(57)【要約】本発明は、シヌクレイン病の治療または予防において有用な薬剤のためのスクリーニングの方法、その診断または予後の方法、ならびに治療および予防の方法を提供する。本発明は、一部には、シヌクレイン病に罹患する対象由来の食作用活性を伴う細胞が、α−シヌクレインのレベルを増加させ、食作用活性を減少させることと、他の薬剤の中でもとりわけ、ＩＬ−４による治療によって、これらのプロセスを反転させることができるという結果に基づく。食作用活性の増加は、容易に検出されやすく、薬剤が、食作用細胞と接触され、薬剤が、α−シヌクレインレベルを減少させる能力を有するという指標である、食作用活性に及ぼす薬剤の効果が検出されたという、スクリーニング検定の根拠を提供する。また、食作用活性のレベルの減少は、随意に、α−シヌクレインの細胞内レベルの増加と組み合わせて、診断、予後、またはモニタリング検定の根拠を提供する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シヌクレイン病をモニタリングする、あるいは対象におけるシヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標方法を提供するであって、対象由来の血液試料または他の食作用細胞中の食作用活性を判定すること、を含み、前記食作用活性は、前記対象におけるシヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標をモニタリングまたは提供するために使用される、方法。
【請求項２】
食作用活性は、前記対象由来の血液試料中で判定され、前記方法は、前記対象由来の血液試料の前記食作用活性を食作用活性の１つ以上の対照レベルと比較することを含み、非罹患個人由来の血液試料の食作用活性と比較して減少した前記対象における食作用活性は、シヌクレイン病の存在、感受性、または程度の指標である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記個人は、シヌクレイン病の少なくとも１つの兆候または症状を有し、前記食作用活性の減少は、前記症状と組み合わせて、は、シヌクレイン病に罹患する対象を診断するために使用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象は、シヌクレイン病の症状がなく、前記食作用活性の減少は、シヌクレイン病に対する感受性の査定において使用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記対象は、シヌクレイン病と診断され、前記食作用活性の減少は、シヌクレイン病の重症度を査定するために使用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記対象の末梢マクロファージをＩＬ−４またはＩＬ−１３またはそのアゴニストに接触させ、前記食作用活性が、前記ＩＬ−４またはＩＬ−１３またはそのアゴニストに応答して、増加するかどうかを査定することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記対象由来の血液試料または他の食作用細胞の食作用活性を複数回判定し、該当する場合、食作用活性の変化を前記疾患の感受性または重症度の変化と関連付けることを含む、対象におけるシヌクレイン病をモニタリングするための請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記対象は、シヌクレイン病と診断され、食作用活性の経時的増加は、疾患の重症度低下と関連付けられる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記対象は、薬物によって治療されており、前記複数回とは、前記薬物の投与開始前および後を含み、食作用活性の増加は、前記対象における前記薬物に対する陽性反応を示す、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象は、モニタリング開始時、シヌクレイン病と診断されず、食作用活性の経時的減少は、疾患に対する感受性増加と関連付けられる、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記食作用活性が、前記血液試料中で判定され、前記血液試料由来の細胞内のα−シヌクレイン発現もまた、判定され、前記食作用活性および／またはα−シヌクレインのレベルは、前記シヌクレイン病の感受性または重症度の指標を提供する、請求項７、８、または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象由来の血液試料または前記対象由来の他の食作用細胞の細胞中のα−シヌクレイン発現もまた、判定され、前記食作用活性および／またはα−シヌクレインのレベルは、シヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記α−シヌクレイン発現および食作用活性は、血液試料中で判定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記血液試料の細胞中のα−シヌクレインのレベルを判定することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記食作用活性および前記α−シヌクレイン発現は、同一血液試料に基づいて判定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記食作用活性および前記シヌクレイン発現は、前記血液試料中の細胞の同一または重複集団に基づいて判定される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞は、末梢マクロファージを含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞は、多形核細胞を含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記食作用活性は、第１の蛍光シグナルから判定され、α−シヌクレインの発現は、第２の蛍光シグナルから判定される、請求項１２または１３のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記第１および第２の蛍光シグナルは、同時に検出される、請求項１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記第１および第２の蛍光シグナルは、フローサイトメトリーによって検出される、請求項１９または２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記食作用活性は、蛍光標識された細胞またはビーズの取り込みから判定され、前記α−シヌクレイン発現は、細胞内α−シヌクレインに特異的に結合する、蛍光標識された抗体の取り込みから判定される、請求項１９〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記対象における前記血液試料の前記食作用活性を非罹患個人由来の血液試料の食作用活性の１つ以上の対照レベルと比較することをさらに含む、請求項１２〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記対象における前記血液試料の前記α−シヌクレイン発現を非罹患個人由来の血液試料のα−シヌクレイン発現の１つ以上の対照レベルと比較することをさらに含む、請求項１２〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記食作用活性および前記対象における前記血液試料の前記α−シヌクレイン発現を非罹患個人由来の血液試料の食作用活性およびα−シヌクレイン発現の１つ以上の対照レベルと比較することをさらに含む、請求項１２〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記比較は、前記比較を行い、シヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標の出力を提供するようにプログラムされたコンピュータにおいて行われる、請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記シヌクレイン病は、散発性パーキンソン病である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記対象は、Ｇ２０１９Ｓ非保有者である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記対象は、Ｇ２０１９Ｓ保有者である、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
非罹患個人由来の血液試料の食作用活性およびα−シヌクレイン発現と比較した前記対象における食作用活性の減少および／またはα−シヌクレイン発現の増加は、シヌクレイン病の存在、感受性、または程度の指標である、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記個人は、シヌクレイン病の少なくとも１つの兆候または症状を有し、前記食作用活性の減少および／またはシヌクレイン発現の増加は、前記症状と組み合わせて、シヌクレイン病に罹患する対象を診断するために使用される、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象は、シヌクレイン病の症状がなく、前記食作用活性の減少および／またはα−シヌクレイン発現の増加は、シヌクレイン病に対する感受性の査定において使用される、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象は、シヌクレイン病と診断され、前記食作用活性の減少および／またはα−シヌクレイン発現の増加は、シヌクレイン病の重症度を査定するために使用される、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３４】
食作用活性の減少は、前記対象が、症候性シヌクレイン病を有することの指標を提供する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
食作用活性の増加は、指標前記対象が、症候性シヌクレイン病を有していないことの指標を提供する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
シヌクレイン病の診断、予後、またはモニタリングにおける食作用活性の使用。
【請求項３７】
前記食作用活性は、血液試料中で測定される、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
シヌクレイン病の治療において有用な活性のための試験薬剤をスクリーニングする方法であって、
試験薬剤を、α−シヌクレインを発現する外来遺伝子を含有する、またはシヌクレイン病に罹患する対象由来の食作用細胞と接触させることと、
前記試験薬剤が前記細胞の前記食作用活性を増加させるかどうかを判定し、増加は、前記薬剤が、シヌクレイン病の治療において有用であることとの指標を提供することと、
を含む、方法。
【請求項３９】
前記判定は、前記食作用細胞を不活性粒子またはアポトーシス細胞と接触させ、前記食作用細胞中の前記粒子または細胞の取り込みを計数することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞は、シヌクレイン病に罹患する対象またはα−シヌクレイン導入遺伝子を伴うトランスジェニック動物由来のミクログリア細胞あるいは末梢マクロファージである、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞は、α−シヌクレインが導入された神経細胞である、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記試験薬剤と接触させる前および後に、前記細胞の前記α−シヌクレイン内容物を判定することをさらに含む、請求項３８〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記試験薬剤を、シヌクレイン病の動物モデルに投与し、前記試験薬剤が、シヌクレイン病の少なくとも１つの兆候または症状を阻害、減少、または遅延させるかどうかを判定することをさらに含む、請求項３８〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
シヌクレイン病に罹患する対象を差別的に治療する方法であって、
前記対象の食作用細胞または血液試料中の食作用活性を判定することと、
ある治療計画によって、正常を下回る食作用活性を伴う対象を治療し、異なる治療計画によって、正常以上の食作用活性を伴う対象を治療することと、
を含む、方法。
【請求項４５】
シヌクレイン病を治療するための薬物を伴う臨床試験に参加するための候補ヒト対象を選択するための方法であって、
前記ヒト対象の食作用細胞または血液試料の食作用活性を判定することと、
前記食作用活性のレベルに基づいて、前記試験における選択基準または除外基準に関して、前記対象を分別することと、
を含む、方法。
【請求項４６】
正常を下回る食作用活性を伴う個人は、前記試験に含まれ、正常以上のレベルを伴う個人は、除外される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記候補ヒト対象は、ＬＲＲＫ２の２０１９の突然変異を有する、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
ＬＲＲＫ２結合剤または変調剤をスクリーニングする方法であって、
試験薬剤を、α−シヌクレイン過剰発現を伴わない対照細胞と比較して、食作用活性の減少を有する、α−シヌクレインを過剰発現する食作用細胞と接触させることと、
前記試験薬剤が前記細胞の前記食作用活性を増加させるかどうかを判定し、増加が、前記薬剤が、ＬＲＲＫ２の阻害に有用であることの指標を提供することと、
を含む、方法。
【請求項４９】
前記食作用細胞は、ＬＲＲＫ２に２０１９の突然変異を有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞をＩＦＮ−γと接触させることをさらに含む、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記試験薬剤のエナンチオマーを前記食作用細胞と接触させること、
前記エナンチオマーが、前記細胞の前記食作用活性を増加させるかどうかを判定することと、
をさらに含み、前記試験薬剤による前記食作用活性の増加および前記エナンチオマーによる食作用活性の不変は、前記試験薬剤が、ＬＲＲＫ２の阻害に有用であることの指標を提供する、請求項４８〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
ＬＲＲＫ２結合剤または変調剤をスクリーニングする方法であって、
試験薬剤を、ＬＲＲＫ２  ２０１９突然変異を有する、および／またはＩＦＮ−γで処置された食作用細胞と接触させ、前記食作用細胞は、α−シヌクレインを過剰発現せず、ＬＲＲＫ２２０１９突然変異を伴わず、かつＩＦＮ−γで処置されていない対照細胞と比較して、食作用活性の増加を有することと、
前記試験薬剤が、前記細胞の前記食作用活性を低下させるかどうかを判定し、低下は、前記薬剤が、ＬＲＲＫ２の阻害に有用であることの指標を提供することと、
を含む、方法。
【請求項５３】
前記試験薬剤のエナンチオマーをＩＦＮ−γで処置された前記食作用細胞と接触させること、
前記エナンチオマーが、前記細胞の前記食作用活性を低下させるかどうか判定することと、
をさらに含み、前記試験薬剤による前記食作用活性の増加および前記エナンチオマーによる食作用活性の不変は、前記試験薬剤が、ＬＲＲＫ２の阻害に有用であることの指標を提供する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記判定は、前記食作用細胞を不活性粒子またはアポトーシス細胞と接触させ、前記食作用細胞中の前記粒子または細胞の取り込みを計数することを含む、請求項４８〜５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞は、ミクログリア細胞または末梢マクロファージである、請求項４８〜５４に記載の方法。
【請求項５６】
貪食され得る実体と、α−シヌクレインに対する抗体と、を含む、診断キット。
【請求項５７】
前記貪食される実体は、標識された不活性粒子またはアポトーシス細胞である、請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
シヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標方法を提供するであって、
対象の末梢マクロファージの食作用活性を判定することと、
前記対象における末梢マクロファージの前記食作用活性を食作用活性の１つ以上の対照レベルと比較し、非罹患個人由来の末梢マクロファージの食作用活性と比較した前記対象における食作用活性の減少は、シヌクレイン病の存在、感受性、または程度の指標であることと、
を含む、方法。
【請求項５９】
前記個人は、シヌクレイン病の少なくとも１つの兆候または症状を有し、前記食作用活性の減少は、前記症状と組み合わせて、シヌクレイン病に罹患する対象を診断するために使用される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記対象は、シヌクレイン病の症状がなく、前記食作用活性の減少は、シヌクレイン病に対する感受性の査定において使用される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記対象は、シヌクレイン病と診断され、前記食作用活性の減少は、シヌクレイン病の重症度を査定するために使用される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記対象の末梢マクロファージをＩＬ−４またはＩＬ−１３またはそのアゴニストと接触させ、前記食作用活性が、前記ＩＬ−４またはＩＬ−１３またはそのアゴニストに応答して、増加するかどうかを査定することをさらに含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
シヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標方法を提供するであって、
ＩＬ−４またはＩＬ−１３またはそれらに対するアゴニストの存在および不在下において、対象の末梢マクロファージの食作用活性を判定することを含み、ＩＬ−４またはＩＬ−１３またはアゴニストの存在下における活性の増加は、シヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標である、方法。
【請求項６４】
シヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標方法を提供するであって、
ＩＬ−４またはＩＬ−１３またはそれらに対するアゴニストの存在および不在下において、対象由来の血液試料の食作用活性を判定することを含み、ＩＬ−４またはＩＬ−１３またはアゴニストの存在下における活性の増加は、シヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標である、方法。
【請求項６５】
前記対象の末梢マクロファージの食作用活性を複数回判定し、該当する場合、食作用活性の経時的変化を疾患の感受性または重症度の変化と関連付けることを含む、対象におけるシヌクレイン病のモニタリングの方法。
【請求項６６】
前記対象は、シヌクレイン病と診断され、食作用活性の経時的増加は、疾患の重症度低下と関連付けられる、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記対象は、薬物によって治療されており、前記複数回とは、前記薬物の投与開始前および後を含み、食作用活性の増加は、前記対象における前記薬物に対する陽性反応を示す、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記対象は、モニタリング開始時、シヌクレイン病と診断されず、食作用活性の経時的減少は、疾患に対する感受性増加と関連付けられる、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記食作用細胞中のα−シヌクレイン発現もまた、判定され、前記食作用活性および／またはα−シヌクレインのレベルは、前記シヌクレイン病の感受性または重症度の指標を提供する、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
