(57)【要約】癌を処置するため（直接、および癌細胞をＤＮＡ損傷処置に対して感作させることによって）、またはウイルスの感染、増殖もしくは代謝を阻害もしくは予防するための、細胞核に浸透し、ＤＮＡ修復を阻害するまたはＤＮＡ代謝に干渉する抗体が提供される。該方法は、細胞を、細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体またはその誘導体を含有する組成物を、単独で、またはＤＮＡ損傷を誘導する処置、例えば、ＤＮＡ損傷化学療法または放射線照射などと併用して処理することを伴う。細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体またはその誘導体の影響は、ＤＮＡ修復が欠損した癌細胞において強化され、細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体またはその誘導体は、ＤＮＡ修復の欠損を伴う癌細胞に対して合成致死性である。
2014513069.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
新生細胞またはウイルスに曝露されたもしくは感染した細胞におけるＤＮＡ修復を阻害する方法であって、前記細胞を、ＤＮＡ損傷を強化するまたはＤＮＡ代謝に干渉する細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体を含む医薬組成物と接触させるステップを含む、方法。
【請求項２】
前記新生細胞が、肉腫、リンパ腫、白血病、癌腫および腺癌腫、芽細胞腫、胚細胞性腫瘍、神経膠腫、神経内分泌腫瘍、黒色腫、ラブドイド腫瘍（ｒｈａｂｄｏｉｄ  ｔｕｍｏｒ）、胚芽腫、神経外胚葉性腫瘍、カルチノイド、頭蓋咽頭腫、組織球腫、髄上皮腫、中皮腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、未分化神経外胚葉性腫瘍、唾液腺腫瘍、胸腺腫、胸腺癌腫、甲状腺癌、およびウィルムス腫瘍からなる群より選択される癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が放射線抵抗性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が化学療法に対して抵抗性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、ＤＮＡ修復の内因性の欠陥または欠損を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞を、ＤＮＡ修復の欠陥もしくは欠損を有するもしくはそれを引き起こす、または感染、組込み、もしくは複製について宿主ＤＮＡ修復経路に依存するウイルスに曝露または感染させる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞をレンチウイルスに曝露または感染させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、ＸＲＣＣ１、ＡＤＰＲＴ（ＰＡＲＰ−１）、ＡＤＰＲＴＬ２、（ＰＡＲＰ−２）、ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ  ＢＥＴＡ、ＣＴＰＳ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＦＡＮＣＤ２、ＰＭＳ２、ｐ５３、ｐ２１、ＰＴＥＮ、ＲＰＡ、ＲＰＡ１、ＲＰＡ２、ＲＰＡ３、ＸＰＤ、ＥＲＣＣ１、ＸＰＦ、ＭＭＳ１９、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５１ｂ．、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄ、ＤＭＣ１、ＸＲＣＣＲ、ＸＲＣＣ３、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５０、ＭＲＥ１１、ＮＢ５１、ＷＲＮ、ＢＬＭ、ＫＵ７０、ＫＵ８０、ＡＴＭ、ＡＴＲ  ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＲＡＤ１、およびＲＡＤ９からなる群より選択されるＤＮＡ修復遺伝子に１つまたは複数の変異を有するか、またはその異常な発現を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、欠陥のある癌抑制遺伝子、例えば、ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２などを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が低酸素性腫瘍の一部である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体を放射線増感剤と組み合わせて投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記放射線増感剤が、シスプラチン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、ＰＡＲＰ１阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、プロテアソーム阻害剤、上皮増殖因子受容体（ＥＧＲＦ）阻害剤、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）受容体阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、キナーゼ阻害剤、ペントキシフィリン、およびビノレルビンからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
被験体を、放射線療法で処置するステップをさらに含み、ここで、前記細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体により、放射線療法に対する前記細胞の感受性が増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞を、ＤＮＡに損傷を与えるまたはＤＮＡ修復を阻害する抗新生物薬で処理するステップをさらに含み、ここで、前記細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体により、前記抗新生物薬に対する前記細胞の感受性が増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記新生細胞が被験体内にあり、前記被験体を、治療用モノクローナル抗体を用いて処置するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体が自己免疫疾患の被験体または動物に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記自己免疫疾患が全身性エリテマトーデス、またはその動物モデルである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、その細胞浸透性断片、保存的改変体、またはヒト化形態を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体が、３Ｅ１０の単鎖可変性断片（３Ｅ１０  ｓｃＦｖ）を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体が、担体または結合体による補助を伴わずに前記細胞の核内に輸送される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
薬学的に許容される賦形剤中の細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体またはその断片を含む投薬単位であって、前記抗体が、ＤＮＡ修復の内因性の欠損を伴う、または伴わない癌細胞またはウイルス感染細胞におけるＤＮＡ修復を阻害するために有効な量で存在する、投薬単位。
【請求項２２】
抗新生物剤または放射線感作剤をさらに含む、請求項２１に記載の投薬単位。
【請求項２３】
前記抗新生物剤が、シスプラチン、シトキサン、ドキソルビシン、メトトレキセート、マイトマイシンＣ、ナイトロジェンマスタード、ヒドロキシウレア、チラパザミン、テモゾロミド、カンプトテシン、ＰＡＲＰ阻害剤、カルボプラチン、エピルビシン、リボヌクレオチド還元酵素阻害剤、イホスファミド、セツキシマブ、リツキシマブ、スニチニブ、ストレプトゾシン、ソラフェニブ、アクチノマイシンＤ、プロカルバジン、ＤＴＩＣ、８−ＭＯＰ、ペメトレキセド、エベロリムス、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、ダカルバジン、エトポシド、グリアデル（Ｇｌｉａｄｅｌ）、アルキル化剤、ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項２２に記載の投薬単位。
【請求項２４】
放射線増感剤が、シスプラチン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、ＰＡＲＰ１阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、プロテアソーム阻害剤、上皮増殖因子受容体（ＥＧＲＦ）阻害剤、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）受容体阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ペントキシフィリン、ビノレルビン、ミソニダゾール、マイトマイシンＣ、アルキル化剤、ヌクレオシド類似体、およびヌクレオチド類似体からなる群より選択される、請求項２２に記載の投薬単位。
【請求項２５】
ＤＮＡ修復を阻害するヒトまたはヒト化モノクローナル細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体であって、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ２４３９ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体３Ｅ１０以外の、担体または結合体による補助を伴わずに細胞の核内に輸送される、細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体。
【請求項２６】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ２４３９ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体３Ｅ１０と同じまたは異なるエピトープ特異性を有する、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
モノクローナル抗体３Ｅ１０のパラトープを有する組換え抗体を含む、請求項２６に記載の抗体。
【請求項２８】
自己免疫疾患のヒト被験体から、または自己免疫疾患の動物モデルから単離されたリンパ球を用いて調製したハイブリドーマにより産生される、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２９】
単鎖抗体、またはその断片である、請求項２６から２８までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３０】
第２の標的に特異的に結合する二重特異性モノクローナル抗体である、請求項２６から２８までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３１】
ＤＮＡ修復タンパク質、ＤＮＡ複製タンパク質、およびＤＮＡ損傷応答タンパク質からなる群より選択されるタンパク質に特異的に結合する、請求項３０に記載の抗体。
【請求項３２】
熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、Ｍｙｃタンパク質、またはＲａｆ／Ｒａｓタンパク質に特異的に結合する、請求項３１に記載の抗体。
【請求項３３】
ＤＮＡ損傷療法に対する被験体の感受性を決定する方法であって、前記被験体由来の試料を、細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体のレベルについてアッセイするステップを含み、前記試料中の細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体が対照と比較して増大することは、前記被験体が、前記ＤＮＡ損傷療法に対して感受性であることの指標である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１１年４月１日に出願された米国仮出願第６１／４７０，９１８号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府によって資金提供された研究または開発に関する声明
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈによってＰｅｔｅｒ  Ｇｌａｚｅｒに付与された契約Ｐ０１  ＣＡ１２９１８６の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、一般に、癌を処置するための抗体療法の分野、より詳細には、ＤＮＡ修復を阻害するため、細胞を放射線治療（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）およびＤＮＡ損傷化学療法に対して感作させるため、ならびにＤＮＡ修復における既存の欠損を有する癌細胞を選択的に死滅させるための、細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
大部分の癌療法は、非特異的な組織毒性に起因する著しい副作用によって重度に限定され、癌細胞に対して選択的に毒性を有する、または腫瘍を処置に対して選択的に感作させる新規の薬剤を同定することが、癌研究における重要な目標である。著しい量の研究で、モノクローナル抗体の特異的な結合活性を適用して腫瘍に特異的な療法を開発することが焦点とされている。選択抗体、例えば、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、およびセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））などは、ヒトの癌療法における使用に関して認可を受けているが、これらは全て、癌細胞内に浸透する能力を欠き、したがって、腫瘍細胞の外面に位置する標的への攻撃に限定される。
【０００５】
腫瘍に特異的な標的は、相当数が細胞および核の内部に位置し、多数の種類の癌が、ＤＮＡ修復を阻害する処置に対して特に脆弱である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、ＤＮＡ修復を阻害する抗ＤＮＡ抗体などの細胞浸透性抗体を提供することが本発明の目的である。
【０００７】
本発明のさらなる目的は、癌細胞の放射線療法（ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）および／または化学療法に対する感受性を増大させる組成物を提供することである。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、一般にはＤＮＡ修復遺伝子における変異に起因するが、ＤＮＡ修復遺伝子におけるサイレンシングまたは変異に伴っても散発的に起こる家族性の症候群に関連するＤＮＡ修復における既存の欠損を有する癌細胞または他の望ましくない細胞に対して選択的に毒性を有する細胞浸透性抗体およびそれらの誘導体を提供することである。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、宿主ＤＮＡ修復を乱すことによってウイルスの感染、組込み、および／または複製を予防または阻害する細胞浸透性抗体およびそれらの誘導体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
細胞核に浸透し、ＤＮＡ修復を阻害するための抗ＤＮＡ抗体の使用方法が開発されてきた。好ましい実施形態では、細胞は、新生物、一般には、癌腫などの癌細胞である。癌性細胞または特定の感染細胞を処置する方法は、細胞と、細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体を、単独で、または化学療法剤または放射線などの他の薬剤と組み合わせて接触させるステップを伴う。いくつかの実施形態では、該方法は、被験体または腫瘍を、ＤＮＡ修復を損なう、正常な遺伝子発現における１つまたは複数の遺伝子変異または変化についてアッセイし、次いで、変化した発現または機能の１つまたは複数の変異またはパターンが同定された場合に、抗ＤＮＡ抗体を細胞の処理に使用するために選択するステップを伴う。
【００１１】
