(57)【要約】  本発明は、ｉ）対象となる治療核酸を用いて製剤化された薬学的組成物を、病的眼の脈絡膜上腔に送達する工程、およびｉｉ）薬学的組成物が送達された領域を電場にかける工程からなる工程を含む、被験者における眼疾患を処置するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）対象となる治療核酸を用いて製剤化された薬学的組成物を、病的眼の脈絡膜上腔に送達する工程、およびｉｉ）薬学的組成物が送達された領域を電場にかける工程からなる工程を含む、被験者における眼疾患を処置するための方法。
【請求項２】
対象となる核酸がプラスミドに挿入される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
対象となる核酸が、酵素、血液製剤、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、ケモカイン、抗炎症因子、成長因子、栄養因子、神経栄養因子、造血因子、血管新生因子、抗血管新生因子、メタロプロテイナーゼ阻害剤、アポトーシスのレギュレーター、凝固因子、そのレセプター、特に可溶性レセプター、レセプターもしくは接着タンパク質のアゴニストもしくはアンタゴニストであるペプチド、その抗原、抗体、フラグメントもしくは誘導体、および細胞の他の必須構成成分、ＲＰＥ細胞内の視覚サイクルに関与するタンパク質、または網膜細胞の構造タンパク質をコードする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
眼疾患が網膜疾患である、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
前記の眼疾患が、眼内増殖性疾患、眼神経変性疾患、緑内障、眼感染症、眼炎症疾患、例えば結膜炎、角膜炎、内皮炎、ブドウ膜炎、脈絡膜炎、網膜炎、脈絡網膜炎、前部ブドウ膜炎、および炎症性視神経症、網膜変性、特に網膜色素変性症、末梢網膜変性、黄斑変性症、例えばドライ型加齢黄斑変性症、虚血性網膜症、特に未熟児網膜症、および糖尿病性網膜症、網膜血管障害、眼虚血症候群、および他の血管形成異常、脈絡膜異常、および脈絡膜腫瘍、硝子体の異常、グリア細胞の増殖、例えば増殖性硝子体網膜症、および糖尿病性網膜前血管新生に関連したグリア細胞の増殖からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項６】
前記核酸が、ＴＮＦ［α］レセプター、ＴＧＦ［β］２レセプター、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＣＣＲ２またはＭＩＰ１の可溶性フラグメントをコードするか、あるいはさもなくば、免疫療法の目的のための認識能を有する抗体、一本鎖抗体の可変フラグメント（ＳｃＦｖ）、または任意の他の抗体フラグメントをコードするか、あるいはこれらの治療タンパク質のいずれか１つの前駆体をコードする、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
薬学的組成物が、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースからなる群より選択される増粘剤を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
電場が、電気穿孔法によって実施される、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
電場の磁場強度が、１〜６００ボルト、好ましくは１〜４００ボルト、さらにより好ましくは１〜２００ボルト、有利には１０〜１００ボルト、またはさらには１５〜７０ボルトである、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
電場を印加する全期間が、０．０１ミリ秒〜１秒、好ましくは０．０１〜５００ミリ秒、より好ましくは１〜５００ミリ秒、有利には１０ミリ秒〜１００ミリ秒、最も好ましくは２０ミリ秒である、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
電場が、２つの電極を使用することによって印加され、前記電極の一方が、脈絡膜上腔に導入され、そして他方が、脈絡膜上への注射が実施されたのとは反対側の眼の表面上に適用される、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
電場が、２つの電極を使用することによって印加され、前記電極の一方が、脈絡膜上への注射が実施された領域に隣接した強膜の表面上に適用され、そして他方が、脈絡膜上への注射が実施されたのとは反対側の、眼の表面上、例えば強膜または結膜に適用される、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
眼疾患が眼内新生血管または黄斑浮腫であり、そして前記方法がそれを患う被験者の脈絡膜上腔に、抗ＶＥＧＦ、抗ＶＥＧＦレセプターまたは抗ＰＬＧＦをコードする治療核酸を用いて製剤化された薬学的組成物を送達することを含む、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
眼疾患が網膜色素変性症であり、そして前記方法が、それを患う被験者の脈絡膜上腔に、神経栄養因子をコードする治療核酸を用いて製剤化された薬学的組成物を送達することを含む、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
眼疾患が糖尿病性網膜症であり、そして前記方法が、それを患う被験者の脈絡膜上腔に、抗ＩＲＳ−１またはＩＧＦ−１をコードする治療核酸を用いて製剤化された薬学的組成物を送達することを含む、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、被験者における眼疾患の処置のための方法および薬学的組成物に関する。
【０００２】
発明の背景：
近年、生物学的療法を使用した、加齢黄斑変性および糖尿病性網膜症などの眼疾患の処置のためのエキサイティングな新たな進展があった。眼は、バリアによって隔離された小さく限局された器官であるため、局所的な遺伝子療法のために選択される器官であると同定されている。
【０００３】
例えば、遺伝性網膜ジストロフィーは、光受容体（錐体および杆体）または網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）におけるタンパク質をコードする遺伝子の突然変異に起因する。光受容体細胞の遺伝子置換は、依然として前臨床評価中であるが、この分野における最も顕著な進展は、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）の処置のための、ＲＰＥ細胞におけるＲＰＥ６５遺伝子の置換に対してなされた。ＲＰＥへのウイルスによる遺伝子の導入が動物モデルにおいて実行可能でそして効率的であることが示されただけでなく、近年、患者はｒＡＡＶ４の網膜下注射を受けて、有望な機能的結果が得られ、失明病を患う患者に希望をもたらしている。
【０００４】
ウイルスベクターはＲＰＥ細胞の効率的なトランスフェクションを可能とし、そしてこれは概念証明を検証するために役立っているが、網膜および脳へのウイルス粒子の長期間の存続は、特に処置が小児に適用される場合には、安全性の懸念が依然として生じる。
【０００５】
硝子体に注射した場合、ウイルスベクターはＲＰＥ細胞には到達せず、そしてその網膜下注射のみが、ＲＰＥ細胞または光受容体を標的化するのに効果的であることが示された。さらに、網膜下注射を使用すると、中心視野の回復を目指す場合に、剥離した網膜領域（これは黄斑の剥離を意味する）およびその近傍におけるＲＰＥ細胞のみがトランスフェクションされる。このような黄斑剥離は、視力を脅かし得る。実際に、網膜剥離後の視力回復が不十分であることは、黄斑剥離に関連していることがよく知られている。スペクトラルドメインＯＣＴを使用した近年の研究は、網膜剥離の成功裏の手術による処置後、眼の６２％が、解剖学的な中心窩の異常を呈し、そして特に、手術前に黄斑が剥離していた場合にのみ観察された外境界膜の破壊が、最も不良な視力の予後に関連していたという証拠を提供した。黄斑剥離後の視力回復を予測し得る因子に関する論議は依然として存在するけれども、復位時の黄斑の健康は、おそらく最も重要な変数である。病的眼では、黄斑剥離後の中心視野の回復の不確実性は知られているが、黄斑下への注射は危険ではないことを保証するのは困難である。
【０００６】
多くの非ウイルス性遺伝子導入ベクターまたは方法が開発され、そして眼遺伝子療法のために適応されている（Andrieu-Soler C Mol Vis 2006 12:1334; Bejjani RA Surv Ophthalmol 2007 52:196; Bloquel C Adv Drug Deliv Rev 2006 58:1224）。これらの中で、電流がプラスミドＤＮＡを細胞中へと運ぶ「エレクトロトランスファー」とも呼ばれる電気穿孔法は、とりわけ最も効率的であり（Mir LM Adv Genet 2005 54:83; Mir LM Methods Mol Biol 2008 423:3; Isaka Y Expert Opin Drug Deliv 2007 4:561）、そして臨床的に評価されるまでに発展してきた（Daud AI J Clin Oncol 2008 26:5896）。以前の報告は、網膜下へのプラスミドの投与後、電気穿孔法は新生児マウスＲＰＥの効率的なトランスフェクション（Matsuda T Proc Natl Acad Sci USA 2004 101:16）、および動物モデルにおける網膜変性の遅延（Chen B Science 2009 323:256）を可能としたことを示した。効率的で持続したＲＰＥのトランスフェクションはまた、特定のＲＰＥプロモーターを含むプラスミドの網膜下への注入と電気穿孔法との組合せを使用して成体ラットにおいても達成された（Kachi S Gene Ther 2005 12:843; Johnson CJ Mol Vis 2008 14:2211）。
【０００７】
脈絡膜上腔は、内側の血管膜である脈絡膜と、眼球の外側の層である強膜との間に位置する、眼球における潜在的な空間である。脈絡膜上腔は、毛様体の後の眼球の前側部分から、視神経までの眼球の後ろ部分まで延びている。従って、眼球の脈絡膜上腔は、薬物送達のための可能性ある経路として研究されてきた。例えば、Olsen, et al., American J. Opthamology 142(5): 777-87 (November 2006); Iscience Interventional CorporationのＰＣＴ特許出願公開公報第WO 2007/100745号を参照されたい。脈絡膜上腔は、実際に、後方領域を処置するために、眼球の前部領域から近づくことのできる経路を提供する。しかしながら、前記経路は、ウイルスを介さない遺伝子療法については考えられてこなかった。
