(57)【要約】本開示は、他の局面の中でも、ＡｃｔＲＩＩＡに結合する中和抗体およびその一部、ならびにこれらの使用を提供する。別の局面において、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡに結合し、かつＡｃｔＲＩＩＡ媒介性もしくはアクチビン媒介性のシグナル伝達を阻害する抗体およびそのフラグメントを提供する。このようなタンパク質についての種々の使用は、本明細書に記載される。例えば、上記抗体は、筋肉減少もしくは筋損傷によって特徴付けられる疾患もしくは状態を有する患者において、筋肉量もしくは除脂肪体重を増大させて、必要な患者においてＦＳＨを低下させ、悪液質（特に、がん悪液質）を処置し、肥満症を低減し、それによって、肥満症のような障害を処置するため、ならびに公知かつ新規なＡｃｔＲＩＩＡ結合剤を同定するためのアッセイの一部として使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＡｃｔＲＩＩＡへのアクチビンＡの結合を阻害する、単離された抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項２】
ヒトＡｃｔＲＩＩＡに結合しかつヒトＡｃｔＲＩＩＡへのＡｂ−１４Ｅ１の結合を交叉ブロックする、請求項１に記載の単離された抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項３】
ヒトＡｃｔＲＩＩＡへのアクチビンＡおよびアクチビンＢの結合を阻害する、単離された抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項４】
前記抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体もしくはフラグメントは、（ａ）卵胞刺激ホルモンレベルをインビボで低下させる活性、および（ｂ）細胞株においてインビトロでアクチビンＡシグナル伝達を阻害する活性からなる群より選択される活性を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項５】
前記抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体もしくはフラグメントは、（ａ）卵巣切除した雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて卵胞刺激ホルモンレベルを低下させる活性、および（ｂ）アクチビンＡに曝されたＡ２０４細胞株においてＣＡＧＡ１２によって調節されるレポーター遺伝子の発現を阻害する活性からなる群より選択される活性を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項６】
前記抗体もしくはそのフラグメントは、以下からなる群：
ａ．配列番号１６の１３位にあるフェニルアラニン、
ｂ．配列番号１６の１４位にあるフェニルアラニン、
ｃ．配列番号１６の１５位にあるアスパラギン、
ｄ．配列番号１６の１７位にあるアスパラギン、
ｅ．配列番号１６の２１位にあるアスパラギン酸、
ｆ．配列番号１６の２２位にあるアルギニン、
ｇ．配列番号１６の２３位にあるスレオニン、
ｈ．配列番号１６の２９位にあるグルタミン酸、
ｉ．配列番号１６の３０位にあるプロリン、
ｊ．配列番号１６の３１位にあるシステイン、
ｋ．配列番号１６の３２位にあるチロシン、
ｌ．配列番号１６の３３位にあるグリシン、
ｍ．配列番号１６の３４位にあるアスパラギン酸、
ｎ．配列番号１６の３６位にあるアスパラギン酸、
ｏ．配列番号１６の３７位にあるリジン、
ｐ．配列番号１６の３９位にあるアルギニン、
ｑ．配列番号１６の４０位にあるヒスチジン、
ｒ．配列番号１６の４２位にあるフェニルアラニン、
ｓ．配列番号１６の４４位にあるスレオニン、
ｔ．配列番号１６の４６位にあるリジン、
ｕ．配列番号１６の５５位にあるバリン、
ｖ．配列番号１６の５６位にあるリジン、
ｗ．配列番号１６の５７位にあるグルタミン、
ｘ．配列番号１６の５８位にあるグリシン、
ｙ．配列番号１６の５９位にあるシステイン、
ｚ．配列番号１６の６０位にあるトリプトファン、
ａａ．配列番号１６の６１位にあるロイシン、
ｂｂ．配列番号１６の６２位にあるアスパラギン酸、
ｃｃ．配列番号１６の６３位にあるアスパラギン酸、
ｄｄ．配列番号１６の６４位にあるイソロイシン、
ｅｅ．配列番号１６の６５位にあるアスパラギン、
ｆｆ．配列番号１６の６６位にあるシステイン、
ｇｇ．配列番号１６の７６位にあるリジン、
ｈｈ．配列番号１６の８０位にあるグルタミン酸、
ｉｉ．配列番号１６の８１位にあるバリン、
ｊｊ．配列番号１６の８３位にあるフェニルアラニン、および
ｋｋ．配列番号１６の８５位にあるシステイン、
より選択される、ヒトＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメインにおける１個以上のアミノ酸と接触する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項７】
前記抗体もしくはそのフラグメントは、以下：
ａ．配列番号１２のシステイン１から−２０位にあるバリン、
ｂ．配列番号１２のシステイン１から＋４位にあるグリシン、
ｃ．配列番号１２のシステイン１から＋５位にあるチロシン、
ｄ．配列番号１２のシステイン１から＋９位にあるセリン、
ｅ．配列番号１２のシステイン１から＋１０位にあるグリシン、
ｆ．配列番号１２のシステイン１から＋１１位にあるチロシン、
ｇ．配列番号１２のシステイン１から＋１２位にあるチロシン、
ｈ．配列番号１２のシステイン１から＋３２位にあるチロシン、
ｉ．配列番号１２のシステイン１から＋３７位にあるアスパラギン、
ｊ．配列番号１２のシステイン２から＋４位にあるアラニン、
ｋ．配列番号１２のシステイン２から＋５位にあるチロシン、
ｌ．配列番号１２のシステイン２から＋６位にあるアルギニン
ｍ．配列番号１２のシステイン２から＋７位にあるアスパラギン、
ｎ．配列番号１２のシステイン２から＋８位にあるアスパラギン酸、
ｏ．配列番号１２のシステイン２から＋１０位にあるアルギニン、
ｐ．配列番号１２のシステイン２から＋１２位にあるアラニン、
ｑ．配列番号１２のシステイン２から＋１３位にあるチロシン；および
ｒ．前述のうちのいずれかの保存的置換、
からなるＶＨ残基の群より選択される１個以上のアミノ酸を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離された抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項８】
前記抗体もしくはそのフラグメントは、以下：
ａ．配列番号１３のシステイン１から＋５位にあるアスパラギン酸、
ｂ．配列番号１３のシステイン１から＋７位にあるセリン、
ｃ．配列番号１３のシステイン１から＋９にあるアスパラギン、
ｄ．配列番号１３のシステイン１から＋１０位にあるフェニルアラニン、
ｅ．配列番号１３のシステイン１から＋２７位にあるチロシン、
ｆ．配列番号１３のシステイン１から＋２８位にあるフェニルアラニン、
ｇ．配列番号１３のシステイン１から＋３０位にあるセリン、
ｈ．配列番号１３のシステイン１から＋３１位にあるアルギニン、
ｉ．配列番号１３のシステイン１から＋３２位にあるロイシン、
ｊ．配列番号１３のシステイン１から＋３４位にあるセリン、
ｋ．配列番号１３のシステイン２から−２１位にあるセリン、
ｌ．配列番号１３のシステイン２から＋３位にあるグリシン、
ｍ．配列番号１３のシステイン２から＋４位にあるアスパラギン、
ｎ．配列番号１３のシステイン２から＋５位にあるスレオニン、
ｏ．配列番号１３のシステイン２から＋６位にあるロイシン、
ｐ．配列番号１３のシステイン２から＋８位にあるトリプトファン、および
ｑ．前述のうちのいずれかの保存的置換
からなるＶＬ残基の群より選択される１個以上のアミノ酸を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離された抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項９】
配列番号４、５、６、７、８、および９からなる群より選択されるＣＤＲに対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１個のＣＤＲ配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項１０】
配列番号４、５、６、７、８、および９からなる群より選択されるＣＤＲに対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個もしくは少なくとも６個のＣＤＲ配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項１１】
３個のＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメントであって、ここでＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号４に対して少なくとも８０％同一である配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号５に対して少なくとも８０％同一である配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号６に対して少なくとも８０％同一である配列を含む、抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項１２】
重鎖を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメントであって、ここで該重鎖は、配列番号１２に示される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを含む、抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項１３】
軽鎖を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメントであって、ここで該軽鎖は、配列番号１３に示される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを含む、抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項１４】
重鎖および軽鎖の両方を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメントであって、ここで該重鎖は、配列番号１２に示される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを含み、該軽鎖は、配列番号１３に示される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを含む、抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項１５】
ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤を生成する方法であって、該方法は、生存可能なホモ接合性ＡｃｔＲＩＩＡ欠損マウスを、ＡｃｔＲＩＩＡに由来する抗原ペプチドで免疫化する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
望ましくないＡｃｔＲＩＩＡ依存性シグナル伝達を有する患者において状態を処置する方法であって、該方法は、状態の処置を必要とする患者に、有効量の、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
前記状態は、不十分な除脂肪体重によって特徴付けられる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記状態は、筋肉量もしくは筋機能の低下によって特徴付けられる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記状態は、がん悪液質もしくは筋肉減少症である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記患者は、望ましくない高レベルの卵胞刺激ホルモンを有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメントを含む、薬学的組成物。
【請求項２２】
薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤、もしくはキャリアのうちの１種以上と組み合わせた、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項２３】
Ｆｃ、ポリエチレングリコール、アルブミン、およびトランスフェリンのうちの少なくとも１つに結合体化されている、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、２０１０年１１月８日に出願された米国仮出願第６１／４１１，３９６号の利益を主張する。上記の出願の全教示は、参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
アクチビンレセプタータイプＩＩ  Ａ（ＡｃｔＲＩＩＡもしくはＡＣＶＲ２Ａ）は、アクチビンタンパク質の高親和性レセプター、およびＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーである。ＡｃｔＲＩＩＡは、一般に、１種以上のＳＭＡＤ転写因子（特に、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３およびＳＭＡＤ５）のリン酸化をもたらすシグナルを伝達すると考えられる。ＡｃｔＲＩＩＡは、広い範囲の生物学的プロセス（骨形成、筋形成、赤血球形成、腫瘍増殖、免疫機能および生殖ホルモン（例えば、ＦＳＨ）の生成が挙げられる）の調節に影響を与えてきた。
【０００３】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は、下垂体前葉によって生成され、生殖腺機能（配偶子の生成および成熟が挙げられる）を調節する。下垂体からのＦＳＨ分泌は、性腺ホルモンおよび下垂体から生じるパラクリンエフェクターと連携して、脳からの性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）によって調節される。アクチビンは、下垂体生殖腺刺激ホルモン産生細胞からＦＳＨ分泌を増大させるその能力によって最初に同定され、アクチビン媒介性シグナル伝達は、一部は、アクチビンレセプタータイプＩＩＡ（ＡｃｔＲＩＩＡ）を介し、いまや、複数の調節レベルにおける作用を介してＦＳＨ分泌を促進すると考えられている（非特許文献１）。
【０００４】
ＦＳＨ放出は、雌性における排卵および雄性における精子の成熟にとって必須である。雌性においては、ＦＳＨは、卵巣における濾胞性顆粒膜細胞増殖を刺激し、エストロゲン合成（卵胞成熟および排卵に不可欠であるホルモン）に影響を及ぼす。雄性においては、ＦＳＨは、精子細胞の成熟に関与する。より具体的には、雄性におけるＦＳＨ作用は、セルトリ細胞に向けられ、セルトリ細胞は、上記ホルモンの認識される標的であり、精子成熟（精子形成）のプロセスを支援する。ＦＳＨはまた、前立腺において生成され、前立腺では、ＦＳＨは、細胞増殖の重要なメディエーターである。
【０００５】
よって、ＦＳＨ放出のインヒビターは、雄性および雌性の両方において避妊薬として有用である。
【０００６】
繁殖可能性における機能に加えて、ＦＳＨはまた、いくつかの疾患状態において役割を果たす。ＦＳＨレセプターの増大したレベルは、前立腺がんと関連し、最高のレベルは、ホルモン無反応性前立腺がんと関連する。前立腺がんは、米国人男性において最も一般的ながんであり、毎年、２００，０００を超える新たな症例が診断され、前立腺がんに起因する約３０，０００例の死亡が、２０１０年の間に予測されている（非特許文献２）。外科手術もしくは照射で処置した個体のうちの約４０％は、再発性前立腺がんを発症する（Ｗａｌｓｈ  Ｐ  Ｃ，  Ｒｅｔｉｋ  Ａ  Ｂ，  Ｖａｕｇｈａｎ  Ｅ  Ｄ，  ｅｄｓ．  Ｃａｍｐｂｅｌｌ’ｓ  Ｕｒｏｌｏｇｙ．  ７ｔｈ  ｅｄ．  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  Ｐａ．：  ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ；  １９９８）。再発性前立腺がんのための最も一般的な処置は、睾丸摘出、エストロゲン処置、抗アンドロゲン投与、および／もしくはＧｎＲＨアゴニスト／アンタゴニスト処置を介する、精巣テストステロン生成の抑制である。これは、通常、２〜３年間にわたって寛解を生じるが、その後、前立腺がんは、「ホルモン無反応性」となる。このことは、血中アンドロゲン濃度を去勢レベルへと低下させたとしても、前立腺がんが増殖する能力を発現することを意味する。結論として、改善された組成物および方法が、前立腺がん（特に、ホルモン無反応性前立腺がん）を処置するために必要とされる。
【０００７】
下垂体腫瘍（腺腫）は、上記腫瘍の特定の位置に依存して、異なるホルモン生成領域に代表的には影響を及ぼす非癌性の増殖である。下垂体腫瘍は、頭蓋内腫瘍のうちの約１５％を占め、局所圧効果（ｌｏｃａｌ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ）、ホルモン過剰分泌、もしくは処置関連内分泌欠損に起因して、重大な罹病率と関連する（Ｈｅａｎｅｙ  Ａ．  Ｐ．ら：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｔｕｍｏｒｓ．  Ｉｎ：  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  Ｗａｓｓ  Ｊ．  Ａ．  Ｈ．  ａｎｄ  Ｓｈａｌｅｔ  Ｓ．  Ｍ．，  （Ｅｄｓ．），  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ２００２）。下垂体腺腫の大部分は、良性であり、比較的ゆっくりと増殖する。しかし、下垂体腫瘍は、下垂体ホルモンのうちの１種以上の過剰生成をもたらし得る。ＦＳＨ分泌下垂体腫瘍は、しばしば、多嚢胞性卵巣（ｍｕｌｔｉｃｙｓｔｉｃ  ｏｖａｒｉｅｓ）の発症および上昇したエストラジオールレベルをもたらす。次に、エストラジオールレベルの増大は、子宮内膜がんおよび前立腺がんを含む、健康上のリスクに寄与する。結論として、改善された組成物および方法は、ＦＳＨ分泌下垂体腫瘍と関連した症状を処置するために必要とされる。
【０００８】
ＦＳＨシグナル伝達経路は、腫瘍タイプの広い範囲において腫瘍血管形成と関連してきた。Ｒａｄｕ  Ａ，ら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２０１０  Ｏｃｔ  ２１；３６３（１７）：１６２１−３０。よって、ＦＳＨ分泌を阻害する化合物は、種々の処置において有用である。
【０００９】
本開示は、一部、ＦＳＨ生成を阻害するために使用され得るＡｃｔＲＩＩＡのアンタゴニスト、および他の使用を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｇｒｅｇｏｒｙら、Ｓｅｍｉｎ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｍｅｄ（２００４）２２：２５３〜２６７
【非特許文献２】Ｊｅｍａｌ  Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，  ２０１０．  ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ（２０１０）６０：２７７〜３００
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本開示は、他の局面の中でも、ＡｃｔＲＩＩＡに結合し、かつＡｃｔＲＩＩＡ媒介性もしくはアクチビン媒介性のシグナル伝達を阻害する抗体およびそのフラグメントを提供する。このようなタンパク質についての種々の使用は、本明細書に記載される。例えば、上記抗体は、筋肉減少（ｍｕｓｃｌｅ  ｌｏｓｓ）もしくは筋損傷によって特徴付けられる疾患もしくは状態を有する患者において、筋肉量もしくは除脂肪体重（ｌｅａｎ  ｂｏｄｙ  ｍａｓｓ）を増大させて、必要な患者においてＦＳＨを低下させ、悪液質（特に、がん悪液質）を処置し、肥満症を低減し、それによって、肥満症のような障害を処置するため、ならびに公知かつ新規なＡｃｔＲＩＩＡ結合剤を同定するためのアッセイの一部として使用され得る。
【００１２】
本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡに特異的に結合し、必要に応じて、１種以上のＡｃｔＲＩＩＡリガンド（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ミオスタチン、ＢＭＰ７および／もしくは他の公知のＡｃｔＲＩＩＡリガンド）の結合を阻害する結合剤（例えば、抗体）に関する。上記結合剤は、これらが、ＡｃｔＲＩＩＡへの本明細書で開示される少なくとも１種の抗体の結合を交叉ブロックし、そして／または上記抗体のうちの少なくとも１種によってＡｃｔＲＩＩＡの結合から交叉ブロックされる能力によって特徴付けられ得る。特定の実施形態において、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体もしくはそのフラグメントは、細胞株におけるＡｃｔＲＩＩＡ媒介性シグナル伝達をインビトロで阻害し得る。ＡｃｔＲＩＩＡ媒介性シグナル伝達は、例えば、ＡｃｔＲＩＩＡを発現する細胞と、ＡｃｔＲＩＩＡリガンド（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ミオスタチンもしくはＧＤＦ−１１）とを、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体の存在下で接触させることによって、測定され得る。特定の実施形態において、中和抗体もしくはそのフラグメントのような結合剤は、リガンド結合に重要な複数の残基において、ＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメインを同時に接触させることによって、１種以上のＡｃｔＲＩＩＡリガンドへのＡｃｔＲＩＩＡの結合を阻害し得る。部分的に、本開示は、以下：
（ａ）配列番号１６の１３位にあるフェニルアラニン、（ｂ）配列番号１６の１４位にあるフェニルアラニン、（ｃ）配列番号１６の１５位にあるアスパラギン、（ｄ）配列番号１６の１７位にあるアスパラギン、（ｅ）配列番号１６の２１位にあるアスパラギン酸、（ｆ）配列番号１６の２２位にあるアルギニン、（ｇ）配列番号１６の２３位にあるスレオニン、（ｈ）配列番号１６の２９位にあるグルタミン酸、（ｉ）配列番号１６の３０位にあるプロリン、（ｊ）配列番号１６の３１位にあるシステイン、（ｋ）配列番号１６の３２位にあるチロシン、（ｌ）配列番号１６の３３位にあるグリシン、（ｍ）配列番号１６の３４位にあるアスパラギン酸、（ｎ）配列番号１６の３６位にあるアスパラギン酸、（ｏ）配列番号１６の３７位にあるリジン、（ｐ）配列番号１６の３９位にあるアルギニン、（ｑ）配列番号１６の４０位にあるヒスチジン、（ｒ）配列番号１６の４２位にあるフェニルアラニン、（ｓ）配列番号１６の４４位にあるスレオニン、（ｔ）配列番号１６の４６位にあるリジン、（ｕ）配列番号１６の５５位にあるバリン、（ｖ）配列番号１６の５６位にあるリジン、（ｗ）配列番号１６の５７位にあるグルタミン、（ｘ）配列番号１６の５８位にあるグリシン、（ｙ）配列番号１６の５９位にあるシステイン、（ｚ）配列番号１６の６０位にあるトリプトファン、（ａａ）配列番号１６の６１位にあるロイシン、（ｂｂ）配列番号１６の６２位にあるアスパラギン酸、（ｃｃ）配列番号１６の６３位にあるアスパラギン酸、（ｄｄ）配列番号１６の６４位にあるイソロイシン、（ｅｅ）配列番号１６の６５位にあるアスパラギン、（ｆｆ）配列番号１６の６６位にあるシステイン、（ｇｇ）配列番号１６の７６位にあるリジン、（ｈｈ）配列番号１６の８０位にあるグルタミン酸、（ｉｉ）配列番号１６の８１位にあるバリン、（ｊｊ）配列番号１６の８３位にあるフェニルアラニン、および（ｋｋ）配列番号１６の８５位にあるシステイン
からなる群より選択されるヒトＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメインにおける１個以上のアミノ酸と接触する抗体およびそのフラグメントのような結合剤に関する。
【００１３】
ＡｃｔＲＩＩＡ結合抗体もしくはそのフラグメントにおける複数の残基は、ＡｃｔＲＩＩＡシグナル伝達を中和する目的で、ＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメインにおける領域と接触させるために使用され得る。本明細書で例示されるように、ＶＨにおいて高度に保存された残基は、可変性残基を示すために参照点として働き得る２個のシステインを含む。特定の局面において、本開示は、以下：
（ａ）配列番号１２のシステイン１から−２０位にあるバリン、（ｂ）配列番号１２のシステイン１から＋４位にあるグリシン、（ｃ）配列番号１２のシステイン１から＋５位にあるチロシン、（ｄ）配列番号１２のシステイン１から＋９位にあるセリン、（ｅ）配列番号１２のシステイン１から＋１０位にあるグリシン、（ｆ）配列番号１２のシステイン１から＋１１位にあるチロシン、（ｇ）配列番号１２のシステイン１から＋１２位にあるチロシン、（ｈ）配列番号１２のシステイン１から＋３２位にあるチロシン、（ｉ）配列番号１２のシステイン１から＋３７位にあるアスパラギン、（ｊ）配列番号１２のシステイン２から＋４位にあるアラニン、（ｋ）配列番号１２のシステイン２から＋５位にあるチロシン、（ｌ）配列番号１２のシステイン２から＋６位にあるアルギニン、（ｍ）配列番号１２のシステイン２から＋７位にあるアスパラギン、（ｎ）配列番号１２のシステイン２から＋８位にあるアスパラギン酸、（ｏ）配列番号１２のシステイン２から＋１０位にあるアルギニン、（ｐ）配列番号１２のシステイン２から＋１２位にあるアラニン、（ｑ）配列番号１２のシステイン２から＋１３位にあるチロシン；および（ｒ）前述のうちのいずれかの保存的置換
からなるＶＨ残基の群より選択される１個以上のアミノ酸を含む結合剤（例えば、抗体およびそのフラグメント）に関する。
【００１４】
ＶＬにおける高度に保存された残基はまた、可変性残基を示すために参照点として働き得る２個のシステインを含む。特定の局面において、本開示は、以下：
（ａ）配列番号１３のシステイン１から＋５位にあるアスパラギン酸、（ｂ）配列番号１３のシステイン１から＋７位にあるセリン、（ｃ）配列番号１３のシステイン１から＋９位にあるアスパラギン、（ｄ）配列番号１３のシステイン１から＋１０位にあるフェニルアラニン、（ｅ）配列番号１３のシステイン１から＋２７位にあるチロシン、（ｆ）配列番号１３のシステイン１から＋２８位にあるフェニルアラニン、（ｇ）配列番号１３のシステイン１から＋３０位にあるセリン、（ｈ）配列番号１３のシステイン１から＋３１位にあるアルギニン、（ｉ）配列番号１３のシステイン１から＋３２位にあるロイシン、（ｊ）配列番号１３のシステイン１から＋３４位にあるセリン、（ｋ）配列番号１３のシステイン２から−２１位にあるセリン、（ｌ）配列番号１３のシステイン２から＋３位にあるグリシン、（ｍ）配列番号１３のシステイン２から＋４位にあるアスパラギン、（ｎ）配列番号１３のシステイン２から＋５位にあるスレオニン、（ｏ）配列番号１３のシステイン２から＋６位にあるロイシン、（ｐ）配列番号１３のシステイン２から＋８位にあるトリプトファン、および（ｑ）前述のうちのいずれかの保存的置換
からなるＶＬ残基の群より選択される１個以上のアミノ酸を含む結合剤（例えば、抗体およびそのフラグメント）に関する。
【００１５】
ＡｃｔＲＩＩＡに特異的に結合し、配列番号４、５、６、７、８、および９から選択される少なくとも１個のＣＤＲ配列、ならびに前述のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％同一なポリペプチドを含むか、これらからなるか、もしくはこれらから本質的になる結合剤（例えば、抗体およびそのフラグメント）が、本明細書で提供される。ＡｃｔＲＩＩＡに特異的に結合し、そして配列番号４、５、６、７、８、および９から選択される少なくとも２個のＣＤＲ配列、ならびに前述のうちのいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％同一なポリペプチドを含むか、これらからなるか、もしくはこれらから本質的になる結合剤（例えば、抗体およびそのフラグメント）もまた、本明細書で提供される。別の実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩＡに特異的に結合し、そして配列番号４、５、６、７、８、および９から選択される少なくとも３個のＣＤＲ配列、ならびに前述のうちのいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％同一なポリペプチドを含むか、これらからなるか、もしくはこれらから本質的になる結合剤（例えば、抗体およびそのフラグメント）が提供される。別の実施形態は、ＡｃｔＲＩＩＡに特異的に結合し、そして配列番号４、５、６、７、８、および９に由来する少なくとも４個のＣＤＲ配列、ならびに前述のうちのいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％同一なポリペプチドを含むか、これらからなるか、もしくはこれらから本質的になる結合剤（例えば、抗体およびそのフラグメント）を提供する。さらに別の実施形態は、ＡｃｔＲＩＩＡに特異的に結合し、配列番号４、５、６、７、８、および９に由来する少なくとも５個のＣＤＲ配列、ならびに前述のうちのいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％同一なポリペプチドを含むか、これらからなるか、もしくはこれらから本質的になる結合剤（例えば、抗体およびそのフラグメント）を提供する。なお別の実施形態において、ＡｃｔＲＩＩＡに特異的に結合し、配列番号４、５、６、７、８、および９に由来する少なくとも６個のＣＤＲ配列、ならびに前述のうちのいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％同一なポリペプチドを含むか、これらからなるか、もしくはこれらから本質的になる結合剤（例えば、抗体およびそのフラグメント）が提供される。
【００１６】
本開示はさらに、３個のＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３）を含む結合剤（例えば、抗体およびそのフラグメント）に関し、ここでＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％同一な配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％同一な配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％同一な配列を含む。
【００１７】
