(57)【要約】  本願は、ＶＥＧＦに特異的に結合する２重リガンド及び３重リガンドタンパク質−触媒捕捉（ＰＣＣ）剤、並びに検出、診断及び治療薬としてのこれら捕捉剤の使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＥＧＦを特異的に結合する安定な合成捕捉剤であって、
当該捕捉剤は設計アンカーリガンド、設計２次リガンド、及び任意に設計３次リガンドを有し；
アンカーリガンド及び２次リガンドは選択的にＶＥＧＦを結合する、
合成捕捉剤。
【請求項２】
当該捕捉剤は２重リガンドであり；
アンカーリガンドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸と９５％一致するアミノ酸配列を有し、及び
２次リガンドは式：  
Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６
（式中Ｘ２はＤ−アルギニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−バリン、グリシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−イソロイシン及びＤ−アラニンからなるグループから選択される；
式中Ｘ３はＤ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、グリシン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−リジン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−トリプトファン及びＤ−チロシンからなるグループから選択される；
式中Ｘ４はＤ−イソロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トレオニン及びＤ−ヒスチジンからなるグループから選択される；
式中Ｘ５はＤ−イソロイシン、グリシン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−リジン、Ｄ−グルタメート、Ｄ−ヒスチジン及びＤ−アルギニンからなるグループから選択される；
式中Ｘ６はＤ−アルギニン、Ｄ−リジン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−バリン、グリシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−アラニン及びＤ−グルタミンからなるグループから選択される）
を有する、
請求項１に記載の合成捕捉剤。
【請求項３】
アンカーリガンド及び２次リガンドは、１，４−置換−１，２，３−トリアゾール残基（Ｔｚ４）を介して一緒に結合している、
請求項２に記載の２重リガンド捕捉剤。
【請求項４】
当該捕捉剤は、
【化１】
2014531424.tif 000023
【化２】
2014531424.tif 000024
及び
【化３】
2014531424.tif 000025
からなるグループから選択される構造を有する、請求項２に記載の２重リガンド捕捉剤。
【請求項５】
当該捕捉剤は３重リガンドであり；
アンカーリガンドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸と９５％一致するアミノ酸配列を有し、及び
２次リガンドは式：  
Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６
（式中Ｘ２はＤ−アルギニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−バリン、グリシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−イソロイシン及びＤ−アラニンからなるグループから選択される；
式中Ｘ３はＤ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、グリシン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−リジン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−トリプトファン及びＤ−チロシンからなるグループから選択される；
式中Ｘ４はＤ−イソロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トレオニン及びＤ−ヒスチジンからなるグループから選択される；
式中Ｘ５はＤ−イソロイシン、グリシン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−リジン、Ｄ−グルタメート、Ｄ−ヒスチジン及びＤ−アルギニンからなるグループから選択される；
式中Ｘ６はＤ−アルギニン、Ｄ−リジン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−バリン、グリシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−アラニン及びＤ−グルタミンからなるグループから選択される）を有し：及び
３次リガンドは式：
Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６
（式中Ｘ２はＤ−ヒスチジン、Ｄ−アルギニン及びＤ−リジンからなるグループから選択される；Ｘ３はＤ−トレオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−アラニン、及びＤ−グルタメートからなるグループから選択される；Ｘ４はＤ−ヒスチジン、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−ロイシン及びＤ−チロシンからなるグループから選択される；Ｘ５はＤ−バリン、Ｄ−プロリン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−セリン及びＤ−チロシンからなるグループから選択される；及びＸ６はＤ−アルギニン、Ｄ−チロシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−リジン及びＤ−ヒスチジンからなるグループから選択される；
Ｘ２はＤ−チロシン、Ｄ−フェニルアラニン及びＤ−トリプトファンからなるグループから選択される；Ｘ３はＤ−プロリン、Ｄ−アラニン、グリシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン及びＤ−ヒスチジンからなるグループから選択される；Ｘ４はＤ−アルギニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−グルタメート、Ｄ−プロリン、Ｄ−セリン及びＤ−トレオニンからなるグループから選択される；Ｘ５はＤ−プロリン、Ｄ−アスパルテート、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−チロシン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アラニン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン及びＤ−アスパラギンからなるグループから選択される；及びＸ６はＤ−ヒスチジン、Ｄ−リジン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパルテート、Ｄ−セリン、Ｄ−チロシン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−グルタメート及びＤ−バリンからなるグループから選択される；又は
Ｘ２はＤ−グルタメート及びＤ−アスパルテートからなるグループから選択される；Ｘ３はＤ−グルタメート、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−リジン、Ｄ−アスパラギン及びＤ−セリンからなるグループから選択される；Ｘ４はＤ−イソロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−アスパルテート、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−チロシン及びＤ−ヒスチジンからなるグループから選択される；Ｘ５はＤ−アルギニン、Ｄ−チロシン、グリシン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−リジン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アラニン、Ｄ−アスパラギン及びＤ−ロイシンからなるグループから選択される；及びＸ６はＤ−アスパルテート、Ｄ−プロリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−セリン及びＤ−トレオニンからなるグループから選択される）
を有する、請求項１に記載の合成捕捉剤。
【請求項６】
アンカーリガンド及び２次リガンドは、１，４−置換−１，２，３−トリアゾール残基（Ｔｚ４）を介して一緒に結合している、請求項５に記載の３重リガンド捕捉剤。
【請求項７】
２次リガンド及び３次リガンドは、１，４−置換−１，２，３−トリアゾール残基（Ｔｚ４）を介して一緒に結合している、請求項５に記載の３重リガンド捕捉剤。
【請求項８】
当該捕捉剤は、
【化４】
2014531424.tif 000026
【化５】
2014531424.tif 000027
【化６】
2014531424.tif 000028
及び
【化７】
2014531424.tif 000029
からなるグループから選択される構造を有する、請求項５に記載の３重リガンド捕捉剤。
【請求項９】
ＶＥＧＦに対する前記捕捉剤の結合はＶＥＧＦ活性を阻害する、請求項１に記載の合成捕捉剤。
【請求項１０】
前記捕捉剤はＶＥＧＦのＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）への結合を阻害する、請求項１に記載の合成捕捉剤。
【請求項１１】
当該捕捉剤は温度約−８０°Ｃ乃至約４０°Ｃにおいて安定している、請求項１に記載の合成捕捉剤。
【請求項１２】
当該捕捉剤は室温において安定している、請求項１に記載の合成捕捉剤。
【請求項１３】
当該捕捉剤は血清もしくは血漿において少なくとも２４時間安定している、請求項１に記載の合成捕捉剤。
【請求項１４】
当該捕捉剤は約３乃至約１２の範囲のｐＨにおいて安定している、請求項１に記載の合成捕捉剤。
【請求項１５】
当該捕捉剤はビオチン及び銅−ＤＯＴＡからなるグループから選択されるラベルで標識化される、請求項１に記載の合成捕捉剤。
【請求項１６】
生物学的サンプルにおけるＶＥＧＦを検出する検出剤としての請求項１に記載の捕捉剤の使用。
【請求項１７】
イムノアッセイを使用する生物学的サンプルにおけるＶＥＧＦを検出する方法であって、
イムノアッセイは請求項１に記載の捕捉剤を利用し；
前記捕捉剤はイムノアッセイにおける抗体もしくはその同等物に取って代わる、
方法。
【請求項１８】
イムノアッセイはウエスタンブロット、プルダウンアッセイ、ドットブロット及びＥＬＩＳＡからなるグループから選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
それを必要としている対象における増大したＶＥＧＦ発現及び／又は活性に関連した状態を治療する方法であって、請求項１に記載の捕捉剤の治療的に有効な量を投与することを有する、方法。
【請求項２０】
前記状態は癌、増殖性網膜症、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）のウェット型疾病病理学もしくは関節リウマチからなるグループから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
対象におけるＶＥＧＦ活性を阻害する方法であって、請求項１に記載の捕捉剤を対象に投与することを有する、方法。
【請求項２２】
捕捉剤は６４Ｃｕ  ＤＯＴＡ、６８Ｇａ  ＤＯＴＡ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８９Ｚｒ、１２４Ｉ、８６Ｙ、９４ｍＴｃ、１１０ｍＩｎ、１１Ｃもしくは７６Ｂｒからなる検出可能部分で標識化される、請求項１に記載の捕捉剤。
【請求項２３】
ヒトもしくはマウス対象におけるＶＥＧＦ発現癌を診断する方法であって、以下のステップ：
ａ）検出可能な部分に結合した請求項１に記載のＶＥＧＦ捕捉剤を対象に投与すること；及び
ｂ）対象におけるＶＥＧＦ捕捉剤に結合した部分を検出すること（ここで部分の検出は対象におけるＶＥＧＦ発現癌を診断する）、
を有する、方法。
【請求項２４】
捕捉剤は６４Ｃｕ  ＤＯＴＡ、６８Ｇａ  ＤＯＴＡ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８９Ｚｒ、１２４Ｉ、８６Ｙ、９４ｍＴｃ、１１０ｍＩｎ、１１Ｃもしくは７６Ｂｒ．２６からなる検出可能部分で標識化される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＶＥＧＦ捕捉剤に結合した部分はＰＥＴもしくはＳＰＥＣＴを使用して検出される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
対象のＶＥＧＦ発現癌においてもしくは近傍において請求項１もしくは請求項５に記載のＶＥＧＦ捕捉剤に結合した、小分子ポジトロン断層法リガンドを患者に投与することを有する、ＶＥＧＦ指向療法を受ける対象の治療をモニタする方法。
【請求項２７】
サンプルにおけるＶＥＧＦを検出する方法であって、
ａ）検出可能な部分に結合した請求項１に記載のＶＥＧＦ捕捉剤にサンプルを曝露すること；及び
ｂ）対象におけるＶＥＧＦ捕捉剤に結合した部分を検出すること（ここで部分の検出は対象におけるＶＥＧＦ発現癌を診断する）、
を有する方法。
【請求項２８】
捕捉剤は６４Ｃｕ  ＤＯＴＡ、６８Ｇａ  ＤＯＴＡ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８９Ｚｒ、１２４Ｉ、８６Ｙ、９４ｍＴｃ、１１０ｍＩｎ、１１Ｃもしくは７６Ｂｒからなる検出可能部分で標識化される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＶＥＧＦ捕捉剤に結合した部分はＰＥＴもしくはＳＰＥＣＴを使用して検出される、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、ＶＥＧＦに特異的に結合する２重リガンド及び３重リガンドタンパク質−触媒捕捉（ＰＣＣ）剤、並びに検出、診断及び治療薬としてのこれら捕捉剤の使用に関する。
関連出願
本願は、米国特許仮出願第６１／５２９，８７２号（２０１１年８月３１日出願）、米国特許仮出願第６１／５５６，７１３号（２０１１年１１月７日出願）、米国特許仮出願第６１／５８５，５９０号（２０１２年１月１１日出願）及び米国特許仮出願第６１／６７５，２９８号（２０１２年７月２４日出願）に対して優先権を主張する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
背景
早期での病気の検出は、生物学的サンプルにおけるキータンパク質バイオマーカーの多岐にわたる測定を必要とする。複雑な生物学的混合物からバイオマーカーを見分ける高親和性、高選択性組成物を利用できるかどうかは、疾患もしくは健康の変化を示し得るタンパク質の正確な検出にとって決定的な要素である。
【０００３】
血管内皮細胞増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ）は、血管新生及び脈管形成の強力な内皮細胞特異的伝達物質である。ＶＥＧＦは、癌、増殖性網膜症、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）のウェット型疾病病理学及び関節リウマチに病理学的に関与しており、それ自体が重要な診断及び治療標的を意味している。ＶＥＧＦシグナリングは血管新生を調整し、ＶＥＧＦレベルは腫瘍タイプの一種において上昇する。ＶＥＧＦそれ自体が癌の造影、検出及び治療のための興味をそそる候補を示す。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
概要
ある実施形態においてここに規定されるのは、ＶＥＧＦに特異的に結合する安定な合成ＶＥＧＦ捕捉剤である。
【０００５】
ある実施形態において、ここに規定されるＶＥＧＦ捕捉剤は、設計アンカーリガンド及び設計２次リガンド（両方とも選択的にＶＥＧＦを結合する）を有する。ある実施形態において、捕捉剤はさらに設計３次リガンドを有する。
【０００６】
ある実施形態において、ここに規定されるＶＥＧＦ捕捉剤は２重リガンド（ｂｉｌｉｇａｎｄ）である。これらの実施形態のあるものにおいて、２重リガンドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列からなるアンカーリガンド及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３もしくは４のアミノ酸配列からなる２次リガンドを有する。ある実施形態において、アンカーリガンドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に明らかなアミノ酸配列と８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは１００％一致するアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、アンカーリガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列のフラグメントを有する。ある実施形態において、このフラグメントは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７もしくは１８個のアミノ酸を含む。他の実施形態において、このフラグメントは５乃至１８、１０乃至１８、５乃至１５、７乃至１５、９乃至１５もしくは３乃至１６個のアミノ酸を含む。ある実施形態において、２次リガンドは式：  Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６を有する。ある実施形態において、Ｘ２は、プラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸及び中性Ｄ−アミノ酸から選択される。他の実施形態において、Ｘ２はＤ−アルギニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−バリン、グリシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−イソロイシン及びＤ−アラニンから選択される。他の実施形態において、Ｘ３は中性Ｄ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸もしくはプラスに帯電したアミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ３はＤ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、グリシン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−リジン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−トリプトファン及びＤ−チロシンから選択される。他の実施形態において、Ｘ４は中性Ｄ−アミノ酸、プラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸及び極性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ４はＤ−イソロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トレオニン及びＤ−ヒスチジンから選択される。他の実施形態において、Ｘ５は中性Ｄ−アミノ酸、プラスに帯電したＤ−アミノ酸及びマイナスに帯電したＤ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ５はＤ−イソロイシン、グリシン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−リジン、Ｄ−グルタメート、Ｄ−ヒスチジン及びＤ−アルギニンから選択される。他の実施形態において、Ｘ６はプラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸、中性Ｄ−アミノ酸及び極性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ６はＤ−アルギニン、Ｄ−リジン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−バリン、グリシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−アラニン及びＤ−グルタミンから選択される。
【０００７】
ある実施形態において、Ｘ２はプラスに帯電したＤ−アミノ酸及び芳香族Ｄ−アミノ酸から選択される。他の実施形態において、Ｘ２はＤ−アルギニン及びＤ−トリプトファンから選択される。他の実施形態において、Ｘ３は中性Ｄ−アミノ酸及び芳香族Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ３はＤ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン及びグリシンから選択される。他の実施形態において、Ｘ４は中性Ｄ−アミノ酸である。ある実施形態において、Ｘ４はＤ−イソロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−プロリン及びＤ−アラニンから選択される。他の実施形態において、Ｘ５は中性Ｄ−アミノ酸である。ある実施形態において、Ｘ５はＤ−イソロイシン、グリシン及びＤ−バリンから選択される。他の実施形態において、Ｘ６はプラスに帯電したＤ−アミノ酸である。ある実施形態において、Ｘ６はＤ−アルギニン及びＤ−リジンから選択される。
【０００８】
ある実施形態において、Ｘ２は中性Ｄ−アミノ酸である。他の実施形態において、Ｘ２はＤ−ロイシン、Ｄ−バリン、グリシン及びＤ−プロリンから選択される。他の実施形態において、Ｘ３はプラスに帯電したアミノ酸である。ある実施形態において、Ｘ３はＤ−アルギニン、Ｄ−リジン及びＤ−ヒスチジンから選択される。他の実施形態において、Ｘ４は中性Ｄ−アミノ酸、プラスに帯電したＤ−アミノ酸及び芳香族  Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ４はＤ−プロリン、Ｄ−アルギニン及びＤ−フェニルアラニンから選択される。他の実施形態において、Ｘ５は中性Ｄ−アミノ酸及びプラスに帯電したＤ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ５はＤ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−アラニン、Ｄ−プロリン及びＤ−リジンから選択される。他の実施形態において、Ｘ６はプラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸及び中性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ６はＤ−アルギニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−プロリン及びＤ−バリンから選択される。
【０００９】
ある実施形態において、Ｘ２は中性Ｄ−アミノ酸である。他の実施形態において、Ｘ２Ｄ−ロイシン、グリシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−イソロイシン及びＤ−アラニンから選択される。他の実施形態において、Ｘ３は芳香族Ｄ−アミノ酸である。ある実施形態において、Ｘ３はＤ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン及びＤ−チロシンから選択される。他の実施形態において、Ｘ４はプラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸及び極性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ４はＤ−アルギニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トレオニン及びＤ−ヒスチジンから選択される。他の実施形態において、Ｘ５は中性Ｄ−アミノ酸、プラスに帯電したＤ−アミノ酸及びマイナスに帯電したＤ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ５はグリシン、Ｄ−アラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタメート、Ｄ−ヒスチジン及びＤ−アルギニンから選択される。他の実施形態において、Ｘ６はプラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸、中性Ｄ−アミノ酸及び極性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ６はＤ−アルギニン、Ｄ−トリプトファン、グリシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−アラニン及びＤ−グルタミンから選択される。
【００１０】
他の実施形態において、２次リガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、４、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０及び２１から選択されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、２次リガンドはアミノ酸配列（該配列中において１個のアミノ酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、４、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０及び２１から選択されるアミノ酸配列と異なる）を有する。他の実施形態において、２次リガンドはアミノ酸配列（ここでは該アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、４、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０及び２１から選択されるアミノ酸配列からなる）を有する。
【００１１】
ある実施形態において、アンカーリガンド及び２次リガンドは、１，４−二置換−１，２，３−トリアゾール（Ｔｚ４）結合を介して一緒に結合している。ある実施形態において、２重リガンドは、
【００１２】
【化１】
2014531424.tif 000002
【００１３】
【化２】
2014531424.tif 000003
及び
【００１４】
【化３】
2014531424.tif 000004
から選択される構造を有する。
【００１５】
ある実施形態において、ここに規定されるＶＥＧＦ捕捉剤は３重リガンド（ｔｒｉｌｉｇａｎｄｓ）である。これらの実施形態のあるものにおいて、３重リガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列からなるアンカーリガンド、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列からなる２次リガンド、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、６、７もしくは８のアミノ酸配列からなる３次リガンドを有する。他の実施形態において、アンカーリガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に明らかなアミノ酸配列と８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは１００％一致するアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、アンカーリガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列のフラグメントを有する。ある実施形態において、このフラグメントは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７もしくは１８個のアミノ酸を含む。他の実施形態において、このフラグメントは５乃至１８、１０乃至１８、５乃至１５、７乃至１５、９乃至１５もしくは３乃至１６個のアミノ酸を含む。ある実施形態において、２次リガンドは式：  Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６を有する。
【００１６】
ある実施形態において、Ｘ２はプラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸及び中性Ｄ−アミノ酸から選択される。他の実施形態において、Ｘ２は、Ｄ−アルギニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−バリン、グリシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−イソロイシン及びＤ−アラニンから選択される。他の実施形態において、Ｘ３は中性Ｄ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸もしくはプラスに帯電したアミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ３はＤ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、グリシン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−リジン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−トリプトファン及びＤ−チロシンから選択される。他の実施形態において、Ｘ４は中性Ｄ−アミノ酸、プラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸及び極性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ４はＤ−イソロイシンＤ−ロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トレオニン及びＤ−ヒスチジンから選択される。他の実施形態において、Ｘ５は中性Ｄ−アミノ酸、プラスに帯電したＤ−アミノ酸及びマイナスに帯電したＤ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ５はＤ−イソロイシン、グリシン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−リジン、Ｄ−グルタメート、Ｄ−ヒスチジン及びＤ−アルギニンから選択される。他の実施形態において、Ｘ６はプラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸、中性Ｄ−アミノ酸及び極性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ６はＤ−アルギニン、Ｄ−リジン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−バリン、グリシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−アラニン及びＤ−グルタミンから選択される。
【００１７】
ある実施形態において、Ｘ２はプラスに帯電したＤ−アミノ酸及び芳香族Ｄ−アミノ酸から選択される。他の実施形態において、Ｘ２はＤ−アルギニン及びＤ−トリプトファンから選択される。他の実施形態において、Ｘ３は中性Ｄ−アミノ酸及び芳香族Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ３はＤ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン及びグリシンから選択される。他の実施形態において、Ｘ４は中性Ｄ−アミノ酸である。ある実施形態において、Ｘ４はＤ−イソロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−プロリン及びＤ−アラニンから選択される。他の実施形態において、Ｘ５は中性Ｄ−アミノ酸である。ある実施形態において、Ｘ５はＤ−イソロイシン、グリシン及びＤ−バリンから選択される。他の実施形態において、Ｘ６はプラスに帯電したＤ−アミノ酸である。ある実施形態において、Ｘ６はＤ−アルギニン及びＤ−リジンから選択される。
【００１８】
