(57)【要約】  本発明は、試料、好ましくは血液試料から、核酸を単離するための方法であって、以下のステップ、ａ）少なくとも１種の陽イオン性界面活性剤の使用によって、安定化されている試料を得るステップであって、前記陽イオン性界面活性剤が、前記核酸と複合体を形成しているステップ、ｂ）場合によって、前記安定化されている試料由来の他の試料成分と一緒に前記複合体を得るステップであって、前記複合体が、単離されるべき前記核酸を含むステップ、ｃ）前記複合体を再懸濁させ、場合によって、１種または複数の添加剤を、再懸濁前、再懸濁中および／または再懸濁後に加えることによって、少なくともｉ）単離されるべき前記核酸、ｉｉ）少なくとも１種のカオトロピック剤およびｉｉｉ）少なくとも１種のキレート剤を含む、再懸濁させた試料を得るステップ、ならびにｄ）前記再懸濁させた試料から、核酸を単離するステップを含む、方法に関する。再懸濁中にキレート剤を加えると、容器壁に不可逆的に付着する沈殿の形成がかなり減少するため、核酸収量がかなり増加することが見出された。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料、好ましくは血液試料から、核酸を単離するための方法であって、以下のステップ、
ａ）少なくとも１種の陽イオン性界面活性剤の使用によって、安定化されている試料を得るステップであって、前記陽イオン性界面活性剤が、前記核酸と複合体を形成しているステップ；
ｂ）場合によって、前記安定化されている試料由来の他の試料成分と一緒に前記複合体を得るステップであって、前記複合体が、単離されるべき前記核酸を含むステップ；
ｃ）前記複合体を再懸濁させ、場合によって、１種または複数の添加剤を、再懸濁前、再懸濁中および／または再懸濁後に加えることによって、少なくとも
ｉ）単離されるべき前記核酸；
ｉｉ）少なくとも１種のカオトロピック剤；および
ｉｉｉ）少なくとも１種のキレート剤；
を含む、再懸濁させた試料を得るステップ、
ならびに
ｄ）前記再懸濁させた試料から、核酸を単離するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記再懸濁させた試料が、ステップｃ）とステップｄ）との間で、少なくとも０．２時間、少なくとも０．３時間、少なくとも０．４時間、少なくとも０．５時間、少なくとも０．７５時間または少なくとも１時間の間および／または０．５時間から１２時間まで、１時間から１０時間まで、１．５時間から８時間まで、２時間から７時間まで、３時間から６時間までの期間、待機状態である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｃ）において行われる前記再懸濁が、以下の特徴、
ａ）非カオトロピック塩、好ましくはアンモニウム塩を含む再懸濁溶液が加えられる；
ｂ）前記キレート剤が、再懸濁前、再懸濁中または再懸濁後に加えられる；
ｃ）前記キレート剤が、再懸濁溶液とは別個に加えられる；
ｄ）前記キレート剤が、再懸濁溶液中に含まれる；
ｅ）前記再懸濁させた試料が前記キレート剤を、０．５ｍＭから７５ｍＭまで、１ｍＭから５０ｍＭまで、２．５ｍＭから２５ｍＭまでおよび５から１５ｍＭまでから選択される濃度で含むような濃度で、前記キレート剤が加えられる；
ｆ）前記キレート剤が、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジニトリロ四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）およびＮ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン（ＮＴＡ）からなる群から選択される、および／または
ｇ）少なくとも１種の添加剤が、再懸濁前、再懸濁中および／または再懸濁後に加えられ、前記添加剤が、カオトロピック剤、タンパク質分解化合物および緩衝剤からなる群から選択され、それによって前記再懸濁させた試料中に含まれる、
のうちの１つまたは複数を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記再懸濁させた試料中に存在する前記キレート剤が、
ａ）沈殿した試料の、前記試料を含む容器への結合を減少させる；
ｂ）前記単離された核酸の収量を増加させる；および／または
ｃ）ステップｃ）とｄ）との間の待機時間が異なることに起因する、前記核酸単離の効率および／または量における変動を減少させる、
請求項１から３の１項または複数項に記載の方法。
【請求項５】
前記再懸濁させた試料中に含まれる前記カオトロピック剤に関して、以下の特徴、
ａ）前記再懸濁させた試料中の前記カオトロピック剤の濃度が、０．１Ｍから４Ｍまで、０．５Ｍから３Ｍまでおよび０．７５Ｍから２．５Ｍまでからなる群から選択され、好ましくは少なくとも１Ｍである；
ｂ）前記カオトロピック剤が、ステップｃ）において、別個の溶液の形で加えられる；
ｃ）前記カオトロピック剤が、ステップｃ）において、前記複合体の再懸濁後に加えられ、それによって前記再懸濁させた試料中に含まれる；および／または
ｄ）ステップｃ）において存在する前記カオトロピック剤が、カオトロピック塩、グアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジンイソチオシアン酸塩、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸ナトリウム、尿素からなる群から選択され、好ましくはＧＴＣまたはＧＩＴＣである、
のうちの１つまたは複数を有する、請求項１から４の１項または複数項に記載の方法。
【請求項６】
タンパク質分解化合物が、ステップｃ）において加えられる、請求項１から５の１項または複数項に記載の方法。
【請求項７】
ステップｃ）において加えられる前記タンパク質分解化合物に関して、以下の特徴、
ａ）前記タンパク質分解化合物が、タンパク質分解酵素である；および／または
ｂ）前記タンパク質分解化合物が、プロテイナーゼ、プロテアーゼ、スブチリシンおよびサブチラーゼからなる群から選択されるタンパク質分解酵素であり、好ましくはプロテイナーゼＫである、
のうちの１つまたは複数を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップｃ）が、
ａａ）非カオトロピック塩およびキレート剤を含み、カオトロピック剤を含まない再懸濁溶液が加えられ、前記複合体が再懸濁されること、
ｂｂ）カオトロピック剤が、前記複合体の再懸濁後に加えられ、それによって前記再懸濁させた試料中に含まれるようになることであって、好ましくは、前記カオトロピック剤が、水溶液の形で、前記再懸濁させた複合体に加えられること、
ｃｃ）場合によって、タンパク質分解酵素が、前記複合体の再懸濁後に加えられ、それによって前記再懸濁させた試料中に含まれること、
を含む、請求項１から７の１項または複数項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｄ）において行われる前記単離が、以下のステップ、
ｉ）好ましくは、前記再懸濁させた試料を、タンパク質分解酵素の存在下で加熱および／または撹拌することによって、前記再懸濁させた試料を消化するおよび／または変性させるステップ；
ｉｉ）適切な結合条件を使用して、前記核酸を固相に結合させるステップ、ならびに
ｉｉｉ）場合によって、前記核酸を洗浄するステップ；
ｉｖ）場合によって、前記核酸を溶出するステップ、
を含む、請求項１から８の１項または複数項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が血液試料であり、ステップａ）において、前記血液試料を、
ｉ）一般式：
Ｙ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｒ4Ｘ-
の陽イオン性（cationic）化合物
［式中、Ｙは、窒素またはリン、好ましくは窒素を表し、
Ｒ1Ｒ2Ｒ3およびＲ4は、独立して、分枝または非分枝のＣ1〜Ｃ20−アルキル基、Ｃ6〜Ｃ20-アリール基および／またはＣ6〜Ｃ26アラルキル基を表し、
Ｘ-は、無機または有機の、一塩基酸または多塩基酸の陰イオン（anion）を表す］および
ｉｉ）少なくとも１つのプロトン供与体、
を含む、安定化させる組成物と接触させることによって、前記血液試料が安定化される、請求項１から９の１項または複数項に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が血液試料であり、ステップａ）において、前記血液試料を、
（ｉ）下記式（２）
Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｎ（Ｏ）ｘ  （２）
［式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル残基、Ｃ６〜Ｃ１２アリール残基またはＣ６〜Ｃ１２アラルキル残基であり、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２６アリール残基またはＣ６〜Ｃ２６アラルキル残基であり、
Ｘは、０および１の整数である］
を有するアミノ界面活性剤および
（ｉｉ）酸または酸性塩、
を含む、安定化させる組成物と接触させることによって、前記血液試料が安定化される、請求項１から９の１項または複数項に記載の方法。
【請求項１２】
複数の試料が処理され、ステップｃ）とステップｄ）との間の前記待機時間が、前記再懸濁させた試料のうちの少なくともいくつかの間で異なる、請求項１から１１、特に請求項８から１１の１項または複数項に記載の方法。
【請求項１３】
以下の特徴、
ａ）前記核酸がＲＮＡである；
ｂ）複数の試料がステップａ）からステップｃ）に従って調製され、それによって、複数の再懸濁させた試料を得、前記再懸濁させた試料がバッチに分けられ、前記核酸がステップｄ）に従って前記バッチから単離され、ステップｃ）とｄ）との間の前記待機時間が、少なくとも２つのバッチ間で異なる；
ｃ）ステップｄ）が、自動化システムを使用して行われる；
ｄ）複数の試料が、ステップｃ）まで手動で処理され、それによって、複数の再懸濁させた試料を得、好ましくは、ステップｄ）において、前記再懸濁させた試料が、前記核酸を単離するための自動化システムを使用して処理される；および／または
ｅ）少なくともＲＮＡが、少なくともＲＮＡおよびＤＮＡを含む試料から単離され、単離ステップｄ）が、以下のステップ、
−  タンパク質分解酵素を含む前記再懸濁させた試料を得るステップおよび好ましくは、前記再懸濁させた試料を、少なくとも５分間、室温を超える、好ましくは５０℃を超える温度でインキュベートすることによって、前記再懸濁させた試料の消化を続けるステップ；
−  ＤＮＡを第１の固相に結合させ、前記第１の固相に結合された前記ＤＮＡを、前記ＲＮＡを含む残りの試料から分離することによって、前記再懸濁および消化された試料から少なくとも一部の前記ＤＮＡを除去するステップ、
−  少なくとも１種のカオトロピック剤および３０％ｖ／ｖ以上の濃度の少なくとも１種のアルコールが、このＲＮＡ結合ステップ中に使用される、ＲＮＡを第２の固相に結合させるステップ、
−  場合によって、前記第２の固相に結合されているＲＮＡを洗浄するために、少なくとも１つの洗浄ステップを行うステップ、
−  場合によって、ＤＮａｓｅ消化および／またはタンパク質分解酵素を使用した消化を行うステップ、
−  場合によって、前記ＲＮＡを溶出するステップ、
を含む、
のうちの１つまたは複数を有する、請求項１から１２の１項または複数項に記載の方法。
【請求項１４】
以下のステップ、
ａ）少なくとも１種の陽イオン性界面活性剤の使用によって、安定化されている試料を得るステップであって、前記陽イオン性界面活性剤が、前記核酸と複合体を形成しており、好ましくは、請求項１０または１１に記載の陽イオン性界面活性剤が、安定化のために使用されたステップ；
ｂ）場合によって、前記安定化されている試料由来の他の試料成分と一緒に前記複合体を得るステップであって、前記複合体が、単離されるべき前記核酸を含むステップ；
ｃ）前記複合体を再懸濁させ、場合によって、１種または複数の添加剤を、再懸濁前、再懸濁中および／または再懸濁後に加えるステップであって、ステップｃ）が、
ａａ）非カオトロピック塩およびキレート剤を含む再懸濁溶液を加えることであって、前記再懸濁溶液が、カオトロピック剤を含まないこと、ならびに前記複合体を再懸濁すること、
ｂｂ）カオトロピック剤を、前記複合体の再懸濁後に加えることであって、好ましくは、前記カオトロピック剤を、水溶液の形で、前記再懸濁させた複合体に加えること、
ｃｃ）場合によって、タンパク質分解酵素を、前記複合体の再懸濁後に加えること、
それによって、少なくとも
ｉ）単離されるべき前記核酸；
ｉｉ）少なくとも１種のカオトロピック剤；および
ｉｉｉ）少なくとも１種のキレート剤；および
ｉｖ）場合によって、タンパク質分解酵素；
を含む再懸濁させた試料を得ること、
を含むステップ、
ならびに
ｄ）前記再懸濁させた試料からＲＮＡを単離するステップであって、好ましくは、前記ＲＮＡが、請求項１３のｅ）に記載の特徴に従って単離され、好ましくは、シリカ粒子が前記ＲＮＡを結合させるための固相として使用され、好ましくは、自動化システムが、ＲＮＡ単離に使用されるステップ、
を含み、
複数の試料がステップａ）からステップｃ）に従って調製され、それによって、複数の再懸濁させた試料を得、前記再懸濁させた試料がバッチに分けられ、前記核酸がステップｄ）に従って前記バッチから単離され、ステップｃ）とｄ）との間の前記待機時間が、少なくとも２つのバッチ間で異なる、血液試料からＲＮＡを単離するための、請求項１から１３の１項または複数項に記載の方法。
【請求項１５】
試料、好ましくは血液試料から、核酸を単離するための方法であって、前記核酸が複数の試料から単離され、調製される試料から前記核酸が単離される前の待機時間が、単離用に調製される前記複数の試料で異なることに起因する、前記複数の試料から単離される前記核酸の収量および質における変動が、単離用に調製される前記試料が少なくとも１種のカオトロピック剤および少なくとも１種のキレート剤を含むことによって減少する、方法。
【請求項１６】
前記核酸が、請求項１から１４の１項または複数項に記載の方法に従って単離される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１種のカオトロピック剤および核酸を含む試料の容器壁に付着する沈殿の形成を防ぐまたは減少させるための、キレート剤の使用。
【請求項１８】
前記試料が、陽イオン性界面活性剤、タンパク質分解化合物、塩および／または緩衝液の群から選択される少なくとも１種の成分を含む、請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を単離する分野、特に、生物試料から、特に血液試料から、高い完全性を有するＲＮＡを高収量で単離することに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明に至る研究は、欧州共同体の第７次枠組計画（European Community's Seventh Framework Programme）(FP7/2007-2013)から、贈与契約番号２２２９１６の下に、財政的支援を受けている。
【０００３】
ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなどの核酸を単離するための方法は、異なる原理に基づく数種の方法が先行技術において知られている。一般的な核酸単離方法の例は、抽出、固相抽出、フェノール−クロロホルム抽出、クロマトグラフィー、沈殿およびその組合せを含むが、これらに限定されない。非常に一般的なものは、核酸を固相、例えばシリカを含むまたはシリカからなる固相に結合させるためのカオトロピック剤および／またはアルコールの使用を含む核酸単離方法である。ＲＮＡ分解酵素はかなりの高量で遍在し、広い温度範囲にわたって活性であり、通常それらの活性のための補因子を必要としないため、ＲＮＡの単離は特に困難である。それ故に、良好な収量および質でＲＮＡをもたらすＲＮＡ単離方法を提供することは難題である。
【０００４】
さらに、例えば診断の分野などの多くの分野において、多数の試料から核酸を単離することが望まれておりまたは必須であるとさえされている。この目的のために、自動化プロセス（例えば、多くの試料が同時に処理される）を使用することが一般的である。使用者を支援し、人の手を要する時間を削減するために、平行して多数の試料を処理することができるロボットシステムが、一般的に使用される。通常、試料を核酸単離用に手動で調製し、次いで、ロボットシステムの中に入れる。それぞれの手動調製ステップは、例えば、安定化された血液試料を得るための一般的なものである。それぞれの手動ステップは、例えば、核酸を含有するペレットを生成するための安定化された試料の遠心分離および例えば再懸濁緩衝液中へのペレットの再懸濁（それによって試料容量を減少させる）を含む。次いで、それぞれに再懸濁させた試料を、例えば消化および単離用の試料として準備し、ロボットシステムの中に置く。この原理または類似の原理に従って作動する市販のロボットシステムの例は、キアシンフォニー（ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ）（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ））、キアキューブ（ＱＩＡｃｕｂｅ）（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ））およびマグナピュア（ＭａｇｎａＰｕｒｅ９６）（ロシュ（ＲＯＣＨＥ））を含むが、これらに限定されない。
【０００５】
これらのロボットシステムは、多数の試料を処理する際に注目すべき利点を提供するにもかかわらず、ある特定の限界も有する。例えば、前記ロボットシステムは、通常、ある特定の数の試料を一度に処理することのみ可能である。前記数は、核酸単離用の１バッチとして手動で調製される試料の数よりも少ないことが多い。したがって、調製された試料のすべてを同時に処理することができるとは限らない。このことは、核酸単離用に調製される試料において、核酸単離用の試料の調製（例えば、以上に記載されているような、ペレットの遠心分離および再懸濁）と実際の核酸単離との間の待機時間が、多くの場合異なるという影響をもたらす。調製された試料の第１のバッチがロボットシステムで処理されている間、調製された他の試料は待機状態である。調製された試料の待機時間が異なると、単離される核酸の質および核酸収量に影響を及ぼす可能性があることが見出された。より長い待機時間中に、一部の核酸が容器に不可逆的に固着し、したがって、精製することができない沈殿を形成することがある。さらに、核酸、特にＲＮＡの完全性が損なわれる可能性がある。したがって、ロボットシステムにおいて処理される調製された試料の、第２のバッチおよびその後のバッチの核酸の量および／または質は、より低くなることが多い。よって、待機時間がより長いと、単離される核酸の質および／または量が減少する可能性がある。このことは、例えば、血液または血液に由来する試料および／または特定の化学物質を使用して安定化させた試料などの複合体試料が処理される場合に、問題を特に引き起こす。この問題は、多量の試料（例えば、１．５ｍｌ以上）が処理される場合に、さらに悪化する。収量および／または完全性におけるこの損失は、特に、収量および量に関して一様な核酸単離が重要であり、よって、使用される核酸単離方法による変動を避けなければならないような、例えば診断の分野などの慎重を要する適用分野において、問題を引き起こすことがある。
【０００６】
さらに、磁性ビーズを、核酸を結合および単離させるための固相として使用する方法は、その代わりに核酸結合膜を使用する類似の方法と比較して、核酸収量の減少を示すことが多い。それ故に、沈殿形成による核酸収量の損失は、磁性粒子を核酸結合固相として使用するそれぞれの方法およびシステムに、さらに強い影響を与える。
【０００７】
よって、たとえ待機時間が試料間で異なり、延長された待機時間中であっても、匹敵する高い核酸収量をもたらし、小さい核酸の収量をも高め、核酸、特にＲＮＡの高い完全性をもたらす核酸単離プロトコルを提供することが、現況技術において必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
それ故に、本発明の目的は、試料、特に血液試料から、核酸、特にＲＮＡを単離するための改良された方法を提供することである。さらに、本発明の目的は、たとえ単離用の試料の調製と核酸の実際の単離との間の待機時間が異なっても、複数の試料から、匹敵する質および／または量で核酸を単離することができる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、少なくとも１種のカオトロピック剤および少なくとも１種のキレート剤が、核酸単離用に調製される試料中に含まれる場合に、核酸の収量および質における変動が、著しく減少し得るという驚くべき発見に基づいている。たとえ、核酸がそれぞれ調製される試料から実際に単離される前に、調製される試料が、長期間（例えば、０．５時間から１２時間まで、０．７５時間から１１時間まで、１時間から１０時間まで、１．２５時間から９時間まで、１．５時間から８．５時間まで、１．７５時間から８時間まで、１．７５時間から７．５時間まで、１．２５時間から７時間まで、１．５時間から６．５時間まで、１．７５時間から６時間まで、２時間から５．５時間までから選択される）静止したままであるとしても、少なくとも１種のカオトロピック剤および少なくとも１種のキレート剤を核酸単離用に調製される試料中に含むことにより、それぞれ調製される試料から単離される核酸の質および収量が十分に維持されるという利点を有することが見出された。この場合に、特に自動化システムを使用する際に、試料間の待機時間が異なることがむしろ一般的であるため、この利点は、多数の試料を処理する際に特に重要である。しかし、この利点はまた、核酸単離用に調製される試料から核酸を直ちに単離する必要を減らすため、一般に重要である。このことは、より柔軟性をもたらす。
【００１０】
第１の態様によると、本発明は、試料、好ましくは血液試料から、核酸、好ましくはＲＮＡを単離するための方法であって、以下のステップ、
ａ）少なくとも１種の陽イオン性界面活性剤の使用によって、安定化されている試料を得るステップであって、陽イオン性界面活性剤が、核酸と複合体を形成しているステップ、
ｂ）場合によって、安定化されている試料由来の他の試料成分と一緒に複合体を得るステップであって、前記複合体が、単離されるべき核酸を含むステップ、
ｃ）複合体を再懸濁させ、場合によって、１種または複数の添加剤を、再懸濁前、再懸濁中および／または再懸濁後に加えることによって、少なくとも
ｉ）単離されるべき核酸、
ｉｉ）少なくとも１種のカオトロピック剤および
ｉｉｉ）少なくとも１種のキレート剤
を含む、再懸濁させた試料を得るステップ、
ならびに
ｄ）再懸濁させた試料から、核酸を単離するステップ
を含む、方法を提供する。
【００１１】
以上に論じられているように、本発明による方法によって、たとえステップｃ）とステップｄ）との間の待機時間が異なるとしても、試料から、匹敵する良好な収量および質で核酸を単離することができる。カオトロピック剤を加えると、再懸濁させた試料中に含有される核酸、特にＲＮＡの質が保たれる。しかし、カオトロピック剤を加えることは、より長い待機時間中に核酸が沈殿し、さらに、沈殿した核酸が、試料を含む容器の壁に不可逆的に固着する可能性があり、このことが核酸収量をかなり減少させるという欠点を有する。本発明者らは今回、驚いたことに、再懸濁させた試料中にキレート剤を組み込むことが、沈殿の形成をかなり減少させ、さらに、カオトロピック剤を含む再懸濁させた試料を含む容器の壁への沈殿の付着を防ぐことを見出した。それによって、核酸収量の損失が、効果的に減少し得る。したがって、本発明の教示により、たとえ、以上に記載されているような核酸単離用に調製される再懸濁させた試料が、直ちに処理されずに、待機時間が異なるおよび／または長期であっても、核酸、特にＲＮＡを、匹敵する収量および質で効果的に単離することが可能になる。
【００１２】
第２の態様によると、試料から、好ましくは血液試料から、核酸を単離するための方法であって、核酸が複数の試料から単離され、調製される試料から核酸が単離される前の待機時間が、単離用に調製される複数の試料で異なることに起因する、前記複数の試料から単離される核酸の収量および質における変動が、単離用に調製される試料が少なくとも１種のカオトロピック剤および少なくとも１種のキレート剤を含むことによって減少する、方法が提供される。
【００１３】
第３の態様によると、本発明は、少なくとも１種のカオトロピック剤および核酸を含む試料の容器壁に付着する沈殿の形成を防ぐまたは減少させるための、キレート剤の使用に関する。以上に論じられているように、それぞれの試料の長期の待機時間が、結果として、カオトロピック剤を含有する試料を含む容器壁に固着する沈殿の形成をもたらし、それによって、核酸収量を大幅に減少させる。したがって、本発明によって教示されているように、キレート剤の追加が、それぞれの沈殿の形成を減少させるまたは完全に防ぐこともあるという有利な効果をもたらす。したがって、たとえ単離用の試料の調製と実際の単離との間の待機時間が増えても、核酸は、良好な収量および質で単離することができる。このことは、本発明の技術が、核酸を自動化プロセス中で単離するために使用され、多数の試料が核酸単離用に調製されるが、調製される試料の一部のみが、自動化システム上でバッチ式に処理され得る場合に、特定の利点をもたらす。したがって、本発明の教示は、たとえ異なる試料間で待機時間が異なるおよび／または長期に及ぶとしても、質および収量に関して、実質的に一様な単離結果を保証し、このことは、医学および／または診断の分野のための核酸の単離などの挑戦のしがいがある分野にとって、特に有利である。
【００１４】
本出願の他の目的、特徴、利点および態様は、以下の記載および添付の特許請求の範囲から、当業者には明らかになる。しかし、以下の記載、添付の特許請求の範囲および特定の実施例は、本出願の好ましい実施形態を示すものであるが、例証としてのみ与えられていることが理解されるべきである。開示されている本発明の精神および範囲内の種々の変更および改変は、以下を読むことで、当業者には容易に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】先行技術のプロトコルに従って処理した第１のバッチの試料については、ＲＮＡ完全性が卓越していることを示す。
【図２】実施例２の結果を示す。
【図３】本発明による改変された再懸濁ステップが、沈殿形成に及ぼす効果を示す。
【図４】種々のバッチのプロトコルを用いて得られる全体的なＲＮＡ収量を、比較下に示す。
【図５】本発明による方法を用いて達成されるＲＮＡ完全性を示す。
【図６】種々の試験プロトコルを用いて得られた溶出液を分析する際に、ｍｉＳｃｒｉｐｔ（登録商標）プライマー（Primer）アッセイ（ｈｓａ−ｍｉＲ  ３０ｂ）を用いて得られた平均ＣＴを示す。
【図７】平均総ＲＮＡ収量を示す。
【図８】再懸濁させた試料を４時間、わきに置いておいた。次いで、上清を除去し、沈殿をガラス試験管およびプラスチック試験管の両方にデカンテーションした。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、試料調製と実際の核酸単離との間の待機時間が異なることに起因する、核酸の質および収量における差が、少なくとも１種のカオトロピック剤および少なくとも１種のキレート剤を、核酸単離用に調製される試料中に組み込むことによって減少し得るという発見に基づいている。
【００１７】
第１の態様によると、本発明は、試料、好ましくは血液試料から、核酸を単離するための方法であって、以下のステップ、
ａ）少なくとも１種の陽イオン性界面活性剤の使用によって、安定化されている試料を得るステップであって、陽イオン性界面活性剤が、核酸と複合体を形成しているステップ、
ｂ）場合によって、安定化されている試料由来の他の試料成分と一緒に複合体を得るステップであって、前記複合体が、単離されるべき核酸を含むステップ、
ｃ）複合体を再懸濁させ、場合によって、１種または複数の添加剤を、再懸濁前、再懸濁中および／または再懸濁後に加えることによって、少なくとも
ｉ）単離されるべき核酸、
ｉｉ）少なくとも１種のカオトロピック剤および
ｉｉｉ）少なくとも１種のキレート剤
を含む、再懸濁させた試料を得るステップ、
ならびに
ｄ）再懸濁させた試料から、核酸を単離するステップ
を含む、方法を提供する。
【００１８】
方法の個々のステップを、さらに詳細に説明する。
【００１９】
ステップａ）において、少なくとも１種の陽イオン性界面活性剤の使用によって、安定化されている試料を得る。例えば、試料を少なくとも１種の陽イオン性界面活性剤と接触させることによって、試料を安定化することができる。陽イオン性界面活性剤は、試料中に含有される細胞の溶解を支援し、遊離した核酸と複合体を形成する。核酸は、それによって安定化する。試料、特に血液試料を安定化させるための陽イオン性界面活性剤の使用は、先行技術（例えば、参照することにより本明細書に援用されている、欧州特許出願公開第１０３１６２６号明細書および国際公開第０２／００５９９号パンフレットを参照のこと）に記載されており、以下にさらに詳細に記載される。それぞれの安定化された試料は、例えば、１つの施設、例えば病院で得られ、第２の施設、例えば研究所に輸送され得、試料はさらに処理され、安定化された試料から核酸が単離される。
【００２０】
ステップｂ）において、複合体は、安定化されている試料から得られる。前記複合体は、単離されるべき核酸を含む。前記複合体は、試料を安定化させるために使用された陽イオン性界面活性剤も含む。前記複合体は、例えば沈降法またはろ過によって得ることができる。それによって、通常、タンパク質および細胞残屑などの他の試料成分も、核酸を含有する複合体と一緒に得られる。好ましくは、複合体は、ペレットの形で得られる。それぞれのペレットは、例えば、試料を遠心分離し、上清を捨て、それによって、核酸および陽イオン性界面活性剤を含む複合体を含む試料を得ることによって、得ることができる。処理されるべき試料のタイプに応じて、それぞれのペレットは、通常、タンパク質および／または細胞残屑などのさらなる試料成分も含む。これは特に、例えば、全血または血清もしくは血漿などの血液に由来する試料などの複合体試料を処理する場合である。複合体を分離するのに適した方法、例えば、それらを安定化された試料からペレットの形で得ることによる方法は、参照することにより本明細書に援用されている欧州特許出願公開第１０３１６２６号明細書、パラグラフ［５１］以下参照にも記載されている。複合体を、例えばペレットの形で得ることは、ステップｄ）において行われるその後の核酸単離を少量で行うことができ、このことは、核酸単離に必要な試薬がより少なくて済むため、コスト効率が高いという利点を有し、核酸単離に自動化方法を使用する際に、多くの自動化システムが、それらが処理できる容量に関して制限されているため、重要な利点をもたらす。
【００２１】
