(57)【要約】本明細書において、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および／もしくは２５−ヒドロキシビタミンＤ３などのビタミンＤ誘導体、またはビタミンＤ−Ｃ２２免疫原性分子もしくは化合物などの２５−ヒドロキシビタミンＤアナログと結合する能力がある抗体を発生するために使用することができる抗原性分子が提供される。これらの抗原性分子および関連する抗原性化合物を使用して産生される抗体も記載される。加えて、本明細書において、対象でのビタミンＤ欠乏を検出するための方法、ビタミンＤ欠乏を有すると疑われる対象を処置するための方法、対象でのビタミンＤ欠乏の進行をモニタリングするための方法、およびビタミンＤ欠乏の処置を必要とする対象でのその処置をモニタリングするための方法が開示される。また、２５−ヒドロキシビタミンＤ２およびＤ３の検出または定量のための方法および試薬、ビタミンＤアナログを安定化するための方法、ならびに生物学的試料中のビタミンＤ結合タンパク質から２５−ヒドロキシビタミンＤ２およびＤ３を分離するための方法が提供される。
2014516540.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
重鎖可変ドメインが、配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
軽鎖可変ドメインが、配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１または２記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
重鎖定常領域が、マウスＩｇＧ１抗体のアミノ酸配列を含む、請求項１記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
軽鎖定常領域が、マウスＩｇκ鎖のアミノ酸配列を含む、請求項１または４記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
抗体が、マウス抗体である、請求項１〜５のいずれか一項記載の抗体。
【請求項７】
抗体が、リコンビナントである、請求項１〜５のいずれか一項記載の抗体。
【請求項８】
抗体が、２５−ヒドロキシビタミンＤ２と結合する、請求項１〜７のいずれか一項記載の抗体。
【請求項９】
抗体が、２５−ヒドロキシビタミンＤ３と結合する、請求項１〜７のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１０】
抗体が、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３と結合する、請求項１〜９のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１１】
実質的に類似の親和性で２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３と結合する、請求項１０記載の抗体。
【請求項１２】
抗体が、溶液中でビタミンＤ２またはビタミンＤ３と有意に結合しない、請求項１〜１１のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１３】
抗体が、哺乳類にビタミンＤ−Ｃ２２を含む免疫原を注射することによって産生される、請求項１〜１２のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１４】
免疫原が、さらに、担体タンパク質、および直鎖中に少なくとも６個の原子を含むリンカーを含む、請求項１３記載の抗体。
【請求項１５】
担体タンパク質が、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンである、請求項１４記載の抗体。
【請求項１６】
リンカーが、約１２〜１６個の原子の直鎖を含む、請求項１４または１５記載の抗体。
【請求項１７】
リンカーが、１４個の原子の直鎖を含む、請求項１６記載の抗体。
【請求項１８】
免疫原が、式：
【化３】
2014516540.tif 000015
［式中、ｘおよびｙは、独立して１〜１２であり、少なくとも１個のリンカーコンジュゲーション型ビタミンＤ−Ｃ２２分子が担体タンパク質と結合している］
によって表される、請求項１３〜１７のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１９】
免疫原が、式：
【化４】
2014516540.tif 000016
［式中、少なくとも１個のリンカーコンジュゲーション型ビタミンＤ−Ｃ２２分子がＢＳＡ担体タンパク質と結合している］
によって表される、請求項１３〜１８のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２０】
免疫原が、式：
【化５】
2014516540.tif 000017
［式中、少なくとも１個のリンカーコンジュゲーション型ビタミンＤ−Ｃ２２分子がＫＬＨ担体タンパク質と結合している］
によって表される、請求項１３〜１８のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２１】
哺乳類がマウスである、請求項１３または２０記載の抗体。
【請求項２２】
ビタミンＤ−Ｃ２２を含む免疫原を哺乳類に注射することを含む、請求項１記載の抗体を産生させる方法。
【請求項２３】
免疫原が、さらに、担体タンパク質、および直鎖中に少なくとも６個の原子を含むリンカーを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
担体タンパク質が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
リンカーが、約１２〜１６個の原子の直鎖を含む、請求項２３または２４記載の方法。
【請求項２６】
リンカーが、１４個の原子の直鎖を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
免疫原が、式：
【化６】
2014516540.tif 000018
［式中、ｘおよびｙは、独立して１〜１２であり、少なくとも１個のリンカーコンジュゲーション型ビタミンＤ−Ｃ２２分子が担体タンパク質と結合している］
によって表される、請求項２２〜２６のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
免疫原が、式：
【化７】
2014516540.tif 000019
［式中、少なくとも１個のリンカーコンジュゲーション型ビタミンＤ−Ｃ２２分子がＢＳＡ担体タンパク質と結合している］
によって表される、請求項２２〜２７のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
免疫原が、式：
【化８】
2014516540.tif 000020
［式中、少なくとも１個のリンカーコンジュゲーション型ビタミンＤ−Ｃ２２分子がＫＬＨ担体タンパク質と結合している］
によって表される、請求項２２〜２７のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
哺乳類がマウスである、請求項２２または２９記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜２１のいずれか一項記載の抗体を発現している、単離された細胞。
【請求項３２】
免疫処置されたマウスから得られる、請求項３１記載の細胞。
【請求項３３】
細胞が、ハイブリドーマである、請求項３２記載の細胞。
【請求項３４】
細胞が、リコンビナント産生される、請求項３１記載の細胞。
【請求項３５】
請求項１〜２１のいずれか一項記載の抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３６】
ポリヌクレオチドが、リコンビナントである、請求項３５記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３７】
ポリヌクレオチドが、ｃＤＮＡである、請求項３５または３６記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３８】
ポリヌクレオチドが、重鎖ＣＤＲ１をコードする配列番号２で示される配列；重鎖ＣＤＲ２をコードする配列番号３で示される配列；および重鎖ＣＤＲ３をコードする配列番号４で示される配列を含む、抗体重鎖をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３９】
配列番号８を含む、請求項３８記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４０】
軽鎖ＣＤＲ１をコードする配列番号１８で示される配列；軽鎖ＣＤＲ２をコードする配列番号１９で示される配列；および軽鎖ＣＤＲ３をコードする配列番号２０で示される配列を含む、抗体軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４１】
配列番号２４を含む、請求項４０記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４２】
請求項３８および４０記載のポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４３】
請求項３８記載の配列が、請求項４０記載の配列と異なるオープンリーディングフレーム内に存在する、請求項４２記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４４】
試料を、請求項１〜２１のいずれか一項記載の抗体または抗原結合フラグメントと接触させることを含む、該試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ２または２５−ヒドロキシビタミンＤ３を検出する方法。
【請求項４５】
請求項１〜２１のいずれか一項記載の抗体または抗原結合フラグメントが、検出可能にラベルされている、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
対象から得られた生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルを決定することを含む、該対象でのビタミンＤ欠乏を検出するための方法であって、
生物学的試料中のレベルと正常対照中のレベルまたは閾値レベル３０ng/mLとの間の減少が、該対象でのビタミンＤ欠乏を示す方法。
【請求項４７】
ビタミンＤ欠乏を有すると疑われる対象を処置するための方法であって、該対象から得られた生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルを決定すること；および正常対照でのレベルまたは閾値レベル３０ng/mLに対する生物学的試料中のレベルの減少が決定された場合、該対象にビタミンＤ欠乏のための処置を施すことを含む方法。
【請求項４８】
ビタミンＤ欠乏の進行のモニタリングを必要とする対象での該モニタリングするための方法であって、該方法が、
１回目に該対象から得られた第１の生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルを決定すること；および
該１回目よりも後の２回目に該対象から得られた第２の生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルを決定すること
を含み；ここで、第１の生物学的試料中のレベルと第２の生物学的試料中のレベルとの間の減少が、該対象でのビタミンＤ欠乏の進行を示し、ここで、第１の生物学的試料中のレベルと第２の生物学的試料中のレベルとの間にほとんどまたは全く変化がないことが、対象でのビタミンＤ欠乏の安定化を示し、ここで、第１の生物学的試料中のレベルと第２の生物学的試料中のレベルとの間の増加が、対象でのビタミンＤ欠乏の軽減を示す方法。
【請求項４９】
ビタミンＤ欠乏の処置を必要とする対象における該処置をモニタリングするための方法であって、該方法が、
１回目に該対象から得られた第１の生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルを決定すること；および
該１回目よりも後の２回目に、該ビタミンＤ欠乏についての該対象の処置後に該対象から得られた第２の生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルを決定すること
を含み；ここで、第１の生物学的試料中のレベルに対する第２の生物学的試料中のレベルの増加または安定化が、該対象でのビタミンＤ欠乏の処置の有効性を示し、ここで、第１の生物学的試料中のレベルに対する第２の生物学的試料中のレベルの減少が、該対象でのビタミンＤ欠乏の処置の無効果を示す方法。
【請求項５０】
処置が、ビタミンＤ摂取を補充することである、請求項４７または４９記載の方法。
【請求項５１】
処置が光線療法である、請求項４７または４９記載の方法。
【請求項５２】
光線療法が、自然太陽光への曝露増加または紫外線Ｂの人工光源への曝露である、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
２５−ヒドロキシビタミンＤが、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３である、請求項４６、４７、４８、または４９記載の方法。
【請求項５４】
２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３のレベルが、生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させることによって決定される、請求項４６〜４９のいずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
抗体または抗原結合フラグメントが、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３について等モル認識を有する、請求項５４または５５記載の方法。
【請求項５７】
抗体または抗原結合フラグメントが、ビタミンＤ３またはビタミンＤ２と有意な交差反応性を有さない、請求項５４、５５、または５６記載の方法。
【請求項５８】
抗体または抗原結合フラグメントが、配列番号２６で示されるＬｃ ＣＤＲ１、配列番号２７で示されるＬｃ ＣＤＲ２、および配列番号２８で示されるＬｃ ＣＤＲ３、配列番号１０で示されるＨｃ ＣＤＲ１、配列番号１１で示されるＨｃ ＣＤＲ２および配列番号１２で示されるＨｃ ＣＤＲ３を含む、請求項５４、５５、５６、または５７記載の方法。
【請求項５９】
抗体がモノクローナル抗体１０Ｈ９である、請求項５４、５５、５６、５７、または５８記載の方法。
【請求項６０】
抗体を発生するために使用される抗原が、ｖｉｔ Ｄ−Ｃ２２−ジアミノブタン−スベロイル−ＢＳＡである、請求項５４、５５、５６、５７、５８、または５９記載の方法。
【請求項６１】
決定するステップが、競合イムノアッセイによって行われる、請求項５４〜６０のいずれか一項記載の方法。
【請求項６２】
抗体が、化学発光化合物、リン光化合物、蛍光化合物、放射性ラベル、ビオチン、または酵素でラベルされている、請求項５４〜６１のいずれか一項記載の方法。
【請求項６３】
抗体が、固相支持体上に固定化されている、請求項５４〜６２のいずれか一項記載の方法。
【請求項６４】
抗体が、担体タンパク質とコンジュゲーションされている、請求項５４〜６３のいずれか一項記載の方法。
【請求項６５】
抗体−担体タンパク質が、固相支持体上に固定化されている、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
生物学的試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の総レベルが、強化化学発光（ＥＣＬ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウエスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光、平衡透析、免疫識別、または酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によって検出される、請求項５４〜６５のいずれか一項記載の方法。
【請求項６７】
生物学的試料が血液である、請求項４６〜６６のいずれか一項記載の方法。
【請求項６８】
生物学的試料が血清である、請求項４６〜６６のいずれか一項記載の方法。
【請求項６９】
生物学的試料が血漿である、請求項４６〜６６のいずれか一項記載の方法。
【請求項７０】
生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる前に、該生物学的試料が、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）で処理される、請求項５４〜６９のいずれか一項記載の方法。
【請求項７１】
生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、該生物学的試料が、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）で処理される、請求項５４〜６９のいずれか一項記載の方法。
【請求項７２】
生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる前に、該生物学的試料が、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）およびエチレングリコールで処理される、請求項５４〜６９のいずれか一項記載の方法。
【請求項７３】
生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、該生物学的試料が、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）およびエチレングリコールで処理される、請求項５４〜６９のいずれか一項記載の方法。
【請求項７４】
対象でのビタミンＤ欠乏が、疾患を示すか、または疾患に関連する、請求項４６〜７３のいずれか一項記載の方法。
【請求項７５】
疾患が、くる病、骨軟化症、高血圧症、骨粗鬆症、自己免疫病、心血管疾患、統合失調症、うつ病、神経系疾患、糖尿病、感染症、喘息、アレルギーまたはガンである、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
生物学的試料が、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）およびエチレングリコールで処理される、請求項４６〜４９のいずれか一項記載の方法。
【請求項７７】
生物学的試料が、メタノールで処理されない、請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
生物学的試料が、メタノールで処理される、請求項７６記載の方法。
【請求項７９】
２５−ヒドロキシビタミンＤアナログが、接触させるステップの後に生物学的試料に添加される、請求項５４記載の方法。
【請求項８０】
２５−ヒドロキシビタミンＤアナログがラベルされている、請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
２５−ヒドロキシビタミンＤアナログが、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）を含む緩衝液中に存在する、請求項７９記載の方法。
【請求項８２】
ラベルされた２５−ヒドロキシビタミンＤアナログが、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）を含む緩衝液中に存在する、請求項８０記載の方法。
【請求項８３】
決定するステップが２０分以内を要する、請求項４６、４７、４８、または４９のいずれか一項記載の方法。
【請求項８４】
２５−ヒドロキシビタミンＤアナログを８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）と接触させることを含む、２５−ヒドロキシビタミンＤアナログを安定化する方法。
【請求項８５】
さらに、２５−ヒドロキシビタミンＤアナログ／８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）をアッセイ系外で２ヶ月間よりも長く保存することを含む、請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
さらに、２５−ヒドロキシビタミンＤアナログ／８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）をアッセイ系内で７日間よりも長く保存することを含む、請求項８４記載の方法。
【請求項８７】
容器中で生物学的試料と置換緩衝液とを混合すること；
該容器に、第１のラベルとコンジュゲーションされた、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３と優先的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを添加すること；
該容器に、担体タンパク質および第２のラベルとコンジュゲーションされた２５−ヒドロキシビタミンＤアナログを添加すること；
該容器に、第２のラベルを認識する抗体とコンジュゲーションされた固相支持体を添加すること；ならびに
生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルを測定すること
を含む、対象から得られた生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルを決定することによって、該対象でのビタミンＤ欠乏を検出するための方法であって、
ここで、生物学的試料中のレベルと正常対照中のレベルまたは閾値レベル３０ng/mLとの間の減少が、該対象でのビタミンＤ欠乏を示す方法。
【請求項８８】
置換緩衝液が、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）を含む、請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
置換緩衝液が、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）およびエチレングリコールを含む、請求項８７記載の方法。
【請求項９０】
置換緩衝液が、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）、エチレングリコールおよびメタノールを含む、請求項８７記載の方法。
【請求項９１】
第１のラベルが、化学発光化合物、リン光化合物、蛍光化合物、放射性ラベル、ビオチン、または酵素を含む、請求項８７、８８、８９、および９０のいずれか一項記載の方法。
【請求項９２】
担体タンパク質が、ウシ血清アルブミンを含む、請求項８７、８８、８９、９０および９１のいずれか一項記載の方法。
【請求項９３】
第２のラベルが、フルオレセインを含む。請求項８７、８８、８９、９０、９１および９２のいずれか一項記載の方法。
【請求項９４】
固相支持体が、常磁性粒子である、請求項８７〜９３のいずれか一項記載の方法。
【請求項９５】
固相支持体とコンジュゲーションされている抗体が、フルオレセインと結合する抗体である、請求項８７記載の方法。
【請求項９６】
方法が、２０分以内を要する、請求項８７〜９５のいずれか一項記載の方法。
【請求項９７】
２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３と優先的に結合する抗体または抗原結合フラグメントが、好ましい実施態様において配列番号２６で示されるＬｃ ＣＤＲ１、配列番号２７で示されるＬｃ ＣＤＲ２、および配列番号２８で示されるＬｃ ＣＤＲ３、配列番号１０で示されるＨｃ ＣＤＲ１、配列番号１１で示されるＨｃ ＣＤＲ２および配列番号１２で示されるＨｃ ＣＤＲ３を含む、請求項８７〜９７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９８】
２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３と優先的に結合する抗体が、モノクローナル抗体１０Ｈ９である、請求項８７〜９７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９９】
モノクローナル抗体を発生するために使用される抗原が、ビタミンＤ−Ｃ２２−ジアミノブタン−スベロイル−ＢＳＡである、請求項８７〜９７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１００】
２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３と優先的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントが、固相支持体上に固定化されている、請求項８７〜９９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０１】
２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３と優先的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントが、担体タンパク質とコンジュゲーションされている、請求項８７〜９９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０２】
