(57)【要約】  本願は、組換え植物に由来する生物学的サンプル中のａａｄ−１２遺伝子イベントを検出するための材料および方法、ならびに組換え植物に由来するサンプル中の混入イベントを検出するための材料および方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６を含む、単離されたプライマーまたはプローブ。
【請求項２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６からなる、単離されたプライマーまたはプローブ。
【請求項３】
標識されている、請求項１または２に記載の単離されたプローブ。
【請求項４】
前記標識が、放射性同位体、蛍光標識、リガンド、化学発光物質または酵素である、請求項３に記載の単離されたプローブ。
【請求項５】
容器、ならびに：
ａ）配列番号１、配列番号２および配列番号３；
ｂ）配列番号４、配列番号５および配列番号６；
ｃ）配列番号１および配列番号２；
ｄ）配列番号４および配列番号５；
ｅ）配列番号１および配列番号３；
ｆ）配列番号２および配列番号３；
ｇ）配列番号４および配列番号６；
ｈ）配列番号１および配列番号４；
ｉ）配列番号１および配列番号５；
ｊ）配列番号１および配列番号６；
ｋ）配列番号２および配列番号４；
ｌ）配列番号２および配列番号５；
ｍ）配列番号２および配列番号６；
ｎ）配列番号３および配列番号４；
ｏ）配列番号３および配列番号５；または
ｐ）配列番号３および配列番号６
から選択される核酸配列の組み合わせを含む組成物を備える、キット。
【請求項６】
前記核酸配列のいずれかが標識されている、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記標識が、放射性同位体、蛍光標識、リガンド、化学発光物質または酵素である、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
ダイズ植物ゲノムのＤＮＡの接合状態を判定する方法であって、（ａ）イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含むダイズ植物由来の生物学的サンプル由来のゲノムＤＮＡを含む生物学的サンプル由来のゲノムＤＮＡを用いる核酸増幅反応において使用されたとき、該生物学的サンプルのゲノムＤＮＡ内のａａｄ−１２遺伝子の存在を識別する第１アンプリコンを生成する配列番号１および２のプライマー対と該生物学的サンプルを接触させる工程；（ｂ）核酸増幅反応を行う工程；（ｃ）生成された第１アンプリコンを検出する工程；（ｄ）ダイズ植物由来のゲノムＤＮＡを含む生物学的サンプルを用いる核酸増幅反応において使用されたとき、イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６として識別される導入遺伝子挿入のダイズゲノム領域に相同な野生型ダイズゲノムＤＮＡを識別するプライマーの組み合わせからアンプリコンを生成する配列番号４および５の第２プライマー対と、同じサンプルを接触させる工程；（ｅ）核酸増幅反応を行う工程、および（ｆ）生成された第２アンプリコンを検出する工程を包含し；ここで：（ｉ）両方のアンプリコンの検出は、該ダイズサンプルがイベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６についてヘテロ接合であることを示唆し；（ｉｉ）前記第１アンプリコン（ａａｄ−１２遺伝子の存在を識別する）のみの検出は、該生物学的サンプルが、イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６についてホモ接合であることを示唆し；（ｉｉｉ）前記第２アンプリコンのみの検出は、該生物学的サンプル内にイベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６が存在しないことを示唆する、方法。
【請求項９】
前記第１アンプリコンが、配列番号３を含むプローブを用いて検出され、前記第２アンプリコンが、配列番号６を含むプローブを用いて検出される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
生物学的サンプル中のイベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６に対応するＤＮＡの存在を検出する方法であって、
（ａ）イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含む１つまたはそれ以上のダイズ植物から得られたゲノムＤＮＡを用いる核酸増幅反応において使用されたとき、該植物を、イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含むと識別するアンプリコンを生成するプライマーセットと該生物学的サンプルを接触させる工程；
（ｂ）核酸増幅反応を行い、それにより、該アンプリコンを生成する工程；および
（ｃ）該アンプリコンを検出する工程であって、前記アンプリコンの検出は、イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６に対応するＤＮＡが存在することを示唆する、工程
を包含する、方法。
【請求項１１】
生物学的サンプル中のイベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６に対応するＤＮＡの存在を検出する方法であって、
（ａ）イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含むダイズ植物由来のゲノムＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズし、かつコントロールダイズ植物とはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズしないプローブと該生物学的サンプルを接触させる工程；
（ｂ）該生物学的サンプルおよびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供する工程；および
（ｃ）イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含むＤＮＡへの該プローブのハイブリダイゼーションを検出する工程であって、ここで、そのようなハイブリダイゼーションの検出は、該植物のゲノム内にイベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６に対応するＤＮＡが存在することを示唆する、工程
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記プローブが、配列番号３を含む、請求項１０または１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ダイズ植物のゲノム内のイベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６の存在を識別するために生物学的サンプル中の核酸を増幅する方法であって、
（ａ）イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含むダイズ植物由来の生物学的サンプル由来のゲノムＤＮＡを含む生物学的サンプル由来のゲノムＤＮＡを用いる核酸増幅反応において使用されたとき、該生物学的サンプルのゲノムＤＮＡ内のａａｄ−１２遺伝子の存在を識別するを生成する配列番号１および２のプライマー対と該生物学的サンプルを接触させる工程；（ｂ）核酸増幅反応を行う工程；および（ｃ）前記増幅反応によって生成されたアンプリコンを検出する工程であって、前記アンプリコンの検出は、該生物学的サンプルがａａｄ−１２遺伝子を含むことを示唆する、工程
を包含する、方法。
【請求項１４】
