(57)【要約】  提供される足場は、自然のホモ二量体（対称）Ｆｃ分子により達成可能なものを越える、エフェクター機能を調整するのに関与する様々なＦｃ受容体の間の選択性並びに結果として生じる変異体Ｆｃヘテロ二量体の安定性及び純度の増大を達成するために、様々なドメイン（例えばＣＨ２及びＣＨ３）において非対称性の重鎖を有する。これらの新規な分子は、抗体が挙動する自然の方法を変化させるように設計され、治療薬における使用を見出す、不均一な構成成分の複合体を含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、安定性が増大したヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ３ドメインが、約７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、上記単離ヘテロ多量体。
【請求項２】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、ヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、Ｆｃガンマ受容体の選択的な結合を促進する非対称性のアミノ酸改変を含む変異体ＣＨ２ドメインをさらに含む、上記単離ヘテロ多量体。
【請求項３】
変異体ＣＨ２ドメインが、野生型ＣＨ２ドメインと比較して、ＦｃガンマＩＩＩａ受容体に選択的に結合する、請求項２に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項４】
変異体ＣＨ３ドメインが、約７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項２又は請求項３に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項５】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、野生型Ｆｃ領域に比べてＣＨ３ドメイン中にさらなるジスルフィド結合を含まない、請求項１から３までのいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項６】
約７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）がさらなるジスルフィド結合の非存在下におけるものであることを条件として、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、野生型Ｆｃ領域に比べて変異体ＣＨ３ドメイン中にさらなるジスルフィド結合を含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項７】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、野生型Ｆｃ領域に比べて、変異体ＣＨ３ドメイン中にさらなるジスルフィド結合を含み、変異体ＣＨ３ドメインが、約７７．５℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項１から３までのいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項８】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、約９０％を超える純度を有する、請求項１から３までのいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項９】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、約９５％以上の純度を有する、請求項１から３までのいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項１０】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、約９８％以上の純度を有する、請求項１から３までのいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項１１】
Ｔｍが、約７１℃以上である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項１２】
Ｔｍが、約７４℃以上である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項１３】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、約９８％以上の純度を有し、Ｔｍが、約７３℃である、請求項１から３までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１４】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、約９０％以上の純度を有し、Ｔｍが、約７５℃である、請求項１から３までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１５】
第１のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ａ及びＫ４０９Ｆを含む、請求項１に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項１６】
第１のＣＨ３ドメインポリペプチド又は第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０、又はＫ３９２位にさらなるアミノ酸改変を含む、請求項１５に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項１７】
Ｔ４１１位のアミノ酸改変が、Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、又はＴ４１１Ｗから選択される、請求項１６に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項１８】
Ｄ３９９位のアミノ酸改変が、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ、又はＤ３９９Ｋから選択される、請求項１６に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項１９】
Ｓ４００位のアミノ酸改変が、Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、又はＳ４００Ｋから選択される、請求項１６に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項２０】
Ｆ４０５位のアミノ酸改変が、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ、又はＦ４０５Ｗから選択される、請求項１６に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項２１】
Ｎ３９０位のアミノ酸改変が、Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ、又はＮ３９０Ｄから選択される、請求項１６に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項２２】
Ｋ３９２位のアミノ酸改変が、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ、又はＫ３９２Ｅから選択される、請求項１６に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項２３】
第１のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｖ及びＫ４０９Ｆを含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項２４】
第１のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ａ及びＫ４０９Ｆを含む、請求項１のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項２５】
第１のＣＨ３ドメインポリペプチド又は第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、さらなるアミノ酸改変Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ、及びＳ４００Ｒを含む、請求項２４に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項２６】
第１のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｄ３９９Ｒ、Ｓ４００Ｒ、及びＹ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ３９２Ｅ、及びＴ４１１Ｅを含む、請求項２４に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項２７】
変異体ＣＨ３ドメインが、約７４℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、ヘテロ二量体が、約９５％以上の純度を有する、請求項２４から２６までのいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項２８】
第１のＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｌ３５１及びＹ４０７位にアミノ酸改変を含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｔ３６６位のアミノ酸改変及びアミノ酸改変Ｋ４０９Ｆを含む、請求項１に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項２９】
Ｌ３５１位のアミノ酸改変が、Ｌ３５１Ｙ、Ｌ３５１Ｉ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｒ、又はＬ３５１Ｆから選択される、請求項２８に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項３０】
Ｙ４０７位のアミノ酸改変が、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｖ、又はＹ４０７Ｓから選択される、請求項２８に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項３１】
Ｔ３６６位のアミノ酸改変が、Ｔ３６６Ａ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６６Ｃ、Ｔ３６６Ｖ、又はＴ３６６Ｗから選択される、請求項２８に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項３２】
変異体ＣＨ３ドメインが、約７５℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、ヘテロ二量体が、約９０％以上の純度を有する、請求項２８から３１までのいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項３３】
第１のＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｆ４０５位のアミノ酸改変並びにアミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ及びＹ４０７Ｖを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３９４Ｗを含む、請求項１に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項３４】
第１のＣＨ３ドメインポリペプチド又は第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｋ３９２、Ｔ４１１、Ｔ３６６、Ｌ３６８、又はＳ４００位にアミノ酸改変を含む、請求項３３に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項３５】
Ｆ４０５位のアミノ酸改変が、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ、又はＦ４０５Ｗである、請求項３３に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項３６】
Ｋ３９２位のアミノ酸改変が、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ、又はＫ３９２Ｅである、請求項３４に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項３７】
Ｔ４１１位のアミノ酸改変が、Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、又はＴ４１１Ｗである、請求項３４に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項３８】
Ｓ４００位のアミノ酸改変が、Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、又はＳ４００Ｋである、請求項３４に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項３９】
Ｔ３６６位のアミノ酸改変が、Ｔ３６６Ａ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６６Ｃ、Ｔ３６６Ｖ、又はＴ３６６Ｗである、請求項３４に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項４０】
Ｌ３６８位のアミノ酸改変が、Ｌ３６８Ｄ、Ｌ３６８Ｒ、Ｌ３６８Ｔ、Ｌ３６８Ｍ、Ｌ３６８Ｖ、Ｌ３６８Ｆ、Ｌ３６８Ｓ、及びＬ３６８Ａである、請求項３４に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項４１】
第１のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３９４Ｗを含む、請求項１に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項４２】
第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｌ又はＴ３６６Ｉを含む、請求項４１に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項４３】
第１のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｍ、及びＴ３９４Ｗを含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項４４】
第１のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、及びＴ３９４Ｗを含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項４５】
第１のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｌ及びＴ３９４Ｗを含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項４６】
第１のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｉ及びＴ３９４Ｗを含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項４７】
変異体ＣＨ３ドメインが、表４において列挙される変異体から選択されるアミノ酸突然変異を含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項４８】
変異体ＣＨ３ドメインが、表６において列挙される変異体から選択されるアミノ酸突然変異を含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項４９】
変異体ＣＨ３ドメインが、表７において列挙される変異体から選択されるアミノ酸突然変異を含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項５０】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチド並びにアミノ酸改変Ｔ３６６Ａ及びＫ４０９Ｆを含む第２のＣＨ３ドメインポリペプチドを含む、上記単離ヘテロ多量体。
【請求項５１】
第１のＣＨ３ドメインポリペプチド又は第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０、又はＫ３９２位にさらなるアミノ酸改変を含む、請求項５０に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項５２】
Ｔ４１１位のアミノ酸改変が、Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、又はＴ４１１Ｗから選択される、請求項５１に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項５３】
Ｄ３９９位のアミノ酸改変が、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ、又はＤ３９９Ｋから選択される、請求項５１に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項５４】
Ｓ４００位のアミノ酸改変が、Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、又はＳ４００Ｋから選択される、請求項５１に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項５５】
Ｆ４０５位のアミノ酸改変が、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ、又はＦ４０５Ｗから選択される、請求項５１に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項５６】
Ｎ３９０位のアミノ酸改変が、Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ、又はＮ３９０Ｄから選択される、請求項５１に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項５７】
Ｋ３９２位のアミノ酸改変が、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ、又はＫ３９２Ｅから選択される、請求項５１に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項５８】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチド並びにアミノ酸改変Ｔ３６６Ｖ及びＫ４０９Ｆを含む第２のＣＨ３ドメインポリペプチドを含む、上記単離ヘテロ多量体。
【請求項５９】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸改変Ｙ４０７Ａを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチド並びにアミノ酸改変Ｔ３６６Ａ及びＫ４０９Ｆを含む第２のＣＨ３ドメインポリペプチドを含む、上記単離ヘテロ多量体。
【請求項６０】
第１のＣＨ３ドメインポリペプチド又は第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、さらなるアミノ酸改変Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ、及びＳ４００Ｒを含む、請求項５９に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項６１】
第１のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｄ３９９Ｒ、Ｓ４００Ｒ、及びＹ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ３９２Ｅ、及びＴ４１１Ｅを含む、請求項５９に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項６２】
変異体ＣＨ３ドメインが、約７４℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、ヘテロ二量体が、約９５％以上の純度を有する、請求項５９から６１までのいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項６３】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、Ｌ３５１位のアミノ酸改変及びアミノ酸改変Ｙ４０７Ａを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｔ３６６位のアミノ酸改変及びアミノ酸改変Ｋ４０９Ｆを含む、上記単離ヘテロ多量体。
【請求項６４】
Ｌ３５１位のアミノ酸改変が、Ｌ３５１Ｙ、Ｌ３５１Ｉ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｒ、又はＬ３５１Ｆから選択される、請求項６３に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項６５】
Ｙ４０７位のアミノ酸改変が、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｖ、又はＹ４０７Ｓから選択される、請求項６３に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項６６】
Ｔ３６６位のアミノ酸改変が、Ｔ３６６Ａ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６６Ｃ、Ｔ３６６Ｖ、又はＴ３６６Ｗから選択される、請求項６３に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項６７】
変異体ＣＨ３ドメインが、約７５℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、ヘテロ二量体が、約９０％以上の純度を有する、請求項６３から６６までのいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項６８】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、Ｆ４０５位のアミノ酸改変並びにアミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ及びＹ４０７Ｖを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３９４Ｗを含む、上記単離ヘテロ多量体。
【請求項６９】
第１のＣＨ３ドメインポリペプチド又は第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｋ３９２、Ｔ４１１、Ｔ３６６、Ｌ３６８、又はＳ４００位にアミノ酸改変を含む、請求項６８に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項７０】
Ｆ４０５位のアミノ酸改変が、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ、又はＦ４０５Ｗである、請求項６８に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項７１】
Ｋ３９２位のアミノ酸改変が、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ、又はＫ３９２Ｅである、請求項６９に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項７２】
Ｔ４１１位のアミノ酸改変が、Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、又はＴ４１１Ｗである、請求項６９に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項７３】
Ｓ４００位のアミノ酸改変が、Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、又はＳ４００Ｋである、請求項６９に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項７４】
Ｔ３６６位のアミノ酸改変が、Ｔ３６６Ａ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６６Ｃ、Ｔ３６６Ｖ、又はＴ３６６Ｗである、請求項６９に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項７５】
Ｌ３６８位のアミノ酸改変が、Ｌ３６８Ｄ、Ｌ３６８Ｒ、Ｌ３６８Ｔ、Ｌ３６８Ｍ、Ｌ３６８Ｖ、Ｌ３６８Ｆ、Ｌ３６８Ｓ、及びＬ３６８Ａである、請求項６９に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項７６】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３９４Ｗを含む、上記単離ヘテロ多量体。
【請求項７７】
第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｌ又はＴ３６６Ｉを含む、請求項７６に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項７８】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸改変Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｍ、及びＴ３９４Ｗを含む、上記単離ヘテロ多量体。
【請求項７９】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸改変Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、及びＴ３９４Ｗを含む、上記単離ヘテロ多量体。
【請求項８０】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸改変Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｌ及びＴ３９４Ｗを含む、上記単離ヘテロ多量体。
【請求項８１】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸改変Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｉ及びＴ３９４Ｗを含む、上記単離ヘテロ多量体。
【請求項８２】
二重特異性抗体である、請求項１から３まで、５０、５８、５９、６３、６８、７６、７８、７９、８０、又は８１のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項８３】
多重特異性抗体である、請求項１から３まで、５０、５８、５９、６３、６８、７６、７８、７９、８０、又は８１のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項８４】
請求項１から３まで、５０、５８、５９、６３、６８、７６、７８、７９、８０、又は８１のいずれか一項に記載のヘテロ多量体並びに薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項８５】
請求項１から３まで、５０、５８、５９、６３、６８、７６、７８、７９、８０、又は８１のいずれか一項に記載のヘテロ多量体をコードする核酸を含む宿主細胞。
【請求項８６】
少なくとも１つの治療用抗体を含む、請求項１から３まで、５０、５８、５９、６３、６８、７６、７８、７９、８０、又は８１のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項８７】
アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アダリムマブ、アレムツズマブ、アウログラブ（ａｕｒｏｇｒａｂ）、バピネオズマブ、バシリキシマブ、ベリムバブ（ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、ベバシズマブ、ブリアキヌマブ（ｂｒｉａｋｉｎｕｍａｂ）、カナキヌマブ（ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）、カツマキソマブ、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エファリズマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ、ルミリキシマブ、メポリズマブ、モタビズマブ（ｍｏｔａｖｉｚｕｍａｂ）、ムロモナブ、ミコグラブ（ｍｙｃｏｇｒａｂ）、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、レスリズマブ（ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ）、リツキシマブ、テプリズマブ（ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ）、トシリズマブ／アトリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、Ｐｒｏｘｉｎｉｕｍ（商標）、Ｒｅｎｃａｒｅｘ（商標）、ウステキヌマブ、及びザルツムマブからなる群から選択される少なくとも１つの治療用抗体を含む、請求項１に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項８８】
癌抗原によって特徴付けられる癌を有する患者における癌を治療する方法であって、治療有効量の請求項８６に記載のヘテロ多量体を前記患者に投与することを含む、上記方法。
【請求項８９】
免疫抗原によって特徴付けられる免疫障害を有する患者における免疫障害を治療する方法であって、治療有効量の請求項８６に記載のヘテロ多量体を前記患者に投与することを含む、上記方法。
【請求項９０】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、増加した安定性が増大したヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ３ドメインが、表１、表６、又は表７において列挙される変異体から選択される、上記単離ヘテロ多量体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１０年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６１／４１０，７４６号；２０１０年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／４２５，３７５号；２０１１年２月３日に出願された米国仮特許出願第６１／４３９，３４１号；２０１１年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／４７５，６１４号；２０１１年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／４９１，８４６号、及び２０１１年６月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／４９７，８６１号について、米国特許法第１１９（ｅ）条の下で利益を主張する。
【０００２】
配列表に関する説明
本出願は、２０１１年１１月４日に作成され、１５キロバイトのサイズを有するテキストファイルＺｙｍｅｗｏｒｋｓ  Ｖ８４４６７ＷＯ．ｔｘｔとして本出願と共に提出された配列表を参照により組み込む。
【０００３】
本開示は、一般に、ポリペプチドヘテロ二量体、その組成物、並びにそのようなポリペプチドヘテロ二量体を作製し、且つ使用するための方法を提供する。より具体的には、本発明は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む、熱安定性で、二重特異性を含む多重特異性の抗体に関する。
【背景技術】
【０００４】
二重特異性抗体は、２つの別個の異なる抗原（又は同じ抗原の異なるエピトープ）に同時に結合することができる抗体ベースの分子である。二重特異性抗体の１つの使用は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によってなどのように、腫瘍細胞の死滅の増強に、細胞傷害性免疫エフェクター細胞を再び方向付けるためのものであった。この状況において、二重特異性抗体の一方のアームは、腫瘍細胞上の抗原に結合し、他方は、エフェクター細胞上に発現される決定基に結合する。腫瘍細胞及びエフェクター細胞に架橋することによって、二重特異性抗体は、腫瘍細胞の近くにエフェクター細胞をもたらすだけでなく、同時に、それらの活性化を引き起こし、有効な腫瘍細胞死滅を導く。二重特異性抗体はまた、正常組織に対する有害な影響を最小限にするために、腫瘍組織中に化学療法剤又は放射線療法剤を高めるためにも使用されてきた。この状況において、二重特異性抗体の一方のアームは、破壊のために標的にされる細胞上に発現される抗原に結合し、他方のアームは、化学療法薬、放射性同位体、又は毒素を送達する。
【０００５】
二重特異性抗体の一般的な開発における主な障害は、臨床前及び臨床研究の両方にとって十分な品質及び量の物質を産生する難しさであった。
【０００６】
完全長二重特異性抗体の従来の産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアの同時発現に基づき、２つの鎖は、異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７〜５３９）。抗体分子のＦｃ部分が二量体化する本質的な傾向は、重鎖及び軽鎖の様々な組合せからなる、１０までの異なるＩｇＧ分子の複合体混合物の形成を導き、これらのうちの１つのみが、妥当な二重特異性構造を有する。アフィニティークロマトグラフィーステップによって通常行われる、妥当な分子の精製は、やや扱いにくく、産物収率は、低い。同様の手順は、ＷＯ９３／０８８２９及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０：３６５５〜３６５９において開示される。したがって、従来のハイブリドーマ技術を使用して、２つの異なる標的に結合するように選択された、２つのＦａｂアームを有する二重特異性抗体分子の産生は、興味深い［Ｓｅｇａｌ  ＤＭら（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２４８、１〜６］。三機能性抗体、Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂは、ラット／マウスクアドローマ由来の二重特異性ｍＡｂであり、この分子の精製は、プロテインＡカラムベースのクロマトグラフィー分離においてｐＨ依存性の溶出に基づいて達成される［Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ  Ｈ．ら（１９９５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５５、２１９〜２２５］。
【０００７】
二重特異性抗体産生のための他の従来の方法は、異なる特異性を有する２つの抗体又はそれらの断片の化学的なコンジュゲーションである。しかしながら、この方法もまた、複雑であり、化学修飾プロセスは、抗体を不活性化し得る又は凝集を促進し得る。望ましくない産物からの精製が困難なままであるので、二重特異性抗体の結果として生じる低収率及び不十分な品質は、このプロセスを、臨床開発にとって必要な大規模生産にとって不適当なものにしてしまう。さらに、これらの分子は、従来の抗体のコンフォメーションを維持しない可能性がある。
【０００８】
最近、様々なヘテロ二量体化技術が、二重特異性抗体の産生を改善するために使用されてきた。しかしながら、ｓｃＦｖドメインへのＪｕｎ／Ｆｏｓコイルドコイルのような単一のヘテロ二量体化ドメインの融合は、ホモ及びヘテロ二量体の混合物を導き、リフォールディングによって構築される必要がある（ｄｅ  Ｋｒｕｉｆ及びＬｏｇｔｅｎｂｅｒｇ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７６３０〜４、１９９６）。抗体全体へのｓｃＦｖ断片の融合もまた、二量体化手段として使用されてきた（Ｃｏｌｏｍａ及びＭｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１５９〜６３、１９９７）。しかしながら、そのような融合は、固形組織浸透能力が不十分な、大きな分子をもたらす。２つのｓｃＦｖ断片の融合もまた、二重特異性タンパク質を生成するためにともに使用されてきた（例えば、Ｍｉｃｒｏｍｅｔ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤによるＢＩＴＥ（登録商標）抗体、米国特許第７，６３５，４７２号）。しかしながら、そのようなタンパク質は、Ｆｃ領域を含有せず、したがって、Ｆｃ領域を介してのそれらの活性の操作を可能にしない。さらに、これらのタンパク質は、小さく（約５５ｋＤａ）、したがって、血清中で比較的短い半減期を有する。
【０００９】
他のヘテロ二量体化技術において、二重特異性抗体は、一方のアームにおける第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖及び他方のアームにおけるハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペア（第２の結合特異性をもたらす）から構成される。二重特異性分子の半分のみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在が、分離の容易な方法を提供するので、この非対称構造は、不要な免疫グロブリン鎖の組合せからの所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることが分かった。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０において開示される。二重特異性抗体を生成するためのさらなる詳細については、例えばＳｕｒｅｓｈら、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１：２１０を参照されたい。
【００１０】
ＷＯ９６／２７０１１において記載される他のアプローチによれば、抗体分子のペアは、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大限にするために操作することができる。この方法において、第１の抗体分子のＣＨ３境界面由来の１つ又は複数の小さなアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と交換される。大きな側鎖（単数又は複数）と同一の又は同様のサイズの代償性の「空洞」は、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えばアラニン又はトレオニン）と交換することによって第２の抗体分子の境界面上に生じる。これは、ホモ二量体などのような他の不要な最終産物に対してヘテロ二量体の収率を増大させるためのメカニズムをもたらす［ＵＳ００５７３１１６８Ａ、ＵＳ００７１８３０７６Ｂ２、Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ、Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ、Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １９９６年７月；９（７）：６１７〜２１；Ａｔｗｅｌｌ  Ｓ、Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ、Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ、Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９９７年７月４日；２７０（１）：２６〜３５］。Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ及び共同研究者［Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  Ｋ．ら（２０１０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８５、１９６３７〜４６］は、最近、選択的なヘテロ二量体化の目的を達成するために相補的な静電設計戦略を用いた。Ｄａｖｉｓ及び共同研究者［Ｄａｖｉｓ，  ＪＨ．ら（２０１０）Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ；２３（４）：１９５〜２０２］は、ヒトＩｇＡ及びＩｇＧ  ＣＨ３配列の互い違いのセグメントを含む鎖交換操作ドメイン（ｓｔｒａｎｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）（ＳＥＥＤ）を使用して、ＣＨ３ドメインを設計し、これらは、優先的に、ヘテロ二量体の形態で結合する。しかしながら、これらの技術はすべて、親分子又は野生型分子よりも著しく安定していないヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む抗体をもたらす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そのため、安定性及び純度が増大したヘテロ二量体を選択するように改変された、代替の多重特異性変異体Ｆｃヘテロ二量体、特に変異体ＣＨ３ドメインについての当技術分野における必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一態様によれば、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、ヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、Ｆｃガンマ受容体の選択的な結合を促進する非対称性のアミノ酸改変を含む変異体ＣＨ２ドメインをさらに含む、単離ヘテロ多量体が提供される。一実施形態では、変異体ＣＨ２ドメインが、野生型ＣＨ２ドメインと比較して、ＦｃガンマＩＩＩａ受容体に選択的に結合する。一実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、約７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する。
【００１３】
他の態様では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、安定性が増大したヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ３ドメインが、約７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、単離ヘテロ多量体が提供される。一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、野生型Ｆｃ領域に比べてＣＨ３ドメイン中にさらなるジスルフィド結合を含まず、より具体的には、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、野生型Ｆｃ領域に比べてＣＨ３ドメイン中にさらなるジスルフィド結合を含まない。代替の実施形態では、約７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）がさらなるジスルフィド結合の非存在下におけるものであることを条件として、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、野生型Ｆｃ領域に比べて変異体ＣＨ３ドメイン中にさらなるジスルフィド結合を含む。さらに他の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、野生型Ｆｃ領域に比べて変異体ＣＨ３ドメイン中にさらなるジスルフィド結合を含み、変異体ＣＨ３ドメインが、約７７．５℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する。
【００１４】
