(57)【要約】  本開示は、オステオプロテゲリンの活性を阻害する薬剤、及び肺高血圧症の治療でのその使用に関する。
2014532637.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺高血圧症の治療で使用するための、オステオプロテゲリン［ＯＰＧ］の発現、又はＯＰＧ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を阻害する薬剤。
【請求項２】
前記阻害剤が、アンタゴニスト抗体又はその活性な抗体結合断片である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記抗体又は結合断片が、配列番号１のアミノ酸配列を含む又はこれからなるポリペプチド、抗原結合部分、又は配列番号１のアミノ酸配列と７５％〜９９％の配列同一性を有する配列変異体と結合し、その活性を阻害する、請求項２に記載の薬剤。
【請求項４】
前記抗体が、配列番号１に示すアミノ酸配列と結合する抗体と競合する、請求項２又は３に記載の薬剤。
【請求項５】
前記抗体が、ポリクロナール抗体である、請求項２から４のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項６】
前記抗体が、モノクロナール抗体である、請求項２から４のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項７】
前記抗体結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、一本鎖抗体断片からなる群より選択される、請求項２から６のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項８】
前記抗体が、キメラ抗体である、請求項６又は７に記載の薬剤。
【請求項９】
前記抗体が、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項６又は７に記載の薬剤。
【請求項１０】
前記抗体又は結合断片が、ＯＰＧのリガンド結合ドメインと結合する、請求項２から９のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１１】
前記薬剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、アンチセンスＲＮＡ分子であり、かつｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ分子の一部である、請求項１１に記載の薬剤。
【請求項１３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスＲＮＡが、１９〜２９ヌクレオチド［ｎｔ］の長さである、請求項１１又は１２に記載の薬剤。
【請求項１４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスＲＮＡが、２１ｎｔの長さである、請求項１３に記載の薬剤。
【請求項１５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡ分子が、修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡ分子が、配列番号２を参照して設計されたヌクレオチド配列を含む、請求項１１から１５のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１７】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡ分子を細胞又は組織に送達するように構成された担体と併用される、請求項１１から１６のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１８】
前記組成物が、肺高血圧症の治療に有効な少なくとも１つの追加薬剤を有効量含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１９】
前記薬剤がカルシウムチャンネル遮断薬、利尿薬、エンドセリン受容体アンタゴニスト、プロスタサイクリン、可溶性グアナレートシクラーゼ、及びホスホジエステラーゼ阻害剤からなる群より選択される、請求項１８に記載の薬剤。
【請求項２０】
肺高血圧症が、肺動脈性高血圧症及び肺疾患と関連したＰＨからなる群より選択される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項２１】
治療を必要とするヒト対象に、オステオプロテゲリンアンタゴニストを有効量投与するステップを含む、肺高血圧症を治療する方法。
【請求項２２】
ＯＰＧの発現量を決定するステップを含む、対象が肺高血圧症を有するか又はこれに対する素因を有するかを判断するための診断又は予知方法であって、対照サンプルと比較したＯＰＧの過剰発現が肺高血圧症又は肺高血圧症に対する素因を示す、方法。
【請求項２３】
ｉ）試験対象となる単離された生体サンプルを用意するステップと、
ｉｉ）前記サンプル及び配列番号２に示す核酸配列を含む核酸分子にアニーリングするように構成されたオリゴヌクレオチドプライマーの対、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドトリホスフェート、並びに補助因子を含む調製物を形成するステップと、
ｉｉｉ）前記核酸分子を増幅するのに十分なポリメラーゼ連鎖反応条件を与えるステップと、
ｉｖ）配列番号２に由来するヌクレオチド配列を含む核酸分子の有無について、前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅生成物を分析するステップと、任意選択で
ｖ）増幅生成物を正常な対応対照と比較するステップと、
を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ｉ）試験対象となる単離された生体サンプルを用意するステップと、
ｉｉ）前記サンプル、及び、前記サンプル中の配列番号１に示すアミノ酸配列により表される１つ又は複数のポリペプチドと特異的に結合して抗体／ポリペプチド複合体を形成する１つ又は複数の抗体を含む調製物を形成するステップと、
ｉｉｉ）そのように形成された１つ又は複数の複合体を検出するステップと、
ｉｖ）前記１つ又は複数のポリペプチドの発現量を正常な対応対照と比較するステップと、
を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ＯＰＧの発現量が、前記サンプル中のＴＲＡＩＬの発現量と比較される、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＯＰＧ：ＴＲＡＩＬの比が、対照サンプル中のＯＰＧ：ＴＲＡＩＬの比と比較される、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記対象が肺高血圧症の治療を必要とする場合に、前記対象に、請求項２から１０のいずれか一項に記載のＯＰＧ抗体を有効量投与することを含む、請求項２２から２６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）の活性を阻害する薬剤、及び肺高血圧症の治療でのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺高血圧症［ＰＨ］には、肺内で異常に高い血圧を引き起こす様々な状態が含まれる。ＰＨは、肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）の形態を採り得るが、特発性（ＩＰＡＨ）又は遺伝性（ｈＰＡＨ）として、またその他の疾患（ＡＰＡＨ）、例えば結合組織疾患と関連して生ずる。ＰＨは、左心性心疾患、肺疾患（特に、うっ血性閉塞性疾患［ＣＯＰＤ］及び肺線維症）、血栓塞栓症の他、門脈高血庄症、鎌状赤血球疾患、及びＨＩＶ等のその他の多因子性の状態にも起因する可能性がある。ＰＨに罹患した患者の予後は不良であり、また疾患群間で異なる。最新の疾患マネジメントとして、カルシウムチャンネル遮断薬、利尿薬、エントセリン受容体アンタゴニスト、プロスタサイクリン、可溶性グアナレートシクラーゼ、及びホスホジエステラーゼ阻害剤の使用が挙げられる。これらの治療の副作用プロファイルは、生活の質のさらなる低下を引き起こし、また疾病管理が不十分となる可能性がある。肺移植が唯一の治癒的治療であるが、行われるのは非常に稀である。したがって、進行の遅延及び／又はＰＨからの回復に有効で、また現行治療と関連した問題を有さない新しい治療法及び薬剤を識別する必要性が継続的に認められる。
【０００３】
オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーのタンパク質であり、少なくとも２つのリガンド、すなわち癌細胞におけるアポトーシスの誘導に関係するＴＮＦ様の細胞表面分子であるＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド［ＴＲＡＩＬ］、及び破骨細胞前駆体、樹状細胞、Ｔ細胞、及び造血性前駆体において発現されるＮＦｋＢリガンドの受容体活性化因子［ＲＡＮＫＬ］と結合する。ＯＰＧはＴＲＡＩＬに対するいくつかのデコイ受容体の１つとして認められ、標的癌細胞に対するその能力を調節するように作用する。ＯＰＧは、該当部位に存在する場合には、癌細胞生存率を高めるものと期待でき、腫瘍細胞の生存率を高めるその能力が立証されている。ＲＡＮＫＬは、細胞表面上でＲＡＮＫと相互作用して、骨代謝に関係する主要な細胞である破骨細胞の生成及び活性を刺激する。ＯＰＧがＲＡＮＫＬと相互作用すると、ＲＡＮＫに結合するＲＡＮＫＬの能力を阻害し、また破骨細胞を刺激するが、ＯＰＧのこの活性こそが、骨喪失を低減するＯＰＧ能力をもたらしている。
【０００４】
骨代謝におけるＯＰＧの活性は、当技術分野において周知されている。米国特許第６，０１５，９３８号は、ＯＰＧを発現するヒト以外の遺伝子組換え動物、及び骨代謝におけるＯＰＧの関与を分析する際のその使用について開示する。米国特許第６，２８４，７４０号は、哺乳類により産生されるＯＰＧの量を増加させ、これにより骨密度を増加させる遺伝子療法について開示する。米国特許第６，２８４，７２８号、及び米国特許第６，６１３，５４４号は、ＯＰＧポリペプチド及びＯＰＧをコードする核酸分子についてそれぞれ開示及び主張する。米国特許第６，３１６，４０８号は、米国特許第６，０８７，５５５号に記載されているＯＰＧの発現を欠いている遺伝子組換えのマウスに対して、破骨細胞活性化因子及び分化因子を投与することにより、骨の疾患を治療又は防止する方法を開示する。いずれのケースでも、ＯＰＧ及び骨代謝におけるその関与を教示する。引用する先行技術のいずれにおいても、ＰＨにおけるＯＰＧの関与、又はＰＨ発症に対するＯＰＧ活性遮断の有益な効果及びその治療効果について示唆していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本開示は、ＰＨの治療におけるＯＰＧアンタゴニストの使用に関する。本発明者らは、ＯＰＧと関連するアンタゴニスト抗体を用いた治療について説明し、またＯＰＧ活性を遮断すれば、ＰＨに対する素因を有する動物が保護されること、及び病理学的症状から回復することを明らかにする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の態様によれば、肺高血圧症の治療で使用するための、オステオプロテゲリン［ＯＰＧ］の発現、又はＯＰＧ遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を阻害する薬剤が提供される。
【０００７】
本発明の好ましい実施形態では、前記阻害剤は、アンタゴニスト抗体又はその活性な結合断片である。
【０００８】
