(57)【要約】【課題】非浸潤性の、敏感な、そして、特にＣＡＤおよびその結果に関するリスクを有する人のための不良な心血管予後の評価および予測に信頼性のある診断および予測方法並びにシステムを提供する。【解決手段】対象において、不良な心血管予後のリスクを決定する方法であって、該方法は、該対象から得たテスト生物試料における複数のバイオマーカーのそれぞれのレベルを測定することを含み、該複数のバイオマーカーは、（ｉ）ＦＤＰマーカー（但し、該ＦＤＰマーカーは少なくとも２つのフィブリンおよびフィブリノーゲンの分解産物（FDPs）の混合物を含む）、および（ｉｉ）少なくとも１つの炎症性バイオマーカー、自己免疫疾患バイオマーカー、または細胞ストレスバイオマーカーを含み；および該複数のバイオマーカーのレベルは、該対象における不良な心血管予後のリスクを示すことを特徴とする方法により解決される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において、不良な心血管予後のリスクを決定する方法であって、
該方法は、該対象から得たテスト生物試料における複数のバイオマーカーのそれぞれのレベルを測定することを含み、
該複数のバイオマーカーは、（ｉ）ＦＤＰマーカー(但し、該ＦＤＰマーカーは少なくとも２つのフィブリンおよびフィブリノーゲンの分解産物（FDPs）の混合物を含む)、および（ｉｉ）少なくとも１つの炎症バイオマーカー、自己免疫疾患バイオマーカー、または細胞ストレスバイオマーカーを含み；および
該複数のバイオマーカーのレベルは、該対象における不良な心血管予後のリスクを示すこと
を特徴とする方法。
【請求項２】
対象における不良な心血管予後のリスクを決定する方法であって、
該方法は、該対象からのテスト生物試料を、複数のバイオマーカーに特異的に結合する薬剤のパネルと接触させ、それにより該複数のバイオマーカーのレベルを測定することを含み；
該複数のバイオマーカーは、ＦＤＰマーカーおよび少なくとも１つの炎症バイオマーカー、自己免疫疾患バイオマーカー、または細胞ストレスバイオマーカーを含み；
該薬剤のパネルは、少なくとも２つのフィブリンおよびフィブリノーゲン分解産物（FDPs）に特異的に結合する薬剤（１または複数）を含み；および、
そのように測定されたレベルは、該対象における不良な心血管予後のリスクを示すこと
を特徴とする方法。
【請求項３】
該複数のバイオマーカーが少なくとも１つの炎症バイオマーカーまたは少なくとも１つの細胞ストレスバイオマーカーを含むことを特徴とする請求項１または２の方法。
【請求項４】
該複数のバイオマーカーが少なくとも１つの炎症バイオマーカーおよび少なくとも１つの自己免疫疾患もしくは細胞ストレスバイオマーカーを含むことを特徴とする請求項１または２の方法。
【請求項５】
該複数のバイオマーカーが少なくとも１つの炎症バイオマーカーおよび少なくとも１つの細胞ストレスバイオマーカーを含むことを特徴とする請求項１または２の方法。
【請求項６】
該複数のバイオマーカーが少なくとも１つの炎症バイオマーカーを含み、Ｃ−反応性タンパク質（CRP）遺伝子産物を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該複数のバイオマーカーが少なくとも１つの細胞ストレスバイオマーカーを含み、熱ショックタンパク質７０（HSP70）遺伝子産物を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該不良な心血管予後がＣＡＤを発症することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該不良な心血管予後がＣＡＤの不良な結果であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該ＣＡＤの不良な結果が心筋梗塞（MI）または死亡であることを特徴とする請求項９の方法。
【請求項１１】
該対象がＣＡＤを有することが知られている患者であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
該対象が、顕著なＣＡＤを有する患者であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
該対象が、非顕著なＣＡＤを有する患者であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
該対象が、ＣＡＤを有すると疑われる患者であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
該対象が、冠動脈疾患の症状を有さないことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法は更に、該テスト生物試料において測定される該複数のバイオマーカーのそれぞれのレベルを、該バイオマーカーのコントロールレベルと比較することを含む。
【請求項１７】
該比較が、コントロール試料における該複数のバイオマーカーのそれぞれのレベルを測定することおよび、そのように測定されたレベルと該テスト生物試料において測定されたレベルを比較することを含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
対象において不良な心血管予後のリスクを決定する方法であって、
該方法は、該対象からのテスト生物試料における複数のバイオマーカーのそれぞれのレベルを、各バイオマーカーのコントロールレベルと比較することを含み、
該複数のバイオマーカーは、（ｉ）ＦＤＰマーカー（但し、該ＦＤＰマーカーは、少なくとも２つのフィブリンおよびフィブリノーゲン分解産物（FDPs）の混合物を含む）、および、（ｉｉ）少なくとも１つの炎症または自己免疫疾患バイオマーカーを含み；および
該コントロールレベルと比較した該テスト試料における該複数のバイオマーカーのレベルの増加が、該対象における不良な心血管予後のリスクを示すこと
を特徴とする方法。
【請求項１９】
該各バイオマーカーのコントロールレベルが、複数のコントロール対象からのコントロール生物試料における該バイオマーカーのレベルを含むデータから計算され、該コントロール対象および評価を受ける対象は、同一の種であり、および、該テスト生物試料および該コントロール試料はプラズマまたは血清を含むことを特徴とする請求項１６または１８に記載の方法。
【請求項２０】
該不良な心血管予後のリスクが、該テスト生物試料におけるレベル（複数）が該コントロールレベル（複数）よりも高い場合に増加することを特徴とする請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
該複数のバイオマーカーが抗サイトメガロウイルス抗体遺伝子産物または熱ショックタンパク質６０に対する抗体(anti-HSP60)の遺伝子産物を更に含むことを特徴とする請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
該ＦＤＰマーカーが少なくとも２つのＦＤＰを含み、フラグメントＤ、フラグメントＥ、およびＤ−ダイマーからなる群より選択されるＦＤＰを含むことを特徴とする請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
該少なくとも２つのＦＤＰがフラグメントＤ、フラグメントＥ，およびＤ−ダイマーを含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
該少なくとも２つのＦＤＰが更にフラグメントＸ、フラグメントＹ、または初期プラスミン消化産物（IPDP）を含むことを特徴とする請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
該テスト生物試料が該対象からの体液または組織を含むことを特徴とする請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記テスト生物試料が、全血、血液分画、血液成分、プラズマ、血小板、血清、脳脊髄液（CSF）、骨髄、尿、涙、乳、リンパ液、臓器組織、神経系組織、非神経系組織、筋組織、生検、剖検、脂肪生検、脂肪組織、細胞、糞便、胎盤、脾臓組織、リンパ組織、膵臓組織、気管支肺胞洗浄（BAL）、および滑液からなる群より選択されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記テスト生物試料が全血、血液分画、血液成分、プラズマ、血小板、血清、または尿を含むことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
該テスト生物試料における該複数のバイオマーカーのレベルを測定することが、免疫分析により行われることを特徴とする請求項１〜１７および１９〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
該免疫分析がＥＬＩＳＡであることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
該複数のバイオマーカーが熱ショックタンパク質７０（HSP70）、Ｃ−反応性タンパク質（CRP）、および該ＦＤＰマーカーを含むことを特徴とする請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
該対象がヒトであることを特徴とする請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
該対象が、安定なＣＡＤを有する患者であることを特徴とする請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
該対象が、最近急性冠症候群（ACS）を有する患者であることを特徴とする請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
該複数のバイオマーカーのレベルの上昇が該不良な心血管予後のリスクの増加を総合して示すことを特徴とする請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
試料ミリリッター当たり１マイクログラムより大きい場合に該ＦＤＰマーカーのレベルが上昇することを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
該複数のバイオマーカーがＣＲＰ遺伝子産物を含み、および試料リッター当たり３ミリグラムより大きい場合に該ＣＲＰ遺伝子産物のレベルが上昇することを特徴とする請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
該複数のバイオマーカーがＨＳＰ７０遺伝子産物を含み、および該試料において検出可能な場合に、該ＨＳＰ７０遺伝子産物のレベルが上昇することを特徴とする請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
該複数のバイオマーカーのレベルの上昇が、該対象において、１年間に、該複数のバイオマーカーのいずれもが上昇しない対象と比較して、急性心筋梗塞（AMI）または死亡のリスクが少なくとも２倍大きいことを総合して示すことを特徴とする請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