ＤＮＡ修復が損なわれている細胞は、この方法の特によい標的である。好ましい実施形態では、細胞は、ＤＮＡ修復、ＤＮＡ損傷チェックポイント、ＤＮＡ合成、相同組換え、または非相同末端結合に関与する遺伝子の発現に欠陥があるまたはその遺伝子に変異を有する。例示的な遺伝子としては、ＸＲＣＣ１、ＡＤＰＲＴ（ＰＡＲＰ−１）、ＡＤＰＲＴＬ２、（ＰＡＲＰ−２）、ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ  ＢＥＴＡ、ＣＴＰＳ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＦＡＮＣＤ２、ＰＭＳ２、ｐ５３、ｐ２１、ＰＴＥＮ、ＲＰＡ、ＲＰＡ１、ＲＰＡ２、ＲＰＡ３、ＸＰＤ、ＥＲＣＣ１、ＸＰＦ、ＭＭＳ１９、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５１ｂ．、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄ、ＤＭＣ１、ＸＲＣＣＲ、ＸＲＣＣ３、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５０、ＭＲＥ１１、ＮＢ５１、ＷＲＮ、ＢＬＭ、ＫＵ７０、ＫＵ８０、ＡＴＭ、ＡＴＲ  ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＲＡＤ１、およびＲＡＤ９が挙げられる。いくつかの実施形態では、欠陥のある遺伝子は、癌抑制遺伝子である。例えば、細胞は、ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２に１つまたは複数の変異を有してよい。
【００１２】
化学療法および放射線治療などの多くの癌療法の手順は、細胞のＤＮＡ損傷を修復する能力を圧倒することによって働き、その結果、細胞死をもたらす。いくつかの実施形態では、細胞は、放射線療法および／または化学療法に対して抵抗性である。被験体に細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体を含有する組成物を投与することによって被験体における放射線治療および／または化学療法の有効性を増強するための方法も提供される。いくつかの実施形態では、抗体により、放射線療法および／または化学療法に対する細胞の感受性が増大する。この方法によって増強することができる化学療法薬としては、ＤＮＡに損傷を与えるまたはＤＮＡ修復を阻害する化学療法薬が挙げられる。抗ＤＮＡ抗体は、放射線治療および／または化学療法を施す前に、それと同時に、またはその後に、被験体に投与することができる。好ましい実施形態では、抗ＤＮＡ抗体を、放射線治療および／または化学療法の少なくとも２日前または２日後に、より好ましくは、放射線治療および／または化学療法の少なくとも１日前または１日後に、なおより好ましくは、放射線治療および／または化学療法と同時に、被験体に投与する。
【００１３】
ＤＮＡ修復を阻害する細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体が開示されている。これらの抗体は、担体または結合体による補助を伴わずに細胞の核内に輸送される。いくつかの実施形態では、抗ＤＮＡ抗体は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、またはそれらの組合せと結合することができる。二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に特異的な抗体は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者の７０％に存在し、それと比較して、ＳＬＥではない人では、その０．５％に存在する。したがって、いくつかの実施形態では、細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体は、ＳＬＥの被験体または同様の自己免疫性状態のマウスもしくはウサギなどの動物から単離される、またはそれに由来するものであり、その後、ヒト化されるか、または組換えによって発現させて、二量体または単鎖の抗体として投与される。
【００１４】
有用な細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体の例は、モノクローナル抗ＤＮＡ抗体３Ｅ１０、または、３Ｅ１０と同じエピトープ（複数可）に結合するその改変体もしくは断片である。好ましい実施形態では、抗ＤＮＡ抗体は、抗ＤＮＡ抗体の単鎖可変性断片、またはその保存的改変体である。例えば、抗ＤＮＡ抗体は、３Ｅ１０の単鎖可変性断片（３Ｅ１０  ｓｃＦｖ）、またはその保存的改変体であってよい。３Ｅ１０  ｓｃＦｖは、酵母、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどの、哺乳動物の細胞において発現ベクターにより発現される組換えタンパク質として産生されることが好ましい。
【００１５】
好ましい実施形態では、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ２４３９ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体３Ｅ１０と同じエピトープ特異性を有する。これは、モノクローナル抗体３Ｅ１０のパラトープを含有する組換え抗体を作製することによって実現することができる。あるいは、これは、ＳＬＥなどの自己免疫疾患のヒト被験体またはマウスまたは他の実験動物から単離されたリンパ球からハイブリドーマを創出することによって実現することができる。適切な抗体としては、全長の抗体、単鎖抗体、および抗体断片が挙げられる。抗体は、細胞の核内の第２の治療標的に特異的に結合する二重特異性モノクローナル抗体であってもよい。例えば、いくつかの実施形態では、抗体は、細胞の核内のタンパク質、例えば、ＤＮＡ修復タンパク質、ＤＮＡ複製タンパク質、ＤＮＡ損傷応答タンパク質、細胞周期制御タンパク質、ＤＮＡ損傷チェックポイントタンパク質、アポトーシス制御タンパク質、またはストレス応答タンパク質などに特異的に結合する。これらのカテゴリー内の例示的な標的としては、それぞれ、ＲＡＤ５２タンパク質、毛細血管拡張性運動失調変異タンパク質（ＡＴＭ）、ＣＨＫ２タンパク質またはＣＨＫ１タンパク質、ＢＣＬ２タンパク質、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）、Ｍｙｃタンパク質、およびＲａｓタンパク質が挙げられる。
【００１６】
好ましい実施形態では、細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体は、癌におけるＤＮＡ修復を阻害するために有効な量の単位投与量（ｕｎｉｔ  ｄｏｓａｇｅ）で提供され、これは、キット中、同じバイアル中にまたは別々に、薬学的に許容される賦形剤を含んでよく、ここで、抗体は、癌細胞におけるＤＮＡ修復を阻害するために有効な量で存在する。好ましい実施形態では、抗体は、約２００ｍｇ／ｍ２、２５０ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、３５０ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、４５０ｍｇ／ｍ２、５００ｍｇ／ｍ２、６００ｍｇ／ｍ２、７００ｍｇ／ｍ２、８００ｍｇ／ｍ２、９００ｍｇ／ｍ２、または１０００ｍｇ／ｍ２を含めた、約２００ｍｇ／ｍ２〜約１０００ｍｇ／ｍ２の量で存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、静脈内注射するための単位剤形である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、腫瘍内投与するための単位剤形である。
【００１７】
医薬組成物（例えば、投薬単位）は、追加的な治療剤をさらに含有してよい、または追加的な治療剤を伴うキットで提供することができる。例えば、追加的な治療剤は、抗新生物剤、放射線感作剤、またはそれらの組合せであってよい。抗新生物剤は、ＤＮＡに損傷を与えるまたはＤＮＡ修復を阻害するものであることが好ましい。いくつかの実施形態では、抗新生物剤は、シスプラチン、シトキサン、ドキソルビシン、メトトレキセート、マイトマイシンＣ、ナイトロジェンマスタード、リボヌクレオチド還元酵素阻害剤（例えば、ヒドロキシウレア）、チラパザミン、テモゾロミド、またはトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、カンプトテシン）である。
【００１８】
医薬組成物中に存在してよい放射線増感剤の非限定的な例としては、シスプラチン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、ＰＡＲＰ１阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、プロテアソーム阻害剤、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）受容体阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、キナーゼ阻害剤、ペントキシフィリン、およびビノレルビンが挙げられる。
【００１９】
医薬組成物（例えば、投薬単位）は、癌を処置するための１種または複数種の治療用モノクローナル抗体をさらに含有してよい。好ましい実施形態では、治療用モノクローナル抗体は、ベバシズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、またはそれらの組合せである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１−１】図１Ａは、連結ドメイン（ＬＤ）によってつながった３Ｅ１０の軽鎖および重鎖の可変領域で構成される３Ｅ１０単鎖抗体可変性断片（３Ｅ１０  ｓｃＦｖ）の概略図である。ＭｙｃタグおよびＨｉｓ６タグを付加して、検出および精製を可能にした。３Ｅ１０  ｓｃＦｖは癌細胞の核内に浸透する（５μＭの３Ｅ１０  ｓｃＦｖを用いて３０分間処理し、次いで固定し、抗Ｍｙｃ抗体を用いて染色したＳｋｏｖ−３卵巣癌細胞で実証された）。図１Ｂは、対照緩衝液（棒１および３）または１０μＭの３Ｅ１０  Ｆｖ（棒２および４）の存在下で０Ｇｙ（棒１〜２）または４Ｇｙ（棒３〜４）で照射したＵ２５１ヒト神経膠腫細胞のクローン原性生存（対照と比較した生存の割合）を示す棒グラフである。エラーバーは、反復実験についての標準誤差を示す。図１Ｃ〜１Ｄは、１０μＭの３Ｅ１０  ｓｃＦｖの存在下（破線）または不在下（実線）における、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）（０〜２５０ｎＭ）（図１Ｅ）またはパクリタキセル（０〜２．５ｎＭ）（図１Ｆ）の関数としての、Ｕ８７ヒト神経膠腫細胞の細胞死（％、ヨウ化プロピジウム蛍光によって測定された）を示すグラフである。
【図１−２】図１Ａは、連結ドメイン（ＬＤ）によってつながった３Ｅ１０の軽鎖および重鎖の可変領域で構成される３Ｅ１０単鎖抗体可変性断片（３Ｅ１０  ｓｃＦｖ）の概略図である。ＭｙｃタグおよびＨｉｓ６タグを付加して、検出および精製を可能にした。３Ｅ１０  ｓｃＦｖは癌細胞の核内に浸透する（５μＭの３Ｅ１０  ｓｃＦｖを用いて３０分間処理し、次いで固定し、抗Ｍｙｃ抗体を用いて染色したＳｋｏｖ−３卵巣癌細胞で実証された）。図１Ｂは、対照緩衝液（棒１および３）または１０μＭの３Ｅ１０  Ｆｖ（棒２および４）の存在下で０Ｇｙ（棒１〜２）または４Ｇｙ（棒３〜４）で照射したＵ２５１ヒト神経膠腫細胞のクローン原性生存（対照と比較した生存の割合）を示す棒グラフである。エラーバーは、反復実験についての標準誤差を示す。図１Ｃ〜１Ｄは、１０μＭの３Ｅ１０  ｓｃＦｖの存在下（破線）または不在下（実線）における、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）（０〜２５０ｎＭ）（図１Ｅ）またはパクリタキセル（０〜２．５ｎＭ）（図１Ｆ）の関数としての、Ｕ８７ヒト神経膠腫細胞の細胞死（％、ヨウ化プロピジウム蛍光によって測定された）を示すグラフである。
【図２−１】図２Ａは、３Ｅ１０−ＤＮＡ結合実験において使用したＤＮＡ基質の異なるコンフォメーションを示す。図２Ｂは、漸増濃度の３Ｅ１０（０〜１μＭ）と一緒にインキュベートした後に３Ｅ１０が結合した遊離の一本鎖テイル（ゲル移動度シフト分析によって決定される）を有する（実線）または有さない（破線）、放射性標識したオリゴヌクレオチドの割合（％）を示すグラフである。これらの結合曲線により、３Ｅ１０の、遊離の一本鎖末端を有する基質およびそれを有さない基質への結合について、それぞれ０．２μＭおよび０．４μＭのＫｄがもたらされる。図２Ｃ〜２Ｈは、各ＤＮＡコンフォメーションについての個々の３Ｅ１０−ＤＮＡ結合曲線を示す。図２Ｉは、対照緩衝液（白抜きの棒）または２０μＭの３Ｅ１０（黒塗りの棒）の存在下で、必要な修復酵素と一緒にインキュベートした合成の放射性標識した二重鎖ＤＮＡ基質における一本鎖切断／塩基除去修復（ＢＥＲ）（％ｎ＋１生成物は、ギャップが生じた二重鎖分子にはヌクレオチドが付加されたが、残りの一本鎖切断は修復されず、全長の生成物がもたらされていない、修復が不完全な中間体の割合を示す）を示す棒グラフである。示されている時点で修復反応を停止させ、ｎ、ｎ＋１、および二重鎖反応生成物をゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーによって定量化した。
【図２−２】図２Ａは、３Ｅ１０−ＤＮＡ結合実験において使用したＤＮＡ基質の異なるコンフォメーションを示す。図２Ｂは、漸増濃度の３Ｅ１０（０〜１μＭ）と一緒にインキュベートした後に３Ｅ１０が結合した遊離の一本鎖テイル（ゲル移動度シフト分析によって決定される）を有する（実線）または有さない（破線）、放射性標識したオリゴヌクレオチドの割合（％）を示すグラフである。これらの結合曲線により、３Ｅ１０の、遊離の一本鎖末端を有する基質およびそれを有さない基質への結合について、それぞれ０．２μＭおよび０．４μＭのＫｄがもたらされる。図２Ｃ〜２Ｈは、各ＤＮＡコンフォメーションについての個々の３Ｅ１０−ＤＮＡ結合曲線を示す。図２Ｉは、対照緩衝液（白抜きの棒）または２０μＭの３Ｅ１０（黒塗りの棒）の存在下で、必要な修復酵素と一緒にインキュベートした合成の放射性標識した二重鎖ＤＮＡ基質における一本鎖切断／塩基除去修復（ＢＥＲ）（％ｎ＋１生成物は、ギャップが生じた二重鎖分子にはヌクレオチドが付加されたが、残りの一本鎖切断は修復されず、全長の生成物がもたらされていない、修復が不完全な中間体の割合を示す）を示す棒グラフである。示されている時点で修復反応を停止させ、ｎ、ｎ＋１、および二重鎖反応生成物をゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーによって定量化した。
【図３−１】図３Ａは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＤＮＡ鎖交換反応アッセイについての概略図である。図３Ｂおよび３Ｃは、野生型ｈＲＡＤ５１タンパク質（図３Ｂ）または改変体であるｈＲＡＤ５１Ｋ１３３Ｒ（図３Ｃ）を使用したＲＡＤ５１媒介性鎖交換反応に対する漸増用量の３Ｅ１０（０〜３５μＭ）の影響を示す棒グラフである。ｈＲＡＤ５１Ｋ１３３Ｒ改変体は、ＡＴＰを加水分解しないので、鎖交換反応に関して野生型タンパク質よりもさらに活性である。３Ｅ１０により、野生型ＲＡＤ５１による鎖交換反応とｈＲＡＤ５１Ｋ１３３Ｒ改変体による鎖交換反応のどちらも阻害される。免疫蛍光による画像により、対照緩衝液または１０μＭの３Ｅ１０  ｓｃＦｖの存在下、２Ｇｙで放射線照射した２４時間後のＵ２５１神経膠腫細胞当たりのＤＮＡ二本鎖切断（γＨ２ＡＸ巣）が実証されている。図３Ｄは、対照緩衝液（白抜きの棒）または１０μＭの３Ｅ１０  ｓｃＦｖ（黒塗りの棒）の存在下、２Ｇｙで照射してから２４時間後のＵ２５１神経膠腫細胞当たりのＤＮＡ二本鎖切断（γＨ２ＡＸ巣）の平均数を示す棒グラフである。エラーバーは、標準誤差を示す。
