(57)【要約】本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対して哺乳動物をワクチン接種する方法を特徴とし、この方法は、以下：：ａ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ皮膚または軟部組織感染を発症するリスクのある哺乳動物を同定する工程；およびｂ）当該哺乳動物に、薬学的に受容可能な媒体中、単離したアグルチニン様配列（Ａｌｓ）３タンパク質（Ａｌｓ３ｐ）、またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを含む、免疫原性量のワクチンを投与する工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対して哺乳動物をワクチン接種する方法であって、該方法は：
ａ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ皮膚または軟部組織感染を発症するリスクがある哺乳動物を同定する工程；ならびに
ｂ）該哺乳動物に、薬学的に受容可能な媒体中、単離したアグルチニン様配列（Ａｌｓ）３タンパク質（Ａｌｓ３ｐ）、またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを含む、免疫原性量のワクチンを投与する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記Ａｌｓ３タンパク質が、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａおよびＣａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓからなる群より選択されるＣａｎｄｉｄａ株に由来するＡｌｓタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓのＡｌｓ３ｐを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓのＡｌｓ３ｐのＮ末端ドメインまたはその免疫原性断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドがＡｌｓ３ｐであり、該Ａｌｓ３ｐのアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号２からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、Ａｌｓ３ｐの免疫原性断片であり、該Ａｌｓ３ｐのアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号２からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのＭＲＳＡ株である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのＭＳＳＡ株である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのバンコマイシン耐性（ＶＲＳＡ）株またはダプトマイシン耐性（ＤＲＳＡ）株である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、担体に結合体化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記担体が、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、エンテロトキシンＢ断片またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ外膜タンパク質複合体を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記担体が、ファージ、酵母、ウイルス、ビロソームまたは組換えウイルス様粒子である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ワクチンが、筋肉内、皮下、皮内、経口、または舌下投与によって投与されるか、あるいは微粒子処方物での吸入のために投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記投与する工程が、追加抗原量を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ワクチンが、免疫刺激アジュバントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
抗生物質を投与する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗生物質が、前記ワクチンと共処方されるか、または該ワクチンと共投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ワクチンが薬学的組成物として投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ皮膚または軟部組織感染を処置または予防する方法で使用するための、単離したＡｌｓ３タンパク質またはその免疫原性断片を含むワクチン。
【請求項２０】
前記Ａｌｓ３タンパク質が、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａおよびＣａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓからなる群より選択されるＣａｎｄｉｄａ株に由来するＡｌｓタンパク質を含む、請求項１９に記載の使用のためのワクチン。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓのＡｌｓ３ｐを含む、請求項１９に記載の使用のためのワクチン。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓのＡｌｓ３ｐのＮ末端ドメインまたはその免疫原性断片を含む、請求項１９に記載の使用のためのワクチン。
【請求項２３】
前記ポリペプチドがＡｌｓ３ｐであり、該Ａｌｓ３ｐのアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号２からなる、請求項１９に記載の使用のためのワクチン。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、Ａｌｓ３ｐの免疫原性断片であり、該Ａｌｓ３ｐのアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号２からなる、請求項１９に記載の使用のためのワクチン。
【請求項２５】
前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのＭＲＳＡ株である、請求項１９に記載の使用のためのワクチン。
【請求項２６】
前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのＭＳＳＡ株である、請求項１９に記載の使用のためのワクチン。
【請求項２７】
前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのバンコマイシン耐性（ＶＲＳＡ）株またはダプトマイシン耐性（ＤＲＳＡ）株である、請求項１９に記載の使用のためのワクチン。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが、担体に結合体化されている、請求項１９に記載の使用のためのワクチン。
【請求項２９】
前記担体が、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、エンテロトキシンＢ断片またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ外膜タンパク質複合体を含む、請求項２８に記載の使用のためのワクチン。
【請求項３０】
前記担体が、ファージ、酵母、ウイルス、ビロソームまたは組換えウイルス様粒子である、請求項２８に記載の使用のためのワクチン。
【請求項３１】
前記ワクチンが、筋肉内、皮下、皮内、経口、または舌下投与によって投与されるか、あるいは微粒子処方物での吸入のために投与される、請求項１９に記載の使用のためのワクチン。
【請求項３２】
前記投与することが、追加抗原量を投与することをさらに含む、請求項１９に記載の使用のためのワクチン。
【請求項３３】
前記ワクチンが、免疫刺激アジュバントを含む、請求項１９に記載の使用のためのワクチン。
【請求項３４】
抗生物質を投与することをさらに含む、請求項１９に記載の使用のためのワクチン。
【請求項３５】
前記抗生物質が、前記ワクチンと共処方されるか、または該ワクチンと共投与される、請求項３４に記載の使用のためのワクチン。
【請求項３６】
