(57)【要約】本発明は、サブドミナント抗原に対するT細胞応答を生じさせ、次いで、該細胞を用いて、細胞の恒常性および免疫応答の性質を治療的に変化させることに関する。好ましい実施態様において、該細胞を患者の体外で産生し、患者の免疫学的環境の影響を回避する。1種または複数種のサブドミナント抗原に対し、組織培養において患者由来のT細胞を刺激しかつ増殖させ、それを患者に移植することによって、十分な細胞が増殖しかつ移植されたならば、この移植された細胞は該応答において内因性のドミナントT細胞を圧倒して、免疫寛容を破綻させるかまたは誘導し、あるいはそうでなければ、その抗原を発現する細胞または生物に対する免疫応答を改変する。免疫記憶細胞が樹立されると、次いでそれらはこの新しい免疫優勢ヒエラルキーを反映し、所望の治療効果を長く継続させる。事実、サブドミナント抗原に対して反応性である外因的に産生されたT細胞を移植すると、抗原刺激が繰り返されて患者の免疫応答のバランスを再調整し、細胞または生物において前述のサブドミナント抗原を標的化し、治療上の利点を生じさせる。2014516538.tif 000008
2014516538.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の免疫優勢ヒエラルキーを変える方法で使用するための、患者においてサブドミナント抗原またはエピトープを認識することができるT細胞。
【請求項２】
T細胞が、
(a)患者から得られた試料中の少なくとも一つのサブドミナント抗原またはエピトープを同定すること、および
(b)該サブドミナント抗原またはエピトープを認識することができるT細胞を培養すること
によって得られる、請求項1記載の使用のためのT細胞。
【請求項３】
免疫優勢ヒエラルキーを変えることが、患者における感染症、ガン、炎症、臓器移植片拒絶、または移植片対宿主病を処置/予防/軽減する、請求項1または2記載の使用のためのT細胞。
【請求項４】
患者の免疫優勢ヒエラルキーを変えるための医薬の製造における、患者においてサブドミナント抗原またはエピトープを認識することができるT細胞の使用。
【請求項５】
T細胞が、
(a)患者から得られた試料中の少なくとも一つのサブドミナント抗原またはエピトープを同定すること、および
(b)該サブドミナント抗原またはエピトープを認識することができるT細胞を培養すること
によって得られる、請求項4記載の使用。
【請求項６】
免疫優勢ヒエラルキーを変えることが、患者における感染症、ガン、炎症、臓器移植片拒絶、または移植片宿主病を処置/予防/軽減する、請求項4または5記載の使用。
【請求項７】
患者から得られた試料中の少なくとも一つのサブドミナント抗原またはエピトープを同定すること、および
該サブドミナント抗原またはエピトープを認識することができるT細胞集団を培養すること
によって得ることができる、患者の免疫優勢ヒエラルキーを変える際に使用するためのT細胞集団。
【請求項８】
治療で使用するための、請求項7記載のT細胞集団。
【請求項９】
(a)患者試料中のドミナント抗原またはエピトープ、およびサブドミナント抗原またはエピトープを同定する段階；
(b)該サブドミナント抗原またはエピトープを認識することができるT細胞を培養する段階；および
(c)患者の免疫優勢ヒエラルキーを変えるために、有効数の該T細胞で該患者を処置する段階
を含む方法。
【請求項１０】
(a)患者試料中の少なくとも一つのサブドミナント抗原またはエピトープを同定する段階；
(b)該サブドミナント抗原またはエピトープを認識することができるT細胞を培養する段階；および
(c)患者の免疫優勢ヒエラルキーを変えるために、有効数の該T細胞で該患者を処置する段階
を含む方法。
【請求項１１】
サブドミナント抗原またはエピトープが、それに対して細胞性または液性免疫応答が検出不可能であるかまたは低いレベルでのみ検出可能な抗原またはエピトープである、請求項9または10記載の方法。
【請求項１２】
サブドミナント抗原が、ウイルス抗原、他の感染性因子抗原、腫瘍抗原、または自己免疫、アレルギー、炎症、臓器移植片拒絶、または移植片対宿主病に関連する抗原である、請求項9または10記載の方法。
【請求項１３】
段階（b）が、ドミナント抗原またはエピトープの非存在下でT細胞を培養する段階をさらに含む、請求項9または10記載の方法。
【請求項１４】
段階（b）が、抑制性T細胞または応答性T細胞のいずれかを増加させるための剤の存在下または非存在下でT細胞を培養する段階をさらに含む、請求項9または10記載の方法。
【請求項１５】
段階（c）が、皮内投与を介して有効数のT細胞を投与する段階をさらに含む、請求項9または10記載の方法。
【請求項１６】
段階（c）の前に、内因性T細胞の数を低下させるために患者を前処理剤で前処置する段階をさらに含む、請求項9または10記載の方法。
【請求項１７】
T細胞が抑制性T細胞であり、かつ段階（c）が、自己免疫疾患、アレルギー、炎症、臓器移植片拒絶、または移植片対宿主病を処置または予防するために、患者において寛容を誘導する段階をさらに含む、請求項9または10記載の方法。
【請求項１８】
T細胞が応答性T細胞であり、かつ段階（c）が、感染症またはガンを処置または予防するために、細胞傷害性免疫応答を誘導する段階をさらに含む、請求項9または10記載の方法。
【請求項１９】
治療が患者の免疫応答のバランスをうまく再調整しているかを決定するために、寛容、またはサブドミナント抗原もしくはエピトープに対する液性または細胞性免疫応答のプロファイルを得る段階をさらに含む、請求項9または10記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その内容が、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、2011年5月26日に出願された米国仮出願第61/490,505号に関連する。
【０００２】
本発明は、細胞恒常性の治療的操作による免疫優勢（immunodominance）ヒエラルキーの改変に基づく、ガン、慢性感染症、自己免疫疾患、および移植のための新規な治療剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ガンの臨床的管理は起源の各部位に特異的であって、ほとんどは、疾患の段階（すなわち、どの程度まで腫瘍が局所的に浸入したか、または転移によって他の臓器に広がったか）に依存する。手術および/または局所の放射線療法は、一般には、化学療法、モノクローナル抗体もしくはサイトカイン療法、または転移性疾患に対する処置である全身照射に処された原発腫瘍に対する最適な処置である。最近、最初の樹状細胞療法であるプロベンジ（Provenge）が、4ヵ月分の進展という利点を示して、前立腺ガンについて認可された。診断は依然として、生検の組織学的分析に基づく。分子マーカーは、もしそれらが薬物（例えば、ハーセプチン）の選択において助けになるならば、基準となることもある。しかしながら、免疫応答のプロファイルを作ることが通常の臨床の場で行われることはない。
【０００４】
T細胞が一次免疫応答の間に抗原と遭遇する環境は、これに続くリコール応答の性質を決定する。最初の認識事象およびその一次細胞の周囲のミクロ環境によって、多くの結果がもたらされ得る。抗原がそれ専門ではないAPCによって提示されるならば、エピトープのサブセットのみがプロセシングの間に放出されるであろう。CD28またはTNFのような同時刺激シグナルが欠けていれば、T細胞は免疫不応性になるであろう。ミクロ環境に依存して、T細胞は制御性T細胞、（CD8＋CTLエフェクターの増殖とともに、より多くの細胞性免疫応答を推進する）Th1サイトカインを分泌するTヘルパー細胞、または（B細胞の増殖と成熟、および抗体産生とともに、より多くの液性免疫応答を推進する）Th2サイトカインを分泌するTヘルパー細胞に分化するであろう。加えて、環境における抗原またはある種の抗原類のある種のエピトープに応答するT細胞が、環境中の他のエピトープまたは抗原と反応性である集団中のT細胞に代わって増殖するように、免疫応答が進展するであろう。指数関数的に細胞が増殖するため、一次免疫応答が鎮静化するにつれ、これらのT細胞の比率はさらに顕著となり、かつ二次刺激に際して、その個体内での免疫応答は、可能なエピトープの小さなサブセットに焦点が当てられるような記憶の形態で貯蔵される。有効なモデルとして働いている多数のメカニズムがあるが、集団で優位を占めるように増殖するT細胞は、免疫応答を支配するようになるエピトープまたは抗原に応答する細胞である。一次免疫応答において、それらは、サブドミナントエピトープに応答するT細胞に代わって増殖しており、記憶されているが故に、引き続いて起こる免疫応答を支配する。
【０００５】
個人の免疫システムが最初に抗原と遭遇した後、数日間にわたって、限定された数のドミナントエピトープに応答するT細胞のドミナント集団が生じ、これらのT細胞がその後、その抗原に対する応答の性質を決定する。関連する細胞には多数のタイプがあるものの、本発明に関連するワーキングモデルは、ドミナント抗原上のドミナントエピトープに応答するT細胞が応答性T細胞（例えば、CD4＋：TH1、TH2、Treg、T濾胞性ヘルパー、TH17、TH22、TH9；CD8＋CTL）として成長するならば、細胞性または液性免疫応答がもたらされるというものである。しかしながら、ドミナント集団中のT細胞が抑制性T細胞（例えば、Treg、TH17、免疫不応性T細胞）であるならば、寛容が誘導される。サブドミナント抗原に応答するT細胞は、ドミナント抗原に応答するT細胞のクローン集団によって圧倒される。
【０００６】
ガンの場合には、慢性または潜伏感染、局所的な抗原のプロセシング/提示、および同時刺激の環境がドミナント抗原に対する一次免疫応答にインパクトを与え、腫瘍または感染因子におけるドミナント抗原に対するT細胞応答は、強力なエフェクター応答よりはむしろ寛容または無効な応答に向かって平衡化される。抗原のプロセシングと同時刺激（CD28およびサイトカイン）には差があるため、樹状細胞（DC）が優勢な抗原提示細胞（APC）である身体表面とは異なって、DCが一般的な抗原提示細胞ではない臓器において、これは顕著になり得るであろう。また、腫瘍および感染因子が、強い一次免疫応答に対して最適ではない免疫抑制環境を作り出すこともよく知られている。あるいは、ドミナント抗原によって自身に反応する細胞がもたらされるならば、寛容は破綻し、その後自己免疫が起こる。このような寛容は、応答に導く慢性または潜伏ウイルスの存在によって破綻し得る（たとえ弱いサブドミナント抗原であっても慢性的ならば）。ウイルスと自己免疫には多くの関連がある。当該部位における炎症は他の抗原の放出を導き、一方ウイルス抗原は、臓器に対して応答性であるT細胞を助けて自己免疫を引き起こす。ドミナンスヒエラルキーが一次応答で確立され、記憶によって強化されると、患者における免疫系は、抗原が存在する毎に同じ応答を効果的に再現すると考えられる。
【０００７】
ドミナントエピトープに対する進行中の免疫応答は、サブドミナントエピトープに対する応答を減少させることができる（Wolpert EZ 1998, Kedl RM 2003）。優勢（dominance）/やや優勢（subdominance）なヒエラルキーは幾分流動的であり得る。例えば、ドミナントエピトープに対するT細胞の応答を欠如させるかまたは抑制することによって、サブドミナントエピトープに対して以前は検出不可能であった応答の出現を導くことができる（Van der Most RG et al. 1997, Andreansky SS et al. 2005）。同様に、エピトープ中のドミナント配列の除去は、抗原に対する応答を排除せず、むしろ、以前にサブドミナントであったエピトープに対してより強力に応答する宿主をもたらす（Allan JEおよびDoherty PC 1985, Mylin LM et al. 2000）。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、細胞恒常性の治療的操作による免疫優勢ヒエラルキーの改変に基づく、ガン、慢性感染、自己免疫疾患、および移植のための新規な治療剤に関する。
【０００９】
とりわけ、ガン、慢性および潜伏感染、自己免疫および移植において有意な治療上の恩恵を提供するための、抗原に対する免疫応答のバランスを再調整する新規なアプローチが開示される。制御されたミクロ環境においてサブドミナントエピトープおよびサブドミナント抗原に対する免疫応答を生じさせることによって、本発明は、基本的には、治療上の恩恵を提供するものに関して、疾患に対する免疫応答の性質を変化させる。本発明は、抗原に対して以前の免疫応答が起こる前または後に、あるいは進行中の免疫応答があったとしても、免疫応答のバランスを変化させ得る。
【００１０】
本発明は、患者試料中のドミナント抗原またはエピトープ、およびサブドミナント抗原またはエピトープを同定する段階、該サブドミナント抗原またはエピトープを認識することができるT細胞を培養する段階、および患者の免疫優勢ヒエラルキーを変えるために患者を有効数のT細胞で処置する段階を含む方法を特徴とする。
【００１１】
本発明はまた、患者試料中の少なくとも一つのサブドミナント抗原またはエピトープを同定する段階、該サブドミナント抗原またはエピトープを認識することができるT細胞を培養する段階、および治療上の恩恵を供するために患者を有効数のこれらのT細胞で処置する段階を含む、患者の免疫優勢ヒエラルキーを変えるための方法を特徴とする。
【００１２】
ある局面において、本発明は、ドミナント抗原またはエピトープの非存在下でT細胞を培養する段階をさらに含む。他の局面において、本発明は、抑制性T細胞または応答性T細胞を増加させる剤の存在または非存在下でT細胞を培養する段階をさらに含む。そのような剤は、限定されるものではないが、成長因子、ホルモン、または他の免疫細胞を含むことができる。
【００１３】
ある局面において、本発明は、皮内投与を介して有効数のT細胞を投与する段階をさらに含む。
【００１４】
他の局面において、本発明は、培養された前記T細胞での患者の処置に先立って内因性のT細胞の数を減少させるために、前処置剤で患者を前処置する段階をさらに含む。該前処置剤は、限定されるものではないが、化学療法剤であり得る。
【００１５】
ある局面において、T細胞は患者からエクスビボで供される。
【００１６】
