(57)【要約】  本発明は、特に、ズッキーニ黄斑モザイクウイルス（ＺＹＭＶ）、カボチャモザイクウイルス（ＷＭＶ）、パパイア輪点ウイルス（ＰＲＳＶ）およびモロッコカボチャモザイクウイルス（ＭＷＭＶ）などのポティウイルスに対する広い範囲の耐性を有するカボチャ植物といったカボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）植物に関する。マーカ育種による広い範囲のポティウイルス耐性を有するカボチャ植物の選抜方法もまた提供されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
好ましくはＭＷＭＶ、ＰＲＳＶ、ＷＭＶおよび／またはＺＹＭＶといったポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも１種の遺伝的決定因子を含む好ましくはペポカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｐｅｐｏ）である栽培されたカボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）植物。
【請求項２】
前記遺伝的決定因子が、ニホンカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ）のゲノムから入手可能である、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
好ましくはＺＹＭＶおよび／またはＭＷＭＶといったポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である前記遺伝的決定因子を少なくとも２種含む、請求項１または２に記載の植物。
【請求項４】
好ましくはＺＹＭＶおよびＭＷＭＶといったポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である前記遺伝的決定因子の少なくとも４種を含む、請求項１または２に記載の植物。
【請求項５】
ａ．前記遺伝的決定因子が、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、前記ポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座ＺＮに遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて同定可能であり；ならびに／または
ｂ．前記遺伝的決定因子が、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子の２種に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはＭＷＭＶ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ｗ１および／またはＷ２に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（それぞれ、配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出；
および／または配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて同定可能であり；ならびに／または
ｃ．前記遺伝的決定因子が、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはＺＹＭＶ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ｎｉ＋に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて同定可能である、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の植物。
【請求項６】
ａ．前記遺伝的決定因子が、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、前記ポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座ＺＮに遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて前記ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）ゲノムに同定可能であり；ならびに／または
ｂ．前記遺伝的決定因子が、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子の２種に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはＭＷＭＶ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ｗ１および／またはＷ２に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（それぞれ、配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出；
および／または配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて前記ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）ゲノムに同定可能であり；ならびに／または
ｃ．前記遺伝的決定因子が、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはＺＹＭＶ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座ＺＮに遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて前記ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）ゲノムに同定可能である、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の植物。
【請求項７】
ａ．前記遺伝的決定因子が、好ましくはＺＹＭＶ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座ＺＮに遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて前記植物の前記ゲノム中に同定可能であり；ならびに／または
ｂ．前記遺伝的決定因子が、前記好ましくはＭＷＭＶ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ｗ１および／またはＷ２に遺伝的に連鎖しており、および、前記オリゴヌクレオチドプライマー対（それぞれ、配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出；
および／または配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて前記植物の前記ゲノム中に同定可能であり；
ｃ．前記遺伝的決定因子は、好ましくはＺＹＭＶ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ｎｉ＋に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて前記植物の前記ゲノム中に同定可能である、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の植物。
【請求項８】
前記遺伝的決定因子が、劣性であり、および、互いに独立して分離する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の植物。
【請求項９】
前記植物がカボチャ植物である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の植物。
【請求項１０】
ポティウイルス耐性カボチャ植物の育成が可能である、請求項９に記載のカボチャ植物の種子。
【請求項１１】
ポティウイルス耐性カボチャ植物を育成するための請求項１０に記載の種子の使用。
【請求項１２】
ａ．ポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも１種の遺伝的決定因子を含むカボチャ植物を同定するステップであって、前記遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）の前記ゲノムから入手可能であり、および、少なくとも１種の前記ポティウイルス耐性表現型を伴って同時分離するマーカ遺伝子座の少なくとも１種に遺伝的に連鎖し、および、
ｉ．配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出、ならびに／または；
ｉｉ．配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出、ならびに／または；
ｉｉｉ．配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出、ならびに／または；
ｉｖ．配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出、ならびに／または；
ｖ．ポティウイルスに対する耐性を伴って同時分離するマーカ遺伝子座を同定可能である順方向および逆方向プライマー
を含む少なくとも一対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーによるＰＣＲにおいて同定可能であるステップを含む、好ましくはＺＹＭＶおよびＭＷＭＶの少なくとも１種といったポティウイルスに対する耐性を示すカボチャ植物を選抜する方法。
【請求項１３】
ａ．好ましくはＺＹＭＶおよびＭＷＭＶの少なくとも１種といったポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも１種の遺伝的決定因子を含むカボチャ植物を同定するステップであって、前記遺伝的決定因子はペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）の前記ゲノムから入手可能であり、および、前記ポティウイルス耐性表現型の少なくとも１種を伴って同時分離する少なくとも１種のマーカ遺伝子座に遺伝的に連鎖し、および、
ｉ．前記マーカ遺伝子座がＺＮである場合、配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出、ならびに／または；
ｉｉ．前記マーカ遺伝子座がＷ１である場合、配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出、ならびに／または；
ｉｉｉ．前記マーカ遺伝子座がＷ２である場合、配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出；
ｉｖ．前記マーカ遺伝子座がＮｉ＋である場合、配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出；
を含む少なくとも一対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーによるＰＣＲにおいて同定可能であるステップを含む、請求項１２に記載の好ましくはＺＹＭＶおよびＭＷＭＶの少なくとも１種といったポティウイルスに対する耐性を示すカボチャ植物を選抜する方法。
【請求項１４】
ステップａ）において選抜された前記植物が、好ましくはＺＹＭＶおよびＭＷＭＶといったポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも３種の遺伝的決定因子を含み；ならびに、ステップｃ）において選抜された子孫が、好ましくはＺＹＭＶおよびＭＷＭＶといったポティウイルスに対する耐性表現型を発現し、前記耐性表現型はステップａ）の３種のマーカ遺伝子座を伴って分離する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップａ）において同定された前記カボチャ植物が請求項１〜９に記載の植物である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップｃ）において得られた前記ウイルス耐性植物と感受性カボチャ植物またはステップｂ）の中度耐性カボチャ植物とを戻し交雑する追加のステップを含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
ａ．雄性不稔性雌株および雄性稔性植物を植えるステップであって、前記雄性不稔性雌株または雄性稔性植物の一方が請求項１〜９のいずれかに記載の植物であるステップ、
ｂ．両方の系統間で他家受粉させるステップ、
ｃ．前記植物を実どまりするまで育成するステップ、
ｄ．前記果実を採取するステップ、ならびに
ｅ．前記ハイブリッド種子を得るステップ
を含むポティウイルスに対して耐性であるカボチャのハイブリッド種子を生成する方法。
【請求項１８】
ａ．請求項１〜１０に記載の植物と他の植物との交雑に由来する生育不能な種間胚芽を提供するステップ；
ｂ．前記胚芽を救出するステップ；
ｃ．ステップｃ）の前記胚芽から植物を再生するステップ；ならびに
ｄ．好ましくはＺＹＭＶ、ＭＷＭＶの少なくとも１種といったポティウイルスに対して耐性であるステップｄ）の植物を選抜するステップ
を含むポティウイルス耐性カボチャ植物を得る方法。
【請求項１９】
ポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である遺伝的決定因子であって、前記遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）の前記ゲノムから入手可能であり、
ａ．前記遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはＺＹＭＶ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座ＺＮに遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて同定可能であり；ならびに／または
ｂ．前記遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子の少なくとも１種に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくは前記ＭＷＭＶ耐性形質といった前記ポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ｗ２に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて同定可能であり；ならびに／または
ｃ．前記遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはＺＹＭＶ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ｎｉ＋に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて同定可能である遺伝的決定因子。
【請求項２０】
好ましくはＺＹＭＶおよびＭＷＭＶの少なくとも１種といったポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも１種の遺伝的決定因子を含むカボチャ植物の同定方法であって、前記遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）の前記ゲノムから入手可能であり、および、前記ポティウイルス耐性表現型の少なくとも１種を伴って同時分離する少なくとも１種のマーカ遺伝子座に遺伝的に連鎖し、および、
ｉ．マーカ遺伝子座がＺＮである場合、配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出、または；
ｉｉ．マーカ遺伝子座がＷ１である場合、配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出、ならびに／または；
ｉｉｉ．マーカ遺伝子座がＷ２である場合、配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出；ならびに／または
ｉｖ．マーカ遺伝子座がＮｉ＋である場合、配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出