ある実施形態において、Ｘ２は中性Ｄ−アミノ酸である。他の実施形態において、Ｘ２はＤ−ロイシン、Ｄ−バリン、グリシン及びＤ−プロリンから選択される。他の実施形態において、Ｘ３はプラスに帯電したアミノ酸である。ある実施形態において、Ｘ３はＤ−アルギニン、Ｄ−リジン及びＤ−ヒスチジンから選択される。他の実施形態において、Ｘ４は中性Ｄ−アミノ酸、プラスに帯電したＤ−アミノ酸及び芳香族Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ４はＤ−プロリン、Ｄ−アルギニン及びＤ−フェニルアラニンから選択される。他の実施形態において、Ｘ５は中性Ｄ−アミノ酸及びプラスに帯電したＤ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ５はＤ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−アラニン、Ｄ−プロリン及びＤ−リジンから選択される。他の実施形態において、Ｘ６はプラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸及び中性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ６はＤ−アルギニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−プロリン及びＤ−バリンから選択される。
【００１９】
ある実施形態において、Ｘ２は中性Ｄ−アミノ酸である。他の実施形態において、Ｘ２はＤ−ロイシン、グリシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−イソロイシン及びＤ−アラニンから選択される。他の実施形態において、Ｘ３は芳香族Ｄ−アミノ酸である。ある実施形態において、Ｘ３はＤ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン及びＤ−チロシンから選択される。他の実施形態において、Ｘ４はプラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸及び極性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ４はＤ−アルギニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トレオニン及びＤ−ヒスチジンから選択される。他の実施形態において、Ｘ５は中性Ｄ−アミノ酸、プラスに帯電したＤ−アミノ酸及びマイナスに帯電したＤ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ５はグリシン、Ｄ−アラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタメート、Ｄ−ヒスチジン及びＤ−アルギニンから選択される。他の実施形態において、Ｘ６はプラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸、中性Ｄ−アミノ酸及び極性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ６はＤ−アルギニン、Ｄ−トリプトファン、グリシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−アラニン及びＤ−グルタミンから選択される。
【００２０】
他の実施形態において、２次リガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、４、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０及び２１から選択されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、２次リガンドはアミノ酸配列（該配列中において１個のアミノ酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、４、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０及び２１から選択されるアミノ酸配列と異なる）を有する。他の実施形態において、２次リガンドはアミノ酸配列（ここでは該アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、４、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０及び２１から選択されるアミノ酸配列からなる）を有する。
【００２１】
ここに規定される２重リガンド及び３重リガンド捕捉剤についてのある実施形態において、３次リガンドは式：  Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６を有する。ある実施形態において、Ｘ２はプラスに帯電したＤ−アミノ酸である。他の実施形態において、Ｘ２はＤ−ヒスチジン、Ｄ−アルギニン及びＤ−リジンから選択される。他の実施形態において、Ｘ３は極性Ｄ−アミノ酸、中性Ｄ−アミノ酸及びマイナスに帯電したアミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ３はＤ−トレオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−アラニン、及びＤ−グルタメートから選択される。他の実施形態において、Ｘ４はプラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸及び中性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ４はＤ−ヒスチジン、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−ロイシン及びＤ−チロシンから選択される。他の実施形態において、Ｘ５は中性Ｄ−アミノ酸、プラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸及び極性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ５はＤ−バリン、Ｄ−プロリン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−セリン及びＤ−チロシンから選択される。他の実施形態において、Ｘ６はプラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸、極性Ｄ−アミノ酸及び中性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ６はＤ−アルギニン、Ｄ−チロシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−リジン及びＤ−ヒスチジンから選択される。
【００２２】
ある実施形態において、Ｘ２は芳香族Ｄ−アミノ酸である。他の実施形態において、Ｘ２はＤ−チロシン、Ｄ−フェニルアラニン及びＤ−トリプトファンから選択される。他の実施形態において、Ｘ３は中性Ｄ−アミノ酸及びプラスに帯電したアミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ３はＤ−プロリン、Ｄ−アラニン、グリシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン及びＤ−ヒスチジンから選択される。他の実施形態において、Ｘ４はプラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸、マイナスに帯電したＤ−アミノ酸、中性Ｄ−アミノ酸及び極性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ４はＤ−アルギニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−グルタメート、Ｄ−プロリン、Ｄ−セリン及びＤ−トレオニンから選択される。他の実施形態において、Ｘ５は中性Ｄ−アミノ酸、マイナスに帯電したＤ−アミノ酸、プラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸及び極性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ５はＤ−プロリン、Ｄ−アスパルテート、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−チロシン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アラニン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン及びＤ−アスパラギンから選択される。他の実施形態において、Ｘ６はプラスに帯電したＤ−アミノ酸、極性Ｄ−アミノ酸、中性Ｄ−アミノ酸、マイナスに帯電したＤ−アミノ酸及び芳香族Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ６はＤ−ヒスチジン、Ｄ−リジン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパルテート、Ｄ−セリン、Ｄ−チロシン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−グルタメート及びＤ−バリンから選択される。
【００２３】
ある実施形態において、Ｘ２はマイナスに帯電したＤ−アミノ酸である。他の実施形態において、Ｘ２はＤ−グルタメート及びＤ−アスパルテートから選択される。他の実施形態において、Ｘ３はマイナスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸、プラスに帯電したアミノ酸及び極性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ３はＤ−グルタメート、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−リジン、Ｄ−アスパラギン及びＤ−セリンから選択される。他の実施形態において、Ｘ４は中性Ｄ−アミノ酸、プラスに帯電したＤ−アミノ酸、極性Ｄ−アミノ酸、マイナスに帯電したＤ−アミノ酸及び芳香族Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ４はＤ−イソロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−アスパルテート、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−チロシン及びＤ−ヒスチジンから選択される。他の実施形態において、Ｘ５はプラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸及び中性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ５はＤ−アルギニン、Ｄ−チロシン、グリシン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−リジン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アラニン、Ｄ−アスパラギン及びＤ−ロイシンから選択される。他の実施形態において、Ｘ６はマイナスに帯電したＤ−アミノ酸、中性Ｄ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸及び極性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ６はＤ−アスパルテート、Ｄ−プロリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−セリン及びＤ−トレオニンから選択される。
【００２４】
他の実施形態において、３次リガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５、６、７、８、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３及び６４から選択されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、２次リガンドはアミノ酸配列（該配列中において１個のアミノ酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、６、７、８、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３及び６４から選択されるアミノ酸配列と異なる）を有する。他の実施形態において、２次リガンドはアミノ酸配列（ここでは該アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５、６、７、８、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３及び６４から選択されるアミノ酸配列からなる）を有する。
【００２５】
ある実施形態において、アンカーリガンド及び２次リガンド及び／又は２次リガンド及び３次リガンドは、Ｔｚ４結合を介して一緒に結合している。ある実施形態において、３重リガンドは
【００２６】
【化４】
2014531424.tif 000005
【００２７】
【化５】
2014531424.tif 000006
【００２８】
【化６】
2014531424.tif 000007
及び
【００２９】
【化７】
2014531424.tif 000008
から選択される構造を有する。
【００３０】
ある実施形態において、ここに規定されるＶＥＧＦ捕捉剤は温度、ｐＨ、貯蔵期間、貯蔵条件及び反応条件について広範囲にわたって安定であり、ある実施形態において捕捉剤は凍結乾燥パウダーとしての貯蔵において安定している。ある実施形態において、捕捉剤は温度約−８０°Ｃ乃至約４０°Ｃにおける貯蔵で安定している。ある実施形態において、捕捉剤は室温における貯蔵で安定している。ある実施形態において、捕捉剤はヒト血清において少なくとも２４時間安定している。ある実施形態において、捕捉剤は約３乃至約８の範囲のｐＨにおいて安定している。
【００３１】
ある実施形態において、ここに規定されるＶＥＧＦ捕捉剤は１個以上の検出可能なラベルを有する。これらの実施形態のあるものにおいて、ラベルは銅−ＤＯＴＡである。他の実施形態において、ラベルは蛍光ラベルである。他の実施形態において、検出可能なラベルは６４Ｃｕ  ＤＯＴＡ、６８Ｇａ  ＤＯＴＡ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８９Ｚｒ、１２４Ｉ、８６Ｙ、９４ｍＴｃ、１１０ｍＩｎ、１１Ｃもしくは７６Ｂｒである。
【００３２】
ある実施形態において、ここに規定されるＶＥＧＦ捕捉剤１種以上を有するキットが提供される。これらの実施形態のあるものにおいて、キットは使用説明書を包含する。
【００３３】
ある実施形態において、ここに規定される捕捉剤を使用して、生物学的サンプルにおけるＶＥＧＦを同定、検出、定量もしくは分離する方法が提供される。ある実施形態において、これらの方法は、ＶＥＧＦ捕捉剤が抗体もしくはその同等物に代わるものとして使用されるイムノアッセイである。ある実施形態において、イムノアッセイはウエスタンブロット、プルダウンアッセイ、ドットブロットもしくはＥＬＩＳＡである。
【００３４】
ある実施形態において、ここに規定される捕捉剤を使用して、それを必要としている対象における増大したＶＥＧＦ発現及び／又は活性に関連した状態を診断もしくは分類する方法が提供される。これらの実施形態のあるものにおいて、この状態は癌、増殖性網膜症、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）のウェット型疾病病理学もしくは関節リウマチから選択される。
【００３５】
ある実施形態において、それを必要としている対象における増大したＶＥＧＦ発現及び／又は活性に関連した状態を治療する方法が提供される。ある実施形態において、これらの方法は、対象にここに規定されるようなＶＥＧＦ捕捉剤の治療的に有効な量を投与することを有する。ある実施形態において、治療される状態は癌、増殖性網膜症、ウェット型ＡＭＤの疾病病理学もしくは関節リウマチである。ある実施形態において、ここに規定されるＶＥＧＦ捕捉剤は、免疫療法薬として機能する。
【００３６】
ある実施形態において、ここに規定されるようなＶＥＧＦ捕捉剤を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏＶＥＧＦ活性を阻害する方法が提供される。
【００３７】
ある実施形態において、ここに規定されるようなＶＥＧＦ捕捉剤を使用して、ＶＥＧＦのＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）への結合を阻害する方法が提供される。
【００３８】
ある実施形態において、ここに規定されるようなＶＥＧＦ捕捉剤を使用して、ＶＥＧＦＲシグナリングを阻害する方法が提供される。
【００３９】
ある実施形態において、それを必要としている対象における増大したＶＥＧＦ発現及び／又は活性に関連した状態を治療する医薬品の調製において使用するため、１個以上のＶＥＧＦ捕捉剤の使用が提供される。
【００４０】
ある実施形態において、ここに開示されるＶＥＧＦ捕捉剤を合成する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
図面の簡単な説明
【図１】Ｆｉｇ．１はｉｎ  ｓｉｔｕクリックケミストリープロトコルである。
【図２】Ｆｉｇ．２はｉｎ  ｓｉｔｕクリックケミストリープロトコルである。
【図３】Ｆｉｇ．３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１  （ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ）のアミノ酸配列を有するアンカーリガンドの構造である。下線はジスルフィド拘束残基を表す。
【図４】Ｆｉｇ．４はアンカーリガンド構築物ビオチン−ＰＥＧ−アンカーリガンド−Ａｚ４の構造である。
【図５】Ｆｉｇ．５。情報処理クラスタリングは２次及び３次リガンドの候補選択をガイドする。タンパク質エピトープの様々な領域が様々なクラスタによりサンプリングされると示唆される。ダークブルー＝２重リガンドスクリーンからの５量体２次リガンドヒット（ｈｉｔｓ）
【図６】Ｆｉｇ．６は２重リガンド構築物ビオチン−ＰＥＧ−  ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ−Ｔｚ４−Ｉｆｒｅｗ−Ａｚ４である。
【図７】Ｆｉｇ．７。情報処理クラスタリングは２次及び３次リガンドの候補選択をガイドする。タンパク質エピトープの様々な領域が様々なクラスタによりサンプリングされると示唆される。ダークブルー＝３重リガンドスクリーンからの５量体３次リガンドヒット
【図８】Ｆｉｇ．８は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアンカーリガンド及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の２次リガンドを有する２重リガンド１の構造である（ｒｐｌｉｒ）。
【図９】Ｆｉｇ．９は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアンカーリガンド及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の２次リガンドを有する２重リガンド２の構造である（ｌｆｒｅｗ）。
【図１０】Ｆｉｇ．１０は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアンカーリガンド及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の２次リガンドを有する２重リガンド３の構造である（ｆｓｒｋｔｅ）。
【図１１】Ｆｉｇ．１１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアンカーリガンド、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の２次リガンド及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の３次リガンドを有する３重リガンド１の構造である（ｆｒｓｖｎ）。
【図１２】Ｆｉｇ．１２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアンカーリガンド、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の２次リガンド及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の３次リガンドを有する３重リガンド２の構造である（ｅｅｉｒｄ）。
【図１３】Ｆｉｇ．１３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアンカーリガンド、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の２次リガンド及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の３次リガンドを有する３重リガンド３の構造である（ｈｔｈｗｌ）。
【図１４】Ｆｉｇ．１４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアンカーリガンド、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の２次リガンド及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の３次リガンドを有する３重リガンド４の構造である（ｅｗｓｒｗ）。
【図１５】Ｆｉｇ．  １５は、ＥＬＩＳＡで測定した３重リガンド２（”Ｔｒｉｌｉｇ２−Ｉｆｒｅｗ−ｅｅｉｒｄ”）、３重リガンド３（”Ｔｒｉｌｉｇ３−ｈｔｈｗｌ−ｈｔｈｗｌ”）、２重リガンド２（”Ｂｉｌｉｇ２−Ｉｆｒｅｗ”）、２価及び３重リガンドのアンカーリガンド（”Ａｎｃｈｏｒ”）成分、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）及びＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）ＦａｂのＶＥＧＦ１６５への結合である。
【図１６】Ｆｉｇ．１６は、ＶＥＧＦ１６５をスパイクしたバッファー（”Ｂ”）及びＶＥＧＦ１６５をスパイクしたヒト血清（”Ｓ”）からの捕捉剤免疫沈降法により測定した、３重リガンド１（”Ｔｒｉｌｉｇ１−Ｉｆｒｅｗ−ｆｒｓｖｎ”）、３重リガンド２（”Ｔｒｉｌｉｇ２−Ｉｆｒｅｗ−ｅｅｉｒｄ”）、３重リガンド３（”Ｔｒｉｌｉｇ３−Ｉｆｒｅｗ−ｈｔｈｗｌ”）、３重リガンド４（”Ｔｒｉｌｉｇ４−Ｉｆｒｅｗ−ｅｗｓｒｗ”）、２重リガンド２（”Ｂｉｌｉｇ２−Ｉｆｒｅｗ”）、２価及び３重リガンドのアンカーリガンド（”Ａｎｃｈｏｒ”）成分及びＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）のＶＥＧＦ１６５への結合である。結果は、銀染色（上のパネル）及びウエスタンブロット（下のパネル）により分析された。
【図１７】Ｆｉｇ．１７：  ３７℃における抗ＶＥＧＦ  ＰＣＣ  ３重リガンドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性のＨＰＬＣ分析。（Ａ）２５％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ男性血清において。（Ｂ）ｐＨ７．２５のＴＢＳにおいて。ＴＢＳ中２５％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ男性血清（ＨＳ−２０、Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｔａｒｚａｎａ、ＣＡ）の存在下もしくは不在下でＰＣＣ  （２００  μｇ）を３７℃でインキュベートした。様々な時点でアリコートを取った。１２，０００ｒｐｍの遠心分離によりＭｉｃｒｏｃｏｎ遠心濾過機（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−１０，  ＭＷＣＯ＝１０ｋＤａ，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）において血漿タンパク質からＰＣＣを分離した。濾過物をＣ１８カラムにおける分析ＨＰＬＣ  により検査した。
【図１８】Ｆｉｇ．１８：  ２重リガンド１（”Ｂｉｌｉｇ１（ｒｐｌｉｒ）”）、２重リガンド２（”Ｂｉｌｉｇ２（Ｉｆｒｅｗ）”）、２重リガンド３（”Ｂｉｌｉｇ３−ｆｓｒｋｔｅ”）、２重リガンドのアンカーリガンド（”Ａｎｃｈｏｒ”）及びＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）によるＨＵＶＥＣ増殖の阻害。
【図１９】Ｆｉｇ．１９：  Ａ．マウスへ２重リガンド１をＩＶ投与（１ｍｇ／ｋｇ）した後の濃度−時間プロファイル。算出Ｔ１／２  ＝  ７．２６１３分（３ポイント、一様な重みづけ）。Ｂ．  マウスへ２重リガンド１をＩＰ投与（５ｍｇ／ｋｇ）した後の濃度−時間プロファイル（２ポイント、一様な重みづけ）。
【図２０】Ｆｉｇ．２０：  競合ＥＬＩＳＡで測定された、３重リガンド２（”Ｔｒｉｌｉｇ２−Ｉｆｒｅｗ−ｅｅｉｒｄ”）、３重リガンド３（”Ｔｒｉｌｉｇ３−Ｉｆｒｅｗ−ｈｔｈｗｌ”）、２重リガンド２（”Ｂｉｌｉｇ２−Ｉｆｒｅｗ”）、２価及び３重リガンドのアンカーリガンド（”Ａｎｃｈｏｒ”）及びＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）Ｆａｂによる、ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦ１６５結合の阻害。
【図２１】Ｆｉｇ．２１：  競合ＥＬＩＳＡで測定された、３重リガンド１（”Ｔｒｉｌｉｇ１−Ｉｆｒｅｗ−ｆｒｓｖｎ”）、３重リガンド２（”Ｔｒｉｌｉｇ２−Ｉｆｒｅｗ−ｅｅｉｒｄ”）、３重リガンド３（”Ｔｒｉｌｉｇ３−Ｉｆｒｅｗ−ｈｔｈｗｌ”）及び２重リガンド２（”Ｂｉｌｉｇ２−Ｉｆｒｅｗ”）による、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）ＦａｂへのＶＥＧＦ１６５結合の阻害。
【図２２】Ｆｉｇ．  ２２：  ２重リガンド２（”Ｂｉｌｉｇ２−Ｉｆｒｅｗ”）、２重リガンド３（”Ｂｉｌｉｇ３−ｆｓｒｋｔｅ”）、２重リガンドアンカーリガンド（”Ａｎｃｈｏｒ”）及び参照化合物オクトレオチド及びワルファリンによる血漿タンパク質結合。
【図２３】Ｆｉｇ．２３：  ＨＰＬＣ及びＭＳ／ＭＳにより測定した、ヒト血漿及びマウス肝臓ミクロソームにおける２重リガンド１（”Ｂｉｌｉｇ１−ｒｐｌｉｒ”）、２重リガンド２（”Ｂｉｌｉｇ２−Ｉｆｒｅｗ”）、２重リガンド３（”Ｂｉｌｉｇ３−ｆｓｒｋｔｅ”）、２重リガンドのアンカーリガンド（”Ａｎｃｈｏｒ”）及び参照化合物オクトレオチド、プロパンテリン及びプロパノロールの安定性。
【図２４】Ｆｉｇ．２４：  ３重リガンド２の４量体形態を製造する方法。
【図２５】Ｆｉｇ．２５：  ストレプトアビジン台上で２官能性（ＤＯＴＡ−及びビオチン−コンジュゲート）３重リガンド２をアセンブルすることにより３重リガンド２のＤＯＴＡ−標識４量体を製造する方法。
【図２６】Ｆｉｇ．２６：  ２官能性（ＤＯＴＡ−及びビオチン−コンジュゲート）３重リガンド２の構造。
【図２７】Ｆｉｇ．２７：  加工したストレプトアビジン台の化学修飾を使用アセンブルすることによる３重リガンド２のＤＯＴＡ−標識４量体を製造する方法。
【図２８】Ｆｉｇ．２８：  ビオチン−コンジュゲート３重リガンド２の構造。
【図２９】Ｆｉｇ．２９：  アミド結合形成を介して多量体捕捉剤を製造する方法。
【図３０】Ｆｉｇ．３０：  アミド結合形成により製造した３重リガンド２ホモ２量体の構造。
【図３１】Ｆｉｇ．３１：  ＣｕＡＡＣを介して多量体捕捉剤を製造する方法。
【図３２】Ｆｉｇ．３２：  ＣｕＡＡＣにより製造した３重リガンド２ホモ２量体の構造。
【図３３】Ｆｉｇ．３３：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ３重リガンド２／３重リガンド３ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｊｏｉｎｅｄｖｉａＣｕＡＡＣ．
【図３４】Ｆｉｇ．３４：  Ｘ−３重リガンド２（式中ＸはＡｃ、ビオチン−ＰＥＧ、ＤＯＴＡ−ＰＥＧ等である）の構造。
【図３５】Ｆｉｇ．３５：  ＰＥＧ化３重リガンド２の合成。
【図３６】Ｆｉｇ．３６：  ＰＥＧ化３重リガンド２の合成。
【図３７】Ｆｉｇ．３７：  多量体３重リガンド２の合成。
【図３８】Ｆｉｇ．３８：  多量体３重リガンド２の合成（ホモ４量体）。
【図３９】Ｆｉｇ．３９：  競合ＥＬＩＳＡで測定した、修飾Ｃ−末端３重リガンド２による、ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦ１６５結合の阻害。
【図４０】Ｆｉｇ．４０：  競合ＥＬＩＳＡで測定した、多量体３重リガンド２による、ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦ１６５結合の阻害。
【図４１】Ｆｉｇ．４１：  多量体３重リガンド２の結合親和性。
【図４２】Ｆｉｇ．４２：  ＶＥＧＦプルダウンアッセイによる３重リガンド修飾の比較。Ｌ：  分子量ラダー（ＭＷｌａｄｄｅｒ）；  １Ｂ／Ｓ：  ３重リガンド２−ＮＨ２；  ２Ｂ／Ｓ：  ３重リガンド２−ＯＨ；  ３Ｂ／Ｓ：  ３重リガンド２−ＰＥＧ４０ＫＤ；  ４Ｂ／Ｓ：  ３重リガンド  ２−分枝ＰＥＧ４０ＫＤ；  Ｃ：  ＶＥＧＦコントロール（５０ｎｇ）。
【図４３】Ｆｉｇ．４３：  ＶＥＧＦプルダウンアッセイによる３重リガンド修飾の比較。Ｌ：  分子量ラダー；  １Ｂ／Ｓ：  ３重リガンド２−ＮＨ２；２Ｂ／Ｓ：  ＰＥＧ２アーム−３重リガンド２（２量体）；３Ｂ／Ｓ：  ＰＥＧ４アーム−３重リガンド２（４量体）；Ｃ：  ＶＥＧＦコントロール（５０ｎｇ）。
【図４４Ａ】マウス１００９についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．４４Ａ：  最大値投映法（ＭＩＰｓ）。画像の固定パーセンタイル値に合わせて、画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。
【図４４Ｂ】マウス１００９についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．Ｂ：  トリミングしたＭＩＰｓ。画像の固定パーセンタイル値に合わせて、画像にガウスフィルターを（０．１００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。
【図４４Ｃ】マウス１００９についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．４４Ｃ：  トリミングした冠状（ｃｏｒｏｎａｌ）切片。画像にガウスフィルターを（０．１００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。
【図４４Ｄ】マウス１００９についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．４４Ｄ：  ３Ｄ  ＲＯＩ  Ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏＱｕａｎｔ（登録商標）を使用して、抽出した腫瘍。左の主要は赤、右の腫瘍は緑である。
【図４４Ｅ】マウス１００９についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．４４Ｅ：  抽出腫瘍のＭＩＰ。２４０分において、カラースケール最小（黒）は０で、カラースケール最大（白）は３．９ｘ１０−５μＣｉであった。１２００分において、カラースケール最小（黒）は０で、カラースケール最大（白）は１．６３ｘ１０−５μＣｉ（同位体崩壊について補正）であった。
【図４５Ａ】マウス１０１０についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．４５Ａ：  最大値投映法（ＭＩＰｓ）。画像の固定パーセンタイル値に合わせて、画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。
【図４５Ｂ】マウス１０１０についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．４５Ｂ：  トリミングしたＭＩＰｓ。画像の固定パーセンタイル値に合わせて、画像にガウスフィルターを（０．１００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。
【図４５Ｃ】マウス１０１０についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．４５Ｃ：  トリミングした冠状（ｃｏｒｏｎａｌ）切片。画像にガウスフィルターを（０．１００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。
【図４５Ｄ】マウス１０１０についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．４５Ｄ：  ３Ｄ  ＲＯＩ  Ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏＱｕａｎｔ（登録商標）を使用して、抽出した腫瘍。左の主要は赤、右の腫瘍は緑である。
