(57)【要約】  本発明は、ピコルナウイルス科のウイルス由来の免疫的活性抗原を製造する物質及び方法を提供するものである。本発明のピコルナウイルス抗原は、治療法の一環として、若しくはピコルナウイルス感染の予防のために被験者に投与するワクチンとして使用できる形態であり得る。本発明のピコルナウイルス抗原は、エンテロウイルス感染を予防するために投与されるワクチンに用いられ得る免疫原性組成物の形態であり得る。本発明は更に、ヒトエンテロウイルスＡ、ヒトエンテロウイルスＢ、ヒトエンテロウイルスＣ、ヒトエンテロウイルスＤの抗原を含む免疫原性組成物と、エンテロウイルス感染の予防を目的とするワクチンとしての用途とを網羅している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、及びその免疫的活性フラグメントから選ばれた１種以上のヒトエンテロウイルスポリペプチドを含む１種以上の免疫的活性抗原を含むことを特徴とする、ワクチン。
【請求項２】
ヒトエンテロウイルスに対する防御免疫反応、及び／又は中和免疫反応を誘導することを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記ヒトエンテロウイルスは、ヒトエンテロウイルスＡ、ヒトエンテロウイルスＢ、ヒトエンテロウイルスＣ及びヒトエンテロウイルスＤのうちから選ばれることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
前記ヒトエンテロウイルスＡは、ヒトエンテロウイルス７１（ＨＥＶ７１）とコクサッキーウイルスＡ１６のうちから選ばれ、前記ヒトエンテロウイルスＢは、コクサッキーウイルスＢとエコーウイルスのうちから選ばれ、前記ヒトエンテロウイルスＣは、ヒトポリオウイルス１、ヒトポリオウイルス２、及びヒトポリオウイルス３のうちから選ばれ、前記ヒトエンテロウイルスＤは、ＥＶ６８であることを特徴とする、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
前記ワクチンは、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ０ポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項６】
前記ワクチンは、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ２ポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項７】
前記ワクチンは、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ３ポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項８】
前記ワクチンは、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ１ポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項９】
前記ワクチンは、１種以上のエンテロウイルス種又は血清型に由来するポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記種又は血清型は、ＨＥＶ７１とコクサッキーウイルスＡ１６のうちから選ばれたヒトエンテロウイルスＡであることを特徴とする、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記種又は血清型は、ＰＶ−１、ＰＶ−２、ＰＶ−３のうちから選ばれたヒトエンテロウイルスＣであることを特徴とする、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１２】
ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、及びその免疫的活性フラグメントのうちから選ばれた１種以上のヒトエンテロウイルスポリペプチドを含む前記１種以上の免疫的活性抗原は、ウイルス様粒子、カプソメア、錯体及び／又は会合体の形態であることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記ウイルス様粒子は、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ０ポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記ウイルス様粒子は、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ２ポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記ウイルス様粒子は、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ３ポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１６】
前記ウイルス様粒子は、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ１ポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１７】
エンテロウイルス感染に対して被験者にワクチン接種を施す方法であって、
ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、及びその免疫的活性フラグメントのうちから選ばれた１種以上のヒトエンテロウイルスポリペプチドを含む１種以上の免疫的活性抗原を含むワクチンの、前記被験者への投与の際にヒトエンテロウイルスに対する防御免疫反応及び／又は中和免疫反応を誘導するほどの有効量を前記被験者に投与することを特徴とする、方法。
【請求項１８】
前記ワクチンは、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ０ポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ワクチンは、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ１ポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ワクチンは、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ３ポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記ワクチンは、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ２ポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、及びその免疫的活性フラグメントのうちから選ばれた１種以上のヒトエンテロウイルスポリペプチドを含む前記１種以上の免疫的活性抗原は、ウイルス様粒子、カプソメア、錯体及び／又は会合体の形態であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記ウイルス様粒子は、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ０ポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ウイルス様粒子は、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ２ポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ウイルス様粒子は、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ３ポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記ウイルス様粒子は、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ１ポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記ワクチンは、１種以上のエンテロウイルス種又は血清型に由来するポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
前記エンテロウイルスの種又は血清型は、ＨＥＶ７１とコクサッキーウイルスＡ１６のうちから選ばれたヒトエンテロウイルスＡであることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記エンテロウイルスの種又は血清型は、ＰＶ−１、ＰＶ−２、ＰＶ−３のうちから選ばれたヒトエンテロウイルスＣであることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
ヒトエンテロウイルスＰ１ポリペプチドをコード化する核酸と操作可能に結合しているプロモーターと、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）と、ヒトエンテロウイルス３ＣＤプロテアーゼをコード化する核酸とを含むことを特徴とする、発現カセット。
【請求項３１】
前記ポリペプチドはヒトエンテロウイルスＰ１であることを特徴とする、請求項３０に記載の発現カセット。
【請求項３２】
前記ヒトエンテロウイルス３ＣＤプロテアーゼは、前記ヒトエンテロウイルスＰ１ポリペプチドを処理することを特徴とする、請求項３０に記載の発現カセット。
【請求項３３】
処理済みの前記ヒトエンテロウイルスＰ１ポリペプチドは、結合してウイルス様粒子、カプソメア、錯体及び／又は会合体を形成することを特徴とする、請求項３２に記載の発現カセット。
【請求項３４】
前記ヒトエンテロウイルスＰ１ポリペプチドは、ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、及びその免疫的活性フラグメントのうちから選ばれたポリペプチドの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項３０に記載の発現カセット。
【請求項３５】
前記ヒトエンテロウイルスは、ヒトエンテロウイルスＡとヒトエンテロウイルスＣのうちから選ばれることを特徴とする、請求項３０に記載の発現カセット。
【請求項３６】
前記ヒトエンテロウイルスＡは、ＨＥＶ７１とコクサッキーウイルスＡ１６のうちから選ばれることを特徴とする、請求項３５に記載の発現カセット。
【請求項３７】
前記ヒトエンテロウイルスＣは、ヒトポリオウイルス１（ＰＶ−１）、ヒトポリオウイルス２（ＰＶ−２）及びヒトポリオウイルス３（ＰＶ−３）のうちから選ばれることを特徴とする、請求項３５に記載の発現カセット。
【請求項３８】
前記ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）から由来したものであることを特徴とする、請求項３０に記載の発現カセット。
【請求項３９】
前記脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来の前記ＩＲＥＳは、遺伝子組換えを行われ、ＩＲＥＳ活性が低減されていることを特徴とする、請求項３８に記載の発現カセット。
【請求項４０】
前記ＥＭＣＶ由来の前記ＩＲＥＳは、ＪＫセグメントのＡ６分岐ループに、ヌクレオチド（Ａ７）一つを加えることにより、遺伝子組換えを行われたことを特徴とする、請求項３９に記載の発現カセット。
【請求項４１】
前記ＩＲＥＳは、ヒトエンテロウイルスから由来したものであることを特徴とする、請求項３０に記載の発現カセット。
【請求項４２】
前記プロモーターは真核生物プロモーターであることを特徴とする、請求項３０に記載の発現カセット。
【請求項４３】
前記真核生物プロモーターはポリヘドリンプロモーターであることを特徴とする、請求項４２に記載の発現カセット。
【請求項４４】
前記プロモーターは、ヒトエンテロウイルスＡのＰ１ポリペプチド、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、及びヒトエンテロウイルスＡの３ＣＤプロテアーゼをコード化する核酸と操作可能に結合していることを特徴とする、請求項３０に記載の発現カセット。
【請求項４５】
前記ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳは、突然変異によりＩＲＥＳ活性が低減されていることを特徴とする、請求項４４に記載の発現カセット。
【請求項４６】
前記プロモーターは、ヒトエンテロウイルスＡのＰ１ポリペプチド、ＨＥＶ７１  ＩＲＥＳ、及びヒトエンテロウイルスＡの３ＣＤプロテアーゼをコード化する核酸と操作可能に結合していることを特徴とする、請求項３０に記載の発現カセット。
【請求項４７】
前記プロモーターは、ヒトエンテロウイルスＡのＰ１ポリペプチド、ヒトエンテロウイルスＣ  ＩＲＥＳ、及びヒトエンテロウイルスＡの３ＣＤプロテアーゼをコード化する核酸と操作可能に結合していることを特徴とする、請求項３０に記載の発現カセット。
【請求項４８】
前記プロモーターは、ヒトエンテロウイルスＣのＰ１ポリペプチド、ヒトエンテロウイルスＣ  ＩＲＥＳ、及びヒトエンテロウイルスＣの３ＣＤプロテアーゼをコード化する核酸と操作可能に結合していることを特徴とする、請求項３０に記載の発現カセット。
【請求項４９】
前記プロモーターは、ヒトエンテロウイルスＣのＰ１ポリペプチド、ＨＥＶ７１  ＩＲＥＳ、及びヒトエンテロウイルスＣの３ＣＤプロテアーゼをコード化する核酸と操作可能に結合していることを特徴とする、請求項３０に記載の発現カセット。
【請求項５０】
前記プロモーターは、ヒトエンテロウイルスＣのＰ１ポリペプチド、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、及びヒトエンテロウイルスＣの３ＣＤプロテアーゼをコード化する核酸と操作可能に結合していることを特徴とする、請求項３０に記載の発現カセット。
【請求項５１】
請求項３０に記載の発現カセットを宿主細胞に取り込み、
前記発現カセットのポリペプチドを生成できる期間の間、前記宿主細胞を培養し、
前記宿主細胞及び／又は培養上清よりヒトエンテロウイルスポリペプチドを回収することを特徴とする、ワクチンの製造方法。
【請求項５２】
前記宿主細胞は真核細胞であることを特徴とする、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記真核細胞は、昆虫細胞、哺乳動物細胞株、及び酵母細胞のうちから選ばれることを特徴とする、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記昆虫細胞は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ，ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、及びＡｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ由来の蚊細胞のうちから選ばれることを特徴とする、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記哺乳動物細胞株は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ−１、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、及びＮＩＨ３Ｔ３から選ばれることを特徴とする、請求項５３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピコルナウイルス科のウイルスに関し、特に、当該ウイルスによる感染に対する予防・治療に効果のある抗原及びワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ピコルナウイルスは、多数の一般疾患の原因となる様々なウイルス科の総称である。ピコルナウイルス科の中でも、エンテロウイルス属のウイルスは、全てが密接な関係を持ち、引き起こす一般疾患の数が特に多い。
【０００３】
エンテロウイルス属のウイルスは、毎年、世界中の数百万の人々を感染させ、感染者の呼吸器分泌物（例えば唾液、痰、鼻粘液など）や大便からよく見つけられる。エンテロウイルスは消化管を感染させるが、「エンテロウイルス（ＥＮＴＥＲОＶＩＲＵＳ）」という名称こそが「ｅｎｔｅｒｉｃ（腸の）」を語源としている。歴史的に、エンテロウイルス、つまりポリオウイルスがもたらしてきた最も重大な疾患といえば、やはり急性灰白髄炎である。ヒト疾患の原因となる非ポリオエンテロウイルスは６２種が存在し、そのうち２３種はコクサッキーＡウイルス、６種はコクサッキーＢウイルス、２８種はエコーウイルス、５種はその他のエンテロウイルスである。ポリオウイルスは、コクサッキーウイルスやエコーウイルスと同様に、糞口経路を介して拡散される。感染による症状の範囲は幅広く、軽い呼吸器疾患（風邪）、手足口病、急性出血性結膜炎、無菌性髄膜炎、心筋炎、重症新生児敗血症類似疾患（ｓｅｖｅｒｅ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｓｅｐｓｉｓ−ｌｉｋｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、急性弛緩性麻痺などが全て含まれる。
【０００４】
ピコルナウイルスの中でもエンテロウイルスは、一本鎖のプラス鎖をゲノムとして持つＲＮＡを特徴とする、多種多様の小さなＲＮＡウイルス群の属を代表する。全てのエンテロウイルスは、約７５００塩基で構成されるゲノムを含む上に、低い複製忠実度と頻繁な組換えのため、突然変異率が非常に高いことで知られている。宿主細胞の感染後、ゲノムはキャップ非依存的翻訳により単一ポリタンパク質に翻訳される。当該タンパク質は、ウイルスにコードされているプロテアーゼにより、構造殻タンパク質と非構造タンパク質とに切断され、これらのタンパク質は主にウイルス複製に関与することになる。
【０００５】
エンテロウイルスは、多種のヒト疾患及び哺乳動物疾患に関連する。血清学的研究は、抗体中和試験に基づき、６６種のヒトエンテロウイルス血清型を区別している。更に、変異株間の低減交差中和又は非相反交差中和（ｒｅｄｕｃｅｄ  ｏｒ  ｎｏｎｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｃｒｏｓｓ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）に基づいて、血清型のうちで追加的に抗原変異体を追加的に定義した。エンテロウイルスは本来、人間及び動物における病因を基準として、ポリオウイルス、コクサッキーＡウイルス（ＣＡ）、コクサッキーＢウイルス（ＣＢ）、エコーウイルスの４群に分類されていたが、異なる群に属しているウイルスの生物学的性状が著しく重なり合うことが気付かれるまであまり時間はかからなかった。
【０００６】
エンテロウイルス属は、下記の１０種を含んでなる。
・牛エンテロウイルス
・ヒトエンテロウイルスＡ
・ヒトエンテロウイルスＢ
・ヒトエンテロウイルスＣ
・ヒトエンテロウイルスＤ
・ヒトライノウイルスＡ
・ヒトライノウイルスＢ
・ヒトライノウイルスＣ
・豚エンテロウイルスＢ
・サルエンテロウイルスＡ
【０００７】
上記の１０種は多様な血清型を持っており、例えば、以下の通りである。
エンテロウイルス血清型のＨＥＶ７１、ＥＶ−７６、ＥＶ−８９、ＥＶ−９０、ＥＶ−９１、ＥＶ−９２、並びにコクサッキーウイルスＡ１６は、ヒトエンテロウイルスＡで発見された。
血清型コクサッキーウイルスＢ１（ＣＶ−Ｂ１）、ＣＶ−Ｂ２、ＣＶ−Ｂ３、ＣＶ−Ｂ４、ＣＶ−Ｂ５（豚水疱病ウイルス［ＳＶＤＶ］を含む）、ＣＶ−Ｂ６、ＣＶ−Ａ９、エコーウイルス１（Ｅ−１；Ｅ−８を含む）、Ｅ−２、Ｅ−３、Ｅ−４、Ｅ−５、Ｅ−６、Ｅ−７、Ｅ−９（ＣＶ−Ａ２３を含む）、Ｅ−１１、Ｅ−１２、Ｅ−１３、Ｅ−１４、Ｅ−１５、Ｅ−１６、Ｅ−１７、Ｅ−１８、Ｅ−１９、Ｅ−２０、Ｅ−２１、Ｅ−２４、Ｅ−２５、Ｅ−２６、Ｅ−２７、Ｅ−２９、Ｅ−３０、Ｅ−３１、Ｅ−３２、Ｅ−３３、エンテロウイルスＢ６９（ＥＶ−Ｂ６９）、ＥＶ−Ｂ７３、ＥＶ−Ｂ７４、ＥＶ−Ｂ７５、ＥＶ−Ｂ７７、ＥＶ−Ｂ７８、ＥＶ−Ｂ７９、ＥＶ−Ｂ８０、ＥＶ−Ｂ８１、ＥＶ−Ｂ８２、ＥＶ−Ｂ８３、ＥＶ−Ｂ８４、ＥＶ−Ｂ８５、ＥＶ−Ｂ８６、ＥＶ−Ｂ８７、ＥＶ−Ｂ８８、ＥＶ−Ｂ９３、ＥＶ−Ｂ９７、ＥＶ−Ｂ９８、ＥＶ−Ｂ１００、ＥＶ−Ｂ１０１、ＥＶ−Ｂ１０６、ＥＶ−Ｂ１０７、ＥＶ−Ｂ１１０（チンパンジー由来）、並びにサルエンテロウイルスＳＡ５は、ヒトエンテロウイルスＢで発見された。