本発明の好ましい実施形態では、前記抗体又は結合断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含む又はこれからなるポリペプチド、抗原結合部分、又は配列番号１のアミノ酸配列と７５％〜９９％の配列同一性を有する配列変異体と結合し、その活性を阻害する。
【０００９】
配列変異体は、配列番号１のポリペプチドと機能的に同等であり、かつ１つ若しくは複数のアミノ酸残基が保存性のアミノ酸残基又は非保存性のアミノ酸残基で置換されたポリペプチド、又は１つ若しくは複数のアミノ酸残基に置換基が含まれるポリペプチドである。保存性の置換とは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅの間の相互置換；ヒドロキシル残基であるＳｅｒとＴｈｒの相互交換；酸性残基であるＡｓｐとＧｌｕの置換；アミド残基であるＡｓｎとＧｌｎの間の置換；塩基性残基であるＬｙｓとＡｒｇの交換；並びに芳香族残基であるＰｈｅとＴｙｒの間の置換である。
【００１０】
さらに、本発明は、配列番号１に示すポリペプチド配列、又はその断片及び抗原性のポリペプチドと少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチド配列を特徴とする。１つの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列と、少なくとも８５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、なおいっそうより好ましくは少なくとも９５％の同一性、なおもより好ましくは少なくとも９７％の同一性、及び最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態では、前記抗体は、配列番号１に示すアミノ酸配列と結合する抗体と競合する。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態では、前記抗体は、ポリクロナール抗体である。
【００１３】
本発明の代替的な好ましい実施形態では、前記抗体は、モノクロナール抗体である。
【００１４】
免疫グロブリンとしても知られている抗体は、外来分子（抗原）に対して特異性を有するタンパク質分子である。免疫グロブリン（Ｉｇ）は、１組が、軽（Ｌ）（低分子量）鎖（κ又はλ）、及び１組が重（Ｈ）鎖（γ、α、μ、δ、及びε）であり、４本すべてがジスルフィド結合により共に結合している２組のポリペプチド鎖からなる構造的に関連するタンパク質のクラスに該当する。Ｈ鎖とＬ鎖の両方は、抗原との結合に寄与する領域、及び１つのＩｇ分子と別のＩｇ分子とで高度に可変の領域を有する。さらに、Ｈ鎖とＬ鎖は、非可変の又は定常的な領域を含む。Ｌ鎖は、２つのドメインから構成される。カルボキシ末端ドメインは、所定の種類のＬ鎖において本質的に同一であり、「定常」（Ｃ）領域と呼ばれる。アミノ末端ドメインは、Ｌ鎖ごとに変化し、抗体の結合部位に寄与する。その可変性にゆえに、「可変」（Ｖ）領域と呼ばれる。Ｉｇ分子のＨ鎖は、いくつかのクラス、α、μ、σ、α、及びγ（このクラスにはいくつかのサブクラスも存在する）に該当する。２本の同一のＨ鎖及びＬ鎖の１つ又は複数のユニットからなる複合したＩｇ分子では、その名称は、これが有するＨ鎖に由来する。したがって、５つのＩｇアイソタイプ：ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＧ（Ｈ鎖の差異に基づく４つのサブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びｌｇＧ４）が存在する。抗体構造及びその様々な機能に関するさらなる詳細は、「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ」に見出される。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、前記断片は、一本鎖抗体断片である。
【００１６】
抗体の様々な断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ等は、当技術分野において公知である。Ｆａｂ断片は、共有結合的に共に連結した免疫グロブリンの重鎖可変領域と免疫グロブリンの軽鎖可変領域の免疫学的に活性な部分からなる多量体タンパク質であり、また抗原と特異的に結合する能力を有する。Ｆａｂ断片は、天然の免疫グロブリン分子をタンパク質分解切断することにより（例えば、パパインにより）生成する。Ｆａｂ２断片は、２つの連結したＦａｂ断片を含む。これらの２つの断片が、免疫グロブリンヒンジ領域により連結すると、その結果Ｆ（ａｂ’）２断片が得られる。Ｆｖ断片は、共有結合的に共に連結した免疫グロブリンの重鎖可変領域と免疫グロブリンの軽鎖可変領域の免疫学的に活性な部分からなる多量体タンパク質であり、また抗原と特異的に結合する能力を有する。断片は、関連する重鎖可変領域を有さない、１本の軽鎖可変領域のみを含む一本鎖ポリペプチド、又は軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含むその断片、又は関連する軽鎖部分を有さない重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含むその断片；及び抗体断片から形成された複数の特異抗体でもあり得、この断片は、例えば米国特許第６，２４８，５１６号に記載されている。Ｆｖ断片又は単一の領域（ドメイン）断片は、関連する識別された領域を、宿主細胞系統で発現させることにより一般的に生み出される。上記免疫グロブリン及びその他の免疫グロブリン、又は抗体断片は、本発明の範囲に含まれ、また「Ｐａｕｌ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｒ  Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋ．，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｐ．、及びＷａｌｐｏｒｔ  Ｐ．」等の標準的な免疫学の教科書に記載されている。
【００１７】
分子生物学により、このような断片の直接的な合成（細胞内発現又は化学的手段により）、並びにこれらを組み合わせたものの合成が今日可能である。抗体又は免疫グロブリンの断片は、上記のような二重特異性機能も有し得る。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態では、前記抗体は、キメラ抗体である。
【００１９】
本発明の代替的な好ましい実施形態では、前記抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体である。
【００２０】
キメラ抗体は、マウス又はラットの抗体の全Ｖ領域が、ヒト抗体Ｃ領域と組み合わされた組換え抗体である。ヒト化抗体は、齧歯類の抗体Ｖ領域に由来する相補性決定領域とヒト抗体Ｖ領域に由来するフレームワーク領域とが融合した組換えハイブリッド抗体である。ヒト抗体に由来するＣ領域も用いられる。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗体の重鎖と軽鎖の両方のＮ末端ドメイン内の領域であり、Ｖ領域の変化の大部分がここに限局する。これらの領域は、抗体分子表面でループを形成する。そのようなループは、抗体と抗原の間に結合表面を提供する。
【００２１】
ヒト以外の動物に由来する抗体は、外来抗体に対する免疫反応、及びその循環系からの排除を誘発する。キメラ抗体及びヒト化抗体のいずれも、組換えハイブリッド抗体内の齧歯類（すなわち外来）由来抗体量が低下しており、一方ヒト抗体領域は免疫反応を引き起こさないので、ヒト対象に注射したときに、抗原性が抑えられている。その結果、引き起こされる免疫反応はより弱いものとなり、抗体が排除される量は低下する。ヒトの疾患治療で治療抗体を使用する際に、これは明らかに望ましい。ヒト化抗体は、「外来」抗体領域がより少なくなるように設計されており、したがってキメラ抗体よりも免疫原性が低いと考えられている。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態では、前記抗体又は結合断片は、ＯＰＧのリガンド結合ドメインに結合する。
【００２３】
本発明の代替的な好ましい実施形態では、前記薬剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００２４】
本明細書で用いる場合、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は「アンチセンス」は、生理的条件下で特別な遺伝子を含むＤＮＡ又は当該遺伝子のｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズし、そうすることで当該遺伝子の転写及び／又は当該ｍＲＮＡの翻訳を阻害するオリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、修飾されたオリゴリボヌクレオチド、又は修飾されたオリゴデオキシリボヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを指す。アンチセンス分子は、標的遺伝子とハイブリダイズすると標的遺伝子の転写又は翻訳を妨害するように設計されている。当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの正確な長さ、及びその標的との相補性の程度は、標的の配列及び当該配列を含む特定の基部を含め、選択された特定の標的に依存することを認識している。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡ分子であり、またｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ分子の一部である。
【００２６】
遺伝子機能を特異的に除去する技法は、阻害的又は干渉性低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とも呼ばれる二本鎖ＲＮＡの細胞への導入により、その結果ｓｉＲＮＡ分子に含まれる配列に相補的なｍＲＮＡの破壊を引き起こす。ｓｉＲＮＡ分子は相互にアニーリングして二本鎖ＲＮＡ分子を形成する、ＲＮＡの２つの相補鎖を含む（センス鎖及びアンチセンス鎖）。ｓｉＲＮＡ分子は、除去対象遺伝子のエクソンに一般的に由来する。ＲＮＡ干渉の機構が明らかにされつつある。多くの微生物は、ｓｉＲＮＡの形成を引き起こすカスケードを活性化させることにより二本鎖ＲＮＡの存在に反応する。二本鎖ＲＮＡが存在すると、この二本鎖ＲＮＡをリボヌクレオタンパク質複合体の一部となる、より小さな断片（ｓｉＲＮＡ、約２１〜２９ヌクレオチドの長さ）に処理するＲＮａｓｅＩＩＩを含むタンパク質複合体を活性化させる。ｓｉＲＮＡは、ＲＮａｓｅ複合体に対するガイドとして作用して、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に相補的なｍＲＮＡを切断し、こうしてｍＲＮＡの破壊を引き起こす。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスＲＮＡは、１９〜２９ヌクレオチド［ｎｔ］の長さ、好ましくは２１ｎｔの長さである。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡ分子は、修飾されたヌクレオチドを含む。
【００２９】
本明細書で用いる場合、用語「修飾された」は、以下に該当する核酸分子を指す；
ｉ）そのヌクレオチドの少なくとも２つは、ヌクレオシド間合成結合（すなわち、１つのヌクレオチドの５’末端と別のヌクレオチドの３’末端の間のホスホジエステル結合以外の結合）により共有結合的に連結している。代替的には、又は好ましくは、前記結合は、１つのヌクレオチドの５’末端と別のヌクレオチドの５’末端との結合、又は１つのヌクレオチドの３’末端と別のヌクレオチドの３’末端との結合であり得る；