【図４５Ｅ】マウス１０１０についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．４５Ｅ．  抽出腫瘍のＭＩＰ。２４０分において、カラースケール最小（黒）は０で、カラースケール最大（白）は３．９ｘ１０−５μＣｉであった。１２００分において、カラースケール最小（黒）は０で、カラースケール最大（白）は１．６３ｘ１０−５μＣｉ（同位体崩壊について補正）であった。
【図４６Ａ】マウス１０１１についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．４６Ａ：  最大値投映法（ＭＩＰｓ）。画像の固定パーセンタイル値に合わせて、画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。
【図４６Ｂ】マウス１０１１についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．４６Ｂ：  トリミングしたＭＩＰｓ。画像の固定パーセンタイル値に合わせて、画像にガウスフィルターを（０．１００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。
【図４６Ｃ】マウス１０１１についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．４６Ｃ：  トリミングした冠状（ｃｏｒｏｎａｌ）切片。画像にガウスフィルターを（０．１００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。
【図４６Ｄ】マウス１０１１についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．４６Ｄ：  ３Ｄ  ＲＯＩ  Ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏＱｕａｎｔ（登録商標）を使用して、抽出した腫瘍。左の主要は赤、右の腫瘍は緑である。
【図４６Ｅ】マウス１０１１についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．４６Ｅ．  抽出腫瘍のＭＩＰ。２４０分において、カラースケール最小（黒）は０で、カラースケール最大（白）は３．９ｘ１０−５μＣｉであった。１２００分において、カラースケール最小（黒）は０で、カラースケール最大（白）は１．６３ｘ１０−５μＣｉ（同位体崩壊について補正）であった。
【図４７Ａ】マウス１０１２についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．４７Ａ：  最大値投映法（ＭＩＰｓ）。画像の固定パーセンタイル値に合わせて、画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。
【図４７Ｂ】マウス１０１２についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．４７Ｂ：  トリミングしたＭＩＰｓ。画像の固定パーセンタイル値に合わせて、画像にガウスフィルターを（０．１００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。
【図４７Ｃ】マウス１０１２についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．４７Ｃ：  トリミングした冠状（ｃｏｒｏｎａｌ）切片。画像にガウスフィルターを（０．１００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。
【図４７Ｄ】マウス１０１２についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．４７Ｄ：  ３Ｄ  ＲＯＩ  Ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏＱｕａｎｔ（登録商標）を使用して、抽出した腫瘍。左の主要は赤、右の腫瘍は緑である。
【図４７Ｅ】マウス１０１２についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．４７Ｅ．  抽出腫瘍のＭＩＰ。２４０分において、カラースケール最小（黒）は０で、カラースケール最大（白）は３．９ｘ１０−５μＣｉであった。１２００分において、カラースケール最小（黒）は０で、カラースケール最大（白）は１．６３ｘ１０−５μＣｉ（同位体崩壊について補正）であった。
【図４８Ａ】マウス１０１２についての生体分布結果。Ｆｉｇ．４８Ａ：  トリミングした冠状切片。左＝ＨＴ２９、右ＭＳＴＯ−２１１Ｈ。固定最大値に合わせて、画像にガウスフィルターを（０．１００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。
【図４８Ｂ】マウス１０１２についての生体分布結果。Ｆｉｇ．４８Ｂ：  トリミングした環状切片。左＝ＨＴ２９、右ＭＳＴＯ−２１１Ｈ。崩壊修正した固定最大値に合わせて、画像にガウスフィルターを（０．１００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。
【図４９】マウス１００４についての生体分布結果。Ｆｉｇ．４９Ａ：  トリミングした冠状切片。左＝ＨＴ２９、右ＭＳＴＯ−２１１Ｈ。固定最大値に合わせて、画像にガウスフィルターを（０．１００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。
【図４９Ｂ】マウス１００４についての生体分布結果。Ｆｉｇ．４９Ｂ：  トリミングした環状切片。左＝ＨＴ２９、右ＭＳＴＯ−２１１Ｈ。崩壊修正した固定最大値に合わせて、画像にガウスフィルターを（０．１００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。
【図５０】Ｆｉｇ．５０：  ＨＲＰ−コンジュゲートストレプトアビジン台上でビオチン化３重リガンド２をアセンブルすることにより３重リガンド２からホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識４量体を製造する方法。
【図５１】Ｆｉｇ．５１：  マウス１１１４Ｒの生体分布結果。左＝ＨＴ２９。結果は同位体崩壊について修正した。
【図５２】Ｆｉｇ．５２：  マウス１０１７の生体分布結果。左＝ＨＴ２９。結果は同位体崩壊について修正した。
【図５３】Ｆｉｇ．５３：  マウス１０２２の生体分布結果。左＝ＨＴ２９。結果は同位体崩壊について修正した。
【図５４】Ｆｉｇ．５４：  マウス１０１３、１０１５、１０１６、及び１１１４Ｒ（コントロール）及びＶＥＧＦ３重リガンド投与後２０時間における１０２１乃至１０２４（４８時間Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）ブロック）についての生体分布結果。左＝ＨＴ２９。結果は同位体崩壊について修正した。
【図５５】Ｆｉｇ．５５：実施例１８における心臓組織サンプルに対する腫瘍について３重リガンド生体分布の結果。
【図５６】Ｆｉｇ．５６：  実施例１８における腫瘍組織におけるＶＥＧＦ３重リガンド取り込みの減少。
【図５７】Ｆｉｇ．５７：  マウス１００９及び１０１１（コントロール）及びＶＥＧＦ３重リガンド投与後２０時間における１０１０及び１０１２（２４時間Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）ブロック）についての生体分布結果。左＝ＨＴ２９、右＝ＭＳＴＯ−２１１Ｈ。
【図５８Ａ】マウス１０１３についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．５８Ａ：  腎臓最大値投映法（ＭＩＰｓ）。画像の固定パーセンタイル値に合わせて、画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図５８Ｂ】マウス１０１３についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．５８Ｂ：  腫瘍トリミングしたＭＩＰｓ。画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図５８Ｃ】マウス１０１３についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．５８Ｃ：  腫瘍トリミングした冠状切片。画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図５８Ｄ】マウス１０１３についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．５８Ｄ：  ３Ｄ  ＲＯＩ  Ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏＱｕａｎｔ（登録商標）を使用して、抽出した腫瘍。画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図５８Ｅ】マウス１０１３についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．５８Ｅ．  ３Ｄ  ＲＯＩ  Ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏＱｕａｎｔ（登録商標）を使用する、抽出腫瘍のＭＩＰ。画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図５９Ａ】マウス１０１４についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．５９Ａ：  腎臓最大値投映法（ＭＩＰｓ）。画像の固定パーセンタイル値に合わせて、画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図５９Ｂ】マウス１０１４についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．５９Ｂ：  腫瘍トリミングしたＭＩＰｓ。画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図５９Ｃ】マウス１０１４についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．５９Ｃ：  腫瘍トリミングした冠状切片。画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図５９Ｄ】マウス１０１４についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．５９Ｄ：  ３Ｄ  ＲＯＩ  Ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏＱｕａｎｔ（登録商標）を使用して、抽出した腫瘍。画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図５９Ｅ】マウス１０１４についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．５９Ｅ．  ３Ｄ  ＲＯＩ  Ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏＱｕａｎｔ（登録商標）を使用する、抽出腫瘍のＭＩＰ。画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図６０Ａ】マウス１０１７についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．６０Ａ：  腎臓最大値投映法（ＭＩＰｓ）。画像の固定パーセンタイル値に合わせて、画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図６０Ｂ】マウス１０１７についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．６０Ｂ：  腫瘍トリミングしたＭＩＰｓ。画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図６０Ｃ】マウス１０１７についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．６０Ｃ：  腫瘍トリミングした冠状切片。画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図６０Ｄ】マウス１０１７についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．６０Ｄ：  ３Ｄ  ＲＯＩ  Ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏＱｕａｎｔ（登録商標）を使用して、抽出した腫瘍。画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図６０Ｅ】マウス１０１７についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．６０Ｅ．  ３Ｄ  ＲＯＩ  Ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏＱｕａｎｔ（登録商標）を使用する、抽出腫瘍のＭＩＰ。画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図６１Ａ】マウス１０１８についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．６１Ａ：  腎臓最大値投映法（ＭＩＰｓ）。画像の固定パーセンタイル値に合わせて、画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図６１Ｂ】マウス１０１８についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．６１Ｂ：  腫瘍トリミングしたＭＩＰｓ。画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図６１Ｃ】マウス１０１８についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．６１Ｃ：  腫瘍トリミングした冠状切片。画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図６１Ｄ】マウス１０１８についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．６１Ｄ：  ３Ｄ  ＲＯＩ  Ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏＱｕａｎｔ（登録商標）を使用して、抽出した腫瘍。画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図６１Ｅ】マウス１０１８についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．６１Ｅ．  ３Ｄ  ＲＯＩ  Ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏＱｕａｎｔ（登録商標）を使用する、抽出腫瘍のＭＩＰ。画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図６２Ａ】マウス１０２１についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．６２Ａ：  腎臓最大値投映法（ＭＩＰｓ）。画像の固定パーセンタイル値に合わせて、画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図６２Ｂ】マウス１０２１についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．６２Ｂ：  腫瘍トリミングしたＭＩＰｓ。画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図６２Ｃ】マウス１０２１についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．６２Ｃ：  腫瘍トリミングした冠状切片。画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図６２Ｄ】マウス１０２１についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．６２Ｄ：  ３Ｄ  ＲＯＩ  Ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏＱｕａｎｔ（登録商標）を使用して、抽出した腫瘍。画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図６２Ｅ】マウス１０２１についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．６２Ｅ．  ３Ｄ  ＲＯＩ  Ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏＱｕａｎｔ（登録商標）を使用する、抽出腫瘍のＭＩＰ。画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図６３Ａ】マウス１０２２についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．６３Ａ：  腎臓最大値投映法（ＭＩＰｓ）。画像の固定パーセンタイル値に合わせて、画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図６３Ｂ】マウス１０２２についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．６３Ｂ：  腫瘍トリミングしたＭＩＰｓ。画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図６３Ｃ】マウス１０２２についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．６３Ｃ：  腫瘍トリミングした冠状切片。画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図６３Ｄ】マウス１０２２についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．６３Ｄ：  ３Ｄ  ＲＯＩ  Ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏＱｕａｎｔ（登録商標）を使用して、抽出した腫瘍。画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図６３Ｅ】マウス１０２２についての生体分布研究結果。Ｆｉｇ．６３Ｅ．  ３Ｄ  ＲＯＩ  Ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏＱｕａｎｔ（登録商標）を使用する、抽出腫瘍のＭＩＰ。画像にガウスフィルターを（０．２００ｍｍ  ＦＷＨＭ）を適用した。カラースケール最大は同位体崩壊について補正。
【図６４】Ｆｉｇ．６４：  マウス単一静脈内（ＩＶ）もしくは腹腔内（ＩＰ）投与後の、ＶＥＧＦ−ＰＣＣの平均（±ＳＤ）血漿濃度（ｎｇ／ｍＬ）。
【図６５】Ｆｉｇ．６５：  保護１，４−トリアゾールジペプチドを得るため、完全保護アルキン含有アミノ酸と完全保護アジド含有アミノ酸との間で、銅触媒を用いるアジドとアルキンとの環化付加反応（ＣｕＡＡＣ）。
【図６６Ａ】（Ｆｉｇ．６６Ａ）  包括的ライブラリによる２重リガンドスクリーンから得られたヒット配列。
【図６６Ｂ】（Ｆｉｇ．６６Ｂ）  アンカー（赤）及び選択された２次リガンド（青）を説明する２重リガンド構造。これらの配列は、上から下へ読み取るＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、２、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、３、２０及び２１である。
【図６７】Ｆｉｇ．６７：  抗ＶＥＧＦ  ＰＣＣ２重リガンド候補対アンカーの親和性。ＶＥＧＦ１６５ＡをＮＵＮＣ  ＭａｘｉＳｏｒｐプレートに固定化し、様々な濃度のビオチン化ペプチドとインキュベートした。全ての値を、飽和において観察された結合に正規化した。
【図６８】Ｆｉｇ．６８：  抗ＶＥＧＦ  ＰＣＣ２重リガンド候補対アンカーによる、バッファー及びヒト血清からの免疫沈降。ビオチン化リガンドを、ＰＢＳｐＨ７．４（Ｐ）中もしくは２５％（ｖ／ｖ）ヒト血清（Ｓ）中の０．５μｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦ１６５Ａとともに１６時間４℃でインキュベートし、その後、ＤｙｎａＢｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジンを３時間４℃で添加した。ビーズを徹底的に洗い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーで溶出し、コントロール（５０ｎｇＶＥＧＦ）と比較するウエスタンブロットによりＶＥＧＦ１６５Ａについて分析した。
【図６９Ａ】Ｆｉｇ．６９Ａ：  包括的ライブラリを有する３重リガンドスクリーンから得られたヒット配列。これらの配列は、３つの欄にわたり上から下へ及び左から右へ読み取るＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、２３、２４、２５、７、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５、４８、４９、５０、６、５１、５２、５３、８、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３及び６４である。
【図６９Ｂ】（図６９Ｂ）アンカー（赤）、２次リガンド（青）及び選択された３次リガンド（緑）を説明する３重リガンド構造。
【図７０】Ｆｉｇ．７０：  抗ＶＥＧＦ  ＰＣＣ３重リガンド候補の親和性。ＶＥＧＦ１６５ＡをＮＵＮＣ  ＭａｘｉＳｏｒｐプレートに固定化し、様々な濃度のビオチン化ＰＣＣもしくはベバシズマブ（ｍＡｂもしくはＦａｂ）とインキュベートした。全ての値を、飽和において観察された結合に正規化した。
【図７１】Ｆｉｇ．７１：  抗ＶＥＧＦ  ＰＣＣ３重リガンド候補による、バッファー及びヒト血清からの免疫沈降。ビオチン化リガンドを、ＰＢＳｐＨ７．４（Ｐ）中もしくは２５％（ｖ／ｖ）ヒト血清（Ｓ）中の０．５μｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦ１６５Ａとともに１６時間４℃でインキュベートし、その後、ＤｙｎａＢｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジンを３時間４℃で添加した。ビーズを徹底的に洗い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーで溶出し、コントロール（５０ｎｇＶＥＧＦ）と比較するウエスタンブロットによりＶＥＧＦ１６５Ａについて分析した。
【図７２】Ｆｉｇ．７２：  抗ＶＥＧＦ  ＰＣＣ３重リガンド候補による、ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦ結合の阻害。ＰＣＣもしくはベバシズマブＦａｂの段階希釈物の存在下、ＶＥＧＦＲ２被覆ウェルへのビオチン化ＶＥＧＦ１６５Ａ結合を測定することにより、受容体ブロック活性をスクリーンした。
【図７３】Ｆｉｇ．７３：  銀染色ゲル視覚化全免疫沈降タンパク質。ビオチン化リガンドを、ＰＢＳｐＨ７．４（Ｐ）中もしくは２５％（ｖ／ｖ）ヒト血清（Ｓ）中の０．５μｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦ１６５Ａとともに１６時間４℃でインキュベートし、その後、ＤｙｎａＢｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジンを３時間４℃で添加した。ビーズを徹底的に洗い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーで溶出し、銀染色を有するＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％ゲル）により分析した。
【図７４】Ｆｉｇ．７４：  腹腔内注入後のＨＴ−２９異種移植片を有するヌードマウスにおける６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−３重リガンドの組織分布。％ＩＤ／ｇを、注入後４及び２０時間で得られたマイクロＰＥＴ画像から算出した。ヒトＶＥＧＦ−Ａをブロックするため、６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−３重リガンドの前４８時間、非標識化ベバシズマブ（１ｍｇ）を静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。データは、時点ごと４匹のマウスの平均レベル±ＳＤを示す。
【図７５】Ｆｉｇ．７５：  マウス血漿におけるＩＮ−ＶＴ−１００１の代表的クロマトグラム。動物番号２７（ＩＰ），１２０分。
【図７６】Ｆｉｇ．７６：  ３重リガンドのＣ末端と、ホモ４量体の形成で得られる４−アームＰＥＧ誘導体（ＭＷ４０，０００；Ｊｅｎｋｅｍ＃４ＡＲＭ−ＮＨ２−４０Ｋ）との反応スキーム。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
発明の詳細な説明
本発明についての以下の記載は、単に本発明の様々な実施形態を説明することを意図している。検討された具体的修正それ自体は、本発明の範囲における限定の意味にとるべきではない。当業者には明らかなことであるが、本発明の範囲から逸脱しない様々な同等物、変更及び改良がなされてよく、当然のことながらそのような同等実施形態はここに含まれるという。
略語：
ＡＭＤ：  加齢黄斑変性；  
Ａｚ４：  ６−アジド−Ｌ−ノルロイシン；  
ＣｕＡＡＣ：  銅触媒を用いるアジドとアルキンとの環化付加反応；  
ＤＩＥＡ：  Ｎ−ヒドロキシ−７−アザ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ），  もしくはジイソプロピルエチルアミン；
ＨＡＴＵ：  Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート；
ＨＢＴＵ：  Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−ホスファート；
ＮＭＰ：  １−メチル−２−ピロリジノン；  
ＯＢＯＣ：  １ビーズ−１化合物；  
ＴＩＳ：  トリイソプロピルシラン；  
ＴＦＡ：  トリフルオロ酢酸；
Ｔｚ４：  １，４−二置換１，２，３−トリアゾール；
ＶＥＧＦ：  血管内皮細胞増殖因子；
ＶＥＧＦＲ：  血管内皮細胞増殖因子受容体。
定義
ここで使用する用語「捕捉剤」は、１個以上の標的結合部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を有するタンパク質触媒捕捉（ＰＰＣ）剤を意味し、当該捕捉剤はこれら標的結合部分を介して標的タンパク質に特異的に結合する。各標的結合部分は、個別にもしくは他の標的結合部分との組み合わせのいずれかで、標的タンパク質について結合親和性を示す。ある実施形態において、各標的結合部分は、１個以上の非共有結合的相互作用（例えば水素結合、疎水性相互作用及びファンデルワールス相互作用を包含する）を介して標的タンパク質に結合する。捕捉剤は、例えばポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド及び他の非重合性分子を包含する１個以上の有機分子を有してよい。
【００４３】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを有するアミノ酸配列を意味するようにここでは交互に使用される。これらの用語は、アミノ酸ポリマー（ここでの１個以上のアミノ酸残基は対応する天然アミノ酸の人為的化学的模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃ）である）、並びに天然アミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーに適用される。
【００４４】
用語「アミノ酸」は、天然及び合成アミノ酸、並びに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸模倣物、及びその異性体を意味する。天然アミノ酸は、遺伝子コードによりコードされているもの、並びに後で修飾したこれらのアミノ酸であり、例えばヒドロキシプロリン、カルボキシグルタメート、Ｏ−ホスホセリン及びこれらの異性体である。用語「アミノ酸アナログ」は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物を意味し（すなわちここでは炭素は水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合される）、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムである。このようなアナログは修飾Ｒ基（例えばノルロイシン）もしくは修飾ペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を維持する。用語「アミノ酸模倣物」は、アミノ酸の一般的化学構造と異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化学化合物を意味する。アミノ酸は、ここでは普通に知られる３文字記号、もしくはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会が推奨する１文字記号のいずれかにより、ここでは参照されてよい。
【００４５】
ここで使用される用語「非天然アミノ酸」は、２０個の天然アミノ酸
(アラニン、アルギニン、グリシン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、セリン、トレオニン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン)とはその側鎖官能基において異なるアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸は、２０個の天然アミノ酸の１種の近似アナログであり得、当該非天然アミノ酸の疎水性が天然アミノ酸の疎水性と同等以上である限り、全く新規な官能性及び化学を導入可能である。非天然アミノ酸はタンパク質における現存するアミノ酸に置き換わること（置換）も、野生型配列への追加となること（挿入）も可能である。非天然アミノ酸の取り込みは、固相ペプチド合成もしくはネイティブ・ケミカル・リゲーションを包含する周知の化学的方法又は生物学的方法により達成可能である。
【００４６】
ここで使用される用語「特異的結合」「選択的結合」、「選択的に結合する」もしくは「特異的に結合する」は、結合剤のランダムではない結合例えば所定の抗原におけるエピトープへの捕捉剤の結合、を意味する。典型的には結合剤は親和性（ＫＤ）約１０−１Ｍ未満、例えば約１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍもしくは１０−１０Ｍもしくはさらにそれ以下で結合する。
【００４７】
ここで使用される用語「ＫＤ」は、捕捉剤のような結合剤とその抗原との間での特有の相互作用の解離平衡定数を意味する。例えばリガンドとしての抗原、分析物としての捕捉剤を使用するＢｉａｃｏｒｅの装置の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して決定されたように、典型的には本発明の捕捉剤はＶＥＧＦに解離平衡定数（ＫＤ）約１０−１Ｍ未満、例えば約１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍもしくは１０−１０Ｍもしくはさらにそれ以下で結合し、且つ所定の抗原もしくは密接な関係がある抗原以外の非特異的抗原（例えばＢＳＡ、カゼイン）についてのその親和性よりも少なくとも１０倍低い、例えば少なくとも１００倍低い、例えば少なくとも１，０００倍低い、例えば少なくとも１０，０００倍低い、例えば少なくとも１００，０００倍低いＫＤに対応する親和性で所定の抗原に結合する。低親和性のその量は、捕捉剤のＫＤに依存し、その結果捕捉剤のＫＤがきわめて低いとき（即ち捕捉剤が高特異的である）、抗原に関する親和性が非特異性抗原に関する親和性よりも低いその量は、少なくとも１０，０００倍であり得る。
【００４８】
ここで使用される用語「ｋｄ」（ｓｅｃ’）は、特有の結合剤−抗原相互作用の解離速度定数を意味する。前記値はｋｏｆｆ値ともいう。
【００４９】
ここで使用される用語「ｋａ」（Ｍ−’ｘｓｅｃ’）は、特有の結合剤−抗原相互作用の会合速度定数を意味する。
【００５０】
ここで使用される用語「ＫＤ」（Ｍ）は、特有の結合剤−抗原相互作用の解離平衡定数を意味する。
【００５１】
ここで使用される用語「ＫＡ」（Ｍ−’）、特有の結合剤−抗原相互作用の会合平衡定数を意味し、ｋａをｋｄで割ることにより得られる。
【００５２】
ここで使用される用語「状態」（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）は、通常は疾患、イベントもしくは健康状態の変化を意味する。健康状態の変化は特有の疾患もしくはイベントに関連し得るのであって、そのような場合該変化は疾患もしくはイベントと同時もしくはそれより先に生じる。健康状態の変化が疾患もしくはイベントより先に生じる場合、該健康状態の変化は疾患もしくはイベントの前兆として利用得る。例えば、健康状態の変化は、疾患もしくはイベントと関連した特定の遺伝子の発現レベルにおける改変であり得る。あるいは、健康状態の変化は特定の疾患もしくはイベントと関連しなくともよい。