シヌクレイン病を有する、またはその危険性が既知である、対象に、ＩＬ−４、またはＩＬ−４をコードする核酸、またはＩＬ−４のアゴニストを投与することを含む、シヌクレイン病の治療または効果的予防の方法。
【請求項７１】
前記アゴニストは、亜鉛フィンガータンパク質またはそれをコードする核酸であって、前記亜鉛フィンガータンパク質は、ＩＬ−４に結合し、その転写を刺激する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
ｒａｂ３ｂまたはｒａｂ１１ｂ、またはこれらのいずれかをコードする核酸、またはこれらのいずれかのアゴニストを投与することを含む、シヌクレイン病の治療または効果的予防の方法。
【請求項７３】
前記アゴニストは、ｒａｂ３ｂまたはｒａｂ１１ｂに結合し、その転写を刺激する、亜鉛フィンガータンパク質である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
シヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標方法を提供するであって、対象の食作用細胞の食作用活性を判定することを含み、前記食作用細胞中のα−シヌクレイン発現もまた、判定され、前記食作用活性および／またはα−シヌクレインのレベルは、シヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標を提供する、方法。
【請求項７５】
前記食作用細胞中のα−シヌクレインのレベルを判定することをさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記細胞は、末梢マクロファージを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記細胞は、多形核細胞を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記食作用活性は、第１の蛍光シグナルから判定され、α−シヌクレインの発現は、第２の蛍光シグナルから判定される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
前記第１および第２の蛍光シグナルは、同時に検出される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記第１および第２の蛍光シグナルは、蛍光活性化細胞分類によって検出される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記食作用活性は、蛍光標識された細胞またはビーズの取り込みから判定され、前記α−シヌクレイン発現は、細胞内α−シヌクレインに特異的に結合する、蛍光標識された抗体の取り込みから判定される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
前記対象における前記食作用細胞の前記食作用活性を非罹患個人由来の食作用細胞の食作用活性の１つ以上の対照レベルと比較することをさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項８３】
前記対象における前記食作用細胞の前記α−シヌクレイン発現を非罹患個人由来の食作用細胞のα−シヌクレイン発現の１つ以上の対照レベルと比較することをさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項８４】
前記対象における前記食作用細胞の前記食作用活性および前記α−シヌクレイン発現を非罹患個人由来の食作用細胞の食作用活性およびα−シヌクレイン発現の１つ以上の対照レベルと比較することをさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項８５】
前記比較は、前記比較を行い、シヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標の出力を提供するようにプログラムされたコンピュータにおいて行われる、請求項８２〜８４のいずれか記載の方法。
【請求項８６】
前記シヌクレイン病は、散発性パーキンソン病である、請求項７４に記載の方法。
【請求項８７】
前記対象は、Ｇ２０１９Ｓ非保有者である、請求項７４〜８６のいずれか記載の方法。
【請求項８８】
前記対象は、Ｇ２０１９Ｓ保有者である、請求項７４〜８６のいずれか記載の方法。
【請求項８９】
非罹患個人由来の食作用細胞の食作用活性およびα−シヌクレイン発現と比較した前記対象における食作用活性の減少および／またはα−シヌクレイン発現の増加は、シヌクレイン病の存在、感受性、または程度の指標である、請求項８７または８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記個人は、シヌクレイン病の少なくとも１つの兆候または症状を有し、前記食作用活性の減少および／またはα−シヌクレイン発現の増加は、前記症状と組み合わせて、シヌクレイン病に罹患する対象を診断するために使用される、請求項８７または８８のいずれか記載の方法。
【請求項９１】
前記対象は、シヌクレイン病の症状がなく、前記食作用活性の減少および／またはα−シヌクレイン発現の増加は、シヌクレイン病に対する感受性の査定において使用される、請求項８７または８８に記載の方法。
【請求項９２】
前記対象は、シヌクレイン病と診断され、前記食作用活性の減少および／またはα−シヌクレイン発現の増加は、シヌクレイン病の重症度を査定するために使用される、請求項８７または８８に記載の方法。
【請求項９３】
食作用活性の減少は、前記対象が、シヌクレイン病に罹患していることの指標を提供する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９４】
食作用活性の増加は、前記対象が、シヌクレイン病に罹患していないことの指標を提供する、請求項８８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本願は、２０１０年１１月２４日出願の第６１／４１７，１７４号および２０１１年４月２８日出願の第６１／４８０，３２３号の利益を主張する非仮出願であって、両願とも、あらゆる目的のために、参照することによって、その全体として組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
α−シヌクレインによる脳の病変は、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型痴呆（ＤＬＢ）、アルツハイマー病のレビー小体変異型（ＬＢＶＡＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、および脳の鉄凝集を伴う神経変性１型（ＮＢＩＡ−１）を含む、いくつかの神経変性疾患の顕著な特徴である。これらの疾患のすべてに共通するシヌクレイン病と名付けられているものは、主として、α−シヌクレインから成る、神経細胞およびグリア細胞におけるタンパク質の不溶性封入体である。
【０００３】
レビー小体およびレビー神経突起は、主として、α−シヌクレインから成る神経細胞内封入体である。レビー小体およびレビー神経突起は、パーキンソン病（ＰＤ）の顕著な神経病理学的特徴である。ＰＤおよび他のシヌクレイン病は、集合的に、レビー小体病（ＬＢＤ）と呼ばれてきた。ＬＢＤは、ドーパミン作動系の変性、運動変化、認知障害、およびレビー小体（ＬＢ）の形成を特徴とする。（非特許文献１）。他のＬＢＤには、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病のレビー小体変異型（ＬＢＶＡＤ）、ＰＤとアルツハイマー病（ＡＤ）の混合型、および多系統萎縮症等がある。レビー小体型痴呆（ＤＬＢ）は、ＬＢＤの専門用語の差異を調整するために新たに作られた用語である。
【０００４】
ＬＢによる疾患は、依然として、老齢者における運動障害および認知力低下の共通の原因である（非特許文献２）。その発生率は上昇し続け、深刻な公衆衛生問題を引き起こしているが、今日まで、これらの疾患は治療も予防もできるものではなく、ＰＤの原因および発症機序を理解することは新たな治療法の開発に重大な意味を伴う（非特許文献３）。ＰＤの原因は議論の余地があり、種々の神経毒および遺伝的感受性因子等、多数の要因が役割を果たしていると提唱されてきた。
【０００５】
特に、いくつかの研究によって、以下のことから、シナプス・タンパク質であるα−ＳＮがＰＤ発症において中心的な役割を果たしていることが示されている：（１）このタンパク質がＬＢに凝集すること（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）、（２）α−ＳＮ遺伝子の突然変異が稀な家族性パーキンソン病と同時分離すること（非特許文献７；非特許文献８）、ならびに（３）トランスジェニックマウス（非特許文献９）およびショウジョウバエ（非特許文献１０）におけるその過剰発現がいくつかのＰＤの病理学的態様を模倣すること。したがって、脳におけるα−ＳＮの凝集がヒト、マウス、およびハエなどの多様な種において類似した形態学的および神経学的変化と関連付けられるという事実が、この分子がＰＤの発症の一因となっていることを示唆している。
【０００６】
パーキンソン病に罹患する対象は、ＣＳＦにおいてだけではなく、剖検分析後の脳においても、ＩＬ−６およびＩＬ−１β等の炎症性サイトカインが上昇していることが報告されている（Ｂｌｕｍ−Ｄｅｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０２，１７−２０（１９９５），Ｍｏｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１８０，１４７−１５０（１９９４ａ），Ｍｏｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，１６５，２０８−２１０（１９９４ｂ）、およびＭｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃａｎｄ．９８，１４２−１４４（１９９８））。パーキンソン病対象における脳の黒質（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ  ｎｉａｇｒａ）領域は、脳の他の領域と比較して、４から５倍も多くミクログリアを含有する。パーキンソン病の病変は、この領域に制限されないが、病理変化が、対象症状に有意に影響を及ぼす領域である。主として、ニューロンであると考えられていた家族性パーキンソン病の発症と関連付けられるいくつかの遺伝子は、最近、ミクログリアにおいて認められている（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍ．１７：３７０−３７９，Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３，５９７−６１２（２００６））。ミクログリアによるこの炎症性反応が、原因性であるか、または反作用性であるかは、議論の対象である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＭｃＫｅｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ（ＤＬＢ）：Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤＬＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９９６）４７：１１１３−２４
【非特許文献２】Ｇａｌａｓｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｅｍｅｎｔｉａｓ．Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９４）５１：８８８−９５
【非特許文献３】Ｔａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ａｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．（２０００）１３：４２７−３０
【非特許文献４】Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３８８：８３９−４０
【非特許文献５】Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＭ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９９８）１５２：３６７−７２
【非特許文献６】Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．（１９９７）２３９：４５−８
【非特許文献７】Ｋｒｕｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎ．（１９９８）１８：１０６−８
【非特許文献８】Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７６：２０４５−７
【非特許文献９】Ｍａｓｌｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１２６５−９
【非特許文献１０】Ｆｅａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０４：３９４−８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、シヌクレイン病をモニタリングする、または対象におけるシヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標方法を提供する。そのような方法は、対象由来の血液試料または他の食作用細胞中の食作用活性を判定することを含む。食作用活性は、対象におけるシヌクレイン病のモニタリングにおいて、あるいはその存在、感受性、または重症度の指標を提供するために使用される。
【０００９】
本発明はさらに、シヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標を提供する方法であって、対象の末梢マクロファージの食作用活性を判定することと、対象における末梢マクロファージの食作用活性を食作用活性の１つ以上の対照レベルと比較することとを含み、非罹患個人由来の末梢マクロファージの食作用活性と比較した対象における食作用活性の減少が、シヌクレイン病の存在、感受性、または程度の指標である、方法を提供する。随意に、個人は、少なくとも１つのシヌクレイン病の症状を有し、食作用活性の減少は、症状と組み合わせて、シヌクレイン病に罹患する対象を診断するために使用される。随意に、対象は、シヌクレイン病の症状がなく、食作用活性の減少は、シヌクレイン病に対する感受性の査定において使用される。随意に、対象は、シヌクレイン病と診断され、食作用活性の減少は、シヌクレイン病の重症度を査定するために使用される。随意に、方法はさらに、対象の末梢マクロファージをＩＬ−４またはＩＬ−１３またはそのアゴニストと接触させ、食作用活性が、ＩＬ−４またはＩＬ−１３またはそのアゴニストに応答して、増加するかどうかを査定することを含む。
【００１０】
本発明はさらに、シヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標方法を提供する方法であって、ＩＬ−４またはＩＬ−１３またはそれらに対するアゴニストの存在および不在下において、対象の末梢マクロファージの食作用活性を判定することを含み、ＩＬ−４またはＩＬ−１３またはアゴニストの存在下における活性の増加が、シヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標である、方法を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、対象におけるシヌクレイン病をモニタリングする方法であって、対象の末梢マクロファージの食作用活性を複数回判定し、該当する場合、経時的食作用活性の変化を疾患の感受性または重症度の変化と関連付けることを含む、方法を提供する。いくつかの方法では、対象は、シヌクレイン病と診断され、食作用活性の経時的増加は、疾患の重症度低下と関連付けられる。いくつかの方法では、対象は、薬物によって治療されており、複数回とは、薬物の投与開始前および後を含み、食作用活性の増加は、対象における薬物に対する陽性反応を示す。いくつかの方法では、対象は、モニタリング開始時、シヌクレイン病と診断されず、食作用活性の経時的減少は、疾患に対する感受性増加と関連付けられる。任意のそのような方法では、食作用細胞中のα−シヌクレイン発現もまた、判定することができ、食作用活性および／またはα−シヌクレインのレベルは、シヌクレイン病の感受性または重症度の指標を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、対象におけるシヌクレイン病をモニタリングする方法であって、対象由来の血液試料の食作用活性を複数回判定し、該当する場合、食作用活性の変化を疾患の感受性または重症度の変化と関連付けることを含む、方法を提供する。いくつかの方法では、対象は、シヌクレイン病と診断され、食作用活性の経時的増加は、疾患の重症度低下と関連付けられる。いくつかの方法では、対象は、薬物によって治療されており、複数回とは、薬物の投与開始前および後を含み、食作用活性の増加は、対象における薬物に対する陽性反応を示す。いくつかの方法では、対象は、モニタリング開始時、シヌクレイン病と診断されず、食作用活性の経時的減少は、疾患に対する感受性増加と関連付けられる。いくつかの方法では、血液試料由来の細胞内のα−シヌクレイン発現もまた、判定され、食作用活性および／またはα−シヌクレインのレベルは、シヌクレイン病の感受性または重症度の指標を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、シヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標を提供する方法であって、対象由来の血液試料中の食作用活性を判定し、対象由来の血液試料の食作用活性を食作用活性の１つ以上の対照レベルと比較することを含み、非罹患個人由来の血液試料の食作用活性と比較して減少した対象における食作用活性が、シヌクレイン病の存在、感受性、または程度の指標である、方法を提供する。随意に、個人は、シヌクレイン病の少なくとも１つの兆候または症状を有し、食作用活性の減少は、症状と組み合わせて、シヌクレイン病に罹患する対象を診断するために使用される。随意に、対象は、シヌクレイン病の症状がなく、食作用活性の減少は、シヌクレイン病に対する感受性の査定において使用される。随意に、対象は、シヌクレイン病と診断され、食作用活性の減少は、シヌクレイン病の重症度を査定するために使用される。随意に、方法はさらに、対象の末梢マクロファージをＩＬ−４またはＩＬ−１３またはそのアゴニストと接触させ、食作用活性が、ＩＬ−４またはＩＬ−１３またはそのアゴニストに応答して、増加するかどうかを査定することを含む。
【００１４】
本発明はさらに、シヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標を提供する方法であって、ＩＬ−４またはＩＬ−１３またはそれらに対するアゴニストの存在および不在下において、対象由来の血液試料の食作用活性を判定することを含み、ＩＬ−４またはＩＬ−１３またはアゴニストの存在下における活性の増加が、シヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標である、方法を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、対象におけるシヌクレイン病をモニタリングする方法であって、対象由来の血液試料の食作用活性を複数回判定し、食作用活性の増加を疾患の重症度の低下と関連付けることを含む、方法を提供する。随意に、対象は、薬物によって治療されており、複数回とは、薬物の投与開始前および後を含み、食作用活性の増加は、対象における薬物に対する陽性反応を示す。
【００１６】