サブドミナント抗原またはサブドミナントエピトープは、例えば、それに対して細胞性または液性免疫応答が検出不可能であるか、または低いレベルでのみ検出可能である、抗原またはエピトープである。あるいは、サブドミナント抗原またはサブドミナントエピトープは、ドミナント抗原またはドミナントエピトープのよりも弱い寛容または免疫応答を惹起する抗原またはエピトープである。サブドミナント抗原は、例えば、ウイルス抗原、真菌抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、プリオン抗原、腫瘍抗原、または自己免疫、アレルギー、炎症、臓器移植片拒絶、移植片対宿主病に関連する抗原である。ウイルス抗原は、例えば、慢性または潜伏ウイルス抗原である。ウイルス抗原はEBV、HPV、HSV、VZV、B型肝炎、C型肝炎、HIV、HTLV、CMV、RSV、またはインフルエンザ由来のものである。腫瘍抗原は、例えば、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原、またはガン幹細胞または転移に関連する抗原である。
【００１７】
本発明はまた、患者試料中のドミナント抗原またはエピトープおよび/またはサブドミナント抗原またはエピトープを同定するための方法であって、
該サブドミナント抗原またはエピトープを認識することができるT細胞を培養する段階であって、該T細胞が抑制性T細胞である、段階、および
患者の免疫優勢ヒエラルキーを変えるために、該患者を有効数の該T細胞で処置し、それによって自己免疫疾患、アレルギー、炎症、臓器移植片拒絶、または移植片対宿主病の治療または予防のために該患者における寛容を誘導する段階
を含む方法を特徴とする。
【００１８】
本発明はまた、患者試料中のドミナント抗原またはエピトープおよび/またはサブドミナント抗原またはエピトープを同定するための方法であって
該サブドミナント抗原またはエピトープを認識することができるT細胞を培養する段階であって、該T細胞が応答性T細胞である、段階、および
患者の免疫優勢ヒエラルキーを変えるために、該患者を有効数の該T細胞で処置し、それによって感染症またはガンの治療または予防のために該患者における細胞傷害性免疫応答を誘導する段階
を含む方法を特徴とする。該感染症は、例えば、細菌、ウイルス、寄生虫、またはプリオンの感染症である。
【００１９】
本発明の方法のいずれかにおいて、疾患、感染症、ガン、または医学的状態の治療または予防は、疾患、感染症、ガン、または医学的状態の少なくとも一つの兆候の軽減または緩和を含む。治療上の恩恵には、疾患、感染症、ガン、または医学的状態の少なくとも一つの兆候のいずれかの軽減、緩和、改善、予防、または治療が含まれる。
【００２０】
ある局面において、患者試料は血液試料である。
【００２１】
本発明はまた、治療によって免疫応答のバランスがうまく再調整されているかを決定するために、サブドミナント抗原またはエピトープに対する応答における寛容または液性もしくは細胞性免疫応答についてアッセイすることによって、患者のプロファイルを再度得る段階をさらに含む方法を特徴とする。
【００２２】
特に断りのない限り、本明細書中で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野における当業者によって通常理解されるのと同一の意味を有する。本明細書中に記載されたのと同様なまたは同等な方法および材料を本発明の実施で用いることができるが、適当な方法および材料は後に記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の文献は、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み入れられる。コンフリクトする場合には、定義を含めた本明細書が支配する。加えて、本明細書中に記載された材料、方法および例は説明的なものに過ぎず、限定的であることを意図しない。
【００２３】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載および特許請求の範囲から明らかであり、それらに包含される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図1A、図1Bおよび図1Cは51Cr放出アッセイの結果を示す。
【図２】51Cr放出アッセイの結果を示す。
【図３Ａ】図3Aは、51Cr放出アッセイの結果を示す。
【図３Ｂ】図3Bは、51Cr放出アッセイの結果を示す。
【図３Ｃ】図3Cは、生存可能なAPCの割合を示す。
【図４】Elispotによって測定されたIFNγ産生細胞を示す。
【図５】51Cr放出アッセイの結果を示す。
【図６】51Cr放出アッセイの結果を示す。
【図７】51Cr放出アッセイの結果を示す。
【図８】51Cr放出アッセイの結果を示す。
【図９】慢性B型肝炎のマウスモデルを示す。
【図１０】マウスモデルの処理を示す。
【図１１】HBsおよびHBcに対するT細胞応答を示す。
【図１２】投与の方法による応答を示す。
【図１３】投与の方法による応答を示す。
【図１４】抗原のヒエラルキーを示す。
【図１５】ICSによる応答を示す。
【図１６】抗原のヒエラルキーを示す。
【図１７】急性のフレアに続く免疫応答、次いで肝炎の排除を示す。
【図１８】排除後の抗原のヒエラルキーを示す。
【図１９】T細胞が患者の肝細胞癌腫を完全に消散させたことを示す（処理前-左側; 治療の8週間後-右側）。
【図２０】患者の腫瘍中に存在する抗原を示す。
【図２１】NY-ESO-1抗原に応答する細胞を示す。
【図２２】本発明による治療後に存在する抗原を示す。
【図２３】免疫優勢ヒエラルキーのバランスが再調整されたことを示す。
【図２４】本発明によるT細胞療法の前および後のCTスキャンである。
【図２５】処理後の、進行なしでの生存を示す。
【図２６】本発明による治療およびリツキサン＋CHOPの比較を示す。
【図２７】動物に投与されたT細胞の特徴を示す。
【図２８】試験マウスについての臨床病スコアを示す。
【図２９】試験マウスにおける関節炎の発生率を示す。
【図３０】図30A、図30Bおよび図30Cは、正常なラット、ヒトのプロテオグリカンで免疫化されたラット、およびT細胞で処理されたラットの組織病理学を示す。
【図３１】本発明の治療で用いられるバイオリアクターの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
詳細な説明
A．定義
「抗体」という用語は、その最も広い意味で用いられ、具体的には、ヒト、非ヒト（たとえば、マウス）、およびヒト化モノクローナル抗体（完全長のモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（たとえば、二重特異的抗体）およびそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片をその範囲に含む。
【００２６】
「抗原」という用語は、動物に注射または吸収される組成物を含む、動物において抗体の産生またはT細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、または物質を意味する。抗原は、異種免疫原によって誘導される産物を含む特異的な液性または細胞性免疫の産物と反応する。「抗原」という用語は、関連する全ての抗原性エピトープを含む。
【００２７】
「抗原提示細胞」または「APC」は、T細胞に抗原を提示するために用いられる免疫系の細胞である。APCは、樹状細胞、単球、マクロファージ、辺縁帯クッパー細胞、ミクログリア、ランゲルハンス細胞、T細胞、およびB細胞を含む（たとえば、Rodriguez-Pinto and Moreno (2005) Eur. J. Immunol. 35: 1097-1105を参照されたい）。
【００２８】
「自己免疫」、「自己免疫疾患」、「自己免疫状態」または「自己免疫障害」は、発現される自己免疫レパートリーの定性的および／または定量的欠損によって示される、変化した免疫恒常性に関連する一連の持続的な臓器特異的または全身性の臨床症状および徴候を意味する。自己免疫疾患の病理は、自己免疫応答によって誘導される構造的または機能的損傷のいずれかの結果として示される。自己免疫疾患は、自己抗原上のエピトープに対する液性免疫応答（たとえば、抗体媒介）、細胞性免疫応答（たとえば、細胞障害性Tリンパ球媒介）、または両方のタイプの免疫応答の組み合わせを特徴とする。罹患した個体の免疫系は、それらの特異的自己抗原を提示する細胞および組織にねらいを定めて炎症カスケードを活性化する。攻撃された抗原、組織、細胞タイプ、または臓器の破壊が、疾患の症状を生じさせる。
【００２９】
「ガン」という用語は、制御されない細胞増殖を特徴とする疾患または障害を意味する。ガンの例には、癌腫、リンパ腫、芽腫および肉腫が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。特異的ガンの例には、肺ガン、結腸ガン、乳ガン、精巣ガン、胃ガン、膵臓ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、結腸直腸ガン、および前立腺ガンが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。当技術分野において公知のさらなるガンも同様に企図される。
【００３０】
「ドミナント抗原」または「ドミナントエピトープ」は、その抗原またはエピトープに対して特異的なT細胞が、応答するT細胞の総数の約70％超の量で存在することを特徴としうる、強い寛容または免疫応答を誘発する抗原またはエピトープを意味する。
【００３１】
「エピトープ」という用語は、特定の免疫グロブリンによる認識に関係する一連のアミノ酸残基を意味し、つまりT細胞において、これらの残基はT細胞受容体タンパク質および／または主要組織適合抗原複合体（MHC）受容体による認識にとって必要である。インビトロまたはインビボでの免疫系において、エピトープは、免疫グロブリン、T細胞受容体、またはHLA分子によって認識される部位を共に形成する分子、例えば一次、二次、および三次ペプチド構造などと電荷との集合的な特徴である。
【００３２】
「肝炎」は、肝臓の炎症によって定義される医学的状態を意味する。
【００３３】
「ヒト白血球抗原」または「HLA」は、ヒトクラスIまたはクラスII主要組織適合抗原複合体（MHC）タンパク質である（たとえば、Stites, et al., IMMUNOLOGY, 8TH ED., Lange Publishing, Los Altos, Calif. (1994)を参照されたい）。
【００３４】
「免疫応答」は、刺激に対するB細胞、T細胞、または単球などの免疫系の細胞の応答を意味する。1つの態様において、応答は、特定の抗原に対して特異的である（「抗原特異的応答」）。1つの態様において、免疫応答は、CD4+応答またはCD8+応答などのT細胞応答である。別の態様において、応答はB細胞応答であり、それによって特異的抗体が産生される。
【００３５】
免疫優勢とは、抗原において可能性があるエピトープ（抗原断片）が多数あるにもかかわらず、免疫系がその応答を限られた数のエピトープに集中させて、再現可能なヒエラルキーとして順列付けされうることである（Sercarz et al. 1993)。免疫優勢は、人工抗原、インフルエンザおよびワクシニアを含むヒトウイルス、ならびに細胞内細菌に対する免疫応答の場合にも当てはまる（Chen WS 1994, Belze GT et al. 2000, Chen W 2000, Tscharke DC 2005）。免疫優勢の最終的な結論は、MHC結合親和性、適切なMHC結合ペプチドを生成するための細胞でのプロセシング効率、MHC結合ペプチドとMHCとの複合体を認識するためのTCRの利用可能性、その後の細胞の免疫調節機構（Yewdell JW 2006, Sette A et al. 2009）を含む多数の段階によって決定される。
【００３６】
「リンパ球」は、体の免疫防御に関係する、あるタイプの白血球細胞を意味する。リンパ球には主に2つのタイプ、すなわちB細胞とT細胞が存在する。
【００３７】
「主要組織適合抗原複合体」または「MHC」は、ヒト白血球抗原（「HLA」）を含む、異なる種において記述される組織適合抗原系を包含することを意味する一般的名称である。
【００３８】
「サブドミナント抗原」または「サブドミナントエピトープ」は、ドミナント抗原またはドミナントエピトープよりも弱い寛容または免疫応答を誘発する抗原またはエピトープを意味する。
【００３９】
「処置」という用語は、患者によって示されるまたは患者において予防されるべき疾患、障害、もしくは生理的状態に反応して行われる臨床的介入を意味する。処置の目的は、症状の軽減および／または予防、ならびに疾患、障害、または状態の進行の遅延、停止、または逆転を含む。「処置」は、治療的処置および予防的（prophylactic）または予防的(preventive)手段の両方を意味する。処置を必要とする人は、疾患または障害または望ましくない生理的状態に既に罹患している人、ならびに疾患または障害または望ましくない生理的状態が予防されるべき人を含む。
【００４０】
「腫瘍」は、悪性または良性であるかによらず、全ての新生物細胞の生育および増殖、ならびに全ての前ガン様およびガン様の細胞および組織を意味する。
【００４１】
「＿mer」という用語は、標的抗原に存在するアミノ酸＿個の直線的配列を意味する。
【００４２】
B．サブドミナントエピトープとドミナントエピトープを認識／区別するアッセイ
患者の腫瘍または感染症を、腫瘍に関連するウイルスまたは他の抗原のパネルの有無に関して最初にアッセイする。これは一般的に、腫瘍生検の免疫組織化学または血液悪性疾患の場合にはFACSによって行われる。患者の腫瘍または感染症を、腫瘍に関連するウイルスまたは他の抗原のパネルの有無に関してアッセイする。これは、一般的に腫瘍生検の免疫組織化学または血液悪性疾患の場合にはFACSによって行われる。患者の血液を採取して、存在する抗原に対する液性および細胞性免疫応答の両方に関して試験する。免疫応答が検出できないかまたは低レベルで検出可能である抗原を、インビトロでT細胞を増殖させるために積極的に選択する。これらのT細胞を増殖させた後、再注入した抗原に対する応答に関してT細胞を試験することができ、抗原に対する応答に関して、患者の血液をアッセイすることができる。このようにして、効果的に患者の免疫応答のバランスを再調整して、治療上の恩恵を提供することができる。好ましい態様において、液性免疫のアッセイは、ELISAアッセイを含むことができるがこれらに限定されるわけではない。好ましい態様において、細胞性免疫のアッセイは、インターフェロンγ（IFNγ）および腫瘍壊死因子α（TNFα）を含むがこれらに限定されるわけではないサイトカインに関する細胞内サイトカイン染色（ICS）を含むことができるがこれらに限定されるわけではない。応答するT細胞のサブセット（たとえば、CD8、CD4、Treg）もまた、このアッセイにおいてアッセイすることができる。または、細胞性免疫のアッセイは、IFNγまたはTNFαに関するELISPOTアッセイを含むことができるがこれらに限定されるわけではない。代わりの態様において、ElispotまたはICSは、IL-4、IL-12（TH2およびTH1）、IL-10（Treg）またはIL-21（濾胞性ヘルパーT細胞サブセット）をアッセイすることができる。なお別の態様において、細胞性免疫プロファイリングアッセイは、これらまたは他のサイトカインに関する細胞内染色（ICS）でありうる。試験される抗原は、完全長の抗原、エピトープが欠失した抗原、またはドミナントもしくはサブドミナントエピトープを有する抗原でありうる。エピトープの場合、バイオインフォマティクスソフトウェアを用いて、患者のMHCに結合するエピトープを予測することができ、次にこれらのエピトープをアッセイする。1つの態様において、このソフトウェアは、Net MHCpanまたはアッセイの章に記載されるコンセンサスエピトープイムノインフォマティクスソフトウェアである。エピトープに関して、HLAタイプがわかっている場合には、CTLを定量するための代替アッセイとして4量体結合を用いることができる。ペプチドを含む4量体を細胞と混合して、細胞を染色し、FACSを用いて各4量体を認識する細胞の割合（％）を決定する。これは、患者がHLA A2などの公知のHLAタイプである場合に有用である。しかし、好ましい方法は液性応答に関してELISAであり、または細胞性応答に関してはICSもしくはElispotである。好ましい態様において、CTLは末梢血から生成される。または、CTLは、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）または注射部位周囲のDTHから生成される。
