(57)【要約】  本発明は、単細胞に対する新規手術用ツール及び選択された細胞に試薬を送達するための基板／デバイスを提供する。特定の実施形態では、基板は、一つ以上のオリフィスを備えた表面を有し、ナノ粒子及び／又は薄膜がオフィリスの表面又はオリフィスの近くに堆積されて、ナノ粒子及び／又は薄膜が電磁放射と接触した際に加熱される物質で形成される。特定の実施形態では、細孔が、細胞内に送達される一以上の試薬を含有するマイクロチャネルと流体連結している。
2014513984.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内に物質を送達するためのデバイスであって、
電磁放射と接触した際に加熱される物質のナノ粒子及び／又は薄膜を有する表面を備えたデバイス。
【請求項２】
前記表面がベッセルの表面を備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記ベッセルが細胞培養ベッセルを備える、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記ベッセルがマイクロタイタープレートを備える、請求項２に記載のデバイス。
【請求項５】
前記表面が、マイクロタイタープレートのウェルの、シリコン若しくはガラスウェーハの、顕微鏡スライドの、細胞培養ベッセルの、又はマイクロ流体デバイスのチャンバ若しくはチャネルの、壁及び／又は床を備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
前記表面が、細胞を含むように構成され且つ顕微鏡で観察するように配置されたチャンバの表面を備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】
前記チャンバが、開放された頂部を有する、請求項６に記載のデバイス。
【請求項８】
前記チャンバが、該チャンバを閉じる頂部を有する、請求項６に記載のデバイス。
【請求項９】
前記表面が、ガラス、鉱物、及びプラスチックから成る群から選択された物質を備える、請求項１から８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記表面が一つ以上のオリフィスを備え、前記ナノ粒子及び／又は薄膜が前記オリフィスのうち少なくとも一つの表面に及び／又は前記オリフィスのうち一つの近くに堆積されている、請求項１から９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記表面が少なくとも二つのオリフィスを備え、前記ナノ粒子及び／又は薄膜が、前記オリフィスの表面の上に及び／又は前記オリフィスの近くに堆積されている、請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記表面が、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、又は少なくとも５００個のオリフィスを備え、各オリフィスが、ナノ粒子及び／又は薄膜を有する表面を備え、及び／又は、前記オリフィスの近くに配置されたナノ粒子及び／又は薄膜を有する、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記オリフィスが略２ｃｍ２以下、略１．５ｃｍ２以下、略１ｃｍ２以下、略０．５ｃｍ２以下、又は略０．１ｃｍ２以下の領域内に全て配置されている、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記ナノ粒子及び／又は薄膜が、前記オリフィスから略１００μｍ以内、略５０μｍ以内、略２５μｍ以内、略２０μｍ以内、略１５μｍ、略１０μｍ以内、又は略５μｍ以内に配置されている、請求項１０から１３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記ナノ粒子及び／又は薄膜が、前記オリフィスの壁に及び／又は縁の全周囲に堆積されている、請求項１０から１４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記ナノ粒子及び／又は薄膜が、前記オリフィスの壁又は縁の一つの領域に優先的に存在している、請求項１０から１４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記ナノ粒子及び／又は薄膜が、細胞が配置されるのと同じ側の前記表面の面の上に及び／又はオリフィスの縁の上に堆積されている、請求項１から１６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記ナノ粒子及び／又は薄膜が、細胞が配置されるのと反対側の前記表面の面の上に及び／又はオリフィスの縁の上に堆積されている、請求項１から１６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記ナノ粒子及び／又は薄膜が薄膜を備える、請求項１から１８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記ナノ粒子及び／又は薄膜がナノ粒子を備え、該ナノ粒子のサイズの範囲が略５ｎｍから略５００ｎｍまでである、請求項１から１８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２１】
前記ナノ粒子が、ナノビーズ、ナノワイヤ、ナノチューブ、ナノドット、ナノコーン、及び量子ドットから成る群から選択されている、請求項１から２０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２２】
前記ナノ粒子及び／又は薄膜が、半導体、金属、金属合金、窒化金属、及び酸化金属から成る群から選択された物質を備える、請求項１から２１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２３】
前記ナノ粒子及び／又は薄膜が、遷移金属、遷移金属合金、窒化遷移金属、及び酸化遷移金属から成る群から選択された物質を備える、請求項２２に記載のデバイス。
【請求項２４】
前記ナノ粒子及び／又は薄膜が、金、チタン（Ｔｉ）、ＴｉＮ、ＴｉＣＮ、及びＴｉＡｌＮからなる群から選択された物質を備える、請求項２２に記載のデバイス。
【請求項２５】
前記ナノ粒子及び／又は薄膜が、ＩＩＩ族物質又はＶ族物質でドープされたＩＶ族物質である半導体を備える、請求項２２に記載のデバイス。
【請求項２６】
前記ナノ粒子及び／又は薄膜が、ホウ素、ヒ素、リン、及びガリウムから成る群から選択された物質でドープされたシリコン又はゲルマニウムを備える、請求項２５に記載のデバイス。
【請求項２７】
前記オリフィスのうち一つ以上が、細胞内に送達される試薬を含むチャンバと流体連結している、請求項１から２６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２８】
前記デバイスがマイクロチャネルを備え、前記オリフィスのうち一つ以上が、前記マイクロチャネルと流体連結している、請求項１から２６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２９】
前記デバイスが複数のマイクロチャネルを備える、請求項２８に記載のデバイス。
【請求項３０】
異なる複数のマイクロチャネルが異なる複数のオリフィスと流体連結している、請求項２９に記載のデバイス。
【請求項３１】
前記デバイスが、異なる複数のマイクロチャネルに流体を送達するマニホールド及び／又はバルブを備える、請求項３０に記載のデバイス。
【請求項３２】
前記マイクロチャネルが、細胞内に送達される試薬を含む、請求項２８から３１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３３】
前記試薬が、核酸、リボザイム、タンパク質、ペプチド、酵素、抗体、細胞小器官、染色体、病原体、及びマイクロ粒子、ナノ粒子から成る群から選択されている、請求項２７又は３２に記載のデバイス。
【請求項３４】
前記マイクロチャネルがポンプの制御で加圧され、又は重力送りによって供給が行われる、請求項２８から３３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３５】
前記デバイスが、前記マイクロチャネル内の流れを監視及び／又は制御し、且つ前記表面の照射のタイミング及び任意で位置を制御する制御装置を更に備える、請求項２８から３４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３６】
前記デバイスが、倒立顕微鏡上のステージを置換するように構成されている、請求項１から３５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３７】
細胞が前記表面の上に配置されている、請求項１から３６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３８】
前記細胞が、前記基板のオリフィスの上に又はオリフィスに隣接して配置されている、請求項３７に記載のデバイス。
【請求項３９】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項３７又は３８に記載のデバイス。
【請求項４０】
細胞内に物質を送達する選択的開口用システムであって、
請求項１から３４のいずれか一項に記載のデバイスと、
前記ナノ粒子又は薄膜を加熱する電磁エネルギー源とを備えたシステム。
【請求項４１】
前記電磁エネルギー源がレーザ又は非コヒーレント光源である、請求項４０に記載のシステム。
【請求項４２】
前記電磁エネルギー源がレーザである、請求項４１に記載のシステム。
【請求項４３】
前記システムが、レンズシステム、ミラーシステム、マスク、及び／又は、前記表面の特定の領域に電磁エネルギーを向ける位置決めシステムを備える、請求項４０から４２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４４】
前記システムが、前記電磁エネルギー源による照射のタイミング及び／又はパターンを制御する制御装置を備える、請求項４０から４３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４５】
細胞内に試薬を送達する方法であって、
請求項１から３６のいずれか一項に記載のデバイスの上に及び／又は請求項４０から４４のいずれか一項に記載のシステムに細胞を提供するステップであって、前記細胞が前記表面の上に配置される、ステップと、
前記細胞を前記試薬に接触させるステップと、
前記表面の領域を電磁放射に晒すことによって、前記薄膜及び／又は粒子の加熱を誘起するステップとを備え、前記加熱が、加熱された領域において又は近くにおいて細胞膜に開口を導入する気泡を形成して、細胞内に試薬が送達される、方法。
【請求項４６】
前記細胞を取り囲む培地に前記試薬を提供することによって、前記細胞を前記試薬と接触させる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記表面に存在している一つ以上のオリフィスに前記試薬を提供することによって、前記細胞を前記試薬と接触させる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記オリフィスと流体連結している一つ以上のマイクロ流体チャネルに前記試薬を提供することによって、前記細胞を前記試薬と接触させる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
異なる複数の試薬が異なる複数のオリフィスに導入される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記晒すことが、レーザパルス又は非コヒーレント光源に前記表面の領域を晒すことを備える、請求項３９から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記試薬が、核酸、染色体、タンパク質、標識、細胞小器官、及び小有機分子から成る群から選択される、請求項３９から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
細胞に対するマイクロマニピュレーションを行う方法であって、
前記細胞をマイクロサージャリーツールと接触させるステップであって、前記ツールが、電磁エネルギーの印加によって加熱される膜（コーティング）又はナノ粒子を先端に及び／又は先端近くに有するマイクロキャピラリを備える、ステップと、
前記ツールに電磁エネルギーを印加することによって、前記金属膜又は金属ナノ粒子の温度を上昇させて、前記細胞の膜に開口を形成するステップとを備え、前記マイクロサージャリーツールと前記細胞との接触角及び／又は前記電磁エネルギーの偏光を変化させて、前記細胞に導入される開口のサイズ及び／又は形状を変更する、方法。
【請求項５３】
前記電磁エネルギーを印加することが、光を印加して前記金属膜又はナノ粒子を加熱することを備える、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記マイクロサージャリーツールの先端が導光体として機能するように構成されている、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記電磁エネルギーを印加することが、レーザビームを印加して前記膜又はナノ粒子を加熱することを備える、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記電磁エネルギーを印加することが、磁場を印加して前記膜又はナノ粒子を加熱することを備える、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記電磁エネルギーを印加することが、電場を印加して前記膜又はナノ粒子を加熱することを備える、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
前記膜又は金属ナノ粒子の温度が、大気温度よりも少なくとも１５０℃上昇する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
前記方法が、前記マイクロキャピラリチューブを介して前記細胞内に試薬を注入するステップを更に備えた、請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
前記マイクロキャピラリの先端の直径範囲が略０．１μｍから略５μｍまでである、請求項５２に記載の方法。
【請求項６１】
前記ナノ粒子のサイズ範囲が略５ｎｍから略５００ｎｍまでである、請求項５２に記載の方法。
【請求項６２】
前記金属膜又はナノ粒子が、半導体を備えるか、又は、貴金属、貴金属合金、窒化貴金属、及び酸化貴金属から成る群から選択された金属を備える、請求項５２に記載の方法。
【請求項６３】
前記金属コーティング又はナノ粒子が、遷移金属、遷移金属合金、窒化遷移金属、及び酸化遷移金属を備える、請求項５２に記載の方法。
【請求項６４】
前記金属コーティング又はナノ粒子が、金、チタン（Ｔｉ）、ＴｉＮ、ＴｉＣＮ、及びＴｉＡｌＮから成る群から選択された物質を備える、請求項５２に記載の方法。
【請求項６５】
前記マイクロキャピラリが、ガラス、鉱物、セラミック、及びプラスチックから成る群から選択された物質を備える、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１１年５月１３日出願の米国特許出願第６１／４８６１１４号の優先権を主張し、その内容はあらゆる目的のため全体が参照として本願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、染色体、核、無生物粒子（量子ドット、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ，ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒａｍａｎ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）粒子、マイクロビーズ等）といった多様なサイズのカーゴ（積荷物質）を哺乳類の細胞に移植することは、生物学の多様な分野において非常に望まれている。エンドサイトーシス等の送達方法では、エンドソーム内にカーゴを取り込ませることができるが、低ｐＨ微小環境及びリチック・エンチームがカーゴの劣化をもたらすことが多い（非特許文献１）。ウイルス及び化学的分配方法では、カーゴをウイルス内に充填したり、摂取を増強する化学的錯体を形成する（非特許文献２、非特許文献３）。しかしながら、毒性、細胞型特異的摂取、更に致命的にはカーゴの充填容量の制限によって、カーゴのサイズ及び送達可能なセルの種類に大きな制約が課せられる（非特許文献１）。
【０００３】
物理的移植方法として、ランダムに分布したナノスケール細孔を形成するエレクトロポレーション（非特許文献４）及びソノポレーション（非特許文献５）や、レーザの焦点箇所において細胞膜に細孔を形成するオプトポレーション（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）が挙げられる。こうした細孔を介して、熱拡散又は電場によって、小型カーゴが細胞内に送達される。これらの方法で大型カーゴを送達することは、カーゴの拡散速度が遅いこと、及び細孔のサイズが大きくなると共に細胞の生存率が低くなることのため、効率が悪い（非特許文献９）。マイクロキャピラリインジェクション（非特許文献１０）では、送達のために、鋭いチップを用いて細胞膜を機械的に貫く。しかしながら、膜の貫通による機械的外傷によって、細胞の生存率を維持するために、典型的なピペットの先端は直径０．５μｍまでに制限される。
【０００４】
ピペットの先端よりも大きなカーゴは、ピペットの詰まり及びカーゴのせん断のため、注入不能である。エレクトロポレーションをマイクロキャピラリインジェクションと組み合わせたエレクトロインジェクションを用いて、電場で接触細胞膜を弱めた後に細胞を優しく機械的に貫くことによって、ＲＮＡやプラスミドＤＮＡ等の小分子を生細胞内に送達すること（非特許文献１２、非特許文献１３）、バクテリアを人工脂質小胞内に送達すること（非特許文献１４）が実証されている。他方、ＳＬＡＭ（ｓｉｍｐｌｅ  ｌｉｐｉｄ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，単純脂質補助マイクロインジェクション）法（非特許文献１５）では、ガラスマイクロキャピラリの先端に合成脂質分子を取り込む。ＳＬＡＭマイクロピペットと細胞膜との接触は、脂質分子を細胞膜を融合させて、カーゴ送達用の連続的で一時的な経路を形成する。この方法は、細胞膜を介するマイクロピペットの先端のジグザグの穿孔運動を防止する。しかしながら、カーゴ及び細胞膜の脂溶性相互作用は、細胞及び送達カーゴの望ましくない生物学的効果を生じさせる可能性があり、この方法が特定の細胞タイプ及びカーゴ成分に制限される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５６４４０４８号明細書
【特許文献２】米国特許第５３８６０２３号明細書
【特許文献３】米国特許第５６３７６８４号明細書
【特許文献４】米国特許第５６０２２４０号明細書
【特許文献５】米国特許第５２１６１４１号明細書
【特許文献６】米国特許第４４６９８６３号明細書
【特許文献７】米国特許第５２３５０３３号明細書
【特許文献８】米国特許第５０３４５０６号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２００７／０１６４２５０号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００６／０２６９６１２号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００５／０１１８１０２号明細書
【特許文献１２】米国特許第７２１２２８４号明細書
【特許文献１３】米国特許第７２０４９９９号明細書
【特許文献１４】米国特許第７１４７７１２号明細書
【特許文献１５】米国特許第７１２８８９１号明細書
【特許文献１６】米国特許第６９７２０４６号明細書
【特許文献１７】米国特許第６６８８４９４号明細書
【特許文献１８】米国特許第５６６５２７７号明細書
【特許文献１９】国際公開第２００７／０２４３２３号
【特許文献２０】米国特許第６７０６２４８号明細書
【特許文献２１】米国特許第６４８５８５８号明細書
【特許文献２２】米国特許第７１２８８９１号明細書
【特許文献２３】米国特許第７０６０１２１号明細書
【特許文献２４】米国特許第５９５８３４８号明細書
【特許文献２５】米国特許第３９４１５６７号明細書
【特許文献２６】米国特許第６２５４９２８号明細書
【特許文献２７】米国特許第５９５８３４８号明細書
【特許文献２８】米国特許第６２２５００７号明細書
【特許文献２９】米国特許第６２００６７４号明細書
【特許文献３０】米国特許第６０８０３３７号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌｕｏ  ａｎｄ  Ｓａｌｔｚｍａｎ（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３３−３７
【非特許文献２】Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２：２６３−２６７
【非特許文献３】Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３−７４１７
【非特許文献４】Ｃｈｕ，  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：１３１１−１３２６
【非特許文献５】Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ（２００５）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，４：２５５−２６０
【非特許文献６】Ｔｉｒｌａｐｕｒ  ａｎｄ  Ｋｏｎｉｇ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ，４１８：２９０−２９１
【非特許文献７】Ｖｏｇｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｂ：Ｌａｓｅｒ  Ｏｐｔ．，８１（８）：１０１５−１０４７
【非特許文献８】Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔ．，１１：０１４０３４
【非特許文献９】Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ，１４：７１２５−７１３３
【非特許文献１０】Ｋｉｎｇ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４５：Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  １；Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．：Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ
【非特許文献１１】Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，４：２１５−２２５
【非特許文献１２】Ｂｏｕｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ．，１７０：２０４−２１１
【非特許文献１３】Ｋｉｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．，５：６１−６７
【非特許文献１４】Ｈｕｒｔｉｇ  ａｎｄ  Ｏｒｗａｒ（２００８）Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ，４：１５１５−１５２０
【非特許文献１５】Ｌａｆｆａｆｉａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌｅｔｔ（１９９８）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７５：２５５８−２５６３
【非特許文献１６】Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９（１０）：１９２５
【非特許文献１７】Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ（１９７０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００
【非特許文献１８】Ｓｐｒｉｎｚｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９
【非特許文献１９】Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３４８７
【非特許文献２０】Ｓａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５
【非特許文献２１】Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０
【非特許文献２２】Ｐａｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  ２６：１４１９
【非特許文献２３】Ｍａｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１４３７
【非特許文献２４】Ｂｒｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１
【非特許文献２５】Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献２６】Ｅｇｈｏｌｍ（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５
【非特許文献２７】Ｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８
【非特許文献２８】Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６
【非特許文献２９】Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：２０７
【非特許文献３０】Ｄｅｎｐｃｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６０９７
【非特許文献３１】Ａｎｇｅｗ．（１９９１）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３０：４２３
【非特許文献３２】Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０
【非特許文献３３】Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  １３：１５９７
【非特許文献３４】Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ２  ａｎｄ  ３，ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ；
【非特許文献３５】Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５；
【非特許文献３６】Ｊｅｆｆｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ  ３４：１７；
【非特許文献３７】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６）
【非特許文献３８】Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ６  ａｎｄ  ７，ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ
【非特許文献３９】Ｊｅｎｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．ｐｐ１６９−１７６
【非特許文献４０】Ｒａｗｌｓ，Ｃ＆Ｅ  Ｎｅｗｓ  Ｊｕｎｅ  ２，１９９７  ｐａｇｅ３５
【非特許文献４１】Ｌｙｎｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ（１９９８）Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｄａｔａ  ｆｏｒ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｍｅｔａｌｓ．Ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄｓ，Ｖｏｌ．ＩＩＩ；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ
【非特許文献４２】Ｗｉｅｒｓｉｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４：２７２−２８２
【非特許文献４３】Ｂｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂ，６２（４）：Ｒ２２９１−２２９４
【非特許文献４４】Ｆｅｄｌｈｅｉｍ  ａｎｄ  Ｃｏｌｂｙ（２００１）Ｍｅｔａｌ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ＆Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．
【非特許文献４５】Ｂａｒａｔｏｎ（２００２）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ
【非特許文献４６】Ｆｅｎｄｌｅｒ（１９９８）Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｆｉｌｍｓ：  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｎ．Ｙ．
【非特許文献４７】Ｈｉｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｃｈｅｍ．，Ａ１３：７２７
【非特許文献４８】Ｈｉｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，９０５
【非特許文献４９】Ｔｏｓｈｉｍａ  ａｎｄ  Ｙｏｎｅｚａｗａ（１９９２）Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．，５９：２８１
【非特許文献５０】Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｔｏｓｈｉｍａ（１９９７）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，９７：１１５４２
【非特許文献５１】Ｐａｓｔｏｒｉｚａ‐Ｓａｎｔｏｓ  ａｎｄ  Ｌｉｚ‐Ｍａｒｚａｎ（２０００）Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，７２（１−２）：８３−９０
【非特許文献５２】Ｈａｇｇｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）ｐｐ１６５−２４１  Ｉｎ：  Ｌａｓｅｒ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊ．Ｊ．Ｓｔｅｉｎｆｅｌｄ
【非特許文献５３】Ｂｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，８（７）：１６６６−１６７４
【非特許文献５４】Ｂｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１０（１１）：２８７５−２８８４
【非特許文献５５】Ｃｕｒｃｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４６：２２５−２２９
【非特許文献５６】Ｄａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＳＰＩＥ，４５８：１２４−１３０
【非特許文献５７】Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＳＰＩＥ，４５８：１３１−１３９
【非特許文献５８】Ｈａｒｔｌａｎｄ（２００６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，５７：４０３−４３０
【非特許文献５９】Ｐｉｔｓｉｌｌｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，８４：４０２３−４０３２
【非特許文献６０】Ｋｏｔａｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，１２４（１８），Ａｒｔ．Ｎｏ．１８４７０２
【非特許文献６１】Ｊａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，１０５（１９）：４０６５−４０６７
【非特許文献６２】Ｎｉｋｏｏｂａｋｈｔ  ａｎｄ  Ｅｌ‐Ｓａｙｅｄ（２００３）Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．１５（１０）：１９５７−１９６２
【非特許文献６３】Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．，１６（１１）：２２５９−２２６６
【非特許文献６４】Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔｉｃｓ，１０（６）：０６４０１２
【非特許文献６５】Ｍａｒｍｏｔｔａｎｔ  ａｎｄ  Ｈｉｌｇｅｎｆｅｌｄｔ（２００３）Ｎａｔｕｒｅ，４２３：１５３−１５６
【非特許文献６６】Ｌｏｋｈａｎｄｗａｌｌａ  ａｎｄ  Ｓｔｕｒｔｅｖａｎ（２００１）Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４６：４１３−４３７
【非特許文献６７】Ｈｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎ．，１：２４−３５
【非特許文献６８】Ｐｅｔｅｒｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，６：８５７−８６３
【非特許文献６９】Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：６８１−６８６
【非特許文献７０】Ｇｏｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９８：１２２２１−１２２２６
【非特許文献７１】Ｓｔｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８７：７８５７−  ７８６２
【非特許文献７２】Ｂｅｎｊａｍｉｎ  ａｎｄ  Ｗｅａｖｅｒ（１９６１）Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｓｅｒ．Ａ，２６１：５１６−５３１）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
多様な実施形態において、本発明は、細胞に対する損傷又はストレスを顕著に減らして、細胞の高度に局所的な貫通を達成することができる。特定の実施形態において、細胞マイクロサージャリー（細胞微小手術）ツールは、そのツールが、電磁エネルギーの印加によって加熱可能な金属膜又は複数のナノ粒子を先端に及び／又は先端付近に有するマイクロキャピラリ（例えば、マイクロピペット）を備えるものとして提供される。
【０００８】
特定の実施形態では、細胞マイクロサージャリーツールが提供される。典型的には、そのツールは、電磁エネルギーの印加によって加熱可能な金属膜又は複数のナノ粒子を先端に及び／又は先端付近に有するマイクロキャピラリを備える。特定の実施形態では、マイクロキャピラリは中空のボア（孔）を備える。特定の実施形態では、マイクロキャピラリの先端の直径は、略０．０１μｍ、０．０５μｍ、０．１μｍ又は０．５μｍから、略１μｍ、３μｍ、５μｍ、８μｍ又は１０μｍまでの範囲に及ぶ。特定の実施形態では、マイクロピペットは、略０．５μｍから略２μｍ又は３μｍまでの範囲の外径（ＯＤ）を有する。多様な実施形態において、ナノ粒子のサイズ範囲は略５０ｎｍから略５００ｎｍまでである。多様な実施形態において、ナノ粒子のサイズ範囲は略１０ｎｍから略５００ｎｍである。多様な実施形態において、ナノ粒子は、ナノビーズ、ナノワイヤ、ナノチューブ、ナノドット、ナノコーン、及び量子ドットから成る群から選択から選択される。多様な実施形態において、金属膜又はナノ粒子は、貴金属、貴金属合金、窒化貴金属、及び／又は酸化貴金属を備える。多様な実施形態において、金属膜又はナノ粒子は、遷移金属、遷移金属合金、窒化遷移金属、及び／又は酸化遷移金属を備える。多様な実施形態において、金属膜又はナノ粒子は、磁性体、常磁性体、超常磁性体を備える。多様な実施形態において、マイクロキャピラリは、ガラス、鉱物、セラミック、及びプラスチックから成る群から選択された物質を備える。特定の実施形態では、マイクロキャピラリは、先端付近にナノ粒子を有するガラスマイクロキャピラリを備える。特定の実施形態では、マイクロキャピラリは、先端付近に金ナノ粒子を有するガラスマイクロキャピラリを備える。特定の実施形態では、マイクロキャピラリは、ナノ粒子がマイクロキャピラリの先端から１００μｍ以内に主に配置されているガラスマイクロキャピラリを備える。
【０００９】
また、細胞に対するマイクロマニピュレーション（微小操作）を実施する方法も提供される。本方法は、典型的に、本願で説明されるマイクロサージャリーツールを細胞に接触させることと、ツールに電磁エネルギーを印加することによって、金属膜又は金属ナノ粒子の温度を上昇させて、細胞の膜内へのツールの侵入を促進することとを含む。特定の実施形態では、電磁エネルギーを印加することは、光を印加して金属膜又はナノ粒子を加熱することを備える。特定の実施形態では、電磁エネルギーを印加することは、レーザビームを印加して金属膜又はナノ粒子を加熱することを備える。一般的にはレーザ加熱が好ましいが、他の電磁源も想定される。従って、特定の実施形態では、電磁エネルギーを印加することは、電場を印加して金属膜又はナノ粒子を加熱することを備える。特定の実施形態では、電磁エネルギーを印加することは、電場を印加して金属膜又はナノ粒子を加熱することを備える。多様な実施形態において、金属膜又は金属ナノ粒子の温度は、大気温度よりも少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、又は３５０℃上昇する。特定の実施形態では、本方法は、マイクロキャピラリチューブを介して細胞内に物質を注入することを更に備える。特定の実施形態では、本方法は、マイクロキャピラリチューブを介して細胞から物質を取り除くことを更に備える。特定の実施形態では、マイクロキャピラリチューブは、中空の孔を備える。特定の実施形態では、マイクロキャピラリの先端の直径範囲は、略０．１μｍから略５μｍに及ぶ。特定の実施形態では、ナノ粒子のサイズ範囲は、略５ｎｍから略５００ｎｍ、及び／又は略１０ｎｍから略４００ｎｍに及ぶ。特定の実施形態では、ナノ粒子は、ナノワイヤ、ナノチューブ、ナノドット、ナノコーン、及び量子ドットから成る群から選択される。多様な実施形態において、金属膜又はナノ粒子は、貴金属、貴金属合金、窒化貴金属、酸化貴金属を備える。多様な実施形態において、金属膜又はナノ粒子は、遷移金属、遷移金属合金、窒化遷移金属、酸化遷移金属を備える。多様な実施形態において、金属膜又はナノ粒子は、磁性体、常磁性体、超常磁性体を備える。特定の実施形態では、マイクロキャピラリは、ガラス、鉱物（例えば、石英）、セラミック、及びプラスチック（例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、デルリン（登録商標）、テフロン（登録商標）等）から成る群から選択された物質を備える。特定の実施形態では、マイクロキャピラリは、先端付近にナノ粒子を有するガラス又は石英のマイクロキャピラリを備える。特定の実施形態では、マイクロキャピラリは、先端付近に金ナノ粒子を有するガラスマイクロキャピラリを備える。特定の実施形態では、マイクロキャピラリは、ナノ粒子がマイクロキャピラリの先端から１００μｍ以内に主に配置されているガラスマイクロキャピラリを備える。
【００１０】
また、細胞に対するマイクロサージャリーを実施するためのシステムも提供され、そのシステムは、本願で説明されるマイクロサージャリーツールと、そのマイクロサージャリーツールを位置決めするためのマイクロマニピュレータ（マイクロポジショナ）とを備える。特定の実施形態では、本システムは、マイクロサージャリーツールによって操作させる細胞を可視化するための顕微鏡を更に備える。特定の実施形態では、本システムは、マイクロサージャリーツールを用いて試薬（例えば、分子、細胞小器官、流体）を送達又は取り除くためのポンプを更に備える。特定の実施形態では、本システムは、マイクロサージャリーツール上の粒子／ナノ粒子及び／又は薄膜を励起するための電磁エネルギー源（例えば、レーザ）を更に備える。多様な実施形態において、電磁エネルギー源は、磁場発生器、レーザ、ＲＦ場発生器等から成る群から選択される。
【００１１】
多様な実施形態において、本発明は、細胞に対するマイクロサージャリーのためのツールを作製するための方法を提供する。本方法は、典型的に、マイクロキャピラリチューブの先端において又はその付近において複数のナノ粒子をマイクロキャピラリチューブに付着させて、ナノ粒子に対する電磁エネルギーの印加によって局所的に加熱可能なデバイスを提供することを含む。特定の実施形態では、付着させることは、ナノ粒子をマイクロキャピラリに吸着させることを備える。特定の実施形態では、付着させることは、マイクロキャピラリ上にｉｎ  ｓｉｔｕ（その場、インサイチュ）でナノ粒子を形成することを備える。特定の実施形態では、付着させることは、ナノ粒子をマイクロキャピラリに化学的に結合させることを備える。
【００１２】
特定の実施形態では、本発明の単細胞手術ツールは、原子間力測定（ＡＦＭ，ａｔｏｍｉｃ  ｆｏｒｃｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）チップを含む。例えば、ナノ粒子を、細胞手術応用のためにＡＦＭチップと集積させることができる。このナノ粒子集積ＡＦＭチップは、チップを走査してレーザパルスを印加することによって、細胞膜を所望の形状に切断することができる。
【００１３】
特定の他の実施形態では、本発明のツールは、原子間力測定（ＡＦＭ）チップを明示的に除外する。
【００１４】
また、細胞内に物質（エージェント）を送達ためのデバイス（トランスフェクションデバイス）も提供される。多様な実施形態において、本デバイスは、粒子及び／又はナノ粒子及び／又は膜（例えば、薄膜）を有する表面（例えば、トランスフェクション基板）を備え、その粒子及び／又はナノ粒子及び／又は薄膜は、エネルギー源（例えば、レーザ等の電磁放射）に晒された（例えば照射された）際に加熱される物質を備える。細胞は、基板上に又はその付近に配置され得て、粒子／ナノ粒子及び／又は薄膜が加熱された際に、細胞に開口が形成されて（例えば、細胞膜が透過処理されて）、細胞に対する多様な試薬の導入及び除去が可能になる。特定の実施形態では、表面は、ベッセル（例えば、細胞培養ベッセル）、マイクロタイタープレート、マイクロ流体デバイスのチャンバ等の表面を備える。特定の実施形態では、表面は、マイクロタイタープレートのウェル、シリコン又はガラスのウェーハ、顕微鏡スライド、細胞培養ベッセル、マイクロ流体デバイスのチャンバ又はチャネルの壁及び／又は床を備える。特定の実施形態では、表面は、細胞を含有するように構成され且つ顕微鏡で観察するように配置されたチャンバの表面を備える。特定の実施形態では、表面は、顕微鏡（例えば、倒立顕微鏡）のステージを置換するように構成されたチャンバの表面を備える。特定の実施形態では、チャンバは、開放した頂部を有するが、他の実施形態では、チャンバの頂部は閉じている。特定の実施形態では、表面は、ガラス、鉱物、及びプラスチックから成る群から選択された物質を備える。特定の実施形態では、表面は、ＩＩ族物質、ＩＩＩ族物質、ＩＶ族物質、Ｖ族物質、及び／又はＶＩ族物質から選択された物質を備える。特定の実施形態では、表面はＩＶ族物質（例えば、シリコン、ゲルマニウム等）を備える。
【００１５】