２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３と優先的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントと担体タンパク質とのコンジュゲートが、固相支持体上に固定化されている、請求項１０１記載の方法。
【請求項１０３】
生物学的試料が、血液である、請求項８７〜１０２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０４】
生物学的試料が、血清である、請求項８７〜１０２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０５】
生物学的試料が、尿または血漿である、請求項８７〜１０２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０６】
２５−ヒドロキシビタミンＤアナログが、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）を含む安定化緩衝液中に存在する、請求項８７〜１０５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０７】
対象でのビタミンＤ欠乏が、疾患を示す、請求項８７〜１０６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０８】
疾患が、くる病、骨軟化症、高血圧症、骨粗鬆症、自己免疫病、心血管疾患、統合失調症、うつ病、神経系疾患、糖尿病、感染症、喘息、アレルギーまたはガンである、請求項１０７記載の方法。
【請求項１０９】
２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３と優先的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントが、ビタミンＤ３またはビタミンＤ２と有意な交差反応性を有さない、請求項８７〜１０８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１０】
２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３と優先的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントが、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３について等モル認識を有する、請求項８７〜１０９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１１】
生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルを測定するステップが、化学発光を測定することを含む、請求項８７〜１１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１２】
２５−ヒドロキシビタミンＤアナログが、ビタミンＤ−Ｃ２２である、請求項７９、８０、８１、８２、８４、８５、８６および８７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１３】
ハイブリドーマならびに２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３と結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを産生させる方法であって：
ａ．動物に、ビタミンＤ−Ｃ２２
【化９】
2014516540.tif 000021
またはカルボン酸官能基が保護されてアミドを形成しているその誘導体を含む免疫原を免疫処置すること；
ｂ．動物から脾臓細胞を回収すること；
ｃ．脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを形成させること；ならびに
ｄ．該ハイブリドーマから、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３と結合する抗体または抗原結合フラグメントを産生させること
を含む方法。
【請求項１１４】
抗体または抗原結合フラグメントが、試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３を検出する、請求項１１３記載の方法。
【請求項１１５】
抗体または抗原結合フラグメントが、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の等モル認識を有する、請求項１１３記載の方法。
【請求項１１６】
抗体が、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の交差反応パーセンテージ１００％〜１０２％を有する、請求項１１３記載の方法。
【請求項１１７】
抗体が、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１１３記載の方法。
【請求項１１８】
免疫原が、タンパク質担体に取り付けられている、請求項１１３記載の方法。
【請求項１１９】
免疫原が、式：
【化１０】
2014516540.tif 000022
［式中、ｘおよびｙは、独立して１〜１２であり、少なくとも１個のリンカーコンジュゲーション型ビタミンＤ−Ｃ２２分子が、担体タンパク質と結合している］
によって表される、請求項１１３記載の方法。
【請求項１２０】
免疫原が、式：
【化１１】
2014516540.tif 000023
［式中、ｘおよびｙは、独立して１〜１２であり、少なくとも１個のリンカーコンジュゲーション型ビタミンＤ−Ｃ２２分子が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合している］
によって表される、請求項１１３記載の方法。
【請求項１２１】
免疫原が、式：
【化１２】
2014516540.tif 000024
［式中、少なくとも１個のリンカーコンジュゲーション型ビタミンＤ−Ｃ２２分子が、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合している］
によって表される、請求項１１３記載の方法。
【請求項１２２】
２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３と結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項１２３】
配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項１２４】
試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３と結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２５】
抗体または抗原結合フラグメントが、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の等モル認識を有する、請求項１２４記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１２６】
抗体または抗原結合フラグメントが、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の交差反応パーセンテージ１００％〜１０２％を有する、請求項１２４記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１２７】
抗体が、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１２４記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１２８】
生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルを検出または決定するための方法であって、該試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３と結合する抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させることを含む方法。
【請求項１２９】
決定するステップが、フルオレセインコンジュゲーション型ビタミンＤ−Ｃ２２を使用する競合イムノアッセイを含む、請求項１２８記載の方法。
【請求項１３０】
抗体および抗原結合フラグメントが、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および／または２５−ヒドロキシビタミンＤ３などのビタミンＤ誘導体を検出するために使用される、請求項１２８記載の方法。
【請求項１３１】
試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３と結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含むキット。
【請求項１３２】
試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３と結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む診断装置。
【請求項１３３】
さらに、アルカリホスファターゼコンジュゲーション型ビタミンＤ−Ｃ２２−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む、請求項１３１記載のキット。
【請求項１３４】
さらに、アルカリホスファターゼ−コンジュゲーション型ビタミンＤ−Ｃ２２−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む、請求項１３２記載の診断装置。
【請求項１３５】
装置が、強化化学発光（ＥＣＬ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウエスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光、平衡透析、免疫識別、または酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）を行う、請求項１３２記載の装置。
【請求項１３６】
ａ．動物を、ビタミンＤ−Ｃ２２を含む免疫原で免疫処置すること；
ｂ．動物から脾臓細胞を回収すること；および
脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを形成させること
を含む、ハイブリドーマを産生させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年５月２０日に出願された米国特許仮出願第６１／４８８，６３０号の利益を主張する、２０１２年４月２７日に出願された米国特許出願第１３／４５８，８４７号の優先権を主張し、それらの両方は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本明細書において、２５−ヒドロキシビタミンＤ２およびＤ３の検出または定量のための方法および試薬、ビタミンＤアナログを安定化するための方法、ならびに生物学的試料中のビタミンＤ結合タンパク質から２５−ヒドロキシビタミンＤ２およびＤ３を分離するための方法が提供される。
【０００３】
背景
ビタミンＤは、カルシウムの腸管吸収およびカルシウムホメオスタシスのレギュレーションに関与するステロイドホルモンである。ビタミンＤは、強く健康な骨の形成および維持に不可欠である。
【０００４】
ビタミンＤ欠乏は、日光への不十分な曝露、不十分な食事摂取、吸収減退、異常代謝、またはビタミンＤ抵抗性に起因しうる。ビタミンＤ欠乏は、くる病、骨軟化症、骨粗鬆症、高血圧症、心血管疾患、統合失調症、うつ病、神経系疾患、糖尿病、感染症、喘息、アレルギー、ガン、およびいくつかの自己免疫病に結び付いていた。
【０００５】
消費されようと産生されようと、両形態のビタミンＤ（Ｄ２およびＤ３）は、肝臓によって２５−ヒドロキシビタミンＤ（２５（ＯＨ）Ｄ）に代謝され、次に肝臓または腎臓内で１，２５−ジヒドロキシビタミンＤに変換される。ビタミンＤ代謝物は、血漿中で担体タンパク質に結合され、身体全体に分布する。２５（ＯＨ）Ｄは、ビタミンＤ状態の最も信頼できる臨床指標である代謝物であると一般に認められている。それは、血清２５（ＯＨ）ＤレベルがビタミンＤの体内貯蔵レベルを反映し、ビタミンＤ欠乏の臨床症状と相関するからである。
【０００６】
健康管理にとってのビタミンＤ検出の価値にかかわらず、ビタミンＤまたはその誘導体の検出のための正確で高感度なアッセイは限られている。ビタミンＤ用の好結果のアッセイの開発にとっての一障害は、被験生物学的試料中で強固に結合した２５−ヒドロキシビタミンＤ３および２５−ヒドロキシビタミンＤ２をそれらのビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）から単離することの技術的困難性であった。ＤＢＰは、ビタミンＤステロール、Ｇ−アクチン、脂肪酸および走化性薬剤と結合する血清糖タンパク質である。Swamy et al., Archives of Biochemistry and Biophysics 402: 14-23 (2002)。血漿中で、２５−ヒドロキシビタミンＤ３および２５−ヒドロキシビタミンＤ２は、２〜３週間の半減期を有し、それでも０．０５％未満が遊離型で存在するだけである。大部分は、水素結合および疎水性相互作用を伴う１０９Ｍ−１のような高い会合親和性でＤＢＰと結合している。
【０００７】
ビタミンＤに関する競合結合イムノアッセイを開発する上での別の一障害は、抗体結合部位を生物学的試料中のビタミンＤと競合するために使用されるビタミンＤアナログの不安定性である。ＤＢＰの不在下のビタミンＤは、生物学的試料または緩衝溶液中で高度に不安定である。
【０００８】
したがって、生物学的試料中に存在する遊離型またはＤＢＰ結合型のいずれかのビタミンＤおよびビタミンＤ誘導体を正確に検出および／または定量するアッセイ方法の必要性が存在する。
【０００９】
概要
本明細書において、ビタミンＤ由来分子と結合する能力がある抗体を発生させるために使用できる抗原性分子が提供される。いくつかの態様では、抗原性分子は、担体タンパク質にコンジュゲーションして抗原性化合物を形成することができる。抗原性分子への担体タンパク質のコンジュゲーションは、化学リンカーの使用によって生じうる。いくつかの態様では、抗原性タンパク質は、異なるビタミンＤ誘導体と結合する、モノクローナル抗体などの抗体を発生しうる。記載された抗原性分子の多くは、ビタミンＤ−Ｃ２２免疫原を組み入れている（図１（ａ））。より具体的には、本明細書において、ビタミンＤ−Ｃ２２ジアミノブタン−スベロイル−ＢＳＡ（ビタミンＤ−Ｃ２２ ＢＳＡ）を産生させるための、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とコンジュゲーションされたビタミンＤ−Ｃ２２免疫原が開示される（図１（ｃ））。または、ビタミンＤ−Ｃ２２ジアミノブタン−スベロイル−ＫＬＨ（ｖｉｔ Ｄ−Ｃ２２ ＫＬＨ）を産生させるために、ビタミンＤ−Ｃ２２をＫＬＨとコンジュゲーションすることができる（図１（ｄ））。本明細書において提供される前記抗原性分子および抗原性化合物は、マウスなどの哺乳類において抗原反応性抗体を産生させるために使用することができる。抗原反応性モノクローナル抗体を産生するクローン性ハイブリドーマ細胞系を産生させるために、今度は、免疫処置された哺乳類は、Ｂ細胞源として使用することができる。
【００１０】
本明細書において、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および／もしくは２５−ヒドロキシビタミンＤ３などのビタミンＤ誘導体、またはビタミンＤ−Ｃ２２免疫原性分子もしくは化合物などの２５−ヒドロキシビタミンＤアナログと結合できる単離された抗体およびその抗原結合フラグメントも開示される。いくつかの態様では、前記抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの局面では、前記抗体および抗原結合フラグメントは、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を有する。そのような抗体は、本明細書記載のモノクローナル抗体１０Ｈ９によって例示される。さらに記載されるように、本明細書において提供される抗体は、本質的にモノクローナルであるものの、１種以上の抗原と優先的に結合する能力を有する。これに関して、本明細書に提供される抗体のいくつかは、本質的に識別不能なように２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３と結合することができる。記載された抗体および抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドならびに前記ポリヌクレオチドの増殖および／または発現のためのベクターも提供される。
【００１１】
さらに、本明細書において、対象から得られた生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルを決定することによって、その対象でのビタミンＤ欠乏を検出するための方法が提供され、ここで、正常対照でのレベルまたは閾値レベル３０ng/mLに対して生物学的試料中のレベルが減少していることが、対象でのビタミンＤ欠乏を示す。
【００１２】
また、本明細書において、対象から得られた生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルを決定すること、および正常対照でのレベルまたは閾値レベル３０ng/mLに対して生物学的試料中のレベルが減少していることが検出された場合、その対象にビタミンＤ欠乏のための処置を施すことによって、ビタミンＤ欠乏を有する疑いのある対象を処置するための方法が提供される。
【００１３】
また、本明細書において、１回目に対象から得られた第１の生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルを決定すること、および次に１回目よりも後の２回目に対象から得られた第２の生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルを決定することによって、ビタミンＤ欠乏の進行、退行、または安定化のモニタリングを必要とする対象でのそのモニタリングのための方法が開示され、ここで、第１の生物学的試料中のレベルと第２の生物学的試料中のレベルの間の減少は、対象でのビタミンＤ欠乏の進行または悪化を示し、ここで、第１の生物学的試料中のレベルと第２の生物学的試料中のレベルとの間にほとんどまたは全く変化がないことは、対象でのビタミンＤ欠乏の安定化を示し、第１の生物学的試料中のレベルと第２の生物学的試料中のレベルとの間の増加は、対象でのビタミンＤ欠乏の退行または改善を示す。
【００１４】
また、本明細書において、１回目に対象から得られた第１の生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルを決定すること、および次に１回目よりも後の２回目に、ビタミンＤ欠乏についての対象の処置後に、対象から得られた第２の生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルを決定することによって、前記ビタミンＤ欠乏の処置を必要とする対象でのその処置をモニタリングするための方法が提供され、ここで、第１の生物学的試料中のレベルに対して第２の生物学的試料中のレベルが増加または安定化していることは、前記対象でのビタミンＤ欠乏の処置が有効であることを示し、ここで、第１の生物学的試料中のレベルに対して第２の生物学的試料中のレベルが減少していることは、前記対象でのビタミンＤ欠乏の処置が無効であることを示す。
【００１５】
２５−ヒドロキシビタミンＤアナログを８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）と接触させることによって２５−ヒドロキシビタミンＤアナログを安定化するための方法が開示される。ＡＮＳは、ＡＮＳの酸または塩（例えば、ＡＮＳナトリウム塩、ＡＮＳカリウム塩、ＡＮＳヘミマグネシウム塩またはＡＮＳアンモニウム塩）の形態でありうる。
【００１６】
また、本明細書において、対象でのビタミンＤ欠乏を検出するための方法が提供される。対象でのビタミンＤ欠乏を検出するための方法は、生物学的試料と置換緩衝液を混合することによって、対象から得られた生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルを決定することを伴う。好ましい態様では、置換緩衝液は、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）を含有する。ＡＮＳは、ＡＮＳの酸または塩（例えば、ＡＮＳナトリウム塩、ＡＮＳカリウム塩、ＡＮＳヘミマグネシウム塩またはＡＮＳアンモニウム塩）の形態でありうる。置換緩衝液は、さらに、エチレングリコールを含有しうる。いくつかの態様では、置換緩衝液は、ＡＮＳおよびメタノールを含有する。いくつかの好ましい態様では、置換緩衝液は、ＡＮＳ、エチレングリコール、およびメタノールを含有する。次に、第１のラベルとコンジュゲーションした、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および／もしくは２５−ヒドロキシビタミンＤ３などのビタミンＤ誘導体、またはビタミンＤ−Ｃ２２免疫原性分子もしくは化合物などの２５−ヒドロキシビタミンＤアナログと優先的に結合する抗体または抗原結合フラグメントが、アッセイ混合物と混合される。２５−ヒドロキシビタミンＤ２および／もしくは２５−ヒドロキシビタミンＤ３などのビタミンＤ誘導体、またはビタミンＤ−Ｃ２２免疫原性分子もしくは化合物などの２５−ヒドロキシビタミンＤアナログと優先的に結合する抗体または抗原結合フラグメントは、好ましくは、本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメント、例えば、配列番号２６で示されるＬｃ ＣＤＲ１、配列番号２７で示されるＬｃ ＣＤＲ２、および配列番号２８で示されるＬｃ ＣＤＲ３、配列番号１０で示されるＨｃ ＣＤＲ１、配列番号１１で示されるＨｃ ＣＤＲ２および配列番号１２で示されるＨｃ ＣＤＲ３を含む抗体または抗原結合フラグメントである。好ましい態様では、抗体は、モノクローナル抗体１０Ｈ９である。次に、第２のラベルを有する２５−ヒドロキシビタミンＤアナログが、アッセイ混合物と混合される。２５−ヒドロキシビタミンＤアナログは、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）を含む安定化緩衝液中に存在しうる。ＡＮＳは、ＡＮＳの酸または塩（例えば、ＡＮＳナトリウム塩、ＡＮＳカリウム塩、ＡＮＳヘミマグネシウム塩またはＡＮＳアンモニウム塩）の形態でありうる。いくつかの態様では、２５−ヒドロキシビタミンＤアナログは、担体タンパク質とコンジュゲーションされる。第２のラベルを認識する抗体とコンジュゲーションされた固相支持体も、アッセイ混合物と混合される。生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルは、第１のラベルによって送り出されるシグナルを測定することによって決定され、ここで、正常対照でのレベルまたは閾値レベル３０ng/mLに対する生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルの減少は、対象でのビタミンＤ欠乏を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ビタミンＤ−Ｃ２２分子および抗原性化合物の化学構造を示す図である。図１（ａ）に非コンジュゲーション型ビタミンＤ−Ｃ２２分子を示す。図１（ｂ）に、一般的なビタミンＤ−Ｃ２２抗原性化合物を表示する。図１（ｃ）および１（ｄ）に、ビタミンＤ−Ｃ２２分子がリンカーによってＢＳＡまたはＫＬＨのいずれかにコンジュゲーションされた特異的ビタミンＤ−Ｃ２２抗原性化合物であるＤ−Ｃ２２ジアミノブタン−スベロイル−ＢＳＡ（図１（ｃ））およびＤ−Ｃ２２ジアミノブタン−スベロイル−ＫＬＨ（図１（ｄ））を示す。
【図２】ｖｉｔ Ｄ−Ｃ２２酸の化学的製造方法を示す図である。
【図３】ｖｉｔ Ｄ−Ｃ２２酸をｖｉｔＤ−ＤＡＢ−スベロイル−ＮＨＳまたはｖｉｔＤ−ＤＡＢ−ＰＥＧ５−ＮＨＳのいずれかに変換する化学的方法を示す図である。
【図４】タンパク質担体にｖｉｔ Ｄ−Ｃ２２、ｖｉｔＤ−ＤＡＢ−スベロイル−ＮＨＳまたはｖｉｔＤ−ＤＡＢ−ＰＥＧ５−ＮＨＳをコンジュゲーションするための化学反応スキームを説明する図である。
【図５】ビタミンＤ−ＤＡＢ−ＰＥＧ５−ＢＳＡ−フルオレセインコンジュゲートを製造するための二段階反応を示す図である。
【図６】２５−ヒドロキシビタミンＤ２または２５−ヒドロキシビタミンＤ３のいずれかの存在下または不在下での、ビタミンＤ−Ｃ２２−ジアミノブタン−スベロイルＫＬＨと、ハイブリドーマ１０Ｈ９上清からの抗体との間の結合度のグラフ表示である。
【図７】２５−ヒドロキシビタミンＤ２または２５−ヒドロキシビタミンＤ３のいずれかの存在下または不在下での、ビタミンＤ Ｃ２２−ジアミノブタン−スベロイル−アルカリホスファターゼと精製１０Ｈ９モノクローナル抗体との間の結合度のグラフ表示である。
【図８】ADVIA Centaur総ビタミンＤアッセイの模式図を示す図である。この図は、説明だけを目的とし、決して限定として見なしてはならない。
