(57)【要約】  逆相置換クロマトグラフィーによって混合物から有機化合物を分離するための方法であって、疎水性固定相を提供する工程；該疎水性固定相に、分離される有機化合物を含む混合物を適用する工程；非界面活性疎水性アニオン性置換剤分子および約１０重量％以下の有機溶媒を含む水性組成物をそれに適用することにより、該疎水性固定相から該有機化合物を置換する工程；および該分離した有機化合物を含む、該疎水性固定相から溶出した複数の画分を採集する工程を含み、ここで該非界面活性疎水性アニオン性置換剤分子が、本開示で定義したとおりの一般式ＡまたはＢ    【化１】2014531604.tif 000022を有する疎水性アニオンおよびカウンターイオン（ＣＩ）を含む。
2014531604.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆相置換クロマトグラフィーによって混合物から有機化合物を分離するための方法であって、
疎水性固定相を提供する工程；
該疎水性固定相に、分離される有機化合物を含む混合物を適用する工程；
非界面活性疎水性アニオン性置換剤分子を含む水性組成物をそれに適用することにより、該疎水性固定相から該有機化合物を置換する工程；および
該分離した有機化合物を含む、該疎水性固定相から溶出した複数の画分を採集する工程；
を含み、
ここで、該非界面活性疎水性アニオン性置換剤分子は、一般式ＡまたはＢ：
【化１】
2014531604.tif 000018
を有する疎水性アニオンおよびカウンターイオン（ＣＩ）を含み、
ここで、該一般式ＡおよびＢにおいて、各ＣＭまたはＣＭが、カルボキシレート（ＸＶＩ）、Ｎ−アシル−α−アミノ酸（ＸＶＩＩ）、スルホネート（ＸＶＩＩＩ）、硫酸モノエステル（ＸＩＸ）、リン酸モノエステル（ＸＸ）、リン酸ジエステル（ＸＸＩ）、ホスホン酸モノエステル（ＸＸＩＩ）、ホスホネート（ＸＸＩＩＩ）、テトラアリールボレート（ＸＸＩＶ）、ボロネート（ＸＸＶ）、ボロン酸エステル（ＸＸＶＩ）から選択される負の形式電荷を有する独立した疎水性化学部分であり；ここで、化学部分（Ｉ）〜（ＸＸＶＩ）が、以下の化学構造を有し：
【化２】
2014531604.tif 000019
ここで該一般式Ｂにおいて、ＣＭおよびＣＭ’は、同一または反対の形式電荷を有する独立した荷電化学部分であり；そして二重連結化学部分Ｒ＊により互いに化学的に付着され、該二重連結化学部分Ｒ＊は、ＣＭ上の１つのＲ１、Ｒ２（存在するならば）、Ｒ３（存在するならば）またはＲ４（存在するならば）化学部分を置換し、かつＣＭ’上の１つのＲ１’、Ｒ２’（存在するならば）、Ｒ３’（存在するならば）またはＲ４’（存在するならば）化学部分を置換し；
ここでＲ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ４およびＲ４’の各々が、式：
−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−ＡＲ１−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−ＡＲ２
によって独立して定義された直鎖状または分岐状化学部分であり、
Ｒ＊が、直接化学結合であるか、または式：
−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−ＡＲ１−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−
によって定義された二重連結直鎖状または分岐状化学部分であり、
そして、Ｒ５が、式
−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−ＡＲ２
によって定義された直鎖状または分岐状化学部分であり；
ここで、ＡＲ１が独立して、二重連結メチレン部分（−ＣＸ１Ｘ２−、メタン由来）、二重連結フェニレン部分（−Ｃ６Ｇ４−、ベンゼン由来）、二重連結ナフチレン部分（−Ｃ１０Ｇ６−、ナフタレン由来）または二重連結ビフェニレン部分（−Ｃ１２Ｇ８−、ビフェニル由来）であり；
ここで、ＡＲ２が独立して、水素（−Ｈ）、フッ素（−Ｆ）、フェニル基（−Ｃ６Ｇ５）、ナフチル基（−Ｃ１０Ｇ７）またはビフェニル基（−Ｃ１２Ｇ９）であり；
ここで各Ｘ、Ｘ１およびＸ２が個々にかつ独立して、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌまたは−ＯＨであり；
ここで、任意の−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−内または任意の−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−内または任意の−（ＣＸ１Ｘ２）ｐ−内の任意のメチレン部分（−ＣＸ１Ｘ２−）が個々にかつ独立して、独立したエーテル酸素原子（−Ｏ−）、独立したチオエーテル硫黄原子（−Ｓ−）、または独立したケトンカルボニル基（−Ｃ（Ｏ）−）と、各エーテル酸素原子、各チオエーテル硫黄原子または各ケトンカルボニル基がそれぞれの側で脂肪族炭素原子または芳香族炭素原子に結合されるように置換されてもよく；
ここで、２以下のエーテル酸素原子、２以下のチオエーテル硫黄原子および２以下のケトンカルボニル基が、任意の−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−または任意の−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−に置換されてもよく；
ここで、ｍｘが、エーテル酸素原子、チオエーテル硫黄原子およびケトンカルボニル基と置換されている各−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−におけるメチレン基の総数であり、そしてｍｕが、エーテル酸素原子、チオエーテル硫黄原子およびケトンカルボニル基と置換されている各−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−におけるメチレン基の総数であり；
ここで、Ｇが個々にかつ独立して、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＨ３、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＦ３、−ＣＯ２Ｍｅ、−ＣＯ２ＮＨ２；−ＣＯ２ＮＨＭｅ、−ＣＯ２ＮＭｅ２の任意の組み合わせであり；
ここで、Ｇ＊が個々にかつ独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｒ２、−ＯＨ、−ＯＲ２、−ＮＲ２Ｒ３、−ＣＦ３、−ＣＯ２Ｍｅ、−ＣＯ２ＮＨ２；−ＣＯ２ＮＨＭｅ、−ＣＯ２ＮＭｅ２の任意の組み合わせであり；
ここで、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ４およびＲ４’の対が、Ｒ２／Ｒ３、Ｒ２／Ｒ４、Ｒ３／Ｒ４、Ｒ２’／Ｒ３’、Ｒ２’／Ｒ４’またはＲ３’／Ｒ４’が個々にかつ独立して、−（ＣＸ１Ｘ２）ｐ−（ここでｐ＝３、４、５または６である）であるような単一の化学部分を含んでもよく；
ここでｘ、ｒ、ｕ、ｓ、ｍｘ、ｍｕの各々の整数値が、各Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’およびＲ＊について独立して選択され、整数値ｒおよびｓは、含有され単離されたシス／トランスオレフィン（アルケン）基の総数＋含有された単純単環式構造の総数であり、かつ０≦ｒ≦２および０≦ｓ≦２の範囲内にあり、数量ｘ＋ｕ−ｍｘ−ｍｕが０≦ｘ＋ｕ−ｍｘ−ｍｕ≦１１の範囲内にあり；
ここで、少なくとも１つの芳香族化学部分、複素環芳香族化学部分、イミダゾリン化学部分、アミジン化学部分またはグアニジン化学部分がＡまたはＢのＣＭまたはＣＭ’内に含まれており；
ここで、各Ｒ化学部分についての基疎水性指数（ｎ）が、脂肪族炭素原子数とオレフィン炭素原子数とチオエーテル硫黄原子数と塩素原子数とフッ素原子数の１／５とエーテル酸素原子数の１／２とケトン炭素原子数の１／２と芳香族炭素原子数の１／２との合計に数値的に等しく、６からヒドロキシル酸素原子数を引いた数（１を超える）を超えるものであり；
ここで、各［ＣＭ］または［ＣＭ−Ｒ＊−ＣＭ’］についての全体疎水性指数（Ｎ）が、脂肪族炭素原子数とオレフィン炭素原子数とチオエーテル硫黄原子数と塩素原子数とフッ素原子数の１／５とエーテル酸素原子数の１／２とケトン炭素原子数の１／２と芳香族炭素原子数の１／２との合計に数値的に等しく、６からヒドロキシル酸素原子数（１を超える）を引いた数を超えるものであり；
ここで、Ｒ１およびＲ１’についての基疎水性指数（１ｎおよび１’ｎ）が、４．０＜１ｎ，１’ｎ＜１２．０の範囲内にあり、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ＊についての基疎水性指数（２ｎ、２’ｎ、３ｎ、３’ｎ、５ｎ、５’ｎおよび＊ｎ）が、存在する場合、０．０≦２ｎ，２’ｎ，３ｎ，３’ｎ，５ｎ，５’ｎ，＊ｎ＜１２．０の範囲内にあり、そしてＲ４およびＲ４’についての基疎水性指数（４ｎおよび４’ｎ）が、存在する場合、０．０≦４ｎ，４’ｎ≦５．０の範囲内にあり；
ここで、値ｇにより除算される該全体疎水性指数（Ｎ）が、１０．０≦Ｎ／ｇ＜２４．０の範囲内にあり；
ここで、Ａにおいて、荷電化部分ＣＭが形式負電荷を有する場合、ｇ＝１であり、そしてＢにおいて、ＣＭとＣＭ’との両方が形式負電荷を有する場合、ｇ＝２であり、そしてＢにおいて、ＣＭおよびＣＭ’が正反対の形式電荷を有し、[ＣＭ−Ｒ＊−ＣＭ’]の全体の電荷は負である場合、ｇ＝１であり；
ここで、環式化学部分について算出した基疎水性指数の数値が、該２つのそれぞれのＲ化学部分間で等しく分割され；
ここで、１つのこのような化学部分のみがＣＭまたはＣＭ’に付着されている場合、Ｒ１またはＲ１’が、Ｒ化学部分として同定され；ここで、ＣＭまたはＣＭ’に付着された１より多くのこのようなＲ化学部分が存在する場合、Ｒ１またはＲ１’が、基疎水性指数の最大値を有するＲ化学部分として同定され；ここで、ＣＭまたはＣＭ’に付着された３より多くのこのような化学部分が存在する場合、Ｒ４またはＲ４’が、基疎水性指数の最小値を有するＲ化学部分として同定され；そして
ここで、ＣＩは、非干渉性で、正反対の電荷を有するカウンターイオンまたはそのようなカウンターイオンの混合物であり、そしてｄの値はゼロ、正の整数または正の分数であり、全体の疎水性化合物の電気的中性が維持されている、方法。
【請求項２】
前記非界面活性疎水性アニオン性置換剤分子を含む水性組成物が、ｐＨ緩衝液以外の付加塩を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＭが、一般式ＸＸＩＶまたはＸＸＶを有し：
【化３】
2014531604.tif 000020
ここで、該一般式ＸＸＩＶにおいて、Ｒ１がフェニル、４−ＥｔＣ６Ｈ４−、４−ｎＰｒＣ６Ｈ４−、４−ｎＢｕＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＯＣ６Ｈ４−、４−ＦＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＯＣ６Ｈ４−、４−ＥｔＣ６Ｈ４−、４−ＣｌＣ６Ｈ４−、またはＣ６Ｆ５−であり；そしてＲ２、Ｒ３およびＲ４の各々が独立してフェニル、４−ＦＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＯＣ６Ｈ４−、４−ＥｔＣ６Ｈ４−、４−ＣｌＣ６Ｈ４−またはＣ６Ｆ５−であり；そして
ここで、該一般式ＸＸＶにおいて、Ｒ１が４−（４−ｎＢｕＣ６Ｈ４）Ｃ６Ｈ４−または４−（４−ｎＢｕＣ６Ｈ４）−３−ＣｌＣ６Ｈ３−である、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
ＣＭが、４−Ｒ１Ｃ６Ｈ４ＳＯ３Ｈ、５−Ｒ１−２−ＨＯ−Ｃ６Ｈ３ＳＯ３Ｈ、４−Ｒ１−Ｃ６Ｈ４−Ｃ６Ｈ３Ｘ−４’−ＳＯ３Ｈ、および４−Ｒ１−Ｃ６Ｈ４−Ｃ６Ｈ３Ｘ−３’−ＳＯ３Ｈから選択される一般式を有し、ここで、Ｒ１がＣＨ３（ＣＨ２）ｎであり、ここで、ｎ＝４〜１０であり、そしてＸがＨまたはＯＨである、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＣＭが、一般式ＸＶＩＩＩまたはＸＸＩＩＩを有し：
【化４】
2014531604.tif 000021
ここで、該一般式ＸＶＩＩＩにおいて、および該一般式ＸＸＩＩＩにおいて、Ｒ１がＣ６Ｈ５（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎ＝５〜１１である、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＣＭが、５−Ｒ１−２−ＨＯ−Ｃ６Ｈ３ＣＯ２ＨおよびＲ１Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｃ６Ｈ５）ＣＯ２Ｈから選択される一般式を有し、ここで、Ｒ１がＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎ＝４〜１０である、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＣＭが、一般式４−Ｒ１Ｃ６Ｈ４ＰＯ３Ｈ２を有し、ここで、Ｒ１がＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎ＝４〜１０である、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＣＩが、アルカリ金属イオン（Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋）、アルカリ土類金属イオン（Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋）、二価の遷移金属イオン（Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋）およびＮＨ４＋の群から選択される、非干渉性の無機カチオンまたはそのような非干渉性カチオンの混合物であり；ここで、ＣＩは、プロトン化一級アミン（１＋）、プロトン化二級アミン（１＋）、プロトン化三級アミン（１＋）、プロトン化ジアミン（２＋）、４級アンモニウムイオン（１＋）、スルホニウムイオン（１＋）、スルホキソニウムイオン（１＋）、ホスホニウムイオン（１＋）、ビス−４級アンモニウムイオン（２＋）（Ｃ１〜Ｃ６アルキル基および／またはＣ２〜Ｃ４ヒドロキシアルキル基を含んでいてもよい）の群から選択される、非干渉性の有機カチオンまたはそのような非干渉性カチオンの混合物である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記非界面活性疎水性アニオン性置換剤分子を含む水性組成物が、約２５容量％までの有機溶媒を含む、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
置換クロマトグラフィー（ＤＣ）は、カラムクロマトグラフィーの３つの明確に定義された型―溶出、置換、前端（frontal）の１つである。ＤＣは、主に分取方法であるが、また、充填された、「口径の狭い」またはキャピラリーカラムを用いて、「マイクロ分取」ＤＣを用いて分析にも適用することができる。
【０００２】
置換クロマトグラフィーは、適切な高純度な置換剤分子が利用可能であれば、４つの一般的なクロマトグラフ法のどれを用いても実行され得るる。ＤＣは、（ａ）イオン交換クロマトグラフィー（カチオン置換、アニオン置換）、（ｂ）疎水性クロマトグラフィー（逆相、疎水的相互作用、疎水的電荷誘導、チオフィリック）、（ｃ）親水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を含む順相クロマトグラフィー、および（ｄ）固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）において使用される。
【０００３】
最適化されたＤＣを用いて、同時に、高純度（高分解能）、高回収（高収量）および高カラム処理量（高容量）が得られ得る。後者は、過負荷分取溶出クロマトグラフィーよりもずっと高い。ほとんどの場合、これらの利点は、ＤＣの欠点（流速が遅い、実行時間が長い、高純度の置換物が必要等の）を補って余りある。
【０００４】