前記ワクチンが薬学的組成物として投与される、請求項１９に記載の使用のためのワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１１年７月２２日に出願された米国仮出願第６１／５１０，８９６号（これは、参考として本明細書に援用される）に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府によって資金提供された研究についての声明
本発明は、管理獲得部門としても働くＴｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａｒｍｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ、８２０  Ｃｈａｎｄｌｅｒ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｆｏｒｔ  Ｄｅｔｒｉｃｋ  ＭＤ  ２１７０２−５０１４によって付与されたｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｍｙ  Ａｗａｒｄ第Ｗ８１ＸＷＨ−１０−２−００３５号によって資金提供された。本明細書に開示された情報の内容は、政府の立場または方針を必ずしも反映するものではなく、また正式の公認が推察されるべきものでもない。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するワクチンに関連する。
【０００４】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、蜂巣炎およびフルンケル症を含む、皮膚および皮膚構造感染の主な原因であり、そして菌血症の最もよくある原因の１つである。メチシリン耐性表現型を示すＳ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）株は、免疫適格性宿主における侵襲性疾患、免疫抑制（例えば好中球減少症、固体臓器または骨髄移植）における、および再発する皮膚感染を示す遺伝性免疫機能不全（例えばヨブ症候群、慢性肉芽腫性疾患）におけるものを含む、医療および市中感染の主な原因である。適当な抗菌薬治療によっても、侵襲性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ疾患に関連する死亡率が高いことを考慮すると（例えば、菌血症および心内膜炎において１５〜４０％）、公衆衛生に対するＭＲＳＡの有意な影響は、特別に重要である。生命を脅かす感染の率の増大および抗生物質に対する感受性の低下が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを標的とした有効なワクチンの開発を必要とする。本発明は、このニーズを満たす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は一般的に、以下の工程を含む、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対して哺乳動物をワクチン接種する方法に関連する：ａ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ皮膚または軟部組織感染を発症するリスクがある哺乳動物（例えば、ヒト、または家畜、例えばウシ種、ウマ種、ブタ種またはヒツジ種、または飼育哺乳動物、例えばイヌまたはネコのような、非ヒト哺乳動物）を同定する工程；およびｂ）当該哺乳動物に、薬学的に受容可能な媒体中、単離したアグルチニン様配列（Ａｌｓ）３タンパク質（Ａｌｓ３ｐ）、またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを含む、免疫原性量のワクチンを投与する工程。代表的なポリペプチドは、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  Ａｌｓ３ｐ（例えば、図１Ａに示すＡｌｓ３ｐ、例えば配列番号１または配列番号２、またはその免疫原性断片）を含む。他の実施態様において、そのポリペプチドは、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  Ａｌｓ３ｐのＮ末端ドメインまたはその免疫原性断片を含む。本明細書中で開示される方法は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）株に対するワクチン接種のために特に有用である。本明細書中で開示される方法はまた、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの他の薬剤耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（例えばバンコマイシン耐性、ダプトマイシン耐性等）、またはメチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）株に対するワクチン接種のために有用である。他の実施態様において、そのポリペプチドを、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、エンテロトキシンＢ断片、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ外膜タンパク質複合体、または当該分野において結合体ワクチンに使用されるあらゆる他の担体タンパク質のような担体に結合体化させる。そのような担体はまた、ファージ、酵母、ウイルス、ビロソーム、または組換えウイルス様粒子を含み得る。そのワクチンを、一般的に、筋肉内、皮下、皮内、経口、または舌下投与によって投与する、または微粒子処方物において吸入のために投与する。もし望ましいなら、そのワクチンを、追加抗原量として投与し得る。そのワクチンは任意で、免疫刺激アジュバントを含み得る。さらに他の実施態様において、その方法は、ワクチンと組み合わせて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する抗生物質を投与することを含み、例えばここで、その抗生物質を、ワクチンと共処方（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅ）または共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）する。
【０００６】
別の局面において、本発明は、以下の工程を含む、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対して哺乳動物（例えばヒト、または家畜、例えばウシ種、ウマ種、ブタ種またはヒツジ種、または飼育哺乳動物、例えばイヌまたはネコのような、非ヒト哺乳動物）をワクチン接種する方法を特徴とする：ａ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ皮膚または軟部組織感染を発症するリスクのある哺乳動物を同定する工程；およびｂ）当該哺乳動物に、薬学的に受容可能な媒体中、１本鎖または２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、２本鎖ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターを含み得る、適当な送達ビヒクルに組込まれた、Ａｌｓ３ｐ、またはその免疫原性断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば単離ポリヌクレオチド）を含む、有効な量のワクチンを投与する工程であって、ここでそのポリヌクレオチドは、インビボで発現し、そしてその哺乳動物は免疫反応を生じる、工程。そのポリヌクレオチドを含むワクチンは、哺乳動物において、免疫反応、例えばＡｌｓ３ｐに対する特異性を示す抗Ａｌｓ３ｐ抗体の産生を誘発する。
【０００７】
さらに別の局面において、本発明は、哺乳動物においてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ皮膚または軟部組織感染を処置または予防する方法において使用するための、単離Ａｌｓ３タンパク質、またはその免疫原性断片を特徴とする。
【０００８】
別の局面において、本発明は、哺乳動物においてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ皮膚または軟部組織感染を処置または予防する方法において使用するための、単離Ａｌｓ３タンパク質、またはその免疫原性断片を含むワクチンを特徴とする。
【０００９】
単離タンパク質またはワクチンを調製するために有用なそのようなＡｌｓ３ｐは、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、およびＣａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓにおいて同定されたもの、および公的に利用可能なデータベースの検索によって同定されたＡｌｓ３タンパク質を含む。
【００１０】