該複数のバイオマーカーのレベルの上昇が、該対象において、１年間に、該複数のバイオマーカーのいずれもが上昇しない対象と比較して、急性心筋梗塞（AMI）または死亡のリスクが少なくとも３倍大きいことを総合して示すことを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
該複数のバイオマーカーのレベルの上昇が、該対象において、１年間に、該複数のバイオマーカーのいずれもが上昇しない対象と比較して、急性心筋梗塞（AMI）または死亡のリスクが少なくとも５倍大きいことを総合して示すことを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
該バイオマーカーの中の１つのみの単独でのレベルの上昇は、リスクの増加を示さないであろうことを特徴とする請求項３４〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
該対象が、ＦＲＳテスト、冠動脈カルシウムテスト、または第二の血液テストの結果に基づく中程度または高いリスクを有する対象であることを特徴とする請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
該対象が、直近の３０日間で急性心筋梗塞（AMI）イベントを有していなかった対象であることを特徴とする請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
治療の方法であって、該方法は、
（ａ）請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法によって対象における不良な心血管予後のリスクを評価すること；および、
（ｂ）該対象を不良な心血管予後について治療すること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法は、
（ｃ）治療後の期間の後にステップ（ａ）を繰り返すことを更に含み、該バイオマーカーのレベルが減少していないまたは実質的に減少していないことの決定が、追加の治療が必要であることを示すこと
を特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法が、（ｄ）該対象に追加の治療をほどこすことを更に含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願との相互関係】
【０００１】
本出願は、２０１１年９月７日に出願された米国仮出願番号６１／５３２，０１２号の優先権を主張し、これに記載される事項は、その全体が引用により本願に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
いくつかの側面において本発明は、マーカーの組み合わせが冠動脈疾患（CAD）および、狭心症および末梢血管疾患のような関連する疾病の発症（develop）に関する個人のリスクを予測するために（これらを発症する個人の可能性を提供するために）使用される診断および予測テストに関連し、および、さらに特別には、マーカーの組み合わせが心筋梗塞、死亡、および／または脳卒中の個人のリスクを決定するために使用される診断および予測テストに関連する。本方法と組成物は、１）既知の冠動脈疾患でない個人におけるＣＡＤを検出するために、またはＣＡＤを発症するリスクを検出するために、２）既知のＣＡＤを有する個々人における急性の心筋梗塞（ＡＭＩ）または死亡のリスクを検出するために、および、３）既知のＣＡＤでない個々人におけるＡＭＩまたは死亡のリスクを検出するために、いくつかの側面において使用され得る。
【背景技術】
【０００３】
冠動脈疾患およびその結果は、世界中の何百万の人々に影響を与え、これは、米国において、死因の主要なものである。もっとも一般的なＣＡＤの兆候は、心筋虚血を原因とする胸の痛み（狭心症）であり、心臓麻痺（急性心筋梗塞またはＡＭＩ）および突然死を導き得る。ＣＤＣによれば、約１３０万のアメリカ人が、毎年、心臓麻痺を患っている。虚血性心疾患の臨床症状を示す者に加えて、他の多くの人々が、高血圧、高レベルの血清コレステロールおよび／または家族の（疾病の）履歴のような標識に基づく、心臓疾患を発症する高いリスクを有している。しかしながら、ＵＣＬＡによる全国的調査（national study）は、心臓麻痺を患った患者の約７５％が、高いコレステロールを有していなかったことを表す（Am Heart J. 2009 Jan;157(1):111-117.e2. Epub 2008 Oct 22）。心臓麻痺を有するこれらの患者のうちの８８％が、ちょうど前日に、低程度から中程度のリスクを有するとみなされている（BaleDoneen CVD prevention program. www.baledoneen.com）。現存のツールは、心臓のイベントに関する高いリスク有する多くの患者を決定することについては十分でない（remiss）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Am Heart J. 2009 Jan;157(1):111-117.e2. Epub 2008 Oct 22
【非特許文献２】BaleDoneen CVD prevention program.  www.baledoneen.com
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在の診断手段は、例えば、ある予後に関するリスクを有する個々人を特定するのには完全に満足できるものではない。非浸潤性の、敏感な、そして、特にＣＡＤおよびその結果に関するリスクを有する人のための、不良な（adverse）心血管予後（outcomes）の評価および予測に信頼性のあるような診断および予測方法並びにシステムが、冠動脈疾患に必要である。これらの必要性を満たすための実施形態が提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一側面において、本願に記載される発明は、特に、ＣＡＤのリスクを有する個々人および、ＣＡＤおよびＣＡＤの結果を有する個々人についての不良な心血管予後を評価および予測する必要性を満たす。ＣＡＤおよび関連する予後および状態のような不良な心血管予後（およびそれらのリスク）を評価し、検出し、予測し、および予知するための診断および予測方法；これら方法を行うための、例えばキットのようなシステム；及び、例えば、診断または予測方法を使用して評価される個々人の治療の方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、リスクを決定しまたは、１以上のＣＡＤの不良な予後の可能性の増加（ないし、増加した可能性）を評価する。一側面において、提供される方法およびシステムは、１）既知のＣＡＤでない個人において、ＣＡＤを検出するまたはＣＡＤを発症するリスクを検出するため、２）既知のＣＡＤを有する患者（個人）における、心筋梗塞（ＭＩ）、例えば急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、および／または死亡のリスクを検出しおよび予測するため、および、脳卒中のリスクを予測するため、および、３）以前に知られていないＣＡＤを有する患者（個人）における、ＡＭＩおよび／または死亡のリスクを予測し、および／または脳卒中のリスクを予測するための非浸潤的な方法の必要性を満たす。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
いくつかの実施形態において、方法は、（典型的には、この方法により評価される対象から得られるような、例えばテスト生物試料のような試料における複数のバイオマーカーのそれぞれの）バイオマーカーの有無、発現および／またはレベルを検出しまたは測定することにより行われる。
【０００８】
いくつかの実施形態において、方法は、この方法により評価される対象から得られるようなテスト生物試料と、複数のバイオマーカーに特異的に結合する薬剤のパネルを接触させることにより行われ、それにより、複数のバイオマーカーのレベルを測定する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、方法は、対象（例えば、対象由来のテスト試料）における複数のバイオマーカーのそれぞれのレベルと、個別のバイオマーカーのコントロール（ないしは対照、control）レベルを比較することにより行われる。
【００１０】
複数のバイオマーカーは、一般的に、血栓症バイオマーカー、細胞ストレスバイオマーカー、炎症バイオマーカー、および／または自己免疫バイオマーカーの１以上、典型的には、血栓症バイオマーカー、細胞ストレスバイオマーカーもしくは自己免疫バイオマーカー、炎症バイオマーカーの少なくとも２つを含み、およびいくつかの側面においては、血栓症バイオマーカー、細胞ストレスバイオマーカーもしくは自己免疫バイオマーカー、および、炎症バイオマーカーを含み、例えば、血栓症バイオマーカー、細胞ストレスバイオマーカーおよび炎症バイオマーカー、または、血栓症バイオマーカー、自己免疫バイオマーカーおよび炎症バイオマーカーを含む。複数のバイオマーカーは、いくつかのケースにおいて、更に、感染バイオマーカーを含む。２以上、３以上、または４、または全てのタイプのバイオマーカー（炎症性バイオマーカー、感染性バイオマーカー、血栓症バイオマーカー、細胞ストレスバイオマーカー、自己免疫バイオマーカー）のレベルが評価され得る。同一のタイプの２以上のバイオマーカー（例えば、２以上の炎症性バイオマーカー、２以上の感染性バイオマーカー、２以上の血栓症バイオマーカー、２以上の細胞ストレスバイオマーカー、２以上の自己免疫バイオマーカー）のレベルが測定され得る。
【００１１】
いくつかの実施形態において、血栓症バイオマーカーはＦＤＰマーカーであり、ここで、ＦＤＰマーカーは、少なくとも１つのフィブリンおよびフィブリノーゲン分解産物（FDP）を含み、およびいくつかの実施形態においては、少なくとも２つのフィブリンおよびフィブリノーゲン分解産物（FDP）の混合物を含む。したがって、いくつかの実施例において、複数のバイオマーカーは、ＦＤＰマーカーを含み、ここで、ＦＤＰマーカーは、少なくとも１つのフィブリンおよびフィブリノーゲン分解産物の遺伝子産物、または少なくとも２つのフィブリンおよびフィブリノーゲン分解産物の遺伝子産物の混合物（例えば、少なくとも１つのフィブリンおよびフィブリノーゲン分解産物（FDPs）または少なくとも２つのフィブリンおよびフィブリノーゲン分解産物（FDPs）の混合物）を含む。一実施例において、少なくとも１つまたは少なくとも２つのＦＤＰは、フラグメントＤ、フラグメントＥ、およびＤ−ダイマーの中から選択されるＦＤＰを含み、または、フラグメントＤおよびフラグメントＥの中から選択されるＦＤＰを含む。一実施例において、少なくとも１つまたは２つのＦＤＰは、フラグメントＤ、フラグメントＥ、およびＤ−ダイマー、またはフラグメントＤおよびＥを含む。いくつかの実施例において、ＦＤＰは、更に、フラグメントＸ、フラグメントＹ、または１以上の初期プラスミン消化産物（IPDPs）を含む。いくつかのケースにおいて、少なくとも１つまたは２つのＦＤＰは、ＤＲ−７０（登録商標）ＥＬＩＳＡ分析によって検出される１以上、または全てのＦＤＰを含む。他の実施例において、これらは、１以上の、国際出願公開番号ＷＯ２０１０／１１４５１４Ａ１号に記載される、ＦＤＰを含む。他の実施例において、これらは、１以上の、フィブリノーゲンＥＬＩＳＡ分析により検出される、ＦＤＰを含む。