置換クロマトグラフィーは、（ａ）適用可能なクロマトグラフィー方法、（ｂ）適切な寸法を有する適したクロマトグラフィーカラム、（ｃ）適切な移動相条件、（ｄ）適した置換剤分子および（ｅ）適切に設定されたＬＣ機器とともに適した操作プロトコルを選択することで実行される。最初は、適した「弱い置換移動相」（キャリア）が選択され、カラムは適切な流速で平衡化される。キャリアは、有用なｐＨ値に調整されたｐＨ緩衝性の化合物を含有し得る。最適な置換流速は、時折より速いが、典型的には３５〜１０５ｃｍ／時間で、遅い傾向にある。適切な量の試料溶液が試料負荷流速でカラムに負荷される。試料溶液は、試料または置換分子が荷電していれば、適切なレベルのイオン対形成剤またはイオン対形成塩とともに、キャリア内で精製されるべき物質を含有する。典型的な試料負荷は、操作ブレークスルー容量の５０〜８０％である。次に、キャリア溶液中で適切な濃度にて適した置換剤化合物から調製された置換剤移動相（置換剤緩衝液）が、置換剤のブレークスルーが観察されるまで、置換流速でカラムにポンプで送給される。精製された試料は、置換剤がブレークスルー前端の前にカラムから落ちる。カラムからの画分は集められ、内容物および純度について別々に分析される。最終的に、置換剤は「置換剤除去溶液」を用いてカラムから除かれ、次いで、カラムはきれいにされ、保存または次の使用のために最初の状態に再生される。
【０００５】
いくつかの局面において、溶出クロマトグラフィーとは異なるが、置換クロマトグラフィーは、理解が容易であり、かつ実施も容易である。ＤＣにおいて、試料は、移動相によりカラムから「溶出」されるよりも、置換剤によりカラムから「置換」される。カラムの生成物がオンラインでモニタリングされると（例えば、ＵＶ吸収、ｐＨ、または伝導度を介して）、「溶出クロマトグラム」よりも「置換列」が得られる。置換列は、クロマトグラムの溶媒分離「溶出ピーク」よりも、並んだ「置換バンド」から構成される。置換バンドが固定相を飽和するまで充分に大きければ、台形の「飽和バンド」が形成される。置換バンドが固定相を飽和するほど十分に大きくなければ、小さな三角形の「非飽和バンド」が形成される。飽和バンドの高さは、操作の時点の結合等温線により決定される。この台形のバンドまたは三角のバンドの面積は、成分の量に比例する。
【０００６】
疎水性クロマトグラフィーは、ほとんど排他的に、ユニークな水の溶媒和特性に依存する。溶媒和特性は、高度に構造化され、自己会合し、水素結合した液体に由来する。伝統的な逆相クロマトグラフィーの固定相（非荷電のＣ１８カラム）にとって、結合は通常は、しばしば好ましくないエンタルピー（＋ΔＨ）を乗り越えなければならないエントロピー（＋ＴΔＳ）により実行される。それゆえ、クロマトグラフィーによってよく使われる温度範囲（１０〜７０℃）にわたって、分析物の結合と置換剤の結合がしばしば温度増加とともにより強くなる。疎水性クロマトグラフィーのもう１つの有用な特徴は、水ベースの溶媒の自己水素結合の構造と、強さとの両方を改変する添加剤の使用である。これらの添加剤としては、以下が挙げられる：塩（ＮａＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４）、有機溶媒（ＭｅＣＮ、ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ）、および極性有機分子（尿素、オリゴ−エチレングリコール）（クロマトグラフィー緩衝液中）。
【０００７】
疎水性置換クロマトグラフィーは、キラル分析物、キラル置換剤およびキラルクロマトグラフィーのマトリックスを使用して実行することができる。これらの条件下で、アキラルな置換剤が使用され得るが、キラルな置換剤のラセミ体混合物は使用され得ない。ラセミ体のキラルな分析物はまた、アキラルなクロマトグラフィーカラムとアキラルな置換剤を用いて精製され得る。この場合において、ジアステレオマーを含む不純物は、目的のラセミ混合物から除去されるが、エナンチオマーのキラル分割はない。アニオン性置換剤は１つまたはそれ以上のキラル中心を含み得る。キラルクロマトグラフィーマトリックス、移動相およびアキラルな置換剤の適切な選択により、エナンチオマーは分取スケールで規定通りに分割（分離）される。具体的な状況に応じて、キラルな固定相でエナンチオマーを置換分離する場合、良好なエナンチオマー的に純粋なキラル置換剤が、良好なアキラル置換剤よりも性能上の利点を有し得る。
【０００８】
良好な疎水性置換剤分子は、それらが効果的に機能するために、化学的および物理的特性のユニークな組合せを持つべきである。いくつかの可溶な疎水性分子は、置換剤として機能し得るが、限られた少ない機能のみがよく機能する。本明細書に記載の分子の多くは、充分に機能する置換剤に必要とされる要求を満たす。
【０００９】
有用な逆相の分取置換クロマトグラフィーの開発が、適切な高純度の置換剤分子が利用できないことにより妨げられてきた。例えば、米国特許第６，２３９，２６２号は、低分子量界面活性化合物を置換剤として用いる様々な逆相液体クロマトグラフィーシステムを記載している。米国特許第６，２３９，２６２号は、疎水性部分と結合し、置換剤として使用することができる界面活性化合物を形成し得る、極端に広い範囲の可能な荷電部分を開示するが、開示された置換剤の界面活性特性を軽減するために高い比率の有機溶媒を含む必要があることを開示している。そのような高い比率の有機溶媒の存在は、顕著にプロセスを変え、逆相疎水性置換クロマトグラフィーの利点を損なう。それに加えて、米国特許第６，２３９，２６２号に開示された界面活性剤置換剤化合物は十分に機能せず、「精製された」生産物に顕著なレベルの不純物が含まれ得る、相対的に低い品質の置換列になる。
【００１０】
我々は、本明細書において、疎水性置換クロマトグラフィーの種々の形態において有用性を有する新規な置換剤分子およびそれらの使用方法を記載する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
我々は、疎水性置換クロマトグラフィーにおける良好な置換剤挙動に必要な化学的特性および物理的特性の組合せを独特に有する負荷電化疎水性有機化合物（塩または双性イオンのいずれも）のクラスを発見し、開発した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、本発明は、１つの実施形態では、逆相置換クロマトグラフィーによって混合物から有機化合物を分離するための方法であって、
疎水性固定相を提供する工程；
該疎水性固定相に、分離される有機化合物を含む混合物を適用する工程；
非界面活性疎水性アニオン性置換剤分子を含む水性組成物をそれに適用することにより、該疎水性固定相から該有機化合物を置換する工程；および
該分離した有機化合物を含む、該疎水性固定相から溶出した複数の画分を採集する工程；
を含み、
ここで、該非界面活性疎水性アニオン性置換剤分子は、一般式ＡまたはＢ：
【００１３】
【化１】
2014531604.tif 000003
【００１４】
を有する疎水性アニオンおよびカウンターイオン（ＣＩ）を含み、
ここで、該一般式ＡおよびＢにおいて、各ＣＭまたはＣＭ’が、カルボキシレート（ＸＶＩ）、Ｎ−アシル−α−アミノ酸（ＸＶＩＩ）、スルホネート（ＸＶＩＩＩ）、硫酸モノエステル（ＸＩＸ）、リン酸モノエステル（ＸＸ）、リン酸ジエステル（ＸＸＩ）、ホスホン酸モノエステル（ＸＸＩＩ）、ホスホネート（ＸＸＩＩＩ）、テトラアリールボレート（ＸＸＩＶ）、ボロネート（ＸＸＶ）、ボロン酸エステル（ＸＸＶＩ）から選択される負の形式電荷を有する独立した疎水性化学部分であり；ここで、化学部分（ＸＶＩ）〜（ＸＸＶＩ）が、以下の化学構造を有し：
【００１５】
【化２】
2014531604.tif 000004
【００１６】
ここで該一般式Ｂにおいて、ＣＭおよびＣＭ’は、同一または反対の形式電荷を有する独立した荷電化学部分であり；そして二重連結化学部分Ｒ＊により互いに化学的に付着され、該二重連結化学部分Ｒ＊は、ＣＭ上の１つのＲ１、Ｒ２（存在するならば）、Ｒ３（存在するならば）またはＲ４（存在するならば）化学部分を置換し、かつＣＭ’上の１つのＲ１’、Ｒ２’（存在するならば）、Ｒ３’（存在するならば）またはＲ４’（存在するならば）化学部分を置換し（本明細書中においては、ＣＭ’上のＲ基を、プライム（’）と共に称する、例えば、Ｒ１’は、ＣＭ’上のＲ１基である）；
ここでＲ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ４およびＲ４’の各々が、式：
−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−ＡＲ１−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−ＡＲ２
によって独立して定義された直鎖状または分岐状化学部分であり、
Ｒ＊が、直接化学結合であるか、または式：
−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−ＡＲ１−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−
によって定義された二重連結直鎖状または分岐状化学部分であり、
そして、Ｒ５およびＲ５’の各々が独立して、式
−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−ＡＲ２
によって定義された直鎖状または分岐状化学部分であり；
ここで、各ＡＲ１が独立して、二重連結メチレン部分（−ＣＸ１Ｘ２−、メタン由来）、二重連結フェニレン部分（−Ｃ６Ｇ４−、ベンゼン由来）、二重連結ナフチレン部分（−Ｃ１０Ｇ６−、ナフタレン由来）または二重連結ビフェニレン部分（−Ｃ１２Ｇ８−、ビフェニル由来）であり；
ここで、各ＡＲ２が独立して、水素（−Ｈ）、フッ素（−Ｆ）、フェニル基（−Ｃ６Ｇ５）、ナフチル基（−Ｃ１０Ｇ７）またはビフェニル基（−Ｃ１２Ｇ９）であり；
ここで各Ｘ、Ｘ１およびＸ２が個々にかつ独立して、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌまたは−ＯＨであり；
ここで、任意の−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−内または任意の−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−内または任意の−（ＣＸ１Ｘ２）ｐ−内の任意のメチレン部分（−ＣＸ１Ｘ２−）が個々にかつ独立して、独立したエーテル酸素原子（−Ｏ−）、独立したチオエーテル硫黄原子（−Ｓ−）、または独立したケトンカルボニル基（−Ｃ（Ｏ）−）と、各エーテル酸素原子、各チオエーテル硫黄原子または各ケトンカルボニル基がそれぞれの側で脂肪族炭素原子または芳香族炭素原子に結合されるように置換されてもよく；
ここで、２以下のエーテル酸素原子、２以下のチオエーテル硫黄原子および２以下のケトンカルボニル基が、任意の−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−または任意の−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−に置換されてもよく；
ここで、ｍｘが、エーテル酸素原子、チオエーテル硫黄原子およびケトンカルボニル基と置換されている各−ＣｘＸ２ｘ−２ｒ−におけるメチレン基の総数であり、そしてｍｕが、エーテル酸素原子、チオエーテル硫黄原子およびケトンカルボニル基と置換されている各−ＣｕＸ２ｕ−２ｓ−におけるメチレン基の総数であり；
ここで、Ｇが個々にかつ独立して、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＨ３、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＦ３、−ＣＯ２Ｍｅ、−ＣＯ２ＮＨ２；−ＣＯ２ＮＨＭｅ、−ＣＯ２ＮＭｅ２の任意の組み合わせであり；
ここで、Ｇ＊が個々にかつ独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｒ２、−ＯＨ、−ＯＲ２、−ＮＲ２Ｒ３、−ＣＦ３、−ＣＯ２Ｍｅ、−ＣＯ２ＮＨ２；−ＣＯ２ＮＨＭｅ、−ＣＯ２ＮＭｅ２の任意の組み合わせであり；
ここで、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ４およびＲ４’の対が、Ｒ２／Ｒ３、Ｒ２／Ｒ４、Ｒ３／Ｒ４、Ｒ２’／Ｒ３’、Ｒ２’／Ｒ４’またはＲ３’／Ｒ４’が個々にかつ独立して、−（ＣＸ１Ｘ２）ｐ−（ここでｐ＝３、４、５または６である）であるような単一の化学部分を含んでもよく；
ここでｘ、ｒ、ｕ、ｓ、ｍｘ、ｍｕの各々の整数値が、各Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’およびＲ＊について独立して選択され、整数値ｒおよびｓは、含有され単離されたシス／トランスオレフィン（アルケン）基の総数＋含有された単純単環式構造の総数であり、かつ０≦ｒ≦２および０≦ｓ≦２の範囲内にあり、数量ｘ＋ｕ−ｍｘ−ｍｕが０≦ｘ＋ｕ−ｍｘ−ｍｕ≦１１の範囲内にあり；
ここで、少なくとも１つの芳香族化学部分、複素環芳香族化学部分、イミダゾリン化学部分、アミジン化学部分またはグアニジン化学部分がＡまたはＢのＣＭまたはＣＭ’内に含まれており；
ここで、各Ｒ化学部分についての基疎水性指数（ｎ）が、脂肪族炭素原子数とオレフィン炭素原子数とチオエーテル硫黄原子数と塩素原子数とフッ素原子数の１／５とエーテル酸素原子数の１／２とケトン炭素原子数の１／２と芳香族炭素原子数の１／２との合計に数値的に等しく、６からヒドロキシル酸素原子数（１を超える）を引いた数を超えるものであり；
ここで、各［ＣＭ］または［ＣＭ−Ｒ＊−ＣＭ’］についての全体疎水性指数（Ｎ）が、脂肪族炭素原子数とオレフィン炭素原子数とチオエーテル硫黄原子数と塩素原子数とフッ素原子数の１／５とエーテル酸素原子数の１／２とケトン炭素原子数の１／２と芳香族炭素原子数の１／２との合計に数値的に等しく、６からヒドロキシル酸素原子数（１を超える）を引いた数を超えるものであり；
ここで、Ｒ１およびＲ１’についての基疎水性指数（１ｎおよび１’ｎ）が、４．０＜１ｎ，１’ｎ＜１２．０の範囲内にあり、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ＊についての基疎水性指数（２ｎ、２’ｎ、３ｎ、３’ｎ、５ｎ、５’ｎおよび＊ｎ）が、存在する場合、０．０≦２ｎ，２’ｎ，３ｎ，３’ｎ，５ｎ，５’ｎ，＊ｎ＜１２．０の範囲内にあり、そしてＲ４およびＲ４’についての基疎水性指数（４ｎおよび４’ｎ）が、存在する場合、０．０≦４ｎ，４’ｎ≦５．０の範囲内にあり；
ここで、値ｇにより除算される該全体疎水性指数（Ｎ）が、１０．０≦Ｎ／ｇ＜２４．０の範囲内にあり；
ここで、Ａにおいて、荷電化部分ＣＭが形式負電荷を有する場合、ｇ＝１であり、そしてＢにおいて、ＣＭとＣＭ’との両方が形式負電荷を有する場合、ｇ＝２であり、そしてＢにおいて、ＣＭおよびＣＭ’が正反対の形式電荷を有し、[ＣＭ−Ｒ＊−ＣＭ’]の全体の電荷は負である場合、ｇ＝１であり；
ここで、環式化学部分について算出した基疎水性指数の数値が、該２つのそれぞれのＲ化学部分間で等しく分割され；
ここで、１つのこのような化学部分のみがＣＭまたはＣＭ’に付着さている場合、Ｒ１またはＲ１’が、Ｒ化学部分として同定され；ここで、ＣＭまたはＣＭ’に付着された１より多くのこのようなＲ化学部分が存在する場合、Ｒ１またはＲ１’が、基疎水性指数の最大値を有するＲ化学部分として同定され；ここで、ＣＭまたはＣＭ’に付着された３より多くのこのような化学部分が存在する場合、Ｒ４またはＲ４’が、基疎水性指数の最小値を有するＲ化学部分として同定され；そして
ここで、ＣＩは、非干渉性で、正反対の電荷を有するカウンターイオンまたはそのようなカウンターイオンの混合物であり、そしてｄの値はゼロ、正の整数または正の分数であり、全体の疎水性化合物の電気的中性が維持されている、方法に関する。
【００１７】
１つの実施形態では、非界面活性疎水性アニオン性置換剤分子を含む水性組成物は、ｐＨ緩衝液以外の付加塩を含まない。
【００１８】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＸＸＩＶまたはＸＸＶを有し：
【００１９】
【化３】
2014531604.tif 000005
【００２０】
ここで、該一般式ＸＸＩＶにおいて、Ｒ１がフェニル、４−ＥｔＣ６Ｈ４−、４−ｎＰｒＣ６Ｈ４−、４−ｎＢｕＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＯＣ６Ｈ４−、４−ＦＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＯＣ６Ｈ４−、４−ＥｔＣ６Ｈ４−、４−ＣｌＣ６Ｈ４−、またはＣ６Ｆ５−であり；そしてＲ２、Ｒ３およびＲ４の各々が独立してフェニル、４−ＦＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＣ６Ｈ４−、４−ＭｅＯＣ６Ｈ４−、４−ＥｔＣ６Ｈ４−、４−ＣｌＣ６Ｈ４−またはＣ６Ｆ５−であり；そして