血清型ＥＶ−９５、ＥＶ−９６、ＥＶ−９９、ＥＶ−１０２、ＥＶ−１０４、ＥＶ−１０５、ＥＶ−１０９は、ヒトエンテロウイルスＣで発見された。
血清型ＥＶ−６８、ＥＶ−７０、ＥＶ−９４は、ヒトエンテロウイルスＤで発見された。
ポリオウイルス血清型のＰＶ−１、ＰＶ−２、ＰＶ−３はヒトエンテロウイルスＣで発見された。
【０００８】
エンテロウイルス感染による疾患に含まれる急性灰白髄炎は、エンテロウイルス感染が原因となる疾患の中でも最も有名な疾患といえる。しかしながら、エンテロウイルス感染の発現として最も一般的なものは、非特異的な発熱性疾患である。 
【０００９】
エンテロウイルスは、児童の無菌性髄膜炎の最も一般的な原因でもある。米国の場合、３００００〜５００００人の髄膜炎患者が、エンテロウイルスを原因として発病している。脳炎はエンテロウイルス感染の兆候としては珍しいケースであるが、一応発病すれば、脳炎を最も頻発に引き起こすエンテロウイルスは、エコーウイルス９である。
【００１０】
エンテロウイルスによる胸膜痛は、発熱を伴う胸部及び腹部の発作性激痛を特徴とし、時折は吐き気、頭痛、嘔吐を伴うこともなる。
【００１１】
心膜炎及び／又は心筋炎は、通常、エンテロウイルスを病因とする。不整脈、心不全、心筋梗塞などの症状も報告されている。
【００１２】
急性出血性結膜炎もエンテロウイルスがもたらし得る疾患である。
【００１３】
手足口病は、コクサッキーＡウイルス又はＨＥＶ７１による感染が原因となる小児疾病のうち、最も一般的なものである。
【００１４】
２００７年度の研究は、エンテロウイルスが関連する急性呼吸器感染又は急性胃腸感染は、慢性疲労症候群の要因となり得ると示唆している。
【００１５】
ＨＥＶ７１、ポリオウイルス、コクサッキーウイルスＡ１６を含むエンテロウイルス属の構成員は、全て、一本鎖のプラス鎖ＲＮＡゲノムを有する。当該ＲＮＡゲノムは、ポリタンパク質Ｐ１をコード化する単一読取枠（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）を有し、ポリタンパク質Ｐ１は、殻タンパク質のＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１、並びにポリタンパク質Ｐ１を個別の殻タンパク質ＶＰ１、ＶＰ３、ＶＰ０に開裂するウイルスプロテアーゼ３Ｃ及び３ＣＤを含む非構造タンパク質からなる。ＶＰ０は最終的にＶＰ２及びＶＰ４に切断される。殻タンパク質は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に組織化することができる。
【００１６】
ヒトエンテロウイルス７１（ＨＥＶ７１）及びコクサッキーウイルスＡ１６は、手足口病（ＨＦＭＤ）の主な病原体としてよく知られているエンテロウイルス血清型である。ＨＥＶ７１は、時折、様々な中枢神経系疾患に関わることもある。１９６９年、カリフォルニアで、神経系疾患の患者を対象とした研究においてＨＥＶ７１の分離及び特徴付けは初めて成功を収めた。現在まで、ＨＥＶ７１感染に対する宿主反応の分子機序に関して知られている事実は極僅かに過ぎなかったが、ケモカインをコード化するｍＲＮＡ、タンパク質分解に関わるタンパク質、補体タンパク質、アポトーシス促進タンパク質の増加に関連していると信じられてきた。
【００１７】
手足口病（ＨＦＭＤ）は、ヒトコクサッキーウイルスＡ１６（ＣＶＡ１６）、コクサッキーウイルスＡ１０（ＣＶＡ１０）及びヒトエンテロウイルスＡ７１（ＨＥＶ７１）などのエンテロウイルスＡ群（ピコルナウイルス科）が原因となる、一般の自己限定性小児疾病である。ウイルスは糞便中に排泄されるが、咽頭の分泌物からも検出できる。子供同士の接触や環境汚染を介して伝染される場合が多い。当該疾病は、急性発熱が特徴とであり、掌、足の裏、臀部、膝の発疹や、頬粘膜の小水疱などがそれに伴う。通常、症状は７〜１０日ほど経てば自然に解消する。ＨＦＭＤを発症した小児の極一部だけが重病に発展する。
【００１８】
髄膜炎、脳炎、急性弛緩性麻痺、肺水腫、心不全などの症候群として表われる、主に神経系及び心血管系に関する重症疾患は、一般的に、ＨＥＶ７１感染のみで発症する。アジア太平洋地域において最も致命的な神経学的症候群は脳幹脳炎であり、死亡率は４０〜８０％に達する。重症のＨＦＭＤを患っている子供は、回復にも数ヶ月は掛かり、運が悪ければ永続的な神経障害を受ける可能性もある。現在、ＨＦＭＤに対する特定の抗ウイルス治療法や、ポリオを除く他のエンテロウイルス感染を防止するワクチンは存在しないのが事実である。
【００１９】
ＨＥＶ７１は、１９６９年、カリフォルニアで脳炎で死亡した子供から初めて分離に成功し、１９７４年に始めて報告された。それ以降、ＨＥＶ７１は世界中で検出され続けてきたが、最近、ＨＥＶ７１の病原型が地域ごとに出現されるにつれ、アジアにおけるＨＦＭＤの地域的流行の恐れが高まっている。死亡率の高いＨＦＭＤの大発生が始めて認識されたのは１９９７年、マレーシアのサラワクからであった。当該発生に関わったウイルスはＨＥＶ７１だった。台湾は１９９８年の流行病発生において、１２９，１０６件のＨＦＭＤ発症、４０５種の重大疾患、そして７８人の死亡者を出している。シンガポールは２０００年〜２００１年の間、９０００件の流行病が発症したことを報告した。死亡者は全て７名。以降、シンガポールは２〜３年ごとに繰り返して流行病発症に悩まされている。２００８年の最初の８ヶ月間、シンガポールでが報告したＨＦＭＤの発症数は１９，５３０件、死亡者は一人だった。それ以来、シンガポールは勿論、タイランド、マレーシア、台湾、日本、韓国及びベトナムからもＨＥＶ７１疾患の大発生が定期的に報告されている。
【００２０】
中国は２００７年、８３，３４４件の発症数と１７人の死亡者を出している。２００８年には、疾病の大発生が安徽省の阜陽市から始まり、中国全土に広がっていった。マスコミ関係者たちはこの大発生を多角的に取材しながら、特に子女たちの健康に向ける親の心配や、感染の鎖を断ち切るために保険所が断行した学校や託児所などの閉鎖による社会混乱に重点を置いた。それ以降、中国は毎年大発生を記録している。
【００２１】
ピコルナウイルス科に属する他のウイルスが原因となる疾病について、ポリオは古代から、人間においてのみ自然感染及び流行をもたらす伝染病だった。発展途上国では、未だに多くの人々が毎年ポリオに感染されている。従って、ポリオの根絶は、現在進行中の課題であると言える。
【００２２】
ポリオウイルスは、かつてはピコルナウイルス科のエンテロウイルス属に属する種として分類されていた。しかしながら現在、ポリオウイルス種は、エンテロウイルス属から排除されている。ポリオウイルスは血清型、つまりヒトポリオウイルス１（ＰＶ−１）、ヒトポリオウイルス２（ＰＶ−２）、ヒトポリオウイルス３（ＰＶ−３）として分類され、更に、ピコルナウイルス科エンテロウイルス属に属するヒトエンテロウイルスＣ種の亜型として認識されている。エンテロウイルス属における基準種は、２００８年、ポリオウイルスからヒトエンテロウイルスＣに変更された。
【００２３】
ヒトエンテロウイルスＣ種の３亜型、つまりＰＶ−１、ＰＶ−２、ＰＶ−３は、少しずつ異なる殻タンパク質を有するという特徴を持つ。殻タンパク質は、細胞受容体特異性とウイルス抗原性を決定する。自然状態で最も遭遇し易い一般的な形態はＰＶ−１であるが、とにかく上記の３亜型は全て伝染率が非常に高く、脊髄に影響を及ぼして急性灰白髄炎をもたらす原因となり得る。
【００２４】
ヒトエンテロウイルスＣによる感染はいつも深刻な問題として扱われてきた。集団予防接種には不活化全粒子ワクチン（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｗｈｏｌｅ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ）が用いられ、今でも有効である。Ｓａｌｋが開発した方法によって製造できる不活化急性灰白髄炎ワクチンは、良好な成果を出した上に、あらゆる面で改良されてきた。通常、このようなワクチンは、不活化ポリオウイルスのＭａｈｏｎｅｙ株と、ＭＥＦ１株と、Ｓａｕｋｅｔｔ株の混合物を含有する。
【００２５】
弱毒化経口ポリオワクチンとして弱毒化ヒトエンテロウイルスＣを製造し使用しているにも関わらず、弱毒化ヒトエンテロウイルスＣは、接種対象の体内で、若しくはウイルス全体との接触により、病原性（麻痺系神経毒力）が逆戻りしてしまう危険性をはらんでいる。従って、病原性を完全に取り除いた、完全かつ効率的なポリオワクチンの開発が求められる。
【００２６】
他のエンテロウイルスと同様に、ヒトエンテロウイルスＣの外皮ポリペプチド／殻ポリペプチドの４種は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４として特定される。これらは、正二十面体ウイルスの外殻の形成に関わる。通常的に、ヒトエンテロウイルスＣの各ポリペプチドを用いるワクチン接種を行った所で分離ポリペプチドは人間及び動物の体内で中和抗体を増やすことはできないと言われている（Ｍｅｌｏｅｎ、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、４５：７６１−７６３、１９７９）。
【００２７】
米国特許第４５０８７０８号は、ポリオウイルスと手足口病ウイルスの各ポリペプチド、つまりＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４は、人間及び動物の体内で中和抗体を増やす機能を持たず、手足口病ウイルスの各ポリペプチドのうち、ＶＰ１のみがその機能を有すると教示している。更に、米国特許第４５０８７０８号は、ヒトエンテロウイルスＣII型ＭＥＦ１ウイルス粒子のＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３ポリペプチドのうち、ＶＰ３のみが中和抗体の誘導機能を持っており、その代わり、抗体力価は低いと明示している。しかしながら、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３は、ピコルナウイルスの複製を選択的に抑制すると言われる広範囲の抗ウイルス物質に相当するアリルドンを用いて免疫化を執り行った場合にのみ中和抗体を誘導できるということが明らかになった（Ｌａｎｇｆｏｒｄ，ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ２８：５７８−５８０、１９８５）。
【００２８】
従って、解決すべき課題とは、ヒトエンテロウイルス感染に対する防御免疫を提供する効率的なワクチンを、抗ウイルス性化合物を使用せず製造する方法となる。防御免疫が必要であるヒトエンテロウイルスとして、例えば、コクサッキーウイルスＡ１６及びヒトエンテロウイルス７１を含むヒトエンテロウイルスＡ；コクサッキーウイルスＢ血清型、エコーウイルス、及びエンテロウイルス血清型を含むヒトエンテロウイルスＢ；ヒトポリオウイルス１、ヒトポリオウイルス２、及びヒトポリオウイルス３を含むヒトエンテロウイルスＣ；ＥＶ６８を含むヒトエンテロウイルスＤが挙げられる。
【００２９】
本発明の目的のために、当業者は、ワクチンを、一つ以上の病原生物から由来した抗原を含有し、患者又は動物に投与した場合、前記又ははそれに関する病原生物による感染に対して能動免疫及び予防効果をもたらす（つまり防御免疫効果をもたらす）予防用物質又は治療用物質と理解するものとする。
【００３０】
更に、当業者は防御免疫に関しても良く理解していると思われるが、とにかく、防御免疫とは、少なくとも、ウイルスを中和させる中和抗体及び／又はＴ細胞免疫反応の誘導、又は誘発を指す。
【００３１】
ワクチン分野において、病原体由来の抗原が防御免疫を誘導できるか否かに関して、未だに明確ではないことは既によく知られている。Ｅｌｌｉｓ（Ｃｈａｐｔｅｒ２９  ｏｆ  ワクチン、Ｐｌｏｔｋｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）、ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ｐｐ５７１、１９９８）は、「（ワクチン開発における）問題の鍵は、自ら防御抗体の生成を誘導できるウイルス又は微生物病原体のタンパク質成分を特定し、…従って病原体による攻撃から宿主を守ることである」と、前記の問題を例証している。
【００３２】
ピコルナウイルスに対するワクチンを改善する方法として、死菌ワクチン（ｋｉｌｌｅｄ  ｗｈｏｌｅ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ）により生成されるものと同様の防御抗体を誘導し得る、ウイルスの外殻構造又はその構成要素を模倣する手段を試みた。こういう手段は、病原性の逆戻りの可能性が最初から皆無であるため、死菌／不活化／弱毒化ワクチンより安全である。
【００３３】
全てのピコルナウイルスは、Ｐ１遺伝子における４つの構造遺伝子、つまりＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４を含む同じゲノム構造を共有する。ＶＰ４及びＶＰ２は、ＶＰ０、並びに３Ｃ及び３Ｄ遺伝子におけるウイルスプロテアーゼと共に発現する。ウイルスプロテアーゼはＰ１遺伝子を切断し、それによってウイルスは、エンテロウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ウイルスカプソメア、錯体及び／又は抗原に組織化される。
【００３４】
ＨＥＶ７１感染を含むエンテロウイルス感染の予防及び治療に用いられるワクチンの基礎として、エンテロウイルスの主要殻タンパク質であるＶＰ１を含むサブユニットワクチンを用いる方法が提案された（Ｗｕ、ｅｔ  ａｌ．、２００１）こともあったが、中くらいの成功を収めただけであった。
【００３５】
エンテロウイルス感染に対する予防法に関して、防御抗体を誘導すると言われる死菌ワクチンの観点から接近する方法こそが最も想定し易い方法であった。しかしながら、ウイルス力価があまりにも低いため、そのようなエンテロウイルスワクチンを製造することは、冒険に近かったのは現状である。
【００３６】
本発明は、ピコルナウイルス科ウイルスの抗原性外皮タンパク質／殻タンパク質を含有し、神経毒力の一因となるウイルスＲＮＡを持っていないワクチンに関する。本発明のワクチンは、抗原として、エンテロウイルスに対して中和抗体を誘導できる、ポリペプチドＰ１又はＶＰ０、或いは、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及び／又はＶＰ４として指定されている殻タンパク質（ＶＰ）、若しくは、これらの免疫的活性フラグメント又は生物活性フラグメントを含んでなる。
【００３７】
本発明は、ピコルナウイルス抗原が１種以上のピコルナウイルスポリペプチド、特にヒトエンテロウイルスペプチドであるＶＰ２、ＶＰ３又はＶＰ０、その免疫原性フラグメント、及び／又はその抗原性決定基の形で発現される、ワクチンに関する。ピコルナウイルスポリペプチドは、ヒトエンテロウイルスのアミノ酸配列又は核酸配列を用いたＤＮＡ組換え技術、或いは化学合成により取得しても良い。
【発明の概要】
【００３８】
ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、及びその免疫的活性フラグメントから選ばれた１種以上のヒトエンテロウイルスポリペプチドを含む１種以上の免疫的活性抗原を含むことを特徴とする、ワクチン。
【００３９】
例えば、ヒトエンテロウイルスに対する防御免疫反応、及び／又は中和免疫反応を誘導することを特徴とする、ワクチン。
【００４０】
例えば、前記ヒトエンテロウイルスは、ヒトエンテロウイルスＡ、ヒトエンテロウイルスＢ、ヒトエンテロウイルスＣ及びヒトエンテロウイルスＤのうちから選ばれることを特徴とする、ワクチン。
【００４１】
例えば、前記ヒトエンテロウイルスＡは、ヒトエンテロウイルス７１（ＨＥＶ７１）とコクサッキーウイルスＡ１６のうちから選ばれ、前記ヒトエンテロウイルスＢは、コクサッキーウイルスＢとエコーウイルスのうちから選ばれ、前記ヒトエンテロウイルスＣは、ヒトポリオウイルス１、ヒトポリオウイルス２、及びヒトポリオウイルス３のうちから選ばれ、前記ヒトエンテロウイルスＤは、ＥＶ６８であることを特徴とする、ワクチン。
【００４２】
例えば、前記ワクチンは、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ０ポリペプチドを含むことを特徴とする、ワクチン。
【００４３】
例えば、前記ワクチンは、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ２ポリペプチドを含むことを特徴とする、ワクチン。
【００４４】
例えば、前記ワクチンは、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ３ポリペプチドを含むことを特徴とする、ワクチン。
【００４５】
例えば、前記ワクチンは、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ１ポリペプチドを含むことを特徴とする、ワクチン。
【００４６】
例えば、前記ワクチンは、１種以上のエンテロウイルス種又は血清型に由来するポリペプチドを含むことを特徴とする、ワクチン。
【００４７】
例えば、前記種又は血清型は、ＨＥＶ７１とコクサッキーウイルスＡ１６のうちから選ばれたヒトエンテロウイルスＡであっても良いことを特徴とする、ワクチン。
【００４８】
例えば、前記種又は血清型は、ＰＶ−１、ＰＶ−２、ＰＶ−３のうちから選ばれたヒトエンテロウイルスＣであっても良いことを特徴とする、ワクチン。
【００４９】
例えば、ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、及びその免疫的活性フラグメントのうちから選ばれた１種以上のヒトエンテロウイルスポリペプチドを含む前記１種以上の免疫的活性抗原は、ウイルス様粒子、カプソメア、錯体及び／又は会合体の形態であることを特徴とする、ワクチン。
【００５０】
例えば、前記ウイルス様粒子は、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ０ポリペプチドを含むことを特徴とする、ワクチン。
【００５１】
例えば、前記ウイルス様粒子は、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ２ポリペプチドを含むことを特徴とする、ワクチン。
【００５２】
例えば、前記ウイルス様粒子は、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ３ポリペプチドを含むことを特徴とする、ワクチン。
【００５３】
例えば、前記ウイルス様粒子は、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ１ポリペプチドを含むことを特徴とする、ワクチン。
【００５４】
エンテロウイルス感染に対して被験者にワクチン接種を施す方法であって、ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、及びその免疫的活性フラグメントのうちから選ばれた１種以上のヒトエンテロウイルスポリペプチドを含む１種以上の免疫的活性抗原を含むワクチンの、前記被験者への投与の際にヒトエンテロウイルスに対する防御免疫反応及び／又は中和免疫反応を誘導するほどの有効量を前記被験者に投与することを特徴とする、方法。
【００５５】
例えば、前記ワクチンは、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ０ポリペプチドを含むことを特徴とする、方法。
【００５６】
例えば、前記ワクチンは、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ１ポリペプチドを含むことを特徴とする、方法。
【００５７】
例えば、前記ワクチンは、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ３ポリペプチドを含むことを特徴とする、方法。
【００５８】
例えば、前記ワクチンは、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ２ポリペプチドを含むことを特徴とする、方法。