【図３−２】図３Ａは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＤＮＡ鎖交換反応アッセイについての概略図である。図３Ｂおよび３Ｃは、野生型ｈＲＡＤ５１タンパク質（図３Ｂ）または改変体であるｈＲＡＤ５１Ｋ１３３Ｒ（図３Ｃ）を使用したＲＡＤ５１媒介性鎖交換反応に対する漸増用量の３Ｅ１０（０〜３５μＭ）の影響を示す棒グラフである。ｈＲＡＤ５１Ｋ１３３Ｒ改変体は、ＡＴＰを加水分解しないので、鎖交換反応に関して野生型タンパク質よりもさらに活性である。３Ｅ１０により、野生型ＲＡＤ５１による鎖交換反応とｈＲＡＤ５１Ｋ１３３Ｒ改変体による鎖交換反応のどちらも阻害される。免疫蛍光による画像により、対照緩衝液または１０μＭの３Ｅ１０  ｓｃＦｖの存在下、２Ｇｙで放射線照射した２４時間後のＵ２５１神経膠腫細胞当たりのＤＮＡ二本鎖切断（γＨ２ＡＸ巣）が実証されている。図３Ｄは、対照緩衝液（白抜きの棒）または１０μＭの３Ｅ１０  ｓｃＦｖ（黒塗りの棒）の存在下、２Ｇｙで照射してから２４時間後のＵ２５１神経膠腫細胞当たりのＤＮＡ二本鎖切断（γＨ２ＡＸ巣）の平均数を示す棒グラフである。エラーバーは、標準誤差を示す。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｂは、対照緩衝液（白抜きの棒）または１０μＭの３Ｅ１０  ｓｃＦｖ（黒塗りの棒）を用いて処理したＢＲＣＡ２非欠損（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）ヒト卵巣癌細胞（図４Ａ）またはＢＲＣＡ２欠損ヒト卵巣癌細胞（図４Ｂ）の、処理後１〜２週間に測定されたコロニー形成によるクローン原性生存（対照と比較した生存の割合）を示す棒グラフである。図４Ｃは、３Ｅ１０  ｓｃＦｖ（０〜２μＭ）を用いて処理したＢＲＣＡ２欠損（ＰＥＯ１）ヒト卵巣癌細胞およびＢＲＣＡ２非欠損（ＰＥＯ４）ヒト卵巣癌細胞の％細胞死を示すグラフである。処理の３日後に、細胞生存に対する３Ｅ１０  ｓｃＦｖの影響を、代謝的に活性な細胞の尺度としてＡＴＰレベルが報告されるＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）発光によって評価した。エラーバーは、６回の測定の平均値の標準誤差を示す。図４Ｄは、対照緩衝液または３Ｅ１０  ｓｃＦｖを用いて処理したＢＲＣＡ２欠損ＣＡＰＡＮ１／ｎｅｏ細胞（ヒト膵癌細胞）のクローン原性生存（コロニー形成によって測定された、対照と比較した生存の割合）を示すグラフである。図４Ｅは、０μＭ、２．５μＭ、５μＭ、または１０μＭの完全な３Ｅ１０抗体を用いて処理したＢＲＣＡ２欠損ヒト卵巣癌細胞（破線）またはＢＲＣＡ２非欠損ヒト卵巣癌細胞（実線）の細胞死（％）を示すグラフである。図４Ｆおよび４Ｇは、対照緩衝液（棒１）、１０μＭの３Ｅ１０（棒２）、３ｎＭのドキソルビシン（Ｄｏｘ）（棒３）、または１０μＭの３Ｅ１０＋３ｎＭのドキソルビシン（棒４）を用いて処理したＢＲＣＡ２欠損ヒト卵巣癌細胞（図４Ｇ）またはＢＲＣＡ２非欠損ヒト卵巣癌細胞（図４Ｆ）の細胞死（％）を示す棒グラフである。
【図４−２】図４Ａ〜４Ｂは、対照緩衝液（白抜きの棒）または１０μＭの３Ｅ１０  ｓｃＦｖ（黒塗りの棒）を用いて処理したＢＲＣＡ２非欠損（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）ヒト卵巣癌細胞（図４Ａ）またはＢＲＣＡ２欠損ヒト卵巣癌細胞（図４Ｂ）の、処理後１〜２週間に測定されたコロニー形成によるクローン原性生存（対照と比較した生存の割合）を示す棒グラフである。図４Ｃは、３Ｅ１０  ｓｃＦｖ（０〜２μＭ）を用いて処理したＢＲＣＡ２欠損（ＰＥＯ１）ヒト卵巣癌細胞およびＢＲＣＡ２非欠損（ＰＥＯ４）ヒト卵巣癌細胞の％細胞死を示すグラフである。処理の３日後に、細胞生存に対する３Ｅ１０  ｓｃＦｖの影響を、代謝的に活性な細胞の尺度としてＡＴＰレベルが報告されるＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）発光によって評価した。エラーバーは、６回の測定の平均値の標準誤差を示す。図４Ｄは、対照緩衝液または３Ｅ１０  ｓｃＦｖを用いて処理したＢＲＣＡ２欠損ＣＡＰＡＮ１／ｎｅｏ細胞（ヒト膵癌細胞）のクローン原性生存（コロニー形成によって測定された、対照と比較した生存の割合）を示すグラフである。図４Ｅは、０μＭ、２．５μＭ、５μＭ、または１０μＭの完全な３Ｅ１０抗体を用いて処理したＢＲＣＡ２欠損ヒト卵巣癌細胞（破線）またはＢＲＣＡ２非欠損ヒト卵巣癌細胞（実線）の細胞死（％）を示すグラフである。図４Ｆおよび４Ｇは、対照緩衝液（棒１）、１０μＭの３Ｅ１０（棒２）、３ｎＭのドキソルビシン（Ｄｏｘ）（棒３）、または１０μＭの３Ｅ１０＋３ｎＭのドキソルビシン（棒４）を用いて処理したＢＲＣＡ２欠損ヒト卵巣癌細胞（図４Ｇ）またはＢＲＣＡ２非欠損ヒト卵巣癌細胞（図４Ｆ）の細胞死（％）を示す棒グラフである。
【図４−３】図４Ａ〜４Ｂは、対照緩衝液（白抜きの棒）または１０μＭの３Ｅ１０  ｓｃＦｖ（黒塗りの棒）を用いて処理したＢＲＣＡ２非欠損（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）ヒト卵巣癌細胞（図４Ａ）またはＢＲＣＡ２欠損ヒト卵巣癌細胞（図４Ｂ）の、処理後１〜２週間に測定されたコロニー形成によるクローン原性生存（対照と比較した生存の割合）を示す棒グラフである。図４Ｃは、３Ｅ１０  ｓｃＦｖ（０〜２μＭ）を用いて処理したＢＲＣＡ２欠損（ＰＥＯ１）ヒト卵巣癌細胞およびＢＲＣＡ２非欠損（ＰＥＯ４）ヒト卵巣癌細胞の％細胞死を示すグラフである。処理の３日後に、細胞生存に対する３Ｅ１０  ｓｃＦｖの影響を、代謝的に活性な細胞の尺度としてＡＴＰレベルが報告されるＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）発光によって評価した。エラーバーは、６回の測定の平均値の標準誤差を示す。図４Ｄは、対照緩衝液または３Ｅ１０  ｓｃＦｖを用いて処理したＢＲＣＡ２欠損ＣＡＰＡＮ１／ｎｅｏ細胞（ヒト膵癌細胞）のクローン原性生存（コロニー形成によって測定された、対照と比較した生存の割合）を示すグラフである。図４Ｅは、０μＭ、２．５μＭ、５μＭ、または１０μＭの完全な３Ｅ１０抗体を用いて処理したＢＲＣＡ２欠損ヒト卵巣癌細胞（破線）またはＢＲＣＡ２非欠損ヒト卵巣癌細胞（実線）の細胞死（％）を示すグラフである。図４Ｆおよび４Ｇは、対照緩衝液（棒１）、１０μＭの３Ｅ１０（棒２）、３ｎＭのドキソルビシン（Ｄｏｘ）（棒３）、または１０μＭの３Ｅ１０＋３ｎＭのドキソルビシン（棒４）を用いて処理したＢＲＣＡ２欠損ヒト卵巣癌細胞（図４Ｇ）またはＢＲＣＡ２非欠損ヒト卵巣癌細胞（図４Ｆ）の細胞死（％）を示す棒グラフである。
【図４−４】図４Ａ〜４Ｂは、対照緩衝液（白抜きの棒）または１０μＭの３Ｅ１０  ｓｃＦｖ（黒塗りの棒）を用いて処理したＢＲＣＡ２非欠損（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）ヒト卵巣癌細胞（図４Ａ）またはＢＲＣＡ２欠損ヒト卵巣癌細胞（図４Ｂ）の、処理後１〜２週間に測定されたコロニー形成によるクローン原性生存（対照と比較した生存の割合）を示す棒グラフである。図４Ｃは、３Ｅ１０  ｓｃＦｖ（０〜２μＭ）を用いて処理したＢＲＣＡ２欠損（ＰＥＯ１）ヒト卵巣癌細胞およびＢＲＣＡ２非欠損（ＰＥＯ４）ヒト卵巣癌細胞の％細胞死を示すグラフである。処理の３日後に、細胞生存に対する３Ｅ１０  ｓｃＦｖの影響を、代謝的に活性な細胞の尺度としてＡＴＰレベルが報告されるＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）発光によって評価した。エラーバーは、６回の測定の平均値の標準誤差を示す。図４Ｄは、対照緩衝液または３Ｅ１０  ｓｃＦｖを用いて処理したＢＲＣＡ２欠損ＣＡＰＡＮ１／ｎｅｏ細胞（ヒト膵癌細胞）のクローン原性生存（コロニー形成によって測定された、対照と比較した生存の割合）を示すグラフである。図４Ｅは、０μＭ、２．５μＭ、５μＭ、または１０μＭの完全な３Ｅ１０抗体を用いて処理したＢＲＣＡ２欠損ヒト卵巣癌細胞（破線）またはＢＲＣＡ２非欠損ヒト卵巣癌細胞（実線）の細胞死（％）を示すグラフである。図４Ｆおよび４Ｇは、対照緩衝液（棒１）、１０μＭの３Ｅ１０（棒２）、３ｎＭのドキソルビシン（Ｄｏｘ）（棒３）、または１０μＭの３Ｅ１０＋３ｎＭのドキソルビシン（棒４）を用いて処理したＢＲＣＡ２欠損ヒト卵巣癌細胞（図４Ｇ）またはＢＲＣＡ２非欠損ヒト卵巣癌細胞（図４Ｆ）の細胞死（％）を示す棒グラフである。
【図５】図５は、対照緩衝液（棒１）、３Ｅ１０抗体単独で（ＰＢＳ  ０．５ｍＬ中０．８ｍｇ、１０μＭ）（棒２）、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）単独で（８０μｇ／ｋｇ）（棒３）、または３Ｅ１０とドキソルビシンの両方（棒４）を腹腔内注射することによって処置した、ＳＣＩＤマウスにおいて皮下注射によって生成したＵ８７神経膠腫瘍の腫瘍体積（％増大）を示す棒グラフである。各処置群はマウス４匹で構成された。処置の影響を、注射の３日後に腫瘍の成長を測定することによって評価した。
【図６Ａ】図６Ａは、Ｕ８７細胞を移植した２６日後（腫瘍はおよそ１００ｍｍ３の平均サイズに成長していた）、および２４時間後に再度、対照ＰＢＳ緩衝液（黒塗りのひし形および三角形）または３Ｅ１０（ＰＢＳ中１ｍｇ）（白抜きのひし形および三角形）を腹腔内注射し、次いで、２回目の注射の２時間後に０Ｇｙ（ひし形）または８Ｇｙ（三角形）で照射したヒト神経膠腫異種移植マウスの腫瘍体積（ｍｍ３）を時間（日数）の関数として示すグラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、各群における無進行生存のカプラン・マイヤープロットを示す。無進行生存は、ベースラインのサイズと比較してサイズが３倍以上増大していない腫瘍を伴う生存と定義される。ベースラインのサイズは、抗体処置する１日前の腫瘍サイズと定義され、これは、図６Ａでは２５日目、図６Ｂでは０日目と示される。腫瘍三倍化時間（腫瘍の体積がベースラインの３倍に増大するために必要な時間）は、８Ｇｙで処置した腫瘍では９．５±０．５日間であり、それと比較して、８Ｇｙ＋３Ｅ１０で処置した腫瘍では１３．７±１．８日であった（ｐ＝０．０４）。しかし、３Ｅ１０単独では、対照緩衝液単独と比較して、Ｕ８７腫瘍に対する影響はなく、腫瘍三倍化時間は対照腫瘍では６．８±０．７日であったのに対し、３Ｅ１０単独で処置した腫瘍では６．５±０．３日であった（ｐ＝０．６７）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
Ｉ．定義
「抗体」という用語は、標的抗原に選択的に結合する天然抗体または合成抗体を指す。この用語は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を包含する。「抗体」という用語には、インタクトな免疫グロブリン分子に加えて、標的抗原に選択的に結合する、それらの免疫グロブリン分子の断片またはポリマーおよび免疫グロブリン分子のヒトまたはヒト化バージョンも包含される。
【００２２】
「細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体」という用語は、生きている哺乳動物の細胞の核内に輸送され、ＤＮＡ（例えば、一本鎖ＤＮＡおよび／または二本鎖ＤＮＡ）に特異的に結合する抗体を指す。好ましい実施形態では、抗体は、担体または結合体による補助を伴わずに細胞の核内に輸送される。他の実施形態では、抗体を細胞浸透性ペプチドなどの細胞浸透性部分と結合体化する。
【００２３】
「特異的に結合する」という用語は、抗体がその同族抗原（例えばＤＮＡ）には結合するが、他の抗原には有意に結合しないことを指す。抗体は、抗原に、約１０５ｍｏｌ−１（例えば、１０６ｍｏｌ−１、１０７ｍｏｌ−１、１０８ｍｏｌ−１、１０９ｍｏｌ−１、１０１０ｍｏｌ−１、１０１１ｍｏｌ−１、および１０１２ｍｏｌ−１またはそれ以上）を超える親和定数（Ｋａ）で、その第２の分子を伴って「特異的に結合する」ことが好ましい。
【００２４】
「モノクローナル抗体」または「ＭＡｂ」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、集団内の個々の抗体が、抗体分子の小さなサブセットに存在し得る、可能性のある自然に起こる変異以外は同一である集団から得られた抗体を指す。
【００２５】
「ＤＮＡ修復」という用語は、細胞がＤＮＡ分子の損傷を同定し、補正するプロセスの集合を指す。一本鎖欠陥は、塩基除去修復（ＢＥＲ）、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）、またはミスマッチ修復（ＭＭＲ）によって修復される。二本鎖切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、または相同組換えによって修復される。ＤＮＡ損傷の後、細胞周期チェックポイントが活性化され、これにより細胞周期が休止し、細胞に、分裂を続ける前に損傷を修復する時間が与えられる。チェックポイントメディエータータンパク質としては、ＢＲＣＡ１、ＭＤＣ１、５３ＢＰ１、ｐ５３、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、およびｐ２１が挙げられる。
【００２６】
「ＤＮＡ修復が損なわれている」という用語は、変異した細胞または遺伝子発現の変化を伴う細胞が、ＤＮＡ修復を行うことができない、または１つまたは複数のＤＮＡ修復経路の活性が低下している、またはそのＤＮＡの損傷を修復するために野生型細胞と比較してより時間がかかる状態を指す。
【００２７】
「化学感受性」という用語は、抗癌剤の効果に対する癌細胞の相対的な感受性を指す。癌細胞の化学感受性が高いほど、その癌細胞を死滅させるために必要な抗癌剤は少なくなる。
【００２８】
「放射線感受性」という用語は、電離放射線の有害作用に対する細胞の相対的な感受性を指す。細胞の放射線感受性が高いほど、その細胞を死滅させるために必要な放射線は少なくなる。一般に、細胞の放射線感受性は細胞分裂の速度に正比例し、ＤＮＡ修復に関する細胞の能力に反比例することが見いだされている。
【００２９】
「放射線抵抗性」という用語は、臨床的に適切な線量の放射線に曝露されても死滅しない細胞を指す。
【００３０】
「新生細胞」という用語は、異常な細胞増殖（「新形成」）を受けている細胞を指す。新生細胞の成長は、その周りの正常組織の成長を超え、それと調和しない。成長は、一般には、刺激の休止後でさえも同じく過剰に持続し、一般には、腫瘍の形成が引き起こされる。
【００３１】
「腫瘍」または「新生物」という用語は、新生細胞を含有する、異常な組織の塊を指す。新生物および腫瘍は良性、前悪性、または悪性であり得る。
【００３２】
「癌」または「悪性新生物」という用語は制御されていない成長、近接する組織への浸潤、および多くの場合、身体の他の場所への転移を示す細胞を指す。
【００３３】
「抗新生物」という用語は、癌の成長、浸潤、および／または転移を阻害または予防することができる薬物または生物製剤などの組成物を指す。
【００３４】
「抗癌部分」という用語は、抗体の抗癌性を増強するために、開示されている抗ＤＮＡ抗体と組み合わせることができるペプチド、タンパク質、核酸、または小分子などの任意の薬剤を指す。この用語は、抗新生物薬、癌細胞内の他の治療標的に結合し、それを阻害する抗体、および癌細胞を指向性ターゲティングするための癌細胞に対する親和性を有する物質を包含する。
【００３５】
「ウイルスにより形質転換された細胞」という用語は、ウイルスに感染した細胞またはそのゲノム内にウイルスＤＮＡまたはＲＮＡが組み入れられた細胞を指す。ウイルスは、急性的に形質転換する発癌性ウイルス、またはゆっくりと形質転換する発癌性ウイルスであってよい。急性的に形質転換するウイルスでは、ウイルス粒子は、ウイルスの癌遺伝子（ｖ−ｏｎｃ）と称される活性が過剰な（ｏｖｅｒａｃｔｉｖｅ）癌遺伝子をコードする遺伝子を保有し、感染細胞は、ｖ−ｏｎｃが発現するとすぐに形質転換される。対照的に、ゆっくりと形質転換するウイルスでは、ウイルスのゲノムは宿主ゲノム内の癌原遺伝子の近くに挿入される。例示的なオンコウイルスとしては、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＨＨＶ−８）、メルケル細胞ポリオーマウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）が挙げられる。
【００３６】
ウイルス感染細胞とは、ウイルスに曝露されているまたはウイルスに感染したまたはウイルスの遺伝子材料、ＲＮＡもしくはＤＮＡを保有する細胞を指す。ウイルスは、発癌性ウイルスまたは溶解性ウイルスまたは潜伏ウイルスであってよく、癌、免疫不全、肝炎、脳炎、肺臓炎、呼吸器疾患、または他の疾患状態を引き起こす可能性がある。レトロウイルス、特にＨＩＶは、宿主ＤＮＡへの組込みのために塩基除去修復（ＢＥＲ）経路に部分的に依拠することが以前に示されている。ＤＮＡ修復を阻害する３Ｅ１０の能力により、３Ｅ１０および他の抗ＤＮＡ抗体によって、ウイルスによって引き起こされた疾患を、詳細には、ＤＮＡ修復を妨害することによって、およびそれにより、ウイルスの生活環の一部であるＤＮＡまたはＲＮＡの代謝ならびに細胞のウイルス感染の一部を遮断することによって緩和することができる機構がもたらされる。実施例により、３Ｅ１０によりＢＥＲ経路が阻害されることが実証されており、そのようなレトロウイルスの感染性を抑制することにおける有効性が裏付けられる。
【００３７】
「個体」、「宿主」、「被験体」、および「患者」という用語は、互換的に使用され、投与または処置の標的である任意の個体を指す。被験体は脊椎動物、例えば、哺乳動物であってよい。したがって、被験体はヒト患者または獣医学上の患者であってよい。
【００３８】
「治療的に有効な」という用語は、使用される組成物の量が、疾患または障害の１つまたは複数の原因または症状を緩和するために十分な分量であることを意味する。そのような緩和には、低下または変化のみが必要であり、排除は必ずしも必要ではない。癌を処置するための治療有効量の組成物は、腫瘍の退縮を引き起こすまたは腫瘍を放射線または化学療法に対して感作させるために十分な量であることが好ましい。
【００３９】
「薬学的に許容される」という用語は、生物学的にまたは他の点で望ましくないものではない材料、すなわち、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こすことなく、または材料が含有される医薬組成物の他の構成成分のいずれとも有害に相互作用することなく、被験体に投与することができる材料を指す。担体は、当業者には周知の通り、活性成分のいかなる分解も最小限になるように、また、被験体におけるいかなる有害な副作用も最小限になるように当然選択される。
