(57)【要約】  本開示は被験者がリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）に感染しているか否かを判断する方法を提供する。当該方法は、ＬＣＭＶ感染の罹患性が高い被験者からサンプルを得る工程、サンプルをＬＣＭＶを検出するための１つ以上の組成物と接触させる工程、およびＬＣＭＶを検出するための１つ以上の組成物がサンプルからのＬＣＭＶのマーカに関連付けられるか否かを判断する工程を含み、関連付けられることの検出は被験者がＬＣＭＶに感染していることを示す。
2014502848.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者におけるリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）感染状態または活性を評価する方法であって、
評価する被験者を選択する工程を含み、前記被験者はＬＣＭＶに晒されたおよび／または増加したＬＣＭＶ活性のリスクがあり、さらに
前記被験者からサンプルを得る工程、
ＬＣＭＶを検出するための少なくとも１つの組成物でサンプルを接触させる工程、および
前記ＬＣＭＶを検出するための少なくとも１つの組成物がサンプルからＬＣＭＶのマーカに関連付けられるか否かを判断する工程を備え、関連付けられることの検出は前記被験者がＬＣＭＶに感染しているおよび／または活性ＬＣＭＶを有することを示す、方法。
【請求項２】
前記判断は、前記被験者に対しておよび／または被験者に関連する医療実務者に対して、前記被験者がＬＣＭＶに感染しているおよび／または活性ＬＣＭＶを有することを報告する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記判断は、ＬＣＭＶに感染しているおよび／または活性ＬＣＭＶを有する被験者の、ＬＣＭＶのレベルおよび／または活性を検出する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記被験者に対しておよび／または被験者に関連する医療実務者に対して、検出したＬＣＭＶのレベルおよび／または活性を報告する工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
増加したＬＣＭＶ活性のリスクを有する被験者は、低酸素状態に伴う症状のリスクがある、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記被験者は妊娠している、免疫不全である、移植レシピエントである、癌を発症するリスクがある、または癌を患っている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＬＣＭＶを検出するための組成物は、１つ以上のＬＣＭＶ核酸に特異的に結合する少なくとも１つのプライマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つのプライマーは、１０個以上の核酸を含み、前記１０個以上の核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−５１のいずれか１つのターゲット領域に対して、少なくとも８０％以上の同一性を有し、前記プライマーはターゲット領域に特異的に結合する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記プライマーは、SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, およびSEQ ID NO:73からなる群から選択される、請求項７または８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記プライマーは、ＬＣＭＶ  ＮＰをエンコードする核酸に結合する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８および５９に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６および６７に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プライマーは、ＬＣＭＶ  ＧＰをエンコードする核酸に結合する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記プライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０および６１に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８および６９に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プライマーは、ＬＣＭＶ  ＺＰをエンコードする核酸に結合する、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記プライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２および６３に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２および７３に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記プライマーは、ＬＣＭＶ  Ｌをエンコードする核酸に結合する、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記プライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０および７１に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記プライマーは、ＬＣＭＶ  ＮＰ、ＬＣＭＶ  ＧＰ、ＬＣＭＶ  ＺＰおよびＬＣＭＶ  Ｌのうちの２つ以上をエンコードする核酸に結合する、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＬＣＭＶを検出するための組成物は、少なくとも１つの分離されたＬＣＭＶタンパク質またはその断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＬＣＭＶを検出するための組成物は、少なくとも１つの分離されたモノクローナル抗体または抗体断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体または断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭＪ３、ＬＭＢＰ受領番号９２１７ＣＢによって産出された抗体を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体または断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭ１６６、ＬＭＢＰ受領番号９２１６ＣＢによって産出された抗体を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体または断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭＪ３、ＬＭＢＰ受領番号９２１７ＣＢによって産出された抗体と、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭ１６６、ＬＭＢＰ受領番号９２１６ＣＢによって産出された抗体とを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体または断片は、１つ以上の保守的アミノ酸置換を含む、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体または断片は、１つ以上の保守的アミノ酸置換を含む、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体または断片は、１つ以上の保守的アミノ酸置換を含む、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体または断片は、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体または断片は、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体または断片は、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体または断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４と同一性を有する抗原結合ペプチドを含み、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４内の相補性決定領域に対応するアミノ酸配列内の領域は、１つ以上の保守的アミノ酸置換を含み、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４内のフレームワーク領域に対応するアミノ酸配列内の領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４の対応する領域に対して、８０％以上の同一性を有し、
前記抗原結合ペプチドはＬＣＭＶ  ＮＰに結合する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗原結合ペプチドは、抗体または抗体断片である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
サンプルにおけるリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）感染状態または活性を評価するための診断キットであって、前記キットは
１つ以上のＬＣＭＶ核酸に特異的に結合する少なくとも１つのプライマーと、
少なくとも１つのＬＣＭＶタンパク質またはその断片と、
少なくとも１つの分離されたＬＣＭＶ結合抗体または抗体断片と、または
そのいずれかの組合せを含む、キット。
【請求項３３】
前記キットは、１つ以上のＬＣＭＶ核酸に特異的に結合する少なくとも１つのプライマーを含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記プライマーは、１０個以上の核酸を有する少なくとも１つの核酸プライマーを含み、前記１０個以上の核酸は、１つ以上のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−５１内の１つ以上のターゲット領域に対して、少なくとも８０％以上の同一性を有し、前記プライマーは１つ以上のターゲット領域に特異的に結合する、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記プライマーは、SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, およびSEQ ID NO:73からなる群から選択される、請求項３３に記載のキット。
【請求項３６】
前記プライマーは、ＬＣＭＶ  ＮＰをエンコードする核酸に結合する、請求項３３に記載のキット。
【請求項３７】
前記プライマーは、ＬＣＭＶ  ＧＰをエンコードする核酸に結合する、請求項３３に記載のキット。
【請求項３８】
前記プライマーは、ＬＣＭＶ  ＺＰをエンコードする核酸に結合する、請求項３３に記載のキット。
【請求項３９】
前記プライマーは、ＬＣＭＶ  Ｌをエンコードする核酸に結合する、請求項３３に記載のキット。
【請求項４０】
前記プライマーは、ＬＣＭＶ  ＮＰ、ＬＣＭＶ  ＧＰ、ＬＣＭＶ  ＺＰおよびＬＣＭＶ  Ｌのうちの２つ以上をエンコードする核酸に結合する、請求項３３に記載のキット。
【請求項４１】
前記キットは、少なくとも１つの分離されたＬＣＭＶ結合抗体または抗体断片を含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項４２】
前記抗体または断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭＪ３、ＬＭＢＰ受領番号９２１７ＣＢによって産出されたモノクローナル抗体を含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
前記抗体または断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭ１６６、ＬＭＢＰ受領番号９２１６ＣＢによって産出されたモノクローナル抗体を含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４４】
前記抗体または断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭＪ３、ＬＭＢＰ受領番号９２１７ＣＢによって産出されたモノクローナル抗体と、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭ１６６、ＬＭＢＰ受領番号９２１６ＣＢによって産出されたモノクローナル抗体とを含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４５】
前記抗体または断片は、１つ以上の保守的アミノ酸置換を含む、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）を含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４６】
前記抗体または断片は、１つ以上の保守的アミノ酸置換を含む、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）を含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
前記抗体または断片は、１つ以上の保守的アミノ酸置換を含む、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）を含む、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
前記抗体または断片は、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）を含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４９】
前記抗体または断片は、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）を含む、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記抗体または断片は、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）を含む、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
前記抗体または断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４と同一性を有する抗原結合ペプチドを含み、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４内の相補性決定領域に対応するアミノ酸配列内の領域は、１つ以上の保守的アミノ酸置換を含み、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４内のフレームワーク領域に対応するアミノ酸配列内の領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４の対応する領域に対して、８０％以上の同一性を有し、
前記抗原結合ペプチドはＬＣＭＶ  ＮＰに結合する、請求項４１に記載のキット。
【請求項５２】
前記抗原結合ペプチドは抗体または抗体断片である、請求項５１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は２０１１年１月７日に出願された米国特許仮出願第６１／４３０，８２２号の優先権を主張し、その全体の内容は、引用により全体がここに援用される。
【０００２】
技術分野
本開示は、被験者におけるウイルスを検出するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
特定のウイルスを確実に検出および診断するための組成物および方法は限定されている。さらに、急性のウイルス感染および慢性のウイルス感染を区別するための技術も限定されており、信頼性が低い。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
概要
本開示は、被験者におけるリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）を検出するための、および／または急性ＬＣＭＶ感染と慢性ＬＣＭＶ感染とを区別するための、組成物および方法を提供する。したがって、本開示は、たとえばＬＣＭＶを特定し、ＬＣＭＶ感染を治療するための個別の治療を開発する（たとえば、ＬＣＭＶ抗ウイルス性治療のための被験者を選択し、かつ必要ならＬＣＭＶ抗ウイルス治療を変える）、ＬＣＭＶの蔓延を減少させ、ホスト間ＬＣＭＶ伝達を減らし、ＬＣＭＶ疾病の発生および病因を減らし、およびＬＣＭＶ病理状態を評価するために、用いることができる。
【０００５】
したがって、一局面において、本開示は被験者がリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）に感染したか否かを判断するための方法を提供する。当該方法は、ＬＣＭＶ感染の罹患性が高い被験者を選択すること、被験者からサンプルを得ること、サンプルをＬＣＭＶを検出するための１つ以上の組成物と接触させること、ＬＣＭＶを検出するための１つ以上の組成物がサンプルからのＬＣＭＶのマーカと関連付けられるかどうかを判断することを含み、関連付けられることの検出は被験者がＬＣＭＶに感染していることを示す。
【０００６】
別の局面において、本開示は被験者がリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）に感染したか否かを判断するための方法を提供する。当該方法は、ＬＣＭＶに感染している被験者を選択すること、被験者からサンプルを得ること、サンプルをＬＣＭＶを検出するための１つ以上の組成物と接触させること、ＬＣＭＶを検出するための１つ以上の組成物がサンプルからのＬＣＭＶのマーカと関連付けられるかどうかを判断することを含み、関連付けられることの検出は被験者がＬＣＭＶに感染していることを示す。
【０００７】
別の局面において、本開示は被験者がリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）に感染したか否かを判断するための方法を提供する。当該方法は、被験者からサンプルを得ること、サンプルを、１つ以上のＬＣＭＶ核酸もしくは１つ以上のＬＣＭＶ核酸の一部に特異的に結合する１つ以上のプローブまたはプライマー、１つ以上のＬＣＭＶタンパク質またはその断片、および１つ以上のＬＣＭＶペプチドまたはＬＣＭＶペプチド断片を検出するための１つ以上の組成物（たとえば、１つ以上の抗体または抗体の断片）からなる群から選択された少なくとも２つの組成物と接触させること、ならびに２つ以上の組成物がサンプルからのＬＣＭＶのマーカに関連付けられるか否かを判断することを含み、関連付けられることの検出は被験者がＬＣＭＶに感染していることを示す。
【０００８】
さらに他の局面において、本開示は被験者がリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）に感染したか否かを判断するための方法を提供する。当該方法は、低酸素状態を経験しているまたはリスクがある被験者を選択すること、被験者からサンプルを得ること、サンプルをＬＣＭＶを検出するための１つ以上の組成物と接触させること、およびＬＣＭＶを検出するための１つ以上の組成物がサンプルからＬＣＭＶのマーカに関連付けられるか否かを判断することを含み、関連付けられることの検出は被験者がＬＣＭＶに感染していることを示す。
【０００９】
一部の実施の形態において、被験者は、たとえば、妊娠している、免疫不全である、移植レシピエントである、癌を発症するリスクがある、もしくは癌を患っている、またはそのいずれかの組合せを有し得る。一部の実施の形態において、被験者は低酸素状態を経験している、または低酸素状態の危険性があり得る。
【００１０】
他の実施の形態において、ＬＣＭＶを検出するための１つ以上の組成物は、１つ以上のＬＣＭＶ核酸もしくは１つ以上のＬＣＭＶ核酸の一部に特異的に結合する１つ以上のプローブまたはプライマーであり得る。
【００１１】
さらに他の実施の形態において、ＬＣＭＶを検出するための１つ以上の組成物は、１つ以上のＬＣＭＶタンパク質またはその断片であり得る。
【００１２】
さらに他の実施の形態において、ＬＣＭＶを検出するための１つ以上の組成物は、１つ以上のＬＣＭＶペプチドまたはＬＣＭＶペプチドの断片を検出するための１つ以上の組成物（たとえば１つ以上の抗体または抗体の断片）であり得る。
【００１３】
一局面において、本開示は、１つ以上のＬＣＭＶ核酸もしくは１つ以上のＬＣＭＶ核酸の一部に特異的に結合する１つ以上のプローブまたはプライマー、１つ以上のＬＣＭＶタンパク質またはその断片、および１つ以上のＬＣＭＶペプチドまたはＬＣＭＶペプチド断片を検出するための１つ以上の組成物（たとえば、１つ以上の抗体または抗体の断片）からなる群から選択された２つ以上の組成物を含む組成物を提供する。
【００１４】
別の局面において、本開示は診断キットを提供し、当該キットは、少なくとも１つの分離されたＬＣＭＶポリペプチドまたはその断片、たとえばＮＰ、ＧＰ、ＧＰＣ、ＧＰＬもしくはＺＰ抗原、またはその断片を含む。代替的に、または付加的に、当該キットはＮＰ、ＧＰ、ＧＰＣ、ＧＰＬもしくはＺＰ抗原に結合する少なくとも１つの分離された抗体または抗体断片、またはその抗原結合断片を含むことができる。代替的に、または付加的に、当該キットは１つ以上のＬＣＭＶ核酸またはその一部に特異的に結合する少なくとも１つのプローブまたはプライマー、たとえばＮＰ、ＧＰ、ＧＰＣ、ＧＰＬもしくはＺＰ抗原をエンコードする核酸を含むことができる。場合によっては、当該キットはそのいずれかの組み合わせを含むことができる。
【００１５】
さらに別の局面において、本開示は複数の分離されたポリペプチドを提供し、その複数のものは少なくとも２、たとえば３、４、または５種類のポリペプチドを含み、ポリペプチドは、分離されたＮＰ抗原またはその断片、分離されたＧＰ抗原またはその断片、分離されたＧＰＣ抗原またはその断片、分離されたＧＰｌ抗原またはその断片、および分離されたＺＰ抗原またはその断片からなる群から選択される。場合によっては、本開示はこのような複数のポリペプチドを含む診断キットを提供する。
【００１６】
さらに他の局面において、本開示は複数の分離された抗体、たとえばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を提供し、その複数のものは少なくとも２、たとえば３、４、または５種類のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含むかまたは該抗体からなり、ポリペプチドは、分離されたＮＰ抗原またはその断片、分離されたＧＰ抗原またはその断片、分離されたＧＰＣ抗原またはその断片、分離されたＧＰｌ抗原またはその断片、および分離されたＺＰ抗原またはその断片からなる群から選択される。場合によっては、本開示はこのような複数の分離された抗体を含む診断キットを提供する。
【００１７】
さらに他の局面において、本開示は複数の分離された核酸プローブまたはプライマーを提供し、その複数のものは少なくとも２、たとえば３、４、または５種類のポリペプチドであって、ＮＰ抗原またはその断片、ＧＰ抗原またはその断片、ＧＰＣ抗原またはその断片、ＧＰｌ抗原またはその断片、およびＺＰ抗原またはその断片からなる群から選択される少なくとも２つのポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列に特異的に結合するプローブもしくはプライマーを含むかまたは該プローブもしくはプライマーからなる。場合によっては、本開示はこのような複数のプローブまたはプライマーを含む診断キットを提供する。
【００１８】
一部の実施例において、ここに記載されている診断キットは、被験者のＬＣＭＶまたはその症状を治療するための薬、たとえば抗ウイルス薬を含むことができる。
【００１９】
さらに他の局面において、本開示はＬＣＭＶ感染の被験者を治療する方法を提供する。当該方法は、ＬＣＭＶを罹っているまたはＬＣＭＶ感染のリスクがある被験者から生体サンプルを得ること、上記の診断キット、上記の複数のポリペプチド、上記の複数の抗体、または上記の複数のプローブもしくはプライマー、またはそのいずれかの組合せを用いて、サンプルをスクリーニングして、被験者がＬＣＭＶに感染しているか否かを判断すること、ならびに患者がＬＣＭＶに感染しているのなら、ＬＣＭＶまたはその症状を治療する薬、たとえば抗ウイルス薬を、被験者に投与することを含む。場合によっては、ＬＣＭＶ感染しているまたはそのリスクがある被験者は、低酸素状態に係わる症状を有する。場合によっては、ＬＣＭＶ感染しているまたはそのリスクがある被験者は、妊娠している、免疫不全である、移植レシピエントである、癌を発症するリスクがある、もしくは癌を患っている、またはそのいずれかの組合せを有する。
【００２０】
さらに別の実施例において、本開示は被験者がＬＣＭＶに感染したか否かを判断する方法を提供する。当該方法は、ＬＣＭＶに感染しているまたはそのリスクがある被験者から生体サンプルを得ること、サンプルを、上記の複数のポリペプチド、上記の複数の抗体、または上記の複数のプローブもしくはプライマー、またはそのいずれかの組合せと接触させること、および複数のポリペプチド、複数の抗体、複数のプローブもしくはプライマー、またはそのいずれかの組合せは、サンプルからのＬＣＭＶのマーカに関連付けられるか否かを判断することを含み、関連付けられることの検出はその被験者がＬＣＭＶに感染していることを示す。
【００２１】
別の局面において、本開示は、ＬＣＭＶ  ＮＰに特異的に結合するモノクローナル抗体Ｍ５９またはその抗原結合断片、たとえば相補性決定領域（ＣＤＲ）、たとえばそのＣＤＲ３を提供する。場合によっては、本開示はこのような抗体を含むキットを提供する。
【００２２】
他の局面において、本開示はＬＣＭＶ  ＮＰに特異的に結合するモノクローナル抗体Ｍ８７またはその抗原結合断片、たとえば相補性決定領域（ＣＤＲ）、たとえばそのＣＤＲ３を提供する。場合によっては、本開示はこのような抗体を含むキットを提供する。
【００２３】