【００１２】
したがって、いくつかの実施形態において、薬剤のパネルは、ＦＤＰマーカーの検出用の１つの薬剤または薬剤（複数）を含む。いくつかの側面において、パネルは、（フラグメントＤ、フラグメントＥ、およびＤ−ダイマーの中から選択され、またはフラグメントＤおよびフラグメントＥから選択される少なくとも２つのＦＤＰのような）少なくとも２つのＦＤＰに特異的に結合することが可能な、一つの薬剤または薬剤（複数）を含む。一つの実施例において、少なくとも１つまたは２つのＦＤＰは、フラグメントＤ、フラグメントＥ、およびＤ−ダイマー、またはフラグメントＤおよびＥを含む。いくつかの実施例において、ＦＤＰは、更に、フラグメントＸ，フラグメントＹ、または、１以上の初期プラスミン消化産物（IPDPs）を含む。いくつかのケースにおいて、少なくとも１つまたは２つのＦＤＰは、ＤＲ−７０（登録商標）ＥＬＩＳＡ分析により検出される、１以上、あるいは全てのＦＤＰを含む。他の実施例において、これらは、国際出願公開番号ＷＯ２０１０／１１４５１４Ａ１号に記載される１以上のＦＤＰを含む。他の実施例において、これらは、フィブリノーゲンＥＬＩＳＡ分析により検出される１以上のＦＤＰを含む。
【００１３】
いくつかのそのような実施例において、複数のバイオマーカーは、更に、少なくとも１つの炎症または自己免疫疾患または細胞ストレスバイオマーカーを含み、または（例えば、炎症および自己免疫疾患バイオマーカーまたは炎症および細胞ストレスバイオマーカーのような）炎症バイオマーカーと、自己免疫疾患のバイオマーカーかまたは細胞ストレスバイオマーカーかの両者の少なくとも１つを含む。したがって、いくつかの側面において、薬剤は、そのようなバイオマーカーに特異的に結合する１つの薬剤または薬剤（複数）を含む。
【００１４】
いくつかの側面において、少なくとも１つの炎症バイオマーカーは、ＣＲＰタンパク質のようなＣ−反応性タンパク質（CRP）遺伝子産物を含む。いくつかの側面において、少なくとも１つの自己免疫疾患または細胞ストレスバイオマーカーは、ＨＳＰ７０タンパク質のような熱ショックタンパク質７０（HSP70）遺伝子産物を含む。したがって、いくつかの側面において、薬剤は、そのようなバイオマーカーに特異的に結合する一つの薬剤または薬剤（複数）を含む。
【００１５】
いくつかの側面において、バイオマーカーは、更に、抗サイトメガロウイルス抗体のような抗サイトメガロウイルス抗体遺伝子産物を含む。いくつかの側面において、バイオマーカーは、更に、例えば抗ＨＳＰ６０タンパク質のような熱ショックタンパク質６０に対する抗体（anti-HSP60）の遺伝子産物を含む。したがって、いくつかの側面において、薬剤は、そのようなバイオマーカーに特異的に結合する一つの薬剤または薬剤（複数）を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーは、熱ショックタンパク質７０（HSP70）、Ｃ−反応性タンパク質（CRP）、およびＦＤＰマーカーを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＣＲＰおよびＦＤＰマーカーのレベルを測定し、ＣＲＰ、ＦＤＰマーカーおよびＨＳＰ７０のレベルを測定し、ＣＲＰ、ＦＤＰマーカーおよび抗ＣＭＶＡｂのレベルを測定し、または、ＣＲＰ、ＦＤＰマーカー、ＨＳＰ７０および抗ＣＭＶＡｂのレベルを測定する。したがって、いくつかの側面において、薬剤は、そのようなバイオマーカーに特異的に結合する一つの薬剤または薬剤（複数）を含む。
【００１７】
複数のバイオマーカーのレベル（例えば、検出されまたは測定されるレベル）または、複数のバイオマーカーの、コントロールレベルのような他のレベルと比較されるレベルは、一般的に、対象における不良な（adverse）心血管予後のリスクを示す。典型的に、レベル（複数）、例えばレベル（複数）はリスクを総合して示す。例えば、バイオマーカー（複数）のレベル（複数）は、不良な心血管予後のリスクの増加（ないし、増加したリスク）（例えば、不良な心血管予後が、健康な個々人、ＣＡＤを有さない個々人、またはそのような予後に関して低いリスクを有する個々人のような対象の所定の集団における予後の平均の可能性と比較して対象においてより起こりそうであること）を総合して示すことができる。
【００１８】
いくつかの側面において、バイオマーカー（複数）の中の一つのみの単独でのレベルの上昇（ないし、上昇したレベル）またはレベルの増加（ないし、増加したレベル）（すなわち、すくなくとも１つの他の上昇しまたは増加したバイオマーカーを有さないこと）は、リスクの増加を示さないだろう。
【００１９】
いくつかの側面において、バイオマーカーの、（例えば、上昇したレベルのような）レベルは、（複数のバイオマーカーのいずれもが上昇しないまたは陽性でないような）他の対象と比較した、対象における、例えば１年間で、少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、８、９、１０以上倍大きい、例えば脳卒中または死亡のような不良な心血管予後のリスクを例えば総合して示す。
【００２０】
いくつかの側面において、一つのバイオマーカー、および典型的に少なくとも２つ（例えば、２、３、４以上）のバイオマーカーが上昇するという結果（ないしは決定、determination）は、対象における不良な心血管予後のリスク、例えば、１２００日以内のような、１年、２年、３年、４年以上のような、所定の期間内のＡＭＩまたは死亡のような不良な予後が発症する（例えば、ちょうど（at）または約（about）または少なくともちょうど（at least at）または少なくとも約（at least about）２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％以上の）リスクを示す。一つの実施例において、少なくとも２つのバイオマーカーが上昇するという結果は、一定期間内の、ちょうどまたは約２０％、２５％、３０％または３５％の不良な予後のリスクを示し；他の実施例において、少なくとも３つのバイオマーカーが上昇するという結果は、一定期間内の、ちょうどまたは約３０％、３５％、４０％、４５％または５０％の不良な予後のリスクを示す。
【００２１】
１つの側面において、対象における、例えばコントロールレベルと比較されるテスト試料における、複数のバイオマーカーのレベルの増加は、対象における不良な心血管予後のリスクを例えば総合して示す。
【００２２】
いくつかの実施形態において、ＦＤＰマーカーのレベルは、試料ミリリッター当たり１マイクログラムよりも大きい場合に、上昇しまたは陽性である；いくつかの実施形態において、ＣＲＰ遺伝子産物のレベルは、試料リッター当たり３ミリグラムよりも大きい場合に、上昇しまたは陽性である；ひとつの実施形態において、ＨＳＰ７０遺伝子産物のレベルは、試料において検出可能である場合に、上昇しまたは陽性である。
【００２３】
本願に記載されるように、ＣＲＰ、ＦＤＰマーカーおよびＨＳＰ７０の測定に基づいた総合スコア（aggregate score）は、個々人におけるＣＡＤを発症する（発症する可能性の）更なるリスクの強力な予測の判断材料（predictor）である。ひとつの実施形態において、総合スコアは、ＣＡＤを有することが知られていない対象（例えば、冠動脈造影法によるような評価が考慮されている患者）における、心筋梗塞（MI）（または、急性ＭＩ（ＡＭＩ）ともいう）および死亡のようなＣＡＤの不良な結果のリスクの強力な予測判断材料である。代わりの実施形態において、総合スコアは、既知のＣＡＤを有する対象（例えば患者）におけるＡＭＩおよび死亡のようなＣＡＤの不良な結果のリスクの強力な予測判断材料である。
【００２４】
したがって、不良な心血管予後は、ＣＡＤ、ＣＡＤの不良な結果、そのようなＡＭＩ、脳卒中または死亡を発症［生じ］させ得る。いくつかのケースにおいて、不良な心血管予後とは、１〜２、２〜３、または１〜３年以内のような 、例えば、１年、２年、３年、４年、５年以上の所定の期間におけるそのような予後の発生である。したがって、いくつかのケースにおいて、方法は、上記の予後のいずれかのものの近い期間のリスク（例えば、予後が２〜３年において生じるだろうリスク）を予測する。
【００２５】
評価される個人由来の生物学的（テスト）試料においてＦＤＰマーカーのレベルが測定される実施形態において、生物試料におけるＦＤＰマーカーのレベルが、（ＣＡＤを有しない個々人におけるＦＤＰマーカーのレベルのような）参照または標準におけるレベルより著しく高い場合には、評価される個体は、ＣＡＤまたはＣＡＤの不良な予後を発症するリスクの増加を有し、またはＣＡＤまたはＣＡＤの不良な予後を発症するより大きな可能性（probability）がある。評価される個体由来の生物試料においてＦＤＰマーカーのレベルおよびＣＲＰのレベルが測定される実施形態において、生物試料におけるＦＤＰマーカーのレベルが、（ＣＡＤを有しない個々人におけるＦＤＰマーカーのレベルのような）参照または標準におけるＦＤＰマーカーレベルより著しく高い場合および、生物試料におけるＣＲＰのレベルが、（ＣＡＤを有しない個々人におけるＣＲＰレベルのような）参照または標準におけるＣＲＰレベルより著しく高い場合には、評価される個体は、ＣＡＤまたはＣＡＤの不良な予後を発症するリスクの増加を有し、またはＣＡＤまたはＣＡＤの不良な予後を発症するより大きな可能性がある。評価される個体由来の生物試料においてＦＤＰマーカーのレベル、ＣＲＰのレベル、およびＨＳＰ７０のレベルが測定される実施形態において、（ａ）生物試料におけるＦＤＰマーカーのレベルが、（ＣＡＤを有しない個々人におけるＦＤＰマーカーのレベルのような）参照または標準におけるＦＤＰレベルより著しく高い場合；（ｂ）生物試料におけるＣＲＰのレベルが、（ＣＡＤを有しない個々人におけるＣＲＰレベルのような）参照または標準におけるＣＲＰレベルより著しく高い場合；および（ｃ）ＨＳＰ７０が、（ＣＡＤを有しない個々人におけるＨＳＰ７０レベルのような）参照または標準におけるＨＳＰ７０レベルより著しく高い場合には、評価される個体は、ＣＡＤまたはＣＡＤの不良な予後を発症するリスクの増加を有し、またはＣＡＤまたはＣＡＤの不良な予後が発症するより大きな可能性がある。
【００２６】
１つの実施形態において、生物試料におけるＦＤＰマーカーのレベルが約１．０μｇ／ｍｌより大きいと決定され；生物試料におけるＣＲＰのレベルが、約３．０ｍｇ／Ｌより大きい、かつ（例えば、生物試料において、ＨＳＰ７０がとても低いレベルで検出されたとしても）ＨＳＰ７０が検出可能である場合には、評価される個体は、ＦＤＰマーカーレベルが約１．０μｇ／ｍｌに満たない；ＣＲＰレベルが３．０ｍｇ／Ｌに満たないそしてＨＳＰ７０が検出されない場合よりもより大きなリスクを有する。
【００２７】