特定の実施形態において、本開示は、配列番号１２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％の同一性を有するポリペプチドを含む重鎖を含む結合剤（例えば、抗体およびそのフラグメント）に関する。別の実施形態において、本発明は、配列番号１３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％の同一性を有するポリペプチドを含む軽鎖を含む結合剤（例えば、抗体およびそのフラグメント）に関する。なお別の実施形態において、本発明は、重鎖および軽鎖の両方を含む結合剤（例えば、抗体およびそのフラグメント）に関し、ここで上記重鎖は、配列番号１２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％の同一性を有するポリペプチドを含み、上記軽鎖は、配列番号１３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。
【００１８】
別の実施形態において、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡに特異的に結合し得る抗体を生成するための方法に関し、上記方法は、生存可能なホモ接合性ＡｃｔＲＩＩＡ欠損マウスを、ＡｃｔＲＩＩＡに由来する抗原ポリペプチドで免疫化する工程を包含する。
【００１９】
本発明は、望ましくないＡｃｔＲＩＩＡ媒介性もしくはアクチビン媒介性のシグナル伝達を有する患者における状態（がん、上昇したＦＳＨ、および不十分な除脂肪体重、もしくは肥満症が挙げられるが、これらに限定されない）を処置するための方法に関し、上記方法は、有効量のＡｃｔＲＩＩＡ結合剤（例えば、抗体もしくはそのフラグメント）を投与する工程を包含する。
【００２０】
特定の局面において、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡ関連状態（例えば、神経筋障害（例えば、筋ジストロフィーおよび筋萎縮）、鬱血性閉塞性肺疾患（ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）もしくは肺気腫（および関連する筋消耗）、筋消耗症候群（ｍｕｓｃｌｅ  ｗａｓｔｉｎｇ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、筋肉減少症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、悪液質、脂肪組織障害（例えば、肥満症）、２型糖尿病、ならびに骨変性疾患（例えば、骨粗鬆症））を処置し得る抗体に関する。本発明のＡｃｔＲＩＩＡ結合剤は、本明細書で記載されるように、従来のがん治療との組み合わせにおいて、前立腺がんにおけるＦＳＨを低下させるか、またはがん悪液質において筋肉を増大させるために使用され得る。よって、ＡｃｔＲＩＩＡに結合する抗体およびそのフラグメントは、必要な患者において前立腺がんもしくはがん悪液質の処置、予防、もしくは管理のための組み合わせ治療において使用され得る。実施例において示されるように、ＡｃｔＲＩＩＡに結合するアクチビンＡおよび／もしくはアクチビンＢを阻害する抗体は、ＦＳＨレベルを低下させ、筋肉を増大させ、脂肪を低下させ、そして悪液質を改善するために、インビボで使用され得る。
【００２１】
本発明はまた、上記ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤（例えば、抗体もしくはそのフラグメント）を含む薬学的組成物を提供し、上記組成物中には、薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤、もしくはキャリアのうちの１種以上が存在し得る。本明細書で開示される場合、上記抗体もしくはそのフラグメントは、Ｆｃ、ポリエチレングリコール、アルブミン、もしくはトランスフェリンのうちの少なくとも１種に結合体化され得る。
【００２２】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して明らかになる。本明細書で開示される全ての参考文献は、各々が個々に援用されるかのように、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、Ａｂ−１４Ｅ１の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。２個の強調されたアミノ酸は、Ｊフラグメント（下線を付した）を完全にするために含められ得る。
【図２】図２は、Ａｂ−１４Ｅ１の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（配列番号１３）を示す。
【図３】図３は、Ａｂ−１４Ｅ１のＶＨをコードするヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す。６個の強調されたヌクレオチドは、Ｊフラグメントを完全にするために含められ得る。２種の代替の活性Ｎ末端配列は、「元の」および「最終の」と示される。
【図４】図４は、Ａｂ−１４Ｅ１のＶＬをコードするヌクレオチド配列（配列番号１５）を示す。
【図５】図５は、ｘ線結晶解析によって決定された、高親和性結合に際してヒトＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と接触する１４Ｅ１  Ｆａｂ  ＶＨ配列中の特異性決定残基（ＳＤＲ、アスタリスクとともに強調）を示す。ＶＨにおける２個のシステインは、番号付けされ、ＣＤＲ配列は、下線を付される。
【図６】図６は、ヒトＡｃｔＲＩＩＡ  ＥＣＤのアミノ酸配列（配列番号１６）を示し、結晶解析によって決定される場合、高親和性結合に際して１４Ｅ１  Ｆａｂ  ＶＨによって接触される残基（アスタリスクとともに強調）を同定する。
【図７】図７は、結晶解析によって決定される場合、高親和性結合に際してヒトＡｃｔＲＩＩＡ  ＥＣＤと接触する１４Ｅ１  Ｆａｂ  ＶＬ配列中の特異性決定残基（ＳＤＲ、アスタリスクとともに強調）を示す。ＶＬ中の２個のシステインは番号づけられ、ＣＤＲ配列には、下線が付される。
【図８】図８は、ヒトＡｃｔＲＩＩＡ  ＥＣＤのアミノ酸配列を示し、結晶解析によって決定される場合、高親和性結合に際して１４Ｅ１  Ｆａｂ  ＶＬによって接触される残基（アスタリスクとともに強調）を同定する。
【図９】図９は、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭベースの分析によって決定される場合、Ａｂ−１４Ｅ１に結合するＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃの動態を示す。Ａ．Ａｂ−１４Ｅ１を、共有結合的に固定した抗ｍＦＣ  ＩｇＧでチップに捕捉し、次いで、異なる濃度においてＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃに曝した。Ｂ．非線形回帰による分析から、ＫＤ  １２ｐＭを得た。これは、そこから計算される解離速度定数（ｋｄ，  １０−６ｓ−１）が遅すぎて正確には測定できないので、近似値である。ＲＵ，相対単位。
【図１０】図１０は、Ａｂ−１４Ｅ１が、異なるＡｃｔＲＩＩＡリガンドへのＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃの結合をブロックする能力を示す。Ａ．このＢＩＡＣＯＲＥＴＭベースの測定において、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃは、まず、捕捉したＡｂ−１４Ｅ１へ結合させ、次いで、これを、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ＢＭＰ−１０、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−８、もしくはＧＤＦ−１１（各２０ｎＭにおいて）に曝した。Ｂ．ほぼ平坦な応答プロフィールによって示されるように、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃへのこれらリガンドの結合は、Ａｂ−１４Ｅ１によってほぼ完全に阻害された。
【図１１】図１１は、Ａｂ−１４Ｅ１が、異なるＡｃｔＲＩＩＡリガンドへのＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃの結合をブロックする能力を実証するような、逆にしたタンパク質構成の使用を示す。Ａ．このＢＩＡＣＯＲＥＴＭベースの測定において、捕捉されたＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃは、Ａｂ−１４Ｅ１へ結合させ、次いで、これを、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ＢＭＰ−１０、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−８、もしくはＧＤＦ−１１（各２０ｎＭにおいて）に曝した。Ｂ．図１０におけるように、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃへのリガンド結合は、Ａｂ−１４Ｅ１によってほぼ完全に阻害された。
【図１２】図１２は、ＡｃｔＲＩＩＡリガンドが、Ａｂ−１４Ｅ１へのＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃの結合を競合的に阻害する能力を示す。Ａ．このＢＩＡＣＯＲＥＴＭベースの測定において、捕捉されたＡｂ−１４Ｅ１を、種々の濃度の所定のリガンド（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ＢＭＰ−１０、もしくはＧＤＦ−１１）と予め混合した固定濃度のＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ（５０ｎＭ）を含む溶液に曝した。Ｂ．試験した最高濃度（１００ｎＭ）において、アクチビンＡ（示される）およびＢＭＰ−１０は、Ａｂ−１４Ｅ１へのＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃの結合を９５％阻害した一方で、他のリガンドは、この濃度においてより低い阻害の程度を示した。
【図１３】図１３は、Ａｂ−１４Ｅ１が、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビンＡ媒介性シグナル伝達を中和する能力を示す。Ａ２０４細胞において、レポーター遺伝子発現に対するアクチビンＡの効果が、ＡｃｔＲＩＩＡによって主に媒介される場合、Ａｂ−１４Ｅ１は、濃度依存性様式において、ＩＣ５０  ５７．１ｎｇ／ｍｌでアクチビンＡ刺激性遺伝子発現を阻害した。
【図１４】図１４は、卵巣切除したマウス（ＯＶＸ）もしくは偽手術したマウスにおける卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の血清レベルに対するＡｂ−１４Ｅ１の効果を示す。平均±ＳＥＭ；＊＊，ＯＶＸ＋ビヒクルに対してｐ＜０．０１。Ａｂ−１４Ｅ１での処置は、ＯＶＸマウスにおけるＦＳＨレベルを、５０％超低下させた。
【図１５】図１５は、がん悪液質様症候群に負けるインヒビン欠損雄性マウスにおける体重に対するＡｂ−１４Ｅ１の効果を示す。０日目に始めた同時の投与および体重測定を、動物が死亡するまで続けた；８０日目までの結果を示す。Ａｂ−１４Ｅ１での処置は、ビヒクルと比較して、改善した体重プロフィールによって実証されるように、腫瘍依存性悪液質を緩和した。
【図１６】図１６は、正常マウスにおける体重増加に対するＡｂ−１４Ｅ１の効果を示す。＊，対応する研究日数に対するビヒクルに対してｐ＜０．０５。コントロールと比較して、Ａｂ−１４Ｅ１で処置したマウスは、研究の過程全体を通じて、有意により大きな体重増加を示した。
【図１７】図１７は、全身ＮＭＲによって決定される場合、研究の終わりに、正常マウスにおける除脂肪量（ｌｅａｎ  ｍａｓｓ）増加に対するＡｂ−１４Ｅ１の効果を示す。＊＊＊，ビヒクルに対してｐ＜０．００１。処置の４週間後に、Ａｂ−１４Ｅ１で処置したマウスは、コントロールの２倍超程度、除脂肪量を増加させた。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
（１．概説）
トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーは、共通配列エレメントおよび構造モチーフを共有する種々の増殖因子を含む。これらタンパク質は、脊椎動物および無脊椎動物の両方において、非常に多くの細胞タイプに対して生物学的効果を発揮することが公知である。上記スーパーファミリーのメンバーは、パターン形成および組織明確化（ｔｉｓｓｕｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）における胚発生の間に重要な機能を発揮し、種々の分化プロセス（脂肪生成、筋発生、軟骨形成、心臓発生、造血、神経発生、および上皮細胞分化が挙げられる）に影響を及ぼし得る。上記ＴＧＦ−βファミリーのメンバーの活性を操作することによって、生物において重大な生理学的変化を引き起こすことは、しばしば可能である。例えば、ＰｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅおよびＢｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅというウシ品種は、筋肉量において顕著な増大を引き起こす、ＧＤＦ８（ミオスタチンともいわれる）遺伝子における機能喪失変異を有する。Ｇｒｏｂｅｔら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  １９９７，  １７（１）：７１−４。さらに、ヒトにおいては、ＧＤＦ８の不活性対立遺伝子は、増大した筋肉量、および報告によれば、例外的な強さと関連している。Ｓｃｈｕｅｌｋｅら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００４，  ３５０：２６８２−８。
【００２５】
アクチビンは、上記ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するダイマーポリペプチド増殖因子である。２種の密接に関連したβサブユニットのホモ／ヘテロダイマー（βＡβＡ、βＢβＢ、およびβＡβＢ）である３種の重要なアクチビン形態（Ａ、Ｂ、およびＡＢ）がある。ヒトゲノムはまた、肝臓において主に発現されるアクチビンＣおよびアクチビンＥをコードする。上記ＴＧＦ−βスーパーファミリーにおいて、アクチビンは、特有のかつ多機能の因子であり、これは、卵巣および胎盤の細胞におけるホルモン生成を刺激し得、神経細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ）の生存を支援し得、細胞タイプに依存して陽性にもしくは陰性に細胞周期進行に影響を与え得、少なくとも両生類の胚において中胚葉分化を誘導し得る（ＤｅＰａｏｌｏら、１９９１，  Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．  １９８：５００〜５１２；Ｄｙｓｏｎら、１９９７，  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．  ７：８１〜８４；Ｗｏｏｄｒｕｆｆ，  １９９８，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ５５：９５３〜９６３）。さらに、刺激されたヒト単球性白血病細胞から単離した赤血球分化誘導因子（ＥＤＦ）は、アクチビンＡと同一であることが見いだされた（Ｍｕｒａｔａら、１９８８，  ＰＮＡＳ，  ８５：２４３４）。アクチビンＡは、骨髄において造血の天然の陽性レギュレーターとして作用することが示唆された。いくつかの組織において、アクチビンシグナル伝達は、その関連ヘテロダイマーであるインヒビンによって拮抗される。例えば、下垂体からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出の間に、アクチビンは、ＦＳＨ分泌および合成を促進する一方で、インヒビンは、ＦＳＨ分泌および合成を妨げる。アクチビンの生物活性を調節し、そして／またはアクチビンに結合し得る他のタンパク質としては、フォリスタチン（ＦＳ）、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ）、α２−マクログロブリン、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、およびエンドグリンが挙げられる。
【００２６】
アクチビンシグナルは、タイプＩおよびタイプＩＩ  セリン／スレオニンキナーゼレセプター（これは、リガンド刺激の際に、下流のＳｍａｄタンパク質をリン酸化および活性化する）のヘテロマー複合体によって媒介される（Ｍａｓｓａｇｕｅ，  ２０００，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １：１６９〜１７８）。これらタイプＩおよびタイプＩＩレセプターは、膜貫通タンパク質であり、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および推定セリン／スレオニン特異性を有する細胞質ドメインから構成される。タイプＩレセプターは、シグナル伝達に必須であり；タイプＩＩレセプターは、リガンドを結合するため、およびタイプＩレセプターの発現のために必要とされる。タイプＩおよびタイプＩＩのアクチビンレセプターは、リガンド結合の後に安定な複合体を形成し、タイプＩＩレセプターによるタイプＩレセプターのリン酸化を生じる。
【００２７】
２種の関連するタイプＩＩレセプターである、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣおよびアクチビンＥのタイプＩＩレセプターとして同定された（ＭａｔｈｅｗｓおよびＶａｌｅ，  １９９１，  Ｃｅｌｌ  ６５：９７３〜９８２；Ａｔｔｉｓａｎｏら、１９９２，  Ｃｅｌｌ  ６８：９７〜１０８）。アクチビンの他に、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢは、いくつかの他のＴＧＦ−βファミリータンパク質（ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１が挙げられる）と生化学的に相互作用し得る（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、１９９５，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １３０：２１７〜２２６；ＬｅｅおよびＭｃＰｈｅｒｒｏｎ，  ２００１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９８：９３０６〜９３１１；ＹｅｏおよびＷｈｉｔｍａｎ，  ２００１，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ７：９４９〜９５７；Ｏｈら、２００２，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １６：２７４９〜５４）。ＡＬＫ４は、アクチビンの（特に、アクチビンＡの）主なタイプＩレセプターであり、ＡＬＫ−７は、同様にアクチビンの（特に、アクチビンＢの）レセプターとして働き得る。
【００２８】
アクチンシグナル伝達経路のインヒビターは、種々の障害（筋肉減少、過剰なＦＳＨ、肥満症、骨喪失、種々の腫瘍（多発性骨髄腫および乳がんが挙げられる）および貧血が挙げられる）の処置について提唱されてきた。本発明者らの知識では、ＡｃｔＲＩＩＡに結合し、上記ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーによるシグナル伝達を阻害する抗体は、何ら生成されていない。ＡｃｔＲＩＩＡは、ほぼ２０年間にわたって知られているものの、ヒト、マウスおよび他の脊椎動物のＡｃｔＲＩＩＡ配列の間での高度の保存が、ＡｃｔＲＩＩＡノックアウト動物の報告された致死性と組み合わせて、中和抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体の生成を妨げた可能性がある。本明細書で実証されるように、ＡｃｔＲＩＩＡシグナル伝達を中和する抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体が生成され得、本開示は、広範囲の構造的および機能的特徴付けを提供して、広い範囲の中和抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体およびそのフラグメントを利用しやすいようにする。
【００２９】
本明細書で示されるように、中和抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体は、種々の適応症において（がんおよび悪液質の処置が挙げられる）、および必要な患者においてＦＳＨレベルを低下させるために、使用され得る。
【００３０】
本明細書において使用される用語は、一般に、当該分野において、本発明の状況内で、および各用語が使用される具体的文脈において、それらの通常の意味を有する。特定の用語は、本発明の組成物および方法、ならびにそれらの作製法および使用法を記載するにあたって、実務家にさらなるガイドラインを提供するために、以下でもしくは本明細書中の他の箇所で考察される。用語の何らかの使用の範囲および意味は、上記用語が使用される具体的文脈から明らかである。
【００３１】
「約（ａｂｏｕｔ）」および「約、およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」とは、一般に、測定の性質および精度を考慮して、測定される量についての誤差の許容される程度を意味するものとする。代表的には、例示的な誤差の程度は、所定の値もしくは値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは、１０％以内、およびより好ましくは、５％以内である。代わりに、および特に、生物学的システムにおいて、用語「約」および「約、およそ」は、所定の値の一桁以内、好ましくは５倍以内、およびより好ましくは２倍以内である値を意味し得る。本明細書で与えられる数値的な量は、別段示されなければ近似値であり、用語「約」もしくは「約、およそ」が、明らかに示されない場合には暗示され得ることを意味する。
【００３２】
本発明の方法は、互いに配列を比較する工程（１種以上の変異体（配列改変体）に対して野生型配列が挙げられる）を包含し得る。このような比較は、代表的には、ポリマー配列のアラインメント（例えば、当該分野で周知の配列アラインメントプログラムおよび／もしくはアルゴリズム（例えば、いくつか挙げると、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＭＥＧＡＬＩＧＮ）を使用する）を含む。当業者は、このようなアラインメントにおいて、変異が、残基挿入もしくは欠失を含む場合に、上記配列アラインメントが、「ギャップ」（代表的には、ダッシュもしくは「Ａ」によって表される）を挿入もしくは欠失した残基を含まないポリマー配列の中に導入することを容易に理解し得る。別段示されなければ、ＢＬＡＳＴは、比較のためのデフォルトアルゴリズムであるものとする。
【００３３】
「相同な」とは、その全ての文法的形態および綴りのバリエーションにおいて、同じ生物種におけるスーパーファミリーに由来するタンパク質、および異なる生物種に由来する相同なタンパク質を含む、「共通する進化起源」を有する２種のタンパク質の間の関係をいう。このようなタンパク質（およびそれらのコードする核酸）は、配列同一性、または特定の残基もしくはモチーフおよび保存された位置の存在に関わらず、それらの配列類似性によって示されるように配列相同性を有する。
【００３４】
用語「配列類似性」は、その全ての文法的形態において、共通する進化起源を共有してもよいし、しなくてもよい核酸もしくはアミノ酸配列の間の同一性もしくは対応の程度に言及する。
【００３５】
しかし、一般的使用法において、および本願において、用語「相同な」とは、「高度に」のような副詞で修飾される場合、配列類似性に言及し得、共通の進化起源に関連してもよいし、関連しなくてもよい。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「ＡｃｔＲＩＩＡ」とは、任意の種に由来するアクチビンレセプタータイプＩＩＡ（ＡｃｔＲＩＩＡ）タンパク質のファミリーおよびこのようなＡｃｔＲＩＩＡタンパク質に由来する改変体に言及する。本明細書でのＡｃｔＲＩＩＡへの言及は、現在同定された形態のうちのいずれか１つへの言及であることが理解される。上記ＡｃｔＲＩＩＡファミリーのメンバーは、一般に、膜貫通タンパク質であり、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および推定セリン／スレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインから構成される。
【００３７】
上記ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆タンパク質配列は、以下のとおりであり、下線が付された配列は、文献で報告された成熟細胞外ドメインに対応し、この中には、中和抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体および他のＡｃｔＲＩＩＡ結合剤によって標的とされるエピトープがある。
【００３８】
【化１】
2014502260.tif 000002
ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆タンパク質をコードする核酸配列は、以下のとおりである（ＧｅｎｂａｎｋエントリーＮＭ＿００１６１６のヌクレオチド１６４〜１７０５）：
【００３９】
【化２】
2014502260.tif 000003
（２．ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤）
本発明は、一部は、全長ＡｃｔＲＩＩＡにまた結合する抗体によって認識されるエピトープを含む上記ＡｃｔＲＩＩＡタンパク質の領域、およびこれらエピトープを作製および使用するための方法に関する。本発明はまた、ＡｃｔＲＩＩＡもしくはＡｃｔＲＩＩＡの一部に特異的に結合する結合剤（例えば、抗体）、およびこのような結合剤を使用するための方法を提供する。上記結合剤は、１種以上のリガンドへのヒトＡｃｔＲＩＩＡの結合をブロックするかもしくは損ない、そしてその生物学的活性に干渉するために有用である。
【００４０】
ＡｃｔＲＩＩＡのオルソログの間に高度の配列同一性が存在するということは、当業者によって理解されている。ヒトＡｃｔＲＩＩＡのマウスオルソログは、既に記載されており（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ．  Ｓｅｑ．：  ＮＰ＿０３１４２２）、これは、成熟した４９４アミノ酸タンパク質において２個の置換によってのみ異なり、一方ラットオルソログは、既に記載されており（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ．  Ｓｅｑ．：  ＮＰ＿１１３７５９）、これは、３個の置換によってのみ異なる。よって、ヒトＡｃｔＲＩＩＡに結合する薬剤は、上記結合剤の認識部位（例えば、エピトープのような抗体結合部位）が、高度に保存されており、特に、ヒト配列に対してほぼもしくは完全に同一である場合に、マウスＡｃｔＲＩＩＡもしくはラットＡｃｔＲＩＩＡに結合すると予期される。従って、用語「ＡｃｔＲＩＩＡに特異的に結合する」が使用される場合、複数の種の間の配列が保存されている場合、複数の種のＡｃｔＲＩＩＡに結合することを含むことが理解される。
【００４１】
本発明に従う結合剤の例としては、抗体１４Ｅ１（Ａｂ−１４Ｅ１）が挙げられる。本明細書で使用される場合、Ａｂ−１４Ｅ１は、配列番号１４および配列番号１５において示されるヌクレオチドによって発現されるポリペプチドを含む。
【００４２】
本発明の結合剤は、代表的には、本明細書で定義されるように、抗体もしくはそのフラグメントである。用語「抗体」とは、インタクトな抗体もしくはその結合フラグメントに言及する。抗体は、完全な抗体分子（全長の重鎖および／もしくは軽鎖を有するポリクローナルバージョン、モノクローナルバージョン、キメラバージョン、ヒト化バージョンもしくはヒトバージョンを含む）を含み得るか、またはそれらの抗原結合フラグメントを含む。抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆｃ、およびＦｄフラグメントを含み、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、マキシボディー（ｍａｘｉｂｏｄｉｅｓ）、ミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、イントラボディー（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、トリボディー（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディー（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖ（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，  ２００５，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２３，  ９，  １  １２６−１１３６を参照のこと）へと組み込まれ得る。抗体様ポリペプチドはまた、米国特許第６，７０３，１９９号［「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに譲渡］において開示されており、これは、フィブロネクチンポリペプチドモノボディー（ｍｏｎｏｂｏｄｉｅｓ）を含む。他の抗体様ポリペプチドは、米国特許公開第２００５／０２３８６４６号において開示されており、これは、一本鎖ポリペプチドである。本明細書で使用される場合、上記単離された抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体などであり得る。結合剤のこれらタイプの各々において、一般に、本明細書で開示される抗体に由来する１個以上のＣＤＲを挿入して、代替的なＡｃｔＲＩＩＡ結合剤を生成することが期待される。
【００４３】
本発明に従う抗体は、あらゆる免疫グロブリンクラス（例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＧ２／４ハイブリッドを含む）、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＡ）に属し得る。上記抗体は、動物（例えば、トリ（例えば、ニワトリ）および哺乳動物（これらとしては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ヒト、もしくは他の霊長類が挙げられるが、これらに限定されない））から得られるか、もしくはこれらに由来し得る。上記抗体は、内在化抗体（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であり得る。
【００４４】