さらに別の局面において、本発明は、単離Ａｌｓ３タンパク質を特徴とし、ここでその単離Ａｌｓ３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２から成る。
【００１１】
さらに別の局面において、本発明は、単離Ａｌｓ３タンパク質、および薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的組成物を特徴とし、ここでその単離Ａｌｓ３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２から成る。
【００１２】
さらに別の局面において、本発明は、単離Ａｌｓ３タンパク質を含むワクチンを特徴とし、ここでその単離Ａｌｓ３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２から成る。いくつかの実施態様において、そのタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、エンテロトキシンＢ断片、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ外膜タンパク質複合体、または当該分野において結合型ワクチンに使用されるあらゆる他の担体タンパク質のような担体に結合体化させる。そのような担体はまた、ファージ、酵母、ウイルス、ビロソーム、または組換えウイルス様粒子を含み得る。そのワクチンを、一般的に、筋肉内、皮下、皮内、経口、または舌下投与によって投与する、または微粒子処方物において吸入のために投与する。もし望ましいなら、そのワクチンを、追加抗原量として投与し得る。そのワクチンは任意で、免疫刺激アジュバントを含み得る。他の実施態様において、そのワクチンは、単離Ａｌｓ３タンパク質と、例えばＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、およびＣａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓからなる群より選択されるＣａｎｄｉｄａ株由来の、１つまたはそれより多い他の単離Ａｌｓタンパク質との組み合わせを含み得る。
【００１３】
別の局面において、本発明は、薬学的に受容可能な媒体中、１本鎖または２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、２本鎖ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターを含み得る、適当な送達ビヒクルに組込まれた、Ａｌｓ３ｐ、またはその免疫原性断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば単離ポリヌクレオチド）を含むワクチンを特徴とする。例えば、免疫原性Ａｌｓ３ポリヌクレオチドワクチン、例えば部分的にまたはその全体として、配列番号第３番を含むか、またはそれからなり、かつワクチンとして使用するために適当な核酸配列を、例えばＡｌｓ３遺伝子またはその断片、例えばＡｌｓ３ｐの免疫原性断片をコードする断片から調製し得る。そのワクチンはさらに、Ａｌｓ３ｐまたはその免疫原性断片と同時発現する、免疫刺激ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。そのようなポリヌクレオチドワクチンを、例えばポリヌクレオチド投与のための生理学的に受容可能な液体溶液またはエマルジョン中で、注射剤として調製し得る。核酸リポソーム（例えば、国際公開第ＷＯ９３／２４６４０において記載されたような）またはポリヌクレオチドは、アジュバントと結合し得るので、そのポリヌクレオチドは、レシチンリポソームまたは当該分野で公知の他のリポソームのようなリポソームに結合し得る。陽イオン性脂質を含むリポソームは、ＤＮＡおよびＲＮＡのようなポリアニオンと自発的にかつ迅速に相互作用し、１００％までのポリヌクレオチドを捕捉するリポソーム／核酸複合体を生じる。それに加えて、ポリカチオン性複合体は、細胞膜と融合し、リソソーム区画の分解酵素を回避する、ポリヌクレオチドの細胞内送達をもたらす。国際公開第ＷＯ９４／２７４３５は、陽イオン性脂質およびポリヌクレオチドを含む、遺伝子免疫化のための組成物を記載する。カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、エレクトロポレーション、および他のトランスフェクション促進剤のような、ポリヌクレオチドの細胞取り込みを補助する薬剤を、有利に使用し得る。液体形態および再構築される凍結乾燥形態はどちらも、好ましくは緩衝液を、注射溶液のｐＨを適切に調節するために必要な量で含む。
【００１４】
「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ皮膚または軟部組織感染」、「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＳＳＴＩ」、「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ皮膚／皮膚構造感染」、および「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＳＳＳＩ」は、本明細書中で交換可能に使用され、そして切り傷、すり傷、刺し傷、または他の創傷が皮膚を破壊した部位で、Ｓ．ａｕｒｅｕｓが身体に入ることから起こる、皮膚または軟部組織感染（例えば蜂巣炎、軟部組織膿瘍、皮膚壊死、筋炎、または他の感染）を指す。いくつかの場合において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＳＳＳＩは、身体上に生存するＳ．ａｕｒｅｕｓの結果であり、そして皮膚損傷または創傷の目に見える部位が無く自然に起こり得る。そのような感染は、皮膚の層、または筋肉および結合組織（靭帯、腱、および身体の他の支持構造を形成する組織の組み合わさったフレームワーク）のような、より深い組織に影響を与え得る。皮膚膿瘍はまた、身体がＳ．ａｕｒｅｕｓ感染と戦った皮膚の領域で起こり得る。皮膚または軟部組織感染の原因となる、より重要なＳ．ａｕｒｅｕｓの株は、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）として公知である、抗生物質耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓである；Ｓ．ａｕｒｅｕｓのバンコマイシン耐性およびダプトマイシン耐性株も、ＳＳＳＩを引き起こし得る。ＭＲＳＡは、普通の抗生物質に対して耐性である。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＳＳＳＩは、メチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）によっても引き起こされ得る。
【００１５】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ皮膚または軟部組織感染を発症するリスクのある哺乳動物を、予防的様式で処置し得る。あるいは、哺乳動物を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ皮膚または軟部組織感染の症状を示す場合に処置し得る。本明細書中で記載されるワクチン接種は、症状の重症度を低減する、その発症を遅延または予防する。哺乳動物は、入院している、または施設コミュニティーに住んでいる、抗生物質処置している、またはＨＩＶ／ＡＩＤＳまたは免疫機能を損なう他の疾患を有する小児を含んで免疫抑制されている、医療システムと頻繁に接触する個体である、糖尿病、癌、ＨＩＶ／ＡＩＤＳのような慢性疾患を有する、非常に若年または非常に高齢である、頻繁に抗生物質を使用する、開放創、皮膚炎または皮膚病変を有する、栄養不足または不衛生であるなら、感染のリスクは上昇する。他のリスクのある哺乳動物は、過密な生活状態で住む人々、軍人、特に配備された部隊、アスリート、および刑務所の囚人を含む。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ皮膚または軟部組織感染を発症するリスクのあるさらに他の人は、以前にそのような感染を有していた個体、または外科的または侵襲的医療手順を予定している、またはそれを受けた個体である。
【００１６】
「Ａｌｓ３ｐ」によって、図１Ａに示す配列、例えば配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列と、またはＧｅｎＢａｎｋ：ＸＰ＿７１０４３１．１、ＸＰ＿７１０４３５．１、ＡＡＯ７２９５９．１、ＸＰ＿７１２６４６．１、ＸＰ＿７１２６６６．１、ＥＡＫ９１１７３．１、ＥＡＫ９１１６９．１、ＡＡＯ７２９５８．１、ＥＡＫ９３４９４．１、ＥＡＫ９３４７２．１、Ｏ７４６２３．１、ＡＡＤ０２５８０．１、ＥＡＫ９０７０４．１、ＸＰ＿７０９９８５．１で同定される、ＣａｎｄｉｄａＡＬＳ３タンパク質と実質的に同一であるポリペプチドを意味する。望ましくは、Ａｌｓ３ｐは、図１Ａに示す配列、例えば配列番号１または配列番号２と、少なくとも７０、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性さえ有する。
