(57)【要約】  本発明は、核酸の操作、特にDNA操作、およびその利用の分野に関する。具体的には、本発明は、たとえば形質転換された微生物を作製するための、核酸の連結に関わる方法およびそのような連結核酸の使用に関する。また、本発明はそうした方法に有用な材料に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
a) 連結されるべき一連の少なくとも3つの核酸断片を用意するステップであって、これらの核酸断片が対となる適合末端を含有しており、これらの核酸断片のうち少なくとも2つが、少なくともそれぞれの適合末端領域内で二本鎖となっており、それぞれの適合末端の各々の逆ストランドが非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドを含有する、前記ステップ、
b) 非酵素的除去用に構成された上記のヌクレオチドを非酵素的に除去するステップ、
c) 核酸断片をハイブリッド形成条件下で混合するステップ
を含んでなる、核酸連結法。
【請求項２】
適合末端が5から25ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載の核酸連結法。
【請求項３】
各々の適合末端領域について非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドの数が5から25である、請求項１または２に記載の核酸連結法。
【請求項４】
少なくとも1つの断片が、ステップb)を行った後に二本鎖部分を含有する、請求項１〜３のいずれか1つに記載の核酸連結法。
【請求項５】
ステップc)で、少なくとも2つの核酸断片を20:1から1:20のモル比で混合する、請求項１〜４のいずれか1つに記載の核酸連結法。
【請求項６】
非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドがホスホロチオエート骨格を有する、請求項１〜５のいずれか1つに記載の核酸連結法。
【請求項７】
ステップb)が、断片をヨウ素およびエタノールに暴露することを含む、請求項６に記載の核酸連結法。
【請求項８】
a) 鋳型核酸を提供し、その鋳型核酸の鋳型セクションを増幅するためのプライマーを用意するステップであって、1つまたはすべてのプライマーが非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドを有する、前記ステップ、
b) 核酸断片を得るために鋳型核酸の鋳型セクションを増幅するステップ、
c) 少なくとも2つの核酸断片を得るために、ステップa)およびb)を繰り返すステップ、
d) ステップc)の核酸断片に対して、請求項１〜７のいずれか１項による核酸連結法を実施し、ステップc)で2つしか核酸断片が得られない場合には、少なくとも1つの追加の核酸断片を導入するステップ
を含んでなる、核酸変異法。
【請求項９】
核酸断片の連結によって得られる産物が、
- 点変異、
- 配列セクションの順序および/または数および/または方向、
- 転写および/または翻訳に影響を及ぼす部位との機能的連鎖、
- 転写および/または翻訳された配列セクションの順序および/または数および/または長さ
のうち1つもしくは複数の点で、鋳型の少なくとも1つ、および/または基準の核酸と異なる、請求項８に記載の核酸変異法。
【請求項１０】
少なくとも１つの第１のプライマーが少なくとも１つのヌクレオチドで鋳型核酸の対応するセクションと異なる、請求項９に記載の核酸変異法。
【請求項１１】
a) 請求項１〜１０のいずれか１つに記載の核酸連結法を実施するステップ、ならびに
b) ステップa)で得られた連結された核酸で標的細胞を形質転換するステップ
を含んでなる、形質転換法。
【請求項１２】
連結された断片がクローニングベクターを形成する、請求項１１に記載の形質転換法。
【請求項１３】
鋳型または基準の核酸に対して少なくとも１つの相違を作り出すための、非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドを有する核酸の使用であって、この相違が
- 点変異、
- 配列セクションの順序および/または数および/または方向の相違、
- 転写および/または翻訳に影響を及ぼす部位との機能的連鎖の相違、
- 転写および/または翻訳された配列セクションの順序および/または数および/または長さの相違
から、独立して選択される、前記使用。
【請求項１４】
少なくとも３つの核酸断片を連結するためのキットであって、
- 非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドを有する、各断片について２つの増幅プライマー、および
- １つもしくは複数の非酵素的ヌクレオチド除去剤
を含んでなる、前記キット。
【請求項１５】
機械解釈可能なデータキャリアを含んでなるコンピュータープログラム製品であって、前記データキャリアは、核酸取扱装置が読みとって解釈すると、その装置に請求項１〜１２のいずれか１つの方法を実施させる命令集合を含んでいる、前記製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の操作、特にDNA操作、およびその利用の分野に関する。具体的には、本発明は、たとえば形質転換された微生物を作製するための、核酸の連結に関わる方法およびそのような連結核酸の使用に関する。また、本発明はそうした方法に有用な材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸操作法はいつまでも必要とされている。たとえば、核酸もしくはそれによってコードされるタンパク質の機能分析は、当該核酸の変異体、特に異なる塩基配列を有する変異体の作製に役立つことが多い。同様に、効率のよい生産株もしくはベクターを構築するために、いくつかの核酸セグメントを組み合わせること、たとえばいくつかの遺伝子もしくはエクソンを望ましい調節エレメントの制御下におくことは、多くの場合望ましい。
【０００３】
実用的な理由から、全長核酸で作業しない方がよいことが多い。その代わりに、より小さいセグメントを得て、修飾し、後で組み合わせて、修飾された全長核酸を得る。通例、セグメントの数は核酸に導入される修飾の数とともに増加する。また、クローニングもしくは発現の目的で、核酸を操作してそれをベクターに挿入することは、一般的である。
【０００４】
2つ以上の核酸を組み合わせることを含むこのような操作方法のために、一般に、安定した組み合わせを達成する必要があることが、問題となる。組み合わせの安定性は、組み合わされた核酸を用いた細胞の形質転換のために、特に必要である。形質転換中およびその後で、核酸は、たとえば、細胞内への強制的移動、ならびに異質な核酸を除去するように設計されている細胞酵素によって、ストレスを受ける。
【０００５】
一本鎖の隣接ヌクレオチド間でホスホジエステル骨格にニック、すなわち切れ目を有する、組み合わされた核酸は、分解しやすいことがしばしば観察されている。また、ニックの入った核酸は、低い形質転換効率をもたらすと思われる。たとえば、VroomおよびWang (BioTechniques 2008, 924-926)は、ベクターおよびいくつかの挿入断片に関するクローニング実験を記載している。その挿入断片およびベクターは、13-15ヌクレオチドのオーバーラップによって連結されるので、ベクターおよび各挿入断片は、組み合わされた核酸にニックを加えることになる。著者らの観察によれば、形質転換体の数は、追加の挿入断片ごとに一桁減少している。たとえば、挿入断片が1つだけ存在する場合、261コロニーが観察されたが、2つの挿入断片が同時に存在する場合、わずか16コロニーしか見られず、3つの挿入断片については、3コロニーしか観察されなかった。したがって、プラスミドのような組み合わされた核酸の構築に際しては、ニックの存在は回避されるべきである。さらに特に、修飾された核酸のライブラリー構築のために、ニックの存在は回避されなければならないが、その理由は、形質転換効率の低さが形質転換体ライブラリーの作製を妨げ、あるいは受け入れがたいほど妨害すると考えられるからである。したがって、異なる核酸を保有する形質転換細胞のライブラリーの構築は長引いて厄介であり、こうした理由から、多数の核酸変異体の機能を分析して比較すること、または複数の核酸セグメントを組み合わせることは、今のところ困難である。
【０００６】
それ故に、特に、組み合わされた核酸を形質転換体の作製に使用すべき場合には、そうした核酸にニックが存在しないようにすることが望ましい。したがって、リガーゼの作用で、またはニックのないストランドの合成によって、たとえば核酸ポリメラーゼの作用で、組み合わされた核酸のホスホジエステル骨格をライゲートすることが、一般に試みられている。
【０００７】
しかしながら、ライゲーションは面倒なことで知られているプロセスであって、ライゲーション効率は、明確な理由もなしに変動することがある。加えて、核酸ポリメラーゼによる増幅も不要な追加ステップと考えられ、人為的結果を招きかねない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】BioTechniques 2008, 924-926
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、上記の先行技術の欠点を除去または軽減する、複数の核酸を連結するための方法を提供する必要がある。その方法は、少なくとも3つ、好ましくは少なくとも4つ、より好ましくは少なくとも5つの核酸を組み合わせることを可能にすべきである。また、その方法は、高い形質転換効率の達成を可能にすべきである。その方法は、形質転換体のライブラリーの作製に役立つ、組み合わされた核酸の作製を可能にすべきである。また、その方法は、信頼性があって、迅速でなければならず、高価な材料や装置は不要とすべきである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明にしたがって核酸連結法が与えられるが、その方法は、
a) 連結すべき一連の少なくとも3つの核酸断片を用意するステップであって、その核酸断片が対となる適合末端を含有しており、核酸断片のうち少なくとも2つは、少なくともそれぞれの適合末端領域において二本鎖となっていて、それぞれの適合末端の各々の逆ストランド（カウンター鎖）が非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドを含有する、前記ステップ、
b) 非酵素的除去用に構成された前記のヌクレオチドを非酵素的に除去するステップ、
c) ハイブリッド形成条件下で核酸断片を混合するステップ
を含んでなる。
【００１１】
ここで、驚くべきことに、本発明にしたがって上記のように断片を調製することによって、すなわち、非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドを非酵素的に除去することによって、たとえ連結されたそれぞれの核酸がニックを含有していても高い効率で形質転換可能な、連結された核酸を得ることができることが判明した。具体的には、本発明の方法は、高い形質転換効率で形質転換することができる、組み合わされた核酸を達成するために、ライゲーションもしくはポリメラーゼ反応をする必要性をなくす。したがって、本発明の方法は、好都合なことに、後で説明するように、形質転換ステップを必要とするさまざまな応用に適している。
【００１２】
また、本発明は、適合末端を作製してそのような適合末端を連結するために酵素を使用する必要なしに、複数の核酸断片を連結するための驚くほど効率的な方法を提供する。本発明者らは、本発明にしたがって連結された核酸をさらにリガーゼで処理しても、形質転換効率は、ライゲートされない連結核酸と比べて有意に増加しないことを見いだした。ニックのない核酸よりニックのある核酸の方が、形質転換中もしくはその後に分解する可能性が非常に高い：したがって、高い形質転換効率を達成するためにライゲーションが必須であり、少なくとも有用であると予想されたので、これは予想外であった。本発明者らは現在、ヌクレオチドの非酵素的除去が、一本鎖の適合末端を作製するために、予想以上に効率のよいプロセスを提供すると考えている：進化はこれまで、適合末端のライゲーションおよび作製のためにほとんど最適な酵素を発達させてきたはずなので、これは特に驚くべきことである。したがって、本発明による形質転換効率が、核酸断片の作製および/または連結で酵素を用いるプロセスと比べて、同じかかなり高くなりそうであることは驚くべきことであった。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】OmniChangeのスキーム。
【図２−１】図2：OmniChangeで作製されたマルチサイト飽和ライブラリーからの48ランダムクローンに対する野生型遺伝子（鋳型DNA）の部分的配列アラインメント。
【図２−２】図２−１の続き。
【図３】OmniChangeの開発に使用されたオリゴヌクレオチド。
【図４】OmniChange実験後ランダムに選抜された48個のクローン由来の5つの集中的なNNKランダム化位置のコドン多様性に関する概括。
【図５】ドメイン-PLICingの図解。
【図６】ドメイン-PLICingによる、ランダムに選抜された42クローンのシャフリング結果。
【図７−１】ドメイン-PLICingの開発に使用されたオリゴヌクレオチド。
【図７−２】図７−１の続き。
【図７−３】図７−１の続き。
【図７−４】図７−１の続き。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明を説明するために、「核酸」という用語は少なくとも2つのヌクレオシドのエステルを指しており、このヌクレオシドは、好ましくはプリンおよびピリミジン塩基から選択される塩基、より好ましくはアデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシルから選択される塩基、ならびに、好ましくはリボースおよびデオキシリボースから選択される五炭糖部分を含有する。したがって、好ましいヌクレオシドは、リボヌクレオシド用にはアデノシン、グアノシン、シチジン、およびウリジンであり、デオキシリボヌクレオシド用にはデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、チミジンおよびデオキシウリジンであって、これらは特に好ましいヌクレオシドである。本発明の他のヌクレオシドは、たとえば、イノシン、キサントシン、7-メチルグアノシン、ジヒドロウリジン、および5-メチルシチジンである。