【０００８】
発明の概要：
本発明は、
ｉ）対象となる治療核酸を用いて製剤化された薬学的組成物を、病的眼の脈絡膜上腔に送達する工程、およびｉｉ）薬学的組成物が送達された領域を電場にかける工程からなる工程を含む、被験者における眼疾患を処置するための方法に関する。
【０００９】
発明の詳細な説明：
本発明者らは、眼球外電気穿孔法を伴う、ラット眼球の上脈絡膜へのプラスミド溶液の注射が、脈絡膜およびＲＰＥ細胞および／または神経網膜のトランスフェクションに対して効率的であり得るかどうかを評価した。本発明者らは、本明細書において、網膜下への注射およびその後の剥離を必要としないこの最少限に侵襲的な手法を使用すると、ＲＰＥ細胞および脈絡膜細胞だけでなく光受容体も効率的にトランスフェクションされるという概念証明をもたらす。従って、本発明は被験者における眼疾患の処置のためのこのような方法の使用に関する。
【００１０】
従って、本発明は、
ｉ）対象となる治療核酸を用いて製剤化された薬学的組成物を、病的眼の脈絡膜上腔に送達する工程、およびｉｉ）薬学的組成物が送達された領域を電場にかける工程からなる工程を含む、被験者における眼疾患を処置するための方法に関する。
【００１１】
本発明に使用しようとする核酸は、生物学的特性を示す対象となる任意の核酸であり得る。より特定すると、核酸は、生物学的活性を示す天然の、切断短縮された、人工の、キメラの、または組換えの産物［例えば対象となるポリペプチド（タンパク質またはペプチドを含む）、ＲＮＡなど］をコードする任意の核酸であり得る。
【００１２】
核酸は、好ましくは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子（ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、合成ＤＮＡ、人工ＤＮＡ、組換えＤＮＡなど）またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子（ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＲＮＡｓｉ、触媒ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ウイルスＲＮＡなど）である。核酸は一本鎖または多重鎖核酸、好ましくは二本鎖核酸であり得るか、または複合体を形成し得る。核酸は、ハイブリッド配列、または合成もしくは半合成配列を含み得る。それは、当業者に公知の任意の手法によって、特にライブラリーのスクリーニングによって、化学合成によって、または代替的にはライブラリーのスクリーニングによって得られた配列の化学的もしくは酵素的修飾を含む混合法によって得ることができる。
【００１３】
特定の態様において、治療核酸は、合成または生合成を起源とするか、あるいはウイルスから、または単細胞もしくは細胞周囲の真核生物もしくは原核生物から抽出される。
【００１４】
本発明に使用される治療核酸は、脈絡膜上腔に投与される場合に、裸であっても、任意の化学的薬剤、生化学的薬剤または生物学的薬剤と複合体を形成していても、ベクターなどに挿入されていてもよい。
【００１５】
本明細書において使用した「裸ＤＮＡ」という用語は、前記ＤＮＡの送達もしくは導入を改善する、または細胞へのその進入を容易にする、合成的薬剤、生合成的薬剤、化学的薬剤、生化学的薬剤または生物学的薬剤と組み合わせられていない、任意の核酸分子を指す。
【００１６】
本明細書において使用した「ベクター」という用語は、それが連結している別の核酸を輸送することのできる核酸分子を指す。この用語はまた、本出願において、その細胞内送達を増加させるために、治療または予防核酸に会合させた組成物などの、任意の送達担体を指す。
【００１７】
好ましいベクターは、それらが連結している核酸の自律的複製および／または発現を行なうことができるものである。ベクターが作動可能に連結している遺伝子の発現を指令することのできるベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と呼ばれている。一般的に、組換えＤＮＡ手法において有用な発現ベクターは、しばしば「プラスミド」の形態であり、これは、環状の二本鎖ＤＮＡループを指し、これはそのベクター形態において、染色体に結合していない。本発明において、プラスミドは最も頻繁に使用されるベクターの形態である。プラスミドは、本発明の裸ＤＮＡの好ましい形態である。
【００１８】
ベクターはまたエピソームＤＮＡ、酵母人工染色体、ミニ染色体またはウイルスベクターであり得、前記ウイルスベクターはレンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびウイルス様ベクターからなる群より選択される。
【００１９】
ベクターはまた、リポソームなどの脂質小胞であり得る。リポソームではない脂質をベースとした化合物もさらに使用され得る。例えば、リポフェクチンおよびサイトフェクチンは、負に荷電した核酸と結合し、そして細胞膜を横切ってＤＮＡを運ぶことのできる複合体を形成する、脂質をベースとした陽イオンである。本発明は、等価な機能を果たし、そして当技術分野において公知となった、このような他の形態の発現ベクターも続いて本明細書において含むことを意図する。
【００２０】
さらに、本発明による核酸はまた、１つ以上の追加の領域、例えば当業者に入手可能な小さいまたは大きなサイズの調節エレメント、例えばプロモーター領域（構成性、調節性、誘導性、組織特異性など）、例えば標的化組織（例えば脈絡膜または網膜）または細胞（例えばＲＰＥまたは光受容体）における発現を可能とするおよび／または促進する配列、転写終結シグナル、分泌配列、複製起点、および／または細胞核へのポリヌクレオチドの導入をさらに増強する核内移行シグナル（ｎｌｓ）配列を含み得る。ＳＶ４０ラージＴ抗原配列を含むこのようなｎｌｓ配列は、従来技術において記載されている。
【００２１】
さらに、核酸は、核酸の導入の結果（どの組織に導入されたか、発現期間など）を選択、測定およびモニタリングするのに有用である選択マーカーをさらに含み得る。使用することができる、または使用のために適応させることのできる発現系およびリポーター遺伝子のタイプは当技術分野において周知である。例えば、ルシフェラーゼ活性、アルカリホスファターゼ活性、または緑蛍光タンパク質活性をコードする遺伝子が一般的に使用されている。
【００２２】
本発明による核酸は、任意のサイズの任意のヌクレオチド配列を含み得る。従って、核酸は、シンプルなオリゴヌクレオチドから、より大きな分子、例えば任意のサイズ（小または大）のエキソンおよび／またはイントロンおよび／または調節エレメントを含むヌクレオチド配列、任意のサイズの遺伝子、例えば大きなサイズの遺伝子、または例えば染色体までサイズが変化し得、そしてプラスミド、エピソーム、ウイルスゲノム、ファージ、酵母人工染色体、ミニ染色体、アンチセンス分子などであり得る。
【００２３】
特に好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、生物学的活性を有する産物をコードする、二本鎖の環状ＤＮＡ、例えばプラスミドである。
【００２４】
核酸を、増幅、原核または真核宿主細胞中での培養、精製などの、従来の組換えＤＮＡ手法に従って調製および産生することができる。組換えＤＮＡ技術の手法は、当業者には公知である。
【００２５】
特定の態様において、対象となる核酸は、標的細胞に対して有益な効果を奏功することができる。それは内因性物質の欠乏を補ったり、または過剰を減少させたりすることができる。あるいは、それは標的細胞に対して新たな特性を付与し得る。それは例えば、眼細胞の機能、形態、活性および／または代謝に影響を及ぼし得るポリペプチドをコードするアンチセンス配列または核酸であり得る。
【００２６】
アンチセンス核酸を使用した遺伝子発現のダウンレギュレーションは、翻訳レベルまたは転写レベルで達成され得る。本発明のアンチセンス核酸は、好ましくは、内因性の眼内活性物質をコードしている核酸または対応するメッセンジャーＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションすることのできる核酸フラグメントである。これらのアンチセンス核酸は、場合によりその安定性および選択性を改善するように改変された、合成オリゴヌクレオチドであり得る。それらはまた、その発現が、内因性眼内活性物質をコードしているｍＲＮＡの全部または一部に対して相補的であるＲＮＡを細胞内で産生するＤＮＡ配列であり得る。アンチセンス核酸は、内因性眼内活性物質をコードしている核酸の全部または一部の逆方向での発現によって調製され得る。内因性眼内活性物質の発現をダウンレギュレーションまたは遮断することができる限り、任意の長さのアンチセンス配列が本発明の実施に適している。好ましくは、アンチセンス配列は少なくとも２０ヌクレオチド長である。アンチセンス核酸、アンチセンスＲＮＡをコードしているＤＮＡの調製および使用、並びにオリゴおよび遺伝子アンチセンスの使用は、国際公開公報第９２／１５６８０号に開示され、その内容は本明細書に参照として組み入れられる。
【００２７】
前記したような核酸によって場合により発現され、そして本発明の実施に適した、生物学的に活性なポリペプチドまたはタンパク質には、酵素、血液製剤、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、ケモカイン、抗炎症因子、成長因子、栄養因子、神経栄養因子、造血因子、血管新生因子、抗血管新生因子、メタロプロテイナーゼ阻害剤、アポトーシスのレギュレーター、凝固因子、そのレセプター、特に可溶性レセプター、レセプターまたは接着タンパク質のアゴニストもしくはアンタゴニストであるペプチド、その抗原、抗体、フラグメントまたは誘導体、および細胞の他の必須構成成分、ＲＰＥ細胞内の視覚サイクルに関与するタンパク質、および網膜細胞の構造タンパク質（構造タンパク質、光伝達プロセスおよび／または視覚サイクル（網膜再循環）および／または光受容体外節の食作用に関与するタンパク質）がある。
【００２８】
