(57)【要約】  本発明は、インターロイキン２３（ＩＬ−２３）に結合するフィブロネクチンをベースとするスカフォールドドメインタンパク質に関する。本発明はまた、自己免疫疾患を処置するための治療的適応における革新的なタンパク質の使用に関する。本発明は、さらに、このようなタンパク質、このようなタンパク質またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む細胞、および革新的なタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブロネクチンＩＩＩ型第１０ドメイン（１０Ｆｎ３）を含むポリペプチドであって、該１０Ｆｎ３は、ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比較して、改変されたアミノ酸配列を有するループＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有し、該ポリペプチドは５００ｎＭ未満のＫＤでＩＬ−２３に結合する、ポリペプチド。
【請求項２】
フィブロネクチンＩＩＩ型第１０ドメイン（１０Ｆｎ３）を含むポリペプチドであって、該１０Ｆｎ３は、ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比較して、改変されたアミノ酸配列を有するループＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有し、該ポリペプチドはＩＬ−２３のｐ１９サブユニットの構造的エピトープに結合する、ポリペプチド。
【請求項３】
ＢＣループが配列番号：２−１１から選択される、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ＤＥループが配列番号：１２−２２から選択される、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ＦＧループが配列番号：２３−２５から選択される、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ＢＣ、ＤＥまたはＦＧループアミノ酸配列が、配列番号：２−２５のいずれか１つと少なくとも８０％同一である、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：２７−３９のいずれか１つと少なくとも８０％同一である、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ポリエチレングリコール、シアル酸、Ｆｃ、Ｆｃフラグメント、トランスフェリン、血清アルブミン、血清アルブミン結合タンパク質および血清免疫グロブリン結合タンパク質からなる群から選択される１つ以上の薬物動態（ＰＫ）部分をさらに含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ＰＫ部分がポリエチレングリコールである、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
組成物が本質的にエンドトキシンを含まない、請求項１−９のいずれか１つに記載のポリペプチドを含む薬学的に許容される組成物。
【請求項１１】
Ｔｈ１７細胞と内因性ＩＬ−２３の反応を妨げるために有効な量において請求項１−９のいずれか１つに記載のポリペプチドをＩＬ−２３と接触させることを含む、Ｔｈ１７細胞の病原性を調節するための方法。
【請求項１２】
Ａストランド前のＮ−末端領域が標的分子に結合する、フィブロネクチンＩＩＩ型第１０ドメイン（１０Ｆｎ３）を含むポリペプチド。
【請求項１３】
Ｎ−末端領域がＰｒｏ５、Ａｒｇ６およびＡｓｐ７を含む、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
Ｔｙｒ２６、Ｔｙｒ２８、Ａｓｐ８２およびＴｙｒ８５をさらに含む、請求項１２に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、インターロイキン２３（ＩＬ−２３）に結合するフィブロネクチンをベースとするスカフォールドドメインタンパク質に関する。本発明はまた、自己免疫疾患を処置するための治療的適応における革新的なタンパク質の使用に関する。本発明はさらに、このようなタンパク質、このようなタンパク質またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む細胞、および該革新的なタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
イントロダクション
ＩＬ−２３は、ＩＬ−１２ヘテロダイマーサイトカインファミリーのメンバーである。それは、ＩＬ−１２と共有しているｐ４０サブユニットおよびユニークな(unique)ｐ１９サブユニットを含む。ＩＬ−２３は、ＩＬ−１２Ｒｂ１およびＩＬ−２３Ｒからなるヘテロダイマー受容体複合体を介してシグナル伝達する（Aggarwal, Sら “Interleukin-23 promotes a distinct CD4 T cell activation state characterized by the production of interleukin-17”, J. Biol. Chem., 278:1910-1914 (2003)）。ＩＬ−２３は、慢性炎症性疾患、例えば、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、乾癬およびクローン病の処置のための標的候補である。
【０００３】
フィブロネクチンをベースとするスカフォールドは、興味ある任意の化合物に結合するように発達させることができるタンパク質のファミリーである。一般的にフィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）またはＦｎ３様ドメインに由来するスカフォールドを使用するこれらのタンパク質は、いわば、天然の抗体または操作された抗体（すなわち、ポリクローナル、モノクローナルまたは一本鎖抗体）の特性で機能し、加えて、構造的利点を有する。具体的には、これらの抗体模倣物の構造は、抗体における構造および機能を通常引き起こす条件下でさえ、最適なフォールディング、安定性および溶解度となるように設計されている。フィブロネクチンをベースとするスカフォールドタンパク質の例は、アドネクチン（Adnexus, a Bristol-Myers Squibb R&D Company）である。
【０００４】
フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順に、ベータまたはベータ様鎖、Ａ；ループ、ＡＢ；ベータまたはベータ様鎖、Ｂ；ループ、ＢＣ；ベータまたはベータ様鎖Ｃ；ループＣＤ；ベータまたはベータ様鎖Ｄ；ループＤＥ；ベータまたはベータ様鎖、Ｅ；ループ、ＥＦ；ベータまたはベータ様鎖Ｆ；ループＦＧ；およびベータまたはベータ様鎖Ｇを含む。ループＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧのいずれかまたはすべてが、標的結合に関与し得る。ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、免疫グロブリン由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）と構造的および機能的に両面で類似している。米国特許第７，１１５，３９６号は、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの変化が高親和性ＴＮＦａバインダーをもたらすＦｎ３ドメインタンパク質を記載している。同時係属米国仮特許出願６１／３０５，５６６および６１／３３０，７０６は、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの変化が高親和性ＩＬ−２３−特異的ｐ１９サブユニットバインダーをもたらすＦｎ３ドメインタンパク質を記載している。両方の仮出願を、出典明示により本明細書に包含させる。
【０００５】
自己免疫疾患の治療処置のための改善されたフィブロネクチンドメインスカフォールドタンパク質を得ることは有利である。インターロイキン１７を生産するエフェクターＴ細胞のサブセット（ＩＬ−１７；「Ｔｈ１７細胞」）は、非常に炎症性であり、重度の自己免疫を誘導する。Ｔｈ１７細胞は、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞と比較して、ＩＬ−６、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＬ−２２、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆならびにケモカイン受容体ＣＣＲ６を含む異なるサイトカインおよびケモカインのサブセットを発現する。ＩＬ−２３は、活性化Ｔ細胞によるＩＬ−１７の生産を促進させ（Aggarwal, S.ら “Interleukin-23 promotes a distinct CD4 T cell activation state characterized by the production of interleukin-17”, J. Biol. Chem., 278:1910-1914 (2003))、ＩＬ−１７−生産ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導するために重要なサイトカインである。ＩＬ−２３への暴露は、Ｔｈ１７細胞の病原性を決定する重要な特徴であるように思われる。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
本出願は、ヒトＩＬ−２３に対するアドネクチンを提供する。本発明の１つの局面は、１つ以上の溶媒接触可能ループがランダム化または変異されているＦｎ３ドメインを含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、Ｆｎ３ドメインは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインの野生型第１０モジュール（１０Ｆｎ３）に由来するＦｎ３ドメインである。いくつかの態様において、本発明の１０Ｆｎ３ポリペプチドは、ヒト１０Ｆｎ３ドメインと少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％同一である。
【０００７】
いくつかの態様において、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される１つ以上のループは、対応するヒトフィブロネクチンループと比較して長さにおいて伸長または短縮されてもよい。
【０００８】
いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは第１０フィブロネクチンＩＩＩ型（１０Ｆｎ３）ドメインを含み、該１０Ｆｎ３ドメインは、ループ、ＡＢ；ループ、ＢＣ；ループ、ＣＤ；ループ、ＤＥ；ループＥＦ；およびループＦＧを含み；ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比較して改変されたアミノ酸配列を有するループＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有する
【０００９】
いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、非ループ領域と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＦｎ３ドメインを含む。
【００１０】
いくつかの態様において、本発明のタンパク質のＢＣループは、配列番号：２−１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１１】
いくつかの態様において、本発明のタンパク質のＤＥループは、配列番号：１２−２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１２】
いくつかの態様において、本発明のタンパク質のＦＧループは、配列番号：２３−２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
いくつかの態様において、１０Ｆｎ３ドメインは、アミノ酸置換、挿入もしくは欠失で開始および／または終止してもよい。
【００１４】
いくつかの態様において、本発明のタンパク質は、配列番号：２−１１に示されるＢＣループ配列からの１つのループ配列、配列番号：１２−２２に示される１つのＤＥループ配列、および配列番号：２３−２５に示される１つのＦＧループ配列を含む。
【００１５】
いくつかの態様において、本発明のタンパク質は、配列番号：２−２５のいずれか１つと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００％同一であるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループアミノ酸配列を含む。