一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、安定性が増大したヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ３ドメインが、約７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、且つヘテロ二量体Ｆｃ領域が、約９０％を超える純度を有する又はヘテロ二量体Ｆｃ領域が、約９５％以上の純度を有する又はヘテロ二量体Ｆｃ領域が、約９８％以上の純度を有する、単離ヘテロ多量体が提供される。
【００１５】
一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、安定性が増大したヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ３ドメインが、約７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する又はＴｍが、約７１℃以上である又はＴｍが、約７４℃以上である、単離ヘテロ多量体も提供される。他の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、約９８％以上の純度を有し、且つＴｍが、約７３℃である又はヘテロ二量体Ｆｃ領域が、約９０％以上の純度を有し、且つＴｍが、約７５℃である。
【００１６】
ある実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチド並びにアミノ酸改変Ｔ３６６Ａ及びＫ４０９Ｆを含む第２のＣＨ３ドメインポリペプチドを含む、単離ヘテロ多量体が提供される。一態様では、第１のＣＨ３ドメインポリペプチド又は第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０、又はＫ３９２位にさらなるアミノ酸改変を含む。Ｔ４１１位のアミノ酸改変は、Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、又はＴ４１１Ｗから選択される。Ｄ３９９位のアミノ酸改変は、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ、又はＤ３９９Ｋから選択される。Ｓ４００位のアミノ酸改変は、Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、又はＳ４００Ｋから選択される。Ｆ４０５位のアミノ酸改変は、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ、又はＦ４０５Ｗから選択される。Ｎ３９０位のアミノ酸改変は、Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ、又はＮ３９０Ｄから選択される。Ｋ３９２位のアミノ酸改変は、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ、又はＫ３９２Ｅから選択される。
【００１７】
ある実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチド並びにアミノ酸改変Ｔ３６６Ｖ及びＫ４０９Ｆを含む第２のＣＨ３ドメインポリペプチドを含む、単離ヘテロ多量体が提供される。
【００１８】
他の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸改変Ｙ４０７Ａを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチド並びにアミノ酸改変Ｔ３６６Ａ及びＫ４０９Ｆを含む第２のＣＨ３ドメインポリペプチドを含む、単離ヘテロ多量体が提供される。一態様では、第１のＣＨ３ドメインポリペプチド又は第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、さらなるアミノ酸改変Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ、及びＳ４００Ｒを含む。他の態様では、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｄ３９９Ｒ、Ｓ４００Ｒ、及びＹ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ３９２Ｅ、及びＴ４１１Ｅを含む。さらなる実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、約７４℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、ヘテロ二量体が、約９５％以上の純度を有する。
【００１９】
他の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、Ｌ３５１位のアミノ酸改変及びアミノ酸改変Ｙ４０７Ａを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、Ｔ３６６位のアミノ酸改変及びアミノ酸改変Ｋ４０９Ｆを含む、単離ヘテロ多量体が提供される。一態様では、Ｌ３５１位のアミノ酸改変が、Ｌ３５１Ｙ、Ｌ３５１Ｉ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｒ、又はＬ３５１Ｆから選択される。他の態様では、Ｙ４０７位のアミノ酸改変が、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｖ、又はＹ４０７Ｓから選択される。さらに他の態様では、Ｔ３６６位のアミノ酸改変が、Ｔ３６６Ａ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６６Ｃ、Ｔ３６６Ｖ、又はＴ３６６Ｗから選択される。一実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、約７５℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、ヘテロ二量体が、約９０％以上の純度を有する。
【００２０】
他の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、Ｆ４０５位のアミノ酸改変並びにアミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ及びＹ４０７Ｖを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３９４Ｗを含む、単離ヘテロ多量体が提供される。一態様では、第１のＣＨ３ドメインポリペプチド又は第２のＣＨ３ドメインポリペプチドは、Ｋ３９２、Ｔ４１１、Ｔ３６６、Ｌ３６８、又はＳ４００位にアミノ酸改変を含む。Ｆ４０５位のアミノ酸改変は、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ、又はＦ４０５Ｗである。Ｋ３９２位のアミノ酸改変は、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ、又はＫ３９２Ｅである。Ｔ４１１位のアミノ酸改変は、Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、又はＴ４１１Ｗである。Ｓ４００位のアミノ酸改変は、Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、又はＳ４００Ｋである。Ｔ３６６位のアミノ酸改変は、Ｔ３６６Ａ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６６Ｃ、Ｔ３６６Ｖ、又はＴ３６６Ｗである。Ｌ３６８位のアミノ酸改変は、Ｌ３６８Ｄ、Ｌ３６８Ｒ、Ｌ３６８Ｔ、Ｌ３６８Ｍ、Ｌ３６８Ｖ、Ｌ３６８Ｆ、Ｌ３６８Ｓ、及びＬ３６８Ａである。
【００２１】
他の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３９４Ｗを含む、単離ヘテロ多量体が提供される。一態様では、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドは、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｌ又はＴ３６６Ｉを含む。
【００２２】
さらに他の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸改変Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｍ、及びＴ３９４Ｗを含む、単離ヘテロ多量体が提供される。
【００２３】
ある実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸改変Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、及びＴ３９４Ｗを含む、単離ヘテロ多量体が提供される。
【００２４】
他の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸改変Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｌ及びＴ３９４Ｗを含む、単離ヘテロ多量体が提供される。
【００２５】
他の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、アミノ酸改変Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖを含む第１のＣＨ３ドメインポリペプチドを含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｉ及びＴ３９４Ｗを含む、単離ヘテロ多量体が提供される。
【００２６】
ヘテロ多量体のある実施形態では、二重特異性抗体又は多重特異性抗体が、提供される。
【００２７】
他の実施形態では、本発明のヘテロ多量体及び薬学的に許容される担体を含む組成物が、提供される。
【００２８】
他の実施形態では、本発明のヘテロ多量体をコードする核酸を含む宿主細胞が、提供される。
【００２９】
ある実施形態では、少なくとも１つの治療用抗体を含むヘテロ多量体が、提供される。一態様では、治療用抗体は、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アダリムマブ、アレムツズマブ、アウログラブ（ａｕｒｏｇｒａｂ）、バピネオズマブ、バシリキシマブ、ベリムバブ（ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、ベバシズマブ、ブリアキヌマブ（ｂｒｉａｋｉｎｕｍａｂ）、カナキヌマブ（ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）、カツマキソマブ、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エファリズマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ、ルミリキシマブ、メポリズマブ、モタビズマブ（ｍｏｔａｖｉｚｕｍａｂ）、ムロモナブ、ミコグラブ（ｍｙｃｏｇｒａｂ）、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、レスリズマブ（ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ）、リツキシマブ、テプリズマブ（ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ）、トシリズマブ／アトリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、Ｐｒｏｘｉｎｉｕｍ（商標）、Ｒｅｎｃａｒｅｘ（商標）、ウステキヌマブ、及びザルツムマブからなる群から選択される。
【００３０】
本発明のヘテロ多量体の他の実施形態では、癌抗原によって特徴付けられる癌を有する患者における癌を治療する方法であって、治療有効量のヘテロ多量体を当該患者に投与することを含む、方法が提供される。
【００３１】
本発明のヘテロ多量体の他の実施形態では、免疫抗原によって特徴付けられる免疫障害を有する患者における免疫障害を治療する方法であって、治療有効量のヘテロ多量体を当該患者に投与することを含む、方法が提供される。
【００３２】
さらに他の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、安定性が増大したヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ３ドメインが、表１、表６、又は表７において列挙される変異体から選択される、単離ヘテロ多量体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＣＨ３（上）、ＣＨ２（中央）及び受容体領域を示す野生型抗体の３−Ｄ構造の図である。ＣＨ３の標的領域の２つの領域、領域１及び領域２を示す右手側は、左手側の点線の長方形を拡大したものである。
【図２】３６８位の野生型残基を示す３−Ｄ表示の図である。
【図３】突然変異した３６８位を示す領域１の３−Ｄ表示の図である。
【図４】領域２中のさらなる突然変異の３−Ｄ表示の図である。
【図５】最初の３つの変異体ＡＺ１、ＡＺ２及びＡＺ３に関するクラッシュスコア、境界面積差、パッキング差、静電エネルギー差及び全体の「親和性スコア」のコンピューター計算の表である。
【図６】変異体ＡＺ１の「上に構築された」変異体ＡＺ２及びＡＺ３を示す３−Ｄ画像を示す図である。
【図７】ＡＺ２及びＡＺ３変異体の３−Ｄ表示を示す図である。
【図８】図５と同様であるが、ＡＺ１、ＡＺ２及びＡＺ３ヘテロ二量体、並びにホモ二量体に関する表である。親和性スコアはホモ二量体には適さないため、ホモ二量体のその側面について示すスコアはない。
【図９】野生型（左）及び突然変異したＡＺ４（右側）の３−Ｄ表示を図示したものである。
【図１０】ＡＺ４ヘテロ二量体及びホモ二量体のコンピューター計算を示す図５と同様の表である。
【図１１】ＣＨ３変異体ＡＺ５（左）及びＡＺ６（右）を図示したものである。
【図１２】ＡＺ４、ＡＺ５及びＡＺ６に関するコンピューターによるデータを示す図５について記載された表である。
【図１３】ヘテロ二量体手法を用いて受容体領域での結合特性の可能性を図示したものと共に、左側に抗体の３−Ｄ表示を図示したものである。
【図１４】ＩｇＧ分子の略図である。
【図１５】Ｆｃγ受容体の複数の配列アラインメントを示す図である。Ｇｅｎｅｂａｎｋ／Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＩＤ：ＦｃγＲＩＩＡ（ｓｐ  Ｐ１２３１８）、ＦｃγＲＩＩＢ（ｓｐ  Ｐ３１９９４）、ＦｃγＲＩＩＣ（ｇｉ  １２６１１６５９２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ｓｐ  Ｐ０８６３７）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ｓｐ  Ｏ７５０１５）。
【図１６】Ｆｃ−ＦｃγＲＩＩＩｂ複合体［ＰＤＢ  ＩＤ：１Ｔ８３、Ｒａｄａｅｖ  ＆  Ｓｕｎ］の結晶構造の略図である。Ｆｃ及びＦｃγ受容体の１：１複合体が、Ｆｃの２つの鎖とＦｃγＲとの間の非対称的接触と共に観察される。
【図１７】非対称性Ｆｃ足場に基づく選択的多機能分子：非対称性Ｆｃ足場及び非対称性Ｆｃ単量体ＩｇＧアームの略図である。
【図１８】非対称性Ｆｃ足場に基づく選択的多機能分子：非対称性Ｆｃ−一特異的ＩｇＧアーム及び非対称性Ｆｃ−二特異的ＩｇＧアーム（共通の軽鎖）の略図である。
【図１９】非対称性Ｆｃ足場に基づく選択的多機能分子の略図である。非対称性Ｆｃ−二特異的ＩｇＧアーム及び毒素などの機能的分子。
【図２０】非対称性Ｆｃ足場に基づく選択的多機能分子：非対称性Ｆｃ−単一ｓｃＦｖアーム及び非対称性Ｆｃ−二特異的ｓｃＦｖアームの略図である。
【図２１】非対称性Ｆｃ足場に基づく選択的多機能分子：非対称性Ｆｃ−三特異的ｓｃＦｖアーム及び非対称性Ｆｃ−四特異的ｓｃＦｖアームの略図である。
【図２２】より良好なＦｃγＲ選択性のためのＦｃのある面上での突然変異の非対称的設計が、ＦｃγＲ相互作用のための生産側及び野生型様相互作用に関する非生産面を導入することを示す図である。Ｆｃの非生産面上に突然変異を導入してＦｃＲとの相互作用を遮断し、生産面上でのみ相互作用するようにＦｃのバイアス極性を導入することができる。
【図２３】野生型ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列を示す図である。
【図２４】以下に詳細に記載される正及び負の設計戦略を組み合わせるＦｃヘテロ二量体設計の反復プロセスを示す図である。
【図２５Ａ】ヘテロ二量体の純度を決定するのに用いられたｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを示す図である。このアッセイは、異なる分子量の２つのＦｃ重鎖を有する完全長一特異的抗体足場に基づくものである；重鎖ＡはＣ末端のＨｉｓＴａｇ（Ｈｉｓ）を有し、重鎖ＢはＣ末端の切断可能なｍＲＦＰ  Ｔａｇ（ＲＦＰ）を有する。２つの重鎖Ａ（Ｈｉｓ）及びＢ（ＲＦＰ）は、固定量の軽鎖と一緒に異なる相対比で発現され、異なる分子量を有する３つの可能な二量体種：ａ）ホモ二量体鎖Ａ（Ｈｉｓ）／鎖Ａ（Ｈｉｓ）（約１５０ｋＤａ）；ｂ）ヘテロ二量体鎖Ａ（Ｈｉｓ）／鎖Ｂ（ＲＦＰ）（約１７５ｋＤａ）；ｃ）ホモ二量体鎖Ｂ（ＲＦＰ）／鎖Ｂ（ＲＦＰ）（約２００ｋＤａ）を生じる。発現後、例２に記載のように、ヘテロ二量体と２つのホモ二量体の比率は、分子量による３つの二量体種の分離を可能にする非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルはクマシーブリリアントブルーで染色した。  試験した変異体はＷＴ鎖Ａ（Ｈｉｓ）のみ；ＷＴ鎖Ｂ（ＲＦＰ）のみ；ＷＴ鎖（Ｈｉｓ）及び鎖Ｂ（ＲＦＰ）；９５％を超える報告されたヘテロ二量体純度を有する対照１鎖Ａ（Ｈｉｓ）及び鎖Ｂ（ＲＦＰ）であった。二量体のバンドの組成を、上記で例示されたようなＩｇＧ−Ｆｃ（抗Ｆｃ）、ｍＲＦＰ  Ｔａｇ（抗ｍＲＦＰ）及びＨｉｓＴａｇ（抗Ｈｉｓ）に対する抗体を用いるウェスタンブロットによって検証した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｈｉｓ／Ｈｉｓホモ二量体の単一のバンド、Ｈｉｓ／ＲＦＰヘテロ二量体の二重バンド及びＲＦＰホモ二量体の多重バンドを示す。多重バンドはｍＲＦＰ  Ｔａｇのアーチファクトであり、Ｆｃヘテロ二量体の物理特性に影響しないことが確認された。
【図２５Ｂ】ヘテロ二量体の純度を決定するのに用いられたｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを示す図である。このアッセイは、異なる分子量の２つのＦｃ重鎖を有する完全長一特異的抗体足場に基づくものである；重鎖ＡはＣ末端のＨｉｓＴａｇ（Ｈｉｓ）を有し、重鎖ＢはＣ末端の切断可能なｍＲＦＰ  Ｔａｇ（ＲＦＰ）を有する。２つの重鎖Ａ（Ｈｉｓ）及びＢ（ＲＦＰ）は、固定量の軽鎖と一緒に異なる相対比で発現され、異なる分子量を有する３つの可能な二量体種：ａ）ホモ二量体鎖Ａ（Ｈｉｓ）／鎖Ａ（Ｈｉｓ）（約１５０ｋＤａ）；ｂ）ヘテロ二量体鎖Ａ（Ｈｉｓ）／鎖Ｂ（ＲＦＰ）（約１７５ｋＤａ）；ｃ）ホモ二量体鎖Ｂ（ＲＦＰ）／鎖Ｂ（ＲＦＰ）（約２００ｋＤａ）を生じる。発現後、例２に記載のように、ヘテロ二量体対２つのホモ二量体の比率は、分子量による３つの二量体種の分離を可能にする非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルはクマシーブリリアントブルーで染色した。  ＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイを、対照として公開されたＦｃヘテロ二量体変異体対照１〜４を用いて検証した（表Ａを参照されたい）。変異体は異なる相対比の鎖Ａ（Ｈｉｓ）対鎖Ｂ（ＲＦＰ）で発現された：具体的には、それぞれ、比１：３は、２５％、１０％、６５％のＬＣ、ＨＣ＿Ｈｉｓ、ＨＣ＿ｍＲＦＰ比に等しい；比１：１は２５％、２０％、５５％及び比３：１は２５％、４０％、３５％に等しい（鎖Ａ（Ｈｉｓ）と鎖Ｂ（ＲＦＰ）の見かけの１：１の発現はＷＴ  Ｆｃについて２０％／５５％（Ｈｉｓ／ＲＦＰ）に近いと決定された）。
【図２５Ｃ】ヘテロ二量体の純度を決定するのに用いられたｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを示す図である。このアッセイは、異なる分子量の２つのＦｃ重鎖を有する完全長一特異的抗体足場に基づくものである；重鎖ＡはＣ末端のＨｉｓＴａｇ（Ｈｉｓ）を有し、重鎖ＢはＣ末端の切断可能なｍＲＦＰ  Ｔａｇ（ＲＦＰ）を有する。２つの重鎖Ａ（Ｈｉｓ）及びＢ（ＲＦＰ）は、固定量の軽鎖と一緒に異なる相対比で発現され、異なる分子量を有する３つの可能な二量体種：ａ）ホモ二量体鎖Ａ（Ｈｉｓ）／鎖Ａ（Ｈｉｓ）（約１５０ｋＤａ）；ｂ）ヘテロ二量体鎖Ａ（Ｈｉｓ）／鎖Ｂ（ＲＦＰ）（約１７５ｋＤａ）；ｃ）ホモ二量体鎖Ｂ（ＲＦＰ）／鎖Ｂ（ＲＦＰ）（約２００ｋＤａ）を生じる。発現後、例２に記載のように、ヘテロ二量体対２つのホモ二量体の比率は、分子量による３つの二量体種の分離を可能にする非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルはクマシーブリリアントブルーで染色した。  足場１変異体のヘテロ二量体純度を決定するための非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイを示す。Ｆｃ変異体は鎖Ａ（Ｈｉｓ）対鎖Ｂ（ＲＦＰ）の異なる相対比で発現され、図２に記載の非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。具体的には、それぞれ、比１：３は２５％、１０％、６５％のＬＣ、ＨＣ＿Ｈｉｓ、ＨＣ＿ｍＲＦＰ比に等しい；比１：１は２５％、２０％、５５％及び比３：１は２５％、４０％、３５％に等しい（鎖Ａ（Ｈｉｓ）と鎖Ｂ（ＲＦＰ）の見かけの１：１の発現はＷＴ  Ｆｃについて２０％／５５％（Ｈｉｓ／ＲＦＰ）に近いと決定された。
【図２６Ａ】特定の比の鎖Ａ（Ｈｉｓ）対鎖Ｂ（ＲＦＰ）で発現され（表２を参照されたい）、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製され、図２５に記載のような非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析されたＦｃヘテロ二量体変異体を示す図である。  異なる変異体をどのようにＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果の目視に基づいて純度のカテゴリーに入れたかを示す。比較のために、等量のプロテインＡ精製された生成物をゲル上に載せた。非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づくこの純度の定義は、選択された変異体に関するＬＣ／ＭＳによって確認された（図２８を参照されたい）。
【図２６Ｂ】特定の比の鎖Ａ（Ｈｉｓ）対鎖Ｂ（ＲＦＰ）で発現され（表２を参照されたい）、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製され、図２５に記載のような非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析されたＦｃヘテロ二量体変異体を示す図である。  足場１及び２の選択されたプロテインＡ精製されたヘテロ二量体変異体（ＡＺ９４、ＡＺ８６、ＡＺ７０、ＡＺ３３及びＡＺ３４）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果の例である。
【図２７Ａ】２つの独立した方法を用いた、ＣＨ３−ＣＨ３ドメインの融解温度を決定するためのＤＳＣ分析を例示する図である。  サーモグラムを４つの独立した非２状態遷移に適合させ、最適化したところ、約７２℃（ＣＨ２）及び約８２℃（Ｆａｂ）のハーセプチンに関して報告された文献の値に近いＣＨ２及びＦａｂ遷移の値が得られた。
【図２７Ｂ】２つの独立した方法を用いた、ＣＨ３−ＣＨ３ドメインの融解温度を決定するためのＤＳＣ分析を例示する図である。  ヘテロ二量体変異体の正規化され、基準補正されたサーモグラムをＷＴから差し引いたところ、ＣＨ３遷移についてのみ正及び負のピーク差が得られた。
【図２８】例２に記載された変異体例ＡＺ７０のＬＣ／ＭＳ分析を示す図である。グリコシル化されたヘテロ二量体及びホモ二量体の予想される（計算上の平均）質量を示す。ヘテロ二量体質量と一致する領域はグリシンの喪失（−５７Ｄａ）及び１個又は２個のヘキソースの付加（それぞれ＋１６２Ｄａ及び＋３２４Ｄａ）に対応する主要なピークを含有する。ヘテロ二量体純度は、いずれかのホモ二量体に対応する有意なピークが存在しない場合、９０％を超えるものとして分類される。
【図２９】ＷＴ  Ｆｃ（図２９Ａ）；ＡＺ６（図２９Ｂ）；ＡＺ３３（図２９Ｃ）；ＡＺ１９（図２９Ｄ）のＣＨ３境界面を示す図である。詳細な説明の節に記載される包括的コンピューター分析、及び変異体とＷＴとの比較により、初期のＡＺ３３ヘテロ二量体のＷＴより低い安定性の理由の１つがＹ４０７及びＴ３６６のコア相互作用／パッキングの喪失であることが示された。初期のＡＺ３３は、図２９Ｂに示される通りこの疎水性コアにおいて最適でないパッキングを示し、これは、この領域、特にＴ３６６での最適化がＡＺ３３の安定性を改善することを示唆している。これはＴ３６６Ｉ及びＴ３６６Ｌと共に図２９Ｃ及び図２９Ｄに例示されている。実験データはこの構造分析と相関し、Ｔ３６６ＬがＴｍの最も大きい改善をもたらすことを示している。例５を参照されたい。
【図３０】初期の足場１変異体ＡＺ８で例示された、コンフォメーション動力学分析の有用性及び重要性を示す図である。コンピューターによる突然変異誘発後の構造（ＷＴに近い骨格コンフォメーション）を、５０ｎｓ分子動力学シミュレーション分析の代表的構造と重ね合わせる。本図面は、ＡＺ８変異体と、同様に溶媒に対して疎水性コアを曝露させ、ＡＺ８ヘテロ二量体の安定性の低下を引き起こすＷＴとのループ領域Ｄ３９９〜Ｓ４００における大きなコンフォメーションの相違を強調する。
【図３１】包括的コンピューター分析及びＭＤシミュレーションからの情報を、記載の正の設計戦略において用いた方法を示す図である。図３０に示される通り、ＡＺ８のＷＴより低い安定性の理由の１つは、ループ３９９〜４００の４０９との弱くなった相互作用であり、これは主にＦ４０５パッキング相互作用の喪失に起因する（図３１Ａ（ＷＴ）と図３１Ｂ（ＡＺ８）との比較を参照されたい）。正の設計戦略の１つは、３９９〜４００のループコンフォメーションを安定化させるための領域の疎水性パッキングの最適化であった。これは、図３１Ｃに示されるＫ３９２Ｍ突然変異によって達成された。図３１Ｃは、７４℃のＴｍを有するヘテロ二量体ＡＺ３３と、６８℃の初期の負の設計の変異体ＡＺ８を表す。
【図３２】分子動力学軌道の主成分分析を用いて観察されたＦｃ分子の動力学を示す図である。図３２Ａは、参照としてＦｃ構造の骨格トレースを示す。図３２Ｂ及びＣは、Ｆｃ構造における運動のトップ２の基本モードに沿って観察された動力学のオーバーレイを表す。鎖Ａ及びＢのＣＨ２ドメインは、互いと比べて有意な開閉運動を示すが、ＣＨ３ドメインは比較的硬直的である。ＣＨ３境界面での突然変異は、ＣＨ２ドメインにおけるこの開閉運動の相対的可撓性及び動力学に影響する。
【図３３】２つの足場２変異体とＷＴとの疎水性コアパッキングを示す図である。図３３Ａ（ＷＴ  Ｆｃ）；図３３Ｂ（ＡＺ６３）；及び図３３Ｃ（ＡＺ７０）。初期足場２変異体の包括的コンピューター分析は、Ｙ４０７−Ｔ３６６のコアＷＴ相互作用の喪失が初期足場２変異体のＷＴより低い安定性の理由の１つであることを示唆した。Ｙ４０７−Ｔ３６６の喪失は、突然変異Ｋ４０９Ｆによって一部相殺されるが、図３３Ｂに示されるように、特にＴ３６６Ａ突然変異は疎水性コア中に空洞を残し、変異体対ＷＴを脱安定化する。図３３Ｃ中のＦｃ変異体ＡＺ７０により示されるように、さらなる突然変異Ｔ３６６Ｖ＿Ｌ３５１Ｙによるこの疎水性コアの標的化が成功していることが分かった；ＡＺ７０は７５．５℃の実験的に決定されたＴｍを有する。表４及び例６を参照されたい。
【図３４】２つの足場２変異体とＷＴとのループ３９９〜４００の相互作用を示す図である：図３４Ａ（ＷＴ  Ｆｃ）；図３４Ｂ（ＡＺ６３）；及び図３４Ｃ（ＡＺ９４）。初期足場２変異体の包括的コンピューター分析は、突然変異Ｋ４０９Ｆに起因するＷＴ塩−架橋Ｋ４０９−Ｄ３９９（図３４Ａ）の喪失及びしたがって満たされていないＤ３９９（図３４Ｂ）が、３９９〜４００ループのより「開いた」コンフォメーションを引き起こすことを示唆した。これはさらに、疎水性コアのより大きい溶媒曝露及び変異体対ＷＴのさらなる脱安定化をもたらす。３９９〜４００ループを安定化し、Ｋ４０９−Ｄ３９９相互作用の喪失を相殺するために用いられた戦略の１つは、変異体ＡＺ９４について図３４Ｃに示されたさらなる塩架橋Ｄ３９９Ｒ−Ｔ４１１Ｅ及びＳ４００Ｒ−Ｋ３９２Ｅの設計であった。実験データにより、９５％を超える純度及び７４℃のＴｍが示された。表４及び例６を参照されたい。さらに、ＡＺ９４は初期足場２変異体（純度９０％未満、Ｔｍ  ７１℃）と比較してかなりより高い純度及び安定性を有するが、ＡＺ９４の疎水性コア突然変異は、変異体ＡＺ７０において同定された「最良の」疎水性コア突然変異よりもあまり好ましいものではない（図３３）。ＡＺ７０中の疎水性コアでの突然変異（Ｔ３６６Ｖ＿Ｌ３５１Ｖ）はループ３９９〜４００でのＡＺ９４の塩架橋突然変異から遠位であるため、ＡＺ７０アミノ酸突然変異とさらなるＡＺ９４突然変異との組合せは、ＡＺ７０又はＡＺ９４よりも高い融解温度を有することが予想される。この組合せは例１〜４に記載のように試験することができる。
【図３５】ホモ二量体ＩｇＧ１  Ｆｃ、ヘテロ二量体変異体ｈｅｔ１（対照１）：Ａ：Ｙ３４９Ｃ＿Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｂ：Ｓ３５４Ｃ＿Ｔ３６６Ｗ及びｈｅｔ２（対照４）：６個のＦｃガンマ受容体に結合するＡ：Ｋ４０９Ｄ＿Ｋ３９２Ｄ／Ｂ：Ｄ３９９Ｋ＿Ｄ３５６Ｋの結合定数（Ｋａ（Ｍ−１））を示す図である。ヘテロ二量体Ｆｃ変異体は、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃと比較してわずかに変化したＦｃガンマ受容体への結合を示す傾向がある。例７を参照されたい。
【図３６Ａ】参照としての野生型結合強度に基づく、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ並びにＩＩｂＦ、ＩＩＢＹ及びＩＩａＲ受容体に対するその様々なホモ二量体及び非対称突然変異形態の相対結合強度を示す図である。（ホモＦｃ＋Ｓ２６７Ｄ）は、ホモ二量体Ｆｃと、両方の鎖上のＳ２６７Ｄ突然変異との結合強度を指す。（Ｈｅｔ  Ｆｃ＋非対称Ｓ２６７Ｄ）は、ヘテロ二量体Ｆｃと、Ｆｃ中の２つの鎖の一方に導入されたＳ２６７Ｄとの結合強度を指す。２つのＦｃ鎖のいずれかに突然変異を導入することによって得られた結合強度の平均が報告される。一方の鎖上へのこの突然変異の導入は、ホモ二量体様式での同じ突然変異について観察された強度のおおよそ半分まで結合強度を低下させた。（Ｈｅｔ  Ｆｃ＋非対称Ｓ２６７Ｄ＋非対称Ｅ２６９Ｋ）は、ヘテロ二量体Ｆｃと、２つのＦｃ鎖の一方上に非対称様式で導入されたＳ２６７Ｄ及びＥ２６９Ｋ突然変異の両方との結合強度を指す。Ｅ２６９Ｋ突然変異は、ＦｃｇＲと、Ｆｃの表面の１つとの相互作用を遮断し、非対称Ｓ２６７Ｄ変異体（Ｈｅｔ  Ｆｃ＋Ｓ２６７Ｄ）単独について観察されたもののおおよそ半分まで結合強度を低下させることができる。ここでＨｅｔ  Ｆｃは、図３５中の変異体ｈｅｔ２（対照４）について示されたＣＨ３突然変異から構成される。
【図３６Ｂ】様々なＦｃ及びその変異体と、いくつかのＦｃｇＲＩＩａ、ＦｃｇＲＩＩｂ及びＦｃｇＲＩＩＩａアロタイプとの結合定数（Ｋａ（Ｍ−１））を示す図である。様々なＦｃｇ受容体に対する野生型ＩｇＧ１  ＦｃのＫａを、水平の影付きのカラムとして表す。垂直の影付きのバー（ホモ二量体塩基２）は、ホモ二量体Ｆｃと突然変異Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｓ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８ＡとのＫａを表す。斜線の影付きのカラムは、ヘテロ二量体Ｆｃと、ＣＨ２ドメイン中の非対称突然変異Ａ：Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｓ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ２６９Ｋ及びＢ：Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｓ／Ｓ２９８ＡとのＫａを表す。非対称突然変異の導入は、ＩＩＩａ受容体とＩＩａ／ＩＩｂ受容体との間の選択性の増加を達成することができる。ここでヘテロ二量体Ｆｃは、図３５中の変異体ｈｅｔ２（対照４）について示されたＣＨ３突然変異から構成される。
【図３６Ｃ】野生型ＩｇＧ１及びＦｃ領域のＣＨ２ドメイン中にホモ二量体又は非対称突然変異を含む３つの他の変異体の結合定数（Ｋａ（Ｍ−１））を示す図である。野生型ＦｃのＫａを、格子で影を付けたカラムで表す。Ｆｃの両方の鎖上にホモ二量体様式（ホモ二量体塩基１）で導入された塩基突然変異Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａを有するＦｃ変異体のＫａを、斜線パターンのカラムで示す。ヘテロ二量体Ｆｃ（ヘテロ塩基１）の鎖Ａ及びＢ中への非対称様式での関連する突然変異の導入を水平の線で示す。垂直の影付きの線を有するカラムは、Ｅ２６９Ｋ突然変異（ヘテロ塩基１＋ＰＤ）を含む非対称変異体を表す。ここでヘテロ二量体Ｆｃは、図３５中の変異体ｈｅｔ２（対照４）について示されたＣＨ３突然変異から構成される。
【図３７】表６は足場１について例５に記載された第３の設計段階に基づく変異体ＣＨ３ドメインの一覧である。
【図３８】表７は足場２について例６に記載された第３の設計段階に基づく変異体ＣＨ３ドメインの一覧である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、ヘテロ二量体形成を促進する特異的なアミノ酸改変を含む改変ＣＨ３ドメインを提供する。一実施形態では、改変ＣＨ３ドメインが、ヘテロ二量体形成を促進する特異的なアミノ酸改変を含む（例えば表１を参照されたい）。他の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインが、安定性が増大したヘテロ二量体形成を促進する特異的なアミノ酸改変を含む（例えば表４、表６、及び表７を参照されたい）。安定性は、ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）として測定され、安定性の増大は、約７０℃以上のＴｍを指す。ＣＨ３ドメインは、ヘテロ多量体又は二重特異性抗体のＦｃ領域の一部を形成する。したがって、一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含むヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、ヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む改変又は変異体ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ３ドメインが、表１において列挙される変異体から選択される、ヘテロ多量体が、本明細書において提供される。第２の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含むヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、安定性が増大したヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ３ドメインが、約７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、ヘテロ多量体が提供される。
【００３５】
改変ＣＨ３ドメインを生成するために利用されてもよいアミノ酸改変は、アミノ酸挿入、欠失、置換、及び再配列を含むが、これらに限定されない。ＣＨ３ドメインの改変及び改変ＣＨ３ドメインは、「ＣＨ３改変」、「改変ＣＨ３ドメイン」、「変異体ＣＨ３ドメイン」、又は「ＣＨ３変異体」と本明細書においてまとめて呼ばれる。これらの改変ＣＨ３ドメインは、最適な分子の中に組み込まれてもよい。したがって、一実施形態では、改変ＣＨ３ドメインを組み込んでいるＦｃ領域（本明細書において使用されるように、「Ｆｃ領域」及び同様の用語は、ＣＨ３ドメインの少なくとも１つの部分を含む任意の重鎖定常領域ドメインを包含する）を含む、分子、特にポリペプチド、より具体的には、免疫グロブリン（例えば抗体）、及び他の結合タンパク質が提供される。改変ＣＨ３ドメイン（例えば１つ又は複数のアミノ酸挿入、欠失、置換、又は再配列を含むＣＨ３ドメイン）を含むＦｃ領域を含む分子は、「Ｆｃ変異体」、「ヘテロ二量体」、又は「ヘテロ多量体」と本明細書において呼ばれる。本発明のＦｃ変異体は、ヘテロ二量体Ｆｃ変異体又は領域を生成するように非対称的に改変されたＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃ領域は、２つの重鎖定常ドメインポリペプチド−Ａ鎖及びＢ鎖を含み、これらは、Ｆｃ領域がそれぞれ、１つのＡ鎖及び１つのＢ鎖ポリペプチドを含むことを条件として、区別なく使用することができる。アミノ酸改変は、２つの改変ＣＨ３ドメインがＦｃ変異体を形成する場合にヘテロ二量体をもたらす非対称性の方法においてＣＨ３の中に導入される（例えば表１を参照されたい）。本明細書において使用されるように、非対称性のアミノ酸改変は、１つのポリペプチド（例えば「Ａ鎖」）上の特定の位置のアミノ酸が、ヘテロ二量体又はＦｃ変異体の同じ位置の第２のポリペプチド（例えば「Ｂ鎖」）上のアミノ酸とは異なる任意の改変である。これは、Ｆｃ変異体のＡ鎖及びＢ鎖由来の２つのアミノ酸のうちの１つのみの改変又は両方のアミノ酸の２つの異なるアミノ酸への改変の結果とすることができる。変異体ＣＨ３ドメインが１つ又は複数の非対称性のアミノ酸改変を含むことが理解される。
【００３６】
本発明の記載において、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比範囲、又は整数範囲は、他に示されない限り、記載される範囲内の任意の整数の値並びに適切な場合、その小数（整数の１０分の１及び１００分の１など）を含むことを理解されたい。本明細書において使用されるように、「約」は、他に示されない限り、示される範囲、値、配列、又は構造の±１０％を意味する。本明細書において使用される用語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、他に示されない限り又はその文脈によって指示されない限り、「１つ又は複数の」数えられる構成成分を指すことを理解されたい。代替の（例えば「又は」）の使用は、代替物の一方、両方、又はその任意の組合せを意味することを理解されたい。本明細書において使用されるように、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、同義的に使用される。さらに、本明細書において記載される構造及び置換基（例えば変異体ＣＨ３ドメイン）の様々な組合せに由来する個々の単鎖ポリペプチド又はヘテロ二量体は、あたかも単鎖ポリペプチド又はヘテロ二量体がそれぞれ個々に記載されるのと同じ程度まで本出願によって開示されることを理解されたい。したがって、個々の単鎖ポリペプチド又はヘテロ二量体を形成するための特定の構成成分の選択は、本開示の範囲内にある。
【００３７】
「第１のポリペプチド」は、本明細書において「Ａ鎖」とも呼ばれる、第２のポリペプチドと関連することとなる任意のポリペプチドである。第１及び第２のポリペプチドは、「境界面」で接触する。「第２のポリペプチド」は、本明細書において「Ｂ鎖」とも呼ばれる、「境界面」を介して第１のポリペプチドと関連することとなる任意のポリペプチドである。「境界面」は、第２のポリペプチドの境界面における１つ又は複数の「接触」アミノ酸残基と相互作用する、第１のポリペプチドにおける「接触」アミノ酸残基を含む。本明細書において使用されるように、境界面は、ＩｇＧ抗体、最も好ましくはヒトＩｇＧ１抗体に好ましくは由来するＦｃ領域のＣＨ３ドメインを含む。
【００３８】
本明細書において使用されるように、「単離」ヘテロ多量体は、同定され、その自然の細胞培養環境の構成成分から分離及び／又は回収されたヘテロ多量体を意味する。その自然環境の混入物の構成成分は、ヘテロ多量体についての診断上の又は治療上の使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性の溶質を含んでいてもよい。
【００３９】
変異体Ｆｃヘテロ二量体は、実質的な均一性まで一般に精製される。語句「実質的に均一な」、「実質的に均一な形態」、及び「実質的な均一性」は、望ましくないポリペプチドの組合せ（例えばホモ二量体）に由来する副産物が産物に実質的にないことを示すために使用される。純度に関して表現されるように、実質的な均一性は、パーセンテージが重量によるものである場合、副産物の量が１０％を超過しない、好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満、最も好ましくは０．５％未満であることを意味する。
【００４０】
抗体技術の当業者らによって理解される用語はそれぞれ、本明細書において明確に異なって定義されない限り、当技術分野において得られる意味が与えられる。抗体は、可変領域、ヒンジ領域、及び定常ドメインを有することが知られている。例えば、免疫グロブリン構造及び機能は、Ｈａｒｌｏｗら編、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｈａｐｔｅｒ１４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８８）において概説される。
【００４１】
野生型ホモ二量体からの変異体Ｆｃヘテロ二量体の設計は、安定性対特異性のバランスを保つことによる、タンパク質工学との関連における正及び負の設計の概念によって例証され、突然変異は、ポリペプチドが細胞培養条件において発現される場合に、ホモ二量体形成に対してヘテロ二量体形成を推進する目的で導入される。負の設計戦略は、一方の鎖上にかさ高い側鎖を導入し、反対の鎖上に小さな側鎖を導入すること、例えば、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ、Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ、Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．’Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ’ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＣＨ３  ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｏｒ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１９９６年７月；９（７）：６１７〜２１；Ａｔｗｅｌｌ  Ｓ、Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ、Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ、Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．Ｓｔａｂｌｅ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｏｆ  ａ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２７０（１）：２６〜３５（１９９７）））によって開発されたｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ戦略によって又はホモ二量体形成の反発作用を導く静電エンジニアリング、例えば、Ａｍｇｅｎ（Ｇｕｎａｓｋｅｋａｒａｎ  Ｋら  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｃ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ＩｇＧ．ＪＢＣ  ２８５（２５）：１９６３７〜１９６４６（２０１０））によって開発された静電ステアリング戦略によって、ホモ二量体の形成にとって好ましくない相互作用を最大限にする。これらの２つの例において、負の設計による非対称性の点突然変異は、ヘテロ二量体形成を推進するために野生型ＣＨ３ドメインの中に導入された。現在までに、負の設計戦略のみが、Ｆｃヘテロ二量体を開発するために使用されてきた。公開された結果は、負の設計アプローチのみを使用して設計されたヘテロ二量体が、＞９５％のヘテロ二量体を有する高度な特異性を導くが、複合体をかなり不安定にすることを示す（前掲）。これらの負の設計によるヘテロ二量体は、６９℃以下の、改変ＣＨ３ドメインの融解温度を有し、野生型と比較して、さらなるジスルフィド結合がない。下記の表Ａを参照されたい。