及び／又は
ｉｉ）通常は核酸と結合しない化学基、例えばコレステロール等が、二本鎖核酸に共有結合的に付加されている。
ｉｉｉ）好ましいヌクレオシド間合成結合は、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホロアミデート、カルバメート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、ペプチド、及びカルボキシメチルエステルである。
【００３０】
用語「修飾された」には、共有結合的に修飾された塩基及び／又は糖を有するヌクレオチドも含まれる。例えば、修飾されたヌクレオチドには、３’位のヒドロキシル基ではなく、また５’位のリン酸基ではない、低分子量有機基に共有結合的に付加した糖を有するヌクレオチドが含まれる。したがって修飾されたヌクレオチドには、２’置換型の糖、例えば２’−Ｏ−メチル−；２−Ｏ−アルキル；２−Ｏ−アリル；２’−Ｓ−アルキル；２’−Ｓ−アリル；２’−フルオロ−；２’−ハロ−、又は２；アジド−リボース、炭素環状糖類似体α−アノマー糖；エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース又はリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、及びセドヘプツロースも含まれ得る。
【００３１】
修飾されたヌクレオチドは、当技術分野において公知であり、また制限を設けるのではなく事例として、これには、アルキル化プリン及び／又はピリミジン；アシル化プリン及び／又はピリミジン；又はその他の複素環が含まれる。このようなピリミジン及びプリンのクラスは当技術分野において公知であり、シュードイソシトシン；Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン；８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデニン；４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル；５−フルオロウラシル；５−ブロモウラシル；５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル；５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル；ジヒドロウラシル；イノシン；Ｎ６−イソペンチル−アデニン；１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル；１−メチルグアニン；２，２−ジメチルグアニン；２−メチルアデニン；２−メチルグアニン；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；７−メチルグアニン；５−メチルアミノメチルウラシル；５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル；β−Ｄ−マンノシルクエオシン；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メトキシウラシル；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル；シュードウラシル；２−チオシトシン；５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル；４−チオウラシル；５−メチルウラシル；Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル；ウラシル５−オキシ酢酸；クエオシン；２−チオシトシン；５−プロピルウラシル；５−プロピルシトシン；５−エチルウラシル；５−エチルシトシン；５−ブチルウラシル；５−ペンチルウラシル；５−ペンチルシトシン；及び２，６−ジアミノプリン；メチルシュードウラシル；１−メチルグアニン；１−メチルシトシンが含まれる。修飾された二本鎖核酸には、Ｃ−５プロピン修飾塩基等の塩基類似体も含まれ得る（Ｗａｇｎｅｒらの、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１４巻：８４０〜８４４頁、１９９６年を参照）。
【００３２】
好ましくは、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２を参照して設計されたヌクレオチド配列を含む。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態では、前記薬剤は、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡ分子を細胞又は組織に送達するように構成された担体と併用される。
【００３４】
アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡの送達は、当技術分野において公知の送達媒体を用いて実現される。例えば、ｓｉＲＮＡは、化学的に修飾され、そしてセンス鎖の３’末端の親油性コレステロール部分と結合し得る。カチオン性の送達システムも、ｓｉＲＮＡの送達で利用可能である。これらには、カチオン性の脂質及びリポソーム、カチオン性のポリマー、カチオン性のデンドリマー、並びにカチオン性の細胞貫通ペプチドが含まれる。カチオン性の送達媒体は、負電荷を有するｓｉＲＮＡとの複合体形成を促進する共通正電荷を有する。リポソームに基づく送達媒体の市販の例として、リポフェクチン、ＲＮＡｉｆｅｃｔ、オリゴフェクトアミン、リポフェクトアミンが挙げられ、またＴｒａｎｓＩＴ  ＴＫＯは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いられてきた。ＤＯＴＡＰ（Ｎ［１−（２、３−ジオレオイルオキシ）］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムプロパン）及びオリグフェクトアミンは、ｉｎ  ｖｉｖｏで利用されてきた。その他のリポソームに基づく送達媒体として、ポリエチレングリコールとも結合した固体核酸脂質粒子［ＳＮＡＬＰ］が挙げられる。ペプチド送達媒体は、ｓｉＲＮＡを送達する際にも有用であった。ＲＧＤペプチドを含むペグ化されたポリエチレンイミン［ＰＥＩ］は、ｓｉＲＮＡをＶＥＧＦ等の血管形成因子の標的とせしめるのに用いられてきた。アテロコラーゲンは、腫瘍にｓｉＲＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏで送達する際に用いられてきた。ｓｉＲＮＡの送達は、シクロデキストリンポリマーの利用でも実証されている。ｓｉＲＮＡ送達媒体のなおもさらなる例として、固形及び転移性の腫瘍に送達するのに用いられてきた自己組織化ＬＰＤナノ粒子が挙げられる。ＬＰＤナノ粒子は、負電荷を有するｓｉＲＮＡと相互作用するプロタミンと結合するカチオン性の脂質を含む。薬物動態が改善しているＬＰＤナノ粒子のペグ化されたバージョンも公知である。最新の送達媒体のレビューは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、２００８年、第６巻［３］、６５１〜６５８頁；Ｔｈｅ  ＡＡＰＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２００９年、第１１巻［４］、６３９頁；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００９年、第２６巻［３］、６５７頁；及びＮａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００９年、第８巻、１２９頁に見出すことができる。
【００３５】
投与する際には、本発明の薬剤は、薬学的に許容される調製物に含め投与される。かかる調製物は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合性を有する担体、及び補助的な抗癌剤をルーチン的に含み得る。
【００３６】
本発明の薬剤は、注射又は長期にわたる低速輸液を含む任意の従来経路により投与可能である。投与は、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、体腔内、皮下、経皮的、又は経上皮的であり得る。
【００３７】
本発明の薬剤は、有効量で投与される。「有効量」とは、単独で、又はさらなる投与と共に、所望の反応を生み出す薬剤の量である。肺高血圧症を治療する場合は、所望の反応とは疾患の進行阻害である。この反応は、疾患の進行の一時的遅延と関係するに過ぎないと考えられるが、より好ましくは、これは、疾患の進行の恒久的停止と関係する。これは、ルーチン的な方法によりモニタリング可能である。かかる量は、もちろん、治療の対象となる具体的な状態、状態の重症度、年齢、身体状態、サイズ、及び体重を含む個々の患者パラメータ、治療期間、同時療法（もしあれば）の性質、固有の投与経路、及び医療専門家の知見及び専門知識内の類似の要因に依存する。これらの要因は、当業者に周知されており、またルーチン実験法の域を超えずに対処可能である。個々の成分又はこれらを組み合わせたものの最高用量、すなわち妥当な医学的判断に基づく最高安全用量を用いるのが一般的に好ましい。しかし、患者は、医学的理由、心理学的理由、又は実際にはその他の不特定の理由により、より低用量又は耐容用量を主張するものと、当業者には理解されよう。
【００３８】
上記方法で用いられる薬剤は、好ましくは滅菌状態であり、また所望の反応を生み出すために、患者への投与に適する重量単位又は容積単位で本発明による薬剤を有効量含む。
【００３９】
対象に投与される本発明による薬剤の投与法は、異なるパラメータに基づき、特に用いられる投与方式及び対象の状態に基づき選択可能である。その他の要因として、所望の治療期間が挙げられる。初回投与を行ったときに、対象に認められる反応が不十分な場合には、より高用量（又は異なる、より局所的送達経路による、有効性においてより高用量）が、患者の耐用性が許す限度において採用可能である。
【００４０】
一般論として、１ｎＭ〜１μΜのアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの投与が、標準手順に基づき一般的に処方化及び投与される。好ましくは、用量は、１ｎＭ〜５００ｎＭ、５ｎＭ〜２００ｎＭ、及び１０ｎＭ〜１００ｎＭであり得る。組成物を投与するその他のプロトコールは、当業者にとって公知であり、その場合投与量、注射スケジュール、注射部位、投与方式等は、上記とは異なる。ヒト以外の哺乳類に対する組成物の投与は（例えば、試験目的又は獣医学治療目的で）、上記のような条件と実質的に同一の条件下で実施される。対象とは、本明細書で用いる場合、哺乳類、好ましくはヒトであるが、またヒト以外の霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、又は齧歯類も含まれる。
【００４１】
投与する際には、本発明の薬剤調製物は、薬学的に許容される量で、薬学的に許容される組成物中に適用される。用語「薬学的に許容される」とは、有効成分が有する生物活性の有効性を阻害しない無毒性の物質を意味する。かかる調製物は、塩、緩衝剤、防腐剤、適合性を有する担体、及び任意選択でその他の治療薬（例えば、肺高血圧症の治療で一般的に用いられる薬剤）を通常含み得る。医薬品で用いる際には、塩は薬学的に許容されるべきであるが、但し薬学的に許容される塩以外の塩も、薬学的に許容されるその塩を調製するのに好都合に利用可能であり、本発明の範囲から除外されない。かかる薬理学的及び薬学的に許容される塩として、下記の酸から調製される塩が挙げられるが、但しこれらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸等。また、薬学的に許容される塩は、アルカリ金属の塩又はアルカリ土類金属の塩、例えばナトリウム、カリウム、又はカルシウムの塩として調製可能である。
