(57)【要約】本発明は、生産物阻害が低減したバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチド、バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドを含む組成物、たとえばセルラーゼ組成物に関する。バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドおよび関連組成物は、多様な農業および工業用途に使用できる。本発明はさらに、バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドをコードする核酸、およびバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドを組換え発現する宿主細胞に関する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基準セロビオヒドロラーゼＩ（“ＣＢＨ  Ｉ”）触媒ドメインと比較してバリアントＣＢＨ  Ｉ触媒ドメインを含むポリペプチドであって、
（ａ）トリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)ＣＢＨ  ＩのＲ２６８に対応するアミノ酸位置における置換（“Ｒ２６８置換”）；
（ｂ）トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  ＩのＲ４１１に対応するアミノ酸位置における置換（“Ｒ４１１置換”）；または
（ｃ）Ｒ２６８置換とＲ４１１置換の両方
を含み、
その際、置換（ａ）、（ｂ）または（ｃ）が基準ＣＢＨ  Ｉ触媒ドメインと比較して生産物阻害を低減させるポリペプチド。
【請求項２】
Ｒ２６８置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
Ｒ２６８置換基がリジンである、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
Ｒ２６８置換基がアラニンである、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
Ｒ４１１置換を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
Ｒ４１１置換基がリジンである、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
Ｒ４１１置換基がアラニンである、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項８】
バリアントＣＢＨ  Ｉ触媒ドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸１８−４４４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
バリアントＣＢＨ  Ｉ触媒ドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸１８−４４４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
Ｒ２６８および／またはＲ４１１置換以外は、バリアントＣＢＨ  Ｉ触媒ドメインがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸１８−４４４の配列を含む、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
バリアントＣＢＨ  Ｉ触媒ドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のタンパク質と比較して下記のアミノ酸置換またはアミノ酸置換対のうちの１つを含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド：
（ａ）Ｒ２６８ＫおよびＲ４１１Ｋ；
（ｂ）Ｒ２６８ＫおよびＲ４１１Ａ；
（ｃ）Ｒ２６８ＡおよびＲ４１１Ｋ；
（ｄ）Ｒ２６８ＡおよびＲ４１１Ａ；
（ｅ）Ｒ２６８Ａ；
（ｆ）Ｒ２６８Ｋ；
（ｇ）Ｒ４１１Ａ；ならびに
（ｈ）Ｒ４１１Ｋ。
【請求項１２】
バリアントＣＢＨ  Ｉ触媒ドメインがＲ２６８Ａ置換を含まない、請求項８〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
そのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９９を含まない、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
そのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９９からなるものではない、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
バリアントＣＢＨ  Ｉ触媒ドメインがＲ４１１Ａ置換を含まない、請求項８〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
そのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３００を含まない、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
そのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３００からなるものではない、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置１８−４４４に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のタンパク質と比較してＲ２６８Ｋ置換およびＲ４１１Ａ置換を有するポリペプチド。
【請求項１９】
そのアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置１８−４４４に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
バリアントＣＢＨ  Ｉ触媒ドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸２６−４５５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
バリアントＣＢＨ  Ｉ触媒ドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸２６−４５５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
Ｒ２６８および／またはＲ４１１置換以外は、バリアントＣＢＨ  Ｉ触媒ドメインがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸２６−４５５の配列を含む、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
バリアントＣＢＨ  Ｉ触媒ドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のタンパク質と比較して下記のアミノ酸置換またはアミノ酸置換対のうちの１つを含む、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のポリペプチド：
（ａ）Ｒ２７３ＫおよびＲ４２２Ｋ；
（ｂ）Ｒ２７３ＫおよびＲ４２２Ａ；
（ｃ）Ｒ２７３ＡおよびＲ４２２Ｋ；
（ｄ）Ｒ２７３ＡおよびＲ４２２Ａ；
（ｅ）Ｒ２７３Ａ；
（ｆ）Ｒ２７３Ｋ；
（ｇ）Ｒ４２２Ａ；ならびに
（ｈ）Ｒ４２２Ｋ。
【請求項２４】
バリアントＣＢＨ  Ｉ触媒ドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のタンパク質と比較してアミノ酸置換Ｒ２７３ＫおよびＲ４２２Ｋを含む、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
バリアントＣＢＨ  Ｉ触媒ドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のタンパク質と比較してＲ２７３ＫおよびＲ４２２Ｋの両方の置換を含まない、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
そのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０２を含まない、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
そのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０２からなるものではない、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
バリアントＣＢＨ  Ｉ触媒ドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜１４９のいずれかの触媒ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
バリアントＣＢＨ  Ｉ触媒ドメインがセルロース結合ドメインに作動可能に連結されている、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
触媒ドメインがリンカーを介してセルロース結合ドメインに作動可能に連結されている、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
セルロース結合ドメインが触媒ドメインに対してＣ−末端側にある、請求項２９または請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
セルロース結合ドメインが触媒ドメインに対してＮ−末端側にある、請求項２９または請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
成熟ポリペプチドである、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
シグナル配列をさらに含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
該ポリペプチドに対して、セロビオースが、前記Ｒ２６８置換および／またはＲ４１１置換を含まない基準ＣＢＨ  ＩのＩＣ５０の少なくとも２倍のＩＣ５０を有する、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
そのＣＢＨ  Ｉ活性が、Ｒ２６８置換および／またはＲ４１１置換を含まない基準ＣＢＨ  ＩのＣＢＨ  Ｉ活性の少なくとも５０％である、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項３８】
前記ポリペプチドが前記組成物中の全ポリペプチドの少なくとも１％に相当する、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ポリペプチドが前記組成物中の全ポリペプチドの少なくとも５％に相当する、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ポリペプチドが前記組成物中の全ポリペプチドの少なくとも２５％に相当する、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
全セルラーゼである、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４２】
全セルラーゼが、前記ポリペプチドを組換え発現する宿主細胞により産生される、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
糸状菌の全セルラーゼである、請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４４】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む発酵ブロス。
【請求項４５】
糸状菌発酵ブロスである、請求項４４に記載の発酵ブロス。
【請求項４６】
無細胞発酵ブロスである、請求項４４または請求項４５に記載の発酵ブロス。
【請求項４７】
請求項３７〜４３のいずれか１項に記載の組成物または請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の発酵ブロスでバイオマスを処理することを含む、バイオマスを糖化するための方法。
【請求項４８】
単糖類を回収することをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
エタノールを製造するための方法であって、
（ａ）請求項３７〜４３のいずれか１項に記載の組成物または請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の発酵ブロスでバイオマスを処理し、これにより単糖類を製造すること；および
（ｂ）段階（ａ）で産生した単糖類の存在下に発酵条件下で発酵微生物を培養し、これによりエタノールを製造すること
を含む方法。
【請求項５０】
段階（ａ）の前に、バイオマスを前処理することをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記発酵微生物が細菌または酵母である、請求項４９または請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記発酵微生物が、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)、大腸菌(Escherichia coli)およびクレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)から選択される細菌である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記発酵微生物が、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・ウバルム(Saccharomyces uvarum)、クルイベロミセス・フラギリス(Kluyveromyces fragilis)、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、カンジダ・プソイドトロピカリス(Candida pseudotropicalis)およびパチソレン・タンノフィルス(Pachysolen tannophilus)から選択される酵母である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記バイオマスが、トウモロコシ葉茎、バガス、モロコシ、ヨシタケ、チカラシバ、ススキ、スギ、麦わら、スイッチグラス、硬材パルプ、軟材パルプ、粉砕サトウキビ、ワセオバナ、またはネピアグラスである、請求項４９〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項５６】
請求項５５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項５７】
複製起点をさらに含む、請求項５６に記載のベクター。
【請求項５８】
ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列をさらに含む、請求項５６または請求項５７に記載のベクター。
【請求項５９】
プロモーター配列が酵母において作動可能である、請求項５８に記載のベクター。
【請求項６０】
プロモーター配列が糸状菌において作動可能である、請求項５８に記載のベクター。
【請求項６１】
請求項５５に記載の核酸を発現するように操作された組換え細胞。
【請求項６２】
真核細胞である、請求項６１に記載の組換え細胞。
【請求項６３】
糸状菌細胞である、請求項６２に記載の組換え細胞。
【請求項６４】
糸状菌細胞が、アスペルギルス属(Aspergillus)、ペニシリウム属(Penicillium)、リゾプス属(Rhizopus)、クリソスポリウム属(Chrysosporium)、ミセリオフトラ属(Myceliophthora)、トリコデルマ属(Trichoderma)、ヒューミコラ属(Humicola)、アクレモニウム属(Acremonium)、またはフザリウム属(Fusarium)のものである、請求項６３に記載の組換え細胞。
【請求項６５】
糸状菌細胞が、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、ペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)、ミセリオフトラ・テルモフィラ(Myceliophthora thermophila)またはリゾプス・オリゼ(Rhizopus oryzae)種のものである、請求項６３に記載の組換え細胞。
【請求項６６】
酵母細胞である、請求項６２に記載の組換え細胞。
【請求項６７】
サッカロミセス属(Saccharomyces)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、カンジダ属(Candida)、ピチア属(Pichia)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、クロッケラ属(Klockera)、シュワニオミセス属(Schwanniomyces)、またはヤロウィア属(Yarrowia)の酵母細胞である、請求項６６に記載の組換え細胞。
【請求項６８】
酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエ(S. cerevisiae)、サッカロミセス・ブルデリ(S. bulderi)、サッカロミセス・バルネッティ(S. barnetti)、サッカロミセス・エクシグウス(S. exiguus)、サッカロミセス・ウバルム(S. uvarum)、サッカロミセス・ディアスタティクス(S. diastaticus)、クルイベロミセス・ラクティス(K. lactis)、クルイベロミセス・マルキシアヌス(K. marxianus)、またはクルイベロミセス・フラギリス(K. fragilis)種のものである、請求項６７に記載の組換え細胞。
【請求項６９】
サッカロミセス・セレビシエ(S. cerevisiae)細胞である、請求項６８に記載の組換え細胞。
【請求項７０】
請求項５６〜６０のいずれか１項に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項７１】
原核細胞である、請求項７０に記載の宿主細胞。
【請求項７２】
細菌細胞である、請求項７１に記載の宿主細胞。
【請求項７３】
真核細胞である、請求項７０に記載の宿主細胞。
【請求項７４】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載のポリペプチドを製造する方法であって、前記ポリペプチドを発現するように操作された組換え細胞を、そのポリペプチドを発現する条件下で培養することを含む方法。
【請求項７５】
ポリペプチドがシグナル配列を含み、そのポリペプチドが組換え細胞から分泌される条件下で組換え細胞を培養する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
そのポリペプチドを細胞培養物から回収することをさらに含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
ポリペプチドを回収することが、細胞および／または細胞屑を遠心除去する段階を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
ポリペプチドを回収することが、細胞および／または細胞屑を濾去する段階を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
生産物耐容性バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドを作成するための方法であって、
（ａ）ＣＢＨ  Ｉコード核酸のヌクレオチド配列を、該核酸がバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドをコードするように修飾すること、その際、前記バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは下記のものを含む：
