(57)【要約】本発明は、自己免疫疾患である尋常性天疱瘡に関するネイティブ抗原に対する抗原代用物の同定を提供する。自己免疫疾患に対する既知の抗体に対してスクリーニングされる大型無作為ペプトイドまたは環状ペプトイドライブラリーを用いて、リガンドは発見される。リガンドは、このような疾患の処置における薬剤として有用であり得るし、自己免疫障害に関連したＴ細胞の同時除去と組合せても用いられ得る。【選択図】図１
2014504594.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己抗体により特異的に認識される抗原代用物リガンドの同定方法であって、（１）尋常性天疱瘡から選択される自己免疫疾患に関連した自己抗体をリガンドライブラリーに曝露すること；（２）自己抗体と結合される少なくとも１つのリガンドを検出すること；そして（３）前記結合リガンドを同定することを包含する方法。
【請求項２】
前記リガンドが３−ｍｅｒ、４−ｍｅｒ、５−ｍｅｒ、６−ｍｅｒ、７−ｍｅｒ、８−ｍｅｒ、９−ｍｅｒまたは１０−ｍｅｒである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記リガンドが支持体と結合される請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記支持体がビーズ、チップ、フィルター、計量棒、膜、ポリマーマトリックスまたはウェルである請求項３記載の方法。
【請求項５】
抗原代用物で自己免疫疾患を有する患者を処置する方法であって、前記抗原代用物が請求項１記載の方法に従って同定されるリガンドを含む方法。
【請求項６】
次式：
【化１】
2014504594.tif 000010
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、独立して、水素；アルキル；アリル；メチル；エチル；ｎ−プロピル；イソプロピル；ｎ−ブチル；イソブチル；ｓｅｃ−ブチル；ｔｅｒｔ−ブチル；ペンチル；ヘキシル；イソペンチル；アリール；ヘテロアリール；フラニル；インドリル；チオフェニル；チアゾリル；イミダゾリル；イソキサゾイル；オキサゾイル；ピペロニル；ピラゾイル；ピロリル；ピラジニル；ピリジル；ピリミジル；ピリミジニル；プリニル；シンノリニル；ベンゾフラニル；ベンゾチエニル；ベンゾトリアゾリル；ベンゾキサゾリル；キノリン；イソキサゾリル；イソキノリン；シクロアルキル；アルケニル；シクロアルケニル；フェニル；ピリジル；メトキシエチル；（Ｒ）−メチルベンジル；Ｃ１−Ｃ６アルキル（これらの各々は、独立して、置換されないか、あるいはハロゲン（ＣＩ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ）、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＯＣｌ−Ｃ６アルキルまたは−ＳＨで置換され得る）；Ｃ２−Ｃ６アルキニル（置換されないか、またはＮＨ２；ＯＨまたはＳＨで置換される）から選択される）
の抗原代用物、またはその製薬上許容可能な塩。
【請求項７】
次式：
【化２】
2014504594.tif 000011
の請求項６記載の抗原代用物、またはその製薬上許容可能な塩。
【請求項８】
式Ｉの抗原代用物、および任意に次式：
【化３】
2014504594.tif 000012
（式中、ｎは０〜８であり；Ｌはリンカーであり；Ｙは毒素または抗体断片であり；ＺはＮＨ２、Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）２、ＯＨまたはＯ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）であり；そしてＲｌ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８（４より大きいｎの各値に関しては、数字順に次のＲ基を式Ｉまたは式ＩＩに付加する）は、水素；アルキル；アリル；メチル；エチル；ｎ−プロピル；イソプロピル；ｎ−ブチル；イソブチル；ｓｅｃ−ブチル；ｔｅｒｔ−ブチル；ペンチル；ヘキシル；イソペンチル；アリール；ヘテロアリール；フラニル；インドリル；チオフェニル；チアゾリル；イミダゾリル；イソキサゾイル；オキサゾイル；ピペロニル；ピラゾイル；ピロリル；ピラジニル；ピリジル；ピリミジル；ピリミジニル；プリニル；シンノリニル；ベンゾフラニル；ベンゾチエニル；ベンゾトリアゾリル；ベンゾキサゾリル；キノリン；イソキサゾリル；イソキノリン；シクロアルキル；アルケニル；シクロアルケニル；フェニル；ピリジル；メトキシエチル；（Ｒ）−メチルベンジル；Ｃ１−Ｃ６アルキル（置換されないか、あるいはＮＨ２、ＯＨまたはＳＨで置換される）；Ｃ２−Ｃ６アルキニル（置換されないか、またはＮＨ２；ＯＨまたはＳＨで置換される）であり得る）
を有するペプトイドを含む診断キット。
【請求項９】
自己免疫疾患を有する患者の処置方法であって、自己免疫疾患に対する抗原代用物、および任意に自己免疫疾患関連Ｔ細胞選択的リガンドの投与を包含する方法。
【請求項１０】
前記抗原代用物が、次式：
【化４】
2014504594.tif 000013
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、独立して、水素；アルキル；アリル；メチル；エチル；ｎ−プロピル；イソプロピル；ｎ−ブチル；イソブチル；ｓｅｃ−ブチル；ｔｅｒｔ−ブチル；ペンチル；ヘキシル；イソペンチル；アリール；ヘテロアリール；フラニル；インドリル；チオフェニル；チアゾリル；イミダゾリル；イソキサゾイル；オキサゾイル；ピペロニル；ピラゾイル；ピロリル；ピラジニル；ピリジル；ピリミジル；ピリミジニル；プリニル；シンノリニル；ベンゾフラニル；ベンゾチエニル；ベンゾトリアゾリル；ベンゾキサゾリル；キノリン；イソキサゾリル；イソキノリン；シクロアルキル；アルケニル；シクロアルケニル；フェニル；ピリジル；メトキシエチル；（Ｒ）−メチルベンジル；Ｃ１−Ｃ６アルキル（これらの各々は、独立して、置換されないか、あるいはハロゲン（ＣＩ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ）、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＯＣｌ−Ｃ６アルキルまたは−ＳＨで置換され得る）；Ｃ２−Ｃ６アルキニル（置換されないか、またはＮＨ２；ＯＨまたはＳＨで置換される）から選択される）
の化合物、またはその製薬上許容可能な塩から選択される請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が、以下の：
【化５】
2014504594.tif 000014
またはその製薬上許容可能な塩から選択される請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
自己免疫障害を有する患者の処置方法であって、束縛オリゴマーから選択される抗原代用物を投与することを包含する方法。
【請求項１３】
前記自己免疫障害が尋常性天疱瘡から選択される請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記束縛オリゴマーがペプトイドまたはペプトイド様部分から選択される請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記自己免疫障害が尋常性天疱瘡から選択される請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
束縛オリゴマーからなる群から選択される抗原代用物、および製薬上許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項１７】
自己免疫Ｔ細胞により特異的に認識される束縛オリゴマーの同定方法であって、以下の：
（ｅ）健常被験体からの第一Ｔ細胞集団を提供すること（ここで、前記集団は第一検出可能標識で標識される）；
（ｆ）自己免疫疾患または障害を疑われるかまたはそれを有する被験体からの第二Ｔ細胞集団を提供すること（ここで、前記集団は第二検出可能標識で標識される）；
（ｇ）前記第一および第二Ｔ細胞集団を、複数の束縛リガンドまたは束縛リガンドおよび非束縛リガンドの組合せと接触させること；そして
（ｈ）前記第一および第二Ｔ細胞集団と、前記束縛リガンドまたは束縛リガンドおよび非束縛リガンドの組合せとの結合を査定すること
を包含する方法。
【請求項１８】
前記自己免疫疾患または障害が尋常性天疱瘡である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
自己免疫疾患または障害に罹患している被験体から自己免疫Ｔ細胞を取り出す方法であって、以下の：
（ｄ）自己免疫Ｔ細胞と特異的に結合する束縛リガンドを提供すること（ここで、前記束縛リガンドは支持体と結合される）；
（ｅ）自己免疫Ｔ細胞と前記支持体結合束縛リガンドとの結合を可能にするのに十分な時間の間、前記被験体からのＴ細胞含有試料を前記支持体結合束縛リガンドと接触させること；そして
（ｆ）前記試料から前記支持体を分離すること
を包含する方法。
【請求項２０】
ステップ（ｃ）の前記試料を前記被験体に戻すことをさらに包含する請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記自己免疫疾患または障害が尋常性天疱瘡である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