を含む少なくとも一対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーによるＰＣＲにおいて同定可能である方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポティウイルスに耐性の新規な植物および前記植物の種子に関する。本発明はまた、このような植物の形成方法およびその種子の生成方法に関する。本発明はさらに、マーカおよびマーカ育種におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポティウイルス群（命名は、その原型構成種、ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）に由来）は、現在認知されている３４種の植物ウイルス群および科のうち最大のものである（Ｗａｒｄ  ＆  Ｓｈｕｋｌａ，１９９１；Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３２，２６９−２９６）。この群は、少なくとも１８０種の確定された、および、可能性のある構成種（すべての既知の植物ウイルスの３０％）を包含し、これらは、農業用、牧草用、園芸用および観賞用作物において顕著な損失をもたらす（Ｗａｒｄ  ＆  Ｓｈｕｋｌａ，１９９１；Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３２，２６９−２９６）。
【０００３】
カボチャ栽培における主な問題は、植物および果実に損傷を与えるポティウイルスの発生である。ズッキーニ黄斑モザイクウイルス（ＺＹＭＶ）、カボチャモザイクウイルス（ＷＭＶ）、パパイア輪点ウイルス（ＰＲＳＶ）、モロッコカボチャモザイクウイルス（Ｍｏｒｏｃｃａｎ  ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＭＷＭＶ）といった、カボチャに高頻度で感染する少なくとも４種のポティウイルスが存在している。カボチャにおけるポティウイルス病害の症状は、モザイク化、黄化、葉の奇形化（ｓｈｏｅｓｔｒｉｎｇ  ｌｅａｖｅｓ）、萎縮、ならびに、果実および種子の奇形化を含む。
【０００４】
ウイルスは突然変異して既存の耐性遺伝子に打ち勝ってしまう傾向にあるため、ポティウイルスに対する安定な耐性がカボチャ育種者に対する重要な要素である。カボチャにおけるこれまで知られている唯一の安定な耐性は、遺伝子修飾アプローチを介して達成されている。欧州においては、カボチャ農家においてこのような「耐性」品種におけるポティウイルス感染症が目にされる頻度が増している。それ故、カボチャ植物をポティウイルス感染症から保護するための簡便で経済的、かつ、持続可能なストラテジーに対する要求は未だ対応されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、一般にカボチャに影響を及ぼす異なるポティウイルスに対する安定しており、かつ、広範な耐性を有するカボチャ植物を提供することによりこの要求に対応する。この耐性は、標準的な種間交雑および胚救出によってカボチャ植物に導入された少なくとも３種の劣性遺伝的決定因子によって与えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、好ましくはＭＷＭＶ、ＰＲＳＶ、ＷＭＶおよびＺＹＭＶの１種以上であるポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも１種の遺伝的決定因子を含む栽培されたカボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）植物に関する。
【０００７】
一実施形態において、前記遺伝的決定因子は、ニホンカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ）、好ましくはカボチャ属の１種（Ｃ．ｍｏｓｃｈａｔａ  ｖａｒ．Ｎｉｇｅｒｉａ）のゲノムから入手可能である。
【０００８】
他の実施形態において、既述の実施形態のいずれかに記載の植物は、ポティウイルス感染症に対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である前記少なくとも１種の遺伝的決定因子を含む。
【０００９】
他の実施形態において、既述の実施形態のいずれかに記載の植物は、ポティウイルス感染症に対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも２種の遺伝的決定因子を含む。
【００１０】
他の実施形態において、既述の実施形態のいずれかに記載の植物は、ポティウイルス感染症、好ましくはＺＹＭＶおよびＭＷＭＶ感染症に対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも３種の遺伝的決定因子を含む。
【００１１】
他の実施形態において、本発明は、いずれかの既述の実施形態による植物に関し、ここで、
遺伝的決定因子の少なくとも１種は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはＺＹＭＶおよびＰＲＳＶといったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座ＺＮに遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号１（５’ＡＧＧＴＴＴＣＡＴＧＧＧＣＴＴＴＴＡＡＴＧＧ３’）の順方向プライマーおよび配列番号２（５’ＣＧＴＧＡＧＣＣＴＡＡＡＡＣＧＧＴＴＡＡＴＧ３’）の逆方向プライマー、続いて、耐性対立遺伝子特異的プローブ：ＦＡＭ−ＣＡＣＴＴＣＣＣＡＧＣＣＣＡＡＡＴ−ＭＧＢ−ＮＦＱ（配列番号７）および／または感受性対立遺伝子特異的プローブ：ＶＩＣ−ＣＡＣＴＴＴＣＣＡＧＣＣＣＡＡＡＴ−ＭＧＢ−ＮＦＱ（配列番号８）による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて同定可能であり；ならびに／または
遺伝的決定因子の少なくとも２種は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはＭＷＭＶ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ｗ２に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号３（５’ＧＧＧＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＧＴＣＴＡＧＡＡＡＧ３’）の順方向プライマーおよび配列番号４（５’ＧＴＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＴＧＴＧＣＡＴＣＴＧＴ３’）の逆方向プライマー、続いて、耐性対立遺伝子特異的プローブ：ＦＡＭ−ＴＣＡＴＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＡＴＧ−ＭＧＢ−ＮＦＱ（配列番号９）および／または感受性対立遺伝子特異的プローブ：ＶＩＣ−ＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＣＡＡＣＡＴＧＧ−ＭＧＢ−ＮＦＱ（配列番号１０）による検出；
および／または配列番号５（５’ＴＴＧＴＧＴＴＴＡＴＡＴＧＴＡＴＧＴＧＴＧＣＧＡＧ３’）の順方向プライマーおよび配列番号６（５’ＴＴＴＣＴＡＧＡＴＣＴＣＡＧＴＧＴＡＡＧＡＧＡＡＣＡＣＡ３’）の逆方向プライマー、続いて、耐性対立遺伝子特異的プローブ：ＦＡＭ−ＴＴＴＧＴＴＴＧＣＴＴＧＡＧＣＴＧＧ−ＭＧＢ−ＮＦＱ（配列番号１１）および／または感受性対立遺伝子特異的プローブ：ＶＩＣ−ＴＴＴＧＴＴＣＧＡＴＴＧＡＧＣＴＧＧ−ＭＧＢ−ＮＦＱ（配列番号１２）による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて同定可能であり；ならびに／または
遺伝的決定因子の少なくとも１種は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはＺＹＭＶ耐性形質、より好ましくはＺＹＭＶ菌株Ｎｉｖｉｒ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ｎｉ＋に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号１３（５’ＴＴＧＣＡＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＡＴＧＧＧＴ３’）の順方向プライマーおよび配列番号１４（５’ＧＧＣＡＡＣＣＴＣＴＧＴＣＣＡＡＴＴＴＣＴＴＴＣ３’）の逆方向プライマー、続いて、耐性対立遺伝子特異的プローブ：ＦＡＭ−ＡＧＴＴＧＣＧＡＣＴＴＴＣＣＡ−ＭＧＢ−ＮＦＱ（配列番号１５）および／または感受性対立遺伝子特異的プローブ：ＴＥＴ−ＡＧＴＴＧＣＧＡＣＴＴＴＴＣＡＴＴ−ＭＧＢ−ＮＦＱ（配列番号１６）による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて同定可能である。
【００１２】
他の実施形態において、本発明は、いずれかの既述の実施形態による植物に関し、ここで、
遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはＺＹＭＶおよびＰＲＳＶ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座ＺＮに遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいてペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）ゲノムに同定可能であり；
および／または遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはＭＷＭＶ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ｗ１およびＷ２に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出および／または配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいてペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）ゲノムに同定可能であり；ならびに／または
遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはＺＹＭＶ耐性形質、より好ましくはＺＹＭＶ菌株Ｎｉｖｉｒ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ｎｉ＋に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいてペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）ゲノム中に同定可能である。
【００１３】
他の実施形態において、本発明はいずれかの既述の実施形態による植物に関し、ここで、
遺伝的決定因子は、好ましくはＺＹＭＶおよびＰＲＳＶ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座ＺＮに遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて前記植物のゲノム中に同定可能であり；ならびに／または
遺伝的決定因子は、好ましくはＭＷＭＶ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ｗ１および／またはＷ２に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出；
および／または配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて前記植物のゲノム中に同定可能であり；ならびに／または
遺伝的決定因子は、好ましくはＺＹＭＶ耐性形質、より好ましくはＺＹＭＶ菌株Ｎｉｖｉｒ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ｎｉ＋に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて前記植物のゲノム中に同定可能である。
【００１４】
他の実施形態において、本発明はいずれかの既述の実施形態による植物に関し、ここで、遺伝的決定因子は劣性であり、および、互いに独立して分離する。
【００１５】
他の実施形態において、本発明はいずれかの既述の実施形態による植物に関し、ここで、植物はカボチャ植物である。
【００１６】
本発明はまた、ポティウイルス耐性カボチャ植物の育成が可能であるいずれかの既述の実施形態によるカボチャ植物の種子に関する。本発明はまた、ポティウイルス耐性カボチャ植物を育成するための前記種子の使用に関する。
【００１７】
本発明はまた：
ａ）ポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも１種の遺伝的決定因子を含むカボチャ植物を選抜するステップであって、前記遺伝的決定因子はペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）のゲノムから入手可能であり、および、ポティウイルスに対する耐性を伴って同時分離するマーカ遺伝子座の少なくとも１種に遺伝的に連鎖し、および、
ｉ．配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出、ならびに／または；
ｉｉ．配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出、ならびに／または；
ｉｉｉ．配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出、ならびに／または；
ｉｖ．配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出、ならびに／または
ｖ．ポティウイルスに対する耐性を伴って同時分離するマーカ遺伝子座を同定可能である順方向および逆方向プライマー
を含む少なくとも一対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーによるＰＣＲにおいて同定可能であるステップ；
ｂ）ステップａ）の前記植物とポティウイルスに感受性であるカボチャ植物または前記ポティウイルスの少なくとも１種に対して中レベルの耐性を示すカボチャとを交雑するステップ；ならびに
ｃ）ポティウイルスに対する耐性表現型を発現する前記交雑に由来する子孫を選抜するステップであって、前記耐性表現型は、ステップａ）の前記少なくとも１種のマーカ遺伝子座を伴って分離するステップ
を含む、好ましくはＭＷＭＶ、ＰＲＳＶ、ＷＭＶおよびＺＹＭＶの少なくとも１種といったポティウイルスに対する耐性を示すカボチャ植物を生成する方法に関する。
【００１８】
本発明はまた：
ａ）好ましくはＺＹＭＶおよびＭＷＭＶの少なくとも１種といったポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも１種の遺伝的決定因子を含むカボチャ植物を選抜するステップであって、前記遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）のゲノムから入手可能であり、および、ポティウイルス耐性を伴って同時分離する少なくとも１種のマーカ遺伝子座に遺伝的に連鎖し、および、
ｉ．マーカ遺伝子座がＺＮである場合、配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出、または；
ｉｉ．配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出、ならびに／または
ｉｉｉ．マーカ遺伝子座がＷ２である場合、配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出、ならびに／または
ｉｖ．マーカ遺伝子座がＮｉ＋である場合、配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出
を含む少なくとも一対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーによるＰＣＲにおいて同定可能であるステップ；
ｂ）ステップａ）の前記植物と、ポティウイルスに感受性であるカボチャ植物または前記ポティウイルスの少なくとも１種に対して中レベルの耐性を示すカボチャ植物とを交雑させるステップ；ならびに
ｃ）ポティウイルスに対する耐性表現型を発現する前記交雑に由来する子孫を選抜するステップであって、前記耐性表現型は、ステップａ）の前記少なくとも１種のマーカ遺伝子座を伴って分離するステップ
を含む、いずれかの既述の実施形態によるポティウイルスに対する耐性を示すカボチャ植物を生成する方法に関する。
【００１９】
一実施形態においては、本発明はいずれかの既述の実施形態による方法に関し、ここで、ステップａ）において選抜された植物は、ポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも２種の遺伝的決定因子を含み；ならびに、ステップｃ）において選抜された子孫は、好ましくはＺＹＭＶおよびＭＷＭＶといったポティウイルスに対する耐性表現型を発現し、ここで、前記耐性表現型はステップａ）の２種のマーカ遺伝子座を伴って分離する。
【００２０】
他の実施形態において、本発明はいずれかの既述の実施形態による方法に関し、ここで、ステップａ）において選抜された植物は、好ましくはＺＹＭＶおよびＭＷＭＶといったポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも３種の遺伝的決定因子を含み；ならびに、ステップｃ）において選抜された子孫は、好ましくはＺＹＭＶおよびＭＷＭＶといったポティウイルスに対する耐性表現型を発現し、ここで、前記耐性表現型は、ステップａ）の３種のマーカ遺伝子座を伴って分離する。