多様な実施形態において、表面は一つ又は複数のオリフィス（孔）を備える。特定の実施形態では、ナノ粒子及び／又は薄膜は、オリフィスの表面上に又はオリフィス付近に配置される。特定の実施形態では、表面は、少なくとも２個のオリフィス、少なくとも３個のオリフィス、少なくとも４個のオリフィス、少なくとも５個のオリフィス、少なくとも８個のオリフィス、少なくとも１０個のオリフィス、少なくとも１５個のオリフィス、少なくとも２０個のオリフィス、少なくとも２５個のオリフィス、少なくとも３０個のオリフィス、少なくとも４０個のオリフィス、少なくとも５０個のオリフィス、少なくとも７５個のオリフィス、少なくとも１００個のオリフィス、少なくとも２００個のオリフィス、少なくとも３００個のオリフィス、又は少なくとも５００個のオリフィスを備える。特定の実施形態では、それらオリフィスは全て、略２ｃｍ２以下、略１ｃｍ２以下、略０．５ｃｍ２以下、又は少なくとも０．１ｃｍ２以下の前記表面の領域内に配置される。特定の実施形態では、ナノ粒子及び／又は薄膜は全て、そのオリフィスから略１００μｍ以内、略５０μｍ以内、略２５μｍ以内、略２０μｍ以内、略１５μｍ以内、略１０μｍ以内、又は略５μｍ以内に配置される。特定の実施形態では、粒子／ナノ粒子及び／又は薄膜は、複数のオリフィスの表面上に及び／又は複数のオリフィス付近に配置される。特定の実施形態では、粒子／ナノ粒子及び／又は薄膜は、大部分のオリフィスの表面上に及び／又は大部分のオリフィス付近に配置される。特定の実施形態では、粒子／ナノ粒子及び／又は薄膜は、実質的に全てのオリフィスの表面上に及び／又は実質的に全てのオリフィス付近に配置される。特定の実施形態では、ナノ粒子及び／又は薄膜は、オリフィスの壁上に及び／又は縁の全周囲に配置される。特定の実施形態では、ナノ粒子及び／又は薄膜は、オリフィスの壁又は縁の一領域上に優先的に存在する。特定の実施形態では、ナノ粒子及び／又は薄膜は、細胞が配置されているのと同じ側の表面の面上に及び／又はオリフィスの縁上に配置される。特定の実施形態では、ナノ粒子及び／又は薄膜は、細胞が配置されているのと反対側の表面の面上に及び／又はオリフィスの縁上に配置される。特定の実施形態では、ナノ粒子及び／又は薄膜は薄膜を備える。特定の実施形態では、ナノ粒子及び／又は薄膜はナノ粒子を備え、そのナノ粒子のサイズ範囲は略５ｎｍから略５００ｎｍに及ぶ。特定の実施形態では、ナノ粒子のサイズ範囲は略２ｎｍ、略５ｎｍ、略１０ｎｍ略１５ｎｍ、略２０ｎｍから、略４００ｎｍ、略３００ｎｍ、略２５０ｎｍ、略２００ｎｍ、略１５０ｎｍ、略１００ｎｍ、略７５ｎｍ、略５０ｎｍまでに及ぶ。特定の実施形態では、ナノ粒子は、ナノビーズ、ナノスフィア、ナノワイヤ、ナノチューブ、ナノドット、ナノコーン、及び量子ドットから成る群から選択される。特定の実施形態では、ナノ粒子及び／又は薄膜は、半導体、金属、金属合金、窒化金属、及び酸化金属から成る群から選択された物質を備える。特定の実施形態では、ナノ粒子及び／又は薄膜は、遷移金属、遷移金属合金、窒化遷移金属、及び酸化遷移金属から成る群から選択された物質を備える。特定の実施形態���は、ナノ粒子及び／又は薄膜は、金、チタン（Ｔｉ）、ＴｉＮ、ＴｉＣＮ、及びＴｉＡｌＮから成る群から選択された物質を備える。特定の実施形態では、ナノ粒子及び／又は薄膜は、ＩＩＩ族物質又はＶ族物質でドープされたＩＶ族物質（例えば、シリコン、ゲルマニウム等）を備える。特定の実施形態では、ナノ粒子及び／又は薄膜は、ホウ素、ヒ素、リン、及びガリウムから成る群から選択された物質でドープされたシリコン又はゲルマニウムを備える。特定の実施形態では、複数のオリフィスのうちの一つ以上が、細胞に送達される試薬を含有するチャンバと流体連結している。特定の実施形態では、本デバイスはマイクロチャネルを備え、複数のオリフィスのうちの一つ以上がそのマイクロチャネルと流体連結している。特定の実施形態では、本デバイスは複数のマイクロチャネルを備える。特定の実施形態では、別々の異なる複数のマイクロチャネルが別々の異なる複数のオリフィスと流体連結している。特定の実施形態では、本デバイスは、流体を別々の異なる複数のマイクロチャネルに送達するためのマニホールド及び／又はバルブを備える。特定の実施形態では、マイクロチャネルは、細胞内に送達される試薬を含む。特定の実施形態では、試薬は、核酸、リボザイム、タンパク質若しくはペプチド、酵素、抗体、細胞小器官、染色体、病原体、及びマイクロ粒子若しくはナノ粒子から成る群から選択される。特定の実施形態では、マイクロチャネル（又はチャンバ）は、ポンプ制御の下で加圧され、重力送りで供給が行われ、又は電動でポンピングされる。特定の実施形態では、本デバイスは、マイクロチャネル内の流れを監視及び／又は制御して、表面の照明タイミングを制御して、また、任意で表面の照明位置も制御する制御装置を更に備える。多様な実施形態において、本デバイスは、倒立顕微鏡上のステージを置換するように構成される。多様な実施形態において、一つ以上の細胞が表面上に配置されて、特定の実施形態では、細胞が基板内のオリフィス上に又はこれに隣接して配置される。特定の実施形態では、細胞は哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞、ヒト以外の哺乳類細胞）である。特定の実施形態では、細胞は幹細胞（例えば、胎児幹細胞、臍帯血幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ，ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）等）である。
【００１６】
特定の実施形態では、一つの細胞又は一組の細胞に開口部を選択的に形成するためのシステムが提供される。特定の実施形態では、本システムは、細胞内に薬剤を選択的に送達するためのものである。本システムは、典型的には、トランスフェクション基板（例えば、上述のもの）を備えたデバイスと、ナノ粒子又は薄膜を加熱可能な電磁エネルギー源とを備える。特定の実施形態では、電磁エネルギー源は、レーザ、又は非コヒーレント光源である。特定の実施形態では、電磁エネルギー源はレーザである。特定の実施形態では、本システムは、レンズシステム、ミラーシステム、又はマスク、及び／又は表面の特定領域に電磁エネルギーを向けるための位置決めシステムを備える。特定の実施形態では、本システムは、電磁放射源による照射のタイミング及び／又はパターンを制御する制御装置を備える。
【００１７】
特定の実施形態では、一つの細胞又は一組の細胞に選択的に開口部を形成するための方法が提供される。特定の実施形態では、本方法を用いて、細胞内に一つの試薬（又は多数の試薬）を選択的に送達することができる。多様な実施形態において、本方法は、トランスフェクション基板及び／又は（例えば上述のようなもの）を利用する。従って、特定の実施形態では、細胞内に試薬を送達するための方法が提供される。本方法は、トランスフェクション基板（例えば、上述のようなもの）を備えたデバイス上に、及び／又は細胞をトランスフェクションするためのデバイスを備えたシステム（細胞は表面（トランスフェクション基板）上に配置される）に細胞を提供することと、細胞を試薬と接触させることと、表面の領域を電磁放射に晒すことによって薄膜及び／又は粒子の加熱を誘起することとを備え、その加熱が、加熱された領域において（又はその付近において）細胞膜に開口部を導入する気泡を形成して、試薬が細胞内に送達される。特定の実施形態では、細胞を取り囲む流体（例えば、緩衝剤、培養媒体）内に試薬を提供することによって、細胞を試薬と接触させる。特定の実施形態では、表面に存在している一つ以上のオリフィスに試薬を提供することによって、細胞を試薬と接触させる。特定の実施形態では、オリフィスと流体連結している一つ以上のマイクロ流体チャネルに試薬を提供することによって、細胞を試薬と接触させる。特定の実施形態では、別々の試薬が別々のオリフィスに送達される。特定の実施形態では、晒すことは、基板の領域をレーザパルス又は非コヒーレント光源に晒すことを備える。特定の実施形態では、試薬は、核酸、染色体、タンパク質、標識、細胞小器官、及び小有機分子から成る群から選択される。
【００１８】
特定の実施形態では、マイクロキャピラリの先端を、導光体として及び／又は先端における加熱分布を微調整するものとして利用した、細胞に対するマイクロマニピュレーションを実施するための方法が提供される。特定の実施形態では、本方法は、細胞をマイクロサージャリーツールと接触させること（そのツールは、先端に及び／又は先端付近に電磁エネルギーの印加によって加熱可能な金属膜（コーティング）又は金属ナノ粒子を有するマイクロキャピラリを備える）と、ツールに電磁エネルギーを印加することによって、金属膜又は金属ナノ粒子の温度を上昇させて、細胞膜に開口を形成することとを含み、マイクロサージャリーツールと細胞との接触角及び／又は電磁エネルギーの偏光を変化させて、細胞内に導入された開口部のサイズ及び／又は形状を変更する。特定の実施形態では、電磁エネルギーを印加することは、光（例えば、レーザや非コヒーレント光）を印加して、膜又はナノ粒子を加熱することを備える。特定の実施形態では、マイクロサージャリーツールの先端は導光体として機能するように構成される。特定の実施形態では、電磁エネルギーを印加することは、電場及び／又は磁場を印加して金属膜又はナノ粒子を加熱することを備える。特定の実施形態では、金属膜又は金属ナノ粒子の温度は、大気温度よりも少なくとも１５０℃上昇する。特定の実施形態では、本方法は、マイクロキャピラリチューブを介して細胞内に試薬を注入することを更に備える。特定の実施形態では、マイクロキャピラリの先端のサイズ範囲は略０．１μｍから略５μｍに及ぶ。特定の実施形態では、ナノ粒子のサイズ範囲は略５ｎｍから略５００ｎｍに及ぶ。特定の実施形態では、金属膜又はナノ粒子は半導体を備え、又は、貴金属、貴金属合金、窒化貴金属、及び酸化貴金属から成る群から選択された金属を備える。特定の実施形態では、金属コーティング又はナノ粒子は、遷移金属、遷移金属合金、窒化遷移金属、酸化遷移金属を備える。特定の実施形態では、金属コーティング又はナノ粒子は、金、チタン（Ｔｉ）、ＴｉＮ、ＴｉＣＮ、及びＴｉＡｌＮから成る群から選択された物質を備える。特定の実施形態では、マイクロキャピラリは、ガラス、鉱物、セラミック、及びプラスチックから成る群から選択された物質を備える。特定の実施形態では、ナノ粒子又は膜は膜を備える。特定の実施形態では、ナノ粒子又は膜はナノ粒子を備える。
【００１９】
［定義］
“ナノ粒子”との用語は、本願において、電子顕微鏡画像及び／又は標準的な２シータＸ線回折走査の回折ピーク半値幅で測定して、略８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、又は５００ｎｍ以下、好ましくは２００ｎｍ、１５０ｎｍ、又は１００ｎｍ以下、より好ましくは略５０ｎｍ又は２０ｎｍ以下の平均サイズの、又は、略１０ｎｍ以下の微結晶サイズの、少なくとも一寸法を有する粒子を指称する。特定の実施形態では、好ましくは、サイズ分布の第一標準偏差は、平均粒子サイズの６０％以下、好ましくは４０％以下、最も好ましくは１５から３０％である。
【００２０】
ナノ粒子のサイズに関する“サイズ範囲”との表現は、ナノ粒子が主に存在するサイズ範囲のことを示す。従って、例えば、特定の実施形態では、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％、９９％、又は全てのナノ粒子がそのサイズ範囲内に存在する。
【００２１】
“遷移金属”との用語は、周期表のＤブロック元素（亜鉛、カドミウム、水銀を除く）を典型的に指称する。
【００２２】
“マイクロキャピラリチューブ”、“マイクロキャピラリ”、“マイクロピペット”との用語は相互可換に使用される。“マイクロキャピラリ”は、略５０μｍ未満、好ましくは略２５μｍ未満、より好ましくは略１５μｍ若しくは１０μｍ未満、最も好ましくは略５μｍ未満の直径の先端を有するチューブである。特定の実施形態では、マイクロキャピラリは、略２μｍ以下の先端直径を有する。特定の実施形態では、マイクロキャピラリはソリッドロッドとなり得る。特定の実施形態では、マイクロキャピラリを、より大きな先端直径（例えば、本願で説明されるように略２００ｎｍを超える）を有するピペット（キャピラリチューブ）と置換することができる。
【００２３】
“核酸”、“オリゴヌクレオチド”、又はこれらと文意上等価な用語は、本願において、互いに共有結合した少なくとも二つのヌクレオチドを指称する。本発明の核酸は、好ましくは一重鎖又は二重鎖であり、一般的にはホスホジエステル結合を含むが、場合によっては、以下で概説するように、代わりの主鎖を有する核酸類似体も含まれ、例えば、ホスホアミド（非特許文献１６、及びその中の参考文献である非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２）、ホスホロチオエート（非特許文献２３、特許文献１）、ホスホロジチオエート（特許文献２４）、Ｏ‐メチルホスホラミダイト結合（非特許文献２５を参照）、ペプチド核酸主鎖及び結合（非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２８、非特許文献２９を参照）を備える。他の類似核酸として、陽性主鎖（非特許文献３０）、非イオン性主鎖（特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、非特許文献３１、非特許文献３２、非特許文献３３、非特許文献３４、非特許文献３５、非特許文献３６、非特許文献３７）、非リボース主鎖（特許文献７、特許文献８、非特許文献３８に記載されているもの等）が挙げられる。一以上の炭素環糖を含有する核酸も、核酸の定義に含まれる（特許文献３９を参照）。いくつかの核酸類似体が非特許文献４０に記載されている。リボースリン酸主鎖のこうした修飾を行い、ラベル等の追加的部分を加えることを容易にしたり、生理学的環境におけるこうした分子の安定性及び半減期を増やしたりすることができる。
【００２４】
“ポリペプチド”、“ペプチド”、“タンパク質”との用語は、アミノ酸残基のポリマーを指称するものとして本願において相互可換に使用される。これらの用語は、一以上のアミノ酸残基が対応する自然発生アミノ酸の人工化学類似物であるアミノ酸ポリマーに適用され、また、自然発生アミノ酸ポリマーにも適用される。また、これらの用語は、ポリペプチドを構成するアミノ酸を結合する従来のペプチド結合に対する変形例も含む。好ましくは、“ペプチド”、“ポリペプチド”、“タンパク質”は、α炭素がペプチド鎖を介して結合しているアミノ酸鎖である。従って、鎖の一端の末端アミノ酸（アミノ末端）が自由アミノ基を有する一方、鎖の他端の末端アミノ酸（カルボキシ末端）は自由カルボキシル基を有する。本願において、“アミノ末端”との用語（Ｎ末端と略称される）は、ペプチドのアミノ末端におけるアミノ酸の自由αアミノ基、又はペプチド内の他の箇所におけるアミノ酸のαアミノ基（ペプチド結合に関与する場合にはイミノ基）を指称する。同様に、“カルボキシ末端”との用語は、ペプチドのカルボキシ末端の自由カルボキシル基、又は、ペプチド内の他の箇所におけるアミノ酸のカルボキシル基を指称する。また、ペプチドは、本質的にあらゆるポリアミノ酸を含み、アミド結合とは対照的にエーテルによって結合されたアミノ酸等のペプチド模倣薬が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２５】
“試薬”との用語は、細胞内に送達される物質に関して用いられる場合、細胞内に送達される（又は細胞から抽出される）あらゆる物質を含む。このような試薬として、核酸（例えば、ベクター及び／又は発現カセットを含む）、抑制ＲＮＳ（例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）、リボザイム、タンパク質／ペプチド、酵素、抗体、イメージング試薬、細胞小器官（例えば、核、ミトコンドリア、核小体、リソソーム、リボソーム等）、染色体、細胞内病原体、無生物粒子（量子ドット、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）粒子、マイクロビーズ等）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】細胞手術ツールの一実施形態を概略的に示す。
【図２】炭素でコーティングされたガラスマイクロピペットのＳＥＭ画像（左図）と、合成された金ナノ粒子のＴＥＭ画像（右図）とを示す。
【図３】レーザパルス印加前後の細胞を示す。（上）ガラスマイクロピペット  （中）炭素でコーティングされたマイクロピペット  （下）金ナノ粒子でコーティングされたマイクロピペット
【図４】３．２（Ａ：２４時間）及び５．８（Ｃ：７２時間）のアスペクト比のＴＥＭ画像を示す。
【図５】プラスチック基板上に金ナノ粒子を直接衝突させるためのバイオリスティック注入器を用いたトランスフェクション基板の製造を示す（左図）。中央図は基板上の典型的な粒子を示し、右図は、基板上の粒子密度を示す。
【図６】Ａ〜Ｄは、薄膜を加熱して（例えば、レーザパルスを用いる）アニーリングされた粒子を形成することによって、表面上にナノ粒子を形成する方法を示す。この例では、２ｎｍのチタン接着層を備えた３０ｎｍの金膜が、１１３．２ｍＪ／ｃｍ２で１００回のパルスでのパルスレーザ（５３２ｎｍ、６ｎｓ）で加熱された。粒子サイズの範囲は０．１から０．７μｍまでであった（例えば、図Ｃを参照）。粒子密度は略０．６５個／μｍ２  ＝  １細胞当たり６５個の粒子（細胞面積〜１０μｍ×１０μｍと仮定）であった。
【図７】金ナノ粒子でコーティングされた基板を用いて光パターン化分子送達を行うことのできるデバイスの一実施形態の概略を示す。
【図８】光パターン化分子送達用の実験設定と、キャビテーション気泡の動力学を撮影するのに用いられた時間分解イメージングシステムとの概略を示す。
【図９】金粒子状のパルスレーザ照射によって誘起された気泡を示す。（ａ）レーザパルス印加前  （ｂ）レーザパルス印加の７８ｎｓ後。バーは５０μｍである。
【図１０】シャドウマスクを用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞内への光パターン化蛍光色素摂取を示す。（ａ）明視野  （ｂ）蛍光画像（マスクが破線の右側を覆っていた。）
【図１１】２９３Ｔ細胞に対する準備的な光熱ピペットの試験を示す。左側がレーザパルス印加前で、右側がレーザパルス印加後である。ピペットは異なる厚さのＡｕ／Ｐｄ薄膜でコーティングされていた。膜厚は（ａ）で５ｎｍであり、（ｂ）で１３ｎｍであった。両実験で用いられたレーザフルーエンスは８８．３ｍＪ／ｃｍ２であった。
【図１２】ａからｃは、金薄膜でコーティングされたピペットを用いた接着性２９３Ｔ細胞内へのＧＦＰエンコーディングプラスミドのマイクロインジェクションを示す。ａ：マイクロインジェクション手順。  ｂ：注入から２４時間後の細胞の蛍光画像であり、細胞が生きていてＧＦＰを発現していることが示されている。  ｃ：位相コントラスト画像及び蛍光画像を重ねた画像。
【図１３】光ピンセットと組み合わせたプラズモン光熱ピペットを用いた非接着性細胞マイクロインジェクションの概略（上図）と、光熱ピペットの先端に接触しつつ光ピンセットによってトラップされたＮａｌｍ‐６細胞を示す画像（下図）を示す。
【図１４】細胞内への一以上の試薬の並列的で選択的な送達用の基板を概略的に示す。
【図１５】細胞内に試薬を選択的に送達するためのマイクロチャネルを備えた“トランスフェクション基板”の一構成を概略を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａから図１６Ｃは、細胞内への一以上の試薬の並列的で選択的な送達のための例示的な一基板の動作を概略的に示す。図１６Ａに示されるように、アレイ中の複数のオリフィスのうち一つの上に細胞が配置されて、そのオリフィスはマイクロチャネルと流体連結している。図示されるように、オリフィスの一方の縁は薄膜（この場合チタン）でコーティングされている。エネルギー源（例えば、レーザパルス）を用いて膜を加熱する。これは、図１６Ｂに示されるように薄膜の加熱をもたらす。膨張する蒸気泡が形成されて、細胞の脂質二重層を介する開口が形成される。図１６Ｃに示されるように、受動的な拡散又は能動的なポンピングによって、送達可能な物質がマイクロチャネルからオリフィスを通って細胞内に入る。
【図１６Ｂ】図１６Ａから図１６Ｃは、細胞内への一以上の試薬の並列的で選択的な送達のための例示的な一基板の動作を概略的に示す。図１６Ａに示されるように、アレイ中の複数のオリフィスのうち一つの上に細胞が配置されて、そのオリフィスはマイクロチャネルと流体連結している。図示されるように、オリフィスの一方の縁は薄膜（この場合チタン）でコーティングされている。エネルギー源（例えば、レーザパルス）を用いて膜を加熱する。これは、図１６Ｂに示されるように薄膜の加熱をもたらす。膨張する蒸気泡が形成されて、細胞の脂質二重層を介する開口が形成される。図１６Ｃに示されるように、受動的な拡散又は能動的なポンピングによって、送達可能な物質がマイクロチャネルからオリフィスを通って細胞内に入る。
【図１６Ｃ】図１６Ａから図１６Ｃは、細胞内への一以上の試薬の並列的で選択的な送達のための例示的な一基板の動作を概略的に示す。図１６Ａに示されるように、アレイ中の複数のオリフィスのうち一つの上に細胞が配置されて、そのオリフィスはマイクロチャネルと流体連結している。図示されるように、オリフィスの一方の縁は薄膜（この場合チタン）でコーティングされている。エネルギー源（例えば、レーザパルス）を用いて膜を加熱する。これは、図１６Ｂに示されるように薄膜の加熱をもたらす。膨張する蒸気泡が形成されて、細胞の脂質二重層を介する開口が形成される。図１６Ｃに示されるように、受動的な拡散又は能動的なポンピングによって、送達可能な物質がマイクロチャネルからオリフィスを通って細胞内に入る。
【図１７】図１４に示されるもののような基板を製造する一方法を概略的に示す。
【図１８】例示的なトランスフェクション基板の写真を示す。
【図１９】試薬送達基板上の並列的な気泡励起を示す。基板にレーザパルス（パルス幅６ｎｓ、波長５３２ｎｍ）を照射することによって、各円形開口に気泡が同期的に発生した。新月状のＴｉ薄膜コーティングのため、気泡の破裂は、シリンダー状の側壁の一部に沿ってのみ生じた。
【図２０】ａ及びｂは、膜の開口（ａ）と、ＨｅＬａ細胞への試薬の送達のための試薬送達基板の使用（ｂ）とを示す。膜不透過性緑色蛍光ＦＩＴＣデキストラン（分子量＝３ｋ  Ｄａ）を、２００μｇ／ｍｌの濃度で細胞培地に担持した。１５６ｍＪ／ｃｍ２でのレーザパルス印加後、円形オリフィス上に成長しレーザトリガー気泡破裂に晒された細胞における蛍光色素摂取を観測した。この場合、送達は受動拡散によるものである。
【図２１】生哺乳類細胞内へのカーゴ送達用の光熱ナノブレードを用いた超高速膜切断のメカニズムを示す。ナノ秒レーザパルスによる励起後、Ｔｉは、熱伝導によって周囲の水薄層と共に急速に加熱される。＜１μｓで膨張及び崩壊する破裂性蒸気ナノ気泡は、マイクロキャピラリ部分の圧力駆動送達と同期して、接触している細胞膜を切断する。
【図２２Ａ】図２２Ａから図２２Ｄは、Ｔｉでコーティングされたマイクロピペットの構造と、レーザ励起による強度パターンの計算結果とを示す。図２２Ａ及び図２２Ｂは、引き伸ばされてＴｉでコーティングされたマイクロピペットの走査型電子顕微鏡画像である。内側直径＝１．３８±０．１μｍ（平均±標準偏差）。外側直径＝１．８８±０．１μｍ。Ｔｉ薄膜の厚さ＝１０２±８ｎｍ。（矢印は、マイクロピペット内部を走るガラスフィラメントの縁を示す。）図２２Ｃは、レーザ励起でのマイクロピペットの先端における正規化強度プロファイルである。（ｎＴｉ＝１．８６＋２．５６ｉ（非特許文献４１）、ｎｇｌａｓｓ＝１．４６、ｎｗｔｅｒ＝１．３４、λ＝５３２ｎｍ、θ＝３０°）。図２２Ｄは、マイクロピペットの先端におけるＴｉリングの時間平均光吸収プロファイル（∝｜Ｅａｖｅ｜２）である。
【図２２Ｂ】図２２Ａから図２２Ｄは、Ｔｉでコーティングされたマイクロピペットの構造と、レーザ励起による強度パターンの計算結果とを示す。図２２Ａ及び図２２Ｂは、引き伸ばされてＴｉでコーティングされたマイクロピペットの走査型電子顕微鏡画像である。内側直径＝１．３８±０．１μｍ（平均±標準偏差）。外側直径＝１．８８±０．１μｍ。Ｔｉ薄膜の厚さ＝１０２±８ｎｍ。（矢印は、マイクロピペット内部を走るガラスフィラメントの縁を示す。）図２２Ｃは、レーザ励起でのマイクロピペットの先端における正規化強度プロファイルである。（ｎＴｉ＝１．８６＋２．５６ｉ（非特許文献４１）、ｎｇｌａｓｓ＝１．４６、ｎｗｔｅｒ＝１．３４、λ＝５３２ｎｍ、θ＝３０°）。図２２Ｄは、マイクロピペットの先端におけるＴｉリングの時間平均光吸収プロファイル（∝｜Ｅａｖｅ｜２）である。