【００４３】
DTH浸潤リンパ球は、皮膚の4 mm穿孔生検を採取して、10％FCS（CSL）を添加したRPMI培地1640中で細切することによって調製することができる。単細胞浮遊液を1μg/mlフィトヘマグルチニン（Sigma）によって刺激して、放射線照射自己PBMCと共に10 IU/ml のIL-2（Cetus）および10 ng/ml のIL-7（Peprotech, Rocky Hill, NJ）の存在下で同時培養した。培地を2〜3日毎に交換した。
【００４４】
液性免疫応答のプロファイリングに関して、患者の血清を1/100から1/100000まで連続して1：4倍希釈して、標準的なELISAにおいて精製組み換え型腫瘍抗原（一般的に大腸菌（E. coli）において作製される）と共に用いる。2から10000+の抗原をアッセイすることができる。各精製タンパク質1マイクログラムをマイクロウェルプレート（Nunc）に4℃で終夜吸収させる。プレートをPBSによって洗浄して、2％FCS/PBSによってブロックする。患者の血清を2％FCS/PBS中で希釈して2時間添加する。プレートを洗浄して、ヤギ抗ヒトIgG-AP（Southern Biotechnology Assoc）を添加する。プレートを洗浄して、Attophose基質（JBL Bioscientific）と共に25分間インキュベートした後、直ちに読み取る（CytoFluor 2350, Millipore）。読み出しはUV吸光度である。
【００４５】
細胞性応答のプロファイリングには2つの方法がある。第一の方法として、IFNγに関する酵素結合免疫吸着スポット（「ELISPOT」）アッセイを用いる。96ウェルポリフッ化ビニリデンバックプレート（Millipore, Bedford, MA）を、5〜15μg/mlの抗IFNγモノクローナル抗体1-DIK（MABTECH, Stockholm, Sweden）によって4℃で終夜コーティングした。ウェルを洗浄して、5％ヒトAB血清（Valeant Pharm）によってブロックした。ウェルあたりPBMC 5×106個（またはインビトロで増殖後にアッセイを行う場合にはCTL 5×105個）を、抗原の各々に関して2μMのペプチドミックスと共に添加する。37℃で5％CO2下で終夜（18時間）インキュベートする。細胞を捨てて、0.05％Tween 20を含むPBSによってウェルを洗浄する。1μg/mlビオチニル化抗IFNγモノクローナル抗体7-B6-1（MABTECH）と室温で2〜4時間インキュベートした後、ストレプトアビジンコンジュゲートアルカリホスファターゼ（MABTECHまたはSigma Aldrich）と共にさらに2時間インキュベートする。この後、アルカリホスファターゼ基質キット（Bio-Rad Richmond, CA）の5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェートおよびニトロブルーテトラゾリウムと、30分間の反応を行う。解剖顕微鏡（SZ CTV Olympus microscope）を用いてスポットを計数する。スポットはまた、AIDELISPOTリーダー（Autoimmun Diagnostika, Strassberg, Germany）においても計数することができる。各スポットは、PBMC 105個あたりのスポット形成細胞（SFC）として報告される細胞である。10μg/ml PHAを陽性対照として用いることができ、ペプチドを有しない細胞単独を陰性対照とすることができる。
【００４６】
第二の方法として、IFNγおよびTNFαに関する細胞内サイトカイン染色を用いる。PBMC 5×106個（またはインビトロ増殖後にアッセイ行う場合にはCTL 5×105個）を、1％FCSを含むPBS 100μl中で、試験されるエピトープまたは抗原の各々に関するペプチド（最終濃度10-5から10-9 M）と共に96ウェルプレートにおいて平板培養する。IL-2（150 U/MI）、50μMのβ-メルカプトエタノールおよびブレフェルジンA（1μg/ml）またはGolgi Plug（BD Biosciences, San Diego, CA）（後者の成分はいずれも応答細胞におけるIFNγまたはTNFαの蓄積を増加させるためである）の存在下で6時間インキュベートした後、細胞を沈降させて、1％FCSを有するPBS 200 mlで洗浄した後、表面抗原に関する染色（CD4フルオレセインイソチオシアネートおよびCD8アロフィコシアニン0.25μg/ml（Pharmingen, Becton Dickinson））によって4℃で30分間（または氷中で30分間）標識する。洗浄後、細胞をCytofix/Cytopermによって氷中で20分間透過性にした後、フィコエリスリンコンジュゲート抗IFNγ（0.4μg/ml）または抗TNFα抗体（0.8μg/ml）（Pharmingen, Becton Dickinson）によって染色する。次に細胞を洗浄して固定し、1％FCSを有するPBS中に浮遊させて、FACScanフローサイトメーターにおいて試験して、Cell Questソフトウェアを用いて分析する。または、FACS Canto（Becton Dickinson）を用いることができる。TH1またはTH2サブセットを測定するために、IL-12およびIL-4を含むがこれらに限定されるわけではない他のサイトカインをアッセイすることができる。T細胞のより広いアッセイを与えるためのサイトカインパネルは、IL-12、IFNγ、IL-4、IL-10およびIL-17を測定することができるであろう。濾胞性ヘルパーT細胞は、CD4+、CXCR5+、ICOS+細胞として測定することができる。B細胞は、CD19+およびB220+細胞として測定することができる。T細胞におけるIL-21は、B細胞活性化および抗体の親和性成熟に関連しているはずであり、そのためIL-21もまたこれを調べるために用いることができる。IFNγ、IL-4（BD Biosciences）、IL-12、IL-10、IL-17（R & D Systems）およびIL-21抗体（R & D Systems）のプロファイルを決定するための代替法として、ELISPOTを同様に用いることができる。ICSは実際に、異なる抗原またはエピトープに対応するCD8またはCD4 T細胞の％のプロファイルを決定する。Tregを含む他の細胞サブセットも同様に、分析することができる。チトクローム標識CD25モノクローナル抗体を、ほとんどのTregの表面マーカーとして用いることができる。またはBD Biosciencesのチトクローム標識ヒトFoxP3モノクローナル抗体クローン259D/C7を用いて、透過後の細胞を染色してTreg細胞の割合(%)およびその状態を測定する。IL-10も同様にアッセイすることができる。
【００４７】
NetMHCpanは、HLA-AおよびBに結合するペプチドを定量的に予測するためのバイオインフォマティクス法である（Nielsen M 2007）。コンセンサスエピトープ予測アプローチも同様に開発されている（Mouaftsi M 2006）。これらの方法を用いて、抗原に関して可能性があるMHC Iエピトープの全てをソーティングして、ペプチドの上位1％をランク付けすることによって、このようにエピトープを予測することができる。これらの予測エピトープを9〜10merのペプチドとして合成して、試験する（たとえば、患者のPBMCに対して、または関心対象のHLAタイプに関するトランスジェニックマウスにおいて）。
【００４８】
特異的MHC（たとえば、HLA A A2）を有する4量体を8量体ペプチドエピトープ（クラスI MHCの場合）および15量体ペプチドエピトープ（MHCクラスIIの場合）と共に合成する。培養T細胞を、1/200倍希釈した4量体によって室温で20分間染色する。次に、抗CD8抗体を添加してさらに30分間染色した。次に細胞を洗浄して、FACS Calibur（BD Biosciences）において100,000個を獲得してFlowjoソフトウェア（Tree Star）によって分析した。
【００４９】
治療後、治療が免疫応答のバランスを再調整することに成功したか否かを決定するために、サブドミナント抗原またはエピトープに応答した寛容または液性もしくは細胞性免疫応答に関してアッセイすることによって、患者のプロファイルを再度決定する。
【００５０】
C．免疫応答バランスの再調整
本発明の1つの態様において、サブドミナント抗原または抗原上のサブドミナントエピトープに対して患者由来のT細胞をエクスビボで増殖させた後、これらのT細胞を患者に注入または投与することによって、免疫応答のバランスを再調整することができる。サブドミナント抗原またはエピトープに対するT細胞を、エクスビボで（患者の免疫調節環境から離れて）組織培養において増殖させる。以前に優勢であった細胞を圧倒するほど十分に細胞を増殖させた後、細胞を患者に再度注入して、細胞のバランスを偏らせ、優勢ヒエラルキーを治療的に切り替える。さらに好ましい態様において、治療としてデノボで導入されるこの多数のT細胞は、抗原、感染性物質、腫瘍、または臓器に対応するT細胞の5％より多い。内因性のT細胞数を減少させる前処理物質（すなわち、化学療法剤）によって患者を前処置すると、注入した細胞に有利となるように、比率をさらに偏らせることができる。
【００５１】
本発明は、組織培養におけるサブドミナント抗原に対するT細胞の増殖を最適にする方法を伴う。1つの態様において、細胞を、ドミナント抗原の非存在下で増殖させる。これは、ドミナント抗原に曝露されていない専門的な抗原提示細胞を選択すること、および処理される抗原の能力を制限するドミナントエピトープまたは他の成分を消失させるように抗原を改変することによって行われる。
【００５２】
本治療法は、T細胞がサブドミナント抗原／エピトープに関して増加し、理想的にはサブドミナント抗原／エピトープに対して十分に応答することが必要であることから、そのようなT細胞を増殖させるための効率的な方法が重要である。ドミナントエピトープおよび抗原に対して他のT細胞が増殖すると、この比率を偏らせるために十分な特異的な細胞を生成するために要する培養時間が増加する。その上、ドミナントエピトープに対して増殖する細胞は、再注入時の適切な比率を達成するのに逆らうように作用する。それゆえ、ドミナント抗原またはエピトープの導入を特異的に制限するT細胞培養法が開発されている。たとえば、本方法は全ての腫瘍に対して広く応用可能であるが、これはEBV形質転換B細胞（EBVドミナント抗原／エピトープを発現する）を用いないことから、EBV悪性疾患に関して明らかな利点を有する。本方法はまた、CTLの有意な割合(％)がサブドミナント抗原／エピトープに応答するような細胞に投与する場合にも、より信頼できる。
【００５３】
単球由来樹状細胞は、インビトロで患者の末梢血単核球（PBMC）から生成される。好ましい態様において、組織培養フラスコにおいてPBMCを2時間平板培養して、単球を接着させる。代わりの態様において、CD14+磁気ビーズを用いてPBMCから樹状細胞を単離することができる（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）。この時点で、非接着細胞を除去して、後にT細胞源とするために-80℃で凍結する。接着した単球をインターロイキン4（IL-4）および顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）によって処置すると、約1週間で未成熟な樹状細胞（iDC）への分化が起こる。次に、腫瘍壊死因子（TNF）またはマクロファージ条件培地によって2日間処置すると、iDCは成熟樹状細胞へとさらに分化する。これらの細胞に、サブドミナント抗原を含むペプチドまたはプラスミドをさらに2時間パルスした後、PBMCを融解してパルスした樹状細胞に添加する。数時間後、細胞をプールして、IL-2またはIL-15（IL-15が好ましい）を含む培地に浮遊させて、抗原を認識するT細胞をインビトロで増殖させる。あるプロトコルに関して、T細胞の生存を増加させるために、IL-7およびIL-15を添加する。他のプロトコルに関して、T細胞のあるサブセットの増殖を最適にするために、培養条件を調節する。たとえば、TH1細胞へと向かわせるためにIL-12を添加することができる。または、TH2へと向かわせるために、IL-4を添加することができる。あるプロトコルにおいて、Tregの増殖を阻止するためにIL-6を添加することができる。自己免疫または臓器移植への応用において有用であるなお別の変化形において、Tregの増殖を加速するために、低レベルIL-2+ラパマイシンを添加することができる。より詳細なプロトコルを様々な実施例において概要し、特定のT細胞サブセットへと細胞を向かわせるプロトコルによって産生された細胞のインビボ比較を、実施例3、図3に記述する。T細胞を組織培養フラスコにおいて増殖させる場合、14日目および21日目に培地を交換しなければならない。しかし、好ましい態様において、バイオリアクター、たとえばGrex（Wilson Wolf）またはHyperstack（Corning）などの気体透過性のバイオリアクターを用いてこの培地交換の必要性を緩和することができる。一般的に、バイオリアクターでは、患者に投与するために十分な細胞を2〜6週間以内に生成することができるが、これに対し、従来の方法では12〜24週間である。