【表１】
2014504265.tif 000003
【００４２】
負の設計とは対照的に、タンパク質を操作するために使用される一般的な概念は、正の設計である。この場合、アミノ酸改変は、タンパク質内の又はタンパク質間の好ましい相互作用を最大限にするために、ポリペプチドの中に導入される。この戦略は、ホモ二量体に対する影響を無視して、所望のヘテロ二量体を特異的に安定化する複数の突然変異を導入する場合に、正味の効果が、ホモ二量体に対して、所望のヘテロ二量体相互作用についてより良い特異性、よって、より大きなヘテロ二量体特異性になるであろうということを想定する。タンパク質工学との関連において、正の設計戦略は、所望のタンパク質相互作用の安定性を最適化するが、＞９０％特異性をめったに達成しないことが理解される（Ｈａｖｒａｎｅｋ  ＪＪ  ＆  Ｈａｒｂｕｒｙ  ＰＢ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．１０（１）：４５〜５２（２００３）；Ｂｏｌｏｎ  ＤＮ、Ｇｒａｎｔ  ＲＡ、Ｂａｋｅｒ  ＴＡ、Ｓａｕｅｒ  ＲＴ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｖｅｒｓｕｓ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｓｉｇｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．６；１０２（３６）：１２７２４〜９（２００５）；Ｈｕａｎｇ  ＰＳ、Ｌｏｖｅ  ＪＪ、Ｍａｙｏ  ＳＬ．Ａ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１６（１２）：２７７０〜４（２００７））。また、したがって、現在までに、正の設計戦略は、特異性が治療用抗体の生産及び開発にとって安定性よりも重要であったので、Ｆｃヘテロ二量体を設計するために使用されてこなかった。さらに、有益な正の設計による突然変異は、予測するのが困難になり得る。さらなるジスルフィド結合などのような安定性を改善するための他の方法論は、Ｆｃヘテロ二量体における安定性を改善するために試みられてきたが、分子に対する改善の成功は限られたものであった。（表Ａを参照されたい）これは、操作されたＦｃ  ＣＨ３ドメインジスルフィド結合がすべて、溶媒に曝露されているからである可能性があり、これは、ジスルフィド結合の短い寿命をもたらし、そのため、とりわけ、操作されたＣＨ３ドメインがさらなるジスルフィド結合を伴わないで７０℃未満のＴｍを有する場合、ヘテロ二量体の長期安定性に対して著しい影響をもたらす（ジスルフィドを伴わないで６９℃のＴｍを有する対照４においてのように）（対照２を参照されたい）。ジスルフィド結合などのような安定性を改善するための他の方法論はまた、ＣＨ３ドメインの本質的な安定性（融解温度として測定される）が、ジスルフィド結合を伴わないで７０℃以上であることを条件として、特に、ＣＨ３ドメインの本質的な安定性（融解温度として測定される）が、ジスルフィド結合を伴わないで７２℃以上である場合、本発明のＦｃ変異体でも用いることができることが企図される。
【００４３】
そのため、本発明者らは、本明細書において、安定しているだけでなくまた高度に特異的なヘテロ二量体形成をもたらすＦｃヘテロ二量体を設計するための新規な方法を開示する。この設計法は、構造及びコンピューターモデリングにより導かれるタンパク質工学技術と共に負及び正の両方の設計戦略を組み合わせる。この有力な方法は、本発明者らが、ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインにおいて突然変異の新規な組合せを設計することを可能にし、標準的な細胞培養条件のみを使用して、ヘテロ二量体は、ホモ二量体と比較して９０％を超える純度で形成され、結果として生じるヘテロ二量体は、７０℃以上の融解温度を有した。例示的な実施形態では、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体が、７３℃以上の融解温度及び９８％を超える純度を有する。他の例示的な実施形態では、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体が、７５℃以上の融解温度及び９０％を超える純度を有する。
【００４４】
ある実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、安定性が増大したヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ３ドメインが、７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、単離ヘテロ多量体が提供される。本明細書において使用されるように、「安定性の増大」又は「安定したヘテロ二量体」は、約７０℃以上の融解温度を有する、ヘテロ二量体形成中の変異体ＣＨ３ドメインを指す。さらに、用語「ヘテロ二量体形成を促進する」は、本明細書において、ホモ二量体形成と比較して、９０％を超えるヘテロ二量体形成をもたらす、ＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸突然変異を指すことが理解される。
【００４５】
さらなる実施形態では、この安定性の増大は、さらなるジスルフィド結合の非存在下におけるものである。具体的には、安定性の増大は、ＣＨ３ドメインにおけるさらなるジスルフィド結合の非存在下におけるものである。一実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、野生型ＣＨ３ドメインと比較して、さらなるジスルフィド結合を含まない。代替の実施形態では、変異体ＣＨ３がジスルフィド結合の非存在下において７０℃以上の融解温度を有することを条件として、変異体ＣＨ３が野生型ＣＨ３ドメインと比較して、少なくとも１つのジスルフィド結合を含む。一実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、野生型ＣＨ３ドメインと比較して少なくとも１つのジスルフィド結合を含み、変異体ＣＨ３ドメインが、約７７．５℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する。一実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、野生型ＣＨ３ドメインと比較して少なくとも１つのジスルフィド結合を含み、変異体ＣＨ３ドメインが、約７８℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する。他の実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、野生型ＣＨ３ドメインと比較して少なくとも１つのジスルフィド結合を含み、変異体ＣＨ３ドメインは、約７８℃を超える又は約７８．５℃を超える又は約７９℃を超える又は約７９．５℃を超える又は約８０℃を超える又は約８０．５℃を超える又は約８１℃を超える融解温度（Ｔｍ）を有する。
【００４６】
一実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、約７０℃を超える又は約７０．５℃を超える又は約７１℃を超える又は約７１．５℃を超える又は約７２℃を超える又は約７２．５℃を超える又は約７３℃を超える又は約７３．５℃を超える又は約７４℃を超える又は約７４．５℃を超える又は約７５℃を超える又は約７５．５℃を超える又は約７６℃を超える又は約７６．５℃を超える又は約７７℃を超える又は約７７．５℃を超える又は約７８℃を超える又は約７８．５℃を超える又は約７９℃を超える又は約７９．５℃を超える又は約８０℃を超える又は約８０．５℃を超える又は約８１℃を超える融解温度を有する。他の実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、約７０℃又は約７０．５℃又は約７１℃又は約７１．５℃又は約７２℃又は約７２．５℃又は約７３℃又は約７３．５℃又は約７４℃又は約７４．５℃又は約７５℃又は約７５．５℃又は約７６℃又は約７６．５℃又は約７７℃又は約７７．５℃又は約７８℃又は約７８．５℃又は約７９℃又は約７９．５℃又は約８０℃又は約８０．５℃又は約８１℃の融解温度を有する。さらに他の実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、約７０℃〜約８１℃又は約７０．５℃〜約８１℃又は約７１℃〜約８１℃又は約７１．５℃〜約８１℃又は約７２℃〜約８１℃又は約７２．５℃〜約８１℃又は約７３℃〜約８１℃又は約７３．５℃〜約８１℃又は約７４℃〜約８１℃又は約７４．５℃〜約８１℃又は約７５℃〜約８１℃又は約７５．５℃〜約８１℃又は７６℃〜約８１℃又は約７６．５℃〜約８１℃又は約７７℃〜約８１℃又は約７７．５℃〜約８１℃又は約７８℃〜約８１℃又は約７８．５℃〜約８１℃又は約７９℃〜約８１℃の融解温度を有する。さらに他の実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、約７１℃〜約７６℃又は約７２℃〜約７６℃又は約７３℃〜約７６℃又は約７４℃〜約７６℃の融解温度を有する。
【００４７】
改善された安定性に加えて、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、ヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含む。ヘテロ二量体形成を促進するこれらのアミノ酸突然変異が、ホモ二量体形成と比較される通りであることが理解される。ホモ二量体形成と比較したこのヘテロ二量体形成は、「純度」若しくは「特異性」又は「ヘテロ二量体純度」若しくは「ヘテロ二量体特異性」として一緒に本明細書において言及される。ヘテロ二量体純度は、ヘテロ二量体種の選択的な精製の前の、標準的な細胞培養条件下で溶液中で形成されるホモ二量体種と比較した、形成される所望のヘテロ二量体のパーセンテージを指すことが理解される。例えば、９０％のヘテロ二量体純度は、溶液中の二量体種の９０％が所望のヘテロ二量体であることを示す。一実施形態では、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体が、約９０％を超える又は約９１％を超える又は約９２％を超える又は約９３％を超える又は約９４％を超える又は約９５％を超える又は約９６％を超える又は約９７％を超える又は約９８％を超える又は約９９％を超える純度を有する。他の実施形態では、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体が、約９０％又は約９１％又は約９２％又は約９３％又は約９４％又は約９５％又は約９６％又は約９７％又は約９８％又は約９９％又は約１００％の純度を有する。
【００４８】
特定の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、安定性が増大したヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ３ドメインが、７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、結果として生じるヘテロ二量体が、９０％を超える純度を有する、単離ヘテロ多量体。一態様では、結果として生じるＦｃ変異体ヘテロ二量体が、９０％を超える純度を有し、変異体ＣＨ３ドメインが、約７０℃を超える又は約７１℃を超える又は約７２℃を超える又は約７３℃を超える又は約７４℃を超える又は約７５℃を超える又は約７６℃を超える又は約７７℃を超える又は約７８℃を超える又は約７９℃を超える又は約８０℃を超える又は約８１℃を超える融解温度を有する。さらなる態様では、変異体ＣＨ３ドメインが、７０℃以上の融解温度を有し、結果として生じるＦｃ変異体ヘテロ二量体が、約９０％を超える又は約９１％を超える又は約９２％を超える又は約９３％を超える又は約９４％を超える又は約９５％を超える又は約９６％を超える又は約９７％を超える又は約９８％を超える又は約９９％を超える純度を有する。
【００４９】
改善された安定性及び純度を有するこれらのＦｃ変異体を設計するために、本発明者らは、正及び負の設計戦略のうちで最も好結果の組合せを選択するために、コンピューター設計及び実験スクリーニングの反復プロセスを用いた（図２４を参照されたい）。
【００５０】
具体的には、最初の設計段階では、異なる負の設計によるＦｃ変異体ヘテロ二量体を作製し、例１〜３において記載されるように発現及び安定性について試験した。最初の設計段階は、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体ＡＺ１〜ＡＺ１６を含んだ（表１を参照されたい）。低い安定性（例えば７１℃未満のＴｍ）を有することが予想された、負の設計によるＦｃ変異体ヘテロ二量体のこの最初のセットから、９０％を超える純度及び約６８℃以上の融解温度を有するＦｃ変異体ヘテロ二量体をさらなる開発のために選択した。これは、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体ＡＺ６、ＡＺ８、及びＡＺ１５を含んだ。第２の設計段階では、それらの選択されたＦｃ変異体ヘテロ二量体は、詳細なコンピューター及び構造解析後に、正の設計戦略を使用して、安定性及び純度の両方を上昇させるようにさらに改変した。選択されたＦｃ変異体ヘテロ二量体（ＡＺ６、ＡＺ８、及びＡＺ１５）はそれぞれ、これらのＦｃ変異体がＩｇＧ１について８１℃である野生型Ｆｃホモ二量体よりも低い安定性を有する構造の理由を同定するために、コンピューターによる方法及び包括的な構造機能解析を用いて解析した。Ｆｃ変異体ヘテロ二量体及びＴｍ値のリストについての表４を参照されたい。
【００５１】
ある実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、ＡＺ１又はＡＺ２又はＡＺ３又はＡＺ４又はＡＺ５又はＡＺ６又はＡＺ７又はＡＺ８又はＡＺ９又はＡＺ１０又はＡＺ１１又はＡＺ１２又はＡＺ１３又はＡＺ１４又はＡＺ１５又はＡＺ１６から選択される。選択される実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、ＡＺ６又はＡＺ８又はＡＺ１５である。
【００５２】
コンピューターツール及び構造機能解析は、分子動態解析（ＭＤ）、側鎖／主鎖再パッキング（ｒｅ−ｐａｃｋｉｎｇ）、ナレッジベースポテンシャル（Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｂａｓｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）（ＫＢＰ）、空洞及び（疎水性）パッキング解析（ｃａｖｉｔｙ  ａｎｄ（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）ｐａｃｋｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＬＪ、ＣＣＳＤ、ＳＡＳＡ、ｄＳＡＳＡ（炭素／全原子））、静電ＧＢ計算（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ−ＧＢ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ）、並びに結合解析（ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を含んだが、これらに限定されなかった。（コンピューター戦略の概要については図２４を参照されたい）
【００５３】
本発明者らのタンパク質工学アプローチの態様は、Ｘ線結晶解析に由来するＦｃ  ＩｇＧタンパク質の構造の情報を、ＣＨ３ドメインの野生型及び変異体形態のコンピューターモデリング及びシミュレーションと組み合わせることに依存した。これは、本発明者らが、個々のアミノ酸の可能性のある役割及びそれらの協同的な作用についての新規な構造及び物理化学的見識を得ることを可能にした。それらの安定性及び純度に関係する、結果として生じる経験的なデータと共に、複数の変異体ＣＨ３ドメインから得られた構造及び物理化学的見識は、本発明者らが、Ｆｃホモ二量体及びシミュレートされた構造モデルと比較した、Ｆｃヘテロ二量体の純度及び安定性の関係についての理解を進展させるのを支援した。本発明者らのシミュレーションを実行するために、本発明者らは、完全で現実的なモデルを構築し、ＩｇＧ１抗体の野生型Ｆｃ構造の品質を改良することから開始した。Ｘ線結晶解析に由来するタンパク質構造は、生理的条件下の水性媒体におけるタンパク質のある特徴に関する細部を欠いており、本発明者らの改良方法により、これらの限界について検討した。これらは、タンパク質構造の欠けている領域、多くの場合、ループ及びいくつかの残基側鎖などのようなタンパク質の可動性の部分を構築すること、中性及び荷電残基のプロトン化状態並びにタンパク質と関連する可能性のある機能的に関連する水分子の配置を評価し、定めることを含む。
【００５４】
分子動態（ＭＤ）アルゴリズムは、水性環境におけるＦｃホモ二量体及び変異体ＣＨ３ドメインの本質的な動的な性質を評価するために、タンパク質構造をシミュレートすることによる、本発明者らが使用した１つのツールである。分子動態シミュレーションは、タンパク質及びその局所的な環境におけるすべての原子要素、この場合、Ｆｃ及びその周囲の水分子を構成する原子の間に作用する相互作用及び力から生じる運動に起因する分子の動的な軌道を追跡する。分子動態シミュレーションの後に、Ｆｃホモ二量体及び変異体Ｆｃヘテロ二量体の構造の及び動的な特徴の見識を得るために軌道の様々な側面を解析し、本発明者らは、分子の純度及び安定性の両方を改善するために、特異的なアミノ酸突然変異を同定するためにこれらを使用した。
【００５５】
そのため、生成されたＭＤの軌道は、Ｆｃ構造における運動の本質的な低頻度のモードを明らかにするために主成分分析などのような方法を使用して研究した。これは、タンパク質の可能性のあるコンフォメーションの準安定状態についての見識を提供する（図３２を参照されたい）。Ｆｃ領域におけるＡ鎖及びＢ鎖の間の決定的なタンパク質間相互作用が、ＣＨ３ドメインの境界面で起こるが、本発明者らのシミュレーションは、この境界面が、互いに関してＣＨ２ドメインのＮ末端の「開口」及び「閉鎖」に関係する運動においてかなめとして作用することを示した。ＣＨ２ドメインは、図１６において見られるように、この末端でＦｃｇＲと相互作用する。したがって、理論によって束縛されることを望むものではないが、ＣＨ３境界面でのアミノ酸突然変異の導入は、ＦｃのＮ末端での開／閉運動の大きさ及び性質、そのため、ＦｃがＦｃｇＲと相互作用する方法に影響を与えるように思われる。例４及び表５を参照されたい。
【００５６】
生成されたＭＤの軌道はまた、それらの可動性のプロファイリング及びそれらの環境の解析に基づいて、Ｆｃ構造における特定のアミノ酸残基位置の変異性を決定するために研究した。このアルゴリズムは、本発明者らが、タンパク質構造及び機能に影響を及ぼし得る残基を同定することを可能にし、変異体ＣＨ３ドメインの続く設計段階のための残基の特徴及び変異性に対するユニークな見識を提供した。この解析はまた、本発明者らが、複数のシミュレーションを比較し、プロファイリング後の異常値に基づいて変異性を評価することを可能にした。
【００５７】
生成されたＭＤの軌道はまた、タンパク質における相互に関係する残基運動及びそれらの間の結合の結果としての残基のネットワークの形成を決定するためにも研究した。Ｆｃ構造内の残基の動的な相関及びネットワークの発見は、動的な要素としてタンパク質を理解し、遠位部位の突然変異の影響についての見識を進展させるのに決定的なステップとなる。例えば例６を参照されたい。
【００５８】
したがって、本発明者らは、突然変異の部位の局所的な環境に対する突然変異の影響を詳細に研究した。Ａ鎖及びＢ鎖の間のＣＨ３境界面で十分にパッキングされたコアの形成は、安定したＦｃ構造における２つの鎖の自発的なペアリングにとって重要である。好適なパッキングは、接触する基の間の好ましい相互作用により結合する相互作用分子パートナーの間の強力な構造の相補性の結果である。好ましい相互作用は、溶媒曝露から十分に離れた埋没した疎水性接触及び／又は親水性極性基の間の相補的な静電接触の形成に起因する。これらの疎水性及び親水性接触は、ＣＨ３境界面での二量体形成の自由エネルギーに対してエントロピー及びエンタルピー寄与を有する。本発明者らは、Ａ鎖及びＢ鎖の間のＣＨ３境界面でのパッキングを正確にモデル化し、続いて、多くの関連する物理化学的特性をスコア化することによって境界面の熱力学的特性を評価するために様々なアルゴリズムを用いる。
【００５９】
本発明者らは、本発明者らがコンピューターによりスクリーニングした多くの変異体についてのモデル構造を最適化し、調製するために可動性の主鎖を含む多くのタンパク質パッキング法を用いた。パッキングの後に、本発明者らは、接触密度、衝突スコア、水素結合、疎水性、及び静電気を含む多くの事項を評価した。溶媒和モデルの使用は、本発明者らが、溶媒環境の影響をより正確に検討し、代替の残基タイプへのタンパク質における特定の位置の突然変異の後に自由エネルギー差異を対比するのを可能にした。接触密度及び衝突スコアは、相補性の基準、有効なタンパク質パッキングの決定的な側面を提供する。これらのスクリーニング法は、ナレッジベースポテンシャル又はペアの残基相互作用エネルギー及びエントロピー計算に依存する結合解析手法の適用に基づく。
【００６０】
この包括的なｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにおける解析は、境界面ホットスポット、非対称性の部位、空洞及びパッキングが不十分な領域、個々の部位の構造の動態、及び局所的なアンフォールディングの部位に関して、野生型と比較した、それぞれのＦｃ変異体の差異についての詳細な理解を提供した。記載されるコンピューター解析の結果についてのこれらの組合せは、最適化されておらず、組み合わせて、より低い安定性（例えば６８℃のＴｍ）及び／又は＜９０％純度のより低い特異性の原因となる特定の残基、配列／構造モチーフ、及び空洞を同定した。第２の設計段階では、本発明者らは、さらなる点突然変異によって、これらの仮説について特に検討するために、標的とする正の設計を使用し、上記に記載される方法論及び解析を使用して、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏエンジニアリングによってこれらを試験した（図２４を参照されたい）。段階２におけるそれぞれの標的とする設計について安定性及び純度を改善するために設計したＦｃ変異体ヘテロ二量体（Ｆｃ変異体ヘテロ二量体ＡＺ１７〜ＡＺ１０１）は、例１〜４において記載されるように発現及び安定性について実験的に検証した。
【００６１】
ある実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、安定性が増大したヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ３ドメインが、ＡＺ１７、又はＡＺ１８、又はＡＺ１９、又はＡＺ２０、又はＡＺ２１、又はＡＺ２２、又はＡＺ２３、又はＡＺ２４、又はＡＺ２５、又はＡＺ２６、又はＡＺ２７、又はＡＺ２８、又はＡＺ２９、又はＡＺ３０、又はＡＺ２１、又はＡＺ３２、又はＡＺ３３、又はＡＺ３４、又はＡＺ３５、又はＡＺ３６、又はＡＺ３７、又はＡＺ３８、又はＡＺ３９、又はＡＺ４０、又はＡＺ４１、又はＡＺ４２、又はＡＺ４３、又はＡＺ４４、又はＡＺ４５、又はＡＺ４６、又はＡＺ４７、又はＡＺ４８、又はＡＺ４９、又はＡＺ５０、又はＡＺ５１、又はＡＺ５２、又はＡＺ５３、又はＡＺ５４、又はＡＺ５５、又はＡＺ５６又はＡＺ５７、又はＡＺ５８、又はＡＺ５９、又はＡＺ６０、又はＡＺ６１、又はＡＺ６２、又はＡＺ６３、又はＡＺ６４、又はＡＺ６５、又はＡＺ６６、又はＡＺ６７、又はＡＺ６８、又はＡＺ６９、又はＡＺ７０、又はＡＺ７１、又はＡＺ７２、又はＡＺ７３、又はＡＺ７４、又はＡＺ７５、又はＡＺ７６、又はＡＺ７７、又はＡＺ７８、又はＡＺ７９、又はＡＺ８０、又はＡＺ８１、又はＡＺ８２、又はＡＺ８３、又はＡＺ８４、又はＡＺ８５、又はＡＺ８６、又はＡＺ８７、又はＡＺ８８、又はＡＺ８９、又はＡＺ９０、又はＡＺ９１、又はＡＺ９２、又はＡＺ９３、又はＡＺ９４、又はＡＺ９５、又はＡＺ９６、又はＡＺ９７、又はＡＺ９８、又はＡＺ９９、又はＡＺ１００又はＡＺ１０１である、単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。例示的な実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、ＡＺ１７、又はＡＺ１８、又はＡＺ１９、又はＡＺ２０、又はＡＺ２１、又はＡＺ２２、又はＡＺ２３、又はＡＺ２４、又はＡＺ２５、又はＡＺ２６、又はＡＺ２７、又はＡＺ２８、又はＡＺ２９、又はＡＺ３０、又はＡＺ２１、又はＡＺ３２、又はＡＺ３３、又はＡＺ３４、又はＡＺ３８、又はＡＺ４２、又はＡＺ４３、又はＡＺ  ４４、又はＡＺ４５、又はＡＺ４６、又はＡＺ４７、又はＡＺ４８、又はＡＺ４９、又はＡＺ５０、又はＡＺ５２、又はＡＺ５３、又はＡＺ５４、又はＡＺ５８、又はＡＺ５９、又はＡＺ６０、又はＡＺ６１、又はＡＺ６２、又はＡＺ６３、又はＡＺ６４、又はＡＺ６５、又はＡＺ６６、又はＡＺ６７、又はＡＺ６８、又はＡＺ６９、又はＡＺ７０、又はＡＺ７１、又はＡＺ７２、又はＡＺ７３、又はＡＺ７４、又はＡＺ７５、又はＡＺ７６、又はＡＺ７７、又はＡＺ７８、又はＡＺ７９、又はＡＺ８１、又はＡＺ８２、又はＡＺ８３、又はＡＺ８４、又はＡＺ８５、又はＡＺ８６、又はＡＺ８７、又はＡＺ８８、又はＡＺ８９、又はＡＺ９１、又はＡＺ９２、又はＡＺ９３、又はＡＺ９４、又はＡＺ９５、又はＡＺ９８、又はＡＺ９９、又はＡＺ１００又はＡＺ１０１である。特定の実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、ＡＺ３３又はＡＺ３４である。他の実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、ＡＺ７０又はＡＺ９０である。
【００６２】
例示的な実施形態では、ＣＨ３ドメインが、第１及び第２のポリペプチドを含み（本明細書においてＡ鎖及びＢ鎖とも呼ばれる）、第１のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｍ、及びＴ３９４Ｗを含む。他の実施形態では、第１のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｅ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｉ、Ｎ３９０Ｒ、Ｋ３９２Ｍ、及びＴ３９４Ｗを含む。
【００６３】
コンピューター構造機能解析、標的エンジニアリング、及び実験検証のこの反復プロセスは、続く設計段階において、表１において列挙される残りのＦｃ変異体を設計するために使用し、９０％を超える純度及び７０℃を超えるＣＨ３ドメイン融解温度を有する安定性が増大したＦｃ変異体ヘテロ二量体がもたらされた。ある実施形態では、Ｆｃ変異体が、ＡＺ１〜ＡＺ１３６から選択されるアミノ酸突然変異を含む。さらなる実施形態では、Ｆｃ変異体が、表４において列挙されるＦｃ変異体から選択されるアミノ酸突然変異を含む。
【００６４】
第１及び第２の設計段階から、２つのコア足場、足場１及び足場２が、同定され、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体の純度及び安定性を微調整するために、さらなるアミノ酸改変をこれらの足場の中に導入した。ＡＺ８、ＡＺ１７〜６２、及び表６において列挙される変異体を含む足場１の開発の詳細な説明については、例５を参照されたい。ＡＺ１５及びＡＺ６３〜１０１並びに表７において列挙される変異体を含む足場２の開発の詳細な説明については、例６を参照されたい。
【００６５】
足場１のコア突然変異は、Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗを含む。足場１ａは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを含み、足場１ｂは、アミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを含む。例５を参照されたい。
【００６６】
ある実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、第１及び第２のポリペプチドを含み（本明細書においてＡ鎖及びＢ鎖とも呼ばれる）、第１のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３９４Ｗを含む。一態様では、変異体ＣＨ３ドメインが、Ｆ４０５及び／又はＫ３９２位に点突然変異をさらに含む。
【００６７】
Ｋ３９２位のこれらの突然変異は、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ、又はＫ３９２Ｅを含むが、これらに限定されない。Ｆ４０５位のこれらの突然変異は、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ、又はＦ４０５Ｗを含むが、これらに限定されない。他の態様では、変異体ＣＨ３ドメインが、Ｔ４１１及び／又はＳ４００位に点突然変異をさらに含む。Ｔ４１１位のこれらの突然変異は、Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、又はＴ４１１Ｗを含むが、これらに限定されない。Ｓ４００位のこれらの突然変異は、Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、又はＳ４００Ｋを含むが、これらに限定されない。さらに他の実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、第１及び第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３９４Ｗを含み、第１及び／又は第２のポリペプチドが、Ｔ３６６及び／又はＬ３６８位にさらなるアミノ酸改変を含む。Ｔ３６６位のこれらの突然変異は、Ｔ３６６Ａ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６６Ｃ、Ｔ３６６Ｖ、又はＴ３６６Ｗを含むが、これらに限定されない。例示的な実施形態では、Ｔ３６６位のアミノ酸突然変異が、Ｔ３６６Ｉである。他の例示的な実施形態では、Ｔ３６６位のアミノ酸突然変異が、Ｔ３６６Ｌである。Ｌ３６８位の突然変異は、Ｌ３６８Ｄ、Ｌ３６８Ｒ、Ｌ３６８Ｔ、Ｌ３６８Ｍ、Ｌ３６８Ｖ、Ｌ３６８Ｆ、Ｌ３６８Ｓ、及びＬ３６８Ａを含むが、これらに限定されない。
【００６８】
ある実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、第１及び第２のポリペプチドを含み（本明細書においてＡ鎖及びＢ鎖とも呼ばれる）、第１のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｌ及びＴ３９４Ｗを含む。他の実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、第１及び第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｉ及びＴ３９４Ｗを含む。
【００６９】
ある他の実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、第１及び第２のポリペプチドを含み（本明細書においてＡ鎖及びＢ鎖とも呼ばれる）、第１のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、及びＴ３９４Ｗを含む。他の実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、第１及び第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｍ、及びＴ３９４Ｗを含む。
【００７０】
さらに他の実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、第１及び第２のポリペプチドを含み（本明細書においてＡ鎖及びＢ鎖とも呼ばれる）、第１のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、及びＴ３９４Ｗを含む。他の実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、第１及び第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｍ、及びＴ３９４Ｗを含む。
【００７１】
ある実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、第１及び第２のポリペプチドを含み（本明細書においてＡ鎖及びＢ鎖とも呼ばれる）、第１のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｌ及びＴ３９４Ｗを含む。他の実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、第１及び第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｉ及びＴ３９４Ｗを含む。
【００７２】
例示的な実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、安定性が増大したヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ３ドメインが、約７４℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。他の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、安定性が増大したヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ３ドメインが、約７４℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、ヘテロ二量体が、約９８％以上の純度を有する、単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。
【００７３】
ある実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、安定性が増大したヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ３ドメインが、７０℃を超える融解温度（Ｔｍ）を有し、変異体ＣＨ３ドメインが、表６から選択される、単離ヘテロ多量体。
【００７４】
足場２のコア突然変異は、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆを含む。足場２ａは、アミノ酸突然変異Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆを含み、足場２ｂは、アミノ酸突然変異Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆを含む。例６を参照されたい。
【００７５】
ある実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、第１及び第２のポリペプチドを含み（本明細書においてＡ鎖及びＢ鎖とも呼ばれる）、第１のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａを含み、第２のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ａ及びＫ４０９Ｆを含む。一態様では、変異体ＣＨ３ドメインが、Ｔ３６６、Ｌ３５１、及びＹ４０７位に点突然変異をさらに含む。Ｔ３６６位のこれらの突然変異は、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６６Ｃ、Ｔ３６６Ｖ、又はＴ３６６Ｗを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、Ｔ３６６位の突然変異が、Ｔ３６６Ｖである。Ｌ３５１位の突然変異は、Ｌ３５１Ｉ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｒ、又はＬ３５１Ｆを含むが、これらに限定されない。Ｙ４０７位の突然変異は、Ｙ４０７Ｖ又はＹ４０７Ｓを含むが、これらに限定されない。表１及び表４及び例６におけるＣＨ３変異体ＡＺ６３〜ＡＺ７０を参照されたい。
【００７６】
例示的な実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、第１及び第２のポリペプチドを含み（本明細書においてＡ鎖及びＢ鎖とも呼ばれる）、第１のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａを含み、第２のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ｖ及びＫ４０９Ｆを含む。
【００７７】
例示的な実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、安定性が増大したヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ３ドメインが、約７５．５℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。他の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、安定性が増大したヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ３ドメインが、約７５℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、ヘテロ二量体が、約９０％以上の純度を有する、単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。
【００７８】
他のある実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、第１及び第２のポリペプチドを含み（本明細書においてＡ鎖及びＢ鎖とも呼ばれる）、第１のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｌ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａを含み、第２のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ａ及びＫ４０９Ｆを含み、変異体ＣＨ３ドメインが、Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０、及び／又はＫ３９２位に１つ又は複数のアミノ酸改変を含む。Ｄ３９９位のこれらの突然変異は、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ、又はＤ３９９Ｋを含むが、これらに限定されない。Ｔ４１１位の突然変異は、Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、又はＴ４１１Ｗを含むが、これらに限定されない。Ｓ４００位の突然変異は、Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、又はＳ４００Ｋを含むが、これらに限定されない。Ｆ４０５位の突然変異は、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ、又はＦ４０５Ｗを含むが、これらに限定されない。Ｎ３９０位の突然変異は、Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ、又はＮ３９０Ｄを含むが、これらに限定されない。Ｋ３９２位の突然変異は、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ、又はＫ３９２Ｅを含むが、これらに限定されない。表１及び表４及び例６におけるＣＨ３変異体ＡＺ７１〜１０１を参照されたい。
【００７９】
例示的な実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、第１及び第２のポリペプチドを含み（本明細書においてＡ鎖及びＢ鎖とも呼ばれる）、第１のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｙ４０７Ａを含み、第２のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ａ及びＫ４０９Ｆを含む。一態様では、この変異体ＣＨ３ドメインが、アミノ酸改変Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ、及びＳ４００Ｒをさらに含む。さらなる実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインが、第１及び第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｄ３９９Ｒ、Ｓ４００Ｒ、及びＹ４０７Ａを含み、第２のポリペプチドが、アミノ酸改変Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ３９２Ｅ、及びＴ４１１Ｅを含む。
【００８０】
例示的な実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、安定性が増大したヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ３ドメインが、約７４℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。他の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、安定性が増大したヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ３ドメインが、約７４℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、ヘテロ二量体が、約９５％以上の純度を有する、単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。
【００８１】
ある実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、安定性が増大したヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ３ドメインが、７０℃を超える融解温度（Ｔｍ）を有し、変異体ＣＨ３ドメインが、表７から選択される、単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。
【００８２】
さらに、改善された安定性及び純度を有するＦｃ変異体ヘテロ二量体を設計するこの新しい方法は、Ｆｃ領域の他のクラス及びアイソタイプに適用することができる。ある実施形態では、Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域である。さらなる実施形態では、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリン由来のものである。いくつかの実施形態では、ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４からなる群から選択されるサブタイプである。
【表２−１】
2014504265.tif 000004
【表２−２】
2014504265.tif 000005
【表２−３】
2014504265.tif 000006
【表２−４】
2014504265.tif 000007
【表２−５】
2014504265.tif 000008
【表２−６】
2014504265.tif 000009
【表２−７】
2014504265.tif 000010
【表２−８】
2014504265.tif 000011
【表２−９】
2014504265.tif 000012
【表２−１０】
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【表２−１１】
2014504265.tif 000014
【表２−１２】
2014504265.tif 000015
【００８３】
本明細書において定義されるＦｃ領域は、ＣＨ３ドメイン又はその断片を含み、ヒンジ、ＣＨ１、又はＣＨ２を含む、１つ又は複数の追加定常領域ドメイン又はその断片をさらに含んでいてもよい。Ｆｃアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔら、１９９１、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１〜３２４２、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、ＶａにあるようなＥＵインデックスのナンバリングであることが理解されるであろう。「Ｋａｂａｔにおいて記載されるＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１  Ｋａｂａｔ抗体のＥＵインデックスナンバリングを指す。便宜上、表Ｂは、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ２及びＣＨ３ドメインのＫａｂａｔにおいて記載されるＥＵインデックスに従ってナンバリングされたアミノ酸を提供する。