【００５９】
例えば、ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、及びその免疫的活性フラグメントのうちから選ばれた１種以上のヒトエンテロウイルスポリペプチドを含む前記１種以上の免疫的活性抗原は、ウイルス様粒子、カプソメア、錯体及び／又は会合体の形態であることを特徴とする、方法。
【００６０】
例えば、前記ウイルス様粒子は、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ０ポリペプチドを含むことを特徴とする、方法。
【００６１】
例えば、前記ウイルス様粒子は、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ２ポリペプチドを含むことを特徴とする、方法。
【００６２】
例えば、前記ウイルス様粒子は、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ３ポリペプチドを含むことを特徴とする、方法。
【００６３】
例えば、前記ウイルス様粒子は、免疫的活性エンテロウイルスＶＰ１ポリペプチドを含むことを特徴とする、方法。
【００６４】
例えば、前記ワクチンは、１種以上のエンテロウイルス種又は血清型に由来するポリペプチドを含むことを特徴とする、方法。
【００６５】
例えば、エンテロウイルスの前記種又は血清型は、ＨＥＶ７１とコクサッキーウイルスＡ１６のうちから選ばれたヒトエンテロウイルスＡであっても良いことを特徴とする、方法。
【００６６】
例えば、エンテロウイルスの前記種又は血清型は、ＰＶ−１、ＰＶ−２、ＰＶ−３のうちから選ばれたヒトエンテロウイルスＣであっても良いことを特徴とする、方法。
【００６７】
ヒトエンテロウイルスＰ１ポリペプチドをコード化する核酸に操作可能に結合しているプロモーターと、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）と、ヒトエンテロウイルス３ＣＤプロテアーゼをコード化する核酸とを含むことを特徴とする、発現カセット。
【００６８】
例えば、前記ポリペプチドはヒトエンテロウイルスＰ１であることを特徴とする、発現カセット。
【００６９】
例えば、前記ヒトエンテロウイルス３ＣＤプロテアーゼは、前記ヒトエンテロウイルスＰ１ポリペプチドを処理することを特徴とする、発現カセット。
【００７０】
例えば、処理済みの前記ヒトエンテロウイルスＰ１ポリペプチドが、結合してウイルス様粒子、カプソメア、錯体及び／又は会合体を形成することを特徴とする、発現カセット。
【００７１】
例えば、前記ヒトエンテロウイルスＰ１ポリペプチドは、ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、及びその免疫的活性フラグメントのうちから選ばれたポリペプチドの組み合わせを含むことを特徴とする、発現カセット。
【００７２】
例えば、前記ヒトエンテロウイルスは、ヒトエンテロウイルスＡとヒトエンテロウイルスＣのうちから選ばれることを特徴とする、発現カセット。
【００７３】
例えば、前記ヒトエンテロウイルスＡは、ＨＥＶ７１とコクサッキーウイルスＡ１６のうちから選ばれることを特徴とする、発現カセット。
【００７４】
例えば、前記ヒトエンテロウイルスＣは、ヒトポリオウイルス１（ＰＶ−１）、ヒトポリオウイルス２（ＰＶ−２）及びヒトポリオウイルス３（ＰＶ−３）のうちから選ばれることを特徴とする、発現カセット。
【００７５】
例えば、前記ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）から由来したものであることを特徴とする、発現カセット。
【００７６】
例えば、前記脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来の前記ＩＲＥＳは、遺伝子組換えを行われ、ＩＲＥＳ活性が低減されていることを特徴とする、発現カセット。
【００７７】
例えば、前記ＥＭＣＶ由来の前記ＩＲＥＳは、ＪＫセグメントのＡ６分岐ループに、ヌクレオチド（Ａ７）一つを加えることにより、遺伝子組換えを行われたことを特徴とする、発現カセット。
【００７８】
例えば、前記ＩＲＥＳは、ヒトエンテロウイルスから由来したものであることを特徴とする、発現カセット。
【００７９】
例えば、前記プロモーターは真核生物プロモーターであることを特徴とする、発現カセット。
【００８０】
例えば、前記真核生物プロモーターはポリヘドリンプロモーターであることを特徴とする、発現カセット。
【００８１】
例えば、前記プロモーターは、ヒトエンテロウイルスＡのＰ１ポリペプチド、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、及びヒトエンテロウイルスＡの３ＣＤプロテアーゼをコード化する核酸と操作可能に結合していることを特徴とする、発現カセット。
【００８２】
例えば、前記ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳは、突然変異によりＩＲＥＳ活性が低減されていることを特徴とする、発現カセット。
【００８３】
例えば、前記プロモーターは、ヒトエンテロウイルスＡのＰ１ポリペプチド、ＨＥＶ７１  ＩＲＥＳ、及びヒトエンテロウイルスＡの３ＣＤプロテアーゼをコード化する核酸と操作可能に結合していることを特徴とする、発現カセット。
【００８４】
例えば、前記プロモーターは、ヒトエンテロウイルスＡのＰ１ポリペプチド、ヒトエンテロウイルスＣ  ＩＲＥＳ、及びヒトエンテロウイルスＡの３ＣＤプロテアーゼをコード化する核酸と操作可能に結合していることを特徴とする、発現カセット。
【００８５】
例えば、前記プロモーターは、ヒトエンテロウイルスＣのＰ１ポリペプチド、ヒトエンテロウイルスＣ  ＩＲＥＳ、及びヒトエンテロウイルスＣの３ＣＤプロテアーゼをコード化する核酸と操作可能に結合していることを特徴とする、発現カセット。
【００８６】
例えば、前記プロモーターは、ヒトエンテロウイルスＣのＰ１ポリペプチド、ＨＥＶ７１  ＩＲＥＳ、及びヒトエンテロウイルスＣの３ＣＤプロテアーゼをコード化する核酸と操作可能に結合していることを特徴とする、発現カセット。
【００８７】
例えば、前記プロモーターは、ヒトエンテロウイルスＣのＰ１ポリペプチド、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、及びヒトエンテロウイルスＣの３ＣＤプロテアーゼをコード化する核酸と操作可能に結合していることを特徴とする、発現カセット。
【００８８】
ＶＬＰ発現カセットを宿主細胞に取り込み、前記発現カセットのポリペプチドを生成できる期間の間、前記宿主細胞を培養し、前記宿主細胞及び／又は培養上清よりヒトエンテロウイルスポリペプチドを回収することを特徴とする、ワクチンの製造方法。
【００８９】
例えば、前記宿主細胞は真核細胞であることを特徴とする、方法。
【００９０】
例えば、前記真核細胞は、昆虫細胞、哺乳動物細胞株、及び酵母細胞のうちから選ばれることを特徴とする、方法。
【００９１】
例えば、前記昆虫細胞は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ，ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、及びＡｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ由来の蚊細胞のうちから選ばれることを特徴とする、方法。
【００９２】
例えば、前記哺乳動物細胞株は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ−１、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、及びＮＩＨ３Ｔ３から選ばれることを特徴とする、方法。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】ＨＥＶ７１のＶＬＰ発現カセット［Ｐ１＋ＩＲＥＳ＋３ＣＤ］及びｐＳＮ０１プラスミド
【図２】ＨＥＶ７１のＶＬＰ発現カセット［Ｐ１＋ＩＲＥＳ＋３Ｃ］及びｐＳＮ０３プラスミド
【図３】ＳＮ０７感染Ｓｆ９細胞の上清におけるＶＰ１の発現
【図４】上清及び溶解物の両方における処理済みＶＰ１
【図５】１００ｋＤａの分画分子量（ＭＷＣＯ）膜による限外濾過後の残余分におけるＶＰ１及びＶＰ０
【図６】中和抗体を生成する免疫化スケジュール
【図７】３つの採取時間における、ＶＰ０（矢印）に対する多クローン性ウサギ抗血清から探知した免疫ブロット
【図８】ＳＮ０７感染Ｓｆ９細胞の上清におけるオリゴマー抗原で免疫化を受けたマウスから摘出したプール中和血清。ＥＬＩＳＡ法において組換えＶＰ２に対し高い力価を示した。
【図９】ＳＮ０７感染Ｓｆ９細胞の上清におけるオリゴマー抗原で免疫化を受けたマウスから摘出したプール中和血清。ＶＰ１に比べ、ＶＰ２及びＶＰ０とより強く結合する。
【図１０】ＥＭＣＶゲノムのＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
【図１１】ＥＭＣＶ開始コドンと３ＣＤプロテアーゼコード配列のアウトフレーム（ＯＵＴ  ＦＲＡＭＩＮＧ）：天然ＩＲＥＳ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）と突然変異ＩＲＥＳ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の比較
【図１２】プラスミドｐＳＮ０１−Ｍ１
【図１３】プラスミドｐＳＮ０１−Ｍ２
【図１４】プラスミドｐＳＮ０１−Ｍ３
【図１５】ＨＥＶ７１  ＶＬＰの発現に用いられる、異なる設計の組換えバキュロウイルスの発現の比較
【図１６】プラスミドｐＦａｓｔＢａｃＴＭ  ＨＴ
【図１７】ヒトエンテロウイルスＡ及びヒトエンテロウイルスＣの抗原性融合タンパク質に対する原核発現構築体
【図１８】ＳＮ０７残余分で免疫化を受けたマウスから摘出したプール中和血清からの抗体。ＨＥＶ７１  ＶＬＰの構成要素全てと結合する。
【図１９】ＨＥＶ７１  ＶＬＰの特性評価。培養上清からのＨＥＶ７１  ＶＬＰのプルダウン。
【図２０】アフィニティーカラム（ＡＦＣ）精製ＨＥＶ７１  ＶＬＰの分析
【図２１】ＡＦＣ精製ＨＥＶ７１  ＶＬＰの電子顕微鏡写真
【図２２】ヒトエンテロウイルスＣ（ポリオウイルス−ＰＶ）のＶＬＰ発現
【図２３】ポリオウイルスのＶＬＰ  ＶＰ３−ＶＰ１のＥＬＩＳＡ
【図２４】ＨＥＶ７１−ＩＲＥＳ及びＨＥＶ７１  ３ＣＤプロテアーゼを持つＨＥＶ７１  ＶＬＰ発現カセット
【図２５】ＰＶ−ＩＲＥＳ及びＨＥＶ７１  ３ＣＤプロテアーゼを持つＨＥＶ７１  ＶＬＰ発現カセット
【発明を実施するための形態】
【００９４】
本発明は、ピコルナウイルス感染の予防及び／又は治療に用いられる免疫原性組成物及び／又はワクチンとしてピコルナウイルス科のウイルスから得た、抗原のウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ウイルスカプソメア、会合体、及び錯体を提供する。代表例は、エンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ポリオウイルスなどを含む。
本発明の異なる様態は、中和抗体を誘導するウイルスのタンパク質、例えばＰ１タンパク質、或いはピコルナウイルスのＶＰ０タンパク質、ＶＰ１タンパク質、ＶＰ２タンパク質、ＶＰ３タンパク質、及び／又はＶＰ４タンパク質の組み合わせ、若しくはその免疫的活性フラグメント又は生物活性フラグメントを提供する。本発明は、上述のウイルスタンパク質及び／又はそのフラグメントを含む融合タンパク質を含み、当該融合タンパク質は、防御免疫性を持つ中和抗体の生成を誘導する、免疫的活性又は生物活性のものである。
【００９５】
実施形態において、エンテロウイルスの抗原はエンテロウイルスの外皮タンパク質／殻タンパク質の組み合わせ、若しくはその免疫的活性フラグメントであっても良い。ウイルスの外皮タンパク質／殻タンパク質は、ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及び／又はＶＰ４タンパク質のうちいずれかの組み合わせであっても良く、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、カプソメア、錯体及び／又は会合体のうちいずれかの形を取っても良い。組み合わせは、融合タンパク質の形になっても良い。
【００９６】
本発明の更に異なる様態は、ピコルナウイルス科のウイルス様粒子（ＶＬＰ）、カプソメア、錯体及び／又は会合体を生成する方法を含む。当該方法は、（ｉ）ピコルナウイルスのタンパク質、例えばＰ１タンパク質、或いはピコルナウイルスのＶＰ０タンパク質、ＶＰ１タンパク質、ＶＰ２タンパク質、ＶＰ３タンパク質、及び／又はＶＰ４タンパク質の組み合わせをそれぞれコード化する１種以上の核酸を含むプロモーターと操作可能に結合している発現カセットを構築し、前記タンパク質は内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）と操作可能に結合しており、当該ＩＲＥＳは３Ｃ又は３ＣＤプロテアーゼと操作可能に結合しているステップと、（ii）当該発現カセットを以って適合な宿主細胞に対してトランスフェクション又は形質転換を行うステップと、（iii）カセットに含まれている核酸の発現後、細胞によりウイルス様粒子（ＶＬＰ）及び／又はカプソメア及び／又は抗原が生成される条件下で当該宿主細胞を培養するステップとを含む。
【００９７】
核酸又は組換えＤＮＡ分子を取得し、それによってコクサッキーウイルスＡ１６、ＨＥＶ７１、ヒトエンテロウイルスＣ（ヒトポリオウイルスＰＶ１、ＰＶ２及び／又はＰＶ３）、ＥＶ６８、若しくはその他のピコルナウイルスのタンパク質及びプロテアーゼをコード化する読取枠を、コクサッキーウイルスＡ１６、ＨＥＶ７１、ヒトエンテロウイルスＣ、若しくはその他のピコルナウイルスの核酸配列を補完する適合設計プライマーを用いるＰＣＲ増幅により増幅しても良い。適合なプライマーは、コクサッキーウイルスＡ１６、ＨＥＶ７１、ヒトエンテロウイルスＣ、若しくはその他のピコルナウイルスを含むエンテロウイルスの入手可能な核酸配列から、従来の技術を用いて設計しても良い。全ゲノム塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能であり、更に、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）で調べても良い。
【００９８】
実施形態において、ピコルナウイルスのＰ１タンパク質、若しくは他のエンテロウイルスのＰ１タンパク質は、ポリペプチドとして発現する。続いて、当該ポリペプチドは３Ｃ又は３ＣＤプロテアーゼにより、ウイルスタンパク質のＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ３、若しくはその免疫的活性フラグメント又は生物活性フラグメントに切断される。エンテロウイルスのタンパク質は、エンテロウイルスに対する中和抗体を誘導する。ＶＰ０タンパク質は、やはりエンテロウイルスに対する中和抗体を誘導するＶＰ２タンパク質とＶＰ４タンパク質、若しくはその免疫的活性フラグメント又は生物活性フラグメントに更に切断されても良い。ウイルスタンパク質を、エンテロウイルスタンパク質のＶＬＰ、カプソメア及び／又は会合体に自己組織化させても良い。更に、プロテアーゼ遺伝子は、ＶＬＰ発現カセットの同じＤＮＡ組換え分子、或いは異なるＤＮＡ組換え分子に含まれていても良く、及び／又は、異なるプロモーターや翻訳要素から発現しても良い。
【００９９】
ＶＬＰ発現カセットの組換えＤＮＡ分子及び核酸を構築し、それによって、ピコルナウイルスの構造タンパク質又はプロテアーゼをコード化する読取枠をピコルナウイルスの核酸配列を補完する適合設計プライマーを用いるＰＣＲ増幅により増幅しても良い。
【０１００】
更なる実施形態において、組換えＤＮＡ分子は、少なくとも２種のエンテロウイルスの構造タンパク質、若しくはその一部を有する融合タンパク質コード化しても良い。当該タンパク質は、単一ポリペプチド抗原として発現される。
【０１０１】
本発明は、エンテロウイルスの構造タンパク質（Ｐ１領域）とプロテアーゼ（３ＣＤ）に対する遺伝子配列を提供するＶＬＰ発現カセットを包含する。当該遺伝子配列は、Ｐ１タンパク質をウイルス外殻のタンパク質に切断するために必ず必要である。切断により、エンテロウイルスＶＬＰは自己組織化を執り行う。発現カセットは、エンテロウイルスのＰ１タンパク質に対する核酸コード配列の上流に位置するプロモーターを用いる２シストロン性ベクターである。Ｐ１タンパク質をコード化するシストロンの下流には、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）配列が位置し、３ＣＤプロテアーゼをコード化するヌクレオチド配列を含みシストロンがその後に続く。
【０１０２】
Ｐ１領域と３ＣＤプロテアーゼの発現は単一２シストロン性伝令から進み、ここにおいて、３ＣＤプロテアーゼ遺伝子は、ＩＲＥＳの制御の下で、キャップ非依存的翻訳を施される。プロテアーゼ３ＣＤの発現は、やや有毒であるため宿主細胞の早死の原因となり得る。それによって、エンテロウイルスの殻タンパク質やＶＬＰの収率が低減する。カセットからのＰ１タンパク質の発現を高レベルで維持しながら、プロテアーゼの活性を低減しても良い。突然変異を含む様々なＩＲＥＳ及びＩＲＥＳ配列を発現カセットに挿入することで、細胞毒性を持つことなくＰ１を適切に切断できるよう、３ＣＤプロテアーゼの発現／活性を制御し、有効ＩＲＥＳを特定する。ＶＬＰの効率的生成のために、異なるウイルス種又は血清型からのＩＲＥＳの制御の下で発現する完全Ｐ１コード配列と完全３ＣＤプロテアーゼコード配列を持つ組換えバキュロウイルスに対してテストを行った。
【０１０３】
例えば、本発明の発現カセットは、ヒトエンテロウイルスＡのＰ１ポリペプチド、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、ヒトエンテロウイルスＡの３ＣＤプロテアーゼをコード化する核酸と操作可能に結合しているプロモーターからなっても良い。
【０１０４】
本発明の発現カセットは、ヒトエンテロウイルスＡのＰ１ポリペプチド、ヒトエンテロウイルスＣ  ＩＲＥＳ、ヒトエンテロウイルスＡの３ＣＤプロテアーゼをコード化する核酸と操作可能に結合しているプロモーターからなっても良い。
【０１０５】
本発明の発現カセットは、ヒトエンテロウイルスＣのＰ１ポリペプチド、ＨＥＶ７１  ＩＲＥＳ、ヒトエンテロウイルスＣの３ＣＤプロテアーゼをコード化する核酸と操作可能に結合しているプロモーターからなっても良い。
【０１０６】
更に、本発明の発現カセットは、ヒトエンテロウイルスＣのＰ１ポリペプチド、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、ヒトエンテロウイルスＣの３ＣＤプロテアーゼをコード化する核酸と操作可能に結合しているプロモーターからなっても良い。
【０１０７】
なお、有効ＩＲＥＳを含む発現カセットにおける３ＣＤプロテアーゼの切断及び突然変異により、ＶＬＰの最大収率を達成することができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＤＱ３４１３６２．１のアミノ酸１６７１番であるＨＥＶ７１の３Ｃプロテアーゼのグリシンは、変異ＨＥＶ７１  ３Ｃの発現に対する部位特異的突然変異誘発法と、それに続くＨＥＶ７１のＰ１ポリペプチドの切断とによりアラニンに転換する。
【０１０８】
発現カセットからのタンパク質の発現及び活性を高レベルに引き上げるという目標に関する当該分野の一般的な知識とは逆に、実施形態において、本発明はタンパク質の活性を低減して最大タンパク質収率を得ることに成功している。活性を低減させるＩＲＥＳ又は３Ｃプロテアーゼ核酸の変異は、予想外に、エンテロウイルスの殻タンパク質とＶＬＰの収率を増加させる。
【０１０９】
発現カセットは、適合なベクターに移植され、エンテロウイルスを含むピコルナウイルスによる感染を予防するワクチン用の抗原の発現・精製に関わる適合な宿主細胞にトランスフェクション／形質転換を行っても良い。
【０１１０】
ピコルナウイルス抗原をコード化する発現カセットは、真核宿主細胞へのトランスフェクションが可能であり、適合な増殖条件下で発現しても良いプラスミドからなっても良い。適切な真核生物発現系は当業者に既に知られており、誘導性発現系と適合な真核宿主細胞とを含んでなる。