【００１６】
いくつかの態様において、抗ＩＬ−２３アドネクチンは、配列番号：２７−３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【００１７】
いくつかの態様において、抗ＩＬ−２３アドネクチンは、配列番号：２７−３９のいずれか１つの位置３−９６由来のＦｎ３ドメインアミノ酸配列を含む。
【００１８】
１つの局面において、抗ＩＬ−２３アドネクチンは、薬物動態学（ＰＫ）部分をさらに含む。いくつかの態様において、ＰＫ部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【００１９】
１つの局面において、本出願は、自己免疫疾患の処置において有用な抗ＩＬ−２３アドネクチンを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１ａ−１ｂは、本発明の抗−ＩＬ２３アドネクチンの全長アミノ酸配列を示す。
【００２１】
【図２】図２ａ−２ｃは、本発明の抗−ＩＬ２３アドネクチンの全長核酸配列を示す。
【００２２】
【図３】図３は、ＩＬ−２３へのアドネクチン１４５４Ｂ０８の結合を示す。アドネクチンは、赤色のβストランド、橙色の非繰り返し二次構造、および紫紅色の多様なループを用いて画として示される。ＩＬ−２３は、表面（灰色）として示される。この図は、アドネクチン１４５４Ｂ０８がｐ４０およびｐ１９サブユニット間の接合面で結合し、それがｐ４０サブユニット上のドメインＤ２およびＤ３の両方と相互作用することを強調する。図はＰｙＭｏｌ（ＤｅＬａｎｏ、２００２）で作製した。
【００２３】
【図４】図４は、ＩＬ−２３との接触に関与するアドネクチン１４５４Ｂ０８の残基を示す。アドネクチン骨格は、赤色のβストランド、橙色の非繰り返し二次構造、および紫紅色の多様なループを用いて画として示される。多様なループからの接触に関与する残基は、紫紅色の炭素原子、青色の窒素原子および赤色の酸素原子で示される。アドネクチンの残りからの接触に関与する残基は、二次構造の画上に黒色の炭素原子および黒色の領域で示される。Ｎ−末端領域からの残基、Ｃ鎖、多様なループからの分子の反対側上のＣＤループ、Ｅ鎖およびＦ鎖が、ＩＬ−２３との接触を作ることに注意する。図はＰｙＭｏｌ（ＤｅＬａｎｏ、２００２）で作製した。
【００２４】
【図５】図５は、１０Ｆｎ３（ＰＤＢ  １ＦＮＦ  残基１４１６から１５０９）上に重ね合わせた１４５４Ｂ０８の二面図を示す。カラーコード：１ＦＮＦ（青色）、１４５４Ｂ０８（青緑色）。核のβストランドならびにＡＢおよびＥＦループ（Ｃ−末端で、分子の右側部分）の優れた重ね合わせ。左側は多様なループ：ＢＣ、ＤＥおよびＦＧである。きわめて短いＤＥループは、これらの構造においてほとんど変異を示さない。ＢＣループは、少しの変異を示す。対照的に、ＦＧループは、等長１４５４Ｂ０８および１０Ｆｎ３ループ間の位置でさえ劇的な変異を示す。１０Ｆｎ３のＮ−末端と１４５４Ｂ０８のＮ−末端はかなり違う。図はＰｙＭｏｌ（ＤｅＬａｎｏ、２００２）で作製した。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
定義
「ポリペプチド」によって、長さ、翻訳後修飾または機能にかかわらず、２つまたはそれ以上のアミノ酸の任意の配列が意味される。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用される。ポリペプチドは、天然アミノ酸および非天然アミノ酸、例えば、出典明示により本明細書に包含させる米国特許第６，５５９，１２６号に記載されているものを含むことができる。ポリペプチドはまた、種々の標準化学法のいずれかで修飾することができる（例えば、アミノ酸は保護基で修飾することができる；カルボキシ末端アミノ酸は末端アミド基にさせることができる；アミノ末端残基は、例えば、親油性を増強するための基で修飾することができる；またはポリペプチドは、化学的にグリコシル化、あるいは、安定性もしくはインビボ半減期を増大するように修飾することができる）。ポリペプチド修飾は、ポリペプチドへの別の構造、例えば、環状化合物または他の分子の結合を含むことができ、また、１つ以上のアミノ酸を変化した立体配置（すなわち、ＲもしくはＳ；または、ＬもしくはＤ）で含むポリペプチドを含むことができる。本発明のペプチドは、ＩＬ−２３に特異的に結合するように修飾されている第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに由来するタンパク質であり、本明細書において「アドネクチン」または「抗ＩＬ−２３アドネクチン」と称される。
【００２６】
用語「ＰＫ」は、「薬物動態(pharmokinetic)」の頭字語であり、一例として、対象による吸収、分布、代謝および排出を含む化合物の特性を含む。「ＰＫ調節タンパク質」または「ＰＫ部分」は、生物学的に活性な分子と融合されるか、一緒に投与されるとき、生物学的に活性な分子の薬物動態特性に影響する任意のタンパク質、ペプチドまたは部分を示す。ＰＫ調節タンパク質またはＰＫ部分の例は、ＰＥＧ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）バインダー（米国公開第２００５／０２８７１５３および２００７／０００３５４９号に記載されているような）、ヒト血清アルブミン、ＦｃまたはＦｃフラグメントおよび糖（例えば、シアル酸）を含む。
【００２７】
「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、本明細書において、配列同一性の一部として保存的置換を何ら考慮することなく、最大配列同一性パーセントをなし遂げるために、配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入した後の、選択された配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当分野の種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標））ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用してなし遂げることができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントをなし遂げるために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適当なパラメータを決定することができる。
【００２８】
「単離された」ポリペプチドは、その天然環境の成分から同定および分離および／または回収されているものである。その天然環境の汚染成分は、ポリペプチドの診断または治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク性または非タンパク性溶質を含み得る。好ましい態様において、ポリペプチドは、（１）ローリー法によって決定されるとき、９５重量％を超える、より好ましくは９９重量％を超えるポリペプチドに、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によりＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも残基を得るために十分な程度に、または（３）クマシーブルーもしくは、好ましくは、銀染色を使用する還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質性に精製される。単離されたポリペプチドは、ポリペプチドの天然環境の少なくとも１種の成分が存在しないため、組換え細胞内でｉｎ  ｓｉｔｕでポリペプチドを含む。しかしながら、通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００２９】
概観
本出願は、ヒトＩＬ−２３に対するアドネクチンを提供する。ＩＬ−２３特異的アンタゴニストを同定するために、抗−ｐ４０ｍＡｂを使用して、ＩＬ−２３をアドネクチンの大規模合成ライブラリーへ提示した。ＩＬ−２３に結合するアドネクチンは、ヒトＩＬ−２３との結合、ＩＬ−２３／ＩＬ−２３Ｒ相互作用の競合、およびＴ−細胞系におけるＩＬ−２３誘導シグナル伝達の阻害についてスクリーニングされた。抗ＩＬ−２３アドネクチンは、標的濃度を低下させ、遅い解離速度(slow off-rates)で抗ＩＬ−２３アドネクチンを選択することによるさらなる選択圧に供された。この最適化工程から、アドネクチンのファミリーは、好ましい生化学的および生物物理的特性を有するＩＬ−２３特異的インヒビターとして同定された。
【００３０】
フィブロネクチンをベースとするスカフォールド
本出願の１つの局面は、１つ以上の溶媒接触可能ループがランダム化または変異されているＦｎ３ドメインを含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、Ｆｎ３ドメインは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインの野生型第１０モジュール（１０Ｆｎ３）に由来するＦｎ３ドメイン：ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号：１）である。上記１０Ｆｎ３配列において、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループには下線が引かれている。
【００３１】
種々の変異体１０Ｆｎ３スカフォールドが報告されている。１つの局面において、Ａｓｐ７、Ｇｌｕ９および２３の１つ以上が、別のアミノ酸、例えば、負の電荷を有さないアミノ酸残基（例えば、Ａｓｎ、Ｌｙｓなど）により置換されている。これらの突然変異は、野生型形態と比較して、中性ｐＨでの変異体１０Ｆｎ３のより大きな安定性を促進する効果を有すると報告されている（ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０４５２３参照）。有益または中立のいずれかである１０Ｆｎ３スカフォールドにおける種々のさらなる変化が開示されている。例えば、Batoriら Protein Eng., 15(12):1015-1020 (Dec. 2002); Koideら Biochemistry, 40(34):10326-10333 (Aug. 28, 2001)参照。
【００３２】
変異体および野生型１０Ｆｎ３タンパク質の両方が、同じ構造、すなわちＡからＧと表される７つのベータ鎖ドメイン配列および７つのベータ鎖ドメイン配列を接続する６つのループ領域（ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、ＥＦループおよびＦＧループ）により特徴付けられる。Ｎ−およびＣ−末端の最も近くに位置するベータ鎖は、溶液中でベータ様コンホメーションをとり得る。配列番号：１において、ＡＢループは残基１５−１６に対応し、ＢＣループは残基２１−３０に対応し、ＣＤループは残基３９−４５に対応し、ＤＥループは残基５１−５６に対応し、ＥＦループは残基６０−６６に対応し、ＦＧループは残基７６−８７に対応する（XuらChemistry & Biology, 9:933-942 (2002)）。
【００３３】
いくつかの態様において、１０Ｆｎ３ポリペプチドは、配列番号１に示されるヒト１０Ｆｎ３ドメインと少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％同一であり得る。可変性の多くは、一般的に、１つ以上のループ中で起こる。１０Ｆｎ３ポリペプチドのベータまたはベータ様鎖のそれぞれは、このような変異が生理学的条件におけるポリペプチドの安定性を破壊しない条件で、本質的に配列番号：１の対応するベータまたはベータ様鎖の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列からなり得る。
【００３４】
いくつかの態様において、本明細書は、第１０フィブロネクチンＩＩＩ型（１０Ｆｎ３）ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインは、ループ、ＡＢ；ループ、ＢＣ；ループ、ＣＤ；ループ、ＤＥ；ループＥＦ；およびループＦＧを含み；ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比較して改変されたアミノ酸配列を有するループＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有するポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、ＢＣおよびＦＧループは変化されており、いくつかの態様において、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは変化されており、すなわち、Ｆｎ３ドメインは非天然ループを含む。「変化」は、（ヒトフィブロネクチンドメインに対応する）鋳型配列と比較して１つ以上のアミノ酸配列の変化を意味し、アミノ酸付加、欠失および置換を含む。アミノ酸配列の変化は、一般的に核酸コード配列の意図的な、盲検的な(blind)または自発的な配列変異によって成し遂げられ得、任意の技術、例えば、ＰＣＲ、エラープローンＰＣＲまたは化学的ＤＮＡ合成によって起こり得る。