ステップｃ）において、好ましくはペレットの形で得られる、複合体および任意選択の他の試料成分を再懸濁させ、それによって、再懸濁させた試料を得る。前記再懸濁させた試料は、単離されるべき核酸、陽イオン性界面活性剤および場合によって、複合体と一緒に回収されたさらなる試料成分、例えばタンパク質および／または細胞残屑などを含む。さらに、場合によって、さらなる添加剤、例えばカオトロピック剤および／またはタンパク質分解化合物などを、再懸濁前、再懸濁中または再懸濁後に加えることができる。本明細書において、本発明者らは、任意選択のさらなる試料成分および／または再懸濁前、再懸濁中および／または再懸濁後に加えられた任意選択の添加剤を含む再懸濁させた複合体を、「再懸濁させた試料」と呼ぶ。本発明によると、再懸濁させた試料は、少なくとも１種のカオトロピック剤を含む。好ましくは、カオトロピック剤は、複合体を再懸濁させた後に、別個の添加剤として加えられ、カオトロピック剤を含む再懸濁させた試料を得る。特に複合体がペレットの形で得られる場合に、カオトロピック剤が複合体の実際の再懸濁プロセスを妨げる可能性があるため、この順序が好ましい。好ましくは、とりわけ核酸およびカオトロピック剤を含む再懸濁させた試料を生成するために、カオトロピック剤を、以下に記載されているような水溶液の形で、再懸濁させた複合体に加える。以上に論じられているように、カオトロピック剤は、核酸、特にＲＮＡを分解から保護し、それによって、単離される核酸の質を増加させる。例において示されているように、カオトロピック剤を再懸濁させた試料中に含む場合、たとえ待機時間が異なり、例えば、ステップｃ）とステップｄ）との間が延長されるとしても、このことは、核酸、特にＲＮＡを、匹敵する質で得ることができるという効果をもたらす。それ故に、本発明による方法を使用する場合、ステップｃ）とステップｄ）との間の待機時間が異なる、異なる試料について得られる単離結果は、より一様であり、したがって、より匹敵したものとなる。しかし、カオトロピック剤は、核酸の完全性の保存に関して有益な効果をもたらすのみならず、問題も引き起こす。より長い待機時間中に、それは、再懸濁させた試料を含む容器の壁（「壁」という用語は、底も含む）に固着し得る沈殿の形成を引き起こす。再懸濁させた試料中にカオトロピック剤が含まれる場合に観察される、この沈殿形成および容器壁への付着は、再懸濁させた試料から単離され得る核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）の収量を減少させる。例によって示されているように、再懸濁させた試料が、ステップｃ）とステップｄ）との間で、長期の待機時間、静置された状態になっている場合、収量は３０％までもまたはそれ以上も減少し得る。この問題は、再懸濁させた試料中に少なくとも１種のキレート剤を追加的に含むことによる、本発明の教示によって克服される。キレート剤は、驚いたことに、不溶性の沈殿の形成を減少させ、容器壁への前記沈殿の付着も減少させ、それによって、ステップｃ）とステップｄ）との間の延長された待機時間中の核酸の損失を、効果的に減少させる。核酸収量を減少させる沈殿の形成を減少させ、それぞれ防ぐために、キレート剤は、複合体の再懸濁前、再懸濁中または再懸濁後に加えられ得る。好ましくは、キレート剤は、カオトロピック剤を加える前に、加えられる。キレート剤が複合体の再懸濁後に加えられる場合、キレート剤が上記のその有益な効果を発揮できることを保証するために、基本的には、再懸濁直後に加えられるべきである。キレート剤は、１時間以内、好ましくは３０分以内、より好ましくは１５分以内、より好ましくは１０分以内、より好ましくは５分以内、最も好ましくは３分以内に加えられるべきである。
【００２２】
場合によって、ステップｄ）のための再懸濁させた試料を調製するために、方法はさらなる処理ステップを含み得る。それぞれの追加のステップの例を、以下にさらに詳細に記載する。
【００２３】
ステップｄ）において、核酸は、再懸濁させた試料から単離される。ここでは、基本的に任意の核酸単離方法を使用することができる。適した核酸単離方法は、先行技術において知られており、抽出、固相抽出、シリカベースの精製方法、カオトロピック剤および／または少なくとも１種のアルコールを使用して核酸を固相に結合させる核酸単離手法、磁性粒子ベースの精製、フェノール−クロロホルム抽出、クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー（陰イオン交換表面を使用する）、電気泳動、ろ過、沈殿、クロマチン免疫沈降およびその組合せを含むが、これらに限定されない。好ましくは、核酸は、ステップｄ）において、自動化システムを使用して単離される。好ましくは、核酸は、複数の試料から単離される。複数の試料は、バッチ式に処理され得る。たとえ待機時間がバッチ間で著しく異なっても、本発明は、匹敵する核酸単離結果を保証するため、待機時間は個々のバッチ間で異なってよい。適した方法および待機時間も、以下に記載されている。
【００２４】
それぞれの方法の利点が、以上に説明され、例によっても実証されている。ステップｃ）とステップｄ）との間の待機時間がより長いことに起因する、単離される核酸の質および／または量の損失は、本発明によって教示されている改変された再懸濁ステップのおかげで、効果的に避けることができる。それ故、本方法は、ステップｃ）とステップｄ）との間の許容される待機時間に関して、より柔軟性をもたらし、このことは、本発明による方法が、自動化システム上で行われ、好ましくは複数の試料がバッチ式手法で処理される場合に、特に有益である。
【００２５】
続いて、本発明による方法およびステップａ）からステップｄ）までの好ましい実施形態を記載する。
【００２６】
一実施形態によると、再懸濁溶液は、ステップｃ）において、得られた複合体に加えられ、前記再懸濁溶液は、塩、好ましくは非カオトロピック塩を含む。塩として、数種の塩を使用することができ、かかる塩には、アンモニウム塩およびアルカリ金属塩、好ましくは酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、ＫＣｌまたはＮａＣｌが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、アンモニウム塩が使用される。好ましくは、キレート剤が、再懸濁溶液中に含まれる。この実施形態は、取り扱いが容易であり、さらに、核酸を保護するために再懸濁させた試料にカオトロピック剤が加えられる場合に、キレート剤が沈殿の形成および／または容器壁への核酸の付着を防ぐという点において、キレート剤が、再懸濁させた試料に及ぼすその有益な効果を速やかに発揮することができることも保証する。以上に論じられているように、カオトロピック剤を、複合体が再懸濁された後、よって再懸濁溶液が加えられた後に、加えることが好ましい。よって、再懸濁溶液は、好ましくはカオトロピック剤を含まず、特にカオトロピック塩を含まず、よって、非カオトロピックな再懸濁溶液である。一実施形態によると、再懸濁溶液は、キレート剤を、少なくとも１ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、好ましくは少なくとも７．５ｍＭ、より好ましくは少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１５ｍＭまたは少なくとも２０ｍＭの濃度で含む。好ましくは、濃度範囲は、１ｍＭから１５０ｍＭまで、５ｍＭから１００ｍＭまで、５ｍＭから７５ｍＭまで、７．５ｍＭから６５ｍＭまで、７．５ｍＭから５０ｍＭまでおよび１０ｍＭから３０ｍＭまでから選択される。既に、例によって示されているように、沈殿形成に及ぼす有益な効果を達成するために、低濃度のＥＤＴＡなどのキレート剤が十分である。いくつかの実施形態では、低濃度から中濃度までの、例えば１ｍＭから５０ｍＭまで、好ましくは５ｍＭから３０ｍＭまでまたは７．５ｍＭから２０ｍＭまでの範囲のキレート剤を使用すること。沈殿形成に及ぼす有益な効果をその後も達成するとはいえ、低濃度のキレート剤を使用することは、キレート剤が溶出液中にキャリーオーバーされるリスクを減らす。キレート剤はまた、再懸濁溶液とは別個に、例えば液体または固体の形で加えられてもよい。
【００２７】
一実施形態によると、キレート剤は、再懸濁させた試料が、キレート剤を少なくとも０．５ｍＭ、少なくとも２．５ｍＭ、好ましくは少なくとも３．５ｍＭ、より好ましくは少なくとも５ｍＭ、少なくとも７．５ｍＭまたは少なくとも１０ｍＭの濃度で含むような濃度で加えられる。好ましくは、キレート剤は、再懸濁させた試料が、キレート剤を０．５ｍＭから１００ｍＭまで、２．５ｍＭから７５ｍＭまで、２．５ｍＭから６０ｍＭまで、３．５ｍＭから５０ｍＭまで、３．５ｍＭから３０ｍＭまで、３．５ｍＭから２５ｍＭまで、３．５ｍＭから２０ｍＭまで、５ｍＭから１５ｍＭまでおよび５ｍＭから１０ｍＭまでから選択される濃度で含むような濃度で加えられる。
【００２８】
本発明に従って使用されるキレート剤は、再懸濁させた試料中に含まれる場合に、沈殿の形成および／または容器への沈殿の付着を防ぐまたは減少させる。一実施形態によると、キレート剤は、金属陽イオンへの２つ以上の別個の配位結合を形成することができ、求核性配位原子として少なくとも１つの窒素原子を含む有機配位子である。一実施形態によると、キレート剤は、金属陽イオンへの２つ以上の別個の配位結合を形成することができ、少なくとも４つの求核性配位原子を含む有機配位子である。一実施形態によると、キレート剤は、金属陽イオンへの２つ以上の別個の配位結合を形成することができ、少なくとも４つのカルボキシル基を含む有機配位子である。一実施形態によると、キレート剤は、金属陽イオンへの２つ以上の別個の配位結合を形成することができ、結果として生じる錯体の安定度定数が、金属陽イオンとしてカルシウムの場合に少なくとも１０4Ｍ-1である有機配位子である。本発明によるキレート剤は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジニトリロ四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）およびＮ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン（ＮＴＡ）を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態によると、ＥＤＴＡが使用される。本明細書において使用される場合、「ＥＤＴＡ」という用語は、例えば、Ｋ2ＥＤＴＡ、Ｋ3ＥＤＴＡまたはＮａ2ＥＤＴＡなどのＥＤＴＡ化合物の、とりわけＥＤＴＡ部分を指す。
【００２９】
以上に論じられているように、キレート剤は、いくつかの有益な効果を有する。特に、核酸が再懸濁させた試料から単離される前に、再懸濁させた試料が長期間静止したままである場合に（例えば、０．１時間を超える、０．２時間を超える、０．３時間を超える、特に０．５時間を超える、０．７５時間を超える、１時間を超える、１．２５時間を超える、１．５時間を超える、１．７５時間を超える、２時間を超える、２．５時間を超えるもしくは３時間を超える時間または０．１時間から１２時間まで、０．５時間から１１時間まで、０．７５時間から１０時間まで、１時間から９時間まで、１．２５時間から８．５時間まで、１．５時間から８時間まで、１．７５時間から７．５時間まで、１．２５時間から７時間まで、１．５時間から６．５時間まで、１．７５時間から６時間までもしくは２時間から５．５時間までの範囲で）、キレート剤は、沈殿形成および特に核酸を含有する沈殿の、カオトロピック剤を含む再懸濁させた試料を含む容器への結合を減少させ、それによって、核酸収量の損失を減少させるまたは防ぐこともある。それによって、キレート剤は、ステップｃ）とｄ）との間の待機時間が異なるおよび特に長期であることに起因する、核酸単離の効率および／または量における変動を減少させる。
【００３０】
一実施形態によると、核酸を含有する沈殿の形成および／または容器への沈殿の付着を防ぐまたは減少させるために使用されるキレート剤は、再懸濁させた試料中に含まれる場合に、クエン酸塩などの古典的な緩衝剤ではない。しかし、沈殿の形成および／または容器への沈殿の付着を防ぐまたは減少させるために使用されるキレート剤に加えて、緩衝剤も、再懸濁させた試料中に含まれ得、好ましくは含まれる。それぞれの緩衝剤が、例えば再懸濁溶液中に含まれ得る。
【００３１】
以上に論じられているように、試料中に含まれる核酸の完全性を保存するために、特にＲＮＡの完全性をおよび特に再懸濁させた試料のより長い待機時間中に保存するために、カオトロピック剤が、再懸濁させた試料中に組み込まれ、したがってその中に含まれる。このことは、遍在するＲＮＡ分解酵素に非常に感受性であるＲＮＡを単離する場合に、特に有利である。例によって実証されているように、核酸を複数の試料から自動化システムを使用して単離する場合によくあることであるが、特に、再懸濁させた試料が、ステップｃ）とステップｄ）との間で、より長い時間静止したままである場合に、および特に、複数の試料を処理するためにバッチ式手法が使用される場合に、再懸濁させた試料中にカオトロピック剤を組み込むことは、単離されるＲＮＡの質をかなり向上させる。
【００３２】
例えば、限定されないが、タンパク質または核酸の、二次、三次または四次構造を変化させると同時に一次構造を無傷のままにしておくことによって、タンパク質または核酸に障害を引き起こす任意のカオトロピック剤が、ステップｃ）において使用され得る。好ましくは、カオトロピック塩が使用される。好ましいカオトロピック剤は、限定されないが、例えば、チオシアン酸塩、イソチオシアン酸塩、過塩素酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩もしくはヨウ化物を含むおよび／またはグアニジニウムを含むカオトロピック塩を含み、好ましくは、グアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジンイソチオシアン酸塩、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸ナトリウム、尿素などから選択される。好ましくは、カオトロピック剤は、ＧＴＣもしくはＧＩＴＣまたは同等に強いカオトロピック剤である。それぞれの強カオトロピック剤は、核酸、特にＲＮＡを分解から保護する際に、非常に効果的である。しかし、それぞれの強カオトロピック剤は、沈殿形成および上記の容器壁への沈殿の付着を強力に誘導する。一実施形態によると、再懸濁させた試料は、カオトロピック剤を、０．１から飽和限界まで、０．２から６Ｍまで、０．１Ｍから４Ｍまで、０．５Ｍから３Ｍまで、０．７５Ｍから２．５Ｍまで、最も好ましくは少なくとも１Ｍからなる群から選択される濃度で含む。例において示されているように、それぞれの濃度を使用することは、組み込まれた核酸の完全性を効果的に保存するのに有用である。少なくとも１種のカオトロピック剤が、ステップｃ）において、別個の溶液の形で加えられ得る。前記別個の溶液は、好ましくは、カオトロピック塩、例えばグアニジニウム塩、緩衝液および／またはキレート剤を含む。好ましくは、前記緩衝液は、クエン酸ナトリウムを含む。
【００３３】
再懸濁させた試料のｐＨ値は、好ましくは、５から１０まで、５．５から９．５まで、６から９まで、６．５から８．５まで、好ましくは７から８までから選択される範囲にある。５から８．５までのｐＨ範囲において、血液試料から得られたペレットは、特に良好に再懸濁された。それ故、一実施形態によると、再懸濁溶液は、ステップｃ）において、陽イオン性界面活性剤および核酸を含む複合体に、好ましくはペレットに加えられ、この再懸濁溶液は、加えられた量で、再懸濁させた試料において上記で定義されているｐＨ範囲にあるｐＨ値を達成するようなｐＨ値を有する。一実施形態によると、再懸濁溶液のｐＨ値は、５から１０．５まで、５．５から１０まで、５．７から１０まで、６から９．７まで、６．３から９．５まで、６から９までおよび６から８．５までから選択されるｐＨ範囲にある。好ましくは、ｐＨ範囲は、５．７から１０まで、より好ましくは６から９までの範囲にある。その場合に、達成される核酸収量が、最適であった。