束縛オリゴマーを含む自己免疫疾患または症状の処置のためのワクチン。
【請求項２３】
自己免疫疾患または障害に罹患している被験体から得られる自己免疫Ｔ細胞の殺害方法であって、以下の：
（ｃ）自己免疫Ｔ細胞と特異的に結合する束縛リガンドを提供すること（ここで、前記リガンドは毒素と共役される）；
（ｄ）少なくとも１つの自己免疫Ｔ細胞と前記共役体との結合を可能にするのに十分な時間の間、前記被験体からのＴ細胞含有試料を前記共役体と接触させること（ここで、前記共役体は前記自己免疫Ｔ細胞の死を引き起こす）
を包含する方法。
【請求項２４】
前記試料がex vivoで処置される請求項２３記載の方法であって、その試料を前記被験体に戻すことをさらに包含する方法。
【請求項２５】
前記自己免疫疾患または障害が尋常性天疱瘡である請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
自己免疫疾患または障害に罹患している被験体から得られる自己免疫Ｔ細胞の殺害方法であって、以下の：
（ｃ）自己免疫Ｔ細胞と特異的に結合する束縛リガンドを提供すること（ここで、前記束縛リガンドはＩｇＧ  Ｆｃ含有分子と共役される）；そして
（ｄ）少なくとも１つの自己免疫Ｔ細胞と前記共役体との結合を可能にするのに十分な時間の間、自己免疫Ｔ細胞集団を前記共役体と接触させること（ここで、前記共役体は、前記自己免疫Ｔ細胞に免疫エフェクターを動員して、その死を引き起こす）
を包含する方法。
【請求項２７】
前記自己免疫Ｔ細胞集団がex vivoで処置される請求項２６記載の方法であって、前記試料を前記被験体に戻すことをさらに包含する方法。
【請求項２８】
前記自己免疫疾患または障害が尋常性天疱瘡である請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記束縛オリゴマーがペプトイドまたはペプトイド様部分である請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
前記ＩｇＧ  Ｆｃ含有分子が抗体、一本鎖抗体またはＦｃ断片である請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
前記ＩｇＧ  Ｆｃ含有分子が抗体または一本鎖抗体であり、そして前記束縛リガンドが前記抗体の抗原結合部位に繋ぎとめられる請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記ＩｇＧ  Ｆｃ含有分子がＩｇＧ可変領域を欠くＦｃ断片であり、そして前記束縛リガンドが前記Ｆｃ断片のカルボキシ末端に繋ぎとめられる請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
自己抗体により特異的に認識される抗原代用物リガンドの同定方法であって、（１）自己免疫疾患に関連した自己抗体を束縛リガンドライブラリーまたは束縛および非束縛リガンドを有する組合せライブラリーに曝露すること；（２）自己抗体と結合される少なくとも１つのリガンドを検出すること；そして（３）前記結合リガンドを同定することを包含する方法。
【請求項３４】
前記束縛リガンドおよび任意の非束縛リガンドが３−ｍｅｒ、４−ｍｅｒ、５−ｍｅｒ、６−ｍｅｒ、７−ｍｅｒ、８−ｍｅｒ、９−ｍｅｒまたは１０−ｍｅｒである請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記束縛リガンドおよび任意の非束縛リガンドが支持体と結合される請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
前記支持体がビーズ、チップ、フィルター、計量棒、膜、ポリマーマトリックスまたはウェルである請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
自己免疫疾患を有する患者を抗原代用物で処置する方法であって、前記抗原代用物が請求項３３記載の方法に従って同定されるリガンドを含む方法。
【請求項３８】
それを必要とする患者における特定の自己免疫疾患または障害の処置方法であって、以下の：
（ｅ）特定の自己免疫疾患または症状に関連した特定自己抗体に対してリガンドライブラリーをスクリーニングして、高親和性リガンドを見出すステップ；
（ｆ）前記特定自己免疫疾患または障害に関連した前記特定自己抗体に対する高親和性リガンドを同定するステップ；
（ｇ）前記ライブラリーから前記高親和性リガンドを単離するステップ；そして
（ｈ）単離高親和性リガンドで前記患者を処置するステップ
を包含する方法。
【請求項３９】
前記特定自己免疫疾患または障害が尋常性天疱瘡である請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
請求項３８に従って同定される高親和性リガンドを含む薬学的組成物。
【請求項４１】
前記高親和性リガンドが束縛オリゴマーである請求項４０記載の組成物。
【請求項４２】
前記束縛オリゴマーがペプトイド、ペプトイド様部分または環状ペプトイドから選択される請求項４１記載の組成物。
【請求項４３】
特定の自己免疫疾患または障害に関連した自己抗体に対する高親和性リガンドの同定方法であって、（１）特定の自己免疫疾患または障害に関連した自己抗体を選択するステップ、（２）前記自己抗体に対してリガンドのライブラリーをスクリーニングするステップ、そして（３）前記自己抗体と選択的に結合する高親和性リガンドを同定するステップを包含する方法。
【請求項４４】
請求項４３に従って同定される高親和性リガンドを含む診断用キット。
【請求項４５】
特定の自己免疫疾患または障害を有する患者を併用療法で処置する方法であって、（ａ）前記特定自己免疫疾患または障害に関連した自己抗体に関する特異性を有する薬学的有効量の高親和性リガンド、および（ｂ）前記特定自己免疫疾患または障害に関連したＴ細胞に関する特異性を有する薬学的有効量のリガンドを、前記患者に投与することを包含する方法。
【請求項４６】
ステップ（ｂ）がex vivoで実施される請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
ステップ（ａ）がex vivoで実施される請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
前記自己免疫疾患または障害が尋常性天疱瘡から選択される請求項４５記載の方法。
【請求項４９】
ステップ（ａ）における前記高親和性リガンドが束縛オリゴマーである請求項４５記載の方法。
【請求項５０】
前記束縛オリゴマーがペプトイド様部分、ペプトイドまたは環状ペプトイドから選択される請求項４９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許仮出願第６１／４３１，３２８号（２０１１年１月１０日出願）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、一般的に、分子生物学、免疫学および医学の分野に関する。さらに特定的には、本発明は、自己免疫疾患および症状において存在する自己抗体により認識されるペプトイドの同定に関する。これらのペプトイドまたは他のリガンドは、自己免疫疾患に罹患しているかまたはその危険がある被験体を同定するために、ならびに自己抗体が天然ネイティブ抗原を攻撃するのを防止し、したがって当該疾患または症状を処置するために用いられ得る。
【背景技術】
【０００３】
多数の自己免疫疾患の分子的基礎が、依然として不明である。一部は分子レベルの理解についてこの欠如のため、自己免疫疾患のための診断薬および有効な療法の開発における当該技術分野の状態は、最適条件からは程遠い。例えば、大半の自己免疫疾患の診断のための高度に信頼できる血清タンパク質マーカーは存在しない。ほぼ例外なく、これらの症状を処置するために用いられる薬剤は、自己免疫応答それ自体の下流の事象、例えば炎症を抑制するか、あるいは全免疫系を非選択的に調整するかまたは抑止しようと試みる（Hemmer & Hartung, 2007）が、有意の望ましくない副作用を伴う。診断的および治療的適用の両方に関して、理想的には、自己反応性Ｂ細胞（そしてそれらを産生する抗体）およびＴ細胞を直接的に標的にするが、しかし、外来抗原を認識するＢおよびＴ細胞を無視する分子を得たいと思う。本出願人は、ある種のこのような分子および方法を網羅する特許出願である米国特許第１２／７８９，７１１号を出願している（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）。このような分子は、自己免疫抗体、Ｂ細胞およびＴ細胞の検出および濃化のための診断薬および検索ツールとして用いられ得る。さらに、これらの分子は、免疫系の適正な機能に影響を及ぼさずに、これらの自己反応性細胞を根絶することに向けられる新規薬剤開発プログラムのための基礎として役立ち得る。マイクロアレイ上のランダムリガンドのある種のライブラリーは、種々の疾患関連バイオマーカーに関してスクリーニングし得る、ということも知られている。米国特許出願第１１／４３３，０６９号（これらの記載内容も、参照により本明細書中で援用される）は、調製され得る、そして抗体を含めた疾患関連バイオマーカーならびに自己免疫疾患に関連した抗体を有する生物学的試料に対してスクリーニングされ得る種々のランダムライブラリーを教示する。