前記アンプリコンが、配列番号３を含むプローブを用いて検出される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物学的サンプルが、ダイズの細胞、ダイズの組織、ダイズの茎、ダイズの根、ダイズの葉、ダイズの花もしくはその一部、ダイズの種子、ダイズの莢またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項８、１０、１１または１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記プローブが、標識されている、請求項９、１２または１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記プローブが、放射性同位体、蛍光標識、リガンド、化学発光物質または酵素で標識されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
バッファー、ならびに
ａ）配列番号１、配列番号２および配列番号３；
ｂ）配列番号４、配列番号５および配列番号６；
ｃ）配列番号１および配列番号２；
ｄ）配列番号４および配列番号５；
ｅ）配列番号１および配列番号３；
ｆ）配列番号２および配列番号３；
ｇ）配列番号４および配列番号６；
ｈ）配列番号１および配列番号４；
ｉ）配列番号１および配列番号５；
ｊ）配列番号１および配列番号６；
ｋ）配列番号２および配列番号４；
ｌ）配列番号２および配列番号５；
ｍ）配列番号２および配列番号６；
ｎ）配列番号３および配列番号４；
ｏ）配列番号３および配列番号５；または
ｐ）配列番号３および配列番号６
から選択される核酸配列の組み合わせを含む、組成物。
【請求項１９】
前記核酸分子の少なくとも１つが、放射性同位体または蛍光標識またはリガンドまたは化学発光物質または酵素で標識されている、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
組換え植物における混入イベントを判定するための方法であって、（ａ）ゲノムＤＮＡに隣接して連結された導入遺伝子を含むＤＮＡフラグメントからなる組換え植物ＤＮＡサンプルを、ゲノムＤＮＡに隣接して連結された導入遺伝子を含む前記ＤＮＡフラグメントにハイブリダイズする第１プライマー対と接触させる工程、（ｂ）核酸増幅反応を行う工程；（ｃ）ゲノムＤＮＡに隣接して連結された導入遺伝子を含む前記ＤＮＡフラグメントからなる第１アンプリコンを生成する工程；（ｄ）該第１アンプリコンを検出する工程；（ｅ）天然のホモ接合遺伝子を含むＤＮＡフラグメントからなる前記組換え植物ＤＮＡサンプルを、天然のホモ接合遺伝子を含む前記ＤＮＡフラグメントとハイブリダイズする第２プライマー対と接触させる工程；（ｆ）核酸増幅反応を行う工程；（ｇ）前記天然のホモ接合遺伝子からなる第２アンプリコンを生成する工程；（ｈ）該第２アンプリコンを検出する工程；（ｉ）前記第１および第２アンプリコンからのシグナル強度がほぼ等しいことを判定する工程であって、ここで、該第１および第２アンプリコンの等しいシグナル強度は、混入イベントが存在しないことを示唆する、工程；（ｊ）導入遺伝子を含むＤＮＡフラグメントからなる前記組換え植物ＤＮＡサンプルを、導入遺伝子を含む前記ＤＮＡフラグメントとハイブリダイズする第３プライマー対と接触させる工程；（ｋ）核酸増幅反応を行う工程；（ｌ）前記導入遺伝子からなる第３アンプリコンを生成する工程；（ｍ）該第３アンプリコンを検出する工程、および；（ｎ）第１および第３アンプリコンのシグナル強度がほぼ等しいことを判定する工程であって、ここで、該第１および第３アンプリコンの等しいシグナル強度は、混入イベントが存在しないことを示唆する、工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１１年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／５４８，５４３号の利益を主張する。
【０００２】
ダイズは、重要な作物であり、世界の多くの地域において主たる食料源である。農業形質および製品の品質を改善するためにダイズにバイオテクノロジーの方法が適用されている。ダイズ植物に導入される農業形質の例としては、除草剤抵抗性および害虫抵抗性が挙げられる。
【０００３】
ａａｄ−１２遺伝子（デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）由来）は、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ−１２）タンパク質をコードする。この遺伝子は、例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸およびピリジルオキシアセテート除草剤への耐性を付与する。植物に除草剤耐性を導入するためのａａｄ−１２遺伝子自体は、国際公開第２００７／０５３４８２号に開示された。
【０００４】
植物における異種遺伝子または外来遺伝子（導入遺伝子）の発現は、染色体のどこにその外来遺伝子が導入されたかに影響される。これは、例えば、クロマチン構造（例えば、ヘテロクロマチン）、または組み込み部位の近くに転写制御エレメント（例えば、エンハンサー）が近接することに起因し得る（Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988）。したがって、同じタイプのトランスジェニック植物（または他の生物）における同じ遺伝子が、種々のイベント（events）の間で発現レベルの幅広いバリエーションを示し得る。発現の空間的パターンまたは時間的パターンにおいても差が存在する場合がある。例えば、様々な植物組織における導入遺伝子の相対的な発現の差は、その植物に導入された遺伝子コンストラクトに存在する転写制御エレメントから予想されるパターンに対応しない場合がある。
【０００５】
したがって、所与の目的のために、導入される目的遺伝子を満足のいくレベルまで発現するイベントを識別するために、しばしば、多数のイベントが作り出され、スクリーニングされる。商業目的の場合、数百から数千の異なるイベントを作製し、それらのイベントを、所望の導入遺伝子の発現のレベルおよびパターンを有する単一のイベントについてスクリーニングするのが一般的である。所望のレベルおよび／またはパターンの導入遺伝子発現を有するイベントは、従来の育種方法を使用した有性他家生殖（sexual outcrossing）によってその導入遺伝子を他の遺伝的背景に移入するために有用である。そのような交雑種の子孫は、初代形質転換体の導入遺伝子発現の特徴を維持する。このストラテジーは、局所的な生育条件に十分に適合されたいくつかの品種において、信頼できる遺伝子発現を保証するために、用いられる。
【０００６】
有性交雑（sexual cross）の子孫が目的の導入遺伝子および／またはゲノムＤＮＡを含むか否かを判定するために、特定の植物の導入遺伝子および／またはゲノムＤＮＡの存在を検出することができることは、有益であろう。さらに、特定の植物における導入遺伝子および／またはゲノムＤＮＡの存在を検出するための方法は、組換え作物植物に由来する食品の市販前承認および表示を必要とする規制に従うときに役立つだろう。
【０００７】
任意の周知の核酸検出方法によって導入遺伝子の存在を検出することが可能である。例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または核酸プローブを使用するＤＮＡハイブリダイゼーションが挙げられる。これらの検出方法は、通常、頻繁に使用される遺伝的エレメント（例えば、プロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子または他の通常使用される遺伝的エレメント）に焦点を当てる。そのような方法は、挿入ＤＮＡに隣接する染色体ＤＮＡ（「フランキングＤＮＡ」）の配列が既知でない限り、種々のイベント、特に、同じＤＮＡコンストラクトを使用してもたらされたイベントを判別するためには有用でない場合がある。
【０００８】