別の局面において、本開示はＬＣＭＶ  ＧＰｌに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片、たとえば相補性決定領域（ＣＤＲ）、たとえばそのＣＤＲ３を提供する。場合によっては、本開示はこのような抗体を含むキットを提供する。
【００２４】
別の局面において、本開示はアミノ酸配列ＲＳＧＷＧＷＡＧＳＤＧＫＴＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８９）に特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体、またはその抗体の抗原結合断片、たとえば相補性決定領域（ＣＤＲ）、たとえばそのＣＤＲ３を提供する。場合によっては、本開示はこのような抗体を含むキットを提供する。
【００２５】
他の局面において、本開示はＬＣＭＶ  ＺＰに特異的に結合するモノクローナル抗体ＭＪ３またはその断片、たとえば相補性決定領域（ＣＤＲ）、たとえばそのＣＤＲ３を提供する。場合によっては、本開示はこのような抗体を含むキットを提供する。
【００２６】
一部の局面において、本開示は被験者におけるリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）感染または活量を評価（たとえば、検出、判断、診断および／またはモニタ）する方法を提供する。このような方法は、評価する被験者を選択することを含むことができ、候補の被験者はＬＣＭＶに晒されている、またはＬＣＭＶに感染している人間または動物に晒されている疑いがある。当該方法は、選択された被験者からサンプルを得るまたは供給すること、サンプルをＬＣＭＶを検出するための１つ以上の組成物に接触させること、およびＬＣＭＶを検出するための１つ以上の組成物はサンプルからのＬＣＭＶのマーカに関連付けられるか否かを判断することを含み、関連付けられることの検出は被験者がＬＣＭＶに感染していることを示す。
【００２７】
一部の局面において、本開示は被験者、たとえばＬＣＭＶに感染している被験者、またはＬＣＭＶ感染の源、たとえばＬＣＭＶに感染している人間または動物に晒されている疑いのある被験者における、レベル（たとえばＬＣＭＶ核酸、タンパク質、および／または活量のレベル）を含む、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）を評価（たとえば、検出、判断、診断および／またはモニタ）する方法を提供する。一部の実施の形態において、このような方法は、被験者を選択すること（たとえば、候補被験者）、被験者からサンプルを得るまたは供給すること、およびＬＣＭＶを検出するための１つ以上の組成物はサンプルからのＬＣＭＶのマーカに関連付けられるか否かを判断することを含み、関連付けられることの検出は被験者がＬＣＭＶに感染していることを示す。
【００２８】
一部の局面において、本開示は被験者、たとえばＬＣＭＶに感染している被験者、またはＬＣＭＶ感染の源、たとえばＬＣＭＶに感染している人間または動物に晒されている疑いのある被験者における、レベル（たとえばＬＣＭＶ核酸、タンパク質、および／または活量のレベル）を含む、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）を評価（たとえば、検出、判断、診断および／またはモニタ）する方法を提供する。一部の実施の形態において、当該方法は被験者（たとえば、適切な被験者）からサンプルを得るまたは供給すること、サンプルを、１つ以上のＬＣＭＶ核酸もしくは１つ以上のＬＣＭＶ核酸の一部に特異的に結合する１つ以上のプローブまたはプライマー、１つ以上のＬＣＭＶタンパク質またはその断片、および１つ以上のＬＣＭＶペプチドまたはＬＣＭＶペプチド断片を検出するための１つ以上の組成物（たとえば、１つ以上の抗体または抗体の断片）からなる群から選択された少なくとも２つの組成物と接触させること、および２つ以上の組成物はサンプルからのＬＣＭＶのマーカに関連付けられるか否かを判断することを含み、関連付けられることの検出は被験者がＬＣＭＶに感染していることを示す。
【００２９】
一部の局面において、本開示は被験者、たとえばＬＣＭＶに感染している被験者、またはＬＣＭＶ感染の源、たとえばＬＣＭＶに感染している人間または動物に晒されている疑いのある被験者における、レベル（たとえばＬＣＭＶ核酸、タンパク質、および／または活量のレベル）を含む、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）を評価（たとえば、検出、判断、診断および／またはモニタ）する方法を提供する。一部の実施の形態において、当該方法は被験者からサンプルを得るまたは供給すること、サンプルを、ＬＣＭＶを検出するための１つ以上の組成物と接触させること、およびＬＣＭＶを検出するための１つ以上の組成物はサンプルからのＬＣＭＶのマーカに関連付けられるか否かを判断することを含み、関連付けられることの検出は被験者がＬＣＭＶに感染していることを示す。
【００３０】
一部の実施の形態において、本開示の方法は、低酸素状態および／または遊離基形成の高いレベルに伴う症状を有する、またはそのリスクがある被験者を選択することを含む。このような被験者は、たとえば妊娠している、免疫不全である、移植レシピエントである、および／または癌を発症するリスクを有する、または癌を患っているものを含む。
【００３１】
一部の実施の形態において、本開示の方法はここに開示されている１つ以上の組成物を単独で、またはここに開示している他の組成物のいずれかと組合せて用いることができる。たとえば、２つ以上の組成物を組合せて使用することは同時使用に限定されず、たとえば並行に、または後で使用することを含む。一部の実施の形態において、１つの組成物を用いて観察された結果は、ここに開示されている１つ以上の他の組成物を用いて検証または確認することができる。
【００３２】
一部の実施の形態において、本開示の方法は、１つ以上のＬＣＭＶ核酸または１つ以上のＬＣＭＶ核酸の一部に特異的に結合する１つ以上のプローブまたはプライマーの使用を含むことができる。たとえば、このようなプローブまたはプライマーは、１０個以上の核酸を有する核酸プローブまたはプライマーを含むことができ、ここで１０個以上の核酸は１つ以上のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−５１内の１つ以上のターゲット領域に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、その１つ以上の核酸プローブまたはプライマーは当該１つ以上のターゲット領域に特異的に結合する。
【００３３】
一部の実施の形態において、本開示の方法は、１つ以上のSEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73に対して８０％以上の同一性を有する１つ以上の核酸配列からなる群から選択された１つ以上のプローブまたはプライマーを含むことができる。一部の実施の形態において、本開示の方法は、SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73からなる群から選択された１つ以上のプローブまたはプライマーを含むことができる。
【００３４】
一部の実施の形態において、本開示の方法は、ＬＣＭＶ  ＮＰをエンコードする核酸に結合する１つ以上のプローブまたはプライマーの使用を含むことができる。たとえば、このようなプローブまたはプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８および５９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８および５９に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６および６７、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６および６７に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列を含むことができる。
【００３５】
一部の実施の形態において、本開示の方法は、ＬＣＭＶ  ＧＰをエンコードする核酸に結合する１つ以上のプローブまたはプライマーの使用を含むことができる。たとえば、このようなプローブまたはプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０および６１、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０および６１に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８および６９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８および６９に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列を含むことができる。
【００３６】
一部の実施の形態において、本開示の方法は、ＬＣＭＶ  ＺＰをエンコードする核酸に結合する１つ以上のプローブまたはプライマーの使用を含むことができる。たとえば、このようなプローブまたはプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２および６３、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２および６３に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２および７３、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２および７３に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列を含むことができる。
【００３７】
一部の実施の形態において、本開示の方法は、ＬＣＭＶ  Ｌをエンコードする核酸に結合する１つ以上のプローブまたはプライマーの使用を含むことができる。たとえば、このようなプローブまたはプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０および７１、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０および７１に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列を含むことができる。
【００３８】
一部の実施の形態において、本開示の方法はＬＣＭＶ  ＮＰ、ＬＣＭＶ  ＧＰ、ＬＣＭＶ  ＺＰおよびＬＣＭＶ  Ｌのうちの２つ以上をエンコードする核酸の使用を含むことができる。
【００３９】
一部の実施の形態において、本開示の方法は以下の使用を含むことができる：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８および５９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８および５９に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６および６７、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６および６７に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列であって、ここでプライマーは、ＬＣＭＶ  ＮＰに結合する；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０および６１、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０および６１に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８および６９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８および６９に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列であって、ここでプライマーは、ＬＣＭＶ  ＧＰに結合する；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２および６３、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２および６３に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２および７３、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２および７３に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列であって、ここでプライマーは、ＬＣＭＶ  ＺＰに結合する；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０および７１、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０および７１に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列であって、ここでプライマーは、ＬＣＭＶ  Ｌに結合する。
【００４０】
一部の実施の形態において、本開示の方法は、１つ以上のＬＣＭＶタンパク質またはその断片の使用を含む。
【００４１】
一部の実施の形態において、本開示の方法は、１つ以上の抗体または抗体の断片の使用を含むことができる。一部の実施の形態において、このような抗体または抗体の断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭＪ３、ＬＭＢＰ受領番号９２１７ＣＢと同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体を含むことができる。一部の実施の形態において、このような抗体または抗体の断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭＪ３、ＬＭＢＰ受領番号９２１７ＣＢによって産出されたモノクローナル抗体を含むことができる。一部の実施の形態において、このような抗体または抗体の断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭ１６６、ＬＭＢＰ受領番号９２１６ＣＢと同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体を含むことができる。一部の実施の形態において、このような抗体または抗体の断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭ１６６、ＬＭＢＰ受領番号９２１６ＣＢによって産出されたモノクローナル抗体を含むことができる。一部の実施の形態において、このような抗体または抗体の断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭＪ３、ＬＭＢＰ受領番号９２１７ＣＢと同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体と、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭ１６６、ＬＭＢＰ受領番号９２１６ＣＢと同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体とを含むことができる。一部の実施の形態において、このような抗体または抗体の断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭＪ３、ＬＭＢＰ受領番号９２１７ＣＢによって産出されたモノクローナル抗体と、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭ１６６、ＬＭＢＰ受領番号９２１６ＣＢによって産出されたモノクローナル抗体とを含むことができる。一部の実施の形態において、このような抗体または抗体の断片は以下を備えることができる：保守的アミノ酸置換を全く含まない（たとえばゼロ）もしくは少なくとも１つ（たとえば、１、２、３、４、５、１０未満、２０未満、３０未満、５０未満、または１００未満）含む、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）、および／または保守的アミノ酸置換を全く含まない（たとえばゼロ）もしくは少なくとも１つ（たとえば、１、２、３、４、５、１０未満、２０未満、３０未満、５０未満、または１００未満）含む、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、および／または保守的アミノ酸置換を全く含まない（たとえばゼロ）もしくは少なくとも１つ（たとえば、１、２、３、４、５、１０未満、２０未満、３０未満、５０未満、または１００未満）含む、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）。一部の実施の形態において、このような抗体または抗体の断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４と同一性を有する抗原結合ペプチド（たとえば、抗体および／または抗原結合抗体断片を含む）を含むことができ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４内の相補性決定領域に対応するアミノ酸配列内の領域は、１つ以上の保守的アミノ酸置換を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４内のフレームワーク領域に対応するアミノ酸配列の領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４の対応する領域に対して８０％以上の同一性を有し、および／または抗原結合ペプチドはＬＣＭＶ  ＮＰに結合する。
【００４２】
一部の局面において、本開示は、１つ以上のＬＣＭＶ核酸もしくは１つ以上のＬＣＭＶ核酸の一部に特異的に結合する１つ以上のプローブまたはプライマー、１つ以上のＬＣＭＶタンパク質またはその断片、および１つ以上の抗体または抗体の断片の組合せ（たとえば、１つ、２つまたは３つ）を含む。一部の実施の形態において、ここに記載される組成物の１つ以上のプローブまたはプライマーは、１０個以上の核酸を有する１つ以上の核酸プローブまたはプライマーを含むことができ、１０個以上の核酸は１つ以上のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１-５０内の１つ以上のターゲット領域に対して８０％以上の同一性を有し、それにより１つ以上の核酸プローブまたはプライマーは、１つ以上のターゲット領域に特異的に結合する。一部の実施の形態において、ここに記載される組成物の１つ以上のプローブまたはプライマーは、SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73のうちの１つ以上に対して８０％以上の同一性を有する１つ以上の核酸配列からなる群から選択されている。一部の実施の形態において、ここに記載される組成物の１つ以上のプローブまたはプライマーは、SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73からなる群から選択される。一部の実施の形態において、ここに記載される組成物の１つ以上のプローブまたはプライマーは、ＬＣＭＶ  ＮＰをエンコードする核酸に結合する１つ以上のプローブまたはプライマーを含む。一部の実施の形態において、ここに記載される組成物の１つ以上のプローブまたはプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８および５９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８および５９に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６および６７、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６および６７に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列から選択される１つ以上のプローブまたはプライマーを含む。
【００４３】
一部の実施の形態において、ここに記載される組成物の１つ以上のプローブまたはプライマーは、ＬＣＭＶ  ＧＰをエンコードする核酸に結合する１つ以上のプローブまたはプライマーを含む。たとえば、このようなプローブまたはプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０および６１、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０および６１に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８および６９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８および６９に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列を含む。
【００４４】
一部の実施の形態において、ここに記載される組成物の１つ以上のプローブまたはプライマーは、ＬＣＭＶ  ＺＰをエンコードする核酸に結合する１つ以上のプローブまたはプライマーを含む。たとえば、このようなプローブまたはプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２および６３、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２および６３に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２および７３、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２および７３に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列を含む。
【００４５】
一部の実施の形態において、ここに記載される組成物の１つ以上のプローブまたはプライマーは、ＬＣＭＶ  Ｌをエンコードする核酸に結合する１つ以上のプローブまたはプライマーを含む。たとえば、このようなプローブまたはプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０および７１、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０および７１に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列を含む。
【００４６】
一部の実施の形態において、ここに記載される組成物の１つ以上のプローブまたはプライマーは、ＬＣＭＶ  ＧＰをエンコードする核酸に結合する１つ以上のプローブまたはプライマーを含む。たとえば、このようなプローブまたはプライマーは、ＬＣＭＶ  ＮＰ、ＬＣＭＶ  ＧＰ、ＬＣＭＶ  ＺＰおよび／またはＬＣＭＶ  Ｌのうちの２つ以上をエンコードする核酸に結合する１つ以上のプローブまたはプライマーを含む。
【００４７】
一部の実施の形態において、ここに記載される組成物の１つ以上のプローブまたはプライマーは、ＬＣＭＶ  ＧＰをエンコードする核酸に結合する１つ以上のプローブまたはプライマーを含む。たとえば、このようなプローブまたはプライマーは、以下を含む１つ以上のプローブまたはプライマーを含む：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８および５９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８および５９に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６および６７、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６および６７に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列であって、ここでプライマーは、ＬＣＭＶ  ＮＰに結合する；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０および６１、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０および６１に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８および６９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８および６９に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列であって、ここでプライマーは、ＬＣＭＶ  ＧＰに結合する；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２および６３、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２および６３に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２および７３、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２および７３に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列であって、ここでプライマーは、ＬＣＭＶ  ＺＰに結合する；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０および７１、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０および７１に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列であって、ここでプライマーは、ＬＣＭＶ  Ｌに結合する。
【００４８】