【表３】
2014504265.tif 000016
【００８４】
ある実施形態では、Ｆｃ変異体が、ＣＨ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインが、変異体ＣＨ２ドメインである。いくつかの実施形態では、変異体ＣＨ２ドメインが、第１及び／又は第２のポリペプチド鎖において非対称性のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体が、当該ヘテロ多量体の一方の鎖がＦｃ受容体に選択的に結合するように、ＣＨ２ドメイン中に非対称性のアミノ酸置換を含む。
【００８５】
ある実施形態では、ヘテロ多量体が、Ｆｃ受容体に選択的に結合する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体が、Ｆｃγ受容体ファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、受容体が、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩｂから選択される。一実施形態では、ＣＨ２ドメインが、Ｆｃガンマ受容体への選択的な結合を促進する非対称性のアミノ酸改変を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体が、ＦｃγＲＩＩＩａに選択的に結合する。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体が、Ｓ２６７Ｄ、Ｋ３９２Ｄ、及びＫ４０９Ｄから選択される非対称性のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体が、ＦｃγＲＩＩａに選択的に結合する。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体が、Ｓ２３９Ｄ、Ｋ３２６Ｅ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅから選択される非対称性のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体が、ＦｃγＲＩＩｂに選択的に結合する。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体が、Ｓ２３９Ｄ、Ｄ２６５Ｓ、Ｅ２６９Ｋ、及びＩ３３２Ｅから選択される非対称性のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体が、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩａに選択的に結合する。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体が、Ｓ２３９Ｄ、Ｄ２６５Ｓ、及びＳ２９８Ａから選択される非対称性のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体が、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｂに選択的に結合する。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体が、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ｋ３２６Ｅ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅから選択される非対称性のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体が、ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｂに選択的に結合する。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体が、Ｓ２３９Ｄ、Ｄ２６５Ｓ、Ｓ２９８Ａ、及びＩ３３２Ｅから選択される非対称性のアミノ酸置換を含む。
【００８７】
ある実施形態では、本明細書において記載されるヘテロ多量体を含む多機能性治療薬を設計する方法がある。いくつかの実施形態では、変異体Ｆｃヘテロ二量体を含む二機能性治療薬を設計する方法がある。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインにおける突然変異により誘導される変異体Ｆｃヘテロ二量体のＣＨ２ドメインにおける非対称性の突然変異の設計のための方法がある。いくつかの実施形態では、非対称性のＦｃにおける突然変異に基づく、異なるＦｃガンマ受容体についての選択性を設計するための方法がある。ある実施形態では、Ｆｃ分子の一方の面へのＦｃガンマ受容体の結合を偏らせる突然変異を設計するための方法がある。ある実施形態では、本明細書において記載されるヘテロ多量体の非対称性のＦｃ足場の一方の面のみと相互作用するようにＦｃγ受容体を偏らせる極性ドライバー（ｐｏｌａｒｉｔｙ  ｄｒｉｖｅｒ）を設計するための方法がある。
【００８８】
いくつかの実施形態では、優先的なＦｃガンマ受容体選択性プロファイルを導く、非対称性のＦｃのＣＨ２ドメインにおける突然変異を含むポリペプチドが、提供される。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインにおける突然変異が、ヘテロ二量体Ｆｃの優先的な形成を導く。ある実施形態では、本明細書において記載される非対称性のＦｃに基づいて二重特異性治療成分を設計するための方法がある。ある実施形態では、本明細書において記載される非対称性のＦｃに基づいて多重特異性治療成分を設計するための方法がある。
【００８９】
ＩｇＧなどのようなモノクローナル抗体は、２つの等価な重ポリペプチド鎖及び２つの軽ポリペプチド鎖から構成される対称な分子であり（図１４）、それぞれ、複数の免疫グロブリン（Ｉｇ）構造ドメインを含む。ｍＡｂのＩｇＧクラスは、４つのアイソフォーム、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のうちの１つで存在する。それぞれ、重鎖は、４つの（ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）Ｉｇドメインから構成され、軽鎖は、２つの（ＶＬ及びＣＬ）Ｉｇドメインから構成される。重鎖のそれぞれからのＶＨ及びＣＨ１ドメインは、ｍＡｂの２つのＦａｂ（「抗原結合断片」）アームを形成するために、軽鎖のＶＬ及びＣＬドメインと組み合わせる。２つの重鎖のＣＨ３及びＣＨ２ドメインは、ホモ二量体Ｆｃ（「結晶化可能な断片」）領域を形成するために、ＣＨ３ドメインにわたるタンパク質間接触及びＣＨ２ドメインにおけるグリコシル化を介して相互作用する。抗体のＣＨ１及びＣＨ２ドメインの間のリンカー領域は、抗体分子のヒンジ領域を構成する。ｍＡｂのＦａｂ及びＦｃ領域をつなぐこととは別に、ヒンジはまた、２つの重鎖にわたるジスルフィド結合を維持し、それらを一緒に保持する。ヒンジ領域におけるアミノ酸及びジスルフィド結合の数は、ＩｇＧの４つのアイソタイプの中で顕著に異なる。ＩｇＧ分子におけるグリコシル化パターンは、著しく多様になり得、約３０の異なる炭水化物成分が、ＩｇＧ分子において観察された［Ａｒｎｏｌｄ  Ｊ．Ｎ．；Ｗｏｒｍａｌｄ  Ｍ．Ｒ．；Ｓｉｍ  Ｒ．Ｂ．；Ｒｕｄｄ  Ｐ．Ｍ．及びＤｗｅｋ  Ｒ．Ａ．（２００７）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２５、２１〜５０］。
【００９０】
モノクローナル抗体構造の対称な性質は、同じエピトープを認識するように親和性成熟したそれらの抗原結合能力を有する両方のＦａｂアームをもたらす。反対側で、抗体分子のＦｃ部分は、免疫又は「エフェクター」細胞上の様々な受容体分子との相互作用に関与し、これらの相互作用のいくつかは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、及び補体活性化などのようなエフェクター機能の媒介を担う。一般に、エフェクター機能は、体液性免疫系から病原体又は毒素中和及び排除、補体活性化、並びに食作用性応答を導く免疫応答に関係する。エフェクター細胞上のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）分子は、エフェクター応答を媒介し、調節するために、不可欠な抗体−抗原免疫複合体に関与する、活性化ＩｇＧ抗体のＦｃに接触する。これらのＦｃγ受容体へのモノクローナル抗体ベースのタンパク質治療剤の相互作用の最適化は、これらの薬剤候補の効能における改善を導くことができる。
【００９１】
ヒトでは、それぞれのクラス内にさらなる多型タイプを有する３つの既知のクラスのＦｃγＲがある。ＩｇＧ１分子中のＦｃは、ナノモル範囲の解離定数でＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）に結合することが知られているが、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びｆｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）結合は、マイクロモル範囲で起こる［Ｂｒｕｈｎｓ  Ｐ．；Ｉａｎｎａｓｃｏｌｉ  Ｂ．；Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐ．；Ｍａｎｃａｒｄｉ  Ｄ．Ａ．；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｎ．；Ｊｏｒｉｅｕｘ  Ｓ．及びＤａｅｒｏｎ  Ｍ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ  １１３：３７１６〜２５］。高親和性ＦｃγＲＩ受容体は、単量体形態でＩｇＧに結合することができるが、低親和性ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩ受容体は、アビディティー効果の結果として抗原−抗体免疫複合体又はＩｇＧ集合体のみに結合することができる。異なるＩｇＧ形態は、異なるＦｃγＲに対して様々な親和性を有する；特に、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３は、より強力な活性を示す。Ｆｃγ受容体は、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインであり、細胞内のシグナル伝達経路の調節に関与する細胞質ドメインを有する。抗体媒介性の免疫複合体との結合の結果、免疫細胞表面上に密集すると、これらの細胞表面受容体の細胞質末端上の、ＦｃγＲに連結されたシグナル伝達ユニットの性質に応じて、これらの分子は、エフェクター応答を調節する［Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  Ｆ．及びＲａｖｅｔｃｈ  Ｊ．Ｖ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕ  Ｒｅｖ  ８（１）：３４〜４７］。
【００９２】
ヒト染色体レベルでは、３つの遺伝子が、ＦｃγＲＩ（ＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢ、ＦｃγＲＩＣ）及びＦｃγＲＩＩ（ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ）をコードし、２つの遺伝子が、ＦｃγＲＩＩＩ（ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ）をコードする。ＩｇＧ結合ヒトＦｃγ受容体の中で、ＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＣ、及びＦｃγＲＩＩＩＡタイプは、エフェクター機能の活性化を導く細胞質免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する、共通のγ−鎖シグナルアダプタータンパク質と膜結合することが示された。ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＣもまた、細胞質ＩＴＡＭを含むが、共通のγ−鎖シグナルアダプタータンパク質を有していない。同時に、ＦｃγＲＩＩＢは、免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）に連結している。ＩＴＩＭリン酸化をもたらすＦｃγＲＩＩＢの活性化は、活性化シグナル伝達カスケードの阻害をもたらす。ＦｃγＲＩＩＩＢは、チロシンベースの免疫調整細胞質側末端のどちらかを欠くが、ＧＰＩ（グリコシルホスファチジルイノシトール）アンカーを有し、ＦｃγＲＩＩＡの存在下においていくつかの顆粒球の活性化に寄与することが示された。
【表４】
2014504265.tif 000017
【００９３】
ＩＴＡＭ及びＩＴＩＭモチーフ並びに関連する受容体分子の機能的な役割が知られているが、組合せにおけるシグナル伝達の調整の性質及びメカニズムは、とりわけ、シグナル伝達に関与する多数の他の免疫細胞表面受容体及びアダプター分子（例えばＢＣＲ、ＣＤ２２、ＣＤ４５など）の活性と組み合わせる場合、完全に理解されていない。この関連において、精巧な選択性プロファイルによりこれらのＦｃγ受容体と相互作用することができるＦｃ様分子の設計は、わずかな調節活性によりそのような受容体分子の効果をデコンボリュートし（ｄｅ−ｃｏｎｖｏｌｕｔｅ）、調整するための任意の試みにおいて、有益な足場となる。
【００９４】
ＦｃγＲを区別することができる抗体分子の設計との関連において、試みは、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩ受容体タイプの細胞外Ｆｃ結合部が、祖先の部分的重複に少なくとも部分的に起因し得る高度な配列類似性を示す（図１５）という事実によって複雑になる。２つの主なタイプのＦｃγＲＩＩ受容体、Ａ及びＢは、６９％の配列同一性を有するが、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＩＡは、約４４％の配列同一性を示す。ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＣは、細胞外領域において２つの残基によってしか異ならないが、それらは、細胞内領域において著しく異なる。注目すべきは、それぞれ、ＩＴＩＭ及びＩＴＡＭモチーフの存在である。その結果として、一方の受容体に結合することが必要とされる治療用抗体分子がまた、可能性として他の受容体クラスにも結合し、おそらく意図されない治療効果をもたらすであろうということが予期され得る。
【００９５】
さらに面倒なことには、それぞれの受容体クラスは、複数の一塩基多型（ＳＮＰ）及びコピー数多型（ＣＮＶ）を示す。結果として生じる受容体多様性は、ＩｇＧに対するそれらの親和性及び作用のそのメカニズムに異なって影響を与える。これらの遺伝的変異は、Ｆｃγ受容体に対する特定のＩｇＧサブクラスの親和性に影響を及ぼし、下流のエフェクター事象を変化させ又は受容体発現のレベルを変化させるメカニズムに影響を与え、機能的に関連する表現型、非機能性又は機能的に未知の受容体変異体をもたらし得る（Ｂｏｕｒｎａｚｏｓ  Ｓ．；Ｗｏｏｆ  Ｊ．Ｍ．；Ｈａｒｔ  Ｓ．Ｐ．及びＤｒａｎｓｆｉｅｌｄ  Ｉ．（２００９）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５７（２）：２４４〜５４）。それらは、可能性として複雑な影響を導き、活性化及び阻害性受容体シグナル伝達の間のバランスを変化させ、疾患感受性の表現型の生成をもたらす。
【００９６】
これらの対立遺伝子変異のうちのいくつかを表Ｃに列挙する。特に、ＦｃγＲＩＩａにおけるＲ１３１変異体は、ＩｇＧ１と高レスポンダーであるが、代替のＨ１３１変異体は、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３とより効率的な相互作用を示す。ＦｃγＲＩＩＩａの場合には、１５８位のＶについてホモ接合性のドナーは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に対する前者のアロタイプのより高度な親和性により、ホモ接合性Ｆ／Ｆ１５８個人と比較して、増大したＮＫ細胞活性を示す。ＦｃγＲＩＩＩｂの対立遺伝子変異体ＮＡ１及びＮＡ２は、受容体のグリコシル化における差異をひいては導く４つのアミノ酸置換の結果である。ＮＡ１対立遺伝子は、好中球による免疫複合体の結合の増強及び食作用を示す。ＦｃγＲＩＩＢは、２つの既知の対立遺伝子変異体、２３２Ｉ及び２３２Ｔを有する。２３２Ｔ変異体は、その負の調節活性が強く損なわれていることが知られている。ＦｃγＲ多型の頻度並びに感染に対する特異な応答性又は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、脈管炎、免疫媒介性血小板減少性紫斑病（ｉｍｍｕｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ）（ＩＴＰ）、重症筋無力症、多発性硬化症（ＭＳ）、及び免疫ニューロパチー（ｉｍｍｕｎｏ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）（ギラン−バレー症候群（ＧＢＳ））などのような疾患状態に対する素因に対するその関連が、報告されている。
【００９７】
ＦｃγＲ遺伝子の、特に、ＦｃγＲＩＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩｃ、及びＦｃγＲＩＩＩＡについての座におけるコピー数多型が、示されており、これらの受容体の細胞表面発現に対するこれらの差異のさらなる相関が注目されてきた。対照的に、ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｂは、遺伝子コピー数多型を示さない。ＦｃγＲＩＩＩｂの低コピー数は、実際に、自己免疫疾患全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）における糸球体腎炎に関連した［Ａｉｔｍａｎ  ＴＪら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ１６；４３９（７０７８）：８５１〜５］。非シグナル伝達ＧＰＩモジュールがＦｃγＲＩＩＩｂ受容体を固定するという事実を考慮すれば、これは特に興味深い。これらのＦｃγＲＩＩＩｂ受容体の存在が他のシグナル伝達ＦｃγＲとのＦｃ相互作用の競合的阻害剤として可能性として作用し得るということを仮定することができる。ＦｃγＲＩＩｃにおけるコピー数多型の効果もまた、とりわけ興味深い。ＦｃγＲＩＩｃにおける２０２位のＣ／Ｔ  ＳＮＰは、グルタミン残基を終止コドンに変換し、機能性タンパク質の生成を妨げる。ＦｃγＲＩＩｃの機能性オープンリーディングフレームは、健康な個人（白人人口）の９％において発現され、ＩＴＰ集団において対立遺伝子の著しい過剰出現（１９％）があり、ＩＴＰに対するこれらの表現型の素因を暗示する［Ｂｒｅｕｎｉｓ  ＷＢら（２００８）Ｂｌｏｏｄ１１１（３）：１０２９〜３８］。ＮＫ細胞上に機能性ＦｃγＲＩＩｃを発現する個人において、達成されるＡＤＣＣは、ＦｃγＲＩＩＩａよりも大きな程度までこれらの受容体によって媒介されることが実証されている。これらの多型及び遺伝的変異と関連するそのような複雑性は、高度なテーラード治療を必要とする、個人化された治療戦略の必要性を強調する。
【００９８】
様々なエフェクター細胞は、これらのＦｃγ受容体の提示並びにそれらの体液及び組織分布が異なり、したがって、活性化及び作用のそれらのメカニズムにおける違いの一因となる［表Ｄ］。特異的なＦｃγＲタイプの認識に対する治療用抗体の選択性のチューニング及びあるクラスのエフェクター細胞の影響の調整は、特定の疾患状態についてのエフェクターメカニズムの最適化を導く。これは、治療されている疾患状態に応じて、特異的なエフェクターモダリティーを選択的に活性化する又は阻害することを意味する。
【表５】
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【００９９】
さらに、ＦｃγＲはまた、濾胞樹状細胞、内皮細胞、小グリア細胞、破骨細胞、及びメサンギウム細胞によっても発現される。現在、これらの他の細胞についてのＦｃγＲ発現の機能的な有意性は、知られていない。
【０１００】
高親和性ＦｃγＲＩは、３つのＣ型免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメインから構成されるが、低親和性ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩは、それぞれ、２つのＣ型ＩｇＳＦドメインから構成される。ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩｂ受容体タンパク質の構造は、結晶学によって解明された。これらの構造の２つのＩｇＳＦドメインは、互いに関して５０〜５５度で位置し、ヒンジによってつながれている。
【０１０１】
Ｆｃ−ＦｃγＲ共複合体（ｃｏ−ｃｏｍｐｌｅｘ）の公的に入手可能な構造は、Ｆｃ−ＦｃγＲＩＩＩｂ系のものであり、複合体のＦｃγＲの形状は、タンパク質のａｐｏ状態において観察されるものに非常に近い形状に維持されている［Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  Ｐ．；Ｈｕｂｅｒ  Ｒ．；Ｏｏｓｔｈｕｉｚｅｎ  Ｖ．及びＪａｃｏｂ  Ｕ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０６、２６７〜２７３；Ｒａｄａｅｖ  Ｓ．；Ｍｏｔｙａｋａ  Ｓ．；Ｆｒｉｄｍａｎ  Ｗ．；Ｓａｕｔｅｓ−Ｆｒｉｄｍａｎ  Ｃ．及びＳｕｎ  Ｐ．Ｄ．（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６、１６４６９〜１６４７７；Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  Ｐ．ら  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．２００２年８月；３０（４）：４８１〜６；Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  Ｐ，Ｏｏｓｔｈｕｉｚｅｎ  Ｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．２００２年６月３日；８２（１−２）：５１〜６；Ｒａｄａｅｖ  Ｓ、Ｓｕｎ  Ｐ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２年５月；３８（１４）：１０７３〜８３］［図１６］。受容体の間の有力な配列及び構造の類似性は、他の受容体に結合するＦｃの相対的なモデルの基礎を形成する。他方では、これらの受容体分子の間の配列及び構造の類似性はまた、受容体及びそれらの多様なアイソタイプの間の精巧な選択性を有するＦｃの設計を困難にもする。
【０１０２】
結晶学に基づいたＦｃ−ＦｃγＲ複合体の構造の評価の前に、Ｆｃ分子における２倍の対称軸が、Ｆｃ−ＦｃγＲ結合について２つの可能性のある結合部位及び有効な２：１化学量論を意味するかどうかという疑問があった。Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用の核磁気共鳴（ＮＭＲ）ベースの構造研究は、Ｆｃの分子の一方の面上での１つのＦｃγＲへの結合が、同じ抗体分子のＦｃに対する第２のＦｃγＲ分子の結合を防止するコンフォメーション変化を誘発することを示す［Ｋａｔｏ  Ｋ．ら（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２９５（２）：２１３〜２４］。Ｆｃ−ＦｃγＲＩＩＩｂの入手可能な共結晶複合体の形状により、１：１化学量論での非対称性の配向でのＦｃへのＦｃγＲの結合が確認される。図１６において示されるように、ＦｃγＲは、馬蹄形をしたＦｃ分子の一方の末端のくぼみに結合し、両方の鎖由来のＣＨ２ドメインに接している。
【０１０３】
アラニンスキャニング突然変異誘発［Ｓｈｉｅｌｄｓ  ＲＬら（２００１）ＪＢＣ  ２７６（９）：６５９１〜６０４］は、多様な受容体タイプと連結し、よってＦｃ−ＦｃγＲ相互作用及び認識に関与する、Ｆｃの残基に対する見識を提供する。従来より、治療用抗体の最適化は、活性化受容体ＦｃγＲＩＩＩへの結合の増大［米国特許第６，７３７，０５６号］又はＦｃγＲＩＩｂへの親和性の減少［ＵＳ２００９／００１０９２０Ａ１］を示す突然変異に集中してきた。これらのすべての代替の変異体において、突然変異は、両方の鎖に同時に導入される。
【０１０４】
モノクローナル抗体は、多くの場合、標的及びエフェクター免疫細胞の空間的な局在化を誘発することによってそれらの治療活性を示す。自然抗体は、そのＦａｂドメインを使用して標的及びＦｃドメインを使用してエフェクター細胞と相互作用することによってこれを媒介する。それらは、細胞媒介性の応答を誘発することができるように、エフェクター細胞と向かい合って、免疫複合体を並列させる（ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎ）ことができる。複数の抗体分子による単一の標的のターゲティングを伴う免疫複合体の形成の際に生じるＦｃγＲシグナル伝達に必要なアビディティー効果は、免疫作用における時空間的構成の有意な他の例である。
【０１０５】
ｍＡｂ分子のエフェクター活性の一部として誘発される細胞シグナル伝達にも時空間的側面がある。ＦｃγＲ分子活性化に基づくものなどのような細胞シグナル伝達は、脂質ラフトと呼ばれる膜ドメインの領域内での関連する受容体分子の局在化を伴う。脂質ラフトは、スフィンゴ糖脂質及びコレステロール並びにＳｒｃファミリーキナーゼを含む、いくつかのクラスの上流シグナルトランスデューサーが豊富である。細胞刺激に際して、様々なシグナル伝達分子、アダプタータンパク質、及びシグナル伝達キナーゼ並びにホスファターゼが、動員される。脂質ラフトでの分子の集合は、シグナル伝達に重要である。
【０１０６】
より良い結合特性をもたらすために異なる抗原特異性及びアビディティーの増大を組み合わせる非自然設計戦略は、二重特異性治療薬設計の基礎である。二重特異性抗体又は二重特異性若しくは多重機能性タンパク質治療薬の他の形態は、標的及び様々なエフェクター細胞の間の相互作用を媒介するように設計される［Ｍｕｌｌｅｒ  ＆  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２０１０）ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２４（２）：８９〜９８］。多重特異性治療用分子は、特異的な標的細胞に対してヘルパーＴ細胞又は他の免疫エフェクター細胞を再び方向付けるように操作される。
【０１０７】
他の実施形態では、本発明は、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、及び／又はＦｃγＲＩＩＩａに対する計算された結合親和性に基づいてｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにおいてＦｃ変異体ポリペプチドを同定するための方法に関する。他の実施形態では、方法が、当該Ｆｃ変異体ポリペプチドの静電気、溶媒和、パッキング、パッキング密度、水素結合、及びエントロピー効果をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにおいて計算することをさらに含む。さらに他の実施形態では、本発明の方法が、Ｆｃ変異体ポリペプチドを構築すること及び治療用抗体との関連において当該ポリペプチドを発現させること及び哺乳動物細胞において当該抗体をさらに発現させることをさらに含む。さらに他の実施形態では、本発明の方法が、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲベースの突然変異誘発、カセット突然変異誘発、又は新規合成によってｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにおいて同定されるＦｃ変異体ポリペプチドを構築することを含む。
【０１０８】
合成Ｆｃ足場の設計において考慮に入れられる因子は、立体反発についてのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにおける計算、埋没した境界面面積の変化、相対的な接触密度、相対的な溶媒和、及び静電効果を含む。これらのマトリックスはすべて、親和性スコアになるように使用した。
【０１０９】
一態様では、本出願は、ヘテロ二量体Ｆｃに基づいて構築された非対称性の足場の設計を介して精巧なＦｃγＲ選択性プロファイルを達成するための分子設計を記載する。この足場は、様々な新規な選択性プロファイルを達成するためにＣＨ２ドメインにおける非対称性の突然変異を考慮する。さらに、足場は、多機能性（二、三、四、又は五機能性）治療用分子のエンジニアリングのための本質的な特徴を有する。
【０１１０】
非対称性の足場は、分子のより良い再利用を可能にし、その半減期及び関連する薬物動態学的特性を増強するために、新生Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対するｐＨ依存性の結合特性について最適化することができる。
【０１１１】
非対称性の足場は、機能的に関連するＦｃγＲＩ受容体アロタイプへの結合について最適化することができる。ＦｃγＲＩは、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、乾癬、及び多くの肺疾患などのような慢性の炎症性障害に関与するマクロファージ上の顕著なマーカーである。
【０１１２】
非対称性の足場は、プロテインＡ結合について最適化することができる。プロテインＡ結合は、多くの場合、抗体分子の分離及び精製のために使用される。突然変異は、保存の間の治療薬の凝集を避けるために、非対称性の足場中に導入することができる。
【０１１３】
そのため、本発明のＦｃ変異体は、とりわけ、血清半減期の増大、結合親和性の増大、免疫原性の低下、産生の増大、ＡＤＣＣ若しくはＣＤＣ活性の増強若しくは低下、グリコシル化及び／又はジスルフィド結合の変化、並びに結合特異性の改変を含むが、これらに限定されない、好ましい特徴を有する抗体をもたらす、１つ又は複数のさらなるアミノ酸残基置換、突然変異、及び／又は改変を含有していてもよいことが特に企図される。
【０１１４】
本発明のＦｃ変異体は、類似の分子に比べて、哺乳動物、特にヒトにおけるｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期（例えば血清半減期）の増大；ｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば血清半減期）及び／若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば有効期間）における安定性の増大、並びに／又は融解温度（Ｔｍ）の増大を含む、他の変化した特徴を有していてもよいことが企図される。一実施形態では、本発明のＦｃ変異体が、１５日を超える、２０日を超える、２５日を超える、３０日を超える、３５日を超える、４０日を超える、４５日を超える、２か月を超える、３か月を超える、４か月を超える、又は５か月を超える、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期を有する。他の実施形態では、本発明のＦｃ変異体が、１５日を超える、３０日を超える、２か月を超える、３か月を超える、６か月を超える、又は１２か月を超える、又は２４か月を超える、又は３６か月を超える、又は６０か月を超える、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける半減期を有する（例えば液体、又は粉末製剤）。
【０１１５】
本発明のＦｃ変異体は、対象に投与される場合、変化した免疫原性を有していてもよいこともまた、当業者によって十分に理解されるであろう。したがって、Ｆｃ変異体の免疫原性を最小限にする変異体ＣＨ３ドメインは、治療上の適用に一般により望ましいことが企図される。
【０１１６】
本発明のＦｃ変異体は、エフェクター機能を変化させる改変を含むが、これらに限定されない他のＦｃ改変と組み合わせてもよい。本発明は、抗体又はＦｃ融合タンパク質において付加的な、相乗的な、又は新規な特性をもたらすために、他のＦｃ改変と本発明のＦｃ変異体を組み合わせることを包含する。そのような改変は、ヒンジ、ＣＨ１、若しくはＣＨ２（又は、それが、本発明の変異体ＣＨ３ドメインの安定性及び純度の特性を負に変化させないことを条件として、ＣＨ３）ドメイン又はその組合せにおけるものであってもよい。本発明のＦｃ変異体が、それらが組み合わせられる改変の特性を増強することが企図される。例えば、本発明のＦｃ変異体が、野生型Ｆｃ領域を含む類似の分子よりも高度な親和性でＦｃγＲＩＩＩＡに結合することが知られている突然変異体と組み合わせる場合、本発明の突然変異体との組合せは、ＦｃγＲＩＩＩＡ親和性において数倍高い増強をもたらす。
【０１１７】
一実施形態では、本発明のＦｃ変異体は、Ｄｕｎｃａｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：５６３〜５６４；Ｌｕｎｄら、１９９１、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４７：２６５７〜２６６２；Ｌｕｎｄら、１９９２、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９：５３〜５９；Ａｌｅｇｒｅら、１９９４、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５７：１５３７〜１５４３；Ｈｕｔｃｈｉｎｓら、１９９５、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：１１９８０〜１１９８４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．４４：１１１〜１１７；Ｌｕｎｄら、１９９５、Ｆａｓｅｂ  Ｊ  ９：１１５〜１１９；Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ５４：１０１〜１０４；Ｌｕｎｄら、１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７：４９６３〜４９６９；Ａｒｍｏｕｒら、１９９９、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９：２６１３〜２６２４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、２０００、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：４１７８〜４１８４；Ｒｅｄｄｙら、２０００、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：１９２５〜１９３３；Ｘｕら、２０００、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００：１６〜２６；Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、２００１、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６：２５７１〜２５７５；Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：６５９１〜６６０４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、２００２、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８２：５７〜６５；Ｐｒｅｓｔａら、２００２、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ  ３０：４８７〜４９０）；米国特許第５，６２４，８２１号；第５，８８５，５７３号；第６，１９４，５５１号；米国特許出願第６０／６０１，６３４号及び第６０／６０８，８５２号；ＰＣＴ公開ＷＯ００／４２０７２及びＷＯ９９／５８５７２において開示されるものなどのような他の既知のＦｃ変異体と組み合わせてもよい。
【０１１８】
当業者は、本発明のＦｃ変異体が、変化したＦｃリガンド（例えばＦｃγＲ、Ｃ１ｑ）結合特性（結合特性の例は、結合特異性、平衡解離定数（ＫＤ）、分離及び結合速度（それぞれ、Ｋｏｆｆ及びＫｏｎ）、結合親和性、並びに／又はアビディティーであるが、これらに限定されない）を有していてもよいこと並びにある種の変化が多かれ少なかれ望ましいことを理解するであろう。平衡解離定数（ＫＤ）がｋｏｆｆ／ｋｏｎとして定義されることは当技術分野においてよく知られている。低ＫＤを有する結合分子（例えば、及び抗体）が高ＫＤを有する結合分子（例えば、及び抗体）より好ましいことは一般に理解される。しかしながら、いくつかの場合において、ｋｏｎ又はｋｏｆｆの値は、ＫＤの値よりも関連している可能性がある。当業者は、どの動力学的パラメーターが所定の抗体適用にとって最も重要かを決定することができる。例えば、負の制御因子ＦｃγＲＩＩＢへのＦｃ結合を不変のままにしながら又はさらに低下させながら、１つ又は複数の正の制御因子（例えばＦｃγＲＩＩＩＡ）へのＦｃ結合を増強する改変ＣＨ３及び／又はＣＨ２は、ＡＤＣＣ活性の増強にとってより好都合であろう。その代わりに、１つ若しくは複数の正の制御因子への結合を低下させる及び／又はＦｃγＲＩＩＢへの結合を増強する改変ＣＨ３及び／又はＣＨ２は、ＡＤＣＣ活性を低下させるのに好都合であろう。したがって、結合親和性（例えば平衡解離定数（ＫＤ））の比は、Ｆｃ変異体のＡＤＣＣ活性が増強される又は減少することを示すことができる。例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＢ平衡解離定数（ＫＤ）の比の減少は、ＡＤＣＣ活性の改善と相互に関係するであろうが、比の増大は、ＡＤＣＣ活性の減少と相互に関係するであろう。
【０１１９】
Ｆｃ変異体の特徴付けの一部として、それらは、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）及びＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２ｂ）に対する結合親和性について試験され、野生型ＩｇＧ１と比較した比として報告された（例４及び表５を参照されたい）。この場合では、活性化及び阻害性Ｆｃ受容体への結合に対するＣＨ３ドメイン突然変異の影響を評価することが可能であった。一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、安定性が増大したヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ３ドメインが、７０℃を超える融解温度（Ｔｍ）を有し、ＣＤ１６ａへのヘテロ二量体の結合が、野生型ホモ二量体と比較してほぼ同じである、単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。ある実施形態では、ＣＤ１６ａへのヘテロ二量体の結合が、野生型ホモ二量体と比較して、増大する。代替の実施形態では、ＣＤ１６ａへのヘテロ二量体の結合が、野生型ホモ二量体と比較して、低下する。
【０１２０】
ある実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む単離ヘテロ多量体であって、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、安定性が増大したヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ３ドメインが、７０℃を超える融解温度（Ｔｍ）を有し、ＣＤ３２ｂへのヘテロ二量体の結合が、野生型ホモ二量体と比較してほぼ同じである、単離ヘテロ多量体が本明細書において提供される。ある実施形態では、ＣＤ３２ｂへのヘテロ二量体の結合が、野生型ホモ二量体と比較して、増大する。代替の実施形態では、ＣＤ３２ｂへのヘテロ二量体の結合が、野生型ホモ二量体と比較して、低下する。
【０１２１】
当業者は、野生型ホモ二量体に対するＦｃ変異体の比として結合ＣＤ１６ａ及びＣＤ３２ｂのＫＤを報告する代わりに、ＣＤ３２ｂへのＦｃ変異体結合に対するＣＤ１６ａへのＦｃ変異体結合の比としてＫＤを報告することができることを理解するであろう（データ示さず）。この比は、より詳細に下記に記載される、ＡＤＣＣに対する変異体ＣＨ３ドメイン突然変異の指標、野生型と比較して不変、増大〜減少を提供するであろう。
【０１２２】
ＦｃγＲに対する本発明のＦｃ変異体の親和性及び結合特性は、ＥＬＩＳＡアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイ（以下の「特徴付け及び機能的アッセイ」と題する部を参照されたい）、並びに間接的結合アッセイ、競合的阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、ゲル電気泳動、及びクロマトグラフィー（例えばゲル濾過）などのような他の方法を含むが、これらに限定されない、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用、つまりＦｃγＲに対するＦｃ領域の特異的な結合を決定するための、当技術分野において既知のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるアッセイ（生化学又は免疫学ベースのアッセイ）を使用して、最初に決定される。これら及び他の方法は、検査されている１つ若しくは複数の構成成分上に標識を利用してもよく、且つ／又は発色性、蛍光、発光、若しくは同位体標識を含むが、これらに限定されない様々な検出方法を用いてもよい。結合親和性及び反応速度の詳細な説明は、抗体−免疫原相互作用に集中しているＰａｕｌ，Ｗ．Ｅ．編、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９９）において見出すことができる。
【０１２３】
本発明の分子の結合特性はまた、１つ又は複数のＦｃγＲメディエーターエフェクター細胞機能を決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける機能的アッセイによって特徴付けられることが企図される（以下の「特徴付け及び機能的アッセイ」と題する部を参照されたい）。ある実施形態では、本発明の分子が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏベースのアッセイにおけるように、ｉｎ  ｖｉｖｏモデル（本明細書において記載され開示されるものなど）において同様の結合特性を有する。しかしながら、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏベースのアッセイにおいて所望の表現型を示さないが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて所望の表現型を示す、本発明の分子を排除しない。
【０１２４】
本発明は、類似の分子に比べて、増大した親和性でＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）に結合するＦｃ変異体を包含する。特定の実施形態では、本発明のＦｃ変異体は、増大した親和性でＦｃγＲＩＩＩＡに結合し、類似の分子に比べて、不変である又は低下した結合親和性でＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２ｂ）に結合する。さらに他の実施形態では、本発明のＦｃ変異体が、類似の分子に比べて減少した、ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＢ平衡解離定数（ＫＤ）の比を有する。
【０１２５】
類似の分子に比べて、減少した親和性でＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）に結合するＦｃ変異体もまた、本発明によって包含される。特定の実施形態では、本発明のＦｃ変異体は、類似の分子に比べて、減少した親和性でＦｃγＲＩＩＩＡに結合し、類似の分子に比べて、不変である又は増大した結合親和性でＦｃγＲＩＩＢに結合する。
【０１２６】