本発明はさらに、シヌクレイン病の診断、予後、またはモニタリングにおける食作用活性の使用であって、随意に、食作用活性が、血液試料中で測定される、使用を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、シヌクレイン病の治療または効果的予防の方法であって、シヌクレイン病を有する、またはその危険性がある対象に、ＩＬ−４またはＩＬ−４をコードする核酸またはＩＬ−４のアゴニストを投与することを含む、方法を提供する。随意に、アゴニストは、亜鉛フィンガータンパク質またはそれをコードする核酸であって、亜鉛フィンガータンパク質は、ＩＬ−４に結合し、その転写を刺激する。
【００１８】
本発明はさらに、シヌクレイン病の治療または効果的予防の方法であって、ｒａｂ３ｂまたはｒａｂ１１ｂ、またはこれらのいずれかをコードする核酸、またはこれらのいずれかのアゴニストを投与することを含む、方法を提供する。随意に、アゴニストは、ｒａｂ３ｂまたはｒａｂ１１ｂに結合し、その転写を刺激する、亜鉛フィンガータンパク質である。
【００１９】
本発明は、シヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標を提供する方法を提供する。そのような方法は、対象の食作用細胞の食作用活性を判定することを含み、食作用細胞中のα−シヌクレイン発現もまた、判定され、食作用活性および／またはα−シヌクレインのレベルは、シヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標を提供する。随意に、方法はさらに、食作用細胞中のα−シヌクレインのレベルを判定することを含む。随意に、細胞は、末梢マクロファージまたは多形核細胞を含む。随意に、食作用活性は、第１の蛍光シグナルから判定され、α−シヌクレインの発現は、第２の蛍光シグナルから判定される。随意に、第１および第２の蛍光シグナルは、同時に検出される。随意に、第１および第２の蛍光シグナルは、ＦＡＣＳによって検出される。随意に、食作用活性は、蛍光標識された細胞またはビーズの取り込みから判定され、α−シヌクレイン発現は、細胞内α−シヌクレインに特異的に結合する、蛍光標識された抗体の取り込みから判定される。随意に、方法はさらに、対象における食作用細胞の食作用活性を非罹患個人由来の食作用細胞の食作用活性の１つ以上の対照レベルと比較することを含む。随意に、方法はさらに、対象における食作用細胞のα−シヌクレイン発現を非罹患個人由来の食作用細胞のα−シヌクレイン発現の１つ以上の対照レベルと比較することを含む。随意に、方法はさらに、対象における食作用細胞の食作用活性およびα−シヌクレイン発現を非罹患個人由来の食作用細胞の食作用活性およびα−シヌクレイン発現の１つ以上の対照レベルと比較することを含む。比較は、例えば、比較を行い、シヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標の出力を提供するようにプログラムされたコンピュータにおいて行うことができる。随意に、シヌクレイン病は、散発性パーキンソン病である。対象は、Ｇ２０１９Ｓ保有者または非保有者であることができる。いくつかの方法では、非罹患個人由来の食作用細胞食作用活性およびα−シヌクレイン発現と比較した対象における食作用活性の減少および／またはα−シヌクレイン発現の増加は、シヌクレイン病の存在、感受性、または程度の指標である。いくつかの方法では、個人は、シヌクレイン病の少なくとも１つの兆候または症状を有し、食作用活性の減少および／またはα−シヌクレイン発現の増加は、症状と組み合わせて、シヌクレイン病に罹患する対象を診断するために使用される。いくつかの方法では、対象は、シヌクレイン病の症状がなく、食作用活性の減少および／またはα−シヌクレイン発現の増加は、シヌクレイン病に対する感受性の査定において使用される。いくつかの方法では、対象は、シヌクレイン病と診断され、食作用活性の減少および／またはα−シヌクレイン発現の増加は、シヌクレイン病の重症度を査定するために使用される。いくつかの方法では、食作用活性の減少は、対象が、シヌクレイン病に罹患していることの指標を提供する。いくつかの方法では、食作用活性の増加は、対象が、シヌクレイン病に罹患していないことの指標を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、シヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標を提供する方法であって、対象の血液試料中の細胞の食作用活性を判定することを含み、対象由来の血液試料の細胞中のα−シヌクレイン発現もまた、判定され、食作用活性および／またはα−シヌクレインのレベルが、シヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標を提供する、方法を提供する。いくつかの方法はさらに、血液試料の細胞中のα−シヌクレインのレベルを判定することを含む。いくつかの方法では、食作用活性およびα−シヌクレイン発現は、同一血液試料において判定される。いくつかの方法では、食作用活性およびα−シヌクレイン発現は、血液試料中の細胞の同一または重複集団において判定される。いくつかの方法では、細胞は、末梢マクロファージを含む。いくつかの方法では、細胞は、多形核細胞を含む。いくつかの方法では、食作用活性は、第１の蛍光シグナルから判定され、α−シヌクレインの発現は、第２の蛍光シグナルから判定される。いくつかの方法では、第１および第２の蛍光シグナルは、同時に検出される。いくつかの方法では、第１および第２の蛍光シグナルは、フローサイトメトリーによって検出される。いくつかの方法では、食作用活性は、蛍光標識された細胞またはビーズの取り込みから判定され、α−シヌクレイン発現は、細胞内α−シヌクレインに特異的に結合する、蛍光標識された抗体の取り込みから判定される。いくつかの方法はさらに、対象における血液試料の食作用活性を非罹患個人由来の血液試料の食作用活性の１つ以上の対照レベルと比較することを含む。いくつかの方法はさらに、対象における血液試料のα−シヌクレイン発現を非罹患個人由来の血液試料のα−シヌクレイン発現の１つ以上の対照レベルと比較することを含む。いくつかの方法はさらに、対象における血液試料の食作用活性およびシヌクレイン発現を非罹患個人由来の血液試料の食作用活性およびα−シヌクレイン発現の１つ以上の対照レベルと比較することを含む。いくつかの方法では、比較は、比較を行い、シヌクレイン病の存在、感受性、または重症度の指標の出力を提供するようにプログラムされたコンピュータにおいて行われる。いくつかの方法では、シヌクレイン病は、散発性パーキンソン病である。対象は、Ｇ２０１９Ｓ保有者または非保有者であることができる。いくつかの方法では、非罹患個人由来の血液試料の食作用活性およびα−シヌクレイン発現と比較した対象における食作用活性の減少および／またはα−シヌクレイン発現の増加は、シヌクレイン病の存在、感受性、または程度の指標である。いくつかの方法では、個人は、シヌクレイン病の少なくとも１つの兆候または症状を有し、食作用活性の減少および／またはα−シヌクレイン発現の増加は、症状と組み合わせて、シヌクレイン病に罹患する対象を診断するために使用される。いくつかの方法では、対象は、シヌクレイン病の症状がなく、食作用活性の減少および／またはシヌクレイン発現の増加は、シヌクレイン病に対する感受性の査定において使用される。いくつかの方法では、対象は、シヌクレイン病と診断され、食作用活性の減少および／またはα−シヌクレイン発現の増加は、シヌクレイン病の重症度を査定するために使用される。いくつかの方法では、食作用活性の減少は、対象が、症候性シヌクレイン病を有することの指標を提供する。いくつかの方法では、食作用活性の増加は、対象が症候性シヌクレイン病を有していないことの指標を提供する。
【００２１】
本発明はさらに、シヌクレイン病に罹患する対象を差別的に治療する方法であって、対象の食作用細胞または血液試料中の食作用活性を判定することと、ある治療計画によって、正常を下回る食作用活性を伴う対象を治療し、または異なる治療計画によって、正常以上の食作用活性を伴う対象を治療することとを含む、方法を提供する。
【００２２】
本発明はさらに、シヌクレイン病を治療するための薬物を伴う臨床試験における参加のための候補ヒト対象を選択する方法であって、ヒト対象の食作用細胞または血液試料の食作用活性を判定することと、食作用活性のレベルに基づいて、試験における選択基準または除外基準に関して、対象を分別することとを含む、方法を提供する。いくつかの方法では、正常を下回る食作用活性を伴う個人は、試験に含まれ、正常以上のレベルを伴う個人は、除外される。いくつかの方法では、候補ヒト対象は、ＬＲＲＫ２の２０１９の突然変異を有する。
【００２３】
本発明はさらに、ＬＲＲＫ２結合剤または変調剤をスクリーニングする方法であって、試験薬剤を、α−シヌクレイン過剰発現を伴わない対照細胞と比較して、食作用活性の減少を有する、α−シヌクレインを過剰発現する食作用細胞と接触させることと、試験薬剤が細胞の食作用活性を増加させるかどうかを判定し、増加が、薬剤が、ＬＲＲＫ２の阻害に有用であることの指標を提供することとを含む、方法を提供する。いくつかの方法では、食作用細胞は、ＬＲＲＫ２に２０１９の突然変異を有する。いくつかの方法はさらに、細胞をＩＦＮ−γと接触させることを含む。いくつかの方法はさらに、試験薬剤のエナンチオマーを食作用細胞と接触させることと、エナンチオマーが、細胞の食作用活性を増加させるかどうかを判定することとを含み、試験薬剤による食作用活性の増加およびエナンチオマーによる食作用活性の不変は、試験薬剤が、ＬＲＲＫ２の阻害に有用であることの指標を提供する。
【００２４】
本発明はさらに、ＬＲＲＫ２結合剤または変調剤をスクリーニングする方法であって、試験薬剤をＬＲＲＫ２の２０１９の突然変異を有する、および／またはＩＦＮ−γで処置された食作用細胞と接触させ、食作用細胞が、α−シヌクレインを過剰発現せず、ＬＲＲＫ２の２０１９の突然変異を伴わず、かつＩＦＮ−γで処置されていない対照細胞と比較して、食作用活性の増加を有し、食作用細胞が、α−シヌクレインを過剰発現しておらず、ＬＲＲＫ２の２０１９の突然変異を伴わず、かつＩＦＮ−γで処置されていない、対照細胞と比較して、食作用活性の増加を有することと、試験薬剤が、細胞の食作用活性を低下させるかどうかを判定し、低下が、薬剤がＬＲＲＫ２の阻害に有用であることの指標を提供することとを含む、方法を提供する。いくつかの方法はさらに、試験薬剤のエナンチオマーをＩＦＮ−γで処置された食作用細胞と接触させること、エナンチオマーが、細胞の食作用活性を低下させるかどうか判定することとを含み、試験薬剤による食作用活性の低下およびエナンチオマーによる食作用活性の不変は、試験薬剤が、ＬＲＲＫ２の阻害に有用であることの指標を提供する。いくつかの方法では、判定は、食作用細胞を不活性粒子またはアポトーシス細胞と接触させ、食作用細胞中の粒子または細胞の取り込みを計数することを含む。いくつかの方法では、細胞は、ミクログリア細胞または末梢マクロファージである。
【００２５】
本発明は、シヌクレイン病の治療において有用な活性のための試験薬剤をスクリーニングする方法であって、試験薬剤を、α−シヌクレインを発現する外来遺伝子を含有する、またはシヌクレイン病に罹患する対象由来の食作用細胞と接触させることと、試験薬剤が細胞の食作用活性を増加させるかどうかを判定することとを含み、増加が、薬剤がシヌクレイン病の治療において有用であることとの指標を提供する、方法を提供する。随意に、判定は、食作用細胞を不活性粒子またはアポトーシス細胞と接触させ、食作用細胞中の粒子または細胞の取り込みを計数することを含む。随意に、細胞は、シヌクレイン病に罹患する対象またはα−シヌクレイン導入遺伝子を伴うトランスジェニック動物由来のミクログリア細胞または末梢マクロファージである。随意に、細胞は、α−シヌクレインが導入された神経細胞である。随意に、方法はさらに、試験薬剤と接触させる前および後に、細胞のα−シヌクレイン内容物を判定することを含む。随意に、方法はさらに、試験薬剤を、シヌクレイン病の動物モデルに投与し、試験薬剤が、シヌクレイン病の少なくとも１つの兆候または症状を阻害、減少、または遅延させるかどうかを判定することを含む。
【００２６】
本発明はさらに、貪食され得る実体と、α−シヌクレインに対する抗体とを含む、診断キットを提供する。貪食される実体は、標識された不活性粒子またはアポトーシス細胞であることができる。
【００２７】
定義
「特異的結合」とは、少なくとも１つの非関連標的に対して生じる非特異的結合より規模が大きく検出可能な程度に規模が大きく、それと区別可能である、標的（例えば、試料の成分）への薬剤の結合を指す。特異的結合は、特定の官能基または特定の空間適合（例えば、鍵と鍵穴型）間の結合の形成の結果であり得るが、非特異的結合は、通常、ファン・デル・ワールス力の結果である。しかしながら、特異的結合は、薬剤が、１つかつ１つのみの標的を結合することを含意しない。したがって、薬剤は、いくつかの異なる標的に対して、異なる強度の特異的結合を示し、他の標的に対しては、非特異的結合のみ示すことができ、多くの場合、そうである。特異的結合は、通常、１０７、１０８、または１０９Ｍ−１以上の結合定数を伴う。
【００２８】
「抗体」または「イムノグロブリン」という用語は、完全抗体およびその結合断片を含むように使用される。典型的には、断片は、抗原に対する特異的結合に関して、自身が由来する完全抗体と競合する。断片は個々の重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、およびＦｖを含む。断片は、組み換えＤＮＡ技術により、あるいは完全なイムノグロブリンの酵素的または化学的な分離によって産生される。また、「抗体」という用語は、他のタンパク質との融合タンパク質として化学的に結合されているか、発現されている１つ以上のイムノグロブリン鎖も含む。また、「抗体」という用語は二重特異性抗体も含むものである。二重特異性または二重機能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。また、「抗体」という用語は、重鎖および軽鎖の可変領域がスペーサーを介して連結している単鎖抗体も含む。
【００２９】
「対象」という用語は、ヒトおよび他の哺乳類対象を含む。この用語は、疾患のいずれの兆候または症状も有していない個人から、疾患の全症状を伴う個人まで、スペクトル上のいずれかにおける個人を指すことができる。このスペクトルにおける個人は、無症候性から、疾患の１つ以上の兆候、１つ以上の症状を有する状態、末期の疾患状態へと進行し得る。疾患の兆候および症状は、連続して、または並行して、発症し得る。これらの段階のいずれかにおける個人は、疾患を発症する遺伝的または他の既知の危険性を有しても有していなくてもよい。
【００３０】
対象が、（例えば、診断および統計資料ＩＶ  ＴＲによって）従来定義されているような疾患を未だ有していないが、危険因子を伴う対象が、危険因子を伴わない対象（随意に、年齢一致対象）より疾患を発症する可能性が有意に高くなる、既知の危険因子（例えば、遺伝的突然変異、家族歴、職業性）を有する場合、対象は、疾患を発症する危険性が既知である。
【００３１】
「感受性」とは、疾患を発症する、および／または疾患の発症が迫っている、確率または危険性を指す。感受性は、対象個人を対照個人または集団（例えば、非罹患個人）と比較する、または同一患者に基づく一連の測定を比較する、相対的用語であり得る。感受性が高いほど、危険性が高くなり、および／または測定と疾患の発症との間の期間が短くなることを意味する。例えば、現在無症候性である個人では、非罹患対照個人と比較した食作用レベルの減少および／またはα−シヌクレインのレベルの増加は、対照個人より疾患を発症する危険性が高いことを示す。さらに例証するために、無症候性個人に基づく一連の測定では、食作用レベルの低下および／または食作用レベルの上昇は両方とも、危険性の増加および最後の測定から症候性疾患の発症までの時間が短いことを示す。
【００３２】
「症状」という用語は、対象によって知覚されるような歩行の変化等、疾患の主観的証拠を指す。「兆候」とは、医師によって観察されるような疾患の客観的証拠を指す（例えば、レビー小体の形態における、体液内における、または食作用細胞の細胞内のいずれかにおける、食作用レベルの減少またはα−シヌクレインレベルの増加）。
【００３３】
「単離された薬剤または他の部分」とは、その部分が、事実上、見つけられる場合、少なくとも部分的に、ペプチドが、より長いタンパク質の一部である場合、フランキング配列を含め、それと必然的に関連付けられる分子から分離されることを意味する。ペプチドまたは部分が、合成である場合、「単離される」とは、少なくとも部分的に、その生成物中で使用される化学物質から分離されることを意味する。単離された薬剤は、必ずしも、薬剤と関連付けられない、またはその合成において使用されない、医薬品賦形剤等の異種成分の存在を除外しない。単離された薬剤はまた、汚染物質がなく純粋であり得る（例えば、純度少なくとも５０、７５、９０、または９９重量％）。単離された高分子薬剤はまた、組成物中の主要高分子種であり得る。
【００３４】
「薬剤」という用語は、薬理学的活性の有無を問わない化合物、天然化合物、合成化合物、小分子、ペプチド、およびペプチド模倣薬を含む、任意の化合物を含む。
【００３５】
「薬理学的薬剤」という用語は、薬理学的活性を有する薬剤を意味する。薬理学的薬剤は、既知の薬物である化合物、薬理学的活性が同定されているが、動物モデルまたは臨床試験におけるさらなる治療上の評価を受けている段階の化合物を含む。薬剤は、活性薬剤が、疾患の予防または治療において有用である、あるいは有用であり得ることを示す、スクリーニングシステムにおいて活性を呈する場合、薬理学的活性を有すると説明することができる。スクリーニングシステムは、生体外、細胞、動物、またはヒトであることができる。薬剤は、さらなる試験が、疾患の治療における実際の予防的または治療的有用性を確立するために要求され得るにもかかわらず、薬理学的活性を有すると説明することができる。
【００３６】
「外来遺伝子」とは、通常、細胞または動物（例えば、トランスジェニックマウスにおけるヒト遺伝子）において見られない遺伝子、または正常と異なるゲノム場所で生じる遺伝子である。「遺伝子」という用語は、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、ミニ遺伝子、および同等物を含む。
【００３７】
統計的有意性は、ｐ値≦０．０５を含意する。
【００３８】
「Ｇ２０１９Ｓ保有者」とは、ＬＲＲＫ２のＧ２０１９Ｓ突然変異に対してホモ接合型またはヘテロ接合型である、対象を意味する。そのような保有者は、パーキンソン病患者の約１％を占める。ヘテロ接合型およびホモ接合型突然変異は両方とも、パーキンソン病の既知の危険性と関連付けられる。Ｇ２０１９Ｓ突然変異は、広範囲の疾患発症（約３０〜７５）および不完全浸透と関連付けられるため、保有者は、症候性または無症候性であり得る。
【００３９】
「末梢マクロファージ」および「単球」という用語は、本願では、同一意味を有する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ヒトシヌクレイン（系統２６）のＢａｃコンストラクトを含有する幼獣Ｐ１−Ｐ３から単離されたミクログリアは、同腹子対照と比較して、ヒトシヌクレインタンパク質のレベルが上昇している。
【図２】ヒトシヌクレインＢＡＣコンストラクト（系統２６）または野生型同腹子を含有する幼獣から単離されたミクログリアを、９０分間、１０ミクロンのビーズまたはアポトーシスＪｕｒｋａｔ  Ｔ−細胞でインキュベートした。細胞を固定し、食作用指数を検鏡によって計算した（ｎ＝１７＋／−標準誤差＊ｐ＜０．０００１）。
【図３】１２月齢の系統２６同腹子マウスから単離された幼獣ミクログリアまたは腹腔マクロファージを、２４時間、培養後、９０分間、アポトーシスＪｕｒｋａｔ  Ｔ−細胞でインキュベートし、食作用指数を検鏡によって計算した（ｎ＝２４および１８＋／−標準誤差＊ｐ＜０．０００１）
【図４】５匹の系統２６トランスジェニックメス由来の腎臓を、Ｃ３、ＩｇＧ、およびＩｇＭに対して染色し、抗体染色の重症度を野生型のシヌクレインゲノムメスにおいて定量化した（ｎ＝１０＋／−標準誤差０．００６３、０．００７７、０．００３９）（Ｈ）。
【図５】１８月齢の系統２６マウスからの腹腔マクロファージを、３日間、Ａｃｃｅｌｌ培地、標的ヒトシヌクレインｓｉＲＮＡのＡｃｃｅｌｌ培地＋ａプール、またはＡｃｃｅｌｌ培地＋非標的ｓｉＲＮＡにおいて培養した。ヒトシヌクレインｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを査定した。Ａｃｃｅｌｌ  ｓｉＲＮＡ処置３日後、マクロファージに、９０分間、１０ｕＭビーズを供給し、固定し、食作用指数を計算した（ｎ＝１４＋／−標準誤差＊ｐ＜０．０００１）