（ｉ）Ｒ２６８置換；
（ｉｉ）Ｒ４１１置換；または
（ｉｉｉ）Ｒ２６８置換とＲ４１１置換の両方；および
（ｂ）前記バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドを発現させること
を含み、これにより生産物耐容性バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドを作成する方法。
【請求項８０】
生産物耐容性バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドをコードする核酸を作成するための方法であって、ＣＢＨ  Ｉコード核酸のヌクレオチド配列を、該核酸がバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドをコードするように修飾することを含み、その際、前記バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは下記のものを含み：
（ｉ）Ｒ２６８置換；
（ｉｉ）Ｒ４１１置換；または
（ｉｉｉ）Ｒ２６８置換とＲ４１１置換の両方；
これにより生産物耐容性バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドをコードする核酸を作成する方法。
【請求項８１】
修飾が部位特異的変異誘発によるものである、請求項７９または請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
バリアントＣＢＨ  ＩポリペプチドがＲ２６８置換を含む、請求項７９〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
Ｒ２６８置換基がリジンである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
Ｒ２６８置換基がアラニンである、請求項２に記載の方法。
【請求項８５】
Ｒ４１１置換を含む、請求項７９〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
Ｒ４１１置換基がリジンである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
Ｒ４１１置換基がアラニンである、請求項８５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1.関連出願の引照
[0001]  本出願は、35 U.S.C. § 119(e)のもとで、2010年10月6日に出願されたU.S. Provisional Application no. 61/390,392の利益を主張し、その内容を全体として本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
2.背景
[0002]  セルロースは、β（１→４）−グリコシド結合により連結されたグルコースの非分枝ポリマーである。セルロース鎖は互いに水素結合形成により相互作用して、機械的強度および化学的安定性の高い結晶質固体を形成することができる。セルロース鎖は、グルコースおよび短いオリゴ糖に脱重合され、その後、エタノール製造に用いられる発酵微生物などの生物がそれらを代謝燃料として利用できる。セルラーゼ酵素は、バイオマス中のセルロースを加水分解（β−１，４−Ｄ−グルカン結合を加水分解）してグルコース、セロビオース、および他のセロオリゴ糖などの生産物にするのを触媒する。セルラーゼは、多数の植物および微生物が産生しうるエキソ作用性のセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）類、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）類、およびβ−グルコシダーゼ（ＢＧ）類を含む多酵素混合物を表わす一般名である。トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)のセルラーゼ中の酵素には、ＣＢＨ  Ｉ（より一般的には、Ｃｅｌ７Ａ）、ＣＢＨ２（Ｃｅｌ６Ａ）、ＥＧ１（Ｃｅｌ７Ｂ）、ＥＧ２（Ｃｅｌ５）、ＥＧ３（Ｃｅｌ１２）、ＥＧ４（Ｃｅｌ６１Ａ）、ＥＧ５（Ｃｅｌ４５Ａ）、ＥＧ６（Ｃｅｌ７４Ａ）、Ｃｉｐ１、Ｃｉｐ２、β−グルコシダーゼ（たとえば、Ｃｅｌ３Ａを含む）、アセチルキシランエステラーゼ、β−マンナナーゼ、およびスウォレニン(swollenin)が含まれる。
【０００３】
[0003]  セルラーゼ酵素類は相乗的に働き、セルロースをグルコースに加水分解する。ＣＢＨ  ＩとＣＢＨ  ＩＩはセルロース鎖の反対側末端に作用し(Barr et al., 1996, Biochemistry 35:586-92)、一方、エンドグルカナーゼ類はセルロースの内部位置に作用する。これらの酵素の一次産物はセロビオースであり、これが１つ以上のβ−グルコシダーゼによってさらに加水分解されてグルコースになる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Barr et al., 1996, Biochemistry 35:586-92
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
[0004]  セロビオヒドロラーゼは、それらの直接生産物であるセロビオースによる阻害を受けやすく、その結果、生産物が蓄積するのに伴って糖化反応の速度が低下する。セルロースを発酵性糖にするのを維持する改善された生産性を備えた、パルプおよび紙、編織物ならびに動物飼料などのセルロース材料処理の関連分野のための、新たな改善されたセロビオヒドロラーゼが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
3.概要
[0005]  本発明は、バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドに関する。自然界に存在する大部分のＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）のＲ２６８およびＲ４１１に対応する位置にアルギニンをもつ。本発明のバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは一方または両方の位置に置換を含み、その結果、生産物（たとえば、セロビオース）阻害が低減する。そのようなバリアントを、本明細書中で時に“生産物耐容性”であると表現する。
【０００７】
[0006]  本発明のバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、最低でも少なくともＣＢＨ  Ｉ触媒ドメインを含み、これは（ａ）トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  ＩのＲ２６８に対応するアミノ酸位置における置換（“Ｒ２６８置換”）；（ｂ）トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  ＩのＲ４１１に対応するアミノ酸位置における置換（“Ｒ４１１置換”）；または（ｃ）Ｒ２６８置換とＲ４１１置換の両方を含む。Ｒ２６８および／またはＲ４１１置換を導入できる代表的なＣＢＨ  Ｉポリペプチドのアミノ酸位置を表１に示し、これらの代表的なＣＢＨ  Ｉポリペプチド中のＲ２６８および／またはＲ４１１に対応するアミノ酸位置を表２に示す。
【０００８】
[0007]  Ｒ２６８および／またはＲ４１１置換は、リジンおよび／またはアラニンを含むことができる。したがって、本発明は、下記のＲ２６８および／またはＲ４１１置換のアミノ酸置換または対のうちの１つをもつＣＢＨ  Ｉ触媒ドメインを含む、バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドを提供する：（ａ）Ｒ２６８ＫおよびＲ４１１Ｋ；（ｂ）Ｒ２６８ＫおよびＲ４１１Ａ；（ｃ）Ｒ２６８ＡおよびＲ４１１Ｋ；（ｄ）Ｒ２６８ＡおよびＲ４１１Ａ；（ｅ）Ｒ２６８Ａ；（ｆ）Ｒ２６８Ｋ；（ｇ）Ｒ４１１Ａ；ならびに（ｈ）Ｒ４１１Ｋ。ただし、ある態様において、バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３００、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０１、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０２を含まないか、あるいはそれらからなることはない。
【０００９】
[0008]  本発明のバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、一般に表１に例示する基準ＣＢＨ  ＩのＣＤに対して少なくとも５０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むＣＤを含む。表１に例示するＣＢＨ  ＩポリペプチドのＣＤ部分を表３に示す。バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、表１に例示するセルロース結合部をもつことができる。表１に例示するＣＢＨ  ＩポリペプチドのＣＤ部分を表３に示す。バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、触媒ドメイン（“ＣＤ”）配列のほかに、セルロース結合ドメイン（“ＣＢＤ”）配列をもつことができる。ＣＢＤはＣＤに対してＮ−またはＣ−末端側のいずれにあってもよく、ＣＢＤとＣＤは場合によりリンカー配列を介して連結している。
【００１０】
[0009]  バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは成熟ポリペプチドであってもよく、あるいはそれらはシグナル配列をさらに含んでもよい。
[0010]  バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドの他の態様をセクション5.1.に提示する。
【００１１】
[0011]  本発明のバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、一般にセロビオースによる生産物阻害の低減を示す。特定の態様において、本発明のバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドに対するセロビオースのＩＣ５０は、バリアント中に存在するＲ２６８置換および／またはＲ４１１置換を含まない基準ＣＢＨ  Ｉに対するセロビオースのＩＣ５０の少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、または少なくとも２倍である。バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドの生産物阻害特性の他の態様をセクション5.1.に提示する。
【００１２】
[0012]  本発明のバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、一般にある程度のセロビオヒドロラーゼ活性を保持する。特定の態様において、バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、バリアント中に存在するＲ２６８置換および／またはＲ４１１置換を含まない基準ＣＢＨ  ＩのＣＢＨ  Ｉ活性の少なくとも５０％を保持する。バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドのセロビオヒドロラーゼ活性の他の態様をセクション5.1.に提示する。
【００１３】
[0013]  本発明は、バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドを含む組成物（セルラーゼ組成物、たとえば全セルラーゼ組成物、および発酵ブロスを含む）をさらに提供する。バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドを含む組成物の他の態様をセクション5.3.に提示する。バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドおよびそれらを含む組成物は、特にバイオマスを糖化するためのプロセスに使用できる。糖化反応のさらなる詳細、およびバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドの他の用途をセクション5.4.に提示する。
【００１４】
[0014]  本発明は、本明細書に記載するバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（たとえば、ベクター）、およびバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドを発現するように操作された組換え細胞をさらに提供する。組換え細胞は、原核細胞（たとえば、細菌）または真核細胞（たとえば、酵母または糸状菌）であってもよい。さらに、バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドを製造し、場合により回収する方法を提供する。バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドの発現および製造に適した組換え発現系の他の態様をセクション5.2.に提示する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
4.図面及び表の簡単な説明
【図１】[0015]  図１Ａ〜１Ｂ：４−ＭＵＬアッセイを用いた、野生型ＣＢＨ  Ｉ（ＢＤ２９５５５；図１Ａ）およびＲ２６８Ｋ／Ｒ４１１ＫバリアントＣＢＨ  Ｉ（置換Ｒ２７３Ｋ／Ｒ４２２ＫをもつＢＤ２９５５５；図１Ｂ）についてのセロビオース用量応答曲線。
【図２】[0016]  図２Ａ〜２Ｂ：バガスアッセイにおける７２時間後のグルカンの転化率％に基づく、セロビオース蓄積が野生型ＣＢＨ  ＩおよびＲ２６８Ｋ／Ｒ４１１ＫバリアントＣＢＨ  Ｉの活性に及ぼす影響。図２Ａはβ−グルコシダーゼ（ＢＧ）の存在下（＋）および非存在下（−）における相対活性を示し、その際、相対活性はＢＧ存在下の野生型活性に対して正規化されている（ＷＴ＋＝１）。図２Ｂはセロビオースに対する耐容性を、β−グルコシダーゼの非存在下−対−存在下の活性比の関数として示す（活性比＝活性−ＢＧ／活性＋ＢＧ）。
【図３】[0017]  図３：２つの野生型ＣＢＨ  Ｉポリペプチドと比較した、ＰＡＳＣアッセイを用いたＲ２６８Ｋ／Ｒ４１１ＫバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドについてのセロビオース用量応答曲線。
【図４】[0018]  図４：β−グルコシダーゼ（ＢＧ）の存在下（＋）および非存在下（−）でのバガスアッセイにおける７２時間後のグルカンの転化率％に基づく、セロビオース蓄積が野生型ＣＢＨ  ＩおよびＲ２６８Ｋ／Ｒ４１１ＫバリアントＣＢＨ  Ｉの活性に及ぼす影響。活性はＢＧ存在下の野生型活性に対して正規化されている（ＷＴ＋＝１）。
【図５】[0019]図５：バガスアッセイにおけるβ−グルコシダーゼ（ＢＧ）の非存在下および存在下での７２時間後のグルカンの転化率％に基づく、バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドのセロビオース生産物耐容性の特性分析；耐容性を、β−グルコシダーゼの非存在下−対−存在下の活性比の関数として評価する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
データベース。これらのアミノ酸配列は、タンパク質結晶化を促進する変異を含むＰＤＢデータベースからの若干の配列を除いて、大部分が野生型である。
[0021]  表２：代表的な基準ＣＢＨ  Ｉポリペプチドにおける、トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  ＩのＲ２６８およびＲ４１１に対応するアミノ酸位置。データベース識別子は表１についてのものと同様である。
【００１７】
[0022]  表３：ＣＢＨ  Ｉポリペプチドドメインのおおよそのアミノ酸位置。使用した略号：ＳＳはシグナル配列である；ＣＤは触媒ドメインである；ＣＢＤはセルロース結合ドメインである。データベース識別子は表１のものと同様である。
【００１８】
[0023]  表４：表４は、代表的な基準ＣＢＨ  Ｉポリペプチドそれぞれの触媒ドメイン内の、活性部位ループ（太字、下線文字で示す）および触媒残基（大部分のＣＢＨ  Ｉポリペプチドにおいてグルタミン酸）（太字、二重下線文字で示す）を含むセグメントを示す。データベース識別子は表１のものと同様である。
【００１９】
[0024]  表５：ＢＤ２９５５５のバリアントについてのＭＵＬおよびバガスアッセイの結果。ＮＤは測定しなかったことを意味する。±  活性％（＋／−セロビオース）＝［（セロビオース存在下の活性）／（セロビオース非存在下の活性）］*１００。\  活性％（−／＋  ＢＧ）＝［（ＢＧ非存在下の活性）／（ＢＧ存在下の活性）］*１００］。
【００２０】
[0025]  表６：トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  ＩのバリアントについてのＭＵＬおよびバガスアッセイの結果。ＮＤは測定しなかったことを意味する。±  活性％（＋／−セロビオース）＝［（セロビオース存在下の活性）／（セロビオース非存在下の活性）］*１００。\  活性％（−／＋  ＢＧ）＝［（ＢＧ非存在下の活性）／（ＢＧ存在下の活性）］*１００。
【００２１】
[0026]  表７：非公式配列リスト。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−１４９は代表的な基準ＣＢＨ  Ｉポリペプチドに対応する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９９は、Ｒ２６８Ａ置換をもつ成熟トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸２６−５２９）に対応する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３００は、Ｒ４１１Ａ置換をもつ成熟トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸２６−５２９）に対応する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０１は、Ｒ２６８Ｋ置換およびＲ４１１Ｋ置換の両方をもつ全長ＢＤ２９５５５に対応する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０２は、Ｒ２６８Ｋ置換およびＲ４１１Ｋ置換の両方をもつ成熟ＢＤ２９５５５に対応する。
は、Ｒ４１１Ａ置換をもつ成熟トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸２６−５２９）に対応する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２は、Ｒ２６８Ｋ置換およびＲ４１１Ｋ置換の両方をもつ全長ＢＤ２９５５５に対応する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３は、Ｒ２６８Ｋ置換およびＲ４１１Ｋ置換の両方をもつ成熟ＢＤ２９５５５に対応する。
【００２２】
5.詳細な説明
[0027]  本発明は、バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドに関する。自然界に存在する大部分のＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）のＲ２６８およびＲ４１１に対応する位置にアルギニンをもつ。本発明のバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは一方または両方の位置に置換を含み、その結果、生産物（たとえば、セロビオース）阻害が低減する。以下のサブセクションに、バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチド、およびそれらの代表的な製造方法、それらを含む代表的なセルラーゼ組成物、ならびにそれらのポリペプチドおよびセルラーゼ組成物の幾つかの産業用途をより詳細に記載する。
【００２３】
5.1.バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチド
[0028]  本発明は、生産物阻害を低減させる少なくとも１つのアミノ酸置換を含むバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドを提供する。“バリアント”は、アミノ酸配列中の１または多数の異なる部位の１以上のアミノ酸の置換により基準ポリペプチドと配列が異なるポリペプチドを意味する。代表的な基準ＣＢＨ  Ｉポリペプチドを表１に示す。
【００２４】
[0029]  本発明のバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、基準ＣＢＨ  Ｉポリペプチドと比較して、トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）のＲ２６８に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換（“Ｒ２６８置換”）、（ｂ）トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  ＩのＲ４１１に対応するアミノ酸位置における置換（“Ｒ４１１置換”）；または（ｃ）Ｒ２６８置換とＲ４１１置換の両方をもつ。Ｒ２６８およびＲ４１１のナンバリングは、成熟酵素には一般に存在しないシグナル配列を含む全長トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  Ｉを基準として行なうことを明記する。成熟トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  Ｉ（たとえば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を参照）における対応するナンバリングは、それぞれＲ２５１およびＲ３９４である。
【００２５】
[0030]  したがって、本発明は、トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  ＩのＲ２６８およびＲ４１１に対応するアミノ酸位置のうち少なくとも１つ、場合によりトリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  ＩのＲ２６８およびＲ４１１に対応するアミノ酸位置の両方、がアルギニンではないバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドを提供する。
【００２６】
[0031]  表１の基準ポリペプチドにおいてトリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  ＩのＲ２６８およびＲ４１１に対応するアミノ酸位置を表２に示す。他のＣＢＨ  ＩポリペプチドにおいてＲ２６８およびＲ４１１に対応するアミノ酸位置は、それらの配列を配列比較アルゴリズムを用いてトリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  Ｉと整列させることにより同定できる。比較のための最適な配列アラインメントは、たとえば下記より実施できる：Smith & Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482-89の局所相同性アルゴリズム;Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-53の相同性アラインメントアルゴリズム;Pearson & Lipman, 1988, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 85:2444-48の類似性検索法; これらのアルゴリズムのコンピューター化実施形態(GAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA：Wisconsin Genetics Software Package中, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)、または視覚判定。
【００２７】
[0032]  Ｒ２６８および／またはＲ４１１置換は、好ましくは（ａ）Ｒ２６８ＫおよびＲ４１１Ｋ；（ｂ）Ｒ２６８ＫおよびＲ４１１Ａ；（ｃ）Ｒ２６８ＡおよびＲ４１１Ｋ；（ｄ）Ｒ２６８ＡおよびＲ４１１Ａ；（ｅ）Ｒ２６８Ａ；（ｆ）Ｒ２６８Ｋ；（ｇ）Ｒ４１１Ａ；ならびに（ｈ）Ｒ４１１Ｋから選択される。
【００２８】
[0033]  ＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、グリコシルヒドロラーゼファミリー７（“ＧＨ７”）に属する。このファミリーのグリコシルヒドロラーゼ類は、エンドグルカナーゼ類およびセロビオヒドロラーゼ類（エキソグルカナーゼ類）を含む。セロビオヒドロラーゼ類はセルロース鎖の還元末端から順次作用してセロビオースを生成する。細菌および真菌に由来するセルラーゼ類は特徴的に、触媒ドメイン（“ＣＤ”）のＮまたはＣ−末端側のいずれかにリンカーペプチドを介して連結された小さなセルロース結合ドメイン（“ＣＢＤ”）をもつ(Suumakki et al., 2000, Cellulose 7: 189-209を参照)。ＣＤは活性部位を含み、一方、ＣＢＤは酵素をセルロースに結合させることによりセルロースと相互作用する(van Tilbeurgh et al., 1986, FEBS Lett. 204(2): 223-227; Tomme et al., 1988, Eur. J. Biochem. 170:575-581)。トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  Ｉの触媒ドメインの三次元構造は解明されている(Divne et al., 1994, Science 265:524-528)。ＣＤは、対面充填してβ−サンドイッチを形成した２つのβ−シートからなる。ＣＤ中の残りの大部分のアミノ酸は、β−シートを連結するループである。若干のループは伸長し、活性部位の周りで折れ曲がって、（約５０Å）のセルロース結合トンネルを形成している。これに対し、エンドグルカナーゼ類は、トンネルではなく解放された基質結合裂／溝(cleft / groove)をもつ。一般に、触媒残基はトリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  ＩのＥ２２９およびＥ２３４に対応するグルタミン酸である。
【００２９】
[0034]  基準ＣＢＨ  Ｉポリペプチドの活性部位に特徴的なループ（“活性部位ループ”）（ＧＨ７ファミリーのエンドグルカナーゼ類には存在しない）、および基準ＣＢＨ  Ｉポリペプチドの触媒グルタミン酸残基を表４に示す。本発明のバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、好ましくは触媒グルタミン酸残基を保持するか、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の場合のように、Ｅ２３４に対応する位置に代わりにグルタミンを含むことができる。ある態様において、バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、そのバリアントが由来する基準ＣＢＨ  Ｉポリペプチドと対比して、活性部位ループ内に置換を含まないか、あるいは保存的置換のみを含む。
【００３０】
[0035]  多くのＣＢＨ  ＩポリペプチドがＣＢＤをもたず、種々の基質に対するセルラーゼドメインの活性に関する大部分の研究がＣＢＨ  Ｉポリペプチドの触媒ドメインについてのみ実施されてきた。セロビオヒドロラーゼ活性をもつＣＤはパパインによる成熟ＣＢＨ  Ｉの制限タンパク質分解により生成できるので(たとえば、Chen et al., 1993, Biochem. Mol. Biol. Int. 30(5): 901-10を参照)、それらはしばしば“コア”ドメインと呼ばれる。したがって、バリアントＣＢＨ  ＩはＣＢＨ  ＩのＣＤ“コア”のみを含むことができる。代表的な基準ＣＤは、下記に対応するアミノ酸配列を含む： SEQ ID NO:1の位置26-455、SEQ ID NO:2の位置18-444、SEQ ID NO:3の位置26-455、SEQ ID NO:4の位置1-427、SEQ ID NO:5の位置24-457、SEQ ID NO:6の位置18-448、SEQ ID NO:7の位置27-460、SEQ ID NO:8の位置27-460、SEQ ID NO:9の位置20-449、SEQ ID NO:10の位置1-424、SEQ ID NO:11の位置18-447、SEQ ID NO:12の位置18-434、SEQ ID NO:13の位置18-445、SEQ ID NO:14の位置19-454、SEQ ID NO:15の位置19-443、SEQ ID NO:16の位置2-426、SEQ ID NO:17の位置23-446、SEQ ID NO:18の位置19-449、SEQ ID NO:19の位置23-446、SEQ ID NO:20の位置19-449、SEQ ID NO:21の位置2-416、SEQ ID NO:22の位置19-454、SEQ ID NO:23の位置19-447、SEQ ID NO:24の位置19-447、SEQ ID NO:25の位置20-443、SEQ ID NO:26の位置18-447、SEQ ID NO:27の位置19-442、SEQ ID NO:28の位置18-451、SEQ ID NO:29の位置23-446、SEQ ID NO:30の位置18-444、SEQ ID NO:31の位置18-451、SEQ ID NO:32の位置18-447、SEQ ID NO:33の位置19-449、SEQ ID NO:34の位置18-447、SEQ ID NO:35の位置26-459、SEQ ID NO:36の位置19-450、SEQ ID NO:37の位置19-453、SEQ ID NO:38の位置18-448、SEQ ID NO:39の位置19-443、SEQ ID NO:40の位置19-442、SEQ ID NO:41の位置18-444、SEQ ID NO:42の位置24-457、SEQ ID NO:43の位置18-449、SEQ ID NO:44の位置19-453、SEQ ID NO:45の位置26-456、SEQ ID NO:46の位置19-451、SEQ ID NO:47の位置18-443、SEQ ID NO:48の位置18-448、SEQ ID NO:49の位置19-451、SEQ ID NO:50の位置18-444、SEQ ID NO:51の位置2-419、SEQ ID NO:52の位置27-461、SEQ ID NO:53の位置21-445、SEQ ID NO:54の位置19-449、SEQ ID NO:55の位置19-448、SEQ ID NO:56の位置18-443、SEQ ID NO:57の位置20-443、SEQ ID NO:58の位置18-448、SEQ ID NO:59の位置18-447、SEQ ID NO:60の位置26-455、SEQ ID NO:61の位置19-449、SEQ ID NO:62の位置19-449、SEQ ID NO:63の位置26-460、SEQ ID NO:64の位置18-448、SEQ ID NO:65の位置19-451、SEQ ID NO:66の位置19-447、SEQ ID NO:67の位置1-424、SEQ ID NO:68の位置19-448、SEQ ID NO:69の位置19-443、SEQ ID NO:70の位置23-447、SEQ ID NO:71の位置17-448、SEQ ID NO:72の位置19-449、SEQ ID NO:73の位置18-444、SEQ ID NO:74の位置23-458、SEQ ID NO:75の位置20-452、SEQ ID NO:76の位置18-435、SEQ ID NO:77の位置18-446、SEQ ID NO:78の位置22-457、SEQ ID NO:79の位置18-448、SEQ ID NO:80の位置1-431、SEQ ID NO:81の位置19-453、SEQ ID NO:82の位置21-440、SEQ ID NO:83の位置19-442、SEQ ID NO:84の位置18-448、SEQ ID NO:85の位置17-446、SEQ ID NO:86の位置18-447、SEQ ID NO:87の位置18-443、SEQ ID NO:88の位置23-448、SEQ ID NO:89の位置18-451、SEQ ID NO:90の位置21-447、SEQ ID NO:91の位置18-444、SEQ ID NO:92の位置19-442、SEQ ID NO:93の位置20-436、SEQ ID NO:94の位置18-450、SEQ ID NO:95の位置22-453、SEQ ID NO:96の位置16-472、SEQ ID NO:97の位置21-445、SEQ ID NO:98の位置19-447、SEQ ID NO:99の位置19-450、SEQ ID NO:100の位置19-451、SEQ ID NO:101の位置18-448、SEQ ID NO:102の位置19-442、SEQ ID NO:103の位置20-457、SEQ ID NO:104の位置19-454、SEQ ID NO:105の位置18-440、SEQ ID NO:106の位置18-439、SEQ ID NO:107の位置27-460、SEQ ID NO:108の位置23-446、SEQ ID NO:109の位置17-446、SEQ ID NO:110の位置21-447、SEQ ID NO:111の位置19-447、SEQ ID NO:112の位置18-449、SEQ ID NO:113の位置22-457、SEQ ID NO:114の位置18-445、SEQ ID NO:115の位置18-448、SEQ ID NO:116の位置18-448、SEQ ID NO:117の位置23-435、SEQ ID NO:118の位置21-442、SEQ ID NO:119の位置23-435、SEQ ID NO:120の位置20-445、SEQ ID NO:121の位置21-443、SEQ ID NO:122の位置20-445、SEQ ID NO:123の位置23-443、SEQ ID NO:124の位置20-445、SEQ ID NO:125の位置21-435、SEQ ID NO:126の位置20-437、SEQ ID NO:127の位置21-442、SEQ ID NO:128の位置23-434、SEQ ID NO:129の位置20-444、SEQ ID NO:130の位置21-435、SEQ ID NO:131の位置20-445、SEQ ID NO:132の位置21-446、SEQ ID NO:133の位置21-435、SEQ ID NO:134の位置22-448、SEQ ID NO:135の位置23-433、SEQ ID NO:136の位置23-434、SEQ ID NO:137の位置23-435、SEQ ID NO:138の位置23-435、SEQ ID NO:139の位置20-445、SEQ ID NO:140の位置20-437、SEQ ID NO:141の位置21-435、SEQ ID NO:142の位置20-437、SEQ ID NO:143の位置21-435、SEQ ID NO:144の位置26-435、SEQ ID NO:145の位置23-435、SEQ ID NO:146の位置24-443、SEQ ID NO:147の位置20-445、SEQ ID NO:148の位置21-441、およびSEQ ID NO:149の位置20-437。
【００３１】
[0036]  ＣＢＤは特に結晶性セルロースの加水分解に関与する。ＣＢＤが存在しない場合はセロビオヒドロラーゼが結晶性セルロースを分解する能力は低下することが示されている(Linder and Teeri, 1997, Journal of Biotechnol. 57:15-28)。本発明のバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、ＣＢＤをさらに含むことができる。代表的なＣＢＤは、下記に対応するアミノ酸配列を含む：SEQ ID NO:1の位置494-529、SEQ ID NO:2の位置480-514、SEQ ID NO:3の位置494-529、SEQ ID NO:5の位置491-526、SEQ ID NO:6の位置477-512、SEQ ID NO:7の位置497-532、SEQ ID NO:8の位置504-539、SEQ ID NO:13の位置486-521、SEQ ID NO:15の位置556-596、SEQ ID NO:18の位置490-525、SEQ ID NO:20の位置495-530、SEQ ID NO:23の位置471-506、SEQ ID NO:27の位置481-516、SEQ ID NO:30の位置480-514、SEQ ID NO:35の位置495-529、SEQ ID NO:36の位置493-528、SEQ ID NO:38の位置477-512、SEQ ID NO:39の位置547-586、SEQ ID NO:40の位置475-510、SEQ ID NO:41の位置479-513、SEQ ID NO:42の位置506-541、SEQ ID NO:43の位置481-516、SEQ ID NO:45の位置503-537、SEQ ID NO:46の位置488-523、SEQ ID NO:48の位置476-511、SEQ ID NO:49の位置488-523、SEQ ID NO:50の位置479-513、SEQ ID NO:52の位置500-535、SEQ ID NO:55の位置493-528、SEQ ID NO:58の位置479-514、SEQ ID NO:60の位置494-529、SEQ ID NO:61の位置490-525、SEQ ID NO:62の位置497-532、SEQ ID NO:64の位置475-510、SEQ ID NO:65の位置477-512、SEQ ID NO:66の位置486-521、SEQ ID NO:67の位置470-505、SEQ ID NO:68の位置491-526、SEQ ID NO:69の位置476-511、SEQ ID NO:73の位置480-514、SEQ ID NO:74の位置506-540、SEQ ID NO:76の位置471-504、SEQ ID NO:78の位置501-536、SEQ ID NO:79の位置473-508、SEQ ID NO:83の位置481-516、SEQ ID NO:86の位置488-523、SEQ ID NO:92の位置475-510、SEQ ID NO:93の位置468-504、SEQ ID NO:96の位置501-536、SEQ ID NO:98の位置482-517、SEQ ID NO:99の位置481-516、SEQ ID NO:100の位置488-523、SEQ ID NO:101の位置472-507、SEQ ID NO:102の位置481-516、SEQ ID NO:105の位置471-505、SEQ ID NO:106の位置481-516、SEQ ID NO:107の位置495-530、SEQ ID NO:111の位置488-523、SEQ ID NO:112の位置478-513、SEQ ID NO:113の位置501-536、SEQ ID NO:115の位置491-526、およびSEQ ID NO:116の位置503-538。
【００３２】