【００１５】
他に好ましいヌクレオチドは、2'-アミノ-2'-デオキシアデノシン(2'-AdA)、3'-アミノ-3'-デオキシアデノシン(3'-AdA)、3'-アミノ-3'-デオキシグアノシン(3'-AdG)、5'-アミノ-5'-デオキシアデノシン(5'-NH2-Ado)、5'-アミノ-5'-デオキシグアノシン(5'-NH2-Guo)、2-アミノ-6-クロロプリンリボシド(2-NH2-6-Cl-PuR)、5-アミノイミダゾール-4-カルボキサミド-1-β-D-リボフラノシド(AICAR/アカデシン（Acadesine）/Z-リボシド)、2',3'-O-p-アニシリデングアノシン(2',3'-O-pAnisyl-Guo)、2-Aza-1、N6-エテノアデノシン(2-Aza-ε-Ado)、8-アジドアデノシン(8-N3-Ado)、8-ブロモ-2',3',5'-tri-O-アセチルグアノシン(8-Br-2',3',5'-TAc-Guo)、8-ブロモ-2'-デオキシアデノシン(8-Br-dAdo)、8-ブロモ-2'-デオキシグアノシン(8-Br-dGuo)、8-ブロモ-2'-O-メチルグアノシン(8-Br-2'-O-Me-Guo)、8-ブロモアデノシン、8-ブロモグアノシン、6-ブロモツベルシジン/8-ブロモ-7-デアザアデノシン(6-Br-Tu)、8-ブロモキサントシン(8-Br-Xao)、N6-カルバモイルトレオニルアデノシン(t6-Ado)、8-カルボキシエチルアミノアデノシン(8-CEA-Ado)、2-クロロ-2'-デオキシアデノシン(2-Cl-dAdo、クラドリビン(Cladribine))、8-クロロ-2'-デオキシアデノシン(8-Cl-d-Ado)、5-クロロ-2'-デオキシシチジン(CldC)、8-クロロ-2'-デオキシグアノシン(8-Cl-dGuo)、2-クロロアデノシン(2-Cl-Ado)、8-クロロアデノシン(8-Cl-Ado)、5-クロロシチジン(5-Cl-C)、8-クロログアノシン(8-Cl-Guo)、2-クロロイノシン(2-Cl-Ino)、8-クロロイノシン(8-Cl-Ino)、8-(4-クロロフェニルチオ)-2'-O-メチルアデノシン(8-pCPT-2'-O-Me-Ado)、8-(4-クロロフェニルチオ)-2'-O-メチルグアノシン(8-pCPT-2'-O-Me-Guo)、8-(4-クロロフェニルチオ)アデノシン(8-pCPT-Ado)、8-(4-クロロフェニルチオ)グアノシン(8-pCPT-Guo)、6-クロロプリン リボシド、5-クロロウリジン(5-Cl-U)、2'-デオキシ-1,N6-エテノアデノシン(ε-dAdo)、2'-デオキシ-2'-フルオロアデノシン(2'-F-dAdo)、2'-デオキシ-8-ヒドロキシアデノシン(8-OH-dAdo)、2'-デオキシ-8-ヒドロキシグアノシン(8-OH-dGuo)、2'-デオキシグアノシン、3'-デオキシグアノシン(3'-dG)、2'-デオキシイノシン、3'-デオキシチミジン/2',3'-ジデオキシチミジン(ddT)、3',5'-ジアミノ-3',5'-ジデオキシアデノシン(3',5'-DA-ddA)、5,6-ジクロロ-1-β-D-リボフラノシル ベンズイミダゾール(DRB)、2,6-ジクロロ-2',3',5'-トリアセチルプリンリボシド、2,6-ジクロロプリン リボシド、2',3'-ジデオキシアデノシン(ddA)、2',3'-ジデオキシグアノシン(ddG)、N2,N2-ジメチルグアノシン(M22Guo)、1,N6-エテノアデノシン(ε-Ado)、8-ヒドロキシアデノシン(8-OH-Ado)、8-ヒドロキシグアノシン(8-OH-Guo)、5-ヨードツベルシジン/7-デアザ-7-ヨードアデノシン(5-I-Tu)、2',3'-イソプロピリデングアノシン(2',3'-Ipr-Guo)、2',3'-イソプロピリデンイノシン、8-メルカプトグアノシン、6-メルカプトプリンリボシド、8-(4-メトキシフェニルチオ)アデノシン(8-pMeOPT-Ado)、2'-O-メチルアデノシン(2'-O-Me-Ado)、2'-O-メチルグアノシン、6-メチルメルカプトプリンリボシド、2-メチルチオアデノシン(2-MeS-Ado)、8-ニトログアノシン(8-NO2-Guo)、8-フェニルチオアデノシン(8-PT-Ado)、プリンリボシド(PuR)/ネブラリン(Nebularine)、5'-[(2,2,5,5-テトラメチル-3-ピロリン-1-オキシル-3-カルボキシルアミノ)アデノシン(5'-TMPO-Ado)、2',3',5'-トリ-O-ベンゾイルグアノシン(2',3',5'-TBnz-Guo)、2',3',5'-トリアセチルイノシン、N2,N2,7-トリメチルグアノシン(m2,2,7G/TMG)、および、蛍光ヌクレオチド、2-アミノプリンリボシド-3',5'-一リン酸(2-NH2-cPuMP)、2-アミノプリン リボシ��-5'-O-三リン酸(2-NH2-PuTP)、2-アザ-1,N6-エテノアデノシン(2-Aza-ε-Ado)、2-Aza-1,N6-エテノアデノシン-3',5'-環状一リン酸(2-Aza-ε-cAMP)、8-アジド-1,N6-エテノアデノシン-3',5'-環状一リン酸(8-N3-ε-cAMP)、8-アジド-N6-(2-[DY-547]-アミノエチル)アデノシン-3',5'-環状一リン酸(8-N3-6-[DY-547]-AE-cAMP)、6,7-ビス(カルボキシメトキシ)クマリン-4-イル)メチル-アデノシン-3',5'-環状一リン酸(BCMCM-ケージドcAMP)、[6,7-ビス(カルボキシメトキシ)クマリン-4-イル]メチル-8-ブロモアデノシン-3',5'-環状一リン酸(BCMCM-ケージド8-Br-cAMP)、[6,7-ビス(カルボキシメトキシ)クマリン-4-イル]メチル-8-ブロモグアノシン-3',5'-環状一リン酸(BCMCM-ケージド8-Br-cGMP)、[6,7-ビス(カルボキシメトキシ)クマリン-4-イル]メチルグアノシン-3',5'-環状一リン酸(BCMCM-ケージドcGMP)、2'-デオキシ-1,N6-エテノアデノシン(ε-dAdo)、2'-デオキシ-1,N6-エテノアデノシン-5'-O-一リン酸(ε-5'-dAMP)、2'-デオキシ-1,N6-エテノアデノシン-5'-O-三リン酸(ε-dATP)、2'-デオキシ-3'-O-(N'-メチルアントラニロイル)アデノシン-5'-O-二リン酸(MANT-dADP)、2'-デオキシ-3'-O-(N'-メチルアントラニロイル)アデノシン-5'-O-一リン酸(MANT-5'-dAMP)、2'-デオキシ-3'-O-(N'-メチルアントラニロイル)アデノシン-5'-O-三リン酸(MANT-dATP)、2'-デオキシ-3'-O-(N'-メチルアントラニロイル)グアノシン-5'-O-二リン酸(MANT-dGDP)、2'-デオキシ-3'-O-(N'-メチルアントラニロイル)グアノシン-5'-O-一リン酸(MANT-5'-dGMP)、2'-デオキシ-3'-O-(N'-メチルアントラニロイル)グアノシン-5'-O-三リン酸(MANT-dGTP)、2'-,2''-O-(Di-N'-メチルアントラニロイル)-環状 ジグアノシン一リン酸(Di-MANT-c-diGMP)、8-(2-[DY-547]-アミノエチルチオ)-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸(8-[DY-547]-AET-2'-O-Me-cAMP)、8-(2-[DY-547]-アミノエチルチオ)グアノシン-3',5'-環状一リン酸(8-[DY-547]-AET-cGMP)、8-(2-[DY-647]-アミノエチルチオ)グアノシン-3',5'-環状一リン酸(8-[DY-647]-AET-cGMP)、1,N6-エテノアデノシン-3',5'-環状一リン酸(ε-cAMP)、1,N6-エテノアデノシン-5'-O-ジホスホリボース(ε-ADPR/ε-ADP-リボース)、1,N6-エテノアデノシン-5'-O-ジホスホリボースリン酸(ε-ADPRP)、1,N6-エテノアデノシン-5'-O-一リン酸(ε-5'-AMP)、1,N6-エテノアデノシン-5'-O-三リン酸(ε-ATP)、8-(2-[フルオレセイニル]アミノエチルチオ)アデノシン-3',5'-環状一リン酸(8-[Fluo]-cAMP)、8-(2-[フルオレセイニル]アミノエチルチオ)グアノシン-3',5'-環状一リン酸(8-[Fluo]-cGMP)、2'-O-(6-[フルオレセイニル]アミノヘキシルカルバモイル)-環状 ジグアノシン一リン酸(2'-Fluo-AHC-c-diGMP)、2'-(6-[フルオレセイニル]アミノヘキシルカルバモイル)アデノシン-3',5'-環状一リン酸(2'-Fluo-AHC-cAMP/FAM-cAMP)、2'-/ 3'-O-(6-[フルオレセイニル]アミノヘキシルカルバモイル)アデノシン-5'-O-一リン酸(2'-/3'-Fluo-AHC-5'-AMP/FAM-AMP)、2'-(6-[フルオレセイニル]アミノヘキシルカルバモイル)グアノシン-3',5'-環状一リン酸(2'-Fluo-AHC-cGMP/FAM-cGMP)、2'-O-(N-メチルアントラニロイル)アデノシン-3',5'-環状一リン酸(MANT-cAMP)、2'-/3'-O-(N'-メチルアントラニロイル)アデノシン-5'-O-二リン酸(MANT-ADP)、2'-/3'-O-(N'-メチルアントラニロイル)アデノシン-5'-O-一リン酸(MANT-5'-AMP)、2'-/3'-O-(N-メチルアントラニロイル)アデノシン-5'-O-三リン酸(MANT-ATP)、2'-O-(N'-メチルアントラニロイル)シチジン-3',5'-環状一リン酸(MANT-cCMP)、2'-O-(N-メチルアントラニロイル)グアノシン-3',5'-環状一リン酸(MANT-cGMP)、2'-/3'-O-(N'-メチルアントラニロイル)グアノシン-5'-O-二リン酸(MANT-GDP)、2'-,3'-O-(N'-メチルアントラニロイル)グアノシン-5'-O-一リン酸(MANT-5'-GMP)、2'-/3'-O-(N'-メチルアントラニロイル)グアノシン-5'-O-三リン酸(MANT-GTP)、2'-/ 3'-O-(N'-メチルアントラニロイル)グアノシン-5'-O-[(β,γ)-イミド]三リン酸(MANT-GppNHp)、8-(4-[N-メチルアントラニロイル]アミノブチルアミノ)アデノシン-3',5'-環状一リン酸(8-MABA-cAMP)、N6-(6-[N-メチルアントラニロイル]ヘキシルアミノ)アデノシン-3',5'-環状一リン酸(6-MAH-cAMP)、β-ニコチンアミド-1,N6-エテノアデニン ジヌクレオチド(ε-NAD+)、β-ニコチンアミド-1,N6-エテノアデニン ジヌクレオチド リン酸(ε-NADP+)、β-ニコチンアミド-N6-(2-(6-[フルオレセイニル]アミノヘキサノイル)アミノエチル)アデニンジヌクレオチド(6-Fluo-10-NAD+)、ニコチン酸-1,N6-エテノアデニン ジヌクレオチド リン酸(ε-NAADP)、8-(2-[7-ニトロ-4-ベンゾフラザニル]アミノエチルチオ)アデノシン-3',5'-環状一リン酸(8-NBD-cAMP)、8-(2-[7-ニトロ-4-ベンゾフラザニル]アミノエチルチオ)グアノシン-3',5'-環状一リン酸(8-NBD-cGMP)、8-[Pharos-450]-アデノシン-3',5'-環状一リン酸(8-[φ-450]-cAMP)、8-[Pharos-450]-グアノシン-3',5'-環状一リン酸(8-[φ-450]-cGMP)、8-[Pharos-575]-2'-O-メチルアデノシン-3',5'-環状一リン酸(8-[φ-575]-2'-O-Me-cAMP)、8-[Pharos-575]-アデノシン-3',5'-環状一リン酸(8-[φ-575]-cAMP)、8-[Pharos-575]-グアノシン-3',5'-環状一リン酸(8-[φ-575]-cGMP)、2'-O-(2-[テトラメチルローダミニル]アミノエチルカルバモイル)グアノシン-3',5'-環状一リン酸(2'-TAMRA-AEC-cGMP)、2'-O-(6-[テトラメチルローダミニル]アミノヘキシルカルバモイル)グアノシン-3',5'-環状一リン酸(2'-TAMRA-AHC-cGMP)からなる一群から選択される。
【００１６】
ヌクレオチドのエステル結合は好ましくは、ホスホジエステル結合であるが、下記のように修飾されたホスホジエステル結合も好ましく、その場合ホスホロチオエートがもっとも好ましい。このような共有結合で結合されたリン酸もしくは修飾リン酸基を有するヌクレオシドは、本発明を説明するために、ヌクレオチドと称される。リン酸もしくは修飾リン酸基は、好ましくはヌクレオチドの五炭糖の3'炭素原子に共有結合している。
【００１７】
本発明の上で、「核酸断片」（もしくは単に「断片」）という用語は、別の核酸との組み合わせを意図した核酸を指すものであって、別の核酸も同様に本発明にしたがって断片とよばれる。核酸断片が、前の、より大きな核酸の消化に由来することは、あり得るが必要ではない；それよりむしろ、核酸断片は、たとえばポリメラーゼ連鎖反応もしくは他のメカニズムによる、デノボ合成の直接的な結果であってもよい。
【００１８】
好ましくは核酸もしくは核酸断片はRNAまたはDNAであって、非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドを追加して含有するが、それは、ホスホロチオエート基を有するヌクレオチドであることがもっとも好ましい。本発明に使用される核酸は、より詳細には、二本鎖RNAまたはDNAとすることができ、本発明の連結方法は、混合型核酸を得るために、RNA断片をDNA断片につなぐことを可能にする。
【００１９】
2つの核酸および核酸断片は、それらの適合塩基の水素結合によってハイブリダイズすることができる。ハイブリダイズされた核酸は、その後、二本鎖核酸の2つのストランドを形成する。本発明を説明するために、ほとんどの場合、一本鎖核酸と二本鎖核酸の明確な区別はなされない。また、本発明の核酸は、その全長にわたって一本鎖であってもよく、その全長にわたって二本鎖であってもよく、または一本鎖および二本鎖部分を含有していてもよい。具体的には、本発明の核酸断片は、完全に一本鎖であってもよく、1つもしくは複数の二本鎖部分を含有してもよい。好ましくは、本発明の核酸断片は、ステップb)の後で、その両端に一本鎖部分を含有する；より好ましくは、完全に一本鎖であって、5'末端に至る一本鎖部分および3'末端に及ぶ一本鎖部分を有し、あるいは、二本鎖であって、各ストランドの5'末端に伸びた一本鎖末端部分を有する。
【００２０】
