(57)【要約】  本発明は、皮膚老化で特徴的な変化を示す遺伝子をスクリーニングする方法、及びこれらの遺伝子の発現を調節して老化を防止する物質をスクリーニングする方法に関し、本発明を通じて皮膚老化に関連した新しいターゲット遺伝子を獲得し、上記遺伝子の発現を調節することによって、皮膚老化抑制及び皮膚疾患治療に効果がある新しい物質を提供することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）皮膚組職から全体ＲＮＡを抽出した後、マイクロアレイを実行する段階；
２）バイオインフォマティクス技法を利用して老化によって変化する遺伝子を分析する段階；
３）皮膚老化と関連した候補遺伝子を選別する段階；及び
４）逆転写重合酵素連鎖反応により真偽有無を確認する段階を経て候補遺伝子を確定する段階；
を含む、皮膚老化と関連した遺伝子をスクリーニングする方法。
【請求項２】
上記皮膚老化は、時間の経過による内因性老化、ホルモンによる閉経期老化又はしみであることを特徴とする請求項１に記載の皮膚老化と関連した遺伝子をスクリーニングする方法。
【請求項３】
上記内因性老化は、ＬＰＬ、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＬＮ、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＳＰＲＲ１Ａ、ＳＴＰ１２Ａ、ＩＮＳＩＧ１及びＧＡＬよりなる群から選択された１種以上の遺伝子と関連することを特徴とする請求項２に記載の皮膚老化と関連した遺伝子をスクリーニングする方法。
【請求項４】
上記閉経期老化は、ＭＭＰ３、ＦＩＧＦ、ＣＭＡ１、ＲＳＰＯ３、ＤＰＰ４、ＣＯＬ１Ａ１、ＬＰＨＮ３、ＧＲＥＢ１及びＯＧＮよりなる群から選択された１種以上の遺伝子と関連することを特徴とする請求項２に記載の皮膚老化と関連した遺伝子をスクリーニングする方法。
【請求項５】
上記しみは、ＬＯＸＬ２、ＷＮＴ３、ＣＯＬ１７Ａ１、ＣＩＤＥＢ、ＨＯＸＡ７、ＣＤＨ３、ＳＩＬＶ、ＭＸ１、ＰＬＡＴ、ＣＣＬ２、ＩＤ１、ＡＱＰ３、ＴＮＳ４、ＩＳＧ１５、ＦＧＦＲ３及びｐ１６よりなる群から選択された１種以上の遺伝子と関連することを特徴とする請求項２に記載の皮膚老化と関連した遺伝子をスクリーニングする方法。
【請求項６】
１）試験皮膚細胞に細胞内遺伝子の発現を調節する候補物質を処理する段階；
２）試験皮膚細胞を皮膚老化原因環境に置かれるようにして、細胞内遺伝子の発現を誘導する段階；及び
３）上記２）段階の細胞で皮膚老化原因による細胞内遺伝子の発現程度を測定する段階；
を含む、皮膚老化を防止する物質をスクリーニングする方法。
【請求項７】
上記細胞内遺伝子は、時間の経過による内因性老化、ホルモンによる閉経期老化又はしみと関連した遺伝子であることを特徴とする請求項６に記載の皮膚老化を防止する物質をスクリーニングする方法。
【請求項８】
上記内因性老化は、ＬＰＬ、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＬＮ、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＳＰＲＲ１Ａ、ＳＴＰ１２Ａ、ＩＮＳＩＧ１及びＧＡＬよりなる群から選択された１種以上の遺伝子と関連することを特徴とする請求項７に記載の皮膚老化を防止する物質をスクリーニングする方法。
【請求項９】
上記閉経期老化は、ＭＭＰ３、ＦＩＧＦ、ＣＭＡ１、ＲＳＰＯ３、ＤＰＰ４、ＣＯＬ１Ａ１、ＬＰＨＮ３、ＧＲＥＢ１及びＯＧＮよりなる群から選択された１種以上の遺伝子と関連することを特徴とする請求項７に記載の皮膚老化を防止する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
上記しみは、ＬＯＸＬ２、ＷＮＴ３、ＣＯＬ１７Ａ１、ＣＩＤＥＢ、ＨＯＸＡ７、ＣＤＨ３、ＳＩＬＶ、ＭＸ１、ＰＬＡＴ、ＣＣＬ２、ＩＤ１、ＡＱＰ３、ＴＮＳ４、ＩＳＧ１５、ＦＧＦＲ３及びｐ１６よりなる群から選択された１種以上の遺伝子と関連することを特徴とする請求項７に記載の皮膚老化を防止する物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚老化で特徴的な変化を示す遺伝子をスクリーニングする方法、及びこれら遺伝子の発現を調節して老化を防止する物質をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在までの皮膚老化に対する研究は、主に皮膚真皮層の変化に対して行われ、コラーゲンとコラーゲンの分解酵素であるＭＭＰ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）の生合成を調節するのに焦点を合わせて進行して来た。また、コラーゲンの生合成を増加させるのに効果的であると知られている抗老化化粧品の有効成分は、現在レチノールが唯一である。
【０００３】