【図２２Ｃ】図２２Ａから図２２Ｄは、Ｔｉでコーティングされたマイクロピペットの構造と、レーザ励起による強度パターンの計算結果とを示す。図２２Ａ及び図２２Ｂは、引き伸ばされてＴｉでコーティングされたマイクロピペットの走査型電子顕微鏡画像である。内側直径＝１．３８±０．１μｍ（平均±標準偏差）。外側直径＝１．８８±０．１μｍ。Ｔｉ薄膜の厚さ＝１０２±８ｎｍ。（矢印は、マイクロピペット内部を走るガラスフィラメントの縁を示す。）図２２Ｃは、レーザ励起でのマイクロピペットの先端における正規化強度プロファイルである。（ｎＴｉ＝１．８６＋２．５６ｉ（非特許文献４１）、ｎｇｌａｓｓ＝１．４６、ｎｗｔｅｒ＝１．３４、λ＝５３２ｎｍ、θ＝３０°）。図２２Ｄは、マイクロピペットの先端におけるＴｉリングの時間平均光吸収プロファイル（∝｜Ｅａｖｅ｜２）である。
【図２２Ｄ】図２２Ａから図２２Ｄは、Ｔｉでコーティングされたマイクロピペットの構造と、レーザ励起による強度パターンの計算結果とを示す。図２２Ａ及び図２２Ｂは、引き伸ばされてＴｉでコーティングされたマイクロピペットの走査型電子顕微鏡画像である。内側直径＝１．３８±０．１μｍ（平均±標準偏差）。外側直径＝１．８８±０．１μｍ。Ｔｉ薄膜の厚さ＝１０２±８ｎｍ。（矢印は、マイクロピペット内部を走るガラスフィラメントの縁を示す。）図２２Ｃは、レーザ励起でのマイクロピペットの先端における正規化強度プロファイルである。（ｎＴｉ＝１．８６＋２．５６ｉ（非特許文献４１）、ｎｇｌａｓｓ＝１．４６、ｎｗｔｅｒ＝１．３４、λ＝５３２ｎｍ、θ＝３０°）。図２２Ｄは、マイクロピペットの先端におけるＴｉリングの時間平均光吸収プロファイル（∝｜Ｅａｖｅ｜２）である。
【図２３Ａ】図２３Ａから図２３Ｃは、光熱ナノブレードによる超高速膜切断と細胞生存率の評価を示す。図２３Ａは、細胞膜と接触した際のピペットの先端の縁から０．４μｍまでの最大半径を有するナノ気泡を示す。図２３Ｂは、自由懸濁液中の２７０ｎｓ以内の及びＨｅＬａ細胞膜としている１７０ｎｓ以内の蒸気ナノ気泡の膨張及び崩壊動力学を示す。図２３Ｃは、光熱送達後の細胞生存率を示す。対照実験を、ガラスのみのマイクロピペットを細胞に接触させて、同一のフルーエンス（１８０ｍＪ／ｃｍ２）のレーザパルスを照射することによって行った。細胞生存率は＞９０％であり、細胞がレーザパルス印加及び膜開口のみを受けた場合には、９８±１１％（平均±標準偏差）であり、細胞がレーザパルス印加及び液体注入を受けた場合には、９４±４％であった。
【図２３Ｂ】図２３Ａから図２３Ｃは、光熱ナノブレードによる超高速膜切断と細胞生存率の評価を示す。図２３Ａは、細胞膜と接触した際のピペットの先端の縁から０．４μｍまでの最大半径を有するナノ気泡を示す。図２３Ｂは、自由懸濁液中の２７０ｎｓ以内の及びＨｅＬａ細胞膜としている１７０ｎｓ以内の蒸気ナノ気泡の膨張及び崩壊動力学を示す。図２３Ｃは、光熱送達後の細胞生存率を示す。対照実験を、ガラスのみのマイクロピペットを細胞に接触させて、同一のフルーエンス（１８０ｍＪ／ｃｍ２）のレーザパルスを照射することによって行った。細胞生存率は＞９０％であり、細胞がレーザパルス印加及び膜開口のみを受けた場合には、９８±１１％（平均±標準偏差）であり、細胞がレーザパルス印加及び液体注入を受けた場合には、９４±４％であった。
【図２３Ｃ】図２３Ａから図２３Ｃは、光熱ナノブレードによる超高速膜切断と細胞生存率の評価を示す。図２３Ａは、細胞膜と接触した際のピペットの先端の縁から０．４μｍまでの最大半径を有するナノ気泡を示す。図２３Ｂは、自由懸濁液中の２７０ｎｓ以内の及びＨｅＬａ細胞膜としている１７０ｎｓ以内の蒸気ナノ気泡の膨張及び崩壊動力学を示す。図２３Ｃは、光熱送達後の細胞生存率を示す。対照実験を、ガラスのみのマイクロピペットを細胞に接触させて、同一のフルーエンス（１８０ｍＪ／ｃｍ２）のレーザパルスを照射することによって行った。細胞生存率は＞９０％であり、細胞がレーザパルス印加及び膜開口のみを受けた場合には、９８±１１％（平均±標準偏差）であり、細胞がレーザパルス印加及び液体注入を受けた場合には、９４±４％であった。
【図２４】光熱ナノブレードによって送達可能な多様なカーゴサイズを示す。ＧＦＰ発現ＲＮＡを、リポフェクタミン耐性ＩＭＲ９０一次ヒト肺線維芽細胞内に送達した。１００ｎｍの緑色蛍光ビーズ上にコーティングしたＤｓＲｅｄ含有レンチウイルスが、移植後にＲＯＣＫ抑制剤分散ヒト胚性幹細胞内に発現した。直径２００ｎｍの蛍光ビーズを詰まらせずにＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に送達した。ＨｅＬａ細胞内へのバークホルデリア・タイランデンシス細菌の移植を高効率及び高細胞生存率で達成した。
【図２５Ａ】図２５Ａから図２５Ｃは、光熱ナノブレードによるＨｅＬａ細胞内への高効率細菌送達を示す。図２５Ａは、移植後の細菌接種の過程を示す（非特許文献４２）。図２５Ｂは、ＧＦＰ標識バークホルデリア・タイランデンシスが、赤色蛍光デキストランテトラメチルローダミンと共に、ＨｅＬａ細胞内へ移植された様子を示す（平均効率＝４６±３３％（平均（標準偏差）））。共焦点ｚ軸走査は、赤色蛍光細胞内部の多数の細菌を示している。図２５Ｃは、ＨｅＬａ細胞内に移植されたｍＣｈｅｒｒｙ標識バークホルデリア・タイランデンシスの増殖及びアクチン重合を示す。
【図２５Ｂ】図２５Ａから図２５Ｃは、光熱ナノブレードによるＨｅＬａ細胞内への高効率細菌送達を示す。図２５Ａは、移植後の細菌接種の過程を示す（非特許文献４２）。図２５Ｂは、ＧＦＰ標識バークホルデリア・タイランデンシスが、赤色蛍光デキストランテトラメチルローダミンと共に、ＨｅＬａ細胞内へ移植された様子を示す（平均効率＝４６±３３％（平均（標準偏差）））。共焦点ｚ軸走査は、赤色蛍光細胞内部の多数の細菌を示している。図２５Ｃは、ＨｅＬａ細胞内に移植されたｍＣｈｅｒｒｙ標識バークホルデリア・タイランデンシスの増殖及びアクチン重合を示す。
【図２５Ｃ】図２５Ａから図２５Ｃは、光熱ナノブレードによるＨｅＬａ細胞内への高効率細菌送達を示す。図２５Ａは、移植後の細菌接種の過程を示す（非特許文献４２）。図２５Ｂは、ＧＦＰ標識バークホルデリア・タイランデンシスが、赤色蛍光デキストランテトラメチルローダミンと共に、ＨｅＬａ細胞内へ移植された様子を示す（平均効率＝４６±３３％（平均（標準偏差）））。共焦点ｚ軸走査は、赤色蛍光細胞内部の多数の細菌を示している。図２５Ｃは、ＨｅＬａ細胞内に移植されたｍＣｈｅｒｒｙ標識バークホルデリア・タイランデンシスの増殖及びアクチン重合を示す。
【図２６】多様なレーザ偏光及びマイクロピペットの向きにおいて光熱ナノブレードによって生成される細胞膜切断パターンを示す。レーザフルーエンス＝３６０ｍＪ／ｃｍ２。ピペット先端の直径＝２μｍ。Ａは直線偏光、Ｂは円偏光、Ｃは垂直軸から３０°傾斜させたマイクロピペットでの直線偏光レーザ励起を示す。バーは１μｍである。
【図２７】ナノブレードの先端における熱分布に対する照射角度及び偏光の影響を示す。瞬間強度が上の行に示されていて、時間平均強度が下の行に示されている。左の列は直線偏光での垂直な向きの先端を示す。中央の列は、円偏光での垂直な向きの先端を示す。右の列は、直線偏光での傾斜させた先端（３０°）を示す。
【図２８Ａ】図２８Ａから図２８Ｃは、細胞内に設けられた開口における照射角度及び偏光の影響を示す。図２８Ａは、直線偏光を用いて加熱した垂直ピペット（ナノブレード）で設けられた開口を示す。図２８Ｂは、円偏光を用いた加熱した垂直ピペット（ナノブレード）で設けられた開口を示す。図２８Ｃは、傾斜ピペット（ナノブレード）で設けられた開口を示す。
【図２８Ｂ】図２８Ａから図２８Ｃは、細胞内に設けられた開口における照射角度及び偏光の影響を示す。図２８Ａは、直線偏光を用いて加熱した垂直ピペット（ナノブレード）で設けられた開口を示す。図２８Ｂは、円偏光を用いた加熱した垂直ピペット（ナノブレード）で設けられた開口を示す。図２８Ｃは、傾斜ピペット（ナノブレード）で設けられた開口を示す。
【図２８Ｃ】図２８Ａから図２８Ｃは、細胞内に設けられた開口における照射角度及び偏光の影響を示す。図２８Ａは、直線偏光を用いて加熱した垂直ピペット（ナノブレード）で設けられた開口を示す。図２８Ｂは、円偏光を用いた加熱した垂直ピペット（ナノブレード）で設けられた開口を示す。図２８Ｃは、傾斜ピペット（ナノブレード）で設けられた開口を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
特定の実施形態では、本発明は、単細胞に対する“手術”用の新規ツール／デバイスに関し、また、細胞操作及び／又は細胞に対する試薬の送達又は抽出用の基板に関する。
【００２８】
［細胞に対する手術用の手術ツール］
多様な実施形態において、“単細胞手術ツール”は、最小の細胞損傷で、マイクロインジェクション（微量注入）、マイクロエクストラクション（微量抽出）、及び／又は細胞内操作を行うものとして提供される。これは、脂質二重層によって区切られたあらゆる細胞（例えば、真核細胞、より好ましくは脊椎動物細胞、更に好ましくは哺乳類細胞）に対して使用可能である。特定の実施形態では、本デバイスは、細胞壁を備えた細胞（例えば、植物細胞）に対して利用可能である。
【００２９】
特定の例示的実施形態では、本デバイスはマイクロキャピラリチューブ（例えば、マイクロピペット）を備え、そのマイクロキャピラリチューブは、マイクロキャピラリチューブの先端又はその付近に“エネルギー吸収”ナノ粒子及び／又は“エネルギー吸収”薄膜を備える。本デバイスは、マイクロキャピラリ上にコーティングされた金属膜（例えばナノコーティング）及び／又は金属粒子／ナノ粒子の励起／加熱（例えばレーザ誘起加熱）によって、細胞の正確で制御可能なナノスケール修飾を達成する。特定の理論に縛られるものではないが、細胞の表面に近付けると又は接触させると、この極端な局所的加熱が、細胞膜（及び／又は細胞壁）に正確なサイズの孔を穿つと考えられる。このようにして、現状のマイクロインジェクション及びエクストラクション法に伴う機械的及び生物化学的損傷を誘発せずに、マイクロピペットが簡単に細胞膜を貫くことができる。従って、本ツールは、小型で機械的に脆弱な細胞に対する高い成功率での手術を促進する。
【００３０】
単細胞マイクロインジェクションは、細胞内に異物を導入するための、細胞間における細胞成分の抽出及び移植のための、及び／又は細胞内に一般的に見られない成分（プローブ、検出器、遺伝子組み換え細胞小器官、遺伝子、タンパク質等）の導入のための強力な多目的技術である。従来のガラスピペット法（遺伝子組み換えマウスを産み出すために使われるもの等）は、細胞に対して大きな機械的及び生物化学的ストレスを課し、特に機械的に脆弱な細胞に対して成功率が低い。
【００３１】
現状のレーザ誘起細胞アブレーション法はこの機械的ストレスを排除するが、高度に集束した光を必要として、損傷体積が回折限界となる。対照的に、本願で説明される細胞手術ツールは、ピペット先端における又はその付近での粒子／ナノ粒子及び／又は薄膜の局所的加熱によって、キャピラリマイクロピペットの先端又はその付近でのナノメートルサイズのスケールでの操作（例えばアブレーション）を達成することができる。粒子／ナノ粒子及び／又は薄膜は、電磁放射（例えば、電場、磁場、ＲＦ場、広帯域又は集束レーザパルス等）を用いて加熱される。
【００３２】
多様な実施形態において、本願で説明される細胞手術法は、金属粒子／ナノ粒子及び／又は金属薄膜の光熱効果を利用する。例えば、粒子の幾何学的形状（例えば、アスペクト比）及び／若しくは組成、並びに／又は膜の厚さ又は組成を制御することによって、電磁放射（例えば、レーザエネルギー）が粒子及び／又は薄膜には強力に吸収されるが、その近傍の細胞又は細胞成分には強力に吸収されないようにして、従来のレーザベースの細胞操作法によって生じる細胞又は遺伝子の損傷を回避するように、物質を“微調整”することができる。現状のレーザ細胞法は、アブレーション又はキャビテーション効果を生じさせるために細胞成分によるレーザ出力の強力な吸収に因っているものである。このようなプロセスは細胞を損傷させる可能性があり、細胞成分の望ましくない破壊や、操作されている細胞の生態に影響し得る化学的効果を生じさせる可能性がある。
【００３３】
対照的に、本願で説明されるマイクロサージャリーツールを利用すると、レーザ又は他の電磁エネルギー源を用いて、マイクロキャピラリピペットに結合されて細胞膜に局在化した粒子／ナノ粒子及び／又は薄膜を加熱することができる。従って、エネルギー源（例えば、レーザ）が、操作されている細胞を実質的に損傷しない。
【００３４】
物質の選択に応じて、ナノ粒子及び／又は薄膜は、本質的にあらゆる電磁放射の印加によって励起（加熱）可能である。従って、多様な実施形態において、ナノ粒子及び／又は薄膜の加熱は、磁場及び／又は電場及び／又はＲＦ場及び／又は光（例えば、レーザ）の印加によって達成される。
【００３５】
例えば、金属粒子、ナノ粒子、薄膜は、表面プラズモン周波数に近い周波数（一般的に可視及び近赤外線範囲内）の電磁波を強力に吸収する。粒子、ナノ粒子、薄膜は、吸収されたエネルギーによって急速に加熱され、周囲媒体の蒸発を伴う過熱現象を生じさせる。細胞手術ツールの特定の実施形態では、例えば図１に示されるように、個々の又は多数のナノ粒子がマイクロピペットの先端（チップ）上にコーティングされる。レーザパルス励起によって、ナノメートル直径の蒸気泡がナノ粒子周辺に生成される。細胞表面に近付けるか又は接触させると、このプロセスは、細胞膜（及び／又は細胞壁）に制御された正確なサイズの孔を発生させる。このようにして、マイクロピペットは、現状のマイクロインジェクション及びエクストラクション法に付随する機械的及び生物化学的損傷を誘発せずに、細胞膜を簡単に貫くことができる。キャビテーション又は“孔開け”プロセスは数ナノ秒で完了する。結果として、膜の残りの部分には反応する時間がなく、機械的に影響を受けていないままである。ピペットが細胞内の適切な箇所に存在していると、ピペットの中空のボア（孔）を介して通された光ファイバデバイス等のデバイスの操作用に、“膜孔”を開いたままにすることができる。特定の実施形態では、マイクロキャピラリの先端に及び／又はその付近に配置された金属薄膜を用いて、同様の効果を得ることができる。
【００３６】
例示的な一動作モードでは、顕微鏡（例えば、倒立顕微鏡）下で、マイクロマニピュレータ及び／又は自動（例えば、ピエゾ駆動）ステージによって、マイクロピペットを標的細胞の隣に配置することができる。マイクロピペットの先端にレーザ（又は他のエネルギー源）パルスを印加することによって、細胞の顕著な変形を生じさせずに、ピペットが簡単に膜を貫通する。ピペットが細胞内部に存在していると、後続の分子及び細胞成分の注入や抽出を実施することができ、生細胞の細胞内操作が可能となる。
【００３７】
従って、細胞手術ツールを用いて、単細胞マイクロインジェクション及び／又はエクストラクション及び／又は細胞内操作を実施することができる。接着細胞膜に対する孔開けについて説明してきたが、これは、懸濁液中の細胞に対して、光学ピンセットを用いて固定した細胞に対して、及び／又は標準的な吸引ベースの保持ピペットを用いたクラスター、コロニー又はクランプ内で日々成長している細胞に対して容易に拡張される。例示的な実験結果が図３に示されている。
【００３８】
多様な実施形態において、ピペット（ナノブレード）の角度を変更することによって、及び／又はレーザ偏光を変更することによって、異なった膜切断を達成することができる。例えば、ピペットが０度（垂直）から３０度に傾くと、チタンリング上のホットスポット（高温スポット）が、正反対の位置から互いに近づいて移動する（例えば、図２７を参照）。その結果としての膜の切断は、“蝙蝠の眼（バットアイ）”状になる（例えば、図２８Ａ〜図２８Ｃを参照）。
【００３９】
切断パターンを制御する他の要因（Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ誌で述べられている）は、ピペット先端のサイズである。ピペットの先端サイズが２マイクロメートルに低下すると、熱が二つのホットスポット間で拡散して、膜状に一つの“猫用ドア（キャットドア）”状の切断部を生じさせることができる。
【００４０】
これは図２６に示されている。光熱ナノブレードによる切断パターンをイメージング用に保存するため、ＨｅＬａ（ヒーラ）細胞をグルタルアルデヒドで２０分間にわたって前処理して、タンパク質架橋を誘起して、細胞膜が再び閉じることを著しく遅くした。レーザパルス（３６０ｍＪ／ｃｍ２のレーザフルーエンス）印加（３６０ｍＪ／ｃｍ２のレーザフルーエンス）中に、２μｍのサイズの先端直径のＴｉコーティングマイクロピペットを、細胞膜表面に垂直に軽く接触させて配置した。
【００４１】
レーザパルス印加後に、細胞膜を走査型電子顕微鏡で撮像した。直線偏光レーザパルスを印加することによって、Ｔｉナノ構造でコーティングされた先端の両側に沿って、二つの孔（各々  ＜１μｍ）が細胞膜に切り取られた一方で、円偏光レーザ励起によって、円形切断部（直径略１．５μｍ）が形成されて、対応する気泡のパターンと一致している（図２６（ａ）及び２６（ｂ））。マイクロキャピラリを傾斜させて、Ｔｉリングの一方の側のみが細胞膜と光接触するようにすることによって、略１．５μｍの“猫用ドア”の半月状開口部が膜に形成された（図２６（ｃ））。これらの制御させた切断パターンは再現性の高いものであった。
【００４２】
他の例示的であるが非限定的な構成では、ピペットが、ガラスキャピラリの先端及び外壁の両方にチタンコーティングを有する。この場合、気泡は一般的にチップの全周囲に発生する（ドーナツ状）。膜の切断部は、ピペット先端に接触している領域に制限される。この場合、気泡の形状は、ピペットの傾斜又はレーザの偏光と共に顕著には変化しないので、特定の実施形態では、マイクロインジェクション用により適したものとなる。
【００４３】
細胞手術ツールは、作業者によって決定される期間にわたって開いたままであるか、必要に応じて急速に閉じる特定のサイズ膜孔によって、生細胞操作に対する細胞損傷を最少にするか又は無くして、正確な細胞内アクセスを提供することができる。本デバイスを用いて、前核ＤＮＡマイクロインジェクション、胚盤胞内への胚性幹細胞の移植、体細胞核移植、他の細胞内の細胞小器官の修復や置換を実施することに対する、プローブ等の非細胞物体等の導入に対する効率及び成功率を上げることができる。
【００４４】
［試薬の送達及び細胞トランスフェクション用の基板］
他の実施形態では、物質（エージェント）（例えば、核酸、タンパク質、有機分子、細胞小器官、抗体、他の配位子等）を生細胞内に送達する、及び／又は、それを細胞から抽出するための方法、デバイス、及びシステムが提供される。典型的には、本デバイスは、粒子（例えば、ナノ粒子）及び／または薄膜を有する基板を備える（例えば、上述のようなもの）。細胞をこの基板上に播種することができ、また、任意で、密集培養物が形成されるまで成長させることができる。特定の実施形態では、パルスレーザ（又は他の電磁エネルギー源）を基板全体に照射するか、又は基板の一領域に選択的に照射する（例えば、シャドウマスクに照射して、対応する照射パターンを基板上にうつすことによって）ことができる。エネルギー源（例えば、パルスレーザ）に晒された領域において、吸収されたエネルギーによって、粒子及び／又は薄膜が高温に加熱される。典型的には、数ナノ秒以内で、粒子及び／又は薄膜を取り囲む液体媒体層内に熱が散逸して、蒸気泡を発生させる。蒸気泡の急速な膨張及びその後の崩壊が過渡流体の流れを引き起こして、その近傍の細胞に強力なせん断応力を誘起して、細胞膜（及び／又は細胞壁）に局所的な細孔が形成される。結果として、流体の流れ又は熱拡散によって、膜不透過性分子を細胞内に運ぶことができる。キャビテーション気泡は、粒子及び／又は薄膜がエネルギー源に晒された箇所において優先的に生じるので、細胞培養物の特定の領域において及び／又は特定の時間において、分子摂取を誘起する照射パターンを選択／設計することができる。基板上の摂取領域の位置を、粒子／ナノ粒子及び／又は薄膜のパターンと、照射パターンとの組み合わせによって決めることができる。同様に、摂取のタイミングを照射のタイミングによって制御することができる。このようにして、基板上の粒子のサイズ、物質及び／若しくは密度、並びに／又は、基板上の膜の物質及び／若しくは厚さ、エネルギー源のタイミング、強度及び頻度、並びに、照射パターンを制御することによって、高スループットで空間的に標的化された及び／又は時間的に標的化された分子送達が可能になる。
【００４５】
他の例示的な実施形態では、基板及び／又はマイクロ流体構造上にエネルギー吸収膜及び／又はマイクロ粒子若しくはナノ粒子を集積することによって、試薬送達プラットフォームが提供される。特定の実施形態では、ナノ粒子及び／又は薄膜を、基板上に設けられた特定の特徴部（例えば、細孔、隆起部、チャネル等）に、その上に又はその付近に局在化させることができる。特定の実施形態では、粒子／ナノ粒子及び／又は薄膜を基板の“頂部側”（細胞が配置されている箇所）に配置するが、他の実施形態では、追加的に又は代替的に、粒子／ナノ粒子及び／又は薄膜を基板の底部側（例えば、細胞が配置される側の反対側）に配置する。いずれの場合でも、エネルギー吸収膜又は粒子（例えば、金属粒子／ナノ粒子及び／又は薄膜）は、表面プラズモン周波数に近い周波数を有する電磁波を強力に吸収して、吸収されたエネルギーによって急速に加熱され、周囲媒体を蒸発させる過熱現象を生じさせる。例えば、レーザパルス励起の際に、ナノメートル直径の蒸気泡がナノ粒子又は薄膜の周囲に形成されて、細胞の表面に接触するか又は近づくと、このプロセスが細胞膜（及び／又は細胞駅）に制御された正確なサイズの孔を生じさせて、例えば試薬の出入りを可能にする。キャビテーション又は“孔開け”プロセスは数ナノ秒で完了する。結果として、膜の残りの部分には実質的に反応する時間がなく、機械的に比較的影響を受けていないままである。
【００４６】
特定の実施形態では、こうしたデバイスが、一つ以上のマイクロ流体オリフィスを備えることができ（例えば、基板の上／中／貫通して）、エネルギー吸収膜（例えば、Ｔｉ膜）又はナノ粒子がオリフィスの縁及び／又は側壁に（又はオリフィスの縁付近に）配置される（例えば、図１４及び図１８を参照）。特定の実施形態では、本デバイスは、マイクロ流体オリフィスのアレイを備え（例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上のオリフィス）、エネルギー吸収マイクロ粒子又は膜がオリフィスの縁、側壁、又は近くに配置される。オリフィスは、一つのチャネル、又はチャネルのネットワークに接続可能である（例えば、マイクロ流体チャネル）。細胞をオリフィスの上又は近くに配置することができる。
【００４７】
特定の理論に縛られるものではないが、このようなデバイスにおいて細胞膜が開くことには二つのメカニズムが存在していると考えられる。一つは粒子又は膜と細胞膜との直接接触（又は近接近）であり、キャビテーション気泡が細胞膜のすぐ隣に発生して細胞膜を破壊する。もう一つのメカニズムは、細胞膜が粒子及び／又は薄膜と接触していない場合のものである。例えば、細胞及び粒子及び／又は膜が基板の両側に存在している場合、キャビテーション気泡がキャビティ／細孔を介して流体を押し付けて、結果としての液体ジェットが細胞膜に孔を穿つ。