【００３４】
一実施形態によると、タンパク質分解化合物は、ステップｃ）において加えられ、したがって、再懸濁させた試料中に含まれる。タンパク質分解化合物の追加は、キレート剤の効果を支援することが本発明者らによって見出された。したがって、タンパク質分解化合物を再懸濁させた試料中に含むことは、沈殿形成および核酸を含有する沈殿の容器壁への付着を防ぐのに有益である。好ましい実施形態によると、タンパク質分解化合物は、タンパク質分解酵素である。タンパク質分解酵素は、例えばタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドにおいて、ペプチド結合の開裂に触媒作用を及ぼす酵素を指す。例示的なタンパク質分解酵素は、プロテイナーゼおよびプロテアーゼ、特にスブチリシン、サブチラーゼ、アルカリセリンプロテアーゼなどを含むが、これらに限定されない。サブチラーゼは、セリンプロテアーゼのファミリー、すなわち活性端にセリン残基を有する酵素である。スブチリシンは、広範の基質特異性を有する微生物セリンプロテアーゼである。スブチリシンは、尿素およびグアニジン塩酸塩などのカオトロピック剤ならびにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの陰イオン性界面活性剤による変性に、比較的耐性である。例示的なスブチリシンは、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＲ、プロテイナーゼＴ、スブチリシン、スブチリシンＡ、キアゲン  プロテアーゼ（QIAGEN Protease）などを含むが、これらに限定されない。サブチラーゼ、スブチリシン、プロテイナーゼＫおよび他のプロテアーゼの論考は、数ある中でも、ゲノヴ（Genov）ら, インターナショナル  ジャーナル  オブ  ペプチド  プロテイン  リサーチ（Int. J. Peptide Protein Res.） 45: 391 -400, 1995に見出され得る。好ましくは、タンパク質分解酵素はプロテイナーゼＫである。特にタンパク質分解酵素などのタンパク質分解化合物を再懸濁させた試料中に組み込むことは、ステップｄ）において核酸が単離される前の待機時間中に、再懸濁させた試料が予備消化もされるという利点を有する。限定されない態様では、タンパク質分解酵素は、再懸濁させた試料中に、約０．０５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの間の濃度で含む。他の実施形態では、範囲は、約０．１ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌまでの間または約０．２ｍｇ／ｍｌから約１．０ｍｇ／ｍｌまでの間であり得る。本発明者らによって、特にタンパク質分解酵素などのタンパク質分解化合物が、沈殿形成および容器壁への沈殿の付着を防ぐのを支援することが見出された。たとえ試料が、タンパク質分解酵素の能力を引き出すのに最適である条件下で（例えば加熱および撹拌）インキュベートされなかったとしても、この効果は見られた。
【００３５】
ステップｄ）における核酸単離用に、再懸濁させた試料を効果的に調製するために、核酸を単離する前に、再懸濁させた試料を完全に消化することが好ましい。ここでは、本発明と併せて使用され得る、種々の選択肢が存在する。続いて、いくつかの限定されない選択肢を記載する。
【００３６】
一実施形態によると、タンパク質分解酵素は、再懸濁させた試料中に含まれるのが好ましい。以上に論じられているように、タンパク質分解酵素は、ステップｃ）において、複合体の再懸濁前、再懸濁中または再懸濁後に、好ましくは再懸濁直後に直接加えられ得、それによって、再懸濁させた試料中に含まれる。一実施形態によると、それぞれ調製され再懸濁させた試料は、次いで、試料の少なくとも部分的な消化を可能にする条件下でインキュベートされる。消化は、例えば、再懸濁させた試料の、例えば室温での待機時間中に生じ得る。それによって、再懸濁させた試料は、待機時間にもよるが、ステップｄ）より前に、少なくとも部分的に消化される。消化は、ステップｃ）とｄ）との間の待機時間中には不完全であり得る。ステップｄ）における効果的な核酸単離を保証するために、再懸濁させた試料の完全な消化が好ましい。したがって、一実施形態によると、再懸濁させた試料の待機時間後、したがって、好ましくはステップｄ）において行われる核酸単離の最初のステップにおいて、再懸濁させた試料は、ステップｄ）において、再懸濁させた試料の消化を支援する条件下で、好ましくは、少なくとも３分間、好ましくは少なくとも５分間の加熱および撹拌下で、インキュベートされる。タンパク質分解酵素が、ステップｃ）において全く加えられていない場合、再懸濁させた試料の効果的な消化を可能にするために、タンパク質分解酵素は、ステップｄ）で加えられることになる。たとえタンパク質分解酵素が、ステップｃ）において、再懸濁させた試料中に既に含まれていたとしても、追加の量またはさらなる（例えば異なる）タンパク質分解酵素またはタンパク質分解化合物を、ステップｄ）において加えることも、本発明の範囲内である。
【００３７】
好ましい実施形態によると、タンパク質分解酵素は、ステップｃ）において得られる再懸濁させた試料中に含まれる。再懸濁させた試料の待機時間中に、タンパク質分解酵素は、最適ではないインキュベーション条件下でも（例えば室温で）、再懸濁させた試料を少なくとも部分的に消化することができる。高効率の消化を保証するために、再懸濁させた試料は、好ましくは、待機時間後、ステップｄ）において行われる核酸単離の最初のステップにおいて、試料の消化を促進する条件下で、例えば加熱および撹拌下で、インキュベートされる。
【００３８】
一実施形態によると、試料の消化を可能し、好ましくはステップｄ）において使用される条件は、以下の
ａ）加熱、
ｂ）撹拌、
ｃ）塩の存在、
ｄ）６から９の間のｐＨ値および／または
ｅ）少なくとも３分、好ましくは少なくとも５分、最も好ましくは少なくとも１０分間のインキュベーション期間
のうちの１つまたは複数を含む。
【００３９】
好ましくは、前記インキュベーションステップは、加熱下で行われる。好ましくは、再懸濁させた試料は、インキュベーション中に、少なくとも３５℃、少なくとも４０℃または少なくとも５０℃の温度に加熱され、好ましくは、少なくとも５５℃の温度に加熱される。プロテイナーゼＫなどのタンパク質分解酵素が、より高い温度で、その最適なそれぞれの最も高い活性を示すタンパク質分解化合物として使用される場合には、インキュベーション中に、それぞれのより高い温度を使用することは、特に好都合である。そのような条件下で、再懸濁させた試料の消化が促進される。言うまでもなく、タンパク質分解酵素が活性である温度が使用されるべきである。さらに、再懸濁させた試料を撹拌している間に、前記インキュベーションステップが行われることが好ましい。撹拌の限定されない例は、振盪、かき混ぜ、混合または振動を含む。ある特定の態様では、撹拌は、振盪を含む。振盪は、一次元、二次元または三次元の振盪であり得る。種々の振盪デバイスまたは撹拌デバイスが使用され得る。限定されない例は、サーモミキサー（Thermomixer）（エップンドルフ(Eppendorf)）、ターボミックス（TurboMix（サイエンティフィック  インダストリーズ(Scientific Industries)）、モー  バイオ  ボルテックス  アダプター（Mo Bio Vortex Adapter）（モー  バイオ  インダストリーズ(Mo Bio Laboratories)）、マイクロチューブ  ホルダー  ボルテックス  アダプター（Microtube holder vortex adapter）（トロエムナー(Troemner)）およびマイクロチューブ  フォーム  ラック  ボルテックス  アタッチメント（Microtube foam rack vortex attachment）（サイエンティフィック  インダストリーズ(Scientific Industries)）である。撹拌は、例えばミキサー中、少なくとも５０ｒｐｍ、少なくともｌ００ｒｐｍ、少なくとも２００ｒｐｍまたは少なくとも５００ｒｐｍで行われ得る。好ましくは、加熱および撹拌は、例えば、サーモミキサーまたは加熱および撹拌を同時に行うことができる同等の装置を使用することによって、同時に行われる。タンパク質分解化合物として少なくとも１種のタンパク質分解酵素を使用する場合、前記酵素が効果的に働き、触媒的に活性であることを保証するインキュベーション条件が使用される。条件は、使用されるタンパク質分解酵素によって決まり、それぞれ当業者によって決定可能であると知られている。好ましくは、インキュベーションは、タンパク質分解酵素の活性を促進および／または維持する塩および／またはイオンの存在下で行われる。適した塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2もしくはＣａＣｌ2またはカオトロピック塩などのカオトロピック剤を含むが、これらに限定されない。
【００４０】
上記の条件は、タンパク質分解化合物としてタンパク質分解酵素を使用する場合には、特に好都合であり、前記条件は、再懸濁させた試料の消化を促進する。以上に論じられているように、それぞれの条件下で再懸濁させた試料の消化は、核酸ステップｄ）における最初のステップとして行われることが好ましい。
【００４１】
さらに、含まれる核酸、特にＲＮＡの完全性を保存するために、少なくとも１種のカオトロピック剤が、再懸濁させた試料中に含まれるため、消化は、少なくとも１種のカオトロピック剤、好ましくはカオトロピック塩の存在下で行われる。さらなる量またはタイプのカオトロピック剤を、消化が行われる時点で加えることも、本発明の範囲内である。この目的のために、再懸濁させた試料中に含まれるもの（１種または複数）と同一でありまたは異なり得る少なくとも１種のカオトロピック剤を含む消化溶液を加えることができる。前記消化溶液は、例えば界面活性剤および塩などの、消化を促進するおよび／または含まれる核酸を保存する追加の化合物も含み得る。例えば、限定されないが、タンパク質または核酸の、二次、三次または四次構造を変化させると同時に一次構造を無傷のままにしておくことによって、タンパク質または核酸に障害を引き起こす任意のカオトロピック剤が、その目的のために使用され得る。インキュベーション中に、少なくとも１種のタンパク質分解化合物とともに使用することができる、好ましいカオトロピック剤は、限定されないが、グアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジンイソチオシアン酸塩、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸ナトリウム、尿素など含むカオトロピック塩である。
【００４２】
再懸濁させた試料を消化するための、少なくとも１種のタンパク質分解化合物を用いたインキュベーションは、通常、含まれる核酸の分解につながらないｐＨ値で行われる。さらに、タンパク質分解化合物としてタンパク質分解酵素を使用する場合、タンパク質分解酵素が活性であるｐＨ値を使用するべきである。好ましくは、再懸濁させた試料を消化するための、少なくとも１種のタンパク質分解化合物を用いたインキュベーションは、ｐＨ４．３から９までの間、６から８までの間で行われ、好ましくは、中性のｐＨ値で行われる。
【００４３】
以上に論じられているように、一実施形態によると、タンパク質分解酵素は、再懸濁させた試料中に含まれる。この実施形態において、消化は、ステップｃ）とｄ）との間の、再懸濁させた試料の待機時間中に、既に生じる。しかし、再懸濁させた試料は、ステップｄ）より前の待機時間が異なることがあり、さらに、消化は、待機時間中に存在する条件下で完全ではない可能性があるため、待機時間後、ステップｄ）において行われる核酸単離の最初のステップにおいて、試料の消化を促進する条件下で、再懸濁させた試料を追加的にインキュベートすることが好ましい。
【００４４】
好ましい実施形態によると、再懸濁させた試料を消化するためのインキュベーションは、加熱、撹拌下、カオトロピック剤の存在下で、ｐＨ５から９まで、好ましくは６から８まで、好ましくは中性のｐＨで、少なくとも３分、好ましくは少なくとも５分のインキュベーション期間で行われる。ステップｄ）におけるタンパク質の効果的な分解を保証するために、再懸濁させた試料は、ステップｄ）において、少なくとも３分、好ましくは少なくとも５分の期間、タンパク質の効果的な分解を保証するために、高温で、好ましくは５０℃を超える温度でインキュベートされるべきである。好ましい実施形態によると、インキュベーションは、少なくとも５分間、好ましくは少なくとも１０分間行われる。
【００４５】
ステップｄ）における核酸単離手法の最初のステップとして、以上に記載されているように、再懸濁させた試料を場合によって、しかし好ましくは消化した後、核酸を、例えば固相に結合させることができ、核酸を、場合によってそこから溶出することができる。好ましい実施形態は、以下に記載されている。
【００４６】
固相として、試料中に存在するまたは試料から放出される核酸を結合することができる任意の材料が使用され得、これは、適した条件下で核酸を結合することができる種々の材料を含み得る。本発明と併せて使用され得る例示的な固相は、限定されないが、シリカ粒子、二酸化ケイ素、珪藻土、ガラス、アルキルシリカ、ケイ酸アルミニウムおよびホウケイ酸塩を含むシリカ、ニトロセルロース、ジアゾ化紙、ヒドロキシアパタイト（ヒドロキシルアパタイトとも称される）、ナイロン、金属酸化物、ジルコニア、アルミナ、ポリマー支持体、ジエチルアミノエチル−およびトリエチルアミノエチル−誘導化支持体、疎水性クロマトグラフィー樹脂（フェニル−またはオクチルセファロースなど）などを含む化合物を含むが、これらに限定されない。固相という用語は、その形またはデザインに関して、いずれの限定も含意することを意図するものではない。したがって、固相という用語は、多孔性または非多孔性、透過性または不透過性である適切な材料を包含し、膜、フィルター、シート、粒子、磁性粒子、ビーズ、ゲル、粉末、繊維などを含むが、これらに限定されない。一実施形態によると、例えばシリカ固相などの固相の表面は、改変されない、例えば官能基を用いて修飾されない。
【００４７】
好ましい実施形態によると、シリカを含む固相が使用される。シリカベースの核酸単離方法は、先行技術において幅広く使用されている。シリカを含む固相は、例えばフィルター、繊維、膜または粒子の形を有し得る。特に、ビーズの形で使用することができ、好ましくは、約０．０２から３０μｍまで、より好ましくは０．０５から１５μｍまで、最も好ましくは０．１から１０μｍまでの粒子サイズを有するシリカ粒子の使用が好ましい。固相に結合する核酸の処理を容易にするために、好ましくは磁性シリカ粒子が使用される。磁性シリカ粒子は、例えば、フェリ磁性、強磁性、常磁性または超常磁性であり得る。適した磁性シリカ粒子は、例えば国際公開第０１／７１７３２号パンフレット、国際公開第２００４／００３２３１号パンフレットおよび国際公開第２００３／００４１５０号パンフレットに記載されている。他の磁性シリカ粒子は、先行技術からも知られており、例えば国際公開第９８／３１８４０号パンフレット、国際公開第９８／３１４６１号パンフレット、欧州特許出願公開第１２６０５９５号明細書、国際公開第９６／４１８１１号パンフレットおよび欧州特許出願公開第ＥＰ０３４３９３４号明細書（ＥＰ０３４３９３４）に記載されており、例えば磁性シリカガラス粒子も含む。