【図６】系統２６、系統４２２、または系統３のへテロ接合体交配による、野生型の個々の幼獣から単離されたミクログリアを、９０分間、１０ｕＭビーズで培養した。食作用指数を計算した（＋／−標準誤差＊ｐ＜０．００１１、Ｐ＜０．００６、Ｐ＜０．００９５）。
【図７】Ｈ４細胞を、２５または１００ｎｇのシヌクレインの野生型Ａ５３ＴまたはＡ３０Ｐ突然変異形態によって２日間、トランスフェクトした後、９０分間、４ミクロンのビーズを添加した。Ａ５３Ｔ形態のシヌクレインの過剰発現は、野生型シヌクレインより低い濃度において、食作用をより強く阻害した。
【図８】系統２６、系統４２２、または系統３のへテロ接合交配による野生型の幼獣から単離されたミクログリアを、１８時間、ＬＰＳで刺激し、ＴＮＦ−αレベルをＥｌｉｓａによって測定した。シヌクレインを過剰発現するミクログリアは、野生型同腹子対照より、ＬＰＳ刺激に応じて、有意に少ないサイトカインを分泌する。
【図９】マウスシヌクレインヌルバックグラウンド上におけるシヌクレインヌルまたはシヌクレイン過剰発現ミクログリアを、８時間、ＬＰＳで刺激し、サイトカイン発現を、多重分析によって、ｍＲＮＡレベルで査定した。シヌクレイン過剰発現は、野生型対照と比較して、より低いレベルのサイトカインを放出するが、ｍＲＮＡレベルにおけるＬＰＳに対するその反応は、野生型細胞に相当する。
【図１０】野生型またはシヌクレイン過剰発現幼獣から単離されたミクログリアに、９０分間、ビーズを供給後、１０分間、氷上でＦＭ−１４３を添加し、蛍光性をフローサイトメトリーによって査定した。３つの独立実験からのＦＭ−１４３の幾何平均蛍光をコンパイルした。野生型ミクログリアは、食作用後、細胞膜体積の増加を実証したが、そのプロセスは、シヌクレイン過剰発現シヌクレインから単離されたミクログリアでは生じなかった。
【図１１】Ｒａｂタンパク質を、テトラサイクリン誘導型シヌクレインコンストラクトを含有する安定Ｈ４細胞中にトランスフェクトした。細胞を、４８時間、テトラサイクリンで処置または処置せず、次いで、９０分間、４μΜビーズを供給し、食作用指数を計算した。Ｒａｂタンパク質の過剰発現は、野生型細胞における食作用にほとんど影響を及ぼさなかったが、Ｒａｂ３ＢおよびＲａｂ１１Ｂの過剰発現は、シヌクレイン過剰発現細胞における食作用を回復させた。
【図１２】３人のヒトドナーから単離されたミクログリアのマイクロアレイ分析を、２４時間、ＩＬ−４で刺激し、マイクロアレイ実験を行い、結果をｑＰＣＲによって確認した。ｑＰＣＲはまた、ＩＬ−４処置系統２６／シヌクレインヌル幼獣から単離されたミクログリアにおいて行った。両事例において、ＩＬ−４による処置によって、シヌクレインｍＲＮＡレベルにおいて、５０％の減少がもたらされた。
【図１３】系統３、２６、または４２２同腹子幼獣細胞から単離された野生型またはシヌクレイン過剰発現ミクログリアを、２４時間、ＩＬ−４で処置し、９０分間、ビーズを供給し、食作用指数を判定した。Ｉｌ−４による処置は、検査された全３つのゲノム系統において、食作用を回復した。
【図１４】ＬＲＫＫ２のキナーゼ活性Ｇ２０１９Ｓ形態を伴うミクログリアのヌクレオポレーション（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒａｔｉｏｎ）は、Ｆ−アクチンファロイジン染料による染色増加および細胞周囲の微小突起の誘発によって測定されるような自発的アクチン転位を誘発する。
【図１５】ＬＲＲＫ２のＧ２０１９Ｓ形態の過剰発現は、食作用を向上させた一方、野生型形態は、何ら影響を及ぼさなかった。
【図１６】ミクログリアのＩＮＦ−γ処置は、約２倍、ＬＲＲＫ２  ｍＲＮＡ転写レベルおよびタンパク質レベルを誘発した。
【図１７】２４時間のＩＮＦγによるミクログリアの処置は、食作用を増加させた一方、２４時間のＩＮＦγによる細胞の処置に続く、２０分間の種々のＬＲＲＫ２阻害剤による処置は、１０ミクロンのビーズの食作用を減少させた。
【図１８】野生型ミクログリアでは、ＬＲＲＫのＧ２０１９Ｓ形態は、食作用を向上させた。シヌクレイン過剰発現細胞では、食作用を有意に低下させた。
【図１９】野生型ミクログリアのＩＮＦγ処置は、食作用を向上させた一方、このシヌクレイン過剰発現細胞における同一処置は、食作用にさらなる減少をもたらした。
【図２０】ストレプトアビジン標識蛍光抗体は、ビオチンでコーティングされたビーズを検出し（上図）、蛍光標識ビオチンは、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズに結合し、それを同定した（下図）。
【図２１】正常ミクログリアは、５および６ミクロンのビーズを取り込むことが可能であって、およびサイトカラシンＤ処置は、この食作用を阻止し、これは、ビーズへのビオチンＡＰＣ結合によって確認された。
【図２２】ウェスタンブロット法によって我々が観察したものと同様に、シヌクレイン発現における２倍の増加が、シヌクレイン過剰発現と野生型細胞との間に観察された。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
Ｉ．総説
本発明は、シヌクレイン病の治療または予防において有用な薬剤のためのスクリーニングの方法、その診断または予後の方法、ならびに治療および予防の方法を提供する。本発明は、一部には、シヌクレイン病に罹患する対象由来の食作用活性を伴う細胞が、α−シヌクレインのレベルを増加させ、食作用活性を減少させ、他の薬剤の中でもとりわけ、ＩＬ−４による処置によって、これらのプロセスが、反転され得る（すなわち、α−シヌクレインレベルが低下し、食作用レベルが上昇した）という結果に基づく。食作用活性の増加は、容易に検出されやすく、また、薬剤が食作用細胞と接触され、薬剤がα−シヌクレインレベルを減少させる能力を有するという指標である、食作用活性に及ぼす薬剤の効果が検出される、スクリーニング検定のための根拠を提供する。α−シヌクレインのそのような細胞内沈着物によって特徴付けられる、α−シヌクレインの細胞内レベルを減少させる能力は、シヌクレイン病の治療および予防に有用である。食作用活性の減少、随意に、α−シヌクレインレベルの増加と組み合わせもまた、対象における有用な診断または予後指標である。食作用活性の減少は、単独で、またはα−シヌクレインレベルの増加と組み合わせて、対象におけるシヌクレイン病の存在、発症の危険性、および／または重症度の指標を提供する。食作用活性の減少は、対象の末梢マクロファージ内で検出することができる。これらの細胞は、ほぼアクセス不可能である、脳またはＣＮＳ内に存在する、シヌクレイン病の他の潜在的マーカーとは対照的に、末梢血液内に存在する。α−シヌクレインレベルはまた、食作用を査定するために使用される食作用細胞と同一または異なる、末梢血液由来の細胞内で測定することができる。
【００４２】
本発明の実践は、機序の理解に依存しないが、α−シヌクレインの細胞内レベルの増加は、小胞輸送に干渉し、損なわれた小胞輸送が、シヌクレイン病をもたらす、または少なくともそれに寄与すると考えられる。損なわれた小胞輸送はまた、食作用活性の減少に寄与する。小胞輸送は、疾患病変および食作用活性の両方に関連するため、食作用活性の障害は、疾患病変の指標としての役割を果たす。食作用活性の障害はまた、神経変性産物を除去するための能力低下を通して、疾患病変に直接影響を及ぼし得る。
【００４３】
ＩＩ．食作用細胞
スクリーニングおよび診断検定は、時として、食作用細胞と称される、食作用活性を伴う細胞を採用する。細胞は、ヒト、または他の哺乳類、特定の齧歯類またはマウスのものであることができる。細胞は、シヌクレイン病に罹患する対象（通常、ヒト）または疾患のトランスジェニック動物モデル（例えば、マウス）から得ることができる。細胞はまた、α−シヌクレイン遺伝子を発現するように形質転換された細胞株であることができる。細胞は、ミクログリア細胞または末梢マクロファージまたは多形核細胞または他の食作用細胞を含む。ミクログリアは、対象またはトランスジェニック動物モデル由来のＥＳ細胞、骨髄、ｉＰＳまたは他の幹または多機能性細胞源の生検または分化または分化転換によって得ることができる。そのような食作用細胞は、非罹患個人由来の対照細胞より高いα−シヌクレインの細胞内レベルを有する。食作用活性を伴ういくつかの神経細胞はまた外科的生検によって、または死後、あるいはＥＳ細胞、骨髄、ｉＰＳまたは他の幹または多機能細胞源の分化または分化転換によって、そのような対象から得ることができる。診断検定のために、検定される食作用細胞は、好ましくは、さらに以下に論じされるように、血液試料由来であるが、対象由来の他の食作用細胞源もまた、使用することができる。これらの全細胞タイプ（すなわち、ミクログリア、末梢マクロファージ、および神経細胞）はまた、トランスジェニックシヌクレイン病（すなわち、α−シヌクレイン導入遺伝子を発現する）の動物モデルから得ることができる。そのような源から得られたこれらの細胞は、その他の点では同等である対照非トランスジェニック動物由来の同一タイプの対照細胞より高いα−シヌクレインの細胞内レベルを有する。食作用細胞はまた、同等の非形質転換細胞より高いレベルにおいて、α−シヌクレインを発現するように、非罹患個人または非トランスジェニック動物から得られた一次細胞または細胞株を形質転換することによって、得ることができる。好適な細胞株の一実施例は、α−シヌクレインをコードするコンストラクトによって形質転換されたＨ４ヒト神経細胞株（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１４８（商標）；Ａｒｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．５２：７１−８４，１９７４；Ｄａｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ２７９：７９７−７９９，１９７９）である。
【００４４】
いくつかの食作用細胞は、ＬＲＲＫ２のＧ２０１９Ｓまたは他の突然変異形態を含む。そのような細胞は、随意に、α−シヌクレインをコードする第２の導入遺伝子とともに、Ｇ２０１９Ｓ突然変異を含むＬＲＲＫ２を伴う、細胞株またはトランスジェニック動物の形質転換によって得ることができる。そのような細胞株はまた、レビー小体病の症状を未だ伴わない保有者であり得る、または症状を有し得る、Ｇ２０１９Ｓ突然変異を伴うヒトから得ることができる。細胞が、α−シヌクレインによって同時にトランスフェクトされたか、または症候性パーキンソン病に罹患するＧ２０１９Ｓ保有者から得られたかどうかに応じて、そのような細胞は、α−シヌクレインの上昇レベルを有している、または有していない可能性がある。以下により詳細に論じられるように、症候性Ｇ２０１９Ｓ保有者において生じるように、Ｇ２０１９Ｓ突然変異およびα−シヌクレインの上昇レベルの同時存在は、食作用の減少と関連付けられる一方、α−シヌクレインの上昇レベルを伴わないＧ２０１９Ｓ突然変異（例えば、α−シヌクレインによってトランスフェクトされていない細胞または無症候性Ｇ２０１９Ｓ保有者由来）は、非罹患個人における平均レベルと比較した食作用レベルの上昇と関連付けられる。
【００４５】
ＩＩＩ．スクリーニング検定
スクリーニング検定の成分は、食作用活性を伴う細胞、スクリーニングされる試験薬剤、および貪食され得る実体を含む。そのような実体は、好ましくは、サイズ４〜１０ミクロンのラテックスビーズ等の不活性粒子であることができる。実体はまた、Ｊｕｒｋａｔ細胞等のアポトーシス細胞であることができる。細胞および不活性実体は、異なる機序によって貪食され、前者は、受容体依存性である。通常、細胞は、食作用される実体に添加する前に、最初に、試験薬剤と接触され、一定周期（例えば、１〜４８時間）の間、インキュベートされる。食作用は、食作用細胞中に貪食される実体の取り込みを検出する他の方法の中でもとりわけ、光学顕微鏡検査またはフローサイトメトリーによって追尾することができる。食作用の検出のための方法は、任意の蛍光ベースのプラットフォーム（例えば、フローサイトメトリー、顕微鏡検査、アレイ走査、またはＴｒ−ｆｒｅｔ、蛍光プレートリーダー）酵素、または比色読取を含むことができる。
【００４６】
食作用活性の増加は、食作用細胞を試験薬剤または試験薬剤が不在である対照反応と接触させる前に、基底値と比較して、査定することができる。そのような対照は、陰性対照である。食作用活性の増加はまた、α−シヌクレインのレベル低下を伴う細胞の食作用活性を刺激することが知られている薬剤（例えば、ＩＬ−４）等、陽性対照と比較して、査定することができる。ＩＬ−４と比較して、同等以上の食作用活性の刺激は、試験薬剤が、食作用細胞の刺激において有用な活性を有することの指標を示し、提供する。以下の実施例のうちのいくつかでは、試験薬剤のエナンチオマーは、陰性対照として使用される。試験薬剤とそのエナンチオマーとの間の異なる効果（例えば、試験薬剤は、食作用を増加させるが、エナンチオマーは、そうではない）は、試験薬剤が、ＬＲＲＫ２の阻害等、標的特異的効果を介して作用することを示す。付加的対照反応は、実施例において説明されるように、細胞の表面に結合されるが、取り込まれない、ビーズの任意のバックグラウンドレベルを検出し、控除するように行うことができる。
【００４７】
スクリーニング検定は、並行または連続して、異なるタイプの食作用細胞において行うことができる。いくつかの薬剤は、全部または複数の細胞タイプにおいて、食作用活性を刺激する。他の薬剤は、全部ではなく、いくつかの細胞タイプにおいて食作用活性を刺激してもよい。例えば、ＩＬ−４は、Ｈ４神経細胞ではなく、ミクログリア細胞および末梢マクロファージ内の食作用活性の刺激に有効であって、Ｈ４細胞における刺激の欠如は、ＩＬ−４受容体の欠如によるものである。
【００４８】
前述の検定によって検出される食作用活性の増加は、α−シヌクレインの細胞内濃度が低下し、その結果、シヌクレイン病の治療のための所望の薬理学的活性である、小胞輸送の減少が救済されたことの代理マーカーとしての役割を果たす。食作用の増加は、代替として、または加えて、α−シヌクレイン局在化の改変、または小胞機序の要素と相互作用する能力によるものであり得る。α−シヌクレインの細胞内レベルの減少はまた、食作用が検定されるのと同様に、ものと同一、重複、または個別集団の細胞において、そのような検定において、直接、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルにおいて査定することができる。ｍＲＮＡを分析するために、食作用細胞は、溶解され、とりわけ、プローブハイブリダイゼーション（例えば、プローブアレイに対して）または定量的ＰＣＲによって、ｍＲＮＡ分析される。代替として、α−シヌクレインタンパク質のレベルは、細胞内染色後、フローサイトメトリー、あるいはウェスタンブロット法またはＥＬＩＳＡ（または、Ｌｕｍｉｎｅｘ分析）等の免疫学的検定によって査定することができる。食作用細胞を試験薬剤と接触させる前に、基底測定と比較した、α−シヌクレインまたはα−シヌクレインタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルの減少は、ＩＬ−４等の陽性対照と比較して、同等以上のレベルとして、所望の薬理学的活性を示す。
【００４９】
スクリーニングされる薬剤は、ＩＬ−４（例えば、ＩＬ−４受容体に対するアゴニスト抗体）、ＩＬ−１３、またはペプチド模倣体のアゴニストまたは模倣体であることが既知である、あるいはそのように推測される薬剤、もしくはＩＬ−４またはＩＬ−１３を含むことができる。ＩＬ−４を模倣することが報告されている薬剤の１つは、転写因子ＳＴＡＴ６（Ｋａｍｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｍｏｌ．１６１（３）：１０７４−７（１９９８））である。ＩＬ−４ＲαのためのＩＬ−４の推定結合エピトープが、段階的に転写された骨格として、酵母転写因子ＧＣＮ４のロイシンジッパー領域を組み込む、ＩＬ−４の２つのヘリックスコイル状のコイルペプチド模倣剤は、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６（７）：６５２−６（１９９９）に説明されている。ＤＨＰ−１４−ＡＢ系ｐｍと称される、さらなるＩＬ−４アゴニストである、４ヘリックスに設計されたタンパク質は、Ｌａｐｏｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０２（６）：１８８９−９４（２００５）に説明されている。スクリーニングされる天然産物はまた、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から得ることができる。ペプチドまたは他の薬剤のランダムライブラリもまた、好適性のためにスクリーニングすることができる。組み合わせライブラリは、段階的に合成され得る、多くのタイプの薬剤のために生成することができる。そのような薬剤として、ポリペプチド、βターン模倣剤、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーＮ−置換グリシン、およびオリゴカルバメート（ｏｌｉｇｏｃａｒｂａｍａｔｅ）が挙げられる。化合物の大規模な組み合わせライブラリは、Ａｆｆｙｍａｘの第ＷＯ９５／１２６０８号、Ａｆｆｙｍａｘの第ＷＯ９３／０６１２１号、Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの第ＷＯ９４／０８０５１号、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａの第ＷＯ９５／３５５０３号、およびＳｃｒｉｐｐｓの第ＷＯ９５／３０６４２号（それぞれ、あらゆる目的のために、参照することによって本明細書に組み込まれる）に説明される、コード化合成ライブラリ（ＥＳＬ）法によって構築することができる。ペプチドライブラリはまた、ファージ提示法によって生成することができる。例えば、Ｄｅｖｌｉｎの第Ｗ０９１／１８９８０号を参照されたい。
【００５０】
特に、Ｇ２０１９Ｓ突然変異を伴う細胞において、スクリーニングされ得る試験薬剤のクラスの１つは、ＬＲＲＫ２の既知の結合剤または変調剤であって、そのうちのいくつかは、知られている。そのような変調剤は、好ましくは、後に、ＬＲＲＫ２をアゴナイズまたはアンタゴナイズすることができる。そのような化合物として、とりわけ、ＬＲＲＫ２に対する抗体、ＬＲＲＫ２の発現を阻害するｓｉＲＮＡ、ＬＲＲＫ２の優性陰性変異株が、挙げられる。ＬＲＲＫ２阻害剤の他の実施例として、ＧＷ５０７４（３−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−５−ヨード−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オン（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６：９９８−１０００，２０１０）、および第ＵＳ２０１０／０２７３７６９号に報告されるものが挙げられる。ＬＲＲＫ２阻害剤は、野生型ＬＲＲＫ２を優先的に阻害する、またはＧ２０１９Ｓ  ＬＲＲＫ２を優先的に阻害する、または両方を阻害してもよい。試験薬剤はまた、ｃＦＭＳまたはＰＬＫ２等の他のキナーゼを阻害することが既知である、またはそのように推測される、薬剤を含むことができる。
【００５１】
スクリーニング検定はまた、Ｇ２０１９突然変異またはインターフェロン・ガンマ等のアゴニストによる処置の結果、向上したＬＲＲＫ２活性を伴う食作用細胞において行うことができる。そのような細胞がまた、α−シヌクレインを過剰発現する場合（例えば、形質転換から、またはレビー小体病に罹患する症候性患者から得られた結果）、食作用活性は、向上したＬＲＲＫ２活性を持たない対照細胞と比較して減少され、化合物は、前述のようにスクリーニングすることができる。そのような方法は、特に、ＬＲＲＫ２に結合し、および／またはその生体外キナーゼ活性を阻害することが既知である、薬剤のための二次スクリーニングとして有用である。前述の検定と同様に、対照と比較した、薬剤による処置から生じる食作用活性の増加は、薬剤が、ＬＲＲＫ２の阻害を介して、シヌクレイン病の治療のための有用活性を有することの指標を提供する。随意に、対照は、試験される薬剤のエナンチオマーであることができる。この場合、エナンチオマーではなく薬剤による食作用の刺激またはエナンチオマーと比較した薬剤の刺激の増加は、薬剤が、ＬＲＲＫ２に関与する経路に及ぼす二次的影響によってではなく、ＬＲＲＫ２の直接阻害によって、作用することの指標を提供する。
【００５２】
