(57)【要約】  修飾されたヒト酸性アルファ−グルコシダーゼポリペプチド、ならびに糖原貯蔵障害を治療するための修飾されたヒト酸性アルファ−グルコシダーゼを製造および使用する方法を提供する。【選択図】  図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端７０ｋＤａプロセシング部位で、またはその近くで修飾を有するヒト酸性アルファ−グルコシダーゼまたはその触媒活性断片からなるポリペプチド。
【請求項２】
Ｎ末端７０ｋＤａのプロセシング部位で、またはその近くで修飾を有するヒト酸性アルファ−グルコシダーゼまたはその触媒活性断片を含むポリペプチド。
【請求項３】
修飾がＮ末端７０ｋＤａプロセシング部位で、またはその近くで高められた疎水性である、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
修飾が配列番号１の位置１９５〜２０９に相当する１つまたはそれ以上のアミノ酸にある、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
修飾が配列番号１の位置２００〜２０４に相当する１つまたはそれ以上のアミノ酸にある、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
修飾が配列番号１の位置２０１に相当するアミノ酸にある、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
修飾が、
ａ）より疎水性のアミノ酸による１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、または
ｂ）１つまたはそれ以上の疎水性アミノ酸の挿入
を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
断片が７０ｋＤａ、７６ｋＤａ、８２ｋＤａ、９５ｋＤａ、またはヒト酸性アルファ−グルコシダーゼの他の任意の触媒活性断片から選択される、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ポリペプチドが受容体標的配列をさらに含む、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
受容体標的配列がＩＧＦ２である、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ポリペプチドが配列番号１の少なくとも５００個のアミノ酸に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ポリペプチドが配列番号１の少なくとも５００個のアミノ酸に対して少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
ポリペプチドが配列番号１の少なくとも５００個のアミノ酸に対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
修飾されたポリペプチドが、未修飾のヒト酸性アルファ−グルコシダーゼと比較したときに、より迅速なリソソームプロテアーゼプロセシングを示す、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
ポリペプチドの少なくとも５０％が、投与２０時間以内に７０ｋＤａ形態にタンパク分解プロセシングされる、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
実質的にすべてのポリペプチドが、投与５５時間以内に７０ｋＤａ形態にタンパク分解プロセシングされる、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
ポリペプチドが、少なくとも１つのマンノース−６−リン酸を含むオリゴ糖に複合化される、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項から選択されるポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１９】
請求項１８に記載の核酸により安定にトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２０】
宿主細胞が、請求項１８に記載の核酸によってコードされたポリペプチドを分泌することができる、請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１または２に記載のポリペプチドの有効量を、必要とする患者に投与することを含む、組織中のグリコーゲン蓄積を低減または予防する方法。
【請求項２２】
患者が糖原病を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
糖原病がポンペ病である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１または２に記載のポリペプチドの治療有効量を、必要とする患者に投与することを含む、糖原病を治療する方法。
【請求項２５】
糖原病がポンペ病である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
糖原病の治療に使用するための請求項１〜１７のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２７】
ポリペプチドが凍結乾燥された、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
組織中のグリコーゲン蓄積を低減または予防する薬剤の製造における請求項１〜１７のいずれか１項に記載されたポリペプチドの使用。
【請求項２９】
グリコーゲン蓄積が糖原病に起因する、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
糖原病がポンペ病である、請求項２９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１１年４月２２日に出願された特許文献１の優先権の利益を請求し、それは全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、一般に修飾されたヒト酸性アルファ−グルコシダーゼおよび糖原病の治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ポンペ病は、ＩＩ型糖原病（ＧＳＤ）および酸性マルターゼ欠損症、リソソーム酵素酸性アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）の欠損によって生じる常染色体性劣性代謝性ミオパチーである。ＧＡＡは、リソソーム中でグリコーゲンをグルコースに加水分解するエキソ−１，４および１，６−α−グルコシダーゼである。ＧＡＡの欠損は、リソソーム中のグリコーゲン蓄積を招き、呼吸器、心臓および骨格の筋肉に進行性損傷を生じる。この疾患は、通常、１〜２歳までに死に至る、急速進行性の乳児期の経過のものから、小児および成人では顕著な罹病率および早期の死亡率をもたらす、より遅い進行性であり、かつ不均一な経過のものまである。非特許文献１；非特許文献２。