方法は、様々な対象、典型的には患者を評価するために行うことができる。いくつかの実施形態において、対象は、例えばヒトのような哺乳類である。対象は、例えば、（顕著なまたは非顕著なＣＡＤ、安定なＣＡＤのような）ＣＡＤを有することが知られている患者、すなわち、確認されたＣＡＤを有する患者、またはＣＡＤを有することが疑われる患者であり得る。いくつかの側面において、対象は、ＣＡＤを有することが知られている患者、顕著なＣＡＤを有する患者または非顕著なＣＡＤを有する患者である。いくつかのケースにおいて、対象は、ＣＡＤを有することが疑われる患者である。いくつかの側面において、対象は、［ＣＡＤを］示さない者、今まで［ＣＡＤを］示していない者、またはＣＡＤの症状を有さないかまたは他の心血管予後の症状を有す者である。１つの側面において、対象は、最近急性冠症候群（ACS）を患った者である。他の側面において、対象は、既知のＣＡＤを有するまたは有しない患者であり又は、ＣＡＤの症状を有するまたは有しない患者であるが、高冠動脈カルシウムスコアを有すると見出された者であり、またはＦＲＳ、冠動脈カルシウムテスト、または、対象が中程度または高いリスクを有することを示す第二の血液テストでテストされたばかりの者である。他の側面において、対象は、直近の（the last）３０日間にＡＭＩイベント（event）を有していない、顕著なＣＡＤを有する患者である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、方法は、更に、テスト生物試料において測定される複数のバイオマーカーの１つ以上、典型的にはそれぞれのレベルを、個々のバイオマーカーのコントロールレベルと比較することを含む。１つの側面において、比較は、コントロール試料における複数のバイオマーカーの１つ以上、例えばそれぞれの、レベルを測定することを含む。典型的に、そのように測定されるコントロールレベルは、次に、テスト生物試料において測定されるレベルと比較される。あるいは、方法は、以前に決定されるか、または予め定義されたコントロールレベルをテスト生物試料において測定されたレベルと単純に比較することを含むことができる。例えば、各バイオマーカーのコントロールレベルは、複数のコントロール対象由来のコントロール生物試料におけるバイオマーカーのレベルを含んでいるデータなどのデータから計算することができる。多くの場合、コントロール対象および評価対象は、同種である。一つの実施例において、テスト生物試料およびコントロール試料はプラズマまたは血清を含む。一つの側面において、テスト生物試料におけるレベルがコントロールレベルよりも高い場合に、対象における不良な心血管予後のリスクは増加する。
【００２９】
いくつかの実施例において、少なくとも２つのバイオマーカーのレベルが、その個々のコントロールレベルと著しく異なる（または、より高い）場合は、対象（例えば哺乳類）は、ＣＡＤまたは心筋梗塞または死亡の可能性が増加すると評価されるかまたは特定される。
【００３０】
試料（例えば、テスト生物試料およびコントロール試料）は、任意の生物試料であり得る。典型的には、試料は、対象から得られる体液または組織である。方法で使用するための試料のタイプは、全血、血液分画、血液成分、プラズマ、血小板、血清、脳脊髄液（CSF）、骨髄、尿、涙、乳、リンパ液、臓器組織、神経系組織、非神経系組織、筋組織、生検（biopsy）、剖検（necropsy）、脂肪生検、脂肪組織、細胞、糞便、胎盤、脾臓組織、リンパ組織、膵臓組織、気管支肺胞洗浄（BAL）、および滑液である。いくつかの実施形態において、テスト生物試料および／またはコントロール試料は、全血、血液分画、血液成分、プラズマ、血小板、血清、または尿である。
【００３１】
バイオマーカーレベルの検出または測定は、多くの既知の方法の任意のものを使用して行うことができる。１つの側面において、測定または検出は、ＥＬＩＳＡによるような、例えば、評価される生物試料またはそれら由来の試料と、個々の相手と抗体の結合が生じるような条件で複数のバイオマーカーに特異的に結合する抗体を合わせることによる免疫学的検定によって行われる。１つの側面において、ＦＤＰマーカー（例えば、ＦＤＰ（複数）の混合物）のレベルは、ＤＲ７０（登録商標）分析を使用して測定される。他の実施例において、これらは、抗フィブリノーゲンポリクローナル抗体または、多重の（multiple）モノクローナル抗体のいずれかを使用するフィブリノーゲンＥＬＩＳＡ分析によって検出される１以上のＦＤＰを含む。他の側面において、ＣＲＰ遺伝子産物（例えば、ＣＲＰタンパク質）は、高感度ＣＲＰ（hs-CRP）分析を使用して測定される。
【００３２】
また、例えば、上記の方法により評価される対象の治療の方法も提供される。いくつかの実施形態において、方法は、不良な心血管予後のリスクを評価するまたは決定すること、または、上記の方法の任意のものにより対象における複数のバイオマーカーのレベルを検出することおよび例えば不良な心血管予後に関して対象の治療を処置し、変更しまたは修正しまたは、対象の治療を停止することにより行われる。いくつかのケースにおいて、方法は、リスクを決定する前に、心血管イベントまたは予後に関して対象を最初に処置するステップを更に含む。
【００３３】
いくつかの側面において、そのような方法は、繰り返す仕方で行われる。例えば、いくつかのケースにおいて、方法は、治療後のある一定の期間、例えば、治療後の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ月以上の期間、例えば、リスクおよび／または疾患が治療により好ましく変化しているかどうかを決定するため、および／または追加の（例えば、より積極的な）治療が必要であるかどうかを決定するために、治療後に評価または決定ステップを繰り返すことを更に含む。例えば、バイオマーカーレベルが減少していないまたは実質的に減少していないというそのような繰り返しの後の決定は、リスクが好ましく変化していないこと、および／または追加の（例えば、より積極的な）治療が必要であることを示すことができる。したがって、いくつかの側面において方法は、次に追加の治療を対象にほどこすことを更に含む。いくつかの側面において、治療方法は、対象が、例えば上記方法により不良な心血管予後を有するリスクの増加（可能性の増加）を有するかどうかを決定すること、および、対象が不良な心血管予後を有する可能性の増加を有する場合に特別な治療コースを選択することを含む。
【００３４】
上記のような任意の組み合わせで、バイオマーカーに特異的に結合するまたはハイブリダイズする１以上の薬剤、典型的には複数のバイオマーカーのそれぞれに特異的に結合またはハイブリダイズする薬剤を含むキットのような診断方法を行うためのシステム（例えば、キット）も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、実施例２Ａに記載の研究における患者に関するバイオマーカーによるベースラインデモグラフィックス（baseline demographics）の概要を表す。
【００３６】
【図２】図２は、実施例２Ａに記載されるような顕著（重症）なＣＡＤを有する患者における１、２、または３つの上昇したバイオマーカーの存在を使用した死亡またはＭＩ（心筋梗塞）の将来リスクに関するリスクスコア（ハザード比、ＨＲ）を表す（ここで、ＦＤＰマーカーは、１．０μｇ／ｍｌよりも大きい場合に上昇したとみなされ；ＣＲＰのレベルは、約３．０ｍｇ／Ｌよりも大きい場合に上昇したとみなされ、および、ＨＳＰ７０は検出可能な場合に上昇したとみなされた）。括弧の前に表示される番号は、ＨＲの中央値を表し；括弧の中の番号は、信頼区間を表す。
【００３７】
【図３】図３は、実施例２Ａに記載されるような非顕著（非重症）なＣＡＤを有する患者における１、２、または３つの上昇したバイオマーカーの存在を使用した死亡またはＭＩの将来リスクに関するリスクスコア（ハザード比、ＨＲ）を表す（ここで、ＦＤＰマーカーは、１．０μｇ／ｍｌよりも大きい場合に上昇したとみなされ；ＣＲＰのレベルは、約３．０ｍｇ／Ｌよりも大きい場合に上昇したとみなされおよび、ＨＳＰ７０は検出可能な場合に上昇したとみなされた）。括弧の前に表示される番号は、ＨＲの中央値を表し；括弧の中の番号は、信頼区間を表す。
【００３８】
【図４】図４は、次の群における、顕著なＣＡＤを有する患者（パネルＡ）、および非顕著なＣＡＤを有する患者（パネルＢ）に関する一年間イベント率（１年以内にイベント（ＡＭＩまたは死亡のいずれか）を有する患者の所定の群におけるパーセンテージ）を表す：実施例２Ａに定められているように、０のバイオマーカーが上昇した［群］、１つのバイオマーカーが上昇した［群］、２つのバイオマーカーが上昇した［群］、および３つのバイオマーカーが上昇した［群］（ここで、ＦＤＰマーカーは、１．０μｇ／ｍｌよりも大きい場合に上昇したとみなされ；ＣＲＰのレベルは、約３．０ｍｇ／Ｌよりも大きい場合に上昇したとみなされおよび、ＨＳＰ７０は検出可能な場合に上昇したとみなされた）。Ｙ軸は、１年以内にイベントを有する患者群のパーセンテージを表す。各グラフにおいて、４つの棒は、左から右に、（１）０の上昇したバイオマーカーを有する患者（患者の４０％）、（２）１つの上昇したバイオマーカーを有する患者（患者の４０％）、（３）２つの上昇したバイオマーカーを有する患者（患者の１５％）、および（４）３つの上昇したバイオマーカーを有する患者（患者の５％）を表す。
【００３９】
【図５】図５は、実施例２Ａに記載の、上昇したとみなされたバイオマーカーの数にしたがって群分けされた、実施例２Ａおよび２Ｂに記載された研究における、顕著な冠動脈疾患を有する参加者（図５Ａ）および非顕著な冠動脈疾患を有する参加者（図５Ｂ）のイベントフリー生存曲線を表す。
【００４０】
［発明の詳細な説明］
［既知の］利用できるＣＡＤ診断および予測方法は、例えば、急性心筋梗塞（AMI）または死亡のリスクを有する個々人の大部分を特定することにおいて完全に効果的ではなかった。心臓のマーカーは、心血管疾患の早期検出およびモニタリングにおいて重要な役割を果たす。疾病のマーカーは、典型的に、簡単に測定できる身体試料において見出される物質である。測定される量は、根本的な疾病病態生理、進行中のまたは差し迫った心臓イベントの有無、または将来の心臓イベントの可能性と関連付けることができる。現存のマーカーは、他の測定またはリスク因子と組み合わせても、ＣＡＤおよびその不良な結果のリスクを有する患者を的確に特定しない。
【００４１】
[発明の効果]
本願発明は、炎症、血栓症疾患、細胞ストレス、および自己免疫疾患（そして特に、炎症、血栓症、および細胞ストレス）およびに任意に感染に関連するバイオマーカーの組み合わせのレベルが測定でき、および集合において（総合して、in the aggregate）、レベルが、ヒトにおける不良な心臓イベントのリスクを評価するのに使用されることができるという発見にある程度関連する。炎症、細胞ストレス、感染、および血栓症および自己免疫疾患は、個々の経路を介して、ＣＡＤおよびその不良な結果、特に、プラーク破綻（急性心筋梗塞（AMI）としても知られる）または死亡に関するリスクの総合の負担（aggregate burden）に寄与することができる。炎症性、細胞ストレス、感染性、血栓症、および免疫経路を含む種々の病態生理学的過程の活性化は、ＣＡＤ、それに続くプラーク破綻および不良な予後の発症の一因となる。いくつかの実施形態において、ＣＲＰ遺伝子産物およびＦＤＰマーカー（２以上のＦＤＰを含む）のようなバイオマーカーの測定を含む方法を提供し、いくつかのケースにおいて、［これは］ＨＳＰ７０および／またはＣＭＶと組み合わせて、対象における不良な心臓予後のリスク評価を行う。そのような方法は、例えば、既知のＣＡＤを示し、プラーク破綻のような顕著な不良な心血管予後を経験する可能性（確率）が上昇している対象を特定するのに役立つ。分析はまた、ＣＡＤの事前の診断結果を有していない対象、ＣＡＤを有しているが、狭窄が血行動態として顕著（重症）であるとみなされない対象、および／または不良な心臓予後のリスクの増加を有する対象を特定するのにも役立つ（個々人を特定するのに役立つ）。