ここで、該一般式ＸＸＶにおいて、Ｒ１が４−（４−ｎＢｕＣ６Ｈ４）Ｃ６Ｈ４−または４−（４−ｎＢｕＣ６Ｈ４）−３−ＣｌＣ６Ｈ３−である。
【００２１】
１つの実施形態では、ＣＭは、４−Ｒ１Ｃ６Ｈ４ＳＯ３Ｈ、５−Ｒ６−２−ＨＯ−Ｃ６Ｈ３ＳＯ３Ｈ、４−Ｒ１−Ｃ６Ｈ４−Ｃ６Ｈ３Ｘ−４’−ＳＯ３Ｈ、および４−Ｒ１−Ｃ６Ｈ４−Ｃ６Ｈ３Ｘ−３’−ＳＯ３Ｈから選択される一般式を有し、ここで、Ｒ１がＣＨ３（ＣＨ２）ｎであり、ここで、ｎ＝４〜１０であり、そしてＸがＨまたはＯＨである。
【００２２】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式ＸＶＩＩＩまたはＸＸＩＩＩを有し：
【００２３】
【化４】
2014531604.tif 000006
【００２４】
ここで、該一般式ＸＶＩＩＩにおいて、および該一般式ＸＸＩＩＩにおいて、Ｒ１がＣ６Ｈ５（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎ＝５〜１１である。
【００２５】
１つの実施形態では、ＣＭは、５−Ｒ１−２−ＨＯ−Ｃ６Ｈ３ＣＯ２ＨおよびＲ１Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（Ｃ６Ｈ５）ＣＯ２Ｈから選択される一般式を有し、ここで、Ｒ１がＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎ＝４〜１０である。
【００２６】
１つの実施形態では、ＣＭは、一般式４−Ｒ１Ｃ６Ｈ４ＰＯ３Ｈ２を有し、ここで、Ｒ１がＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎ＝４〜１０である。
【００２７】
１つの実施形態では、ＣＩは、アルカリ金属イオン（Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋）、アルカリ土類金属イオン（Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋）、二価の遷移金属イオン（Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋）およびＮＨ４＋の群から選択される、非干渉性の無機カチオンまたはそのような非干渉性カチオンの混合物であり；ここで、ＣＩは、プロトン化一級アミン（１＋）、プロトン化二級アミン（１＋）、プロトン化三級アミン（１＋）、プロトン化ジアミン（２＋）、４級アンモニウムイオン（１＋）、スルホニウムイオン（１＋）、スルホキソニウムイオン（１＋）、ホスホニウムイオン（１＋）、ビス−４級アンモニウムイオン（２＋）（Ｃ１〜Ｃ６アルキル基および／またはＣ２〜Ｃ４ヒドロキシアルキル基を含んでいてもよい）の群から選択される、非干渉性の有機カチオンまたはそのような非干渉性カチオンの混合物である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】本発明の例示の実施形態に従う置換クロマトグラフィー方法について、時間（ｘ軸）対相対吸光単位（ｙ軸）をプロットする、粗合成ペプチドの精製に関する置換トレースである。
【図１Ｂ】本発明の例示の実施形態に従う置換クロマトグラフィー方法について、画分数（Ｘ軸）対各画分における各成分の濃度（μｇ／ｍＬ）をプロットする、図１Ａに示す置換データの画分分析である。
【図２Ａ】本発明の例示の実施形態に従う置換クロマトグラフィー方法について、時間（Ｘ軸）対相対吸光単位（ｙ軸）をプロットする、粗合成オリゴヌクレオチドの精製に関する置換トレースである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本明細書中において使用されるように、本発明に従って用いられる中性非界面活性アニオン性置換剤化合物に関して、「非界面活性」とは、そのように記載された化合物が、本発明による置換クロマトグラフィー方法で用いられる化合物の濃度より大きい臨界ミセル濃度（「ＣＭＣ」）を有することを意味する。１つの実施形態では、非界面活性置換剤化合物の濃度は、ＣＭＣに影響し得る有機溶媒、塩、または他の因子の非存在下、水中にあるその化合物についてのＣＭＣの約８０％未満である。１つの実施形態では、非界面活性置換剤化合物の濃度は、ＣＭＣに影響し得る有機溶媒、塩、または他の因子の非存在下、水中にあるその化合物についてのＣＭＣの約６０％未満である。１つの実施形態では、非界面活性置換剤化合物の濃度は、ＣＭＣに影響し得る有機溶媒、塩、または他の因子の非存在下、水中にあるその化合物についてのＣＭＣの約５０％未満である。
【００３０】
１つの実施形態では、本発明に従って用いられる非界面活性疎水性アニオン性置換剤分子を含む水性組成物は、以下の１つまたは２つもしくはそれ以上の組み合わせによって、不利な界面活性特性を示さない：（１）そのＣＭＣより低い濃度でアニオン性非界面活性置換剤化合物が存在する；（２）ｇの値で除算した各［ＣＭ］または［ＣＭ−Ｒ＊−ＣＭ’］についての全体疎水性指数（Ｎ）が１０≦Ｎ／ｇ＜２４の範囲内にある；（３）各Ｒ１またはＲ１’についての基疎水性指数（１ｎ）が、４＜１ｎ＜１２の範囲内にあり、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ５、Ｒ５’およびＲ＊（存在する場合）の各々についての基疎水性指数（２ｎ、３ｎ、５ｎおよび＊ｎ）が、０≦２ｎ、３ｎ、５ｎ、＊ｎ＜１２の範囲内にあり、そしてＲ４またはＲ４’（存在する場合）についての基疎水性指数（４ｎ）が、０≦４ｎ≦５の範囲内にある；（４）組成物が約５容量％またはそれ以上より多くの有機溶媒を含有する。
【００３１】
本明細書中において使用されるように、「低有機溶媒含量」とは、例えば、本発明に従う非界面活性アニオン性置換剤化合物を含む水性「キャリア」組成物中で、約２５容量％未満の有機溶媒含量を一般にいう。１つの実施形態では、水性「キャリア」組成物の有機溶媒含量は、約２０容量％未満の任意の有機溶媒を含有する。１つの実施形態では、水性「キャリア」組成物の有機溶媒含量は、約１５容量％未満の任意の有機溶媒を含有する。１つの実施形態では、水性「キャリア」組成物の有機溶媒含量は、約１０容量％未満の任意の有機溶媒を含有する。１つの実施形態では、水性「キャリア」組成物の有機溶媒含量は、約５容量％未満の任意の有機溶媒を含有する。１つの実施形態では、水性「キャリア」組成物は、有機溶媒を含有しない。
【００３２】
１つの実施形態では、有機溶媒は、メタノール（ＣＨ３ＯＨまたはＭｅＯＨ）、エタノール（Ｃ２Ｈ５ＯＨまたはＥｔＯＨ）またはアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮまたはＭｅＣＮ）の１つまたは２つもしくはそれ以上の混合物である。１つの実施形態では、水性「キャリア」組成物は、適切な有機溶媒の混合物を含有する。１つの実施形態では、水性「キャリア」組成物は、有機溶媒を含有しない。
【００３３】
疎水性置換クロマトグラフィーは、キラル分析物、キラル置換剤およびキラルクロマトグラフィーマトリックスを用いて実施され得る。これらの条件下では、アキラル置換剤を用いてもよいが、キラル置換剤のラセミ混合物は用いられ得ない。ラセミキラル分析物はまた、アキラルクロマトグラフィーカラムおよびアキラル置換剤を用いて精製され得る。この場合、不純物（ジアステレオマーを含む）が目的のラセミ化合物から取り除かれるが、エナンチオマーのキラル分割はない。
【００３４】
アニオン性置換剤は、１つまたはそれ以上のキラル中心を有していてもよい（例えば、キラル置換剤化合物６８９および６９８（以下の表Ｖ〜ＸＩＩＩ参照）を参照）。置換剤６１３および６３９はアキラルな置換剤化合物を表す。キラルクロマトグラフィーマトリックス、移動相およびアキラルな置換剤の適切な選択により、エナンチオマーは、分取スケールで常に分解（分離）される。特定の環境に依存して、良好な鏡像異性的に純粋なキラル置換剤は、キラル固定相上でエナンチオマーの置換分離を実施する際に、良好なアキラル置換剤を超える性能の利点を有し得る。
【００３５】
（有用ｐＨ範囲）  一般式ＡまたはＢを有する種々のクラスのアニオン性疎水性置換剤は、荷電部分の化学的性質に依存して異なる有用ｐＨ範囲を有する。プロトン化可能なアニオン基を含むアニオン性疎水性置換剤は、実際のｐＫａ値を１〜２単位またはそれ以上上回るｐＨにて操作されるべきである。
・（スルホネート）  一般に、脂肪族スルホネート（ｐＫａ約−１．９）および芳香族スルホネート（ｐＫａ約−２．７）は、それらの非常に低いｐＫａ値のために、広範な有用ｐＨ範囲（１〜１１）を有する。
・（カルボキシレート）  一般に、単純脂肪族カルボキシレート（ｐＫａ約４．７）、Ｎ−アシル−α−フェニルグリシネート（ｐＫａ約３．０）、芳香族カルボキシレート（ベンゾエート、ｐＫａ約４．２）、およびサリチレート（オルト−ＯＨベンゾエート、ｐＫａ約３．０）はそれぞれ、６．７〜１０、５．０〜１０、６．２〜１０および５．０〜１０の有用ｐＨ範囲を有する。それらの充分に脱プロトン化された形態でさえ、いくつかのカルボキシレート置換剤は溶解限度を有する。
・（ホスホネート基）  ホスホネートは有用なアニオン性置換剤であるが、それらの使用は、第二の酸解離（ｐＫａ２）により複雑化され得る。ｐＨは、ＤＣにおける良好なクロマトグラフ分解能を得るために置換剤のほどんど（＞９０％）が１−体となる、またはほとんど（＞９０％）が２−体となるように調節されるべきである。一般に、単純脂肪族ホスホネート（ｐＫａ約２．２、７．７）は、４．２〜６．７（１−）および８．７〜１０（２−）の有用ｐＨ範囲を有し、その一方で単純芳香族ホスホネート（ｐＫａ約２．０、７．２）は、４．０〜６．２（１−）および８．２〜１０（２−）の有用ｐＨ範囲を有する。適切に配置された置換基が好都合に芳香族ホスホン酸のｐＫａ値をシフトし、かつそれらの有用ｐＨ範囲をシフトする。例えば、芳香族ホスホン酸における−ＰＯ３Ｈ２に対してオルト位の−ＯＣＨ３基はｐＫａ２値（２．３、７．９）を増大させ、その一方でメタ−ＮＯ２基（ｐＫａ約１．５、６．４）またはオルト−ＯＨ基（ｐＫａ約２．０、６．４）はｐＫａ２値を低下させる。
・（テトラアリールボレート）  一般に、これらの分子は、中性ｐＨ範囲（６〜８）に限定される。その範囲外での加水分解による不安定性の問題のためである。いくつかのテトラアリールボレートは溶解限度を有し、そして狭い範囲のカチオン性イオン対剤とともにのみ使用され得る。
・（アリールボロネート）  ほとんどの置換剤用途について、通常のアリールボロン酸のｐＫａ値（ｐＫａ約８．９）は余りに高すぎて、中性ｐＨ範囲において有用ではない。メタ−ＮＯ２（ｐＫａ約７．４）またはメタ−Ｃｌ（ｐＫａ約８．１）のような電子吸引性基を用いてさえ、ｐＫａ値はまだ高い。しかし、特定のポリオールの付加によるボロネートエステルの形成により、特定の場合において２．０〜２．５のｐＫａ単位分低いｐＫａ値を有する組成物となる。ポリオール分子の化学的性質はまた、得られるボロネートエステル置換剤の疎水性および溶解性に影響する。有用なポリオールとしては、フルクトース、リボース、ソルビトール、マンニトール、シス−１，２−ジヒドロキシシクロペンタンおよびシス−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフランが挙げられ、これらが７．１〜１０．０のｐＨ範囲内で有用な置換剤となる。典型的なポリオール濃度（ｍＭ）は、置換剤の約２倍の濃度、または置換剤の濃度よりも２５ｍＭ大きいものであり、いずれもより大きいものである。
【００３６】
（置換剤結合強度）  置換剤は、試料の全成分よりも強く、または少なくとも目的の主要成分全てよりも強く、カラムに結合すべきである。確かな経験則では、試料質量のわずか１〜４％しか、置換剤よりも強く結合すべきではない。
【００３７】
最適な置換剤は、固定相への結合が強すぎずかつ弱すぎないものであるべきである。適切な結合強度は、目的の分析物および付随する結合等温線に依存する。通常、広範な結合強度を有する広範な置換剤が、種々の異なるカラムおよび精製されるべき分析物に必要とされる。置換剤の結合が強すぎると、得られる性能は不十分である（例えば、分解能がより低くなる、分析物結合能が低くなる、置換剤の除去が困難、およびサイクル時間が長くなる）。置換剤の結合が弱すぎると、置換剤の下に置換された分析物の「テーリング」が過度に多い不十分な置換トレーン（ｔｒａｉｎ）が生じ得るか、または部分的な置換のみとなるか、もしくは全く置換がないものとなり得る。
【００３８】
適切な結合強度を有する置換剤を選択するのに役立つ便利な経験上の方法は、置換実験に用いられるものと同様のカラムおよび移動相を用いて、可能性のある置換剤および分析物の簡易グラジエント溶出クロマトグラフィーを実施することである。第一のスクリーンでは、置換剤は、６０分グラジエントで目的の分析物よりも５〜１５分遅く溶出するべきである。理想的には、１つの分析物および分析物混合物の等温線を測定するが、これは、時間を要し、かつしばしば非実用的である。それは結合等温線において早期に動作するので、この経験上の方法は、完全ではないが、さらなるＤＣ至適化に好都合な出発点を提供する。
【００３９】
（使用可能な結合等温線）  適切な結合強度とは別に、有用な疎水性置換剤は、特定の他の有用な特徴を有する結合等温線を有することが必要とされる。
【００４０】
（１）置換剤および分析物分子について単峰性で上方に凸状の等温線（ラングミュア型等温挙動）であることは、イソタクチック置換トレーンの規則的な形成を促進し、そしてその方法の最適化プロセスを簡素化する。これは、多くのアニオン性置換剤分子の有用な特性である。これに対し、多くの他の非荷電疎水性置換剤分子（例えば、芳香族アルコール（例えば、置換フェノール、ナフトール、ヒドロキシビフェニル）、脂肪族アルコール（例えば、１−ドデカノール、１，２−ドデカンジオール）および非荷電脂肪族カルボン酸（例えば、ミリスチン酸））の結合等温線は、低濃度で正常に挙動し、高濃度になると二峰性になり、再度上昇する（ＢＥＴ型等温挙動）。この結合挙動は、しばしば、各層が異なる結合特性を有する多層の疎水性置換剤の堆積から生じる。この結合挙動は、置換プロセスおよびその有用な実行を大いに複雑化させる。
【００４１】
（２）ＤＣにおけるクロマトグラフィー結果はまた、置換剤分子が溶液中で自己会合を受けた場合に複雑化され得る。濃度が増大するにつれて、置換剤の自己会合の問題が悪化する。また、アニオン性疎水性置換剤における荷電基は、水溶液中の自己会合の問題を減少させる。
【００４２】
（３）生成物および／または不純物の等温線がより高い非線形結合領域で置換剤の等温線と交叉する場合に、さらなる複雑化が生じ得る。この挙動は、置換順序の反転、置換バンド間の重なり領域のブロード化、および共置換の問題を生じる。このような場合、置換剤濃度のわずかな変動が置換トレーンに大きな変化を生じ得、それにより方法の最適化を非常に困難なものとし得る。
【００４３】
我々は、適切に設計したアニオン性置換剤分子に適切なカウンターイオン、および必要な場合、少量の有用な有機溶媒を補充することで、ラングミュア型結合挙動および有用範囲の結合強度を有する効果的な疎水性置換剤のファミリーを提供することを見出した。
【００４４】
（アニオン性置換剤のためのイオン対形成カチオン）  それらの多くの利点の全てと共に、アニオン性疎水性置換剤分子は、１つの余分な必要性（適切なイオン対形成カチオンＣＩ）を有する。カチオンは、置換剤の結合等温線ならびに置換剤の機能および有用性に有意に影響する。カチオンの濃度は、適切な量のイオン対形成カチオンのＣｌ−／ＨＣＯ２−塩を付加することにより、独立して調整される。荷電疎水性置換剤のイオン対形成カチオンの特性は、その置換特性に強く影響する。少数のカチオンが溶液中イオン対形成に関与し得、そして全てのカチオンが、疎水性マトリックス上で吸着状態にてイオン対形成に関与し得る。さらに、カチオンは、分析物（例えば、ｐＨ＝７でのアニオン性オリゴヌクレオチド）とともにイオン対形成に関与する。良好なクロマトグラフィー分解能のために、置換剤および分析物について、同じイオン対形成カチオンが用いられるべきである。有用なイオン対形成カチオンは、通常、一価に荷電化されている。それらの高い溶媒和エネルギーのために、通常、二価イオン（Ｃａ２＋）および三価イオン（Ｌａ３＋）はやや有用ではないが、いくつかの特殊な場合において用いられ得る。この原則に対する例外は、１つの有機イオン中で離れて位置する複数の一価の荷電部分（例えば、Ｍｅ３Ｎ＋（ＣＨ２）４Ｎ＋Ｍｅ３）である。これらのイオンもまた、ジ−カチオン性置換剤のためのカウンターイオンとして有用であり得る。