【００２１】
他の実施形態において、本発明はいずれかの既述の実施形態による方法に関し、ここで、ステップａ）のドナー植物は本明細書に記載の植物である。
【００２２】
他の実施形態において、本発明は、ステップｃ）において得られたウイルス耐性植物と、感受性カボチャ植物またはステップｂ）の中度耐性カボチャ植物とを戻し交雑する追加のステップを含むいずれかの既述の実施形態による方法に関する。
【００２３】
本発明はまた、雄性不稔性雌株および雄性稔性植物を植えるステップであって、前記雄または雌系統の少なくとも一方が本明細書に記載の植物であるステップ、両方の系統間で他家受粉させるステップ、植物を実どまりするまで育成するステップ、果実を採取するステップ、ならびに、ハイブリッド種子を得るステップを含むポティウイルスに対して耐性であるカボチャのハイブリッド種子を生成する方法に関する。
【００２４】
本発明はまた、
ａ）本明細書に記載のとおり、または、本明細書に記載の方法により植物を得るステップ；
ｂ）前記植物とポティウイルス感受性植物または中度耐性カボチャ植物とを交雑させるステップ；
ｃ）ステップｂ）の交雑からもたらされる胚芽を救出するステップ；
ｄ）ステップｃ）の前記胚芽から植物を再生するステップ；ならびに
ｅ）ポティウイルスに対して耐性であるステップｄ）の植物を選抜するステップ
を含むポティウイルス耐性カボチャ植物を得る方法に関する。
【００２５】
本発明はまた、本明細書に記載の植物の種子または本明細書に記載の方法により得られた植物の種子を播種するステップ；ならびに、果実を形成させるために前記植物を育成するステップ、および、前記植物により形成された果実を収穫するステップを含むポティウイルスに対して耐性であるカボチャ果実を得る方法に関する。
【００２６】
本発明はまた、ポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である遺伝的決定因子に関し、ここで、前記遺伝的決定因子はペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）のゲノムから入手可能であり、および、
遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはＺＹＭＶおよびＰＲＳＶ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座ＺＮに遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて同定可能であり；ならびに／または
遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはＭＷＭＶ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ｗ２に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出
および／または配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて同定可能であり；ならびに／または
遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはＺＹＭＶ耐性形質、より好ましくはＺＹＭＶ菌株Ｎｉｖｉｒ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ｎｉ＋に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて同定可能である。
【００２７】
本発明はまた、好ましくはＺＹＭＶおよびＭＷＭＶの少なくとも１種といったポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも１種の遺伝的決定因子を含むカボチャ植物の同定方法に関し、ここで、前記遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）のゲノムから入手可能であり、および、前記ポティウイルス耐性表現型の少なくとも１種を伴って同時分離する少なくとも１種のマーカ遺伝子座に遺伝的に連鎖し、ならびに、
マーカ遺伝子座がＺＮである場合、配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出、または；
マーカ遺伝子座がＷ１である場合、配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出、ならびに／または
マーカ遺伝子座がＷ２である場合、配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出；または；
マーカ遺伝子座がＮｉ＋である場合、配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出
を含む少なくとも一対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーによるＰＣＲにおいて同定可能である。
【００２８】
本発明はまた、果実を形成し、および、前記果実を収穫するためのポティウイルス耐性カボチャ植物の育成のための本明細書に記載のカボチャ植物からのポティウイルス耐性繁殖体の使用に関する。
【００２９】
定義
本明細書において用いられるところ、「確立された育種固体群」という句は、例えば、商業的な育種プログラムといった育種プログラムにおいて親によってもたらされるおよび／または親として用いられる可能性のある育種パートナーの一群を指す。確立された育種固体群の構成種は、典型的には、遺伝的および／または表現型的に十分に特徴付けられている。例えば、数々の関心のある表現型形質は、例えば異なる環境条件、複数の位置および／または異なる時間で評価された可能性がある。あるいは、または、加えて、表現型形質の発現に関連する１つ以上の遺伝子座は同定されている可能性があり、育種固体群の構成種の１種以上は、１つ以上の遺伝子座に関して、ならびに、１つ以上の遺伝子座に関連する１つ以上の遺伝子マーカに関して遺伝子型が同定されている可能性がある。
【００３０】
栽培されたペポカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｐｅｐｏ）植物は、本発明の範囲内において、ヒトの世話によって発育されて、栽培植物化された自然の状態ではないものであって、農業用用途および／またはヒトによる摂取のための植物を指すと理解される。例として、本発明によるペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ）植物は栽培された植物であるとみなされるべきであり、ゲムカボチャ（ｇｅｍ  ｓｑｕａｓｈ）、ペポカボチャ（ｓｕｍｍｅｒ  ｓｑｕａｓｈ）、セイヨウカボチャ、ズッキーニ、黄色の曲がり首カボチャ（ｙｅｌｌｏｗ  ｃｒｏｏｋｎｅｃｋ  ｓｑｕａｓｈ）、黄色のペポカボチャ（ｙｅｌｌｏｗ  ｓｕｍｍｅｒ  ｓｑｕａｓｈ）、ココゼル、パティパンカボチャ、ストレートネックカボチャおよびナタウリを含む群から選抜されることが可能である。本発明の文脈において、「栽培されたペポカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｐｅｐｏ）植物」は栽培に適応されており、病害耐性、ズッキーニ黄斑モザイクウイルス（ＺＹＭＶ）中度耐性などの特に中度耐性を示す。さらに、栽培されたカボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）植物は、天然形質および／または天然遺伝子の一部として本発明の主題である形質を含む野生型種は含まないと理解される。
【００３１】
誤解を避けるため、カボチャ属の一種（Ｃ．Ｍｏｓｃｈａｔａ  ｖａｒ．Ｎｉｇｅｒｉａ）は耐性の「野生源」であり、栽培植物としてみなされるべきではない。
【００３２】
本明細書において用いられるところ、「二倍体個体」という句は、典型的には２つの親の各々から１組ずつ、２組の染色体を有する個体を指す。しかしながら、いくつかの実施形態において、二倍体個体は、植物の後続の世代をもたらすために植物が自殖した場合など、同一の単一の生体に由来する「母系」および「父系」の組の染色体を有していることが可能であることが理解される。
【００３３】
「ホモ接合」は、本発明の範囲内において、相同な染色体における１つ以上の対応する遺伝子座における対立遺伝子様であることを指すと理解される。
【００３４】
「ヘテロ接合」は、本発明の範囲内において、相同な染色体における１つ以上の対応する遺伝子座における対立遺伝子様ではないことを指すと理解される。
【００３５】
「戻し交雑」は、本発明の範囲内において、雑種子孫が一方の親に対して繰り返し戻し交雑されるプロセスを指すと理解される。その後の戻し交雑において異なる反復親が用いられてもよい。
【００３６】
「遺伝子座」は、本発明の範囲内において、遺伝子またはいずれかの他の遺伝子要素または形質に寄与する因子を含む染色体における領域を指すと理解される。
【００３７】
本明細書において用いられるところ、「マーカ遺伝子座」とは、個体のゲノム中に存在し、および、１つ以上の対象の遺伝子座に関連するヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含む、遺伝子またはいずれかの他の遺伝子要素または形質に寄与する因子を含み得る染色体における領域を指す。「マーカ遺伝子座」とはまた、プローブとして用いられる核酸の配列などのゲノム配列に対して相補性であるポリヌクレオチド配列を含む染色体における領域を指す。
【００３８】
「遺伝子連鎖」は、本発明の範囲内において、遺伝子座間の組換えのパーセント（センチモルガンｃＭ）によって計られる同一の染色体において近接した遺伝子の位置による遺伝における形質の関連性を指すと理解される。
【００３９】
遺伝子座間の距離は、通常、同一の染色体における遺伝子座間の交差頻度によって計られる。２つの遺伝子座が離れているほど、これらの間で交差が生じる可能性は高くなる。反対に、２つの遺伝子座が近接していれば、交差が生じる可能性は低い。原則として、１センチモルガン（ｃＭ）は遺伝子座（マーカ）間の１％組換えに等しい。ＱＴＬが複数のマーカによって示されることが可能である場合、端点マーカ間の遺伝子距離がＱＴＬのサイズの指標である。
【００４０】
「マーカ遺伝子座に遺伝的に連鎖する」という句は、マーカ遺伝子座が、耐性形質を与える遺伝的決定因子から、１０ｃＭ、より好ましくは５ｃＭ、より好ましくは２ｃＭ、最も好ましくは１ｃＭよりも近いことを意味するとみなされるべきである。
【００４１】
「発現を方向づけするまたは制御する遺伝的決定因子」は、本明細書において、ＤＮＡ自身のレベルで、最終ポリペプチド産物の翻訳、転写および／または活性化レベルで、形質の発現に寄与して、形質の表現型発現をもたらすことが可能である遺伝可能な遺伝子要素を指すと理解される。
【００４２】
本発明の目的のために、「同時分離」という用語は、形質に係る対立遺伝子およびマーカに係る対立遺伝子は同一の染色体において物理的に近接しているために一緒に伝達される傾向にあり（物理的な近さによる組換えの低減）、同一の染色体における近さに起因する対立遺伝子の選抜的な関連性がもたらされるという事実を指している。「同時分離」とはまた、少なくとも一方が遺伝的であることが知られており、偶然によっては容易に説明ができない、単一の植物における２つ以上の形質の存在を指す。
【００４３】
本明細書において用いられるところ、「質的形質遺伝子座での遺伝子アーキテクチャ」という用語は、対象表現型形質に統計的に相関し、対象表現型形質の根底にある遺伝学的基礎を表すゲノム領域を指す。
【００４４】
本明細書において用いられるところ、本開示の主題の文脈において、「有性交雑」および「有性生殖」という句は、子孫をもたらす配偶子の接合（例えば、植物における受粉による種子をもたらすなどの受精による）を指す。「有性交雑」または「他家受精」は、いくつかの実施形態において、一個体と他の固体との受精である（例えば、植物における他家受粉）。「自家受粉」という用語は、いくつかの実施形態において、自家受精または自家受粉による種子の生成を指し；すなわち、花粉および胚珠が同一の植物に由来する。
【００４５】
本明細書において用いられるところ、「遺伝子マーカ」という句は、１つ以上の対象の遺伝子座に関連する個体のゲノム（例えば、個体のゲノム中に存在するヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列）の形質を指す。いくつかの実施形態において、遺伝子マーカは、文脈に応じて、対象固体群における多型であるか、または、多型性によって占有された遺伝子座である。遺伝子マーカとしては、他の多くの例のうち、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）、インデル（すなわち、挿入／欠失）、単純配列反復（ＳＳＲ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、開裂増幅多型配列（ＣＡＰＳ）マーカ、多様性アレイ技術（ＤＡｒＴ）マーカおよび増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）が挙げられる。遺伝子マーカは、例えば、様々な表現型形質に寄与する、染色体における対立遺伝子を含有する遺伝子座の位置を突き止めるために用いられることが可能である。「遺伝子マーカ」という句はまた、プローブとして用いられる核酸の配列などの、ゲノム配列に対して相補性のポリヌクレオチド配列を指すことが可能である。
【００４６】
「ペポカボチャ（Ｃ．Ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）に存在する対応するゲノム決定因子に対する相補性」という句は、染色体ＤＮＡの領域において見出される遺伝子（またはそのプロモータ領域）を意味するとみなされるべきであり、前記領域は、長さが０．５ＭＢ、１ＭＢ、２ＭＢ、３ＭＢ、４ＭＢ、５ＭＢまたは１０ＭＢであり、ペポカボチャ（Ｃ．Ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）染色体ＤＮＡの対応する領域において見出される同一の遺伝子（またはそのプロモータ領域）と同等である。
【００４７】
遺伝子マーカは、関連している遺伝子座の内側または外側の染色体上の位置に物理的に位置されていることが可能である（すなわち、それぞれ遺伝子内または遺伝子外である）。換言すると、例えば遺伝子外の調節エレメント中といった、対象遺伝子座に対応する遺伝子または機能的突然変異の染色体上の位置が同定されておらず、および、遺伝子マーカと対象遺伝子座との間の組換え率が非ゼロである場合、遺伝子マーカが典型的には利用されるが、
本開示の主題はまた、物理的に遺伝子座の境界の内側の遺伝子マーカを利用することも可能である（例えば、特にこれらに限定されないが、遺伝子のイントロンまたはエクソン中の多型性などの遺伝子に関連するゲノム配列の内側）。本開示の主題のいくつかの実施形態において、１つ以上の遺伝子マーカは１〜１０塩基対のマーカを含み、いくつかの実施形態において、１つ以上の遺伝子マーカは１０塩基対を超える遺伝子マーカを含む。
【００４８】
本明細書において用いられるところ、「遺伝子型」という用語は、細胞または生体の遺伝子構造を指す。ある個体の「一組の遺伝子マーカに係る遺伝子型」は、その個体のハプロタイプに存在する、１つ以上の遺伝子マーカ遺伝子座に対する特異的対立遺伝子を含む。技術分野において公知であるとおり、遺伝子型は、遺伝子座が関連しているかもしくは無関連であるか、および／または、連鎖されているかもしくは未連鎖であるかに関わらず、単一遺伝子座または多重遺伝子座に関連していることが可能である。いくつかの実施形態において、ある個体の遺伝子型は、１種以上の遺伝子が関心のある表現型の発現に関連している（例えば、本明細書において定義されているとおり定量的または質的形質に）という点で関連する１種以上の遺伝子に関連している。それ故、いくつかの実施形態において、遺伝子型は、定量的または質的形質の１つ以上の遺伝子座で個体中に存在する１つ以上の対立遺伝子のまとまりを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子型は、ハプロタイプと表記される（本明細書において以下に定義されている）。
【００４９】
本明細書において用いられるところ、「生殖質」という用語は、固体群または個体の他の群（例えば、種）の遺伝子型の全体を指す。「生殖質」という用語は植物材料を指すことも可能である（例えば、種々の対立遺伝子のためのリポジトリとして作用する植物の一群）。「適応生殖質」という句は証明された遺伝子優位性の植物材料を指し（例えば、所与の環境または地理的領域に関して）、一方で、句「非適応生殖質」、「粗生殖質」および「外来生殖質」は未知または証明されていない遺伝子価値の植物材料を指し（例えば、所与の環境または地理的領域に関して）、それ故に、「非適応生殖質」という句は、いくつかの実施形態においては、確立された育種固体群の一部ではなく、および、確立された育種固体群の構成種に対して既知の関係を有さない植物材料を指す。
【００５０】
本明細書において用いられるところ、「ハイブリッド」、「ハイブリッド植物」および「雑種子孫」という用語は、遺伝的に異なる親に由来する個体を指す（例えば、遺伝的にヘテロ接合性の、または、主にヘテロ接合性の個体）。
【００５１】