【００３５】
いくつかの態様において、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される１つ以上のループは、対応するヒトフィブロネクチンループと比較して、長さが伸長または短縮され得る。いくつかの態様において、ループの長さは、２−２５アミノ酸によって伸長され得る。いくつかの態様において、ループの長さは、１−１１アミノ酸によって減少され得る。したがって、抗原結合を最適化するために、１０Ｆｎ３のＦＧループの長さは、抗原結合において最大の起こり得る柔軟性および親和性を得るように、長さならびに配列において変化され得る。
【００３６】
いくつかの態様において、ポリペプチドは、配列番号：１の非ループ領域と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＦｎ３ドメインを含み、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループは変化されている。いくつかの態様において、変化されているＢＣループは、最大１０個のアミノ酸置換、最大４個のアミノ酸欠失、最大１０個のアミノ酸挿入、またはそれらの組合せを有する。いくつかの態様において、変化されているＤＥループは、最大６個のアミノ酸置換、最大４個のアミノ酸欠失、最大１３個のアミノ酸挿入、またはそれらの組合せを有する。いくつかの態様において、ＦＧループは、最大１２個のアミノ酸置換、最大１１個のアミノ酸欠失、最大２５個のアミノ酸挿入、またはそれらの組合せを有する。
【００３７】
いくつかの態様において、本発明のタンパク質のＢＣループは、ＤＨＤＹＰＹＲ（配列番号：２）、ＤＭＹＹＰＹＳ（配列番号：３）、ＹＨＤＹＰＹＲ（配列番号：４）、ＹＭＨＹＰＹＳ（配列番号：５）、ＹＨＭＹＳＹＲ（配列番号：６）、ＥＨＤＹＰＹＲ（配列番号：７）、ＭＨＤＹＰＹＲ（配列番号：８）、ＤＨＮＹＳＹＲ（配列番号：９）、ＮＨＮＹＳＹＹ（配列番号：１０）およびＤＨＮＹＴＷＹ（配列番号：１１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３８】
いくつかの態様において、本発明のタンパク質のＤＥループは、ＲＮＩＮ（配列番号：１２）、ＫＥＹＤ（配列番号：１３）、ＫＤＥＥ（配列番号：１４）、ＫＱＨＤ（配列番号：１５）、ＲＤＶＤ（配列番号：１６）、ＫＤＶＤ（配列番号：１７）、ＭＥＥＤ（配列番号：１８）、ＲＨＴＤ（配列番号：１９）、ＲＥＤＳ（配列番号：２０）、ＲＧＶＡ（配列番号：２１）およびＲＧＶＤ（配列番号：２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３９】
いくつかの態様において、本発明のタンパク質のＦＧループは、ＳＳＹＫＹＤＭＱＹＳ（配列番号：２３）、ＳＳＹＫＹＤＩＱＹＰ（配列番号：２４）およびＳＴＬＫＹＤＩＱＹＳ（配列番号：２５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４０】
１０Ｆｎ３ドメインは、アミノ酸変化で始まってもよい。例えば、さらなるＭＧ配列が、Ｆｎ３ドメインのＮ−末端に配置され得る。Ｍは、通常、切断除去され、Ｎ末端にＧが残る。いくつかの態様において、１０Ｆｎ３ドメインのＣ末端に、配列が配置されていてもよい。例えば、システイン含有リンカー、例えば、ＧＳＧＣ（配列番号：２６）がＣ−末端に加えられる、部位特異的ペグ化において。
【００４１】
いくつかの態様において、本発明のタンパク質は、配列番号：２−１１に示されるＢＣループ配列からの１つのループ配列、配列番号：１２−２２に示される１つのＤＥループ配列および配列番号：２３−２５に示される１つのＦＧループ配列を含む。いくつかの態様において、本発明のタンパク質は、配列番号：２−２５のいずれか１つと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００％同一であるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループアミノ酸配列を含む。
【００４２】
いくつかの態様において、抗ＩＬ−２３アドネクチンは、配列番号：２７−３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗ＩＬ−２３アドネクチンは、配列番号：２７−３９のいずれか１つの位置３−９６由来のＦｎ３ドメインアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗ＩＬ−２３アドネクチンは、配列番号：２７−３９のいずれか１つと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００４３】
いくつかの態様において、抗ＩＬ−２３アドネクチンは、配列番号：４０−５２のいずれか１つの核酸配列を含む。いくつかの態様において、抗ＩＬ−２３アドネクチンは、配列番号：４０−５２のいずれか１つと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００％同一である核酸配列を含む。
【００４４】
フィブロネクチンは、そのインテグリン結合モチーフ、「アルギニン−グリシン〜アスパラギン酸」（ＲＧＤ）を介して特定の種類のインテグリンと天然に結合する。いくつかの態様において、ポリペプチドは、（ＲＧＤ）インテグリン結合モチーフを欠く１０Ｆｎ３ドメインを含む。
【００４５】
薬物動態部分
１つの局面において、本出願は、薬物動態（ＰＫ）部分をさらに含む抗ＩＬ−２３アドネクチンを提供する。改善される薬物動態は、認識される治療的必要性にしたがって評価され得る。しばしば、恐らく、タンパク質が投与後の血清において利用できるままである時間を増大することによって、バイオアベイラビリティを増大すること、および／または用量間の時間を増大することが望ましい。場合によっては、時間とともにタンパク質の血清濃度の連続性を改善すること（例えば、投与の直後および次の投与の直前のタンパク質の血清濃度の違いの減少）が望ましい。抗ＩＬ−２３アドネクチンは、未修飾アドネクチンと比較して哺乳動物（例えば、マウス、ラットまたはヒト）においてポリペプチドのクリアランス速度を３倍超低減する部分に結合させてもよい。改善される薬物動態の他の尺度は血清半減期を含むことができ、これは、しばしば、アルファ相およびベータ相に分類される。いずれかの相または両方の相が、適当な部分の付加によって有意に改善され得る。
【００４６】
本明細書において「ＰＫ部分」と呼ばれる血液からのタンパク質のクリアランスを遅延させる傾向がある部分は、ポリオキシアルキレン部分、例えば、ポリエチレングリコール、糖（例えば、シアル酸）および耐容性良好であるタンパク質部分（例えば、Ｆｃ、Ｆｃフラグメント、トランスフェリンまたは血清アルブミン）を含む。アドネクチンは、米国公開第２００７／００４８２８２号に記載されているアルブミンまたはフラグメント（部分）またはアルブミンの変異体と融合させてもよい。
【００４７】
いくつかの態様において、ＰＫ部分は、血清アルブミン結合タンパク質、例えば、米国公開第２００７／０１７８０８２および２００７／０２６９４２２号に記載されているものである。
【００４８】
いくつかの態様において、ＰＫ部分は、血清免疫グロブリン結合タンパク質、例えば、米国公開第２００７／０１７８０８２号に記載されているものである。
【００４９】
いくつかの態様において、アドネクチンは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。１つ以上のＰＥＧ分子はタンパク質上の異なる位置に結合され得、このような結合は、アミン、チオールまたは他の適当な反応基での反応によりなし遂げられ得る。アミン部分は、例えば、ポリペプチドのＮ末端に見られる第一級アミンまたはアミノ酸、例えば、リジンまたはアルギニン中に存在するアミン基であり得る。いくつかの態様において、ＰＥＧ部分は、ａ）Ｎ−末端；ｂ）Ｎ末端と最もＮ末端側のベータストランドまたはベータ様鎖との間；ｃ）標的結合部位と反対側のポリペプチドの面上に位置するループ；ｄ）Ｃ末端と最もＣ末端側のベータストランドまたはベータ様鎖との間；およびｅ）Ｃ−末端からなる群から選択されるポリペプチド上の位置に結合している。
【００５０】
ペグ化は、部位特異的ペグ化によりなし遂げられ得、ペグ化が優先的に起こる部位を作り出すために、適当な反応基がタンパク質に導入され得る。いくつかの態様において、タンパク質は、所望の位置にシステイン残基を導入するように修飾され、システイン上で部位特異的ペグ化が可能となる。ＰＥＧは、分子量が大きく変わってもよく、分岐または直鎖であってもよい。
【００５１】
いくつかの態様において、アドネクチンは、Ｆｎ３ドメインおよびＰＫ部分を含む。いくつかの態様において、Ｆｎ３ドメインは１０Ｆｎ３ドメインである。いくつかの態様において、ＰＫ部分は、Ｆｎ３ドメイン単独と比較して、ポリペプチドの血清半減期を５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、２００、４００、６００、８００、１０００％またはそれ以上を増大する。
【００５２】
いくつかの態様において、ＰＫ部分はポリマー糖である。いくつかの態様において、ＰＫ部分はポリエチレングリコール部分である。いくつかの態様において、ＰＫ部分は血清アルブミン結合タンパク質である。いくつかの態様において、ＰＫ部分はヒト血清アルブミンである。いくつかの態様において、ＰＫ部分は血清免疫グロブリン結合タンパク質である。いくつかの態様において、ＰＫ部分はトランスフェリンである。いくつかの態様において、ＰＫ部分は血清タンパク質に対して特異的な別のアドネクチンである。
【００５３】
生物物理学および生化学的特性化
本出願は、ＩＬ−２３に結合するＦｎ３ドメインを含むアドネクチンを提供する。実施例２に示されるとおり、標的分子に結合するポリペプチドは、平衡定数（例えば、解離、ＫＤ）に関して、および速度定数（例えば、結合速度定数、ｋｏｎおよび解離速度定数、ｋｏｆｆ）に関して評価され得る。アドネクチンは、一般的に、５００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ未満のＫＤで標的分子に結合するが、ｋｏｆｆが十分に低い、またはｋｏｎが十分に高いとき、より高いＫＤ値も許容され得る。
【００５４】
本発明の抗ＩＬ−２３アドネクチンのファミリーのＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ配列は、対応する全長配列番号と共に下記の表１に提示される。
表１：抗ＩＬ−２３アドネクチンファミリー
【表１】
2014504587.tif 000002
【００５５】
核酸−タンパク質融合技術
１つの局面において、本出願は、ＩＬ−２３に結合するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含むアドネクチンを提供する。特異的結合特性を有するＦｎ３ドメインを、迅速に作り、試験する一つの方法は、Adnexus, a Bristol-Myers Squibb R&D Companyの核酸−タンパク質融合技術である。本出願は、インビトロ発現および核酸−タンパク質融合（ＲＮＡ−およびＤＮＡ−タンパク質融合）を利用して、タンパク質との結合にとって重要である新規ポリペプチドおよびアミノ酸モチーフを同定する、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎと呼ばれるタグ技術を利用する。核酸−タンパク質融合技術は、タンパク質をそのコーディング遺伝情報と共有結合によってカップリングする技術である。ＲＮＡ−タンパク質融合技術およびフィブロネクチンをベースとするスカフォールドタンパク質ライブラリースクリーニング方法の詳細な説明について、Ｓｚｏｓｔａｋら米国特許第６，２５８，５５８、６，２６１，８０４、６，２１４，５５３、６，２８１，３４４、６，２０７，４４６、６，５１８，０１８、６，８１８，４１８号；およびRobertsら Proc Natl. Acad. Sci., 94:12297-12302 (1997)（これらを出典明示により本明細書に包含させる）参照。
【００５６】
ベクターおよびポリヌクレオチド態様
本明細書に記載されている種々のタンパク質またはポリペプチドのいずれかをコードする核酸は、化学的に合成され得る。コドン使用頻度は、細胞における発現を改善するように選択され得る。このようなコドン使用頻度は、選択される細胞型に依存する。特定化されたコドン使用頻度パターンが、大腸菌および他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞において開発されている。例えば：Mayfieldら Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(2):438-442 (Jan. 21, 2003); Sinclairら Protein Expr. Purif., 26(I):96-105 (Oct. 2002); Connell, N.D., Curr. Opin. Biotechnol., 12(5):446-449 (Oct. 2001); Makridesら Microbiol. Rev., 60(3):512-538 (Sep. 1996);およびSharpら Yeast, 7(7):657-678 (Oct. 1991)、参照。