［定義］
【００４２】
提供される実施形態の理解を助けるために、本出願で使用される選択された用語が以下に論じられる。
【００４３】
アテローム動脈硬化［症］から生じる、用語「不良な心血管予後」は、冠動脈疾患（CAD）、虚血性心疾患（IHD）、狭心症、ＡＭＩ、死亡、脳卒中および末梢血管疾患を意味する。
【００４４】
用語「冠動脈疾患」は、冠状動脈のアテローム性動脈硬化症を意味するが、また、足および脳にあるような末梢動脈のアテローム性動脈硬化症の可能性を推測し、および、（心筋梗塞および死亡、狭心症、脳卒中および末梢血疾患のような）ＣＡＤの結果を含む。
【００４５】
用語「バイオマーカー」とは、代表的な、生物学のまたは生物学的に由来する、過程、イベント、または状態の指標を意味する。本願で使用されるようなバイオマーカーは、タンパク質を含む遺伝子産物、核酸および代謝物、それと共に、それらの多型、変異体（mutations）、バリアント（variants）、修飾物（modifications）、サブユニット、フラグメント、タンパク質−リガンド複合体、および分解産物、タンパク質−リガンド複合体、エレメント、関係する代謝物、および他の検体（analytes）または生物学的状態に関連する試料由来の測定物（sample-derived measures）を制限なしに包含する。バイオマーカーは、また、変異タンパク質または変異核酸をも含むことができる。バイオマーカーは、好ましくは、炎症性、感染、血栓症のまたは自己免疫バイオマーカーを含む。
【００４６】
本願で用いられる用語「炎症バイオマーカー」または「炎症のバイオマーカー」は、炎症の指標であるバイオマーカーを意味する。例示的な炎症バイオマーカーは、Ｃ−反応性タンパク質（CRP）、インターロイキン（IL）−６、および血清アミロイドＡタンパク質、ホモシステインを含む。
【００４７】
本願で用いられる用語「感染のバイオマーカー」または「感染バイオマーカー」は、感染症の指標であるバイオマーカーを意味する。潜在的な感染バイオマーカー（感染のバイオマーカー）のリストは、感染症バイオマーカーデータベース（IDBD、http://biomarker.cdc.go.kr および http://biomarker.korea.ac.kr）にて見出すことができる。例示的な感染バイオマーカーは、ＣＲＰ、抗サイトメガロウイルス（CMV）抗体、クラミジアニューモニア（Chlamydia pneumonia）、単純ヘルペスウイルス（HSV）１型および２型、ヘリコバクターピロリ、およびＡ型肝炎ウイルス、並びに、歯周病原菌（periodontal pathogens）の遺伝子産物（タンパク質を含む）を含む。
【００４８】
本願で用いられる「自己免疫疾患バイオマーカー」または「自己免疫疾患のバイオマーカー」は、自己免疫疾患の指標であるバイオマーカーを意味する。遺伝子産物（例えば、タンパク質）の３つの群は、自己免疫疾患過程を反映する：（１）影響を受けた組織の破壊から生じた分解産物、（２）組織分解において役割を果たす酵素および（３）免疫活性と関連するサイトカインおよび他のタンパク質（Prince, H.E., Biomarkers, 2005, Nov. 10, Suppl 1: S44-49）。例示的な自己免疫疾患バイオマーカーは、熱ショックタンパク質６０に対する抗体（anti-HSP60）、熱ショックタンパク質７０（HSP70）、アグレカン（aggrecan）フラグメント、ＩＩ型コラーゲンのＣ−プロペプチドおよび軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質（cartilage oligomeric matrix protein）、マトリクスメタロプロテアーゼ（MMP）−１、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−１／阻害剤複合体チオレドキシン（MMP-1/inhibitor complexes thioredoxin）、ＩＬ−１６および腫瘍壊死因子（TNF）−アルファ、ニューロフィラメント光タンパク質（neurofilament light protein）およびグリア細胞繊維性酸性タンパク質（glial fibrillary acidic protein）、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９およびＴＮＦ−アルファおよび可溶性血管接着分子−１の遺伝子産物（タンパク質を含む）を含む。
【００４９】
本願で用いられる「細胞ストレスバイオマーカー」または「細胞ストレスのバイオマーカー」は、バイオマーカーを意味し、細胞がストレスに曝される場合にこのバイオマーカーのレベルは増加する。例示的な細胞ストレスバイオマーカーは、熱ショックタンパク質（HSP）７０（HSP70）、および、ＨＳＰ３２、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７２、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ４７のようなある特定の他のＨＳＰ、並びに、ユビキチン、およびＨｓｃ７０、および、Rajdev and Sharp, Toxicologic Pathology, 28(1) 105-112 (2000); Zhou ら、 Circulation, 110: 207-213 (2004)で議論される細胞ストレスバイオマーカーを含む。
【００５０】
本願で用いられる用語「血栓症のバイオマーカー」または「血栓症バイオマーカー」は、血栓症の指標であるバイオマーカーを意味する。いくつかの実施例は、フィブリノーゲン、プロトロンビン１．２、組織プラスミノーゲンアクチベーター抗原（tPA）、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−１（PAI-1）、および、少なくとも２つのフィブリンおよびフィブリノーゲン分解産物（FDPs）（例えば、２以上のフラグメントＸ，Ｙ，Ｄ，Ｄ−ダイマー、およびＥフラグメントＹ、および初期プラスミン消化産物（IPDP））の混合物を含むＦＤＰマーカーのようなＦＤＰマーカーを含む。
【００５１】
本願で用いられるように、用語「フィブリン分解産物（１または複数）」、「フィブリンおよびフィブリノーゲン分解産物（１または複数）」および「ＦＤＰ」は、フィブリンまたはフィブリノーゲンのいずれかが分解されるときに生じる１以上のフラグメントを意味する。ＦＤＰは、様々なコンビネーション（combinations）で遊離するＸ，Ｙ，Ｄ，およびＥフラグメント（フラグメントＸ、フラグメントＹ、フラグメントＤ、およびフラグメントＥ）と称される４つの主要なＦＤＰを含む。プラスミンによるフィブリノーゲンの開裂は、主要最終産物（primary end-products）として、フラグメントＤおよびＥを生じる。トロンビンは、フィブリノーゲンをフィブリンに変換する。フィブリン塊（fibrin clot）がプラスミンにより壊されるときに、分解される最終のフラグメント（２つのＤサブユニットおよび１つのＥサブユニットを含む）は分裂し、Ｅフラグメントおよび、お互いに結合する２つのＤフラグメント（「Ｄ−ダイマー」と称される）を放出する。このＤ−ダイマーは、フィブリンから生じ、フィブリノーゲン分解により生じるものではない。その結果、ＦＤＰバイオマーカーは、１以上のＸ、Ｄ、およびＥフラグメントの存在を含み得る。一つの実施例において、ＦＤＰバイオマーカーは、フラグメントＹを含み；一つの実施例においては、これは、初期プラスミン消化産物（IPDP）の１または２の区別できる形態を含む。いくつかの実施形態において、提供される方法およびシステムは、ＦＤＰマーカーのレベルを検出する；一側面において、このＦＤＰマーカーは、少なくとも２つの（フラグメントＤ、Ｅ、およびＤダイマーのような）ＦＤＰの混合物を含み、およびいくつかの側面において、更に１以上のフラグメントＸ、Ｙ、およびＩＰＤＰを含む。一つの実施例において、ＦＤＰマーカーは、ＤＲ−７０（登録商標）ＥＬＩＳＡ分析により検出される、１以上、または全てのＦＤＰを含む。他の実施例において、ＦＤＰは、国際出願公開番号ＷＯ２０１０／１１４５１４Ａ１号に記載される１以上のＦＤＰを含む。他の実施例において、これらは、抗フィブリノーゲンポリクローナル抗体または多重の（multiple）モノクローナル抗体のいずれかを使用したフィブリノーゲンＥＬＩＳＡ分析によって検出される１以上のＦＤＰを含む。
【００５２】
「Ｃ−反応性タンパク質」はまた、「ｈｓＣＲＰ」または「ＣＲＰ」としても知られ、炎症性反応の反応物プラズマタンパク質コンポーネント（reactant plasma protein component）のマーカーである。ＣＲＰは、炎症状態への非特異的急性期反応（non-specific acute phase response）の一部として肝細胞により生じるタンパク質である。これは、広い範囲の感染症の診断および観察に使用される。
【００５３】
「熱ショックタンパク質７０」はまた、「ＨＳＰ７０」、「ＨＳＰ７３」、「ＨＳＰＡ８」としても知られている。他のファミリーのメンバーは、ＨＳＰ７０−１、ＨＳＰ７０−２、ＨＳＰ７０−４、ＨＳＰ７０−４Ｌ、ＨＳＰ７０−５、ＨＳＰ７０−６、ＨＳＰ７０−７、ＨＳＰ７０−８、ＨＳＰ７０−９、ＨＳＰ７０−１２ａ、ＨＳＰ７０−１４を含む。レベルの増加は、細胞がストレスにさらされる状態の間に見出される。したがって、ＨＳＰ７０は、細胞ストレスバイオマーカーの１つである。
【００５４】
「サイトメガロウイルス」、「ＣＭＶ」は、ウイルスのヘルペスファミリーの一種である。他のファミリーメンバーは、単純ヘルペスウイルス１型（HSV-1またはHHV-1）および単純ヘルペスウイルス２型（HSV-2またはHHV-2）、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）−６、ＨＨＶ−７、およびＨＨＶ−８を含む。ＣＭＶを検出するためのバイオマーカーは、ＣＭＶ抗体（CMV-Ab）を含む。
【００５５】
用語「哺乳類」または「対象」は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ネコ、イヌ、ブタのような生物を意味し、より好ましくは、サルおよび類人猿であり、そしてもっとも好ましくはヒトである。いくつかの実施形態において、対象はヒトであり、そして使用されるテストまたは生物試料（テスト試料またはコントロール試料であり得る）は体液または体組織である。
【００５６】
本願で用いられる用語「体液」は、循環する液体および非循環の液体を含む。循環する液体の例としては、血液、ＣＳＦ、およびリンパ液を含む。非循環の液体の例としては、滑液を含む。