一方、本発明は、特定の自己免疫疾患を引き起こすかまたは悪化させるのを防止するための自己抗体との結合に有用である抗原代用物を見出すために、特定の自己免疫疾患と関連することが既知である自己抗体に対してリガンドのライブラリーをスクリーニングする方法に関する。さらに、このようなリガンドは、自己免疫疾患および症状に関して個体をスクリーニングするための診断薬としても用いられ得る。好ましい一実施形態では、本発明は、自己免疫疾患に関連した少なくとも１つの自己抗体に対して環状ペプトイドリガンドのライブラリーをスクリーニングすることに関する。米国特許出願第１２／９０５，６０５号（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）は、環状ペプトイドライブラリーの調製を教示する。別の好ましい実施形態では、スクリーニングは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはこのような抗体を産生するかまたは産生を引き起こす他の細胞が、特許出願１２／７８９，７１１に開示された方法に従ってこのようなＢ細胞またはＴ細胞に関する高親和性リガンドを見出すためにリガンドの一ライブラリーに対してスクリーニングされる組合せスクリーニングであり得るが、この場合、上記リガンドは、このような自己抗体を産生するＢ細胞、および／または健常細胞に関しては未だ選択的でない細胞、またはこのような自己免疫障害に��連がない細胞を賛成するこのような抗体の産生を刺激するのを手助けするＴ細胞に関して高度に選択的である。その処置を必要とする患者の血液または体液からこのようなＢ細胞および／またはＴ細胞を引き出すために用いられる方法は、疾患と関連する既知の自己抗体に対してリガンドライブラリーをスクリーニングすることにより、本明細書中に開示される方法に従って見出される高親和性リガンドでこのような自己免疫障害を有する患者を処置することと組合せされて、このようなＢ細胞から産生されるかまたはＴ細胞によるこのような産生を手助けする自己抗体の作用を除去するか、および／または緩和する。これらの既知の自己抗体に対してスクリーニングするためのライブラリーのサイズは、支持系によって、１０，０００〜１００万のリガンドの範囲であり得る。リガンドライブラリーは、当該技術分野で開示された方法により調製される。このような参考文献は、例えば、米国特許第１１／４３３，０６９号（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）で見出され得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、合成分子、すなわち、自己免疫障害を処置するための薬剤としての複合生物学的混合物中に存在するタンパク質、核酸、炭水化物または非接着性細胞のようなリガンド結合部分を結合するリガンドを用いる方法を提供する。このようなリガンドは、自己免疫疾患および障害に関連した既知の自己抗体のライブラリースクリーニング方法を介して見出される。本明細書中の方法に従って見出される高選択的リガンドは、広範囲の構造を有し、自己抗体を結合するかまたは自己抗体に関する親和性を有する任意のリガンドを含み得る。
【０００５】
したがって、本発明に従って、自己抗体により特異的に認識されるリガンドまたはペプトイドの同定方法であって、（ａ）ペプチド、核酸、ペプトイド、環状ペプトイド、炭水化物または他の化学的ライブラリーから選択される合成または天然分子のリガンドライブラリーを提供すること；（ｂ）任意の特定自己免疫疾患または障害に関連した自己抗体に上記リガンドライブラリーを曝露すること；そして（ｃ）自己免疫抗体（単数または複数）と結合するリガンドを同定することを包含する方法が提供される。
【０００６】
本発明は、関連自己免疫疾患または症状を処置するためのこのような同定されたリガンドの使用も包含する。リガンドは、典型的には、少なくともマイクロモルの、好ましくはナノモルの親和性の自己抗体に関する親和性を有する。その使用は、その処置を必要とする患者の処置方法であって、薬学的組成物の形態で患者にリガンドを投与することを包含する方法を伴う。薬学的組成物は、製薬上許容可能な賦形剤と組合せられて、スクリーニング方法において見出されるリガンドを含む。送達方法は、任意の既知の手段、例えば経口送達または非経口送達によるものであり得る。
【０００７】
自己免疫疾患は、多発性硬化症または関節リウマチ、あるいは任意数の他の自己免疫疾患または障害、例えば尋常性天疱瘡であり得る。
【０００８】
リガンドまたはペプトイドは、３−ｍｅｒ、４−ｍｅｒ、５−ｍｅｒ、６−ｍｅｒ、７−ｍｅｒ、８−ｍｅｒ、９−ｍｅｒまたは１０−ｍｅｒまたはそれ以上のオリゴマー（例えば，１１ｍｅｒ〜１６ｍｅｒ）であり得る。リガンドは、任意の種類の束縛オリゴマーであり得る。特に、ペプトイドの束縛オリゴマーが、好ましくは、本発明で用いられる。したがって本発明は、束縛オリゴマーで自己免疫障害または症状を処置する方法に関する。「束縛される」という用語は、相対的用語であって、本出願では、より束縛されたオリゴマーは、環状ペプトイド、ならびに例えば線状ペプトイドまたは線状ペプトイド様部分より相対的に束縛される他のオリゴマーを含む。尋常性天疱瘡のような自己免疫障害を処置するためのより好ましい化合物としては、このような束縛オリゴマー、例えば環状ペプトイドが挙げられる。したがって本発明は、自己免疫障害または症状の処置方法であって、ペプトイドまたはペプトイド様分子、例えば環状ペプトイド、または相対的により強く、このような分子の「結合立体配座」に似ている他のこのような分子からなる群から選択される薬学的有効量の束縛リガンドを投与することを包含する方法に関する。「結合立体配座」という用語は、自己抗体上の特定の標的受容体部位または活性部位と結合される場合の、分子の立体配座を意味する。結合または束縛リガンドは、本明細書中では抗原代用物とも呼ばれる。束縛または「より強固な」ペプトイドへの言及は、具体的には、米国特許出願第１２／９０５，６０５号に見出され、ＵＳ２０１１／００９２３８４（この記載内容は参照により具体的に援用される）として公開されている。
【０００９】
本明細書中で列挙されるスクリーニング方法に従って見出される抗原代用物は、自己免疫ＴまたはＢ細胞により特異的に認識されるリガンドを同定する方法であって、以下の：
（ａ）健常被験体からの第一Ｔ細胞またはＢ細胞集団を提供すること（ここで、前記集団は第一検出可能標識で標識される）；
（ｂ）自己免疫疾患を有する被験体からの第二Ｔ細胞またはＢ細胞集団を提供すること（ここで、前記集団は第二検出可能標識で標識される）；
（ｃ）前記第一および第二Ｔ細胞またはＢ細胞集団を、複数の候補リガンドと接触させること；そして
（ｄ）前記第一および第二Ｔ細胞またはＢ細胞集団と、前記候補リガンドとの結合を査定すること（ここで、前記リガンドが前記第二Ｔ細胞またはＢ細胞と結合するが、しかし前記第一Ｔ細胞またはＢ細胞集団とは結合しない場合、前記リガンドは自己免疫Ｔ細胞またはＢ細胞により認識されるが、しかし健常Ｔ細胞またはＢ細胞によっては認識されない）
を包含する方法により発見されるかまたは見出されるリガンドと組合せても、用いられ得る
【００１０】
上記の第一および第二標識は、蛍光または化学発光、あるいは量子ドット、あるいは当該技術分野で既知の任意の他の既知の標識であり得る。
【００１１】
本明細書中に記載される工程または方法のうちのいずれか１つで用いられるペプトイドまたはリガンドは、支持体、例えばビーズ、チップ、フィルター、計量棒、膜、ポリマーマトリックスまたはウェルと結合され得る。接触ステップは、Ｔ細胞のスクリーニングの場合、自己抗体スクリーニングの使用と組合せて用いる場合は、前記支持体を同時に前記第一および第二Ｔ細胞集団と接触させることを包含し得る。Ｔ細胞集団は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含み得る。被験体は、ヒトまたは動物であり得る。
【００１２】
別の実施形態では、自己免疫疾患に罹患している被験体から自己抗体を取り出す方法であって、自己免疫自己抗体と特異的に結合するリガンドまたはペプトイドを投与することを包含する方法が提供される。自己免疫疾患は、多発性硬化症または関節リウマチ、あるいは他の多数の自己免疫疾患または症状のうちのいずれかであり得る。
【００１３】
リガンドまたはペプトイドは、３−ｍｅｒ、４−ｍｅｒ、５−ｍｅｒ、６−ｍｅｒ、７−ｍｅｒ、８−ｍｅｒ、９−ｍｅｒまたは１０−ｍｅｒまたはそれ以上であり得る。図１で示される「Ｒ」基は、本明細書中で列挙されるような、あるいは米国特許出願第１２／７８９，７１１号に、または米国特許出願第１２／７９１，３８９号（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されているような任意のペプトイド置換基であり得る。図１で示される構造中の「ｎ」は、好ましくは３であるが、２〜７でもあり得る。
【００１４】
リガンドまたはペプトイドは、３−ｍｅｒ、４−ｍｅｒ、５−ｍｅｒ、６−ｍｅｒ、７−ｍｅｒ、８−ｍｅｒ、９−ｍｅｒまたは１０−ｍｅｒであり得る。毒素は、いくつかの組合せ処置実施形態に関して、本明細書中に開示されるリガンドと組合せて用いられるか、または併用される場合、リシン、ジフテリア毒素またはコレラ毒素であり得る。代替的には、毒素は、光活性化毒素、例えばルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジルであり得るし、ステップ（ｂ）は、上記試料を可視光に曝露することをさらに包含し得る。試料は、血液、脳脊髄液または精液であり得る。当該方法は、上記非検体から上記試料を得ることをさらに包含し得る。被験体は、ヒトまたは動物であり得る。