【００４２】
薬剤は、望む場合には、薬学的に許容される担体と併用可能である。用語「薬学的に許容される担体」とは、本明細書で用いる場合、ヒトへの投与に適する１つ又は複数の適合性を有する固体又は液体の充填剤、賦形剤、又はカプセル化物質を意味する。用語「担体」とは、この文脈において、天然又は合成を問わず、有機成分又は無機成分を意味し、有効成分がこれと併用されて適用を促進する（例えば、リポソーム又は免疫リポソーム）。また医薬組成物の成分は、所望の薬学的有効性を実質的に損なう相互作用が生じないように、本発明の薬剤と混合及び相互混合される能力も有する。
【００４３】
本発明による薬剤を含む医薬組成物は、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸、及び塩中のリン酸を含む適する緩衝剤を含み得る。医薬組成物は、適する防腐剤、例えば塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン、及びチメロサールを任意選択で含み得る。
【００４４】
薬剤は、単位投与剤形の形態で好都合に提供され得るが、また薬剤学の技術分野において周知の任意の方法により調製可能である。すべての方法には、活性な薬剤を１つ又は複数の付随成分を構成する担体と関連付けるステップが含まれる。本発明による薬剤を含む組成物は、エアゾール及び吸入剤として投与され得る。非経口投与に適する組成物は、薬剤の水性又は非水性滅菌調製物を好都合に含み、好ましくは摂取者の血液と等張である。本調製物は、適する分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いる公知の方法により処方化され得る。また、滅菌注射用調製物は、滅菌状態の注射液、又は無毒性の非経口的に許容される賦形剤若しくは溶媒中の懸濁物、例えば１，３−ブタンジオールを溶媒とする溶液であり得る。採用可能な許容される溶媒として、とりわけ水、リンガー溶液、及び生理食塩水が挙げられる。さらに、滅菌状態の不揮発性油が、溶媒又は懸濁媒体として慣習的に利用される。この目的のために、合成モノ−又はジ−グリセリドを含む任意の無菌不揮発性油が利用可能である。さらに、オレイン酸等の脂肪酸が、注射剤の調製物で利用可能である。口腔、皮下、静脈内、筋肉内等の投与に適する担体処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡに見出すことができる。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態では、前記組成物は、肺高血圧症の治療で有効な、少なくとも１つの追加薬剤を有効量含む。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態では、前記薬剤は、カルシウムチャンネル遮断薬、利尿薬、エンドセリン受容体アンタゴニスト、プロスタサイクリン、可溶性グアナレートシクラーゼ、及びホスホジエステラーゼ阻害剤からなる群より選択される。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態では、肺高血圧症は、肺動脈性高血圧症及び肺疾患と関連したＰＨからなる群より選択される。
【００４８】
本発明のさらなる態様によれば、治療を必要するヒト対象に、オステオプロテゲリンアンタゴニストを有効量投与するステップを含む、肺高血圧症を治療する方法が提供される。
【００４９】
本発明のさらなる態様によれば、ＯＰＧの発現量を決定するステップを含む、対象が、肺高血圧症を有するか、又はこれに対する素因を有するかを判断するための診断方法又は予知方法であって、対照サンプルと比較してＯＰＧが過剰発現していれば、それが肺高血圧症又は肺高血圧症に対する素因を示唆する、方法を提供する。
【００５０】
本発明の好ましい方法では、前記方法は、
ｉ）試験の対象となる単離された生体サンプルを用意するステップと、
ｉｉ）前記サンプル及び配列番号２に示すような核酸配列を含む核酸分子にアニーリングするように構成されたオリゴヌクレオチドプライマーの対、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドトリホスフェート、並びに補助因子を含む調製物を形成するステップと、
ｉｉｉ）前記核酸分子を増幅するのに十分なポリメラーゼ連鎖反応条件を与えるステップと、
ｉｖ）配列番号２に由来するヌクレオチド配列を含む核酸分子の有無について、前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅生成物を分析するステップと、任意選択で
ｖ）増幅生成物を正常な対応対照と比較するステップと
を含む。
【００５１】
本発明の代替的な好ましい方法では、前記方法は、
ｉ）試験の対象となる単離された生体サンプルを用意するステップと、
ｉｉ）前記サンプル、及び前記サンプル中の、配列番号１に示すアミノ酸配列により表される１つ又は複数のポリペプチドと特異的に結合して抗体／ポリペプチド複合体を形成する１つ又は複数の抗体を含む調製物を形成するステップと、
ｉｉｉ）そのように形成された１つ又は複数の複合体を検出するステップと、
ｉｖ）前記ポリペプチド（複数可）の発現量を正常な対応対照と比較するステップと
を含む。
【００５２】
本発明の好ましい方法では、ＯＰＧの発現量は、前記サンプル中のＴＲＡＩＬの発現量と比較される。
【００５３】
本発明の好ましい方法では、ＯＰＧ：ＴＲＡＩＬの比が、対照サンプル中のＯＰＧ：ＴＲＡＩＬの比と比較される。
【００５４】
本発明のさらに好ましい実施形態では、前記方法は、本明細書において開示されるＯＰＧ抗体を有効量投与するステップを含む。
【００５５】
本明細書の説明及び主張全体を通じて、単語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「〜を含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、並びに当該単語の変形形態、例えば「〜を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、但し〜に限定されない（ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」を意味し、そしてその他の部分、付加物、構成要素、整数、又はステップを除外するつもりはない（及び除外しない）。
【００５６】
本明細書の説明及び主張全体を通じて、文脈から別途要求されなければ単数形は複数形も含む。特に、不定冠詞が用いられる場合には、本明細書は、文脈から別途要求されなければ複数並びに単数が考慮されているものと理解される。
【００５７】
本発明の特定の態様、実施形態、又は実施例と共に記載されている特性、整数、特徴、化合物、化学的部分又は基は、矛盾しない限り、本明細書に記載する任意のその他の態様、実施形態、又は実施例に適用可能と理解される。
【００５８】
事例目的に限定して、及び下記の図を参照しながら、本発明の実施形態を記載する。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１Ａ】特発性肺動脈性高血圧症（ＩＰＡＨ）の患者から単離された肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）中では、対照肺から単離された細胞と比較して、ＯＰＧのｍＲＮＡが有意に増加していることを示す図である。
【図１Ｂ】ＩＰＡＨ患者の血清中では、年齢対応対照と比較して、ＯＰＧタンパク質が有意に増加していることを示す図である。
【図１Ｃ】ヒトＰＡＳＭＣからのＯＰＧ分泌は、セロトニン（５−ＨＴ）の添加により刺激を受けることを示す図である。
【図１Ｄ】ヒトＰＡＳＭＣからのＯＰＧ分泌は、ＢＭＰ−Ｒ２のｓｉＲＮＡによるＢＭＰ−Ｒ２のノックダウン（ＢＭＰ−Ｒ２のｓｉ）により刺激を受けることを示す図である。
【図１Ｅ】ヒトＰＡＳＭＣからのＯＰＧ分泌は、組換えＩｌ−１βの添加により刺激を受けることを示す図である。
【図１Ｆ】組換えヒトＯＰＧ（ｒＯＰＧ）は、トリチウム標識したチミジンの取り込みが示すように、用量依存性でヒトＰＡＳＭＣ増殖を誘発することを示す図である。
【図１Ｇ】ｒＯＰＧは、用量依存性でヒトＰＡＳＭＣの移動を誘発することを示す図である。
【図１Ｈ】ＰＡＨと整合して血行動態が変化すると、生理食塩水で治療を受けた対照ラットと比較して、モノクロタリン（Ｍｃｔ）で処置を受けたラットにおいて、皮下注射後２１日目から右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）の有意な上昇が引き起こされることを示す図である。
【図１Ｉ】ラットＭｃｔモデルにおいて、血行動態変化を推進する肺血管リモデリングが、疾患発症後７日間という早期に明らかとなることを示す図である。
【図１Ｊ】ラットＭｃｔモデルにおいて、ＲＶＳＰが有意に増加する前の１４日目から、ＯＰＧの血清濃度が、有意に上昇していることを示す図である。
【図１Ｋ】Ｍｃｔ処置後２１日目に、全肺ライセート中のＯＰＧ遺伝子発現量が有意に増加していることを示す図である。
【図１Ｌ】モノクロタリン（Ｍｃｔ）注射後２１日目から、生理食塩水で治療を受けた対照ラットと比較して、ＯＰＧの全肺タンパク質発現量が有意に増加していることを示す図である。
【図１Ｍ】皮下浸透圧ポンプにより送達された抗ＯＰＧ抗体で治療を受けたラットが、モノクロタリンに反応してＰＡＨを発症することから保護されたことを示す図である。対照的に、ＩｇＧの投与を受けたラットでは、ＲＶＳＰが有意に増加した。
【図１Ｎ】Ｍ）と同様に、抗ＯＰＧ抗体で治療を受けたラットと比較して、ＩｇＧで治療を受けたラットにおいて、５０μｍ未満の小肺動脈／細動脈のリモデリング（中膜面積／断面積（中膜面積／ＣＳＡ）で表される）で、有意な増加を示す図である。
【図１Ｏ】Ｎ）と同様に、抗ＯＰＧ抗体で治療を受けたラットと比較して、ＩｇＧで治療を受けたラットにおいて、中膜面積／断面積（中膜面積／ＣＳＡ）で表される筋肉化で、小〜中程度の太さ（５１〜１００μｍ）の肺動脈について有意な増加を示す図である。
【図１Ｐ】アポＥ−／−及びアポＥ−／−／ＩＬ−１Ｒ１−／−マウスが、８週間のパイゲン飼料による飼育に反応して重度のＰＡＨを発症することを示す図である。
【図１Ｑ】通常飼料で飼育された同腹子と比較して、重度のＰＡＨを有するパイゲン飼料で飼育されたアポＥ−／−及びアポＥ−／−／ＩＬ−１Ｒ１−／−マウスにおいて、全肺ライセート中のＯＰＧ遺伝子発現量が有意に増加していることを示す図である。
【図１Ｒ】通常飼料で飼育された同腹子と比較して、重度のＰＡＨを有するパイゲン飼料で飼育されたアポＥ−／−及びアポＥ−／−／ＩＬ−１Ｒ１−／−マウスにおいて、全肺ライセート中のＯＰＧタンパク質量が有意に増加していることを示す図である。
【図１Ｓ】パイゲンで飼育されたアポＥ−／−モデルを対象に、抗ＯＰＧ抗体を送達する皮下浸透圧ポンプにより、手順第８週目から４週間、確立されたＰＡＨの治療を行い、その結果、ＩｇＧで治療を受けて疾患がさらに進行したマウスと比較して、ほぼ正常レベルまでＲＶＳＰが低下したことを示す図である。
【図１Ｔ】パイゲンで飼育されたアポＥ−／−／ＩＬ−１Ｒ１−／−モデルを対象に、抗ＯＰＧ抗体を送達する皮下浸透圧ポンプにより、手順第８週目から４週間、確立されたＰＡＨの治療を行い、その結果、ＩｇＧで治療を受けて疾患がさらに進行したマウスと比較してほぼ正常レベルまでＲＶＳＰが低下したことを示す図である。
【図１Ｕ】抗ＯＰＧ抗体によるアポＥ（−／−）マウスの治療により、疾患から回復することが明らかとなったことを示す図である。疾患からの回復及び血行動態の正常化は肺血管リモデリング（中膜面積／ＣＳＡ）の程度の有意な低下と関連し、これは増殖性細胞（ＰＣＮＡ陽性）の有意な低下及びアポトーシス（ＴＵＮＥＬ陽性）の有意な増加に起因した。