【００５４】
本発明の別の態様において、本発明者らは、ドミナントエピトープが欠失している抗原に対する、養子移入のためのT細胞を開発し、より多くのT細胞がサブドミナントエピトープに対して生成されることを証明する。そのようなタンパク質または対応するDNAワクチンを用いて、サブドミナントエピトープに対して広い免疫応答を有するT細胞を生成することができる。このアプローチは、サブドミナントエピトープに対する免疫応答のバランスを達成するために、EBV、ガン、HIV、または肝炎を含むがこれらに限定されるわけではない広範囲の疾患に対して広く応用可能であるはずである。別の態様において、抗原またはそれをコードするプラスミド／組み換え型ワクチンを用いて、サブドミナント抗原に対するデノボでの広い免疫応答を誘導するために患者にワクチン接種する。別の態様において、応答を強化するために、サブドミナント抗原によるワクチン接種後にサブドミナント反応性T細胞を投与することができる。なお別の態様において、本アプローチは、治療的または予防的に用いることができ、疾患に罹るリスクを測定するために患者の免疫プロファイルを決定することができ、次に、本明細書において開示される任意のアプローチを用いて、適切なサブドミナント抗原に対して患者を抗原刺激することができる。
【００５５】
代わりのアプローチにおいて、増殖させたT細胞は寛容を誘導して、自己免疫疾患、アレルギー、炎症、臓器移植片拒絶、または移植片対宿主病を予防または処置する。所望のT細胞のタイプに応じて、CD8、CD4、TH1、TH2、またはTregを含むがこれらに限定されるわけではない関連するサブセットを選択的に増殖または増加させるように、培養条件を改変することができる。たとえば、T細胞をある増殖因子、サイトカイン、薬物、低分子、または他の免疫細胞の存在下または非存在下で増殖させることができる。好ましい態様において、サブドミナント抗原反応性T細胞は、刺激された専門的な抗原提示細胞（たとえば、単球由来樹状細胞、マクロファージ、またはEBV不死化B細胞）の存在下で組織培養において末梢血単核球（PBMC）から生成される。
【００５６】
別の態様において、様々な技術を用いて、サブドミナントエピトープに有利となるように抗原のプロセシングを修飾する。本発明の1つの態様において、これは、ドミナントエピトープ、抗原プロセシングを阻害する領域を消失させるように、または抗原提示細胞に対して一度に提示されるドミナントもしくはサブドミナントエピトープの数を制限するように、抗原を改変することによって行われる。これらの改変によって、認識されるサブドミナントエピトープの応答および多様性が増加する（実施例1、図5）。代わりの態様において、改変されたLMP1、LMP2、およびEBNA-1配列を、アデノウイルスまたはワクシニアウイルスなどのウイルスベクターを用いてAPCに送達することができる。他の抗原（LMP1およびEBNA-1）の場合、十分でない抗原プロセシングをもたらすタンパク質の領域を消失させると、それらの抗原上のサブドミナントエピトープに対する免疫応答が大いに増強される（実施例1、図6）。改変されたLMP1、LMP2、およびEBNA-1配列を、ペプチド、タンパク質、プラスミド、またはアデノウイルスもしくはワクシニアなどのウイルスベクターを用いてAPCに送達することができる。
【００５７】
代わりの態様において、認識されるサブドミナントエピトープの数を増加させるために、かつサブドミナント抗原に対する応答を増強するために、CTL産生の際に、プロテオソーム拮抗剤をAPCおよび抗原に添加してもよい（実施例2、図7）。異なる反応機構を有する多くの利用可能なプロテオソーム拮抗剤（たとえば、ボルテゾミブ、クリオキノール、ラクタシスチン、エポキソミシン、MG-132、MLN9708、カルフィルゾミブ（PR-171））が存在する。
【００５８】
代わりの態様において、抗原を、サブドミナント決定基に対する応答に関して様々なアイソタイプを有する抗体との複合体で投与してもよい（実施例3、図13）。専門の抗原提示細胞を標的として、抗原のプロセシングを隣接するエピトープに向けるために、意図されるT細胞エピトープに隣接する決定基に結合している抗体と共に抗原を注射する。
【００５９】
本発明の別の態様において、サブドミナントエピトープまたは抗原を含むプラスミドを用いてT細胞を生成し、これを、サブドミナント抗原に対する応答を誘導するために、様々な投与経路によって、IFNγ、IL-21、もしくは他のサイトカインと併用して患者に直接投与するか、またはパルスした樹状細胞と共に投与する。サブドミナントエピトープに対するT細胞の応答性を増加させるために、かつ免疫優勢ヒエラルキーを改変するために、T細胞を刺激する前に、IFNγまたは他のサイトカインを誘導してもよい。
【００６０】
別の態様において、免疫優勢ヒエラルキーを変えるために、投与経路を改変する。ワクシニア応答の投与経路は、ドミナント決定基の優勢の程度を決定する。ドミナント決定基は、皮内投与の場合は応答の半分を占めるのに対して、腹腔内投与する場合は応答の4分の1を占めるに過ぎないことが見いだされている（Tscharke DC et al. 2006, Tscharke DC et al 2005）。実施例3、図11に示されるように、IM経路によって抗原を投与すると、IPまたはIV経路よりも、サブドミナントエピトープに対してより強い応答およびより広い応答を生じる。このように、投与経路の改変は、免疫優勢ヒエラルキーを改変するために本発明者らが主張する別のインビボ反応機構である。好ましい態様において、培養されるT細胞は、皮内投与によって送達される。異なるAPC（たとえば、マクロファージ、樹状細胞）を標的とすることによって、投与経路は、優勢ヒエラルキーを変化させる（実施例3、図12）。
【００６１】
好ましい態様において、抗原はウイルス抗原、特にサブドミナントエピトープを有する潜在ウイルス抗原または慢性ウイルス抗原である。たとえば、ウイルス抗原は、EBV、HSV、VZV、B型およびC型肝炎、HIV、およびHTLVを含む群から選択されるウイルスに由来する。ウイルス抗原は、たとえば、EBV LMP1、LMP2、EBNA-1、HPV E6、またはHPV E7である。たとえば、ウイルス抗原は、EBV、HSV、VZV、B型およびC型肝炎、HIV、ならびにHTLV、CMV、RSV、またはインフルエンザに関連する。別の態様において、抗原は、他の慢性感染および潜伏感染物質上の抗原、たとえば、細菌、真菌、寄生虫、またはプリオンに関連する物質上の抗原である。なお別の態様において、抗原は、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原、ガン幹細胞または転移に関連する抗原を含むがこれらに限定されるわけではない腫瘍抗原である。他の態様において、抗原は、自己免疫、アレルギー、炎症、または臓器移植片拒絶または移植片対宿主病に関連する。
【００６２】
1つの態様において、患者の免疫優勢ヒエラルキーは、患者の試料中のドミナント抗原またはエピトープ、およびサブドミナント抗原またはエピトープを同定する段階、サブドミナント抗原またはエピトープを認識することができるT細胞を培養する段階、ならびにT細胞の有効数によって患者を処置する段階によって変わる。
【００６３】
1つの態様において、患者の免疫優勢ヒエラルキーは、患者の試料中の少なくとも1つのサブドミナント抗原またはエピトープを同定する段階、サブドミナント抗原またはエピトープを認識することができるT細胞を培養する段階、および治療上の恩恵を提供するためにそれらのT細胞の有効数によって患者を処置する段階によって変わる。
【００６４】
別の態様において、T細胞は応答性T細胞であり、患者の免疫優勢ヒエラルキーを変えるためにT細胞の有効数によって患者を処置して、それによって感染症またはガンを処置または予防するために患者において細胞障害性免疫応答を誘導する。感染症は、たとえば細菌、ウイルス、寄生虫、またはプリオン感染症である。
【００６５】
本発明の任意の方法において、疾患、感染症、ガン、または医学的状態の処置または予防は、疾患、感染症、ガン、または医学的状態の少なくとも1つの症状を軽減または改善する段階を含む。
【００６６】
D．治療法
1．ガン
ドミナントおよびサブドミナント抗原の免疫プロファイリングを臨床で使用する際の作業の流れ
段階1：腫瘍の生検（免疫組織化学）または血液（IHC、FACS、またはElisa）抗原1、2、3、4、5、6、7、8、9、10
結果：腫瘍の抗原1、2および6を使用、パネルの他の抗原は使用しない
段階2：免疫応答のプロファイリング
液性応答プロファイル：  細胞性応答プロファイル
血清のELISA：  各抗原によって刺激したPBMCのElispotまたはICS（T細胞サブセットをアッセイするために、少なくともIFNγ、同様にIL-10、IL-4、IL-12、IL-21に関して）
結果：抗原1  強い応答（ドミナント）；抗原2および6  なし／中等度の応答（サブドミナント）
段階3：インビトロでサブドミナント抗原に対するT細胞（CD8およびCD4）を増殖させる
結果：T細胞は抗原2および6に対して応答する
段階4（治療が良好に確立された場合には任意）：増殖させたT細胞の5％超がサブドミナント抗原に応答することを、細胞性免疫プロファイリング（ElispotまたはICS）を用いて確認
結果：T細胞の25％が抗原2および6に応答する
T細胞の少なくとも5％がサブドミナント抗原に応答すれば段階5に進む
段階5：予め前処理（たとえば、シクロホスファミド）を行ってまたは行わずに細胞を患者にIV注入する
段階6：（治療が十分に確立された場合には任意となりうる）：注入後2〜3週目で血液からPBMCを単離して免疫応答のプロファイルを決定する
結果：細胞性応答プロファイル  抗原1  なし／中等度の応答；抗原2および抗原の少なくとも1つに対する強い応答（ドミナント）
段階7：臨床反応の評価
RECIST（CR、PR）：生存または無増悪生存
結果：応答率および生存の改善
【００６７】
実施例4では、この系統的方法を用いて黒色腫を処置する。実施例5では、本方法を応用して、マルチプラスミドLMP2によってリンパ腫を処置する。実際に、T細胞治療は、リンパ腫の自然経過を、再発性の寛解である経過から永続的な寛解である経過へと変化させる。この抗原ならびに欠失したLMP1およびEBNA-1もまた用いて、鼻咽頭ガン、バーキットリンパ腫、CLL、ホジキンリンパ腫、および、中でもいくつかの胃ガンを含む、EBV抗原を含む他の腫瘍を処置することができる。実施例3では、類似の方法を用いて肝細胞ガンを処置する。これらの例は、参照により本明細書に組み入れられ、サブドミナント抗原に向けての免疫応答のバランスを再調整することが、全ての型の腫瘍に対して広く応用可能であることを証明している。
【００６８】
2．汎腫瘍タイプの治療を行うための腫瘍における多数のサブドミナント抗原の一般的使用
別の態様において、本発明者らは、特定のタイプの腫瘍に対して必要なサブドミナント抗原を同定することができれば、そのタイプの腫瘍を、患者を試験する必要なく、多数のサブドミナント抗原に対するT細胞によって処置することができると提唱する。同様に、同じ腫瘍上の多数の抗原を標的とすることにより、耐性、たとえば併用化学療法を減少させるであろう。たとえば、リンパ腫の40%に存在するサブドミナント抗原であるEBV LMP2を標的とし、かつ生存している（リンパ腫の50％に存在する）1種類のT細胞株を開発することができれば、これらの2つの抗原に対して特異的なT細胞株によってリンパ腫のおよそ80％を標的とすることができるであろう。リンパ腫全体に対する産物の臨床試験を実施例5で実証する。3年目まで、リンパ腫全体に対する産物によって処置した患者の、進行なしでの生存は、治療前に抗原を試験する産物と同等である。これは、併用化学療法と同様に、同じ腫瘍上の多数の抗原に対するCTLの応答が、腫瘍が免疫を逃れる可能性を減少させ得るからである。全てのリンパ腫（1種類の抗原に関して陽性であるそのサブセットを単に処置する必要はない）を1種類のT細胞産物によって処置できることは、新しい産物の考え方である。本発明の他の態様において、本発明者らはまた、実質的に任意のガンに関する類似のガン全体に対する産物を主張する。
【００６９】
3．慢性感染症
肝炎および肝細胞ガン
慢性肝炎患者では、HBs抗体は産生されないが、HBc抗体が生成される（Ganem D et al 2004）。急性肝炎患者では、両方の抗原に対する抗体が生成される。新生児の90％超および年齢1〜5歳の小児の30％が慢性型を発症するが、成人は90％超の確率でウイルスが急激に消失する。肝細胞ガンの95％がB型肝炎ウイルスによる慢性感染症に関連しており、HBsAgがしばしば、HCCの細胞表面上に存在する。これらの知見を考慮して、本発明者らは、HBsが肝炎および肝細胞ガン患者においてサブドミナントであったか否か、およびT細胞の増殖が、サブドミナント抗原に対する免疫応答のバランスを再調整して治療的でありうるHBs抗原に対するCTLを生成することができるか否かを試験することを選択する。
【００７０】
この知見に基づいて、本発明者らは、肝炎の動物モデルおよび最終的にHBV関連HCC患者において慢性肝炎を処置するために、HBsAgに対して増殖させたCTLを投与した。動物モデルにおいてHBVtgRAG細胞を投与して試験した。対照細胞を投与された動物では、慢性肝炎が発症した。さらに、動物が肝炎を発症して、サブドミナント抗原に対するCTLを投与した場合、動物は急性肝炎を発症したが、肝炎ウイルスは消失した（実施例3、図9〜11）。
【００７１】
有望な動物データを考慮して、肝炎患者を、T細胞のバランスを再調整する治療法によって処置した。
【００７２】
ドミナントおよびサブドミナント抗原の免疫プロファイリングを臨床で使用する際の作業の流れ
段階1：肝炎表面抗原および肝炎コア抗原の免疫応答プロファイリング
液性応答プロファイル：  細胞性応答プロファイル
血清のELISA：  抗原によって刺激したPBMCのElispotまたはICS（T細胞サブセットをアッセイするために、少なくともIFNγ、同様にIL-10、IL-4、IL-12、IL-21に関して）
結果：Hbc  強い応答（ドミナント）；HBs  なし／中等度の応答（サブドミナント）
段階2：インビトロでサブドミナント抗原に対するT細胞（CD8およびCD4）を増殖させる
結果：T細胞はHBs抗原に応答する
段階3（治療が十分に確立された場合は任意）：増殖させたT細胞の5％超がサブドミナント抗原に応答することを、細胞性免疫プロファイリング（ElispotまたはICS）を用いて確認
結果：T細胞の25％がHBs抗原に応答
少なくとも5％のT細胞がサブドミナント抗原に応答する場合段階4に進む