【００５３】
ある状態に関してここで使用される用語「ｔｒｅａｔ」、「ｔｒｅａｔｉｎｇ」、もしくは「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」は、該状態を予防すること；状態の開始、発生もしくは展開速度を遅らせること；状態を展開するもしくは経験するリスクを減ずること；状態に関連する症状の展開を予防もしくは遅らせること；状態に関連する症状を永続的にもしくは一時的に減ずるもしくは終わらせること；状態の重篤さを和らげること；もしくはこれらのいくつかの組み合わせを意味する。
【００５４】
ここで使用される「治療的に有効な量」は、所望の治療結果を達成するために必要な投与量及び期間における効果的な量を意味する。治療的に有効な量は、様々な因子、例えば疾患の状態、年齢、性及び固体の体重、及び固体における所望の応答を引き出す捕捉剤の能力により変化する。
【００５５】
ここで使用される用語「血管内皮細胞増殖因子」もしくは「ＶＥＧＦ」は、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６を包含するＶＥＧＦ−Ａのいずれのスプライシング・アイソフォームもしくはその一部、例えばエピトープを意味する。
【００５６】
ここで使用される用語「抗体」は、抗原による刺激の後で活性化Ｂ細胞により産生され、生物学的システムにおける免疫応答を促進する抗原に特異的に結合可能である種類のタンパク質を意味する。完全抗体は典型的には、重鎖２本及び軽鎖２本を包含する４個のサブユニットからなる。用語「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体もしくはこれらのフラグメントを包含する（ただしこれらに限定されない）天然及び合成抗体を包含する。典型的な抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＭ及びその他を包含する。典型的なフラグメントは、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びその他を包含する。モノクローナル抗体は、「エピトープ」と称する別の生体分子の単一で特有の空間的及び極性の組織に特異的に結合し、それにより相補的であると定義される抗体である。いくつかの形態において、モノクローナル抗体は同じ構造をも有し得る。ポリクローナル抗体は様々なモノクローナル抗体の混合物を意味する。いくつかの形態において、ポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体少なくとも２個が異なる抗原エピトープに結合しているモノクローナル抗体の混合物であり得る。異なる抗原エピトープは、同じ標的、異なる標的もしくは組み合わせ上に存在してよい。抗体は、当該技術において周知であるテクニック、例えばホスト及び血清の採集の免疫処理（ポリクローナル）により、又は継続的ハイブリドーマ細胞株を調製し、分泌タンパク質を採集することにより（モノクローナル）、調製可能である
捕捉剤もしくはその医薬製剤に関してここで使用される用語「安定」は、ここに記載された方法において有用であるのに十分な期間、その捕捉剤もしくは医薬製剤が構造的及び機能的に完全な状態を維持することを意味する。
【００５７】
捕捉剤に関してここで使用される用語「合成」は、捕捉剤が生物学的手段ではなく化学的に生成されたことを意味する。合成捕捉剤は、構造面を決定する生物情報学分析ツールを使用して特異的に設計される。アンカーリガンドは、固有の特性に基づき潜在的アンカーリガンドのプールから選択される。
【００５８】
特に明示しない限り、ここで定義される配列相同性／類似性の値は、デフォルトパラメータを使用するプログラムパッケージＢＬＡＳＴ２．０を使用して得られた値である（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−４０２）。
【００５９】
普通の当業者ならばわかることであるが、ＢＬＡＳＴサーチは、タンパク質はランダム配列としてモジュール化可能であると想定している。しかしながら、多くの実際のタンパク質はランダムではない配列の領域を有しており、当該配列はホモポリマー区域、短期間繰り返しもしくは１位個以上のアミノ酸に富む領域であってよい。タンパク質の他の領域は全くに類似していないにも関わらず、このような低複雑性領域は非関連タンパク質の間に整列化されてよい。このような低複雑性アライメントを減らすため、いくつかの低複雑性フィルタプログラムが利用可能である。例えばＳＥＧ（Ｗｏｏｔｅｎ及びＦｅｄｅｒｈｅｎ，  （１９９３）  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｃｈｅｍ．  １７：１４９−６３）及びＸＮＵ（Ｃｌａｖｅｒｉｅ及びＳｔａｔｅｓ，  （１９９３）  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｃｈｅｍ．  １７：１９１−２０１）低複雑性フィルタを単独もしくは組み合わせて利用可能である。
【００６０】
ここで使用される、２個の核酸もしくはペプチド配列という状況における「配列相同性」もしくは「相同性」は、２個の配列（特定比較ウィンドウにおいて最大の対応に関して整列されるとき、当該配列は同一である）における残基を意味することを包含する。配列相同性の百分率がタンパク質に関して使用されるとき、同一でない残基位置がしばしば保守的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）アミノ酸置換によって異なることが認められる。ここではアミノ酸残基は同様の化学特性（例えば電荷もしくは疎水性）を有する他のアミノ酸残基に置き換わり、従って分子の官能特性を変更しない。配列が保守的置換において異なる場合、置換の保守的性質を矯正するため％配列相同性を上向きに調整してよい。このような保守的置換により異なる配列は、「配列類似性」もしくは「類似性」を有するといわれる。この調節をするための手段は、当業者に周知である。典型知己にはこれは、保守的置換を完全なミスマッチとしてではなく部分的なものとしてスコアし、それにより％配列相同性が増加することを伴う。よって例えば、相同性アミノ酸がスコア１で非保守的置換がスコア０であるとき、保守的置換はスコア０乃至１である。保守的置換のスコアリングは、例えばＭｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，  （１９８８）  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｓｃｉ．  ４：１１−１７のアルゴリズムに従い、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  Ｃａｌｉｆ．，  ＵＳＡ）において実行されるように算出される。
【００６１】
ここで使用されるような「配列相同性の百分率」は、比較ウィンドウに最適に整列した配列２個を比較することにより決定される値を意味する。ここで比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は、２個の配列の最適アライメントに関するリファレンス配列（これは追加も削除を有しない）と比較して、追加もしくは削除（即ちギャップ）を有してよい。百分率は、適合した位置の数をもたらすため両配列において相同核酸塩基もしくはアミノ酸残基が発生する位置の数を決定し、適合した位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数で割り、配列相同性の百分率をもたらすためその結果を１００倍することにより算出される。
【００６２】
用語ポリヌクレオチド配列の「実質的相同性」は、ポリヌクレオチドが、標準パラメータを使用する記載のアライメントプログラムの一つを使用してリファレンス配列と比較した、５０乃至１００％配列相同性、好ましくは少なくとも５０％配列相同性、好ましくは少なくとも６０％配列相同性、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％及び最も好ましくは少なくとも９５％を有する配列を有することを意味する。熟練者にはわかることであるが、２個のヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質の対応する相同性を決定するために、コドンの縮退、アミノ酸類似性、読み取り枠位置決めその他を考慮することにより、これらの値は適切に調節可能である。これらの目的に関してアミノ酸配列の実質的相同性は、通常５５乃至１００％，好ましくは少なくとも５５％，好ましくは少なくとも６０％，より好ましくは少なくとも７０％，８０％，９０％及び最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を意味する。
ＶＥＧＦの開発：
ｉｎ  ｓｉｔｕクリックケミストリー（Ｍａｎｅｔｓｃｈ  ２００４；  Ｍｏｃｈａｒｌａ  ２００４；  Ｗｈｉｔｉｎｇ  ２００６）は、小分子酵素阻害剤が２個の部分に分離し、該２個のそれぞれは次いで小さなライブラリに発展するテクニック（一方のライブラリはアセチレン官能基を含み、他方はアジド基を含む）である。次いで酵素それ自体は、トリアゾール結合を形成するためアセチレンとアジド基との間の１，３−双極性環付加反応を選択的に促進することにより（「クリック」反応）、これらライブラリ成分から「最良適合（ｂｅｓｔ  ｆｉｔ）」阻害剤を構築する。酵素は、正しい配向でタンパク質に結合するこれらライブラリ成分間でだけクリック反応を促進する。得られる阻害剤は、２個のライブラリの基礎を形成した最初の阻害剤に比例して、はるかに優れた親和性特徴を示し得る（Ｊｅｎｃｋｓ  １９８１；  Ｍｕｒｒａｙ  ２００２）。
【００６３】
連続的ｉｎ  ｓｉｔｕクリックケミストリーは、多重リガンド（ｍｕｌｔｉｌｉｇａｎｄ）捕捉剤を発見可能にするためのｉｎ  ｓｉｔｕクリックケミストリーコンセプトを拡張する。このプロセスは、モデルタンパク質炭酸脱水素酵素ＩＩ（ＣＡＩＩ）に対する３重リガンド捕捉剤を生成するためにかつて使用されていた（Ａｇｎｅｗ  ２００９）。連続的ｉｎ  ｓｉｔｕクリックケミストリーはいくつかの利点を有する。第１に、タンパク質標的についての構造的情報は、きわめて大きな化学空間をサンプル化し、捕捉剤のリガンド成分を同定する能力に置き換わる。例えば、最初のリガンドは、大規模（＞１０６エレメント）１ビーズ−１化合物（ＯＢＯＣ）（Ｌａｍ  １９９１）ペプチドライブラリ（ここでペプチドは天然、非天然及び／又は人工アミノ酸からなってよい）に対するタンパク質スクリーニングにより同定されてよい。得られるアンカーリガンドは次いで、２重リガンドを同定するため大規模ＯＢＯＣライブラリを再び使用するｉｎ  ｓｉｔｕクリックスクリーンにおいて利用される。第２の利点は、３重リガンドを同定するためのアンカーとして２重リガンドが使用されるなどのため、プロセスが繰り返し可能であることである。比較的簡単な且つ大部分は自動化された化学反応を使用して、最終的捕捉剤はスケールアップ可能であり、またその構造に固有な一部としてビオチン基のようなラベルで開発可能である。このアプローチは、分岐、環状及び直鎖捕捉剤構造の探索を可能に知る。タンパク質指向多重リガンドアセンブリのための多くの方策が記載されてきたところ（Ｓｈｕｋｅｒ  １９９６；  Ｅｒｌａｎｓｏｎ  ２０００）、大多数はスクリーニング戦略をガイドするため標的における詳細な構造的情報を必要とし、大多数は（例えばオリジナルのｉｎ  ｓｉｔｕクリックアプローチ）低多様性小分子ライブラリのために最適化される。
【００６４】
ここに開示されているように、繰り返しｉｎ  ｓｉｔｕクリックケミストリーアプローチは、ＶＥＧＦを特異的に結合する２重リガンド及び３重リガンド捕捉剤を合成するために利用された。２重リガンド捕捉剤は、向上したＶＥＧＦ結合親和性及びそのアンカーリガンドに対する特異性示し、またＶＥＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦにより仲介されるＨＵＶＥＣ増殖を阻害する能力をも示した。３重リガンド捕捉剤は、ＶＥＧＦ結合親和性及び特性において、２重リガンドのそれを超える向上を示し、またＶＥＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦを阻害する能力をも示した。３重リガンドの３個はＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）との結合エピトープを共有することが分かった。全ての捕捉剤は、血清において高度の安定性を示した。捕捉剤の多量体も開発された。これら多量体捕捉剤のあるものは向上した親和性、特異性及び／又は効能を示す。
【００６５】
ここに開示された結果に基づき、本願発明は２重リガンド及び３重リガンドＶＥＧＦ捕捉剤及びこれらの多量体、並びにＶＥＧＦを同定、検出、定量及び分離するため及び増大したＶＥＧＦ発現及び／又は活性に関連した様々な状態を診断、分類及び治療するため、これらの捕捉剤を使用する方法を提供する。
ＶＥＧＦ捕捉剤：
ある実施形態においてここに規定されるのは、２個の標的結合部分を有する合成２重リガンドＶＥＧＦ捕捉剤である。第１の標的結合部分はアンカーリガンドと呼ばれ、第２のものは２次リガンドと呼ばれる。
【００６６】
ある実施形態においてここに規定されるのは、３個の標的結合部分を有する合成３重リガンドＶＥＧＦ捕捉剤である。第１の標的結合部分はアンカーリガンドと呼ばれ、第２のものは２次リガンドと呼ばれ、第３のものは３次リガンドと呼ばれる。
【００６７】
ある実施形態においてここに規定されるのは、ここに開示された２重リガンド及び／又は３重リガンドＶＥＧＦ捕捉剤の多量体である。ある実施形態においてこれら多量体捕捉剤は、ここに開示された２重リガンド及び／又は３重リガンドの二量体、三量体もしくは四量体を有する。ある実施形態において、多量体捕捉剤はホモ多量体（これは多量体の２重リガンド及び／又は３重リガンド成分全てが同一であることを意味する）である。他の実施形態において、多量体捕捉剤はヘテロ多量体（これは２種以上の異なる２重リガンド及び／又は３重リガンドを有することを意味する）である。
【００６８】
ある実施形態において、標的結合部分は１個以上のポリペプチドもしくはペプチドを有する。これらの実施形態のあるものにおいて、標的結合部分は、置換及び未置換アルキル、置換及び未置換アジド、置換及び未置換アルキニル、置換及び未置換ビオチニル、置換及び未置換アジドアルキル、置換及び未置換ポリエチレングリコール及び置換及び未置換１，２，３−トリアゾールからなるグループから選択される官能基で置換されたＤ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸、及び／又はアミノ酸を有する１個以上のペプチドを有する。
【００６９】
ある実施形態において、ここに規定される２重リガンド及び３重リガンド捕捉剤におけるアンカーリガンド及び２次リガンドは、共有結合を介して互いに結合している。同様にある実施形態において、ここに規定される３重リガンド捕捉剤における２次リガンド及び３次リガンドは、共有結合を介して互いに結合している。上記実施形態のあるものにおいて、共有結合はアミド結合もしくは下に示す１，４−二置換−１，２，３−トリアゾール結合である。
【００７０】
【化８】
2014531424.tif 000009
１，４−二置換−１，２，３−トリアゾール結合を介して１個以上の標的結合部分が互いに結合しているこれらの実施形態において、１，４−二置換−１，２，３−トリアゾール結合は銅触媒を用いるアジドとアルキンとの環化付加反応（ＣｕＡＡＣ）により形成されてよい。
【００７１】
ある実施形態において、アンカー及び２次リガンド及び／又は３次リガンドは、以下の構造を有するＴｚ４結合を介して互いに結合している。
【００７２】
【化９】
2014531424.tif 000010
アンカー、２次リガンド及び３次リガンド１個以上がアミド結合を介して互いに結合しているこれらの実施形態において、アミド結合はカップリング剤（例えばＯ−（７−アゾベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、Ｎ−ヒドロキシ−７−アザ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、もしくはＤＭＦ中のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ））の存在下カルボン酸基及びアミノ基をカップリングすることにより形成されてよい。
ここに規定される２重リガンド及び３重リガンド捕捉剤のある実施形態において、アンカーリガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に明らかなアミノ酸配列のフラグメントを有する。他の実施形態において、アンカーリガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に明らかなアミノ酸配列と８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは１００％一致するアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、アンカーリガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列のフラグメントを有する。ある実施形態において、このフラグメントは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７もしくは１８個のアミノ酸を含む。他の実施形態において、このフラグメントは５乃至１８、１０乃至１８、５乃至１５、７乃至１５、９乃至１５もしくは３乃至１６個のアミノ酸を含む。
【００７３】
ここに規定される２重リガンド及び３重リガンド捕捉剤のある実施形態において、アンカーリガンドはＦｉｇ．３もしくはＦｉｇ．４に明らかな構造を有する。
【００７４】
ここに規定される２重リガンド及び３重リガンド捕捉剤のある実施形態において、２次リガンドは式：  Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６を有する。ある実施形態において、Ｘ２はプラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸及び中性Ｄ−アミノ酸から選択される。他の実施形態において、Ｘ２はＤ−アルギニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−バリン、グリシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−イソロイシン及びＤ−アラニンから選択される。他の実施形態において、Ｘ３は中性Ｄ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸もしくはプラスに帯電したアミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ３はＤ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、グリシン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−リジン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−トリプトファン及びＤ−チロシンから選択される。他の実施形態において、Ｘ４は中性Ｄ−アミノ酸、プラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸及び極性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ４はＤ−イソロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トレオニン及びＤ−ヒスチジンから選択される。他の実施形態において、Ｘ５は中性Ｄ−アミノ酸、プラスに帯電したＤ−アミノ酸及びマイナスに帯電したＤ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ５はＤ−イソロイシン、グリシン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−リジン、Ｄ−グルタメート、Ｄ−ヒスチジン及びＤ−アルギニンから選択される。他の実施形態において、Ｘ６はプラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸、中性Ｄ−アミノ酸及び極性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ６はＤ−アルギニン、Ｄ−リジン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−バリン、グリシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−アラニン及びＤ−グルタミンから選択される。
【００７５】
ある実施形態において、Ｘ２はプラスに帯電したＤ−アミノ酸及び  芳香族Ｄ−アミノ酸から選択される。他の実施形態において、Ｘ２はＤ−アルギニン及びＤ−トリプトファンから選択される。他の実施形態において、Ｘ３は中性Ｄ−アミノ酸及び芳香族Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ３はＤ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン及びグリシンから選択される。他の実施形態において、Ｘ４は中性Ｄ−アミノ酸である。ある実施形態において、Ｘ４はＤ−イソロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−プロリン及びＤ−アラニンから選択される。他の実施形態において、Ｘ５は中性Ｄ−アミノ酸である。ある実施形態において、Ｘ５はＤ−イソロイシン、グリシン及びＤ−バリンから選択される。他の実施形態において、Ｘ６はプラスに帯電したＤ−アミノ酸である。ある実施形態において、Ｘ６はＤ−アルギニン及びＤ−リジンから選択される。
【００７６】
ある実施形態において、Ｘ２は中性Ｄ−アミノ酸である。他の実施形態において、Ｘ２はＤ−ロイシン、Ｄ−バリン、グリシン及びＤ−プロリンから選択される。他の実施形態において、Ｘ３はプラスに帯電したアミノ酸である。ある実施形態において、Ｘ３はＤ−アルギニン、Ｄ−リジン及びＤ−ヒスチジンから選択される。他の実施形態において、Ｘ４は中性Ｄ−アミノ酸、プラスに帯電したＤ−アミノ酸及び芳香族Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ４はＤ−プロリン、Ｄ−アルギニン及びＤ−フェニルアラニンから選択される。他の実施形態において、Ｘ５は中性Ｄ−アミノ酸及びプラスに帯電したＤ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ５はＤ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−アラニン、Ｄ−プロリン及びＤ−リジンから選択される。他の実施形態において、Ｘ６はプラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸及び中性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ６はＤ−アルギニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−プロリン及びＤ−バリンから選択される。
【００７７】
ある実施形態において、Ｘ２は中性Ｄ−アミノ酸である。他の実施形態において、Ｘ２はＤ−ロイシン、グリシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−イソロイシン及びＤ−アラニンから選択される。他の実施形態において、Ｘ３は芳香族Ｄ−アミノ酸である。ある実施形態において、Ｘ３はＤ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン及びＤ−チロシンから選択される。他の実施形態において、Ｘ４はプラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸及び極性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ４はＤ−アルギニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トレオニン及びＤ−ヒスチジンから選択される。他の実施形態において、Ｘ５は中性Ｄ−アミノ酸、プラスに帯電したＤ−アミノ酸及びマイナスに帯電したＤ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ５はグリシン、Ｄ−アラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタメート、Ｄ−ヒスチジン及びＤ−アルギニンから選択される。他の実施形態において、Ｘ６はプラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸、中性Ｄ−アミノ酸及び極性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ６はＤ−アルギニン、Ｄ−トリプトファン、グリシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−アラニン及びＤ−グルタミンから選択される。
【００７８】
他の実施形態において、２次リガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、４、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０及び２１から選択されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、２次リガンドはアミノ酸配列（該配列中において１個のアミノ酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、４、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０及び２１から選択されるアミノ酸配列と異なる）を有する。他の実施形態において、２次リガンドはアミノ酸配列（ここでは該アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、４、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０及び２１から選択されるアミノ酸配列からなる）を有する。
【００７９】
ここに規定される２重リガンド及び３重リガンド捕捉剤についてのある実施形態において、２次リガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，３もしくは４に明らかなアミノ酸配列を有する。
【００８０】
ここに規定される２重リガンド及び３重リガンド捕捉剤についてある実施形態において、３次リガンドは式：  Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６を有する。ある実施形態において、Ｘ２はプラスに帯電したＤ−アミノ酸である。他の実施形態において、Ｘ２はＤ−ヒスチジン、Ｄ−アルギニン及びＤ−リジンから選択される。他の実施形態において、Ｘ３は極性Ｄ−アミノ酸、中性Ｄ−アミノ酸及びマイナスに帯電したアミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ３はＤ−トレオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−アラニン、及びＤ−グルタメートから選択される。他の実施形態において、Ｘ４はプラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸及び中性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ４はＤ−ヒスチジン、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−ロイシン及びＤ−チロシンから選択される。他の実施形態において、Ｘ５は中性Ｄ−アミノ酸、プラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸及び極性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ５はＤ−バリン、Ｄ−プロリン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−セリン及びＤ−チロシンから選択される。他の実施形態において、Ｘ６はプラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸、極性Ｄ−アミノ酸及び中性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ６はＤ−アルギニン、Ｄ−チロシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−リジン及びＤ−ヒスチジンから選択される。
【００８１】
ある実施形態において、Ｘ２は芳香族Ｄ−アミノ酸である。他の実施形態において、Ｘ２はＤ−チロシン、Ｄ−フェニルアラニン及びＤ−トリプトファンから選択される。他の実施形態において、Ｘ３は中性Ｄ−アミノ酸及びプラスに帯電したアミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ３はＤ−プロリン、Ｄ−アラニン、グリシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン及びＤ−ヒスチジンから選択される。他の実施形態において、Ｘ４はプラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸、マイナスに帯電したＤ−アミノ酸、中性Ｄ−アミノ酸及び極性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ４はＤ−アルギニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−グルタメート、Ｄ−プロリン、Ｄ−セリン及びＤ−トレオニンから選択される。他の実施形態において、Ｘ５は中性Ｄ−アミノ酸、マイナスに帯電したＤ−アミノ酸、プラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸及び極性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ５はＤ−プロリン、Ｄ−アスパルテート、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−チロシン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アラニン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン及びＤ−アスパラギンから選択される。他の実施形態において、Ｘ６はプラスに帯電したＤ−アミノ酸、極性Ｄ−アミノ酸、中性Ｄ−アミノ酸、マイナスに帯電したＤ−アミノ酸及び芳香族Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ６はＤ−ヒスチジン、Ｄ−リジン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパルテート、Ｄ−セリン、Ｄ−チロシン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−グルタメート及びＤ−バリンから選択される。
【００８２】
ある実施形態において、Ｘ２はマイナスに帯電したＤ−アミノ酸である。他の実施形態において、Ｘ２はＤ−グルタメート及びＤ−アスパルテートから選択される。他の実施形態において、Ｘ３はマイナスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸、プラスに帯電したアミノ酸及び極性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ３はＤ−グルタメート、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−リジン、Ｄ−アスパラギン及びＤ−セリンから選択される。他の実施形態において、Ｘ４は中性Ｄ−アミノ酸、プラスに帯電したＤ−アミノ酸、極性Ｄ−アミノ酸、マイナスに帯電したＤ−アミノ酸及び芳香族Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ４はＤ−イソロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−アスパルテート、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−チロシン及びＤ−ヒスチジンから選択される。他の実施形態において、Ｘ５はプラスに帯電したＤ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸及び中性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ５はＤ−アルギニン、Ｄ−チロシン、グリシン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−リジン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アラニン、Ｄ−アスパラギン及びＤ−ロイシンから選択される。他の実施形態において、Ｘ６はマイナスに帯電したＤ−アミノ酸、中性Ｄ−アミノ酸、芳香族Ｄ−アミノ酸及び極性Ｄ−アミノ酸から選択される。ある実施形態において、Ｘ６はＤ−アスパルテート、Ｄ−プロリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−セリン及びＤ−トレオニンから選択される。