[0037]  ＣＤとＣＢＤはしばしばリンカーを介して連結している。代表的なリンカー配列は、下記に対応する：SEQ ID NO:1の位置456-493、SEQ ID NO:2の位置445-479、SEQ ID NO:3の位置456-493、SEQ ID NO:5の位置458-490、SEQ ID NO:6の位置449-476、SEQ ID NO:7の位置461-496、SEQ ID NO:8の位置461-503、SEQ ID NO:13の位置446-485、SEQ ID NO:15の位置444-555、SEQ ID NO:18の位置450-489、SEQ ID NO:20の位置450-494、SEQ ID NO:23の位置448-470、SEQ ID NO:27の位置443-480、SEQ ID NO:30の位置445-479、SEQ ID NO:35の位置460-494、SEQ ID NO:36の位置451-492、SEQ ID NO:38の位置449-476、SEQ ID NO:39の位置444-546、SEQ ID NO:40の位置443-474、SEQ ID NO:41の位置445-478、SEQ ID NO:42の位置458-505、SEQ ID NO:43の位置450-480、SEQ ID NO:45の位置457-502、SEQ ID NO:46の位置452-487、SEQ ID NO:48の位置449-475、SEQ ID NO:49の位置452-487、SEQ ID NO:50の位置445-478、SEQ ID NO:52の位置462-499、SEQ ID NO:55の位置449-492、SEQ ID NO:58の位置449-478、SEQ ID NO:60の位置456-493、SEQ ID NO:61の位置450-489、SEQ ID NO:62の位置450-496、SEQ ID NO:64の位置449-474、SEQ ID NO:65の位置452-476、SEQ ID NO:66の位置448-485、SEQ ID NO:67の位置425-469、SEQ ID NO:68の位置449-490、SEQ ID NO:69の位置444-475、SEQ ID NO:73の位置445-479、SEQ ID NO:74の位置459-505、SEQ ID NO:76の位置436-470、SEQ ID NO:78の位置458-500、SEQ ID NO:79の位置449-472、SEQ ID NO:83の位置443-480、SEQ ID NO:86の位置448-487、SEQ ID NO:92の位置443-474、SEQ ID NO:93の位置437-467、SEQ ID NO:96の位置473-500、SEQ ID NO:98の位置448-481、SEQ ID NO:99の位置451-480、SEQ ID NO:100の位置452-487、SEQ ID NO:101の位置449-471、SEQ ID NO:102の位置443-480、SEQ ID NO:105の位置441-470、SEQ ID NO:106の位置440-480、SEQ ID NO:107の位置461-494、SEQ ID NO:111の位置448-487、SEQ ID NO:112の位置450-478、SEQ ID NO:113の位置458-500、SEQ ID NO:115の位置449-490、およびSEQ ID NO:116の位置449-502。
【００３３】
[0038]  ＣＢＨ  Ｉポリペプチドはモジュール状(modular)であるので、異なるＣＢＨ  Ｉポリペプチド、たとえば表１の代表的なＣＢＨ  ＩポリペプチドのＣＢＤ、ＣＤおよびリンカーは互換的に使用できる。しかし、好ましい態様において、本発明のバリアントＣＢＨ  ＩのＣＢＤ、ＣＤおよびリンカーは同じポリペプチドに由来する。
【００３４】
[0039]  本発明のバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、好ましくは生産物阻害が少なくとも２倍低減しており、したがってセロビオースは、バリアントＣＢＨ  Ｉに対して、対応する基準ＣＢＨ  Ｉ、たとえばＲ２６８置換および／またはＲ４１１置換を含まないＣＢＨ  ＩのＩＣ５０の少なくとも２倍のＩＣ５０をもつ。より好ましくは、バリアントＣＢＨ  Ｉに対するセロビオースのＩＣ５０は、対応する基準ＣＢＨ  ＩのＩＣ５０の少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍、または少なくとも１５倍である。具体的な態様において、バリアントＣＢＨ  Ｉに対するセロビオースのＩＣ５０は、対応する基準ＣＢＨ  ＩのＩＣ５０の２倍から１５倍まで、２倍から１０倍まで、３倍から１０倍まで、５倍から１２倍まで、４倍から１２倍まで、５倍から１０倍まで、５倍から１２倍まで、２倍から８倍まで、または８倍から２０倍までの範囲である。ＩＣ５０は、後記の実施例に例示するように、リン酸膨潤セルロース(phosphoric acid swollen cellulose)（“ＰＡＳＣ”）アッセイ(Du et al., 2010, Applied Biochemistry and Biotechnology 161:313-317)またはメチルウンベリフェリルラクトシド（“ＭＵＬ”）アッセイ(van Tilbeurgh and Claeyssens, 1985, FEBS Letts. 187(2):283-288)で決定できる。
【００３５】
[0040]  本発明のバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、好ましくは対応する基準ＣＢＨ  Ｉ、たとえば２６８置換および／またはＲ４１１置換を含まないＣＢＨ  Ｉのセロビオヒドロラーゼ活性の少なくとも３０％であるセロビオヒドロラーゼ活性をもつ。より好ましくは、バリアントＣＢＨ  Ｉのセロビオヒドロラーゼ活性は、対応する基準ＣＢＨ  Ｉのセロビオヒドロラーゼ活性の少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％である。具体的な態様において、バリアントＣＢＨ  ＩのＩＣ５０セロビオヒドロラーゼ活性は、対応する基準ＣＢＨ  Ｉのセロビオヒドロラーゼ活性の３０％から８０％まで、４０％から７０％まで、３０％から６０％まで、５０％から８０％まで、または６０％から８０％までの範囲である。セロビオヒドロラーゼ活性のアッセイは、たとえばBecker et al., 2011, Biochem J. 356:19-30、およびMitsuishi et al., 1990, FEBS Letts. 275:135-138に記載されており、そのそれぞれを明示的に本明細書に援用する。単離された可溶性および不溶性の基質を加水分解するＣＢＨ  Ｉの能力も、Srisodsuk et al., 1997, J. Biotech. 57:4957、およびNidetzky and Claeyssens, 1994, Biotech. Bioeng. 44:961-966に記載されるアッセイを用いて測定できる。セロビオヒドロラーゼ活性をアッセイするのに有用な基質には、結晶性セルロース、濾紙、リン酸膨潤セルロース、セロオリゴ糖、メチルウンベリフェリルラクトシド、メチルウンベリフェリルセロビオシド、オルトニトロフェニルラクトシド、パラニトロフェニルラクトシド、オルトニトロフェニルセロビオシド、パラニトロフェニルセロビオシドが含まれる。セロビオヒドロラーゼ活性は、基質としてのＰＡＳＣおよびカルコフロールホワイト検出法を用いるアッセイで測定できる(Du et al., 2010, Applied Biochemistry and Biotechnology 161:313-317)。ＰＡＳＣは、Walseth, 1952, TAPPI 35:228-235 およびWood, 1971, Biochem. J. 121:353-362に記載されているように調製できる。
【００３６】
[0041]  前記のＲ２６８および／またはＲ４１１置換のほかに、本発明のバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、好ましくは：
・表１に例示する基準ＣＢＨ  ＩのＣＤ（すなわち下記に対応するアミノ酸配列を含むＣＤ）に対して少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれ以上の、または完全な(100%)配列同一性をもつアミノ酸配列を含む：SEQ ID NO:1の位置26-455、SEQ ID NO:2の位置18-444、SEQ ID NO:3の位置26-455、SEQ ID NO:4の位置1-427、SEQ ID NO:5の位置24-457、SEQ ID NO:6の位置18-448、SEQ ID NO:7の位置27-460、SEQ ID NO:8の位置27-460、SEQ ID NO:9の位置20-449、SEQ ID NO:10の位置1-424、SEQ ID NO:11の位置18-447、SEQ ID NO:12の位置18-434、SEQ ID NO:13の位置18-445、SEQ ID NO:14の位置19-454、SEQ ID NO:15の位置19-443、SEQ ID NO:16の位置2-426、SEQ ID NO:17の位置23-446、SEQ ID NO:18の位置19-449、SEQ ID NO:19の位置23-446、SEQ ID NO:20の位置19-449、SEQ ID NO:21の位置2-416、SEQ ID NO:22の位置19-454、SEQ ID NO:23の位置19-447、SEQ ID NO:24の位置19-447、SEQ ID NO:25の位置20-443、SEQ ID NO:26の位置18-447、SEQ ID NO:27の位置19-442、SEQ ID NO:28の位置18-451、SEQ ID NO:29の位置23-446、SEQ ID NO:30の位置18-444、SEQ ID NO:31の位置18-451、SEQ ID NO:32の位置18-447、SEQ ID NO:33の位置19-449、SEQ ID NO:34の位置18-447、SEQ ID NO:35の位置26-459、SEQ ID NO:36の位置19-450、SEQ ID NO:37の位置19-453、SEQ ID NO:38の位置18-448、SEQ ID NO:39の位置19-443、SEQ ID NO:40の位置19-442、SEQ ID NO:41の位置18-444、SEQ ID NO:42の位置24-457、SEQ ID NO:43の位置18-449、SEQ ID NO:44の位置19-453、SEQ ID NO:45の位置26-456、SEQ ID NO:46の位置19-451、SEQ ID NO:47の位置18-443、SEQ ID NO:48の位置18-448、SEQ ID NO:49の位置19-451、SEQ ID NO:50の位置18-444、SEQ ID NO:51の位置2-419、SEQ ID NO:52の位置27-461、SEQ ID NO:53の位置21-445、SEQ ID NO:54の位置19-449、SEQ ID NO:55の位置19-448、SEQ ID NO:56の位置18-443、SEQ ID NO:57の位置20-443、SEQ ID NO:58の位置18-448、SEQ ID NO:59の位置18-447、SEQ ID NO:60の位置26-455、SEQ ID NO:61の位置19-449、SEQ ID NO:62の位置19-449、SEQ ID NO:63の位置26-460、SEQ ID NO:64の位置18-448、SEQ ID NO:65の位置19-451、SEQ ID NO:66の位置19-447、SEQ ID NO:67の位置1-424、SEQ ID NO:68の位置19-448、SEQ ID NO:69の位置19-443、SEQ ID NO:70の位置23-447、SEQ ID NO:71の位置17-448、SEQ ID NO:72の位置19-449、SEQ ID NO:73の位置18-444、SEQ ID NO:74の位置23-458、SEQ ID NO:75の位置20-452、SEQ ID NO:76の位置18-435、SEQ ID NO:77の位置18-446、SEQ ID NO:78の位置22-457、SEQ ID NO:79の位置18-448、SEQ ID NO:80の位置1-431、SEQ ID NO:81の位置19-453、SEQ ID NO:82の位置21-440、SEQ ID NO:83の位置19-442、SEQ ID NO:84の位置18-448、SEQ ID NO:85の位置17-446、SEQ ID NO:86の位置18-447、SEQ ID NO:87の位置18-443、SEQ ID NO:88の位置23-448、SEQ ID NO:89の位置18-451、SEQ ID NO:90の位置21-447、SEQ ID NO:91の位置18-444、SEQ ID NO:92の位置19-442、SEQ ID NO:93の位置20-436、SEQ ID NO:94の位置18-450、SEQ ID NO:95の位置22-453、SEQ ID NO:96の位置16-472、SEQ ID NO:97の位置21-445、SEQ ID NO:98の位置19-447、SEQ ID NO:99の位置19-450、SEQ ID NO:100の位置19-451、SEQ ID NO:101の位置18-448、SEQ ID NO:102の位置19-442、SEQ ID NO:103の位置20-457、SEQ ID NO:104の位置19-454、SEQ ID NO:105の位置18-440、SEQ ID NO:106の位置18-439、SEQ ID NO:107の位置27-460、SEQ ID NO:108の位置23-446、SEQ ID NO:109の位置17-446、SEQ ID NO:110の位置21-447、SEQ ID NO:111の位置19-447、SEQ ID NO:112の位置18-449、SEQ ID NO:113の位置22-457、SEQ ID NO:114の位置18-445、SEQ ID NO:115の位置18-448、SEQ ID NO:116の位置18-448、SEQ ID NO:117の位置23-435、SEQ ID NO:118の位置21-442、SEQ ID NO:119の位置23-435、SEQ ID NO:120の位置20-445、SEQ ID NO:121の位置21-443、SEQ ID NO:122の位置20-445、SEQ ID NO:123の位置23-443、SEQ ID NO:124の位置20-445、SEQ ID NO:125の位置21-435、SEQ ID NO:126の位置20-437、SEQ ID NO:127の位置21-442、SEQ ID NO:128の位置23-434、SEQ ID NO:129の位置20-444、SEQ ID NO:130の位置21-435、SEQ ID NO:131の位置20-445、SEQ ID NO:132の位置21-446、SEQ ID NO:133の位置21-435、SEQ ID NO:134の位置22-448、SEQ ID NO:135の位置23-433、SEQ ID NO:136の位置23-434、SEQ ID NO:137の位置23-435、SEQ ID NO:138の位置23-435、SEQ ID NO:139の位置20-445、SEQ ID NO:140の位置20-437、SEQ ID NO:141の位置21-435、SEQ ID NO:142の位置20-437、SEQ ID NO:143の位置21-435、SEQ ID NO:144の位置26-435、SEQ ID NO:145の位置23-435、SEQ ID NO:146の位置24-443、SEQ ID NO:147の位置20-445、SEQ ID NO:148の位置21-441、およびSEQ ID NO:149の位置20-437(好ましくは、SEQ ID NO:1の位置26-455またはSEQ ID NO:2の18-444に対応するＣＤ）;ならびに／あるいは
・表１に例示する基準ＣＢＨ  Ｉの成熟ポリペプチド（すなわち下記に対応するアミノ酸配列を含む成熟タンパク質）に対して少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれ以上の、または完全な(100%)配列同一性（相同性）をもつアミノ酸配列を含む：SEQ ID NO:1の位置26-529、SEQ ID NO:2の位置18-514、SEQ ID NO:3の位置26-529、SEQ ID NO:4の位置1-427、SEQ ID NO:5の位置24-526、SEQ ID NO:6の位置18-512、SEQ ID NO:7の位置27-532、SEQ ID NO:8の位置27-539、SEQ ID NO:9の位置20-449、SEQ ID NO:10の位置1-424、SEQ ID NO:11の位置18-447、SEQ ID NO:12の位置18-434、SEQ ID NO:13の位置18-521、SEQ ID NO:14の位置19-454、SEQ ID NO:15の位置19-596、SEQ ID NO:16の位置2-426、SEQ ID NO:17の位置23-446、SEQ ID NO:18の位置19-525、SEQ ID NO:19の位置23-446、SEQ ID NO:20の位置19-530、SEQ ID NO:21の位置2-416、SEQ ID NO:22の位置19-454、SEQ ID NO:23の位置19-506、SEQ ID NO:24の位置19-447、SEQ ID NO:25の位置20-443、SEQ ID NO:26の位置18-447、SEQ ID NO:27の位置19-516、SEQ ID NO:28の位置18-451、SEQ ID NO:29の位置23-446、SEQ ID NO:30の位置18-514、SEQ ID NO:31の位置18-451、SEQ ID NO:32の位置18-447、SEQ ID NO:33の位置19-449、SEQ ID NO:34の位置18-447、SEQ ID NO:35の位置26-529、SEQ ID NO:36の位置19-528、SEQ ID NO:37の位置19-453、SEQ ID NO:38の位置18-512、SEQ ID NO:39の位置19-586、SEQ ID NO:40の位置19-510、SEQ ID NO:41の位置18-513、SEQ ID NO:42の位置24-541、SEQ ID NO:43の位置18-516、SEQ ID NO:44の位置19-453、SEQ ID NO:45の位置26-537、SEQ ID NO:46の位置19-523、SEQ ID NO:47の位置18-443、SEQ ID NO:48の位置18-511、SEQ ID NO:49の位置19-523、SEQ ID NO:50の位置18-513、SEQ ID NO:51の位置2-419、SEQ ID NO:52の位置27-535、SEQ ID NO:53の位置21-445、SEQ ID NO:54の位置19-449、SEQ ID NO:55の位置19-528、SEQ ID NO:56の位置18-443、SEQ ID NO:57の位置20-443、SEQ ID NO:58の位置18-514、SEQ ID NO:59の位置18-447、SEQ ID NO:60の位置26-529、SEQ ID NO:61の位置19-525、SEQ ID NO:62の位置19-532、SEQ ID NO:63の位置26-460、SEQ ID NO:64の位置18-510、SEQ ID NO:65の位置19-512、SEQ ID NO:66の位置19-521、SEQ ID NO:67の位置1-505、SEQ ID NO:68の位置19-526、SEQ ID NO:69の位置19-511、SEQ ID NO:70の位置23-447、SEQ ID NO:71の位置17-448、SEQ ID NO:72の位置19-449、SEQ ID NO:73の位置18-514、SEQ ID NO:74の位置23-540、SEQ ID NO:75の位置20-452、SEQ ID NO:76の位置18-504、SEQ ID NO:77の位置18-446、SEQ ID NO:78の位置22-536、SEQ ID NO:79の位置18-508、SEQ ID NO:80の位置1-431、SEQ ID NO:81の位置19-453、SEQ ID NO:82の位置21-440、SEQ ID NO:83の位置19-516、SEQ ID NO:84の位置18-448、SEQ ID NO:85の位置17-446、SEQ ID NO:86の位置18-523、SEQ ID NO:87の位置18-443、SEQ ID NO:88の位置23-448、SEQ ID NO:89の位置18-451、SEQ ID NO:90の位置21-447、SEQ ID NO:91の位置18-444、SEQ ID NO:92の位置19-510、SEQ ID NO:93の位置20-504、SEQ ID NO:94の位置18-450、SEQ ID NO:95の位置22-453、SEQ ID NO:96の位置16-536、SEQ ID NO:97の位置21-445、SEQ ID NO:98の位置19-517、SEQ ID NO:99の位置19-516、SEQ ID NO:100の位置19-523、SEQ ID NO:101の位置18-507、SEQ ID NO:102の位置19-516、SEQ ID NO:103の位置20-457、SEQ ID NO:104の位置19-454、SEQ ID NO:105の位置18-505、SEQ ID NO:106の位置18-516、SEQ ID NO:107の位置27-530、SEQ ID NO:108の位置23-446、SEQ ID NO:109の位置17-446、SEQ ID NO:110の位置21-447、SEQ ID NO:111の位置19-523、SEQ ID NO:112の位置18-513、SEQ ID NO:113の位置22-536、SEQ ID NO:114の位置18-445、SEQ ID NO:115の位置18-526、SEQ ID NO:116の位置18-538、SEQ ID NO:117の位置23-435、SEQ ID NO:118の位置21-442、SEQ ID NO:119の位置23-435、SEQ ID NO:120の位置20-445、SEQ ID NO:121の位置21-443、SEQ ID NO:122の位置20-445、SEQ ID NO:123の位置23-443、SEQ ID NO:124の位置20-445、SEQ ID NO:125の位置21-435、SEQ ID NO:126の位置20-437、SEQ ID NO:127の位置21-442、SEQ ID NO:128の位置23-434、SEQ ID NO:129の位置20-444、SEQ ID NO:130の位置21-435、SEQ ID NO:131の位置20-445、SEQ ID NO:132の位置21-446、SEQ ID NO:133の位置21-435、SEQ ID NO:134の位置22-448、SEQ ID NO:135の位置23-433、SEQ ID NO:136の位置23-434、SEQ ID NO:137の位置23-435、SEQ ID NO:138の位置23-435、SEQ ID NO:139の位置20-445の位置、SEQ ID NO:140の位置20-437、SEQ ID NO:141の位置21-435、SEQ ID NO:142の位置20-437、SEQ ID NO:143の位置21-435、SEQ ID NO:144の位置26-435、SEQ ID NO:145の位置23-435、SEQ ID NO:146の位置24-443、SEQ ID NO:147の位置20-445、SEQ ID NO:148の位置21-441、およびSEQ ID NO:149の位置20-437、好ましくはSEQ ID NO:1の位置26-529またはSEQ ID NO:2の位置18-514に対応する成熟ポリペプチド)。