種々の網膜由来の神経栄養因子は、変性している光受容体細胞を救出する能力を有し、そして本発明による方法を通して送達され得る。好ましい生物学的に活性な薬剤は、ＶＥＧＦ、アンギオテンシン、アンジオポエチン−１、ＤｅＭ、酸性または塩基性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−２、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、分散因子（ＳＦ）、レプチン、ミッドカイン、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板由来増殖因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、ＲｄＣＶＦ（杆体に由来する錐体生存因子）、プログラニュリン、プロリフェリン、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、ＰＥＧＦ、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血管透過性因子（ＶＰＦ）、ＣＮＴＦ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＰＥＤＦ、ＮＴ３、ＢＦＧＦ、アンジオポエチン、エフリン、ＥＰＯ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ＮＴ５、Ｇａｘ、成長ホルモン、［α］−１−アンチトリプシン、カルシトニン、レプチン、アポリポプロテイン、ビタミンの生合成のための酵素、ホルモンまたは神経伝達物質、ケモカイン、サイトカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、そのレセプター、前記レセプターのいずれか１つを遮断する抗体、ＴＩＭＰ、例えばＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、ＴＩＭＰ−４、アンジオアレスチン、エンドスタチン、例えばエンドスタチンＸＶＩＩＩおよびエンドスタチンＸＶ、ＡＴＦ、アンジオスタチン、エンドスタチンとアンジオスタチンの融合タンパク質、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２のＣ末端ヘモペキシンドメイン、ヒトプラスミノーゲンのクリングル５ドメイン、エンドスタチンとヒトプラスミノーゲンのクリングル５ドメインの融合タンパク質、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤、血小板第４因子（ＰＦ４）、プロラクチンフラグメント、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、抗血管新生アンチトロンビンＩＩＩ、軟骨由来阻害剤（ＣＤＩ）、ＣＤ５９補体フラグメント、Ｃ３ａおよびＣ５ａ阻害剤、膜侵襲複合体阻害剤、Ｈ因子、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、カベオリン、ＰＫＣゼータ、ジャンクションタンパク質、ＪＡＭ、ＣＤ３６、ＭＥＲＴＫバスキュロスタチン、バソスタチン（カルレチキュリンフラグメント）、トロンボスポンジン、フィブロネクチン、特にフィブロネクチンフラグメントｇｒｏ−β、ヘパリナーゼ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インターフェロンα／β／γ、インターフェロン誘導性タンパク質（ＩＰ−１０）、インターフェロンγによって誘導されるモノカイン（Ｍｉｇ）、インターフェロンα誘導性タンパク質１０（ＩＰ１０）、ＭｉｇとＩＰ１０の融合タンパク質、可溶性Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（ＦＬＴ−１）レセプター、キナーゼインサートドメインレセプター（ＫＤＲ）、アポトーシスのレギュレーター、例えばＢｃｌ−２、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、Ｂｉｋ、Ｂｃｌ−Ｘ短鎖アイソフォームおよびＧａｘ、そのフラ���メントまたは誘導体などから選択され得る。
【００２９】
特定の態様において、核酸は、ＴＮＦαレセプター、ＴＧＦβレセプター、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＣＣＲ２またはＭＩＰ１の可溶性フラグメントをコードする。核酸はまた、別の好ましい態様において、免疫療法の目的のための認識能を有する抗体、一本鎖抗体の可変フラグメント（ＳｃＦｖ）または任意の他の抗体フラグメントをコードし得る。
【００３０】
本発明の特定の態様において、生物学的に活性な核酸は、前記したような本発明に使用できる治療タンパク質の前駆体をコードする。
【００３１】
別の特定の態様において、本発明の方法は、特に、遺伝子置換を実施するのに適している。従って、核酸は、標的化組織において天然に発現されている欠陥タンパク質を置き換えることのできるタンパク質をコードし得る。典型的には、置き換えられ得る欠陥遺伝子としては、網膜変性疾患、例えば網膜色素変性症（ＲＰ）、レーバー先天黒色障（ＬＣＡ）、劣性ＲＰ、優性網膜色素変性症、Ｘ連鎖性網膜色素変性症、不完全優性Ｘ連鎖性網膜色素変性症、優性レーバー先天黒色障、網膜色素変性症を伴う劣性後索型失調症、ＲＰＥの側細動脈蓄積を伴う劣性網膜色素変性症、網膜色素変性症ＲＰ１２、アッシャー症候群、感音性難聴を伴う優性網膜色素変性症、劣性白点状網膜炎、劣性アルストレーム症候群、劣性バルデ・ビードル症候群、優性脊髄小脳失調症、黄斑ジストロフィーまたは網膜変性、劣性無βリポタンパク血症、黄斑変性を伴う劣性網膜色素変性症、成人型劣性レフサム病、乳児型劣性レフサム病、劣性Ｓ錐体増強症候群、精神遅滞を伴う網膜色素変性症、ミオパチーを伴う網膜色素変性症、劣性ニューファウンドランド杆体錐体ジストロフィー、無色素性網膜色素変性症、区画型網膜色素変性症、限局性網膜色素変性症、シーニア・ローケン症候群、ジュベール症候群、若年性シュタルガルト病、遅発性シュタルガルト病、優性シュタルガルト型黄斑ジストロフィー、優性シュタルガルト様黄斑ジストロフィー、劣性黄斑ジストロフィー、劣性黄色斑眼底、劣性錐体杆体ジストロフィー、Ｘ連鎖性進行性錐体杆体ジストロフィー、優性錐体杆体ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、de Grouchy症候群、優性錐体ジストロフィー、Ｘ連鎖性錐体ジストロフィー、劣性錐体ジストロフィー、超正常桿網膜電図を伴う劣性錐体ジストロフィー、Ｘ連鎖性萎縮性黄斑ジストロフィー、Ｘ連鎖性網膜分離症、優性黄斑ジストロフィー、優性の放射状の黄斑部ドルーゼン、優性牛眼黄斑ジストロフィー、優性蝶形黄斑ジストロフィー、優性成人型卵黄様黄斑ジストロフィー、優性ノースカロライナ型黄斑ジストロフィー、優性網膜錐体ジストロフィー１、優性嚢胞状黄斑ジストロフィー、優性非定型卵黄様黄斑ジストロフィー、中心窩黄斑萎縮症、優性Ｂｅｓｔ型黄斑ジストロフィー、進行性の優性ノースカロライナ様黄斑ジストロフィー、貧毛症を伴う劣性若年性黄斑ジストロフィー、劣性の中心窩形成不全および前眼部形成不全、劣性錐体順応遅延、青錐体一色型色覚異常の黄斑ジストロフィー、ＩＩ型糖尿病および難聴を伴う黄斑性パターンジストロフィー、神鳥斑点網膜、パターンジストロフィー、優性スティックラー症候群、優性マーシャル症候群、優性硝子体網膜変性、優性家族性滲出性硝子体網膜症、優性硝子体網脈絡膜症、優性血管新生炎症性硝子体網膜症、ゴールドマン・ファーブル症候群、劣性色覚異常、優性３型２色覚、劣性桿体一色型色覚異常、先天性赤緑色覚異常、２型２色覚、１型２色覚、２型３色覚、１型３色覚、劣性小口病、優性遅発性黄斑ジストロフィー、劣性脳回転状萎縮症、優性限局性萎縮（atrophia greata）、優性中心性輪紋状脈絡膜ジストロフィー、Ｘ連鎖性全脈絡膜萎縮症、中心性輪紋状脈絡膜萎縮症、中心性脈絡膜萎縮症、乳頭周囲脈絡膜萎縮症、進行性の優性二病巣性網脈絡膜萎縮症、進行性の二病巣性網脈絡膜萎縮症、優性ドイン蜂巣状網膜変性（Malattia Leventinese）、遺伝性エナメル形成不全症、劣性ビエッティ結晶状角膜網膜ジストロフィー、レイノー現象および片頭痛を伴う優性遺伝性血管網膜症、優性ワーグナー病およびびらん性硝子体網膜症、劣性小眼球および網膜疾患症候群、劣性小眼球症、劣性精神遅滞、痙攣および網膜変性、劣性ボスニアジストロフィー、劣性弾性線維性仮性黄色腫、優性弾性線維性仮性黄色腫、劣性若年性バッテン病（セロイド−リポフスチン沈着症）、優性アラジール症候群、マッキュージック・カウフマン症候群、低プレβリポタンパク血症、有棘赤血球増加、淡蒼球変性、劣性ハラーホルデン・スパッツ症候群、優性ソースビー眼底変性症、オレゴン眼病、カーンズ・セイヤー症候群、発達異常および神経異常を伴う網膜色素変性症、Basseb Korenzweig症候群、ハーラー病、サンフィリポ病、シャイエ病、黒色腫を随伴する網膜症、Sheen網膜ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、およびバードショット脈絡網膜症に関与する遺伝子が挙げられるがそれらに限定されない。遺伝子の例としては、ＡＴＰ結合カセット輸送体、ＲＰＥ６５、ＲｄＣＶＦ、ＣＰ２９０をコードする遺伝子が挙げられるがそれらに限定されない。
【００３２】
別の態様において、本発明の方法は、網膜変性疾患に関与する突然変異タンパク質の機能を回復させるためのエキソンスキッピングを実施するのに特に適している。エキソンスキッピングは、タンパク質の機能不全に関与するアミノ酸配列をコードする１つ以上の標的化エキソンが、成熟ｍＲＮＡに取り込まれることを遮断または阻止することに関与する。これは、前記タンパク質をコードするエキソンを含むプレｍＲＮＡを、１つ以上の標的化エキソンの正しいスプライシングのために必要とされる配列モチーフに相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）に曝すことによって達成される。ＡＯＮはプレｍＲＮＡ中の相補的な必要とされる配列に結合し、そして正常なスプライシングを妨げる。代わりに、標的化エキソンは切り出され、そしてタンパク質へと翻訳される成熟ｍＲＮＡには含まれず、そして標的化エキソンによってコードされるアミノ酸配列は、翻訳されたタンパク質から欠失する。
【００３３】
さらに、本発明の別の態様において、明確に異なる生物学的に活性な産物をコードする核酸の混合物を使用することができる。この変異体は、眼細胞において異なる産物の共発現を可能とする。
【００３４】
本発明の薬学的組成物はまた、適合性または生理学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含み得る。
【００３５】