また、育種、形質移入（trait introgression）および種子純度について、植物におけるトランスジェニックイベントの接合状態を判定することができることも重要である。制御および種子品質のために、ダイズ植物材料における混在のａａｄ−１２遺伝子イベント（意図されたものまたは意図されないもの）の存在を迅速に検出することができることも有益である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００７／０５３４８２号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、生物学的サンプルにおけるａａｄ−１２遺伝子イベントの検出に関する。本発明は、１つまたはそれ以上のａａｄ−１２イベントを含むゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を有する遺伝的に操作された植物を識別する方法を提供する。本特許に記載されるアッセイ方法は、ａａｄ−１２遺伝子特異的であって、イベント特異的ではなく、任意のａａｄ−１２遺伝子イベントの接合状態を検出し、必要に応じて判定する方法である。本発明は、導入遺伝子のコピー数解析によって、特定のａａｄ−１２に対する意図されないａａｄ−１２イベントの混入を判定することができる。
【００１２】
したがって、本発明の一態様は、生物学的サンプル（例えば、ダイズ由来）におけるａａｄ−１２導入遺伝子の存在を検出するためのアッセイを提供する。それらのアッセイは、ダイズゲノムに挿入された組換えコンストラクトのＤＮＡ配列に基づき得る。それらのアッセイを行う際に有用なキットおよび条件も提供される。
【００１３】
本発明は、ａａｄ−１２遺伝子に関連するＤＮＡ配列のクローニングおよび解析にとって有用な核酸配列にも関する。本発明のこの態様のある特定の実施形態は、ａａｄ−１２を検出するための遺伝子特異的プライマーおよびこれらの遺伝子特異的プライマーセットを用いて生成されるＰＣＲアンプリコンを提供する。したがって、これらの手順および他の関連する手順は、ａａｄ−１２遺伝子を含む植物を識別するために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ａａｄ−１２イベント４１６に対する遺伝子特異的アッセイ。上部の黒いスポットの群は、ａａｄ−１２についてホモ接合のダイズサンプルからの蛍光の読取値を表している。中央の薄い色のドットの群は、ａａｄ−１２についてヘミ接合のダイズサンプルからの蛍光の読取値を表している。下部のドットの群は、ａａｄ−１２イベントについてネガティブである野生型ダイズサンプルからの蛍光の読取値を表している。
【図２】ａａｄ−１２イベント４４０６に対する遺伝子特異的アッセイ。上部の黒いスポットの群は、ａａｄ−１２についてホモ接合のダイズサンプルからの蛍光の読取値を表している。中央の薄い色のドットの群は、ａａｄ−１２についてヘミ接合のダイズサンプルからの蛍光の読取値を表している。下部のドットの群は、ａａｄ−１２イベントについてネガティブである野生型ダイズサンプルからの蛍光の読取値を表している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
植物ゲノムへの導入遺伝子の導入および組み込みは、ランダムなイベントを含み（それゆえ、発現される所与の挿入に対して「イベント」という呼称）、多くの形質転換法（例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換、「遺伝子銃」形質転換およびＷＨＩＳＫＥＲＳ）の場合、導入遺伝子が植物のゲノムのどこに挿入されるようになるかは、予測不可能である。
【００１６】
１つのそのようなａａｄ−１２遺伝子イベントであるｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含むダイズ系統の少なくとも２５００個の種子が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，２０１１０に寄託され、公衆に無制限に利用可能になった（が、特許権に制約されている）。その寄託物は、２０１０年６月１０日の寄託日を有するＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１１０２８と命名された。この寄託は、特許手続上の種子寄託に関するブダペスト条約に従っておよび基づいて行われたものであり、維持されるものである。この寄託は、公共の寄託機関であるＡＴＣＣ寄託機関において、３０年もしくは最新の要請後５年の期間または本特許の有効期間のどちらか長い期間にわたって、無制限に維持され、その期間中、生存不能になった場合には取り替えられる。
【００１７】
本発明の説明を助けるため、および本発明を実施する当業者を指導するために、定義および例が本明細書中に提供される。別段述べられない限り、用語は、関連する分野の当業者による従来の使用法に従って理解されるべきである。
【００１８】
「生物学的サンプル」は、ダイズの細胞または組織（茎、根、葉、花もしくは花の一部、種子または種子の莢などを含む）に由来する任意の有機材料（検出可能な量の、そのような有機材料に対応するヌクレオチド配列を含む）を含み得る。
【００１９】
「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはレポーター分子、例えば、放射性同位体、フルオロフォア、リガンド、化学発光物質または酵素に結合された単離された核酸である。そのようなプローブは、標的核酸の鎖、本発明の場合、ａａｄ−１２遺伝子をコードする組換えＤＮＡの鎖に相補的である。本発明に係るプローブは、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合する、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなくポリアミドおよび他のプローブ材料も含み、そのような結合は、その標的ＤＮＡ配列の存在を検出するために使用することができる。
【００２０】
「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な標的ＤＮＡ鎖にアニールされることにより、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間でハイブリッドを形成し、次いで、ポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼによって、標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長される、単離された核酸である。本発明のプライマー対は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の従来の核酸増幅法による、標的核酸配列の増幅のためのそれらの使用のことを指す。
【００２１】
プローブおよびプライマーは、一般に、１１〜３０ヌクレオチド長またはそれ以上である。ある特定の場合においては、プローブおよびプライマーは、３０ヌクレオチドより長い長さを有し得る。サイズに関係なく、プローブおよびプライマーは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下において、標的配列に特異的にハイブリダイズできる。好ましくは、本発明に係るプローブおよびプライマーは、標的配列と完全な配列類似性を有するが、標的配列と異なりかつ標的配列にハイブリダイズする能力を保持するプローブが、従来の方法によってデザインされてもよい。
【００２２】
本明細書中で使用されるとき、用語「子孫」は、ａａｄ−１２イベントを含む（comprises）（または含む（contains））親植物の任意の世代の子孫のことを表す。
【００２３】
トランスジェニック「イベント」は、異種ＤＮＡ、すなわち、目的の導入遺伝子を含む核酸コンストラクトで植物細胞を形質転換し、その植物のゲノムへの導入遺伝子の挿入から生じた植物の集団を再生し、特定のゲノム位置への挿入を特徴とする特定の植物を選抜することによって、作製される。用語「イベント」とは、異種ＤＮＡを含む初代形質転換体およびその形質転換体の子孫のことを指す。用語「イベント」は、形質転換体と、そのゲノム／導入遺伝子ＤＮＡを含む別の品種との間の有性他家生殖によって作出される子孫のことも指す。反復親に繰り返し戻し交雑した後でさえ、形質転換された親由来の、挿入された導入遺伝子ＤＮＡおよび隣接のゲノムＤＮＡ（ゲノム／導入遺伝子ＤＮＡ）は、その交雑の子孫において、同じ染色体の位置に存在する。用語「イベント」は、挿入ＤＮＡを含む１つの親系統（例えば、初代形質転換体および自殖に起因する子孫）と挿入ＤＮＡを含まない親系統との有性交雑の結果として、目的の導入遺伝子を含む挿入ＤＮＡを受け継ぐ子孫に移されると予想され得る、挿入ＤＮＡおよび挿入ＤＮＡに直接隣接した隣接のゲノム配列を含む初代形質転換体およびその子孫に由来するＤＮＡのことも指す。