しかし、皮膚老化防止は、単純にコラーゲンの合成を増加させることだけでは足りなく、様々な老化の原因による皮膚老化の症状及び関連された因子も異なる。したがって、次世代機能性化粧品を開発するためには、総体的な新しい接近方式が必要であり、皮膚老化と関連した特徴的な遺伝子の変化を総体的に確認することによって、皮膚老化の原因を究明し、発生機作を理解し、これら遺伝子の発現を調節することによって、これを標的とする皮膚老化防止及び治療技術を開発する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これより、本発明者は、遺伝子チップを利用して皮膚老化で特徴的な変化を示す遺伝子の変化を総体的に確認し、老化防止と関連した新しいターゲット遺伝子を見つけるために研究を重ねた。
【０００５】
したがって、本発明の目的は、老化調節と関連した新しいターゲット遺伝子を提供することにある。
【０００６】
また、本発明の他の目的は、上記遺伝子の発現を調節することによって、皮膚老化抑制及び皮膚疾患治療に効果がある新しい物質をスクリーニングする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、１）皮膚組織で全体ＲＮＡを抽出した後、マイクロアレイを実行する段階；２）バイオインフォマティクス（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）技法を利用して老化によって変化する遺伝子を分析する段階；３）皮膚老化と関連した候補遺伝子を選別する段階；及び４）逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により真偽有無を確認する段階を経て候補遺伝子を確定する段階；を含む、皮膚老化と関連した遺伝子をスクリーニングする方法を提供する。
【０００８】
また、本発明は、１）試験皮膚細胞に細胞内遺伝子の発現を調節する候補物質を処理する段階；２）試験皮膚細胞を皮膚老化原因環境に置かれるようにして、細胞内遺伝子の発現を誘導する段階；及び３）上記２）段階の細胞で皮膚老化原因による細胞内遺伝子の発現程度を測定する段階；を含む、皮膚老化を防止する物質をスクリーニングする方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によるスクリーニング方法によって様々な皮膚老化の原因による関連遺伝子を確保することができ、既に知られた紫外線による光老化だけでなく、閉経と関連した内因性老化原因遺伝子をも究明することができ、対象とする遺伝子別に差別化された概念の製品開発が可能なので、より根本的に皮膚老化を防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、若者と老人の皮膚でガラニンプレプロペプチドに対してマイクロアレイ及び定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した結果を示す図である。
【００１１】
【図２】図２は、ガラニンの機能分析のためにｓｉＲＮＡ方法を通じてガラニンプレプロペプチドの発現を抑制させた後、紫外線による抗老化マーカー（ＭＭＰ）、炎症性サイトカインの遺伝子発現の変化を示す図である。
【図３】図３は、ガラニンの機能分析のためにｓｉＲＮＡ方法を通じてガラニンプレプロペプチドの発現を抑制させた後、紫外線による抗老化マーカー（ＭＭＰ）、炎症性サイトカインの遺伝子発現の変化を示す図である。
【００１２】
【図４】図４は、図２及び図３と同様に、ガラニン発現の抑制を通じてガラニンプレプロペプチドとコラーゲン発現との関係を示す図である。
【００１３】
【図５】図５は、若者と老人の皮膚でオステオグリシンに対してマイクロアレイと定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した結果を示す図である。
【００１４】
【図６】図６は、オステオグリシン発現の抑制を通じたオステオグリシンとコラーゲン発現間の関係を示す図である。
【００１５】
【図７】図７は、しみで発現が増加した１６個の遺伝子を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
皮膚老化の原因は、様々なものがあるが、本発明は、特に次のものに焦点を合わせて記述する。
１．時間の経過による内因性老化
２．ホルモンによる閉経期老化
３．しみ
【００１７】
本発明の方法は、様々な原因による老化と関連した遺伝子をスクリーニングする方法を提供し、これは、マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）を施行することによって行われる。
【００１８】
本発明は、１）皮膚組織で全体ＲＮＡを抽出した後、マイクロアレイを実行する段階；２）バイオインフォマティクス（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）技法を利用して老化によって変化する遺伝子を分析する段階；３）皮膚老化と関連した候補遺伝子を選別する段階；及び４）逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により真偽有無を確認する段階を経て候補遺伝子を確定する段階；を含む、皮膚老化と関連した遺伝子をスクリーニングする方法を提供する。