【００４８】
このような基板の一つ（例えば、トランスフェクション基板）が図１５に概略的に示されている。図示されているように、基板は、オリフィスの列を備え、各列はマイクロチャネルによって接続されている。この例示的であり非限定的な実施形態では、二本のマニホールドが設けられていて、その各々が試薬を二つのマイクロチャネルに送達する。オリフィス付近の表面又はオリフィスを備えた表面は、照射された際に選択的に加熱される薄膜（例えば、Ｔｉを備えた薄膜）及び／又はナノ粒子でコーティングされる。基板の選択的領域（例えば、照射領域１及び２）に所望の通りに照射して、照射領域内に配置された細胞内部に試薬を送達することができる。図１５は二本のマニホールドを例示しているが、多様な実施形態においては、これよりも多い又は少ない数のマニホールドが想定される。追加的に又は代替的に、バルブシステムによって、オリフィスへの試薬の送達を制御することができる。特定の実施形態では、マニホールドを省略することができる。
【００４９】
例示的であり非限定的な一実施形態では、マイクロ流体構造上にエネルギー吸収膜及び／又はマイクロ粒子若しくはナノ粒子を集積することによって、試薬送達プラットフォームが提供される。このようなデバイスは、一つ以上のマイクロ流体オリフィスを備えることができ（例えば、基板の上／中／貫通して）、エネルギー吸収膜（例えば、Ｔｉ膜）又はナノ粒子が、オリフィスの縁及び／又は側壁に（又はオフィリスの縁の近くに）配置される（例えば、図１４を参照）。特定の実施形態では、本デバイスは、マイクロ流体オリフィスのアレイを備え（例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上のオリフィス）、エネルギー吸収マイクロ粒子又は膜をオリフィスの縁、側壁、又は近くに備える。オリフィスは、一つのチャネル、又はチャネルのネットワークに接続可能である（例えば、マイクロ流体チャネル）。細胞をオリフィスの上又は近くに配置することができる。
【００５０】
図１６に概略的に示されるように、オリフィスが加熱／励起されると（例えば、レーザパルスによって）、開口部が細胞膜及び／又は細胞壁に形成されて、拡散によって、又は、マイクロチャネルを介する流体のポンピング（例えば、外部圧力源を用いる）によって、マイクロ流体チャネル内に試薬を細胞内に送達することができる。
【００５１】
多様な実施形態において、オリフィスの直径範囲は、略１μｍから略１００μｍ若しくは略５０μｍ、略２μｍ若しくは略５μｍから略２０μｍ若しくは３０μｍ、略１μｍ若しくは２μｍ若しくは略５μｍから略１０μｍ若しくは略１５μｍ若しくは略２０μｍ若しくは略２５μｍ若しくは略３０μｍ、又は略５μｍから略１０μｍ若しくは１５μｍ若しくは２０μｍである。特定の実施形態では、オリフィスの直径は略１０μｍである。
【００５２】
多様な例示的実施形態において、マイクロ流体チャネル（マイクロチャネル）は、略１０００μｍ以下の幅及び／又は深さ、略８００μｍ以下の幅及び／又は深さ（又は直径や特徴的寸法）、略５００μｍ以下の幅及び／又は深さ（又は直径や特徴的寸法）、略４００μｍ以下の幅及び／又は深さ（又は直径や特徴的寸法）、略３００μｍ以下の幅及び／又は深さ（又は直径や特徴的寸法）、略２００μｍ以下の幅及び／又は深さ（又は直径や特徴的寸法）、略１５０μｍ以下の幅及び／又は深さ（又は直径や特徴的寸法）、略１００μｍ以下の幅及び／又は深さ（又は直径や特徴的寸法）、略５０μｍ以下の幅及び／又は深さ（又は直径や特徴的寸法）、又は、略２０μｍ以下の幅及び／又は深さ（又は直径や特徴的寸法）を有する。
【００５３】
特定のオリフィスに対して選択的に照射／加熱を行うことによって、試薬（例えば、本願で説明されるようなもの）を、照射／加熱されたオリフィスの頂部又は近傍において細胞に選択的に送達することができる。同様に、適切なマイクロチャネルに送達されるべき物質を選択的に提供することによって、同じ物質又は異なる物質を同じ基板上の異なる細胞に送達することができる。
【００５４】
本願で説明される“アドレス可能”送達（デリバリー）デバイス／基板は、広範な状況において使用可能である。例えば、高スループットシステムにおいて、物質（エージェント）を媒体に投与して、細胞を含有する領域（この領域内に物質が届けられる）に（例えばレーザ放射を）照射することによって単純に、異なる複数のウェル又は単一のウェルの異なる複数の領域が、標的細胞内に選択的に送達された試薬を有することができる。そして、第一の物質を洗い出して、第二の物質を適用して、別の領域に対して照射することによって、培養物中の異なる位置に異なる物質がトランスフェクションされた細胞を生成することができる。これは、細胞の並列処理を大幅に促進して、一以上の試薬のタイミング及び空間的にアドレス可能な送達に対する顕著な制御を可能にする。
【００５５】
一方、特定の実施形態では、細胞内にトランスフェクションされる物質が、基板上のオリフィスに流体連結されたマイクロチャネル内に提供されて、そのデバイスをこの方法で動作させる必要がない。例えば、細胞内にトランスフェクションされる物質を培地に提供することができる。細胞の領域又はその近くに領域を選択的に加熱すると、細胞内に細孔が形成されて、細胞内に物質がトランスフェクションされる。従って、ナノ粒子又は薄膜領域が、表面の一部に存在することができて、開口／オリフィスが関係なくなる。
【００５６】
特定の実施形態では、例えば、本願で説明されるデバイスを、特定の物質を細胞に送達するためのポンプ又はバルブを備えた他のマイクロ流体デバイス（例えば、ラボオンチップ）と集積することができる。
【００５７】
本願で説明される実施形態は例示的なものであり限定的なものではない。本願で与えられる教示を用いて、こうした“トランスフェクション基板”及びマイクロ流体デバイスの構成を変更して、例えば、基板上の特徴（例えば、細孔（オリフィス）サイズ、サイズ分布、空間分布）、膜及び／又はナノ粒子の種類、マイクロ流体チャネルの分布及び／又は構成等を変更することができる。
【００５８】
［エネルギー源及び選択的照射］
物質の選択に応じて、本質的にはあらゆる種類の方法を適用して、本願で説明される手術デバイス及び／又は基板を備えたナノ粒子及び／又は薄膜を励起（加熱）することができる。こうした方法として、マイクロ波、レーザ、非コヒーレント光放射（例えば、赤外線放射）、電気加熱、電子スピン共鳴（ＥＳＲ，ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｓｐｉｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）加熱、磁気的加熱の印加等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特定の例示的実施形態では、ナノ粒子及び／又は薄膜の加熱は、磁場及び／又は電場及び／又はＲＦ場及び／又は光（例えば、レーザ）の印加によって達成される。
【００５９】
例えば、金属粒子／ナノ粒子及び／又は薄膜は、表面プラズモン周波数付近の周波数（一般的に、可視及び近赤外線範囲）を有する電磁波を強力に吸収する。粒子、ナノ粒子及び薄膜は、吸収されたエネルギーによって急速に加熱され、周囲媒体を蒸発させる過熱現象を生じさせる。
【００６０】
手術デバイス及び／又は基板を選択的に加熱する場合（例えば基板の一部）、デバイス又は基板を局所的／選択的に加熱するあらゆる手段を用いることができると考えられる。従って、例えば、特定の実施形態では、基板の特定の領域の局所的照射を、集束レーザ、集束非コヒーレント光（例えば、赤外線）源を用いて、達成することができる。
【００６１】
特定の実施形態では、基板の一つ以上の領域の選択的照射がマスク（シャドウマスク）を用いることによって達成される。特定の実施形態では、局所的照射を、レンズ及び／又はミラーシステムを用いて照射エネルギー源（例えば、レーザ）を特定の領域に集束させることによって単純に達成することができる。特定の実施形態では、エネルギー源を固定領域に集束させ、基板を動かして（例えば、可動ステージ又は他のマニピュレータ）、特定の領域の局所的照射を達成することができる。照射領域は所望の形状をとることができる。例えば、特定の実施形態では、照射領域は、円形、正方形、楕円形、六角形、三日月形、他の規則的な又は不規則な形状である。特定の実施形態では、基板上の多数の領域に対して同時に又は逐次的に照射が行われる。
【００６２】
特定の実施形態では、実施例で実証されるように、静的なシャドウマスクだけではなくて、ＴＩ社のＤＭＤマイクロディスプレイやＬＣＤディスプレイ等の空間光変調器を用いた動的なマスクによって、エネルギーパルス（例えば、レーザパルス）を成形することができる。これは、標的細胞内へのマイクロインジェクションの実時間でインタラクティブな制御を提供する。
【００６３】
［製造］
特定の実施形態では、単細胞手術デバイスが、電磁エネルギー源（例えば、レーザ）を用いて加熱可能な粒子又はナノ粒子及び／又は薄膜をチップに又はその近くに有するマイクロピペットを備えて提供される。多様な実施形態において、細胞トランスフェクションデバイスは、電磁エネルギー源（例えば、レーザ）を用いて加熱可能なナノ粒子及び／又は薄膜を備えた基板（例えば、細胞培養ベッセル、マイクロタイタープレート等）を備えて提供される。
【００６４】
本願で説明されるマイクロピペット及び“トランスフェクション基板”を、当業者に既知の方法を用いて製造することができる。例えば、多様な実施形態において、注入マイクロピペットが、例えば、市販のピペットプラー（ｐｕｌｌｅｒ）を用いて製造される一方、半導体業界において既知のマイクロ製造方法を用いて基板を製造することができる。
【００６５】
［マイクロキャピラリ／マイクロピペットの製造］
マイクロキャピラリ／マイクロピペットを、加熱及び細胞貫通を許容するのに必要な強度及び耐熱性を提供しながら、引き伸ばすことのできる、エッチングすることのできる、又は他の所望の寸法にすることのできるあらゆる物質から製造することができる。また、物質、対象の細胞にとって有毒ではないことが好ましい。特定の実施形態では、マイクロキャピラリは、ガラス、鉱物（例えば、石英）、セラミック、プラスチック（例えば、デルリン（登録商標）、テフロン（登録商標）等）、金属、半導体等の物質を備える。
【００６６】
マイクロピペットを製造する場合、ピペットの断面形状は典型的に円形である。しかしながら、これは、円形のピペットのみが細胞手術ツールに使用可能であるという意味ではない。他の断面を有するマイクロピペットも製造することができる。例えば、所望のパターン、円形、矩形、三角形のピペット先端部をまずガラス又はシリコンウェーハ上に形成して、次に、注入ピペットに移して組み立てることができる。
【００６７】
また、予め引き伸ばされたマイクロピペットが市販されている（例えば、英国ハートフォードシャー州のＷｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）。
【００６８】
ピペットの直径は、単細胞手術器具によって重要なパラメータである。本願で説明される単細胞手術器具の利点の一つは、細胞の巻き添え損傷を少なくして、細胞膜に略μｍサイズの孔を開けることができる点である。これは、大型のＤＮＡ又は他の物質を細胞内に殺さずに送達することを可能にする。巻き添え損傷を減らすため、従来のマイクロピペット法では、典型的に、ガラスピペットの外側の先端直径が２００ｎｍ未満であることが必要とされ、小さな哺乳類細胞の柔軟な細胞膜に対する貫通を容易にする。この制約は、従来のマイクロピペット法で送達可能な粒子のサイズを大きく制限する。染色体、核、細胞小器官、他の細胞外物質等の物質は、大きな研究価値及び市場価値を有するが、ピペットの開口部の物理的サイズよりも大きなサイズを有することが多く、従来の方法では細胞内に導入することができない。
【００６９】
本願で説明される“レーザ”細胞手術ピペットは、この問題に対して独創的な解決策を提供し、マイクロピペット業界全体に革命を起こす可能性を有する。一般的に、本発明の方法及びデバイスは、大型のＤＮＡ断片（例えば、ＢＡＣサイズのＤＮＡやこれよりも大きなＤＮＡ）、核、細胞小器官、他の大型物質を、他の方法よりも細胞の損傷を少なくして、より効率的に細胞内に導入するのに有効である。従って、特定の実施形態では、本願で説明される単細胞手術ツールを備えたマイクロピペットは、２００ｎｍよりも大きな、略３００ｎｍよりも大きな、略４００ｎｍよりも大きな、略５００ｎｍよりも大きな、略６００ｎｍよりも大きな、略７００ｎｍよりも大きな、略８００ｎｍよりも大きな、略９００ｎｍ若しくは１μｍよりも大きな先端直径を有する。
【００７０】
［トランスフェクション基板の製造］
同様に、好ましくは細胞に対して有毒ではなく、粒子、ナノ粒子又は薄膜コーティングを有することができて、且つ、粒子、ナノ粒子及び／又は薄膜に対する電磁エネルギーの印加によって生じる局所的加熱に耐えることができるあらゆる従来の物質から、“トランスフェクション基板”を備えた基板を製造することができる。適切な物質として、ガラス／シリコン、ゲルマニウム、鉱物（例えば、石英）、セラミック、プラスチック（例えば、デルリン（登録商標）、テフロン（登録商標）等）、金属、半導体等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７１】
特定の実施形態では、基板は、細胞スクリーニング及び／又は細胞培養に用いられるベッセルの表面を備える。例えば、接着又は担持細胞培養のためのベッセルが挙げられる。また、マイクロタイタープレート（例えば、９６個、３８４個、８６４個、１５３６個のウェル等）、マイクロ流体デバイス、高密度（マイクロアレイ）基板、顕微鏡スライド、チャンバ等も挙げられる。
【００７２】
特定の実施形態では、細胞トランスフェクション基板を、半導体業界において既知の方法を用いて製造する。一つの方法が図１７に概略的に示されている。この例示的な実施形態では、マイクロ流体オリフィス及びチャネルが、ガラスカバースリップ基板上のＳＵ‐８フォトレジストをパターニングすることによって製造される。まず、底部トレンチを、高さ１００μｍのＳＵ‐８  ２０７５フォトレジストの層にフォトリソグラフィで画定する。Ｓｕ‐８  ２００５フォトレジストの他の薄層（厚さ４μｍ）を底部層上にスピンコーティングして、第二のフォトリソグラフィステップによって円形の開口部を画定する。二層Ｓｕ‐８構造を現像した後、基板傾斜角６０度の電子ビーム蒸着によって、厚さ１００ｎｍのＴｉ薄膜をその構造上に堆積させて、円形のオリフィスの頂部及び側壁の両方をコーティングする。最終ステップでは、頂部層のＴｉをドライエッチングして、マイクロチャネルを外部の流体ポンプに接続する。例示的な一実施形態では、底部トレンチは幅２００μｍであり、また３００μｍで離隔される。円形のオリフィスは、１０から２０μｍの範囲の直径を有する。これらのオリフィスを正方向のアレイに配置して、１００μｍで離隔する。新月状のＴｉ薄膜を円形のオリフィスの側壁にコーティングする。
【００７３】
図示されているオリフィスは円形であるが、これに限定されるものではない。標準的な方法（例えば、エッチング法）を用いて、本質的にはあらゆる形状のオリフィス（例えば、円形、正方形、五角形、六角形、楕円形、台形、不定形等）を形成することができる。同様に、オリフィスのパターニングも、本質的にはあらゆる所望のパターンとなり得る。
【００７４】
特定の実施形態では、ナノ粒子及び／又は薄膜がオリフィスの一部にコーティングされるが（例えば、或る角度で膜を堆積させることによって）、他の特定の実施形態では、オリフィス及び／又は残りの表面が、ナノ粒子及び／又は薄膜で均一にコーティングされる。
【００７５】
［粒子／ナノ粒子／薄膜の物質］
多様な実施形態において、本願で説明される多様なデバイスを構成する粒子及び／又はナノ粒子又は薄膜は、全て同一の物質で形成される。他の実施形態では、特定のデバイスの粒子及び／又はナノ粒子又は薄膜は異なる物質を含む。従って、例えば、所定のデバイス（例えば、ピペット、トランスフェクション基板）が、二種、三種、四種、五種、又はそれ以上の異なる種類の粒子（例えば、粒子サイズ、及び／又は形状及び／又は物質が異なる）を有する粒子／ナノ粒子又は薄膜を含むことができる。同様に、本デバイスを構成する薄膜は、多数の膜（例えば、多層や、マイクロピペット又は基板の異なる箇所に異なる膜）を備えることができる。例えば、金属薄膜の上に、他の金属又は誘電体（例えば、酸化シリコン、窒化シリコン等）層をコーティングすることによって、本デバイスを修正して、基板の加熱又はピペットの先端によって損傷を受ける細胞の面積の割合に影響を与えるように微小気泡の膨張パターンを制御することができる。
【００７６】
多様な実施形態において、マイクロピペット及び／又は“トランスフェクション基板”上の粒子／ナノ粒子及び／又は薄膜を、適切な電磁エネルギーの印加によって加熱可能な金属、金属合金、半導体、又は他の物質から製造する。多様な実施形態において、半導体、金属、金属合金、それらの酸化物及び／又は窒化物が想定される。サイズ、アスペクト比、膜厚、及び／又は物質に応じて、多様なエネルギー源（例えば、レーザ光、電場、ＥＦ場、磁場、超音波源等）を用いて、このような金属を容易に加熱することができる。
【００７７】
本願で与えられる説明の多くは、半導体又は金属の粒子／ナノ粒子及び／又は膜に関係していて、実施例では、金粒子及び／又は金又はチタンの膜について説明しているが、エネルギー源によって加熱される物質はこれらに限定されるものではない。本質的には、適切なエネルギーを吸収し、その結果として加熱を生じさせるあらゆる物質を、本願で説明される方法及びデバイスの加熱物質として使用することができる。従って、特定の実施形態では、金、銀、タンタル、プラチナ、パラジウム、ロジウム、チタン、これらの酸化物、窒化物、合金が想定される。
【００７８】
本願で説明されるデバイス及び方法を構成するナノ粒子及び／又は薄膜において有用な物質のうち重要な一つは、チタン（Ｔｉ）及び／又はその酸化物、窒化物、合金、ドープ酸化物、ドープ窒化物、それらの合金である。特定の実施形態では、本願で説明されるデバイス及び方法を構成するナノ粒子及び／又は薄膜は、非常に硬く物質であり、金の融点よりも三倍高い融点を有するチタン及び／又は窒化チタン（ＴｉＮ）を備える。ピペット上にコーティングして、４０個の細胞を、一つのピペットを用いて連続的に注入したが、ピペットに損傷は見受けられなかった。また、これは、ＴｉＮでコーティングされたピペットが、ピペットを交換する必要なく、数百個から数千個の細胞を注入する可能性を有していることを意味している。これは、金でコーティングされたピペット（強力な破裂性気泡及び高温励起によって一、二回又は数回の使用で損傷する可能性がある）と比較すると、顕著な改善である。
【００７９】
ＴｉＮの他の変形例は当業者には周知である。炭窒化チタン（ＴｉＣＮ）や窒化チタンアルミニウム（ＴｉＡｌＮ）が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、これらの物質を個別に使用したり、ＴｉＮと交互の層にして使用したり、ＴｉＮ粒子と共に混合粒子群として使用したりすることができる。こうしたコーティングは、耐腐食性及び硬度における同様の又は優れた増強を提供し、また、異なる（更には微調整可能な）吸収特性を提供する。
【００８０】
上述のように、本願で説明されるデバイス及び／又は方法を構成する粒子又は膜は、金属を備えた物質に限定されるものではない。例えば、本発明者は、ブラックカーボンも、ピペット近くに破裂性気泡を誘起して、単細胞を殺す又は貫通することができることを実証している。従って、特定の実施形態では、例えば、カーボンナノチューブ（これに限定されるものではない）等の炭素ナノ粒子を、本願で説明される方法及びデバイスにおいて使用することができる。
【００８１】
多様な実施形態において、周期表のＩＩ族、ＩＩＩ族、ＩＶ族、Ｖ族又はＶＩ族からの一種以上の物質を備えた粒子／ナノ粒子及び／又は薄膜も想定され、また、それらの酸化物、窒化物、合金、ドープされたもの、及び／又は、遷移金属、酸化遷移金属、窒化遷移金属、遷移金属を備えた合金又は複合材等も想定される。特定の好ましい実施形態では、ナノ粒子及び／又は膜は、ＩＩ族、ＩＩＩ族、ＩＶ族、Ｖ族の物質（例えば、炭素、シリコン、ゲルマニウム、錫、鉛）、ドープされたＩＩ族、ＩＩＩ族、ＩＶ族、Ｖ族、ＶＩ族元素、純粋な又はドープされたＩＩ族、ＩＩＩ族、ＩＶ族、Ｖ族、ＶＩ族元素の酸化物、遷移金属、酸化遷移金属、又は窒化遷移金属を備える。特定の好ましい実施形態では、粒子／ナノ粒子及び／又は薄膜は、ＩＩＩ族、ＩＶ族、又はＶ族の半導体を備える。
【００８２】
本願の教示から、特定の実施形態では、粒子／ナノ粒子及び／又は薄膜が、Ｓｉ、Ｇｅ、ＳｉＣ、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｔａ、Ｔｉ、Ｒｕ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｍｎ、Ｈｆ、Ｚｒ、Ｖ、Ｎｂ、Ｌａ、Ｙ、Ｇｄ、Ｓｒ、Ｂａ、Ｃｓ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｚｎ、Ｇａ、Ｉｎ、Ｃｄ、Ｒｈ、Ｒｅ、Ｗ、これらの酸化物や窒化物等の一種以上の物質を含むことを理解されたい。
【００８３】
上述のように、多様な実施形態において、ナノ粒子及び／又は薄膜を構成するＩＩ族、ＩＩＩ族、ＩＶ族、Ｖ族、ＶＩ族元素、遷移金属、酸化又は窒化遷移金属は本質的に純粋なものであるか、又は、ドープされたもの（例えば、ｐドープ又はｎドープ）であるか、又は合金化されたものであり得る。ＩＩ族からＶＩ族元素で使用される、特にＩＩＩ族、ＩＶ族及びＶ族元素で使用される、特にＩＶ族元素（例えば、シリコン、ゲルマニウム等）で使用されるｐドーパント及びｎドーパントは、当業者には周知である。このようなドーパントとして、リン化合物、ホウ素化合物、ヒ素化合物、アルミニウム化合物等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８４】
特定の実施形態では、粒子／ナノ粒子及び／又は膜は、シリコン、ゲルマニウム、炭化シリコン等のＩＶ族半導体を備える。このような半導体について最も一般的なドーパントとして、ＩＩＩ族元素のアクセプタや、Ｖ族元素のドナーが挙げられる。このようなドーパントとして、ホウ素、ヒ素、リン、場合によってはガリウムが挙げ有れるが、これらに必ずしも限定されるものではない。
【００８５】