【００４８】
一実施形態によると、結合は、以下の特徴、
ａ）結合が、少なくとも１種のカオトロピック剤の存在下で行われる、
ｂ）結合が、少なくとも１種のアルコールの存在下で行われる、
ｃ）結合が、少なくとも１種の界面活性剤の存在下で行われる、
ｄ）結合が、核酸、特にＲＮＡの結合を促進する条件下で行われる、および／または
ｅ）結合が、小さい核酸、特に小さいＲＮＡ種の結合を促進する条件下で行われる
のうちの、１つまたは複数、好ましくは少なくとも２つを有する条件下で行われる。
【００４９】
一実施形態によると、核酸の固相への結合は、ステップｄ）において、少なくとも１種のカオトロピック剤、好ましくはカオトロピック塩の存在下でおよび／または少なくとも１種のアルコールの存在下で行われる。以上に論じられているように、カオトロピック剤の混合物も使用することができる。結合中に使用される、カオトロピック剤またはカオトロピック剤の混合物の濃度は、０．０５Ｍから飽和限界までの範囲にあり得る。好ましい濃度範囲は、使用されるカオトロピック剤によって決まり、０．１Ｍから７Ｍまで、１Ｍから７Ｍまで、１．５Ｍから６Ｍまでおよび２Ｍから４Ｍまでの範囲内にある。適したカオトロピック剤は、特にカオトロピック塩であり、限定されないが、グアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジンイソチオシアン酸塩、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸ナトリウム、尿素などを含み、特に好ましいものは、グアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアン酸塩およびグアニジンイソチオシアン酸塩である。以上に論じられているように、再懸濁させた試料は、ステップｃ）とステップｄ）との間のより長い待機時間中に、再懸濁させた試料中の核酸の完全性を保存するために加えられている、少なくとも１種のカオトロピック剤を既に含む。したがって、核酸の固相への結合を可能にするために、カオトロピック剤を追加的に加えることは必要ではない。しかし、ステップｄ）において、例えば水性結合溶液の形で、少なくとも１種のカオトロピック剤を追加的に加えることも、本発明の範囲内である。
【００５０】
結合を促進するために使用することができるアルコールとして、好ましくは１から５個までの炭素原子を有する、単鎖の分枝または非分枝のアルコールを使用することが好ましい。例として、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールおよびブタノールが挙げられる。アルコールの混合物も使用することができる。アルコールは、好ましくはイソプロパノールおよびエタノールから選択され、標的核酸としてＲＮＡを単離する場合に、特に十分に適しているのはイソプロパノールである。好ましくは、本発明による方法は、フェノールおよび／またはクロロホルムの使用を含まない。
【００５１】
アルコールは、１０％ｖ／ｖから９０％ｖ／ｖまで、特に１５％ｖ／ｖから８０％ｖ／ｖまで、２０％から８０％ｖ／ｖまでの濃度で、結合混合物中に含まれ得る。結合混合物は、再懸濁させた試料および固相を特に含み、場合によって、結合条件を確立し、それぞれ改良するために加えられたさらなる薬剤を含み得る。小さいＲＮＡも含む総ＲＮＡを単離するために、結合中、したがって結合混合物中に、３０％ｖ／ｖ以上、好ましくは４０％ｖ／ｖ以上から９０％ｖ／ｖ以下まで、より好ましくは５０％ｖ／ｖ以上から９０％ｖ／ｖ以下までまたは６０％ｖ／ｖ以上から８０％ｖ／ｖ以下までのアルコール濃度を使用することが有益である。
【００５２】
アルコールのそれぞれのより高い濃度によって、結合が向上し、したがって、短い核酸（通常、それぞれ５００ｎｔ以下の長さのサイズを有する）、特に小さいＲＮＡ種の単離が向上する。小さいＲＮＡを含むＲＮＡを単離することを意図する場合、結合中に、４０％ｖ／ｖ以上から９０％ｖ／ｖ以下までまたは６０％ｖ／ｖ以上から８０％ｖ／ｖ以下までのアルコール濃度が最も好ましい。１種または複数のカオトロピック剤がより高い濃度で存在する場合および核酸をシリカ表面に結合させる場合に、これらの濃度は、特に良好に働く。
【００５３】
したがって、一実施形態によると、ステップｄ）における単離は、核酸を固相に結合させるための、以下の特徴、
ａ）１０％ｖ／ｖから９０％ｖ／ｖまで、１５％ｖ／ｖから９０％ｖ／ｖまで、２０％ｖ／ｖから８５％ｖ／ｖまで、３０％ｖ／ｖから８０％ｖ／ｖまで、４０％ｖ／ｖから８５％ｖ／ｖまで、４０％ｖ／ｖから８０％まで、４０％ｖ／ｖから７０％まで、５０％ｖ／ｖ以上から８０％ｖ／ｖ以下までおよび６０％ｖ／ｖ以上から８０％ｖ／ｖ以下までからなる群から選択されるアルコール濃度を使用する、
ｂ）０．０５Ｍから飽和限界まで、０．１Ｍから６Ｍまでおよび１Ｍから４Ｍまでからなる群から選択される、１種または複数のカオトロピック剤の濃度を使用する、および／または、
ｃ）小さいＲＮＡを含むＲＮＡを固相に結合させるために、少なくとも３０％ｖ／ｖ、好ましくは少なくとも４０％ｖ／ｖのアルコール濃度および少なくとも１種のカオトロピック剤を使用する
のうちの１つまたは複数を有する結合条件を使用して行われる。
【００５４】
それぞれの結合条件を確立するために、例えばアルコールおよびカオトロピック剤を含む結合溶液を、例えば再懸濁させた試料に、好ましくは再懸濁させ消化された試料に加えることができる。
【００５５】
場合によって、核酸の固相への結合を促進するために、１種または複数の界面活性剤を結合混合物に加えることができる。好ましくは、少なくとも１種のイオン性界面活性剤および／または少なくとも１種の非イオン性界面活性剤が加えられる。好ましくは、非イオン性界面活性剤は、少なくとも５％の濃度で使用される。それぞれの消化溶液が、消化、それぞれ試料の溶解を促進するために加えられる場合、前記界面活性剤は、例えば結合溶液と一緒に加えられ得るまたは再懸濁させた試料および／または消化溶液によって得られ得る。
【００５６】
さらに、生理的緩衝液などの緩衝液を、結合のために使用することができ、それぞれ結合溶液中に組み込むことができる。生理的緩衝液の限定されない例は、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＲＩＳ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳプロパンおよび他のものを含むが、これらに限定されない。好ましくは、Ｔｒｉｓ緩衝液が、結合溶液中に使用される。
【００５７】
それ故、一実施形態によると、再懸濁させた試料中に含まれる核酸を固相に結合させることを可能にする結合条件を確立するために、ステップｄ）における核酸単離は、少なくとも１種のアルコールおよび／または少なくとも１種のカオトロピック剤および場合によって生理的緩衝液、好ましくはＴｒｉｓを含む結合溶液の追加を含む。場合によって、結合溶液は、以上に記載されているような界面活性剤を追加的に含む。しかし、結合混合物における適した結合条件を確立するために、成分を別個に加えることもできる。好ましくは、結合溶液のｐＨは、８を含む範囲である。一実施形態によると、結合溶液のｐＨは、ｐＨ７．０から９まで、好ましくは７．５から８．５までの範囲であり、最も好ましくは、結合溶液はｐＨ８を有する。
【００５８】
一実施形態によると、単離された核酸をさらに精製するために、１つまたは複数の洗浄ステップが、単離ステップｄ）において行われる。一実施形態によると、１つまたは複数の洗浄ステップは、核酸が固相に結合されている間に行われる。この目的のために、一般的な洗浄溶液が使用され得る。一実施形態によると、洗浄に使用される溶液は、少なくとも１種のカオトロピック剤、少なくとも１種のアルコール、少なくとも１種の界面活性剤および／または少なくとも１種の緩衝成分を含む。洗浄溶液中に使用することができるカオトロピック剤は、グアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジンイソチオシアン酸塩およびヨウ化ナトリウムを含むが、これらに限定されない。さらに、トリクロロ酢酸塩、過塩素酸塩およびトリフルオロ酢酸塩からなる群から選択されるカオトロピック陰イオンを含むカオトロピック塩を使用することができる。それぞれのカオトロピック塩の例は、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウムおよびトリフルオロ酢酸ナトリウムのようなアルカリ塩である。それぞれ洗浄溶液中に、アルコールとして、好ましくは１から５個までの炭素原子を有する単鎖の分枝または非分枝のアルコールを、洗浄に使用することができる。例として、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールおよびブタノールが挙げられる。好ましくは、イソプロパノールおよび／またはエタノールが使用される。好ましくは、洗浄溶液は、少なくとも５０％アルコールおよび少なくとも１Ｍカオトロピック塩、好ましくは少なくとも２Ｍカオトロピック塩を含む。さらに、洗浄溶液は、界面活性剤を含み得る。好ましくは、イオン性界面活性剤および／または非イオン性界面活性剤が、界面活性剤として使用される。好ましくは、非イオン性界面活性剤は、少なくとも５％の濃度で使用される。
【００５９】
代替的にまたは上記の洗浄溶液に加えても使用することができる、さらなる適した洗浄溶液は、アルコールおよび生理的緩衝液を含む。適したアルコールおよび生理的緩衝液は、以上に記載されている。好ましくは、イソプロパノールまたはエタノール、最も好ましくはエタノールが、この第２の洗浄ステップに使用される。好ましくは、エタノールが、少なくとも７０％ｖ／ｖ、好ましくは少なくとも８０％ｖ／ｖの濃度で使用される。生理的緩衝液は、好ましくは約７から８までのｐＨのＴｒｉｓである。一実施形態によると、洗浄に使用される溶液は、少なくとも１種のカオトロピック剤、少なくとも１種のアルコール、少なくとも１種の界面活性剤および／または少なくとも１種の緩衝成分を含む。
【００６０】
核酸を固相から溶出するために、溶出ステップを行うことが望ましい場合には、溶出は、例えば水、溶出緩衝液などの古典的な溶出溶液、特にＴｒｉｓなどの生理的緩衝液を用いて行うことができ、好ましくは、意図された後続の適用を妨げない溶出溶液が使用される。溶出後、溶出液は、加熱変性され得る。しかし、ステップｃ）および／またはｅ）において、例えば加熱などの他の溶出手段によって、核酸を固相から放出する、したがって溶出することも、本発明の範囲内である。
【００６１】
一実施形態によると、本発明の方法に従って、ＲＮＡのみならずＤＮＡも、ステップｄ）において固相に結合され、したがって単離される。以上に論じられているように、本発明の教示は、核酸の完全性を保存しながら、全体的な核酸収量を増加させる。
【００６２】
一実施形態によると、試料は、少なくとも１種の非標的核酸および少なくとも１種の標的核酸ならびに標的核酸を主に単離することを目指す方法を含む。例えば、非標的核酸はＤＮＡであり得、標的核酸はＲＮＡであり得、またはその逆も同様である。
【００６３】
一実施形態によると、単離ステップｄ）は、主に標的核酸の単離を可能にするために、いくつかの中間ステップを含む。一実施形態によると、単離ステップｄ）は、試料の消化ステップ（以上を参照のこと）のみならず、少なくとも一部の非標的核酸を除去する中間ステップも含む。好ましくは、非標的核酸は、少なくとも一部の非標的核酸を、適切な条件下で固相に結合させ、次いで、標的核酸を含む残りの試料から、固相に結合された非標的核酸を分離することによって除去される。これは、例えば、主に非標的核酸が固相に結合される条件下で、適した固相を加えることによって達成することができる。非標的核酸を標的核酸から選択的に除去するのに適した方法は、例えば、参照することにより本明細書に援用されている、欧州特許出願公開第０８８０５３７号明細書および国際公開第９５／２１８４９号パンフレットに記載されている。所望ならば、前記非標的核酸はまた、さらに使用され得、例えば固相から溶出されるなど、例えばさらに処理され得る。しかし、それはまた捨てられ得る。ＲＮＡ（のみ）を標的核酸として単離することを意図する場合、非標的核酸は、通常ＤＮＡである。
【００６４】
単離された標的核酸中の非標的核酸の量をさらに減少させるために、少なくとも一部の非標的核酸が除去された後に、適した酵素を使用して、非標的核酸を分解するための中間ステップを行うことができる。除去ステップを省略し、１種または複数の適切な酵素のみを使用することによって、非標的核酸を破壊することも、本発明の範囲内である。したがって、一実施形態によると、単離ステップｄ）は、（残りの）非標的核酸を分解するために、酵素処理を行うことを含む。ＲＮＡが標的核酸として単離される一実施形態によると、ＤＮａｓｅ処理が行われる。ＤＮａｓｅ消化を行うための条件は、先行技術において知られているため、それらは、本明細書でのさらなる説明を必要としない。基本的には、ＤＮＡを標的核酸として単離する場合、よって、ＲＮＡを非標的核酸として分解するためのＲＮａｓｅを使用する場合と同一のことが適用される。
【００６５】
ＲＮＡが少なくともＲＮＡおよびＤＮＡを含む試料から単離される、本発明の好ましい実施形態によると、単離ステップｄ）は、以下のステップ、
ｉ）ＤＮＡを第１の固相に結合させ、前記第１の固相に結合されたＤＮＡを、ＲＮＡを含む残りの試料から分離することによって、再懸濁させ好ましくは消化された試料から、少なくとも一部のＤＮＡを除去するステップ、
ｉｉ）少なくとも１種のカオトロピック剤および３０％ｖ／ｖ以上の濃度の少なくとも１種のアルコールが、この結合ステップｉｉ）中に使用される、ＲＮＡを第２の固相に結合させるステップ、
−  場合によって、前記第２の固相に結合されているＲＮＡを洗浄するために、少なくとも１つの洗浄ステップを行うステップ、ならびに
−  場合によって、ＲＮＡを前記第２の固相から溶出するステップ
を含む。
【００６６】
単離ステップｄ）は、残りのＤＮＡおよび／またはタンパク質汚染物を消化するために、追加のステップ、例えば少なくとも１種の追加の酵素的消化ステップも含み得る。
【００６７】
少なくともＲＮＡが、少なくともＲＮＡおよびＤＮＡを含む試料から単離される、本発明の好ましい実施形態によると、単離ステップｄ）は、以下のステップを含む。
【００６８】
−  タンパク質分解酵素を含む再懸濁させた試料を得るステップおよび好ましくは、再懸濁させた試料を、少なくとも５分間、室温を超える、好ましくは５０℃を超える温度でインキュベートすることによって、再懸濁させた試料の消化を続けるステップ。適したインキュベーション条件は、以上に記載されており、それは、それぞれの開示に言及されている。
【００６９】
−  ＤＮＡを第１の固相に結合させ、前記第１の固相に結合されたＤＮＡを、ＲＮＡを含む残りの試料から分離することによって、再懸濁および消化された試料から少なくとも一部のＤＮＡを除去するステップ。それによって、ＤＮＡを除去することができる。除去されたＤＮＡは、例えば分析されるまたは増幅されるなど、さらに処理され得る。場合によって、ＲＮＡおよびＤＮＡの平行単離が関心対象である場合、ＤＮＡは第１の固相から溶出される。
【００７０】