第1の核酸の一本鎖末端部分は、ハイブリッド形成条件下で、その末端が、本発明の方法のハイブリッド形成ステップで使用される第2の核酸の末端部分とハイブリダイズするならば、適合末端（適合性の末端）とよばれるが、この第1および第2の核酸は、それぞれもう一方に対する、厳密にマッチングする対のストランド（逆ストランド）で構成されない。好ましくは、対になる適合末端（付着末端もしくは粘着末端ともよばれる）は、アデニンがチミンもしくはウラシルに対応し、その逆も同様に対応し、グアニンはシトシンと対応し,その逆もまた対応するという標準的な塩基対合則にしたがって、相互に厳密にマッチングするヌクレオチド配列を有する。しかしながら、本発明はこの点に制限されない；核酸ストランド部分は、それらがミスマッチとなるのが最大3カ所であれば、ただしそれぞれの末端からもっとも遠いミスマッチの位置を発端として少なくとも5つの厳密にマッチする位置が連続して伸びているならば、やはり互いに適合性であると見なされる。
【００２１】
本発明のハイブリッド形成条件は、対応する塩基対の水素結合による二本鎖核酸の形成を可能にする条件である。したがって、ハイブリッド形成条件は、核酸の塩基配列によって変動する。本発明のハイブリダイゼーションは水中で行われるが、好ましくは緩衝液中で行われる。ハイブリッド形成条件の最重要パラメーターは、水温であり、ハイブリダイゼーション温度ともよばれる。以下のハイブリダイゼーション温度が好ましいハイブリダイゼーション条件である：
【表１】
2014513972.tif 000002
【００２２】
したがって、当業者は、連結されるべき核酸断片の個別の必要に応じてハイブリッド形成条件を選ぶことができる。原則として、温度が高いほど、よりストリンジェントなハイブリダイゼーションをもたらし、塩基のミスマッチは減少することになる。また、概して温度が高いほど、アデニンとチミンもしくはウラシルとの水素結合の切断が促進されるので、これらの塩基の含量が高い核酸の二本鎖は、容易に形成されなくなるか、または減少することになる。したがって、当業者は、それぞれの核酸のアデニン、チミンおよびウラシルの含量を考慮して、求められる塩基対合の特異性に応じて,温度を調整することができる。好ましくは、ハイブリッド形成条件は、核酸の適合末端がミスマッチなしにハイブリダイズするように選択される。
【００２３】
本発明の利点を考慮して、核酸連結法の後に、連結された核酸のライゲーションもしくは増幅のステップが続かないことがきわめて好ましい。特に本発明は、以下により詳細に説明するように、本発明にしたがって連結された核酸をそのまま細胞の形質転換のために使用することを可能にする。連結された核酸をライゲートする、または増幅することは可能であるにしても、本発明はそうしたライゲーションもしくは増幅ステップなしに最大限活用されるのであって、その理由は、形質転換効率を落とすことなしに追加ステップを回避できることが、上記のように本発明の重要な利点とみなされるからである。
【００２４】
本発明によれば、ステップa)において、連結されるべき一組の少なくとも3つの核酸断片が与えられる。断片は、適合末端を比べると互いに構造的に関連付けられており、これは、上記のように水素結合によるそれぞれの適合末端のハイブリダイゼーションを可能にする。各々の核酸断片が他のすべての核酸断片と適合する末端を含有することは必要ではなく、望ましくないことさえ多い。そうではなくて、各核酸断片のそれぞれの末端が他の1つの核酸断片の適合末端とのみ適合するように、適合末端が選択されることが好ましい。このように核酸断片の間の明確な鎖の関係を維持することができ、それはたとえば、5'-3'の方向で、第1の核酸塩基配列を有する断片Aが、第2の核酸塩基配列を有する断片Bと適合し、その断片Bがこんどはそのもう一方の末端部分で第3の核酸塩基配列を有する断片Cと適当する、などといった具合である。核酸断片の末端が、他の2つ以上の核酸断片の末端と適合するならば、それらの断片は無作為に連結される可能性があり、ステップc)で得られる連結された核酸が必ずしもすべて、ステップa)で与えられるすべての核酸断片を含んでいるわけではない可能性が高い。これが好ましいのは、ステップc)で得られる連結核酸の正確な組成が決定的でない場合、すなわちあらゆる連結核酸の中にすべての核酸断片が存在することが必要ではない場合、またはそれぞれの連結核酸中の核酸断片の出現数が1回より多くてもよい場合の適用にのみ好ましい。
【００２５】
好ましくは、ステップa)で、連結されるべき3から8つの核酸断片のセットが与えられるが、上記のように、適合末端によって、曖昧さのない鎖の関係性が維持されることが好ましい。最大の断片数は制限されないとしても、本発明の方法で8個以下の断片を結合する方法によって、これまで最良の結果が得られてきた。より好ましくは、ステップa)で提供される核酸断片の数は、4から16であり、さらに好ましくは4から10であり、さらにいっそう好ましくは5から8である。VroomおよびWangによる上記文献を考慮すると、このように多数の断片を連結し、高い形質転換効率で形質転換に使用することが可能であることは、特に驚くべきことであった。VroomおよびWangの方法によって得ることができる形質転換体の数が非常に少ないため、先行技術のこのような方法は、工業的に応用することはできず、連結された核酸を得ようとすると当業者に不当な負担を課すことになる。また、Pachukらの文献（Chain reaction cloning: a one step method for directional ligation of multiple DNA fragments, Gene 243 (2000), 19-25）を考慮すると、当業者は、非常に複雑なプロトコールだけが6個の断片のライゲーションを十分に提供することができると想定しなければならなかったが、本発明によれば非常に単純なプロトコールで十分である。また、Pachukらは形質転換効率を公表しなかったが、全クローンのうちわずか50％しか望ましい構築物を含んでいないことが観察された。したがって、当業者は、このような方法が、遺伝子シャフリング、エクソンシャフリングもしくはドメインシャフリングなどの何らかの核酸シャフリングのために必要とされるような、さまざまに異なる核酸のライブラリーを得るために有用でないことを想定しなければならなかった。ステップa)で提供される断片数は少なくとも5個であることが、よりいっそう好ましい。VroomおよびWangの記載する方法によれば、当業者は、過度の負担なしに少なくとも5個の断片の関わる連結法をうまく行うことについて合理的な期待をいだくことができなかったが、それは、4つの断片の連結でさえ、実用的な数の形質転換体は得られなかったと著者らが記載しているためである。同じ理由で、ステップa)で与えられる核酸断片数が少なくとも6個、より好ましくは少なくとも7個である本発明の方法は、好ましい。
【００２６】
塩基配列を考慮した核酸断片の組成は、それらが適合性の末端を含有するという要件による以外、制限を受けない。断片は、ヘアピンループ、制限酵素結合部位、転写因子結合部位、組換え部位、複製開始点、足場付着部位、プロモーター、転写終結因子、他の非コード核酸配列、メタゲノム核酸部分（たとえば、Handelsman J. et al., Chemistry & Biology 1998, 5:R245-249）、エクソン、イントロン、遺伝子、およびオペロンから選択される、1つもしくは複数のエレメントを含んでいてもよい。本発明にしたがって、断片はたとえば、（連結後に）標的細胞を形質転換するためのベクターとして役立つような組成を有することができる。ベクターは一般に、ベクターの複製を可能にするための少なくとも1つの複製開始点、ならびに選択された標的細胞によってそれに挿入された任意の核酸セグメントを含有する。好ましくは、ベクターは、標的細胞中にそれが存在することを検出するための手段、好ましくはレポーター遺伝子、そしてもっとも好ましくは、色素、光、および/または選択されたストレス要因に対する耐性、好ましくは抗生物質耐性を生じる遺伝子も含有する。好ましくは、ステップa)において、断片の少なくとも1つは、ベクターの断片であって、ステップc)では、上記のように複製することができる核酸が与えられる。また、好ましくは、ステップa)において、少なくとも2つの断片が与えられ、それらの断片は、連結された後に、そうして得られた核酸が複製されることを可能にする。このような場合、ベクターは基本的に、2つ以上の断片で作製される。本発明のベクターは好ましくは、プラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、またはウイルスベクターである。しかしながら、上記のように、連結された核酸はベクターである必要はまったくなく、それを含む必要もない。
【００２７】
また、断片の長さは、断片が適合性の末端を含有するという要件による以外、制限を受けない。好ましくは、断片は、30から1,150,000ヌクレオチドの長さを有するが、より好ましくは30から50,000ヌクレオチドである。より詳細には、本発明は、有利なことに、たとえば、Gibson et al. (Creation of a Bacterial Cell Controlled by a Chemically Synthesized Genome; Science 329 (2010), 52-56)によって記載されるような非常に大きな断片でさえ、実用上有効な形質転換効率で連結することを可能にし、具体的にはさまざまな形質転換体のライブラリーを作製することを可能にする。大型の断片をこのように連結することはかつては非常に面倒であって、引用された先行技術に記載のように、断片１つずつでしか達成できなかった。
【００２８】
本発明によれば、断片は、相互に適合する末端を含有する。上記のように、適合末端の塩基配列は、ステップc)で得られることになる連結された核酸のタイプを考慮の上で選択される。したがって、適合末端は、明確な鎖の関係性を維持するように選択されてもよいが、そうでなくてもよい。各断片のそれぞれの末端が別の断片の少なくとも一方の末端と適合することは必要ではない。当然、そのような断片だけが、本発明の方法において連結されるが、それは別の核酸断片の少なくとも一方の末端に適合する少なくとも1つの末端を含有する断片である。したがって、すべての断片について、あらゆる末端が別の断片の少なくとも一方の末端と適合するならば、ステップc)でニックの入った環状の核酸が得られる。いつでも形質転換およびクローニングに使える状態になっている核酸を提供するために、これは好ましい。少なくとも1つの断片が別の断片と適合する末端を1つだけ含有する場合、直鎖状の核酸がステップc)で得られる。このような直鎖状の核酸は、たとえば、核酸チップを構築するために使用することが可能であって、このチップはキャリアーチップの表面に結合した一連の核酸（核酸アレイ）を含有する。また、そうした核酸はブロッティングのDNAプローブとして、または抗原として使用できると考えられる。さらにまた、直鎖状の核酸を、転写およびin vitroタンパク質発現のための鋳型として使用することもできる。好ましくは、ステップc)で得られる直鎖状の核酸は、5'および3'末端の修飾、好ましくはビオチン標識もしくは蛍光標識を含有する。
【００２９】
本発明によれば、核酸断片のうち少なくとも2つは、少なくともそれぞれの適合末端の領域内で二本鎖となっており、それぞれの適合末端の各々の逆ストランド（逆鎖）は、非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドを含有する。また、これらの断片は、それぞれの適合末端を連結した後、ニック以外に連結された核酸内にギャップが残らないように、二本鎖となっていることが好ましい。しかしながら、好ましいのは、ステップa)で与えられる断片すべてが、少なくともそれぞれの適合末端領域において二本鎖となっており、それぞれの適合末端の各々の逆ストランドが非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドを含有することである。このように、本発明にしたがって使用するためのすべての核酸断片を調製することは特に容易であるが、それは、それらすべてを同じように、たとえば、下記のように修飾されたプライマーによる増幅によって、調製することができるからである。しかしながら、ベクターのような一部の断片は、市販の供給源から直鎖状にした形で容易に得ることもできる。したがって、1つを除いてすべての核酸断片が少なくともそれらのそれぞれの適合末端の全領域内で二本鎖となっており、それぞれの適合末端の各々の逆ストランドが非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドを含有する本発明の方法も好ましい。
【００３０】
好ましくは、非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドは、核酸鎖の5'末端領域にある（以下：標識鎖）。このように標識された鎖は、たとえば、非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドを含むプライマーを用いて、そのプライマーを鋳型による増幅反応、たとえばPCRによって伸長させることによって、容易に合成することができる。次に、それぞれの核酸断片は、下記のように非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドを除去した後、それぞれの逆ストランドの3'末端に一本鎖となっている領域を有することになる。
【００３１】
非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドは、標識鎖の3'末端領域にあってもよい。そのような場合には、非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドは、ホスホロチオエート化を含んでいることが好ましい。たとえば、第1の断片は、3'末端領域に存在する非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドを含有するだけであるが、第2および第3の断片はそれぞれの3'および5'末端領域に存在する非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドを含有することができる。このように、3つの断片の連結の仕方は1つしか存在せず、したがって、連結プロセスを十分にコントロールすることができる。
【００３２】