【００８３】
他の実施形態において、３次リガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５、６、７、８、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３及び６４から選択されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、２次リガンドはアミノ酸配列（該配列中において１個のアミノ酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、６、７、８、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３及び６４から選択されるアミノ酸配列と異なる）を有する。他の実施形態において、２次リガンドはアミノ酸配列（ここでは該アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５、６、７、８、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３及び６４から選択されるアミノ酸配列からなる）を有する。
【００８４】
上記実施形態の全てについて、グリシンの非キラル性にも関わらず、グリシンは中性Ｄ−アミノ酸属の一種とみなされる。
【００８５】
ここに規定される３重リガンド捕捉剤のある実施形態において、３次リガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、６もしくは７に明らかなアミノ酸配列を有する。
【００８６】
ある実施形態において、ここに規定される２重リガンドはＦｉｇ．６、８、９もしくは１０に明らかな構造を有する。
【００８７】
ある実施形態において、ここに規定される３重リガンドはＦｉｇ．１１、１２、１３もしくは１４に明らかな構造を有する。
【００８８】
ある実施形態において、ここに規定される捕捉剤は、反応条件及び／又は貯蔵期間の広範囲にわたり安定である。ここで使用される「安定」な捕捉剤は、標的にタンパク質に特異的に結合する能力を維持し、少なくともタンパク質分解に対して部分的に抵抗力がある。
【００８９】
ある実施形態において、ここに規定される捕捉剤は、６か月以上の保存可能期間を有する。これは６か月以上の間の貯蔵で安定していることを意味する。これらの実施形態のあるものにおいて、捕捉剤は、１年以上、２年以上、もしくは３年以上の保存可能期間を有する。これらの実施形態のあるものにおいて、捕捉剤は凍結乾燥パウダーとして貯蔵される。ある実施形態において、ここに規定される捕捉剤は同じ標的タンパク質への生物学的結合よりも長い保存可能期間を有する。
【００９０】
ある実施形態において、ここに規定される捕捉剤は、温度約−８０°Ｃ乃至約１２０°Ｃにおいて安定している。これらの実施形態のあるものにおいて、捕捉剤は−８０℃乃至−４０℃；−４０℃乃至−２０℃；−２０℃乃至℃；０℃乃至２０℃；２０℃乃至４０℃；４０℃乃至６０℃；６０℃乃至８０℃；及び／又は８０℃乃至１２０℃の温度範囲内で安定している。ある実施形態において、ここに規定される捕捉剤は同じ標的タンパク質への生物学的結合よりもより広い温度範囲にわたり安定であり、及び／又は同じ標的タンパク質への生物学的結合よりもより長い期間特定の温度で安定なままである。
【００９１】
ある実施形態において、ここに規定される捕捉剤のｐＨは、約３．０乃至約１２．０の範囲である。これらの実施形態のあるものにおいて、捕捉剤のｐＨは、約５．０乃至約９．０の範囲である。捕捉剤のｐＨは、当該技術において知られた方法を使用して生理学的に適合した範囲に調整されてよい。例えばある実施形態において、捕捉剤のｐＨは約６．５乃至約８．５の範囲に調整されてよい。
【００９２】
ある実施形態において、ここに規定される捕捉剤は血清において１２時間以上安定している。これらの実施形態のあるものにおいて、血清中の捕捉剤は１８時間以上、２４時間以上、３６時間以上、４８時間以上もしくは９６時間以上安定している。ある実施形態において、ここに規定される捕捉剤は血清において、同じ標的タンパク質への生物学的結合よりもより長い期間安定している。
【００９３】
ある実施形態において、ここに規定される捕捉剤は、例えばビオチン、銅−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（銅−ＤＯＴＡ）、デフェロキサミンＢ（ＤＦＯ）、６８Ｇａを有する放射性標識のためのリガンド、もしくは他の放射性標識プロダクト（ガンマ放射体、プロトン放射体、陽電子放射体、三重水素もしくは他の方法により検出可能なカバーされたタグ（例えばガドリニウム）を包含してよい）を包含する１個以上の検出ラベルを有してよい。
【００９４】
ある実施形態において、ここに規定される捕捉剤は１個以上の検出可能なラベルを有する。これらの実施形態のあるものにおいて、ラベルは銅−ＤＯＴＡである。他の実施形態において、検出可能なラベルは６４ＣｕＤＯＴＡ、６８ＧａＤＯＴＡ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８９Ｚｒ、１２４Ｉ、８６Ｙ、９４ｍＴｃ、１１０ｍＩｎ、１１Ｃ及び７６Ｂｒから選択される。   他の実施形態において、検出可能なラベルは１２３Ｉ、１３１Ｉ、６７Ｇａ、１１１Ｉｎ及び９９ｍＴｃから選択される。他の実施形態において、ラベルは蛍光ラベルである。
【００９５】
ある実施形態において、ここに規定される捕捉剤は、望ましい化学的もしくは生物学的活性を得るために修飾されてよい。望ましい化学的もしくは生物学的活性の例は、向上した可溶性、安定性、生物学的利用能、検出可能性もしくは反応性を包含する（ただし限定されない）。捕捉剤に導入してよい特異的修飾の例は、ジスルフィド結合の形成による捕捉剤を環化すること；他の官能基もしくは分子で捕捉剤を修飾することを包含する（ただし限定されない）。同様に、捕捉剤はタンパク質における非標準もしくは非生物的エピトープに結合するように合成されてよく、それによりタンパク質の多様性が増す。ある実施形態において、カップリング反応の前に標的結合部分の合成ブロックを修飾することにより、捕捉剤を修飾してよい。
【００９６】
ある実施形態においてここに規定されるのは、ここに規定される捕捉剤１個以上を有する医薬製剤である。ある実施形態において、これら医薬製剤は１個以上の医薬的に許容可能な担体、賦形剤もしくは希釈剤を有する。これら担体、賦形剤もしくは希釈剤は、使用目的及び／又は製剤の投与ルートに基づき選択されてよい。
【００９７】
ある実施形態においてここに規定されるのは、ここに開示される捕捉剤１個以上を有するキットである。ある実施形態において、これらのキットはＶＥＧＦを同定、検出、定量及び／又は分離するのに使用してよく、これらの実施形態のあるものにおいて、当該キットを増大したＶＥＧＦ発現及び／又は活性に関連した状態の診断及び／又は病期分類において使用してよい。
ある実施形態において、ここに規定されるキットは
（ａ）その上に吸着剤を有する基質（ここで吸着剤はＶＥＧＦを結合するのに適する）、及び
（ｂ）洗浄液もしくは洗浄液を作製する説明書（ここで吸着剤と洗浄液の組み合わせはＶＥＧＦの検出を可能にする）
を有する。他の実施形態において、ここに規定されるキットを増大したＶＥＧＦ発現及び／又は活性に関連した状態の治療で使用してよい。
【００９８】
ある実施形態において、ここに規定されるキットはさらに適当な操作パラメータのための説明書をラベルもしくは折り込みの形態で有してよい。例えばキットは、血漿サンプルもしくは他の組織サンプルがプローブにおいて接触したした後どうのようにプローブを洗浄するのか、消費者／キット使用者に情報を提供する標準的な説明書を有してよい。
【００９９】
ある実施形態において、ここに規定されるキットは
（ａ）ＶＥＧＦを特異的に結合する１個以上のＶＥＧＦ捕捉剤；及び
（ｂ）検出試薬
を有する。このようなキットはここに記載した材料から調製可能である。
【０１００】
ここに規定されるキットは、任意に標準もしくはコントロール情報、及び／又はコントロール量の材料を有し、その結果、サンプル中で検出されたＶＥＧＦの検査料が特定の条件の診断と一致しているかどうかを決定するため、検査サンプルはコントロール情報もしくは標準及び／又はコントロール量と比較可能である。
ＶＥＧＦ捕捉剤を使用する方法：
ある実施形態においてここに規定されるのは、生物学的サンプルにおけるＶＥＧＦを同定、検出、定量及び／又は分離するために、ここに開示されるＶＥＧＦ捕捉剤を使用する方法である。ここに開示されるＶＥＧＦ捕捉剤は、生化学アッセイにおけるモノクローナル抗体の完全代替品として利用可能である。従ってある実施形態においてここに規定される方法は、抗体もしくはその同等物にと取って代わる捕捉剤を有するイムノアッセイを利用する。ある実施形態において、イムノアッセイはウエスタンブロット、プルダウンアッセイ、ドットブロットもしくはＥＬＩＳＡでよい。
【０１０１】
ここに規定される方法において使用するための生物学的サンプルは、器官、組織、体液及び細胞からなるグループから選択される。生物学的サンプルが体液である場合、当該体液は血液、血清、血漿、尿、痰、唾液、便、髄液、脳脊髄液、リンパ液、皮膚分泌物、気道分泌物、腸分泌物、尿生殖器管分泌物、涙及び乳汁から選択され得る。
【０１０２】
ある実施形態においてここに規定されるのは、ｉｎ  ｖｉｖｏＶＥＧＦを同定、検出、定量及び／又は局在化する方法である。これらの実施形態のあるものにおいて、捕捉剤は造影剤として使用されてよい。これらの実施形態において、捕捉剤は上で検討したような検出ラベル１個以上を有してよい。
【０１０３】
ある実施形態においてここに規定されるのは、ＶＥＧＦ活性を阻害するためのここに開示されるＶＥＧＦ捕捉剤を使用する方法である。これらの実施形態のあるものにおいて、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲへの結合をブロックし、それによりＶＥＧＦＲ  活性を阻害することにより、捕捉剤はＶＥＧＦ活性を阻害する。従って、さらにここに規定されるものは、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲへの結合を阻害するため及び／又はＶＥＧＦＲ活性を阻害するため、ここに来開示されるＶＥＧＦ捕捉剤を使用する方法である。
【０１０４】
ある実施形態においてここに規定されるのは、例えば様々な癌を包含する増大したＶＥＧＦ発現及び／又は活性に関連した状態を診断及び／又は分類（例えば病期分類）するために、ここに開示されるＶＥＧＦ捕捉剤を使用する方法である。ある実施形態において、これらの方法は
（ａ）対象から生物学的サンプルを得ること；
（ｂ）ＶＥＧＦ捕捉剤によりサンプル中のＶＥＧＦの有無を測定すること；
（ｃ）ＶＥＧＦレベルをＶＥＧＦに関する所定のコントロール範囲と比較すること；及び
（ｄ）生物学的サンプル中のＶＥＧＦレベルと所定のコントロールとの違いに基づき、増大したＶＥＧＦ発現に関連した状態を診断すること
を有する。
【０１０５】
ここに規定される診断及び／又は分類方法のある実施形態において、ＶＥＧＦ捕捉剤を対象の健康状態の変化を診断するのに使用してよい。ここで健康状態の変化とは疾患もしくはイベントの前兆である。これらの実施形態のあるものにおいて、方法を、疾患もしくはイベントの症状をまだ何も示さない対象における疾患もしくはイベントの発生を予見するのに利用してよい。ある実施形態において、健康状態の変化はＶＥＧＦレベルの増加であり得る。
【０１０６】
ある実施形態においてここに規定されるのは、捕捉剤１個以上もしくはここに開示される医薬製剤の治療的に有効な量を投与することにより、それを必要としている対象における増大したＶＥＧＦ発現及び／又は活性に関連した状態を治療する方法である。これらの実施形態のあるものにおいて、捕捉剤は、例えば化学療法薬を包含する１個以上の追加の治療薬と結合されてよい。好ましい実施形態において、捕捉剤は医薬組成物として投与される。ある実施形態において、治療される状態は癌、増殖性網膜症、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）のウェット型疾病病理学もしくは関節リウマチからなるグループから選択される疾患である。
【０１０７】
捕捉剤もしくは医薬製剤は、いずれか適当な経路を介して治療を必要としている患者に投与されてよい。投与経路は例えば非経口投与（例えば例えばドリップパッチによる皮下、筋肉内、静脈内投与を包含する）を包含する。さらに適当な投与経路は、経口、経腸、経鼻、局所（頬及び舌下を包含する）、注入、膣内、皮内、腹腔内、硬膜下腔内及び硬膜外投与又は例えばネブライザもしくは吸入器による、もしくは経口もしくは経鼻吸入を介する、もしくは移植による投与を包含する（ただしこれらに限定されない）。
【０１０８】
捕捉剤もしくは医薬製剤は、ミクロスフェア、リポソーム、他の微粒子送達システム、又は血液を含むある組織に置いた徐放性製剤を介して投与されてもよい。徐放性キャリアの適当な例は、共通の物品の形態における半透過性ポリマーマトリックス、例えば坐剤もしくはマイクロカプセルを包含する。上で述べたテクニック及びプロトコル、及び本発明にしたがって使用し得る他のテクニック及びプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ａ．  Ｒ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；  ２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｄｅｃ．  １５，  ２０００）  ＩＳＢＮ０−９１２７３４−０４−３及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；  Ａｎｓｅｌ，  Ｎ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  ７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ＩＳＢＮ０−６８３３０５−７２−７に見出される（これらの開示全体は参照により本願に取り入れられる）。
【０１０９】
ある実施形態においてここに規定されるものは、増大したＶＥＧＦ発現及び／又は活性に関連した状態を治療する医薬の製造におけるここに規定される捕捉剤の使用である。
捕捉剤の製造方法：
ある実施形態において、ここに規定されるような捕捉剤を合成する方法が提供される。ある実施形態において、これらの方法は
ａ）標的結合部分の合成ブロックを調製すること（当該合成ブロックは標的結合部分、及び他の合成ブロックと望ましい結合を形成可能な反応性基少なくとも１個を有するのであって、ここで
ｉ）当該結合は、アミド結合、１，４−二置換−１，２，３−トリアゾール結合及び１，５−二置換−１，２，３−トリアゾール結合から選択される；
ｉｉ）標的結合部分の他の活性官能基全ては、望まない反応を避けるために保護されている）；及び
ｂ）捕捉剤を提供するため標的結合部分の合成ブロックをカップリングすること
を有する。
【０１１０】
以下の実施例は、特許請求した発明をよりよく説明するためにあるのであって、発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。具体的材料が述べられているという点について、単に説明目的であり、発明を限定することを意図していない。当業者ならば、創造的能力を発揮することなく、且つ発明の範囲から逸脱することなく同等の手段もしくは反応物質を開発し得る。
【実施例】
【０１１１】
実施例
実施例１：ＶＥＧＦ捕捉剤の合成：
３個の抗ＶＥＧＦ２重リガンド捕捉剤及び４個の抗ＶＥＧＦ３重リガンド捕捉剤をｉｎ  ｓｉｔｕクリックケミストリーアプローチを使用して同定した。
【０１１２】
試薬：  Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｘ−ＯＨ  （Ｆｍｏｃ、フルオレン−９−イルメトキシカルボニル）（Ｘ＝Ａｌａ，  Ａｒｇ（Ｐｂｆ）  （Ｐｂｆ，  ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル），  Ａｓｎ（Ｔｒｔ）  （Ｔｒｔ，  トリチル），  Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）  （ｔＢｕ，  ｔｅｒｔ−ブチル），  Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），  Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），  Ｇｌｙ，  Ｈｉｓ（Ｔｒｔ），  Ｉｌｅ，  Ｌｅｕ，  Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）  （Ｂｏｃ，  ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル），  Ｍｅｔ，  Ｐｈｅ，  Ｐｒｏ，  Ｓｅｒ（ｔＢｕ），  Ｔｈｒ（ｔＢｕ），  Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），  Ｔｙｒ（ｔＢｕ）及びＶａｌ）  （Ａｎａｓｐｅｃ；  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＧＡ）。アミノ酸カップリング反応を、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−ホスファート（ＨＢＴＵ；  ＡＡＰＰＴｅｃ）及びＤＩＥＡにより１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ，  ９９％）中で行った。Ｎα−Ｆｍｏｃ保護基の除去のため、ＮＭＰ中２０％ピペリジン溶液を使用した。ペプチドライブラリーの最終的脱保護のため、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、９８％ｍｉｎ．滴定）及びトリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）を使用した。全ての溶剤及び試薬は
Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）から購入した。
【０１１３】
ペプチドライブラリの構築：  Ｔｉｔａｎ  ３５７自動シンセサイザ（ＡＡＰＰＴｅｃ）を使用し、標準スプリット・ミックス法によりポリエチレングリコール−グラフト化ポリスチレンビーズにおいて（ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｓ−ＮＨ２，９０ｐｍ，０．２９ｍｍｏｌ／ｇ，２．８６ｘ１０６ビーズ／ｇ）ペンタペプチドのランダム化ＯＢＯＣライブラリを合成した。典型的なライブラリ構築において、非天然Ｄ−立体異性体を、ペプチド配列の各位置で使用した。カップリングステップのため、Ｆｍｏｃケミストリー（Ｆｉｅｌｄｓ  １９９０）による標準固相ペプチド合成方法を使用した。回収容器（ＣＶ）において２時間ＭＮＰ中で樹脂を膨潤させた。Ｆｍｏｃ−メチオニン（４当量）のカップリングを３．８当量ＨＡＴＵ（ＣｈｅｍＰｅｐ）及び１２当量ＤＩＥＡを添加することにより開始した。カップリング反応を３０分間行った。カップリング反応の後、ビーズを完全に洗い（４ｘＮＭＰ）、ＮＭＰ中の２０％ピペリジンで処理した（５分間、その後脱保護溶液の新鮮なアリコートで１５分間洗浄）。樹脂を完全に洗い（４ｘ  ＮＭＰ，４ｘＤＣＭ）、反応容器（ＲＶ）における次のカップリングサイクルのために複数の等量アリコートに分割した。カップリング及びＦｍｏｃ脱保護が完了したら、樹脂を回収容器において合わせた。ペプチドの望ましい長さが得られるまで手順を繰り返した。アミノ酸側鎖保護基を次いで、２時間ＴＦＡ（９４％），水（３％）及びＴＩＳ（３％）中でインキュベーションすることにより除去した。ライブラリ樹脂を次いでジクロロメタン（ＤＣＭ；  ５ｘ），メタノール（ＭｅＯＨ；  ５ｘ），水（５ｘ），ＭｅＯＨ（５ｘ），ＤＣＭ（５ｘ）及びジエチルエーテル（５ｘ）で完全に洗った。得られた樹脂を真空乾燥し、４℃で保存した。
２重リガンド選択：  ｉｎ  ｓｉｔｕクリックケミストリーテクニックを使用して選択を行った。ここでは標的タンパク質は、アジドをアルキン候補リガンドに結合する触媒としてふるまう（Ｆｉｇ．１及び２；Ａｇｎｅｗ  ２００９）。選別のため、Ｎ−末端でＤ−プロパルギルグリシンと結合したＯＢＯＣライブラリの一部２００ｍｇを８ｍＬ容量Ａｌｌｔｅｃｈ容器に移し、ＰＢＳバッファー中（ｐＨ７．４）の０．０５％ＮａＮ３，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．１％ＢＳＡからなるブロッキング溶液で２５℃における３６０°ローテータにおいて２時間プレインキュベートした。別個に、ブロッキング溶液で希釈した１０ｎＭヒトＶＥＧＦ１６５Ａ（＃ａｂ５６６２０；  Ａｂｃａｍ，  ＭＡ）の３ｍＬ体積を、アンカーリガンド構築物ビオチン−ＰＥＧ−ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ−Ａｚ４，  （式中ＰＥＧ＝３ｘエチレングリコールリンカー，  Ａｚ４＝６−アジド−Ｌ−ノルロイシン，  ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ＝  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列（Ｆｉｇ．３），及び下線部＝ジスルフィド拘束残基  （Ｆｉｇ．４）（Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒ  １９９８）とともに２５℃、３６０°ローテータで２時間プレインキュベートした。
【０１１４】
アンカーリガンドをタンパク質の３０００倍モル過剰で供給した。ＯＢＯＣライブラリのからブロッキング溶液を排出した後、１０ｎＭ  ＶＥＧＦ１６５Ａ及びアンカーリガンドのプレインキュベートした溶液をライブラリ樹脂に添加し、２５℃、３６０°ローテータで４時間インキュベートした。スクリーンをブロッキング溶液３ｘ５ｍＬで洗浄し、１：１０，０００  ＡＰ結合ストレプトアビジン３ｍＬ（＃Ｖ５５９１；Ｐｒｏｍｅｇａ）を２５℃ で４５分間インキュベートした。ＡＰ結合ストレプトアビジンは、ビオチンラベルを含むこれらビーズを、従ってＶＥＧＦテンプレート化ｉｎ  ｓｉｔｕクリック２重リガンド複合化（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）を識別した。非特異的に結合したタンパク質を除くため、スクリーンを５ｘ３ｍＬブロッキング溶液，５ｘ３ｍＬ洗浄１バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＣＩ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，７００ｍＭ  ＮａＣＩ，  ｐＨ７．５）及び５ｘ３ｍＬ洗浄２バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＣＩ，  ｐＨ７．５）で洗い、真空で排水した。アルカリホスファターゼ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ，  ｐＨ９．０，  １５０ｍＭ  ＮａＣＩ，  １ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で新しく調製したＢＣＩＰ：ＮＢＴ  （＃Ｓ３７７１；Ｐｒｏｍｅｇａ）をスクリーンを開発するのに使用した。もっとも強く色づいた紫色ビーズ（”ｈｉｔｓ”）をマニュアルで選択した。結合タンパク質を除去するため選択されたビーズを７．５Ｍグアニジン塩酸塩（ｐＨ２．０）で処理し、ＭＮＰで脱色した。スクリーンを巣角化するために使用した試薬への非特異的結合を示したビーズを除くため、抗スクリーンを別々に行った。この精製の後、真正のヒットの配列化をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ及び半自動化アルゴリズム（Ｌｅｅ  ２０１０）で行った。包括的ライブラリに対するＶＥＧＦスクリーニングから得られた２重リガンドヒット配列をＦｉｇ．６６に示す。
【０１１５】
ＶＥＧＦに対する候補２重リガンドを分析し、商標名Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ生物情報学クラスタリングプログラムを使用し、同様の電荷及び同様の保存モチーフによりグループ化した。生理化学的特徴に基づき候補ペプチドを一緒にグループ化した（Ｆｉｇ．５）。生理化学的特性の領域の両極端において非ランダムに選択されたリガンドが生じるので、２重リガンド候補選択を合理的にガイドするため、この生物情報学クラスタリング方法を使用した。この多次元表示により（すなわち異なるクラスタは、タンパク質エピトープの異なる領域をサンプル化し得る）ヒットの様々なクラスをも同定した。
【０１１６】
１，４−置換−１，２，３−トリアゾールを含有する２重リガンド候補を次いで個々に合成し、ＶＥＧＦ結合親和性及びアンカーリガンドに対する特異性において最大の向上を有する２重リガンドを決定するため、生物学的アッセイを行った。
【０１１７】
選択された２重リガンドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアンカーリガンド及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ｒｐｌｉｒ；  ”Ｂｉｌｉｇａｎｄ１”），３（ｌｆｒｅｗ；”Ｂｉｌｉｇａｎｄ２”）もしくは４（ｆｓｒｋｔｅ；”Ｂｉｌｉｇａｎｄ３”）のアミノ酸配列を有する２次リガンドを有した。２重リガンド１，２及び３の構造はそれぞれＦｉｇ．８，９及び１０に明らかである。
３重リガンド選択：  Ｎ−末端でＤ−プロパルギルグリシンと結合したＯＢＯＣライブラリの一部２００ｍｇを８ｍＬ容量Ａｌｌｔｅｃｈ容器に移し、ＰＢＳバッファー中（ｐＨ７．４）の０．０５％ＮａＮ３，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．１％ＢＳＡからなるブロッキング溶液で２５℃における３６０°ローテータにおいて２時間プレインキュベートした。別個に、ブロッキング溶液で希釈した１ｎＭ  ＶＥＧＦ１６５Ａの３ｍＬ体積を、２重リガンド構築物ビオチン−ＰＥＧ−ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ−Ｔｚ４−Ｉｆｒｅｗ−Ａｚ４（式中ＰＥＧ＝３ｘエチレングリコールリンカー（Ｆｉｇ．６））とともに２５℃、３６０°ローテータで２時間プレインキュベートした。
【０１１８】
２重リガンドをタンパク質の５０００倍モル過剰で供給した。ＯＢＯＣライブラリのからブロッキング溶液を排出した後、１ｎＭ  ＶＥＧＦ１６５Ａ及び２重リガンドのプレインキュベートした溶液をライブラリ樹脂に添加し、２５℃、３６０°ローテータで４時間インキュベートした。ＡＰ結合ストレプトアビジンを実行する、生成物選別及び抗スクリーンを上記のように実施した。真正のヒットの配列化をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ及び半自動化アルゴリズム（Ｌｅｅ  ２０１０）で行った。包括的ライブラリに対するＶＥＧＦスクリーニングから得られた３重リガンドヒット配列をＦｉｇ．６９に示す。
【０１１９】
３重リガンド候補選択をガイドするのに使用した商標名Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ生物情報学クラスタリングアルゴリズムを使用して、ヒット配列を分析した。生理化学的特徴に基づき候補ペプチドを一緒にグループ化した（Ｆｉｇ．７）。
【０１２０】
１，４−置換−１，２，３−トリアゾールを含有する３重リガンド候補を次いで個々に合成し、ＶＥＧＦ結合親和性及び２重リガンドに対する特異性において最大の向上を有する３重リガンドを決定するため、生物学的アッセイを行った。ＶＥＧＦＲ２及び多種へ結合するＶＥＧＦにおける３重リガンドの阻害効果を特徴化するため、競合アッセイも行った。
【０１２１】
選択された３重リガンド捕捉剤は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５（ｆｒｓｖｎ；”Ｔｒｉｌｉｇａｎｄ１”），６（ｅｅｉｒｄ；”Ｔｒｉｌｉｇａｎｄ２”），７（ｈｔｈｗｌ；”Ｔｒｉｌｉｇａｎｄ３”）もしくは８（ｅｗｓｒｗ；”Ｔｒｉｌｉｇａｎｄ４”）のアミノ酸配列を有する３次リガンドに結合した２重リガンド２を有する。３重リガンド１乃至４の構造はそれぞれＦｉｇ．１１乃至１４に明らかである。
【０１２２】
単一ビーズ由来”Ｈｉｔ”ペプチドのＣＮＢｒ開裂：  単一ビーズを、純水（１０μＬ）を収容するマイクロ遠心チューブに移した。ＣＮＢｒ（１０μＬ，０．２Ｎ  ＨＣＩ中の０．５０Ｍ溶液）添加後、反応容器をアルゴンでパージし、次いで１分間マイクロ波の下に置いた（Ｌｅｅ  ２００８）。得られる溶液を、遠心真空下、４５℃、２時間濃縮した。
【０１２３】
単一ビーズ由来開裂”Ｈｉｔ”ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ分析：  α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸ＣＨＣＡ（０．５μＬ，０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）含有アセトニトリル／水（７０：３０）中５ｍｇ／ｍＬマトリックス溶液）を各チューブに添加した。混合溶液を取り、３８４ウェルＭＡＬＤＩプレートにスポットし、これを１５分間放置して自然乾燥した。次いでサンプルを、リフレクトロンモードで操作されるＢｒｕｋｅｒ  ｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ（登録商標）ＴＯＦ／ＴＯＦ装置（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ；  Ｂｒｅｍｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）飛行時間（ＴＯＦ）質量分析法（ＭＳ）により分析した。ＬＩＦＴ（登録商標）モードにおける各サンプルについてＭＳ／ＭＳスペクトルを得た。
実施例２：  ＶＥＧＦ捕捉剤の大規模生成：
生物学的アッセイのため、ＶＥＧＦ捕捉剤の大規模生成を必要とした。慣用の及びマイクロ波アシストＦｍｏｃベース固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）の組み合わせを使用して、各３重リガンドを調製した。具体的には、ＡＡＰＰＴＥＣ  Ｔｉｔａｎ  ３５７ペプチドシンセサイザを使用して、各３重リガンドの様々な３次リガンドが、ｒｉｎｋアミド樹脂上に平行に合成された。各アミノ酸カップリング反応は、４当量Ｆｍｏｃ−アミノ酸、４当量ＨＢＴＵ及び１０当量ＤＩＥＡを合体した。Ｆｍｏｃ基の脱保護は２０％ピペリジン／ＮＭＰを必要とした。
【０１２４】
抗ＶＥＧＦ２重リガンド（Ｘ−ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ−Ｔｚ４−Ｉｆｒｅｗ−Ｔｚ４（式中ＸはＰＥＧ化されたレポータータグ（例えばビオチン−ＰＥＧ，ＤＯＴＡ−ＰＥＧ，等）である））を調製するため、ｒｉｎｋアミド結合３次リガンドを、ＣＥＭ  Ｌｉｂｅｒｔｙ  １マイクロウェーブペプチド合成装置に移した。各アミノ酸、ＰＥＧリンカー、レポーターカップリング反応は、４当量Ｆｍｏｃ−アミノ酸、４当量ＨＢＴＵ及び１０当量ＤＩＥＡを包含した。２個のＴｚ４リンカーのカップリング条件を、４当量Ｆｍｏｃ−アミノ酸，４当量ＨＡＴＵ及び１０当量ＤＩＥＡを使用して変更した。Ｆｍｏｃ基の脱保護は２０％ピペリジン／ＮＭＰを必要とした。ＰＥＧ化されたレポータータグが必要とされないならば、樹脂結合３重リガンドはＡｃ２Ｏ／ＤＩＥＡを使用してＮ−末端でキャップされた。捕捉剤を、Ｃ１８カラム及び直線勾配を使用する逆相ＨＰＬＣ（溶媒Ａ：  Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ，溶媒Ｂ：  ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ）により精製した。
実施例３：結合親和性分析：
直接固相マクロプレート酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を、捕捉剤のＶＥＧＦ１６５（＃ａｂ５６６２０；  Ａｂｃａｍ，  ＭＡ）へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合を測定するために使用した。抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））の完全ＩｇＧ及びＦａｂフラグメント（パパイン分解により製造）についても、結合を測定した。ＥＬＩＳＡは、捕捉剤濃度のある範囲にわたる結合を検出するのに高度に感受性かつ確実であった。捕捉剤の解離平衡定数（ＫＤ）は、最大半量蛍光発光に対応する濃度として推定されてよい。並行してアッセイする多様な（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）捕捉剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合の相対的及び絶対的比較を可能にする。