【００４５】
イオン対形成カチオンは、疎水性特徴が大きいほど結合強度を増大しかつ溶解度を減少させる傾向にある。さらに、疎水性置換剤を用いる場合、ＤＣの分解能は、カチオンそれ自体が過度に疎水性または過度に親水性であれば減少し得る。典型的には、カチオンの中間の疎水性／親水性特徴が最良の結果を与えるが、これは、精製される分子に依存して変動する。各精製について最適なイオン対形成カチオンは、実験的に決定されるべきである。揮発性のイオン対形成剤は減圧下で好都合に除去されるが、他方非揮発性のものは他の手段（例えば、ダイアフィルトレーション、沈降または結晶化）によって容易に除去される。表Ｉは、有用な一価のイオン対形成カチオンの一部のリストを示す。プロトン化アミン（ｐＫａ約９．８〜１１．０）、プロトン化アミジン（ｐＫａ約１２．５）またはプロトン化グアニジン（ｐＫａ約１３．５）のイオン対形成剤を用いる場合、操作ｐＨは、それぞれのアミンのｐＫａを２以上のｐＨ単位またはそれ以上下回るべきである。
【００４６】
【表１】
2014531604.tif 000007
【００４７】
（ＲＰマトリックスに対するアニオン性分析物のアンモニウムイオン対形成補助結合の評価）
・疎水性および結合増強は、脂肪族炭素原子数と共に増大する。
・同数の脂肪族炭素原子については、一級アンモニウム基が四級アンモニウム基よりも良好に分析物結合を増強する（ｎブチル−ＮＨ３＋＞Ｅｔ２ＮＨ２＋＞ＥｔＭｅ２ＮＨ＋＞Ｍｅ４Ｎ＋）。
・同数の脂肪族炭素原子については、直鎖状基が分岐状基よりも良好に分析物結合を増強する（ｎブチル＞ｉブチル）。
・同数の脂肪族炭素原子については、直鎖状基が環状基よりも良好に分析物結合を増強した（ｎペンチル＞シクロペンチル）。
・特定の化学部分については、アンモニウムイオンといくつかの分析物との間の水素結合が分析物結合を増強する；例えば、一級アンモニウムとリン酸ジエステル（オリゴヌクレオチド）およびグアニジニウムとカルボキシレート（Ａｓｐ含有ペプチドおよびＧｌｕ含有ペプチド）。
【００４８】
混合イオン対形成カチオンはしばしばクロマトグラフィー分解能の損失を生じるので、一般には回避されるべきである。しかし、混合カチオンが用いられ得る場合の１つの条件セットがある；すなわち、（ａ）目的のカチオンが、存在する他のカウンターイオンよりも有意に強いイオン対形成特性を有し、かつ（ｂ）目的のカチオンが、試料負荷混合物中および置換剤緩衝液中で化学量論的に過度に存在する場合である。
【００４９】
イオン対形成カウンターイオンの時間を要する可能性のあるスクリーニングを簡素化するために、イオン形成カチオンのための最初の出発点として、以下が推奨される：
・ペプチドおよび小タンパク質（ｐＨ＝６．０〜９．０）：Ｍｅ４Ｎ＋、Ｍｅ３ＮＨ＋、Ｍｅ３ＮＥｔ＋、Ｍｅ２ＥｔＮＨ＋
・オリゴヌクレオチド（ｐＨ＝６．５〜８．０）：ｎブチル−ＮＨ３＋、ｎペンチル−ＮＨ３＋、ｎヘキシル−ＮＨ３＋
・ＤＭＴ−Ｏｎオリゴヌクレオチド（ｐＨ＝７．０〜８．０）：ＥｔＮＨ３＋、Ｅｔ３ＮＨ＋。
【００５０】
多くの有用なアミンまたはアミン塩がＨＰＬＣグレードの純度で市販されていないため、有用な形態は、化学的により安定であり、かつ再結晶の繰り返しによってより容易に精製されるそれらのプロトン化アンモニウム塩である。適切なアミンのリン酸水素（２−）、モノメチルホスフェート（２−）、ホスホネート（２−、別称ホスファイト）、メチルホスホネート（２−）およびエチルホスホネート（２−）塩が以下のアニオン性置換剤とともに用いられ得る：[MeNH3+]2[HOPO32-]、 [Me3NH+]2[HOPO32-]、 [nBuNH3+]2[HOPO32-]、 [nC6H13NH3+]2[HOPO32- ]、[MeNH3+]2[EtPO32-]、 [Me3NH+]2[EtPO32-]、 [nBuNH3+]2[EtPO32-]、[nC6H13NH3+]2[EtPO32- ]。
【００５１】
（溶解度）  「疎水性クロマトグラフィー」またはより適切には「疎溶媒性クロマトグラフィー」において、主溶媒成分が水である場合、可能な疎水性置換剤分子はしばしば限られた溶解度を有する。疎水性分子は、当該疎水性分子に付着した「親水基」（例えば、荷電化イオン性基、親水性カウンターイオン、極性基、または水素結合供与体もしくは受容体として機能する基）が存在しない限り、通常、認識可能な程度にまで水中に溶解しない。芳香族分子は、π電子が弱水素結合受容体として作用する独特の様式のために、独特の様式にて水と相互作用する。さらに、芳香族分子は、水溶液中で直面するπスタッキングに関与し得る。これらの小さいが重要な効果は、シクロヘキサン（約１０μＭ）およびトランスデカリン（＜１μＭ）と比較してベンゼン（９ｍＭ）およびナフタレン（２００μＭ）の方が水の溶解度が高く、非水酸化アレーンと比較してフェノール（９６０ｍＭ）およびβ−ナフトール（７ｍＭ）の方が溶解度が高いことに反映されている。有用な置換剤分子の分子構造は、水中または低有機含量の水中の適度な溶解度（１０〜５０ｍＭ）を促進すべきであり、同時に、それが固定相に強く結合するのに十分に疎水性であるべきである。一般に、荷電化した置換剤分子は、荷電化した種（特にカウンターイオン）の増大した溶媒和エネルギーのために、中性のものよりも良好な溶解度特性を有する。それは、アニオン性分子が良好な置換剤として挙動するために、物理的特性および化学的特性の独特の平衡を必要とする。
【００５２】
一般的にいえば、不十分な置換剤溶解度を補うために有機溶媒のレベルを増大することが、有用な結果を生じることはまれであることに留意することが重要である。最良のクロマトグラフィー結果は、０〜２５％の有機溶媒、またはより好ましくは２〜１５％の有機溶媒で得られる。いくつかの場合では、より高い有機含量（２５〜７５％）での移動相が用いられ得るが、しばしば容量および分解能が悪くなる。
【００５３】
（還元生成物・置換剤会合）  疎水性置換クロマトグラフィーを用いる１つの潜在的な問題は、溶液中の疎水性分析物と疎水性置換剤との会合の可能性である。これは、分解能の顕著な損失およびコンタミネーションを生じ得る。固定相上の吸着した状態での置換剤−分析物会合もまた生じ得るが、適量の適切なイオン対形成剤が存在する場合はそれほど問題ではない。この問題を取り扱うのによい方法は、同じ電荷を有する荷電化した分析物および荷電化した疎水性置換剤を用いることである。これらの問題は、中性の疎水性置換剤と中性の疎水性分析物とが相互作用する場合に時折より高頻度で生じる。
【００５４】
（置換剤自己会合およびミセル形成）  化学的構造および物理的特性が伝導性であるいくつかの場合において、アニオン性疎水性分子が自己会合し、溶液中でミセルおよびミセル様の自己会合構造を形成し得る。この状況は、ＤＣの分解能の損失ならびに置換剤溶液の所望でない発泡を生じ得る。溶液中の置換剤は、種々の化学平衡によって相関される種々の形態におかれる。さらに、ミセルは、疎水性分析物分子のためのキャリアとして作用し、それらの分子を種々の形態で溶液中に存在させ得る。この所望でない現象は濃度依存性であり、そして少量の適切な有機溶媒（例えば、メタノール、エタノールまたはアセトニトリル）の添加によって効果的に抑制される。適切に設計されたアニオン性置換剤分子はミセル形成を抑制し、より良好な置換結果を与える。したがって、Ｒ基のＲ１〜Ｒ３について１２．０を下回る基疎水性指数の維持により、所望でない界面活性の問題が減少する。
【００５５】
（高純度−置換剤中の不純物）  置換剤は、十分な純度を有するべきである。分取クロマトグラフィーの目的は、目的の構成成分から不純物を除去することである。置換物自体による所望の化合物のコンタミネーションが問題となることはまれであるが、置換剤溶液中の「早期置換」不純物によるコンタミネーションは、場合によっては問題となり得、これは、不純物の量およびそれらの結合特性に依存する。したがって、良好な置換剤は、早期置換不純物をほとんどまたは全く含まないものであるべきである。
【００５６】
（適切なＵＶ吸光度）  ＤＣ実験を通して置換剤の位置および量を追跡して、置換剤のブレークスルー曲線を監視しそしてカラム再生手順の間に置換剤除去を行うために、中程度の紫外線吸収を有する置換剤を有することが有用である。高い吸収は必要ではなく、また高濃度の置換剤および分析物のためにも好ましくない。一般に、低吸光度の戦略的に位置づけられたウインドウを有するＵＶスペクトルを有する、無色の置換剤が好ましい。それにより、分析物をある周波数で追跡し、かつ置換剤を他の周波数でモニタリングすることができる。
【００５７】
（製造容易性および費用）  化学合成、生産および製造の便利な費用効果の高い方法は、有用な置換剤の製造および合理的な費用のために重要である。さらに、精製（特に、非クロマトグラフィー精製）のための実用的な方法が、費用効果的に純度要求を達成するために必要である。
【００５８】
（化学的安定性、低毒性および長期保存期間）  他の所望の化学的特性および物理的特性全ての中でも、有用な置換剤分子は、化学的に安定であるべきである。それは、分析物分子に対して不活性であり、かつ水、一般有機溶媒、穏やかな塩基、穏やかな酸、および酸素（空気）に対して化学的に安定（非反応性）であるべきである。それは、典型的な使用および保存条件下で光安定性でありかつ熱的に安定であり、そして適度な保存期間を有するべきである。置換剤分子は、視覚的に無色であるにも関わらず、必要レベルのＵＶ吸光度を有することが非常に好ましい。一般に、染料は、ＤＣにおける有用な置換剤とならない。有用な置換剤分子はまた、作業者の保護のためだけでなく、置換剤と接触し得る生物学的試料および薬物試料の保護のために、低毒性である必要がある。
【００５９】
（適切なクロマトグラフィーカラム）：逆相カラムの最も一般的なタイプはオクタデシル被覆シリカであるが、多くの疎水性の固定相がＤＣにおける有用性を見出している。適切な固定相の例を表ＩＩに列挙する。最終的には、固定相の最良の選択は、研究中の各システムについて実験的に決定される。
【００６０】
【表２】
2014531604.tif 000008
【００６１】
置換クロマトグラフィーにおけるより良好な結果は十分に充填されたカラム長さが長いほど得られ、より良好な回収および収率を与える。表ＩＩＩは、カラム寸法および初期流速の初期選択のためのガイドを提供する。
【００６２】
【表３】
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【００６３】
適切なカラム長さが良好な結果にとって重要である。それは、置換トレーンを十分にシャープにし、良好な分解能を与えるのに十分な長さであるべきである。なお、過度に長いカラムは分離時間を不要に増大させるので、時折床の充填が不十分となり、そして分解能を低下させる。多くの場合、良好なクロマトグラフィー結果を有する２つの十分に充填された短いカラムが、末端間接合され得る。小さな分子（ＭＷ＜３ＫＤａ）を用いる相当の実験は、最適なカラム長が、５μｍ粒子について１５〜４５ｃｍおよび１０μｍ粒子について２０〜６０ｃｍの範囲内にあることを示している。８０〜１００Åの孔径を有する多孔質粒子が伝統薬および小さなペプチドに適しており、１２０〜１５０Åの孔径が中程度および大きなオリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドに適しており、そして３００〜５００Åの孔径がほとんどのタンパク質およびＤＮＡに適している。無孔性粒子が用いられ得るが、負荷容量は有意に減少する。
【００６４】
円筒カラムにおいて、流れの軸に対して垂直であるように平面フローフロントを樹立することが重要である。小型のカラムで最適化プロトコルが一旦開発されれば、より大量の試料の精製までスケールアップすることは、置換クロマトグラフィーにおいて簡単かつ容易である。最短の許容可能なカラム長が見出された後、スケールアップは単に、一定の線形流速を維持しながらカラム直径を増大させることにより達成される。適切な改変と共に、置換クロマトグラフィーは、半径流カラムと共に、および軸流モノリスカラムと共に用いられ得る。置換クロマトグラフィーの原理はまた、分析用および分取用の薄層クロマトグラフィーにおいて適用され得る。
【００６５】
（連続置換クロマトグラフィー実験の実行）
有機化合物、伝統薬およびペプチドの置換クロマトグラフィーは長年にわたって実施されているが、並〜不十分という結果がしばしば得られる。本明細書中に開示されるような良好な置換剤、良好なカラムおよび良好な操作プロトコルにより、優れた再現性および顕著に良好なクロマトグラフィー性能に至る。
【００６６】
（置換剤および濃度）  初期評価は、適切な結合強度を有するトリメチルアンモニウム塩のような良好な汎用のアニオン性置換剤を用いて行われる。操作ｐＨにて、アニオン性分析物分子はアニオン性置換剤を必要とする。操作ｐＨにて、アニオン性置換剤は、アニオン性および中性の分析物を精製するために用いられ得る。置換剤は、精製されるべき材料よりも強くカラムに結合すべきであるが、置換剤は、過度に強く結合すべきではない。典型的な置換剤濃度は、１０〜５０ｍＭの範囲内である。初めは、置換剤濃度は１０〜１５ｍＭに設定される。必要に応じて、ｐＨ緩衝液およびイオン対形成剤が置換剤溶液に添加される。置換剤溶液およびキャリア溶液は、置換剤の存在およびイオン対形成塩のレベルを除いて、同一の組成（ｐＨを含む）を有するべきである。置換剤５７９、６０９および６３４（以下の表Ｖ〜ＸＩＩI参照）は、良好な汎用のアニオン性置換剤の例である。方法の最適化の間、２０〜３０ｍＭまたはそれ以上まで置換剤濃度を増大させることが有用であり得る。
【００６７】
（イオン対形成剤の選択）  表Ｉは、疎水性クロマトグラフィーにとって有用である、有用な一価のイオン対形成カチオン（ＣＩ）のリストを含む。それらは、置換剤または分析物が荷電化されている場合に必要である。アニオン性分析物および置換剤について、結合等温線は、カウンターイオンの化学的特性およびその濃度に強く依存する。中〜中強の結合特性を有するイオン対形成カチオンが、通常、使用に最良である。初期実験の間は、トリメチルアンモニウムホルメートまたはホスフェートで開始する。分析物がイオン対形成剤を必要とする場合、それは、通常、ＤＣ実験の間にイオン対形成剤の選択を決定づける。分析物および置換剤のイオン対形成剤は同じであるべきである。
【００６８】
（イオン対形成剤の濃度）  先に述べたように、良好なイオン対形成剤を不十分なレベルで用いることは、置換クロマトグラフィー実験において不十分なクロマトグラフィー性能となる主な原因の１つである。試料溶液中のイオン対形成剤の適切な濃度（ＣＩＰＳ，ｍＭ）を算出する式は以下によって示される：
ＣＩＰＳ＝Ｅｓ×Ｃｓ（ｍＭ）×Ｇｓ
ここで、Ｅｓは試料についての過剰係数であり、Ｃｓは試料濃度（ｍＭ）であり、そしてＧｓは操作ｐＨでの試料の正味電荷の絶対値である。Ｅｓの最適値は、実験的に決定される必要があるパラメータである。置換剤溶液中のイオン対形成剤の適切な濃度（ＣＩＰＤ，ｍＭ）を算出する式は以下によって示される：
ＣＩＰＤ＝Ｅｄ×Ｃｄ（ｍＭ）×Ｇｄ
ここで、Ｅｄは置換剤についての過剰係数であり、Ｃｄは置換剤濃度（ｍＭ）であり、そしてＧｄは操作ｐＨでの置換剤の正味電荷の絶対値である。Ｅｄの最適値は、実験的に決定される必要があるパラメータである。少なくとも化学量論量のイオン対形成剤が溶液中に存在することが必須である（Ｅｓ≧１．０およびＥｄ≧１．０）。実際、我々の経験では、Ｅｓは１．１〜１０．０の範囲内、より好ましくは１．２〜６．０の範囲内、よりなお好ましくは１．５〜４．５の範囲内にあるべきである。さらに、我々の経験では、Ｅｄは１．１〜１０．０の範囲内、より好ましくは１．２〜４．０の範囲内にあるべきである。クロマトグラフィー性能の重大な低下は、イオン対形成濃度が最適でないかまたは低すぎる場合、すなわち、Ｅｓ＜１．０および／またはＥｄ＜１．０の場合に生じる。
【００６９】
（ＲＰカラムの選択）  初期の逆相作業について、いくつかの良質のオクタデシル担持シリカまたはフェニルヘキシル担持シリカカラムが評価されるべきである（５μｍ球状粒子で寸法４．６×２５０ｍｍ）。より大きな分取カラムへのスケールアップはこれからすることができ、比較的容易である。重要な問題は、適切な孔径を選択することである。過度に大きいまたは過度に小さい孔を有するマトリックスはしばしば、容量低下、および時に分解能低下に至る。上記表ＩＩおよびＩＩＩを参照。
【００７０】