【図９】ADVIA Centaur総ビタミンＤアッセイの検出限界（ＬｏＤ）および実効感度（functional sensitivity）（点線）を示す精度プロファイルを示す図である。
【図１０】１１９人のドナーからセラムレッドトップ（serum red top）チューブおよびＳＳＴチューブ中に採取された総ビタミンＤレベルと、実効感度の間の相関を示す図である。
【図１１】１１９人のドナーからセラムレッドトップチューブおよびＥＤＴＡチューブ中に採取された総ビタミンＤレベルの相関を示す図である。
【図１２】ADVIA Centaurと市販の総ビタミンＤアッセイとの相関を示す図である。
【図１３】ADVIA CentaurとＬＣ−ＭＳ／ＭＳ総ビタミンＤアッセイとの相関を示す図である。
【図１４】１０Ｈ９モノクローナル抗体重鎖可変領域の注釈付きの説明を提供する図である。
【図１５】１０Ｈ９モノクローナル抗体軽鎖可変領域の注釈付きの説明を提供する図である。
【００１８】
例証的態様の詳細な説明
説明の局面に関する様々な用語が、本明細書および特許請求の範囲にわたり使用される。そのような用語は、別段の指示がない限り、それらの通常の意味が与えられるべきである。他の具体的に定義された用語は、本明細書に提供される定義と一致するように解釈すべきである。
【００１９】
本明細書および添付の特許請求の範囲に使用する単数形「a」、「an」および「the」には、内容について別段のはっきりした指示がない限り、複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば「細胞（a cell）」への参照には、２個以上の細胞の組み合わせなどが含まれる。
【００２０】
量、持続時間（temporal duration）などの測定可能な値を参照するときに、規定値から最大±２０％の変動が開示の方法を行うために適するので、本明細書に使用する用語「約」は、その変動を包含することが意味される。別段の指示がない限り、明細書および特許請求の範囲に使用される成分の量、分子量などの性質、反応条件などを表現する全ての数字は、全ての場合に用語「約」によって修飾されると理解されたい。したがって、特に正反対のことが示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に示される数値パラメーターは、本発明によって得ようと努められる所望の性質に応じて変動しうる近似である。最低限でも、そして特許請求の範囲への均等論の適用を限定しようとするのではなく、各数値パラメーターは、少なくとも、報告された有効数字の数に照らして、通常の丸め処理（rounding techniques）を適用することによって解釈すべきである。
【００２１】
本発明の広い範囲を述べている数値域および数値パラメーターは、近似であるにもかかわらず、具体例に示された数値は、できる限り正確に報告される。しかし、任意の数値は、本質的に、それらの個々の試験測定から見出される標準偏差に必然的に起因するある程度の誤差を含有する。
【００２２】
「単離された」は、自然状態から「人工的に」変化されたことを意味する。分子または組成物が自然界に存在する場合に、それがその本来の環境から変えられるか、もしくは取り出されたならば、またはその両方ならば、それは「単離」されている。例えば、生きた植物または動物中に自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」おらず、その自然状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書に採用された用語として「単離されて」いる。
【００２３】
同意語として「核酸分子」または「核酸」と呼ばれる「ポリヌクレオチド」は、未改変のＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改変されたＲＮＡもしくはＤＮＡでありうる任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを表す。「ポリヌクレオチド」には、非限定的に、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域との混合であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域と二本鎖領域との混合であるＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖、またはより典型的には二本鎖、もしくは一本鎖領域と二本鎖領域との混合でありうる）が含まれる。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を表す。ポリヌクレオチドという用語には、また、１個または複数の改変塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性または他の理由のために改変されたバックボーンを有するＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。「改変された」塩基には、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの珍しい塩基が含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡに多様な改変を加えることができることから、「ポリヌクレオチド」は、自然界に典型的に見出されるものに比べて化学的、酵素的または代謝的に改変された形態のポリヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的な化学形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。「ポリヌクレオチド」は、また、しばしばオリゴヌクレオチドとも呼ばれる相対的に短い核酸鎖を包含する。
【００２４】
核酸またはアミノ酸配列に関して「実質的に同じ」は、２種以上の配列の間の少なくとも６５％の同一性を意味する。好ましくは、この用語は、２種以上の配列の間の少なくとも７０％の同一性、より好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９１％の同一性、より好ましくは少なくとも９２％の同一性、より好ましくは少なくとも９３％の同一性、より好ましくは少なくとも９４％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、より好ましくは少なくとも９６％の同一性、より好ましくは少なくとも９７％の同一性、より好ましくは少なくとも９８％の同一性、より好ましくは少なくとも９９％以上の同一性を表す。そのような同一性は、ｍＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定することができる（Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7）。
【００２５】
「ベクター」は、別の核酸セグメントの複製または発現をもたらすように、そのセグメントが作動可能に挿入されうるプラスミド、ファージ、コスミド、またはウイルスなどのレプリコンである。
【００２６】
「作動可能に連結される」または「作動可能に挿入される」という用語は、コード配列の発現を可能にするように、コード配列の発現に必要な調節配列が、コード配列に対して適切な位置の核酸分子内に置かれることを意味する。例として、プロモーターが、コード配列の転写または発現をコントロールする能力がある場合、そのプロモーターは、コード配列と作動可能に連結されている。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向でプロモーターまたは調節配列と作動可能に連結されうる。「作動可能に連結される」という用語は、時に、発現ベクター内の他の転写制御エレメント（例えばエンハンサー）の配置に適用される。
【００２７】
ＤＮＡなどの外因性核酸または異種核酸が細胞内部に導入されている場合、細胞は「トランスフォーメーション」されている。トランスフォーメーション性ＤＮＡは、細胞のゲノム内に組み込まれている（共有結合）場合も、または組み込まれていない場合もある。例えば、原核生物、酵母、および哺乳類細胞では、トランスフォーメーション性ＤＮＡは、プラスミドなどのエピソームエレメント上に維持することができる。真核細胞に関して、安定トランスフォーメーションされた細胞、または「安定細胞」は、真核細胞が、トランスフォーメーション性ＤＮＡを含有する娘細胞集団から構成される細胞系またはクローンを樹立する能力によって実証される。「クローン」は、単一細胞または共通祖先から有糸分裂によって得られる細胞集団である。「細胞系」は、in vitroで多世代にわたり安定成長する能力がある初代細胞のクローンである。本明細書に提供されるいくつかの実施例では、細胞は、その細胞にＤＮＡをトランスフェクションすることによってトランスフォーメーションされる。
【００２８】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または改変ペプチド結合、すなわちペプチドイソスターによって相互に結合された２個以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を表す。「ポリペプチド」は、一般にペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる短鎖、および広くタンパク質と呼ばれる長鎖の両方を表す。ポリペプチドは、遺伝子にコードされる２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含有しうる。「ポリペプチド」には、翻訳後プロセッシングなどの自然過程、または当技術分野で周知の化学的改変技法のいずれかによって改変されたアミノ酸配列が含まれる。そのような改変は、基礎的な教科書、研究書、および研究文献に詳細に記載されている。改変は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含めた、ポリペプチド内の任意の場所に存在しうる。同じ種類の改変が、所与のポリペプチド内のいくつかの部位に、同じまたは多様な程度で存在しうる。また、所与のポリペプチドは、多種類の改変を含有しうる。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分岐している場合があり、それらが分岐を伴って、または伴わずに、環状の場合もある。環状、分岐および分岐環状ポリペプチドは、自然翻訳後過程に起因しうるか、または合成法によって製造されうる。改変には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジル（phosphotidyl）イノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋結合の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などの、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ介在性付加、およびユビキチン化が挙げられる（例えば、Proteins - Structure and Molecular Properties，2nd Ed.，T.  E.  Creighton，W.  H.  Freeman and Company，New York，1993およびWold，F.，Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects，pgs. 1-12、出典：Posttranslational Covalent Modification of Proteins，B. C. Johnson，Ed.，Academic Press，New York，1983; Seifter et al.，Analysis for Protein Modifications and Nonprotein Cofactors，Meth Enzymol (1990) 182:626-646およびRattan et al.，Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging，Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62参照）。
【００２９】
「生体分子」には、タンパク質、ポリペプチド、核酸、脂質、単糖、多糖、およびその全てのフラグメント、アナログ、ホモログ、コンジュゲート、および誘導体が含まれる。
【００３０】
「発現する」および「産生する」という用語は、本明細書において同義語的に使用され、遺伝子産物の生合成を表す。これらの用語は、ＲＮＡへの遺伝子転写を包含する。これらの用語は、また、１種または複数のポリペプチドへのＲＮＡの翻訳を包含し、さらに、全ての自然の転写後改変および翻訳後改変を包含する。抗体またはその抗原結合フラグメントの発現または産生は、細胞の細胞質でのもの、または細胞培養の成長培地などの細胞外環境内へのものでありうる。
【００３１】
「抗体」は、別段の記載がない限り、各アイソタイプの様々なモノマー形態およびポリマー形態を含めた全てのアイソタイプの免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＹ）を表す。
【００３２】
抗原結合フラグメントは、特定抗原に対して結合親和性を示しうる任意のタンパク質性構造である。いくつかの抗原結合フラグメントは、親抗体分子の抗原結合特異性を保持する、インタクトな抗体の部分から構成される。例えば、抗原結合フラグメントは、特定抗原と結合することが知られている抗体の少なくとも１種の可変領域（重鎖もしくは軽鎖可変領域のいずれか）または１種もしくは複数のＣＤＲを含みうる。適切な抗原結合フラグメントの例には、非限定的に、二重特異性抗体および単鎖分子、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆａｂｃ、およびＦｖ分子、単鎖（Ｓｃ）抗体、個別の抗体軽鎖、個別の抗体重鎖、抗体鎖またはＣＤＲと他のタンパク質、タンパク質足場、または分子とのキメラ融合体、重鎖モノマーまたはダイマー、軽鎖モノマーまたはダイマー、１本の重鎖および１本の軽鎖から成るダイマーなどが挙げられる。抗原結合フラグメントを産生するために全ての抗体アイソタイプを使用することができる。追加的に、抗原結合フラグメントは、関心が持たれる所与の抗原に対する親和性を付与する配向でポリペプチドセグメントをうまく組み入れることができる、タンパク質足場などの非抗体タンパク質性フレームワークを含みうる。抗原結合フラグメントは、リコンビナント産生させるか、またはインタクトな抗体の酵素もしくは化学切断によって産生させることができる。語句「抗体またはその抗原結合フラグメント」は、所与の抗原結合フラグメントが、その語句中で参照される抗体の１個または複数のアミノ酸セグメントを組み入れていることを意味するために使用することができる。
【００３３】
「抗体組成物」は、本明細書記載の少なくとも１種の薬学的に許容される担体、化学療法剤、または診断部分と一緒にされる抗体またはその結合フラグメントを表す。
【００３４】
「特異的結合」は、抗体または抗原結合フラグメントが、他の生体分子と結合できる親和性よりも大きな親和性で特定の生体分子と結合する能力を表す。この用語は、特定の結合相互作用が、他のそのような相互作用の全てではなく大部分よりも、相互作用要素に恵まれていることを意味する「優先的」結合の同義語として使用される。
【００３５】
本明細書記載の態様は、特定の方法、試薬、化合物、組成物または生物学的システムに限定されず、もちろん変動しうる。さらに、本明細書において使用される用語は、特定の抗体または抗原結合フラグメントを説明することだけを目的とし、限定するつもりはない。
【００３６】
抗原性分子および抗原性化合物
本明細書において、ビタミンＤ由来分子と結合する能力がある抗体を発生させるために使用することができる抗原性分子が提供される。いくつかの態様では、抗原性化合物を形成させるために、抗原性分子を担体タンパク質とコンジュゲーションすることができる。抗原性分子への担体タンパク質のコンジュゲーションは、化学リンカーの使用によって生じうる。いくつかの態様では、抗原タンパク質は、異なるビタミンＤ誘導体と等しく結合する抗体を生じうる。
【００３７】
本明細書記載の抗原性分子は、図１（ａ）に示すように、未コンジュゲーション型でＣ２２カルボキシ基を含むビタミンＤ炭素数２２誘導体（ビタミンＤ−Ｃ２２）の使用に基づく（Hollis et al., Clin. Chem. 39(3):529-33 (1993)）。この化合物に基づく抗原性分子は、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３（これらの分子は、ビタミンＤ−Ｃ２２分子に不在の側枝（side arm）だけが構造的に異なる）の共通部分を保持する。ビタミンＤ−Ｃ２２、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の間の構造共通性を考えると、ビタミンＤ−Ｃ２２に基づく抗原を使用して発生された抗体は、２５−ヒドロキシビタミンＤ２と２５−ヒドロキシビタミンＤ３との両方を認識することができる可能性がある。
【００３８】
本明細書に開示された抗原性分子は、抗原性化合物を産生させるために担体タンパク質と組み合わせることができる。担体タンパク質の使用は、抗原性分子が哺乳類での免疫応答を誘発する能力を高めるために有用でありうる。例えば、担体タンパク質は、ホストでのより長い半減期を可能にすることができ、または複数の抗原性分子を同じ担体と結合させて多価抗原性化合物を産生させることができる。いくつかの態様では、記載された抗原性分子は、タンパク質担体に直接取り付ける（affix）ことができる。例えば、ビタミンＤ−Ｃ２２は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と直接コンジュゲーションすることができる。いくつかの態様では、多価抗原性化合物を産生させるために、複数の抗原性分子を同じ担体タンパク質とコンジュゲーションすることができる。所与のタンパク質担体とコンジュゲーションされうる抗原性分子の数は、使用される担体に基づき変動する。例えば、ＢＳＡは、比較的適度な数の、おそらく約１０〜約２５個の抗原性分子の連結に対応し；または、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの担体は、約２００〜約３００個の抗原性分子に対応しうる。一態様では、約７〜約２１個の抗原性分子が担体とコンジュゲーションされるように、ビタミンＤ−Ｃ２２がＢＳＡとコンジュゲーションされる。一態様では、約１２〜約１６個の抗原性分子が担体とコンジュゲーションされるように、ビタミンＤ−Ｃ２２がＢＳＡとコンジュゲーションされる。別のそのような態様では、約１４個のビタミンＤ−Ｃ２２分子がＢＳＡ担体とコンジュゲーションされる。当業者は、本明細書記載の目的のために、多種多様な担体タンパク質を使用できることを理解している。いくつかの適切な担体には、少数だけ挙げると、ＫＬＨ、ＰＥＧ化ＫＬＨ、Concholepas concholepasヘモシアニン（ＣＣＨ）、カチオン化ＢＳＡ、および卵白アルブミンが含まれる。いくつかの態様では、抗原性分子は、担体タンパク質上に存在するアミン基を介して担体タンパク質とコンジュゲーションされる。この性質のコンジュゲーション化学反応は、当業者に一般に公知である。
【００３９】
本明細書記載の抗原性化合物の別の局面は、前記担体タンパク質への前記抗原性分子の間接的コンジュゲーションを可能にする化学リンカーでありうる。化学リンカーは、アルキル、アリール、アルキルオキシ、アミド、スルホンアミドまたはカルボニルまたはペプチド基から構成されうる。タンパク質へのビタミンＤ誘導体のコンジュゲーションは、タンパク質のアミノ基と、ビタミンｄ誘導体の反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）基との間の反応によって達成することができる。リンカーの長さは、使用される担体および担体とコンジュゲーションされる抗原性分子の数に応じて変動しうる。しかし、他の態様では、ＢＳＡまたはＫＬＨなどの多様な担体タンパク質とのコンジュゲーションのために、同じ抗原性分子を同じリンカーと共に使用することができる。いくつかの態様では、リンカーは、式
【００４０】
【化１】
2014516540.tif 000003
［式中、ｘおよびｙは、独立して、約１から約１２まで変動しうる］
を有する直鎖から構成される。このリンカーは、図１（ｂ）に示される式を有する一般抗原性化合物を与える。いくつかの態様では、ｘは３でありえ、ｙは６でありうる。いくつかの態様では、ｘは３でありえ、ｙは７でありうる。いくつかの態様では、ｘは４でありえ、ｙは７でありうる。いくつかの態様では、ｘは５でありえ、ｙは７でありうる。いくつかの態様では、ｘは４でありえ、ｙは６でありうる。いくつかの態様では、ｘは５でありえ、ｙは６でありうる。いくつかの態様では、ｘは３でありえ、ｙは５でありうる。いくつかの態様では、ｘは４でありえ、ｙは５でありうる。いくつかの態様では、ｘは５でありえ、ｙは５でありうる。いくつかの態様では、ｘは３でありえ、ｙは４でありうる。いくつかの態様では、ｘは４でありえ、ｙは４でありうる。いくつかの態様では、ｘは５でありえ、ｙは４でありうる。いくつかの態様では、リンカーは、ビタミンＤ−Ｃ２２とＢＳＡをコンジュゲーションしてビタミンＤ−Ｃ２２ジアミノブタン−スベロイル−ＢＳＡ（ｖｉｔ Ｄ−Ｃ２２ ＢＳＡ）（図１（ｃ））を産生させるために使用される。別の態様では、リンカーは、ビタミンＤ−Ｃ２２とＫＬＨコンジュゲーションしてビタミンＤ−Ｃ２２ジアミノブタン−スベロイル−ＫＬＨ（ｖｉｔ Ｄ−Ｃ２２ ＫＬＨ）（図１（ｄ））を産生させるために使用される。
【００４１】
本明細書に提供される抗原性分子および抗原性化合物は、哺乳類において抗原反応性抗体を産生させるために使用することができる。抗体を産生させるために使用することができる哺乳類には、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ブタ、ウシ、ウサギ、ロバ、ヒトなどが挙げられる。一態様では、哺乳類はマウスである。抗原陽性血清を有する哺乳類は、抗体産生Ｂ細胞の供給源として使用することができ、そのＢ細胞を単離して、ハイブリドーマ細胞などの長寿命抗体産生細胞を産生させるために使用することができる。いくつかの態様では、免疫処置されたマウスから単離されたＢ細胞は、ビタミンＤ−Ｃ２２またはビタミンＤ誘導体と結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を産生させるために使用することができる。
【００４２】
抗体
本明細書において、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および／もしくは２５−ヒドロキシビタミンＤ３などのビタミンＤ誘導体、またはビタミンＤ−Ｃ２２免疫原性分子もしくは化合物などの２５−ヒドロキシビタミンＤアナログと優先的に結合する、単離された抗体または抗原結合フラグメントが記載される。一態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントである。
【００４３】
５個のクラスの免疫グロブリンがあり、その際、Ｆｃ領域中の重鎖の一次構造が免疫グロブリンのクラスを決定する。具体的には、α、δ、ε、γ、およびμ鎖は、それぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭアイソタイプに対応する。前記抗体または抗原結合フラグメントには、４本鎖免疫グロブリンの構造の全てのアイソタイプおよび合成マルチマーが挙げられる。前記抗体または抗原結合フラグメントには、また、一般にメンドリまたはシチメンチョウの血清およびメンドリまたはシチメンチョウの卵黄から見出されるＩｇＹアイソタイプが挙げられる。抗体または抗原結合フラグメントは、非共有結合的に、優先的に、そして可逆的に抗原と結合する。
【００４４】
開示された主題の抗体または抗原結合フラグメントは、任意の種から得ることができる。例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ブタ、ウシ、ウサギ、ロバ、ヒトなどから得ることができる。いくつかの態様では、抗体および抗原結合フラグメントは、マウスから得られる。いくつかの態様では、抗体および抗原結合フラグメントは、本明細書記載の免疫原性化合物を免疫処置されたマウスから得られる。いくつかの態様では、抗体および抗原結合フラグメントは、ビタミンＤ−Ｃ２２ ＢＳＡを免疫処置されたマウスから得られる。いくつかの態様では、抗体は、本明細書記載の免疫原性分子または化合物を使用して産生されたモノクローナル抗体である。前記モノクローナル抗体は、本明細書記載の免疫原性分子または化合物の任意の１種以上を免疫処置されたマウスから得ることができる。例えば、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および／もしくは２５−ヒドロキシビタミンＤ３などのビタミンＤ誘導体、またはビタミンＤ−Ｃ２２免疫原性分子もしくは化合物などの２５−ヒドロキシビタミンＤアナログと優先的に結合する能力があるモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、ビタミンＤ−Ｃ２２免疫原性分子または化合物を免疫処置されたマウスから得ることができる。
【００４５】
いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、キメラでありうる。本明細書に使用される用語「キメラ」抗体または抗原結合フラグメントは、非ヒト哺乳類、げっ歯類、または爬虫類の抗体アミノ酸配列由来の少なくとも１種の可変ドメインの少なくともいくつかの部分を有する一方で、その抗体またはその抗原結合フラグメントの残りの部分がヒト由来である、抗体またはその抗原結合フラグメントを意味する。例えば、キメラ抗体は、ヒトＦｃまたは他のそのような構造ドメインを有するマウス抗原結合ドメインを含みうる。
【００４６】
いくつかの態様では、前記抗体は、ヒト化されうる。例えば、ヒト抗体のＣＤＲを本明細書記載の重鎖および軽鎖ＣＤＲと交換して、本明細書記載の抗体と同じまたは実質的に類似の結合特徴を有する抗体またはその抗原結合フラグメントであるが、ヒト定常領域およびヒトフレームワーク領域から構成される抗体またはその抗原結合フラグメントを産生させることができる。そのような抗体を産生させる方法は、当業者に一般に公知であり、したがって本開示の範囲内であると見なすべきである。
【００４７】
本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントは、例えば診断応用のために、様々な化学的部分または生体分子部分と、ラベル化またはその他の方法でコンジュゲーションすることができる。その部分は、検出可能なラベル、例えば化学発光ラベル（例えば、アクリジニウムエステルおよびスルホンアミド、ルミノールおよびイソルミノール）、リン光ラベル、蛍光ラベル（例えばＦＩＴＣ）、電気化学発光ラベル（例えばルテニウム（ＩＩ）キレート）、クローニングされた酵素ドナー、ＬＯＣＩ（luminescent oxygen channeling immunoassay）用の光増感粒子または化学発光粒子、ＴＲ−ＦＩＡ（time-resolved fluorescence immunoassay）用のランタニドキレート、放射性ラベル、ビオチン、ジゴキシゲニン、酵素など、例えば、非限定的にトリチウム、炭素１４、鉛２１２、ビスマス２１２、アスタチン２１１、ヨウ素１３１、スカンジウム４７、レニウム１８６、レニウム１８８、イットリウム９０、ヨウ素１２３、ヨウ素１２４、ヨウ素１２５、臭素７７、インジウム１１１などの放射性核種、およびホウ素１０またはアクチニドなどの核分裂性核種でありうる。いくつかの態様では、試料中の結合型抗体を検出するために、酵素が前記抗体または抗原結合タンパク質とコンジュゲーションされる場合がある。そのような酵素コンジュゲートには、非限定的に、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）が挙げられる。溶液に基づくイムノアッセイで抗体結合を決定するために使用される他の酵素は、本明細書記載の抗体および抗原結合フラグメント用のコンジュゲートとしての使用に適していることが、当業者によって理解されている。加えて、イムノアッセイでの検出を可能にするために、アクリジニウムエステルなどの化合物も、提供された抗体および抗原結合フラグメントとコンジュゲーションすることができる。
【００４８】
抗体結合は、主に、６個のＣＤＲ領域、特にＨ鎖ＣＤＲ３によって決定される（Kala et al., 132 J. Biochem. 535-41 (2002); Morea et al., 275 J. Mol. Biol. 269-94 (1998); and Chothia et al., 196 J. Mol. Biol. 901-17 (1987)）。しかし、抗体フレームワーク領域は、抗原抗体相互作用に（Panka et al., 85 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 3080-4 (1988)）、特にＣＤＲループのコンフォメーションに影響を及ぼすことに役割を果たしうる（Foote et al., 224 J. Mol. Biol. 487-99 (1992)）。したがって、記載された抗体または抗原結合フラグメントは、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および／もしくは２５−ヒドロキシビタミンＤ３またはビタミンＤ−Ｃ２２に基づく免疫原に対する優先的結合を付与する、ＨまたはＬ鎖のＣＤＲまたはＦＷＲ領域の任意の組み合わせを含みうる。当技術分野で日常的に実施されるドメインシャフリング実験（Jirholt et al., 215 Gene 471-6 (1998); Soederlind et al., 18 Nature Biotechnology 852-6 (2000)）を、ここに記載および例示された明細書にしたがって２５−ヒドロキシビタミンＤ２および／もしくは２５−ヒドロキシビタミンＤ３またはビタミンＤ−Ｃ２２に基づく免疫原と優先的に結合する抗体を発生させるために採用することができる。そのようなドメインシャフリング実験によって発生した抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントの範囲内である。さらに、ＣＤＲは、また、ＣＤＲ足場形成として役立つ抗体様タンパク質を工学処理することによって、所与の抗原と結合するように配置することができる（Nicaise et al., 13 Protein Sci. 1882 (2004)）。そのような抗原結合タンパク質は、本明細書記載の抗体の範囲内である。
【００４９】
本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントは、多様な形態で存在することができるが、表１に示される抗体セグメントの１個または複数を含むであろう。
【００５０】
【表１】
2014516540.tif 000004
【００５１】
いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１０と実質的に同じまたは同一の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１１と実質的に同じまたは同一の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１２と実質的に同じまたは同一の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２６と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２７と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２８と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１０と実質的に同じまたは同一の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号１１と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号１２と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２６と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２７と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号２８と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、重鎖および軽鎖を含む場合があり、ここで、重鎖は、配列番号１０と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号１１と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号１２と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有し；軽鎖は、配列番号２６と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２７と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号２８と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する。ＣＤＲの抗原結合配置は、また、ＣＤＲ足場形成として抗体様タンパク質を使用して工学処理することができる。そのような工学処理された抗原結合タンパク質は、本開示の範囲内である。
【００５２】
いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１３と実質的に同じまたは同一の重鎖ＦＷＲ１アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１４と実質的に同じまたは同一の重鎖ＦＷＲ２アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１５と実質的に同じまたは同一の重鎖ＦＷＲ３アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２９と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＦＷＲ１アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号３０と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＦＷＲ２アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号３１と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＦＷＲ３アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１３と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ１アミノ酸配列；配列番号１４と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ２アミノ酸配列；および配列番号１５と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ３アミノ酸配列を有する重鎖を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２９と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ１アミノ酸配列；配列番号３０と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ２アミノ酸配列；および配列番号３１と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ３アミノ酸配列を有する軽鎖を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、重鎖および軽鎖を含む場合があり、ここで、重鎖は、配列番号１３と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ１アミノ酸配列；配列番号１４と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ２アミノ酸配列；および配列番号１５と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ３アミノ酸配列を含み；軽鎖は、配列番号２９と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ１アミノ酸配列；配列番号３０と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ２アミノ酸配列；および配列番号３１と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ３アミノ酸配列を含む。
【００５３】
いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１０と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号１１と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号１２と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ３アミノ酸配列；配列番号１３と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ１アミノ酸配列；配列番号１４と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ２アミノ酸配列；および配列番号１５と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ３アミノ酸配列を有する重鎖を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２６と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２７と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号２８と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ３アミノ酸配列；配列番号２９と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ１アミノ酸配列；配列番号３０と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ２アミノ酸配列；および配列番号３１と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ３アミノ酸配列を有する軽鎖を含む。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、重鎖および軽鎖を含み、ここで、重鎖は、配列番号１０と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号１１と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号１２と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ３アミノ酸配列；配列番号１３と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ１アミノ酸配列；配列番号１４と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ２アミノ酸配列；および配列番号１５と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ３アミノ酸配列を含み；軽鎖は、配列番号２６と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２７と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号２８と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ３アミノ酸配列；配列番号２９と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ１アミノ酸配列；配列番号３０と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ２アミノ酸配列；および配列番号３１と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ３アミノ酸配列を含む。ＣＤＲおよびＦＷＲの抗原結合配置は、また、ＣＤＲ足場形成として抗体様タンパク質を使用して工学処理することができる。そのような工学処理された抗原結合タンパク質は、本開示の範囲内である。
【００５４】
いくつかの態様では、本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントは、マウス重鎖を有する。いくつかの態様では、本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントは、マウス軽鎖を有する。記載された抗体または抗原結合フラグメントは、重鎖および軽鎖を有する場合があり、ここで、重鎖はマウス重鎖であり、軽鎖はマウス軽鎖である。いくつかの態様では、本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントは、マウスＩｇＧ１重鎖を有する。いくつかの態様では、本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントは、マウスＩｇκ軽鎖を有する。前記抗体または抗原結合フラグメントは、重鎖および軽鎖を有する場合があり、ここで、重鎖はマウスＩｇＧ１重鎖であり、軽鎖はマウスＩｇκ鎖である。
【００５５】
抗体をコードするポリヌクレオチド
２５−ヒドロキシビタミンＤ２および／もしくは２５−ヒドロキシビタミンＤ３などのビタミンＤ誘導体、またはビタミンＤ−Ｃ２２免疫原性分子もしくは化合物などの２５−ヒドロキシビタミンＤアナログと優先的に結合する抗体または抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドも記載される。記載されたポリヌクレオチドは、多様な形態で存在することができ、したがって、ネイティブなポリヌクレオチド、リコンビナントポリヌクレオチド（ｃＤＮＡなど）、または合成的に産生されたポリヌクレオチドでありうる。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号１０と実質的に同じまたは同一の重鎖ＣＤＲ１配列、例えば配列番号２を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号１１と実質的に同じまたは同一の重鎖ＣＤＲ２、例えば配列番号３を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号１２と実質的に同じまたは同一の重鎖ＣＤＲ３、例えば配列番号４を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号２６と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号１８を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号２７と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＣＤＲ２、例えば配列番号１９を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号２８と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＣＤＲ３、例えば配列番号２０を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。ポリヌクレオチドは、配列番号１０と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ１、例えば配列番号２；配列番号１１と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ２、例えば配列番号３；および配列番号１２と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ３、例えば配列番号４を有する重鎖を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードしうる。ポリヌクレオチドは、配列番号２６と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号１８；配列番号２７と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ２、例えば配列番号１９；および配列番号２８と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ３、例えば配列番号２０を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードしうる。ポリヌクレオチドは、配列番号１０と実質的に同じまたは同一の重鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号２；配列番号１１と実質的に同じまたは同一のヌクレオチド配列、例えば配列番号３によってコードされるＣＤＲ２；および配列番号１２と実質的に同じまたは同一のヌクレオチド配列、例えば配列番号４によってコードされるＣＤＲ３；および配列番号２６と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号１８；配列番号２７と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ２、例えば配列番号１９；および配列番号２８と実質的に同じまたは同一のＣＤＲ３、例えば配列番号２０を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードしうる。
【００５６】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号１３と実質的に同じまたは同一の重鎖ＦＷＲ１、例えば配列番号５を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号１４と実質的に同じまたは同一の重鎖ＦＷＲ２、例えば配列番号６を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号１５と実質的に同じまたは同一の重鎖ＦＷＲ３、例えば配列番号７を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号２９と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＦＷＲ１、例えば配列番号２１を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号３０と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＦＷＲ２、例えば配列番号２２を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号３１と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＦＷＲ３、例えば配列番号２３を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号１３と実質的に同じまたは同一の重鎖ＦＷＲ１、例えば配列番号５；配列番号１４と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ２、例えば配列番号６；および配列番号１５と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ３、例えば配列番号７を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号２９と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＦＷＲ１、例えば配列番号２１；配列番号３０と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ２、例えば配列番号２２；および配列番号３１と実質的に同じまたは同一のＦＷＲ３、例えば配列番号２３を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、重鎖および軽鎖を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードし、ここで、重鎖ＦＷＲ１は、配列番号１３と実質的に同じまたは同一、例えば配列番号５であり；重鎖ＦＷＲ２は、配列番号１４と実質的に同じまたは同一、例えば配列番号６であり；重鎖ＦＷＲ３は、配列番号１５と実質的に同じまたは同一、例えば配列番号７であり；軽鎖ＦＷＲ１は、配列番号２９と実質的に同じまたは同一、例えば配列番号２１であり；軽鎖ＦＷＲ２は、配列番号３０と実質的に同じまたは同一、例えば配列番号２２であり；軽鎖ＦＷＲ３は、配列番号３１と実質的に同じまたは同一、例えば配列番号２３である。