【００４０】
「処置」という用語は、疾患、病的状態、または障害を治癒、緩和、安定化、または予防するための、患者の医学的管理を指す。この用語は、積極的治療、すなわち、疾患、病的状態、または障害を改善することを特に対象とする処置を包含し、また、原因治療、すなわち、関連する疾患、病的状態、または障害の原因を除去することを対象とする処置も包含する。さらに、この用語は、待期療法、すなわち、疾患、病的状態、または障害を治癒するよりも症状を軽減するために設計された処置；予防的治療、すなわち、関連する疾患、病的状態、または障害の発生を最小限にすること、または部分的もしくは完全に阻害することを対象とする処置；および支持的治療、すなわち、関連する疾患、病的状態、または障害を改善することを対象とする別の特定の療法を補助するために用いられる処置を包含する。
【００４１】
「阻害する」という用語は、活性、応答、状態、疾患、または他の生物学的パラメータが減少することを意味する。これは、これだけに限定されないが、活性、応答、状態、または疾患の完全な消失を含んでよい。これは、例えば、活性、応答、状態、または疾患がネイティブなレベルまたは対照レベルと比較して１０％低下することも含んでよい。したがって、低下は、ネイティブなレベルまたは対照レベルと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはその間の任意の量の低下であってよい。
【００４２】
「融合タンパク質」とは、２種以上のポリペプチドを、一方のポリペプチドのアミノ末端ともう一方のポリペプチドのカルボキシル末端との間に形成されるペプチド結合を通じてつなぐことによって形成されるポリペプチドを指す。融合タンパク質は、構成要素であるポリペプチドを化学的にカップリングすることによって形成することができるか、または、単一の連続した融合タンパク質をコードする核酸配列から単一のポリペプチドとして発現させることができる。単鎖の融合タンパク質は、単一の連続したポリペプチドの主鎖を有する融合タンパク質である。融合タンパク質は、２つの遺伝子をインフレームでつないで単一の核酸配列にし、次いで、適切な宿主細胞において、融合タンパク質が産生される条件下で核酸を発現させる、分子生物学における従来の技法を用いて調製することができる。
【００４３】
ＩＩ．組成物
Ａ．抗ＤＮＡ抗体
標的とされる細胞の、化学療法および／または放射線に対する感受性を増強することにおいて使用するための細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体が開示されている。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者の血清中に一本鎖または二本鎖のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に対する自己抗体がしばしば同定され、これは多くの場合、疾患の病因に関係づけられる。したがって、いくつかの実施形態では、抗ＤＮＡ抗体はＳＬＥの患者に由来するものであってよい、またはＳＬＥの患者から単離することができる。好ましい実施形態では、抗ＤＮＡ抗体は、モノクローナル抗体、またはそれらの断片または改変体である。ＤＮＡに対して反応性の循環自己抗体（抗ＤＮＡ抗体）が存在することは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者における目印となる実験上の知見である。ＳＬＥにおける抗ＤＮＡ抗体の正確な役割は不明であるが、この抗体は、ＳＬＥの病態生理において積極的な役割を果たすことが示唆される。１９９０年代の初めに、マウスループス抗ＤＮＡ抗体である３Ｅ１０が、ＳＬＥに対する実験的なワクチン療法において試験された。これらの試みは、ＳＬＥ患者における抗ＤＮＡ抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を開発することを目的とするものであった。しかし、思いがけなく、３Ｅ１０は、いかなる観察される細胞毒性も引き起こすことなく生細胞および核に浸透することが見いだされた（Ｗｅｉｓｂａｒｔ  ＲＨら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９０年、１４４巻（７号）：２６５３〜２６５８頁；Ｚａｃｋ  ＤＪら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９６年、１５７巻（５号）：２０８２〜２０８８頁）。その後、ＳＬＥのワクチン療法における３Ｅ１０に関する研究は、３Ｅ１０を、治療分子を細胞および核内に輸送するための分子送達ビヒクルとして開発することを焦点とした試みに取って代わられた。他の抗体も細胞に浸透することが報告されている。
【００４４】
３Ｅ１０抗体およびその単鎖可変性断片（３Ｅ１０  ｓｃＦｖ）は、細胞および核内に浸透し、化学的な結合体化または組換え融合のいずれかによって抗体に付着させた治療用タンパク質カーゴを輸送することができることが証明されている。３Ｅ１０または３Ｅ１０  ｓｃＦｖによって細胞に送達されるタンパク質カーゴとしては、カタラーゼ、ｐ５３、およびＨｓｐ７０が挙げられる（Ｗｅｉｓｂａｒｔ  ＲＨら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０００年、１６４巻：６０２０〜６０２６頁；Ｈａｎｓｅｎ  ＪＥら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００７年２月１５日；６７巻（４号）：１７６９〜７４頁；Ｈａｎｓｅｎ  ＪＥら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ２００６年５月９日；１０８８巻（１号）：１８７〜９６頁）。３Ｅ１０  ｓｃＦｖにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＨｓｐ７０のニューロンへの送達が有効に媒介され、その結果、ラット脳卒中モデルにおいて大脳梗塞の体積が減少し、神経学的な機能が改善された（Ｚｈａｎ  Ｘら、Ｓｔｒｏｋｅ．  ２０１０年、４１巻（３号）：５３８〜４３頁）。
【００４５】
現在、３Ｅ１０および３Ｅ１０  ｓｃＦｖにより、いかなる治療用タンパク質とも結合体化することなく、癌細胞の放射線感受性および化学感受性が増強されること、および、この効果はＤＮＡ修復が欠損した細胞において強化されることが発見されている。さらに、３Ｅ１０および３Ｅ１０  ｓｃＦｖは、放射線または化学療法の不在下であっても、ＤＮＡ修復が欠損した癌細胞に対して選択的に致死的である。食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）により、モノクローナル抗体をヒトの療法に発展させる経路が確立され、３Ｅ１０は、ＳＬＥに対する実験的なワクチン療法における３Ｅ１０の有効性を試験するために設計された第Ｉ相ヒト臨床試験における使用に関してすでにＦＤＡによって認可されている（Ｓｐｅｒｔｉｎｉ  Ｆら、Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．  １９９９年、２６巻（１２号）：２６０２〜８頁）。したがって、これらの種類の抗体を、ＤＮＡ修復が欠損した癌に対するターゲティング療法のために、ならびに癌に対する新規のターゲティング療法においてＤＮＡ修復が非欠損の癌ならびにＤＮＡ修復が欠損した癌における他の癌処置モダリティを強化するために使用することができる。
【００４６】
他の細胞浸透性抗体として、ＳＬＥ患者に天然に存在するもの、および抗体ライブラリーをスクリーニングすることまたは公知の細胞浸透性抗体を誘導体化することによって得られるものの両方が公知である。いくつかの実施形態では、抗ＤＮＡ抗体を、細胞内への侵入および核への輸送を容易にするために、細胞浸透性ペプチドなどの細胞浸透性部分と結合体化する。細胞浸透性ペプチドの例としては、これらだけに限定されないが、ポリアルギニン（例えば、Ｒ９）、アンテナペディア配列、ＴＡＴ、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ペネトラチン、Ａｎｔｐ−３Ａ（Ａｎｔｐ変異体）、Ｂｕｆｏｒｉｎ  ＩＩ、トランスポータン、ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）、Ｋ−ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ−１、ＳｙｎＢ１、Ｐｅｐ−７、ＨＮ−１、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロール、およびＢＧＴＣ（ビス−グアニジニウム−トレン−コレステロール）が挙げられる。他の実施形態では、ＴｒａｎｓＭａｂｓ（商標）技術（ＩｎＮｅｘｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）を用いて抗体を修飾することができる。
【００４７】
好ましい実施形態では、抗ＤＮＡ抗体は、担体または結合体による補助を伴わずに細胞の核内に輸送される。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて哺乳動物の細胞の核に細胞毒性効果を伴わずに輸送されるモノクローナル抗体３Ｅ１０およびその活性断片は、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｗｅｉｓｂａｒｔの米国特許第４，８１２，３９７号および同第７，１８９，３９６号に開示されており、そこには３Ｅ１０抗体および３Ｅ１０抗体の作製および修飾方法が記載されている。簡単に述べると、抗体は、抗ＤＮＡ抗体の血清レベルが上昇した宿主（例えば、ＭＲＬ／１ｐｒマウス）由来の脾臓細胞を、公知の技法に従って骨髄腫細胞と融合することによって、または、脾臓細胞を、適切な形質転換ベクターを用いて形質転換して、細胞を不死化することによって調製することができる。細胞を選択培地において培養し、スクリーニングしてＤＮＡに結合する抗体を選択することができる。
【００４８】
使用することができる抗体としては、任意のクラスの免疫グロブリン全体（すなわち、インタクトな抗体）、その断片、および少なくとも抗体の抗原結合可変ドメインを含有する合成タンパク質が挙げられる。可変ドメインは、抗体の間で配列が異なり、特定の抗体のそれぞれの、その特定の抗原に対する結合および特異性に使用されている。しかし、通常、変動性は抗体の可変ドメインを通して一様に分布しているのではない。軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方にある相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と称される３つのセグメントに集中することが一般的である。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と称される。ネイティブな重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、４つのＦＲ領域を含み、これは主としてベータ−シート立体配置をとっており、３つのＣＤＲによって接続されており、ＣＤＲはベータ−シート構造を接続し、いくつかの場合にはベータ−シート構造の一部を形成するループを形成している。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域の極めて近傍にまとめて保持されており、他の鎖に由来するＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。したがって、抗体は、少なくとも、細胞に浸透し、ＤＮＡの結合を維持し、かつ／またはＤＮＡ修復を妨害するために必要なＣＤＲの構成成分を含有する。３Ｅ１０の可変領域は、３つの性質の全てを有する。
【００４９】
生物活性を有する抗体の断片も開示されている。他の配列に付着しているかどうかにかかわらず、断片の活性が、修飾されていない抗体または抗体断片と比較して有意に変更されない、または損なわれないのであれば、断片は、特定の領域または特定のアミノ酸残基に挿入、欠失、置換、または他の選択された修飾を含む。
【００５０】
抗原性タンパク質に特異的な単鎖抗体の作製に技法を適応させることもできる。単鎖抗体を作製するための方法は当業者に周知である。単鎖抗体は、重鎖および軽鎖の可変ドメインを、短いペプチドリンカーを用いて融合し、それにより、単一分子上の抗原結合部位を再構成することによって創出することができる。一方の可変ドメインのＣ末端が他方の可変ドメインのＮ末端と１５〜２５アミノ酸ペプチドまたはリンカーで係留された単鎖抗体可変性断片（ｓｃＦｖ）が、抗原の結合または結合の特異性を有意に撹乱することなく開発されてきた。リンカーは、重鎖および軽鎖がそれらの適切なコンフォメーション方向で結合することが可能になるように選択される。
【００５１】
抗ＤＮＡ抗体を修飾して、それらの治療可能性を改善することができる。例えば、いくつかの実施形態では、細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体を、癌細胞の核内の第２の治療標的に特異的な別の抗体と結合体化する。例えば、細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体は、３Ｅ１０  ｓｃＦｖおよび第２の治療標的に特異的に結合するモノクローナル抗体の単鎖可変性断片を含有する融合タンパク質であってよい。他の実施形態では、細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体は、３Ｅ１０由来の第１の重鎖および第１の軽鎖ならびに第２の治療標的に特異的に結合するモノクローナル抗体由来の第２の重鎖および第２の軽鎖を有する二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。
【００５２】
二価の単鎖可変性断片（ｄｉ−ｓｃＦｖ）は、２つのｓｃＦｖを連結することによって作り出すことができる。これは、２つのＶＨ領域および２つのＶＬ領域を有する単一のペプチド鎖を作製することによって行うことができ、これにより、タンデムなｓｃＦｖがもたらされる。ＳｃＦｖは、２つの可変領域が一緒に折りたたまれるには短いリンカーペプチド（約５アミノ酸）を用いて設計することができ、これにより、ｓｃＦｖは二量体を形成することになる。この種類のものは、二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）として公知である。二特異性抗体は、対応するｓｃＦｖの４０分の１に至るまで低い解離定数を有する、つまり、それらの標的に対してさらに高い親和性を有することが示されている。さらに短いリンカー（１アミノ酸または２アミノ酸）により、三量体（三特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙまたはｔｒｉｂｏｄｙ））の形成が導かれる。四特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）も作製されている。これらは、それらの標的に対して二特異性抗体よりもさらに高い親和性を有する。
【００５３】
抗体の治療的機能は、抗体またはその断片を治療剤とカップリングすることによって増強することができる。そのような抗体または断片と治療剤のカップリングは、免疫結合体を作出することによって、または融合タンパク質を作出することによって、または、抗体もしくは断片をｓｉＲＮＡなどの核酸もしくは抗体または抗体断片および治療剤を含む小分子と連結することによって達成することができる。
【００５４】
組換え融合タンパク質は、融合遺伝子を遺伝子操作することによって創出されるタンパク質である。これは、一般には、第１のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列から終止コドンを除去し、次いで、第２のタンパク質のｃＤＮＡ配列をライゲーションまたはオーバーラップ伸長ＰＣＲによってインフレームで付け加えることを伴う。次いで、このＤＮＡ配列を、細胞に単一のタンパク質として発現させる。このタンパク質を作り出して、元のタンパク質の両方、またはいずれかの一部のみの完全な配列を含めることができる。２つの実体がタンパク質であれば、多くの場合、タンパク質がそれぞれ独立に折りたたまれ、予測通り挙動する可能性を高めるリンカー（または「スペーサー」）ペプチドを付加することもできる。
【００５５】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「移入」残基と称され、これは、一般には、「移入」可変ドメインから取得される。抗体ヒト化技法は、一般に、抗体分子の１つまたは複数のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作するために組換えＤＮＡ技術を用いることを伴う。
【００５６】