一実施形態では、Ｆｃ変異体が、増大した親和性でＦｃγＲＩＩＩＡに結合する。特定の実施形態では、当該Ｆｃ変異体が、類似の分子の少なくとも２倍又は少なくとも３倍又は少なくとも５倍又は少なくとも７倍又は少なくとも１０倍又は少なくとも２０倍又は少なくとも３０倍又は少なくとも４０倍又は少なくとも５０倍又は少なくとも６０倍又は少なくとも７０倍又は少なくとも８０倍又は少なくとも９０倍又は少なくとも１００倍又は少なくとも２００倍を超える、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性を有する。他の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて少なくとも１０％又は少なくとも２０％又は少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％又は少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくともＳ０％又は少なくとも９０％又は少なくとも１００％又は少なくとも１５０％又は少なくとも２００％まで増大したＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性を有する。
【０１２７】
他の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて約２分の１〜１０分の１又は約５分の１〜５０分の１又は約２５分の１〜２５０分の１又は約１００分の１〜５００分の１又は約２５０分の１〜１０００分の１まで減少した、Ｆｃリガンド（例えばＦｃγＲ、Ｃ１ｑ）に対する平衡解離定数（ＫＤ）を有する。
【０１２８】
他の実施形態では、当該Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて少なくとも２分の１又は少なくとも３分の１又は少なくとも５分の１又は少なくとも７分の１又は少なくとも１０分の１又は少なくとも２０分の１又は少なくとも３０分の１又は少なくとも４０分の１又は少なくとも５０分の１又は少なくとも６０分の１又は少なくとも７０分の１又は少なくとも８０分の１又は少なくとも９０分の１又は少なくとも１００分の１又は少なくとも２００分の１又は少なくとも４００分の１又は少なくとも６００分の１まで低下した、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する平衡解離定数（ＫＤ）を有する。他の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて少なくとも１０％又は少なくとも２０％又は少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％又は少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％又は少なくとも１００％又は少なくとも１５０％又は少なくとも２００％まで低下した、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する平衡解離定数（ＫＤ）を有する。
【０１２９】
一実施形態では、Ｆｃ変異体が、不変である又は低下した親和性でＦｃγＲＩＩＢに結合する。特定の実施形態では、当該Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて不変である又は少なくとも１分の１まで若しくは少なくとも３分の１まで若しくは少なくとも５分の１まで若しくは少なくとも１０分の１まで若しくは少なくとも２０分の１まで若しくは少なくとも５０分の１まで若しくは少なくとも１００分の１まで低下したＦｃγＲＩＩＢに対する親和性を有する。他の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて不変である又は少なくとも１０％若しくは少なくとも２０％若しくは少なくとも３０％若しくは少なくとも４０％若しくは少なくとも５０％若しくは少なくとも６０％若しくは少なくとも７０％若しくは少なくとも８０％若しくは少なくとも９０％若しくは少なくとも１００％若しくは少なくとも１５０％若しくは少なくとも２００％まで低下したＦｃγＲＩＩＢに対する親和性を有する。
【０１３０】
他の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて不変である又は少なくとも２倍若しくは少なくとも３倍若しくは少なくとも５倍若しくは少なくとも７倍若しくは少なくとも１０倍若しくは少なくとも２０倍若しくは少なくとも３０倍若しくは少なくとも４０倍若しくは少なくとも５０倍若しくは少なくとも６０倍若しくは少なくとも７０倍若しくは少なくともＳ０倍若しくは少なくとも９０倍若しくは少なくとも１００倍若しくは少なくとも２００倍まで増大したＦｃγＲＩＩＢに対する平衡解離定数（ＫＤ）を有する。他の特定の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて不変である又は少なくとも１０％若しくは少なくとも２０％若しくは少なくとも３０％若しくは少なくとも４０％若しくは少なくとも５０％若しくは少なくとも６０％若しくは少なくとも７０％若しくは少なくとも８０％若しくは少なくとも９０％若しくは少なくとも１００％若しくは少なくとも１５０％若しくは少なくとも２００％まで増大した、ＦｃγＲＩＩＢに対する平衡解離定数（ＫＤ）を有する。
【０１３１】
さらに他の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて増大した親和性でＦｃγＲＩＩＩＡに結合し、類似の分子に比べて不変である又は低下した親和性でＦｃγＲＩＩＢに結合する。特定の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて少なくとも１倍まで又は少なくとも３倍まで又は少なくとも５倍まで又は少なくとも１０倍まで又は少なくとも２０倍まで又は少なくとも５０倍まで又は少なくとも１００倍まで増大したＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性を有する。他の特定の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて不変である又は少なくとも２分の１若しくは少なくとも３分の１若しくは少なくとも５分の１若しくは少なくとも７分の１若しくは少なくとも１０分の１若しくは少なくとも２０分の１若しくは少なくとも５０分の１若しくは少なくとも１００分の１まで低下した、ＦｃγＲＩＩＢに対する親和性を有する。他の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて少なくとも１０％又は少なくとも２０％又は少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％又は少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％又は少なくとも１００％又は少なくとも１５０％又は少なくとも２００％まで増大したＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性を有し、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて不変である又は少なくとも１０％若しくは少なくとも２０％若しくは少なくとも３０％若しくは少なくとも４０％若しくは少なくとも５０％若しくは少なくとも６０％若しくは少なくとも７０％若しくは少なくとも８０％若しくは少なくとも９０％若しくは少なくとも１００％若しくは少なくとも１５０％若しくは少なくとも２００％まで増大したＦｃγＲＩＩＢに対する親和性を有する。
【０１３２】
さらに他の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて減少した、ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＢ平衡解離定数（ＫＤ）の比を有する。特定の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて少なくとも１分の１まで又は少なくとも３分の１まで又は少なくとも５分の１まで又は少なくとも１０分の１まで又は少なくとも２０分の１まで又は少なくとも５０分の１まで又は少なくとも１００分の１まで減少した、ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＢ平衡解離定数（ＫＤ）の比を有する。他の特定の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて少なくとも１０％又は少なくとも２０％又は少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％又は少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％又は少なくとも１００％又は少なくとも１５０％又は少なくとも２００％まで減少した、ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＢ平衡解離定数（ＫＤ）の比を有する。
【０１３３】
他の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて減少した親和性でＦｃγＲＩＩＩＡに結合する。特定の実施形態では、当該Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて少なくとも１分の１まで又は少なくとも３分の１まで又は少なくとも５分の１まで又は少なくとも１０分の１まで又は少なくとも２０分の１まで又は少なくとも５０分の１まで又は少なくとも１００分の１まで低下した、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性を有する。他の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて少なくとも１０％又は少なくとも２０％又は少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％又は少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％又は少なくとも１００％又は少なくとも１５０％又は少なくとも２００％まで減少した、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性を有する。
【０１３４】
さらに他の実施形態では、Ｆｃ変異体が、減少した親和性でＦｃγＲＩＩＩＡに結合し、類似の分子に比べて不変である又は増大した親和性でＦｃγＲＩＩＢに結合する。特定の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて少なくとも１分の１まで又は少なくとも３分の１まで又は少なくとも５分の１まで又は少なくとも１０分の１まで又は少なくとも２０分の１まで又は少なくとも５０分の１まで又は少なくとも１００分の１まで低下したＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性を有する。他の特定の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子の少なくとも２倍又は少なくとも３倍又は少なくとも５倍又は少なくとも７倍又は少なくとも１０倍又は少なくとも２０倍又は少なくとも５０倍又は少なくとも１００を超えるＦｃγＲＩＩＢに対する親和性を有する。他の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて少なくとも１０％又は少なくとも２０％又は少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％又は少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％又は少なくとも１００％又は少なくとも１５０％又は少なくとも２００％まで減少した、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性を有し、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて少なくとも１０％又は少なくとも２０％又は少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％又は少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％又は少なくとも１００％又は少なくとも１５０％又は少なくとも２００％まで増大したＦｃγＲＩＩＢに対する親和性を有する。
【０１３５】
さらに他の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子と比較した場合、少なくとも１倍まで又は少なくとも３倍まで又は少なくとも５倍まで又は少なくとも１０まで又は少なくとも２０倍まで又は少なくとも５０倍まで増大した、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する平衡解離定数（ＫＤ）を有する。特定の実施形態では、当該Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて少なくとも２分の１に又は少なくとも３分の１に又は少なくとも５分の１に又は少なくとも７分の１に又は少なくとも１０分の１に又は少なくとも２０分の１に又は少なくとも５０分の１に又は少なくとも１００分の１まで減少した、ＦｃγＲＩＩＢに対する平衡解離定数（ＫＤ）を有する。
【０１３６】
ｆｃγＲ選択性についてのＣＨ２変異
この複合体におけるＦｃ−ＦｃγＲタンパク質間相互作用は、Ｆｃ分子中の２つの鎖がＦｃγＲ分子上の２つの異なる部位と相互作用することを示す。自然Ｆｃ分子では２つの重鎖において対称性があるが、一方の鎖上の残基のまわりの局所的なＦｃγＲ環境は、反対のＦｃ鎖上の同じ残基位置を取り囲むＦｃγＲ残基とは異なる。２つの対称に関連する位置は、異なる選択のＦｃγＲ残基と相互作用する。
【０１３７】
ＦｃγＲへのＦｃの結合における非対称性を考慮すれば、Ｆｃ分子のＡ鎖及びＢ鎖における同時の突然変異は、ＦｃγＲとの相互作用に対称な様式では影響を与えない。ホモ二量体Ｆｃ構造において、その局所的なＦｃγＲ環境を有するＦｃの一方の鎖上の相互作用を最適化するために突然変異を導入する場合、第２の鎖における対応する突然変異は、好ましい、好ましくない、又は必要とされるＦｃγＲ結合及び選択性プロファイルに寄与しない可能性がある。
【０１３８】
構造及びコンピューターの使用により導かれるアプローチを使用して、Ｆｃの両方の鎖上に同じ突然変異を導入する従来のＦｃエンジニアリング戦略のこれらの限界を克服するために、非対称性の突然変異を、Ｆｃの２つの鎖において操作する。Ｆｃの２つの鎖が受容体分子のそれらの対応する面に対する結合の増強のために独立して最適化される場合、受容体の間で、より良い結合選択性を達成することができる。
【０１３９】
例えば、Ｆｃの一方の鎖上の特定の位置の突然変異は、特定の残基に対する選択性を増強するために設計することができるが、正の設計の試み、同じ残基位置は、代替のＦｃγ受容体タイプにおけるその局所的な環境と不都合に相互作用するように突然変異させることができ、負の設計の試み、よって、２つの受容体の間でより良い選択性が達成される。ある実施形態では、異なるＦｃガンマ受容体と比較して、あるＦｃガンマ受容体に選択的に結合する（例えば、ＦｃｇＲＩＩｂの代わりにＦｃｇＲＩＩＩａに選択的に結合する）、ＣＨ２ドメインにおける非対称性のアミノ酸改変を設計するための方法が、提供される。他のある実施形態では、ヘテロ二量体形成を促進するＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸改変を含む変異体Ｆｃヘテロ二量体のＣＨ２ドメインにおける非対称性のアミノ酸改変を設計するための方法が、提供される。他の実施形態では、ＣＨ２ドメインにおける非対称性のアミノ酸改変を含む変異体Ｆｃヘテロ二量体に基づいて異なるＦｃガンマ受容体に対する選択性を設計するための方法が、提供される。さらに他の実施形態では、Ｆｃ分子の一方の面へのＦｃガンマ受容体の結合を偏らせる非対称性のアミノ酸改変を設計するための方法が、提供される。他のある実施形態では、ＣＨ２ドメインにおける非対称性のアミノ酸改変を含む変異体Ｆｃヘテロ二量体の一方のみの面と相互作用するようにＦｃガンマ受容体を偏らせる極性ドライバーを設計するための方法が、提供される。
【０１４０】
ＣＨ２ドメインにおける突然変異の非対称性の設計は、Ｆｃ分子の一方の面上でＦｃγＲを認識するように調整することができる。これは、非対称性のＦｃ足場の生産的な面を構成するが、反対の面は、設計された選択性プロファイルを有さない野生型様の相互作用の性質を示し、非生産的な面と見なすことができる。負の設計戦略は、非対称性のＦｃ足場のこの側面に対するＦｃγＲ相互作用を遮断するために、非生産的な面上に突然変異を導入するために用い、それによって、Ｆｃγ受容体への所望の相互作用傾向を強いることができる。
【表６】
2014504265.tif 000019
【０１４１】
本発明はまた、Ｆｃ領域に融合された結合ドメインを含む融合ポリペプチドであって、Ｆｃ領域が、安定性が増大したヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ３ドメインが、７０℃を超える融解温度（Ｔｍ）を有する、融合ポリペプチドにも関する。変異体ＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体を含む分子は、当業者によく知られている方法によって生成されてもよいことが特に企図される。手短に言えば、そのような方法は、所望の特異性を有する可変領域又は結合ドメイン（例えば、ファージディスプレイ若しくは発現ライブラリーから単離された又はヒト若しくは非ヒト抗体又は受容体の結合ドメインに由来する可変領域）を変異体Ｆｃヘテロ二量体と組み合わせることを含むが、これらに限定されない。その代わりに、当業者は、Ｆｃ領域を含む分子（例えば抗体）のＦｃ領域中のＣＨ３ドメインを改変することによって、変異体Ｆｃヘテロ二量体を生成してもよい。
【０１４２】
一実施形態では、Ｆｃ変異体が、抗体又はＦｃ融合タンパク質である。特定の実施形態では、本発明は、安定性が増大したヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含むＦｃ領域を含む抗体であって、変異体ＣＨ３ドメインが、７０℃を超える融解温度（Ｔｍ）を有する、抗体を提供する。そのような抗体は、Ｆｃ変異体を生成するように改変することができるＣＨ３ドメインを含有するＦｃ領域を天然に含むＩｇＧ分子又は変異体ＣＨ３ドメインを含むＦｃ領域を含有するように操作された抗体誘導体を含む。本発明のＦｃ変異体は、変異体ＣＨ３ドメインを組み込むＦｃ領域を含む抗原に好ましくは特異的に結合する（つまり、特異的な抗原−抗体結合をアッセイするために当技術分野においてよく知られているイムノアッセイによって決定されるように非特異的結合に競合する）、任意の抗体分子を含む。そのような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、一重特異性、二重特異性、多重特異性、ヒト、ヒト化キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ、及びＶＬ若しくはＶＨドメインを含有する断片、又はさらに、ある場合には、変異体Ｆｃヘテロ二量体を含有するように操作された若しくはそれに融合された、抗原に特異的に結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むが、これらに限定されない。
【０１４３】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」は、ある種の細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合した、分泌された抗体により、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が、抗原治療（ａｎｔｉｇｅｎ−ｈｅａｌｉｎｇ）標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させるのを可能にする、細胞傷害の形態を指す。標的細胞の表面に対する特異的な高親和性ＩｇＧ抗体は、細胞傷害性細胞を「武装させ」、そのような死滅に絶対的に必要とされる。標的細胞の溶解は、細胞外のものであり、直接的な細胞間接触を必要とし、補体を伴わない。
【０１４４】
任意の特定の抗体がＡＤＣＣによって標的細胞の溶解を媒介する能力は、アッセイすることができる。ＡＤＣＣ活性を評価するために、対象の抗体は、免疫エフェクター細胞と組み合わせて標的細胞に添加され、これは、抗原−抗体複合体によって活性化され、標的細胞の細胞溶解をもたらし得る。細胞溶解は、溶解した細胞からの標識（例えば放射性基質、蛍光色素、又は自然細胞内タンパク質）の放出によって一般に検出される。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＡＤＣＣアッセイの特定の例は、Ｗｉｓｅｃａｒｖｅｒら、１９８５、７９：２７７；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、１９８７、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６６：１３５１；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、２００１、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５８：１８３；Ｐａｔｅｌら、１９９５  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：２９、並びに本明細書（以下の「特徴付け及び機能的アッセイ」と題する部を参照されたい）において記載される。その代わりに又はさらに、対象の抗体のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、１９９８、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：６５２において開示されるものなどのような動物モデルにおいて、評価されてもよい。
【０１４５】
本発明のＦｃ変異体は、１つ又は複数のＦｃγＲメディエーターエフェクター細胞機能を決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける機能的なアッセイによって特徴付けられることが企図される。特定の実施形態では、本発明の分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏベースのアッセイにおけるものと、ｉｎ  ｖｉｖｏモデル（本明細書において記載され、開示されるものなど）において、同様の結合特性及びエフェクター細胞機能を有する。しかしながら、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏベースのアッセイにおいて所望の表現型を示さないが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて所望の表現型を示す、本発明の分子を排除しない。
【０１４６】
本発明は、ＣＤＣ機能が増強したＦｃ変異体をさらに提供する。一実施形態では、Ｆｃ変異体が、増大したＣＤＣ活性を有する。一実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子の少なくとも２倍又は少なくとも３倍又は少なくとも５倍又は少なくとも１０倍又は少なくとも５０倍又は少なくとも１００倍を超えるＣＤＣ活性を有する。他の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子の少なくとも２倍又は少なくとも３倍又は少なくとも５倍又は少なくとも７倍又は少なくとも１０倍又は少なくとも２０倍又は少なくとも５０倍又は少なくとも１００倍を超える親和性でＣ１ｑに結合する。さらに他の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて少なくとも１０％又は少なくとも２０％又は少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％又は少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％又は少なくとも１００％又は少なくとも１５０％又は少なくとも２００％まで増大したＣＤＣ活性を有する。特定の実施形態では、本発明のＦｃ変異体が、増大した親和性でＣ１ｑに結合し、増強したＣＤＣ活性を有し、少なくとも１つの抗原に特異的に結合する。
【０１４７】
本発明はまた、低下したＣＤＣ機能を有するＦｃ変異体をも提供する。一実施形態では、Ｆｃ変異体が、低下したＣＤＣ活性を有する。一実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子の少なくとも２分の１又は少なくとも３分の１又は少なくとも５分の１又は少なくとも１０分の１又は少なくとも５０分の１又は少なくとも１００分の１のＣＤＣ活性を有する。他の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて少なくとも１分の１まで又は少なくとも３分の１まで又は少なくとも５分の１まで又は少なくとも１０分の１まで又は少なくとも２０分の１まで又は少なくとも５０倍分の１まで又は少なくとも１００分の１まで低下した親和性でＣ１ｑに結合する。他の実施形態では、Ｆｃ変異体が、類似の分子に比べて少なくとも１０％又は少なくとも２０％又は少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％又は少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％又は少なくとも１００％又は少なくとも１５０％又は少なくとも２００％まで減少したＣＤＣ活性を有する。特定の実施形態では、Ｆｃ変異体は、減少した親和性でＣ１ｑに結合し、低下したＣＤＣ活性を有し、少なくとも１つの抗原に特異的に結合する。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ変異体が、１つ又は複数の操作されたグリコフォーム、つまり、Ｆｃ領域を含む分子に共有結合された炭水化物組成物を含む。操作されたグリコフォームは、エフェクター機能を増強する又は低下させることを含むが、これらに限定されない様々な目的に有用であってもよい。操作されたグリコフォームは、当業者に知られている任意の方法によって、例えば、操作された若しくは変異体発現株を使用することによって、１つ若しくは複数の酵素、例えばβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩ１１）との同時発現によって、様々な生物若しくは様々な生物由来の細胞系においてＦｃ領域を含む分子を発現することによって、又はＦｃ領域を含む分子が発現された後に炭水化物（単数又は複数）を修飾することによって生成されてもよい。操作されたグリコフォームを生成するための方法は、当技術分野において知られており、Ｕｍａｎａら、１９９９、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：１７６〜１８０；Ｄａｖｉｅｓら、２００１７  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４：２８８〜２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００２、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３〜２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａら、２００３、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６〜３４７３）米国特許第６，６０２，６８４号；Ｕ．Ｓ．Ｓｅｒ．Ｎｏ．１０／２７７，３７０；Ｕ．Ｓ．Ｓｅｒ．Ｎｏ．１０／１１３，９２９；ＰＣＴ  ＷＯ００／６１７３９Ａ１；ＰＣＴ  ＷＯ０１／２９２２４６Ａ１；ＰＣＴ  ＷＯ０２／３１１１４０Ａ１；ＰＣＴ  ＷＯ０２／３０９５４Ａ１において記載されるもの；Ｐｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔ（商標）技術（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）グリコシル化エンジニアリング技術（ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むが、これらに限定されない。例えばＷＯ０００６１７３９；ＥＡ０１２２９１２５；ＵＳ２００３０１１５６１４；Ｏｋａｚａｋｉら、２００４、ＪＭＢ、３３６：１２３９〜４９を参照されたい。
【０１４９】
Ｆｃ変異体は、可変領域及びヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む抗体を含み、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、安定性が増大したヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸突然変異を含む変異体ＣＨ３ドメインを含み、変異体ＣＨ３ドメインは、７０℃を超える融解温度（Ｔｍ）を有することが企図される。抗体であるＦｃ変異体は、少なくとも１つの抗原に特異的に結合する可変ドメイン又はその断片を変異体ＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃ領域と組み合わせることによって、「新規に」産生されてもよい。その代わりに、ヘテロ二量体Ｆｃ変異体は、抗原に結合する抗体を含有するＦｃ領域のＣＨ３ドメインを改変することによって産生されてもよい。
【０１５０】
本発明の抗体は、合成抗体、モノクローナル抗体、組換え産生抗体、イントラボディ、一重特異性抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、単鎖ＦｖＦｃ（ｓｃＦｖＦｃ）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体を含むが、これらに限定されない。特に、本発明の方法において使用される抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分を含む。本発明の免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、又はサブクラスの免疫グロブリン分子とすることができる。
【０１５１】
本発明の抗体は、鳥及び哺乳動物（例えばヒト、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、又はニワトリ）を含む任意の動物起源からのものであってもよい。特定の実施形態では、抗体が、ヒト又はヒト化モノクローナル抗体、特に二重特異性モノクローナル抗体である。本明細書において使用されるように、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリー又はヒト遺伝子から抗体を発現するマウスから単離された抗体を含む。
【０１５２】
抗体は、すべてのポリペプチドと同様に、ポリペプチドが正味の荷電を持たないｐＨとして一般に定義される等電点（ｐＩ）を有する。タンパク質溶解性は、溶液のｐＨがタンパク質の等電点（ｐＩ）と等しい場合、典型的に最も低いことが当技術分野において知られている。ｐＩを調整するために、抗体中のイオン化可能な残基の数及び位置を変化させることによって、溶解性を最適化することが可能である。例えば、ポリペプチドのｐＩは、適切なアミノ酸置換を行うことによって動かすことができる（例えば、アラニンなどのような荷電していない残基とリシンなどのような荷電したアミノ酸を置換することによって）。あらゆる特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、当該抗体のｐＩの変化をもたらす、抗体のアミノ酸置換は、抗体の溶解性及び／又は安定性を改善してもよい。当業者は、どのアミノ酸置換が、所望のｐＩを達成するのに特定の抗体にとって最も適切であるかを理解するであろう。タンパク質のｐＩは、等電点電気泳動及び様々なコンピューターアルゴリズムを含むが、これらに限定されない様々な方法によって決定されてもよい（例えばＢｊｅｌｌｑｖｉｓｔら、１９９３、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １４：１０２３）。一実施形態では、本発明のＦｃ変異体のｐＩが、ｐＨ６．２〜ｐＨ８．０である。他の実施形態では、本発明の抗体のｐＩが、ｐＨ６．８〜ｐＨ７．４である。一実施形態では、本発明のＦｃ変異体のｐＩにおける変化をもたらす置換が、抗原に対するその結合親和性を著しく減少させないであろう。安定性が増大した変異体ＣＨ３ドメインはまた、ｐＩの変化をもたらしてもよいことが企図される。一実施形態では、変異体Ｆｃヘテロ二量体が、安定性及び純度の増大の両方並びにｐＩにおける任意の所望の変化を達成するために特に選ばれる。
【０１５３】
本発明の抗体は、一重特異性、二重特異性、三重特異性であってもよい又はより大きな多重特異性を有していてもよい。多重特異性抗体は、所望の標的分子の異なるエピトープに特異的に結合してもよい又は標的分子及び異種ポリペプチド若しくは固体支持体物質などのような異種エピトープの両方に特異的に結合してもよい。例えば、国際特許出願ＷＯ９４／０４６９０；ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ９１／００３６０；及びＷＯ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０〜６９；米国特許第４，４７４，８９３号；第４，７１４，６８１号；第４，９２５，６４８号；第５，５７３，９２０号、及び第５，６０１，８１９号、並びにＫｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７を参照されたい）。
【０１５４】
多機能性ターゲティング分子の様々な実施形態は、図２０において示されるように、この非対称性足場に基づいて設計することができる。
【０１５５】
多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する。そのような分子は、２つの抗原のみに通常結合するであろうが（つまり二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）、三重特異性抗体などのようなさらなる特異性を有する抗体は、本発明によって包含される。ＢｓＡｂの例は、限定を伴うことなく腫瘍細胞抗原に対する一方のアーム及び細胞傷害性分子に対する他方のアームを有するもの又は両方のアームが２つの異なる腫瘍細胞抗原に対するもの又は両方のアームが２つの異なる可溶性リガンドに対するもの又は一方のアームが可溶性リガンドに対し、他方のアームが細胞表面受容体に対するもの又は両方のアームが２つの異なる細胞表面受容体に対するものを含む。二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野において知られている。
【０１５６】
様々なアプローチに従って、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。融合は、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものであってもよい。軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）は、融合物の少なくとも１つにおいて存在することが企図される。免疫グロブリン重鎖融合物及び所望される場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別個の発現ベクターの中に挿入され、適した宿主生物の中にコトランスフェクトされる。これは、構築において使用される３つのポリペプチド鎖の不等な比が最適の収率をもたらす場合、実施形態において３つのポリペプチド断片の相互の割合を調整する際にすぐれた柔軟性を提供する。例１及び表２を参照されたい。しかしながら、等しい比の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高収率をもたらす場合又はその比が特に有意でない場合、１つの発現ベクター中に２又は３つすべてのポリペプチド鎖についてのコード配列を挿入することが可能である。
【０１５７】
二重特異性抗体は、架橋又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体のうちの一方は、アビジンに結合することができ、他方は、ビオチンに結合することができる。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞に不要な細胞を標的とさせること（米国特許第４，６７６，９８０号）並びにＨＩＶ感染の治療について（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、及びＥＰ０３０８９）提唱された。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋方法を使用して作製されてもよい。適した架橋作用物質は、当技術分野においてよく知られており、多くの架橋技術と共に、米国特許第４，６７６，９８０号において開示される。
【０１５８】
変異体ＣＨ３ドメインを組み込む２つを超える結合価を有する抗体及び本発明の結果として生じるＦｃヘテロ二量体が、企図される。例えば、三重特異性抗体は、調製することができる。例えばＴｕｔｔら  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）を参照されたい。
【０１５９】
本発明の抗体はまた、１５日を超える、２０日を超える、２５日を超える、３０日を超える、３５日を超える、４０日を超える、４５日を超える、２か月を超える、３か月を超える、４か月を超える、又は５か月を超える、哺乳動物（例えばヒト）における半減期（例えば血清半減期）を有するものをも包含する。哺乳動物（例えばヒト）における本発明の抗体の半減期の増大は、哺乳動物における、当該抗体又は抗体断片のより高度な血清力価をもたらし、したがって、当該抗体若しくは抗体断片の投与の頻度を低下させる及び／又は投与されることとなる当該抗体又は抗体断片の濃度を低下させる。増大したｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける半減期を有する抗体は、当業者らに既知の技術によって生成することができる。例えば、増大したｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期を有する抗体は、Ｆｃドメイン及びＦｃＲｎ受容体の間の相互作用に関与するとして同定されたアミノ酸残基を改変する（例えば置換する、欠失させる、又は追加する）ことによって生成することができる（例えば、国際特許出願公開ＷＯ９７／３４６３１；ＷＯ０４／０２９２０７；米国特許第６，７３７，０５６号、及び米国特許出願公開第２００３／０１９０３１１号を参照されたい）。
【０１６０】
特定の実施形態では、変異体ＣＨ３ドメインを含む変異体Ｆｃヘテロ二量体は、多重特異性抗体（本明細書において本発明の抗体と呼ばれる）であり、本発明の抗体は、対象の抗原に特異的に結合する。特に、本発明の抗体は、二重特異性抗体である。一実施形態では、本発明の抗体は、ポリペプチド抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、本発明の抗体は、非ポリペプチド抗原に特異的に結合する。さらに他の実施形態では、疾患又は障害に罹患している哺乳動物への本発明の抗体の投与は、その哺乳動物において治療上の利益をもたらしてもよい。
【０１６１】
事実上、タンパク質の以下のリスト並びにタンパク質の以下のリストに属するサブユニット、ドメイン、モチーフ、及びエピトープを含むが、これらに限定されない任意の分子が、変異体Ｆｃヘテロ二量体タンパク質（例えば抗体、Ｆｃ融合タンパク質）によって標的にされてもよい及び／又はその中に組み込まれてもよい：レニン；ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ１抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩ因子、ファクターＶＩＩＩＣ、第ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）、及びフォンウィルブランド因子などのような凝固因子；プロテインＣなどのような抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；ウロキナーゼ又はヒト尿若しくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などのようなプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血性増殖因子；腫瘍壊死因子アルファ及びベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化と同時に調節、正常Ｔ細胞が発現し、分泌する）；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；ヒト血清アルブミンなどのような血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン（ｐｒｏｒｅｌａｘｉｎ）；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；ベータラクタマーゼなどのような微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ−４などのような細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）；例えばＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲなどのようなホルモン又は増殖因子に対する受容体；アルファインターフェロン（α−ＩＦＮ）、ベータインターフェロン（β−ＩＦＮ）、及びガンマインターフェロン（γ−ＩＦＮ）などのようなインターフェロン；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、若しくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、若しくはＮＴ−６）、又は神経増殖因子などのような神経栄養因子；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；ＡＦＧＦ及びＰＦＧＦなどのような線維芽細胞増殖因子；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−１、ＴＧＦ−２、ＴＧＦ−３、ＴＧＦ−４、又はＴＧＦ−５を含むＴＧＦアルファ及びＴＧＦベータなどのような形質転換増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５２、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ８０、及びＣＤ１４７などのようなＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導性因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロンアルファ、ベータ、及びガンマなどのようなインターフェロン；Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦなどのようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１〜ＩＬ−１３；ＴＮＦα、スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；解離促進因子；例えば、エイズエンベロープの一部、例えばｇｐ１２０などのようなウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；ＬＦＡ−１、Ｍａｃ  １、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３、及びＶＣＡＭ、その１つ又は複数のサブユニットを含むａ４／ｐ７インテグリン及びＸｖ／ｐ３インテグリンなどのような細胞接着分子、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、アルファ７、アルファ８、アルファ９、アルファＤ、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ５１、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４１、アルファＩＩｂ、アルファＩＥＬｂなどのようなインテグリンアルファサブユニット；ＣＤ２９、ＣＤ  １８、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、ベータ５、ベータ６、ベータ７、及びベータ８などのようなインテグリンベータサブユニット；αＶβ３、αＶβ５、及びα４β７を含むが、これらに限定されないインテグリンサブユニットの組合せ；アポトーシス経路のメンバー；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐ１受容体；ＣＴＬＡ−４；プロテインＣ；ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＢ２などのようなＥｐｈ受容体；ＨＬＡ−ＤＲなどのようなヒト白血球抗原（ＨＬＡ）；補体受容体ＣＲ１、Ｃ１Ｒｑ、並びにＣ３及びＣ５などのような他の補体因子などのような補体タンパク質；ＧｐＩｂα、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、及びＣＤ２００などのような糖タンパク質受容体；並びに上記に列挙されるポリペプチドのいずれかの断片。