上述のように、多様な実施形態では、粒子／ナノ粒子は半導体を備える。ドープされたＩＩ族、ＩＩＩ族、ＩＶ族、Ｖ族、ＶＩ族元素の多くは半導体であり、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＳｅ、ＢａＴｅ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂ、ＡｌＳ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、Ｃｄ３Ｓｂ２、Ｚｎ３Ｐ２、Ｚｎ３Ａｓ２、Ｚｎ３Ｓｂ２、ＴｉＯ２、ＴｉＯ２、ＴｉＯ２、Ｃｕ２Ｏ、ＣｕＯ、ＵＯ２、ＵＯ３、Ｂｉ２Ｏ３、ＳｎＯ２、ＢａＴｉＯ３、ＳｒＴｉＯ３、ＬｉＮｂＯ３、Ｌａ２ＣｕＯ４、ＰｂＩ２、ＭｏＳ２、ＧａＳｅ、ＳｎＳ、Ｂｉ２Ｓ３、ＧａＭｎＡｓ、ＩｎＭｎＡｓ、ＣｄＭｎＴｅ、ＰｂＭｎＴｅ、Ｌａ０．７Ｃａ０．３ＭｎＯ３、ＦｅＯ、ＮｉＯ、ＥｕＯ、ＥｕＳ、ＣｒＢｒ３、Ｃｕ（Ｉｎ，Ｇａ）Ｓｅ２、Ｃｕ２ＺｎＳｎＳ４、ＣｕＩｎＳｅ２、ＡｇＧａＳ２、ＺｎＳｉＰ２、Ａｓ２Ｓ３、ＰｔＳｉ、ＢｉＩ３、ＨｇＩ２、ＴｌＢｒ、Ｓｅ、Ａｇ２Ｓ、ＦｅＳ２、Ｇｅ、Ｓｉ、これらの三元混合物、四元混合物等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８６】
レーザエネルギーに加えて、磁場、電場、ＲＦ場を用いて、粒子、ナノ粒子及び／又は特定の薄膜を加熱することも容易である。従って、例えば、参照として本願に組み込まれる特許文献９には、磁場中に置かれると、サイズ、組成、又はそれら両方の関数として、磁場の特定の周波数において選択的に加熱される磁性ナノ粒子が開示されている。
【００８７】
多様な実施形態において、このようなナノ粒子又は薄膜は、十分な強度の磁場に晒されるとエネルギーを変換する磁性体（Ｆｅｒｒｏ  Ｖ磁性顔料等）を備える。従って、例えば、交番磁場が、粒子内に交流を誘起して、熱を発生させる。多様な磁性体が使用可能である。また、こうした物質として、Ｆｅ‐Ｏ４、Ｆｅ２Ｏ３等の磁性体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、特定の実施形態では、銀、銅、プラチナ、パラジウム等が、本発明のデバイスに使用される粒子、ナノ粒子及び／又は薄膜を構成する。特定の実施形態では、粒子、ナノ粒子及び／又は薄膜は、ＴｉＯ２、ＣｅＯ２、Ａｇ、ＣｕＯ、イットリウムアルミニウムガーネット（ＹＡＧ，Ｙｔｔｒｉｕｍ  Ａｌｕｍｉｎｕｍ  Ｇａｒｎｅｔ）、ＩｎＯ２、ＣｄＳ、ＺｒＯ２、またはこれらの組み合わせを備えることができる。他の実施形態では、任意の酸化金属、金属合金、炭化金属及び／又は遷移金属を本発明において使用し得る。一部実施形態では、コーティングが印加場に対する応答性を変更しないようにして、粒子をコーティングすることができる。
【００８８】
特定の実施形態では、本発明のデバイスで使用される粒子、ナノ粒子、又は薄膜が磁性体製となり得るが、他の実施形態では、常磁性体又は超常磁性体製となり得る。
【００８９】
従って、特定の実施形態では、粒子、ナノ粒子及び／又は薄膜は、電子スピン共鳴吸収（ＳＰＭ）及び／又は強磁性共鳴を用いて加熱可能な常磁性体又は超常磁性体を備えることができる。電子スピン共鳴（ＥＳＲ）及び強磁性共鳴（ＦＭＲ，ｆｅｒｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）については、参照として本願に組み込まれる特許文献１０及び特許文献１１に記載されている。イットリウム鉄ガーネットＹ３Ｆｅ５Ｏ１２及びγ‐Ｆｅ２Ｏ３は、ＥＳＲ及び／又はＦＭＲ加熱に適した周知の二物質である。多様な応用において、多様なドーパントを追加して、これらの物質のスピン共鳴周波数を低下させることができる。磁性ガーネット及びスピネルも、一般的な環境条件下においては化学的に不活性であり壊れにくい。
【００９０】
また、周期表のＩＩ族、ＩＩＩ族、ＩＶ族、Ｖ族の物質を備えた多様な物質及び／又は半導体も想定される。
【００９１】
一般的な｛ｃ｝３（ａ）２［ｄ］３Ｏ１２及びスピネルＡ［Ｂ］２Ｏ４フェライト化合物として考えられるものの例示的な一欄が表１に与えられている。
【００９２】
【表１】
2014513984.tif 000003
【００９３】
粒子又はナノ粒子は、考えられる複数の形態のうち任意のものをとることができ、それでも本発明における使用に適してものとなる。従って、例えば、本発明は、以下の種類のナノチューブを用いることを想定している：  ジグザグ型のカイラリティを有する、複数のカイラリティが混じった、ねじれた、真っ直ぐな、曲がった、よじれた、巻かれた、扁平な、丸い、単層、二層、多層ナノチューブ；  ナノチューブのロープ、ねじれたナノチューブのロープ、編まれたナノチューブのロープ；  ナノチューブの小型バンドル（束）（例えば、特定の実施形態ではチューブの数は略１０本未満である）、ナノチューブの中型バンドル（例えば、特定の実施形態では、チューブの数は数百本である）、ナノチューブの大型バンドル（例えば、特定の実施形態では、チューブの数は数千本である）；  ナノトリイ（ナノ鳥居）、ナノコイル、ナノロッド、ナノワイヤ、ナノホーン；  中空のナノケージ、中実のナノケージ、多面ナノケージ、中空のナノコクーン（ナノ繭）、中実のナノコクーン、多面ナノコクーン；  薄いナノプレートレット、厚いナノプレートレット、インターカレート型ナノプレートレット、ナノコーン等。多様なナノ粒子（ナノ構造）は不均一型となり得る。このような不均一型として、構造の一部分が特定の化学組成を有する一方で構造の他の部分が異なる化学組成を有する構造が挙げられるが、これに限定されるものではない。一例は、各層の化学組成が互いに異なり得る多層ナノチューブである。また、不均一型として、多様な型のナノ構造物質も挙げられ、上記のもののうち一つがより大きな不規則構造に結合されている。また、特定の実施形態では、上記物質のうちいずれかが、ひび、転位、分岐、他の不純物及び／又は不完全性を有し得る。
【００９４】
特定の実施形態では、本発明において使用される粒子又はナノ粒子のサイズ、並びに／又は薄膜の面積及び／若しくは厚さを調節又は最適化して、ナノ粒子又は膜の物質の選択、励起エネルギーの性質、励起エネルギーの周波数及び／又は強度を反映するようにすることができる。特定の実施形態では、ナノ粒子のサイズの範囲（例えば、長さ及び／又は幅及び／又は直径）は略１０から略５００ｎｍまで、好ましくは略２０ｎｍから略２００ｎｍまで、より好ましくは、略２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ又は５０ｎｍから１００ｎｍ、１５０ｎｍ又は２００ｎｍまでである。本発明で使用されるナノ粒子のサイズの範囲は、特定の実施形態では略４ｎｍから略２５ｎｍまでであり、他の実施形態では８ｎｍから５ｎｍまでであり、他の実施形態では５ｎｍから１００ｎｍまでであり、他の実施形態では１０ｎｍから８００ｎｍまでであり、他の実施形態では１０ｎｍから５０ｎｍまでであり、他の実施形態では５０ｎｍから２００ｎｍまでであり、他の実施形態では１５０ｎｍから５００ｎｍまでである。
【００９５】
多様な実施形態において、存在する場合には、金属膜の厚さの範囲は、略１、２、５、１０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００又は５００ｎｍから、略８００ｎｍ、１μｍ、５μｍ、１０μｍ、５０μｍ又は１００μｍまでである。特定の実施形態では、金属膜の厚さの範囲は、略２ｎｍ、５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ又は３０ｎｍから、略１００ｎｍ、３００ｎｍ、５００ｎｍ、８００ｎｍ又は１μｍまでである。特定の実施形態では、金属膜の厚さの範囲は、１ｎｍから１５０ｎｍまでであり、好ましくは５ｎｍから１００ｎｍまでであり、より好ましくは略５ｎｍ、１０ｎｍ又は２０ｎｍから、略５０ｎｍ、７５ｎｍ又は１００ｎｍまでである。特定の実施形態では、金属膜の厚さは略３０ｎｍである。
【００９６】
多様な実施形態において、本願で説明されるデバイスを構成するコーティングされた層は、連続的な薄膜、若しくは複数の小型領域（例えば、５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍの領域）に分割された薄膜であり得て、又は、本願で説明される離散的な粒子又はナノ粒子を備え得る。粒子の形状及び薄膜の厚さ並びに粒子又は膜の組成は、物質の吸収スペクトル、所望の局所的加熱を生じさせるのに必要なエネルギー源及び強度に影響を与える。
【００９７】
一般的に、膜厚及び／又は粒子サイズは、局所的加熱によって生成される気泡のサイズと、気泡付近のマイクロ流体の流れの性質に影響する。これは、細胞内に生じるせん断応力と開口のサイズを決定する。一般的に、粒子が大きいほど、生成される気泡が大きくなり、細胞に与えられる衝撃が大きくなる。薄膜の厚さは、粒子サイズと同様の影響を有する。膜が厚くなるほど、生成される気泡が大きくなり、細胞に生じる孔が大きくなる。
【００９８】
［粒子／ナノ粒子の製造と、マイクロキャピラリ及び／又は“トランスフェクション基板”への粒子及び／又は膜の適用］
粒子又はナノ粒子を製造して表面上に堆積させる又はこのような粒子を表面上にｉｎ  ｓｉｔｕで合成する方法と、表面上に薄膜を堆積させる方法とは当業者には周知である。
【００９９】
例えば、スパッタリング堆積、化学気相堆積（ＣＶＤ，ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｖａｐｏｒ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、分子ビームエピタキシ（ＭＢＥ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｍ  ｅｐｉｔａｘｙ）、プラズマ支援気相堆積、陰極アーク堆積、アークＰＶＤ、電子ビーム蒸着等の適切な方法によって、薄膜を堆積させることができるが、これらの方法に限定されるものではない。単細胞手術デバイスの多様な実施形態においては、膜は、先端から最大１００μｍ、５０μｍ、２５μｍ、１０μｍ、又は５μｍまでの距離で、先端から最大１μｍまでの距離で、より好ましくは先端から最大８００ｎｍ、好ましくは最大５００ｎｍ、より好ましくは最大３００、２００、１５０、１００、５０又は２５ｎｍまでの距離で、マイクロキャピラリの先端を部分的に又は完全に覆う。
【０１００】
粒子及びナノ粒子を製造する方法も当業者には周知である。こうした方法として、燃焼合成（例えば、酸化還元反応において酸化剤（例えば、金属塩）及び燃料（例えば、有機化合物）を用いる）、蒸発／凝縮（ＥＣ，ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ／ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）発生器、噴霧熱分解（例えば、プラズマ処理及び粉末噴霧）、超臨界流体等の溶液化学を用いた液相法、化学的還元、機械的合金化、テンプレート法（例えば、小さな空隙又は領域内にナノ粒子を形成する。ゼオライト、柱状粘土、ナノ多孔質膜、逆ミセル）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない（例えば、参照として本願に組み込まれる特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７、特許文献１８、特許文献１９を参照）。ナノホーンの製造は、例えば、非特許文献４３に記載されていて、一方、ナノファイバの製造は、例えば、参照として本願に組み込まれる特許文献２０、特許文献２１に記載されている。また、非特許文献４４、非特許文献４５、非特許文献４６等も参照されたい。
【０１０１】
特定の実施形態では、界面活性剤系においてナノ粒子が合成される。このような表面活性剤ベースの方法は当業者には周知である。このような方法の一つは実施例１において例示される。
【０１０２】
より一般的には、特定の実施形態において、有機溶媒（例えば、エタノール）によって金属塩を還元して金属コロイドを形成することで、ナノ粒子を形成することができる（例えば、非特許文献４７、非特許文献４８、非特許文献４９、非特許文献５０等を参照）。例示的な一方法は非特許文献５１に記載されている。こうした方法では、Ａｇ＋イオンが、安定剤が存在するまたは存在しない状況において、Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ，ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）によって還元される。この反応は、表面上に静電的に付着した銀ナノ粒子の薄膜、又は銀ナノ粒子の安定分散体のいずれかの形成をもたらす。
【０１０３】
他の例示的方法では、鉄塩を、アルコール、カルボン酸及びアミンと有機溶媒中で混合して、その混合物を２００〜３６０℃に加熱することによって、磁鉄鉱ナノ粒子物質を作製することができる。粒子のサイズは、鉄塩対酸／アミンの比を変更することによって、又は、多数の金属酸化物で小さなナノ粒子をコーティングすることによって、制御可能である。サイズ分布が狭くて、２ｎｍから２ｎｍまでの範囲のサイズの磁鉄鉱ナノ粒子を簡単に得ることができる。この方法は、他の酸化鉄系ナノ粒子物質にも簡単に拡張可能であり、ＭＦｅ２Ｏ４（ここで、Ｍは、例えば、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｂａ、Ｍｇ等である）ナノ物質や、酸化鉄でコーティングされたナノ粒子物質が挙げられる。また、この方法は、反応混合物においてアルコールをチオールに置換することによって、硫化鉄の合成することができる。磁鉄鉱ナノ粒子は、γ‐Ｆｅ２Ｏ３又はα‐Ｆｅ２Ｏ３に参加可能であり、又は、ｂｃｃ‐Ｆｅナノ粒子に還元可能であり、一方で、酸化鉄系物質を用いて、二元鉄系金属ナノ粒子（ＣｏＦｅ、ＮｉＦｅ、ＦｅＣｏＳｍＸ等）を作製することができる（例えば、参照として本願に組み込まれる特許文献２２を参照）。
【０１０４】
金ナノ粒子を生成する一方法は、金塩溶液を吸着剤と混合することを含む。錯体状の金が吸着剤の表面に吸着される。金担持吸着剤を、スクリーニング、濾過、沈殿又は他の方法で溶液から分離した後に、灰にする。その灰は、金ナノ粒子と、ナトリウムやカリウムやカルシウムの酸化物等の不純物とを含有する。不純物は、希釈酸を用いた溶解によって、除去可能である。不純物が除去された後に、比較的純粋な金ナノ粒子が得られる。活性炭や金吸着樹脂を吸着剤として用いることもできる。この方法で、銀又は白金族金属ナノ粒子も簡単に生成することができる（例えば、参照として本願に組み込まれる特許文献２３を参照）。
【０１０５】
更に他の方法では、レーザ熱分解を用いてナノ粒子を形成することができる。従来のレーザ熱分解プロセス（光熱プロセスとも称される）は、当業者には周知である（例えば、参照として本願に組み込まれる特許文献２４、特許文献２５、特許文献２６等を参照）。このプロセスでは、放射吸収体又は他の前駆体ガス状種がエネルギー（例えば、レーザ光）を吸収して、反応領域における物質の加熱をもたらし、反応領域内における化学成分間の熱による化学反応を生じさせる。典型的には、レーザ熱分解プロセスは、化学蒸気領域を通過するレーザ光によって発生させる明確に確定された高温領域（ホットゾーン）（典型的には１０００〜１５００℃）を用い、ガスが熱的に反応して、所望のナノスケール微粒子物質が形成される。高温領域に接触する壁が存在しないことによって、汚染が回避される。
【０１０６】
熱分解反応によって形成される物質は、典型的には重力又は気流による高温領域を残す。物質は、急速に冷却／急冷されて、サイズ及び形状の分布が極めて均一なナノ粒子が形成される。典型的な実施形態では、二酸化炭素（ＣＯ２）レーザを用いて、光吸収によりガス分子を直接加熱する。レーザを用いることの他の利点は、そのスペクトル幅が狭いことであり、これは、正確な吸収波長（消費されるレーザ出力の１５％以上）を有する分子前駆体と光との間の効率的な結合を可能にする。この技術を用いて、金属、炭化金属、窒化金属、酸化金属から多様なナノサイズ物質が生成されている（例えば、非特許文献５２、非特許文献５３、非特許文献５４、非特許文献５５、非特許文献５６、非特許文献５７、特許文献２７、特許文献２８、特許文献２９、特許文献３０等を参照）。
【０１０７】
同様に、ＴｉＮ薄膜を生成する最も一般的な方法は、物理気相堆積（ＰＶＤ，ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｖａｐｏｒ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ、一般的にはスパッタ堆積、陰極アーク堆積、電子ビーム加熱）及び化学気相堆積（ＣＶＤ）である。両方の方法において、純チタンを昇華して、高エネルギー真空環境において窒素と反応させる。
【０１０８】
粉末金属チタンを所望の形状にパッキングして、適切な密度に圧縮し、純窒素雰囲気において燃やすことによって、バルクのセラミック体を製造することができる。金属とガスとの間の化学反応によって放出される熱は、窒化反応生成物を硬い完成品に焼結するのに十分なものである。
【０１０９】
当業者には既知の複数の方法のいずれかによって、粒子又はナノ粒子を、マイクロキャピラリ又は細胞トランスフェクション基板に付着させることができる。粒子を単純に適所にスパッタすること、金属コロイドの形成中に表面上に形成すること、核形成粒子上の適所に成長させること、表面にイオン的に付着させること、又は、表面に共有結合させること等ができる（例えば、直接的に、又はリンカー／官能化剤（例えば、‐ＳＨ、シラン（例えば、３‐アミノプロピルトリメトキシシラン等））を用いて）。
【０１１０】
実施例で説明されるように、一実施形態では、バイオリスティック細胞注入器（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて金粒子を直接プラスチック基板上に衝突させることによって細胞トランスフェクション基板を製造することができる（例えば、実施例４、図５を参照）。
【０１１１】
他の方法では、例えばパルスレーザを用いて、基板又はマイクロピペット上の薄膜を加熱することによって、薄膜を離散的なナノ粒子にアニーリングすることができることが発見された。従って、図６に示されるように、製造方法は、接着金属（例えば、チタン、クロム）の層、次に金（又は他の金属）膜の層をガラスやプラスチックや石英等の基板上に堆積させることを含み得る。そして、そのサンプルを加熱する（例えば、レーザパルスを照射する）。十分に高いレーザエネルギーにおいて、金属フィルムが溶融して、その溶融金属が凝固して、ビーズ状の粒子が基板又はマイクロピペット上に形成される（図６のＳＥＭ画像に見て取れるように）。
【０１１２】
任意の接着金属（例えば、チタン）層を基板と金層との間に挟むことによって、基板に対する金膜並びにアニーリング後の金ビーズのより強力な接着が得られる。接着層が無くても、レーザパルス又は他の加熱方法によって、金を表面上のナノ粒子ビーズにアニーリングすることができる。
【０１１３】
他の方法では、薄膜を有する基板又はマイクロピペットが提供される。そして、薄膜をエッチングして、レーザ又は他のエネルギー源の印加によって加熱可能なナノスケールサイズ領域を残す。
【０１１４】
粒子アレイ製造方法を、ナノインプリント、電子ビームリソグラフィ等の他のマイクロ又はナノ製造法に拡張することができる。現状のプラスチック基板を、ＰＤＭＳ等の他のポリマー物質や、ガラス基板、シリコン基板等と置換することができる。
【０１１５】
上述の表面上に粒子及びナノ粒子を生成及び付着させる方法及び表面上に薄膜を形成する方法は例示的なものであり限定的なものではない。本願で開示される方法を用いれば、せいぜい通常通りの実験によって、他の粒子、ナノ粒子及び薄膜でコーティングされた表面を形成することができる。
【０１１６】
［光ピンセットとの集積］
非接着性細胞への従来のマイクロインジェクションは、吸引力を印加して細胞を安定化させるために他の保持ピペットを用いる必要があるので、面倒なプロセスである。この方法では、ピペットが細胞膜を貫通する際に注入ピペットによって与えられる力に対抗する支えを細胞が有する。吸気圧力は、注入ピペット及び保持ピペットを相対的に位置決めするものであるが、致命的な細胞の損傷及び脆弱な細胞の死に関与する可能性がある。非接着性細胞のマイクロインジェクション効率を上昇させるための現状の一方法は、注入の前及び基板からの細胞の取り外しの際に表面処理された基板上に細胞を結合させることである。この方法は、細胞に対する追加の化学処理をもたらすだけではなく、時間のかかるものである。光ピンセットについては、ミクロン更にはサブミクロンサイズの物体及び生体学的成分をトラップして操作することができると示されている。光ピンセットのトラッピング力は、典型的にピコニュートンのオーダである。結果として、一般的には、光ピンセットを用いて、従来のガラスマイクロキャピラリ注入中に非接着性細胞を固定することは不可能である。
【０１１７】
これに対して、プラズモン光熱ピペット（本発明の手術ツール）は、容易に光ピンセットと組み合わせる可能である。この場合、操作される細胞は、光学力によって注入位置に自己整列される。注入プロセス中において、細胞は最小のせん断力及び機械的歪み（注入された細胞を生きたままにするための二つの重要なパラメータ）を受ける。光ピンセットと集積させたレーザ手術方法は、非接着性細胞に対する高速高効率マイクロインジェクションの可能性を有する。
【０１１８】
［細胞の種類］
一般的に、本願で説明される方法及びデバイスは、細胞膜を有する本質的にはあらゆる細胞に対して使用可能である。また、本方法及びデバイスは、細胞壁を有する細胞に対しても使用可能である。
【０１１９】
従って、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ胚腎臓線維芽細胞、ＨｅＬａ子宮頸がん細胞を含む接着性細胞が、本願で説明されるデバイス及び方法を用いて、ＧＥＰ発現プラスミドに注入されている。一般的に、接着性哺乳類細胞型を、本願で説明されるデバイス及び方法を用いて、以下の理由により簡単に注入することができると考えられる：（１）効果的な孔開け及び細胞の生存率の維持に関して最適に決定されるレーザフルーエンスが、試験された全ての種類の細胞に対して比較的狭い範囲内に存在しているから；  （２）適切な注入箇所（例えば、核周囲や核自体）を決定するのに用いられる接着性細胞の特徴部が視覚的に容易に識別されるから。
【０１２０】
リンパ球、多様な種類の幹細胞、胚細胞等は非接着性であるが、このような細胞に対して注入又は他の“手術”を行うことが望まれることは多い。本願で説明される細胞手術ツールを光ピンセットと集積すると、これが可能になる。
【０１２１】
また、本願で説明される方法及びデバイスを用いると、細胞クラスター内に個々の細胞を注入すること（ヒト胚性幹細胞の成長及び多能性の維持に必要とされる）が、特に幹細胞クラスターの表面に対して可能となる。また、クラスター内に特定の細胞を定位的に注入すること（例えば、発育の追跡、勾配の評価等の多様な理由により望まれる）も可能になると考えられる。
【０１２２】
［送達可能な物質］
本願で説明される方法及びデバイスを用いて、本質的にはあらゆる所望の物質を細胞内に送達することができると考えられる。このような物質として、核酸、タンパク質、細胞小器官、ドラッグデリバリーナノ粒子、プローブ、標識等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本願で説明される方法を用いて細胞内にプラスミドＤＮＡを送達することは、既に少なくとも三種類の接着性細胞において実証されている。従って、本願で説明される方法及びデバイスを用いて、あらゆるプラスミドサイズの遺伝物質を簡単にトランスフェクションすることができる。