本明細書において用いられるところ、「単交雑Ｆ１ハイブリッド」という句は、２種の近交系統間の交雑で生じたＦ１ハイブリッドを指す。
【００５２】
本明細書において用いられるところ、「近交系統」という句は、遺伝的にホモ接合性のまたはほぼホモ接合性の固体群を指す。例えば、近交系統は、同胞育種もしくは自家受粉の数回のサイクルを介して、または、二ゲノム性半数体生成に由来することが可能である。いくつかの実施形態において、近交系統は、関心のある表現型形質の１種以上に当てはまるよう育種される。「近交系」、「近交系個体」または「近交系子孫」は近交系統からサンプルされた個体である。
【００５３】
本明細書において用いられるところ、「二ゲノム性半数体系統」という用語は、他の培養から生じた安定な近交系統を指す。特定の培地および環境で栽培されたいくつかの花粉粒（一倍体）はｎ染色体を含有する小植物を発生させることが可能である。次いで、これらの小植物は「倍加」されて２ｎ染色体を含有することとなる。これらの小植物の子孫は「二ゲノム性半数体」と命名され、基本的にこれ以上は分離しない（安定）。
【００５４】
本明細書において用いられるところ、「連鎖」という用語、および、その文法上の変形は、同一の染色体上の異なる遺伝子座にある対立遺伝子が、伝達が独立していた場合に偶然期待されるであろうものよりも頻繁に一緒に分離する傾向を指す。
【００５５】
本明細書において用いられるところ、「核酸」という句は、ヌクレオチドのストリングに対応することが可能であるモノマー単位のいずれかの物理的なストリングを指し、ヌクレオチドのポリマー（例えば、典型的なＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡポリマー）、変性オリゴヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル化オリゴヌクレオチドなどの、生物学的ＲＮＡまたはＤＮＡに典型的ではない塩基を含むオリゴヌクレオチド）等が含まれる。いくつかの実施形態において、核酸は、一本鎖、二重鎖、多重鎖、または、これらの組み合わせであることが可能である。他に示されている場合を除き、任意により、本開示の主題の特定の核酸配列は、明記されているいずれかの配列に加えて、相補的配列を含むか、または、コード化する。
【００５６】
本明細書において用いられるところ、「表現型形質」という句は、そのゲノム、プロテオームおよび／またはメタボロームと環境との相互作用からもたらされる個体の外観または他の検出可能な特徴を指す。
【００５７】
本明細書において用いられるところ、「耐性」という句は、特定の病原体および／または病原体によって生じる損傷の成長および発生を、同様の環境条件および病原体による圧力下で、感受性植物と比して制限する植物の能力を指す。耐性植物は、例えばＺＹＭＶ病原体による圧力といった病原体による圧力下でいくらかの病害症状または損傷を示し得る。
【００５８】
本明細書において用いられるところ、「感受性」という句は、ＺＹＭＶなどの例えばポティウイルス病原体といった特定の病原体の成長および発生を十分に制限できない植物を指す。
【００５９】
耐性植物は、以下の実施例において定義されている試験条件下で、芽胞形成を全くまたはほとんど伴わずにネクローシスを全くまたはほとんど示すことはない。
【００６０】
本明細書において用いられるところ、「複数の」という用語は、２つ以上を指す。それ故、「複数の個体」とは、少なくとも２つの個体を指す。いくつかの実施形態において、複数のという用語は、全体の半数を超えていることを指す。例えば、いくつかの実施形態において、「複数の固体群」とは、その固体群の構成種の半数を超えていることを指す。
【００６１】
本明細書において用いられるところ、「子孫」という用語は、特定の交雑の派生種を指す。典型的には、子孫は２つの個体の育種から生じるが、いくつかの種（特にいくつかの植物および雌雄同体動物）は自殖可能である（すなわち、同一の植物が雄および雌配偶子の両方のドナーとして働く）。派生種は、例えば、Ｆ１、Ｆ２またはいずれかのその後の世代のものであることが可能である。
【００６２】
本明細書において用いられるところ、「質的形質」という句は、主な表現型効果を発現する１つまたは少数の遺伝子によって決定される表現型形質をさす。このため、質的形質は、典型的には単純に遺伝される。植物における例としては、これらに限定されないが、花の色、果実の色および数々の既知の病害耐性が挙げられる。
【００６３】
「マーカに基づく選抜」は、本発明の範囲内において、例えば植物から１つ以上の核酸を検出するための遺伝子マーカの使用を指すと理解され、ここで、核酸は、望ましい（または望ましくない）形質に係る遺伝子を有する植物を同定するための所望の形質に関連しており、これにより、これらの植物を選抜育種プログラムにおいて用いる（または回避する）ことが可能である。
【００６４】
「ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）」は、本発明の範囲内において、ゲノムのＤＮＡまたはサブセットの特定の領域を比較的多量に生じさせ、これにより、これらの領域に基づいた種々の分析を可能とする方法を指すと理解される。
【００６５】
「ＰＣＲプライマー」は、本発明の範囲内において、ＤＮＡの特定の領域のＰＣＲ増幅において用いられる一本鎖ＤＮＡの比較的短い断片を指すと理解される。
【００６６】
「表現型」は、本発明の範囲内において、遺伝的に調節された形質の識別可能な特徴を指すと理解される。
【００６７】
本明細書において用いられるところ、「表現型形質」という句は、そのゲノム、プロテオームおよび／またはメタボロームと環境との相互作用によりもたらされる、個体の外観または他の検出可能な特徴を指す。
【００６８】
「多型性」は、本発明の範囲内において、固体群における、例えば選択的スプライシング、ＤＮＡメチル化等を介して入手可能な、遺伝子、遺伝子マーカ、または、遺伝形質もしくは遺伝子産物の２つ以上の異なる形態の存在を指すと理解される。
【００６９】
「選抜育種」は、本発明の範囲内において、親と同様に望ましい形質を有するか発現する植物を用いる育種プログラムを指すと理解される。
【００７０】
「テスター」植物は、本発明の範囲内において、試験される植物における形質を遺伝的に特性決定するために用いられる植物を指すと理解される。典型的には、試験される植物は「テスター」植物と交雑され、交雑の子孫における形質の分離比をスコア化した。
【００７１】
本明細書において用いられるところ、「プローブ」とは、特定の標的分子または細胞構造を認識および結合し、これにより、標的分子または構造の検出を可能とすることが可能である一群の原子または分子を指す。特に、「プローブ」とは、分子ハイブリダイゼーションによって相補的配列の存在を検出し、および、定量化するために用いられることが可能である標識化ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。
【００７２】
本明細書において用いられるところ、「ハイブリダイズ」という用語は、従来のハイブリダイゼーション条件であって、好ましくは、溶液として５×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、１×デンハート液が用いられ、および／または、ハイブリダイゼーション温度が３５℃〜７０℃、好ましくは６５℃であるハイブリダイゼーション条件を指す。ハイブリダイゼーションの後、好ましくは先ず２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで、その後、３５℃〜７５℃、特に４５℃〜６５℃、特に５９℃の温度で０．２×ＳＳＣで洗浄が行われる（ＳＳＰＥ、ＳＳＣおよびデンハート液の定義に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．ｌｏｃ．ｃｉｔ．を参照のこと）。例えば前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌに記載の高厳密性ハイブリダイゼーション条件が特に好ましい。特に好ましい厳密性ハイブリダイゼーション条件は、例えば、上記のとおり、ハイブリダイゼーションおよび洗浄が６５℃で行われる場合に存在する。例えばハイブリダイゼーションおよび洗浄が４５℃で行われる非厳密性厳密性ハイブリダイゼーション条件は好ましさに劣り、ハイブリダイゼーションおよび洗浄が３５℃で行われるものはさらに好ましさに劣る。
【００７３】
「配列相同性または配列同一性」は、本明細書において同義的に用いられる。２つ以上の核酸またはタンパク質配列の文脈において、「同等の」または「一致率」という」用語は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、または、目視検査により計測される最大一致性について比較およびアラインした場合に同じであるアミノ酸残渣またはヌクレオチドの特定の割合を有するか、または、同一である２つ以上の配列またはサブ配列を指す。相互に比較される２つの配列の長さが異なる場合、配列同一性は、配列が長いヌクレオチド残渣と同等である、配列が短いヌクレオチド残渣の割合に関連していることが好ましい。配列同一性は、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１  １）などのコンピュータプログラムを用いて簡便に判定可能である。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２つの配列間で配列同一性が最も高いセグメントを見つけるために、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２（１９８１），４８２−４８９の局部的な相同性アルゴリズムを利用する。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは他の配列アライメントプログラムを用いて特定の配列が本発明の参照配列と例えば９５％一致率を有するかを判定する場合、パラメータは、一致率が参照配列の全長にわたって算出され、および、参照配列中のヌクレオチドの総数の５％以下の相同性ギャップが許容されるよう調節されることが好ましい。Ｂｅｓｔｆｉｔが用いられる場合、いわゆる任意のパラメータは、予め設定された（「デフォルト」）値のままとされることが好ましい。所与の配列および上記の本発明の配列間の比較において見られる偏差は、例えば付加、欠失、置換、挿入または組換えによって生じ得る。このような配列比較はまた、好ましくは、プログラム「ｆａｓｔａ２０ｕ６６」（バージョン２．０ｕ６６、１９９８年９月、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｒ．ＰｅａｒｓｏｎおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｇｉｎｉａ；また、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８３，６３−９ａに添付の例およびｈｔｔｐ：／／ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ．ｓｄｓｃ．ｅｄｕ／も参照のこと）で行うことも可能である。この目的のためには、「デフォルト」パラメータ設定が用いられ得る。２つの核酸配列が実質的に同等であることの他の指標は、２つの分子が厳密性条件下で相互にハイブリダイズするかである。「〜に特異的にハイブリダイズする」という句は、その配列が複雑な混合物（例えば、合計細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡに存在する場合における、厳密性条件下での特定のヌクレオチド配列のみへの分子の結合、倍加またはハイブリダイズを指す。「実質的に結合する」とは、プローブ核酸と標的核酸との間の相補性ハイブリダイゼーションを指し、標的核酸配列の所望の検出を達するためにハイブリダイゼーション媒体の厳密性を低減することにより適応させられることが可能であるわずかな不適正塩基対を含む。
【００７４】
サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈において、「厳密性ハイブリダイゼーション条件」および「厳密性ハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列に依存し、および、異なる環境パラメータ下において異なる。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する詳細な案内は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに見出される。一般に、高厳密性ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定のイオン強度およびｐＨでの特定の配列の熱融点よりも約５℃低く選択される。典型的には、「厳密性条件」下では、プローブは他の配列ではなく、その標的サブ配列にハイブリダイズすることとなる。
【００７５】
熱融点は、標的配列の５０％がパーフェクトマッチプローブにハイブリダイズする温度（規定のイオン強度およびｐＨ下で）である。超厳密性条件が、特定のプローブに係るＴmと等しくなるよう選択される。サザンまたはノーザンブロットにおけるフィルタに１００塩基対を超える相補性残渣を有する相補性核酸のハイブリダイゼーションに係る厳密性ハイブリダイゼーション条件の一例は、４２℃で５０％ホルムアミドおよび１ｍｇのヘパリンであり、ハイブリダイゼーションは一晩かけて行われる。高厳密性洗浄条件の一例は、０．１  ５Ｍ  ＮａＣｌで７２℃、約１５分間である。厳密性洗浄条件の一例は、６５℃での１５分間の０．２倍ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝剤の説明については後述のＳａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。度々、高厳密性洗浄に先だって、バックグラウンドプローブシグナルを除去するための低厳密性洗浄が行われる。例えば１００塩基対超のヌクレオチドの二重鎖に対する中厳密性洗浄の例は、４５℃で１５分間の１倍ＳＳＣである。例えば１００超のヌクレオチドの二重鎖に対する低厳密性洗浄の一例は、４０℃で１５分間の４〜６倍ＳＳＣである。短いプローブ（例えば、約１０〜５０塩基対ヌクレオチド）に関して、厳密性条件は、典型的には、約１．０Ｍ未満のＮａイオン、典型的には約０．０１〜１．０Ｍ  Ｎａイオン濃度（または他の塩）の塩濃度、ｐＨ７．０〜８．３を含み、温度は典型的には少なくとも約３０℃である。厳密性条件はまた、ホルムアミドなどの脱安定化剤の添加で達成されることが可能である。普通、特異的ハイブリダイゼーションアッセイにおける未関連のプローブについて観察されるものの２倍（または、以上）のＳＮ比が、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。厳密性条件下で相互にハイブリダイズしない核酸は、コード化するタンパク質が実質的に同等である場合には未だ実質的に同等である。これは、例えば、遺伝子コードによって許容される最大のコドンの縮退を用いて核酸の複製物が形成される場合に生じる。
【００７６】
「植物」は、いずれかの成長段階にあるいずれかの植物であって、特に種子植物である。
【００７７】
「植物細胞」は植物の構造単位および生理学的単位であって、プロトプラストおよび細胞壁を含む。植物細胞は、単離された単一の細胞もしくは培養された細胞の形態であっても、または、例えば、植物組織、植物器官もしくは植物全体などのより高度に組織化された単位の一部とされていてもよい。
【００７８】
「植物細胞培養物」とは、種々の発達段階での、例えば原形質体、細胞培養細胞、植物組織中の細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚嚢、接合体および胚芽などの植物単位の培養物を意味する。
【００７９】
「植物材料」または「植物から入手可能な植物材料」とは、葉、茎、根、花もしくは花部、果実、花粉、卵細胞、接合体、種子、挿し木、細胞もしくは組織培養物、または、植物のいずれかの他の部分もしくは生成物を指す。
【００８０】
「植物器官」は、根、茎、葉、花芽または胚芽などの植物の明確で、視認可能に構造化および分化した部分である。
【００８１】
本明細書において用いられるところ、「植物組織」は、構造および機能単位に組織化された一群の植物細胞を意味する。植物体または培養における植物のいずれかの組織が含まれる。この用語は、特に限定されないが、植物全体、植物器官、植物種子、組織培養物、ならびに、構造および／または機能単位に組織化された植物細胞のいずれかの群を含む。上記に列挙されているか、そうでなくてもこの定義によって包含されるいずれかの特定のタイプの植物組織と併せた、または、これらを伴わないこの用語の使用は、いずれかの他のタイプの植物組織を排除することは意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】格付け１の写真である。
【図２】格付け２の写真である。
【図３】格付け３の写真である。
【図４】格付け４の写真である。
【図５】格付け５の写真である。
【図６】格付け６の写真である。
【図７】格付け７の写真である。
【図８】格付け８の写真である。
【図９】格付け９の写真である。