「薬学的に」または「薬学的に許容される」という用語は、適宜、哺乳動物、特にヒトに投与した場合に、有害反応、アレルギー反応または他の望ましくない反応を生じない分子実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体または賦形剤は、任意のタイプの無毒性の固体、半固体、または液体の充填剤、希釈剤、封入剤または製剤化補助剤を指す。
【００３６】
薬学的に適合性または生理学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤としては、本発明の方法に対して薬学的に許容可能であり、無菌であり、そして中性から僅かに酸性の、等張性の、緩衝化された食塩水（リン酸塩、塩化物などを含む）、水性または油性の溶液または懸濁液、より好ましくはスクロース、トレハロース、界面活性剤、タンパク質およびアミノ酸から選択され得る、希釈剤および充填剤が挙げられる。薬学的に適合性または生理学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤は、好ましくは、等張溶液を形成するための適切な分散剤、湿潤剤、懸濁剤、緩和剤、等張剤または増粘剤、安定化剤、保存剤および適切な緩衝剤を使用して製剤化される。特定の薬学的に許容される担体および活性化合物と担体の比は、組成物の溶解度および化学的特性、具体的な投与形態、および標準的な薬務によって決定される。当業者は、公知の技術によってこのようなビヒクルを製剤化する方法を理解しているだろう。
【００３７】
安定化剤の例は、エデト酸二ナトリウムなどである。等張化剤の例は、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ソルビトールおよびマンニトールなどである。緩衝剤の例は、クエン酸、リン酸水素ナトリウム、氷酢酸およびトロメタモールなどである。ｐＨ調整剤の例は、塩酸、クエン酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウムなどである。緩和剤の例はベンジルアルコールなどである。保存剤の例は、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、安息香酸ナトリウムおよびクロロブタノールなどである。
【００３８】
活性化合物の眼内吸収を増加させるために、製剤を施用する際のばらつきを減少させるために、製剤の懸濁液またはエマルションの成分の物理的な分離を減少させるために、および／または別の点で眼製剤を改良するために、単純な水性溶液よりも大きな粘度が望ましくあり得る。このような増粘剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースまたは当業者には公知の他の薬剤が挙げられる。このような薬剤は、典型的には、約０．０１〜２重量％のレベルで使用される。
【００３９】
脈絡膜上腔への投与を目的とした薬学的組成物の剤形は、好ましくは液体製剤である。液体製剤は、例えば、ＢＳＳ（平衡塩溶液）、グリセリン溶液、ヒアルロン酸溶液などに生物学的に活性な薬剤を溶解することによって調製することができる。特定の組成物は、例えばＢＢＳ（６０％）およびヒアルロン酸（４０％）を含む。安定化剤、等張剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、緩和剤、保存剤、電解質、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムおよび／または塩化物などを、場合により、適切な量で、液体製剤に添加することができる。
【００４０】
薬学的組成物は、任意の追加の活性成分または補助剤を含み得るか、または生物学的に活性な薬剤は、任意の追加の活性成分または補助剤と（本発明による使用において）組み合わせられ得る。補助剤は、予防剤または治療剤の送達または導入を改善する任意の生物学的、合成的または生合成的薬剤などの、予防剤または治療剤の生物学的活性を促進または増加させる、任意の物質、混合物、溶質または組成物から選択され得、そして本発明によるベクター（送達担体として）に同化されていてもよい。補助剤を適当な状態とし得、そして、予防剤または治療剤を含む組成物とは別々にまたは連続的に、および／または別個の注射部位に投与し得る。本発明による複数の薬剤および／または補助剤を用いての処置は、薬剤および／または補助剤の混合物を使用して実施される必要はなく、別々の薬学的製剤を使用して実施されてもよい。製剤は、まさに同じ時刻に送達される必要はなく、同じ処置期間中に、すなわち１週間または１か月以内に、互いに患者に送達されるように連係されていてもよい。
【００４１】
任意の適切な治療剤を、本発明の組成物と連係させることができる。上の生物学的に活性な（予防または治療）薬剤に加えて本発明の方法を通して投与され得る治療剤の非制限的な例としてはまた、透過剤、例えばウイルス、脂質小胞、ヒアルロン酸、脂質をベースとした陽イオン、ポリカチオン性エマルション、カチオン性ペプチド、ポリプレックスなど；抗生物質および抗微生物剤、例えばテトラサイクリン塩酸塩、ロイコマイシン、ペニシリン、ペニシリン誘導体、エリスロマイシン、スルファチアゾールおよびニトロフラゾン；局所麻酔剤、例えばベンゾカイン；血管収縮剤、例えばフェニレフリン塩酸塩、テトラヒドロゾリン塩酸塩、ナファゾリン硝酸塩、オキシメタゾリン塩酸塩およびトラマゾリン塩酸塩；強心剤、例えばジギタリスおよびジゴキシン；血管拡張剤、例えばニトログリセリンおよびパパベリン塩酸塩；防腐剤、例えばクロルヘキシジン塩酸塩、ヘキシルレゾルシノール、デカリニウム塩化物およびエタクリジン；酵素、例えば塩化リゾチームおよびデキストラナーゼ；降圧剤；鎮静剤；抗腫瘍剤；ステロイド性抗炎症剤、例えばヒドロコルチゾン、プレドニゾン、フルチカゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アセトニド、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ベクロメタゾン、およびベクロメタゾンジプロピオン酸塩；非ステロイド性抗炎症剤、例えばアセトアミノフェン、アスピリン、アミノピリン、フェニルブタゾン、メフェナム酸、イブプロフェン、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、コルヒチンおよびプロベネシド；酵素性の抗炎症剤、例えばキモトリプシンおよびブロメラインセラチオペプチダーゼ；抗ヒスタミン剤、例えばジフェンヒドラミン塩酸塩、クロロフェニラミンマレイン酸塩およびクレマスチン；抗アレルギー剤；および鎮痛化合物が挙げられる。
【００４２】
本発明の組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、所望の生物学的活性を得るのに効果的である量の活性成分が得られるように、適応させ得る。しかしながら、任意の特定の患者に対する具体的な投与量レベルは、体重、全般的な健康状態、性別、食事、時刻、吸収速度および排泄速度、他の薬物との組合せ、および処置される特定の疾患の重度を含む、種々の因子に依存すると理解すべきである。
【００４３】
薬学的組成物を脈絡膜上腔に注射する手段は、注射針であり得るか、または好ましくは軟性カテーテルまたはマイクロカニューレであり得る。薬学的注射液を脈絡膜上腔に注射するための方法は当技術分野において周知である（例えば、Einmahl S. Invest Ophtamol Vis Sci 2001 42:695: Galimova VU. Vestn Oftalmo 2001 117:20; Olsen TW Am J. Ophtalmol 2006 142:777）。薬学的組成物を脈絡膜上腔に注射するための装置も当技術分野において周知である（例えば、Olsen TW Am J. Ophtalmol 2006 142:777, 米国特許第2010173866号、国際公開公報第2007100745号および国際公開公報第2011053512号）。
【００４４】
薬学的組成物が送達された領域を電場にかけることは、眼外電気穿孔法を通して実施され得る。電気穿孔法は、実際に、核酸などの生物学的に活性な薬剤の、細胞膜および／または脈絡膜上腔に隣接した標的化組織の少なくとも一部の透過性のために適しているか、またはその透過性を増加させる。さらに、特定の磁場強度を有する簡潔な電気インパルスを使用して、電気泳動効果によって、組織を通してまたは細胞膜を横切って薬剤の細胞中への輸送または移動を可能とする。電気穿孔手法は、当業者には周知である。しかしながら、今まで、電気穿孔法では、プラスミドを眼窩にまたは網膜下腔のいずれかに注射した場合に、成人光受容体細胞をトランスフェクションすることはできなかった。
【００４５】
特定の態様において、１つ以上の電気パルスからなる電場がかけられる。
【００４６】
その磁場強度は、約１〜６００ボルト、好ましくは１〜４００ボルト、さらにより好ましくは約１〜２００ボルト、有利には約１０〜１００ボルト、または１５〜７０ボルトである。
【００４７】
電場を印加する全期間は、０．０１ミリ秒〜１秒、好ましくは０．０１〜５００ミリ秒、より好ましくは１〜５００ミリ秒、さらにより好ましくは１または１０ミリ秒を超え得る。好ましい態様において、電場を印加する全期間は、１０ミリ秒〜１００ミリ秒であり、好ましくは２０ミリ秒である。
【００４８】
印加される電気パルスは、例えば１〜１０００００であり得る。その周波数は０．１〜１０００ヘルツであり得る。それは好ましくは一定周波数である。
【００４９】
電気パルスはまた、互いに不規則な様式で送達され得、あるパルスについての時間の関数としての電場の強度を記述した関数は、好ましくは変数である。
【００５０】
電気パルスは単極性または双極性パルス波であり得る。それらは、例えば、方形波パルス、指数関数的に減少しているパルス波、持続時間の短い変動している単極性パルス波、持続時間の短い変動している双極性パルス波、または他の波形から選択され得る。優先的には、電気パルスは、方形波パルスまたは変動している双極性パルス波を含む。
【００５１】
本発明において、脈絡膜を標的とする場合、２つの電極を使用することによって電場を印加し、前記電極の一方は脈絡膜上腔に導入され、他方は脈絡膜上注射が実施されたのとは反対側の強膜の表面上に適用される。
【００５２】
あるいは、網膜を標的とする場合、２つの態様が可能である。第１の態様において、２つの電極を使用することによって電場を印加し、前記電極の一方は脈絡膜上腔に導入され、他方は、脈絡膜上注射が実施されたのとは反対側の眼の表面上に適用される。第２の態様において、２つの電極を使用することによって電場を印加し、前記電極の一方は、脈絡膜上注射が実施された領域に隣接した強膜の表面上に適用され、そして他方は、脈絡膜上注射が実施されたのとは反対側の眼の表面上（例えば強膜または結膜）に適用される。