【００２４】
上で論じたように、本発明の一態様は、ａａｄ−１２導入遺伝子の識別に関する。関連するＰＣＲプライマーおよびアンプリコンが、本発明に含まれる。本発明によると、挿入ＤＮＡにわたるアンプリコンを使用する分析的なＰＣＲ方法は、ａａｄ−１２イベントを含む専売のトランスジェニック植物に由来する商品化されたトランスジェニック植物の品種または系統を検出または識別するために使用することができる。したがって、本発明の様々な実施形態は、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５またはそれらの様々な組み合わせを含むプライマー、ならびに配列番号３、配列番号６または配列番号３および６の両方を含むプローブを提供する。
【００２５】
本明細書中に開示される検出手法は、植物育種と併せて、目的の１つまたはそれ以上のさらなる形質を子孫に付与することを目指して前記イベントを含む親植物を別の植物系統と交雑した後のａａｄ−１２イベントを含む子孫植物を識別するために有用である。これらのＰＣＲ解析法は、植物育種プログラム、ならびに特に、商品化されたトランスジェニック種子に対する品質管理に恩恵をもたらすものであり、製品の登録および製品の監督にも恩恵をもたらし得る。
【００２６】
当業者は、プライマーおよびプローブが、一連の標準的なハイブリダイゼーション条件および／またはＰＣＲ条件（そのプライマーまたはプローブが、例示される配列と完璧に相補的でない条件を含む）下においてハイブリダイズするようにデザインされ得ることも認識するだろう。つまり、いくらかのミスマッチを許容することができる。例えば、およそ２０ヌクレオチドのプライマーについては、ミスマッチする塩基が、アンプリコンの向かい側の内部またはプライマーの末端に存在する場合、典型的には、１つまたは２つまたはそれくらいのヌクレオチドが、逆鎖とハイブリダイズしなくてもよい。様々な適切なハイブリダイゼーション条件を下記に提供する。さらに、合成ヌクレオチドアナログ（例えば、イノシン）もまた、プローブにおいて使用できる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡプローブも使用できる。
【００２７】
イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６の存在を検出するための組成物が提供される。これらの組成物は、イベント特異的プライマー（例えば、配列番号１および／または配列番号２）およびイベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含まない植物の野生型ゲノムに共通のＤＮＡとハイブリダイズするプライマー（配列番号４および／または配列番号５）を含む。ＰＣＲ解析は、イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含むダイズ系統が、これらのイベント特異的プライマーセット（配列番号１および２）を用いて生成されたＰＣＲアンプリコンの解析によって識別され得ることを証明した。これらの手順および他の関連する手順を使用することにより、イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含むこれらのダイズ系統をユニークに識別することができる。したがって、そのようなプライマーに由来するＰＣＲアンプリコンを使用することにより、イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含むダイズ系統を識別することができ、開示される発明の別の実施形態を形成することができる。
【００２８】
本発明は、ａａｄ−１２遺伝子を含む植物材料を含むサンプルにおけるＤＮＡの存在を検出する方法も含む。そのような方法は、（ａ）ＤＮＡを用いる核酸増幅反応において使用されたとき、そのサンプル内のａａｄ−１２配列を識別するアンプリコンを生成するプライマーセットと、ＤＮＡを含むサンプルを接触させる工程；（ｂ）核酸増幅反応を行い、それにより、アンプリコンを生成する工程；および（ｃ）そのアンプリコンを検出する工程を包含し得る。
【００２９】
本発明のさらなる検出方法は、サンプルにおける、ａａｄ−１２に対するコード配列に対応するＤＮＡの存在を検出する方法を含み、ここで、前記方法は、（ａ）ａａｄ−１２イベントを含む植物材料由来のＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズし、かつコントロール植物（ａａｄ−１２イベントを含まない植物）由来の植物材料とはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズしないプローブと、ＤＮＡを含むサンプルを接触させる工程；（ｂ）そのサンプルおよびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供する工程；および（ｃ）そのＤＮＡに対するそのプローブのハイブリダイゼーションを検出する工程を包含する。
【００３０】
本発明の別の態様によると、イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含む植物との交雑の子孫の接合状態を判定する方法が提供される。これらの方法は、ダイズＤＮＡを含むサンプルを、本明細書中に開示されるプライマーセットと接触させる工程を包含し得る。これらのプライマーは、イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含む植物由来のゲノムＤＮＡとともに核酸増幅反応において使用されたとき、植物を、イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含むと識別する第１アンプリコンを生成する。これらの方法はさらに、核酸増幅反応を行い、それにより、第１アンプリコンを生成する工程；第１アンプリコンを検出する工程；およびダイズ植物由来のゲノムＤＮＡとともに核酸増幅反応において使用されたとき、ダイズゲノム領域に対してホモ接合の天然のダイズゲノムＤＮＡを含む第２アンプリコンを生成する別のプライマーセットと、ダイズＤＮＡを含むサンプルを接触させる工程を包含する。その方法はさらに、第２アンプリコンを生成する核酸増幅反応を行う工程、第２アンプリコンを検出する工程、ならびにサンプル中の第１および第２アンプリコンを比較する工程も包含し得る。サンプル中の両方のアンプリコンの存在は、そのサンプルが、イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６についてヘテロ接合であることを示唆する。
【００３１】
「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはレポーター分子（例えば、放射性同位体、リガンド、化学発光物質または酵素）に結合された、単離された核酸分子である。本明細書中に開示されるプローブは、配列番号３および／または６を含む。本発明に係るプローブは、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合する、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなくポリアミドおよび他のプローブ材料も含み、その標的ＤＮＡ配列の存在を検出するために使用することができる。プローブおよびプライマーを調製および使用するための方法は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989に記載されている。
【００３２】