抗体に由来する抗原結合フラグメントは、例えば、上記抗体のタンパク質分解的加水分解（例えば、従来法に従う完全抗体のペプシン消化もしくはパパイン消化）によって得られ得る。例示によれば、抗体フラグメントは、抗体をペプシンで酵素的に切断して、Ｆ（ａｂ’）２といわれる５Ｓフラグメントを提供することによって生成され得る。このフラグメントは、チオール還元剤を使用してさらに切断されて、３．５Ｓ  Ｆａｂ  １価フラグメントを生成し得る。必要に応じて、上記切断反応は、ジスルフィド結合の切断に起因するスルフヒドリル基のためのブロッキング基を使用して行われ得る。代わりに、パパインを使用する酵素的切断は、２種の１価ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントを直接生成する。これら方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇによって、米国特許第４，３３１，６４７号、Ｎｉｓｏｎｏｆｆら、Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ８９：２３０，  １９６０；  Ｐｏｒｔｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ７３：１１９，  １９５９；  Ｅｄｅｌｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １  ：４２２  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９６７）において；およびＡｎｄｒｅｗｓ，  Ｓ．  Ｍ．およびＴｉｔｕｓ，  Ｊ．  Ａ．によって、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．  Ｅ．，ら、ｅｄｓ），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （２００３），  ｐａｇｅｓ  ２．８．１〜２．８．１０および２．１０Ａ．１〜２．１０Ａ．５において記載されている。抗体を切断するための（例えば、重鎖を分離して、１価軽鎖−重鎖フラグメント（Ｆｄ）を形成するための）他の方法、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的、化学的、もしくは遺伝的技術もまた、上記フラグメントが、上記インタクトな抗体によって認識される上記抗原に結合する限りにおいて使用され得る。
【００４５】
抗体フラグメントはまた、任意の合成タンパク質もしくは遺伝子操作されたタンパク質であり得る。例えば、抗体フラグメントは、軽鎖可変領域からなる単離されたフラグメント、上記重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメント、軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって接続された組換え一本鎖ポリペプチド分子（ｓｃＦｖタンパク質）を含む。
【００４６】
抗体フラグメントの別の形態は、抗体の１個以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドである。ＣＤＲ（「最小認識単位」もしくは「超可変領域」ともいわれる）は、上記目的のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを構築することによって得られ得る。このようなポリヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、テンプレートとして抗体生成細胞のｍＲＮＡを使用して可変領域を合成することによって調製される（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ：  Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：１０６，  １９９１；  Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ，  「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｒｉｔｔｅｒら、（ｅｄｓ．），  ｐａｇｅ  １６６  （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；およびＷａｒｄら、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｂｉｒｃｈら、（ｅｄｓ．），  ｐａｇｅ  １３７  （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９９５）を参照のこと）。
【００４７】
従って、一実施形態において、上記結合剤は、本明細書に記載される少なくとも１個のＣＤＲを含む。上記結合剤は、本明細書に記載されるように、少なくとも２個、３個、４個、５個もしくは６個のＣＤＲを含む。上記結合剤は、本明細書に記載される抗体の少なくとも１個の可変領域ドメインをさらに含み得る。上記可変領域ドメインは、任意のサイズもしくはアミノ酸組成のものであり得、一般に、ヒトＡｃｔＲＩＩＡに対する結合を担う少なくとも１個のＣＤＲ配列（例えば、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３）を含み、そして／または上記軽鎖ＣＤＲは、本明細書に具体的に記載され、１種以上のフレームワーク配列に隣接しているか、または上記フレームワークとインフレームにある。一般的用語において、上記可変（Ｖ）領域ドメインは、免疫グロブリン重鎖（ＶＨ）および／もしくは軽鎖（ＶＬ）可変ドメインの任意の適切な配置であり得る。従って、例えば、上記Ｖ領域ドメインは、モノマーであってもよいし、ＶＨドメインもしくはＶＬドメインであってもよく、これは、以下に記載されるように１×１０−７Ｍ以下と少なくとも等しい親和性でヒトＡｃｔＲＩＩＡに独立して結合し得る。あるいは、上記Ｖ領域ドメインは、ダイマーであってもよいし、ＶＨ−ＶＨダイマー、ＶＨ−ＶＬダイマー、もしくはＶＬ−ＶＬダイマーを含んでいてもよい。上記Ｖ領域ダイマーは、非共有結合的に会合している可能性のある少なくとも１個のＶＨおよび少なくとも１個のＶＬ鎖（本明細書中以降、ＦＶといわれる）を含む。所望であれば、上記鎖は、直接的に（例えば、２個の可変ドメインの間のジスルフィド結合を介して）、もしくはリンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介してかのいずれかで、共有結合的に結合されて、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成し得る。
【００４８】
上記可変領域ドメインは、任意の天然に存在する可変ドメインもしくはその操作されたバージョンであり得る。操作されたバージョンとは、組換えＤＮＡ操作技術を使用して作製された可変領域ドメインを意味する。このような操作されたバージョンは、例えば、上記特異的抗体のアミノ酸配列における挿入、欠失、もしくは変更によって特異的抗体可変領域から作製されたものを含む。特定の例としては、第１の抗体に由来する少なくとも１個のＣＤＲ、および必要に応じて、１個以上のフレームワークアミノ酸、ならびに第２の抗体に由来する上記可変領域ドメインの残りを含む操作された可変領域ドメインを含む。
【００４９】
上記可変領域ドメインは、Ｃ末端アミノ酸において、少なくとも１個の他の抗体ドメインもしくはそのフラグメントに共有結合され得る。従って、例えば、上記可変領域ドメインに存在するＶＨドメインは、免疫グロブリンＣＨ１ドメインもしくはそのフラグメントに連結され得る。同様に、ＶＬドメインは、ＣＫドメインもしくはそのフラグメントに連結され得る。このように、例えば、上記抗体は、Ｆａｂフラグメントであり得、ここで上記抗原結合ドメインは、それらのＣ末端において、それぞれ、ＣＨ１ドメインおよびＣＫドメインに共有結合的に連結される、会合したＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む。上記ＣＨ１ドメインは、さらなるアミノ酸で伸長されて、Ｆａｂフラグメントにおいて見いだされるようにヒンジ領域もしくはヒンジ領域の一部を提供し得るか、またはさらなるドメイン（例えば、抗体ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）を提供し得る。
【００５０】
本明細書で記載されるように、結合剤は、これらＣＤＲのうちの少なくとも１個を含み得る。例えば、１個以上のＣＤＲは、公知の抗体フレームワーク領域（ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２など）へと組み込まれ得るか、または適切なビヒクルに結合体化されて、それらの半減期を増強し得る。適切なビヒクルとしては、Ｆｃ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、トランスフェリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらおよび他の適切なビヒクルは、当該分野で公知である。このような結合体化されたＣＤＲペプチドは、モノマー、ダイマー、テトラマー、もしくは他の形態にあり得る。一実施形態において、１種以上の水溶性ポリマーが、結合剤の１個以上の特定の位置において、例えば、アミノ末端において結合される。
【００５１】
特定の実施形態において、結合剤は、１種以上の水溶性ポリマー結合物（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）を含み、これらとしては、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、もしくはポリプロピレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号および同第４，１７９，３３７号を参照のこと。特定の実施形態において、誘導体の結合剤は、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、もしくは他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール、ならびにこのようなポリマーの混合物のうちの１種以上を含む。特定の実施形態において、１種以上の水溶性ポリマーは、１個以上の側鎖に無作為に結合される。特定の実施形態において、ＰＥＧは、結合剤（例えば、抗体）の治療能力を改善するために作用し得る。特定のこのような方法は、例えば、米国特許第６，１３３，４２６号（これは、あらゆる目的のために本明細書に参考として援用される）において考察されている。
【００５２】
本発明に従う抗体は、本明細書で記載され、そして当該分野で公知であるとおりの従来の免疫化および細胞融合手順によって得られ得る。本発明のモノクローナル抗体は、種々の公知の技術を使用して、生成され得る。一般に、特定の抗原に結合するモノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって得られ得る（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５，  １９７５；  Ｃｏｌｉｇａｎら、（ｅｄｓ．），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １  ：２．５．１２．６．７  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９１）；米国再発行特許第ＲＥ  ３２，０１１号、米国特許第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号、および同第４，４１１，９９３号；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｋｅｎｎｅｔｔ，  ＭｃＫｅａｒｎ，  ａｎｄ  Ｂｅｃｈｔｏｌ  （ｅｄｓ．）  （１９８０）；ならびにＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （ｅｄｓ．），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８８）；  Ｐｉｃｋｓｌｅｙら、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅ．  ｃｏｌｉ」，  ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｇｌｏｖｅｒら（ｅｄｓ．），  ｐａｇｅ  ９３  （Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）を参照のこと）。抗体フラグメントは、任意の適切な標準的技術（例えば、タンパク質分解的消化）を使用して、もしくは必要に応じて、タンパク質分解的消化（例えば、パパインもしくはペプシンを使用して）、続いて、ジスルフィド結合の穏和な還元およびアルキル化によって、上記モノクローナル抗体から得られ得る。あるいは、このようなフラグメントはまた、本明細書で記載される組換え遺伝子操作技術によって生成され得る。
【００５３】
モノクローナル抗体は、動物（例えば、ラット、ハムスター、ウサギ、もしくは、好ましくは、マウス、好ましくは、ＡｃｔＲＩＩＡ欠損性マウス）に、配列番号１のヒトＡｃｔＲＩＩＡ、もしくはそのフラグメントを含む免疫原を、当該分野で公知でありかつ本明細書で記載される方法に従って注射することによって、得られ得る。ＡｃｔＲＩＩＡ欠損性マウス（すなわち、Ａｃｖｒ２−／−ノックアウトマウス）は、実質的に低下した生存能および他の欠損を有するので、十分に健康かつ適切に繁殖されたマウスを得るためには、注意が必要である。特異的抗体生成の存在は、血清サンプルを得、ヒトＡｃｔＲＩＩＡもしくはペプチドに結合する抗体の存在を、当該分野で公知でありかつ本明細書に記載されるいくつかの免疫検出法のうちのいずれか１つを使用して検出することによって、最初の注射後および／もしくはブースター注射の後に、モニターされ得る。所望の抗体を生成する動物から、リンパ系細胞（最も一般には、脾臓もしくはリンパ節に由来する細胞）は、Ｂリンパ球を得るために取り出される。次いで、上記Ｂリンパ球は、薬物感作した骨髄腫細胞融合パートナー（好ましくは、免疫化した動物と同系でありかつ必要に応じて、他の所望の特性（例えば、内因性Ｉｇ遺伝子生成物を発現できない能力）を有するもの（例えば、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ  ８．６５３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ＣＲＬ  １５８０）；ＮＳＯ、ＳＰ２０）と融合されて、ハイブリドーマ（これは、不死の真核生物細胞株である）を生成する。上記リンパ系（例えば、脾臓）細胞および上記骨髄腫細胞は、数分間にわたって膜融合促進剤（例えば、ポリエチレングリコールもしくは非イオン性洗剤）と合わせられ得、次いで、低密度において、ハイブリドーマ細胞の増殖を支持するが、非融合骨髄腫細胞は支持しない選択培地上にプレートされ得る。好ましい選択培地は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）である。十分な時間（通常は、約１〜２週間）の後に、細胞のコロニーが観察される。単一のコロニーが単離され、上記細胞によって生成される抗体は、ヒトＡｃｔＲＩＩＡに対する結合活性について、当該分野で公知でありかつ本明細書に記載される種々のイムノアッセイのうちのいずれか１つを使用して試験され得る。上記ハイブリドーマはクローニングされ（例えば、限界希釈クローニングによって、もしくは軟寒天プラーク単離によって）、ＡｃｔＲＩＩＡに特異的な抗体を生成する陽性クローンが選択されかつ培養される。上記ハイブリドーマ培養物に由来するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物の上清から単離され得る。マウスモノクローナル抗体を生成するための代替法は、同系マウス（例えば、上記モノクローナル抗体を含む腹水の形成を促進するように処置された（例えば、プリスタンで初回刺激された（ｐｒｉｍｅｄ））マウス）の腹腔へと上記ハイブリドーマ細胞を注射することである。モノクローナル抗体は単離され得、種々の十分に確立された技術によって精製され得る。このような単離技術としては、プロテイン−Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでのアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる（例えば、Ｃ��ｌｉｇａｎ  ａｔ  ｐａｇｅｓ  ２．７．１〜２．７．１２  ａｎｄ  ｐａｇｅｓ  ２．９．１−２．９．３；  Ｂａｉｎｅｓら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  （ＩｇＧ）」，  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １０，  ｐａｇｅｓ  ７９−  １０４  （Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９９２）を参照のこと）。モノクローナル抗体は、適切なリガンド（その選択は、上記抗体の特定の特性（例えば、重鎖もしくは軽鎖のアイソタイプ、結合特異性など）に基づく）を使用して、アフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。固体支持体に固定化された適切なリガンドの例としては、プロテインＡ、プロテインＧ、抗定常領域（軽鎖もしくは重鎖）抗体、抗イディオタイプ抗体、およびＡｃｔＲＩＩａタンパク質、またはこれらのフラグメントもしくは改変体が挙げられる。
【００５４】
本発明の結合剤が、上記結合剤が結合特異性を保持するという条件で少なくとも１個のアミノ酸置換を有し得ることは、当業者によって理解される。従って、上記結合剤の構造への改変は、本発明の範囲内に包含される。これらは、アミノ酸置換を含み得、上記アミノ酸置換は、保存的であってもよいし、非保存的であってもよく、結合剤のＡｃｔＲＩＩＡ結合能を破壊しない。保存的アミノ酸置換は、天然に存在しないアミノ酸残基（これらは、代表的には、生物学的システムにおける合成よりむしろ、化学ペプチド合成によって組み込まれる）を包含し得る。これらは、アミノ酸部分のペプチド摸倣物および他の逆転した形態（ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｆｏｒｍ）または反転した形態（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｆｏｒｍ）を含む。保存的アミノ酸置換はまた、その位置でのアミノ酸残基の極性もしくは電荷に対してほとんどもしくは全く影響がないように、標準の残基での天然のアミノ酸残基の置換を包含し得る。
【００５５】
保存的置換は、「好ましい置換」の見出しの下で、表１に示される。このような置換が、生物学的活性における変化を生じれば、より実質的な変化（表１中の「例示的置換」、もしくはアミノ酸クラスに言及して以下でさらに記載されるように称される）が導入され得、その生成物がスクリーニングされ得る。
【００５６】
【表１】
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上記抗体の生物学的特性における実質的改変は、（ａ）上記置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造（例えば、シートもしくはヘリックスコンホメーションとして）、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ高さ、を維持することに対してそれらの効果が有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、一般的な側鎖特性に基づいて、以下の群に分けられる：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ノルロイシン；
（２）中性かつ親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００５７】
非保存的置換は、アミノ酸もしくはアミノ酸摸倣物のあるクラスのメンバーを、異なる物理的特性（例えば、サイズ、極性、疎水性、電荷）を有する別のクラスのメンバーと交換することを包含し得る。このような置換された残基は、非ヒト抗体と相同なヒト抗体の領域へ、もしくは上記分子の非相同性領域へと導入され得る。
【００５８】
さらに、当業者は、各所望のアミノ酸残基において単一のアミノ酸置換を含む試験改変体を生成し得る。次いで、上記改変体は、本明細書で記載されるとおりの活性アッセイを使用してスクリーニングされ得る。このような改変体は、適切な改変体についての情報を集めるために使用され得る。例えば、特定のアミノ酸残基への変更が、破壊された活性、望ましくなく低下された活性、もしくは不適切な活性を生じたことが発見されれば、このような変更を有する改変体は、回避され得る。言い換えれば、このような慣用的実験から集めた情報に基づいて、当業者は、単独で、もしくは他の変異と組み合わせてのいずれかで、さらなる置換を回避すべきアミノ酸を容易に決定し得る。
【００５９】
当業者は、周知の技術を使用して、本明細書で示されるポリペプチドの適切な改変体を決定し得る。特定の実施形態において、当業者は、活性にとって重要であるとは考えられない領域を標的とすることによって、活性を破壊することなく変化させられ得る上記分子の適切な領域（ａｒｅａ）を同定し得る。特定の実施形態において、類似のポリペプチドの中で保存されている、上記分子の残基および部分が同定され得る。特定の実施形態においては、生物学的活性にとって、もしくは構造にとって重要であり得る領域すら、上記生物学的活性を破壊することなく、もしくは上記ポリペプチド構造に有害に影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換に供され得る。
【００６０】
さらに、当業者は、活性もしくは構造にとって重要である類似のポリペプチド中の残基を同定する構造−機能研究を検討し得る。このような比較に鑑みて、類似のタンパク質における活性もしくは構造にとって重要なアミノ酸残基に対応する、タンパク質中のアミノ酸残基の重要性が、予測され得る。当業者は、このような予測される重要なアミノ酸残基のための化学的に類似のアミノ酸置換を決定し得る。
【００６１】
本開示は、ヒトＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と複合体化したモノクローナルＡｂ−１４Ｅ１  Ｆａｂフラグメントのｘ線結晶解析の結果を包含する。実施例において詳述されるように、分析は、Ａｂ−１４Ｅ１  ＶＨ（配列番号１２）において１７アミノ酸残基、およびＡｂ−１４Ｅ１  ＶＬ（配列番号１３）において１６残基を同定した。これら残基は、ヒトＡｃｔＲＩＩＡ  ＥＣＤにおけるアミノ酸と接触しているので、特異性決定残基（ＳＤＲ）と考えられ得る（Ｐａｄｌａｎら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ９：１３３−１３９  （１９９５））。これらＳＤＲの大部分は、上記ＣＤＲ内に集中している。２個以上のＳＤＲは、ＣＤＲに直ぐ隣接して位置し、第１は、ＣＤＲ−Ｈ１の次に、かつ上記第１の保存的されたシステイン（Ｃ１）からの＋４残基に優先的に位置したグリシン。配列番号１２においてＣ１から＋３残基もしくは＋５残基に位置したグリシンを含む改変体が企画される。上記第２のこのようなＳＤＲは、ＣＤＲ−Ｌ２の次に、かつＣ１から＋２６残基に優先的に位置したチロシンであり、配列番号１３におけるＣ１から＋２４残基、＋２５残基、＋２７残基、もしくは＋２８残基に位置したチロシンを有する改変体が企画される。最後に、２種のさらなる（「サテライト」）ＳＤＲは、ＣＤＲの十分外側に位置し、第１は、配列番号１２におけるＣ１から−２０残基に優先的に位置するバリンであり、第２は、配列番号１３における第２の保存されたシステイン（Ｃ２）から−２１残基に優先的に位置するセリンである。改変体は、配列番号１２におけるＣ１から−１８残基、−１９残基、−２１残基、もしくは−２２残基に位置するバリンを含むか、または配列番号１３におけるＣ２から−１９残基、−２０残基、−２２残基、もしくは−２３残基に位置するセリンを含むと想定される。上記３３個のＳＤＲ位置において、および上記ＣＤＲ内の非ＳＤＲ位置において存在するとしても、保存的変異のみが許容されることは、予測される。改変体、特に、配列番号４、５、６、７、８、および９の対応する一部に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の同一性を有するものが企図される。上記ＳＤＲおよびＣＤＲの外側にあるフレームワーク領域では、非保存的変異が許容されることが予測され、改変体は、配列番号１２および配列番号１３の対応する一部に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の同一性を有すると企図される。
【００６２】
多くの科学刊行物が、二次構造の予測に捧げられてきた。Ｍｏｕｌｔ  Ｊ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ７（４）：４２２−４２７  （１９９６），  Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １３（２）：２２２−２４５  （１９７４）；  Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １１３（２）：２１１−２２２  （１９７４）；  Ｃｈｏｕら、Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  Ｒｅｌａｔ．  Ａｒｅａｓ  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．，  ４７：  ４５−１４８  （１９７８）；  Ｃｈｏｕら、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ４７：２５１−２７６およびＣｈｏｕら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．，  ２６：３６７−３８４  （１９７９）を参照のこと。さらに、コンピュータープログラムは、二次構造の予測を補助するために現在利用可能である。二次構造を予測する一方法は、相同性モデル化に基づく。例えば、３０％より大きい配列同一性、もしくは４０％より大きい配列類似性を有する２種のポリペプチドもしくはタンパク質は、しばしば、類似の構造トポロジーを有する。上記タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の発展は、ポリペプチドもしくはタンパク質の構造内の潜在的折りたたみ回数を含む、二次構造の増強された予測可能性を提供した。Ｈｏｌｍら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．，  ２７（ｌ）：２４４〜２４７（１９９９）を参照のこと。所定のポリペプチドもしくはタンパク質において、折りたたみ回数が制限されていること、およびいったん構造の限界の個数（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｎｕｍｂｅｒ）が解明されると、構造予測は、劇的により正確になることは、示唆される（Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，  ７（３）：３６９〜３７６（１９９７））。
【００６３】
二次構造を予測するさらなる方法としては、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，  Ｄ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，  ７（３）：３７７〜８７（１９９７）；Ｓｉｐｐｌら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ４（１）：１５〜１９（１９９６））、「プロフィール分析」（Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５３：１６４〜１７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍ．，  １８３：１４６〜１５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８４（１３）：４３５５〜４３５８（１９８７））、および「進化的連関（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍ，前出（１９９９）、およびＢｒｅｎｎｅｒ，前出（１９９７）を参照のこと）が挙げられる。
【００６４】
いくつかのタンパク質（例えば、抗体）が、宿主細胞からの発現および分泌の間に、種々の翻訳後修飾を受け得ることは、当業者によって理解される。これら修飾のタイプおよび程度は、しばしば、上記タンパク質を発現するために使用される宿主細胞株、および培養条件に依存する。このような修飾としては、グリコシル化、メチオニンもしくはトリプトファンの酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化およびアスパラギン脱アミドにおける変動が挙げられ得る。頻繁な修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用に起因する（Ｈａｒｒｉｓ，  ＲＪ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ７０５：１２９〜１３４、１９９５に記載されるように）、カルボキシ末端塩基性残基（例えば、リジンもしくはアルギニン）の喪失である。上記タンパク質がいったん発現されかつプロセシングされたら、それらタンパク質は、「成熟」形態にある。従って、本発明は、本発明のＤＮＡの発現から生じる成熟抗体を包含することは理解される。
【００６５】
特定の実施形態において、結合剤の改変体としては、グリコシル化改変体が挙げられ、ここでグリコシル化部位の数および／もしくはタイプは、親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、変化されている。特定の実施形態において、改変体は、上記天然タンパク質より多くのもしくはより少ない数のＮ結合型グリコシル化部位を含む。Ｎ結合型グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒもしくはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられ、ここでＸとして示される上記アミノ酸残基は、プロリンを除く任意のアミノ酸残基であり得る。この配列を作るためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ結合型炭水化物鎖の付加のための潜在的な新たな部位を提供する。あるいは、この配列を除去する置換は、既存のＮ結合型炭水化物鎖を除去する。Ｎ結合型炭水化物鎖の再配列（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）もまた提供され、ここで１個以上のＮ結合型グリコシル化部位（代表的には、天然に存在するもの）は除去され、１個以上の新たなＮ結合型部位が作られる。さらなる好ましい抗体改変体としては、１個以上のシステイン残基が、上記親アミノ酸配列と比較して、欠失されるかもしくは別のアミノ酸（例えば、セリン）で置換されているシステイン改変体が挙げられる。システイン改変体は、抗体が生物学的に活性なコンホメーションへと（例えば、不溶性封入体の単離の後に）再折りたたみされなければならない場合に有用であり得る。システイン改変体は、一般に、上記天然タンパク質より少ないシステイン残基を有し、代表的には、不対システインから生じる相互作用を最小限にするために偶数を有し得る。