【００１７】
「Ａｌｓ３ｐ断片」または「Ａｌｓ３ｐの断片」によって、１０５０、１０２５、１０００、９７５、９５０、または９４５より少ないアミノ酸を含む、Ａｌｓ３ｐポリペプチドの部分を意味する。いくつかの実施態様において、Ａｌｓ３ｐ断片は、３００および３５０の間、または２５０から５００アミノ酸の長さである。いくつかの実施態様において、その断片は、１０５０、１０２５、１０００、９７５、９５０、または９４５、９４０、９３７、９３６、９３５、９３４、９３３、９３２、９３１、または９３０、９２０、９１０、９００、８９０、８８０、８７０、８６０、８５０、８４０、８３０、８２０、８１０、８００、７９０、７８０、７７０、７６０、７５０、７４０、７３０、７２０、７１０、７００、６９０、６８０、６７０、６６０、６５０、６４０、６３０、６２０、６１０、６００、５９０、５８０、５７０、５６０、５５０、５４０、５３０、５２０、５１０、５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５０、４４０、４３０、４２０、４１０、４００、３９０、３８０、３７０、３６０、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、または１０アミノ酸より少なく、そしていくつかの場合、免疫原性である。
【００１８】
代表的なＡｌｓ３ｐ断片は、図１Ａに示すような、配列番号２、またはその断片である。いくつかの場合、Ａｌｓ３ｐ断片は、長さが１４および２０アミノ酸の間である。一般的に、その断片は、例えば３２５、３２０、３１０、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、または１１アミノ酸より少なくあり得、そして望ましくは、免疫原性である。いくつかの場合、Ａｌｓ３ｐ断片は、１４および２０アミノ酸の間である。
【００１９】
それに加えて、例えば、Ａｌｓ３ｐ断片は、図１Ａに示す配列、例えば配列番号１または配列番号２に、１つまたはそれより多い保存的アミノ酸置換を含み得る。さらなる望ましいＡｌｓ３ｐ断片は、図１Ａに示す配列、例えば配列番号１または配列番号２に、１つまたはそれより多い保存的アミノ酸置換、および／または図１Ａに示す配列、例えば配列番号１または配列番号２のＮおよび／またはＣ末端に、少なくとも１つの隣接アミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の隣接アミノ酸）を含む。他の好ましいＡｌｓ３ｐ断片は、図１Ａに示す配列、例えば配列番号１または配列番号２の、７つまたはそれより多い連続的アミノ酸を含む。
【００２０】
Ａｌｓ３ｐ断片の制限しない例は、図１Ａに示す配列、例えば配列番号１または配列番号２の、アミノ酸１−４０、１０−５０、２０−６０、３０−７０、４０−８０、５０−９０、６０−１００、７０−１１０、８０−１２０、９０−１３０、１００−１４０、１１０−１５０、１２０−１６０、１３０−１７０、１４０−１８０、１５０−１９０、１６０−２００、１７０−２１０、１８０−２２０、１９０−２３０、２００−２４０、２１０−２５０、２２０−２６０、２３０−２７０、２４０−２８０、２５０−２９０、および２６０−３００、２７０−３１０、２８０−３２０、および２９０−３３１アミノ酸；および以下の特徴のうちの１つまたはそれより多くを有するこれらの断片を含む：図１Ａに示す配列、例えば配列番号１または配列番号２における、１つまたはそれより多い保存的アミノ酸置換（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個の保存的アミノ酸置換）；図１Ａに示す配列、例えば配列番号１または配列番号２のＮおよび／またはＣ末端からの、１つまたはそれより多いアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６アミノ酸）の短縮；および図１Ａに示す配列、例えば配列番号１または配列番号２のＮおよび／またはＣ末端における、少なくとも１つの隣接アミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の隣接アミノ酸）。
【００２１】
「実質的に同一」によって、参照配列と少なくとも５０％の同一性を示すアミノ酸配列または核酸配列を意味する。そのような配列は一般的に、参照配列に対して、アミノ酸レベルまたは核酸レベルにおいて、少なくとも、例えば５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。一般的に、ポリペプチドに関して、比較配列の長さは、少なくとも５アミノ酸、例えば１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、またはそれより長いアミノ酸、そのポリペプチドの全長までであり得る。核酸に関して、比較配列の長さは一般的に、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、またはそれより長いヌクレオチド、その核酸分子の全長までであり得る。ＤＮＡ配列をＲＮＡ配列に対して比較する場合、配列同一性を決定する目的のために、チミンヌクレオチドは、ウラシルヌクレオチドと同等であることが理解される。
【００２２】
本明細書中で列挙したあらゆるＡｌｓ３ｐポリペプチドまたはその断片をコードする核酸配列も企図される。
【００２３】
本明細書中で使用する場合、ポリペプチドまたは核酸配列が、参照配列に対して「少なくともＸ％の配列同一性」を有すると言われるなら、配列を最適に整列した場合に、そのポリペプチドまたは核酸中の少なくともＸパーセントのアミノ酸またはヌクレオチドが、参照配列のものと同一であることを意味する。配列の最適な整列を、当該分野の技術の範囲内である、様々な方法で、例えばＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ整列アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−７、１９８１）およびＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０、１９９０）で決定し得る。これらのおよび他の整列アルゴリズムは、ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ  ＰｌｕｓＴＭ（ＳｃｈｗａｒｚおよびＤａｙｈｏｆ、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．編、３５３−３５８頁、１９７９）に組込まれた、「Ｂｅｓｔ  Ｆｉｔ」（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ、４８２−４８９、１９８１）、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ、ＢＬＡＳＴ−Ｘ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、ＣＬＵＳＴＡＬ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）のような、公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを用いて利用可能である。それに加えて、当業者は、比較する配列の長さにわたって最適な整列を達成するために必要なあらゆるアルゴリズムを含む、整列を測定するための適当なパラメーターを決定し得る。
【００２４】
「アジュバント」によって、免疫系の刺激を引き起こす、１つまたはそれより多い物質を意味する。この文脈において、アジュバントを、１つまたはそれより多いワクチン抗原または抗体に対する免疫反応を増強するために使用する。アジュバントを、ワクチンまたは抗体の投与の前に、それと組み合わせて、またはその後に、被験体に投与し得る。アジュバントとして使用される化学的化合物の例は、アルミニウム化合物（例えばミョウバン、アルハイドロゲル）、油、ブロックポリマー、免疫刺激複合体、ビタミンおよびミネラル（例えばビタミンＥ、ビタミンＡ、セレン、およびビタミンＢ１２）、ＱｕｉｌＡ（サポニン）、細菌および真菌細胞壁成分（例えば、リポ多糖、リポタンパク質、および糖タンパク質）、ホルモン、サイトカイン、および共起刺激因子を含むがこれに限らない。
【００２５】
結合体の文脈において、「担体」によって、本明細書中で記載したようなポリペプチドに連結される、またはそれを提示するために適当な部分または粒子、例えばＫＬＨ、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、エンテロトキシンＢ断片、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ外膜タンパク質複合体、あらゆる他の担体タンパク質、ファージ、酵母、ウイルス、ビロソーム、または組換えウイルス様粒子を意味する。
【００２６】
