(57)【要約】  ウイルスに感染した宿主細胞におけるウイルス生産を改良するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスを生産するために適当な条件下でウイルスに感染した宿主細胞を培養する工程を含むウイルスを生産するための方法であって、該条件は、ウイルス生産を可能にするために有効な量および時間で脂肪酸を含む、方法。
【請求項２】
ウイルスが、脂肪酸なしで行われる方法において生産されるウイルスと比較して、脂肪酸の存在下でより多い量で生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
条件が脂肪酸およびコレステロールの存在を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ウイルスが、脂肪酸およびコレステロールなしで行われる方法において生産されるウイルスと比較して、脂肪酸およびコレステロールの存在下でより多い量で生産される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
条件がスカベンジング化合物をさらに含む、請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項６】
ウイルスが、スカベンジャー化合物なしで行われる方法において生産されるウイルスと比較して、スカベンジャー化合物の存在下でより多い量で生産される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
条件が、最大１つの脂肪酸を含む、請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
条件が、最大２つの脂肪酸を含む、請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
条件が、最大３つの脂肪酸を含む、請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
条件が、最大４つの脂肪酸を含む、請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
条件が、少なくとも２つの異なる脂肪酸を含む、請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
条件が、少なくとも３つの異なる脂肪酸を含む、請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
条件が、少なくとも４つの異なる脂肪酸を含む、請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
条件が、４つまたはそれ以上の異なる脂肪酸を含む、請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
脂肪酸またはそれぞれの脂肪酸が、培養物に導入されるとき、本質的に均質である、請求項１−１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ウイルスを細胞培養培地から単離する工程をさらに含む、請求項１−１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ウイルスを宿主細胞から単離する工程をさらに含む、請求項１−１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
宿主細胞をウイルスで感染する工程をさらに含む、請求項１−１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
宿主細胞をウイルス感染細胞と共培養することによる宿主細胞を感染する工程をさらに含む、請求項１−１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
宿主細胞をウイルスで感染する前に、約８０％のコンフルエンス、約７０％のコンフルエンス、約６０％のコンフルエンス、約５０％のコンフルエンス、または５０％未満のコンフルエンスにまで宿主細胞を増殖する工程をさらに含む、請求項１−１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
宿主細胞をウイルスで感染する前に、コンフルエンスまたは９０％のコンフルエンスにまで宿主細胞を増殖する工程をさらに含む、請求項１−１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
宿主細胞をウイルスで感染した後に、宿主細胞を培養する工程をさらに含む、請求項１−２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
ウイルスを単離する前に、宿主細胞に対する増殖培地を添加または変化する工程をさらに含む、請求項１−２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
吸着期間中、宿主細胞を感染ウイルスとインキュベートする工程をさらに含む、請求項１８−２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
培地を添加または変化する工程中、脂肪酸、コレステロールおよび／またはスカベンジング化合物を導入する工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
宿主細胞をウイルスまたはウイルス感染細胞で感染する前に、脂肪酸、コレステロールおよび／またはスカベンジング化合物を導入する工程をさらに含む、請求項１８−２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
宿主細胞をウイルスで感染した後に、脂肪酸、コレステロールおよび／またはスカベンジング化合物を導入する工程をさらに含む、請求項１８−２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
細胞を培養する工程中、脂肪酸、コレステロールおよび／またはスカベンジング化合物を２回以上導入する工程をさらに含む、請求項１−２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
ウイルスを単離する前に、宿主細胞を凍結する工程をさらに含む、請求項１−２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
宿主細胞を凍結しないで、ウイルスを単離する工程をさらに含む、請求項１−２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
宿主細胞を破壊して、ウイルスを単離する工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
宿主細胞の破壊が、加圧型細胞破壊装置(French press)、超音波処理、または凍結／解凍循環を使用して行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
宿主細胞がウイルス感染しやすい、請求項１−３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
宿主細胞が哺乳動物である、請求項１−３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
宿主細胞がヒトである、請求項１−３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
宿主細胞が繊維芽細胞または上皮細胞である、請求項１−３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
宿主細胞がＭＲＣ５細胞、網膜細胞またはＡＲＰＥ−１９細胞である、請求項１−３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
ウイルスがエンベロープウイルスである、請求項１−３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
ウイルスがエンベロープＤＮＡウイルスまたはエンベロープＲＮＡウイルスである、請求項１−３７のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
ウイルスがヘルペスウイルスである、請求項１−３７のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