【図１Ｖ】アポＥ／ＯＰＧ（−／−）マウスでは、このようなマウスは肺高血圧症の発症から保護されていることを示す図である
【発明を実施するための形態】
【００６０】
材料及び方法
動物
ラット
非近交系のオス、アルビノスプラーグドーリーラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ又はＨａｒｌａｎ、英国）（開始時体重約２００ｇ）を実験で用いた。肺動脈性高血圧症を誘発するのに、モノクロタリン（ＭＣＴ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、英国）の左側大腿部への単回皮下注射を用いた。５〜６週間内に致命的となる重度のＰＡＨを発症せしめるような、十分に立証された用量である６０ｍｇ／ｋｇを用いた。
【００６１】
モノクロタリン（ＭＣＴ）、２００ｍｇを、最初に１Ｍ塩酸、０．６ｍｌに十分に溶解し、そして４０分間ボルテックス処理した。滅菌水を添加して容積を５ｍｌとし、そして滅菌したＮａＯＨを用いてｐＨを７．０に調整した。滅菌水を用いて最終溶液を１０ｍｌとした。
【００６２】
マウス
すべての近交系マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド上にあり、アポリポタンパク質Ｅ欠損であった（アポＥ−／−）。マウスは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄの学内コロニーから入手可能であった。アポＥ−／−（Ｊａｘ２０５２）マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｂｏｒ、ＭＥ、米国）から当初調達した。８〜１４週齢のオスマウスを、すべてのｉｎ  ｖｉｖｏ実験で用いた。ＯＰＧ−／−マウスを、ＪＡＸ  ｌａｂｓ、米国（Ｂ６．１２９Ｓ４−Ｔｎｆｒｓｆ１１ｂ＜ｔｍ１Ｅａｃ＞／Ｊ、ストック番号０１０６７２）から入手し、その後Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから当初調達したアポＥ−／−（Ｊａｘ  ２０５２）と７世代交配して、アポＥ−／−／ＯＰＧ−／−マウスを作製した。
【００６３】
飼料及び飼育
齧歯類を、標準実験飼料（４．３％脂肪、０．０２％コレステロール、及び０．２８％ナトリウム、Ｈａｒｌａｎ、英国）で飼育した。適応される場合には、１８．５％脂肪、０．９％コレステロール、０．５％コール酸塩、及び０．２５９％ナトリウムから構成される高脂肪アテローム生成食（以後パイゲンと呼ぶ）で、実験マウスを８週間又は１２週間飼育した（ｓｐｅｃｉａｌ  Ｄｉｅｔ  ｓｅｒｖｉｃｅｓ、英国）。すべての動物は、飲料水が提供され、自由に飼育された。マウスは、温湿度、及び１２時間昼夜サイクルが制御された専用の検査室に収容された。
【００６４】
動物の飼育及び研究は、本大学の倫理方針声明書及び動物科学手順規則１９８６年版の運用における英国ホームオフィスガイダンスに適合した。ＡＨは、英国ホームオフィスパーソナルライセンス（ＰＩＬ４０／９３３２）を取得しており、またＡＬが保有するＨ．Ｏプロジェクトライセンス（ＰＰＬ４０／２９５２）に詳記する手順に従い、作業を行った。
【００６５】
介入物
記載する場合には、ポリクロナールヤギ抗マウスＯＰＧ（抗ＯＰＧ）又は対照のヤギＩｇＧアイソタイプ抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、英国）を、皮下に埋め込まれた浸透圧ポンプ（Ｄｕｒｅｃｔ  Ｃｏｒｐ．、ＣＡ、米国）を経由して齧歯類に送達した。Ａｌｚｅｔ（登録商標）１００４マイクロポンプ（１００μｌリザーバー、０．１μｌ／時で４週間）を経由してマウスに、及びＡｌｚｅｔ（登録商標）２００２ミニポンプ（２００μｌリザーバー、０．５μｌ／時、８５ｎｇ／時で２週間）を経由してラットに介入物を送達した。
【００６６】
ポンプ移植プロトコール
クラスＩＩ層流フード内、滅菌状態の下で、各ポンプを該当する介入物で充填し、移植前に３７℃、２４時間、滅菌状態で、０．９％生理食塩水中に配置した。１００％酸素（流速１．５Ｌ／分）を通じてイソフルラン蒸気麻酔（２〜３％、ＩｓｏＦｌｏ（登録商標）１００％ｗ／ｗ吸入用気化性液体、Ａｂｂｏｔ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ、Ｋｅｎｔ、英国）の下で表面の毛皮をクリッピングし、皮膚を洗浄、滅菌した後、下部肋骨縁下の左後方外側の胸部壁上で１〜１．５ｃｍ皮膚切開した。滅菌外科条件下で、事前充填されたポンプを鈍的切開により形成された皮下ポケットに埋め込んだ。創傷をその後洗浄し、断続的な２−０バイクリル吸収性縫合糸（Ｂ−Ｂｒａｕｎ、Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ、英国）を用いて閉鎖した。マウスに対する移植は、ポンプを４８時間プライミングし、頚椎（スクラッフライン）後方に埋め込み、そして断続的な絹製縫合糸（Ｓｉｌｋａｍ（登録商標）、Ｂ−Ｂｒａｕｎ  Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ、英国）により創傷を閉鎖した以外、同一であった。
【００６７】
実験プロトコール
マウス
アポＥ−／−ノックアウトマウス（１０〜１６週齢、ｎ＝４〜７／群）を、疾患表現型構築前８週間、通常食又はパイゲンのいずれかで飼育した（下記を参照）。
【００６８】
確立した疾患を有するマウスを対象として、ＯＰＧを阻害する効果を確認するために、アポＥ−／−マウス（８〜１０週齢、ｎ＝６〜７／群）を、８週間パイゲン飼料で飼育し、次に抗ＯＰＧ抗体（２０ｎｇ／時）又は第１２週目に実施した表現型を有するアイソタイプコントロールを投与した。
【００６９】
ラット
タイムコース実験では、ラット（２００〜２６０ｇ、ｎ＝７／群／時点）に、ＭＣＴ（６０ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水対照で注射した後、２、７、１４、２１、又は２８日目に血行動態試験を行い、これを絶命せしめた。
【００７０】
ＯＰＧが疾患の発症に必要であったか調査するために（予防試験）、ラット（２００〜２４０ｇ、ｎ＝４／群）を、浸透圧ポンプにより２週間送達された抗ＯＰＧ抗体（８４ｎｇ／時）又はアイソタイプコントロールで治療したが、同治療はＭＣＴ注射によるベースライン時に開始した。疾患の表現型分析を１週後、すなわちＭＣＴ注射後２１日目に実施した。
【００７１】
疾患表現型
各齧歯類について、心エコー検査（適応される場合）を心臓カテーテル治療前に実施し、次になおも麻酔下で絶命せしめた。血清を得、ＲＮＡを単離（適応される場合）するために、心臓穿刺により血液を収集した。腹部大動脈を切断し、また肺が目視上白くなるまで、右心室内の針を経由して肺をＰＢＳで灌流した。心臓及び肺を一括して除去した。後続する生化学分析用として、右肺を手早く分離した後、液体窒素内で急速冷凍した。左肺を、１０％（ｖ／ｖ）ホルマリンを用いて、膨張圧力２０ｃｍ  Ｈ２Ｏ、気管経由で灌流固定し、次に１０％ホルマリン中にオーバーナイト、４０℃で心臓と共に配置した。左肺を、その後組織学分析及び免疫組織化学分析で用いた。
【００７２】
齧歯類心エコー検査
ＲＭＶ７０７Ｂ（マウス）又はＲＭＶ７１０Ｂ（ラット）スキャンヘッドを備えた前臨床高周波超音波画像処理システム（Ｖｅｖｏ７７０（登録商標）、Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｏｎｉｃｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、カナダ）を用いて、経胸壁心エコー検査を実施した。齧歯類を、酸素経由のイソフルランで麻酔した後、加熱プラットフォーム上に仰臥位で配置し、そして熱損失を最小限に抑えるために覆った。酸素を用いた維持用イソフルラン（０．５〜１．５％）をノーズコーン経由で送達し、呼吸速度及び直腸温度と共に連続記録の対象とされた心拍数について最大心拍数（マウスにつき約５００ｂｐｍ及びラットにつき３５０ｂｐｍ）を実現するように調整した。マウスの胸部を脱毛し、そして後続する画像取得用として事前加熱された超音波ゲルを塗布した（Ａｑｕａｓｏｎｉｃｓ  １００  Ｇｅｌ、Ｐａｒｋｅｒ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、米国）。
【００７３】
試験プロトコール
左心室：乳頭筋中央レベルの短軸像において左心室の標準パラメータを測定した。収縮性の一次インデックスとして左室内径面積変化率（ＦＡＣ）を導くために、ＬＶの拡張末期面積及び収縮末期面積のマニュアルトレーシングを行った。ＬＶ壁及び空洞寸法（ＬＶＩＤｄ）についてＭモード測定を行い、これから駆出率（ＥＦ％）、短縮率（ＦＳ％）、及び補正後のＬＶ心筋重量を標準自動分析により求めた。脈波組織ドップラー（ＴＤＩ）速度を、左心室後壁の心内膜側から手動により記録し、収縮性の別の独立したインデックスとして提示した。一回心拍出量を、大動脈弁輪レベルで流量及び直径の速度時間積分値（ＶＴｉ）の測定から導き、これに心拍数を掛け算して心拍出量を得た。
【００７４】
右心室及び肺動脈：右胸骨傍長軸像から、Ｍモード機能を用いて右室自由壁測定値を記録した。短軸像から、近接する肺動脈（肺動脈弁の直後）よりドップラー血流量を記録した。血流の開始からピーク速度（ＰＡ加速時間；ＰＡＡＴ）までの時間をトレースするスペクトルドップラーから、排出期間（ＰＡ排出時間；ＰＡＥＴ）及び１回心仕事（ＰＡ  ＶＴＩ）を測定した。
【００７５】
分析は、付随するソフトウェア（Ｖｅｖｏ７７０、Ｖ３．０）を用いて、オフラインで実施した。吸息作用によるアーチファクトと重ならない心周期の関連する段階において測定を行った。観察者間のばらつきを最小限に抑えるために、画像取得及び分析は、いずれも実験対象の状態が伏せられた経験を有する一人のオペレーター（ＡＧＨ）により実施された。
【００７６】
心臓カテーテル治療
心エコー検査の後、右室及び左室（適応される場合）カテーテル治療を、右外頸静脈及び右内頸動脈経由で、閉胸法を用いて実施した。事前浸漬されたＭｉｌｌａｒハイフィデリティ微圧計カテーテル（マウスにつき１Ｆｒ  ＳＰＲ−１０００圧力カテーテル／１Ｆｒ  ＰＶＲ−１０４５圧容積カテーテル、及びラットにつき２Ｆｒ  ＳＰＲ−３２０圧力カテーテル／ＳＰＲ−８３８圧容積カテーテルを使用した、Ｍｉｌｌａｒ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）により、データを取得した。カテーテルをＭｉｌｌａｒ  ＭＰＶＳ３００及びＰｏｗｅｒＬａｂ８／３０データ取得システム（ＡＤ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、英国）と連結し、Ｃｈａｒｔ  ｖ６及びｖ７ソフトウェア（ＡＤ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて記録した。圧力トレーシングを、トレーシングが安定化し、定常状態に達したときに記録した。右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）を、肺高血圧症を定義するのに用い、またこれは、右心室と肺動脈の間に閉塞がなければ肺動脈収縮期圧（ＰＡＳＰ）と等価である。適応される場合には、ＰＶＡＮ  ｖ２．３を用いて圧容積分析を実施した。
【００７７】
血管アクセス術に関するプロトコール
麻酔剤ヴェポライザー及び誘発チャンバー（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、英国）を用い、１００％医療用酸素（流速２ｌ／分）を通じて、３〜５％イソフルランにより動物を麻酔した。マウス及びラットの手術プロトコールは、最近公表されたプロトコール（Ｐａｃｈｅｒ、Ｎａｇａｙａｍａら、２００８年）を踏襲した。