「結合体」によって、別の部分または粒子、例えばＫＬＨ、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、エンテロトキシンＢ断片、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ外膜タンパク質複合体、あらゆる他の担体タンパク質、ファージ、酵母、ウイルス、ビロソーム、または組換えウイルス様粒子に連結した本発明のポリペプチドを含む化合物を意味する。
【００２７】
「免疫原性」によって、被験体において免疫反応を誘発し得るあらゆる物質を意味する。
【００２８】
ワクチンの文脈において、「免疫原性量」によって、臨床的に関連のある様式で、被験体において免疫反応を誘発するために必要なワクチンの量を意味する。本明細書中で記載したようなワクチン接種の方法を実施するために使用するワクチンの免疫原性量は、投与の様式、被験体の年齢、体重、および一般的な健康に依存して変動する。最終的に、処方者が適当な量および投与レジメンを決定する。
【００２９】
「単離した」または「精製した」によって、他の天然に付随する成分から分離していることを意味する。典型的には、化合物（例えば核酸、ポリペプチド、抗体、または小分子）は、重量で少なくとも６０％、それが天然に結合しているタンパク質および／または天然に存在する有機分子を含まないなら、それは実質的に単離されている。その定義はまた、例えばその隣接配列から分離されたポリペプチドまたは核酸分子にも拡大される（例えば、アミノ酸配列に関して、単離されていることは、その配列がポリペプチド中で天然に結合している隣接アミノ酸を含まない配列を指す）。いくつかの例において、その化合物は、重量で少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９９％単離されている。単離された化合物、例えばポリペプチドを、標準的な技術、例えば天然の供給源からの抽出によって（例えばＣａｎｄｉｄａが感染した細胞からの精製）；Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含むがこれに限らないあらゆる標準的な発現システムにおける、Ａｌｓ３ｐ、Ａｌｓ３ｐ断片または改変体、またはその融合タンパク質をコードする組換え核酸の発現によって；またはポリペプチドを化学的に合成することによって、得ることができる。純度を、あらゆる適当な方法によって、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析によって測定し得る。
【００３０】
結合体の文脈において、「連結した」または「結合体化した」によって、ポリペプチドおよび担体または融合パートナーの間の、共有結合または非共有結合相互作用を意味する。非共有結合相互作用は、水素結合、荷電した基間のイオン性相互作用、静電性の結合、ファンデルワールス相互作用、非極性基間の疎水性相互作用、疎油性相互作用、およびＬｏｇＰに基づく引力を含むがこれに限らない。
【００３１】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、交換可能に使用され、そして翻訳後修飾（例えばグリコシル化またはリン酸化）に関わらず、本明細書中で記載するような、天然に存在する、または天然に存在しないポリペプチドまたはペプチドの全てまたは一部を構成する、２つまたはそれより多い天然または非天然アミノ酸のあらゆる鎖を指す。
【００３２】
「薬学的に受容可能な担体」および「薬学的に受容可能な賦形剤」という用語は、交換可能に使用され、そしてそれと一緒に投与される化合物の治療的性質を保持しながら、処置される哺乳動物にとって生理学的に受容可能な担体または賦形剤を意味する。１つの代表的な薬学的に受容可能な担体物質は、生理食塩水である。他の生理学的に受容可能な担体およびその処方は、当業者に公知であり、そして例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第２１版）、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、２００５、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡにおいて記載されている。
【００３３】
「薬学的組成物」によって、薬学的に受容可能な賦形剤と共に処方され、そして哺乳動物における疾患または事象の処置または予防のための治療レジメンの一部として、政府規制当局の認可によって製造または販売される、本発明のポリペプチド、結合体、ワクチン、または抗体を含む組成物を意味する。薬学的組成物を、例えば静脈内投与のために（例えば粒子性塞栓を含まない滅菌溶液として、および静脈内で使用するために適当な溶媒システムで）、経口投与のために（例えば錠剤、カプセル、カプレット（ｃａｐｌｅｔ）、ジェルカプセル（ｇｅｌｃａｐ）、またはシロップ）、または本明細書中で記載されるあらゆる他の処方物、例えば単位剤形で処方し得る。
【００３４】
「処置すること」または「処置」によって、薬学的組成物を投与することによって、疾患、病理学的状態、障害、または事象を、治癒する、寛解させる、安定化させる、可能性を低減する、または予防する意図による、哺乳動物、例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物の医学的管理を意味する。この用語は、積極的処置、すなわち、疾患、病理学的状態、障害、または事象の改善を明確に目指した、またはその治癒に関連する処置を含み、そしてまた原因療法、すなわち関連する疾患、病理学的状態、障害、または事象の原因の除去へ向けた処置を含む。それに加えて、この用語は、緩和処置、すなわち疾患、病理学的状態、障害、または事象の治癒よりも症状の軽減のためにデザインされた処置；症候性処置、すなわち関連する疾患、病理学的状態、障害、または事象の体質的な症状に対する処置；予防的処置、すなわち例えばまだ病気ではないが、特定の疾患、病理学的状態、障害、または事象にかかりやすい、さもなければそのリスクのある哺乳動物において、関連する疾患、病理学的状態、障害、または事象の発症を最小限にする、または部分的にまたは完全に阻害するための処置；および支持療法、すなわち関連する疾患、病理学的状態、障害、または事象の改善に向けた別の特定の治療を補助するために採用される処置を含む。
【００３５】
本明細書中で使用される「ワクチン」によって、それが投与される被験体において免疫反応を誘発する組成物を意味する。投与の様式、用量、および投与の回数を、当業者が公知の方法で最適化し得る。
【００３６】
本明細書中で使用される「ワクチン接種する」または「ワクチン接種」によって、例えば疾患、病理学的状態、障害、または事象を予防または寛解させるために、ワクチンを投与することによって哺乳動物を処置することを意味する。
【００３７】
本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１Ａ】図１Ａは、２つのＡｌｓ３ｐアミノ酸配列、配列番号１および配列番号２の一覧である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、１つのＡｌｓ３核酸配列、配列番号第３番の一覧である。
【図２】図２は、インビボイメージングによって評価された、ＮＤＶ−３の比較有効性動態を示す写真のセットである。その写真は、感染後２、４、および７日目の各投与量群のマウスを示す。
【図３】図３は、ＮＤＶ−３がマウスＳＳＳＩにおいてＭＲＳＡ膿瘍体積を制限することを示す表である。その表は、コントロール群および３μｇ、１０μｇ、３０μｇ、および１００μｇのＮＤＶ−３投与量群の平均体積（ｃｍ３）／膿瘍を示す。
【図４】図４は、ＮＤＶ−３がマウスＳＳＳＩにおいてＭＲＳＡ膿瘍体積を制限することを示す、１対の写真である。左、コントロール群のマウス、右、１００μｇのＮＤＶ−３投与量群のマウス。
【図５】図５は、ＮＤＶ−３がマウスＳＳＳＩにおいてＭＲＳＡの増殖を抑制することを示す表である。その表は、コントロール群、および３μｇ、１０μｇ、３０μｇ、および１００μｇのＮＤＶ−３投与量群の、平均フラックス（ｆｌｕｘ）／膿瘍を示す。
【図６】図６は、ＮＤＶ−３が、ＭＲＳＡの増殖を制限し、そして好中球をリクルートすることを示す画像のセットである。示したデータは、感染後７日目の、１００μｇＮＤＶ−３投与量群に由来する。
【図７】図７は、ＮＤＶ−３が、ＣＤ３＋Ｔ細胞をリクルートし、そしてＩＬ−１７の発現を誘発することを示す画像のセットである。示したデータは、感染後７日目の、１００μｇのＮＤＶ−３投与量群に由来する。
【図８】図８は、ＮＤＶ−３が、ＩＬ−２２発現およびβ−デフェンシン反応を刺激することを示す画像のセットである。示したデータは、感染後７日目の１００μｇのＮＤＶ−３投与量群に由来する。
【図９】図９は、コントロールマウスおよびワクチン接種マウスのメジアン側腹部膿瘍面積を示す図表である。
【図１０】図１０は、コントロールマウスおよびワクチン接種マウスのメジアン側腹部膿瘍体積を示す図表である。