本発明にしたがって、非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドはステップb)において非酵素的に除去される。非酵素的除去用に構成されていないヌクレオチドはステップb)で除去されてはならないと考えられ、そうでないと、ステップc)で連結するための核酸が何も残らないことになる。非酵素的なヌクレオチド除去のために特に好ましい方法および試薬を以下に記す。ステップb)において、1つの反応混合物中ですべての断片を処理することが好ましいのは、その方法が特に実施しやすく早いからである。しかしながら、その代わりに、断片の一部またはすべてを別々の反応混合物中で処理することもできる。そうした個別処理は、小量の反応混合液量を維持することを可能にするので、高い熱交換効率を維持することができる。また、本発明の連結法の混合ステップc)において、個々の断片を個別に評価することができるので、1つまたは複数の断片から見た優先傾向もしくはかたよりを回避することができる。
【００３３】
ステップb)の間、もしくはその後に、核酸断片をハイブリッド形成条件下で混合する。ステップb)で必ずしもすべての断片が1つの反応混合物もしくは保存混合物中に保持されていないならば、ここでそれらを合わせる。このような場合、断片の数が1つずつ増加するように、ハイブリダイゼーション混合物に断片を順次添加することができる。断片の長さが、ステップc)で連結されるもっとも長い核酸鎖と比べて20％を越えて差があるならば、大きい断片に、それより小さい断片を加える逐次添加のほうが、高い収率で正しく連結された核酸をもたらす。大きい断片にそれより小さい断片を加えるこの逐次添加は、たとえば、大きいほうの断片の適合末端を、望ましい次の小さいほうの断片で飽和させ、そうしてはじめて次の断片を添加して、連結された核酸の、対応する適合末端を望ましい次の断片で再び飽和させることによって、確実に、断片の望ましい順序を達成できるようにするために、特に有用である。ベクター断片をそれより小さい挿入断片の鎖に連結すべき場合には、ハイブリダイゼーションでベクター断片と連結されるべき第1の断片を添加した後、すべての断片がハイブリダイゼーション混合物中に存在するようになるまで、引き続いて次の断片を添加することが好ましい。しかしながら、断片のシャフリングおよび組換えにはこれが必要とされないことがありうる。なぜならばこうした場合には高度のランダム性が一般に望ましいからである。
【００３４】
しかしながら、最初にすべての断片を1つの混合物に入れて混合し、次いで、形成される可能性のあるあらゆるハイブリダイゼーションをばらばらにし、最後にハイブリッド形成条件を適用することも可能である。たとえば、断片を4℃に保持された1つの混合物に入れて混合して、確実に、ハイブリッド形成された断片の有意な自然分離が起こらないようにすることができる。すべての断片を混合した後、混合物を加熱して断片のハイブリダイゼーションをばらばらにするが、これは好ましくは、混合物の温度を3分間70-80℃に上昇させることによる。これより低い温度を用いた場合、断片のハイブリダイゼーションをばらばらにするためにはもっと長い時間が必要であり、これより高い温度を用いた場合には、断片の自然分解が起こる可能性がある。加熱後、混合物の温度を上記のハイブリダイゼーション温度まで下げて、その混合物をあらかじめ選択した時間その温度に維持するが、好ましくは20℃で5分間である。驚くべきことに、そのような混合、加熱、およびハイブリッド形成プロトコールにより、選択的でない、断片のハイブリダイゼーションが生じる。本発明の方法はこのように、連結された断片の偏りのない混合物を調製することを可能にするので、これは非常に有利である。
【００３５】
ステップc)の後、連結された核酸産物が得られるが、それは、たとえば、ライゲーションもしくは核酸増幅によって産物中のニックを除去する必要なしに、標的細胞の形質転換に使用して、形質転換体のライブラリーを構築することができるものである。
【００３６】
本発明の適合末端は、好ましくは、5から25ヌクレオチドの長さを有するが、より好ましくは7から25ヌクレオチド、さらにより好ましくは10から18ヌクレオチド、そしてもっとも好ましくは11から14ヌクレオチドの長さを有する。少なくとも7ヌクレオチドの長さを有する適合末端について、温度20-25℃でのハイブリダイゼーションは高度に選択的であり、核酸断片の適合末端によって、明確な断片鎖を定義することができる。したがって、ステップc)でのハイブリダイゼーションは、標準的な実験室の室温で行うことができ、ハイブリッド形成した断片の混合物を加熱もしくは冷却するために追加の装置を必要としない。
【００３７】
本発明によれば、それぞれの適合末端領域について、非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドの数は、5から25個、より好ましくは7から25個、さらにより好ましくは10から18個、そしてもっとも好ましくは11から14個である。したがって、適合末端の逆ストランドのすべてのヌクレオチドが非酵素的除去用に構成されている必要はない。たとえば、逆ストランドが適合末端領域内にいくつかの個別の標準的なヌクレオチドを、非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドの間に分散して含んでいるならば、非酵素的除去用に構成されていないそうした標準的なヌクレオチドは、ステップc)でそれらが正確なハイブリダイゼーションを妨害するので、適合末端とあまりしっかりと結合しないことになる。したがって、多くても6個、より好ましくはせいぜい4個、さらにより好ましくは多くても2個のヌクレオチドが適合末端の逆ストランド部分もしくは領域を形成するセクションに含まれていることが好ましい。適合末端の逆ストランド、すなわち適合末端の逆ストランド領域を形成する断片の全ヌクレオチドが、非酵素的除去用に構成されていることがさらにいっそう好ましい。
【００３８】
上記のように、少なくとも1つの断片が、ステップb)を行った後で二本鎖部分を含有することが好ましく、すべての断片が、ステップb)を行った後で二本鎖部分を含んでいることがさらにより好ましい。このように連結された核酸は、ホスホジエステル骨格にあるニック以外にギャップを含まない。ニック以外にギャップのないことは、有利なことに、そうした連結核酸の形質転換効率を高める。
【００３９】
本発明によれば、ステップc)で少なくとも2つの核酸断片を、20:1から1:20のモル比で混合することが好ましいが、より好ましくは1:1から1:10であり、さらに好ましくは1:1から1:8である。好ましくは、小さい方の断片を過剰に加える。
【００４０】
非酵素的除去用に構成（設定）されたすべてのヌクレオチドは、そのようなすべてのヌクレオチドを除去する唯一のメカニズムを使用することが必要であるように構成されることが好ましい。この制約が、本発明の連結法の容易さおよびスピードの速さを高める。
【００４１】
本発明の好ましい方法において、非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドは、ホスホロチオエート基を含有する。この基は、隣接するヌクレオチドの糖部分に共有結合しており、核酸骨格のリン酸基がそれぞれのヌクレオチドでホスホロチオエート基で置き換えられている。ホスホロチオエートヌクレオチドの合成およびアルキル化、ならびに中間体の切断はEcksteinらによる文献、たとえばAccounts of Chemical Research 1979, 204-210, Ann. Rev. Biochem. 1985 (54), 367-402 、およびScience 1988 (240), 1520-1522に記載されている。こうしたヌクレオチドは、標準的なヌクレオチドと比べてあまり高価ではないので、重合反応に使用することができ、安定した二本鎖核酸の形成を可能にするが、本発明の連結法のステップb)の中で、加水分解により容易に除去することができる。
【００４２】
本発明によれば、ホスホロチオエート基を含有するヌクレオチドは、元素状ヨウ素、およびモル過剰のアルコールに暴露することによって、非酵素的に除去されることが好ましく、前記アルコールは、エタノール（もっとも好ましい）、イソプロパノール、ならびにC1またはC2炭素原子に電子求引性部分を含有するそれらの誘導体、たとえば、ペルフルオロエタノール、ペルクロロエタノール、ペルブロモエタノール、2-フルオロエタノール、2-クロロエタノール、2-ブロモエタノール、ペルフルオロイソプロピルアルコール、ペルクロロイソプロピルアルコール、ペルブロモイソプロピルアルコール、2-フルオロイソプロピルアルコール、2-クロロイソプロピルアルコール、および2-ブロモイソプロピルアルコールから選択される。好ましくは、ヌクレオチドは、元素状ヨウ素およびエタノールを含有する混合物に暴露されるが、このエタノールはモル過剰に存在する。好ましくは、混合物は元素状ヨウ素およびエタノールを、1(ヨウ素)：80(エタノール)から1(ヨウ素)：500(エタノール)のモル比で含有するが、より好ましくは1：120から1：240、そしてもっとも好ましくは1：160から1：180である。このような比率で、ホスホロチオエートヌクレオチドの加水分解が起こるが、通常のリン酸骨格の加水分解は実質的に回避される。また、ホスホロチオエート基は、ヨウ素およびエタノールに、好ましくはpH 8-9.5、さらにより好ましくはpH 8.8-9.1で、温度は65-75℃、好ましくは70℃で暴露される。こうした条件下で、上記の標準的なヌクレオチドの存在が、適合末端領域からのヌクレオチドの除去を妨げないことが現在判明している。これが、本発明のもう1つの有意な利点であるのは、適合末端領域内に限られた数の上記の標準的なヌクレオチドを分散させることが可能になるからである。
【００４３】
Blanusa et al, Analytical Biochemistry 2010, 141-146は、ホスホロチオエートに基づくリガーゼ非依存性遺伝子クローニング法を記載する。その方法は、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを非酵素的に除去してベクターおよび挿入断片の適合粘着末端を作製することによるものである。著者らは、そこで検討される方法が定方向タンパク質進化、およびハイスループットスクリーニング系の開発に適用可能であることを記載している。しかしながら、その文書は、3つ以上の断片を結合して高効率で形質転換し、さまざまな核酸のクローン化ライブラリーを作製することができるとは明記も示唆もしていない。また、上記のVroomおよびWangの文献を考慮すると、当業者は、5個以上のニックを含有するライゲートされない核酸が、たとえばしばらく後に形質転換するための保存といった操作に対して、標準的な実験条件下で十分安定であると、合理的に予想することはできないであろう。
【００４４】
本発明の核酸連結法は、所与の核酸を改変して、たとえば前記核酸の変異体の機能を調べることにより前記核酸の機能を検討するために特に有用である。したがって、本発明によって、核酸変異法も与えられ、その方法は
a) 鋳型核酸を提供し、鋳型核酸の鋳型セクションを増幅するためのプライマーを用意するステップであって、その1つもしくはすべてのプライマーが非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドを有する、前記ステップ、
b) 核酸断片を得るために鋳型核酸の鋳型セクションを増幅するステップ、
c) 少なくとも2つの核酸断片を得るためにステップa)およびb)を繰り返すステップ、
d) ステップc)の核酸断片に対して上記核酸連結法を実施し、ステップc)で核酸断片が2つしか得られない場合には、少なくとも1つの追加の核酸断片を導入するステップ
を含んでなる。
【００４５】
上記のように、本発明の連結法は、1つもしくは複数の所与の核酸の、多数の変異体を作製するために、または核酸セグメントを組み合わせたり並べ替えたりするために、特に有用である。連結法の好ましい使用、ならびに本発明の変異法の追加的ステップの好ましい使用もまた、以後、本明細書および実施例で説明することとする。
【００４６】
ステップa)で与えられる、非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドを含有するプライマーは、本発明の連結法の適合末端逆ストランドに対応する。プライマーは、それぞれの鋳型核酸に対して塩基対のミスマッチを含まないことが好ましい。しかしながら、プライマーは、非酵素的除去用のヌクレオチド（好ましくは上記のようなホスホロチオエートヌクレオチド）を含有する5'末端部分、および非酵素的除去用のヌクレオチドを含まない隣接する3'末端部分からなることもありうる。このような場合、5'末端部分は、本発明の連結法のステップa)による適合末端の逆ストランドに対応する。この5'末端部分は鋳型核酸に対して有意な相同性を有していてもよいが、必ずしもそうである必要はない；その代わり、プライマーの3'末端部分は、核酸断片が得られるように上記ステップb)で増幅するために、鋳型核酸とハイブリダイズするよう選択される。好ましくは、この3'末端部分は、少なくとも15ヌクレオチドの長さを有するが、さらにより好ましくは18-35ヌクレオチドであり、もっとも好ましくは少なくとも20ヌクレオチドの長さを有する。
【００４７】
本発明の連結および変異法は、1つもしくは複数の鋳型核酸に関係する断片を有する新規核酸の作製を可能にする。変異法の上記ステップc)で同一の核酸断片を得るために同一プライマーを使用することは、一般に可能である。しかしながら、好ましくは、プライマーは、上記ステップc)でさまざまな核酸断片をもたらすように選択される。これは好ましくは、(a)鋳型核酸の異なる位置とハイブリダイズするプライマーを使用すること、または(b)鋳型核酸の同一位置とハイブリダイズするプライマーを使用するが、そのプライマーの核酸塩基配列が互いに異なっていること、または(c)異なる鋳型核酸を使用すること、または(d)異なる鋳型核酸、およびそれぞれの鋳型核酸とハイブリダイズするプライマーを使用するが、そのハイブリダイゼーションが1つもしくは複数の塩基のミスマッチを含んでいること、または(e)によって達成される。
【００４８】
変異体(a)の利点は、本発明の方法で使用する核酸の数が比較的少ないことである。たとえば、1つの鋳型核酸から調節エレメントおよび遺伝子配列をコピーするようにプライマーを選択することができるが、この調節エレメントは鋳型核酸のそれぞれの遺伝子に影響を及ぼさない。そこで本発明の方法は、ベクター断片、調節エレメント含有断片、および遺伝子含有断片を連結して、その遺伝子を連結された核酸において調節エレメントの制御下におくことができる。したがって、本発明は、所与の鋳型核酸の各部分を並べ替えることを可能にする；こうした再配置の好ましい目的は以下に記載する。