【０１６２】
ＡＬＫ受容体（プレイオトロフィン受容体）、プレイオトロフィン、ＫＳ  １／４全癌腫（ｐａｎ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ）抗原；卵巣癌抗原（ＣＡ１２５）；前立腺酸性ホスフェート（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）；前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）；メラノーマ関連抗原ｐ９７；メラノーマ抗原ｇｐ７５；高分子量メラノーマ抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）；前立腺特異的膜抗原；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；多型上皮ムチン抗原；ヒト乳脂肪球抗原；ＣＥＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＯ１７−１Ａ、ＧＩＣＡ  １９−９、ＣＴＡ−１、及びＬＥＡなどのような結腸直腸腫瘍関連抗原；バーキットリンパ腫抗原−３８．１３；ＣＤ１９；ヒトＢ−リンパ腫抗原ＣＤ２０；ＣＤ３３；ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、及びガングリオシドＧＭ３などのようなメラノーマ特異的抗原；腫瘍特異的移植型細胞表面抗原（ＴＳＴＡ）；Ｔ抗原、ＤＮＡ腫瘍ウイルス、及びＲＮＡ腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原を含むウイルス誘発性腫瘍抗原；結腸のＣＥＡ、５Ｔ４癌胎児性トロホブラスト糖タンパク質、及び膀胱腫瘍癌胎児性抗原などのような癌胎児性抗原アルファフェトプロテイン；ヒト肺癌抗原Ｌ６及びＬ２０などのような分化抗原；線維肉腫の抗原；ヒト白血病Ｔ細胞抗原−Ｇｐ３７；ネオ糖タンパク質；スフィンゴリピド；ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）などのような乳癌抗原；ＮＹ−ＢＲ−１６；ＮＹ−ＢＲ−１６及びＨＥＲ２抗原（ｐ１８５ＨＥＲ２）；多型上皮ムチン（ＰＥＭ）；悪性ヒトリンパ球抗原−ＡＰＯ−１；胎児赤血球において見つけられるＩ抗原などのような分化抗原；成体型赤血球において見つけられる一次内胚葉Ｉ抗原（ｐｒｉｍａｒｙ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  Ｉ  ａｎｔｉｇｅｎ）；着床前胚；胃腺癌において見つけられるＩ（Ｍａ）；乳房上皮において見つけられるＭ１８、Ｍ３９；骨髄性細胞において見つけられるＳＳＥＡ−１；ＶＥＰ８；ＶＥＰ９；Ｍｙｌ；Ｖａ４−Ｄ５；結腸直腸癌において見つけられるＤ１５６−２２；ＴＲＡ−１−８５（血液型Ｈ）；精巣及び卵巣癌において見つけられるＳＣＰ−１；結腸腺癌において見つけられるＣ１４；肺腺癌において見つけられるＦ３；胃癌において見つけられるＡＨ６；Ｙハプテン；胚性癌細胞において見つけられるＬｅｙ；ＴＬ５（血液型Ａ）；Ａ４３１細胞において見つけられるＥＧＦ受容体；膵癌において見つけられるＥ１シリーズ（血液型Ｂ）；胚性癌細胞において見つけられるＦＣ１０．２；胃腺癌抗原；腺癌において見つけられるＣＯ−５１４（血液型Ｌｅａ）；腺癌において見つけられるＮＳ−１０；ＣＯ−４３（血液型Ｌｅｂ）；Ａ４３１細胞のＥＧＦ受容体において見つけられるＧ４９；結腸腺癌において見つけられるＭＨ２（血液型ＡＬｅｂ／Ｌｅｙ）；結腸癌において見つけられる１９．９；胃癌ムチン；骨髄性細胞において見つけられるＴ５Ａ７；メラノーマにおいて見つけられるＲ２４；胚性癌細胞において見つけられる４．２、ＧＤ３、Ｄ１．１、ＯＦＡ−１、ＧＭ２、ＯＦＡ−２、ＧＤ２、及びＭ１：２２：２５：８並びに４〜８細胞期の胚において見つけられるＳＳＥＡ−３及びＳＳＥＡ−４；皮膚Ｔ細胞リンパ腫抗原；ＭＡＲＴ−１抗原；シアリルＴｎ（ＳＴｎ）抗���；結腸癌抗原ＮＹ−ＣＯ−４５；肺癌抗原ＮＹ−ＬＵ−１２変異体Ａ；腺癌抗原ＡＲＴ１；腫瘍随伴性関連脳精巣癌抗原（腫瘍ニューロン（ｏｎｃｏｎｅｕｒｏｎａｌ）抗原ＭＡ２；腫瘍随伴性ニューロン抗原）；神経腫瘍腹側抗原２（Ｎｅｕｒｏ−ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｖｅｎｔｒａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ２）（ＮＯＶＡ２）；肝細胞癌抗原遺伝子５２０；腫瘍関連抗原ＣＯ−０２９；腫瘍関連抗原ＭＡＧＥ−Ｃ１（癌／精巣抗原ＣＴ７）、ＭＡＧＥ−Ｂ１（ＭＡＧＥ−ＸＰ抗原）、ＭＡＧＥ−Ｂ２（ＤＡＭ６）、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−４−ａ、ＭＡＧＥ−４−ｂ、及びＭＡＧＥ−Ｘ２；癌精巣抗原（ＮＹ−ＥＯＳ−１）、並びに上記に列挙されるポリペプチドのいずれかの断片を含むが、これらに限定されない癌抗原に特異的に結合する本発明の抗体もまた、企図される。
【０１６３】
ある実施形態では、本明細書において記載されるヘテロ多量体は、少なくとも１つの治療用抗体を含む。いくつかの実施形態では、治療用抗体は、癌標的抗原に結合する。一実施形態では、治療用抗体は、アバゴボマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、アウログラブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ、ベリムバブ、ベバシズマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、カツマキソマブ、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エファリズマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ、ルミリキシマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ムロモナブ、ミコグラブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、テプリズマブ、トシリズマブ／アトリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、Ｐｒｏｘｉｎｉｕｍ（商標）、Ｒｅｎｃａｒｅｘ（商標）、ウステキヌマブ、ザルツムマブ、及び任意の他の抗体のうちの１つであってもよく、それからなる群から選択される。
【０１６４】
本発明の抗体は、修飾された誘導体を含む（つまり、共有結合のような、任意のタイプの分子の抗体への共有結合によって）。例えば、限定としてではないが、抗体誘導体は、例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基若しくは遮断基による誘導体化、タンパク分解性の切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への連結などによって修飾された抗体を含む。多数の化学修飾のいずれも、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むが、これらに限定されない既知の技術によって実行されてもよい。さらに、誘導体は、１つ又は複数の非古典的アミノ酸を含有してもよい。
【０１６５】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期が増大した抗体又はその断片は、抗体又は抗体断片に、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのような高分子を付加することによって生成することができる。ＰＥＧは、当該抗体若しくは抗体断片のＮ若しくはＣ末端へのＰＥＧの部位特異的コンジュゲーションを通して又はリシン残基上に存在するイプシロンアミノ基を介して、多機能性リンカーを用いて又は用いないで、抗体又は抗体断片に付加することができる。生物学的活性の最小限の損失をもたらす、直線状又は分岐ポリマー誘導体化が、使用されるであろう。抗体へのＰＥＧ分子の適切なコンジュゲーションを確実にするために、コンジュゲーションの程度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析法によって厳密にモニターされるであろう。未反応のＰＥＧは、例えばサイズ排除又はイオン交換クロマトグラフィーによって、抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離することができる。
【０１６６】
さらに、抗体は、抗体又は抗体断片をｉｎ  ｖｉｖｏにおいてより安定したものにするために又はｉｎ  ｖｉｖｏにおいてより長い半減期を有するようにアルブミンにコンジュゲートすることができる。技術は、当技術分野においてよく知られており、例えば国際特許出願公開ＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００、及びＷＯ０１／７７１３７；並びに欧州特許ＥＰ４１３，６２２を参照されたい。本発明は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、ミメティック作用物質、合成薬剤、無機分子、及び有機分子を含むが、これらに限定されない１つ又は複数の成分にコンジュゲートされた又は融合された抗体又はその断片の使用を包含する。
【０１６７】
本発明は、融合タンパク質を生成するために、異種タンパク質又はポリペプチド（又はその断片）に、例えば、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、又は少なくとも１００アミノ酸のポリペプチドに、組換えで融合された又は化学的にコンジュゲートされた（共有結合及び非共有結合コンジュゲーションの両方を含む）抗体又はその断片の使用を包含する。融合は、必ずしも直接的である必要はないが、リンカー配列を通して行われてもよい。例えば、抗体は、特定の細胞表面受容体に対して特異的な抗体に抗体を融合する又はコンジュゲートすることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて又はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、異種ポリペプチドに特定の細胞型を標的とさせるために使用されてもよい。異種ポリペプチドに融合された又はコンジュゲートされた抗体もまた、当技術分野において既知の方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏイムノアッセイ及び精製方法において使用されてもよい。例えば国際特許出願公開ＷＯ９３／２１２３２；欧州特許ＥＰ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、１９９４，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１〜９９；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９９２、ＰＮＡＳ  ８９：１４２８〜１４３２；及びＦｅｌｌら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６〜２４５２を参照されたい。
【０１６８】
本発明は、抗体断片に融合された又はコンジュゲートされた異種タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドを含む組成物をさらに含む。例えば、異種ポリペプチドは、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ、ＶＬ  ＣＤＲ、又はその断片に融合されてもよい又はコンジュゲートされてもよい。抗体部分にポリペプチドを融合する又はコンジュゲートするための方法は、当技術分野においてよく知られている。例えば米国特許第５，３３６，６０３号；第５，６２２，９２９号；第５，３５９，０４６号；第５，３４９，０５３号；第５，４４７，８５１号、及び第５，１１２，９４６号；欧州特許ＥＰ３０７，４３４及びＥＰ３６７，１６６；国際特許出願公開ＷＯ９６／０４３８８及びＷＯ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５３５〜１０５３９；Ｚｈｅｎｇら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０〜５６００；並びにＶｉｌら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１１３３７〜１１３４１を参照されたい。
【０１６９】
例えば、抗原に特異的に結合する抗体（例えば前掲）のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシャフリング、及び／又はコドンシャフリング（まとめて「ＤＮＡシャフリング」と呼ばれる）の技術を通して生成されてもよい。ＤＮＡシャフリングは、本発明の抗体又はその断片の活性を変化させるために用いられてもよい（例えば、より高度な親和性及びより低い解離速度を有する抗体又はその断片）。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号；第５，８１１，２３８号；第５，８３０，７２１号；第５，８３４，２５２号、及び第５，８３７，４５８号、並びにＰａｔｔｅｎら、１９９７、Ｃｕｒｒ．ＯｐｉｎｉｏｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４〜３３；Ｈａｒａｙａｍａ、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６〜８２；Ｈａｎｓｓｏｎら、１９９９、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５〜７６；及びＬｏｒｅｎｚｏ及びＢｌａｓｃｏ、１９９８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４（２）：３０８〜３１３を参照されたい。抗体若しくはその断片又はコード抗体若しくはその断片は、組換えの前に、エラープローンＰＣＲによるランダム突然変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入、又は他の方法にかけることによって変化させてもよい。その部分が抗原に特異的に結合する抗体又は抗体断片をコードするポリヌクレオチドの１つ又は複数の部分は、１つ又は複数の異種分子の１つ又は複数の構成成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などと組換えてもよい。
【０１７０】
本発明は、治療剤にコンジュゲートされた変異体Ｆｃヘテロ二量体又はその断片の使用をさらに包含する。
【０１７１】
抗体又はその断片は、細胞毒、例えば細胞増殖抑制若しくは細胞破壊剤、治療剤又は放射性金属イオン、例えばアルファ放射体などのような治療用成分にコンジュゲートされてもよい。細胞毒又は細胞傷害剤は、細胞に有害な任意の作用物質を含む。例として、リボヌクレアーゼ、モノメチルオーリスタチン（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）Ｅ及びＦ、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、及びシクロホスファミド並びにそのアナログ又は相同体を含む。治療剤は、代謝拮抗薬（例えばメトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブチル、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシスジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、並びに有糸分裂阻害剤（例えばビンクリスチン及びビンブラスチン）を含むが、これらに限定されない。治療用成分のより広範囲なリストは、ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０７５９５７において見つけることができる。
【０１７２】
さらに、抗体又はその断片は、所定の生物学的応答を改変する治療剤又は薬剤成分にコンジュゲートされてもよい。治療剤又は薬剤成分は、古典的な化学的治療剤に限定されるように解釈されないものとする。例えば、薬剤成分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質又はポリペプチドであってもよい。そのようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、Ｏｎｃｏｎａｓｅ（若しくは他の細胞傷害性ＲＮアーゼ）、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、又はジフテリア毒素などのような毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス作用物質、例えばＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ  Ｉ（国際特許出願公開ＷＯ９７／３３８９９を参照されたい）、ＡＩＭ  ＩＩ（国際特許出願公開ＷＯ９７／３４９１１を参照されたい）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６：１５６７）、及びＶＥＧＩ（国際特許出願公開ＷＯ９９／２３１０５を参照されたい）、血栓症作用物質又は抗血管新生剤、例えばアンジオスタチン若しくはエンドスタチンなどのようなタンパク質；又は例えばリンホカイン（例えばインターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）及び顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」））、若しくは増殖因子（例えば成長ホルモン（「ＧＨ」））などのような生物学的応答調節物質を含んでいてもよい。
【０１７３】
さらに、抗体は、放射性金属イオンをコンジュゲートするのに有用な放射性物質又は大環状キレート剤などのような治療用成分にコンジュゲートすることができる（放射性物質の例については上記を参照されたい）。ある実施形態では、大環状キレート剤は、リンカー分子を介して抗体に付加することができる１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。そのようなリンカー分子は、当技術分野において一般的に知られており、Ｄｅｎａｒｄｏら、１９９８、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４：２４８３；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、１９９９、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：５５３；及びＺｉｍｍｅｒｍａｎら、１９９９、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６：９４３において記載される。
【０１７４】
ポリペプチド成分に抗体を融合する又はコンジュゲートする方法は、当技術分野において知られている。例えば米国特許第５，３３６，６０３号；第５，６２２，９２９号；第５，３５９，０４６号；第５，３４９，０５３号；第５，４４７，８５１号、及び第５，１１２，９４６号；ＥＰ３０７，４３４；ＥＰ３６７，１６６；ＰＣＴ公開ＷＯ９６／０４３８８及びＷＯ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、１９９１、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５；Ｚｈｅｎｇら、１９９５、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５４：５５９０；並びにＶｉｌら、１９９２、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：１１３３７を参照されたい。成分への抗体の融合は、必ずしも直接的である必要はないが、リンカー配列を通して行われてもよい。そのようなリンカー分子は、当技術分野において一般的に知られており、Ｄｅｎａｒｄｏら、１９９８、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４：２４８３；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、１９９９、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １０：５５３；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、１９９９、Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ２６：９４３；Ｇａｒｎｅｔｔ、２００２、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５３：１７１において記載される。
【０１７５】
Ｆｃ変異体、その誘導体、アナログ、又は断片（例えば本発明の抗体又は融合タンパク質）の組換え発現は、Ｆｃ変異体（例えば抗体又は融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。Ｆｃ変異体（例えば抗体又は融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドが一度得られたら、Ｆｃ変異体（例えば抗体又は融合タンパク質）の産生のためのベクターは、当技術分野においてよく知られている技術を使用する組換えＤＮＡ技術によって産生されてもよい。したがって、ヌクレオチド配列をコードするＦｃ変異体（例えば抗体又は融合タンパク質）を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク質を調製するための方法は、本明細書において記載される。当業者らによく知られている方法は、Ｆｃ変異体（例えば抗体又は融合タンパク質）コード配列並びに適切な転写及び翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組換えを含む。本発明は、したがって、プロモーターに作動可能に連結された、本発明のＦｃ変異体をコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば国際特許出願公開ＷＯ８６／０５８０７；国際特許出願公開ＷＯ８９／０１０３６；及び米国特許第５，１２２，４６４号）並びに抗体の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよい又はＦｃ変異体を生成するためのポリペプチドは、完全長抗体鎖（例えば重鎖若しくは軽鎖）又は非抗体由来ポリペプチド及び少なくとも変異体ＣＨ３ドメインを組み込むＦｃ領域の融合物を含む完全なＦｃ変異体の発現のために、そのようなベクターの中にクローニングされてもよい。
【０１７６】
発現ベクターは、従来の技術によって宿主細胞に移入され、トランスフェクトされた細胞は、次いで、本発明のＦｃ変異体を産生するために、従来の技術によって培養される。したがって、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結された、本発明のＦｃ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。二重鎖抗体を含むＦｃ変異体の発現のための特定の実施形態では、重鎖及び軽鎖の両方をコードするベクターは、下記に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞において同時発現されてもよい。
【０１７７】
様々な宿主発現ベクター系は、本発明のＦｃ変異体（例えば抗体又は融合タンパク質分子）を発現させるために利用されてもよい（例えば米国特許第５，８０７，７１５号を参照されたい）。そのような宿主発現系は、対象のコード配列が産生され、続いて精製されてもよいビヒクルに相当するが、また、適切なヌクレオチドコード配列により形質転換された又はトランスフェクトされた場合に、ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて本発明のＦｃ変異体を発現し得る細胞にも相当する。これらは、Ｆｃ変異体コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、若しくはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などのような微生物；Ｆｃ変異体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母（例えばサッカロミセス、ピキア）；Ｆｃ変異体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；Ｆｃ変異体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した若しくは組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）により形質転換された植物細胞系；又は哺乳動物細胞のゲノム（例えばメタロチオネインプロモーター）若しくは哺乳動物ウイルス（例えばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含有する組換え発現構築物を含む哺乳動物細胞系（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳ０、及び３Ｔ３細胞）を含むが、これらに限定されない。ある実施形態では、大腸菌又は真核細胞などのような細菌細胞は、組換え抗体又は融合タンパク質分子であるＦｃ変異体の発現に使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーター（ｍａｊｏｒ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）エレメントなどのようなベクターと併用するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などのような哺乳動物細胞は、抗体についての有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、１９８６、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１；及びＣｏｃｋｅｔｔら、１９９０、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２）。特定の実施形態では、本発明のＦｃ変異体（例えば抗体又は融合タンパク質）をコードするヌクレオチド配列の発現が、恒常的プロモーター、誘発性プロモーター、又は組織特異的プロモーターによって調節される。
【０１７８】
細菌系では、多くの発現ベクターは、発現されているＦｃ変異体（例えば抗体又は融合タンパク質）について意図される使用に応じて、好都合に選択することができる。例えば、大量のそのようなタンパク質がＦｃ変異体の医薬組成物の生成のために産生されることになっている場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましい可能性がある。そのようなベクターは、ｌａｃ  Ｚ融合タンパク質が産生されるように、Ｆｃ変異体コード配列がｌａｃ  Ｚコード領域とインフレームでベクターの中に個々にライゲーションされてもよい大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、１９８３、ＥＭＢＯ  １２：１７９１）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ、１９８５、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１〜３１０９；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３〜５５０９）などを含むが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために使用されてもよい。一般に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着及び結合、その後に続く遊離グルタチオンの存在下における溶出によって、溶解した細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物をＧＳＴ成分から放出することができるように、トロンビン又は第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０１７９】
昆虫系では、オウトグラファカリフォルニア核多汗症ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、外来遺伝子を発現させるためにベクターとして使用される。ウイルスは、ヨトウガ細胞中で成長する。Ｆｃ変異体（例えば抗体又は融合タンパク質）コード配列は、ウイルスの非本質的な領域（例えばポリヘドリン遺伝子）の中に個々にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置されてもよい。
【０１８０】
哺乳動物宿主細胞では、多くのウイルスベースの発現系が、利用されてもよい。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合において、対象のＦｃ変異体（例えば抗体又は融合タンパク質）コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーター及び三連リーダー配列ライゲーションされてもよい。次いで、このモザイク遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ組換えによってアデノウイルスゲノム中に挿入されてもよい。ウイルスゲノムの非本質的な領域（例えば領域Ｅ１又はＥ３）中への挿入は、感染宿主において生存可能であり、Ｆｃ変異体（例えば抗体又は融合タンパク質）を発現することができる組換えウイルスをもたらすであろう（例えばＬｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３５５〜３５９を参照されたい）。特異的な開始シグナルもまた、挿入抗体コード配列の効率的な翻訳のために必要とされてもよい。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含む。さらに、開始コドンは、全挿入物の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと同調していなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、自然及び合成の両方の様々な起源のものとすることができる。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの包含によって増強されてもよい（例えばＢｉｔｔｎｅｒら、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６〜５４４を参照されたい）。
【０１８１】
Ｆｃ変異体（例えば抗体又は融合タンパク質）の発現は、当技術分野において既知の任意のプロモーター又はエンハンサーエレメントによって制御されてもよい。Ｆｃ変異体（例えば抗体又は融合タンパク質）をコードする遺伝子の発現を制御するために使用されてもよいプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ及びＣｈａｍｂｏｎ、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４〜３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列中に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０、Ｃｅｌｌ  ２２：７８７〜７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１〜１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９〜４２）、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７〜５５５１）；β−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７〜３７３１）又はｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１〜２５；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ、１９８０、２４２：７４〜９４の「Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ」も参照されたい）などのような原核生物発現ベクター；ノパリンシンテターゼプロモーター領域を含む植物発現ベクター（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：２０９〜２１３）又はカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター（Ｇａｒｄｎｅｒら、１９８１、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：２８７１）及び光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：１１５〜１２０）；Ｇａｌ  ４プロモーターなどのような酵母又は他の菌類由来のプロモーターエレメント、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、並びに組織特異性を示し、トランスジェニック動物において利用されてきた以下の動物転写制御領域：膵腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４、Ｃｅｌｌ  ３８：６３９〜６４６；Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９〜４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５〜５１５）；膵臓ベータ細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５〜１２２）、リンパ様細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４、Ｃｅｌｌ  ３８：６４７〜６５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３〜５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ��．７：１４３６〜１４４４）、睾丸、乳房、リンパ様、及び肥満細胞において活性なマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６、Ｃｅｌｌ  ４５：４８５〜４９５）、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８〜２７６）、肝臓において活性なアルファフェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９〜１６４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３〜５８；肝臓において活性なアルファ１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１〜１７１）、骨髄性細胞において活性なベータグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８〜３４０；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６、Ｃｅｌｌ  ４６：８９〜９４；脳における乏突起膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７、Ｃｅｌｌ  ４８：７０３〜７１２）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３〜２８６）；ニューロン細胞において活性なニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）（Ｍｏｒｅｌｌｉら、１９９９、Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：５７１〜８３）；ニューロン細胞において活性な脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）遺伝子制御領域（Ｔａｂｕｃｈｉら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２５３：８１８〜８２３）；アストロサイトにおいて活性なグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター（Ｇｏｍｅｓら、１９９９、Ｂｒａｚ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  ３２（５）：６１９〜６３１；Ｍｏｒｅｌｌｉら、１９９９、Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：５７１〜８３）、及び視床下部において活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２〜１３７８）を含むが、これらに限定されない。
【０１８２】
本発明のＦｃ変異体（例えば抗体又は融合タンパク質）をコードする遺伝子の挿入物を含有する発現ベクターは、３つの一般的なアプローチによって同定することができる：（ａ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在又は不在、及び（ｃ）挿入された配列の発現。第１のアプローチでは、発現ベクターにおいてペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又は融合タンパク質をコードする遺伝子の存在は、それぞれ、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又は融合タンパク質をコードする挿入遺伝子に相同な配列を含むプローブを使用する核酸ハイブリダイゼーションによって検出することができる。第２のアプローチでは、組換えベクター／宿主系は、ベクターにおける抗体又は融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の挿入によって引き起こされるある種の「マーカー」遺伝子機能（例えばチミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する抵抗性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける包埋体形成など）の存在又は不在に基づいて同定し、選択することができる。例えば、Ｆｃ変異体（例えば抗体又は融合タンパク質）をコードするヌクレオチド配列が、ベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、抗体又は融合タンパク質挿入物をコードする遺伝子を含有する組換え体は、マーカー遺伝子機能の不在によって同定することができる。第３のアプローチでは、組換え発現ベクターは、組換え体によって発現される遺伝子産物（例えば抗体又は融合タンパク質）をアッセイすることによって同定することができる。そのようなアッセイは、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系における融合タンパク質の物理的又は機能的特性、例えば抗生物活性分子抗体との結合に基づくものとすることができる。
【０１８３】
さらに、所望の特異的な方法において挿入された配列の発現を調整する又は遺伝子産物を修飾し、プロセシングする宿主細胞株が、選ばれてもよい。ある種のプロモーターからの発現は、ある種の誘発因子の存在下において上昇させることができ、それによって、遺伝子操作された融合タンパク質の発現が制御されてもよい。さらに、様々な宿主細胞は、翻訳及び翻訳後プロセシング及び修飾（例えば、タンパク質のグリコシル化、リン酸化）について特徴的で特異的なメカニズムを有する。適切な細胞系又は宿主系は、発現される外来タンパク質の所望の修飾及びプロセシングを確実にするように選ぶことができる。例えば、細菌系における発現は、非グリコシル化産物を産生するであろう、また、酵母における発現は、グリコシル化産物を産生するであろう。遺伝子産物の一次転写物の適切なプロセシングについての細胞の機構（例えばグリコシル化及びリン酸化）を有する真核生物の宿主細胞が、使用されてもよい。そのような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、ＮＳ０、特に、例えばＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＦＩ、ＳＫ−Ｎ−ＤＺヒト神経芽細胞腫（Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、１９８４、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．７３：５１〜５７）、ＳＫ−Ｎ−ＳＨヒト神経芽細胞腫（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９８２、７０４：４５０〜４６０）、Ｄａｏｙヒト小脳髄芽腫（Ｈｅら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１１４４〜１１４８）、ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ  膠芽腫細胞（Ｋｒｕｓｅら、１９９２、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２８Ａ：６０９〜６１４）、ＩＭＲ−３２ヒト神経芽細胞腫（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９７０、３０：２１１０〜２１１８）、１３２１Ｎ１ヒト星状細胞腫（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９７７、７４：４８１６）、ＭＯＧ−Ｇ−ＣＣＭヒト星状細胞腫（Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９８４、４９：２６９）、Ｕ８７ＭＧヒト膠芽腫星状細胞腫（Ａｃｔａ  Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．、１９６８、７４：４６５〜４８６）、Ａ１７２ヒト膠芽腫（Ｏｌｏｐａｄｅら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：２５２３〜２５２９）、Ｃ６ラット神経膠腫細胞（Ｂｅｎｄａら、１９６８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６１：３７０〜３７１）、Ｎｅｕｒｏ−２ａマウス神経芽細胞腫（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９７０、６５：１２９〜１３６）、ＮＢ４１Ａ３マウス神経芽細胞腫（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９６２、４８：１１８４〜１１９０）、ＳＣＰヒツジ脈絡叢（Ｂｏｌｉｎら、１９９４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４８：２１１〜２２１）、Ｇ３５５−５、ＰＧ−４ネコ正常アストロサイト（Ｈａａｐａｌａら、１９８５、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５３：８２７〜８３３）、Ｍｐｆシロイタチ脳（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅら、１９８２、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  １８：９５２〜９６０）、並びに例えばＣＲＬ７０３０及びＨｓ５７８Ｂｓｔなどのような、例えばＣＴＸ  ＴＮＡ２ラット正常皮質脳（Ｒａｄａｎｙら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ���ＵＳＡ  ８９：６４６７〜６４７１）などのような正常細胞系などのようなニューロン細胞系を含むが、これらに限定されない。さらに、様々なベクター／宿主発現系は、様々な程度までプロセシング反応を達成してもよい。