【００３７】
[0042]  配列類似性を判定するのに適したアルゴリズムの例はBLASTアルゴリズムであり、それらはAltschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。BLAST分析を実行するためのソフトウェアはNational Center for Biotechnology Informationにより公開されている。このアルゴリズムは、最初に、クエリー配列において、データベース配列中の同じ長さのワードと整列された際に、ある正の値をもつ閾値スコアＴと一致するかまたはそれを満たす長さＷのショートワードを同定することによる、高スコア配列対(high scoring sequence pair)（ＨＳＰ）の同定を伴う。これらの最初の近傍ワードヒットが、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための出発点として用いられる。累積アラインメントスコアを増大させることができる限り、これらのワードヒットを、比較する２配列それぞれに沿って両方向へ拡張する。下記の場合には、ワードヒットの拡張を停止する：累積アラインメントスコアが最大達成値から量Ｘ低下した場合；累積スコアがゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。BLASTアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTプログラムは、テデフォルトとしてワード長さ（Ｗ）１１、BLOSUM62スコアリング行列(Henikoff & Henikoff, 1992, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 89:10915-10919を参照)アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ’５、Ｎ’−４、および両鎖の比較を用いる。
【００３８】
[0043]  大部分のＣＢＨ  Ｉポリペプチドは分泌されることから、ポリペプチドが細胞から分泌される際に切断されるシグナル配列を含む状態で発現する。したがって、特定の観点において、本発明のバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、シグナル配列をさらに含む。代表的なシグナル配列は、下記に対応するアミノ酸配列を含む：SEQ ID NO:1の位置1-25、SEQ ID NO:2の位置1-17、SEQ ID NO:3の位置1-25、SEQ ID NO:5の位置1-23、SEQ ID NO:6の位置1-17、SEQ ID NO:7の位置1-26、SEQ ID NO:8の位置1-27、SEQ ID NO:9の位置1-19、SEQ ID NO:11の位置1-17、SEQ ID NO:12の位置1-17、SEQ ID NO:13の位置1-17、SEQ ID NO:14の位置1-18、SEQ ID NO:15の位置1-18、SEQ ID NO:17の位置1-22、SEQ ID NO:18の位置1-18、SEQ ID NO:19の位置1-22、SEQ ID NO:20の位置1-18、SEQ ID NO:22の位置1-18、SEQ ID NO:23の位置1-18、SEQ ID NO:24の位置1-18、SEQ ID NO:25の位置1-19、SEQ ID NO:26の位置1-17、SEQ ID NO:27の位置1-18、SEQ ID NO:28の位置1-17、SEQ ID NO:29の位置1-22、SEQ ID NO:30の位置1-18、SEQ ID NO:31の位置1-17、SEQ ID NO:32の位置1-17、SEQ ID NO:33の位置1-18、SEQ ID NO:34の位置1-17、SEQ ID NO:35の位置1-25、SEQ ID NO:36の位置1-18、SEQ ID NO:37の位置1-18、SEQ ID NO:38の位置1-17、SEQ ID NO:39の位置1-18、SEQ ID NO:40の位置1-18、SEQ ID NO:41の位置1-17、SEQ ID NO:42の位置1-23、SEQ ID NO:43の位置1-17、SEQ ID NO:44の位置1-18、SEQ ID NO:45の位置1-25、SEQ ID NO:46の位置1-18、SEQ ID NO:47の位置1-17、SEQ ID NO:48の位置1-17、SEQ ID NO:49の位置1-18、SEQ ID NO:50の位置1-17、SEQ ID NO:52の位置1-26、SEQ ID NO:53の位置1-20、SEQ ID NO:54の位置1-18、SEQ ID NO:55の位置1-18、SEQ ID NO:56の位置1-17、SEQ ID NO:57の位置1-19、SEQ ID NO:58の位置1-17、SEQ ID NO:59の位置1-17、SEQ ID NO:60の位置1-25、SEQ ID NO:61の位置1-18、SEQ ID NO:62の位置1-18、SEQ ID NO:63の位置1-25、SEQ ID NO:64の位置1-17、SEQ ID NO:65の位置1-18、SEQ ID NO:66の位置1-18、SEQ ID NO:68の位置1-18、SEQ ID NO:69の位置1-18、SEQ ID NO:70の位置1-23、SEQ ID NO:71の位置1-17、SEQ ID NO:72の位置1-18、SEQ ID NO:73の位置1-17、SEQ ID NO:74の位置1-22、SEQ ID NO:75の位置1-19、SEQ ID NO:76の位置1-17、SEQ ID NO:77の位置1-17、SEQ ID NO:78の位置1-21、SEQ ID NO:79の位置1-18、SEQ ID NO:81の位置1-18、SEQ ID NO:82の位置1-20、SEQ ID NO:83の位置1-18、SEQ ID NO:84の位置1-17、SEQ ID NO:85の位置1-16、SEQ ID NO:86の位置1-17、SEQ ID NO:87の位置1-17、SEQ ID NO:88の位置1-22、SEQ ID NO:89の位置1-17、SEQ ID NO:90の位置1-20、SEQ ID NO:91の位置1-17、SEQ ID NO:92の位置1-18、SEQ ID NO:93の位置1-19、SEQ ID NO:94の位置1-17、SEQ ID NO:95の位置1-21、SEQ ID NO:96の位置1-15、SEQ ID NO:97の位置1-20、SEQ ID NO:98の位置1-18、SEQ ID NO:99の位置1-18、SEQ ID NO:100の位置1-18、SEQ ID NO:101の位置1-17、SEQ ID NO:102の位置1-18、SEQ ID NO:103の位置1-19、SEQ ID NO:104の位置1-18、SEQ ID NO:105の位置1-17、SEQ ID NO:106の位置1-17、SEQ ID NO:107の位置1-26、SEQ ID NO:108の位置1-22、SEQ ID NO:109の位置1-16、SEQ ID NO:110の位置1-20、SEQ ID NO:111の位置1-18、SEQ ID NO:112の位置1-17、SEQ ID NO:113の位置1-21、SEQ ID NO:114の位置1-17、SEQ ID NO:115の位置1-17、SEQ ID NO:116の位置1-18、SEQ ID NO:117の位置1-22、SEQ ID NO:118の位置1-20、SEQ ID NO:119の位置1-22、SEQ ID NO:120の位置1-19、SEQ ID NO:121の位置1-20、SEQ ID NO:122の位置1-19、SEQ ID NO:123の位置1-22、SEQ ID NO:124の位置1-19、SEQ ID NO:125の位置1-20、SEQ ID NO:126の位置1-19、SEQ ID NO:127の位置1-21、SEQ ID NO:128の位置1-22、SEQ ID NO:129の位置1-19、SEQ ID NO:130の位置1-20、SEQ ID NO:131の位置1-19、SEQ ID NO:132の位置1-20、SEQ ID NO:133の位置1-20、SEQ ID NO:134の位置1-21、SEQ ID NO:135の位置1-22、SEQ ID NO:136の位置1-22、SEQ ID NO:137の位置1-22、SEQ ID NO:138の位置1-22、SEQ ID NO:139の位置1-19、SEQ ID NO:140の位置1-19、SEQ ID NO:141の位置1-20、SEQ ID NO:142の位置1-19、SEQ ID NO:143の位置1-20、SEQ ID NO:144の位置1-25、SEQ ID NO:145の位置1-22、SEQ ID NO:146の位置1-23、SEQ ID NO:147の位置1-19、SEQ ID NO:148の位置1-20、およびSEQ ID NO:149の位置1-19。
【００３９】
5.2.バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドの組換え発現
5.2.1.細胞培養系
[0044]  本発明はまた、バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドを発現するように操作された組換え細胞を提供する。適切には、バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、プロモーターに作動可能に連結された核酸によりコードされる。
【００４０】
[0045]  糸状菌宿主における組換え発現が望ましい場合、プロモーターは糸状菌プロモーターであってもよい。核酸は、たとえばヘテロロガスプロモーターの制御下にあってもよい。バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、構成的または誘導性プロモーターの制御下で発現させることもできる。使用できるプロモーターの例には、セルラーゼプロモーター、キシラナーゼプロモーター、１８１８プロモーター（トリコデルマのＥＳＴマッピングにより高発現タンパク質として以前に同定された）が含まれるが、これらに限定されない。たとえば、プロモーターは、適切にはセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、またはβ−グルコシダーゼのプロモーターであってもよい。特に適切なプロモーターは、たとえばトリコデルマ・リーゼイのセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、またはβ−グルコシダーゼのプロモーターであってもよい。プロモーターの非限定的な例には、ｃｂｈｌ、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｅｇｌ３、ｅｇｌ４、ｅｇｌ５、ｐｋｉ１、ｇｐｄｌ、ｘｙｎｌ、またはｘｙｎ２プロモーターが含まれる。
【００４１】
[0046]  適切な宿主細胞にはいずれかの微生物（たとえば、細菌、原生生物、藻類、真菌（たとえば、酵母または糸状菌）、または他の微生物）の細胞が含まれ、好ましくは細菌、酵母または糸状菌の細胞である。
【００４２】
[0047]  細菌属の適切な宿主細胞には、エシェリキア属(Escherichia)、バチルス属(Bacillus)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、シュードモナス属(Pseudomonas)、およびストレプトミセス属(Streptomyces)の細胞が含まれるが、これらに限定されない。適切な細菌種の細胞には、大腸菌(Escherichia coli)、バチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、およびストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)の細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
[0048]  酵母属の適切な宿主細胞には、サッカロミセス属(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、カンジダ属(Candida)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、ピチア属(Pichia)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、およびファフィア属(Phaffia)の細胞が含まれるが、これらに限定されない。適切な酵母種の細胞には、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)、ピチア・カナデンシス(P. canadensis)、クルイベロミセス・マルキシアヌス(Kluyveromyces marxianus)、およびファフィア・ロドザイマ(Phaffia rhodozyma)の細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
[0049]  糸状菌の適切な宿主細胞には、Eumycotina亜門のすべての糸状形態のものが含まれる。糸状菌属の適切な細胞には、下記の細胞が含まれるが、これらに限定されない：アクレモニウム属(Acremonium)、アスペルギルス属(Aspergillus)、オーレオバシジウム属(Aureobasidium)、ブジェルカンデラ属(Bjerkandera)、セリポリオプシス属(Ceriporiopsis)、クリソポリウム属(Chrysoporium)、コプリヌス属(Coprinus)、コリオラス属(Coriolus)、コリナスカス属(Corynascus)、ケトミウム属(Chaetomium)、クリプトコッカス属(Cryptococcus)、フィロバシジウム属(Filobasidium)、フザリウム属(Fusarium)、ジベレラ属(Gibberella)、ヒューミコラ属(Humicola)、ヒポクレア属(Hypocrea)、マグナポルテ属(Magnaporthe)、ムコール属(Mucor)、ミセリオフトラ属(Myceliophthora)、ムコール属(Mucor)、ネオカリマスティクス属(Neocallimastix)、ニューロスポラ属(Neurospora)、ペシロミセス属(Paecilomyces)、ペニシリウム属(Penicillium)、ファネロケテ属(Phanerochaete)、フレビア属(Phlebia)、ピロミセス属(Piromyces)、プロイロタス属(Pleurotus)、シタルジウム属(Scytaldium)、シゾフィラム属(Schizophyllum)、スポロトリクム属(Sporotrichum)、タラロミセス属(Talaromyces)、テルモアスカス属(Thermoascus)、チエラビア属(Thielavia)、トリポクラジウム属(Tolypocladium)、トラメテス属(Trametes)、およびトリコデルマ属(Trichoderma)。より好ましくは、組換え細胞はトリコデルマ属の種（たとえば、トリコデルマ・リーゼイ)、ペニシリウム属の種、ヒューミコラ属の種（たとえば、ヒューミコラ・インソレンス(Humicola insolens)）;アスペルギルス属の種（たとえば、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)）、クリソポリウム属の種、フザリウム属の種、またはヒポクレア属の種である。適切な細胞には、これらの糸状菌属の種々のアナモルフおよびテレオモルフ形態のものも含めることができる。
【００４５】
[0050]  糸状菌種の適切な細胞には、下記の細胞が含まれるが、これらに限定されない：アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・フミガータス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・フェチダス(Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・ヤポニカス(Aspergillus japonicus)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、クリソポリウム・ルックノウェンス(Chrysosporium lucknowense)、フザリウム・バクトリディオイデス(Fusarium bactridioides)、フザリウム・セレアリス(Fusarium cerealis)、フザリウム・クルックウェレンス(Fusarium crookwellense)、フザリウム・クルモラム(Fusarium culmorum)、フザリウム・グラミネアルム(Fusarium graminearum)、フザリウム・グラミウム(Fusarium graminum)、フザリウム・ヘテロスポラム(Fusarium heterosporum)、フザリウム・ネグンディ(Fusarium negundi)、フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)、フザリウム・レティキュラタム(Fusarium reticulatum)、フザリウム・ロゼウム(Fusarium roseum)、フザリウム・サムブシナム(Fusarium sambucinum)、フザリウム・サルコクロウム(Fusarium sarcochroum)、フザリウム・スポロトリチオイデス(Fusarium sporotrichioides)、フザリウム・スルフレウム(Fusarium sulphureum)、フザリウム・トルロサム(Fusarium torulosum)、フザリウム・トリコテシオイデス(Fusarium trichothecioides)、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)、ブジェルカンデラ・アダスタ(Bjerkandera adusta)、セリポリオプシス・アネイリナ(Ceriporiopsis aneirina)、セリポリオプシス・アネイリナ(Ceriporiopsis aneirina)、セリポリオプシス・カレギエア(Ceriporiopsis caregiea)、セリポリオプシス・ギルベッセンス(Ceriporiopsis gilvescens)、セリポリオプシス・パンノシンタ(Ceriporiopsis pannocinta)、セリポリオプシス・リブロサ(Ceriporiopsis rivulosa)、セリポリオプシス・サブルファ(Ceriporiopsis subrufa)、セリポリオプシス・サブベルミスポラ(Ceriporiopsis subvermispora)、コプリヌス・シネレウス(Coprinus cinereus)、コリオラス・ヒルスタス(Coriolus hirsutus)、ヒューミコラ・インソレンス(Humicola insolens)、ヒューミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)、ムコール・ミーヘイ(Mucor miehei)、ミセリオフトラ・テルモフィラ(Myceliophthora thermophila)、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)、ニューロスポラ・インテルメディア(Neurospora intermedia)、ペニシリウム・プルプロゲナム(Penicillium purpurogenum)、ペニシリウム・カネッセンス(Penicillium canescens)、ペニシリウム・ソリタム(Penicillium solitum)、ペニシリウム・フニキュロサム(Penicillium funiculosum)、ファネロケテ・クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)、フレビア・ラディアテ(Phlebia radiate)、プロイロタス・エリンギイ(Pleurotus eryngii)、タラロミセス・フラブス(Talaromyces flavus)、チエラビア・テレストリス(Thielavia terrestris)、トラメテス・ビローサ(Trametes villosa)、トラメテス・ベルシカラー(Trametes versicolor)、トリコデルマ・ハルジアヌム(Trichoderma harzianum)、トリコデルマ・コニンギイ(Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ロンギブラキアタム(Trichoderma longibrachiatum)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、およびトリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)。