【０１２５】
ＮＵＮＣ  ＭＡＸＩＳＯＲＰ（登録商標）マイクロタイタープレートを、ｐＨ７．４のＰＢＳ中のＶＥＧＦ１６５（＃ａｂ５６６２０；  Ａｂｃａｍ，  ＭＡ）２μｇ／ｍＬで２時間２５℃でコートした。各ウェルをＰＢＳ（３ｘ）で洗浄後、プレートを０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有ＴＢＳ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，  １５０ｍＭ  ＮａＣＩ，  ｐＨ７．２５）中の５％脱脂粉乳で満たし、２５℃で２時間ブロックした。プレートを０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有ＴＢＳ中の１％脱脂粉乳で洗い（３ｘ）、次いで０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有ＴＢＳ中の１％脱脂粉乳中で連続希釈されたビオチン化された捕捉剤を２５℃で３時間インキュベートした。全てのマイクロウェルをＴＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で洗浄後（５ｘ）、ＴＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中の０．１μｇ／ｍＬストレプトアビジンＰｏｌｙ−ＨＲＰコンジュゲート（Ｐｉｅｒｃｅ，  ＩＬ）を２５℃で３時間インキュベートした。プレートを吸引し、ＴＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で（５ｘ）、次いでＴＢＳで（５ｘ）洗浄し、次いでＱｕａｎｔａＲｅｄ（登録商標）増強化学発光ＨＲＰ基質を添加することにより現像した。５３５ｎｍの励起波長を使用し、捕捉剤濃度の関数として５９５ｎｍの蛍光発光をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＴＸ８８０光度計（Ｂｒｅａ，  ＣＡ）により記録した。４パラメータ回帰曲線フィッティングプログラム（Ｏｒｉｇｉｎ  ８．５，  Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，  ＭＡ）を使用して、滴定曲線をあてはめた。
【０１２６】
これらの捕捉剤の３重リガンド２及び３、２重リガンド２及びアンカーリガンドの親和性をＦｉｇ．１５に示す。２重リガンド１及び３重リガンド１及び４の親和性はそれざれさらにＦｉｇ．６７及び７０に示す。検出剤として、２重リガンド２は、アンカーリガンド単独と比較して、ＶＥＧＦについてのその親和性において５倍の向上を示した一方、最良の３重リガンドは追加の親和性増加を示した（２乃至３倍，  ＫＤ≒１５ｎＭ）。これらの結果は、捕捉剤選択プロセスは本質的に親和性を発展させることを示唆している。Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）及びＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）Ｆａｂの親和性をＫＤ≒０．２ｎＭ及びＫＤ≒４．５ｎＭとしてそれぞれ測定した。Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）Ｆａｂの減少したアビディティ（ａｖｉｄｉｔｙ）はこの実験における親和性損失として明らかである、と思われる。Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）２価性はＦａｂフラグメントに親和性及びアビディティを与えるのと同様に、２量体３重リガンド捕捉剤は追加の親和性増加をもたらす。
実施例４：結合特異性分析：
バッファーもしくは複雑なメディア（例えばヒト血清）からＶＥＧＦ１６５を精製する捕捉剤の能力を測定することにより、ＶＥＧＦに関する捕捉剤特異性を評価するのにプルダウンアッセイを使用した。捕捉剤をストレプトアビジン官能化磁気ビーズに固定し、得られる樹脂を、ＶＥＧＦ１６５をスパイクした血清もしくはバッファーで洗った（ｐａｎｎｅｄ）。
【０１２７】
ＶＥＧＦ１６５のプルダウン検出を、抗体ではなく捕捉剤を包含した変更した免疫沈降法テクニックを使用して行った。まず、ビオチン化捕捉剤（４００ｎＭ；０．１％ＤＭＳＯ，ｖ／ｖ）を、２ｍＬＴＢＳ中ＶＥＧＦ１６５  １μｇ／ｍＬとともに４℃で一晩インキュベートした。別々に、ビオチン化捕捉剤（４００ｎＭ；０．１％ＤＭＳＯ，ｖ／ｖ）を、２５％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ男性血清（＃ＨＳ−２０，  Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｔａｒｚａｎａ，  ＣＡ）２ｍＬ中のＶＥＧＦ１６５  １μｇ／ｍＬとともに同じ条件でインキュベートした（４℃、一晩）。各サンプルには賦形剤のみの対照（０．１％ＤＭＳＯ，ｖ／ｖ）が加わった。
【０１２８】
４℃で４時間の回転下、ＢＳＡ−ブロックしたＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＃１１２−０５Ｄ）によりタンパク質が捕捉された（プルダウン条件ごとに５０％スラリー１００μＬ）。ＤｙｎａＭａｇ（登録商標）−Ｓｐｉｎマグネット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１２３−２０Ｄ）の適用により、ビーズを血清もしくはバッファーマトリックスタンパク質から分離し、捕捉タンパクは還元Ｌａｅｍｍｌｉバッファー３０μＬにおいてビーズから溶出された。溶出サンプルを、１ｘＴＧＳ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１９２ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ，０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ），ｐＨ８．３）中で２００Ｖ、３０分間、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離に付した。引き続きサンプルを電気泳動により１００Ｖで４５分間、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１９２ｍＭグリシン，ｐＨ８．３，２０％（ｖ／ｖ）メタノール含有におけるニトロセルロースメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）に移した。移動後、ニトロセルロースメンブレンはＴＢＳ中５％脱脂粉乳中４℃で２時間ブロックした。次いでメンブレンをＴＢＳで（３ｘ）洗い、ＴＢＳ中０．５％脱脂粉乳中マウス抗ヒトＶＥＧＦ１６５抗体［６Ｂ７］（＃ａｂ６９４７９；  Ａｂｃａｍ，  ＭＡ）１μｇ／ｍＬを４℃で一晩インキュベートした。０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）含有ＴＢＳで洗浄後（５ｘ）、ＴＢＳ中０．５％脱脂粉乳中マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（＃ａｂ６７８９；  Ａｂｃａｍ，  ＭＡ）に対するＨＲＰ−結合ヤギポリクローナル２次抗体０．２μｇ／ｍＬをメンブレンに添加した（４℃、１時間インキュベーション）。０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）含有ＴＢＳで洗浄後（５ｘ）、次いでＴＢＳ洗浄（５ｘ）、メンブレンをＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学蛍光増強剤及び基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ，  ＩＬ）で現像し、直ちにＨｙＢｌｏｔ  ＣＬ  ＡＲフィルムに露出した。ウエスタン結果との比較において捕捉剤の特異性を評価するため、総タンパク質量に関して複製１２％ゲルを銀染色（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）により別々に視覚化した。
【０１２９】
プルダウンアッセイの結果はＦｉｇ．１６，６８，７１及び７３に明らかである。
【０１３０】
ＶＥＧＦ抗体でウエスタンブロットによる溶出の精査は捕捉効率における増加を確認した。アンカーから２重リガンドへ、３重リガンドへ翻訳することにより捕捉剤の結合親和性／特異性マトリックスが増加するからである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる総免疫沈降タンパク質の分析は、全ての捕捉剤について容認できる乃至低非選択的結合を示したが、ＶＥＧＦについての捕捉効率とよく関連している。ヒト血清からのＶＥＧＦ検出は、アンカーリガンドが２重リガンド次いで３重リガンド捕捉剤へ展開した後でのみ、観察された。３重リガンド２は、最高到達捕捉剤特異性を示すバッファー及び血清（レーン  Ｂ  ｖｓ．  Ｓ）中のＶＥＧＦ同等量を捕捉し、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）結果と十分に匹敵する。
【０１３１】
これらの結果は、捕捉剤選択プロセスは親和性を発展させるだけでなく、本質的に特異性を発展させることを示唆している。結果は、同等親和性の３重リガンドは必ずしも特異性においても同等ではない（３重リガンド２及び３対比）こと、従って親和せ及び特異性の両者は独立に発達可能な捕捉剤の臨界的性能パラメータであることをも示唆している。
実施例５：  血清安定性：
タンパク質分解安定性は、ｉｎ  ｖｉｖｏ用途でペプチドを使用するため、及び血清タンパク質診断のための重要なファクターである。たいていの天然ペプチドは酵素的分解を防止するため変性されないといけない。Ｄ−アミノ酸、非天然アミノ酸及び環化を包含するいくつかのアプローチが、捕捉剤安定性を向上させるために使用されてきた。
【０１３２】
安定性は、８００μＬ全体積における２５％（ｖ／ｖ）ｈｕｍａｎ  ＡＢ男性血清（ＨＳ−２０，  Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｔａｒｚａｎａ，  ＣＡ）含有ＴＢＳ中２００μｇ捕捉剤を混合することにより検討された。ペプチドを３７℃でインキュベートし、０分、３０分、次いで４時間までの１時間毎にアリコート１００μＬを取った。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ冷却マイクロ遠心分離機（Ｂｒｅａ，ＣＡ）を２０分使用する１２，０００ｒｐｍの遠心分離によりＭｉｃｒｏｃｏｎ遠心濾過機（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−１０，ＭＷＣＯ＝１０ｋＤａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で、血漿タンパク質からペプチドを分離した。濾過物を、分析ＨＰＬＣ  （Ｃ１８カラム，６０分にわたる０→１００％Ｂの直線勾配，ここでＡ＝Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ）により、次いでＢｒｕｋｅｒ  ＵｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ  ＭＡＬＤＩ質量分析により検査した。
【０１３３】
平衡して２つのコントロールアッセイが行われ、上と同じ条件：
１）ＴＢＳ中２重リガンド、及び
２）２５％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ男性血清含有ＴＢＳ、
に付された。
【０１３４】
３７℃２４時間ヒト血清もしくはバッファーとのインキュベーション後も捕捉剤は依然として完全であった（Ｆｉｇ．１７）。捕捉剤は、生理学的温度及びバッファーにおける２４時間以上のヒト血清におけるタンパク質分解に対して安定であることが示唆される。結果は、環化は（天然）Ｌ−アミノ酸含有配列セグメントについてタンパク質分解性消化に抵抗を向上させるための効率的且つ単純なアプローチであること、及びＤ−アミノ酸及び非天然アミノ酸は本来安定な要素であることを示している。このアプローチは、何ら配列修正なしに、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究のペプチド設計にとって有用であり得る。
実施例６：  ＨＵＶＥＣ増殖の阻害：
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）は、ＶＥＧＦＲ２にオートクライン的方法で結合するＶＥＧＦを恒常的に分泌する。Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）は直接ＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ２複合体の形成をブロックし、それによりブロック受容体シグナル伝達による増殖を減じる。２重リガンド捕捉剤は、ＨＵＶＥＣ増殖を阻害するその能力について評価される。
【０１３５】
ＨＵＶＥＣを、５％ＣＯ２中Ｍ１９９培地（ｐＨ７．４）中、３７°Ｃで１８時間培養した。検査化合物及び／又は賦形剤を、ヘパリン（１０μｇ／ｍＬ）及び０．５％ＦＢＳの存在下、細胞（１．１ｘ１０５／ｍＬ）とともに３７℃で４８時間インキュベートした。捕捉剤を１０，１，０．１，０．０１及び０．００１μＭにおいて及び二通りに選別した。Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）を１００，１０，１，０．１及び０．０１ｎＭにおいて及び二通りに選別した。ＶＥＧＦ１６５（アゴニスト，ＥＣ５０＝０．０７９ｎＭ）及びＳＵ５４１６（アンタゴニスト，ＩＣ５０＝４８ｎＭ）を標準対照としてアッセイした。引き続き、追加５０分のインキュベーション期間に、試薬カルセイン（Ｃａｌｃｅｉｎ）ＡＭ染料（２０μｇ／ｍｌ）を添加した。蛍光強度を、ＳｐｅｃｔｒｏＦｌｕｏｒ  Ｐｌｕｓプレートリーダーにおいて読み取った。
【０１３６】
％阻害対化合物濃度を説明する応答曲線はＦｉｇ．１８に明らかである。１ｎＭ  ＶＥＧＦ１６５コントロール応答に比較して、細胞増殖の検査化合物誘発刺激５０％以上は、顕著なアゴニスト活性を示す一方で、０．２ｎＭＶＥＧＦ１６５誘発細胞増殖５０％以上の検査化合物誘発抑制は顕著なアンタゴニスト活性を示す。結果をＦｉｇ．１８に示す。一覧にしたＩＣ５０値は、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）媒介拮抗作用（ＩＣ５０＝０．６８７ｎＭ）を陽性対照として確認する。
【０１３７】
捕捉剤の可溶性ＶＥＧＦへの結合は、細胞表面におけるＶＥＧＦＲ２への連結を防止し、受容体によるブロックシグナル伝達による増殖を減ずる。
実施例７：  薬物動態：
マウスへの静脈内投与（ＩＶ）及び腹腔内投与（ＩＰ）投与に続いて、２重リガンド２の予備的薬物動態評価を行った。
【０１３８】
ＨＰＬＣ−ＭＳ最適化：
検査化合物溶液を表１及び２に明記したように用意し、一定速度のシリンジポンプによりＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍソースに注入した。古スキャンＭＳ分析を行い、全イオンカレントクロマトグラム及び対応するマススペクトルを検査化合物につい陽イオン化モード及び陰イオン化モードの両方で発生させた。ＭＳ／ＭＳのための前駆イオンを、それぞれのイオン存在量の関数として、陽性もしくは陰性質量スペクトルのいずれかから選択した。加えて、定量分析での使用のため適切な選択されたフラグメンテーション反応を決定するため、プロダクトイオンＭＳ／ＭＳ分析を行った。成分の複雑な混合物内に存在する場合の検査化合物を定量化する能力を最大化するように、最終反応モニタリングパラメータを選択した。各検査化合物について使用すべき特定ＳＲＭ遷移の同定に続き、ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎワークスペースにおける自動化プロトコルを使用して、検出パラメータを最適化した。最後に、適当なＬＣカラムにおいて分析物を注入及び分離すること及び必要に応じて勾配条件を調節することにより、ＬＣ−ＭＳ分析に使用すべきクロマトグラフ条件を確認した。
【０１３９】
【表１】
2014531424.tif 000011
【０１４０】
【表２】
2014531424.tif 000012
結晶中線形性：
血漿のアリコートを特定濃度における検査化合物でスパイクした。スパイクしたサンプルを、アセトニトリル沈殿を使用して処理し、ＨＰＬＣ−ＭＳもしくはＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。ピーク領域対濃度の校正曲線を構築した。定量下限（ＬＬＱ）に沿って、アッセイの報告線形範囲を決定した。
定量生体分析（血漿）：
血漿サンプルを、アセトニトリル沈殿を使用して処理し、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。血漿校正曲線を生成された。薬物なし血漿のアリコートを、特定濃度における検査化合物でスパイクした。スパイクした血漿サンプルを、未知の血漿サンプルと一緒に同じ手順を使用して処理した。処理した血漿サンプルを−２０℃でＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析まで貯蔵した。ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析において時間ピーク領域を記録し、未知の血漿サンプルにおける検査化合物の濃度を、各校正曲線を使用して決定した。定量下限（ＬＬＱ）に沿って、アッセイの報告線形範囲を決定した。
調合：
リン酸緩衝塩類溶液，ｐＨ７．４（ＰＢＳ）における検査化合物の溶解度を目視検査によりまず評価する。化合物が標的濃度において可溶性であるならば、ＰＢＳを賦形剤として使用する。化合物がＰＢＳに十分に可溶性でないならば、ＩＶ投与に適合する他の賦形剤を評価してよい。このような賦形剤は、ＤＭＳＯ，Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５及びＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬその他を包含する。ＩＰ投与については、検査化合物がＰＢＳに十分に可溶性でないならば、ＤＭＳＯ／Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５／ＰＢＳ（５／５／９０，ｖ／ｖ／ｖ）もしくはＤＭＳＯ／１％メチルセルロース（５／９５，ｖ／ｖ）を賦形剤として使用してよい。カスタム調合を収容可能である。
マウスからの血漿サンプル回収（並列サンプリング）：
表３乃至５に明記したようにｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態特徴化を行った。動物を全身吸入麻酔（３％イソフルラン）で鎮静化し、心臓穿刺により血液を回収した。各マウスを採血（ｏｎｅ  ｂｌｏｏｄ  ｄｒａｗ）に付した。血液アリコート（３００乃至４００μＬ）をヘパリンリチウムでコートしたチューブに集め、穏やかに混合し、次いで氷上に保ち、回収１時間以内で４℃で１５分２，５００ｘｇで遠心分離した。血漿を次いで得て、さらなる処理まで−２０℃で凍結させて保った。
【０１４１】
【表３】
2014531424.tif 000013
【０１４２】
【表４】
2014531424.tif 000014
【０１４３】
【表５】
2014531424.tif 000015
化合物対時間のプロットを構築した。ＩＰ及びＩＶ投与後、化合物の主要薬物動態パラメータ（ＡＵＣｌａｓｔ，ＡＵＣＩＮＦ，Ｔｖ２，ＣＩ，ＶＺ，Ｖｓｓ，Ｔｍａｘ及びＣｍａｘ）が、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎを使用する血漿のノンコンパートメント分析（ＮＣＡ）から得られた。もし該当するならば、生体利用率を算出した。ノンコンパートメント分析は、薬物もしくは代謝物いずれかについて具体的コンパートメントモデルの前提データを必要としない。ＮＣＡは、血漿濃度−時間曲線における領域の測定ついて台形公式の適用を可能とする（Ｇａｂｒｉｅｌｓｓｏｎ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，  Ｄ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ．  １９９７）。
【０１４４】
各投与経路についての半減期のグラフをＦｉｇ．１９に示す。算出ＰＫパラメータを表６及び７に要約する。ペプチドについて予期されたように、ＩＶ投与により化合物は迅速にクリアされる（Ｔ１／２＝７分）．興味深いことに、ＩＶ半減期とＩＰ半減期（Ｔ１／２＝１５４分）との間には顕著な違いがある。ＩＰ投与についての半減期に対して２個のフェーズがあるようだ。これらの結果は、ＩＰが優れた投与経路であることを示唆する。
【０１４５】
【表６】
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【０１４６】
【表７】
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実施例８：  ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦ結合の阻害：
ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）へのヒトＶＥＧＦ１６５結合を阻害する捕捉剤の能力を測定するため、ＥＬＩＳＡプレートを、５０ｍＭ炭酸塩バッファー，ｐＨ  ９．６、中のヒトＩｇＧ  Ｆｃ（＃３０９−００６−００８；ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ，ＰＡ）に対して１０μｇ／ｍＬウサギＦ（ａｂ’）２で２５℃で２時間コートし、０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＴＢＳ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ  ＮａＣＩ，ｐＨ７．２５）中の５％脱脂粉乳で、一晩４℃でブロックした。０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＴＢＳ中の組み換えヒトＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ），Ｆｃキメラ（＃３５７−ＫＤ，１０μｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）をプレートで１時間２５℃でインキュベートした。捕捉剤もしくはＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）Ｆａｂの３倍段階希釈物を０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＴＢＳ中１％脱脂粉乳中の１０ｎＭ  ビオチン化ＶＥＧＦ１６５（＃２１４３５ＥＺ−ＬｉｎｋＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン化キット，Ｐｉｅｒｃｅ，ＩＬを使用してビオチン化した）とともに、１時間２５℃でインキュベートした。チューブからの溶液を次いでＥＬＩＳＡプレートに写し、５分間インキュベートした。０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＴＢＳ中で調製された０．２μｇ／ｍＬホースラディッシュ  ペルオキシダーゼ−標識ストレプトアビジン（＃ａｂ７４０３；Ａｂｃａｍ，ＭＡ）を使用して、結合ビオチン化ＶＥＧＦ１６５を検出し、次いでＱｕａｎｔａＲｅｄ（登録商標）増強化学蛍光ＨＲＰ基質を添加することにより現像した。５３５ｎｍの励起波長を使用し、捕捉剤濃度の関数として５９５ｎｍの蛍光発光をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＴＸ８８０光度計（Ｂｒｅａ，ＣＡ）により記録した。４パラメータ回帰曲線フィッティングプログラム（Ｏｒｉｇｉｎ  ８．５，  Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，  ＭＡ）を使用して、滴定曲線をあてはめた。滴定曲線の中点吸光度に対応するペプチドの濃度を算出し、ＩＣ５０値として使用した。
【０１４７】
これら捕捉剤の３重リガンド２及び３、２重リガンド２及びアンカーリガンドのｉｎ  ｖｉｔｒｏブロッキングポテンシャルをＦｉｇ．２０に示す。３重リガンド１及び４ｉｎ  ｖｉｔｒｏブロッキングポテンシャルをさらにＦｉｇ．７２に示す。アンカーも２重リガンド２も、検査した濃度において（＜５０μＭ）結合する受容体をブロックしなかった。従って３重リガンド捕捉剤の３次リガンド成分はブロッキング活性に顕著に貢献しているように見える一方で、アンカー及び２次リガンド成分は親和性及び特異性における増強をもたらす。この適用（３重リガンド２乃至４）において確認された３重リガンド捕捉剤の３つのクラスは、それぞれ受容体結合部位と顕著に重複する結合部位を有することが分かった。３重リガンド２（ＩＣ５０＝２μＭ）について最大のｉｎ  ｖｉｔｒｏブロッキング効果が観察され、これはＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）Ｆａｂについて測定されたＩＣ５０の１００倍以内である。ＶＥＧＦの部分的封鎖でさえ、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍血管新生をブロックするのに十分であり得る（Ｌｉａｎｇ  ２００６）。
実施例９：  Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）ＦａｂへのＶＥＧＦ結合の阻害：
Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）Ｆａｂの存在下、ＶＥＧＦにおける受容体相互作用表面への捕捉剤結合を定量するのに、固相競合アッセイを使用した。３重リガンド捕捉剤及びＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）Ｆａｂは同様の結合親和性を共有するので、濃度依存競合は、これらが結合エピトープを共有することを確認する。
【０１４８】
ＮＵＮＣ  ＭＡＸＩＳＯＲＰ（登録商標）マイクロタイタープレートを、５０ｍＭ炭酸塩バッファー，ｐＨ９．６，中１０μｇ／ｍＬ  Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）Ｆａｂで、２５℃で２時間コートし、０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＴＢＳ（２５ｍＭＴｒｉｓ，１５０ｍＭ  ＮａＣＩ，ｐＨ７．２５）中５％脱脂粉乳とともに一晩４℃でブロックした。捕捉剤の２倍段階希釈物を、０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＴＢＳ中１％脱脂粉乳中１０ｎＭビオチン化ＶＥＧＦ１６５とともにＦａｂ固定化プレート上で１時間インキュベートした。結合したビオチン化ＶＥＧＦ１６５を、０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＴＢＳ中で調製した０．２μｇ／ｍＬホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ標識化ストレプトアビジン（＃ａｂ７４０３；Ａｂｃａｍ，ＭＡ）を使用して検出し、ＱｕａｎｔａＲｅｄ（登録商標）増強化学発光ＨＲＰ基質を添加することにより現像した。５３５ｎｍの励起波長を使用し、捕捉剤濃度の関数として５９５ｎｍの蛍光発光をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＴＸ８８０光度計（Ｂｒｅａ，ＣＡ）により記録した。４パラメータ回帰曲線フィッティングプログラム（Ｏｒｉｇｉｎ８．５，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、滴定曲線をあてはめた。滴定曲線の中点吸光度に対応するペプチドの濃度を算出し、ＩＣ５０値として使用した。
【０１４９】
Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）Ｆａｂと捕捉剤とのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  競合をＦｉｇ．２１に示す。ＶＥＧＦブロッキングは、３重リガンド２（ＩＣ５０＝０．４μＭ）及び３重リガンド１及び３（ＩＣ５０＝２μＭ）で観察された。ＶＥＧＦにおける３重リガンド結合エピトープはＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）Ｆａｂについてのエピトープと重複することが示唆される。２重リガンド２は濃度依存競合をも示したが、３重リガンド捕捉剤ほど顕著ではなかった。３次リガンド成分はエピトープのより大きい適応範囲となる特異的結合特性を与えるらしいことが示唆される。
実施例１０：  血漿タンパク質結合：
平衡透析テクニックを、非結合検査化合物のフラクションをタンパク質に結合したフラクションから分離するのに使用した。
【０１５０】
テフロン（登録商標）から構築した透析ブロックで９６ウェルフォーマットにおいてアッセイを行った。タンパク質マトリックスを、最終ＤＭＳＯ濃度１％（ｖ／ｖ）を有する１０μＭ（ｎ＝２）において検査化合物でスパイクした。透析物コンパートメントに１５０μＬリン酸塩バッファー（ｐＨ７．５）をロードし、サンプル側に同量のスパイクしたタンパク質マトリックス同僚をロードした。透析プレートを次いでシールし、３７℃で一晩（１８±２時間）インキュベートした。インキュベート後、サンプルを各コンパートメントから取出し、リン酸塩バッファーで希釈し、アセトニトリルの添加及び遠心分離が続いた。次いで上澄をＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に使用した。アッセイサンプルと同じやりかたでスパイクしたタンパク質マトリックスからコントロールサンプル（ｎ＝２）を調製した（透析なし）。このコントロールサンプルを回収率測定についての基準として利用する。サンプルを、選択された反応モニタリングを使用するＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。ＨＰＬＣ条件は、Ｃ１８カラム（２ｘ２０ｍｍ）を有するバイナリＬＣポンプ、及び勾配溶出からなった。タンパク質への％結合及び回収は以下のように算出した。
【０１５１】
【数１】
2014531424.tif 000018
式中Ａｒｅａｐｅは平衡でのタンパク質マトリックスにおける分析物のピーク面積であり、Ａｒｅａｂｅは平衡でのアッセイバッファー中分析物のピーク面積であり、Ｖｐｅは平衡でのタンパク質マトリックスの体積であり、ＶＰはタンパク質マトリックスの初期体積であり、Ａｒｅａｃｓはコントロールサンプル中の分析物のピーク面積である。回収率測定は、算出タンパク質結合値の信頼性の指標として役立った。
【０１５２】
最も成功した薬物は血漿結合成分を有する。低血漿タンパク質結合は高特異性を説明するが、一方で高程度の血漿タンパク結合は、ある化合物がより長い循環時間及びより乏しい特異性を犠牲にして標的への潜在的に増加したアクセス示すことを予測する。血漿タンパク質結合結果の分析は、２重リガンド２（Ｂｉｌｉｇ２−Ｉｆｒｅｗ）が低血漿タンパク質結合を示す（Ｆｉｇ．２２）一方で、２重リガンド３（Ｂｉｌｉｇ３−ｆｓｒｋｔｅ）はより高レベルの血漿タンパク質結合を呈したことを示す。捕捉剤による血漿タンパク質結合は、オクトレオチド（ペプチド治療薬）及びワルファリン（小分子薬物）に対して十分に匹敵する。捕捉剤についての血漿タンパク質結合の傾向は、プルダウンアッセイ及びウエスタンブロット結果における傾向（実施例４）を反映している。％タンパク質回収率は全ての捕捉剤について高く、アッセイの最中にサンプルの劣化がないことを示唆している。
実施例１１：  ヒト血漿及びマウス肝臓ミクロソームにおける安定性：
ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により様々な時点でヒト血漿における捕捉剤安定性を定量した。
【０１５３】
ヒト血漿を３７℃水浴で５分間予熱した後、最終ＤＭＳＯ濃度０．５％（ｖ／ｖ）を有する５μＭ検査化合物を添加した。３７℃水浴で０，１５，３０，４５及び６０分間インキュベーションを行った。各時点で、インキュベーション混合物のアリコートをアセトニトリルに移した。次いでサンプルを混合し、遠心分離した。上澄をＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に使用した。サンプルを、選択された反応モニタリングを使用するＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。ＨＰＬＣシステムは、オートサンプラを有するバイナリＬＣポンプ、Ｃ−１８カラム及び勾配からなった。検査化合物に対応するピーク面積を記録した。化合物残余（％）を、時間ゼロに対して各時点におけるピーク面積を比較することにより算出した。
【０１５４】