【００５７】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号１０と実質的に同じまたは同一の重鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号２；配列番号１１と実質的に同じまたは同一の重鎖ＣＤＲ２、例えば配列番号３；および配列番号１２と実質的に同じまたは同一の重鎖ＣＤＲ３、例えば配列番号４；配列番号１３と実質的に同じまたは同一の重鎖ＦＷＲ１、例えば配列番号５；配列番号１４と実質的に同じまたは同一の重鎖ＦＷＲ２、例えば配列番号６；および配列番号１５と実質的に同じまたは同一の重鎖ＦＷＲ３、例えば配列番号７を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号２６と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号１８；配列番号２７と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＣＤＲ２、例えば配列番号１９；および配列番号２８と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＣＤＲ３、例えば配列番号２０；配列番号２９と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＦＷＲ１、例えば配列番号２１；配列番号３０と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＦＷＲ２、例えば配列番号２２；および配列番号３１と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＦＷＲ３、例えば配列番号２３を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。
【００５８】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、重鎖および軽鎖を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードし、ここで、そのポリヌクレオチドは、配列番号１０と実質的に同じまたは同一の重鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号２；配列番号１１と実質的に同じまたは同一の重鎖ＣＤＲ２、例えば配列番号３；配列番号１２と実質的に同じまたは同一の重鎖ＣＤＲ３、例えば配列番号４；配列番号１３と実質的に同じまたは同一の重鎖ＦＷＲ１、例えば配列番号５；配列番号１４と実質的に同じまたは同一の重鎖ＦＷＲ２、例えば配列番号６；および配列番号１５と実質的に同じまたは同一の重鎖ＦＷＲ３、例えば配列番号７；および配列番号２６と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＣＤＲ１、例えば配列番号１８；配列番号２７と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＣＤＲ２、例えば配列番号１９；配列番号２８と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＣＤＲ３、例えば配列番号２０；配列番号２９と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＦＷＲ１、例えば配列番号２１；配列番号３０と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＦＷＲ２、例えば配列番号２２；および配列番号３１と実質的に同じまたは同一の軽鎖ＦＷＲ３、例えば配列番号２３をコードする。
【００５９】
工学処理された抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドも、本開示の範囲内である。
【００６０】
いくつかの態様では、前記ポリヌクレオチド（およびそれらがコードするペプチド）は、リーダー配列を含む。当技術分野において公知の任意のリーダー配列を採用することができる。いくつかの態様では、リーダー配列は、抗体の重鎖または軽鎖リーダー配列であるか、またはそれに基づきうる。リーダー配列には、非限定的に、制限部位または翻訳開始部位が含まれうる。
【００６１】
重鎖および軽鎖ならびにそれらをコードする遺伝子の間に存在するおそれがある自然配列変異のせいで、独特な結合特性（例えば特異性および親和性）にほとんどまたは全く影響なしに、そのアミノ酸配列または本明細書記載の抗体もしくは抗原結合フラグメントをコードする遺伝子内に多少のレベルの変異が見出されることが予期されよう。そのような予期は、一部に遺伝コードの縮重のせいであり、さらにはコードされるタンパク質の性質をあまり変化させない保存的アミノ酸配列変異の進化的成功のせいである。したがって、いくつかの態様は、本明細書における抗体または抗原結合フラグメントと９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有する抗体または抗原結合フラグメントを含む。他の態様は、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および／もしくは２５−ヒドロキシビタミンＤ３などのビタミンＤ誘導体、またはビタミンＤ−Ｃ２２免疫原性分子もしくは化合物などの２５−ヒドロキシビタミンＤアナログと優先的に結合する抗体またはそのような抗体の抗原結合フラグメントであって、本明細書記載の抗体および抗原結合フラグメントと顕著な相同性を共有しないフレームワーク、足場、または他の非結合領域を有するが、結合性を付与するために必要な１種または複数のＣＤＲまたは他の配列（本明細書記載のそのような配列と９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同である）を実際に組み入れている、抗体または抗原結合フラグメントを含む。
【００６２】
本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントには、前記抗体または抗原結合フラグメントの生物学的性質（例えば結合親和性または結合選好性）を有する１個または複数のアミノ酸置換、欠失、または付加を有する変異体が含まれる。当業者は、１個または複数のアミノ酸置換、欠失、または付加を有する変異体を産生させることができる。これらの変異体には：（ａ）１個以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸で置換された変異体、（ｂ）１個以上のアミノ酸がポリペプチドから付加または欠失された変異体、（ｃ）１個以上のアミノ酸が置換基を含む変異体、および（ｄ）ポリペプチドが、例えば抗体に対するエピトープ、ポリヒスチジン配列、ビオチン部分などの、ポリペプチドに有用な性質を付与しうる、融合パートナー、タンパク質タグまたは他の化学部分などの別のペプチドまたはポリペプチドと融合された変異体が含まれうる。本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントには、ある種からのアミノ酸残基が、保存された位置または保存されていない位置のいずれかで、別の種での対応する残基に置換されている変異体が含まれうる。他の態様では、保存されていない位置のアミノ酸残基は、保存的または非保存的残基で置換されている。遺伝的（抑制、欠失、突然変異など）、化学的、および酵素的技法を含めた、これらの変異体を得るための技法は、当業者に公知である。
【００６３】
本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥなどのいくつかの抗体アイソタイプを具体化しうる。抗体またはその抗原結合フラグメントの特異性は、主として、ＣＤＲのアミノ酸配列および配置によって決定される。したがって、抗原特異性を変化させずに、あるアイソタイプのＣＤＲを別のアイソタイプに移行させることができる。または、抗原特異性を変化させずに、ハイブリドーマに、ある抗体アイソタイプから別のアイソタイプへとスイッチさせる（アイソタイプスイッチング）技法が確立されている。したがって、そのような抗体アイソタイプは、前記抗体または抗原結合フラグメントの範囲内である。
【００６４】
本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントは、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および／もしくは２５−ヒドロキシビタミンＤ３などのビタミンＤ誘導体、またはビタミンＤ−Ｃ２２免疫原性分子もしくは化合物などの２５−ヒドロキシビタミンＤアナログに対して、１×１０−２未満の解離定数（ＫＤ）が含まれる結合親和性（Ｍ単位）を有する。いくつかの態様では、ＫＤは、１×１０−３未満である。他の態様では、ＫＤは、１×１０−４未満である。いくつかの態様では、ＫＤは、１×１０−５未満である。なお他の態様では、ＫＤは、１×１０−６、２×１０−６、３×１０−６、４×１０−６、５×１０−６、６×１０−６、７×１０−６、８×１０−６、または９×１０−６未満である。他の態様では、ＫＤは、１×１０−７、２×１０−７、または３×１０−７、２×１０−７、３×１０−７、４×１０−７、５×１０−７、６×１０−７、７×１０−７、８×１０−７、または９×１０−７未満である。他の態様では、ＫＤは、１×１０−８、２×１０−８、３×１０−８、４×１０−８、５×１０−８、６×１０−８、７×１０−８、８×１０−８、または９×１０−８未満である。他の態様では、ＫＤは、１×１０−９、２×１０−９、３×１０−９、４×１０−９、５×１０−９、６×１０−９、７×１０−９、８×１０−９、または９×１０−９未満である。他の態様では、ＫＤは、１×１０−１０、２×１０−１０、３×１０−１０、２×１０−１０、３×１０−１０、４×１０−１０、５×１０−１０、６×１０−１０、７×１０−１０、８×１０−１０、または９×１０−１０未満である。なお他の態様では、ＫＤは、１×１０−１１、２×１０−１１、３×１０−１１、４×１０−１１、５×１０−１１、６×１０−１１、７×１０−１１、８×１０−１１、または９×１０−１１未満である。いくつかの態様では、ＫＤは、１×１０−１２未満である。他の態様では、ＫＤは、１×１０−１３未満である。他の態様では、ＫＤは、１×１０−１４未満である。なお他の態様では、ＫＤは、１×１０−１５未満である。
【００６５】
本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントは、いくつかの態様では、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の等モル認識を行う。
【００６６】
例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントがそのエピトープと結合するのを共有結合が阻止しないように、任意の種類の分子を抗体またはその抗原結合フラグメントに共有結合させることによって、本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントを改変することができる。適切な改変の例には、非限定的に、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化などが挙げられる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、それ自体、公知の保護／ブロッキング基、タンパク質分解切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質との連結などによって誘導体化することができる。抗体または抗原結合フラグメントは、活性または安定性を改善する翻訳後部分を抗体またはその抗原結合フラグメント上に有しうる。これらの部分には、硫黄、メチル、糖質、リンおよび免疫グロブリン分子上に通常見出される他の化学基が挙げられる。さらに、抗体または抗原結合フラグメントは、１個以上の非古典的アミノ酸を含有しうる。
【００６７】
本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントは、診断ラベルでラベル、または診断ラベルとコンジュゲーションすることができる。
【００６８】
本明細書記載のポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。ベクターは、発現ベクターでありうる。したがって、関心が持たれるポリペプチドをコードする配列を含有するリコンビナント発現ベクターが提供される。発現ベクターは、非限定的に、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）、選択マーカー、およびポリアデニル化シグナルなどの１種以上の追加的な配列を含有しうる。いくつかの態様では、ベクターは、本明細書記載の抗体または抗原結合タンパク質の重鎖セグメントをコードしうる。いくつかの態様では、ベクターは、本明細書記載の抗体または抗原結合タンパク質の軽鎖セグメントをコードしうる。ときには、重鎖および軽鎖構成要素は、単一のベクターによってコードされうる。他の態様では、重鎖および軽鎖構成要素は、異なるベクターによってコードされうる。多種多様なホスト細胞をトランスフォーメーションするためのベクターは、周知であり、それには、非限定的に、プラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ならびに他の細菌、酵母およびウイルスベクターが挙げられる。
【００６９】
本明細書の範囲内のリコンビナント発現ベクターは、適切な調節エレメントと作動可能に連結されうる、少なくとも１種のリコンビナントタンパク質をコードする合成、ゲノム、またはｃＤＮＡ由来核酸フラグメントを含む。そのような調節エレメントには、転写プロモーター、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終止をコントロールする配列が含まれうる。発現ベクター、特に哺乳類発現ベクターは、また、複製起点、発現されるべき遺伝子に連結された適切なプロモーターおよびエンハンサー、他の５’または３’フランキング非転写配列、５’または３’非翻訳配列（必要なリボソーム結合部位など）、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、または転写終止配列などの１種または複数の非転写エレメントを含みうる。ホストにおいて複製する能力を付与する複製起点もまた、組み入れることができる。
【００７０】
脊椎動物細胞をトランスフォーメーションする際に使用されるべき、発現ベクター中の転写および翻訳コントロール配列は、ウイルス起原によって提供することができる。例示的なベクターは、Okayama and Berg, 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983)に記載のように構築することができる。
【００７１】
いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントをコードする配列は、以下の遺伝子用のプロモーターなどの、強力な構成的プロモーターのコントロール下に置かれる：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、β−アクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチンなど。加えて、多数のウイルスプロモーターが、原核細胞で構成的に機能し、前記態様での使用に適している。そのようなウイルスプロモーターには、非限定的に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、マロニー（Maloney）白血病ウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および他のレトロウイルス、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。一態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントのコード配列は、メタロチオネインプロモーター、テトラサイクリン誘導プロモーター、ドキシサイクリン誘導プロモーター、プロテインキナーゼＲ、２’，５’−オリゴアデニル酸合成酵素、Ｍｘ遺伝子、ＡＤＡＲ１などの１個以上のインターフェロン活性化応答エレメント（ＩＳＲＥ）を含有するプロモーターなどの誘導プロモーターのコントロール下に置かれる。
【００７２】
本明細書記載のベクターは、１個以上の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有しうる。融合ベクター内へのＩＲＥＳ配列の包含は、いくつかのタンパク質の発現を高めるために有益でありうる。いくつかの態様では、ベクター系は、任意の上述の核酸配列の上流または下流でありうる１個または複数のポリアデニル化部位（例えばＳＶ４０）を含む。ベクター構成要素は、遺伝子産物を発現させるために最適な間隔を提供するように（すなわちＯＲＦの間に「スペーサー」ヌクレオチドを導入することによって）、連続的に連結もしくは配置する、または別の方法で位置付けることができる。ＩＲＥＳモチーフなどの調節エレメントも、発現のために最適な間隔を提供するように配置することができる。
【００７３】
ベクターは、当技術分野において周知の選択マーカーを含みうる。選択マーカーには、正のおよび負の選択マーカー、例えば抗生物質耐性遺伝子（例えばネオマイシン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ペニシリン耐性遺伝子）、グルタミン酸合成酵素遺伝子、ＨＳＶ−ＴＫ、ガンシクロビル選択用のＨＳＶ−ＴＫ誘導体、または６−メチルプリン選択用の細菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子が挙げられる（Gadi et al., 7 Gene Ther. 1738-1743 (2000)）。選択マーカーまたはクローニング部位をコードする核酸配列は、関心が持たれるポリペプチドをコードする核酸配列またはクローニング部位の上流または下流でありうる。
【００７４】
本明細書記載のベクターは、様々な細胞に、前記抗体または抗原結合フラグメントをコードする遺伝子をトランスフォーメーションするために使用することができる。例えば、ベクターは、抗体または抗原結合フラグメントを産生する細胞を発生させるために使用することができる。したがって、別の局面は、本明細書において記載および例示された抗体または抗原結合フラグメントなどの、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および／もしくは２５−ヒドロキシビタミンＤ３などのビタミンＤ誘導体、またはビタミンＤ−Ｃ２２免疫原性分子もしくは化合物などの２５−ヒドロキシビタミンＤアナログと結合する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含むベクターをトランスフォーメーションされたホスト細胞を特徴とする。
【００７５】
細胞に外来遺伝子を導入するための多数の技法が、当技術分野において公知であり、それらの方法は、本明細書において記載および例示された多様な態様にしたがって前記方法を実施する目的でリコンビナント細胞を構築するために使用することができる。異種遺伝子配列が細胞後代によって遺伝および発現可能であるように、その結果、レシピエント細胞の必要な発生および生理機能が破壊されないように、使用される技法は、ホスト細胞に異種遺伝子配列が安定導入されるよう備えるべきである。使用できる技法には、非限定的に、染色体導入（例えば、細胞融合、染色体介在性遺伝子導入、微小細胞介在性遺伝子導入）、物理的方法（例えば、トランスフェクション、スフェロプラスト融合、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム担体）、ウイルスベクター導入（例えば、リコンビナントＤＮＡウイルス、リコンビナントＲＮＡウイルス）などが挙げられる（Cline, 29 Pharmac. Ther. 69-92 (1985)に記載）。リン酸カルシウム沈殿およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導性の細菌プロトプラストと哺乳類細胞との融合も、細胞をトランスフォーメーションするために使用することができる。
【００７６】
本明細書記載の抗体または抗体結合フラグメントの発現に使用するために適した細胞は、好ましくは、真核細胞、より好ましくは植物、げっ歯類、またはヒト起源の細胞、例えば、非限定的にＮＳＯ、ＣＨＯ、ｐｅｒＣ．６、Ｔｋ−ｔｓ１３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ−７、Ｔ９８Ｇ、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＮＳ１、Ｓｐ２／０ミエローマ細胞、およびとりわけＢＨＫ細胞系である。加えて、抗体の発現は、ハイブリドーマ細胞を使用して果たすことができる。ハイブリドーマを産生させるための方法は、当技術分野において十分に確立されている。
【００７７】
本明細書記載の発現ベクターをトランスフォーメーションされた細胞は、本明細書記載の抗体または抗体結合フラグメントのリコンビナント発現について選択またはスクリーニングすることができる。リコンビナント陽性細胞がエクスパンションされ、所望の表現型（高レベル発現、増強された成長特性、または例えばタンパク質の改変または翻訳後改変の変化により所望の生化学的特徴を有するタンパク質を産生する能力など）を示すサブクローンについてスクリーニングされる。これらの表現型は、所与のサブクローンの固有の性質または突然変異が原因でありうる。突然変異は、化学物質、ＵＶ波長光、放射線、ウイルス、挿入突然変異原、ＤＮＡミスマッチ修復阻害、またはそのような方法の組み合わせの使用によりもたらすことができる。
【００７８】
所望のタンパク質を発現している細胞が同定されたならば、それをエクスパンションさせて選択することができる。トランスフォーメーションされた細胞は、いくつかの方法で選択することができる。例えば、関心が持たれるポリペプチドの発現について細胞を選択することができる。蛍光タンパク質の産生などの選択マーカーを含有するベクターをトランスフォーメーションされた細胞は、そのマーカーの発現についてポジティブ選択することができる。他の態様では、薬物耐性遺伝子を有するベクターを含有する細胞は、選択条件下で成長する能力についてポジティブ選択することができる。
【００７９】
アッセイおよび方法
本明細書記載の抗体および抗原結合フラグメントは、試料中のビタミンＤ誘導体またはアナログを検出するために使用することができる。いくつかの態様では、抗体および抗原結合フラグメントは、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および／もしくは２５−ヒドロキシビタミンＤ３などのビタミンＤ誘導体、またはビタミンＤ−Ｃ２２免疫原性分子もしくは化合物などの２５−ヒドロキシビタミンＤアナログを検出するために使用される。いくつかの態様では、前記抗体および抗原結合フラグメントは、患者または対象から得られた生物学的試料中のビタミンＤ誘導体またはアナログを検出するために使用することができる。いくつかの態様では、試料は、血液、または血清などの血液成分でありうる。好ましい態様では、患者または対象はヒトである。いくつかの局面では、生物学的試料は、ヒト患者または対象から、例えばヒト血液から得ることができる。記載された方法は、抗体および抗原結合フラグメント単独で、または他の容易に入手可能な抗体または検出試薬と共に使用することができる。
【００８０】
本明細書において、対象でのビタミンＤ欠乏を検出するための方法が提供される。好ましい態様では、対象はヒトである。方法は、対象から得られた生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルを決定することを含み、ここで、正常対照中のレベルまたは閾値レベル３０ng/mLに対する、生物学的試料中のレベルの減少または低下は、対象でのビタミンＤ欠乏を示す。
【００８１】
２５−ヒドロキシビタミンＤは、２種の形態、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３のいずれかでありうる。対象でのビタミンＤ欠乏を検出するための方法の好ましい態様では、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３のレベルは、生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させることによって決定される。
【００８２】
競合的または非競合的のいずれかの様々な異種および同種プロトコールを、対象でのビタミンＤ欠乏を検出するための方法の実施に採用することができる。好ましい態様では、方法は、連続競合イムノアッセイによって行われる。Centaur（商標）、Vista（商標）、およびImmulite（商標）は、競合イムノアッセイを行うために使用することができるアッセイ系である。
【００８３】
対象でのビタミンＤ欠乏を検出するための方法によると、生物学的試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の総レベルは、強化化学発光（ＥＣＬ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウエスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光、平衡透析、免疫識別（immunodifferentiation）、または酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によって検出することができる。
【００８４】
対象でのビタミンＤ欠乏を検出するための方法の好ましい態様では、その方法にしたがって使用される抗体または抗原結合フラグメントは、ビタミンＤ２および／またはビタミンＤ３と交差反応しない。好ましい態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントである。例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２６で示されるＬｃ ＣＤＲ１、配列番号２７で示されるＬｃ ＣＤＲ２、および配列番号２８で示されるＬｃ ＣＤＲ３、配列番号１０で示されるＨｃ ＣＤＲ１、配列番号１１で示されるＨｃ ＣＤＲ２および配列番号１２で示されるＨｃ ＣＤＲ３を含む。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３について等モル認識する性質を有する。好ましい態様では、抗体は、モノクローナル抗体１０Ｈ９である。