一部の局面において、本開示は、１つ以上の抗体を含む組成物を含む。一部の実施の形態において、このような抗体または抗体の断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭＪ３、ＬＭＢＰ受領番号９２１７ＣＢと同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体を含むことができる。一部の実施の形態において、このような抗体または抗体の断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭＪ３、ＬＭＢＰ受領番号９２１７ＣＢによって産出されたモノクローナル抗体を含むことができる。一部の実施の形態において、このような抗体または抗体の断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭ１６６、ＬＭＢＰ受領番号９２１６ＣＢと同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体を含むことができる。一部の実施の形態において、このような抗体または抗体の断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭ１６６、ＬＭＢＰ受領番号９２１６ＣＢによって産出されたモノクローナル抗体を含むことができる。一部の実施の形態において、このような抗体または抗体の断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭＪ３、ＬＭＢＰ受領番号９２１７ＣＢと同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体と、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭ１６６、ＬＭＢＰ受領番号９２１６ＣＢと同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体とを含むことができる。一部の実施の形態において、このような抗体または抗体の断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭＪ３、ＬＭＢＰ受領番号９２１７ＣＢによって産出されたモノクローナル抗体と、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭ１６６、ＬＭＢＰ受領番号９２１６ＣＢによって産出されたモノクローナル抗体とを含むことができる。一部の実施の形態において、このような抗体または抗体の断片は、以下を含むことができる：１つ以上の保守的アミノ酸置換を含む、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）、１つ以上の保守的アミノ酸置換を含む、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、および／または１つ以上の保守的アミノ酸置換を含む、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）。
【００４９】
一部の実施の形態において、本開示の組成物に含まれる抗体または抗体の断片は、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）、および／またはモノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、および／またはモノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）を含むことができる。
【００５０】
一部の実施の形態において、本開示の組成物に含まれる抗体または抗体の断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４と同一性を有する抗原結合ペプチド（たとえば、抗体および／または抗原結合抗体断片を含む）を含むことができ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４内の相補性決定領域に対応するアミノ酸配列内の領域は、１つ以上の保守的アミノ酸置換を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４内のフレームワーク領域に対応するアミノ酸配列の領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４の対応する領域に対して８０％以上の同一性を有し、および／または抗原結合ペプチドはＬＣＭＶ  ＮＰに結合する。
【００５１】
一部の局面において、本開示は診断キットを含む。一部の実施の形態において、このような診断キットは以下を含むことができる：、少なくとも１つの分離したＬＣＭＶポリペプチドまたはその断片であって、ＬＣＭＶポリペプチドは、ＮＰ、ＧＰもしくはＺＰ抗原またはその断片である；ＮＰ、ＧＰもしくはＺＰ抗原またはその抗原結合断片に結合する１つ以上の分離された抗体または抗体の断片；および／または１つ以上のＬＣＭＶ核酸もしくはその一部に特異的に結合する１つ以上のプローブまたはプライマー；および／またはその組合せ。
【００５２】
一部の実施の形態において、本開示の診断キットは、１つ以上のプローブまたはプライマーを含むことができ、これは１０個以上の核酸を有する１つ以上の核酸プローブまたはプライマーを含み、ここで１０個以上の核酸は１つ以上のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１-５１内の１つ以上のターゲット領域に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、それにより１つ以上の核酸プローブまたはプライマーは、１つ以上のターゲット領域に特異的に結合する。一部の実施の形態において、本開示の診断キットに含まれるプローブまたはプライマーは、SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73のうちの１つ以上に対して８０％以上の同一性を有する１つ以上の核酸配列からなる群から選択されるプローブまたはプライマーを含む。一部の実施の形態において、ここに本開示の診断キットに含まれるプローブまたはプライマーは、SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73からなる群から選択されるプローブまたはプライマーを含む。
【００５３】
一部の実施の形態において、本開示の診断キットに含まれるプローブまたはプライマーは、ＬＣＭＶ  ＮＰをエンコードする核酸に結合する１つ以上のプローブまたはプライマーを含む。一部の実施の形態において、このようなプローブまたはプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８および５９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８および５９に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６および６７、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６および６７に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列を含むことができる。
【００５４】
一部の実施の形態において、本開示の診断キットに含まれるプローブまたはプライマーは、ＬＣＭＶ  ＧＰをエンコードする核酸に結合する１つ以上のプローブまたはプライマーを含む。たとえば、このようなプローブまたはプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０および６１、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０および６１に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８および６９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８および６９に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列を含むことができる。
【００５５】
一部の実施の形態において、本開示の診断キットに含まれるプローブまたはプライマーは、ＬＣＭＶ  ＺＰをエンコードする核酸に結合する１つ以上のプローブまたはプライマーを含む。一部の実施の形態において、このようなプローブまたはプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２および６３、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２および６３に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２および７３、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２および７３に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列を含むことができる。
【００５６】
一部の実施の形態において、本開示の診断キットに含まれるプローブまたはプライマーは、ＬＣＭＶ  Ｌをエンコードする核酸に結合するプローブまたはプライマーを含む。一部の実施の形態において、このようなプローブまたはプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０および７１、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０および７１に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列を含むことができる。
【００５７】
一部の実施の形態において、本開示の診断キットに含まれるプローブまたはプライマーは、ＬＣＭＶ  ＮＰ、ＬＣＭＶ  ＧＰ、ＬＣＭＶ  ＺＰおよびＬＣＭＶ  Ｌのうちの２つ以上をエンコードする核酸に結合する１つ以上のプローブまたはプライマーを含む。
【００５８】
一部の実施の形態において、本開示の診断キットに含まれるプローブまたはプライマーは、以下を含む：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８および５９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８および５９に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６および６７、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６および６７に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列であって、ここでプライマーは、ＬＣＭＶ  ＮＰに結合する；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０および６１、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０および６１に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８および６９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８および６９に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列であって、ここでプライマーは、ＬＣＭＶ  ＧＰに結合する；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２および６３、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２および６３に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２および７３、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２および７３に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列であって、ここでプライマーは、ＬＣＭＶ  ＺＰに結合する；および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０および７１、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０および７１に対して８０％以上の同一性を有する１対の核酸配列であって、ここでプライマーは、ＬＣＭＶ  Ｌに結合する。
【００５９】
一部の実施の形態において、本開示の診断キットは、１つ以上の分離された抗体または抗体断片を含む。一部の実施の形態において、本開示の診断キットに含まれる分離された抗体または抗体断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭＪ３、ＬＭＢＰ受領番号９２１７ＣＢと同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体を含むことができる。一部の実施の形態において、本開示の診断キットに含まれる分離された抗体または抗体断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭＪ３、ＬＭＢＰ受領番号９２１７ＣＢによって産出されたモノクローナル抗体を含むことができる。一部の実施の形態において、本開示の診断キットに含まれる分離された抗体または抗体断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭ１６６、ＬＭＢＰ受領番号９２１６ＣＢと同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体を含むことができる。一部の実施の形態において、本開示の診断キットに含まれる分離された抗体または抗体断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭ１６６、ＬＭＢＰ受領番号９２１６ＣＢによって産出されたモノクローナル抗体を含むことができる。一部の実施の形態において、本開示の診断キットに含まれる分離された抗体または抗体断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭＪ３、ＬＭＢＰ受領番号９２１７ＣＢと同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体と、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭ１６６、ＬＭＢＰ受領番号９２１６ＣＢと同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体とを含むことができる。一部の実施の形態において、本開示の診断キットに含まれる分離された抗体または抗体断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭＪ３、ＬＭＢＰ受領番号９２１７ＣＢによって産出されたモノクローナル抗体と、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭ１６６、ＬＭＢＰ受領番号９２１６ＣＢによって産出されたモノクローナル抗体とを含むことができる。
【００６０】
一部の実施の形態において、本開示の診断キットに含まれる分離された抗体または抗体断片は、以下を含むことができる：１つ以上の保守的アミノ酸置換を含む、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）、および／または１つ以上の保守的アミノ酸置換を含む、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、および／または１つ以上の保守的アミノ酸置換を含む、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）。
【００６１】
一部の実施の形態において、本開示の診断キットに含まれる分離された抗体または抗体の断片は、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）、および／またはモノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、および／またはモノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）を含むことができる。
【００６２】
一部の実施の形態において、本開示の診断キットに含まれる分離された抗体または抗体断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４と同一性を有する抗原結合ペプチド（たとえば、抗体および／または抗原結合抗体断片を含む）を含むことができ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４内の相補性決定領域に対応するアミノ酸配列内の領域は、１つ以上の保守的アミノ酸置換を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４内のフレームワーク領域に対応するアミノ酸配列の領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４の対応する領域に対して８０％以上の同一性を有し、および／または抗原結合ペプチドはＬＣＭＶ  ＮＰに結合する。
【００６３】
一部の局面において、本開示は複数の分離されたポリペプチドを含み、この複数のものは、分離されたＮＰ抗原またはその断片、分離されたＧＰ抗原またはその断片、分離されたＧＰＣ抗原またはその断片、分離されたＧＰｌ抗原またはその断片、および分離されたＺＰ抗原またはその断片からなる群から選択された少なくとも２つのポリペプチドを含む。一部の実施例において、本開示の複数のものは、分離されたＮＰ抗原またはその断片、分離されたＧＰ抗原またはその断片、分離されたＧＰＣ抗原またはその断片、分離されたＧＰｌ抗原またはその断片、および分離されたＺＰ抗原またはその断片からなる群から選択された少なくとも３つのポリペプチド、分離されたＮＰ抗原またはその断片、分離されたＧＰ抗原またはその断片、分離されたＧＰＣ抗原またはその断片、分離されたＧＰｌ抗原またはその断片、分離されたＺＰ抗原またはその断片、分離されたＮＰ抗原またはその断片、分離されたＧＰ抗原またはその断片、分離されたＧＰＣ抗原またはその断片、分離されたＧＰｌ抗原またはその断片、および分離されたＺＰ抗原またはその断片からなる群から選択された少なくとも４つのポリペプチドを含むことができる。一部の実施の形態において、このような複数のものはキットとして提供できる、またはキット内に含むことができる。
【００６４】
一部の局面において、本開示は複数の分離された抗体または抗体の断片を含み、複数のものはＮＰ抗原またはその断片、ＧＰ抗原またはその断片、ＧＰＣ抗原またはその断片、ＧＰｌ抗原またはその断片、およびＺＰ抗原またはその断片からなる群から選択された少なくとも２つのポリペプチドに特異的に結合される抗体またはその断片を含む。
【００６５】
一部の局面において、本開示は複数の分離された抗体または抗体の断片を含み、複数のものはＮＰ抗原またはその断片、ＧＰ抗原またはその断片、ＧＰＣ抗原またはその断片、ＧＰｌ抗原またはその断片、およびＺＰ抗原またはその断片からなる群から選択された少なくとも３つのポリペプチドに特異的に結合される抗体またはその断片を含む。
【００６６】
一部の局面において、本開示は複数の分離された抗体または抗体の断片を含み、複数のものはＮＰ抗原またはその断片、ＧＰ抗原またはその断片、ＧＰＣ抗原またはその断片、ＧＰｌ抗原またはその断片、およびＺＰ抗原またはその断片からなる群から選択された少なくとも４つのポリペプチドに特異的に結合される抗体またはその断片を含む。
【００６７】
一部の局面において、本開示は複数の分離された抗体または抗体断片を含み、複数のものはＮＰ抗原またはその断片、ＧＰ抗原またはその断片、ＧＰＣ抗原またはその断片、ＧＰｌ抗原またはその断片、およびＺＰ抗原またはその断片に特異的に結合される抗体または断片を含む。
【００６８】
一部の実施の形態において、本開示の複数のものは、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭＪ３、ＬＭＢＰ受領番号９２１７ＣＢと同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体を含むことができる。一部の実施の形態において、このような抗体または抗体の断片は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭＪ３、ＬＭＢＰ受領番号９２１７ＣＢによって産出されたモノクローナル抗体を含むことができる。一部の実施の形態において、本開示の複数のものは、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭ１６６、ＬＭＢＰ受領番号９２１６ＣＢと同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体を含むことができる。一部の実施の形態において、本開示の複数のものは、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭ１６６、ＬＭＢＰ受領番号９２１６ＣＢによって産出されたモノクローナル抗体を含むことができる。一部の実施の形態において、本開示の複数のものは、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭＪ３、ＬＭＢＰ受領番号９２１７ＣＢと同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体と、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭ１６６、ＬＭＢＰ受領番号９２１６ＣＢと同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体とを含むことができる。一部の実施の形態において、本開示の複数のものは、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭＪ３、ＬＭＢＰ受領番号９２１７ＣＢによって産出されたモノクローナル抗体と、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭ１６６、ＬＭＢＰ受領番号９２１６ＣＢによって産出されたモノクローナル抗体とを含むことができる。
【００６９】
一部の実施の形態において、本開示の複数のものは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４と同一性を有する抗原結合ペプチドを含むことができ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４内の相補性決定領域に対応するアミノ酸配列内の領域は、１つ以上の保守的アミノ酸置換を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４内のフレームワーク領域に対応するアミノ酸配列の領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４の対応する領域に対して８０％以上の同一性を有し、および／または抗原結合ペプチドはＬＣＭＶ  ＮＰに結合する。
【００７０】
一部の局面において、本開示の複数のものは診断キットとして提供（たとえば、販売、販売に供せられる、市場に出される、出荷される、保管される、および／またはパッケージ化される）または診断キット内に含まれるものとして提供できる。
【００７１】
一部の局面において、本開示の複数のものは、ＮＰ抗原またはその断片、ＧＰ抗原またはその断片、ＧＰＣ抗原またはその断片、ＧＰｌ抗原またはその断片、およびＺＰ抗原またはその断片からなる群から選択された少なくとも２つのポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列に特異的に結合するプローブまたはプライマーを含むことができる。一部の実施例において、本開示の複数のものは、ＮＰ抗原またはその断片、ＧＰ抗原またはその断片、ＧＰＣ抗原またはその断片、ＧＰｌ抗原またはその断片、およびＺＰ抗原またはその断片からなる群から選択された少なくとも３つのポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列に特異的に結合するプローブまたはプライマーを含むことができる。一部の実施例において、本開示の複数のものは、ＮＰ抗原またはその断片、ＧＰ抗原またはその断片、ＧＰＣ抗原またはその断片、ＧＰｌ抗原またはその断片、ＺＰ抗原またはその断片からなる群から選択された少なくとも４つのポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列に特異的に結合するプローブまたはプライマーを含むことができるを含むことができる。一部の実施の形態において、本開示の複数のものは、ＮＰ抗原またはその断片、ＧＰ抗原またはその断片、ＧＰＣ抗原またはその断片、ＧＰｌ抗原またはその断片、およびＺＰ抗原またはその断片をエンコードするヌクレオチド配列に特異的に結合するプローブまたはプライマーを含むことができる。
【００７２】
一部の局面において、本開示の複数のものは、診断キットとして提供（たとえば、販売、販売に供せられる、市場に出される、出荷される、保管される、および／またはパッケージ化される）または診断キット内に含まれるものとして提供できる。一部の実施の形態において、このような診断キットは、被験者のＬＣＭＶまたはその症状を治療するための１つ以上の（たとえば１、２、３、４、５以上）の薬（たとえば医薬）をさらに含むことができる。一部の実施の形態において、１つ以上の薬は、抗ウイルス薬である。
【００７３】
一部の実施の形態において、本開示はＬＣＭＶ感染に対して被験者を治療する方法を提供し、当該方法は、ＬＣＭＶを罹っているまたはＬＣＭＶ感染のリスクがある被験者から生体サンプルを得ること、請求項１に記載の方法を用いて、サンプルをスクリーニングして、被験者がＬＣＭＶに感染しているか否かを判断すること、ならびに患者がＬＣＭＶに感染しているのなら、ＬＣＭＶまたはその症状を治療する薬を、被験者に投与することを含む。一部の実施の形態において、本開示の治療方法は、低酸素状態に伴う症状を有する、またはそのリスクがある被験者を選択することを含む。このような被験者は、たとえば妊娠している、免疫不全である、移植レシピエントである、および癌を発症するリスクを有する、または癌を罹っているものを含む。
【００７４】
一部の局面において、本開示は、ＬＣＭＶ  ＮＰに特異的に結合するモノクローナル抗体Ｍ５９またはその断片を提供する。
【００７５】
一部の局面において、本開示は、ＬＣＭＶ  ＮＰに特異的に結合するモノクローナル抗体Ｍ８７またはその断片を提供する。
【００７６】