【図１１】図１１は、感染後７日目のコントロールマウスおよびワクチン接種マウスにおけるＭＲＳＡ株による平均膿瘍体積を示す図表である。アスタリスクは、それぞれのコントロールと比較して有意な低減を示す。
【図１２】図１２は、ＮＤＶ−３（１００μｇ）ワクチン接種マウス由来の、ＭＲＳＡ膿瘍の合成免疫蛍光画像である。
【図１３】図１３は、コントロールマウス由来の、ＭＲＳＡ膿瘍の合成免疫蛍光画像である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
特許または出願ファイルは、カラーの図面（図２、４、６−８、１２、および１３）を含む。カラーの図面を有するこの特許または特許出願公開のコピーが、リクエストおよび必要な料金の支払い時に受理官庁によって提供される。
【００４０】
下記で記載されるように、アグルチニン様配列３タンパク質（Ａｌｓ３ｐ）は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ皮膚または軟部組織感染を発症するリスクがあると同定された哺乳動物において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対するワクチン接種を可能にする。
【００４１】
ＭＲＳＡ皮膚／皮膚構造感染（ＳＳＳＩ）のマウスモデルにおいて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに起因する皮膚または軟部組織感染の発症に対する、Ａｌｓ３ｐワクチンの有効性を評価するためにデザインされた以下の分析において（特に、実施例１の予備研究および実施例２の最適化研究）、生物および方法をまず説明する。
【００４２】
生物
ＭＲＳＡ株
ＭＲＳＡ  Ｘｅｎ３０（ｌｕｘ＋）Ｒｏｃｈｅ−１６
ＭＲＳＡ  ＬＡＣ−ＵＳＡ３００ＵＳＡ３００
ＭＲＳＡ  ＭＷ２  ＵＳＡ４００  。
【００４３】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株Ｘｅｎ３０を、これらのインビボ研究において使用した。それは親株Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＲＳＡ−１６（Ｒｏｃｈｅ）由来であり、そして単一の染色体組み込み部位にｌｕｘＡ−Ｅオペロンを含む。このＭＲＳＡ株は、ルシフェラーゼ酵素およびアルデヒド基質を産生し、そして代謝的に活性な場合、構成的に生物発光シグナルを発する。そのビルレンスは、予備研究において証明されたように、使用したＳＳＳＩマウスモデルにおいて他のＭＲＳＡ株と同等であり、そして試験した全ての株は、他は同様の表現型および増殖の特徴を有する。対数期の細胞（ＢＨＩ；３７℃）を、望ましいＣＦＵまで、定量的およびビルレンス確認マスター細胞バンクから培養し、回収およびＰＢＳに懸濁し、超音波処理し、そして分光測定によって定量した。
【００４４】
方法
ＮＤＶ−３ワクチンの有効性を、マウスＳＳＳＩモデルにおいて、メチシリン耐性ＳＡ（ＭＲＳＡ）：Ｘｅｎ３０（ｌｕｘ＋）；ＬＡＣＵＳＡ３００；またはＭＷ２（ＵＳＡ４００）に対して評価した。ＮＤＶ−３は、リン酸緩衝化食塩水、ｐＨ７中、Ｃａｎｄｉｄａ表面タンパク質Ａｌｓ３タンパク質（図１Ａ；配列番号２）の組換えＮ末端およびアジュバントであるアルハイドロゲル（登録商標）の処方物であり、例えば０．５ｍＬの用量は例えば３０−３００μｇのＡｌｓ３タンパク質を含み、そして任意でさらに水酸化アルミニウムを１．０ｍｇＡｌ／ｍＬで含む。０日目にアルハイドロゲルアジュバント（ＩＭ）と共に投与し、そして２１日目に追加刺激したＮＤＶ−３レジメン間で、有効性を比較した。コントロールにはアジュバントのみを投与した。２ヶ所の側腹部の皮下接種（２×１０７ＣＦＵ）による感染を、追加刺激の１４日後に行った。膿瘍面積、体積、およびＣＦＵを、チャレンジ後の複数の日に定量した。膿瘍のフラックスのインビボイメージング（ＩＶＩＳ）を、Ｘｅｎ３０によって感染したマウスにおいて行った。血清ＩｇＧ（ＥＬＩＳＡ）、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７Ａ（ＥＬＩＳｐｏｔ）反応を、並行したワクチンレジメンで定量した。組織ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ｍβＤ−３、ＣＤ３＋細胞および好中球シグナルを、免疫組織化学によって、感染後７日目に評価した。
【００４５】
ワクチン。ＮＤＶ−３ワクチン接種を、アルハイドロゲルアジュバントの同じレジメンを用いて、用量範囲にわたって評価した。３、１０、３０、１００、または３００μｇ（ＩＭ）の用量を、並行して試験した。一次ワクチン接種（０日目）に続いて、研究２１日目に同じ追加刺激を行った。マウスを、追加刺激後１４日目（試験３５日目）に感染させた。
【００４６】
ＳＳＳＩのマウスモデル。全ての動物実験を、Ｈａｒｂｏｒ−ＵＣＬＡにおけるＬＡＢｉｏＭｅｄの認可された動物使用ポリシーにしたがって行った。Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ）を、上記のようにワクチン接種した。皮下皮膚／軟部組織膿瘍モデルを、これらの試験のために、Ｄｉｎｇら（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２００８  １９０：７１２３−９）および／またはＶｏｙｉｃｈら（Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００６  １９４：１７６１−１７７０）から修飾した。試験３５日目、マウスを麻酔し、側腹部の毛を剃り、そして滅菌し、そして２×１０７ＣＦＵの接種材料（ビーズもマトリックスも無し）を、注射（１００μｌ）によって皮下区画に導入した。コントロール群またはワクチンレジメン群あたり最低２０匹のマウスを、各試験で使用した。
【００４７】
膿瘍の定量。チャレンジ後１４日目までの試験期間、膿瘍の面積／体積を、各マウス側腹部において測定した。そのために、マウスを麻酔し、そして病変部位の長さ（ｌ）および幅（ｗ）を評価して膿瘍または皮膚壊死面積を定量した（ｃｍ２）。球面楕円体の式：［ｖ＝（π／６）×ｌ×ｗ２］によって、膿瘍の体積（ｃｍ３）を計算した。
【００４８】
イメージング研究。Ｘｅｎ３０  ＭＲＳＡ株は、その染色体に組込まれた自己完結型ｌｕｘオペロンを有する。その構築物は、アルデヒド基質およびルシフェラーゼ酵素自体をコードする；従って、外来性のルシフェリン基質は必要ない（Ｋａｄｕｒｕｇａｍｕｗａら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ２００３  ７１：８８２−８９０）。選択した試験日において、コントロールおよびワクチン接種したマウスで、ＩＶＩＳシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、インビボイメージング（ＩＶＩＳ）を行った。５分間にわたって発光シグナルを捕捉し、そしてＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを用いて、光子／分／膿瘍として分析した。
【００４９】
定量的培養。前もって選択した感染後の時間に、マウスを人道的に屠殺し、そして膿瘍の定量的培養のために処理した。各側腹部を無菌的に解剖し、膿瘍を除去し、そして培養のために調製した。膿瘍を個々にホモジナイズし、そしてヒツジ血液寒天プレート上の定量的培養のために、滅菌ＰＢＳ中で連続的に希釈した。培養物を２４時間インキュベートし（３７℃）、そしてできたコロニーを数えた。
【００５０】
免疫学的メカニズム。ＭＲＳＡによるＳＳＳＩのマウスモデルにおける、ＮＤＶ−３ワクチンの有効性の潜在的な関連を評価するために、複数かつ補完的なアプローチを使用した。これらの研究はＸｅｎ３０株に焦点を合わせ、７ｄエンドポイントでのＩＶＩＳデータとの関連を可能にした。
【００５１】
Ａ．抗体の定量。血清ＩｇＧ抗体レベルを、ある範囲の希釈で、９６ウェルＥＬＩＳＡフォーマットで決定した。値は、免疫化血清対コントロール血清を比較して、三連のアッセイの幾何平均補正希釈を示す。
【００５２】
Ｂ．サイトカインの定量。Ｔ細胞ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７Ａ反応を、免疫化マウス対コントロールマウスから単離し、そしてＮＤＶ−３免疫原に曝露した脾細胞のＥＬＩＳｐｏｔ分析によって決定した。スポット形成単位（ＳＰＵまたはＳＦＵ、交換可能に使用される）の数を、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−１７Ａのいずれかを産生する、１０６細胞ごとに定量した。細胞生存度を、確立されたプロトコールによって、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）およびイオノマイシンによる刺激後のＩＦＮ−γの産生によって確認した。
【００５３】