【００５７】
体液は、全血、血液分画、血液成分、プラズマ、血小板、リンパ液、唾液、血清、胃液、胆汁、脳脊髄液（CSF）、骨髄、涙、乳、臓器組織、神経系組織、非神経系組織、筋組織、生検（biopsy）、剖検（necropsy）、脂肪生検、脂肪組織、細胞、糞便、胎盤、脾臓組織、リンパ組織、膵臓組織、気管支肺胞洗浄（BAL）、滑液および尿からなる群から選択される。ほとんどの場合の体液は、血液である。
【００５８】
生物試料におけるバイオマーカーは、クロマトグラフィー、免疫分析、酵素学的分析、および分光法からなる群より選択される方法を限定されずに含む様々な方法により測定され得る；バイオマーカーは、直接的にまたは間接的に検出され得る。
【００５９】
「マーカーレベル」は、試料におけるマーカーの量を意味し、そして、濃度、質量、モル、体積、濃度、または試料に存在するマーカーの量を示す他の尺度（measure）のユニットを意味する。
【００６０】
使用されるクロマトグラフの方法は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）またはガスクロマトグラフィー（GC）であり得る。使用される分光法は、例えば、紫外分光法（UV またはUV/Vis 分光法）、赤外分光法（IR）、または核磁気共鳴分光法（NMR）であり得る。
【００６１】
免疫分析は、ＣＲＰ、ＦＤＰ、ＨＳＰ７０および抗ＣＭＶＡｂからなる群より選択される（少なくとも１つの；一つ以上の）生物学的マーカーを好ましくは検出する。好ましくは、免疫分析は、抗マーカー抗体または他の免疫学的に活性な分子を使用して、テスト試料におけるバイオマーカーを検出する。免疫分析は、酵素結合免疫吸着分析（enzyme-linked immunosorbant assay）（ELISA）であり得る。ＦＤＰは、ＤＲ７０（登録商標）と称されるＥＬＩＳＡを使用して測定され得る。ＦＤＰはまた、抗フィブリノーゲンポリクローナル抗体または多重の（multiple）モノクローナル抗体のいずれかを使用するフィブリノーゲンＥＬＩＳＡによって測定され得る。
【００６２】
用語「バイオマーカーのコントロールレベル」は、正常な対象の母集団におけるバイオマーカーのレベルを意味する。評価を受ける対象およびコントロール対象は、同一の種である（例えば、ヒト対象は評価される対象であり、およびコントロール対象もまたヒトである）。
【００６３】
本願で用いられるように、「顕著（重症）な」冠動脈疾患（CAD）は、血管造影法により決定されるような、５０％以上（５０％≦）の冠動脈狭窄を伴う１以上の病変部（lesion）を有するＣＡＤを意味する。したがって、「非顕著（非重症）な（insignificant）」または「顕著（重症）でない（non-significant）」ＣＡＤは、血管造影法により決定されるような、５０％以上（５０％≦）の冠動脈狭窄を伴わない（即ち、５０％未満（５０％＞）の冠動脈狭窄のみである）ＣＡＤを意味する。
［実施形態］
【００６４】
対象（例えば、ヒト）における不良な心血管予後のリスクを決定するための診断、予知（prognostic）、および予測（predictive）方法及びシステム（例えば、キット）が提供される。一つの実施形態において、方法およびシステムは、哺乳類における既知の疾病がない状況において、冠動脈疾患（CAD）または関連する疾病、またはＣＡＤまたは関連する疾病を発症するリスクを検出し、または予測する。他の実施形態において、方法およびシステムは、（ＡＭＩの可能性の増加を評価するための方法のような）方法を行った後の１年のような所定の期間内における、心筋梗塞（MI）（例えば急性ＭＩ（AMI））または死亡のようなＣＡＤの不良な結果を検出または予測する。したがって、方法は、ＣＡＤ（例えば、顕著なまたは非顕著なＣＡＤ）を有することが知られているまたは、ＣＡＤを有する疑いのある対象、ＣＡＤの如何なる症状も示さない対象、安定的なＣＡＤを有する対象、または例えば３０日以内のような最近の期間内で、ＭＩのイベントを有していない対象を含む最近急性冠症候群（ACS）を有している対象において行われてもよい。いくつかの側面において、方法は、既知のＣＡＤを示し、例えばプラーク破綻（plaque rupture）のような顕著な不良な心血管予後を経験する可能性が上昇している対象を特定するのに役立つ。この分析はまた以前ＣＡＤの診断結果を有していない一般的な集団から、不良な心臓予後（adverse cardiac outcome）のリスクの増加を有する対象を特定する役割を有し、または、哺乳類における心筋梗塞、死亡、または脳卒中のリスク（可能性、確率）の増加を評価するための役割を有する。
【００６５】
方法は、対象における（通常、対象から得られるテスト生物試料における）複数のバイオマーカーの有無、またはレベルを検出することまたは測定することを通常含む。いくつかの側面において、複数のバイオマーカーのレベルは、対象における、上記のような不良な心血管予後のリスクを、例えば総合して示す。
【００６６】
一側面において、方法は、この方法における使用のための生物試料を提供するまたは得るステップを含む。試料は、例えば細胞、組織、または体液からの任意の生物試料タイプであり得、そして、通常は、全血、血液分画、血液成分、プラズマ、血小板、または血清のような血液由来の試料である。他の例示の試料タイプは、脳脊髄液（CSF）、骨髄、尿、涙、乳、リンパ液、臓器組織、神経系組織、非神経系組織、筋組織、生検（biopsy）、剖検（necropsy）、脂肪生検、脂肪組織、細胞、糞便、胎盤、脾臓組織、リンパ組織、膵臓組織、気管支肺胞洗浄（BAL）、および滑液を含む。
【００６７】
複数のバイオマーカーは、少なくとも２つのバイオマーカーを含み、かつ通常、１以上の血栓症バイオマーカーを含み、通常ＦＤＰマーカーを含む。上記のように、ＦＤＰマーカーは典型的には、例えばフラグメントＤ、Ｅ、およびＤ−ダイマーのような、少なくとも２つのＦＤＰの混合物であり、およびいくつかの側面においては、更に、１以上のフラグメントＸ、Ｙ、及びＩＰＤＰ、ＤＲ−７０（登録商標）ＥＬＩＳＡ分析によって検出される１以上、または全てのＦＤＰ、または国際出願公開番号ＷＯ２０１０／１１４５１４Ａ１号に記載されるようなＦＤＰを含む。他の例において、ＦＤＰは、抗フィブリノーゲンポリクローナル抗体または多重のモノクローナル抗体を使用するフィブリノーゲンＥＬＩＳＡにより測定され得る。バイオマーカーのパネル（組み合せ）は、通常また、少なくとも１つの炎症性（炎症）バイオマーカー、少なくとも１つの自己免疫疾患または細胞ストレスバイオマーカー、およびいくつかのケースにおいては、感染バイオマーカー、またはそれらの組み合わせを含む。例示の炎症バイオマーカーは、ＣＲＰタンパク質のようなＣ−反応性タンパク質（CRP）遺伝子産物を含む。例示の細胞ストレスバイオマーカーはＨＳＰ７０タンパク質のような熱ショックタンパク質７０（HSP70）遺伝子産物を含む。いくつかの実施形態において、パネルは、血栓症バイオマーカー、炎症バイオマーカー、および自己免疫疾患もしくは細胞ストレスバイオマーカー、およびいくつかの場合において、血栓症バイオマーカー、炎症バイオマーカー、および細胞ストレスマーカーを含み；いくつかの側面において、これは更に、感染バイオマーカーを含む。
【００６８】
したがって、特別の実施形態において、方法は、対象における不良な心臓予後のリスク評価を決定するためにバイオマーカー、ＣＲＰおよびＦＤＰマーカーを測定すること；ＣＲＰ、ＦＤＰマーカーおよびＨＳＰ７０を測定すること；ＣＲＰ、ＦＤＰマーカー、および抗ＣＭＶＡｂを［測定すること］、またはＣＲＰ、ＦＤＰマーカー、ＨＳＰ７０および抗ＣＭＶＡｂを測定することを含む。
【００６９】
一つの側面において、方法は、哺乳類由来の試料（テスト生物試料と称される）における少なくとも２つのバイオマーカー（HSP70、CRP、 FDPおよび／または抗CMVAb）のレベルを測定するステップ；（ｂ）テスト試料において測定されるバイオマーカーのレベルを各［バイオマーカーの］コントロールレベルと比較する［ステップ］；および（ｃ）２以上のバイオマーカーのレベルが、そのそれぞれのコントロールバイオマーカーレベルと有意に（significantly）異なっているかどうかを決定するステップを含む。このとき、２以上の各バイオマーカーのレベルが、各個のコントロールレベルより有意に大きい場合には、個体はリスクの増加（ないしは、増加したリスク）を有する。
【００７０】
一つの実施形態において、方法は、ＣＲＰおよびＦＤＰマーカーのレベルを測定する。他の実施形態において、方法は、ＣＲＰ、ＦＤＰマーカーおよびＨＳＰ７０のレベルを測定する。代わりの実施形態において、方法は、ＣＲＰ、ＦＤＰマーカーおよび抗ＣＭＶＡｂのレベルを測定する。代わりの実施形態において、方法は、ＣＲＰ、ＦＤＰマーカー、ＨＳＰ７０および抗ＣＭＶＡｂのレベルを測定する。
【００７１】
他の実施形態において、方法は以下のステップにより、ＨＳＰ７０、Ｃ反応性タンパク質（CRP）、ＦＤＰマーカー、および、サイトメガロウイルス（CMV）抗体のレベルを測定する：即ち、体液を提供する（provide）こと；ＨＳＰ７０、Ｃ−反応性タンパク質（CRP）、ＦＤＰマーカー、および／または抗サイトメガロウイルス抗体への薬剤の結合が可能である状況下で、ホモジネート（homogenate）をバイオマーカー特異的結合薬剤に接触させ、もしあるならば、複合体（complex）を形成すること；および、前記対象の生体試料において、もしあれば、ＨＳＰ７０、ＣＲＰおよびＦＤＰマーカーおよび抗サイトメガロウイルス抗体をその免疫学的分析により検出すること。
【００７２】
いくつかの実施例において、レベルがコントロールレベルより高い、または著しく高い、または特有の程度で高い（例えば、レベルがそのようでない状況と比較して上昇しているとみなされる）場合に、所定の不良な予後のリスクは、例えば２、３、４、５、６以上倍に増加しているとみなされる。１つの実施例において、ミリリッター当たり１マイクログラムより大きい場合に、ＦＤＰマーカーは上昇する［とみなされる］。１つの実施例において、試料リッター当たり３ミリグラムより大きい場合に、ＣＲＰ遺伝子産物は上昇する［とみなされる］。１つの実施例において、検出された場合に、ＨＳＰ７０遺伝子産物は上昇する［とみなされる］。
【００７３】
いくつかの側面において、方法は、体組織または他の生物試料のホモジネートを提供することおよび、薬剤のバイオマーカーへの結合が可能である状況下で、ホモジネートまたは試料をバイオマーカー特異的結合剤と接触させ、もしあるならば、複合体を形成することを含む。いくつかの側面において、［方法は、］バイオマーカーの免疫分析によって、もしあるならば、生物試料におけるバイオマーカーを検出することを含む。この実施形態において、薬剤は、１つのバイオマーカーと結合するものであり得、または、それぞれが、異なったバイオマーカーと結合する、または二つ以上のバイオマーカーと結合することができる多重（多反応性）薬剤（multi-reagent）であり得る。したがって、バイオマーカーのレベルは、免疫分析によって測定され得る。好ましくは、免疫分析は、抗マーカー抗体を使用して、テスト試料におけるバイオマーカーを検出する。免疫分析は、好ましくは、酵素結合免疫吸着分析（ELISA）であり得る。一つの実施形態において、ＦＤＰマーカー用のＥＬＩＳＡはＤＲ７０（登録商標）である。ＤＲ７０（登録商標）は、結腸直腸癌を観察するためにＵＳＦＤＡによってクリアされた、診断に用いる癌テストである。ＤＲ７０（登録商標）は、一つの経路または一つの経路産物を測定するのみの他のＦＤＰ分析とは異なる、多重の経路から生じるＦＤＰマーカーレベルを測定する。他の実施例において、ＦＤＰ産物は、ポリクローナル抗フィブリノーゲン抗体または多重モノクローナル抗フィブリノーゲン抗体のいずれかを含むフィブリノーゲンＥＬＩＳＡによるような、ポリクローナル抗フィブリノーゲン抗体および／またはモノクローナル抗フィブリノーゲン抗体、典型的には、多重モノクローナル抗体を使用して測定され得る。