【００１５】
さらに別の実施形態では、（１）自己免疫疾患に罹患している被験体から得られる自己免疫Ｔ細胞の殺害方法であって、以下の：（ａ）自己免疫Ｔ細胞と特異的に結合するリガンドまたはペプトイドを提供すること（ここで、前記リガンドまたはペプトイドはＩｇＧ  Ｆｃ含有分子と共役される）；（ｂ）少なくとも１つの自己免疫Ｔ細胞と前記共役体との結合を可能にするのに十分な時間の間、自己免疫Ｔ細胞集団を前記共役体と接触させること（ここで、前記共役体は前記自己免疫Ｔ細胞に免疫エフェクターを動員して、その死を引き起こす）を包含する方法を包含する組合せ処置が提供される。自己免疫Ｔ細胞集団は、ex vivoで処置され得るし、当該方法は、ステップ（ｂ）の試料を前記被験体に戻すこと、そして（２）前記患者を抗原代用物で処置することをさらに包含し得る。自己免疫疾患は、多発性硬化症または関節リウマチ、あるいは任意の自己免疫疾患であり得る。本発明において、当該実施形態は、本明細書中に列挙される方法により見出される抗原代用物での患者の処置と組合せて、この方法（１）を使用することを伴う。
【００１６】
リガンドまたはペプトイドは、３−ｍｅｒ、４−ｍｅｒ、５−ｍｅｒ、６−ｍｅｒ、７−ｍｅｒ、８−ｍｅｒ、９−ｍｅｒまたは１０−ｍｅｒまたはそれ以上であり得る。ＩｇＧ  Ｆｃ含有分子は、抗体、一本鎖抗体またはＦｃ断片、例えば抗体または一本鎖抗体であり、そして前記リガンドまたはペプトイドは、前記抗体またはＩｇＧ可変領域を欠くＦｃ断片の抗原結合部位に繋ぎとめられ、そして前記リガンドまたはペプトイドは、前記Ｆｃ断片のカルボキシ末端に繋ぎとめられる。試料は、Ｔ細胞または他の細胞がスクリーニングされる事象において、血液、脳脊髄液または精液であり得る。当該方法はさらに、前記被験体から前記試料を得ることを包含し得る。被験体は、ヒトまたは動物であり得る。自己抗体リガンドに関する初期スクリーニングの場合、試料は、既知のまたは単離された自己抗体であるかまたはそれを含有する。この自己抗体は、標識され得るか、あるいは標識化二次抗体で検出され得るリガンド抗体に結合される非標識化自己抗体であり得る。試料は、好ましくは、既知の自己抗体をゆする希釈試料である。
【００１７】
診断目的のために、抗原代用物は一旦検出され、同定されると、前記代用物は、単独で、またはＴ細胞キットと組合せ手、またはＴ細胞リガンドと組合せて診断キットで用いられて、患者試料における自己免疫疾患を検出し得る。
【００１８】
ある実施形態では、抗原代用物と組合せて用いられる本発明の化合物（この場合、化合物は自己免疫Ｔ細胞検出のためである）は、次式を有する：
【化１】
2014504594.tif 000003
（式中、ｎは０〜８であり；Ｌはリンカーであり；Ｙは毒素または抗体断片であり；ＺはＮＨ２、Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）２、ＯＨまたはＯ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）であり；そしてＲｌ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８（４より大きいｎの各値に関しては、数字順に次のＲ基を式Ｉまたは式ＩＩに付加する）は、水素；アルキル；アリル；メチル；エチル；ｎ−プロピル；イソプロピル；ｎ−ブチル；イソブチル；ｓｅｃ−ブチル；ｔｅｒｔ−ブチル；ペンチル；ヘキシル；イソペンチル；アリール；ヘテロアリール；フラニル；インドリル；チオフェニル；チアゾリル；イミダゾリル；イソキサゾイル；オキサゾイル；ピペロニル；ピラゾイル；ピロリル；ピラジニル；ピリジル；ピリミジル；ピリミジニル；プリニル；シンノリニル；ベンゾフラニル；ベンゾチエニル；ベンゾトリアゾリル；ベンゾキサゾリル；キノリン；イソキサゾリル；イソキノリン；シクロアルキル；アルケニル；シクロアルケニル；フェニル；ピリジル；メトキシエチル；（Ｒ）−メチルベンジル；Ｃ１〜Ｃ６アルキル（置換されないか、あるいはＮＨ２、ＯＨまたはＳＨで置換される）；Ｃ２〜Ｃ６アルキニル（置換されないか、またはＮＨ２；ＯＨまたはＳＨで置換される）であり得る）。
【００１９】
ある態様では、Ｒ１は、ＮＨ２、特に４アミノブタンで末端置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【００２０】
さらなる態様では、Ｒ２は、ＮＨ２、特に４アミノブタンで末端置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【００２１】
さらなる態様では、Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、特にイソブチルである。
【００２２】
ある態様では、Ｒ４は、ＮＨ２、特に４アミノブタンで末端置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【００２３】
さらなる態様では、Ｒ５は（Ｒ）−メチルベンジルである。
【００２４】
さらなる態様では、Ｒ６はフラニルである。
【００２５】
ある態様では、Ｒ７は、ＮＨ２、特に４アミノブタンで末端置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【００２６】
さらなる態様では、Ｒ８は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、特にイソブチルである。
【００２７】
本発明のある実施形態は８−ｍｅｒを含み、この場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ７は４−アミノブタンであり；Ｒ３およびＲ８はイソブチルであり；Ｒは（Ｒ）−メチルベンジルであり；そしてＲ６はフラニルである（化合物ＡＧ１２Ａ）。ＡＧ１２Ａは、リシル（４−アミノブタン）、ヒドロキシルまたはカルボキシル基で終結し得る。
【００２８】
他の態様では、末端Ｒ基は、リシル、カルボキシルまたはヒドロキシル基で終結する。
【００２９】
本発明の他の実施形態では、候補ペプトイドまたは環状ペプトイドを含めて本発明の肯定により見出される抗原代用物は、ペプトイドのアミン上の置換基のために上記のＲ基のいずれかも有し得る。本発明が尋常性天疱瘡の自己抗体に対する抗原代用物を含む場合、好ましい化合物は、式Ｉ：
【化２】
2014504594.tif 000004
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、独立して、水素；アルキル；アリル；メチル；エチル；ｎ−プロピル；イソプロピル；ｎ−ブチル；イソブチル；ｓｅｃ−ブチル；ｔｅｒｔ−ブチル；ペンチル；ヘキシル；イソペンチル；アリール；ヘテロアリール；フラニル；インドリル；チオフェニル；チアゾリル；イミダゾリル；イソキサゾイル；オキサゾイル；ピペロニル；ピラゾイル；ピロリル；ピラジニル；ピリジル；ピリミジル；ピリミジニル；プリニル；シンノリニル；ベンゾフラニル；ベンゾチエニル；ベンゾトリアゾリル；ベンゾキサゾリル；キノリン；イソキサゾリル；イソキノリン；シクロアルキル；アルケニル；シクロアルケニル；フェニル；ピリジル；メトキシエチル；（Ｒ）−メチルベンジル；Ｃ１〜Ｃ６アルキル（これらの各々は、独立して、置換されないか、あるいはハロゲン（ＣＩ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ）、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＯＣｌ−Ｃ６アルキルまたは−ＳＨで置換され得る）；Ｃ２〜Ｃ６アルキニル（置換されないか、またはＮＨ２；ＯＨまたはＳＨで置換される）から選択される）
の化合物、またはその製薬上許容可能な塩である。環状ペプトイドは、上に図示したように、分子の左側のアミド部分のＮＨ２基を介して、マイクロアレイのような支持体または他の支持体と連結される。
【００３０】
好ましい一実施形態では、尋常性天疱瘡における抗原代用物として作用する環状ペプトイドは、次式のものである：
【化３】
2014504594.tif 000005
【００３１】
本発明は、自己免疫障害を有する患者の処置方法であって、束縛オリゴマーから選択される抗原代用物を投与することを包含する方法にも関する。当該方法は、好ましくは、上記患者の処置方法に関するが、この場合、自己免疫障害は尋常性天疱瘡から選択される。好ましくは、当該方法では、束縛オリゴマーはペプトイドまたはペプトイド様部分から選択される。
【００３２】
本発明は、束縛オリゴマーからなる群から選択される抗原代用物、および製薬上許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物も含む。
【００３３】
本発明はさらに、自己免疫Ｔ細胞により特異的に認識される束縛リガンドの同定方法であって、以下の：
（ａ）健常被験体からの第一Ｔ細胞集団を提供すること（ここで、前記集団は第一検出可能標識で標識される）；
（ｂ）自己免疫疾患または障害が疑われるかまたはそれを有する被験体からの第二Ｔ細胞を提供すること（ここで、前記集団は第二検出可能標識で標識される）；
（ｃ）前記第一および第二Ｔ細胞集団を、複数の束縛リガンドまたは束縛リガンドと非束縛リガンドの組合せと接触させること；そして