一部の局面において、本開示は、ＬＣＭＶ  ＧＰｌに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその断片を提供する。
【００７７】
一部の局面において、本開示は、アミノ酸配列ＲＳＧＷＧＷＡＧＳＤＧＫＴＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８９）に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。
【００７８】
一部の局面において、本開示は、ＬＣＭＶ  ＺＰに特異的に結合するモノクローナル抗体ＭＪ３またはその断片を提供する。
【００７９】
一部の局面において、本開示は、ここに記載の１つ以上の抗体の抗原結合断片を提供する。
【００８０】
一部の局面において、本開示はここに記載の１つ以上の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を提供する。一部の実施の形態において、ＣＤＲはＣＤＲ３である。
【００８１】
一部の局面において、ここに開示されている１つ以上の抗体または抗体結合断片は、診断キットとして（たとえば、販売、販売に供せられる、市場に出される、出荷される、保管される、および／またはパッケージ化される）、または診断キット内に含まれるものとして提供できる。
【００８２】
一部の局面において、本開示はベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭＪ３、ＬＭＢＰ受領番号９２１７ＣＢと同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体を提供する。
【００８３】
一部の局面において、本開示は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭＪ３、ＬＭＢＰ受領番号９２１７ＣＢによって産出されたモノクローナル抗体を提供する。
【００８４】
一部の局面において、本開示は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭＪ３、ＬＭＢＰ受領番号９２１７ＣＢの細胞を提供する。
【００８５】
一部の局面において、本開示は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭ１６６、ＬＭＢＰ受領番号９２１６ＣＢと同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体を提供する。
【００８６】
一部の局面において、本開示は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭ１６６、ＬＭＢＰ受領番号９２１６ＣＢによって産出されたモノクローナル抗体を提供する。
【００８７】
一部の局面において、本開示は、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM)に寄託されたハイブリドーマＭ１６６、ＬＭＢＰ受領番号９２１６ＣＢの細胞を提供する。
【００８８】
一部の局面において、本開示は、以下を含む分離された抗体または抗体断片を提供する：１つ以上の保守的アミノ酸置換を含む、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）、および／または１つ以上の保守的アミノ酸置換を含む、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、および／または１つ以上の保守的アミノ酸置換を含む、モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）。
【００８９】
一部の局面において、本開示は、以下を含む分離された抗体または抗体断片を提供する：モノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）、および／またはモノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、および／またはモノクローナル抗体Ｍ８７の重鎖可変領域のＣＤＲ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）。
【００９０】
一部の局面において、本開示は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４と同一性を有する抗原結合ペプチド（たとえば、抗体または抗体断片）を提供し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４内の相補性決定領域に対応するアミノ酸配列内の領域は、１つ以上の保守的アミノ酸置換を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４内のフレームワーク領域に対応するアミノ酸配列の領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４の対応する領域に対して８０％以上の同一性を有し、および／または抗原結合ペプチドはＬＣＭＶ  ＮＰに結合する。
【００９１】
特に定義しない限り、ここに用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者にとって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本発明で使用するために方法および材料がここに記載されているが、当該技術分野において既知の他の適切な方法および材料も用いることができる。材料、方法および実施例は例示的なものであり、限定する意図はない。ここに言及されている出版物、特許出願、特許、配列、データベース入力および他の引例は、その全体が引用によりここに援用される。相反する場合、定義を含む本明細書が支配する。
【００９２】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、ならびに請求項から、明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１Ａ】図１Ａは、ＬＣＭＶビリオンおよびウイルス複製戦略の外側膜貫通糖タンパク質１および２（ＧＰ１およびＧＰ２）、Ｚタンパク質、ＮＰ、ＲＮＡおよびＬタンパク質を含む、ＬＣＭＶの構造を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＬＣＭＶ寿命サイクルを概略的に示す図である。
【図２】図２ｉ−２ｖｉは、選択されたＬＣＭＶ株／分離株のＳセグメントの上のＮＰゲノム領域のヌクレオチド配列の配置を示す図である。
【図３】図３ｉ−３ｖｉは、選択されたＬＣＭＶ株／分離株のＳセグメントの上のＧＰ（すなわちＧＰＣ、ＧＰ１およびＧＰ２を含む）ゲノム領域のヌクレオチド配列の配置を示す図である。
【図４】図４は、選択されたＬＣＭＶ株／分離株のＬセグメント上のＺＰゲノム領域のヌクレオチド配列の配置を示す図である。
【図５】図５ｉ−５ｉｉは、選択されたＬＣＭＶ株／分離株のＮＰ抗原のアミノ酸配列の配置を示す図である。
【図６】図６ｉ−６ｉｉは、選択されたＬＣＭＶ株／分離株のＧＰ抗原のアミノ酸配列の配置を示す図である。
【図７】図７は、選択されたＬＣＭＶ株／分離株のＺＰ抗原のアミノ酸配列の配置を示す図である。
【図８】図８Ａ−８Ｄは、ここに開示されている方法で使用する、抗体に基づく例示的なアッセイを示す図である。
【図９】図９は、ここに開示されている方法で使用する、RNAに基づく例示的なアッセイを示す図である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、低酸素状態はＬＣＭＶ遺伝子発現を上方制御することを示すヒストグラム図であり、誘導倍率は酸素正常状態コントロールとの比較を基に定められ、値は４回行なわれた３つの別個の実験の平均を表わし、エラーバーは標準偏差を示し、ここで＊  Ｐ〈０．０２、＊＊＊  Ｐ〈０．００１（低酸素状態（ＨＹ）対酸素正常状態（ＮＯ））となる図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＤＭＯＧ治療はＬＣＭＶ遺伝子発現を上方制御することを示すヒストグラムであり、値は２つの実験のうちの１つの代表的実験における３倍の決定の平均を表わし、エラーバーは標準偏差を示し、ここで＊  Ｐ〈０．０５、＊＊＊  Ｐ〈０．００１（ＤＭＯＧ対ＤＭＯＧなし）となる図である。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、低酸素状態はＬＣＭＶタンパク質発現を上方制御することを示す免疫ブロットの画像であり、アクチンはロードおよび転送効率のコントロールとして示され、ＨＩＦ−ｌアルファの検出は、低酸素状態に対する細胞誘導のためのコントロールとして働き、同様の結果を有する少なくとも３つの独立した実験の１つの代表的なものが示される図である。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、ＲＬＭ−ＲＡＣＥによって解析された、酸素正常状態および低酸素状態下のさまざまなＬＣＭＶ遺伝子の相対的発現レベルを示す棒グラフ図である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＲＴ−ＰＣＲによって検出された、酸素正常状態（ＮＯ）下で培養されたＨｅＬａ−ＭＸ細胞からの媒体および低酸素状態（ＨＹ）下で培養された細胞からの媒体におけるＬＣＭＶゲノムの存在を確認するゲルの画像図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲによって解析された、パッセージ（Ｐ）１、Ｐ３、Ｐ５およびＰ１０でのＨｅＬａ−ＭＸ細胞からの媒体を用いて感染した細胞のＬＣＭＶ遺伝子発現を示すゲルの画像図である。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ＨｅＬａ−ＭＸ細胞からの媒体を用いて感染した細胞の画像であり、細胞はＬＣＭＶ用に染色され、核染色も用いられ、細胞はＰ１、Ｐ３およびＰ１０で染色され、２０の倍率が用いられ、データは２つの独立した実験を表わす図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、抗体重鎖の可変領域の配列を特徴付けるために用いられたプロトコルを示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＭＡｂ  Ｍ８７の重鎖の可変領域のアミノ酸配列を示す図であり、黄色の色の付いた箇所はシグナルペプチド配列を示し、緑の色の付いた箇所は超可変領域を示す図である。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ＭＡｂ  Ｍ８７の重鎖の構造を示す図である。
【図１３】図１３は、自然流産した女性の血清の抗ＮＰ抗体の存在を確認する免疫ブロットの画像であり、ヒト血清の抗ＮＰ抗体は免疫沈澱によって検出された図である。
【図１４】図１４は、腎臓腫瘍（Ａ）および陰性のコントロール（Ｂ）におけるウイルスＮＰの免疫組織化学的検出を示す画像であり、図１４Ｃは、免疫沈澱およびＮＰ特異モノクローナル抗体を用いた後の免疫ブロッティングによる、ヒトＲＣＣ被験者からの組織におけるＬＣＭＶ  ＮＰの免疫検出を示す免疫ブロットの画像であり、ＨＴ＝健康な組織、ＴＴ＝腫瘍組織、ＨＭＸ＝ＨｅＬａ／ＭＸ（陽性コントロール）、Ｈ＝ＨｅＬａ（陰性コントロール）とした図である。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、Ｍ８７抗体とＭ５９抗体との競合的結合研究結果を示すグラフ図である。
【図１６】図１６は、ＮＰ断片へのＮＰ特異抗体のエピトープ結合を示す線グラフ図である。
【図１７】図１７は、精製された組換タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示すゲルの画像であり、レーン１は精製されたＬＣＭＶ−ＮＰ抗原であり、レーン２は精製された陰性コントロール抗原であり、約６２ｋＤａ（レーン１）のＬＣＭＶ−ＮＰ抗原のタンパク質バンドが検出されたことを示す図である。
【図１８】図１８Ａ−１８Ｂは、ＬＣＭＶ  ＰＣＲ産出物の電気泳動を示すアガロースゲルの画像図である。
【図１９】図１９Ａ−１９Ｂは、シングルプレックスフォーマットにおけるＬＣＭＶ  ＭＸ  ＮＰ  およびＧＰ遺伝子のリアルタイム検出を示す線グラフ図である。
【図２０】図２０は、デュプレックスフォーマットにおけるＬＣＭＶ  ＭＸ  ＮＰ  およびＧＰ遺伝子のリアルタイム検出を示す線グラフ図である。
【図２１】図２１Ａ−２１Ｂは、シングルプレックスフォーマットにおけるＬＣＭＶ  ＡＲＭ  ＮＰ  およびＧＰ遺伝子のリアルタイム検出を示す線グラフ図である。
【図２２】図２２は、デュプレックスフォーマットにおけるＬＣＭＶ  ＡＲＭ  ＮＰ  およびＧＰ遺伝子のリアルタイム検出を示す線グラフ図である。
【図２３】図２３Ａ−２３Ｄは、ＬＣＭＶリアルタイムＰＣＲ解析の感度を示す線グラフであり、一連の希釈されたＬＣＭＶ感染細胞で混ぜられた血液サンプルは、シングルプレックス（Ａ、Ｂ）およびデュプレックス（Ｃ、Ｄ）フォーマットでリアルタイムＰＣＲ解析によってテストされた図である。
【図２４】図２４は、リアルタイムＰＣＲで分析された、低酸素状態および酸素正常状態下でのＬＣＭＶ  ＭＸ  ＮＰ  およびＧＰ遺伝子発現を示す棒グラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００９４】
詳細な説明
本開示は、持続しているＬＣＭＶは低酸素状態によって再活性化されるという驚くべき発見にとりわけ基づいている。このようなウイルス再活性化は弱い被験者、たとえば妊娠している、免疫障害を持っている、移植レシピエントである、癌を発症する危険を有する、もしくは癌に罹っている者を含むがこれらに限定されない被験者において、臨床的にその兆候が現われ得る。したがって、本開示はＬＣＭＶ、たとえば再活性ＬＣＭＶを確実に検出するための組成物および方法を提供する。
【００９５】
リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）は、アレナウイルス科の原型メンバーであり、エンベロープを持ったビリオンおよび二等分された一本鎖ＲＮＡゲノムを有する（図１参照）。両方のセグメント（小さい［Ｓ］および大きい［Ｌ］）は互いに対向する配向において２つのオープンリーディングフレームを有し、アンビセンスコーディング戦略を用いる（Meyer他、２００２年）。Ｓ  ＲＮＡは、主ウイルスタンパク質核タンパク質（ＮＰ）および糖タンパク質前駆体（ＧＰ−Ｃ）をエンコードし、これは末梢糖タンパク質１（ＧＰ１）および膜貫通糖タンパク質２（ＧＰ２）に共同並進的に切断される(Southern et al, Virology, 157(1): 145-55 (1987))。Ｌ  ＲＮＡセグメントは、ＲＮＡ−依存ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）および規制リングフィンガＺタンパク質（ＺＰ）をエンコードする(Buchmeier Curr Top Microbiol Immunol. 262: 159-73 (2002); Salvato, Virology 173, 1-10 (1989))。
【００９６】
ウイルス複製は負の極性の３′ＲＮＡゲノムアームのＬポリメラーゼ駆動転写で始まり、後でＮＰおよびＬポリメラーゼに翻訳されるｍＲＮＡを産出する。これらのウイルスタンパク質は、ＲＮＡゲノムがウイルスｃＲＮＡに転写される支援を行ない、新しいゲノムＲＮＡ分子の合成ならびにＧＰＣおよびＺＰに翻訳されるサブゲノムｍＲＮＡのテンプレートとして働く。この二段階の複製戦略は、ウイルスの持続性の確立を促し、これはＲＮＡゲノムであるＮＰおよびＬポリメラーゼからなるウイルスリボ核タンパク質によって維持できるが、糖タンパク質の発現がないまたは制限されることによる成熟ビリオン産出がない場合である(van der Zeijst et al, J Virol 48:249-61 (1983); Buchmeier, 2003)。ＬＣＭＶはさまざまな種から得られる多様な細胞の種類に持続的感染を簡単に起こし、重大な細胞機能を乱さないが、非本質的な表現型の特徴を変える(Oldstone, Curr Top Microbiol Immunol. 263:83-117 (2002); Peters et al, Supra)。
【００９７】
ＬＣＭＶは種Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓのげっ歯類に伴って世界中で広がっている。人間は感染したげっ歯類またはペット（動物の唾液、尿および糞便のウイルスに汚染されたエアゾールを吸入することにより）直接または間接的に接触した後気道を通して一般に感染する。免疫適格の個人では、ＬＣＭＶは穏やかなインフルエンザ型兆候から稀には重症の脳炎の病を引起す(Jahrling and Peters, 1992, Buchmeier et al, 2007)。妊娠中でのこのウイルスの感染は自然流産や奇形に繋がっている(Jamieson et al, 2006, Meritet et al, 2009)。より驚くべきことに、感染したドナーからの移植された臓器を介して免疫不全のレシピエントにうつされたＬＣＭＶ感染の致命的な事例が最近報告されており、この一見無害に見えるウイルスへの注意が喚起された(Fischer et al, 2006, Amman et al, 2007)。
【００９８】
急性感染は成熟ＧＰ１およびＧＰ２の産出を含み、慢性／持続性感染は未熟なＧＰＣの産出を示すが、糖タンパク質の成熟した形はないかまたは減少し、ＮＰは急性および慢性／持続性状況で産出され、同様にＺＰも急性および慢性／持続性状況で産出されるが、その発現は低酸素状態による再活性化によって増加する（Ｂｕｃｈｍｅｉｅｒ、２００３年、Ｔｏｍａｓｋｏｖａ他、未出版データ）。この事実はＬＣＭＶを検出する今までの試みで見過ごされていたが、低酸素状態に応じてＧＰ、ＮＰおよびＺＰの産出および感染性ビリオンの形成の相対的な増加を示す当方の研究データによって、最近呼び起されており、これは胚発生、心臓および脳虚血、癌などを含む、多くの生理学的および病理学的状況に伴っている。さらにＬＣＭＶ「再活性化」は免疫抑制（移植目的のために、化学療法による、および他の状況）によって起こることが知られており、さらにウイルスＧＰ、ＮＰおよびＺＰの増加した発現に伴う。
【００９９】
今まで、ＬＣＭＶ検出、ＬＣＭＶ急性および／または慢性感染のスクリーニングおよび診断のための確実な方法は、臨床研究所での定例的使用に対して利用可能ではなく、スクリーニング／診断されるべきターゲット（リスク）母集団はない。なぜなら包括的な疫学データがないからである。既存の解析（たとえば、免疫蛍光検査法、ＥＬＩＳＡ、補体結合、およびＲＴ  ＰＣＲ測定を含む）は、十分な感度および再現性を示さず、急性と慢性／持続性感染との区別ができず、たまに発生した状況または他のウイルスが検出できない場合に適用されるだけである。さらに、既存の解析は、ＮＰ、ＧＰ、ＺＰ（または代替的にＧＣＰおよびＧＰ１）およびＺＰ−派生オリゴヌクレオチドまたはポリペプチドを組合せてウイルスおよび／またはウイルス特異抗体を検出しないので、感染が他の態様で証明された場合でも、ＬＣＭＶの感染の検出に失敗する。したがって、正確で、感度があり、かつ再現可能な定例的解析の利用性が強く望まれている。
【０１００】
ＬＣＭＶ検出用の組成物
本開示に含まれる組成物は、生体サンプルのＬＣＭＶの１つ以上のマーカを特異的に検出することができる生体的および合成材料を含む。
【０１０１】
ＬＣＭＶのマーカは、たとえば１つ以上または少なくとも１つ（たとえば、１、２、３、４、５個以上、２、３、４または５個の組合せを含む）のＬＣＭＶ核酸（たとえばＬＣＭＶ  ｍＲＮＡおよび／またはＬＣＭＶゲノムＤＮＡ／ＲＮＡであって、１つ以上のＬＣＭＶペプチドをエンコードするＬＣＭＶ（たとえばＬＣＭＶ  ＧＰ（１および／または２）、Ｚタンパク質、ＮＰ、および／またはＬタンパク質））、および／またはＬＣＭＶタンパク質またはペプチド（たとえば、１、２、３、４、５個以上、２、３、４または５個の組合せを含む）、ＬＣＭＶ  ＧＰ（１および／または２）、Ｚタンパク質、ＮＰ、および／またはＬタンパク質）を含むことができる。たとえば、場合によっては、ＬＣＭＶのマーカは、ＬＣＭＶ  ＧＰおよび／またはＬＣＭＶ  ＮＰ核酸および／またはタンパク質を含むことができる。場合によっては、ＬＣＭＶのマーカは、マーカの一部をターゲット化することにより、含むかまたは検出することができる。場合によっては、ＬＣＭＶマーカの一部は、たとえば、１つ以上のＬＣＭＶ株または分離株間で保たれる核酸の領域を含むことができる。たとえば、検出用の適切な部分は、図２から図４において保存されていると特定される領域を含むことができる（たとえば、１つ以上のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−５７）。代替的に、または付加的に、適切な部分は１つ以上の明確なＬＣＭＶ株（たとえば１つ以上のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−５７）における領域に対して、５０％以上の同一性（たとえば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の同一性）を有するＬＣＭＶ核酸内の領域を含むことができる。場合によっては、適切な部分は１つ以上のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−５１によってエンコードされたタンパク質の領域に対して５０％以上の同一性（たとえば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の同一性）を有するＬＣＭＶタンパク質内の領域を含むことができる。場合によっては、適切な部分は１つ以上のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２−５７の領域に対して５０％以上の同一性（たとえば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の同一性）を有するＬＣＭＶタンパク質内の領域を含むことができる。
【０１０２】
このような１つ以上または少なくとも１つのＬＣＭＶ核酸またはその部分を特異的に検出するのに適する組成物は、核酸プローブまたはプライマーを含むが、これらに限定されない。適切なプローブまたはプライマーを設計および合成する方法は当該技術分野において既知である。場合によっては、１つ以上または少なくとも１つのＬＣＭＶのマーカを検出するのに用いることができる核酸プローブまたはプライマーは、たとえば１０個以上の核酸（例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個の核酸、または１０００個以上の核酸）を含有する核酸プローブまたはプライマーを含むことができ、たとえば１０個以上の核酸は、１つ以上のＬＣＭＶマーカ（たとえば１つ以上のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−５１内）のターゲット領域に対して５０％以上の同一性（たとえば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の同一性）を有し、その核酸プローブまたはプライマーはターゲット領域（たとえば１つ以上のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−５１内）に特異的に結合する。場合によっては、プローブまたはプライマーは、緊縮結合状態（たとえば、低い緊縮、中間緊縮、または高い緊縮）下でのターゲット領域に結合（たとえば、特異的に結合）できる。低い、中間の、および高い緊縮の雑種形成条件として適格な雑種形成条件は、当該技術分野において既知である。相補的核酸配列は特異的に雑種形成可能であるためにそのターゲット核酸に対して１００％相補である必要がないことは当該技術分野において理解されている。本発明の相補的核酸配列は、増幅またはターゲット部が起こるようターゲット配列に対する配列またはその一部の結合が起こった場合に特異的に雑種形成可能である。場合によっては、複数のプローブまたはプライマーを用いて、サンプル（「サンプル」または「生体サンプル」の用語は、被験者（ヒトまたは動物）から得られる組織または体液のサンプルを指すが、血液、血清、プラズマ、組織生検および外科的試験片、唾液、尿、脳脊髄液などを含むが、これらに限定されない。生体サンプルは、インビトロで培養された細胞および培養された媒体を含む。サンプルは、加熱、遠心分離、沈殿などによって、分析の前に処理されてもよい）における同じＬＣＭＶ核酸を検出することができる。このような場合、プローブは同じＬＣＭＶ核酸の重なっている部分を検知、または同じＬＣＭＶ核酸の重なっていない部分を検知することができる。代替的に、または付加的に、複数のプローブまたはプライマーを用いて、サンプルの明確なＬＣＭＶ核酸を検出することができる。場合によっては、１つ以上または少なくとも１つのＬＣＭＶマーカを検出するために用いることができる核酸プローブまたはプライマーは、たとえば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９（たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８および５９の組合せであって、ＬＣＭＶ  ＮＰを検出）、ＳＥＱ  ＩＤ  ���Ｏ：６０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１（たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０−６１の組合せであって、ＬＣＭＶ  ＧＰを検出）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３（たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２−６３の組合せであって、ＬＣＭＶ  ＺＰを検出）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７（たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６−６７の組合せであって、ＬＣＭＶ  ＮＰを検出）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９（たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８−６９の組合せであって、ＬＣＭＶ  ＧＰを検出）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１（たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０−７１の組合せであって、ＬＣＭＶ  Ｌを検出）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３（たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２−７３の組合せであって、ＬＣＭＶ  Ｚを検出）のうちの１つ以上または少なくとも１つを含むことができる。場合によっては、１つ以上または少なくとも１つのＬＣＭＶマーカを検出するために用いることができる核酸プローブまたはプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９（たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８および５９の組合せであって、ＬＣＭＶ  ＮＰを検出）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１（たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０−６１の組合せであって、ＬＣＭＶ  ＧＰを検出）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３（たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２−６３の組合せであって、ＬＣＭＶ  ＺＰを検出）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７（たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６−６７の組合せであって、ＬＣＭＶ  ＮＰを検出）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９（たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８−６９の組合せであって、ＬＣＭＶ  ＧＰを検出）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１（たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０−７１の組合せであって、ＬＣＭＶ  Ｌを検出）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３（たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２−７３の組合せであって、ＬＣＭＶ  Ｚを検出）に対して、５０％以上（たとえば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％）の配列相同性または同一性を有する核酸プローブまたはプライマーを含むことができる。場合によっては、１つ以上または少なくとも１つのＬＣＭＶマーカを検出するために用いることができる核酸プローブまたはプライマーは、ここの実施例２１に記載されているプローブまたはプライマーを１つ以上含むことができる。
