(57)【要約】本発明は、標的分子を検出するための方法、組成物、キットおよびデバイスを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、多重化された標的分子検出を可能にする。本発明は、複数の標的が複数の細胞に存在するか否かを同定するための方法に関し、その方法は、その標的に複数のタグを結合する工程を包含し、タグは、ａ）その標的の同一性およびｂ）タグが結合している細胞の同一性を表すコードを含む。いくつかの実施形態において、個々の細胞の分離または単離は、その結合工程に不必要である。
2014513916.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の標的が複数の細胞に存在するか否かを同定するための方法であって、該方法は、該標的に複数のタグを結合する工程を包含し、タグは、
ａ）該標的の同一性、および
ｂ）タグが結合している該細胞の同一性
を表すコードを含む、方法。
【請求項２】
個々の細胞の分離または単離が、前記結合する工程に不必要である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的に関連する単一細胞を同定するための方法であって、該方法は、該標的にタグを結合する工程を包含し、該タグは、
ａ）該標的、および
ｂ）該単一細胞
を表すコードを含み、該結合する工程中、該単一細胞は、細胞の集団から単離されず、かつ該単一細胞を表す該コードは、該結合する工程の前は未知である、方法。
【請求項４】
前記コードを検出する工程をさらに包含し、個々の細胞の分離または単離は、該検出する工程に不必要である、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
各標的が、タンパク質または核酸である、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
前記タグが、核酸である、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
前記タグが、ＵＢＡを含む、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＵＢＡが、前記標的のうちの１つに特異的である、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項９】
前記タグが、ＵＢＡを含む、請求項１〜８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＵＢＡが、抗体を含む、請求項１〜９に記載の方法。
【請求項１１】
前記タグが、ＥＳＢを含む、請求項１〜１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＥＳＢが、共通リンカー（ＣＬ）を含む、請求項１〜１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＥＳＢが、該標的の同一性をコードする、請求項１〜１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＥＳＢが、核酸を含む、請求項１〜１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記タグが、ＡＰＳを含む、請求項１〜１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＡＰＳが、検出可能な検出可能に異なるコードユニットである、請求項１〜１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記結合する工程中に、複数個のＡＰＳが、分割プール合成の連続したラウンドにおいて順序づけられた様式で該タグに付加される、請求項１〜１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記タグが、少なくとも１０個のＡＰＳを含む、請求項１〜１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＡＰＳが、核酸を含む、請求項１〜１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記タグが、ライゲーションによって連結された、複数個のＡＰＳ、ＥＳＢおよびＵＢＡを含む、請求項１〜１９に記載の方法。
【請求項２１】
複数個のＡＰＳ、前記ＥＳＢおよび／または前記ＵＢＡが、クリックケミストリーで連結されることが可能である、請求項１〜２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＡＰＳまたは前記ＥＳＢが、増幅プライマー結合領域を含む、請求項１〜２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳが、鋳型になり得る、請求項１〜２２に記載の方法。
【請求項２４】
ａ）第１の標的分子、
ｂ）該第１の標的分子に特異的な第１のユニーク結合物質（ＵＢＡ）、
ｃ）第１の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）、および
ｄ）複数の順序づけられたアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）
を含み、該ＡＰＳの順序は、検出可能である、組成物。
【請求項２５】
前記標的分子が、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、リンタンパク質、抗体、核酸、ペプチド核酸、合成小分子、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、脂質、ステロイドおよびリン脂質からなる群より選択される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
粒子の集団を含む組成物であって、該粒子の各々は、少なくとも第１の標的分子を含み、該第１の標的分子は、
（ａ）該第１の標的分子に特異的な第１のユニーク結合物質（ＵＢＡ）、
（ｂ）第１の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）、および
（ｃ）第１の複数の順序づけられたアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）
と関連しており、ここで、該集団中の第１の粒子の該第１の標的分子と関連している該複数の順序づけられたＡＰＳは、該集団中の第２の粒子の該第１の標的分子と関連している該複数の順序づけられたＡＰＳと検出可能に異なる、組成物。
【請求項２７】
前記複数の順序づけられたＡＰＳは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のＡＰＳを含む、請求項２４〜２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記複数の順序づけられたＡＰＳは、２０個より多いＡＰＳを含む、請求項２４〜２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ＡＰＳは、鋳型になり得る、請求項２４〜２８に記載の組成物。
【請求項３０】
少なくとも１つの粒子が、細胞、リポソーム、細胞小器官、ミセル、液滴およびビーズからなる群より選択される、請求項２６〜２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記標的分子が、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、リンタンパク質、抗体、核酸、ペプチド核酸、合成小分子、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、脂質、ステロイドおよびリン脂質からなる群より選択される、請求項２６〜３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記第１のＥＳＢが、第１の共通リンカー（ＣＬ）を含む、請求項２４〜３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記第１の標的分子が、前記第１のＵＢＡに直接結合されており、前記第１のＥＳＢが、該第１のＵＢＡに直接結合されている、請求項２４〜３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記複数の順序づけられたＡＰＳが、別個のラウンドにおけるＡＰＳの段階的付加によって形成されている、請求項２４〜３３に記載の組成物。
【請求項３５】
各ラウンドにおいて付加された前記ＡＰＳが、第１の複合体に連結されている、３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記連結が、ラウンドの順序においてされている、請求項３４〜３５に記載の組成物。
【請求項３７】
ＡＰＳ、ＥＳＢまたはＵＢＡの前記連結が、化学的方法を用いて行われている、請求項２４〜３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記化学的方法が、クリックケミストリーを含む、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記連結が、ＣｕＩの存在下で行われている、請求項３５〜３８に記載の組成物。
【請求項４０】
ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢが、核酸を含む、請求項２４〜３９に記載の組成物。
【請求項４１】
ＵＢＡ、ＡＰＳおよびＥＳＢから選択される２つの構成要素に対する第１および第２の相補的領域を含む第１の連結オリゴヌクレオチドをさらに含む、４０に記載の組成物。
【請求項４２】
ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢが、ＵＢＡ、ＡＰＳおよびＥＳＢから選択される２つの構成要素に対する前記第１および第２の相補的領域を含む連結オリゴヌクレオチドを用いて連結されている、請求項４０〜４１に記載の組成物。
【請求項４３】
ＵＢＡ、ＡＰＳおよびＥＳＢから選択される２つの構成要素に対する第３および第４の相補的領域を含む第２の連結オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項４０〜４２に記載の組成物。
【請求項４４】
ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢが、ＵＢＡ、ＡＰＳおよびＥＳＢから選択される２つの構成要素に対する前記第３および第４の相補的領域を含む連結オリゴヌクレオチドを用いて連結されている、請求項４０〜４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記第２および第４の相補的領域が、同一である、請求項４３〜４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記第２および第４の相補的領域が、同一である、請求項４３〜４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記第１または第２の相補的領域が、前記複数のＡＰＳのうちの２つのＡＰＳ間で共有されている、請求項４１〜４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記連結が、ライゲーションによって行われている、請求項４２〜４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記連結オリゴヌクレオチドが、前記ＡＰＳまたは前記ＥＳＢの起源をコードするサブコードを含む、請求項４１〜４８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記ＡＰＳが、該ＡＰＳの起源をコードするサブコードを有する、請求項２４〜４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記ＥＳＢが、該ＥＳＢの起源をコードするサブコードを有する、請求項２４〜５０に記載の組成物。
【請求項５２】
個別のＡＰＳ、ＥＳＢまたは連結オリゴヌクレオチド分子が、ユニークなカウンタータグを含む、請求項２４〜５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記ユニークなカウンタータグが、検出可能である、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記ＥＳＢが、前記連結オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結されている、請求項４１〜５３に記載の組成物。
【請求項５５】
ＡＰＳまたはＥＳＢが、増幅プライマー結合領域を含む、請求項２４〜５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記ＡＰＳおよびＥＳＢが、連結される場合、二次産物をコードすることが可能である、請求項２４〜５５に記載の組成物。
【請求項５７】
前記二次産物が、ＲＮＡまたはペプチドである、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
前記ＡＰＳおよびＥＳＢが、連結される場合、ポリメラーゼ開始部位を含む、請求項２４〜５７に記載の組成物。
【請求項５９】
前記ペプチドが、親和性タグを含む、請求項５７〜５８に記載の組成物。
【請求項６０】
前記親和性タグが、Ｈｉｓタグである、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
前記ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳが、鋳型になり得る、請求項２４〜６０に記載の組成物。
【請求項６２】
プローブをさらに含む、請求項２４〜６１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記プローブが、表面に付着させられている、請求項２４〜６２に記載の組成物。
【請求項６４】
前記表面が、アレイを含む、請求項２４〜６３に記載の組成物。
【請求項６５】
前記表面が、ビーズを含む、請求項２４〜６４に記載の組成物。
【請求項６６】
前記ＵＢＡが、抗体、ペプチド、アプタマー、ペプトイドおよび核酸からなる群より選択される、請求項２４〜６５に記載の組成物。
【請求項６７】
前記ＥＳＢが、核酸、ビーズおよび化学サブユニットからなる群より選択される、請求項２４〜６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記ＡＰＳが、決定論的重量の核酸、小分子または組立可能な複合分子を含む、請求項２４〜６７に記載の組成物。
【請求項６９】
細胞の集団中の細胞の標的分子を細胞起源バーコードで標識するためのキットであって、
（ａ）ｍ個のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のｎ個のセットであって、各々は、異なる情報パッケージを含み；ここで、該情報パッケージは、順序づけられた形式で連結されることが可能である、セット；
（ｂ）標的分子特異的なユニーク結合物質（ＵＢＡ）
を備える、キット。
【請求項７０】
細胞の集団中の細胞の標的分子を細胞起源バーコードで標識するためのキットであって、
（ａ）ｍ個のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のｎ個のセットであって、各々は、異なる情報パッケージを含み；ここで、該情報パッケージは、順序づけられた形式で連結されることが可能である、セット；
（ｂ）標的分子特異的な複数のユニーク結合物質（ＵＢＡ）であって、各々は、ＵＢＡ特異的なエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）と連結されている、標的分子特異的な複数のユニーク結合物質（ＵＢＡ）
を備える、キット。
【請求項７１】
細胞の集団中の細胞の標的分子を細胞起源バーコードで標識するためのキットであって、
（ａ）ｍ個のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のｎ個のセットであって、各々は、異なる情報パッケージを含み；ここで、該情報パッケージは、順序づけられた形式で連結されることが可能である、セット；
（ｂ）標的分子特異的な複数のユニーク結合物質（ＵＢＡ）；
（ｃ）ＵＢＡ特異的な複数のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）であって、各ＥＳＢは、指定のＵＢＡと連結することが可能である、ＵＢＡ特異的な複数のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）
を備える、キット。
【請求項７２】
ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である、請求項６９〜７１に記載のキット。
【請求項７３】
ｍが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である、請求項６９〜７２に記載のキット。
【請求項７４】
ｎが、１０より大きい、請求項６９〜７３に記載のキット。
【請求項７５】
ｍが、２０より大きい、請求項６９〜７４に記載のキット。
【請求項７６】
第１のＥＳＢが、第１の共通リンカー（ＣＬ）を含む、請求項７０〜７５に記載のキット。
【請求項７７】
前記ＥＳＢが、前記ＵＢＡに直接結合することが可能である、請求項７０〜７６に記載のキット。
【請求項７８】
前記ＵＢＡが、前記標的分子に直接結合することが可能である、請求項６９〜７７に記載のキット。
【請求項７９】
前記アッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のセットのうちの少なくとも２つが、同一である、請求項６９〜７８に記載のキット。
【請求項８０】
第１のセット中の前記ＡＰＳが、第２のセット中の前記ＡＰＳと連結可能である、請求項６９〜７９に記載のキット。
【請求項８１】
第１のセット中の前記ＡＰＳが、順序づけられた形式で第２のセット中の前記ＡＰＳとさらに連結可能である、請求項８０に記載のキット。
【請求項８２】
ＡＰＳ、ＥＳＢまたはＵＢＡが、化学的方法を用いて連結されることが可能である、請求項７９〜８１に記載のキット。
【請求項８３】
前記化学的方法が、クリックケミストリーを含む、請求項８２に記載のキット。
【請求項８４】
ＣｕＩの存在が、連結のために必要とされる、請求項８２〜８３に記載のキット。
【請求項８５】
ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢが、核酸を含む、請求項６９〜８４に記載のキット。
【請求項８６】
ＵＢＡ、ＡＰＳおよびＥＳＢから選択される２つの構成要素に対する第１および第２の相補的領域を含む第１の連結オリゴヌクレオチドをさらに備える、請求項８５に記載のキット。
【請求項８７】
ＵＢＡ、ＡＰＳおよびＥＳＢから選択される２つの構成要素に対する第３および第４の相補的領域を含む第２の連結オリゴヌクレオチドをさらに備える、請求項８６に記載のキット。
【請求項８８】
前記第１および第３の相補的領域が、同一である、請求項８７に記載のキット。
【請求項８９】
前記第２および第４の相補的領域が、同一である、請求項８６〜８７に記載のキット。
【請求項９０】
ＡＰＳ、ＥＳＢまたはＵＢＡが、ライゲーションによって連結されることが可能である、請求項８５〜８９に記載のキット。
【請求項９１】
前記連結オリゴヌクレオチドが、前記ＡＰＳまたは前記ＥＳＢの起源のセットをコードするサブコードを含む、請求項８６〜９０に記載のキット。
【請求項９２】
前記ＡＰＳが、該ＡＰＳの起源集団をコードするサブコードを有する、請求項６９〜９１に記載のキット。
【請求項９３】
前記ＥＳＢが、該ＥＳＢの起源集団をコードするサブコードを有する、請求項６９〜９２に記載のキット。
【請求項９４】
個々のＡＰＳ、ＥＳＢまたは連結オリゴヌクレオチド分子が、ユニークなカウンタータグを含む、請求項６９〜９３に記載のキット。
【請求項９５】
前記ユニークなカウンタータグが、検出可能である、請求項９４に記載のキット。
【請求項９６】
前記ＥＳＢが、前記連結オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結される、請求項８６〜９５に記載のキット。
【請求項９７】
ＡＰＳまたはＥＳＢが、増幅プライマー結合領域を含む、請求項６９〜９６に記載のキット。
【請求項９８】
前記ＡＰＳおよびＥＳＢが、連結される場合、二次産物をコードすることが可能である、請求項６９〜９７に記載のキット。
【請求項９９】
前記二次産物が、ＲＮＡまたはペプチドである、請求項９８に記載のキット。
【請求項１００】
前記ＡＰＳおよびＥＳＢが、連結される場合、ポリメラーゼ開始部位を含む、請求項６９〜９９に記載のキット。
【請求項１０１】
前記ペプチドが、親和性タグを含む、請求項９９〜１００に記載のキット。
【請求項１０２】
前記親和性タグが、Ｈｉｓタグである、請求項１０１に記載のキット。
【請求項１０３】
前記ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳが、鋳型になり得る、請求項６９〜１０２に記載のキット。
【請求項１０４】
プローブをさらに備える、請求項６９〜１０３に記載のキット。
【請求項１０５】
前記プローブが、表面に付着させられている、請求項６９〜１０４に記載のキット。
【請求項１０６】
前記表面が、アレイを含む、請求項６９〜１０５に記載のキット。
【請求項１０７】
前記表面が、ビーズを含む、請求項６９〜１０６に記載のキット。
【請求項１０８】
前記複数のＵＢＡが、２、３、４、５、１０、２０、３０、５０、１００、２００、３００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個または１０００個より多いＵＢＡを含む、請求項６９〜１０７に記載のキット。
【請求項１０９】
前記複数のＵＢＡが、最大２０００個のＵＢＡを含む、請求項６９〜１０８に記載のキット。
【請求項１１０】
前記ＵＢＡが、抗体、ペプチド、アプタマー、ペプトイドおよび核酸からなる群より選択される、請求項６９〜１０９に記載のキット。
【請求項１１１】
前記ＥＳＢが、核酸、ビーズおよび化学サブユニットからなる群より選択される、請求項６９〜１１０に記載のキット。
【請求項１１２】
前記ＡＰＳが、決定論的重量の核酸、小分子または組立可能な複合分子を含む、請求項６９〜１１１に記載のキット。
【請求項１１３】
共通の粒子起源を共有している標的分子を同定するための方法であって、該方法は、
ｘ個の粒子の集団中の第１の粒子の第１の複数の標的を第１の起源バーコードで標識する工程；および
ｘ個の粒子の集団中の第２の粒子の第２の複数の標的を第２の起源バーコードで標識する工程；
を包含し、ここで、各起源バーコードは、ｎ個のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のセットを含み、ここで、該ＡＰＳの第１および第２のセット中の該ｎ個のＡＰＳの各々は、ｍ個の異なるＡＰＳを含む群から選択され、ここで、該第１および第２の起源バーコードは、ｃ＝１−［（１−１／ｘ）＾（ｍｎ）］の確実性で互いと検出可能に異なる、方法。
【請求項１１４】
ｘが、１，０００，０００より大きい、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
ｃが、９９．９％より大きい、請求項１１３〜１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
ｃが、９９．９９％より大きい、請求項１１３〜１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
ｃが、９９．９９９％より大きい、請求項１１３〜１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
ｃが、９９．９９９９％より大きい、請求項１１３〜１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
ｃが、９９．９９９９９％より大きい、請求項１１３〜１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
ｎが、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である、請求項１１３〜１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
ｍが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である、請求項１１３〜１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
ｎが、１０より大きい、請求項１１３〜１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
ｍが、２０より大きい、請求項１１３〜１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
少なくとも１つの別々の粒子が、細胞、リポソーム、細胞小器官、ミセル、液滴およびビーズからなる群より選択される、請求項１１３〜１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記標的分子が、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、リンタンパク質、抗体、核酸、ペプチド核酸、合成小分子、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、脂質、ステロイドおよびリン脂質からなる群より選択される、請求項１１３〜１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
ｍ個の異なるＡＰＳを含む少なくとも２つの群が、同一である、請求項１１３〜１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ｎ個のＡＰＳが、別個のラウンドにおいて付加される、請求項１１３〜１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
別個のラウンドの前記ＡＰＳが、連結される、請求項１１３〜１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記連結が、ラウンドの順序においてされる、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
粒子の集団の粒子の構成要素に粒子特異的コードを付与する方法であって、該方法は、アッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）の第１の順序づけられたセットを粒子の集団の第１の粒子の第１の構成要素に連結する工程を包含し、ここで、該ＡＰＳの順序は、検出方法によって検出可能である、方法。
【請求項１３１】
前記第１の構成要素と連結されたＡＰＳの前記第１の順序づけられたセットを検出することによって、該第１の構成要素の粒子の起源を決定する工程をさらに包含する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
アッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）の第２の順序づけられたセットを粒子の集団の前記第１の粒子の第２の構成要素に連結する工程をさらに包含し、ここで、該ＡＰＳの順序は、検出可能である、請求項１３０〜１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記第２の構成要素と連結されたＡＰＳの前記第２の順序づけられたセットを検出することによって、該第２の構成要素の粒子の起源を決定する工程をさらに包含する、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記第１の粒子の前記第１および第２の構成要素と連結されたＡＰＳの前記第１および第２の順序づけられたセットが、同じである、請求項１３０〜１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
アッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）の第３の順序づけられたセットを粒子の集団の第２の粒子の第１の構成要素に連結する工程をさらに包含し、ここで、該ＡＰＳの順序は、検出可能である、請求項１３０〜１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記第１の粒子の前記第１の構成要素と連結されたＡＰＳの前記第１の順序づけられたセットが、前記第２の粒子の前記第１の構成要素と連結されたアッセイ可能ポリマーサブユニットの前記第３の順序づけられたセットと異なる、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
構成要素特異的なエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）を前記第１の構成要素に連結する工程をさらに包含する、請求項１３０〜１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
構成要素特異的なＥＳＢを前記第２の構成要素に連結する工程をさらに包含する、請求項１３０〜１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
少なくとも前記粒子が、細胞、リポソーム、細胞小器官、ミセル、液滴およびビーズからなる群より選択される、請求項１３０〜１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
少なくとも１つの標的分子が、前記第１のＵＢＡに直接結合され、前記ＥＳＢが、該ＵＢＡに直接結合される、請求項１３０〜１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記アッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のセットのうちの少なくとも２つが、同一である、請求項１３０〜１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
ＡＰＳの前記順序づけられたセットの各ＡＰＳが、第１の複合体に連結される、請求項１３０〜１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記連結が、ラウンドの順序においてされる、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳが、二次産物をコードする、請求項１３０〜１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記二次産物が、ＲＮＡまたはペプチドである、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳが、鋳型になり得る、請求項１３０〜１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記ＥＳＢが、ユニークなカウンタータグをさらに含む、請求項１３７〜１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
分子の前記標的分子の量が、前記カウンタータグを用いて推定される、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記ＡＰＳが、ラウンド特異的サブコードをさらに含む、前述の請求項１４３〜１４８のいずれかに記載の方法。
【請求項１５０】
前記検出が、指定のラウンドのＡＰＳの存在の決定をさらに含む、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
検出が、デジタルである、請求項１３０〜１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
検出が、間接的である、請求項１３０〜１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
検出が、質量分析を含む、請求項１３０〜１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
検出が、核酸配列決定を含む、請求項１３０〜１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
検出が、ペプチド配列決定を含む、請求項１３０〜１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
検出が、大規模ゲル電気泳動を含む、請求項１３０〜１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
検出が、ＨＰＬＣまたは他のクロマトグラフィー分離を含む、請求項１３０〜１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
検出が、１つ以上の個々のＡＰＳに関連する１つ以上のシグナルの検出を含む、請求項１３０〜１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
前記シグナルが、順序づけられている、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
検出が、１つ以上のプローブの使用を含む、請求項１３０〜１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
前記プローブが、表面に付着させられている、請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
前記表面が、アレイを含む、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
前記表面が、ビーズを含む、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６４】
検出が、分離を含む、請求項１３０〜１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
前記分離が、多次元的である、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記分離が、第１の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）を第２の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）から分ける、請求項１６４〜１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
３、４、５、１０、２０、３０、５０、１００、２００、３００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個または１０００個より多い異なる標的分子が、検出される、請求項１３０〜１６６に記載の方法。
【請求項１６８】
最大２０００個の異なる標的分子が、検出される、請求項１３０〜１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
前記ＵＢＡが、抗体、ペプチド、アプタマー、ペプトイドおよび核酸からなる群より選択される、請求項１３０〜１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
前記ＥＳＢが、核酸、ビーズおよび化学サブユニットからなる群より選択される、請求項１３０〜１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
前記ＡＰＳが、決定論的重量の核酸、小分子または組立可能な複合分子を含む、請求項１３０〜１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
前記ＡＰＳが、ライゲーションまたは重合を介した伸長によって連結される、請求項１３０〜１７１に記載の方法。
【請求項１７３】
細胞起源バーコード（ＣＯＢ）が、前記ＡＰＳの前記順序づけられたセットのＡＰＳを用いて生成される、請求項１３０〜１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
複数の複合体内の各ＣＯＢが、該ＣＯＢと細胞の前記集団中の他のＣＯＢとを区別する検出可能なシグナルまたは配列を有する、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
ＡＰＳ、ＥＳＢまたはＵＢＡが、化学的方法を用いて連結される、請求項１３０〜１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
前記化学的方法が、クリックケミストリーを含む、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７７】
前記連結が、ＣｕＩの存在下で行われる、請求項１７５〜１７６に記載の方法。
【請求項１７８】
ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢが、核酸を含む、請求項１３０〜１７７に記載の方法。
【請求項１７９】
ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢの前記連結が、連結される２つの構成要素に対する第１および第２の相補的領域を含む連結オリゴヌクレオチドを用いて行われる、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
前記第１または第２の相補的領域が、ＡＰＳの集団内のＡＰＳ間で共有されている、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
前記第１または第２の相補的領域が、ＡＰＳの２つの異なるラウンド特異的セットに関して異なる、請求項１７９〜１８０に記載の方法。
【請求項１８２】
ライゲーションをさらに含む、請求項１７９〜１８１に記載の方法。
【請求項１８３】
前記標的分子が、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、リンタンパク質、抗体、核酸、ペプチド核酸、合成小分子、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、脂質、ステロイドおよびリン脂質からなる群より選択される、請求項１３０〜１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
前記第１のＥＳＢが、第１の共通リンカー（ＣＬ）を含む、請求項１３０〜１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
前記第１のＥＳＢが、第１の共通リンカー（ＣＬ）を含む、請求項１３０〜１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
個々のＡＰＳ、ＥＳＢまたは連結オリゴヌクレオチド分子が、ユニークなカウンタータグを含む、請求項１３０〜１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
検出が、前記ユニークなカウンタータグの検出を含む、請求項１８６に記載の方法。
【請求項１８８】
特定のＥＳＢと関連しているユニークなカウンタータグの数が決定される、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
検出されたユニークなカウンタータグの数が、前記特定のＥＳＢの初期量に関係する、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
前記ＥＳＢが、前記連結オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結される、請求項１７９〜１８９に記載の方法。
【請求項１９１】
ＡＰＳまたはＥＳＢが、増幅プライマー結合領域を含む、請求項１３０〜１９０に記載の方法。
【請求項１９２】
ＣＯＢが、ペプチド配列をコードする、請求項１７３〜１９１に記載の方法。
【請求項１９３】
前記ＣＯＢが、ポリメラーゼ開始部位を含む、請求項１７３〜１９２に記載の方法。
【請求項１９４】
前記ペプチドが、親和性タグを含む、請求項１９２〜１９３に記載の方法。
【請求項１９５】
前記親和性タグが、Ｈｉｓタグである、請求項１９４に記載の方法。
【請求項１９６】
複数の別々の粒子を起源とする複数の特性を検出するための方法であって、該方法は、
ａ）
ｉ）少なくとも第１の標的分子を含む粒子の集団、
ｉｉ）該第１の標的分子に特異的な第１のユニーク結合物質（ＵＢＡ）、