用途に応じて、標的配列に対して様々な程度のプローブ選択性を達成する様々なハイブリダイゼーション条件を使用することができる。高い選択性を必要とする用途の場合、典型的には、ハイブリッドを形成するために比較的ストリンジェントな条件を使用することになり、例えば、比較的低い塩条件および／または高い温度条件（例えば、約５０℃〜約７０℃の温度における約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍ ＮａＣｌによって提供される）を選択することになるだろう。ストリンジェントな条件は、例えば、ハイブリダイゼーションフィルターを高ストリンジェンシー洗浄バッファー（０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃）で少なくとも２回洗浄することを含み得る。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件、例えば、約４５℃における６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）に続く５０℃における２．０×ＳＳＣでの洗浄が、当業者に公知である。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃における約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃における約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまでより選択され得る。さらに、洗浄工程における温度は、室温である約２２℃における低ストリンジェンシー条件から、約６５℃における高ストリンジェンシー条件に上昇させることができる。温度と塩の両方を変更してもよいし、温度または塩濃度のいずれかを、他方の変数を変更させつつ、一定に保持してもよい。そのような選択的条件は、プローブと鋳型または標的鎖との間の、もしあるとすれば、わずかなミスマッチを許容する。ハイブリダイゼーションによるＤＮＡ配列の検出は、当業者に周知であり、米国特許第４，９６５，１８８号および同第５，１７６，９９５号の教示が、ハイブリダイゼーション解析の方法の例示である。特定の実施形態において、本明細書中に開示されるプライマーまたはプローブは、イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含むゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする。イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含むＤＮＡに対するプローブまたはプライマーのハイブリダイゼーションは、当業者に公知のいくつもの方法によって検出することができ、これらとしては、蛍光タグ、放射性タグ、抗体ベースのタグおよび化学発光タグが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００３３】
特定の増幅プライマー対を使用した標的核酸配列の増幅（例えば、ＰＣＲによる増幅）に関して、「ストリンジェントな条件」は、そのプライマー対を、対応する野生型配列を有するプライマー（またはその相補鎖）に結合する標的核酸配列だけにハイブリダイズすることを可能にし、好ましくは、それにより、ユニークな増幅産物であるアンプリコンを生成することを可能にする条件である。用語「（標的配列）に特異的な」は、プローブまたはプライマーが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、標的配列を含むサンプル中の標的配列だけにハイブリダイズすることを示唆する。
【００３４】
本明細書中で使用されるとき、「増幅されたＤＮＡ」または「アンプリコン」とは、核酸鋳型の一部である標的核酸配列の核酸増幅産物のことを指す。例えば、有性交雑から生じたダイズ植物が、そのゲノムＤＮＡ内にイベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含むか否かを判定するために、ダイズ植物組織サンプルから抽出されたＤＮＡが、本明細書中に開示されるプライマー対を使用する核酸増幅法に供されて、イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６の存在を識別するアンプリコンを生成し得る。そのアンプリコンは、プライマー対の組み合わせ長＋１ヌクレオチド塩基対、および／またはプライマー対の組み合わせ長＋約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、もしくは５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、またはそれ以上のヌクレオチド塩基対（＋または−上に列挙された任意の増分）の長さの範囲であり得る。用語「アンプリコン」の使用は、ＤＮＡ熱的増幅反応において形成され得るプライマーダイマーを明確に除外する。
【００３５】
核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む当分野で公知の様々な核酸増幅法のいずれかによって達成することができる。種々の増幅方法が当分野で公知であり、とりわけ、米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，２０２号に記載されている。最大２２ｋｂのゲノムＤＮＡを増幅するＰＣＲ増幅法が開発されている。これらの方法ならびに当分野で公知の他のＤＮＡ増幅法を本発明の実施において使用してよい。主題のダイズイベントからの異種導入遺伝子ＤＮＡインサートの配列は、本明細書中に提供される配列から得られるプライマーを使用して上記イベントからそのような配列を増幅した後、ＰＣＲアンプリコンまたはクローニングされたＤＮＡの標準的なＤＮＡ配列決定を行うことによって、確かめることができる（および必要であれば訂正することができる）。これらの方法によって生成されたアンプリコンは、複数の手法によって検出され得る。アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイドによる染色が、ＤＮＡアンプリコンを検出する通常の周知の方法である。
【００３６】
ＴＡＱＭＡＮ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）は、ＤＮＡ配列の存在を検出および定量する方法である。簡潔には、目的の配列（例えば、ａａｄ−１２遺伝子またはダイズゲノムに本来存在する遺伝子）とハイブリダイズするＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブをデザインする。そのＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマーを、耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下においてサイクルする。特異的な増幅の間、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、ＦＲＥＴプローブ上のクエンチング部分から蛍光部分を取り除き、放出する。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功に起因する目的の配列の存在を示唆する。分子ビーコンもまた、配列の検出において使用するためのものとして記載されており、本発明において使用することができる。
【００３７】
本発明の別の態様によると、生物学的サンプル中のイベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６に対応するＤＮＡの存在を検出する方法が提供される。これらの方法は、（ａ）イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含むダイズ植物由来のゲノムＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズし、かつコントロールダイズ植物とはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズしないプローブとその生物学的サンプルを接触させる工程；（ｂ）その生物学的サンプルおよびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供する工程；および（ｃ）イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含むＤＮＡへの上記プローブのハイブリダイゼーションを検出する工程（そのようなハイブリダイゼーションの検出は、その植物のゲノム内にイベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６に対応するＤＮＡが存在することを示唆する）を包含する。好ましくは、そのプローブは、配列番号３である。