【０１２３】
ＢＡＣ（細菌人工染色体，ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）は、細胞を形質導入するのが難しく、大きな遺伝子異常を導入するのにサイズ制限（プラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス）を有する送達媒体であり、発育中に特定の遺伝子の制限された発現を追跡するのが望まれている目標である。
【０１２４】
従って、本願で説明されるデバイス及び方法を用いて、自然の染色体又は合成染色体の全体又は一部を送達することができると考えられる。ＢＡＣと同様に、従来の方法では多くの細胞型内に導入することが不可能な大型の染色体や染色体断片を、本方法によって細胞内に移植することができ、例えば、ヒトトリソミー症のモデル（例えば、ダウン症候群、クラインフェルター症候群）を求めることができる。
【０１２５】
同様に、本方法を、核の移植（例えば、体細胞核移植）に用いることができ、他の細胞小器官（例えば、ミトコンドリア、ナノ加工構造）を細胞内に容易に導入することができる。
【０１２６】
多様な実施形態において、試薬を構成する送達可能物質として、核酸（例えば、ベクター及び／又は発現カセット）、抑制ＲＮＡ（例えば、ＳｉＲＮＡ、ＳｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）、リボザイム、タンパク質／ペプチド、酵素、抗体、イメージング試薬、細胞小器官（例えば、核、ミトコンドリア、核小体、リソソーム、リボソーム等）、染色体、細胞内病原体、無生物粒子（量子ドット、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）粒子、マイクロビーズ等）等から成る群から選択された試薬が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１２７】
［モジュールシステム］
特定の実施形態では、基板（トランスフェクション基板）が、既存の設備と容易に集積可能な“モジュール”として提供される。例えば、特定の実施形態では、トランスフェクション基板が、既存の顕微鏡のステージに対して追加可能な又は置換可能な形態で提供される。特定の実施形態では、基板は、倒立顕微鏡（例えば、Ｚｅｉｓ倒立顕微鏡）上のｘ／ｙ／ｚステージを置換するような形態とされる。
【０１２８】
特定の実施形態では、トランスフェクション基板は、マイクロ流体システム（例えば、ラボオンチップシステム）として及び／又はマイクロ流体システムと集積可能なモジュールとして提供される。
【０１２９】
［細胞手術システム及びパターン化トランスフェクションシステム］
多様な実施形態において、本発明は、細胞手術又は細胞のパターン化トランスフェクションのためのシステムを想定している。特定の実施形態では、細胞手術システムは、本願で説明されるマイクロサージャリーツールと、例えば細胞に対してツールを正確に配置するためのマイクロマニピュレータ／ポジショナとを備える。本システムは、任意で、細胞を保持するための手段（例えば、ピペットや他のマニピュレータ）、手術ツールを介して細胞内に流体及び／又はガス又はデバイスを送達するための手段、例えばツールを介して細胞から流体、細胞小器官等を取り除くための手段等を更に備える。特定の実施形態では、本システムは、視覚化システム（例えば、顕微鏡）、データ／イメージ取得システム、視覚化システム、マイクロマニピュレータ、データ／イメージ取得システムを制御するためのコンピュータ制御システム等を備えることができる。
【０１３０】
同様に、多様な実施形態では、パターン化トランスフェクションシステムは、細胞トランスフェクション基板（例えば、本願で説明される粒子、ナノ粒子及び／又は薄膜を有する一以上の表面を備えた培養ベッセル）を備える。基板は、典型的に、細胞、及び／又は細胞培養物を有する。本システムは、任意で、試薬を送達するための手段、細胞内にトランスフェクションされる物質（エージェント）、電磁エネルギー源から基板の一部をマスキングするための手段等を備えることができる。
【０１３１】
特定の実施形態では、本システムは、任意で、手術ツール又はトランスフェクション基板上の粒子、ナノ粒子及び／又は薄膜を加熱する電磁エネルギー源を更に含む。適切なエネルギー源として、レーザ、磁場発生器、ＲＦ場発生器等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１３２】
多様な実施形態において、本システムは、制御装置（例えば、レーザ制御装置）を含み得る。制御装置は、照射源の強度及び／若しくは持続期間及び／若しくは波長、並びに／又はマイクロサージャリーツール及び／若しくはトランスフェクション基板の照射パターンを制御するように構成可能である。特定の実施形態では、制御装置は、トランスフェクション基板及び／又はマイクロ流体システム（その中にトランスフェクション基板が配置される）を構成するマイクロチャネルを介する試薬の流れを検出及び／又は制御する。トランスフェクション基板が顕微鏡（例えば、倒立顕微鏡）上に設けられる場合、制御装置は、任意で、顕微鏡ステージ、顕微鏡焦点及び／又は顕微鏡からのイメージ取得を制御することができる。特定の実施形態では、制御装置は、任意で、マイクロキャピラリ（マイクロサージャリーツールを構成する）の充填、細胞表面及び／若しくは照射に対するマイクロサージャリーツールの角度、並びに／又は細胞内に試薬を注入するマイクロキャピラリの操作を制御する。特定の実施形態では、制御装置は、エネルギー源による先端部の照射に対するマイクロサージャリーツールの動作を調整する。
【０１３３】
［キット］
他の実施形態では、本発明は、単細胞手術、又は細胞内への物質（エージェント）のパターン化送達（パターン化トランスフェクション）を実施するためのキットを提供する。特定の実施形態では、本キットは、本願で説明される単細胞手術ツール及び／又はトランスフェクション基板を含む容器を備える。多様な実施形態において、本キットは、任意で、本願で説明される手術及び／又は細胞のパターン化トランスフェクションを実施するための試薬やデバイス（例えば、試薬、緩衝剤、チューブ、インジケータ、マニピュレータ等）のいずれかを追加的に含むことができる。
【０１３４】
また、本キットは、任意で、本発明の手術ツール及び／又はパターン化トランスフェクション基板を使用するための（例えば、本方法を実施するための）説明（つまり、プロトコル）を提供するラベル及び／又は説明書を含む。特定の実施形態では、その説明書には、物質を注入又は取り除くための及び／若しくは細胞の成分を操作するための本願で説明される細胞手術ツールの使用方法、並びに／又は細胞内に一以上の物質（エージェント）を送達するためのトランスフェクション基板の使用方法が記載されている。
【０１３５】
説明書は典型的には文書又は印刷物を備えるが、これに限定されるものではない。このような説明を記憶してそれをエンドユーザに伝えることができるあらゆる媒体が本発明において想定される。このような媒体として、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ‐ＲＯＭ）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。このような媒体は、こうした説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含み得る。
【０１３６】
［実施例］
以下の実施例は例示的なものであり、本願発明を限定するものではない。
［０１６１］
［実施例１］
［細胞手術ツールの製造及び使用］
本実施例は、ナノ粒子光熱効果をマイクロキャピラリ法と集積した新規細胞手術デバイスに関する。ここでは、概念実証のための実験結果を与える。従来のマイクロキャピラリ法は、単細胞の記録及び操作を行うための多目的ツールであるが、マイクロキャピラリが細胞膜に孔を穿つ際に、細胞に対して過度の応力を課す。結果として、この方法は、特に、小型の又は機械的に脆弱な細胞に対して、細胞の死をもたらすことが多い。
【０１３７】
レーザアブレーションを用いた現状の細胞手術方法（非特許文献７）は、機械的応力をなくすが、しっかり集束した光と、レーザの集束スポットに注入マイクロピペットを正確に位置決めすることとを必要とする。本実施例で説明される細胞手術デバイスは、マイクロキャピラリピペットの先端上のナノ粒子の光熱効果を利用する。ピペットが細胞に当たると、ナノ粒子のレーザ誘起加熱は細胞膜に一時的な孔を生じさせる。加熱は、ナノ粒子と接触している膜領域においてのみ生じるので、本デバイスは、非集束レーザ又は軽く集束したレーザを用いて動作することできる。このようにして、望ましくない応力が最少化される。強力なレーザ強度によって考えられる化学的影響が避けられて、研究されている操作細胞の生態が影響を受けないことが保証される。
【０１３８】
図１は、細胞手術ツールの概略を示す。金ナノ粒子がマイクロピペットの先端上にコーティングされている。貴金属ナノ粒子は、その表面プラズモン周波数に近い周波数を有する電磁波（通常は可視範囲及び近赤外線範囲）を強力に吸収する（非特許文献５８）。例えば、直径３０ｎｍの金ナノ球は、その消光スペクトルの５３２ｎｍ付近の波長にピークを示す。レーザパルス励起により、ナノ粒子は、吸収されたエネルギーによって急速に加熱され、周囲媒体の過熱及び蒸発を生じさせる。この直接加熱又は崩壊する蒸気泡からのキャビテーション力が、細胞膜の透過性の上昇又は膜の“孔開け”をもたらす。損傷体積は、レーザパルスのフルーエンス及びナノ粒子のサイズによって制御可能である。加熱される体積は、３０ｎｍの金ナノ球の表面から数十ナノメートル広がり、ナノ粒子は、レーザパルスの印加後数ナノ秒以内に平衡温度まで冷えることが示されている（非特許文献５９、非特許文献６０）。結果として、膜又は細胞の残りの部分には反応するのに十分な時間がなく、機械的に影響を受けていないままである。このようにして、マイクロピペットが、簡単に細胞膜を貫通することができて、細胞の損傷が最少化される。
【０１３９】
［実験及び結果］
［金ナノロッドの合成］
多様な実施形態において、ナノロッドの合成は、リジッドテンプレート又は表面活性剤の使用のいずれかによって達成可能である。本応用では、比較的容易な合成方法である表面活性剤の方を採用した。概説すると、合成されたナノロッドは、Ｊａｎａ等（非特許文献６１）によって開発されたシード媒介成長法によって生成され、この方法では、表面活性剤の存在下において、３〜４ｎｍのシードが成長溶液に加えられて熟成されて、特異なアスペクト比を有するナノロッドが得られる。表面活性剤の濃度に加えて、特定の量の銀イオンを加えることによって、アスペクト比が制御されることが示されている（非特許文献６２）。結果物のナノロッド溶液を、炭素でコーティングされた銅グリッド上でＴＥＭにより特性評価した。図４は、アスペクト比が３．２及び５．８の合成されたナノロッドを示す。
【０１４０】
［合成プロセス］
ベンジルジメチルアンモニウムクロライドハイドレート（ＢＤＡＣ，Ｂｅｎｚｙｌｄｉｍｅｈｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｈｙｄｒａｔｅ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムボロミド（ＣＴＡＢ，ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、Ｌ‐アスコルビン酸、硝酸銀（ＡｇＮＯ３）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、テトラクロロ金酸（ＨＡｕＣｌ４‐３Ｈ２Ｏ）を、シグマアルドリッチ社から入手した。脱イオン水（１８Ｍ）を実験全体を通して使用した。
【０１４１】
［シード溶液］
５．０ｍｌの０．２０Ｍ  ＣＴＡＢを、５．０ｍｌの０．０００５Ｍ  ＨＡｕＣｌ４と混合して、２５℃で撹拌した。０．６０ｍｌの良く冷えた０．０１Ｍ  ＮａＢＨ４をその混合物に加えた。結果物の溶液は、金の還元により、茶色がかった黄色に変わった。結果物の溶液を二分間激しく撹拌して、全てのＡｕがＡｕ０に還元されていることを保証した。
【０１４２】
［成長溶液］
２０．０ｍｌの０．１５Ｍ  ＢＤＡＣ及び０．４０ｇのＣＴＡＢを組み合わせて、４０℃で２０分間超音波処理して、ＣＴＡＢを完全に溶解させた。四つの別々の小瓶に、２００μｌ０．００４Ｍ  ＡｇＮＯ３を分配して、続いて、５ｍｌのＢＤＡＣ／ＣＴＡＢ表面活性剤溶液を分配した。これによって、異なるように熟成される四つの異なる成長溶液が得られた。成長溶液はオレンジ色を帯びていた。各小瓶に対して、５．０ｍｌの０．００１０Ｍ  ＨＡｕＣｌ４を加えて穏やかに混合し、続いて、７０μｌの０．９７７８Ｍ  Ｌ‐アスコルビン酸を加えた。Ａｕ３＋からＡｕ０への還元中にオレンジ色は消えた。１２μｍのシード溶液を各小瓶に加えた。これによって、赤みがかった色が生じ、これは、少なくとも６０％のＡｕが還元したことを示す。結果物の溶液を、１時間、２４時間、４８時間、７２時間熟成した。
【０１４３】
シードＡｕがガラス上に直接成長して、続いて、成長溶液中にピペットを浸漬して、Ａｕ粒子を大きくした。
【０１４４】
［細胞手術ツールの使用］
ここで説明される実験では、波長５３２ｎｍで持続時間５ナノ秒のパルスレーザを用いた。レーザは、５×３ｍｍ２の非集束スポット上に８８３Ｊ／ｍ２のフルーエンスを伝えた。非特許文献６３で報告された方法を用いて、金ナノ粒子をガラスマイクロピペット上に直接合成した（図２）。ＲＰＭＩ中で培養したＮＡＬＭ‐６細胞を使用した。ガラスマイクロピペット上のナノ粒子の光熱効果によって、細胞膜に高度に局在化させた一時的な開口を生じさせ、典型的な開口の寸法は、マイクロピペットの先端サイズに近く、２μｍ程度であった（図３Ｃ）。このプロセスの後において、細胞は生きたままであった。金ナノ粒子を有さない同じサイズのガラスマイクロピペットを用いた対照実験も行った。細胞膜はその形状を瞬間的に復元して、レーザパルスの印加後において孔が開いた兆候を示さなかった。また、導電性及び熱伝導性アモルファスカーボンコーティングのレーザ誘起光熱効果についても調べた。アモルファスカーボンの薄膜をガラスマイクロピペット上にスパッタリングした。実験結果は、同一のレーザ影響下において、細胞を瞬間的に溶解して殺す破裂性効果が大きな体積にわたって広がっているというものであった（図３Ｂ）。
【０１４５】
［結論］
この実験は、金属ナノ粒子の光熱効果を利用した新規細胞手術ツールを例示し、概念を立証する実験を与えるものである。アモルファスカーボンでコーティングされたマイクロピペットが瞬間的に細胞を溶解して殺すことと比べると、金ナノ粒子でコーティングされたマイクロピペットを用いると、細胞膜に対して局在化された一時的な孔開けが得られる。
【０１４６】
［実施例２］
［プラスミドＤＮＡのトランスフェクション及び発現］
本プラズモン光熱ピペットを用いて、細胞膜に対する孔開けを実証した。ここで説明される実験では、Ｑスイッチ周波数二倍Ｎｄ：ＹＡＧパルスレーザを５３２ｎｍの波長及び６ｎｓのパルス持続期間で用いた（Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ社のＭｉｌｉｌｉｔｅ  Ｉ）。レーザは、１１．８ｍｍ２の非集束スポット上に８８．３ｍＪ／ｃｍ２のフルーエンスを伝えた。スパッタリングによって、金／パラジウム薄膜をガラスマイクロピペット上に堆積させた。ＤＭＥＭ内で培養したヒト胚腎臓ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた。ガラスマイクロペット上のＡｕ／Ｐｄ薄膜の光熱効果によって、細胞膜の崩壊を生じさせた。５ｎｍの膜厚に対して、膜の開口の寸法は、マイクロピペットの先端サイズに近く、２μｍ程度であった（例えば、図１１のａを参照）。厚さ１３ｎｍの膜に対しては、大きな体積にわたって広がっている破裂性効果が、同一のレーザ影響下において、細胞を瞬間的に溶解して殺した（図１１のｂ）。コーティングを有さない同じサイズのガラスマイクロピペットを用いた対照実験も行った。細胞膜は、レーザパルス印加後において孔開け又は損傷の兆候を示さなかった。
【０１４７】
また、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内にプラスミドをエンコードする緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ，ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のマイクロインジェクションも実証した。プラスミドは、ＤＮＡの環状鎖であり、細胞内へ注入されると、細胞にＧＦＰを生じさせて緑色蛍光発光する。図１２のａは、マイクロインジェクションプロセスを示す。光熱ピペットが細胞膜に優しく接触すると、プラスミド含有緩衝剤の連続流がピペットの先端から放出された。レーザパルスの印加後、細胞全体にわたって緩衝剤を挿入して、ピペットを細胞から直ちに外した。注入後２４時間にわたって注入された細胞は生きていて、ＧＦＰを発現した。別途対照実験を行い、レーザパルスを印加せずに細胞膜に接触させつつプラスミドを含有する緩衝剤の流れをピペットが放出した。２４時間後に、ＧＦＰを発現している細胞は発見されなかった。これは、プラズモン光熱ピペットが細胞膜に孔を開けて、その中にプラスミドを流し込むことに成功したことの直接的な証拠である。また、細胞はこのプロセスから生き延び、２４時間後において生きたままであった。
【０１４８】
［実施例３］
［光ピンセットとの集積］
図１３には、開口数（Ｎ．Ａ．）１．３  １００×の油浸レンズの焦点（集束点）における５０ｍＷで１０６４ｎｍのレーザビームによってトラップされ、光熱ピペットの先端に接触しているＮａｌｍ‐６細胞が示されている。この光ピンセットは、光熱細胞手術プロセスの時間分解イメージを撮るために用いられるＺｅｉｓｓ社の倒立顕微鏡の上に構築されている。これは、光学トラッピング、細胞手術、時間分解イメージングを同時に行うことができる集積光学システムを提供する。光熱ピペットは、細胞膜に孔を開けるのにナノ気泡の破裂を用いるものであるので、ピペットの先端が細胞に優しく接触するだけでよい。この場合、光ピンセットは、そのプロセス中に細胞を適所に保持するのに十分なトラッピング力を有する。保持ピペット及び注入ピペットの両方から細胞に印加される接触力を最少化することに加えて、光ピンセットを組み込むことの他の利点は、操作中の細胞の選択、トラッピング、放出のし易さという点である。
【０１４９】
［実施例４］
［金粒子でコーティングされた基板を用いた生細胞への光イメージパターン化分子送達］
オプトポレーションは、細胞内に分子及び遺伝子を送達する方法であり、強く集束したパルスレーザビームを利用して、細胞膜に細孔を生成する（非特許文献７）。この方法は、無接触送達を可能にし、フェムト秒レーザを用いて、単細胞を標的にした１００％のトランスフェクション効率が実証されている（非特許文献６）。この方法の欠点の一つは、サイト特定又はパターン化細胞トランスフェクションを得るために、レーザビームが全細胞を走査しなければならない点であり、これは、大型のパターン化細胞トランスフェクションが望まれる場合には、複雑さの問題等により時間がかかる。
【０１５０】
細胞膜の透過性を増大させる他の無接触法は、光吸収マイクロ粒子又はナノ粒子を使うことである（非特許文献５９）。短パルスレーザの照射によって、粒子は、過渡性で局在化された破裂性気泡を生成し、粒子に隣接する細胞膜の一部を崩壊させて、残りの細胞構造を無傷のままにする。粒子のサイズ、密度、レーザフルーエンスを制御することによって、細胞の透過性上昇及びトランスフェクションが高効率で達成可能である（非特許文献６４）。
【０１５１】
ここでは、光イメージパターニングによって分子送達に対して細胞を空間的に選択及び標的化することができる単純なデバイスについて説明する。本方法は、複雑な単層混合物内における特定の細胞への明確なパターンのイメージベース分子及び遺伝子の大規模送達を達成する可能性を有する。
【０１５２】
［原理及びデバイス構造］
特定の実施形態では、本デバイスは、表面上に固定した粒子（例えば、金粒子）を備えたプラスチック基板で構成される（例えば、図７を参照）。例えば、密集培養物が形成されるまで、細胞をこの基板上に播種する。パルスレーザをシャドウマスクに照射して、対応する照射パターンを基板上に写す。パルスレーザに晒された領域において、吸収された光エネルギーによって、金粒子が高温に加熱される。数ナノ秒以内に、熱は金粒子を取り囲む液体媒体薄層に散逸して、破裂性の蒸気泡を発生させる（非特許文献６０）。蒸気泡の急速な膨張及びその後の崩壊が、過渡流体流れを生じさせて、接着性細胞に強力なせん断応力を誘起して、細胞膜に局在化した細孔が形成される。結果として、流体流れ又は熱拡散によって、膜不透過性分子を細胞内に運ぶことができる。キャビテーション気泡が、金粒子がレーザに晒された箇所においてのみ生じるので、細胞培養物の特定の領域における分子摂取を対象とするように、光学パターンを設計することができる。このようにして、基板上の金粒子のサイズ、密度、励起レーザフルーエンスを制御することによって、高スループットで空間的に標的化された分子送達が可能になる。
【０１５３】
［実験及び結果］
一実験では、２２００ｐｓｉの衝突圧力でバイオリスティック注入器（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ社のＰＤＳ‐１０００）を用いて、０．６μｍの金ナノ球（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ社製）をプラスチックペトリ皿に衝突させた。そして、ＤＭＥＭ内で培養した不死化ヒト胚肝臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）を皿の上に置いて、略７０〜８０％の細胞密集度が得られるまで一晩培養した。Ｑスイッチ周波数二倍の波長５３２ｎｍのＮｄ：ＹＡＧレーザ（Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ社のＭｉｎｉｌｉｔｅ  Ｉ）を用いて、デバイスに照射を行った。レーザは、６ナノ秒のパルス幅及び９．４ｍｍ２のスポットサイズを有する。シャドウマスクをビーム経路に配置して、所望の光学パターンを投射して、０．８３×の縮写で、デバイス上に写した。金粒子から誘起されたキャビテーション気泡を、図８に示される時間分解イメージングシステムを用いて撮影した。高速増感ＣＣＤカメラ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社のＰＩ‐ＭＡＸＩＩ）によって、５００ｐｓの短さの露光時間が得られた。撮影された気泡のイメージと励起レーザパルスとの間のナノ秒の時間遅延を、光ファイバ遅延ラインの長さによって制御した。レーザパルス印加中、１ｍｇ／ｍｌの膜不透過性蛍光色素カルセイン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製で、分子量６２２．５）を含有する媒体中に細胞を浸漬した。キャビテーション導入後、細胞培養物をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、蛍光染色を調べる前に、新品の媒体中に再び浸漬した。