ｉｉｉ）第１の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）、
ｉｖ）ラウンド特異的な複数のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のセットであって、各セットは、互いに検出可能に異なる複数のＡＰＳを含む、セット
を提供する工程、
ｂ）該少なくとも第１の標的分子、該第１のＵＢＡプローブおよび該第１のＥＳＢを含む少なくとも第１の複合体を形成する工程、
ｃ）ｎラウンドの分割プール合成を行う工程であって、各ラウンドは、
ｉ）粒子の該集団をｍ個の反応体積に分割する工程、
ｉｉ）該ラウンドに特異的な該ＡＰＳのセットのＡＰＳと１つ以上の反応体積とを接触させる工程、
ｉｉｉ）２つ以上の反応体積をプールする工程
を含む、工程、
ｄ）粒子の該集団の少なくとも１つの粒子から複数の特性を検出する工程、
を包含し、ここで、該特性の少なくとも１つは、該粒子に関連する標的分子についての量または同一性に関係する、方法。
【請求項１９７】
複数の別々の粒子を起源とする複数の特性を検出するための方法であって、該方法は、
ａ）
ｉ）少なくとも第１の標的分子を含む粒子の集団、
ｉｉ）該第１の標的分子に特異的な第１のユニーク結合物質（ＵＢＡ）、
ｉｉｉ）第１の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）、および
ｉｖ）ラウンド特異的な複数のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のセットであって、各セットは、互いに検出可能に異なる複数のＡＰＳを含む、セット
を提供する工程、
ｂ）該少なくとも第１の標的分子、該第１のＵＢＡプローブおよび該第１のＥＳＢを含む少なくとも第１の複合体を形成する工程、
ｃ）ｎラウンドの分割プール合成を行う工程であって、各ラウンドは、
ｉ）粒子の該集団をｍ個の反応体積に分割する工程、
ｉｉ）該ラウンドに特異的な該ＡＰＳのセットのＡＰＳと１つ以上の反応体積とを接触させる工程、および
ｉｉｉ）２つ以上の反応体積をプールする工程
を含む、工程、
ｄ）工程ｃ）のｉ）およびｃ）のｉｉ）を含む分割プール合成の別のラウンドを行う工程、
ｅ）粒子の該集団の少なくとも１つの粒子から複数の特性を検出する工程、
を包含し、ここで、該特性の少なくとも１つは、該粒子に関連する標的分子についての量または同一性に関係する、方法。
【請求項１９８】
ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である、請求項１９６〜１９７に記載の方法。
【請求項１９９】
ｎが、２０より大きい、請求項１９６〜１９８に記載の方法。
【請求項２００】
ｍが、少なくとも２ラウンドの間で異なる、請求項１９６〜１９９に記載の方法。
【請求項２０１】
ｍが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である、請求項１９６〜２００に記載の方法。
【請求項２０２】
ｍが、２０より大きい、請求項１９６〜２０１に記載の方法。
【請求項２０３】
少なくとも１つの別々の粒子が、細胞、リポソーム、細胞小器官、ミセル、液滴およびビーズからなる群より選択される、請求項１９６〜２０２に記載の方法。
【請求項２０４】
前記標的分子が、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、リンタンパク質、抗体、核酸、ペプチド核酸、合成小分子、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、脂質、ステロイドおよびリン脂質からなる群より選択される、請求項１９６〜２０３に記載の方法。
【請求項２０５】
前記第１のＥＳＢが、第１の共通リンカー（ＣＬ）を含む、請求項１９６〜２０４に記載の方法。
【請求項２０６】
前記少なくとも１つの標的分子が、前記第１のＵＢＡに直接結合され、前記ＥＳＢが、該ＵＢＡに直接結合される、請求項１９６〜２０５に記載の方法。
【請求項２０７】
前記アッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のセットのうちの少なくとも２つが、同一である、請求項１９６〜２０６に記載の方法。
【請求項２０８】
各ラウンドにおいて付加される前記ＡＰＳが、前記第１の複合体に連結される、請求項１９６〜２０７に記載の方法。
【請求項２０９】
前記連結が、ラウンドの順序においてされる、請求項２０８に記載の方法。
【請求項２１０】
前記ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳが、二次産物をコードする、請求項１９６〜２０９に記載の方法。
【請求項２１１】
前記二次産物が、ＲＮＡまたはペプチドである、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１２】
前記ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳが、鋳型になり得る、請求項１９６〜２１１に記載の方法。
【請求項２１３】
前記ＥＳＢが、ユニークなカウンタータグをさらに含む、請求項１９６〜２１２に記載の方法。
【請求項２１４】
分子の標的分子の量が、前記カウンタータグを用いて推定される、請求項２１３に記載の方法。
【請求項２１５】
前記ＡＰＳが、ラウンド特異的サブコードをさらに含む、請求項１９６〜２１４に記載の方法。
【請求項２１６】
前記検出が、指定のラウンドのＡＰＳの存在の決定をさらに含む、請求項２１５に記載の方法。
【請求項２１７】
検出が、デジタルである、請求項１９６〜２１６に記載の方法。
【請求項２１８】
検出が、間接的である、請求項１９６〜２１７に記載の方法。
【請求項２１９】
検出が、質量分析を含む、請求項１９６〜２１８に記載の方法。
【請求項２２０】
検出が、核酸配列決定を含む、請求項１９６〜２１９に記載の方法。
【請求項２２１】
検出が、ペプチド配列決定を含む、請求項１９６〜２２０に記載の方法。
【請求項２２２】
検出が、１つ以上の個々のＡＰＳに関連する１つ以上のシグナルの検出を含む、請求項１９６〜２２１に記載の方法。
【請求項２２３】
前記シグナルが、順序づけられている、請求項２２２に記載の方法。
【請求項２２４】
検出が、１つ以上のプローブの使用を含む、請求項１９６〜２２３に記載の方法。
【請求項２２５】
前記プローブが、表面に付着させられている、請求項２２４に記載の方法。
【請求項２２６】
前記表面が、アレイを含む、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２２７】
前記表面が、ビーズを含む、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２２８】
検出が、分離を含む、請求項１９６〜２２７に記載の方法。
【請求項２２９】
前記分離が、多次元的である、請求項２２８に記載の方法。
【請求項２３０】
前記分離が、前記第１の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）を第２の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）から分ける、請求項２２８〜２２９に記載の方法。
【請求項２３１】
３、４、５、１０、２０、３０、５０、１００、２００、３００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個または１０００個より多い異なる標的分子が、検出される、請求項１９６〜２３０に記載の方法。
【請求項２３２】
最大２０００個の異なる標的分子が、検出される、請求項１９６〜２３１に記載の方法。
【請求項２３３】
前記ＵＢＡが、抗体、ペプチド、アプタマー、ペプトイドおよび核酸からなる群より選択される、請求項１９６〜２３２に記載の方法。
【請求項２３４】
前記ＥＳＢが、核酸、ビーズおよび化学サブユニットからなる群より選択される、請求項１９６〜２３３に記載の方法。
【請求項２３５】
前記ＡＰＳが、決定論的重量の核酸、小分子または組立可能な複合分子を含む、請求項１９６〜２３４に記載の方法。
【請求項２３６】
前記ＡＰＳが、ライゲーションまたは重合を介した伸長によって連結される、請求項１９６〜２３５に記載の方法。
【請求項２３７】
細胞起源バーコード（ＣＯＢ）が、ラウンド特異的なＡＰＳのセットのＡＰＳから生成される、請求項１９６〜２３６に記載の方法。
【請求項２３８】
複数の複合体内の各ＣＯＢが、該ＣＯＢと細胞の前記集団中の他のＣＯＢとを区別する検出可能なシグナルまたは配列を有する、請求項２３７に記載の方法。
【請求項２３９】
ＡＰＳ、ＥＳＢまたはＵＢＡが、化学的方法を用いて連結される、請求項１９６〜２３８に記載の方法。
【請求項２４０】
前記化学的方法が、クリックケミストリーを含む、請求項２３９に記載の方法。
【請求項２４１】
前記連結が、ＣｕＩの存在下で行われる、請求項２３９〜２４０に記載の方法。
【請求項２４２】
ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢが、核酸を含む、請求項１９６〜２４１に記載の方法。
【請求項２４３】
ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢの前記連結が、連結される２つの構成要素に対する第１および第２の相補的領域を含む連結オリゴヌクレオチドを用いて行われる、請求項２４２に記載の方法。
【請求項２４４】
前記第１または第２の相補的領域が、ＡＰＳの集団内のＡＰＳ間で共有される、請求項２４３に記載の方法。
【請求項２４５】
前記第１または第２の相補的領域が、ＡＰＳの２つの異なるラウンド特異的セットに関して異なる、請求項２４３〜２４４に記載の方法。
【請求項２４６】
ライゲーションをさらに含む、請求項２４３〜２４５に記載の方法。
【請求項２４７】
前記連結オリゴヌクレオチドが、前記ＡＰＳまたは前記ＥＳＢの起源集団をコードするサブコードを含む、請求項２４３〜２４６に記載の方法。
【請求項２４８】
前記ＡＰＳが、該ＡＰＳのラウンド特異的セットをコードするサブコードを有する、請求項１９６〜２４７に記載の方法。
【請求項２４９】
前記ＥＳＢが、該ＥＳＢの起源の存在をコードするサブコードを有する、請求項１９６〜２４８に記載の方法。
【請求項２５０】
個々のＡＰＳ、ＥＳＢまたは連結オリゴヌクレオチド分子が、ユニークなカウンタータグを含む、請求項１９６〜２４９に記載の方法。
【請求項２５１】
検出が、前記ユニークなカウンタータグの検出を含む、請求項２５０に記載の方法。
【請求項２５２】
特定のＥＳＢと関連しているユニークなカウンタータグの数が決定される、請求項２５１に記載の方法。
【請求項２５３】
検出されたユニークなカウンタータグの数が、前記特定のＥＳＢの初期量に関係する、請求項２５２に記載の方法。
【請求項２５４】
前記ＥＳＢが、前記連結オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結される、請求項２４３〜２５３に記載の方法。
【請求項２５５】
ＡＰＳまたはＥＳＢが、増幅プライマー結合領域を含む、請求項１９６〜２５４に記載の方法。
【請求項２５６】
ＣＯＢが、ペプチド配列をコードする、請求項２３７〜２５５に記載の方法。
【請求項２５７】
前記ＣＯＢが、ポリメラーゼ開始部位を含む、請求項２３７〜２５６に記載の方法。
【請求項２５８】
前記ペプチドが、親和性タグを含む、請求項２５６〜２５７に記載の方法。
【請求項２５９】
前記親和性タグが、Ｈｉｓタグである、請求項２５８に記載の方法。
【請求項２６０】
直前の分割によって作製された反応体積の各々に、前記ＡＰＳのセットの異なるＡＰＳを投入する、請求項１９６〜２５９に記載の方法。
【請求項２６１】
サンプル中の少なくとも１つの標的分子を検出するための方法であって、
（ａ）
（ｉ）少なくとも１つの標的分子を潜在的に含む細胞の集団、
（ｉｉ）第１の標的分子に特異的な第１のユニーク結合物質（ＵＢＡ）、
（ｉｉｉ）該第１のＵＢＡのある領域に特異的な第１のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）であって、ここで、該ＥＳＢは、第１の共通リンカー部分を含む、第１のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）、および
（ｉｖ）アッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）の集団であって、ここで、該ＡＰＳは、第２の共通リンカー部分および第３の共通リンカー部分を含み、該第２のリンカー部分は、該第１のＥＳＢの該第１の共通リンカー部分と相補的である、集団
を提供する工程；
（ｂ）該少なくとも１つの標的分子、該第１のＵＢＡプローブおよび該第１のＥＳＢを含む少なくとも第１の複合体を形成する工程であって、ここで、該少なくとも１つの標的分子は、該第１のＵＢＡに結合され、該ＥＳＢは、該ＵＢＡに結合される、工程、
（ｃ）該集団を２つ以上のサンプルに分割する工程、
（ｄ）工程（ｃ）の該２つ以上のサンプルにＡＰＳの該集団のＡＰＳを１サンプルあたり１つ加える工程であって、ここで、該少なくとも１つの標的分子、該第１のＵＢＡプローブ、該第１のＥＳＢおよび第１のＡＰＳによって第２の複合体が形成され、該第１のＡＰＳの該第２の共通リンカー部分は、該第１のＥＳＢの該第１のリンカー部分に結合される、工程、
（ｅ）工程（ｃ）の該２つ以上のサンプルを１つのサンプルにプールする工程、
（ｆ）工程（ｅ）の該サンプルを２つ以上のサンプルに分割する工程、
（ｇ）工程（ｅ）の該２つ以上のサンプルにＡＰＳの該集団のＡＰＳを１サンプルあたり１つ加える工程であって、ここで、該少なくとも１つの標的分子、該第１のＵＢＡプローブ、該第１のＥＳＢ、該第１のＡＰＳおよび第２のＡＰＳによって第３の複合体が形成され、該第２のＡＰＳの該第２の共通リンカー部分は、該第１のＡＰＳの該第３のリンカー部分に結合され、該第１のＡＰＳおよび該第２のＡＰＳは、細胞起源バーコード（ＣＯＢ）を形成する、工程、および
（ｃ）該第３の複合体または該第３の複合体の少なくとも一部を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項２６２】
工程（ｅ）から（ｇ）を繰り返す工程をさらに包含する、請求項２６１に記載の方法。
【請求項２６３】
工程（ｂ）において複数の複合体を形成する工程を包含する方法によって複数の標的分子を検出する工程をさらに包含し、各複合体は、（ｉ）少なくとも１つの標的分子、（ｉｉ）第１のＵＢＡ、および（ｉｉｉ）該第１のＵＢＡのある領域に特異的な第１のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）を含み、ここで、該ＥＳＢは、第１の共通リンカー部分を含み、該少なくとも１つの標的分子は、該第１のＵＢＡに結合され、該ＥＳＢは、該ＵＢＡに結合される、請求項２６１に記載の方法。
【請求項２６４】
前記複数の複合体中の各ＣＯＢが、該ＣＯＢと細胞の前記集団中の他のＣＯＢとを区別する検出可能なシグナルまたは配列を有する、請求項２６３に記載の方法。
【請求項２６５】
前記複合体が、配列決定または質量分析によって検出される、請求項２６１〜２６４に記載の方法。
【請求項２６６】
前記第３の複合体が、該第３の複合体の１つ以上の分子の存在を個別に計数する工程を包含する方法によって検出され、ここで、該第３の複合体の該１つ以上の分子の存在は、細胞内の前記標的分子の濃度または存在を示す、請求項２６１に記載の方法。
【請求項２６７】
個別に検出する工程が、デジタルのシグナルを検出する工程をさらに包含する、請求項２６６に記載の方法。
【請求項２６８】
３、４、５、１０、２０、３０、５０、１００、２００、３００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個または１０００個より多い異なる標的分子が、検出される、請求項２６３に記載の方法。
【請求項２６９】
最大２０００個の異なる標的分子が、検出される、請求項２６３に記載の方法。
【請求項２７０】
前記ＵＢＡが、抗体、ペプチド、アプタマー、ペプトイドおよび核酸または任意の組み合わせからなる群より選択される構造を含む、請求項２６１に記載の方法。
【請求項２７１】
前記ＥＳＢが、核酸、ビーズおよび化学サブユニットまたは任意の組み合わせからなる群より選択される構造を含む、請求項２６１に記載の方法。
【請求項２７２】
前記ＡＰＳが、決定論的重量の核酸、小分子または組立可能な複合分子を含む、請求項２６１に記載の方法。
【請求項２７３】
前記ＡＰＳが、検出可能な標識が付着させられている相補的なポリヌクレオチド配列にハイブリダイズされる一本鎖核酸を含む、請求項２６１に記載の方法。
【請求項２７４】
前記第１のＡＰＳが、ライゲーションまたは重合を介した伸長によって前記第１のＥＳＢに付着させられる、請求項２６１に記載の方法。
【請求項２７５】
前記第２のＡＰＳが、ライゲーションまたは重合を介した伸長によって前記第１のＡＰＳに付着させられる、請求項２６１に記載の方法。
【請求項２７６】
前記共通リンカー部分が、核酸である、請求項２６１に記載の方法。
【請求項２７７】
前記ＥＳＢが、前記ＵＳＢに付着させられる、請求項２６１〜２７６に記載の方法。
【請求項２７８】
サンプル中の少なくとも１つの標的分子を検出するための方法であって、
（ａ）
（ｉ）少なくとも１つの標的分子を潜在的に含む細胞の集団、
（ｉｉ）第１の標的分子に特異的な第１のＵＢＡ、
（ｉｉｉ）該第１のＵＢＡのある領域に特異的な第１のエピトープ特異的バーコードＥＳＢであって、ここで、該ＥＳＢは、第１の共通リンカー部分を含む、第１のエピトープ特異的バーコードＥＳＢ、および
（ｉｖ）ＣＯＢの集団であって、ＣＯＢの該集団は、第２の共通リンカー部分を含み、該第２のリンカー部分は、該第１のＥＳＢの該第１の共通リンカー部分と相補的である、集団
を提供する工程、
（ｂ）該少なくとも１つの標的分子、該第１のＵＢＡプローブおよび該第１のＥＳＢを含む少なくとも第１の複合体を形成する工程であって、ここで、該少なくとも１つの標的分子は、該第１のＵＢＡに結合され、該ＥＳＢは、該ＵＢＡに結合される、工程、
（ｃ）ＣＯＢの該集団を加える工程であって、ここで、該少なくとも１つの標的分子、該第１のＵＢＡプローブ、該第１のＥＳＢおよび第１のＣＯＢによって第２の複合体が形成され、該第１のＣＯＢの該第２の共通リンカー部分は、該第１のＥＳＢの該第１のリンカー部分に結合され、ＣＯＢの該集団の該ＣＯＢは、細胞の該集団の細胞に関連している、工程、および
（ｄ）該第２の複合体または第３の複合体の少なくとも一部を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項２７９】
前記第１のＣＯＢが、複数のＡＰＳを含む、請求項２７８に記載の方法。
【請求項２８０】
工程（ｂ）において複数の複合体を形成する工程を包含する方法によって複数の標的分子を検出する工程をさらに包含し、各複合体は、（ｉ）少なくとも１つの標的分子、（ｉｉ）第１のＵＢＡ、および（ｉｉｉ）該第１のＵＢＡのある領域に特異的な第１のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）を含み、ここで該ＥＳＢは、第１の共通リンカー部分を含み、該少なくとも１つの標的分子は、該第１のＵＢＡに関連させられ、該ＥＳＢは、該ＵＢＡに関連させられる、請求項２７８に記載の方法。
【請求項２８１】
前記複数の複合体内の各ＣＯＢが、該ＣＯＢと細胞の前記集団中の他のＣＯＢとを区別する検出可能なシグナルまたは配列を有する、請求項２６３に記載の方法。
【請求項２８２】
ＡＰＳ、ＥＳＢまたはＵＢＡの前記連結が、化学的方法を用いて行われる、請求項２６１〜２８１に記載の方法。
【請求項２８３】
前記化学的方法が、クリックケミストリーを含む、請求項２８２に記載の方法。
【請求項２８４】
前記連結が、ＣｕＩの存在下で行われる、請求項２８２〜２８３に記載の方法。
【請求項２８５】
ＡＢＳｍ、ＥＳＢまたはＵＢＡの連結が、結合親和性を用いて行われる、請求項２６４〜２８４に記載の方法。
【請求項２８６】
ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢが、核酸を含む、請求項２６１〜２８５に記載の方法。
【請求項２８７】
ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢの前記連結が、連結される２つの構成要素に対する第１および第２の相補的領域を含む連結オリゴヌクレオチドを用いて行われる、請求項２８６に記載の方法。
【請求項２８８】
前記第１または第２の相補的領域が、ＡＰＳの集団内のＡＰＳ間で共有される、請求項２８７に記載の方法。
【請求項２８９】
前記第１または第２の相補的領域が、ＡＰＳの異なる集団に関して異なる、請求項２８７〜２８８に記載の方法。
【請求項２９０】
ライゲーションをさらに含む、請求項２８７〜２８９に記載の方法。
【請求項２９１】
前記連結オリゴヌクレオチドが、前記ＡＰＳまたは前記ＥＳＢの起源集団をコードするサブコードを含む、請求項２８７〜２９０に記載の方法。
【請求項２９２】
前記ＡＰＳが、該ＡＰＳの起源集団をコードするサブコードを有する、請求項２６１〜２９０に記載の方法。
【請求項２９３】
前記ＥＳＢが、該ＥＳＢの起源集団をコードするサブコードを有する、請求項２６１〜２９２に記載の方法。
【請求項２９４】
個々のＡＰＳ、ＥＳＢまたは連結オリゴヌクレオチド分子が、ユニークタグを含む、請求項２６１〜２９３に記載の方法。
【請求項２９５】
検出が、前記ユニークタグの検出を含む、請求項２９４に記載の方法。
【請求項２９６】
特定のＥＳＢと関連しているユニークタグの数が決定される、請求項２９５に記載の方法。
【請求項２９７】
検出されたユニークタグの数が、前記特定のＥＳＢの初期量に関係する、請求項２９６に記載の方法。
【請求項２９８】
前記ＥＳＢが、前記連結オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結される、請求項２８７〜２９７に記載の方法。
【請求項２９９】
ＡＰＳまたはＥＳＢが、増幅プライマー結合領域を含む、請求項２６１〜２９８に記載の方法。
【請求項３００】
ＣＯＢが、ペプチド配列をコードする、請求項２６１〜２９９に記載の方法。
【請求項３０１】
前記ＣＯＢが、ポリメラーゼ開始部位を含む、請求項２６１〜３００に記載の方法。
【請求項３０２】
前記ペプチドが、親和性タグを含む、請求項３００〜３０１に記載の方法。
【請求項３０３】
前記親和性タグが、Ｈｉｓタグである、請求項３０２に記載の方法。
【請求項３０４】
前記２つ以上のサンプルが、少なくとも５個のサンプルを含む、請求項２６１に記載の方法。
【請求項３０５】
前記２つ以上のサンプルが、少なくとも１０個のサンプルを含む、請求項２６１に記載の方法。
【請求項３０６】
前記２つ以上のサンプルが、少なくとも２０個のサンプルを含む、請求項２６１に記載の方法。
【請求項３０７】
直前の分割によって作製された前記サンプルの各々に、異なるＡＰＳを投入する、請求項２６１に記載の方法。
【請求項３０８】
細胞の集団中の細胞のＥＳＢに連結された標的分子を細胞起源バーコード（ＣＯＢ）で標識するための方法であって、
各細胞を個々の反応体積に分離する工程、および
化学的手段または親和性手段を介して該ＣＯＢを該ＥＳＢに付加する工程
を包含する、方法。
【請求項３０９】
前記反応体積が、微小気泡、微小滴、ウェル、微小ウェルおよびマイクロ流体デバイス内の囲われた空間からなる群より選択される、請求項３０８に記載の方法。
【請求項３１０】
細胞を起源とする種々のタイプの構成要素を解離させる工程および該構成要素を粒子上に配置する工程を包含する方法であって、該構成要素は、該粒子上で標識される、方法。
【請求項３１１】
前記標識する工程が、細胞の起源に従って標識することを包含する、請求項３１０に記載の方法。
【請求項３１２】
前記標識する工程が、構成要素のタイプに従って標識することを包含する、請求項３１０〜３１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、以下の同時係属中の特許出願：出願番号第６１／４３７，８５４号（２０１１年１月３１日に出願）への優先権を主張し、上記出願番号第６１／４３７，８５４号は、参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒトの身体のすべての細胞は、同じ遺伝物質を含んでいるが、それらの細胞のすべてにおいて同じ遺伝子が活性であるわけではない。遺伝子発現パターンの変化は、生物学的機能に重大な影響を及ぼし得る。さらに、遺伝子産物（タンパク質）、そのバリアントおよび相互作用パートナーの動態および制御を理解することは、例えば、遺伝的障害／および環境的に誘導される障害の背後にあるメカニズムまたは薬物媒介性治療の影響を理解する際に不可欠である。この理解は、さらなる臨床上および診断上の分析にとって基本的根拠になる可能性がある。ゆえに、細胞内での遺伝子および／またはそれらの産物の発現および制御の同定および定量は、治療上および診断上の新しい標的の発見を助け得る。
【０００３】
これらの研究に極めて重要なことは、遺伝子発現および全タンパク質の特定のバリアント（例えば、スプライスバリアント、点変異、翻訳後修飾されたバージョンおよび環境的／治療的に誘導される改変）を定性的に決定できること、ならびにそれらの定量的調節を考察できることである。さらに、細胞内のたった１つではなく複数の標的分子からこれらの分析を行うことが、ますます重要になっている。これまでに利用可能な方法は、かなりの量の生物学的サンプルをなおも必要とするか、または細胞特異的な情報を提供しない。そのうえ、タンパク質サンプルに固有のさらなる難題のために、多重化されたタンパク質測定技術の方法は限られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、複雑な細胞集団の各細胞において標的分子を正確かつ高感度に検出、同定および定量する必要があり、ならびにその標的分子に関する細胞特異的な情報を保持する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
本発明は、概して、サンプル中の標的分子の検出、同定および定量の分野に関する。本発明は、複雑な細胞集団の単一細胞内の個々の標的分子に関する細胞特異的な情報を保持しながらの、その標的分子の検出、同定および定量に部分的に関する。
【０００６】
いくつかの実施形態において、本発明は、複数の標的が複数の細胞に存在するか否かを同定するための方法に関し、その方法は：その標的に複数のタグを結合する工程を包含し、タグは、ａ）その標的の同一性およびｂ）タグが結合している細胞の同一性を表すコードを含む。いくつかの実施形態において、個々の細胞の分離または単離は、その結合工程に不必要である。いくつかの実施形態において、タグは、例えば、共有結合性結合または親和性による会合によって、互いに直接または間接的に関連させられる基本ブロック（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋｓ）を含む。いくつかの実施形態において、タグは、所定の位置における基本ブロックの重合によって形成される。いくつかの実施形態において、複数個の基本ブロックが、１つの工程において付加される。いくつかの実施形態において、単一の基本ブロックが、各工程において付加される。いくつかの実施形態において、細胞は、生存している。いくつかの実施形態において、細胞は、溶解されているかまたは固定されている。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本発明は、標的に関連する単一細胞を同定するための方法に関し、その方法は：その標的にタグを結合する工程を包含し、そのタグは、ａ）その標的およびｂ）その単一細胞を表すコードを含み；その結合において、その単一細胞は、細胞の集団から単離されず、かつその単一細胞を表すコードは、結合の前は未知である。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本発明は、標的に関連する単一細胞を同定するための方法に関し、その方法は：その標的にタグを結合する工程を包含し、そのタグは、ａ）その標的およびｂ）その単一細胞を表すコードを含み；その結合において、その単一細胞は、細胞の集団から単離され、かつその単一細胞を表すコードは、結合の前は未知である。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本発明は、上記コードを検出する工程をさらに包含し、ここで、個々の細胞の分離または単離は、その検出工程に不必要である。いくつかの実施形態において、各標的は、タンパク質または核酸である。いくつかの実施形態において、タグは、核酸またはポリペプチドである。いくつかの実施形態において、タグは、解読可能なコードを含む一連のモノマーサブユニットを含む。いくつかの実施形態において、タグは、解読され得るコードされた分子構成物である。いくつかの実施形態において、タグは、タグの性質を決定するために解読され得る部分の組み合わせを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、タグは、ＵＢＡを含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、標的のうちの１つに特異的である。いくつかの実施形態において、タグは、ＵＢＡを含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、抗体を含む。いくつかの実施形態において、タグは、ＥＳＢを含む。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、共通リンカー（ＣＬ）を含む。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、標的の同一性をコードする。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、核酸を含む。いくつかの実施形態において、タグは、ＡＰＳを含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、検出可能な検出可能に異なるコードユニットである。いくつかの実施形態において、結合工程中に、複数個のＡＰＳが、分割プール合成（ｓｐｌｉｔ  ｐｏｏｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）の連続したラウンドにおいて順序づけられた様式で前記タグに付加される。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも１０個のＡＰＳを含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、核酸を含む。いくつかの実施形態において、タグは、ライゲーションによって連結される複数個のＡＰＳ、ＥＳＢおよびＵＢＡを含む。いくつかの実施形態において、複数個のＡＰＳ、ＥＳＢおよび／またはＵＢＡは、クリックケミストリーで連結されることが可能である。いくつかの実施形態において、ＡＰＳまたはＥＳＢは、増幅プライマー結合領域を含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳは、鋳型になり得る（ｔｅｍｐｌａｔａｂｌｅ）。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳは、異なった識別可能構成物である（ＧＰＮ：そのコードの１つの部分が、核酸であり得、別の部分が、ポリペプチドであり得、別の部分が、小分子などであり得ることを意味する）。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本発明は、ａ）第１の標的分子、ｂ）第１の標的分子に特異的な第１のユニーク結合物質（ＵＢＡ）、ｃ）第１の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）およびｄ）複数の順序づけられたアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）を含む組成物に関し、ここで、そのＡＰＳの順序は、検出可能である。いくつかの実施形態において、標的分子は、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、リンタンパク質、抗体、核酸、ペプチド核酸、合成小分子、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、脂質、ステロイドおよびリン脂質からなる群より選択される。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本発明は、粒子（各々が少なくとも第１の標的分子を含む）の集団を含む組成物に関し、ここで、その第１の標的分子は：ａ）第１の標的分子に特異的な第１のユニーク結合物質（ＵＢＡ）、ｂ）第１の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）およびｃ）第１の複数の順序づけられたアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）と関連しており、ここで、その集団中の第１の粒子の第１の標的分子と関連している複数の順序づけられたＡＰＳは、その集団中の第２の粒子の第１の標的分子と関連している複数の順序づけられたＡＰＳとは検出可能に異なる。
【００１３】
いくつかの実施形態において、複数の順序づけられたＡＰＳは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のＡＰＳを含む。いくつかの実施形態において、複数の順序づけられたＡＰＳは、２０個より多いＡＰＳを含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、鋳型になり得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの別々の粒子は、細胞、リポソーム、細胞小器官、ミセル、液滴およびビーズからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、標的分子は、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、リンタンパク質、抗体、核酸、ペプチド核酸、合成小分子、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、脂質、ステロイドおよびリン脂質からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、第１のＥＳＢは、第１の共通リンカー（ＣＬ）を含む。いくつかの実施形態において、前記第１の標的分子は、前記第１のＵＢＡに直接結合され、前記第１のＥＳＢは、前記第１のＵＢＡに直接結合される。いくつかの実施形態において、複数の順序づけられたＡＰＳは、別個のラウンドにおけるＡＰＳの段階的付加によって形成される。いくつかの実施形態において、各ラウンドにおいて付加されるＡＰＳは、第１の複合体に連結される。いくつかの実施形態において、連結は、ラウンドの順序でされている。いくつかの実施形態において、連結は、結合親和性を介して行われる。いくつかの実施形態において、ＡＰＳ、ＥＳＢまたはＵＢＡの連結は、化学的方法を用いて行われる。いくつかの実施形態において、その化学的方法は、クリックケミストリーを含む。いくつかの実施形態において、連結は、ＣｕＩの存在下で行われる。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢは、核酸を含む。いくつかの実施形態は、ＵＢＡ、ＡＰＳおよびＥＳＢから選択される２つの構成要素に対する第１および第２の相補的領域を含む第１の連結オリゴヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢは、ＵＢＡ、ＡＰＳおよびＥＳＢから選択される２つの構成要素に対する第１および第２の相補的領域を含む連結オリゴヌクレオチドを用いて連結される。いくつかの実施形態は、ＵＢＡ、ＡＰＳおよびＥＳＢから選択される２つの構成要素に対する第３および第４の相補的領域を含む第２の連結オリゴヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢは、ＵＢＡ、ＡＰＳおよびＥＳＢから選択される２つの構成要素に対する第３および第４の相補的領域を含む連結オリゴヌクレオチドを用いて連結される。いくつかの実施形態において、第２および第４の相補的領域は、同一である。いくつかの実施形態において、第２および第４の相補的領域は、同一である。いくつかの実施形態において、第１または第２の相補的領域は、複数のＡＰＳのうちの２つのＡＰＳ間で共有される。いくつかの実施形態において、連結は、ライゲーションによって行われる。いくつかの実施形態において、連結オリゴヌクレオチドは、ＡＰＳまたはＥＳＢの起源をコードするサブコードを含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、ＡＰＳの起源をコードするサブコードを有する。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、ＥＳＢの起源をコードするサブコードを有する。いくつかの実施形態において、個々のＡＰＳ、ＥＳＢまたは連結オリゴヌクレオチド分子は、ユニークなカウンタータグ（ｃｏｕｎｔｅｒ  ｔａｇ）を含む。いくつかの実施形態において、ユニークなカウンタータグは、検出可能である。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、連結オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、ＡＰＳまたはＥＳＢは、増幅プライマー結合領域を含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＳおよびＥＳＢは、連結される場合、二次産物をコードすることができる。いくつかの実施形態において、その二次産物は、ＲＮＡまたはペプチドである。いくつかの実施形態において、ＡＰＳおよびＥＳＢは、連結される場合、ポリメラーゼ開始部位を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、親和性タグを含む。いくつかの実施形態において、その親和性タグは、Ｈｉｓタグである。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳは、鋳型になり得る。いくつかの実施形態において、組成物は、プローブをさらに含む。いくつかの実施形態において、プローブは、表面に付着させられている。いくつかの実施形態において、その表面は、アレイを含む。いくつかの実施形態において、その表面は、ビーズを含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、抗体、ペプチド、アプタマー、ペプトイドおよび核酸からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、核酸、ビーズおよび化学サブユニットからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、前記ＡＰＳは、決定論的重量（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｓｔｉｃ  ｗｅｉｇｈｔ）の核酸、小分子または組立可能な複合分子（ｂｕｉｌｄａｂｌｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞の集団中の細胞の標的分子を細胞起源バーコードで標識するためのキットに関し、そのキットは、ａ）ｍ個のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のｎ個のセット（その各々は、異なる情報パッケージを含み；ここで、その情報パッケージは、順序づけられた形式で連結されることが可能である）；ｂ）標的分子特異的なユニーク結合物質（ＵＢＡ）を備える。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞の集団中の細胞の標的分子を細胞起源バーコードで標識するためのキットに関し、そのキットは、ａ）ｍ個のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のｎ個のセット（その各々は、異なる情報パッケージを含み；ここで、その情報パッケージは、順序づけられた形式で連結されることが可能である）；ｂ）標的分子特異的な複数のユニーク結合物質（ＵＢＡ）（その各々は、ＵＢＡ特異的なエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）と連結されている）を備える。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞の集団中の細胞の標的分子を細胞起源バーコードで標識するためのキットに関し、そのキットは、ａ）ｍ個のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のｎ個のセット（その各々は、異なる情報パッケージを含み；ここで、その情報パッケージは、順序づけられた形式で連結されることが可能である）；ｂ）標的分子特異的な複数のユニーク結合物質（ＵＢＡ）；ｃ）ＵＢＡ特異的な複数のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）（各ＥＳＢは、指定のＵＢＡと連結することができる）を備える。