【００７４】
いくつかの実施形態において、ＣＲＰバイオマーカー（例えば、ＣＲＰタンパク質）は、Ｒｏｂｅｒｔｓら，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４６：４，  ４６１−６８  （２０００）に記載される分析、Ｓｈｉｎｅ  Ｂら，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ，Ａｃｔａ  １９８１；１１７：１３−２３に記載される分析のような高感度ＣＲＰ（hs-CRP）分析、Ｄａｄｅ−Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｃ．から市販されているＢＮＩＩ自動化システム、および／またはｒａｔｅ  ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｙ（Behring NA latex CRP; Behring, Germany）および／またはＧｅｎＷａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，Ｉｎｃ．，カタログ番号４０−０５２−１１５０４２により利用できるテストを使用して測定される。
【００７５】
いくつかの実施形態において、少なくとも２つのバイオマーカーのレベルは、そのようなバイオマーカーのコントロールレベル（例えば、それらの個々の所定の値（コントロール値）のレベル）と比較される。好まれる実施形態において、所定の値は、正常な心臓の状態を示す。
【００７６】
この所定の値は、既知の方法または本願に記載された方法を使用して決定され得、および、特定の患者に対して特別のものであり得または所定の集団に関して包括的な（generic）ものであり得る。１つの実施形態において、コントロールバイオマーカーレベル（バイオマーカーに関するコントロールレベル）は、健康的な対象（２０％＞［２０％未満］冠動脈狭窄を有する対象のようなＣＡＤを有さない対象）の集団におけるバイオマーカー（すなわち、ＦＤＰマーカー、ＣＲＰ、ＨＳＰ７０、抗ＣＭＶＡｂ）に関するレベル（またはレベルの範囲）である。
【００７７】
所定の（コントロール）値は、（生物試料（これはまたテスト試料と称される）から得られる）評価される対象とおよそ同じ年齢のヒトから、好ましくは得られる。性別、民族（ethnicity）、喫煙歴、体重／他の状態（例えば、糖尿病および心血管リスク因子）のような追加の特徴はまた、考慮に入れられる。ある実施形態において、所定の値は、例えば前歴が無く患者が心臓の症状（例えば胸の痛み）を有した時のような特定の患者のマーカーレベル、および／または確認されたＣＡＤを有する患者におけるマーカーレベルの前もっての測定により構築されていてもよい。
【００７８】
更なる実施形態において、方法は、対象を治療する方法であり、対象が不良な心血管予後を有するという増加した可能性を有しているかどうかを決定すること、および、対象が、不良な心血管予後を有するという増加した可能性を有している場合に特定の治療コースを選択することを含む。不良な心血管予後の可能性の増加の予測は、ＣＡＤの症状を示す対象、またはそれを示さない対象においてなされ得る。
【００７９】
また、上記のような任意の組み合わせにおける、複数のバイオマーカーと特異的に結合しおよび／または検出する複数の薬剤を含むキットのような、この方法における使用のためのシステム（例えば、キット）も提供される。方法において有用なキットは、費用効率が高く、不良な心臓予後、他の心臓の状態、急性心筋梗塞（AMI）の可能性を評価するために使用される得る迅速なテストを提供する。キットは、生物試料において評価される２つ以上のバイオマーカーのうちの１つに特異的な少なくとも１つのバイオマーカーを含む。例えば、キットは、ＦＲＰを検出する特異的なバイオマーカー（例えば、そしてＣＲＰを検出する特異的なバイオマーカー）を含んでもよい。
【００８０】
加えて、ある実施形態において、提供される診断方法は、（ＣＡＤを示さない人々において；ＣＡＤを有することが知られていない人々において）症状が起こる前にＣＡＤを有するまたは発症する可能性を評価する、または、冠動脈狭窄の重症度が、重症または重症でないとみなされるかどうかに関わらず既知のＣＡＤを有する人々における心筋梗塞または死亡のリスクを評価するのに有用である。加えて、方法および組成物は、虚血および心臓不全を取り除く（ないし軽減する、relieve）ためにデザインされた治療介入（therapeutic intervention）の有効性を観察するのに使用され得る。観察のためのいくつかの実施形態は、必要に応じて、３か月、６か月、または１年の間隔での治療介入の間またはその後に、対象をテストすることを含む。
【００８１】
記載されるような診断または予知の方法を行い、および続いて、例えば分析の結果を基にして、対象の治療を処置し、治療を中止し、または治療を変えることを含む治療の方法もまた提供される。いくつかの側面において、方法は更に対象を第一に治療することを含む。
【００８２】
いくつかの実施形態において、方法は、リスク評価アルゴリズムを含む統計的な解析を含む。ひとつの実施例において、提供される方法およびシステムは、例えば、所定の期間内の所定の予後（例えば、ＡＭＩまたは死亡）を有するだろうと思われるまたは有する可能性の高い個々人と、そのような予後を有しないだろうと思われるまたは有しない可能性が高い個々人を区別することができる。
【００８３】
いくつかの側面において、例えば、（１以上のバイオマーカーの特有のレベルまたは、１以上のバイオマーカーが、本願に記載されるように、上昇しているまたは陽性であるとみなされる特有のレベルのような）１以上の所定の値（１または複数）または共変量（１または複数）（covariate）と、（死亡またはＡＭＩの発生のような）、特別な予後、終点（endpoint）、またはイベントとの関係を示すために、よく知られた統計学的な解析方法を用いて、ハザード比（HR）が計算される。したがって、ＨＲは、値（１または複数）または共変量（１または複数）に関連する、予後、イベント、または、終点の発生のリスクを記載する。
【００８４】
１つの側面において、方法は、受信者動作特性（ROC）曲線およびＲＯＣ曲線下の領域（面積、area）（AUC；Ｃ−統計量）の確率解釈（probabilistic interpretation）の使用を含む。ＲＯＣ曲線は、所与のテストまたは予測モデルの感度（ｙ軸にプロットされる）のテストまたはモデルの偽陽性率（FPR；１−特異度）（ｘ軸にプロットされる）に対するプロットである。グラフ上の各点は異なった切点（cut-point）を使用することによって生じる。いくつかの実施例において、切点は、バイオマーカーが、切点以上のとき試料において「上昇する」とみなされる点に対する所与のバイオマーカーの濃度または量である。ＡＵＣ（Ｃ−統計量）は、全ての可能性のあるカットオフ値に関するプロット（曲線）の下の面積である。したがって、ＲＯＣ曲線は、全ての可能性のある切点での尺度の共通のセットでの２以上のテストの直接目視比較を可能にする。１．０のＣ−統計量を有するテスト（例えばリスク予測モデル）は、完全に正確である（なぜなら、ＦＰＲが０．０の時、感度が１．０であるからである）；０．０のＣ−統計量を有するテストは、完全に不正確である。したがって、いくつかの実施形態において、ＲＯＣ曲線を利用してＣ−統計量が求められ、かつ個別のバイオマーカーが加えられる場合並びにバイオマーカーのサブセットが評価されている場合に、バイオマーカーを使用するようなリスク予測モデルに関してＣ−統計量が比較される。全体的に、Ｃ−統計量が１．０に近づけば近づくほど、リスク予測モデルは良くなる。
【００８５】
以下の実施例は、発明を説明するために提供されるが、発明を限定するものではない。
【実施例】
【００８６】
実施例１：臨床検証試験（Clinical Validation Study）
Ｃ−反応性たんぱく質（CPR）、フィブリンおよびフィブリノーゲン分解産物（FDP）マーカー（多重FDPの混合物を含む）、および熱ショックタンパク質７０（HSP70）のレベルを含む総合のバイオマーカーリスクスコアを決定することを示すこの実施例は、対象における不良なイベントの更なるリスクを評価しまたは示すことができる。サイトメガロウイルス抗体（anti-CMV Ab）および熱ショックタンパク質６０に対する抗体（anti-HSP60）もまた評価した。ＣＲＰは、高感度ＣＲＰ（hs-CRP）分析を使用して測定した（GenWay Biotech., Inc.,カタログ番号40-052-115042）。ＦＤＰマーカーは、ＤＲ−７０（登録商標）ＥＬＳＩＡ分析を使用して測定した。
【００８７】
方法：ケースコントロール研究（case-control study）において、Ｅｍｏｒｙ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｂａｎｋ（心臓カテーテルを受ける患者の登録）から、１５００の対象を選択した。；これは、（１）登録後の追跡（follow-up）の２年の時点で、死亡、ＭＩを患っており、血管造影法によるＣＡＤを有する対象（n=200対象）；（２）血管造影法によるＣＡＤを有しＭＩまたは死亡していないもの（ｎ＝８００）であり、このうち３００の対象は登録後の2年間の追跡の間、血行再建手術を受けた；および（３）血管造影法に基づいて顕著でないＣＡＤを有するもの（ｎ＝５００）を含む。群は、傾向スコアリング（propensity scoring）を使用して、年齢、性別および心臓血管リスク因子に関してマッチさせた(match)（Rosenbaum, P.R.および Rubin, D.B., Biometrika, 1983, 70(1), 41-55; http://en.wikipedia.org/wiki/Propensity_score_matching)。血清バイオマーカーは、ＥＬＩＳＡ（GenWay（登録商標）Inc.）を使用して測定した。Ｃｏｘ比例ハザードサバイバル解析は、年齢、ＢＭＩ、性別、人種、喫煙、糖尿病、および高血圧に関して更に調整したモデルを使用して行った。データは、連続変数として、かつ、認められた（accepted）数値を元に割り当てられたカットポイントで解析した。
【００８８】