段階4：予め前処理（たとえば、シクロホスファミド）を行ってまたは行わずに細胞を患者にIV注入する
段階5（治療が十分に確立された場合は任意でありうる）：注入後2〜3週目に血液からPBMCを単離して、免疫応答のプロファイルを決定する
結果：細胞性応答のプロファイル  HBc  なし／中等度の応答；HBs  強い応答（ドミナント）
段階6：臨床反応の評価
結果：感染症の消失
【００７３】
HBVおよびHCC患者5人について免疫プロファイリングを行った。予想されたように、ELISAは、B型肝炎コア抗原（HBc Ag）に対して高い力価の抗体を証明したが、B型肝炎表面抗原（HBs Ag）に対しては、抗体は証明されなかった（実施例3、図17）。しかし、PBMCを樹状細胞へと誘導して、B型肝炎コア抗原（HBc Ag）およびB型肝炎表面抗原（HBs Ag）によってパルスし、これを用いて同じ患者のPBMC由来のCTLを増殖させると、驚くべき結果が観察された。ElispotでのIFN産生T細胞の頻度により、ヒエラルキーが観察された：抗原なし（10 sfc）＜HBs Ag（15 sfc）＜HBcAg（45 sfc）（実施例3、図14）。このことは、B型肝炎表面抗原が肝炎コア抗原と比較して実際にサブドミナントであったことを示している。さらに、HBsの1つのエピトープ（FLL）が、Elispot（実施例3、図14）およびICS（実施例3、図15）によってドミナントであるように思われた。このエピトープを含むペプチドを、患者由来の細胞を増殖させるために用いられるペプチドミックスから除外した。
【００７４】
HCC患者において、サブドミナントHBsに対するT細胞を投与された患者5人中3人（実施例3、図16）ではHB抗原が消失し、肝機能検査においてアラニントランスアミナーゼ（ALT）が一過性に上昇した後、HCCに対するCRが実証された（実施例3、図17および19）。それらの患者のPBMCを投与後2週目に試験すると、ドミナント応答は、HBcおよびこれまでサブドミナントであったHBsのエピトープではなく、HBsに対して起こり（実施例3、図18）、これは患者の免疫優勢ヒエラルキーのバランスが再調整されたことを示している。治療および免疫優勢ヒエラルキーが切り替わった結果として、治療上の恩恵が提供された（実施例3、図17および19）。
【００７５】
このように、サブドミナント抗原に対するT細胞養子免疫療法を用いて、慢性ウイルスを撲滅して、それらが存在するガンを処置することができる。さらに、サブドミナント抗原およびエピトープに対するT細胞の産生を指示する免疫プロファイリングは、多数の疾患において新しい治療の道筋を開く。
【００７６】
C型肝炎ウイルスおよびHIVウイルスを含むがこれらに限定されない任意のウイルス、細菌、真菌、プリオン、寄生虫、または他の感染性疾患を実質的に処置することができる。他の慢性疾患も同様に、バランスを再調整することによって処置することができる。たとえば、マイコバクテリアによる結核症は、多くの患者において慢性感染症であるが、免疫系が抑制される場合に限って再活性化する。その休眠状態では、これは通常肺の肉芽腫に含まれる。マイコバクテリア食胞のプロテオームに関する最近の研究から、MTBが樹状細胞における抗原提示をマクロファージより大きい程度に抑制することが示されている（Li et al. 2011）。この目的に対して、本発明者らは、サブドミナントエピトープに応答するように免疫系のバランスを再調整することが、実質的に任意のガンまたは感染性疾患に対する広い治療的アプローチであることを提唱する。
【００７７】
4．自己免疫
疫学的研究により、多発性硬化症を発症する患者のリスクはEBV抗体力価と相関することが証明されている。EBVに感染する前および初回感染後数年間、数百から数千人の人を追跡することによって、Ascherioらは、MSを発症した患者305人を調べることが可能であった。MSのリスクはEBV感染後急激に増加した（Ascherio A et al. 2010）。EBNA-1 400-641に応答するメモリーCTLは、同様にEBVキャリアである健康な人と比較すると、他のEBV抗原に対する応答と比較してMS患者において上昇した（Lunemann JD et al. 2006）。EBNA-1特異的Th1細胞は、自己抗原の交叉認識によって、またはバイスタンダー反応機構によって自己免疫を維持することができるように思われる。さらに、トランスジェニックマウスの研究により、LMP2aを発現するB細胞は、正常な寛容のチェックポイントを迂回して、自己免疫疾患の発生を増強することが示唆されている（Swanson-Mungerson M 2007）。そのため、本発明者らは、EBVおよびEBV関連ガンの処置としてEBVサブドミナントエピトープに対して反応性のT細胞を調べたところ、EBVサブドミナントエピトープに対して反応性のT細胞はまた、自己免疫におけるバランスを元に戻すためにも有用でありうる。EBV潜在抗原（EBNA-1、LNP1およびLMP2）に応答するT細胞を増殖させて導入することによって、本発明者らは、免疫応答のバランスを再調整することができ、EBVとの関連を有する自己免疫疾患において寛容を再誘導することができることを提唱する。同じことが他の自己免疫疾患に関連する他のウイルスについても当てはまるであろう。たとえば、コクサッキーウイルスB3などのピコルナウイルスは、心筋炎／拡張型心筋症、1型糖尿病、脳炎、筋炎、精巣炎、肝炎を引き起こす。
【００７８】
なお他の態様において、臓器特異的自己免疫が発生する臓器に関連する抗原に対してT細胞を生成することができる。免疫優勢の現象は、同時に処理される全ての抗原由来のエピトープを含むことから、その時点で自己免疫応答を促進する正確な自己抗原を完全に知る必要はない。たとえば、コラーゲンの反応性サブドミナントエピトープに対するT細胞を作製してリウマチ性関節炎患者の炎症関節に導入すると、進行中の免疫応答のバランスが再調整されて、寛容が元に戻るであろう。活性なT細胞を炎症部位に導入することは有益であろうと考えることは、通常とは逆であり予想外であるが、本発明者らの効果のあるモデルに従って、その部位での免疫応答のバランスが再調整されると、異常な免疫応答に対して適切な制御を回復するであろう。自己免疫疾患の処置は、本発明の別の態様である。
【００７９】
5．Tregインビトロ増殖
免疫調節の原理の1つは、T細胞の他のサブセットに対するTregのバランスである。本発明の別の態様は、エクスビボでのT細胞増殖をTreg細胞に向かわせることである。この場合、サブドミナントエピトープを標的とする代わりに、免疫応答のバランスを再調整するための別の方法として、ドミナントエピトープに対するTregを生成する。1つの態様において、そのように生成されたTreg T細胞を、単独の治療用産物として用いる。別の態様において、Tregサブセットを、サブドミナントエピトープまたはサブドミナント抗原に対して増殖させた他のサブセット由来のT細胞と併用して用いる。Tregは、FACSソーティングを用いて非抗原特異的に増殖させた後、抗CD23および抗CD28コーティングビーズによって増殖させるが（Putnam et al. 2009）、今日まで養子免疫療法のために抗原特異的にTregを増殖させた人はいない。本明細書において、異なる抗原、特に自己免疫疾患、移植片対宿主病、または移植の拒絶において観察される免疫応答において、ドミナントである抗原に対して特異的なTregを確立するために有用な方法が記述される。
【００８０】
Tregを自己免疫または移植患者のPBMCから、CD4-PerCP（SK3）、CD127-PE（hIL-7R-M21）、CD25 APC（2A3）、CD45RA-PE.Cy7（L48）およびCD45RO-PE.Cy5（UCHLI）を用いてGMPクリーンルームにおける無菌的技術を用いて、FACSソーティング（BD FACS Aria II高速セルソーター）によって単離した。CD4+CD127lo/-CD25+、およびCD4+CD127lo/-T細胞をソーティングして、熱不活化してプールした10％ヒトAB血清（Valley Biomedical, Winchester, VA）を含む、X-Vivo 15培地（Lonza, Walkersville, MD）3 ml中に収集した。またはTregを、同じ抗体によってコーティングした磁気ビーズ（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）を用いて分離することができる。これらの細胞を、各ウェルがTreg：APCの比1：5でドミナント抗原によって予めパルスされているPBMC（上記のT細胞刺激に関して記述したように）から調製された樹状細胞を含む24ウェルプレート（Costar, Cambridge, MA）において、Treg 2.5×105個/ウェルで平板培養した。18時間インキュベーション後、細胞にラパマイシン（100 ng/ml；Wyeth, Madison, NJ）を、培養1日目から7日目まで投与した。2日目に培養体積を倍にして、300単位/ml IL-2（Chiron, Emeryville, CA）を添加した。細胞を新鮮な培地に浮遊させてIL-2を2、5、7、9、および12日目に添加した。9日目に、ペプチドをパルスした樹状細胞によって細胞を再刺激した。または、抗CD23/抗CD28をコーティングしたマイクロビーズ（Invitrogen, Carlsbad, CA）をこの第二の刺激のために用いることができる。さらに気体透過性のバイオリアクター（Grexなどの）を用いて、閉鎖システムにおいてより少ない操作でこの細胞増殖を行うことができ、増殖の動態を改善することができる。別の変化形において、IL-10の高レベルを分泌してTH1およびTh2応答を調節するTreg1へのTregのさらなる分化を促進するために、コーティングビーズによる刺激時にIL-10を添加する。
【００８１】
自己免疫におけるドミナントおよびサブドミナント抗原の免疫プロファイリングを臨床で用いる際の作業の流れ
段階1：免疫応答のプロファイリング
液性応答のプロファイル：  細胞性応答のプロファイル
血清のELISA：  各抗原によって刺激したPBMCのElispotまたはICS（T細胞サブセットをアッセイするために少なくともIFNγ、同様にIL-10、IL-4、IL-12、IL-21に関して）
結果：抗原1  強い応答（ドミナント）；抗原2  なし／中等度の応答（サブドミナント）
段階2：インビトロでサブドミナント抗原に対するT細胞（CD8およびCD4）を増殖させる；インビトロでドミナント抗原に対するTregを増殖させる
結果：T細胞はサブドミナント抗原に応答性；Tregはドミナント抗原に対して応答性
段階3（治療が十分に確立された場合には任意）：増殖させたT細胞の5％超がサブドミナント抗原に応答し、Tregがドミナント抗原に対して増殖することを、細胞性免疫応答プロファイリング（ElispotまたはICS）を用いて確認
結果：T細胞の25％が抗原に応答する
T細胞の少なくとも5％がサブドミナント抗原に応答し、かつ／またはTreg細胞の少なくとも5％がドミナント抗原に応答する場合、段階4に進む
段階4：予め前処理（たとえば、シクロホスファミド）を行ってまたは行わずに患者に細胞をIV注入する
段階5（治療が十分に確立された場合には任意となりうる）：注入後2〜3週目で血液からPBMCを単離して、免疫応答のプロファイルを決定する
結果：細胞性応答プロファイル  抗原1  なし/中等度のエフェクター応答；抗原2および強いTreg応答（ドミナント）
段階6：臨床反応の評価
自己免疫（MS−再燃が減少、リウマチ性関節炎−関節腫脹の減少、喘息−発作回数の減少、初期I型糖尿病、膵臓が維持される）、移植−臓器拒絶率および移植片対宿主病は減少
結果：臨床転帰の改善
【００８２】
6．自己免疫または移植におけるドミナント抗原に対するTregの投与
なお別の態様において、ドミナント抗原に対するTregを、サブドミナント抗原に対してそれ自身反応性であるTH1、TH2またはCTLサブセットのT細胞と組み合わせることができる。そのような組み合わせは、応答のバランスをサブドミナントエピトープに向けてより完全に切り替えるであろう。本発明者らは、関節炎において2つのタイプのT細胞のあいだに相乗効果があることを証明した（実施例6）。
【００８３】
7．移植
代わりの態様において、他の健康なドナーの樹状細胞（または放射線照射PBMC）を用い、上記のTreg培養条件を用いて健康なドナーのPBMCからTregを増殖させる。このようにしてMHCの各々に対する同種異系反応性Treg株を確立してバンクを作製する。本発明者らが上記で考察したように、MHCの80％を、20〜50個のMHCハプロタイプに対して生成されたTreg株によってカバーすることができる。これらの株の各々を-80℃で1用量のアリコートとして凍結することができる。臓器移植またはBMTを行う場合、ミスマッチMHCに対して反応性のTreg 5×107個/m2もまた患者に移植する。このようにして、同種異系拒絶または移植片対宿主病が緩和される。
【００８４】
8．自動免疫プロファイリングアッセイおよび閉鎖システム細胞培養装置
気体透過性メンブレン装置は、培養技術の好ましい態様である。メンブレンは気体透過性であることから、培養の規模は、メンブレンの表面積および細胞を増殖させるために必要な培地の体積によって決定される。これらの気体透過性装置の例には、Hyperstack（Corning）またはGrex（Wilson Wolf）が挙げられる。このタイプのバイオリアクターの有用な特色の1つは、細胞培養プロセスの段階的な規模拡大が可能である点である。本発明者らのアプローチの標準化の一部として、本発明者らは、産生セットにおいて用いるための標準的なCO2インキュベータ中にスライドするタイプのバイオリアクターを設計している。異なる態様において、本発明者らは、自動産生施設において標準的な積み重ね型温室に適合するバイオリアクターを設計している。自動化に関して意図されるバイオリアクターは2つの大きさに作製される：1つは、個々の患者に関する自己細胞を増殖させるためのバイオリアクター、および第二のより大きいバージョンは、同種異系T細胞株の商業的産生のためのバイオリアクター。改善された方法において、自動化のために細胞培養装置を四角形形状へと改変すると、標準的なCO2インキュベータの溝にスライドする。気体透過性メンブレンがフラスコの底部にあり、棚の上に載せられると遮断されることから、これは有意な利点である。フラスコを棚にすることによって、メンブレンへの気流はより良好となる。重要な属性はバイオリアクターの重量を支えるフラスコの側面の突縁である。1つの態様において、スライドを棚の支持体に形成するステンレススチールのフレームにバイオリアクターを据え付ける。別の態様において、それらはプラスチックの一部として成型される。態様の1つにおいて、それらは棚全体の設置面積を有する。別の態様において、それらは棚の1/2、1/4または1/3または1/5を構成する。好ましい態様において、インキュベータは、New Brunswick, Forma, ThermoElectron, Nuaire, ESCOによって作製される。好ましい態様において、インキュベータは空気もしくは水で包み込む設計であるかまたは他の設計でありうる。なお別の態様において、それらは金属フレームである棚の中に、または温室中の平板に適合する。別の好ましい態様において、平板はロボットが移動して処理する。なお別の態様において、バイオリアクターは、採取前の浮遊液へと細胞を戻すロッカーを含むがこれらに限定されない様々な販売用処理装置に適合する。