（ｄ）前記第一および第二Ｔ細胞集団と、前記束縛リガンドまたは束縛リガンドと非束縛リガンドの組合せとの結合を査定すること
を包含する方法を含む。
【００３４】
上記方法において、好ましい自己免疫疾患または障害は尋常性天疱瘡である。
【００３５】
本発明は、自己免疫疾患または障害に罹患している被験体から自己免疫Ｔ細胞を取り出す方法であって、以下の：
（ａ）自己免疫Ｔ細胞と特異的に結合する束縛リガンドを提供すること（ここで、前記束縛リガンドは支持体と結合される）；
（ｂ）自己免疫Ｔ細胞と前記支持体結合束縛リガンドとの結合を可能にするのに十分な時間の間、前記被験体からのＴ細胞含有試料を前記支持体結合束縛リガンドと接触させること；そして
（ｃ）前記試料から前記支持体を分離すること
を包含する方法も含む。
【００３６】
当該方法は、ステップ（ｃ）の前記試料を前記被験体に戻すことをさらに包含する。
【００３７】
前記方法では、選択される自己免疫疾患または障害は尋常性天疱瘡である。
【００３８】
本発明は、束縛オリゴマーを含む自己免疫疾患または症状の処置のためのワクチンにも関する。前記ワクチンまたは抗原代用物の投与は、ワクチン単独で、またはワクチンアジュバントと組合せて投与される場合、自己免疫疾患または症状を処置するために十分である。
【００３９】
本発明は、自己免疫疾患または障害に罹患している被験体から得られる自己免疫Ｔ細胞の殺害方法であって、以下の：
（ａ）自己免疫Ｔ細胞と特異的に結合する束縛リガンドを提供すること（ここで、前記リガンドは毒素と共役される）；
（ｂ）少なくとも１つの自己免疫Ｔ細胞と前記共役体との結合を可能にするのに十分な時間の間、前記被験体からのＴ細胞含有試料を前記共役体と接触させること（ここで、前記共役体は前記自己免疫Ｔ細胞の死を引き起こす）
を包含する方法にも関する。
【００４０】
当該方法はさらに、試料をex vivoで処置し、その試料を前記被験体に戻すことを包含する。
【００４１】
上記の処置の好ましい方法は、尋常性天疱瘡から選択される自己免疫疾患または障害に関する。
【００４２】
本発明は、自己免疫疾患または障害に罹患している被験体からまたは被験体において得られる自己免疫Ｔ細胞の殺害方法であって、以下の：
（ａ）自己免疫Ｔ細胞と特異的に結合する束縛リガンドを提供すること（ここで、前記束縛リガンドはＩｇＧ  Ｆｃ含有分子と共役される）；そして
（ｂ）少なくとも１つの自己免疫Ｔ細胞と前記共役体との結合を可能にするのに十分な時間の間、自己免疫Ｔ細胞集団を前記共役体と接触させること（ここで、前記共役体は、前記自己免疫Ｔ細胞に免疫エフェクターを動員して、その死を引き起こす）
を包含する方法にも関する。
【００４３】
当該方法は、前記自己免疫Ｔ細胞集団をex vivoで処置すること、そして前記試料を前記被験体に戻すことをさらに包含する。
【００４４】
上記方法において選択される自己免疫疾患または障害は、尋常性天疱瘡である。選択される抗原代用物または束縛リガンドは、ペプトイドまたはペプトイド様部分である。
【００４５】
本発明はさらに、前記ＩｇＧ  Ｆｃ含有分子が抗体、一本鎖抗体またはＦｃ断片である上記方法を包含する。
【００４６】
本発明はさらに、前記ＩｇＧ  Ｆｃ含有分子が抗体または一本鎖抗体であり、そして前記束縛リガンドが前記抗体の抗原結合部位に繋ぎとめられる上記方法を包含する。
【００４７】
本発明はさらに、前記ＩｇＧ  Ｆｃ含有分子がＩｇＧ可変領域を欠くＦｃ断片であり、そして前記束縛リガンドが前記Ｆｃ断片のカルボキシ末端に繋ぎとめられる上記方法に関する。
【００４８】
本発明は、その処置を必要とする患者における特定の自己免疫疾患または障害の処置方法であって、以下の：
（ａ）特定の自己免疫疾患または症状に関連した特定自己抗体に対してリガンドライブラリーをスクリーニングして、高親和性リガンドを見出すステップ；
（ｂ）前記特定自己免疫疾患または障害に関連した前記特定自己抗体に対する高親和性リガンドを同定するステップ；
（ｃ）前記ライブラリーから前記高親和性リガンドを単離するステップ；そして
（ｄ）単離高親和性リガンドで前記患者を処置するステップ
を包含する方法にも関する。
【００４９】
選択される特定自己免疫疾患または障害は、尋常性天疱瘡である。
【００５０】
本発明は、前段落における上記方法に従って同定される高親和性リガンドを含む薬学的組成物にも関する。
【００５１】
好ましい一実施形態では、組成物は、束縛オリゴマーから選択される高親和性リガンドを含む。
【００５２】
好ましい一実施形態では、組成物は、ペプトイド、ペプトイド様部分または環状ペプトイドから選択される束縛オリゴマーを含む。
【００５３】
本発明は、特定の自己免疫疾患または障害に関連した自己抗体に対する高親和性リガンドの同定方法であって、（１）特定の自己免疫疾患または障害に関連した自己抗体を選択するステップ、（２）前記自己抗体に対してリガンドのライブラリーをスクリーニングするステップ、そして（３）前記自己抗体と選択的に結合する高親和性リガンドを同定するステップを包含する方法にも関する。本発明は、前記自己免疫疾患または障害の処置における、あるいはこのような疾患または障害の診断における前記高親和性リガンドの使用にも関する。
【００５４】
本発明は、その処置を必要塑する特定の自己免疫疾患または障害を有する患者を、以下の：（ａ）前記特定自己免疫疾患または障害に関連した自己抗体に関する特異性を有する高親和性リガンド、および（ｂ）前記特定自己免疫疾患または障害に関連したＴ細胞に関する特異性を有するリガンド：を含む組合せで、処置することを包含する併用療法にも関する。
【００５５】
本明細書中に記載される任意の方法または組成物は、本明細書中に記載される任意の他の方法または組成物と関連して実行され得る、と意図される。
【００５６】
「１つの（a）」または「１つの（an）」という語の使用は、特許請求の範囲および／または明細書中で「〜を含む」という用語と結びつけて用いられる場合、「１つ（one）」を意味し得るが、しかし、「１つまたはそれ以上」、「少なくとも１つ」および「１または１より多い」という意味とも一致する。
【００５７】
この明細書中で考察される任意の実施形態は、本発明の任意の方法または組成物に関連して実行される（その逆もある）、と意図される。さらに、本発明の組成物およびキットは、本発明の方法を達成するために用いられ得る。
【００５８】
この出願全体を通して、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するために用いられている装置、方法に関する誤差の固有の変動、または試験被験体の間に存在する変動を含む、ということを示すために用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
以下の図は、本明細書の一部を構成し、そして本発明のある態様をさらに実証するために包含される。本発明は、本明細書中に示される具体的実施形態の詳細な説明と組合せて、これらの図のうちの１つ以上を参照することにより、より良好に理解され得る。
【図１】各ビーズが環状ペプトイドおよび類似の線状コード鎖を保有するライブラリーを作成するために用いられる一般的戦略の模式図である。
【図２】１ビーズ２化合物戦略によるコード化環状ペプトイドライブラリーの合成。サブモノマーペプトイド合成に用いられるアミンを、図の下部に示す（１，４−ジアミノブタン中のアミンの１つ、およびエタノールアミン中のヒドロキシル基が保護された）。
【図３】マレイミド活性化スライドガラスへのＣｙｓ含有環状ペプトイドの付着（図３Ａ）。チオール側鎖の切断および脱保護化の前に各ビーズ上に作られる環状および線状分子の一般的構造。下段：スポッティング実験のために生成された５つのペプトイドの可変領域の配列（図３Ｂ）。５つのペプトイドの各々が活性化表面にスポットされているマイクロアレイの蛍光画像。各ペプトイドのＤＭＳＯ溶液（≒２ｍＭ）を２回スポットして、溶液を３倍希釈し、再びスポットして、という手順を実行した。洗浄および乾燥後、アレイをＣｙ３共役化ストレプトアビジンとハイブリダイズして、洗浄し、スライドを蛍光スキャナで走査した（詳細に関しては参考文献３０参照）。スポットは、擬似色の緑である（図３Ｃ）。Ｃｙｓは、マイクロアレイ上のペプトイドの保持に不可欠である。２つのペプトイドを合成した。各々が、配列：フルオレセイン−Ｎｌｙｓ−Ｎｓｅｒ−Ｎｌｅｕ−Ｎｓｅｒ−Ｎａｌｌ−Ｎｐｉｐ−Ｎｌｙｓ−Ｎｌｙｓを有した。１つのペプトイドはＣ末端システインも含有したが、しかし他のものは含有しなかった。２つのペプトイドを、マレイミド活性化スライドガラス上にスポットした。洗浄後、スライドを蛍光スキャナを用いて走査した。蛍光強度は、擬似色の青である。
【図４】ビーズ上でのモデルペプトイドの環化反応。
【図５】ＰｙＢＯＰを用いた環化前および環化後のペプトイドのＲＰ−ＨＰＬＣトレース。
【図６】Ｎ末端にＮｍｅａを有する環状ペプトイドライブラリーからの無作為成員に関する配列解析：（ａ）Ｎｍｅａ−Ｎｆｆａ−Ｎａｌｌ−Ｎｌｙｓ−Ｎｌｅｕ−Ｎｐｉｐ−Ｎｌｙｓ。
【図７】Ｎ末端にＮｍｅａを有する環状ペプトイドライブラリーからの無作為成員に関する配列解析：（ｂ）Ｎｍｅａ−Ｎｌｙｓ−Ｎａｌｌ−Ｎｆｆａ−−Ｎａｌａ−Ｎｌｅｕ−Ｎｌｙｓ。
【図８】Ｎ末端にＮｍｅａを有する環状ペプトイドライブラリーからの無作為成員に関する配列解析：（ｃ）Ｎｍｅａ−Ｎｌｐｈｅ−Ｎａｌａ−Ｎｐｈｅ−Ｎａｌｌ−Ｎｌｅｕ−Ｎｌｙｓ。環状ペプトイドおよびコード化線状ペプトイドのＲＰ−ＨＰＬＣトレースも示す。