【０００４】
ＧＡＡの生合成、標的化、およびリソソームプロセシング（processing）に関与するステップは、複雑である。ヒトＧＡＡの一次翻訳産物は、７つのコンセンサスＮ−グリコシル化部位を含む９５２個のアミノ酸ポリペプチドである。非特許文献３。ＧＡＡ上のＮ−グリカンは、複雑かつ高マンノースタイプのグリカンを含み、そのうちのいくつかはマンノース６−リン酸によって修飾されている。ＧＡＡは、カチオン非依存性のマンノース６−リン酸受容体を介してリソソームに対して標的設定される。リソソーム中で、その酵素は、プロテアーゼおよびグリコシダーゼによってさらにプロセシングを受け、グリコーゲンクリアランスを高めることができる成熟ペプチドを生じる。
【０００５】
図１は、ＧＡＡプロセシング経路の概略図を示す。Moreland et al., 2005。典型的に、ＧＡＡは、プロセシング中に４つまでの切断事象を受ける。最初に、一次ＧＡＡ翻訳産物をアミノ酸５７あたりで切断して１００〜１１０ｋＤａの見かけの分子量を有する前駆体を形成する。次に、この１００〜１１０ｋＤａの前駆体をアミノ酸１１３および１２２あたりで切断して３．９ｋＤａ（ａａ７８〜１１３）および９５ｋＤａ（ａａ１２２〜９５２）の部分を形成する。次いで、この９５ｋＤａのポリペプチドをアミノ酸７８１および７９２あたりで切断して７６ｋＤａ（ａａ１２２〜７８１）および１９．４ｋＤａ（ａａ７９２〜９５２）の断片を得てもよい。この７６ｋＤａの種は、１９．４ｋＤａおよび３．９ｋＤａのポリペプチドと結合したままである。さらなるタンパク質分解切断は、この７６ｋＤａを、１９．４、１０．４、および３．９ｋＤａのポリペプチドと結合したままである７０ｋＤａ（ａａ２０４〜７８１）の種に変換する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許仮出願第６１／４７８,３３６号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Hirschhorn RR, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 3: 3389-3420 (2001, McGraw-Hill)
【非特許文献２】Van der Ploeg and Reuser, Lancet 372: 1342-1351 (2008)
【非特許文献３】Moreland et al., J. Biol. Chem. 280: 6780-6791 (2005)
【非特許文献４】Moreland et al., 2005; Wisselaar et al., J. Biol. Chem. 268: 2223-2231 (1993)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ポンペ病を治療するための現在のヒト療法は、組換えヒトＧＡＡ（例えば、ＭＹＯＺＹＭＥＴＭ）の投与を含む。組換えヒトＧＡＡは、患者においてグリコーゲン蓄積を効果的に低減するにもかかわらず、投与時に７０ｋＤａの形態に完全にプロセシングされない。プロテアーゼプロセシングの結果として、グリコーゲンに対するＧＡＡの親和性をかなり高めることができるため（非特許文献４）、組換えヒトＧＡＡプロセシングの速度を高めることにより、用量の低下および／またはＧＡＡ療法の適用頻度の減少を含む、ＧＡＡの治療有効性を改善することができた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明者らは、本明細書において未修飾のヒトＧＡＡより迅速にプロセシングされる修飾されたＧＡＡポリペプチドを記述する。
【００１０】
特定の実施態様は、Ｎ末端７０ｋＤａのプロセシング部位で、またはその近くで修飾を有するヒト酸性アルファ−グルコシダーゼまたはその触媒活性断片を含む。いくつかの実施態様では、Ｎ末端７０ｋＤａのプロセシング部位で、またはその近くで修飾を有する、ヒト酸性アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）またはその触媒活性断片を含むポリペプチドを提供する。触媒活性断片は、７０ｋＤａ、７６ｋＤａ、８２ｋＤａ、９５ｋＤａまたは任意の他の触媒活性断片から選択してもよい。特定の実施態様において、ポリペプチドは、受容体標的配列をさらに含む。いくつかの実施態様において、受容体標的配列は、ＩＧＦ２配列である。
【００１１】
特定の場合において、修飾は、Ｎ末端７０ｋＤａのプロセシング部位で、またはその近くで疎水性を高める。いくつかの場合において、ポリペプチドは、配列番号１の位置１９５〜２０９に相当する１つまたはそれ以上のアミノ酸で修飾される。さらなる実施態様において、修飾は、配列番号１のアミノ酸位置２００〜２０４に相当する１つまたはそれ以上のアミノ酸にある。特定の実施態様において、修飾は、配列番号１の位置２０１に相当するアミノ酸にある。さらなる実施態様において、修飾は、より疎水性のアミノ酸による１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換である。別の実施態様において、修飾は、１つまたはそれ以上の疎水性アミノ酸の挿入である。なおさらなる実施態様において、疎水性アミノ酸は、ロイシンおよびチロシンから選択される。
【００１２】
特定の実施態様において、ポリペプチドは、配列番号１の少なくとも５００個のアミノ酸に対して少なくとも８０％の同一性を有する。いくつかの場合において、ポリペプチドは、配列番号１の少なくとも５００個のアミノ酸に対して少なくとも９０％の同一性を有する。別の場合において、ポリペプチドは、配列番号１の少なくとも５００個のアミノ酸に対して少なくとも９５％の同一性を有する。
【００１３】
特定の実施態様において、未修飾のヒト酸性アルファ−グルコシダーゼと比較したときに、ポリペプチドは、より迅速なリソソームのプロテアーゼプロセシングを示す。いくつかの実施態様において、ポリペプチドの少なくとも５０％は、投与２０時間以内に７０ｋＤａ形態にタンパク質分解プロセシングされる。別の実施態様において、実質的にすべてのポリペプチドは、投与５５時間以内に７０ｋＤａ形態にタンパク分解プロセシングされる。
【００１４】
いくつかの実施態様は、少なくとも１つのマンノース−６−リン酸を含むオリゴ糖に複合化された（conjugated）ポリペプチドを含む。
【００１５】
特定の実施態様では、修飾されたＧＡＡポリペプチドをコードする核酸を提供する。さらなる実施態様では、その核酸を用いて安定にトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。さらなる実施態様において、その宿主細胞は、修飾されたＧＡＡを分泌することができる。
【００１６】