【０１８４】
組換えタンパク質の長期高収率産生のために、安定した発現は、多くの場合、好ましい。例えば、本発明のＦｃ変異体（例えば抗体又は融合タンパク質）を安定して発現する細胞系は、操作されてもよい。ウイルス複製開始点を含有する発現ベクターを使用する代わりに、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されるＤＮＡ及び選択マーカーにより形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入の後に、操作された細胞は、栄養強化倍地において１〜２日間、成長させ、次いで、選択培地に入れ替えられる。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する抵抗性を付与し、細胞が、それらの染色体の中にプラスミドを安定して統合し、成長して、ひいてはクローニングされ、細胞系へと増殖することができるフォーカスを形成するのを可能にする。この方法は、抗原に特異的に結合するＦｃ変異体を発現する細胞系を操作するために好都合に使用されてもよい。そのような操作された細胞系は、抗原に特異的に結合するＦｃ変異体（例えばポリペプチド又は融合タンパク質）の活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニング及び評価において特に有用であってもよい。
【０１８５】
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、１９７７、Ｃｅｌｌ  １１：２２３）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、１９６２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２６）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、１９８０、Ｃｅｌｌ  ２２：８１７）遺伝子を含むが、これらに限定されない多くの選択系が、使用されてもよく、それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、又はａｐｒｔ−細胞において用いることができる。また、代謝拮抗薬抵抗性は、メトトレキサートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら、１９８０、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５６７；Ｏ’Ｈａｒｅら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７）；ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、１９８１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１）；及びヒグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、１９８４、Ｇｅｎｅ  ３０：１４７）遺伝子について選択の基準として使用することができる。
【０１８６】
一度、本発明のＦｃ変異体（例えば抗体、又は融合タンパク質）が組換え発現によって産生されたら、それは、タンパク質の精製について当技術分野において既知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、親和性、特にプロテインＡ後の特異的な抗原に対する親和性によって、及びサイジングカラムクロマトグラフイー）、遠心分離、溶解度差によって、又はタンパク質の精製についての任意の他の標準的な技術によって精製されてもよい。
【０１８７】
Ｆｃ変異体は、分泌ポリペプチドとして培養培地から一般に回収されるが、それはまた、分泌シグナルなしで直接産生される場合、宿主細胞溶解産物から回収されてもよい。Ｆｃ変異体が膜結合型である場合、それは、適した界面活性剤溶液（例えばＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）を使用して、膜から放出させることができる。
【０１８８】
Ｆｃ変異体がヒト起源のうちの１つ以外の組換え細胞において産生される場合、それは、ヒト起源のタンパク質又はポリペプチドが完全にない。しかしながら、Ｆｃ変異体に関して実質的に均一な調製物を得るために、組換え細胞タンパク質又はポリペプチドからＦｃ変異体を精製することが必要である。第１のステップとして、培養培地又は溶解産物は、粒状の細胞デブリを除去するために通常、遠心分離される。
【０１８９】
抗体定常ドメインを有するＦｃヘテロ二量体は、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーによって好都合に精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーは、好ましい精製技術である。イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上でのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫安塩析などのようなタンパク質精製のための他の技術もまた、回収されることとなるポリペプチドに応じて利用可能である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、使用される免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖をベースとする免疫グロブリンＦｃ領域を精製するために使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１〜１３（１９８３））。タンパク質Ｇは、すべてのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推薦される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが付加されるマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースであるが、他のマトリックスが利用可能である。コントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどのような機械的に安定したマトリックスは、アガロースにより達成することができるものよりも速い流速及び短い処理時間を可能にする。イムノアドヘシンをプロテインＡ又はＧアフィニティーカラムに結合するための条件は、Ｆｃドメインの特徴；すなわち、その種及びアイソタイプによって全体的に決定される。一般に、適切なリガンドが選ばれる場合、効率的な結合は、無条件培養液から直接行われる。結合した変異体Ｆｃヘテロ二量体は、酸性ｐＨ（３．０以上）で又は弱カオトロピック塩を含有する中性ｐＨバッファーにおいて効率的に溶出することができる。このアフィニティークロマトグラフィーステップは、＞９５％純粋な変異体Ｆｃヘテロ二量体調製物をもたらすことができる。
【０１９０】
Ｆｃ変異体（例えば抗体又は融合タンパク質）の発現レベルは、ベクター増幅によって増大させることができる（概説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ及びＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照されたい）。例えば、抗体又は融合タンパク質を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養において存在する阻害剤のレベルの増大は、マーカー遺伝子のコピーの数を増大させるであろう。増幅領域が抗体遺伝子と関連するので、抗体又は融合タンパク質の産生もまた、増大するであろう（Ｃｒｏｕｓｅら、１９８３、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７）。
【０１９１】
宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクターによりコトランスフェクトされてもよい。例えば、第１のベクターは、重鎖由来のポリペプチドをコードし、第２のベクターは、軽鎖由来のポリペプチドをコードする。２つのベクターは、同一の選択マーカーを含有していてもよく、それは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする。その代わりに、融合タンパク質又は重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、発現することができる単一のベクターが、使用されてもよい。融合タンパク質又は重鎖及び軽鎖についてのコード配列は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含んでいてもよい。
【０１９２】
特徴付け及び機能的なアッセイ
本発明のＦｃ変異体（例えば抗体又は融合タンパク質）は、様々な方法において特徴付けられてもよい。一実施形態では、変異体Ｆｃヘテロ二量体の純度が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、ウェスタンブロット、濃度測定、又は質量分析法を含むが、これらに限定されない、当技術分野においてよく知られている技術を使用して評価される。タンパク質安定性は、サイズ排除クロマトグラフィー、紫外可視分光法及びＣＤ分光法、質量分光法、示差光散乱（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）、ベンチトップ安定性アッセイ（ｂｅｎｃｈ  ｔｏｐ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ）、他の特徴付け技術とつながれた凍結融解、示差走査熱量測定、示差走査蛍光分析（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、等電点電気泳動、受容体結合アッセイ、又は相対的なタンパク質発現レベルに限定されない、多くの技術を使用して、特徴付けることができる。例示的な実施形態では、変異体Ｆｃヘテロ二量体の安定性は、示差走査熱量測定又は示差走査蛍光分析などのような当技術分野においてよく知られている技術を使用して、野生型ＣＨ３ドメインと比較した、変異体ＣＨ３ドメインの融解温度によって評価される。
【０１９３】
本発明のＦｃ変異体はまた、リガンド（例えばＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、Ｃ１ｑ）に特異的に結合する能力についてアッセイされてもよい。そのようなアッセイは、溶液において（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１３：４１２〜４２１、１９９２）、ビーズ上で（Ｌａｍ、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：８２〜８４、１９９１、チップ上で（Ｆｏｄｏｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３６４：５５５〜５５６、１９９３）、細菌上で（米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド上で（Ｃｕｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１８６５〜１８６９、１９９２）、又はファージ上で（Ｓｃｏｔｔ及びＳｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：３８６〜３９０、１９９０；Ｄｅｖｌｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：４０４〜４０６、１９９０；Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６３７８〜６３８２、１９９０；及びＦｅｌｉｃｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：３０１〜３１０、１９９１）実行されてもよい。次いで、リガンド（例えばＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、Ｃ１ｑ、又は抗原に）に特異的に結合することが同定された分子は、リガンドに対するそれらの親和性についてアッセイすることができる。
【０１９４】
本発明のＦｃ変異体は、当技術分野において既知の任意の方法によって、抗原（例えば癌抗原及び他の抗原との交差反応性）又はリガンド（例えばＦｃγＲ）などのような分子への特異的な結合についてアッセイされてもよい。特異的な結合及び交差反応性を解析するために使用することができるイムノアッセイは、ほんの少し例を挙げれば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイなどのような技術を使用する競合的及び非競合的アッセイ系を含むが、これらに限定されない。そのようなアッセイは、当技術分野においてルーチン的であり、よく知られている（例えばＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。
【０１９５】
抗原又はリガンド（例えばＦｃγＲ）などのような分子への本発明のＦｃ変異体の結合親和性及び相互作用のオフ速度は、競合的結合アッセイによって決定することができる。競合的結合アッセイの１つの例は、ＦｃγＲなどのような非標識リガンドの増大性の量の存在下における、対象の分子（例えば本発明のＦｃ変異体）との、ＦｃγＲなどのような標識リガンドのインキュベーション（例えば３Ｈ又は１２５Ｉ）及び標識リガンドに結合した分子の検出を含むラジオイムノアッセイである。リガンドに対する本発明の分子の親和性及び結合オフ速度は、スキャチャード解析によって飽和データから決定することができる。
【０１９６】
Ｆｃ変異体の動力学的パラメーターはまた、当技術分野において既知の任意の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのアッセイ（例えばＢＩＡｃｏｒｅ反応速度解析）を使用して決定されてもよい。ＳＰＲベースの技術の概説については、Ｍｕｌｌｅｔら、２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２：７７〜９１；Ｄｏｎｇら、２００２、Ｒｅｖｉｅｗ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、８２：３０３〜２３；Ｆｉｖａｓｈら、１９９８、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９７〜１０１；Ｒｉｃｈら、２０００、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：５４〜６１を参照されたい。さらに、米国特許第６，３７３，５７７号；第６，２８９，２８６号；第５，３２２，７９８号；第５，３４１，２１５号；第６，２６８，１２５号において記載されるタンパク質間相互作用を測定するためのＳＰＲ機器及びＳＰＲベースの方法のいずれかは、本発明の方法において企図される。
【０１９７】
当業者らに知られている技術のいずれかを使用する蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）は、細胞表面上に発現される分子（例えばＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ）へのＦｃ変異体の結合を特徴付けるために使用することができる。フローソーターは、ライブラリー挿入物を含有する多くの個々の細胞を急速に検査することができる（例えば毎時１０〜１００百万個の細胞）（Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、１９９５）。生物学的細胞をソートし、検査するためのフローサイトメーターは、当技術分野においてよく知られている。既知のフローサイトメーターは、例えば米国特許第４，３４７，９３５号；第５，４６４，５８１号；第５，４８３，４６９号；第５，６０２，０３９号；第５，６４３，７９６号；及び第６，２１１，４７７号において記載される。他の既知のフローサイトメーターは、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙによって製造されたＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（商標）システム及びＵｎｉｏｎ  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃａによって製造されたＣＯＰＡＳ（商標）システムである。
【０１９８】
本発明のＦｃ変異体は、ＦｃγＲ媒介性のエフェクター細胞機能を媒介するそれらの能力によって特徴付けることができる。アッセイすることができるエフェクター細胞機能の例は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、オプソニン作用、オプソニン化貪食作用、Ｃ１ｑ結合、及び補体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＣＤＣ）を含むが、これらに限定されない。エフェクター細胞機能活性を決定するための、当業者らに知られている任意の細胞ベースの又は無細胞アッセイを使用することができる（エフェクター細胞アッセイについては、Ｐｅｒｕｓｓｉａら、２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２１：１７９〜９２；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉら、１９９８  Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ、４４（１０）：８４１〜８；Ｌｅｈｍａｎｎら、２０００  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４３（１−２）：２２９〜４２；Ｂｒｏｗｎ  Ｅ  Ｊ．１９９４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、４５：１４７〜６４；Ｍｕｎｎら、１９９０  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７２：２３１〜２３７、Ａｂｄｕｌ−Ｍａｊｉｄら、２００２  Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５：７０〜８１；Ｄｉｎｇら、１９９８、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：４０３〜４１１を参照されたい）。
【０１９９】
特に、本発明のＦｃ変異体は、当業者らに知られている標準的な方法のいずれかを使用して、エフェクター細胞（例えばナチュラルキラー細胞）におけるＦｃγＲ媒介性ＡＤＣＣ活性についてアッセイすることができる（例えばＰｅｒｕｓｓｉａら、２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２１：１７９〜９２を参照されたい）。本発明の分子のＡＤＣＣ活性を決定するための例示的なアッセイは、［５１Ｃｒ］Ｎａ２ＣｒＯ４による標的細胞の標識（この細胞膜透過性分子は、ゆっくりとした反応速度で細胞から自発的に放出されるが、細胞質タンパク質に結合し、標的細胞壊死の後に大量に放出されるので、標識のために一般的に使用される）；本発明のＦｃ変異体により標的細胞をオプソニン化すること；エフェクター細胞に対する標的細胞の適切な比で、マイクロタイタープレートにおいて、エフェクター細胞とオプソニン化された放射標識標的細胞を組み合わせること；３７℃で１６〜１８時間、細胞の混合物をインキュベートすること；上清を収集すること；及び放射活性を解析することを含む５１Ｃｒ放出アッセイに基づく。次いで、本発明の分子の細胞傷害は、例えば以下の式を使用して決定することができる：溶解％＝（実験ｃｐｍ−標的リークｃｐｍ）／（界面活性剤溶解ｃｐｍ−標的リークｃｐｍ）×１００％。その代わりに、溶解％＝（ＡＤＣＣ−ＡＩＣＣ）／（最大放出−自発的放出）。特異的な溶解は、式：特異的溶解＝本発明の分子による溶解％−本発明の分子の非存在下における溶解％を使用して計算することができる。図は、標的：エフェクター細胞比又は抗体濃度を変えることによって生成することができる。
【０２００】
Ｆｃ変異体がＣ１ｑに結合し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介する能力を特徴付けるための方法は、当技術分野においてよく知られている。例えば、Ｃ１ｑ結合を決定するために、Ｃ１ｑ結合ＥＬＩＳＡが、実行されてもよい。例示的なアッセイは、以下を含んでいてもよい：アッセイプレートは、コーティングバッファーにおいて４℃でポリペプチド変異体又は出発ポリペプチド（対照）により一晩コートされてもよい。次いで、プレートは、洗浄され、遮断されてもよい。洗浄の後に、ヒトＣ１ｑの一定分量は、それぞれのウェルに添加され、室温で２時間インキュベートされてもよい。さらなる洗浄の後に、１００ｕＬのヒツジ抗補体Ｃ１ｑペルオキシダーゼコンジュゲート抗体は、それぞれのウェルに添加され、室温で１時間インキュベートされてもよい。プレートは、洗浄バッファーにより再び洗浄されてもよく、１００ｕｌのＯＰＤ（Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸化合物（Ｓｉｇｍａ））を含有する基質バッファーは、それぞれのウェルに添加されてもよい。黄色の色の出現によって観察される酸化反応は、３０分間進行させ、１００ｕｌの４．５ＮＨ２  ＳＯ４の添加によって停止させてもよい。次いで、吸光度は、（４９２〜４０５）ｎｍで読み取られてもよい。
【０２０１】
補体活性化を評価するために、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイが、実行されてもよい（例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３において記載されるように）。手短に言えば、様々な濃度のＦｃ変異体及びヒト補体は、バッファーにより希釈されてもよい。Ｆｃ変異体が結合する抗原を発現する細胞は、約１×１０６細胞／ｍｌの密度まで希釈されてもよい。Ｆｃ変異体、希釈されたヒト補体、及び抗原を発現する細胞の混合物は、平底組織培養９６ウェルプレートに添加され、補体媒介性細胞溶解を容易にするために、３７℃及び５％ＣＯ２で２時間、インキュベートされてもよい。次いで、５０ｕＬのａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ（Ａｃｃｕｍｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を、それぞれのウェルに添加し、３７℃で一晩インキュベートされてもよい。吸光度は、５３０ｎｍの励起及び５９０ｎｍの放射で９６ウェル蛍光光度計を使用して測定される。結果は、相対的蛍光単位（ＲＦＵ）で表現されてもよい。試料濃度は、標準曲線から計算されてもよく、類似の分子（つまり非改変又は野生型ＣＨ３ドメインを有するＦｃ領域を含む分子）に比べた活性パーセントは、対象のＦｃ変異体について報告される。
【０２０２】
補体アッセイは、モルモット、ウサギ、又はヒト血清により実行されてもよい。標的細胞の補体溶解は、Ｋｏｒｚｅｎｉｅｗｓｋｉら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６４（３）：３１３〜２０；及びＤｅｃｋｅｒら、１９８８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１５（１）：６１〜９において記載されるように、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）などのような細胞内酵素の放出又は標的細胞が標識されるユウロピウム、クロム５１、若しくはインジウム１１１などのような細胞内標識の放出をモニターすることによって検出されてもよい。
【０２０３】
方法
本発明は、疾患、障害、又は感染と関連する１つ又は複数の症状を予防する、治療する、又は回復させるために、動物、特に哺乳動物、具体的にはヒトに、本発明の１つ又は複数のＦｃ変異体（例えば抗体）を投与することを包含する。本発明のＦｃ変異体は、エフェクター細胞機能（例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣ）の効能の変化が所望される疾患又は障害の治療又は予防に特に有用である。Ｆｃ変異体及びその組成物は、原発性又は転移性新生物疾患（つまり癌）及び感染症の治療又は予防に特に有用である。本発明の分子は、当技術分野において知られている又は本明細書において記載される薬学的に許容される組成物中に提供されてもよい。下記に詳述されるように、本発明の分子は、癌（特に受動免疫療法において）、自己免疫疾患、炎症性障害、又は感染症を治療する又は予防するための方法において使用することができる。
【０２０４】
本発明のＦｃ変異体はまた、癌、自己免疫疾患、炎症性障害、又は感染症の治療又は予防のために、当技術分野において既知の他の治療剤と組み合わせて好都合に利用されてもよい。特定の実施形態では、本発明のＦｃ変異体が、例えば、分子と相互作用するエフェクター細胞の数又は活性を増大させ、免疫応答を増大させるように働くモノクローナル若しくはキメラ抗体、リンホカイン、又は造血性増殖因子（例えばＩＬ−２、ＩＬ−３、及びＩＬ−７など）と組み合わせて使用されてもよい。本発明のＦｃ変異体はまた、例えば抗癌剤、抗炎症剤、又は抗ウイルス剤などのような、疾患、障害、又は感染を治療するために使用される１つ又は複数の薬剤と組み合わせて、好都合に利用されてもよい。
【０２０５】
したがって、本発明は、本発明の１つ又は複数のＦｃ変異体を投与することによって、癌及び関連する状態と関連する１つ又は複数の症状を予防する、治療する、又は回復させるための方法を提供する。作用のいかなるメカニズムによっても拘束されるつもりはないが、類似の分子よりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＩＡ及び／若しくはＦｃγＲＩＩＡに結合し、類似の分子よりも低い親和性でＦｃγＲＩＩＢにさらに結合する本発明のＦｃ変異体並びに／又は当該Ｆｃ変異体は、増強したエフェクター機能、例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣ、食作用、オプソニン作用などを有し、癌細胞の選択的なターゲティング及び効率的な破壊をもたらすであろう。
【０２０６】
本発明は、通例の標準的な及び実験的な化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法、又は外科手術を含むが、これらに限定されない、癌の治療又は予防について当業者らに知られている他の療法と組み合わせて、本発明の１つ又は複数のＦｃ変異体を投与することをさらに包含する。いくつかの実施形態では、本発明の分子が、癌の治療及び／又は予防について当業者らに知られている、治療又は予防有効量の１つ又は複数の抗癌剤、治療用抗体、又は他の作用物質と組み合わせて投与されてもよい。本発明のＦｃ変異体と組み合わせて使用することができる投薬レジメン及び療法の例は、当技術分野においてよく知られており、詳細に別記されている（例えばＰＣＴ公開ＷＯ０２／０７０００７及びＷＯ０３／０７５９５７を参照されたい）。
【０２０７】
本発明の方法及び組成物によって治療することができる又は予防することができる癌及び関連する障害は、以下を含むが、これらに限定されない：白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨及び結合組織肉腫、脳腫瘍、乳癌、副腎癌、甲状腺癌、膵癌、下垂体癌、眼癌、膣癌、外陰癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、肺癌、精巣癌、前立腺癌、陰茎癌（ｐｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）；口腔癌、唾液腺癌、咽頭癌、皮膚癌、腎臓癌、膀胱癌（そのような障害の概説については、Ｆｉｓｈｍａｎら、１９８５、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ及びＭｕｒｐｈｙら、１９９７、Ｉｎｆｏｒｍｅｄ  Ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ：Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ、Ｖｉｋｉｎｇ  Ｐｅｎｇｕｉｎ，  Ｐｅｎｇｕｉｎ  Ｂｏｏｋｓ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｉｎｃ．、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａを参照されたい）。
【０２０８】
本発明は、抗体が本発明の変異体ＣＨ３ドメインを組み込むＦｃ領域を含むように、癌及び関連する障害の治療及び／又は予防のための当技術分野において既知の抗体のいずれかを操作することをさらに企図する。
【０２０９】
特定の実施形態では、本発明の分子（例えば変異体Ｆｃヘテロ二量体を含む抗体）は、本発明の当該分子の非存在下における原発性腫瘍又は転移の成長に比べて、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、又は少なくとも１０％まで、原発性腫瘍の成長又は癌性細胞の転移を阻害する又は低下させる。
【０２１０】
本発明は、対象における炎症性障害と関連する１つ又は複数の症状を予防する、治療する、又は管理するための本発明の１つ又は複数のＦｃ変異体の使用を包含する。作用のいかなるメカニズムによっても拘束されるつもりはないが、ＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が増強したＦｃ変異体は、活性化受容体を弱め、したがって免疫応答を弱めることを導き、自己免疫障害を治療する及び／又は予防するための治療上の効能を有するであろう。さらに、炎症性障害と関連する、変異体Ｆｃヘテロ二量体を含む二重特異性抗体などのような１つを超える標的に結合する抗体は、一価療法に対して、相乗的効果をもたらしてもよい。
【０２１１】
本発明は、治療又は予防有効量の１つ又は複数の抗炎症剤と組み合わせて、本発明のＦｃ変異体を投与することをさらに包含する。本発明はまた、治療又は予防有効量の１つ又は複数の免疫調節作用物質と組み合わせて、本発明のＦｃ変異体を当該対象に投与することをさらに含む、自己免疫疾患と関連する１つ又は複数の症状を予防する、治療する、又は管理するための方法をも提供する。本発明のＦｃ変異体を投与することによって治療されてもよい自己免疫障害の例は、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎及び精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、チャーグ−ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円盤状狼瘡、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン−バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少症紫斑（ＩＴＰ）、ＩｇＡニューロパシー、若年性関節炎、扁平苔癬、紅斑性狼瘡、メニエル病、混合結合組織病、多発性硬化症、１型又は免疫媒介性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多発内分泌腺症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発筋炎及び皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、高安動脈炎及び側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、疱疹状皮膚炎脈管炎などのような血管炎、尋常性白斑、並びにウェゲナー肉芽腫症を含むが、これらに限定されない。炎症性障害の例は、喘息、脳炎、炎症性腸感染、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー障害、敗血症性ショック、肺線維症、未分化型脊椎関節障害（ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｓｐｏｎｄｙｌｏａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）、未分化型関節障害（ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）、関節炎、炎症性骨溶解、及び慢性ウイルス又は細菌感染に起因する慢性炎を含むが、これらに限定されない。いくつかの自己免疫障害は、炎症性の状態と関連し、したがって、自己免疫障害及び炎症性障害と見なされるものの間に重複がある。そのため、いくつかの自己免疫障害は、炎症性障害とも見なされてもよい。本発明の方法に従って予防する、治療する又は管理することができる炎症性障害の例は、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー障害、敗血症性ショック、肺線維症、未分化型脊椎関節障害、未分化型関節障害、関節炎、炎症性骨溶解、及び慢性ウイルス又は細菌感染に起因する慢性炎を含むが、これらに限定されない。
【０２１２】
本発明のＦｃ変異体は、炎症性障害を有する動物、特に哺乳動物が経験する炎症を低下させるために使用することもできる。特定の実施形態では、本発明のＦｃは、当該分子を投与されない動物における炎症に比べて、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、又は少なくとも１０％まで、動物における炎症を低下させる。
【０２１３】
本発明は、抗体が本発明の変異体Ｆｃヘテロ二量体を含むように、自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療及び／又は予防のための当技術分野において既知の抗体のいずれかを操作することをさらに企図する。
【０２１４】
本発明はまた、本発明の治療又は予防有効量の１つ又は複数のＦｃ変異体を投与することを含む、対象における感染症を治療する又は予防するための方法を包含する。本発明のＦｃ変異体によって治療する又は予防することができる感染症は、ウイルス、細菌、菌類、原生動物、及びウイルスを含むが、これらに限定されない感染病原体によって引き起こされる。
【０２１５】
本発明の方法と併用して本発明のＦｃ変異体を使用して治療する又は予防することができるウイルス性疾患は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純ヘルペスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス（ｅｃｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、天然痘、エプスタインバーウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）、及びウイルス性髄膜炎、脳炎、デング熱、又は天然痘などのようなウイルス性疾患の病原体によって引き起こされるものを含むが、これらに限定されない。
【０２１６】
細菌によって引き起こされる、本発明の方法と併用して本発明のＦｃ変異体を使用して治療する又は予防することができる細菌性疾患は、ミコバクテリア・リケッチア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、マイコプラズマ、ナイセリア、Ｓ．ニューモニエ、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）（ライム病）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽病）、テタヌス、連鎖球菌、ブドウ球菌、ミコバクテリウム、テタヌス、ペルチサス（ｐｅｒｔｉｓｓｕｓ）、コレラ、ペスト、ジフテリア、クラミジア、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、及びレジオネラを含むが、これらに限定されない。原生動物によって引き起こされる、本発明の方法と併用して本発明の分子を使用して治療する又は予防することができる原虫症は、リーシュマニア、コクジジオア（ｋｏｋｚｉｄｉｏａ）、トリパノソーマ、又はマラリアを含むが、これらに限定されない。寄生虫によって引き起こされる、本発明の方法と併用して本発明の分子を使用して治療する又は予防することができる寄生虫症は、クラミジア及びリケッチアを含むが、これらに限定されない。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、本発明のＦｃ変異体が、感染症の治療及び／又は予防のための、当業者らに知られている、治療又は予防有効量の１つ又はさらなる治療剤と組み合わせて投与されてもよい。本発明は、抗生物質、抗真菌剤、及び抗ウイルス剤を含むが、これらに限定されない、感染症の治療及び／又は予防のための、当業者らに知られている他の分子と組み合わせた、本発明の分子の使用を企図する。
【０２１８】
本発明は、方法及び本発明のＦｃ変異体（例えば抗体、ポリペプチド）を含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、有効量の本発明の少なくとも１つのＦｃ変異体又は本発明の少なくとも１つのＦｃ変異体を含む医薬組成物を対象に投与することによる、疾患、障害、又は感染と関連する１つ又は複数の症状の治療、予防、及び回復の方法を提供する。一態様では、Ｆｃ変異体が、実質的に精製される（つまり、その効果を制限する又は望ましくない副作用をもたらす物質が実質的になく、これは、ホモ二量体及び他の細胞物質を含む）。特定の実施形態では、対象が、非霊長動物（例えば雌ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）並びに霊長動物（例えば、カニクイザルなどのようなサル及びヒト）を含む哺乳動物などのような動物である。特定の実施形態では、対象が、ヒトである。さらに他の特定の実施形態では、本発明の抗体が、対象と同じ種由来のものである。
【０２１９】
組成物の投与のルートは、治療されることとなる状態に依存する。例えば、静脈内注射は、リンパ腺癌又は転移した腫瘍などのような全身性の障害の治療に好ましいことがある。投与されることとなる組成物の投薬量は、標準的な用量−応答研究と併用して、不必要な実験作業を伴わないで、当業者によって決定することができる。それらの決定を行う際に考慮されることとなる関連する環境は、治療されることとなる状態（単数又は複数）、投与されることとなる組成物の選択、個々の患者の年齢、体重、及び応答、並びに患者の症状の重症度を含む。状態に応じて、組成物は、経口的に、非経口的に、鼻腔内に、経膣的に、直腸に、舌の方向に、舌下に、頬側に、頬内に、及び／又は経皮的に、患者に投与することができる。
【０２２０】
したがって、経口、舌、舌下、頬側、及び頬内投与のために設計された組成物は、例えば不活性の希釈剤又は食用の担体と共に、当技術分野においてよく知られている手段によって、不必要な実験作業を伴わないで作製することができる。組成物は、ゼラチンカプセル中に封入されてもよい又は錠剤に圧縮されてもよい。経口治療の投与の目的のために、本発明の医薬組成物は、賦形剤と共に組み込まれ、錠剤、トローチ、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、オブラート、チューインガムなどの形態で使用されてもよい。
【０２２１】
錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチなどはまた、結合剤、レシピエント、崩壊剤、滑沢剤、甘味料、及び／又は香料を含有してもよい。結合剤のいくつかの例は、結晶セルロース、トラガカントゴム、及びゼラチンを含む。賦形剤の例は、デンプン及びラクトースを含む。崩壊剤のいくつかの例は、アルギン酸、コーンスターチなどを含む。滑沢剤の例は、ステアリン酸マグネシウム及びステアリン酸カリウムを含む。滑剤の例は、コロイド状二酸化ケイ素である。甘味料のいくつかの例は、スクロース、サッカリンなどを含む。香料の例は、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香味料などを含む。これらの様々な組成物を調製するのに使用される物質は、使用される量において薬学的に純粋であり、無毒性であるべきである。
【０２２２】
本発明の医薬組成物は、例えば静脈内、筋肉内、鞘内、及び／又は皮下注射によってなどのように、非経口的に投与することができる。非経口投与は、水剤又は懸濁剤の中に本発明の組成物を組み込むことによって達成することができる。そのような水剤又は懸濁剤はまた、注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、及び／又は他の合成溶媒などのような滅菌希釈剤を含んでいてもよい。非経口製剤はまた、例えばベンジルアルコール及び／又はメチルパラベンなどのような抗菌剤、例えばアスコルビン酸及び／又は亜硫酸水素ナトリウムなどのような酸化防止剤、並びにＥＤＴＡなどのようなキレート化剤を含んでいてもよい。アセテート、シトレート、及びホスフェートなどのようなバッファー並びに塩化ナトリウム及びデキストロースなどのような張度の調節のための作用物質もまた、追加されてもよい。非経口調製物は、ガラス製又はプラスチック製のアンプル、使い捨ての注射器、及び／又は多用量バイアル中に封入することができる。直腸投与は、直腸及び／又は大腸の中に組成物を投与することを含む。これは、坐剤及び／又は浣腸剤を使用して達成することができる。坐剤製剤は、当技術分野における既知の方法によって作製することができる。経皮的投与は、皮膚を通しての組成物の経皮吸収を含む。経皮的製剤は、パッチ、軟膏剤、クリーム剤、ゲル、軟膏などを含む。本発明の組成物は、患者に経鼻的に投与することができる。本明細書において使用されるように、経鼻的に投与すること又は経鼻投与は、患者の鼻通路及び／又は鼻腔の粘膜に組成物を投与することを含む。
【０２２３】
本発明の医薬組成物は、疾患、障害、又は感染と関連する１つ又は複数の症状を予防する、治療する、又は回復させるための本発明の方法に従って使用されてもよい。本発明の医薬組成物は滅菌されており、対象への投与に適した形態をしていることが企図される。
【０２２４】
一実施形態では、本発明の組成物は、内毒素及び／又は関連する発熱性物質が実質的にない、発熱物質がない製剤である。内毒素は、微生物内に限られ、微生物が分解された又は死亡した場合に放出される毒素を含む。発熱性物質はまた、細菌及び他の微生物の外膜由来の発熱誘発性で熱安定性の物質（糖タンパク質）をも含む。これらの物質は両方とも、ヒトに投与された場合、発熱、低血圧、及びショックを引き起こし得る。可能性のある有害な影響により、静脈内投与医薬水剤から低量の内毒素でさえ除去することは好都合である。Ｆｏｏｄ  ＆  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（「ＦＤＡ」）は、静脈内薬剤適用のための単一の１時間の期間において、体重１キログラム当たり１用量当たり５内毒素単位（ＥＵ）の上限を設定した（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｆｏｒｕｍ  ２６（１）：２２３（２０００））。治療用タンパク質が、モノクローナル抗体の場合であり得るように、体重１キログラム当たり数百又は数千ミリグラムの量で投与される場合、極微量の内毒素でさえ除去することは好都合である。特定の実施形態では、組成物中の内毒素及び発熱物質のレベルは、１０ＥＵ／ｍｇ未満又は５ＥＵ／ｍｇ未満又は１ＥＵ／ｍｇ未満又は０．１ＥＵ／ｍｇ未満又は０．０１ＥＵ／ｍｇ未満又は０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。
【０２２５】