【００４９】
変異性をさらに高めるために、同一の鋳型ストランドおよび位置にハイブリダイズする第1および第2の核酸断片に対する、変異体(b)のプライマーは、異なる核酸塩基配列を有していてもよい。したがって、いくつかの位置で当該鋳型部分とは異なる核酸鋳型部分のコピーを作製することが可能である。これは、たとえば点変異のライブラリーを作製するのに有用である。当然、鋳型の異なる部分とハイブリダイズする第1および第2の核酸断片に対するプライマーを使用することによって、変異体(a)および(b)を組み合わせることができるが、このハイブリダイゼーションは1つもしくは複数の塩基のミスマッチを含む。
【００５０】
変異体(c)によって、異なる鋳型核酸を使用して、第1および第2の（またはそれ以上の）核酸断片が調製される。鋳型に応じて、プライマーの核酸塩基配列は、同一であってもよく、たとえばその場合、そのようなプライマーは保存された配列のような、同一の、もしくは類似性の高い配列と結合する。この場合、断片はまだ、鋳型配列におけるプライマーハイブリダイゼーション部分の間の相違に起因する、異なる核酸塩基配列を有していてもよい。また、変異体(c)にしたがって、第1および第2の断片に対するプライマー配列は、それらを配列相同性の低い鋳型部分にミスマッチなしにハイブリダイズさせることができるように、互いに異なっていてもよい。異なる鋳型の使用は、たとえば、異種核酸部分を組み合わせることを可能にする。また、たとえば核酸配列の一部分を、その部分の両端をコピーした断片を作製することによって置き換えること、ならびに、当該部分の置き換え断片として機能すべき第3の断片を提供することが可能である。本発明にしたがって断片が連結されると、その結果得られる核酸産物は、置き換えられる部分の代わりに第3の断片を含有することになる。
【００５１】
変異体(d)によれば、異なる配列を有する第1および第2の断片に対するプライマーを使用することも可能であって、たとえばこれらのプライマーを相同性の非常に低い鋳型部分とハイブリダイズさせ、または上記の点変異のような追加の差異を導入することができる。
【００５２】
したがって、本発明の連結法は、少なくとも1つの点変異により鋳型とは異なっている、連結された核酸産物を作製することを可能にする。その1つまたは複数の点変異は、本発明の変異法のステップa)でプライマーに対応する部分に存在してもよい。この点変異の位置が好ましいのは、それに応じて変異したプライマーを合成しやすいからである。また、連結された核酸産物は、鋳型に対して2つ以上の点変異を含んでいてもよく、1つもしくは複数の断片が、最終的な連結核酸産物に1つもしくは複数の点変異を提供する。これは、鋳型の変異体のライブラリーを作製するために特に好ましく、この鋳型の2つ以上の位置が鋳型と比べて変異している。たとえば、連結された核酸産物は、翻訳されると、2つ以上のアミノ酸配列位置で互いに異なるタンパク質をもたらす、種々の産物の混合物の形をとることができる。したがって、断片の適合末端の核酸塩基配列を選ぶことによって、異なる断片種、すなわちわずかな位置でのみ互いに異なっている断片、の組み合わせを可能にすると同時に、断片の、確定した鎖の関係性を維持することができる。
【００５３】
それに加えて、変異法のステップa)で使用されるプライマーに対応する部分以外に、点変異を導入することができる。たとえば、増幅ステップb)の中で標準的でない核酸塩基を有するヌクレオチドを使用することによって、または増幅ステップb)の後の化学修飾によって、追加的変異を導入することができる。
【００５４】
本発明の連結法は、配列セクションの順序が鋳型と異なる、連結された核酸産物を作製することも可能にする。たとえば、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションによって、対応する断片の順序が逆転するか、そうでなければ、鋳型核酸の対応するセクションの順序と異なるような核酸塩基配列を有するように、プライマーを選択することができる。同様に、本発明は、配列セクションの方向が鋳型と異なる、連結された核酸を作製することができる。
【００５５】
連結された核酸産物は、配列セクションの数が鋳型と異なることもある。たとえば、断片の適合末端は、鋳型もしくは基準の核酸内で中断する断片によって相互に分離されているセクションを連結するように選択することができる。そうした変異はたとえば、イントロンの欠失のために好ましい。また、追加のセグメントを、鋳型核酸の中で互いに隣接するセクションの間に入れることができる。また、連結された核酸産物は、セクションの繰り返しを含んでいることで鋳型と異なっていてもよい。セクションの繰り返しの数は、鎖の関係性を維持するように適合末端の核酸塩基配列を適切に選択することによって、コントロールすることができる。その一方で、セグメント（または2つ以上の断片を連結した中間産物）がそれ自体に適合するようにセグメントのそれぞれの適合末端を選択することによって、ランダムな数のセクションの繰り返しを達成することができ、セグメントの際限のない反復が可能となる。
【００５６】
また、上記のように、本発明の変異および連結法は、転写および/または翻訳に影響を及ぼす部位への、核酸セグメントの、機能的な連鎖をもたらすことができる。そのような方法が好ましいのは、たとえば、選択された遺伝子の発現を転写および/または翻訳調節メカニズムによって制御することが求められている場合であって、選択された遺伝子は、あらかじめ選択された条件下で形質転換細胞において、スイッチをオンおよび/またはオフにすることができる。1つの好ましい方法は、1つもしくは複数の選択された遺伝子を、lacリプレッサーエレメントの制御下において、形質転換細胞をIPTGに暴露することで選択された遺伝子の転写および翻訳を選択的に可能にすることである。また、リボソーム結合部位もしくは他のオペレーター結合エレメントも、要望通り核酸もしくは遺伝子に結合させることができると考えられ、たとえば、タンパク質タグ（例、His-Tag、myc-Tag、HA-Tag、FLAG-Tag、TAP-Tag）、タンパク質融合リンカー（例、Ala(n)リンカー）、または細胞局在のためのシグナル配列を導入することができる。さらに考えられる修飾はコード核酸産物におけるイントロンの導入である。本発明にしたがって、(a)選択された核酸断片に機能しうるように連結することができる、または(b)変異させることができる、追加的な、転写および/または翻訳に影響を及ぼす部位は、アクチベーターまたはリプレッサー結合部位、5'-UTR領域、リボスイッチ、およびターミネーター領域である。
【００５７】
本発明の変異および/または連結法を使用して、転写および/または翻訳された配列セクションの、順序、および/または数、および/または長さが鋳型または基準の核酸と異なる、連結された核酸産物を作製することもできる。本発明の方法を使用する利点および手段は、それに応じて上記で説明した。
【００５８】
本発明の核酸セグメントを組み合わせることによって、転写および/または翻訳のための、新規の、または変異した、核酸配列を作製することができる。したがって、本発明は、たとえば上記の手段のいずれかを用いて、新規のタンパク質（たとえば、温度、pH、プロテアーゼ、および/または有機溶媒に関して異なる安定性を有するタンパク質、または異なる生理学的性質、たとえば、基質特異性および/または代謝回転、阻害剤特異性および/または感受性、活性化剤感受性および/または感受性を有するタンパク質、または、たとえば、細胞局在シグナルを含有することによって、異なる細胞輸送特性を有するタンパク質、または、たとえば、上記のようにHisタグもしくは他のタグを含有することによって、精製特性を有するタンパク質）、および核酸（たとえば、アンチセンスRNA）を作製するための、驚くほど迅速で確実であるが面倒ではない方法を提供する。より詳細には、本発明の変異および連結法は、下記の1つ以上を改変することを可能にする：
1つもしくは複数のエクソンのヌクレオチド配列、
1つもしくは複数のイントロンのヌクレオチド配列、
当該コード領域のヌクレオチド配列（たとえば、標的生物のコドン選択に応じて配列を最適化するため）、エクソンの数および/または順序、1つもしくは複数のイントロンの欠失、1つもしくは複数のイントロンの、1つもしくは複数の他のイントロンによる置き換え、
核酸上のコード領域の距離、たとえばキメラタンパク質を作製するために2つ以上のあらかじめ別々に転写されたコード領域を融合することによる、
核酸の構成、たとえば、オペロンを生じるように2つ以上のコード核酸セグメントを含有する転写核酸を作製するため、
核酸の調節、たとえば、プロモーターもしくは他の転写因子結合部位の位置および/または配列、および/または転写ターミネーターの位置および/または配列、たとえば、コード核酸セグメントをプロモーターおよび/またはターミネーターエレメントに機能しうるように連結することによって発現カセットを作製するためであって、このプロモーターはオペロンの転写および/または翻訳を調節するように、構成的に活性、誘導可能、または抑制可能であり、この発現カセットは転写および/または翻訳に影響を及ぼすエレメントを追加して含有してもよい、
核酸セグメントの他の機能、たとえばマトリックスもしくは足場付着部位、制限エンドヌクレアーゼ結合部位、複製開始点、パッケージングシグナル配列の位置および/または配列、
1つもしくは複数のタンパク質のアミノ酸配列、たとえば、タンパク質分解酵素切断部位、細胞局在シグナル、グリコシル化部位、ドメインおよびフィールディング構造を追加、修飾、または除去することによる。
【００５９】
このような修飾は、本発明にしたがって、(a)核酸断片を定められた順序で連結することにより、決められた通りに行うことができ、この1つもしくは複数の核酸断片は、適宜、上記のように1つもしくは複数の鋳型核酸に基づいて作製されていてもよいが、(b)本発明の組換えおよび/またはシャフリング法に関して、下記に、より詳細に記載するように、さまざまに異なる核酸からなるライブラリーを作製するために、そうした核酸断片を事実上ランダムに連結することによって無作為に行うこともできる。さまざまに異なる核酸は、たとえば、異なる細胞型もしくは生物などのコード核酸セグメントのアイソフォームもしくは相同型を含むことができる。したがって、本発明は、代謝経路の遺伝子クラスターのライブラリーを作製することも可能にする。
【００６０】
本発明の方法は、核酸組換え技術、より詳細にはシャフリング技術、そして具体的にはDNAシャフリングに特に適している。一般に、そうした技術は、鋳型核酸を酵素的に断片化して核酸断片を得るステップ、オーバーラップ・エクステンションPCR法にしたがって核酸ポリメラーゼ、通常はDNAポリメラーゼによって一本鎖核酸断片を増幅するステップ、ならびに、最終的に、1つの挿入断片をベクターに挿入するために完全な核酸を増幅するステップを含む。本発明は、以下のステップを含んでなる核酸組換え法を提供することによって、この技術のいくつかの欠点を回避する：
a)一組の核酸セクションおよびプライマーを、前記セクションを増幅するために選択するステップであって、このプライマーが上記の非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドを含んでいる、前記ステップ、
b) 非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドを含有する、一組の対応する核酸断片を得るために、前記セクションを増幅するステップ、
c) 本発明の連結法によって、ステップb)で得られた断片、および必要に応じてベクター断片を連結するステップ、
d) 好ましくは下記のように、ステップc)で得られた連結核酸で形質転換するステップ。
【００６１】
本発明の組換えおよびシャフリング法は、形質転換の前に、連結された核酸断片を最終的に核酸増幅またはライゲーションする必要性をなくす。また、断片は個別に調製することができるので、制限酵素処理によってその場で調製する必要はない。したがって、求める断片を電気泳動ゲルから単離するのに必要となるような損失なしに、決められた量の求める核酸断片を得ることは、非常に容易である。本発明のもう1つの利点は、上記のように、プライマーを適切に選択することによって、そのプライマーは本発明の連結法の適合末端をもたらすのであるが、選択された断片セットについて考えられる組み合わせの数を制限することができる。また、適合末端の長さはかなり短く、具体的には10から18ヌクレオチドであり、好ましくは11から14ヌクレオチドとすることができるので、断片の組み合わせの可能な範囲は、実用的な目的のためにほとんど制限されないが、それは特に、適合末端がハイブリッド形成条件下で1、2、または3個以上の塩基のミスマッチを含んでいてもよいからである。
【００６２】
本発明の核酸組換えもしくはシャフリング法は、好ましくは本発明のDNAシャフリング法の形で、エクソン、核酸の保存されたセクション、タンパク質ドメイン、ヘアピンループなどの核酸ドメイン、調節エレメント、ホメオドメイン、および相同遺伝子の組換えもしくはシャフリングに特に有用である。組換えもしくはシャフリング法は、相同性とほとんど無関係であり、用語のいかなる実用的定義によっても、組換えもしくはシャフリングを行うべき断片の数によって制限されない。その方法は、シャッフルされない野生型配列を低率で含む、大規模なライブラリーの作製を可能にする。
【００６３】
本発明の核酸組換えまたはシャフリング法はまた、2つ以上の遺伝子または発現ユニットからなる遺伝子クラスターまたは経路の全体の組換えまたはシャフリングに使用することができると考えられる。発現ユニットは、1つもしくは複数の制御配列に、機能しうるように連結されたコード領域からなる。
【００６４】
また、上記のように、本発明の連結法、ならびに場合によっては変異法を、形質転換のための連結核酸の調製に使用することができることは特に有利である。したがって、本発明によれば、次のステップを含んでなる形質転換法も与えられる：
a) 上記の核酸連結法を行うステップであって、場合によっては本発明の核酸変異法のステップも含む、前記ステップ、ならびに
b) ステップa)で得られた連結された核酸によって標的細胞を形質転換するステップ。
【００６５】