特定の実施態様では、本明細書に記載するポリペプチドの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、組織中のグリコーゲン蓄積を低減または予防する方法を提供する。さらなる実施態様において、患者は、糖原病を有する。なおさらなる実施態様において、糖原病は、ポンペ病である。
【００１７】
別の実施態様では、修飾されたＧＡＡの治療有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、糖原病を治療する方法を提供する。さらなる実施態様において、糖原病は、ポンペ病である。別の実施態様では、糖原病の治療に使用するための、本明細書に記載する修飾されたＧＡＡを含む医薬組成物を提供する。
【００１８】
いくつかの実施態様では、ポリペプチドを凍結乾燥する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】天然のヒトＧＡＡの成熟のためのモデルを示す図である。
【図２】組換えＧＡＡ（レーン１）、ヒト胎盤ＧＡＡ（レーン２）およびウシ精巣ＧＡＡ（レーン３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図３】Ａは、マウス、ハムスター、ウシ、およびウズラからのＧＡＡを用いたアミノ酸１９７から２０６までのヒトＧＡＡのアラインメントを示す。Ｂは、異なるプロセシングのＧＡＡを比較するウェスタンブロットの結果を示す。レーン１は、胎盤から精製されたヒトＧＡＡを示す。レーン２および３は、野生型ヒトＧＡＡ構築物でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞から精製した対照ＧＡＡである。レーン４〜７は、アミノ酸２０１のヒスチジンを以下のアミノ酸：アルギニン（レーン４）、ロイシン（レーン５）、チロシン（レーン６）、およびリシン（レーン７）に変えたヒトＧＡＡ構築物でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞から精製した修飾されたＧＡＡである。
【図４】安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞中のｒｈＧＡＡ（Ｈ２０１Ｌ）およびｒｈＧＡＡ（ＷＴ）の生合成を示す。
【図５】ｒｈＧＡＡ（ＷＴ）およびｒｈＧＡＡ（Ｈ２０１Ｌ）のポンペ線維芽細胞の取り込みおよびプロセシングを示す。
【図６】抗ＧＡＡ１８３−２００（図６Ａ）およびモノクローナル抗体ＧＡＡ１（図６Ｂ）を用いて調べたウェスタンブロットの結果を示す。
【図７】ｒｈＧＡＡ（Ｈ２０１Ｌ）についてのプロセシングモデルの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本開示の理解を助けるために、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義を、明細書を通じて提供する。
【００２１】
本明細書に用いるように、用語「Ｎ末端７０ｋＤａのプロセシング部位」とは、配列番号１（天然のヒトＧＡＡ）のアミノ酸２００〜２０４に相当する位置でＧＡＡを切断するタンパク質分解酵素の認識部位のことをいう。
【００２２】
本明細書に用いるように、用語「修飾されたＧＡＡ」とは、Ｎ末端７０ｋＤａのプロセシング部位で、またはその近くで、天然のヒトＧＡＡ中に見いだされるアミノ酸と異なる少なくとも１つのアミノ酸を有するヒトＧＡＡおよびＧＡＡ変異体のことをいう。また、修飾されたＧＡＡは、本説明において「修飾されたヒトＧＡＡ」とも称する。「修飾されたＧＡＡ」という用語は、シグナル配列を含む完全長ＧＡＡポリペプチドと同様に細胞から分泌された部分的にプロセシングされたＧＡＡポリペプチドを含む。
【００２３】
本明細書に用いるように、単数形で表されたものは、その内容が明らかに別のものを指していなければ、複数の対象を含む。したがって、たとえば、「化合物」を含む方法についての言及は、２つまたはそれ以上の化合物の混合物を含む。用語「または」は、その内容が明らかに別のものを指していなければ、一般に「および／または」を含むその意味において用いる。
【００２４】
本明細書を通して、タンパク質およびポリペプチドのサイズは、「ｋＤａ」単位で示す。これらのサイズがＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの電気泳動アッセイにおけるポリペプチドの見掛けの分子量に基づくことは、当業者に明らかである（たとえば、Moreland et al., 2005を参照のこと）。正確な分子量は、グリコシル化状態および他のポリペプチドとの結合などの他のパラメーターに左右され、当業者に周知のさまざまな方法によって決定することができる。
【００２５】
本明細書に引用されたすべての文献は、それらの全体として参照によって組み込まれる。参照により組み込まれた刊行物および特許または特許出願が、本明細書に含まれる本発明と矛盾する場合、本明細書は、任意の矛盾材料に優先する。
【００２６】
Ｉ．酸性アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）
上記のように、ＧＡＡは、グリコーゲンのクリアランスに関与するリソソーム酵素である。ＧＡＡという用語は、このタンパク質の完全長、野生型の両方の形態、ならびに他の触媒活性変異体を包含する。触媒活性ＧＡＡおよびＧＡＡ変異体は、グリコーゲンに対する触媒的活性を少なくとも保持することになる。天然のヒトＧＡＡの多くの変異体は、当業者に知られており、切断されたもの、他のポリペプチドに融合もしくは結合したもの、そのアミノ酸配列が変化したもの、または組換え的にもしくは化学的に変化したものが含まれる。たとえば、活性を失うことなく、天然のヒトＧＡＡ（配列番号１）から少なくとも７７個のＮ末端アミノ酸を除去できることが知られている。Moreland et al., 2005。さらに、複合体（conjugates）および融合タンパク質が記載されている。いくつかの実施態様では、ＧＡＡまたはＧＡＡの触媒活性断片は、受容体標的配列に結合または融合することができる。いくつかの場合において、受容体標的配列は、細胞受容体によって認識できる。たとえば、米国特許第７，７８５，８５６に記載されたように、切断型ＧＡＡをＩＧＦ２ドメインに融合してもよく、それは全体として参照により組み込まれる。また、ＧＡＡを変化させて合成部分、炭化水素部分および／または増加したレベルのマンノース−６−リン酸を加えたこともある。たとえば、増加したレベルのマンノース−６−リン酸を含む修飾された炭化水素部分を有するリソソーム酵素が、米国特許第７，００１，９９４号；同第７，７２３，２９６号；同第７，７８６，２７７号；米国特許公開第２０１０／０１７３３８５号；およびＰＣＴ公開２０１０／０７５０１０号に記載されており、それらはそれらの全体として参照により組み込まれる。
【００２７】