【００７８】
血行動態表現型分析の第１ステップでは、右内頸静脈（右心室の順行性カテーテル治療の場合）、及び必要な場合には右内頸動脈（逆行性大動脈及び左心室カテーテル治療の場合）の単離を必要としたが、そのステップを以下の通り記載する。
【００７９】
右心圧の測定
動物を加熱パッド（＃ＴＲ２００  Ｆｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ  Ｉｎｃ）上に配置した。足の神経反射が消失したら、正中線右側に小規模の頸部切開を行った。解剖顕微鏡及び横方向鈍的切開法を用いて、右外頸静脈（ＲＪＶ）を識別した。弯曲鉗子を使用して、鈍的切開法により血管を自由にした。遠位側のＲＪＶを５−０非吸収性絹製縫合糸（Ｓｉｌｋａｍ（登録商標）、Ｂ−Ｂｒａｕｎ、Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ、英国）でしっかりと緊結して、静脈が心臓側に還流するのを止めた。右鎖骨下静脈の挿入点の近位側で、ＲＪＶに牽引力を加えながら絹製縫合糸をモスキートクリップにゆるく取り付けた。こうして、本実験のカテーテルを挿入するための約１ｃｍの長さの血管が得られた。顕微鏡により直接的可視化を行いながら、血管を脂肪組織について徹底洗浄して、血管真腔へのカニューレ挿入が失敗しないようにした。９００で先端が屈曲し、下方に向いた斜角を有する２５Ｇ５／８’’のオレンジ色の針を用いて血管を穿刺し、血管の上壁を速やかに、但し軽く上方に懸架して、カテーテルの同時挿入及び進入を可能にした。カテーテルを、生理食塩水中で少なくとも３０分間、事前浸漬した。
【００８０】
該当するカテーテルを前進させ、逆流出血を避けるために近位側のスリングを締め付けた。圧力記録のリアルタイム視覚化は、右心房腔及び右心室腔について特徴的なトレーシングを識別するのに役立った。カテーテルが各腔内で安定したら、後続する分析のために記録を行った。
【００８１】
少なくとも１０〜２０回の心拍動の記録が、圧力測定値を平均するのに用いられた。
【００８２】
右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）、圧力の最大及び最小導関数（最大及び最小ｄｐ／ｄｔ）を、特別に記録した。肺動脈圧の記録は、上記のような直線的端部を有するカテーテルでは不可能であったので、ＲＶＳＰを肺動脈圧の代用として扱った。肺動脈弁レベルにおいて閉塞が一切認められない場合には、ＲＶＳＰはＰＡＳＰと同一である。カテーテルを抜去したら、近位側のＲＪＶをしっかり緊結した。
【００８３】
左心圧の測定
ＲＶＳＰ測定終了後、気管に対して深部及び横方向に右頸動脈を識別した。弯曲鉗子を用いて、静脈と同様に右頸動脈を自由にした。遠位側のセグメントには締め付けられた緊結材を、中央部及び近位側セグメントには緩い緊結材（５−０絹製縫合糸）を適用した。後者は、モスキートクリップに取り付けられ、牽引力が付加された。静脈の場合と類似した技法を用いて、動脈切開を実施し、カテーテルを大動脈及び左心室内に進入させた。圧力及び容積のトレーシングが安定し、明瞭となったら、記録を行った。ＬＶからカテーテルを引き戻すことによる大動脈圧のトレーシングを記録した後、カテーテルを抜去した。少なくとも１０〜２０回の心拍動の記録が、圧力測定値を平均するのに用いられた。
【００８４】
組織の採集及び処理
血液
血液をベンチ上で放置して凝固させ、その後１２００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。血清を採取、分取、ラベル表示し、そして後続の分析を行うまで−８０℃で凍結した。ＲＮＡ用の全血を収納するチューブ（ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）、Ｑｉａｇｅｎ／ＢＤ、英国、又はＴｅｍｐｕｓ（登録商標）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、英国）を、後続するＲＮＡ単離を行うまで−２０℃で凍結した。
【００８５】
肺組織
プロトコール
心臓穿刺後、齧歯類に麻酔剤を過量投与し、その後に頸椎脱臼を行った。上腹部壁を切開して肝臓を露出した。上方向の牽引力を胸骨の剣状突起に加えながら、横隔膜を微小なハサミで慎重に切り取った。胸骨及び胸壁を切除した。腹部大動脈を識別し、切断した（失血させるために）。２５Ｇオレンジ色の針及びシリンジを用いて、右心室を識別し、肺が青白くなるまでＰＢＳでフラッシュした。気管を識別し、中間鎖骨境界（ｍｅｄｉａｌ  ｃｌａｖｉｃｕｌａｒ  ｂｏｒｄｅｒ）間で自由にした。気管に上方向の強い牽引力を加えながら、胸腔の後壁から心臓及び肺を一括して除去した。不注意で肺を穿刺してしまうのを避けるように注意を払った。
【００８６】
右肺を、５−０絹製縫合糸を用いて門部でしっかりと固定し、そして分離した後、後続する全肺タンパク質の単離及び測定及びＲＮＡ発現のために液体窒素中で急速凍結した。
【００８７】
ポリエチレンチューブを気管内に挿入し、縫合糸でしっかりと固定した。１０％リン酸緩衝化ホルマリン（０．４％ｗ／ｖのＮａＨ２ＰＯ４・２（Ｈ２Ｏ）、０．６５％ｗ／ｖのＮａ２ＨＰＯ４・２（Ｈ２Ｏ）、及び４％ｖ／ｖのホルムアルデヒドからなる水溶液）を収納するシリンジを用いて左肺を手動によりゆっくりと膨張させ、次に心臓及び左肺の両方を、ホルマリン中で２４時間固定化した後、ＰＢＳ内に移した。ラット予防試験以降、２０ｃｍ  Ｈ２Ｏクランプ装置を用いて肺を膨張させて、膨張操作を標準化した。後続する組織学検査のために、左肺を心臓から分離した。
【００８８】
心臓重量及び右心室肥大（ＲＶＨ）
ＲＶＨを、Ｆｕｌｔｏｎらが最初に記載した通りに、ＲＶ重量を左心室／中隔の重量（ＲＶ／ＬＶ＋Ｓ）で割り算したものとして定義した。
【００８９】
プロトコール
小型の一対の微小なハサミを用いて、周囲を取り巻く脂肪、組織、及び大血管を心臓の周囲から除去した。心房を切除し、血栓をすべて除去し、そして秤量した。解剖学的ランドマークを利用して、右心室を左心室及び中隔から分離した。
【００９０】
右室流出路（ＲＶＯＴ）から開始し、ＲＶの中隔周辺部を切除して、組織の稜が残存しないことを徹底した。切開は、動脈根に隣接しこれを取り巻くＲＶＯＴから内側三尖弁輪に向うように行って、ＲＶの基部を分離した。側方三尖弁輪から、ＲＶを含まない壁を切除して、ＲＶ組織の稜が残らないことを再度徹底した。切開は、尖端に向い継続し、そしてＲＶＯＴに向かって遡上した。
【００９１】
最終的に、左心室を切り取り、これからクロットを残さず除去した後、すべての腔をパディッド乾燥及び秤量した。
【００９２】
肺組織検査及び免疫組織化学検査
組織の処理及び組織学検査
左肺を球欠平面（ラット）又は横断面（マウス）で分割した。肺を、段階的濃度のアルコール（５０％、最高１００％）中で最初に脱水して処理した。次に、キシレン中に配置した後、溶融パラフィンワックス内に埋め込んだ。厚さ５μｍのパラフィンに埋め込まれた切片を切り取り、後続する組織検査、免疫組織化学染色、及び形態測定分析のためにスライドにマウントした。
【００９３】
すべてのスライドを、１０分間、次に再度２分間、キシレン中に配置して最初に脱脂した。次に、スライドを、段階的濃度のアルコール（１００％、１００％、９０％、７０％、５０％のそれぞれに、次に最終的に水に１分間）中で再水和した。最終的な共通ステップとして染色した後、いずれについても、すべてのスライドを同一であるが逆転した順番で脱水し、ＤＰＸ（ジブチルフタレートキシレン）にマウントし、そしてオーバーナイトで放置乾燥させた。
【００９４】
アルシアンブルーエラスティックワンギーソン染色（ＡＢＥＶＧ）
脱脂及び再水和したスライドを、０．２５％過マンガン酸カリウム中で３分間酸化し、そして蒸留水中でリンスした後、１％シュウ酸で３分間漂白した。リンス後、スライドをＣａｒａｚｚｉのヘマトキシリンで２分間染色し、酸アルコール（７０％ＩＭＳを溶媒とする１％ｖ／ｖ  ＨＣｌ）中で数秒間、識別化した後、高温の水道水中に５分間浸漬した。スライドを、次にアルシアンブルー（３％酢酸水溶液を溶媒とする１％ｗ／ｖ、ｐＨ２．５）で５分間染色した。スライドを水で再度リンスし、９５％ＩＭＳ中に急速に浸漬した後、Ｍｉｌｌｅｒのエラスチン染色液に３０分間浸漬した。スライドを次にリンスし、９５％ＩＭＳ中に数秒間配置し、そして水で再度リンスした。次にスライドを、Ｃｕｒｔｉｓの改変されたワンギーソン試薬で６分間染色した。次にスライドを、上記再水和の際のスライドと同一であるが逆転した順番で脱水した後、ＤＰＸにマウントした。
【００９５】
免疫組織化学検査
パラフィンに包埋された５μｍ肺切片を、血管平滑筋細胞についてα−ＳＭＡ、内皮細胞を局所化させるためにｖＷＦ、及び増殖性細胞についてＰＣＮＡの免疫組織化学染色を行った。肺血管病変内のあらゆる発現を識別するために、ＯＰＧについて免疫染色を実施した。アポトーシスレベルを、ＤＮＡの断片化を検出する比色分析法（ＦＲＡＧＥＬ（登録商標）、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、英国）により、製造業者の説明書の規定に従い求めた。対照スライドのＤＮＡｓｅ処理により、陽性対照を作製した。
【００９６】
プロトコール
スライドの脱脂及び再水和後、３％（ｖ／ｖ）過酸化水素に１０分間インキュベーションすることにより、内因性の組織ペルオキシダーゼをブロックした後、スライドを水道水でリンスした。スライドを下記のいずれかでインキュベーションすることにより、抗原回復（スライド透過化処理）を行った：
ａ）クエン酸バッファー、ｐＨ６．０中で９５℃で２０分間、事前加熱した後、ＲＴで２０分間冷却する。次に、組織を０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ１００に１０分間、ＲＴでインキュベーションすることにより透過化処理した（ＯＰＧのＩＨＣの場合）
ｂ）０．１％（ｗ／ｖ）トリプシン／ＴＢＳ、ｐＨ７．８中、３７℃で１０分間、事前加熱した後、水に浸漬することにより反応を停止した（ｖＷＦのＩＨＣの場合）
ｃ）ＳＭＡ染色の場合、抗原回復ステップは実施しなかった
【００９７】
次に、スライドを１％（ｗ／ｖ）スキムミルク／ＰＢＳ中、ＲＴで３０分間、ブロックした（二次抗体の非特異結合を防止するため）。ミルクを除去し、過剰のミルクを吸い取った。
ＰＢＳで希釈された関連する一次抗体を、以下の通り添加及びインキュベーションした：
ａ）モノクロナールマウス抗ヒトα−ＳＭＡ  １：１５０（＃ｍ０８１、Ｄａｋｏ）、ＲＴで１時間
ｂ）ポリクロナールウサギ抗ヒトｖＷＦ  １：３００（＃Ａ００８２、Ｄａｋｏ）、ＲＴで１時間。
ｃ）ポリクロナールウサギ抗ヒトＯＰＧ  １：１００（＃ａｂ７３４００、Ａｂｃａｍ）、４℃でオーバーナイト。
【００９８】
スライドを、ＰＢＳ中で５分間、３回洗浄した後、種特異的ビオチン化二次抗体（ＰＢＳで１：２００希釈）をＲＴで３０分間添加した。スライドを、ＰＢＳ中で５分間、３回再洗浄し、アビジン−ビオチン化酵素複合体を添加した（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ、Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．  ＣＡ、米国）。さらなるＰＢＳ洗浄ステップ後、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質を、５〜１０分間添加した。最適発色後、水道水でスライドを洗浄することにより、発色反応を停止した。次にスライドを、Ｃａｒａｚｚｉのヘマトキシリンで１分間、対比染色した後、水で最終洗浄した。スライドを記載通りに脱水し、ＤＰＸマウンタントでマウントした。スライドを放置してオーバーナイト乾燥した後、光学顕微鏡下で調べた
【００９９】
肺の形態測定及び画像分析