上記のように、本発明の連結法のステップc)で得られた、連結された核酸を、事前に核酸増幅もしくはライゲーションステップを行う必要なしに、直接、標的細胞の形質転換に使用できることは本発明の特別な利点である。本発明の方法はそれによって、アーティファクトを取り込む可能性があり形質転換効率を下げる可能性のある、2つのステップを取り除く。したがって、本発明の形質転換法は、モル核酸当たり多数の形質転換体を作製するのに特に有用である。本発明はそれによって、下記のステップを含んでなる、クローニングライブラリーを作製するための方法を提供する：
a) さまざまに異なる一連の核酸を得るために本発明の核酸変異法を実施するステップ、ならびに
b) ステップa)で得られた核酸を用いて標的細胞のセットを形質転換するステップ。
【００６６】
本発明の「形質転換」または「形質転換する」という用語は、原核細胞の遺伝物質の改変に限定されない。それどころか、その用語は、あらゆる種類の細胞、すなわち核酸の複製を行う能力を有する閉ざされたコンパートメントへの、核酸の導入を意味するので、形質導入およびトランスフェクションとしても知られている方法も含んでいる。したがって、本発明の形質転換法は、原核細胞および真核細胞への核酸の導入を可能にする。好ましい細胞は、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、シュードモナス属（Pseudomonas）、ザントモナス属（Xanthomonas）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、リーシュマニア属（Leishmania）、ストレプトミセス属（Streptomyces）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パトリス（Pichia pastoris）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pompe）、アオカビ属（Penicillum）、アスペルギルス属（Aspergillus）、トリコデルマ属（Trichoderma）およびチャイニーズハムスター卵巣細胞からなる一群の細胞から選択される。
【００６７】
形質転換は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、熱ショック形質転換、プロトプラスト形質転換（たとえば、Chang et al., Molec. gen. Genet. 1979(168), 111-115）、リポフェクション、粒子ベースの形質転換（たとえば、GeneGun(遺伝子銃)）、トランスフェクション、形質導入によって、達成されることが好ましい。
【００６８】
本発明の連結法によって連結された1つもしくは複数の核酸を使用する本発明の形質転換法は、有利なことに、μg核酸あたり、好ましくはDNAあたりの、形質転換体コロニー数で評価されるように、高い形質転換効率を達成する。実施例で説明されるように、高い形質転換効率は、5-6 kbの市販のベクター、および0.1-0.5 kbの5つの挿入断片を連結することによって達成することができる。形質転換効率が非常に高いので、シャッフルされた挿入断片のライブラリーも容易に調製することができる。
【００６９】
形質転換のために、本発明の連結法で使用される断片の1つがベクターを形成すること、または2つ以上の断片が組み合わされてベクターを形成することが好ましい。上記のように、本発明のベクターは、標的細胞内で当該核酸の複製を可能にする核酸である。したがって、連結された核酸は、ベクターおよび1つもしくは複数の追加の「挿入断片」核酸を含んでいる。
【００７０】
本発明の連結法は、少なくとも3つの核酸断片を連結するための本発明のキットを用いて容易に実施することができるが、このキットは、
- 各断片について、非酵素的除去用に構成されたヌクレオチドを有する、2つの増幅プライマー、および
- 1つもしくは複数の非酵素的ヌクレオチド除去剤、好ましくはヨウ素、エタノール、またはそれらの混合物
を含んでなる。
【００７１】
また、本発明にしたがって、コンピュータープログラム製品が与えられるが、これは機械解釈可能なデータキャリアを含んでおり、このデータキャリアは、核酸取扱装置が読んで解釈するとその装置に本発明の方法を実行させる、命令集合を含んでいる。より詳細には、その命令は、核酸操作の装置に、選定された時間にヨウ素およびエタノールを、核酸を含有する1つもしくは複数の容器に分注させること（この核酸はホスホロチオエート基を含有するヌクレオチドを含んでいる）、および/または、PCR法に有用な加熱および冷却プロトコールを実行することによって核酸を増幅させることができる。
【００７２】
（実施例）
本発明は下記で、本発明の選ばれた態様を際立たせる図および実施例を用いて、さらに説明される。実施例は、請求の範囲、または詳細な説明の他の部分の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００７３】
5つのコドンの同時部位飽和のための"OmniChange"配列非依存的方法
図1：OmniChangeは4つのステップを含む：ステップ1. NNK飽和コドンを有する5つのDNA断片（*で示す）の増幅。ステップ2. 相補的な一本鎖5'オーバーハングを生じるための化学的切断。ステップ3. 10個のDNAニックを含有する完全な環状プラスミドへの全断片のハイブリダイゼーション。ステップ4. 大腸菌（E. coli）BL21-Gold（DE3）lacIQ1における形質転換およびニック修復。
【００７４】
図2：OmniChangeで作製されたマルチサイト飽和ライブラリーからの48ランダムクローンに対する野生型遺伝子（鋳型DNA）の部分的配列アラインメント。飽和の標的となる5つの部位を白で強調している。矢印は、塩基対における標的位置の間の距離を示す。白い縦列の中のコドンの比較は、5つの独立した位置をOmniChangeで同時に飽和させることによって得られる多様性を示す。
【００７５】
図3: OmniChangeの開発に使用されたオリゴヌクレオチド。小文字はホスホロチオエート結合を示し、リバースプライマーの下線を付したヌクレオチドは、NNK縮重コドンを強調する。
【００７６】
図4: OmniChange実験後ランダムに選抜された48個のクローン由来の5つの集中的なNNKランダム化位置のコドン多様性に関する概括。グレーで強調されたコドンは、それぞれの位置で2回以上出現する。
【００７７】
酵素、試薬、およびオリゴヌクレオチド
使用した試薬はすべて分析グレードのものとし、Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)およびAppliChem (Darmstadt, Germany)より購入した。酵素は、New England Biolabs (Frankfurt, Germany)より入手し、dNTPは、Fermentas (St.Leon-Rot, Germany)から購入した。オリゴヌクレオチドは、塩類を含まない状態で、Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Germany)によりHPLC純度で合成された。供給業者の推奨にしたがって、すべてのオリゴヌクレオチドは、Milli-Q水で希釈して終濃度100μMとした。本研究に使用したすべてのオリゴヌクレオチドを図3にまとめている。
【００７８】
細胞株およびベクター
エルシニア・モラレッティイ（Yersinia mollaretii）由来の1.3 kbフィターゼ（ホスファターゼ）遺伝子（エルシニア・インターメディア（Yersinia intermedia）由来のフィターゼ遺伝子と81％の配列同一性（BLAST）；GenBank: DQ986462.1）をクローニングし、pALXtreme-5bという名称のpET-22b(+)-由来Novagenベクター（Darmstadt, Germany） (2.1 kb)で発現させた（Blanusa, M. et al., (2010) Phosphorothioate-based ligase-independent gene cloning (PLICing): An enzyme-free and sequence-independent cloning method. Anal. Biochem., 406, 141-146）。pALXtreme-5bからの遺伝子発現は、lacIリプレッサー遺伝子を細菌ゲノム内に組み込む必要があるため、宿主系として大腸菌（Escherichia coli）BL21-Gold (DE3) lacIQ1を必要とする（Blanusa, M. et al., (2010) Phosphorothioate-based ligase-independent gene cloning (PLICing): An enzyme-free and sequence-independent cloning method. Anal. Biochem., 406, 141-146）。化学的コンピテント大腸菌（E. coli）BL21-Gold (DE3) lacIQ1細胞は、標準のプロトコール（Inoue,H. et al., (1990) High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene, 96, 23-28）にしたがって調製し、確定した形質転換効率は1.4 x 106 cfu/μg pUC19であった。
【００７９】
変異原性オリゴヌクレオチドデザイン
同時に飽和する5つのコドンのためにPCRプライマーとして10個のオリゴヌクレオチドをデザインした（図3）。NNKコドンを有するリバースプライマーは、PCR産物の収率を最適化するために、StratageneのQuikChange部位特異的変異誘発キットマニュアル (La Jolla, CA, USA)にしたがってデザインされた。それに加えて、すべてのオリゴヌクレオチドは、5'末端に、少なくとも12個のホスホロチオエートヌクレオチド結合を有し、ヨウ素切断後にDNAハイブリダイゼーションのための一本鎖オーバーハングを生じる（Blanusa, M. et al., (2010) Phosphorothioate-based ligase-independent gene cloning (PLICing): An enzyme-free and sequence-independent cloning method. Anal. Biochem., 406, 141-146）（図3）。
【００８０】
DNA断片のPCR増幅
QIAGEN QIAprep Spin Miniprepキット (Hilden, Germany)を用いて標準的なプラスミド分離を行った。標準のPCRの設定は、1x Phusion DNAポリメラーゼバッファー、0.2 mM dNTP混合物、0.4μM 断片に特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマー（図3）、5 U Phusion DNAポリメラーゼ、および20 ng DNA鋳型を最終容量50μl中に含むものとした。すべてのPCR増幅は、Thin-wall PCRチューブ（Sarstedt, Nuembrecht, Germany）を用いてEppendorf Mastercycler proS (Hamburg, Germany)で行った。標的コドンに対するPCRは、それぞれの断片サンプル混合物を94℃に3分間あらかじめ加熱した後、94℃にて30秒、55℃にて30秒、および72℃にて30秒（断片B、C、D、およびE）または1.5分（断片A2-Vector-A1）を25サイクルで行った。最終的な伸長反応のために、フィルアップサイクルを72℃にて1分間（断片B、C、D、およびE）または3分間（断片A2-Vector-A1）行った。PCR産物を2 % (w/v) Tris-酢酸-EDTA (TAE)アガロースゲル上で分離して、それぞれのPCR産物のサイズを確認した（Maniatis,T. et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1-545）。メチル化された鋳型DNAの特異的分解は、1μl（20 U）のDpnIを各PCRサンプルに添加することによって行われた。インキュベーション（37℃にて4時間）後、Macherey-Nagel NucleoSpin ExtractII DNA精製キット（Dueren, Germany）を用いてPCR産物を精製し、50μl Milli-Q水に溶出した。精製されたPCR産物は、Nanodrop 1000 紫外分光光度計（NanoDrop Technologies, DE, Wilmington, USA）を用いて定量した。
【００８１】
ヨウ素切断、DNA断片アニーリング、および形質転換
すべてのステップは、特に明記しない限り、氷上で行った。精製された断片A2-Vector-A1、ならびに断片B、C、D、およびEは、それぞれMilli-Q水を用いて0.02 pmol/μlまたは0.11 pmol/μlに希釈した。PCR産物は、PLICingクローニング技術（Blanusa, M. et al., (2010) Phosphorothioate-based ligase-independent gene cloning (PLICing): An enzyme-free and sequence-independent cloning method. Anal. Biochem., 406, 141-146）に以下の変更を加えた方法にしたがって切断した：PCRチューブ内で各PCR断片の4μlを2μlヨウ素切断バッファー（0.25 M Tris-HCl pH 9.0; 30 mMヨウ素; 30 % (v/v)エタノール）と混合し、サーモサイクラー内でインキュベートし（70℃；5分）、最後に氷上に保持した（5分）。切断した断片のアニーリングは、最初に6μl断片B切断混合物を6μlの断片A2-Vector-A1切断混合物に添加することによって、少しずつ行った。2つの断片のハイブリダイゼーションは、20℃にて5分間行った。その後、断片C、D、およびEの切断混合物を添加して、ハイブリッド形成させ、環状の、ニックを有するB-C-D-E-A2-Vector-A1構築物を得た。混合物をさらに5分間氷上に保持した。A2-Vector-A1断片のセルフハイブリダイゼーションは、A2-Vector-A1断片を単独で、ニックのあるB-C-D-E-A2-Vector-A1構築物と同様に調製することによって、確かめられた。後者の品質管理において、断片B、C、D、およびEは、それぞれ4μlのMilli-Q水で置き換えられた。最後に、双方のハイブリダイゼーション混合物4μlを、熱ショックにより、それ以上の精製ステップなしに、100μl化学的コンピテント大腸菌（E. coli）BL21-Gold (DE3) lacIQ1細胞に形質転換した（Hanahan,D.et al., (1991) Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria. Methods Enzymol., 204, 63-113）。形質転換混合物を寒天プレート（LB；100μg/mlアンピシリン）上に塗抹して一晩インキュベートした。