ウイルスがアルファファミリーヘルペスウイルスである、請求項１−３７のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
ウイルスがベータファミリーヘルペスウイルスである、請求項１−３７のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
ウイルスがガンマファミリーヘルペスウイルスである、請求項１−３７のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
ウイルスがＶＺＶである、請求項１−３７のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
ウイルスがＣＭＶである、請求項１−３７のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
ウイルスがＲＮＡウイルス、非エンベロープＲＮＡウイルス、エンベロープＲＮＡウイルス、ＤＮＡウイルス、非エンベロープＤＮＡウイルス、およびエンベロープＤＮＡウイルス、ポックスウイルス、ピコルナウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタインバー(Epstein Barr)ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デングウイルス、ＨＩＶ、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、ロタウイルスおよび／またはパラインフルエンザウイルスである、請求項１−３７のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
コレステロールがコレステロール誘導体である、請求項１−４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
コレステロールがコレステロールエステルである、請求項１−４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
脂肪酸が長鎖脂肪酸または超長鎖脂肪酸である、請求項１−４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
脂肪酸がオメガ−３脂肪酸である、請求項１−４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
脂肪酸がオメガ−６脂肪酸である、請求項１−４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
脂肪酸が天然脂肪酸である、請求項１−５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
脂肪酸が天然脂肪酸の誘導体である、請求項１−５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
脂肪酸が非天然脂肪酸である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
脂肪酸が遊離脂肪酸である、請求項１−５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
脂肪酸が脂肪酸エステルである、請求項１−５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
脂肪酸が脂肪酸誘導体である、請求項１−５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
脂肪酸誘導体がトリグリセリドである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
脂肪酸誘導体がジグリセリドである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
脂肪酸誘導体がモノグリセリドである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
脂肪酸誘導体がリン脂質(phopspholipid) である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
脂肪酸が少なくとも１８個の炭素を有する、請求項１−６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
脂肪酸が少なくとも２０個の炭素を有する、請求項１−６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
脂肪酸が少なくとも２２個の炭素を有する、請求項１−６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
脂肪酸が少なくとも２４個の炭素を有する、請求項１−６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
脂肪酸が少なくとも２６個の炭素を有する、請求項１−６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
脂肪酸が少なくとも２８個の炭素を有する、請求項１−６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】
脂肪酸が少なくとも３０個の炭素を有する、請求項１−６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
脂肪酸が少なくとも３２個の炭素を有する、請求項１−６１のいずれかに記載の方法。
【請求項７０】
脂肪酸が少なくとも３４個の炭素を有する、請求項１−６１のいずれかに記載の方法。
【請求項７１】
脂肪酸が少なくとも３６個の炭素を有する、請求項１−６１のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
脂肪酸が少なくとも３８個の炭素を有する、請求項１−６１のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
脂肪酸が少なくとも４０個の炭素を有する、請求項１−６１のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
脂肪酸が飽和である、請求項１−７３のいずれかに記載の方法。
【請求項７５】
脂肪酸が不飽和である、請求項１−７３のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
脂肪酸がポリ不飽和である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
脂肪酸が１つまたはそれ以上の二重結合を有する、請求項７５−７６のいずれかに記載の方法。
【請求項７８】
脂肪酸が２つまたはそれ以上の二重結合を有する、請求項７５−７７のいずれかに記載の方法。
【請求項７９】
脂肪酸が３つまたはそれ以上の二重結合を有する、請求項７５−７８のいずれかに記載の方法。
【請求項８０】
脂肪酸が４つまたはそれ以上の二重結合を有する、請求項７５−７９のいずれかに記載の方法。
【請求項８１】
脂肪酸が５つまたはそれ以上の二重結合を有する、請求項７５−８０のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
脂肪酸が６つまたはそれ以上の二重結合を有する、請求項７５−８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
脂肪酸が７つまたはそれ以上の二重結合を有する、請求項７５−８２のいずれかに記載の方法。
【請求項８４】
脂肪酸が８つまたはそれ以上の二重結合を有する、請求項７５−８３のいずれかに記載の方法。
【請求項８５】
脂肪酸が９つまたはそれ以上の二重結合を有する、請求項７５−８４のいずれかに記載の方法。
【請求項８６】
脂肪酸が１０個またはそれ以上の二重結合を有する、請求項７５−８５のいずれかに記載の方法。
【請求項８７】
脂肪酸が１１個またはそれ以上の二重結合を有する、請求項７５−８６のいずれかに記載の方法。
【請求項８８】
脂肪酸が１２個またはそれ以上の二重結合を有する、請求項７５−８７のいずれかに記載の方法。
【請求項８９】
脂肪酸がリノール酸（ＬＡ）、α−リノレン酸（ＬＬＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、アラキドン酸（ＡＡ）、ヘキサコサン酸（ＨＳＡ）およびオクタコサン酸（ＯＳＡ）からなる群から選択される、請求項１−４８のいずれかに記載の方法。
【請求項９０】