【００５３】
電極は、好ましくは、ワイヤータイプの電極およびプレート接触タイプの電極から選択され、各タイプの電極は場合により、眼の表面上に可逆的に適用されるように適応される。好ましくはプレート接触タイプの電極は湾曲している。
【００５４】
特定の態様において、プレート接触電極は、好ましくは、固い材料からなり、そして、強膜または眼（例えば結膜）の表面の形状に適応した湾曲形からなる。電極は、有利には、例えばイリジウムまたはプラチナから選択された導電性非酸化物金属からなる。
【００５５】
典型的には、電場は、実施例に記載されるような装置を用いて印加される。
【００５６】
本発明の方法は、眼の後部領域を冒す眼疾患、より特定すると脈絡膜、網膜または神経網膜を冒す眼疾患の処置に特に適している。本発明の方法によって処置され得る眼疾患の非制限的な例としては、黄斑を冒す眼疾患、例えば加齢黄斑変性（ウェット型およびドライ型）または遺伝性黄斑変性、あらゆる原因の黄斑浮腫（加齢黄斑変性、糖尿病、炎症、変性、中心性漿液性網膜絡膜症またはびまん性上皮症など）、遺伝性網膜ジストロフィー、例えばレーバー先天黒内障、網膜色素変性症、錐体杆体ジストロフィー、best卵黄状黄斑症、眼内炎症、例えば網膜炎、脈絡網膜炎、脈結膜炎、虚血性網膜症（特に未熟児網膜症および糖尿病性網膜症）、網膜血管障害、眼虚血症候群、および他の血管異常、脈絡膜の異常および腫瘍、硝子体の異常、グリア増殖、例えば増殖性硝子体網膜症、および糖尿病性前網膜血管新生に関連したグリア増殖、虚血性または増殖性糖尿病性網膜症が挙げられる。
【００５７】
遺伝性網膜ジストロフィーまたは網膜色素変性症は、視覚サイクルに関与する遺伝子の突然変異または欠失に因る遺伝性失明病である。それらは幼少時に始まり、そして全盲となるまでゆっくりと進行する。光受容体の減少は、網膜色素細胞の減少、並びに後の段階における血管および視神経の萎縮症に関連している。これらの遺伝性変性のいくつかは、ミトコンドリアＤＮＡの突然変異に因る。特に、網膜変性疾患の非制限的な例としては、網膜色素変性症（ＲＰ）、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）、劣性ＲＰ、優性網膜色素変性症、Ｘ連鎖性網膜色素変性症、不完全優性Ｘ連鎖性網膜色素変性症、優性レーバー先天黒色障、網膜色素変性症を伴う劣性後索型失調症、ＲＰＥの側細動脈蓄積を伴う劣性網膜色素変性症、網膜色素変性症ＲＰ１２、アッシャー症候群、感音性難聴を伴う優性網膜色素変性症、劣性白点状網膜炎、劣性アルストレーム症候群、劣性バルデ・ビードル症候群、優性脊髄小脳失調症、黄斑ジストロフィーまたは網膜変性、劣性無βリポタンパク血症、黄斑変性を伴う劣性網膜色素変性症、成人型劣性レフサム病、乳児型劣性レフサム病、劣性Ｓ錐体増強症候群、精神遅滞を伴う網膜色素変性症、ミオパチーを伴う網膜色素変性症、劣性ニューファウンドランド杆体錐体ジストロフィー、無色素性網膜色素変性症、区画型網膜色素変性症、限局性網膜色素変性症、シーニア・ローケン症候群、ジュベール症候群、若年性シュタルガルト病、遅発性シュタルガルト病、優性シュタルガルト型黄斑ジストロフィー、優性シュタルガルト様黄斑ジストロフィー、劣性黄斑ジストロフィー、劣性黄色斑眼底、劣性錐体杆体ジストロフィー、Ｘ連鎖性進行性錐体杆体ジストロフィー、優性錐体杆体ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、de Grouchy症候群、優性錐体ジストロフィー、Ｘ連鎖性錐体ジストロフィー、劣性錐体ジストロフィー、超正常桿網膜電図を伴う劣性錐体ジストロフィー、Ｘ連鎖性萎縮性黄斑ジストロフィー、Ｘ連鎖性網膜分離症、優性黄斑ジストロフィー、優性の放射状の黄斑部ドルーゼン、優性牛眼黄斑ジストロフィー、優性蝶形黄斑ジストロフィー、優性成人型卵黄様黄斑ジストロフィー、優性ノースカロライナ型黄斑ジストロフィー、優性網膜錐体ジストロフィー１、優性嚢胞状黄斑ジストロフィー、優性非定型卵黄様黄斑ジストロフィー、中心窩黄斑萎縮症、優性Ｂｅｓｔ型黄斑ジストロフィー、進行性の優性ノースカロライナ様黄斑ジストロフィー、貧毛症を伴う劣性若年性黄斑ジストロフィー、劣性の中心窩形成不全および前眼部形成不全、劣性錐体順応遅延、青錐体一色型色覚異常の黄斑ジストロフィー、ＩＩ型糖尿病および難聴を伴う黄斑性パターンジストロフィー、神鳥斑点網膜、パターンジストロフィー、優性スティックラー症候群、優性マーシャル症候群、優性硝子体網膜変性、優性家族性滲出性硝子体網膜症、優性硝子体網脈絡膜症、優性血管新生炎症性硝子体網膜症、ゴールドマン・ファーブル症候群、劣性色覚異常、優性３型２色覚、劣性桿体一色型色覚異常、先天性赤緑色覚異常、２型２色覚、１型２色覚、２型３色覚、１型３色覚、劣性小口病、優性遅発性黄斑ジストロフィー、劣性脳回転状萎縮症、優性限局性萎縮（atrophia greata）、優性中心性輪紋状脈絡膜ジストロフィー、Ｘ連鎖性全脈絡膜萎縮症、中心性輪紋状脈絡膜萎縮症、中心性脈絡膜萎縮症、乳頭周囲脈絡膜萎縮症、進行性の優性二病巣性網脈絡膜萎縮症、進行性の二病巣性網脈絡膜萎縮症、優性ドイン蜂巣状網膜変性（Malattia Leventinese）、遺伝性エナメル形成不全症、劣性ビエッティ結晶状角膜網膜ジストロフィー、レイノー現象および片頭痛を伴う優性遺伝性血管網膜症、優性ワーグナー病およびびらん性硝子体網膜症、劣性小眼球および網膜疾患症候群、劣性小眼球症、劣性精神遅滞、痙攣および網膜変性、劣性ボスニアジストロフィー、劣性弾性線維性仮性黄色腫、優性弾性線維性仮性黄色腫、劣性若年性バッテン病（セロイド−リポフスチン沈着症）、優性アラジール症候群、マッキュージック・カウフマン症候群、低プレβリポタンパク血症、有棘赤血球増加、淡蒼球変性、劣性ハラーホルデン・スパッツ症候群、優性ソースビー眼底変性症、オレゴン眼病、カーンズ・セイヤー症候群、発達異常および神経異常を伴う網膜色素変性症、Basseb Korenzweig症候群、ハーラー病、サンフィリポ病、シャイエ病、黒色腫を随伴する網膜症、Sheen網膜ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、およびバードショット脈絡網膜症が挙げられるがそれらに限定されない。
【００５８】
眼内炎症は、眼内組織、おもにブドウ膜および網膜のすべてのタイプの炎症を再編成する。眼内炎症は、免疫学的原因、感染的な原因、医原的な原因または未知の病因に由来し得る。それらは急性、再発性または慢性であり得る。眼内炎症は、治癒可能な盲目の最も一般的な原因の１つである。後眼部眼内炎症は、血管炎、視神経炎、硝子体炎および脈絡網膜炎、網膜炎、脈絡膜炎、脈絡膜血管新生、ＡＭＤ、近視、炎症に因る脈絡膜血管新生、びまん性上皮症、ブルッフ膜破裂、外傷後のポリープ状脈絡膜血管症などに関連し得る。
【００５９】
２つの主要なタイプの緑内障が存在する：慢性緑内障または原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）および急性閉塞隅角緑内障。他の種類としては、先天性緑内障、色素性緑内障、血管新生緑内障および続発性緑内障が挙げられる。緑内障は、高眼圧症に類似しているが、視神経障害および視力喪失を伴う。緑内障は、通常、点眼薬、レーザーまたは慣用的な眼の手術により処置される。処置されなければ、緑内障は失明を引き起こす。
【００６０】
血管新生は、新しい毛細血管の形成であり、これにより新血管新生がもたらされる。血管新生は複雑なプロセスであり、これには内皮細胞により媒介される血管基底膜および間質マトリックスの破壊、内皮細胞の遊走、内皮細胞の増殖、および内皮細胞によるループ状毛細血管の形成を含む一連の連続的な工程が含まれる。血管形成は、脈管構造の発達または維持のための正常なプロセスであるが、血管の増殖が実際に有害である場所に病的状態（すなわち血管新生依存性疾患）が発生する。血管新生は、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、未熟児網膜症、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、および角膜瘢痕を含む、眼組織の重要な疾患に特に関連している。眼の血管のあらゆる異常な増殖は、網膜に到達する前に、入射光を散乱および遮断し得る。新血管新生は眼のほぼどの部位にでも起こり得、そして有意に眼組織の機能を変化させ得る。最も脅威である眼血管新生疾患のいくつかは、網膜に関するものである。例えば、多くの糖尿病患者が網膜症を発症し、これは、網膜の前表面および硝子体における漏出性の新血管の形成（増殖性硝子体網膜症を引き起こす）によって特徴付けられる。加齢黄斑変性の患者の一部は、網膜下新血管新生を発症し、それは最終的には失明に至る。
【００６１】
糖尿病性網膜症は、眼内の網膜血管が血液および液体を周辺の組織に漏出した場合に起こる。糖尿病患者の約８０％が糖尿病性網膜症を発症する。この疾患は、一般的にレーザーを使用して処置される。しかしながら、レーザー療法は、網膜静脈閉塞症、視力の低下、硝子体出血を含む合併症、および時に失敗が起こる。処置されないままに放置されると、糖尿病性網膜症は失明を引き起こし得る。
【００６２】
未熟児網膜症（ＲＯＰ）は、未熟児が罹患する。それは網膜内および硝子体内の血管の異常な増殖からなる。ＲＯＰの後期段階への進行は、網膜上での瘢痕組織の形成、硝子体出血、および網膜剥離に至り得る。処置は、通常、レーザーまたは寒冷療法（凍結）のいずれかによって実施される。
【００６３】
虚血性網膜症は血管の閉塞（毛細血管または大血管）に関連した網膜症であり、これにより神経網膜の病変、細胞死および新血管新生に至る。黄斑変性は、中心視野に影響を及ぼしそして視力喪失に至る疾患である。若年者を悩ます形態の黄斑変性もあるが、前記状態は、通常、６０歳を超える人に起こる。従って、この疾患は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）と呼ばれる。人の中心視野のみが通常冒されるので、この疾患からは失明は滅多に起こらない。しかしながら、網膜の中心の黄斑への損傷は、真っすぐにはっきりと見る能力を破壊し得る。ドライ型は、神経網膜、ＲＰＥ細胞および脈絡膜の変性を伴う。ウェット型は、以前に記載した現象および脈絡毛細管および／または網膜血管からの新血管の増殖、網膜下剥離および出血、上皮下出血および涙液などを伴う。黄斑変性は、通常、６０歳以後に起こる。中心視野が減少するが、大半の患者は、いくらかの視野を保持し、そして完全に失明とは決してならない。
【００６４】