【図９】Ｎ末端にＮｍｅａを有するビオチン標識化環状ペプトイド（１）に関するＭＳ、ＭＳ／ＭＳデータ。
【図１０】Ｎ末端にＮｍｅａを有するビオチン標識化環状ペプトイド（２）に関するＭＳ、ＭＳ／ＭＳデータ。
【図１１】Ｎ末端にＮｍｅａを有するビオチン標識化環状ペプトイド（３）に関するＭＳ、ＭＳ／ＭＳデータ。
【図１２】Ｎ末端にＮｍｅａを有するビオチン標識化環状ペプトイド（４）に関するＭＳ、ＭＳ／ＭＳデータ。
【図１３】Ｎ末端にＮｍｅａを有するビオチン標識化環状ペプトイド（５）に関するＭＳ、ＭＳ／ＭＳデータ。
【図１４】Ｎ末端にＮｍｅａを有するビオチン標識化環状ペプトイド（６）に関するＭＳ、ＭＳ／ＭＳデータ。
【図１５】Ｎ末端にＮｍｅａを有するビオチン標識化環状ペプトイド（７）に関するＭＳ、ＭＳ／ＭＳデータ。
【図１６】Ｎ末端にＮｍｅａを有するビオチン標識化環状ペプトイド（８）に関するＭＳ、ＭＳ／ＭＳデータ。
【図１７】Ｎ末端にＮｍｅａを有するビオチン標識化環状ペプトイド（９）に関するＭＳ、ＭＳ／ＭＳデータ。
【図１８】Ｎ末端にＮｍｅａを有するビオチン標識化環状ペプトイド（１０）に関するＭＳ、ＭＳ／ＭＳデータ。
【図１９】ビオチン標識化環状ペプトイドマイクロアレイおよびストレプトアビジン−Ｃｙ３のハイブリダイゼーション。Ｎ末端にＮｍｅａを有するビオチン標識化環状ペプトイドからなるマイクロアレイを調製した。約２ｍＭ溶液の３倍連続希釈を用いて、マレイミド官能基化スライドグラス上に、ビオチン標識化環状ペプトイドをスポットした。１×ＴＢＳＴ（５０ｍＭトリス／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．１％トゥイーン２０、ｐＨ８．０）で、４℃で３０分間、マイクロアレイを平衡させた。４℃で４５分間、静かに振盪しながら、１×ＴＢＳＴ（総量１ｍＬ溶液）中のストレプトアビジン（１０μＬ、Sigma）およびＢＳＡ（５０μＬ、２ｍｇ／ｍＬ）とともに、マイクロアレイスライドをインキュベートした。スライドを１×ＴＢＳＴ（３×５分）で４℃で洗浄し、次いで、遠心分離により乾燥した。ハイブリダイズ化マイクロアレイを、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂスキャナーで走査した。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本発明は、ここで、自己抗体と、ならびに自己抗体および自己反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＢ細胞と結合するリガンドの組合せと、高特異性で結合する合成分子の同定方法を記載する。このような組合せ発明の目的のために、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）、ヒト多発性硬化症（ＭＳ）に関する動物モデルに関連してプロトコールがここに記載されるが、これはネイティブ抗原（単数または複数）の性質を理解する前には必要でない。代わりに、それは、ネイティブ集団中の自己反応性Ｔ細胞および正常Ｔ細胞を結合するライブラリー中の各化合物の能力が同時に査定される比較結合戦略を用いる。自己反応性Ｔ細胞に関する高選択性を示す化合物だけが、自己免疫疾患または障害に関連した自己抗体と結合するリガンドに関するスクリーニングからの「ヒット」と組合せて用いられ得る「ヒット」として選択される。代替的には、または付加的には、束縛オリゴマーは、本明細書中に記載される工程に従ってＴ細胞に対して直接的にスクリーニングされ得る。Ｔ細胞と選択的に結合することが見出されたこのような束縛オリゴマーも、本発明の範囲内である。併用療法は、自己抗体を生じる疾患に関する親和性を有するリガンドでの連続処置、ならびに自己免疫疾患または症状に関連したＴ細胞に関する親和性を有するリガンドでの処置を包含し得る。熟練医は、患者に基づいて患者に関する適切なレジメンを決定する。
【００６１】
ＥＡＥスクリーニングからの１つのヒットの詳細な特性化は、それがＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と結合する、ということを示唆する。さらに、この化合物は、in vitroでの抗原駆動性Ｔ細胞増殖のアンアゴニストであると示されている。最後に、この化合物が、光分解されると隣接タンパク質に対する酸化的損害を媒介し得るルテニウム錯体と共役される場合（Lee et al., 2008）、共役体は、養子移入実験において疾患を媒介する自己反応性Ｔ細胞の能力を抑制する。合わせて考えると、これらのデータは、抗原特異的自己反応性Ｔ細胞を結合し、抑制し得る合成化合物を同定するこの技術の能力を立証する。一旦、これらのＴ細胞が同定されれば、それらは本明細書中に記載される併用療法に用いられ得る。
Ｉ．  自己免疫疾患
【００６２】
本発明は、上記のように、種々の疾患状態からの自己免疫Ｔ細胞を結合する分子と組合せて用いられる自己抗体または抗体を結合し得る分子の同定を提供する。ある態様では、疾患状態としては、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全症、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、軸索性およびニューロン性神経疾患、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック・スプルー（非局所性）、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害（ＣＩ  ＤＰ）、慢性再発性多病巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜性類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素病、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、クレスト病、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性神経疾患、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状狼瘡、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス症候群、繊維筋痛、繊維化性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（一過性動脈炎）、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブ病、ギランバレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、インスリン依存性糖尿病（１型）、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、狼瘡（ＳＬＥ）、ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発性血管炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーバーマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック病）、好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、再発性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌に関連した小児自己免疫神経精神障害）、腫瘍随伴性小脳変性、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パーリー・ロンバーグ症候群、パーソネージ・ターナー症候群、扁平部炎（末梢ブドウ膜炎）、天疱瘡、末梢神経疾患、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発性動脈炎、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型自己免疫性多腺性症候群、リウマチ性多発性筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺繊維症、壊疽性膿皮症、純赤芽球無形成症、レイノー現象、灼熱痛、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、不穏下肢症候群、後腹膜繊維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎���強皮症、シェーグレン症候群、精子および精巣自己免疫、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、交感性眼炎、高安動脈炎、一過性動脈炎／巨細胞動脈、血小板減少性紫斑病（ＴＰＰ）、トローザ・ハント症候群、横断脊髄炎、潰瘍性結腸炎、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、水疱性皮膚炎、白斑またはウェーゲナー肉芽腫症、あるいは慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、拡張性心筋症、心筋炎、自己免疫性多発性内分泌症候群  Ｉ型（ＡＰＳ−Ｉ）、嚢胞性繊維症性血管炎、後天性上皮小体機能低下症、冠動脈疾患、落葉状店疱瘡、尋常性天疱瘡、ラスムッセン脳炎、自己免疫性胃炎、インスリン低血糖症候群（平田病）、Ｂ型インスリン抵抗性、表皮肥厚症、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、悪性貧血、難治性ライム関節炎、多発性神経障害、脱髄性疾患、アトピー性皮膚炎、自己免疫性甲状腺機能低下症、白斑、甲状腺関連眼症、自己免疫性腹腔疾患、ＡＣＴＨ欠乏症、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、進行性全身性硬化症、限局性強皮症、原発性抗リン脂質症候群、慢性特発性蕁麻疹、結合組織症候群、壊死性および半月体形成性糸球体腎炎（ＮＣＧＮ）、全身性血管炎、レイノー症候群、慢性肝疾患、内臓リーシュマニア症、自己免疫性ＣＩ欠損症、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、凝固時間延長、免疫不全症、アテローム硬化症、神経細胞障害、腫瘍随伴性天疱瘡、腫瘍随伴性スティッフマン症候群、腫瘍随伴性脳脊髄炎、亜急性自己免疫性神経疾患、癌関連網膜症、腫瘍随伴性眼球クローヌス筋クローヌス運動失調、下位運動ニューロン症候群およびランバート・イートン筋無力症候群といったような疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