スクリーニング検定はまた、α−シヌクレインを過剰発現しない、向上したＬＲＲＫ２活性を伴う、食作用細胞において行うことができる。そのような細胞は、α−シヌクレインではなく、ＬＲＲＫ２  Ｇ２０１９Ｓで形質転換された細胞株またはトランスジェニック動物から、あるいは症候性ではない、Ｇ２０１９Ｓの保有者である個人から、もしくはガンマインターフェロン等のＬＲＲＫ２のアゴニストで処置された食作用細胞から得ることができる。そのような細胞は、正常ＬＲＲＫ２活性（すなわち、野生型遺伝子であって、アゴニストで処置されない）を有する、その他の点では同等である対照細胞と比較して、向上した食作用を示す。そのような細胞は、ＬＲＲＫ２結合剤または阻害剤であることが既知である、あるいはそのように推測される、薬剤と接触され得る。この場合、ＬＲＲＫ２阻害は、対照と比較して、薬剤での処置から生じる食作用の減少によって認められ得る。
【００５３】
ＩＶ．動物モデル
いくつかのシヌクレイン病のトランスジェニック動物モデルは、科学および特許文献に説明されている。一般に、そのような動物は、神経細胞内に発現されるプロモーターと機能可能な連結において、α−シヌクレインをコードする導入遺伝子を有する。そのような動物モデルは、α−シヌクレイン凝集体またはα−シヌクレインから形成されるレビー小体様構造等、シヌクレイン病の少なくとも１つの兆候または症状を発症するように配置される。動物モデルの実施例は、第ＵＳ６，５０４，０８０号，Ｇｉｓｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４，４１９−４２９（２００３），Ｆｅａｎｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０４，３９３−３９８（２０００），第ＷＯ００／２００２０号、第ＷＯ０１／６０７９４号、第ＷＯ０３／０１５５０７号、第ＵＳ６，５０４，０８０号に説明されている。この実施例おいて使用される、ゲノムα−シヌクレイン導入遺伝子を組み込む、トランスジェニック動物は、同時係属中の共同譲渡された第１１／３５２，４０３号により詳細に説明されている。トランスジェニック動物モデルは、生体外検定によって同定された薬剤をスクリーニングし、シヌクレイン病の少なくとも１つの兆候または症状を阻害、遅延、あるいは減少させる活性を確認するために有用である。トランスジェニック動物モデルはまた、前述のように、食作用検定のための食作用細胞源として使用することができる。
【００５４】
Ｖ．診断、予後、およびモニタリング検定
本発明はさらに、本明細書にさらに定義されるように、シヌクレイン病を有する、または有する危険がある、個人を診断し、予測し、モニタリングし、またはその重症度を査定するための検定を提供する。検定は、疾患のいずれの兆候または症状も有していない個人から、疾患の全症状（および、兆候）を伴う個人まで、スペクトル上のいずれかにおける個人において行うことができる。このスペクトルにおける個人は、無症候性から、疾患の１つ以上の兆候、完全に症状が出ていないが、１つ以上の症状を有する状態、末期の疾患状態（例えば、ＤＳＭ  ＩＶ  ＴＲ基準を満たす）へと進行し得る。疾患の兆候および症状は、連続して、または並行して、発症し得る。これらの段階のいずれかにおける個人は、疾患を発症する遺伝的または他の既知の向上した危険性を有する、または有していない可能性がある。
【００５５】
検定は、対象から除去され、典型的には、戻されない、流体試料において行うことができる。試料は、血液試料またはＣＮＳ試料であることができる。検定は、そのような個人由来の食作用細胞において行われる。好ましくは、細胞は、末梢血（例えば、末梢マクロファージまたは多形核細胞または他の食作用細胞）から得られるが、これは、そのような細胞が、低侵襲的技術（すなわち、単純採血）によって利用可能であるためである。そのような検定は、好ましくは、末梢マクロファージを含有する、食作用活性を伴う細胞を含有する、全血または任意の分画において行うことができる。試料は、血液またはＣＮＳを問わず、検定を行う前に、処理を受けてもよく、またはそうでなくてもよいが、食作用活性を含有する細胞は、検定を行うためのままであるべきである。
【００５６】
そのような対象から採取された細胞（例えば、血液またはＣＮＳ試料の形態において）は、貪食され得る実体（例えば、ラテックスビーズまたはアポトーシス細胞）と接触され、食作用活性が、シヌクレイン病を有していない、またはその危険性が既知ではない（すなわち、非罹患個人）個人または個人集団由来のその他の点では同等である細胞と比較して測定される。非罹患個人における基準（例えば、平均値を下回る標準偏差１または２未満）と比較して、試験対象の有意に低下した食作用活性は、シヌクレイン病の存在、感受性（例えば、症状発症の切迫性または確率）、または程度の指標を提供する。反対に、正常レベル（例えば、平均値の標準偏差１または２以内）または正常を上回るレベルは、症候性シヌクレイン病の不在の指標を提供する。そのような指標は、シヌクレイン病の診断において、シヌクレイン病の他の兆候または症状とともに使用することができる。そのような指標は、随意に、シヌクレイン病の他の兆候および／または症状と組み合わせて、現在無症候性の個人において、あるいは疾患と一致する兆候または症状を有するが、それらだけでは、未だ診断に十分ではない、個人において、シヌクレイン病を発症する危険性および／または切迫性を含む、感受性の指標を提供することができる。この方法は、例えば、遺伝的突然変異等の既知の危険因子を伴い、かつ疾患と一致するが、また、他の診断とも一致する、いくつかの兆候および／または症状を伴う対象においても使用することができる。この方法はまた、既知の危険因子が欠如しているが、いくつかのそのような兆候および／または症状を伴う個人においても使用することができる。シヌクレイン病と診断された個人では、食作用活性のレベルは、疾患の重症度の指標を提供することができ、レベルが低いほど、疾患がより重症であることを示す。この方法はまた、任意の既知の危険因子が欠如しており、かつシヌクレイン病の任意の兆候または症状が欠如している個人においても使用することができる。レベルはまた、治療をモニタリングするために使用することができ、治療開始前の基底値と比較して、食作用のレベルが増加している、あるいは治療開始後、（未治療患者における悪化と比較して）レベルが全くまたは殆ど減少していない場合、治療が所望の結果を達成していることの指標を提供する。
【００５７】
食作用レベルはまた、疾患の発症に対する進行のために、対象のモニタリングにおいて使用することができる。そのようなモニタリングの開始前に、対象は、シヌクレイン病の既知の兆候または症状を有していなくてもよく、あるいは１つ以上の兆候または症状を有するが、シヌクレイン病の診断を行うには不十分であってもよい。食作用レベルの経時的減少は、シヌクレイン病に対する感受性の増加を示す。反対に、一定レベルの維持は、食作用活性のレベルの増加同様に、シヌクレイン病に対する感受性が同一または減少していることを示す。
【００５８】
そのような診断、予後、またはモニタリング検定は、ＩＬ−４またはＩＬ−１３等のα−シヌクレインのレベルの増加による、食作用細胞の食作用活性を刺激することが知られている薬剤の存在および不在下で行うことができる。ＩＬ−４、ＩＬ−１３、または同様の既知の刺激剤で処置されている対象由来の細胞における食作用活性の減少レベルの救済は、個人における食作用活性が減少し、その結果、細胞内α−シヌクレインのレベルが上昇したこと、したがって、対象におけるシヌクレイン病の存在、感受性、または重症度のさらなる指標を提供する。
【００５９】
診断、予後、またはモニタリングにおける食作用の査定は、α−シヌクレインレベルの査定と組み合わせることができる。測定されるα−シヌクレインレベルは、好ましくは、細胞内α−シヌクレインの測定値であるが、また、血液または血漿等の体液中の可溶性α−シヌクレインの測定値であることもできる。α−シヌクレインレベルの査定は、食作用の査定と同一または異なる試料において行うことができる。細胞内α−シヌクレインレベルおよび食作用レベルは、同一細胞集団、重複集団、または個別集団において査定することができる。好ましくは、食作用およびα−シヌクレインレベルは両方とも、末梢血細胞内の細胞から査定される。他の分析におけるように、血液試料中の個別の分析のために使用される細胞は、同一、重複、または異なる集団であることができる。食作用およびシヌクレインレベルの分析は、順番に、または並行して、行うことができる。いくつかの方法では、食作用およびα−シヌクレインレベルは、並行して、同一細胞において測定される。同時分析は、例えば、食作用によって取り込まれる細胞またはビーズおよびα−シヌクレインの分別標識化と、例えば、顕微鏡検査、例えば、ＡＲＲＡＹＳＣＡＮ（商標）蛍光走査撮像装置、フローサイトメトリー、またはＦＡＣＳ（登録商標）による分別検出とによって行うことができる。
【００６０】
食作用の分析は、時として、細胞中に取り込まれる実体（例えば、ビーズ、細胞、または他の粒子）を表面に結合されたものと区別するために、対照とともに行われる。実体の取り込み後、標識された対照分子は、対照分子が、表面上の任意の実体に結合するが、それ自体、有意に取り込まれないような条件下、細胞と接触される。これは、ビオチンまたはストレプトアビジンで標識された蛍光実体と、それぞれ、差別的に標識されたストレプトアビジンまたはビオチンである対照分子の食作用を査定することによって達成することができる。細胞の表面上の細胞およびビーズによって取り込まれる実体は、次いで、分別標識化によって区別することができる。α−シヌクレインの細胞内レベルもまた、検出される場合、また、細胞内ビーズに対するもの、表面結合ビーズに対するもの、および細胞内α−シヌクレインに対するものと、３つの異なる標識が存在するように、差別的に標識化することができる。標識は、同時に、または連続して、または任意の組み合わせにおいて、または順番に、検出することができる。
【００６１】
細胞内シヌクレインのレベル上昇は、特に、食作用のレベルの減少と組み合わせて、シヌクレイン病の発症の存在、感受性、または重症度の指標を提供する。例えば、細胞内α−シヌクレインのレベルが高いほど、より高い感受性または重症度を示す。細胞内α−シヌクレインのレベルは、非罹患個人における平均値の標準偏差を少なくとも１または２超えて増加される場合に上昇する。一般に、食作用の低下および細胞内シヌクレインの増加の組み合わせは、特に、同一血液試料中で測定される時、いずれかの指標単独よりも、シヌクレイン病の発症の存在、感受性、または重症度とより強く関連付けられる。
【００６２】
類似原理は、他の患者のように、Ｇ１９２０Ｓ保有者における診断検定を行う際に適用されるが、無症候性保有者では、食作用レベルは、正常レベルより有意に上昇し得る（例えば、非罹患個人における平均値の標準偏差を１または２上回る）。この場合、食作用の減少および／またはα−シヌクレインレベルの増加は、依然として、症候性疾患の存在、感受性、または切迫性の指標である。しかしながら、食作用の上昇および／または正常α−シヌクレインの検出は、保有者が、無症候性であって、症候性疾患を発症する切迫した危険状態にないことの指標である。
【００６３】
そのような患者における食作用のレベルのモニタリングは、随意に、α−シヌクレインレベルの測定と組み合わせて、無症候性から症候性状態への進行またはその欠如の測定値として使用することができる。例えば、食作用が上昇し始め、正常食作用から食作用の減少へと進行する患者は、無症候性から症候性状態へ進行しているとして示される。食作用の安定上昇レベルを有する患者は、無症候性のままであるとして示される。食作用のレベルが上昇し始め、正常レベルに進む患者は、症候性疾患の発症が差し迫っているとして示される。患者状態は、症状単独の発症から査定されることができると考えられ得るが、実際、パーキンソン病の初期症状は、遺伝的突然変異によって（または、別様に）、疾患にかかる危険性があるものにおいて、他の疾患または心気症のものと区別が難しい可能性があり、客観的指標の可用性は、単独で、または該当する場合、症状の査定と組み合わせて、患者のより正確な診断または予後を提供する。
【００６４】
診断、予後、またはモニタリングの前述の方法は、他のそのような方法と同様に、診断、予後、またはモニタリングが、常時、完全に正確ではないにもかかわらず、有用である。そのような方法は、検定が行われない状況と比較して、正確な診断、予後、またはモニタリングの確率を増加させることを前提として有用である。正確度は、時として、他の方法（例えば、疾患の兆候および症状の従来のモニタリング）と組み合わせて、前述の方法を行うことによって、増加させることができる。一般に、診断は、患者の現在の状態（例えば、シヌクレイン病の存在）を示し、予後は、将来の状態（例えば、シヌクレイン病）の発症の予測であって、モニタリングは、経時的状態変化（例えば、治療に対する反応）を査定するための一連の測定（すなわち、少なくとも２回）である。しかしながら、当技術分野におけるように、本願でも使用されるように、用語は、意味的に重複する。例えば、パーキンソン病の末期の兆候および症状を有していない患者における食作用の低下および／またはα−シヌクレインの上昇の検出は、現在異常であることの診断だけではなく、疾患の初期段階ならびに末期の疾患の将来的発症の予後としても捉えることができる。同様に、治療に対する陽性反応を示すことによって、モニタリングは、患者の将来的状態を予測することができる（例えば、重症度の低下または低速悪化）。したがって、同一測定は、時として、患者の現在の状態、将来の状態、または変化の査定の一部あるいは全部に対して、使用することができる。
【００６５】
前述のように、食作用活性およびα−シヌクレインレベルは、同時に、または個々に、測定することができる。食作用活性は、例えば、顕微鏡検査またはフローサイトメトリーによって追従される、標識されたビーズの取り込みから測定することができる。α−シヌクレインレベルは、例えば、顕微鏡検査、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法、フローサイトメトリー、またはＦＡＣＳによって、タンパク質レベルにおいて、あるいはプローブハイブリダイゼーションまたは定量的ＰＣＲによって、ｍＲＮＡレベルにおいて、検出することができる。好ましくは、α−シヌクレインは、細胞中の細胞内α−シヌクレインの染色およびフローサイトメトリーまたはＦＡＣＳによる細胞の検出によって、検出される。染色が、α−シヌクレインに対する抗体等の高分子による場合、細胞は、好ましくは、例えば、実施例に説明されるように、透過処理される。
【００６６】
診断検定の成分（例えば、貪食されるビーズまたは細胞内α−シヌクレインに結合する抗体）は、検出可能なように標識化することができる。検出可能標識とは、検出するために使用される、または使用することができる（例えば、物理的または化学的特性によって）、あるいは検出可能標識が結合される、標的の存在を示す、原子（例えば、放射性核種）、分子（例えば、フルオレセイン）、酵素、または錯体を指す。結合は、標識がビーズに結合される場合、直接的である、または細胞内α−シヌクレインが、それ自体、標識される、抗体の結合を介して、標識される場合、間接的であり得る。ビーズ材料自体内に組み込まれる種々の蛍光標識を伴うビーズは、市販されている。有用な検出可能標識として、標識されたストレプトアビジン複合体で染色するためのビオチンまたはその逆、蛍光染料（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、および同等物）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、ヒドロラーゼ、特に、アルカリ性ホスファターゼ、エステラーゼ、およびグリコシダーゼ等のホスファターゼ、またはオキシドレダクターゼ、特に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等のペルオキシダーゼ、およびＥＬＩＳＡにおいて一般に使用されるその他）、基質、補因子、阻害剤、化学発光基、発色剤、およびコロイド金あるいは着色ガラスまたはプラスチック等の比色標識（例えば、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号、および第４，３６６，２４１号参照）が挙げられる。放射性標識および化学発光標識は、写真用フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出することができ、蛍光マーカーは、放出された光を検出するための光検出器を使用して、検出されてもよい（例えば、フローサイトメトリーまたは蛍光活性細胞分類におけるように）。酵素標識は、典型的には、酵素を基質に提供し、基質上の酵素の作用による反応産物を検出することによって、検出され、比色標識は、単に、着色標識を視覚化することによって、検出される。したがって、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的手段によって検出可能な任意の組成物である。
【００６７】
検定は、食作用レベルおよび／またはα−シヌクレインを示すシグナルが、非罹患個人における平均シグナルとの比較等によって、検定における検体のレベルを表すシグナルを受信および分析し、結果（すなわち、食作用レベルおよび／またはα−シヌクレインレベル）の出力を提供するようにプログラムされたデジタルコンピュータによって受信されるように、自動化することができる。結果は、例えば、非罹患個人におけるものの範囲（例えば、平均値の周囲において標準偏差＋／−１または２）と比較して、患者において食作用のレベルを図示するチャートとして、提示されてもよい。出力は、診断、予後、またはモニタリング結果（例えば、症候性疾患の指標、治療に対する陽性反応、無症候性から症候性疾患への進行）を示してもよく、またはそうでなくてもよい。好適なコンピュータは、計算を行うための中央処理ユニット、出力を表示するためのディスプレイ、インターフェース、キーボード、指示デバイス、種々のプログラムを記憶するメインメモリ、および検定から受信したデータ、プログラムミング、または出力データを記憶することができる、記憶デバイスを含むことができる。コンピュータは、パーソナルコンピュータ、デジタル対応テレビ、携帯電話、携帯情報端末、または同等物であることができる。メインメモリまたは記憶デバイス内に常駐する情報は、そのようなシステムをプログラムするために使用することができ、例えば、ディスクタイプの光学または磁気媒体、磁気テープ、固体動的または静的メモリを表すことができる。
【００６８】
ＶＩ．タンパク質
本願は、α−シヌクレイン、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ｒａｂ３ｂ、ｒａｂ１１ｂを含む、いくつかのタンパク質を参照する。文脈から別様に明白でない限り、そのようなタンパク質のヒト形態が、意図される。ヒトα−シヌクレインの変種（例えば、哺乳類）または誘導変異体（例えば、少なくとも９０％の配列同一性）もまた、使用することができるが、ヒト配列が、好ましい。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースからの例示的配列は、α−シヌクレイン（Ｐ３７８４０）、ＩＬ−４（Ｐ０５１１２）、ＩＬ−１３（Ｐ３５２２５）、ｒａｂ３ｂ（Ｐ２０３３７）、およびｒａｂ１１ｂ  Ｑ１５９０７である。Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔデータベースはまた、ヒト配列のいくつかの対立遺伝子多型および変種も列挙している。ヒトα−シヌクレインのいくつかの既知の自然変異体として、Ｅ４６Ｋ、Ａ３０Ｐ、およびＡ５３Ｔが挙げられる（最初の文字は、野生型Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ配列におけるアミノ酸を示し、数字は、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ配列におけるコドン座位であって、２番目の文字は、対立遺伝子多型におけるアミノ酸である）。これらの自然変異体の組み合わせを含む、α−シヌクレインの形態もまた、生成することができる。
【００６９】