（流速）  置換クロマトグラフィーは「準平衡技術」であるので、比較的遅い流速がしばしば必要とされる。最適な流速は、分解能を損失することなく可能な限り最速の流速である。試料負荷の流速および置換剤流速は、ともに３５〜１０５ｃｍ／時間の範囲内で、ほぼ同じであるべきである。伝統薬、オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドについては７５ｃｍ／時間、またはタンパク質およびＤＮＡについては４０ｃｍ／時間で開始する。再生流速は、置換流速の２〜８倍であるべきである。逆相カラム上で高温にて薬、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドを精製する場合、より速い流速が用いられ得る。
【００７１】
（温度）  逆相クロマトグラフィーおよび他の形態の疎水性クロマトグラフィーは大部分は＋ΔＨと共に＋ＴΔＳによって行われるので、温度が高いほど、しばしば結合が強くなり、結合反応速度が速くなり、そして分解能の差異が明瞭となる。結果として、カラムの温度およびある程度は置換緩衝液の温度が、バンドのブロード化を防ぐために注意深く制御されるべきである（＋／−０．５℃）。初期作業はしばしば２５℃にて実施され、次いで試料が許容しかつ有機溶媒の沸点が適切であれば、温度上昇（４５、６５℃）が試される。
【００７２】
（有機溶媒の選択）  ほとんどの水混和性有機溶媒が機能するが、アセトニトリル、メタノールおよびエタノールが最も一般的に用いられる。いくつかのＤＣ精製は、有機溶媒をほとんどまたは全く用いずに実施される。これは、低塩および低有機溶媒による非変性タンパク質の実用的なＲＰＣおよびＨＩＣ精製を可能にする。有機溶媒を用いない操作は、揮発性の可燃性の溶媒に関連した安全性の問題がある場合にも有用であり得る。実験する場合、まず、ペプチド、低分子量有機薬物および小さなタンパク質についてアセトニトリル、または大きなタンパク質、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡについてメタノールが試される。水中の試料の溶解度が許容可能であれば、キャリア緩衝液、置換剤緩衝液、および試料負荷溶液中、３％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ、４％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨまたは５％（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨで開始する；これらの３つの溶液中の有機含量は、同じであるべきである。有機溶媒含量は、各試料、カラム、および置換剤について最適化される必要がある重要なパラメータである。汎用の操作のために、有機溶媒は、約１５容量％未満、より好ましくは約１０容量％未満、よりなお好ましくは約５容量％未満であるべきである。オクタデシルカラムを用いる場合、２〜３容量％アセトニトリル、３〜４容量％エタノールまたは４〜５容量％メタノールが、通常、マトリックスの最適な機能化のために必要とされる。フェニルヘキシルカラムおよびオクチルカラムは、通常、有機溶媒の非存在を許容し得る。
【００７３】
（ｐＨおよびｐＨ緩衝液の選択）  ｐＨ緩衝液は、試料、置換剤、イオン対形成剤中、または固定相上にイオン化可能なプロトンが存在する場合、必要とされる。いくつかの分析物は、特定のｐＨ範囲内でのみ安定である。いくつかの分析物については、クロマトグラフィー分解能はｐＨ依存性が強い。アニオン性タンパク質を含むアニオン性試料（ｐＨ＞ｐＩ）は、アニオン性置換剤およびアニオン性ｐＨ緩衝液を用いて精製される。アニオン性ｐＨ緩衝液と関連したカチオンは、イオン対形成カチオンと同じであるべきであるが、いくつかの場合において、顕著に弱いイオン対形成特性を有するカチオンであってもよい。さらに、ややまれな場合において、カチオン性ｐＨ緩衝液が用いられ得るが、それらが主要イオン対形成カチオンよりも弱いイオン対形成特性を有する場合のみである。したがって、時にＮ−メチルモルホリン（７．４，ＮＭＭ）、トリエタノールアミン（７．８，ＴＥＯＡ）およびＴＲＩＳ（８．１）が、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウムまたはｎ−ブチルアンモニウムがイオン対形成カチオンである場合、ｐＨ緩衝液として用いられ得る。中範囲のｐＫａ値を有するアニオン性化合物が、有用なｐＨ緩衝液であり得る：カーボネート（９．９）、ボレート（９．０）、ＴＡＢS（８．９）、ＴＡＰＳ（８．４）、ＴＡＰＳＯ（７．６）、メチルホスホン酸（７．６，ＭＰＡ）、ＭＯＰＳ（７．２）、ＭＯＰＳＯ（６．９）、リン酸（６．８）、モノメチルリン酸（６．３）、亜リン酸（６．３）、ＭＥＳ（６．２）、３，３−ジメチルグルタル酸（５．９，ＤＭＧ）、コハク酸（５．２，ＳＵＣ）、酢酸（４．６，ＨＯＡｃ）。
【００７４】
【表４】
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【００７５】
（共置換）  数百もの成分および不純物を含む試料を用いて作業する場合、共置換が、ほとんど回避不能な現象である。ＤＣ実験が起こる結合等温線のどこにでも、目的の主成分と共置換するいくつかの微量成分が存在すると思われるためである。幸いなことに、置換クロマトグラフィーにおける共置換は、分取溶出クロマトグラフィーにおける共溶出に比べて遥かに深刻な問題ではない。共置換は、２つの条件下で生じる：（１）結合等温線が非常に類似しており、分解能が不十分である場合、および（２）結合等温線の操作領域近辺で結合等温線の交叉がある場合。幸いなことに、この問題を取り扱う簡単な方法がある：異なる条件下で第二のＤＣ実験を実施することであり、以下により結合等温線上の異なる点で操作することによる：
ａ．置換剤の濃度を変更する、
ｂ．異なる結合特性を有する異なる置換剤に変更する。
あるいは、等温線自体が、以下により変更され得る：
ｃ．クロマトグラフィーマトリックス（固定相）を変更する、
ｄ．有機溶媒の濃度を変更する、
ｅ．異なる有機溶媒に変更する、
ｆ．異なるイオン対形成剤に変更する、
ｇ．温度を変更する。
第二の「直交」ＩＰ−ＲＰ  ＤＣ工程は、典型的には、優れた収率（９０〜９５％）にて優れた純度（約９９．５％）を与える。
【００７６】
（カラム負荷）  ＤＣ実験は比較的高い負荷、典型的には、最大負荷容量の６０〜８０％の範囲内で実施される。操作カラム負荷容量は定数ではなく、むしろ結合等温線上でＤＣ実験が作用する場所に依存する。
【００７７】
使用のために、カラム容量の全部が利用可能であるわけではない（以下の「例外」参照）。実際には、カラム容量の９０〜９８％のみが使用可能である。試料をカラムに負荷したら、次いで置換剤緩衝液がカラムにポンプ注入される。展開する３つの先端があり、各々が、異なる速度でカラム下方に移動する：（１）液体前端（Ｔ１，置換剤緩衝液−置換剤）、（２）試料前端（Ｔ２）および（３）置換剤飽和前端自体（Ｔ３）。第一の前端は、第二の前端および第三の前端よりも速く移動して、使用可能なカラム容量を制限する。これは、第一の前端が、置換トレーン（Ｔ２）が外へ出始める前にカラムから出るべきであるためである。これらの前端の実際の速度は、置換流速に直接的に依存する。これらの前端速度の割合α（Ｖｅｌ１／Ｖｅｌ２）は以下の式によって示される：
α＝Ｋｍ／（Ｒ×Ｃｄ）
ここで、Ｋｍは、Ｃｄの置換剤濃度でのマトリックスの置換剤結合容量（ｍｇ置換剤／ｍＬ充填マトリックス）であり、ここで、Ｃｄは、置換剤緩衝液中の置換剤濃度（ｍｇ置換剤／ｍＬ置換剤緩衝液）であり、Ｒは、カラムの全容量に対するカラム中の液の容量の比（ｍＬ液／ｍＬ床容量）である。使用可能カラム容量の最大％は、以下により示される：
（１００×（α−１））／α。
以下の実施例２では、それぞれのα値は２１．９８であり、それぞれの最大使用可能容量は９５．４％である。Ｃｄが増大するにつれてＫｍもまた増大するが、等温線の非線形部の高い部分で操作する場合はそれほどでもないことに留意されたい。したがって、αが減少すると、使用可能カラム容量の最大％は減少する。
【００７８】
前記には例外がある。有意レベルの望ましくない早期置換不純物が試料中に存在する場合は、１００％超でさえもカラムの使用可能容量を増大させ得る。これは、カラムを過剰に負荷し、置換剤流を開始させる前の試料負荷の間にこれらの不純物をあふれ出させることによる。したがって、カラム負荷は、全試料に基づき最大１０５％であり得るが、カラム負荷は、主生成物＋後置換不純物の量に基づき８０％のみでもあり得る。
【００７９】
（試料負荷の方法）  ２つの方法のうち１つを用いて、試料注入バルブを介して試料がカラムに負荷される。試料は、ＤＣ実験が起こる結合等温線上の同じ点で、前端クロマトグラフィー条件下にて負荷されるべきである。キャリアは試料が負荷された後カラムを通過しない。方法１：試料負荷ポンプが用いられる；方法２：注入ループが用いられる。通常、部分ループ注入のみが用いられる。ループ内の試料は、まずキャリアによって、次いで置換剤溶液によって、カラム上のループ外へ流される（ｄｒｉｖｅｎ  ｏｕｔ）べきである。キャリアによって希釈された試料が負荷されないように、ループ容量の８５〜９５％以下がカラム上に負荷されるべきである。
【００８０】
（試料溶液の濃度および容量）  負荷試料の濃度は重要な操作パラメータである。最適試料負荷濃度（ｍｇ／ｍＬ）は、置換実験からの精製生成物の産出濃度と同じである−置換トレーンのプラトー領域。結合等温線、カラム結合容量および産出濃度は、初期は不明である。以下に示すような初期概算を用いて試料溶液をカラムに負荷する、最初の置換実験を単に実施する：
（１）作業を望む初期カラム負荷率を選定する、例えば７５％。  
試料負荷時間＝置換剤ブレークスルー時間（Ｔ３−Ｔ１）×０．７５
＝（７３６分−３１２分）×０．７５＝３１８分（実施例１について）
（２）２つの方法のうち１つにより、試料の初期濃度を選定する：
（ａ）初期試料濃度（ｍｇ／ｍＬ）＝０．１２×置換剤濃度（ｍＭ）×処方重量（ｍｇ／μモル）
＝０．１２×１０ｍＭ×２．３０ｍｇ／μモル＝２．７６ｍｇ／ｍＬ（実施例１について）
（ｂ）試料の概算カラム結合容量を選定する、例えば５０ｍｇ試料／ｍＬマトリックス。置換剤流速および試料負荷流速が同じであるとする：
初期試料濃度（ｍｇ／ｍＬ）＝
（カラム結合容量（ｍｇ／ｍＬｍ）×カラム容量（ｍＬｍ）／（（Ｔ２−Ｔ１）×試料流速（ｍＬ／分））
＝（５０ｍｇ／ｍＬｍ×４．１５５ｍＬｍ）／（（７３６分−３１２分）×０．２０８ｍＬ／分）＝２．３６ｍｇ／ｍＬ（実施例１について)。
負荷試料を用いた最初のＤＣ実験が過負荷状態（＞１００％負荷）を生じる場合、試料濃度を半分にして実験を繰り返す。最初の成功したＤＣ実験の結果から、試料を用いる間、実際の負荷濃度および実際のカラム負荷容量が容易に算出され、次いでこれらの値は第二のＤＣ実験のために試料濃度および負荷を調整するために用いられる。
【００８１】
（試料調製）  負荷試料溶液は、上記濃度および量にて調製される。ループの過充填または試料負荷ポンプおよび送達ラインのデッドボリュームの充填のために、十分過剰な溶液が必要とされる。ｐＨ、ｐＨ緩衝液の量および有機溶媒の量は、キャリアおよび置換剤緩衝液と同じである。試料をキャリアに溶解することでそのｐＨが変化するので、試料溶液のｐＨは、溶解後に再調整されなければならない。しかし、イオン対形成剤の量は異なっていてもよい。試料溶液に用いられるイオン対形成剤は、置換剤緩衝液に用いられるものと同じでなければならない。これに関して、試料のイオン対形成要件が、試料溶液中および置換剤溶液中でどのイオン対形成剤が用いられるかを決定づける。操作ｐＨでの形式化学電荷および主分析物の濃度に基づいて、イオン対形成剤またはイオン対形成塩の濃度が算出される。上記「イオン対形成剤の濃度」を参照。
【００８２】
試料の組成および履歴は既知であるべきである。試料がカチオンを含有する場合、その化学的性質および量（濃度）もまた既知であるべきである。（ａ）カチオンが存在しないことが明らかな場合、試料調製において調整はなされない。（ｂ）試料中のカチオンがＤＣにおいて用いたイオン対形成剤と同じである場合、それに応じて試料溶液へのイオン対形成剤の添加量は減らされる。（ｃ）試料中のカチオンがＤＣにおいて用いたイオン対形成カチオンよりも有意に弱いイオン対形成特性を有する場合、その存在は無視される。（ｄ）試料中のカチオンがＤＣにおいて用いたイオン対形成カチオンよりも強いイオン対形成特性を有する場合、進める前に、そのカチオンは交換または除去されるべきである。
【００８３】
（画分採集）−置換クロマトグラフィーは、優れたクロマトグラフィー分解能を与える（特に、良好なＣ１８逆相カラムを用いる最適化プロトコルの場合）。しかし、分解能は、視覚化が困難である。バンドの全てが、置換トレーンにおいて相次ぐバンドとして一緒にカラムから出てくるためである。小さな不純物のトライアングルバンドの多くは、３０秒未満の幅である（＜１００μＬ）。したがって、置換剤ブレークスルー時間が２５０分であり、かつ８０％試料負荷の実験では置換トレーンは約２００分幅であり、画分採集プロセスの間にクロマトグラフィー分解能が失われないように、４００を超える画分が採取されなければならない。４００画分の分析は実に啓発的であり興味深いが、困難な作業でもある。これは、オンラインのリアルタイム画分分析が有用である場合である。実際には、分解能を幾分か無視し、１００〜１３０のより大きな画分のみを採集し得る。この減じられた数の画分ですら分析は、相当量の作業となる。
【００８４】
分取ＤＣ実験を実施し、精製された主成分のみを目的とする場合、画分採集プロセスは、大いに簡素化される。種々の周波数（ＵＶ）で観察された置換トレーンの形状に基づいて、目的の主バンドの始まりおよび終わりを判断し、次いで両領域において約１０画分を分析し、どの画分をプールするかを決定する。１００〜１３０画分の代わりに２０画分を分析するのは、より容易な作業である。
【００８５】
以下の実施例３では、分析はずっと容易である。上記方法に基づいて、目的の主バンドの始まりおよび終わりを判断し、いかなる分析を行うこともなく保存的なプールを行い、最終のプールで１つの分析のみが実施される。
【００８６】
（置換剤除去およびカラム再生）  置換剤は、いかなるｐＨ緩衝液またはイオン対形成剤も用いることなく、５〜１０カラム容量の９５／５（ｖ／ｖ）エタノール−水または８０／１０／１０（ｖ／ｖ／ｖ）アセトニトリル−ｎプロパノール−水を用いて除去される。目的は、最短時間にてカラムから置換剤の９９．９％またはそれ以上より多くを効率的に除去することである。マトリックスが増大した背圧を許容する場合、カラム再生プロセスを加速するために流速が増大される（１００〜４００ｃｍ／時間）。置換剤の最大吸収（置換剤の指示書を参照）の付近で置換剤除去を観察することは、再生プロセスがＵＶ検出によって注意深くモニタリングされて最適化されることを可能にする。
【００８７】
（付加塩の効果）−水性溶媒中の塩によって、溶解された疎水性分析物および疎水性置換剤にとってより快適でない溶媒となり、疎水性クロマトグラフィーマトリックスに対するより強い結合を生じさせる。これは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の背後にある原理である。分析物の溶解度がこの塩溶液で十分である限り、塩の付加は、疎水性マトリックスへの分析物結合および選択性を調整するために良好な方法である。
【００８８】
いくつかの場合には、疎水性マトリックスに対する分析物結合は非常に弱く、十分な分析物結合を得るために付加塩が必要とされる。一般に用いられる塩溶液は、０．５〜２．５Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、ＮａＣｌおよびＫＣｌの１つを含む。種々の濃度での多くの異なる塩の助けで、置換モードのＨＩＣは、タンパク質の有用なクロマトグラフィー分離に多くのオプションを提供する。
【００８９】