【００５７】
核酸操作の一般的な技術は、例えば、出典明示により本明細書に包含させる、Sambrookら Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)またはAusubel, Fら Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987))および定期的更新に記載されている。一般的に、ポリペプチドをコードするＤＮＡは、哺乳動物、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来する適当な転写または翻訳調節要素に作動可能に連結される。このような調節要素は、転写プロモーター、転写をコントロールする任意のオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結をコントロールする配列を含む。宿主において複製する能力は、通常、複製起点によって付与され、形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子をさらに組み込まれる。
【００５８】
本明細書に記載されているタンパク質は、直接的にだけではなく、好ましくはシグナル配列または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ−末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしてもまた、組換え的に生産され得る。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。
【００５９】
天然シグナル配列を認識およびプロセッシングしない原核生物宿主細胞のために、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。
【００６０】
酵母分泌のために、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、因子リーダー（サッカロミセス(Saccharomyces)およびクルイベロマイセス(Kluyveromyces)アルファ因子リーダーを含む）、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンス(albicans)グルコアミラーゼリーダー、または米国特許第５，６３１，１４４号に記載されているシグナルにより置換され得る。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。このような前駆体領域のＤＮＡを、リーディングフレームでタンパク質をコードするＤＮＡとライゲートしてもよい。
【００６１】
発現およびクローニングベクターは両方とも、ベクターが１つ以上の選択される宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列を含む。一般的に、クローニングベクターにおいて、該配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡと独立して複製することを可能にするものであり、複製起点または自己複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に対して適当であり、２ミクロンのプラスミド起点は、酵母に対して適当であり、種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞中のクローニングベクターのために有用である。一般的に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターのために必要でない（ＳＶ４０起点は、一般的に、それが早期プロモーターを含むためのみに使用され得る）。
【００６２】
発現およびクローニングベクターは、選択可能なマーカーとも称される選択遺伝子を含み得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求欠損を補完する、または（ｃ）複合培地からは利用できない決定的な栄養素を供給するタンパク質をコードし、例えば、バチルス(Bacilli)のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。
【００６３】
発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、本発明のタンパク質、例えば、フィブロネクチンをベースとするスカフォールドタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結しているプロモーターを含む。原核生物宿主での使用のために適当なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、ベータ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、およびハイブリッドプロモーター、例えば、ｔａｎプロモーターを含む。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターも適当である。細菌系における使用のためのプロモーターもまた、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡに作動可能に連結したシャイン−ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。真核生物のためのプロモーター配列が使用されている。実質的にはすべての真核細胞遺伝子は、転写が開始される部位から約２５から３０塩基上流に位置するＡＴ−リッチ領域を有する。多数の遺伝子の転写の開始から７０から８０塩基上流に見出される別の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。ほとんどの真核細胞遺伝子の３’末端は、コード配列の３’末端へのポリＡテールの付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列のすべてが、真核発現ベクターに適当に挿入される。
【００６４】
酵母宿主とともに使用するために適当なプロモーター配列の例は、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼに対するプロモーターを含む。
【００６５】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写は、宿主細胞系と適合性である場合、例えば、ウイルス、例えば、ポリオーマ・ウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびより好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、ヒートショックプロモーターから得られるプロモーターによりコントロールすることができる。
【００６６】
高等真核生物による本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの転写は、しばしば、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより増加される。多数のエンハンサー配列は、現在、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトプロテインおよびインスリン）から知られている。一般的に、しかしながら、１つは、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例は、複製起点の後ろ側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。真核細胞プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントにおいて、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)も参照。エンハンサーは、ペプチドをコードする配列の５’または３’側の位置でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくは、プロモーターの５’側に位置する。
【００６７】
真核宿主細胞（例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物体に由来する有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、転写の終結のために、およびｍＲＮＡを安定化するために必要な配列を含む。このような配列は通常、真核またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および場合により、３’非翻訳領域から利用することができる。これらの領域は、本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６およびそこに記載されている発現ベクター参照。
【００６８】
組換えＤＮＡはまた、タンパク質を精製するために有用であり得る任意の種類のタンパク質タグ配列を含むことができる。タンパク質タグの例は、限定はしないが、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグまたはＧＳＴタグを含む。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主とともに使用するために適当なクローニングおよび発現ベクターは、Cloning Vector: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985)中に見ることができ、この関連記載を出典明示により本明細書に包含させる。
【００６９】
発現構築物は、当業者に明らかである宿主細胞に適当な方法を使用して、宿主細胞に導入される。核酸を宿主細胞に導入するための種々の方法は、当分野で知られており、限定はしないが、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランまたは他の物質を使用するトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（ベクターが感染因子である）を含む。
【００７０】
適当な宿主細胞は、原核生物、酵母、哺乳動物細胞または細菌細胞を含む。適当な細菌は、グラム陰性またはグラム陽性生物体、例えば、大腸菌またはバチルス種を含む。好ましくはサッカロミセス種に由来する酵母、例えば、サッカロミセス・セレビシエもまた、ポリペプチドの生産のために使用され得る。種々の哺乳動物または昆虫細胞培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために使用することができる。昆虫細胞における異種タンパク質の生産のためのバキュロウイルス系は、Ｌｕｃｋｏｗら（Biotechnology, 6:47 (1988)）に総説されている。適当な哺乳動物宿主細胞系の例は、内皮細胞、ＣＯ８−７サル腎臓細胞、ＣＶ−１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胚腎細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３ＴおよびＢＨＫ細胞系を含む。精製ポリペプチドは、組換えタンパク質を発現するために適当な宿主／ベクター系を培養することにより調製される。多数の適用のために、本明細書に記載されているポリペプチド中の多くの小さいサイズのポリペプチドは、発現のための好ましい方法として大腸菌において発現させる。次に、タンパク質は、培養培地または細胞抽出物から精製される。
【００７１】
タンパク質生産
宿主細胞は、タンパク質生産のための本明細書に記載されている発現またはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、または、所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に修飾された慣用の栄養素培地において培養される。本明細書に示される実施例において、ハイスループットタンパク質生産（ＨＴＰＰ）および中規模生産のために使用される宿主細胞は、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ細菌株であった。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどは、発現のために選択される宿主細胞と共に以前に使用されているものであり、当業者には明らかである。