【００６６】
アミノ酸置換（保存的であろうと非保存的であろうと）は、このような置換が所望される場合に、当業者によって決定され得る。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、ＡｃｔＲＩＩＡに対する抗体の重要な残基を同定するために、または本明細書に記載されるＡｃｔＲＩＩＡに対する抗体の親和性を増大もしくは低下させるために、使用され得る。
【００６７】
特定の実施形態によれば、好ましいアミノ酸置換は、以下のものである：（１）タンパク質分解への感受性を低下させる、（２）酸化への感受性を低下させる、（３）タンパク質複合体を形成させるために結合親和性を変化させる、（４）結合親和性を変化させる、そして／または（４）このようなポリペプチドに対して他の物理化学的特性もしくは機能的特性を付与するかもしくは改変する。特定の実施形態によれば、単一もしくは複数のアミノ酸置換（特定の実施形態において、保存的アミノ酸置換）は、天然に存在する配列において作製され得る（特定の実施形態において、上記ドメインの外側にあるポリペプチドの一部において、分子間接触を形成する）。特定の実施形態において、保存的アミノ酸置換は、代表的には、上記親配列の構造的特徴を実質的に変更しなくてもよい（例えば、置換アミノ酸は、上記親配列に存在するヘリックスを壊す傾向にも、上記親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を破壊する傾向にもないはずである）。当該分野で認識されているポリペプチド二次構造および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  （Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｅｄ．，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））；  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  （Ｃ．  Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｔｏｏｚｅ，  ｅｄｓ．，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）（これらは、各々本明細書に参考として援用される）に記載されている。
【００６８】
特定の実施形態において、本発明の結合剤は、ポリマー、脂質もしくは他の部分と化学的に結合され得る。
【００６９】
上記結合剤は、生体適合性のフレームワーク構造に組み込まれる、本明細書に記載されるＣＤＲのうちの少なくとも１個を含み得る。一例において、上記生体適合性フレームワーク構造は、コンホメーション的に安定な構造支持体、もしくはフレームワーク、もしくは足場を形成するために十分なポリペプチドもしくはその一部を含む。これは、局在化した表面領域における抗原に結合する１つ以上のアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ、可変領域など）を提示し得る。このような構造は、天然に存在するポリペプチドもしくはポリペプチド「折りたたみ」（構造モチーフ）であり得るか、または１種以上の改変（例えば、天然に存在するポリペプチドもしくは折りたたみに対するアミノ酸の付加、欠失もしくは置換）を有し得る。これら足場は、任意の種（例えば、ヒト、他の哺乳動物、他の脊椎動物、無脊椎動物、植物、細菌、もしくはウイルス）の（もしくは１より多くの種の）ポリペプチドに由来し得る。
【００７０】
代表的には、上記生体適合性のフレームワーク構造は、免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質足場もしくは骨格に基づく。例えば、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルチノスタチン（ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｉｎ）、シトクロームｂ、ＣＰｌジンクフィンガー、ＰＳＴｌ、コイルドコイル、ＬＡＣｌ−Ｄｌ、Ｚドメインおよびテンダミスタット（ｔｅｎｄｒａｍｉｓａｔ）ドメインに基づくものが、使用され得る（例えば、Ｎｙｇｒｅｎ  ａｎｄ  Ｕｈｌｅｎ，  １９９７，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ７，  ４６３〜４６９を参照のこと）。
【００７１】
好ましい実施形態において、本発明の結合剤が、ヒト化抗体（これは、当業者に公知の技術を使用して生成され得る）を含むことは、理解される（Ｚｈａｎｇ，  Ｗ．，ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ４２（１２）：１４４５〜１４５１、２００５；Ｈｗａｎｇ  Ｗ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ．３６（ｌ）：３５〜４２、２００５；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  Ｗ  Ｆ，ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６（ｌ）：４３〜６０、２００５；およびＣｌａｒｋ，  Ｍ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ．  ２１（８）：３９７〜４０２、２０００）。
【００７２】
本発明の抗体はまた、ヒトモノクローナル抗体であり得る。ヒトモノクローナル抗体は、当業者が精通している多くの技術によって生成され得る。このような方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ヒト末梢血細胞（例えば、Ｂリンパ球を含む）のエプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）形質転換、ヒトＢ細胞のインビトロ免疫化、挿入されたヒト免疫グロブリン遺伝子を有する免疫化したトランスジェニックマウスに由来する脾細胞の融合、ヒト免疫グロブリンＶ領域ファージライブラリーからの単離、もしくは当該分野で公知のかつ本明細書中の開示に基づく他の手順。例えば、ヒトモノクローナル抗体は、抗原チャレンジに応じて、特異的ヒト抗体を生成するように操作されたトランスジェニックマウスから得られ得る。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ７：１３，  １９９４；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６，  １９９４；Ｔａｙｌｏｒら、Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６：５７９，  １９９４；米国特許第５，８７７，３９７号；  Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、１９９７  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ８：４５５〜５８；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９５  Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７６４：５２５〜３５によって記載されている。この技術において、上記ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座のエレメントは、上記内因性重鎖および軽鎖の遺伝子座の標的化した破壊を含む胚性幹細胞株から得られたマウス系統に導入される（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ８：４５５〜５８（１９９７）もまた参照のこと）。例えば、ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、ミニ遺伝子構築物、もしくは酵母人工染色体上のトランス遺伝子座（ｔｒａｎｓｌｏｃｉ）であり得、これらは、Ｂ細胞特異的ＤＮＡ再配列およびマウスリンパ組織における超変異を受ける。ヒトモノクローナル抗体は、上記トランスジェニックマウスを免疫化することによって得られ得る。次いで、上記マウスは、ＡｃｔＲＩＩＡに特異的なヒト抗体を生成し得る。上記免疫化トランスジェニックマウスのリンパ系細胞は、本明細書に記載される方法に従って、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを生成するために使用され得る。ヒト抗体を含むポリクローナル血清はまた、上記免疫化動物の血液から得られ得る。
【００７３】
本発明のヒト抗体を生成するための別の方法は、ＥＢＶ形質転換によってヒト末梢血細胞を不死化する工程を包含する。例えば、米国特許第４，４６４，４５６号を参照のこと。このような、ＡｃｔＲＩＩＡに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する不死化Ｂ細胞株（もしくはリンパ芽球様細胞株）は、本明細書に提供される免疫検出法（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって同定され得、次いで、標準的なクローニング技術によって単離され得る。抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体を生成する上記リンパ芽球様細胞株の安定性は、上記形質転換された細胞株と、マウス骨髄腫とを融合して、当該分野で公知の方法に従って、マウス−ヒトハイブリッド細胞株を生成することによって改善され得る（例えば、Ｇｌａｓｋｙら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ８：３７７〜８９（１９８９）を参照のこと）。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのなお別の方法は、インビトロ免疫化であり、これは、ヒトＡｃｔＲＩＩＡでヒト脾臓Ｂ細胞を初回刺激し、続いて、初回刺激したＢ細胞とヘテロハイブリッド融合パートナーとを融合する工程を包含する。例えば、Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：８６〜９５を参照のこと。
【００７４】
特定の実施形態において、抗ヒトＡｃｔＲＩＩＡ抗体を生成しているＢ細胞が選択され、上記軽鎖および重鎖の可変領域が、当該分野で公知であり（ＷＯ  ９２／０２５５１；米国特許第５，６２７，０５２号；  Ｂａｂｃｏｏｋら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：７８４３−４８  （１９９６））かつ本明細書で記載される分子生物学技術に従って上記Ｂ細胞からクローニングされる。免疫化した動物に由来するＢ細胞は、脾臓、リンパ節、もしくは末梢血サンプルから、ＡｃｔＲＩＩＡに特異的に結合する抗体を生成している細胞を選択することによって単離され得る。Ｂ細胞はまた、ヒトから、例えば、末梢血サンプルから単離され得る。所望の特異性を有する抗体を生成している単一のＢ細胞を検出するための方法は、当該分野で周知であり、例えば、プラーク形成、蛍光標識細胞分取、インビトロ刺激、続いて、特異的抗体の検出などによる。特異的抗体生成Ｂ細胞の選択法は、例えば、ヒトＡｃｔＲＩＩＡを含む軟寒天中でＢ細胞の単一細胞懸濁物を調製する工程を包含する。上記抗原への、Ｂ細胞によって生成された上記特異的抗体の結合は、複合体の形成を生じ、これは、免疫沈降物として目に見え得る。上記所望の抗体を生成するＢ細胞が選択された後、上記特異的抗体の遺伝子は、当該分野で公知かつ本明細書に記載される方法に従って、ＤＮＡもしくはｍＲＮＡを単離および増幅することによってクローニングされ得る。
【００７５】
さらに、当業者は、適切な結合剤が、本明細書で具体的に開示されるように、これら抗体の一部（例えば、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３のうちの１個以上）を含むことを認識する。ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の領域のうちの少なくとも１個は、上記結合剤が、上記置換されていないＣＤＲの結合特異性を保持するという条件で、少なくとも１個のアミノ酸置換を有し得る。ＣＤＲは、長さも増大もしくは減少するように変化させられ得るので、置換、挿入および欠失として特徴付けられる変化は、全て企図される。上記結合剤の非ＣＤＲ部分は、非タンパク質分子であり得、ここで上記結合剤は、ＡｃｔＲＩＩＡへの本明細書で開示される抗体の結合を交叉ブロックし、そして／またはＡｃｔＲＩＩＡを中和する。上記結合剤の上記非ＣＤＲ部分は、アミノ酸から構成され得、ここで上記結合剤は、組換え結合タンパク質もしくは合成ペプチドであり、上記組換え結合タンパク質は、ＡｃｔＲＩＩＡへの本明細書で開示される抗体の結合を交叉ブロックし、そして／またはＡｃｔＲＩＩＡを中和する。上記結合剤の上記非ＣＤＲ部分は、アミノ酸から構成され得、ここで上記結合剤は、組換え結合タンパク質であり、上記組換え結合タンパク質は、上記ヒトＡｃｔＲＩＩＡペプチドエピトープ競合結合アッセイ（本明細書以降に記載される）において、ヒトＡｃｔＲＩＩＡペプチドへの、抗体Ａｂ−１４Ｅ１によって示されるものと類似する結合パターンを示し、そして／またはＡｃｔＲＩＩＡを中和する。
【００７６】
一実施形態において、ライブラリースクリーンにおいて上記抗体重鎖を「ベイト（ｂａｉｔ）」として使用し得ることが企図され、ここで上記ライブラリーは、上記再構成された抗体がＡｃｔＲＩＩＡに結合する補完ヒト軽鎖を同定するために、ヒト抗体軽鎖から構成される。この実施形態において、上記重鎖は、ＡｃｔＲＩＩＡに特異的な抗体に由来し、マウス、キメラ、もしくはヒト化されている。
【００７７】
抗体が、上記のように、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のうちの１個以上を含む場合、上記抗体は、これら配列をコードするＤＮＡを含む宿主細胞からの発現によって得られ得る。各ＣＤＲ配列をコードするＤＮＡは、上記ＣＤＲのアミノ酸配列に基づいて決定され得、適切な場合、オリゴヌクレオチド合成技術、部位指向性変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して、任意の所望の抗体可変領域フレームワークおよび定常領域のＤＮＡ配列と一緒に合成され得る。可変領域フレームワークおよび定常領域をコードするＤＮＡは、遺伝子配列データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ．ＲＴＭ．）から当業者に広く利用可能である。
【００７８】
いったん合成されると、本発明の抗体もしくはそのフラグメントをコードするＤＮＡは、核酸切り出し、連結、形質転換、および多くの公知な発現ベクターを使用するトランスフェクションに関する周知の技術のうちのいずれかに従って、増殖および発現させられ得る。従って、特定の実施形態において、抗体フラグメントの発現は、原核生物宿主（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎら、１９８９  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １７８：４９７〜５１５を参照のこと））において好ましいものであり得る。特定の他の実施形態において、上記抗体もしくはそのフラグメントの発現は、真核生物宿主細胞（酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、動物細胞（哺乳動物細胞を含む）もしくは植物細胞が挙げられる）において好ましいものであり得る。適切な動物細胞の例としては、骨髄腫（例えば、マウスＮＳＯ株）、ＣＯＳ、ＣＨＯ、もしくはハイブリドーマ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。植物細胞の例としては、タバコ、トウモロコシ、大豆、およびイネの細胞が挙げられる。
【００７９】
抗体可変領域および／もしくは定常領域をコードするＤＮＡを含む１種以上の複製可能な発現ベクターが調製され得、適切な細胞株（例えば、非生成骨髄腫細胞株（例えば、マウスＮＳＯ株）もしくは細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ））を形質転換するために使用され得、ここで上記抗体の生成が起こる。効率的な転写および翻訳を得るために、各ベクター中のＤＮＡ配列は、適切な調節配列（特に、上記可変ドメイン配列に作動可能に連結されたプロモーターおよびリーダー配列）を含むはずである。このようにして抗体を生成するための特定の方法は、一般に、周知でありかつ慣用的に使用される。例えば、基本的な分子生物学手順は、Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；Ｍａｎｉａｔｉｓら、３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  （２００１）もまた参照のこと）によって記載されている。ＤＮＡ配列決定は、Ｓａｎｇｅｒら（ＰＮＡＳ  ７４：５４６３，  （１９７７））およびＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｈａｎｄｂｏｏｋにおいて記載されるとおりに行われ得、部位指向性変異誘発は、当該分野で公知の方法に従って行われ得る（Ｋｒａｍｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：９４４１，  （１９８４）；  Ｋｕｎｋｅｌ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：４８８〜９２  （１９８５）；  Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４：３６７〜８２（１９８７）；Ａｎｇｌｉａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ  ｈａｎｄｂｏｏｋ）。さらに、多くの刊行物が、ＤＮＡの操作、発現ベクターの作製、および適切な細胞の形質転換および培養による、抗体の生成に適切な技術を記載している（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ａ  ａｎｄ  Ａｄａｉｒ，  Ｊ  Ｒ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  （ｅｄ．  Ｔｏｍｂｓ，  Ｍ  Ｐ，  １０，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １  ，  １９９２，  Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，  Ａｎｄｏｖｅｒ，  ＵＫ）；  「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，  １９９９，  Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  （ｅｄ．），  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【００８０】
上記のＣＤＲのうちの１個以上を含む本発明に従う抗体の親和性を改善することが所望される場合、改善された抗体は、多くのアフィニティー成熟プロトコル（上記ＣＤＲを維持すること（Ｙａｎｇら、Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．，  ２５４，  ３９２〜４０３，  １９９５）、鎖シャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １０，  ７７９〜７８３，  １９９２）、Ｅ．ｃｏｌｉの変異株の使用（Ｌｏｗら、Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．，  ２５０，  ３５０〜３６８，  １９９６）、ＤＮＡシャッフリング（ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（Ｐａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ８，  ７２４〜７３３，  １９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．，  ２５６，  ７〜８８，  １９９６）およびセクシャルＰＣＲ（ｓｅｘｕａｌ  ＰＣＲ）（Ｃｒａｍｅｒｉ，ら、Ｎａｔｕｒｅ，  ３９１，  ２８８〜２９１，  １９９８）が挙げられる）によって、得られ得る。アフィニティー成熟のこれら方法の全ては、Ｖａｕｇｈａｎら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １６，  ５３５〜５３９、１９９８）によって考察されている。
【００８１】
本発明の抗体を得るためのさらなる方法は、ファージディスプレイによる。例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、１９９４  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２：４３３〜５５；Ｂｕｒｔｏｎら、１９９４  Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５７：１９１〜２８０を参照のこと。ヒトもしくはマウスの免疫グロブリン可変領域遺伝子のコンビナトリアルライブラリーは、ファージベクターにおいて作製され得、上記ライブラリーは、ＡｃｔＲＩＩＡまたはこれらの改変体もしくはフラグメントに特異的に結合するＩｇフラグメント（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、もしくはこれらのマルチマー）を選択するためにスクリーニングされ得る。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｈｕｓｅら、１９８９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５〜８１；Ｓａｓｔｒｙら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：５７２８〜３２（１９８９）；Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：１−９  （１９９０）；  Ｋａｎｇら、１９９１  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：４３６３−６６；  Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９２  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：３８１−３８８；  Ｓｃｈｌｅｂｕｓｃｈら、１９９７  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６：４７−５２およびそこで引用される参考文献を参照のこと。例えば、Ｉｇ可変領域フラグメントをコードする複数のポリヌクレオチド配列を含むライブラリーは、糸状バクテリオファージ（例えば、Ｍ１３もしくはその改変体）のゲノムの中に、ファージコートタンパク質をコードする配列とインフレームで挿入され得る。融合タンパク質は、上記コートタンパク質と上記軽鎖可変領域ドメインおよび／もしくは上記重鎖重鎖可変領域ドメインとの融合物であり得る。特定の実施形態によれば、免疫グロブリンＦａｂフラグメントはまた、ファージ粒子上でディスプレイされ得る（例えば、米国特許第５，６９８，４２６号を参照のこと）。
【００８２】
重鎖および軽鎖の免疫グロブリンｃＤＮＡ発現ライブラリーはまた、λファージにおいて、例えば、λ  ＩｍｍｕｎｏＺａｐ  ＴＭ（Ｈ）およびλ  ＩｍｍｕｎｏＺａｐ  ＴＭ（Ｌ）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  Ｃａｌｉｆ．）を使用して、調製され得る。簡潔には、ｍＲＮＡは、Ｂ細胞集団から単離され、重鎖および軽鎖の免疫グロブリンｃＤＮＡ発現ライブラリーを、λ  ＩｍｍｕｎｏＺａｐ（Ｈ）およびλ  ＩｍｍｕｎｏＺａｐ（Ｌ）ベクターにおいて作るために使用される。これらベクターは、個々にスクリーニングされ得るか、またはＦａｂフラグメントもしくは抗体を形成するように、共発現され得る（Ｈｕｓｅら、前出を参照のこと；Ｓａｓｔｒｙら、前出もまた参照のこと）。陽性プラークを、その後非溶解性プラスミドに変換し得、Ｅ．ｃｏｌｉからモノクローナル抗体フラグメントの高レベル発現を可能にし得る。
【００８３】
ハイブリドーマにおける一実施形態において、目的のモノクローナル抗体を発現する遺伝子の可変領域は、ヌクレオチドプライマーを使用して増幅される。これらプライマーは、当業者によって合成され得るか、または商業的に利用可能な供給元から購入され得る（例えば、とりわけ、ＶＨａ、ＶＨｂ、ＶＨｃ、ＶＨｄ、ＣＨＩ、ＶＬおよびＣＬ領域のためのプライマーを含む、マウスおよびヒト可変領域のプライマーを販売するＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  （Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  Ｃａｌｉｆ．）を参照のこと）。これらプライマーは、重鎖もしくは軽鎖の可変領域を増幅するために使用され得、これらは、次いで、ベクター（例えば、それぞれ、ＩｍｍｕｎｏＺＡＰ  ＴＭ  ＨもしくはＩｍｍｕｎｏＺＡＰ  ＴＭ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））の中に挿入され得る。これらベクターは、次いで、発現のために、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、もしくは哺乳動物ベースのシステムの中に導入され得る。上記ＶＨおよびＶＬドメインの融合物を含む大量の単鎖タンパク質は、これら方法を使用して生成され得る（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，  １９８８を参照のこと）。
【００８４】
本発明に従う抗体を生成する細胞が、上記の免疫化および他の技術のうちのいずれかを使用していったん得られたら、上記特異的抗体の遺伝子は、本明細書に記載されるとおりの標準的手順に従って、そこからＤＮＡもしくはｍＲＮＡを単離および増幅することによってクローニングされ得る。そこから生成される抗体は、配列決定され得、かつ上記ＣＤＲを同定し得、上記ＣＤＲをコードするＤＮＡは、他の本発明に従う抗体を生成するために以前に記載されるように操作され得る。
【００８５】
好ましくは、上記結合剤は、ＡｃｔＲＩＩＡに特異的に結合する。全ての結合剤および結合アッセイのように、当業者は、結合剤が、治療上有効でかつ適切であるために、検出可能に結合しないはずである種々の部分が、網羅的でありかつ列挙するのは実行可能でないことを認識する。従って、本明細書で開示される結合剤に関して、用語「特異的に結合する」とは、結合剤が、非関連コントロールタンパク質に結合するより大きな親和性でＡｃｔＲＩＩＡ（好ましくは、ヒトＡｃｔＲＩＩＡ）に結合する能力に言及する。好ましくは、上記コントロールタンパク質は、鶏卵の卵白リゾチームである。好ましくは、上記結合剤は、ＡｃｔＲＩＩＡに、コントロールタンパク質の親和性より少なくとも５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、もしくは１０，０００倍大きい親和性で結合する。結合剤は、１×１０−７Ｍ以下、１×１０−８Ｍ以下、１×ｌ０−９Ｍ以下、１×１０−１０Ｍ以下、１×１０−１１Ｍ以下、もしくは１×１０−１２Ｍ以下というヒトＡｃｔＲＩＩＡに対する結合親和性を有し得る。
【００８６】
親和性は、アフィニティーＥＬＩＳＡアッセイによって決定され得る。特定の実施形態において、親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭアッセイによって決定され得る。特定の実施形態において、親和性は、動的方法によって決定され得る。特定の実施形態において、親和性は、平衡／溶液法によって決定され得る。このような方法は、本明細書でさらに詳細に記載されるかもしくは当該分野で公知である。
【００８７】
結合剤（例えば、抗体もしくは結合パートナー）の親和性、ならびに結合剤（例えば、抗体）が結合を阻害する程度は、従来技術を使用して、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；  ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ，  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  Ｎ．Ｊ．）によって、またはＳｃａｔｃｈａｒｄらによって記載される方法（Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５１  ：６６０〜６７２（１９４９））に従って、当業者によって決定され得る。表面プラズモン共鳴に関しては、標的分子は、固相に固定化され、フローセルにそって流れる移動相中でリガンドに曝される。上記固定化された標的へのリガンド結合が起こる場合、局所的な屈折率が変化し、ＳＰＲ角度における変化がもたらされ、このことは、反射光の強度における変化を検出することによって、リアルタイムでモニターされ得る。上記ＳＰＲシグナルの変化の速度は、上記結合反応の会合相および解離相の見かけの速度定数を得るために分析され得る。これら値の比は、見かけ上の平衡定数（親和性）を与える（例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５３：２５６０〜６５（１９９３）を参照のこと）。
【００８８】
オリゴペプチドもしくはポリペプチドは、それが、実施例に示されるＣＤＲ（配列番号４、５、６、７、８、および９）のうちの少なくとも１個に対して；ならびに／またはＡｃｔＲＩＩＡへのＡｂ−１４Ｅ１の結合を交叉ブロックしかつ／もしくはＡｂ−１４Ｅ１によるＡｃｔＲＩＩＡへの結合から交叉ブロックされるＡｃｔＲＩＩＡ結合剤のＣＤＲに対して；ならびに／またはＡｃｔＲＩＩＡ結合剤が細胞ベースのアッセイにおいてＡｃｔＲＩＩＡの効果をブロックし得る上記ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤（すなわち、ＡｃｔＲＩＩＡ中和結合剤）のＣＤＲに対して、少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一なアミノ酸配列を有する場合、本発明の範囲内にある。
【００８９】
本発明の範囲内にあるＡｃｔＲＩＩＡ結合剤ポリペプチドおよび抗体の例は、Ａｂ−１４Ｅ１の可変領域（配列番号１２および配列番号１３）に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一でありかつＡｃｔＲＩＩＡへのＡｂ−１４Ｅ１の結合を交叉ブロックし、そして／またはＡｂ−１４Ｅ１によるＡｃｔＲＩＩＡへの結合から交叉ブロックされ；そして／または細胞ベースのアッセイにおいてＡｃｔＲＩＩＡの阻害効果をブロックし得る（すなわち、ＡｃｔＲＩＩＡ中和結合剤）；そして／または以下の実施例に記載される接触残基のうちの１個以上に結合するアミノ酸配列を有するものである。