【００３８】
本発明のなおも別の態様は、イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含むダイズ植物の子孫の接合状態を判定する方法である。その方法は、（ａ）イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含むダイズ植物由来の生物学的サンプル由来のゲノムＤＮＡを含む生物学的サンプル由来のゲノムＤＮＡを用いる核酸増幅反応において使用されたとき、その生物学的サンプルのゲノムＤＮＡ内のａａｄ−１２遺伝子の存在を識別する第１アンプリコンを生成する配列番号１および２のプライマー対とその生物学的サンプルを接触させる工程；（ｂ）核酸増幅反応を行う工程；（ｃ）生成された第１アンプリコンを検出する工程（標識プローブとして配列番号３を使用する）；（ｄ）ダイズ植物由来のゲノムＤＮＡを含む生物学的サンプルを用いる核酸増幅反応において使用されたとき、イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６として識別された導入遺伝子挿入のダイズゲノム領域に相同な野生型ダイズゲノムＤＮＡを識別するプライマーの組み合わせからアンプリコンを生成するプライマー対の配列番号４および５と、同じサンプルを接触させる工程；（ｅ）核酸増幅反応を行う工程、および（ｆ）生成された第２アンプリコンを検出する工程（検出プローブとして配列番号６を使用する）を包含し；ここで：（ａ）両方のアンプリコンの検出は、そのダイズサンプルがイベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６についてヘテロ接合であることを示唆し；（ｂ）前記第１アンプリコン（ａａｄ−１２遺伝子の存在を識別する）のみの検出は、その生物学的サンプルが、イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６についてホモ接合であることを示唆し；（ｃ）前記第２アンプリコンのみの検出は、その生物学的サンプル内にイベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６が存在しないことを示唆する。それらのアンプリコンの検出は、標識プローブ（例えば、配列番号３および６）を使用して行うことができる。上で論じたように、プローブは、従来の検出可能な標識またはレポーター分子、例えば、放射性同位体、蛍光標識、リガンド、化学発光物質または酵素で標識され得る。いくつかの実施形態において、プローブは、ａａｄ−１２遺伝子を含むアンプリコンとａａｄ−１２遺伝子を含まないアンプリコンとを区別することを可能にする蛍光標識（例えば、フルオロフォア／クエンチャーの組み合わせ、例えば、クエンチャーと併用される６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）またはテトラクロロフルオレセイン（tetrachlorofluorescin）（ＴＥＴ）、例えば、テトラメチルローダミン、（ＴＡＭＲＡ）またはジヒドロシクロピロロインドールトリペプチド（ＭＧＢ）で標識される。
【００３９】
本発明の別の実施形態において、ａａｄ−１２遺伝子特異的アッセイは、イベント特異的ＰＣＲ（例えば、２０１１年１０月１８日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６１／５４８，５３３号（Attorney Docket No. DAS.160P; MATERIALS AND METHODS FOR DETECTING THE ARYLOXYALKANOATE DIOXYGENASE GENE (AAD-12) CONTAINING EVENT pDAB4472-1606 IN PLANTS; Inventors: Chandra Channabasavaradhya and Andrew Greenwald；その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されているもの）と組み合わせることができる。この実施形態は、混在のａａｄ−１２イベントが同じ植物に存在するか否か、およびイベント特異的アッセイによって検出されたイベントがヘミ接合であるかまたはホモ接合であるかを判定するために使用することができる。この実施形態では、遺伝子特異的アッセイを行い、その遺伝子特異的アッセイによって生成された蛍光シグナル強度に基づいて遺伝子コピー数を推定する。次いで、これを、公知のイベント特異的接合状態アッセイの遺伝子コピー数と比較する。そのａａｄ−１２遺伝子のコピー数の推定値が、そのイベント特異的アッセイによって推定されたものと類似の強度である場合、サンプルは、意図されたａａｄ−１２イベントだけを有すると見なされる。遺伝子特異的アッセイによって推定されたコピー数が、イベント特異的アッセイによって推定されるコピー数よりも多い場合、その研究中のサンプルは、意図されたイベントに加えて、さらなるａａｄ−１２遺伝子コピーを有すると見なされ、ゆえに、他のａａｄ−１２遺伝子イベントの混入の可能性が示唆される。このスキームは、ａａｄ−１２遺伝子以外の同一の遺伝子エレメント（例えば、そのイベントのすべてに共通する、プロモーターまたは選択マーカー配列または他の任意の同一の配列）を有する混入イベントを検出するためにも使用することができる。後者のアプローチは、類似のエレメントを遺伝子カセットに有すること以外の様々な形質のトランスジェニックイベントの接合状態および／または混入を判定するために適用可能であり得る。
【００４０】
配列番号１、２、４および／または５から選択されるプライマーならびに配列番号３および６から選択されるプローブを使用して、植物およびそれに由来する生物学的サンプルにおけるａａｄ−１２を検出するためのキットが提供される。前記キットを使用して生成されるアンプリコンは、そのアンプリコンが配列番号３を含むプローブとハイブリダイズするとき、生物学的サンプルを、ａａｄ−１２イベントを含むと識別する。そのキットは、植物（またはそれに由来する生物学的サンプル）内のａａｄ−１２イベントの存在を特異的に検出するための手段として提供され得るか、またはそのキットは、種々のいくつもの生物学的サンプルの種々のトランスジェニックイベントの多重度を検出するための手段として提供され得る。後者の場合、すなわち、種々のトランスジェニックイベントの多重度を検出するためのキットの場合、そのキットは、商業化が認められているかまたは認められていないかに関係なく、前記キットのユーザーにトランスジェニックサンプルと非トランスジェニックサンプルとの差異、トランスジェニックイベントの接合状態、およびイベントの有無さえも区別する能力を提供する、マイクロアレイの形態または任意の種類のアレイの形態でプローブまたはプライマーを提供し得る。そのようなキットを使用したある特定のイベントの有無の検出またはスコアリングは、蛍光定量の、比色定量の、同位体のまたは化学発光の手段によるものであり得る。
【００４１】
本明細書において言及されたまたは引用されたすべての特許、特許出願、仮出願および刊行物は、それらが本明細書の明示的な教示と矛盾しない限りにおいて、それらの全体が参照により援用される。
【００４２】
以下の実施例は、本発明の実施のための手順を例証するため、および本発明のある特定の好ましい実施形態を証明するために含められる。これらの実施例は、限定と解釈されるべきでない。以下の実施例に開示される手法がその実施のための好ましい様式を例証するために使用される特定のアプローチであることが当業者によって認識されるべきである。しかしながら、当業者は、なおも同様のまたは類似の結果が得られる限り、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなくこれらの特定の実施形態において多くの変更を行うことができることを認識するべきである。別段示されない限り、すべてのパーセンテージは、重量基準であり、すべての溶媒混合物の比率は、別段述べられない限り、体積基準である。
【実施例】
【００４３】