本発明の特定の局面は、眼内新血管または黄斑浮腫を処置する方法であって、これは、それを患う被験者の脈絡膜上腔に、抗ＶＥＧＦ、抗ＶＥＧＦレセプターまたは抗ＰＬＧＦをコードする核酸を送達することを含む。
【００６５】
本発明のさらなる特定の局面は、網膜色素変性症を処置または遅延させる方法であって、これは、それを患う被験者の脈絡膜上腔に、前記したような神経栄養因子をコードする核酸を送達することを含む。
【００６６】
本発明の別の特定の局面は、糖尿病性網膜症を処置する方法であって、これは、それを患う被験者の脈絡膜上腔に、抗ＩＲＳ−１またはＩＧＦ−１をコードする核酸を送達することを含む。
【００６７】
本発明の方法によると、眼疾患を予防または処置するためのキットが考えられる。本発明による装置および薬学的組成物は、キットで一緒に供給され得る。キット内で、前記成分は別々にパッケージングまたは含有されていてもよい。他の成分、例えば賦形剤、担体、他の薬物または補助剤、活性物質または組成物の投与のための説明書、および投与または注射装置も、同様にキットで供給され得る。説明書は、書面、ビデオまたはオーディオ形でもよく、紙に、電子媒体に含まれていても、またはさらには別の入手源（たとえばウェブサイトまたは参考マニュアル）を参照するようになっていてもよい。
【００６８】
本発明は、以下の図面および実施例によってさらに説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例および図面は、いずれにしても本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
【００６９】
実施例：
材料および方法
動物
８〜１０週令の雌のアルビノルイスラット（Elevage Janvier, Le Genest Saint Isle, France）を大半の実験において使用し、そして視覚および眼科研究における動物の使用についてのＡＲＶＯ宣言に従って取り扱った。蛍光眼底血管造影による追跡のために、８〜１０週令の雄の色素沈着Brown-Norwayラット（Charles River, L.’Arbresle, France）を使用した。ラットを、ケタミン（７５mg/kg）（Virbac、France）＋ラーガクティル（０．５mg/kg）（Sanofi-Aventis, France）の筋肉内注射によって麻酔した。実験終了時に、動物を二酸化炭素吸入によって屠殺した。
【００７０】
プラスミド
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター制御下のβ−ガラクトシダーゼリポーター遺伝子をコードしている市販されているｐＶＡＸ１ ＬａｃＺプラスミド（６ｋｂｐ、２５ｎｍ、Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）を使用して、脈絡膜上への注射後、エレクトロトランスファーを行ないまたは行なわず、遺伝子の発現を局在化させた。ラット可溶性血管内皮細胞増殖因子レセプター１（ｓＦｌｔ−１）をコードしているｐＶＡＸ２−ｓＦｌｔ−１プラスミド（４．９ｋｂｐ）を、ラット胎盤から抽出したｓＦｌｔ−１ｍＲＮＡの単離および逆転写後に構築し、その後、ｐＶＡＸ２骨格におけるＣＭＶβプロモーターの下流のｃＤＮＡの増幅およびサブクローニングを行なった。その配列はＤＮＡシークエンスによって確認され、そして、それは毛様体筋へのエレクトロトランスファーを通した送達後に脈絡膜新血管新生ラットモデルにおいて検証された。この研究において、それは、同じモデルにおいて脈絡膜上へのエレクトロトランスファーによる送達を通してその効力を評価するために使用された。コードされていないｐＶＡＸ１およびｐＶＡＸ２プラスミド骨格を陰性対照として使用した。プラスミドをEscherichia coli菌において増幅させ、そしてエンドトキシンフリーで調製した（EndoFree Plamid Kit; Qiagen, Courtaboeuf, France）。プラスミドを、以前に記載されているように７７ｍＭのＮａＣｌ（半生理食塩水）（生理食塩水、ＮａＣｌ ０．９％、Versol", Laboratoire Aguettant, Lyon, France）を含むエンドトキシンフリーな水（ＥＦ）で希釈した[２４]。ＤＮＡの濃度は、分光測定によって決定された（２６０ｎｍにおける吸光度）。
【００７１】
脈絡膜上腔へのＤＮＡの注射
プラスミドＤＮＡ（３０μg）、ビヒクル（半生理食塩水）またはマイヤーヘマトキシリン溶液を、湾曲した３０Ｇの使い捨て針（マイクロファイン＋デミシリンジ、０．３０×８mm、BD Biosciences、Le Pont de Claix、France）を使用して３０μlの容量で脈絡膜上腔に注射した（特記しない限り）。注射を、角膜縁よりも１mm後方の眼の耳側の半球に実施した。強膜を穿孔した後、針は、脈絡膜上腔で容易に可視化することができた。注射はゆっくりと実施して、この実質的な空間の開口を徐々に誘導した。
【００７２】
脈絡膜上腔へのエレクトロトランスファー
脈絡膜上腔へのプラスミドＤＮＡの注射直後に、接種した領域を、装置２として提示した装置を使用して電場にかけた。接触湾曲プラチナ／イリジウムシート（陽極、＋）を、注射した領域のすぐ上の強膜に付着させた。半環状プラチナ／イリジウムシート（陰極、−）を、眼の反対側の陽極に面した強膜上に配置した。全ての電極は、Good Fellow（Lille, France）から購入した白金ホールド（folds）から手作りされた。エレクトロトランスファーは、８３０ＢＴＸ電気パルス発生器（Genetronics, san Diego, CA）によって発生した８つの方形波電気パルス（２０Ｖ電圧、２０ミリ秒の期間、５Ｈｚの周波数）を印加することによって実施された。この標準的な手順（装置および電気パラメーター）を、他の電気装置または他の電気パラメーターを評価するために設計された実験を除く、大半の実験において使用した（詳細については結果の章を参照されたい）。
【００７３】
眼底検査
脈絡膜上への注射直後、眼底を、角膜表面上に適用したカバーガラスを使用して、手術用顕微鏡下で調べて、注射の正確な配置を評価し、そして網膜剥離が起こった領域が全くないことを確かめた。写真を数値カメラ（Coolpix, Nikon, Fnac, Paris, France）を使用して撮影した。蛍光眼底血管造影を、脈絡膜新血管新生誘導前に、処置から３日後に麻酔した色素沈着ラットに実施した（「治療適用」の章を参照されたい）。この目的のために、瞳孔を１％トロピカミドを用いて散大させ、そしてフルオレセイン（生理食塩水中１０％フルオレセイン０．２mL）を静脈内投与した。血管造影図を、耳側の処置した領域においておよび視神経乳頭において、共焦点レーザー走査型検眼鏡（ｃＳＬＯ）（HRA, Heidelberg Engineering, Dossenheim, Germany）を使用して確立した［３２］。
【００７４】
上脈絡膜剥離の組織学的分析
マイヤーヘマトキシリン溶液の上脈絡膜への注射の２〜５分後、眼球を摘出し、そして室温で２時間かけてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中４％パラホルムアルデヒドおよび０．５％グルタルアルデヒドの混合物を用いて固定した。それらをＰＢＳ中で２時間かけて濯ぎ、漸増濃度のエタノールを用いて室温で脱水し、その後、Leica Historesin Embeddingキットに提供された浸潤溶液と共に４℃で一晩かけてインキュベーションした。試料をレジン（Leica）に包埋し、そして５μmの厚さの組織学的薄片の切開を、ミクロトーム（Leica）を使用して眼の鼻耳側面に沿って実施した。薄片をゼラチンでコーティングされたスライド上に固着し、１％トルイジンブルー溶液を用いて２分間かけて染色し、そしてLeica DFC480カメラと連結させたAristoplan光学顕微鏡（Leica, Rueil-Malmaison, France）下で光学顕微鏡によって観察した。
【００７５】
β−ガラクトシダーゼ活性の可視化
眼組織におけるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現の場所を決定するために、ｐＶＡＸ１ＬａｃＺの脈絡膜上へのエレクトロトランスファーから７日後、１４日後、１か月後または４．５カ月後に眼球を摘出した。ｐＶＡＸ１骨格を対照として使用した。新たに眼球を摘出された眼の角膜縁に切り込みをいれ、そして２％パラホルムアルデヒドおよび０．２％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳ中で４℃で１時間かけて固定した。それらを、ＰＢＳ中で３回濯ぎ、その後、室温で１mg/mLのＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルガラクトピラノシド；Sigma-Aldrich、Saint-Quentin Fallavier、France）と共に、５mMのＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６、５mMのＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６、２mMのＭｇＣｌ２および０．０２％ＮＰ４０を含むＰＢＳ中で以前に詳述されているように一晩かけてインキュベーションした［３３］。ＰＢＳで洗浄後、眼の外側からの直接的な造影を、数値カメラ（Coolpix, Nikon, Fnac, Paris, France）を使用して実現した。
【００７６】
その後、分析を、組織学的薄片およびフラットマウント（flatmount）で実施した。組織学的分析のために、眼球を、漸増濃度のエタノールを用いて室温で脱水し、その後、パラフィンに包埋した。β−ガラクトシダーゼリポーター遺伝子を発現している青色の領域に実施された鼻耳側の切開薄片（１０μmの厚さ）を、ヘマトキシリン−エオシンを用いて対比染色し、そしてLeica DFC480カメラと連結したAristoplan光学顕微鏡（Leica, Rueil-Malmaison, France）下で光学顕微鏡によって観察した。
【００７７】
フラットマウント分析のために、眼を、角膜縁から１mmにおける横断切開によって注意深く解剖した。前眼部を廃棄し、そして神経網膜を、残りのＲＰＥ−脈絡膜−強膜複合体から注意深く分離した。神経網膜およびＲＰＥ−脈絡膜−強膜複合体を、ＰＢＳ／グリセロール（１／１、ｖ／ｖ）中に別々に平らに乗せ、そして数値カメラ（Coolpix, Nikon, Fnac, Paris, France）を使用して手術用顕微鏡下で観察した。
【００７８】
網膜電図検査（ＥＲＧ）