【０１１１】
本発明の発現カセットを含む哺乳動物細胞発現ベクターは、宿主細胞及び細胞株への一過性のトランスフェクションができるものを含む。更に、哺乳動物細胞発現ベクターは、トランスフェクション後の宿主細胞内で安定的に維持されるベクターであっても良い。
【０１１２】
また、哺乳動物細胞発現ベクターは、哺乳動物宿主細胞又は細胞株に安定的に、若しくは一過性のトランスフェクションを行われたベクターを含んでも良い。ここにおいて、実験対象のタンパク質の発現は、培地への誘導剤の添加するにより誘導することができる。哺乳動物宿主細胞及び細胞株は、例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ  ２９３、ＣＯＳ−１、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を含む。更に、当然ではあるが、他の真核宿主細胞は、酵母細胞、又は他の哺乳動物細胞株を含んでも良い。
【０１１３】
発現カセットは、宿主細胞へのトランスフェクションが可能である組換えウイルスに含まれていても良い。当該目的に用いられ得る適合なウイルスには、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、シンドビスウイルス、ＳＶ４０、センダイウイルス、レトロウイルスやアデノウイルスが含まれる。適合な宿主細胞は、前記ウイルスと互換性のある宿主細胞を含んでも良く、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（例えばＳｆ９細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞、ＣＨＯ細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、ＢＨＫ細胞、ヒトＳＷ１３細胞、ショウジョウバエ細胞、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ由来の蚊細胞などの昆虫細胞がそれに当該する。
【０１１４】
エンテロウイルス核酸を含む発現カセットは、当業者に知られている手段により適合な宿主細胞に取り組まれても良い。宿主細胞は、エンテロウイルス遺伝子及びタンパク質の発現が許容される条件下で、増殖し培養される。
【０１１５】
エンテロウイルスに対する中和抗体を誘導するエンテロウイルスのＶＰ２タンパク質、若しくはその免疫的活性フラグメント又は生物活性フラグメントをコード化する遺伝子は、適合なプロモーターを含有するプラスミドに挿入され、宿主細胞で発現されても良い。生成されたエンテロウイルスのＶＰ２タンパク質は、ワクチンの用途又は診断用途に用いられるため、免疫原性組成物に基づいて分離／利用される。
【０１１６】
エンテロウイルスに対する中和抗体を誘導するエンテロウイルスのＶＰ４タンパク質、若しくはその免疫的活性フラグメント又は生物活性フラグメントをコード化する遺伝子は、適合なプロモーターを含有するプラスミドに挿入され、宿主細胞で発現されても良い。生成されたエンテロウイルスのＶＰ４タンパク質は、ワクチンの用途又は診断用途に用いられるため、免疫原性組成物に基づいて分離／利用される。
【０１１７】
エンテロウイルスに対する中和抗体を誘導するエンテロウイルスのＶＰ０タンパク質、若しくはその免疫的活性フラグメント又は生物活性フラグメントをコード化する遺伝子は、適合なプロモーターを含有するプラスミドに挿入され、宿主細胞で発現されても良い。生成されたエンテロウイルスのＶＰ０タンパク質は、ワクチンの用途又は診断用途に用いられるため、免疫原性組成物に基づいて分離／利用される。
【０１１８】
エンテロウイルスのＶＰ０タンパク質をコード化する遺伝子は、適合なプロモーターと操作可能に結合し、プラスミドに挿入されても良い。当該プラスミドは、適合なプロモーターと結合しているエンテロウイルスプロテアーゼを示して二重組換えプラスミドを提供する。当該二重組み替えプラスミドは、最終的に真核細胞発現系又は原核細胞発現系において発現されても良い。
【０１１９】
エンテロウイルスのポリペプチド抗原の遺伝子クローニング及び発現に用いられるべき適合なベクターには、コスミッドとプラスミドが含まれている。適合な発現系には、当業者にも知られている原核生物発現系と、大腸菌を含み、原核細胞内のタンパク質の発現に用いられるコスミッド又はプラスミドにより形質転換を行う原核宿主細胞とが含まれる。
【０１２０】
更に、適合な発現系には、当業者にも知られている真核生物発現系と、様々な真核宿主細胞及び細胞株におけるタンパク質の発現に用いられるプラスミドにより形質変換を行う真核宿主細胞とが含まれる。
【０１２１】
なお、エンテロウイルスのポリペプチド抗原を、当業者に知られている手段により宿主細胞又は培養上清から得ても良い。
【０１２２】
エンテロウイルスのＶＬＰ、カプソメア、抗原、その免疫的活性要素、及び／又はその会合体は、トランスフェクション及び／又は形質転換を施された宿主細胞、或いは宿主細胞の培地、上清及び溶解物から、当業者に知られている適切な精製手段により取得しても良い。培地から遊離されたタンパク質の分離は、エンテロウイルスのＶＬＰ、カプソメア、抗原及び／又は会合体を取得する簡便な方法である。エンテロウイルスのＶＬＰ、カプソメア、抗原、その免疫的活性要素、及び／又はその会合体は、当業者に知られている手段により、更に濃縮・精製を行われても良い。
【０１２３】
本発明のもう一つの様態は、エンテロウイルスの抗原、ＶＬＰ及び／又はカプソメアと抗原性補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）との組み合わせなど、ピコルナウイルス抗原を含有するワクチンを含む。ピコルナウイルスの抗原、その免疫的活性フラグメント、ＶＬＰ及び／又はカプソメアを、変異ワクシニアウイルス、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、硫酸バンド、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、不完全フロイントアジュバントや完全フロイントアジュバント、Ｑｕｉｌ  Ａ、その他のサポニン、或いはＶａｎｓｅｌｏｗ（１９８７）Ｓ．Ｖｅｔ．Ｂｕｌｌ．５７  ８８１−８９６の実施例に記載されているその他の抗原性補助剤など、適切な抗原性補助剤と組み合わせて用いても良い。
【０１２４】
本明細書にて用いられる「リン酸アルミニウム」及び「水酸化アルミニウム」という用語は、ワクチンの補助剤として相応しい水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムの形状を全て含むものとする。
【０１２５】
更に、ピコルナウイルスの抗原を、ヒトポリオウイルスの入手可能な核酸又はタンパク質配列に基づくポリペプチドの化学合成、若しくは化学合成により、製造しても良い。
【０１２６】
一様態において、本発明は１種以上のヒトエンテロウイルスＣ抗原を含むワクチンを提供する。本明細書にて用いられる「ポリオウイルス抗原」又は「ヒトエンテロウイルスＣ抗原」という表現は、ヒトエンテロウイルスＣに対して中和抗体を刺激することができる抗原全てを指す。ウイルス抗原は、外皮タンパク質／殻タンパク質、若しくはそのフラグメント、抗原性決定基、及び／又は他のヒトエンテロウイルスＣのタンパク質からなっても良い。
【０１２７】
本発明のもう一つの様態は、単独ヒトエンテロウイルスＣの外皮タンパク質／殻タンパク質を抗原として含む、ヒトエンテロウイルスＣのサブユニットワクチンに関する。より詳しくは、本発明は、ヒトエンテロウイルスＣのＶＰ２外皮タンパク質／殻タンパク質、若しくはその免疫原性フラグメントを抗原として含むワクチンに関する。
【０１２８】
本発明のもう一つの様態は、ヒトエンテロウイルスＣのＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及び／又はＶＰ４、若しくはＶＰ０タンパク質を含む、ヒトエンテロウイルスＣのウイルス様粒子（ＶＬＰ）、カプソメア、錯体及び／又は会合体を含むワクチンを含む。
【０１２９】
組換えＤＮＡ分子を取得し、それによって、ヒトエンテロウイルスＣの構造タンパク質又はプロテアーゼをコード化する読取枠を含む核酸を、ヒトエンテロウイルスＣの核酸配列を補完する適合設計プライマーを用いるＰＣＲ増幅により取得しても良い。適合なプライマーは、ヒトエンテロウイルスＣの入手可能な核酸配列、例えばその全ゲノム塩基配列から、従来の技術を用いて設計しても良い。全ゲノム塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能であり、更に、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）で調べても良い。ヒトエンテロウイルスＣの全ゲノム、ポリオウイルスＩ型ゲノムに対するアクセス番号は、Ｖ０１１４９及びＶ０１１５０である。
【０１３０】
本発明の発現カセットは、ヒトエンテロウイルスＣのＰ１ポリペプチドをコード化する核酸からなっても良い。Ｐ１ポリペプチドは、発現カセットのＩＲＥＳの制御の下で翻訳された３ＣＤプロテアーゼにより切断され、ＶＰ１、ＶＰ３及び／又はＶＰ０ポリペプチドを生成する。ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ３の組み合わせはウイルス様粒子に自己組織化しても良い。
【０１３１】
ヒトエンテロウイルスＣのポリペプチド抗原は、ＶＰ０を更に切断して得た生成物であるヒトエンテロウイルスＣの外皮ＶＰ２タンパク質／殻ＶＰ２タンパク質と、他のポリオウイルスのＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ３及び／又はＶＰ４外皮タンパク質／殻タンパク質との組み合わせからなっても良い。ヒトエンテロウイルスＣの外皮タンパク質／殻タンパク質の組み合わせは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、カプソメア、錯体及び／又は会合体の形をしていても良い。
【０１３２】
ヒトエンテロウイルスＣの外皮タンパク質／殻ＶＰ２タンパク質をコード化する遺伝子は、適合なプロモーターを含有するプラスミドに挿入され、宿主細胞で発現されても良い。当該タンパク質は、ワクチンとして用いられるため、免疫原性組成物に基づき分離される。更に、ヒトポリオウイルスのＶＰ２タンパク質をコード化する遺伝子は、適合なプロモーターを含有するプラスミドに挿入され、宿主細胞で発現されても良い。当該タンパク質は、ワクチンとして用いられるため、免疫原性組成物に基づいて分離／利用される。
【０１３３】
ヒトエンテロウイルスＣの外皮タンパク質／殻ＶＰ４タンパク質をコード化する遺伝子は、適合なプロモーターを含有するプラスミドに挿入され、宿主細胞で発現されても良い。当該タンパク質は、ワクチンとして用いられるため、免疫原性組成物に基づき分離される。更に、ヒトポリオウイルスのＶＰ４タンパク質をコード化する遺伝子は、適合なプロモーターを含有するプラスミドに挿入され、宿主細胞で発現されても良い。当該タンパク質は、ワクチンとして用いられるため、免疫原性組成物に基づいて分離／利用される。
【０１３４】
ヒトエンテロウイルスＣの外皮タンパク質／殻ＶＰ０タンパク質をコード化する遺伝子は、適合なプロモーターを含有するプラスミドに挿入され、宿主細胞で発現されても良い。当該タンパク質は、ワクチンとして用いられるため、免疫原性組成物に基づき分離される。更に、ヒトポリオウイルスのＶＰ０タンパク質をコード化する遺伝子は、適合なプロモーターを含有するプラスミドに挿入され、宿主細胞で発現されても良い。当該タンパク質は、ワクチンとして用いられるため、免疫原性組成物に基づいて分離／利用される。
【０１３５】
本発明は、ヒトエンテロウイルスＣのＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４ポリペプチド、及びその免疫的活性フラグメンのうち一つ以上を含む、１種以上の免疫的活性抗原を含むワクチンを包含する。当該ワクチンはヒトエンテロウイルスに対する防御免疫反応及び／又は中和免疫反応を誘導する。
【０１３６】
実施形態において、発現カセットは主に、ヒトエンテロウイルスＣのＰ１ポリタンパク質をコード化する核酸、ＩＲＥＳ、並びＩＲＥＳの翻訳的制御下のエンテロウイルスの３ＣＤプロテアーゼにより構成される。当該プロテアーゼは、ヒトエンテロウイルスＣのＰ１ポリタンパク質を構造殻タンパク質に切断する。
【０１３７】
もう一つの様態において、本発明は、ＶＰ２、ＶＰ４及び／又はＶＰ０タンパク質、及び／又は生物活性フラグメント又は免疫的活性フラグメントを含むＰ１ポリタンパク質由来のヒトエンテロウイルスＡ抗原を含むワクチンを提供する。ヒトエンテロウイルスＡ抗原は、ＨＥＶ７１及び／又はコクサッキーウイルスＡ１６から由来しても良い。ＨＥＶ７１抗原は、単独ヒトエンテロウイルスの外皮タンパク質／殻タンパク質であっても良い。特に、ＨＥＶ７１抗原は、人間への投与により免疫反応を誘導する、ＨＥＶ７１のＰ１ポリタンパク質、ＶＰ４、ＶＰ２又はＶＰ０ポリペプチド、若しくはそのフラグメントであっても良い。
【０１３８】
実施形態において、ヒトエンテロウイルスＡ抗原は、ヒトエンテロウイルスＡの外皮タンパク質／殻タンパク質、若しくはその免疫的活性フラグメントの組み合わせであっても良い。例えば、ヒトエンテロウイルスＡ抗原は、ポリオウイルスのＶＰ２タンパク質と、ＶＰ１、ＶＰ３及び／又はＶＰ４ポリペプチドのうちから選ばれる、他のポリオウイルスの外皮タンパク質／殻タンパク質との組み合わせからなっても良い。ＶＰ２ポリペプチドと、他のポリオウイルスの外皮タンパク質／殻タンパク質との組み合わせは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、カプソメア、錯体及び／又は会合体の形をしていても良い。更に、当該組み合わせは、融合タンパク質の形であっても良い。
【０１３９】
より詳しくは、本発明は、ヒトエンテロウイルスＡのＶＰ２外皮タンパク質／殻タンパク質、若しくはその免疫原性フラグメントを抗原として含むワクチンに関する。
【０１４０】
本発明のもう一つの様態は、ヒトエンテロウイルスＡのＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及び／又はＶＰ４、若しくはＶＰ０タンパク質を含む、ヒトエンテロウイルスＡのウイルス様粒子（ＶＬＰ）及び／又はカプソメアを含むワクチンを含む。
【０１４１】
組換えＤＮＡ分子を取得し、それによって、ヒトエンテロウイルスＡの構造タンパク質及び／又はプロテアーゼをコード化する読取枠を、ヒトエンテロウイルスＡの核酸配列を補完する適合設計プライマーを用いるＰＣＲ増幅により増幅しても良い。適合なプライマーは、ＨＥＶ７１の入手可能な核酸配列から、従来の技術を用いて設計しても良い。ＨＥＶ７１の全ゲノム塩基配列に対するアクセス番号は、ＤＱ３４１３６２、ＡＢ２０４８５２、ＡＦ３０２９９６、及びＡＹ４６５３５６である。
【０１４２】
組換えＤＮＡ分子を取得し、それによって、ヒトエンテロウイルスＡのＰ１、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及び／又はＶＰ４、若しくはＶＰ０タンパク質、並びにその免疫的活性フラグメント、及びプロテアーゼをコード化する読取枠を、ヒトエンテロウイルスＡの核酸配列を補完する適合設計プライマーを用いるＰＣＲ増幅により増幅しても良い。
【０１４３】
本発明のある様態において、ヒトエンテロウイルスＡのＰ１タンパク質は発現してポリタンパク質又はポリペプチドを形成し、続いてポリタンパク質又はポリペプチドは、３Ｃ又は３ＣＤプロテアーゼによりＶＰ０、ＶＰ１、及びＶＰ３タンパク質に切断される。ＶＰ０タンパク質は、更にＶＰ２及びＶＰ４タンパク質に切断されても良い。エンテロウイルスのタンパク質を、エンテロウイルスのタンパク質のＶＬＰ、カプソメア、錯体及び／又は会合体に自己組織化させても良い。更に、非構造遺伝子及びプロテアーゼ遺伝子は、同じＤＮＡ組換え分子、或いは異なるＤＮＡ組換え分子に含まれていても良く、及び／又は、異なるプロモーターや翻訳要素から発現しても良い。
【０１４４】
本発明の発現カセットは、ヒトエンテロウイルスＡのＰ１ポリペプチドをコード化する核酸からなっても良い。Ｐ１ポリペプチドは発現カセットのＩＲＥＳの制御の下で翻訳された３ＣＤプロテアーゼにより切断され、ＶＰ１、ＶＰ３及び／又はＶＰ０ポリペプチド、並びにその免疫的活性フラグメントを生成する。ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ３ポリペプチドの組み合わせはウイルス様粒子に自己組織化しても良い。
【０１４５】
ヒトエンテロウイルスＡのＶＰ２タンパク質、若しくはその免疫的活性フラグメントをコード化する遺伝子は、適合なプロモーターを含有するプラスミドに挿入され、宿主細胞で発現されても良い。ＨＥＶ７１のＶＰ２タンパク質は、ワクチンの用途又は診断用途に用いられるため、免疫原性組成物に基づいて分離／利用されても良い。
【０１４６】
ヒトエンテロウイルスＡのＶＰ４タンパク質、若しくはその免疫的活性フラグメントをコード化する遺伝子は、適合なプロモーターを含有するプラスミドに挿入され、宿主細胞で発現されても良い。分離されたＶＰ４タンパク質は、ワクチンの用途又は診断用途に用いられるため、免疫原性組成物に基づいて分離／利用されても良い。
【０１４７】
ヒトエンテロウイルスＡのＶＰ０タンパク質、若しくはその免疫的活性フラグメントをコード化する遺伝子は、適合なプロモーターを含有するプラスミドに挿入され、宿主細胞で発現されても良い。分離されたＶＰ０タンパク質は、ワクチンの用途又は診断用途に用いられるため、免疫原性組成物に基づいて分離／利用されても良い。
【０１４８】
ヒトエンテロウイルスＡのＶＰ０タンパク質、若しくはその免疫的活性フラグメントをコード化する遺伝子は、適合なプロモーターと操作可能に結合し、プラスミドに挿入されても良い。当該プラスミドは、適合なプロモーターと結合しているヒトエンテロウイルスＡのプロテアーゼを示して二重組換えプラスミドを提供する。当該二重組み替えプラスミドは、最終的に真核細胞発現系又は原核細胞発現系において発現されても良い。
【０１４９】
発現カセットに含まれているヒトエンテロウイルスＡの遺伝子及び核酸は、当業者に知られている手段により適合な宿主細胞に取り組まれても良い。宿主細胞は、ヒトエンテロウイルスＡ遺伝子及びタンパク質の発現が許容される条件下で、増殖し培養される。
【０１５０】
本発明は、ヒトエンテロウイルスＡのＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４ポリペプチド、及びその免疫的活性フラグメンのうち一つ以上を含む、１種以上の免疫的活性抗原を含むワクチンを包含する。当該ワクチンはヒトエンテロウイルスに対する防御免疫反応及び／又は中和免疫反応を誘導する。
【０１５１】
一実施形態において、発現カセットは主に、ヒトエンテロウイルスＡのＰ１ポリタンパク質をコード化する核酸、ＩＲＥＳ、並びＩＲＥＳの翻訳的制御下のエンテロウイルスの３ＣＤプロテアーゼにより構成される。当該プロテアーゼは、エンテロウイルスのＰ１ポリタンパク質をエンテロウイルスの構造殻タンパク質に切断する。当該構造タンパク質は、ＶＬＰ、カプソメア、錯体及び／又は会合体の形をしていても良い。
【０１５２】
実際に、本明細書に記載されているエンテロウイルスのタンパク質１種以上の発現は、抗体を誘導する抗原を提供する。当該抗体は機能性であり、ＨＥＶ７１、コクサッキーウイルスＡ１６、ヒトエンテロウイルスＣ、若しくはその他のピコルナウイルスから選ばれたエンテロウイルスを高力価に中和することができる。
【０１５３】
エンテロウイルスのタンパク質１種以上の発現は、ＶＰ２及び／又はＶＰ０ポリペプチドが抗血清の中和により認識されるエピトープを含んでいることを示唆する。
【０１５４】
これらの機能的抗体は、珍しいことに、エンテロウイルスのＶＰ１ポリペプチドよりも、ＶＰ２及びＶＰ０ポリペプチドとより強く結合する。ＶＰ１ポリペプチドは当該分野において、中和抗体の生成に主に用いられる殻タンパク質として知られているため、ＶＰ２ポリペプチドがＨＥＶ７１感染に対する中和抗体の生成に重要な役割を果たすという事実は、確実に予想外であった。
【０１５５】