【００８２】
プラスミド構築物のコロニーPCRおよび配列決定
5個の飽和コドンを有するB-C-D-E-A2-Vector-A1構築物への、5つの断片の正確な構築（図1）を確認するためにコロニーPCRを行った。20個のコロニーを無作為に選んでLB液体培地（2 ml、100μg/mlアンピシリン）に入れ、一晩増殖させた（14時間、37℃、250 rpm）。培養液（10μl）を溶解させて（50μl Milli-Q水、95℃、15分）、遠心分離し（13000 g、2分）、5μlの透明な上清をコロニーPCR増幅のための鋳型DNAとした（1x Taq DNAポリメラーゼバッファー、0.2 mM dNTP混合物、0.4μMフォワードプライマーおよびリバースプライマー（図3）、5 U Taq DNAポリメラーゼ； A2-Vector-A1断片増幅用と同じサイクリングプログラム）。各PCRサイクルの伸長時間は、フィルアップ反応では1分および3分に延ばした。PCRサンプルは、1％（w/v）TAEアガロースゲル上で分離し、各PCR産物のサイズを確認した。GATC Biotech (Konstanz, Germany)で配列決定を行い、配列分析はClone Manager 9 Professional Editionソフトウェア (Scientific & Educational Software, Cary, NC, USA)を用いて行った。
【００８３】
マイクロタイタープレートでのフィターゼ活性測定
フィターゼ活性測定のために、ランダムに選択したコロニーを寒天プレートから200μl酢酸ナトリウム (NaAc)バッファー (pH 5.5、250 mM酢酸ナトリウム；1 mM CaCl2；0.01 % (w/v) Tween20)を入れたGreiner Bio-One 96ウェルマイクロタイタープレート(Greiner, Frickenhausen, Germany)に移した。酵素反応は、リン酸4-メチルウンベリフェリル（1 mM）を含有する50μl NaAcバッファーの添加によって開始した。フィターゼ活性は、Infinite M 1000プレートリーダー(Tecan, Groeding, Austria, 37°C for 15 min)を用いて、4-メチルウンベリフェロン形成に起因する蛍光の増加（λex: 360 nm; λem:  460 nm）を追うことによって測定した。もとの（鋳型の）フィターゼ遺伝子を有するコロニー、および空のpALXtreme-5bベクターだけを有するコロニーを基準として使用した。
【００８４】
結果
OmniChangeマルチサイト飽和法は、4つのステップからなる：ステップ1. NNKコドンを含有するオリゴヌクレオチドを用いたPCRによる断片作製、ステップ2. 相補的な5'オーバーハングを生じるためのDNA切断反応、ステップ3. DNAハイブリダイゼーションによる構築、ならびにステップ4. 大腸菌（E. coli）BL21-Gold（DE3）lacIQ1における形質転換およびニック修復（図1）。
【００８５】
エルシニア・モラレッティイ（Yersinia mollaretii）由来フィターゼのアミノ酸位置G31、T77、K139、G187、およびV298をNNK飽和のために選択した。この5つのコドンは、ランダムな多様性を生じ、耐熱性の向上について選別するために、配列飽和変異誘発法(Wong,T.S. et al., (2004) Sequence saturation mutagenesis (SeSaM): a novel method for directed evolution. Nucleic Acids Res., 32, e26)を用いて、定方向フィターゼ進化実験で同定された（未発表の結果）。
【００８６】
断片作製のためのオリゴヌクレオチド（ステップ1）は、一般的な配列スキーム5’-(nt)*12-NNK-(nt)12-3’を用いてデザインすることができる。QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kitマニュアル (Stratagene, La Jolla, CA, USA)にしたがって、オリゴヌクレオチドデザイン（TmおよびGC含量）をさらに最適化した。5'末端の12個のヌクレオチド（nt*）は、普通のホスホジエステル結合で連結された、3’末端の残りの12個の最小で望ましいヌクレオチド、およびそれぞれのリバースプライマー中のNNKコドンとは対照的に、ホスホロチオジエステル結合（Eckstein,F. et al., (1989) Phosphorothioates in molecular biology. Trends Biochem. Sci., 14, 97-100）で連結される（図3）。5つのDNA断片A2-Vector-A1、B、C、D、およびEのPCR増幅の成功（ステップ1）は、アガロースゲル電気泳動により検証された（A2-Vector-A1: 2571 bp; B: 160 bp; C: 199 bp; D: 157 bp およびE: 345 bp）。DpnI消化、ヨウ素切断（ステップ2）、ハイブリダイゼーション（ステップ3）、および大腸菌（E. coli）BL21-Gold (DE3) lacIQ1への形質転換（ステップ4）の後、1つの寒天プレート上で392個のコロニーが得られ、5つのDNA断片について104 cfu/μgの形質転換効率と想定される（セルフメイドコンピテントセルの形質転換効率：1.4 x 106 cfu/μg pUC19）。十分な量のコロニー（> 1000コロニー/μgハイブリッドDNA）が得られるまで、断片の調製、切断、およびハイブリダイゼーションでさまざまな最適化ステップを行った。
【００８７】
以下の「コントロール実験」は、開発されたOmniChange変異誘発法の多用途性およびロバストネスを評価するために行った。第1に、起こりうるベクター断片セルフハイブリダイゼーション（DNA-断片 A2-Vector-A1）を判定し、同一条件下での全変異体数の約1％に相当する4つのコロニーを生じた。第2に、全長プラスミドおよび遺伝子の、ニック修復および構築を、20個のランダムに選抜したクローンのDNA制限酵素分析およびコロニーPCRによって検証し、完全な鋳型DNA情報がOmniChangeによって100％の効率で構築されていることが明らかになった。さらに、5個のランダムに選抜したクローンを配列決定したが、5カ所のランダム化位置はすべてユニークで、対応する野生型配列とは異なっていた。最後のコントロールとして、リン酸4-メチルウンベリフェリル検出系(Garrett,J.B.et al., (2004) Enhancing the thermal tolerance and gastric performance of a microbial phytase for use as a phosphate-mobilizing mo)を用いて、20個のランダムに選抜したコロニーのフィターゼ活性を測定した。驚くべきことに、20個の変異体はすべて、高い変異荷重にもかかわらず、構築されたプラスミドからの機能的発現を示す、少なくとも、低いが検出可能な活性を示した。後者のコントロールは、10個までのニックなら大腸菌（E. coli）BL21-Gold (DE3) lacIQ1でライゲートすることができ、作製された相補末端（12 ntオーバーハング）は形質転換条件に耐えることができることを示す。
【００８８】
詳細な統計分析のために、48個のランダムに選抜されたクローンを順方向および逆方向の配列決定に供した。野生型配列との多重配列アラインメントから、5つのコドンすべてが完全に飽和され、どのクローンももとの配列を保有していないことが確認された（図2および図4）。分析した48個の配列から、1つの野生型コドンがアミノ酸位置G31およびG187にそれぞれ見いだされ、2つの野生型コドンがV298位に見いだされた。アミノ酸T77位には、1つの野生型コドンも認められなかったが、それはNNKがそれぞれの野生型コドンを提供しないという事実による（Firth,A.E. et al., (2008) GLUE-IT and PEDEL-AA: new programmes for analyzing protein diversity in randomized libraries. Nucleic Acids Res., 36, W281-285）。驚くべきことに、NNKはランダム導入コドンとしてAAAを提供しないのに、配列決定後にK139位に1つの野生型コドンが同定された（クローン8）（図2）。この場合については、オリゴヌクレオチド合成は必ずしも完全にエラーなしに行われるわけではなく、Phusionポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性もPCR中にミスマッチを修正しなかったと考える必要がある。NNK縮重は、それぞれの位置で、すべての標準アミノ酸をカバーすると同時に3つの終止コドンのうち2つを回避する、多様な32の異なるコドンを提供する（Reetz,M.T. et al., (2008) Addressing the numbers problem in directed evolution. ChemBioChem, 9, 1797-1804）。G31位では21の異なるコドンが認められたが、わずか48クローンの配列決定後に、起こりうる多様性のすでに65.6％に相当する。他のすべての位置について、さらに高いカバー率を得ることができた：T77（26の個別コドン、81.25％）、K139（24の個別コドン、75％）、G187（27の個別コドン、84.4％）、V298（27の個別コドン、84.4％多様性）（図4）。二本鎖DNAの5'末端からのホスホロチオエート化ヌクレオチドの部位特異的切断は、クローニング技術として開発されたが、切断反応が追加的な変異を引き起こさなかったことが報告されている（Blanusa, M. et al., (2010) Phosphorothioate-based ligase-independent gene cloning (PLICing): An enzyme-free and sequence-independent cloning method. Anal. Biochem., 406, 141-146）。48クローンの配列分析から、切断反応（ステップ2）および断片のハイブリダイゼーション（ステップ3）は追加の点変異を導入することはなく、挿入も欠失も引き起こさないことも示された。
【００８９】
さらに、OmniChangeは、追加的かつ共同的効果を詳細にあらゆる標的位置の組み合わせで検討するために、標的コドンのモジュール式の組み合わせ構築を可能にする。同一セットのオリゴヌクレオチドを用いて、互いに100 bpに満たない距離を有するコドンが標的とされるかどうかを調べるためにD52位を選択した。原理を証明するため、2つのライブラリーが作製された：D52およびT77位を標的とするライブラリー1（プライマーの組み合わせK139Fw/D52Rv （断片C-D-E-A2-Vector-A1）およびT77Fw’/T77Rv (fragment B’)；図3を参照されたい）、ならびにT77、K139、G187、およびV298を標的とするライブラリー2（断片C、D、E、およびA2-Vector-A1-Bを生じる表1のオリゴヌクレオチドの組み合わせ）。2つのライブラリーからランダムに選抜された5つのクローンの配列決定はやはり、他の位置がすべて不変のままであるのに対して、標的コドンがもっぱら飽和されていることを示した（データは示さない）。
【実施例２】
【００９０】
複数のDNA断片を組み合わせて構築するための酵素不要で配列に依存しない方法
図5：4ステップからなるドメイン-PLICingの図解：1) 個々のドメインの増幅、2) クロスオーバー部位に一本鎖オーバーハングを生じるための化学的切断、3) 全DNA断片のワンポット組換えおよびハイブリダイゼーション、ならびに4) 形質転換。
【００９１】
図6：ドメイン-PLICingによる、ランダムに選抜された42クローンのシャフリング結果。各ドメインがどれであるかをDNA配列決定により確認した。全クローンを配列決定順にならべ、各ドメインの起源を色で明示する：白:phyY；灰色;appA；黒:phyX。
【００９２】
図7：ドメイン-PLICingの開発に使用されたオリゴヌクレオチド。小文字は、ホスホロチオエート結合を示し、相補的5'オーバーハングのために変異させる必要があるヌクレオチドには下線を付す。
【００９３】
酵素、試薬、およびオリゴヌクレオチド
すべての化学物質は、Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)、Serva (Heidelberg, Germany)またはAppliChem (Darmstadt, Germany)より購入したが、特に明記しない限り分析グレードとした。酵素および対応バッファーはFermentas (St. Leon-Rot, Germany)より入手し、ヌクレオチドはすべて、HPLC精製され、塩類を含まない形でEurofins MWG Operon (Ebersberg, Germany)より購入した。オリゴヌクレオチドはMilli-Q水で希釈して、終濃度100μMとした。本研究に使用したすべてのオリゴヌクレオチドを図7にまとめている。
【００９４】
菌株、遺伝子、およびベクター
3つのフィターゼ、大腸菌（Escherichia coli）(GenBank: AF537219)のappA、エルシニア・モラレッティイ（Yersinia mollaretii）(GeneBank: NZ_AALD02000002)のphyY、およびハフニア属の一種（Hafnia sp.）LU11047 (WO2011048046, SeqID 12)のphyXは、合成遺伝子として注文した（GENEART AG, Regensburg）。発現ベクターpET22b(+)はNovagen (Merck KGaA, Darmstadt, Germany)から入手し、大腸菌（E. coli）BL21-Gold (DE3)はInvitrogen (Karlsruhe, Germany)より購入した。1.4 x 106 cfu/μg pUC19の実測形質転換効率を有する化学的コンピテント大腸菌（E. coli）BL21-Gold (DE3)細胞は、公表された手順（Inoue et al., 1990）に従って調製された。