【００８５】
各々のバイオリアクターは、培地、成分、および細胞を導入するための、ならびにそこから凍結および品質管理のために細胞を回収するためのアクセス口を備えた閉鎖システムである。好ましい態様において、これらのアクセス口は流体および細胞をバイオリアクターの内外に運ぶチューブであり、そのキャップはバイオリアクターの底部に達する固形チューブと一体化している。代わりの態様において、アクセス口は、流体、細胞または他の試薬を手動でまたは自動ロボットを用いて注入または除去するために、その中に針または他のプローブをバイオリアクターに挿入することができるゴム製の無菌的シートである。装置にはそれらを追跡するためのバーコードをつけて、各患者および各細胞株が自身の専用バイオリアクターを有するようにする。バイオリアクターは使用後使い捨てである。バイオリアクターはまた、積み重ね、輸送体、およびロック式撹拌装置を含むがこれらに限定されない自動細胞培養における標準的なロボット自動化装置に適合する大きさである。図31はそのようなバイオリアクターの一例である。
【００８６】
バイオリアクターと同様に、抗原のパネルに対する抗体およびT細胞応答の力価を測定する処理を可能にするために、販売用の多重免疫プロファイリングアッセイも同様に設計される。これを行うために、ELISPOTアッセイを、標準的な96ウェルプレートフォーマットとして用い、応用することができる。好ましい態様において、AIDELISPOTリーダー（Autoimmun Diagnostika, Strassberg, Germany）を用いてスポットを計数する。または、96ウェルプレートを用いて、ICSアッセイのためにFACSに細胞を投入する。いずれにせよ各患者は、バーコードがつけられ、全てのプレートが使い捨てである自身の専用の96ウェルプレートを有する。これらの販売用のアッセイおよび製造プロセスは、本発明の態様である。
【実施例】
【００８７】
E.実施例
1.実施例1：EBV潜伏感染症、リンパ腫および鼻咽頭癌腫
血液中の抗体によって測定されるように、世界の人口の90％は、EBV（単球増加症の原因ウイルス）に曝露されてきた。EBVはB細胞に潜伏し、そのタンパク質の大部分はなくなるが、非常に低レベルの潜伏抗原LMP1、LMP2および、時々EBNA-1を発現する。これらの蛋白質の免疫原性は弱いが、ウイルスが潜伏状態であっても該ウイルスを維持するのに必要とされる。それらは主にB細胞に由来するゆえに、リンパ腫試験の40％はEBV潜伏抗原に対して陽性である。かくして、これらの抗原は、養子細胞療法におけるCTL応答を発生させる標的として働くことができる。加えて、他の腫瘍（例えば、胃ガンの10％）がそうであるように、鼻咽頭癌腫もまたEBV潜伏抗原を発現する。CTLがEBVリンパ腫を治療するのに用いられてきた一方で、現在の産生方法は時間を消費するものであり（3〜6ヵ月）、反復刺激としてEBVで形質転換されたB細胞を用いるので面倒である。さらに、LMP2に対してこのようにして作成されたCTLは、産生後LMP2に対して検出可能な応答を有していたものがバッチの半分しかないT細胞のバッチを生じさせた。本発明者らは、この理由として、時間の50％でLMP2に対する細胞を増殖させるCTLを生じさせたEBVで形質転換したLCL細胞におけるEBVタンパク質由来のドミナントエピトープの存在によるものであると考えた。大きな腫瘍を持つ患者において、伝統的なプロセスによって産生されたCTLで処置された患者の52％は完全な応答を示した。先行技術ではLMP2に対する応答の存在または欠如にかかわらず全てのCTLが同等であると考えられていたが、本発明者らは、これは変動する臨床的応答に対する一つの理由であろうと考えた。さらに、本発明の有効なモデルが実際当てはまると予測された。従って、LMP2に対するCTL発生の効率を増加させることが臨床的に重要であろう。
【００８８】
CTL産生の他の方法もまた本発明で具体化されるが、以下の方法を用いて、以下の実験データを作成した：40ml〜100mlの末梢血液を患者からバキュテナー管中に収集した。Lymphoprep（Nycomed,オスロ,ノルウェー）を用いて末梢血液単核細胞（PBMC）を遠心によって単離し、10％胎児子ウシ血清（FCS）と共に、2mMのLグルタミン、100IU/mlのペニシリン、100μgのストレプトマイシン/mlを含むRPMI 1640（Gibco, Grand Island, NY）中に再懸濁させ（5×106細胞/ml）、107細胞/ウェルとなるよう6ウェルプレート（Costar Corp,Cambridge,MA）上に播いた。37℃での2時間後に、非接着性細胞を取り出し、試験管に入れた10％ポリエチレングリコール（PEG）を含むFCS中に再懸濁し、ドライアイスで凍結して-80℃フリーザー中に貯蔵した。6ウェルプレート中に依然として存在する接着性細胞を、1mlあたり50ngのGM-CSFおよび1000UのIL-4を補足したRPMI＋10％FCS中で培養した。培地の半分を、2日目および4日目に、前述と同一の成長因子を含む新鮮な培地で置き換えた。6日目に、培地を前述の培地で完全に置き換え、かつ体積の25％に相当するマクロファージ条件培地を加えて成熟を刺激した。マクロファージ条件培地は、（PBS中の免疫グロブリン、平板培養、および4℃での一晩のインキュベーションによって調製された）免疫グロブリン被覆プレートに対して接着性のPBMCによって、RPMI 10％FCS中、37℃で24時間ののち上清を収穫し、ポアサイズ0.2mmの膜（Acrodisc,Gelman Sciences）を通して濾過することによって産生され、使用するまでの最大8週間、-20℃で貯蔵した。非接着性細胞を2日後に回収し、樹状細胞源として用いた。CD54、CD80、CD83およびCD86を含む表面マーカーに対するモノクローナル抗体での免疫蛍光染色を行って、樹状細胞の質（50％超の細胞が陽性）を確認した。
【００８９】
3μg/mlのヒトβ2ミクログロブリンを補充した血清無しのRPMI 1640中にて、DC刺激剤を、（ペプチドについては50）μg/mlの濃度の蛋白質に対し、予め37℃にて2時間曝露した。次いでそれらを洗浄し、IL-7 5ng/mlを補充したRPMI 10％FCS中で105細胞/2mlウェルで播いた。応答体と刺激剤の比率が20：1となるように、2×106細胞のPBMCを各ウェルに加えた。14日目および21日目に、20U/mlのIL-2を補充したRPMI 10％FCS中の自己ペプチド負荷樹状細胞で培養物を再度刺激した（必要であれば、さらなるウェルに分けた）。
【００９０】
患者を処置するのに用いられるCTLを放出するための試験には、70％超の生存率、7日後に細菌および真菌に関して培養陰性、エンドトキシンテストで5EU/ml未満、マイコプラズマについて陰性結果、20：1の比率での51Cr放出アッセイにおいて受容体リンパ芽球の殺傷が20％未満、CD19＋B細胞が2％未満、CD14＋単球が2％未満、およびHLAが同一であること、が含まれた。
【００９１】
ポリクローナルなT細胞の集団を収穫し、5時間のクロム放出アッセイにおいてエフェクターとして用いた。クロム放出アッセイでは、線維芽細胞の単層培養をCTLドナーの皮膚生検から樹立し、組換えワクシニアウイルスに曝露した（9cmのペトリ皿あたり2×106細胞）。トランスフェクションの18時間後に細胞を収穫して51CrO4で1時間標識し、3回洗浄し、5時間のクロム放出アッセイにおいて標的として用いた。γカウンターで計数する前に、このアッセイの上清を1％ホルムアルデヒド中に回収した。
【００９２】
a.実験1：サブドミナントエピトープに応答するT細胞の相対的頻度は、樹状細胞または活性化されたマクロファージをLCLの代わりに抗原提示細胞として用いると増強される
刺激剤としての3種の異なる抗原提示細胞：EBVで形質転換されたリンパ芽球系細胞系（LCL）の提示および増殖；サイトカインの増加を伴う樹状細胞（DC）の提示；サイトカインの増加を伴うIFNγマクロファージ（MAC）の提示を用い、T細胞系を10人の患者から調製した。抗原提示の間に、これら3種の各々を、EBNA-1（aa90〜325を欠失したEBNA-1）、LMP1（aa1〜43およびaa260〜315を欠失したLMP1）およびLMP2（1つのプラスミドがaa1〜399を発現し、第2のプラスミドがaa400〜497を発現する2つのプラスミド中のLMP2A）のサブドミナントエピトープを発現する3つのプラスミドの混合物で刺激した。本発明のプロトコルを用いてそのように生じさせたT細胞系を、次いで、51Cr放出アッセイで検討した。
【００９３】
図1Aおよび1B：  2つの異なるエフェクター：標的（E/T）の比率が各々、20：1および10：1である場合に（CTL系：HLAが一致する線維芽細胞）、示された抗原、CTL系を増殖するために異なる示されたAPCを用いて代表的な患者から増殖したCTL由来のペプチドミックスで予めパルスされた、HLAが一致する線維芽細胞における51Cr放出。
【００９４】
結論：樹状細胞（DC）およびマクロファージ（MAC）は、EBVで形質転換したB細胞（LCL）よりも、より選択的にサブドミナント抗原に対するCTLの増殖を刺激する。
【００９５】
図1C：  3つの異なるエフェクター：標的（E/T）の比率の場合に（CTL：HLAが一致する線維芽細胞）、血液を回収した直後（培養の前）に、同一患者のPBMC由来の示された抗原CTL由来のペプチドミックスで予めパルスされた、HLAが一致する線維芽細胞における51Cr放出。
【００９６】
結論：患者はEBVドミナント抗原に対していくらか応答を有したが、それはT細胞培養後よりも、有意により高いE/T比率の場合であった。
【００９７】
図2：  エフェクター：標的（E/T）の比率が20：1の場合に（CTL系：HLAが一致する線維芽細胞）、前記の3つの異なる方法を用いて同一患者から作成したCTLと共にLMP2からの特異的HLA A2制限サブドミナントエピトープを表すペプチドで予めパルスされた、HLAが一致する線維芽細胞における51Cr放出。
【００９８】
結論：樹状細胞およびマクロファージは共に、LCLよりも、より大きい数のサブドミナントエピトープおよびより高いレベルのCTL活性に対する応答に至り、異なるエピトープに対する応答の大きさは樹状細胞およびマクロファージの間で異なる。
【００９９】
図3Aおよび3B：  エフェクター：標的（E/T）比率が20：1である場合に（CTL系：HLAが一致する線維芽細胞）、図3AにおけるLMP2：LCL刺激および図3BにおけるDC/MAC刺激からのペプチドで予めパルスされた、HLAが一致する線維芽細胞における51Cr放出。
【０１００】
結論：樹状細胞およびマクロファージは、検出可能なLMP2応答を有する患者からのCTL系の50％しか導いていないLCLとは対照的に、患者の90％においてCTL系に至る。従って、DC/MACプロセスはより頑強であって、サブドミナント抗原およびエピトープに対してT細胞を生じさせるのに再現性がある。
【０１０１】
図3C：抗原提示細胞としてマクロファージ、樹状細胞またはLCL細胞を用いて増殖したCTL系における、CD4＋、CD8＋およびCD25＋であり生存能力があるCD3＋細胞の割合（％）。系を、CD3、CD4、CD8およびCD25に対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１０２】
結論：全ての方法はCD8＋細胞を樹立し、Tregを樹立しない一方で、APCとしての樹状細胞およびマクロファージの使用は、LCLで産生されたものと比べCD4＋細胞の％を増加させるように見える。
【０１０３】
ELISpotアッセイ：
Elispotアッセイを行って、特定の抗原に対して産生されたT細胞の数を決定した。Elispot γIFN 96ウェルの二フッ化ポリビニリデンで裏打ちしたプレート（Millipore, Bedford, MA）を、15μg/mlの抗-IFNγモノクローナル抗体1-DIK（MABTECH,ストックホルム,スウェーデン）で被覆した。ウェルあたり5×106個のPBMCを、各々が、タンパク質の各々からのものであるペプチドミックス2μMと共に加え、37℃、5％ CO2で一晩インキュベートした。細胞を捨て、1μg/mlのビオチニル化抗-IFNγモノクローナル抗体7-B6-1（MABTECH）と室温にて2〜4時間インキュベートし、続いて、ストレプトアビジン結合アルカリ性ホスファターゼ（MABTECH）とさらに2時間インキュベートした。試料の数に応じて、alk-phos基質キット（Bio-Rad Richmond,CA）からのリン酸5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルおよびニトロブルーテトラゾリウムとの30分間の反応後、解剖顕微鏡を用いるか、またはAIDELISPOTリーダー（Autoimmun Diagnostika,ストラスブルグ,ドイツ）にて、スポットをカウントした。各スポットは、105個の PBMCあたりのスポット形成細胞（SFC）として報告された細胞であった。これらのアッセイにおいて、陽性対照は細胞＋10μg/ml PHAであり、かつ陰性対照はペプチドを含まない細胞単独であった。
【０１０４】
図4：  Elispotによって測定された、105個のT細胞あたりの、インビトロで増殖させたIFN産生細胞（SFC）。
【０１０５】
結論：樹状細胞およびマクロファージは、LCLよりも選択的にサブドミナント抗原に対してT細胞を増殖させる。
【０１０６】
サブドミナントエピトープに対する応答を確立するための抗原の最適化
LMP2を最適化のために選択した。というのは、それはEBNA-3に対するサブドミナント抗原であって、認識されるEBVサブドミナントエピトープの大部分は、コンセンサスソフトウェアおよびPBMCテストを用いて同定されたこのタンパク質上にあるように見えたからである。認識されたサブドミナントエピトープの数を増加させる努力において、LMP2を2つ以上のプラスミドに分割した。CMVプロモーターおよび人工ATGおよびポリAの制御下にあるpシャトルまたはpUC19プラスミドにおいて、以下のプラスミドを構築した：