（機器プロトコル）  実施例２のプロトコル例を参照（デュアルポンプ操作）。前の実験から残った置換剤は問題となる可能性があるので、プロトコルは、ラインパージ操作、迅速カラム再生、および平衡操作を有する。ＨＰＬＣシステムおよびカラムが完全にクリーンであり、試料負荷直前に適切に平衡化されることを確実にするためである。これらの工程は、単に予防であり、常に必要ではない。プロトコルは、１つのプロトコルに以下を含む：（ａ）予備平衡化シークエンス、（ｂ）平衡化シークエンス、（ｃ）試料負荷シークエンス、（ｄ）置換シークエンスおよび（ｅ）再生シークエンス。このシステムにおけるデッドボリュームの問題を克服するために、カラムにポンプ注入する直前に、負荷緩衝液、置換緩衝液および試料溶液の全てが、システムを通じて廃液にパージされる。このように、カラムでは、バルブ切り替え直後に無希釈溶液のシャープな先端が見える。試料溶液は、中で気泡が生じないように脱気されるべきである。注入ループを用いる場合、それらは、約１０％過充填される必要がある。過充填は、さらなる使用のために採集され得る。全量のループ注入は用いられるべきではなく、部分ループ注入のみが用いられるべきである。経験によれば、ループチューブの内径に依存して、ループ容量の８５〜９５％のみが用いられ得ることにより決定づけられる。試料溶液は、流れる溶液と混合して、それを希釈するためである。ループ内の試料は、負荷緩衝液によってカラムに流されるが、試料負荷プロセスの終わり頃に、流す溶液は置換剤緩衝液に変更される。このことは、置換剤緩衝液それ自体がカラムに直接ポンプ注入される直前に、置換剤緩衝液がシステムにわたってパージされることを可能にする。再生プロセスの初期の間は、より遅い流速が用いられる。したがって、高背圧の問題が生じることはまれである。置換剤のほとんどが除去されれば、より高い流速が用いられ得る。
【００９０】
（方法最適化）  全ての形態の分取クロマトグラフィーと同様、クロマトグラフィーの方法および手順の最適化が重要であるが、それは、いくらかの実験を要する。置換クロマトグラフィーの利益は、しばしば時間という代償を伴う。時間を要する要因は、方法最適化の間に最小化され得る。
・分離時間を考慮することなく、置換精製について最適に近い条件を決定する。
・置換剤濃度および試料負荷溶液の濃度を分解度が低下するまで増大する。
・置換流速および試料負荷流速を分解度が低下するまで増大する。
・前平衡シークエンスおよび置換剤除去／カラム再生シークエンスを短縮する。
【００９１】
既存のプロトコルは方法の最適化の有用な開始点を提供するが、それらは、研究中の特定試料について改変を必要とする。試料プロトコル（実施例２）を以下に示すが、これは、時間を考慮することなく純度について最適化したものである。目的の試料の特定の物理的特性およびクロマトグラフィー特性に適応した方法最適化を実施することが重要である。最適化に際し、長いプロセス時間（６００〜８００分）がしばしば２００〜３００分に減少され得、またある場合には１００〜１５０分に減少され得る。
【００９２】
置換モードで使用する疎水性クロマトグラフィーは、（ａ）高マトリックス生産性（マトリックスの寿命にわたるマトリックス１リットル当たりの生成物のグラム）、（ｂ）高容量生産性（カラム容量１リットル当たりの生成物のグラム）、（ｃ）高溶媒生産性（用いた溶媒１リットル当たりの生成物のグラム）を有するが、（ｄ）並の時間生産性（時間単位当たり生成物のグラム）を有し得る。適切な方法最適化は、時間要因を軽減する。
【００９３】
（適切に構成した計装）  小型分取ＨＰＬＣシステムについての典型的な計装構成を以下に示す。
・主ポンプ：ステンレス鋼、チタン、セラミック、ＰＥＥＫ；正確には０．０１〜１０ｍＬ／分の流速；３０００〜４５００ｐｓｉの圧力。
・オプションのカラムバイパスバルブ：２ポジションの６ポート切換バルブ（ステンレス鋼、ＰＥＥＫ）；カラムインラインまたはバイパスカラム。これは便宜的なオプションである。
・必要な試料注入バルブ：２ポジションの６ポート注入バルブ（ステンレス鋼、ＰＥＥＫ）、注入ループまたは試料注入ポンプ用。
・注入ループ：２０〜４０ｍＬの注入ループ（ステンレス鋼、ＰＥＥＫ）。ループは過負荷（約１０％）されるべきである。部分ループ注入のみが用いられ、典型的には、ループ容量の８５〜９５％以下である。注入ループまたは試料ポンプのいずれか１つを用いる。
・試料ポンプ：これは、試料注入用の主ポンプと同様である。試料はポンプヘッドの流路と適合するものであるべきである。注入ループまたは試料ポンプのいずれか１つを用いる。２ポンプ操作を用いる場合、２つのポンプの流速は、それらの流れが釣り合うように較正されるべきである。
・グラジエントミキサーは不要：置換クロマトグラフィーにおいてはグラジエントミキサーが回避または除去される。
・ＵＶ検出器：多波長またはフォトダイオードアレイ検出器、２００〜４００ｎｍ周波数範囲、短光路低体積石英フローセルを備える（０．２〜２．０ｍｍ流路、＜１０μＬ流量容量）。
・オプションの電気伝導度検出器：ＵＶ検出器後のフローセル（０．１〜２００ｍＳ、＜１００μＬ流量容量）を有する電気伝導度検出器；置換流速＜５００μＬ／分にて分析のために画分を採集する場合、伝導度フローセルが回避される。
・画分採集器：１０μＬ〜１０ｍＬ／画分（時間または滴数による）
・カラム冷却器／加熱器：０〜１００℃＋／−０．５℃。カラムを周辺温度と実質的に異なる温度で操作する場合、緩衝液溶液を加熱または冷却する配置を行う必要がある。
【実施例】
【００９４】
実施例１：中性ｐＨ付近にて置換剤５７９（４−ｎヘキシルベンゼンスルホネート）（アニオン性置換剤）を用いる粗独自ペプチド（２０マー）の置換クロマトグラフィー精製（図１Ａ−置換トレース、図１Ｂ分析を参照）
（操作条件）
出発ペプチド：粗２０マーペプチド、純度６５．８％、ＦＷ約２．３００ｍｇ／μモル、電荷＝−４
カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ１３０、５μｍ、１３５Å、４．６×２５０ｍｍ  ＳＳ、−Ｃ１８担持シリカ
流速：負荷＝２０８μＬ／分；置換＝２０８μＬ／分
イオン対形成剤：トリメチルアンモニウム（Ｍｅ３ＮＨ＋）；
温度＝２３℃；ｐＨ＝７．１；
置換緩衝液：１０．０ｍＭ  置換剤５７９＋１５ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４（ＨＰＬＣグレード）のＤＩ水ｗ／５％（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨ溶液、ｐＨ＝７．１、ｗ／３７％  Ｍｅ３Ｎ（ＨＰＬＣグレード）、最終Ｍｅ３ＮＨ＋濃度約２５ｍＭ。
負荷緩衝液：１５ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４（ＨＰＬＣグレード）の水ｗ／５％（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨ溶液、ｐＨ＝７．１、ｗ／３７％  Ｍｅ３Ｎ（ＨＰＬＣグレード）、Ｍｅ３ＮＨ＋濃度約２５ｍＭ。
試料溶液：３．０２ｍｇ／ｍＬペプチドの水と５％（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨとの溶液、１５ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４、ｐＨ＝７．１、ｗ／３７％  Ｍｅ３Ｎ、Ｍｅ３ＮＨ＋濃度約２５ｍＭ。
負荷量：負荷ポンプ（ポンプ２）から１５７．２ｍｇ；    負荷時間＝２５０．０分
画分サイズ：５２０μＬ；各画分に５ｍＬの蟻酸を添加し、ｐＨを３．５まで下げる；試料を即座に凍結する（−２０℃）（分析またはプールまで）。
【００９５】
（結果）
画分分析：希釈していない画分を、分析溶出ＨＰＬＣにて２１５ｎｍで分析した（１７μＬ注入容量）；算出を面積％に基づいて行う。
総実行時間：１２．３時間
出力濃度：２．７７ｍｇ／ｍＬ
カラム負荷：最大容量の８８．２％
カラム容量：
約４２．９ｍｇペプチド／ｍＬマトリックス（２．７９ｍｇペプチド／ｍＬ溶液（全試料基準））
約５８．６ｍｇペプチド／ｍＬマトリックス（２．７９ｍｇペプチド／ｍＬ溶液（純生成物基準））
約２１２μモル置換剤／ｍＬマトリックス（１０．０μモル置換剤／ｍＬ溶液）
純度％：９９．３％    ９９．３％    ９９．３％    ９９．３％
収率％：８０％        ８５％        ９０％        ９５％。
【００９６】
（コメント）  試料濃度／出力濃度＝１．１
試料中のＭｅ３ＮＨ＋の量＝４．７倍の化学量論的量。
良好な結果が、合理的な負荷（４２．９ｇ／Ｌ）で得られ、優れた純度および優れた収率（９９．３％の純度、９０％の収率）が小型の「分析型」カラムを用いて１工程で粗ペプチドから得られる。本実施例は、中性ｐＨ（７．１）にて、アニオン性置換剤をカチオン性イオン対形成剤と共に用いる粗合成アニオン性ペプチドの精製を示すために設けられている。トランス−アミド化反応の可能性を抑えるために、１級または２級アミンを用いるよりも、プロトン化３級アミンをＩＰ剤として選択した。様々な３級アミンのスクリーニングにより、トリメチルアミンが最良の分離能、純度および収率を与えたことが本実施例で明らかとなった。同様のカラムを用いる分取条件の下で、主要な不純物が、ｐＨ＝２．０（９８．６％の純度、９０％の収率；トリフルオロ酢酸を用いる３％  ＭｅＣＮ；データ示さず）よりもｐＨ＝７．１（９９．３％の純度、９０％の回収；リン酸トリメチルアンモニウムを用いる５％  ＭｅＯＨ）にてより良好に除去される。置換剤のバンドおよびぺプチドのバンドは完全にシャープであり、ほぼ矩形の置換バンドおよびほぼ均一な共置換（ｃｏｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を生じる（全量０．７％が５つの少量の不純物から構成される）。結果として、回収純度は９９．３％でほぼ不変であり、収率は８０〜９５％の範囲である。１つの不純物のみが両方のｐＨ条件（２．０、７．１）の下で共置換しており、２つの異なるｐＨ値での同様のカラムによるこのペプチドの２工程の精製により、２工程の収率が全体で８５〜９０％にて最終純度が９９．８〜９９．９％となる。
【００９７】
実施例２：粗合成オリゴヌクレオチドの精製のための置換プロトコル
（機器構成）  主ポンプ（１）（４つの緩衝液ラインを有する）、試料負荷ポンプ（２）（１つの溶媒ラインを有する）、ポンプ選択バルブ、カラムバイパスバルブ
ポンプ選択バルブ：６ポートバルブ（単一チャネルトグルロジックにより制御）（Ｓ３＝０、ポンプ１からカラム−ポンプ２から廃液、Ｓ３＝１  ポンプ１から廃液−ポンプ２からカラム）
カラムバルブ：６ポートバルブ（単一チャネルトグルロジックにより制御）（Ｓ６＝０、液流はカラムを通る、Ｓ６＝１、液流はカラムを回避する）
カラム後ＵＶフォトダイオードアレイ検出器（フローセル：０．５ｍｍ路長、９μＬ容量）に続き電気伝導度検出器（フローセル：１７０μＬ容量）；電気伝導度フローセルは、画分を分析のために採集中である場合、除去される。
負荷緩衝液＝ポンプ１上のＡライン（Ｓ１＝１−フローオン（ｆｌｏｗ  ｏｎ）、Ｓ１＝０−フローオフ（ｆｌｏｗ  ｏｆｆ））；置換剤緩衝液＝ポンプ１上のＢライン（Ｓ２＝１−フローオン、Ｓ２＝０−フローオフ）；置換剤除去緩衝液＝ポンプ１上のＣライン（Ｓ４＝１−フローオン、Ｓ４＝０−フローオフ）；カラム保存緩衝液＝ポンプ１上のＤライン（Ｓ５＝１−フローオン、Ｓ５＝０−フローオフ）；試料溶液＝ポンプ２上のＡライン（Ｓ７＝１，試料フローオン、Ｓ７＝０  試料フローオフ）。試料溶液を濾過（０．２μ）し、脱気する。
シークエンスが開始する前、清浄したカラムをＡ緩衝液を用いて短時間パージし、カラム保存緩衝液を除去する。他の詳細の説明については実施例３を参照。
置換剤除去緩衝液（Ｃ緩衝液）＝１０％（ｖ／ｖ）１−プロパノール、１０％（ｖ／ｖ）ＤＩ水（アセトニトリル中）。
カラム保存緩衝液（Ｄ緩衝液）＝７０／３０（ｖ／ｖ）メタノール／水（ギ酸（１５ｍＭ）およびギ酸アンモニウム（１５ｍＭ）を有する）。
【００９８】
【表５】
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【００９９】
実施例３：中性付近ｐＨにて置換剤６０７ｂ（５−ｎヘキシル−２−ヒドロキシベンゼンスルホネート）（アニオン性置換剤）を用いる粗オリゴヌクレオチド（２０マー）の置換クロマトグラフィー精製（図２Ａ参照）
（操作条件）：
出発ペプチド：粗合成オリゴヌクレオチド（２０マー、Ａ２Ｇ６Ｔ８Ｃ４、アンモニウム塩、モノチオホスフェート骨格）、８２．２％純度、ＦＷ＝６．７３９７ｍｇ／μモル、電荷＝−１９。
カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ１３０、５μｍ、１３５Å、４．６×２５０ｍｍ  ＳＳ，−Ｃ１８担持シリカ。
流速：負荷＝２０８μＬ／分；置換＝２０８μＬ／分。
イオン対形成剤：ｎブチルアンモニウム（ｎＢｕＮＨ３＋）
温度＝２３℃
ｐＨ＝７．０
置換剤緩衝液：１５．０ｍＭ  置換剤６０７ｂ＋２０ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４（ＨＰＬＣグレード）＋５０ｍＭ精製ｎＢｕＮＨ２（ＤＩ水ｗ／５％（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨ、ｐＨ＝７．０ｗ／５０％  ＨＣＯ２Ｈ（ＨＰＬＣグレード）。
負荷緩衝液：２０ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４（ＨＰＬＣグレード）＋５０ｍＭ精製ｎＢｕＮＨ２（水ｗ／５％（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨ、ｐＨ＝７．０ｗ／５０％  ＨＣＯ２Ｈ（ＨＰＬＣグレード）。
試料溶液：３．７８ｍｇ／ｍＬ（５６１μＭ）オリゴ（水と５％（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨ中）、２０ｍＭ    Ｈ３ＰＯ４＋１００ｍＭ精製ｎＢｕＮＨ２；ｐＨ＝７．０ｗ／５０％ＨＣＯ２Ｈ（ＨＰＬＣグレード）。
負荷量：１２４．２ｍｇ（負荷ポンプ（ポンプ２）より）；負荷時間＝１５８．０分（２．６３時間）
画分サイズ：６２４μＬ
試料調製：粗合成２０マーオリゴヌクレオチドのアンモニア水溶液（２５．１ｍｇ／ｍＬ）を、減圧下でロータリーエバポレータ（３０℃）に入れ、ほとんどすべてのＮＨ３および水が除去されるまでそのままとし、無色で粘性の残渣を形成する。希釈緩衝液１および負荷緩衝液の組合せを用いて、試料を（ロータリエバポレータで溶媒を除去する前の）同様の元の容量まで再希釈し、試料が１００ｍＭのｎＢｕＮＨ３＋を含有するようにする。ほんのわずかなｐＨ調整のみが必要である。一部の濃縮物を、２５．１ｍｇ／ｍＬから３．７８ｍｇｍ／ｍＬまで希釈緩衝液２を用いて希釈する。希釈した試料溶液を濾過し、脱気し、そして使用まで４℃で保管する。希釈緩衝液１は、１２０ｍＭのｎＢｕＮＨ３＋を用いることを除き、負荷緩衝液と同様である。希釈緩衝液２は、１００ｍＭのｎＢｕＮＨ３＋を用いることを除き、負荷緩衝液と同様である。
【０１００】
（結果）
画分分析：画分分析は実施せず。精製画分を置換トレースの形状に基づいて保存的に（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｌｙ）プールする。
プールした生成物の分析を分析溶出ＩＰ−ＲＰクロマトグラフィーおよびアニオン交換クロマトグラフィーを用いて実施する。画分を２６０ｎｍでモニタリングする；算出を面積％に基づいて行う。
総実行時間：７．５時間
出力濃度：２．４０ｍｇ／ｍＬ
カラム負荷：全試料を基準とする最大容量の１００．３％
主バンドを基準とする最大容量の８５．２％
カラム容量：約３０．０ｍｇオリゴ／ｍＬマトリックス（２．４０ｍｇオリゴ／ｍＬ（全試料基準））
約３５．３ｍｇオリゴ／ｍＬマトリックス（２．４０ｍｇオリゴ／ｍＬ（主バンド基準））
約２２１μモル置換剤／ｍＬマトリックス（１５．０μモル置換剤／ｍＬ溶液）
純度％：９９．０％
収率％：７５％；データは、画分分析なしの保存的画分プールに基づく；実際の有効収率は、もっと高いと思われる（８０〜８５％）。
【０１０１】
（コメント）  試料濃度／出力濃度＝１．５７
試料中のｎＢｕＮＨ３＋量＝９．４倍化学量論量。
負荷濃度が少々高く（３．７８ｍｇ／ｍＬと２．４０ｍｇ／ｍＬ）、そして負荷量が少し高い（１００％と８０％）にも関わらず、良好な結果が、合理的な負荷（３０．０ｇ／Ｌ）および良好な純度（９９．０％の純度、７５％の収率）で小型の「分析型」カラムを用いて１工程にて粗オリゴヌクレオチドから得られる。本実施例は、アニオン性置換剤をカチオン性イオン対形成剤と共に用いる粗合成オリゴヌクレオチドの置換精製を示すために設けられている。本実施例はまた、画分の広範な分析を行うことなく、試料のプールに成功し得ることを示す。１級、２級および３級アミン、ならびに４級アンモニウム塩のスクリーニングにより、合理的な結合強度および分解能を生じる３つのイオン対形成剤：ｎＣ４Ｈ９ＮＨ３＋、ｎＣ５Ｈ１１ＮＨ３＋およびｎＣ６Ｈ１３ＮＨ３＋を示す。分取ＩＰ−ＲＰ置換クロマトグラフィーは、オリゴヌクレオチドの分取アニオン交換置換クロマトグラフィーの補完かつ置き換えの両方となる。さらに、この方法は中性付近のｐＨ（ｐＨ＝７〜８）で操作され、かつオリゴ−ＲＮＡの精製に適合可能である。