【００８５】
対象でのビタミンＤ欠乏を検出するための方法に使用することができる、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識する抗体および抗原結合フラグメントは、例えば、検出可能なラベルでラベルすることができる。例示的なラベルには、非限定的に、化学発光化合物（例えばアクリジニウムエステル化合物）、リン光化合物、蛍光化合物、放射性ラベル、ビオチン、または酵素が挙げられる。言及された例示的なラベルは、通常、非限定的に、異なる化学物質の添加、光による刺激、または基質もしくは他の化合物への曝露が含まれる方法によって励起された場合にのみ検出することができる。アクリジニウムエステル化合物を使用する場合、化学発光は、適切な計装によって読み取ることができる閃光を生じるペルオキシドおよび酸／塩基によってトリガーされる。検出可能なラベルが検出可能になり始める前に、随意の洗浄ステップを用いることができる。
【００８６】
抗体または抗原結合フラグメントは、固相支持体上に固定化することができる。
【００８７】
抗体または抗原結合フラグメントは、担体タンパク質とコンジュゲーションすることができる。抗体または抗原結合タンパク質と担体タンパク質との間の複合体も、固相支持体上に固定化することができる。
【００８８】
対象でのビタミンＤ欠乏を検出するための方法に使用するための固相支持体には、常磁性粒子；商標SEPHADEX（Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.）で入手可能な架橋デキストラン；アガロース；ポリスチレンビーズ；シート、ストリップもしくはパドルなどの、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロースもしくはナイロンベースのウェブ；またはポリスチレンもしくはポリ塩化ビニル製などのチューブ、プレートもしくはマイクロタイタープレートのウェルが挙げられる。常磁性粒子を使用する場合、随意の洗浄ステップの間に、ある磁場源を用いて、粒子および粒子に直接または間接的に結合している分子を保持することができる。分子は、共有結合的に、塩橋、水素結合または別の種類の結合によって、結合することができる。
【００８９】
生物学的試料は、血液、血清または血漿でありうる。いくつかの態様では、生物学的試料は、本明細書記載の方法への使用前に、生物学的条件下で最大２４時間保存することができる。
【００９０】
対象でのビタミンＤ欠乏を検出するための方法のいくつかの態様では、生物学的試料は、その生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させる前に、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）で処理またはそれと混合される。または、生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、その生物学的試料は、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）で処理またはそれと混合することができる。ＡＮＳは、ＡＮＳの酸または塩（例えば、ＡＮＳナトリウム塩、ＡＮＳカリウム塩、ＡＮＳヘミマグネシウム塩またはＡＮＳアンモニウム塩）の形態でありうる。ＡＮＳは、例えば、置換緩衝液中に存在しうる。場合により、生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させる前に、または生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、メタノールを８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）と共に使用することができる。メタノールは、例えば、置換緩衝液中に入れることができる。
【００９１】
対象でのビタミンＤ欠乏を検出するための方法のいくつかの態様では、また、その生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させる前に、生物学的試料は、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）およびエチレングリコールで処理またはそれと混合される。または、生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、その生物学的試料は、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）およびエチレングリコールで処理またはそれと混合することができる。ＡＮＳは、ＡＮＳの酸または塩（例えば、ＡＮＳナトリウム塩、ＡＮＳカリウム塩、ＡＮＳヘミマグネシウム塩またはＡＮＳアンモニウム塩）の形態でありうる。ＡＮＳおよびエチレングリコールは、置換緩衝液中に存在しうる。場合により、生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させる前に、または生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、メタノールを８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）およびエチレングリコールと共に使用することができる。メタノールは、例えば、置換緩衝液中に入れることができる。
【００９２】
対象でのビタミンＤ欠乏を検出するための方法のいくつかの態様では、２５−ヒドロキシビタミンＤアナログは、接触させるステップの後に、生物学的試料に添加される。２５−ヒドロキシビタミンＤアナログはラベルすることができる。２５−ヒドロキシビタミンＤアナログまたはラベルされた２５−ヒドロキシビタミンＤアナログは、また、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）を含む安定化緩衝液中に存在しうる。ＡＮＳは、ＡＮＳの酸または塩（例えば、ＡＮＳナトリウム塩、ＡＮＳカリウム塩、ＡＮＳヘミマグネシウム塩またはＡＮＳアンモニウム塩）の形態でありうる。
【００９３】
本明細書記載のビタミンＤアナログは、図１（ａ）に示すような未コンジュゲーションのときにＣ２２カルボキシ基を含むビタミンＤ炭素数２２誘導体（ビタミンＤ−Ｃ２２）の使用に基づきうる（Hollis et al., Clin. Chem. 39(3):529-33 (1993)）。いくつかの態様では、ビタミンＤアナログは、ビタミンＤ−Ｃ２２でありうる。いくつかの態様では、ビタミンＤアナログは、担体タンパク質とコンジュゲーションしている場合がある。
【００９４】
対象でのビタミンＤ欠乏を検出するための方法のいくつかの態様では、前記ビタミンＤアナログは、タンパク質担体に直接取り付けることができる。例えば、ビタミンＤ−Ｃ２２は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と直接コンジュゲーションすることができる。所与のタンパク質担体とコンジュゲーションされうるビタミンＤアナログの数は、使用される担体に基づき変動する。当業者は、本明細書記載の目的のために、多種多様な担体タンパク質を使用できることを理解している。いくつかの適切な担体には、少数だけ挙げると、ＫＬＨ、ＰＥＧ化ＫＬＨ、Concholepas concholepasヘモシアニン（ＣＣＨ）、カチオン化ＢＳＡ、および卵白アルブミンが含まれる。
【００９５】
ビタミンＤアナログへの担体タンパク質のコンジュゲーションは、化学リンカーの使用によって起こりうる。化学リンカーは、アルキル、アリール、アルキルオキシ、アミド、スルホンアミドまたはカルボニルまたはペプチド基から構成されうる。タンパク質へのビタミンＤアナログまたはビタミンＤ誘導体のコンジュゲーションは、タンパク質のアミノ基とビタミンＤアナログまたはビタミンＤ誘導体の反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）基との間の反応によって果たすことができる。
【００９６】
対象でのビタミンＤ欠乏を検出するための方法のいくつかの態様では、ビタミンＤレベルは、生物学的試料が置換緩衝液と混合された時点から開始して２０分以内に検出することができる。
【００９７】
対象でのビタミンＤ欠乏は、疾患を示すか、または疾患に関連しうる。ビタミンＤ欠乏に関連する疾患には：くる病、骨軟化症、高血圧症、骨粗鬆症、自己免疫病、心血管疾患、統合失調症、うつ病、神経系疾患、糖尿病、感染症、喘息、アレルギーまたはガンを挙げることができる。
【００９８】
本明細書において、また、対象から得られた生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルを決定すること、および正常対照でのレベルまたは閾値レベル３０ng/mLに対する生物学的試料中のレベルの減少が決定された場合、対象にビタミンＤ欠乏の処置を施すことによって、ビタミンＤ欠乏を有すると疑われる対象を処置するための方法が提供される。好ましい態様では、対象はヒトである。ビタミンＤ欠乏を処置するためにいくつもの適切な方法がある。ビタミンＤ欠乏は、ビタミンＤ摂取の補充または光線療法によって処置することができる。光線療法には、自然太陽光への曝露増加または紫外線Ｂの人工光源への曝露が含まれうる。
【００９９】
ビタミンＤ欠乏を有すると疑われる対象を処置するための方法の好ましい態様では、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３のレベルは、生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させることによって決定される。
【０１００】
ビタミンＤ欠乏を有すると疑われる対象を処置するための方法を行う際に、競合的または非競合的のいずれかの様々な異種および同種プロトコールを採用することができる。好ましい態様では、その方法は、連続競合イムノアッセイによって行われる。Centaur（商標）、Vista（商標）、およびImmulite（商標）は、競合イムノアッセイを行うために使用することができるアッセイ系である。
【０１０１】
ビタミンＤ欠乏を有すると疑われる対象を処置するための方法によると、生物学的試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の総レベルは、強化化学発光（ＥＣＬ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウエスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光、平衡透析、免疫識別、または酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によって検出することができる。
【０１０２】
ビタミンＤ欠乏を有すると疑われる対象を処置するための方法の好ましい態様では、その方法にしたがって使用される抗体または抗原結合フラグメントは、ビタミンＤ２および／またはビタミンＤ３と交差反応しない。好ましい態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントである。例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２６で示されるＬｃ ＣＤＲ１、配列番号２７で示されるＬｃ ＣＤＲ２、および配列番号２８で示されるＬｃ ＣＤＲ３、配列番号１０で示されるＨｃ ＣＤＲ１、配列番号１１で示されるＨｃ ＣＤＲ２および配列番号１２で示されるＨｃ ＣＤＲ３を含む。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の等モル認識の性質を有する。好ましい態様では、抗体は、モノクローナル抗体１０Ｈ９である。
【０１０３】
ビタミンＤ欠乏を有すると疑われる対象を処置するための方法に使用することができる、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識する抗体および抗原結合フラグメントは、例えば、検出可能なラベルでラベルすることができる。例示的なラベルには、非限定的に、化学発光化合物（例えばアクリジニウムエステル化合物）、リン光化合物、蛍光化合物、放射性ラベル、ビオチン、または酵素が挙げられる。言及された例示的なラベルは、通常、非限定的に、異なる化学物質の添加、光による刺激、または基質もしくは他の化合物への曝露が含まれる方法によって励起された場合にのみ検出することができる。アクリジニウムエステル化合物を使用する場合、化学発光は、適切な計装によって読み取ることができる閃光を生じるペルオキシドおよび酸／塩基によってトリガーされる。検出可能なラベルが検出可能になり始める前に、随意の洗浄ステップを用いることができる。
【０１０４】
抗体または抗原結合フラグメントは、固相支持体上に固定化することができる。
【０１０５】
抗体または抗原結合フラグメントは、担体タンパク質とコンジュゲーションすることができる。抗体または抗原結合タンパク質と担体タンパク質との間の複合体も、固相支持体上に固定化することができる。
【０１０６】
本明細書記載の方法に使用するための固相支持体には、常磁性粒子；商標SEPHADEX（Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.）で入手可能な架橋デキストラン；アガロース；ポリスチレンビーズ；シート、ストリップもしくはパドルなどの、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロースもしくはナイロンベースのウェブ；またはポリスチレンもしくはポリ塩化ビニル製などのチューブ、プレートもしくはマイクロタイタープレートのウェルが挙げられる。常磁性粒子を使用する場合、随意の洗浄ステップの間に、ある磁場源を用いて、粒子および粒子に直接または間接的に結合している分子を保持することができる。分子は、共有結合的に、塩橋、水素結合または別の種類の結合によって、結合することができる。
【０１０７】
生物学的試料は、血液、血清または血漿でありうる。いくつかの態様では、生物学的試料は、本明細書記載の方法に使用する前に、生物学的条件下で最大２４時間、保存することができる。
【０１０８】
ビタミンＤ欠乏を有すると疑われる対象を処置するための方法のいくつかの態様では、生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させる前に、その生物学的試料は、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）で処理またはそれと混合される。または、生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、その生物学的試料は、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）で処理またはそれと混合することができる。ＡＮＳは、ＡＮＳの酸または塩（例えば、ＡＮＳナトリウム塩、ＡＮＳカリウム塩、ＡＮＳヘミマグネシウム塩またはＡＮＳアンモニウム塩）の形態でありうる。ＡＮＳは、例えば、置換緩衝液中に存在しうる。場合により、生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させる前に、または生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、メタノールを８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）と共に使用することができる。メタノールは、例えば、置換緩衝液中に入れることができる。
【０１０９】
ビタミンＤ欠乏を有すると疑われる対象を処置するための方法のいくつかの態様では、また、生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させる前に、その生物学的試料は、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）およびエチレングリコールで処理またはそれと混合される。または、生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、その生物学的試料は、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）およびエチレングリコールで処理またはそれと混合することができる。ＡＮＳは、ＡＮＳの酸または塩（例えば、ＡＮＳナトリウム塩、ＡＮＳカリウム塩、ＡＮＳヘミマグネシウム塩またはＡＮＳアンモニウム塩）の形態でありうる。ＡＮＳおよびエチレングリコールは、置換緩衝液中に存在しうる。場合により、生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させる前に、または生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、メタノールを８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）およびエチレングリコールと共に使用することができる。メタノールは、例えば、置換緩衝液中に入れることができる。
【０１１０】
ビタミンＤ欠乏を有すると疑われる対象を処置するための方法のいくつかの態様では、２５−ヒドロキシビタミンＤアナログが、接触させるステップの後に生物学的試料に添加される。２５−ヒドロキシビタミンＤアナログはラベルすることができる。２５−ヒドロキシビタミンＤアナログまたはラベルされた２５−ヒドロキシビタミンＤアナログは、また、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）を含む安定化緩衝液中に存在しうる。ＡＮＳは、ＡＮＳの酸または塩（例えば、ＡＮＳナトリウム塩、ＡＮＳカリウム塩、ＡＮＳヘミマグネシウム塩またはＡＮＳアンモニウム塩）の形態でありうる。
【０１１１】
本明細書記載のビタミンＤアナログは、図１（ａ）に示すような未コンジュゲーションのときにＣ２２カルボキシ基を含むビタミンＤ炭素数２２誘導体（ビタミンＤ−Ｃ２２）の使用に基づきうる（Hollis et al., Clin. Chem. 39(3):529-33 (1993)）。いくつかの態様では、ビタミンＤアナログは、ビタミンＤ−Ｃ２２でありうる。いくつかの態様では、ビタミンＤアナログは、担体タンパク質とコンジュゲーションしている場合がある。
【０１１２】
ビタミンＤ欠乏を有すると疑われる対象を処置するための方法のいくつかの態様では、記載されたビタミンＤアナログは、タンパク質担体に直接取り付けることができる。例えば、ビタミンＤ−Ｃ２２は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と直接コンジュゲーションすることができる。所与のタンパク質担体とコンジュゲーションできるビタミンＤアナログの数は、使用される担体に基づき変動する。当業者は、本明細書記載の目的のために、多種多様な担体タンパク質を使用できることを理解している。いくつかの適切な担体には、少数だけ挙げると、ＫＬＨ、ＰＥＧ化ＫＬＨ、Concholepas concholepasヘモシアニン（ＣＣＨ）、カチオン化ＢＳＡ、および卵白アルブミンが含まれる。
【０１１３】
ビタミンＤアナログへの担体タンパク質のコンジュゲーションは、化学リンカーの使用によって起こりうる。化学リンカーは、アルキル、アリール、アルキルオキシ、アミド、スルホンアミドまたはカルボニルまたはペプチド基から構成されうる。タンパク質へのビタミンＤアナログまたはビタミンＤ誘導体のコンジュゲーションは、タンパク質のアミノ基とビタミンＤアナログまたはビタミンＤ誘導体の反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）基との間の反応によって果たすことができる。
【０１１４】
ビタミンＤ欠乏を有すると疑われる対象を処置するための方法のいくつかの態様では、ビタミンＤレベルは、生物学的試料が置換緩衝液と混合された時点から開始して２０分以内に検出することができる。
【０１１５】
対象でのビタミンＤ欠乏は、疾患を示すか、または疾患に関連しうる。ビタミンＤ欠乏に関連する疾患には：くる病、骨軟化症、高血圧症、骨粗鬆症、自己免疫病、心血管疾患、統合失調症、うつ病、神経系疾患、糖尿病、感染症、喘息、アレルギーまたはガンを挙げることができる。
【０１１６】
本明細書において、さらに、１回目に、対象から得られた第１の生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルを決定すること、および次に１回目よりも後の２回目に対象から得られた第２の生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルを決定することによって、ビタミンＤ欠乏の進行をモニタリングする必要のある対象でのそのモニタリングのための方法が提供され、ここで、第１の生物学的試料中のレベルから第２の生物学的試料中のレベルの間の減少は、対象でのビタミンＤ欠乏の進行を示し、ここで、第１の生物学的試料中のレベルから第２の生物学的試料中のレベルの間でほとんどまたは全く変化ないことは、対象でのビタミンＤ欠乏の安定化を示し、ここで、第１の生物学的試料中のレベルから第２の生物学的試料中のレベルの間の増加は、対象でのビタミンＤ欠乏の軽減を示す。好ましい態様では、対象はヒトである。
【０１１７】
対象でのビタミンＤ欠乏の進行をモニタリングするための方法の好ましい態様では、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３のレベルは、生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させることによって決定される。
【０１１８】
競合的または非競合的のいずれかの様々な異種および同種プロトコールは、対象でのビタミンＤ欠乏の進行をモニタリングするための方法の実施に採用することができる。好ましい態様では、方法は、競合イムノアッセイによって行われる。Centaur（商標）、Vista（商標）、およびImmulite（商標）は、競合イムノアッセイを行うために使用することができるアッセイ系である。
【０１１９】
対象でのビタミンＤ欠乏の進行をモニタリングするための方法によると、生物学的試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の総レベルは、強化化学発光（ＥＣＬ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウエスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光、平衡透析、免疫識別、または酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によって検出することができる。
【０１２０】
対象でのビタミンＤ欠乏の進行をモニタリングするための方法の好ましい態様では、その方法にしたがって使用される抗体または抗原結合フラグメントは、ビタミンＤ２および／またはビタミンＤ３と交差反応しない。好ましい態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントである。例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２６で示されるＬｃ ＣＤＲ１、配列番号２７で示されるＬｃ ＣＤＲ２、および配列番号２８で示されるＬｃ ＣＤＲ３、配列番号１０で示されるＨｃ ＣＤＲ１、配列番号１１で示されるＨｃ ＣＤＲ２および配列番号１２で示されるＨｃ ＣＤＲ３を含む。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の等モル認識の性質を有する。好ましい態様では、抗体は、モノクローナル抗体１０Ｈ９である。
【０１２１】
これらの方法に使用することができる、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識する抗体および抗原結合フラグメントは、例えば、検出可能なラベルでラベルすることができる。例示的なラベルには、非限定的に、化学発光化合物（例えばアクリジニウムエステル化合物）、リン光化合物、蛍光化合物、放射性ラベル、ビオチン、または酵素が挙げられる。言及された例示的なラベルは、通常、非限定的に、異なる化学物質の添加、光による刺激、または基質もしくは他の化合物への曝露が含まれる方法によって励起された場合にのみ検出することができる。アクリジニウムエステル化合物を使用する場合、化学発光は、適切な計装によって読み取ることができる閃光を生じるペルオキシドおよび酸／塩基によってトリガーされる。検出可能なラベルが検出可能になり始める前に、随意の洗浄ステップを用いることができる。
【０１２２】
抗体または抗原結合フラグメントは、固相支持体上に固定化することができる。
【０１２３】
抗体または抗原結合フラグメントは、担体タンパク質とコンジュゲーションすることができる。抗体または抗原結合タンパク質と担体タンパク質との間の複合体も、固相支持体上に固定化することができる。
【０１２４】