特定の実施態様において、本明細書に記載したＧＡＡは、ヒトＧＡＡまたはＧＡＡ変異体に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する。いくつかの場合において、ＧＡＡは、配列番号１の少なくとも５００個、５５０個、６００個、６５０個、７００個、７５０個、８００個、８５０個、または９００個のアミノ酸に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する。
【００２８】
このセクションに記載した任意の触媒活性なヒトＧＡＡを、本明細書に記載する修飾されたＧＡＡの塩基配列として用いることができる。どのＧＡＡ変異体が本発明における使用に適しているかは、当業者に明らかである。塩基ＧＡＡ配列が天然のヒトＧＡＡと比較して異なる長さまたはグリコシル化パターンを有する場合、プロセシングされたポリペプチドは、それに応じて変化したサイズを有することになる。
【００２９】
ＩＩ．修飾されたＧＡＡ
さまざまな実施態様では、Ｎ末端７０ｋＤａのプロセシング部位で、またはその近くで修飾された、修飾されたヒトＧＡＡを含むポリペプチドを提供する。Ｎ末端７０ｋＤａのプロセシング部位「の近くの」領域には、Ｎ末端７０ｋＤａのプロセシング部位の上流または下流の５つまでのアミノ酸が含まれる。特定の実施態様において、Ｎ末端７０ｋＤａのプロセシング部位の、またはその近くの領域には、配列番号１の位置１９５〜２０９に相当するアミノ酸が含まれる。
【００３０】
本明細書に記載する修飾されたＧＡＡは、未修飾のＧＡＡよりもさらに迅速にプロセシングされる。特定の実施態様において、修飾されたＧＡＡは、Ｎ末端７０ｋＤａのプロセシング部位で、またはその近くで疎水性が高められている。いくつかの実施態様において、修飾されたＧＡＡは、７０ｋＤａの成熟形態へのより速いタンパク質分解プロセシング速度を有する。いくつかの実施態様において、そして出発配列に応じて、修飾されたＧＡＡは、７０ｋＤａの成熟形態の変異体にプロセシングされる。成熟ポリペプチドがさらなるポリペプチド断片と結合したままとなるように、修飾されたＧＡＡがプロセシングされてもよい。特定の実施態様において、修飾されたＧＡＡは、未修飾のＧＡＡと同じ経路を介してプロセシングされる。別の実施態様では、修飾されたＧＡＡは、未修飾のＧＡＡと比較して異なる中間体を介してプロセシングされる。たとえば、修飾された完全長ＧＡＡは、７６ｋＤａもしくは８２ｋＤａの中間体または両方を介してプロセシングされてもよい。修飾されたＧＡＡは、未修飾のＧＡＡと同じプロテアーゼによって認識され、同一または異なる順序でプロセシングされてもよい。
【００３１】
特定の実施態様では、少なくとも１つのアミノ酸をより疎水性のアミノ酸で置換することによってＮ末端７０ｋＤａのプロセシング部位で、またはその近くでＧＡＡを修飾してその疎水性を高める。いくつかの実施態様では、Ｎ末端７０ｋＤａのプロセシング部位の５アミノ酸上流または下流内で置換を行ってもよい。特定の例では、配列番号１の位置１９５〜２０９に相当するアミノ酸のところでアミノ酸置換を行ってもよい。別の場合、配列番号１の位置２００〜２０４に相当するアミノ酸のところでアミノ酸置換を行ってもよい。さらなる実施態様において、修飾されたヒトＧＡＡは、配列番号１のアミノ酸位置２０１に相当する位置で疎水性アミノ酸を含む。いくつかの実施態様において、Ｎ末端７０ｋＤａのプロセシング部位で、またはその近くで１つまたはそれ以上の疎水性アミノ酸を挿入することによってＧＡＡを修飾する。さらなる修飾には、Ｎ末端７０ｋＤａのプロセシング部位の、またはその近くの１つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失が含まれる。
【００３２】
特定の実施態様では、Ｎ末端７０ｋＤａのプロセシング部位の複数の位置で、またはＮ末端７０ｋＤａのプロセシング部位の５アミノ酸以内で疎水性アミノ酸（天然または合成）を含む、修飾されたヒトＧＡＡを提供する。一実施態様において、修飾されたアミノ酸の１つは、配列番号１のアミノ酸２０１に相当する位置にある。
【００３３】
さまざまな実施態様において、疎水性アミノ酸は、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、システインまたはアラニンから選択される。さらなる実施態様において、疎水性アミノ酸は、ロイシンまたはチロシンである。いくつかの実施態様において、修飾されたヒトＧＡＡは、疎水性を示す、合成または非天然のアミノ酸を含む。一般に、置換されたアミノ酸は、野生型アミノ酸よりもより疎水性であるため、Ｎ末端７０ｋＤａのプロセシング部位で、またはその近くで疎水性を高める。
【００３４】
一例となる実施態様において、修飾されたＧＡＡは、配列番号１のアミノ酸２０１に相当する位置でロイシンを有する。別の実施態様において、修飾されたＧＡＡは、配列番号１のアミノ酸２０１に相当する位置でチロシンを有する。
【００３５】
特定の実施態様では、配列番号１の少なくとも５００個、５５０個、６００個、６５０個、７００個、７５０個、８００個、８５０個、または９００個のアミノ酸に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、または９９％の相同性を有する修飾されたヒトＧＡＡであって、修飾されたヒトＧＡＡが、Ｎ末端７０ｋＤａプロセシング部位において、より疎水性のアミノ酸で置換された少なくとも１つのアミノ酸を有するヒトＧＡＡを提供する。
【００３６】
いくつかの実施態様では、修飾されたヒトＧＡＡの少なくとも５０％が、２０、３０、または４０時間以内にリソソーム中で７０ｋＤａ形態にプロセシングされる。なおさらなる実施態様では、修飾されたヒトＧＡＡの実質的にすべてが、５５、６５、または７５時間以内にリソソーム中で７０ｋＤａの形態にプロセシングされる。
【００３７】
特定の実施態様において、本発明の修飾されたヒトＧＡＡは、成熟した７０ｋＤａ形態またはその対応する変異体へのそのより迅速なタンパク質分解プロセシングによって同定することができる。別の実施態様において、本明細書に記載した修飾されたヒトＧＡＡは、天然のヒトＧＡＡのタンパク質分解プロセシング中に産生されない８２ｋＤａの中間体ポリペプチドの産生によって同定することができる。さらなる実施態様において、修飾されたヒトＧＡＡは、未修飾のヒトＧＡＡのタンパク質分解プロセシング中に産生される７６ｋＤａの中間体ポリペプチドの欠如によって同定することができる。
【００３８】
ＩＩＩ．修飾されたＧＡＡの産生