脂肪酸および／またはコレステロールが、細胞への送達および／または細胞における取込みを改良する混合物中で製剤化される、請求項１−８９のいずれかに記載の方法。
【請求項９１】
脂肪酸および／またはコレステロールがポリマーと結合している、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
ポリマーがタンパク質または合成ポリマーである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
脂肪酸および／またはコレステロールが小分子と結合している、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
スカベンジング化合物がカルボニルスカベンジング化合物または遊離基スカベンジング化合物である、請求項２−９３のいずれかに記載の方法。
【請求項９５】
カルボニルスカベンジング化合物および遊離基スカベンジング化合物をさらに含む、請求項２−９４のいずれかに記載の方法。
【請求項９６】
スカベンジング化合物がアミノグアニジン、アルファ−トコフェロール、ヒドララジン、グリコシルイソビテキシン、Ｎ−アセチル−システイン、メトホルミン、ペニシラミン、ピリドキサミン、エダラボン（ＥＤＡ）、テニルセタム(tenilsetam)、リポ酸、３，３−ジメチル−Ｄ−システイン（ＤＭＣ）、Ｌ−３，３−ジメチル−Ｄ−システイン（Ｌ−ＤＭＣ）、Ｎ−アセチル−３，３−ジメチル−Ｄ−システイン（ＡＤＭＣ）、Ｎα−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、３，３−ジメチル−Ｄ−システイン−ジスルフィド（ＤＭＣＳＳ）、Ｓ−メチル−ＤＭＣ（ＳＭＤＭＣ）、Ｌ−システイン（ＣＹＳ）、Ｌ−システイン−Ｏ−メチルエステル（ＣＹＳＭ）、３，３−ジメチル−Ｄ−システイン−メチルエステル（ＤＭＣＭ）、３−メチル−３−エチル−Ｄ−システイン（ＭＥＣ）、セミカルバジド塩酸塩ＳＣ（ヒドラジン  カルボキサミド）、１，１−ジメチル−ビグアニド塩酸塩（ＤＭＢＧ）、Ｎ−ｔｅｒｔブチルヒドロキシルアミン（ＢＨＡ）、フラボノイド、フラバノール、エピカテキン、フラバノン、ナリンゲニン、フラボノール、ケルセチン、フラボン(flavones)、ルテオリン、イソフラボン、ゲニステイン、アントシアニジン、シアニジン、フェノール／フェノール酸、フラバン(flavan)−３−オール化合物、プロシアニジン  Ｂ１（９．８）、プロシアニジン  Ｂ２、（＋）−カテキン、（−）−エピカテキン、カフタル酸、カフェ酸、およびケンペロールからなる群から選択される、請求項２−９５のいずれかに記載の方法。
【請求項９７】
脂肪酸が少なくとも５μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１５μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも２５μＭ、少なくとも３０μＭ、少なくとも３５μＭ、少なくとも４０μＭ、少なくとも４５μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも５５μＭ、少なくとも６０μＭ、少なくとも６５μＭ、少なくとも７０μＭ、少なくとも７５μＭ、少なくとも８０μＭ、少なくとも８５μＭ、少なくとも９０μＭ、少なくとも９５μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも１１０μＭ、少なくとも１２０μＭ、少なくとも１３０μＭ、少なくとも１４０μＭ、少なくとも１５０μＭまたはそれ以上の濃度で存在し、脂肪酸が５００μＭ以下の濃度または宿主細胞に毒性でない濃度で存在する、請求項１−９６のいずれかに記載の方法。
【請求項９８】
コレステロールが少なくとも５μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１５μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも２５μＭ、少なくとも３０μＭ、少なくとも３５μＭ、少なくとも４０μＭ、少なくとも４５μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも５５μＭ、少なくとも６０μＭ、少なくとも６５μＭ、少なくとも７０μＭ、少なくとも７５μＭ、少なくとも８０μＭ、少なくとも８５μＭ、少なくとも９０μＭ、少なくとも９５μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも１１０μＭ、少なくとも１２０μＭ、少なくとも１３０μＭ、少なくとも１４０μＭ、少なくとも１５０μＭまたはそれ以上の濃度で存在し、コレステロールが５００μＭ以下の濃度または宿主細胞に毒性でない濃度で存在する、請求項１−９７のいずれかに記載の方法。
【請求項９９】
スカベンジング化合物が少なくとも１μＭ、少なくとも２μＭ、少なくとも３μＭ、少なくとも４μＭ、少なくとも５μＭ、少なくとも６μＭ、少なくとも７μＭ、少なくとも８μＭ、少なくとも９μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１５μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも２５μＭ、少なくとも３０μＭ、少なくとも３５μＭ、少なくとも４０μＭ、少なくとも４５μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも５５μＭ、少なくとも６０μＭ、少なくとも６５μＭ、少なくとも７０μＭ、少なくとも７５μＭ、少なくとも８０μＭ、少なくとも８５μＭ、少なくとも９０μＭ、少なくとも９５μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも１１０μＭ、少なくとも１２０μＭ、少なくとも１３０μＭ、少なくとも１４０μＭ、少なくとも１５０μＭまたはそれ以上の濃度で存在し、スカベンジング化合物が５００μＭ以下の濃度または宿主細胞に毒性でない濃度で存在する、請求項２−９８のいずれかに記載の方法。
【請求項１００】
脂肪酸が最大５μＭ、最大１０μＭ、最大１５μＭ、最大２０μＭ、最大２５μＭ、最大３０μＭ、最大３５μＭ、最大４０μＭ、最大４５μＭ、最大５０μＭ、最大５５μＭ、最大６０μＭ、最大６５μＭ、最大７０μＭ、最大７５μＭ、最大８０μＭ、最大８５μＭ、最大９０μＭ、最大９５μＭ、最大１００μＭ、最大１１０μＭ、最大１２０μＭ、最大１３０μＭ、最大１４０μＭ、または最大１５０μＭの濃度で存在する、請求項１−９６、９８および９９のいずれかに記載の方法。
【請求項１０１】
コレステロールが最大５μＭ、最大１０μＭ、最大１５μＭ、最大２０μＭ、最大２５μＭ、最大３０μＭ、最大３５μＭ、最大４０μＭ、最大４５μＭ、最大５０μＭ、最大５５μＭ、最大６０μＭ、最大６５μＭ、最大７０μＭ、最大７５μＭ、最大８０μＭ、最大８５μＭ、最大９０μＭ、最大９５μＭ、最大１００μＭ、最大１１０μＭ、最大１２０μＭ、最大１３０μＭ、最大１４０μＭ、または最大１５０μＭの濃度で存在する、請求項１−９６、９９および１００のいずれかに記載の方法。
【請求項１０２】
スカベンジング化合物が最大５μＭ、最大１０μＭ、最大１５μＭ、最大２０μＭ、最大２５μＭ、最大３０μＭ、最大３５μＭ、最大４０μＭ、最大４５μＭ、最大５０μＭ、最大５５μＭ、最大６０μＭ、最大６５μＭ、最大７０μＭ、最大７５μＭ、最大８０μＭ、最大８５μＭ、最大９０μＭ、最大９５μＭ、最大１００μＭ、最大１１０μＭ、最大１２０μＭ、最大１３０μＭ、最大１４０μＭ、または最大１５０μＭの濃度で存在する、請求項１−９６、１００および１０１のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本願は、２０１１年４月１８日付け米国仮特許出願番号６１／４７６４９７の利益を主張し、この記載は、その全体において本明細書に包含させる。
【０００２】
政府支援の言及
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）により認可された認可番号ＡＩ０６８６７８、およびＮＩＨにより認可された認可番号ＣＡ８２３９６の下に政府支援で作られた。政府は、本発明に関して一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本願は、ウイルス生産のための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