【０１０３】
場合によっては、１つ以上または少なくとも１つのＬＣＭＶ核酸またはその部分を検出するのに適する方法は、たとえばＲＴ−ＰＣＲおよび／またはＲＬＭ−ＲＡＣＥ（たとえば、ここの実施例２で記載されている）を含むことができる。
【０１０４】
代替的に、または付加的に、ＬＣＭＶのマーカは１つ以上のＬＣＭＶペプチド（たとえば、ポリペプチドまたはタンパク質を含む）、およびＬＣＭＶを検出するための方法は、たとえば１つ以上のＬＣＭＶペプチドの検出を含むことができる。
【０１０５】
「ポリペプチド」および「タンパク質」の用語は、アミノ酸残基のポリマーまたはオリゴマーを指し、完全長タンパク質、断片、ペプチド、オリゴペプチド、マルチマーなどを含む。当該用語は翻訳後の変質（グリコシル化、リン酸化、アセチル化など）、や天然配列に対する削除、追加、置換、突然変異（自然突然変異および自然変異）、たとえば産出物が所望の活性を維持する限りにおいて）、たとえばここに開示されている１つ以上のＬＣＭＶペプチドをも含む。
【０１０６】
場合によっては、ＬＣＭＶペプチドは完全長ＬＣＭＶペプチドまたはＬＣＭＶペプチドの断片、たとえばここに開示されているＬＣＭＶペプチドの断片であり得る（たとえば、１つ以上のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−５１によってエンコードされたペプチドもしくはペプチド断片、または１つ以上のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２−５８、もしくは１つ以上のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２−５８の断片／部分）。適切な断片は、１つ以上のＬＣＭＶ株または分離株の間で保存されるアミノ酸の領域を含むことができる。たとえば、適切な断片は図５から図７において保存されていると同定されている領域、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−５１（たとえば、１つ以上のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−５１によってエンコードされたペプチドを含む）を含むことができる。代替的に、または付加的に、適切な断片は、１つ以上の異なるＬＣＭＶ株の領域に対して５０％以上の同一性（たとえば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の同一性）を有するＬＣＭＶアミノ酸内の領域を含むことができる。場合によっては、適切な断片は少なくとも３個のアミノ酸（たとえば、３から１０個のアミノ酸）を含むことができる。代替的にまたは付加的に、適切な断片は３, ４, ５, ６, ７, ８, ９, １０, １１, １２, １３, １４, １５, １６, １７, １８, １９, ２０, ２５, ３０, ４０, ５０, ６０, ７０, ８０, ９０, １００,または１００個以上のアミノ酸を含むことができる。場合によっては、適切な断片は抗原またはエピトープを含むことができる。「抗原」はＬＣＭＶ抗体を結合する１つ以上のエピトープを含み、ＬＣＭＶの分離株／株のいずれかから得られる、さまざまなＬＣＭＶポリペプチドおよびその断片（天然、組換、または合成）を指す。さらに、抗原は基準のＬＣＭＶ抗原分子（完全長またはその断片）とＬＣＭＶ抗原の再活性化を損なわない別の抗原／タンパク質／ペプチドとの融合タンパク質であり得る。抗原は免疫原性組成物の成分であってもよく、実質的に精製されないかまたは精製される（存在しているサンプルの５０％以上をなす）、または分離（別個のおよび異なる形）であるサンプル（感染細胞、全細胞溶解液、タンパク質抽出物を含むがこれらに限定されない）であり得る。
【０１０７】
ＮＰ抗原の用語は、ＬＣＭＶＭのヌクレオカプシドタンパク質に由来する抗原を指す（たとえば、任意のＬＣＭＶ株および分離株を含む）。ＬＣＭＶのさまざまなＮＰ抗原のヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列は既知である（図２および図５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−１１および３１−４０）。付加的な配列は先の文献に特定されているように（以下参照）Genbankに寄託されている。本解析で有用な代表的免疫反応性のＮＰ抗原は、ＬＣＭＶのＭＸ株に由来する融合タンパク質である。これはいくつかのエピトープを含み、この抗原を結合する抗体はArmstrong株からのＮＰ抗原で交差反応し得る。
【０１０８】
リボ核タンパク質またはＲＮＰの用語は、ＮＰ抗原にカバーされているウイルスゲノムＲＮＡセグメント（Ｓおよび／またはＬ）の複合体を指す。このようなＲＮＰは感染細胞内のＬＣＭＶ感染の際に形成され、細胞外空間に放たれ得る。
【０１０９】
ＧＰ抗原の用語は、ＬＣＭＶ（任意のＬＣＭＶ株および分離株を含む）の糖タンパク質に由来する抗原を指す。ＬＣＭＶのさまざまなＧＰ抗原のヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列は既知である（たとえば、図３および図６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２−２３および４１−５１参照）。付加的な配列は先の文献に特定されているように（以下参照）Genbankに寄託されている。本解析で有用な代表的免疫反応性のＧＰ抗原は、ＬＣＭＶのＭＸ株に由来する融合タンパク質である。これはいくつかのエピトープを含み、この抗原を結合する抗体はArmstrong株からのＧＰ抗原で交差反応し得る。
【０１１０】
ＧＰＣ抗原の用語は、前駆体であって、ＧＰ抗原の未熟な形であり、持続性または異常な感染において典型的である。これはＧＰ１およびＧＰ２のＧＰＣ切断の領域（断片）に跨るエピトープを含み、ＧＰＣの特異的認識にのみ該当する。ＬＣＭＶのさまざまなＧＰＣ抗原の配列は既知である（図３および図６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２−２３および４１−５１参照）。
【０１１１】
ＧＰ１抗原の用語は、急性感染で一般的なエンベロープ抗原の成熟外部サブユニットを意味する。ＧＰ１のＣ末端領域（断片）のエピトープを含み、これはＧＰＣに晒されない。ＬＣＭＶのさまざまなＧＰＬ抗原のアミノ酸配列が既知である。
【０１１２】
ＺＰ抗原の用語は、ＬＣＭＶのＺタンパク質に由来する抗原を指す。ＬＣＭＶのさまざまなＺＰ抗原のヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列は既知である（図４および図７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４−３０および５２−５７参照）。付加的な配列は先の文献に特定されているように（以下参照）Genbankに寄託されている。本解析で有用な代表的免疫反応性のＺＰ抗原は、ＬＣＭＶのＭＸ株に由来する融合タンパク質である。これはいくつかのエピトープを含み、この抗原を結合する抗体はArmstrong株からのＺＰ抗原で交差反応し得る。
【０１１３】
エピトープの用語は、特異的Ｂ細胞および／またはＴ細胞が反応する、抗原の部位を意味し、生体サンプルにあるＬＣＭＶ抗体と反応し、抗体の産出を促す。この用語は「抗原決定基または抗原部位」と入れ替えて用いることができる。エピトープは独自の整合したまたは線形の態様で組合せられた３から５個以上のアミノ酸を含むことができる。
【０１１４】
免疫原性組成物の用語は、少なくとも１つの免疫原ポリペプチド（たとえば、ＮＰ、ＧＰ、ＺＰおよび／またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ））を指す。
【０１１５】
一部の実施の形態において、ＬＣＭＶのペプチドマーカは、診断用に、たとえば、生体サンプルにおけるＬＣＭＶに対する抗体を検出するために、用いることができる。
【０１１６】
抗原はさらに診断で用いるためのポリクローナルおよびモノクローナル抗体を産出するためにも用いることができる。ポリクローナル抗体は、分離された、もしくは実質的に精製されたＬＣＭＶ抗原を、または免疫原組成物の一部として（すなわち感染細胞の形で）、哺乳類、たとえばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ラマ、ウマなどに投与することによって産出することができる。免疫性が与えられた抗原からの血清を集めて、抗体をさらに精製することができる。ポリクローナル抗体を産出および処理するための技術は当該技術分野において既知である。
【０１１７】
抗体の用語は最も広い意味で用いられ、具体的には、たとえば単一のモノクローナル抗体（作動、拮抗、および中和抗体、免疫性が取除かれた、マウス、キメラ、またはヒト化抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、単一鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、免疫結合体および抗体断片を網羅する。
【０１１８】
ここで用いられる「モノクローナル抗体」の用語は、実質的に均質の抗体の母集団から得られた抗体を指す、すなわち、少量存在し得る自然に起こる突然変異を除き、母集団を含む個々の抗体は同じである。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原部位に向けられる。さらに、異なる決定基（エピトープ）に向けられる異なる抗体を含むポリクローナル抗体決定基とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対して向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体に汚染されることなく合成できることで有利である。「モノクローナル」という修飾語により、抗体が実質的に均質な抗体の母集団によって得られる特性を示し、特定の方法による抗体の産出を必要とするものとして解釈されてはならない。たとえば、本発明に従い用いられるべきモノクローナル抗体は、Kohler et al, Nature, 256:495 (1975)によって初めて記載されたハイブリドーマ（マウスまたはヒト）方法によって、または組換ＤＮＡ方法（たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作成することができる。「モノクローナル抗体」はClackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks et al, J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991)に記載されている技術を用いてファージ抗体ライブラリから分離できる。
【０１１９】
「抗体断片」または「抗原結合断片」は、完全な抗体の一部、好ましくは抗原結合またはその可変領域を含む。抗体断片の例は、完全長ではない抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、およびＦｖ断片；二重特異性抗体、線形抗体、単一鎖抗体分子；単一鎖抗体、単一ドメイン抗体分子、融合タンパク質、組換タンパク質、および抗体断片から形成された多数特異的抗体を含む。
【０１２０】
対象の抗原、たとえばＬＣＭＶ抗原またはマーカを「結合する」抗体は、その抗体が抗原を発現している細胞をターゲット化する際に治療または診断エージェントとして有用であるよう、その抗原を十分な親和性で結合可能な抗体である。抗体がＬＣＭＶ抗原またはマーカを結合するものであるのなら、一般に他の抗原に対してＬＣＭＶ抗原またはマーカを優先的に結合し、非特異的Ｆｃコンタクトといった偶発的結合や他の抗原に共通の翻訳後の変形に結合するものを含まず、他のタンパク質と著しく交差反応しないものである。対象の抗原を結合する抗体を検出するための方法は、当該技術分野において周知であり、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットといった分析を含むが、これらに限定されない。
【０１２１】
ヒトでない（たとえばマウスの）免疫グロブリンの「ヒト化」および／または「キメラ」フォームは、特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（たとえば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２または抗体の他の抗原結合配列）を含む抗体を指し、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、またはヒト抗ヒト抗体（ＨＡＨＡ）反応が、元の抗体と比べて減少する結果となり、所望の効果を再現するのに必要な前記非ヒト免疫グロブリンに由来する必要な部分（たとえば、ＣＤＲ、抗原結合領域、可変ドメインなど）を含みながら、前記非ヒト免疫グロブリンに匹敵する結合特性を同時に保持する。大部分において、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエント抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基は、所望の特異性、親和性および容量を有する、マウス、ラットまたはウサギといった非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置き換えられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒトＦＲ残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体または挿入されたＣＤＲもしくはＦＲ配列のどちらにも見出されない残基を含み得る。これらの修飾は抗体パフォーマンスをさらに精製および最適化するために行なわれる。一般に、ヒト化抗体は少なくとも１つ、および典型的には２つの可変ドメインのうちの実質的にすべてを含み、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのものと対応し、ＦＲ残基のすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリン共通配列のものである。ヒト化抗体は任意に免疫グロブリン不変部領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含む。場合によっては、ここに開示されている抗体はヒト化することができる。
【０１２２】
本願において、ハイブリドーマ細胞株、およびそれから産出されるモノクローナル抗体は、その内部的名称、たとえばＭ５９、Ｍ８７、Ｍ１６６およびＭＪ３、またはその寄託名称LMBP 9216CB (M166) およびLMBP 9217CB (MJ3)で呼ばれる。
【０１２３】
ここで用いられる「免疫接合」は、レポータ部分に化学的にまたは生体的に結合される、抗体または抗体断片といった任意の分子を意味する。抗体はそのターゲットに結合できる限りにおいて、分子に沿ったどの場所でもレポータ部分にリンクすることができる。
【０１２４】
モノクローナル抗体は、上記のように、ＬＣＭＶ抗原またはその断片での免疫化の後、生成することができる。正常なＢ細胞を含む免疫が付けられた動物の脾臓は、KohlerおよびMilstein（１９７５年）が開発したプロシージャによって本質的にミエローマ細胞に融合させることができ、生成したハイブリドーマをスクリーニングして、さまざまな免疫検出方法を用いて特異的抗体を産出することができる。特異的モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ媒体の形で、またはタンパク質Ａ／Ｇセファロース上の親和クロマトグラフィによって精製された形で得ることができる。抗体分子断片、たとえばＦ（ａｂ′）２、Ｆｖ、およびｓＦｖ分子は、既知の技術を用いて産出することができる。代替的に、ファージ表示システムを用いてインビトロでモノクローナル抗体分子母集団を同定および伸長させて、および／または抗体の免疫学的特性を向上させることができる。
【０１２５】
１つ以上のＬＣＭＶペプチドまたはＬＣＭＶペプチド断片を特異的に検出するのに適する組成物は、抗体および／または抗体断片を含むが、これに限定されない。場合によっては、「抗体」の用語は、ある分子、その断片（Ｆａｂ′２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ミニ体、および他の機能性断片）、そのハイブリッド（キメラ）または二重特異性変異体であって、対象の抗原および／またはエピトープに特異的に結合するものを指す。この用語は、ポリクローナルおよびモノクローナルの調製の両方によって得られる抗体を含む。場合によっては、抗体または抗体断片はヒト化することができる。
【０１２６】
場合によっては、１つ以上のＬＣＭＶペプチドまたは断片を検出するための組成物は、たとえばここに開示されている１つ以上の抗体、たとえば１つ以上のＭ８７、Ｍ５９、Ｍ１６６および／またはＭＪ３の、重鎖および／または軽鎖可変領域、またはその部分を含む（たとえば、からなる、本質的に〜からなる、または備える）ことができる。たとえば、組成物は、Ｍ８７、Ｍ５９、Ｍ１６６およびＭＪ３の重鎖および軽鎖可変領域またはその部分を含むことができる。代替的に、組成物はＭ８７、Ｍ５９、Ｍ１６６およびＭＪ３の重鎖可変領域またはその一部、ならびにＭ８７、Ｍ５９、Ｍ１６６およびＭＪ３の軽鎖可変領域またはその一部を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は同じ抗体から由来しない。場合によっては、組成物はＭ８７、Ｍ５９、Ｍ１６６および／またはＭＪ３のうちの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を１つ以上含むことができる（たとえば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３のうちの１つ以上の）。たとえば、異なる抗体からのＣＤＲを組合せることができる。
【０１２７】
場合によっては、１つ以上のＬＣＭＶペプチドまたは断片を検出するための組成物は、抗体Ｍ８７（すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）の重鎖可変領域、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４に対して５０％以上の同一性（たとえば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む（たとえば、からなる、本質的に〜からなる、または備える）ことができる。場合によっては、１つ以上のＬＣＭＶペプチドまたは断片を検出するための組成物は、たとえば、以下に記載される、少なくとも１つ(たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０未満、４０未満、５０未満、または１００未満)の保守的アミノ酸置換を含む抗体Ｍ８７（すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）の重鎖可変領域を含む（たとえば、からなる、本質的に〜からなる、または備える）ことができる。たとえば、場合によっては、組成物は抗体Ｍ８７（すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）の重鎖可変領域を含むことができ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３に対応する領域は、少なくとも１つ(たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０未満、４０未満、５０未満、または１００未満)の保守的アミノ酸置換を含むことができ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３に対応するものの外の領域（たとえばフレームワーク領域（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、および／またはＦＲ３））は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４の対応する領域に対して５０％以上の同一性（たとえば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の同一性）を有する。場合によっては、１つ以上のＬＣＭＶペプチドまたは断片を検出するための組成物は、抗原Ｍ８７（すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）の重鎖可変領域のＣＤＲ３、および／またはＭ８７（すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）の重鎖可変領域のＣＤＲ２、および／またはＭ８７（すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）の重鎖可変領域のＣＤＲ１を含むことができ、ＣＤＲ３、２、１のいずれかは、任意に少なくとも１つ(たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０未満、４０未満、５０未満、または１００未満)の保守的アミノ酸置換を含む（たとえば、からなる、本質的に〜からなる、または備える）ことができる。
【０１２８】
場合によっては、１つ以上のＬＣＭＶペプチドまたは断片を検出するための組成物は、ＬＭＰＢ  ９２１６ＣＢ（Ｍ１６６）および／またはＬＭＢＰ  ９２１７ＣＢ（ＭＪ３）を含む（たとえば、からなる、本質的に〜からなる、または備える）ことができる。
【０１２９】
ここで用いられる、「細胞」、「細胞株」および「細胞培養」の表現は置き換え可能に用いられ、これらの表現すべては子孫を含む。すべての子孫は、故意のまたは故意でない突然変異により、ＤＮＡ内容において正確に同一でないかもしれないことは理解されるであろう。元の形質転換された細胞でスクリーニングされた同じ機能または生体活性を有する突然変異体子孫が含まれる。これは異なる名称が意図されているコンテキストから明らかとなる。
【０１３０】
１つ以上のＬＣＭＶペプチドまたはＬＣＭＶペプチド断片を特異的に検出するのに適切な他の組成物は、抗原結合ペプチドを含むことができる。このようなペプチドは、１つ以上のＬＣＭＶペプチドまたはＬＣＭＶペプチド断片に特異的に結合する。場合によっては、このようなペプチドはここに開示されている抗体（たとえば、１つ以上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことができる。
【０１３１】
場合によっては、１つ以上の抗体は、１つ以上の保守的アミノ酸置換を挿入することにより、修飾することができる。
【０１３２】
「必須ではない」アミノ酸残基は、ポリペプチドの野生型配列から変えることから変えることができる（その活性をなくすまたは実質的に変えることがない）残基である。「必須の」アミノ酸残基は、ポリペプチドの野生型配列から変えられると、ポリペプチド活性をなくすまたは実質的になくすことをもたらす残基である。
【０１３３】