Ａ．  強直性脊椎炎
【００６３】
ＡＳは、脊椎関節症のより広範な疾患分類内の疾患亜群である。脊椎関節症の種々の亜群に冒された患者は、細菌感染から遺伝までの範囲のしばしば非常に異なる疾患病因を有する。依然として、すべての亜群において、疾患過程の最終結果は、体軸性関節炎である。種々の患者集団で観察される初期の臨床的差異にかかわらず、それらの多くは、１０〜２０年の疾患経過後、終わりはほぼ同一になる。疾患開始から強直性脊椎炎の臨床的診断までの平均時間は７．５年である、ということを近年の試験は示唆している（Khan, 1998）。これらの同一試験は、脊椎関節症が、関節リウマチの場合に近い有病率を有し得る、ということを示唆している（Feldtkeller et al., 2003; Doran et al., 2003）。
【００６４】
ＡＳは、骨外性症状発現を伴うかまたは伴わない体軸性骨格の慢性全身性炎症性リウマチ障害である。仙腸関節および脊椎が主に冒されるが、しかし股関節および肩関節、ならびに余り一般的ではないが末梢関節またはある種の関節外構造、例えば目、血管系、神経系および消化管系も包含され得る。その病因は、依然として完全に理解されているわけではない（Wordsworth, 1995; Calin and Taurog, 1998）。それは、主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣ  Ｉ）  ＨＬＡ−Ｂ２７対立遺伝子と大いに関連がある（Calin and Taurog, 1998）。ＡＳは、それらの一生の初期に個体を冒し、慢性疼痛、ならびに腱、靭帯、関節および骨の不可逆的損傷を引き起こすその潜在能力のために恐れられている（Brewerton et al., 1973; Brewerton et al., 1973; Schlosstein et al., 1973）。ＡＳは、単独で、または別の型の脊椎関節症、例えば反応性関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、腱付着部炎、潰瘍性結腸炎、過敏性腸疾患またはクローン病と関連して（この場合、それは第二ＡＳとして分類される）起こり得る。
【００６５】
典型的には、罹患部位としては、脊椎の椎間板脊椎、椎間、肋椎および肋横突起関節、ならびに脊椎傍靭帯状構造が挙げられる。腱付着部（骨への筋腱および靭帯付着の部位である）の炎症も、この疾患では顕著である（Calin and Taurog, 1998）。腱付着部は、形質細胞、リンパ球および多形核細胞に浸潤されることが知られている。炎症過程は、しばしば、漸進的な繊維性および骨性強直を生じる（Ball, 1971; Khan, 1990）。
【００６６】
症候がしばしばより一般的な背部問題に起因すると考えられるため、診断遅延は一般的である。腰椎における柔軟性の劇的損失が、ＡＳの早期徴候である。他の一般的症候としては、慢性疼痛および腰背部の凝り（これは、通常は下位脊椎が骨盤または股関節に連結される場所で始まる）が挙げられる。
【００６７】
大半の症候は腰部および仙腸骨域で始まるが、しかしそれらは首および上背部を同様に包含し得る。関節炎は、肩、股関節および足でも怒り得る。患者の中には眼の炎症を有する者もあり、より重症症例は、心臓弁関与に関して観察されなければならない。
【００６８】
最も高頻度の症状は背部痛であるが、しかし疾患は、特に小児および女性において、非典型的に末梢関節で始まり、そして稀に急性虹彩炎（前部ブドウ膜炎）を伴う。付加的な早期症候および徴候は、散在性肋椎関与からの胸部拡張の減少、低度の発熱、疲労、食欲不振、体重減少および貧血である。再発性背部痛  −しばしば、夜間性で、強度も種々である−  は、活動により典型的には軽減される早朝硬直である場合、究極的愁訴である。屈曲または前屈み姿勢は背部痛および傍脊椎筋痙攣を楽にする；したがって、ある程度の脊柱後彎は、非処置患者においては一般的である。
【００６９】
全身性症状発現は、患者の３分の１に起こる。再発性の、通常は半限定性の急性虹彩炎（前部ブドウ膜炎）は、稀に、引き伸ばされ、そして視力を減損するほど十分に重症である。神経学的徴候は、時として、圧迫性神経根炎または坐骨神経症、脊椎骨折または亜脱臼、ならびに馬尾症候群（インポテンス、夜尿症、膀胱縮小および便意、ならびにアキレス腱反射の非存在からなる）に起因する。心臓血管性症状発現は、大動脈弁閉鎖不全、狭心症、心膜炎、およびＥＣＧ伝導異常を包含し得る。稀な肺知見は、上葉繊維症で、時として空洞形成を伴うが、これはＴＢに関して間違えられ得るし、アスペルギルス属感染により悪化され得る。
【００７０】
ＡＳは、活動性脊椎炎の軽度および中等度拡大により特性化され、大半のまたは全体的不活性炎症の期間に伴って変わる。ほとんどの患者における適正な処置は、背部硬直にかかわらず、無能性を最小にするかまたは無くし、そして完全な生産的生活をもたらす。時として、経過は重症で且つ進行性であり、無能力を生じる変形を顕著にする。予後は、難治性虹彩炎患者に関しては、そして派生的アミロイドーシスを有する稀な患者に関しては、希望が無い。
【００７１】
ＥＳＲおよびその他の急性相反応体（例えば、Ｃ反応性タンパク質および血清Ｉｇレベル）は、活動性ＡＳを有するほとんどの患者において、軽度に上がる。ＩｇＭリウマチ様因子および抗核抗体に関する試験は、陰性である。ＨＬＡ−Ｂ２７に関する陽性試験は、通常であるが、しかし一定不変で且つ特異的でない（陰性試験は、陽性試験がそれを診断する場合に有用であるよりも、ＡＳを排除するのを手助けするのにより有用である）。この試験は、典型的疾患を有する患者において必要であるというわけではない。
【００７２】
診断は、ｘ線により確証されなければならない。最早期異常（肋軟骨下糜爛による擬似拡大、硬化または後期狭小化）は、仙腸骨関節で起きる。脊椎の早期変化は、上部腰椎方形化および脱髄、一様でない靭帯石灰化、および１または２つの生成中の靭帯骨棘形成である。顕著な靭帯骨棘形成および散在性傍脊椎靭帯石灰化を伴う古典的竹様脊柱は、早期診断のために有用でない；これらの変化は、１０年という平均期間に亘って、患者の少数に現われる。
【００７３】
関節関与の重症度および全身症候の低度は、個体によって大いに変わる。早期では、精確な診断および治療は、患者の年数および能力障害を最小限にし得る。
【００７４】
関節不快カンは、薬剤で軽減され得る。処置計画は、通常は、変形の防止、遅延または補正、ならびに心理社会的およびリハビリテーション必要性を検討する。適正な姿勢および関節の動きのために、毎日の運動およびその他の支持手段（例えば姿勢訓練、治療的運動）は、潜在的変形の方向を逆にする筋肉群を強化する（すなわち、屈筋よりむしろ伸筋群を強化する）ために不可欠である。腹這い姿勢での、したがって首を伸ばしての読書は、背部を柔軟に保持するのに役立ち得る。
【００７５】
ＮＳＡＩＤは、関節の炎症、疼痛および筋肉痙攣を抑止することにより、運動およびその他の支持的手段を促進する。ほとんどのＮＳＡＩＤは、ＡＳにおいて立証された価値を有するが、しかし効力の最低限の差よりむしろ、耐容性および毒性が薬剤選択を指図する。患者は、モニタリングされ、潜在的悪反応を警告されるべきである。ＮＳＡＩＤの１日用量は出来るだけ低くすべきであるが、しかしインドメタシンのような薬剤の最大用量は、活動性疾患に伴って必要とされ得る。薬剤退薬は、活動性疾患の全身性および関節徴候が数ヶ月間抑止された後に、専ら徐々に試みられるべきである。シクロオキシゲナーゼ−２を阻害するためにＣＯＸ−２薬剤として言及されるいくつかの新規のＮＳＡＩＤは、ＣＯＸ−１を阻害する薬剤と同じ有効性を提供し、胃粘膜および血小板凝集に及ぼす副作用の機会は少ない。
【００７６】
コルチコステロイドは、治療的価値を限定する；長期使用は、多くの重篤な副作用、例えば硬直性脊椎の骨粗鬆症と関連する。急性虹彩炎に関しては、局所的コルチコステロイド（および散瞳薬）が通常は適切である；経口コルチコステロイドは、稀に指示される。関節内コルチコステロイドは、特に１または２つの末梢関節が他のものより重く炎症を起こされ、それにより運動およびリハビリテーションが危うくされる場合、有益である。