十分なウイルス収量を得る能力が、ワクチン製造を制限し得るため、ウイルス生産の改善された方法は、いつも、重要な産業的および医学的ニーズにこたえるために必要とされる。以前の試験は（Mungerら PLoS Pathog 2:e132, 2006; Mungerら Nat Biotech 26:1179-86, 2008）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）が脂肪酸の合成を誘導すること、重要なことには、ウイルスが、最適な収量の感染性産物を産生するために、脂肪酸のデノボ合成を必要とすることを証明した。かかる理解にもかかわらず、米国特許第５，３６０，７３６号は、特定のウイルスの増殖中、特に培養細胞の感染の開始後に、脂質の添加がウイルス生産を阻害することを記載している。
【発明の概要】
【０００５】
貯蔵ウイルスの調製は、治療方法および材料の開発のために必要である。したがって、ウイルス生産に対する改善された方法は、ウイルス収量の改善、さらに具体的にはワクチン生産のために有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ＨＣＭＶ収量に対する、培地添加物としての異なる脂肪酸の効果。
【０００７】
【図２】ＨＣＭＶ収量に対する、カルボニル／遊離基スカベンジング化合物の効果。
【０００８】
【図３】ＶＺＶ収量に対する、細胞をＡＡまたはＤＨＡで補う効果。
【０００９】
【図４】αＴは、ＶＺＶ複製を容易にするＡＡおよびＤＨＡの能力を増強する。
【００１０】
【図５】ＶＺＶ収量に対する、異なる処理方法の効果。
【００１１】
【図６】ＶＺＶ収量に対する、細胞を脂肪酸の異なる組合せで補う効果。
【００１２】
【図７】コレステロールは、無細胞ＶＺＶ生産を容易にするＤＨＡの能力を増強する。
【００１３】
【図８】ウイルス粒子生産およびＶＺＶの感染性に対する、ＤＨＡおよびα−Ｔ処理の効果。
【００１４】
【図９】α−Ｔおよびコレステロールと組み合わせてＤＨＡで処理された細胞におけるＶＺＶの拡大。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の記載
培養細胞からのウイルス生産の収量を増加させるための方法が、本明細書において提供される。一般的に、脂肪酸の増殖培地への添加は、脂肪酸の非存在下で行われる同じ方法と比較して、培養における感染細胞において生産されるウイルスの収量を増加させる方法を提供する。該分野を考慮して、該方法は、日常的に実施される方法において予期されない改良を提供する。提供される方法は、培養における細胞の感染の前およびウイルス感染の後の両方で、細胞増殖および細胞維持の条件と関連する日常的に利用される変化と組み合わせて、米国特許５３６０７３６（記載している全てについてその全体を本願明細書に包含される）に記載されており、そして／または、ウイルス増殖およびウイルス貯蔵物の調製の当業者に知られているウイルス貯蔵物を回収、調製、安定化および保管する既知の方法と組み合わせて、有用である。
【００１６】
一般的な態様において、感染宿主細胞が、ウイルス生産を可能にするために適当な量の脂肪酸および時間の存在下で培養されるウイルス生産のための方法が、提供される。脂肪酸の非存在下で行われる同じ方法と比較して、ウイルス生産を増加させる方法を提供する。
【００１７】
したがって、ウイルスを生産するために適当な条件および時間下でウイルスに感染した宿主細胞を培養する工程を含むウイルスを生産するための方法であって、該条件は、ウイルス生産を可能にするために有効な量および時間で脂肪酸を含む方法を提供する。種々の局面において、ウイルスの生産は、（ｉ）感染性ウイルス粒子の数、（ｉｉ）ウイルス粒子、感染性および非感染性の数、（ｉｉｉ）特定のウイルス抗原の量、および／または（ｉｖ）（ｉ）−（ｉｉｉ）の組合せにより測定される。該方法は、脂肪酸を含まない条件下の同じ方法と比較して、ウイルス収量を増加させる。方法の種々の局面において、条件は、脂肪酸およびコレステロールの存在を含む。方法の種々の局面において、条件は、スカベンジング化合物をさらに含む。種々の局面において、方法は、最大１つの脂肪酸、最大２つの脂肪酸、最大３つの脂肪酸または最大４つの脂肪酸を含む条件下で行われる。方法の種々の局面において、条件は、少なくとも２つの異なる脂肪酸、少なくとも３つの異なる脂肪酸、少なくとも４つの異なる脂肪酸または４つまたはそれ以上の異なる脂肪酸を含む。種々の局面において、脂肪酸は本質的に均質である。「本質的に均質な」脂肪は、約５％以下の汚染脂肪酸を含むと定義される。説明の目的のための例および該目的のためのみに、本質的に均質な脂肪酸Ｘは、約５％以下の非脂肪酸Ｘを含み、ここで、非脂肪酸Ｘは脂肪酸Ｘではない脂肪酸である。
【００１８】
種々の局面において、提供される方法は、細胞培養培地から該ウイルスを単離する工程をさらに含む。種々の局面において、方法は、宿主細胞からウイルスを単離する工程をさらに含む。種々の局面において、方法は、宿主細胞をウイルスで感染する工程をさらに含む。種々の局面において、宿主細胞は、約１：２５から１．６２５の間の、約１：２５の、約１：１２５またはそれ以上の、または約１：７から１：６２５の間の感染の多重度（ＭＯＩ）で、感染の種々の多重度で、ウイルスに感染される。種々の局面において、提供される方法は、宿主細胞をウイルスで感染する前に、約９０％のコンフルエンス、約８０％のコンフルエンス、約７０％のコンフルエンス、約６０％のコンフルエンス、約５０％のコンフルエンス、または５０％のコンフルエンス未満までに宿主細胞を増殖する工程をさらに含む。種々の局面において、方法は、宿主細胞をウイルスで感染した後に、宿主細胞を培養する工程をさらに含む。種々の局面において、方法は、ウイルスを単離する前に、宿主細胞に対する増殖培地を添加または変化する工程をさらに含む。種々の局面において、方法は、吸着期間中、宿主細胞を感染ウイルスとインキュベートする工程をさらに含む。種々の局面において、方法は、培地を添加または変化する工程中、脂肪酸、コレステロールおよび／またはスカベンジング化合物を導入する工程をさらに含む。種々の局面において、方法は、宿主細胞をウイルスで感染する前に、脂肪酸、コレステロールおよび／またはスカベンジング化合物を導入する工程、および／または宿主細胞をウイルスで感染した後に、脂肪酸、コレステロールおよび／またはスカベンジング化合物を導入する工程をさらに含む。種々の局面において、方法は、細胞を培養する工程中、脂肪酸、コレステロールおよび／またはスカベンジング化合物を２回以上導入する工程をさらに含む。このような反復投与の利点は、プロセスにおけるあらゆる時点で毒性レベルに達することなしに望ましいレベルの収量増強成分を維持する能力、および、かかる収量増強化合物のレベルをウイルス複製の種々の段階の特定の要求に合わせる能力である。種々の局面において、方法は、ウイルスを単離する前に、宿主細胞を凍結する工程をさらに含む。種々の局面において、方法は、宿主細胞を凍結しないでウイルスを単離する工程をさらに含む。種々の局面において、方法は、宿主細胞を超音波処理し、ウイルスを単離する工程をさらに含む。
【００１９】
種々の局面において、方法は、ウイルスを単離する前に、宿主細胞を凍結する工程をさらに含む。種々の局面において、方法は、宿主細胞を凍結しないでウイルスを単離する工程をさらに含む。種々の局面において、方法は、宿主細胞を超音波処理し、ウイルスを単離する工程をさらに含む。
【００２０】
種々の局面において、方法は、ウイルスに感染しやすい宿主細胞、哺乳動物である宿主細胞、ヒトである宿主細胞、繊維芽細胞である宿主細胞、またはＭＲＣ５細胞である宿主細胞を利用する。種々の局面において、方法は、上皮細胞である宿主細胞、網膜細胞である宿主細胞、またはＡＲＰＥ−１９細胞である宿主細胞を利用する。当業者は、多くの種々の細胞型が、本願方法における使用に適しており、本願明細書により考慮されることは容易に理解される。
【００２１】
種々の局面において、方法は、エンベロープＤＮＡウイルス、ヘルペスウイルス、アルファファミリーヘルペスウイルス、ベータファミリーヘルペスウイルス、ガンマファミリーヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ポックスウイルス、非エンベロープピコルナウイルス、例えば、限定はしないが、ポリオウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、または口蹄疫ウイルス、ＲＮＡウイルス、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタインバー(Epstein Barr)ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デングウイルス、ＨＩＶ、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、ロタウイルスおよび／またはパラインフルエンザウイルスで使用され（生産される）。