全視野ＥＲＧ記録のために、ラットを、ケタミン（４０mg/ml）およびキシラジン（４mg/ml、Rompun）を含む溶液の筋肉内注射（０．８〜１．２ml/kg）によって麻酔した。動物を、２５ｃｄｍ２ ｃｄ＃ｓ/ｍ２のバックグラウンド光を用いて１０分間かけて光に適応させた。角膜をノベシン（Novartis Ophthalmics）の液滴を用いて脱感作させ、そして瞳孔をトロピカミド（Novartis Ophthalmics）の液滴を用いて散大させた。両眼の各膜上に配置されたゴールドワイヤーリング電極および前頭部に挿入された電極は、それぞれ、作用電極および基準電極として作用した。ステンレス鋼針状電極を、接地のために動物の尾に挿入した。全ての操作は、暗赤色灯下で実施され、測定は、市販のVisioSystem装置(Siem Biomedicale)を使用して実施された。
【００７９】
その後、光フラッシュをかけ、フラッシュの光強度は１０cd.s/m2である。１０秒間の刺激間隔の５回の記録を平均化した。ａ波およびｂ波の振幅を測定し（μＶ）、そして同じ実験群に属する各眼から得られたデータを平均化した。
【００８０】
治療適用
脈絡膜新血管新生が、Browm Norwayの処置されていない対照眼において、または耳側上脈絡膜への３０μgのｐＶＡＸ２またはｐＶＡＸ２−ｓＦｌｔ−１のエレクトロトランスファーによって３日前に処置された眼において、レーザー光凝固によって誘導された。細隙灯（Hagg-Streitt, BQ 900）に積載された５３２nmのアルゴンレーザー（Viridis 532nm, Quantel Medical, Clermont-Ferrand, France）を初めから終わりまで使用した。カバーガラスは、レーザー伝送中にコンタクトレンズの役割を果たした。耳側網膜における４つの病変および鼻側網膜における４つの病変という、１眼あたり８つのレーザースポット（１００μmのスポットサイズ、０．１秒の期間および１７５mWの電力）を実施した。レーザー伝送後に網膜表面で観察された反応性バブルは、適切に焦点が合わせられたことの証拠として、およびブルッフ膜の破裂の徴候として考えられた。
【００８１】
脈絡膜新血管新生の誘導から１５日後に眼球を摘出し、そしてＰＢＳ中パラホルムアルデヒド（ＰＡＦ）４％溶液を用いて１５分間かけて直ちに固定した。ＰＢＳ中で洗浄した後、ＲＰＥ−脈絡膜−強膜の複合体を、神経網膜から注意深く分離し、そしてメタノール１００％を用いて１５分間かけて−２０℃で後固定した。組織を、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ中で再水和し、そしてフルオレセインイソチオシアネートにコンジュゲーションしたBandeiraea simplicifolia由来のレクチン（Bandeiraea simplicifoliaに由来するＦＩＴＣ標識されたレクチン、ＢＳ−Ｉ、Ｒｅｆ．Ｌ９３８１、Sigma Aldrich）と共に一晩インキュベーションした。ＰＢＳ中で洗浄後、組織を、ゲルマウント（Biomeda Corp., VWR, Fontenay-sous-Bois, France）を使用して平らに乗せ、そしてオリンパスＢＸ５１顕微鏡を使用して蛍光顕微鏡によって観察した。同じ露光時間およびコントラスト設定を使用して写真を撮影した。脈絡膜新血管新生領域（μｍ２）は、ＦＩＴＣ−レクチン蛍光によって決定され、そしてImageJソフトウェアを使用してフラットマウント画像上の標識された領域の周辺部の輪郭を描くことによって測定された。複数の病変から得られた新血管新生領域の測定は、各眼について単一の数値へと平均化された。
【００８２】
統計学的分析
各実験のために、１条件あたりに処置された眼の数を、図の説明文に記載した。数値データについては、結果は、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表現され、そしてノンパラメトリックマンホイットニーＵ検定（Prism 4.0、Graph Pad Software Inc., San Diego, CA）を使用して比較した。ｐ＜０．０５を有意と判断した。
【００８３】
結果：
上脈絡膜への注射
脈絡膜上腔（すなわち、強膜と下にある脈絡膜との間）への注射を検証するために、手順をまずマイヤーヘマトキシリン溶液を使用してin vivoにおいてモニタリングした。注射中の脈絡膜上腔への染料の拡散は、リアルタイムでアルビノラットの眼の外側から可視化できた。注射針が、注射が終わった後に除去されると、脈絡膜上ポケットの推定領域に対応する着色円形領域を、眼の外側から観察することができた。光受容体外節（ＯＳ）と網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）との間の剥離に対応する網膜下ブレブは、眼底には全く認められず、染料は、脈絡膜上腔により深く局在していた。これらの肉眼的観察を確認するために、樹脂による組織切開を、注射から数分後に固定された眼に対して実施した。脈絡膜と強膜との間の剥離を、全神経網膜を、ブルッフ膜および脈絡毛細管／脈絡膜に依然として付着した網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に付着させたままで、強調することができた。剥離は、耳側半球の前半分に広がった。それは、針挿入部位の近くの前部分では大きく完全であり、そして後ろでは除々に減少し、脈絡膜と強膜との間では明らかに局所的に付着していた。上脈絡膜剥離の後ろで行われた観察は、脈絡膜が、処置されていない対照眼において観察されたように、強膜と密接に接触していたことを示した。どの眼にも出血は認められなかった（ｎ＝５）。以下の全ての実験において、眼底検査を注射後に実施して、分析から網膜剥離のバブルを有する眼が除外された。全ての処置された眼の中で２つの眼だけが、偶発的な網膜下への注射のために分析から除外された。出血（bleeding）または出血（hemorrhage）は、手術中または手術直後にも全く認められず、注射のみの７日後にも認められなかったことを注記する。ｐＶＡＸ１−ＬａｃＺプラスミドＤＮＡの簡単な上脈絡膜への注射から７日後に非常に僅かなβ−ガラクトシダーゼ活性が観察されたか、またはβ−ガラクトシダーゼ活性は全く観察されず、そしてｐＶＡＸ１プラスミド骨格を用いて青色の着色は全く見られず、これは、注射のみではトランスフェクションが全く起こらないかまたは非常に僅かなトランスフェクションしか起こらないことを実証する。
【００８４】
上脈絡膜へのエレクトロトランスファー（ＥＴ）のための電気装置
脈絡膜上腔へのプラスミド注射（３０μl中３０μgのｐＶＡＸ１−ＬａｃＺ）直後、注射領域を、種々の電極形および電極配置の適用によって作られた電場にかけた（エレクトロトランスファー手順）。電場は、５Ｈｚの周波数を有する２０Ｖの電圧強度および２０ミリ秒の期間の８つのパルスを使用して作られた。注射のみに比べて、β−ガラクトシダーゼ遺伝子発現は、試験した全ての電極を用いてのＥＴによって有意に増強された。しかしながら、各装置は、異なるトランスフェクション効力を示した。事前の実験において、使用した装置は、両電極の位置に関して幾分適応させた、本発明者らの研究室においてＥＴによってin vivoにおいて眼の毛様体筋線維に伝達するために開発されたものであった［２４］。プラチナ／イリジウム（Ｐｔ／Ｉｒ）ワイヤー（２５０μmの直径、陰極）を、注射針を引っ張り出した後に、注射部位の反対側の強膜に付着した半環状Ｐｔ／Ｉｒシート（陽極）に面して、脈絡膜上腔に挿入した。このような状態において、眼の外側から観察されたβ−ガラクトシダーゼを発現している組織の領域は、ワイヤー電極が挿入された部位に対応する線として出現した。細胞によるプラスミドＤＮＡの取り込みおよび発現を拡大するために、本発明者らはより大きな電極を使用し、そしてそれらを外部に配置することを決定した。半環状Ｐｔ／Ｉｒシート（陽極）を、強膜表面上の眼後極の底部に配置された半環状Ｐｔ／Ｉｒワイヤー電極（陰極）と共に、接種領域の上に位置する強膜表面上に配置した場合（装置１）、β−ガラクトシダーゼ発現は、シート電極が位置していた後眼部の前部分に局在していた。接触湾曲プラチナ／イリジウムシート（陽極、＋）を、強膜上に配置された半環状プラチナ／イリジウムシート（陰極、−）と共に、眼の反対側の陽極に面して、注射領域の上の強膜に付着させた場合（装置２）、β−ガラクトシダーゼリポーター遺伝子を発現している組織の領域は、２つの他の装置と比べて大きく広がっていた。このような装置を用いて、陽極は、上脈絡膜剥離の全領域を網羅し、そしてリポーター遺伝子は、電場が全く発生しなかった、接触湾曲電極を維持するために眼表面に配置されたプラスチック製接続用ピンセットに対応する僅かなゾーンを除いて、ほぼ全ての剥離表面において発現された。どのような電気装置を使用したとしても、ｐＶＡＸ１骨格のＥＴによって処置された眼においては青い着色は全く観察されなかった。電場印加中またはＥＴの７日後には出血は全く認められなかった。
【００８５】
上脈絡膜へのエレクトロトランスファーのための最適な電気パラメーター
装置２を使用して、いくつかのセットの電気パラメーターを、電圧強度（Ｖ）およびパルス期間（ミリ秒）を変化させて、３０μg（３０μl中）のｐＶＡＸ１−ＬａｃＺの脈絡膜上腔への注射後に試験した。処置から数日後、β−ガラクトシダーゼ発現によって可視化されたトランスフェクション効率（青い着色）は、注射のみによって処置された眼で得られたものと比べて、７Ｖの８つのパルス（２０ミリ秒、５Ｈｚ）にかけた眼において違いはなかった。逆に、１５Ｖ、３０Ｖおよび６０Ｖの電圧強度を有する８つのパルス（２０ミリ秒、５Ｈｚ）の印加は、注射のみによって処置された眼と比べて、β−ガラクトシダーゼ発現を有意に増強させた。トランスフェクション効率は電圧の増加と共に増加し、より良好な効率は３０Ｖで得られた。この条件を使用して、リポーター遺伝子発現を、ほぼ全部の耳側半球において検出することができた。本発明者らは、別様に、リポーター遺伝子活性は、３０Ｖの電圧を使用するよりも２０Ｖの電圧を使用すると、さらにより効率的であることを実証した。
【００８６】
パラフィン組織薄片分析によって判断したところ、網膜形態は、注射のみによって処置された対照眼と比較して、３０Ｖより低いかまたは３０Ｖに等しい電圧にかけられた眼においてよく保存されていた。実際に、網膜層は、電場の印加によりトランスフェクションされた領域において、注射のみの領域で観察されたものと類似した組成および厚さを有していた。しかしながら、６０Ｖの電圧の印加は、全網膜層の顕著な網膜組織崩壊を誘導し、そして網膜厚の増加は、浮腫の現象によって誘発され得る。電場の印加から７日後には、どのような電圧が考慮されようとも、出血は全く検出することができなかった。従って、電場の印加は、少なくとも網膜形態の観点からすれば、選択された条件下で安全であるように思われた。安全かつ効果的な遺伝子導入に一致する最も低い電圧は２０Ｖであったので、さらなる実験をこのパラメーターを使用して実施した。