肺血管リモデリングの程度を、細動脈を対象に２つの方法により数値化し、血管サイズに応じてカテゴリー分類した（２０〜５０μｍ、５０〜１００μｍ、及び＞１００μｍ）（Ｓｃｈｅｒｍｕｌｙ、Ｄｏｎｙら、２００５年）。齧歯類の実験的状態を伏せて血管をスコア化した。
【０１００】
中膜面積：断面積（中膜面積／ＣＳＡ）比
全血管面積の割合を表す中膜面積／ＣＳＡを、α−ＳＭＡ染色スライドより求めた中膜の筋肉化から得た。サイズ群毎に６本の血管を４０倍対物レンズで分析した（血管１８本／１切片、及び１切片／齧歯類）。断面積は、血管の内弾性板と外弾性板の間の領域として定義される中膜を含む血管周辺部として定義される総面積であった。
【０１０１】
血管肥厚率（％）
血管肥厚率（％）を、ＡＢＥＶＧ染色スライドを用いて求めた。スライド毎に、ランダムな視野３〜４箇所を、１０倍対物レンズ（倍率１００倍）を用いてサンプリングした。サイズ群毎に、完全閉塞、部分閉塞、及び非肥厚性の血管数を計測し、視野毎の各血管の合計数の割合（％）として表した。
【０１０２】
血管増殖及びアポトーシスレベルの定量
リモデリングした血管内の増殖レベルを求めるために、ＰＣＮＡ陽性染核数を計測し、血管内の全核に占める割合（％）として表した。関連する場合、対象とする血管から直接延在するようなとき、外膜又は血管周囲領域内の核も計測した。各切片（１切片／動物）について、サイズ毎に６本の血管を４０倍対物レンズでスコア化した。
【０１０３】
同一の方式で、アポトーシス陽性の核の割合（％）（ＤＮＡ断片化レベルに関する比色分析から求めた通り）を、１肺切片（１切片／動物）につき、サイズ毎に６本の血管について数値化した。
【０１０４】
スライドを、デジタルカメラ（Ｎｉｋｏｎ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｉｔｅ  ＤＳＲｉ１）と連結し、ＮＩＳベーシックエレメントソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｃ．）を備える光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６００）で観察した。
【０１０５】
ＲＮＡの発現及び齧歯類肺組織由来タンパク質の試験
肺組織由来のタンパク質及びＲＮＡの単離及び精製
液体窒素中で凍結した肺セグメントを、乳棒及び液体窒素を含む乳鉢を用いて微粉末に粉砕し、秤量した。ＲＮＡａｓｅによる汚染を最小限に抑えるために、注意を払った。総タンパク質及びＲＮＡを、市販のＲＮＡ／タンパク質精製キット（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ、Ｏｎｔａｒｉｏ、カナダ）を用いて、製造業者が提供するプロトコールに従い単離した。精製キットは、スピンカラムクロマトグラフィー技法を採用し、３０分以内に同一サンプルからタンパク質及びＲＮＡを溶出することが可能であった。
【０１０６】
注記：マウス／ラット介入用のＱＩＡＧＥＮキット
プロトコール
簡潔には、肺組織に溶解溶液を添加し、次にエタノールを添加した。これをスピンカラムにロードした。１４０００ｒｐｍで遠心分離した後、溶液内のすべての核酸は、樹脂によって捕捉され、一方タンパク質は、通過画分内に除去された。捕捉されたＲＮＡを洗浄し、再度遠心し、次に精製されたＲＮＡを溶離した。溶出液中のＲＮＡ濃度を、分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて求め、そして−８０℃で凍結した。
【０１０７】
ｐＨ調整後、タンパク質通過画分を当初のスピンカラムに再ロードし、遠心分離、洗浄、及び溶離を行った。
【０１０８】
最終的に、タンパク質濃度を、市販の分析法（ＤＣＴＭ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ、ＢｉｏＲＡＤ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、英国）を用いて、製造業者が提供するプロトコールに従い求めた。簡潔には、この分析法は、タンパク質とアルカリ性銅酒石酸溶液の間の反応を利用する比色分析法である。同法では、フォリン試薬を用いる還元ステップがこれに続く。７５０ｎｍの吸収を読み取った。タンパク質量を、タンパク質標準曲線（アルブミン、ＢＳＡ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｆｉｓｈｅｒ、英国）から作製した吸収データから求めた。タンパク質サンプルを−８０℃で保管した。
【０１０９】
ウェスタン免疫ブロット法
プロトコール
タンパク質を、市販の電気泳動キット（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。すべてのバッファー及び試薬は、別途記載がなければ、ＮｕＰＡＧＥレンジの一部であった。タイムコース実験に由来するラット肺から精製されたタンパク質３５μｇ、サンプルバッファー、及び還元剤を含む、最終容積を３０μｌ（脱イオン水中）とした容積を、７０℃で１０分間加熱した。次にサンプル及び事前染色されたマーカーラダーを、１０ウェルの事前成形したＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｍｉｎｉゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にロードした。さらに、混合した実験肺組織サンプルも、後続する定量分析を可能にするために、追加の対照として各ゲル上にロードした。
【０１１０】
ＳＤＳ泳動バッファーをすでに含有する電気泳動セル（ＸＣｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ（登録商標）Ｍｉｎｉ  ｃｅｌｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、ロード済みのゲルを配置する直前に、５００μｌの酸化防止剤を添加した。ゲルを２００Ｖで３５分間泳動した。
【０１１１】
移動バッファー（酸化防止剤及び１０％メタノールｖ／ｖを含む）中のニトロセルロース膜（膜及び吸い取りパッドは、移動バッファーに事前浸漬し、気泡を除去した）上にゲルを移動し、３０Ｖで６０分間泳動した。移動が適切であったことを確認するために、ポンソーＳ染色を用いた。
【０１１２】
次に膜を、５％ミルク（ｗ／ｖ）及び０．１％ツイーン２０（ｖ／ｖ）を含むＰＢＳ、１０ｍｌ中で１時間、振とう式プラットフォーム上でブロックした。ブロットを、ＰＢＳ／０．１％ツイーン２０中で３回リンスした後、５％ミルク／ＰＢＳ／０．１％ツイーン２０中の関連する一次抗体を、振とう式プラットフォーム上、４℃、オーバーナイトで添加した（マウス抗ヒトＴＲＡＩＬ  １：５０、Ｎｏｖｏ  Ｃａｓｔｒｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏ  Ｄｕｒｈａｍ、英国、及び抗マウスβアクチン１：２０００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、米国）。
【０１１３】
ブロットを１０分間、３回リンスした後、ＰＢＳで希釈した、該当する種特異的ペルオキシダーゼ標識二次抗体（ポリクロナールヤギ抗マウス免疫グロブリン／ＨＲＰ  １：２０００、＃ｐ０４４７、Ｄａｋｏ、Ｅｌｙ、英国）を添加した
【０１１４】
記載の通りさらなるリンスステップを実施した後、１ｍｌの市販分析試薬（Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｆｉｓｈｅｒ）をブロットに添加することにより、増感式化学発光を暗光内で５分間実施した。暗光室内で、オートラジオグラフィーフィルム（ＨｙｐｅｒＦｉｌｍＴＭ  ＧＥ  Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）及び現像液／固定液を用いて、ブロットを現像した。
【０１１５】
ブロットを引きはがし（Ｒｅｂｌｏｔ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｌｄ  Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、上記の通りアクチンについて再プロービングした。
【０１１６】
現像したブロットを乾燥し、ラダー標識した。市販ソフトウェア（Ｓｙｎｇｅｎｅ  ＳＮＡＰ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｃｈｅｍｉｇｅｎｉｕｓ２  ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ、ＳｙｎＧｅｎｅ）に装備されたデンシトメトリー機能を用いて、アクチン及び対照サンプルについてノーマライズすることにより、バンド内のＴＲＡＩＬの量を求めた。
【０１１７】
定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
ファーストストランド合成のためのＲＮＡの逆転写
このステップは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩＩファーストストランド合成システム（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、英国）において提供される成分を用いて実施した。実験用齧歯類の肺（及びＰＡＸ−遺伝子チューブを用いて全血）から単離された全ＲＮＡ３μｇを含む容積を、分子グレードの水を用いて１０μｌとした。１μｌのランダム六量体プライマー（５０ｎｇ）及び１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰをこれに添加し、そして変性ステップとして６５℃で５分間加熱した。１０μｌのｃＤＮＡ合成混合物［１０×ＲＴバッファー（２μｌ）、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（４μｌ）、０．１Ｍ  ＤＴＴ（２μｌ）、ＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）（１μｌ）、及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ逆転写酵素（１μｌ）を含む］を本溶液に添加するまで、サンプルを氷上に配置し、そして混合した。サンプルをサーマルサイクラー（Ｇ  Ｓｔｏｒｍ  ＧＳ１、ＧＲＩ  Ｌｔｄ、Ｅｓｓｅｘ、英国）内で、パラメータを以下のように設定して加熱した。ｉ）２５℃、１０分間（アニーリングステップ）、ｉｉ）５０℃、５０分間（ｃＤＮＡ合成）、及び最終的にｉｉｉ）８５℃、５分後、４℃に維持（反応停止）。１μｌのＲＮａｓｅＨを各チューブに添加した後、３７℃で２０分間、最終インキュベーションステップ。
【０１１８】
あるいは（すべてのマウス及びラットへの介入について）、市販の高能力ＲＮＡ→ｃＤＮＡキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、２μｇのＲＮＡを逆転写した。簡潔には、ＲＮＡを、１０μｌの２×ＲＴバッファー及び１μｌのＲＴ酵素混合物を含むＰＣＲチューブに添加した。サンプルを、サーマルサイクラー（Ｇ  Ｓｔｏｒｍ  ＧＳ１、ＧＲＩ  Ｌｔｄ、Ｅｓｓｅｘ、英国）内で、パラメータを以下のように設定して加熱し、ｉ）３７℃、６０分間、ｉｉ）９５℃、５分間、そして次に４℃に維持して反応を停止した。
【０１１９】
リアルタイム定量的ＰＣＲ−マウスについて数を確保するのに必要