本発明は、疾患、障害、又は感染と関連する１つ又は複数の症状を予防する、治療する、又は回復させるための方法であって、（ａ）１つ又は複数のＦｃ変異体を含む予防又は治療有効量の用量の組成物をその必要のある対象に投与すること及び（ｂ）抗原に継続的に結合する、望ましいレベル（例えば約０．１〜約１００μｇ／ｍｌ）にＦｃ変異体の血漿濃度を維持するために、１つ又は複数の続く用量の当該Ｆｃ変異体を投与することを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、Ｆｃ変異体の血漿濃度は、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、３５μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、４５μｇ／ｍｌ、又は５０μｇ／ｍｌに維持される。特定の実施形態では、投与されることとなる当該有効量のＦｃ変異体が、１用量当たり少なくとも１ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。他の特定の実施形態では、投与されることとなる当該有効量のＦｃ変異体が、１用量当たり少なくとも４ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇである。さらに他の特定の実施形態では、投与されることとなる当該有効量のＦｃ変異体が、１用量当たり５０ｍｇ〜２５０ｍｇである。さらに他の特定の実施形態では、投与されることとなる当該有効量のＦｃ変異体が、１用量当たり１００ｍｇ〜２００ｍｇである。
【０２２６】
本発明はまた、Ｆｃ変異体が、Ｆｃ変異体及び／又は変異体融合タンパク質以外の療法（例えば予防又は治療剤）と組み合わせて使用される、疾患、障害、又は感染と関連する１つ又は複数の症状を予防する、治療する、又は回復させるためのプロトコールをも包含する。本発明は、部分的に、本発明のＦｃ変異体が、通例の標準的な及び実験的な化学療法を含む他の癌療法の効能を高め、それと相乗作用を示す、その効力を増強する、その耐性を改善する、及び／又はそれによって引き起こされる副作用を低下させるという認識に基づく。本発明の併用療法は、付加的な効力、付加的な治療効果、又は相乗効果を有する。本発明の併用療法は、当該対象の生活の質を改善するために及び／又は予防若しくは治療効果を達成するために、疾患、障害、若しくは感染と関連する１つ若しくは複数の症状を予防する、治療する、若しくは回復させるためにＦｃ変異体と併用して利用される療法（例えば予防若しくは治療剤）の投薬量をより低くする及び／又は疾患、障害、若しくは感染を有する対象へのそのような予防若しくは治療剤の投与の頻度を低下させるのを可能にする。さらに、本発明の併用療法は、通例の単一作用物質による療法及び／又は既存の併用療法の投与と関連する不要な又は有害な副作用を低下させ又は回避し、これは、ひいては、治療プロトコールへの患者のコンプライアンスを改善する。本発明のＦｃ変異体と組み合わせて利用することができる多数の分子は、当技術分野においてよく知られている。例えばＰＣＴ公開ＷＯ０２／０７０００７；ＷＯ０３／０７５９５７、及び米国特許出願公開第２００５／０６４５１４号を参照されたい。
【０２２７】
本発明は、疾患、障害、又は感染と関連する１つ又は複数の症状をモニターする、診断する、予防する、治療する、又は回復させるのに使用するための、１つ又は複数の容器における、検出可能な作用物質、治療剤、又は薬剤にコンジュゲートされた又は融合された抗原に特異的に結合する、ＦｃγＲ及び／又はＣ１ｑに対する変化した結合親和性並びに変化したＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を有する１つ又は複数のＦｃ変異体を含むキットを提供する。
【実施例】
【０２２８】
以下の例は、本発明の実施を例示するために与えられるものである。それらは本発明の範囲全体を限定又は規定することを意図するものではない。
【０２２９】
（例１：ヘテロ二量体Ｆｃドメインを有する二価一特異的抗体の生成）
抗体重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を、ヒト／哺乳動物発現のために最適化されたコドンを用いる遺伝子合成により構築した。Ｆａｂ配列は公知のＨｅｒ２／ｎｅｕ結合Ａｂから生成され（Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．ら（１９９２）、Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ  Ｐ１８５  Ｈｅｒ２  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８９、４２８５頁）、ＦｃはＩｇＧ１アイソタイプであった（配列番号１）。最終遺伝子産物を哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（ＮＲＣ−ＢＲＩ、Ｃａｎａｄａ）（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，  Ｙ．、Ｐｅｒｒｅｔ，Ｓ．＆  Ｋａｍｅｎ，Ａ．、Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｇｒｏｗｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１  ｃｅｌｌｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０、Ｅ９（２００２））中にサブクローニングした。ＣＨ３ドメイン中の突然変異は、ｐＴＴ５鋳型ベクターの部位特異的突然変異誘発により導入された。作製した変異体ＣＨ３ドメイン突然変異の一覧については、表１及び表６及び表７を参照されたい。
【０２３０】
ヘテロ二量体の形成を評価し、ホモ二量体とヘテロ二量体との比率を決定するために、異なるサイズのＣ末端伸長部を有する２つのヘテロ二量体重鎖を設計した（特に、Ｃ末端ＨｉｓＴａｇを有する鎖Ａ及びＣ末端ｍＲＦＰ＋ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩを有する鎖Ｂ）。この分子量の差異は、図２５Ａに示される非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるホモ二量体とヘテロ二量体との区別を可能にする。
【０２３１】
細胞指数増殖期（１５０〜２００万個の細胞／ｍＬ）のＨＥＫ２９３細胞に、２．５：１のＰＥＩ：ＤＮＡ比で水性１ｍｇ／ｍＬの２５ｋＤａポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）をトランスフェクトした（Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｃ．ら、Ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ．５５（１）：４４〜５１頁（２０１１））。ヘテロ二量体を形成させるための最適な濃度範囲を決定するために、２つの重鎖の３つの別々の比率でＤＮＡをトランスフェクトした。例えば、これを、２ｍｌ培養容量並びに５％ＧＦＰ、４５％サケ精子ＤＮＡ、２５％軽鎖及び２５％全重鎖を含むトランスフェクションＤＮＡ中で行い、ここで６５％／５５％／３５％又は１０％／２０％／４０％の重鎖Ａプラスミド（Ｃ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇを含む）及び重鎖Ｂプラスミド（Ｃ末端ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩ＋ＲＦＰを含む）を１０％／６５％；２０％／５５％；４０％／３５％の３つの異なる相対比（鎖＿Ａ（Ｈｉｓ）／鎖＿Ｂ（ｍＲＦＰ）でサンプリングした（ＷＴ＿Ｈｉｓ／ＷＴ＿ｍＲＦＰヘテロ二量体の見かけの１：１発現比はＤＮＡ比２０％／５５％に近いものであると決定された）。Ｆ１７無血清培地（Ｇｉｂｃｏ）中でのトランスフェクションの４〜４８時間後、ＴＮ１ペプトンを０．５％の最終濃度となるように添加する。発現された抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、最適なヘテロ二量体形成のための重鎖と軽鎖の最良の比率を決定した（図２５Ｂ及びＣを参照されたい）。
【０２３２】
選択されたＤＮＡ比、例えば、ＡＺ３３及びＡＺ３４の５０％の軽鎖プラスミド、２５％の重鎖Ａプラスミド、２５％の重鎖Ｂを、５％ＧＦＰ、及び４５％サケ精子ＤＮＡと共に用いて、上記のように１５０ｍＬの細胞培養液をトランスフェクトした。培養培地を４０００ｒｐｍでの遠心分離後に回収し、０．４５μｍフィルターを用いて清澄化して、トランスフェクトされた細胞を５〜６日後に収穫した。純度及び融解温度の決定などのさらなる分析のために作製されたＣＨ３突然変異を有するそれぞれの抗体のスケールアップトランスフェクションアッセイにおいて用いた軽鎖及び重鎖Ａ及びＢプラスミドのパーセンテージの一覧については、以下の表２を参照されたい。
【表７−１】
2014504265.tif 000020
【表７−２】
2014504265.tif 000021
【０２３３】
（例２：ヘテロ二量体Ｆｃドメインを有する二価一特異的抗体の精製）
清澄化された培養培地を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）プロテインＡカラム上に充填し、ｐＨ７．２の１０倍カラム容量のＰＢＳバッファーで洗浄した。抗体をｐＨ３．６の１０倍カラム容量のクエン酸バッファーで溶出させ、抗体を含有するプールされた画分をｐＨ１１のＴＲＩＳで中和した。Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ  １０ＤＧカラム（ＢｉｏＲａｄ）を用いてタンパク質を最終的に脱塩した。抗体とエンテロキナーゼ（ＮＥＢ）とを１：１０，０００の比率で、２５℃でＰＢＳ中で一晩インキュベートすることにより、重鎖Ｂ上のＣ末端ｍＲＦＰタグを除去した。ゲル濾過により混合物から抗体を精製した。ゲル濾過のために、３．５ｍｇの抗体混合物を１．５ｍＬに濃縮し、１ｍＬ／ｍｉｎの流速でＡＫＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＦＰＬＣを介してＳｅｐｈａｄｅｘ  ２００  ＨｉＬｏａｄ  １６／６００  ２００ｐｇカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に充填した。ｐＨ７．４のＰＢＳバッファーを１ｍＬ／ｍｉｎの流速で用いた。精製された抗体に対応する画分を回収し、約１ｍｇ／ｍＬに濃縮し、−８０℃で保存した。
【０２３４】
ホモ二量体と比較したヘテロ二量体の形成を、非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析を用いてアッセイした。プロテインＡで精製された抗体を４〜１２％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、非還元ゲル上で泳動して、エンテロキナーゼ（ＥＫ）処理の前に形成されたヘテロ二量体のパーセンテージを決定した（図２６を参照されたい）。質量分析のために、すべてのＴｒａｐ  ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）実験を、Ｗａｔｅｒｓ  Ｑ−ＴＯＦ２質量分析計と接続されたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステム上で実施した。５μｇのゲル濾過精製された抗体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＭｉｃｒｏＴｒａｐ（８．０ｍｍにより１．０）中に注入し、１％アセトニトリルで８分間洗浄し、１〜２０％勾配のアセトニトリル／０．１％ギ酸で２分間、次いで、２０〜６０％のアセトニトリル／０．１％ギ酸の勾配で２０分間溶出させた。溶出液（３０〜５０μＬ／ｍｉｎ）を分光計に誘導し、毎秒スペクトルを獲得した（ｍ／ｚ  ８００〜４，０００）（図２８を参照されたい）。それぞれ８５％より多いヘテロ二量体形成を有したＡＺ１２及びＡＺ１４を除いて、９０％より多いヘテロ二量体を有する変異体をさらなる分析のために選択した。
【０２３５】
（例３：示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いるヘテロ二量体Ｆｃドメインを有する二価一特異的抗体の安定性の決定）
すべてのＤＳＣ実験を、ＧＥ  ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ装置を用いて実行した。タンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でバッファー交換し、０．４〜０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、０．１３７ｍＬを試料セル中に充填し、２０〜１００℃で１℃／ｍｉｎの走査速度で測定した。ＰＢＳバッファーのバックグラウンドを差し引いて、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてデータを分析した（図２７を参照されたい）。試験した変異体及び決定された融解温度の一覧については表３を参照されたい。７０℃以上の融解温度を有する変異体及びそれぞれの変異体に関する特定のＴｍの一覧については表４を参照されたい。
【表８−１】
2014504265.tif 000022
【表８−２】
2014504265.tif 000023
【表９−１】
2014504265.tif 000024
【表９−２】
2014504265.tif 000025
【０２３６】
（例４：表面プラズモン共鳴を用いるＦｃガンマＲ結合の評価）
すべての結合実験を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．４）と共に２５℃でＢｉｏＲａｄ  ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６装置を用いて実行した。約３０００共鳴単位（ＲＵ）が固定され、残りの活性基がクエンチされるまで、２５μＬ／ｍｉｎで１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）中の４．０μｇ／ｍＬを注入することにより、組換えＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ｐ１８５、ＥｒｂＢ−２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．））を活性化ＧＬＭセンサーチップ上に捕捉した。安定なベースラインを確立するためのバッファー注入の後、２５μＬ／ｍｉｎで２４０ｓ注入した場合に（約５００ＲＵが得られる）Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に結合させることにより、変異体ＣＨ３ドメインを含む精製された抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体４０μｇ／ｍＬをセンサーチップ上に間接的に捕捉した。ＦｃガンマＲ（ＣＤ１６ａ（ｆアロタイプ）及びＣＤ３２ｂ）濃度（６０００、２０００、６６７、２２２及び７４．０ｎＭ）を、６０μＬ／ｍｉｎで１２０ｓ注入し、１８０ｓの解離段階を行って、結合センサーグラムのセットを得た。得られたＫＤ値を、平衡適合モデルを用いて結合等温線から決定し、３回の独立した実行の平均として値を報告した。野生型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインとの比較を行い、変異体ｋＤに対するＷＴ  ｋＤの比率として結合を表す（表５を参照されたい）。
【表１０−１】
2014504265.tif 000026
【表１０−２】
2014504265.tif 000027
【表１０−３】
2014504265.tif 000028
【０２３７】
（例５：Ｆｃ＿ＣＨ３操作を用いるＦｃ変異体の合理的設計−足場１（１ａ及び１ｂ）並びにＡＺ１７−６２及びＡＺ１３３〜ＡＺ２４３８の開発）
安定性及び純度に関する初期の負の設計のＦｃ変異体ＡＺ８を改善するために、上記の構造及びコンピューター戦略を用いた（図２４を参照されたい）。例えば、ＡＺ８の徹底的な構造機能分析により、野生型ヒトＩｇＧ１と比較したＡＺ８のそれぞれの導入された突然変異、Ｌ３５１Ｙ＿Ｖ３９７Ｓ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｋ３９２Ｖ＿Ｔ３９４Ｗに関する詳細な理解が提供され、重要なコアヘテロ二量体突然変異はＬ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗであるが、Ｖ３９７Ｓ、Ｋ３９２Ｖはヘテロ二量体形成とは関連しないことが示された。このコア突然変異（Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ）を、本明細書では「足場１」突然変異と呼ぶ。分析はさらに、野生型（ＷＴ）ホモ二量体形成に関して失われる重要な境界面ホットスポットがＷＴ−Ｆ４０５−Ｋ４０９、Ｙ４０７−Ｔ３６６と、Ｙ４０７−Ｙ４０７及び−Ｆ４０５のパッキングとの相互作用であることを示した（図２９を参照されたい）。これは、ループ領域Ｄ３９９〜Ｓ４００〜Ｄ４０１（図３０を参照されたい）及びＫ３７０で結合したβ−シートの大きいコンフォメーションの相違を示した、パッキング、空洞及びＭＤ分析に反映された。これは鎖間相互作用Ｋ４０９−Ｄ３９９の喪失（図３０を参照されたい）及びＥ３５７への強いＫ３７０水素結合の弱体化をもたらした（Ｋ３７０は最早Ｓ３６４及びＥ３５７と直接接触していないが、完全に溶媒に曝露している）。ＷＴ  ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインにおいて、これらの領域は、境界面を縁で繋ぎ、バルク溶媒競合（ｂｕｌｋ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）からコア相互作用を保護し、好ましい疎水性ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ相互作用の動的発生を増加させる。その結果は、ＷＴと比較してより少なく埋没したＡＺ８の表面積及び疎水性コアのより高い溶媒接近性であった。これは、ＷＴの安定性と比較したＡＺ８のより低い安定性に関する最も重要な因子が、ａ）ＷＴ−Ｆ４０５−Ｋ４０９相互作用及びＦ４０５のパッキングの喪失、並びにｂ）Ｙ４０７−Ｙ４０７及びＹ４０７−Ｔ３６６の強いパッキング相互作用の喪失であることを示していた。図２９を参照されたい。
【０２３８】
結果として、本発明者らは、ＷＴと比較してＡＺ８の低い安定性の原因となる鍵となる残基／配列モチーフを同定した。したがって、ＡＺ８の安定性及びヘテロ二量体特異性を改善するために、その後の正の設計操作の努力を、より「閉じた」ＷＴ様コンフォメーション中の３９９〜４０１位のループコンフォメーションの安定化（図３０を参照されたい）並びにＴ３６６及びＬ３６８位の疎水性コアの全体としてわずかに低下した（より緩い）パッキングの相殺（図２９を参照されたい）に特に集中した。
【０２３９】
３９９〜４０１位のループコンフォメーションのこの安定化を達成するために、記載されたコンピューター手法を用いて、本発明者らの異なる標的化設計アイデアを評価した。具体的には、Ｆｃ変異体ＡＺ８に関する３つの異なる独立した選択肢を分析して、安定性を改善するための同定された鍵となる領域を最適化した。第１に、Ｋ４０９位及びＦ４０５Ａ位に近い空洞を、疎水性コアを保護し、また３９９〜４００のループコンフォメーションを安定化するためのより良好な疎水性パッキングについて評価した（図３０を参照されたい）。これらのものは、Ｆ４０５位及びＫ３９２位にさらなる点突然変異を含んでいたが、それらに限定されるものではなかった。第２に、３９９〜４０９位の静電相互作用を改善するための選択肢を評価して、３９９〜４００のループコンフォメーションを安定化し、疎水性コアを保護した。これは、Ｔ４１１位及びＳ４００位にさらなる点突然変異を含んでいたが、それらに限定されるものではなかった。第３に、Ｔ３６６位、Ｔ３９４Ｗ位及びＬ３６８位のコアパッキングでの空洞を評価して、コア疎水性パッキングを改善した（図２９を参照されたい）。これらのものは、Ｔ３６６位及びＬ３６８位にさらなる点突然変異を含んでいたが、それらに限定されるものではなかった。異なる独立した正の設計のアイデアをコンピューター上で試験し、コンピューターツールを用いて最良に順位付けされた変異体（ＡＺ１７〜ＡＺ６２）を、例１〜４に記載のように発現及び安定性に関して実験的に検証した。７０℃以上の融解温度を有するこの設計段階からのＦｃ変異体の一覧については表４を参照されたい。
【０２４０】
Ｆｃ変異体ＡＺ３３は、安定性及び純度を改善するために足場１が改変されて足場１ａ突然変異をもたらすＦｃ変異体の開発の一例である。このＦｃ変異体は、疎水性コアを保護し、また３９９〜４００のループコンフォメーションを安定化させるために３９２〜３９４〜４０９位及び３６６位の疎水性パッキングを改善する目的でＡＺ８に基づいて設計された。このＦｃ変異体ＡＺ３３ヘテロ二量体は、ＡＺ８、Ｋ３９２Ｍ及びＴ３６６Ｉのコア突然変異とは異なる２つのさらなる点突然変異を有する。突然変異Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを、本明細書では「足場１ａ」突然変異と呼ぶ。突然変異Ｋ３９２Ｍを、Ｋ４０９位及びＦ４０５Ａ位に近い空洞でのパッキングを改善して、疎水性コアを保護し、３９９〜４００のループコンフォメーションを安定化するために設計した（図３１を参照されたい）。Ｔ３６６Ｉを、コア疎水性パッキングを改善し、Ｔ３９４Ｗ鎖のホモ二量体の形成を排除するために設計した（図２９を参照されたい）。ＡＺ３３に関する実験データは、初期の負の設計のＦｃ変異体ＡＺ８（Ｔｍ６８℃）よりも有意に改善された安定性を示したが、ＡＺ３３は７４℃のＴｍ及び９８％を超えるヘテロ二量体含量を有する（図２５Ｃを参照されたい）。
【０２４１】
（Ｆｃ変異体ヘテロ二量体の第３段階設計において足場１突然変異を用いるＦｃ変異体の開発）
ＡＺ３３は初期の出発変異体ＡＺ８よりも有意な安定性及び特異性（又は純度）の改善を提供するが、本発明者らの分析は、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体の安定性に対するさらなる改善を、ＡＺ３３の実験データ及び上記の設計方法を用いるさらなるアミノ酸改変と共に行うことができることを示唆する。異なる設計アイデアを発現及び安定性について独立に試験したが、独立した設計アイデアは移転可能であり、最も成功したヘテロ二量体は異なる設計の組合せを含む。具体的には、ＡＺ８の最適化のために、Ｋ４０９−Ｆ４０５Ａ−Ｋ３９２に近い空洞でのパッキング突然変異を、残基Ｌ３６６Ｔ〜Ｌ３６８でのコアパッキングを最適化する突然変異から独立に評価した。これらの２つの領域３６６〜３６８及び４０９〜４０５〜３９２は、互いに遠位で、独立していると考えられる。例えば、Ｆｃ変異体ＡＺ３３を、３６６〜３６８ではなく４０９〜４０５〜３９２でパッキングのために最適化したが、これは、これらの最適化突然変異を別々に評価したためであった。３６６〜３６８突然変異の比較は、Ｔ３６６ＬがＴ３６６及びまたＦｃ変異体ＡＺ３３の開発において用いられた点突然変異であるＴ３６６Ｉよりも改善された安定性を有することを示唆する。結果として、提示された実験データは、例えば、Ｔ３６６Ｉの代わりにＴ３６６Ｌを導入することによるＡＺ３３のさらなる最適化を直接示唆する。したがって、ＣＨ３ドメイン中のアミノ酸突然変異Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを本明細書では「足場１ｂ」突然変異と呼ぶ。
【０２４２】
同様の様式で、完全な実験データを分析して、現在のＦｃ変異体ヘテロ二量体ＡＺ３３をさらに改善するために用いることができる点突然変異を同定した。これらの同定された突然変異を、上記のコンピューター手法により分析し、順位付けして、表６に示されたようなＡＺ３３に基づくさらなるＦｃ変異体ヘテロ二量体の一覧を得た。
【０２４３】
（例６：Ｆｃ＿ＣＨ３操作を用いるＦｃ変異体の合理的設計−足場２（ａ及びｂ）並びにＡＺ６３−１０１及びＡＺ２１９９−ＡＺ２５２４の開発）
安定性及び純度に関して初期の負の設計段階のＦｃ変異体ＡＺ１５を改善するために、上記の構造及びコンピューター戦略を用いた（図２４を参照されたい）。例えば、Ｆｃ変異体ＡＺ１５の包括的構造機能分析により、野生型（ＷＴ）ヒトＩｇＧ１と比較したＡＺ１５の導入された突然変異Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｅ３５７Ｌ＿Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ＿Ｔ４１１Ｎの各々に関する詳細な理解が提供され、重要なコアヘテロ二量体突然変異はＬ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆであるが、Ｅ３５７Ｌ、Ｔ４１１Ｎはヘテロ二量体の形成及び安定性に関して直接関連しないことが示唆された。このコア突然変異（Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ）を本明細書では「足場２」突然変異と呼ぶ。分析はさらに、野生型（ＷＴ）ホモ二量体形成に関して失われる重要な境界面ホットスポットが塩架橋Ｄ３９９−Ｋ４０９、水素結合Ｙ４０７−Ｔ３６６及びＹ４０７−Ｙ４０７のパッキングであることを示した。以下に提供される本発明者らの詳細な分析は、本発明者らがどのように本発明者らの元のＦｃ変異体ＡＺ１５の安定性を改善し、改善された安定性を有するこれらのＦｃ変異体を達成するために位置及びアミノ酸改変を行ったかを記載する。
【０２４４】
（足場２突然変異を用いるＦｃ変異体の開発及び足場２ａ突然変異のさらなる開発）
本発明者らのコンピューター分析は、Ｆｃ変異体ＡＺ１５突然変異Ｋ４０９Ｆ＿Ｔ３６６Ａ＿Ｙ４０７Ａの最適でないパッキング及びＷＴ−Ｙ４０７−Ｙ４０７相互作用の喪失に起因する疎水性コアの全体的なパッキングの低下を示した。その後の操作段階における正の設計の努力は、初期のＦｃ変異体ＡＺ１５中のこれらのパッキング欠損を相殺するための点突然変異に集中した。標的化された残基はＴ３６６、Ｌ３５１及びＹ４０７位を含んでいた。これらの異なる組合せをコンピューターにより試験し、コンピューターツールを用いて最良に順位付けされたＦｃ変異体（ＡＺ６３〜ＡＺ７０）を、例１〜４に記載のように発現及び安定性について実験的に検証した。
【０２４５】
Ｆｃ変異体ＡＺ７０は、安定性及び純度を改善するために足場２が改変されて足場２ａ突然変異をもたらすＦｃ変異体の開発の一例である。このＦｃ変異体は、上記のように疎水性コアでのより良いパッキングを達成する目的でＡＺ１５に基づいて設計された。Ｆｃ変異体ＡＺ７０は、Ｔ３６６がＴ３６６Ａの代わりにＴ３６６Ｖに突然変異されたことを除いて、上記と同じ足場２コア突然変異（Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ）を有する（図３３）。Ｌ３５１Ｙ突然変異は、３６６Ａ＿４０９Ｆ／４０７Ａ変異体の融解温度を７１．５℃から７４℃に改善し、３６６Ａから３６６Ｖへのさらなる変化はＴｍを７５．５℃に改善する（それぞれ、７１．５℃、７４℃及び７５．５℃のＴｍを有する、表４中のＡＺ６３、ＡＺ６４及びＡＺ７０を参照されたい）。このコア突然変異（Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ）を、本明細書では「足場２ａ」突然変異と呼ぶ。Ｆｃ変異体ＡＺ７０に関する実験データは、初期の負の設計のＦｃ変異体ＡＺ１５（Ｔｍ７１℃）よりも有意に改善された安定性を示し、ここでＡＺ７０は７５．５℃のＴｍ及び９０％を超えるヘテロ二量体含量を有する（図３３及び２７）。
【０２４６】
（足場２突然変異を用いるＦｃ変異体の開発及び足場２ｂ突然変異のさらなる開発）
分子動力学シミュレーション（ＭＤ）及びパッキング分析により、ＷＴ塩架橋Ｋ４０９−Ｄ３９９の喪失におそらく起因するループ３９９〜４００の好ましいより「開いた」コンフォメーションが示された。これはまた、満たされていないＤ３９９をもたらし、次いで、Ｋ３９２との相殺的相互作用を選択し、より「開いた」コンフォメーションのループを誘導した。このより「開いた」ループコンフォメーションは、コアＣＨ３ドメイン境界面残基の全体として低下したパッキング及びより高い溶媒接近性をもたらし、次いで、ヘテロ二量体複合体を有意に脱安定化した。したがって、標的化された正の設計の努力の１つは、Ｄ３９９−Ｋ４０９塩架橋の喪失及びＫ４０９のパッキング相互作用の喪失を相殺するさらなる点突然変異による、より「閉じた」ＷＴ様のコンフォメーションにおけるこのループの連結であった。標的化された残基は、Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０、Ｋ３９２位及びその組合せを含んでいた。異なるパッキング、疎水的及び静電的な正の操作戦略を、上記の位置に関してコンピューターにより試験し、コンピューターツールを用いて決定された最良に順位付けされたＦｃ変異体（ＡＺ７１〜ＡＺ１０１）を、例１〜４に記載のように発現及び安定性について実験的に検証した。
【０２４７】
Ｆｃ変異体ＡＺ９４は、足場２が改変されて、安定性及び純度を改善するためのさらなる点突然変異と共に足場２ｂ突然変異をもたらすＦｃ変異体の開発の一例である。このＦｃ変異体は、より「閉じた」ＷＴ様のコンフォメーションにおけるループ３９９〜４００を繋ぎ、上記のようなＤ３９９−Ｋ４０９塩架橋の喪失を相殺する目的でＡＺ１５に基づいて設計された。Ｆｃ変異体ＡＺ９４は、足場２に対する４個のさらなる点突然変異（Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ）を有し、Ｌ３５１Ｙを野生型Ｌ３５１に戻し、このＦｃ変異体のためのコア突然変異として残す（Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ）。このコア突然変異Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆを、本明細書では「足場２ｂ」突然変異と呼ぶ。ＡＺ９４の４個のさらなる点突然変異は、Ｋ３９２Ｅ＿Ｔ４１１Ｅ／Ｄ３９９Ｒ＿Ｓ４００Ｒである。突然変異Ｔ４１１Ｅ／Ｄ３９９Ｒを操作して、さらなる塩架橋を形成させ、Ｋ４０９／Ｄ３９９相互作用の喪失を相殺させた（図３４）。さらに、両方の潜在的なホモ二量体における電荷間相互作用を疎外することによってホモ二量体形成を防止するように、この塩架橋を設計した。さらなる突然変異Ｋ３９２Ｅ／Ｓ４００Ｒは、別の塩架橋を形成し、したがって、より「閉じた」ＷＴ様コンフォメーションにおいて３９９＿４００ループをさらに繋ぐように意図されたものであった（図３４）。ＡＺ９４に関する実験データは、初期の負の設計のＦｃ変異体ＡＺ１５よりも改善された安定性及び純度を示し（Ｔｍ７１℃、純度＞９０％）、ここでＦｃ変異体ＡＺ９４は７４℃のＴｍ及び９５％を超えるヘテロ二量体含量又は純度を有する。
【０２４８】
（Ｆｃ変異体ヘテロ二量体の第３段階設計における足場２突然変異を用いるＦｃ変異体の開発）
Ｆｃ変異体ＡＺ７０及びＡＺ９４は両方とも、初期の負の設計のＦｃ変異体ＡＺ１５よりも安定性及び純度における有意な改善を提供するが、本発明者らの分析並びにＡＺ７０及びＡＺ９４の比較は、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体の安定性に対するさらなる改善をさらなるアミノ酸改変と共に行うことができることを直接示唆する。例えば、Ｆｃ変異体ＡＺ７０及びＡＺ９４は、初期変異体ＡＺ１５中の２つの異なる非最適化領域を標的化するように設計され、これは、疎水性コアでのパッキングを改善し、３９９〜４０１位のループコンフォメーションを安定化するためのさらなる塩架橋及び水素結合をもたらすコア境界面残基の外側に突然変異を作製することによって達成された。Ｆｃ変異体ＡＺ７０及びＡＺ９４のさらなる点突然変異は互いに遠位で、したがって、独立しており、２ａ及び２ｂ突然変異などの同じ足場２のコア突然変異の周囲で設計された他のＦｃ変異体に移行可能である。具体的には、ＡＺ７０のみが最適化されたコア突然変異Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆを担持するが、さらなる塩架橋を担持せず、一方、ＡＺ９４は４個のさらなる静電突然変異（Ｋ３９２Ｅ＿Ｔ４１１Ｅ／Ｄ３９９Ｒ＿Ｓ４００Ｒ）を含むが、疎水性コア境界面における１つ少ない突然変異を有する（Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ）。これらの足場２ｂ突然変異はＡＺ７０よりも安定性が低い（例えば、ＡＺ９４と同等のコア突然変異を有し、７２℃のＴｍを有するＡＺ６３を参照されたい）が、Ｋ３９２Ｅ＿Ｔ４１１Ｅ／Ｄ３９９Ｒ＿Ｓ４００Ｒ突然変異の付加によって相殺される。提示される安定性及び純度に関する実験データは、疎水性コアを最適化するＡＺ７０の突然変異と、ＡＺ９４の静電突然変異との組合せが、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体の安定性及び純度をさらに改善するべきであることを示唆する。同様の様式で、足場２のＦｃ変異体（ＡＺ６３〜１０１）に関する完全な実験データを分析して、Ｆｃ変異体ヘテロ二量体ＡＺ７０及びＡＺ９４をさらに改善するために用いることができる点突然変異を同定した。これらの同定された突然変異を上記のコンピューター手法によってさらに分析し、順位付けして、表７に示されるようなＡＺ７０及びＡＺ９４に基づくさらなるＦｃ変異体ヘテロ二量体の一覧を得た。
【０２４９】
（例７：ＦｃｇＲ結合に対するヘテロ二量体ＣＨ３の効果）
ＦｃｇＲを含むヘテロ二量体Ｆｃ活性の原型例として、本発明者らは、ＦｃｇＲ結合について例４に記載されたＳＰＲアッセイにおいて、Ｈｅｒ２結合Ｆａｂアームを用いて、ヘテロ二量体Ｆｃ領域Ａ：Ｋ４０９Ｄ＿Ｋ３９２Ｄ／Ｂ：Ｄ３９９Ｋ＿Ｄ３５６Ｋ（対照１（図３５中のｈｅｔ１））及びＡ：Ｙ３４９Ｃ＿Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｂ：Ｓ３５４Ｃ＿Ｔ３６６Ｗ（対照４（図３５中のｈｅｔ２））を含む２つの変異体抗体を試験した。図３５に示されるように、本発明者らは、両方のヘテロ二量体Ｆｃ領域は、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域と同じ相対強度で異なるＦｃガンマ受容体に結合することを観察するが、全体として、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は野生型抗体よりもわずかに良好にそれぞれのＦｃｇＲに結合した。これは、ＦｃのＣＨ３境界面での突然変異は、本発明者らの分子動力学シミュレーション及び分析において観察されたようにＣＨ２ドメインにわたるＦｃガンマ受容体のＦｃ領域の結合強度に影響し得ることを示唆する。
【０２５０】
（例８：ＦｃｇＲ結合に対するヘテロ二量体ＦｃのＣＨ２における非対称突然変異の効果）
Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン中の２６７位のセリンのアスパラギン酸への突然変異（Ｓ２６７Ｄ）は、ＣＨ２ドメインの２つの鎖中にホモ二量体様式で導入された場合、ＦｃガンマＩＩｂｆ、ＩＩｂＹ及びＩＩａＲ受容体への結合を増強することが知られている。この突然変異は、ヘテロ二量体Ｆｃ分子中のＣＨ２ドメインの１つにのみ導入することができ、図３６Ａに提示されたデータが示す通り、ホモ二量体ＣＨ２  Ｆｃ中にこの突然変異が導入された場合と比較して結合強度のおおよそ半分の改善が得られる。他方、Ｆｃのホモ二量体ＣＨ２ドメイン中のＥ２６９Ｋ突然変異は、ＦｃｇＲへのＦｃ領域の結合を阻害する。本発明者らは、ＦｃのＣＨ２ドメイン中の２つの鎖の１つへのこれらの好ましい及び好ましくない突然変異の非対称的導入によってＦｃｇ受容体に対するＦｃ領域の結合強度の操作を増強するためのスキームを提示する。ヘテロ二量体Ｆｃ中の１つのＣＨ２鎖への非対称様式でのＥ２６９Ｋ突然変異の導入は、それが存在する面でのＦｃｇＲの結合を遮断することによって極性ドライバーとして作用するが、Ｆｃの他方の面は通常の様式でＦｃｇＲと相互作用させる。この実験からの結果を図３６Ａに提示する。独立した様式でのＦｃの両方の鎖を介する結合強度を選択的に変化させる機会は、ＦｃとＦｃｇ受容体との間の結合強度及び選択性を操作する機会の増加を提供する。かくして、ＣＨ２ドメイン中の突然変異のそのような非対称設計により、特定の結合モデルを支持するか又は疎外する正及び負の設計を導入することが可能になり、選択性を導入するためのより大きな機会を提供する。
【０２５１】
その後の実験において、本発明者らは、ＦｃガンマＩＩａＲ、ＩＩｂＦ及びＩＩｂＹ受容体へのより弱い結合を示し続けながら、ＦｃガンマＩＩａＦ及びＩＩＩａＶ受容体への結合強度の増加を示すベースＦｃ突然変異体Ｓ２３９Ｄ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｉ３３２Ｅ＿Ｓ２９８Ａの選択性プロファイルを変化させた。これは図３６Ｂ中に示される結合プロファイルに示される。鎖Ａ中に非対称突然変異Ｅ２６９Ｋを導入し、鎖Ｂ中でのＩ３３２Ｅ突然変異を回避することにより、本発明者らはＩＩａ及びＩＩｂ受容体結合をさらに弱め、ＦｃをＩＩＩａ受容体結合に対してより特異的にする新規ＦｃｇＲ結合プロファイルを作製することができる。
【０２５２】
図３６Ｃに示される別の例において、ＣＨ２ドメイン中に突然変異Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａを含むホモ二量体Ｆｃと比較して、非対称突然変異が強調される。野生型ＩｇＧ１  Ｆｃと比較して、この変異体はＩＩＩａ受容体に対する結合の増加を示すが、野生型Ｆｃよりもわずかに強くＩＩａ及びＩＩｂ受容体にも結合する。ＩＩＩａ結合を低下させながら、非対称様式でのこれらの突然変異Ａ：Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ及びＢ：Ｓ２９８Ａの導入は、ＩＩａ／ＩＩｂ受容体結合をも増加させ、プロセスにおける選択性を緩める。このヘテロ二量体変異体中に非対称Ｅ２６９Ｋ突然変異、すなわち、Ａ：Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ２６９Ｋ及びＢ：Ｓ２９８Ａを導入することにより、本発明者らは、ＩＩａ／ＩＩｂ結合を低下させ、野生型レベルまで戻すことができる。これは、ＦｃのＣＨ２ドメイン中での非対称突然変異の使用が改善されたＦｃガンマＲ選択性を設計する有意な機会を提供することができるという事実を強調する。
【０２５３】
実験で用いた試薬は市販されているか、又は当業界で公知の市販の器具、方法若しくは試薬を用いて調製することができる。上記例は本発明の様々な態様及び本発明の方法の実施を例示するものである。例は、本発明の多くの異なる実施形態の網羅的な説明を提供することを意図されるものではない。かくして、上記発明は明確な理解のために例示及び例を用いていくらか詳細に説明されたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなくそれに対して多くの変更及び改変を加えることができることを容易に理解できる。
【０２５４】
本明細書に記載のすべての刊行物、特許及び特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許又は特許出願が具体的且つ個別に参照により本明細書に組み込まれると指摘されたのと同程度まで、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２４】
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【図３２】
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【図３５】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３７−３】
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【図３７−４】
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【図３７−５】
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【図３７−６】
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【図３７−７】
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【図３７−８】
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【図３７−９】
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【図３７−１０】
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【図３７−１１】
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【図３７−１２】
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【図３７−１３】
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【図３７−１４】
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【図３７−１５】
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【図３７−１６】
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【図３７−２０】
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【図３７−２１】
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【図３７−２２】
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【図３７−２３】
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【図３７−２４】
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【図３７−２６】
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【図３７−２７】
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【図３７−２９】
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【図３７−３０】
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【図３７−３１】
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【図３７−３３】
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【図３７−３４】
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【図３７−３５】
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【図３７−３６】
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【図３７−３７】
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【図３７−３８】
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【図３７−３９】
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【図３７−４０】
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【図３８−１】
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【図３８−２】
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【図３８−３】
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【図３８−４】
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【図３８−５】
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【図３８−６】
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【図３８−７】
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【図３８−８】
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【図３８−９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図２２】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ−Ｃ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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