ダイズにおけるａａｄ−１２遺伝子に対するＭＧＢプローブの存在を検出するおよび育種集団における植物の接合状態を判定するイベント特異的ＴＡＱＭＡＮ  ＡＳＳＡＹ（登録商標）を開発した。ダイズにおけるａａｄ−１２遺伝子の特異的検出のために、２つの遺伝子特異的プライマーを使用して、５９ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅した。このＰＣＲ産物の増幅を、５’末端にＦＡＭレポーターを含む標的特異的ＭＧＢプローブによって測定した。ダイズにおけるａａｄ−１２遺伝子に対するこのＴａｑｍａｎ検出法の特異性を、ダイズ特異的な内在性の参照遺伝子ＧＷＳ１１６との二重形式において、様々なレベルの接合状態のダイズイベントおよび非トランスジェニックダイズに対して試験した。
【００４４】
ｇＤＮＡの単離
Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  ９６  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔを使用して、ゲノムＤＮＡを抽出した。新鮮なダイズの葉の円盤状物（１サンプルあたり８つ）を、改変されたＱｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  ９６  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔプロトコルを使用するｇＤＮＡ抽出のために使用した。Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ法を製造供給元の指示書（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）に従って用いて、ｇＤＮＡを定量した。サンプルをＤＮａｓｅフリー水で希釈して、本研究の目的のために１．２ｎｇ／μＬの濃度を得た。
【００４５】
Ｔａｑｍａｎアッセイおよび結果
Ｔａｑｍａｎアッセイによってダイズにおけるａａｄ−１２遺伝子を検出するための特異的なＴａｑｍａｎプライマーおよびプローブをデザインした。これらの試薬を下記に列挙される条件とともに使用することにより、ダイズ内のａａｄ−１２遺伝子を検出することができる。表１は、ダイズにおけるａａｄ−１２遺伝子の検出のために特異的に開発されたプライマー配列およびプローブ配列を列挙している。
【表１−１】
2014531912.tif 000002
【表１−２】
2014531912.tif 000003
【００４６】
増幅のための多重ＰＣＲ条件を表２に列挙する。混合物を、３８４ウェルプレートにピペットで入れ、以下の条件を使用して増幅した：ｉ）５０℃を２分、ｉｉ）９５℃を１０分、ｉｉｉ）９５℃を１５秒、ｉｖ）６０℃を６０秒、ｉｖ）工程ｉｉｉ〜ｉｖを３５サイクル繰り返し、ｖ）４℃で保持。このリアルタイムＰＣＲを、ＢＩＯ−ＲＡＤ  ＩＣＹＣＬＥＲ（商標）およびＡＢＩ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００サーモサイクラー（thermocyler）において行った。データ解析は、蛍光の測定値が設定値に達したときのＰＣＲサイクル数であるサイクル閾値（Ｃｔ）の測定に基づいた。Ｃｔ値をｉＣｙｃｌｅｒソフトウェアによって自動的に計算した。
【００４７】
接合状態のコールを行うために標準的なΔΔＣｔ法を使用した（図１を参照のこと）。まず、イベント特異的な系のＣｔ値と各サンプルの参照系のＣｔ値との差異であるΔＣｔ値を計算した。次いで、各未知サンプルのΔＣｔ値とヘミ接合体コントロールのΔＣｔ値（または１つより多いヘミ接合体コントロールの場合、平均値）との差異であるΔΔＣｔ値を続いて計算した。以下の式：
未知サンプルのコピー数＝２ΔΔＣｔ
を使用して、各未知サンプルの接合状態（コピー数）のコールを計算することができる。およそ１という生のコピー数を有するサンプルは、ヘミ接合であり、２は、ホモ接合であり、０は、ヌル（null）である。
【表２】
2014531912.tif 000004
【００４８】
ダイズにおけるａａｄ−１２遺伝子に対するＴａｑｍａｎ検出法を、参照遺伝子としてダイズ野生型特異的プライマーとの二重形式で、ホモ接合、ヘミ接合およびヌルのサンプルに対して試験した。このアッセイは、ダイズにおけるＡＡＤ１２遺伝子を特異的に検出し、コントロールからはいかなる偽陽性の結果も生成または増幅しなかった。上記遺伝子特異的プライマーおよびプローブは、ダイズにおけるａａｄ−１２遺伝子の検出のために使用することができ、これらの条件および試薬は、接合状態アッセイに適用可能である。
【図１】
2014531912.tif 000005
【図２】
2014531912.tif 000006
【配列表】
2014531912000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年9月8日(2014.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６からなる、単離されたプライマーまたはプローブ。
【請求項２】
前記プライマーが、配列番号１、配列番号２、配列番号４または配列番号５からなる群から選択される、請求項１に記載の単離されたプライマー。
【請求項３】
前記プローブが配列番号３または配列番号６である、請求項１に記載の単離されたプローブ。
【請求項４】
前記プローブが、放射性同位体、蛍光標識、リガンド、化学発光物質または酵素で標識されている、請求項３に記載の単離されたプローブ。
【請求項５】
容器、ならびに：
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６からなる核酸配列の組み合わせを含む組成物を含み、
前記核酸配列の組み合わせが
ａ）配列番号１、配列番号２および配列番号３；
ｂ）配列番号４、配列番号５および配列番号６；
ｃ）配列番号１および配列番号２；
ｄ）配列番号４および配列番号５；
ｅ）配列番号１および配列番号３；
ｆ）配列番号２および配列番号３；
ｇ）配列番号４および配列番号６；
ｈ）配列番号１および配列番号４；
ｉ）配列番号１および配列番号５；
ｊ）配列番号１および配列番号６；
ｋ）配列番号２および配列番号４；
ｌ）配列番号２および配列番号５；
ｍ）配列番号２および配列番号６；
ｎ）配列番号３および配列番号４；
ｏ）配列番号３および配列番号５；または
ｐ）配列番号３および配列番号６
から選択される、キット。
【請求項６】
配列番号３または配列番号６が、放射性同位体、蛍光標識、リガンド、化学発光物質または酵素で標識されている、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
ダイズ植物ゲノムのＤＮＡの接合状態を判定する方法であって、
（ａ）イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含むダイズ植物由来の生物学的サンプル由来のゲノムＤＮＡを含む生物学的サンプル由来のゲノムＤＮＡを用いる核酸増幅反応において使用されたとき、該生物学的サンプルのゲノムＤＮＡ内のａａｄ−１２遺伝子の存在を識別する第１アンプリコンを生成する配列番号１および２からなるプライマー対と該生物学的サンプルを接触させる工程；
（ｂ）核酸増幅反応を行う工程；
（ｃ）生成された第１アンプリコンを検出する工程；
（ｄ）ダイズ植物由来のゲノムＤＮＡを含む生物学的サンプルを用いる核酸増幅反応において使用されたとき、イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６として識別される導入遺伝子挿入のダイズゲノム領域に相同な野生型ダイズゲノムＤＮＡを識別するプライマーの組み合わせからアンプリコンを生成する配列番号４および５からなる第２プライマー対と、同じサンプルを接触させる工程；(ｅ）核酸増幅反応を行う工程、および
（ｆ）生成された第２アンプリコンを検出する工程を包含し；ここで：
（ｉ）両方のアンプリコンの検出は、該ダイズサンプルがイベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６についてヘテロ接合であることを示唆し；
（ｉｉ）前記第１アンプリコン（ａａｄ−１２遺伝子の存在を識別する）のみの検出は、該生物学的サンプルが、イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６についてホモ接合であることを示唆し；