さまざまな実施態様において、修飾されたＧＡＡポリペプチドは、当業者に知られた方法に従って産生させることができる。たとえば、修飾されたＧＡＡをコードする核酸で安定にトランスフェクトされた細胞系統から、修飾されたＧＡＡポリペプチドを発現し、分泌させることができる。適した細胞系統としては、当業者に認められたものの中で、線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、２９３Ｔ細胞、または植物細胞が挙げられる。例となる細胞系統および産生方法は、米国特許第７，３５１，４１０号および同第７，１３８，２６２号；ならびに米国特許公開第２０１０／０１９６３４５号に記載されており、それらはそれらの全体として参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施態様では、修飾されたＧＡＡをコードする核酸を、細胞系統から発現させるための適当なプロモーターおよび調節配列を含むプラスミドまたはベクター中に挿入する。哺乳動物細胞系統における修飾されたＧＡＡの産生に有用なプロモーターには、当業者に認められた多くの他のものの中でｒｐＳ２１およびベータ−アクチンプロモーター（たとえば、米国特許第７,４２３,１３５号を参照のこと）が挙げられる。特定の実施態様では、修飾されたＧＡＡをさらに変化させてグリコシル化のレベルまたはマンノース―６―リン酸を増加または減少させ、それによって分泌および／またはリソソームの標的化を増強する。
【００３９】
ＩＶ．医薬組成物
特定の実施態様において、修飾されたＧＡＡは、賦形剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、安定剤、または賦形剤などの少なくとも１つの添加剤を含む医薬組成物中に存在する。標準医薬製剤技術は、当業者によく知られている（たとえば、2005 Physicians' Desk ReferenceR, Thomson Healthcare: Montvale, NJ, 2004; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Gennado et al., Eds. Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000を参照のこと）。適した医薬添加剤としては、例えば、マンニトール、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、穀粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、および同様のものが挙げられる。特定の実施態様において、医薬組成物は、ｐＨ緩衝試薬および湿潤剤または乳化剤を含んでもよい。さらなる実施態様において、組成物は、防腐剤または安定剤を含んでもよい。
【００４０】
いくつかの実施態様において、修飾されたヒトＧＡＡを含む医薬組成物は、以下：マンニトール、ポリソルベート８０、二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、および一塩基性リン酸ナトリウム一水和物の１つまたはそれ以上をさらに含んでもよい。別の実施態様において、医薬組成物は、２％までのグリシン、２％までのマンニトール、および０．０１％までのポリソルベート８０と共に１０ｍＭヒスチジンｐＨ６．５を含んでもよい。さらなる例となる医薬組成物は、ＰＣＴ公開第２０１０／０７５０１０号に見いだすことができる。
【００４１】
医薬組成物の製剤は、意図する投与経路および他のパラメーターに応じて変化してもよい（たとえば、Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4th ed., APhA Publications, 2003.を参照のこと）。いくつかの実施態様において、修飾されたＧＡＡ組成物は、凍結乾燥されたケークまたは粉末であってもよい。静脈注射による投与では、凍結乾燥された組成物を、例えばSterile Water for Injection, USPを用いて再構成してもよい。別の実施態様において、組成物は、非発熱性滅菌溶液であってもよい。
【００４２】
本明細書に記載した医薬組成物は、単独の活性化合物として修飾されたＧＡＡを含んでもよく、または別の化合物、組成物、もしくは生物学的物質と組み合わせて送達してもよい。また、たとえば、医薬組成物は、ポンペ病および／またはポンペ病もしくはその治療に関連する副作用の治療に有用な１つまたはそれ以上の小さな分子を含んでもよい。いくつかの実施態様において、組成物は、ミグルスタットおよび／または、例えば、米国特許出願公開第２００３／００５０２９９号、同第２００３／０１５３７６８号；同第２００５／０２２２２４４号；もしくは同第２００５／０２６７０９４号に記載された１つもしくはそれ以上の化合物を含んでもよい。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、１つまたはそれ以上の免疫抑制剤、ｍＴＯＲ阻害剤または自己消化阻害剤を含んでもよい。免疫抑制剤の例としては、ラパマイシンおよびベルケードが挙げられる。ラパマイシンは、ｍＴＯＲ阻害剤でもある。
【００４３】
Ｖ．治療方法
いくつかの実施態様では、修飾されたヒトＧＡＡを用いて患者の組織中のグリコーゲン蓄積を低減または予防する。別の実施態様では、修飾されたヒトＧＡＡを用いて糖原病を治療する。さらなる実施態様において、糖原病はポンペ病である。例となる実施態様では、修飾されたＧＡＡは、患者への投与後、続いてリソソーム中で成熟ＧＡＡにプロセシングされる。
【００４４】
本明細書に記載する修飾されたＧＡＡは、任意の適した送達系によって投与してもよく、非経口（皮下、静脈内、頭蓋内、骨髄内、関節内、筋肉内、髄腔内、または腹腔内注射を含む）、経皮的、または経口（たとえば、カプセル剤、懸濁剤または錠剤中）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。一実施態様では、修飾されたＧＡＡを静脈内投与によって送達する。
【００４５】
さらなる実施態様において、修飾されたＧＡＡをコードする核酸を患者に送達することができる。遺伝子療法に適したベクターを用いて核酸を送達してもよい。遺伝子療法の方法の例は、たとえば、米国特許第５，９５２，５１６号；同第６，０６６，６２６号；同第６，０７１，８９０号；および同第６，２８７，８５７号に記載されている。
【００４６】
患者への投与は、単回投与または反復投与で、そしてさまざまな生理学的に許容しうる塩の形態のいずれかで、ならびに／または医薬組成物の一部として許容しうる薬学的担体および／もしくは添加剤と共に行ってもよい。
【００４７】
本明細書に記載した修飾されたＧＡＡ組成物は、治療有効量で投与する。一般に、治療有効量は、被験体の年齢、全身状態および性別、ならびに被験体における医学的状態の重症度に応じて変えてもよい。投与量は、医師によって決定され、必要に応じて、観察された治療効果に合わせて調整してもよい。
【００４８】