いくつかの実施形態では、細胞浸透性抗体を修飾して、その半減期を変化させる。いくつかの実施形態では、抗体が循環内または処置部位により長い期間存在するように、抗体の半減期を増大させることが望ましい。例えば、癌、例えば、ＤＮＡ修復が損なわれている癌細胞を処置するために抗ＤＮＡ抗体を単独で使用している場合、循環内または処置される場所における抗体の力価が長期間維持されることが望ましい。他の実施形態では、潜在的な副作用を減少させるために、抗ＤＮＡ抗体の半減期を減少させる。例えば、抗体を放射線治療または化学療法と併せて使用している場合、抗体は、放射線または抗新生物薬を用いた処置の間は循環内に高用量で存在することが好ましいが、そうでなければ、循環から直ちに除去する。３Ｅ１０  ｓｃＦｖなどの抗体断片は、完全なサイズの抗体よりも半減期が短いことが予測される。半減期を変化させる他の方法は公知であり、記載されている方法において用いることができる。例えば、抗体を、例えば、Ｘｔｅｎｄ（商標）抗体半減期延長技術（Ｘｅｎｃｏｒ、Ｍｏｎｒｏｖｉａ、ＣＡ）を使用して、半減期を延長するＦｃ改変体を用いて作り出すことができる。
【００５７】
Ｂ．癌およびウイルスにより形質転換された細胞
抗体を使用して、制御されていない成長、浸潤、または転移を受けている細胞を処置することができる。ＤＮＡ修復が損なわれている癌細胞は細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体の特によい標的である。いくつかの実施形態では、細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体は、ＤＮＡ修復が損なわれている細胞に対して致死的である。好ましい実施形態では、細胞は、ＤＮＡ修復、ＤＮＡ合成、または相同組換えに関与する遺伝子の発現に欠陥を有する。例示的な遺伝子としては、ＸＲＣＣ１、ＡＤＰＲＴ（ＰＡＲＰ−１）、ＡＤＰＲＴＬ２、（ＰＡＲＰ−２）、ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ  ＢＥＴＡ、ＣＴＰＳ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＦＡＮＣＤ２、ＰＭＳ２、ｐ５３、ｐ２１、ＰＴＥＮ、ＲＰＡ、ＲＰＡ１、ＲＰＡ２、ＲＰＡ３、ＸＰＤ、ＥＲＣＣ１、ＸＰＦ、ＭＭＳ１９、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５１Ｂ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄ、ＤＭＣ１、ＸＲＣＣＲ、ＸＲＣＣ３、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５０、ＭＲＥ１１、ＮＢ５１、ＷＲＮ、ＢＬＭ、ＫＵ７０、ＫＵ８０、ＡＴＭ、ＡＴＲ  ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＲＡＤ１、およびＲＡＤ９が挙げられる。いくつかの実施形態では、欠陥のある遺伝子は、癌抑制遺伝子である。好ましい実施形態では、細胞は、ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２に１つまたは複数の変異を有する。ＢＲＣＡ１変異およびＢＲＣＡ２変異などの遺伝子変異は、標準のＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、または配列決定技法を用いて同定することができる。
【００５８】
したがって、いくつかの実施形態では、抗ＤＮＡ抗体を使用して、ＤＮＡ修復の欠損した家族性の症候群から生じる癌（例えば、乳癌、卵巣癌、および膵癌）を処置することができる。これらの実施形態では、抗ＤＮＡ抗体は、放射線治療または化学療法を伴わずに有効であり得る。例えば、抗ＤＮＡ抗体を使用して、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＯＲ  ＲＡＤ５１Ｂ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄまたは関連する遺伝子における変異に関連づけられる癌を処置することができる。抗ＤＮＡ抗体を使用して、ＤＮＡミスマッチ修復に関連する遺伝子、例えば、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、および関連する遺伝子などにおける変異に関連づけられる結腸癌、子宮内膜腫瘍、または脳腫瘍を処置することもできる。抗ＤＮＡ抗体を使用して、ＢＲＣＡ１、ＭＬＨ１、ＯＲ  ＲＡＤ５１Ｂ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＯＲ  ＲＡＤ５１ＤなどのＤＮＡ修復遺伝子がサイレンシングされた癌を処置することもできる。これらの好ましい実施形態では、ＤＮＡ修復を阻害する抗ＤＮＡ抗体の能力は、これらの癌の固有の修復欠損と相まって、細胞死を誘導するために十分であり得る。
【００５９】
したがって、いくつかの実施形態では、抗ＤＮＡ抗体を使用して、ウイルスにより形質転換された細胞、例えば、オンコウイルスに感染した細胞などを処置することができる。ウイルスによる形質転換により、細胞に、高飽和密度、足場非依存性成長、接触阻止の喪失、有向成長（ｏｒｉｅｎｔａｔｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ）の喪失、不死化、および細胞の細胞骨格の破壊などの表現型の変化が課される可能性がある。細胞形質転換のためには、ウイルスのゲノムの少なくとも一部が細胞内に残ることが必要である。これは、癌遺伝子などのいくつものウイルス遺伝子からの連続的な発現を伴う可能性がある。これらの遺伝子は、細胞の観察される表現型の変化の原因となる細胞のシグナル伝達経路を妨害する可能性がある。いくつかの場合には、ウイルスのゲノムは、宿主ゲノム内の癌原遺伝子の近くに挿入される。最終結果は、ウイルスに好都合である細胞分裂の増大を示す形質転換された細胞である。いくつかの実施形態では、ウイルスによる形質転換、ウイルス感染、および／または代謝は、ＤＮＡ修復機構に依存する。これらの実施形態では、開示されている抗ＤＮＡ抗体を使用してＤＮＡ修復を阻害することにより、細胞におけるウイルスによる形質転換、ウイルス感染および／または代謝も阻害される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ウイルスによる形質転換、ウイルス感染、および／または代謝は、ウイルスの生活環の一部としての、ウイルスにコードされるＲＮＡまたはＤＮＡの代謝に依存し、３Ｅ１０または他の抗ＤＮＡ抗体による結合および／または阻害の対象となる中間体が産生される。これらの実施形態では、開示されている抗ＤＮＡ抗体を用いて処置することにより、細胞におけるウイルスによる形質転換、ウイルス感染および／または代謝も阻害される。
【００６１】
レンチウイルス（例えば、ＨＩＶなど）は、感染および組込みのために宿主のＢＥＲ活性に依存することが以前に見いだされている（Ｙｏｄｅｒら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２０１１年３月６巻（３号）ｅ１７８６２頁）。さらに、毛細血管拡張性運動失調変異（ａｔａｘｉａ−ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔｅｓｉａ−ｍｕｔａｔｅｄ）（ＡＴＭ）ＤＮＡ損傷応答がＨＩＶ複製には重大であると思われる（Ｌａｕら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００５年、７巻（５号）：４９３〜５００頁）。いくつかの実施形態では、レトロウイルス（レンチウイルス、ＨＩＶを含む）の感染および組込みは、宿主ＤＮＡ修復機構に依存する。これらの実施形態では、開示されている抗ＤＮＡ抗体を用いて処置することにより、ウイルス感染／組込みも抑制され、ウイルスの生活環における再感染が抑制される。
【００６２】
いくつかの実施形態では、レンチウイルス（ＨＩＶ）の複製は、ＤＮＡ修復に依存する。これらの実施形態では、開示されている抗ＤＮＡ抗体を用いて処置することにより、ウイルスの複製も抑制され、ウイルスの生活環における再感染が抑制される。したがって、抗ＤＮＡ抗体を使用して、オンコウイルスなどのウイルスに感染した細胞を処置することができる。いくつかの実施形態では、抗体により、ウイルスによる形質転換、複製、代謝、またはそれらの組合せが阻害される。抗ＤＮＡ抗体の影響を受ける可能性がある例示的なオンコウイルスとしては、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＨＨＶ−８）、メルケル細胞ポリオーマウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）が挙げられる。抗ＤＮＡ抗体を使用して、潜伏ウイルスを処置することもできる。いくつかの実施形態では、感染細胞がＨＳＶ−１などのウイルスに対するＤＮＡ損傷応答を確立することができないことが潜伏の確立に寄与する。したがって、これらのウイルス感染細胞は、ＤＮＡ修復が損なわれており、抗ＤＮＡ抗体を用いた処置に対して感受性である。例示的な潜伏ウイルスとしては、ＣＭＶ、ＥＢＶ、単純ヘルペスウイルス（１型および２型）、および水痘帯状疱疹ウイルスが挙げられる。
【００６３】
抗ＤＮＡ抗体を使用して、癌、免疫不全、肝炎、脳炎、肺臓炎、呼吸器疾患、または他の疾患状態を生じさせるウイルスに起因する活動性ウイルス感染症を、抗体の、ＤＮＡに結合する能力およびウイルスの生活環の一部であるＤＮＡ修復またはＲＮＡ代謝を妨害する能力によって処置することもできる。
【００６４】
生活環または生じた感染症の症状が抗体の投与の影響を受ける可能性がある代表的なウイルスとしては、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＨＨＶ−８）、メルケル細胞ポリオーマウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）が挙げられる。
【００６５】
抗体の投与の影響を受ける可能性がある追加的なウイルスとしては、パルボウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、および他のＤＮＡウイルスが挙げられる：
【００６６】
【表１】
2014513069.tif 000003
抗体の投与の影響を受ける可能性があるＲＮＡウイルスとしては、以下が挙げられる：
【００６７】
【表２−１】
2014513069.tif 000004
【００６８】
【表２−２】
2014513069.tif 000005
レトロウイルスも影響を受ける可能性がある：
・  アルファレトロウイルス属；基準種：トリ白血病ウイルス；他のものとしてはラウス肉腫ウイルスが挙げられる
・  ベータレトロウイルス属；基準種：マウス乳腺癌ウイルス
・  ガンマレトロウイルス属；基準種：マウス白血病ウイルス；他のものとしてはネコ白血病ウイルスが挙げられる
・  デルタレトロウイルス属；基準種：ウシ白血病ウイルス；他のものとしては発癌性ヒトＴリンパ球向性ウイルスが挙げられる
・  イプシロンレトロウイルス属；基準種：ウォールアイ皮膚肉腫ウイルス
・  レンチウイルス属；基準種：ヒト免疫不全ウイルス１型；他のものとしてはサル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルスが挙げられる
・  スプーマウイルス属；基準種：サル泡沫状ウイルス
・  ヘパドナウイルス科ファミリー−例えばＢ型肝炎ウイルス
抗体の投与の影響を受ける可能性がある他のウイルス性疾患としては、コロラドダニ熱（コルチウイルス、ＲＮＡウイルスによって引き起こされる）、西ナイル熱（主に中東およびアフリカにおいて起こる、フラビウイルスによって引き起こされる脳炎）、黄熱病、狂犬病（ラブドウイルス科ファミリーの向神経性ウイルスのいくつもの異なる株によって引き起こされる）、ウイルス性肝炎、胃腸炎（ウイルス性）−ノーウォークウイルス、ノーウォーク様ウイルス、ロタウイルス、カリシウイルス、およびアストロウイルスによって引き起こされる急性ウイルス性胃腸炎、灰白髄炎、抗原性が頻繁に変動する可能性があるオルトミクソウイルスによって引き起こされるインフルエンザ（流感）、麻疹（ｍｅａｓｌｅｓ）（麻疹（ｒｕｂｅｏｌａ））、パラミクソウイルス科、流行性耳下腺炎、ウイルス性肺炎を含めた呼吸器症候群および集合的に急性呼吸器ウイルスと称される種々のウイルスによって引き起こされるクループを含めた急性呼吸器症候群、ならびに、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ、低年齢の小児における呼吸器感染症の最も危険な原因）によって引き起こされる呼吸器疾患が挙げられる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、抗ＤＮＡ抗体を放射線治療、化学療法、またはそれらの組合せと併用して、癌腫、神経膠腫、肉腫、またはリンパ腫を含めた任意の癌を処置することができる。これらの実施形態では、抗ＤＮＡ抗体により、細胞を、放射線治療または化学療法のＤＮＡ損傷効果に対して感作させることができる。抗体を使用して処置することができる癌の代表的であるが非限定的な一覧は、血液およびリンパ系の癌（白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、孤立性形質細胞腫、多発性骨髄腫を含む）、泌尿生殖器系の癌（前立腺癌、膀胱癌、腎癌、尿道癌、陰茎癌、睾丸癌を含む）、神経系の癌（髄膜腫（ｍｅｎｇｉｏｍａ）、神経膠腫、神経膠芽腫、上衣腫を含む）、頭頸部の癌（口腔、鼻腔、鼻咽頭腔、口腔咽頭腔（ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｖｉｔｙ）、喉頭、および副鼻腔の扁平上皮癌を含む）、肺癌（小細胞肺癌および非小細胞肺癌を含む）、婦人科の癌（子宮頸癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、卵巣癌および卵管癌を含む）、胃腸癌（胃癌、小腸癌、結腸直腸癌、肝癌、肝胆道癌、および膵癌を含む）、皮膚癌（黒色腫、扁平上皮癌、および基底細胞癌腫を含む）、乳癌（腺管癌および小葉癌を含む）、および小児癌（神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、髄芽腫を含む）を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、癌は、放射線治療または化学療法に対していくらかの抵抗性を示す新生物または腫瘍である。標準の方法を用いた放射線治療に対して抵抗性である癌としては、これらだけに限定されないが、肉腫、腎細胞癌、黒色腫、リンパ腫、白血病、癌腫、芽細胞腫、および胚細胞性腫瘍が挙げられる。
【００７１】
Ｃ．放射線治療
開示されている細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体は、放射線療法と併用することができる。放射線療法（Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）（別名放射線治療（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ））とは、悪性細胞を制御するための癌処置の一部として電離放射線を医学的に使用することである。放射線治療には、三叉神経痛、重篤な甲状腺眼症（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｅｙｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、翼状片、色素性絨毛結節性滑膜炎の処置、ケロイド瘢痕の成長の予防、および異所性骨化の予防など、非悪性状態においてもいくつかの適用がある。いくつかの実施形態では、抗ＤＮＡ抗体を使用して非悪性状態に対する放射線感受性を増大させる。
【００７２】
放射線療法は、分裂している細胞、例えば、癌細胞のＤＮＡに損傷を与えることによって働く。このＤＮＡ損傷は、光子または荷電粒子の２種類のエネルギーのうちの１つによって引き起こされる。この損傷は、直接的または間接的なものである。水がイオン化した結果として、間接的なイオン化が起こり、これによりフリーラジカル、特にヒドロキシルラジカルが形成され、次いでこれがＤＮＡに損傷を与える。例えば、光子療法（ｐｈｏｔｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）によって引き起こされる放射線効果の大部分はフリーラジカルを通じたものである。光子放射線治療の主要な限定のうちの１つは、固形腫瘍の細胞では酸素が欠損するようになり、低酸素環境における腫瘍細胞の放射線損傷に対する抵抗性が正常な酸素環境における抵抗性の２〜３倍になることである。
【００７３】