−  少なくとも１種のカオトロピック剤および３０％ｖ／ｖ以上の濃度の少なくとも１種のアルコールが、このＲＮＡ結合ステップ中に使用される、ＲＮＡを第２の固相に結合させるステップ。適した結合条件ならびに特にカオトロピック剤およびアルコールの適した濃度範囲は、以上に記載されており、それは、それぞれの開示に言及されている。
【００７１】
−  場合によって、前記第２の固相に結合されているＲＮＡを洗浄するために、少なくとも１つの洗浄ステップを行うステップ。洗浄ステップに関する詳細は、以上に記載されており、それは、それぞれの開示に言及されている。
【００７２】
−  場合によって、ＤＮａｓｅ消化および／またはタンパク質分解酵素を使用した消化を行うステップ。ＤＮａｓｅ消化を行うことは、残りの微量のＤＮＡを、効果的に除去することができるという利点を有する。第２のタンパク質消化ステップを行うことも、単離されるＲＮＡの純度を増加させるために有利である。好ましくは、ＲＮＡは、ＤＮａｓｅ消化を行う前に溶出され、タンパク質分解酵素は、ＤＮａｓｅ消化が行われた後に加えられ、反応混合物は、カオトロピック剤の存在下でインキュベートされる。適した消化条件も、以上に記載されている。好ましくは、プロテイナーゼＫが、タンパク質分解酵素として使用される。前記第２のタンパク質消化ステップに関する詳細および関連する利点は、欧州特許出願公開第１０００７３４６．９号明細書（ＥＰ１０００７３４６．９）に記載されている。タンパク質消化ステップが行われた後、好ましくは、少なくとも１種のカオトロピック剤および少なくとも１種のアルコールを加えることによって、ＲＮＡは、第２の固相に再結合される。適した結合条件は、以上に記載されており、それは、それぞれの開示に言及されている。好ましくは、第１のＲＮＡ結合ステップにおいて使用されたのと同一の結合条件が使用される。再結合した後、場合によって、１つまたは複数の洗浄ステップが行われ得る。場合によって、ＲＮＡは、前記第２の固相から溶出され、場合によって、溶出されたＲＮＡは、加熱処理を行うことによって変性される。
【００７３】
本明細書に記載されているもの以外の追加の中間ステップを行うことも、本発明の範囲内である。しかし、ある特定の実施形態によると、本明細書に記載されているもの以外の追加のステップは、全く行われない。
【００７４】
核酸が単離されるべき試料は、一実施形態によると、試料を、安定化させる組成物と接触させることによって、それぞれ安定化され得、かかる安定化させる組成物は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を有する。
ａ）安定化させる組成物は、
ａ）一般式
Ｙ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｒ4Ｘ-
の陽イオン性（cationic）化合物
［式中、Ｙは、窒素またはリン、好ましくは窒素を表し、
Ｒ1Ｒ2Ｒ3およびＲ4は、独立して、分枝または非分枝のＣ1〜Ｃ20−アルキル基、Ｃ6〜Ｃ20−アリール基および／またはＣ6〜Ｃ26アラルキル基を表し、
Ｘ-は、無機または有機の、一塩基酸または多塩基酸の陰イオン（anion）を表す］
および
ｂ）少なくとも１つのプロトン供与体
を含む。
【００７５】
一実施形態によると、ＲＮＡが全血または血漿もしくは血清などの血液製剤などの生物試料から単離される場合が特に好ましく、試料中に含まれる核酸集団の現状、特に転写パターンを保存するために、試料中に含有される核酸は、好ましくは、生物試料がその自然環境から採取された直後に安定化される。このことは、医学および診断の分野において、特に有益である。
【００７６】
したがって、一実施形態によると、試料が得られた後、その試料から核酸を単離する前に、試料は、前記試料中の核酸を安定化させるための核酸貯蔵安定化組成物と、速やかに混合されることが好ましい。例えば、試料は、適した採取デバイス中、例えば、安定化組成物を含む真空採血管中に採取することができる。それによって、試料は、採取時に速やかに安定化される。一実施形態によると、前記安定化組成物は、
ａ）一般式
Ｙ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｒ4Ｘ-
の陽イオン性（cationic）化合物
［式中、Ｙは、窒素またはリン、好ましくは窒素を表し、
Ｒ1Ｒ2Ｒ3およびＲ4は、独立して、分枝または非分枝のＣ1〜Ｃ20−アルキル基、Ｃ6〜Ｃ20−アリール基および／またはＣ6〜Ｃ26アラルキル基を表し、
Ｘ-は、無機または有機の、一塩基酸または多塩基酸の陰イオン（anion）を表す］
および
ｂ）好ましくは、組成物中に、５０ｍＭを超えて飽和までの濃度で存在し、好ましくは、飽和脂肪族モノカルボン酸、不飽和アルケニル−カルボン酸、飽和および／または不飽和脂肪族Ｃ2〜Ｃ6−ジカルボン酸、脂肪族ヒドロキシル−ジ−およびトリカルボン酸、脂肪族ケトカルボン酸、アミノ酸もしくは無機酸またはその塩の、単独または組合せからなる群から選択される、少なくとも１つのプロトン供与体
を含む。
【００７７】
好ましくは、Ｒ1は、１２、１４または１６個の炭素原子を有する高級アルキル基を意味し、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれメチル基を表す。
【００７８】
好ましくは、陰イオンＸ-は、ハロゲン化水素酸の陰イオンまたは一塩基もしくは二塩基の有機酸の陰イオンを表し、最も好ましくは、陰イオンＸ-は、臭化物、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩またはクエン酸塩からなる群から選択される。
【００７９】
好ましくは、プロトン供与体は、飽和脂肪族モノカルボン酸、不飽和アルケニル−カルボン酸、飽和および／または不飽和脂肪族Ｃ2〜Ｃ6−ジカルボン酸、脂肪族ケトカルボン酸、アミノ酸もしくは無機酸またはその塩およびその組合せからなる群から選択される。好ましくは、脂肪族モノカルボン酸は、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸、ｎ−吉草酸、イソ吉草酸、エチル−メチル−酢酸（２−メチル−酪酸）、２，２−ジメチルプロピオン酸（ピバル酸）、ｎ−ヘキサン酸、ｎ−オクタン酸、ｎ−デカン酸もしくはｎ−ドデカン酸（ラウリン酸）またはその混合物からなる群から選択されるＣ1〜Ｃ6−アルキル−カルボン酸を含む。好ましくは、脂肪族アルケニル−カルボン酸は、アクリル酸（プロペン酸）、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸もしくはビニル酢酸またはその混合物からなる群から選択される。好ましくは、飽和脂肪族Ｃ2〜Ｃ6−ジカルボン酸は、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸もしくはアジピン酸またはその混合物からなる群から選択される。最も好ましくは、脂肪族ジカルボン酸は、シュウ酸もしくはコハク酸またはその混合物である。好ましくは、脂肪族ヒドロキシ−ジ−および−トリカルボン酸は、タルトロン酸、Ｄ−（＋）、Ｌ−（−）もしくはＤＬ−リンゴ酸、（２Ｒ、３Ｒ）−（＋）−酒石酸、（２Ｓ、３Ｓ）−（−）−酒石酸、メソ−酒石酸およびクエン酸またはその混合物からなる群から選択される。最も好ましくは、不飽和ジカルボン酸は、マレイン酸および／またはフマル酸またはその混合物である。好ましくは、不飽和トリカルボン酸は、アコニット酸である。好ましくは、脂肪族ケトジカルボン酸は、メソシュウ酸もしくはオキサロ酢酸またはその混合物である。好ましくは、アミノ酸は、アミノ酢酸（グリシン）、α−アミノプロピオン酸（アラニン）、α−アミノ−イソ−吉草酸（バリン）、α−アミノ−イソ−カプロン酸（ロイシン）およびα−アミノ−β−メチル吉草酸（イソロイシン）またはその混合物からなる群から選択される。
【００８０】
好ましくは、安定化させる組成物は、水溶液中に存在する。好ましくは、陽イオン性化合物は、０．０１重量パーセントから１５重量パーセントまでの範囲の濃度で含まれる。
【００８１】
適した安定化させる溶液は、例えば、参照することにより本明細書に援用されている米国特許第７，２７０，９５３号明細書にも、詳細に記載されている。以上に記載されているように、安定化組成物中に含まれる陽イオン性化合物は、試料中に含まれる核酸と複合体を形成する。一実施形態によると、安定化された試料は、キレート剤を含まない。別の実施形態によると、それは、キレート剤を含み得る。
【００８２】
代替の実施形態によると、安定化組成物は、使用される条件下で、荷電した第４級アンモニウム陽イオンを極性頭部基として含む界面活性剤を含み、したがって、使用される安定化条件下で、陽イオン性であるまたは陽イオン性となる。よって、界面活性剤が、安定化中、それぞれ複合体形成中に、陽イオン性であるまたは陽イオン性となる場合には、本来は非イオン性の界面活性剤も、核酸複合体を得るために使用することができる。したがって、恒久的に荷電した頭部基を含む陽イオン性界面活性剤の他に、本来は第３級アミンも、もしも酸性環境で、それによって第３級アミンがプロトンを取り込み、正に帯電するようになるならば、陽イオン性界面活性剤として使用することができる。
【００８３】
一実施形態によると、下記式２
Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｎ（Ｏ）ｘ  （２）
［式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル残基、Ｃ６〜Ｃ２６アリール残基またはＣ６〜Ｃ２６アラルキル残基であり、好ましくはＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル残基、Ｃ６〜Ｃ１２アリール残基またはＣ６〜Ｃ１２アラルキル残基であり、
Ｒ３、はＣ１〜Ｃ２０アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２６アリール残基またはＣ６〜Ｃ２６アラルキル残基であり、
Ｘは、０および１の整数である］
を有するアミノ界面活性剤は、安定化組成物中で界面活性剤として使用され、これは使用される安定化条件下で、陽イオン性であるまたは陽イオン性となり、それによって陽イオン性界面活性剤として機能する。
【００８４】
一実施形態によると、ｘは１であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒ３はＣ１〜Ｃ２０アルキルである。好ましい実施形態によると、ｘは０である。一実施形態によると、前記アミノ界面活性剤は、ドデシルアミン、Ｎ−メチルドデシルアミン、Ｎ、Ｎ−ジメチルドデシルアミン、Ｎ、Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮオキシドおよび４−テトラデシルアニリンからなる群から選択される。好ましくは、前記アミノ界面活性剤は、第４級アンモニウム陽イオンになるための、少なくとも１種のプロトン供与体、好ましくは酸または酸性塩を追加的に含む安定化組成物中に含まれる。一実施形態によると、安定化組成物は、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、シュウ酸、カルボン酸および鉱酸からなる群から選択される少なくとも１種の酸性塩を含む。安定化組成物中の前記酸性塩の総濃度は、好ましくは０．０１Ｍから１Ｍまでの範囲であり得る。
【００８５】
陽イオン性界面活性剤を使用して、以上に記載されているように安定化される複合体試料は、特に、試料が血液試料または血液に由来する試料である場合には、安定化させる溶液中の添加剤および試料の高タンパク質含量が原因で、核酸を単離するには特に難題である。本発明の方法は、これらの困難を克服し、それぞれの安定化された試料からならびに特に、全血および軟膜、血清および／または血漿などの血液製剤または組織試料、特に、例えば肺または肝臓から得られる臓器組織試料などの複雑な生物試料から、小さいＲＮＡ（所望ならば）を含むＲＮＡの単離を、良好な収量および高純度で可能にする。それ故、 本発明の方法は、医学および特に診断の分野において、特に有用である。
【００８６】
一実施形態によると、核酸、少なくとも１種のカオトロピック剤、少なくとも１種のキレート剤および場合によってタンパク質分解化合物を含む再懸濁させた試料は、ステップｃ）とステップｄ）との間で待機状態である。ステップｄ）において核酸を単離する前の前記待機時間は、０．１時間を超える、０．２５時間を超える、０．５時間を超える、０．７５時間を超える、１時間を超える、１．５時間を超える、２時間を超える、２．５時間を超えるもしくは３時間を超える期間を有し得、好ましくは０．２５時間から１２時間まで、０．５時間から１１時間まで、０．７５時間から１０時間まで、１時間から９時間まで、１．２５時間から８．５時間まで、１．５時間から８時間まで、１．７５時間から７．５時間まで、１．２５時間から７時間まで、１．５時間から６．５時間まで、１．７５時間から６時間までおよび２時間から５．５時間までから選択される範囲にある。
【００８７】
以上に論じられているように、試料が、ステップｃ）における再懸濁と実際の核酸単離ステップｄ）との間で待機状態である状況は、自動化システムを使用して複数の試料を処理する場合に生じることが多い。以上に論じられているように、試料は、（例えば、試料を遠心分離し、陽イオン性界面活性剤および核酸を含む複合体を含むペレットを得、再懸濁化学物質を加えることによって）核酸単離用に手動で調製されることが多い。その後、調製し、再懸濁させた試料を、核酸単離用のロボットシステムの中に置く。前記ロボットシステムは、加熱および／または撹拌ステップを行うように設計されていることが多いため、上記の消化ステップも遂行され得る。本発明による方法は、複数の試料を処理する場合、特に自動化システムを使用する場合に、特定の利点を有する。
【００８８】
したがって、一実施形態によると、ステップｃ）とステップｄ）との間の待機時間が、再懸濁させた試料のうちの少なくともいくつかの間で異なる、複数の試料が処理される。この実施形態によると、複数の試料は、ステップｃ）までの本方法に従って処理される。ステップｃ）における再懸濁後、一部の前記複数の試料は、残りの再懸濁させた試料が、待機状態である間に、ステップｄ）に従って、さらに処理される。次いで、好ましくは核酸が再懸濁させた試料のうちの最初の部分から単離された後に、待機状態であったこれらの再懸濁させた試料が、ステップｄ）に従って、さらに処理される。
【００８９】
好ましくは、複数の試料は、磁性粒子を処理することができる自動化システムを使用して処理される。ステップｄ）において、再懸濁させた試料から核酸を単離するために、磁性粒子を使用することは、取り扱いが簡素化されるので有益である。磁性粒子は、磁場を用いて処理され得る。適したおよび好ましい磁性粒子は、以上に記載されている。この点で、ステップｄ）における核酸単離中に、磁性粒子を処理するために、本発明と併せて使用され得る先行技術において、種々の自動化ロボットシステムが存在する。一実施形態によると、磁性粒子を、反応器の底部または側部で回収し、残りの液体試料を反応器から除去し、回収された磁性粒子を後に残し、これに核酸を結合させる。残りの試料の除去は、デカンテーションまたは吸引によって生じ得る。そのようなシステムは、先行技術においてよく知られており、したがって、本明細書でのさらなる説明を必要としない。磁性粒子を処理することで知られている代替システムにおいて、カバーまたはエンベロープによって通常被覆されている磁石が反応器中に投じられて、磁性粒子を回収する。結合された核酸を担持する磁性粒子は、次いで、例えばさらなる処理溶液、例えば洗浄溶液などを含む新しい反応器中に移され得る。それぞれのシステムは、先行技術においてよく知られており、市販もされているため（例えばキアシンフォニー（ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ）、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ））、それらは、本明細書でのさらなる説明を全く必要としない。磁性粒子を処理することで知られている、さらなる代替の自動化システムにおいて、磁性粒子を含む試料を、ピペットの先端中に吸引することができ、例えばピペットの先端の側部に磁石を適用することによって、ピペットの先端に磁性粒子を回収することができる。次いで、ピペットの先端にある磁石のために、結合された核酸を担持する回収された磁性粒子が、残ったままになっている間に、残りの試料が、ピペットの先端から放出され得る。回収された磁性粒子は、次いで、さらに処理され得る。そのようなシステムも、先行技術においてよく知られており、市販もされており（例えばバイオロボット（ＢｉｏＲｏｂｏｔ）ＥＺ１、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ））、したがって、本明細書でのさらなる説明を全く必要としない。