結果：ＣＭＶ抗体および抗‐ＨＳＰ６０のレベルは、如何なる予後にも有意に関連するものではなかった。２年の時点の死亡またはＭＩの主要予後（primary outcome）に関して、標準の心臓血管リスク因子に関する調整を使用して、各バイオマーカーの関連性をモデル化し、続いて、１．５５（p<0.0001）のハザード比（HR）を表した。切点を使用したモデリングは、ＣＰＲ>３．０ｍｇ／Ｌの場合に関して１．８９（p <0.001）のハザード比を表し；ＨＳＰ７０が検出可能な場合には、ＨＳＰ７０に関して１．４２（p=0.005）のＨＲを表し；およびＦＤＰ＞１．０μｇ／ｍｌの場合に関して２．０４（p<0.001）のＨＲを表した。集合において（総合して）、３つの有意なバイオマーカーの全てを使用して計算されたカテゴリーリスクスコア（categorical risk score）を使用した主要予後に関するＨＲは、１つの上昇したバイオマーカーに関しては１．６８（p= 0.008）、２つの上昇したバイオマーカーに関しては２．６４（p <0.0001）、および３つの上昇したバイオマーカーに関しては３．７６（p <0.0001）を表した。これらの結果は、スコアリングシステムについての基礎および総合スコア（aggregate score）についての基礎を提供した。
【００８９】
結果は、ＣＲＰ、ＦＤＰマーカー、およびＨＳＰ７０のレベルの、特に総合した測定は、既知のＣＡＤでない患者における死亡およびＭＩの将来のリスクの強力な予測判断材料であることを表した。
［表１］
ＣＡＤを「コントロール」群として使用したＣＲＰ，ＨＳＰ７０およびＤＲ７０とＭＩ＋死亡イベントの関連 
2014525593.tif 000003
＊年齢、性別、人種、ＢＭＩ、以前の喫煙、ＨＴＮおよび糖尿病に関して調整された
＊＊ＰＣＩ履歴、以前のＭＩ、プラビックス（登録商標）（Plavix）およびアスピリンの使用を調整１に加えたもの
オールインワンモデルとは、全ての列挙されたバイオマーカーが同一モデルにおいて検討されたことを意味する
分離モデルとは、列挙されたバイオマーカーのそれぞれが、別個のモデルにおいて検討されたことを意味する
［表２］
2014525593.tif 000004
【００９０】
実施例２Ａ：臨床検証研究（Clinical Validation Study）
追加の研究を、４つの患者群を使用して行った：コホートＡ−ＭＩまたは死亡であり、顕著なＣＡＤ（≧５０％［５０％以上］の冠動脈狭窄）が血管造影によって確認された［群］；コホートＢ−ＭＩまたは死亡でなく、顕著なＣＡＤが血管造影法によって確認された［群］；コホートＣ−ＭＩまたは死亡であり、非顕著なＣＡＤ（血管造影法により決定された＜５０％［５０％未満］の冠動脈狭窄）が血管造影によって確認された［群］；およびコホートＤ−ＭＩまたは死亡でなく、非顕著なＣＡＤ（血管造影法により決定された＜５０％［５０％未満］の冠動脈狭窄）が血管造影法によって確認された［群］；総計３８００の対象。１５００の対象を、初期テスト研究（initial testing study）に使用し；２３００の対象を、次の検証研究に使用した。
【００９１】
血液は、サンプリング用に採取され、その全てが、カテーテル処置の前に採取された。重症度および冠動脈疾患の存在を、アルゴリズムを用いて実証した。データ回収期間は、２．７５年の平均追跡で示した。ＣＲＰ、ＨＳＰ７０抗原、（上記の）ＦＤＰマーカー、およびＣＭＶ抗体の血清レベルを測定した。ＣＲＰは、ＧｅｎＷａｙＢｉｏｔｅｃｈ．，Ｉｎｃ．，カタログ番号４０−０５２−１１５０４２に記載されたような高感度ＣＲＰ（hs-CRP）分析を使用して測定した。以下の表３は、群による対象のベースラインデモグラフィックを概要する。図１は、バイオマーカー陽性（すなわち、以下に記載の「上昇した」もの）の数に関するベースラインデモグラフィックを表す。
［表３］
群によるベースラインデモグラフィックの概要
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＊＊急性ＭＩを有していた参加者、移植を有する参加者、および、以前のＭＩ、ＰＣＩ履歴またはバイオマーカーリスクスコアに関するデータが欠落した参加者を除いた後、ＣＡＤを有する参加者のみに関して、この解析においては、１６３７の参加者があった；これら参加者のうち１９０が死亡またはＭＩイベントを有していた。
＊急性ＭＩを有していた参加者、移植を有する参加者、および、以前のＭＩ、ＰＣＩ履歴またはバイオマーカーリスクスコアに関するデータが欠落した参加者を除いた後、総参加者に関して、この解析においては２９５１の参加者があった；これら参加者のうち２９６が死亡またはＭＩイベントを有していた。
†糖尿病を薬剤の使用またはグルコース≧２００ｍｇ／ｄＬと定義した
‡高血圧を、薬剤の使用、ＳＢＰ＞１４０またはＤＢＰ＞９０と定義した
◆ＣＲＰ＞３．０ｍｇ／Ｌ、ＨＳＰ７０＞０ｎｇ／ｍＬ、ＦＤＰ＞１．０μｇ／ｍＬ
【００９２】
Ｃｏｘ比較ハザードサバイバル解析を、年齢、性別、人種、喫煙、糖尿病、および高血圧に関して更に調整したモデルを使用して行った。ＣＲＰは、３．０ｍｇ／Ｌより大きい場合に、「上昇した」とみなした。ＨＳＰ７０は、検出可能な場合に「上昇した」とみなした。ＦＤＰマーカーは、１．０マイクログラム／ｍＬより大きい場合に「上昇した」とみなした。
【００９３】
図２に表されるように、顕著なＣＡＤを有する患者において、集合において（総合して）、様々な数のバイオマーカーを使用して計算したカテゴリーリスクスコアを使用した死亡またはＭＩの将来のリスクに関するハザード比（ＨＲ）は、１つの上昇したバイオマーカーについては、２．０８、２つの上昇したバイオマーカーについては、３．３８、および３つの上昇したバイオマーカーについては、５．３７であった。括弧内の番号は、ＨＲ（ハザード比）信頼区間を示す。
【００９４】
図３に表されるように、非顕著なＣＡＤを有する患者において、集合において（総合して）、様々な数のバイオマーカーを使用して計算したカテゴリーリスクスコアを使用した死亡またはＭＩの将来のリスクに関するハザード比は、１つの上昇したバイオマーカーについては、１．４０、２つの上昇したバイオマーカーについては、４．１１、および３つの上昇したバイオマーカーについては、５．５０であった。括弧内の番号は、信頼区間のＨＲ（ハザード比）を示す。
【００９５】
中央値および括弧内の信頼区間に関してリストされた番号と共に、結果の詳細な概要を以下の表４に表す。
［表４］
研究の結果の概要（実施例２）
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＊年齢、人種、性別、ＢＭＩ、今までの喫煙、ＨＴＮ、糖尿病、アスピリン使用、スタチン使用、急性ＭＩ、以前のＭＩ、ｇｅｎｓｉｎｉスコア、脂質異常症およびｅＧＦＲに関する調整
＊＊年齢、人種、性別、ＢＭＩ、今までの喫煙、ＨＴＮ、糖尿病、アスピリン使用、プラビックス（登録商標）使用、スタチン使用、ＰＣＩ履歴、急性ＭＩ、以前のＭＩ、ｇｅｎｓｉｎｉスコア、脂質異常症およびｅＧＦＲに関する調整
†年齢、人種、性別、ＢＭＩ、以前の喫煙、ＨＴＮ、糖尿病、アスピリン使用、スタチン使用、ｇｅｎｓｉｎｉスコア、脂質異常症およびｅＧＦＲに関する調整
留意点：これらのモデルは、ＡＭＩに関して調整したが、移植は依然として除外した
【００９６】
ＲＯＣ曲線を使用して、Ｃ−統計量を得、かつ、バイオマーカー対従来のリスク因子（ベースモデル）を使用したリスク予測モデルに関して比較した。以下の表５に表されるように、３つのバイオマーカー（FDPマーカー、HSP70、およびCRP）の従来のリスク因子への追加により、Ｃ−統計量を改良し、利用できるリスク評価ツールと比較した本願において提供される心血管予後のリスクを評価する方法の有用性を表す。
［表５］
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＊年齢、性別、人種、糖尿病、高血圧、喫煙、ＢＭＩ、ＰＣＩｃｏｍｐｏｓｉｔｅ、アスピリン使用、プラビックス（登録商標）使用、スタチン使用、Ｏｌｄ  Ｍｉｃｏｍｐｏｓｉｔｅ、以前のＡＭＩ、Ｇｅｎｓｉｎｉスコア、脂質Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ、およびｅＧＦＲＣＫＤに関して調整したモデル
†３．０ｍｇ／Ｌを超えて上昇したとみなされたＣＲＰ、検出された（０でカット）場合に上昇したとみなされたＨＳＰ７０、ｍＬ当たり１．０マイクログラムを超えて上昇したとみなされたＦＤＰが、ベースラインモデルに加えられた。
【００９７】
顕著なＣＡＤを有する患者および非顕著なＣＡＤを有する患者に関して、年間基準（annual basis）の主要なイベント（ＡＭＩまたは死亡）を有する各４つの群（０、１、２、または３つ全てのバイオマーカーが上昇したとみなされたもの）の患者のパーセンテージを計算した。図４に表される結果には、３つ全てのバイオマーカーが上昇した顕著なＣＡＤ患者の１８．２％が、１年間に（annually）、主要なイベントを有した、それと比較して、正常なバイオマーカーレベルを有するＣＡＤ患者ではたった２．４％であったことを示し、および、３つ全てのバイオマーカーが上昇した非顕著なＣＡＤ患者の１４．２％が、１年間に主要なイベントを有した、それと比較して、正常なバイオマーカーレベルを有する非顕著なＣＡＤ患者では、たった１．８％であったことを示した。
【００９８】
実施例２Ｂ：臨床検証研究に関するイベントフリー生存曲線
図５に表されるイベントフリー生存曲線は、実施例２Ａに記載の研究に関して得られたものであり、０、１、２、および３つの上昇したバイオマーカー（CRP、HSP70、およびFDPマーカー）を有する個々人に関するイベントフリー生存（ＡＭＩまたは死亡の終点がない）を比較した。顕著なＣＡＤ（≧５０％［５０％以上］の狭窄）を有する個々人に関して、バイオマーカーがひとつも上昇しなかったもののうち約２％のみが、追跡の１２００日の間にイベント（ＡＭＩまたは死亡）を有した。これに対して、顕著なＣＡＤを有しかつ３つ全てのバイオマーカーが上昇した個々人のうち４５％が、追跡の１２００日の間にイベントを有した。
【００９９】
この結果は、顕著でない（非顕著な）ＣＡＤを有する個々人に関して類似していた。このコホートにおいて、１２００日間のイベントのリスクは、ゼロまたは１つの上昇したバイオマーカーを有する患者については低かった。２つの上昇したバイオマーカーの存在は、１２００日間のイベントの中度のリスクを示した（このコホート中の２つの上昇したバイオマーカーを有する参加者のうち２０％が、血液採取後１２００日間にそのようなイベントを有した（２０％イベント率））。３つ全ての上昇したバイオマーカーの存在は、血液採取後１２００日間のイベントの高いリスクを示した。３つ全ての上昇したバイオマーカーを有する患者は、非顕著なＣＡＤを有するコホートの５％にあたった。血液採取後の１２００日間で、この群の３５％の者がイベントを有した（３５％イベント率）。
【０１００】
この結果は、この研究において、（図５Ａおよび５Ｂを比較することにより示されるような）狭窄のパーセンテージおよび単一のバイオマーカーの上昇のいずれも不良なイベントのリスクの良い予測材料でないことを表した。これに対して、２つまたは３つのバイオマーカーのレベルの上昇は、イベント（ＡＭＩまたは死亡）のリスクを総合して予測した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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