Ｃ．免疫組織化学。ワクチンの有効性に関連する免疫学的決定要因を、標準的な方法によって、感染の７日後にワクチン接種動物およびコントロール動物から得た組織において評価した。免疫組織化学的研究のために、手短に言えば、３μｍの垂直パラフィン包埋切片を脱ろうし、そして再水和し、続いて標的回復溶液中で熱誘導抗原回復を行った（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）。切片を、室温で１５分間、ｄｕａｌ  ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｄａｋｏ）とインキュベートして、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックし、そして非特異的抗体結合を、一次抗体に対応する５％の正常血清とインキュベートすることによってブロックした。次いで切片を、関心のある特定の抗原を標的とする一次抗体と、４℃で一晩インキュベートした（表１）。次いで切片を洗浄し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化されたかまたはビオチン化されたかのいずれかの適当な二次抗体（表１）と３０分間インキュベートした（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）。次いで免疫組織化学的展開を、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｄａｋｏ）および３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）による３０分の展開によって達成し、そしてヘマトキシリンで対比染色した。画像捕捉のためにＤＰ２１デジタルカメラを採用するＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４３顕微鏡を用いて、画像を視覚化した。
【００５４】
Ｄ．免疫蛍光。インビボにおける感染の状況で、ＮＤＶ−３ワクチン接種の、免疫原性決定要因およびＳ．ａｕｒｅｕｓの相互関係に対する影響を評価するために、共焦点顕微鏡法を採用する免疫蛍光研究を、確立した方法を用いて行った。簡単には、パラフィン包埋切片を上記のように調製し、そして免疫蛍光緩衝液（１％のウシ血清アルブミンおよび２％のウシ胎仔血清）と、室温で１時間インキュベートした。関心のある標的抗原に対する一次抗体（表１）を、コントロールまたはワクチン接種マウス由来の組織切片と、４℃で一晩インキュベートした。次に、ＩＦＦ緩衝液に希釈した対応する二次抗体（表１）（２μｇ／ｍｌ）を、６０分間インキュベートした。次いで切片をＰＢＳで洗浄し、そして光退色を最低限にするために、ＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄＨ−１５００（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を用いてマウントした。アルゴン（４８８ｎｍ）、クリプトン（５６８ｎｍ）、およびヘリウム−ネオン（６３３ｎｍ）レーザーを採用するＬｅｉｃａＳＰ２共焦点顕微鏡、および共焦点バージョン２．０ソフトウェア（Ｌｅｉｃａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、画像を視覚化した。
【００５５】
表１．免疫組織化学または免疫蛍光研究のために使用した抗体
一次抗体
標的抗原
Ｌｙ−６Ｇ（顆粒球）
Ｌｙ−６Ｃ（単球／マクロファージ）
マウスβ−デフェンシン−１（ｍＢＤ−１）
マウスβ−デフェンシン−３（ｍＢＤ−３）
マウス血小板第４因子（ＰＦ−４）
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（マウス）
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ウサギ）
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  プロテインＡ
ＣＤ３−γ
ＣＤ３−ε
ＩＬ−１７
ＩＬ−２２
二次抗体
Ａｌｅｘａ４８８−結合体化ロバα−ウサギ
Ａｌｅｘａ４８８−結合体化ロバα−ラット
Ａｌｅｘａ５５５−結合体化ヤギα−ラット
Ａｌｅｘａ５６８−結合体化ロバα−ウサギ
Ａｌｅｘａ６３３−結合体化ロバα−ヤギ
Ａｌｅｘａ６４７−結合体化ロバα−ウサギ
Ａｌｅｘａ６３３−結合体化ストレプトアビジン  。
【００５６】
統計学的分析。実験結果の差を、群あたり１６〜２０匹のマウスが、組織１ｇ、または膿瘍面積２ｍｍあたり、ＣＦＵの１ｌｏｇの差を検出するために＞８５％の検出力（ｐｏｗｅｒ）を生じることを示す検出力の推定値に基づいて比較した（ａ＝０．０５；マンホイットニーのＵ検定）。Ｐ値を表２および表３で規定する（下記）。
【実施例】
【００５７】
実施例１
予備試験において、ＮＤＶ−３によるワクチン接種は、ＭＲＳＡによるＳＳＳＩパラメーターを低減し、Ｘｅｎ３０、ＵＳＡ３００、およびＭＷ２株に関して、膿瘍面積、体積、およびＣＦＵの制限において同等の有効性であった。マウス免疫反応は、ＮＤＶ−３の用量関連保護有効性と相関していた。これらの結果を表２および図２に示す。これらの結果は、ＮＤＶ−３ワクチンが、確固としたＢ細胞反応およびＴ細胞反応を誘発したことを示し、それはＳＳＳＩのマウスモデルにおけるＭＲＳＡに対する保護有効性に対応する。
【００５８】
【表２】
2014521605.tif 000002
【００５９】
分析
ＮＤＶ−３ワクチンは、このＭＲＳＡ  ＳＳＳＩのマウスモデルにおいて、膿瘍面積、体積、発光シグナル、およびＣＦＵ密度を有意に低減した。ＮＤＶ−３の有効性は、この研究において評価したＭＲＳＡ株のそれぞれに関して同等であった。感染でチャレンジしたものと同一にワクチン接種したマウス由来の免疫学的データは、ＮＤＶ−３ワクチンが、確固としたＢ細胞反応およびＴ細胞反応を誘発したことを示し、それは用量−反応関係を反映しているようである。感染でチャレンジしたものと同一にワクチン接種したマウス由来の免疫学的データは、ＮＤＶ−３ワクチンが、確固としたＢ細胞反応およびＴ細胞反応を誘発したことを示し、それは用量−反応関係を反映する。全体として、これらの結果は、ＮＤＶ−３が、主に保護有効性と関連するようである、混合Ｔｈ１／Ｔｈ１７反応を誘発するという証拠を提供する。抗体反応が、ＮＤＶ−３の保護メカニズムに寄与し得る。これらの結果は、ＮＤＶ−３ワクチンが、哺乳動物においてＭＲＳＡ皮膚感染もしくは膿瘍またはそれらの両方を、予防または軽減するための手段として有用であることを示す。
【００６０】
実施例２
さらなる最適化した分析を行い、そして結果を表３および図３−８にまとめる。実施例１と同様、この研究は、メチシリン耐性ＳＡ（ＭＲＳＡ）による皮膚／皮膚構造感染のマウスモデルにおいて、ＮＤＶ−３ワクチンの有効性および免疫学的メカニズムを評価した。膿瘍サイズ、ＭＲＳＡ密度およびＣＦＵを、ＮＤＶ−３免疫化群およびコントロール群で時間をわたって比較した。ＩｇＧ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１７Ａの血清濃度、組織ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、およびｍβＤ−３の誘導、およびＮＤＶ−３によって媒介されるＣＤ３＋Ｔ細胞または好中球の浸潤を、並行して決定した。ＮＤＶ−３免疫化は、アジュバント単独と比較して、膿瘍面積、体積、細菌密度およびＣＦＵに関して、ＭＲＳＡに対する保護有効性を達成した。ＮＤＶ−３の保護有効性は、血清ＩｇＧ、Ｔｈ１−Ｔｈ１７極性化の血清および組織バイオマーカー、および膿瘍の状況における対応する好中球の浸潤および宿主防御ペプチド誘発の増大に対応した。これらのデータはさらに、ＮＤＶ−３免疫化は、皮膚および粘膜の状況において、ＭＲＳＡに対する保護有効性の確固としたＢ細胞メカニズムおよびＴ細胞メカニズムを誘発することを示した。
【００６１】
結果
ＮＤＶ−３は、アジュバント単独に対して減少した膿瘍面積、体積、およびＣＦＵによって測定されるように、ＭＲＳＡに対して有効であった（表３）。皮膚壊死の面積および膿瘍体積によって測定した有効性は、試験した全ての株で同等であった。血清ＩｇＧ、Ｔｈ１（ＩＦＮ−γ）およびＴｈ１７（ＩＬ−１７）極性化の血清および組織バイオマーカーの有意な増大（表３）、好中球の浸潤（Ｌｙ６Ｇ）、ＩＬ−２２の生成、およびｍβＤ−３の誘発が、ＮＤＶ−３保護有効性と関連していた（図３−８）。
【００６２】
【表３】
2014521605.tif 000003
【００６３】
結論
ＮＤＶ−３は、マウスＳＳＳＩにおいて、ＭＲＳＡに対する保護有効性を誘発した。有効性の免疫学的メカニズムは、感染の状況において好中球および宿主防御ペプチドを標的化および調整する、Ｔｈ１−Ｔｈ１７パラダイムと一致する、確固としたＢ細胞反応およびＴ細胞反応を含む。
【００６４】
実施例３
Ｘｅｎ３０ＭＲＳＡおよびＭＲＳＡの比較株によるＳＳＳＩのマウスモデルにおいて、ＮＤＶ−３ワクチンの有効性を評価するために、さらなるセットの実験を行った。実験を、実施例１および２で記載したように行った。ワクチン有効性対時間のメジアンデータ動態を、図９（コントロールマウスおよびワクチン接種マウスのメジアン側腹部膿瘍面積）および図１０（コントロールマウスおよびワクチン接種マウスの平均側腹部膿瘍体積）に示す。これらのデータは、ＮＤＶ−３によるワクチン接種が、特に３μｇより高い投与量において、膿瘍の発達を抑制することを確認する。