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。いくつかの実施形態において、ｍは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である。いくつかの実施形態において、ｎは、１０より大きい。いくつかの実施形態において、ｍは、２０より大きい。いくつかの実施形態において、第１のＥＳＢは、第１の共通リンカー（ＣＬ）を含む。いくつかの実施形態において、前記ＥＳＢは、前記ＵＢＡに直接結合することができる。いくつかの実施形態において、前記ＵＢＡは、標的分子に直接結合することができる。いくつかの実施形態において、アッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）セットのうちの少なくとも２つは、同一である。いくつかの実施形態において、第１のセット中のＡＰＳは、第２のセット中のＡＰＳと連結可能である。いくつかの実施形態において、第１のセット中のＡＰＳは、順序づけられた形式で第２のセット中のＡＰＳとさらに連結可能である。いくつかの実施形態において、ＡＰＳ、ＥＳＢまたはＵＢＡは、化学的方法を用いて連結されることが可能である。いくつかの実施形態において、その化学的方法は、クリックケミストリーを含む。いくつかの実施形態において、ＣｕＩの存在が、連結のために必要とされる。いくつかの実施形態において、キットの構成要素は、親和性結合によって組み立てられ得る。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢは、核酸を含む。いくつかの実施形態において、キットは、ＵＢＡ、ＡＰＳおよびＥＳＢから選択される２つの構成要素に対する第１および第２の相補的領域を含む第１の連結オリゴヌクレオチドをさらに備える。いくつかの実施形態において、キットは、ＵＢＡ、ＡＰＳおよびＥＳＢから選択される２つの構成要素に対する第３および第４の相補的領域を含む第２の連結オリゴヌクレオチドをさらに備える。いくつかの実施形態において、第１および第３の相補的領域は、同一である。いくつかの実施形態において、第２および第４の相補的領域は、同一である。いくつかの実施形態において、ＡＰＳ、ＥＳＢまたはＵＢＡは、ライゲーションによって連結されることが可能である。いくつかの実施形態において、連結オリゴヌクレオチドは、ＡＰＳまたはＥＳＢの起源のセットをコードするサブコードを含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、ＡＰＳの起源集団をコードするサブコードを有する。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、ＥＳＢの起源集団をコードするサブコードを有する。いくつかの実施形態において、個々のＡＰＳ、ＥＳＢまたは連結オリゴヌクレオチド分子は、ユニークなカウンタータグを含む。いくつかの実施形態において、そのユニークなカウンタータグは、検出可能である。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、連結オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、ＡＰＳまたはＥＳＢは、増幅プライマー結合領域を含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＳおよびＥＳＢは、連結される場合、二次産物をコードすることができる。いくつかの実施形態において、その二次産物は、ＲＮＡまたはペプチドである。いくつかの実施形態において、ＡＰＳおよびＥＳＢは、連結される場合、ポリメラーゼ開始部位を構成する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、親和性タグを含む。いくつかの実施形態において、その親和性タグは、Ｈｉｓタグである。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳは、鋳型になり得る。いくつかの実施形態において、キットは、プローブをさらに備える。いくつかの実施形態において、そのプローブは、表面に付着させられている。いくつかの実施形態において、その表面は、アレイを含む。いくつかの実施形態において、その表面は、ビーズを含む。いくつかの実施形態において、複数のＵＢＡは、２、３、４、５、１０、２０、３０、５０、１００、２００、３００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個または１０００個より多いＵＢＡを含む。いくつかの実施形態において、複数のＵＢＡは、最大２０００個のＵＢＡを含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、抗体、ペプチド、アプタマー、ペプトイドおよび核酸からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、核酸、ビーズおよび化学サブユニットからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、前記ＡＰＳは、決定論的重量の核酸、小分子または組立可能な複合分子を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本発明は、共通の粒子起源を共有している標的分子を同定するための方法に関し、その方法は、ｘ個の粒子の集団中の第１の粒子の第１の複数の標的を第１の起源バーコードで標識する工程；およびｘ個の粒子の集団中の第２の粒子の第２の複数の標的を第２の起源バーコードで標識する工程を包含し、各起源バーコードは、ｎ個のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のセットを含み；ここで、ＡＰＳの第１および第２のセット中のそのｎ個のＡＰＳの各々は、ｍ個の異なるＡＰＳを含む群から選択され；第１および第２の起源バーコードは、ｃ＝１−［（１−１／ｘ）＾（ｍｎ）］の確実性で互いと検出可能に異なる。いくつかの実施形態において、ｘは、１，０００，０００より大きい。いくつかの実施形態において、ｃは、９９．９％より大きい。いくつかの実施形態において、ｃは、９９．９９％より大きい。いくつかの実施形態において、ｃは、９９．９９９％より大きい。いくつかの実施形態において、ｃは、９９．９９９９％より大きい。いくつかの実施形態において、ｃは、９９．９９９９９％より大きい。いくつかの実施形態において、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。いくつかの実施形態において、ｍは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である。いくつかの実施形態において、ｎは、１０より大きい。いくつかの実施形態において、ｍは、２０より大きい。
【００１９】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの別々の粒子は、細胞、リポソーム、細胞小器官、ミセル、液滴およびビーズからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、標的分子は、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、リンタンパク質、抗体、核酸、ペプチド核酸、合成小分子、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、脂質、ステロイドおよびリン脂質からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ｍ個の異なるＡＰＳを含む少なくとも２つの群は、同一である。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ｎ個のＡＰＳが、別個のラウンドにおいて付加される。いくつかの実施形態において、その別個のラウンドのＡＰＳは、連結される。いくつかの実施形態において、連結は、ラウンドの順序においてされる。いくつかの実施形態において、適切なｎおよび／またはｍは、細胞数ｘが与えられた場合に所望の確実性のレベルに基づいて選択される。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本発明は、粒子の集団の粒子の構成要素に粒子特異的コードを付与する方法に関し、その方法は：アッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）の第１の順序づけられたセットを粒子の集団の第１の粒子の第１の構成要素に連結する工程を包含し、ここで、そのＡＰＳの順序は、検出可能である。いくつかの実施形態において、その方法は、第１の構成要素と連結されたＡＰＳの第１の順序づけられたセットを検出することによって、第１の構成要素の粒子の起源を決定する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、その方法は、アッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）の第２の順序づけられたセットを粒子の集団の第１の粒子の第２の構成要素に連結する工程をさらに包含し、ここで、そのＡＰＳの順序は、検出可能である。いくつかの実施形態において、その方法は、第２の構成要素と連結されたＡＰＳの第２の順序づけられたセットを検出することによって、第２の構成要素の粒子の起源を決定する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、第１の粒子の第１および第２の構成要素と連結されたＡＰＳの第１および第２の順序づけられたセットは、同じである。いくつかの実施形態において、その方法は、アッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）の第３の順序づけられたセットを粒子の集団の第２の粒子の第１の構成要素に連結する工程をさらに包含し、ここで、そのＡＰＳの順序は、検出可能である。いくつかの実施形態において、第１の粒子の第１の構成要素と連結されたＡＰＳの第１の順序づけられたセットは、第２の粒子の第１の構成要素と連結されたアッセイ可能ポリマーサブユニットの第３の順序づけられたセットと異なる。いくつかの実施形態において、その方法は、構成要素特異的なエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）を第１の構成要素に連結する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、その方法は、構成要素特異的なＥＳＢを第２の構成要素に連結する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、少なくとも上記粒子は、細胞、リポソーム、細胞小器官、ミセル、液滴およびビーズからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的分子は、前記第１のＵＢＡに直接結合され、前記ＥＳＢは、前記ＵＢＡに直接結合される。いくつかの実施形態において、アッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）セットのうちの少なくとも２つは、同一である。いくつかの実施形態において、ＡＰＳの順序づけられたセットの各ＡＰＳは、第１の複合体に連結される。いくつかの実施形態において、連結は、ラウンドの順序においてされる。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳは、二次産物をコードする。いくつかの実施形態において、その二次産物は、ＲＮＡまたはペプチドである。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳは、鋳型になり得る。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、ユニークなカウンタータグをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記分子の標的分子の量は、カウンタータグを用いて推定される。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、ラウンド特異的サブコードをさらに含む。いくつかの実施形態において、検出は、指定のラウンドのＡＰＳの存在の決定をさらに含む。いくつかの実施形態において、検出は、デジタルである。いくつかの実施形態において、検出は、間接的である。いくつかの実施形態において、検出は、質量分析を含む。いくつかの実施形態において、検出は、核酸配列決定を含む。いくつかの実施形態において、検出は、ペプチド配列決定を含む。いくつかの実施形態において、検出は、大規模ゲル電気泳動（ｍａｓｓ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を含む。いくつかの実施形態において、検出は、ＨＰＬＣまたは他のクロマトグラフィー分離を含む。いくつかの実施形態において、検出は、１つ以上の個々のＡＰＳに関連する１つ以上のシグナルの検出を含む。いくつかの実施形態において、そのシグナルは、順序づけられている。いくつかの実施形態において、検出は、１つ以上のプローブの使用を含む。いくつかの実施形態において、そのプローブは、表面に付着させられている。いくつかの実施形態において、その表面は、アレイを含む。いくつかの実施形態において、その表面は、ビーズを含む。いくつかの実施形態において、検出は、分離を含む。いくつかの実施形態において、その分離は、多次元的である。いくつかの実施形態において、その分離は、第１の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）を第２の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）から分ける。いくつかの実施形態において、３、４、５、１０、２０、３０、５０、１００、２００、３００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個または１０００個より多い異なる標的分子が、検出される。いくつかの実施形態において、最大２０００個の異なる標的分子が、検出される。いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、抗体、ペプチド、アプタマー、ペプトイドおよび核酸からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、核酸、ビーズおよび化学サブユニットからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、前記ＡＰＳは、決定論的重量の核酸、小分子または組立可能な複合分子を含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、ライゲーションまたは重合を介した伸長によって連結される。いくつかの実施形態において、細胞起源バーコード（ＣＯＢ）は、ＡＰＳの順序づけられたセットのＡＰＳを用いて生成される。いくつかの実施形態において、前記複数の複合体内の各ＣＯＢは、それと細胞の前記集団中の他のＣＯＢとを区別する検出可能なシグナルまたは配列を有する。いくつかの実施形態において、ＡＰＳ、ＥＳＢまたはＵＢＡは、化学的方法を用いて連結される。いくつかの実施形態において、その化学的方法は、クリックケミストリーを含む。いくつかの実施形態において、連結は、ＣｕＩの存在下で行われる。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢは、核酸を含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢの連結は、連結される２つの構成要素に対する第１および第２の相補的領域を含む連結オリゴヌクレオチドを用いて行われる。いくつかの実施形態において、第１または第２の相補的領域は、ＡＰＳの集団内のＡＰＳ間で共有される。いくつかの��施形態において、第１または第２の相補的領域は、ＡＰＳの２つの異なるラウンド特異的セットに関して異なる。いくつかの実施形態において、上記方法は、ライゲーションをさらに含む。いくつかの実施形態において、標的分子は、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、リンタンパク質、抗体、核酸、ペプチド核酸、合成小分子、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、脂質、ステロイドおよびリン脂質からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、第１のＥＳＢは、第１の共通リンカー（ＣＬ）を含む。いくつかの実施形態において、第１のＥＳＢは、第１の共通リンカー（ＣＬ）を含む。いくつかの実施形態において、個々のＡＰＳ、ＥＳＢまたは連結オリゴヌクレオチド分子は、ユニークなカウンタータグを含む。いくつかの実施形態において、検出は、ユニークなカウンタータグの検出を含む。いくつかの実施形態において、特定のＥＳＢと関連しているユニークなカウンタータグの数が、決定される。いくつかの実施形態において、検出されたユニークなカウンタータグの数は、特定のＥＳＢの初期量に関係する。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、連結オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、ＡＰＳまたはＥＳＢは、増幅プライマー結合領域を含む。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、ペプチド配列をコードする。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、ポリメラーゼ開始部位を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、親和性タグを含む。いくつかの実施形態において、その親和性タグは、Ｈｉｓタグである。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本発明は、複数の別々の粒子を起源とする複数の特性を検出するための方法に関し、その方法は：ａ）ｉ）少なくとも第１の標的分子を含む粒子の集団；ｉｉ）第１の標的分子に特異的な第１のユニーク結合物質（ＵＢＡ）；ｉｉｉ）第１の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）；ｉｖ）ラウンド特異的な複数のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）セット（その各セットは、互いに検出可能に異なる複数のＡＰＳを含む）を提供する工程；ｂ）前記少なくとも第１の標的分子、前記第１のＵＢＡプローブおよび前記第１のＥＳＢを含む少なくとも第１の複合体を形成する工程；ｃ）ｎラウンドの分割プール合成を行う工程（その各ラウンドは；ｉ）粒子の集団をｍ個の反応体積に分割する工程；ｉｉ）そのラウンドに特異的なＡＰＳセットのＡＰＳと１つ以上の反応体積とを接触させる工程；ｉｉｉ）２つ以上の反応体積をプールする工程を含む）；ｄ）その粒子の集団の少なくとも１つの粒子から複数の特性を検出する工程を包含し、ここで、その特性の少なくとも１つは、その粒子に関連する標的分子についての量または同一性に関する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本発明は、複数の別々の粒子を起源とする複数の特性を検出するための方法に関し、その方法は：ａ）ｉ）少なくとも第１の標的分子を含む粒子の集団；ｉｉ）第１の標的分子に特異的な第１のユニーク結合物質（ＵＢＡ）；ｉｉｉ）第１の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）；およびｉｖ）ラウンド特異的な複数のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）セット（その各セットは、互いに検出可能に異なる複数のＡＰＳを含む）を提供する工程；ｂ）前記少なくとも第１の標的分子、前記第１のＵＢＡプローブおよび前記第１のＥＳＢを含む少なくとも第１の複合体を形成する工程；ｃ）ｎラウンドの分割プール合成を行う工程（その各ラウンドは、ｉ）粒子の集団をｍ個の反応体積に分割する工程；ｉｉ）そのラウンドに特異的なＡＰＳセットのＡＰＳと１つ以上の反応体積とを接触させる工程；およびｉｉｉ）２つ以上の反応体積をプールする工程を含む）；ｄ）工程ｃ）のｉ）およびｃ）のｉｉ）を含む分割プール合成の別のラウンドを行う工程；ｅ）その粒子の集団の少なくとも１つの粒子から複数の特性を検出する工程を包含し、ここで、その特性の少なくとも１つは、その粒子に関連する標的分子についての量または同一性に関する。
【００２４】
いくつかの実施形態において、分割プール法は、例えば、微小ウェルまたはマイクロ流体デバイス内での粒子の分離によって置き換えられる。いくつかの実施形態において、分離された細胞は、細胞起源バーコードで標識される。いくつかの実施形態において、細胞起源バーコードは、基本ブロックの段階的付加によって適当な位置において組立てられる。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である。いくつかの実施形態において、ｎは、２０より大きい。いくつかの実施形態において、ｍは、少なくとも２ラウンドの間で異なる。いくつかの実施形態において、ｍは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である。いくつかの実施形態において、ｍは、２０より大きい。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの別々の粒子は、細胞、リポソーム、細胞小器官、ミセル、液滴およびビーズからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、標的分子は、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、リンタンパク質、抗体、核酸、ペプチド核酸、合成小分子、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、脂質、ステロイドおよびリン脂質からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、第１のＥＳＢは、第１の共通リンカー（ＣＬ）を含む。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的分子は、前記第１のＵＢＡに直接結合され、前記ＥＳＢは、前記ＵＢＡに直接結合される。いくつかの実施形態において、アッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）セットのうちの少なくとも２つは、同一である。いくつかの実施形態において、各ラウンドにおいて付加されるＡＰＳは、第１の複合体に連結される。いくつかの実施形態において、連結は、ラウンドの順序においてされる。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳは、二次産物をコードする。いくつかの実施形態において、その二次産物は、ＲＮＡまたはペプチドである。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳは、鋳型になり得る。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、ユニークなカウンタータグをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記分子の標的分子の量は、カウンタータグを用いて推定される。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、ラウンド特異的サブコードをさらに含む。いくつかの実施形態において、検出は、指定のラウンドのＡＰＳの存在の決定をさらに含む。いくつかの実施形態において、検出は、デジタルである。いくつかの実施形態において、検出は、間接的である。いくつかの実施形態において、検出は、質量分析を含む。いくつかの実施形態において、検出は、核酸配列決定を含む。いくつかの実施形態において、検出は、ペプチド配列決定を含む。いくつかの実施形態において、検出は、１つ以上の個々のＡＰＳに関連する１つ以上のシグナルの検出を含む。いくつかの実施形態において、そのシグナルは、順序づけられている。いくつかの実施形態において、検出は、１つ以上のプローブの使用を含む。いくつかの実施形態において、そのプローブは、表面に付着させられている。いくつかの実施形態において、その表面は、アレイを含む。いくつかの実施形態において、その表面は、ビーズを含む。いくつかの実施形態において、検出は、分離を含む。いくつかの実施形態において、その分離は、多次元的である。いくつかの実施形態において、その分離は、第１の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）を第２の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）から分離する。いくつかの実施形態において、３、４、５、１０、２０、３０、５０、１００、２００、３００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個または１０００個より多い異なる標的分子が、検出される。いくつかの実施形態において、最大２０００個の異なる標的分子が、検出される。いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、抗体、ペプチド、アプタマー、ペプトイドおよび核酸からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、核酸、ビーズおよび化学サブユニットからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、前記ＡＰＳは、決定論的重量の核酸、小分子または組立可能な複合分子を含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、ライゲーションまたは重合を介した伸長によって連結される。いくつかの実施形態において、細胞起源バーコード（ＣＯＢ）は、ラウンド特異的なＡＰＳセットのＡＰＳから生成される。いくつかの実施形態において、前記複数の複合体内の各ＣＯＢは、それと細胞の前記集団中の他のＣＯＢとを区別する検出可能なシグナルまたは配列を有する。いくつかの実施形態において、ＡＰＳ、ＥＳＢまたはＵＢＡは、化学的方法を用いて連結される。いくつかの実施形態において、その化学的方法は、クリックケミストリーを含む。いくつかの実施形態において、連結は、ＣｕＩの存在下で行われる。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢは、核酸を含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢの連結は、連結される２つの構成要素に対する第１および第２の相補的領域を含む連結オリゴヌクレオチドを用いて行われる。いくつかの実施形態において、第１または第２の相補的領域は、ＡＰＳの集団内のＡＰＳ間で共有される。いくつかの実施形態において、第１または第２の相補的領域は、ＡＰＳの２つの異なるラウンド特異的セットに関して異なる。いくつかの実施形態は、ライゲーションをさらに含む。いくつかの実施形態において、連結オリゴヌクレオチドは、ＡＰＳまたはＥＳＢの起源集団をコードするサブコードを含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、そのＡＰＳのラウンド特異的セットをコードするサブコードを有する。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、ＥＳＢの起源の存在をコードするサブコードを有する。いくつかの実施形態において、個々のＡＰＳ、ＥＳＢまたは連結オリゴヌクレオチド分子は、ユニークなカウンタータグを含む。いくつかの実施形態において、検出は、ユニークなカウンタータグの検出を含む。いくつかの実施形態において、特定のＥＳＢと関連しているユニークなカウンタータグの数が、決定される。いくつかの実施形態において、検出されたユニークなカウンタータグの数は、特定のＥＳＢの初期量に関係する。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、連結オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、ＡＰＳまたはＥＳＢは、増幅プライマー結合領域を含む。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、ペプチド配列をコードする。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、ポリメラーゼ開始部位を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、親和性タグを含む。いくつかの実施形態において、その親和性タグは、Ｈｉｓタグである。いくつかの実施形態において、直前の分割によって作製された反応体積の各々に、ＡＰＳセットの異なるＡＰＳを投入する。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本発明は、サンプル中の少なくとも１つの標的分子を検出するための方法を提供し、その方法は：（ａ）（ｉ）少なくとも１つの標的分子を潜在的に含む細胞の集団、（ｉｉ）第１の標的分子に特異的な第１のＵＢＡ、（ｉｉｉ）第１のＵＢＡのある領域に特異的な第１のエピトープ特異的バーコードＥＳＢ（そのＥＳＢは、第１の共通リンカー部分を含む）、および（ｉｖ）ＣＯＢの集団（そのＣＯＢの集団は、第２の共通リンカー部分を含み、その第２のリンカー部分は、第１のＥＳＢの第１の共通リンカー部分と相補的である）を提供する工程；（ｂ）少なくとも１つの標的分子、第１のＵＢＡプローブおよび第１のＥＳＢを含む少なくとも第１の複合体を形成する工程（その少なくとも１つの標的分子は、第１のＵＢＡに結合され、ＥＳＢは、ＵＢＡに結合される）；（ｃ）ＣＯＢの集団を加える工程（ここで、少なくとも１つの標的分子、第１のＵＢＡプローブ、第１のＥＳＢおよび第１のＣＯＢによって第２の複合体が形成され、第１のＣＯＢの第２の共通リンカー部分は、第１のＥＳＢの第１のリンカー部分に結合され、ＣＯＢの集団のＣＯＢは、細胞の集団の細胞に関連している）；および（ｄ）第２の複合体または第３の複合体の少なくとも一部を検出する工程を包含する。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本発明は、サンプル中の少なくとも１つの標的分子を検出するための方法を提供し、その方法は：（ａ）（ｉ）少なくとも１つの標的分子を潜在的に含む細胞の集団、（ｉｉ）第１の標的分子に特異的な第１のユニーク結合物質（ＵＢＡ）、（ｉｉｉ）第１のＵＢＡのある領域に特異的な第１のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）（そのＥＳＢは、第１の共通リンカー部分を含む）、および（ｉｖ）アッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）の集団（そのＡＰＳは、第２の共通リンカー部分および第３の共通リンカー部分を含み、その第２のリンカー部分は、第１のＥＳＢの第１の共通リンカー部分と相補的である）を提供する工程；（ｂ）少なくとも１つの標的分子、第１のＵＢＡプローブおよび第１のＥＳＢを含む少なくとも第１の複合体を形成する工程（その少なくとも１つの標的分子は、第１のＵＢＡに結合され、ＥＳＢは、ＵＢＡに結合される）；（ｃ）その集団を２つ以上のサンプルに分割する工程；（ｄ）工程（ｃ）の２つ以上のサンプルにＡＰＳの集団のＡＰＳを１サンプルあたり１つ加える工程（ここで、少なくとも１つの標的分子、第１のＵＢＡプローブ、第１のＥＳＢおよび第１のＡＰＳによって第２の複合体が形成され、第１のＡＰＳの第２の共通リンカー部分は、第１のＥＳＢの第１のリンカー部分に結合される）；（ｅ）工程（ｃ）の２つ以上のサンプルを１つのサンプルにプールする工程；（ｆ）工程（ｅ）のサンプルを２つ以上のサンプルに分割する工程；（ｇ）工程（ｅ）の２つ以上のサンプルにＡＰＳの集団のＡＰＳを１サンプルあたり１つ加える工程（ここで、少なくとも１つの標的分子、第１のＵＢＡプローブ、第１のＥＳＢ、第１のＡＰＳおよび第２のＡＰＳによって第３の複合体が形成され、第２のＡＰＳの第２の共通リンカー部分は、第１のＡＰＳの第３のリンカー部分に結合され、第１のＡＰＳおよび第２のＡＰＳは、細胞起源バーコード（ＣＯＢ）を形成する）；および（ｃ）第３の複合体または第３の複合体の少なくとも一部を検出する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、工程（ｅ）から（ｇ）を繰り返す工程をさらに包含する。
【００２８】
いくつかの実施形態において、上記方法は、工程（ｂ）において複数の複合体を形成することによって複数の標的分子を検出する工程をさらに包含し、その各複合体は、（ｉ）少なくとも１つの標的分子、（ｉｉ）第１のＵＢＡ、および（ｉｉｉ）第１のＵＢＡのある領域に特異的な第１のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）を含み、ここで、そのＥＳＢは、第１の共通リンカー部分を含み、少なくとも１つの標的分子は、第１のＵＢＡに結合され、ＥＳＢは、ＵＢＡに結合される。
【００２９】
いくつかの実施形態において、複数の複合体中の各ＣＯＢは、それと細胞の集団中の他のＣＯＢとを区別する検出可能なシグナルを有する。
【００３０】
いくつかの実施形態において、上記複合体は、配列決定または質量分析によって検出される。いくつかの実施形態において、第３の複合体は、第３の複合体の１つ以上の分子の存在を個別に計数する工程を包含する方法によって検出され、ここで、その第３の複合体の１つ以上の分子の存在は、細胞内の標的分子の濃度を示す。いくつかの実施形態において、個別に検出する工程は、デジタルのシグナルを検出する工程をさらに包含する。
【００３１】
いくつかの実施形態において、３、４、５、１０、２０、３０、５０、１００、２００、３００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個または１０００個より多い異なる標的分子が、検出される。いくつかの実施形態において、最大２０００個の異なる標的分子が、検出される。
【００３２】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、抗体、ペプチド、アプタマー、ペプトイドおよび核酸からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、核酸、ビーズおよび化学サブユニットからなる群より選択される。
【００３３】
いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、決定論的重量の核酸、小分子または組立可能な複合分子である。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、検出可能な標識が付着させられている相補的なポリヌクレオチド配列にハイブリダイズされる一本鎖核酸を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態において、第１のＡＰＳは、ライゲーションまたは重合を介した伸長によって第１のＥＳＢに付着させられる。いくつかの実施形態において、第２のＡＰＳは、ライゲーションまたは重合を介した伸長によって第１のＡＰＳに付着させられる。
【００３５】
いくつかの実施形態において、共通リンカー部分は、核酸である。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、ＵＳＢに付着させられる。
【００３６】
いくつかの実施形態において、前記第１のＣＯＢは、複数のＡＰＳを含む。
【００３７】
いくつかの実施形態は、工程（ｂ）において複数の複合体を形成する工程を包含する方法による複数の標的分子の検出をさらに含み、その各複合体は、（ｉ）少なくとも１つの標的分子、（ｉｉ）第１のＵＢＡ、および（ｉｉｉ）前記第１のＵＢＡのある領域に特異的な第１のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）を含み、ここで、前記ＥＳＢは、第１の共通リンカー部分を含み、前記少なくとも１つの標的分子は、前記第１のＵＢＡに関連させられ、前記ＥＳＢは、前記ＵＢＡに関連させられる。
【００３８】
いくつかの実施形態において、前記複数の複合体内の各ＣＯＢは、それと細胞の前記集団中の他のＣＯＢとを区別する検出可能なシグナルまたは配列を有する。
【００３９】
いくつかの実施形態において、ＡＰＳ、ＥＳＢまたはＵＢＡの連結は、化学的方法を用いて行われる。いくつかの実施形態において、その化学的方法は、クリックケミストリーを含む。いくつかの実施形態において、連結は、ＣｕＩの存在下で行われる。いくつかの実施形態において、ＡＢＳ、ＥＳＢまたはＵＢＡの連結は、結合親和性を用いて行われる。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢは、核酸を含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢの連結は、連結される２つの構成要素に対する第１および第２の相補的領域を含む連結オリゴヌクレオチドを用いて行われる。いくつかの実施形態において、第１または第２の相補的領域は、ＡＰＳの集団内のＡＰＳ間で共有される。いくつかの実施形態において、第１または第２の相補的領域は、ＡＰＳの異なる集団に関して異なる。いくつかの実施形態は、ライゲーションをさらに含む。いくつかの実施形態において、連結オリゴヌクレオチドは、ＡＰＳまたはＥＳＢの起源集団をコードするサブコードを含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、ＡＰＳの起源集団をコードするサブコードを有する。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、ＥＳＢの起源集団をコードするサブコードを有する。いくつかの実施形態において、個々のＡＰＳ、ＥＳＢまたは連結オリゴヌクレオチド分子は、ユニークタグを含む。いくつかの実施形態において、検出は、ユニークタグの検出を含む。いくつかの実施形態において、特定のＥＳＢと関連しているユニークタグの数が、決定される。いくつかの実施形態において、検出されたユニークタグの数は、その特定のＥＳＢの初期量に関係する。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、連結オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、ＡＰＳまたはＥＳＢは、増幅プライマー結合領域を含む。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、ペプチド配列をコードする。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、ポリメラーゼ開始部位を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、親和性タグを含む。いくつかの実施形態において、その親和性タグは、Ｈｉｓタグである。いくつかの実施形態において、２つ以上のサンプルは、少なくとも５個のサンプルを含む。いくつかの実施形態において、２つ以上のサンプルは、少なくとも１０個のサンプルを含む。いくつかの実施形態において、２つ以上のサンプルは、少なくとも２０個のサンプルを含む。いくつかの実施形態において、直前の分割によって作製されたサンプルの各々に、異なるＡＰＳを投入する。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞の集団中の細胞のＥＳＢに連結された標的分子を細胞起源バーコード（ＣＯＢ）で標識するための方法に関し、その方法は、各細胞を個々の反応体積に分離する工程；および化学的手段または親和性手段を介してＣＯＢをＥＳＢに付加する工程を包含する。いくつかの実施形態において、その反応体積は、微小気泡、微小滴、ウェル、微小ウェルおよびマイクロ流体デバイス内の囲われた空間（ｅｎｃｌｏｓｕｒｅ）からなる群より選択される。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞を起源とする種々のタイプの構成要素を解離する工程およびその構成要素を粒子上に配置する工程を包含する方法に関し、ここで、その構成要素は、前記粒子上で標識される。いくつかの実施形態において、その標識は、細胞の起源に従って標識する工程を包含する。いくつかの実施形態において、その標識は、構成要素のタイプに従って標識する工程を包含する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、検出工程中のシグナルは、順序づけられている。いくつかの実施形態において、検出は、１つ以上のプローブの使用を含む。いくつかの実施形態において、そのプローブは、表面に付着させられている。いくつかの実施形態において、その表面は、アレイを含む。いくつかの実施形態において、その表面は、ビーズを含む。いくつかの実施形態において、検出は、分離を含む。いくつかの実施形態において、その分離は、多次元的である。