癌細胞ＤＮＡに対する直接的な損傷は、プロトン、ホウ素イオン、炭素イオンまたはネオンイオンなどの高ＬＥＴ（線エネルギー付与）荷電粒子によって起こる。これらの粒子は主に、通常二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こす直接のエネルギー付与を介して作用するので、この損傷は腫瘍の酸素供給とは無関係である。プロトンおよび他の荷電粒子は質量が比較的大きいので、組織における外側への散乱は少ない；ビームは大きく広がらず、腫瘍形状に集束したままとどまり、周囲の組織には低線量の副作用しか送達しない。光子放射線療法において用いられる放射線の量はグレイ（Ｇｙ）で測定され、処置されている癌の種類および病期に応じて変動する。治癒的な場合には、固形上皮腫瘍に対する典型的な線量は、６０〜８０Ｇｙにわたり、一方リンパ腫は２０〜４０Ｇｙを用いて処置する。手術後の（アジュバント）線量は、一般には、１．８〜２Ｇｙに分けておよそ４５〜６０Ｇｙである（乳癌、頭部癌、および頸部癌に対して）。線量を選択する際には、患者が化学療法を受けているかどうか、患者の共存症、外科手術前、またはその後に放射線療法が施行されているかどうか、および外科手術の成功の程度を含めた多くの他の因子が放射線腫瘍専門医によって考慮される。
【００７４】
放射線に対する癌の応答は、その放射線感受性によって表される。放射線感受性が高い癌細胞はそれほど高くない線量の放射線によって急速に死滅する。これらとしては、白血病、大部分のリンパ腫および胚細胞性腫瘍が挙げられる。大多数の上皮癌は、放射線感受性が中程度のみであり、根治を実現するためには著しく高い線量の放射線（６０〜７０Ｇｙ）が必要である。一部の種類の癌は特に放射線抵抗性である、すなわち、根治をもたらすためには、臨床上の実施において安全である可能性がある線量よりもさらに高い線量が必要である。腎細胞癌および黒色腫は、一般に、放射線抵抗性であると考えられている。
【００７５】
放射線治療に対する腫瘍の応答は、そのサイズにも関連する。複雑な理由で、非常に大きな腫瘍は、より小さな腫瘍または顕微鏡レベルの疾患ほど放射線に応答しない。この影響を克服するために種々の戦略が用いられている。最も一般的な技法は、放射線治療前に外科的切除を行うことである。これは、乳癌の処置において最も一般的に見られ、広範な局所的切除または乳房切除の後にアジュバント放射線治療が続く。別の方法は、ラジカル放射線治療の前にネオアジュバント化学療法を用いて腫瘍を縮小することである。第３の技法は、放射線治療の過程中に特定の薬物を与えることによって癌の放射線感受性を増強することである。開示されている細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体は、この第３の機能を果たす。これらの実施形態では、抗ＤＮＡ抗体により、放射線治療に対する細胞の感受性が、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％増大する。さらに、細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体は、１種または複数種の追加的な放射線増感剤と組み合わせることができる。公知の放射線増感剤の例としては、シスプラチン、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、ペントキシフィリン、ビノレルビン、ＰＡＲＰ阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、およびプロテアソーム阻害剤が挙げられる。
【００７６】
Ｄ．化学療法薬
多数の化学療法薬、特に抗新生物薬が抗体と組み合わせるために利用可能である。大多数の化学療法薬は、アルキル化剤、代謝拮抗薬、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、モノクローナル抗体、および他の抗腫瘍剤に分けることができる。
【００７７】
好ましい実施形態では、抗新生物薬はＤＮＡに損傷を与える、またはＤＮＡ修復を妨げる。なぜなら、これらの活性が最も効果的に抗ＤＮＡ抗体と協同するからである。これらの実施形態では、抗体により、化学療法に対する細胞の感受性が、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％増大する。ＤＮＡに損傷を与えるまたはＤＮＡ修復を阻害する抗新生物薬の非限定的な例としては、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、イホスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、プロカルバジン、テモゾロミド、およびバルルビシンが挙げられる。いくつかの実施形態では、抗新生物薬はテモゾロミドであり、これは、神経膠芽腫に対して一般に使用されるＤＮＡ損傷性アルキル化剤である。いくつかの実施形態では、抗新生物薬はＰＡＲＰ阻害剤であり、これにより、ＤＮＡ損傷の塩基除去修復のステップが阻害される。いくつかの実施形態では、抗新生物薬はヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であり、これにより、ＤＮＡ修復が転写レベルで抑制され、クロマチン構造が撹乱される。いくつかの実施形態では、抗新生物薬はプロテアソーム阻害剤であり、これにより、細胞におけるユビキチン代謝が破壊されることによってＤＮＡ修復が抑制される。ユビキチンはＤＮＡ修復を調節するシグナル伝達分子である。いくつかの実施形態では、抗新生物薬はキナーゼ阻害剤であり、これにより、ＤＮＡ損傷応答シグナル伝達経路が変化することによってＤＮＡ修復が抑制される。
【００７８】
他の実施形態では、抗新生物薬は、癌細胞における異なる活性をターゲティングすることによって抗ＤＮＡ抗体を補完する。これらの実施形態では、抗新生物薬はＤＮＡ修復を阻害もしないし、ＤＮＡに損傷も与えない。
【００７９】
細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体と組み合わせることができる抗新生物薬の例としては、これらだけに限定されないが、アルキル化剤（例えば、テモゾロミド、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ダカルバジン、ロムスチン、カルムスチン、プロカルバジン、クロラムブシルおよびイホスファミドなど）、代謝拮抗薬（例えば、フルオロウラシル、ゲムシタビン、メトトレキセート、シトシンアラビノシド、フルダラビン、およびフロクスウリジンなど）、一部の抗有糸分裂薬、およびビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、およびビンデシンなど）、アントラサイクリン系薬剤（ドキソルビシン、ダウノルビシン、バルルビシン、イダルビシン、およびエピルビシン、ならびにアクチノマイシンＤなどのアクチノマイシンを含む）、細胞毒性抗生物質（マイトマイシン、プリカマイシン、およびブレオマイシンを含む）、ならびにトポイソメラーゼ阻害剤（イリノテカンおよびトポテカンなどのカンプトテシンならびにアムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、およびテニポシドなどのエピポドフィロトキシンの誘導体を含む）が挙げられる。
【００８０】
Ｅ．医薬組成物
細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体は、薬学的に許容される担体と組み合わせて治療的に使用することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤中の細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体またはその断片を含有する単位投与量であり、抗体は、癌または感染細胞におけるＤＮＡ修復を阻害するために有効な量で存在する。好ましい実施形態では、抗体は、約２００ｍｇ／ｍ２〜約１０００ｍｇ／ｍ２、より好ましくは、約２００ｍｇ／ｍ２、２５０ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、３５０ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、４５０ｍｇ／ｍ２、５００ｍｇ／ｍ２、６００ｍｇ／ｍ２、７００ｍｇ／ｍ２、８００ｍｇ／ｍ２、９００ｍｇ／ｍ２、または１０００ｍｇ／ｍ２の量で存在する。いくつかの実施形態では、単位投与量は、静脈内注射するための単位剤形である。いくつかの実施形態では、単位投与量は、腫瘍内投与するための単位剤形である。
【００８１】
材料は、溶液、エマルション、または懸濁液中に存在していてよい（例えば、微小粒子、リポソーム、または細胞に組み入れられている）。一般には、製剤には、製剤を等張性にするために、適量の薬学的に許容される塩が使用される。薬学的に許容される担体の例としては、これらだけに限定されないが、食塩水、リンゲル液およびブドウ糖溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、約５〜約８であることが好ましく、約７〜約７．５であることがより好ましい。医薬組成物は、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝液、保存剤、および表面活性剤を含んでよい。別の担体としては、持続的放出調製物、例えば、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどが挙げられ、マトリックスは、成形粒子、例えば、薄膜、リポソームまたは微小粒子の形態である。例えば、投与される組成物の投与経路および濃度に応じて特定の担体がより好ましいことが当業者には明らかであろう。医薬組成物は、抗菌剤、抗炎症剤、および麻酔薬などの１種または複数種の活性成分も含んでよい。
【００８２】
非経口投与用の調製物としては、滅菌された水性または非水性の溶液、懸濁液、およびエマルションが挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、または不揮発性油が挙げられる。保存剤および他の添加物、例えば、抗菌薬、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスなども存在してよい。
【００８３】
水性の環境への抗体の溶解を補助するために、界面活性剤を湿潤剤として添加することができる。界面活性剤は、陰イオン性洗剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルソジウムスルホスクシネートおよびジオクチルソジウムスルホネートなどを含んでよい。陽イオン洗剤を使用することができ、これらとしては、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムが挙げられる。界面活性剤として製剤に含めることができる潜在的な非イオン性洗剤の一覧は、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアレート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０および６０、グリセロールモノステアレート、ポリソルベート２０、４０、６０、６５および８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、タンパク質または誘導体の製剤中に、単独で、または異なる比率の混合物として存在してよい。ペプチドの取込みを増強する可能性がある添加物は、例えば、脂肪酸であるオレイン酸、リノール酸およびリノレン酸である。
【００８４】
ＩＩＩ．方法
Ａ．治療的投与
被験体における癌または感染症を、被験体に治療有効量の細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体を投与することによって処置するための方法が提供される。被験体における細胞の放射線感受性または化学感受性を、被験体に細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体を含有する医薬組成物を投与することによって増大させる方法も提供される。いくつかの実施形態では、該方法は、まず、癌または腫瘍などの新生物、またはウイルスなどの病原体の感染症と診断された被験体を選択するステップを伴う。
【００８５】
医薬組成物は、局所的処置または全身的処置のいずれが望まれるかに応じて、および処置される領域に応じて、いくつものやり方で投与することができる。例えば、組成物は、静脈内に、筋肉内に、髄腔内に、腹腔内に、皮下に投与することができる。組成物は、直接腫瘍または組織内に、例えば、定位的に投与することができる。いくつかの実施形態では、組成物を脳または肝臓内に、注射によって、または外科的に埋め込んだシャントによって投与する。
【００８６】
必要とされる正確な組成物の量は、被験体間で、被験体の種、年齢、体重および全身状態、処置されている障害の重症度、および組成物の投与形態に応じて変動する。したがって、あらゆる組成物について正確な量を特定することは不可能である。しかし、適量は、当業者が、本明細書における教示を考慮して、常套的な実験のみを用いて決定することができる。例えば、組成物を投与するための有効な投与量およびスケジュールを経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは、当技術分野の技術の範囲内である。組成物を投与するための投与量の範囲は、標的細胞におけるＤＮＡ修復を損なわせるため、および／または標的細胞を放射線治療および／または化学療法に対して感作させるために十分なほど大きいものである。投与量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などの有害な副作用が引き起こされるほど大きくすべきではない。一般に、投与量は、患者の年齢、状態、および性別、投与経路、レジメンに他の薬物が含まれるかどうか、ならびに処置される癌の種類、病期、および場所によって変動する。投与量は、任意の禁忌（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）の事象において個々の医師が調整することができる。投与量は変動してよく、１つまたは複数の投与用量で、毎日、１日または数日にわたって投与することができる。所定のクラスの医薬製品についての適切な投与量に関する手引きは文献に見いだすことができる。単独で使用される抗体の典型的な１日の投与量は、上記の因子に応じて、１日当たり体重１ｋｇ当たり約１μｇから１００ｍｇまで、またはそれ以上にわたってよい。好ましい実施形態では、抗体は、約２００ｍｇ／ｍ２〜約１０００ｍｇ／ｍ２、より好ましくは、約２００〜９００ｍｇ／ｍ２、３００〜８００ｍｇ／ｍ２、４００〜７００ｍｇ／ｍ２、５００〜６００ｍｇ／ｍ２の量で存在する。いくつかの実施形態では、静脈内注射するための単位剤形中に単位投与量が存在する。いくつかの実施形態では、経口投与用の単位剤形中に単位投与量が存在する。いくつかの実施形態では、腫瘍内投与するための単位剤形中に単位投与量が存在する。
【００８７】
抗ＤＮＡ抗体により、癌の放射線感受性または化学感受性が増大する。有効用量の化学療法および／または放射線療法は、ある特定の癌に対して毒性である可能性がある。いくつかの実施形態では、抗ＤＮＡ抗体により、癌を処置するために必要な抗新生物薬物または放射線レベルの必要有効用量が減少し、それにより、有効用量の毒性が低下する。例えば、最も一般的に使用されるドキソルビシンの投与量は、２１〜２８日ごとに４０〜６０ｍｇ／ｍ２ＩＶ、または２１日に１回、６０〜７５ｍｇ／ｍ２ＩＶである。患者のビリルビンレベルが１．２ｍｇ／ｄＬから３ｍｇ／ｄＬの間である場合、用量を５０％低下させるべきである。患者のビリルビンレベルが３．１ｍｇ／ｄＬから５．０ｍｇ／ｄＬの間である場合、用量を７５％低下させるべきである。多くの場合に心臓の支持療法に対して無反応性であるうっ血性心不全に至る重大な不可逆的心筋毒性については、ドキソルビシンの総投与量が４５０ｍｇ／ｍ２に近づいたときに発生する可能性がある。抗ＤＮＡ抗体と併用する場合、ドキソルビシンの投与量を減少させて、有効性を失うことなく心筋毒性を減少させることができる。
【００８８】
他の実施形態では、開示されている抗ＤＮＡ抗体を通常の用量の薬物または放射線と一緒に使用して、有効性を増大させることができる。例えば、抗ＤＮＡ抗体を使用して、薬物抵抗性または放射線抵抗性である癌に対する薬物または放射線療法を強化することができる。標準の方法を用いた放射線治療に対して抵抗性である癌としては、肉腫、リンパ腫、白血病、癌腫、芽細胞腫、および胚細胞性腫瘍が挙げられる。
【００８９】
Ｂ．スクリーニングアッセイ
抗ＤＮＡ抗体は、癌細胞におけるＤＮＡ修復を阻害し、放射線感受性および／または化学感受性を増大させることが示されているので、試料中の抗ＤＮＡ抗体を検出する方法も提供される。例えば、試料は、ＳＬＥの被験体、またはＳＬＥの疑いがある被験体由来の、血液、血清、または血漿などの抗体を含有する体液であってよい。試料は、生検材料などの組織試料または細胞試料であってよい。
【００９０】
いくつかの実施形態では、該方法を用いて、ＳＬＥの被験体の診断または予後をモニターすることができる。例えば、細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体を検出することにより、ＳＬＥが再発しそうになっている患者を早期検出することができる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、該方法を用いて、化学療法または放射線治療に対する被験体の感受性を予測することができる。これらの実施形態では、試料中の細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体のレベルは、化学療法または放射線治療に対する感受性のレベルに対応する可能性がある。好ましい実施形態では、化学療法は、ＤＮＡ修復を阻害するまたはＤＮＡ損傷を引き起こすものである。