対象でのビタミンＤ欠乏の進行をモニタリングするための方法に使用するための固相支持体には、常磁性粒子；商標SEPHADEX（Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.）で入手可能な架橋デキストラン；アガロース；ポリスチレンビーズ；シート、ストリップもしくはパドルなどの、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロースもしくはナイロンベースのウェブ；またはポリスチレンもしくはポリ塩化ビニル製などのチューブ、プレートもしくはマイクロタイタープレートのウェルが挙げられる。常磁性粒子を使用する場合、随意の洗浄ステップの間に、ある磁場源を用いて、粒子および粒子に直接または間接的に結合している分子を保持することができる。分子は、共有結合的に、塩橋、水素結合または別の種類の結合によって、結合することができる。
【０１２５】
生物学的試料は、血液、血清または血漿でありうる。いくつかの態様では、生物学的試料は、本明細書記載の方法に使用する前に、生物学的条件下で最大２４時間、保存することができる。
【０１２６】
対象でのビタミンＤ欠乏の進行をモニタリングするための方法のいくつかの態様では、生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させる前に、その生物学的試料は、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）で処理またはそれと混合される。または、生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、その生物学的試料は、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）で処理またはそれと混合することができる。ＡＮＳは、ＡＮＳの酸または塩（例えば、ＡＮＳナトリウム塩、ＡＮＳカリウム塩、ＡＮＳヘミマグネシウム塩またはＡＮＳアンモニウム塩）の形態でありうる。ＡＮＳは、例えば、置換緩衝液中に存在しうる。場合により、生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させる前に、または生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、メタノールを８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）と共に使用することができる。メタノールは、例えば、置換緩衝液中に入れることができる。
【０１２７】
対象でのビタミンＤ欠乏の進行をモニタリングするための方法のいくつかの態様では、また、生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させる前に、その生物学的試料は、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）およびエチレングリコールで処理またはそれと混合される。または、生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、その生物学的試料は、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）およびエチレングリコールで処理またはそれと混合することができる。ＡＮＳは、ＡＮＳの酸または塩（例えば、ＡＮＳナトリウム塩、ＡＮＳカリウム塩、ＡＮＳヘミマグネシウム塩またはＡＮＳアンモニウム塩）の形態でありうる。ＡＮＳおよびエチレングリコールは、置換緩衝液中に存在しうる。場合により、生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させる前に、または生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、メタノールを８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）およびエチレングリコールと共に使用することができる。メタノールは、例えば、置換緩衝液中に入れることができる。
【０１２８】
対象でのビタミンＤ欠乏の進行をモニタリングするための方法のいくつかの態様では、２５−ヒドロキシビタミンＤアナログが、接触させるステップの後に生物学的試料に添加される。２５−ヒドロキシビタミンＤアナログはラベルすることができる。２５−ヒドロキシビタミンＤアナログまたはラベルされた２５−ヒドロキシビタミンＤアナログは、また、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）を含む安定化緩衝液中に存在しうる。ＡＮＳは、ＡＮＳの酸または塩（例えば、ＡＮＳナトリウム塩、ＡＮＳカリウム塩、ＡＮＳヘミマグネシウム塩またはＡＮＳアンモニウム塩）の形態でありうる。
【０１２９】
本明細書記載のビタミンＤアナログは、図１（ａ）に示すような未コンジュゲーションのときにＣ２２カルボキシ基を含むビタミンＤ炭素数２２誘導体（ビタミンＤ−Ｃ２２）の使用に基づきうる（Hollis et al., Clin. Chem. 39(3):529-33 (1993)）。いくつかの態様では、ビタミンＤアナログは、ビタミンＤ−Ｃ２２でありうる。いくつかの態様では、ビタミンＤアナログは、担体タンパク質とコンジュゲーションしている場合がある。
【０１３０】
対象でのビタミンＤ欠乏の進行をモニタリングするための方法のいくつかの態様では、記載されたビタミンＤアナログは、タンパク質担体に直接取り付けることができる。例えば、ビタミンＤ−Ｃ２２は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と直接コンジュゲーションすることができる。所与のタンパク質担体とコンジュゲーションできるビタミンＤアナログの数は、使用される担体に基づき変動する。当業者は、本明細書記載の目的のために、多種多様な担体タンパク質を使用できることを理解している。いくつかの適切な担体には、少数だけ挙げると、ＫＬＨ、ＰＥＧ化ＫＬＨ、Concholepas concholepasヘモシアニン（ＣＣＨ）、カチオン化ＢＳＡ、および卵白アルブミンが含まれる。
【０１３１】
ビタミンＤアナログへの担体タンパク質のコンジュゲーションは、化学リンカーの使用によって起こりうる。タンパク質へのビタミンＤアナログまたはビタミンＤ誘導体のコンジュゲーションは、タンパク質のアミノ基とビタミンＤアナログまたはビタミンＤ誘導体の反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）基との間の反応によって果たすことができる。
【０１３２】
対象でのビタミンＤ欠乏の進行をモニタリングするための方法のいくつかの態様では、ビタミンＤレベルは、生物学的試料が置換緩衝液と混合された時点から開始して２０分以内に検出することができる。
【０１３３】
対象でのビタミンＤ欠乏は、疾患を示すか、または疾患に関連しうる。ビタミンＤ欠乏に関連する疾患には：くる病、骨軟化症、高血圧症、骨粗鬆症、自己免疫病、心血管疾患、統合失調症、うつ病、神経系疾患、糖尿病、感染症、喘息、アレルギーまたはガンを挙げることができる。
【０１３４】
本明細書において、また、１回目に、対象から得られた第１の生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルを決定すること、および次に１回目よりも後の２回目に、ビタミンＤ欠乏について対象を処置後に、対象から得られた第２の生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルを決定することによって、該ビタミンＤ欠乏の処置を必要とする対象でのその処置のモニタリングのための方法が提供され、ここで、第１の生物学的試料中のレベルに対する第２の生物学的試料中のレベルの増加または安定化は、該対象でのビタミンＤ欠乏の処置の有効性を示し、ここで、第１の生物学的試料中のレベルに対する第２の生物学的試料中のレベルの減少は、該対象でのビタミンＤ欠乏の処置の無効果を示す。好ましい態様では、対象はヒトである。
【０１３５】
対象でのビタミンＤ欠乏の処置をモニタリングするための方法の好ましい態様では、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３のレベルは、生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させることによって決定される。
【０１３６】
競合的または非競合的のいずれかの様々な異種および同種プロトコールは、対象でのビタミンＤ欠乏の処置をモニタリングするための方法の実施に採用することができる。好ましい態様では、方法は、連続競合イムノアッセイによって行われる。Centaur（商標）、Vista（商標）、およびImmulite（商標）は、競合イムノアッセイを行うために使用することができるアッセイ系である。
【０１３７】
対象でのビタミンＤ欠乏の処置をモニタリングするための方法によると、生物学的試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の総レベルは、強化化学発光（ＥＣＬ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウエスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光、平衡透析、免疫識別、または酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によって検出することができる。
【０１３８】
対象でのビタミンＤ欠乏の処置をモニタリングするための方法の好ましい態様では、その方法にしたがって使用される抗体または抗原結合フラグメントは、ビタミンＤ２および／またはビタミンＤ３と交差反応しない。好ましい態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントである。例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２６で示されるＬｃ ＣＤＲ１、配列番号２７で示されるＬｃ ＣＤＲ２、および配列番号２８で示されるＬｃ ＣＤＲ３、配列番号１０で示されるＨｃ ＣＤＲ１、配列番号１１で示されるＨｃ ＣＤＲ２および配列番号１２で示されるＨｃ ＣＤＲ３を含む。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３を等モル認識する性質を有する。好ましい態様では、抗体は、モノクローナル抗体１０Ｈ９である。
【０１３９】
対象でのビタミンＤ欠乏の処置をモニタリングするための方法に使用することができる、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３を認識する抗体および抗原結合フラグメントは、例えば、検出可能なラベルでラベルすることができる。例示的なラベルには、非限定的に、化学発光化合物（例えばアクリジニウムエステル化合物）、リン光化合物、蛍光化合物、放射性ラベル、ビオチン、または酵素が挙げられる。言及された例示的なラベルは、通常、非限定的に、異なる化学物質の添加、光による刺激、または基質もしくは他の化合物への曝露が含まれる方法によって励起された場合にのみ検出することができる。アクリジニウムエステル化合物を使用する場合、化学発光は、適切な計装によって読み取ることができる閃光を生じるペルオキシドおよび酸／塩基によってトリガーされる。検出可能なラベルが検出可能になり始める前に、随意の洗浄ステップを用いることができる。
【０１４０】
抗体または抗原結合フラグメントは、固相支持体上に固定化することができる。
【０１４１】
抗体または抗原結合フラグメントは、担体タンパク質とコンジュゲーションすることができる。抗体または抗原結合タンパク質と担体タンパク質との間の複合体も、固相支持体上に固定化することができる。
【０１４２】
本明細書記載の方法に使用するための固相支持体には、常磁性粒子；商標SEPHADEX（Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.）で入手可能な架橋デキストラン；アガロース；ポリスチレンビーズ；シート、ストリップもしくはパドルなどの、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロースもしくはナイロンベースのウェブ；またはポリスチレンもしくはポリ塩化ビニル製などのチューブ、プレートもしくはマイクロタイタープレートのウェルが挙げられる。常磁性粒子を使用する場合、随意の洗浄ステップの間に、ある磁場源を用いて、粒子および粒子に直接または間接的に結合している分子を保持することができる。分子は、共有結合的に、塩橋、水素結合または別の種類の結合によって、結合することができる。
【０１４３】
生物学的試料は、血液、血清または血漿でありうる。いくつかの態様では、生物学的試料は、本明細書記載の方法に使用する前に、生物学的条件下で最大２４時間保存することができる。
【０１４４】
対象でのビタミンＤ欠乏の処置をモニタリングするための方法のいくつかの態様では、生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させる前に、その生物学的試料は、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）で処理またはそれと混合される。または、生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、その生物学的試料は、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）で処理またはそれと混合することができる。ＡＮＳは、ＡＮＳの酸または塩（例えば、ＡＮＳナトリウム塩、ＡＮＳカリウム塩、ＡＮＳヘミマグネシウム塩またはＡＮＳアンモニウム塩）の形態でありうる。ＡＮＳは、例えば、置換緩衝液中に存在しうる。場合により、生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させる前に、または生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、メタノールを８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）と共に使用することができる。メタノールは、例えば、置換緩衝液中に入れることができる。
【０１４５】
対象でのビタミンＤ欠乏の処置をモニタリングするための方法のいくつかの態様では、また、生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させる前に、その生物学的試料は、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）およびエチレングリコールで処理またはそれと混合される。または、生物学的試料を、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、その生物学的試料は、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）およびエチレングリコールで処理またはそれと混合することができる。ＡＮＳは、ＡＮＳの酸または塩（例えば、ＡＮＳナトリウム塩、ＡＮＳカリウム塩、ＡＮＳヘミマグネシウム塩またはＡＮＳアンモニウム塩）の形態でありうる。ＡＮＳおよびエチレングリコールは、置換緩衝液中に存在しうる。場合により、生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させる前に、または生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、メタノールを８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）およびエチレングリコールと共に使用することができる。メタノールは、例えば、置換緩衝液中に入れることができる。
【０１４６】
対象でのビタミンＤ欠乏の処置をモニタリングするための方法のいくつかの態様では、接触させるステップの後に２５−ヒドロキシビタミンＤアナログが生物学的試料に添加される。２５−ヒドロキシビタミンＤアナログはラベルすることができる。２５−ヒドロキシビタミンＤアナログまたはラベルされた２５−ヒドロキシビタミンＤアナログは、また、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）を含む安定化緩衝液中に存在しうる。ＡＮＳは、ＡＮＳの酸または塩（例えば、ＡＮＳナトリウム塩、ＡＮＳカリウム塩、ＡＮＳヘミマグネシウム塩またはＡＮＳアンモニウム塩）の形態でありうる。
【０１４７】
本明細書記載のビタミンＤアナログは、図１（ａ）に示すような未コンジュゲーションのときにＣ２２カルボキシ基を含むビタミンＤ炭素数２２誘導体（ビタミンＤ−Ｃ２２）の使用に基づきうる（Hollis et al., Clin. Chem. 39(3):529-33 (1993)）。いくつかの態様では、ビタミンＤアナログは、ビタミンＤ−Ｃ２２でありうる。いくつかの態様では、ビタミンＤアナログは、担体タンパク質とコンジュゲーションしている場合がある。
【０１４８】
対象でのビタミンＤ欠乏の処置をモニタリングするための方法のいくつかの態様では、記載されたビタミンＤアナログは、タンパク質担体に直接取り付けることができる。例えば、ビタミンＤ−Ｃ２２は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と直接コンジュゲーションすることができる。所与のタンパク質担体とコンジュゲーションできるビタミンＤアナログの数は、使用される担体に基づき変動する。例えば、ＢＳＡは、比較的適度な数の、おそらく約１０〜約２５個のタンパク質の連結に対応し；または、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの担体は、約２００〜約３００個の抗原性分子に対応しうる。当業者は、本明細書記載の目的のために、多種多様な担体タンパク質を使用できることを理解している。いくつかの適切な担体には、少数だけ挙げると、ＫＬＨ、ＰＥＧ化ＫＬＨ、Concholepas concholepasヘモシアニン（ＣＣＨ）、カチオン化ＢＳＡ、および卵白アルブミンが含まれる。
【０１４９】
ビタミンＤアナログへの担体タンパク質のコンジュゲーションは、化学リンカーの使用によって起こりうる。タンパク質へのビタミンＤアナログまたはビタミンＤ誘導体のコンジュゲーションは、タンパク質のアミノ基とビタミンＤアナログまたはビタミンＤ誘導体の反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）基との間の反応によって果たすことができる。
【０１５０】
対象でのビタミンＤ欠乏の処置をモニタリングするための方法のいくつかの態様では、ビタミンＤレベルは、生物学的試料が置換緩衝液と混合された時点から開始して２０分以内に検出することができる。
【０１５１】
対象でのビタミンＤ欠乏は、疾患を示すか、または疾患に関連しうる。ビタミンＤ欠乏に関連する疾患には：くる病、骨軟化症、高血圧症、骨粗鬆症、自己免疫病、心血管疾患、統合失調症、うつ病、神経系疾患、糖尿病、感染症、喘息、アレルギーまたはガンを挙げることができる。
【０１５２】
本明細書において、また、２５−ヒドロキシビタミンＤアナログを８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）と接触させることによって２５−ヒドロキシビタミンＤアナログを安定化するための方法が提供される。ＡＮＳは、ＡＮＳの酸または塩（例えば、ＡＮＳナトリウム塩、ＡＮＳカリウム塩、ＡＮＳヘミマグネシウム塩またはＡＮＳアンモニウム塩）の形態でありうる。８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）で安定化された２５−ヒドロキシビタミンＤアナログは、アッセイ系外で２ヶ月間よりも長く保存することができる。８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）で安定化された２５−ヒドロキシビタミンＤアナログは、アッセイ系内で７日間よりも長く保存することができる。
【０１５３】
本明細書において、また、対象でのビタミンＤ欠乏を検出するための方法が提供される。好ましい態様では、対象はヒトである。その方法に使用するための生物学的試料は、対象から得られた血液、血清または血漿でありうる。対象でのビタミンＤ欠乏を検出するための方法は、生物学的試料と置換緩衝液を混合することによって、対象から得られた生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルを決定することを伴う。アッセイ混合物を形成させるために、生物学的試料を置換緩衝液に添加する、またはその逆にすることができる。置換緩衝液は、ビタミンＤ結合タンパク質からビタミンＤを置換する。好ましい態様では、置換緩衝液は、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）を含有する。ＡＮＳは、ＡＮＳの酸または塩（例えば、ＡＮＳナトリウム塩、ＡＮＳカリウム塩、ＡＮＳヘミマグネシウム塩またはＡＮＳアンモニウム塩）の形態でありうる。置換緩衝液は、さらに、エチレングリコールを含有しうる。いくつかの態様では、置換緩衝液は、ＡＮＳおよびメタノールを含有する。いくつかの好ましい態様では、置換緩衝液は、ＡＮＳ、エチレングリコール、およびメタノールを含有する。
【０１５４】
次に、第１のラベルとコンジュゲーションされた、２５−ヒドロキシビタミンＤ２、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、またはビタミンＤ−Ｃ２２に基づく免疫原と優先的に結合する抗体または抗原結合フラグメントが、アッセイ混合物と混合される。抗体または抗原結合フラグメントは、アッセイ混合物に添加する、またはその逆にすることができ、その一構成要素になる。２５−ヒドロキシビタミンＤ２、および２５−ヒドロキシビタミンＤ３、またはビタミンＤ−Ｃ２２に基づく免疫原と優先的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントは、好ましくは、上記抗体または抗原結合フラグメントである。好ましい態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２６で示されるＬｃ ＣＤＲ１、配列番号２７で示されるＬｃ ＣＤＲ２、および配列番号２８で示されるＬｃ ＣＤＲ３、配列番号１０で示されるＨｃ ＣＤＲ１、配列番号１１で示されるＨｃ ＣＤＲ２および配列番号１２で示されるＨｃ ＣＤＲ３を含む。好ましい態様では、抗体は、モノクローナル抗体１０Ｈ９である。２５−ヒドロキシビタミンＤ２、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、またはビタミンＤ−Ｃ２２に基づく免疫原と優先的に結合する抗体または抗原結合フラグメントは、固相支持体上に固定化することができる。２５−ヒドロキシビタミンＤ２、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、またはビタミンＤ−Ｃ２２に基づく免疫原と優先的に結合する抗体または抗原結合フラグメントは、担体タンパク質とコンジュゲーションすることができる。２５−ヒドロキシビタミンＤ２、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、またはビタミンＤ−Ｃ２２に基づく免疫原と優先的に結合する抗体または抗原結合フラグメントと、担体タンパク質との複合体は、また、固相支持体上に固定化することができる。
【０１５５】
第１のラベルは、好ましくは、検出可能なラベルである。第１のラベルは、化学発光化合物（例えば、アクリジニウムエステル化合物）、リン光化合物、蛍光化合物、放射性ラベル、ビオチン、または酵素でありうる。言及された例示的なラベルは、通常、非限定的に、異なる化学物質の添加、光による刺激、または基質もしくは他の化合物への曝露が含まれる方法によって励起された場合にのみ検出することができる。アクリジニウムエステル化合物を使用する場合、化学発光は、適切な計装によって読み取ることができる閃光を生じるペルオキシドおよび酸／塩基によってトリガーされる。検出可能なラベルが検出可能になり始める前に、随意の洗浄ステップを用いることができる。
【０１５６】
次に、第２のラベルを有する２５−ヒドロキシビタミンＤアナログが、アッセイ混合物と混合される。２５−ヒドロキシビタミンＤアナログは、アッセイ混合物に添加する、またはその逆にすることができ、その一構成要素になる。第２のラベルは、抗フルオレセイン抗体と結合するためのフルオレセイン、アビジン、ストレプトアビジン、もしくは抗ビオチン抗体と結合するためのビオチン、抗ジゴキシゲニン抗体と結合するためのジゴキシゲニン、または他のハプテンおよび結合パートナーでありうる。２５−ヒドロキシビタミンＤアナログは、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）を含む安定化緩衝液中に存在しうる。ＡＮＳは、ＡＮＳの酸または塩（例えば、ＡＮＳナトリウム塩、ＡＮＳカリウム塩、ＡＮＳヘミマグネシウム塩またはＡＮＳアンモニウム塩）の形態でありうる。いくつかの態様では、２５−ヒドロキシビタミンＤアナログは、担体タンパク質とコンジュゲーションされる。担体タンパク質は、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、免疫グロブリン、またはウシγグロブリンＩｇＧでありうる。
【０１５７】
第２のラベルを認識する抗体とコンジュゲーションされた固相支持体は、また、アッセイ混合物と混合される。第２のラベルを認識する抗体とコンジュゲーションされた固相支持体は、アッセイ混合物に添加する、またはその逆にすることができ、アッセイ混合物の一構成要素になる。固相支持体とコンジュゲーションされた抗体は、フルオレセインと結合する抗体でありうる。