【００１９】
対象とする皮膚老化原因によって老化が進行した遺伝子とそうでない遺伝子、または男性と女性において発現が増加または減少する遺伝子が異なって現われ、このように発現に変化がある遺伝子は、皮膚老化と関連した遺伝子として判断することができるので、このような遺伝子を皮膚老化と関連した候補遺伝子として選別することができる。
【００２０】
本発明では、上記スクリーニング方法によりガラニンプレプロペプチド、Ｗｎｔ３、ＴＮＳ４、オステオグリシンなどを皮膚老化と関連した新しいターゲット遺伝子になることができることを確認したが、これにのみ限定されるものではない。
【００２１】
また、本発明は、上記ターゲット遺伝子の発現を調節することによって、皮膚老化を防止することができる物質をスクリーニングする方法を提供する。
【００２２】
皮膚老化を防止することができる候補物質の選別は、１次的に細胞を利用した検索システムを利用し、２次的に志願者の皮膚を利用して実質的に人体に作用する効能を評価することによって、皮膚老化防止に効果がある物質を選別することができる。
【００２３】
本発明は、１）試験皮膚細胞に細胞内遺伝子の発現を調節する候補物質を処理する段階；２）試験皮膚細胞を皮膚老化原因環境に置かれるようにして、細胞内遺伝子の発現を誘導する段階；及び３）上記２）段階の細胞で皮膚老化原因による細胞内遺伝子の発現程度を測定する段階；を含む、皮膚老化を防止する物質をスクリーニングする方法を提供する。
【００２４】
上記１）段階で、試験細胞は、皮膚老化原因環境に置かれることによって、皮膚老化と関連した細胞内遺伝子の発現を誘導することができる細胞ならいずれも使用が可能である。また、上記皮膚老化原因環境としては、特に制限されないが、紫外線、熱、ホルモンなど皮膚老化と関連した様々な原因のうち１つに該当することができる。
【００２５】
また、上記３）段階で、環境有害因子による細胞内因子の発現程度は、逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を通じて測定して確認することができる。
【００２６】
上記のような方法により皮膚老化と関連した新しいターゲット遺伝子を見つけ、様々な皮膚老化の原因による関連遺伝子に対して作用する新しくて且つ差別化された製品の開発が可能である。
【実施例】
【００２７】
以下、下記実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。しかし、下記実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の思想と範囲内で様々な変形または修正を行うことができる。
【００２８】
［試験例１］内因性老化モデルでのマイクロアレイ施行
時間による皮膚老化である内因性老化と関連した遺伝子をスクリーニングするために、本発明ではヒト皮膚で実験を進行した。
【００２９】
１８歳〜２５歳の男性若者と女性若者それぞれ４名、７８〜８２歳の男性老人と女性老人それぞれ４名を選定し、これらの非露出部位の皮膚である尻皮膚を４〜８ｍｍパンチ生検（ｐｕｎｃｈ  ｂｉｏｐｓｙ）でそれぞれ４〜６個採取した。
【００３０】
採取した皮膚から全体ＲＮＡを抽出した後、マイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐＨｕｍａｎ  ＨＧ−Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２．０）を実行し、バイオインフォマティクス（ＤＡＶＩＤ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／Ｇｅｎｅ  ｓｐｒｉｎｇ）技法を利用して老化によって変化する遺伝子を分析した。
【００３１】
分析結果から皮膚老化と関連した候補遺伝子を選別し、定量的ＲＴ−ＰＣＲを通じて候補遺伝子の真偽有無を確認した後、候補遺伝子として確定した。
男性及び女性で増加または減少する遺伝子の個数を下記表１に示した。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
男性では増加したが、女性では減少したプローブはなかったので、共通遺伝子で男性と女性の差異が反対であるプローブはなかった。
男性老人と女性老人の皮膚において共通に増加した遺伝子は、下記表２に示した。
【００３４】
【表２】
2014504155.tif 000004
【００３５】
男性老人と女性老人の皮膚において共通に減少した遺伝子は、下記表３に示した。
【００３６】
【表３】
2014504155.tif 000005
【００３７】
男性老人の皮膚において増加した遺伝子は、下記表４に示した。
【００３８】
【表４】