従って、驚くことに、エンテロウイルスの殻タンパク質の中では、ＶＰ２ポリペプチドがエンテロウイルス感染に対する中和抗体の生成において、優性エピトープ若しくは抗原性決定基の役割を果たしている。ＨＥＶ７１のＶＰ２ポリペプチドは、単独で、若しくは他のＨＥＶ７１の殻タンパク質、例えばＶＰ０ポリペプチドとの組み合わせで、ＨＥＶ７１に対する中和抗体を誘導する優性抗原として機能する。
【０１５６】
本発明の一様態において、エンテロウイルス感染の予防を目的とする予防接種は、ヒトエンテロウイルスのＶＰ０及び／又はＶＰ２構造タンパク質を免疫原性組成物に取り組んだワクチンを用いることが期待される。免疫原性組成物又はワクチンは、ＨＥＶ７１及びコクサッキーウイルスＡ１６含むヒトエンテロウイルスＡから由来するＶＰ０又はＶＰ２構造タンパク質、若しくはその組み合わせからなっても良い。免疫原性組成物は、接種対象に投与され、ヒトエンテロウイルスに対する中和抗体を誘導する。免疫原性組成物は、ＨＥＶ７１及び／又はコクサッキーウイルスＡ１６などのヒトエンテロウイルスＡが原因となる手足口病を予防するために接種対象に投与するワクチンに含まれていても良い。
【０１５７】
本発明のもう一つの様態において、治療接種は、ＨＥＶ７１及び／又はコクサッキーウイルスＡ１６感染による合併症、例えば髄膜炎、脳炎、急性弛緩性麻痺、肺水腫及び心不全などの症候群として表われる神経系又は心血管系の合併症の予防及び／又は緩和を目的として提供される。
【０１５８】
本発明の一様態において、エンテロウイルス感染の予防を目的とする予防接種は、ヒトエンテロウイルスＣのＶＰ０又はＶＰ２構造タンパク質、例えばＰＶ１、ＰＶ２、ＰＶ３構造タンパク質、若しくはその組み合わせ、或いはその生物活性フラグメント又は免疫的活性フラグメントを取り組んだワクチンを用いることが期待される。免疫原性組成物は、ＰＶ１、ＰＶ２、ＰＶ３を含むヒトエンテロウイルスＣが原因となるポリオを予防するために接種対象に投与するワクチンに含まれていても良い。
【０１５９】
更に、免疫原性組成物又はワクチンは、ヒトエンテロウイルスＣとヒトエンテロウイルスＡの両方から由来した抗原の組み合わせからなっても良い。
【０１６０】
添付の図面に図示されている、本発明の様々な実施形態に関して説明する。これらの実施形態において、エンテロウイルスのＶＬＰ、カプソメア、抗原及び会合体、並びにＤＮＡ組換え分子の特定構築体を例示として挙げることにする。
【０１６１】
中和抗体の生成にエンテロウイルスのＶＰ２ポリペプチドこそ重要であると結論を出すことができる。ＶＰ２ポリペプチドは、ヒトエンテロウイルスＡのＨＥＶ７１及びコクサッキーウイルスＡ１６；ヒトエンテロウイルスＣの１型、２型、３型；ヒトエンテロウイルスＤのＥＶ６８などのピコルナウイルスによる感染に対するワクチンの考案に十分であるとも言える。
【０１６２】
本発明の一様態において、ピコルナウイルス感染の予防を目的とする予防接種は、ウイルスの少なくともＶＰ０及び／又はＶＰ２、並びにＶＰ４構造タンパク質を免疫原性組成物に取り組んだワクチンを用いることが期待される。免疫原性組成物は接種対象に投与され、ピコルナウイルスに対する中和抗体を誘導する。免疫原性組成物は、ピコルナウイルス感染の予防を目的として接種対象に投与するワクチンに含まれていても良い。
【０１６３】
本発明のもう一つの様態において、ピコルナウイルス感染による合併症、例えば髄膜炎、脳炎、急性弛緩性麻痺、肺水腫及び心不全などの症候群として表われる神経系又は心血管系の合併症の予防及び／又は緩和を目的として提供される。
【０１６４】
本発明の更にもう一つの様態において、薬物として用いられる、本発明によるワクチン組成物が提供される。
【０１６５】
更にもう一つの様態において、本発明は、エンテロウイルスのＶＰ０及び／又はＶＰ２及び／又はＶＰ４抗原を含む２価ワクチン又は多価ワクチンを提供する。例えば、ヒトエンテロウイルスＡのＶＰ０及び／又はＶＰ２及び／又はＶＰ４抗原を結合しても良い。更に、ヒトエンテロウイルスＡの異なる血清型から得た上述の抗原、つまりコクサッキーウイルスＡ１６及びＨＥＶ７１由来の抗原を、例えばヒト手足口病に対するワクチンに組み合わせることも可能である。
【０１６６】
２価ワクチン又は多価ワクチンのエンテロウイルス抗原は、本明細書に記載された発現カセットから生成することができる。エンテロウイルス抗原は、ウイルス様粒子、カプソメア、錯体及び／又は会合体の形をしていても良い。
【０１６７】
更にもう一つの様態において、本発明は、エンテロウイルス抗原を含む２価ワクチン又は多価ワクチンを提供する。当該抗原は、ジフテリア（Ｄ）、破傷風（Ｔ）、百日咳（Ｐ）、b型インフルエンザ菌（Ｈｉｂ）、Ａ型肝炎（ＨＡ）、Ｂ型肝炎（ＨＢ）、及びヒトエンテロウイルス７１型などの病原体のうち、一つ以上の病原体に対して免疫力を提供する。
【０１６８】
小児用ワクチンにおいて、互換性のある他の抗原、例えばＢ型髄膜炎、Ａ型髄膜炎、Ｃ型髄膜炎、中耳炎に効果的であると知られている抗原が含まれていても良い。 
【０１６９】
各ワクチンの投与量におけるピコルナウイルス抗原の量は、接種を受けた人によく表われる有害な副作用を伴うことなく、防御免疫反応を誘発できるほどの量として選ぶものとする。前記量は、免疫原として採用されたものによって変わることになる。特定のワクチンにおける最適量は、接種対象における抗体力価及び他の反応に対する観察を含む、一連の一般研究により確定することができる。最初のワクチン接種では、防御免疫反応を提供するため、最適の間隔を置いて、２〜３回にかけてワクチンを投与しても良い。
【０１７０】
従って本発明は、人間におけるピコルナウイルスの感染を予防する方法を提供する。当該方法は、上述した本発明の様態のうち一つによるワクチンの免疫学的有効量を以って、それを必要とする被験者に治療を施すことを含む。
【０１７１】
本明細書と請求項において、下記の用語は、以下通りの意味を持つものと見なされる。
【０１７２】
「抗体」とは、抗原（免疫原）によって人間又はその他の動物の体内で誘発された特定のアミノ酸配列を持つＢリンパ球様細胞が生成する免疫グロブリン分子を指す。当該分子は、抗原との具体的な反応をその特徴とする。
【０１７３】
「抗体反応」又は「液性反応」とは、Ｂリンパ球様細胞により生成された抗体が、抗原刺激に応じて血液及び／又はリンプ液に分泌される種類の免疫反応を指す。正常に機能する免疫反応において、抗体は細胞（例えば病原体）の表面上で特に抗原と結合し、食細胞及び／又は補体媒介メカニズムにより破壊すべきものとして当該細胞マーキングする。
【０１７４】
「抗原」とは、適切な細胞との接触の結果、感作状態及び／又は免疫反応性を誘発し、感作被験対象の抗体及び／又は免疫細胞と明白に反応する物質を指す。
【０１７５】
「エピトープ」とは、錯体抗原分子上の、抗原性決定基の最も単純な形態を指す。これは、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体により認識される抗原の特定部位に相当する。
【０１７６】
「融合タンパク質」とは、相違するエンテロウイルスの構造タンパク質から由来した２つ以上の遺伝子配列を組み合わせて作り上げたポリペプチドの発現により形成されたタンパク質抗原を指す。
【０１７７】
「免疫的活性フラグメント」又は「生物活性フラグメント」とは、エンテロウイルスに対する中和抗体を誘導するエンテロウイルスの構造タンパク質のフラグメントを指す。よって、本発明の文脈においては、免疫的活性フラグメントは特定の免疫反応を及ぼすために、より好ましくは誘導するために有機体の免疫系に現れ、エンテロウイルスによる感染に対して有機体を予防的に保護するものとする。
【０１７８】
中和抗体免疫反応は、免疫系の特異性細胞が異種タンパク質、ペプチド又はエピトープが現れたことを認識し、特定の免疫反応を開始することを指す。
【０１７９】
実施形態において、本発明によるワクチン抗原は防御免疫反応を誘発することができる。本明細書にて用いられる「防御免疫反応」及び／又は「中和免疫反応」という用語は、ワクチン接種被験者が、ワクチン接種を行った原因となった病原因子による感染に対して抵抗、若しくは自らを保護する手段を指す。
【０１８０】
「細胞性反応」又は「細胞性宿主反応」とは、ウイルス感染細胞又はがん性細胞を直接排除できる特定のヘルパーＴ細胞とキラーＴ細胞を媒介として行われる種類の免疫反応を指す。
【０１８１】
「抗原提示細胞」とは、抗原を取り扱い、リンパ球に提示する機能を担当する抗原誘導事象の補助細胞を指す。抗原提示細胞（ＡＰＣ）と抗原の相互作用は、リンパ球が抗原分子と遭遇しそれを認識して活性化させるようにするという点で、免疫誘導において非常に重要な段階である。ＡＰＣとしては、大食細胞、ランゲルハンス−樹状細胞、ろ胞樹状細胞、Ｂ細胞などが挙げられる。
【０１８２】
「Ｂ細胞」とは、抗原と相互作用を持つ免疫グロブリン又は抗体を生成するリンパ球の種類を指す。
【０１８３】
「細胞障害性Ｔ細胞」とは、ウイルス抗原を生成し、異質細胞や、感染性因子により感染された宿主細胞を破壊することができる特殊なリンパ球を指す。
【０１８４】
「主に構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という表現は、必須成分に加え他の成分も組成物内に存在し得るが、例え他の成分が存在していても、組成物の本質的、基本的及び／又は新規特性は、その存在に対して影響を受けないという意味である。
【０１８５】
「操作可能に結合（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」という表現は、記載された成分同士が、お互い意図通りに機能できる関係を結んでいるという意味である。例えば、シストロンの、若しくは一つ以上のシストロンの核酸と「操作可能に結合」しているプロモーターは、単一のシストロン性伝令ＲＮＡ、単一の２シストロン性伝令ＲＮＡ、若しくは単一の多シストロン性伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を生成できる方式で組み合わせていることになる。伝令ＲＮＡのタンパク質発現は核酸配列の転写要素／翻訳要素により調整されても良い。ＩＲＥＳ配列がシストロンより上流（５‘）側の方向で発現カセットに挿入されたということは、つまり、シストロン性ｍＲＮＡの翻訳がＩＲＥＳの制御の下で調整されるように、シストロンの核酸とＩＲＥＳ配列が結合するということである。
【実施例】
【０１８６】
添付の図面に図示されている、本発明の様々な実施形態に関して説明する。これらの実施形態において、ピコルナウイルスのＶＬＰ、カプソメア、抗原及び会合体、並びにＤＮＡ組換え分子の特定構築体を例示として挙げることにする。
【０１８７】
実施例１．ＨＥＶ７１のＶＬＰ発現カセット及びベクターに関する記述
発現カセットは、当該分野で周知に手段により構築されても良い。
１．１．ＨＥＶ７１のＶＬＰ発現カセット［Ｐ１＋ＩＲＥＳ＋３ＣＤ］
特徴：
カセットサイズ：５１７２ｂｐ
ｐｒＰｓ：ポックスウイルスの強力初期／後期  合成プロモーター、４３ｂｐ
Ｐ１：ＥＶ７１−ＳＢ１２７３６−ＳＡＲ−０３からのＰ１タンパク質のコード配列
（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＤＱ３４１３６２）終止コドンを添加
２５８８ｂｐ
ＩＲＥＳ：内部リボソーム導入部位、５８５ｂｐ
３ＣＤ：ＥＶ７１−ＳＢ１２７３６−ＳＡＲ−０３からの、Ｃ及びＤのＰ３タンパク質のコード配列
（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＤＱ３４１３６２）ＡＴＧを添加
開始コドン及び終止コドン、１９４０ｂｐ
ＰａｃＩ：レアカッター、カセットをｐＳＮＸ０１にクローニング
（ＭＶＡ  ｄｅｌ  ３組み込み型ベクター）
カセットはｐＤＯＮＲ２２１ゲートウェイエントリーベクター（インビトロジェン）にクローニングされ、ｐＳＮ０１を生成した。
発現カセットとｐＳＮ０１プラスミドに関する概略図は、図１を参照すること。
１．２．ＨＥＶ７１のＶＬＰ発現カセット［Ｐ１＋ＩＲＥＳ＋３Ｃ］
特徴：
カセットサイズ：３７７３ｂｐ
ｐｒＰｓ：ポックスウイルスの強力初期／後期  合成プロモーター、４３ｂｐ
Ｐ１：ＥＶ７１−ＳＢ１２７３６−ＳＡＲ−０３からのＰ１タンパク質のコード配列
（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＤＱ３４１３６２）終止コドンを添加
２５８８ｂｐ
ＩＲＥＳ：内部リボソーム導入部位、５８５ｂｐ
３ＣＤ：ＥＶ７１−ＳＢ１２７３６−ＳＡＲ−０３からの、ＣのＰ３タンパク質のコード配列
（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＤＱ３４１３６２）ＡＴＧを添加
開始コドン及び終止コドン、５５１ｂｐ
ＰａｃＩ：レアカッター、カセットをｐＳＮＸ０１にクローニング
（ＭＶＡ  ｄｅｌ  ３組み込み型ベクター）
カセットはｐＤＯＮＲ２２１ゲートウェイエントリーベクター（インビトロジェン）にクローニングされ、ｐＳＮ０３を生成した。
発現カセットとｐＳＮ０３プラスミドに関する概略図は、図２を参照すること。
１．３．挿入ＨＥＶ７１［Ｐ１＋ＩＲＥＳ＋３ＣＤ］又は［Ｐ１＋ＩＲＥＳ＋３Ｃ］を含む組換えバキュロウイルスの取得方法
ＨＥＶ７１のＰ１＋３ＣＤの原物質はｐＳＮ０１であり、Ｐ１＋３ＣはｐＳＮ０３である。目標は、インビトロジェンＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ（登録商標）マニュアル（２００９）の指示に従って、ＨＥＶ７１−ＶＬＰカセットを、ＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）を用いたａｔｔＬ／ａａＲインビトロ組換えにより、ｐＳＮ０１及びｐＳＮ０３（エントリーベクター）からバキュロウイルス発現プラスミドｐＤＥＳＴ８（デスティネーションベクター）に組み込むことである。
これによって、二つのリコンビナーゼ反応を構成した。
ｐＳＮ０１（ＥＶ７１−Ｐ１＋３ＣＤ）×ｐＤＥＳＴ８：ｐＳＮ０７を生成
ｐＳＮ０３（ＥＶ７１−Ｐ１＋３Ｃ）×ｐＤＥＳＴ８：ｐＳＮ０８を生成
ｐＳＮ０７及びｐＳＮ０８を用いて、インビトロジェンＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ（登録商標）マニュアルに記載されているように、ＤＨ１０Ｂａｃの形質転換により、組換えバクミドのｂａｃＳＮ０７及びｂａｃＳＮ０８を生成した。組換えバクミドにＳｆ９細胞へのトランスフェクションを行うことで、組換えバキュロウイルスのＳＮ０７及びＳＮ０８をレスキューする。組換えバキュロウイルスのＳＮ０７及びＳＮ０８を、６個のウェルプレートに入っている感染Ｓｆ９細胞に用いて、切断した殻タンパク質の発現を評価した。ＶＰ１に対して特異的である多クローン性ウサギ抗血清を用いて、組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞から得た溶解物及び上清のウェスタンブロットでＶＰ１タンパク質を特定した。
１．４．ＳＮ０７に感染したＳｆ９細胞の上清におけるＶＰ１の発現
感染Ｓｆ９細胞の上清は、感染後３日目から７日目にかけて毎日採取したものである。タンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解し、ニトロセルロース膜に移動させた後、多クローン性ウサギ抗ＶＰ１抗血清（１：４０００希釈率）で一晩中検査し、続いてＨＲＰ共役抗ウサギ抗体（１：１０００希釈率）を以って室温で１時間検査した。続いてＴＭＢを用いてウェスタンブロット法を行った。結果は図３を参照すること。ＨＥＶ７１のＶＰ１が切断されたことが分かり、感染後３日目と４日目の上清からタンパク質の発現が観測され、その後、ＶＰ１の発現量は減衰していった。Ｓｆ９細胞を感染させることにより、組換えバキュロウイルスのＳＮ０７は、上清で見付けられる抗原を生成する。
【０１８８】
実施例２．上清及び溶解物の両方における切断済みのＶＰ１
ＳＮ０７、ＳＮ０８、対照群のバキュロウイルスｂａｃＧＵＳ、模倣感染（ｍｏｃｋ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ）を含む組換えバキュロウイルス分離株により、Ｓｆ９細胞を感染効率（ＭＯＩ）１０で感染させた。感染後３日目と４日目に上清及び溶解物を採取し、ウサギ抗ＶＰ１抗血清（１：４０００希釈率）を用いてウェスタンブロット法によりタンパク質の発現を評価し、ＳＮ０７及びＳＮ０８により生成されたタンパク質の収率を比較した。図４に示されているように、感染後３日目と４日目の両日において、上清及び溶解物の両方で、発現構築体ＳＮ０７は、発現構築体ＳＮ０８より多くの切断ＶＰ１を生成した。
【０１８９】
実施例３．ＶＰ１及びＶＰ０は１００ｋＤの分画分子量（ＭＷＣＯ）膜による限外濾過後の濃縮液に存在する。
感染後３日目にＳＮ０７に感染したＳｆ９細胞からの上清を浄化し、１００ｋＤａのＭＷＣＯと共にＡＭＩＣＯＮ（登録商標）フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を通過させた。濃縮液をテストし、切断したＶＰ１及びＶＰ０の存在を確認した。ＶＰ１の分子量は略３３ｋＤａ、ＶＰ０の分子量は略３６ｋＤａであるため、これらのタンパク質は、オリゴマー型でしか濃縮液に残存していられないと思われた。図５に示されているように、これらの抗原は、１００ｋＤａのＭＷＣＯ限外ろ過装置にかけられた上清の濃縮液に残存していた。これは、当該抗原がオリゴマー型と関連していることを示唆している。よって、ＶＰ１及びＶＰ０は切断されており、他の殻タンパク質とオリゴマー関係（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）にあると結論を出すことができる。
【０１９０】
実施例４．当該濃縮液は、マウスに接種した場合、ＨＥＶ７１に対する強い中和抗体を誘導する。
実施例３で製造したＳＮ０７に感染したＳｆ９からの上清濃縮物を非近交系の白いマウス２群に接種した。使用した免疫化スケジュールは、図６に図示されている。
【０１９１】
接種群のマウスは、表１に示されているように、ＨＥＶ７１を中和する抗体を生成した。マウスへの接種に用いた濃縮液は、ＨＥＶ７１に対する強い中和抗体を誘導している。
【表１】
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【０１９２】
従って、オリゴマー型のタンパク質はマウスにて中和抗体を誘導することができたと結論に達しても良いと思われる。 
【０１９３】
オリゴマータンパク質は、免疫原性組成物に用いられるか、及び／又は、エンテロウイルス感染の予防のために投与するワクチンに含まれても良い。
【０１９４】
実施例５．ＶＰ０はＳＮ０７に感染したＳｆ９細胞の溶解物にて発現する。
Ｓｆ９細胞をＳＮ０７により感染させ、７２時間目、９６時間目、１２０時間目に溶解物を採取した。免疫ブロット法でＥＶ７１のＶＰ０に対する多クローン性ウサギ抗血清を調べた。その結果、ＶＰ０は感染後７２時間目に発現したことが分かった。図７に示されているように、ＶＰ０の一部は、感染後９６時間目から切断されＶＰ２となった。従って、ＳＮ０７感染細胞の溶解物にはＶＰ０とＶＰ２の両方が存在する。
【０１９５】
実施例６．ＳＮ０７に感染したＳｆ９細胞の上清におけるオリゴマー抗原で免疫化を受けたマウスから摘出したプール中和血清。ＥＬＩＳＡ法において組換えＶＰ２に対し高い力価を示した。
ＥＬＩＳＡプレートを同量の組換えＶＰ１及びＶＰ２で被覆し、プール中和マウス抗血清のテストに用いた。図８は、上清濃縮液から製造した抗原を接種されたマウスは、ＶＰ１に比べＶＰ２により良く結合することを図示している。従って、当該抗体が機能的であり、高い力価でＨＥＶ７１を中和すると結論を出すことができる。
【０１９６】
実施例７．ＳＮ０７に感染したＳｆ９細胞の上清におけるオリゴマー抗原で免疫化を受けたマウスから摘出したプール中和血清。ＶＰ１に比べ、ＶＰ２及びＶＰ０とより強く結合する。
図９のウェスタンブロットは、プール中和マウス抗血清は、各ウェルに同じ総量のタンパク質を添加した場合であっても、ＶＰ１に比べＶＰ２及びＶＰ０とより強く結合するということを図示している。これに基づいて、ＶＰ２及びＶＰ０は、中和抗血清により認識できるエピトープを含むと推定することができる。
【０１９７】
これらの機能性抗体は、ＶＰ１よりもＶＰ２及びＶＰ０と強く結合するので、ＶＰ２及びＶＰ０こそが中和抗体の生成に必須である主要殻タンパク質であると見なされる。実際、ＶＰ２は中和抗体の生成に重要な役割を果たしていると思われる。
【０１９８】
ワクチン製剤におけるＶＰ２の存在こそが中和抗体の形成に重要であると思われる。ＶＰ２は、ＨＥＶ７１、そしてコクサッキーウイルスＡ１６、エコーウイルス３０、並びにポリオウイルス１型、２型及び３型などを含むエンテロウイルスＡ、Ｂ、Ｃのうち何れかの種に対するワクチンの製造するのに十分である可能性が高い。