プラスミド1 LMP2B（aa1〜497）
プラスミド2 LMP2A第一のエクソン（aa1〜119）
プラスミド3 LMP2A第二のエクソン（aa120〜497）
プラスミド4 LMP2A（aa120〜399）
プラスミド5 LMP2A（aa400〜497）
プラスミド6 LMP2A（aa120〜440）
プラスミド7 LMP2A（aa440〜497）
プラスミド8 LMP2A（aa1〜399）
プラスミド9 LMP2A（aa400〜497）。
【０１０７】
全てのプラスミドは、SCS110細菌株（Stratagene, La Jolla, CA）において標準的な手法を用いて生じさせ、エンドフリープラスミドMaxiキット（Qiagen, Hilden,ドイツ）で精製した。抗原提示細胞は、106細胞あたり2〜20μgのプラスミドDNAと共にAmaxa DCヌクレオフェクションキット（Amaxa,ケルン,ドイツ）を用いて成熟から24時間後にトランスフェクトした。
【０１０８】
LMP2上のT細胞免疫サブドミナントエピトープは、限定されるものではないが、以下のものを含む：
2014516538.tif 000003
。
【０１０９】
これらのエピトープについてのペプチドを合成し、これを用いて、PBMCドナーの皮膚から単離されたHLA-A2発現線維芽細胞での51Cr放出アッセイにおいてCTL応答をテストした。
【０１１０】
図5：  エフェクター：標的（E/T）比率が20：1である場合（CTL系：HLAが一致する線維芽細胞）に、（1P：497aa LMP2B；  2P： 1プラスミド上のLMP2A第一のエクソン（119aa）、LMP2A第二のエクソン（378aa）；  3P： 1プラスミド上のLMP2A第一のエクソン（119aa）、プラスミド2上のLMP2A（120〜399aa）および3番目のプラスミド上のLMP2A（400〜497aa）；  4P：プラスミド1上のLMP2A第一のエクソン（119aa）、プラスミド2上のLMP2A（120〜399aa）、第三のプラスミド上のLMP2A（400〜440aa）、第四のプラスミド上のLMP2A（440〜497aa）；2P 2：プラスミド1（aa120〜440）、プラスミド2（aa440〜497））である、1、2、3または4つのプラスミドに分れたLMP2で樹立されたLMP2：CTL系からのペプチドで予めパルスされた、HLAが一致する線維芽細胞における51Cr放出。
【０１１１】
結論：一方はaa400〜497を含有し、他方は399前の残基を含有する少なくとも2つのプラスミドにLMP2を分割する結果、より多数のサブドミナントエピトープに対する、より強い応答がもたらされる。
【０１１２】
Gly Ala反復ドメインに対応するEBNA-1のアミノ酸90〜325をEBNA-1配列から欠失させ、CMVプロモーターの制御下にあるpシャトルプラスミドに挿入した。ペプチドのプロセシングを阻害することが示されたため、この配列を欠失のために選択した。以下のHLA-A2制限ペプチドを用いて、応答を評価した：VLK 574-582 HLA A2。
【０１１３】
さらに、（プロテオソームプロセシングからその凝集/保護を妨げるために）aa1〜43を欠失させ、かつ260〜315（11のアミノ酸タンデム反復の5コピー）を欠失させてLMP1配列を調製した。これらの配列を、CMVプロモーターの制御下にあるpシャトルプラスミドにおいて構築し、野生型LMP1と比較した。応答の幅を評価するために、LMP1の以下のHLA-A2制限エピトープを調製し、試験した：
2014516538.tif 000004
。
【０１１４】
図6Aおよび6B：  エフェクター：標的（E/T）比率が20：1である（CTL系：HLAが一致する線維芽細胞）場合の、EBNA-1またはLMP1由来のペプチドで予めパルスされた、HLAが一致する線維芽細胞における51Cr放出：  EBNA-1野生型 対 EBNA-1欠失、およびLMP1野生型 対 LMP1欠失にて樹立されたCTL系の比較。
【０１１５】
結論：抗原プロセシングを避けるためのタンパク質のある領域の欠失の結果、より多数のサブドミナントエピトープに対する、より強い応答がもたらされる。
【０１１６】
b.実施例2
以下の実験において、抗原プロセシングを増加させて、サブドミナントエピトープの産生と応答性であるT細胞に有利であるように設計された別の変形を施して、上記実施例1で概説したのと同様にT細胞を増殖した。
【０１１７】
図7：  エフェクター：標的（E/T）比率が20：1である（CTL系：HLAが一致する線維芽細胞）場合の、ドミナント抗原（EBNA-3A）、サブドミナント抗原（LMP2）、ならびに2つの異なる方法、つまり一つは抗原提示の間に100nM〜300nMボルテゾミブが添加されたもの、もう一つはボルテゾミブの添加なしのもの、を用いて同一患者から作成されたCTLを用いたLMP2由来の特異的HLA A2制限サブドミナントエピトープを表すペプチドで予めパルスされた、HLAが一致する線維芽細胞におけるCr放出（51Cr放出）。
【０１１８】
結論：CTL抗原提示の間におけるプロテオソーム拮抗物質ボルテゾミブの添加は、抗原プロセシングを修飾し、ドミナントエピトープに対する応答において中程度の減少をもたらして、より多数のサブドミナントエピトープに対するCTLを生じさせる。
【０１１９】
図8：  エフェクター：標的（E/T）比率が20：1である（CTL系：HLAが一致する線維芽細胞）場合に、ドミナント抗原（EBNA-3A）、サブドミナント抗原（LMP2）、ならびに2つの異なる方法、つまり一つは12時間前と抗原提示の間に10ng/mlのインターフェロンγ（IFNγ）が添加されたもの、もう一つはIFNγの添加なしのもの、を用いて同一の患者から作成されたCTLを用いたLMP2由来の特異的HLA A2制限サブドミナントエピトープを表すペプチドで予めパルスされた、HLAが一致する線維芽細胞におけるCr放出（51Cr放出）。
【０１２０】
結論：CTL抗原提示の間におけるIFNγの添加は、抗原プロセシングを修飾し、ドミナントエピトープに対する応答において中程度の減少をもたらして、より多数のサブドミナントエピトープに対するCTLを生じさせる。この効果は、樹状細胞においてよりもマクロファージにおいて、より劇的である。
【０１２１】
c.実施例3：肝炎および肝細胞癌腫
慢性肝炎のマウスモデルが最近開発されており、これは、B型肝炎における一次および二次免疫応答の実験を可能とする（Publicover J et al. 2011）。このHBVtgRAGマウスは、15世代にわたってウイルス複製およびビリオンの構成的な放出が可能である、C57BL/6がバックグラウンドのHBV-複製トランスジェニックマウス（HBVRpl）と、RAG-1欠乏マウスとの間の交雑種であり、TおよびB細胞を生じさせることができないる。108個の脾臓細胞をC57BL/6マウスから移動させると、免疫系が再度構成され、肝炎感染症に対する一次免疫応答のモデルとなる。この脾臓細胞を若い（3〜4週齢）マウスに投与すれば、（B型肝炎に感染した若い子供と同様に）この動物は慢性肝炎を発症する。ヒトと同様に、それらはHBcを排除するが、HBsは高いレベルで血清中に残る（図1）。慢性肝炎のこのモデルを以下の実験で用いた。
【０１２２】
アラニンアミノトランスフェラーゼは、Cobas Miras Plusアナライザー（Roche Diagnostics）にて、ALT-L3Kキット（Diagnostic Chemicals Ltd）を用いて測定した。HBs AgはETI-MAX 2 Plus（Diasorin）を用いて測定し；HBs抗体は、ETI-AB-AUK-PLUSおよびABAU標準セット（Diasorin）を用いて測定した。HBcABは、ETI-AB-COREK-PLUS（Diasorin）を用いて測定した。アッセイはELx800（Biotek Instruments）波長450nmおよび630nmで読んだ。
【０１２３】
図9：  慢性B型肝炎のHBVtgRAGマウスモデル。
【０１２４】
我々のプロトコルを用いてエクスビボにてT細胞をHBsに成長させ、元来の脾臓細胞の移動から3〜4週間後に、尾静脈注射によって注射した。プラトーである1×106細胞に到達した際に、1×105〜1×108細胞で滴定を行った。以下で見ることができるように、我々のT細胞のバランスを再調整する治療法は、HBVtgRAGモデルにおいて慢性肝炎を排除する。
【０１２５】
図10：  HBs Agに対して応答性であるT細胞でHBVtgRAGモデルを処理すると、急性炎症、および従前の慢性感染の排除が導かれる。
【０１２６】
IL-4またはIL-21を、抗原提示の間に培地への補充として用いると、プラトー効果に達するのに必要なT細胞の数は、各々5×105および7×104であった。細胞のこの数は、標準的なIL-15プロトコルにおいて増殖したT細胞よりも低いログ（log）よりも大きく、これは、T濾胞性ヘルパー細胞およびTH2細胞に向かわせる培養に有利であることを示す。他方、IL-12では、プラトーに達するのに細胞の数を1×107まで増加させ、IL-2とラパマイシンでTregに向かわせると、治療に対する応答がなくなる。
【０１２７】
HBVtgRAGマウスにおける肝炎を排除する場合、異なる培養条件の結果、異なるT細胞のサブセットへ向かい、プラトーに達するまでのT細胞の数が異なる。
2014516538.tif 000005
【０１２８】
従って、異なるT細胞サブセットへT細胞を向かわせることは、重要な治療効果を有する。
【０１２９】
異なるエピトープに対するT細胞の頻度に与えるT細胞療法の効果を決定するために、異なるエピトープに対するIFNγ産生エピトープの割合（％）をElispotによって決定した。移植から6週間後に、HBs Agに対して産生されたプラトーレベルのT細胞で処理されていないか、または処理されたHBVtgRAGマウスから脾臓細胞を収集した。脾臓細胞を、肝炎コア抗原（HBc）、肝炎表面抗原（HBs）、あるいはHBsの2つのKb制限ペプチドである、ILSまたはWWLでパルスした。
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。
以下の結果が観察された。
【０１３０】
図11：HBs T細胞での処理は、免疫系のバランスを再調整し、優勢ヒエラルキーが新しくなる。
【０１３１】
理解できるように、我々のプロトコルを用いて産生されたT細胞系は、HBsに対する有意により高いT細胞応答、およびHBcに対するわずかに減少した応答を生じさせた。HBs応答は、前記のサブドミナントエピトープ（WWL）に対するデノボ応答によって主にもたらされた。このように、HBs内の優勢ヒエラルキーは、T細胞のバランスを再調整する治療法によって切り替えられた。これは、（弱いにもかかわらず）未処理動物に存在する応答が、以前にドミナントであったHBc抗原に対して以前にサブドミナントであったHBs抗原に好都合なようにHBV応答の全体のバランスを切り替える、ドミナントエピトープ（ILS）に対するものだからである。
【０１３２】
また、HBVtgRAGマウスモデルを用いて、インビボ方法がやはり免疫優勢ヒエラルキーのバランスを再調整するか否かを調べた。一つのアプローチにおいて、本発明者らは、フロイントアジュバント中のHBsを尾静脈注射（IV）、筋肉内（IM）または腹腔内（IP）に注射した。別法として、100μgのプラスミドDNAをマウスあたり投与した（データは示さず）。
【０１３３】
図12：  IM投与経路の結果、ワクチン接種中にプロテアーゼ阻害剤での用量処理にともなって、サブドミナント抗原に対するより広い応答がもたらされる。
【０１３４】
理解できるように、他の2つの投与に比べて、IM投与では4倍より強い応答が生じた。これはサブドミナントエピトープに対する応答に関連する。さらに、このマウスをプロテオソーム拮抗物質ボルテゾミブで処理し、かつ該抗原をIM投与すると、サブドミナントエピトープに対する応答はさらに強調された。
【０１３５】
実験の第二の組において、単独での、および異なるイソタイプ（IgG1対IgG2a）の2つのHBs応答性ネズミ抗体と組み合わせた場合の応答：
HBs Agに対するモノクローナル抗体
10-H05ネズミIgG1 HBsAg（Fitzgerald, Concord, MA）
10-H05AネズミIgG2a HBsAg（Fitzgerald, Concord, MA）。
【０１３６】
図13：  HBs Agに特異的な、IgG1抗体はそうでもないが、IgG2aモノクローナル抗体は、異なる優勢ヒエラルキーと、IV経路による有意に良好な抗原提示とをもたらす。
【０１３７】
抗原抗体複合体を静脈内およびIM投与すると、IgG2a複合体はサブドミナントエピトープに対するより大きな応答を生じさせた。さらに、このプロトコルは、IM投与によって達成されたものにほとんど匹敵するレベルのIV投与による免疫応答を生じさせ、これは、IgG2a免疫複合体のIV投与が、インビボにて、免疫優勢ヒエラルキーのバランスを再調整することができるであろうことを示す。
【０１３８】
本発明者らは、この観察に対する、おこりうるメカニズムとして、IgG2aが、樹状細胞で優先的に発現される高アフィニティーFcRに結合し、かくして、HBs抗原を樹状細胞に対して標的化するということではないかと仮定する。加えて、HBs Ag α決定基の第一のループ（aa124〜147）は、中和抗体による認識のための主要なエピトープであって、ILSエピトープはさらに離れているので、ILSについての抗原プロセシングが増強される可能性がある。
【０１３９】
HBV関連肝細胞癌腫におけるT細胞のバランスを再調整する治療法の臨床試験
HLA-A＊0201であったHBVおよびHCCを持つ5人の患者について、彼らの液性および細胞性免疫応答に関する免疫プロファイルを作成した。前処理臨床実験室的テストでは、B型肝炎コア抗原（HBc Ag）に対する抗体の高い力価が示されたが、B型肝炎表面抗原（HBs Ag）に対しては示されなかった（図10）。
【０１４０】
PBMCを樹状細胞に誘導し、B型肝炎コア抗原（HBc Ag）およびB型肝炎表面抗原（HBs Ag）でパルスし、これを用いて、IFMγについてElispotで試験したPBMCからCTLを成長させた。
【０１４１】
図14：患者3由来の105個のPBMCにおけるスポット形成細胞の数。
【０１４２】
ElispotでのIFNγ産生T細胞の頻度によって、ヒエラルキーが観察された：抗原なし（10sfc）＜HBsAg（15sfc）＜HBcAg（45sfc）。これは、B型肝炎表面抗原が肝炎コア抗原と比べてサブドミナントであることを示す。さらに、HBsの3つのペプチド（FLL、GLSおよびILS）を調査した：
2014516538.tif 000007
。
