島の細胞構成
【００５９】
組織培養における膵島の成熟過程の膵島の細胞構成を特徴付けるために、０日目（回復相培養の初日）、３日目、７日目及び１１日目の１５，０００〜２０，０００膵島当量（ＩＥ）の群を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、２００×ｇで遠心分離し、その後、１５分のＡｃｕｔａｓｅ（商標）（５００〜７２０Ｕ／ｍｌ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）分離反応に、３７℃において供した、この反応は製造業者の取り扱い説明書に従って実施した。その後、膵島細胞の単一細胞懸濁液を、４０μｍのフィルターを通してろ過して残屑を除去し、次いで、ｉ）腺房細胞マーカーのアミラーゼ（ヒツジポリクローナル抗アミラーゼ、Ａｂｃａｍ、ＰＬＣ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡから購入）；ｉｉ）ベータ細胞マーカーのｃ−ペプチド（マウスマウスモノクローナル抗Ｃ−ペプチド、Ａｂｃａｍ、ＰＬＣから購入）；及びｉｉｉ）アルファ細胞マーカーのグルカゴン（ウサギポリクローナル抗グルカゴン、Ａｂｃａｍ、ＰＬＣから入手）に特異的な抗体で、１５分間染色した。その後、細胞を、ＤＰＢＳで２回洗浄し、１５００×ｇで５分間遠心分離し、次いで対応する二次抗体と共に１５分間インキュベートした（Ａｌｅｘａ（商標）５５５ヤギ抗マウス、Ａｌｅｘａ（商標）４８８ヤギ抗ウサギ、ヒツジに対するＤｙＬｉｇｈｔ（商標）６５０  Ｄｎｋ  ａＡｂ、これらはそれぞれ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．；及びＡｂｃａｍ  ＰＬＣから購入した）。細胞懸濁液を、その後、生存能力に関してヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を使用して１５分間染色した。細胞集団をその後、フローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（商標）ＩＩ、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ（商標）ソフトウェアＶ．６．５）を使用して、１００ｕｍのノズルを介して２５ｐｓｉで試料を流すことによって３重測定で定量化した。これらの分析からの結果を、表２に報告する。結果は、平均±ｓｅｍ、ｎ＝３で示し、三連に実施している。アミラーゼの割合は培養の０日目の６３．９±１０％から７日目に２０．４±６％に減少し、一方、膵島内のベータ細胞の割合は１６．９±３％から、培養３日後及び７日後にそれぞれ２５．４±４％及び４９．８±７％に増加した（ｐ＜０．０５）。培養１１日後、ベータ細胞の割合は、５４．４±８％にさらに増加し、腺房細胞の割合は１３．０±８％にさらに減少した。グルカゴン陽性細胞には、培養３日目から１１日目までの過程にわたって有意な差は観察されなかった（３日目において３０．５±６％対７日目において２７．６±３％及び１１日目において３０．７±６％、ｐ＝ｎｓ）。
【００６０】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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