【００４６】
[0051]  操作された宿主細胞を、プロモーターを活性化するのに適切であるように改変した一般的な栄養培地で培養して、形質転換体を選択するか、またはバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドをコードする核酸配列を増幅することができる。培養条件、たとえば温度、ｐＨなどは、発現のために選択した宿主細胞について従来用いられているものであり、当業者に自明であろう。前記のように、細菌および真菌に由来する細胞を含めた多くの細胞の培養および製造については多数の参考文献がある。細胞培養培地は、一般にAtlas and Parks (eds.), 1993, The Handbook of Microbiological Media, CRC Press, Boca Raton, FLに述べられており、これを本明細書に援用する。糸状菌細胞における組換え発現については、たとえば、Pourquie et al., 1988, Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, eds. Aubert, et al., Academic Press, pp. 71-86;およびIlmen et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63:1298-1306に記載されているような、生理的塩類および栄養素を含有する標準培地で細胞を培養する。培養条件も標準的であり、たとえば培養物を２８℃において振とう培養または発酵槽で、所望のレベルのバリアントＣＢＨ  Ｉ発現に達するまでインキュベートする。所定の糸状菌に好ましい培養条件は、科学文献中にあり、ならびに／あるいは真菌の供給源、たとえばAmerican Type Culture Collection (ATCC)から入手できる。真菌の増殖が確立した後、バリアントＣＢＨ  Ｉの発現を起こすかまたは許容するのに有効な条件下に細胞をおく。
【００４７】
[0052]  バリアントＣＢＨ  Ｉコード配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合、誘導剤、たとえば糖、金属塩または抗生物質を、バリアントＣＢＨ  Ｉ発現を誘導するのに有効な濃度で培地に添加する。
【００４８】
[0053]  １態様において、組換え細胞はアスペルギルス・ニガーであり、これは過剰発現ポリペプチドを得るために有用な株である。たとえば、アスペルギルス・ニガー変異株アワモリｄｇｒ２４６(A. nigervar. awamori dgr246)は、多量の分泌セルラーゼを産生することが知られている(Goedegebuur et al., 2002, Curr. Genet. 41:89-98)。アスペルギルス・ニガー変異株アワモリの他の株、たとえばＧＣＤＡＰ３、ＧＣＤＡＰ４およびＧＡＰ３−４が知られている(Ward et al., 1993, Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:738-743)。
【００４９】
[0054]  別の態様において、組換え細胞はトリコデルマ・リーゼイであり、これは過剰発現ポリペプチドを得るために有用な株である。たとえば、Sheir-Neiss et al., 1984, Appl. Microbiol. Biotechnol. 20:46-53により記載されるＲＬ−Ｐ３７は、多量のセルラーゼ酵素を分泌することが知られている。ＲＬ−Ｐ３７の機能均等物には、トリコデルマ・リーゼイ株ＲＵＴ−Ｃ３０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５６７６５）および株ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２６９２１）が含まれる。これらの株はバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドの過剰発現にも有用であると考えられる。
【００５０】
[0055]  本発明のバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドを発現する細胞を、バッチ発酵、フェドバッチ発酵または連続発酵の条件下で増殖させることができる。古典的なバッチ発酵は閉鎖系であり、その際、培地の組成は発酵の開始時に設定され、発酵中は人為的な変更を受けない。バッチシステムの変法はフェドバッチ発酵であり、その場合は発酵が進行するのに伴って基質を漸増添加する。フェドバッチシステムは、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する可能性がある場合、および培地中に限定量の基質があることが望ましい場合に有用である。バッチ発酵およびフェドバッチ発酵は一般的であり、当技術分野で周知である。連続発酵は解放系であり、その際、規定の発酵培地をバイオリアクターに連続添加し、同時に等量の馴化培地を処理のために取り出す。連続発酵は、一般に培養物を一定の高密度に維持し、ここで細胞は主に対数増殖期にある。連続発酵システムは、定常状態の増殖条件を維持するように努める。連続発酵プロセスのための栄養素および増殖因子を調節する方法、ならびに生産物形成の速度を最大にするための手法は、工業微生物学の技術分野で周知である。
【００５１】
5.2.2.植物における組換え発現
[0056]  本発明は、バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドを組換え発現するトランスジェニック植物および種子を提供する。本発明は、バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドを含む植物生産物、たとえば油類、種子、葉、抽出物なども提供する。
【００５２】
[0057]  トランスジェニック植物は双子葉植物(dicotyledonous (a dicot))または単子葉植物(monocotyledonous (a monocot))であってもよい。本発明は、これらのトランスジェニック植物および種子を作成および使用する方法も提供する。バリアントＣＢＨ  Ｉを発現するトランスジェニック植物または植物細胞は、当技術分野で既知のいずれかの方法に従って構築できる。たとえば、U.S. Patent No. 6,309,872を参照。トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  Ｉをトランスジェニックタバコ(Nicotiana tabaccum)およびバレイショ(Solanum tuberosum)において発現させるのに成功している。Hooker et al., 2000, Glycosyl Hydrolases for Biomass Conversion, ACS Symposium Series, Vol. 769, Chapter 4, pp. 55-90を参照。
【００５３】
[0058]  特定の観点において、本発明は、トランスジェニック植物または植物器官におけるＣＢＨ  Ｉバリアントの発現、およびその産生方法を提供する。好ましくは、バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドの発現を指令することができる調節配列の制御下にある、バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドをコードする核酸で植物を形質転換するための、ＤＮＡ発現構築体を提供する。これらの調節配列には、植物において構成的にあるいは時期特異的および／または組織特異的な様式で転写を指令することができる配列が含まれる。
【００５４】
[0059]  植物におけるバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドの発現は、多様な手段で達成できる。具体的には、たとえば双子葉植物の種（たとえば、タバコ、バレイショ、トマト、ペチュニア属(Petunia)、アブラナ属(Brassica)）および単子葉植物の種を含めた多数の植物種を形質転換するための技術を利用できる。さらに、たとえば外来遺伝子を植物で発現させるための方策を利用できる。さらにまた、植物および植物細胞において機能性発現できるキメラ遺伝子の構築に使用できる植物遺伝子由来の調節配列が同定されている(たとえば、Klee, 1987, Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467-486; Clark et al., 1990, Virology 179(2): 640-7; Smith et al., 1990, Mol. Gen. Genet. 224(3):477-81。
【００５５】
[0060]  植物への核酸の導入は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)、またはアグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)による形質転換を含めた幾つかの技術を用いて達成できる。形質転換できる植物組織の非限定的な例には、プロトプラスト、小芽胞または花粉、ならびに外植体、たとえば葉、幹、根、下子葉および子葉が含まれる。さらに、バリアントＣＢＨ  ＩをコードするＤＮＡを、プロトプラストおよび植物の細胞または組織に、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、粒子衝撃法、および直接ＤＮＡ取込みによって直接導入することができる。
【００５６】
[0061]  バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドを、植物において多様な発現系により産生させることができる。たとえば、構成的プロモーター、たとえばカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター(Guilley et al., 1982, Cell 30:763-73)の使用は、トランスジェニック植物の実質的にすべての器官における発現タンパク質の蓄積のために役立つ。あるいは、組織特異的および／または時期特異的であるプロモーターを使用でき(Higgins, 1984, Annu. Rev. Plant Physiol. 35:191-221; Shotwell and Larkins, 1989, The Biochemistry of Plants Vol. 15 (Academic Press, San Diego: Stumpf and Conn, eds.), p. 297)、バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドを標的組織および／または所望の発生時期に発現させることができる。
【００５７】
5.3.バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドの組成物
[0062]  一般に、細胞培養に際して産生されたバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは培地中へ分泌され、たとえば目的外成分を細胞培養培地から除去することによって精製または単離することができる。しかし、場合によってはバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは細胞性形態で産生され、細胞溶解物からの回収が必要となる可能性がある。そのような場合、バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドを、それが産生された細胞から、当業者がルーティンに用いる手法で精製する。例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：アフィニティークロマトグラフィー(Van Tilbeurgh et al., 1984, FEBS Lett. 169(2): 215-218)、イオン交換クロマトグラフィー法(Goyal et al., 1991, Bioresource Technology, 36: 37-50; Fliess et al., 1983, Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol.17: 314-318; Bhikhabhai et al., 1984, J. Appl. Biochem. 6: 336-345; Ellouz et al., 1987, Journal of Chromatography, 396: 307-317)：高い分解能をもつ物質を用いるイオン交換 (Medve et al., 1998, J. Chromatography A, 808: 153-165)、疎水性相互作用クロマトグラフィー(Tomaz and Queiroz, 1999, J. Chromatography A, 865: 123-128)、および２相分配(Brumbauer et al., 1999, Bioseparation 7: 287-295) を含む。
【００５８】
[0063]  本発明のバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、セルラーゼ組成物中に用いるのに適切である。セルラーゼはセルロース（ベータ−１，４−グルカンまたはベータ  Ｄ−グルコシド結合）を加水分解してグルコース、セロビオース、セロオリゴ糖などを生成する酵素として当技術分野で知られている。セルラーゼ酵素は、伝統的に３つの主要クラスに分類されている：エンドグルカナーゼ（“ＥＧ”）、エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）（“ＣＢＨ”）、およびベータ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）（“ＢＧ”）(Knowles et al., 1987, TIBTECH 5: 255-261; Schulein, 1988, Methods in Enzymology 160(25): 234-243)。
【００５９】
[0064]  特定の真菌は、エキソ−セロビオヒドロラーゼまたはＣＢＨ型セルラーゼ、エンドグルカナーゼまたはＥＧ型セルラーゼ、およびβ−グルコシダーゼまたはＢＧ型セルラーゼを含む、完全なセルラーゼ系を産生する(Schulein, 1988, Methods in Enzymology 160(25): 234-243)。そのようなセルラーゼ組成物を本明細書中で“全(whole)”セルラーゼと呼ぶ。しかし、時にはこれらの系はＣＢＨ型セルラーゼを欠如し、細菌セルラーゼも一般にＣＢＨ型セルラーゼをほとんどまたはまったく含まない。さらに、ＥＧ成分とＣＢＨ成分は相乗的に相互作用してセルロースをより効率的に分解することが示された。たとえば、Wood, 1985, Biochemical Society Transactions 13(2):407-410を参照。
【００６０】
[0065]  本発明のセルラーゼ組成物は、一般にバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドのほかに１つ以上のセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼおよび／またはβ−グルコシダーゼを含む。セルラーゼ組成物は、それらの最も粗製の形態では、それらの酵素成分を産生した微生物培養物を含有する。“セルラーゼ組成物”は、微生物の粗製発酵産物をも表わす。粗製発酵産物は、好ましくは微生物の細胞および／または細胞屑から分離した（たとえば、遠心および／または濾過により）発酵ブロスである。場合によっては、ブロス中の酵素を所望により希釈、濃縮、部分精製もしくは精製および／または乾燥することができる。バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、セルラーゼ組成物の他の成分のうちの１つ以上と同時発現させることができ、あるいはそれを別個に発現させ、場合により精製し、他のセルラーゼ成分のうちの１つ以上を含む組成物と混和することができる。
【００６１】
[0066]  バリアントＣＢＨ  Ｉは、セルラーゼ組成物中に用いる場合、一般にバイオマスから可溶性糖を放出させるのに十分な量で存在する。バリアントＣＢＨ  Ｉ酵素の添加量は糖化すべきバイオマスのタイプに依存し、当業者が容易に決定できる。特定の態様において、バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドの重量％は、適切には、セルラーゼ組成物中の総ポリペプチドの少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、または少なくとも２０重量％である。代表的なセルラーゼ組成物は、本発明のバリアントＣＢＨ  Ｉを下記の範囲の量で含有する：組成物中の総ポリペプチドの約１から約２０重量％まで、約１から約２５重量％まで、約５から約２０重量％まで、約５から約２５重量％まで、約５から約３０重量％まで、約５から約３５重量％まで、約５から約４０重量％まで、約５から約４５重量％まで、約５から約５０重量％まで、約１０から約２０重量％まで、約１０から約２５重量％まで、約１０から約３０重量％まで、約１０から約３５重量％まで、約１０から約４０重量％まで、約１０から約４５重量％まで、約１０から約５０重量％まで、約１５から約２０重量％まで、約１５から約２５重量％まで、約１５から約３０重量％まで、約１５から約３５重量％まで、約１５から約３０重量％まで、約１５から約４５重量％まで、または約１５から約５０重量％まで。
【００６２】
5.4.バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドの有用性
[0067]  本発明のバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチド、およびバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドを含む組成物を、多様な用途において有用であることは認識できる；たとえば、高い洗浄能、軟化剤としての機能を示し、および／または木綿布帛の感触を改善する（たとえば、“ストーンウォッシング(stone washing)”または“バイオポリッシング(biopolishing)”）洗浄剤組成物、あるいは木材パルプを糖に分解するための（たとえば、バイオ−エタノール製造のための）セルラーゼ組成物。他の用途には、機械的パルプの処理(Pere et al., 1996, Tappi Pulping Conference, pp. 693-696 (Nashville, TN, Oct. 27-31, 1996))、飼料添加剤としての用途(たとえば、WO 91/04673を参照)、および穀粒湿式製粉が含まれる。