「保守的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換が類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらファミリーは、基本側鎖を有するアミノ酸（たとえば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖（たとえばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極側鎖（たとえばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性の側鎖（たとえばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（たとえばトレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖（たとえばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【０１３４】
一部の実施の形態において、ここで用いられる「必須」アミノ酸残基は、必須アミノ酸の保守的置換を含む。一般に、「必須の」アミノ酸残基は、アルファヘリックスの相互作用面で見出される。
【０１３５】
アルファヘリックスの「相互作用面」は、他のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基を含む。この場合、相互作用面は、ＬＣＭＶで相互作用するアミノ酸を含む。ペプチドの相互作用面を同定するための方法は当該技術分野において既知である（たとえば、Broglia et al, Protein sci. , 14(10):2668-81, 2005; Hammond et al., J. Pharm. Sci., 98(l):4589-603, 2009; Ng and Yang, J. Phys. Chem. B., 111(50): 13886-93, 2007; およびBird et al, PNAS USA, 197: 14093, 2010参照）。一部の実施の形態において、ここに記載の任意のペプチドのアミノ酸配列は、相互作用面の残基がＳＡＨ−ｐ５３−８のものと同じであるか、またはその保守的置換である限り、変形することができる。
【０１３６】
一部の実施の形態において、１つ以上のＬＣＭＶペプチドまたはＬＣＭＶペプチド断片を特異的に検出するのに適する組成物は、たとえば、アミノおよび／またはカルボキシル末端ラベルまたは部分（たとえば、検出可能な部分）を含むよう、変形することができる。例示的部分は、蛍光部分（たとえば、蛍光プローブ（たとえばフルオレセインまたはローダミン））、金属キレート化基、放射性同位体または放射性同位体をキレート化できる部分（たとえば、メルカプトアチセルトリグリシン、またはＲｅ、ＩｎもしくはＹの放射性同位体にキレート化された１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″′−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ））、ターゲット化された部分、ビオチン部分、ｔａｔタンパク質、親和標識、脂肪酸由来アシル基、および他の態様ではペプチドにない他の検出可能な部分、および／またはここに開示されている方法に存在する他のペプチド（たとえば、天然のペプチド）、または使用されるべき他のペプチド（たとえば、ＬＣＭＶペプチドもしくはその断片、またはＬＣＭＶペプチドもしくはその断片を検出するためのペプチド）を含むが、これらに限定されない。アミノおよび／またはカルボキシル末端部分を有するペプチドを調製するための方法は、型通りのものであり、当該技術分野において既知である。「標識」は、放射性同位体、蛍光染料、化学発光の染料、発色団、金属イオン、金属塩類、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、アダプター（ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン）などといった検出可能な分子を指す。
【０１３７】
当業者なら、２つの核酸またはアミノ酸の特定をどのように決定するかについては理解しているであろう。たとえば、同定が最も高いレベルにあるよう、２つの配列を並べた後に、同定を計算することができる。たとえば、核酸の同定は、Zuker, Science 244:48-52 (1989); Natl.Acad. Sci.USA 86:7706-10 (1989);およびJaeger et al, Methods Enzymol.183 :281-306 (1989)で開示されているアルゴリズムを用いて定めることができる。これは、少なくとも核酸整合に関するその試料について、ここに引用により援用する。任意の方法を典型的に用いることができ、特定の状況では、これらさまざまな方法の結果は異なることは理解されるべきであるが、当業者なら、これら方法の少なくとも１つの方法で求められる同定のレベルがわかれば、配列は示される同定を有するものであり、ここに開示されることを当業者なら理解するであろう。
【０１３８】
本発明のペプチドは、当業者にとって周知である化学合成方法によって作成することができる。たとえば、Fields et al, Chapter 3 in Synthetic Peptides:A User's Guide, ed.Grant, W. H. Freeman & Co., New York, N.Y., 1992,第７７頁参照。こうして、ペプチドは固相合成の自動化されたメリフィールド技術を用いて合成することができ、α−ＮＨ2はたとえばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒモデル４３０Ａあるいは４３１で、側鎖保護アミノ酸を用いてｔ−ＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学作用のどちらかで保護される。
【０１３９】
ここに記載されているペプチドを作成する１つの態様として、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いることである。Ｃ末端アミノ酸は、リンカー分子を有する酸に不安定な結合を介して、交差結合ポリスチレン樹脂に接続される。この樹脂は合成に用いられる溶媒には溶けないので、過剰な試薬および副産物を洗い流すのは相対的に簡単かつ速くなる。Ｎ末端基はＦｍｏｃ基で保護され、これは酸において安定しているが、塩基によって除去可能である。側鎖官能基は塩基が安定している、酸不安定基で保護される。
【０１４０】
在来の化学の連結反応を用いて、個々の合成ペプチドを結合することにより、より長いペプチドを作成することができる。代替的に、周知の組換ＤＮＡ技術によって、より長い合成ペプチドを合成することができる。このような技術は詳細なプロトコルでもって周知の基準マニュアルに示される。本発明のペプチドをエンコードする遺伝子を構成するために、アミノ酸配列は逆翻訳されて、アミノ酸配列をエンコードする核酸配列を得るが、これは好ましくは遺伝子が発現するべき有機体に最適なコドンを伴う。次に、合成遺伝子が作成され、これはペプチドをエンコードするオリゴヌクレオチドおよび必要なら他の調節要素を合成することによって典型的に作成される。合成遺伝子は適切なクローンベクトルに挿入され、宿主細胞へ移入される。次にペプチドは選択された発現システムおよび宿主に適する適切な条件下で発現される。ペプチドは精製され、標準の方法で特徴付けられる。
【０１４１】
ペプチドは、たとえばAdvanced Chemtechから入手可能な高いスループットのマルチチャネル組合せ測定系シンセサイザを用いて、高いスループットの組合せ測定系の態様で作成できる。
【０１４２】
ペプチドはさらに多様なシステムと昆虫、哺乳類、バクテリア、ウイルス、および酵母発現系ならびに細胞を含む宿主細胞とで発現（たとえば、組換発現）でき、すべては当該技術分野において周知である。
【０１４３】
上記のシステムで使用する適切な宿主細胞のいくつかも既知である。たとえば、哺乳類細胞株は、細胞培養収集から得られる不死化細胞株、たとえばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫなどを含むが、これらに限定されない。
【０１４４】
調製の後、定例の方法を用いてペプチドを解析し、たとえばその配列、結合親和性、および安定性を（インビトロおよびインビボで）確認することができる。
【０１４５】
一部の実施の形態において、ここに開示されている１つ以上の組成物は、固体支持体に取付けることができる。「固体支持体」の用語は、巨大分子、たとえば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチドを接続することができる固体表面を指すが、マイクロプレートウェル、セファロース／アガロースマトリックス、磁気ビーズ、スライドガラス、ナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース膜、シリカプレートなどを含むが、これらに限定されない。さらに、固体支持体は、細胞表面で晒されるまたは細胞質内に存在するＬＣＭＶ抗原を含む培養されたまたは組織の試料における感染細胞によって表わすことができる。
【０１４６】
「免疫複合体」の用語は解析設定において抗体を抗原に結合することによって形成される分子複合物を指す。さらに生体サンプルにおいてウイルスリボ核タンパク質および免疫グロブリンを含む自然に発生する多重分子合成物を指す。
【０１４７】
診断方法
本開示はサンプルにおけるＬＣＭＶを検出する方法を示し、ここに開示されているＬＣＭＶを検出するための組成物を１つ以上用いる（たとえば、１つ以上のプローブもしくはプライマー、および／または１つ以上のＬＣＭＶペプチドもしくはＬＣＭＶペプチド断片、および／または１つ以上のＬＣＭＶペプチドもしくはＬＣＭＶペプチド断片を検出するための１つ以上の組成物（たとえば、１つ以上の抗体または抗体断片）を用いる。
【０１４８】
ＬＣＭＶ抗原／エピトープに対する抗体を用いて、生体サンプルにおけるＬＣＭＶタンパク質またはリボ核タンパク質の存在を検出することができ、これはたとえば異なる免疫学的測定法または分子方法と組合せられた免疫学的測定法を用いて行なう。免疫学的測定法は１つ以上の抗体を使用することができ、プロトコルは異なるフォーマットを含むことができ、これは直接反応、挟持、競合、免疫沈澱、免疫ブロッティングなどを含む。さらに、免疫ＰＣＲフォーマットにおける増幅プロシージャと組合せることができ、増幅テンプレートはウイルスＲＮＡによって、または抗体／抗原もしくはディテクタに結合されたオリゴヌクレオチドによって表わされる。このようなプロシージャは当該技術において既知である。
【０１４９】
診断分析は、ウイルス抗原または抗ウイルス抗体のどちらかを検出し得る。解析は、免疫沈澱（ＩＰ）、免疫ブロット法（ＩＢ）、ＩＢと組合せたＩＰ、酵素標識免疫測定法、ビオチン／アビジン型アッセイ、ＰＣＲ、免疫ＰＣＲなどを含み得る。検出は一般に蛍光、化学発光、放射性の標識、酵素標識、もしくは色素分子、または増幅用のオリゴヌクレオチドといったラベルの曝露を含んで、標識が付けられた産出物を生成する。
【０１５０】
解析は抗原−抗体複合体が結合される固体支持体（キャプチャなしまたはキャプチャあり）から液相の結合されていない抗体または抗原の分離を含む。次に、抗原−抗体複合体は、ラベルと相互作用または接合されたディテクタで検出される。
【０１５１】
典型的に、固体支持体は最初はキャプチャと反応させられる。次に、固定化されていない成分は洗浄により取除かれ、固体支持体−結合成分は適切な条件下で生体サンプルと接触させられる。結合されていない材料を取除くための洗浄の後、第２のバインダ部分、すなわちディテクタは、適切な結合状態の後加えることができる。ディテクタの存在は、当該技術分野において周知の技術を用いて検出することができる。代替的に、ディテクタは標識の付けられた競合分子と同時に加えられて、競合の度合はサンプルに存在するディテクタの量を示すことができる。
【０１５２】
図８および図９に示されるように、アッセイのいくつかの異なる変形を行なうことができる。図８は、ＬＣＭＶ抗原または抗体のどちらかを用いる例示的免疫検出テストの組成物を示す。
【０１５３】
Ａシリーズのアッセイでは、個々のウイルス抗原またはその混合は、生体サンプルからの抗／ＬＣＭＶ抗体が結合するキャプチャとして働き、次にさまざまなディテクタまたはその組合せで検出される。Ａ１変異体では、標識が直接付けられているタンパク質Ａ／Ｇによって表わされる。Ａ２変異体では、ディテクタは直接標識が付けられている二次的抗ヒト（または抗マウスまたは他の動物スピーシーズに特異の）ＩｇＧまたはＩｇＭによって表わされる。Ａ３変異体では、ディテクタ抗体はビオチンで接合され、これはアビジン／ストレプトアビジンによってさらに結合され、次に標識−接合ビオチンで示される。Ａ４変異体では、二次的抗体がオリゴヌクレオチドで結合され、これは標識の付けられたトリヌクレオチドの存在下で対応するプライマーによって増幅することができる。Ａ５変異体では、二次的抗体はビオチンで接合され、これはアビジン／ストレトアビジンとオリゴヌクレオチドで結合されたビオチンと反応させられ、これは標識の付けられたトリヌクレオチドの存在下で対応するプライマーによって増幅することができる。
【０１５４】
Ｂシリーズのアッセイでは、ＮＰ、ＧＰ（たとえばＧＰＣ、ＧＰ１）および／またはＺＰに特異的な抗体は固相に取付けられ、生体サンプルからのＬＣＭＶ抗原が結合するキャプチャとして働き、次に競合しない抗体または抗体／関連ディテクタで検出される。Ｂ１変異体では、ディテクタは標識で直接接合されるＬＣＭＶ抗原−特異抗体によって表わされる。Ｂ２変異体では、ディテクタは直接標識が付けられている抗ヒト（または抗マウスまたは他の動物スピーシーズに特異の）ＩｇＧまたはＩｇＭによって表わされる。Ｂ３変異体では、ディテクタ抗体はビオチンで接合され、これはアビジン／ストレプトアビジンによってさらに結合され、次に標識−接合ビオチンで示される。Ｂ４変異体では、二次的抗体がオリゴヌクレオチドで結合され、これは標識の付けられたトリヌクレオチドの存在下で対応するプライマーによって増幅することができる。Ｂ５変異体では、二次的抗体はビオチンで接合され、これはアビジン／ストレトアビジンとオリゴヌクレオチドで結合されたビオチンと反応させられ、これは標識の付けられたトリヌクレオチドの存在下で対応するプライマーによって増幅することができる。
【０１５５】
一部の実施の形態において、当該方法は被験者を選択することを含む（「被験者」は本明細書において動物、ヒト、またはヒトではないものを示すために用いられている。ヒトおよび獣医の用途両方が意図される。この用語は、たとえばヒトといった哺乳類、他の霊長類、ブタ、ハツカネズミやラットといったげっ歯類、ラビット、モルモット、ハムスター、メウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジおよびヤギを含む）。たとえば、ＬＣＭＶ感染のリスクがある被験者またはＬＣＭＶを罹っていると疑われる被験者を選択することができる。代替的にまたは付加的に、ＬＣＭＶによって引起される害により晒されやすくなる状況または疾病を有する被験者を選択することができる。このような被験者は、妊娠する予定のあるまたは妊娠している被験者、免疫不全被験者、移植レシピエント、および癌を発症するリスクのあるまたは癌を患っている被験者を含むことができる。一部の実施の形態において、被験者が低酸素症を示すことが知られる症状を有する被験者が選択される。
【０１５６】
一部の実施の形態において、選択の後、サンプルを被験者から得ることができる。そのサンプルはここに開示されているＬＣＭＶを検出するための１つ以上の組成物（たとえば１つ以上のプローブもしくはプライマー、および／または１つ以上のＬＣＭＶペプチドまたはＬＣＭＶペプチド断片）、および／または１つ以上のＬＣＭＶペプチドまたはＬＣＭＶペプチド断片を検出するための１つ以上の組成物（たとえば１つ以上の抗体または抗体断片）と接触させられる。場合によっては、当該方法は被験者にＬＣＭＶが検出された場合には、ＬＣＭＶ感染の治療、または治療を被験者に推奨することを含むことができる。
【０１５７】
当該方法は、治療の効能を定めるために、治療の途中および後で患者をモニタまたは評価すること、および必要なら治療の効果を向上させるために治療を調整することを含むことができる。
【０１５８】
キット
本開示は、ここに開示されているＬＣＭＶを検出するための１つ以上の組成物を含むキットを示す。当該キットは、組成物および組成物を用いる方法に関連する情報材料をも含むことができる。この情報材料は、ここに開示されている組成物および方法に関連する記述的、指示的、または販売に関する、または他の材料であり得る。
【０１５９】
キットの情報材料はその形は制限されていない。多くの場合、情報材料（たとえば指示）は印刷物、たとえば印刷された文字、図面、および／またはラベルや印刷された紙の写真で提供される。しかし、情報材料は他のフォーマット、たとえば点字、コンピュータ読取可能材料、映像記録、またはオーディオ記録で提供される。もちろん、情報材料はフォーマットの任意の組合せで提供することができる。
【０１６０】
化合物に加えて、キットの組成物は他の成分、たとえば溶剤または緩衝剤、安定剤、保存料、および／またはここに記載されている症状または疾患を治療する第２の薬剤を含むことができる。代替的に、他の成分は、その化合物とは異なる組成物または容器で、キットに含むことができる。このような実施の形態において、キットは薬剤および他の成分を混合するための指示、および１つ以上の化合物を他の成分とともに使用する指示を含むことができる。
【０１６１】
ここに開示されている配列はオンラインで公開されている、たとえばNational Center for Biotechnology Information (NCBI)のウェブサイト(ncbi.nlm.nih.gov参照)で、さらに以下の文献において公開されている：
LCMV strain MX GPC gene, NCBI Accession no. EU195888 (EU195888.1) and Tomaskova,J et al, Virus Genes, 37:31-38 (2008);
LCMV strain MX NP gene, NCBI Accession no. Y16308 (Y16308.1) and Reiserova,L. et al, Virology 257:73-83 (1999); 
LCMV strain MX Z gene, NCBI accession no. AJ131281 (A Jl 31281.1) and Gibadulinova,A. et al, Acta Virol., 42:369-374 (1998); 
LCMV strain Armstrong 53b - S segment, NCBI accession no. M20869 
(M20869.1) and Salvato,M. et al, Virology, 164:517-522 (1988); 
LCMV strain Armstrong 53b -LS segment, NCBI accession no. AY847351 (AY847351.1) and Grande-Perez,A. et al, J. Virol., 79: 10451-10459 (2005); 
LCMV strain CH-5692 - S segment, NCBI accession no. AF325214 
(AF325214.1); 
LCMV strain CH-5692 - L segment, NCBI accession no. DQ868484 
(DQ868484.1); 
LCMV strain CH-5871 - S segment, NCBI accession no. AF325215 
(AF325215.1) and Asper, M. et al., Virology, 284:203-213 (2001); 
LCMV strain Traub - S segment, NCBI accession no. DQ868487 
(DQ868487.1); 
LCMV strain Traub - L segment, NCBI accession no. DQ868488 
(DQ868488.1) and Emonet,S. et al, Genetic comparisons and evolution of 6 LCMV strains; 
LCMV strain LE GPC gene, NCBI accession no. EF164923 (EF164923.1) and 
Meritet,J.F. et al., Human Fetal Lymphocytic Choriomeningitis Virus Infection with a New Genomic Variant; 
LCMV strain Ml - S segment, NCBI accession no. AB261991 (AB261991.1); 
LCMV strain M2 - S segment, NCBI accession no. AB261990 (AB261990.1) and Ike, F. et al, Comp. Med. 57:272-281 (2007); 
LCMV isolate Marseille #12 - S segment, NCBI accession no. DQ286931 (DQ286931.1); 
LCMV isolate Marseille #12 - L segment, NCBI accession no. DQ286932 (DQ286932.1) and Emonet, S. et al, Emerging Infect. Dis., 13:472-475 (2007); 
LCMV strain WE - S segment, NCBI accession no. M22138 (M22138.1) and 
Romanowski, V. et al, Virus Res., 3:101-114 (1985); 
LCMV strain WE - S segment, NCBI accession no. AF004519 (AF004519.1) and 
Djavani, M. et al, Virus Genes, 17: 151-155 (1998); 
LCMV strain Bulgaria - S segment, NCBI accession no. GQ862982 
(GQ862982.1); 
LCMV strain Bulgaria - S segment, NCBI accession no. GQ862981 
(GQ862981.1) and Palacios,G. et al, Genetic diversity of Lymphocytic 
choriomeningitis viruses; 
LCMV strain Y - S segment, NCBI accession no. DQ1 18959 (DQ1 18959.1) and Compton,S.R., Lymphocytic choriomeningitis virus strain Y; および
NCBI accession nos. FJ607019-FJ607038, 13-JUL-2010, Albarino,C.G. et al, Emerging Infect. Dis., 16: 1093-1100 (2010).
【実施例】
【０１６２】
本発明は以下の実施例においてさらに記載されており、これはクレームに記載の本発明の範囲を限定するものではない。
【０１６３】
実施例１：ＬＣＭＶの多種多様な株／分離株間に配列保守領域が存在する
多様な地理的および時間的な源から集められた２９ＬＣＭＶ株の最近のゲノム分析は、これらのウイルスが多種多様であることを示した。いくつかの異なる系列があるが、分離について時間や場所の相関は少ない（Albarino他２０１０年）。既知のＬＣＭＶ分離株すべてのＳおよびＬセグメント配列は、３つ（Ｌセグメント）または４つ（Ｓセグメント）の異なる遺伝子グループまたは系列で分散された。Ｓセグメント系列間では２５％までのヌクレオチド変異、およびＬセグメント系列間では２８％の変異が観察された。このヌクレオチド変異は、Ｚ、Ｌ、ＧＰＣおよびＮＰタンパク質のアミノ酸配列においてそれぞれ１８％、１３％、１０％、および６％の変異に翻訳される（Albarino他２０１０年）。しかし、異なる株／分離株間でかなりの配列同一性の領域があり（図２から図７参照）、さらに抽出された抗原はＬＣＭＶ−特異抗体に対して交差反応を示した。
【０１６４】
これらの観察は、適切な分子および免疫検出技術を用いて複数のＬＣＭＶ株および／または分離株を検出できることを裏付ける。
【０１６５】
実施例２：低酸素状態は持続性感染からＬＣＭＶを再活性化させる
ＬＣＭＶ  ＭＸ株（ＨｅＬａ−ＭＸ）で持続的に感染させられたＨｅＬａ細胞は４８時間、正常酸素状態（２１％Ｏ２）または低酸素状態（２％Ｏ２）でインキュベートされた。ＨｅＬａ−ＭＸ細胞の別の母集団は、酸素正常状況下で２４時間１ｍＭのＤＭＯＧ（低酸素を模倣するエージェント）で処理された。
【０１６６】
ＲＴ−ＰＣＲ
細胞内の総ＲＮＡは、メーカーの指示に従いInstaPure試薬で抽出された。逆転写は任意の七量体プライマーを用いてＭ−ＭｕＬＶ逆転写構造で行なわれた。ウイルス遺伝子発現のレベルは、定量リアルタイムＰＣＲによって分析され、これはPOWER SYBR(登録商標）Green PCR Master Mix および以下の遺伝子特異プライマーを用いて、StepOneTM Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA.) で行われた：
NP (246 base pair (bp) PCR product): 
Forward: 5'- GATCAGAAACAGTTCAAACAGGACT-3 ' (SEQ ID NO: 58) 
Reverse: 5'- GTCCCACACTTTGTCTTCATACTCT-3 ' (SEQ ID NO:59) GP (25 lbp PCR product): 
Forward: 5'- AACCAGTGCAGAACTTTTAGAGGTA-3 ' (SEQ ID NO: 60) 
Reverse: 5'- GCAAGTCTTCTAGTGAGGAACTTTG-3 ' (SEQ ID NO:61) ZP (272bp PCR product): 
Forward: 5'- CCTGTGAGAGTACAGAGACAAACCT-3 ' (SEQ ID NO:62) 
Reverse: 5'- GATATCTTCAGCTTGGTTGGTAATG-3 ' (SEQ ID NO:63) β-actin (236bp PCR product): 
Forward: 5'- CCAACCGCGAGAAGATGA-3 ' (SEQ ID NO: 64) 
Reverse: 5'- GATCTTCATGAGGTAGTCAGT-3 ' (SEQ ID NO:65)
各遺伝子について、β−アクチンを内因的コントロールとして用いて、酸素正常コントロールからの値との比較で誘導倍率が定められた。
【０１６７】