【００４３】
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるような少なくとも１つのＵＢＡ、ＥＳＢおよび／またはＡＰＳを調製するための方法を提供する。
【００４４】
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるようなＵＢＡ、ＥＳＢおよび／またはＡＰＳの集団を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるようなＵＢＡ、ＥＳＢおよびＡＰＳの集団ならびにそれを使用するための指示書を備えるキットを提供する。
【００４５】
参照による援用
本明細書中で述べられるすべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願の各々が、参照により援用されると明確かつ個々に示されたのと同程度に、参照により本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
本発明の新規特徴は、添付の請求項に特に示される。本発明の特徴および利点のより十分な理解は、本発明の原理が用いられている例証的な実施形態を示す以下の詳細な説明および添付の図面を参照することにより得られるだろう：
【図１】図１は、各エピトープについての細胞起源の別個のシグネチャ（バーコード）を表している情報の量を表している。
【図２】図２は、本発明のエピトープ特異的バーコードおよび細胞起源バーコードの構成要素ならびにそれらの組み立ての１つの実施形態の図による表示を示している。
【図３】図３は、本発明の１つの実施形態のＵＢＡ−ＥＳＢ−ＣＬ試薬を示している。
【図４−１】図４は、ＵＢＡ−ＥＳＢ−ＣＬ試薬による、本発明の１つの実施形態における細胞の標識を表している。
【図４−２】図４は、ＵＢＡ−ＥＳＢ−ＣＬ試薬による、本発明の１つの実施形態における細胞の標識を表している。
【図５】図５は、本発明の１つの実施形態のＥＳＢ−ＣＯＢ試薬を表している。
【図６】図６は、本発明の１つの実施形態に係るＥＳＢ−ＣＯＢの組み立てを表している。
【図７】図７は、本発明の別の実施形態に係るＥＳＢ−ＣＯＢの組み立てを表している。
【図８】図８は、本発明の別の実施形態に係るＥＳＢ−ＣＯＢの組み立てを表している。
【図９】図９は、本発明の別の実施形態に係るＥＳＢ−ＣＯＢの組み立てを表している。
【図１０−１】図１０は、本発明の別の実施形態に係るＥＳＢ−ＣＯＢの組み立てを表している。
【図１０−２】図１０は、本発明の別の実施形態に係るＥＳＢ−ＣＯＢの組み立てを表している。
【図１１】図１１は、本発明の１つの実施形態に係るペプチドベースのＥＳＢ−ＣＯＢの読み出しを表している。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
発明の詳細な説明
用語「核酸」は、ヌクレオチドポリマーのことを指し、別段限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で機能し得る（例えば、ハイブリダイズし得る）天然ヌクレオチドの公知のアナログを含む。
【００４８】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用される。それらは、任意の長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらのアナログの重合形のことを指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有してよく、既知または未知の任意の機能を発揮し得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、遺伝子間ＤＮＡ、連鎖分析から定義される遺伝子座、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子核ＲＮＡ、リボザイム、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）（通常、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の逆転写または増幅によって得られる、ｍＲＮＡのＤＮＡ表現である）；合成的にまたは増幅によって生成されるＤＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド（例えば、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ）を含み得る。ヌクレオチド構造に対する改変は、存在する場合、ポリマーの組み立ての前または後に行われ得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識構成要素による結合体化などによって、重合後にさらに改変され得る。ポリヌクレオチド配列は、提供されるとき、別段述べられない限り、５’から３’の向きで列挙される。
【００４９】
核酸という用語は、二本鎖または三本鎖核酸ならびに一本鎖分子を包含する。二本鎖または三本鎖核酸において、核酸鎖は、同一の広がりを有する必要はない（すなわち、二本鎖核酸は、両鎖の全長にわたって二本鎖である必要はない）。
【００５０】
核酸という用語は、その任意の化学修飾（例えば、メチル化および／またはキャッピングによるもの）も包含する。核酸修飾は、個々の核酸塩基またはその核酸全体にさらなる電荷、分極率、水素結合、静電相互作用および官能性を組み込む化学基の付加を含み得る。そのような修飾は、塩基の修飾（例えば、２’位の糖の修飾、５位のピリミジンの修飾、８位のプリンの修飾、シトシン環外アミンにおける修飾、５−ブロモ−ウラシルの置換、骨格修飾、イソ塩基であるイソシチジンおよびイソグアニジンなどの通常でない塩基対形成の組み合わせなど）を含み得る。
【００５１】
より詳細には、ある特定の実施形態において、核酸には、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、およびプリンまたはピリミジン塩基のＮ−またはＣ−グリコシドである他の任意のタイプの核酸、ならびに非ヌクレオチド（ｎｏｒｍｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ）骨格を含む他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））およびポリモルホリノ（Ｎｅｕｇｅｎｅとして、Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，Ｏｒｅｇ．から商業的に入手可能）ポリマー、ならびに他の合成配列特異的核酸ポリマー（そのポリマーが、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるような塩基対の形成および塩基のスタッキングを可能にする配置で核酸塩基を含む場合）が含まれ得る。核酸という用語は、米国特許第６，７９４，４９９号、同第６，６７０，４６１号、同第６，２６２，４９０号および同第６，７７０，７４８号（ＬＮＡの開示のために、その全体が本明細書中で参照により援用される）に記載されている連結型核酸（ＬＮＡ）も包含する。
【００５２】
上記核酸は、固相媒介性の化学合成などの完全化学合成プロセス、核酸を産生する任意の種からの単離によるものなどの生物学的供給源、または分子生物学ツールによる核酸の操作を含むプロセス（例えば、ＤＮＡ複製、ＰＣＲ増幅、逆転写またはそれらのプロセスの組み合わせ）から得ることができる。
【００５３】
核酸「プローブ」は、１つ以上のタイプの化学結合によって、一般に、相補的な塩基対形成によって、通常、水素結合形成によって、相補的配列の標的核酸に結合することができ、ゆえに、二重鎖構造を形成することができる、オリゴヌクレオチドである。そのプローブは、「プローブ結合部位」に結合するかまたはハイブリダイズする。そのプローブは、特にいったんそのプローブがその相補的な標的とハイブリダイズしたらプローブの容易な検出を可能にする検出可能な標識で標識され得る。あるいは、しかしながら、そのプローブは、標識されない場合もあるが、直接または間接的に標識されたリガンドとの特異的な結合によって検出可能であり得る。プローブのサイズは、有意に変動し得る。一般に、プローブは、少なくとも７〜１５ヌクレオチド長である。他のプローブは、少なくとも２０、３０または４０ヌクレオチド長である。なおも他のプローブは、それよりもいくらか長く、少なくとも５０、６０、７０、８０または９０ヌクレオチド長である。さらに他のプローブは、なおもそれより長く、少なくとも１００、１５０、２００ヌクレオチド長またはそれ以上である。プローブは、上記の任意の値によって境界がなされる任意の範囲内の任意の長さ（例えば、１５〜２０ヌクレオチド長）でもあり得る。
【００５４】
プライマーまたはプローブは、標的核酸配列と完全に相補的であり得るか、または完全には相補的でないことがある。ある特定の実施形態において、プライマーは、少なくとも７ヌクレオチドの配列にわたって、より代表的には、１０〜３０ヌクレオチドの範囲の配列にわたって、しばしば、少なくとも１４〜２５ヌクレオチドの配列にわたって、標的核酸配列の相補鎖と少なくとも６５％の同一性を有し、より頻繁には、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する。ある特定の塩基（例えば、プライマーの３’塩基）が、標的核酸配列の対応塩基と一般に望ましくは完全に相補的であることが理解されるだろう。プライマーおよびプローブは、代表的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にアニールする。
【００５５】
親和性に依存する、混合物中に存在する利用可能な結合相互作用は、２つ以上の構成要素の結合特異性に対する特異性を定義する。一般に、第１の相互作用における１つ以上の結合パートナーにとって利用可能である他の利用可能な相互作用の結合親和性と比較して、第１の相互作用に対する高い結合親和性は、高特異性をもたらす。高特異性を有する結合パートナーは、指定された結合パートナーを形成する。
【００５６】
ここで、本発明の特に好ましい実施形態に対して詳細に言及する。好ましい実施形態の例は、下記の実施例の項で例証される。
【００５７】
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書中で言及されるすべての特許および刊行物は、その全体が参照により援用される。
【００５８】
いくつかの実施形態において、本発明は、生体分子サンプル中の個々の標的分子を検出および定量するための方法、組成物およびキットを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、その標的分子に関する細胞特異的な情報を保持しつつ、複雑な細胞集団の各細胞内の個々の標的分子を検出および定量するための方法、組成物およびキットを提供する。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、複雑な細胞集団を含むサンプル中の個々の標的分子を単一細胞ベースで検出および定量するための方法、組成物およびキットを提供する。したがって、いくつかの実施形態において、各細胞について、その細胞に関連する各標的分子の量がアッセイされる。特に、本発明は、個々の標的分子に結合できるユニーク結合物質を提供する。本発明は、標的分子をタグ化するエピトープ特異的バーコードの使用も提供する。本発明は、細胞の起源を示す細胞起源バーコードの使用も提供する。エピトープ特異的バーコードおよび細胞起源バーコードを介することにより、ユニーク結合物質と標的分子との結合によって、その標的分子が同定される。そのようなユニーク結合物質および／またはエピトープ特異的バーコードおよび／または細胞起源バーコードを作製および使用する方法も提供される。本明細書中に記載される方法および組成物は、診断、予後診断、品質管理およびスクリーニングの適用などの多種多様の適用において使用され得る。本発明のいくつかの実施形態は、細胞を個別にタグ化するための方法、組成物およびキットに関する。
【００５９】
用語「エピトープ」および「標的分子」は、本明細書中に記載される方法によって検出および／または定量される目的の分子（その一部または分子全体）のことを指すために本明細書中で交換可能に使用される。
【００６０】
本発明のある特定の態様は、複数個の標的分子の検出に関する。本明細書中に記載される方法は、複数個の標的分子の検出、定量および感度の分野において潜在的な利益を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、複数個のタンパク質の測定および／または複数個の核酸の測定を研究するための高感度かつ高信頼性の方法および組成物を提供する。
【００６１】
１つのサンプル内で単一細胞レベルで多重化することが、このアプローチの重要な利点である。１つのサンプル内での多重化は、有意に労力を節約し、測定数に比例してサンプルの必要量を減少させ、サンプル取扱工程と測定工程とが別々であることにより悪化する誤差を排除することによって精度を改善する。さらに、複雑な細胞集団内の単一細胞中の複数個の標的分子の測定結果を得ることによって、個々の各細胞内の生理学的プロセスがより十分に理解される。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法は、一度に分析されるプロセシング中に種々のサンプルを一緒にプールすることを可能にする。これにより、処理量の利点が提供され、種々のサンプルの分析が加速し得る。
【００６２】
いくつかの実施形態において、本発明は、標的分子を分析するためのユニーク結合物質（ＵＢＡ）を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、多重化アッセイにおいて使用するためのＵＢＡ集団を提供する。その集団中の各ＵＢＡは、標的分子に特異的である。したがって、ＵＢＡは、細胞において認識される標的分子に対する特異性を提供する。次いで、標的分子とＵＢＡとの結合は、エピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）および細胞起源バーコード（ＣＯＢ）を用いて検出される。各ＥＳＢは、特定の標的分子に関連し得るユニークなコードを含む。各ＣＯＢは、特定の細胞の起源に関連し得るユニークなコードを含む。
【００６３】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、直接または間接的にＵＢＡに付着させられる。他の実施形態において、ＥＳＢは、例えば、アッセイ手順の一部として、細胞内またはサンプル中のＵＢＡに結合する。ユニークＣＯＢは、各ＣＯＢが特定の細胞内のＵＢＡに結合した標的分子と関連させられ得るように、その細胞内のＵＢＡと関連させられる。いくつかの実施形態において、特定のＥＳＢ／ＣＯＢの組み合わせは、標的分子またはエピトープの各々を表す情報の量として言及される（図１を参照のこと）。
【００６４】
いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、１つ以上のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）から構成される。本発明のある特定の態様は、デザインされた（例えば、合成配列）ＡＰＳのライブラリーまたは集団の選択に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、デザインされた（例えば、合成の）ＡＰＳの集団を提供し、ここで、前記ＡＰＳは、ユニーク配列および／または検出可能分子を含み、各ＣＯＢにおける１つ以上の異なるＡＰＳの組み合わせは、その各ＣＯＢと前記集団中の他のＣＯＢとを区別する検出可能なシグナルまたは配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明は、検出可能な標識が付着させられているユニークな相補的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするユニーク配列（例えば、合成）を含むＡＰＳを提供する。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、配列決定によって検出される。したがって、本発明のある特定の態様は、ユニークＣＯＢまたはＥＳＢ／ＣＯＢの集団を提供し、その各々は、ユニークＡＰＳに基づく組み合わせを含み、ここで、その集団中のＣＯＢまたはＥＳＢ／ＣＯＢの各々は、その集団中の他のＣＯＢまたはＥＳＢ／ＣＯＢと異なる。ＡＰＳは、通常、ＣＯＢを含むコンストラクトを形成することができる。そのような形成を可能にする任意の化学構造が、ＡＰＳのために使用され得る。
【００６５】
ユニーク結合物質（ＵＢＡ）
ＵＢＡは、少なくとも１つの標的分子、少なくとも１つの標的分子代用物またはその両方と結合するようにデザインされた分子または構築部品（ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ）であり；適切な条件下において、ＵＢＡおよび標的分子を含む分子複合体を形成し得る。標的分子の例としては、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、イオン、小分子、有機モノマーおよび薬物が挙げられるが、これらに限定されない。単に便宜のため、本明細書中に記載される実施形態のほとんどが、標的タンパク質または標的ｍＲＮＡに結合するＵＢＡに照らして説明される。しかしながら、これらの実施形態は、他の標的分子にも適用され得る。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「アミノ酸配列」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーのことを指すために本明細書中で交換可能に使用される。そのポリマーは、直鎖状であっても分枝状であってもよく、改変されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸または合成アミノ酸によって中断されてもよい。上記の用語は、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識構成要素による結合体化などの他の任意の操作によって改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書中で使用されるとき、用語「アミノ酸」は、天然および／もしくは非天然または合成のアミノ酸（グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物を含むがこれらに限定されない）のことを指す。
【００６６】
ＵＢＡは、代表的には配列特異的様式、コンフォメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）特異的様式またはその両方での（例えば、抗原−抗体結合、アプタマー−標的結合などであるがこれらに限定されない）、少なくとも１つの標的分子、少なくとも１つの標的分子の少なくとも一部、少なくとも１つの標的分子代用物、標的分子代用物の少なくとも一部またはそれらの組み合わせとＵＢＡとの結合または相互作用を可能にする少なくとも１つの反応部分を含む。
【００６７】
ある特定の実施形態において、ＵＢＡは、同一性部分または同一性部分の少なくとも一部、例えば、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＥＳＢおよび／またはリンカーオリゴを含む。ある特定の実施形態において、ＵＢＡは、捕捉領域を含む。いくつかの実施形態において、その捕捉領域は、ＵＢＡの単離および／または表面へのＵＢＡの固定化のために使用される。その捕捉領域は、親和性タグ、ビーズ、スライド、アレイ、微小滴、マイクロ流体デバイス内の囲われた空間または当該分野の他の任意の好適な捕捉領域であり得る。いくつかの実施形態において、捕捉領域は、ＥＳＢであり、例えば、そのＥＳＢは、検出可能なビーズ（例えば、ユニークなスペクトルシグネチャを有するビーズ（例えば、赤色および赤外フルオロフォアで内部的に染色されたビーズ））であり得る。捕捉領域は、本発明の組成物の操作を行うことができる反応体積を定義し得る。
【００６８】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、抗体である。本明細書中で使用されるとき、抗体という用語は、インタクトな抗体分子（例えば、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＧおよび免疫グロブリンＭであるがこれらに限定されない）だけでなく、少なくとも１つのエピトープに免疫特異的に結合する、抗体分子の任意の免疫反応性の構成要素も含むように広い意味で使用される。そのような免疫反応性の構成要素としては、ＦＡｂフラグメント、ＦＡｂ’フラグメント、ＦＡｂ’２フラグメント、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）、ミニ抗体、ダイアボディ、架橋抗体フラグメント、ＡｆｆｉｂｏｄｙＴＭ、シクロチド、分子などが挙げられるがこれらに限定されない。抗体操作またはタンパク質操作の手法を用いて得られる免疫反応性の産物もまた、明確に抗体という用語の意味の範囲内である。関連するプロトコルを含む、抗体および／またはタンパク質操作の詳細な説明は、とりわけ、Ｊ．Ｍａｙｎａｒｄ  ａｎｄ  Ｇ．Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．２：３３９  ７６（２０００）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｒ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｄｕｂｅｌ，ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（２００１）；米国特許第５，８３１，０１２号；およびＳ．Ｐａｕｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）に見られる。
【００６９】
当業者は、抗体が、種々の供給源（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異的抗体、組換え的に発現された抗体、ヒト化抗体、植物抗体などを含むがこれらに限定されない）から得ることができること；および種々の動物種（ウサギ、マウス、ヤギ、ラット、ヒト、ウマ、ウシ、モルモット、ニワトリ、ヒツジ、ロバ、ヒトなどを含む）から得ることができること認識するだろう。多種多様の抗体が商業的に入手可能であり、特注の抗体をいくつかの契約研究所から得ることができる。関連するプロトコルを含む、抗体の詳細な説明は、とりわけ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎらｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９９年、２００３年８月までの改訂を含む）；Ｔｈｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ；Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｇ．Ｈｏｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｄ．Ｂｅｔｈｅｌ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）；Ｊ．Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｄ  Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）；Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）；Ａ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍ．Ｔｕｒｎｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １  ａｎｄ  ２，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）；Ｃ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｄ  ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ａ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｔｈｏｒｐｅ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｔｄ．（１９９６）；Ｈ．Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ（Ｂａｓｉｃｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｂｅｎｃｈ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（２０００）；およびＳ．Ｈｏｃｋｆｉｅｌｄら、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）に見られる。さらに、莫大な数の商業的に入手可能な抗体（標識されたかまたは標識されていない；ポリクローナル、モノクローナルおよび単一特異的抗体、ならびにそれらの免疫反応性の構成要素を含む）；カスタム抗体供給業者などは、とりわけ、ワールドワイドウェブ上のｂｉｏｃｏｍｐａｒｅ．ｃｏｍにおけるＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｅａｒｃｈページ、ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍにおけるＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｐａｇｅおよびｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍにおけるＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒページに見られる。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される抗体は、核酸、例えば、リンカーオリゴまたは核酸ＥＳＢに付着させられる。核酸を抗体に付着する方法は、当該分野で公知である。核酸を抗体に付着する任意の好適な方法が、本発明の方法に含まれる。本明細書中に記載される抗体は、Ｇｕｌｌｂｅｒｇら、ＰＮＡＳ  １０１（２２）：２２８４２０−８４２４頁（２００４）；およびＢｏｏｚｅｒら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７６（２３）：６９６７−６９７２頁（２００４）（両方が、本明細書中で参照により援用される）に記載されている方法によって、核酸に付着させられ得る。本明細書中に記載される抗体は、ランダムなアミン付着によって核酸に付着させられ得る。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される抗体は、１０対１の比の核酸と抗体とを使用するランダムなアミン付着によって核酸に付着させられ得る。本明細書中に記載される抗体は、本明細書中で参照により援用されるＫｏｚｌｏｖら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ５：７３（５）：６２１−６３０頁（２００４）に記載されている方法によって核酸に付着させられ得る。本明細書中に記載される抗体は、ヒドラジン化学によって核酸に付着させられ得る。本明細書中に記載される抗体は、本明細書中で参照により援用されるＮｏｌａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２，１１−１２（２００５）に記載されているようにタドポール（ｔａｄｐｏｌｅ）を用いて核酸に付着させられ得る。本明細書中に記載される抗体は、本明細書中に記載される抗体を含む操作された抗体を作製する当該分野で公知の任意の好適な方法によって核酸に付着させられ得る。
【００７１】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、アプタマーである。アプタマーには、核酸アプタマー（すなわち、一本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＲＮＡ分子）およびペプチドアプタマーが含まれる。アプタマーは、高度に特異的なコンフォメーション依存的様式で、代表的には、非常に高い親和性で、標的分子に結合するが、それより低い結合親和性を有するアプタマーも所望であれば選択され得る。アプタマーは、非常に小さい構造的差異（例えば、メチル基またはヒドロキシル基の有無）に基づいて標的を区別すると示されており、ある特定のアプタマーは、Ｄ−エナンチオマーとＬ−エナンチオマーを区別し得る。小さな分子標的（薬物、金属イオンおよび有機色素を含む）、ペプチド、ビオチンおよびタンパク質（ストレプトアビジン、ＶＥＧＦおよびウイルスタンパク質を含むがこれらに限定されない）に結合するアプタマーが得られている。アプタマーは、ビオチン化後、フルオレセイン標識後、ならびにガラス表面およびミクロスフェアに付着させられたときに、機能活性を保持すると示されている。
【００７２】
シュピーゲルマー（ｓｐｅｉｇｅｌｍｅｒ）を含む核酸アプタマーは、試験管内進化法（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＳＥＬＥＸ）として公知のインビトロ選択プロセスによって同定される。このＳＥＬＥＸプロセスでは、オリゴヌクレオチドの非常に大きなコンビナトリアルライブラリー、例えば、６０〜１００ヌクレオチド長の大きさであることが多い１０１４〜１０１５個の個々の配列が、インビトロ選択および増幅の反復プロセスによって慣例的にスクリーニングされる。ほとんどの標的が、８〜１５サイクル以内に親和性濃縮され、そのプロセスは、自動化されており、より迅速なアプタマー単離が可能になっている。ペプチドアプタマーは、代表的には、当該分野で公知のいくつかの異なるタンパク質操作手法（ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、選択的感染ファージ技術（ＳＩＰ）などを含むがこれらに限定されない）によって同定される。当業者は、核酸アプタマーおよびペプチドアプタマーが、従来の手順に従って、かつ過度の実験を行うことなく、得ることができることを理解するだろう。関連するプロトコルを含む、アプタマーの詳細な説明は、とりわけ、Ｌ．Ｇｏｌｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（２３）：１３５８１  ８４（１９９５）；Ｓ．Ｊａｙａｓｅｎａ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４５：１６２８−５０（１９９９）；Ｖ．Ｓｉｅｂｅｒら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（１０）：９５５−６０（１９９８）；Ｄ．Ｗｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓｚｏｓｔａｋ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６８：６１１−４７（１９９９）；Ｌ．Ｊｅｒｍｕｔｕｓら、Ｅｕｒ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，３１：１７９−８４（２００２）；Ｓ  Ｓ．Ｓｐａｄａら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７８：４４５−５６（１９９７）；Ｂ．Ｗｌｏｔｚｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９９：８８９８−８９０２（２００２）に見られる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、アプタマーは、リンカーオリゴまたは核酸ＥＳＢなどの核酸にライゲートされるかまたはハイブリダイズされる。アプタマーのハイブリダイゼーションまたはライゲーションは、当該分野で公知の任意の好適な方法によって行われ得る。例えば、ライゲーションは、少なくとも１つのＤＮＡリガーゼまたは少なくとも１つのＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）リガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡリガーゼまたはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）リガーゼであるがこれらに限定されない）によって酵素的に行われ得る。ライゲーションは、活性化剤および還元剤（例えば、カルボジイミド、臭化シアン（ＢｒＣＮ）、イミダゾール、１−メチルイミダゾール／カルボジイミド／シスタミン、Ｎ−シアノイミダゾール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）および紫外線）を用いる化学的ライゲーションによっても行われ得る。
【００７４】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、ペプトイドである。ペプトイドは、タンパク質に結合するＮ−置換グリシン合成ペプチドの短い配列である。いくつかの実施形態において、小さいサイズのペプトイドは、拡散および本明細書中に記載される方法の動態を改善する。ペプトイドを作製する当該分野で公知の任意の好適な方法は、本明細書中に記載される方法に包含される。Ｓｉｍｏｎら、ＰＮＡＳ  １５；８９（２０）：９３６７−９３７１（１９９２）（本明細書中で参照により援用される）を参照のこと。
【００７５】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、核酸配列、例えば、標的ｍＲＮＡに対するアンチセンスＤＮＡである。その核酸配列は、好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド長、より好ましくは、少なくとも２０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、標的特異的配列は、約１０〜５００、２０〜４００、３０〜３００、４０〜２００または５０〜１００ヌクレオチド長である。他の実施形態において、標的特異的配列は、約３０〜７０、４０〜８０、５０〜９０または６０〜１００、３０〜１２０、４０〜１４０または５０〜１５０ヌクレオチド長である。
【００７６】
エピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）
いくつかの実施形態において、本発明は、エピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）を提供する。各ＥＳＢは、特定の標的分子と関連し得るユニークなコードを含む。ＥＳＢは、少なくとも１つのＵＢＡまたはＵＢＡの一部と結合するようにデザインされた分子または構築部品であり；適切な条件下において、ＥＳＢ、ＵＢＡおよび標的分子を含む分子複合体を形成し得る。
【００７７】
ＥＳＢは、代表的には配列特異的様式、コンフォメーション特異的様式またはその両方での（例えば、ＵＢＡ−抗体結合、アプタマー−標的結合などであるがこれらに限定されない）、ＥＳＢと少なくとも１つのＵＢＡとの結合または相互作用を可能にする少なくとも１つの同一性同定部分を含み得る。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、直接または間接的にＵＢＡに付着させられる。他の実施形態において、ＥＳＢは、例えば、アッセイ手順の一部として、細胞またはサンプル中のＵＢＡに結合する。
【００７８】
ある特定の実施形態において、ＥＳＢは、固体表面または捕捉領域であり、例えば、ＥＳＢは、検出可能なビーズ（例えば、ユニークなスペクトルシグネチャを有するビーズ（例えば、赤色および赤外フルオロフォアで内部的に染色されたビーズ））であり得る。いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、その捕捉領域に直接または間接的に付着させられる。
【００７９】
ある特定の実施形態において、ＥＳＢは、共通リンカー部分、例えば、リンカーオリゴを含む。ある特定の実施形態において、共通リンカーオリゴは、細胞起源バーコード（ＣＯＢ）を形成するアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）における共通リンカーオリゴと相補的である。
【００８０】
ある特定の実施形態において、ＥＳＢは、捕捉領域を含む。いくつかの実施形態において、その捕捉領域は、ＥＳＢの単離および／または表面へのＥＳＢの固定化のために使用される。捕捉領域は、親和性タグ、ビーズ、スライドまたはアレイであり得る。いくつかの実施形態において、捕捉領域は、検出可能なビーズ（例えば、ユニークなスペクトルシグネチャを有するビーズ（例えば、赤色および赤外フルオロフォアで内部的に染色されたビーズ））である。
【００８１】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、上に記載されたような抗体もしくはそのフラグメント、アプタマー、核酸またはペプトイドである。
【００８２】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、核酸である。いくつかの実施形態において、その核酸の一部は、当該分野で公知のような分枝鎖またはローリングサークルアプローチを用いて増幅される。
【００８３】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、ペプトイドである。ペプトイドは、タンパク質に結合するＮ−置換グリシン合成ペプチドの短い配列である。いくつかの実施形態において、小さいサイズのペプトイドは、拡散および本明細書中に記載される方法の動態を改善する。ペプトイドを作製する当該分野で公知の任意の好適な方法は、本明細書中に記載される方法に包含される。Ｓｉｍｏｎら、ＰＮＡＳ  １５；８９（２０）：９３６７−９３７１（１９９２）（本明細書中で参照により援用される）を参照のこと。
【００８４】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、核酸配列、例えば、相補的な標的核酸配列に対するアンチセンス核酸である。その核酸配列は、好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド長、より好ましくは、少なくとも２０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、標的特異的配列は、約１０〜５００、２０〜４００、３０〜３００、４０〜２００または５０〜１００ヌクレオチド長である。他の実施形態において、標的特異的配列は、約３０〜７０、４０〜８０、５０〜９０または６０〜１００、３０〜１２０、４０〜１４０または５０〜１５０ヌクレオチド長である。
【００８５】
細胞起源バーコード（ＣＯＢ）
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞起源バーコード（ＣＯＢ）を提供する。各ＣＯＢは、特定の細胞の起源に関連し得るユニークなコードを提供する。いくつかの実施形態において、ＥＳＢに関連する共通リンカー部分（例えば、共通リンカーオリゴ）にＣＯＢを結合する際、ＣＯＢコードは、ＵＢＡ／ＥＳＢ複合体が結合する標的分子の細胞起源を同定する。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のＣＯＢは、２つの主要な部分：（ｉ）ＵＢＡ／ＥＳＢプローブに関連する共通リンカー部分（例えば、共通リンカーオリゴ）に特異的な配列；および（ｉｉ）特定の細胞起源に関連し得るユニークなコードを含む。