検査化合物をリン酸塩バッファー（ｐＨ７．４）中にプールしたマウス肝臓ミクロソーム（雄ＣＤ−１，０．３ｍｇ／ｍＬ）とともに５分間３７℃振盪水浴でプレインキュベートした。検査化合物の濃度は、０．０１％ＤＭＳＯ，０．２５％アセトニトリル及び０．２５％メタノールに対して１μＭであった。反応を、ＮＡＤＰＨ生成システム（１．３ｍＭ  ＮＡＤＰ，３．３ｍＭ  Ｇ６Ｐ及び０．４Ｕ／ｍＬ  Ｇ６ＰＤＨアーゼ）を添加することにより開始し、０，１５，３０，４５及び６０分間インキュベートした。インキュベーション混合物を当量のアセトニトリル／メタノール（１／１，ｖ／ｖ）に移すことにより、反応を停止した。次いでサンプルを混合し、遠心分離した。上澄をＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に使用した。サンプルを、選択された反応モニタリングを使用するＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。ＨＰＬＣシステムは、オートサンプラを有するバイナリＬＣポンプ、Ｃ−１８カラム及び勾配からなった。検査化合物に対応するピーク面積を記録した。化合物残余（％）を、時間ゼロに対して各時点におけるピーク面積を比較することにより算出した。化合物残余（％）の対数曲線の初期線形範囲対時間の傾きから、一次速度論を仮定し、半減期を算出した。さらに、半減期から固有クリアランスを算出した。
【０１５５】
検査した捕捉剤は全て、３７℃６０分のアッセイ期間にわたりヒト血漿及びマウス肝臓ミクロソームにおいて安定であった（Ｆｉｇ．２３）。捕捉剤安定性はペプチド（例えばオクトレオチド）のそれと同様であり、いくつかの小分子（例えばプロパンテリン，プロパノロール）のそれを上回る。これは、捕捉剤を劣化を予知することなくｉｎ  ｖｉｖｏ投与してよいことの兆候である。
実施例１２：  ３重リガンド捕捉剤の４量体バリアント：
ストレプトアビジン台上で非共有結合的アセンブリにより３重リガンド２の４量体バリアントを調製した。ストレプトアビジンは、きわめて高い親和性（ＫＤ〜１ｘ１０−１５Ｍ）及び特異性でビオチンに結合する、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉにより生成される４量体タンパク質であり、３重リガンド捕捉時あの官能的ポテンシャルを増進するのに理想的な台を代表する。単一ストレプトアビジン４量体を、４個の異なるビオチン分子に、あるいは下に明らかなように４個のビオチン化捕捉剤に結合してよい。
【０１５６】
３重リガンド４量体を調製するため、ＤＭＳＯ中４．１９ｍＭ３重リガンド２保存溶液４．１μＬ（４．５当量）及びリン酸緩衝塩類（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）中１９μＭストレプトアビジン４量体２００μＬ（１当量；Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｚ７０４１）を、ローテータにおいて４℃６０分間インキュベートした（Ｆｉｇ．２４）。空位のビオチン結合部位含有コンジュゲート（即ちＳａ４量体につき３重リガンド４個未満を有するコンジュゲート）を除去するため、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ａｇａｒｏｓｅ（＃２０２１８）を引き続き添加し、この混合物をローテータ上４℃で６０分インキュベートした。この処理の後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン（１０ｍｇ／ｍＬスラリー，６５０−９００ｐｍｏｌ／ｍｇビオチン結合能力；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１１２−０６Ｄ）２ｍＬを添加及びローテータ上４℃で３０分間インキュベートして、全ての過剰なビオチン化分子を除去した。精製３重リガンド４量体を得るため、最終的に、磁場を適用することにより（ＤｙｎａＭａｇ（登録商標）−Ｓｐｉｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１２３−２０Ｄ）Ｓａ−Ｄｙｎａｂｅａｄをペレット化した。
【０１５７】
共有結合したプローブもしくは官能基（例えばＤＯＴＡ，フルオロフォア酵素タグ，追加のビオチン分子）を含む、上述の３重リガンド４量体のバリアントを生成してよい。ＤＯＴＡ−標識３重リガンド２  ４量体を製造する典型的な方法をＦｉｇ．２５及びに２７に示す。ＨＲＰ−標識３重リガンド２  ４量体を製造する典型的な方法をＦｉｇ．５０に示す。これらの方法は、興味の対象となるいずれの官能基と組み合わせたいずれのビオチンコンジュゲート捕捉剤に一般的に適用可能である。Ｆｉｇ．５０に明らかな方法は、単一分子内に共有結合Ｃ−末端ビオチン及びＮ−末端ＤＯＴＡ標識の両方を有する２官能性３重リガンド２を利用する（Ｆｉｇ．２６）。非標識化３重リガンドについて上述のようにストレプトアビジン台上で非共有結合的アセンブリにより、標識化３重リガンド２  ４量体を調製した。
【０１５８】
Ｆｉｇ．２７に明らかな方法は、Ｃ−末端システイン残基を発現するストレプトアビジンの設計したバリアントを利用する（Ｋｗｏｎｇ  ２００９）。このＣ−末端システイン残基を、チオール反応性カップリグにより３重リガンド  ４量体に、様々な標識基（例えばＤＯＴＡ，ビオチンもしくはフルオロフォア）を取り付けるのに使用してよい（例えばＵＳ特許出願公開Ｎｏ．２０１１／００３９７１７を参照）。Ｆｉｇ．２７において，Ｃ−−末端システインを、ＤＯＴＡ−標識ストレプトアビジン４量体を生成するのに使用する。この実施例においてストレプトアビジン４量体を、マレイミド−モノ−アミド−ＤＯＴＡ（Ｂ−２７２；Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ，ＴＸ）と反応させる。過剰なＤＯＴＡラベルを除去する透析の後、ビオチン標識化３重リガンド２（Ｆｉｇ．２８）を上述のように４量体に結合する。
【０１５９】
Ｆｉｇ．５０に明らかな方法は、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合した３重リガンド２  ４量体という結果になる。
【０１６０】
単離３重リガンド  ４量体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％ゲル）により特徴化される。完全４量体を保持するため、非還元条件下及び煮沸なしでサンプルは調製される。ＶＥＧＦに対する親和性及び特異性について、４量体３重リガンド捕捉剤は評価され、及びさらにｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えばＶＥＧＦＲからＶＥＧＦの置換及び／又は拮抗作用は細胞成長を減ずる結果となる）及びｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば血管新生の減少）生物学的活性についても評価される。
実施例１３：  捕捉剤の他の多量体バリアント：
ここに開示される２重リガンド及び３重リガンドの多量体バリアント（例えば２量体，３量体及び４量体）は様々な方法で合成される。
【０１６１】
２重リガンド２についてＦｉｇ．２９に示す方法を使用して、ホモ多量体２重リガンド捕捉剤を合成してよい。側鎖保護Ｘ−ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ−Ｔｚ４−Ｉｆｒｅｗ（式中ＸはＰＥＧ化されたレポータータグ（例えばビオチン−ＰＥＧ，ＤＯＴＡ−ＰＥＧ，等）もしくはＮ−末端キャッピング基（例えばアセチル）である）から多量体バリアントが合成される。多数の（２，３もしくは４）反応性部位からなる商業的に入手可能なＰＥＧ化されたリンカーにより、合成は開始し、アミドカップリング手順に続く。
【０１６２】
２重リガンド２についてＦｉｇ．３１に示される方法を使用して、ホモ多量体２重リガンド捕捉剤も合成されてよい。側鎖保護Ｘ−ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ−Ｔｚ４−Ｉｆｒｅｗ−Ａｚ４（式中ＸはＰＥＧ化されたレポータータグ（例えばビオチン−ＰＥＧ，ＤＯＴＡ−ＰＥＧ，等）もしくはＮ−末端キャッピング基（例えばアセチル）である)から多量体バリアントが合成される。多数の反応性部位からなる商業的に入手可能なＰＥＧ化されたリンカーにより、合成は開始する。各部位はまずアルキン部分により付加され、次いでＣｕＡＡＣを介して捕捉剤にコンジュゲートする。
【０１６３】
ホモ多量体３重リガンド捕捉剤も生成される。例えば、３重リガンド２の多量体バリアントをＸ−ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ−Ｔｚ４−Ｉｆｒｅｗ−Ｔｚ４−ｅｅｉｒｄ（式中ＸはＰＥＧ化されたレポータータグ（例えばビオチン−ＰＥＧ，ＤＯＴＡ−ＰＥＧ，等）もしくはＮ−末端キャッピング基（例えばアセチル）である)から合成してよい。この方法により生成される典型的３重リガンド２ホモ２量体の構造はＦｉｇ．３０に明らかである。同様に、３重リガンド２の多量体バリアントをＸ−ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ−Ｔｚ４−Ｉｆｒｅｗ−Ｔｚ４−ｅｅｉｒｄ−Ａｚ４（式中ＸはＰＥＧ化されたレポータータグ（即ちビオチン−ＰＥＧ，ＤＯＴＡ−ＰＥＧ，等）もしくはＮ−末端キャッピング基（即ちアセチル）である)から合成してよく、次いで上記のように評価される。この方法により生成される典型的３重リガンド２ホモ２量体の構造はＦｉｇ．３２に明らかである。
【０１６４】
２重リガンド及び３重リガンド捕捉剤のヘテロ多量体バリアントを様々な方法により合成してもよい。例えば、Ｆｉｇ．３３に明らかな３重リガンド２及び３のヘテロ２量体を、上述のように共有結合を介して調製される。合成されたヘテロ２量体（ここで２量体の各ペプチドは配列において異なり、それぞれは単一タンパク質における別個の重複しないエピトープと相互作用する）は結合親和性及び／又は２個のペプチドを結合する適当な長さのリンカーによる受容体ブロッキングにおける向上を最大化し得る。
【０１６５】
ＶＥＧＦに対する向上した親和性及び特異性について、多量体２重リガンド及び３重リガンドは評価される。多量体捕捉剤はさらにｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えばＶＥＧＦＲからＶＥＧＦの置換及び／又は拮抗作用は細胞成長を減ずる結果となる）及びｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば血管新生の減少）両方の生物学的活性についても評価される。多量体捕捉剤は、捕捉剤及び／又は他のペプチドの様々な非共有結合混合物と比較して評価される。
実施例１４：  ＰＥＧ化３重リガンド２の合成：
Ｘ−３重リガンド２のＰＥＧ化バリアント（Ｆｉｇ．３４）（ここでＸはビオチン−ＰＥＧ３リンカーもしくはＮ−末端キャッピング基（例えばアセチル）である）を調製した。アミドカップリング手順を使用し、３重リガンド２を商業的に入手可能な直鎖もしくは分岐のＰＥＧ化モジュールに共有結合した。
【０１６６】
ＣＴＣ樹脂上の側鎖保護Ｎ−アセチル３重リガンドの調製。マイクロ波アシストＦｍｏｃベース固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して、２−クロロトリチルクロリド（ＣＴＣ）樹脂上でＸ−３重リガンド２を調製した。製造供給元のプロトコルに従い、第１のアミノ酸は樹脂に取り付けた。残りの３重リガンドを製造するため、樹脂をＣＥＭ  Ｌｉｂｅｒｔｙ１マイクロウェーブペプチド合成装置に移した。各アミノ酸カップリング反応は、４当量Ｆｍｏｃ−アミノ酸、４当量ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−ホスファート）及び１０当量Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を包含した。Ｆｍｏｃ基の脱保護は２０％ピペリジン／ＮＭＰを、次いでＮＭＰによる洗浄を必要とした。４当量Ｆｍｏｃ−アミノ酸、４当量ＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート）及び１０当量Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を包含するため、２個のＴｚ４リンカーのカップリング条件を変更した。Ｆｍｏｃ基の脱保護は２０％ピペリジン／ＮＭＰを、次いでＮＭＰによる洗浄を必要とした。
【０１６７】
オプション（Ａ）：  最終Ｎ−末端キャッピング（０．１２５ｍｍｏｌスケール）のため、樹脂をＤＩＥＡ（１．１ｍＬ），ＮＭＰ（１．０ｍＬ）及び無水酢酸（０．６ｍＬ）の溶液にさらした。室温で３０分間振盪後、樹脂を濾過し、ＮＭＰ（３ｘ），ＤＣＭ（３ｘ）及びＭｅＯＨ（３ｘ）で洗った。樹脂を真空下で〜１０分間乾燥した。
【０１６８】
オプション（Ｂ）：  Ｎ−末端ビオチン化３重リガンドの製造のため、ＣＥＭ  Ｌｉｂｅｒｔｙ１マイクロウェーブペプチド合成装置を使用して、ＰＥＧ３リンカー及びビオチン基を３重リガンド含有樹脂に結合した。カップリング条件は、４当量ＰＥＧ３リンカー含有Ｆｍｏｃ−アミノ酸、４当量ＨＢＴＵ及び１０当量ＤＩＥＡであった。Ｆｍｏｃ基の脱保護は２０％ピペリジン／ＮＭＰを、次いでＮＭＰによる洗浄を必要とした。ビオチンのためのカップリング条件は、ＤＭＳＯ／ＮＭＰ（１：１）に溶解したビオチン４当量、ＨＢＴＵ４当量及びＤＩＥＡ１０当量であった。樹脂を濾過し、ＮＭＰ（３ｘ），ＤＣＭ（３ｘ）及びＭｅＯＨ（３ｘ）で洗い、真空下で〜１０分間乾燥した。
【０１６９】
ＣＴＣ樹脂（０．２５ｍｍｏｌスケール）からの側鎖保護３重リガンドの開裂。ＤＣＭ／ＴＦＥ（８：２）３−４ｍＬを乾燥側鎖保護３重リガンド樹脂に添加した。室温で１時間撹拌後、樹脂を木綿もしくはグラスウールを通して〜３０ｍＬ冷エーテル含有遠心分離チューブ濾過した。白色沈殿を形成した。沈殿を形成しなくなるまで樹脂を８：２ＤＣＭ／ＴＦＥで洗った（〜３−４ｍＬ）。合計体積５０ｍＬまで、追加のエーテルを添加し、次いで粗生成物を遠心分離した（４５００ｒｐｍ，５分，４℃）。遠心分離の後、上澄を除去し、粗製固体を凍結乾燥した。
【０１７０】
Ｃ−末端直鎖ＰＥＧ４０  ＰＥＧ化を有するＡｃ−３重リガンドの製造。側鎖保護Ａｃ−３重リガンド（１２５ｍｇ，１７．２μｍｏｌ）を、Ａｒでパージしたバイアルに添加し、無水ＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解した。次いで０．５Ｍ  ＨＡＴＵ／ＨＯＡｔ（３４μＬ，１７μｍｏｌ）の溶液及びＤＩＥＡ（２．９μＬ，１６．６μｍｏｌ）を添加し、１５分間室温で撹拌した。この間、ＰＥＧ４０アミン（１００ｍｇ，２．５μｍｏｌ；Ｊｅｎｋｅｍ＃Ｍ−ＮＨ２−４０Ｋ）を別個に無水ＤＣＭ（０．５ｍＬ）に溶解した。Ａｃ−３重リガンド含有反応混合物を室温でＰＥＧ４０アミン溶液に添加し、次いで一晩（１２−１６時間）撹拌した。この反応混合物を３０ｍＬ冷エーテルを有する遠心分離チューブに滴下し、白色沈殿物を形成させた。チューブを冷エーテルで〜４５ｍＬまで満たした後、サンプルを遠心分離した３ｘ（４５００ｒｐｍ，５分，４℃）。遠心分離の後、上澄を除去し、粗製固体を凍結乾燥した。
【０１７１】
Ｃ−末端分岐ＰＥＧ４０  ＰＥＧ化を有するＡｃ−３重リガンドの製造。側鎖保護Ａｃ−３重リガンド（１２５ｍｇ，１７．２μｍｏｌ）を、Ａｒでパージしたバイアルに添加し、無水ＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解した。次いで０．５Ｍ  ＨＡＴＵ／ＨＯＡｔ（３４μＬ，１７μｍｏｌ）の溶液及びＤＩＥＡ（２．９μＬ，１６．６μｍｏｌ）を添加し、１５分間室温で撹拌した。この間、Ｙ字型ＰＥＧ４０アミン（１００ｍｇ，２．５μｍｏｌ；Ｊｅｎｋｅｍ＃Ｙ−ＮＨ２−４０Ｋ）を別個に無水ＤＣＭ（０．５ｍＬ）に溶解した。Ａｃ−３重リガンド含有反応混合物を室温でＹ字型ＰＥＧ４０アミン溶液に添加し、次いで一晩（１２−１６時間）撹拌した。この反応混合物を、３０ｍＬ冷エーテルを有する遠心分離チューブに滴下し、白色沈殿物を形成させた。チューブを冷エーテルで〜４５ｍＬまで満たした後、サンプルを遠心分離した３ｘ（４５００ｒｐｍ，５分，４℃）。遠心分離の後、上澄を除去し、粗製固体を凍結乾燥した。
【０１７２】
ビオチン化ＰＥＧ化３重リガンドを同様の方法により製造したが、側鎖保護３重リガンドの出発物質はＮ−末端ビオチンリンカーを有していた。
【０１７３】
脱保護及びジスルフィド環化。粗製ＰＥＧ化３重リガンド（上記由来）をＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／トリイソプロピルシラン［ＴＩＳ］／２，２’−（エチレンジオキシ）−ジエタンジオール［ＤＯＤＴ］（９２．５／２．５／２．５／２．５）  ２．５−３．５ｍＬに溶解し、次いで室温で４時間撹拌した。冷エーテル（〜４５ｍＬ）を次いで各チューブに添加した。チューブを激しく浸透し、次いで遠心分離した（４５００ｒｐｍ，５分，４℃）。上澄除去後、粗製固体を別の冷エーテル４５ｍＬに際懸濁し、２回以上遠心分離した。最終の上澄を除去し、粗製固体を凍結乾燥した。
【０１７４】
ジスルフィド環化のため、粗製固体をＤＭＳＯ２５０μＬに溶解した。固体がほとんど溶解した後、Ｈ２Ｏ（２．５ｍＬ）を添加し、炭酸アンモニウム（５％）溶液を滴下することによりｐＨ６−７に達するまで、ｐＨを調節した。この混合物を室温で≧４時間撹拌した。この溶液をさらにメタノールで希釈し、次いでＨＰＬＣにより直接精製した。
【０１７５】
ＰＥＧ化合成反応はＦｉｇ．３５及び３６に要約される。ＰＥＧ化３重リガンドは、ＶＥＧＦについての親和性及び特異性について、並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ生物学的活性について評価される。
実施例１５：  多アームＰＥＧ化台における３重リガンド多量体化：
Ｘ−３重リガンド２の２量体及び４量体バリアント（Ｆｉｇ．３４）（ここでＸはビオチン−ＰＥＧ３リンカーもしくはＮ−末端キャッピング基（例えばアセチル）である）を調製した。アミドカップリング手順を使用し、３重リガンド２を商業的に入手可能な、複数（２個もしくは４個）藩の性部位からなる多アームＰＥＧ化リンカーに共有結合した。
【０１７６】
ＣＴＣ樹脂上の側鎖保護Ｎ−アセチル３重リガンドの調製。マイクロ波アシストＦｍｏｃベース固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して、２−クロロトリチルクロリド（ＣＴＣ）樹脂上でＸ−３重リガンド２を調製した。製造供給元のプロトコルに従い、第１のアミノ酸は樹脂に取り付けた。残りの３重リガンドを製造するため、樹脂をＣＥＭ  Ｌｉｂｅｒｔｙ１マイクロウェーブペプチド合成装置に移した。各アミノ酸カップリング反応は、４当量Ｆｍｏｃ−アミノ酸、４当量ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−ホスファート）及び１０当量Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を包含した。Ｆｍｏｃ基の脱保護は２０％ピペリジン／ＮＭＰを、次いでＮＭＰによる洗浄を必要とした。４当量Ｆｍｏｃ−アミノ酸、４当量ＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート）及び１０当量Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を包含するため、２個のＴｚ４リンカーのカップリング条件を変更した。Ｆｍｏｃ基の脱保護は２０％ピペリジン／ＮＭＰを、次いでＮＭＰによる洗浄を必要とした。
【０１７７】
オプション（Ａ）：  最終Ｎ−末端キャッピング（０．１２５ｍｍｏｌスケール）のため、樹脂をＤＩＥＡ（１．１ｍＬ），ＮＭＰ（１．０ｍＬ）及び無水酢酸（０．６ｍＬ）の溶液にさらした。室温で３０分間振盪後、樹脂を濾過し、ＮＭＰ（３ｘ），ＤＣＭ（３ｘ）及びＭｅＯＨ（３ｘ）で洗った。樹脂を真空下で〜１０分間乾燥した。
【０１７８】
オプション（Ｂ）：  Ｎ−末端ビオチン化３重リガンドの製造のため、ＣＥＭ  Ｌｉｂｅｒｔｙ１マイクロウェーブペプチド合成装置を使用して、ＰＥＧ３リンカー及びビオチン基を３重リガンド含有樹脂に結合した。カップリング条件は、４当量ＰＥＧ３リンカー含有Ｆｍｏｃ−アミノ酸、４当量ＨＢＴＵ及び１０当量ＤＩＥＡであった。Ｆｍｏｃ基の脱保護は２０％ピペリジン／ＮＭＰを、次いでＮＭＰによる洗浄を必要とした。ビオチンのためのカップリング条件は、ＤＭＳＯ／ＮＭＰ（１：１）に溶解したビオチン４当量、ＨＢＴＵ４当量及びＤＩＥＡ１０当量であった。樹脂を濾過し、ＮＭＰ（３ｘ），ＤＣＭ（３ｘ）及びＭｅＯＨ（３ｘ）で洗い、真空下で〜１０分間乾燥した。
【０１７９】
ＣＴＣ樹脂（０．２５ｍｍｏｌスケール）からの側鎖保護３重リガンドの開裂。ＤＣＭ／ＴＦＥ（８：２）３−４ｍＬを乾燥側鎖保護３重リガンド樹脂に添加した。室温で１時間撹拌後、樹脂を木綿もしくはグラスウールを通して〜３０ｍＬ冷エーテル含有遠心分離チューブ濾過した。白色沈殿を形成した。沈殿を形成しなくなるまで樹脂を８：２ＤＣＭ／ＴＦＥで洗った（〜３−４ｍＬ）。合計体積５０ｍＬまで、追加のエーテルを添加し、次いで粗生成物を遠心分離した（４５００ｒｐｍ，５分，４℃）。遠心分離の後、上澄を除去し、粗製固体を凍結乾燥した。
【０１８０】
Ａｃ−４量体の製造。側鎖保護Ａｃ−３重リガンド（７６０ｍｇ，０．１０５ｍｍｏｌ）Ａｒでパージしたバイアルに添加し、無水ＤＭＦ（２．０ｍＬ）に溶解した。ＨＡＴＵ（３８ｍｇ，０．１００ｍｍｏｌ），ＨＯＡｔ（１３．６ｍｇ，０．１００μｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１７μＬ，９７．６μｍｏｌ）を次いで添加し、１５分間室温で撹拌した。この間、４ＡＲＭ  ＰＥＧ４０アミン（２００ｍｇ，５．０μｍｏｌ；Ｊｅｎｋｅｍ＃４ＡＲＭ−ＮＨ２−４０Ｋ）を別個に無水ＤＣＭ（１．５ｍＬ）に溶解した。Ａｃ−３重リガンド含有反応混合物を室温で４ＡＲＭ  ＰＥＧ４０アミン溶液に添加し、次いで一晩（１２−１６時間）撹拌した。この反応混合物を３０ｍＬ冷エーテルを有する遠心分離チューブ２本に滴下し、白色沈殿物を形成させた。各チューブを冷エーテルで〜４５ｍＬまで満たした後、サンプルを遠心分離した３ｘ（４５００ｒｐｍ，５分，４℃）。遠心分離の後、上澄を除去し、粗製固体を凍結乾燥した。
【０１８１】
Ａｃ−２量体の製造。側鎖保護Ａｃ−３重リガンド（２０８ｍｇ，２８．７μｍｏｌ）をＡｒでパージしたバイアルに添加し、無水ＤＭＦ（２．０ｍＬ）に溶解した。次いでＨＡＴＵ（１８．７ｍｇ，４９．２μｍｏｌ），ＨＯＡｔ（７．１５ｍｇ，５２．５μｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（８．５μＬ，４８．８μｍｏｌ）を添加し、１５分間室温で撹拌した。この間、２ＡＲＭ  ＰＥＧ７．５アミン（３７．５ｍｇ，５．０μｍｏｌ；Ｊｅｎｋｅｍ＃ＮＨ２−ＰＥＧ７５００−ＮＨ２）を別個に無水ＤＣＭ（１．５ｍＬ）に溶解した。Ａｃ−３重リガンド含有反応混合物を室温で２ＡＲＭ  ＰＥＧ７．５アミン溶液に添加し、次いで一晩（１２−１６時間）撹拌した。この反応混合物を、３０ｍＬ冷エーテルを有する遠心分離チューブ２本に滴下し、白色沈殿物を形成させた。各チューブを冷エーテルで〜４５ｍＬまで満たした後、サンプルを遠心分離した３ｘ（４５００ｒｐｍ，５分，４℃）。遠心分離の後、上澄を除去し、粗製固体を凍結乾燥した。
【０１８２】
ビオチン化３重リガンド２量体及び４量体を同様の方法により製造したが、側鎖保護３重リガンドの出発物質はＮ−末端ビオチンリンカーを有していた。
【０１８３】
脱保護及びジスルフィド環化。粗製ＰＥＧ化ＰＣＣ２量体もしくは４量体（上記由来）をＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／トリイソプロピルシラン［ＴＩＳ］／２，２’−（エチレンジオキシ）−ジエタンジオール［ＤＯＤＴ］（９２．５／２．５／２．５／２．５）  ２．５−３．５ｍＬに溶解し、次いで室温で４時間撹拌した。冷エーテル（〜４５ｍＬ）を次いで各チューブに添加した。チューブを激しく浸透し、次いで遠心分離した（４５００ｒｐｍ，５分，４℃）。上澄除去後、粗製固体を別の冷エーテル４５ｍＬに際懸濁し、２回以上遠心分離した。最終の上澄を除去し、粗製固体を凍結乾燥した。
【０１８４】
ジスルフィド環化のため、粗製固体をＤＭＳＯ２５０μＬに溶解した。固体がほとんど溶解した後、Ｈ２Ｏ（２．５ｍＬ）を添加し、炭酸アンモニウム（５％）溶液を滴下することによりｐＨ６−７に達するまで、ｐＨを調節した。この混合物を室温で≧４時間撹拌した。この溶液をさらにメタノールで希釈し（必要により２．５ｍＬ以上）、次いでＨＰＬＣにより直接精製した。
【０１８５】
多量体化合成反応はＦｉｇ．３７及び３８に要約される。ＰＥＧ化３重リガンドは、ＶＥＧＦについての親和性及び特異性について、並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ生物学的活性について評価される。
実施例１６：  ３重リガンド多量体化及び修飾：
ＶＥＧＦ捕捉剤のＣ−末端は医薬品化学最適化のためのポテンシャル部位を提供する。カルボン酸末端（−ＣＯＯＨ）は生理学的ｐＨでマイナスに帯電している一方で、カルボキサミド末端（−ＣＯＮＨ２）は帯電中性である。捕捉剤の標的とされるタンパク質エピトープの性質に依存して、Ｃ−末端は他よりも向上した特性を有し得る。
【０１８６】
固定化ｒｈＶＥＧＦＲ２を使用する実施例８に明らかなように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ競合結合アッセイを行った。多量体ストレプトアビジンコンジュゲート３重リガンド２のそれに接近するブロッキングにより、３重リガンド２−ＣＯＯＨはカルボキサミド末端を有するオリジナル３重リガンド２の〜４ｘの向上をブロッキングにおいて見せた（Ｆｉｇ．３９）。３重リガンド２−ＣＯＯＨ及び３重リガンド２−ＣＯＮＨ２の多量体ストレプトアビジンコンジュゲートは同様にブロックすることが分かった（Ｆｉｇ．３９）。これらの結果は、抗ＶＥＧＦ３重リガンドにおけるＣ−末端カルボキサミドからＣ−末端カルボン酸への変化はｉｎ  ｖｉｔｒｏブロッキングのために重要であること、ただし最適化はモノマーのためだけに重要であることを示唆する。別の競合結合実験において、ＰＥＧ２アーム−３重リガンド２（２量体）はモノマー３重リガンド２に対して増強された結合を見せた一方で、ＰＥＧ４アーム−３重リガンド２（４量体）によるブロッキングはさらなる向上を示唆しており、多量体ストレプトアビジン−コンジュゲート３重リガンド２のブロッキングに接近する（Ｆｉｇ．４０）。概して、これらの結果は、多量体化はブロッキングに対して支配的な影響であり得ること、親和性及びサイズ貢献の両方に起因し得ることを示唆している。
【０１８７】
結合親和性ＥＬＩＳＡアッセイを、実施例３に明らかなとおり行った。多量体ストレプトアビジン−コンジュゲート３重リガンド２及びＰＥＧ４アーム−３重リガンド２（４量体）は、ｒｈＶＥＧＦ１６５に関して同様の結合親和性を共有することが分かった（Ｆｉｇ．４１）。さらに、ＰＥＧ２アーム−３重リガンド２（２量体）の親和性（ＫＤ＝〜７．５ｎＭ）は、４量体のそれ（ＫＤ＝〜１ｎＭ）よりも低かったが、モノマーのそれ（ＫＤ＝〜１５ｎＭ）よりも高かった（Ｆｉｇ．４１）。これらの結果は、多量化及びサイズは結合親和性について重大なファクターでのようであることを示唆する。
【０１８８】
プルダウンアッセイ及びウエスタンブロットを、結合特異性を評価するため、実施例４に記載されたように行った。能化磁気ビーズを使用し、ＶＥＧＦをスパイクしたバッファー（Ｂ）もしくは２５％ｖ／ｖヒト血清（Ｓ）からＶＥＧＦを免疫沈降させた。Ｃ−末端ＰＥＧ化は、特異性に対してプラスの影響を有する（即ち血清蛋白質のより少ない捕捉）が、親和性に対してはマイナスの影響を有する（即ちＶＥＧＦのより少ない捕捉）ことが分かった（Ｆｉｇ．４２）。酸に対するＣ−末端アミドに関して、違いは見られなかった。ＰＥＧ２アーム−３重リガンド２（２量体）の特異性は、モノマーとおおよそ同じであることが分かった（Ｆｉｇ．４３）。
実施例１７：  ３重リガンド生体分布：
樹脂からのペプチドをリリース及びＨＰＬＣによる精製の前に、ＤＯＴＡ−トリス（ｔ−Ｂｕエステル）（Ｂ−２６０；Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）との固相反応により、ＶＥＧＦ３重リガンドをＮ−末端ＤＯＴＡコンジュゲートとして調製した。０．１ＭＮａ２ＨＰＯ４バッファー中Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）とＤＯＴＡ−ＮＨＳ−エステル（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）との反応により、ＤＯＴＡコンジュゲートＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）を生成した。Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）のコンジュゲート後、非コンジュゲート小分子を除去するため０．１Ｍ  ｐＨ６．５クエン酸アンモニウムを使用して、反応混合物を、ＹＭ−３０Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）遠心濾過機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）により繰り返し遠心分離した。精製ＤＯＴＡコンジュゲートを、ＵＶ分光光度計（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）の２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより求めた。放射性標識のため、ＤＯＴＡ−コンジュゲート３重リガンド及びＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）をｐＨ６．５  ０．１Ｍクエン酸アンモニウム中６４Ｃｕとともに、４３℃で１時間インキュベートした。標識化６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−検査剤を、サイズ排除カラム（Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ６，ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により精製した。放射化学的純度を、ＨＰＬＣの面積を積分することにより求めた。この分析をサイズ排除カラムで行い、１５０ｋＤａタンパク質ピークと関連する放射能の百分率で特徴化した。
【０１８９】
免疫不全ＮＵ／Ｊマウス３０匹をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た（２５匹  腫瘍保持，５匹  非腫瘍保持）。全てのマウスの重さを量り、一般的客観的観察を受けさせた。腫瘍保持マウスために、皮下ヒトＨＴ２９結腸腺癌首相細胞（ＶＥＧＦ−陽性）を左後ろ脇腹に移植し、ヒトＭＳＴＯ−２１１Ｈ中皮腫腫瘍細胞（ＶＥＧＦ−陰性）を右後ろ脇腹に移植した。ＨＴ２９細胞を、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞の移植２週間後に移植した。ＶＥＧＦ−陽性及びＶＥＧＦ−陰性腫瘍細胞の同時移植は、限局性ＶＥＧＦ発現を有する非対称腫瘍になった。
【０１９０】
研究のためマウスのうち１４匹を選んだ。これら１４匹のマウスをグループ１乃至６に分けた。グループ１及び２は非腫瘍保持（マウス合計３匹）であったが、グループ３乃至６は腫瘍保持（マウス合計１１匹）であった。グループ１乃至４及び６には、６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ放射性標識化ＶＥＧＦ３重リガンドを腹腔内投与（ＩＰ）（グループ１，３，４及び６）もしくは静脈内投与（ＩＶ）（グループ２）した。陽性コントロールマウス（グループ５）は、検査剤として６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ放射性標識Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）を受けた。グループ６マウスには、６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ放射性標識ＶＥＧＦ３重リガンド投与の２４時間前に、ブロッカーとしてＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）もしくは賦形剤コントロールをＩＶ投与した。検査剤を、ＨＴ２９移植１週間後のグループ１、２週間後のグループ４及び５、及び３週間後のグループ６に投与した。研究プロトコルは表８に要約される。
【０１９１】
【表８】
2014531424.tif 000019