【図１０】植物がポティウイルスに対して試された場合のすべての４種の遺伝的決定因子を有する有益な効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
本発明は、ポティウイルス感染症に耐性であり、それ故、この病原体によって引き起こされる損傷から保護された新規なカボチャ植物に関する。本発明はまた、このような植物を形成し、用いる方法に関する。
【００８４】
本発明による植物は２つ以上の親遺伝子型を交雑させることにより入手し得、その少なくとも一方は、特に、ポティウイルス耐性に寄与する対応する遺伝子座にある１つ以上の対立遺伝子といった１つ以上の対立遺伝子を有し得、ここで、対立遺伝子は、他方の親遺伝子型を欠いているか、または、他の遺伝子型を補完して、本発明によるおよび本明細書に記載の植物が得られる。２つ以上の遺伝子座が耐性形質の発現に寄与し、および、２つの元の親遺伝子型が対立遺伝子のすべての組を提供しない場合、他のソースが育種固体群に含まれていることが可能である。他の親遺伝子型が、市場によって要求される作物品質を含む望ましい形質に寄与していてもよい。
【００８５】
親遺伝子型は子孫種子を生じさせるために互いに交雑され得る。親遺伝子型は、未調節または自然受粉の原野から選抜されたヘテロ接合植物を自家受粉させることにより、および、反復的な選抜法を利用することにより発生させた近交系統であり得る。優位の植物が自家受粉し、次の世代において選抜される。次の世代において、ヘテロ接合条件は自家受粉および選抜によって均一な系統に打ち負ける。自殖の引き続く世代では、植物はますますホモ接合となり、および、子孫植物内で一様となる。典型的には、自家受粉の第５世代から第７世代またはそれ以降の世代（Ｆ１からＦ２；Ｆ３からＦ４；Ｆ４からＦ５）および系統選抜が行われて、植物および種子の特徴が一様であり、ならびに、継続的な自家受精下で一様であり続けるであろう近交系統が得られ得る。
【００８６】
自殖においては、ヘテロ接合遺伝子座上の多くの望ましくない対立遺伝子がより好ましい対立遺伝子によって置換され、および、好ましくないまたは望ましくない対立遺伝子が子孫から排除されることとなる。しかも、マーカに基づく選抜を通して、より好ましくない対立遺伝子が同定されてより好ましい対立遺伝子によって逐次置換されることにより、好ましい対立遺伝子の数が最大限とされることが可能である。
【００８７】
一態様においては、本発明による植物は、祖先植物、特に野生祖先植物に由来するポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である遺伝的決定因子を栽培されたカボチャ植物、特に栽培されたペポカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｐｅｐｏ）植物に遺伝子移入することにより得られ得る。
【００８８】
本発明の特定の一実施形態において、ポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である遺伝的決定因子を入手し得る野生の祖先は、野生のニホンカボチャ（Ｃ．ｍｏｓｃｈａｔａ）、特に野生のカボチャ属の１種（Ｃ．ｍｏｓｃｈａｔａ  ｖａｒ．Ｎｉｇｅｒｉａ）であるか、または、前記遺伝的決定因子を含むその子孫もしくは祖先に由来する。この形質を発現する植物に、好ましくはＭＷＭＶ、ＰＲＳＶ、ＷＭＶおよびＺＹＭＶの１種以上といったポティウイルス感染症に対する耐性を与える本発明によるポティウイルス耐性形質は、代わりに、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）から、または、ポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である遺伝的決定因子を含むペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）の子孫もしくは祖先から得られ得る。
【００８９】
従って、本発明の特定の実施形態において、ポティウイルス耐性形質に寄与する親遺伝子型は、その種子サンプルが２０１０年６月１４日に受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている寄託ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）の本発明の関連する特性（すなわち、ポティウイルス耐性に関連する遺伝子座における実質的に同一のゲノムアーキテクチャ）を有する近交系統である。ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）は、ＭＷＭＶ、ＰＲＳＶ、ＷＭＶおよびＺＹＭＶに耐性である。耐性は遺伝的決定因子Ｚｎ、Ｎｉ＋、Ｗ１およびＷ２によってもたらされている。これらの決定因子は２６８ＮｉＷにおいてホモ接合劣性である。これらの決定因子は複数の遺伝子バックグラウンド間で伝達可能である。耐性アッセイにより、これらの遺伝的決定因子は例えば黄色のカセルタ（Ｃａｓｅｒｔａ）といったこれらの異なるバックグラウンドにおいてもポティウイルスに対する広い範囲の耐性を提供し続けることが実証されている。異なるポティウイルス菌株に対する耐性レベルが表２に示されている。植物がポティウイルスに対して試された場合のすべての４種の遺伝的決定因子を有する有益な効果が表２および図１０に示されている。
【００９０】
近交系統の実用性およびその雑種子孫に対する遺伝的な寄与の可能性を判定するために、試験−交雑を他の近交系統と行い、得られた子孫を表現型的に評価した。
【００９１】
本発明の他の特定の実施形態において、耐性形質に寄与する親遺伝子型は、その種子サンプルが２０１０年６月１４日に受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている寄託ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）の本発明の関連する特性（すなわち、ポティウイルス耐性に関連する遺伝子座における実質的に同一のゲノムアーキテクチャ）を有するハイブリッドである。
【００９２】
ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）を、ポティウイルス耐性形質のドナーとしての野生カボチャ属の１種（Ｃ．ｍｏｓｃｈａｔａ  ｖａｒ．Ｎｉｇｅｒｉａ）とペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ）近交系統との交雑から得た。この交雑のポティウイルス耐性子孫を異なる遺伝子バックグラウンドのさらなる近交系統と交雑させて、最終的にペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）を得た。
【００９３】
従って、ポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である遺伝的決定因子を含有するペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）またはいずれかの他の植物系統は、前記耐性形質をいずれかの所望の遺伝子バックグラウンドに遺伝子移入するためのソース材料として用いられて、本発明によりポティウイルス感染症に高度に耐性であるカボチャ植物が得られ得、また、市場によって要求される作物品質形質などの１種以上の望ましい形質がさらに含有され得る。作物品質に加えて、例えば良好な植物アーキテクチャ、高い生産性および病原体に対する基礎的耐性などの農業経済学的に重要な特徴も含有され得る。
【００９４】
本発明の記載に基づいて、本明細書に記載のとおりポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも１種の遺伝的決定因子を含有するペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（そのサンプルは、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄに寄託されている）またはその子孫もしくは祖先を所有する当業者は、技術分野において周知である育種技術を用いて、本発明の前記少なくとも１種の遺伝的決定因子を種々のタイプの他のカボチャ植物に容易に移すことが可能である。本発明の形質は例えば他のカボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）種に移され得、従って、一実施形態において、本発明の植物はポティウイルス感染症に耐えることが可能であるカボチャ植物である。本発明の一実施形態において、カボチャ植物は、（ハイブリッド）種子または商業的なカボチャの生産のために育成される。
【００９５】
従って、他の実施形態において、本発明は、ａ）前記形質を含む植物を入手するステップ；ｂ）これを前記形質を欠く植物と交雑させるステップ；ｃ）ステップｂ）の交雑による植物を得るステップ；ｄ）本発明によるポティウイルス感染症に耐えることが可能であるステップｃ）の植物を選抜するステップを含む本発明によるポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも１種の遺伝的決定因子を前記形質を欠くカボチャ植物に移入する方法を開示する。一実施形態において、この方法は、ｅ）ステップｄ）から得られる植物とカボチャ植物とを戻し交雑するステップ、および、ｆ）本発明によるポティウイルス感染症に耐えることが可能であるカボチャ植物を選抜するステップをさらに含む。一実施形態において、この方法は、本発明によるポティウイルス感染症に耐えることが可能である近交系カボチャ植物を得るステップをさらに含み、および、一実施形態において、この方法は、前記近交系カボチャ植物を他のカボチャ植物と交雑させて本発明によるポティウイルス感染症に耐えることが可能であるハイブリッドカボチャ植物を生成するステップをさらに含む。一実施形態において、カボチャ植物は、本明細書に記載のとおりポティウイルスの存在不在を判定することにより選抜される。一実施形態において、前記形質を含むステップａ）の植物はペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＳ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）、または、前記植物の子孫もしくは祖先である。
【００９６】
マーカ−育種もまた、本明細書に記載のとおり、ポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも１種の遺伝的決定因子、および／または、隣接するマーカ遺伝子座もしくはこれに遺伝的に連鎖したマーカ遺伝子座を含有する個体を同定するために用いられ得る。
【００９７】
マーカに基づく選抜は、近交系の開発早期において、度々、視覚的に判定可能である表現型特徴に大きく基づいており、および、商業的なハイブリッド生産における植物の利用の好適性に関連する重要な性能指数に関連しているスクリーニング法と組み合わされて既に用いられている場合がある。選抜はまた、関心のある形質に連鎖していてもいなくてもよい分子マーカに基づいていてもよい。
【００９８】
特に、マーカに基づく選抜は、表現型選抜と組み合わされて、または、表現型選抜の後に、本明細書に既述の本発明の関連する遺伝子座のすべてがホモ接合を好む遺伝子型を有する個体を同定するために採用され得る。
【００９９】
特にこれらに限定されないが、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、多型ＤＮＡのランダム増幅（ＲＡＰＤ）、および、増幅制限断片長多型（ＡＦＬＰ）を含む、マーカに基づく選抜において用いられ得る数々のタイプの分子マーカが存在する。
【０１００】
ＲＦＬＰには、制限酵素を用いた染色体ＤＮＡの特定の短い制限部位での切断が関与しており、制限部位における部位または突然変異間の倍加または欠失により多型性がもたらされる。
【０１０１】
ＲＡＰＤは、任意の配列を有する単一のプライマーを伴う低厳密性ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を利用して、無名のＤＮＡ断片の菌株−特異的アレイを生成する。この方法はごくわずかなＤＮＡサンプルしか必要ではなく、多数の多型遺伝子座が分析される。
【０１０２】
ＡＦＬＰは、特定の断片を増幅するために、ＰＣＲおよび選抜ヌクレオチドを用いる前に、プライマーにおける制限酵素による細胞ＤＮＡの消化を必要とする。得られた断片を可視化するこの方法技術では、プライマーの組み合わせ当たり１００塩基対以下の多型遺伝子座を計測することが可能であり、ごく少量のＤＮＡサンプルしか各試験で必要とされない。
【０１０３】
ＳＳＲ分析は、真核生物のゲノム全体に広く存在しており、単純配列反復における変位を検出するために選抜的に増幅されるＤＮＡマイクロサテライト（短い反復）配列に基づいている。ごくわずかなＤＮＡサンプルしかＳＳＲ分析には必要とされない。ＳＮＰは、点突然変異を効率的に拾い上げるＰＣＲ拡張アッセイを用いる。この手法はサンプル当たりのＤＮＡ必要量が少ない。上記方法の１つまたは２つが、典型的なマーカに基づく選抜育種プログラムにおいて用いられ得る。
【０１０４】
植物ゲノムの多型領域におよぶヌクレオチドの増幅を達成する最も好ましい方法は、その二重鎖形態において多型性を定義する近位配列にハイブリダイズすることが可能である順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含むプライマー対を用いる、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．ＢｉｏＩ．５１：２６３  ２７３（１９８６））を利用する。
【０１０５】
２対のオリゴヌクレオチドプローブを用いて特定の標的を数関数的に増幅させる「リガーゼ連鎖反応」（「ＬＣＲ」）（Ｂａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳＣｉ．（Ｕ．ＳＡ）８８：１８９  １９３（１９９１））などの、代替的な方法が断片の増幅に利用され得る。オリゴヌクレオチドの各対の配列は選抜されてこの対をハイブリダイズさせて、標的の同一ストランドの配列を接続する。このようなハイブリダイゼーションでは鋳型−依存リガーゼに係る基材が形成される。ＰＣＲと同様に、得られる生成物はそれ故、その後のサイクルにおいて鋳型となり、および、所望の配列の指数関数的な増幅が達成される。
【０１０６】
ＬＣＲは、多型部位の同一のストランドの近位および遠位配列を有するオリゴヌクレオチドで実施されることが可能である。一実施形態においては、いずれかのオリゴヌクレオチドが多型性の実際の多型部位を含むよう設計されることとなる。このような実施形態において、反応条件は、標的分子がオリゴヌクレオチドに存在する多型部位に相補性である特定のヌクレオチドを含有するかまたは含有していない場合にのみ、オリゴヌクレオチドが一緒に連結可能であるよう選抜される。あるいは、オリゴヌクレオチドは、多型部位を含まないよう選抜され得る（Ｓｅｇｅｖ、国際公開第９０１０１０６９号パンフレットを参照のこと）。
【０１０７】
代わりに利用され得るさらなる方法は、「オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ」（「ＯＬＡ」）（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７  １０８０（１９８８））である。ＯＬＡプロトコルは、ハイブリダイズされて標的の単一ストランドの配列を接続することが可能であるよう設計された２種のオリゴヌクレオチドを用いる。ＯＬＡは、ＬＣＲと同様に、点突然変異の検出に特に好適である。しかしながら、ＬＣＲとは異なり、ＯＬＡは、標的配列の指数関数的な増幅ではなく「直鎖」をもたらす。
【０１０８】
代わりに利用され得るさらに他の方法は、オーバーラップする対立遺伝子−特異的オリゴヌクレオチドの一塩基多型（ＳＮＰ）部位を含有する標的ＤＮＡへのハイブリダイゼーションによって形成される三次元錯体を構造特異的フラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）を用いて切断する「インベーダーアッセイ」である。オリゴヌクレオチド相補性の標的分子におけるＳＮＰ対立遺伝子に対するアニーリングによって、熱安定性のＦＥＮによるオリゴヌクレオチドの切断が開始される。切断は、数々の異なるアプローチによって検出可能である。最も一般的には、切断生成物が蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）カセットにおける第２の切断反応を生起させて蛍光シグナルがリリースされる。あるいは、切断は、蛍光偏光（ＦＰ）プローブの使用または質量分光測定により直接的に検出可能である。切断反応は高度に特異的であり、低い破損率を有し、および、ゼプトモル量の標的ＤＮＡを検出可能である。１回の反応で１つのサンプル中の１つのＳＮＰを調べるアッセイが伝統的に用いられているが、新規なチップ系またはビーズ系アプローチが、これを多重化および高スループットＳＮＰ遺伝子型同定に適応可能な効率的正確なアッセイとするべく試験されている。
【０１０９】
Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．が、ＰＣＲおよびＯＬＡの特性を組み合わせた核酸検出アッセイを記載している（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８７：８９２３  ８９２７（１９９０））。この方法においては、ＰＣＲが標的ＤＮＡの指数関数的な増幅の達成に用いられ、次いで、これがＯＬＡを用いて検出される。