本明細書に記載した修飾されたＧＡＡは、たとえば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、もしくはそれ以上の日数ごとの外来診療の場で静脈内注入によって、または、たとえば、毎週、隔週、毎月、もしくは隔月の投与によって投与してもよい。化合物の適当な治療有効量は、治療する臨床医によって選択され、約１μｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇまで、約１０ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで、約２０ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで、そして約２０ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇまでの範囲であってもよい。いくつかの実施態様では、適当な治療用量を、たとえば、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、および１００ｍｇ／ｋｇから選択する。さらに、具体的な投与量の例を、米医薬品便覧（Physicians' Desk Reference(R)）に見いだしてもよい。
【００４９】
いくつかの実施態様において、本方法は、修飾されたヒトＧＡＡを投与し、それによって被験体におけるグリコーゲンクリアランスを、内因性活性と比較して、たとえば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％高めることを含む。いくつかの実施態様において、本方法は、修飾されたヒトＧＡＡを投与し、それによって被験体におけるグリコーゲンクリアランスを、内因性活性と比較して、たとえば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、または１０００倍高めることを含む。高められたグリコーゲンクリアランスは、たとえば、臨床症状の低減によって、または適当な臨床的なもしくは生物学的なアッセイ、例えばリソソームグリコーゲン貯蔵アッセイによって決定してもよい。
【００５０】
特定の実施態様において、修飾されたヒトＧＡＡを含む医薬組成物を用いた患者の治療後の高められたグリコーゲンクリアランスは、たとえば、心筋細胞、骨格筋細胞、または皮膚線維芽細胞中の減少したリソソームのグリコーゲン蓄積の生化学的観察（たとえば、Zhu et al., J. Biol. Chem. 279: 50336-50341 (2004)参照）または組織学的観察によって決定してもよい。また、ＧＡＡ活性は、たとえば、筋生検サンプル中、培養された皮膚線維芽細胞中、リンパ球中、および乾燥血斑中で検定してもよい。乾燥血斑検査は、例えば、Umpathysivam et al., Clin. Chem. 47:1378-1383 (2001) and Li et al., Clin. Chem. 50:1785-1796 (2004)に記載されている。また、ポンペ病の治療は、たとえば、クレアチニンキナーゼの血清レベル、運動機能における増進（たとえば、Alberta Infant Motor Scaleによって評価されるような）、心エコー図によって測定されるような左室重量係数（left ventricular mass index）、および心電図によって測定されるような心臓の電気的活性における変化によって評価してもよい。また、修飾されたヒトＧＡＡを含む医薬組成物の投与により、ポンペ病の１つまたはそれ以上の症状、たとえば心臓肥大、心筋症、日中の傾眠、労作性呼吸困難、成長障害、摂食困難、「だらしなさ（floppiness）」、歩行異常、頭痛、低血圧、臓器巨大症（たとえば、心臓、舌、肝臓の肥大）、脊柱前弯症、平衡感覚の喪失、腰痛、起床時の頭痛、筋力低下、呼吸不全、肩甲骨対称捻転、脊柱側弯症、深部腱反射低下、睡眠時無呼吸、呼吸器感染症に対する感受性、および嘔吐における低減を生じることができる。
【００５１】
特定の実施態様において、本方法は、修飾されたヒトＧＡＡを含む医薬組成物を、１つまたはそれ以上のさらなる治療剤と共に投与することを含む。１つまたはそれ以上のさらなる治療剤は、修飾されたヒトＧＡＡの投与と同時に（合剤として同時投与を含む）、その前に、またはその後に投与してもよい。いくつかの場合において、修飾されたＧＡＡの投与間にさらなる治療剤を投与することができる。たとえば、小分子療法を用いてグリコーゲンの再蓄積を遅らせ、修飾されたＧＡＡの投与頻度を少なくすることができる。
【００５２】
いくつかの実施態様において、本方法は、（上記の修飾されたヒトＧＡＡを用いた治療の前に、その後、またはその間に）解熱剤、抗ヒスタミン剤、および／または免疫抑制剤を用いて被験体を治療することを含む。特定の実施態様において、注入関連の反応を低下させるまたは予防するために、修飾されたヒトＧＡＡを用いた治療の前に、解熱剤、抗ヒスタミン剤、および／または免疫抑制剤を用いて被験体を治療してもよい。たとえば、アセトアミノフェン、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、ジフェンヒドラミン、メトトレキセート、ミコフェノール酸モフェチル、経口ステロイド、またはラパマイシンの１つまたはそれ以上を用いて被験体を前処置してもよい。
【００５３】
いくつかの実施態様において、本方法は、（修飾されたヒトＧＡＡを用いた治療の前に、その後に、またはその間に）糖原貯蔵障害の治療のための小分子療法および遺伝子療法を含む、小分子療法および／または遺伝子療法を用いて被験体を治療することを含む。小分子療法は、ミグルスタットおよび／または、たとえば、米国特許出願第２００３／００５０２９９号、同第２００３／０１５３７６８号；同第２００５／０２２２２４４号；および同第２００５／０２６７０９４号に記載された１つもしくはそれ以上の化合物の投与を含んでもよい。遺伝子療法は、たとえば、米国特許第５，９５２，５１６号；同第６，０６６，６２６号；同第６，０７１，８９０号；および同第６，２８７，８５７号；ならびに米国特許出願公開第２００３／００８７８６８号に記載されたように実施してもよい。
【００５４】
ＶＩ．実施例
以下の実施例は、本開示の説明に役立つが、なんら限定されることはない。
【００５５】
実施例１：物質および方法
Ａ．検定用試薬および物質
コンカナバリンＡ、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦおよびSuperdex 200調製グレードはAmersham Pharmacia Biotech（Piscataway, NJ）から入手した。α−メチルグルコシド（ベンズアミジン）、および４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−グルコシドは、Sigma-Aldrich（Saint Louis, MO）から入手した。他の化学物質は、試薬グレードまたはそれより上のものであり、標準的な供給元からであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、Invitrogen（San Diego, CA）から入手した。ローラーボトルは、Corning（Corning, NY）から入手した。ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、JRH Biosciences（Lenexa, KS）から入手した。ポンペ線維芽細胞（ＧＭ００２４８）は、Coriell Cell Repositories（Camden, NJ）から入手した。