【００９０】
本発明の範囲内にあるＡｃｔＲＩＩＡ結合剤をコードするポリヌクレオチドの例は、Ａｂ−１４Ｅ１の可変領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号１５および１６）に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるポリヌクレオチド配列を有するものであり、ここで上記コードされるＡｃｔＲＩＩＡ結合剤は、ＡｃｔＲＩＩＡへのＡｂ−１４Ｅ１の結合を交叉ブロックし、そして／またはＡｂ−１４Ｅ１によるＡｃｔＲＩＩＡへの結合から交叉ブロックされ；そして／または細胞ベースのアッセイにおいてＡｃｔＲＩＩＡの阻害効果をブロックし得る（すなわち、ＡｃｔＲＩＩＡ中和結合剤）；または以下の実施例に記載される接触残基のうちの１個以上に結合する。
【００９１】
本発明のＡｃｔＲＩＩＡ結合剤は、好ましくは、本明細書で記載される細胞ベースのアッセイおよび／もしくは本明細書で記載されるインビボアッセイにおいて、ＡｃｔＲＩＩＡ機能を調節し、そして／または以下の実施例に記載されるＡｃｔＲＩＩＡの接触残基のうちの１個以上に結合し、そして／または本願に記載される抗体Ａｂ−１４Ｅ１の結合を交叉ブロックし、そして／または本願において記載される抗体Ａｂ−１４Ｅ１によるＡｃｔＲＩＩＡの結合から交叉ブロックされる。よって、このような結合剤は、本明細書で記載されるアッセイを使用して同定され得る。
【００９２】
特定の実施形態において、結合剤は、実施例に記載されるＡｃｔＲＩＩＡの接触残基のうちの１個以上に結合し、そして／または本明細書で記載される細胞ベースのおよび／もしくはインビボアッセイにおいて中和し、そして／または本願において記載される抗体Ａｂ−１４Ｅ１を交叉ブロックし、そして／または本願において記載される抗体Ａｂ−１４Ｅ１によるＡｃｔＲＩＩＡの結合から交叉ブロックされる抗体を最初に同定することによって、作製される。これら抗体に由来するＣＤＲ領域は、次いで、適切な生体適合性フレームワークの中に挿入して、ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤を生成するために使用される。上記結合剤の非ＣＤＲ部分は、アミノ酸から構成されてもよいし、非タンパク質分子であってもよい。本明細書に記載されるアッセイは、結合剤の特徴づけを可能にする。好ましくは、本発明の結合剤は、本明細書で定義される抗体である。
【００９３】
本発明に従う抗体を生成するための本明細書で記載される方法（新たなフレームワークおよび／もしくは定常領域への上記特異的Ａｂ−１４Ｅ１  ＣＤＲの操作を含む）において、適切なアッセイが、所望の抗体もしくは結合剤を選択するために利用可能である（すなわち、ＡｃｔＲＩＩＡへの結合親和性を決定するためのアッセイ；交叉ブロッキングアッセイ（例えば、以下の実施例４に記載されるＢＩＡＣＯＲＥＴＭベースのヒトＡｃｔＲＩＩＡペプチドエピトープ競合結合アッセイ）；Ａ２０４細胞ベースのアッセイ；インビボアッセイ）。
【００９４】
用語「交叉ブロックする」、「交叉ブロックされる」、および「交叉ブロッキング」とは、抗体もしくは他の結合剤が、ＡｃｔＲＩＩＡへの他の抗体もしくは結合剤の結合に干渉する能力を意味するために本明細書において交換可能に使用される。
【００９５】
抗体もしくは他の結合剤が、ＡｃｔＲＩＩＡへの別のものの結合に干渉し得る程度、従って、上記抗体もしくは他の結合剤が、本発明に従って交叉ブロックするといわれるか否かは、競合結合アッセイを使用して決定され得る。１つの特に適した定量的アッセイは、表面プラズモン共鳴技術を使用して相互作用の程度を測定し得るＢＩＡＣＯＲＥＴＭ機器を使用する。実施例４は、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭベースの交叉ブロッキングアッセイを行うための方法を提供する。別の適切な定量的交叉ブロッキングアッセイは、ＡｃｔＲＩＩＡへのそれらの結合に関して、抗体もしくは他の結合剤の間での競合を測定するために、ＥＬＩＳＡベースのアプローチを使用する。
【００９６】
以下は、一般に、抗体もしくは他の結合剤が、本発明に従って交叉ブロックするかもしくは交叉ブロックし得るかを決定するために適切なＢＩＡＣＯＲＥＴＭアッセイを記載する。便宜上、２種の抗体に対して言及されるが、上記アッセイが、本明細書で記載されるＡｃｔＲＩＩＡ結合剤のうちのいずれかとともに使用され得ることは、認識される。上記ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ機器（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ  ３０００）は、製造業者の推奨に従って操作される。
【００９７】
従って、１つの交叉ブロッキングアッセイにおいて、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃ融合タンパク質は、予め結合された抗ｍＦｃ  ＩｇＧによってＣＭ５  ＢＩＡＣＯＲＥＴＭチップ上で捕捉されて、ＡｃｔＲＩＩＡ被覆表面を生成する。代表的には、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃ（ダイマー）の２００〜８００の共鳴ユニットが、上記チップに結合される（容易に測定可能な結合のレベルを与えるが、使用される試験試薬の濃度によって容易に飽和可能である量）。
【００９８】
互いに交叉ブロックする能力についてアッセイされるべき上記２種の抗体（Ａ＊およびＢ＊と示される）は、上記試験混合物を作るために適した緩衝液中で結合部位の１：１モル比において混合される。結合部位ベースで濃度を計算する場合、抗体の分子量は、上記抗体の総分子量を、その抗体上のＡｃｔＲＩＩＡ結合部位の数で除算したものであると仮定される。
【００９９】
試験混合物中の各抗体の濃度は、上記ＢＩＡＣＯＲＥＴＭチップ上で捕捉されたＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃ分子に対するその抗体の結合部位を容易に飽和させるために十分高くなければならない。上記混合物中の抗体は、（結合ベースで）同じモル濃度において存在し、その濃度は、代表的には、（結合部位ベースで）１．００〜１．５マイクロモル濃度の間である。
【０１００】
抗体Ａ＊のみ、および抗体Ｂ＊のみを含む別個の溶液もまた、調製される。これら溶液中の抗体Ａ＊および抗体Ｂ＊は、上記試験混合物と、同じ緩衝液中および同じ濃度で存在しなければならない。
【０１０１】
上記試験混合物は、上記ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃ被覆ＢＩＡＣＯＲＥＴＭチップ上を通過させ、結合の総量が記録される。上記チップは、次いで、上記チップ結合ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃに損傷を与えずに結合した抗体を除去するような方法において処理される。代表的には、これは、３０ｍＭ  ＨＣｌで６０秒間上記チップを処理することによって行われる。
【０１０２】
次いで、抗体Ａ＊単独の溶液を、上記ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃ被覆表面の上に通過させ、結合量を記録する。上記チップを再び処理して、上記チップに結合したＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃに損傷を与えることなく、上記結合した抗体の全てを除去する。
【０１０３】
次いで、抗体Ｂ＊単独の溶液を、上記ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃ被覆表面の上に通過させ、結合量を記録する。
【０１０４】
抗体Ａ＊および抗体Ｂ＊の混合物の最大の理論的結合を、次に計算する。これは、上記ＡｃｔＲＩＩＡ表面の上に単独で通過させた場合には、各抗体の結合の合計である。上記混合物の実際に記録された結合が、この理論的最大値より低い場合、上記２種の抗体は、互いに交叉ブロックしている。
【０１０５】
従って、一般に、本発明に従う交叉ブロッキング抗体もしくは他の結合剤は、上記アッセイの間に、および本発明の第２の抗体もしくは他の結合剤の存在下で、上記記録された結合が、組み合わせにおける上記２種の抗体もしくは結合剤の上記理論的最大結合のうちの８０％〜０．１％の間（例えば、８０％〜４％）、具体的には、上記理論的最大結合のうちの７５％〜０．１％の間（例えば、７５％〜４％）、およびより具体的には、上記理論的最大結合のうちの７０％〜０．１％の間（例えば、７０％〜４％）（直前で定義されるとおり）であるように、上記ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ交叉ブロッキングアッセイにおいてＡｃｔＲＩＩＡへ結合するものである。
【０１０６】
上記ＢＩＡＣＯＲＥＴＭアッセイは、抗体もしくは他の結合剤が、本発明に従って互いに交叉ブロックするか否かを決定するために使用されるアッセイである。稀な場合には、特定の抗体もしくは他の結合剤は、抗ｍＦｃ  ＩｇＧを介してＣＭ５  ＢＩＡＣＯＲＥＴＭチップへと結合されたＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃに結合しなくてもよい（これは、ＡｃｔＲＩＩＡ上の関連する結合部位が、ｍＦｃへのＡｃｔＲＩＩＡ連結によってマスクされるかもしくは破壊される場合に起こり得る）。このような場合、交叉ブロッキングは、ＡｃｔＲＩＩＡのタグ付きバージョン（例えば、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＡｃｔＲＩＩＡ）を使用して決定され得る。この特定の形式において、抗Ｈｉｓ抗体は、上記ＢＩＡＣＯＲＥＴＭチップに結合され、次いで、上記Ｈｉｓタグ付きＡｃｔＲＩＩＡは、上記チップの表面の上に通過させられ、抗Ｈｉｓ抗体によって捕捉される。上記交叉ブロッキング分析は、本質的に、各チップ再生サイクル後に、新たなＨｉｓタグ付きＡｃｔＲＩＩＡが、抗Ｈｉｓ抗体で被覆された表面に戻って負荷されることを除いて、上記に記載されるとおりに行われる。さらに、当該分野で公知である、種々の他のタグおよびタグ結合タンパク質の組み合わせが、このような交叉ブロッキング分析のために使用され得る（例えば、ＨＡタグと抗ＨＡ抗体；ＦＬＡＧタグと抗ＦＬＡＧ抗体；ビオチンタグとストレプトアビジン）。
【０１０７】
以下は、一般に、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体もしくは他のＡｃｔＲＩＩＡ結合剤が、本発明に従って交叉ブロックするかもしくは交叉ブロックし得るかを決定するためのＥＬＩＳＡアッセイを記載する。便宜上、２種の抗体が言及されるが、上記アッセイが、本明細書に記載されるＡｃｔＲＩＩＡ結合剤のうちのいずれかとともに使用され得ることは、理解される。
【０１０８】
上記アッセイの一般原理は、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体が、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに被覆されることである。過剰量の第２の、潜在的に交叉ブロックする抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体は、溶液中に添加される（すなわち、上記ＥＬＩＳＡプレートに結合されない）。次いで、制限された量のＡｃｔＲＩＩＡ（もしくは代わりにＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃ）が、上記ウェルに添加される。上記被覆された抗体および上記溶液中の抗体は、上記制限された数のＡｃｔＲＩＩＡ（もしくはＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃ）分子の結合について競合する。上記プレートは、上記被覆された抗体によって結合されなかったＡｃｔＲＩＩＡを除去するため、また、上記第２の溶液相の抗体および上記第２の溶液相の抗体とＡｃｔＲＩＩＡとの間で形成されたいかなる複合体をも除去するために洗浄される。次いで、結合したＡｃｔＲＩＩＡの量は、適切なＡｃｔＲＩＩＡ検出試薬を使用して測定される。上記被覆された抗体を交叉ブロックし得る溶液中の抗体は、ＡｃｔＲＩＩＡ分子の数の低下を引き起こし得る。というのは、上記被覆された抗体は、上記被覆された抗体が上記第２の溶液相の抗体の非存在下で結合し得るＡｃｔＲＩＩＡ分子の数に比例して結合し得るからである。
【０１０９】
このアッセイは、Ａｂ−１４Ｅ１および理論的抗体Ａｂ−ＸＸのためにより詳細に本明細書で記載される。Ａｂ−１４Ｅ１が、上記固定化抗体であるように選択される場合において、Ａｂ−１４Ｅ１を、上記ＥＬＩＳＡプレートのウェルに被覆し、その後、上記プレートを、適切なブロッキング溶液でブロックして、その後に添加される試薬の非特異的結合を最小限にする。次いで、過剰量のＡｂ−ＸＸを、上記ＥＬＩＳＡプレートに添加し、Ａｂ−ＸＸ  ＡｃｔＲＩＩＡ結合部位／ウェルのモルが、上記ＥＬＩＳＡプレートの被覆の間に、１ウェルあたりに使用されたＡｂ−１４Ｅ１  ＡｃｔＲＩＩＡ結合部位のモルより少なくとも１０倍高いようにされる。
【０１１０】
次いで、ＡｃｔＲＩＩＡを添加し、１ウェルあたりに添加されるＡｃｔＲＩＩＡのモルが、各ウェルを被覆するために使用したＡｂ−１４Ｅ１  ＡｃｔＲＩＩＡ結合部位のモルの多くとも２５／１になるようにされる。適切なインキュベーション期間の後、上記ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、ＡｃｔＲＩＩＡ検出試薬を添加して、上記被覆された抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体（この場合は、Ａｂ−１４Ｅ１）によって特異的に結合されたＡｃｔＲＩＩＡの量を測定する。上記アッセイについてのバックグラウンドシグナルは、上記被覆された抗体（この場合は、Ａｂ−１４Ｅ１）、溶液相の抗体（この場合は、Ａｂ−ＸＸ）、ＡｃｔＲＩＩＡ緩衝液のみ（すなわち、ＡｃｔＲＩＩＡなし）およびＡｃｔＲＩＩＡ検出試薬とともにウェル中で得られたシグナルとして定義される。上記アッセイについての陽性コントロールシグナルは、上記被覆された抗体（この場合は、Ａｂ−１４Ｅ１）、溶液相の抗体緩衝液のみ（すなわち、溶液相の抗体なし）、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＡ検出試薬とともにウェル中で得られたシグナルとして定義される。上記ＥＬＩＳＡアッセイは、上記バックグラウンドシグナルの少なくとも３倍の上記陽性コントロールシグナルを有するような様式において行われる必要がある。
【０１１１】
方法論的アーティファクトについてのコントロールとして、上記交叉ブロッキングアッセイは、直前で記載される形式において行われ得るか、また、逆にされ得る（Ａｂ−ＸＸが上記被覆された抗体として、およびＡｂ−１４Ｅ１が上記溶液相の抗体として）。
【０１１２】
Ａ２０４横紋筋肉腫細胞でのレポーター遺伝子アッセイを、所定の抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体が、組換えＡｃｔＲＩＩＡリガンド（例えば、アクチビンＡおよびアクチビンＢ）によって内因性のＡｃｔＲＩＩＡの活性化を中和し得るか否かを決定するために使用し得る。抗体の非存在下で、これらＡｃｔＲＩＩＡリガンドは、Ａ２０４細胞におけるＡｃｔＲＩＩＡシグナル伝達を用量依存的に刺激し得る。
【０１１３】
上記アッセイを始めるために、Ａ２０４細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−８２）を、４８ウェルプレート中で、１０５細胞／ウェルにおいて分配する。翌日、細胞を、一次レポータープラスミド（ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２）（Ｄｅｎｎｌｅｒら、１９９８，  ＥＭＢＯ  １７：３０９１−３１００）およびＲｅｎｉｌｌａレポータープラスミド（ｐＲＬＣＭＶ）（これは、トランスフェクション効率を照合するために使用される）でトランスフェクトする。上記ＣＡＧＡ１２モチーフは、ＴＧＦ−β応答性遺伝子に存在するので、このベクターは、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３を介してシグナル伝達する因子に一般に有用である。１０μｇ  ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２、１μｇ  ｐＲＬＣＭＶ、３０μｌ  Ｆｕｇｅｎｅ  ６（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、および９７０μｌ  ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む溶液を、３０分間にわたって予備インキュベートし、次いで、ＭｃＣｏｙの増殖培地に添加し、これを、室温において一晩のインキュベーションにわたって上記プレートした細胞（５００μｌ／ウェル）に適用する。３日目に、培地を除去し、細胞を、６時間にわたって３７℃において、０．１％  ＢＳＡを含むリン酸緩衝化食塩水で希釈した試験物質とともに、インキュベート（２５０μｌ／ウェル）する。すすいだ後、細胞を、受動溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１９４１）で溶解し、−７０℃において一晩貯蔵する。４日目に、プレートを、室温へと穏やかに撹拌しながら加温する。細胞溶解物を、二連において、化学発光プレート（９６ウェル）に移し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１９８０）の試薬でルミノメーターにおいて分析して、正規化したルシフェラーゼ活性を決定する。
【０１１４】
本明細書で開示される抗体は、上記タンパク質のインビボ活性にとって重要であるヒトＡｃｔＲＩＩＡの領域に結合し、それによって、ＡｃｔＲＩＩＡの活性を阻害する。ＡｃｔＲＩＩＡへの抗体の結合は、ＡｃｔＲＩＩＡ媒介性シグナル伝達と関連したバイオマーカー（例えば、循環ＦＳＨ濃度、体重、またはアクチビン依存性腫瘍形成を有する動物においては、悪液質のマーカー）の変化と相関させることができる。
【０１１５】
ＡｃｔＲＩＩＡシグナル伝達に依存する薬物動態パラメーターは、ＡｃｔＲＩＩＡを中和しかつ治療上の利益を提供し得るＡｃｔＲＩＩＡ結合剤を同定するために、それら結合剤のインビボ試験のためのエンドポイントとして測定され得る．このようなパラメーターとしては、実施例に示されるように、卵巣切除した（ＯＶＸ）雌性における血清ＦＳＨ濃度、除脂肪体重および脂肪含有量が挙げられる。ＡｃｔＲＩＩＡ中和結合剤は、ビヒクル処置動物と比較して、このような薬物動態パラメーターにおいて統計的に有意な変化を引き起こし得るものとして定義される。このようなインビボ試験は、任意の適切な哺乳動物（例えば、マウス、ラット、サル）において行われ得る。
【０１１６】
（３．スクリーニングアッセイおよび他の生化学的使用）
特定の局面において、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＡのアゴニストもしくはアンタゴニストである化合物（薬剤）を同定するための、本発明のＡｃｔＲＩＩＡ結合剤の使用に関する。このスクリーニングを介して同定される化合物は、これらがＡｃｔＲＩＩＡ媒介性シグナル伝達をインビボもしくはインビトロで調節する能力を評価するために試験され得る。これら化合物は、例えば、動物モデルにおいて試験され得る。
【０１１７】
種々のアッセイ形式が十分であり、本開示に鑑みて、本明細書に明示的に記載されないものも、それにも関わらず、当業者によって理解される。本明細書に記載されるように、本発明の試験化合物（薬剤）は、任意のコンビナトリアル化学的方法によって作られ得る。あるいは、本発明の化合物は、インビボもしくはインビトロで合成される天然に存在する生体分子であり得る。組織増殖の調節因子として作用するそれらの能力について試験されるべき化合物（薬剤）は、例えば、細菌、酵母、植物もしくは他の生物によって生成され得る（例えば、天然生成物）か、化学的に生成され得る（例えば、低分子（ペプチド摸倣物が挙げられる））か、または組換え生成され得る。本発明によって企図される試験化合物としては、非ペプチジル有機分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド摸倣物、糖、ホルモン、および核酸分子が挙げられる。具体的実施形態において、上記試験薬剤は、分子量  約２，０００ダルトン未満を有する有機低分子である。
【０１１８】
本発明の試験化合物は、単一の別個の実体として提供され得るか、またはより高い複雑性を有するライブラリー（例えば、コンビナトリアルケミストリーによって作製される）の中で提供され得る。これらライブラリーは、例えば、アルコール、アルキルハライド、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテルおよび他のクラスの有機化合物を含み得る。試験システムへの試験化合物の提示は、単離された形態において、もしくは化合物の混合物としてのいずれかで、特に、初期スクリーニング工程において行われ得る。必要に応じて、上記化合物は、他の化合物で必要に応じて誘導体化され得、上記化合物の単離を促進する誘導体化する基（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）を有し得る。誘導体化する基の非限定的な例としては、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、緑色蛍光タンパク質、同位体、ポリヒスチジン、磁性ビーズ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光活性化可能な架橋剤またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０１１９】
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、ハイスループットアッセイは、所定の期間において調査される化合物の数を最大にするために望ましい。無細胞系（例えば、精製タンパク質もしくは半精製タンパク質で得られ得るもの）において行われるアッセイは、しばしば、迅速な開発および試験化合物によって媒介される分子標的における変化の比較的容易な検出を可能にするために行われ得る点において「一次」スクリーニングとして好ましい。さらに、上記試験化合物の細胞毒性もしくはバイオアベイラビリティーの効果は、一般に、インビトロシステムにおいて無視され得、代わりに、上記アッセイは、上記分子標的に対する上記薬物の効果に主に焦点を当てる。なぜなら、それは、ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤とＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドとの間の結合親和性の変化において明らかになり得るからである。
【０１２０】
単に例示するために、本発明の例示的スクリーニングアッセイにおいて、上記目的の化合物は、上記アッセイの目的に適切な場合、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドに通常結合し得る単離されかつ精製されたＡｃｔＲＩＩＡ結合剤と接触させられる。次いで、上記化合物およびＡｃｔＲＩＩＡ結合剤の混合物に、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを含む組成物が添加される。ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドとＡｃｔＲＩＩＡ結合剤との間の複合体の検出および定量は、上記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドとＡｃｔＲＩＩＡ結合剤との間の複合体形成を阻害する（もしくは増強する）ことにおいて、上記化合物の効力を決定するための手段を提供する。上記化合物の効力は、上記試験化合物の種々の濃度を使用して得られたデータから、用量応答曲線を作成することによって評価され得る。さらに、コントロールアッセイもまた、比較のためのベースラインを提供するために行われ得る。例えば、コントロールアッセイにおいて、単離されかつ精製されたＡｃｔＲＩＩＡ結合剤は、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを含む組成物に添加され、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドとＡｃｔＲＩＩＡ結合剤との間の複合体の形成は、上記試験化合物の非存在下で定量される。一般に、上記反応物が混合され得る順序は、変動し得、同時に混合され得ることは、理解される。さらに、精製タンパク質の代わりに、細胞抽出物および溶解物が、適切な無細胞アッセイ系を与えるために使用され得る。
【０１２１】
ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドとＡｃｔＲＩＩＡ結合剤との間の複合体形成は、種々の技術によって検出され得る。例えば、複合体の形成の調節は、例えば、検出可能に標識されたタンパク質（例えば、放射性標識された（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃもしくは３Ｈ）か、蛍光標識された（例えば、ＦＩＴＣ）か、または酵素標識されたＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドもしくはＡｃｔＲＩＩＡ結合剤）を使用して、イムノアッセイによって、もしくはクロマトグラフィー検出によって、定量され得る。
【０１２２】
（４．治療剤の処方および送達）
上記の結合剤（例えば、抗体Ａｂ−１４Ｅ１もしくはそのヒト化バージョン）のうちの１種とともに、薬学的にもしくは生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤もしくは希釈剤を含む薬学的組成物が提供される。
【０１２３】
種々の処置レジメン（例えば、皮下、経口、非経口、静脈内、鼻内、および筋肉内の投与および処方を含む）において、本明細書で記載される特定の組成物を使用するのに適切な投与および処置レジメンの開発は、当該分野で周知である。そのうちのいくつかは、一般的な例示目的で以下に簡潔に考察される。
【０１２４】
特定の適用において、本明細書で開示される薬学的組成物は、動物への経口投与を介して送達され得る。このようにして、これら組成物は不活性希釈剤とともに、もしくは同化できる食用のキャリアとともに、処方されてもよいし、それを硬質シェルもしくは軟質シェルのゼラチンカプセル剤の中に封入されてもよいし、錠剤へと圧縮されてもよいし、食事の食品と一緒に直接組み込まれてもよい。
【０１２５】
特定の状況において、本明細書で開示される薬学的組成物を皮下に、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、もしくはさらに腹腔内に送達することは、望ましい。このようなアプローチは、当業者に周知であり、そのうちのいくつかは、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，６４１，５１５号および米国特許第５，３９９，３６３号においてさらに記載されている。特定の実施形態において、遊離塩基もしくは薬理学的に受容可能な塩としての活性化合物の溶液は、水の中で界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合されて、調製され得る。分散物はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物中で、ならびに油中で調製され得る。貯蔵および使用の通常の条件下では、これら調製物は、一般に、微生物の増殖を防止するように、保存剤を含む。
【０１２６】
注射可能医薬品の使用に適した例示的薬学的形態は、滅菌水性溶液もしくは分散物および滅菌注射用溶液もしくは分散物の即時の調製のための滅菌散剤を含む（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号を参照のこと）。全ての場合において、上記形態は、無菌でなければならず、かつシリンジでの取り扱い（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が容易になる程度に流動性でなければならない。それは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保護されなければならない。上記キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、および／もしくは植物性油を含む溶媒もしくは分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散物の場合には必要とされる粒度の維持によって、および／もしくは界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物活動の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によって促進され得る。多くの場合において、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）（例えば、糖もしくは塩化ナトリウム）を含むことは、好ましい。注射用組成物の長期間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を組成物中で使用することによってもたらされ得る。
【０１２７】
一実施形態において、水性溶液中での非経口投与のために、上記溶液は、必要であれば、適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤は、十分な食塩水もしくはグルコースで最初に等張性にされるべきである。これら特定の水性溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の投与に特に適している。この関連において、使用され得る滅菌水性媒体は、本開示に鑑みて、当業者に公知である。例えば、１投与量は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され得、１０００ｍｌの皮下注入流体に添加され得るか、または提唱される注入部位において注射され得るかのいずれかである（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １５ｔｈ  ｅｄ．，  ｐｐ．  １０３５〜１０３８および１５７０〜１５８０を参照のこと）。投与量におけるある程度の変動は、処置されている被験体の状態に依存して、必然的に生じる。さらに、ヒト投与のためには、調製物は、当然のことながら、好ましくは、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓの基準によって要求されるとおりの滅菌性、発熱性、ならびに一般的な安全性および純度標準を満たす。
【０１２８】