【００９２】
該方法は、細胞を被験体由来の試料と接触させるステップと、細胞に対する試料の効果をモニタリングするステップとを含む。細胞は、通常は放射線抵抗性または化学療法抵抗性であるが、抗ＤＮＡ抗体を用いた処理後には放射線感受性かつ／または化学感受性になることが示されている癌細胞株などの細胞株であることが好ましい。いくつかの実施形態では、細胞に照射し、該方法は、細胞の放射線感受性に対する試料の効果を評価するステップを伴う。他の実施形態では、細胞を抗新生物薬と接触させ、該方法は、化学感受性に対する試料の効果を評価するステップを伴う。さらに他の実施形態では、該方法は、細胞死に対する試料の直接の効果をモニタリングするステップを伴う。これらの実施形態の全てにおいて、放射線感受性、化学感受性、または細胞死が増大することにより、その試料が抗ＤＮＡ抗体を含有することの指標となる。
【００９３】
他の実施形態では、該方法は、抗ＤＮＡ抗体を検出するために設計されたＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーなどの免疫測定を伴う。好ましい実施形態では、該方法は、細胞への浸透を検出するために細胞に基づく。
【００９４】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによりさらに理解されよう。
【実施例】
【００９５】
（実施例１）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体（３Ｅ１０）により細胞の放射線感受性が増強される
材料および方法
細胞株：ＭＣＦ−７、ＨｅＬａ、Ｕ２５１、およびＵ８７細胞株をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。ＰＥＯ１およびＰＥＯ１  Ｃ４−２細胞を入手した（Ｓａｋａｉ  Ｗら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６９巻：６３８１頁（２００９年））。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を追加補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ（登録商標））中、３７℃、５％ＣＯ２で細胞を成長させ、維持した。
【００９６】
３Ｅ１０および３Ｅ１０  ｓｃＦｖの作製および精製：３Ｅ１０を、Ｗｅｉｓｂａｒｔ  ＲＨら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４４巻：２６５３頁（１９９０年）に記載されている通り、ハイブリドーマの上清から精製した。３Ｅ１０  ｓｃＦｖをＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて発現させ、Ｈａｎｓｅｎ  ＪＥら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  １０８８巻：１８７頁（２００６年）に記載されている通り上清から精製した。タンパク質の濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定した。
【００９７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞生存アッセイ：クローン原性アッセイおよびヨウ化プロピジウムに基づくアッセイをＨａｎｓｅｎ  ＪＥら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７巻：１７６９頁（２００７年）；Ｓｔａｃｈｅｌｅｋ  ＧＣら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７０巻：４０９頁（２０１０年））に記載の通り実施した。
【００９８】
細胞への照射：６ウェルプレートまたは１２ウェルプレートで成長させた細胞に、Ｘ−ＲＡＤ３２０  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘ−Ｒａｙ）を製造者の説明書に従って使用して、Ｘ線を指定の線量で照射した。
【００９９】
表１は、３Ｅ１０  ｓｃＦｖにより、ＭＣＦ−７細胞およびＨｅＬａ細胞がＩＲに対して感作されることが実証されているデータを示す。ＭＣＦ−７細胞およびＨｅＬａ細胞に、対照緩衝液または３Ｅ１０  ｓｃＦｖを含有する培地の存在下で照射し、クローン原性生存をコロニー形成アッセイによって決定した。各処理について、照射していない対照細胞と比較した生存の割合±平均値の標準誤差が示されている。３Ｅ１０  ｓｃＦｖの用量は、ＭＣＦ−７細胞に対しては０．２５μＭであり、ＨｅＬａ細胞に対しては１．０μＭであった。ＩＲ線量は、ＭＣＦ−７細胞に対しては４Ｇｙであり、ＨｅＬａ細胞に対しては６Ｇｙであった。
【０１００】
結果
ＳＬＥは、宿主ＤＮＡに対して反応性である自己抗体（抗核抗体；ＡＮＡ）の異常な産生を特徴とする自己免疫疾患である。これらの抗体のまれなサブセットは細胞に浸透することができるが、ほとんど全てが細胞毒性であり、臨床使用には不適切である（Ａｌａｒｃｏｎ−Ｓｅｇｏｖｉａ、Ｄ．  Ｌｕｐｕｓ  １０巻：３１５頁（２００１年））。しかし、ＳＬＥのマウスモデルから単離された、まれな１つの細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体、３Ｅ１０は、培養物中の細胞に対する毒性またはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるマウスに対する毒性が見いだされておらず、ＳＬＥを処置するためのワクチンへの３Ｅ１０の潜在的使用について評価する第Ｉ相ヒト臨床試験において安全であることさえ示されている（Ｓｐｅｒｔｉｎｉ  Ｆら、Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ２６巻：２６０２頁（１９９９年）；Ｗｅｉｓｂａｒｔ  ＲＨら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４４巻：２６５３頁（１９９０年）；Ｚａｃｋ  ＤＪら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７巻：２０８２頁（１９９６年））。３Ｅ１０は、ワクチンとしてはさらに追求されなかったが、その代わりに、分子送達ビヒクルとして調査された（Ｈａｎｓｅｎ  ＪＥら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  １０８８巻：１８７頁（２００６年）；Ｈａｎｓｅｎ  ＪＥら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２巻：２０７９０頁（２００７年））。
【０１０１】
毒性プロファイルが良性であることに加えて、３Ｅ１０はさらに、その細胞浸透の機構によって他の細胞浸透性ＡＮＡとは区別される。他の全てとは異なり、３Ｅ１０による細胞への浸透は、そのＦｃドメインまたは定常ドメインに依存するのではなく、ヒト細胞上に遍在する受動拡散型ヌクレオシド輸送体によって媒介される機構において、３Ｅ１０単鎖可変性断片（３Ｅ１０  ｓｃＦｖ）が単独で細胞に浸透し、核内に局在化することができる（Ｈａｎｓｅｎ  ＪＥら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２巻：２０７９０頁（２００７年）；Ｌｉｓｉ  Ｓら  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １１巻：１頁（２０１１年））。
【０１０２】
完全な３Ｅ１０抗体および３Ｅ１０  ｓｃＦｖはどちらも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ｐ５３およびＨｓｐ７０などのカーゴタンパク質を細胞内に送達することができることが証明されている（Ｈａｎｓｅｎ  ＪＥら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  １０８８巻：１８７頁（２００６年）；Ｈａｎｓｅｎ  ＪＥら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７巻：１７６９頁（２００７年）；Ｚｈａｎ  Ｘら、Ｓｔｒｏｋｅ  ４１巻：５３８頁（２０１０年））。３Ｅ１０を、公知の放射線感作効果を有する連結した分子を癌細胞内に輸送して、放射線治療に対する腫瘍の応答を増強するために使用することが意図された。しかし、最初の実験において、３Ｅ１０単独で細胞の放射線感受性が増強されることが発見された。これは表１および図１Ｂに示されている。表１は、３Ｅ１０  ｓｃＦｖにより、ＭＣＦ−７細胞およびＨｅＬａ細胞がＩＲに対して感作されることが実証されているデータを示す。対照緩衝液または３Ｅ１０  ｓｃＦｖを含有する培地の存在下で、ＭＣＦ−７細胞およびＨｅＬａ細胞に照射し、クローン原性生存をコロニー形成アッセイによって決定した。各処理について、照射していない対照細胞と比較した生存の割合±平均値の標準誤差が示されている。３Ｅ１０  ｓｃＦｖの用量は、ＭＣＦ−７細胞に対しては０．２５μＭであり、ＨｅＬａ細胞に対しては１．０μＭであった。ＩＲ線量は、ＭＣＦ−７細胞に対しては４Ｇｙであり、ＨｅＬａ細胞に対しては６Ｇｙであった。
【０１０３】
図１Ｂは、電離放射線（ＩＲ）を用いて処理したＵ２５１ヒト神経膠腫細胞の生存に対する３Ｅ１０  ｓｃＦｖの影響を測定するクローン原性生存アッセイを示す。Ｕ２５１細胞を、３Ｅ１０  ｓｃＦｖまたは対照緩衝液を含有する成長培地と一緒に１時間インキュベートし、次いで細胞に、０Ｇｙまたは４ＧｙのＩＲを照射し、コロニー形成によってクローン原性について評価した。前の試験と一致して、３Ｅ１０  ｓｃＦｖは、単独では、照射していないＵ２５１細胞に対して毒性ではなかった。しかし、３Ｅ１０  ｓｃＦｖの存在下で照射したＵ２５１細胞は、ＩＲに対する感受性がより高いことが見いだされた。３Ｅ１０  ｓｃＦｖにより、０．２５μＭの低さの用量で、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞およびＨｅＬａヒト子宮頸癌細胞の放射線感受性も増大した（表１）。細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体による放射線感作については以前に記載されていない。
【０１０４】
（実施例２）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体（３Ｅ１０）によりＤＮＡ損傷化学療法が強化される
材料および方法
放射線は、ＤＮＡを標的とするので、ＤＮＡ損傷化学療法に対する癌細胞の応答に対する３Ｅ１０の影響を試験した。詳細には、癌療法において一般に使用される２種の薬剤であるドキソルビシンとパクリタキセルに対する細胞の感受性に対する３Ｅ１０の影響を比較した。ドキソルビシンは、ＤＮＡ内にインターカレートし、鎖の切断を誘導するアントラサイクリン系抗生物質であり（Ｔｅｗｅｙ  ＫＭら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２６巻：４６６頁（１９８４年））、一方、パクリタキセルは微小管機能を妨害するが（Ｊｏｒｄａｎ  ＭＡら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９０巻：９５５２頁（１９９３年））、ＤＮＡには直接損傷を与えない。
【０１０５】
３Ｅ１０  ｓｃＦｖにより、細胞がドキソルビシンに対しては感作されるが、パクリタキセルに対しては感作されないことが予測された。Ｕ８７ヒト神経膠腫細胞を、対照緩衝液または１０μＭの３Ｅ１０  ｓｃＦｖの存在下で漸増用量のドキソルビシン（０〜２５０ｎＭ）またはパクリタキセル（０〜２５ｎＭ）で処理し、次いで、処理した１週間後にパーセント細胞死滅をヨウ化プロピジウム蛍光によって決定した。
【０１０６】
結果
予測通り、３Ｅ１０  ｓｃＦｖにより、ドキソルビシンに対する細胞の感受性は有意に増強されたが、パクリタキセルに対する細胞の感受性は有意に増強されなかった（図１Ｃおよび１Ｄ）。３Ｅ１０  ｓｃＦｖにより、癌細胞をＩＲおよびドキソルビシンの両方に対して感作させることができるが、パクリタキセルに対しては感作させることができないことは、抗体がＤＮＡ損傷療法によって細胞の死滅を選択的に強化することを示している。
【０１０７】
（実施例３）
細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体（３Ｅ１０）により、ＤＮＡ修復が阻害される
３Ｅ１０  ｓｃＦｖにより、細胞がＤＮＡ損傷剤に対して感作されることを確立すると、この効果の根底にある機構を調査した。ＩＲおよびドキソルビシンのどちらによってもＤＮＡ鎖の切断が誘導され、したがって、３Ｅ１０  ｓｃＦｖがＤＮＡ修復、特に鎖の切断修復に対する効果を有する可能性があることが仮定された。第１のステップとして、３Ｅ１０のＤＮＡ結合特性を検査した。一本鎖ＤＮＡ、平滑末端二重鎖ＤＮＡ、異常発生に起因する内部の泡状構造（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｂｕｂｂｌｅ）を有する二重鎖ＤＮＡ、外に広がった一本鎖末端を有する二重鎖ＤＮＡ、５’一本鎖テイルを有する二重鎖ＤＮＡ、および３’テイルを有する二重鎖ＤＮＡを含めたいくつかの異なるＤＮＡ基質（図２Ａ）に対する３Ｅ１０の結合親和性を、Ｘｕ  Ｘら、ＥＭＢＯ  Ｊ  ２８巻：５６８頁（２００９年）に記載されている通り調製した放射性標識したＤＮＡ基質を、漸増濃度の３Ｅ１０（０〜１μＭ）と一緒にインキュベートし、その後、電気泳動移動度シフト分析を行うことによって決定した。
【０１０８】
材料および方法
ＤＮＡ結合試験：放射性標識したＤＮＡ基質（一本鎖ＤＮＡ、平滑末端二重鎖ＤＮＡ、異常発生に起因する内部の泡状構造を有する二重鎖ＤＮＡ、外に広がった一本鎖末端を有する二重鎖ＤＮＡ、５’一本鎖テイルを有する二重鎖ＤＮＡ、および３’テイルを有する二重鎖ＤＮＡ）を、Ｘｕ  Ｘら、ＥＭＢＯ  Ｊ  ２８巻：３００５頁（２００９年）に記載されている通り調製した。各基質を３Ｅ１０（０〜１０μＭ）と一緒に、４℃で３０分インキュベートし、その後、Ｘｕ  Ｘら、ＥＭＢＯ  Ｊ  ２８巻：３００５頁（２００９年）に記載されている通り電気泳動移動度シフト分析を行った。ＩｍａｇｅＪ；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈを使用して、結合したオリゴヌクレオチドのパーセントを３Ｅ１０の濃度に対してプロットすることによってＫｄを算出した。
【０１０９】
ＤＮＡ修復アッセイ：一本鎖切断／塩基除去修復（ＢＥＲ）アッセイおよびＲＡＤ５１媒介性鎖交換反応アッセイを、それぞれ、Ｓｔａｃｈｅｌｅｋ  ＧＣら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７０巻：４０９頁（２０１０年）；およびＤｒａｙ  Ｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８巻：３５６０頁（２０１１年）に記載されている通り実施した。
【０１１０】
顕微鏡検査：免疫組織学的検査およびγＨ２ＡＸ免疫蛍光法を以前に記載されている通り実施した（Ｈａｎｓｅｎ  ＪＥら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２巻：２０７９０頁（２００７年）；Ｓｔａｃｈｅｌｅｋ  ＧＣら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７０巻：４０９頁（２０１０年））。
【０１１１】
結果
結合曲線において、二重鎖基質および泡状基質と比較して、一本鎖基質、外に広がったアーム基質、および５’／３’テイル基質で左側へのシフトが観察され、これにより、３Ｅ１０が、遊離の一本鎖テイルを有する基質とより大きな親和性で結合することが示唆される（図２Ｃ〜２Ｈ）。結果を組み合わせ、プロットして、３Ｅ１０の、遊離の一本鎖テイルを有する基質または遊離の一本鎖テイルを有さない基質との結合を直接比較した。概して、３Ｅ１０は、遊離の一本鎖テイルを有する基質には０．２μＭのＫｄで結合し、遊離の一本鎖テイルを有さない基質には０．４μＭのＫｄで結合した（図２Ｂ）。これらの結果により、３Ｅ１０は、細胞に浸透し、核に局在化すると、一本鎖テイルを有する二重鎖ＤＮＡからなるＤＮＡ修復または複製の中間体に優先的に結合する可能性があることが示唆される。
【０１１２】