ＬＲＲＫ２またはロイシンリッチリピートキナーゼ２は、アンキリンリピート領域、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）領域、キナーゼ領域、ＤＦＧ様モチーフ、ＲＡＳ領域、ＧＴＰａｓｅ領域、ＭＬＫ様領域、およびＷＤ４０領域を含む、タンパク質、またはそれらをコードする遺伝子を指す。タンパク質は、大部分は、細胞質内に存在するが、また、ミトコンドリア外膜とも関連する。ＮＣＢＩデータベースにおける哺乳類ＬＲＲＫ２配列の受託番号として、ＡＡＶ６３９７５．１（ヒト）、ＸＰ＿００１１６８４９４．１（チンパンジー）、ＸＰ＿６１５７６０．３（ウシ）、ＸＰ＿５４３７３４．２（イヌ）、ＮＰ＿０８０００６．２（ハツカネズミ）、およびＸＰ＿２３５５８１．４（ドブネズミ）が挙げられる。ヒトＬＲＲＫ２の自然発生する突然変異の数は、パーキンソン病と関連付けられる。ＬＲＲＫ２遺伝子のエクソン４１における６０５５Ａ突然変異は、ＭＡＰＫＫＫ（分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ）領域の予測される活性ループ内で高度に保存された残基のＧ２０１９Ｓアミノ酸置換につながる。この突然変異は、ＬＲＲＫ２のタンパク質キナーゼ活性を向上させる（例えば、第ＷＯ２００８／１２２７８９号参照）。他のＬＲＲＫ２突然変異として、Ｒ１４４１Ｃ、Ｒ１４４１Ｇ、Ｙ１６９９Ｃ、Ｒ１９１４Ｈ、Ｉ２０１２Ｔ、Ｉ２０２０Ｔ、またはＧ２３８５Ｒが挙げられる。Ｒ１４４１Ｃ、Ｒ１４４１Ｇ、Ｙ１６９９Ｃ、またはＴ２３５６Ｉは、野生型ＬＲＲＫ２と類似タンパク質キナーゼ活性を有する。Ｒ１９１４Ｈ、Ｉ２０１２Τ、およびＧ２３８５Ｒは、ほぼ不活性である。Ｉ２０２０Ｔは、野生型ＬＲＲＫ２とＲ１９１４Ｈまたは１２０１２Ｔとの間の中間活性を有する。随意に、自然突然変異または突然変異の組み合わせ、好ましくは、Ｇ１９２０Ｓ突然変異を伴う、ＬＲＲＫ２のヒト形態が、好ましくは、この方法において使用される。
【００７０】
ＶＩＩ．治療、診断、予後、およびモニタリング治療計画に適した対象
治療、診断、予後、またはモニタリングに適した対象は、シヌクレイン病の危険性があるが、兆候および／または症状を示していない個人、ならびに１つ以上の症状を現在示している対象を含む。シヌクレイン病は、正常（非罹患）個人と比較して、α−シヌクレインを含む、過剰レベルのα−シヌクレインまたは異常な病理学的特性によって特徴付けられる疾患を意味する。そのような疾患として、パーキンソン病の全形態（既知の遺伝的異常性を伴う疾患および特発性パーキンソン病の形態を含む）、ＤＬＢ、ＤＬＢＤ、ＬＢＶＡＤ、純粋自律神経失調症、レビー小体性嚥下障害、偶発性ＬＢＤ、遺伝性ＬＢＤ（例えば、α−ＳＮ遺伝子、ＰＡＲＫ３、およびＰＡＲＫ４の突然変異）、ならびに多系統萎縮症（例えば、オリーブ橋小脳萎縮症、線条体黒質変性症、およびシャイ・ドレーガー症候群）が挙げられる。この治療方法は、シヌクレイン病（例えば、遺伝的または生化学的）の既知の危険性を有するが、無症候性である、または少なくともパーキンソン病の診断のために不十分な症状を有する、個人に予防的に投与することができる。そのような個人として、この疾患に罹患経験のある血縁者を有するもの、およびその危険性が遺伝的または生化学的マーカーの分析によって判定されたものが挙げられる。ＰＤに対する危険性の遺伝的マーカーとして、α−シヌクレイン、またはＰａｒｋｉｎ、ＵＣＨＬＩ、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子、およびＬＲＲＫ２遺伝子における突然変異、特に、α−シヌクレイン遺伝子の座位５３における突然変異およびＬＲＲＫ２におけるＧ２０１９Ｓ突然変異が挙げられる。パーキンソン病に現在罹患している個人は、安静時振戦、筋硬直、運動緩慢、および姿勢動揺を含む、その臨床的顕在化から認識することができる。多くの人々に影響を及ぼす、他の二次的および非運動性症状も、パーキンソン病を認識するために重要であると医師によって益々認識されている（例えば、前傾前屈姿勢、ジストニア、疲労、微細運動の器用さおよび協調障害、粗大運動協調障害、運動消失、静座不能、言語障害、顔貌喪失、小字症、嚥下困難、性的機能障害、痙攣、およびよだれ）。一部の対象は、その一次症状として、振戦を経験する一方、他の対象は、振戦はないが、平衡に関わる問題を有する可能性がある。また、一部の対象では、疾患は、急速に進行し、他の対象では、そうではない。パーキンソン病のこれらおよび他の危険因子または兆候ならびに症状はまた、前述のように、本発明の診断または予後検定を行うための理由を提供することができる。診断または予後検定はまた、予防的または治療的処置のために、シヌクレイン病を発症する既知の危険性にある、あるいはそれを有する患者を同定する手段を提供する。
【００７１】
無症候性対象では、治療は、任意の年齢（例えば、１０、２０、または３０代）において、開始することができる。しかしながら、通常、対象が、４０、５０、６０、または７０代に到達するまで、治療を開始する必要はない。随意に、疾患の症状、兆候、または危険因子の有無は、治療開始前に判定される。
【００７２】
ＶＩＩＩ．治療計画
治療計画において使用することができる薬剤として、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、それをコードする核酸またはそれに対するアゴニスト、ｒａｂ３ｂ、ｒａｂ１１ｂ、それをコードする核酸またはそれに対するアゴニストが挙げられる。アゴニストのクラスの１つは、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ｒａｂ３ｂ、またはｒａｂ１１ｂのいずれかに結合し、活性化する、亜鉛フィンガータンパク質である。アンタゴニストの別のクラスは、ＩＬ−４またはＩＬ−１３に対する抗イディオタイプ抗体である。薬剤はまた、食作用を刺激し、または前述のスクリーニング方法によって同定されるα−シヌクレインの細胞内レベルを低下させる活性を伴う薬剤を含む。
【００７３】
予防的用途では、医薬組成物または医薬品は、疾患の生化学的、組織学的、および／または行動上の症状、その合併症、ならびに疾患の発症の際に現れる中間病理表現型を含む、疾患の危険性を少なくとも減少させる、その重症度を低下させる、またはその発症を遅延させるために十分な治療計画（すなわち、用量、頻度、送達経路）において、シヌクレイン病を発症する危険性が既知である、あるいは別様にその影響を受けやすい対象に投与される。
【００７４】
治療的用途では、組成物または医薬品は、その合併症および中間病理症状を含む、（生化学的、組織学的、および／または行動上の）疾患の症状を減少させる、あるいは少なくとも悪化を減速させるために十分な治療計画（用量、頻度、経路）において、そのような疾患であることが推測される、もしくはそれに既に罹患している対象に投与される。治療または予防的処置を達成するために適度な量は、治療上または予防的に有効な用量として定義される。治療計画では、薬剤は、通常、疾患の症状が消失する、または有意に低下するまで、間隔をおいて投与される。随意に、投与は、再発を防止するために継続することができる。予防的治療計画では、薬剤はまた、通常、いくつかの事例では、対象の一生の残りの間、間隔をおいて投与される。治療は、投与される薬剤のレベルを検定することによって、または対象の反応をモニタリングすることによって、モニタリングすることができる。
【００７５】
前述の条件の治療のための本発明の組成物の有効用量は、投与の手段、標的部位、対象の生理学的状態、対象がヒトまたは動物であるかどうか、他の薬剤が投与されているかどうか、および治療が予防的または治療的であるかどうかを含む、多くの異なる要因に応じて異なる。通常、対象は、ヒトである。トランスジェニック哺乳類を含む、非ヒト哺乳類もまた、治療することができる。治療投与量は、典型的には、安全性および有効性を最適化するために滴定される。
【００７６】
抗体、ペプチド、および小分子の投与量は、宿主体重の約０．０００１から約１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には、約０．０１から約２０ｍｇ／ｋｇの範囲である。例示的治療計画は、１日１回、週１回、２週間に１回、または月１回、あるいは３から６ヶ月に１回の投与を伴う。投与量および投与の頻度は、治療は、予防的または治療的であるかどうかに応じて異なることができる。予防的用途では、比較的に低投与量が、長期間にわたって、比較的に低頻度の間隔において投与される。いくつかの対象は、その一生の残りの間、治療を受け続ける。治療的用途では、比較的に短い間隔において、比較的に高投与量が、時として、疾患の進行が、減速または終了されるまで、好ましくは、対象が、疾患の症状の部分的または完全改善を示すまで、要求される。いくつかの事例では、対象は、予防的投与の場合と同一治療計画を投与することができる。
【００７７】
薬剤をコードする核酸のための用量は、対象あたり約１０ｎｇから１ｇ、約１００ｎｇから約１００ｍｇ、約１μｇから約１０ｍｇ、または約３０から約３００μｇのＤＮＡの範囲である。感染性ウイルスベクターのための用量は、用量あたり約１０から約１００、または約１０３約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、またはそれ以上のビリオンと異なってもよい。
【００７８】
本発明の薬剤は、予防的および／または治療的処置のために、非経口用、局所用、静脈内用、経口用、皮下用、髄腔内用、動脈内用、頭蓋内用、腹腔内用、鼻腔内用、または筋内用手段によって投与することができる。いくつかの方法では、薬剤は、直接、沈着物が凝集された特定の組織中に注入することができ、例えば、頭蓋内注入である。
【００７９】
本発明の薬剤は、随意に、シヌクレイン病の治療に少なくとも部分的に有効である、他の薬剤と組み合わせて投与することができる。そのような薬剤として、α−シヌクレインに対する抗体またはそのような抗体を誘発するα−シヌクレインの断片、Ｓｉｎｅｍｅｔ（Ｌｅｖｏｄｏｐａ／Ｃａｒｂｉｄｏｐａ）、ＲｅｑｕｉｐおよびＭｉｒａｐｅｘ等のドーパミンアゴニスト、Ｓｙｍｍｅｔｒｅｌ、Ａｒｔａｎｅ、Ｃｏｇｅｎｔｉｎ、Ｅｌｄｅｐｒｙｌ（また、Ｄｅｐｒｅｎｙｌとしても知られる）、Ｔａｓｍａｒ、ならびにＣｏｍｔａｎが挙げられる。
【００８０】
本発明の薬剤は、多くの場合、活性治療薬剤および種々の他の薬学的に容認可能成分を含む、組成物として投与される。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９８０）を参照されたい。採用される特定の製剤は、投与および治療的用途の意図された様式に依存する。組成物はまた、所望の製剤に応じて、一般に、動物またはヒト投与のための医薬組成物を処方するために使用される賦形剤として定義される、薬学的に容認可能な非毒性担体または希釈剤を含むことができる。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に負の影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の実施例として、蒸留水、生理学的リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、およびハンクス液が挙げられるが、それらに限定されない。加えて、医薬組成物または製剤はまた、他の担体、アジュバント、または非毒性、非治療的、非免疫原性安定剤、および同等物を含んでもよい。
【００８１】
医薬組成物はまた、タンパク質等の大きなゆっくりと代謝される高分子、キトサン等の多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、コポリマー（ラテックス官能化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ビーズ、アガロース、セルロース、および同等物等）、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体（油滴またはリポソーム等）を含むことができる。
【００８２】
非経口投与の場合、本発明の薬剤は、水、油、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどの滅菌液であり得る、医薬担体を伴う生理的に許容可能な希釈剤中の物質の溶液または懸濁液の注射可能な投与量として投与することができる。ヒト投与のための非経口用組成物は、無菌性、かつ実質的に等張性であって、ＧＭＰ条件下で生成される。加えて、湿潤剤、乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝剤、および同等物等の補助剤が、組成物中に存在することができる。医薬組成物の他の成分は、石油、動物、植物、または合成由来、例えば、ピーナッツ油、大豆油、および鉱油である。一般に、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等のグリコールは、特に、注射用溶液のために好ましい液体担体である。
【００８３】
典型的には、組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの注射剤として調製される。注入に先立って、液体賦形剤中に溶解または懸濁するために好適な固体形態もまた、調製することができる。製剤はまた、前述のように、アジュバント効果を増強するために、リポソームまたはポリラクチド、ポリグリコリド、コポリマー等の微粒子中に乳化あるいは封入することもできる（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１５２７  ３３（１９９０）およびＨａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２８：９７−１１９（１９９７）参照）。本発明の薬剤は、活性成分の持続またはパルス放出を可能にするように処方され得る、デポー注射剤あるいは植込み製剤の形態で投与することができる。
【００８４】
他の投与様式のために好適な付加的製剤は、経口用、鼻腔内用、および呼吸器用製剤、坐剤、ならびに経真皮用用途を含む。鼻腔内用送達は、特に、ペプチドを脳に送達するために有用である。ペプチドは、例えば、鼻腔用スプレーとして、滅菌水中に処方することができる。坐剤の場合、結合剤および担体として、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが挙げられる。そのような坐剤は、約０．５％から約１０％、または約１％から約２％の範囲内の活性成分を含有する混合物から形成することができる。経口用製剤は、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウム等の賦形剤を含むことができる。これらの組成物は、典型的には、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放製剤、または散剤の形態をとり、活性成分を約１０％から約９５％、または約２５％から約７０％含有する。
【００８５】
局所用用途は、経真皮用または皮内送達をもたらすことができる。局所用投与は、薬剤をコレラトキシンまたはその無毒化誘導体もしくはサブユニットあるいは他の同様な細菌毒素と同時投与することによって、促進することができる（Ｇｌｅｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８５１（１９９８）参照）。同時投与は、成分を混合物として、または化学的架橋結合もしくは融合タンパク質としての発現により得られる結合分子として使用することによって、達成することができる。代替として、経真皮用送達は、皮膚パッチまたはトランスフェロソームを使用して、達成することができる。（Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５：３５２１  ２４（１９９５）；Ｃｅｖｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１３６８：２０１  １５（１９９８））。
【００８６】
亜鉛フィンガータンパク質は、所望の遺伝子内の任意の所望の標的部位に結合するように操作または選択され、亜鉛フィンガータンパク質に付着される調節領域のタイプに応じて、その遺伝子の転写を活性化または抑制することができる。例えば、亜鉛フィンガータンパク質は、Ｉｌ−４、ＩＬ−１３、ｒａｂ３ｂ、またはｒａｂ１１ｂに結合し、その転写を活性化するために設定することができる。亜鉛フィンガータンパク質の１つのクラス（Ｃ２Ｈ２クラス）を特徴付ける例示的モチーフは、−Ｃｙｓ−（Ｘ）２−４−Ｃｙｓ−（Ｘ）１２−Ｈｉｓ−（Ｘ）３−５−Ｈｉｓ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸である）である。単一フィンガー領域は、長さ約３０のアミノ酸であって、亜鉛を通して位置付けられるβターンにおける２つの不変ヒスチジン残基および２つの不変システイン残基を含有するαヘリックスを含有する。標的部位は、プロモーターまたはエンハンサー内あるいは構造遺伝子内にあり得る。亜鉛フィンガータンパク質は、ヒトＫＯＸ−１タンパク質由来ＫＲＡＢ抑制領域等の転写抑制因子に連結し、転写を抑えることができる（Ｔｈｉｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ２，３６３−３７４（１９９０）；Ｍａｒｇｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，４５０９−４５１３（１９９４）；Ｐｅｎｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２９０８−２９１４（１９９４）；Ｗｉｔｚｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，４５１４−４５１８（１９９４））。代替として、亜鉛フィンガータンパク質は、ＶＩＰ１６等の転写活性因子に連結し、転写を活性化することができる。亜鉛フィンガータンパク質によって標的化するために好適な標的部位を選択するための方法、および選択された標的部位に結合するための亜鉛フィンガータンパク質を設定するための方法は、第ＷＯ００／００３８８号に説明されている。ファージ提示法を使用して、標的に結合するための亜鉛フィンガータンパク質を選択するための方法は、第ＥＰ．９５９０８６１４．１号に説明されている。亜鉛フィンガータンパク質の設計のために使用される標的部位は、典型的には、約９〜１９ヌクレオチドである。亜鉛フィンガーは、タンパク質として投与することができるが、より一般には、遺伝子療法アプローチによって、核酸として投与され、対象内の原位置で発現される。
【００８７】
治療的薬剤をコードする核酸の送達のためのいくつかのウイルスベクター系は、レトロウイルス系（例えば、Ｌａｗｒｉｅ  ａｎｄ  Ｔｕｍｉｎ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３，１０２−１０９（１９９３）参照）、アデノウイルスベクター（例えば、Ｂｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，５９１１（１９９３）参照）、アデノ関連ウイルスベクター（例えば、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９，１８６７（１９９４）参照）、ワクシニアウイルスおよび鶏痘ウイルスを含む、ポックス科（ｐｏｘ  ｆａｍｉｌｙ）由来ウイルスベクター、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林ウイルス派生のもの等のαウイルス属由来のウイルスベクター（例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，５０８−５１９（１９９６）参照）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（第ＵＳ  ５，６４３，５７６号参照）、ならびに水疱性口内炎ウイルス等のラブドウイルス（第ＷＯ９６／３４６２５号参照）、ならびにパピローマウイルス（Ｏｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６，３２５−３３３（１９９５）；Ｗｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，第ＷＯ  ９４／１２６２９号、およびＸｉａｏ  ＆  Ｂｒａｎｄｓｍａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２４，２６３０−２６２２（１９９６））を含め、利用可能である。
【００８８】
免疫原をコードするＤＮＡまたはそれを含有するベクターは、リポソーム中にパッケージングすることができる。好適な脂質および関連する類似物は、第ＵＳ５，２０８，０３６号、第ＵＳ５，２６４，６１８号、第ＵＳ５，２７９，８３３号、および第ＵＳ５，２８３，１８５号によって説明されている。免疫原をコードするベクターおよびＤＮＡはまた、微粒子状担体に吸着またはそれらと会合され得、その実施例として、ポリメチルメタクリレートポリマーならびにポリラクチドおよびポリ（ラクチドコグリコリド）が挙げられる（例えば、ＭｃＧｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏ  Ｅｎｃａｐ．１９９６参照）。