2014504155.tif 000006
【００３９】
男性老人の皮膚において減少した遺伝子は、下記表５に示した。
【００４０】
【表５】
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【００４１】
女性老人の皮膚において増加した遺伝子は、下記表６に示した。
【００４２】
【表６】
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【００４３】
女性老人の皮膚において減少した遺伝子は、下記表７に示した。
【００４４】
【表７】
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【００４５】
本発明者は、男性老人と女性老人の皮膚細胞において共通に減少した遺伝子であるガラニンプレプロペプチド（ｇａｌａｎｉｎ  ｐｒｅｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ、ＧＡＬ）を皮膚老化と関連した候補遺伝子として選別した。上記遺伝子は、神経系発達と関連して皮膚の神経細胞だけでなく、非神経細胞でも生成され、ＧＡＬ受容体（ＧＡＬＲ１、ＧＡＬＲ２及びＧＡＬＲ３）は、免疫及び細胞増殖、炎症反応、薬物及びストレスに対する反応、インスリン分泌、成長ホルモンの分泌などと関連して生物学的機能に必須な要素である。
【００４６】
本発明者は、若者と老人の皮膚で採取したガラニンプレプロペプチドに対してマイクロアレイと定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施し、その結果は、図１に示した。
【００４７】
図１を見れば、マイクロアレイから出た結果と定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果が同一の形態を示すことを確認することができるので、ガラニンプレプロペプチドを候補遺伝子として確定した。
【００４８】
ｓｉＲＮＡ方法を通じてガラニンの機能を分析しようとし、具体的な実験方法は、次の通りである。
【００４９】
ＨａＣａＴ細胞を１０％血清が入っているＤＭＥＭ培地を使用して６０ｍｍ細胞培養ディッシュに１．２５×１０6細胞／ディッシュの密度で分株した後、３７℃、５％ＣＯ2培養器で約８０％密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）まで培養した。ｓｉＲＮＡを処理して培養後、培地を除去し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１ｍＬを添加し、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＲＮＡ分離法によってＲＮＡを分離した。紫外線検出器（ＨＥＷＬＥＴＴ  ＰＡＣＫＡＲＤ）を利用して２６０ｎｍでＲＮＡを定量した後、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施した。各サンプルに対する遺伝子分析のために相補的な遺伝子である３６Ｂ４を基準として補正した。また、ＭＭＰ−１、９のＥＬＩＳＡ分析は、製造社（Ａｍｅｒｓｈａｒｍ）の実験方法によって行った。
測定結果は図２及び図３に示した。
【００５０】
図２で確認することができるように、紫外線によって皮膚細胞に損傷を与えれば、ガラニンプレプロペプチドの発現が増加し、また、ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−９の発現も増加することが分かる。
【００５１】
また、図３を参照すれば、紫外線がガラニンプレプロペプチドの発現を増加させ、これと共にＣＯＸ−１、ＩＬ−６及びＩＬ−１ｂの発現を増加させることが分かる。
【００５２】
また、上記方法と類似の方法でガラニンプレプロペプチドとコラーゲン発現間の関係を調べた。具体的な実験方法は次の通りである。
【００５３】
ＨａＣａＴ細胞を１０％血清が入っているＤＭＥＭ培地を使用して６０ｍｍ細胞培養ディッシュに１．２５×１０6細胞／ディッシュの密度で分株した後、３７℃、５％ＣＯ2培養器で約８０％密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）まで培養した。ｓｉＲＮＡを処理して培養後、培地を除去し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１ｍＬを添加し、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＲＮＡ分離法によってＲＮＡを分離した。紫外線検出器（ＨＥＷＬＥＴＴ  ＰＡＣＫＡＲＤ）を利用して２６０ｎｍでＲＮＡを定量した後、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施した。各サンプルに対する遺伝子分析のために相補的な遺伝子である３６Ｂ４を基準として補正した。また、プロコラーゲンのＥＬＩＳＡ分析は、製造社（ｔａｋａｒａ）の実験方法によって行った。