【０１０２】
実施例４：ＨＰＬＣ分析
方法４ａ、４ｂ−アニオンについての逆相（スルホネート、カルボキシレート）：
試料注入：２５μＬの約１ｍＭ試料溶液（Ａ緩衝液中）
ＵＶ検出：２０８〜２２０ｎｍ（分析される化合物に依存）
流速：１．０ｍＬ／分。
Ａ緩衝液：５％ＣＨ３ＯＨ（ｖ／ｖ）（ＨＰＬＣグレード蒸留水（１５ｍＭリン酸（ＨＰＬＣグレード）および２５ｍＭトリメチルアミン（ＨＰＬＣグレード）を含む）中）；メタノール添加前の緩衝液のｐＨは７．１０＋／−０．０５である。
Ｂ緩衝液：５％Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）（ＨＰＬＣグレードＣＨ３ＯＨ（１５ｍＭリン酸（ＨＰＬＣグレード）および２５ｍＭトリメチルアミン（ＨＰＬＣグレード）を含む）中）。
サーベイグラジエント法：１００％Ａ                ０〜２分
１００％Ａから１００％Ｂ  ２〜６２分
１００％Ｂ                ６２〜７０分
分析グラジエント法：    １５％Ｂ                  ０〜２分
１５％Ｂから５０％Ｂ      ２〜６２分
５０％Ｂから１００％Ｂ    ６２〜６７分
１００％Ｂ                ６７〜７０分。
【０１０３】
方法４ｃ−アニオンについての逆相（ホスフェート、ホスホネート）：
試料注入：２５μＬの約１ｍＭ試料溶液（Ａ緩衝液中）
ＵＶ検出：２０８〜２２０ｎｍ（分析される化合物に依存）
流速：１．０ｍＬ／分。
Ａ緩衝液：５％ＣＨ３ＯＨ（ｖ／ｖ）（ＨＰＬＣグレード蒸留水（１５ｍＭリン酸（ＨＰＬＣグレード）および２５ｍＭトリメチルアミン（ＨＰＬＣグレード）を含む）中）；緩衝液のｐＨは、メタノールの添加前に蟻酸を用いて６．１０＋／−０．０５に調製される。
Ｂ緩衝液：５％Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）（ＨＰＬＣグレードＣＨ３ＯＨ（１５ｍＭリン酸（ＨＰＬＣグレード）、２５ｍＭトリメチルアミン（ＨＰＬＣグレード）および蟻酸（緩衝液Ａと同量を含む）中）
サーベイグラジエント法：  １００％Ａ                    ０〜２分
１００％Ａから１００％Ｂ      ２〜６２分
１００％Ｂ                    ６２〜７０分。
【０１０４】
方法４ｄ−アニオンについての逆相（ボロネート）：
試料注入：２５μＬの約１ｍＭ試料溶液（Ａ緩衝液中）
ＵＶ検出：２０８〜２２０ｎｍ（分析される化合物に依存）
流速：１．０ｍＬ／分。
Ａ緩衝液：５％ＣＨ３ＯＨ（ｖ／ｖ）（ＨＰＬＣグレード蒸留水（１５ｍＭメチルホスホン酸（ＨＰＬＣグレード）、２５ｍＭトリメチルアミン（ＨＰＬＣグレード）および３５ｍＭシス−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフランを含む）中）；メタノール添加前の緩衝液のｐＨは、７．９０＋／−０．０５である。
Ｂ緩衝液：５％Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）（ＨＰＬＣグレードＣＨ３ＯＨ（１５ｍＭメチルホスホン酸（ＨＰＬＣグレード）、２５ｍＭトリメチルアミン（ＨＰＬＣグレード）および３５ｍＭシス−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフランを含む）中）
サーベイグラジエント法：  １００％Ａ                    ０〜２分
１００％Ａから１００％Ｂ      ２〜６２分
１００％Ｂ                    ６２〜７０分。
【０１０５】
方法４ｅ−長鎖アルキルハライドについての逆相：
試料注入：２５μＬの約１ｍＭ試料溶液（Ａ緩衝液中）
ＵＶ検出：２００〜２２０ｎｍ（分析される化合物に依存）
流速：１．０ｍＬ／分。
Ａ緩衝液：５％ＣＨ３ＣＮ（ｖ／ｖ）（ＨＰＬＣグレード蒸留水（０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含む）中）
Ｂ緩衝液：５％Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）（ＨＰＬＣグレードＣＨ３ＣＮ（０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含む）中）
グラジエント法：  ５０％Ａ／５０％Ｂ                    ０〜２分
５０％Ａ／５０％Ｂから１００％Ｂ      ２〜６２分
１００％Ｂ                            ６２〜７０分。
【０１０６】
実施例５：４−ｎヘキシルベンゼンスルホン酸（置換剤５７９；遊離酸、ｆｗ＝２４２．３４）の調製
９７．３７ｇの新たに蒸留したｎ−ヘキシルベンゼン（０．６０モル、ｆｗ＝１６２．２７６、約１１３ｍＬ）を、１Ｌの３口丸底フラスコ（還流冷却器、マグネチックスターラー、５００ｍＬ添加漏斗、およびテフロン（登録商標）コートした熱電対を備える）中で３００ｍＬの攪拌中の無水１，２−ジクロロメタンに添加する。ガラス器具および他の器具をオーブン中で乾燥して表面水分を取り除く。還流冷却器は、安全予防策であることを除き、実際には必要とされない。反応を緩慢なＮ２パージとともに乾燥窒素雰囲気下で行う。室温で、６９．９２ｇのクロロスルホン酸（ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｎｉｃ）（０．６０モル、ｆｗ＝１１６．５２５、約４０ｍＬ）の３００ｍＬ無水１，２−ジクロロエタン溶液を、全体の添加が約６０分で完結するような速度（約５〜６ｍＬ／分）で撹拌反応混合物に滴下にて添加する。穏やかな発熱反応が観察される（約１０℃）。すべてのクロロスルホン酸を添加した後、混合物を室温で約２０時間撹拌する。反応混合物をＨＰＬＣで定期的にモニタリングする。２０〜２４時間後、残渣のｎ−ヘキシルベンゼンが元の量の５〜１０％である際に、反応が完結したと考えられる。そうならない場合は、追加のクロロスルホン酸のジクロロエタン溶液を、混合物をさらに１２時間撹拌しながら、添加する。反応の終わりで、少量の残渣である未反応のヘキシルベンゼンが観察され、ジスルホン化の兆候が見られない。その後の精製により除去されるいくつかのモノスルホン化異性体が観察される（０．５％  ３−異性体、３．５％  ２−異性体）。この時点で、反応溶液は透明な黄色の溶液である。しかし、反応溶液が曇りまたは濁っている場合、これは、少量の水が系内に入ったことを示す。混合物を湿った空気に晒すことなく、溶媒およびＨＣｌ副生成物を減圧下で除去して、明褐色の油状生成物を得る。ガス状のＨＣｌを、低温トラップを用いる前にＫＯＨペレットを含むトラップを用いて除去し、溶媒および他の揮発成分を保持する。最終的に、生成物を、室温で２４時間高真空下（０．０１トル）に置いて、揮発成分の除去を完了する。４−ｎヘキシルベンゼンスルホン酸（遊離酸）のこの調製をまた、その後の調製に使用する（生成物ａ）。あるいは、生成物を、最少量の乾燥ｎ−ペンタン（約１．５Ｌ）に溶解し、次いでペンタン溶液として使用する（生成物ｂ）；ペンタン中のスルホン酸の濃度をＨＰＬＣで測定する。再度、混合物を湿気に晒すことなく、ｎ−ペンタンを減圧下で除去し、精製された明褐色の油状生成物を得る（生成物ｃ）。留意すべきは、ペンタン溶液の作製の際、ほとんどのスルホン酸生成物（９０〜９５％）が溶解することである；ペンタンに不溶の画分を他の使用のために保管する。しかし、スルホン酸生成物が少しの外気の湿気に晒された場合は、オキソニウム塩が形成され、これはペンタンに不溶であり、そしてより少量のスルホン酸がペンタン抽出の間に溶解する。ｎヘキシルベンゼンスルホン酸（遊離酸）は、独特の分子であり、事実上すべての溶媒（ｎ−ペンタン、シクロペンタン、塩化メチレン、１，２−ジクロロエタン、ジエチルエーテル、ｔブチルメチルエーテル、アセトニトリル、トルエン、ジオキサン、イソプロパノール、��水エタノール、メタノールおよび水）にかなり可溶である。
【０１０７】
実施例６：４−ｎヘキシルベンゼンスルホン酸一水和物（ＯＨ３＋塩、ｆｗ＝２４２．３４）の調製
（方法Ａ）  正確に１当量の精製水（約１０．８ｇ）を、実施例５のｎヘキシルベンゼンスルホン酸（遊離酸）生成物（生成物ａ）全体に撹拌しながら滴下により注意深く添加する。水との反応は発熱が著しい。冷却した反応混合物を、ｎヘキシルベンゼンおよび他の有機材料を除去するために２００ｍＬのｎ−ペンタンで２回抽出する。合わせたペンタン画分を、残渣のペンタンをスルホン酸一水和物から減圧下で除去するうちに廃棄する。反応をほぼ定量的であり、粘性のある明褐色の液体を得る。
【０１０８】
（方法Ｂ）正確に１当量の精製水（６〜１０ｇ）を、実施例５のｎヘキシルベンゼンスルホン酸（遊離酸）生成物のｎ−ペンタン溶液（生成物ｂ）全体に激しく撹拌しながら滴下により注意深く添加する。水との反応は発熱が著しい。冷却した反応混合物を約０℃まで冷却し、上方のペンタン層を除去し、そして下方の生成物層を２００ｍＬのｎ−ペンタンで１回抽出する。合わせたペンタン画分を、残渣のペンタンをスルホン酸一水和物から除去するうちに廃棄する。反応はほぼ定量的であり、粘性のある黄色の液体を得る。
【０１０９】
（方法Ｃ）  上記方法は簡易かつ直接的である一方、生成したアルキルスルホン酸は純度に劣り、精製することが困難である。別の方法には、次に遊離酸に再変換するナトリウム塩の単離および精製が挙げられる。２６．４ｇの精製および再結晶化された４−ｎヘキシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（１００ミリモル、ｆｗ＝２６４．３２）を３００ｍＬのＨＰＬＣグレード２−プロパノールに懸濁させる。撹拌混合物を７０℃まで約１０分間加熱し、次いで、０〜５℃まで冷却する。冷却混合物の重量を量る。ガス状ＨＣｌを、温度を１０℃未満に維持しながら（溶液が猛烈に発熱する点に注意）、冷却した撹拌混合物中でゆっくりかつ注意深くバブリングする。ＨＣｌの添加を、１８〜２０ｇのＨＣｌ添加後に停止する。撹拌混合物を注意深く約５０℃まで加温し、そしてその温度で約６時間維持する。溶媒および過剰のＨＣｌを減圧下（ロータリーエバポレータ）で除去する。３００ｍＬの２−プロパノールを混合物に添加し、そして再び溶媒を減圧下で除去する。残渣を１５０ｍＬのジエチルエーテルに溶解し、溶液を濾過し、そして溶媒および他の揮発分を、ロータリーエバポレータを用いて減圧下で除去する。最終的に、生成物を、室温にて２４時間高減圧下（０．０１トル）に置き、すべての揮発分の除去を完結させる。この手順により、２２〜２３ｇの純粋で無色の粘性オイルを得、これをＰ２Ｏ５を負荷したデシケータで暗中に５℃にて保管する。出発物質のナトリウム塩は純粋であるので、得られるスルホン酸一水和物の純度は９９．７％を上回る（ＨＰＬＣ）。残渣の塩化物含量は０．５モル％未満である。カールフィッシャー滴定により、スルホン酸が一水和物として存在することが示される（０．９〜１．１当量Ｈ２Ｏ／スルホン酸）。
【０１１０】
（方法Ｄ）  １，２−ジクロロエタンまたはＨＣｌを除去する前に実施例５の最終反応溶液に、１０．８ｇの精製水を撹拌しながら注意深く滴下する。アルキルベンゼンスルホン酸の一水和物の溶液は、ジクロロエタンに室温で可溶である。しかし、低温（−２０℃）で、高級アルキルスルホン酸（ｎオクチル、ｎノニル、ｎデシル、ｎウンデシル）の一水和物は、溶液から無色の蝋質結晶としてよく結晶化する。高級アルキルスルホン酸のオキソニウム塩を、湿気がない環境（乾燥Ｎ２）内での焼結ガラスを通じた低温濾過を用いて分離する。結晶を、冷却した無水溶媒（ジクロロエタン／ペンタン（５０／５０）、次いでｎ−ペンタン）で洗浄する。残渣のペンタンを減圧下で除去する。室温まで加温する際に、固形の一水和物は溶融し、次いで−２０℃まで冷却する際に再び再固化する。対照的に、中間体アルキルスルホン酸（ｎペンチル、ｎヘキシル、ｎヘプチル）の一水和物は、−２０℃でジクロロエタンから結晶化しない。
【０１１１】
実施例７：４−ｎヘキシルベンゼンスルホン酸のナトリウム塩（ｆｗ＝２６４．３２）の調製
室温にて、上記調製から得られた４−ｎヘキシルベンゼンスルホン酸の全生成物（実施例５、生成物ａ）を、２Ｌのビーカーに仕込まれた８００ｍＬの激しく撹拌したＮａＢｒ水溶液（３．０、濾過済み）に約３０分間かけて滴下により添加する。添加の間、オフホワイトの固体が形成し、添加完了後、混合物を室温で約６０分間激しく撹拌する。充分量のＮａＯＨ（５０％水溶液）を、ｐＨが中性付近（ｐＨ試験紙でｐＨ＝６〜８）になるまで撹拌溶液に滴下する。固形分を焼結ガラスを通じた濾過により回収し、無水エタノールで２回洗浄し、そしてアセトニトリルを用いて再び２回洗浄する。固形生成物を、乾燥空気を吸い込むことにより一晩乾燥する。生成物を、４倍重量の熱エタノール／水（５０／５０ｗ／ｗ）に溶解し、続いて焼結ガラスを通じて清浄なフラスコ内に手短に濾過することにより再結晶を行う。必要に応じて、減圧濾過の間の損失を補うために、少量の無水エタノールを濾過した溶液に添加する。濾過した溶液を約６５〜７０℃まで加熱し、次いで等量（４倍）の加温（６５〜７０℃）無水エタノールを撹拌しながら急いで添加する。加温混合物を、約４時間室温に保ち、その間に所望の生成物の結晶（白色薄片）が形成し始める。次いで、結晶化混合物を約４時間−２０℃に保ち、結晶化を完了する。冷却混合物を、冷却した焼結ガラスフィルタを用いて急速減圧濾過し、次いで混合物を室温まで加温する。室温にて、生成物を少量のアセトニトリルを用いて１回洗浄し、次いで、乾燥空気をフィルタを通じて通過させることにより乾燥する。この手順により、約８２ｇ（反応したｎヘキシルベンゼンの量に基づく５７％の収率）の白色結晶生成物を、９９．８％（ＨＰＬＣ）を上回るＨＰＬＣ純度で得る。エタノール／水混合物中の溶媒量および水量を調節することにより、他の高純度の、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩を同様に調製する：ｎペンチル、ｎヘプチル、ｎオクチル、ｎノニル、ｎデシル、およびｎウンデシル。
【０１１２】
実施例８：４−ｎヘキシルベンゼンスルホン酸トリメチルアンモニウム塩（ｆｗ＝３０１．４５）の調製
（方法Ａ）  室温にて、上記調製から得られた４−ｎヘキシルベンゼンスルホン酸の全生成物（実施例５、生成物ａ）を、２Ｌのフラスコ内の１０００ｍＬの過酸化物を含まないジエチルエーテルに溶解する。ガス状のトリメチルアミンを、反応が観察されなくなるまで撹拌エーテル溶液内にゆっくりとバブリングする。吸湿性で淡黄色結晶固体を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、そしてフィルタケーキに乾燥窒素を通して乾燥する。生成物を９００ｍＬの加温（４０℃）２−プロパノールに溶解し、次いで、室温まで冷却する。混合物を濾過して不溶物を除去し、さらに９００ｍＬの２−プロパノールを添加し、次いでジエチルエーテル（約５Ｌ）をゆっくりと添加して、生成物の最初の結晶化を起こす。混合物を−２０℃まで冷却し、そしてこの温度にて一晩保持する。焼結ガラスを用いて冷却混合物を濾過して、オフホワイトの結晶を得、その後ジエチルエーテルで洗浄しかつ乾燥する。この生成物を２−プロパノール／ジエチルエーテルから再度再結晶し、１１３ｇ（反応したｎヘキシルベンゼンに基づく６９％の収率）の白色吸湿性結晶を、９９．５％（ＨＰＬＣ）を上回る純度で得る。生成物を真空オーブン（５０℃、２５トル）内で約６時間乾燥し、そしてＰ２Ｏ５を負荷したデシケータに保管する。多くの他の、アルキルベンゼンスルホン酸のアルキルアンモニウム塩は同様に調製され得る。すべてが水および単純アルコールに可溶である。いくつかはジエチルエーテルおよびｎ−ペンタンに不溶である（例えば、トリメチルアンモニウム塩およびテトラメチルアンモニウム塩）。その一方で、他のものはジエチルエーテルには可溶であるが、ｎ−ペンタンには不溶である（例えば、ｎブチルアンモニウム塩およびｎヘキシルアンモニウム塩）。
【０１１３】
（方法Ｂ）  １０００ｍＬの、４−ｎヘキシルベンゼンスルホン酸の冷却（１０℃）した撹拌ｎ−ペンタン溶液において（０．３３ミリモル遊離酸／ｍＬ、実施例５、生成物ｂ）、ガス状トリメチルアミンを、上澄み液が塩基性となる（湿式ｐＨ試験紙）まで、温度を２０℃未満に維持するような速さでゆっくりとバブリングする。溶液を室温で約１５分間撹拌し、生成物の結晶化を完了する。白色結晶を、焼結ガラスを用いて濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、そして乾燥窒素をフィルタケーキを介して通過することにより乾燥する。白色固体を２−プロパノールに室温にて溶解し、濾過し、次いで、上記実施例２０の方法Ａにしたがって２−プロパノール／ジエチルエーテルから再結晶する。この手順により約８４ｇ（収率８４％）の白色結晶性生成物を９９％を上回るＨＰＬＣ純度で得る。