投与後、マウスを個別に吊るされたステンレススチール金網ケージに収容した。マウスは任意に照射ブロックＰｉｃｏＬａｂ  Ｄｉｅｔ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ  ２０  ＃５Ｋ７５（ＰＭＩ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を給餌された。２重リガンド／３重リガンド投与前及びその後週ごとに体重を量った。投与前及びその後週ごとに３回、腫瘍サイズ（長さ及び幅）をキャリパーで測定した。腫瘍体積を以下の式により算出した。：  体積  ＝  長さ  ｘ  幅２／２  （式中、長さは常に長い方の寸法であった。）マウス当たり１個以上の腫瘍があった場合、全ての腫瘍の位置及び寸法を大容量マップに記録した。ダイナミック及び／又はスタティックスキャンを使用するＭｉｃｒｏＰＥＴ／ＣＴ造影により、生体分布を評価した。各動物において最初のＰＥＴスキャンの前にＣＴスキャンを行った。グループ１乃至４及び６を投与０乃至２時間後にダイナミックＰＥＴスキャンし、投与４時間及び２０時間後にスタティックスキャンした。グループ５を投与２０時間後に単一スタティックスキャンした。４時間におけるスタティックスキャンを１５分間行った一方で、２０時間におけるスタティックスキャンを３０分間行った。スキャン終了時（検査剤投与の約２１時間後）、グループ１乃至４及び６のマウスを組織生体分布分析のために屠殺した。以下の組織を回収した：  腫瘍（グループｇｒｏｕｐｓ３，４及び６のみ），肝臓，脾臓，腎臓，血液，筋肉，心臓，膀胱，胆嚢，脳，大腿及び肺。組織の重さを量り、ガンマカウンタもしくはキュリーメータを使用して放射能についてカウントした。注入放射能投与の１０００分の１と同等の残りの検査品目製剤のサンプル２個をもガンマカウンタを使用してカウントし、参照標準として使用した。放射は器官／組織重さにより正規化した。
【０１９２】
動物１１０２Ｒ（グループ１）及び１００４（グループ３）についての生体分布結果はＦｉｇ．４８及び４９にそれぞれ明らかである。
【０１９３】
注入４時間及び２０時間後における組織分布データは、時間の関数として腫瘍に６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−３重リガンドが蓄積することを示唆する（Ｆｉｇ．７４）。
【０１９４】
動物１００９−１０１２（グループ６）についての生体分布結果はＦｉｇ．４４乃至４７にそれぞれ明らかである。非ブロックマウス（１００９及び１０１１）及びＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）ブロックマウス（１０１０及び１０１２）の並列比較はＦｉｇ．５７に明らかである。これらの結果は、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）での予備処理はＨＴ２９腫瘍におけるＶＥＧＦ３重リガンドシグナルの強度を減ずることを示す。このことは、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）及びＶＥＧＦ３重リガンドが共有のエピトープを結合することを示唆する実施例９の結果をさらにサポートする。
実施例１８：３重リガンド生体分布：
ＰＣＣ技術を使用して合成されたペプチドによるＶＥＧＦ受容体：リガンド相互作用のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性及びブロックは、ここに開示されるＶＥＧＦ２重リガンド及び３重リガンドにより同様の分子相互作用がｉｎ  ｖｉｖｏ調節されてもよいことを示唆した。実施例１７に示したように、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）による予備処理は、ＨＴ２９マウスモデルにおいてＶＥＧＦ３重リガンドシグナルをｉｎ  ｖｉｖｏ減少させた。この効果をさらに評価するため、マウスモデルにおけるＨＴ２９異種移植片により発現した表現型ＶＥＧＦに対して追跡生体分布実験を行った。
【０１９５】
放射性標識ＶＥＧＦ３重リガンド及びＨＴ−２９マウスを実施例１７に上述のように用意した。腫瘍が十分な体積に達した後、コントロールマウス４匹（マウス１０１３，１０１５，１０１６及び１１１４Ｒ）に賦形剤コントロールをＩＶ投与した一方で、検査マウスにモル過剰でＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）をＩＶ投与した。２４時間後（検査マウス１０１４，１０１７及び１０１８）もしくは４８時間後（検査マウス１０２１，１０２２，１０２３及び１０２４），マウスに放射性標識ＶＥＧＦ３重リガンド（〜６５μｇ，３．４μＣｉ／μｇ）をＩＰ投与した。生体分布を、３重リガンド投与０，４及び２０時間後におけるスタティックスキャンを使用するＭｉｃｒｏＰＥＴ／ＣＴ造影により評価した。
【０１９６】
動物１０１３（コントロール），１０１４（２４時間ブロック），１０１７（２４時間ブロック），１０１８（２４時間ブロック），１０２１（４８時間ブロック），及び１０２２（４８時間ブロック）に関する生体分布結果Ｆｉｇ．５８乃至６３にそれぞれ明らかである。動物１１１４Ｒ（コントロール），１０１７及び１０２２に関するさらなる生体分布結果はＦｉｇ．５１乃至５３にそれぞれ明らかである。２０時間におけるコントロールマウス及び４８時間ブロックマウスの並列比較はＦｉｇ．５４に明らかである。これらの結果は、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）ブロックがＶＥＧＦ３重リガンドによる腫瘍結合を弱めることを示しており、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）及びＶＥＧＦ３重リガンドは共有のエピトープを結合することが示唆される。
【０１９７】
スキャン終了時、実施例１７に上述のようにマウスを組織生体分布分析のために屠殺した。Ｆｉｇ．５５は、心臓組織サンプルに対する腫瘍についての結果を要約する。マン・ホイットニーのノンパラメトリックなｐ−値０．９３３について、腫瘍組織におけるＶＥＧＦ３重リガンド取り込みの減少は、２４時間Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）ブロックで２９％であり、４８時間Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）で２７％であった。全組織タイプにわたる結果はＦｉｇ．５６に明らかである。これらの結果は、膀胱、血液、脳、大腿、胆嚢、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉及び脾臓において６４Ｃｕが検出可能であったが、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）の予備投与のみ腫瘍組織において６４Ｃｕシグナル減衰となったことを表す。
【０１９８】
ＨＴ２９腫瘍は、ｉｎ  ｖｉｖｏ発現したｈＶＥＧＦにＶＥＧＦ３重リガンドが特異的に結合することを示唆する。
【０１９９】
Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）減衰のない他の１１個の組織における６４Ｃｕシグナルの検出は、ＶＥＧＦ３重リガンドの非特異的局在化を示唆する。しかしながらこれらのデータは、マウス異種移植片モデルにおけるＶＥＧＦ−過剰発現ヒト腫瘍の同様の研究において金属キレート化Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）にういて報告されたデータと類似している（Ｎａｇｅｎｇａｓｔ２０１１；Ｐａｕｄｙａｌ２０１１）。データは、他のＶＥＧＦイソ型に結合するタンパク質を標的とするＶＥＧＦ−エピトープの非特異的結合、もしくは腎臓シグナルにより説明されたような器官特異的なクリアランスのいずれかについてのポテンシャルを示唆する。これらの結果は、ここに開示されるＶＥＧＦ３重リガンドを臨床利用（例えばｉｎ  ｖｉｖｏ分子腫瘍エピトープ表現型化、例えば「分子イメージング」）において使用してよいことを示唆する。このことは患者及び治療意志決定のための腫瘍層別化において有益である。
実施例１９：  マウスにおける単一静脈内（ＩＶ）もしくは腹腔内（ＩＰ）投与後、血漿濃度及びＶＥＧＦ−ＰＣＣの薬物動態：
材料及び方法
検査品目
検査品目：  ＶＥＧＦ−ＰＣＣ（ＩＮ−ＶＴ−１００１  ３重リガンド）（ＰＣＣモノマー）Ａｃ−ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ−Ｔｚ４−ｌｆｒｅｗ−Ｔｚ４−ｅｅｉｒｄ。Ｃｙｓ残基を含む下線部は、ジスルフィド結合，Ａｃ＝Ｎ−末端アセチル化及びＴｚ４＝１，４−二置換−１，２，３−トリアゾールにより環化される。
【０２００】
貯蔵条件：  約−２０℃
サンプル及び貯蔵
２０１２年３月２０日及び４月１０日に治験依頼者からサンプルを受け取り、分析の前後約−７０℃で保存した。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
サンプル分析
分析のためのＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムは、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び５５００Ｑｔｒａｐ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から構成された。固相抽出法の後、内部標準としてアンジオテンシンＩを有する非検証ＬＣ  ＭＳ／ＭＳアッセイを使用して、マウス血漿におけるＶＥＧＦ−ＰＣＣの濃度を求めた。個々のＶＥＧＦ−ＰＣＣ校正及びＱＣ標準を、実験を受けていないマウス血漿に添加することによりそれぞれの中間体ストック溶液から調製した。校正曲線の標的が働く範囲は血漿中５０乃至５，０００ｎｇ／ｍＬであり、ＱＣ標準の標的濃度はＶＥＧＦ−ＰＣＣについて血漿中１５０乃至３，７５０ｎｇ／ｍＬであった。
バッチ１
マウス血漿中ＶＥＧＦ−ＰＣＣについての校正曲線は、相関係数０．９９３６を有する５０乃至５，０００ｎｇ／ｍＬであった。
【０２０１】
マウス血漿中濃度１５０乃至３，７５０ｎｇ／ｍＬにおける複製ＱＣサンプルを分析グループに含めた。さらにマウス血漿中濃度２０，０００ｎｇ／ｍＬにおける複製希釈（１０倍）ＱＣサンプルをも分析グループに含めた。
【０２０２】
マウス血漿中ＶＥＧＦ−ＰＣＣについての定量のアッセイ下限（ＬＬＯＱ）は、バッチ１について５０ｎｇ／ｍＬであった。
バッチ２
マウス血漿中ＶＥＧＦ−ＰＣＣについての校正曲線は、相関係数０．９９１５を有する１００乃至５，０００ｎｇ／ｍＬであった。
【０２０３】
マウス血漿中濃度１５０乃至３，７５０ｎｇ／ｍＬにおける複製ＱＣサンプルを分析グループに含めた。さらにマウス血漿中濃度２０，０００ｎｇ／ｍＬにおける複製希釈（１０倍）ＱＣサンプルをも分析グループに含めた。
【０２０４】
マウス血漿中ＶＥＧＦ−ＰＣＣについての定量のアッセイ下限（ＬＬＯＱ）は、バッチ２について１００ｎｇ／ｍＬであった。
【０２０５】
校正及びＱＣ結果を評価し、試験責任者のレビューに基づいて方法性能は許容可能と結論された。校正標準及びＱＣサンプルのデータはＡｐｐｅｎｄｉｘ  １に示す。
検査品目の濃度
マウス血漿中ＶＥＧＦ−ＰＣＣの濃度は表Ａ及びＢに示し、及びＦｉｇ．６４に図表によって示す。典型的クロマトグラムはＦｉｇ．７５に示す。
【０２０６】
【数２】
2014531424.tif 000020
【０２０７】
【数３】
2014531424.tif 000021
バッチ１
抽出及び分析の前に、３，１０及び３０分における静脈内サンプル及び１０，３０及び６０分における腹腔内サンプルを、未処理マウス血漿で１０倍に希釈した。他のサンプル全てを未希釈で抽出及び分析した。
【０２０８】
１２０分における腹腔内サンプル１個は、ＶＥＧＦ−ＰＣＣ（５，０００ｎｇ／ｍＬ）について定量上限（ＵＬＯＱ）の上であった。
バッチ２
ＵＬＯＱより上であったそのサンプル１個を１０倍希釈して、バッチ２において再分析した。ここではサンプルはもう校正曲線範囲内であった。
薬物動態
静脈内
マウスは１ｍｇ／ｋｇにおけるＶＥＧＦ−ＰＣＣのＩＶ投与を受けた。個々の動物についての血漿濃度の要約は表Ａに示す。血漿薬物動態パラメータを表９で一覧にした。
【０２０９】
【表９】
2014531424.tif 000022
平均血漿濃度対時間曲線をＦｉｇ．６４に示す。
【０２１０】
１ｍｇ／ｋｇにおけるＩＶ投与後、ＶＥＧＦ−ＰＣＣについて平均全身性血漿クリアランス（ＣＬ）及び分布の定常状態容積（Ｖｓｓ）はそれぞれ２．５７ｍＬ／ｍｉｎ／ｋｇ及び０．０９６７Ｌ／ｋｇであった。平均半減期（ｔ１／２）は０．５９８時間であった。
【０２１１】
ＶＥＧＦ−ＰＣについて逆算したＣ０は約１９，４００ｎｇ／ｍＬであった（平均ＩＶ投与量１ｍｇ／ｋｇ及び平均体重３３ｇと仮定、及び平均血液体積約１．７ｍＬと仮定（Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓ，１９９３））。
腹腔内
マウスは５ｍｇ／ｋｇにおけるＶＥＧＦ−ＰＣＣのＩＰ投与を受けた。個々の動物についての血漿濃度の要約は表Ｂに示す。血漿薬物動態パラメータを表９で一覧にした。平均血漿濃度対時間曲線をＦｉｇ．６４に示す。
【０２１２】
５ｍｇ／ｋｇにおけるＶＥＧＦ−ＰＣＣの平均血漿露出（ＡＵＣｉｎｆ）は３２，２００ｎｇ・ｈｒ／ｍＬであった。平均Ｃｍａｘ及び対応するＴｍａｘはそれぞれ１９，８００ｎｇ／ｍＬ及び０．５０時間であった。マウスへの５ｍｇ／ｋｇＩＰ投与におけるＶＥＧＦ−ＰＣＣの相対的生体利用率は約９９％であった。
結論
この研究の目的は、直列式質量分析（ＬＣＭＳ／ＭＳ）方法を有する液体クロマトグラフィーを使用して、それぞれ１もしくは５ｍｇ／ｋｇにおけるＶＥＧＦ−ＰＣＣの単一ＩＶもしくはＩＰ投与後のマウスにおけるＶＥＧＦ−ＰＣＣの血漿濃度及び薬物動態を求めることであった。
【０２１３】
非検証ＬＣ  ＭＳ／ＭＳアッセイを使用してサンプルを分析した。固相抽出法の後、ＶＥＧＦ−ＰＣＣの血漿濃度を、非検証ＬＣ  ＭＳ／ＭＳアッセイを使用して求めた。校正曲線の有効範囲はＶＥＧＦ−ＰＣＣについて血漿中５０乃至５，０００ｎｇ／ｍＬであった。
【０２１４】
マウスは１ｍｇ／ｋｇにおけるＶＥＧＦ−ＰＣＣのＩＶ投与を受けた。平均全身性血漿クリアランス（ＣＬ）及び分布の定常状態容積（Ｖｓｓ）はそれぞれ２．５７ｍＬ／ｍｉｎ／ｋｇ及び０．０９６７Ｌ／ｋｇであった。平均半減期（ｔ１／２）は０．５９８時間であった。ＶＥＧＦ−ＰＣについて逆算した平均Ｃ０は約１９，１００ｎｇ／ｍＬであった。ＶＥＧＦ−ＰＣについて理論Ｃ０は約１９，４００ｎｇ／ｍＬであった（平均ＩＶ投与量１ｍｇ／ｋｇ及び平均体重３３ｇと仮定、及び平均血液体積約１．７ｍＬと仮定（Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓ，１９９３））。
【０２１５】
マウスは５ｍｇ／ｋｇにおけるＶＥＧＦ−ＰＣＣのＩＰ投与を受けた。５ｍｇ／ｋｇにおけるＶＥＧＦ−ＰＣＣの平均血漿露出（ＡＵＣｉｎｆ）は３２，２００ｎｇ・ｈｒ／ｍＬであった。平均Ｃｍａｘ及び対応するＴｍａｘはそれぞれ１９，８００ｎｇ／ｍＬ及び０．５０時間であった。マウスへの５ｍｇ／ｋｇＩＰ投与におけるＶＥＧＦ−ＰＣＣの相対的生体利用率は約９９％であった。
実施例  ２０：  反復Ｉｎ  Ｓｉｔｕクリックケミストリーは、Ｉｎ  Ｖｉｖｏ分子イメージングのためのＶＥＧＦ−標的捕捉剤を生成する：
ＶＥＧＦに対するタンパク質−触媒捕捉剤（ＰＣＣ）の開発を、受容体結合ドメイン１において相互作用することが以前証明された、ファージディスプレイ誘導ペプチドにより開始した。ペプチドのＣ−末端をペンダントアジドで修飾し、アンカーリガンドＸ−ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ−Ａｚ４を得た（式中Ａｚ４＝Ｌ−アジドリジン，Ｘ＝ビオチン−ＰＥＧ３リンカーもしくはＮ−末端キャッピング基（すなわちアセチル）及び下線部＝環化）。ＰＥＧ３はＮ−Ｆｍｏｃ−Ｎ″−スクシニル−４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，６７１５１７−５Ｇ）として付属した。Ｎ−末端キャッピングは無水酢酸によるものであった。分子内ジスルフィド環化を、４乃至１６時間０．０５Ｍ  酢酸アンモニウム及び（５％（ｗ／ｖ）水性炭酸アンモニウムで調製した）ｐＨ７−８における１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯで行った。
【０２１６】
標的ガイドされたｉｎ  ｓｉｔｕクリックケミストリーにより発見された２重リガンド及び３重リガンドを固相合成によりバルクで調製し（ここでＴｚ４＝１，４−二置換１，２，３−トリアゾールリンカー，Ｆｉｇ．６５）、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製及びＶＥＧＦにｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏ結合することについてアッセイする前に、質量分析計で分析した。
【０２１７】
Ｘ−ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ−Ａｚ４．ＦｏｒＸ＝ａｃｅｔｙｌ，ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：Ｃ１１７Ｈ１６５Ｎ３１Ｏ３３Ｓ３（Ｍ＋）について計算２６２８．１；実測２６２８．７．Ｘ＝ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ３，ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）について：Ｃ１３９Ｈ２０３Ｎ３５Ｏ３９Ｓ４（Ｍ＋）について計算３１１４．４；実測３１１４．５．
Ｘ−ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ−Ｔｚ４−ｒｐｌｉｒ．ＦｏｒＸ＝アセチル，ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：Ｃ１５１Ｈ２２６Ｎ４４Ｏ３９Ｓ３（Ｍ＋）について計算３３７５．６；実測３３７５．８．Ｘ＝ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ３，ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）について：Ｃ１７３Ｈ２６４Ｎ４８Ｏ４５Ｓ４（Ｍ＋）について計算３８６１．９；実測３８６１．４．
Ｘ−ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ−Ｔｚ４−ｌｆｒｅｗ．ＦｏｒＸ＝アセチル，ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：Ｃ１５９Ｈ２２２Ｎ４２Ｏ４１Ｓ３（Ｍ＋）について計算３４７１．６；実測（Ｍ＋Ｈ）３４７３．３．Ｘ＝ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ３，ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）について：Ｃ１８１Ｈ２６０Ｎ４６Ｏ４７Ｓ４（Ｍ＋）について計算３９５７．８；実測３９５７．１．
ビオチン−ＰＥＧ３−ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ−Ｔｚ４−ｌｆｒｅｗ−Ａｚ４．ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：Ｃ１８７Ｈ２７０Ｎ５０Ｏ４８Ｓ４（Ｍ＋）について計算４１１２．９；実測（Ｍ＋Ｈ）４１１５．０．
Ｘ−ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ−Ｔｚ４−ｌｆｒｅｗ−Ｔｚ４−ｅｅｉｒｄ．Ｘ＝アセチル，ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）について：Ｃ１９６Ｈ２８１Ｎ５５Ｏ５５Ｓ３（Ｍ＋）について計算４３８２．０；実測（Ｍ＋Ｈ）４３８３．３．Ｘ＝ビオチン−ＰＥＧ３，ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）について：Ｃ２１８Ｈ３１９Ｎ５９Ｏ６１Ｓ４について計算（Ｍ＋）４８６７．３；ｆｏｕｎｄ４８７０．６．
Ｘ−ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ−Ｔｚ４−ｌｆｒｅｗ−Ｔｚ４−ｆｒｓｖｎ．Ｘ＝アセチルについて，ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：Ｃ１９７Ｈ２８０Ｎ５６Ｏ５１Ｓ３について計算（Ｍ＋）４３４３．０；実測（Ｍ＋Ｎａ）４３６８．０．Ｘ＝ビオチン−ＰＥＧ３について，ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：  Ｃ２１９Ｈ３１８Ｎ６０Ｏ５７Ｓ４について計算（Ｍ＋）４８２８．３；実測４８３０．６．
Ｘ−ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ−Ｔｚ４−ｌｆｒｅｗ−Ｔｚ４−ｈｔｈｗｌ．Ｆｏｒ  Ｘ＝アセチル，ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：ｃａｌｃｄ．ｆｏｒＣ２０３Ｈ２８１Ｎ５７Ｏ５０Ｓ３（Ｍ＋）４４１３．０；ｆｏｕｎｄ（Ｍ＋Ｈ）４４１５．２．
Ｘ−ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ−Ｔｚ４−ｌｆｒｅｗ−Ｔｚ４−ｅｗｓｒｗ．Ｆｏｒ  Ｘ＝アセチル，ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：Ｃ２０６Ｈ２８３Ｎ５７Ｏ５２Ｓ３について計算（Ｍ＋）４４８３．０；実測（Ｍ＋Ｈ）４４８４．６．Ｘ＝ビオチン−ＰＥＧ３について，ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：Ｃ２２８Ｈ３２１Ｎ６１Ｏ５８Ｓ４について計算（Ｍ＋）４９６９．３；実測（Ｍ＋Ｋ）５００８．０．
ＤＯＴＡ−ＰＥＧ３−ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ−Ｔｚ４−ｌｆｒｅｗ−Ｔｚ４−ｅｅｉｒｄ．  ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸）のＮ−末端コンジュゲートをＤＯＴＡ−ｔｒｉｓ（ｔ−Ｂｕエステル）（Ｂ−２６０；Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）で固相反応に付し、次いで樹脂からペプチドを解放し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：Ｃ２２４Ｈ３３１Ｎ６１Ｏ６６Ｓ３について計算（Ｍ＋）５０２７．４；実測（Ｍ＋Ｈ）５０３０．７．
増加したサイズ及び／又は結合価由来の追加の潜在的有効性を調査するために、多量体ＰＣＣバリアントを設計及び合成した。３重リガンドのＣ−末端と４−アームＰＥＧ誘導体（ＭＷ４０，０００；Ｊｅｎｋｅｍ＃４ＡＲＭ−ＮＨ２−４０Ｋ）との反応、ホモ４量体の形成となった（Ｆｉｇ．７６）。ＶＥＧＦへのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合についてアッセイする前に、そのホモ４量体をＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで特徴化した。
【０２１８】
Ｘ−ＶＥＰＮＣＤＩＨＶＭＷＥＷＥＣＦＥＲＬ−Ｔｚ４−ｌｆｒｅｗ−Ｔｚ４−ｅｅｉｒｄホモ４量体。Ｘ＝アセチルの場合分子量５７，５００Ｄａ、Ｘ＝ビオチン−ＰＥＧ３の場合分子量５９，５００Ｄａが、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより期待された。還元Ｌａｅｍｍｌｉバッファーにおいて調製されたサンプルを、複製ゲルについて１ｘＴＧＳ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１９２ｍＭグリシン，０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ），ｐＨ８．３）中２００Ｖで３０分間、電気泳動分離にかけた。ペプチド含有バンドを視覚化するため、一方のゲルをＢｉｏ−Ｓａｆｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，＃１６１−０７８６）で１時間染色した。ＰＥＧ含有バンドを視覚化するため、他方のゲルを５％（ｗ／ｖ）水性塩化バリウム及び次いで０．０５Ｍ水性ヨウ素で染色した。両方の染色によりホモ４量体を検出し、予期した分子量において確認した。
【０２１９】
ビオチン化ホモ４量体について、引き続き７．５％ゲル３分の１を、１００Ｖ、３０分間の電気泳動により２０％（ｖ／ｖ）メタノール（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）含有２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１９２ｍＭグリシン，ｐＨ８．３，におけるニトロセルロースメンブレンに移した。移動後、ニトロセルロースメンブレンをＴＢＳ中５％脱脂粉乳で２時間ブロックし、ビオチン標識確認のためストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ，ａｂ７４０３）で調べた。
【０２２０】
上で述べたように、以上のことは単に本発明の様々な実施態様を説明することを意図している。上で論じた具体的変形それ自体は、発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきはない。様々な同等物、変更および修正が発明の範囲から逸脱しない限り、なされてよいことが、当業者には明らかである。当然のことながらこのような同等実施態様はここに含まれる。ここに引用された全ての参考文献は、参照することにより、あたかもここに全文記載してあるがごとく、ここに取り入れられる。
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２４．  Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒ，  Ｗ．  Ｊ．；  Ｃｈｒｉｓｔｉｎｇｅｒ，  Ｈ．  Ｗ．；  Ｃｏｃｈｒａｎ，  Ａ．  Ｇ．；  Ｆｕｈ，  Ｇ．；  Ｋｅｅｎａｎ，  Ｃ．  Ｊ．；  Ｑｕａｎ，  Ｃ．；  Ｓｈｒｉｖｅｒ，  Ｓ．  Ｋ．；  Ｔｏｍ，  Ｊ．  Ｙ．  Ｋ．；  Ｗｅｌｌｓ，  Ｊ．  Ａ．；  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，  Ｂ．  Ｃ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９８，  ３７，  １７７５４−１７７６４．
２５．  （ａ）  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，  Ｓ．  Ｂ．；  Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｌ．  Ｄ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９６，  ２３４，  １９０−１９３．  （ｂ）  Ｋｕｒｆｕｅｒｓｔ，  Ｍ．  Ｍ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９２，  ２００，  ２４４−２４８．
２６．  Ｄｈａｒａ，  Ｄ．；  Ｃｈａｔｔｅｒｊｉ，  Ｐ．  Ｒ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂ  １９９９，  １０３，  ８４５８−８４６１．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2014531424.tif 000039
【図１１】
2014531424.tif 000040
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2014531424.tif 000049
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４４Ｄ】
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【図４４Ｅ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４５Ｃ】
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【図４５Ｄ】
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【図４５Ｅ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４６Ｄ】
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【図４６Ｅ】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４７Ｃ】
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【図４７Ｄ】
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【図４７Ｅ】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８Ａ】
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【図５８Ｂ】
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【図５８Ｃ】
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【図５８Ｄ】
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【図５８Ｅ】
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【図５９Ａ】
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【図５９Ｂ】
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【図５９Ｃ】
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【図５９Ｄ】
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【図５９Ｅ】
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【図６０Ａ】
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【図６０Ｂ】
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【図６０Ｃ】
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【図６０Ｄ】
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【図６０Ｅ】
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【図６１Ａ】
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【図６１Ｂ】
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【図６１Ｃ】
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【図６１Ｄ】
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【図６１Ｅ】
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【図６２Ａ】
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【図６２Ｂ】
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【図６２Ｃ】
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【図６２Ｄ】
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【図６２Ｅ】
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【図６３Ａ】
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【図６３Ｂ】
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【図６３Ｃ】
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【図６３Ｄ】
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【図６３Ｅ】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６Ａ】
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【図６６Ｂ】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９Ａ】
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【図６９Ｂ】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【国際調査報告】
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