【００２２】
種々の局面において、方法は、コレステロール誘導体またはコレステロールエステルであるコレステロールを利用する。
【００２３】
種々の局面において、方法は、長鎖脂肪酸または超長鎖脂肪酸、オメガ−３脂肪酸、オメガ−６脂肪酸、天然脂肪酸、天然脂肪酸の誘導体、非天然脂肪酸、遊離脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪酸誘導体、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、リン脂質、少なくとも１８個の炭素を有する脂肪酸、少なくとも２０個の炭素を有する脂肪酸、少なくとも２２個の炭素を有する脂肪酸、少なくとも２４個の炭素を有する脂肪酸、少なくとも２６個の炭素を有する脂肪酸、少なくとも２８個の炭素を有する脂肪酸、少なくとも３０個の炭素を有する脂肪酸、少なくとも３２個の炭素を有する脂肪酸、少なくとも３４個の炭素を有する脂肪酸、少なくとも３６個の炭素を有する脂肪酸、少なくとも３８個の炭素を有する脂肪酸、少なくとも４０個の炭素を有する脂肪酸、飽和である脂肪酸、不飽和である脂肪酸、ポリ不飽和である脂肪酸、１つまたはそれ以上の二重結合を有する脂肪酸、２つまたはそれ以上の二重結合を有する脂肪酸、３つおよび／またはそれ以上の二重結合を有する脂肪酸、４つまたはそれ以上の二重結合を有する脂肪酸、５つまたはそれ以上の二重結合を有する脂肪酸、６つおよび／またはそれ以上の二重結合を有する脂肪酸、７つまたはそれ以上の二重結合を有する脂肪酸、８つまたはそれ以上の二重結合を有する脂肪酸、９つまたはそれ以上の二重結合を有する脂肪酸、１０つまたはそれ以上の二重結合を有する脂肪酸、１１つまたはそれ以上の二重結合を有する脂肪酸、または１２つまたはそれ以上の二重結合を有する脂肪酸である脂肪酸を利用する。種々の局面において、脂肪酸は、オレイン酸（ＯＡ）、リノール酸（ＬＡ）、α−リノレン酸（ＬＬＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、アラキドン酸（ＡＡ）、ヘキサコサン酸（ＨＳＡ）、オクタコサン酸（ＯＳＡ）、α−リノレン酸および／またはγ−リノレン酸からなる群から選択される。
【００２４】
種々の局面において、方法は、細胞への送達および／または細胞における取込みを改良する混合物中で製剤化される脂肪酸および／またはコレステロールを利用する。種々の局面において、脂肪酸および／またはコレステロールはポリマーと結合している。種々の局面において、脂肪酸および／またはコレステロールはタンパク質および／または合成ポリマーと結合している。種々の局面において、脂肪酸および／またはコレステロールは小分子と結合している。種々の局面において、脂肪酸および／またはコレステロールはシクロデキストリンと結合している。
【００２５】
種々の局面において、方法は、カルボニルスカベンジング化合物および／または遊離基スカベンジング化合物であるスカベンジング化合物を利用する。種々の局面において、方法は、カルボニルスカベンジング化合物および遊離基スカベンジング化合物を利用する。種々の局面において、方法は、アミノグアニジン、アルファ−トコフェロール、ヒドララジン、グリコシルイソビテキシン、Ｎ−アセチル−システイン、メトホルミン、ペニシラミン、ピリドキサミン、エダラボン（ＥＤＡ）、テニルセタム(tenilsetam)、リポ酸、３，３−ジメチル−Ｄ−システイン（ＤＭＣ）、Ｌ−３，３−ジメチル−Ｄ−システイン（Ｌ−ＤＭＣ）、Ｎ−アセチル−３，３−ジメチル−Ｄ−システイン（ＡＤＭＣ）、Ｎα−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、３，３−ジメチル−Ｄ−システイン−ジスルフィド（ＤＭＣＳＳ）、Ｓ−メチル−ＤＭＣ（ＳＭＤＭＣ）、Ｌ−システイン（ＣＹＳ）、Ｌ−システイン−Ｏ−メチルエステル（ＣＹＳＭ）、３，３−ジメチル−Ｄ−システイン−メチルエステル（ＤＭＣＭ）、３−メチル−３−エチル−Ｄ−システイン（ＭＥＣ）、セミカルバジド塩酸塩ＳＣ（ヒドラジン  カルボキサミド）、１，１−ジメチル−ビグアニド塩酸塩（ＤＭＢＧ）、Ｎ−ｔｅｒｔブチルヒドロキシルアミン（ＢＨＡ）、フラボノイド、フラバノール、エピカテキン、フラバノン、ナリンゲニン、フラボノール、ケルセチン、フラボン(flavones)、ルテオリン、イソフラボン、ゲニステイン、アントシアニジン、シアニジン、フェノール／フェノール酸、フラバン(flavan)−３−オール化合物、プロシアニジン  Ｂ１（９．８）、プロシアニジン  Ｂ２、（＋）−カテキン、（−）−エピカテキン、カフタル酸、カフェ酸、およびケンペロールからなる群から選択されるスカベンジング化合物を利用する。
【００２６】
種々の局面において、方法は、少なくとも５μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１５μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも２５μＭ、少なくとも３０μＭ、少なくとも３５μＭ、少なくとも４０μＭ、少なくとも４５μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも５５μＭ、少なくとも６０μＭ、少なくとも６５μＭ、少なくとも７０μＭ、少なくとも７５μＭ、少なくとも８０μＭ、少なくとも８５μＭ、少なくとも９０μＭ、少なくとも９５μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも１１０μＭ、少なくとも１２０μＭ、少なくとも１３０μＭ、少なくとも１４０μＭ、少なくとも１５０μＭまたはそれ以上の濃度で存在する脂肪酸であって、５００μＭ以下の濃度または宿主細胞に毒性でない濃度で存在する脂肪酸を利用する。方法の局面は、約１μＭから約１００μＭ、約５μＭから約１００μＭ、約５μＭから約９０μＭ、約５μＭから約８５、約５μＭから約８０μＭ、約５μＭから約７５μＭ、約５μＭから約７０μＭ、約５μＭから約６５μＭ、約５μＭから約６０μＭ、約５μＭから約５５μＭ、または約５μＭから約５０μＭの範囲における脂肪酸の使用を含む。方法の局面はまた、約１μＭから約１００μＭ、約５μＭから約１００μＭ、約１０μＭから約１００μＭ、約１５μＭから約１００μＭ、約２０μＭから約１００μＭ、約２５μＭから約１００μＭ、約３０μＭから約１００μＭ、約３５μＭから約１００μＭ、約４０μＭから約１００μＭ、約４５μＭから約１００μＭ、または約５０μＭから約１００μＭの範囲における脂肪酸の使用を含む。方法の局面はまた、約１μＭから約１００μＭ、約５μＭから約９５μＭ、約１０μＭから約９０μＭ、約１５μＭから約８５μＭ、約２０μＭから約８０μＭ、約２５μＭから約７５μＭ、約３０μＭから約７０μＭ、約３５μＭから約６５μＭ、約４０μＭから約６０μＭ、または約４５μＭから約５５μＭの範囲における脂肪酸の使用を含む。
【００２７】
種々の局面において、方法は、少なくとも５μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１５μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも２５μＭ、少なくとも３０μＭ、少なくとも３５μＭ、少なくとも４０μＭ、少なくとも４５μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも５５μＭ、少なくとも６０μＭ、少なくとも６５μＭ、少なくとも７０μＭ、少なくとも７５μＭ、少なくとも８０μＭ、少なくとも８５μＭ、少なくとも９０μＭ、少なくとも９５μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも１１０μＭ、少なくとも１２０μＭ、少なくとも１３０μＭ、少なくとも１４０μＭ、少なくとも１５０μＭまたはそれ以上の濃度で存在するコレステロールであって、５００μＭ以下の濃度または宿主細胞に毒性でない濃度で存在するコレステロールを利用する。種々の局面において、コレステロールは、４５０μＭ、４００μＭ、３５０μＭ、３００μＭ、２５０μＭ、２００μＭまたは１５０μＭ未満の濃度で存在する。方法の局面は、約１μＭから約１００μＭ、約５μＭから約１００μＭ、約５μＭから約９０μＭ、約５μＭから約８５、約５μＭから約８０μＭ、約５μＭから約７５μＭ、約５μＭから約７０μＭ、約５μＭから約６５μＭ、約５μＭから約６０μＭ、約５μＭから約５５μＭ、または約５μＭから約５０μＭの範囲におけるコレステロールの使用を含む。方法の局面はまた、約１μＭから約１００μＭ、約５μＭから約１００μＭ、約１０μＭから約１００μＭ、約１５μＭから約１００μＭ、約２０μＭから約１００μＭ、約２５μＭから約１００μＭ、約３０μＭから約１００μＭ、約３５μＭから約１００μＭ、約４０μＭから約１００μＭ、約４５μＭから約１００μＭ、または約５０μＭから約１００μＭの範囲におけるコレステロールの使用を含む。方法の局面はまた、約１μＭから約１００μＭ、約５μＭから約９５μＭ、約１０μＭから約９０μＭ、約１５μＭから約８５μＭ、約２０μＭから約８０μＭ、約２５μＭから約７５μＭ、約３０μＭから約７０μＭ、約３５μＭから約６５μＭ、約４０μＭから約６０μＭ、または約４５μＭから約５５μＭの範囲におけるコレステロールの使用を含む。