【００８６】
いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、モジュラー構造である。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、複数の異なるアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、直鎖状の組み合わせで付着させられた複数のＡＰＳを含む。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、ある特定の基本的エレメント：（ｉ）骨格を形成する直鎖状の組み合わせで付着させられた、標識付着領域を含む複数のＡＰＳ、および（ｉｉ）その骨格の標識付着領域に相補的であり、かつそれに付着させられた、標識を含む相補的なポリヌクレオチド配列を含む分子実体である。標識付着領域という用語は、検出可能分子に対する個別の付着点として働き得る所与の骨格内の規定のポリヌクレオチド配列の領域を含む。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、直鎖状の組み合わせで付着させられた複数の異なるＡＰＳを含み、そのＡＰＳは、決定論的重量の小分子を含む。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、直鎖状の組み合わせで付着させられた２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のユニークＡＰＳを含む。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、直鎖状の組み合わせで付着させられた４個またはそれ以上のＡＰＳを含む。
【００８７】
いくつかの実施形態において、直鎖状の組み合わせで付着させられた複数のＡＰＳは、ユニークにデザインされた核酸配列を含み得る。さらに、ＣＯＢ内の直鎖状の組み合わせで付着させられた複数のＡＰＳは、少なくとも１つの鋳型を含み得る；例えば、少なくとも１つの核酸配列、例えば、直鎖状のもしくは直鎖化可能なウイルスゲノムの少なくとも一部、例えば、アデノウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ロタウイルスなどのゲノム、またはバクテリオファージ、例えば、ラムダ、Ｍ１３、φＸ−１７４、Ｔシリーズバクテリオファージなど、例えば、クローニングカセット、ポリリンカーなどを含むその誘導体、クローニングカセット、ポリリンカーなどを含むその誘導体を含むプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２およびｐＵＣシリーズプラスミドなど）；合成鋳型；人工配列を含む鋳型などであるがこれらに限定されない。当業者は、核酸の実質的に任意のピースが、少なくとも２個のＡＰＳを含むのに十分大きいか、または組み合わされた配列が少なくとも２個のＡＰＳを含むのに十分大きくなるように少なくとも１つの他の核酸配列と組み合わされ得るならば、その断片がＣＯＢを作製するための鋳型として働き得ることを理解するだろう。いくつかの実施形態において、本発明のＥＳＢ、ＡＰＳまたはＣＯＢは、鋳型になり得る基本ブロックに関する。いくつかの実施形態において、本発明のＵＢＡは、鋳型になり得る分子に関する。
【００８８】
いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、共通リンカー部分（例えば、共通リンカーオリゴ）を含む１つ以上のＡＰＳも含む。その共通リンカー部分は、ＡＰＳに直接または間接的に付着させられ得る。したがって、その共通リンカー部分は、ＣＯＢに共有結合的に付着させられ得るか、またはその共通リンカー部分は、後でアッセイにおいてＣＯＢに結合され得る。共通リンカー部分という用語は、約１０〜約２５ヌクレオチドの直列反復配列を含む。共通リンカー部分は、ＣＯＢの５’領域または３’領域において付着させられ得、イメージングまたは検出のためのＣＯＢの捕捉および固定化（例えば、共通リンカー部分と相補的な配列を固体基材に付着することによる）のために使用され得る。
【００８９】
ＣＯＢのエレメントは、単一の分子実体（単独のＣＯＢ）または２つの異なる分子実体（二重のＣＯＢ）として見られ得る。各分子実体は、１つの分子、または共有結合性もしくは非共有結合性手段によって互いに付着させられた２つ以上の分子から構成され得る。いくつかの実施形態において、二重のＣＯＢの各構成要素は、同じ標的分子上の異なる部位に結合する標的分子特異的ＵＢＡ／ＥＳＢを有する。二重のＣＯＢシステムを使用するとき、一方のＣＯＢは、標識されないことがある。いくつかの実施形態において、標識されないＣＯＢは、捕捉領域を含み得る。
【００９０】
本発明の様々な実施形態において、ＣＯＢは、個々のＡＰＳ基本ブロックから組み立てられる。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、直鎖状に組み合わされる。いくつかの実施形態において、ＡＰＳから組み立てられたＣＯＢは、そのＡＰＳの順序を維持する。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、分枝構造を含む。いくつかの実施形態において、分枝ＣＯＢ構造は、ＡＰＳ付加の順序に関する情報を含む。様々な実施形態において、ＣＯＢを形成している個々のＡＰＳが、解読され得る。いくつかの実施形態において、ＣＯＢを形成しているＡＰＳの順序または付加の順序が、解読され得る。理論に拘束されるものではないが、ＡＰＳ付加順序の保護および解読を可能にするプラットフォームは、同数のＡＰＳ基本ブロックからより多数の異なるＣＯＢが作製されるのに役立つ。ＣＯＢ分子タイプの総数が多いほど、ある集団内の２つの細胞／粒子が同じＣＯＢで標識される可能性は低下する。したがって、本発明の様々な実施形態の方法は、細胞／粒子の同一性を決定するためのより高い統計的有意性を可能にする。
【００９１】
いくつかの実施形態において、ＡＰＳに付着させられた相補的なポリヌクレオチド配列は、ＡＰＳに検出可能分子を付着するかまたはモノマーを標識するように働く。その相補的なポリヌクレオチド配列は、例えば、相補的なポリヌクレオチド配列への１つ以上の検出可能分子の共有結合性の組み込みによって、直接標識され得る。あるいは、相補的なポリヌクレオチド配列は、相補的なポリヌクレオチド配列へのビオチンまたは特異的なリガンド相互作用が可能な他の分子の組み込みなどによって、間接的に標識され得る。そのような場合、リガンド（例えば、相補的なポリヌクレオチド配列へのビオチンの組み込みの場合、ストレプトアビジン）が、検出可能分子に共有結合的に付着させられ得る。ＡＰＳに付着させられた検出可能分子が、相補的なポリヌクレオチド配列に直接組み込まれない場合、この配列は、検出可能分子とＡＰＳとの間の架橋として働き、架橋分子、例えば、架橋核酸と呼ばれることがある。
【００９２】
いくつかの実施形態において、本発明の核酸ベースのＣＯＢ、ＣＯＢ−ＥＳＢ複合体またはＣＯＢ／ＥＳＢ／ＵＢＡ複合体は、ＣＯＢの定常領域（例えば、共通リンカー部分、捕捉領域または親和性タグ）と相補的なオリゴヌクレオチドなどの核酸を用いて親和性精製され得るかまたは固定化され得る核酸を含む。上で述べたように、いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、精製および／または固定化（例えば、固体表面への）のための親和性タグとして働き得る少なくとも１つの共通リンカー部分を含む。その共通リンカー部分は、一連の１５塩基反復などの反復ヌクレオチドの２つ以上の直列反復領域を含み得る。そのような例示的な実施形態において、ＣＯＢは、ＥＳＢ、ＥＳＢ／ＵＢＡ、標的分子／ＵＢＡ／ＥＳＢまたはその他のものと複合体化されているかに関係なく、繰り返しユニットの逆相補鎖である１５塩基オリゴヌクレオチドでコーティングされた親和性試薬によって精製または固定化され得る。
【００９３】
ＣＯＢ、ＣＯＢ−ＥＳＢ複合体またはＣＯＢ／ＥＳＢ／ＵＢＡ複合体は、２つ以上の親和性選択工程において精製され得る。例えば、ＣＯＢがＥＳＢ／ＵＢＡ複合体に付着させられる実施形態では、ＣＯＢは、親和性タグを含み得る。他の実施形態において、二重のＣＯＢが使用されるとき、一方のＣＯＢは、第１の親和性タグを含み得、他方のＣＯＢは、第２の（異なる）親和性タグを含み得る。それらのＣＯＢは、標的分子と混合され、二重のＣＯＢの２つのプローブを含む複合体は、一方または両方の個々の親和性タグに対する親和性精製によって未結合物質と分離される。
【００９４】
第１の工程において、その混合物は、第１の親和性タグに対する親和性試薬と結合され得、第１の親和性タグおよび所望の複合体を含むプローブだけが精製される。結合した物質は、第１の親和性試薬から放出され、必要に応じて、第２の親和性タグに対する親和性試薬に結合されて、第１の親和性タグを含むＣＯＢから複合体が分離される。この時点では、完全な複合体だけが結合している。その複合体が、最後に、第２の親和性タグに対する親和性試薬から放出され、次いで、本明細書中に記載される方法によって分析される。その親和性試薬は、親和性タグに対する結合パートナーでコーティングされた任意の固体表面（例えば、結合パートナーでコーティングされたカラム、ビーズ（例えば、ラテックスまたは磁気ビーズ）またはスライド）であり得る。当該分野で公知の種々の親和性タグが、例えば、ＣＯＢ、ＣＯＢ−ＥＳＢ複合体またはＣＯＢ／ＥＳＢ／ＵＢＡ複合体を精製および／または固定化するために、使用され得る。いくつかの実施形態において、ビオチンアンカーが、ＣＯＢ、ＥＳＢおよび／またはＵＢＡに付着させられることにより、ストレプトアビジン表面（例えば、コーティングされたスライドまたはビーズ）上へのＣＯＢ、ＣＯＢ−ＥＳＢ複合体またはＣＯＢ／ＥＳＢ／ＵＢＡ複合体の固定化が可能になる。いくつかの実施形態において、親和性タグは、例えば、ＵＢＡを精製および／または固定化するために、ＵＢＡに付着させられる。親和性タグは、精製を含むがこれに限定されない種々の有用な適用のためにビーズまたは他のマトリックスに付着するために使用され得る。親和性タグならびにそれらを作製するおよび／または核酸に付着する方法の例は、米国特許第７，４７３，７６７号；米国出願番号１０／５４２，４５８；１２／３２４，３５７；１１／６４５，２７０および１２／５４１，１３１（それらの全体が本明細書中で参照により援用される）に記載されている。いくつかの実施形態において、ＥＳＢ、ＵＢＡ、ＡＰＳおよびＣＯＢのうちの少なくとも２つが、本明細書中に記載される異なる化学組成物または当該分野で公知の他の任意の好適な組成物を含む。例えば、ＥＳＢは、ペプチドおよび／または核酸を含み得、ＡＰＳは、ペプチドまたはペプトイドを含む。記載された化学の任意の組み合わせが、本発明の範囲内で構想される。
【００９５】
様々な実施形態において、ＥＳＢ、ＡＰＳおよび／またはＣＯＢは、鋳型であり得、順序づけられ得、およびまたは解読され得る。いくつかの実施形態において、コンストラクト中の任意のこれらのサブユニットの順序が、検出され得る。ＥＳＢ、ＡＰＳおよび／またはＣＯＢは、例えば、核酸または当該分野で公知の他の任意の好適な化学的相補性を介して、ＥＳＢ、ＡＰＳおよび／またはＣＯＢのうちの別のいずれか１つを付加するための鋳型を提供し得る。ＥＳＢ、ＡＰＳおよび／またはＣＯＢは、別の核酸またはペプチドをコードする核酸などの二次産物をコードし得る。いくつかの実施形態において、ＥＳＢ、ＡＰＳおよび／またはＣＯＢの検出は、それを解読する工程、例えば、アンプリコンを生成する工程、またはＥＳＢ、ＡＰＳおよび／もしくはＣＯＢからペプチドを発現させる工程、ならびにその生成物を配列決定するかまたは別途検出する工程を包含する。
【００９６】
所与の細胞のＣＯＢの様々なＡＰＳと関連する標識モノマーによって提供される配列、重量またはシグナルは、ＣＯＢのユニークな同定を可能にする。例えば、核酸配列を使用するとき、ユニーク同一性またはユニーク配列シグネチャを有するＣＯＢは、特定の標的分子またはその一部を認識するＵＢＡと関連させられる。ＣＯＢ配列の検出は、混合物中の標的分子の存在の検出を可能にする（定性的分析）。別の例において、蛍光標識を使用するとき、ユニーク同一性またはユニークスペクトルシグネチャを有するＣＯＢは、特定の標的分子またはその一部を認識するＵＢＡと関連させられる。蛍光標識されたＣＯＢのスペクトルコードなどのＣＯＢシグナルの検出は、混合物中の標的分子の存在の検出を可能にする（定性的分析）。なおも別の例において、コンビナトリアル合成法に従って小分子を使用するとき、ユニークな決定論的重量を有するＣＯＢは、特定の標的分子またはその一部を認識するＵＢＡと関連させられる。ＣＯＢの決定論的重量の検出（例えば、質量分析を介して）は、混合物中の標的分子の存在の検出を可能にする（定性的分析）。所与のシグネチャ（例えば、スペクトルコード、ユニーク配列またはユニーク決定論的重量）に関連するコード（例えば、配列、標識モノマーまたは決定論的重量）を計数およびまたは定量することによって、ＣＯＢに結合されたＵＢＡに関連している混合物中のすべての分子の計数または定量が可能になる（定量的分析）。したがって、ＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体は、公知の生物学的マーカーの定量的分析による種々の生物学的状態（例えば、疾患対健常）の診断または予後診断にとって有用である。
【００９７】
さらに、本発明のＣＯＢによって提供される単一分子の検出および定量の鋭敏な感度は、新しい診断および予後診断マーカー（種々の生物学的状態の間の変動が従来の分子方法を用いて特定の生物学的状態との相関を検出するには少なすぎるマーカーを含む）の同定を可能にする。ＣＯＢに基づく分子検出の感度は、少量の生物学的サンプル中の治療用および診断用薬剤の詳細な薬物動態分析を可能にする。
【００９８】
ＣＯＢの合成は、本明細書中に記載される方法を含む当該分野で公知の任意の好適な方法によって行われ得る。
【００９９】
様々な実施形態において、本発明は、オリゴヌクレオチドを含むアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）の段階的付加によって合成されるＣＯＢに関する。ＣＯＢは、共通リンカー（ＣＬ）を介してＵＢＡに付着させられ得る。ＣＬは、オリゴヌクレオチドの一部でもあり得る。いくつかの実施形態において、エピトープ特異的バーコードも、オリゴヌクレオチドとして提供される。場合によっては、そのエピトープ特異的バーコードは、共通リンカーを含むオリゴヌクレオチドに含められ得る。いくつかの実施形態において、ＣＬ、ＥＳＢおよびＡＰＳはすべて、オリゴヌクレオチド配列を含む。したがって、オリゴヌクレオチドＣＬは、オリゴヌクレオチドＥＳＢまたはＡＰＳにライゲートされ得る。実質的に相補的または厳密に相補的なアニーリング領域が、ハイブリダイゼーションに使用され得る。アニーリング領域は、オリゴヌクレオチドＥＳＢまたはＡＰＳの両端に提供され得る。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、分割プール合成または当該分野で公知の他の任意の好適な段階的合成の様々な工程において付加される。段階的合成の各工程に特異的なアニーリング領域が、上記オリゴヌクレオチドに組み込まれ得る。理論に拘束されるものではないが、オリゴヌクレオチドの付加が工程中にスキップされる場合、次のオリゴヌクレオチドの工程特異的アニーリング領域は、利用可能な以前のオリゴヌクレオチドの工程特異的アニーリング領域に効率的にハイブリダイズしない。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、１つ以上のＡＰＳを欠損しているＣＯＢの合成を止める方法を提供する。
【０１００】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、異なるＣＬオリゴヌクレオチド（その各々が、ＵＢＡに特異的なユニークＥＳＢ配列および共通のアニーリング領域を有する）で標識される。多くの場合、ＡＰＳは、分割プール合成のラウンドにおいて、ＣＯＢに組み立てられる。これらの場合、各ラウンドにおいて、サンプルがｎ個の異なる容器に分割される。異なるオリゴヌクレオチドＡＰＳが、各容器に加えられ得る（合計ｍ個の異なるＡＰＳ）。いくつかの実施形態において、ｎおよびｍは、同じである。他の実施形態において、ｎは、ｍより大きいか、またはｍは、ｎより大きい。各ＡＰＳは、それより前のラウンドにおいて付加されたアニーリング領域と選択的にハイブリダイズするようにデザインされ得る（図６）。様々な実施形態において、ラウンド特異的アニーリング領域の対が、各ＡＰＳに組み込まれる。そのアニーリング領域は、ＡＰＳの各端に組み込まれ得る。ＡＰＳの各端に組み込まれるアニーリング領域は、異なり得る。したがって、付加されるＡＰＳのアニーリング領域は、以前のラウンドの利用可能なアニーリング領域に相補的であり得、それにより組み立てが促される。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、アニーリングプライマーを用いて互いにおよび／またはＣＬにステッチされる（ｓｔｉｔｃｈｅｄ）（図７および８）。そのアニーリングプライマーは、ＣＬまたは段階的合成の前のラウンドに付加されたＡＰＳに対する第１の相補的領域を含み得る。そのアニーリングプライマーは、このラウンドに付加されるＡＰＳに対する第２の相補的領域も含み得る。したがって、そのアニーリングプライマーは、その後のラウンドの２つのオリゴヌクレオチドサブユニットにハイブリダイズし、それらを互いにステッチし得る。いくつかの実施形態において、各ラウンドのアニーリングプライマーの第１の相補的領域は、他のラウンドのアニーリングプライマーの第１の相補的領域と異なる（図７）。いくつかの実施形態において、各ラウンドのアニーリングプライマーの第２の相補的領域は、他のラウンドのアニーリングプライマーの第２の相補的領域と異なる。いくつかの実施形態において、異なるラウンドのアニーリングプライマーの第１または第２の相補的領域は、ラウンドの間で共有される（図８）。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ＣＬオリゴヌクレオチドは、ループアニーリング領域の対を含む（図９および１０）。したがって、ＡＰＳは、ループ形状でＣＬにハイブリダイズするようにデザインされ得、各端においてループアニーリング領域に沿ってＣＬにハイブリダイズする。そのループアニーリング領域は、そのラウンドに特異的であり得る。ハイブリダイゼーションは、ＣＬに沿ってＡＰＳを配置させ得る。それらのＡＰＳは、本明細書中に記載される任意の方法または当該分野で公知の他の通常の方法を用いて互いに連結され得る。それらのＡＰＳは、他のラウンドに特異的なループアニーリング領域に沿ってＣＬに効率的にハイブリダイズしないようにデザインされ得る。その結果として、特定のラウンドのＡＰＳが欠けていると、それらのＡＰＳは、連結プロセスに依存して、首尾良く互いに連結されないことがある。あるいは、ＣＯＢが、ＡＰＳが欠けた状態で（その位置は、ループアニーリング領域の対が隣接する）合成され得る。次いで、得られたＣＯＢは、しかるべく分析され得、処分され得るか、またはその代わりに、引き出された情報が処理され得る。
【０１０３】
所与のラウンドにおける各ＡＰＳは、そのラウンドにおける残りのＡＰＳと異なるユニークサブコード配列を含み得る（図６〜１１）。そのサブコードは、ユニークヌクレオチド配列を含み得る。
【０１０４】
ＣＬまたは１つ以上のＡＰＳは、検出されたＣＯＢのその後の正規化を可能にするランダムなタグ領域をさらに含み得る（図６〜１１）。そのようなランダムなタグ領域を利用する好適な方法の変法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｃａｓｂｏｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，３９：１２，ｅ８１）を参照のこと。場合によっては、そのランダムなタグ領域は、各配列バリアントに関連する鋳型分子の数を推定する分子カウンターとして機能し得る。場合によっては、分子カウンターは、増幅反応、例えば、ＰＣＲの前に、ＣＬ、ＥＳＢ、ＡＰＳまたは組み立てられたＣＯＢに組み込まれる。縮重塩基領域（ＤＢＲ）を含む分子カウンターのライブラリーが、ＣＬ、ＥＳＢ、ＡＰＳまたは組み立てられたＣＯＢに組み込まれ得る。ライブラリー内のユニークＤＢＲの数は、通常、ＤＢＲの長さおよび塩基組成によって限定される。例えば、ＤＢＲ内の単一のヌクレオチドは、４つの可能性のある異なるカウンター（各塩基につき１つ）を可能にし得る。ＤＢＲが長くなるほど、ユニークなカウンター配列の数が多くなり得る。配列のライブラリー由来の分子カウンターは各々、ＣＬ、ＥＳＢ、ＡＰＳまたは組み立てられたＣＯＢにおいて組み込まれ得る。その分子カウンターは、配列バリアントが、単一の鋳型分子に関連するのかあるいは複数個の鋳型分子に関連するのかを決定するために使用され得る。１つの配列バリアントに関連する異なるＤＢＲ配列の数は、最初の鋳型分子の数の直接的な尺度として働き得る。この情報は、各配列バリアントのリード数（例えば、増幅反応、例えば、ＰＣＲの後のリード数を含む）によって提供される情報を補い得るかまたは置き換え得る。ＤＢＲは、配列バリアントが、増幅反応中のポリメラーゼエラーに由来するかまたは増幅反応、例えば、ＰＣＲの前の真の起源バリアントである確率を決定するためにも使用され得る。いくつかの実施形態において、ユニーク結合物質（ＵＢＡ）は、ＣＯＢの組み立ての前またはそれと同時にそれらの標的に固定される。
【０１０５】
本発明の様々な実施形態は、細胞の表面上でのＣＯＢの組み立てに関する。ＣＯＢは、例えば、細胞表面の構成要素を標的にしているＵＢＡに関連した状態で組み立てられ得る。いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、ＣＯＢの組み立ての前またはそれと同時に細胞表面の構成要素に固定される。いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、細胞または細胞内コンパートメントに送達される。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、細胞または細胞内コンパートメント内のＵＢＡと関連した状態で組み立てられる。細胞は、ＵＢＡ、ＥＳＢの付加の前またはＣＯＢ組み立ての前に固定され得る。好適な細胞透過処理方法は、当該分野で公知であり、それを用いることにより、アッセイの構成要素を細胞および細胞構成要素に送達することができる。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、上記アッセイは、細胞ではない物体上で行われる。当該分野で公知の好適な支持物質（例えば、ビーズまたは表面コーティング）が、細胞が作用するのと同じ様式で作用することにより、独自の結合表面を提供し得る。支持物質は、結合標的で修飾され得る。いくつかの実施形態において、支持物質は、結合標的を互いから空間的に離す。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、上記アッセイは、１次結合標的、および１次標的に結合することができる１つ以上の２次結合標的を含み得る。支持物質は、例えば、１つ以上の１次標的でコーティングされ得る。２次標的のライブラリーは、１次標的に結合するように提供され得る。ＵＢＡは、１次および／または２次標的のエピトープに結合するように提供され得る。ＣＯＢは、他のタイプの標的について記載されるように、これらのＵＢＡに関連した状態で組み立てられ得る。１次標的に対する２次標的の相互依存性結合は、ＣＯＢを分析することによってモニターされ得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、複数個のＣＯＢが、同じＵＢＡ分子上に組み立てられる。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢまたは組み立てられたＣＯＢは、誘導配列をコードする。いくつかの実施形態において、ＥＳＢおよび／またはＣＯＢは、ポリヌクレオチド配列を含む。場合によっては、ＥＳＢおよび／またはＣＯＢは、ＲＮＡ配列をコードし得る。場合によっては、ＥＳＢおよび／またはＣＯＢは、ペプチド配列をコードする。ＥＳＢおよび／またはＣＯＢは、ペプチド配列を直接コードし得る。あるいは、ＣＯＢは、ペプチド配列を、間接的に、例えば、中間ＲＮＡ配列を介してコードし得る。例えば、ポリヌクレオチドＥＳＢまたはＣＯＢは、オープンリーディングフレームをコードし得る。場合によっては、そのペプチド配列は、ペプチド発現を可能にするコンストラクトにＥＳＢまたはＣＯＢを導入した後に翻訳される。いくつかの実施形態において、そのコンストラクトは、ベクターである。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢおよびＣＯＢは、オリゴヌクレオチドから組み立てられる。その連結剤は、リガーゼであり得る。いくつかの実施形態において、リガーゼは、周知の手順を用いるＴ４  ＤＮＡリガーゼである（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））。他のＤＮＡリガーゼも使用してよい。ライゲーションに関しては、好熱性の生物に由来するリガーゼなどの他のリガーゼを使用してもよく、ゆえに、高温でのライゲーションが可能になり、より長いオリゴヌクレオチド（特異性が高い）をＥＳＢ、ＣＬまたはＡＰＳとして使用することが可能になり、それにより、そのようなオリゴヌクレオチドのアニーリングにとって通常許容される高温下でアニーリングとライゲーションが同時に行われ得る。しかしながら、そのライゲーションは、酵素による必要はなく、したがって、アニーリング（ａｎｅｅａｌｉｎｇ）領域にヌクレオチド塩基対のミスマッチが無い限り、連結剤は、ＥＳＢとＡＰＳとを連結させる化学剤であってもよい。簡単にするために、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを連結剤として使用する本発明のいくつかの実施形態が記載される。この酵素は、隣接するオリゴヌクレオチド上の３’ＯＨ基に接続される、５’末端におけるリン酸基の存在を必要とする。
【０１１１】
オリゴが、互いに積み重なることにより、それらの末端の接合点において完全一致でアニーリング領域に結合すると、そのアニーリング領域に対する特異的な結合が生じる。ＣＬ、ＥＳＢおよびＡＰＳは、ライゲートされることにより、ＥＳＢに連結したＣＯＢを形成し得る。その後、そのＥＳＢに連結したＣＯＢは、検出のために使用され得る。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢおよび／またはＣＯＢの組み立ては、クリックケミストリーの使用を含む。クリックケミストリーを用いて様々な分子を連結する好適な方法が、当該分野で公知である（オリゴヌクレオチドのクリックケミストリー連結については、例えば、Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒら（ＰＮＡＳ，１０８：２８，１１３３８−１１３４３，２０１１）を参照のこと）。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢおよび／またはＣＯＢの組み立ては、細胞の内部で起きる。いくつかの実施形態において、ＥＳＢおよび／またはＡＰＳが、第１に、細胞の内部で組み立てられる。いくつかの実施形態において、ＥＳＢおよび／またはＡＰＳは、細胞の内部で連結される。いくつかの実施形態において、ＥＳＢおよび／またはＡＰＳは、細胞の外部で連結される。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、組み立てられた生成物は、増幅され、必要に応じて、その結果が、参照サンプルからの同様の標的核酸の増幅と比較される。いくつかの実施形態において、ＡＰＳのライゲート産物が、増幅され、必要に応じて、その結果が、参照サンプルからの同様のＣＯＢの増幅と比較される。増幅は、当該分野で公知の任意の手段によって行われ得る。場合によっては、ライゲート産物は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される。使用され得るＰＣＲ法の例としては、定量的ＰＣＲ、定量的蛍光ＰＣＲ（ＱＦ−ＰＣＲ）、多重蛍光ＰＣＲ（ＭＦ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴＰＣＲ）、単一細胞ＰＣＲ、制限酵素断片長多型ＰＣＲ（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）、ＰＣＫ−ＲＦＬＰＩＲＴ−ＰＣＲ−ＩＲＦＬＰ、ホットスタートＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、インサイチュポロニー（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｐｏｌｏｎｏｎｙ）ＰＣＲ、インサイチュローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ブリッジＰＣＲ、ピコタイターＰＣＲおよびエマルジョンＰＣＲが挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅、自家持続配列複製法、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅、コンセンサス配列プライム（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｒｉｍｅｄ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＣＰ−ＰＣＲ）、任意プライム（ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ  ｐｒｉｍｅｄ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドプライムＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）および核酸ベース配列増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＢＳＡ）が挙げられる。本明細書中で使用され得る他の増幅方法としては、米国特許第５，２４２，７９４号；同第５，４９４，８１０号；同第４，９８８，６１７号；および同第６，５８２，９３８号に記載されているものが挙げられる。いくつかの実施形態において、増幅は、細胞の内部で行われる。
【０１１５】
上記実施形態のいずれかにおいて、ライゲート産物の増幅は、支持体（例えば、ビーズまたは表面）上で行われ得る。本明細書中の実施形態のいずれかにおいて、ＣＯＢは、単一細胞由来の標的上で組み立てられ得る。
【０１１６】
プローブの集団中の各ＵＢＡ／ＥＳＢプローブのユニークさのおかげで、複数の標的分子の多重分析が可能になる。さらに、プローブの集団中の各ＣＯＢプローブのユニークさのおかげで、単一細胞における複数の標的分子の多重分析が可能になる。
【０１１７】
例えば、いくつかの実施形態において、各ＣＯＢは、６つのＡＰＳを含む。それらのＡＰＳが、配列決定されることになり、そのＡＰＳについて可能性のあるユニーク配列が２０個存在する場合、この例では、３．８４×１０８個の可能性のあるＣＯＢが存在し得る。したがって、この例では、３．８４×１０８個の細胞およびそれらの対応するＵＢＡ／ＥＳＢプローブが分析され得る。配列決定の際、一部の蛍光法に存在する色の制約が無いならば、細胞１つあたり複数個のＵＢＡ／ＥＳＢプローブを分析することができる。いくつかの実施形態において、細胞１つあたり１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、６５、７０、９０、１００個の異なるＵＢＡ／ＥＳＢが分析される。いくつかの実施形態において、細胞１つあたり最大１００個の異なるＵＢＡ／ＥＳＢが分析される。いくつかの実施形態において、細胞１つあたり最大１０００個の異なるＵＢＡ／ＥＳＢが分析される。いくつかの実施形態において、細胞１つあたり最大２０００個の異なるＵＢＡ／ＥＳＢが分析される。
【０１１８】
ある特定の実施形態において、検出方法は、多重アッセイにおいて行われ、それにより、複数の標的分子が、同じアッセイ（単一の反応混合物）において検出される。好ましい実施形態において、そのアッセイは、複数の標的分子が同時に検出される、ハイブリダイゼーションアッセイまたは親和性結合アッセイである。好ましい実施形態において、そのアッセイは、複数の標的分子が単一細胞において同時に検出される、ハイブリダイゼーションアッセイまたは親和性結合アッセイである。ある特定の実施形態において、同じアッセイにおいて検出される複数の標的分子は、少なくとも２個、少なくとも５個の異なる標的分子、少なくとも１０個の異なる標的分子、少なくとも２０個の異なる標的分子、少なくとも５０個の異なる標的分子、少なくとも７５個の異なる標的分子、少なくとも１００個の異なる標的分子、少なくとも２００個の異なる標的分子、少なくとも５００個の異なる標的分子または少なくとも７５０個の異なる標的分子または少なくとも１０００個の異なる標的分子である。他の実施形態において、同じアッセイにおいて検出される複数の標的分子は、最大５０個の異なる標的分子、最大１００個の異なる標的分子、最大１５０個の異なる標的分子、最大２００個の異なる標的分子、最大３００個の異なる標的分子、最大５００個の異なる標的分子、最大７５０個の異なる標的分子、最大１０００個の異なる標的分子、最大２０００個の標的分子または最大５０００個の標的分子である。なおも他の実施形態において、検出される複数の標的分子は、前述の数の間の任意の範囲の異なる標的分子（例えば、２０〜５０個の異なる標的分子、５０〜２００個の異なる標的分子、１００〜１０００個の異なる標的分子、５００〜５０００個の異なる標的分子などであるがこれらに限定されない）である。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、検出は、デジタルの検出である。いくつかの実施形態において、検出は、直接的であり、すなわち、その方法は、検出される実体が直接発するシグナルを取得するものである。いくつかの実施形態において、検出は、間接的であり、すなわち、検出される実体の操作は、シグナルを取得する前に行われる。いくつかの実施形態において、検出される実体の複数の構成要素が、直接または間接的に検出シグナルを生じる。いくつかの実施形態において、それらの複数の構成要素の順序が、本明細書中に記載される検出方法によって決定され得る。そのような検出方法は、順序づけられた検出方法または順序づけられたシグナルを用いる検出方法としても記載される。
【０１２０】
上記実施形態のいずれかにおいて、ＣＯＢの検出または定量分析は、配列決定によって達成され得る。ＡＰＳサブユニットまたはＣＯＢ全体が、本明細書中に記載される配列決定方法を含む当該分野で公知の任意の好適な方法、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００によるすべてのＤＮＡタグの全長の配列決定を介して検出され得る。
【０１２１】
配列決定は、当該分野で周知である従来のＳａｎｇｅｒ配列決定法によって達成され得る。配列決定は、ハイスループットシステムを用いても達成され得、そのシステムの一部は、配列決定されるヌクレオチドを成長鎖に組み込んだ直後または組み込む際に、そのヌクレオチドの検出を可能にし、すなわち、リアルタイム（ｒｅｄ  ｔｉｍｅ）または実質的にリアルタイムでの配列の検出を可能にする。場合によっては、ハイスループット配列決定は、１時間あたり少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００または少なくとも５００，０００個の配列リードを生成し；各リードは、１リードあたり少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２０または少なくとも１５０塩基である。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定には、ＩｌｌｕｍｉｎａのＨｉＳｅｑ２０００装置が利用可能な技術の使用が必要である。この装置は、合成化学による可逆的ターミネーターに基づく配列決定を用いる。この装置は、８日間で２０００億個のＤＮＡリードを処理できる。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定には、ＡＢＩ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍが利用可能な技術の使用が必要である。この遺伝子分析プラットフォームは、ビーズに連結されたクローン増幅されるＤＮＡフラグメントの大規模並列の配列決定を可能にする。この配列決定方法は、色素で標識されたオリゴヌクレオチドを用いた連続的なライゲーションに基づく。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定には、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｃｈｉｎｅ（ＰＭＧ）が利用可能な技術の使用が必要である。このＰＧＭは、２時間で１０００万個のリードを処理できる。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定には、合成による単一分子配列決定（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＳＭＳＳ）法などのＨｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）が利用可能な技術の使用が必要である。ＳＭＳＳは、最大２４時間でヒトゲノム全体の配列決定を可能にするので、ユニークである。この高速の配列決定法は、ある配列におけるＳＮＰヌクレオチドを実質的にリアルタイムまたはリアルタイムで検出することも可能である。最後に、ＳＭＳＳは、ＭＩＰ法のように、ハイブリダイゼーションの前の事前増幅工程を必要としないので、強力である。実際に、ＳＭＳＳは、いかなる増幅も必要としない。ＳＭＳＳは、米国公開出願番号２００６００２４７１Ｉ；２００６００２４６７８；２００６００１２７９３；２００６００１２７８４；および２００５０１００９３２に一部記載されている。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定には、その機器のＣＣＤカメラによって記録される、配列決定反応によって生成される化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｎｉｎｅｓｃｅｎｔ）シグナルを透過する光ファイバープレートを含むＰｉｃｏ  Ｔｉｔｅｒ  Ｐｌａｔｅデバイスなどの４５４  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｒａｎｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）が利用可能な技術の使用が必要である。この光ファイバーの使用によって、４．５時間で最低２０００万塩基対の検出が可能である。
【０１２７】
ビーズ増幅の後の光ファイバー検出を使用するための方法は、Ｍａｒｇｕｉｌｅｓ，Ｍ．ら、“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｐｒｉｃｏｌｉｔｒｅ  ｒｅａｃｔｏｒｓ”，Ｎａｔｕｒｅ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０３９５９；ならびに米国公開出願番号２００２００１２９３０；２００３００５８６２９；２００３０１００１０２；２００３０１４８３４４；２００４０２４８１６１；２００５００７９５１０、２００５０１２４０２２；および２００６００７８９０９に記載されている。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定は、Ｃｌｏｎａｌ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａｒｒａｙ（Ｓｏｌｅｘａ，Ｉｎｃ．）、または可逆的ターミネーター化学反応を利用する合成ごとの配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＳＢＳ）を用いて行われる。これらの技術は、米国特許第６，９６９，４８８号；同第６，８９７，０２３号；同第６，８３３，２４６号；同第６，７８７，３０８号；および米国公開出願番号２００４０１０６１３０；２００３００６４３９８；２００３００２２２０７；ならびにＣｏｎｓｔａｎｓ，Ａ．，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ２００３，１７（１３）：３６に一部記載されている。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡまたはＤＮＡのハイスループット配列決定は、ＡｎｙＤｏｔ．ｃｈｊｐｓ（Ｇｅｎｏｖｏｘｘ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行われ得る。特に、ＡｎｙＤｏｔ−ｃｈｉｐｓは、ヌクレオチド蛍光シグナル検出の１０倍〜５０倍の増強を可能にする。ＡｎｙＤｏｔ．ｃｈｉｐｓおよびそれらの使用方法は、国際公開出願番号ＷＯ０２／０８８３８２、ＷＯ０３／０２０９６８、ＷＯ０３／０３１９４７、ＷＯ２００５／０４４８３６、ＰＣＴ／ＥＰ０５／１０５６５７、ＰＣＴ／ＥＰ０５／１０５６５５；ならびに独国特許出願番号ＤＥ１０１４９７８６、ＤＥ１０２１４３９５、ＤＥ１０３５６８３７、ＤＥ１０２００４００９７０４、ＤＥ１０２００４０２５６９６、ＤＥ１０２００４０２５７４６、ＤＥ１０２００４０２５６９４、ＤＥ１０２００４０２５６９５、ＤＥ１０２００４０２５７４４、ＤＥ１０２００４０２５７４５およびＤＥ１０２００５０１２３０１に一部記載されている。