【０１４３】
FLLペプチドはHBsに対する応答がわずかに検出されたため多少は優勢であるように見えたが、応答が弱かったため優勢ヒエラルキーをICSアッセイによって確認した。
【０１４４】
細胞内サイトカイン染色（ICS）
5×105のCTLを再懸濁させ、ペプチド（最終濃度10-5〜10-9M）を含む100μlの1×PBS 1％FCS中で1時間インキュベートし、次いで、Golgi Plug（BD Biosciences,San Diego,CA）を加え、細胞を5％CO2において37℃で5時間インキュベートした。ペレット化して200μlのPBS 1％FCS中で洗浄し、4℃にて、表面抗原（CD4フルオレセインイソチオシアネートおよびCD8アロフィコシアニン（Pharmingen, Becton Dickinson）について30分間染色した。固定および透過化処理溶液中への再懸濁に続いて、抗ヒトIFNγフィコエリスリン（Pharmingen, BD）の1/20希釈物で、氷上で細胞を30分間染色した。1回洗浄し、PBS 1％FCSに再懸濁して、FACS Canto（Becton Dickinson）で分析した。
【０１４５】
図15：HBsエピトープに対する応答のICS分析。
【０１４６】
ICSによって検出可能な応答は強くなかったが、FLLエピトープは、再度、他の2つのエピトープにと比べてドミナントに見えた。
【０１４７】
5×106個のPBMCを各患者から単離し、次いで、（FLLを排除するために）ペプチド15〜30を除いた刺激抗原としてのHBs の15merのペプチドミックスを用い、T細胞を我々のプロトコルに従って増殖した。IL-4＋IL-15を増殖の間に用いた。1×1010個のT細胞が得られ、Elispotテストのために採取したアリコートと共に凍結させた。
【０１４８】
図16：HBs細胞は、患者に投与されるT細胞の大部分であって、これらは以前にサブドミナントであった抗原に応答する。
【０１４９】
理解できるように、生じたCTL系は、以前にサブドミナントであったHBsに対してほぼ例外なく反応性であり、これは以前にサブドミナントであったエピトープによって主としてもたらされた応答である。5×107〜1×108細胞/m2にてIV注入によってCTLを投与し、患者をモニターした。
【０１５０】
図17：  患者は急性フレアーを有し、次いで、肝炎が消散する。
【０１５１】
急性肝炎を発症した後、患者のこの肝炎が消散し、完全に排除された。14日目に、PBMCを再度収集し、細胞性免疫応答のプロファイルを再度決定した。
【０１５２】
図18：患者の免疫優勢ヒエラルキーは、以前にサブドミナントであった抗原（HBs）およびその抗原上の以前にサブドミナントであったエピトープに対して、バランスが再調整された。
【０１５３】
免疫優勢ヒエラルキーは、我々のプロセスによって増殖したT細胞によってうまくバランスが再調整された。慢性肝炎の排除に加えて、患者は、彼の肝細胞癌腫に対する完全な応答も有した。
【０１５４】
図19：  T細胞は患者の肝細胞癌腫を完全に消散させた。
【０１５５】
d.実施例4：ガンを治療するための体系的な方法
ガンの臨床的診断および治療は、その起源の組織、分化および局所的および全身転移の程度を決定するための腫瘍の生検およびイメージングを含む。ガン遺伝子または腫瘍サプレッサー遺伝子中の遺伝子的欠陥に対する診断、および化学療法剤または生物学的製剤を決定するためのアッセイは時々行われるが、一般には、患者は、その特異的ガンおよび段階に応じて、外科的処置、化学療法および放射線の組合せで処置される。同様に、種々の患者における免疫系が異なる技術を用いて研究されてきたが、この情報は患者の臨床的管理では用いられてこなかった。免疫系のバランスを再調整するための細胞療法の出現に伴い、本発明者らは、ガン患者の管理における免疫プロファイリングの使用を確立させなければならなかった。本発明者らは、その患者においてサブドミナントであって腫瘍に対する免疫応答のバランスを再調整するために患者に再度注入することができるT細胞をインビトロで成長させるのに用いることができる抗原を選択するのに用いる、標準化された免疫プロファイリング方法を開発した。治療の後に患者に関して再度プロファイルを作成して、この治療法が免疫系のバランスをうまく再調整したかを決定する。このような治療方法は新規であって、臨床的応答および生存の延長をもたらすことができる。同一のアプローチを感染性疾患および自己免疫、および臓器移植で用いることができる。
【０１５６】
最初の段階は、いずれの腫瘍関連抗原が患者の腫瘍に存在するかを同定することである。これは、一般には、患者の腫瘍からの生検での免疫組織化学によってなされる。試験するパネル抗原は、腫瘍のタイプに依存するであろう。例えば、黒色腫においては、抗原はNY-ESO-1、SSX-2、メランA、gp100、MAGE A4、MAGE A1、チロシナーゼを含み、新しい腫瘍関連抗原が記載されるように補足されるであろう。全ての腫瘍がパネルにおいて抗原の全てを発現するわけではないであろう。患者の腫瘍が有する抗原については、前述の液性および細胞性免疫応答のための全身プロファイリングを用い、異なる抗原に対するベースラインとなる免疫プロファイルを決定する。Elisaを用いて、血清中の各抗原に対する抗体力価を決定し、かつ該抗原に応答するT細胞の割合（％）をIFNγICSまたはElispotによって決定する。このようにして、ベースラインプロファイルが決定される。
【０１５７】
図20：  患者1における腫瘍抗原のパネルに対するIFNγICS。
【０１５８】
患者1においては、患者の腫瘍はNYESO-1、SSX-2、メランA、およびMAGE A4を有していた。ICSはMAGE A4に対して強い応答を示したが、NYESO-1、SSX-2およびメランAに対しては中程度の応答/無応答を示した。かくして、NYESO-、SSX-2およびメランA抗原は、以下のプロトコルを用いてインビトロ培養においてCTLを生育かつ増殖させるように選択される。
【０１５９】
5×106個のPBMCを血液から単離する。組織培養フラスコ中で末梢血液単核細胞（PBMC）を2時間平板培養して、単球の接着を可能とすることにより、単球由来の樹状細胞をPBMCからインビトロで生じさせる。この時点において、非接着性細胞を取り出し、後にT細胞源とするために-80℃において凍結する。インターロイキン4（IL-4）および顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）での接着性単球の処理によって、約1週間以内で未成熟樹状細胞（iDC）への分化に導く。腫瘍壊死因子（TNF）での引き続いての処理は、さらに、iDCを成熟樹状細胞に分化させる。次いで、これらの細胞を、45％のClick培地（Irvine Scientific, Santa Ana, CA）、2mMのGlutamax1および5％のヒト血清を補足したRPMI 1640培地中にて、3つの別々のフラスコ（しかしながら、つまりそれに対してT細胞を増殖させることを望む多くの抗原）に分離する。各フラスコを、注目する抗原についてのコーディング配列を含有する（この患者1においては、NY-ESO-1を含有する、1はSSX-2を含有する、および第三のものはメランAを含有する）3つのプラスミドの一つ（またはpepmix）でパルスする。細胞を37℃にて2時間貯蔵する。他方、PBMCを解凍し、樹状細胞に対するPBMCの比率が1：20〜1：100となるようにパルスされた樹状細胞に加え、37℃にて18時間インキュベートする。次いで、3つのフラスコの細胞をプールし、IL-15（5ng/ml）を含有する同一培地に再懸濁させて、当該抗原を認識したT細胞のインビトロ増殖を生じさせる。Grexガス透過性バイオリアクターを用ると（Wilson Wolf Manufacturing Minneapolis, MN）、培地を交換する必要性を回避し、指数関数的な増殖動態が可能となる。一般に、3×108〜1.5×1010細胞が3〜6週間内に得られ、これは患者に投与するのに十分な細胞である。
【０１６０】
T細胞はガス透過性バイオリアクター中で成長する。
T細胞は、優れたガス交換用のガス透過性膜上で層状に増殖し、必要な密度まで増殖するのに十分な体積の培地を有する。
【０１６１】
インビトロ培養の最後に、同一の抗原：NY-ESO-1、SSX-2、メランA、gp100、MAGE A4、MAGE A1、チロシナーゼを用いて、ICSアッセイでT細胞を調べる。
【０１６２】
図21：  ICSアッセイ患者1。
【０１６３】
このアッセイに基づき、各サブドミナント抗原/エピトープに応答する細胞の割合（％）を決定する。この場合、NY-ESO-1、SSX-2およびメランA。各サブドミナント抗原またはエピトープに応答する細胞の合計数は、この割合（％）および培養におけるCTLの数を用いて計算することができる。患者1の場合には、細胞の61.4％がNY-ESO-1に応答していた（図21）。
【０１６４】
これに基づいて、サブドミナント抗原に対して応答性であるCTLの既知用量を患者に投与することができる。CTLは5×106〜2×108細胞/m2で投与した。
【０１６５】
患者への注入から2〜3週間後に、PBMCを再度収集し、細胞性免疫応答のプロファイルをICSによって再度決定した。
【０１６６】
図22：  治療後のICSによる細胞性免疫プロファイリング-患者1。
【０１６７】
図23：  ELISAによる液性免疫プロファイリング（液性免疫応答の力価の逆数を以下にプロットする）-患者1。
【０１６８】
免疫ヒエラルキーアッセイ由来の細胞性および液性プロファイルから理解できるように、免疫優勢ヒエラルキーのバランスを再調整すると、以前はサブドミナントであった抗原に好都合となった。
【０１６９】
臨床的知見：
臨床的には、患者は、段階IVの転移性黒色腫を持つと診断された52歳の男性であった。彼は、IL-2と組み合わせた、ダカルバジン（DTIC）およびテモダール（テモルゾロマイド）化学療法薬物の組合せ投与レジメンに対して応答しなかった。
【０１７０】
T細胞治療から2年後、この患者は生存しており、かつ完全な応答を経験した。胸部CTスキャンで分かるように、肺中の転移は免疫バランス再調整療法から6ヵ月内に完全に消散しており、かつ安定なままであった。
【０１７１】
図24：  T細胞療法の前後におけるCTスキャン。
【０１７２】
e.実施例5：リンパ腫のT細胞療法
再発した急速に進行する非ホジキンリンパ腫を持つ150人の成人患者を3つのアームにランダム化した：A：リツキサン＋CHOP；B：腫瘍中のEBV LMP1＆LMP2抗原についての試験、続いてEBV LMP1＆LMP2 T細胞のバランス再調整、およびC：リンパ腫全体：抗原に対するアッセイは無し；EBV LMP1、LMP2、生存、MAGE A3に対して応答するように増殖したT細胞での治療。リンパ腫生検試験の40％がEBV LMP2に対して陽性、生存に関する試験は50％が陽性であり、およびMAGE A3に関する試験は15％が陽性である。標準的治療であるR-CHOP投与レジメンを用い、1 m2あたり5×107〜2×108のT細胞を投与した。
【０１７３】
図25：  進行なしでの生存。
【０１７４】
理解できるように、腫瘍に対して応答性であるT細胞は、現行の標準的治療に対して優れた応答率を提供する。1年目には失敗が起こったものの、その1年後には、CTLによって患者が寛解に維持される。これは、適切に機能する免疫系の後、バランスが再調整された証拠である。最後に、EBV LMP T細胞は、最初は良好な応答を提供するが、3年目までに、進行なしでの生存は総リンパ腫産物のそれに近づいた。さらに、リンパ腫は今日、18ヵ月〜2年以内に一般には患者で再発する、再発性寛解性の疾患である。CTLのバランスを再調整する治療法はこのコースを変化させ：一旦患者の免疫化のバランスが再調整されれば、この患者では記憶応答が生じ、これによって長期の寛解が維持される。かくして、リンパ腫の他の療法とは異なり、T細胞療法は持続可能な寛解を提供する。
【０１７５】
図26：  T細胞療法は疾患の自然な履歴を変化させる。
【０１７６】
f.実施例6：自己免疫疾患のT細胞療法
コラーゲン誘導関節炎モデル（CIA）は、DBA/1マウスにおける異種コラーゲンII（CII）での免疫化によって誘導することができる、リウマチ性関節炎（RA）のモデルである。
【０１７７】
DBA/1雄6〜8週齢マウスはJackson Laboratories（Bar Harbor, ME）から入手した。4mg/ml の結核菌(M.tuberculosis)（Chondrex）を含有するCFA中で乳化された100μgのウシCII（Chondrex, Redmond, WA）を、尾に皮下注射した。注射から5週間後までに、未処理マウスの80〜100％で十分に疾患が発症した。
【０１７８】
T細胞のインビトロ増殖について記載されたプロトコルを用い、T細胞を以下のペプチドに対して成長させた。
【０１７９】
コラーゲンII型
Tregの増殖を刺激するのに用いられる263〜270免疫ドミナントペプチド（IL-2＋ラパマイシン）。
T細胞の増殖を刺激するのに用いられる286〜300サブドミナントペプチド（IL-15）。
【０１８０】
誘導から20日後に、単独で、または等量で組み合わせて、5×106の細胞を各動物に投与した。図27参照。CD25はTreg細胞についてのマーカーである。対照動物はPBSを投与された。図28参照。
【０１８１】
最大12個の可能性がある合計スコアに対して、各肢について0〜3のスコアを用い、1週間当たり3回、マウスを臨床病についてスコア取りした：0〜1 正常；1 一桁台の数字で表される穏和な発赤および腫脹；2 紅斑を伴った足首または手首の有意な腫脹；3多数の関節のひどい腫脹および紅斑。各群における関節炎病巣を持つ動物の割合は関節炎の発生率を表す。各群における平均臨床スコアは、疾患の重症度を反映する。図28および図29参照。
【０１８２】
関節の組織病理学
図30Aは正常なラットを示し、図30Bはヒトプロテオグリカンで免疫化したラットを示し、および図30CはT細胞で処理したラットを示す。
【０１８３】
理解できるように、T細胞療法は、動物の関節における炎症の発生率、重症度および量を有意に減少させた。サブドミナントエピトープに対して産生されたT細胞およびドミナントエピトープに対して成長させたTregの間には免疫応答のバランスを再調整する際に相乗効果があるようである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年1月29日(2014.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014516538000001.app
【国際調査報告】
2014516538.tif 000042
2014516538.tif 000043