【００８９】
遺伝子療法ベクターまたは裸のＤＮＡは、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、鼻、胃、皮内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）あるいは局所用途（例えば、第ＵＳ５，３９９，３４６号参照）によって、個人対象への投与により、生体内で送達させることができる。そのようなベクターはさらに、ブピバカイン（例えば、第ＵＳ５，５９３，９７０号参照）等の促進剤を含むことができる。ＤＮＡはまた、遺伝子銃を使用して投与することができる。上記Ｘｉａｏ  ＆  Ｂｒａｎｄｓｍａを参照されたい。免疫原をコードするＤＮＡは、極微金属ビーズ表面上に沈殿される。微小発射体は衝撃波または膨張ヘリウムガスで加速され、いくつかの細胞層の深さまで組織に浸透する。例えば、Ａｇａｃｅｔｕｓ  Ｉｎｃ．（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ）により製造されるＡｃｃｅｌ遺伝子送達デバイスが好適である。代替として、裸のＤＮＡは、化学的または機械的刺激によって、皮膚上にＤＮＡを単にスポットすることにより、皮膚を通して血流中に進めることができる（第ＷＯ９５／０５８５３号参照）。
【００９０】
さらなる変形例では、免疫原をコードするベクターは、個人対象から外植された細胞（例えばリンパ球、骨髄吸引物、組織生検）または普遍的ドナーの造血幹細胞等の細胞に生体外で送達された後、通常、ベクターを組み込んだ細胞の選択後に細胞を対象に再移植することができる。
【００９１】
ＩＸ．臨床治療および異なる治療計画
食作用活性の査定は、臨床試験における選択基準を満たす個人の根拠を提供する。例えば、臨床試験の候補者は、食作用活性に対してスクリーニングされ、正常を下回る食作用活性を有する対象が、試験における選択基準のために選択されることができる。患者はさらにまた、α−シヌクレインのレベルを判定し（前述のように）、正常を下回る食作用活性および正常を上回るα−シヌクレインの両方を有する、試験のための患者を選択することによって、階層化することができる。患者は、加えて、または代替として、ＬＲＲＫ２におけるＧ１９２０Ｓ等、シヌクレイン病と関連付けられた遺伝的突然変異の保有者であることに基づく選択によって、階層化することができる。食作用のレベルの減少（および、随意に、α−シヌクレインの増加）を有する、そのような患者の選択はまた、薬物の治療的試験に有用である。正常を上回るレベルの食作用を有するそのような患者の選択は薬物による予防的治療の試験に有用である。正常レベルの食作用を有するそのような患者の選択は、予防的または初期疾患段階の治療の試験に有用である。
【００９２】
類似原理は、治療を行うかどうか、またはどの治療計画を患者に適用するかどうかの判定に適用される。食作用レベルの減少を有する患者は、症候性疾患を有するとして示され、したがって、本願に説明されるものおよび別様に既知のものを含め、症候性パーキンソン病のための任意の利用可能な治療を受けるべきであると示されてもよい。正常レベルの食作用、またはＧ１９２０Ｓの場合、正常以上のレベルの食作用を有する患者は、予防または初期段階の疾患において有効かつ適切である（すなわち、実質的副作用がない）ことが知られている薬理学的療法または薬理学的療法を投与され得ない。
Ｘ．キット
本発明はさらに、説明される診断、予後、モニタリング、またはスクリーニングの方法を行うために、本明細書で説明される試薬のいずれかを含む、キットを提供する。そのようなキットの１つは、食作用を検出するための１つ以上の試薬をα−シヌクレイン発現を検出するための１つ以上の試薬と組み合わせる。食作用を検出するための１つ以上の試薬は、例えば、不活性粒子またはアポトーシス細胞等、貪食され得る実体を含むことができる。そのような実体は、好ましくは、標識される。α−シヌクレイン発現を検出するための１つ以上の試薬は、α−シヌクレインまたはこの結合特異性を伴う他の部分に対する抗体を含むことができる。試薬もまた、好ましくは、標識される、または標識された抗イディオタイプ抗体等の二次的標識が、含まれる。そのようなキットは、前述のように、診断、予後、またはモニタリングにおいて使用することができる。別のキットは、貪食され得る実体と、食作用細胞とを含む。キットはまた、細胞による実体の食作用を刺激する、陽性対照化合物を含んでもよい。そのようなキットは、前述に開示されるように、治療的活性のためのスクリーニング薬剤において使用することができる。キットはまた、キットによって行われるスクリーニング、診断、予後、またはモニタリング等、方法を行うための指示を提供する、パッケージングあるいは他の標識を含むことができる。
【実施例】
【００９３】
実施例１：ミクログリアおよびマクロファージ中の内因性シヌクレインの過剰発現は、食作用を妨害する
ミクログリア機能に及ぼす内因性シヌクレインの役割を調査するために、我々は、野生型またはＥ４６Ｋ突然変異形態のヒトシヌクレインが、ヒト細菌人工染色体（ｂａｃ）から過剰発現された、トランスジェニックマウスモデルを利用した。ｂａｃコンストラクトは、シヌクレインプロモーターおよび上流配列（４５ｋｂｐ）、ならびに下流３’配列（１５ｂｐ）を含有していた。３つの着目動物系統を同定した。系統４２２は、野生型シヌクレインを発現し、２つの付加的系統、系統２６および系統３は、突然変異体Ｅ４６Ｋ形態を発現する。ヒトシヌクレインの過剰発現と関連付けられた改変ミクログリア機能は、一部には、この系統において観察された高シヌクレイン発現のため、系統２６Ｐ１−Ｐ３幼獣から単離された細胞中で査定された。図１は、系統２６ゲノム幼獣から単離されたミクログリアが、同腹子野生型幼獣由来のミクログリアの４から５倍のシヌクレインを発現し、シグナルが、シヌクレインヌル動物から単離されたミクログリア中には不在であることを示す。マウスミクログリア中のヒトシヌクレインの有意な過剰発現によって、我々は、ミクログリア機能に及ぼすシヌクレインレベル上昇の結果を査定することが可能となった。アポトーシス細胞の食作用は、特異的受容体の係合を要求する一方、ラテックスビーズ等の不活性粒子の摂取は、そうではない。受容体係合のための要件が異なるが、両標的とも、細胞内シグナル伝達、アクチン転位、および食作用カップへの膜組織の動員の活性化を要求する。変化を評価するために、一般に、食作用プロセスミクログリアは、１０μΜビーズまたはアポトーシスＪｕｒｋａｔ  Ｔ−細胞が供給される。ヒトシヌクレインの過剰発現は、図２に示されるように、非トランスジェニック同腹子対照と比較して、ビーズおよびアポトーシス細胞両方のミクログリア食作用を有意に損なわせた。食作用の両形態が、損なわれたため、受容体発現または機能における欠陥ではなく、むしろ、一般に、全体的食作用プロセスの改変が示唆された。シヌクレイン過剰発現と関連付けられた食作用機能の減少は、成獣系統２６動物から単離された腹腔マクロファージが、図３に示されるように、同一規模に対して、欠陥食作用を呈したため、初期発症の間に単離されたミクログリアまたは細胞に制限されない。
【００９４】
生体内欠陥食作用の特徴は、腎臓内の抗核抗体の産生および沈着につながる壊死を被る、アポトーシス細胞の存続である。抗体沈着物は、メスのマウスにおける補体活性化および糸球体腎炎を誘発する。生体外で観察された欠陥食作用が、生体内でも生じるかどうかを確認するために、抗核抗体（抗ＡＮＡ）および腎臓病変が、系統２６マウスにおいて査定された（図４参照）。抗核抗体は、系統３および系統２６動物由来のシヌクレイントランスジェニックメスの血清中で増加された。メスの野生型またはシヌクレイン過剰発現マウス由来の腎臓が、Ｃ３、ＩｇＧ、およびＩｇＭに対して染色され、病変の重症度が、有資格病理学者によって計算された。マウス過剰発現シヌクレインは、腎臓において、Ｃ３、ＩｇＧ、およびＩｇＭ沈着の上昇を示した。
【００９５】
実施例２：シヌクレインレベルの増加は、欠陥食作用をもたらす
ヒトシヌクレインのｓｉＲＮＡノックダウンが、シヌクレインタンパク質レベルの上昇が、食作用の減少に関与したかどうかを確認するために採用された。ヒトシヌクレインのｓｉＲＮＡノックダウンは、１８月齢系統２６マウスから単離された腹腔マウスマクロファージにおいて行われ、貪食が査定された。Ａｃｃｅｌｌ  ｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）から利用可能）によるヒトシヌクレインの特異的標的化は、ヒトシヌクレインｍＲＮＡにおいて５０〜８０％の低下をもたらし、これは、シヌクレインタンパク質レベルの同時低下と一致した（図５参照）。非標的ｓｉＲＮＡによって処置されていない、ヒトシヌクレインのｓｉＲＮＡノックダウンは、シヌクレインを過剰発現するマクロファージ中の食作用を回復し、野生型細胞において最小活性を有していた。ゲノムマウスの付加的懸念は、重要食作用遺伝子を伴うＢＡＣコンストラクトによる挿入または干渉であって、したがって、我々は、野生型（系統４２２）またはＥ４６Ｋシヌクレイン突然変異（系統２６および３）を過剰発現する３つのシヌクレインゲノム系統から単離されたミクログリアの食作用活性を比較した（図６参照）。個々の幼獣から単離されたミクログリアは、培養され、同腹子野生型またはヒトシヌクレイン発現細胞が検査された。全３つの系統における野生型またはＥ４６Ｋヒトシヌクレインの過剰発現は、ミクログリア欠陥食作用をもたらした。これらのデータは、欠陥食作用が、食作用に必要な遺伝子の異常発現によるものではなく、シヌクレインのレベル増加による可能性が高いことを示す。
【００９６】
Ｈ４細胞は、ヒト神経膠腫細胞株であって、我々の研究のために、トランスフェクションの容易性（トランスフェクション効率約６０〜７５％、データ図示せず）、ラテックスビーズを注入するための機能の２つの重要特性を有する。Ｈ４細胞は、α−またはβ−シヌクレインでトランスフェクトされ、４８時間、回復させられ、次いで、９０分間、６μｍのビーズが供給された。細胞は、次いで、固定され、貪食されたビーズが計数された、または細胞は、ウェスタンブロット法分析のために溶解された。β−ではなく、α−シヌクレイン過剰発現は、食作用を５０％減少させ、シヌクレインゲノムミクログリアからのデータに類似していた。
【００９７】
実施例３：ヒト疾患に関係したシヌクレイン点突然変異体およびトランケーションは、食作用表現型を改変する
家族性パーキンソン病に見出されるシヌクレイン突然変異は、より重度の黒質病変および細胞欠陥と関連付けられている。したがって、種々のシヌクレイン突然変異体の相対的影響が、このモデルにおける活性に対して査定された。Ａ５３Ｔ、Ｅ４６Ｋ、およびＡ３０Ｐシヌクレインはすべて、野生型シヌクレインと同程度に、食作用を遮断することが見出された。これらのコンストラクト、野生型、Ａ５３Ｔ、およびＥ４６Ｋ突然変異シヌクレインのサブセットが、食作用に及ぼすその用量依存性に対して査定された。Ｈ４細胞は、４８時間、３０または９０ｎｇ／ｍｌの種々のコンストラクトでトランスフェクトされた。種々のシヌクレイン形態はすべて、類似レベルまで発現されたが、家族性突然変異体Ａ５３Ｔは、より低い用量において、野生型またはＥ４６Ｋ突然変異体より確実に食作用を遮断すると考えられた（図７参照）。
【００９８】
シヌクレイン家族性突然変異体の活性の査定に加え、我々はまた、レビー小体中に見出された、トランケーションされた突然変異体（ＳＮ１−１３３およびＳＮ１−１１９）の活性を調査した（第ＵＳ７，３５８，３３１号）。１１９のトランケーションされた形態ではなく、１３３のトランケーションされた形態を伴うトランスフェクションが、食作用を遮断し、可能性として、食作用に関係した小胞輸送におけるシヌクレインの役割の媒介におけるＣ−末端の役割が指摘された。
【００９９】
実施例４：シヌクレイン発現の増加に伴う改変されたサイトカイン放出プロファイル
活性化されたミクログリアおよび炎症性メディエーターの増加が、パーキンソン病に罹患する対象の脳内で見出されており、生体内シヌクレイン過剰発現と関連付けられる。炎症性反応に及ぼすシヌクレイン上昇の結果を調査するために、ヒトシヌクレインを過剰発現するマウス由来のミクログリアが単離され、１８時間、ＬＰＳに暴露され、その時点において、上清が、サイトカイン産生の定量化のために、収集された。ＣＳＦおよびパーキンソン病に罹患する対象の脳内で観察された炎症性サイトカインの上昇に基づいて、ヒトシヌクレインを過剰発現するミクログリアが、炎症性サイトカイン反応の上昇を有するであろうと予想される。しかしながら、ヒトシヌクレインを過剰発現するミクログリアは、その同腹子対照と比較して、ＬＰＳに応答して、有意に少ないＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βを分泌した（図８参照）。この欠陥は、マウス過剰発現野生型またはＥ４６Ｋ突然変異から単離された細胞中で観察され、再び、そのリン酸化状態における改変ではなく、シヌクレインレベルの上昇が、欠陥に寄与することを示した。
【０１００】
前述の手順は、収集された培地中へと細胞から放出されたサイトカインのみ測定する。食作用を調整する機序およびシグナル伝達経路はまた、サイトカイン含有小胞の開口分泌経路を制御することが知られている。したがって、サイトカイン反応の低下は、産生よりサイトカイン分泌における欠陥を反映し得る。改変されたサイトカイン反応が、欠陥小胞放出によるものであって、その結果、欠陥食作用とサイトカイン反応の減少との間の連鎖を形成する可能性を調査するために、野生型およびシヌクレインゲノムミクログリア中のＬＰＳ誘発シグナル伝達が、査定された。ＬＰＳ反応性サイトカインの誘発は、ＲＴ−ＰＣＲによって、ｍＲＮＡレベルで定量化され、野生型およびシヌクレイン過剰発現ミクログリアが、ＬＰＳに同等に反応するかどうかを調査した。この実験のために、我々は、マウスシヌクレインヌルバックグラウンドにおいて、ヒトシヌクレインを過剰発現し、内因性マウスシヌクレインの任意の交絡的影響を制限した、我々の動物を利用した。８時間、ＬＰＳで刺激されたミクログリア由来のｍＲＮＡが、回収され、１２のサイトカインが、多重分析によって査定された。ＬＰＳは、シヌクレインヌルおよびヒトシヌクレインを過剰発現するミクログリア中において、ｍＲＮＡレベルで同等のサイトカイン産生を刺激した（図９参照）。
【０１０１】
これらのデータは、ヒトシヌクレインを過剰発現するミクログリアからのサイトカイン産生の減少が、その炎症性反応における改変ではなく、サイトカイン含有小胞の放出の低下によるものであることを示唆する。野生型およびシヌクレインゲノムミクログリアが、同等レベルのサイトカインタンパク質を合成するが、サイトカイン含有小胞を放出するその能力が異なるという仮説をさらに試験するために、サイトカインの分泌が遮断され、細胞内サイトカインレベルが査定された。シヌクレインヌルまたはヒトシヌクレインゲノム／マウスシヌクレインヌル幼獣由来のミクログリアが、小胞体からゴルジへの小胞の輸送を防止し、したがって、組織培地中へのサイトカインの放出を防止する、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａを含有する試薬である、ＧＯＬＧＩＰＬＵＧ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから利用可能）の存在または不在下、ＬＰＳで刺激された。組織培養上清が、収集され、サイトカイン放出に及ぼすＧｏｌｇｉ  Ｐｌｕｇの有効性を査定し、細胞が、細胞内サイトカインレベルを定量化するために溶解された。以前に観察されたように、ヒトシヌクレインを過剰発現するミクログリアは、野生型対照と比較して、鈍いＬＰＳサイトカイン反応を呈し、ＧＯＬＧＩＰＬＵＧによる処置は、両集団からのＴＮＦ−α放出を遮断した。細胞溶解物からのサイトカインレベル評価時、ヒトシヌクレインを発現するミクログリアは、野生型対照と比較して、若干高い細胞内ＴＮＦ−αレベルを有していることが見出され、ＧＯＬＧＩＰＬＵＧによる処置は、これらのレベルを有意に増加させた。加えて、ＧＯＬＧＩＰＬＵＧ処置後、野生型およびシヌクレインゲノム試料は、同等細胞内ＴＮＦ−αレベルを有しており、ＬＰＳに対するゲノムミクログリアの見掛けの鈍い反応は、全体的サイトカイン産生における欠陥ではなく、サイトカイン含有小胞の欠陥放出によるものである可能性が高いことを示唆した。シヌクレインゲノムミクログリアからのサイトカインレベルは、低いが、依然として、炎症性であって、潜在的に、周囲細胞に弊害をもたらすほど十分に強力である。
【０１０２】
実施例５：食作用における改変は、欠陥小胞機能によるものである
大粒子の食作用は、細胞膜への有意な量の膜組織の動員および添加を要求する。膜組織の添加は、一部には、回収エンドソームおよび可能性として小胞体と細胞膜の融合に由来する。食作用プロセスの間、マクロファージの細胞膜は、実際には、膜組織が添加されるのに伴って拡張する。このプロセスは、細胞膜標識染料（ＦＭ−１４３）によって、膜組織拡張を追従することによって解明され、膜組織が多いほど、結合する染料が多く、蛍光性シグナルが大きくなる。小胞融合および膜組織拡張に及ぼす、過剰発現されたシヌクレインの影響を査定するために、Ｈ４が、ＧＦＰベクターまたはヒトシヌクレインでトランスフェクトされ、細胞に、９０分間、ビーズが供給され、その時点において、細胞は、ＦＭ−１４３で標識された氷上に留置され、蛍光性が、フローサイトメトリーによって測定された。モックベクタートランスフェクトＨ４は、ビーズ添加後、ＦＭ−１４３蛍光性の増加を呈し、細胞膜との小胞融合およびその拡張を示した。シヌクレインを過剰発現する細胞は、ＦＭ−１４３蛍光性の増加を呈さず、このプロセスにおける欠陥を示した（図１０参照）。欠陥ＦＭ−１４３の蛍光性は、４回の実験にわたって定量化された。食作用の間の欠陥小胞融合もまた、シヌクレインゲノムマウス由来ミクログリア中で定量化された。我々他のデータは、シヌクレイン過剰発現が、サイトカイン含有小胞の放出を妨害し、食作用の間の細胞膜の小胞依存性拡張を減少させるという概念を支持し、したがって、小胞機能の負の調節因子として作用するという概念を強化する。細胞は、種々の小胞プールから成り、最も一般的ものの１つは、エンドソーム（初期、後期、および回収）であって、特異的表面マーカーによって同定することができる。シヌクレイン過剰発現細胞中の小胞輸送の追跡を開始するために、我々は、ＧＦＰで標識された初期エンドソームのマーカーである、使用済みＲａｂ５ａを得た。Ｈ４は、無併用またはシヌクレインと併用して、Ｒａｂ５ａ−ＧＦＰでトランスフェクトされ、トランスフェクト細胞に、９０分間、ビーズが供給され、その後、細胞は、固定され、シヌクレインに対して染色された。Ｒａｂ５ａエンドサイトーシス小胞は、ビーズ摂取の視域に局在化し、プロセスは、シヌクレインの過剰発現によって遮断された。他のエンドソーム小胞における改変も、シヌクレイン過剰発現Ｈ４中で査定された。ビーズ添加後、Ｈ４は、固定され、シヌクレインおよびＳＮＡＰ２３に対して染色された。ＳＮＡＰ２３は、小胞プール上に常駐し、ニューロン内の受容体回収に関与し、ＳＮＡＲＥ錯体の主要要素である。Ｒａｂ５ａ含有小胞と同様に、ＳＮＡＰ２３を伴うエンドソームは、ビーズ添加の視域に転座され、転座は、シヌクレイン過剰発現細胞内で遮断された。
【０１０３】
シヌクレインを過剰発現するＨ４細胞またはモックベクタートランスフェクトＨ４に、９０分間、ビーズが供給され、ＦＭ−１４３の標識化が、氷上で行われた後、フローサイトメトリー分析を行った。（Ｂ）ビーズが供給されたシヌクレインを過剰発現するＨ４細胞の４回の独立実験からの幾何平均蛍光が、コンパイルされた。（Ｃ）シヌクレイン過剰発現幼獣の野生型から単離されたミクログリアが、ビーズ添加に先立って、かつその後、ＦＭ−１４３染色のために、フローサイトメトリーによって査定された。（Ｄ）３回の独立実験からのＦＭ−１４３の幾何平均蛍光が、コンパイルされた。（Ｅ）Ｈ４細胞は、ＧＦＰ−標識Ｒａｂ５ａで同時トランスフェクトされた、いずれとも同時トランスフェクトされない、またはシヌクレインで同時トランスフェクトされた。４８時間後、細胞に、９０分間、４μΜビーズが供給された。細胞は、固定され、シヌクレインに対して染色された。（Ｅ）モックベクターまたはシヌクレインで過度にトランスフェクトされたＨ４細胞に、９０分間、４μΜビーズが供給され、細胞は、固定され、ＳＮＡＰ２３に対して染色された。
【０１０４】
実施例６：小胞動員および融合のシヌクレイン阻害は、改変されたＳＮＡＲＥ錯体形成と関連付けられる