【０１９９】
本発明は、本発明の範疇内に、ポリオウイルス抗原を含むワクチンの有効量を投与するステップを含む、ポリオウイルスに対する直接的免疫反応を生成する方法を含む。
【０２００】
実施例８．中和抗体のレベルの比較
ＨＥＶ７１のＶＰ１を含む免疫原性組成物は、マウスの免疫化に用いられる。同じく、ＨＥＶ７１のＶＰ２及び／又はＶＰ０を含む免疫原性組成物も、マウスの免疫化に用いられる。ＨＥＶ７１のＶＰ２び／又はＶＰ０により免疫化を受けたマウスの中和抗体レベルを、ＨＥＶ７１のＶＰ１により免疫化を受けたマウスの中和抗体レベルと比較する。ＨＥＶ７１のＶＰ２び／又はＶＰ０により免疫化を受けたマウスの中和抗体レベルは、ＨＥＶ７１のＶＰ１により免疫化を受けたマウスの中和抗体レベルより著しく高い。
【０２０１】
実施例９．単一２シストロン性伝令からの、ヒトエンテロウイルスＣのＰ１領域及びプロテアーゼ３ＣＤの発現に対する組換えバキュロウイルスベクターの構築
本実施例は、プロテアーゼ３ＣＤが媒介するバキュロウイルス感染細胞の破壊を低減させることでヒトエンテロウイルスＣ（ポリオウイルス）のＶＬＰを効率的に生成する方法を提供する。
【０２０２】
単一２シストロン性伝令からの、Ｐ１領域及びプロテアーゼ３ＣＤの発現に対する組換えバキュロウイルスベクターの構築は、例えば、図１に図示されている。３ＣＤプロテアーゼ遺伝子は、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの制御の下で、キャップ非依存的翻訳により翻訳される。当該系は、プロテアーゼ３ＣＤの発現の調整に利用することができる。つまり、突然変異ＩＲＥＳ配列を評価し、Ｐ１タンパク質に比べて少ない量のプロテアーゼを生産する最弱のＩＲＥＳを探し出す。
【０２０３】
構築された２シストロン性ベクターでは、プラスミドがＰ１に対するコード配列の上流に位置するポリヘドリンプロモーターを含有する。Ｐ１をコード化するシストロンの下流には、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）の内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＡＦ１１３９６８．２；ヌクレオチド１６６６〜２２５１）があり、プロテアーゼ３ＣＤをコード化するヌクレオチド配列を含むシストロンがその後に続く。ヒトエンテロウイルスＣのＰ１及び３ＣＤの原物質は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手してもよく、周知のヒトエンテロウイルスＣ配列（国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）を介してＧｅｎＢａｎｋから入手可能）から合成しても良い。
【０２０４】
組換えバキュロウイルスは、製造者の指示に従いＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ（登録商標）系を用いて生成する（インビトロジェン）。簡単に言えば、ＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）を用いて、ａｔｔＬ／ａａＲインビトロ組換えにより、ヒトエンテロウイルスＣのＶＬＰカセットをバキュロウイルス発現プラスミドｐＤＥＳＴ８（デスティネーションベクター）に取り組ませる。ＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）反応を２５℃で１時間行い、続いて、プロテイナーゼＫによる培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）を実施する。ＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）反応混合物に、Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＤＨ５αコンピテントセル（形質転換受容性細胞）への形質転換を施し、発現クローンを取得する。結果として得たコロニーからＤＮＡを分離し、制限酵素分析によりヒトエンテロウイルスＣカセットの存在を確認する。発現カセットをＴ７転位リコンビナーゼによりＤＨ１０Ｂａｃ細胞内のバキュロウイルスゲノムに取り組み、組換えバクミドを構築する。５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、７μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、１００μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ、４０μｇ／ｍｌのＩＰＴＧを補充したＬＢ寒天培地上の白色表現型により組換えバクミドを立証することができる。ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＨｉＰｕｒｅプラスミドＤＮＡミニプレップキット（インビトロジェン）を用いて、ＤＨ１０Ｂａｃ大腸菌より高品質のバクミドＤＮＡを精製する。挿入物からのＭ１３順方向プライマー、Ｍ１３逆方法プライマー及び内部プライマーを用いて、ヒトエンテロウイルスＣカセットの存在を確認する。ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＤＮＡをＳｆ９昆虫細胞にトランスフェクションすることにより組換えバキュロウイルスをレスキューする。簡単に言えば、Ｔ２５フラスコ当たり２百万のＳｆ９細胞が播種され、２８℃での６時間の培養により接着される。組換えバクミドＤＮＡ１マイクログラムをＤＮＡ濃縮緩衝液１５０μｌに再懸濁させ、エンハンサー溶液８μｌを混合し室温で５分間培養する。続いて、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標）試薬２５μｌをＤＮＡ混合物に添加し、室温で１０分間培養する。培地１ｍｌをトランスフェクション錯体を含むチューブに添加し、細胞培養フラスコに移相して均一に分布されるようにする。３日目、遠心分離により５分間５００ｇの上清を採取する。続いてトランスフェクションを行い、高力価のウイルスストックを得る。高力価のウイルスストックを一度得れば、目標タンパク質の発現に対する最適時期の決定に用いることができる。
【０２０５】
実施例１０．プロテアーゼ３ＣＤが媒介するバキュロウイルス感染細胞の破壊を低減させることによる、ＨＥＶ７１、並びにヒトエンテロウイルスＣのＶＬＰの生成。
本実験は、単一２シストロン性伝令からの、Ｐ１領域及びプロテアーゼ３ＣＤの発現に対する組換えバキュロウイルスベクターの構築に関するものである。プロテアーゼ遺伝子３ＣＤは、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの制御の下で、キャップ非依存的翻訳により翻訳される。図１０を参照すること。当該系は、プロテアーゼ３ＣＤの発現の調整に利用することができる。つまり、突然変異ＩＲＥＳ配列を評価し、Ｐ１タンパク質に比べて少ない量のプロテアーゼを生産する最弱のＩＲＥＳを探し出す。
【０２０６】
構築された２シストロン性ベクターでは、プラスミドがＰ１に対するコード配列の上流に位置するポリヘドリンプロモーターを含有する。Ｐ１をコード化するシストロンの下流には、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）の内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）配列があり、プロテアーゼ３ＣＤをコード化するヌクレオチド配列を含むシストロンがその後に続く。図１を参照すること。実施例１に用いられたＩＲＥＳは、天然のＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ配列を含み、変異型も存在する。図１０における天然ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ配列は、ＪＫセグメントにＡ６分岐ループを示す。１つのヌクレオチド、例えばアデニン（Ａ７）を加えることで、発現を低減することができる。更に、実施例１に用いられた構築体において、３ＣＤプロテアーゼはアミノ末端で脳心筋炎ウイルスのＩＲＥＳと融合する。ＥＭＣＶの開始コドンと３ＣＤプロテアーゼのコード配列のアウトフレーム（ＯＵＴ  ＦＲＡＭＩＮＧ）は下流遺伝子の発現をかなり低減しなければならない。図１１を参照すること。両方の組換えをｐＳＮ０１ａのＥＭＣＶＩＲＥＳ配列に組み込み、図１２に示されているようにｐＳＮ０１−Ｍ１と名付ける。続いて、ＤＮＡ２．０を以って合成を行う。
【０２０７】
ｐＳＮ０１−Ｍ１の突然変異ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳから発現したＶＬＰを特徴付けられるように実験を設計した。組換えバキュロウイルスは、製造者の指示に従いＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ（登録商標）系を用いて生成する（インビトロジェン）。簡単に言えば、ＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）を用いて、ａｔｔＬ／ａａＲインビトロ組換えにより、ＨＥＶ７１のＶＬＰカセットをバキュロウイルス発現プラスミドｐＤＥＳＴ８（デスティネーションベクター）に取り組ませる。ＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）反応を２５℃で１時間行い、続いて、プロテイナーゼＫによる培養を実施する。ＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）反応混合物に、Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＤＨ５αコンピテントセルへの形質転換を施し、発現クローンを取得する。結果として得たコロニーからＤＮＡを分離し、制限酵素分析によりＨＥＶ７１／ポリオウイルスカセットの存在を確認する。ｐＳＮ０７−Ｍ１の発現カセットをＴ７転位リコンビナーゼによりＤＨ１０Ｂａｃ細胞内のバキュロウイルスゲノムに取り組み、組換えバクミドを構築し、ｂａｃＳＮ０７−Ｍ１を得る。５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、７μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、１００μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ、４０μｇ／ｍｌのＩＰＴＧを補充したＬＢ寒天培地上の白色表現型により組換えバクミドを立証することができる。ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＨｉＰｕｒｅプラスミドＤＮＡミニプレップキット（インビトロジェン）を用いて、ＤＨ１０Ｂａｃ大腸菌より高品質のバクミドＤＮＡを精製する。挿入物からのＭ１３順方向プライマー、Ｍ１３逆方法プライマー及び内部プライマーを用いて、ＨＥＶ７１／ポリオウイルスカセットの存在を確認する。ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＤＮＡをＳｆ９昆虫細胞にトランスフェクションすることにより組換えバキュロウイルスをレスキューする。簡単に言えば、Ｔ２５フラスコ当たり２百万のＳｆ９細胞が播種され、２８℃での６時間の培養により接着される。組換えバクミドＤＮＡ１マイクログラムをＤＮＡ濃縮緩衝液１５０μｌに再懸濁させ、エンハンサー溶液８μｌを混合し室温で５分間培養する。続いて、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標）試薬２５μｌをＤＮＡ混合物に添加し、室温で１０分間培養する。培地１ｍｌをトランスフェクション錯体を含むチューブに添加し、細胞培養フラスコに移相して均一に分布されるようにする。３日目、遠心分離により５分間５００ｇの上清を採取する。続いてトランスフェクションを行い、高力価のウイルスストックを得る。高力価のウイルスストックを一度得れば、目標タンパク質の発現に対する最適時期の決定に用いることができる。問題のタンパク質を分析するために、１０％グレース昆虫細胞用培地（インビトロジェン）で増殖したＳｆ９細胞を１％ＦＢＳ  Ｓｆ９００−ＩＩ  ＳＦＭ培地（インビトロジェン）に再懸濁させて単細胞を取得し、フラスコ内に１ｍｌ当たり百万の密度で播種した後、２８℃で４時間培養した。ウイルスストックを１０ＭＯＩでＰＢＳ洗浄細胞に添加し、１時間なだらかに揺らす。感染細胞をＰＢＳで３回洗浄し、細胞はＳｆ９００ＩＩ−ＳＦＭにて異なる時点で増殖した。フラスコを室温で３０分間揺らして細胞を低張ダウンス緩衝液（ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ  ｄｏｕｎｃｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（ＴＸ−１００）（１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１％ＴＸ−１００）に溶解させ、フラスコから回収した溶解細胞を４℃の温度にて７０００ｒｍｐで遠心分離に３０分間かけ、細胞溶解物を取得する。細胞溶解物と上清の成分を、特定の抗体を用いて免疫ブロット法とＥＬＩＳＡ法により分析する。
【０２０８】
実施例１１．プロテアーゼ３ＣＤが媒介するバキュロウイルス感染細胞の破壊を低減させることによる、ＨＥＶ７１、並びにヒトエンテロウイルスＣ（ポリオウイルス）のＶＬＰの効率的生成。
単一２シストロン性伝令からの、Ｐ１領域及びプロテアーゼ３ＣＤの発現に対する組換えバキュロウイルスベクターの構築は、例えば、図１に図示されている。プロテアーゼ遺伝子３ＣＤは、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの制御の下で、キャップ非依存的翻訳により翻訳される。図１０を参照すること。当該系は、プロテアーゼ３ＣＤの発現の調整に利用することができる。つまり、突然変異ＩＲＥＳ配列を評価し、Ｐ１タンパク質に比べて少ない量のプロテアーゼを生産する最弱のＩＲＥＳを探し出す。
【０２０９】
構築された２シストロン性ベクターでは、プラスミドがＰ１に対するコード配列の上流に位置するポリヘドリンプロモーターを含有する。Ｐ１をコード化するシストロンの下流には、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）の内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）配列があり、プロテアーゼ３ＣＤをコード化するヌクレオチド配列を含むシストロンがその後に続く。図１を参照すること。実施例１に用いられたＩＲＥＳは、天然のＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ配列を含み、変異型も存在する。天然ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ配列は、ＪＫセグメントにＡ６分岐ループを示しており、１つのヌクレオチド（Ａ７）を加えることで、発現を低減することができる。図１０を参照すること。Ａ６分岐ループはＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ配列のｐＳＮ０１にてＡ７に変異され、ｐＳＮ０１−Ｍ２と名付けられる。図１３を参照すること。続いて、ＤＮＡ２．０を以って合成を行う。
【０２１０】
ｐＳＮ０１−Ｍ２の突然変異ＥＭＣＶＩＲＥＳから発現したＶＬＰの特徴を調べた。組換えバキュロウイルスは、製造者の指示に従いＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ（登録商標）系を用いて生成する（インビトロジェン）。簡単に言えば、ＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）を用いて、ａｔｔＬ／ａａＲインビトロ組換えにより、ＨＥＶ７１のＶＬＰカセットをバキュロウイルス発現プラスミドｐＤＥＳＴ８（デスティネーションベクター）に取り組ませる。ＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）反応を２５℃で１時間行い、続いて、プロテイナーゼＫによる培養を実施する。ＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）反応混合物に、Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＤＨ５αコンピテントセルへの形質転換を施し、発現クローンを取得する。結果として得たコロニーからＤＮＡを分離し、制限酵素分析によりＨＥＶ７１／ポリオウイルスカセットの存在を確認する。ｐＳＮ０７−Ｍ２の発現カセットをＴ７転位リコンビナーゼによりＤＨ１０Ｂａｃ細胞内のバキュロウイルスゲノムに取り組み、組換えバクミドを構築して、ｂａｃＳＮ０７−Ｍ２を得る。５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、７μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、１００μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ、４０μｇ／ｍｌのＩＰＴＧを補充したＬＢ寒天培地上の白色表現型により組換えバクミドを立証することができる。ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＨｉＰｕｒｅプラスミドＤＮＡミニプレップキット（インビトロジェン）を用いて、ＤＨ１０Ｂａｃ大腸菌より高品質のバクミドＤＮＡを精製する。挿入物からのＭ１３順方向プライマー、Ｍ１３逆方法プライマー及び内部プライマーを用いて、ＨＥＶ７１／ポリオウイルスカセットの存在を確認する。ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＤＮＡをＳｆ９昆虫細胞にトランスフェクションすることにより組換えバキュロウイルスをレスキューする。簡単に言えば、Ｔ２５フラスコ当たり２百万のＳｆ９細胞が播種され、２８℃での６時間の培養により接着される。組換えバクミドＤＮＡ１マイクログラムをＤＮＡ濃縮緩衝液１５０μｌに再懸濁させ、エンハンサー溶液８μｌを混合し室温で５分間培養する。続いて、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標）試薬２５μｌをＤＮＡ混合物に添加し、室温で１０分間培養する。培地１ｍｌをトランスフェクション錯体を含むチューブに添加し、細胞培養フラスコに移相して均一に分布されるようにする。３日目、遠心分離により５分間５００ｇの上清を採取する。続いてトランスフェクションを行い、高力価のウイルスストックを得る。高力価のウイルスストックを一度得れば、目標タンパク質の発現に対する最適時期の決定に用いることができる。問題のタンパク質を分析するために、１０％グレース昆虫細胞用培地（インビトロジェン）で増殖したＳｆ９細胞を１％ＦＢＳ  Ｓｆ９００−ＩＩ  ＳＦＭ培地（インビトロジェン）に再懸濁させて単細胞を取得し、フラスコ内に１ｍｌ当たり百万の密度で播種した後、２８℃で４時間培養した。ウイルスストックを１０ＭＯＩでＰＢＳ洗浄細胞に添加し、１時間なだらかに揺らす。感染細胞をＰＢＳで３回洗浄し、細胞はＳｆ９００ＩＩ−ＳＦＭにて異なる時点で増殖した。フラス��を室温で３０分間揺らして細胞を低張ダウンス緩衝液１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（ＴＸ−１００）（１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１％ＴＸ−１００）に溶解させ、フラスコから回収した溶解細胞を４℃の温度にて７０００ｒｍｐで遠心分離に３０分間かけ、細胞溶解物を取得する。細胞溶解物と上清の成分を、特定の抗体を用いて免疫ブロット法とＥＬＩＳＡ法により分析する。
【０２１１】
実施例１２．プロテアーゼ３ＣＤが媒介するバキュロウイルス感染細胞の破壊を低減させることによる、ＨＥＶ７１、並びにヒトエンテロウイルスＣ（ポリオウイルス）のＶＬＰの効率的生成。