【０１５８】
本明細書記載の方法に使用するための固相支持体には、常磁性粒子；商標SEPHADEX（Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.）で入手可能な架橋デキストラン；アガロース；ポリスチレン粒子もしくはビーズ；シート、ストリップもしくはパドルなどの、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロースもしくはナイロンベースのウェブ；またはポリスチレンもしくはポリ塩化ビニル製などのチューブ、プレートもしくはマイクロタイタープレートのウェルが挙げられる。常磁性粒子を使用する場合、随意の洗浄ステップの間に、ある磁場源を用いて、粒子および粒子と直接または間接的に結合している分子を保持することができる。分子は、共有結合的に、塩橋、水素結合または別の種類の結合によって、結合することができる。
【０１５９】
生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルは、第１のラベルによって送り出されるシグナルを測定することによって決定され、ここで、正常対照でのレベルまたは閾値レベル３０ng/mLに対して生物学的試料中の総２５−ヒドロキシビタミンＤレベルが低下していることは、対象でのビタミンＤ欠乏を示す。
【０１６０】
本明細書記載の任意の診断系の免疫試薬は、分散液として溶液中に、または実質的に乾燥した粉末として、例えば凍結乾燥された形態で提供することができる。
【０１６１】
いくつかの態様では、ビタミンＤ欠乏は、生物学的試料が置換緩衝液と混合された時点から開始して２０分以内に検出することができる。
【０１６２】
対象でのビタミンＤ欠乏は、疾患を示しうる。その疾患には：くる病、骨軟化症、高血圧症、骨粗鬆症、自己免疫病、心血管疾患、統合失調症、うつ病、神経系疾患、糖尿病、感染症、喘息、アレルギーまたはガンを挙げることができる。
【０１６３】
キット
キットは、本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメント、ならびに例えば、対象から生物学的試料を採取するための、および／または生物学的試料中の総ビタミンＤ量を決定するために抗体または抗原結合フラグメントを使用するための説明書を含みうる。好ましい態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書記載の検出可能なラベルを含む。キットは、また、固体支持体と連結したビタミンＤアナログを含みうる。いくつかの態様では、キットは、正常および／または欠乏ビタミンＤレベルとのビタミンＤの量またはレベルの相関を示す、標準曲線またはデータセットを含みうる。
【０１６４】
本明細書記載の態様をより詳細に説明するために、以下の実施例を提供する。それらは、態様を限定するのでなく、例示することを目的とする。
【０１６５】
実施例
実施例Ｉ  ビタミンＤ−Ｃ２２に基づく分子および化合物の合成
ビタミンＤ−Ｃ２２に基づく抗原を産生させるために、操作可能な形態の分子が必要であった。これを成し遂げるために、HollisおよびNapoli（Clin.Chem、31:1815-1819 (1985)）の合成スキームに基づく合成スキームによりビタミンＤ−Ｃ２２酸を産生させるよう努力した。簡潔には、２３，２４−ビスノル−５−コレン酸−３β−オール−アセテート（２．５０ｇ）をジクロロメタン（２５mL）中でメタノール（０．３１２mL）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．５９ｇ）およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（１６０mg）と３時間反応させ、２３，２４−ビスノル−５−コレン酸−３β−オール−アセテートメチルエステル（１．８０８ｇ）を得た。ヘキサン（２００mL）中で還流下にて３０分間メチルエステル（１．８０８ｇ）をＮ−ブロモスクシンイミド（１．０５ｇ）／アゾイソブチロニトリル（５１．７mg）で臭素化し、続いてＴＨＦ（１１２mL）中でフッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＨＦ中に１Ｍ、２３．８mL）を用いて室温で２時間、脱臭化水素し、２３，２４−ビスノル−５，７−コレジエン酸（choledienic acid）−３β−オール−アセテートメチルエステル（１．２１ｇ）を得た。２３，２４−ビスノル−５，７−コレジエン酸−３β−オール−アセテートメチルエステル（１．２１ｇ）をメタノール（１８mL）およびエチルエーテル（２２mL）中で水酸化カリウム（０．５０ｇ）と室温で２．５時間反応させて、２３，２４−ビスノル−５，７−コレジエン酸−３β−オール−メチルエステル（０．９６２ｇ）を産生させた。エーテル（１１００mL）中で、Vycorフィルターを備える４５０ｗ水銀灯を２３，２４−ビスノル−５，７−コレジエン酸−３β−オール−メチルエステル（０．９６０ｇ）に−１０〜０℃で３分間および３０秒×２回照射し、次に、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって分離し、プレビタミンＤ−Ｃ２２メチルエステルを得、それをエタノール（１００mL）中で３時間還流し、ビタミンＤ−Ｃ２２メチルエステル（０．３８９ｇ）を産生させた。ビタミンＤ−Ｃ２２メチルエステル（２４９mg）をメタノール（３０mL）中で水酸化カリウム（６．２５ｇ）と６０℃で５時間反応させ、ビタミンＤ−Ｃ２２酸（１６５mg）を得た（図２）。
【０１６６】
ビタミンＤ−Ｃ２２とコンジュゲーションされた化合物を形成させるためにＮＨＳ前駆体が必要であった。これを達成するために、ビタミンＤ−Ｃ２２酸（１６５mg）をジシクロヘキシカルボジイミド（dicyclohexycarbodiimide）（１１６mg）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（６４mg）と１，４−ジオキサン中で反応させ、次に１，４−ジアミノブタン（４８０uL）と室温で２時間反応させてビタミンＤ−ＤＡＢ（１４１mg）を得た。タンパク質反応性試薬であるビタミンＤ−ＤＡＢ−スベロイル−ＮＨＳおよびビタミンＤ−ＤＡＢ−ＰＥＧ５−ＮＨＳは、ビタミンＤ−ＤＡＢから、過剰のジスクリンイミジルスベレートまたはＰＥＧ５−ジ−ＮＨＳとの反応によって調製した。ＮＨＳエステルは、Ｃ１８カラムを通過させる分取逆相ＨＰＬＣによって精製した。ＤＭＦ（１．２mL）およびトリエチルアミン（１５uL）中で、ビタミンＤ−ＤＡＢ（３０mg）を過剰のジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ、１３３mg）と３．５時間反応させた。Synergi Hydro-RPカラムを通過させる分取ＨＰＬＣによって生成物（２４．５mg）を精製し、ビタミンＤ−ＤＡＢ−スベロイル−ＮＨＳを産生させた。ＤＭＦ（２．０mL）およびトリエチルアミン（２０uL）中で、ビタミンＤ−ＤＡＢ（４１mg）を過剰のＢｉｓ−ＰＥＧ５−ＮＨＳ（２８２mg）と３．５時間反応させた。Synergi Hydro-RPカラムを通過させる分取ＨＰＬＣによって生成物（３３．７mg）を精製してビタミンＤ−ＤＡＢ−ＰＥＧ５−ＮＨＳを産生させた（図３）。タンパク質コンジュゲートは、図４に示すようにＮＨＳエステルとタンパク質のリシンアミノ基との間の反応によって調製した。Ｖｉｔ Ｄ−ＤＡＢ−スベロイル−ＢＳＡは、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）（１mL）とＤＭＦ（０．４mL）との混液中で、Ｖｉｔ Ｄ−ＤＡＢ−スベロイル−ＮＨＳ（５mg）をＢＳＡ（１０mg）と室温で２時間反応させることによって調製し、緩衝液交換のためにＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いた遠心分離によって精製した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析から、ＢＳＡ１個あたり１４個のビタミンＤラベルのロードが示された。
【０１６７】
ビタミンＤ−ＤＡＢ−ＰＥＧ５−ＢＳＡ−フルオレセインコンジュゲート（図５）は、ＢＳＡの遊離チオールとフルオレセイン−５−マレイミドとの間の反応に続くリシンアミノ基とビタミンＤ−ＤＡＢ−ＰＥＧ５−ＮＨＳとの反応による２段階コンジュゲーションを経て調製した。Sephadex G25カラムを用いたゲル濾過によってコンジュゲートを単離した。１０：１のフルオレセイン−５−マレイミド：ＢＳＡのモル比を用い、続いて２０：１のビタミンＤ−ＤＡＢ−ＰＥＧ５−ＮＨＳ：ＢＳＡのモル比でのコンジュゲーションで調製されたコンジュゲートが最良のCentaur（登録商標）アッセイ曲線を生じたことが分かった。
【０１６８】
ビタミンＤ−フルオレセインコンジュゲートを調製し、Centaur（登録商標）アッセイ用の磁性粒子コーティング抗原として使用した。小分子誘導体であるビタミンＤ−ＤＡＢ−ＰＥＧ５−アミノペンチル−チオウレイジルフルオレセイン、ＭＷ１２０８（構造は下記）を磁性粒子コーティング抗原として使用しても、良好なイムノアッセイの結果が得られた。
【化２】
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【０１６９】
実施例ＩＩ  ビタミンＤ−Ｃ２２抗原性化合物と反応性の抗体の産生
ビタミンＤ−Ｃ２２抗原性分子の構造局面を有する分子と優先的に結合できる抗体を産生させるために実験を行った。これらの実験は、Galfreら（Nature, 266:550 (1977)）の方法をOiおよびHerzenberg（Selected Methods in Cellular Immunology (1980)）が改変したものにしたがって行った。まず、フロイント完全アジュバント中に乳化したビタミンＤ−Ｃ２２ ＢＳＡをＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫処置し、続いてフロイント不完全アジュバントを用いて二次免疫した。２回目の免疫処置の２週間後に、免疫処置後のマウスの血清を採取した。
【０１７０】
採取した血清を、以下のようなＥＬＩＳＡによって抗原反応性について試験した：ビタミンＤ−Ｃ２２ ＫＬＨでコーティングしたマイクロタイタープレートをマウス抗血清と共にインキュベーションし、希釈緩衝液で１時間希釈した。プレートを洗浄し、希釈緩衝液中の、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）とコンジュゲーションした二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ）を添加し、３０分間インキュベーションした。プレートを洗浄し、比色分析用基質３，３’，５，５’−テトラメチルバンジジン（ＴＭＢ）を添加した。１Ｎ硫酸を用いて発色を止め、吸光度を４５０nmで測定した。被験マウス５匹全てからの血清は、正常マウス血清（ＮＭＳ）に比べてかなりの反応性を示した（表２）。
【０１７１】
【表２】
2014516540.tif 000006
【０１７２】
実施例ＩＩＩ  ビタミンＤ−Ｃ２２抗原性化合物と反応性のモノクローナル抗体の産生
ビタミンＤ−Ｃ２２抗原に対して正の免疫応答を示すマウスをモノクローナル抗体発生のために選択した。簡潔には、選択されたマウスから回収した脾臓細胞をマウスＳｐ２／０ミエローマ細胞と融合させた。結果として生じた、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３と反応性の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、限界希釈手順によって少なくとも２回クローニングしてモノクローナル抗体産生細胞を得た。同定され、さらに試験された一つのモノクローナル細胞系は、１０Ｈ９ハイブリドーマであった。
【０１７３】
ハイブリドーマクローンの単離後に、抗体が２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方と結合する相対能力を決定するために研究を行った。これを判断するために、ビタミンＤ−Ｃ２２と、抗原に対して産生された抗体（１０Ｈ９）との間の結合が２５−ヒドロキシビタミンＤ２または２５−ヒドロキシビタミンＤ３の存在によって破壊されうる程度を決定する抗体置換アッセイを行った。ビタミンＤ−Ｃ２２と反応性の抗体を産生する１０Ｈ９ハイブリドーマ細胞系からの細胞培養上清を、ビタミンＤ−Ｃ２２ ＫＬＨをコーティングしたマイクロタイタープレート上で２５−ヒドロキシビタミンＤ２または２５−ヒドロキシビタミンＤ３の存在下または不在下で１時間同時インキュベーションした。プレートを洗浄後に、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰＯを添加し、３０分間インキュベーションした。プレートを洗浄し、次にテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と共にインキュベーションした。１Ｎ硫酸を用いて発色を止め、吸光度を４５０nmで測定した。表３に示すように（そして図６に示すように）、ビタミンＤ−Ｃ２２ ＫＬＨへの抗体結合は、２５−ヒドロキシビタミンＤ２または２５−ヒドロキシビタミンＤ３のいずれかとの同時インキュベーションによって濃度依存的に破壊された。２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方は、被験抗体の等モル親和性の特徴である、実質的に類似の結合破壊プロファイルを示した。
【０１７４】
【表３】
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【０１７５】
次に、細胞上清ではなく精製抗体を使用して置換実験を行った。この実験では、２時間インキュベーションを経て関心が持たれる抗体をマイクロタイタープレート上に直接コーティングした。コーティング後のプレートを洗浄し、次に、これを、アルカリホスファターゼとコンジュゲーションしたビタミンＤ−Ｃ２２−ジアミノブタン−スベロイルの存在下で２５−ヒドロキシビタミンＤ２または２５−ヒドロキシビタミンＤ３のいずれかと共に同時インキュベーションした。３０分後にプレートを洗浄し、基質ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）を添加することによって発色させた。着色した溶液の吸光度を４０５nmで測定した。再び、２５−ヒドロキシビタミンＤ２または２５−ヒドロキシビタミンＤ３のいずれかと共に同時インキュベーションすることによってビタミンＤ−Ｃ２２への１０Ｈ９結合を濃度依存的に破壊した（表４）。２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方は、被験抗体の等モル親和性の特徴である、実質的に類似の結合破壊プロファイルを示した（図７）。
【０１７６】
【表４】
2014516540.tif 000008
【０１７７】
実施例ＩＶ
ビタミンＤアッセイ
生物学的試料に続いて置換緩衝液を反応キュベットに加え、４．５分間反応させる。アクリジニウムエステルとコンジュゲーションしたモノクローナル抗体を添加し、５．５分間反応させて試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤと結合させる。ウシ血清アルブミンおよびフルオレセインとコンジュゲーションした２５−ヒドロキシビタミンＤアナログを、抗フルオレセイン抗体をコーティングした常磁性粒子と一緒に添加し、３．７５分間反応させる。反応キュベットを洗浄し、酸および塩基試薬を添加し、化学発光反応を開始する。結果までの時間は１８分である。患者の試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤの量と、系によって検出された相対光単位（ＲＬＵ）の量との間に逆相関の関係が存在する。
【０１７８】
アッセイ：ADVIA Centaur総ビタミンＤアッセイは、常磁性粒子（ＰＭＰ）と共有結合した、ラベルされた抗フルオレセインモノクローナル抗体、アクリジニウムエステル（ＡＥ）でラベルされたモノクローナル抗体１種、およびフルオレセインでラベルされたビタミンＤアナログを使用する１８分間のワンパス型抗体競合イムノアッセイである（図８）。総ビタミンＤアッセイは、１回の判定のために試料体積２０μLを要する。初回結果までの時間は１８分であり、処理量は２４０回／時間である。
【０１７９】
簡潔には、化学発光技法を用いた連続ステップハプテン／抗体競合イムノアッセイの第１のステップは、アナライザーでキュベットに生物学的試料２０μLを分注し、続いて８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸アンモニウム塩（Sigma-aldrich, St. Louis, MO）およびエチレングリコール（Sigma-aldrich, St. Louis, MO）を含有する置換緩衝液（５０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、０．０９％アジ化ナトリウム、ｐＨ＝７．５）２００μlを添加し、３７℃で４．５分間インキュベーションすることで開始する。アクリジニウムエステルでラベルされた抗２５−ヒドロキシビタミンＤモノクローナル抗体（モノクローナル抗体１０Ｈ９）を含有するＬｉｔｅ試薬（５０μL）をその混合物に添加し、３７℃で５．５分間インキュベーションする。Ｃ２２−ＰＥＧ−ＢＳＡ−フルオレセインコンジュゲート（５０μL）および抗フルオレセインモノクローナル抗体でコーティングされた常磁性ミクロパーティクル（１００μL）をその混合物に添加し、３７℃で３．７５分間インキュベーションする。第４のステップは、Ｃ２２−ＰＥＧ−ＢＳＡ−フルオレセインコンジュゲートおよびアクリジニウムエステルでラベルされた抗２５−ヒドロキシビタミンＤモノクローナル抗体が結合した固相複合体を分離し、続いて３回洗浄して遊離のＬｉｔｅ試薬がもしあれば除去することである。最後のステップは、酸試薬の次に塩基試薬をそれぞれ３００μL連続的に分注し、化学発光反応を開始することである。試料から結果までの総インキュベーション時間は１８分である。生物学的試料中に存在する２５−ヒドロキシビタミンＤの量と、相対光単位（ＲＬＵ）として定量された化学発光の量との間に間接的関係がある。Centaurに基づくアッセイでは、アクリジニウムエステルによって発光したＲＬＵとビタミンＤの量との間に逆相関関係があるが、それは、血漿中の担体タンパク質から放出された２５−ヒドロキシビタミンＤが、限られた量のアクリジニウムラベル型１０Ｈ９モノクローナル抗体との結合を、ビタミンＤ−ＢＳＡ−フルオレセインと競合するからである。患者試料中の２５（ＯＨ）Ｄレベルがより高いと、磁性粒子上のアクリジニウム−ＭＡｂ−ＶｉｔＤ−ＢＳＡ−フルオレセイン複合体の量が低下し、より低いＲＬＵが生じるであろう。
【０１８０】
精度：精度の研究は、ＣＬＳＩプロトコールＥＰ５−Ａ２（１台のADVIA Centaurシステムで１日２回、１０日間）に基づいた。総ビタミンＤが４〜１２０ng/mLの試料を用いてアッセイ精度を決定した。
【０１８１】
分析感度：分析感度は、最低標準から得られた平均シグナル＋２ＳＤを相対光単位（ＲＬＵ）で表現したものに対応する濃度として定義される。分析感度の研究は、ＣＬＳＩプロトコールＥＰ５−Ａ２にしたがって行った。分析感度は、最低標準の６０回の繰り返しを用いて決定した。
【０１８２】
ブランク限界（limit of blank）、検出限界、および実効感度：ブランク限界は、ヒト陰性基本プールの分布の９５パーセンタイルに対応する分析物の濃度として定義される。３システムで２ロットの試薬を用いて総ビタミンＤの低濃度標準を２０回アッセイした（ｎ＝１２０）。検出限界（ＬｏＤ）は、ＣＬＳＩプロトコールＥＰ１７−Ａにより決定する。検出限界は、確率９５％で検出できるビタミンＤの最低濃度として定義される。ＬｏＤは、３システムで２ロットの試薬を用いて２０回アッセイした低レベルビタミンＤ試料を使用することによって決定した（ｎ＝１２０）。機能感度（functional sensitivity）は、１台の機器を使用して１０日間にわたり決定した。１日に２回の運転を二つ組で行い、合計６０回繰り返した。ADVIA Centaur総ビタミンＤ感度パネルのメンバーの濃度は、３．０〜２０．０ng/mLであった。ロット内の０日目の２点検量線を使用して濃度を計算した。
【０１８３】
妨害研究：内因性および非内因性物質からの妨害は、ＮＣＣＬＳ ＥＰ−７Ａのガイドラインにしたがって評価した。各試料に妨害物を添加し、マッチする未添加対照と比較した。
【０１８４】
交差反応性：ADVIA Centaur総ビタミンＤアッセイを用いて５種のビタミンＤ誘導体を分析した。２７ng/mLの総ビタミンＤを含有する試料にビタミンＤ誘導体を添加した。添加された試料を３回の繰り返し（replicate）でアッセイし、総ビタミンＤ濃度を決定した。
【０１８５】
チューブの種類の研究：ADVIA Centaur総ビタミンＤアッセイを用いて、ＥＤＴＡチューブと血清セパレーターチューブ（ＳＳＴ）との間の相関を分析した。１１９人のドナーからセラムレッドトップチューブ、ＳＳＴチューブ、およびＥＤＴＡチューブに血清を採取し、Centaur総ビタミンＤアッセイを用いてアッセイした。各試料を３回の繰り返しで評価した。セラムとＳＳＴとの間、およびセラム対ＥＤＴＡの直線回帰相関を決定した。
【０１８６】
方法の相関：患者の検体１９９個を使用して、各方法について１回の繰り返し（replicate）で、ADVIA Centaur総ビタミンＤアッセイを市販のＦＤＡ認可（FDA-cleared）総ビタミンＤイムノアッセイと比較した。検体濃度は５〜１５０ng/mLであった。加えて、患者の試料２３個をＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよびADVIA Centaur総ビタミンＤアッセイによってアッセイした。この第２集団の検体は、１１〜８２ng/mLであった。
【０１８７】
結果
ADVIA Centaur総ビタミンＤアッセイで得られたデータは、２５（ＯＨ）Ｄ２および２５（ＯＨ）Ｄ３の等モル検出を実証し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳへのトレーサビリティーを示した。２５（ＯＨ）Ｄ２の交差反応性は、５０ng/mLで１０５％と決定された。アッセイは、検出限界（ＬｏＤ）３．０ng/mL未満、機能感度（functional sensitivity）（総ＣＶの２０％用量）４ng/mL未満、および上限２５０ng/mLを示した。２２．１、５２．３、１２１、および１５３ng/mLの試料について、総アッセイＣＶは、それぞれ６．４％、７．１％、４．２％、および３．７％であった。最大２４０ng/mLの直線性が示された。血清試料１５０個を用いてＬＣ−ＭＳ／ＭＳに対する相関研究を行い、傾き０．９６、切片１．０、および回帰係数０．９７を得た。
【０１８８】
精度：ADVIA Centaur総ビタミンＤアッセイの精度プロファイルから、総ＣＶが７．６５ng/mL総２５（ＯＨ）ビタミンＤでの８．８％から１２３．３６ng/mLでの２．０％の間であることが示される。精度分析を表５に示す。
【０１８９】
【表５】
2014516540.tif 000009
【０１９０】
分析感度：ADVIA Centaur総ビタミンＤアッセイの分析感度は２．４ng/mLであった。分析感度を表６に示す。
【０１９１】
【表６】
2014516540.tif 000010
【０１９２】
ブランク限界、検出限界、および機能感度：ADVIA Centaur総ビタミンＤアッセイのブランク限界は２．８ng/mLであり、検出限界は３．８ng/mLであり、機能感度は４ng/mLであった（図９）。
【０１９３】
妨害研究：ADVIA Centaur総ビタミンＤアッセイは、内因性妨害物について検査された濃度で≦１０％のバイアスを示した。内因性妨害研究の結果を表７に示す。
【０１９４】
【表７】
2014516540.tif 000011
【０１９５】
交差反応性：ADVIA Centaur総ビタミンＤアッセイは、非ヒドロキシル化型のビタミンＤ２およびビタミンＤ３、ならびに３−エピ−２５（ＯＨ）Ｄ３と非常に低い交差反応性を示した。交差反応性分析の結果を表８に示す。
【０１９６】
【表８】
2014516540.tif 000012
【０１９７】
チューブの種類の研究：セラムレッドトップ、ＳＳＴ、およびＥＤＴＡの種類のチューブ中に採取したドナーの検体１１９個で試料チューブの種類の対比を行った。セラムレッドトップとＳＳＴとの間の回帰分析から、相関係数（Ｒ）０．９９９、傾き１．０１、および切片−０．１４が示される（図１０）。セラムレッドトップとＥＤＴＡとの間の回帰分析から、相関係数（Ｒ）０．９９７、傾き１．００、および切片０．４１が示される（図１１）。
【０１９８】
方法の比較：検体１９９個を用いて、ADVIA Centaur総ビタミンＤアッセイと市販のＦＤＡ認可総ビタミンＤアッセイを比較する試料の対比を行った。回帰分析から、相関係数（Ｒ）０．９９３、傾き１．００、および切片１．６１が示された（図１２）。加えて、ADVIA Centaur総ビタミンＤアッセイと市販の総ビタミンＤ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイを比較して検体２３個をアッセイした。回帰分析から、相関係数（Ｒ）０．９８、傾き１．０３、および切片−２．３が示された（図１３）。
【０１９９】
【表９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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