シヌクレインを過剰発現する細胞中の食作用を定量化時、我々は、シヌクレインが、食作用カップを転座させ、活性アクチン転位の領域を伴って局在化することに気付いた。静止している状態下、シヌクレインは、細胞質内に常駐し、ビーズ添加４５および９０分後、シヌクレインは、アクチン重合およびビーズ接触部位に転座する。ＳＮＡＲＥ錯体は、３つの成分、ＳＮＡＰ、シンタキシン、およびＶＡＭＰタンパク質から成る。これらの３つのタンパク質は、一体となり、細胞膜と融合するための小胞に刺激を与える。融合すると、小胞は、その内容物を放出し、ＳＮＡＲＥ錯体は、２つのアダプタータンパク質、ＮＳＦおよびα−ＳＮＡＰによって分解される。これらの解離された錯体からのいくつかの要素が、回収エンドソームを介して、細胞質に回収され、後続融合事象に刺激を与えるために使用することができる。ＳＮＡＲＥ錯体の全３つのタンパク質要素は、αヘリックスであって、組み立てると、エネルギー有利な非常に固有のＳＤＳ安定錯体を形成する。これらの錯体は、ＳＤＳ解離に抵抗するが、煮沸後、解離するであろう。したがって、１つのＳＮＡＲＥ錯体は、煮沸および非煮沸溶解物中において、ＳＤＳ安定錯体として流動することができる。我々は、欠陥小胞動員が、ＳＮＡＲＥ錯体の改変されたＳＮＡＲＥ錯体形成と関連付けられる、またはそれによるものであり得ると仮定した。シヌクレインでトランスフェクトされたＨ４細胞は、１５、４５、または９０分間、ビーズが供給され、試料が、溶解され、ウェスタンブロット構造上を走らせた。ビーズの添加は、ベクタートランスフェクト細胞中のＳＮＡＰ２３含有ＳＮＡＲＥ錯体の急速減少を誘発したが、しかしながら、そのような変化は、シヌクレイン過剰発現細胞中では観察されなかった。ＳＮＡＲＥ錯体における改変もまた、シヌクレインゲノムマウスから単離されたミクログリア中で観察された（データ図示せず）。シヌクレインが、小胞輸送およびＳＮＡＲＥ錯体形成／機能をどのように改変するかを明確にするために、我々は、シヌクレインとＳＮＡＲＥファミリーの成分の相互作用を査定した。驚くことに、ＳＮＡＰ２５ではなく、ＳＮＡＰ２３およびシヌクレインは、同時に免疫沈降し、この相互作用は、ビーズ添加後、増加した。Ｒａｂタンパク質は、エンドソーム小胞のマーカーであって、小胞輸送を変調することができ、細胞モジュール中のシヌクレイン誘発毒性から救済することが示されており、黒質ドーパミンニューロンをＭＴＰＴ誘発毒性から保護する。小胞移動を促進する分子が、食作用を遮断するための上昇レベルのシヌクレインの能力を克服し得るか農政を試験するために、シヌクレインを過剰発現する安定Ｈ４細胞株が、種々のＲａｂタンパク質でトランスフェクトされた。我々は、Ｒａｂタンパク質が、過剰発現されたことを検証し、食作用が、野生型およびシヌクレイン過剰発現細胞中で査定された。Ｒａｂ３ｂおよびＲａｂ１１ｂの過剰発現は、食作用のシヌクレイン変調を救済する一方、他のＲａｂタンパク質の過剰発現は、何の影響を有していなかった（図１１）。
【０１０５】
食作用を遮断しない、シヌクレインのデルタ１１９バージョンの過剰発現が、小胞融合に及ぼすその影響に対して査定された。シヌクレインのデルタ１１９形態ではなく、シヌクレインの過剰発現が、食作用活性と相関する、ＦＭ−１４３添加を遮断した。
【０１０６】
実施例７：ＩＬ−４処置は、シヌクレインレベルを減少させ、ゲノムミクログリア中の食作用を回復する
ヒトミクログリアが、ＩＬ−４で処置され、シヌクレイン転写レベルが、マイクロアレイおよびｑＰＣＲによって測定された。ＩＬ−４処置後、シヌクレインレベルは、試験された３つのドナー中において、５０％低下した（図１２）。ＩＬ−４処置はまた、系統２６／シヌクレインヌルゲノムミクログリアにおいて、シヌクレインｍＲＮＡレベルを減少させた。ＩＬ−４処置が、シヌクレイン転写レベルを５０％低下させたため、我々は、シヌクレインタンパク質が、ＩＬ−４処置によって影響を受けたかどうかを調査し、シヌクレインタンパク質レベルが、追跡された。シヌクレインゲノムマウス由来のミクログリアが、２４時間、ＩＬ−４で処置され、シヌクレインｍＲＮＡレベルが低下される間、タンパク質レベルは、影響を受けなかった。シヌクレインは、ゆっくりと代謝回転され、したがって、２４時間は、影響を認めるには早過ぎ得る。これを査定するために、ミクログリアが、４８時間、ＩＬ−４で刺激され、その時点において、シヌクレインタンパク質レベルの５０％減少が、観察された。シヌクレインｍＲＮＡおよびタンパク質レベルに及ぼすＩＬ−４の影響は、他の抗炎症性刺激が、シヌクレインｍＲＮＡまたはタンパク質を改変しなかったため、固有であると考えられる。これは、シヌクレインプロモーターに及ぼすＩＬ−４シグナル伝達の直接影響を指定し得る。
【０１０７】
２４時間のＩＬ−４は、シヌクレインタンパク質を低下させなかったが、全シヌクレインゲノムマウスから単離されたミクログリア中の食作用欠陥を救済した（図１３）。ＩＬ−４は、シヌクレインｍＲＮＡおよびタンパク質を低下させたが、４８時間まで、レベルに影響を及ぼさない一方、食作用を救済するその能力は、２４時間以内に生じ、付加的機序が指摘される。ＩＬ−４が、ＳＮＡＲＥまたは小胞移動を改変することによって、部分的に作用したかどうかを判定するために、シヌクレインゲノムマウス由来のミクログリアが、２４時間、ＩＬ−４で処置され、溶解物が、ＳＮＡＲＥ錯体の成分に対してプローブされた。ＩＬ−４処置は、野生型およびシヌクレインＯＥ細胞中のモノマーＳＮＡＰ２３シンタキシン４ならびにＳＮＡＰ２３ＳＮＡＲＥ錯体を増加させた。ビーズの添加後、我々は、ＳＮＡＲＥ錯体の誘発を認め、これらは、ＩＬ−４処置後、向上した。
【０１０８】
集合的に、これらのデータは、小胞輸送および／または小胞融合の負の調節因子としてのシヌクレインを暗示する。シヌクレインは、小胞輸送を損なわせ、したがって、ＳＮＡＲＥ機能を改変し得る、またはシヌクレインは、ＳＮＡＲＥ機能を改変し、その結果、小胞移動を制限し得る。Ｒａｂデータは、小胞シャペロンとして作用する、Ｒａｂタンパク質の添加によって克服されることができるプロセスである、シヌクレイン改変小胞動員が指摘される。食作用欠陥を救済したＲａｂ３ｂおよびＲａｂ１１ｂは、回収エンドソームプールと関連付けられ、それに関与する。Ｒａｂタンパク質はまた、受容体回収および回収エンドソームプールの維持のために重要であることが示されている。加えて、Ｒａｂ３は、可能性として、ＮＳＦ活性の変調を通して、ＳＮＡＲＥ錯体の形成および安定性を制御することができることが示されている。シヌクレインとＳＮＡＰ２３の相互作用は、ＳＮＡＲＥ錯体活性中の改変を暗示し得る。ドーパミン作動性細胞は、一部には、回収エンドソームプールのその使用により、他の神経細胞の中で固有であって、長期刺激後、小胞の枯渇を防止する。加えて、ＳＮＡＲＥタンパク質および小胞輸送機序の改変は、パーキンソン病およびシヌクレイン毒性の生体内モデルにおいても改変される。加えて、Ｒａｂ過剰発現は、種々の生体外モデルにおいて、細胞をシヌクレイン誘発毒性から保護可能である。
【０１０９】
実施例８：バイオマーカー検定
本実施例は、末梢血（例えば、パーキンソン病患者由来）から単離された単球の食作用指数を評価し、食作用における改変を細胞内シヌクレイン染色における同時増加と相関させるためのフローサイトメトリーバイオマーカー検定を説明する。ＰＤ患者または動物モデル由来の単球中の食作用の減少は、シヌクレインレベルの増加と相関する。この検定では、末梢マクロファージが、感受性患者から単離される。試料は、食作用およびシヌクレインレベルに対して査定される。欠陥食作用は、散発性パーキンソン病を同定し、症候性と無症候性保有者を分離するためのバイオマーカーとして作用する。
【０１１０】
検定は、取り込まれたビーズと、単に細胞の表面に結合されたものを区別するように設計することができる。この検定では、ストレプトアビジン標識またはビオチン標識ビーズが、９０分間、３７℃において、患者血液から単離された末梢マクロファージまたは単球に供給される。蛍光標識されたビオチンまたはストレプトアビジンが、氷上の細胞に添加され、貪食されないビーズを同定する。単離された末梢マクロファージの個々の集団は、表面マーカーから同定され、細胞内シヌクレイン染色が、後述のように行われる。取り込まれたビーズから判定された食作用の低下および細胞内染色によって示されるシヌクレインレベルの増加の組み合わせは、症候性パーキンソン病が、存在する、または切迫していることの指標を提供する。
【０１１１】
蛍光標識されたビーズ：６μｍのストレプトアビジンＦｌｕｏｒｅｓｃｂｒｉｔｅ（登録商標）ＹＧ微小球（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ＃２４１５７、ｌｏｔ５８８４７９）または５．２μｍ（桃色）のビオチンでコーティングされたビーズ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ＃  ＴＦＰ−５０５８−５、Ｌｏｔ  Ｒ０１；ＴＦＰ−３０６７−５、Ｌｏｔ  Ｗ１；ＴＦＰ−２０５８−５、Ｌｏｔ  Ｒ０１）の二次検出の検証が、試験された。ビーズは、ボルテックスされ、かつ少しの間、超音波で分解され、各タイプのビーズの１０μｌ／ウェルを９６ウェルＶ底プレート中に等分する前に、凝集を防止した。ビーズは、室温において、３０分間、暗所内で、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズを１０μｇ／ｍｌビオチン化マウス抗ウサギＩｇＭ（ＢＤ  Ｂｉｏｇｅｎ）または１：１００におけるストレプトアビジン−ＡＰＣ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆ００５０）または検定緩衝剤でインキュベートする前に、１００μｌ／ウェルの検定緩衝剤（Ｈ／Ｓ＋＋／０．３％ＢＳＡ）で２回洗浄した。ビーズは、沈降され、１００μｌ／ウェル検定緩衝剤で２回洗浄された。ストレプトアビジンでコーティングされたビーズは、氷上に１０μｇ／ｍｌにおいて、３０分間、暗所内で１００μｌ／ウェル抗マウスＩｇＧ−ＡＰＣでインキュベートされた。ビーズは、１００μｌ／ウェル検定緩衝剤で１回洗浄され、次いで、試料データを読み取る前に、１００μｌ／ウェル検定緩衝剤中に再懸濁された。ビオチン標識蛍光抗体は、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズ（図２０下）に結合し、それを同定し、ストレプトアビジン標識蛍光抗体は、ビオチンでコーティングされたビーズ（図２０上）を検出し、細胞内と細胞外ビーズを検出するための手段として、このアプローチを検証した。
【０１１２】
食作用検定：６μｍのストレプトアビジンビーズまたは５．２μｍのビオチンビーズが、９０分間、ミクログリアに添加された。細胞は、氷上に移動され、ビオチンまたはストレプトアビジン標識された抗体のいずれかで染色され、非摂取ビーズを同定した。フローサイトメトリーによって、細胞内と細胞外結合ビーズを同定する能力を確認するために、ミクログリアが、ビーズの添加に先立って、３０分間、サイトカラシンＤで処置された。正常ミクログリアは、５および６ミクロンのビーズを取り込み可能であって、サイトカラシンＤ処置は、この食作用を遮断し、これは、ビーズへのビオチン−ＡＰＣ結合によって確認された（図２１）
【０１１３】
細胞内シヌクレイン染色：Ｈ４細胞は、未処理にされた、またはシヌクレイン発現を誘発するために、２４時間、テトラサイクリンで処置された。２４時間後、細胞は、４％ＰＦＡで固定され、３０分間、氷上において、１％サポニンで透過処理された。細胞内シヌクレインは、透過処理された細胞をモノクローナル抗体５Ｃ１２に続いて、ｃｙ３標識抗マウス二次抗体でインキュベートすることによって、検出された。シヌクレイン発現の２倍の増加が、我々が、ウェスタンブロット法によって観察したものと同様に、シヌクレイン過剰発現と野生型細胞との間に観察された（図２２）。
【０１１４】
実施例９：ＬＲＲＫ２のＧ２０１９Ｓ形態の過剰発現は、食作用を向上させた
ニューロンは、ＬＲＲＫ２を発現するが、この発現は、Ｂ−細胞およびマクロファージのものと比較して、低いと考えられる。我々は、一次ミクログリアが、ＬＲＲＫ２を発現し、ＬＲＲＫ２リン酸化反応が、アクチン細胞骨格に係合する刺激（ＭＣＳＦまたはビーズ添加）後、向上され得ることを見出した。例えば、マウスミクログリアは、種々の時間の間、ＭＣＳＦによって、または３０分間、１０ｕＭビーズで刺激された。ＬＲＲＫ２リン酸化反応は、ＰＴ１９６７  Ｐ−ＬＲＲＫ２抗体でプローブされた。
【０１１５】
ＬＲＲＫ２リン酸化反応が、細胞骨格転位後、明らかに誘発されたため、我々は、ＬＲＲＫ２  Ｇ２０１９Ｓでヌクレオポレート（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒａｔｅ）された細胞中のアクチン細胞骨格変化に及ぼすＬＲＲＫ２キナーゼ活性の影響を調査した。ＬＲＫＫ２のキナーゼ活性Ｇ２０１９Ｓ形態を伴うミクログリアのヌクレオポレーションは、Ｆ−アクチンファロイジン染料による染色の増加および細胞の周囲の微小突起の誘発によって測定されるように、自発的アクチン転位を誘発する（図１４）。Ｇ２０１９Ｓ添加に応じたアクチン含有ラッフルの増加は、ヌクレオポレート野生型１９０６、または二重１９０６／２０１９突然変異体は、アクチン細胞骨格変化を誘発しなかったため、キナーゼ活性の増加によるものと考えられた。
【０１１６】
食作用は、アクチン細胞骨格の転位を誘発かつ要求するため、我々は、Ｇ２０１９Ｓ過剰発現に応じて観察された向上したアクチン細胞骨格変化が、ミクログリア食作用活性を改変するであろうと仮定した。これを査定するために、我々は、ヌクレオポレートされたミクログリアに種々のＬＲＲＫ２コンストラクトの１０ミクロンビーズを９０分間供給し、ＬＲＲＫ２のＧ２０１９Ｓ形態の過剰発現が、食作用を向上させた一方、野生型形態が、影響を及ぼさなかったことを見出した（図１５）。活性ＬＲＲＫ２  １９０６および１９０６／２０１９におけるキナーゼの過剰発現は、食作用を減少させ、可能性として、ＬＲＲＫ２ホモ二量体内において、優性陰性パートナーとして作用すると考えられた。
【０１１７】
Ｇ２０１９Ｓヌクレオポレーション後の食作用の上昇に加え、アクチン重合の増加および細胞上の微小突起の増加に関する我々の観察は、Ｒａｃ活性が、ＬＲＲＫ２キナーゼ依存様式において、上昇され得ることを含意した。この仮説を調査するために、我々は、野生型、Ｇ２０１９Ｓ、または１９０６  ＬＲＲＫ２で安定してトランスフェクトされたＨＥＫ細胞中のＲａｃの基底活性化を査定した。ＬＲＲＫ２のＧ２０１９Ｓ形態で安定してトランスフェクトされた細胞は、自発的ｒａｃ活性を上昇させた一方、野生型またはＬＲＲＫ２の１９０６形態のいずれかを発現する細胞は、そうではなかった。ともに得られたこれらのデータは、ＬＲＲＫ２のキナーゼ活性が、アクチン細胞骨格転位の誘発と関連付けられ、Ｒａｃ活性の上昇による可能性が高い、食作用の増加をもたらすことを示す。
【０１１８】
実施例１０：ＬＲＲＫ２キナーゼ活性に及ぼす化合物の有効性を試験するための細胞検定
我々は、ＬＲＲＫ２  Ｇ２０１９Ｓで形質転換された細胞中の食作用に及ぼすＬＲＲＫ２キナーゼ阻害剤の影響を試験した。我々は、ＬＲＲＫ２キナーゼ活性を阻害することが知られている、いくつかの化合物を有する。これらの化合物のうちのいくつかは、ｃＦＭＳまたはＰＬＫ２阻害剤のいずれかの既知の阻害剤であるが、ＬＲＲＫ２に最小の影響を及ぼす、エナンチオマーを有する。１つは、ＬＲＲＫ２の既知の阻害剤であって、１つは、実質的に、ＬＲＲＫ２に影響を及ぼさずに、ｃＦＭＳまたはＰＬＫ２を阻害する、対のエナンチオマーを使用して、食作用に及ぼすＬＲＲＫ２特異的影響を測定することができる。我々は、ミクログリアのＩＮＦ−γ処置が、約２倍、ＬＲＲＫ２ｍＲＮＡ転写レベルおよびタンパク質レベルを誘発し（図１６）、ＬＲＲＫ２レベルの増加が、ＬＲＲＫ−ｔｉｄｅリン酸化反応検定における、ＬＲＲＫ２リン酸化反応の増加ならびにキナーゼ活性の増加によって測定されるように、ＬＲＲＫ２キナーゼ活性の明白な増加と一致したことを見出した。
【０１１９】
２４時間のＩＮＦγによるミクログリアの処置は、食作用を増加させた一方、２４時間のＩＮＦγによる処置後の種々のＬＲＲＫ２阻害剤による２０分の細胞の処置は、１０ミクロンのビーズの食作用を減少させた（図１７）。食作用の減少は、ＬＲＲＫ２不活性エナンチオマー阻害剤で処置された細胞内で観察されなかった。これらの結果は、ＬＲＲＫ２阻害剤が、食作用のレベル上昇を有する細胞における食作用を減少させることを示す。一見、これらの結果は、食作用の減少が、パーキンソン病と関連付けられ、ＬＲＲＫ２阻害剤が、治療パーキンソン病を治療するために有用である場合、ＬＲＲＫ２阻害剤が食作用を増加させることを予期し得るため、変則的であると考えられる。明白な変則性は、ＬＲＲＫ２が、パーキンソン病の場合におけるように、細胞がシヌクレインを過剰発現するかどうかに応じて、食作用活性に拮抗作用を及ぼすことを示す、以下の実施例において解決される。
【０１２０】
実施例１１：食作用活性に及ぼすＬＲＲＫ２キナーゼ活性およびシヌクレインレベルの影響
ＬＲＲＫ２キナーゼ活性およびシヌクレインレベルの上昇は両方とも、食作用活性に影響を及ぼすため、我々は、シヌクレイン過剰発現およびＬＲＲＫ２キナーゼ活性の上昇の組み合わせの影響を試験した。ヒトα−シヌクレイン導入遺伝子に対するホモ接合型の動物から単離されたミクログリアが、種々のＬＲＲＫ２コンストラクトでヌクレオポレートされ、４日後、培養中、ミクログリアに、９０分間、１０μΜビーズが供給され、食作用指数が計算された。驚くことに、ＬＲＲＫのＧ２０１９Ｓ形態が、食作用を向上させた野生型ミクログリアと異なり、シヌクレイン過剰発現細胞では、有意に食作用を低下させた（図１８）。食作用に及ぼすＧ２０１９Ｓコンストラクトの影響は、１９０６および２０１９／１９０６コンストラクトが影響を及ぼさなかったため、キナーゼ活性の増加によるものと考えられる。
【０１２１】
ＬＲＲＫ２の活性化の改変およびシヌクレインの上昇が生じ得る、生理学的システムを試験するために、我々は、野生型およびシヌクレイン過剰発現ミクログリア中の食作用に及ぼすＩＮＦγ処置の影響を試験した。前述のように、ＩＮＦγ処置は、生来、ＬＲＲＫ２レベルならびに増加したＬＲＲＫ２リン酸化反応および活性を上昇させる。各幼獣を個々に培養することによって、野生型およびシヌクレイン過剰発現同腹子培養物が、生成された、我々の系統３ヘテロ接合体×へテロ接合体交配種（ホモ接合型α−シヌクレインマウスを生成する）を使用する。種々の幼獣から単離されたミクログリアは、一晩、ＩＮＦγに暴露され、その時点において、１０ｕＭビーズが、９０分間、添加され、我々が、依然として、各培養物の遺伝子型を分からないようにしたまま、食作用が、査定された。驚くことに、我々は、ＩＮＦγ処置が、Ｇ２０１９Ｓ  ＬＲＲＫ２コンストラクトと同様に、食作用活性を変調させたことを観察した。野生型ミクログリアのＩＮＦγ処置は、食作用を向上させた一方、シヌクレイン過剰発現細胞におけるこの同一処置は、食作用のさらなる減少をもたらした（図１９）。これらのデータは、環境要因、特に、炎症性刺激が、家族性パーキンソン病遺伝子の機能を変調させ得、正確な条件下において、遺伝的、年齢、または付加的環境要因のいずれかによって、既に存在する、欠陥を悪化させ得ることの証拠を与える。これらの経路に影響を及ぼす環境の能力は、ＰＤの種々の家族性形態によって観察されたパーキンソン病症状の不完全浸透および発症を説明するのに有用となり得る。
【０１２２】
前述に列挙されたすべての特許出願、他の刊行物、受託番号、および同等物は、各個々の要素が、具体的かつ個々に、参照することによってそのように組み込まれるように示される場合と同程度において、あらゆる目的のために、参照することによって、その全体として、組み込まれる。異なる配列の変形例が、異なる時における受託番号と関連付けられる場合、本願の有効出願日における受託番号と関連付けられたバージョンが、意図される。有効出願日とは、実際の出願日または関連受託番号を開示する任意の優先出願の出願日の最先のものを指す。本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様は、具体的にそうでないことが示されない限り、任意のいずれかと組み合わせて使用することができる。本発明は、明確化および理解の目的のために、例証および実施例として、ある程度詳細に説明されたが、ある変更および修正が、添付の請求項の範囲内で実践されてもよいことが明白であろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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