単一２シストロン性伝令からの、Ｐ１領域及びプロテアーゼ３ＣＤの発現に対する組換えバキュロウイルスベクターの構築は、例えば、図１に図示されている。プロテアーゼ遺伝子３ＣＤは、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの制御の下で、キャップ非依存的翻訳により翻訳される。図１０を参照すること。当該系は、プロテアーゼ３ＣＤの発現の調整に利用することができる。つまり、突然変異ＩＲＥＳ配列を評価し、Ｐ１タンパク質に比べて少ない量のプロテアーゼを生産する最弱のＩＲＥＳを探し出す。
【０２１２】
構築された２シストロン性ベクターでは、プラスミドがＰ１に対するコード配列の上流に位置するポリヘドリンプロモーターを含有する。Ｐ１をコード化するシストロンの下流には、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）の内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）配列があり、プロテアーゼ３ＣＤをコード化するヌクレオチド配列を含むシストロンがその後に続く。図１を参照すること。実施例１に用いられたＩＲＥＳは、天然のＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ配列を含み、変異型も存在する。ｐＳＮ０１において、３ＣＤプロテアーゼはアミノ末端で脳心筋炎ウイルスのポリタンパク質と融合する。ＥＭＣＶの開始コドンと３ＣＤプロテアーゼのコード配列のアウトフレームは下流遺伝子の発現をかなり低減しなければならない。図１１を参照すること。組換えをｐＳＮ０１のＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ配列に組み込み、ｐＳＮ０１−Ｍ３と名付ける。図１４を参照すること。続いて、ＤＮＡ２．０を以って合成を行う。 
【０２１３】
ｐＳＮ０１−Ｍ３の突然変異ＥＭＣＶＩＲＥＳから発現したＶＬＰの特徴を調べた。組換えバキュロウイルスは、製造者の指示に従いＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ（登録商標）系を用いて生成する（インビトロジェン）。簡単に言えば、ＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）を用いて、ａｔｔＬ／ａａＲインビトロ組換えにより、ＨＥＶ７１のＶＬＰカセットをバキュロウイルス発現プラスミドｐＤＥＳＴ８（デスティネーションベクター）に取り組ませる。ＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）反応を２５℃で１時間行い、続いて、プロテイナーゼＫによる培養を実施する。ＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）反応混合物に、Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＤＨ５αコンピテントセルへの形質転換を施し、発現クローンを取得する。結果として得たコロニーからＤＮＡを分離し、制限酵素分析によりＨＥＶ７１／ポリオウイルスカセットの存在を確認する。ｐＳＮ０７−Ｍ３の発現カセットをＴ７転位リコンビナーゼによりＤＨ１０Ｂａｃ細胞内のバキュロウイルスゲノムに取り組み、組換えバクミドを構築して、ｂａｃＳＮ０７−Ｍ３を得る。５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、７μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、１００μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ、４０μｇ／ｍｌのＩＰＴＧを補充したＬＢ寒天培地上の白色表現型により組換えバクミドを立証することができる。ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＨｉＰｕｒｅプラスミドＤＮＡミニプレップキット（インビトロジェン）を用いて、ＤＨ１０Ｂａｃ大腸菌より高品質のバクミドＤＮＡを精製する。挿入物からのＭ１３順方向プライマー、Ｍ１３逆方法プライマー及び内部プライマーを用いて、ＨＥＶ７１／ポリオウイルスカセットの存在を確認する。ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＤＮＡをＳｆ９昆虫細胞にトランスフェクションすることにより組換えバキュロウイルスをレスキューする。簡単に言えば、Ｔ２５フラスコ当たり２百万のＳｆ９細胞が播種され、２８℃での６時間の培養により接着される。組換えバクミドＤＮＡ１マイクログラムをＤＮＡ濃縮緩衝液１５０μｌに再懸濁させ、エンハンサー溶液８μｌを混合し室温で５分間培養する。続いて、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標）試薬２５μｌをＤＮＡ混合物に添加し、室温で１０分間培養する。培地１ｍｌをトランスフェクション錯体を含むチューブに添加し、細胞培養フラスコに移相して均一に分布されるようにする。３日目、遠心分離により５分間５００ｇの上清を採取する。続いてトランスフェクションを行い、高力価のウイルスストックを得る。高力価のウイルスストックを一度得れば、目標タンパク質の発現に対する最適時期の決定に用いることができる。
【０２１４】
問題のタンパク質を分析するために、１０％グレース昆虫細胞用培地（インビトロジェン）で増殖したＳｆ９細胞を１％ＦＢＳ  Ｓｆ９００−ＩＩ  ＳＦＭ培地（インビトロジェン）に再懸濁させて単細胞を取得し、フラスコ内に１ｍｌ当たり百万の密度で播種した後、２８℃で４時間培養した。ウイルスストックを１０ＭＯＩでＰＢＳ洗浄細胞に添加し、１時間なだらかに揺らす。感染細胞をＰＢＳで３回洗浄し、細胞はＳｆ９００ＩＩ−ＳＦＭにて異なる時点で増殖した。フラスコを室温で３０分間揺らして細胞を低張ダウンス緩衝液１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（ＴＸ−１００）（１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１％ＴＸ−１００）に溶解させ、フラスコから回収した溶解細胞を４℃の温度にて７０００ｒｍｐで遠心分離に３０分間かけ、細胞溶解物を取得する。細胞溶解物と上清の成分を、特定の抗体を用いて免疫ブロット法とＥＬＩＳＡ法により分析する。
【０２１５】
実施例１３．突然変異ＩＲＥＳ構築体Ｍ２は上清において高レベルのＶＰ１を発現する。
野生型又は突然変異型のＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの制御の下でＨＥＶ７１の殻タンパク質を発現する組換えバキュロウイルスを、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳからのＨＥＶ７１の殻タンパク質の発現レベルについて評価した。バキュロウイルスは、実施例１におけるＳＮ０７からの野生型ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、並びに３つの突然変異型ＩＲＥＳ、つまり実施例１０、１１、１２からのＭ１、Ｍ２、Ｍ３の制御の下で発現するＶＬＰを生成し、当該ＶＬＰをＨＥＶ７１の殻タンパク質のバキュロウイルス発現レベルに基づいて評価した。この試験には、異なるプロモーターの下でＰ１及び３ＣＤを発現する組換えバキュロウイルス（Ｆ）、及びｂａｃＧＵＳを発現する制御組換えバキュロウイルス（Ｇ）も含まれる。Ｓｆ９細胞を５ＭＯＩで感染させ、実施例１０〜１２に記載されているように、３日目に溶解物と上清を両方とも採取した。溶解物及び上清を抗ＶＰ１抗体を以って探知し、ＨＥＶ７１の殻タンパク質の発現を検出した。
【０２１６】
図１５の免疫ブロットに示されているように、抗体を以って溶解物のＶＰ１を探知すれば、突然変異型のＭ１及びＭ２は突然変異型のＭ３や２つのプロモーターに駆られた構築体に比べ高いレベルのＶＰ１を発現する。しかしながら、突然変異型のＭ２が上清においてより多いＶＰ１を生成する。データを上方のパネルに示す。
【０２１７】
図１５の下方パネルは、バキュロウイルスの外皮タンパク質に対する抗ｇｐ６４抗体の制御の下で探知を行った場合のブロットを示している。免疫ブロットによれば、各試料は同量のバキュロウイルスを生成している。
【０２１８】
実施例１４．バキュロウイルス発現系を用いたサブユニットワクチンのクローニング、発現、及び精製
本発明は、単一免疫原として融合し、ワクチン接種を受けた個体において防御免疫反応を誘導する組換えＨＥＶ７１とポリオウイルスの構造タンパク質の生成と用途に関する。本発明は、一般的に、ＨＥＶ７１及び／又はポリオウイルスのサブユニットタンパク質、若しくはその免疫原性フラグメント、並びに組換えＨＥＶ７１及び／又はポリオウイルスのサブユニット融合タンパク質と組み合わせられる抗原性補助剤を含む組換えＨＥＶ７１及び／又はポリオウイルス由来の融合タンパク質ワクチン組成物に関する。ＨＥＶ７１及びポリオウイルスのサブユニット融合タンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、それらの組み合わせ、及びそれらの免疫原性フラグメントの組み合わせから選ばれた殻タンパク質からなっても良い。本実施形態の一様態において、組換えＨＥＶ７１及び／又はポリオウイルスの融合タンパク質は、ＨＥＶ７１又はポリオウイルスのサブユニットタンパク質、並びにＨＥＶ７１又はポリオウイルスのサブユニットタンパク質と遺伝的関連のある融合パートナータンパク質を含む。本発明は更に、大腸菌においてバキュロウイルスは勿論、ＶＰ０、ＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３融合物、ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１融合物などのサブユニットワクチを発現する構築体を生成する方法を提供するものとして期待される。
【０２１９】
ＶＰ０、ＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３融合物、ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１融合物をコード化するＨＥＶ７１及び／又はポリオウイルスからｃＤＮＡを生成するために、精製ゲノムウイルスＲＮＡを用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ核酸キット、Ｒｏｃｈｅ）を行う。遺伝子の５‘末端及び３’末端から順方向プライマー及び逆方向プライマーが作り上げられ、当該プライマーは開始コドン及び終止コドンを組み込む。増幅したＰＣＲ生成物はＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化され、図１６に示されているようにｐＦａｓｔＢａｃ  ＨＴベクター（インビトロジェン）にクローニングされる。インビトロジェンからのＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ（登録商標）発現系は市販されており、製造者の指示に従って方法を用いた。融合遺伝子はｐＦａｓｔＢａｃ  ＨＴドナープラスミドにクローニングされ、組換えタンパク質の生成はＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ（登録商標）のバキュロウイルス発現系（インビトロジェン）に基づく。融合遺伝子を担うThe ｐＦａｓｔＢａｃ  ＨＴドナープラスミドに、Ｔ７転位リコンビナーゼによる座位特異的組換えを用いてバキュロウイルスシャトルベクター（バクミド）への形質転換を施す。この結果として、大腸菌株ＤＨ１０Ｂａｃを得た。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞はバクミドを含み、バクミドはカナマイシン抵抗性とヘルパープラスミドを授け、ヘルパープラスミドはトランスポーゼースをコード化し、テトラサイクリンに対する抵抗性を授ける。発現希望遺伝子を持つ組換えｐＦａｓｔＢａｃ  ＨＴプラスミドは、転位に対してＤＨ１０Ｂａｃ細胞への形質転換を達成し、組換えバクミドを生成する。形質転換細胞は順次に希釈され、各希釈物は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、７μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、１００μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ、４０μｇ／ｍｌのＩＰＴＧを補充したＬＢ寒天培地上につけられ、３７℃で少なくとも４８時間培養される。白色コロニーを取り上げ、再度画線を入れて白色表現型を確認した。組換えバクミドをＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＨｉＰｕｒｅプラスミドＤＮＡミニプレップキット（インビトロジェン）により分離し、ＤＮＡ試料を４０μｌのＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ）を溶解させトランスフェクションに用いた。
【０２２０】
分離されたバクミドＤＮＡをＰＣＲによりふるいにかけ、挿入した発現希望遺伝子を探し出す。ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＤＮＡをＳｆ９昆虫細胞にトランスフェクションすることによって組換えバキュロウイルスをレスキューする。Ｔ２５フラスコ当たり２百万のＳｆ９細胞が播種され、２８℃での６時間の培養により接着される。組換えバクミドＤＮＡ１マイクログラムをＤＮＡ濃縮緩衝液１５０μｌに再懸濁させ、エンハンサー溶液８μｌを混合し室温で５分間培養する。続いて、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標）試薬２５μｌをＤＮＡ混合物に添加し、室温で１０分間培養する。培地１ｍｌをトランスフェクション錯体を含むチューブに添加し、細胞培養フラスコに移相して均一に分布されるようにする。３日目、遠心分離により５分間５００ｇの上清を採取する。続いてトランスフェクションを行い、高力価のウイルスストックを得る。高力価のウイルスストックを一度得れば、目標タンパク質の発現に対する最適時期の決定に用いることができる。問題のタンパク質を分析するために、１０％グレース昆虫細胞用培地（インビトロジェン）で増殖したＳｆ９細胞を１％ＦＢＳ  Ｓｆ９００−ＩＩ  ＳＦＭ培地（インビトロジェン）に再懸濁させて単細胞を取得し、フラスコ内に１ｍｌ当たり百万の密度で播種した後、２８℃で４時間培養した。ウイルスストックを１０ＭＯＩでＰＢＳ洗浄細胞に添加し、１時間なだらかに揺らす。感染細胞をＰＢＳで３回洗浄し、細胞はＳｆ９００ＩＩ−ＳＦＭにて異なる時点で増殖した。フラスコを室温で３０分間揺らして細胞を低張ダウンス緩衝液１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（ＴＸ−１００）（１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１％ＴＸ−１００）に溶解させ、フラスコから回収した溶解細胞を４℃の温度にて７０００ｒｍｐで遠心分離に３０分間かけ、細胞溶解物を取得する。細胞における異種タンパク質の発現は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）とＨｉｓ  Ｐｒｏｂｅ−ＨＲＰ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をプローブとして用いるウェスタンブロット法により確認した。バキュロウイルスの生成とタンパク質の発現を一度確認すれば、ウイルスストックは増幅され、発現希望遺伝子を担うバキュロウイルスの濃縮ストックを生成する。昆虫細胞を感染させるウイルスの最も適切な濃度、並びに所望のタンパク質を生成する最適時期を、更に確立する。変性状態における精製のために、細胞を、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓ、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾールが６Ｍのグアニジニウム−ＨＣｌを含有する溶解緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させる。懸濁液は、１分／１パルスで、５パルスと６０ワットの電力設定により、氷の上において超音波により分解され、室温で１時間混合される。溶解物を３０分間２７Ｋｇで遠心分離にかけ、細胞残屑を取り除く。上清を、溶解緩衝液により予め平衡状態となったＨｉｓＴｒａｐ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムにロードする。ロードの後、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓ、３００ｍＭの���ａＣｌ、４０ｍＭのイミダゾールが６Ｍのグアニジニウム−ＨＣｌを含有する溶液（ｐＨ８．０、洗浄緩衝液１）２０カラム体積によりカラムを洗浄する。続いて、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓ、３００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのイミダゾールが８Ｍの尿素を含む溶液（ｐＨ８．０、洗浄緩衝液２）２０カラム体積によりカラムを更に洗浄する。結合タンパク質を、８Ｍの尿素、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓ、３００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液（ｐＨ８、溶出緩衝液）により溶出する。タンパク質を含むフラクションを４℃で一晩中、ＰＢＳに対してプールし透析した。ＴＥＶプロテアーゼを用いてヒスチジンタグを取り除き、製造者の指示に従ってタンパク質精製を行った。
【０２２１】
実施例１５．大腸菌における、ヒトエンテロウイルスＡ及びヒトエンテロウイルスＣ（ポリオウイルス）のサブユニットワクチンの発現と精製
ＣｈａｍｐｉｏｎＴＭ  ｐＥＴＳＵＭＯ  発現系（インビトロジェン）は、大腸菌において最高レベルの可溶性タンパク質を生成する。低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）融合物を用いて、発現融合タンパク質の溶解性を高める。発現後、１１ｋＤのＳＵＭＯ部分を、高度特異的活性ＳＵＭＯ（ＵＬＰ−１）プロテアーゼによりカルボキシル端末で切断することができる。更に、タンパク質の検出と精製に用いられるＮ末端６×Ｈｉｓタグを含む。
【０２２２】