【０１１０】
得られる「ジオリゴヌクレオチド」配列を有する核酸の存在下に２つ（またはそれ以上）のオリゴヌクレオチドを連結し、これにより、ジオリゴヌクレオチドを増幅させることに基づくスキームも公知であり（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０  ５６９（１９８９））、本発明の目的に容易に適応し得る。
【０１１１】
一実施形態において、分子マーカは、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片であり、例えばＳＳＲマーカまたはＲＡＰＤマーカである。一実施形態においては、増幅されたＤＮＡ断片の存在または不在が、形質自体または形質の特異的対立遺伝子の存在または不在を示す。一実施形態においては、増幅されたＤＮＡ断片の長さの違いが形質の特異的対立遺伝子の存在を示し、それ故、形質の異なる対立遺伝子間の区別を可能とする。
【０１１２】
本発明の特定の実施形態においては、ＳＮＰマーカが用いられて、親植物および／またはその祖先、ならびに、前記親植物の交雑に由来する子孫植物におけるポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である本発明の遺伝的決定因子が同定される。ＳＮＰマーカはエンドポイントリーディングＴａｑｍａｎテクノロジー（Ｅｎｄ  Ｐｏｉｎｔ  ｒｅａｄｉｎｇ  Ｔａｑｍａｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって検出可能であり、ならびに、特定の順方向および逆方向プライマー配列に追加して、プローブ（例えば本明細書において開示のとおり）を用いてマーカ遺伝子座の各々におけるＲおよび／またはＳ対立遺伝子の存在の検出を検出することが可能である。従って、開示の遺伝子マーカの各々は２つだけではなく４つの配列から組成されている：標的領域を増幅する順方向および逆方向プライマー、ならびに、標的ＳＮＰを同定する２つのプローブ。
【０１１３】
本発明において、ポティウイルスに対する耐性を伴って同時分離する本発明のＤＮＡマーカの１つ以上は、
ｉ．配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出、および／または；
ｉｉ．配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出、および／または；
ｉｉｉ．配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出、ならびに／または
ｉｖ．配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出
を含む少なくとも一対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーによるＰＣＲにおいて同定可能であり、ＰＣＲ反応において増幅生成物をもたらす前記プライマーは、同等のプライマー対を用いるＰＣＲ反応においてペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（そのサンプルが受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄに寄託されている）から入手可能な対応するＰＣＲ増幅生成物のものに対する対立遺伝子とみなされることが可能であるか、または、実質的に同等である分子量もしくはヌクレオチド配列を示す。
【０１１４】
第１のステップにおいて、ＤＮＡまたはｃＤＮＡサンプルは、葉組織などの好適な植物材料から公知の技術を用いてＤＮＡまたはＲＮＡを抽出することにより得られる。本明細書において上記に開示のとおりポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能であるゲノム領域における、または、これに連鎖している領域におけるＳＮＰを含有する領域に隣接するプライマーは、次いで、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いるＤＮＡサンプルの増幅に用いられる。
【０１１５】
代わりに、所望の対立遺伝子の存在または不在は、二重鎖ＤＮＡ染料または蛍光レポータープローブ法を用いるリアルタイムＰＣＲによって判定され得る。
【０１１６】
マーカ分析は、きわめて若い植物の葉組織からまたは種子から抽出したＤＮＡサンプルを用いて植物の成長における早期に行うことが可能である。これにより、育種サイクルの早期に望ましい遺伝子構成を有する植物の同定を可能とし、および、受粉前に所望される本発明の関連する対立遺伝子を含有しない植物を廃棄することを可能とし、それ故、育種固体群のサイズおよび表現型の要求の低減を可能とする。
【０１１７】
さらに、分子マーカを用いることにより、ポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも１種の遺伝的決定因子において所望される本発明の関連する対立遺伝子の２つのコピーを有するホモ接合植物と、１つのコピーのみを有するヘテロ接合植物と、好ましい対立遺伝子のコピーをまったく含有しない植物との区別を行うことが可能である。
【０１１８】
従って、代わりのマーカを開発し、本発明による、および、本明細書に開示の質的形質遺伝子座の対立遺伝子または一組の対立遺伝子を有する植物の同定および選抜に用いることが可能である。例えば、
ｉ．配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出、ならびに／または；
ｉｉ．配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出、ならびに／または；
ｉｉｉ．配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出；ならびに／または；
ｉｖ．配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出
からなるＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーの対を用いるＰＣＲ増幅において得られる増幅生成物のヌクレオチド配列を得ることが可能であり、ＰＣＲ増幅生成物の新たに判定したヌクレオチド配列に基づいて新規のプライマーもしくはプライマー対が設計される。しかも、本発明による、および、本明細書において上記に開示のマーカはカボチャもしくは他の種の遺伝子地図上に位置されていることが可能であり、ならびに、同一の領域または同族体領域またはオルソログ領域においてマッピングする公知のマーカが新規のマーカの開発の開始点として用いられることが可能である。
【０１１９】
従って、本発明において特定的に開示されているマーカはまた、ポティウイルスに対する耐性に関連する新規または追加のマーカの同定および／または開発においても用いられ得、次いで、これが、ポティウイルス耐性遺伝子座に隣接する組換え体のマーカ育種および／または探索、および／または、微細マッピング、および／または、ポティウイルス耐性遺伝子座のクローニングにおいて用いられることが可能である。
【０１２０】
連鎖不平衡における、ならびに／または、関心領域に連鎖する、および／もしくは、関心領域に位置するマーカ、ならびに、基礎となるポティウイルス耐性形質の実際の原因突然変異を表現するマーカの同定および／または開発に用いられることが可能である利用可能な数々の方法またはアプローチが存在する。完全な網羅ではないが、いくつかのアプローチは以下を含む。
−関心領域における他の配列を同定するためのハイブリダイゼーションアプローチにおける開示の配列／マーカの使用。
−関心領域における他の配列を同定するためのＰＣＲアプローチにおける開示の配列／マーカの使用。
−関心領域における他の配列を同定するためのＰＣＲアプローチにおける開示の配列／マーカの使用。
−同一の領域におけるマーカを同定するためのマッピングおよび／または比較マッピングアプローチにおける開示の配列／マーカの使用（他の地図上におけるポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である前記少なくとも１種の遺伝的決定因子の位置決め）。
−追加の配列／マーカ／（候補）遺伝子を同定するための「インシリコ」アプローチにおける開示の配列／マーカの使用。
−物理的マッピングアプローチにおける開示の配列／マーカの使用（物理的地図またはゲノム配列上における前記遺伝的決定因子の位置決め）。
−他の（物理的）地図またはゲノム上における前記少なくとも１種の遺伝的決定因子の位置決めのための開示の配列／マーカの使用。
−遺伝子アプローチによる関心領域におけるマーカの同定を可能とする適切な個体を選抜するための開示の配列／マーカの使用。
−（位置的）候補遺伝子を探索するための開示情報の使用。
【０１２１】
遺伝子型同定、マッピングまたは関連マッピングに関して、ＤＮＡは、例えば、葉組織などの好適な植物材料から抽出される。特に、複数の植物の葉のバルクが採取される。ＤＮＡサンプルは、複数の多型ＳＳＲ、ＳＮＰまたはカボチャゲノムのすべてをカバーするいずれかの他の好適なマーカ−タイプを用いて遺伝子型が同定される。
【０１２２】
遺伝子型および表現型データの連結分析は標準的なソフトウェアを用いて行われることが可能である。植物導入および生殖質は、前記少なくとも１種の遺伝的決定因子に連鎖するマーカ遺伝子座／遺伝子座におけるマーカのヌクレオチド配列、または、同一の染色体上に位置していると知られているいずれかの他のマーカのヌクレオチド配列、および、対立遺伝子の分子量に基づいて、本明細書に開示されているか当業者に公知である技術の１種以上を用いて、本明細書に開示のポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である対応する少なくとも１種の遺伝的決定因子における対立遺伝子についてスクリーニングされることが可能である。
【０１２３】
マーカ、連鎖マーカまたは本明細書に開示のポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも１種の遺伝的決定因子の核酸配列は、当業者に公知の方法によって判定され得る。例えば、前記少なくとも１種の遺伝的決定因子またはその耐性付与部を含む核酸配列は、前記植物のゲノムの断片化および前記少なくとも１種の遺伝的決定因子を示す１つ以上のマーカを有するこれらの断片の選抜によってポティウイルス耐性ドナー植物から単離され得る。続いて、または、代わりに、前記耐性遺伝子座を示すマーカ配列（またはその一部）が、（ａ）前記植物から得たゲノム核酸サンプルもしくはゲノム断片に由来する前記耐性遺伝子座を含む核酸配列を増幅するために、（ＰＣＲ）増幅プライマーとして用いられ得る。前記少なくとも１種の遺伝的決定因子および／またはこれに含まれるいずれかの追加のマーカのヌクレオチド配列は標準的な配列決定法によって得られ得る。
【０１２４】
従って、本発明はまた、本発明のポティウイルスに対する耐性もしくはその耐性付与部を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも１種の遺伝的決定因子を含む単離された核酸（特にＤＮＡに限定されないが、好ましくはＤＮＡ）配列に関する。それ故、開示されているマーカは、ポティウイルス耐性に連鎖するかコード化する、カボチャもしくは他の野菜作物からの１つ以上のマーカもしくは遺伝子の同定および単離に用いられ得る。
【０１２５】
本発明のポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である前記少なくとも１種の遺伝的決定因子に連鎖する追加のマーカのヌクレオチド配列はまた、例えば、前記少なくとも１種の遺伝的決定因子に関連する１つ以上のマーカのヌクレオチド配列を判定することにより、および、前記マーカの前記配列のためのプライマーを設計することによっても分解され得、これが、次いで、前記マーカの外の配列をさらに判定するのに用いられ得る。例えば、本明細書に開示のＳＮＰマーカのヌクレオチド配列、または、前記少なくとも１種の遺伝的決定因子領域において予測されるか、および／もしくは、前記領域に連鎖するいずれかの他のマーカのヌクレオチド配列は、前記マーカのＰＣＲ増幅生成物を技術分野において周知である方法によって配列決定することにより、あるいは、マーカ配列をＰＣＲにおいてもしくはハイブリダイゼーションプローブとして用いて、例えば、特にこれらに限定されないが、ＢＡＣスクリーニングにより連鎖するヌクレオチド配列を同定することにより得られ得る。
【０１２６】
種子寄託の詳細
ブダペスト条約に基づき、２０１０年６月１４日に、Ｓｙｎｇｅｎｔａ  Ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎｓ  ＡＧ名義で以下の種子サンプルをＮＣＩＭＢ，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ  ＡＢ２１  ９ＹＡ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫに寄託した。
ＮＣＩＭＢ  ４１７２６  ペポカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｐｅｐｏ  ｃｖ．ＰＰ４１５）
ＮＣＩＭＢ  ４１７２７  ペポカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）
【０１２７】
本発明の実施形態
１．好ましくはＭＷＭＶ、ＰＲＳＶ、ＷＭＶおよびＺＹＭＶの１種以上といったポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも１種の遺伝的決定因子を含む好ましくはペポカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｐｅｐｏ）である栽培されたカボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）植物。
【０１２８】
２．前記遺伝的決定因子が、好ましくはカボチャ属の１種（Ｃ．ｍｏｓｃｈａｔａ  ｖａｒ．Ｎｉｇｅｒｉａ）といったニホンカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ）のゲノムから入手可能である、実施形態１に記載の植物。
【０１２９】
３．前記遺伝的決定因子がホモ接合状態で存在する実施形態１または２に記載の植物。
【０１３０】
４．ポティウイルス感染症に対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である前記遺伝的決定因子の少なくとも１種を含む実施形態１〜３に記載の植物。
【０１３１】
５．ポティウイルス感染症に対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である前記遺伝的決定因子の少なくとも２種を含む実施形態１〜３に記載の植物。
【０１３２】
６．好ましくはＺＹＭＶおよびＭＷＭＶ感染症といったポティウイルス感染症に対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である前記遺伝的決定因子の少なくとも４種を含む実施形態１〜３に記載の植物。
【０１３３】
７．
ａ）遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはＺＹＭＶおよびＰＲＳＶ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座ＺＮに遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて同定可能であり；ならびに／または
ｂ）遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子の２種に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはＭＷＭＶ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ｗ１および／またはＷ２に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出
および／または配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて同定可能であり；ならびに／または
ｃ）遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはＺＹＭＶ耐性形質、より好ましくはＺＹＭＶ菌株Ｎｉｖｉｒ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ｎｉ＋に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて同定可能である、
いずれかの既述の実施形態による植物。
【０１３４】
８．
ａ）遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはＺＹＭＶおよびＰＲＳＶ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座ＺＮに遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいてペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）ゲノムに同定可能であり；ならびに／または