本発明の別の実施形態において、本明細書で開示される組成物は、中性形態もしくは塩形態において処方され得る。例示的な薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（上記タンパク質の遊離アミノ基と形成される）が挙げられ、これは、無機酸（例えば、塩酸もしくはリン酸）、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸などと形成される。上記遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、もしくは水酸化鉄（ＩＩＩ））、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から得られ得る。処方に際して、溶液は、投与処方物と適合性の様式において、および治療上有効であるような量において、投与される。
【０１２９】
上記キャリアは、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁物、コロイドなどをさらに含み得る。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体もしくは薬剤が、上記活性成分と不適合性である場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が企図される。補助的活性成分はまた、上記組成物に組み込まれ得る。語句「薬学的に受容可能な」とは、ヒトに投与された場合に、アレルギー反応もしくは類似の都合の悪い反応を生成しない分子実体および組成物に言及する。
【０１３０】
特定の実施形態において、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、脂質粒子、ビヒクルなどは、本発明の組成物を適切な宿主細胞／生物に導入するために使用される。特に、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、ビヒクル、ナノスフェア、もしくはナノ粒子などのいずれかに被包されて送達するために処方される。あるいは、本発明の組成物は、このようなキャリアビヒクルの表面に、共有結合もしくは非共有結合のいずれかで結合され得る。
【０１３１】
潜在的薬物キャリアとしてのリポソームおよびリポソーム様調製物の処方および使用は、一般に、当業者に公知である（例えば、Ｌａｓｉｃ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １６（７）：３０７−２１，  １９９８；  Ｔａｋａｋｕｒａ，  Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ  ５６（３）：６９１〜９５，  １９９８；  Ｃｈａｎｄｒａｎら、Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  ３５（８）：８０１〜０９，  １９９７；  Ｍａｒｇａｌｉｔ，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．  １２（２−３）：２３３〜６１，  １９９５；米国特許第５，５６７，４３４号；米国特許第５，５５２，１５７号；米国特許第５，５６５，２１３号；米国特許第５，７３８，８６８号および米国特許第５，７９５，５８７（各々は、それらの全体において本明細書に具体的に援用される）を参照のこと）。リポソームの使用は、全身送達後の自己免疫応答もしくは受容不能な毒性と関連しないようである。特定の実施形態において、リポソームは、水性媒体中に分散されるリン脂質から形成され、多層状の同心円２層ビヒクル（多層ビヒクル（ＭＬＶ）ともいわれる）を自発的に形成する。
【０１３２】
あるいは、他の実施形態において、本発明は、本発明の組成物の薬学的に受容可能なナノカプセル処方物を提供する。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再現可能な方法で化合物を捕捉し得る（例えば、Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏら、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  Ｉｎｄ．  Ｐｈａｒｍ．  ２４（１２）：  １１１３−２８，  １９９８を参照のこと）。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を回避するために、このような超微細粒子（約０．１μｍの大きさ）が、インビボで分解され得るポリマーを使用して設計され得る。このような粒子は、例えば、Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．  ５（ｌ）：ｌ−２０，  １９８８；  ｚｕｒ  Ｍｕｈｌｅｎら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．  ４５（２）：１４９−５５，  １９９８；  Ｚａｍｂａｕｘら、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５０（ｌ−３）：３１−４０，  １９９８；および米国特許第５，１４５，６８４号によって記載されるとおりに作製され得る。
【０１３３】
さらに、本発明の薬学的組成物は、このような薬学的組成物の使用に関する説明書を提供するパッケージング材料とともに、容器内に配置され得る。一般に、このような説明書は、上記試薬濃度、ならびに特定の実施形態の範囲内において、上記薬学的組成物を再構成するために必要であり得る賦形剤成分もしくは希釈剤（例えば、水、食塩水もしくはＰＢＳ）の相対的な量を記載する明確な表現を含む。
【０１３４】
上記投与される用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜２００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲に及び得る。しかし、当業者に明らかなように、投与の量および頻度は、当然のことながら、処置されている適応症の性質および重篤度、所望の応答、患者の状態などのような要因に依存する。代表的には、上記組成物は、上記のように、種々の技術によって投与され得る。
【０１３５】
（５．ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤の治療的使用）
特定の実施形態において、本発明のＡｃｔＲＩＩＡ結合剤は、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／もしくはＡｃｔＲＩＩＡリガンド（例えば、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、もしくはＧＤＦ１１）の異常な活性と関連する疾患もしくは状態を処置もしくは予防するために使用され得る。これら疾患、障害もしくは状態は、一般に、本明細書において「ＡｃｔＲＩＩＡ関連状態」といわれる。特定の実施形態において、本発明は、必要な個体において、治療上有効な量の上記のＡｃｔＲＩＩＡ結合剤を上記個体に投与することを通して、疾患、障害もしくは状態を処置もしくは予防するための方法を提供する。これら方法は、動物、およびより具体的には、ヒトの治療的および予防的な処置を特に目標とする。
【０１３６】
本開示は、必要な個体における状態もしくは障害を、治療上有効な量のＡｃｔＲＩＩＡ結合剤（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡに対して指向される中和抗体）を上記個体に投与することによって処置するための方法および組成物を提供する。インヒビンαサブユニットが遺伝的に欠損しているマウスは、インヒビンＡおよびインヒビンＢを欠損しており、アクチビンＡおよびアクチビンＢを過剰発現する性腺腫瘍をもたらす（Ｍａｔｚｕｋら、１９９２，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：３１３〜３１９；Ｍａｔｚｕｋら、１９９４，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：８８１７〜８８２１）。全てのこのようなマウスは、これら腫瘍を発症させ、最終的には、ＡｃｔＲＩＩＡを介して作用する高レベルの腫瘍由来アクチビンによって媒介されるがん悪液質様の症候群で死ぬ（Ｃｏｅｒｖｅｒら、１９９６，  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １０：５３４〜５４３）。本発明を限定することは意図しないが、ＡｃｔＲＩＩＡに対して指向される中和抗体は、インヒビン欠損マウスについて本明細書で示されるように、アクチビン生成腫瘍の影響を処置し、アクチビン媒介性悪液質を緩和し、そして患者の生存を延長するために有用である（実施例を参照のこと）。
【０１３７】
ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＡリガンドの複合体は、組織増殖および初期発生プロセス（例えば、種々の構造の正確な形成）において、または１種以上の発生後の能力（ｐｏｓｔ−ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｃａｐａｃｉｔｉｅｓ）（性的発生、下垂体ホルモン生成、ならびに骨および軟骨の生成が挙げられる）において、本質的な役割を果たす。従って、ＡｃｔＲＩＩＡ関連状態は、異常な組織増殖および発生の欠陥を含む。さらに、ＡｃｔＲＩＩＡ関連状態としては、細胞増殖および分化の障害（例えば、炎症、アレルギー、自己免疫疾患、感染性疾患、および腫瘍）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３８】
例示的ＡｃｔＲＩＩＡ関連状態としては、神経筋障害（例えば、筋ジストロフィーおよび筋萎縮）、鬱血性閉塞性肺疾患もしくは肺気腫（および関連する筋消耗）、筋消耗症候群、筋肉減少症、悪液質、脂肪組織障害（例えば、肥満症）、２型糖尿病、および骨変性疾患（例えば、骨粗鬆症）が挙げられる。他の例示的ＡｃｔＲＩＩＡ関連状態としては、筋変性（ｍｕｓｃｕｌｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）障害および神経筋障害、組織修復（例えば、創傷治癒）、神経変性疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症）、免疫学的障害（例えば、リンパ球の異常な増殖もしくは機能に関連した障害）、ならびに肥満もしくは脂肪細胞の異常な増殖に関連した障害が挙げられる。
【０１３９】
特定の実施形態において、本発明のＡｃｔＲＩＩＡ結合剤は、筋ジストロフィーのための処置の一部として使用される。用語「筋ジストロフィー」とは、骨格筋（ならびにときおり、心臓および呼吸筋）が徐々に弱って、劣化することによって特徴付けられる変性性の筋疾患の群に言及する。筋ジストロフィーは、筋肉における微視的変化とともに始まる進行性の筋消耗および虚弱によって特徴付けられる遺伝的障害である。経時的に筋肉が変性するにつれて。上記個体の筋肉の強度は、衰える。本発明のＡｃｔＲＩＩＡ結合剤を含むレジメンで処置され得る例示的な筋ジストロフィーとしては、以下が挙げられる：デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）（ＦＳＨもしくはＦＳＨＤ）（Ｌａｎｄｏｕｚｙ−Ｄｅｊｅｒｉｎｅ型としても公知）、筋強直性筋ジストロフィー（ＭＭＤ）（シュタイネルト病としても公知）、眼球咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー（ＤＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、および肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＳＭＤ）。
【０１４０】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、フランス人神経学者Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ａｍａｎｄ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅによって１８６０年代に最初に記載された。ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、ドイツ人医師Ｐｅｔｅｒ  Ｅｍｉｌ  Ｂｅｃｋｅｒにならって命名され、彼は、ＤＭＤのこの異型を１９５０年代に最初に記載した。ＤＭＤは、男性において最も頻繁な遺伝性疾患のうちの１つであり、３，５００名の男子のうち１名が罹患している。ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子（Ｘ染色体の短腕に位置する）が破壊されているときに生じる。男性は、１コピーのＸ染色体しか有しないので、彼らは、上記ジストロフィン遺伝子を１コピーしか有しない。ジストロフィンタンパク質がなければ、筋肉は、収縮および弛緩のサイクルの間に容易に損傷を受ける。上記疾患において初期の間には、筋肉が再生によって補償され、後には、筋前駆細胞は、進行している損傷に追いついていくことができず、健康な筋肉は、非機能的線維脂肪組織に置き換わる。
【０１４１】
ＢＭＤは、ジストロフィン遺伝子における異なる変異から生じる。ＢＭＤ患者は、ある程度のジストロフィンを有するが、それは、量が不十分であるかまたは質が乏しいのいずれかである。ある程度のジストロフィンがあれば、ＢＭＤを有するものの筋肉を、ＤＭＤを有する人々のものと同程度に悪くもしくは素早く変性することから防御される。
【０１４２】
例えば、研究から、ＧＤＦ８（ＡｃｔＲＩＩＡリガンド）の機能をインビボでブロッキングもしくは除去すると、ＤＭＤ患者およびＢＭＤ患者において少なくとも特定の症状を効果的に処置し得ることが実証されている。従って、本発明のＡｃｔＲＩＩＡ結合剤は、ＧＤＦ８インヒビター（アンタゴニスト）として作用し得、ＤＭＤおよびＢＭＤの患者において、ＧＤＦ８および／もしくはＡｃｔＲＩＩＡの機能をインビボでブロックする代替手段を構成し得る。
【０１４３】
他の実施形態において、ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤はまた、ミオパチーに起因する筋萎縮を処置もしくは予防するために使用され得る。ミオパチーの例としては、炎症性ミオパチー、代謝性ミオパチー、およびミオトニーが挙げられる。本発明のＡｃｔＲＩＩＡ結合剤は、先天性ミオパチー（例えば、筋細管ミオパチー、ネマリンミオパチー、およびミトコンドリアミオパチー）を処置するにおいて適用を有する。本発明のＡｃｔＲＩＩＡ結合剤は、封入体筋炎、ミオグロビン尿症、横紋筋融解症、骨化性筋炎、多発性筋炎、もしくは皮膚筋炎を処置するために使用され得る。さらに、ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤は、グルココルチコイド処置、筋肉減少症、長期床上安静、骨格固定（ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、敗血症、もしくは鬱血性心不全から生じる筋萎縮を処置もしくは予防し得る。
【０１４４】
本発明のＡｃｔＲＩＩＡ結合剤は、筋肉の成長を必要とする他の神経筋疾患もしくは状態において筋肉量を増大する有効な手段を提供する。例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ（ルー・ゲーリック病もしくは運動ニューロン疾患としても公知））は、運動ニューロン（脳を骨格筋に接続するＣＮＳの成分）を攻撃する慢性の、不治のかつ制止できないＣＮＳ障害である。ＡＬＳにおいて、運動ニューロンは劣化し、最終的には死に至るが、個人の脳は、正常に、完全に機能して、機敏な状態のままであり、動かそうとする命令が、筋肉に達し得ない。ＡＬＳを発症する大部分の人々は、４０〜７０歳の間である。最初に衰える運動ニューロンは、腕もしくは脚にいたるものである。ＡＬＳを有するものは、歩行困難を有し得、彼らは、ものを落とし、ころび、発話が不明瞭になり、制御できずに笑うもしくは泣くことがある。最終的に、四肢の筋肉は、不使用から萎縮し始める。この筋肉の虚弱は悪化していき、個人は、車いすが必要になるか、またはベッドを降りて活動できなくなる。大部分のＡＬＳ患者は、呼吸不全からもしくは肺炎のように人工呼吸器による補助の合併症から死亡する（疾患が始まって３〜５年）。ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤が有用であり得る他の神経筋疾患としては、脊髄損傷もしくは脳卒中に起因する麻痺；外傷、または変性性、代謝性、もしくは炎症性のニューロパチーに起因する脱神経；成人運動ニューロン疾患；多病巣性の神経ブロック（ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｂｌｏｃｋ）を伴う自己免疫運動ニューロパチー；ならびに乳児もしくは若年性脊髄性筋萎縮が挙げられる。
【０１４５】
ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤によって誘導される増大した筋肉量はまた、筋消耗疾患に罹患しているものに利益を与え得る。Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら（１９９８，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：１４９３８〜４３）は、ＧＤＦ８発現がヒトにおける除脂肪体重と逆相関し、上記ＧＤＦ８遺伝子の増大した発現が、ＡＩＤＳ消耗症候群を有する男性において、体重減少と関連することを報告した。ＡＩＤＳ患者におけるＧＤＦ８の機能を阻害することによって、ＡＩＤＳの少なくとも特定の症状が、完全に除去されないとしても緩和され得、従って、ＡＩＤＳ患者におけるクオリティーオブライフを有意に改善し得る。
【０１４６】
最も消耗性であり、生命を脅かすがんの局面の中には、がん食欲不振−悪液質症候群がある。がん食欲不振−悪液質症候群における進行性の体重減少は、がんの多くのタイプのうちの一般的な特徴であり、乏しいクオリティーオブライフおよび化学療法に対する乏しい応答の原因であるのみならず、体重減少がない匹敵する腫瘍を有する患者において見いだされるより生存期間もより短い。食欲不振、脂肪および筋組織消耗、心的困難、および低いクオリティーオブライフと関連して、悪液質は、がんと宿主との間の複雑な相互作用から生じる。悪液質は、がん患者の中で最も一般的な死亡原因のうちの１つであり、死亡時に８０％に存在する。悪液質は、タンパク質、炭水化物、および脂肪の代謝に影響を及ぼす代謝的カオスの複雑な例である。腫瘍は、直接的および間接的両方の異常を生じ、食欲不振および体重減少を生じる。現在では、この過程を制御もしくは逆転するための処置は存在しない。がん食欲不振−悪液質症候群は、サイトカイン生成、脂質動員（ｌｉｐｉｄ−ｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ）因子およびタンパク質分解誘導因子の放出、ならびに中間代謝における変化に影響を及ぼす。食欲不振は一般的であるが、食品摂取の低下単独では、がん患者において認められる体組成における変化を説明できず、栄養摂取の増大は、消耗症候群を逆転することはできない。悪液質は、一般に、病前の体重の５％より多くの意図しない体重減少が、６ヶ月以内に起これば、がんを有する患者において疑われる。
【０１４７】
成体マウスにおけるＧＤＦ８の全身の過剰発現は、ヒト悪液質症候群において認められるものに類似する顕著な筋肉および脂肪の減少を誘導することが見いだされた（Ｚｉｍｍｅｒｓら、２００２，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：１４８６〜１４８８）ので、薬学的組成物としての本発明のＡｃｔＲＩＩＡ結合剤は、上記悪液質症候群の症状（ここで筋肉の成長が所望される）を予防、処置もしくは改善するために有益に使用され得る。これは、がんと関連した悪液質、および関節リウマチと関連した悪液質を含む。
【０１４８】
特定の実施形態において、本発明は、必要な個体におけるＦＳＨ分泌を、治療上有効な量のＡｃｔＲＩＩＡ結合剤（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡに対して指向される中和抗体）を上記個体に投与することによって、低下もしくは阻害するための方法を提供する。男性におけるＦＳＨの正常値は、２〜１８  ｍＩＵ／ｍｌ血液の範囲に及ぶ。女性についての正常値は、５〜２５ｍＩＵ／ｍＬの範囲に及ぶ。健康な女性において５０  ｍＩＵ／ｍＬより高いレベルは、閉経と関連する。ＦＳＨの組織濃度は、唾液を試験することによって決定され得る（ｅＭＨＰＴＭ）。
【０１４９】
特定の実施形態において、本発明は、必要な個体において前立腺がんを、治療上有効な量のＡｃｔＲＩＩＡ結合剤（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡに対する中和抗体）を、ＦＳＨ分泌を低下もしくは阻害するために上記個体に投与することによって、処置もしくは予防するための方法を提供する。これら方法は、ヒト（特に、前立腺がんを発症するリスクが高い男性）の治療的および予防的な処置のために使用され得る、あらゆる男性は、前立腺がんを発症させるリスクがあるので、前立腺がんを発症させるリスクが高い男性は、リスク因子が、一般的集団もしくは特定の年齢群内の男性の集団と比較して、上記疾患を発症させるより高い確率を与えるものである。例示的リスク因子としては、年齢、家族歴もしくは遺伝的構成、生活習慣（ｌｉｆｅｓｔｙｌｅ  ｈａｂｉｔ）（例えば、運動および食事）、ならびに放射線もしくは他のがんを引き起こす因子への曝露が挙げられる。
【０１５０】
用語「前立腺がんを処置する」とは、処置されていないコントロールと比べて、または処置する前に疾患の重篤度と比べて、上記疾患の１つ以上の症状もしくは特徴の改善に言及する。上記用語は、上記処置を受けている患者が治癒すること、または上記疾患が上記患者から完全に根絶されることは必ずしも必要としない。前立腺がんを処置する薬剤が、上記疾患の１つ以上の症状の重篤度もしくは特徴を低下させる薬剤であり得る。腫瘍増殖および進行は、種々の要因（細胞周期進行および細胞分裂のメディエーター、ならびに細胞死の調節因子、またはアポトーシスが挙げられる）によって影響を受け得ることに注意すべきである。よって、前立腺がんを処置することは、がん細胞増殖における低下もしくは細胞分裂の速度における低下を包含し得る。代わりにもしくはさらに、前立腺がんを処置することは、がん細胞生存の低下もしくはアポトーシスの増大を包含し得る。よって、特定の実施形態において、前立腺がんを処置することは、細胞分裂の低下および細胞死の増大の両方を包含し得る。機構に拘わらず、前立腺がんを処置することにおける薬剤の有効性は、観察可能な測定基準（例えば、コントロールと比較した、がん細胞の数の低下（増殖の低下、アポトーシスの増大、もしくはその両方のいずれかに起因する）、またはコントロールと比較した腫瘍サイズの低下）によって決定され得る。従って、前立腺がんを処置すること、または腫瘍もしくばがん細胞の増殖を阻害することは、このような変化が起こる機構に関して中立であることが意図される。予防および処置の両方が、医師もしくは他のヘルスケア提供者によって提供される診断および上記治療剤の投与の意図された結果の分析において認識され得る。
【０１５１】
ヒトにおける前立腺がん進行に対する本発明のアンタゴニストの効果を観察する場合、効果は、測定可能な疾患の低下もしくは消失、および／または新たな病変の非存在もしくは転移の予防によって評価され得る。例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤は、非侵襲性および侵襲性の前立腺がんの両方を有する患者において前立腺がん進行を有意に低下もしくは遅延させ得る。さらに、上記薬剤は、上記疾患のリスク因子を有する健康な男性において、前立腺がんを発症させるリスクを防止もしくは低下させ得る。これら薬剤はまた、上記疾患の病歴を有する患者における前立腺がん再発のリスクを低下させ得る。
【０１５２】
よって、ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤は、上記疾患を発症させるリスクがあると考えられる個体において前立腺がんの開始を予防もしくは遅延させるために使用され得、そしてこのようなアンタゴニストは、選択された患者集団において使用され得る。適切な患者集団の例としては、前立腺がんの家族歴を有する患者（例えば、父親もしくは兄弟が上記疾患を有すると診断された男性患者）が挙げられる。一実施形態において、前立腺がんを発症させるリスクが高いと考えられるが、上記疾患を有すると診断されなかった患者は、ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤で処置される。このような処置は、上記患者が、３０歳、４０歳、５０歳、６０歳、もしくは７０歳に達したときに始まり得る。
【０１５３】
本明細書で開示されるＡｃｔＲＩＩＡ結合剤、および特に、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体は、患者（固形腫瘍を有する患者および転移性がんを有する患者が挙げられる）における前立腺がんを処置もしくは予防するために使用され得る。ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤はまた、前立腺の前癌病変もしくは良性病変、または任意の異常な増殖病変（典型的な過形成、異型過形成、および非侵襲性癌腫もしくは上皮内がん（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）が挙げられる）を有するヒト被験体に投与され得る。本開示のアンタゴニストはまた、ホルモン依存性もしくはホルモン応答性のがん、およびホルモン非依存性がん（例えば、ホルモン無反応性前立腺がん）の両方の処置もしくは予防において有用である。ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤は、上昇した（正常前立腺組織由来細胞に比較して）レベルのアクチビン（例えば、Ａ、ＡＢもしくはＢ）または上昇したレベルのＡｃｔＲＩＩＡを発現する腫瘍において特に有用であると判明し得る。
【０１５４】
特定の実施形態において、本発明は、ＦＳＨ分泌下垂体腫瘍に罹患した個体におけるＦＳＨ分泌を、治療上有効な量のＡｃｔＲＩＩＡ結合剤（例えば、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体）を上記個体に投与することによって、低下もしくは阻害するための方法を提供する。これら下垂体腫瘍におけるＦＳＨの過剰分泌を阻害することは、腫瘍症状（例えば、増大したエストロゲンレベルおよび卵巣嚢腫の発生）を低下させるための処置として有用である。本発明の方法は、好ましくは、従来のがん治療（例えば、外科手術）と関連して使用されるが、ＦＳＨ分泌の阻害単独が、特に、外科手術もしくは照射が禁忌である場合において、有効な処置であり得る。抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体はまた、卵巣過剰刺激症候群を有する患者を処置するために使用され得る。
【０１５５】
本発明は、従来のがん治療（例えば、化学療法、放射線療法、光線療法、免疫療法および外科手術、特に、前立腺切除術）の有効性が、本発明の結合剤の使用を介して増強され得ることを認識する。よって、ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤は、前立腺がんの処置、予防、もしくは管理のための組み合わせ治療において使用され得る。上記結合剤は、放射線および／もしくは外科的処置と、ならびに細胞傷害性化学療法および／もしくは内分泌療法と組み合わせて、患者に投与され得る。このような組み合わせ処置は、相乗的に作用し得、上記個々の処置の各々の投与量の低下を可能にし得る。それによって、より高い投与量での各処置によって発揮される有害な副作用が低下する。他の場合において、処置に抗療性である悪性疾患は、２種以上の異なる処置の組み合わせ治療に応答し得る。よって、本開示は、別の従来の抗新生物薬剤と組み合わせて、同時にもしくは逐次的のいずれかで、上記抗新生物薬剤の治療効果を増強するか、またはこのような抗新生物薬剤への細胞耐性を克服するために、ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤を投与することに関する。本開示はまた、ホルモン療法と組み合わせた、ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤の投与に関する。ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤はまた、ＦＳＨ分泌下垂体腫瘍から生じる症状を低下させるために、組み合わせ治療において使用され得る。組み合わせ抗腫瘍療法のために使用され得る薬学的化合物としては、以下が挙げられるが、例示するに過ぎない：アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イリノテカン（ｉｒｏｎｏｔｅｃａｎ）、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトータン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、二塩化チタノセン（ｔｉｔａｎｏｃｅｎｅ  ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ）、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン。
【０１５６】