【００２８】
種々の局面において、方法は、少なくとも５μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１５μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも２５μＭ、少なくとも３０μＭ、少なくとも３５μＭ、少なくとも４０μＭ、少なくとも４５μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも５５μＭ、少なくとも６０μＭ、少なくとも６５μＭ、少なくとも７０μＭ、少なくとも７５μＭ、少なくとも８０μＭ、少なくとも８５μＭ、少なくとも９０μＭ、少なくとも９５μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも１１０μＭ、少なくとも１２０μＭ、少なくとも１３０μＭ、少なくとも１４０μＭ、少なくとも１５０μＭまたはそれ以上の濃度で存在するスカベンジング化合物であって、５００μＭ以下の濃度または宿主細胞に毒性でない濃度で存在するスカベンジング化合物を利用する。種々の局面において、スカベンジャー化合物は、１０ｍＭ、９ｍＭ、８ｍＭ、７ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、９５０μＭ、９００μＭ、８５０μＭ、８００μＭ、７５０μＭ、７００μＭ、６５０μＭ、６００μＭ、５５０μＭ、５００μＭ、４５０μＭ，４００μＭ、３５０μＭ、３００μＭ、２５０μＭ、２００μＭまたは１５０μＭ未満の濃度で存在する。方法の局面は、約１μＭから約１０ｍＭ、約１μＭから約９ｍＭ、約１μＭから約８ｍＭ、約１μＭから約７ｍＭ、約１μＭから約６ｍＭ、約１μＭから約５ｍＭ、約１μＭから約４ｍＭ、約１μＭから約３ｍＭ、約１μＭから約２ｍＭ、約１μＭから約１ｍＭ、約１μＭから約９５０μＭ、約１μＭから約９００μＭ、約１μＭから約８５０μＭ、約１μＭから約８００μＭ、約１μＭから約７５０μＭ、約１μＭから約７００μＭ、約１μＭから約６５０μＭ、約１μＭから約６００μＭ、約１μＭから約５５０μＭ、約１μＭから約５００μＭ、約１μＭから約４５０μＭ、約１μＭから約４００μＭ、約１μＭから約３５０μＭ、約１μＭから約３００μＭ、約１μＭから約２５０μＭ、約１μＭから約２００μＭ、約１μＭから約１５０μＭ、約１μＭから約１００μＭ、約１μＭから約９５μＭ、約１μＭから約９０μＭ、約１μＭから約８５μＭ、約１μＭから約８０μＭ、約１μＭから約７５μＭ、約１μＭから約７０μＭ、約１μＭから約６５μＭ、約１μＭから約６０μＭ、約１μＭから約５５μＭ、約１μＭから約５０μＭ、約１μＭから約４５μＭ、約１μＭから約４０μＭ、約１μＭから約３５μＭ、約１μＭから約３０μＭ、約１μＭから約２５μＭ、約１μＭから約２０μＭ、約１μＭから約１５μＭ、または約１μＭから約１０μＭの範囲におけるスカベンジャー化合物の使用を含む。方法の局面はまた、約１μＭから約１０ｍＭ、約１０μＭから約１０ｍＭ、約２０μＭから約１０ｍＭ、約３０μＭから約１０ｍＭ、約４０μＭから約１０ｍＭ、約５０μＭから約１０ｍＭ、約６０μＭから約１０ｍＭ、約７０μＭから約１０ｍＭ、約８０μＭから約１０ｍＭ、約９０μＭから約１０ｍＭ、約１００μＭから約１０ｍＭ、約１５０μＭから約１０ｍＭ、約２００μＭから約１０ｍＭ、約２５０μＭから約１０ｍＭ、約３００μＭから約１０ｍＭ、約３５０μＭから約１０ｍＭ、約４００μＭから約１０ｍＭ、約４５０μＭから約１０ｍＭ、約５００μＭから約１０ｍＭ、約５５０μＭから約１０ｍＭ、約６００μＭから約１０ｍＭ、約６５０μＭから約１０ｍＭ、約７００μＭから約１０ｍＭ、約７５０μＭから約１０ｍＭ、約８００μＭから約１０ｍＭ、約８５０μＭから約１０ｍＭ、約９００μＭから約１０ｍＭ、約１ｍＭから約１０ｍＭ、約２ｍＭから約１０ｍＭ、約３ｍＭから約１０ｍＭ、約４ｍＭから約１０ｍＭ、約５ｍＭから約１０ｍＭ、約６ｍＭから約１０ｍＭ、約８ｍＭから約１０ｍＭ、または約９ｍＭから約１０ｍＭの範囲におけるスカベンジャー化合物の使用を含む。方法の局面はまた、約１μＭから約１０ｍＭ、約１０μＭから約１ｍＭ、約５０μＭから約９５０μＭ、約１００μＭから約９００μＭ、約１５０μＭから約８５０μＭ、約２００μＭから約８００μＭ、約２５０μＭから約７５０μＭ、約３００μＭから約７００μＭ、約３５０μＭから約６５０μＭ、約４００μＭから約６００μＭ、約４５０μＭから約５５０μＭ、または約４００μＭから約５００μＭの範囲におけるスカベンジャー化合物の使用を含む。
【００２９】
種々の局面において、方法は、最大５μＭ、最大１０μＭ、最大１５μＭ、最大２０μＭ、最大２５μＭ、最大３０μＭ、最大３５μＭ、最大４０μＭ、最大４５μＭ、最大５０μＭ、最大５５μＭ、最大６０μＭ、最大６５μＭ、最大７０μＭ、最大７５μＭ、最大８０μＭ、最大８５μＭ、最大９０μＭ、最大９５μＭ、最大１００μＭ、最大１１０μＭ、最大１２０μＭ、最大１３０μＭ、最大１４０μＭ、最大１５０μＭの濃度で存在する脂肪酸を利用する。
【００３０】
種々の局面において、方法は、最大５μＭ、最大１０μＭ、最大１５μＭ、最大２０μＭ、最大２５μＭ、最大３０μＭ、最大３５μＭ、最大４０μＭ、最大４５μＭ、最大５０μＭ、最大５５μＭ、最大６０μＭ、最大６５μＭ、最大７０μＭ、最大７５μＭ、最大８０μＭ、最大８５μＭ、最大９０μＭ、最大９５μＭ、最大１００μＭ、最大１１０μＭ、最大１２０μＭ、最大１３０μＭ、最大１４０μＭ、最大１５０μＭの濃度で存在するコレステロールを利用する。
【００３１】
種々の局面において、方法は、最大５μＭ、最大１０μＭ、最大１５μＭ、最大２０μＭ、最大２５μＭ、最大３０μＭ、最大３５μＭ、最大４０μＭ、最大４５μＭ、最大５０μＭ、最大５５μＭ、最大６０μＭ、最大６５μＭ、最大７０μＭ、最大７５μＭ、最大８０μＭ、最大８５μＭ、最大９０μＭ、最大９５μＭ、最大１００μＭ、最大１１０μＭ、最大１２０μＭ、最大１３０μＭ、最大１４０μＭ、最大１５０μＭの濃度で存在するスカベンジング化合物を利用する。
【００３２】
本発明のさらなる局面および詳細は、以下の実施例から明らかであり、これは、限定よりもむしろ説明であることを意図する。
【実施例】
【００３３】
実施例
実施例１
ＨＣＭＶの収量が改善され得る可能性を、感染ヒトＭＲＣ５繊維芽細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）の培地へ特定の脂肪酸を添加することにより試験した。
【００３４】
細胞を０．５感染単位／細胞の多重度でＨＣＭＶのＡＤ１６９株に感染させ、２時間の吸着期間の直後に、細胞を１０％のウシ胎仔血清、および、種々の脂肪酸、コレステロールおよびカルボニルスカベンジング化合物を含む培地（ダルベッコ改変イーグル培地、ＤＭＥＭ）で培養した。感染９６時間後、培地中の感染性ウイルスを、ＨＣＭＶ  ＩＥ１タンパク質に対する抗体を使用する蛍光フォーカスアッセイによりアッセイした。
【００３５】
簡潔には、約９０％コンフルエントのＭＲＣ５ヒト繊維芽細胞を、０．５ＩＵ／細胞の多重度でＨＣＭＶに感染させた。感染２時間後、培地を、１０％ウシ胎仔血清およびオレイン酸（ＯＡ、最大約１００μＭ）、リノール酸（ＬＡ、最大約１００μＭ）、α−リノレン酸（ＬＬＡ、最大約１００μＭ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、最大約７５μＭ）またはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、最大約５０μＭ）のいずれかを含む新鮮な培地と置き換えた。該実験はまた、アミノグアニジン（ＡＧ、最大約２５０μＭ）またはコレステロール（ｃｈｏｌ、最大約１３μＭ）のいずれかの存在下で実施した。感染９６時間後に、ウイルス生産をＭＲＣ−５細胞において蛍光フォーカスアッセイにより決定し、５×１０５感染単位であった非処理（ＮＴ）と比較して倍数変化として示した。倍数変化は、２回の独立した感染の平均である。結果は図１に示される。