図１７が示している、ＨＥＶ７１及びポリオウイルスの抗原性融合タンパク質に用いられるｐＥＴ  ＳＵＭＯ−ＶＰ０、ｐＥＴ  ＳＵＭＯ−ＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３、ｐＥＴ  ＳＵＭＯ−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１の発現ベクターの構築は、以下通りである。ＶＰ０、ＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３融合物、ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１融合物のフラグメントは、ＨＥＶ７１とポリオウイルスのサブユニットワクチン用の抗原として用いられる。ＳＵＭＯモチーフと６×Ｈｉｓタグは、融合物のＮ末端と共役され、それぞれタンパク質の可溶化と精製を補助する。抗原性融合タンパク質は、各タンパク質をコード化するｃＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングしてｐＥＴ  ＳＵＭＯ−ＶＰ０、ｐＥＴ  ＳＵＭＯ−ＶＰ０、ｐＥＴ  ＳＵＭＯ−ＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３、ｐＥＴ  ＳＵＭＯ−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１の発現ベクターを形成するステップを含む遺伝子クローニング技術により生成される。融合パートナーをコード化するＤＮＡフラグメントに、順方向プライマーと逆方向プライマーにおける開始コドンと終止コドンを含む特定のプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅をかける。ＰＣＲ生成物の連結反応は、次のように行われる。フレッシュＰＣＲ生成物、１０×連結反応緩衝液、ｐＥＴ  ＳＵＭＯベクター（２５ｎｇ／μｌ）２μｌ、滅菌水を添加して総体積を９μｌとし、１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（４．０Ｗｅｉｓｓ単位）を添加して、連結反応物を１５℃で一晩中培養した後、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｍａｃｈ１ＴＭ−Ｔ１Ｒ（インビトロジェン）コンピテントセルへの形質転換を行う。１０個のコロニーを選択し、ＰｕｒｅＬｉｎｋＴＭＨＱミニプラスミド精製キット（インビトロジェン）を用いてコロニーからプラスミドＤＮＡを分離する。プラスミドを制限分析により分析して、挿入物の存在と正しい方向を確認する。組換え型から、前述したようにプラスミドＤＮＡを分離する。プラスミドに、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）細胞（インビトロジェン）への形質転換を施す。形質転換細胞を増殖させ、ＩＰＴＧによる発現の誘発を数回行って発現の最適時期を決定する。毎回ごとに、誘発された培地と未誘発の培地から５００μｌを取り除き、各細胞ペレットを８０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液に再懸濁させる。沸騰試料に遠心分離にかけた後、各資料の１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、 電気泳動をかける。
【０２２３】
ＨｉｓＴｒａｐニッケルカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて組換え融合タンパク質の精製をスケールアップするために、次の工程を導入する。一晩培養物（５％）を１００〜３００ｍｌのＬＢ＋５０μｇ／ｍｌのカナマイシンに植菌し、２時間後、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導する。２時間後、１０分間３０００ｇで遠心分離を行い、細胞を採取した。１０％（培養物の総体積）の結合緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４）にペレットを再懸濁させる。Ｍｉｓｏｎｉｃ  ＵｌｔｒａＳｏｎｉｃａｔｅ  Ｌｉｑｕｉｄプロセッサにより、氷バケットで１分の間隔を置きながら１分ずつ、５回の超音波分解を細胞に施す。超音波で分解した試料を、４℃にて４０００ｒｍｐで１時間遠心分離を行い、可溶型と不溶型に分離する。不溶型フラクションを、６Ｍの尿素を含有する結合緩衝液に再懸濁させる。可溶型フラクションと不溶型フラクションの両方を、４℃にて４０００ｒｍｐで１時間遠心分離にかけ、その後、０．２２μｍフィルタユニットを用いて濾過する。ＨｉｓＴｒａｐカラムを結合緩衝液を用いて平衡状態にして、濾過した試料をカラムにロードする。次に、カラムを結合緩衝液と４０ｍＭのイミダゾールで洗浄し、組換えタンパク質を０．５Ｍのイミダゾール（不溶型フラクションに対しては６Ｍの尿素）を含む結合緩衝液により溶出する。回収した資料に対して、タンパク質用のクマシーブルー染色プロトコールを用いてテストを行う。溶出フラクションを含む純粋組換えタンパク質を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液とＭｅｒｃｋチューブを用いて透析する。透析後、タンパク質の濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ試薬を用いて評価する。天然タンパク質をＳＵＭＯプロテアーゼを用いて生成し、製造者の指示に従ってＳＵＭＯと６×Ｈｉｓタグを含むＮ末端ペプチドに切断する。
【０２２４】
実施例１６．ＳＮ０７濃縮液で免疫化を受けたマウスから摘出したプール中和血清からの抗体。ＨＥＶ７１  ＶＬＰの構成要素全てと結合する。
ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ０のコード配列を、それぞれ個別的に、実施例１５に記載されているｐＥＴ  ＳＵＭＯベクターにクローニングする。個別の殻タンパク質は、大腸菌内で発現し、実施例１５に記載されている通りに精製される。精製タンパク質のＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３には、ウェスタンブロット法が施され、実際例４で用いられたプール中和血清により１：１０００希釈で調べられる。実施例４で用いた対照群のマウス血清を、本実験でも使用するものとする。
【０２２５】
図１８におけるウェスタンブロット法の結果により、オリゴマー抗原で免疫化を受けたマウスから摘出したプール中和血清は、ＳＮ０７に感染したＳｆ９細胞の上清においてＶＬＰの構成要素全部、つまりＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３と結合するという事実が分かる。
【０２２６】
実施例１７．ＨＥＶ７１  ＶＬＰの特性評価。培養上清からのＨＥＶ７１  ＶＬＰのプルダウン。
組換えバキュロウイルスＳＮ０７に感染した細胞から得た２０ｍｌの上清を、１０ｍｌの単クローン性中和抗体（ＥＶ１８／４／Ｄ６−１／Ｆ１／Ｇ９）に混合し、室温で１時間放置する。ＰＢＳにより予め平衡状態となったＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ）組換えタンパク質Ａの１ｍｌカラム（アガロースビードのサイズ：８５ｕｍ）を介して混合物を徐々にロードし、その後、２０ｍｌのＰＢＳで洗浄し０．５ｍｌの０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）で溶出させる。３０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）によりフラクションを中和させる。溶出フラクションにＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クマシーブルー染色、脱染を順にかける。
【０２２７】
図１９によれば、クマシーブルーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいてＶＬＰの構成要素（ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ３）を視認することができる。
【０２２８】
実施例１８．アフィニティーカラム（ＡＦＣ）精製ＨＥＶ７１  ＶＬＰの分析
バキュロウイルスＳＮ０７の上清濃縮液を用いて生じさせた単クローン性中和抗体（ＥＶ１８／４／Ｄ６−１／Ｆ１／Ｇ９）を以ってアフィニティーカラム（ＡＦＣ）を用意する。ウェスタンブロット法により溶出フラクションを分析し、その結果を図２０にした。レーン１とレーン２の溶出フラクションを抗ＶＰ１抗体を用いて探知した結果、ＡＦＣ精製ＶＬＰにＶＰ１が存在していることが分かった。レーン３とレーン４の溶出フラクションを抗ＶＰ２抗体を用いて探知した結果、ＡＦＣ精製ＶＬＰにＶＰ２も存在していることが分かった。レーン５とレーン６の溶出フラクションを抗ＶＰ２単クローン性抗体を用いて探知した結果、ＡＦＣ精製ＶＬＰにＶＰ２が存在していることが分かった。
【０２２９】
実施例１９．ＡＦＣ精製ＨＥＶ７１  ＶＬＰの電子顕微鏡写真
実施例１８における、アフィニティーカラム（ＡＦＣ）から溶出されたフラクションを電子顕微鏡を用いて評価した。ＡＦＣ精製ＶＬＰの電子顕微鏡写真を図２１に示す。電子顕微鏡で評価した結果、ＨＥＶ７１の構造タンパク質がＶＬＰに組み立てられていることが分かった。
【０２３０】
実施例２０．濃縮液を用いたマウス免疫保護の研究
用いた抗原は、前述した通り組換えバキュロウイルスＳＮ０７の２０ｘ濃縮粗濃縮液である。妊娠を示す膣栓を、交尾後の朝に付け、胎生０．５日目として見なす。１００μｌの濃縮液をＩＭＪＥＣＴ（登録商標）（硫酸バンド）を混合した２回分の投与量を胎生３．５日目の母獣に大して腹腔内投与を行う。体重測定により妊娠を確認し、胎生１７．５日目の母獣に２回目の投与を行う。１回目のワクチン投与に先立って、各マウスから最初の血液試料を採取する。仔マウスへのウイルス攻撃から１４日が経過するまで、試料を毎週採取した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを３群に分け、２０匹には免疫化を行い、ウイルス攻撃をかけた。２０匹には模倣免疫化（ｍｏｃｋ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）を行い、ウイルス攻撃をかけた。５匹には免疫化もせず、ウイルス攻撃もかけなかった。生後５日の仔マウスを、１００×ＨＤ５０のＭＰ−２６Ｍを含有するＭＰ−２６Ｍウイルス５０μｌで感染させた。感染動物を１日に２回観察し、植菌後１４日が経過するまで、疾病の臨床兆候を探した。発育障害、体重減少、ラント症候群、空腹、昏睡、頭部後屈、猫背、粗い毛皮、脱水、低体温、四肢麻痺を含む異常兆候が現れた。麻痺程度を、次の基準に従って採点した。
０：正常
１：筋力は低下しているが四肢は動く
２：患肢を動かせない
３：四肢麻痺、つまり四肢を全く動かせない
【０２３１】
３級の麻痺を患っている動物を麻酔剤（ＨＤ５０）を以って頸椎脱臼により安楽死させた。標的臓器から摘出した部位に対して、病理組織学的検査を行った。 
【０２３２】
防御免疫試験の結果を下記の表２に纏める。
【表２】
2014532691.tif 000003
【０２３３】
ＶＬＰでワクチン接種を受けたマウスのうち、２匹が仔を生んだ。一匹は５匹の仔マウスを生み、母性を見せて仔たちをよく育てた。もう一匹の母獣が生んだ一匹の仔マウスは非常に弱く、母マウスはあまり仔の面倒を見ようとはしなかった。
【０２３４】
結局、免疫化を受けた母体から生まれた仔マウスのうち８３％が、ウイルス攻撃に対して防御力を見せたとの結論を出せる。
【０２３５】
病理組織学的所見を下記の表３に纏める。
【表３】
2014532691.tif 000004
【０２３６】
５匹のマウスが仔マウスを生み、ワクチン防御免疫試験に含まれた（妊娠率１１％）。リード−ミュンヒ法（１９３８）により算出した人道的エンドポイント（ＨＤ５０）は、２．０×１０２ＴＣＩＤ５０のＭＰ−２６Ｍに決められた。免疫化を受けた母から生まれた仔マウスのうち８３％が、ウイルス攻撃に対して防御力を示した。
【０２３７】
病理組織学的所見によれば、ＨＥＶ７１−ＶＬＰ免疫化群に属する母体から生まれた３匹のマウスは、ＨＥＶ７１ウイルスの攻撃を受けたが、感染の臨床兆候を全く見せなかった。
【０２３８】
しかしながら、模倣免疫化群（硫酸バンド／ＰＢＳ）に属する母体から生まれた３匹は、ＨＥＶ７１ウイルスの攻撃を受け、感染したしまった、無接種無ウイルス群に属する母体から生まれた２匹は、感染の臨床兆候を見せなかった。
【０２３９】
ＶＬＰワクチンは、遺伝子型Ｂ３のＨＥＶ７１のマウス馴化株により致命的な攻撃から、同腹の仔マウスたちを防御するのに成功している（免疫化を受けた母マウスの仔６匹のうち５匹／模倣免疫化を受けた母マウスの仔１２匹のうち０匹）。 
【０２４０】
実施例２１．ヒトエンテロウイルスＣ（ポリオウイルス−ＰＶ）のＶＬＰ発現
様々なポリオウイルスの発現カセットを構築し、ポリオウイルスＶＬＰを生成する。発現カセットは、全てポリオウイルスのＰ１ポリペプチドを含むが、それぞれ異なるＩＲＥＳを有する。ＩＲＥＳはポリオウイルスの３ＣＤプロテアーゼの発現を誘導する役割を果たす。（ＰＶ−Ｐ１＋ＨＥＶ７１−ＩＲＥＳ＋ＰＶ−３ＣＤ）、（ＰＶ−Ｐ１＋ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ＋ＰＶ−３ＣＤ）、（ＰＶ−Ｐ１＋ＰＶ−ＩＲＥＳ＋ＰＶ−３ＣＤ）の組み合わせとなる。ポリオウイルスのＶＬＰ発現カセットを持つ組換えバキュロウイルスに対してテストを行う。感染後３日目にバキュロウイルス感染細胞から溶解物を採取し、ウサギ抗ＰＶＰ３抗体（１：２０００）を用いてポリオウイルスＶＰ３の発現を評価する。
【０２４１】
ＰＶ−ＩＲＥＳ含有構築体のみが所望したサイズのＶＰ−３タンパク質を生成した。３ＣＤプロテアーゼがＨＥＶ７１−ＩＲＥＳ又はＥＭＣＶ−ＲＥＳの制御の下にあるときは、ＰＶ−ＩＲＥＳ構築体とは違って、ポリオウイルスのＶＰ３タンパク質は適切に切断されず、結果的に、ポリウイルスＶＬＰの生成に悪影響を及ぼす。従って、ＰＶ−ＩＲＥＳを有するポリオウイルスのＰＶ−ＶＬＰ発現カセットは、ポリオウイルスＶＬＰの生成に非常に効率的である。
【０２４２】
実施例２２．ＥＬＩＳＡ法によるポリオウイルスＰＶ−ＶＬＰアセンブリの立証
ＰＶ−ＶＬＰ発現カセットからのポリオウイルスＶＬＰ生成を立証するため、ＰＶ−ＶＬＰ発現カセットを担う組換えバキュロウイルスからの溶解物及び上清を用いて、両サイトＥＬＩＳＡ法を行う。ＰＶ−３ＣＤプロテアーゼは、ポリオウイルスＩＲＥＳの制御の下にある。Ｓｆ９細胞は、ＰＶ−ＩＲＥＳを含むＰＶ−ＶＬＰ発現カセットを担う組換えバキュロウイルスにより感染される。感染後３日目に溶解物と上清を採取する。ポリオウイルスＶＬＰの形成は、両サイトＥＬＩＳＡ法を用いて評価する。
【０２４３】
両サイトＥＬＩＳＡ法では、タンパク質Ａにより精製したウサギ抗ポリオウイルスＶＰ３抗体を補足抗体として用意し、コーティング緩衝液、つまり０．０５Ｍ炭酸水素塩緩衝液、ｐＨ９．６に５０μｇ／ｍＬまで希釈する。１００μｌ／ウェルの抗体をＮＵＮＣ免疫プレート（ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ）に分散させ、４℃にて一晩中保存する。ＰＢＳＴ（０．０５％）で洗浄した後、免疫プレートを２００μｌ／ウェルの遮断緩衝液、つまり１％のカゼインを溶解させたＰＢＳにより、室温で２時間遮断する。ＰＶ−ＶＬＰ発現カセットを担う組換えバキュロウイルスからの溶解物及び上清の試料（ＰＶ−３ＣＤプロテアーゼはポリオウイルスＩＲＥＳの制御の下にある）は、希釈剤、つまり０．２％のカゼインを溶解させたＰＢＳで希釈され、１００μｌ／ウェルで分散され、１時間室温で培養された後、ＰＢＳＴ（０．０５％）で洗浄される。
【０２４４】
ＶＬＰを検出するために、マウス単クローン性抗体、つまり抗ＶＰ１（クローン５−Ｄ８／１；Ｄａｋｏ）を０．２％のカゼインをＰＢＳに溶解させた希釈剤により１：２５０の希釈率で希釈して用意する。希釈した検出用の単クローン性抗体を、１００μｌ／ウェルで分散させ、室温で１時間培養する。抗マウスＨＲＰ共役２°抗体を、０．２％のカゼインをＰＢＳに溶解させた希釈剤により１：１０００の希釈率で希釈して用意する。ＰＢＳＴ（０．０５％）でプレートを洗浄した後、１００μｌ／ウェルの希釈した２°抗体を分散させ、プレートを室温で１時間培養する。プレートを洗浄緩衝液のＰＢＳＴ（０．０５％）で洗浄した。ＳｕｒｅＢｌｕｅＴＭＴＭＢ  １（ＫＰＬ）成分マイクロウェルペルオキシダーゼ基質を１００μｌ／ウェルで分散させ、室温で１０分間培養し成長させる。１００μｌ／ウェルの停止液、つまり５ｍＭのＮａＯＨを添加し、反応を停止させた。各ウェルの吸収度を６５０ｎｍの光密度で読み取った。
【０２４５】
図２３に示された両サイトＥＬＩＳＡ法の結果によれば、ＶＰ１タンパク質とＶＰ３タンパク質は、ＶＬＰがＰＶ−ＶＬＰ発現カセットから実際に形成されたことを示す相互関係になることが分かる。
【０２４６】
実施例２３．ＨＥＶ７１  ＩＲＥＳ（Ｐ１＋ＨＥＶ７１  ＩＲＥＳ＋３ＣＤ）を有するＨＥＶ７１  ＶＬＰ発現カセットの構築体
ＨＥＶ７１−ＩＲＥＳを持つＨＥＶ７１  ＶＬＰカセットの概略的構造を図２４に図示する。発現カセットは、３ＣＤプロテアーゼの発現がＥＭＣＶ  ＩＲＥＳではなくＨＥＶ７１  ＩＲＥＳによるものであるということを除けば、実施例１に示されている構築体（ｐＳＮ０１）と類似する。ＨＥＶ７１  ＩＲＥＳ配列はＧｅｎＢａｎｋで探すことができる（アクセス番号ＤＱ３４１３６２．１；ヌクレオチド１〜７４７）。インビトロジェンＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ（登録商標）マニュアル（２００９）の指示に従って、ベクターを含むＨＥＶ７１発現カセットを、ＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）を用いたａｔｔＬ／ａａＲインビトロ組換えにより、バキュロウイルス発現プラスミドｐＤＥＳＴ８（デスティネーションベクター）に組み込む。エントリーベクターとｐＤＥＳＴ８間の組換えは発現クローンを生成する。発現クローンは、インビトロジェンＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ（登録商標）マニュアルに記載されているように、ＤＨ１０Ｂａｃの形質変換により組換えバクミドを生じさせる。Ｓｆ９細胞の組換えバクミドへのトランスフェクションは、Ｐ１、ＨＥＶ７１  ＩＲＥＳ、３ＣＤを有する発現カセットを担う組換えバキュロウイルスをレスキューする。
【０２４７】
Ｓｆ９細胞を更に感染させ、６つのウェルプレートにおいて、レスキューした組換えバキュロウイルスを以って切断した殻タンパク質の発現を評価することができる。ＶＰ１、ＶＰ０、ＶＰ３に対して特異的であるウサギ多クローン性抗原は、組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞からの溶解物と上清に対してウェスタンブロット法を行うことにより、組織化したＶＬＰを特定する。 
【０２４８】
実施例２４．ＰＶ−ＩＲＥＳ（Ｐ１＋ＰＶ−ＩＲＥＳ＋３ＣＤ）を有するＨＥＶ７１  ＶＬＰ発現カセットの構築体
発現カセットは、３ＣＤプロテアーゼの発現がＨＥＶ７１−ＩＲＥＳではなくポリオウイルスＩＲＥＳ（ＰＶ−ＩＲＥＳ）によるものであるというを除けば、実施例２４に示されている発現カセットと類似する。ポリオウイルスのＩＲＥＳ配列はＧｅｎＢａｎｋで探すことができる（アクセス番号Ｖ０１１５０．１２；ヌクレオチド１〜６２８）。
【０２４９】
インビトロジェンＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ（登録商標）マニュアル（２００９）の指示に従って、ベクターを含むＨＥＶ７１発現カセットを、ＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）を用いたａｔｔＬ／ａａＲインビトロ組換えにより、バキュロウイルス発現プラスミドｐＤＥＳＴ８（デスティネーションベクター）に組み込む。エントリーベクターとｐＤＥＳＴ８間の組換え反応は発現クローンを生成する。発現クローンは、インビトロジェンＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ（登録商標）マニュアルに記載されているように、ＤＨ１０Ｂａｃの形質変換により組換えバクミドを生じさせる。Ｓｆ９細胞の組換えバクミドへのトランスフェクションは、Ｐ１、ＰＶ  ＩＲＥＳ、３ＣＤを有する発現カセットを担う組換えバキュロウイルスをレスキューする。
【０２５０】
Ｓｆ９細胞を更に感染させ、６つのウェルプレートにおいて、レスキューした組換えバキュロウイルスを以って切断した殻タンパク質の発現を評価することができる。ＶＰ１、ＶＰ０、ＶＰ３に対して特異的であるウサギ多クローン性抗原は、組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞からの溶解物と上清に対してウェスタンブロット法を行うことにより、組織化したＶＬＰを特定する。
【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２４】
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【図２５】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１５】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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