【００８７】
パルス期間に関して、トランスフェクション効率は、１０ミリ秒よりも２０ミリ秒のパルスを使用した方が有意により高く（２０Ｖおよび３０Ｖの両方において、示されていない）、このことはこの期間がさらなる実験において選択された理由である。注射容量に関して、事前実験は、３０μl（または４０μl）の容量が、ＥＴ（３０Ｖ、２０ミリ秒、５Ｈｚ）と組み合わせた場合に良好なトランスフェクション効率を達成するために必要とされ、そして２０μlのようなより少量の容量は適合しない（示していない）ことを実証した。３０μLを使用すると、上脈絡膜剥離の領域はより大きくなり、これはトランスフェクションをより広域でより再現性とすることを可能とした。注射のみを使用すると、全ての容量間で検出可能な差異は全く観察することができなかった。
【００８８】
上脈絡膜へのエレクトロトランスファーの効率
平らに乗せられたＲＰＥ−脈絡膜−強膜の複合体および神経網膜の低倍率での観察は、脈絡膜細胞および血管が、神経組織と同様にトランスフェクションされていることを示す。組織薄片は、脈絡膜血管を含む脈絡膜細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を確認したが、ＲＰＥ細胞および光受容体内節および外節における活性も示した。より大きな倍率は、脈絡膜血管のトランスフェクション、ＲＰＥ細胞の通常のトランスフェクション、光受容体の外節およびより低い程度で内節におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を確認する。染色されていない薄片の位相差分析を使用して、β−ガラクトシダーゼ活性から生じた青色の着色が、脈絡膜血管を含む脈絡膜細胞、ＲＰＥ細胞およびより高倍率で光受容体核周辺および内節においてより良好に検出され、このことは光受容体がトランスフェクションされたことを示唆する。
【００８９】
導入遺伝子発現の期間
β−ガラクトシダーゼ活性は７日目に最大となり（試験した最初の時点）、この時にトランスフェクションが、上脈絡膜剥離領域に相当する全領域で観察された。その後、遺伝子発現は、強度レベルおよび範囲レベルの両方において、７日後から４．５カ月後まで時間をかけて減少した。７日目に行われた観察と比較して、染色は、依然として強力ではあったが、１４日目には均一度が低かった。エレクトロトランスファーから１カ月後、β−ガラクトシダーゼ活性は、僅かであり、大半の発現は、環状環を随伴し、これは上脈絡膜剥離ブレブの縁に相当する。４．５カ月後、リポーター遺伝子発現は、制限された領域においてのみ依然として検出可能であった。観察期間中、外部にまたは眼底において病的変化は全く認められなかった。ＣＭＶプロモーターを使用すると、有意な発現が少なくとも１か月間達成され、その後、４．５カ月後まで減少した。
【００９０】
手順の安全性
上脈絡膜への注射およびエレクトロトランスファー手順によって誘導された、脈絡膜および網膜脈管構造における可能性ある変化を評価するために、眼底血管造影を、プラスミド骨格を用いての処置の３日後に実施した。耳側の処置された領域においては、処置されていない対照眼の同じ領域と比べて、血管漏出またはウィンドウ効果は全く観察されず、このことは、処置が明らかに血管およびＲＰＥの完全性を維持したことを実証する。さらに、両群において視神経乳頭レベルでの漏出血管は全く検出できず、このことは、主要な早期の血管網膜バリアの崩壊はないことを示唆する。上脈絡膜への注射およびエレクトロトランスファーの手順が、網膜電気生理に対して機能的な結果を及ぼしたかどうかを分析するために、ＥＲＧを処置の７日後に記録した。処置されていない対照眼と比較して、ビヒクル溶液（半生理食塩水）の注射のみでは、ａ波およびｂ波振幅の有意な改変を全く誘導しなかった。さらに、ビヒクル注射後のエレクトロトランスファーにかけられた眼と、注射のみによって処置された眼または処置されていない対照眼との間で、ａ波およびｂ波振幅の統計学的差異は、全く検出できなかった。さらに、眼内炎症は、同時点で臨床検査によって認められなかった。
【００９１】
治療効力
ラット可溶性血管内皮増殖因子レセプター１（ｓＦｌｔ−１）をコードしているプラスミドの上脈絡膜へのエレクトロトランスファーの抗血管新生効力を、脈絡膜新血管新生（ＣＮＶ）ラットモデルにおいて評価した。全群において、耳側と鼻側との間にはＣＮＶ領域の統計学的差異は認められず、このことは、１眼あたりに測定された全ての数値が、１つの数値へと平均化された理由である。疾患のピーク時に実施された血管新生領域の観察および定量によって示されるように、有意な減少とレーザー誘導ＣＮＶ領域の２５％が、治療プラスミド（１８５００±１４３０μｍ２）のエレクトロトランスファーによって処置されたラットにおいて、対応する空プラスミド（２５１００±１７１０μｍ２）のエレクトロトランスファーによって処置された対照眼および処置されていない対照眼（２５７００±１４００μｍ２）と比較して観察された。さらに、ＣＮＶの悪化は、処置されていない対照眼と比べて、ｐＶＡＸ２で処置された眼においては認められなかった。
【００９２】
考察：
本発明者らは、すでに、上脈絡膜への投与が、徐放性ポリマーの徐放を可能とする、安全かつ再現性のある手順であることを実証した［２５］。それ以来、他のグループが、この投与経路の実行可能性を確認した。特に、Ｔ. Ｏｌｓｅｎのグループは、後極までの注射器の適切な配置を追跡するための照明システムの備えられたエレガントな上脈絡膜カテーテルを開発した［２６］。本研究において、本発明者らは、この経路をまた使用して、脈絡膜および隣接する網膜細胞にプラスミドＤＮＡを送達することができ、そして前記プラスミドは、この空間に、エレクトロトランスファー電流のab externo適用によるその伝達を可能とするのに十分な長さで閉じ込められたままであることを実証する。脈絡膜における非常に多い血流のために、溶液中のプラスミドは、数秒以内に流されるだろうと予期することができた。しかしながら、脈絡膜上腔への適切な注射は、おそらく、「ポケット」を作り、この中にプラスミド溶液が捕捉され、そしてトランスフェクションを可能とするに十分な時間の間、ＲＰＥ細胞に対する圧力を維持する。プラスミドＤＮＡがどのようにブルッフ膜を通してＲＰＥ細胞に到達することができるかは、３００ＫＤを超える分子はそれを通過することはないと推定されているので明らかではない［２７］。しかしながら、網膜を起源とする２０〜３０nmのリポタンパク質の粒子（プラスミドのサイズ範囲の粒子）が、ブルッフ膜に見られたことが示された［２８］。より意外な観察は、ＲＰＥ細胞だけでなく光受容体もトランスフェクションされたことであった。類似の結果がちょうど、ウサギの眼へのＡＡＶの上脈絡膜への投与後に公開された［２９］。脈絡膜上腔からＲＰＥ細胞および神経網膜へのプラスミドの拡散に関与する輸送機序を分析するために、さらなる研究が必要とされる。興味深いことに、プラスミドの網膜下注射を、成体動物において電気穿孔法と組み合わせて実施した場合にさえ、光受容体はトランスフェクションされなかった［２２、２３］。これは、異なる電極形および電極配置を使用して本発明者らが作製した異なる電流場に関連し得る。注射に加えて、プラスミドを電流の適用なしに注射した場合にはトランスフェクションがなされないことによって示されるように、電場は電気穿孔が起こるのに必須である。適切なパラメーターは、各組織について、効力および毒性閾値を規定するために適合させなければならない。これらの実験において、効力は２０〜３０ボルト（約６６および１００Ｖ/cm）において影響を及ぼし、そして毒性は、電流が２００Ｖ/cm以上の場合に認められた。これらのパラメーターは、毛様体筋［２４］または骨格筋細胞［１６、３０］について記載されたものより低い。選択されたパラメーターを使用して、エレクトロトランスファーは、蛍光血管造影、網膜電図検査および組織診断において安全であり、このことは、安全性の懸念なく後極においてさえそれを使用することができることを実証する。これは勿論、黄斑を標的化すべき場合には最も重要である。
【００９３】
これらの実験において、本発明者らは、特定の遺伝子プロモーターを使用せず、むしろ、ＲＰＥ細胞において短期トランスフェクションを誘導することが知られるＣＭＶプロモーターを使用した。進行中の実験は、他者によって発表された発現の期間を延長する特定のプロモーターの効力を評価中である［２２、２３］。
【００９４】
近年開発されたウイルスベクターの上脈絡膜への注射と比べて、プラスミドＤＮＡおよび電気穿孔法の使用は、より安全であると予期される。なぜなら、裸プラスミドＤＮＡは、骨格筋においてプラスミドＤＮＡのエレクトロトランスファーを使用した臨床試験においてすでに実証されているように、全身循環中に放出された場合でさえも、細胞をトランスフェクションする能力を有さないからである［３１］。
【００９５】
プラスミドの上脈絡膜への電気穿孔を使用して、網膜細胞並びに脈絡膜細胞を標的化することができ、これにより、脈絡膜新血管新生の処置のための抗血管形成タンパク質またはペプチドをin situで産生することができた。概念証明として、本発明者らは、処置された耳側網膜においてだけでなく鼻側の処置されていない網膜においても、ＣＮＶを効率的に阻害するｓＦｌｔ−１を使用し、局所的拡散が起こり得ることを実証した。脈絡膜および網膜の疾患の処置のためのこの新規な方法の現実的な可能性を評価するために他の実験が進行中である。
【００９６】
結論：
これは、安全な手順を使用して、脈絡膜新血管標的化のための可能性ある適用により、脈絡膜だけでなく、ＲＰＥ細胞および潜在的には光受容体をもトランスフェクションすることができるという初めての実証である。非ウイルス性のベクターが使用されるだけでなく、最小限に侵襲的な手順が、網膜剥離およびあらゆる眼内電極配置を回避しつつ実施された。ヒトサイズの眼の後極を特異的に処置するための簡単な使い捨ての装置を設計するための、さらなる技術的改良が行われている。
【００９７】
参考文献：
本出願全体を通して、種々の参考文献が本発明が属する当技術分野の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み入れられる。
【００９８】
【表１】
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【国際調査報告】
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