【０１３０】
他のハイスループット配列決定システムとしては、Ｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００１；Ａｄａｍｓ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４  Ｍａｒｃｈ  ２０００；およびＭ．Ｊ，Ｌｅｖｅｎｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：６８２−６８６，Ｊａｎｕａｒｙ  ２００３；ならびに米国公開出願番号２００３００４４７８１および２００６／００７８９３７に開示されているものが挙げられる。そのようなシステムの全部が、核酸分子上で測定される重合反応を介した塩基の経時的付加による複数の塩基を有する標的核酸分子の配列決定を必要とし、すなわち、配列決定される鋳型核酸分子上での核酸重合酵素の活性が、リアルタイムで追跡される。次いで、一連の塩基付加の各工程における核酸重合酵素の触媒活性によって、どの塩基が標的核酸の成長相補鎖に組み込まれているかを同定することによって配列が推定され得る。標的核酸分子複合体上のポリメラーゼは、標的核酸分子に沿って移動して活性部位においてオリゴヌクレオチドプライマーを伸長するのに適した位置に提供される。複数の標識タイプのヌクレオチドアナログが、活性部位に近接して提供され、ヌクレオチドアナログの識別可能な各タイプは、標的核酸配列内の異なるヌクレオチドに相補的である。成長核酸鎖は、ヌクレオチドアナログを活性部位の核酸鎖に付加するポリメラーゼを使用することによって伸長され、ここで、付加されるヌクレオチドアナログは、その活性部位において標的核酸のヌクレオチドに相補的である。重合工程の結果としてオリゴヌクレオチドプライマーに付加されたヌクレオチドアナログが同定される。標識されたヌクレオチドアナログを提供する工程、成長核酸鎖を重合する工程、および付加されたヌクレオチドアナログを同定する工程が、繰り返されて、その核酸鎖がさらに伸長され、標的核酸の配列が決定される。
【０１３１】
様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドＥＳＢまたはＣＯＢは、直接同定される。その直接的な同定は、上に記載された核酸配列決定を含み得る。いくつかの実施形態において、ＡＰＳ配列は、同様に同定される誘導配列をコードする。例えば、ポリヌクレオチドＥＳＢおよびＣＯＢは、ペプチド配列に翻訳され得る。次いで、そのペプチド配列は、当該分野で公知の好適な方法を用いて同定され得る。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、ＣＯＢまたはＥＳＢに相当する配列は、質量分析を用いて同定される。質量分析を含む配列決定方法が、当該分野で公知である。様々な実施形態において、ペプチドなどの誘導配列が、質量分析方法を用いて配列決定される。いくつかの実施形態において、質量分析方法は、フラグメンテーションを含む。いくつかの実施形態において、質量分析方法は、Ｎ末端の配列決定を含む。いくつかの実施形態において、質量分析方法は、Ｃ末端の配列決定を含む。いくつかの実施形態において、質量分析方法は、エドマン分解を含む。様々な実施形態において、誘導配列は、同定の前に分離プロセスに供される。いくつかの実施形態において、その分離プロセスは、クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、その分離プロセスは、ＨＰＬＣを含む。その分離プロセスのための好適な分離方法は、例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む。イオン交換クロマトグラフィーは、強酸性（代表的には、スルホン酸基、例えば、ナトリウムポリスチレンスルホネートまたはポリＡＭＰＳ）、強塩基性（四級アミノ基、例えば、トリメチルアンモニウム基、例えば、ポリＡＰＴＡＣ）、弱酸性（主にカルボン酸基）または弱塩基性（一級、二級および／または三級アミノ基、例えば、ポリエチレンアミン）である官能基を含む任意のマトリックス物質を使用し得る。その分離方法は、例えば、マトリックスとしてスルホン化ポリスチレンを使用し、酸溶液中にアミノ酸を加え、ｐＨを徐々に上昇させる緩衝液をカラムに通し得る。ｐＨがそれぞれの等電点に達したら、アミノ酸は溶出する。逆相クロマトグラフィーの使用による疎水性相互作用クロマトグラフィーが使用され得る。多くの商業的に入手可能なＣ８およびＣ１８シリカカラムでは、溶出勾配を用いることによる溶液中のペプチドの分離の成功が証明されている。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢ、ＡＰＳおよび得られるＣＯＢに相当するペプチド配列は、検出の簡便さを改善するようにデザインされる。場合によっては、ペプチド配列は、質量分析計におけるフラグメンテーションパターンを改善するようにデザインされ得る。ペプチド配列中の結合のフラグメンテーション効率が配列依存性であることは、当該分野で周知である（例えば、Ｔａｂｂら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．２００３  Ｍａｒｃｈ  １；７５（５）：１１５５およびＫｌａｍｍｅｒら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００８，２４：３４８−３５６を参照のこと）。その配列依存性のフラグメンテーション効率は、所望のフラグメンテーションパターンを有する代表的なペプチド配列をデザインするために使用され得る。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢ、ＡＰＳおよび得られるＣＯＢに相当するペプチド配列は、ある特定の物理的および化学的特徴をペプチド分子に付与するようにデザインされる。例えば、代表的なペプチド配列は、水性溶液中で所望の範囲内の溶解性を有するペプチド分子をもたらすようにデザインされ得る。別の例では、代表的なペプチド配列は、所望の程度の二次もしくは三次構造を有するかまたはそれらを欠くペプチド分子をもたらすようにデザインされ得る。なおも別の例では、代表的なペプチド配列は、ジスルフィド結合を有するかまたはそれを欠くペプチド分子をもたらすようにデザインされ得る。なおもさらなる例では、代表的なペプチド配列は、選択された標的に対して所望の結合特性を有するペプチド分子をもたらすようにデザインされ得る。ＥＳＢ、ＣＬ、ＡＰＳおよび得られるＣＯＢの配列は、特別にロードされたｔＲＮＡをタンパク質発現系において利用するようにさらにデザインされ得る。したがって、得られるペプチド分子に非天然アミノ酸を組み込むことができる。
【０１３５】
様々な実施形態が、ＥＳＢに連結したＣＯＢまたはペプチド配列などの誘導配列を検出前に分離することに関する。いくつかの実施形態において、その分離は、それらの分子の好適な生理化学的特性に基づく。これらの分離のタイプは、分子を検出器に連続的に方向づけ、それによって検出時のそれらの相対存在量およびシグナルの複雑度を高めるために特に有用である。様々な実施形態は、配列標的化様式での分子の分離を含む。例えば、特定のＥＳＢを含むすべての分子が、そのＥＳＢ配列を十分に相補的な配列とハイブリダイズさせるか、ＥＳＢ特異的に連結されたタグを用いて親和性精製するか、そのＥＳＢ配列によってコードされる誘導配列を用いて親和性精製することによって、または当該分野で公知の他の任意の好適な方法によって単離され得る。分離方法は、細胞特異的ＣＯＢまたはその一部も標的にし得る。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢおよびＣＯＢを含むコンストラクトが、分離に供される。例えば、そのコンストラクトは、勾配またはＥＳＢに従った親和性精製選別に供され得る。いくつかの実施形態において、その分離は、複数の次元、例えば、２、３、４、５、６、７またはそれ以上の次元を含み得る。例えば、そのコンストラクトは、１つの次元において第１のＡＰＳに従って選別し、別の次元において第２のＡＰＳに従って選別し、そして必要に応じて、第３の次元においてＥＳＢに従って選別して、分離され得る。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、分離方法は、電磁場を用いたゲル上での勾配による分離および／または当該分野で公知の他の任意の好適な分離方法を含む。いくつかの実施形態において、ＥＳＢおよび／またはＣＯＢを含むコンストラクトは、検出前に分離され得る。例えば、そのコンストラクトは、ＥＳＢに従って分離され得、そのコンストラクト中のＥＳＢおよび／またはＣＯＢは、その分離後に検出され得る。その検出は、モル比検出、酵素検出、配列決定、勾配もしくはゲルにおける親和性差異、電磁場、例えば、ＵＶ、蛍光もしくは化学発光、本明細書中に記載される任意の検出方法、または当該分野で公知の他の任意の好適な検出方法であり得る。いくつかの実施形態において、分離は、コンストラクトの固定化を含む。例えば、そのコンストラクトは、アレイ表面上またはビーズ上に固定化され得る。ＥＳＢおよび／またはＣＯＢの一部が、そのコンストラクトを固定化するために使用され得る。ＥＳＢおよび／またはＣＯＢは、固定化の位置から検出され得る。１つの例において、オリゴヌクレオチドを含むＥＳＢおよび／またはＣＯＢは、相補的なオリゴヌクレオチドでコーティングされたビーズ上またはマイクロアレイ上に固定化され得る。
【０１３８】
ａ．検出可能分子または標識モノマー
本発明のＣＯＢは、任意の種々の標識モノマー（例えば、放射性同位体、蛍光色素、色素、酵素、ナノ粒子、化学発光マーカー、ビオチン、または直接（例えば、発光によって）もしくは間接的に（例えば、蛍光標識された抗体の結合によって）検出され得る当該分野で公知の他のモノマー）で標識され得る。通常、ＣＯＢ内の標識されたＡＰＳの１つ以上が、１つ以上の標識モノマーで標識され、ＣＯＢのＡＰＳに付着させられた標識モノマーによって提供されるシグナルが、ＵＢＡＣＯＢが結合する標的を同定する検出可能なコードを構成する。ある特定の実施形態において、ＡＰＳからの所与のシグナルの欠損（例えば、暗点）もまた、ＣＯＢのコードの一部を構成し得る。
【０１３９】
本明細書中に記載されるＣＯＢとともに使用され得る標識モノマーおよび標識モノマーをＣＯＢに組み込む方法の例は、米国特許第７，４７３，７６７号；米国出願番号１０／５４２，４５８；１２／３２４，３５７；１１／６４５，２７０および１２／５４１，１３１（それらの全体が本明細書中で参照により援用される）に記載されている。
【０１４０】
検出可能分子または標識モノマーをＣＯＢに付加するとき、本発明のＣＯＢによって提供される定性的な分析能力およびそれに基づく分析技術に加えて、本発明のＣＯＢは、定量的分析を行うのにユニークに好適である。生体分子サンプル中の本発明のＣＯＢとそれらの標的分子との間の１対１の結合を提供することによって、そのサンプルに存在する標的分子の全部または代表的な一部が、同定され得、計数され得る。この様々な分子種の個々の計数は、その生体分子サンプル中の標的分子の絶対濃度または相対濃度を決定するための正確かつ直接的な方法を提供する。さらに、混合物中の各分子を個別に扱う能力は、高感度、最小のサンプル必要量、小容積での溶液相の動態によってもたらされる高反応速度、および最終的には非常に低い試薬コストをはじめとした小型化の利点に影響する。
【０１４１】
標的分子
標的分子またはエピトープは、それとＵＢＡとの結合によって検出または測定される分子（ＵＢＡの標的特異的領域が認識する）である。標的分子の例としては、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、小分子、有機モノマーまたは薬物が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中の方法によって分析され得る核酸としては：二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡヘアピン、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）およびＲＮＡヘアピンが挙げられる。単に便宜のため、本明細書中に記載される方法は、タンパク質またはｍＲＮＡの分析に照らして主に説明される。しかしながら、本明細書中に記載される実施形態は、非タンパク質または非ｍＲＮＡ標的を検出するためにも使用され得る。いくつかの実施形態において、標的分子は、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、リンタンパク質、抗体、核酸、ペプチド核酸、合成小分子、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、脂質、ステロイドおよびリン脂質からなる群より選択される。
【０１４２】
標的分子は、他の構成要素を含む生体分子サンプルの一部であり得るか、またはそのサンプルの唯一のもしくは主要な構成要素であり得る。標的分子は、細胞もしくは組織の全体、細胞もしくは組織の抽出物、それらの分画された溶解産物または実質的に精製された分子の構成要素であり得る。標的分子は、溶液相または固相（例えば、チップ、マイクロアレイまたはビーズなどの固体表面を含む）において付着させられ得る。また、標的分子は、既知または未知の構造または配列を有し得る。
【０１４３】
本明細書中に開示される組成物、方法およびキットは、サンプル中の標的分子の存在を決定する多種多様の適用においても使用され得る。例えば、限定されないが、その組成物、方法およびキットは、薬物動態学的研究（薬物代謝、ＡＤＭＥプロファイリングおよび毒性研究；創薬のための標的の確認；遺伝子発現プロファイリング、タンパク質発現プロファイリング；プロテオーム分析；メタボロミクス研究；翻訳後修飾研究（グリコシル化、リン酸化、アセチル化およびアミノ酸修飾（例えば、ガンマ−カルボキシグルタメートを形成するグルタメートの修飾およびヒドロキシル化を形成するプロリンのヒドロキシル化）を含むがこれらに限定されない）；特定の血清または粘膜抗体レベルの分析；非核酸の診断指標の評価；外来抗原の検出；などを含むがこれらに限定されない）にとって有用である。
【０１４４】
ある特定の実施形態において、少なくとも１つのＵＢＡ、少なくとも１つのＥＳＢまたはＵＢＡとＥＳＢの両方が、少なくとも１つの標的分子と特異的に反応する少なくとも１つの抗体、アプタマーまたはペプトイドを含む。ある特定の実施形態において、少なくとも１つのＵＢＡ、少なくともＥＳＢまたはＵＢＡとＥＳＢの両方が、少なくとも１つの標的分子と特異的に相互作用する結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、共通リンカー部分を含む。
【０１４５】
当業者は、本明細書中に記載される分子複合体および分子複合体の少なくとも一部が、とりわけ、特定の分子複合体または切断可能な構成要素の性質ならびに用いられるＳＭＤ法および検出装置に応じて、基材に繋ぎ止められているかもしくは付着させられている間にまたは溶液中で、個別に検出され得ることを認識するだろう。
【０１４６】
方法
本発明は、生体分子サンプル中の標的分子を検出および定量するための方法を提供する。特に、本発明は、個々の標的分子に結合することができるＵＢＡを提供する。本発明は、ＥＳＢおよびＣＯＢの使用も提供する（図２を参照のこと）。ＥＳＢおよびＣＯＢのコードによって、ＵＢＡと標的分子との結合が、単一細胞内での標的分子の同定をもたらす。いくつかの実施形態において、ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体は、標的分子および細胞の起源を表す情報の量を表す（図１を参照のこと）。そのようなＵＢＡおよび／またはＥＳＢならびにＣＯＢを作製および使用する方法も提供される。
【０１４７】
１つの態様において、本発明は、複雑な細胞集団の各細胞において複数個の標的分子を同定する方法およびその標的分子に関する細胞特異的な情報を保持する方法を提供する。ゆえに、各細胞について、その細胞に関連する各標的分子の量がアッセイされる。いくつかの実施形態において、複数の情報の量が、複雑な細胞集団の各細胞において複数個の標的分子を同定するために決定される。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、本発明は、サンプル中の少なくとも１つの標的分子を検出するための方法を提供し、その方法は：（ａ）（ｉ）少なくとも１つの標的分子を潜在的に含む細胞の集団、（ｉｉ）第１の標的分子に特異的な第１のＵＢＡ、（ｉｉｉ）第１のＵＢＡのある領域に特異的な第１のエピトープ特異的バーコードＥＳＢ（そのＥＳＢは、第１の共通リンカー部分を含む）、および（ｉｖ）ＣＯＢの集団（そのＣＯＢの集団は、第２の共通リンカー部分を含み、その第２のリンカー部分は、第１のＥＳＢの第１の共通リンカー部分と相補的である）を提供する工程；（ｂ）少なくとも１つの標的分子、第１のＵＢＡプローブおよび第１のＥＳＢを含む少なくとも第１の複合体を形成する工程（その少なくとも１つの標的分子は、第１のＵＢＡに結合され、ＥＳＢは、ＵＢＡに結合される）；（ｃ）ＣＯＢの集団を加える工程（ここで、少なくとも１つの標的分子、第１のＵＢＡプローブ、第１のＥＳＢおよび第１のＣＯＢによって第２の複合体が形成され、第１のＣＯＢの第２の共通リンカー部分は、第１のＥＳＢの第１のリンカー部分に結合され、ＣＯＢの集団のＣＯＢは、細胞の集団の細胞に関連している）；および（ｄ）第２の複合体または第３の複合体の少なくとも一部を検出する工程を包含する。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＵＢＡを標的分子に結合することによって標的分子を検出および／または定量するための方法を提供する。ＵＢＡは、代表的には、配列特異的様式、コンフォメーション特異的様式またはその両方で（例えば、抗原−抗体結合、アプタマー−標的結合などであるがこれらに限定されない）ＵＢＡが標的分子に結合するかまたはそれと相互作用するのを可能にする少なくとも１つの反応部分を含む（図２および３を参照のこと）。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、少なくとも１つの第１のプローブおよび少なくとも１つの第２のプローブを含む少なくとも１つのプローブセットの一部であり得る。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、ＵＢＡプローブセットを標的分子に結合することによって標的分子を検出および／または定量するための方法を提供し、ここで、そのＵＢＡプローブセットは、第１のＵＢＡプローブおよび第２のＵＢＡプローブを含む。第１のＵＢＡプローブおよび第２のＵＢＡプローブは、例えば、配列特異的様式、コンフォメーション特異的様式またはその両方で、それらのプローブが標的分子の異なる領域に結合するかまたはそれと相互作用するのを可能にする少なくとも１つの反応部分を含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡプローブおよび／または第２のＵＢＡプローブは、本明細書中に記載されるような捕捉領域を含む。
【０１５１】
ある特定の実施形態において、ＵＢＡは、同一性部分または同一性部分の少なくとも一部、例えば、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＥＳＢおよび／またはリンカーオリゴを含む。その同一性部分は、本明細書中に記載される方法の検出工程において、標的分子に結合されているＵＢＡの有無の同定を可能にする。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、ＵＢＡを標的分子に結合することによって標的分子を検出および／または定量するための方法を提供し、ここで、ＵＢＡは、同一性部分（例えば、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＥＳＢおよび／またはリンカーオリゴ）を含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、標的分子は、細胞内においてエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）で間接的にタグ化される。各ＥＳＢは、特定の標的分子に関連し得るユニークなコードを含む。ＥＳＢは、少なくとも１つのＵＢＡまたはＵＢＡの一部に結合するようにデザインされた分子または構築部品であり；適切な条件下において、ＥＳＢ、ＵＢＡおよび標的分子を含む分子複合体を形成し得る。ＥＳＢは、代表的には、配列特異的様式、コンフォメーション特異的様式またはその両方で（例えば、ＵＢＡ−抗体結合、アプタマー−標的結合などであるがこれらに限定されない）、ＥＳＢが少なくとも１つのＵＢＡに結合するかまたはそれと相互作用するのを可能にする少なくとも１つの同一性同定部分を含む。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、ＵＢＡに直接または間接的に付着させられる。他の実施形態において、ＥＳＢは、例えば、アッセイ手順の一部として、細胞またはサンプル中でＵＢＡに結合する。ある特定の実施形態において、ＵＢＡおよび／またはＥＳＢは、捕捉領域を含む。いくつかの実施形態において、その捕捉領域は、ＵＢＡ／ＥＳＢの単離および／または表面へのＵＢＡ／ＥＳＢの固定化のために使用される。その捕捉領域は、親和性タグ、ビーズ、スライドまたはアレイであり得る。ある特定の実施形態において、ＥＳＢは、共通リンカー部分、例えば、リンカーオリゴを含む。ある特定の実施形態において、共通リンカーオリゴは、細胞起源バーコード（ＣＯＢ）を形成するアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）における共通リンカーオリゴに相補的である。
【０１５３】
図３および４は、分割プール合成アプローチを用いて標的分子／ＵＢＡ／ＥＳＢ複合体に対してＣＯＢを付加する本発明の実施形態のうちの１つの模式図を示している。工程１としての図３は、ＵＢＡ−ＥＳＢ−ＣＬ試薬による細胞の標識を示している。このＵＢＡは、細胞内で認識される標的分子に対する特異性を提供する。いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、ＣＤ８のような表面マーカーまたはＳｔａｔ−３などのキナーゼ上のホスホ−エピトープのような細胞内エピトープに特異的な抗体であり得る。いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、固定された細胞内の標的ｍＲＮＡに対するアンチセンスＤＮＡであり得る。そのＵＢＡは、ＣＬ部分を有するＥＳＢを用いて同定され、ＣＬ部分は、細胞特異的なタグ化情報を後で付加するためのものである。工程２である図４は、分割プール合成の始めの部分を示している。この例では、細胞集団が、２０本のチューブに分割される。細胞集団は、ウェル、ビーズまたは当該分野で公知の任意の好適な表面に分割され得る。工程３では、ＡＰＳユニットが、各チューブに加えられる。そのＡＰＳは、ＡＰＳおよびＥＳＢにおける相補的なＣＬを介してＵＢＡ／ＥＳＢ複合体に結合する。工程４では、所与のチューブ内の各細胞が、次に、チューブの内容物によって定義される同じサブユニット（この例では１〜２０のＡＰＳのうちの１つ）を各ＵＢＡ−ＥＳＢ対に付加する。工程３の分割された各集団が、次に、その細胞内のすべてのＤＢＡＡに付加されたＤＡＰＳ「タグ」ポリマーサブユニットを有する。工程５では、その２０本のチューブの細胞が、１本のチューブにまとめられる。それらの細胞の１／２０が、同じＡＰＳサブユニットを有する。工程６では、工程２〜４が繰り返されて、先のＡＰＳに第２のＡＰＳが付加される。この例では、１本のチューブ内の細胞は、細胞の混合物（そのすべてが、２ラウンド目のＡＰＳサブユニットおよび１ラウンド目に使用された２０個のＡＰＳのうちの１つを統計的に等しい分布で有する）を有する。したがって、２ラウンド目において、個々の各チューブ混合物内では、すべてのポリマーが、同じＡＰＳの付加によって伸長される。必要に応じて、このプロセスが繰り返される。連結された細胞起源シグネチャとともにエピトープ／バーコードは、本明細書中に記載される方法を含む当該分野で公知の任意の方法によって読まれる。
【０１５４】
必要とされる分割プールのラウンド数は、アッセイにおける細胞数、および各細胞に対してＣＯＢがユニークであるのを保証するタグの数の過剰提示をもたらし得るものの統計的推定値によって定義される。これは、以下の式：
必要とされるタグの数＝
【０１５５】
【数１】
2014513916.tif 000003
によって与えられ、ここで、Ｃ＝過剰提示の確実性であり、Ｎ＝細胞数である。
【０１５６】
したがって、１００万個の細胞を有しており、タグのユニークさに関して９９．９％の確実性を要求する場合、
【０１５７】
【数２】
2014513916.tif 000004
すなわち、およそ７００万個のタグが必要である。様々な実施形態において、高確実性のタグユニークさは、細胞／粒子を異なる実体として同定することに対して高い統計的有意性を保証する。理論に拘束されるものではないが、高確実性のタグユニークさ（ｔａｇ  ｕｎｉｑｅｎｅｓｓ）は、２つの同一のＣＯＢ標識が同じ細胞／粒子を起源とする高い可能性を提供する。
【０１５８】
しかしながら、１０６個の細胞の場合、７００万個のタグでは、１０００個の細胞対が「同じ」細胞として標識され得ることを意味する。ゆえに、一対の二つ組の細胞が存在することのわずか１０に１つの可能性を有するために、上記式は、９９．９９９９９％に設定されるべきである。
【０１５９】
【数３】
2014513916.tif 000005
したがって、細胞より１６倍多いタグが必要となる。
【０１６０】
バーコードを作製するための所与の数のサブユニットが与えられて、ラウンド数を決定するために：
【０１６１】
【数４】
2014513916.tif 000006
から、
【０１６２】
【数５】
2014513916.tif 000007
が導かれる。２０個のサブユニットを有しているならば、１．７×１０７個のタグの場合、以下のＡＰＳ付加サイクルが必要である：
【０１６３】
【数６】
2014513916.tif 000008
これは、６ラウンドのＡＰＳ付加サイクルに切り上げることができる。１００個のサブユニットを有している場合、わずか３．６ラウンド、すなわち切り上げて４ラウンドのＡＰＳ付加サイクルが必要となる。
【０１６４】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、細胞内の標的分子をＥＳＢで間接的にタグ化するための方法を提供する。細胞集団を、細胞の起源を示す第２のシグネチャすなわち細胞起源バーコードをエピトープ特異的バーコードに付加する分割プール合成アプローチにおいて処理する。ＵＢＡは、タンパク質の場合、抗体、ダイアボディなど、またはＲＮＡの場合、アンチセンスＤＮＡタグおよび核酸の場合、ＤＮＡであり得る。ＥＳＢは、ハイスループット配列決定アプローチによって可読な核酸または質量分析アプローチによってアッセイ可能な化学サブユニットであり得る。ＣＯＢは、ハイスループット配列決定アプローチによって可読な核酸または質量分析アプローチによってアッセイ可能な化学サブユニットであり得る。
【０１６５】
ＡＰＳは、ＤＮＡまたはＤＮＡ模倣物の特定の鎖であり得る。ＡＰＳは、リガーゼによって連結され得る。ライゲーションのために使用され得る酵素の例としては、ＤＮＡリガーゼおよびＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）リガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡリガーゼまたはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）リガーゼ）が挙げられるがこれらに限定されない。化学的ライゲーションは、活性化剤および還元剤（例えば、カルボジイミド、臭化シアン（ＢｒＣＮ）、イミダゾール、１−メチルイミダゾール／カルボジイミド／シスタミン、Ｎ−シアノイミダゾール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）および紫外線）を用いて行われ得る。ライゲーション法（例えば、ギャップフィリング（ｇａｐ−ｆｉｌｌｉｎｇ）ライゲーション（ギャップフィリングＯＬＡおよびＬＣＲを含むがこれらに限定されない）、架橋オリゴヌクレオチドライゲーションおよび訂正ライゲーション）も本発明の範囲内である。これらの手法の説明は、とりわけ、米国特許第５，１８５，２４３号、公開された欧州特許出願ＥＰ３２０３０８およびＥＰ４３９１８２ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０１０６９およびＷＯ０１／５７２６８に見られる。ＡＰＳは、ポリメラーゼによって伸長され得る。
【０１６６】
これらのＡＰＳサブユニットは、本明細書中に記載される配列決定方法を含む当該分野で公知の任意の好適な方法、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００によるすべてのＤＮＡタグの全長配列決定によって検出され得る。
【０１６７】
ＡＰＳは、コンビナトリアル合成法に従った小分子または決定論的重量の組立可能な複合分子であり得る。これらのサブユニットは、質量分析を介して検出され得る。
【０１６８】
したがって、いくつかの実施形態において、細胞特異的情報は、その関連しているＣＯＢに連結されているＵＢＡ（認識されるエピトープに対するバーコード）を介して組み立てられる（その情報がどの細胞を起源にしているか）（図５を参照のこと）。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体は、本明細書中に記載されるような捕捉領域を介して単離される。いくつかの実施形態において、その捕捉領域は、表面へのＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体の固定化のために使用される。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡに関する情報は、本明細書中に記載される方法（例えば、分枝鎖またはローリングサークルアプローチ）を含む当該分野で公知の任意の好適な増幅法によって、その後のＣＯＢ手順（分割プール）の前に、増幅され得る。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、誤りの訂正および検出は、サブユニットにコードされ得る。誤りの検出および訂正を達成するための一般的な概念は、いくらかの冗長性（すなわち、いくらか余分なデータ）をメッセージに付加するということであり、それを受取側は、送達されたメッセージの一貫性を確認するため、および誤っていると決定されたデータを回復するために使用できる。誤りの検出および訂正のスキームは、系統的または非系統的であり得る：系統的スキームでは、伝達側は、元のデータを送り、一定数のチェックビット（またはパリティデータ）（それは、ある決定的アルゴリズムによってそのデータビットから得られる）を添付する。誤りの検出だけが必要とされる場合、受取側は、単純に、受け取ったデータビットに同じアルゴリズムを適用し、その結果を受け取ったチェックビットと比較し得る；その値が一致しない場合は、誤りが伝達中のどこかの点に存在している。非系統的コードを使用するシステムでは、元のメッセージが、その元のメッセージと少なくとも同じビット数を有するコードされたメッセージに変換される。誤りの検出および訂正のスキームは、反復符号、パリティビット、チェックサム、巡回冗長検査（ＣＲＣ）、暗号学的ハッシュ関数、誤り訂正符号、自動再送要求、ハイブリッドＡＲＱ、誤り訂正符号、畳み込み符号、ブロック符号（例えば、ハミング符号、多次元パリティ検査符号、リード・ソロモン符号、ターボ符号および低密度パリティ検査符号（ＬＤＰＣ））を含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、ポリマーが付加しなかった場合、各ラウンドにおける鎖は、さらなる付加から保護される。これは、各ラウンドが、相補的な付加のために異なるオーバーハングを使用する場合、ポリマーユニットとしてのＤＮＡによって達成され得る。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、連結された細胞起源シグネチャとともにエピトープ／バーコードが、本明細書中に記載される方法を含む当該分野で公知の方法を用いる配列決定によって読まれる。各１００ｂｐリードがＥＳＢ−ＣＯＢ対に相当すると仮定する配列決定アプローチに対する感度は、標的タンパク質に対して、以下のとおりである。目的の分子のタンパク質コピー数は、１００〜１００，０００の範囲である。下記の大まかな分布を有する１００種のタンパク質を読みたいと仮定する：
【０１７４】
【表１】
2014513916.tif 000009
テスト１では、細胞内の１００種すべてのタンパク質に到達するためには、細胞１つあたり２，２３２，０００個の配列を読むことができる必要がある。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００などの２×１０９個のリードを処理できる配列決定法を用いるとき、これは、そのアプローチが、約１，０００個の細胞において１００種のタンパク質を読むことができることを意味する。しかしながら、高コピー数のタンパク質を完全に回避することによって、または正規化によってその表示を「キャッピング」することによって、その高コピー数のタンパク質を制限する場合（いくつかのアプローチがこのために機能し得る）、到達可能な細胞数を増加させることができる。ゆえに、１００，０００コピーを１０，０００コピーの限度に正規化およびキャッピングするとすると（テスト２）、リードの総数は、４３２，０００個となる。つまり、約５０００個の細胞において１００種のタンパク質を読むことができる。
【０１７５】
ｍＲＮＡの場合、ＲＮＡは、代表的には一層より少なく発現されるので、その数は異なる。目的の分子のＲＮＡコピー数は、５〜１０００の範囲であり（Ｌｅｗｉｎ’ｓ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｇｅｎｅｓの数に基づくと）；アクチンまたはＩｇのような大量に産生されるタンパク質の特定のｍＲＮＡを計数しない。したがって、下記の大まかな分布を有する１００種のｍＲＮＡを読みたいと仮定する：
【０１７６】
【表２】
2014513916.tif 000010
テスト１では、細胞内の１００種すべてのｍＲＮＡに到達するためには、細胞１つあたり１２，３００個の配列を読むことができる必要がある。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００などの２×１０９個のリードを処理できる配列決定法を用いるとき、これは、そのアプローチが、約１６２，０００個の細胞において１００種のｍＲＮＡを読むことができることを意味する。これは、高パラメータフローサイトメトリーの実施と等しい。同じ分布を有する２００種のｍＲＮＡは、約８０，０００個の細胞において読まれると直線的に概算され得る。
【０１７７】
当業者に明らかであるように、リードの数が増えるほど、細胞数および到達可能なパラメータ（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）が増える。
【０１７８】
本明細書中に記載される任意の実施形態が、複数個の標的分子の検出において使用され得る。いくつかの実施形態において、本発明は、標的分子の分析のためのＵＢＡを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、多重化アッセイにおいて使用するためのＵＢＡ集団を提供する。その集団内の各ＵＢＡは、標的分子に特異的である。次いで、その標的分子とＵＢＡとの結合が、ＥＳＢ−ＣＯＢ対を用いて検出される。各ＥＳＢ−ＣＯＢ対は、本明細書中に記載されるような特定の標的分子および細胞起源に関連し得るユニークな標識コードを含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、下に記載されるＥＳＢ−ＣＯＢの検出は、１分子ずつ計数されるという点でデジタルの性質である。コードを読むために蛍光が用いられるが、そのシグナルは高く、かつスポットが存在するかまたは存在しないことから、デジタルの検出である。シグナルを定量するために使用されるアナログの蛍光シグナルではなくデジタルの検出を用いることにより、より正確な定量がもたらされる。したがって、本明細書中に記載される方法は、より正確な定量およびできる限りより高感度であるために、現在可能なレベルを超えるレベルへの多重化を可能にする。
【０１８０】
生体分子サンプル
本発明のＵＢＡおよびＥＳＢ／ＣＯＢシステムは、任意の生体分子サンプル中の標的分子を検出するために使用され得る。当業者によって認識されるように、そのサンプルは、生物学的サンプル（例えば、実質的に任意の生物の細胞（初代細胞と培養細胞株の両方を含む）、細胞溶解産物または抽出物、組織および組織抽出物）；体液（血液、尿、血清、リンパ液、胆汁、脳脊髄液、間質液、眼房水または硝子体液、初乳、痰、羊水、唾液、肛門および膣の分泌物、汗および精液、漏出液、滲出液（例えば、膿瘍または感染もしくは炎症の他の任意の部位から得られる流体）または関節（例えば、正常関節または疾患（例えば、関節リウマチ、変形性関節症、痛風または化膿性関節炎）に罹患した関節）から得られる流体を含むがこれらに限定されず、哺乳動物のサンプルが好ましく、ヒトサンプルが特に好ましい）；環境サンプル（大気、農業、水および土壌のサンプルを含むがこれらに限定されない）；生物学的兵器剤サンプル；研究サンプル（細胞外液、細胞培養物の細胞外の上清、細菌における封入体、細胞内コンパートメント、細胞周辺質、ミトコンドリアコンパートメントなどを含む）を含むがこれらに限定されない任意の数のものを含み得る。
【０１８１】
上記生体分子サンプルは、生物学的検体から間接的に得られることがある。例えば、目的の標的分子が、タンパク質キナーゼである場合、本発明の生体分子サンプルは、細胞溶解産物由来の単離されたタンパク質を含むサンプルであり得る。別の例では、本発明の生体分子サンプルは、生物学的検体を分画、例えば、サイズ分画または膜分画に供することによって生成される。
【０１８２】
タンパク質単離の手法は、当該分野で周知でもあり、これらの手法のうちの少なくともいくつかを使用するキットが、商業的に入手可能である。タンパク質単離の手法は、代表的には、以下のうちの１つ以上を使用する：浸軟および細胞溶解（物理的、化学的および酵素的方法を含む）；遠心分離；分子量による分離（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーおよび分取電気泳動）；選択的沈殿、例えば、塩溶および塩析手順；様々なクロマトグラフィー方法；など。タンパク質精製の手法の詳細な説明および関連するプロトコルは、とりわけ、Ｍａｒｃｈａｋら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｄ．Ｓｐｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｒ．Ｇｏｌｄｍａｎ，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｒ．Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００３）；およびＤ．Ｌｉｅｂｌｅｒ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００２）に見られる。商業的に入手可能なキット（例えば、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ．ＲＴＭ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能な、ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ．ＴＭ．Ｐａｒｔｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐ−ＰＥＫ）およびＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ．ＴＭ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（Ｃ−ＰＥＫ）であるがこれらに限定されない）も使用され得る。当業者は、本発明の組成物、方法およびキットとともに使用するための非核酸被検体が、そのような精製法および市販のキットを用いて過度の実験を行うことなく容易に入手できることを認識するだろう。