【０１５４】
図９は、シャドウマスクを用いずにレーザパルスを印加した７８ナノ秒後に加熱金粒子によって誘起されたキャビテーション気泡を示す。粒子の密度は略０．００４個／μｍ２である。これは、一細胞当たり０．９個の気泡に対応する（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の面積を略１５μｍ×１５μｍと仮定する）。図１０では、シャドウマスクを用いて、デバイスの左半分のみにレーザパルスを照射した（破線がシャドウマスクの境界に対応する）。レーザのインフルーエンスは１２８．２ｍＪ／ｃｍ２であり、７回のパルスを印加した。蛍光イメージは、色素摂取パターンが照らされた領域と一致していることを明確に示している。
【０１５５】
［結論］
光パターン化分子送達を可能にするデバイスがここで説明された。蛍光分子の送達の成功が、接着性細胞培養物において実証された。標的とされる送達領域をシャドウマスクによって制御した。このデバイスは、生細胞における大規模な、光パターン化分子及び遺伝子送達を達成する可能性を有する。
【０１５６】
［実施例５］
［標的細胞への試薬の並列送達］
マイクロ流体構造上に光吸収金属ナノ構造を集積させることによって他の並列送達プラットフォームを開発した（例えば、図１４を参照）。図示されるデバイスは、側壁にチタンコーティングを有するマイクロ流体オリフィスのアレイで構成される。オリフィスは、その可能のマイクロ流体チャネルのネットワークに接続される。レーザパルスを印加して細胞膜を開口すると、マイクロ流体チャネル中に担持されたカーゴを、外部圧力源によって流体をポンピングすることによって、オリフィスの上の細胞内に積極的に送達することができる。
【０１５７】
このデバイスで、並列気泡励起を試験した。レーザパルス（パルス幅６ｎｓ、波長５３２ｎｍ）を構造に照射することによって、核円形の開口に気泡を同時に発生させた。新月型のＴｉ薄膜コーティングによって、シリンダー状の側壁の一部に沿ってのみ気泡の破裂が生じる（例えば、図１９を参照）。
【０１５８】
細胞膜の開口及びカーゴの送達を試験するため、ＨｅＬａ細胞をこのデバイス上に播種した。例によって、細胞はＳＵ‐８基板及びオリフィスの上に成長して分裂した。膜不透過性緑色蛍光ＦＩＴＣ‐デキストラン（分子量＝３ｋ  Ｄａ）を、２００μｇ／ｍｌの濃度で細胞培地に担持させた。１５６ｍＪ／ｃｍ２のレーザパルス印加後、円形のオリフィスの上に成長してレーザ誘起気泡破裂に晒された細胞において、蛍光色素の摂取が観測された（例えば、図２０を参照）。この場合、送達は、受動拡散によるものであった。
【０１５９】
［実施例６］
［哺乳類細胞内への大型カーゴ送達のための光熱ナノブレード］
弾力的で機械的に脆弱で直ぐに再び閉じてしまう哺乳類細胞膜の制御された切断を達成することは難しい。本実施例では、短レーザパルスエネルギーを取り込んでそれを高度に局在化した破裂性蒸気泡（この気泡は、高速流体流れ及び誘起される一時的なせん断応力によって軽く接触している細胞膜に急速に孔を穿つ）に変換する金属ナノ構造を利用した光熱ナノブレードについて説明する。キャビテーション気泡パターンは、金属構造の構成並びにレーザパルスの持続期間及びエネルギーによって制御される。マイクロピペットと金属ナノ構造を集積させると、ナノブレードが、高濃度カーゴ（５×１０８個の生細菌／ｍＬ）を高効率（４６％）且つ高い細胞生存率（＞９０％）で哺乳類細胞内に送達するためのマイクロメートルサイズの膜アクセルポートを発生させる。三桁のサイズ範囲にわたる追加的な生物学的カーゴ及び無生物カーゴ（ＤＮＡ、ＲＮＡ、２００ｎｍのポリスチレンビーズから２μｍの細菌等）が、多種の哺乳類細胞内に送達されている。全体として、光熱ナノブレードは、哺乳類細胞内に多様なカーゴを送達するための効果的方法である。
【０１６０】
本実施例は、マイクロキャピラリピペットと集積させた金属ナノ構造である光熱ナノブレードに関する（図２１）。光熱ナノブレードは、光パルスエネルギーを取り込んで空間的にパターン化され時間的に同期されたキャビテーション気泡を生じさせて、それが高速で局在化した流体流れを生じさせる。細胞膜等の柔らかい物質又は脆弱な構造は、光熱ブレードと接触すると、超高速で局在化した流れが、構造の残りの部分にはほとんど影響を与えずに、接触領域付近で膜に孔を穿つことができる。膜の切断は、レーザ誘起キャビテーション気泡からの強力で渡過性の機械的せん断応力によって生じる（非特許文献６５、非特許文献６６、非特許文献６７）。従って、細胞内にマイクロピペットを進ませずに細胞内への送達ポータルが生じる。切断中においてブレードは細胞に優しく接触するので、膜の下方における強力な機械的支持体の必要性がなくなる。この新規デバイスは、高効率且つ高い細胞生存率で、哺乳類体細胞内への多様なサイズの物体（生体分子から細菌まで）の細胞内送達を可能にする。
【０１６１】
光熱ナノブレードを実演するため、厚さ１００ｎｍのチタン（Ｔｉ）薄膜を、先端直径２μｍのガラスマイクロキャピラリピペットの先端に堆積させた（図２２Ａ及び図２２Ｂ）。Ｔｉでコーティングされたマイクロピペットを、倒立顕微鏡ステージ上の電動マイクロマニピュレータアームに取り付けた。マイクロピペットの先端を細胞膜に軽く接触させて配置し、波長５３２ｎｍのＮｄ：ＹＡＧレーザの６ｎｓのパルスで、対物レンズを介して幅２６０ｎｍのフィールドに対して照射を行った。パルスレーザへの露出は、Ｔｉ及び隣接する水薄層を急速に加熱して、リング状のＴｉ薄膜に沿って局在化した蒸気泡破裂を誘起して、接触している細胞膜を切断する。レーザパルス、Ｔｉ加熱、キャビテーション気泡膨張そしてその崩壊というこのプロセスには、数百ナノ秒しかかからない。マイクロピペット内部の流体及びカーゴの圧力制御された送達は、レーザパルスの印加及び膜の切断と同期される。
【０１６２】
［物質及び方法］
［デバイスの製造及び実験設定］
チタン（Ｔｉ）でコーティングされたマイクロピペットを、直径１ｍｍのボロシリケートガラスキャピラリチューブ（ＳｕｔｔｅｒＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＰ‐９７）を加熱して引き伸ばし、マグネトロンスパッタ堆積システムを用いて、テーパ状の端部にＴｉ薄膜を堆積させることによって製造した。Ｔｉコーティングの厚さ及びマイクロピペットの先端直径を、走査型電子顕微鏡を用いて定量化した。レーザパルスシステムとして、Ｑスイッチ周波数二倍Ｎｄ：ＹＡＧレーザ（Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ社のＭｉｎｉｌｉｔｅ  Ｉ）を波長５３２ｎｍでパルス幅６ｎｓで作動させた。
【０１６３】
レーザビームを偏光ビームスプリッタで分裂させて、一方のアームを倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社のＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ）の蛍光ポートに送り、対物レンズ（４０×、０．６ＮＡ）幅２６０μｍのレーザスポットをサンプル平面上に発生させた。カーゴ送達用に最適化されたレーザフルーエンスは１８０ｍＪ／ｃｍ２であった。電気スイッチを設けて、励起レーザパルスを液体注入システム（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社のＦｅｍｔｏＪｅｔ）と同期させた。キャビテーション気泡の動力学を特性評価するための時間分解イメージングシステムを、５００ｐｓという短い露光時間を有する増感ＣＣＤカメラ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＰＩ‐ＭＡＸ２）を用いて構築した。レーザトリガー信号の受信とカメラのシャッター開放との間のプログラム可能な遅延を、カメラ制御ユニットによって設定した。偏光ビームスプリッタの後方において、レーザビームの他方のアームを蛍光色素細胞に送った。励起蛍光パルス（略６９８ｎｍに波長の中心がある）をマルチモードファイバに結合して、顕微鏡の集光レンズに送り、カメラのシャッターと同期させてサンプルに照射した。撮影された気泡イメージとサンプル励起レーザパルスとの間のナノ秒の時間遅延を、光ファイバ遅延ラインの長さによって制御した。
【０１６４】
［Ｔｉコーティングされたマイクロピペット上の強度パターンの数値計算］
３次元有限差分時間領域（ＦＤＴＤ，ｆｉｎｉｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｉｍｅ  ｄｏｍａｉｎ）法を用いて、電磁強度パターンをシミュレーションした（ＲＳｏｆｔ  Ｄｅｓｉｎｇ  ＧｒｏｕｐのＦｕｌｌＷＡＶＥ）。シミュレーション領域を、水媒体領域（ｎｗａｔｅｒ＝１．３４）及び、先端及び外側の側壁がＴｉ（ｎＴｉ＝１．８６＋２．５６ｉ）薄膜でコーティングされたガラスマイクロピペット（ｎｇｌａｓｓ＝１．４６）で構築した。全領域を、完全整合境界層で取り囲んで、無限に広がる空間を再現した。ピペットの先端に対して３０度の角度を成す波数ベクトルｋ及びｙに沿って偏光した電場での平面波励起（λ＝５３２ｎｍ）を用いた。Ｔｉの時間平均強度プロファイル｜Ｅａｖｅ｜２を、電磁波振動に対して正規化した電気エネルギー密度によって得た。
【０１６５】
［膜切断用の光熱ナノブレードの最適なレーザフルーエンスの決定］
最適なレーザフルーエンス、膜開口、高い細胞生存率の維持についての基準について検討した。レーザパルス印加前に、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ，ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）色素を細胞培地に加えた。マイクロピペットを細胞膜に接触させて、特定のフルーエンスレベルのレーザパルスを照射した。レーザパルス印加後、加熱された細胞を直ちに調べてＰＩの摂取を評価した。別途、細胞生存率を、レーザパルス印加の９０分後にＰＩを加えて同様に決定し、また経時的に視覚的成長検出を行った。
【０１６６】
［細胞生存率の評価］
細胞生存率を、光熱ナノブレードでの切断の９０分後にＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ（アネキシンＶ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）細胞染色によって決定した。注入された細胞を正確に追跡するため、化学的にパターン化されたガラスカバースリップ基板上に細胞を播種した（非特許文献６８）。円形領域（直径略２００μｍ）を画定して、その領域内に細胞の接着及び成長を制限した。各実験に対して、同一の円形パターン（一つのパターン内に略６０個の細胞）内の全ての細胞について、同一のレーザパルス及びカーゴ送達条件とした。パターン化基板上に培養されている細胞の生存率の影響を排除するため、処理パターン内で生きている細胞のパーセンテージを、同一のガラス基板上の隣接する未処理パターン内で生きている細胞のパーセンテージで正規化した。送達後の生存率を、三つの別々の実験の平均によって決定した。
【０１６７】
［免疫イメージングを用いた生体分子、カルボン酸ビーズ、細菌の送達］
ＧＦＰ発現ＲＮＡを、１×の（１倍の）ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に希釈して、ＩＭＲ９０一次ヒト肺線維芽細胞内に注入した。カチオン性の１００ｎｍの緑色ポリスチレンビーズで、ＤｓＲｅｄエンコーディングレンチウイルスＤＮＡを培養して、球表面にＤＮＡを吸着させた。ビーズを１×のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に懸濁させて、ヒト胚性幹（ｈＥＳ，ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ）細胞内に注入した。マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）の薄層の上でＲＯＣＫ抑制剤（非特許文献６９）を用いて、ｈＥＳ細胞を解離させて培養した。ＤｓＲｅｄの発現を注入の２４時間後に評価した。緑色カルボン酸修飾ポリスチレンビーズ（２００ｎｍ）を１×のＰＢＳ（ｐＨ７．４）（０．１体積％の固体）に懸濁させて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に注入した。蛍光バークホルデリア・タイランデンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）細菌を、１×のＰＢＳ（ｐＨ７．４）（１０８〜１０９／ｍＬの濃度）に懸濁させて、ＨｅＬａ細胞に注入した。ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）を用いて、ペニシリン及びストレプトマイシンを用いずに、チャンバ顕微鏡スライド（Ｎｕｎｃ  ＬａｂＴｅｋ）中で細胞を培養した。注入後直ちに、ＰＢＳで３回、細胞を洗浄して、１０００ｍｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する新品の培地内で２時間にわたって培養して、細胞外細菌を殺した。そして、成長培地を、５ｍｇ／ｍＬのセフタジジムを含有するＤＭＥＭに交換して、細胞外細菌の成長を抑制し、５％のＣＯ２中で３７℃において更に１６〜２４時間にわたって培養した。注入後１５〜２４時間後において、細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定して、Ａｌｕｘａ  Ｆｌｕｏｒ標識化ファロイジンで染色して、アクチン細胞骨格を視覚化した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。そして、細胞を、ＬｅｉｃａのＳＰ２  ＡＯＢＳレーザ走査共焦点顕微鏡設備を用いて視覚化した。
【０１６８】
［細菌の染色及び成長条件］
バークホルデリア・タイランデンシス及び変異派生物をＬ培地で培養した。必要に応じて、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）又はテトラサイクリン（２０μｇ／ｍＬ）を加えた。
【０１６９】
Ｌブロス中で、バークホルデリア・タイランデンシスＥ２６４を、１．０の光学密度（ＯＤ６００）（４×１０８  ＣＦＵ／ｍＬ）に成長させた。全体として、３７℃で２時間にわたって、１０：１の感染多重度（ＭＯＩ，ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で、１２ウェルのプレート中に成長させた１×１０５個のＨｅＬａ細胞を細菌に感染させた。感染細胞を、ＰＢＳで洗浄して、４００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する新品の培地で１５分間にわたって培養して、細胞外細菌を殺し、ＰＢＳ中の１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ‐１００で溶解した。感染ＨｅＬａ細胞溶解物の複数の希釈物を、Ｌ寒天上に分布させて、細胞内細菌の数を、ＣＦＵアッセイによって決定した。
【０１７０】
［結果及び検討］
［光熱ナノブレード上の光強度パターンのシミュレーション］
キャビテーション気泡パターンは、薄膜の組成及び構成、並びにレーザ励起パラメータ（波長、パルス持続期間、エネルギー等）によって制御される。図２２Ｃは、レーザ励起されたＴｉでコーティングされたマクロピペットの３次元有限差分時間領域（ＦＤＴＤ）シミュレーションを用いた計算結果を示す。Ｔｉでコーティングされたマイクロピペットに対して、先端に対して３０°の角度で照射を行った。直線偏光では、プラズモン増強光吸収（∝｜Ｅａｖｅ｜２）は、幅２μｍのＴｉリングに対して不均一である（図２２Ｄ）。高強度領域は、波の偏光方向に沿ってリングの縁に集中している。Ｔｉリングの温度分布は、高強度領域に発生した熱だけではなくて、レーザパルス印加中に低温の金属領域及び周囲媒体に向かう熱拡散によっても支配される。マイクロピペット上のＴｉ膜において、熱拡散帳（〜（Ｄτ）１／２）の見積もりは、６ｎｓにおいて２３０ｎｍである。これは、リング状のピペットの先端全体に沿って滑らかな温度プロファイルをもたらす。従って、Ｔｉ膜からの熱エネルギー伝導が、隣接する水薄層を臨界温度以上に加熱して（非特許文献６０）、リング状のマイクロピペットの先端に蒸気ナノ気泡を発生させる（図２３Ａ）。
【０１７１】
［キャビテーション気泡誘起膜切断及びそれに対応する細胞生存率］
生哺乳類細胞内へのマイクロメートルサイズのカーゴの送達については、過渡性の膜ポータルがカーゴのサイズに適合していることが望まれる。更に、細胞の修復を可能にして生存率を維持するように損傷領域が制限されることが好ましい。図２３Ａは、レーザパルスの照射の７０ｎｓ後における傾斜させたＴｉでコーティングされたマイクロピペットの先端におけるキャビテーション気泡を示す。先端が細胞膜に接触すると、その相互作用が気泡の膨張を抑制するので、気泡サイズの劇的な減少が観測された。この場合、７０ｎｓで、気泡が、先端の縁から最大４００ｎｍの半径にまで成長し、レーザパルスの印加後２００ｎｍ以内に完全に崩壊する（図２３Ａ及び図２３Ｂ）。染色細胞の生存率（図２３Ｃ）によって証明されているように、ブレードの先端は、セル内には決して入っていかず、細胞内構造の完全性が保たれて、迅速で修復可能なように細孔が再び閉じるのに有用となる。細胞生存率を、レーザパルス印加の９０分後におけるＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）排他的染色によって決定した。こうした条件下において、レーザパルス及び破裂のみの場合（１８０ｍＪ／ｃｍ２の最適フルーエンス）、また、ＨｅＬａ細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞内への緩衝剤注入と組み合わせた場合において、＞９０％の細胞生存率が得られた。光熱ブレードで処理された細胞を２４時間にわたってモニタリングしたが、細胞は生きたままで、通常通りに成長及び分裂を続けた。
【０１７２】
［光熱ナノブレードによる生体分子及び細菌の送達］
多様な種類の細胞に対して光熱ナノブレードを用いて送達されるカーゴのサイズを調べた。ＧＦＰ発現ＲＮＡが、リポフェクタミン耐性ＩＭＲ９０一次ヒト肺線維芽細胞内に効率的に送達され、また、注入後に、ＲＯＣＫ３８抑止剤を分散させたヒト胚性幹細胞内における緑色蛍光ポリスチレンビーズ上にコーティングされたＤｓＲｅｄ含有レンチウイルスの発現にも成功した。直径２００ｎｍの蛍光ビーズが詰まらずに送達され、マイクロメートルサイズのバクテリアについても同様であった。更に、最も大きくて脆弱なカーゴとして細胞内細菌の送達についてこの方法で試した（図２５）。バークホルデリア・タイランデンシスは、略０．７μｍ×２μｍのロッド状の細菌である。注入効率を決定するため、ＧＦＰ標識細菌を、略５×１０８／ｍＬの濃度（従来のマイクロインジェクション（非特許文献）よりも２桁高い濃度）で緩衝剤中に懸濁させた。細胞内に送達される液体体積は略１ｐＬに制限されるので、高いカーゴ濃度は、高い送達効率を達成するのに非常に重要である。高濃度にしないと、１回の注入で１個の細菌が放出される確率が低くなる。本実験では、レーザパルス照射及び細胞開口において、１〜５ｐＬの細菌溶液がピペットから放出されて、略１個の細菌／１回の注入の平均に対応している。ピペットの先端は細胞膜に軽く接触して、切断後においてピペットのボアが細胞で完全には密封されていなかったので、放出された溶液の全てが細胞内に送達された訳ではない。この条件下における複数回の別個の実験から、４６％の平均送達効率が得られた。
【０１７３】
更に、バークホルデリア・タイランデンシスを有する細胞を２時間培養することによって、ＨｅＬａ細胞内への自然細胞感染効率を調べた。光熱注入による送達効率は、０．８％のバークホルデリア・タイランデンシスの自然ＨｅＬａ細胞感染率よりも２桁高い。重要なのは、細菌増殖及びアクチン重合（非特許文献７１）によって確かめられるように、移植から２４時間後の注入細胞において、細菌が生き残って、ガラスピペット内部での気泡サイクル中の破壊及び大型ボアの先端開口による注入中のせん断から保護されたことである（図２５Ｃ）。
【０１７４】
［光熱ナノブレードの信頼性評価］
ロバストな動作のためには、金属薄膜が、高温、衝撃波からの過度な圧力、キャビテーション気泡によって生じる高速流に耐えられることが望ましい。Ｔｉが、金等の他の不活性金属と比較して、その高い融点及びガラス基板に対する強い接着性のため、コーティング物質として選択された（非特許文献７２）。本発明者の実験では、金でコーティングされたマイクロピペットが、数回のレーザパルス印加後に、薄膜の損傷のために壊れた。Ｔｉでコーティングされたマイクロピペットは、少なくとも５０回のレーザパルス及び気泡破裂サイクルに対して機能を保ったままであることが確かめられた。
【０１７５】
［結論］
本実施例で説明される光熱ナノブレードは、現状では送達不能な大型カーゴ（現状の送達方法のサイズ制限を超えている染色体、細胞小器官、細胞内病原体等）を哺乳類細胞内に送達する可能性を有する。光熱ナノブレードの追加的な利点はその使い易さである。膜切断がレーザパルスのエネルギー及びＴｉコーティングの構成によって制御させるので、ユーザは、送達を行うためにマイクロピペットの先端を細胞膜に優しく接触させて配置するだけでよい。対照的に、従来のガラスマイクロキャピラリマイクロインジェクションでは、送達効率及び細胞生存率が、ガラスニードルを細胞内に挿入する仕方（例えば、速度、力、角度）に大きく左右される。結果として、従来の方法は、ユーザが熟練するのにかなりの訓練及び経験を要する。また、光熱ナノブレードを用いると、マイクロピペットを細胞に貫通させてまた細胞から抜くための高速“ジグザグ”運動が必要でなくなるので、脆弱なマイクロピペットの先端が壊れる確率が減る。光熱ナノブレードは、今回の実演では、特定の表面プラズモン共鳴モードで動作しているものではない。励起レーザ波長に整合するための金属ナノ構造の更なる最適化は、キャビテーション気泡を励起するための閾値レーザエネルギーを低下させ得る。
【０１７６】
本願で説明される実施例及び実施形態は例示的なものであり、そこから多様な修正や変更が当業者には想定されるものであり、それらは本願の精神及び範囲並びに添付の特許請求の範囲内に含まれるものである。本願で引用される全ての文献は、あらゆる目的のためその全体が参照として本願に組み込まれるものである。
【図２】
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【図３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１９】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｄ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【国際調査報告】
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