ｂ）遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子の２種に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはＭＷＭＶ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ｗ１および／またはＷ２に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出；
および／または配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいてペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）ゲノムに同定可能であり；ならびに／または
ｃ）遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはＺＹＭＶ耐性形質、より好ましくはＺＹＭＶ菌株Ｎｉｖｉｒ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ｎｉ＋に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいてペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）ゲノム中に同定可能である、
いずれかの既述の実施形態による植物。
【０１３５】
９．
ａ）遺伝的決定因子は、好ましくはＺＹＭＶおよびＰＲＳＶ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座ＺＮに遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて前記植物のゲノム中に同定可能であり；ならびに／または
ｂ）遺伝的決定因子は、好ましくはＭＷＭＶ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ｗ２に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出；
および／または配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて前記植物のゲノム中に同定可能であり；ならびに／または
ｃ）遺伝的決定因子は、好ましくはＺＹＭＶ耐性形質、より好ましくはＺＹＭＶ菌株Ｎｉｖｉｒ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ｎｉ＋に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて前記植物のゲノム中に同定可能である、
いずれかの既述の実施形態による植物。
【０１３６】
１０．遺伝的決定因子が劣性であるいずれかの既述の実施形態による植物。
【０１３７】
１１．植物が非遺伝子組換えカボチャ植物であるいずれかの既述の実施形態による植物。
【０１３８】
１２．植物が近交系、二ゲノム性半数体またはハイブリッドであるいずれかの既述の実施形態による植物。
【０１３９】
１３．植物が雄性不稔であるいずれかの既述の実施形態による植物。
【０１４０】
１４．特に限定されないが、葉、茎、根、花もしくは花部、果実、花粉、卵細胞、接合体、種子、挿し木、細胞もしくは組織培養物、または、特に植物に育成された場合に未だポティウイルス耐性表現型を発現する植物のいずれかの他の部分もしくは生成物を含む前記実施形態のいずれかによる植物から入手可能な植物材料。
【０１４１】
１５．特に限定されないが、種々の成長段階における、植物種子、例えば、根、茎、葉、花芽または胚芽等などの植物器官、胚珠、花粉小胞子、植物細胞、植物組織、例えば原形質体、細胞培養細胞、植物組織、花粉、花粉管、胚珠、胚嚢、接合体および胚芽における細胞などの植物細胞培養物等を含み、特に植物に育成された場合に未だポティウイルス耐性表現型を発現する前記実施形態のいずれかによる植物の植物部位。
【０１４２】
１６．ポティウイルス耐性カボチャ植物を育成可能であるいずれかの既述の実施形態によるカボチャ植物の種子。
【０１４３】
１７．実施形態１６による種子であって、ハイブリッド種子である前記種子。
【０１４４】
１８．受入番号４１７２７でＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄに寄託された実施形態１７による種子。
【０１４５】
１９．ポティウイルス耐性カボチャ植物を育成するための実施形態１６〜１８の種子の使用。
【０１４６】
２０．カボチャ植物におけるポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である遺伝的決定因子の検出キットであって、ここで、前記キットは、遺伝的決定因子に連鎖するＤＮＡマーカを増幅させることが可能である１つのＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーまたはＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対を含み、および、ここで、前記ＤＮＡマーカは、
ａ）配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出および／または；
ｂ）配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出および／または：
ｃ）配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出；ならびに／または
ｄ）配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出
から選択されるＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対を伴うＰＣＲにおいて増幅されることが可能であるキット。
【０１４７】
２１．ポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である遺伝的決定因子に連鎖し、および、
ａ）配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出および／または；
ｂ）配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出および／または；
ｃ）配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出；ならびに／または
ｄ）配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出
から選択されるＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対を伴うＰＣＲにおいて増幅されることが可能であるＤＮＡマーカ。
【０１４８】
２２．カボチャ中のポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である遺伝的決定因子の診断上の選抜のための実施形態２１によるＤＮＡマーカのいずれか１つの使用。
【０１４９】
２３．植物におけるポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である遺伝的決定因子の存在を同定するため、および／または、カボチャ中のポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である遺伝的決定因子の遺伝子移入をモニタするための実施形態２１〜２２によるＤＮＡマーカのいずれか１つの使用。
【０１５０】
２４．
ａ）配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出および／または；
ｂ）配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出および／または；
ｃ）配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出；および／または；
ｄ）配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出；
から選択されるＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対を伴うＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて入手可能であるポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドはポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である遺伝的決定因子に統計的に相関し、それ故、遺伝的に連鎖するＤＮＡマーカを含有し、および、前記ポリヌクレオチドは、同一のプライマー対を伴うＰＣＲにおいてペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）から入手可能である増幅生成物に対応するが、ただし、対応するマーカ遺伝子座は、前記ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）植物に未だ存在しており、および／または、その対立遺伝子とみなされることが可能である。
【０１５１】
２５．実施形態２４のポリヌクレオチドの配列に対して、少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、特に少なくとも９６％、特に少なくとも９７％、特に少なくとも９８％、特に少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
【０１５２】
２６．実施形態２５のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を示すポリヌクレオチド。
【０１５３】
２７．ポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも１種の遺伝的決定因子を前記遺伝的決定因子を欠くカボチャ植物に導入する方法であって：
ａ）前記実施形態のいずれか１つによる第１のカボチャ植物を得るステップ；
ｂ）前記第１のカボチャ植物と第２のカボチャ植物とを交雑するステップであって、前記第２のカボチャ植物が前記対立遺伝子を欠いているステップ；ならびに
ｃ）ポティウイルスに対する高い耐性を発現し、および、前記ポティウイルス耐性を伴って同時分離する少なくとも１種のＤＮＡマーカを含む、交雑に由来する植物を同定するステップ；ならびに
ｄ）任意により、前記植物を単離するステップ、ならびに
ｅ）任意により、前記植物を第１または第２のカボチャ植物と戻し交雑するステップ
を含む方法。
【０１５４】
２８．
ａ）前記実施形態のいずれか１つによる第１のカボチャ植物を得るステップ；
ｂ）前記第１のカボチャ植物と第２のカボチャ植物とを交雑するステップであって、前記第２のカボチャ植物は前記遺伝的決定因子を欠いているステップ；ならびに
ｃ）ポティウイルスに対する高い耐性を発現し、および、前記ポティウイルス耐性を伴って同時分離する少なくとも１種のＤＮＡマーカを含む、交雑に由来する植物を同定するステップ；ならびに
ｄ）前記ポティウイルス耐性を伴って同時分離する少なくとも１種のＤＮＡマーカを含む子孫種子を前記交雑から収穫するステップ
を含む、前記実施形態のいずれかによる植物の種子を得る方法。
【０１５５】
２９．ステップｃ）において、交雑からもたらされ、および、ポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも１種の遺伝的決定因子を含む植物は、
ａ）配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出および／または；
ｂ）配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出および／または；
ｃ）配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出；ならびに／または
ｄ）配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出
から選択されるＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対を伴うＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて同定可能である、実施形態２７または２８のいずれか１つによる方法。
【０１５６】
３０．１つ以上のプライマー対の増幅生成物の断片サイズが判定される実施形態２９による方法。
【０１５７】
３１．
ａ）ポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも１種の遺伝的決定因子を含むカボチャ植物を選抜するステップであって、前記遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）のゲノムから入手可能であり、および、ポティウイルスに対する耐性を伴って同時分離する少なくとも１種のマーカ遺伝子座に遺伝的に連鎖しており、および、
ｉ．配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出、および／または；
ｉｉ．配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出、および／または；
ｉｉｉ．配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出、および／または；
ｉｖ．配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出、および／または；
ｖ．前記ポティウイルス耐性表現型の少なくとも１種を伴って同時分離するマーカ遺伝子座を同定可能である順方向および逆方向プライマー
を含む少なくとも一対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーによるＰＣＲにおいて同定可能であるステップ；
ｂ）ステップａ）の前記植物と、ポティウイルスに対して感受性であるか、または、前記ポティウイルスの少なくとも１種に対して中レベルの耐性を発現するカボチャ植物とを交雑させるステップ；ならびに
ｃ）ポティウイルスに対する耐性表現型を発現する子孫を前記交雑から選抜するステップであって、前記耐性表現型は、ステップａ）の前記少なくとも１種のマーカ遺伝子座を伴って分離するステップ
を含む好ましくはＭＷＭＶ、ＰＲＳＶ、ＷＭＶおよびＺＹＭＶの１種以上といったポティウイルスに対する耐性を示すカボチャ植物を生成する方法。
【０１５８】
３２．
ａ）ポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも１種の遺伝的決定因子を含むカボチャ植物を選抜するステップであって、前記遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）のゲノムから入手可能であり、および、ポティウイルスに対する耐性を伴って同時分離する少なくとも１種のマーカ遺伝子座に遺伝的に連鎖しており、および、
ｉ．マーカ遺伝子座がＺＮである場合、配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出、ならびに／または；
ｉｉ．マーカ遺伝子座がＷ１である場合、配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出、ならびに／または；
ｉｉｉ．マーカ遺伝子座がＷ２である場合、配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出；
ｉｖ．マーカ遺伝子座がＮｉ＋である場合、配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出
を含む少なくとも一対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーによるＰＣＲにおいて同定可能であるステップ；
ｂ）ステップａ）の前記植物と、ポティウイルスに対して感受性であるか、または、前記ポティウイルスの少なくとも１種に対して中レベルの耐性を発現するカボチャ植物とを交雑させるステップ；ならびに
ｃ）ポティウイルスに対する耐性表現型を発現する子孫を前記交雑から選抜するステップであって、前記耐性表現型は、ステップａ）の前記少なくとも１種のマーカ遺伝子座を伴って分離するステップ
を含む実施形態３１による好ましくはＺＹＭＶおよびＭＷＭＶの少なくとも１種といったポティウイルスに対する耐性を示すカボチャ植物を生成する方法。
【０１５９】
３３．ステップａ）において選抜された植物が、ポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも２種の遺伝的決定因子を含み；ならびに、ステップｃ）において選抜された子孫がポティウイルス耐性表現型を発現し、前記耐性表現型がステップａ）の２つのマーカ遺伝子座を伴って分離する実施形態３１または３２による方法。