測定結果は、図４に示した。
【００５４】
図４を参照すれば、ガラニンプレプロペプチドの発現量が不足すれば、コラーゲンの発現も減少することを確認することができる。
【００５５】
［試験例２］閉経期老化モデルでのマイクロアレイ施行
本試験例では、上記試験例１の結果を利用した。本発明者は、女性老人の皮膚細胞だけで減少した遺伝子であるオステオグリシン（ｏｓｔｅｏｇｌｙｃｉｎ）を候補遺伝子として選別した。上記遺伝子は、コラーゲン合成と関連した遺伝子であって、オステオグリシンの発現が減少すれば、コラーゲンの合成も減少する。また、オステオグリシンは、角膜再生、退行性関節炎で主に研究されたものであって、正常なコラーゲン線維形成（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｆｉｂｒｉｌｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）、細胞成長、分化及び損傷された組織の回復に関与する。
【００５６】
本発明者は、女性若者と女性老人の皮膚で採取したオステオグリシンに対してマイクロアレイと定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施し、その結果は図５に示した。
【００５７】
図５を参照すれば、マイクロアレイで出た結果と定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果が同一の形態を示すことを確認することができるので、オステオグリシンを候補遺伝子として確定した。
【００５８】
ｓｉＲＮＡ方法を通じてオステオグリシンの機能を分析しようとし、具体的な実験方法は次の通りである。
【００５９】
ＨａＣａＴ細胞を１０％血清が入っているＤＭＥＭ培地を使用して６０ｍｍ細胞培養ディッシュに１．２５×１０6細胞／ディッシュの密度で分株した後、３７℃、５％ＣＯ2培養器で約８０％密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）まで培養した。ｓｉＲＮＡを処理して培養後、培地を除去し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１ｍＬを添加し、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＲＮＡ分離法によってＲＮＡを分離した。紫外線検出器（ＨＥＷＬＥＴＴ  ＰＡＣＫＡＲＤ）を利用して２６０ｎｍでＲＮＡを定量した後、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施した。各サンプルに対する遺伝子分析のために相補的な遺伝子である３６Ｂ４を基準として補正した。また、オステオグリシンのＥＬＩＳＡ分析は、製造社（Ａｍｅｒｓｈａｒｍ）の実験方法によって行った。
測定結果は、図６に示した。
【００６０】
図６を見れば、オステオグリシンがなければ、コラーゲンの形成が抑制されることを確認することができる。
【００６１】
［試験例３］脂漏角化症（しみ）モデルでのマイクロアレイ施行
老人の脂漏角化症と正常皮膚でマイクロアレイを施行し、遺伝子発現を比較した。
老人の脂漏角化症を持っている７８〜８２歳の男性老人及び女性老人それぞれ４名を選定し、これらの脂漏角化症を持っている部位と脂漏角化症がない部位を４〜８ｍｍポンチ生検（ｐｕｎｃｈ  ｂｉｏｐｓｙ）でそれぞれ４〜６個採取した。
【００６２】
採取した皮膚から全体ＲＮＡを抽出した後、マイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐＨｕｍａｎ  ＨＧ−Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２．０）を実行し、バイオインフォマティクス（ＤＡＶＩＤ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇ）技法を利用して老化によって変化する遺伝子を分析した。
遺伝子分析を通じてしみで発現が増加した１６個の遺伝子を確認し、これは図７に示した。
【００６３】
上記のように、様々な皮膚老化の原因によってそれぞれ異なる遺伝子が作用することを確認することができる。したがって、これら遺伝子の発現を調節することができる物質をスクリーニングすることによって、皮膚老化防止に効果的な差別化された製品を開発することができる。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図２】
2014504155.tif 000016
【国際調査報告】
2014504155.tif 000017
2014504155.tif 000018
2014504155.tif 000019
2014504155.tif 000020
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