【００７２】
本明細書に記載されているタンパク質もまた、細胞翻訳系を使用して生産することができる。このような目的のため、ポリペプチドをコードする核酸は、インビトロ転写を可能にしてｍＲＮＡを生産し、使用されている特定の無細胞系（真核、例えば、哺乳動物または酵母無細胞翻訳系または原核、例えば、細菌無細胞翻訳系）におけるｍＲＮＡの無細胞翻訳を可能にするように修飾されなければならない。
【００７３】
本発明のタンパク質はまた、化学合成により（例えば、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, The Pierce Chemical Co, Rockford, IL (1984)に記載されている方法により）生産することができる。タンパク質に対する修飾も、化学合成により生成することができる。
【００７４】
本発明のタンパク質は、タンパク質化学の分野で一般に知られているタンパク質に対する単離／精製方法により精製することができる。非限定的な例は、抽出、再結晶化、塩析（例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムで）、遠心分離、透析、限外ろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法、向流分配またはこれらの任意の組合せを含む。精製後、限定はしないが、濾過および透析を含む、当分野で公知の種々の方法のいずれかにより、ポリペプチドを異なるバッファーに交換してもよく、および／または濃縮してもよい。
【００７５】
精製されたポリペプチドは、好ましくは少なくとも８５％純粋、好ましくは少なくとも９５％純粋、より好ましくは少なくとも９９％純粋である。純度の正確な数値にかかわらず、ポリペプチドは、医薬品として使用するために十分に純粋である。
【００７６】
治療的インビボ使用
１つの局面において、本出願は、自己免疫疾患、例えば、狼瘡（例えば、エリテマトーデス、狼瘡腎炎）、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、グレーブス病、悪性貧血、自己免疫萎縮性胃炎、アジソン病、糖尿病（例えば、インスリン依存性糖尿病、Ｉ型糖尿病）、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡、クローン病、交感性眼炎、自己免疫ブドウ膜炎、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、リウマチ性疾患（例えば、リウマチ性関節炎）、多発性筋炎、強皮症および混合性結合組織疾患の処置において有用な抗ＩＬ−２３アドネクチンを提供する。本出願はまた、対象に抗ＩＬ−２３アドネクチンを投与するための方法を提供する。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、抗ＩＬ−２３アドネクチンは、哺乳動物、特にヒトに対して薬学的に許容される。「薬学的に許容される」ポリペプチドは、例えば、本質的にエンドトキシンを含まない、または極めて低いエンドトキシンレベルを有する、有意な有害な医学的結果なしに動物に投与されるポリペプチドを示す。
【００７７】
製剤および投与
本出願はさらに、本明細書に記載されている抗ＩＬ−２３アドネクチンを含む薬学的に許容される組成物であって、本質的にエンドトキシンを含まない組成物を提供する。抗ＩＬ−２３アドネクチンを含む治療製剤は、所望の程度の純度を有する記載されているアドネクチンを、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Osol, A., ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition (1980)）と混合することにより、水溶液、凍結乾燥された、他の乾燥された製剤の形態で、保存用に調製される。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、バッファー、例えば、リン酸、クエン酸および他の有機酸；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸およびメチオニン；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；単糖類、二糖類および他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノースまたはデキストラン；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【００７８】
本明細書において製剤はまた、処置される特定の適応のために必要とされる２つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含み得る。このような分子は、意図される目的に対して有効である量の組合せで適当に存在する。
【００７９】
インビボ投与のために使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を介する濾過により容易に成し遂げられる。
【００８０】
当業者は、それぞれの治療剤の用量が、薬剤の独自性に依存することを理解する。
【００８１】
治療的適応のために、抗ＩＬ−２３アドネクチンは、薬学的に許容される投与形態において対象に投与される。それらは、ボーラスとして、もしくは期間にわたって連続的な注入により静脈内に、または皮下経路により投与することができる。適当な薬学的に許容される担体、希釈剤および賦形剤は、よく知られており、臨床状況が必要とする際に、当業者により決定することができる。適当な担体、希釈剤および／または賦形剤の例は、（１）ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、（２）０．９％塩水（０．９％  ｗ／ｖ  ＮａＣ１）、および（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロースを含む。
【００８２】
本発明の方法は、インビトロ、インビボまたはエキソビボで実施することができる。
【００８３】
共投与されるか、または連続して投与されるにかかわらず、抗ＩＬ−２３アドネクチンおよび１つ以上のさらなる治療剤の投与は、治療的適応のために上記されるとおりに起こり得る。共投与のために適当な薬学的に許容される担体、希釈剤および賦形剤は、投与される特定の治療剤の独自性に依存することが当業者により理解される。
【００８４】
凍結乾燥されるよりもむしろ水性投与形態において存在するとき、タンパク質は、一般的に、約０．１ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化されるが、これらの範囲の外側の広い変動も許容される。疾患の処置のために、抗ＩＬ−２３アドネクチンの適当な用量は、処置される疾患の型、疾患の重症度および経過、アドネクチンが予防または治療目的のために投与されるのか、以前の治療過程、患者の病歴およびアドネクチンに対する応答、ならびに担当医の判断に依存する。タンパク質は、１回で、または一連の処置にわたって、患者に適当に投与される。
【００８５】
抗ＩＬ−２３アドネクチン／ＩＬ−２３タンパク質複合体の構造
ＩＬ−２３結合アドネクチンの構造の分析は、該アドネクチンおよびその標的間の分子相互作用への多数の見識を生む。標的結合が野生型配列から突然変異された一連のアドネクチンループ残基により媒介されることを考慮すると、これらの残基中の多くが標的に接触することが観察されることは驚かない。ライブラリー中で多様化されており、非野生型残基として選択されたＢＣ、ＤＥおよびＦＧループにおける残基全てが、アドネクチン／標的接合面にて、または該接合面付近で見られるとは限らないことに、より興味がある。逆に、多様なループ（ＢＣ、ＤＥ、ＦＧ）の外側のいくつかの野生型残基は、標的タンパク質と相互作用する。標的結合アドネクチンの主鎖構造と野生型１０Ｆｎ３を比較すると、違いは、３つの多様なループのそれぞれにおいて野生型から観察され、Ｎ−末端は標的タンパク質の表面に結合するために構造変化を起こし得る。
【００８６】
実施例３に記載されているとおり、アドネクチン由来の以下の残基は、ＩＬ−２３と接触していることが見られる：Ｎ−末端領域：Ｐｒｏ５、Ａｒｇ６、Ａｓｐ７、ＢＣ−ループ：Ｇｌｕ２３、Ｈｉｓ２４、Ａｓｐ２５、Ｔｙｒ２６、Ｐｒｏ２７、Ｔｙｒ２８、Ａｒｇ３０、Ｃ−ストランド：Ｔｙｒ３１；ＣＤ−ループ：Ｇｌｙ４０、Ａｓｎ４２、Ｖａｌ４５；Ｆ−ストランド：Ｔｙｒ７３、Ｖａｌ７５；ＦＧ−ループ：Ｔｈｒ７６、Ｓｅｒ７７、Ｓｅｒ７８、Ｔｙｒ７９、Ｌｙｓ８０、Ｔｙｒ８１、Ａｓｐ８２、Ｍｅｔ８３、Ｇｌｎ８４、Ｔｙｒ８５、Ｓｅｒ８６、Ｐｒｏ８７。これらの接触する残基は、多くの非分散(non-diversified)残基を含むことに注意。
【００８７】
特に、Ｔｙｒ２６、Ｔｙｒ２８、Ａｓｐ８２およびＴｙｒ８５は、これらのアミノ酸が重要であることを示すアドネクチンの該セットにおいて完全に保存されており、これらのアミノ酸の他の１９個の天然アミノ酸のいずれかでの置換は、ＩＬ−２３への結合を大幅に減少または除去する可能性がある。コンセンサス配列は、ＢＣループにおけるＴｙｒ２６およびＴｙｒ２８ならびにＦＧループにおけるＳｅｒ７７、Ｌｙｓ８０、Ｔｙｒ８１、Ａｓｐ８２、Ｇｌｎ８４およびＴｙｒ８５を含む。これらのアミノ酸の組合せは、ＩＬ−２３への１４５４Ｂ０８の高親和性結合において重要な役割を果たす可能性があるが、これらの位置において１つまたは２つの変異を有するクローンはいくつかの結合を保持する可能性がある。
【００８８】
Ｎ−末端がアドネクチンにおいてフレキシブル(flexible)であることに注意すべきである。１０Ｆｎ３において、該位置は、９Ｆｎ３へのリンクにより決まる。実施例３に記載されている結晶構造は、１４５４Ｂ０８のＮ−末端が、おそらくＩＬ−２３との衝突を回避するために、１０Ｆｎ３  Ｎ−末端と比較して折り畳まれていること、および、Ａストランドの前のＮ−末端領域におけるＰｒｏ５、Ａｒｇ６、Ａｓｐ７が標的と接触していることを示す。
【００８９】
実施例３に記載されているエネルギー計算およびアラニン変異誘発の組合せにより、１４５４Ｂ０８に対する最小のエネルギーパラトープが、少なくともＢＣループからのＴｙｒ２８、ＦＧループからのＴｙｒ８１、およびＦＧループのＣ−末端からの非分散残基であるＰｒｏ８７からなると同定された。
【００９０】
アドネクチンとのＩＬ−２３複合体の構造は、標的タンパク質と相互作用する残基が、アドネクチンの多様なループのはるかに外側に伸長し得ることを示す。明らかに、結合ループの外側の残基の重要性は、結合親和性を増加または減少させる能力を示す相互作用エネルギー計算および標的化変異誘発実験により証明された。アラニンへのいくつかの接触残基の変異誘発は、分子間相互作用に対する疎水性相互作用の重要性を示す。
【００９１】
多様なループの外側の残基が標的と相互作用する能力に加えて、該構造はいくつかの他の特徴を示す。ＩＬ−２３／１４５４Ｂ０８構造は、多数の残基が相互作用に関与するにもかかわらず、アドネクチン上の３つの多様なループにおける残基全てがＩＬ−２３と直接接触するとは限らないことを示す。さらに、ループおよびＮ−末端は、野生型１０Ｆｎ３構造に見られるもの以外の構造を採用し得る。おそらく、ループは若干フレキシブルであるが、特定の構造のみが標的と生産的に相互作用することができ、これが複合体において見られる。アドネクチンは、小さいサイズおよび凸形状の理由で、抗体に近づきにくい表面、例えば、ＩＬ−２３のｐ４０およびｐ１９ドメイン間の凹面結合点への結合を可能にし得る。最終的に、アドネクチンは抗体Ｆｖドメインダイマーのサイズの半分未満であるが、それらはそれらの標的を有する表面をほとんど完全に覆い隠すことができる。全てのこれらの能力は、アドネクチンがタンパク質治療薬を開発するための非常に成功したプラットホームであることを証明し得ることを示唆する。
【００９２】
構造座標の記載および位置
アドネクチンとの複合体におけるＩＬ−２３の結晶構造の構造座標は、ＲＣＳＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（www.pdb.org, Berman, H.Mら “The Protein Data Bank”, Nucleic Acids Research, 28: 235-242 (2000) and www.wwpdb.org, Berman, H.Mら “Announcing the worldwide Protein Data Bank”, Nature Structural Biology, 10(12):98 (2003)）で２０１１年２月２９日に預けられ、ＰＤＢ  ＩＤ：３ＱＷＲを与えられた。
【実施例】
【００９３】
実施例１：本明細書において使用される材料および方法
ハイスループットタンパク質生産（ＨＴＰＰ）