図１０Ａおよび図１０Ｂに示されるように、低酸素状況およびＤＭＯＧは、ＲＴ−ＰＣＲで評価されたように、酸素正常状況に対して、テストされたすべてのＬＣＭＶタンパク質（すなわち、ＮＰ、ＺＰおよびＧＰ）をエンコードするmRNAの発現を増加させた。コントロール（β−アクチン）では変化が観察されなかった。
【０１６８】
低酸素状態は転写レベルでウイルス遺伝子に影響することを証明するために、５′ｃＤＮＡ末端（ＲＬＭ−ＲＡＣＥ）のＲＮＡリガーゼを介在した迅速増幅はGeneRacer法を用いて行なわれ、これは５′標識転写の選択的増幅を可能にし、標識のないゲノム／抗ゲノムＬＣＭＶ  ＲＮＡテンプレートをなくす。
【０１６９】
ＭＸ  ＬＣＭＶの５′標識転写の選択的増幅は、メーカー(Invitrogen, Life Technologies)の指示に従いGeneRacerＴＭキットを用いて行なわれた。酸素正常状態および低酸素状態のＨｅＬａ−ＭＸ細胞から分離されたＲＮＡのＲＬＭ−ＲＡＣＥで用いられたＬＣＭＶ−ＭＸ遺伝子特異プライマーを以下に挙げる：
NP gene 
5' RACE reverse primer: CAAGGTCGGCAGCGAGAGACATCA (SEQ ID NO:66) 
5' RACE nested reverse primer: AGAAGGCTAGTTGCGTCCTTGATG (SEQ ID NO:67)
GP gene 
5' RACE reverse primer: GGCTGAACATGCATTGGGCATTGT (SEQ ID NO:68) 
5' RACE nested reverse primer: TAGGAGAAGGAAGCTGACCAATGC (SEQ ID NO:69) 
L gene 
5' RACE reverse primer: TCCTGGACACACAACTCCGGACTCTA (SEQ ID NO: 70) 
5' RACE nested reverse primer: ACAGCCACTTTTGTCTGCACTGTC (SEQ ID NO:71) 
Z gene 
5' RACE reverse primer: CTTCGTAGGGAGGTGGTGGGCTTG (SEQ ID NO:72) 
5' RACE nested reverse primer: AGTTCAGTGGACCGAGATAGGTGGT (SEQ ID NO:73)
β−アクチンは、キットに含まれるプライマーを用いた内部基準およびＲＬＭ品質のコントロールとして用いられた。もたらされるＰＣＲ断片は１．５％のアガロースゲルで行なわれ、その特異性はシーケンシングにより、および独立した遺伝子特異プライマーでの再度増幅により、検証された。個別のＰＣＲ産出物に対応するバンドの強度は、Syngene社からのGeneTools Softwareで評価された。遺伝子特異ＰＣＲ産出物の量は、対応するβ−アクチン内部基準の強度に対する各ＬＣＭＶ−特異バンドの強度の比率として、準定量的に表わされた。キットに含まれる商業ＨｅＬａ総ＲＮＡは、ＣＩＰおよびＴＡＰ酵素の活性に対するコントロールとして、β−アクチン増幅のために用いられた。
【０１７０】
図１０Ｄに示されるように、低酸素状態（２％Ｏ2）対酸素正常状態のＨｅＬａ−ＭＸ細胞から分離された総ＲＮＡで行なわれたＲＬＭ−ＲＡＣＥの準定量評価結果は、低酸素状態がウイルス転写に影響することを示唆する上記ＲＴ  ＰＣＲデータ（図１０Ａ参照）と一致していた。
【０１７１】
免疫ブロッティング
１００万のＨｅＬａ−ＭＸはペトリ皿にプレートされ、一晩定着するために放置され、次に酸素正常状態および低酸素状態下で４８時間インキュベートされた。細胞は溶解バッファ( 50 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.1% sodium deoxycholate およびlx Complete protease inhibitor cocktail [Roche, Mannheim, Germany] in PBS)で分裂され、総タンパク質濃度はメーカーの指示に従いＢＣＡアッセイ(Pierce, Rockford, IL, USA)によって定められた。総タンパク質抽出物（１００μｇ／レイン）は減少条件下でＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分けられ、ＰＶＤＣ膜（ImmobilonTM, Millipore, Billerica, MA, USA)上にブロットされ、特異抗体を用い検出され、この検出は、ＮＰ（マウスモノクローナル抗体Ｍ５９）、Ｚタンパク質（マウスモノクローナル抗体ＭＪ３）、ＧＰ１（抗ペプチドポリクローナルの抗体）、西洋ワサビペルオキシターゼで接合された適切な二次的抗体が付属するＨＩＦ−１アルファまたはアルファーアクチンに対して、行なわれた。すべての免疫ブロットはＥＣＬ検出システムで展開された。
【０１７２】
図１０Ｃに示されるように、低酸素状態は酸素正常状態に比べて、テストされたすべてのＬＣＭＶタンパク質（すなわち、ＮＰ、ＺＰおよびＧＰ）の発現レベルを増加させた。コントロール（アクチン）では変化は観察されなかった。
【０１７３】
実施例３：低酸素状態によって活性化されたＬＣＭＶは感染性を有する。
４８時間酸素正常状態または低酸素状態で培養されたＨｅＬａ−ＭＸからのフィルタ処理された媒体を用いて感染していないＨｅＬａ細胞を感染させた。これらの細胞は次に酸素正常状態で培養され、パッセージされ、次にウイルス複製のために評価された。
【０１７４】
酸素正常状態（ＮＯ）および低酸素状態（ＨＹ）下で培養されたＨｅＬａ−ＭＸ細胞からの媒体でのＬＣＭＶゲノムの存在は、ＲＴ−ＰＣＲ法によって確認された（図１１Ａ参照）。さらに、示されている媒体で感染されたＨｅＬａ母集団の感染の広がりは、最初の５つのパッセージにおいて、次に１０のパッセージにおいてＲＴ−ＰＣＲ分析が行なわれた（図１１Ｂ）。感染の進行は、２０倍の倍率で、レシピエント細胞におけるウイルスタンパク質の免疫蛍光検出によってもモニタリングされた（図１１Ｃ）。実験は２回繰返され、その都度同様の結果が示された。図１１Ａから図１１Ｃに示されるように、低酸素状態はＬＣＭＶの感染性を増加させる。
【０１７５】
実施例２および実施例３に示されるデータは、培養（実施例１）におけるウイルスＮＰ、ＺおよびＧＰ（ＧＰ１の発現を含む）遺伝子およびタンパク質の発現を増加させ、感染性ウイルス粒子の形成を引起すことを示す（実施例２）。
【０１７６】
これらのデータは、低酸素状態のリスクを有する被験者におけるＬＣＭＶの診断検出が低酸素状態ウイルス遺伝子、抗原に対する抗体の抗原、およびその組合せでの理由を裏付ける。
【０１７７】
実施例４：ＬＣＭＶ  ＮＰに特異的に結合する抗体の発生
マウスモノクローナル抗体Ｍ５９、Ｍ１６６およびＭ８７はＬＣＭＶ  ＮＰに特異的である。これらの抗体はハイブリドーマ技術（KohlerおよびMilstein１９７５年）を用いて調製された。
【０１７８】
ＢＡＬＢ／ｃマウスは５×１０6ＨｅＬａ−ＭＸ細胞の３回のドーズで免疫が付けられ、その脾細胞はＮＳ−Ｏミエローマ細胞で融合された。ハイブリドーマは、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含むＤＭＥＭ−ＨＡＴ媒体で選択され、差異ＥＬＩＳＡによってＮＰに対する特異的再活性化についてスクリーニングされ、これはＨｅＬａおよびＨｅＬａ−ＭＸ細胞の抽出物を抗原として用いた。陽性のハイブリドーマ培養は、希釈を制限することによってクローン化され、伸長され、ＭＡｂｓ産出のために用いられた。
【０１７９】
Ｍ５９、Ｍ１６６およびＭ８７はすべてＬＣＭＶ  ＭＸからＮＰを結合し、他のＬＣＭＶ株のＮＰと交差反応した。
【０１８０】
実施例４Ａ：Ｍ１６６の寄託
マウスモンクローン抗体Ｍ１６６を発現するハイブリドーマ細胞株は、受領番号ＬＭＢＰ  ９２１６ＣＢとして、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM) (Universiteit Gent, Vakgroep Moleculaire Biolgie- Plasmidicollectie (BCCM(登録商標)/LMBP)に寄託された。
【０１８１】
実施例４Ｂ：Ｍ８７可変領域配列の特徴付け
Ｍ８７重鎖のアミノ酸配列は以下のように定められ、図１２Ａに示される。ＲＮＡは１００万のＭ８７ハイブリドーマ細胞から分離され、任意の六量体プライマーを用いて逆転写された。重鎖可変領域はもたらされるｃＤＮＡから増幅され、これはシグナルペプチド／リーダシーケンスに相補であるよう設計された変性フォワードプライマーと（図１２参照）、定量ドメインのＣＨ１領域に相補な逆プライマーとが用いられた。増幅は忠実性が高いポリメラーゼを用いて行なわれ、予期される大きさ（ｃｃａ  ４００ｂｐ）のＰＣＲ産出物は電気泳動によって分けられ、ゲルから分離された。線形ＰＣＲ単位複製配列はｐＪｅｔ１．２ベクトルに結紮され、次にコンピテント大腸菌に形質転換された。結果の形質転換された細胞はスクリーニングされ、選択されたコロニーは制限酵素切断およびシーケンシングによって検証された。Ｍ８７重鎖可変領域の配列は次のように定められた：
mdsrlnlvflvlilkgvqcdvqlvesggglvqpggsrklscaasgftfssfgmhwvrqapekglewvayissgsstlhyadtvkgrftisrdnplmtlflqrnklpslcygllgsrnlshrllsqndtpirlsigpwklgi (SEQ ID NO: 74)
Ｍ８７重鎖可変領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）内において、mdsrlnlvflvlilkgvqc（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７5）はシグナルペプチド配列であり、gftfssfgmhwv（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７6）はＣＤＲ１であり；issgsstlhyadtvkgrft（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７7）はＣＤＲ２であり、hrllsqndtpirlsigp（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）はＣＤＲ３ある。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４の注釈の付いているものは、図１２Ｂ−図１２Ｃにある。
【０１８２】
実施例５：ＬＣＭＶ  ＧＰ１に特異的に結合される抗体の生成
ＬＣＭＶ  ＭＸ  ＧＰ１に対するポリクローナル抗体は以下のように育成された。
【０１８３】
潜在的Ｂ細胞エピトープは、いくつかの利用可能なプログラムを利用して、ＧＰＣ  ＬＣＭＶ  ＭＸの全配列を用いて同定された。ＧＰ１の領域内でマッピングされるペプチドRSGWGWAGSDGKTT (SEQ ID NO: 41のaa 205-218) （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９）は、ＧＰ１特異ポリクローナル抗体の産出のために選択された。親和性精製ウサギポリクローナル抗体は、免疫沈澱およびウエスタンブロッティングによってテストされた。
【０１８４】
実施例６：ＬＣＭＶ  ＺＰに特異的に結合される抗体の生成
マウスモノクローナル抗体ＭＪ３はＬＣＭＶ  ＺＰに特異的に結合する。ハイブリドーマ技術（とりわけKohlerおよびMilstein）を用いて抗体が生成された。簡単に説明すると、ＢＡＬＢ／ｃマウスは５×１０6ＨｅＬａ−ＭＸ細胞の２回のドーズで免疫が付けられ、グルタチオンセファロース４Ｂに結合される１００μｇのＧＳＴ−Ｚタンパク質で高められた。脾細胞のＳｐ２／０ミエローマ細胞との融合は３日後行なわれた。ハイブリドーマはＤＭＥＭ−ＨＡＴ媒体で選択され、ハイブリドーマによって産出されたモノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡおよび免疫ブロッティングにより、ＧＳＴ−Ｚ対ＧＳＴおよびＨｅＬａ−ＭＸ対非感染ＨｅＬａ細胞におけるＺタンパク質に対する特異的再活性についてスクリーニングされた。ハイブリドーマ培養（ＭＪ３）は制限された希釈でサブクローン化され、伸長され、ＭＡｂ産出に用いられた。
【０１８５】
ＭＡｂ  ＭＪ３は異なる免疫検出方法を用いてＺタンパク質と反応することが示された。
【０１８６】
実施例６Ａ：ＭＪ３の寄託
マウスモノクローナル抗体ＭＪ３を発現するハイブリドーマ細胞株は、受領番号ＬＭＢＰ  ９２１７ＣＢとして、ベルギーのGhent UniversityのBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM) (Universiteit Gent, Vakgroep Moleculaire Biolgie- Plasmidicollectie (BCCM(登録商標)/LMBP)に寄託された。
【０１８７】
実施例７：ヒト被験者における抗ＬＣＭＶ  ＮＰ抗体の検出
血清サンプルは以下から取得された：（ｉ）診断された原因のない自然流産の女性；（ii）満期妊娠の女性；および（iii）腎細胞癌（ＲＣＣ）腫瘍を持った腫瘍患者。ヒト血清の抗ＬＣＭＶ抗体は、免疫沈澱およびＮＰ特異モノクローナル抗体での免疫ブロッティングによって分析された。
【０１８８】
本実施例で用いられるアプローチは非常に感度がよく、急性および慢性／持続性感染の際に産出されたＮＰ特異抗体の検出を可能にする。簡単にいうと、タンパク質Ｇ−セファロース（５０％スラリー）はＰＢＳで洗浄され、ＨｅＬａ−ＭＸ細胞からの全細胞溶解液と混合されて非特異結合タンパク質をpreclearする。１０％ＦＣＳを含有する１９０μｌのＢＰＳの中の１０μｌのヒト血清が、１００μｌのpreclearされた細胞抽出に加えられた。免疫複合体は一晩４℃で形成させた。結果の免疫複合体は４℃で１時間、洗浄されたタンパク質Ｇ−セファローススラリーを３０μｌ加えることによって沈殿された。ビーズはＢＰＳで５回洗浄され、SDS-PAGEに晒され、ポリ塩化ビニリデンチフルオリドメイン膜上に移された。膜は西洋ワサビペルオキシターゼで接合された精製ＭＡｂでプローブされた。付加的洗浄工程の後、免疫ブロットはＥＣＬ検出システムを用いて視認された。
【０１８９】
表１Ａ−表１Ｂに示されるように、流産した女性のＮＰ抗体の血清有病率はコントロールと比較して１９．４％高かった。
【０１９０】
表１Ａ：自然流産を経験したヒト女性被験者における抗ＬＣＭＶ  ＮＰ抗体の検出
【０１９１】
【表１Ａ】
2014502848.tif 000003
【０１９２】
検出された抗体は図１３において免疫ブロットとしても示されている。
表４に示されるように、ＮＰ抗体の非常に高い血清有病率は、ＲＣＣ腫瘍を持つ患者でも観察された。
【０１９３】
表１Ｂ：ＲＣＣ腫瘍の被験者における抗ＬＣＭＶ  ＮＰ抗体の検出
【０１９４】
【表１Ｂ】
2014502848.tif 000004
【０１９５】
実施例７Ｂ：タンデム質量分析によるヒト血清におけるＮＰ特異抗体の検出
免疫沈澱およびＮＰ特異モノクローナル抗体での後の免疫ブロッティングにより、ＮＰに対して陽性であると示された１つのヒト血清は、実施例７に記載されているように免疫沈澱された。洗浄の後、免疫複合体はクエン酸塩バッファ（ｐＨ３）で溶出された。溶出物の最終ｐＨは１ＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．５を添加することにより調整された。その後、免疫複合体を含む溶出物はタンデム質量分析を受けた。簡単に説明すると、サンプルは減縮（１０ｍＭジチオスレイトール）、アルキル化され（５５ｍＭヨードアセタミド）および５０重炭酸アンモニウムの中で２０μｇ／ｍｌトリプシンによって一晩３７℃で消化された。結果のペプチドはマイクロプレートに移され、凍結乾燥によって乾かされた。抽出されたペプチド混合物は、２０μｌの２％水中アセトニトリルの中で、０．１％のギ酸が添加されて溶解され、上記のように(Henrychova et al, 2008)、nanoAcquity UPLCシステム(Waters, Milford, MA)によって分離された。データ取得は、同時に３ＭＳ／ＭＳイベントまで集められた分離値においてデータに依存する態様で行なわれた。データはProteinLynx Global Server v. 2.4(Waters)で処理され、バックグラウンド除去法（５次多項式およびしきい値３５％）、平滑化（Savitzky Golay、３つのチャネルにわたり２回）、およびセントロィディング（トップ、８０％、最小の半値幅４）で処理された。結果のデータは以下の条件に基づきUniProt_LCMVデータベースに対してサーチがかけられた：Ｃｙｓのカルバミドメチル化、可変Ｍｄ酸化、１つの欠失亀裂を有するトリプシンの断片、ペプチド質量許容差５０ｐｐｍ、および断片質量許容差０．０５Ｄａ。結果は、同じシリーズからの３個以上連続する断片イオンの同定により確認された。理論的配列に対して少なくとも２つの一致するペプチドを有するたんぱく質割り当ては陽性の同定であると考えられた。
【０１９６】
表２に示されるように、分析されたサンプルはＬＣＭＶ  ＮＰと同定された。
表２：ＵＰＬＣ−ＭＳによる免疫複合体におけるＮＰの同定
【０１９７】
【表２】
2014502848.tif 000005
【０１９８】
この結果は、テストされたヒト血清はＮＰ特異抗体を含むことを明確に証明した。
実施例８：ヒトＲＣＣ被験者の組織内におけるＬＣＭＶ抗原の免疫検出
ＬＣＭＶ抗原は、免疫化学によってＲＣＣ試料で検出された。簡単に説明すると、切取られた組織は４％の中性緩衝ホルマリン内に固定され、標準の組織学の手続に従いパラフィンに包埋された。４つのμｍ部分はポリリシンが上塗りされたスライド上に置かれ、脱ろうされ、水で戻された。スライドはまずターゲット抽出液で５分間１２５℃で組織前処理プロシージャを受けた（パスカル圧力室、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、カーピンテリア、ＣＡ）。残りの免疫染色手続は、Dako Cytomation EnVision(r)+ System-HRP (DAB)を用いて、以下のメーカーの指示に従い、行なわれた：ａ）ペルオキシターゼおよびタンパク質ブロック（各１０分）；ｂ）ＮＰ（希釈されていないハイブリドーマ媒体）またはＰＢＳ（陰性コントロール）に対して特異的であるプライマリ抗原Ｍ５９でインキュベートされ；ｃ）抗体希釈で１：１０００に希釈されたペルオキシターゼ−接合ヤギ抗−マウス抗体で３０分インキュベートされた。染色は、３，３′−ジアミノベンジジンを発色性基質として１分間ＤＡＢ溶液で視認された。スライドは、ステップａの後１０分間０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を用いてＰＢＳで洗浄され、ステップｂおよびｃの後１０分間２回洗浄され、さらにＤＡＢの視認の後蒸留水で３回洗浄された。インキュベーションおよび洗浄はすべて室温で行なわれた。最後に、当該部分はMayerのヘマトキシリンで対比染色され、５分洗浄され、DePeX (Serva, Heidelberg, Germany)に取付けられた。染色された部分はLeica DM4500B顕微鏡で検査され、Leica DFC480カメラで写真が撮られた。
【０１９９】
図１４Ａ−Ｂに示されるように、ＬＣＭＶ抗原はＲＣＣ被験者からの組織内で検出された。
【０２００】
さらに、ＬＣＭＶ抗原は、免疫沈澱およびＮＰ特異抗体Ｍ８７での免疫ブロッティングにより、ＲＣＣ試料に検出された。簡単に説明すると、１００ｍｇの凍結組織試料は、プロテアーゼの抑制剤(Roche Applied Science, Mannheim, Germany)を含む氷冷溶解バッファ(1% Triton X-100; 150 mM NaCl; 50 mM Tris, pH 7.5; 0.5% Nonidet P-40; 50mM NaF)で均質化された。不溶解の物質は４℃で１５分間１２，０００ｇの遠心分離で除去された。ＭＡｂ  Ｍ８７（１．５ｍｌ培養媒体）は、ＲＴで２時間ＰＢＳ内においてタンパク質Ｇ−セフローゼの５０％懸濁液３０μｌに結合された。組織タンパク質の抽出物（２００μｌ）は２０μｌの５０％懸濁液Ｇ−セフローゼでpre-clearされて、添加されてＭＡｂを結合した。免疫複合体は一晩４℃で形成させられた。ビーズはＰＢＳで６回洗浄され、SDS-PAGEを受け、フッ化ポリビニリデン膜上に移された。膜は西洋ワサビペルオキシターゼで結合された精製ＭＡｂ  Ｍ８７でプローブされた。付加的洗浄工程の後、免疫ブロットはＥＣＬ検出システムを用いて視認された。
【０２０１】
図１４Ｃに示されるように、ＬＣＭＶ  ＮＰはＭＡｂ  ８７を用いてＲＣＣ被験者からの組織に検出された。
【０２０２】
実施例９：ＮＰ特異モノクローナル抗体の分析
ＮＰ  ＬＣＭＶに特異なマウスモノクローナル抗体Ｍ５９、Ｍ１６６およびＭ８７は、ハイブリドーマ技術（KohlerおよびMilstein１９７５年）によって調製された。簡単に説明すると、ＢＡＬＢ／ｃマウスは５×１０6ＨｅＬａ−ＭＸ細胞の３回のドーズで免疫が付けられ、その脾細胞はＮＳ−Ｏミエローマ細胞で融合された。ハイブリドーマは、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含むＤＭＥＭ−ＨＡＴ媒体で選択され、差異ＥＬＩＳＡによってＮＰに対する特異的再活性化についてスクリーニングされ、これはＨｅＬａおよびＨｅＬａ／ＭＸ細胞の抽出物を抗原として用いた。陽性のハイブリドーマ培養は、希釈を制限することによってクローン化され、伸長され、ＭＡｂｓ産出のために用いられた。Ｍ５９、Ｍ１６６およびＭ８７の各々は、他のＬＣＭＶ株のＮＰと交差反応することが示された。
【０２０３】
ＭＡｂｓイソタイプは、親和性精製ラビット抗マウスIgGl,IgG2a,IgG2b,IgG3,IgMおよびIgA抗体（Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents, Sigma）を用いて、メーカーの指示に従いＥＬＩＳＡによって定められた。Ｍ８９およびＭ１６６  ＭＡｂは、ＩｇＧ２ａイソタイプであり、Ｍ８７  ＭＡｂはＩｇＧ１イソタイプであることがわかった。
【０２０４】
抗体はさらに異なる免疫検出方法でテストされた。Ｍ５９は、ＥＬＩＳＡ、免疫沈澱および免疫化学においてＮＰと反応することがわかった。Ｍ１６６は、ＥＬＩＳＡ、ＩＦＡおよび免疫沈澱においてＮＰと反応することがわかった。Ｍ８７は、ＥＬＩＳＡ、免疫沈澱、ＩＦＡおよび免疫ブロッティングにおいてＮＰに結合することがわかった。これらのデータは、抗体がＮＰ分子の異なるエピトープを認識し、Ｍ５９およびＭ１６６は立体構造のエピトープに向けられており、Ｍ８７は線形エピトープに結合することを示唆する。これらの抗体の差異エピトープ特異性は、競合結合アッセイによって証明された。
【０２０５】
簡単に説明すると、ＭＡはまずタンパク質Ａ／Ｇセファロース上の親和クロマトグラフィで精製され、メーカーの指示に従いＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Pierce）で標識が付けられた。ＨｅＬａ−ＭＸ細胞からの抽出物は、標識の付けられた５０％最大結合のＭＡｂに対応する濃度で、マイクロプレートウェルで吸着された。被覆されたプレートは洗浄され、ＰＢＳで１０％のＦＣＳで飽和された。３０μｌの精製ＭＡｂの一連の５倍希釈と３０μｌの定量のビオチン化されたＭＡｂとが添加され、４℃で一晩培養された。プレートは洗浄され、ペルオキシターゼの標識が付けられたストレプトアビジン（Pierce）はディテクタとして用いられた。
【０２０６】
結果は図１５Ａおよび１５Ｂに示される。これらは、Ｍ８７とＭ５９のＭＡｂの間の競合結合の検査を示す図である。ビオチン標識精製抗体（＊）は、標識の付けられていない競合抗体の増加する量の存在下で結合させられた。標識の付けられていない競合物の存在下での標識の付けられた抗体の結合の程度は、競合物がない結合に対するパーセンテージで表わされた。希釈０は標識の付けられていない競合抗体の１０μｇ／ウェルに対応する。これらの結果は同族の競合しか示さないが、標識の付けられた競合物の結合に対する異種阻害は観察されず、ＭＡｂは重ならないエピトープに結合することを示唆していた。
【０２０７】
実施例１０：低酸素状態へのウイルスの反応：パラダイムとしてのＬＣＭＶアレナウイルス
ウイルス感染細胞の生理学的コンテキストは、ウイルス子孫の増幅および広がりに著しい影響を与える。ウイルスが宿主細胞に強く依存し、かつ一般にはその生活機能を損なわない持続的感染の際、低酸素状態といった小さい環境のストレスは、親密なウイルス−宿主関係を壊してウイルス病因を拡大させ得る。累積した証拠は、ＨＩＦ転写ファクタによって支配される低酸素状態によって誘起される分子反応は、ＤＮＡステージを通るウイルスの遺伝子発現を変調させ、プロモータにＨＲＥを含み、核内で複製されることを示唆している。我々は、低酸素状態が持続性細胞質ＲＮＡウイルス感染の出方に影響することを初めて示すことができた。モデルとして、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）を用いた。これはその保全性を乱すことなく異なる細胞タイプで持続し、ほとんど不顕性の感染を引起すものである。したがってＬＣＭＶは害がないと考えられているが、ＬＣＭＶに関連した流産や移植レシピエントでの致命的なＬＣＭＶ感染は、危険性があることを警告している。ＬＣＭＶのＭＸ株はヒトＨｅＬａ細胞において持続したモードで複製し、細胞外の伝染性ビリオンがなければ細胞間態様で広がる。ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞を慢性低酸素状態に晒すと、高められたウイルスＲＮＡ転写をもたらし、ＨＩＦ−１α依存機構によってより高いレベルのウイルスタンパク質をもたらした。低酸素状態はさらに感染性ビリオンの形成を高め、これは細胞のない媒体を介してＬＣＭＶ感染を伝染させる可能性がある。この低酸素状態によって誘起されたＬＣＭＶの「再活性化」は、たとえば発育している胎児や無症候性のドナーから移植を受けるものにとって、健康を損なう結果をもたらし得る。
【０２０８】
実施例１１：組換ＬＣＭＶ−ＮＰ断片のクローン化および発現
ＬＣＭＶ（ＭＸ）−ＮＰ  ｃＤＮＡの３つの重なる断片は、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＮＰをテンプレートとして用いてＰＣＲによってクローン化され、括弧内の数字はＭＸ株の公開されたＮＰ配列に対する場所を示す（ＧｅｎＢａｎｋ受領番号Ｙ１６３０８、Reiserova他２００１年）。
【０２０９】
アミノ酸１−２０５を含む断片Ｉは、以下のプライマーを用いて増幅された：NPMXF1S5'-CCGAATTCATGTCTCTGTCCAAGGAAGTCA-3'(46- 67) (SEQ ID NO:79)およびNPMXF1A 5'-GGCTCGAGGTAAAGCAGACCAAGGTCTGTG-3'(660-639) (SEQ ID NO:80);