次に、特異的なＤＮＡ修復経路に対する３Ｅ１０の影響を検査した。これはｉｎ  ｖｉｔｒｏ一本鎖切断／塩基除去修復（ＢＥＲ）アッセイ（Ｓｔａｃｈｅｌｅｋ  ＧＣら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７０巻：４０９頁（２０１０年））から開始した。ＢＥＲでは、損傷を受けた塩基がグリコシラーゼによって切り取られ、その後、ホスホジエステル骨格がエンドヌクレアーゼによって切断され、一本鎖切断を伴う基質（生成物ｎ）がもたらされる。ＤＮＡポリメラーゼβのｄＲＰリアーゼ活性によりｄＲＰ基が除去され、そのポリメラーゼ活性により、欠けているヌクレオチドが挿入され、正しい塩基対合が回復する（生成物ｎ＋１）。この後、残りの鎖の切断がリガーゼによってライゲーションされ、ホスホジエステル骨格の完全性が回復し、それにより、ｎ＋１生成物が二重鎖コンフォメーションの全長生成物に変換される。したがって、ＢＥＲの効率は、ｎ種およびｎ＋１種のレベルを、全基質および生成物ＤＮＡの百分率と比較して定量化しながら時間をわたって追跡することによって決定される。ＢＥＲに対する３Ｅ１０の影響を測定するために、放射性標識したＤＮＡ基質（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、ＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼβ、およびリガーゼと一緒にインキュベートした）におけるＵ：Ｇミスマッチの修復を、対照緩衝液、対照抗チューブリン抗体、または３Ｅ１０の存在下で試験した。３Ｅ１０により、ｎ＋１種の最終的なライゲーション生成物への変換が緩衝液対照と比較して有意に遅延し、これにより、３Ｅ１０により一本鎖切断修復経路のライゲーションステップが損なわれることが示唆される（図２Ｉ）。抗チューブリン抗体には、対照緩衝液と比較して、ＢＥＲに対する効果がなかった。
【０１１３】
ＤＮＡ修復に対する３Ｅ１０の影響をさらに探るために、ＩＲ誘導性ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）および複製フォークの失速に伴うＤＳＢを含めたＤＳＢを修復するための重要な経路である相同性依存性修復（ＨＤＲ）に対する３Ｅ１０の効果を試験した（Ａｒｎａｕｄｅａｕ  Ｃら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０７巻：１２３５頁（２００１年）；Ｌｉ  Ｘら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １８巻：９９頁（２００８年））。ＨＤＲは、一本鎖ＤＮＡに結合して、鎖の侵入を媒介する核フィラメントを形成するＲＡＤ５１リコンビナーゼに依存する（Ｓｕｎｇ  Ｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５巻：１２４１頁（１９９４年）；Ｓｕｎｇ  Ｐら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８巻：４２７２９頁（２００３年）；Ｓｕｎｇ  Ｐら、Ｃｅｌｌ  ８２巻：４５３頁（１９９５年））。３Ｅ１０は遊離の一本鎖テイルに優先的に結合するので、この抗体により、ＲＡＤ５１に媒介される鎖の侵入および交換が損なわれる可能性があると仮定された。この仮説を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ鎖交換反応アッセイ（Ｄｒａｙ  Ｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８巻：３５６０頁（２０１１年））において試験し、その概略図が図３Ａに示されている。精製ヒトＲＡＤ５１（ｈＲＡＤ５１）を、標識していない１５０ｂｐの一本鎖ＤＮＡ基質と一緒に５分間インキュベートして、鎖の侵入が可能なｈＲＡＤ５１−一本鎖ＤＮＡ核タンパク質を形成させた。次に、３Ｅ１０（０〜３５μＭ）または対照抗Ｈｉｓ６ＩｇＧ抗体を反応物に加え、５分間インキュベートしておいた。次に、放射性標識した鎖を１つ有する平滑末端二重鎖コンフォメーションの４０ｂｐのＤＮＡ基質を加え、ｈＲＡＤ５１−一本鎖ＤＮＡ核タンパク質フィラメントと一緒に、抗体の存在下または不在下で３０分間インキュベートした（概略図が図３Ａに示されている）。次いで、鎖交換反応の程度を電気泳動によって可視化し、定量化した。３Ｅ１０では鎖交換反応が用量依存的に阻害されたが（図３Ｂ）、対照抗Ｈｉｓ６ＩｇＧ抗体には鎖交換反応に対する影響はなかった。３Ｅ１０により、ＡＴＰ加水分解に欠陥があり、したがって野生型ＲＡＤ５１よりもさらに強力な鎖交換反応のメディエーターであるＲＡＤ５１の改変体ｈＲＡＤ５１Ｋ１３３Ｒによって媒介される鎖交換反応を抑制することもできた（Ｃｈｉ  Ｐら、ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ）５巻：３８１頁（２００６年））（図３Ｃ）。これらのデータにより、３Ｅ１０により、ＲＡＤ５１媒介性鎖交換反応が抑制されることによってＨＤＲが阻害されることが実証されている。
【０１１４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて３Ｅ１０によりＨＤＲが阻害されることが見いだされたので、３Ｅ１０を用いて処理した細胞ではＤＮＡ損傷療法によって誘導されるＤＮＡ  ＤＳＢの修復が遅延すると仮定された。この仮説を試験するために、Ｕ２５１神経膠腫細胞を、対照緩衝液または３Ｅ１０  ｓｃＦｖ（１０μＭ）で処理し、２ＧｙのＩＲを照射した。２４時間後に、細胞当たりに存続しているＤＮＡ  ＤＳＢの数を、リン酸化されたヒストン構成成分であるγＨ２ＡＸの巣（ｆｏｃｉ）を免疫蛍光法によって可視化することによって定量化した。３Ｅ１０  ｓｃＦｖの存在下で照射した細胞では、２４時間の時点で細胞当たり平均１０．５±１のγＨ２ＡＸ巣が示され、それと比較して、対照緩衝液中で照射した細胞では６．８±１であった（ｐ＜０．０１）。これらのデータにより、３Ｅ１０  ｓｃＦｖを用いて処理した細胞ではＤＮＡ  ＤＳＢの消散が遅延することが実証されており、これは、３Ｅ１０によってＤＮＡ修復が阻害されることが実証されているｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結果と一致する。
【０１１５】
（実施例４）
細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体（３Ｅ１０）は、ＤＮＡ修復が欠損した癌細胞に対して合成致死性である
材料および方法
ＢＲＣＡ２変異によってＨＤＲに欠損を有する癌細胞（Ｍｏｙｎａｈａｎ  ＭＥら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ７巻：２６３頁（２００１年））は、一本鎖切断修復の阻害によって非常に死滅しやすい（Ｂｒｙａｎｔ  ＨＥら、Ｎａｔｕｒｅ  ４３４巻：９１３頁（２００５年）；Ｆｅｎｇ  Ｚら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８巻：６８６頁（２０１１年）；Ｋａｅｌｉｎ，  Ｊｒ．  ＷＧら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ５巻：６８９頁（２００５年））。そのような阻害は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ−１）またはＤＮＡポリメラーゼβの阻害剤を用いて処理することによって達成することができ、これは、合成致死性と称される現象である（Ｓｔａｃｈｅｌｅｋ  ＧＣら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７０巻：４０９頁（２０１０年）；Ｂｒｙａｎｔ  ＨＥら、Ｎａｔｕｒｅ  ４３４巻：９１３頁（２００５年）；Ｋａｅｌｉｎ，  Ｊｒ．  ＷＧら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ５巻：６８９頁（２００５年）；Ｆａｒｍｅｒ  Ｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ４３４巻：９１７頁（２００５年））。さらに、ＢＲＣＡ２欠損細胞は、ＢＲＣＡ２欠損癌細胞においてＲＡＤ５２をノックダウンすることによる合成致死効果によって示されている通り、ＨＤＲのさらなる阻害に対する感受性が高いことが示されている（Ｆｅｎｇ  Ｚら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８巻：６８６頁（２０１１年））。３Ｅ１０により、一本鎖切断修復およびＨＤＲがどちらも阻害されるという観察に基づいて、３Ｅ１０はＢＲＣＡ２欠損癌細胞に対して合成致死性であると仮定された。この仮説を試験するために、ＢＲＣＡ２欠損（ＰＥＯ１）ヒト卵巣癌細胞およびＢＲＣＡ２非欠損（ＰＥＯ１  Ｃ４−２）ヒト卵巣癌細胞の対応した対に対する３Ｅ１０  ｓｃＦｖまたは完全な３Ｅ１０抗体を用いた処理の影響を評価した（Ｓａｋａｉ  Ｗら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６９巻：６３８１頁（２００９年））。ＢＲＣＡ２非欠損ＰＥＯ４ヒト卵巣癌細胞およびＢＲＣＡ２欠損ＣＡＰＡＮ１／ｎｅｏヒト膵癌細胞に対する３Ｅ１０  ｓｃＦｖの影響についても試験した。
【０１１６】
結果
３Ｅ１０  ｓｃＦｖでの処理により、ＢＲＣＡ２欠損ＰＥＯ１細胞のクローン原性生存が低下した（ｐ＝０．０３）が、ＢＲＣＡ２非欠損ＰＥＯ１  Ｃ４−２細胞の生存には不利な影響はなかった（図４Ａ〜４Ｂ）。同様に、細胞生存能力アッセイにおいて、３Ｅ１０  ｓｃＦｖはＢＲＣＡ２欠損ＰＥＯ１細胞に対しては毒性であったが、ＢＲＣＡ２非欠損ＰＥＯ４細胞に対しては毒性ではなかった（図４Ｃ）。同様に、３Ｅ１０  ｓｃＦｖは単独でＢＲＣＡ２欠損ヒト膵癌細胞（ＣＡＰＡＮ１／ｎｅｏ）に対して毒性であった（図４Ｄ）。完全な３Ｅ１０抗体は、ＢＲＣＡ２欠損ＰＥＯ１細胞に対して同様に選択的に、用量依存的に毒性であった（図４Ｅ）。これらのデータにより、ＤＮＡ修復が欠損した癌細胞に対する細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体の合成致死効果についての最初の証拠がもたらされ、ＤＮＡ修復の欠損を伴う悪性疾患に対するターゲティング癌療法としての３Ｅ１０の潜在的な有用性が実証されている。重要なことに、ＢＲＣＡ２欠損癌細胞に対する３Ｅ１０の合成致死効果は、ＤＮＡ鎖の切断の修復に対する３Ｅ１０の影響が示されている上記の機構的実験と一致する。
【０１１７】
さらに、低酸素状態の癌細胞は、相同性＝指向性修復能（ｃａｐａｃｉｔｙ）が低下していることが示されており（Ｂｉｎｄｒａら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４巻（１９号）：８５０４〜８５１８頁（２００４年））、したがって、３Ｅ１０および同様の抗体は、低酸素の状態である癌細胞に対して合成致死性であることが予測される。
【０１１８】
（実施例５）
細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体である３Ｅ１０により、ＤＮＡ修復欠損癌細胞がＤＮＡ損傷療法に対して極めて大きくかつ選択的に感作される
材料および方法
３Ｅ１０が、ＤＮＡ損傷剤とカップリングした場合にＢＲＣＡ２欠損癌細胞に対するさらに大きな影響を有するかどうかを決定するために、ＢＲＣＡ２欠損ＰＥＯ１卵巣癌細胞およびＢＲＣＡ２非欠損ＰＥＯ１  Ｃ４−２卵巣癌細胞を、対照緩衝液、１０μＭの３Ｅ１０、３ｎＭのドキソルビシン、または１０μＭの３Ｅ１０＋３ｎＭのドキソルビシンで処理した。次いで、処理の３日後に、パーセント細胞死をヨウ化プロピジウム蛍光によって評価した。細胞に対するドキソルビシン単独での効果を最小限にするために低用量のドキソルビシン（３ｎＭ）を選択し、処理のおよそ７日後に明らかであるＢＲＣＡ２欠損細胞に対する３Ｅ１０単独による合成致死性の交絡効果を最小限にするために、処理の３日後にパーセント細胞死を測定することに決定した。
【０１１９】
結果
予測通り、低用量のドキソルビシンは、単独ではＢＲＣＡ２非欠損細胞またはＢＲＣＡ２欠損細胞に対して有意に毒性ではなかった。３Ｅ１０をドキソルビシンに添加することによるＢＲＣＡ２非欠損細胞に対する影響は最小であった。しかし、３Ｅ１０とドキソルビシンの組合せは、ＢＲＣＡ２欠損細胞に対しては高度に細胞毒性であった（６５％±７の細胞死、ｐ＜０．００１）（図４Ｆ〜４Ｇ）。
【０１２０】
（実施例６）
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、３Ｅ１０によりＤＮＡ損傷化学療法が強化される
次に、ＤＮＡ損傷療法への腫瘍細胞の感受性に対する３Ｅ１０の影響がマウス腫瘍モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで保存されるかどうかを決定した。
【０１２１】
材料および方法
完全な３Ｅ１０抗体は可変性断片と比較して循環中での半減期が長いことが予測されるので、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験のためにこれを使用した。ＳＣＩＤマウスにおいて、皮下注射によってＵ８７神経膠腫瘍を生成した。腫瘍が形成され、安定した成長相になったら、マウスに、対照緩衝液、３Ｅ１０抗体単独（ＰＢＳ  ０．５ｍＬ中０．８ｍｇ、１０μＭ）、ドキソルビシン単独（８０μｇ／ｋｇ）、または３Ｅ１０とドキソルビシンの両方の腹腔内注射によって処置した。各処置群はマウス４匹で構成された。次いで、処置の影響を、注射の３日後に腫瘍の成長を測定することによって評価した。この腫瘍測定の時点の選択は、ドキソルビシンへの癌細胞の感受性に対する抗体の影響を処置の３日後に検出することができることが実証されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に基づいた。対照群において急速に達成された、腫瘍が４００ｍｍ３の体積に到達した際の動物の屠殺に関する所定の制度上の要件のために、３日後の追加的な腫瘍測定値を得ることはできなかった。
【０１２２】
結果
対照緩衝液で処置したマウスにおける腫瘍は、体積が５４％±２３増大した。３Ｅ１０またはドキソルビシン単独での処置では、腫瘍の成長に有意な影響はなく、腫瘍体積はそれぞれ４８％±１３および６１％±１０増大した。対照的に、３Ｅ１０とドキソルビシンの組合せで処置したマウスでは、腫瘍の成長が有意に低下し、腫瘍のサイズの増大は、９％±７のみであった（ｐ＝０．００４、ｐは、ドキソルビシン＋３Ｅ１０で処置したマウスとドキソルビシン単独で処置したマウスとで絶対的な腫瘍体積を比較することによって算出した）。これらのデータにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、３Ｅ１０により腫瘍がドキソルビシンに対して感作されることが実証されている（図５）。
【０１２３】
（実施例７）
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、細胞浸透性抗ＤＮＡ抗体（３Ｅ１０）によりヒト神経膠腫異種移植片が電離放射線に対して感作される
材料および方法
ヒト神経膠腫異種移植片を、ヌードマウスの側腹部にＵ８７細胞を皮下注射することによって生成した。処置群は、対照（ｎ＝８）；抗体（ｎ＝８）、８Ｇｙ（電離放射線）（ｎ＝８）、および８Ｇｙ＋抗体（ｎ＝７；１匹の動物が麻酔で失われた）であった。移植の２５日後に、マウスの腫瘍はおよそ１００ｍｍ３の平均サイズに成長した。２６日目に、マウスを、対照緩衝液（ＰＢＳ；「対照」群および「８Ｇｙ」群）または３Ｅ１０（ＰＢＳ中１ｍｇ；「抗体」群および「８Ｇｙ＋抗体」群）の腹腔内注射で処置した。次いで、２４時間後に、各群に同じ試薬の第２の注射を受けさせた。２回目の注射の２時間後に、「８Ｇｙ」群および「８Ｇｙ＋抗体」群の腫瘍に８Ｇｙで照射した。次いで、各群の腫瘍体積を追跡し、腫瘍体積が１０００ｍｍ３に到達したらマウスを屠殺した。腫瘍の移植後の日数に対する腫瘍の成長の測定値が図６Ａに示されている。
【０１２４】
結果
３Ｅ１０単独（白抜きのひし形）では、対照緩衝液単独（黒塗りのひし形）と比較して腫瘍の成長に対して有意な影響はなかった。しかし、３Ｅ１０と８Ｇｙの組合せ（白抜きの三角形）により、８Ｇｙ単独（黒塗りの三角形）よりも大きな程度で腫瘍の成長が抑制された。
【０１２５】
図６Ｂには、各群における無進行生存（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）のカプラン・マイヤープロットが示されている。無進行生存は、ベースラインのサイズと比較してサイズが３倍以上増大していない腫瘍を伴う生存と定義される。ベースラインのサイズは、抗体処置する１日前の腫瘍サイズと定義され、これは、パネルＡでは２５日目、パネルＢでは０日目と示される。腫瘍三倍化時間（腫瘍の体積がベースラインの３倍に増大するために必要な時間）は、８Ｇｙで処置した腫瘍では９．５±０．５日間であり、それと比較して、８Ｇｙ＋３Ｅ１０で処置した腫瘍では１３．７±１．８日であった（ｐ＝０．０４）。しかし、３Ｅ１０単独では、対照緩衝液単独と比較して、Ｕ８７腫瘍に対する影響はなく、腫瘍三倍化時間は対照腫瘍では６．８±０．７日であったのに対し、３Ｅ１０単独で処置した腫瘍では６．５±０．３日であった（ｐ＝０．６７）。これらのデータにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、３Ｅ１０によりヒト神経膠腫異種移植片が電離放射線に対して感作されることが実証されている。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【国際調査報告】
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