【０１８３】
本発明の生体分子サンプルは、天然のもの、例えば、操作もしくは処理に供されていないものであってもよいし、処理されたもの（それは、任意の数の処理（薬物を含む候補物質への曝露、遺伝子操作（例えば、遺伝子の付加または欠失）などを含む）を含み得る）であってもよい。
【０１８４】
生体分子サンプルは、環境サンプル（例えば、細菌または他の生物（例えば、珪藻類、渦鞭毛藻類、藻類、とりわけ、例えば、ある特定の海洋または地上のサンプル中のもの）を含むサンプル）も含み得る。
【０１８５】
ＣＯＢの検出
ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体は、所与のＣＯＢ／ＥＳＢ複合体上の特定の配列またはシグナルを検出することができる当該分野において利用可能な任意の手段によって検出される。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＵＢＡ／ＥＳＢ複合体、ＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体および／またはそれらの組み合わせに関する情報が、増幅され得る。増幅は、当該分野で公知の任意の手段によって行われ得る。場合によっては、ＵＢＡ、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＵＢＡ／ＥＳＢ複合体、ＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体および／またはそれらの組み合わせに関する情報は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される。使用され得るＰＣＲ法の例としては、定量的ＰＣＲ、定量的蛍光ＰＣＲ（ＱＦ−ＰＣＲ）、多重蛍光ＰＣＲ（ＭＦ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、単一細胞ＰＣＲ、制限酵素断片長多型ＰＣＲ（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ／ＲＴ−ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ホットスタートＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、インサイチュポロニーＰＣＲ、インサイチュローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ブリッジＰＣＲ、ピコタイターＰＣＲおよびエマルジョンＰＣＲが挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅、自家持続配列複製法、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅、コンセンサス配列プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＣＰ−ＰＣＲ）、任意プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドプライムＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）および核酸ベース配列増幅（ＮＡＢＳＡ）が挙げられる。本明細書中で使用され得る他の増幅方法としては、米国特許第５，２４２，７９４号；同第５，４９４，８１０号；同第４，９８８，６１７号；および同第６，５８２，９３８号に記載されているものが挙げられる。
【０１８７】
上記実施形態のいずれかにおいて、ＵＢＡ、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＵＢＡ／ＥＳＢ複合体、ＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体および／またはそれらの組み合わせに関する情報の増幅は、ビーズ上で行われ得る。本明細書中の実施形態のいずれかにおいて、標的核酸は、単一細胞から得られることがある。
【０１８８】
本明細書中の実施形態のいずれかにおいて、ＵＢＡ、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＵＢＡ／ＥＳＢ複合体、ＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体および／またはそれらの組み合わせに関する情報は、増幅工程（例えば、ＰＣＲ）の前に予め増幅され得る。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＵＢＡ／ＥＳＢ複合体、ＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体および／またはそれらの組み合わせが、定量される。核酸を定量するための方法は、当該分野で公知であり、それらとしては、ガスクロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー（分配クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーを含む）、電気泳動（キャピラリー電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動、キャピラリー電気クロマトグラフィー、ミセル動電キャピラリークロマトグラフィー、等速電気泳動、一時的等速電気泳動およびキャピラリーゲル電気泳動を含む）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、マイクロアレイ、ビーズアレイおよびハイスループットジェノタイピング（例えば、分子反転プローブ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｐｒｏｂｅ：ＭＩＰ）の使用によるもの）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９０】
ＵＢＡ、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＵＢＡ／ＥＳＢ複合体、ＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体および／またはそれらの組み合わせの定量は、ある状態、すなわち胎児の異常もしくはがんを診断するために、遺伝子／または対立遺伝子のコピー数、遺伝子またはエキソンレベル発現、メチル化状態分析を決定するため、または新規転写物を検出するために使用され得る。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＵＢＡ／ＥＳＢ複合体、ＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体および／またはそれらの組み合わせが、配列決定される。配列決定は、当該分野で周知の従来のＳａｎｇｅｒ配列決定法によって達成され得る。配列決定は、ハイスループットシステムを用いても達成され得、そのシステムの一部は、配列決定されるヌクレオチドを成長鎖に組み込んだ直後または組み込む際に、そのヌクレオチドの検出を可能にし、すなわち、リアルタイムまたは実質的にリアルタイムでの配列の検出を可能にする。場合によっては、ハイスループット配列決定は、１時間あたり少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００または少なくとも５００，０００個の配列リードを生成し；各リードは、１リードあたり少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２０または少なくとも１５０塩基である。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定には、ＩｌｌｕｍｉｎａのＨｉＳｅｑ２０００装置が利用可能な技術の使用が必要である。この装置は、合成化学による可逆的ターミネーターに基づく配列決定を用いる。この装置は、８日間で２０００億個のＤＮＡリードを処理できる。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定には、ＡＢＩ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍが利用可能な技術の使用が必要である。この遺伝子分析プラットフォームは、ビーズに連結されたクローン増幅されるＤＮＡフラグメントの大規模並列の配列決定を可能にする。この配列決定方法は、色素で標識されたオリゴヌクレオチドを用いた連続的なライゲーションに基づく。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定には、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｃｈｉｎｅ（ＰＭＧ）が利用可能な技術の使用が必要である。このＰＧＭは、２時間で１０００万個のリードを処理できる。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定には、合成による単一分子配列決定（ＳＭＳＳ）法などのＨｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）が利用可能な技術の使用が必要である。ＳＭＳＳは、最大２４時間でヒトゲノム全体の配列決定を可能にするので、ユニークである。最後に、ＳＭＳＳは、米国公開出願番号２００６００２４７１１；２００６００２４６７８；２００６００１２７９３；２００６００１２７８４；および２００５０１００９３２に一部記載されている。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定には、その機器のＣＣＤカメラによって記録される、配列決定反応によって生成される化学発光シグナルを透過する光ファイバープレートを含むＰｉｃｏ  Ｔｉｔｅｒ  Ｐｌａｔｅデバイスなどの４５４  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｒａｎｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）が利用可能な技術の使用が必要である。この光ファイバーの使用によって、４．５時間で最低２０００万塩基対の検出が可能である。
【０１９７】
ビーズ増幅の後の光ファイバー検出を使用するための方法は、Ｍａｒｇｕｉｌｅｓ，Ｍ．ら、“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｐｒｉｃｏｌｉｔｒｅ  ｒｅａｃｔｏｒｓ”，Ｎａｔｕｒｅ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０３９５９；ならびに米国公開出願番号２００２００１２９３０；２００３００６８６２９；２００３０１００１０２；２００３０１４８３４４；２００４０２４８１６１；２００５００７９５１０、２００５０１２４０２２；および２００６００７８９０９に記載されている。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定は、Ｃｌｏｎａｌ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａｒｒａｙ（Ｓｏｌｅｘａ，Ｉｎｃ．）または可逆的ターミネーター化学反応を利用する合成ごとの配列決定（ＳＢＳ）を用いて行われる。これらの技術は、米国特許第６，９６９，４８８号；同第６，８９７，０２３号；同第６，８３３，２４６号；同第６，７８７，３０８号；および米国公開出願番号２００４０１０６１１０；２００３００６４３９８；２００３００２２２０７；およびＣｏｎｓｔａｎｓ，Ａ．，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ２００３，１７（１３）：３６に一部記載されている。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定は、ＡｎｙＤｏｔ．ｃｈｉｐｓ（Ｇｅｎｏｖｏｘｘ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行われ得る。特に、ＡｎｙＤｏｔ．ｃｈｉｐｓは、ヌクレオチド蛍光シグナル検出の１０倍〜５０倍の増強を可能にする。ＡｎｙＤｏｔ．ｃｈｉｐｓおよびそれらの使用方法は、国際公開出願番号ＷＯ０２０８８３８２、ＷＯ０３０２０９６８、ＷＯ０３０３１９４７、ＷＯ２００５０４４８３６、ＰＣＴ／ＥＰ０５／０５６５７、ＰＣＴ／ＥＰ０５／０５６５５；ならびに独国特許出願番号ＤＥ１０１４９７８６、ＤＥ１０２１４３９５、ＤＥ１０３５６８３７、ＤＥ１０２００４００９７０４、ＤＥ１０２００４０２５６９６、ＤＥ１０２００４０２５７４６、ＤＥ１０２００４０２５６９４、ＤＥ１０２００４０２５６９５、ＤＥ１０２００４０２５７４４、ＤＥ１０２００４０２５７４５およびＤＥ１０２００５０１２３０１に一部記載されている。
【０２００】
他のハイスループット配列決定システムとしては、Ｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００１；Ａｄａｍｓ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４  Ｍａｒｃｈ  ２０００；およびＭ．Ｊ，Ｌｅｖｅｎｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：６８２−６８６，Ｊａｎｕａｒｙ  ２００３；ならびに米国公開出願番号２００３００４４７８１および２００６／００７８９３７に開示されているものが挙げられる。そのようなシステムの全部が、核酸分子上で測定される重合反応を介した塩基の経時的付加による複数の塩基を有する標的核酸分子の配列決定を必要とし、すなわち、配列決定される鋳型核酸分子上での核酸重合酵素の活性が、リアルタイムで追跡される。次いで、一連の塩基付加の各工程における核酸重合酵素の触媒活性によって、どの塩基が標的核酸の成長相補鎖に組み込まれているかを同定することによって配列が推定され得る。標的核酸分子複合体上のポリメラーゼは、標的核酸分子に沿って移動して活性部位においてオリゴヌクレオチドプライマーを伸長するのに適した位置に提供される。複数の標識タイプのヌクレオチドアナログが、活性部位に近接して提供され、ヌクレオチドアナログの識別可能な各タイプは、標的核酸配列内の異なるヌクレオチドに相補的である。成長核酸鎖は、ヌクレオチドアナログを活性部位の核酸鎖に付加するポリメラーゼを使用することによって伸長され、ここで、付加されるヌクレオチドアナログは、その活性部位において標的核酸のヌクレオチドに相補的である。重合工程の結果としてオリゴヌクレオチドプライマーに付加されるヌクレオチドアナログが同定される。標識されたヌクレオチドアナログを提供する工程、成長核酸鎖を重合する工程、および付加されたヌクレオチドアナログを同定する工程が、繰り返されて、その核酸鎖がさらに伸長され、標的核酸の配列が決定される。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＵＢＡ／ＥＳＢ複合体、ＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体および／またはそれらの組み合わせの配列分析は、４つの位置のうちの１つに対するアンカープライマーのハイブリダイズを含む、ライゲーションスキーム（縮重ライゲーション）による４色配列決定を含み得る。次いで、蛍光色素で標識された縮重九量体の集団とアンカープライマーとの酵素的ライゲーション反応が行われる。任意の所与のサイクルにおいて、使用される九量体の集団は、その位置のうちの１つの同一性が、その九量体に付着させられたフルオロフォアの同一性と相関するような構造である。そのリガーゼが、問い合わされた位置における相補性について判別する限りにおいては、蛍光シグナルは、塩基の同一性の推測を可能にする。ライゲーションおよび４色イメージングを行った後、アンカープライマー：九量体複合体は、取り除かれ、新しいサイクルが開始する。ライゲーションを行った後に配列情報を画像化する方法は、当該分野で公知である。
【０２０２】
１つ以上のＵＢＡ、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＵＢＡ／ＥＳＢ複合体、ＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体および／またはそれらの組み合わせ複合体は、組み立てられた目的の検出複合体の存在を検出および／または定量する任意の方法によって検出および／または定量され得る。そのような方法としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、共焦点顕微鏡を用いるかまたは用いない免疫蛍光組織化学、ラマン分光法、Ｘ線オートラジオグラフィー、Ｘ線ラジオグラフィー、ルミネセンス分光法、逆相アッセイ、均一酵素免疫測定法および関連する非酵素的手法、ウエスタンブロット、全細胞染色、免疫電子顕微鏡法、核酸増幅、遺伝子アレイ、タンパク質アレイ、質量分析、パッチクランプ、２次元ゲル電気泳動、ディファレンシャルディスプレイゲル電気泳動、ミクロスフェアベースの多重化タンパク質アッセイ、無標識細胞アッセイならびにフローサイトメトリーなどが挙げられ得る。米国特許第４，５６８，６４９号には、シンチレーション測定法を用いるリガンド検出システムが記載されている。これらの手法は、改変されたタンパク質パラメータにとって特に有用である。タンパク質および他の細胞決定因子についての細胞の読み出しは、蛍光または別の方法でタグ化されたレポーター分子を用いて得ることができる。形態学的背景においてパラメータを測定するためには顕微鏡法が有用である。細胞内のパラメータを測定するためにはフローサイトメトリー法が有用である。
【０２０３】
蛍光標識された構成要素を本発明の方法および組成物において使用するとき、種々のタイプの蛍光モニタリングシステム、例えば、サイトメトリー測定デバイスシステムを用いることにより本発明が実施され得ることが認識されるだろう。いくつかの実施形態において、フローサイトメトリーシステム、またはハイスループットスクリーニング専用のシステム、例えば、９６ウェルもしくはそれ以上のマイクロタイタープレートが使用される。例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｒ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９８３）；Ｈｅｒｍａｎ，Ｂ．，Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｉｎ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｐａｒｔ  Ｂ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３０，ｅｄ．Ｔａｙｌｏｒ，Ｄ．Ｌ．＆Ｗａｎｇ，Ｙ．−Ｌ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９），ｐｐ．２１９−２４３；Ｔｕｒｒｏ，Ｎ．Ｊ．，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ：Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｌ，Ｉｎｃ．（１９７８），ｐｐ．２９６−３６１。ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体が、蛍光標識される場合、適切な励起源の適切な考慮が検討され得る。可能性のある励起源としては、アークランプ、キセノンランプ、レーザー、発光ダイオードまたはそれらのいくつかの組み合わせが挙げられ得るがこれらに限定されない。適切な励起源は、適切な光学的検出システム、例えば、倒立蛍光顕微鏡、落射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡と組み合わせて使用される。好ましくは、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体上のスポットの配列を決定するのに十分な空間分解能での検出を可能にし得る顕微鏡が使用される。例えば、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体が、３つの異なる色、Ａｌｅｘａ４８８、Ｃｙ３およびＡｌｅｘａ６４７で標識される場合（それぞれ１、２および３と表示される）、色１、２および３は各々、異なるチャネルにおいて取得され、第１および第２のレジスター（それらは、スポットの列として見ることができる）は、数画素ずつ移動することにより、各レジスターを個別に示すことができる。本発明の方法において使用され得る複数個の色を検出するための方法の例は、米国特許第７，４７３，７６７号、米国特許公開番号２００７／０１６６７０８、米国出願番号１１／６４５，２７０およびＰＣＴ出願番号ＵＳ０６／０４９２７４（その全体が本明細書中で参照により援用される）に記載されている。
【０２０４】
サンプル中の蛍光は、蛍光光度計を用いて測定され得る。蛍光を検出する他の方法、例えば、量子ドット法（例えば、Ｇｏｌｄｍａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００２）１２４：６３７８−８２；Ｐａｔｈａｋら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００１）１２３：４１０３−４；およびＲｅｍａｄｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）１８：５５３−８（各々明確に本明細書中で参照により援用される）を参照のこと）ならびに共焦点顕微鏡も使用してよい。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、ＦＡＣＳ細胞選別機（例えば、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅＴＭ，ＬＳＲＩＩまたはＣａｎｔｏ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）が、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体の有無に基づいて細胞を選別および回収するために使用される。ポジティブ細胞を含む液滴に電磁電荷（ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ  ｃｈａｒｇｅ）を与えることによって、それらの細胞は、他の細胞から分離され得る。次いで、ポジティブ選択された細胞は、滅菌された回収容器に収集され得る。これらの細胞選別手順は、例えば、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅＴＭ．Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌに詳細に記載されており、特に、３−１１から３−２８および１０−１から１０−１７の項を参照のこと（それらは、上記装置についてその全体が本明細書によって参照により援用される）。
【０２０６】
別の実施形態において、ポジティブ細胞は、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体の存在に基づく細胞の磁気分離を用いて選別され得る。そのような分離手法では、まず、ポジティブ選択される細胞を、回収可能な粒子（例えば、磁力的に反応性の粒子）を含むＣＯＢ／ＥＳＢ複合体と接触させる。次いで、その細胞を、例えば、磁場を用いて、ポジティブでないかまたは標識されていない細胞から物理的に分離し得る。磁力的に反応性の粒子を使用するとき、ポジティブまたは標識された細胞は、磁場を用いて容器内に保持され得るが、ネガティブ細胞は、除去される。これらのおよび類似の分離手順は、例えば、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｉｓｏｌｅｘトレーニングマニュアル（その全体が本明細書によって参照により援用される）に記載されている。
【０２０７】
いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞が、９６ウェルプレートまたは他の商業的に入手可能なマルチウェルプレートのウェルに含められる。代替の実施形態では、反応混合物または細胞が、サイトメトリー測定デバイスに入れられる。本発明において有用な他のマルチウェルプレートとしては、３８４ウェルプレートおよび１５３６ウェルプレートが挙げられるが、これらに限定されない。反応混合物または細胞を含めるため、かつ本発明において有用ななおも他の容器は、当業者に明らかであろう。
【０２０８】
いくつかの実施形態において、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体の存在量は、誘導結合プラズマ質量分析計（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：ＩＣＰ−ＭＳ）を用いて測定される。特定の元素で標識されたＵＢＡは、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体に結合する。細胞がＩＣＰに導入されると、それは、霧状にされて、イオン化される。ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体を含む細胞の元素組成が測定される。ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体上の標識に対応するシグナルの存在および強度は、その細胞上のＣＯＢ／ＥＳＢ複合体の存在量を示唆する（Ｔａｎｎｅｒら、Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  Ｐａｒｔ  Ｂ：Ａｔｏｍｉｃ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，（２００７），６２（３）：１８８−１９５．）。
【０２０９】
いくつかの実施形態において、「フローサイトメーター」は、複数個のチャネルの並列セットにおける検出デバイスを細胞が通り過ぎるように指示するように工夫されたチャネルにおいて、細胞の測定または細胞の内容物の測定のいくつかが行われるマイクロ流体デバイスである。米国特許第７，３７８，２８０号；同第７，２９４，５０３号；同第７，２９４，２９８号；および同第６，８３０，９３６号を参照のこと。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、細胞またはそれらの内容物のいくらかの一部は、超音波によって液体の個々の液滴内に被包され、個々の各液滴の特徴およびそのような液滴内の物質を測定するようにデザインされた検出デバイスを用いて調べられる。
【０２１１】
適応性のあるハードウェアおよびソフトウェアのおかげで、複数の適用に装置を適合させることができる。ソフトウェアプログラムモジュールが、方法の作製、改変および実行を可能にする。システム診断モジュールが、装置の配列、正しい接続および電動操作を可能にする。カスタマイズされたツール、実験器具、ならびに液体、粒子、細胞および生物の移動パターンが、種々の適用法の実行を可能にする。データベースが、方法およびパラメータの保存を可能にする。ロボットおよびコンピュータのインターフェースが、装置間の通信を可能にする。
【０２１２】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、液体を取扱う構成要素の使用を含む。その液体を取扱うシステムは、任意の数の構成要素を備えるロボットシステムを含み得る。さらに、本明細書中に概説される工程のいずれかまたはすべてが、自動化されてよい；したがって、例えば、それらのシステムは、完全または部分的に自動化されてよい。
【０２１３】
当業者に認識されるように、使用され得る多種多様の構成要素が存在し、それらとしては、１つ以上のロボットアーム；マイクロプレートの位置調整のためのプレートハンドラー；非相互汚染プレート上のウェルに対する蓋をはずして交換するための自動化された蓋またはキャップハンドラー；使い捨てチップを備えたサンプル分配用のチップアセンブリ；サンプル分配用の洗浄可能なチップアセンブリ；９６ウェルローディングブロック；冷却された試薬ラック；マイクロタイタープレートピペットポジション（必要に応じて冷却される）；プレートおよびチップ用のスタッキングタワー；およびコンピュータシステムが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２１４】
完全にロボットのまたはマイクロ流体のシステムには、スクリーニング適用の全工程を行う、ハイスループットピペッティングを含む自動化された液体、粒子、細胞および生物の取扱いが含まれる。これには、液体、粒子、細胞および生物の操作（例えば、吸引、分注、混合、希釈、洗浄、正確な容積移動；ピペットチップの回収および廃棄；ならびに単一サンプルの吸引からの複数個の送達に対して同一の容積の繰返しのピペッティング）が含まれる。これらの操作は、相互汚染のない液体、粒子、細胞および生物の移動である。この装置は、フィルター、膜および／または娘プレートへのマイクロプレートサンプルの自動化された複製、高密度移動、全プレートの連続希釈ならびに大容量の操作を行う。
【０２１５】
いくつかの実施形態において、アッセイの構成要素に対して特異性を有する、化学的に誘導体化された粒子、プレート、カートリッジ、チューブ、磁性粒子または他の固相マトリックスが使用される。マイクロプレート、チューブまたは任意の固相マトリックスの結合表面としては、無極性表面、高極性表面、共有結合を促進する修飾デキストランコーティング、抗体コーティング、融合タンパク質またはペプチドに結合する親和性媒体、表面に固定されたタンパク質（例えば、組換えプロテインＡまたはＧ）、ヌクレオチドレジンまたはコーティングおよび他の親和性マトリックスが挙げられ、本発明において有用である。
【０２１６】
いくつかの実施形態において、マルチウェルプレート、マルチチューブ、ホルダー、カートリッジ、ミニチューブ、音波レビテーションおよび封入、深ウェルプレート、マイクロ遠心管、クライオバイアル、四角形のウェルプレート、フィルター、チップ、マイクロチャネルチップ、マイクロ流体チップ、光ファイバー、ビーズおよび他の固相マトリックスに対するプラットフォーム、または様々な容量を有するプラットフォームが、さらなる能力のためにアップグレードできるモジュラープラットフォームに収容される。このモジュラープラットフォームは、供給源のサンプル、サンプルおよび試薬希釈のための速度可変式オービタルシェーカーおよびマルチポジションワークデッキ、アッセイプレート、サンプルおよび試薬レザバー、ピペットチップならびにアクティブウォッシュステーションを備える。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、プレートリーダーの使用を含む。
【０２１７】
いくつかの実施形態において、サンプルのインキュベートを０℃から１００℃まで正確に温度制御するための制御ブロックまたはプラットフォームなどの熱交換器の温度を安定化させるために、サーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）および温度制御システムが使用される。
【０２１８】
いくつかの実施形態において、単一もしくは複数個の磁性プローブ、親和性プローブまたはピペッターを備える相互交換可能であるピペットヘッド（単一またはマルチチャネル）は、液体、粒子、細胞および生物をロボット制御で操作する。マルチウェルまたはマルチチューブ磁気選別機またはプラットフォームは、単一または複数個のサンプルの形式で液体、粒子、細胞および生物を操作する。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、計測装置は、標識およびアッセイに応じて多種多様の異なる検出器であり得る検出器を備え得る。いくつかの実施形態において、有用な検出器としては、蛍光の複数個のチャネルを備える顕微鏡；一波長および二波長エンドポイントおよび動力学的能力、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、ルミネセンス、クエンチング、二光子励起ならびに強度再分配（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を伴った蛍光、紫外線および可視光の分光光度的検出を提供するプレートリーダー；データおよび画像を捕捉して定量化可能な形式に変換するためのＣＣＤカメラ；ならびにコンピュータワークステーションが挙げられる。
【０２２０】
いくつかの実施形態において、ロボット装置は、バスを介してメモリーおよび入力／出力デバイスセット（例えば、キーボード、マウス、モニター、プリンターなど）と通信する中央処理装置を備える。また、下で概説されるように、これは、ＣＰＵに加えてまたはその代わりに、本発明のデバイスを多重化するためのものであり得る。中央処理装置とメモリーと入力／出力デバイスとバスとの間の一般的な相互作用は、当該分野で公知である。したがって、行われる実験に応じて、種々の異なる手順がＣＰＵメモリーに蓄えられる。
【０２２１】
これらのロボットによる流体取扱いシステムは、任意の数の異なる試薬（緩衝液、試薬、サンプル、洗浄液、標識プローブなどのアッセイ構成要素などを含む）を使用し得る。
【０２２２】
標的分子検出の適用
本発明の組成物および方法は、診断、予後診断、治療、患者の層別化、薬物の開発、処置の選択およびスクリーニングの目的のために、使用され得る。本発明は、多くの異なる標的分子が、本発明の方法を用いて単一の生体分子サンプルから一度に分析され得るという利点を提供する。このおかげで、例えば、いくつかの診断テストを１つのサンプルにおいて行うことが可能になる。
【０２２３】
本発明の組成物および方法は、プロテオミクスにおいて使用され得る。本明細書中に記載される方法は、代表的には、答えを迅速に出し、これは、この適用法にとって非常に望ましい。本明細書中に記載される方法および組成物は、診断または予後診断のためにならびに健康および疾患の指標として使用され得る生物学的マーカーを見つけ出すプロセスにおいて使用され得る。本明細書中に記載される方法および組成物は、薬物をスクリーニングするため、例えば、薬物の開発、処置の選択、処置の有効性の決定、および／または医薬開発のための標的を同定するために、使用され得る。タンパク質は、体内の最終的な遺伝子産物であるので、薬物が関与するスクリーニングアッセイにおいてタンパク質発現を試験できることは、非常に重要である。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法および組成物は、タンパク質と遺伝子発現の両方を同時に測定し得、これは、行われている特定のスクリーニングに関する最大量の情報を提供し得る。
【０２２４】
本発明の組成物および方法は、遺伝子発現分析において使用され得る。本明細書中に記載される方法は、ヌクレオチド配列を区別する。標的ヌクレオチド配列間の差異は、例えば、単一核酸塩基の差異、核酸の欠失、核酸の挿入または再配列であり得る。２つ以上の塩基が関わるそのような配列の差異も、検出され得る。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、それらが実質的に類似のハイブリダイゼーション条件において標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように、実質的に同じ長さを有する。結果として、本発明のプロセスは、感染症、遺伝性疾患およびがんを検出することができる。本発明のプロセスは、環境モニタリング、法医学および食品科学においても有用である。核酸において行われ得る遺伝子分析の例としては、例えば、ＳＮＰ検出、ＳＴＲ検出、ＲＮＡ発現分析、プロモーターメチル化、遺伝子発現、ウイルス検出、ウイルス細分類および薬物耐性が挙げられる。
【０２２５】
本方法は、生体分子サンプル中に病的な細胞型が存在するか否か、その疾患のステージ、患者の予後、その患者が特定の処置に応答する能力またはその患者に対する最良の処置を決定するために、その患者から得られたかまたはその患者に由来するサンプルの分析に適用され得る。本方法は、特定の疾患に対する生物学的マーカーを同定するためにも適用され得る。
【０２２６】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法は、ある状態の診断において使用される。本明細書中で使用されるとき、用語「診断する」またはある状態の「診断」は、その状態を予測するかまたは診断すること、その状態に対する素因を決定すること、その状態の処置をモニターすること、その疾患の治療的応答を診断すること、ならびにその状態、状態の進行およびその状態の特定の処置に対する応答を予後診断することを含む。例えば、血液サンプルが、本明細書中に記載される方法のいずれかに従ってアッセイされて、そのサンプル中の疾患または悪性細胞タイプのマーカーの存在および／または量を測定することにより、疾患またはがんが診断され得るかまたはステージ決定され得る。
【０２２７】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法および組成物は、ある状態の診断および予後診断に使用される。
【０２２８】
数多くの免疫学的、増殖性および悪性の疾患および障害が、本明細書中に記載される方法に特に適用できる。免疫学的疾患および障害としては、アレルギー性疾患および障害、免疫機能の障害ならびに自己免疫疾患および状態が挙げられる。アレルギー性疾患および障害としては、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性喘息、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎および食物アレルギーが挙げられるがこれらに限定されない。免疫不全としては、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、好酸球増多症候群、慢性肉芽腫症、白血球接着不全症ＩおよびＩＩ型、高ＩｇＥ症候群、チェディアック・東、好中球増加症、好中球減少症、無形成症、無ガンマグロブリン血症、高ＩｇＭ症候群、ディジョージ／口蓋心臓顔面（Ｖｅｌｏｃａｒｄｉａｌ−ｆａｃｉａｌ）症候群ならびにインターフェロンガンマ−ＴＨ１経路欠陥が挙げられるがこれらに限定されない。自己免疫性障害および免疫調節不全障害としては、関節リウマチ、糖尿病、全身性エリテマトーデス、グレーブス病、グレーブス眼症、クローン病、多発性硬化症、乾癬、全身性硬化症、甲状腺腫およびリンパ腫性甲状腺腫（橋本甲状腺炎、リンパ節様甲状腺腫）、円形脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ  ａｅｒａｔａ）、自己免疫性心筋炎、硬化性苔癬、自己免疫性ブドウ膜炎、アジソン病、萎縮性胃炎、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、原発性胆汁性肝硬変、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発性動脈炎および炎症性腸疾患、同種移植片拒絶反応、ならびに感染性微生物または環境抗原に対するアレルギー反応による組織破壊が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２２９】
本発明の方法によって評価され得る増殖性疾患および障害としては、新生児血管腫症；二次性進行型多発性硬化症；慢性進行型骨髄変性疾患；神経線維腫症；節神経腫症；ケロイド形成；骨パジェット病；線維嚢胞性疾患（例えば、乳房または子宮の）；サルコイドーシス；ＰｅｒｏｎｉｅｓおよびＤｕｐｕｔｒｅｎ線維症、肝硬変、アテローム性動脈硬化症ならびに血管再狭窄が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３０】
本発明の方法によって評価され得る悪性疾患および障害には、血液悪性腫瘍と固形腫瘍の両方が含まれる。
【０２３１】
血液悪性腫瘍は、血液由来の細胞の変化を伴うので、そのような悪性腫瘍は、サンプルが血液サンプルであるとき本発明の方法に特に適用できる。そのような悪性腫瘍には、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非Ｂ細胞リンパ腫および他のリンパ腫、急性または慢性白血病、赤血球増加症、血小板血症、多発性骨髄腫、骨髄異形成障害、骨髄増殖性障害、骨髄線維症、非定型免疫リンパ球増殖（ａｔｙｐｉｃａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｓ）および形質細胞障害が含まれる。
【０２３２】
本発明の方法によって評価され得る形質細胞障害には、多発性骨髄腫、アミロイドーシスおよびワルデンシュトレームマクログロブリン血症が含まれる。
【０２３３】