【００９５】
フィターゼ遺伝子、個別のフィターゼドメイン、およびベクターpET22b(+)のPCR増幅
DNA分離はすべて、QIAGEN QIAprep Spin Miniprep Kit (Hilden, Germany)を用いて行った。ドメイン-PLICingはほとんど配列非依存的であるが、それは、DNA断片を組み換えるためのクロスオーバーポイントとして、短いひと続きの4つの同一アミノ酸しか必要でないからである。3つのモデルフィターゼにおいて、4つのクロスオーバーポイントが多重アラインメントで同定され、サイズの異なる5種類のタンパク質ドメインを生じさせる（ドメインA：約50 AS；ドメインB：約105 AS；ドメインC：約155 AS；ドメインD：約50 AS；およびドメイン E：約55 AS）。クロスオーバーポイントは、タンパク質レベルでは同一であっても、遺伝暗号の縮重に起因して遺伝子レベルでは多様性を示す。したがって、全体で35個のサイレント変異が、全ドメインのPCR増幅のためのオリゴヌクレオチドデザインの際に、30個のプライマーのうち19個に導入されたが、それはドメイン-PLICingも、それぞれのクロスオーバーポイントで遺伝子レベルでの配列同一性を要求するからである（図7を参照されたい）。すべてのPCRは、thin-wall PCRチューブ（Sarstedt, Nuembrecht, Germany）を用いてEppendorf Gradient Cycler (Darmstadt, Germany)内で、最終容量50μlで実施した。サブクローニング目的のPCRセットアップは、1x PfuSバッファー、0.2 mM dNTP混合物、400 nM フォワードおよびリバースプライマー（appA: P1およびP2; phyY: P3およびP4; phyX: P5およびP6; 図7を参照されたい）、5U PfuS DNAポリメラーゼ、および20 ng 鋳型DNAからなるものとした。サイクルは、94℃にて2分間の最初の変性で開始した。その後、35サイクル（94℃、30秒；55℃、35秒；68℃、50秒（フィターゼ）または4分間(pET22b(+)）および1回のフィルアップサイクル（68℃、10分）を行った。ヨウ素切断の前に、PCR産物を、DpnIで消化して鋳型DNAを除去し、PCR精製キット（Macherey-Nagel, Dueren, Germany）を用いてメーカーの説明書にしたがって精製し、NanoDrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)を用いて定量した。個別のフィターゼドメインを増幅するため、PCRセットアップは、1x Taqバッファー、0.2 mM dNTP混合物、400 nMフォワードおよびリバースプライマー（図7を参照されたい）、5 U Taq DNAポリメラーゼ、および40 ngのそれぞれのpET22b(+)-ベクター鋳型を含有するものとした。サイクルは、94℃にて2分間の最初の変性で開始した。その後、35サイクル（94℃、30秒；55℃、30秒；72℃、7分（ドメインA1、B1、およびC1、これらはpET22b(+)-ベクター配列を含む；図5を参照されたい）または1分（全ドメイン2 - 5；図5を参照されたい））および1回のフィルアップサイクル（72℃、5分）を行った。得られたPCR産物はまず、DpnI消化して鋳型DNAを除去し、その後精製して最後に定量した（NanoDrop）。DNAサンプルを5μlに分割し、次に使用するまで-20℃で保存した。標準プロトコール（Maniatis et al., 1982）にしたがってアガロース-TAEゲル電気泳動を実施し、増幅された遺伝子、個別のドメイン、またはベクターの存在およびサイズを確認した。わずかに変更を加えたサブクローニングPCRプロトコールにしたがって、配列決定前にコロニーPCRを実施した：混合原液を調製し、20μlずつPCRチューブに分注した。コロニーを直接、滅菌ピペットチップを用いてマスタープレートからPCRチューブに移した。94℃での最初の変性時間を5分に増やして、確実に細胞溶解させ、その後、DNA断片サイズ測定のために、得られたPCR産物の5μlをアガロースゲル電気泳動で分析した。
【００９６】
ヨウ素処理、DNA断片ハイブリダイゼーション、および形質転換
組換えを目的として、ヨウ素処理およびDNA断片ハイブリダイゼーション法は、Blanusa et al., 2010によって報告されたホスホロチオエート切断の原理によって、複数のDNA断片を組み換えるように最適化された。最終的に、4μl DNAサンプル（0.03 - 0.6 pmol）、0.5μl切断バッファー（0.5M Tris-HCl pH 9.0）、0.3μlヨウ素原液（100 mMヨウ素、99％エタノール中）、および0.2μlのMilli-Q水が、DNA切断に最適であると判明した。サンプルをPCRチューブ内でインキュベートし（70℃；5分；Eppendorf Mastercycler）、次に使用するまで氷上に保持した。作製されたDNA断片を次に、それ以上精製することなしに、ピペットで混合することによってハイブリダイズさせた。フィターゼのサブクローニングのために、0.15 pmolの切断されたpET22b(+)、および0.2 pmolの切断されたappA、0.22 pmol phyYまたは0.25 pmol phyXを混合した。得られた混合物を、形質転換に先立って5分間、室温でインキュベートした。
【００９７】
ドメイン組換え実験中のハイブリダイゼーションのために、一定のモル比1:4（12個の断片：A2-A5、B2-B5、およびC2-C5がそれぞれ0.36 pmolで0.17 - 0.45 kBであるのに対して、断片A1、B1、およびC1はそれぞれ0.09 pmolで、サイズはいずれも約5.4 kBであって、線状化pET22b(+)-ベクターを含んでいる）が、効率的なハイブリダイゼーションを確保するのに最適であると判明した（図5）。0.09 pmolおよび0.36 pmolのモル比はまた、非常に良好な組換え、および形質転換結果をもたらした（結果の項を参照されたい）。15個のDNA断片（3つのフィターゼ遺伝子のそれぞれの5つのドメイン）はすべて氷上にプールし（図5）、その後、加熱して（70℃；3分；Eppendorf Gradient Cycler (Darmstadt, Germany)）、ピペッティングの順番に起因する優先的ハイブリダイゼーションを回避した。室温でのインキュベーション(20℃、5分)後、3μlのハイブリダイゼーション反応液を、それ以上精製またはライゲーションするステップなしに、標準プロトコール（Hanahan et al., 1991）にしたがって、化学的コンピテント大腸菌（E. coli）BL21-Gold (DE3)細胞（50μl）に入れて形質転換した。形質転換混合物を、アンピシリン(100 mg/ml)添加Luria Bertani (LB)培地の寒天プレート上に塗抹し、一晩インキュベートした（37℃）。
【００９８】
DNA配列決定
シャッフルされたフィターゼドメインを有するpET22b(+)-ベクターを保有するコロニーを直接、96ウェルマスタープレートに移し、アンピシリン(100 mg/ml)添加LB培地（100μl）中で37℃にて一晩増殖させて、保存した（グリセロール（100μl；50容量％）添加後-80℃）。固形寒天の入った96ウェルプレート（GATC Biotech (Konstanz, Germany)）に、シャッフルされたフィターゼキメラを有するpET22b(+)-ベクターを保有するクローンを接種し、それを、配列決定のためにGATC Biotech (Konstanz, Germany)宛てに送った（配列決定オリゴヌクレオチド：P33およびP34;図7）。すべての配列決定データを分析するためにClone Manager 9 Professional Edition ソフトウェア(Scientific & Educational Software, Cary, NC, USA)を使用した。
【００９９】
結果
ドメイン-PLICing法を開発および検証するためのモデル遺伝子として使用するために、3つのフィターゼ、大腸菌（Escherichia coli）のappA（A）、エルシニア・モラレッティイ（Yersinia mollaretii）のphyY（B）、およびハフニア属の一種（Hafnia sp.）LU11047のphyX（C）を選択した。クロスオーバーポイントの数を標的遺伝子内に4つに設定したのは、遺伝子シャフリング法のコンセプトの証明のほとんどが、1から4までのクロスオーバーポイントについてなされてきたからである。ドメイン-PLICingは4つのステップを含む：1) 5'末端に相補的ホスホロチオエートヌクレオチドを有するプライマーを用いた、PCRによるDNA断片の増幅、2)一本鎖オーバーハング（12 nt）を作製するためのヨウ素/エタノール溶液中でのPCR産物の化学的切断、3)室温でのハイブリダイゼーションによる全長キメラ遺伝子へのランダムDNA断片構築、ならびに4) それ以上のDNA精製も、酵素的DNAライゲーションステップもなしでの、コンピテント宿主細胞への形質転換（図5）。
【０１００】
ドメイン-PLICingによるDNA断片の組み合わせ構築
ドメインシャフリング実験の調製ステップとして、PLICingによって、すべてのフィターゼをpET22b(+)-ベクターにサブクローニングした。遺伝子のN末端部分を伴うベクター骨格は、3つのフィターゼ遺伝子に対するドメインA1、B1、およびC1と見なされる（図5）。3つのフィターゼタンパク質の配列アラインメントを用いて、組換えのための4つのクロスオーバー部位を選択した。クロスオーバー部位となりうる位置のわずか4つの保存されたアミノ酸が、5'末端に12個のホスホロチオエートヌクレオチドを有する、遺伝子特異的な相補的オリゴヌクレオチドをデザインするのに必要である（図7）。終止コドンの近くに追加のクロスオーバー部位を1つ選び、3つのフィターゼについて全体で5つのタンパク質ドメインをシャッフルした（図5）。19のケースでは、PCRプライマー内のサイレント変異の組み込みが、効率的なハイブリダイゼーションのための相補的な一本鎖5'オーバーハングを確実にするのに必要であった（図7）。ドメインシャフリングのための15個のDNA断片は、材料および方法の項に記載のように、並行して作製して精製した（図5、ステップ1）。ドメイン-PLICingは、単一の（変異した）遺伝子のためのクローニング技術として開発された、ホスホロチオエートに基づくリガーゼ非依存的遺伝子クローニング（PLICing）に関する記載のように（Blanusa et al., 2010）、複数のDNA断片の一本鎖5'末端とベクター骨格の特異的なハイブリダイゼーションに依存する。ドメイン-PLICingのために、このようなオーバーハングが、アルカリ性エタノール溶液中のヨウ素によるホスホロチオエート結合の化学的切断によって作製された（図5、ステップ2）。そうした結合は、12個の連続したホスホロチオエート化ヌクレオチドを有するホスホロチオエート化プライマーを用いたので、各DNA断片のPCR増幅中にあらかじめDNA断片中に組み込まれた（図7）。5断片を方向づけて構築するための主要な課題は、完全なプラスミドサイズとなるまで全DNA断片を方向づけてハイブリダイズすることを可能にする温熱インキュベーションプロトコールであった（図5、ステップ3）。温熱インキュベーションプロトコールは、形質転換条件下でも、5つの断片および10個のニックDNA位置からなるフィターゼキメラの効率的な構築を可能にする。後者は、70℃の温熱インキュベーション（3分；PCR-Cycler）、20℃に冷却（5分；PCR-Cycler）、そしてその後、形質転換が1100クローンを生じるまで氷上でインキュベートすることによって、達成された（形質転換効率：0.51 x 104 cfu/μg DNA、「材料および方法」を参照されたい）。
【０１０１】
キメラフィターゼライブラリーの配列決定
第1の対照として、25クローンをランダムに選抜し、コロニーPCRを行った。25例のすべてで、PCR産物として適正なサイズの全長遺伝子が得られた（「材料および方法」を参照されたい）。こうした結果に励まされ、42クローンをランダムに選抜し、２つのDNA鎖を配列決定した。図6は、キメラフィターゼ遺伝子のさまざまなパターンを示す。42個の遺伝子はすべて、5つの予想されたドメインを正しい順序で含有しており、方向付けられたハイブリダイゼーションによる効率的な構築をテストした。配列決定したクローンのいずれにおいても、ドメインは欠けておらず、2回以上出現しなかった。ドメイン1、2、4、および5（ドメイン1：appA、18；phyY、12；phyX、12/ドメイン2：appA、19；phyY、13；phyX、10/ドメイン4：appA、14；phyY、14；phyX、14/ドメイン5：appA、14；phyY、15；phyX、13）の分析中に、3つのフィターゼ遺伝子のどのDNA断片も優先的な出現は検出されなかった。phyX-ドメイン3が理想的な場合の14回ではなくて7回しか出現しなかったので、フィターゼA由来のphyX-ドメイン3は、キメラライブラリーにおいて十分に提示されていないとみなすことができる。42個の配列決定されたクローンのうち、5個は組み換えられておらず、フィターゼ遺伝子appA(3x)およびphy(2x)をコードしていた。後者はおそらく、オーバーハングを作製するための化学的切断の前の、鋳型DNAの不完全なDpnI消化に起因する可能性がある。さらに、2つの同一のキメラフィターゼ遺伝子が2回出現した。興味深いことに、5カ所のクロスオーバー部位の近くには変異もフレームシフトも見られなかったが、そのことはキメラライブラリーの全体的な質を低下させると思われる。キメラ遺伝子内でトランジション変異が見られたが、これは使用したtaq DNAポリメラーゼのエラー率2.2 x 10-5に相当する。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【国際調査報告】
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2014513972.tif 000015
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