【０１６０】
３４．ステップａ）において選抜された植物が、好ましくはＺＹＭＶおよびＭＷＭＶといったポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも３種の遺伝的決定因子を含み；ならびに、ステップｃ）において選抜された子孫が好ましくはＺＹＭＶおよびＭＷＭＶといったポティウイルスに対する耐性表現型を発現し、前記耐性表現型がステップａ）のマーカ遺伝子座を伴って分離する実施形態３１または３２による方法。
【０１６１】
３５．ステップａ）のドナー植物がいずれかの既述の実施形態１〜１３の植物であるいずれかの既述の実施形態３１〜３４による方法。
【０１６２】
３６．ステップｃ）において得られたウイルス耐性植物と、感受性カボチャ植物またはステップｂ）の中度耐性カボチャ植物とを戻し交雑する追加のステップを含む実施形態３１〜３５による方法。
【０１６３】
３７．
ａ）雄性不稔性雌株および雄性稔性植物を植えるステップであって、前記雄性不稔性雌株または雄性稔性植物の一方が既述の実施形態１〜１３のいずれかの植物であるステップ、
ｂ）両方の系統間で他家受粉させるステップ、
ｃ）植物を実どまりするまで育成するステップ、
ｄ）果実を採取するステップ、ならびに
ｅ）ハイブリッド種子を得るステップ
を含むポティウイルスに対して耐性であるカボチャのハイブリッド種子を生成する方法。
【０１６４】
３８．
ａ）いずれかの既述の実施形態の植物を得るステップ、または、いずれかの既述の実施形態の方法により植物を得るステップ；
ｂ）前記植物とポティウイルス感受性植物または中度耐性カボチャ植物とを交雑させるステップ；
ｃ）ステップｂ）の交雑からもたらされる胚芽を救出するステップ；
ｄ）ステップｃ）の前記胚芽から植物を再生するステップ；ならびに
ｅ）好ましくはＺＹＭＶおよびＭＷＭＶの少なくとも１種といったポティウイルスに耐性であるステップｄ）の植物を選抜するステップ
を含むポティウイルス耐性カボチャ植物を得る方法。
【０１６５】
３９．
ａ）いずれかの既述の実施形態のいずれか１つの植物、または、いずれかの既述の実施形態のいずれか１つの方法により得た植物の種子を播種するステップ；および
ｂ）果実を形成するために前記植物を育種し、および、前記植物によって形成された果実を収穫するステップ
を含むポティウイルスに対して耐性のカボチャ果実を得る方法。
【０１６６】
４０．ポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である遺伝的決定因子であって、前記遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）ゲノムから入手可能であり、ここで、
ａ）遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはＺＹＭＶおよびＰＲＳＶ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座ＺＮに遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて同定可能であり；ならびに／または
ｂ）遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）中に存在する対応する遺伝的決定因子の少なくとも１種に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはＭＷＭＶ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ｗ１および／またはＷ２に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出；
および／または配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて同定可能であり；ならびに／または
ｃ）遺伝的決定因子は、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはＺＹＭＶ耐性形質、より好ましくはＺＹＭＶ菌株Ｎｉｖｉｒ耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ｎｉ＋に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対（配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出）を用いるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲにおいて同定可能である。
【０１６７】
４１．好ましくはＺＹＭＶおよびＭＷＭＶの少なくとも１種といったポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも１種の遺伝的決定因子を含むカボチャ植物の同定方法であって、前記遺伝的決定因子はペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）のゲノムから入手可能であり、および、前記ポティウイルス耐性表現型の少なくとも１種を伴って同時分離する少なくとも１種のマーカ遺伝子座に遺伝的に連鎖し、および、
ｉ．マーカ遺伝子座がＺＮである場合、配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出、または；
ｉｉ．マーカ遺伝子座がＷ１である場合、配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出、または；
ｉｉｉ．マーカ遺伝子座がＷ２である場合、配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出、または；
ｉｖ．マーカ遺伝子座がＮｉ”である場合、配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出
を含む少なくとも一対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーによるＰＣＲにおいて同定可能である。
【０１６８】
４２．果実を形成し、および、前記果実を収穫するためにポティウイルス耐性カボチャ植物を育成するための前記実施形態のいずれか１つによるカボチャ植物由来のポティウイルス耐性繁殖体の使用。
【実施例】
【０１６９】
実施例１
カボチャにおいてＺＹＭＶおよびＭＷＭＶ耐性遺伝子に密接に連鎖するマーカの発見
１．１  材料
マーカを発見するために、ＺＹＭＶ−（Ｒ系統［ＰＰ４５２］×Ｓ系統［ＴＯＳＣＡ］）およびＭＷＭＶ（Ｓ系統［ＰＰ４７７］×Ｒ系統［ＰＰ４７７／（ＰＰ４１５／（ＰＰ４１９／（Ｎｉｇｅｒｉａ／ＰＰ４３２）］）耐性遺伝子についてニホンカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ  ｃｖ  Ｎｉｇｅｒｉａ）から分離するＦ２個体群を作成し、サンプルとし；ならびに、それぞれＺＹＭＶおよびＭＷＭＶ耐性に係るこれらの対応するＦ３後代表現型を作成し、サンプルとした。
【０１７０】
構築したアッセイの予想される値を、９６のカボチャ系統ならびに異なるタイプおよび市場区分に対応する品種群からなる多様な検証パネルを遺伝子型同定することにより評価した。
【０１７１】
１．２  マーカ発見
ランダム増幅型多型体ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）マーカを用いる集団分離分析（Ｂｕｌｋｅｄ  Ｓｅｇｒｅｇａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＢＳＡ）（Ｏｐｅｒｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｌａｍｅｄａ，Ｃａｌｉｆ．；および、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ製）；を対向する耐性および感受性表現型を伴う異なるＦ２ＤＮＡプールで実施した。ＢＳＡスクリーニングから示された候補マーカ（Ｆ２ＲおよびＳバルク間で明らかな存在／不在パターンを示すＲＡＰＤバンド）をＦ２固体群の個体構成種において連鎖についてさらに試験し；最も密接に連鎖したマーカをさらに特異的なアッセイの構築のために選抜した。
【０１７２】
ＺＹＭＶに関しては、Ｆ２固体群においてＺＹＭＶ耐性表現型を伴う完全な相関（同時分離）を示す単一のＲＡＰＤマーカであるＯＰＢＢ０９＿４５１を、Ｔａｑｍａｎ  Ｅｎｄ  Ｐｏｉｎｔ  Ｒｅａｄｉｎｇ（ＥＰＲ）アッセイ構築様に選抜した。
【０１７３】
ＭＷＭＶに関しては、ＭＷＭＶ耐性表現型と相関するＲＡＰＤマーカを２つの異なる遺伝子座（ＱＴＬ）においてマッピングし、それぞれＱＴＬ１およびＱＴＬ２に対して最も高い関連性（連鎖）を示す最良のマーカＯＰＡＲ１３＿５０７およびＵＢＣ３８５＿６５６を選抜した。
【０１７４】
Ｎｉ＋に関しては、ＢＳＡを２つのバルクを再配列決定することにより実施した。得られた解読結果をカボチャの参照配列とアラインして、ＳＮＰを検出した。次いで、最も密接に連鎖するＳＮＰを、さらに特異的なＴａｑｍａｎ  ＥＰＲアッセイの構築のために選抜した。
【０１７５】
１．３  Ｔａｑｍａｎ  ＥＰＲアッセイ構築
すべての植物ＤＮＡを酢酸カリウム＋プロテイナーゼＫプロトコルに準拠して単離した。対立遺伝子配列決定のために、３つ以下の異なるＰＣＲプライマーの組み合わせを選抜したＲＡＰＤ候補断片の５’および３’端部で設計した。これらのマーカのＰＣＲ生成物およびＤＮＡ配列を耐性および感受性系統のパネルからの系統を用いて得た。
【０１７６】
Ｔａｑｍａｎ  ＥＰＲアッセイ構築は、配列パネルの発見した対立遺伝子に特異的なＳＮＰに基づいていた。ＥＰＲアッセイ構築を、異なるＰＣＲ混合物、ＤＮＡ濃度およびアニーリング温度の試験を含む標準的なガイドラインに従って実施した。プローブは、ＦＡＭ−およびＶＩＣ  ＭＧＢ  Ｔａｑｍａｎプローブ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）である。
【０１７７】
１．４  Ｔａｑｍａｎ  ＥＰＲアッセイプロトコル
１．  標準的なＤＮＡ抽出酢酸カリウム＋プロテイナーゼＫプロトコルでＤＮＡゲノムを単離。最終的に、１５０μｌのＤＮＡ溶液を得た。
【０１７８】
２．  鋳型ＤＮＡの１／１５への希釈。
【０１７９】
３．  ４μｌの希釈ＤＮＡサンプルの各々を個々の３８４ＰＣＲプレートウェルにピペットで移す。
【０１８０】
４．プレートに覆いを掛けて遠心分離し、氷の上に置く。
【０１８１】
５．  マスターミックスの形成。以下は反応当たりである。
【０１８２】
【表１】
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【０１８３】
６．  ６μｌのマスターミックスを各ＰＣＲプレートウェルに添加（既に入っている４μｌ鋳型ＤＮＡと共に）
【０１８４】
７．簡単に遠心沈殿する。
【０１８５】
８．  ３８４プレートをＰＣＲマシーンに装填
【０１８６】
９．  ＡＢＩ  ＧＥＮＥＡＭＰ  ＰＣＲ  ９７００−３８４プレートフォーマットでのＰＣＲプログラムは以下のとおりである。
２分間  ９４℃
１５秒間  ９４℃
１分間  ６０℃
４０×
５分間  ７２℃
【０１８７】
１０．  プレートをＡＢ１７９００で読み取る。
【０１８８】
１．５  ＥＰＲアッセイプライマーおよびプローブ配列
１．５．１．  ＺＹＭＶ−Ｎｉｇｅｒｉａ
順方向プライマー：５’ＡＧＧＴＴＴＣＡＴＧＧＧＣＴＴＴＴＡＡＴＧＧ３’（配列番号１）
逆方向プライマー：５’ＣＧＴＧＡＧＣＣＴＡＡＡＡＣＧＧＴＴＡＡＴＧ３’（配列番号２）
耐性対立遺伝子特異的プローブ：ＦＡＭ−ＣＡＣＴＴＣＣＣＡＧＣＣＣＡＡＡＴ−ＭＧＢ−ＮＦＱ（配列番号７）
感受性対立遺伝子特異的プローブ：ＶＩＣ−ＣＡＣＴＴＴＣＣＡＧＣＣＣＡＡＡＴ−ＭＧＢ−ＮＦＱ（配列番号８）
Ｎｉ＋
順方向プライマー：５’ＴＴＧＣＡＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＡＴＧＧＧＴ３’（配列番号１３）
逆方向プライマー：５’ＧＧＣＡＡＣＣＴＣＴＧＴＣＣＡＡＴＴＴＣＴＴＴＣ３’（配列番号１４）
耐性対立遺伝子特異的プローブ：ＦＡＭ−ＡＧＴＴＧＣＧＡＣＴＴＴＣＣＡ−ＭＧＢ−ＮＦＱ（配列番号１５）
感受性対立遺伝子特異的プローブ：ＴＥＴ−ＡＧＴＴＧＣＧＡＣＴＴＴＴＣＡＴＴ−ＭＧＢ−ＮＦＱ（配列番号１６）
【０１８９】
１．５．２．  ＭＷＭＶ−Ｎｉｇｅｒｉａ
１．５．２．１  ＱＴＬ１
順方向プライマー：５’ＧＧＧＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＧＴＣＴＡＧＡＡＡＧ３’（配列番号３）
逆方向プライマー：５’ＧＴＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＴＧＴＧＣＡＴＣＴＧＴ３’（配列番号４）
耐性対立遺伝子特異的プローブ：ＦＡＭ−ＴＣＡＴＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＡＴＧ−ＭＧＢ−ＮＦＱ（配列番号９）
感受性対立遺伝子特異的プローブ：ＶＩＣ−ＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＣＡＡＣＡＴＧＧ−ＭＧＢ−ＮＦＱ（配列番号１０）
１．５．２．１  ＱＴＬ２
順方向プライマー：５’ＴＴＧＴＧＴＴＴＡＴＡＴＧＴＡＴＧＴＧＴＧＣＧＡＧ３’（配列番号５）
逆方向プライマー：５’ＴＴＴＣＴＡＧＡＴＣＴＣＡＧＴＧＴＡＡＧＡＧＡＡＣＡＣＡ３’（配列番号６）
耐性対立遺伝子特異的プローブ：ＦＡＭ−ＴＴＴＧＴＴＴＧＣＴＴＧＡＧＣＴＧＧ−ＭＧＢ−ＮＦＱ（配列番号１１）
感受性対立遺伝子特異的プローブ：ＶＩＣ−ＴＴＴＧＴＴＣＧＡＴＴＧＡＧＣＴＧＧ−ＭＧＢ−ＮＦＱ（配列番号１２）
【０１９０】
実施例２
病害試験プロトコル
２．１  プロトコルの使用
以下のプロトコルは、カボチャならびにカボチャ属の一種（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｓｐ．）およびキュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  ｓｐ．）におけるすべてのウイルス（ＣＭＶ、ＺＹＭＶ、ＷＭＶ、ＭＷＭＶ）について適用可能である。
【０１９１】
２．２  菌株の保存
新鮮な感染させた葉（１ｇ）を計量した。次いで、葉を小刀で細かく切り、紙製の計量トレイ上に置いた。この計量トレイを無水物カルシウムクロリドを含有するペトリ皿（５５ｍｍ）上に置いた。箱をパラフィルムでシールした。菌株の名前、保存日および調製した新たな葉の重量を箱に記し、箱の数を記録した。ペトリ皿は冷蔵庫の「野菜」用の引き出しの中で保持した。
【０１９２】
２．３  無水調製物からのウイルスの増殖
感受性品種群の１つ以上のテリーヌ（ｔｅｒｒｉｎｅ）を播種した。接種は、植物が「子葉」段階にある時に、無水調製物（以下の試験体の接種を参照のこと）から行った。１週間〜１０日後、最初の症状が見られることとなり、ウイルスが最も活動的な段階である。
【０１９３】
２．４  種菌の調製
感染した若い葉をテリーヌから摘み取った。１グラムの葉に対して、０．１グラムのコールおよび４ｃｃの緩衝剤溶液を調製した。コールおよび最後に緩衝剤溶液を添加する前に、葉を粉砕した。カーボランダムをミックスにまいた。１グラムの新鮮な葉に、２〜３テリーヌを接種可能であった（１テリーヌ＝８０〜１００植物）。
【０１９４】
２．５  試験体の接種
接種材料を氷床上においた。植物に子葉段階で接種した。子葉に接種材料をこすりつけ、必要に応じて毎回溶液を新しくした。１５分間乾燥させた後、次いで、植物に水をやった。最初の解読は接種の５〜６日後に行った。次いで、２回目の解読は、情報を確認し完全なものとするために７〜１０日後に行うことが可能であった。試験を終了するために、葉をプラスチックバッグ中に密閉し、生物学用廃棄物に入れた。試験を行うための最良の温度条件は日中は２５℃±２℃および夜間は２０℃±２℃である。
【０１９５】
２．６  クロノジー
０〜８日目  増殖のテリーヌの播種
０〜２日目  テリーヌの接種
０日目    試験体の播種
０＋６日目  試験体の接種
０＋１４日目  解読開始
０＋３０日目  試験終了
【０１９６】
実施例３
ペポカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｐｅｐｏ）におけるポティウイルス病理学試験用のガイドライン
３．１  評価ガイドライン
以下のガイドラインを用いて、葉および果実におけるＺＹＭＶ、ＷＭＶ、ＰＲＳＶ、ＭＷＭＶ感染症の程度を判定した。解読、評価および格付けを第３葉展開期から成植物期（植物学的に熟した果実を伴う）までの作物にわたって行った。
【０１９７】
格付けは以下のガイドラインに従って１〜９のスケールで行い、その例が図１〜９に示されている。
【０１９８】
【表２】
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【０１９９】
【表３】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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