固形腫瘍の例としては、結腸がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、膀胱腫瘍、メラノーマ、肝臓がん、骨肉腫および他の骨がん、精巣がん腫および卵巣がん腫、頭頸部腫瘍ならびに頸部新生物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３４】
遺伝性疾患もまた、本発明のプロセスによって検出され得る。これは、染色体および遺伝子の異常または遺伝性疾患についての出生前または出生後のスクリーニングによって行うことができる。検出可能な遺伝性疾患の例としては：２１水酸化酵素欠損症、嚢胞性線維症、脆弱Ｘ症候群、ターナー症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィ、ダウン症候群または他のトリソミー、心疾患、単一遺伝子疾患、ＨＬＡタイピング、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球貧血、テイ・サックス病、サラセミア、クラインフェルター症候群、ハンチントン病、自己免疫疾患、リピドーシス、異常肥満（ｏｂｅｓｉｔｙ  ｄｅｆｅｃｔｓ）、血友病、先天性代謝異常および糖尿病が挙げられる。
【０２３５】
本明細書中に記載される方法は、病原体感染、例えば、細胞内の細菌およびウイルスによる感染を、それぞれサンプル中の細菌またはウイルスのマーカーの存在および／または量を決定することによって、診断するために使用され得る。
【０２３６】
多種多様の感染症が、本発明のプロセスによって検出され得る。代表的には、これらは、細菌、ウイルス、寄生生物および真菌の感染病原体によって引き起こされる。薬物に対する様々な感染病原体の耐性も、本発明を用いて決定することができる。
【０２３７】
本発明によって検出され得る細菌の感染病原体としては、大腸菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、ＫｌＥＳＢｉｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｂ−Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｓｔｒｅｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌａｄｉｕｍ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、ＮｏｃａｒｄｉａおよびＡｃｉｔｎｏｍｙｃｅｔｅｓが挙げられる。
【０２３８】
本発明によって検出され得る真菌の感染病原体としては、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｕｔｕｓ、藻菌類（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属）、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、ＣｈｒｏｍｏｍｙｃｏｓｉｓおよびＭａｄｕｒｏｍｙｃｏｓｉｓが挙げられる。
【０２３９】
本発明によって検出され得るウイルスの感染病原体としては、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトＴ細胞リンパ球向性（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｏｔｒｏｐｈｉｃ）ウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス）、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、ポリオウイルス、トガウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、風疹ウイルスおよびレオウイルスが挙げられる。
【０２４０】
本発明によって検出され得る寄生物質としては、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ、Ｏｎｃｈｏｖｅｒｖａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｕｍ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｉｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｂａｌａｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ、Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ  ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ、Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｔｒｉｃｈｉｕｒａ、Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ  ｍｅｄｉｎｅｓｉｓ、ｔｒｅｍａｔｏｄｅｓ、Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ  ｌａｔｕｍ、Ｔａｅｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉおよびＮｅｃａｔｏｒ  ａｍｅｒｉｃａｎｉｓが挙げられる。
【０２４１】
本発明は、感染病原体による薬物耐性の検出にとっても有用である。例えば、バンコマイシン耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、ペニシリン耐性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、多剤耐性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＡＺＴ耐性ヒト免疫不全ウイルスのすべてが、本発明を用いて同定され得る。
【０２４２】
したがって、本発明の組成物および方法を用いて検出される標的分子は、患者マーカー（例えば、がんマーカー）または外来性物質による感染のマーカー（例えば、細菌またはウイルスマーカー）であり得る。
【０２４３】
ＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢの定量的性質のおかげで、本発明の組成物および方法を用いることにより、標的分子（その存在量は、生物学的状態または疾患状態を示す）、例えば、疾患状態の結果としてアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる血液マーカーを定量することができる。
【０２４４】
いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物は、サイトカイン検出のために使用され得る。本明細書中に記載される方法が低感度であれば、例えば、ある状態の生物学的マーカーとしてのサイトカインの早期検出、がんなどの疾患の診断または予後診断、および無症候性の状態の同定にとって有益であり得る。
【０２４５】
キット
本発明は、本発明の１つ以上の構成要素を備えるキットをさらに提供する。そのキットは、例えば、１つ以上のＵＢＡ、１つ以上のＥＳＢおよび／または１つ以上のＡＰＳを備え得る。そのキットは、上に記載された目的を含む当業者に明らかな任意の目的のために使用され得る。
【０２４６】
ある特定の実施形態において、本発明は、ＣＯＢ、ＵＢＡ、ＥＳＢおよび／またはそれらの組み合わせの伸長および選択的固定化にとって有用なキットも提供する。そのキットは、固定化のための基材、ならびにＣＯＢ、ＵＢＡ、ＥＳＢおよび／またはそれらの組み合わせの伸長または固定化を促進する１つ以上の結合パートナーを備え得る。その結合パートナーは、ある特定の実施形態において、適切な力における、ＣＯＢ、ＵＢＡ、ＥＳＢおよび／またはそれらの組み合わせの伸長にとって有用な部分を含み得る。ある特定の実施形態において、その結合パートナーは、表面へのＣＯＢ、ＵＢＡ、ＥＳＢおよび／またはそれらの組み合わせの固定化または選択的固定化を促進し得る。さらなる実施形態において、キットは、ＣＯＢ、ＵＢＡ、ＥＳＢおよび／またはそれらの組み合わせを伸長することができるデバイスを備え得る。
【０２４７】
上記キットは、本明細書中に記載されるようなＣＯＢ、ＡＰＳ、ＵＢＡ、ＥＳＢおよび／またはそれらの組み合わせの集団を備え得る。
【０２４８】
上記キットは、ＡＰＳを標識するための１つ以上の構成要素で予め標識されたＡＰＳまたは標識されていないＡＰＳを備え得る。さらに、キット内に提供されるＥＳＢおよび／またはＡＰＳは、予め付着させられたＵＢＡを有していてもよいし、有していなくてもよい。１つの実施形態において、ＥＳＢおよび／またはＡＰＳに付着させられていないＵＢＡが、キット内に提供される。
【０２４９】
上記キットは、リンカーオリゴおよび架橋オリゴなどの他の試薬を備え得る。いくつかの実施形態において、そのキットは、種々のプレミックスにＵＢＡを分離し得る。
【０２５０】
上記キットは、他の試薬、例えば、ハイブリダイゼーション反応を行うための緩衝液、リンカー、制限エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡ  Ｉリガーゼも備え得る。
【０２５１】
上記キットは、キットの構成要素を使用するためならびに／あるいはＡＰＳ、ＣＯＢ、ＵＢＡおよび／またはＥＳＢを作製および／もしくは使用するための指示書も備え得る。
【実施例】
【０２５２】
仮想実施例（Ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ  Ｅｘａｍｐｌｅ）１−オリゴヌクレオチド調製
当該分野で公知の標準的な手法に従って、オリゴヌクレオチドが合成され得る。例えば、３９４Ａ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）においてオリゴヌクレオチドが合成され得る。
【０２５３】
そのオリゴヌクレオチドを、５５℃で一晩脱保護した後、エタノール沈殿によって精製する。ＰＣＲ増幅に使用されるそのオリゴヌクレオチドのプライマー特異的部分を、１０％アクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルにおけるポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製する。電気泳動後にオリゴヌクレオチドを、照射スクリーン（ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ  ｓｃｒｅｅｎ）に対するＵＶシャドーイングによって可視化し、そのゲルから切り出す（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，１９９２）。次いで、それらのオリゴヌクレオチドを、ＴＮＥ（すなわちＴｒｉｓ−ナトリウムＥＤＴＡ）緩衝液（５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０）中で６４℃において一晩溶出し、Ｓｅｐ  Ｐａｋカートリッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）を製造者の指示書に従って使用して溶出物から回収する。
【０２５４】
オリゴヌクレオチドを、１００μｌのＴＥ（すなわち、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０）に再懸濁する。これらのオリゴヌクレオチドの原液の代表的な濃度は、約１μｇ／μｌまたはおよそ７４ｐｍ／μｌである。
【０２５５】
ライゲーション反応に対する必要条件として、それらのオリゴヌクレオチドを、５’末端においてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化する。２００ｐｍに等しいそれらのオリゴヌクレオチドのアリコートを、１０μｌの１０×キナーゼ緩衝液（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、１０μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰ、２０Ｕ  Ｔ４キナーゼ、および１００μｌという最終容積を得るのに十分な水−ＭＥと組み合わせる。リン酸化を３７℃で３０分間行った後、８５℃で１０分間インキュベートすることにより、Ｔ４酵素を不活性化する。
【０２５６】
そのオリゴヌクレオチドの溶液を好都合な濃度に調整する。キナーゼ処理された（ｋｉｎａｓｅｄ）オリゴヌクレオチド溶液を水で４倍希釈して、１０００ｆｍ／μｌという濃度を得る。２００ｐｍに等しいオリゴヌクレオチドの容積を、４００μｌという最終容積を得るのに十分な水と組み合わせることによって、オリゴヌクレオチドの溶液を作製する。これにより、各オリゴヌクレオチドにおいて１０００ｆｍ／μｌの溶液が生成された。キナーゼ処理されたオリゴヌクレオチドおよびキナーゼ処理されていないオリゴヌクレオチドのアリコート（２０μｌ）をその後の使用のために凍結する。
【０２５７】
クリックケミストリー用のオリゴヌクレオチドの合成および精製の一般的方法
Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒら（ＰＮＡＳ，１０８：２８，１１３３８−１１３４３，２０１１）に記載されているようにオリゴヌクレオチドを合成する。簡潔には、標準的なＤＮＡホスホラミダイト、固体支持体およびさらなる試薬をＬｉｎｋ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入する。酸触媒脱トリチル化、カップリング、キャッピングおよびヨウ素酸化の標準的な０．２または１．０μモルのホスホラミダイトサイクルを用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３９４  自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置においてオリゴヌクレオチドを合成する。すべてのβ−シアノエチルホスホラミダイトモノマーを、使用の直前に無水アセトニトリルに０．１Ｍの濃度に溶解する。通常のＡ、Ｇ、ＣおよびＴモノマーに対するカップリング時間は、３５秒であるのに対し、逆アミダイト（ｒｅｖｅｒｓｅ  ａｍｉｄｉｔｅ）に対するカップリング時間は、１８０秒である。アルキンホスホラミダイトモノマー（図２の２ｃ、Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒら、ＰＮＡＳ，１０８：２８，１１３３８−１１３４３，２０１１）および他の非標準的モノマーは、３６０秒間カップリングされる。固体支持体からのオリゴヌクレオチドの切断および脱保護は、濃アンモニア水性溶液に室温で６０分間曝露した後、密閉チューブ内において５５℃で５時間加熱することによって達成される。そのオリゴヌクレオチドを、酢酸アンモニウム中のアセトニトリルの勾配（３０分間にわたる０％〜５０％緩衝液Ｂ、流速４ｍＬ／分）、緩衝液Ａ：０．１Ｍ酢酸アンモニウム，ｐＨ７．０、緩衝液Ｂ：５０％アセトニトリルを含む０．１Ｍ酢酸アンモニウム，ｐＨ７．０でＸＢｒｉｄｇｅＴＭ  ＢＥＨ３００  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  １０μＭ  １０×２５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ）を使用するＧｉｌｓｏｎシステムにおける逆相ＨＰＬＣで精製する。３０５または２９５ｎｍにおけるＵＶ吸収によって溶出をモニターする。ＨＰＬＣ精製後、オリゴヌクレオチドを、ＮＡＰ−１０カラムを使用して脱塩し、ゲル電気泳動によって分析する。
【０２５８】
ｉ）３’−アルキンオリゴヌクレオチドの合成
３’−アルキンオリゴヌクレオチドの合成を、Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒら（ＰＮＡＳ，１０８：２８，１１３３８−１１３４３，２０１１）に記載されているように行う。簡潔には、Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７（３５）：１５３２９−１５３３４）に従って、３’−プロパルギルチミジンホスホラミダイトモノマー２ｃを用いて、ならびにＡ、Ｇ、ＣおよびＴの３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）デオキシリボヌクレオシド−５’−ホスホラミダイト（逆ホスホラミダイト，Ｌｉｎｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いるか、または５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−プロパルギル−５−メチル−デオキシシチジンを固体支持体（３３μｍｏｌ／ｇのローディング，ＡＭポリスチレン，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に付着することによって、必要とされる配列を５’から３’の方向で組み立てて、３’−アルキンオリゴヌクレオチドを合成する。レジンをツイストカラム（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に詰め、次いでそれを用いて、必要とされる配列を標準的なホスホラミダイトオリゴヌクレオチド合成によって３’から５’の方向で組み立てる。次いで、それらのオリゴヌクレオチドを、上に記載されたように切断し、脱保護し、精製する。
【０２５９】
ｉｉ）５’−アジドオリゴヌクレオチドの合成
５’−アジドオリゴヌクレオチドの合成を、Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒら（ＰＮＡＳ，１０８：２８，１１３３８−１１３４３，２０１１）に記載されているように行う。簡潔には、通常の５’−ＨＯ−ｄＣ、５’−ＨＯ−ｄＴを用いて（またはＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ製の商業的に入手可能な５’−ヨードｄＴモノマーを使用する５’−ヨード−ｄＴを用いて）、一般的方法（上記）に記載されたような０．２または１．０μｍｏｌスケールでオリゴヌクレオチドを組み立てる（トリチルオフ）。５’−ヒドロキシル基を５’−ヨードに変換するために、合成カラムに付着させられた保護されたオリゴマーを、ＤＭＦ中のヨウ化メチルトリフェノキシホスホニウムの０．５Ｍ溶液（１．０ｍＬ）で処理し、それは、室温において１５分間にわたって２本の１ｍＬ注射器によって一定間隔をあけて上記カラムに通す。次いで、そのカラムを乾燥ＤＭＦで数回洗浄する。その５’−ヨード（ｄＴまたはｄＣ）を５’−アジド（ｄＴまたはｄＣ）に変換するために、アジ化ナトリウム（５０ｍｇ）を乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）に懸濁し、７０℃で１０分間加熱し、次いで、冷却し、上清を１ｍＬ注射器に吸い上げ、カラムに往復させて通し、次いで、室温で一晩（または５５℃で５時間）放置する。次いで、そのカラムをＤＭＦおよびアセトニトリルで洗浄し、アルゴンガス流を通すことによって乾燥する。得られる５’−アジドオリゴヌクレオチドを、上に記載されたように固体支持体から切断し、脱保護し、精製する。
【０２６０】
ｉｉｉ）３’−アルキン−５’−アジドオリゴヌクレオチドの合成
３’−アルキン−５’アジドオリゴヌクレオチドの合成を、Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒら（ＰＮＡＳ，１０８：２８，１１３３８−１１３４３，２０１１）に記載されているように行う。簡潔には、ポリスチレン固体支持体上の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−プロパルギル−５−メチルデオキシシチジンをツイストカラム（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に詰め、それを用いて、５’末端に５’−ヨードｄＴ、５’−ＨＯ−ｄＴまたは５’−ＨＯ−ｄＣを有する必要とされる配列を３’から５’の方向で組み立てる（標準的なホスホラミダイトオリゴヌクレオチド合成）。次いで、その５’−ヒドロキシルまたはヨード基を、５’−アジドオリゴヌクレオチドの合成のための上に記載した条件を用いてアジドに変換する。
【０２６１】
仮想実施例２．クリックケミストリーライゲーション
オリゴヌクレオチドＡＰＳを、鋳型にアニールさせ、４℃で一晩維持する。ＣｕＩクリック触媒の溶液を、Ｃｈａｎらに記載されているようなｔｒｉｓ−ヒドロキシプロピルトリアゾールリガンド（Ｃｈａｎ  ＴＲ，Ｈｉｌｇｒａｆ  Ｒ，Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ  ＫＢ，＆  Ｆｏｋｉｎ  ＶＶ（２００４）Ｐｏｌｙｔｒｉａｚｏｌｅｓ  ａｓ  ｃｏｐｐｅｒ（Ｉ）−ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｉｎ  ｃａｔａｌｙｓｉｓ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．６（１７）：２８５３−２８５５；０．２Ｍ  ＮａＣｌ中の２．８μｍｏｌ，３８．０μＬ）、アスコルビン酸ナトリウム（０．２Ｍ  ＮａＣｌ中の４．０μｍｏｌ，８．０μＬ）およびＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（０．２Ｍ  ＮａＣｌ中の０．４μｍｏｌ，４．０μＬ）から調製する。この溶液を、アニールされたオリゴヌクレオチドに加え、その反応混合物を０℃で１時間維持し、次いで、室温でさらに１時間維持する。ＮＡＰ−２５ゲル濾過カラムを用いて、試薬を除去する。
【０２６２】
仮想実施例３．ビーズ上でのＣＯＢの分割プール合成
この実施例では、ＣＯＢをビーズに付着させられた状態で合成する。ＡＰＳをＣＯＢに組み立てるために４つの異なる方法が使用される。
【０２６３】
パッチワークＣＯＢ（図６）
アミノメチルマクロ多孔性ポリスチレン（ＭＰＰＳ）ビーズを、１０個の異なるＣＬオリゴヌクレオチド（各々が、自由選択の第１の増幅プライマー相補的領域、１０個の異なるＥＳＢ配列のうちの１つおよび共通のアニーリング領域を有する）で標識する。６ラウンドの分割プール合成を行う。各ラウンドにおいて、ビーズを２０個の異なる容器に分割する。異なるオリゴヌクレオチドＡＰＳを各容器に加える（合計２０個の異なるＡＰＳ）。所与のラウンドにおける各ＡＰＳは、そのラウンドにおける残りのＡＰＳと異なるユニークサブコード配列をさらに含む。
【０２６４】
１ラウンド目において、各ＡＰＳは、一方の末端に、ＣＬオリゴヌクレオチドのアニーリング領域に相補的なアニーリング領域１、および他方の末端にアニーリング領域２を含む。そのオリゴヌクレオチドＡＰＳは、加えられると、相補的なアニーリング領域１に沿ってＣＬオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。アニーリング領域２は、一本鎖のままであり、その後のラウンドに加えられるＡＰＳとのハイブリダイゼーションに利用可能である。その後のラウンドにおいて、各ＡＰＳは、一方の末端に、前のラウンドのＡＰＳの利用可能なアニーリング領域に相補的なアニーリング領域、および他方の末端にさらなるアニーリング領域を含む。加えられたＡＰＳは、相補的なアニーリング領域に沿って前のラウンドに加えられたＡＰＳとハイブリダイズする。
【０２６５】
最後のサブユニットは、必要に応じて、ＰＣＲまたは配列決定プライマーのハイブリダイゼーションのための第２の増幅プライマー相補的領域を含む。
【０２６６】
ＣＬまたは１つ以上のＡＰＳは、ランダムなタグ領域をさらに含み、それは、上に記載されたような分子カウンターとして作用し、それにより、検出されたＣＯＢのその後の正規化が可能になる。
【０２６７】
各ラウンドにおいてＡＰＳを加えたら、ビーズをプールし、新しい２０個のプールに分け、次のラウンドを開始する。各ラウンドにおいて、上に記載されたような１対のラウンド特異的アニーリング領域を有する新しい２０個のＡＰＳのセットを加える。６個のＡＰＳを加えた後、ビーズ上のハイブリダイズされたＡＰＳは、ポリメラーゼ／リガーゼを用いて互いに継ぎ合わされる。ＣＯＢは、必要に応じて、ＣＬ上および最後のＡＰＳサブユニット上の増幅プライマー相補的領域を標的にするプライマーを用いて、配列決定のためにＰＣＲ増幅される。
【０２６８】
プライマーの特異的アニーリングを用いたステッチＣＯＢ（図７）
アミノメチルマクロ多孔性ポリスチレン（ＭＰＰＳ）ビーズを、１０個の異なるＣＬオリゴヌクレオチド（各々が、自由選択の第１の増幅プライマー相補的領域、１０個の異なるＥＳＢ配列のうちの１つおよび共通のアニーリング領域を有する）で標識する。６ラウンドの分割プール合成を行う。各ラウンドにおいて、ビーズを２０個の異なる容器に分割する。異なるオリゴヌクレオチドＡＰＳを各容器に加える（合計２０個の異なるＡＰＳ）。所与のラウンドにおける各ＡＰＳは、そのラウンドにおける残りのＡＰＳと異なるユニークサブコード配列をさらに含む。
【０２６９】
アニーリングプライマーも加える。１ラウンド目において、そのアニーリングプライマーは、ＣＬオリゴヌクレオチドに対する相補的領域およびＡＰＳに対する相補的領域を有する。そのアニーリングプライマーは、その両方とハイブリダイズして、それらを互いにステッチする。その後のラウンドにおいて、アニーリングプライマーは、その前のラウンドに加えられたＡＰＳに対する相補的領域およびそのラウンドにおいて加えられているＡＰＳに対する相補的領域を有する。同様に、アニーリングプライマーは、その後のラウンドのＡＰＳとハイブリダイズして、それらを互いにステッチする。アニーリングプライマーの相補的領域は、各ラウンドに特異的であり、それにより、その前のラウンドとそのラウンドのサブユニットとだけの効率的なハイブリダイゼーションが可能になる。したがって、アニーリングプライマーは、それより前のラウンドのサブユニット（そのラウンドのアニーリングプライマーに対する相補的領域を有しない）にハイブリダイズしないので、特定のラウンドのサブユニットを欠くＣＯＢのさらなる合成が阻止される。
【０２７０】
最後のサブユニットは、必要に応じて、ＰＣＲまたは配列決定プライマーのハイブリダイゼーションのための第２の増幅プライマー相補的領域を含む。
【０２７１】
ＣＬまたは１つ以上のＡＰＳは、ランダムなタグ領域をさらに含み、それは、上に記載されたような分子カウンターとして作用し、それにより、検出されたＣＯＢのその後の正規化が可能になる。
【０２７２】
各ラウンドにおいてＡＰＳおよびアニーリングプライマーを加えたら、ビーズをプールし、新しい２０個のプールに分け、次のラウンドを開始する。各ラウンドにおいて、上に記載されたような１対のラウンド特異的アニーリング領域を有する新しい２０個のＡＰＳのセットを加える。６個のＡＰＳを加えた後、ビーズ上のハイブリダイズされたＡＰＳは、ポリメラーゼ／リガーゼを用いるかまたは実施例２に記載されたようなクリックケミストリーを用いて互いに永続的にステッチされる。ＣＯＢは、必要に応じて、ＣＬ上および最後のＡＰＳサブユニット上の増幅プライマー相補的領域を標的にするプライマーを用いて、配列決定のためにＰＣＲ増幅される。
【０２７３】
共通の相補的領域を有するプライマーのアニーリングを用いたステッチＣＯＢ（図８）
アミノメチルマクロ多孔性ポリスチレン（ＭＰＰＳ）ビーズを、１０個の異なるＣＬオリゴヌクレオチド（各々が、自由選択の第１の増幅プライマー相補的領域、１０個の異なるＥＳＢ配列のうちの１つおよび共通のアニーリング領域を有する）で標識する。６ラウンドの分割プール合成を行う。各ラウンドにおいて、ビーズを２０個の異なる容器に分割する。異なるオリゴヌクレオチドＡＰＳを各容器に加える（合計２０個の異なるＡＰＳ）。所与のラウンドにおける各ＡＰＳは、そのラウンドにおける残りのＡＰＳと異なるユニークサブコード配列をさらに含む。
【０２７４】
アニーリングプライマーも加える。１ラウンド目において、そのアニーリングプライマーは、ＣＬオリゴヌクレオチドに対する第１の相補的領域およびこのラウンドにおいて加えられるＡＰＳに対する第２の相補的領域を有する。そのアニーリングプライマーは、その両方とハイブリダイズして、それらを互いにステッチする。その後のラウンドにおいて、アニーリングプライマーは、その前のラウンドに加えられたＡＰＳに対する第１の相補的領域およびそのラウンドにおいて加えられているＡＰＳに対する第２の相補的領域を有する。同様に、アニーリングプライマーは、その後のラウンドのＡＰＳとハイブリダイズして、それらを互いにステッチする。アニーリングプライマーの２つの相補的領域のうち、第１の相補的領域は、各ラウンドに特異的であり、それにより、その前のラウンドのサブユニットとだけの効率的なハイブリダイゼーションが可能になる。したがって、アニーリングプライマーは、それより前のラウンドのサブユニット（そのラウンドのアニーリングプライマーに対する相補的領域を有しない）にハイブリダイズしないので、特定のラウンドのサブユニットを欠くＣＯＢのさらなる合成が阻止される。
【０２７５】
最後のサブユニットは、必要に応じて、ＰＣＲまたは配列決定プライマーのハイブリダイゼーションのための第２の増幅プライマー相補的領域を含む。
【０２７６】
ＣＬまたは１つ以上のＡＰＳは、ランダムなタグ領域をさらに含み、それは、上に記載されたような分子カウンターとして作用し、それにより、検出されたＣＯＢのその後の正規化が可能になる。
【０２７７】
各ラウンドにおいてＡＰＳおよびアニーリングプライマーを加えたら、ビーズをプールし、新しい２０個のプールに分け、次のラウンドを開始する。各ラウンドにおいて、上に記載されたような１対のラウンド特異的アニーリング領域を有する新しい２０個のＡＰＳのセットを加える。６個のＡＰＳを加えた後、ビーズ上のハイブリダイズされたＡＰＳは、ポリメラーゼ／リガーゼを用いるかまたは実施例２に記載されたようなクリックケミストリーを用いて互いに永続的にステッチされる。ＣＯＢは、必要に応じて、ＣＬ上および最後のＡＰＳサブユニット上の増幅プライマー相補的領域を標的にするプライマーを用いて、配列決定のためにＰＣＲ増幅される。
【０２７８】
ループＣＯＢ（図９）
アミノメチルマクロ多孔性ポリスチレン（ＭＰＰＳ）ビーズを、１０個の異なるＣＬオリゴヌクレオチド（各々が、自由選択の第１の増幅プライマー相補的領域、１０個の異なるＥＳＢ配列のうちの１つ、６対のＡＰＳ特異的ループアニーリング領域および自由選択の第２の増幅プライマー相補的領域を有する）で標識する。６ラウンドの分割プール合成を行う。各ラウンドにおいて、ビーズを２０個の異なる容器に分割する。異なるオリゴヌクレオチドＡＰＳを各容器に加える（合計２０個の異なるＡＰＳ）。所与のラウンドにおける各ＡＰＳは、そのラウンドにおける残りのＡＰＳと異なるユニークサブコード配列をさらに含む。
【０２７９】
上記ＡＰＳは、ループ形状でＣＬにハイブリダイズするようにデザインされており、各端において、そのラウンドに特異的なループアニーリング領域に沿ってＣＬにハイブリダイズする。そのハイブリダイゼーションは、ＣＬに沿ってＡＰＳを配置させ、次いでそれらは、互いに連結される。それらのＡＰＳは、他のラウンドに特異的なループアニーリング領域に沿ってＣＬに効率的にハイブリダイズしないようにデザインされている。その結果として、特定のラウンドのＡＰＳが欠けていると、それらのＡＰＳは、連結プロセスに依存して、首尾良く互いに連結されないことがある。あるいは、ＡＰＳが欠けた状態で（その位置は、ループアニーリング領域の対が隣接する）ＣＯＢが合成される。次いで、得られたＣＯＢは、しかるべく分析され得、処分され得るか、またはその代わりに、引き出された情報が処理され得る。
【０２８０】
ＣＬまたは１つ以上のＡＰＳは、ランダムなタグ領域をさらに含み、それは、上に記載されたような分子カウンターとして作用し、それにより、検出されたＣＯＢのその後の正規化が可能になる。
【０２８１】
各ラウンドにおいてＡＰＳおよびアニーリングプライマーを加えたら、ビーズをプールし、新しい２０個のプールに分け、次のラウンドを開始する。各ラウンドにおいて、上に記載されたような１対のラウンド特異的アニーリング領域を有する新しい２０個のＡＰＳのセットを加える。６個のＡＰＳを加えた後、ビーズ上のハイブリダイズされたＡＰＳは、ポリメラーゼ／リガーゼを用いるかまたは実施例１に記載されたようにクリックケミストリーを用いて互いに永続的にステッチされる。ＣＯＢは、必要に応じて、ＣＬ上の増幅プライマー相補的領域を標的にするプライマーを用いて、配列決定のためにＰＣＲ増幅される。
【０２８２】
ポリメラーゼなしでのＣＯＢ−ＥＳＢ連結（図１０）
アミノメチルマクロ多孔性ポリスチレン（ＭＰＰＳ）ビーズを、１０個の異なるＣＬオリゴヌクレオチド（各々が、１０個の異なるループＥＳＢ配列のうちの１つに特異的な１対のループアニーリング領域および６対のＡＰＳ特異的ループアニーリング領域を有する）で標識する。１０個のループＥＳＢ配列のすべてを加えることにより、ループ形状でＣＬのループＥＳＢ特異的部分にアニールさせる。ループＥＳＢ配列は、ＣＬのループＥＳＢ特異的領域の残りの部分に対する非特異的なアニーリングを最小にするようにデザインされている。ループＥＳＢ配列は、自由選択の第１の増幅プライマー相補的領域、ＥＳＢ配列、およびＣＬ中のループＥＳＢ特異的ループアニーリング領域に十分に相補的な１対のアニーリング領域を含む。６ラウンドの分割プール合成を行う。各ラウンドにおいて、ビーズを２０個の異なる容器に分割する。異なるオリゴヌクレオチドＡＰＳを各容器に加える（合計２０個の異なるＡＰＳ）。所与のラウンドにおける各ＡＰＳは、そのラウンドにおける残りのＡＰＳと異なるユニークサブコード配列をさらに含む。最後のラウンドのＡＰＳは、必要に応じて、第２の増幅プライマー相補的領域をさらに含む。
【０２８３】
上記ＡＰＳは、ループ形状でＣＬにハイブリダイズするようにデザインされており、各端において、そのラウンドに特異的なループアニーリング領域に沿ってＣＬにハイブリダイズする。そのハイブリダイゼーションは、ＣＬに沿ってＡＰＳを配置させ、次いでそれらは、互いに連結される。それらのＡＰＳは、他のラウンドに特異的なループアニーリング領域に沿ってＣＬに効率的にハイブリダイズしないようにデザインされている。その結果として、特定のラウンドのＡＰＳが欠けていると、それらのＡＰＳは、連結プロセスに依存して、首尾良く互いに連結されないことがある。あるいは、ＡＰＳが欠けた状態で（その位置は、ループアニーリング領域の対が隣接する）ＣＯＢが合成される。次いで、得られたＣＯＢは、しかるべく分析され得、処分され得るか、またはその代わりに、引き出された情報が処理され得る。
【０２８４】
ＣＬまたは１つ以上のＡＰＳは、ランダムなタグ領域をさらに含み、それは、上に記載されたような分子カウンターとして作用し、それにより、検出されたＣＯＢのその後の正規化が可能になる。
【０２８５】
各ラウンドにおいてＡＰＳおよびアニーリングプライマーを加えたら、ビーズをプールし、新しい２０個のプールに分け、次のラウンドを開始する。各ラウンドにおいて、上に記載されたような１対のラウンド特異的アニーリング領域を有する新しい２０個のＡＰＳのセットを加える。６個のＡＰＳを加えた後、ビーズ上のハイブリダイズされたＡＰＳは、実施例２に記載されたようなクリックケミストリーを用いて互いに永続的にステッチされる。ＣＯＢは、必要に応じて、ＣＬ上および最後のＡＰＳサブユニット上の増幅プライマー相補的領域を標的にするプライマーを用いて、配列決定のためにＰＣＲ増幅される。
【０２８６】
仮想実施例４．核酸配列決定による検出
実施例３における方法のいずれかに由来する、組み立てられた、ＥＳＢに連結したＣＯＢを、ＩｌｌｕｍｉｎａのＨｉＳｅｑ２０００装置によって配列決定する。得られた配列は、１０個の異なるＥＳＢ配列のうちの少なくとも１つ、ランダムなタグ領域、および６ラウンドの分割プール合成中にその特定のビーズに付加されたＡＰＳを起源とする６個のサブコードの組み合わせを含む。
【０２８７】
仮想実施例５．ペプチド配列決定による検出（図１１）
実施例３における方法のいずれかを用いて、ＥＳＢに連結したＣＯＢを合成する。得られた配列は、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６開始部位、開始コドン、ＥＳＢ、ＣＯＢ、および必要に応じて、Ｈｉｓ（６）タグをコードする領域を含む（図１１）。Ｔ７プロモーターおよびＳＰ６開始部位は、ＥＳＢを組み込むために使用されたのと同じ方法を用いて、ＥＳＢに連結される配列に組み込まれ得る。あるいは、これらの配列は、最後のＡＰＳ内に組み込まれ得る。必要に応じて、Ｈｉｓ（６）タグをコードする領域は、最後のＡＰＳまたはＥＳＢに組み込まれて連結され得る。
【０２８８】
組み立てられたＥＳＢに連結したＣＯＢは、Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）Ｍａｘｉ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、転写され、ペプチド配列に翻訳される。そのペプチド配列は、アフィニティークロマトグラフィーおよび／またはＨＰＬＣを用いて単離された後、タンデム型質量分析計を使用して配列決定される。
【０２８９】
仮想実施例６．細胞表面上でのＣＯＢの分割プール合成
白血球細胞株（ＨＬ６０、ＪＹおよびＵ９３７）上の細胞表面レセプターは、細胞表面上でのＣＯＢの分割プール合成を用いて検出および定量される。Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｌｌ−ｉｎ−Ｏｎｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を使用して、ＣＤ１、ＣＤ３、ＣＤ８およびＣＤ４に対する抗体が、実施例３に記載されたアミン修飾ＣＬオリゴヌクレオチドと結合体化される。個々に標識された抗体が、ＣＬオリゴヌクレオチド中の配列を標的とする相補的なオリゴヌクレオチドを使用するアフィニティークロマトグラフィーを用いて単離され、各抗体上の標識の数が、質量分析を用いて検証される。１０７個の細胞の細胞懸濁液を、好適な条件下で上記抗体の組み合わせとインキュベートした後、６ラウンドの分割プール合成を行う。得られたＥＳＢに連結したＣＯＢは、実施例３または実施例４に記載されているように検出される。ＣＯＢに連結したＥＳＢに関連する検出されたシグナルが、各ＣＯＢ組み合わせについて定量される。それらの細胞上でのＣＤ１、ＣＤ３、ＣＤ８およびＣＤ４抗原の各々の同時発現が、ペアワイズでプロットされる。主成分分析を用いることにより、発現プロファイルにおける最も強い相関を特定する。
【０２９０】
仮想実施例７．細胞内でのＣＯＢの分割プール合成
メタノールを−２０℃に冷却する。１０７個のＨｅＬａ細胞を含む細胞培養物を、当該分野で公知の好適な組織培養条件を用いて増殖させる。その増殖培地を吸引によって除去する。細胞を直ちに固定し、５０ｍＬの冷メタノールを加えることによって透過処理する。それらの細胞を、外界温度で１０分間、静かに振盪しながらインキュベートする。メタノールを吸引によって慎重に除去する。それらの細胞を１００ｍＬの１×ＰＢＳで３回すすぐ。
【０２９１】
上記細胞を、静かに振盪することによって０．２％ＰＢＳ中の１５０ｍｌの０．１％カゼイン溶液で室温において１．５時間ブロッキングする。ウサギ抗切断カスパーゼ−３、ウサギ抗ｐｈｏｓ−ｐ３８、ウサギ抗ｐｈｏｓ−ＥＲＫ２、マウス抗ＥＲＫ２およびマウス抗β−チューブリン（クローンＡＡ２）を、実施例５に記載されたようにＣＬに結合体化する。細胞を、静かに振盪して、ＣＬに結合体化された抗体と４℃で一晩インキュベートする。それらの細胞を、１×ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間、室温で５回洗浄した後、６回の分割プール合成を行う。
【０２９２】
得られたＥＳＢに連結したＣＯＢを、実施例３または実施例４に記載されたように検出する。ＣＯＢに連結したＥＳＢに関連する検出されたシグナルを、各ＣＯＢ組み合わせについて定量する。それらの細胞におけるホスホ−ｐ５３、ＥＲＫ１の各々の同時発現をペアワイズでプロットする。主成分分析を用いることにより、発現プロファイルにおける最も強い相関を特定する。
【０２９３】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書中に示され、記載されてきたが、そのような実施形態が単に例として提供されていることが当業者には明らかだろう。当業者には数多くのバリエーション、変更および置換が本発明から逸脱することなく思い浮かぶだろう。本明細書中に記載された本発明の実施形態の様々な代替物が、本発明を実施する際に使用され得ることが理解されるべきである。以下の請求項が、本発明の範囲を定義し、これらの請求項の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物が本明細書によって包含されると意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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