【００９０】
「試料」という用語は、本明細書において、幅広い意味で使用されており、核酸を含有する種々の源を含むことを意図する。試料は生物試料であり得るが、この用語は他のもの、例えば、核酸を含む人工試料も含む。例示的な試料は、限定されないが、一般に体液、全血、血清、血漿、赤血球、白血球、軟膜、限定されないが、頬部ぬぐい液、咽喉ぬぐい液、膣ぬぐい液、尿道ぬぐい液、子宮頚部ぬぐい液、咽喉ぬぐい液、直腸ぬぐい液、病巣ぬぐい液、膿瘍ぬぐい液、鼻咽頭ぬぐい液などを含むぬぐい液、尿、痰、唾液、精液、リンパ液、髄液、羊水、脳脊髄液、腹水、胸水、嚢胞からの液、滑液、硝子体液、房水、嚢液、洗眼剤、眼吸引液、血漿、血清、肺洗浄、肺吸引液ならびに限定されないが、肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、脳、心臓、筋肉、膵臓、細胞培養物を含む組織ならびに任意の細胞から得られる溶解物、抽出物または材料ならびに試料上または試料中に存在し得る微生物およびウイルスなどを含む。核酸を含有する、臨床的または法医学的環境から得られる材料も、試料という用語の意図される意味の範囲内である。さらに、当業者は、上記の例示的な試料のいずれかから得られる溶解物、抽出物もしくは材料またはその部分も、試料という用語の範囲内であることを理解する。好ましくは、試料は、ヒト、動物、植物、細菌または真菌に由来する生物試料である。特に、「試料」という用語は、タンパク質も含む、核酸を含有する試料を指す。好ましくは、試料は、細胞、組織、細菌、ウイルスならびに例えば、血液、軟膜、血漿および血清などの血液製剤、尿、髄液、痰、便、ＣＳＦおよび精液などの体液、上皮ぬぐい液、生検、骨髄試料および組織試料、好ましくは肺および肝臓などの臓器組織試料からなる群から選択される。好ましくは、試料は、全血および軟膜、血清または血漿などの血液製剤から選択される。
【００９１】
本明細書において使用される「核酸（nucleic acid）」または「核酸（nucleic acids）」という用語は、特に、典型的には、サブユニット間のホスホジエステル架橋によって、しかしある場合には、ホスホロチオエート、メチルホスホネートなどによって、共有結合しているリボヌクレオシドおよび／またはデオキシリボヌクレオシドを含むポリマーを指す。核酸は、限定されないが、すべてのタイプのＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、例えば、ｇＤＮＡ、環状ＤＮＡ、循環ＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、限定されないが、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ（長鎖非コードＲＮＡ）、ｌｉｎｃＲＮＡ（長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（低分子核小体ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（低分子核内ＲＮＡ）およびｓｔＲＮＡ（低分子一過性ＲＮＡ）を含む非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ｐｉＲＮＡ（ｐｉｗｉ干渉ＲＮＡ）、ｔｉＲＮＡ（転写開始ＲＮＡ）、ＰＡＳＲ（プロモーター関連ＲＮＡ）、ＣＵＴ（潜在性不安定性転写産物（cryptic unstable transcripts））、細胞外液または循環ＲＮＡ、断片化核酸、ミトコンドリアまたは葉緑体などの細胞内小器官から得られる核酸ならびに生物試料中に存在し得る、微生物、寄生生物またはＤＮＡウイルスもしくはＲＮＡウイルスから得られる核酸を含む。生物試料中に加えられるまたは「スパイクされる」ヌクレオチド類似体を含み得るまたは含み得ない合成核酸配列も、本発明の範囲内である。小さいＲＮＡまたは小さいＲＮＡ種という用語は、特に、５００ｎｔ未満、４００ｎｔ未満、３００ｎｔ未満または１００ｎｔ未満の長さを有するＲＮＡを指し、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、他の短鎖干渉核酸、ｓｎｏＲＮＡなどを含むが、これらに限定されない。一実施形態によると、核酸はＲＮＡである。ＲＮＡは、小さいＲＮＡ種を含み得る。
【００９２】
本発明の方法に従って処理することができる試料の記載例から明らかになるように、試料は、２つ以上のタイプの核酸を含み得る。意図される使用に応じて、試料からすべてのタイプの核酸（（例えばＤＮＡおよびＲＮＡ）またはある特定のタイプの核酸のみまたはある特定のタイプの核酸（例えばＲＮＡのみでＤＮＡではないもしくはその逆も同様またはＤＮＡおよびＲＮＡは、別々に得られることになっている）を単離することが望まれ得る。これらのすべての変形は、本発明の範囲内である。ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかまたは両方のタイプの核酸を平行して単離するのに適した方法は、先行技術において知られており、以上に記載もされている。
【００９３】
本発明はまた、試料、好ましくは血液試料から、核酸を単離するための方法であって、核酸が複数の試料から単離され、調製される試料から核酸が単離される前の待機時間が、単離用に調製される複数の試料で異なることに起因する、前記複数の試料から単離される核酸の収量および質における変動が、単離用に調製される試料が少なくとも１種のカオトロピック剤および少なくとも１種のキレート剤を含むことによって減少する、方法に関する。
【００９４】
試料は、試料に含有される核酸と複合体を形成する陽イオン性界面活性剤を使用することによって、安定化されることが好ましい。陽イオン性界面活性剤に関する詳細は、以上に記載されており、それは、上記の開示に言及されている。好ましくは、核酸はＲＮＡであり、試料は、体液、好ましくは全血、血清もしくは血漿、最も好ましくは全血でありまたはそれらに由来する。一実施形態によると、核酸は、上記の方法に従って単離される。それは、本明細書にも適用される上記の開示に言及されている。
【００９５】
さらに、本発明は、カオトロピック剤および核酸を含む試料の容器壁と相互作用する沈殿の形成を防ぐための、キレート剤の使用に関する。試料は、試料に含有される核酸と複合体を形成する陽イオン性界面活性剤を使用することによって、安定化されることが好ましい。陽イオン性界面活性剤に関する詳細は、以上に記載されており、それは、上記の開示に言及されている。好ましくは、核酸はＲＮＡであり、試料は、体液、好ましくは全血、血清もしくは血漿、最も好ましくは全血でありまたはそれらに由来する。カオトロピック剤およびキレート剤のそれぞれの使用の利点、特に、沈殿形成および／または容器壁への付着を防ぐことによる、核酸の質および量の増加に関する利点は、以上に詳細に記載されている。キレート剤およびその濃度、カオトロピック剤およびその濃度、陽イオン性界面活性剤、核酸および試料のタイプの適したおよび好ましい実施形態は、以上に記載されている。それは、本明細書にも適用される上記の開示に言及されている。
【００９６】
本発明は、本明細書において開示されている例示的な方法および材料によって限定されるものではなく、本明細書において記載されているものと類似のまたは同等の、任意の方法および材料を、本発明の実施形態の実施または試験に使用することができる。数値の範囲は、範囲を規定している数字を含む。本明細書において提供されている見出しは、全体として本明細書を参照することにより読み取ることができる、本発明の種々の態様または実施形態を限定するものではない。本明細書において使用される「溶液」という用語は、特に、液体組成物、好ましくは水性組成物を指す。それは、１相のみの均質の混合物であり得るが、本発明に従って使用される溶液が、固体成分、例えば沈殿を含むことも、本発明の範囲内である。一実施形態によると、方法の場合には、ある特定のステップを含むとまたは組成物、溶液および／または緩衝液の場合には、ある特定の成分を含むと、本明細書に記載されている主題は、それぞれのステップまたは成分からなる主題を指す。本明細書に記載されている好ましい実施形態を選択し、組み合わせることが好ましく、好ましい実施形態のそれぞれの組合せから起こる特定の主題も、本開示に属する。
実施例
これから、本発明を以下の限定されない例によって説明する。
実施例１
２４例の血液試料（２．５ｍｌ）を、バッチごとに、（安定化剤として陽イオン性界面活性剤を含む）パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ  チューブ（PAXgene Blood RNA Tube）に採取した。試料を２４ｈ間、室温で安定化させ、キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ  キット（QIAsymphony PAXgene Blood RNA Kit），２００８（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ））を用い、製造業者の使用説明書に従って処理した。
キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ  キット（QIAsymphony PAXgene Blood RNA Kit）
キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）プロトコル（先行技術）において、陽イオン性界面活性剤および核酸を含む複合体を含むペレットを回収し、再懸濁させるために、安定化された試料を手動で調製する。前記ペレットを、遠心分離によって得、上清をデカンテーションする。その後、３００μｌの再懸濁緩衝液ＢＲ１（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ））をペレットに加え、ボルテックスした。次いで、それぞれ手動で調製した試料を、キアシンフォニー（QIAsymphony）ロボットシステム中に装填し、キアシンフォニー（QIAsymphony）のスクリプトに従って、再懸濁させた試料から核酸を単離した。
【００９７】
第１のバッチは、再懸濁後、直ちに処理され、第２のバッチは、２時間５分後に処理された。したがって、第２のバッチの試料は、待機時間が２時間５分長かった。
再懸濁中に、カオトロピック剤の追加を含む改変バージョン
ＲＮＡの完全性を保存するために、カオトロピック剤を再懸濁させた試料に加えることによって、キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）プロトコルを改変した。血液試料を、以上に記載されているように、手動で調製した。再懸濁緩衝液ＢＲ１をペレットに加え、ボルテックスした後、カオトロピック塩（ＧＩＴＣ）を含むさらなる溶液（ＢＲ２、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ））２００μｌを加えた。カオトロピック塩を加えて、ＲＮＡの完全性を保存した。次いで、２つの異なるバージョンに従って、試料を処理した。バージョン１によると、緩衝液ＢＲ２を加えた後に、試料をキアシンフォニー（QIAsymphony）ロボット上に直ちに装填した。バージョン２によると、緩衝液ＢＲ２を加えた後に、試料をボルテックスし、次いでキアシンフォニー（QIAsymphony）ロボット上に装填した。次いで、キアシンフォニー（QIAsymphony）ロボットシステムにおいて、キアシンフォニー（QIAsymphony）のスクリプトに従って、再懸濁させた試料から核酸を単離した。
【００９８】
単離されたＲＮＡの質を、アジレント  バイオアナライザー（Agilent Bioanalyzer）を用いて決定し、ＲＩＮ値（ＲＩＮ＝ＲＮＡ完全性数）で表した。
結果
結果を図１に示す。
１：キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）−第１のバッチ
２：キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）−第２のバッチ
３：改変キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）（カオトロピック剤の追加）−第２のバッチ（ボルテックスなし）
４：改変キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）（カオトロピック剤の追加）−第２のバッチ（ボルテックスあり）
図１は、先行技術のプロトコルに従って処理した第１のバッチの試料については、ＲＮＡ完全性が卓越していることを示す。しかし、試料の再懸濁と核酸抽出との間の待機時間がより長かった第２のバッチにおいて、ＲＮＡ完全性は減少している。したがって、待機時間がより長いと、ＲＮＡ完全性が減少し、よってＲＮＡの質が減少する。
【００９９】
再懸濁させた試料にカオトロピック塩を加える改変バージョンは、バッチ１とバッチ２との間で、ＲＮＡの質に関して差が全くないことを示している。したがって、たとえ試料の待機時間が２時間以上と長くても、ＲＮＡ完全性は保存される。
実施例２
実施例２において、上記のキアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）プロトコルおよび改変バージョン（カオトロピック剤を再懸濁中に加える）を、核酸収量に関して分析した。実施例２で試験した前記改変バージョン３において、核酸単離もキアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）プロトコルに従って、キアシンフォニー（QIAsymphony）上で行ったが、核酸結合、特に小さいＲＮＡの結合を向上させるために、改変結合緩衝液を使用して行った。キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）プロトコルで使用する結合緩衝液ＱＳＢ１の代わりに、実施例２で使用した改変結合緩衝液は、６０％を超えるイソプロパノールおよび０．２Ｍトリクロロ酢酸ナトリウムを含んだ。特に小さい核酸の結合の向上を達成するために、それぞれ改変された結合緩衝液および相当する核酸単離プロトコルは、参照することにより本明細書に援用されている、欧州特許出願公開第１００００４３２．４号明細書（ＥＰ１００００４３２．４）に記載されている。試料の再懸濁は、実施例１（改変バージョン）に記載されているように行い、よって、カオトロピック剤（ＧＩＴＣ）を、ＲＮＡの完全性を保存するために、緩衝液ＢＲ２の形で加えた。