これら化学療法抗腫瘍化合物は、例えば、以下の群へのそれらの作用機構によって分類され得る：代謝拮抗物質／抗がん剤（例えば、ピリミジンアナログ（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビンおよびシタラビン）およびプリンアナログ、葉酸アンタゴニストおよび関連インヒビター（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチンおよび２−シクロデオキシアデノシン（クラドリビン）））；抗増殖／抗有糸分裂剤（ビンカ・アルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン）、微小管破壊因子（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ）（例えば、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロンおよびナベルビンのような天然生成物、エピポドフィロトキシン（ｅｐｉｄｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）（エトポシド、テニポシド）が挙げられる）、ＤＮＡ損傷薬剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびエトポシド（ＶＰ１６））；抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシン  Ｄ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびマイトマイシン）；酵素（Ｌ−アスパラギンを体系的に代謝し、それら自身のアスパラギンを合成する能力を有さない細胞を欠乏させるＬ−アスパラギナーゼ）；抗血小板薬剤；抗増殖／抗有糸分裂アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミドおよびアナログ、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、アルキルスルホネート−ブスルファン、ニトロソウレア（カルムスチン（ＢＣＮＵ）およびアナログ、ストレプトゾシン）、トラゼン（ｔｒａｚｅｎｅ）−ダカルバジン（ＤＴＩＣ））；抗増殖／抗有糸分裂代謝拮抗物質（例えば、葉酸アナログ（メトトレキサート）；白金配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトータン、アミノグルテチミド）；ホルモン、ホルモンアナログ（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）およびアロマターゼインヒビター（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝固剤（ヘパリン、合成ヘパリン塩およびトロンビンの他のインヒビター）；線維素溶解剤（ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）（例えば、組織プラスミノゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼ）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走剤（ａｎｔｉｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）；抗分泌剤（ブレフェルジン（ｂｒｅｖｅｌｄｉｎ））；免疫抑制剤（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；抗脈管形成化合物（ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン）および増殖因子インヒビター（血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）インヒビター、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）インヒビター）；アンギオテンシンレセプターブロッカー；酸化窒素ドナー；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ）；細胞周期インヒビターおよび分化誘導因子（トレチノイン）；ｍＴＯＲインヒビター、トポイソメラーゼインヒビター（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、テニポシド（ｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、エピルビシン、エトポシド、イダルビシンおよびミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン（ｍｅｔｈｙｌｐｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、プレドニゾン、およびプレドニゾロン）；増殖因子シグナル伝達キナーゼインヒビター；ミトコンドリア機能不全誘導因子およびカスパーゼ活性化因子；ならびにクロマチン破壊因子。
【０１５７】
特定の実施形態において、組み合わせ治療のために使用され得る薬学的化合物としては、以下が挙げられる：抗脈管形成薬剤（例えば、（１）「脈管形成分子」（例えば、ＶＥＧＦもしくはｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子））の放出のインヒビター；（２）脈管形成分子の中和剤（例えば、抗βｂＦＧＦ抗体）；および（３）脈管形成刺激に対する内皮細胞応答のインヒビター（コラゲナーゼインヒビター、基底膜ターンオーバーインヒビター、抗血管新生ステロイド、真菌由来脈管形成インヒビター、血小板因子４、トロンボスポンジン、関節炎の薬物（例えば、Ｄ−ペニシラミンおよびチオリンゴ酸金（ｇｏｌｄ  ｔｈｉｏｍａｌａｔｅ）、ビタミンＤ３アナログ、α−インターフェロンなどが挙げられる）。脈管形成のさらに提唱されるインヒビターについては、Ｂｌｏｏｄら、Ｂｉｏｃｈ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  １０３２：８９−１１８  （１９９０），  Ｍｏｓｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４８：１４０８−１４１０  （１９９０），  Ｉｎｇｂｅｒら、Ｌａｂ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ５９：４４−５１  （１９８８）、ならびに米国特許第５，０９２，８８５号、同第５，１１２，９４６号、同第５，１９２，７４４号、同第５，２０２，３５２号および同第６５７３２５６号を参照のこと。さらに、脈管形成を阻害するために使用され得る広く種々の化合物がある（例えば、ＶＥＧＦ媒介性脈管形成経路をブロックするペプチドもしくは薬剤、エンドスタチンタンパク質もしくは誘導体、アンジオスタチンのリジン結合フラグメント、メラニンもしくはメラニン促進化合物、プラスミノゲンフラグメント（例えば、プラスミノゲンのＫｒｉｎｇｌｅｓ  １〜３）、トロポニン（ｔｒｏｐｏｉｎ）サブユニット、ビトロネクチンαｖβ３のアンタゴニスト、サポシンＢに由来するペプチド、抗生物質もしくはアナログ（例えば、テトラサイクリン、もしくはネオマイシン）、ジエノゲスト含有組成物、ペプチドに結合したＭｅｔＡＰ−２阻害コアを含む化合物、化合物ＥＭ−１３８、カルコンおよびそのアナログ、ならびにｎａａｌａｄａｓｅインヒビター）。例えば、米国特許第６，３９５，７１８号、同第６，４６２，０７５号、同第６，４６５，４３１号、同第６，４７５，７８４号、同第６，４８２，８０２号、同第６，４８２，８１０号、同第６，５００，４３１号、同第６，５００，９２４号、同第６，５１８，２９８号、同第６，５２１，４３９号、同第６，５２５，０１９号、同第６，５３８，１０３号、同第６，５４４，７５８号、同第６，５４４，９４７号、同第６，５４８，４７７号、同第６，５５９，１２６号、および同第６，５６９，８４５号を参照のこと。
【０１５８】
上記組み合わせ治療の性質に依存して、本発明の治療用ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤の投与は継続され得る一方で、他の治療が、施されているか、そして／またはその後施される。本明細書に記載の結合剤の投与は、単一用量において、もしくは複数用量において行われ得る。いくつかの場合において、上記結合剤の投与は、従来の治療の少なくとも数日前に始められる一方で、他の場合には、投与は、従来の治療の投与の直前もしくは投与時のいずれかに始められる。
【０１５９】
上記適用の一局面は、繁殖可能性において有用な方法および組成物を提供する。ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤の投与を介するＦＳＨ分泌の低下もしくは阻害は、精子成熟を阻害するための有用な方法である。女性において、ＦＳＨの低下は、卵巣における卵胞顆粒膜細胞の増殖を制限するように作用する。ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤の投与を介するＦＳＨ分泌の低下もしくは阻害は、有用な避妊方法である。低下したＦＳＨはまた、卵巣内の卵胞の成熟を遅らせ得、それによって、女性における制限された数の卵胞の成熟を遅らせる。このような処置は、生活における自然受精および後の妊娠の可能性を増大する潜在能力を有する。ＦＳＨ分泌を低下させることによって卵巣内の卵胞の成熟を遅らせることはまた、急激に分裂する細胞を処置するように設計された化学療法もしくは類似の処置の一般的な副作用である卵母細胞の枯渇を防止することにおいて有用である。
【０１６０】
本願はまた、１種以上の避妊薬と組み合わせて、１種以上のＡｃｔＲＩＩＡ結合剤を含む新規な組成物を提供する。例示的な避妊薬としては、エストロゲン、プロゲステロン、プロゲスチン（例えば、ノルエチノドレル、ノルエチンドロン、ノルゲスチメート（ｎｏｒｇｅｓｔｉｍａｔｅ）、ノルゲストレル、レボノルゲストレル（ｌｅｖｏｎｏｒｇｅｓｔｒｅｌ）、メドロキシプロゲステロンおよびデソゲストレル（ｄｅｓｏｇｅｓｔｒｅｌ））、オルメロキシフェン（Ｏｒｍｅｌｏｘｉｆｅｎｅ）（セントクロマン（Ｃｅｎｔｃｈｒｏｍａｎ））が挙げられる。
【０１６１】
特定の実施形態において、本発明は、必要な個体におけるエストロゲン関連障害を、上記個体に、治療上有効な量のＡｃｔＲＩＩＡ結合剤（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡに対して指向される中和抗体）を、ＦＳＨ分泌を低下もしくは阻害するために投与することによって、処置もしくは予防するための方法を提供する。エストロゲン合成に対してＦＳＨの機能を制御するので、ＦＳＨ分泌の低下はまた、エストロゲン関連障害（例えば、子宮筋腫、子宮内膜症、多嚢胞性卵巣疾患（ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｏｖａｒｉａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、機能不全性子宮出血、および卵巣がん）の処置において有効であり得る。
【実施例】
【０１６２】
（例示）
本発明は、ここで一般的に記載されているが、以下の実施例を参照することによってより容易に理解される。実施例は、本発明の特定の実施形態を例示する目的で含められるに過ぎず、本発明を限定するとは解釈されない。
【０１６３】
（実施例１．モノクローナル抗体の生成）
ＡｃｔＲＩＩＡ（ＡＣＶＲ２Ａ）に対する抗体は、種間でのこのレセプターの高い配列保存に起因して、生成するのは困難であった。出願人は、マウスのＡ／Ｊ、ＢＡＬＢ／ｃ、およびＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ系統を異なるＡｃｔＲＩＩＡベースの免疫原での徹底的な免疫化プロトコルに供したが、これらの試みは全て失敗に終わり、抗体を生成できなかった。
【０１６４】
この難題を克服するために、出願人は、ヒトＡｃｔＲＩＩＡ抗原構築物を使用して、ＡｃｔＲＩＩＡ遺伝子のヌル変異を有するマウスを免疫化した。Ａｃｖｒ２ａ−／−マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ａｃｖｒ２ａｔｍ１Ｚｕｋ）は、低下した生存能を有し、２０〜３０％のマウスは、脳顔面頭蓋異常に起因して周産期に死亡してしまう（Ｍａｔｚｕｋら、１９９５，  Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：３５６〜３６０）。ホモ接合性雄性は繁殖可能性がある一方で、ホモ接合性雌性は、繁殖可能性がない。重要なことには、Ａｃｖｒ２ａ−／−マウスは、それらが上記ヒトＡｃｔＲＩＩＡレセプターに対するモノクローナル抗体の生成のために使用されることを可能にするように成体になるまで十分生存する。従って、８匹の雄性および８匹の雌性Ａｃｖｒ２ａ−／−マウスに、キーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）またはオボアルブミン（ＯＶＡ）のいずれかに結合体化させ、かつ完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、もしくはリン酸緩衝化食塩水の存在下で以下のヒトＡｃｔＲＩＩＡ−Ｈｉｓ配列を皮下に免疫化した（２５μｇ／マウス）。
【０１６５】
【化３】
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免疫化の約１０日後に血液を採取して、抗原としてＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃを使用する間接的ＥＬＩＳＡによって、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体の力価を決定した。そのスクリーニングに基づいて、１匹の免疫化したＡｃｖｒ２ａ−／−マウスに、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｈｉｓ−ＫＬＨ（５０μｇ／マウス）の２回目の投与（ｉ．ｐ．）と抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（１０μｇ／マウス）、ＣＤ４０アゴニストとを与えて、Ｂ細胞活性化を促進した。３日後、脾臓を取り出し、Ｂ細胞を、ＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞と標準的な方法によって融合して、ハイブリドーマを得た。見込みのあるハイブリドーマクローンを、全体的な結合特性（ＥＬＩＳＡ）、解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）（ＢＩＡＣＯＲＥＴＭアッセイ）、および中和能（細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイ）についてのスクリーニングに基づいて同定した。２回のハイブリドーマサブクローニングの後、上記抗体候補１４Ｅ１．Ｈ８．Ｈ１（Ａｂ−１４Ｅ１）を、配列決定、精製、およびさらなる特徴付けのために選択した。
【０１６６】
（実施例２．Ａｂ−１４Ｅ１配列）
本発明に従って生成された抗体の構造を分析するために、抗ＡｃｔＲＩＩＡモノクローナル抗体を生成しているハイブリドーマから重鎖および軽鎖の可変領域をコードする核酸をクローニングした。メッセンジャーＲＮＡを、約４×１０６細胞／ハイブリドーマから、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）ホモジナイゼーションシステムおよびＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で調製した。Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＲＴ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、第１鎖ｃＤＮＡを合成し、次いで、これをＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦ  ２  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）および縮重プライマーセットとの組み合わせにおいて使用して（Ｚｈｏｕら、１９９４，  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２：８８８を参照のこと）、ＰＣＲ増幅を行った。
【０１６７】
ＰＣＲ反応生成物を、アガロースゲルおよびＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。次いで、上記定常領域に相補的な３’  ＰＣＲプライマーを使用する標準的方法によって、配列を決定した。上記Ａｂ−１４Ｅ１のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を、それぞれ、図１および図２に示し、対応するヌクレオチド配列を図３および図４に示す。４個のヌクレオチド置換が、縮重ＰＣＲプライマーによるクローニングの間に、ＶＨのＮ末端付近に導入されたにもかかわらず、これらの置換は、活性な抗体を生じたことに留意すること。これらヌクレオチドを、最終配列において調節して（配列番号１４、３位、６位、７位、および１２位；図３）、上記ハイブリドーマに由来する精製タンパク質のＮ末端配列決定によって確認されるように、公知の免疫グロブリンフレームワーク配列に合わせた。また、サイレントヌクレオチド置換を、ＶＨのＣ末端付近（配列番号１４、３５１位および３５７位；図３）およびＶＬのＣ末端付近（配列番号１５；３１２位および３１５位；図４）に導入して、クローニングのための制限部位を作ったことに留意すること。
【０１６８】
以下に列挙されるのは、Ｋａｂａｔら  （１９８７，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ，  ＵＳＡ）およびＣｈｏｔｈｉａおよび共同研究者（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、１９９７，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２７３：９２７−９４８）に従って定義される、Ａｂ−１４Ｅ１のＣＤＲ配列である。
【０１６９】
【化４】
2014502260.tif 000006
ハイブリドーマ馴化培地からの抗体タンパク質の精製は、プロテインＡクロマトグラフィー、透析、ウイルス濾過、および緩衝液交換によって達成した。
【０１７０】
精製されたＶＨタンパク質およびＶＬタンパク質のＮ末端は、Ｎ末端配列決定によって、それぞれ、ＤＶＱＬＱＥＳＳＧＰＧ（配列番号１０）およびＤＩＱＭＴＱＴＴＳ（配列番号１１）であると確認された。
【０１７１】
（実施例３．Ａｂ−１４Ｅ１とＡｃｔＲＩＩＡとの間の接触部位）
Ａｂ−１４Ｅ１における特異性決定残基（ＳＤＲ）を同定するために、Ａｂ−１４Ｅ１とヒトＡｃｔＲＩＩＡとの間の接触部位を、ａ）１４Ｅ１  Ｆａｂ単独およびｂ）ＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と複合体化した１４Ｅ１  Ｆａｂのｘ線結晶解析によって位置を特定した。
【０１７２】
タンパク質生成。    １４Ｅ１  Ｆａｂを、４ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ  システインを含むリン酸緩衝化食塩水中、１００：１（ｗ／ｗ）  Ａｂ−１４Ｅ１：パパインの比において、４時間にわたって３７℃においてＡｂ−１４Ｅ１を活性化パパインで消化することによって結晶化のために調製した。上記消化したサンプルを２倍希釈し、ｐＨ９．５に調節し、ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのクロマトグラフィーに供して、Ｆａｂ成分（フロースルー）を分離した。次いで、これを、サイズ排除クロマトグラフィーでさらに精製した。精製１４Ｅ１  Ｆａｂを、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、および２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む溶液中、１２ｍｇ／ｍｌにおいて貯蔵した。
【０１７３】
ＡｃｔＲＩＩＡ  ＥＣＤを、エンテロキナーゼ切断部位を含むリンカーによって、Ｆｃドメインに結合したヒトＡｃｔＲＩＩＡ  ＥＣＤからなる融合タンパク質からの結晶化のために調製した。ＡｃｔＲＩＩＡ  ＥＣＤを、この融合タンパク質をエンテロキナーゼで一晩３７℃において消化し、上記Ｆｃ成分をＭＡＢＳＥＬＥＣＴＴＭ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）クロマトグラフィーで取り出すことによって得た。次いで、ＡｃｔＲＩＩＡ  ＥＣＤを、エンドグリコシダーゼＨｆ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で脱グリコシル化し、サイズ排除クロマトグラフィーで精製し、カルボキシペプチダーゼＢおよびカルボキシペプチダーゼＹで消化し（リン酸緩衝化食塩水中２０：１  ＡｃｔＲＩＩＡ  ＥＣＤ：ＣＰＢ／ＣＰＹの比、３７℃において一晩インキュベート）、そしてサイズ排除クロマトグラフィーで再び精製した。上記タンパク質複合体を生成するために、精製１４Ｅ１  Ｆａｂを、精製ＡｃｔＲＩＩＡ  ＥＣＤと比  １：１．２で混合し、最後にサイズ排除クロマトグラフィーで精製した。１４Ｅ１  ＦａｂとＡｃｔＲＩＩＡ  ＥＣＤとの精製した複合体を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）および２５ｍＭ  塩化ナトリウムを含む溶液中、２０．５ｍｇ／ｍｌにおいて貯蔵した。
【０１７４】
結晶化方法。    １４Ｅ１  Ｆａｂを、１５〜２５％においてポリエチレングリコール、塩（例えば、チオシアン酸カリウム、硫酸ナトリウム、マロネート、もしくは酒石酸カリウムナトリウム）を含む条件において、および５．５〜８．５の範囲のｐＨ値において結晶化した。データを、２０％  ポリエチレングリコール  ３３５０、２００ｍＭ  硫酸ナトリウム、および１００ｍＭ  ビス−トリスプロパン中、ｐＨ７．７５において成長させた結晶から集めた。これら結晶を、３：１（ｖ／ｖ）の比率において結晶化緩衝液およびグリセロールからなる緩衝液の中に移し、液体窒素中で急速冷凍し、その後、ｘ線システムに移した。
【０１７５】
１４Ｅ１  ＦａｂとＡｃｔＲＩＩＡ  ＥＣＤとの複合体を、７〜１５％においてポリエチレングリコール、１〜１５ｍＭにおいて塩化亜鉛を含む条件において、および５．５〜７．５の間のｐＨ値において結晶化させた。８％  ポリエチレングリコール  ８０００、８ｍＭ  塩化亜鉛、および１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中、ｐＨ７．００において成長した結晶から、データを集めた。これら結晶を、２５％  エチレングリコールを含む結晶化緩衝液中に移し、液体窒素中で急速冷凍し、その後、ｘ線システムへと移した。
【０１７６】
結晶データ
以下の結晶データを、１４Ｅ１  Ｆａｂ、および１４Ｅ１  ＦａｂとＡｃｔＲＩＩＡ  ＥＣＤとの複合体について得た。
【０１７７】
【表２】
2014502260.tif 000007
構造精密化プロセス。    １４Ｅ１  Ｆａｂの結晶構造を決定するために、出願人は、分子置換モデル化のためのモデルとしてＰＤＢ構造１ＦＩＧを使用し、予測通り、１種のＦａｂ分子からなる単一の溶液を得た。それぞれ、ＰＤＢ構造２Ａ６Ｄおよび１ＫＥＮからの相同なＶＬおよびＶＨドメインを、対応する１ＦＩＧドメインに重ね合わせた。位置づけしたＶＬおよびＶＨドメインを置換して、新たな１４Ｅ１  Ｆａｂモデルを作成し、これを、矛盾するシーケンス領域の調節を介して精密化した。上記１４Ｅ１  Ｆａｂモデルを再構築し、これら調節したシーケンスでさらに精密化して、最終の統計値（ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）（上記表を参照のこと）によって評価されるように、優れたモデルを得た。
【０１７８】
１４Ｅ１  ＦａｂとＡｃｔＲＩＩＡ  ＥＣＤとの間の複合体の結晶構造を決定するために、出願人は、分子置換のためのモデルとしてＡｃｔＲＩＩＡの１４Ｅ１構造およびＰＤＧ  ２ＧＯＯ構造を使用した。予測通り、１種のＡｃｔＲＩＩＡ分子および１種の１４Ｅ１  Ｆａｂ分子からなる単一溶液を得た。上記１４Ｅ１  ＦａｂおよびＡｃｔＲＩＩＡ  ＥＣＤモデルを、次いで、再構築し、精密にして、最終統計値（上記表を参照のこと）によって評価されるように、良好な品質のモデルを得た。
【０１７９】
構造結果。    結晶解析から、１４Ｅ１  ＦａｂとＡｃｔＲＩＩＡ  ＥＣＤとの間の大きな接触表面（
【０１８０】
【化５】
2014502260.tif 000008
）が明らかになった。これは、ＡｃｔＲＩＩＡの以前決定されたリガンド結合領域と大部分が重なる（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、１９９９，  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ６：１８−２２；  Ｇｒａｙら、２０００，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：３２０６−３２１２；  Ａｌｌｅｎｄｏｒｐｈら、２００６，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３：７６４３−７６４８）。ＡｃｔＲＩＩＡと接触する１４Ｅ１  Ｆａｂ  ＶＨにおける特定のアミノ酸残基は、ソフトウェア分析（Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ５０：７６０−７６３，  １９９４）によって決定される場合、図５に示され、以下の表にもまた、各ＶＨ残基が個々のＡｃｔＲＩＩＡ残基と作る原子接触の数とともに、列挙される。以下の表において、ＶＨにおけるアミノ酸位置は、３個の代わりの参照点に関して定義される：  ａ）Ｎ末端アスパラギン酸残基；ｂ）０位として再定義される第１のシステイン残基（Ｃ１，２２位）；もしくはｃ）０位として再定義される第２のシステイン残基（Ｃ２，９６位）。以下の表中のＡｃｔＲＩＩＡ  ＥＣＤ残基の番号付けは、上記ＡｃｔＲＩＩＡ  ＥＣＤ配列（配列番号１６）内のＶＨ接触ＡｃｔＲＩＩＡ残基の分布を示す図６と同じである。
【０１８１】
【表３−１】
2014502260.tif 000009
【０１８２】
【表３−２】
2014502260.tif 000010
【０１８３】
【表３−３】
2014502260.tif 000011
ＡｃｔＲＩＩＡと接触する１４Ｅ１  Ｆａｂ  ＶＬにおける特定のアミノ酸残基は、図７に示され、以下の表において、個々のＡｃｔＲＩＩＡ残基と作る各ＶＬ残基との原子接触の数とともに列挙する。以下の表において、ＶＬにおけるアミノ酸位置は、３個の代わりの参照点に関して定義される：  ａ）Ｎ末端アスパラギン酸残基；ｂ）０位として再定義される第１のシステイン残基（Ｃ１，２３位）；もしくはｃ）０位として再定義される第２のシステイン残基（Ｃ２，８８位）。以下の表におけるＡｃｔＲＩＩＡ  ＥＣＤ残基の番号付けは、上記ＡｃｔＲＩＩＡ  ＥＣＤ配列（配列番号１６）内でのＶＬ接触ＡｃｔＲＩＩＡ残基の分布を示す図８と同じである。
【０１８４】
【表４−１】
2014502260.tif 000012
【０１８５】
【表４−２】
2014502260.tif 000013
＊上記１４Ｅ１−ＡｃｔＲＩＩＡ複合体をモデル化するために使用した上記ＡｃｔＲＩＩＡ構造（ＰＤＢ構造２ＧＯＯ）は、ヒト配列（配列番号１６）と比較して、ＥＣＤ  ２０位にある保存的置換（Ｌｙｓ→Ａｒｇ）を有するマウス配列に基づく；しかし、いずれの残基の側鎖も乱れ、上記複合体の構造全体に認識可能な影響を及ぼさなかった。
【０１８６】
（実施例４．Ａｂ−１４Ｅ１によるＡｃｔＲＩＩＡ結合および中和）
出願人は、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥＴＭベースの分析）を使用して、精製Ａｂ−１４Ｅ１によるヒトＡｃｔＲＩＩＡ結合の動態および親和性を決定した。この抗体は、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃ（ダイマータンパク質）をＫＤ  約１２ｐＭで結合し（図９）、ヒスチジンでタグを付けたモノマーＡｃｔＲＩＩＡ（ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｈｉｓ）を１０分の１の親和性で結合すると見いだされた。
【０１８７】
さらに、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭベースの分析を使用して、Ａｂ−１４Ｅ１がその同族リガンドへのＡｃｔＲＩＩＡの結合をブロックし得るか否かを決定した。重大なことには、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃへの複数のリガンドの結合が、２種の異なる試験構成（図１０〜１１）において、ＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃとＡｂ−１４Ｅ１との予備インキュベーションによって妨げられた。従って、このことは、Ａｂ−１４Ｅ１の中和能力を示す。類似の結果が、ダイマーＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃを、ヒスチジンでタグを付けたＡｃｔＲＩＩＡのモノマー細胞外ドメインで置換した場合に得られた。さらに、ＡｃｔＲＩＩＡリガンド、最も顕著には、アクチビンＡは、濃度依存性様式においてＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃへのＡｂ−１４Ｅ１の結合を競合的に阻害した（図１２）。従って、このことは、共有されたエピトープに起因するＡｃｔＲＩＩＡ中和のさらなる証拠を提供する。
【０１８８】
（実施例５．細胞ベースのアッセイにおけるＡｂ−１４Ｅ１によるＡｃｔＲＩＩＡシグナル伝達の中和）
Ａ２０４細胞におけるレポーター遺伝子アッセイを使用して、ＡｃｔＲＩＩＡリガンドであるアクチビンＡおよびアクチビンＢによるシグナル伝達に対する精製抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体の効果を評価した。このアッセイは、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２レポータープラスミド（Ｄｅｎｎｌｅｒら、１９９８，  ＥＭＢＯ  １７：  ３０９１−３１００）およびトランスフェクション効率を照合するためのＲｅｎｉｌｌａレポータープラスミド（ｐＲＬＣＭＶ）でトランスフェクトしたヒト横紋筋肉腫細胞株に基づく。上記ＣＡＧＡ１２モチーフは、ＴＧＦ−β応答性遺伝子（ＰＡＩ−１遺伝子）に存在するので、このベクターは、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３を介してシグナル伝達する因子について一般的に有用である。上記Ａ２０４細胞株は、主にＡｃｔＲＩＩＡを発現するので、これは、潜在的ＡｃｔＲＩＩＡ中和能に対して抗体を試験するために適している。このようなインヒビターの非存在下において、ＡｃｔＲＩＩＡリガンドは、Ａ２０４細胞におけるＡｃｔＲＩＩＡシグナル伝達を用量依存的に刺激し得る。
【０１８９】
上記アッセイの１日目に、Ａ２０４細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−８２）を、４８ウェルプレート中に、１０５細胞／ウェルにて分配した。翌日、１０μｇ  ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２、１μｇ  ｐＲＬＣＭＶ、３０μｌ  Ｆｕｇｅｎｅ  ６（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、および９７０μｌ  ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む溶液を、３０分間にわたって予備インキュベートし、次いで、マッコイの増殖培地に添加し、これを、室温において一晩のインキュベーションにわたり上記プレートした細胞に適用した（５００μｌ／ウェル）。３日目に、培地を除去し、細胞を、６時間にわたって３７℃において、０．１％  ＢＳＡを含むリン酸緩衝化食塩水中に希釈した試験物質（２５０μｌ／ウェル）とともにインキュベートした。すすいだ後、細胞を、受動的溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１９４１）で溶解し、一晩−７０℃において貯蔵した。４日目の最終日に、プレートを、穏やかに振盪しながら室温へと加温した。細胞溶解物を、二連において化学発光プレート（９６ウェル）へと移し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１９８０）の試薬でルミノメーターにおいて分析して、正規化したルシフェラーゼ活性を決定した。
【０１９０】