（ｉｉｉ）前記第２アンプリコンのみの検出は、該生物学的サンプル内にイベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６が存在しないことを示唆する、方法。
【請求項８】
前記第１アンプリコンが、配列番号３からなるプローブを用いて検出され、前記第２アンプリコンが、配列番号６からなるプローブを用いて検出される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
生物学的サンプル中のイベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６に対応するＤＮＡの存在を検出する方法であって、
（ａ）イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含む１つまたはそれ以上のダイズ植物から得られたゲノムＤＮＡを用いる核酸増幅反応において使用されたとき、該植物を、イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含むと識別するアンプリコンを生成するプライマーセットと該生物学的サンプルを接触させる工程；
（ｂ）核酸増幅反応を行い、それにより、該アンプリコンを生成する工程；および
（ｃ）該アンプリコンを検出する工程であって、前記アンプリコンの検出は、イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６に対応するＤＮＡが存在することを示唆する、工程
を包含する、方法。
【請求項１０】
生物学的サンプル中のイベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６に対応するＤＮＡの存在を検出する方法であって、
（ａ）イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含むダイズ植物由来のゲノムＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズし、かつコントロールダイズ植物とはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズしないプローブと該生物学的サンプルを接触させる工程；
（ｂ）該生物学的サンプルおよびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供する工程；および
（ｃ）イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含むＤＮＡへの該プローブのハイブリダイゼーションを検出する工程であって、ここで、そのようなハイブリダイゼーションの検出は、該植物のゲノム内にイベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６に対応するＤＮＡが存在することを示唆する、工程
を包含する、方法。
【請求項１１】
前記プローブが、配列番号３からなる、請求項９または１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ダイズ植物のゲノム内のイベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６の存在を識別するために生物学的サンプル中の核酸を増幅する方法であって、
（ａ）イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６を含むダイズ植物由来の生物学的サンプル由来のゲノムＤＮＡを含む生物学的サンプル由来のゲノムＤＮＡを用いる核酸増幅反応において使用されたとき、該生物学的サンプルのゲノムＤＮＡ内のａａｄ−１２遺伝子の存在を識別するアンプリコンを生成する配列番号１および２のプライマー対からなる該生物学的サンプルを接触させる工程；
（ｂ）核酸増幅反応を行う工程；および
（ｃ）前記増幅反応によって生成されたアンプリコンを検出する工程であって、前記アンプリコンの検出は、該生物学的サンプルがａａｄ−１２遺伝子を含むことを示唆する、工程
を包含する、方法。
【請求項１３】
前記アンプリコンが、配列番号３からなるプローブを用いて検出される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物学的サンプルが、ダイズの細胞、ダイズの組織、ダイズの茎、ダイズの根、ダイズの葉、ダイズの花もしくはその一部、ダイズの種子、ダイズの莢またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項７、９、１０または１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記プローブが、標識されている、請求項８、１１または１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記プローブが、放射性同位体、蛍光標識、リガンド、化学発光物質または酵素で標識されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
バッファー、ならびに
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６からなる核酸配列の組み合わせを含む組成物であって、
前記核酸配列の組み合わせが
ａ）配列番号１、配列番号２および配列番号３；
ｂ）配列番号４、配列番号５および配列番号６；
ｃ）配列番号１および配列番号２；
ｄ）配列番号４および配列番号５；
ｅ）配列番号１および配列番号３；
ｆ）配列番号２および配列番号３；
ｇ）配列番号４および配列番号６；
ｈ）配列番号１および配列番号４；
ｉ）配列番号１および配列番号５；
ｊ）配列番号１および配列番号６；
ｋ）配列番号２および配列番号４；
ｌ）配列番号２および配列番号５；
ｍ）配列番号２および配列番号６；
ｎ）配列番号３および配列番号４；
ｏ）配列番号３および配列番号５；または
ｐ）配列番号３および配列番号６
から選択される、組成物。
【請求項１８】
配列番号３および配列番号６の少なくとも１つが、放射性同位体または蛍光標識またはリガンドまたは化学発光物質または酵素で標識されている、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
組換え植物における混入イベントを判定するための方法であって、
（ａ）ゲノムＤＮＡに隣接して連結された導入遺伝子を含むＤＮＡフラグメントからなる組換え植物ＤＮＡサンプルを、ゲノムＤＮＡに隣接して連結された導入遺伝子を含む前記ＤＮＡフラグメントにハイブリダイズする第１プライマー対と接触させる工程、
（ｂ）核酸増幅反応を行う工程；
（ｃ）ゲノムＤＮＡに隣接して連結された導入遺伝子を含む前記ＤＮＡフラグメントからなる第１アンプリコンを生成する工程；
（ｄ）該第１アンプリコンを検出する工程；
（ｅ）天然のホモ接合遺伝子を含むＤＮＡフラグメントからなる前記組換え植物ＤＮＡサンプルを、天然のホモ接合遺伝子を含む前記ＤＮＡフラグメントとハイブリダイズする第２プライマー対と接触させる工程；
（ｆ）核酸増幅反応を行う工程；
（ｇ）前記天然のホモ接合遺伝子からなる第２アンプリコンを生成する工程；
（ｈ）該第２アンプリコンを検出する工程；
（ｉ）前記第１および第２アンプリコンからのシグナル強度がほぼ等しいことを判定する工程であって、ここで、該第１および第２アンプリコンの等しいシグナル強度は、混入イベントが存在しないことを示唆する、工程；
（ｊ）導入遺伝子を含むＤＮＡフラグメントからなる前記組換え植物ＤＮＡサンプルを、導入遺伝子を含む前記ＤＮＡフラグメントとハイブリダイズする第３プライマー対と接触させる工程；
（ｋ）核酸増幅反応を行う工程；
（ｌ）前記導入遺伝子からなる第３アンプリコンを生成する工程；
（ｍ）該第３アンプリコンを検出する工程、および；
（ｎ）第１および第３アンプリコンのシグナル強度がほぼ等しいことを判定する工程であって、ここで、該第１および第３アンプリコンの等しいシグナル強度は、混入イベントが存在しないことを示唆する、工程を包含する、方法。
【国際調査報告】
2014531912.tif 000007
2014531912.tif 000008
2014531912.tif 000009