【００３６】
図１において明らかなとおり、オレイン酸（ＯＡ）はＨＣＭＶの収量を減少させ；リノール酸（ＬＡ）は収量に対してほとんど効果を有さず；そして、α−リノレン酸（ＬＬＡ）は収量を約１．２倍に増加させた。エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は、それぞれ、ＨＣＭＶ収量を２．５および４．６倍に増加させた。さらに、アミノグアニジン単独はＨＣＭＶの収量を約２．６倍に増加させたが、該カルボニルスカベンジング化合物の添加によりもたらされる増加は、ＯＡ、ＬＡまたはＬＬＡの含有により減少された。対照的に、アミノグアニジンおよびＥＰＡは、いずれかの添加物単独よりもわずかに高い収量が得られ、アミノグアニジンおよびＤＨＡの組合せは、添加物なしまたはいずれかの添加物単独で成し遂げられるものよりも、収量を６．２倍の実質的に高い収量に増加させた。コレステロール単独（コレステロール溶液、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃Ｓ５４４２）の添加は、ＨＣＭＶ収量に対して影響を与えず、改善させず、いくつかの場合において、脂肪酸の増強効果を阻害した。これらの結果は、脂肪酸の添加が、培養されたＭＲＣ５繊維芽細胞から得られるＨＣＭＶの収量を増強することができ、該増強が、カルボニルスカベンジング化合物の含有によりさらに増強されることができることを示す。
【００３７】
実施例２
実施例１において行われた実験に沿って実験を、他の脂肪酸または脂肪酸誘導体（例えば、アラキドン酸（ＡＡ）またはその誘導体）の単独またはコレステロールまたはコレステロール誘導体と組み合わせての添加が、アミノグアニジンもしくは別のカルボニルスカベンジング化合物または遊離基スカベンジング化合物の存在または非存在下で、ＨＣＭＶの収量を増強することができるか否かを決定するために設計した。
【００３８】
簡潔には、約９０％コンフルエントのＭＲＣ５繊維芽細胞を、０．５ＩＵ／細胞の多重度でＨＣＭＶに感染させた。感染２時間後、培地を、１０％ウシ胎仔血清およびα−トコフェロール（α−Ｔ）またはアミノグアニジン（ＡＧ）を示された濃度で含む新鮮な培地と置き換えた。感染９６時間後に、ウイルス生産をＭＲＣ−５細胞において蛍光フォーカスアッセイにより決定し、非処理（ＮＴ）と比較して倍数変化として示した。倍数変化は、２回の独立した感染の平均である。結果は図２に示される。
【００３９】
該増強は、ＭＲＣ５繊維芽細胞、他の繊維芽細胞またはＨＣＭＶの増殖に適当な他の細胞型において観察することができた。代替脂肪酸、コレステロール、カルボニルスカベンジング化合物および細胞型がＨＣＭＶの生産を増強する範囲まで、本発明は、ウイルス増殖のプロセスにおけるこれらの使用を含む。図２は、アミノグアニジンに対して観察されるようなＨＣＭＶの生産を増強する第２のカルボニルスカベンジング化合物／遊離基スカベンジング化合物の例、アルファ−トコフェロール（αＴ）を示す。
【００４０】
さらに、細胞内で伸長および／または不飽和してＡＡまたはＤＨＡを生産することができる天然または人工脂肪酸の特定の製剤が、それぞれ、ＡＡまたはＤＨＡと置き換えるために使用される。
【００４１】
限定はしないが、本発明の典型的な態様は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、食事必須オメガ−３ポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、およびアミノグアニジン、カルボニルスカベンジング化合物で、ＭＲＣ５細胞を支持する培地を補足することを含む。
【００４２】
実施例３
ＶＺＶの収量がまた、特定の脂肪酸を感染ヒトＭＲＣ５繊維芽細胞の培地へ添加することにより改善され得る可能性を試験した。
【００４３】
該試験のために、ＭＲＣ５細胞（継代２０−２５）を、３００．０００細胞／１００ｍｍ培養皿の密度で播種し、１０％ウシ胎仔血清および２ｍＭのｇｌｕｔａｍａｘ（Invitrogen）を含む１５ｍｌのＤＭＥＭ中で３５℃で増殖した。脂質混合物（ＬＭ−１、１ｍｌ／リットル培地、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃  Ｌ５１４６）を、播種の時間または播種の次の日のいずれかで細胞に加えた。３日後、培養培地を、安定剤として５０ｍＭのスクロースを含む１０ｍｌの増殖培地と置き換えた。細胞をさらに３日間インキュベートし、増殖培地をスクロースを含まない新鮮な培地と置き換えた。細胞がコンフルエンスに達した後、それらを、感染細胞（１感染細胞／５０非感染細胞；感染細胞は、１０％のＤＭＳＯおよび９０％のウシ胎仔血清の溶液中で冷凍され、液体窒素に保存された調製物からであった）を加えることによりＶＺＶに感染させた。感染時、培養物に、１０％のウシ胎仔血清および２ｍＭのｇｌｕｔａｍａｘを含むＤＭＥＭを再び与えた。アラキドン酸（ＡＡ）＋アルファ−トコフェロール（αＴ）またはＤＨＡ＋αＴを示された時間に加えた。感染７２時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０ｍＭの塩化アンモニウムを含む１０ｍｌのＰＢＳ中で５０分間４℃でインキュベートした。細胞を回収し、ＰＳＧＣバッファー（Harperら Arch Virol 143:1163-70, 1998）を−８０℃で冷凍した。次に、感染性ウイルスを、ＡＲＰＥ−１９細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）における超音波処理された細胞のプラークアッセイにより定量した。結果は図３に示される。
【００４４】
結果は、感染前の細胞増殖中でのＬＭ−１の添加が、ウイルス収量をほぼ２倍に増強させたが、感染１日後の添加は、ウイルス生産を増強させなかったことを示す。しかしながら、感染後の種々の時点でのＡＡ＋αＴまたはＤＨＡ＋αＴの添加は、感染性ウイルスの生産を増強し、脂肪酸およびカルボニルスカベンジング化合物が感染１−６時間後に加えられたときにウイルス収量が最大の増強を生じた。
【００４５】
感染６時間後にＭＲＣ５細胞に加えられる脂肪酸およびαＴの量の量を変化させて、実験を繰り返し、結果は図４に示される。
【００４６】
簡潔には、これらの繰り返し実験において、ＭＲＣ５細胞を、ＭＯＩ＝１：５０にてＶＺＶに感染させた。ＡＡ、ＤＨＡおよびαＴを、示されるとおり６ｈｐｉにて細胞に加えた。感染７２時間後、細胞をＰＳＧＣバッファー中に回収し、後のプロセスのために−８０℃で冷凍した。解凍後、細胞を超音波処理し、無細胞ＶＺＶの収量を、ＡＲＰＥ−１９細胞における標準プラークアッセイにより定量した。非処理（ＮＴ）と比較した倍数変化を示す。（＊）は、該組成が、目視検査時に明らかとなった細胞毒性を生じたことを示す。倍数変化は、独立した感染の平均である。
【００４７】
図４に示されるとおり、カルボニルスカベンジング剤の非存在下で、２５μＭのＡＡはウイルスの収量を増強したが、１００μＭのＡＡはウイルス生産を阻害し；対照的に、αＴの存在下で、両方の用量のＡＡはウイルス収量を増加させ、１００μＭで５倍の最大増加を示した。同様に、２５μＭのＤＨＡ単独は収量を約１．５倍に増加させたが、２５μＭのＤＨＡ＋αＴは７．５倍の増加を生じた。１００μＭのＤＨＡは、αＴの非存在または存在下で毒性であった。
【００４８】
これらの実験は、ＶＺＶでの感染後に、カルボニルスカベンジング剤と共に特定の脂肪酸の添加が、感染性子孫の生産増強させることを証明する。非必須脂肪酸であるオレイン酸（１００μＭ）の添加は、観察可能な細胞毒性を引き起こすことなく、ＶＺＶ生産を２倍に減少させた。
【００４９】
実施例４
図３および４において示される実験において、感染細胞をＰＳＧＣバッファー中に回収し、冷凍し、次に解凍し、超音波処理により破壊し、次に力価測定した。次に、この方法により得られた感染性ウイルスの収量を、感染細胞がＰＳＧＣバッファー中に回収し、超音波処理により即座に破壊し、次に、滴定前に−８０℃で冷凍した代替方法と比較した。
【００５０】
簡潔には、ＭＲＣ５細胞を、ＭＯＩ＝１：５０にてＶＺＶに感染させた。脂質混合物１（ＬＭ−１）を、細胞播種後即座に細胞に加えた。感染６時間後、最大約１００μＭのＡＡまたは最大約２５μＭのＤＨＡを、最大約１０μＭのαＴと共に細胞に加えた。感染７２時間後、細胞をＰＳＧＣバッファー中に回収し、そして、−８０℃で冷凍し、ウイルスの放出のために後で超音波処理したか（冷凍された細胞）、または、回収後即座に超音波処理し、無細胞ＶＺＶを含む上清を滴定前に−８０℃で凍結した（冷凍された上清）。無細胞ＶＺＶ収量を、ＡＰＲＥ−１９細胞におけるプラークアッセイにより定量した。非処理（ＮＴ）と比較した倍数変化を示す。バーの上の数は、対応する処理において１ｍｌあたりで得られるウイルスの量を示す。結果は図５に示される。