選択されたバインダーを、ｐＥＴ９ｄベクターにクローニングし、形質転換された大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３  ｐｌｙｓＳ細胞を、２４ウェルフォーマットにおいて５０ｍｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ培地に播種し、３７℃で一晩培養した。新鮮な５ｍｌのＬＢ培地（５０ｍｇ／ｍＬのカナマイシン）培養物を、一晩培養物から２００ｍｌの吸引および適当なウェルに分配することにより、誘導発現のために調製した。培養物をＡ６０００．６−０．９まで３７℃で培養した。１ｍＭのイソプロピル−ｂ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導後、培養物を３０℃で６時間培養し、４℃で２７５０ｇで１０分間遠心分離により回収した。
【００９４】
細胞ペレット（２４ウェルフォーマット中）を、４５０ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１ｘ完全プロテアーゼインヒビターカクテル−ＥＤＴＡフリー（Ｒｏｃｈｅ）、１ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ、４０ｍＭのイミダゾール、１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、３０ｍｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅ、２ｍｇ／ｍｌのアプロチニン、ｐＨ８．０）に再懸濁し、室温で１−３時間振盪することにより溶解した。溶解物を浄化し、９６ウェル、１．２ｍｌのキャッチプレートを備えた９７ウェルＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｄ  ＵＮＩＦＩＬＴＥＲ（登録商標）に移すことにより９６ウェルフォーマットに再び入れ、陽圧により濾過した。浄化された溶解物を、平衡バッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）で平衡化された９６ウェルＮｉ−キレートプレートに移し、５分間インキュベートした。結合していない物質を真空により除去した。樹脂を、真空により除去したそれぞれの洗浄物を有する洗浄バッファー＃１（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣＨＡＰＳ、４０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）で２×０．３ｍｌ／ウェルで洗浄した。溶離の前に、それぞれのウェルを５０ｍｌの溶離バッファー（ＰＢＳ＋２０ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄し、５分間インキュベートし、該洗浄物を真空により捨てた。さらなる１００ｍｌの溶離バッファーをそれぞれのウェルに適用することにより、タンパク質を溶離した。室温で３０分インキュベーション後、プレートを２００ｇで５分間遠心し、溶離されたタンパク質を、溶離前に溶離キャッチプレートの底に加えた５ｍｌの０．５ＭのＭｇＣｌ２を含む９６ウェルキャッチプレートに回収した。溶離されたタンパク質を、タンパク質標準としてＳＧＥを用いるＢＣＡアッセイを使用して定量した。
【００９５】
不溶性フィブロネクチンをベースとするスカフォールドタンパク質バインダーの中規模発現および精製
発現のため、ＨＩＳ６タグが続く選択されたクローンを、ｐＥＴ９ｄベクターにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３  ｐｌｙｓＳ細胞において発現させた。２０ｍｌの種菌培養物（単一のプレートコロニーから作製された）を使用し、５０ｍｇ／ｍｌのカナマイシンおよび３４ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む１リットルのＬＢ培地またはＴＢ−一晩発現培地（自己誘導）に播種した。ＬＢ培地中の培養物を、３７℃でＡ６００  ０．６−１．０までインキュベートし、その時間で１ｍＭのイソプロピル−ｂ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、０℃で４時間増殖させた。ＴＢ−一晩発現培地で増殖させた培養物を、３７℃で５時間インキュベートし、その時間で温度を１９時間１８℃へ下げた。培養物を、４℃で≧１０，０００ｇで３０分間遠心分離により回収した。細胞ペレットを−８０℃で凍結させた。細胞ペレットを、氷上でＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ（登録商標）ホモジェナイザー（ＩＫＡ  ｗｏｒｋｓ）を使用して、２５ｍｌの溶解バッファー（２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１ｘ完全プロテアーゼインヒビターカクテル−ＥＤＴＡフリー（Ｒｏｃｈｅ）、ｐＨ７．４）に再懸濁した。細胞溶解を、Ｍｏｄｅｌ  Ｍ−１１０Ｓ  ＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＺＥＲ（登録商標）（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を使用して、高圧ホモジナイゼーション（≧１８，０００ｐｓｉ）によりなし遂げた。不溶性画分を、４℃で≧２３，３００ｇで３０分間の遠心分離により分離した。溶解物の遠心分離から回収された不溶性ペレットを、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄した。ペレットを、超音波処理を用いて２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ７．４中６．０Ｍの塩酸グアニジンに再可溶化し、次に、３７度で１−２時間インキュベーションした。再可溶化されたペレットを０．４５ｍｍで濾過し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、６．０Ｍのグアニジン  ｐＨ７．４バッファーで平衡化されたＨＩＳＴＲＡＰ（登録商標）カラム上に負荷した。負荷後、カラムを、同じバッファーでさらなる２５ＣＶに対して洗浄した。結合したタンパク質を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、６．０Ｍのグアニジン−ＨＣｌ  ｐＨ７．４中５０ｍＭのイミダゾールで溶離した。精製されたタンパク質を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ４．５またはＰＢＳ  ｐＨ７．２に対する透析によりリフォールディングした。
【００９６】
可溶性フィブロネクチンをベースとするスカフォールドタンパク質バインダーの中規模発現および精製
不溶性バインダーの精製の代替として、可溶性バインダーの精製も使用され得る。発現のため、ＨＩＳ６タグが続く選択されたクローンを、ｐＥＴ９ｄベクターにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ細胞において発現させた。２０ｍｌの種菌培養物（単一のプレートコロニーから作製された）を使用し、５０ｍｇ／ｍｌのカナマイシンおよび３４ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む１リットルのＬＢ培地またはＴＢ−一晩発現培地（自己誘導）に播種した。ＬＢ培地中の培養物を、３７℃でＡ６００  ０．６−１．０までインキュベートし、その時間で１ｍＭのイソプロピル−ｂ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導し３０℃で４時間増殖させた。ＴＢ−一晩発現培地で増殖させた培養物を、３７℃で５時間インキュベートし、その時間で温度を１９時間１８℃へ下げた。培養物を、４℃で≧１０，０００ｇで３０分間遠心分離により回収した。細胞ペレットを−８０℃で凍結させた。細胞ペレットを、氷上でＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ（登録商標）ホモジェナイザー（ＩＫＡ  ｗｏｒｋｓ）を使用して、２５ｍｌの溶解バッファー（２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１ｘ完全プロテアーゼインヒビターカクテル−ＥＤＴＡフリー（Ｒｏｃｈｅ）、ｐＨ７．４）に再懸濁した。細胞溶解を、Ｍｏｄｅｌ  Ｍ−１１０Ｓ  ＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＺＥＲ（登録商標）  （Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を使用して、高圧ホモジナイゼーション（≧１８，０００ｐｓｉ）によりなし遂げた。可溶性画分を、４℃で≧２３，３００ｇで３０分間の遠心分離により分離した。上清を、０．４５ｍｍフィルターを介して浄化する。浄化された溶解物を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ＭのＮａＣｌ  ｐＨ７．４で前平衡化されたＨＩＳＴＲＡＰ（登録商標）カラム（ＧＥ）上に負荷した。次に、カラムを、２５カラム容量の同じバッファー、次に、２０カラム容量の２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４、次に、３５カラム容量の２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４で洗浄した。タンパク質を、１５カラム容量の２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４で溶離し、画分をＡ２８０での吸光度に基づいてプールし、１ｘＰＢＳ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５または５０ｍＭのＮａＯＡｃ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５に対して透析する。あらゆる沈殿を０．２２ｍｍで濾過することにより除去する。
【００９７】
実施例２：インビトロ特性化
結合定数の決定
抗−Ｈｉｓ抗体、ｍＡｂ０５０（ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）を酢酸中２０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．０に希釈し、製造業者の指示にしたがって、ＣＭ５チップ表面（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）のフロー細胞１および２上に〜９０００ＲＵに固定する。全ての表面プラズモン実験は、ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ  ０．０５％の界面活性剤  Ｐ２０）中で２５℃で行った。ＩＬ−２３を抗−Ｈｉｓ  ｍＡｂ捕捉アドネクチンに２分間で注射し、次に、１０分相分離した。Ｔ１００  Ｂｉａｅｖａｌｕｔｉｏｎを使用して、速度論的パラメーターを計算した。
表２：結合定数
【表２】
2014504587.tif 000003
【００９８】
Ｋｉｔ２２５細胞でのＳＴＡＴ３リン酸化
Ｐａｒｈａｍら（“A receptor for the heterodimeric cytokine IL-23 is composed of IL-12Rbeta1 and a novel cytokine receptor subunit, IL-23R”, J. Immunol., 168(11):5699-5708 (Jun. 1, 2002)）は、ヒトＩＬ−２依存性Ｔ−細胞系、Ｋｉｔ２２５からＩＬ−２３Ｒをクローン化した。これらの細胞は、ＩＬ−１２ＲＢ１および１Ｌ−２３Ｒの両方の発現ならびにｐＳＴＡＴ３の刺激によるＩＬ−２３およびｐＳＴＡＴ４の刺激によるＩＬ−１２に対する応答に対して、ＦＡＣＳ分析により特徴づけた。Ｋｉｔ２２５細胞を９６−ウェルプレートに播種し、３７℃で３時間、ＦＢＳおよびＩＬ−２の非存在下で静置した。該インキュベーションに続き、ヒト組換えＩＬ−２３（または、１時間アンタゴニストでプレインキュベートしたＩＬ−２３）を適用し、細胞を３７℃で１５分間インキュベーターへ戻し、ＳＴＡＴ３のリン酸化（ｐ−ＳＴＡＴ３と略される）を刺激した。それぞれの条件は、９６−ウェルプレートにてデュプリケートにおいてアッセイした。刺激は、氷上に細胞を置き、氷冷ＰＢＳの添加により停止した。最後に、細胞を標準プロトコールにしたがってペレット化および溶解し、ｐＳＴＡＴ３生産をＥＬＩＳＡにより検出した。
【００９９】
ＩＬ−２３誘導性ｐＳＴＡＴ３の阻害は、抗−ｐ１９ポリクローナル抗体（ＡＦ１７１６）の滴定により証明された。クローン１２４１Ａ０５は、〜３１ｎＭのＩＣ５０で抗−ｐ１９ポリクローナル抗体と同様の活性を有した（表３）。
表３：抗ＩＬ−２３アンタゴニストによるＩＬ−２３誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害