【００６３】
5.4.1.糖化反応
[0068]  エタノールは、セルロース系バイオマス、たとえば樹木、草本植物、都市固形廃棄物、ならびに農業および林業の残渣から、糖化および発酵プロセスにより製造できる。しかし、微生物が産生する天然のセルラーゼ混合物内の個々のセルラーゼ酵素の比率は、バイオマス中のセルロースを迅速にグルコース転化するために最も効果的ではない可能性がある。エンドグルカナーゼは、それ自体がセロビオヒドロラーゼの作用に対する基質である新たなセルロース鎖末端を生成する作用をもち、これによりセルラーゼ系全体の加水分解効率を改善することが知られている。最適化されたセロビオヒドロラーゼ活性を用いると、エタノールの製造を大幅に向上させることができる。
【００６４】
[0069]  本発明のバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドのうちの１つ以上を含むセルラーゼ組成物を糖化反応に用いて、発酵のための単純糖（simple sugars）を製造することができる。したがって本発明は、本発明のバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドを含むセルラーゼ組成物とバイオマスを接触させることを含む糖化方法を提供し、場合により、得られた糖を微生物により発酵させる。
【００６５】
[0070]  本明細書中で用いる用語“バイオマス”は、セルロース（場合により、ヘミセルロースおよび／またはリグニンも）を含むいずれかの組成物を表わす。本明細書中で用いる場合、バイオマスには、限定ではなく、種子、穀粒、塊茎(tuber)、植物廃棄物または食品加工もしくは工業加工の副産物（たとえば、茎(stalk)）、トウモロコシ（たとえば、穂軸(cob)、葉茎(stover)などを含む）、牧草（たとえば、インディアングラス(Indian grass)、たとえばソルガム・ヌータンス(Sorghastrum nutans);またはスイッチグラス(switchgrass)、たとえばキビ属(Panicum)種、たとえばパニカム・ウィルガツム(Panicum virgatum)を含む)、木材(たとえば、木材チップ、加工廃棄物を含む)、紙、パルプ、および再生紙(たとえば、新聞紙、プリンター用紙などを含む)が含まれる。他のバイオマス材料には、限定ではなく、バレイショ、ダイズ（たとえば、ナタネ）、オオムギ、ライムギ、オートムギ、コムギ、ビート、およびサトウキビのバガスが含まれる。
【００６６】
[0071]  糖化したバイオマス（たとえば、本発明の酵素により処理したリグノセルロース材料）を、たとえば微生物発酵および／または化学合成などのプロセスで多数の生物性製品にすることができる。本明細書中で用いる場合、“微生物発酵”は、発酵微生物を適切な条件下で増殖させて収穫するプロセスを表わす。発酵微生物は、生物性製品を製造するために目的とする発酵プロセスに用いるのに適したいずれの微生物であってもよい。適切な発酵微生物には、限定でなく、糸状菌、酵母および細菌が含まれる。糖化したバイオマスを、たとえば発酵および／または化学合成により燃料（たとえばバイオ燃料、たとえばバイオエタノール、バイオブタノール、バイオメタノール、バイオプロパノール、バイオディーゼル、ジェット燃料など）にすることができる。糖化したバイオマスを、たとえば発酵および／または化学合成により有用化学物質（たとえば、アスコルビン酸、イソプレン、１，３−プロパンジオール）、脂質、アミノ酸、ポリペプチド、および酵素にすることもできる。
【００６７】
[0072]  したがって、特定の観点において、本発明のバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、個別または同時に行なう糖化および発酵プロセスでバイオマスからエタノールを製造するために有用である。個別の糖化および発酵は、それによりバイオマス中に存在するセルロースを糖化して単純糖（たとえば、グルコース）にし、その後これらの単純糖を微生物（たとえば、酵母）により発酵させてエタノールにするプロセスである。同時に行なう糖化および発酵は、それによりバイオマス中に存在するセルロースを糖化して単純糖（たとえば、グルコース）にし、同時に同じ反応器内で微生物（たとえば、酵母）がこれらの単純糖を発酵してエタノールにするプロセスである。
【００６８】
[0073]  糖化の前に、セルロース材料をより酵素に接近しやすくまたは感受性にし、したがって本発明のバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドによる加水分解をより受けやすくするために、好ましくはバイオマスに１以上の前処理段階を施す。
【００６９】
[0074]  代表的な態様において、前処理は、バイオマス材料に反応器内で強酸および金属塩の希溶液を含む触媒を付与することを伴う。バイオマス材料は、たとえば生材料または乾燥材料であってもよい。この前処理によって、セルロース加水分解の活性化エネルギーまたは温度を低下させることができ、最終的には発酵性糖の収量を高めることができる。たとえば、U.S. Patent No. 6,660,506; 6,423,145を参照。
【００７０】
[0075]  別の代表的な前処理方法は、水性媒体中で、セルロースからグルコースへの顕著な脱重合を達成することなく、主にヘミセルロースを効率的に脱重合するように選択した温度および圧力で、バイオマス材料に第１の加水分解段階を施すことにより、バイオマスを加水分解することを伴う。この段階によりスラリーが得られ、その水性液相はヘミセルロースの脱重合から得られた溶解した単糖類を含有し、固相はセルロースおよびリグニンを含有する。次いで、セルロースの主要部分が脱重合する条件下でこのスラリーに第２の加水分解段階を施して、溶解した／可溶性のセルロース脱重合生成物を含有する水性液相が得られる。たとえば、U.S. Patent No. 5,536,325を参照。
【００７１】
[0076]  さらなる代表的な方法は、約０．４％〜約２％の強酸を用いる１以上の希酸加水分解段階；続いて酸加水分解された材料の反応しなかった固体リグノセルロース成分をアルカリ脱リグニン処理することにより、バイオマス材料を加工することを伴う。たとえば、U.S. Patent No. 6,409,841を参照。別の代表的な前処理方法は、下記を含む：バイオマス（たとえば、リグノセルロース材料）を前加水分解反応器内で前加水分解すること；酸性液体を固体リグノセルロース材料に添加して混合物を調製すること；この混合物を反応温度に加熱すること；リグノセルロース材料を、リグノセルロース材料からのリグニンのうち少なくとも約２０％を含有する可溶化された部分とセルロースを含有する固体画分とに分画するのに十分な期間、反応温度を維持すること；可溶化された部分を固体画分から分離し、可溶化された部分を反応温度またはその付近にある間に取り出すこと；および、可溶化された部分を回収すること。固体画分中のセルロースを、より酵素消化を受けやすいようにする。たとえば、U.S. Patent No. 5,705,369を参照。さらなる前処理方法は、過酸化水素Ｈ２Ｏ２の使用を伴うことができる。Gould, 1984, Biotech, and Bioengr. 26:46-52を参照。
【００７２】
[0077]  前処理は、バイオマス材料を化学量論的量の水酸化ナトリウムおよび水酸化アンモニウムときわめて低い濃度で接触させることを含むこともできる。Teixeira et al., 1999, Appl. Biochem.and Biotech. 77-79:19-34を参照。前処理は、リグノセルロースをｐＨ約９〜約１４の化学物質（たとえば塩基、たとえば炭酸ナトリウムまたは水酸化カリウム）と適度の温度、圧力、およびｐＨで接触させることを含むこともできる。PCT Publication WO2004/081185を参照。
【００７３】
[0078]  アンモニア前処理も採用できる。そのような前処理方法は、バイオマス材料を高い固形分の条件下で低いアンモニア濃度におくことを含む。たとえば、U.S. Patent Publication No. 20070031918およびPCT publication WO 06/110901を参照。
【００７４】
5.4.2.バリアントＣＢＨ  Ｉタンパク質を含む洗浄剤組成物
[0079]  本発明はまた、本発明のバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドを含む洗浄剤組成物を提供する。洗浄剤組成物には、バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドのほかに、界面活性剤（陰イオン、非イオンおよび両性界面活性剤を含む）；ヒドロラーゼ；漂白剤；青み剤(bluing agent)；粘結防止剤；可溶化剤；および陽イオン界面活性剤のうち１つ以上を使用できる。これらの成分はすべて洗浄剤技術分野で既知である。
【００７５】
[0080]  バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、好ましくはセルラーゼ組成物の一部として提供される。セルラーゼ組成物は、洗浄剤組成物全体の約０．００００５重量％から約５重量％まで、または約０．０００２重量％から約２重量％まで使用できる。セルラーゼ組成物は、希釈液、顆粒、エマルジョン、ゲル、ペーストなどの形態であってもよい。そのような形態は当業者に既知である。固体洗浄剤組成物を用いる場合、セルラーゼ組成物は好ましくは顆粒として配合される。
【実施例】
【００７６】
6.実施例
6.1.材料および方法
6.1.1.生化学的特性分析のためのＣＢＨ  Ｉポリペプチドの調製
[0081]  ＰＥＧ仲介形質転換法を用いてＣＢＨ  Ｉの発現構築体で形質転換したアスペルギルス・ニガー宿主株において、タンパク質発現を行なった；発現構築体は選択マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子を含み、全長ＣＢＨ  Ｉ配列（シグナル配列、触媒ドメイン、リンカー、およびセルロース結合ドメイン）は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄ）プロモーターの制御下にあった。形質転換体を再生培地上でハイグロマイシンに対する耐性に基づいて選択した。選択した形質転換体をアスペルギルス用の塩類培地（ｐＨ６．２；抗生物質ペニシリン、ストレプトマイシンおよびハイグロマイシン、ならびに８０ｇ／Ｌのグリセロール、２０ｇ／Ｌのソイトン(soytone)、１０ｍＭのウリジン、２０ｇ／ＬのＭＥＳを補充したもの）中で、バフル付き振とうフラスコ内において３０℃、１７０ｒｐｍで培養した。５日間のインキュベーション後、分泌タンパク質上清全体を回収し、次いで中空繊維濾過を行なって濃縮し、試料を酢酸緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＡｃ，ｐＨ５）に交換した。ＣＢＨ  Ｉタンパク質は、これらの試料中の総タンパク質の９０％を超えていた。タンパク質純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質濃度をゲル密度計測および／またはＨＰＬＣ分析により決定した。すべてのタンパク質濃度をアッセイ前に正規化し、１〜２．５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【００７７】
6.1.2.ＣＢＨ  Ｉ活性アッセイ
[0082]  ４−メチルウンベリフェリルラクトシド（４−ＭＵＬ）アッセイ：このアッセイは、蛍光源基質４−ＭＵＬ（ＭＵＬとしても知られる）に対するＣＢＨ  Ｉの活性を測定する。アッセイをｃｏｓｔａｒ  ９６ウェル黒底プレート内で実施し、緩衝液中の酵素に４−ＭＵＬを添加することによりアッセイを開始した（２ｍＭの４−ＭＵＬ；２００ｍＭ  ＭＥＳ中，ｐＨ６）。ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸＴＭプレートリーダーで５分間にわたる蛍光読出しにより、酵素速度をモニターした（ｅｘ／ｅｍ  ３６５／４５０ｎｍ）。直線範囲のデータを用いて初速度（Ｖｏ）を計算した。
【００７８】
[0083]  リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）アッセイ：このアッセイは、ＰＡＳＣを基質として用いてＣＢＨ  Ｉの活性を測定する。アッセイ期間中、ＰＡＳＣに結合しているカルコフロール由来の蛍光シグナルによりＰＡＳＣの濃度をモニターする（ｅｘ／ｅｍ  ３６５／４４０ｎｍ）。酵素（１５μｌ）と反応用緩衝液（８５μｌの０．２％  ＰＡＳＣ，２００ｍＭ  ＭＥＳ，ｐＨ６）を混合することによりアッセイを開始し、次いで３５℃、２２５ＲＰＭで振とうしながらインキュベートした。２時間後、１反応体積のカルコフロール停止溶液（１００μｇ／ｍｌ，５００ｍＭグリシン中，ｐＨ１０）を添加し、蛍光読出しを得た（ｅｘ／ｅｍ  ３６５／４４０ｎｍ）。
【００７９】
[0084]  バガスアッセイ：このアッセイは、バガス、すなわちリグノセルロース基質に対するＣＢＨ  Ｉの活性を測定する。５％希酸で前処理したバガスを入れた１０ｍｌバイアル内で反応を行なった（反応液５ｍｌ当たり２５０ｍｇの固体）。各反応物は、４ｍｇのＣＢＨ  Ｉ酵素／ｇ固体、２００ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ６、カナマイシン、およびクロラムフェニコールを含有していた。反応物を３５℃において、２０ＲＰＭで回転しているハイブリダイゼーションインキュベーター（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内においてインキュベートした。均質スラリー状の試料（１５０μｌ）を９６ウェルのディープウェルプレート内へ移し、停止用緩衝液（４５０μｌの５００ｍＭ炭酸ナトリウム，ｐＨ１０）で反応停止することにより、タイムポイントを求めた。タイムポイント測定を２４時間毎に７２時間行なった。
【００８０】
[0085]  セロビオース耐容性アッセイ（またはセロビオース阻害アッセイ）：セロビオースに対する耐容性（または、セロビオースにより引き起こされる阻害）を、２方式のＣＢＨ  Ｉアッセイで試験した。直接投与型の耐容性試験方法は、すべてのＣＢＨ  Ｉアッセイ（すなわち、４−ＭＵＬ、ＰＡＳＣ、および／またはバガスアッセイ）に適用でき、既知量のセロビオースを外からアッセイ混合物に添加することを伴う。別の間接的方法は、過剰量のβ−グルコシダーゼ（ＢＧ）をＰＡＳＣアッセイおよびバガスアッセイに添加することを伴う（一般に、１ｍｇのβ−グルコシダーゼ／ｇ装填固体）。ＢＧは、これらのアッセイに際して生成するセロビオースを酵素加水分解するであろう；したがって、ＢＧの存在下でのＣＢＨ  Ｉ活性をセロビオースの非存在下での活性の尺度とみなすことができる。さらに、ＢＧの存在下と非存在下での活性が同様である場合、これはセロビオースに対する耐容性を示す。明らかであるが、ＢＧ活性が望ましくないけれども粗製ＣＢＨ  Ｉ酵素調製物中に存在する可能性がある場合は、ＢＧ阻害剤であるグルコノラクトンをＣＢＨ  Ｉアッセイに添加して、セロビオース分解を阻止することができる。
【００８１】
6.2.ライブラリースクリーニングアッセイ
[0086]  改善された生産物耐容性を備えたバリアントを同定するために、野生型ＣＢＨ  ＩポリペプチドＢＤ２９５５５を変異誘発した。ＢＤ２９５５５バリアントの小規模（６０のメンバー）ライブラリーを設計して、生産物阻害が低減したバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドを同定した。この生産物離脱部位ライブラリーは、セロビオースとの相互作用が減弱したバリアントを同定するために、セロビオース産物と直接相互作用する残基であってそこから生産物が野生型酵素より容易に離脱する残基に基づいて設計された。６０メンバーの進化ライブラリーは、ＢＤ２９５５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の位置Ｒ２７３、Ｗ４０５およびＲ４２２における野生型残基および変異を含み、下記の置換を含んでいた：Ｒ２７３（ＷＴ）、Ｒ２７３Ｑ、Ｒ２７３Ｋ、Ｒ２７３Ａ、Ｗ４０５（ＷＴ）、Ｗ４０５Ｑ、Ｗ４０５Ｈ、Ｒ４２２（ＷＴ）、Ｒ４２２Ｑ、Ｒ４２２Ｋ、Ｒ４２２Ｌ、およびＲ４２２Ｅ（位置２７３における４バリアント×位置４０５における３バリアント×位置４２２における５バリアント＝合計６０のバリアント）。ライブラリーの全メンバーを、４−ＭＵＬアッセイを用いて、２５０ｇ／Ｌのセロビオースの存在下および非存在下で、ＢＧ活性をいずれも阻害するためのグルコノラクトンを用いてスクリーニングした。Ｒ２７３Ａ、Ｒ２７３Ｑ、およびＲ２７３Ｋ／Ｒ４２２Ｋバリアントは、増強された生産物耐容性を示した。Ｒ２７３Ｋ／Ｒ４２２Ｋバリアントは、バリアント間で最大の活性、および２５０ｍｇ／Ｌのセロビオース耐容性を示した。Ｒ２７３Ｋバリアントは発現が低いため、生産物阻害試験を行なわなかった。
【００８２】
6.3.ＢＤ２９５５５の生産物耐容性バリアントの特性分析
[0087]  Ｒ２７３Ｋ／Ｒ４２２Ｋ置換を、野生型ＢＤ２９５５５バックグラウンドと、拡張した生産物離脱部位進化ライブラリーのスクリーニングで同定された置換Ｙ２７４Ｑ、Ｄ２８１Ｋ、Ｙ４１０Ｈ、Ｐ４１１Ｇとの組合わせの両方で特性分析した。
【００８３】
[0088]  野生型、Ｒ２７３Ｋ／Ｒ４２２ＫバリアントおよびＲ２７３Ｋ／Ｙ２７４Ｑ／Ｄ２８１Ｋ／Ｙ４１０Ｈ／Ｐ４１１Ｇ／Ｒ４２２Ｋバリアントを、４−ＭＵＬに対する活性について、２５０ｇ／Ｌのセロビオースの存在下および非存在下で試験し、Ｒ２７３Ｋ／Ｒ４２２ＫバリアントはＢＧの存在下および非存在下でのバガスアッセイにおいても試験した。結果を表５にまとめる。
【００８４】
[0089]  これらの活性アッセイからの結果を、セロビオースの存在下および非存在下で残留する活性のパーセントに換算し、その際、１００％に近い値はセロビオース耐容性を示した。ＭＵＬアッセイにおいて、セロビオースの非存在下と対比してセロビオース存在下で残留する活性のパーセントは、Ｒ２７３Ｋ／Ｒ４２２Ｋバリアントが最も耐容性であり、続いてＲ２７３Ｋ／Ｙ２７４Ｑ／Ｄ２８１Ｋ／Ｙ４１０Ｈ／Ｐ４１１Ｇ／Ｒ４２２Ｋバリアント、次いで野生型が、それぞれ９５％、７８％、および２５％の活性であったことを示す。
【００８５】
[0090]  ＢＤ２９５５５の野生型およびＲ２７３Ｋ／Ｒ４２２Ｋバリアントのセロビオース用量応答曲線を４−ＭＵＬアッセイに際して求めた。酵素速度（Ｖｏ）を、種々の濃度のセロビオースの存在下で測定した（２００ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６，２５℃）。速度を四連で測定した。結果を図１Ａ〜１Ｂに示す。図１Ａは、野生型ＢＤ２９５５がセロビオースによって半最大阻害濃度（ＩＣ５０値）６０ｍｇ／Ｌで阻害されることを示す。図１Ｂは、Ｒ２７３Ｋ／Ｒ４２２Ｋバリアントが２５０ｍｇ／Ｌまでのセロビオースに対して耐容性であることを示す。
【００８６】
[0091]  表５（ＢＧの存在下と対比して非存在下で残留する活性のパーセントを列挙する）に示すバガスアッセイ結果も、野生型ＢＤ２９５５５の活性パーセントがＲ２７３Ｋ／Ｒ４２２Ｋバリアントの活性パーセントより低いことを証明し、これは、セロビオースの存在に対してＲ２７３Ｋ／Ｒ４２２Ｋバリアントが野生型より感受性が低いことを示す。図２Ａ〜２Ｂは、ＢＤ２９５５５対Ｒ２７３Ｋ／Ｒ４２２Ｋバリアントのバガスアッセイについての棒グラフデータを示す。図２Ａにおいて、棒は相対活性を示し、それらはセロビオースの非存在下での野生型活性に対して正規化されている（ＷＴ＋ＢＧ＝非阻害活性＝１）。図２Ｂにおいて、棒はセロビオースの存在下での活性（−ＢＧ）とセロビオースの非存在下での活性（＋ＢＧ）の比により表わした、セロビオースに対する耐容性を示す；１に近い比は、セロビオースに対する耐容性がより大きいことを示す。これらのデータも、ＢＤ２９５５５のＲ２７３Ｋ／Ｒ４２２Ｋバリアントが野生型ＢＤ２９５５５よりセロビオースに対してより耐容性であることを証明する。
【００８７】
[0092]  野生型およびＲ２７３Ｋ／Ｒ４２２ＫバリアントをＰＡＳＣアッセイにおいても特性分析した。結果を図３に示す。野生型ＢＤ２９５５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および野生型トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の両方の活性が約１ｇ／Ｌのセロビオース濃度から阻害され始め（ＩＣ５０値はそれぞれ２．２および３ｇ／Ｌ）、これに対しＲ２７３Ｋ／Ｒ４２２Ｋバリアントは１０ｇ／Ｌのセロビオースの存在下でほとんど阻害を示さなかった。