【００５１】
実施例５
凍結前にＰＳＧＣバッファー中で感染細胞を超音波処理することにより感染性ＶＺＶの収量を改善したので、ウイルス生産に対するさらなる脂肪酸（ヘキサコサン酸（ＨＳＡ）およびオクタコサン酸（ＯＳＡ）および脂肪酸組合せ）の効果を試験した。結果は図６に示される。
【００５２】
ＨＳＡおよびＯＳＡは、非処理と比較してウイルス収量を改善したが、これらのさらなる脂肪酸および組合せは、ＤＨＡ＋αＴのようには作用しなかった。さらに、高用量の２つの組合せは、おそらく、組み合せられた脂肪酸の高い総濃度によりもたらされる毒性が原因で、非処理よりも少ないウイルスを産生した。
【００５３】
簡潔には、ＭＲＣ５細胞を、ＭＯＩ＝１：５０にてＶＺＶに感染させた。感染６時間後、細胞を、示された組合せの脂質および１０μＭのαＴで処理した。ヘキサコサン酸（ＨＳＡ）およびオクタコサン酸（ＯＳＡ）を、超音波処理によりＰＢＳ中２０ｍｇ／ｍｌのα−シクロデキストリン（Sigma-Aldrich）に溶解し、ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌの脂肪酸非含有ＢＳＡ（Sigma-Aldrich）の溶液（１：１、ｖ／ｖ）に加え、それぞれの脂肪酸について１０ｍＭの貯蔵濃度を得た。ＨＳＡ、ＯＳＡおよびＤＨＡは２５μＭで使用し、ＡＡは２５μＭで使用した。２セットの脂肪酸濃度を、組合せ処理のために使用した：ＤＨＡ、ＡＡおよびＨＳＡは、それぞれ、２５μＭ、１００μＭおよび２５μＭ（高い）、または１０μＭ、５０μＭおよび１０μＭ（低い）のいずれかの濃度で加えた。感染７２時間後、細胞をＰＳＧＣバッファー中に回収し、即座に超音波処理し、無細胞ＶＺＶ収量を、ＡＲＰＥ−１９細胞におけるプラークアッセイにより定量した。非処理（ＮＴ）と比較した倍数変化を示す。倍数変化は、２回の独立した感染の平均である。結果は図６に示される。
【００５４】
図５において示される実験におけるＨＳＡおよびＯＳＡの比較的乏しい能力は、細胞への該脂肪酸の効率的な送達を成し遂げることの困難性から生じた可能性がある。該脂肪酸の代替製剤は、取込みを改善し、より効率的なウイルス生産を刺激することが意図される。
【００５５】
実施例６
次に、コレステロールの添加が脂肪酸の添加により得られる上昇した収量をさらに増加させる可能性を、試験した。
【００５６】
ＭＲＣ５細胞を、１：１００のＭＯＩで感染させ、感染４８または７２時間後のいずれかで回収した。コントロールとして、細胞を、細胞播種後即座に２つの異なる脂質の混合物で処理した。ＬＭ−１は、オメガ−３脂肪酸に富み、ＬＭ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃  １１９０５）は、主にオメガ−６脂肪酸を含む化学的に定義された混合物である。
【００５７】
簡潔には、ＭＲＣ５細胞を、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭのｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ中で、テキストに記載されているとおり３５℃で増殖させた。脂質混合物１（ＬＭ−１、Ｓｉｇｍａ）または２（ＬＭ−２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、播種後即座に細胞に加えた。細胞を、ＭＯＩ＝１：１００にてＶＺＶに感染させた。感染６時間後、細胞を、示された脂質組合せおよび１０μＭのαＴで処理した。ＨＳＡおよびＤＨＡは２５μＭで使用し、ＡＡは１００μＭで使用した。示されているとき、１３μＭのコレステロールを細胞に加えた。感染４８または７２時間後、細胞をＰＳＧＣバッファーに回収し、即座に超音波処理し、無細胞ＶＺＶ収量を、ＡＲＰＥ−１９細胞における標準プラークアッセイにより定量した。４８ｈｐｉで回収された非処理（ＮＴ）と比較した倍数変化を示す。棒の上の数は、対応する処理において１ｍｌあたりで得られるウイルスの量を示す。倍数変化は、独立した感染の平均である。結果は図７に示される。
【００５８】
両方の脂質混合物は、両方の時間でＶＺＶ収量をわずかに、および同様に上昇させた。これらの脂質混合物の効果は、個々の脂肪酸の効果ほど大きくなかった。以前の実験において、ＤＨＡ、ＡＡおよびＨＳＡはそれぞれ、感染７２時間後でのＶＺＶの収量を上昇させたため、これらの添加物をα−Ｔと試験した。コレステロールもまた、添加物として、感染７２時間後に試験し、ＶＺＶの収量を非処理と比較して約２倍に増加させた。収量は、感染７２時間後よりも４８時間後ではるかに低かった。最後に、ＤＨＡ＋α−ＴおよびＤＨＡ＋ＨＳＡ＋α−Ｔへのコレステロール添加の効果を試験し、ＶＺＶの収量をさらに増加させることを証明した。感染７２時間後、９．６×１０５ＰＦＵ／ｍｌの感染性ＶＺＶは、ＤＨＡ＋α−Ｔおよびコレステロールの添加によりなし遂げられた。
【００５９】
実施例７
次に、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用することによりウイルス貯蔵物中のウイルスＤＮＡの量を定量することにより、ウイルス粒子の収量を定量した。
【００６０】
ウイルス貯蔵物を、ｑＰＣＲ分析前に、ＤＮａｓｅ  Ｉで処理した。ＤＮａｓｅ  Ｉ処理前に、細胞性ＤＮＡは、アクチン座に特異的なプライマーを使用してウイルス貯蔵物中で検出されたが、酵素で処理後、細胞性ＤＮＡはもはや検出されなかった。該観察は、ＤＮａｓｅ  Ｉ処理が、ウイルス粒子内に保護されていなかったウイルス貯蔵物中のＤＮＡを有効に破壊したことを証明した。ＤＮａｓｅ  Ｉ−耐性ＶＺＶ  ＤＮＡのそれぞれのコピーを、１つのウイルス粒子のための代用物として与えた。
【００６１】
簡潔には、無細胞ＶＺＶを、図７に対する説明に記載されているとおり、脂質混合物（ＬＭ−１、Ｓｉｇｍａ）、ＤＨＡ（約２５μＭ）およびαＴ（約１０μＭ）、およびコレステロール（約１３μＭ）の示された組合せで処理した細胞から得た。サンプルをＤＮＡｓｅ  Ｉ（２単位、３０分、３７℃）で処理し、ウイルスエンベロープの外側の汚染ＤＮＡを除去し、ウイルスゲノムを含む粒子の数を定量リアルタイムＰＣＲ分析により決定した。並行して、生産されたウイルスの量をプラークアッセイにより決定し、ウイルスの感染性を、エンベロープウイルス粒子の数を生産された感染性ウイルスの数で割ることにより計算した（粒子／ＰＦＵ）。結果は、非処理（ＮＴ）と比較した倍数変化として示される。
【００６２】
それぞれのサンプルにおける感染の量を、プラークアッセイにより並行して決定した。図８に示されるとおり、ウイルス粒子の数および粒子の特異的感染性は、非処理と比較して、ＬＭ−１によりあまり変化していなかった。感染６時間後のＤＨＡ＋αＴの添加は、ウイルス粒子の数を増加させ、また、粒子／ＰＦＵ比をほぼ２倍に増加させた。ＤＨＡ＋αＴ＋コレステロールの添加は、ウイルス粒子の特異的感染性に対して影響しなかったが（粒子／ＰＦＵ）、ウイルス粒子の数を９倍に増加させた。
【００６３】
重要なことには、次に、感染６時間後のＤＨＡ＋αＴ＋コレステロールの添加は、非処理と比較して、感染７２時間後、ウイルス粒子の収量および感染性を９倍に増加させた。
【００６４】
実施例８
ウイルス拡大を、感染７２時間後に、感染された病巣(foci)のサイズをアッセイすることによってモニタリングした（図９）。
【００６５】
簡潔には、ＡＲＰＥ−１９およびＭＲＣ５細胞をＭＯＩ＝１：２５０にてＶＺＶに感染させた。ＤＨＡ（２５μＭ）、αＴ（１０μＭ）およびコレステロール（ｃｈｏｌ．；１３μＭ）の示された組合せを、６ｈｐｉで細胞に加えた。細胞を、感染７２時間後に撮影した。図９に示されるとおり、病巣がＤＨＡ＋αＴで処理された細胞においてより大きく、  ＤＨＡ＋αＴ＋コレステロールで処理されたときさらに大きく、処理が細胞から細胞へウイルス拡大を促進するという見解と一致した。
【００６６】
上記説明的実施例に記載されている本発明において多数の修飾および変異が、当業者により考えられることが予期される。結果として、特許請求の範囲において見られる限定のみが、本発明に置かれるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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