【０１１４】
（方法Ｃ）  ２６．４ｇの精製かつ再結晶したナトリウム塩（１００ミリモル、ｆｗ＝２６４．３２）を、３００ｍＬのＨＰＬＣグレード２−プロパノールに懸濁する。１１．０ｇの塩化トリメチルアンモニウム結晶（１１５ミリモル、ｆｗ＝９５．５７）を添加し、数滴の新たに調製したＨＣｌ（約８％のガス状ＨＣｌを含むＨＰＬＣグレード２−プロパノール溶液）を、ｐＨが明らかに酸性（湿式ｐＨ試験紙）まで添加し、次いで混合物を撹拌し、７５℃まで１０分間手短に加熱する。撹拌混合物を、６時間をかけて室温までゆっくりと冷却する。混合物を穏やかに約４０℃まで加熱し、次いで焼結ガラスを介して濾過して塩化ナトリウムを除去する。溶媒を減圧下（ロータリーエバポレータ）で濾液から除去し、３００ｍＬのさらなる２−プロパノールを添加し、次いで減圧下でさらに除去する。混合物の全量が約２７０ｍＬとなるようにさらに２−プロパノールを添加し、次いで７３０ｍＬの過酸化物を含まず、インヒビターを含まないジエチルエーテルを添加しかつ混合する。この混合物を−２０℃に一晩冷却して生成物の結晶化を完了する。冷却混合物を焼結ガラスを介して手早く溶かし、ジエチルエーテルで洗浄し、フィルタケーキを介する乾燥窒素を通過することにより乾燥し、さらに真空オーブン（５０℃、２５トル）内で約６時間乾燥し、そしてＰ２Ｏ５を負荷したデシケータに保管する。この手順により約２６ｇ（収率８６％）の純粋な白色結晶性生成物を得る。この材料は置換剤の使用に適切である。アレーンスルホネートアニオンのＨＰＬＣ純度は、出発物質のものと本質的には同一である（＞９９．８％）。残渣の塩化物含量は＜０．２モル％であり、そして残渣のナトリウムは＜０．０５モル％である。
【０１１５】
実施例９：４−ｎプロピルビフェニル−４’−スルホン酸（遊離酸、ｆｗ＝２７６．３６）の調製
１１７．８ｇの新たに蒸留した４−ｎプロピルビフェニル（０．６０モル、ｆｗ＝１９６．２９、約１２０ｍＬ）を、１Ｌの３口丸底フラスコ（還流冷却器、マグネチックスターラー、５００ｍＬ添加漏斗、およびテフロン（登録商標）コートした熱電対を備える）中で３００ｍＬの撹拌無水１，２−ジクロロエタンに添加する。ガラス器具および他の器具をオーブン中で乾燥して全表面水分を取り除く。還流冷却器は、安全予防策であることを除き、実際には必要とされない。反応をゆっくりとＮ２パージしながら乾燥窒素雰囲気下で行う。室温で、６９．９２ｇのクロロスルホン酸（０．６０モル、ｆｗ＝１１６．５３、約４０ｍＬ）の３００ｍＬの無水１，２−ジクロロエタン溶液を、全体の添加が約６０分で完結するような速度（約５〜６ｍＬ／分）で撹拌反応混合物に滴下により添加する。穏やかな発熱反応が観察される。すべてのクロロスルホン酸を添加した後、混合物を室温で約２０時間撹拌する。反応混合物をＨＰＬＣで定期的にモニタリングする。２０時間後、残渣のｎプロピルビフェニルが元の量の５〜１０％である際に、反応が完結したと考えられる。そうでない場合は、追加のクロロスルホン酸のジクロロエタン溶液を、混合物をさらに１２時間撹拌しながら添加する。反応の終わりで主生成物以外に、いくらかの未反応のブチルビフェニル（約５％）がモノスルホン化異性体（約０．２％）およびいくらかのジスルホン化物（約２％）とともに観察され、これらは抽出または再結晶によりその後すべて除去される。この点で、反応溶液は透明な黄色溶液である。混合物を湿った空気に晒すことなく、溶媒およびＨＣｌ副生成物を減圧下で除去して、明褐色の油状生成物を得る。ガス状のＨＣｌを、低温トラップを用いる前にＫＯＨペレットを含むトラップを用いて除去し、溶媒および他の揮発成分を保持する。最終的に、生成物を、室温で２４時間高真空下（０．０１トル）に置いて、揮発成分の除去を完了する。この４−ｎプロピルビフェニル−４’−スルホン酸（遊離酸）の調製物をその後の置換剤調製に使用する。
【０１１６】
実施例１０：４−ｎプロピルビフェニル−４’−スルホン酸一水和物（置換剤６３２、ＯＨ３＋塩、ｆｗ＝２９４．３７）の調製
１，２−ジクロロエタンまたはＨＣｌを除去する前の実施例９の最終反応溶液に、１０．８ｇの精製水を、撹拌しながら３０分間をかけて滴下により注意深く添加する。水添の間、一水和物の白色結晶が溶液から析出する。混合物を６０分間室温で撹拌し、次いで約０℃まで冷却し、そしてこの温度にて２時間保つ。冷却混合物を乾燥Ｎ２雰囲気内の焼結ガラスを用いて濾過し、ジクロロエタン、シクロペンタン、および最終的にｎ−ペンタンで洗浄する。生成物を、フィルタケーキを介する乾燥Ｎ２を通過することにより乾燥し、そして真空オーブン（４５℃、２５トル）内で約６時間最終的に乾燥する。白色固体を、Ｐ２Ｏ５を負荷したデシケータ内に保たれた密封容器に保管する。この手順により、約１２８ｇ（反応したプロピルビフェニルの量に基づく７９％の収率）の吸湿性白色結晶状固定（ＨＰＬＣによる９８〜９９％の純度）を得る。一般に、アルキルビフェニルスルホン酸の一水和物は、室温でジクロロエタンから白色固体としてうまく結晶化する。
【０１１７】
実施例１１：４−ｎプロピルビフェニル−４’−スルホン酸トリメチルアンモニウム塩（置換剤６３４；ｆｗ＝３５５．４７）の調製
５８．８ｇの４−ｎプロピルビフェニル−４’−スルホン酸一水和物（実施例１０、２００ミリモル、ｆｗ＝２９４．３７）を１７５ｍＬの無水エタノールに溶解する。微粒子物が存在する場合、溶液を、焼結ガラスを介して濾過する。室温でこの撹拌溶液を介してガス状のトリメチルアミンを、塩基性（ｐＨ試験紙）になるまで溶液に注意深くバブリングする。溶液は、酸がアミンによって中和されるにつれ、著しく温かくなり、そして温度は５０〜５５℃に上昇する。冷却し、かつ約１時間室温に保ち、白色結晶の塊が溶液から分離する。約４５０ｍＬのジエチルエーテルを添加し、そしてフィルタケーキを介して乾燥Ｎ２を通過することにより乾燥する。この生成物を加温した無水エタノールから２回目の再結晶をし、そして混合物を再び室温で約１時間撹拌する。混合物を、乾燥Ｎ２雰囲気下での焼結ガラスを用いて濾過し、ジエチルエーテルで２回洗浄し、そして上記の通り洗浄／乾燥する。最終的に、生成物を真空オーブン（４５℃、２５トル）内で約６時間乾燥する。白色固体を、Ｐ２Ｏ５を負荷したデシケータ内に保持される密封容器内に保管する。この手順により約６５ｇ（収率９２％）の白色結晶状固体（ＨＰＬＣグレードによる９９．５％を上回る純度）を得る。Ｎａ＋、ＮＨ４＋および他のアルキルアンモニウム塩を同様に調製する。
【０１１８】
実施例１２：７−フェニルヘプタン−１−スルホン酸ナトリウム塩（置換剤６６０；ｆｗ＝２７８．３５）の調製
２５．５ｇの新たに蒸留した１−ブロモ−７−フェニルヘプタン（１００ミリモル、ｆｗ＝２５５．２０）および１９０ｍＬのアセトニトリルを、１Ｌの３口丸底フラスコ（マントルヒータ、メカニカルスターラー、還流冷却器、およびテフロン（登録商標）コートした熱電対を備える）中に配置する。反応を窒素雰囲気下でゆっくりＮ２パージしながら行う。５０．４ｇの亜硫酸ナトリウム（４００ミリモル、ｆｗ＝１２６．０４）を１５０ｍＬの加温した精製水に溶解し、そして溶液を濾過して微粒子物を除去する。亜硫酸水溶液をすべて一度に反応フラスコに添加し、そして反応混合物をメカニカルスターラーで激しく撹拌しながら７６℃で約２０時間加熱する。反応混合物を一晩１５〜２０℃に保ち、混合物を完全に二層に分離する。これらの層を分離し、そして上層（生成物とアセトニトリル）を無水硫酸マグネシウムで乾燥する。次いで、溶媒を減圧下で除去し、白色結晶生成物が形成する。混合物を焼結カラスを介して濾過し、過酸化物を含まないジエチルエーテルで数回洗浄し、そしてフィルタケーキを介して乾燥Ｎ２を通過することによりフィルタ上で乾燥する。生成物をさらに真空オーブン（５０℃、１５トル）で一晩乾燥する。この手順により約２３．９ｇ（収率８６％）の白色結晶状固体（ＨＰＬＣによる９９％を上回る純度）を得る。
【０１１９】
実施例１３：Ｌ−Ｎ−オクタノイル−２−フェニルグリシン遊離酸（ｆｗ＝２７７．３６）の調製
２８．４２ｇのＬ−２−フェニルグリシン（１８８ミリモル、＞９８％ｅｅ、ｆｗ＝１５１．１７、Ｓ−エナンチオマー）を、開口７５０ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ（サーモメータ、マグネチックスターラー、および外部冷却器を備える）内の２００ｍＬの精製水に懸濁する。１３．６０ｇの５０％ＮａＯＨ（１７０ミリモル、ｆｗ＝４０．００）溶液をｍ１５分間にわたって滴下する。混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで、１０〜１５℃に冷却する。１３．８３ｇの新たに蒸留したオクタノイルクロライド（８５ミリモル、ｆｗ＝１６２．６６）を１５分間にわたって滴下により添加し、次いで混合物を１０〜１５℃でさらに６０分間撹拌する。ＮａＯＨ溶液に続きオクタノイルクロライドを撹拌とともにもう２回添加する（８．９６ｇの５０％ＮａＯＨ、９．１６ｇのオクタノイルクロライド、１０〜１５℃で１時間撹拌、７．５２ｇの５０％ＮａＯＨ、７．５９ｇのオクタノイルクロライド、室温で３時間撹拌）。混合物を焼結ガラスを介して濾過し、濾液を１０〜１５℃に冷却し、そして濃ＨＣｌ水溶液（試薬、３７％）を、ｐＨが約１（ｐＨ試験紙）になるまで滴下する。酸添加の間、透明な油状層または粘性の固形物が粗生成物として溶液から生じる。２５０ｍＬの過酸化物を含まないジエチルエーテルを、撹拌しながら添加してエーテル中に生成物を溶解する。層を分離し、上方のエーテル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥（その後濾過により除去）し、そしてエーテルを減圧下で除去して、無色のオイルまたは粘性の白色結晶状の塊を得る。この物質を、最少量の僅かに加温（３０℃）したジエチルエーテルに溶解し、次いで、一晩−２０℃で結晶化する。冷却混合物を焼結ガラスを用いて手早く濾過し、次いでｎ−ペンタンで洗浄し、そして最終的に減圧（０．０１トル）下で室温にて乾燥して、純粋な白色結晶状固体（約４２ｇ、収率８１％）を得る。
【０１２０】
実施例１４：Ｌ−Ｎ−オクタノイル−２−フェニルグリシントリメチルアンモニウム塩（ｆｗ＝３３６．４８）の調製
乾燥し濾過した、Ｌ−Ｎ−オクタノイル−２−フェニルグリシン遊離酸のジエチルエーテル溶液（５ｍＬエーテル／ｇ）を、適切なエルレンマイヤーフラスコ中に配置し、そして室温で磁気撹拌する。ガス状のトリメチルアミン（＞９９％）を、３０℃未満の温度に維持しながら撹拌エーテル溶液にゆっくりとバブリングする。直ちに、トリメチルアンモニウム塩の白色結晶が溶液から結晶化する。一旦上澄み液が充分塩基性（ｐＨ＞８、湿式ｐＨ試験紙）になると、アミンの添加を終了し、そして混合物を２時間５℃に保持する。冷却混合物を焼結ガラスを介して手短に濾過し、エーテルで洗浄し、次いで減圧下で乾燥して、ほぼ定量的収率（＞９５％）のトリメチルアンモニウム塩を得る。生成物を、無水エタノール／ジエチルエーテルから一度再結晶して９９．５％を上回るＨＰＬＣ純度で得る。オクタン酸またはその塩は検出されない。白色固体を、Ｐ２Ｏ５を負荷したデシケータ中で室温に保持される密封容器内に保管する。
【０１２１】
実施例１５：ジ（ｎブチルアンモニウム）メタンホスホネート（ｆｗ＝２４４．３０）
汚染を防止するために、注意深い清浄にしたホウ素化ケイ素ガラス器具、ビーカー、フラスコ、フリットガラスフィルタおよびピペットを使用する；有機抽出可能なプラスチック製実験器具を避ける。３２．６２ｇの新たに蒸留したｎ−ブチルアミン（４４０ミリモル、ｆｗ＝７４．１３８）を、約１５分間かけて、１１０ｍＬ  ＨＰＬＣグレード変性エタノール（９０／５／５ｗ／ｗエタノール／メタノール／２−プロパノール）に溶解した１９．２１ｇの新たに再結晶したメタンホスホン酸（２００ミリモル、ｆｗ＝９６．０２３）の撹拌溶液に滴下により添加する。アミン添加の間に、著しい発熱が見られる。加温した溶液を手短に７０℃まで加熱し、次いで結晶化させるため約６時間、室温に冷却される。次いで、１１０ｍＬの過酸化物を含まず、インヒビターを含まないジエチルエーテルを添加し、混合物を撹拌し、次いで一晩−２０℃に保持する。ジアンモニウム塩を焼結ガラスを用いて濾過し、ジエチルエーテルで２回洗浄し、ＨＰＬＣグレードのｎ−ペンタンで一度洗浄し、そしてフィルタケーキを介して乾燥窒素を吸わせることにより乾燥する。再結晶プロセスを、適切な熱変性エタノール中に白色結晶状生成物を溶解することによりまで２回繰り返す。最終の再結晶の後、生成物をさらに真空オーブン（４５℃、２５トル）内で約６時間乾燥し、次いでＰ２Ｏ５を負荷したデシケータ内で保管する。この手順により約４３ｇ（収率８８％）の安定な、溶媒を含まないやや吸湿性の白色結晶状塩（１０〜１００ｍＭの範囲のＨＰＬＣ緩衝液への添加に充分純粋である）を得る。
【０１２２】
一般に、ＨＰＬＣ緩衝液として使用するためのＨＰＬＣグレードアミンおよび酸は、トリエチルアミンおよびホスホン酸のような汎用である非常に限られた範囲の試薬を除き、得ることが難しい。この理由のため、ＨＰＬＣ用途のための緩衝アニオンの安定な、高純度アンモニウム塩を得ることは有用である。このアンモニウム塩は、対応する遊離アミンよりも化学的に安定であり、それらは純粋なアミン自体よりも取り扱いがより容易である。マイナーな改変を伴うこの一般手順は、メタンホスホン酸、リン酸および亜リン酸の精製ジアンモニウム塩を得るために用いられる。良好な品質のＨＰＬＣグレードリン酸、良好な品質の新たに再結晶化した固形亜リン酸またはメタンホスホン酸が用いられる。液体アミンが多くの不純物を除去するために使用前に蒸留される。高純度（＞９９％）のガス状アミン、Ｍｅ３Ｎ、Ｍｅ２ＮＨ、ＭｅＮＨ２、ＥｔＮＨ２が加圧シリンダからガス状体で送達される。一般に、これらのアミンの市販の水溶液は使用に充分なほど純粋ではない。高純度の水酸化４級アンモニウム水溶液（約３５％）もまた用いられる。２種の溶媒、ＨＰＬＣグレードメタノールまたはＨＰＬＣグレード変性エタノールのいずれかが、塩１ｇあたり溶媒２〜２０ｍＬの使用割合で結晶化のために使用される。広範な結晶ジアンモニウム塩がこの方法を用いて作製される。
【０１２３】
(R1NH3+)2(R-PO32-)          R1=CH3, C2H5, nC3H7, nC4H9, nC5H11, nC6H13;
R=H-, CH3-, C2H5-, HO-, CH3O-
(R1R2NH2+)2(R-PO32-)        R1=R2=CH3; R1=R2=C2H5; R1=CH3, R2=C2H5; R1=CH3, 
R2=nC3H7; R1=CH3, R2=nC4H9; R=H-, CH3-, C2H5-, HO-, CH3O-
(R1R2R3NH+)2(R-PO32-)        R1=R2=R3=CH3; R1=R2=R3=C2H5; R1=R2=CH3, R3=C2H5; 
R1=R2=C2H5, R3=CH3; R1=R2=CH3, R3=nC3H7; R1=R2=CH3, 
R3=nC4H9; R=H-, CH3-, C2H5-, HO-, CH3O-
(R1R2R3R4N+)2(R-PO32-)        R1=R2=R3=R4=CH3; R1=R2=R3=R4=C2H5; R1=R2=CH3, 
R3=R4=C2H5; R1=R2=R3=CH3, R4=C2H5; R1=R2=CH3,
R3+R4=-(CH2)4-; R1=R2=R3=CH3, R4=nC4H9;
R=H-, CH3-, C2H5-, HO-, CH3O-
【０１２４】
【表６】
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【０１２５】
【表７】
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【０１２６】
【表８】
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【０１２７】
【表９】
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【０１２８】
【表１０】
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【０１２９】
【表１１】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【国際調査報告】
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