【００５６】
Ｂ．酸性α−グルコシダーゼ活性およびタンパク質アッセイ
前述のように、４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−グルコシダーゼを用いて、酸性グルコシダーゼをマイクロタイタープレートにおいて蛍光定量的に測定した。Oude Elferink et al., Eur. J. Biochem. 139: 489-495 (1984)。タンパク質濃度は、Ｅ1%＝１０と仮定して２８０ｎｍの吸光度によって、またはウシ血清アルブミンで標準化されたMicro-BCAアッセイを用いて推定した。Smith et al., Anal. Biochem. 150: 76-85 (1985)。
【００５７】
Ｃ．ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
還元および非還元サンプルおよび分子量マーカー（Amersham Pharmacia Biotech）を４〜２０％または１０％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに適用した。電気泳動を１５０ボルトで１．５時間実施し、タンパク質をクーマシーブルーまたは銀染色のいずれかにより視覚化した。Blum et al., Electrophoresis 93-99 (1987)。
【００５８】
Ｄ．組換えおよび胎盤ＧＡＡの単離
組換えおよびヒト胎盤ＧＡＡの生成および精製は、以前に記載されたとおりである。Martiniuk et al., Archives of Biochem. and Biophys. 231: 454-460 (1984)；Mutsaers et al., Biochimica et Biophysica Acta 911: 244-251 (1987); Moreland et al., (2005)。
【００５９】
Ｅ．抗体およびウェスタンブロット分析
以前に記載されたとおり（Moreland et al., 2005）、ウサギを、ＫＬＨに結合された合成ペプチドで免疫化した。各ペプチドの配列は、以下のとおりであった：抗ＧＡＡ５７−７４（ＱＱＧＡＳＲＰＧＰＲＤＡＱＡＨＰＧＲ（配列番号２））、抗ＧＡＡ７８−９４（ＶＰＴＱＣＤＶＰＰＮＳＲＦＤＣＡ（配列番号３））、および抗ＧＡＡ１８３−２００（ＩＫＤＰＡＮＲＲＹＥＶＰＬＥＴＰＲＶ（配列番号４））。精製されたヒト胎盤ＧＡＡに対してヤギポリクローナル抗体を生成した。モノクローナル抗体ＧＡＡ１は、以前に記載されたとおりである。Moreland et al., 2005。ウェスタンブロットは、以前に記載されたとおり実施した。Moreland et al., 2005。
【００６０】
Ｆ．ｒｈＧＡＡの線維芽細胞取り込み
各時点について、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中の約５×１０5のポンペ線維芽細胞を、２５０ｎＭのｒｈＧＡＡ（ＷＴ）またはｒｈＧＡＡ（Ｈ２０１Ｌ）と共にインキュベートした。１６時間で、細胞を洗浄し、ＧＡＡを含まない新たな培地を加えた。所定の時点で、細胞を除去し、リン酸緩衝食塩水で５回、洗浄し、そして−８０℃で保存した。最終時点の後、すべての細胞沈殿物を解凍し、同時に０．２５％トリトンで溶解した。細胞残屑を沈殿させ、抗ＧＡＡ抗体を含む各時点からの上清においてウェスタンブロット分析を実施した。
【００６１】
Ｇ．発現構築物および一過性導入物の調製
標準的方法を用いて、ｐｃＤＮＡ６（Invitrogen）中にアミノ酸置換または欠失を伴うおよび伴わない組換えＧＡＡのための発現プラスミドを作製した。ヒト腎臓２９３Ｔ細胞を、３７℃、５％ＣＯ2下で、１０％ＦＢＳで補充されたＤＭＥＭ中で培養した。各プラスミド６マイクログラムをFugene 6トランスフェクション試薬（Roche）と混合し、そして１０ｃｍのシャーレ中の２．５×１０6の細胞に加えた。７２時間後、付着細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして０．２５％トリトンを含むＰＢＳで溶解した。細胞残屑を遠心分離によって沈殿させ、そして上清を−２０℃で保存した。
【００６２】
Ｈ．代謝標識および免疫沈降
ｒｈＧＡＡ（ＷＴ）またはｒｈＧＡＡ（Ｈ２０１Ｌ）を発現する安定なＣＨＯ細胞系統を以前に記載された方法に従って作製した。Qiu et al., J. Biol. Chem. 278: 32744-32752 (2003)。１０ｃｍのシャーレ中の約５×１０6の細胞を、メチオニンおよびシステインを含まないＤＭＥＭ中で３０分間インキュベートした。メチオニンおよびシステインが欠如したＤＭＥＭ中の１５０μＣｉ／ｍｌ（１１７５Ｃｉ／ｍｍｏｌ Ｔｒａｎ35Ｓ標識）を用いて、細胞を２時間、瞬間標識（pulse-labele）した。細胞をＤＭＥＭで２回洗浄し、０時間の時点とした後、次いで標識なしのＤＭＥＭ中、３７℃で細胞をインキュベートした。各時点で、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。シャーレを−２０℃で保存した。最終時点の後、０．２５％トリトン（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで細胞を溶解した。細胞残屑を遠心分離によって除去し、コンカナバリンＡセファロースの５０％スラリー６０μｌを上清に加えた。２時間インキュベーション後、ビーズをＰＢＳＴで３回洗浄した。０．５Ｍα−メチルグルコシドを含むＰＢＳを用いて標識ＧＡＡを溶離した。次いで、ＮＨＳ−セファロースに結合されたアフィニティー精製ヤギ抗ＧＡＡを用いて、溶出液中に存在するＧＡＡを免疫沈降させた。免疫沈降物をＰＢＳＴで３回洗浄し、β−メルカプトエタノールを含むＳＤＳサンプル緩衝液４０μｌ×２をビーズに加えた。ウェスタンブロット分析前にサンプルを沸騰させた。
【００６３】
Ｉ．略語
本明細書に用いるように、「ｒｈＧＡＡ」は、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼを意味する。「ＣＨＯ」は、チャイニーズハムスター卵巣を意味する。「ＭＳＸ」は、メチオニンスルホキシイミンを意味する。「ＥＲＴ」は、酵素補充療法を意味する。
【００６４】
本明細書に用いるように、「ＧＡＡ（Ｈ２０１Ｒ）」は、位置２０１でヒスチジンからアルギニンへのアミノ酸置換を有する修飾されたＧＡＡを意味する。「ＧＡＡ（Ｈ２０１Ｌ）」は、位置２０１でヒスチジンからロイシンへのアミノ酸置換を有する修飾されたＧＡＡを意味する。「ＧＡＡ（Ｈ２０１Ｙ）」は、位置２０１でヒスチジンからチロシンへのアミノ酸置換を有する修飾されたＧＡＡを意味する。「ＧＡＡ（Ｈ２０１Ｋ）」は、位置２０１でヒスチジンからリシンへのアミノ酸置換を有する修飾されたＧＡＡを意味する。
【００６５】
実施例２：ヒト、ウシおよびハムスターＧＡＡの比較