【表３】
2014504587.tif 000004
【０１００】
実施例３：抗ＩＬ−２３アドネクチン／タンパク質複合体の構造
共結晶化試験のための抗ＩＬ−２３アドネクチンの発現および精製
アドネクチンを、ベクターｐＥＴ９ｄ（New England Biolabs, Ipswich, MA）にクローニングされたアドネクチンをコードする遺伝子で、コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を形質転換することにより発現させた。形質転換体を、カナマイシンを補った自己誘導培地（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）においてエアーレイションで、３７℃で６時間、次に２０℃で１８時間培養した。細胞を遠心分離により回収し、−８０℃で凍結した。
【０１０１】
凍結した細胞を解凍し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．５に再懸濁した。可溶化されたら、ＤＮＡｓｅ（２０ｎｇ／μＬ）を混合物に加えた。細胞を機械的に溶解し（Ａｖｅｓｔｉｎ  Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ−Ｃ３）、遠心し、上清をＩＭＡＣカラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｎｉ−ＮＴＡ、３０ｍＬ）上に負荷した。アドネクチンを、（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、３０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．５で洗浄し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、４００ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．５で溶離された）イミダゾール工程勾配を使用して溶離した。溶離プールをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４にて透析した。
【０１０２】
１４５４Ｂ０８は、３．７ｎＭのＫＤで固定されたＩＬ−２３に結合し、生化学的競合アッセイにおいて１ｎＭのＩＣ５０でＩＬ−２３／ＩＬ−２３Ｒ相互作用と競合した。
【０１０３】
アドネクチンアフィニティーカラムの調製
ＣＮＢｒ−活性化セファロース（登録商標）４高速流樹脂（ＧＥ  Ｃａｔ  ＃  １７−０９８７−０１）を、公開された指示（GE Healthcare 71-5000-15 AD）にしたがって調製した。アドネクチンを樹脂と４℃で一晩震盪しながらインキュベートした。カップリング効率は＞９８％であった（Ａ２８０により決定した）。
【０１０４】
ヒトＩＬ−２３の発現／精製
ヒトＩＬ−２３を、ｐ４０およびｐ１９サブユニットに対する二シストロン構築物を使用することにより、Ｓｆ９細胞において発現させた。分泌ＩＬ−２３を含む培地を濃縮し、タンジェンシャルフロー濾過によりＰＢＳまたはＴＢＳのいずれかにバッファー交換した。濃縮物を、２０ｃｍ／時の流速でアドネクチンアフィニティーカラムに負荷した（異なるサイズカラムを、異なる調製のために使用した）。カラムをＴＦＦバッファーで５カラム容量で洗浄し、次に０．１Ｍの酢酸、ｐＨ４．０、１．０ＭのＮａＣｌで工程溶離した。溶出液を、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ８．０（１／１０容量；最終Ｔｒｉｓ濃度は０．１Ｍであった）で中和し、プールし、濃縮した。サンプルをさらに精製し、予備規模ＳＵＰＥＲＤＥＸ（登録商標）２００  サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムにてＨＢＳにバッファー交換した。
【０１０５】
ＩＬ−２３／１４５４Ｂ０８複合体の調製
ヒトＩＬ−２３およびアドネクチンを１：３モル比で混合し、４℃で一晩インキュベートした。１：１複合体を、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、２００ｍＭのＮａＣｌを含むランニングバッファーにおいてＳＵＰＥＲＤＥＸ（登録商標）２００  カラム（GE Healthcare）でサイズ排除クロマトグラフィーにより単離した。遊離ＩＬ−２３が存在しないことを保証するために、カラムで分離される１倍モル過剰の遊離アドネクチンを、複合体に加えた。最終複合体が１２ｍｇ／ｍＬに濃縮された。
【０１０６】
ＩＬ−２３／１４５４Ｂ０８複合体の結晶化
ヒトＩＬ−２３／１４５４Ｂ０８複合体を、１ｍＬのタンパク質複合体を１Ｍのクエン酸三ナトリウム、０．２Ｍの塩化ナトリウム、０．１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．０を含む１ｍＬの貯蔵溶液と混合することによるｓｉｔｔｉｎｇ  ｄｒｏｐ蒸気拡散方法を使用して、２０℃で結晶化した。結晶の質を播種により改善した。
【０１０７】
データ回収および処理
ＩＬ−２３／１４５４Ｂ０８複合体に対するデータを、Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙでＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  ＳｏｕｒｃｅでＩＭＣＡＣＡＴでビームライン１７ＩＤで回収した。使用された波長は１．０Åであり、検出器は２００ｍｍの距離でＭＡＲ  １６５  ＣＣＤであった。０．５°の回転イメージを、１５０°の範囲のためにそれぞれ３秒間回収した。データを指数化し、統合し、ｄ＊ＴＲＥＫ（Pflugrath, “The finer things in X-ray diffraction data collection”, Acta Crystallogr. Sect. D, 55:1718-1725 (1999)）でスケール化した。空間群、単位格子パラメーターおよびデータ回収統計値を、以下の表４に記載する。
表４：データ回収統計値
【表４】
2014504587.tif 000005
【０１０８】
分子置換
アドネクチンのモデルは、残基１４１６−１４３７、１４４４−１４６６、１４７０−１９１および１５０２−１５０９（すなわちＢＣ、ＥＦおよびＦＧループを欠失している）を使用して、ＰＤＢ  １ＦＮＦから得た。ＩＬ−２３のモデルは、文献において公開されているもの（３ＤＵＨ、３Ｄ８７）由来の異なる結晶型（Ｖ．  Ｒａｍａｍｕｒｔｈｙ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｓｈｅｒｉｆｆ、非公開）において、ＢＭＳで決定された構造であった。それぞれのピースを加えるとき、並進関数Ｚ−スコアおよびＬｏｇ  Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  Ｇａｉｎに注意して、ＰＨＡＳＥＲ（McCoyら “Phaser crystallographic software”, J. Appl. Crystallogr., 40:658-674 (2007)）を分子置換に使用した。ＰＨＡＳＥＲがＩＬ−２３／１４５４Ｂ０８複合体においてアドネクチンを見つけることができないとき、ＡＭｏＲｅ並進関数を使用する６次元サーチを成功裏に使用した（Sheriffら “Implementation of a six-dimensional search using the AMoRe translation function for difficult molecular-replacement problems”, J. Appl. Crystallogr. 32:98-101 (1999); Navaza, “AMoRe: an automated package for molecular replacement”, Acta Crystallgr. Sect. A, 50:157-163 (1994); Navazaら “On the fast translation functions for molecular replacement”, Acta Crystallgr. Sect. A, 51:445-449 (1995); CCP4, “The CCP4 Suite: programs for protein crystallography”, Acta Cryst., D50:760-763 (1994)）。
【０１０９】
モデル構築、精密化およびグラフィック表示
ＣＯＯＴ（Emsleyら 2004 Coot: model-building tools for molecular graphics.  Acta Crystallogr. Sect. D, 60:2126-2132 (2004); Emsleyら “Features and Development of COOT”, Acta Crystallogr. Sect. D, 66:486-501 (2010)）を、構造のモデル構築および一般的な観察のために使用した。精密化は、Ｇｌｏｂａｌｐｈａｓｉｎｇ、Ｌｔｄ．からのａｕｔｏＢＵＳＴＥＲ（Bricogneら 2009 BUSTER, version 2.8.0. Cambridge, United Kingdom: Global Phasing Ltd.）で行った。グラフィック表示は、ＰｙＭＯＬ（DeLano, 2002, The PyMol Molecular Graphics System (2002). DeLano Scientific, San Carlos, CA, US. http:/www.pymol.org）で作成した。精密化統計値は、以下の表５に記載されている。
表５：精密化統計値
【表５】
2014504587.tif 000006
【０１１０】
覆われた表面積を、Ｇｅｌｉｎら、“Side-chain torsional potentials: effect of dipeptide, protein and solvent environment”, Biochemistry, 18:1256-1268 (1979)により定義される１．７Åプローブ範囲(sphere)拡張(extended)原子半径を使用して、プログラムＭＳ（Connolly, “Analytical Molecular Surface Calculation”, J. Appl. Crystallogr., 16:548-558 (1983)）で計算した。接触残基は、Ｇｅｌｉｎら（１９７９）により定義される拡張原子半径を使用した、Ｓｈｅｒｉｆｆら“Structure of Myohemerythrin in the Azidomet State at 1.7/1.3 Å Resolution”, J. Mol. Biol., 197:273-296 (1987)およびSheriff, “Some methods for examining the interactions between two molecules”, Immunomethods, 3:191-196 (1993)、により定義された。
【０１１１】
残基自由エネルギーおよび相互作用エネルギーの概算
タンパク質複合体を、ＭＡＥＳＴＲＯ  ９．０．２１１（Schrodinger, LLC. 2009）におけるタンパク質調製物ＷＩＺＡＲＤ（登録商標）ワークフローを使用して最適化した。該プロセス中、ヒスチジン、アスパラギンおよびグルタミン側鎖に関する側鎖プロトン化状態、ヒスチジン互変異性体および末端Ｃｈｉ回転異性体を最適化する。ワークフローにおける最終工程は、複合体の最小化（０．３Å  ＲＭＳＤ）を抑え、これが、ＯＰＬＳ＿２００５力場内の複合体の微妙な最適化を可能にする。タンパク質モデルを、ＰＲＩＭＥ側鎖精密化プロトコール、次に２つの最小化工程を使用して、それぞれの変異体タンパク質に対して作成した。第１の最小化を、変異部位の５Å以内である残基のサブセットに対する側鎖のみに適用した。最終最小化工程を、残基の同じサブセットに適用したが、それは、最小化において該残基の骨格を含んだ。
【０１１２】
Ｇｉｂｂｓ自由エネルギーの概算は、以前に記載されているとおりに計算した（Novotnyら “On the attribution of binding energy in antigen-antibody complexes McPC 603, D1.3, and HyHel-5”, Biochemistry, 28:4735-4749 (1989); Krystekら “Affinity and specificity of serine endopeptidase-protein inhibitor interactions”, J. Mol. Biol., 234:661-679 (1993)) and implemented in a python script using MAESTRO (Maestro, version 9.0, Schrodinger, LLC, New York, NY, 2009）。残基相互作用エネルギーは、Ｍａｃｒｏｍｏｄｅｌ（MacroModel, version 9.7, Schrodinger, LLC, New York, NY, 2009）を使用する成分相互作用スクリプト（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ）において実行されるＯＰＬＳ＿２００５力場を使用して、決定した。該スクリプトは、一連の残基間の分子力学相互作用エネルギーを計算し、個々のＶＤＷおよび静電寄与期間をアウトプットする。静電成分について、距離依存性誘電は、自由エネルギー計算と同様に、４．０の定数で使用した。