【００６５】
それに加えて、ワクチンの有効性を、３つの異なるＭＲＳＡ株：Ｘｅｎ３０、ＵＳＡ３００、およびＭＷ２に対して試験した。ＭＲＳＡ株それぞれに関して、ネガティブコントロールおよび１００μｇの投与量群を試験した。感染後７日目の平均病変体積を、図１１に示したように決定した。各株は、同じ接種材料（２×１０７）であった。これらの実験において、ＭＷ２は低いビルレンスを示した。
【００６６】
そのデータは、試験したＭＲＳＡ株に関わらず、ＮＤＶ−３ワクチンは、膿瘍体積の制限において同等の有効性（例えば約５０％の低減）を有することを示す。従って、ＮＤＶ−３の有効性は、ＭＲＳＡ株特異的ではない。
【００６７】
実施例４
さらなる実験のセットにおいて、ＭＲＳＡ膿瘍の合成免疫蛍光画像を記録および分析した。図１２は、ＮＤＶ−３（１００μｇ）ワクチン接種マウス由来の代表的なＭＲＳＡ膿瘍の合成免疫蛍光画像であり、そして図１３は、コントロールマウス由来の代表的なＭＲＳＡ膿瘍の合成免疫蛍光画像である。
【００６８】
上記の画像それぞれにおいて、画像の各成分は約５００倍に拡大した、同じ病変のものである。免疫蛍光シグナルは、低倍率で解像するのが困難であるので、高倍率で、病変の各部分で画像を記録し、皮膚の表皮から皮下へ、そして皮下組織まで移動する。従って、成分を合成して、病変中のＳ．ａｕｒｅｕｓ（青）、好中球（赤）、およびＣＤ３＋Ｔ細胞（緑）の連続的免疫蛍光マップを図解し、そして免疫蛍光の解像に十分な倍率を維持する。その画像成分は、膿瘍免疫表現型の直接比較のために、ＮＤＶ−３およびコントロール病変の等価な領域を体系的に捕捉するよう位置づけた高倍率視野の関数（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を示す。
【００６９】
図１２および１３が明らかにするように、ＮＤＶ−３ワクチン接種膿瘍において、ＭＲＳＡ生物は少ししか存在せず（青）、そしてそれらは表皮に限られ、ＣＤ３＋Ｔ細胞（緑）の流入によって媒介される好中球（赤）の浸潤がある。対照的に、コントロール膿瘍において、多くのＭＲＳＡ生物が存在し、そしてそれらは２つの別の領域（表皮および皮下組織）に侵襲しており、実質的により少ない好中球およびＣＤ３＋細胞浸潤と対応する。図１２および１３に示す画像は個々の病変由来であるが、それらは全体としてワクチン接種群およびコントロール群の病変の代表であり、そして前の実施例で記載された定量的な発見と一致している。
【００７０】
実施例５
本明細書中で記載される組成物および方法を、例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対して、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ皮膚または軟部組織感染を発症するリスクのあるヒトをワクチン接種するために使用し得る。最初に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＳＳＳＩを発症するリスクのあるヒトを同定する。２番目に、そのヒトに、薬学的に受容可能な媒体中に、Ａｌｓ３ｐまたはその免疫原性断片を含むポリペプチドを含む免疫原性量のワクチンを投与する。例えば、そのヒトに、用量あたり、３および１０００μｇの間のＣａｎｄｉｄａ表面タンパク質Ａｌｓ３（配列番号２）の組換えＮ末端を含む、１および３用量の間のＮＤＶ−３を投与し、２週間から６ヶ月の間隔で複数回用量を与える。
【００７１】
ワクチンの投与後に、そのヒトは１ヶ月から数年またはそれより長く続く期間、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＳＳＳＩの発症のリスクが低下することが予測される。
【００７２】
同様に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＳＳＳＩを有すると同定されたヒトを、薬学的に受容可能な媒体中に、Ａｌｓ３ｐ、またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを含む、免疫原性量の薬学的組成物の投与によって処置し得る。例えば、そのヒトに、用量あたり３および１０００μｇの間のＣａｎｄｉｄａ表面タンパク質Ａｌｓ３（配列番号２）の組換えＮ末端を含む、１および３用量の間のＮＤＶ−３を投与し、２週間から６ヶ月の間隔で複数回用量を与える。
【００７３】
その薬学的組成物の投与後、ヒトのＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＳＳＳＩの重症度は減少することが予測される。
【００７４】
実施例６
本明細書中で記載される組成物および方法を、例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対して、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ皮膚または軟部組織感染を発症するリスクのあるウシ種をワクチン接種するために使用し得る。特に、ウシ種は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓによって引き起こされるウシ乳房炎を発症するリスクがあり得る。まず、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＳＳＳＩ、例えばウシ乳房炎を発症するリスクのあるウシ種を同定する。例えば、あらゆる乳牛は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓによって引き起こされるウシ乳房炎を発症するリスクがあるとみなされ得る。２番目に、そのウシ種に、薬学的に受容可能な媒体中に、Ａｌｓ３ｐまたはその免疫原性断片を含むポリペプチドを含む、免疫原性量のワクチンを投与する。例えば、そのウシ種に、用量あたり３および１０００μｇの間のＣａｎｄｉｄａ表面タンパク質Ａｌｓ３（配列番号２）の組換えＮ末端を含む、１および３用量の間のＮＤＶ−３を投与し、２週間から６ヶ月の間隔で複数回用量を与える。
【００７５】
ワクチンの投与後、そのウシ種はＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＳＳＳＩ、例えばウシ乳房炎を発症するリスクが低下することが予測される。
【００７６】
同様に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＳＳＳＩ、例えばウシ乳房炎を有すると同定されたウシ種を、薬学的に受容可能な媒体中に、Ａｌｓ３ｐ、またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを含む、免疫原性量の薬学的組成物の投与によって処置し得る。例えば、そのウシ種に、用量あたり３および１０００μｇの間のＣａｎｄｉｄａ表面タンパク質Ａｌｓ３（配列番号２）の組換えＮ末端を含む、１および３用量の間のＮＤＶ−３を投与し、２週間から６ヶ月の間隔で複数回用量を与える。
【００７７】
その薬学的組成物の投与後、ウシ種のＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＳＳＳＩ、例えばウシ乳房炎の重症度は減少することが予測される。
【００７８】
他の実施態様
本明細書中で引用された全ての出版物および特許は、個々の出版物または特許それぞれが明確におよび個々に参考文献に組み込まれると示されたように、本明細書中で参考文献に組み込まれる。前述の発明は、理解の明確さの目的で、例示および実施例によっていくらか詳細に説明されたが、本発明の教示を考慮して、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から離れることなく、それに一定の変更および修飾を行い得ることが、当業者に容易に明らかである。
【図１Ａ】
2014521605.tif 000004
【図１Ｂ】
2014521605.tif 000005
【図２】
2014521605.tif 000006
【図３】
2014521605.tif 000007
【図４】
2014521605.tif 000008
【図５】
2014521605.tif 000009
【図６】
2014521605.tif 000010
【図７】
2014521605.tif 000011
【図８】
2014521605.tif 000012
【図９】
2014521605.tif 000013
【図１０】
2014521605.tif 000014
【図１１】
2014521605.tif 000015
【図１２】
2014521605.tif 000016
【図１３】
2014521605.tif 000017
【配列表】
2014521605000001.app
【国際調査報告】
2014521605.tif 000018
2014521605.tif 000019