胎盤から精製されたＧＡＡをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって調べたところ、７６および７０ｋＤａのポリペプチドに相当する２つのバンドは、ほぼ等しい存在量であった（図２）。同様に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で過剰発現し、細胞溶解物から精製されたｒｈＧＡＡは、７６および７０ｋＤａのバンドを以前に示している。Moreland et al., 2005。対照的に、ＣＨＯ細胞から精製されたハムスターＧＡＡは、もっぱら７０ｋＤａのポリペプチドとして存在する。７０ｋＤａ形態の優位性がハムスターに特有であるか決定するため、ウシ精巣ＧＡＡを精製し、還元銀で染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％アクリルアミド）によって特徴づけすると、同様に７０ｋＤａのポリペプチドしか含まないことがわかった（図２）。
【００６６】
実施例３：ＧＡＡの位置２０１のアミノ酸は、７６ｋＤａ形態から７０ｋＤａへの変換効率に影響を及ぼし、タンパク質分解切断の順序を決定する。
アミノ酸１９７と２０６との間のタンパク質分解部位での哺乳動物ＧＡＡ配列のアラインメント（図３Ａ）は、保持された配列が高度に保存されているが、しかし、削除された配列がいくらか変化を示すことを実証している。ヒトＧＡＡは位置２０１でヒスチジンを含むのに対して、ハムスターおよびウシＧＡＡは、それぞれ、疎水性残基ロイシンおよびチロシンを有する。これらのアミノ酸置換がプロセシングにおける種特異的差異の原因となるかどうかを決定するため、アミノ酸２０１が変更されたＧＡＡ発現プラスミドを作製した。ヒスチジンを、ロイシン（Ｈ２０１Ｌ）、チロシン（Ｈ２０１Ｙ）、アルギニン（Ｈ２０１Ｒ）またはリシン（Ｈ２０１Ｋ）で置換した。ヒト胎生腎細胞（２９３Ｔ）を、各構築物でトランスフェクトした後、ＧＡＡに対するモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析を続けた。細胞溶解物のウェスタンブロット分析は、ＧＡＡ中のアミノ酸２０１をロイシンまたはチロシンで置換したときに、７６ｋＤａ形態から７０ｋＤａ形態への変換が野生型と比較して劇的により効率的であることを示した（図３Ｂ、レーン２〜７）。疎水性アミノ酸置換は、アスタリスクによって示すように、新たな約８２ｋＤａの中間体を形成すると考えられる（図３Ｂ）。ベクターのみの対照（図３、レーン８）では、９倍多い細胞溶解物を装填して、一時的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの溶解物と比較して内因性ＧＡＡを視覚化した。
【００６７】
ＧＡＡ（Ｈ２０１Ｌ）と比較して、野生型ＧＡＡのプロセシング速度を特徴づけるため、パルス追跡実験を実施した。各ＧＡＡを発現する安定なＣＨＯ細胞系統をＴｒａｎ35Ｓで２時間放射性標識化し、標識を含まない培地で示された時間追跡した（図４）。ＣｏｎＡ、続いて実施例１に記載した免疫沈降によって細胞溶解物からｒｈＧＡＡを精製した。時間０時間は、２時間追跡後とした。５５時間の時点で、ＧＡＡ（Ｈ２０１Ｌ）が７０ｋＤａ形態に完全にプロセシングされたのに対して、１２０時間後、野生型ＧＡＡのほんの少ししか７０ｋＤａ形態にプロセシングされなかった。野生型ＧＡＡを発現する細胞では、９５ｋＤａ種が観察されたが、Ｈ２０１Ｌでは存在しなかった。９５ｋＤａ中間体の同一性（identity）は、以前に特徴づけられおり（Moreland et al., 2005）、図１に示されている。
【００６８】
取り込み研究（uptake studies）においてｒｈＧＡＡ（Ｈ２０１Ｌ）が促進プロセシングを受けるかどうかを決定するため、ｒｈＧＡＡ（Ｈ２０１Ｌ）およびｒｈＧＡＡ（ＷＴ）の分泌形態を、安定な組換えＣＨＯ細胞系統から精製した。それらはＧＡＡが欠損しているため、ポンペ線維芽細胞において取り込み研究を実施した（図５）。実施例１に記載したように、ＧＡＡ欠損ポンペ線維芽細胞（ＧＭ００２４８）を２５０ｎＭのｒｈＧＡＡ（ＷＴ）およびｒｈＧＡＡ（Ｈ２０１Ｌ）と共にインキュベートした。指定された時点で、線維芽細胞を集め、−８０℃で凍結した。ヒトＧＡＡに対するモノクローナル抗体を用いて、細胞溶解物の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％アクリルアミド）ウェスタンブロットを調べた（アミノ酸２０４〜７８２の範囲内にある未知のエピトープ）。ＧＡＡの取り込み後、ｒｈＧＡＡ（ＷＴ）については、９５ｋＤａおよび７６ｋＤａの形態が顕著であり、ｒｈＧＡＡ（Ｈ２０１Ｌ）については観察されなかった（図５、レーン５〜１３）。また、プロセシングにおける違いは、ＧＡＡ（Ｈ２０１Ｌ）を有する約８２ｋＤａ中間体の出現を伴った。
【００６９】
約８２ｋＤａ中間体を特徴づけるため、アミノ酸１８３〜２００を認識する（したがって、完全にプロセシングされたＧＡＡから放出される１０．４ｋＤａの断片を結合する）抗ＧＡＡ抗体を用いて、精製されたｒｈＧＡＡ、胎盤ＧＡＡ、およびｒｈＧＡＡ（Ｈ２０１Ｌ）を含むウェスタンブロットを調べた（図６Ａ）。ｒｈＧＡＡ、胎盤ＧＡＡおよび成熟ｒｈＧＡＡ（Ｈ２０１Ｌ）を、実施例１に記載したとおり精製した。胎盤からの７６ｋＤａ種は、抗体結合によって示されるように、依然としてアミノ酸１８３〜２００を含んでいた。対照的に、８２ｋＤａ中間体は、抗体結合の欠如によって示されるように、これらのアミノ酸を含んでいなかった。これは、レーン３の約１０ｋＤａバンドによって明示されるように、抗体認識部位の切断がすでに行われたためである。ＧＡＡに対する個々のモノクローナル抗体は、ｒｈＧＡＡ（Ｈ２０１Ｌ）のサンプル中に８２ｋＤａ中間体の存在を示した（図６Ｂ）。
【００７０】
８２ｋＤａ中間体は、アミノ酸２００〜２０４の間の切断部位で促進されたタンパク質分解から生じたと結論づけることができる。その切断は、アミノ酸７８２〜７９２の間での切断前に行われる。図６Ａに示すように、８２ｋＤａポリペプチドは、アミノ酸１２２〜２００からの約１０ｋＤａ断片を含まない。これらの結果は、図７に示すｒｈＧＡＡ（Ｈ２０１Ｌ）の代替プロセシング経路を示唆している。野生型対ＧＡＡ（Ｈ２０１Ｌ）のプロセシングは、９５ｋＤａ中間体の後に分かれる。野生型ＧＡＡは、カルボキシル末端の近く（アミノ酸７８１〜７９２の間）で切断されて７６ｋＤａ中間体を生じるのに対して、ＧＡＡ（Ｈ２０１Ｌ）は、アミノ酸２００〜２０４の間で切断されて８２ｋＤａ中間体を生じる。両方の経路は、最終的に成熟７０ｋＤａＧＡＡを生じる。
【００７１】
本開示の他の実施態様は、本明細書の考察および本明細書に開示された実施態様の実施から当業者に明らかとなる。本明細書および実施例は、単なる例示とみなすものとする。
【図１】
2014513952.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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