【００８８】
6.4.トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  Ｉの生産物耐容性バリアントの特性分析
[0093]  セロビオース生産物耐容性置換をトリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）に導入した。Ｒ２６８およびＲ４１１にアラニンおよびリジンの単一または二重置換をもつバリアントのパネルを発現させ、分析した。これらのバリアントを４−ＭＵＬに対する活性について、２５０ｍｇ／Ｌのセロビオースの存在下および非存在下で、またバガスアッセイにおいてＢＧの存在下および非存在下で試験した。これらのアッセイからの結果を、それぞれセロビオースおよびＢＧの存在下および非存在下で残留する活性のパーセントに換算した。数値を表６にまとめる。
【００８９】
[0094]  表６に示す４−ＭＵＬアッセイ結果は、野生型トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  Ｉの活性がセロビオースの存在下で２３％に低下し、これに対しＲ２６８およびＲ４１１における二重変異体は同じ条件下で９０％を超える活性を保持していたことを証明する。
【００９０】
[0095]  表６に示すバガスアッセイの結果は、野生型トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  Ｉの活性が、ＢＧの存在によって、単一または二重置換バリアントの活性より著しい影響を受けることを示し、これはこれらのバリアントがセロビオースの蓄積に対して野生型より感受性が低いことを示す。図４および５は、バリアントと対比した野生型トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  Ｉのバガスアッセイについての棒グラフデータを示す。図４において、棒は相対活性を示し、それらはセロビオースの非存在下での野生型活性に対して正規化されている（ＷＴ＋ＢＧ＝１）。図５において、棒は蓄積セロビオースの存在下での活性（−ＢＧ）とセロビオースの非存在下での活性（＋ＢＧ）の比により表わした、セロビオースに対する耐容性を示す；１に近い比は、セロビオースに対する耐容性がより大きいことを示す。
【００９１】
7.具体的態様および援用
[0096]  本明細書に引用するすべての刊行物、特許、特許出願、および他の文書は、それぞれの刊行物、特許、特許出願、および他の文書が個々にあらゆる目的で本明細書に援用されると示されたのと同程度に、あらゆる目的でその全体が本明細書に援用される。
【００９２】
[0097]  多様な具体的態様を説明および記載したが、本発明（単数または複数）の精神および範囲から逸脱することなく多様な変更をなしうることは認識されるであろう。
【００９３】
【表１−１】
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【００９４】
【表１−２】
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【００９５】
【表１−３】
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【００９６】
【表１−４】
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【００９７】
【表１−５】
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【００９８】
【表１−６】
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【００９９】
【表１−７】
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【０１００】
【表１−８】
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【０１０１】
【表１−９】
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【０１０２】
【表１−１０】
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【０１０３】
【表１−１１】
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【０１０４】
【表１−１２】
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【０１０５】
【表１−１３】
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【０１０６】
【表１−１４】
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【０１０７】
【表１−１５】
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【０１０８】
【表１−１６】
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【０１０９】
【表１−１７】
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【０１１０】
【表１−１８】
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【０１１１】
【表１−１９】
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【０１１２】
【表１−２０】
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【０１１３】
【表１−２１】
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【０１１４】
【表１−２２】
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【０１１５】
【表１−２３】
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【０１１６】
【表１−２４】
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【０１１７】
【表１−２５】
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【０１１８】
【表１−２６】
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【０１１９】
【表１−２７】
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【０１２０】
【表１−２８】
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【０１２１】
【表１−２９】
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【０１２２】
【表１−３０】
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【０１２３】
【表１−３１】
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【０１２４】
【表１−３２】
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【０１２５】
【表１−３３】
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【０１２６】
【表１−３４】
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【０１２７】
【表１−３５】
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【０１２８】
【表１−３６】
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【０１２９】
【表２−１】
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【０１３０】
【表２−２】
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【０１３１】
【表２−３】
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【０１３２】
【表２−４】
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【０１３３】
【表２−５】
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【０１３４】
【表２−６】
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【０１３５】
【表３−１】
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【０１３６】
【表３−２】
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【０１３７】
【表３−３】
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【０１３８】
【表３−４】
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【０１３９】
【表３−５】
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【０１４０】
【表３−６】
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【０１４１】
【表３−７】
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【０１４２】
【表３−８】
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【０１４３】
【表４−１】
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【０１４４】
【表４−２】
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【０１４５】
【表４−３】
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【０１４６】
【表４−４】
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【０１４７】
【表４−５】
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【０１４８】
【表４−６】
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【０１４９】
【表４−７】
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【０１５０】
【表４−８】
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【０１５１】
【表４−９】
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【０１５２】
【表４−１０】
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【表４−１１】
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【０１５４】
【表４−１２】
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【０１５５】
【表４−１３】
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【０１５６】
【表４−１４】
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【０１５７】
【表５】
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【０１５８】
【表６】
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【０１５９】
【表７−１】
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【０１６０】
【表７−２】
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【０１６１】
【表７−３】
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【０１６２】
【表７−４】
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【０１６３】
【表７−５】
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【０１６４】
【表７−６】
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【０１６５】
【表７−７】
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【０１６６】
【表７−８】
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【０１６７】
【表７−９】
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【０１６８】
【表７−１０】
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【０１６９】
【表７−１１】
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【０１７０】
【表７−１２】
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【０１７１】
【表７−１３】
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【０１７２】
【表７−１４】
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【表７−１５】
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【０１７４】
【表７−１６】
2014502145.tif 000084
【０１７５】
【表７−１７】
2014502145.tif 000085
【０１７６】
【表７−１８】
2014502145.tif 000086
【０１７７】
【表７−１９】
2014502145.tif 000087
【０１７８】
【表７−２０】
2014502145.tif 000088
【０１７９】
【表７−２１】
2014502145.tif 000089
【０１８０】
【表７−２２】
2014502145.tif 000090
【０１８１】
【表７−２３】
2014502145.tif 000091
【０１８２】
【表７−２４】
2014502145.tif 000092
【０１８３】
【表７−２５】
2014502145.tif 000093
【０１８４】
【表７−２６】
2014502145.tif 000094
【図１】
2014502145.tif 000095
【図２】
2014502145.tif 000096
【図４】
2014502145.tif 000097
【図５】
2014502145.tif 000098
【図３】
2014502145.tif 000099
【誤訳訂正書】
【提出日】平成25年6月11日(2013.6.11)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００５】
[0004]  セロビオヒドロラーゼは、それらの直接生産物であるセロビオースによる阻害を受けやすく、その結果、生産物が蓄積するのに伴って糖化反応の速度が低下する。セルロースの発酵性糖への転化における使用のため、そしてパルプおよび紙、編織物ならびに動物飼料などのセルロース材料処理の関連分野のため、糖化反応の過程においてその反応速度を維持する、改善された生産性を備えた新たな改善されたセロビオヒドロラーゼが必要とされている。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００９】
[0008]  本発明のバリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、一般に表１に例示する基準ＣＢＨ  ＩのＣＤに対して少なくとも５０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含むＣＤを含む。表１に例示するＣＢＨ  ＩポリペプチドのＣＤ部分を表３に示す。バリアントＣＢＨ  Ｉポリペプチドは、触媒ドメイン（“ＣＤ”）配列のほかに、セルロース結合ドメイン（“ＣＢＤ”）配列をもつことができる。ＣＢＤはＣＤに対してＮ−またはＣ−末端側のいずれにあってもよく、ＣＢＤとＣＤは場合によりリンカー配列を介して連結している。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１６】
[0020]  表１：代表的な“基準”ＣＢＨ  Ｉポリペプチドのアミノ酸配列であり、これらをトリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）のＲ２６８および／またはＲ４１１に対応する位置において修飾することができる。データベースアクセッション番号を第２欄に示す。別に指示しない限り、アクセッション番号はＧｅｎｂａｎｋデータベースを参照する。“＃”は、そのＣＢＨ  Ｉがシグナルペプチドをもたないことを示す；“＆”は、その配列がＰＤＢデータベースからのものであってシグナル配列をもたない触媒ドメインのみを表すことを示す；＊は、非公開データベースを示す。これらのアミノ酸配列は、タンパク質結晶化を促進する変異を含むＰＤＢデータベースからの若干の配列を除いて、大部分が野生型である。
[0021]  表２：代表的な基準ＣＢＨ  Ｉポリペプチドにおける、トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  ＩのＲ２６８およびＲ４１１に対応するアミノ酸位置。データベース識別子は表１についてのものと同様である。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２１】
[0026]  表７：非公式配列リスト。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−１４９は代表的な基準ＣＢＨ  Ｉポリペプチドに対応する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９９は、Ｒ２６８Ａ置換をもつ成熟トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸２６−５２９）に対応する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３００は、Ｒ４１１Ａ置換をもつ成熟トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ  Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸２６−５２９）に対応する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０１は、Ｒ２６８Ｋ置換およびＲ４１１Ｋ置換の両方をもつ全長ＢＤ２９５５５に対応する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０２は、Ｒ２６８Ｋ置換およびＲ４１１Ｋ置換の両方をもつ成熟ＢＤ２９５５５に対応する。
【国際調査報告】
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