Ａｂ−１４Ｅ１は、このアッセイにおいてアクチビンＡシグナル伝達の強力なインヒビターであった（図１３）。類似の結果を、Ａｂ−１４Ｅ１とアクチビンＢとについても得た。従って、このことは、Ａｂ−１４Ｅ１が、細胞ベースのシステムにおいて、ＡｃｔＲＩＩＡ媒介性シグナル伝達を中和し得ることを示す。
【０１９１】
（実施例６．マウスにおけるＦＳＨレベルに対するＡｂ−１４Ｅ１の阻害効果）
アクチビンを、もともと、下垂体生殖腺刺激ホルモン産生細胞からＦＳＨ分泌を増大させるその能力によって同定された。アクチビン媒介性シグナル伝達（一部は、ＡｃｔＲＩＩＡを介する）は、いまや、複数の調節レベルにおける作用を介してＦＳＨ分泌を促進すると考えられている（Ｇｒｅｇｏｒｙら、２００４，  Ｓｅｍｉｎ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｍｅｄ  ２２：２５３−２６７）。従って、出願人は、Ａｂ−１４Ｅ１が、上記抗体の中和能のインビボ試験として、マウスにおける循環ＦＳＨ濃度を阻害する能力を調査した。雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６週齢）に、偽手術（ｓｈａｍ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）（ｎ＝１６）もしくは両側の卵巣切除術（ＯＶＸ；ｎ＝１８）のいずれかを受けさせて、ＦＳＨ分泌を脱抑制し、それによって、外因性阻害因子への感受性を増大させた。マウスに６週間の回復期間を与え、次いで、Ａｂ−１４Ｅ１（５０ｍｇ／ｋｇ，ｓ．ｃ．）もしくはビヒクル（Ｔｒｉｓ緩衝化食塩水）で１週間に２回処置した。上記ＯＶＸマウスにおいて４週間の処置後に、および生殖腺が無傷の（偽手術）マウスにおいて処置の８週間後に血液サンプルを集め、マウスＦＳＨの血清レベルを、ラジオイムノアッセイによって決定した。図１４において示されるように、Ａｂ−１４Ｅ１での処置は、ＯＶＸマウスにおいて５０％超（ｐ＜０．０１）、および偽マウスにおいては３０％超、血清ＦＳＨ濃度を低下させたが、後者の差異は、統計学的有意性に達しなかった。この研究の結果は、Ａｂ−１４Ｅ１がインビボでＡｃｔＲＩＩＡシグナル伝達を中和する能力と一致する。
【０１９２】
（実施例７．インヒビン欠損マウスにおけるがん悪液質に対するＡｂ−１４Ｅ１の効果）
インヒビン−αサブユニットが遺伝的に欠損したマウスは、アクチビンＡおよびアクチビンＢを過剰発現する性腺腫瘍を発症させる（Ｍａｔｚｕｋら、１９９２，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：３１３〜３１９；Ｍａｔｚｕｋら、１９９４，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：８８１７〜８８２１）。全てのこのようなマウスは、これら腫瘍を発症させ、最終的には、ＡｃｔＲＩＩＡを介して作用する高レベルの腫瘍由来アクチビンによって媒介されるがん悪液質様症候群で死ぬ（Ｃｏｅｒｖｅｒら、１９９６，  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １０：５３４〜５４３）。従って、出願人は、Ａｂ−１４Ｅ１がこれらマウスにおいて悪液質を阻害する能力を調査した。６週齢で始めて、上記インヒビン−αヌル対立遺伝子についてホモ接合性の雄性および雌性マウスを、Ａｂ−１４Ｅ１（１０ｍｇ／ｋｇ）もしくはビヒクル（リン酸緩衝化食塩水）のいずれかで、１週間に２回、皮下に処置した。マウスを毎日モニターし、重篤な病的状態の事象（脱水、嗜眠、身体を丸めた姿勢、毛並みが乱れた外見（ｕｎｋｅｍｐｔ  ａｐｐｅａｒａｎｃｅ）、呼吸困難、もしくは元の体重の２０％超を喪失）において安楽死させ、体重を、処置の有効性の指数として、１週間に２回測定した。図１５に示されるように、Ａｂ−１４Ｅ１で処置した雄性マウス（ｎ＝９）は、ビヒクル処置した雄性（ｎ＝１１）より研究の過程にわたってより良好な体重増加を示し、雄性におけるＡｂ−１４Ｅ１処置で生存が改善される傾向があった（データは示さず）。それらの雄性の対応するものとは異なり、ビヒクル処置した雌性マウスは、予測外にも、実質的な悪液質を発症せず、Ａｂ−１４Ｅ１での雌性の処置は、ビヒクルと比較して、体重の改善に向かう、有意ではない傾向しかもたらさなかった。この研究の結果から、Ａｂ−１４Ｅ１は、過剰なアクチビンＡｃｔＲＩＩＡシグナル伝達によって引き起こされる腫瘍依存性悪液質をインビボで緩和し得ることが示される。
【０１９３】
まとめると、前述の知見は、ＡｃｔＲＩＩＡ抗原でのＡｃｔＲＩＩＡ欠損マウスの免疫化が、高親和性でＡｃｔＲＩＩＡに結合し得、種々の複雑性の複数のアッセイシステムにおいてＡｃｔＲＩＩＡ媒介性シグナル伝達を中和し得、そしてアクチビン依存性がん悪液質をインビボで緩和し得るモノクローナル抗体（Ａｂ−１４Ｅ１）を生じたことを実証する。
【０１９４】
（実施例８．正常マウスにおける筋肉に対するＡｂ−１４Ｅ１の刺激効果）
出願人は、正常マウスにおいて体重および除脂肪量に対するＡｂ−１４Ｅ１の効果を調査した。６週齢で始めて、雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ａｂ−１４Ｅ１（１０ｍｇ／ｋｇ，  ｉ．ｐ．，  ｎ＝１０）もしくはビヒクル（リン酸緩衝化食塩水，ｎ＝５）で１週間に２回、４週間にわたって処置した。１週間に２回、体重を決定し、除脂肪量を、ベースラインおよび処置の４週間後に、全身核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって決定した。図１６に示されるように、Ａｂ−１４Ｅ１で処置したマウスは、上記研究の過程全体を通じて、コントロールより有意に大きな体重増加を示した。研究の最後に、Ａｂ−１４Ｅ１で処置したマウスは、コントロールの２倍程度より大きく全身除脂肪量が増加した（図１７）。研究の最後に、Ａｂ−１４Ｅ１で処置したマウスにおける胸筋重量（両側）は、ビヒクル処置マウスより１５％大きく、差異は有意な傾向があった（ｐ＝０．１３７）。さらに、ビヒクルと比較して、Ａｂ−１４Ｅ１処置での全身の脂肪重量の蓄積は実質的に低かった（ｐ＝０．０５８）。このことは、ＡｃｔＲＩＩＡに対して指向される抗体が、脂肪蓄積を低下させるために使用され得ることを示す。前述の結果は、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体での処置が、正常マウスにおいて、体重増加、具体的には、除脂肪量（筋肉量の指標）の増加を増大させ得ることを実証する。
【０１９５】
（援用の表示）
本明細書で言及される全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物もしくは特許が、具体的にかつ個々に援用されるために示されるかのように、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
【０１９６】
主題の具体的実施形態が考察されてきたが、本明細書は、例示であって限定ではない。多くのバリエーションは、本明細書および以下の特許請求の範囲を検討すれば、当業者に明らかになる。本発明の全範囲は、特許請求の範囲と、それらの等価物の全範囲、および本明細書と、このようなバリエーションを参照することによって決定されるべきである。
【図５】
2014502260.tif 000014
【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2014502260.tif 000026
【図１４】
2014502260.tif 000027
【図１５】
2014502260.tif 000028
【図１６】
2014502260.tif 000029
【図１７】
2014502260.tif 000030
【配列表】
2014502260000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年7月9日(2013.7.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＡｃｔＲＩＩＡへのアクチビンＡの結合を阻害する、単離された抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項２】
ヒトＡｃｔＲＩＩＡに結合しかつヒトＡｃｔＲＩＩＡへのＡｂ−１４Ｅ１の結合を交叉ブロックする、請求項１に記載の単離された抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項３】
ヒトＡｃｔＲＩＩＡへのアクチビンＡおよびアクチビンＢの結合を阻害する、単離された抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項４】
前記抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体もしくはフラグメントは、（ａ）卵胞刺激ホルモンレベルをインビボで低下させる活性、および（ｂ）細胞株においてインビトロでアクチビンＡシグナル伝達を阻害する活性からなる群より選択される活性を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項５】
前記抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体もしくはフラグメントは、（ａ）卵巣切除した雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて卵胞刺激ホルモンレベルを低下させる活性、および（ｂ）アクチビンＡに曝されたＡ２０４細胞株においてＣＡＧＡ１２によって調節されるレポーター遺伝子の発現を阻害する活性からなる群より選択される活性を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項６】
前記抗体もしくはそのフラグメントは、以下からなる群：
ａ．配列番号１６の１３位にあるフェニルアラニン、
ｂ．配列番号１６の１４位にあるフェニルアラニン、
ｃ．配列番号１６の１５位にあるアスパラギン、
ｄ．配列番号１６の１７位にあるアスパラギン、
ｅ．配列番号１６の２１位にあるアスパラギン酸、
ｆ．配列番号１６の２２位にあるアルギニン、
ｇ．配列番号１６の２３位にあるスレオニン、
ｈ．配列番号１６の２９位にあるグルタミン酸、
ｉ．配列番号１６の３０位にあるプロリン、
ｊ．配列番号１６の３１位にあるシステイン、
ｋ．配列番号１６の３２位にあるチロシン、
ｌ．配列番号１６の３３位にあるグリシン、
ｍ．配列番号１６の３４位にあるアスパラギン酸、
ｎ．配列番号１６の３６位にあるアスパラギン酸、
ｏ．配列番号１６の３７位にあるリジン、
ｐ．配列番号１６の３９位にあるアルギニン、
ｑ．配列番号１６の４０位にあるヒスチジン、
ｒ．配列番号１６の４２位にあるフェニルアラニン、
ｓ．配列番号１６の４４位にあるスレオニン、
ｔ．配列番号１６の４６位にあるリジン、
ｕ．配列番号１６の５５位にあるバリン、
ｖ．配列番号１６の５６位にあるリジン、
ｗ．配列番号１６の５７位にあるグルタミン、
ｘ．配列番号１６の５８位にあるグリシン、
ｙ．配列番号１６の５９位にあるシステイン、
ｚ．配列番号１６の６０位にあるトリプトファン、
ａａ．配列番号１６の６１位にあるロイシン、
ｂｂ．配列番号１６の６２位にあるアスパラギン酸、
ｃｃ．配列番号１６の６３位にあるアスパラギン酸、
ｄｄ．配列番号１６の６４位にあるイソロイシン、
ｅｅ．配列番号１６の６５位にあるアスパラギン、
ｆｆ．配列番号１６の６６位にあるシステイン、
ｇｇ．配列番号１６の７６位にあるリジン、
ｈｈ．配列番号１６の８０位にあるグルタミン酸、
ｉｉ．配列番号１６の８１位にあるバリン、
ｊｊ．配列番号１６の８３位にあるフェニルアラニン、および
ｋｋ．配列番号１６の８５位にあるシステイン、
より選択される、ヒトＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメインにおける１個以上のアミノ酸と接触する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項７】
前記抗体もしくはそのフラグメントは、以下：
ａ．配列番号１２のシステイン１から−２０位にあるバリン、
ｂ．配列番号１２のシステイン１から＋４位にあるグリシン、
ｃ．配列番号１２のシステイン１から＋５位にあるチロシン、
ｄ．配列番号１２のシステイン１から＋９位にあるセリン、
ｅ．配列番号１２のシステイン１から＋１０位にあるグリシン、
ｆ．配列番号１２のシステイン１から＋１１位にあるチロシン、
ｇ．配列番号１２のシステイン１から＋１２位にあるチロシン、
ｈ．配列番号１２のシステイン１から＋３２位にあるチロシン、
ｉ．配列番号１２のシステイン１から＋３７位にあるアスパラギン、
ｊ．配列番号１２のシステイン２から＋４位にあるアラニン、
ｋ．配列番号１２のシステイン２から＋５位にあるチロシン、
ｌ．配列番号１２のシステイン２から＋６位にあるアルギニン
ｍ．配列番号１２のシステイン２から＋７位にあるアスパラギン、
ｎ．配列番号１２のシステイン２から＋８位にあるアスパラギン酸、
ｏ．配列番号１２のシステイン２から＋１０位にあるアルギニン、
ｐ．配列番号１２のシステイン２から＋１２位にあるアラニン、
ｑ．配列番号１２のシステイン２から＋１３位にあるチロシン；および
ｒ．前述のうちのいずれかの保存的置換、
からなるＶＨ残基の群より選択される１個以上のアミノ酸を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離された抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項８】
前記抗体もしくはそのフラグメントは、以下：
ａ．配列番号１３のシステイン１から＋５位にあるアスパラギン酸、
ｂ．配列番号１３のシステイン１から＋７位にあるセリン、
ｃ．配列番号１３のシステイン１から＋９にあるアスパラギン、
ｄ．配列番号１３のシステイン１から＋１０位にあるフェニルアラニン、
ｅ．配列番号１３のシステイン１から＋２７位にあるチロシン、
ｆ．配列番号１３のシステイン１から＋２８位にあるフェニルアラニン、
ｇ．配列番号１３のシステイン１から＋３０位にあるセリン、
ｈ．配列番号１３のシステイン１から＋３１位にあるアルギニン、
ｉ．配列番号１３のシステイン１から＋３２位にあるロイシン、
ｊ．配列番号１３のシステイン１から＋３４位にあるセリン、
ｋ．配列番号１３のシステイン２から−２１位にあるセリン、
ｌ．配列番号１３のシステイン２から＋３位にあるグリシン、
ｍ．配列番号１３のシステイン２から＋４位にあるアスパラギン、
ｎ．配列番号１３のシステイン２から＋５位にあるスレオニン、
ｏ．配列番号１３のシステイン２から＋６位にあるロイシン、
ｐ．配列番号１３のシステイン２から＋８位にあるトリプトファン、および
ｑ．前述のうちのいずれかの保存的置換
からなるＶＬ残基の群より選択される１個以上のアミノ酸を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離された抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項９】
配列番号４、５、６、７、８、および９からなる群より選択されるＣＤＲに対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１個のＣＤＲ配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項１０】
配列番号４、５、６、７、８、および９からなる群より選択されるＣＤＲに対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個もしくは少なくとも６個のＣＤＲ配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項１１】
３個のＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメントであって、ここでＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号４に対して少なくとも８０％同一である配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号５に対して少なくとも８０％同一である配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号６に対して少なくとも８０％同一である配列を含む、抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項１２】
重鎖を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメントであって、ここで該重鎖は、配列番号１２に示される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを含む、抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項１３】
軽鎖を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメントであって、ここで該軽鎖は、配列番号１３に示される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを含む、抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項１４】
重鎖および軽鎖の両方を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメントであって、ここで該重鎖は、配列番号１２に示される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを含み、該軽鎖は、配列番号１３に示される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを含む、抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項１５】
ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤を生成する方法であって、該方法は、生存可能なホモ接合性ＡｃｔＲＩＩＡ欠損マウスを、ＡｃｔＲＩＩＡに由来する抗原ペプチドで免疫化する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
望ましくないＡｃｔＲＩＩＡ依存性シグナル伝達を有する患者において状態を処置するための組成物であって、該組成物は、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体を含む、組成物。
【請求項１７】
前記状態は、不十分な除脂肪体重によって特徴付けられる、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記状態は、筋肉量もしくは筋機能の低下によって特徴付けられる、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記状態は、がん悪液質もしくは筋肉減少症である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
前記患者は、望ましくない高レベルの卵胞刺激ホルモンを有する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメントを含む、薬学的組成物。
【請求項２２】
薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤、もしくはキャリアのうちの１種以上と組み合わせた、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項２３】
Ｆｃ、ポリエチレングリコール、アルブミン、およびトランスフェリンのうちの少なくとも１つに結合体化されている、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して明らかになる。本明細書で開示される全ての参考文献は、各々が個々に援用されるかのように、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
ヒトＡｃｔＲＩＩＡへのアクチビンＡの結合を阻害する、単離された抗体もしくはそのフラグメント。
（項目２）
ヒトＡｃｔＲＩＩＡに結合しかつヒトＡｃｔＲＩＩＡへのＡｂ−１４Ｅ１の結合を交叉ブロックする、項目１に記載の単離された抗体もしくはそのフラグメント。
（項目３）
ヒトＡｃｔＲＩＩＡへのアクチビンＡおよびアクチビンＢの結合を阻害する、単離された抗体もしくはそのフラグメント。
（項目４）
上記抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体もしくはフラグメントは、（ａ）卵胞刺激ホルモンレベルをインビボで低下させる活性、および（ｂ）細胞株においてインビトロでアクチビンＡシグナル伝達を阻害する活性からなる群より選択される活性を有する、項目１〜３のいずれかに記載の抗体もしくはそのフラグメント。
（項目５）
上記抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体もしくはフラグメントは、（ａ）卵巣切除した雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて卵胞刺激ホルモンレベルを低下させる活性、および（ｂ）アクチビンＡに曝されたＡ２０４細胞株においてＣＡＧＡ１２によって調節されるレポーター遺伝子の発現を阻害する活性からなる群より選択される活性を有する、項目１〜４のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
（項目６）
上記抗体もしくはそのフラグメントは、以下からなる群：
ａ．配列番号１６の１３位にあるフェニルアラニン、
ｂ．配列番号１６の１４位にあるフェニルアラニン、
ｃ．配列番号１６の１５位にあるアスパラギン、
ｄ．配列番号１６の１７位にあるアスパラギン、
ｅ．配列番号１６の２１位にあるアスパラギン酸、
ｆ．配列番号１６の２２位にあるアルギニン、
ｇ．配列番号１６の２３位にあるスレオニン、
ｈ．配列番号１６の２９位にあるグルタミン酸、
ｉ．配列番号１６の３０位にあるプロリン、
ｊ．配列番号１６の３１位にあるシステイン、
ｋ．配列番号１６の３２位にあるチロシン、
ｌ．配列番号１６の３３位にあるグリシン、
ｍ．配列番号１６の３４位にあるアスパラギン酸、
ｎ．配列番号１６の３６位にあるアスパラギン酸、
ｏ．配列番号１６の３７位にあるリジン、
ｐ．配列番号１６の３９位にあるアルギニン、
ｑ．配列番号１６の４０位にあるヒスチジン、
ｒ．配列番号１６の４２位にあるフェニルアラニン、
ｓ．配列番号１６の４４位にあるスレオニン、
ｔ．配列番号１６の４６位にあるリジン、
ｕ．配列番号１６の５５位にあるバリン、
ｖ．配列番号１６の５６位にあるリジン、
ｗ．配列番号１６の５７位にあるグルタミン、
ｘ．配列番号１６の５８位にあるグリシン、
ｙ．配列番号１６の５９位にあるシステイン、
ｚ．配列番号１６の６０位にあるトリプトファン、
ａａ．配列番号１６の６１位にあるロイシン、
ｂｂ．配列番号１６の６２位にあるアスパラギン酸、
ｃｃ．配列番号１６の６３位にあるアスパラギン酸、
ｄｄ．配列番号１６の６４位にあるイソロイシン、
ｅｅ．配列番号１６の６５位にあるアスパラギン、
ｆｆ．配列番号１６の６６位にあるシステイン、
ｇｇ．配列番号１６の７６位にあるリジン、
ｈｈ．配列番号１６の８０位にあるグルタミン酸、
ｉｉ．配列番号１６の８１位にあるバリン、
ｊｊ．配列番号１６の８３位にあるフェニルアラニン、および
ｋｋ．配列番号１６の８５位にあるシステイン、
より選択される、ヒトＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメインにおける１個以上のアミノ酸と接触する、項目１〜５のいずれか１項に記載の単離された抗体もしくはそのフラグメント。
（項目７）
上記抗体もしくはそのフラグメントは、以下：
ａ．配列番号１２のシステイン１から−２０位にあるバリン、
ｂ．配列番号１２のシステイン１から＋４位にあるグリシン、
ｃ．配列番号１２のシステイン１から＋５位にあるチロシン、
ｄ．配列番号１２のシステイン１から＋９位にあるセリン、
ｅ．配列番号１２のシステイン１から＋１０位にあるグリシン、
ｆ．配列番号１２のシステイン１から＋１１位にあるチロシン、
ｇ．配列番号１２のシステイン１から＋１２位にあるチロシン、
ｈ．配列番号１２のシステイン１から＋３２位にあるチロシン、
ｉ．配列番号１２のシステイン１から＋３７位にあるアスパラギン、
ｊ．配列番号１２のシステイン２から＋４位にあるアラニン、
ｋ．配列番号１２のシステイン２から＋５位にあるチロシン、
ｌ．配列番号１２のシステイン２から＋６位にあるアルギニン
ｍ．配列番号１２のシステイン２から＋７位にあるアスパラギン、
ｎ．配列番号１２のシステイン２から＋８位にあるアスパラギン酸、
ｏ．配列番号１２のシステイン２から＋１０位にあるアルギニン、
ｐ．配列番号１２のシステイン２から＋１２位にあるアラニン、
ｑ．配列番号１２のシステイン２から＋１３位にあるチロシン；および
ｒ．前述のうちのいずれかの保存的置換、
からなるＶＨ残基の群より選択される１個以上のアミノ酸を含む、項目１〜６のいずれか１項に記載の単離された抗体もしくはそのフラグメント。
（項目８）
上記抗体もしくはそのフラグメントは、以下：
ａ．配列番号１３のシステイン１から＋５位にあるアスパラギン酸、
ｂ．配列番号１３のシステイン１から＋７位にあるセリン、
ｃ．配列番号１３のシステイン１から＋９にあるアスパラギン、
ｄ．配列番号１３のシステイン１から＋１０位にあるフェニルアラニン、
ｅ．配列番号１３のシステイン１から＋２７位にあるチロシン、
ｆ．配列番号１３のシステイン１から＋２８位にあるフェニルアラニン、
ｇ．配列番号１３のシステイン１から＋３０位にあるセリン、
ｈ．配列番号１３のシステイン１から＋３１位にあるアルギニン、
ｉ．配列番号１３のシステイン１から＋３２位にあるロイシン、
ｊ．配列番号１３のシステイン１から＋３４位にあるセリン、
ｋ．配列番号１３のシステイン２から−２１位にあるセリン、
ｌ．配列番号１３のシステイン２から＋３位にあるグリシン、
ｍ．配列番号１３のシステイン２から＋４位にあるアスパラギン、
ｎ．配列番号１３のシステイン２から＋５位にあるスレオニン、
ｏ．配列番号１３のシステイン２から＋６位にあるロイシン、
ｐ．配列番号１３のシステイン２から＋８位にあるトリプトファン、および
ｑ．前述のうちのいずれかの保存的置換
からなるＶＬ残基の群より選択される１個以上のアミノ酸を含む、項目１〜７のいずれか１項に記載の単離された抗体もしくはそのフラグメント。
（項目９）
配列番号４、５、６、７、８、および９からなる群より選択されるＣＤＲに対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１個のＣＤＲ配列を含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
（項目１０）
配列番号４、５、６、７、８、および９からなる群より選択されるＣＤＲに対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個もしくは少なくとも６個のＣＤＲ配列を含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
（項目１１）
３個のＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメントであって、ここでＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号４に対して少なくとも８０％同一である配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号５に対して少なくとも８０％同一である配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号６に対して少なくとも８０％同一である配列を含む、抗体もしくはそのフラグメント。
（項目１２）
重鎖を含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメントであって、ここで該重鎖は、配列番号１２に示される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを含む、抗体もしくはそのフラグメント。
（項目１３）
軽鎖を含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメントであって、ここで該軽鎖は、配列番号１３に示される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを含む、抗体もしくはそのフラグメント。
（項目１４）
重鎖および軽鎖の両方を含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメントであって、ここで該重鎖は、配列番号１２に示される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを含み、該軽鎖は、配列番号１３に示される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを含む、抗体もしくはそのフラグメント。
（項目１５）
ＡｃｔＲＩＩＡ結合剤を生成する方法であって、該方法は、生存可能なホモ接合性ＡｃｔＲＩＩＡ欠損マウスを、ＡｃｔＲＩＩＡに由来する抗原ペプチドで免疫化する工程を包含する、方法。
（項目１６）
望ましくないＡｃｔＲＩＩＡ依存性シグナル伝達を有する患者において状態を処置する方法であって、該方法は、状態の処置を必要とする患者に、有効量の、項目１〜１４のいずれか１項に記載の抗体を投与する工程を包含する、方法。
（項目１７）
上記状態は、不十分な除脂肪体重によって特徴付けられる、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
上記状態は、筋肉量もしくは筋機能の低下によって特徴付けられる、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
上記状態は、がん悪液質もしくは筋肉減少症である、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
上記患者は、望ましくない高レベルの卵胞刺激ホルモンを有する、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
項目１〜１４のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメントを含む、薬学的組成物。
（項目２２）
薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤、もしくはキャリアのうちの１種以上と組み合わせた、項目１〜１４のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
（項目２３）
Ｆｃ、ポリエチレングリコール、アルブミン、およびトランスフェリンのうちの少なくとも１つに結合体化されている、項目１〜１４のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
【国際調査報告】
2014502260.tif 000031
2014502260.tif 000032
2014502260.tif 000033
2014502260.tif 000034
2014502260.tif 000035