アミノ酸１９８−３９１を有する断片ＩＩは、以下のプライマーで増幅された：NPMXF2S5'-GGGAATTCCTCACAGACCTTGGTCTGCTTT-3'(637-658) (SEQ ID NO:81)およびNPMXF2A5'-CCCTCGAGCACTGGATCATTGAACCTACCC-3'(1218-1197) (SEQ ID NO:82);
アミノ酸３８４−５５８を含む断片ＩＩＩは、以下のプライマーを用いて増幅で得られた：NPMXF3S5'-CCGAATTCGAGGGTAGGTTCAATGATCCAG-3'(1195-1226) (SEQ ID NO:83)およびNPMXF3A5'-CCTCGAGTTAGAGTGTCACAACATTTGGTC-3'(1722-1700) (SEQ ID NO: 84)。すべてのプライマーは、それぞれＥｃｏＲＩおよびＸｈｏ  Ｉ限定部位（下線部分）で設計された。ＰＣＲ反応は、上記のプライマーおよびＥＸＴ  ＤＮＡポリメラーゼ(Finnzymes, Oy, Finland)を用いて行なわれた。９４℃での３分間の最初の変性の後、増幅プログラムは以下のとおり設定された：９４℃で３０秒の変性、６０℃で４０秒のアニーリング、１分２０秒の間７２℃で伸長が合計３５サイクル実施し、最後に７２℃で７分の伸長。ＰＣＲ産物はWizard（登録商標）SV Gel & PCR clean-Up System (Promega, USA)を用いて１．２％アガロースゲルで精製され、ＥｃｏＲＢで線形され、Ｔ−Ａクローン化用にｔＴが後ろに付いたpBluescript SK(+) (Stratagene, USA)（＋）に、またはｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔベクトル(Promega, USA)に、サブクローン化された。次にこの３つの断片は、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を用いて、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼとインフレームで、ｐＧＸ−４Ｔ−１（Amersham Pharmacia Biotech AB, Sweden)にクローン化された。ＧＳＴ融合タンパク質を産出するために、確認されたプラスミド構成（pGEX-4Tl-NPI,pGEX-4Tl-NPII,pGEX-4Tl-NPIIIとして示される）は、E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL (Stratagene, USA)競合細胞に形質転換され、０．２ｍＭのＩＰＴＧ(Sigma-Aldrich, USA, USA)で３時間誘起された。
【０２１０】
実施例１２：ＧＳＴ標識付き融合タンパク質の精製
大腸菌の誘起培養物は、遠心分離でペレット化され、氷冷溶解バッファＳＴＥ(10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA in lx PBS)で再度懸濁され、０．４ｍｇ／ｍｌの最終濃度のリゾチーム(Serva, Germany)で１５分間氷の上でインキュベートされた。細菌細胞（２×３０秒）の音波処理の前に、１．５％の最終濃度のＳＴＥにおいて１０％のSarcosyl(Sigma-Aldrich, USA, USA)および５ｍＭの最終濃度の１ＭのＤＴＴ(Sigma-Aldrich, USA, USA)が細胞懸濁液に加えられた。溶解されない材料は４℃で１５分間１２，０００ｇの遠心分離で除去された。ＳＴＥ、ｐＨ８で平衡化されたグルタチオンセファロース４Ｂ(Amersham Pharmacia Biotech)の５０％のスラリの適切な量は、バクテリア溶解物に添加され、４℃の穏やかな撹拌で一晩インキュベートされた。次の日、グルタチオンセファロース４Ｂに結合した融合タンパク質は氷冷ＳＴＥ、ｐＨ８で洗浄され、室温で５０mM Tris-HCl, pH 8.0ｍＨにおいて１５ｍＭ減縮グルタチオン（Merck）で希釈された。精製サンプルにおける融合タンパク質のイールドはSDS-PAGEで、およびＢＳＡの規定された濃度と比較した視認で決定された。
【０２１１】
実施例１３：ＮＰ−ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ−１
マイクロプレートウェルは、一晩３７℃で、０．０５Ｍナトリウム炭酸塩−重炭酸塩バッファ（ｐＨ９．６）で希釈された精製融合タンパク質GST-NPI,GST-NPII,GST-NPIIIおよびGST (50 ng/well)で上塗りされた。ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１０％のスキムミルクでブロックした後、上塗りされたウェルは血清サンプル（５０ｍｌ部分標本）でインキュベートされ、これは二段階で希釈され、１：２０のブロッキング溶液で開始され、室温で１時間インキュベートされた。プレートはＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄され、室温で４５分間ブロッキング溶液内において１：３５００に希釈されたペルオキシターゼ接合ヤギ抗ヒトＩｇＧ(Sigma)でインキュベートされた。洗浄の後、基質溶液 (10 mlのMc Ilweine buffer pH 5.5 (100 mMのNa2HP04,40 mMのクエン酸), 10 mgのｏ−フェニレンジアミン(Sigma)、１０μｌの３０％Ｈ２０２）が各ウェルに添加され、暗い所で５から１０分間インキュベートされた。２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることにより反応が止められ、光学濃度が吸収について４９２ｎｍで測定された。陰性の抗原被覆ウェルのＯＤを対応するウェルのＯＤから引算することにより、調整ＯＤが計算された。
【０２１２】
実施例１４：陽性ヒト血清による組換発現したGST-、NPI、GST-NPII、およびGST-NPIIIのエピトープマッピング
ＮＰ特異血清抗体によって認識されたＮＰ上のエピトープを決定するために、実施例１３で記載されているプロトコルに従いＥＬＩＳＡが実行された。免疫沈澱法によって陽性であると確認された１５個の血清サンプルが用いられた。
【０２１３】
図１６に示されるように、抗ＮＰ血清抗体は、ＮＰの断片ＩＩＩ（アミノ酸３８４−５５８を含む）にあるエピトープを優先的に認識したが、少量の抗体は断片ＩＩ（アミノ酸１９８−３９１）にあるエピトープとも反応した。
【０２１４】
実施例１５：ＮＰ−ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ−２
核タンパク質（ＮＰ）特異血清Ａｂｓの検出は以下の方法によって行なわれた。９６−ウェルポリスチレンプレートは、一晩４℃で０．０５Ｍナトリウム炭酸塩−重炭酸塩バッファ（ｐＨ９．６）で希釈された、濃度６μｇ／ｍｌのＮＰ特異モノクローナル抗体Ｍ８７でコーティングされた。プレートは、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）でＰＢＳにて１０％のミルク（ウェル当たり２００μｌ）で１．５時間ブロックされ、後でブロッキング溶液において１：３００に希釈された細胞溶解物（ＬＣＭＶ  ＭＸで持続的に感染したＨｅＬａ細胞および感染していないＨｅＬａ細胞）で１時間インキュベートされた。平衡プレート上に、ヒト血清サンプルはブロッキング溶液において１：２０および１：６０に希釈された。希釈された血清サンプルのウェル当たり合計５０μｌがＮＰ飽和プレートに移され、１時間インキュベートされた。最後に、プレートはブロッキング溶液で１：３５０００に希釈されたＨＰＲ接合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異）Ａｂ（ＳＩＧＭＡ）で４５分間インキュベートされた。ＨＰＲはＯＰＤカラー反応によって検出され、これは５０μｌの2M H2S04を加えることによって止められた。光学濃度が吸収について４９２ｎｍで測定された。すべての工程は室温で行なわれた。各工程の間、プレートはＰＢＳ−Ｔで４回洗浄された。調整されたＯＤは、陰性の抗原被覆ウェルのＯＤを対応するウェルのＯＤから引算することにより、計算された。
【０２１５】
代替的に、濃度４μｇ／ｍｌで精製された組換ＬＣＭＶ  ＮＰが抗原として用いられた。
【０２１６】
適切な内部陽性および陰性コントロールを見つけるために、ヒト血清は免疫沈澱およびＮＰ特異モノクローナル抗体（実施例７参照）での後の免疫ブロッティングにより分析された。後で、血清の１つは陰性のコントロールとして選択され、別のものは後のテストの陽性コントロールとして選択された。免疫沈澱テストでは陰性であるとされた２５個の血清は後でＮＰ  ＥＬＩＳＡで分析され、得られた調整されたＯＤ値は、内部陽性コントロールのパーセントの正値性（ＰＰ）として表わされた。これは、２つの複製物の平均調製ＯＤ値を、陽性コントロールの４つの複製物の調整されたＯＤ値のメディアン値で割って、１００を掛けた計算によって得られた。ＥＬＩＳＡカットオフ値であって、陽性および陰性の血清サンプルのしきい値として働く値は、この２５個のサンプルプラス２つの標準偏差で得られた平均値ＰＰとして決定された。
【０２１７】
この方法を用いて、カットオフ値は４．２％であると決定され、これは以降の計算に用いられた。
【０２１８】
実施例１６：ＮＰ−ｉｇＧ  ＥＬＩＳＡ−２によるヒトサンプルにおける抗ＬＣＭＶ−ＮＰ抗体の検出
血清サンプルは以下から取得された：（ｉ）診断された原因のない自然流産の女性；（ii）満期妊娠の女性；および（iii）腎細胞癌（ＲＣＣ）腫瘍を持った腫瘍患者。ヒト血清の抗ＬＣＭＶ抗体は、実施例１５に記載されている条件下でテストされ、ＰＰ値が決定され、表３に示される。
【０２１９】
表３：自然流産を経験したヒト女性被験者における抗ＬＣＭＶ  ＮＰ抗体の検出
【０２２０】
【表３】
2014502848.tif 000006
【０２２１】
表３に示されるように、流産を経験した女性のＮＰ抗体の血清有病率は、コントロールに対して１２．１％高かった。表４に示されるように、ＲＣＣ腫瘍を持つ患者でもＮＰ抗体の非常に高い血清有病率が観察された。
【０２２２】
表４：ＲＣＣ腫瘍を持つ被験者における抗ＬＣＭＶ  ＮＰ抗体の検出
【０２２３】
【表４】
2014502848.tif 000007
【０２２４】
実施例１７：Ｈｉｓ−ＬＣＭＶ−ＮＰを発現した組換バキュロウイルスの生成
Ｈｉｓ−ＬＣＭＶ−ＮＰを発現した組換バキュロウイルスは、Bac-to-Bac(R) Baculovirus Expression System (Invitrogen)を用いて生成された。組換ドナーベクトルを構成するために、ＨｅＬａ／ＭＸ細胞からのｃＤＮＡが用いられた。開始コドンおよび終止コドンを有する完全なＮＰ遺伝子は以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅された：NPMXF1S5'-CCGAATTCATGTCTCTGTCCAAGGAAGTCA-3'(46-67) (SEQ ID NO: 85)およびNPMXF3A5'-CCTCGAGTTAGAGTGTCACAACATTTGGTC-3'(1722-1700) (SEQ ID NO:86)。プライマーは、それぞれＥｃｏＲＩおよびＸｈｏ  Ｉ限定部位（下線部分）で設計された。括弧内の数字はＭＸ株の公開されたＮＰ配列に対する場所を示す（ＧｅｎＢａｎｋ受領番号Ｙ１６３０８、Reiserova他２００１年）。
【０２２５】
ＰＣＲ反応は、遺伝子特異プライマーを用いて、Phusion High Fidelity PCR Master MIX (Thermo Scientific)で行なわれた。ＰＣＲプロトコルは、９８℃で２分間の後、以下が３５サイクル行われた：９８℃で３０秒の変性、５８℃で４０秒のアニーリング、および７２℃で２分の伸長、そして最後に７２℃で７分の伸長があった。増幅産物はＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを用いて消化され、pFastBAc HT Aベクトルにクローン化された。挿入されたＬＣＭＶ−ＮＰ  ＤＮＡはシーケンスされ、プロモータの下流の適切な配向において、元の配列と同じであることが確認された。確認された組換ドナープラスミド(pFastBAc HT-LCMV-NP) E. coli DHlOBac競合細胞に基質変形された。組換バクミドＤＮＡへの成功した転換は、ｐＵＣ／Ｍ１３および遺伝子特異プライマーの組合せを用いてＰＣＲで確認された。対象の遺伝子を含む組換バクミドＤＮＡは、ＳＦ９昆虫細胞の移入のために用いられた。最後に、His-LCMV-NPを過剰発現するバキュロウイルスクローンが３つの連続したプラーク精製の後得られた。
【０２２６】
実施例１８：Ｈｉｓ−ＬＣＭＶ−ＮＰの発現および精製
Ｈｉｓ−ＬＣＭＶ−ＮＰ発現する組換バキュロウイルスで感染したＳＦ９細胞は、２６℃で９６時間インキュベートされた。細胞は次に収穫されてＰＢＳで３回洗浄された。細胞はＰＢＳで１％のＮＰ４０で再度懸濁され、１５分間氷の上で放置され、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離された。ペレットは異なる濃度の尿素溶液で連続的に処理された。まず、ペレットはＰＢＳで１％のＮＰ４０の１Ｍ尿素で懸濁され、超音波処理され、８，０００ｒｐｍで５分間遠心分離された。次に、ペレットはＰＢＳで洗浄され、ＰＢＳ内で２Ｍの尿素で懸濁された。懸濁液が超音波処理されかつ遠心分離された後、ペレットはＰＢＳで洗浄され、ＰＢＳ内において８Ｍの尿素で懸濁された。懸濁液は超音波処理され、遠心分離され、上澄みはＬＣＭＶ−ＮＰ抗原として用いられた。コントロール抗原は、ＬＣＭＶ−ＮＰ遺伝子を含まないバキュロウイルスで感染したＳＦ９細胞から産出された。抗原のタンパク質濃度は、ブラッドフォードタンパク質アッセイ(Bio-Rad Laboratories)を用いて決定された。Ｈｉｓ−ＬＣＭＶ−ＮＰの発現および精製効能は、クーマシーブルーで染色された後、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析された（図１７参照）。
【０２２７】
実施例１９：組み換えＬＣＭＶ−ＧＰ１のクローン化および発現
ＭＸ株(GenBank受領番号EU195888, Tomaskova et al. 2008)の公開されたＧＰＣ配列に従うＧＰ１配列（アミノ酸１から２６５）に対応する配列は、以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅された：GPSBamHI 5'-TTGGATCCTGTCAAACTTTGTCCCA CACAAAG-3'(54-77) (SEQ ID NO: 87)およびGPlAEcoRI 5'-AGAATTCTCATCATCTAGTGAGGAACTTTGTCTTT TC-3' (863-840) (SEQ ID NO:88)。このように、BamHIおよびEcoRI制限サイト（下線部分）が導入された。ＰＣＲ反応は上記のプライマーおよびＧｏＴａｑ（登録商標）Flexi DNA Polymerase (Promega, Madison, WI, USA)を用いて行なわれた。９５℃で２分間の最初の変性の後、増幅プログラムは次のように設定された：９５℃で３０秒変性、６０℃で３０秒アニーリング、７２℃で４５秒の伸長が合計３５サイクル行なわれ、最後に７２℃で７分間行なわれた。ＰＣＲ産物はNucleoSpin Extract IIキットMacherey-Nagel)を用いて１％アガロースゲルで精製され、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼとインフレームで、ｐＧＸ−４Ｔ−１にクローン化された。ＧＳＴ融合タンパク質を産出するために、確認されたプラスミド構成（pGEX-4Tl-GP１として示される）は、E. coli DH5α競合細胞に形質転換され、３７℃で０．７５ｍＭのＩＰＴＧ(Sigma-Aldrich, USA, USA)で３時間誘起された。大腸菌の誘起培養物は、遠心分離でペレット化され、氷冷溶解バッファＳＴＥ(10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA in lx PBS)で再懸濁され、０．４ｍｇ／ｍｌの最終濃度のリゾチーム(Serva, Germany)で１５分間氷の上でインキュベートされた。細菌細胞（５×１５秒）の音波処理の前に、１．７％の最終濃度のＳＴＥにおいて１０％のSarcosyl(Sigma-Aldrich,USA)および0．５ｍＭの最終濃度の１ＭのＤＴＴ(Sigma-Aldrich,USA)が細胞懸濁液に加えられた。音波処理の後、１０％のTriton X-100 (AppliChem)がＳＴＥにおいて最終濃度2．５％に加えられ、氷の上で15分インキュベートされた。溶解されない材料は４℃で１５分間１０，０００ｒｐｍの遠心分離で除去された。誘起されたサンプルにおける融合タンパク質のイールドはSDS-PAGEで、およびＢＳＡの規定された濃度と比較した視認で決定された。
【０２２８】
実施例２０：ＧＰＬ−ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ
９６−ウェルポリスチレンプレートは約４μｇの組換ＧＳＴ−ＧＰＬおよび／またはＧＳＴ／ｍｌを含む溶解物で３７℃で一晩コートされた。その後、プレートは０．１％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ−T）でＰＢＳにおいて１０％のミルク（ウェル当たり２００μｌ）で１．５時間ブロックされた。平衡プレート上に、血清サンプルはブロッキング溶液内において１：２０で予め希釈され、2重の希釈系が行われた。ウェル当たり合計５０μｌの希釈された血清サンプルは、ＧＰＬ−およびＧＳＰ−飽和プレートに移され、１時間インキュベートされた。最後に、プレートはブロッキング溶液で１：３５０００に希釈されたヤギ抗ヒトIgG (Fc-specific) Ab (SIGMA)で４５分間インキュベートされた。ＨＰＲはＯＰＤカラー反応によって検出され、これは５０μｌの2M H2S04を加えることによって止められた。光学濃度が吸収について４９２ｎｍで測定された。すべての工程は室温で行なわれた。各工程の間、プレートはＰＢＳ−Ｔで４回洗浄された。調整されたＯＤは、陰性の抗原被覆ウェルのＯＤを対応するウェルのＯＤから引算することにより、計算された。
【０２２９】
実施例２１：ＬＣＭＶ検出のアッセイ
ＬＣＭＶの検出を示すために、以下のアッセイが行なわれた。
【０２３０】
ＭＸ株を用いたＬＣＭＶ検出
ＬＣＭＶ検出のために、蛍光検出システムに基づき二重のラベルが付けられたオリゴヌクレオチドプローブ(TaqMan)でリアルタイムＰＣＲが用いられた。ＬＣＭＶゲノムの２つの特異領域が増幅された：核タンパク質エンコード遺伝子（ＮＰ）の断片および糖たんぱく質エンコード遺伝子（ＧＰ）の断片。増幅はシングルプレックスフォーマット（ＮＰまたはＧＰ）およびデュプレックスフォーマット（ＮＰ＋ＧＰ）の両方で行なわれた。感染していないＨｅＬａ細胞のＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡおよび分子グレードウォータが陰性のコントロールとして含まれた。各ターゲットに対して、１％アガロースゲル上には１個のＰＣＲ産物の存在のみが確認された（図１８参照）。
【０２３１】
図１９Ａ−１９Ｂに示されるように、ＬＣＭＶはシングルプレックスフォーマットで検出された。図２０に示されるように、ＬＣＭＶはさらにデュプレックスフォーマットで検出された。各反応は独自のＮＰおよびＧＰヌクレオチド配列および２つのＴａｑＭａｎプローブ用に２組のＰＣＲプライマーを含んでおり、各々は２つの増幅産物の一方に特異的であり、異なって色が付いた蛍光団で標識が付けられた。ＨＥＸ標識ＴａｑＭａｎ（ＮＰに特異）およびＦＡＭ標識ＴａｑＭａｎの蛍光シグナルは、それぞれ緑色および灰色でプロットされた。
【０２３２】
ＡＲＭ株を用いたＬＣＭＶ検出
異なるＬＣＭＶ株の検出アッセイの容易性は、ＬＣＭＶ  ＡＲＭ株を用いてテストされた。図２１および図２２に示されるように、増幅産出物はシングルプレックスフォーマット（ＮＰまたはＧＰ）およびデュプレックスフォーマット（ＮＰ＋ＧＰ）の両方でうまく検出された。アッセイの安定性は、用いられたプローブによって覆われている領域下のオリゴヌクレオチドが一致していない存在下でも、同じプローブがアンプリコン検出に適しているので、確認された。プライマーおよびプローブ配列は、ＭＸ株の配列と完全に一致するよう設計されていた。ＭＸ株とＡＲＭ株との配列の違いは、ＮＰプローブ／ターゲット領域において４つの一致しないオリゴヌクレオチドと、ＧＰプローブ／ターゲット領域において２つの一致しないヌクレオチドとをもたらした。これにも係わらず、両方のＴａｑＭａｎプローブによって有効な増幅シグナルが生成された。陰性コントロールとしてグレードウォータが加えられた。
【０２３３】
実施例２２：ＬＣＭＶ検出用のアッセイの感度
ｑＰＣＲの分析的感度は、標準ウイルス株ＭＸの一連の希釈をテストすることにより分析された。健康な個人からの血液は、ＲＮＡ抽出を標準化するために、かつＰＣＲの分析的感度を検出するために、ＬＣＭＶ感染細胞の一連の希釈(１０５、１０３、１０、１、０．５、０．２５感染細胞)でスパイクされた。一連の希釈は、Dulbecco変調Eagle成長媒体で調整された。健康な血液のサンプルは、これらの希釈の各々でスパイクされた。健康な個人からの血液とグレードウォータが陰性のコントロールとして含まれた。
【０２３４】
希釈アッセイは、０．２５ＬＣＭＶ感染細胞の再現可能検出限界を示した（図２３Ａ−２３Ｄ参照）。
【０２３５】
実施例２３：ＬＣＭＶ  ＭＸ  ＮＰおよびＧＰ遺伝子発現の低酸素状態誘起上方制御
リアルタイムＰＣＲを用いて、ＬＣＭＶのＮＰおよびＧＰ遺伝子の発現における低酸素状態誘起変化が測定された。総ＲＮＡは、逆転換用に２４時間酸素正常状態または低酸素状態（２％）でインキュベートされた細胞から調製された。ＬＣＭＶ遺伝子の発現は、定量リアルタイムＰＣＲで決定された。折り目変化として表わされる、遺伝子発現の違いは、ＡＣＴＶ（β−アクチン）を内部コントロールとして用いた２Ｃｔ方法で計算された。各遺伝子に対して、折り目誘起は、酸素正常状態コントロールと比較して定められた。
【０２３６】
図２４に示されるように、低酸素状態は、同じ株の酸素正常状態コントロールと比較して、低酸素状態ＨｅＬａ−ＭＸ細胞におけるＮＰおよびＧＰ遺伝子の発現を著しく増加させた（図２１−図２２参照）。
【０２３７】
他の実施の形態
本発明は詳細な説明に合わせて記載されているが、前の説明は本発明を示すものであり、限定するものではなく、本発明は特許請求項の範囲によって規定される。他の局面、利点および変形は、特許請求項の範囲内にある。
【図２ｉ】
2014502848.tif 000008
【図２ｉｉ】
2014502848.tif 000009
【図２ｉｉｉ】
2014502848.tif 000010
【図２ｉｖ】
2014502848.tif 000011
【図２ｖ】
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【図２ｖｉ】
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【図３ｉ】
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【図３ｉｉ】
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【図３ｉｉｉ】
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【図３ｉｖ】
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【図３ｖ】
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【図３ｖｉ】
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【図４】
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【図５ｉ】
2014502848.tif 000021
【図５ｉｉ】
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【図６ｉ】
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【図６ｉｉ】
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【図７】
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【図１３】
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【図１４Ａ−１４Ｃ】
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【図１７】
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【図１８Ａ−１８Ｂ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
2014502848.tif 000034
【図１０Ｂ】
2014502848.tif 000035
【図１０Ｃ】
2014502848.tif 000036
【図１０Ｄ】
2014502848.tif 000037
【図１１Ｂ】
2014502848.tif 000038
【図１２Ａ】
2014502848.tif 000039
【図１２Ｃ】
2014502848.tif 000040
【図１５】
2014502848.tif 000041
【図１６】
2014502848.tif 000042
【図１９】
2014502848.tif 000043
【図２０】
2014502848.tif 000044
【図２１】
2014502848.tif 000045
【図２２】
2014502848.tif 000046
【図２３】
2014502848.tif 000047
【図２４】
2014502848.tif 000048
【配列表】
2014502848000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年9月6日(2013.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２３】
2014502848.tif 000049
【国際調査報告】
2014502848.tif 000050
2014502848.tif 000051
2014502848.tif 000052
2014502848.tif 000053