上記ＲＴステップに由来する標的肺ｃＤＮＡの増幅を次に実施した。各ｃＤＮＡを５０ｎｇ含む容積を、滅菌水を用いて、４．５μｌの容積に希釈した。５μｌのＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現マスターミックス−２Ｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＴＭ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、英国）を、０．５μｌの関連する標的遺伝子プライマー（１０×）と共に、３８４ウェルプレート内の関連するウェル内のｃＤＮＡに添加した。試験した標的遺伝子を、表１に記載し（すべてのＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＴＭより入手した）、１８ｓ及びＡＴＰ５Ｂを事前の試験（ＧｅＮＯＲＭアッセイ）で確認された内在性対照遺伝子として選択した。各遺伝子のサンプル（二重）を同一プレート上にロードした。プレートを、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、反応を７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＴＭ）上で行った。試験遺伝子をハウスキーピング対照遺伝子と比較し、またＳＤＳソフトウェア（ｖ２．２．１、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＴＭ）を用いて、遺伝子毎に実験対象とコントロール対象の間のこの比を比較する（デルタデルタＣＴ法）ことにより、各遺伝子の相対的発現量を数値化した。
【０１２０】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−遺伝子発現分析に関するアッセイＩＤ
遺伝子        ラットプライマー        マウスプライマー
ＡＴＰ５Ｂ    Ｒｎ０１７５６３１６    Ｍｍ００４４３９６７−ｇ１
１８ｓ        Ｈｓ０３００３６３１−ｍ１    Ｈｓ０３００３６３１−ｍ１
ＴＲＡＩＬ    Ｒｎ００５９５５５６−ｍ１    Ｍｍ００４３７１７４−ｍ１
ＯＰＧ        Ｒｎ００５６３４９９−ｍ１    Ｍｍ００４３５４５２−ｍ１
ＢＭＰＲ２    Ｒｎ０１４３７２１０−ｍ１    Ｍｍ０３０２３９７６−ｍ１
ＣＣＬ５      Ｒｎ００５７９５９０−ｍ１    Ｍｍ１３０２４２８−ｍ１
ＩＬ１Ｒ１    Ｒｎ００５６５４８２−ｍ１    Ｍｍ００４３４２３７−ｍ１
ＩＬ１Ｒ２    Ｒｎ００５８８５８９＿ｍｌ    Ｍｍ００４３９６２２−ｍ１
【０１２１】
統計分析
Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ｖ５．０  （Ｇｒａｐｈｐａｄ、米国）ソフトウェアを用いて、データをプロット及び分析した。別途明記しない限り、データを平均値［標準誤差］として表した。Ｓｔｕｄｅｎｔの独立ｔ検定を用いて両群を比較し、３群以上の場合、ボンフェローニの比較後検定（適応される場合）を用いたＡＮＯＶＡにより比較した。統計的有意性は、ｐ値≦０．０５として規定した。
【実施例１】
【０１２２】
ＰＡＨでＯＰＧ発現が増加している：
特発性肺動脈性高血圧症患者の移植後の肺に由来し、体外移植及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖した肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）から単離したｍＲＮＡを用いて、ＯＰＧ遺伝子発現（図１Ａ）、及びタンパク質の血清濃度（図１Ｂ）が、対照サンプルから単離されたものと比較して、増加していることを実証した。
【実施例２】
【０１２３】
ＰＡＨ病因と関連した複数の経路が、ＰＡＳＭＣからのＯＰＧ分泌を高める：
ヒトＰＡＳＭＣに対して、セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン、５−ＨＴ）（Ｓｉｇｍａ）の添加（Ａ）、骨形成タンパク質受容体タイプ２（ＢＭＰ−Ｒ２  ｓｉＲＮＡ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）のノックダウン（Ｂ）、又はインターロイキン−１β（ＩＬ−１ｂ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の添加（Ｃ）を行うと、その結果ＯＰＧ分泌量が有意に増加する。
【実施例３】
【０１２４】
ＯＰＧは、ＰＡＳＭＣの増殖及び移動を誘発する：
ヒトＰＡＳＭＣに対して、組換えヒトＯＰＧ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加すると、その結果増殖（図１Ｆ）及び移動（図１Ｇ）が、用量依存性で増加する。
【実施例４】
【０１２５】
ＯＰＧ発現は、ＰＡＨのラットモノクロタリンモデルにおいて疾患の進行を高める：
各時点、１群当たり７匹のラットに、６０ｍｇ／ｍｌのモノクロタリン又は対照として生理食塩水のいずれかを注射した。ラットは、心臓カテーテル術を受けた後、絶命せしめられ、そして疾患発症後の２、７、１４、２１、及び２８日目に心臓及び肺組織を採集された。これまでの公表データの通り、疾患プロセスと整合して血行動態が上昇するのが１４日目から認められ、２１日目及び２８日目には有意な増加が認められた（図１Ｈ＆図１Ｉ）。ラット血清について実施したＥＬＩＳＡにより、Ｍｃｔで処置を受けたラットでは、血行動態が変化する前、早くも７日目からＯＰＧの有意な上昇が検出されたことが明らかとなり（図１Ｊ）、また全肺ＲＮＡのＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ分析により、Ｍｃｔで処置を受けたラットでは、２１日目からＯＰＧ遺伝子発現が有意に増加することが明らかとなった（図１Ｋ）。ラットから単離された全肺タンパク質のウェスタン分析は、抗ＯＰＧ抗体を用いてプローブされた。ブロットをＯＰＧ発現量について半定量的に分析し、β−アクチンに対してノーマライズした。ＯＰＧタンパク質の有意な増加が、生理食塩水対照と比較してモノクロタリンで処置を受けたラットで、２１日目から検出された（図１Ｌ）。
【実施例５】
【０１２６】
抗ＯＰＧ抗体治療は、モノクロタリンラットモデルにおけるＰＡＨの発症を防止する：
１群当たり４匹のラットに、抗ＯＰＧ抗体又は対照としてＩｇＧのいずれかを送達し、同時に６０ｍｇ／ｋｇの用量のモノクロタリンを投与するために、浸透圧ミニポンプを埋め込んだ。２１日後、ラットは心臓カテーテル術を受けた後、絶命せしめられ、上記と同様に心臓及び肺組織の採集を行った。抗ＯＰＧ抗体の投与を受けたラットでは、ＩｇＧの投与を受けたラットと比較してＲＶＳＰの有意な低下が認められた（図１Ｍ）。ＲＶＳＰの低下は、小肺動脈／細動脈（＜５０μｍ、図１Ｎ）及び小〜中肺動脈（５１〜１００μｍ、図１Ｏ）の肺血管のリモデリング（中膜面積／ＣＳＡ）の有意な低下とも関連した。
【実施例６】
【０１２７】
ＯＰＧ発現は、パイゲン食で飼育されるアポＥ−／−マウスモデルで増加する：
パイゲン食で８週間飼育したアポＥ−／−又はアポＥ−／−／ＩＬ−１Ｒ１−／−マウスでは、ＲＶＳＰの有意な増加が発現した（図１Ｐ）。全肺ＲＮＡのＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ分析により、パイゲンで飼育されたマウスでＯＰＧ遺伝子発現が有意に増加することが明らかとなった（図１Ｑ）。マウスから単離された全肺タンパク質のウェスタン分析は、抗ＯＰＧ抗体を用いてプローブされた。ブロットをＯＰＧ発現量について半定量的に分析し、β−アクチンに対してノーマライズした。ＯＰＧタンパク質の有意な増加が、パイゲンで飼育されたマウスで検出された（図１Ｒ）。
【実施例７】
【０１２８】
抗ＯＧ抗体による確立したＰＡＨの治療は、疾患からの回復を誘発する：
パイゲン食で８週間飼育した後のアポＥ−／−（図Ｓ）又はアポＥ−／−／ＩＬ−１Ｒ１−／−（図Ｔ）マウスに、浸透圧ポンプを、抗ＯＰＧ抗体又はＩｇＧのいずれかを４週間送達するために埋め込んだ。抗ＯＰＧ抗体の投与を受けたマウスは、ＩｇＧで治療を受けたマウスと比較して、ほぼ正常レベルまでＲＶＳＰの有意な低下を示した。
【実施例８】
【０１２９】
ＯＰＧは、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）と相互作用する分泌型分子である。本発明者らは、ＯＰＧ及びＴＲＡＩＬの循環濃度は、ＰＡＨに対する待望のバイオマーカーを提供するものと仮定した。英国のＳｈｅｆｆｉｅｌｄ  Ｔｅａｃｈｉｎｇ  Ｈｏｓｐｉｔａｌｓ、及びＰａｐｗｏｒｔｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｔｒｕｓｔｓの両施設から倫理的承認を得た上で、ＩＰＡＨ、慢性血栓塞栓性の肺高血圧症（ＣＴＥＰＨ）（血管内膜切除術の前後）、急性冠状動脈症候群、安定な狭心症を有する患者、及びしかるべき対照から得られた血清について、ＯＰＧ及びＴＲＡＩＬの濃度を測定した。次に、ＯＰＧ、ＴＲＡＩＬの濃度、及びＯＰＧ／ＴＲＡＩＬ比を、臨床評価と比較した。その他のすべての群と比較してＩＰＡＨ患者由来の血清では、ＯＰＧ発現量は有意に増加し、またＴＲＡＩＬは有意に減少した（Ｐ＜０．０００１、ｎ＝３７〜７６）。ＩＰＡＨ患者では、ＯＰＧ／ＴＲＡＩＬは、対照又はその他の疾患群よりも有意に高く、これは、心臓指数（ｐ＜０．０００１、Ｒ＝０．６２）及び右心房圧（ｐ＜０．０５、Ｒ＝０．４３）と相関関係を認めたが、平均肺動脈圧又は６分間歩行試験では認められなかった。ＯＰＧは、血管内膜切除術後３ヶ月において、ＣＴＥＰＨ患者で有意に低かったが、ＴＲＡＩＬの濃度に有意差は認められなかった。これらのデータに基づき、ＯＰＧ／ＴＲＡＩＬ比は、ＰＡＨ病因を調査するための有用な新規バイオマーカーであり得る。２つの分子を組み合わせることにより、ＰＡＨの病因を明らかにするためのより有力な手段が提供され得る。その他の関連するＰＡＨ群、及びより大規模な患者コホートを対象とした治療効果を検討するために、さらなる研究が必要なのは明らかである。
【図１Ａ】
2014532637.tif 000003
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【図１Ｌ】
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【図１Ｍ】
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【図１Ｎ】
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【図１Ｏ】
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【図１Ｐ】
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【図１Ｑ】
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【図１Ｒ】
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【図１Ｓ】
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【図１Ｔ】
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【図１Ｕ】
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【図１Ｖ】
2014532637.tif 000024
【図２Ａ】
2014532637.tif 000025
【図２Ｂ】
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【配列表】
2014532637000001.app
【国際調査報告】
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2014532637.tif 000028
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