【０１００】
それぞれの改変バージョン３について、３バッチを試験した。第１のバッチの試料は、試料の再懸濁後、直ちに処理され、第２のバッチは、待機時間が２時間５分であり、第３のバッチは、待機時間が４時間１０分であった。追加の参照として、試料はまた、パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ  キット（PAXgene Blood RNA Kit）（膜ベースのシングルスピンカラム法）を用い、製造業者の使用説明書に従って処理した。実施例２の結果を、図２に示す。
１：キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）
２：改変キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）（カオトロピック剤の追加）−第１のバッチ
３：改変キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）（カオトロピック剤の追加）−第２のバッチ
４：改変キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）（カオトロピック剤の追加）−第３のバッチ
５：パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（PAXgene Blood RNA）（ＩＶＤ）
図２から導かれるように、改変バージョンの第１のバッチは、良好な収量を達成しており、先行技術の方法と比較して向上もしている。しかし、改変バージョンの第２および第３のバッチについては、高ＲＩＮ値を保証するために、カオトロピック剤を再懸濁させた試料に加えているにもかかわらず、収量が減少していることが観察される（実施例１および図１を参照のこと）。収量は、２０までから３０％に減少している。核酸収量におけるこの損失の理由は、待機時間中に、沈殿が形成され、それが管のプラスチック壁にしっかり固着するためである。
実施例３
高いＲＮＡ完全性および高い核酸収量の両方を保証するために、本発明の教示に従って、プロトコルを改変した。したがって、ＥＤＴＡを追加的に含めた、改変された再懸濁緩衝液を加えることによって、ペレットを再懸濁した。この目的のために、２５ｍＭ  ＥＤＴＡを、先行技術のプロトコルでは再懸濁用に使用する再懸濁緩衝液ＢＲ１（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ））に加えた。この改変された再懸濁緩衝液ＢＲ１の２８０μｌを、パックスジーン（PAXgene）で安定化された血液試料（実施例１を参照のこと）から得られたペレットに加えた。さらに、再懸濁のために、２０μｌのプロテイナーゼＫを試料ごとに加えた。試料をボルテックスすることによって再懸濁し、カオトロピック剤（ＢＲ２、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）−３Ｍを超えるＧＩＴＣを含む）を含む緩衝液２００μｌを加えた。
【０１０１】
再懸濁させた試料を、キアシンフォニー（QIAsymphony）ロボットシステム上に装填し、自動化核酸抽出を行った。手短には、核酸単離プロトコルは、以下のステップを含む。
１．試料の消化
４０μｌのプロテイナーゼＫを、再懸濁させた試料に加え、１０分間、加熱および振盪下でインキュベートした。
２．ＤＮＡの除去
マグ  アトラクス  Ｇ  ビーズ（Mag Attract G beads）（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ））を、消化された試料に加え、ＤＮＡをビーズに結合させた。次いで、ビーズを試料から除去した。
３．ＲＮＡの結合
マグ  アトラクス  Ｇ  ビーズ（Mag Attract G beads）（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ））を加え、６５％を超えるイソプロパノール、トリクロロ酢酸ナトリウムおよびＴｒｉｓ緩衝液を含む結合緩衝液１５００μｌ。
４．洗浄
洗浄緩衝液ＱＳＢ１およびＢＲ４（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ））を使用して、２つの洗浄ステップを行った。
５．ＤＮａｓｅおよびプロテイナーゼＫによる消化
ＲＮＡを溶出し、ＤＮａｓｅＩを使用して、微量のＤＮＡを消化した。その後、２回目のプロテイナーゼＫ消化を行った（参照することにより本明細書に援用されている、欧州特許出願公開第１０００７３４６．９号明細書（EP10007346.9）を参照のこと）。
６．ＲＮＡの再結合
１４００μｌの結合緩衝液（上記を参照のこと）を加えた。
７．洗浄
４回の最終洗浄ステップを行った（緩衝液ＱＳＢ１、ＱＳＷ５およびＢＲ４、すべてのキアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）を使用する）。
８．溶出および加熱変性
ＲＮＡを２００μｌのＢＲ５（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ））を使用して溶出し、溶出された核酸を１０分間加熱変性させた。
【０１０２】
２４例の血液試料を、バッチごとに、パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ  チューブ（PAXgene Blood RNA Tube）に採取した。本発明によるこのプロトコルを、実施例２（ＲＮＡの完全性を保存するために、カオトロピック剤を再懸濁中に加えるが、ＥＤＴＡは加えない）に記載されているような改変バージョンと比較した。３つのバッチを、それぞれの方法で試験した。第１のバッチは、試料の再懸濁後、直ちに処理され、第２のバッチは、待機時間が２時間２０分という時間であり、第３のバッチは、待機時間が４時間４０分という時間であった。追加の参照として、試料は、パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ  キット（PAXgene Blood RNA Kit）（膜ベースのシングルスピンカラム法）を用いて処理した。
【０１０３】
結果を、図３から６に示す。
【０１０４】
図３は、本発明による改変された再懸濁ステップが、沈殿形成に及ぼす効果を示す。左手側には、カオトロピック剤を再懸濁中に加える（が、ＥＤＴＡは加えない）改変バージョン（実施例２を参照のこと）に従って試料を調製した、第３のバッチの管を示している。確認できるように、容器壁に不可逆的に固着する大きい沈殿が形成されており、したがって、その後の核酸単離にとって損失である（＝収量の減少、実施例２を参照のこと）。右手側には、再懸濁中カオトロピック剤を加える際にＥＤＴＡを加える本発明の方法に従って試料を調製した、第３のバッチの管を示している。確認できるように、沈殿形成は、本発明による方法を用いて、十分に防がれた。
【０１０５】
図４は、種々のバッチのプロトコルを用いて得られる全体的なＲＮＡ収量を、比較下に示す。
１：キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）−第１のバッチ
２：本発明による改変キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）−第１のバッチ
３：キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）−第２のバッチ
４：本発明による改変キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）−第２のバッチ
５：キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）−第３のバッチ
６：本発明による改変キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）−第３のバッチ
７：パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（PAXgene Blood RNA）（ＩＶＤ）
図４は、本発明の方法に従って処理される試料が、種々のバッチ間でのより長い待機時間にもかかわらず、一定の高い核酸収量を達成することを実証している。核酸収量は、かなり向上している。
【０１０６】
図５は、本発明による方法を用いて達成されるＲＮＡ完全性を示す。確認できるように、高いＲＩＮが３つのすべてのバッチで得られている。したがって、ＲＮＡの完全性は、長い待機時間にもかかわらず保存されている。
【０１０７】
図６は、小さいＲＮＡの達成された収量を実証している。
１：キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）−第１のバッチ
２：本発明による改変キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）−第１のバッチ
３：キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）−第２のバッチ
４：本発明による改変キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）−第２のバッチ
５：キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）−第３のバッチ
６：本発明による改変キアシンフォニー  パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（QIAsymphony PAXgene Blood RNA）−第３のバッチ
７：パックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ（PAXgene Blood RNA）（ＩＶＤ）
図６は、種々の試験プロトコルを用いて得られた溶出液を分析する際に、ｍｉＳｃｒｉｐｔ（登録商標）プライマー（Primer）アッセイ（ｈｓａ−ｍｉＲ  ３０ｂ）を用いて得られた平均ＣTを示す。確認できるように、この方法は、小さいＲＮＡの良好な収量を達成しており、先行技術の方法と比較してかなり向上もしている。
実施例４
実施例４において、再懸濁中のＥＤＴＡの追加が、ＲＮＡ収量に及ぼす効果をさらに分析した。場合によって、タンパク質分解化合物（プロテイナーゼＫ）を加えた。
【０１０８】
それぞれの一連の試験について、ヒト全血２．５ｍｌで満たした２４本の試験管（キアゲン（QIAGEN）からのパックスジーン  ブロッド  ＲＮＡ  チューブ（PAXgene Blood RNA Tube）を、１２人の提供者から複製して得、核酸を含有するペレットを得た。上清を除去し、ペレットを、以下の再懸濁緩衝液ＢＲ１（キアゲン（QIAGEN））
−  ２８０μｌＢＲ１（キアゲン（QIAGEN））、２０μｌプロテイナーゼＫ溶液（キアゲン（QIAGEN））および２００μｌのＧＩＴＣを含有する緩衝液（ＢＲ２、キアゲン（QIAGEN））、
−  ２８０μｌＢＲ１（キアゲン（QIAGEN））＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０μｌプロテイナーゼＫ溶液（キアゲン（QIAGEN））および２００μｌのＧＩＴＣを含有する緩衝液（ＢＲ２、キアゲン（QIAGEN））、
−  ２８０μｌＢＲ１（キアゲン（QIAGEN））＋２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０μｌプロテイナーゼＫ溶液（キアゲン（QIAGEN））および２００μｌのＧＩＴＣを含有する緩衝液（ＢＲ２、キアゲン（QIAGEN））、
−  ２８０μｌＢＲ１（キアゲン（QIAGEN））＋５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０μｌプロテイナーゼＫ溶液（キアゲン（QIAGEN））および２００μｌのＧＩＴＣを含有する緩衝液（ＢＲ２、キアゲン（QIAGEN））、
−  ２８０μｌＢＲ１（キアゲン（QIAGEN））＋２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０μｌプロテイナーゼＫ溶液（キアゲン（QIAGEN））および２００μｌのＧＩＴＣを含有する緩衝液（ＢＲ２、キアゲン（QIAGEN））または３００μｌＢＲ１（キアゲン（QIAGEN））＋２５ｍＭ（プロテイナーゼＫなし）および２００μｌのＧＩＴＣを含有する緩衝液（ＢＲ２、キアゲン（QIAGEN））
中でボルテックスすることによって再懸濁した。
【０１０９】
試料を、実施例３に記載されているプロトコルに従って処理した。
【０１１０】
図７は、平均総ＲＮＡ収量を示す。プロテイナーゼＫおよびカオトロピック剤を含むがＥＤＴＡを含まない緩衝液ＢＲ１中で再懸濁させた試料について、バッチ１の試料から（待機時間が短い）達成されたＲＮＡ収量は、バッチ２の試料（待機時間が延長されている）のものよりも高かった。カオトロピック剤、プロテイナーゼＫおよびキレート剤ＥＤＴＡを使用して再懸濁させた試料は、第１のバッチで得られる核酸収量から確認できるように、概して、より多くのＲＮＡをもたらした。したがって、ＲＮＡ収量は、概して向上した。さらに、第２のバッチの試料から、延長された待機時間の後に得られるＲＮＡ収量は、より高いＥＤＴＡ濃度（２５ｍＭおよび５０ｍＭ）では、第１のバッチで得られるＲＮＡ収量に匹敵するまたはそれよりさらに良好である。プロテイナーゼＫを再懸濁中に省略する場合に、類似の結果が達成されている。したがって、ＲＮＡ収量に及ぼす有益な効果は、キレート剤の追加に起因するものである。
実施例５
以上に説明されているように、再懸濁させた試料は、特にカオトロピック剤を再懸濁中に加える場合、より長い待機時間中に沈殿を形成する。沈殿した凝集体は、ＲＮＡ−処理後、試験管に固着したままであり、それ故、精製手法中には含まれていない。結果として、後のバッチの血液試料は、より早いバッチからの試料に比べてより顕著な沈殿を示す。実施例５は、ＲＮＡ収量を減少させる、沈殿形成および容器壁への付着が（上記を参照のこと）、容器の材質に関わりなく生じ、したがって、プラスチック管のみならずガラス管にも生じることを示している。
【０１１１】
安定化したヒト全血（パックスジーン（PAXgene）安定化化学物質を使用した）の試料を、ガラス管またはプラスチック管中で処理した。安定化した試料を遠心分離し、上清を除去し、ペレットを３００μｌ緩衝液ＢＲ１および２００μｌ緩衝液ＢＲ２の混合物中でボルテックスすることによって再懸濁した。さらに、追加的に２５ｍＭのＥＤＴＡを再懸濁中に加える、本発明による再懸濁プロトコルを試験した。
【０１１２】
再懸濁させた試料を４時間、わきに置いておいた。次いで、上清を除去し、沈殿をガラス試験管およびプラスチック試験管の両方にデカンテーションした。
【０１１３】
結果を図８ａおよび図８ｂに示す。試験した両方の材質について、ＥＤＴＡを含まずに再懸濁した試料では、大量の沈殿が試験管の底部に固着しているのが分かった（図８ａを参照のこと）。これは、その後のＲＮＡ単離手法に含まれない損失した材料を表しており、したがって、結果として核酸収量を減少させることにつながる。本発明による方法に従って再懸濁させた試料、よって、ＥＤＴＡを再懸濁中に追加的に含む試料は、４時間という待機時間の後でさえも、全く沈殿が見られなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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