【０１１３】
ＩＬ−２３／１４５４Ｂ０８複合体の構造の概観
ＩＬ−２３は、ＩＬ−１２と共有するｐ４０サブユニットおよびＩＬ−１２のｐ３５サブユニットと異なるｐ１９サブユニットからなる２つのサブユニットタンパク質である。ｐ４０サブユニットは３つのＩｇ様７−ストランド  β−シートドメインからなり、ｐ１９は４−ヘリックス束からなる。１４５４Ｂ０８は、ｐ４０サブユニットのドメイン２および３の両方を含むものと考慮すべき相互作用を作るｐ４０およびｐ１９サブユニットの接合点に結合する（図３）。さらに、３つの多様なループ（ＢＣ、ＤＥおよびＦＧ）は接合面の中心の方であるが、相互作用は、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ末端から離れてβ−ストランドに沿って伸長し、相互作用は、分子の反対の末端上のＣＤループでさえ観察される。該凹部位は、別々のサブユニットおよび６つの超可変ループからの２つのドメインからなる非常に大きい抗体結合部位に近づきにくいようである。実際には、アドネクチン結合部位は、ｐ１９サブユニットのみに結合するＩＬ−２３に対する１つの既知の抗体複合体（ＰＤＢ  ３Ｄ８５）と劇的に異なる（Beyerら “Crystal Structures of the Pro-inflammatory Cytokine Interleukin-23 and its Complex with a High-affinity Neutralizing Antibody”, J. Mol. Biol., 382:942-955 (2008)）。
【０１１４】
ＩＬ−２３とアドネクチン１４５４Ｂ０８の特異的相互作用
アドネクチンおよびＩＬ−２３間の相互作用は、極めて大きく、アドネクチン表面における〜１３２０Å２およびＩＬ−２３表面における〜１３９０Å２を覆う。覆われる表面積は、多数の抗体／抗原相互作用よりも大きく、おそらく、ＩＬ−２３上の結合部位の凹性質を反映する。大きな相互作用表面にもかかわらず、ＩＬ−２３に対する１４５４Ｂ０８のアフィニティーは、それらのタンパク質抗原に対する抗体と同程度の大きさである。該複合体に対するＳｃ統計値は０．７３であり、これは、Ｌａｗｒｅｎｃｅら（“Shape Complementarity at Protein/Protein Interfaces”, J. Mol. Biol., 234:946-950 (1993)）により試験された抗体／抗原複合体よりも、さらに相補的であるということを示唆する。
【０１１５】
主な相互作用は、ＦＧ（〜５４０Å２）およびＢＣ（〜３００Å２）ループを介して起こるが、二次構造の多数のセグメントは、相互作用により覆われる少なくともある程度の表面積を有する。アドネクチン由来の以下の残基が、ＩＬ−２３と接触することが見出される：Ｎ−末端領域：Ｐｒｏ５、Ａｒｇ６、Ａｓｐ７、ＢＣ−ループ：Ｇｌｕ２３、Ｈｉｓ２４、Ａｓｐ２５、Ｔｙｒ２６、Ｐｒｏ２７、Ｔｙｒ２８、Ａｒｇ３０、Ｃ−ストランド：Ｔｙｒ３１；ＣＤ−ループ：Ｇｌｙ４０、Ａｓｎ４２、Ｖａｌ４５；Ｆ−ストランド：Ｔｙｒ７３、Ｖａｌ７５；ＦＧ−ループ：Ｔｈｒ７６、Ｓｅｒ７７、Ｓｅｒ７８、Ｔｙｒ７９、Ｌｙｓ８０、Ｔｙｒ８１、Ａｓｐ８２、Ｍｅｔ８３、Ｇｌｎ８４、Ｔｙｒ８５、Ｓｅｒ８６、Ｐｒｏ８７（図４）。４つの点が、このリストから目立つ。第１には、相互作用する残基の数は多数であり、それらはβ−ストランドおよびループ中の多くに由来する。第２には、多様なＤＥ−ループおよびＩＬ−２３間の接触は存在しない。第３には、多く（７）のチロシン残基が相互作用に関与する。チロシンの頻繁な存在は、抗原と相互作用する抗体に対して観察されており（Padlan, “On the nature of antibody combining sites: Unusual structural features that may confer on these sites an enhanced capacity for binding ligands”, Proteins: Structure, Function and Genetics, 7:112-124 (1989); Mian, “Structure, Function and Properties of Antibody Bingding Sites”, J. Mol. Biol., 217:133-151 (1991); Kossiakoffら “Understanding mechanisms governing protein-protein interactions from synthesis binding interfaces”, Curr. Opin. Struct. Biol., 18:499-506 (2008); Koideら “The importance of Being Tyrosine:  Lessons in Molecular Recognition from Minimalist Synthetic Binding Proteins”, ACS Chem. Biol., 4:325-334 (2009)）、おそらく、チロシン残基が寄与することができる広い表面積と比較して固定されるようになる比較的小さい二面角による比較的低いエントロピーの喪失が原因と考えられ、これはこの場合、合計〜４２０Å２に達する。第４には、多数（９）の多様でない残基は、ＩＬ−２３との直接相互作用に関与する。この第４のカテゴリーの残基は、７個のＴｙｒ残基のうちの２個およびＮ−末端の残基を含む。電子密度はＮ−末端の部分のみに対して説明できるが、Ｎ−末端が野生型１０Ｆｎ３においてＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの方向を示すため、Ｎ−末端はＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの方向を示さず、むしろ方向を逆転し、分子の反対側の方へ向けることが明らかである。方向のこの変化は、ｐ４０およびｐ１９サブユニット間の接合点での狭い領域においてＩＬ−２３との衝突からＮ−末端を防ぐ。
【０１１６】
インターロイキン−２３競合ＥＬＩＳＡ
アドネクチン変異体を、天然ＩＬ−２３受容体（ＩＬ−２３Ｒ）の結合部位と競合する様式において、ＩＬ−２３に結合する能力についてＥＬＩＳＡにより試験した。組換えヒトＩＬ−２３Ｒ−Ｆｃ（R&D Systems, Minneapolis, MN）を、ＰＢＳ中４μｇ／ｍＬで５０μＬで、ＮＵＮＣ（登録商標）Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Thermo Fisher Scientific, Denmark）上に４℃で一晩被覆した。全ての洗浄は、自動プレート洗浄機（Biotek, VT）を使用して、ＰＢＳＴ（０．０５％  （ｗ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ）で行った。ＯｐｔＥＩＡバッファー（BD Bioscience, CA）を、ブロックおよびアッセイ希釈剤として使用した。２００ｎＭから２８ｐＭのアドネクチン希釈物を１時間１ｎＭのＩＬ−２３でプレインキュベートし、３０分間でブロックされたＩＬ−２３Ｒ−Ｆｃ被覆プレートに移した。結合したＩＬ−２３を、抗ＩＬ−２３（GeneTex, CA）および抗マウス−ＨＲＰ（R&D Systems, MN）、次にＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）（BD Bioscience, CA）添加を介して検出した。典型的な展開時間は１０分であった。阻害パーセントは、１００％阻害を定義するために既知のＩＬ−２３アドネクチン中和標準およびネガティブコントロールとして非結合アドネクチン標準を使用することにより計算した。ＩＣ５０を、社内の曲線適合適用で４回の平均から生成した。
【０１１７】
Ｔｙｒ２８、Ｔｙｒ７３、Ｔｙｒ８１およびＰｒｏ８７は、アラニンへ突然変異された４つの重要なアミノ酸であり、本発明者らがエネルギー的に重要な残基と予測することができることを証明した。チロシン残基は全て、ＩＬ−２３接合面で覆われた表面積の７５％以上を有し、Ｐｒｏ８７は、接合面で覆われた表面の約７０％を有する。エネルギー計算は、これらの位置でのアラニンへの変異が結合を減少させることを示唆した。これは、アラニンへ突然変異されたときほとんど効果がなかったＴｙｒ７３に対してでなく、Ｔｙｒ２８、Ｔｙｒ８１およびＰｒｏ８７に対する場合であることを証明した（表６）。
表６：ＩＬ−２３  ＩＣ５０
【表６】
2014504587.tif 000007
【０１１８】
Ｔｙｒ２８は、ＢＣ−ループの中心に位置し、ＩＬ−２３  ｐ１９  ドメイン  Ａ−ヘリックスの末端であるアミノ酸との重要な接触、例えば、Ｔｒｐ２６およびＨｉｓ２９とのエッジツーフェイス(edge-to-face)相互作用を形成する。同様に、ＦＧ−ループの中心に位置するＴｙｒ８１は、ＩＬ−２３  ｐ４０サブユニット、例えば、Ｓｅｒ２０４との重要な接触を有する。ＦＧ−ループのＣ−末端に位置するＰｒｏ８７は、ＦＧ−ループ構造を保持するために必要であり得、ＩＬ−２３  ｐ４０サブユニットの残基Ｇｌｙ１００およびＰｒｏ１０１と接触する。相互作用に対して、それぞれ〜１６および〜１３寄与するＴｙｒ２８およびＴｙｒ８１と比較して、Ｔｙｒ７３は〜６ｋｃａｌのみ寄与することが予期され、最小化構造において、側鎖はＩＬ−２３  ｐ４０サブユニット  Ｌｙｓ９９  カルボニル酸素と水素結合を形成する。
【０１１９】
部位特異的変異の効果
アラニン変異誘発は、置換されるそれぞれの側鎖に対する官能基により作られる寄与を強調するが、他のアミノ酸での置換が、新規分子間相互作用への見識を得るために使用され得る。本発明者らはまた、１４５４Ｂ０８上の部位を見つけることを試み、本発明者らは、新規接触の追加により、結合活性を増強することができた。多くのこれらの変異によって、わずかに活性が変化した。しかしながら、好ましいと予期された１つＴｈｒ３５→Ａｓｐが、活性を大幅に減少させた。他方では、Ｔｙｒ７３→Ｇｌｎは、活性において穏やかな増加を生じた。アラニン変異誘発およびエネルギー計算の組合せにより、本発明者らは、１４５４Ｂ０８に対する最小エネルギーパラトープを、少なくともＢＣループのＴｙｒ２８、ＦＧループのＴｙｒ８１、およびＦＧ−ループのＣ−末端での多様でない残基のＰｒｏ８７からなるものと、定義することができた。
【０１２０】
１０Ｆｎ３と１４５４Ｂ０８の構造の比較
構造比較は、１４５４Ｂ０８が、核β−シートおよび多様であるものから離れた３つのループの２つ（ＡＢおよびＤＥ）の優れた重ね合わせを含む標的分子へ結合しているとき（図５）、野生型分子（１０Ｆｎ３；１ＦＮＦ残基１４１６−１５０９）が１４５４Ｂ０８と非常に類似のトポロジーを有することを示す（図５Ａ、右側）。１４５４Ｂ０８の全３つの多様なループ、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、野生型と長さにおいて同一であり、構造において、短いＤＥループが最小変異を示す。他方では、ＢＣループは、１０Ｆｎ３構造と比較したとき、さらなる変異を示す。最も大きな変異はＦＧループにおいてであり、１ＦＮＦ結晶構造において、天然ＲＧＤモチーフは結晶接触に関与し、接触は、構造における方向性に関与するようである。１４５４Ｂ０８において、ＦＧループは、ＩＬ−２３に結合するとき、異なる構造を採用する。最後に、Ｎ−末端はアドネクチンにおいてフレキシブルであることに注意すべきである。１０Ｆｎ３において、該位置は、９Ｆｎ３とのリンクにより決定される。他方では、１４５４Ｂ０８のＮ−末端は、おそらくＩＬ−２３との衝突を回避するために、１０Ｆｎ３  Ｎ−末端と比較して折り畳まれている。
【図１−１】
2014504587.tif 000008
【図１−２】
2014504587.tif 000009
【図２−１】
2014504587.tif 000010
【図２−２】
2014504587.tif 000011
【図２−３】
2014504587.tif 000012
【図３】
2014504587.tif 000013
【図４】
2014504587.tif 000014
【図５】
2014504587.tif 000015
【配列表】
2014504587000001.app
【国際調査報告】
2014504587.tif 000016
2014504587.tif 000017
2014504587.tif 000018
2014504587.tif 000019