【００７７】
ＲＡに関するほとんどの緩徐作用性（寛解性）薬剤（例えば、筋肉内に投与される金）は、ＡＳに関して試験されたことが無いか、またはＡＳに関して有効でない。スルファサラジンは、特に末梢関節が関与する場合、有用である。投与量は、５００ｍｇ／日で開始し、１週間間隔で５００ｍｇ／日で増大して、１ｇを１日２回にすべきである（第５０章の「関節リウマチ」も参照）。最も一般的な副作用は悪心であって、これが主に中心的であるが、しかし腸溶性錠剤がより良好に耐容される。用量低減が役立ち得る。
【００７８】
麻薬、他の強力な鎮痛薬および筋弛緩薬は、抗炎症特性を欠いており、重症背部痛および痙攣を制御するのを手助けするための補助剤として短期間のみ処方されるべきである。脊椎への放射線療法は、有効であるが、しかし急性骨髄性白血病の危険を１０倍増大するため、最後の手段として推奨される。
【００７９】
リハビリ療法は、不可欠である。適正な睡眠および歩行体位は、腹部および背部運動と対になって、姿勢を保持するのに役立つ。運動は、関節の柔軟性を保持するのに役立つ。最適処置を用いた場合でも、硬直または「強直」脊椎を発症する人もいるが、しかし、この融合が正当な位置で起こるならば、彼等は依然として機能的である。継続的ケアが重要である。ＡＳは一生の問題であり、人々はしばしば処置を継続できず、この場合、恒久的な姿勢および可動性損失が起こる。
Ｂ．  乾癬性関節炎
【００８０】
乾癬は、１．５〜３％の有病率を有する炎症性および増殖性皮膚障害である。乾癬患者の約２０％が、いくつかのパターンを有する特徴的型の関節炎を発症する（Gladman, 1992; Jones et al., 1994; Gladman et al., 1995）。最初に関節症候を呈する個体もいるが、しかし大多数では、皮膚乾癬が最初に現われる。患者の約３分の１は、彼等の皮膚および関節疾患の同時悪化を有し（Gladman et al., 1987）、そして爪および遠位指節間関節疾患の間に局所解剖学的関係が存在する（Jones et al., 1994; Wright, 1956）。皮膚、爪および関節疾患に関連する炎症過程は依然として分かり難いが、しかし免疫媒介性病状が関与している。
【００８１】
乾癬性関節炎（ＰｓＡ）は、関節炎と乾癬の関連により特性づけられる慢性炎症性関節症であり、１９６４年に関節リウマチ（ＲＡ）とは別個の臨床的存在として認識された（Blumberg et al., 1964）。その後の研究は、ＰｓＡが多数の遺伝的、病原的および臨床的特徴を、強直性脊椎炎、反応性関節炎および腸疾患関連関節炎を含む疾患の一群である他の脊椎関節症（ＳｐＡｓ）と共有する、ということを明示した（Wright, 1979）。ＰｓＡはＳｐＡ群に属するという見解は、ＰｓＡを含むが、しかしＲＡは含まない広範な腱付着部炎を実証する画像処理試験からさらなる支持を近年獲得した（McGonagle et al., 1999; McGonagle et al., 1998）。さらに具体的には、腱付着部炎は、ＳｐＡｓにおいて起こる最早期事象のうちの１つであって、脊椎における骨再構築および強直症を、ならびに炎症化腱付着部が末梢関節に近い場合、関節性滑膜炎を引き起こすと仮定されている。しかしながら、ＰｓＡは多様な程度の重症度でかなり異種のパターンの関節関与で存在し得るので、腱付着部炎とＰｓＡにおける臨床的症状発現との間の関連は、依然として非常に不明瞭である（Marsal et al., 1999; Salvarani et al., 1998）。したがって、他の因子は、ＰｓＡの多岐にわたる特徴を説明することを仮定されなければならないが、同定さえているのはこのうちの少数だけである（例えば、ＨＬＡ−Ｂ２７分子の発現。これは体軸性疾患と強力に関連する）。その結果、疾患症状発現を特定の病原機序にマッピングすることは依然として難しく、これは、この症状の処置が依然として経験に大いに頼っていることを意味する。
【００８２】
家族試験は、ＰｓＡの発症に遺伝子が関与することを示唆している（Moll & Wright, 1973）。他の慢性炎症性形態の関節炎、例えば強直性脊椎炎および関節リウマチは、複雑な遺伝的基礎を有すると考えられる。しかしながら、ＰｓＡの遺伝的構成成分は、いくつかの理由のために査定することが困難であった。ＰｓＡの発症のために重要である遺伝的因子を遮蔽し得る乾癬単独に対する遺伝的素質に関して強力な証拠がある。大多数がＰｓＡを別個の疾患実体として許容するが、しかし時折、関節リウマチおよび強直性脊椎炎との表現型重複が認められる。さらにまた、ＰｓＡそれ自体が均質症状ではなく、種々の亜群が提唱されている。これらの混合因子のすべてが本発明の試験において克服されたわけではないが、しかし疾患範囲を包含するＰｓＡ患者の３つの広範な部類における候補遺伝子を調べることに、われわれは集中した。
【００８３】
ＴＮＦＡ領域のプロモーター領域の多型性は、それらがＴＮＦ−α分泌のレベルに影響を及ぼし得るので、少なからず注目の的である（Jacob et al., 1990; Bendzen et al., 1988）。ＴＮＦ−αの量の増大が、乾癬性皮膚（Ettehadi et al., 1994）および滑液（Partsch et al., 1997）の両方で報告されている。
【００８４】
近年の試験は、ＰｓＡ（Mease
et al., 2000）および強直性脊椎炎（Brandt et al., 2000）の両方における抗ＴＮＦ処置の正の利益を示している。さらに、ＴＮＦ−αに関する遺伝子座はＭＨＣのクラスＩＩＩ領域内に存在し、したがって、クラスＩおよびクラスＩＩ了以子をフランキングすることにより提供されるよりもしっかりしたＰｓＡとの関連を提供し得る。われわれの全体的ＰｓＡ群には、ＴＮＦＡ対立遺伝子との相対的に弱い関連が認められた。普通でないＴＮＦＡ−２３８Ａ対立遺伝子が、末梢性多発性関節炎を有する群において頻度が増大され、脊椎炎を有する患者には存在しなかったが、しかしこの知見は、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０６０２との連鎖不平衡により説明され得る。ＴＮＦＡ−２３８対立遺伝子での多型性と関連した機能的結果が存在するか否かは不明である（Pociot et al., 1995）。それでも、乾癬患者に発症する関節炎のパターンがこの特定対立遺伝子と直接的または間接的に関連づけられ得ると考えられる。
【００８５】
ＰｓＡ患者における、ならびに若年発症性乾癬におけるＴＮＦＡ−２３８Ａ対立遺伝子の頻度の増大を、Hohler等（1997）は見出した。ＴＮＦＡ−２３８Ａと若年発症性乾癬およびＰｓＡの両方との関連は、ＨＬＡ−Ｃｗ６との関連性より強かった。同様に、われわれの試験では、若年発症性乾癬とＨＬＡ−Ｃｗ＊０６０２およびＴＮＦＡ−２３８Ａの両方との強い関連が認められたが、しかしいずれの対立遺伝子も関節炎の開始年齢とノ如何なる関係も有さなかった。われわれの試験において、少なくとも１つのＴＮＦＡ−２３８Ａ対立遺伝子を有したＰｓＡ患者はすべてＨＬＡ−Ｃｗ６陽性であったが、このことは、ＰｓＡにおけるこれらの対立遺伝子間の密接な連鎖を強調している。しかしながら、Hohler等（1997）による、そしてＨＬＡ−Ｃｗ＊０６０２との密接な連鎖により説明可能な試験に対比して、ＴＮＦＡ−２３８Ａ対立遺伝子は、末梢性関節炎患者において増大されただけであった。強直性脊椎炎の別個の試験において、同一群が、脊椎炎の発症に及ぼす保護作用を有する普通でないＴＮＦＡ−３０８Ａおよび−２３８Ａ対立遺伝子を見出した、ということも興味深い（Hohler et al., 1998）。
Ｃ．  反応性関節炎
【００８６】
反応性関節炎（ＲｅＡ）において、関節損傷の機序は不明であるが、しかし、サイトカインが重要な役割を果たすと考えられる。より一般的なＴｈ１である高レベルのインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）および低レベルのインターロイキン（ＩＬ−４）が報告されている（Lahesmaa et al., 1992; Schlaak et ai, 1992; Simon et al, 1993; Schlaak el al , 1996; Kotake el al, 1999; Ribbens el al, 2000）が、しかしいくつかの試験は、関節リウマチ（ＲＡ）患者と比較して、反応性関節炎患者の滑膜（Simon el al. , 1994; Yin el al., 1999）ならびに体液（ＳＦ）（Yin et ai, 1999; Yin el al., 1997）におけるＩＬ−４およびＩＬ−１０の相対的優勢、そしてＩＦＮ−γおよび腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の相対的欠如を示している。ＲＡ患者よりも低レベルの反応性関節炎におけるＴＮＦ−α分泌も、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のex vivo刺激後に報告されている（Braun el ai, 1999）。
【００８７】
反応性関節炎関連細菌のクリアランスは、適切なレベルのＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの産生を要するが、一方、ＩＬ−１０は、これらの応答体の抑止により作用する、ということが論議されてきた（Autenrteth el al., 1994; Sieper & Braun, 1995）。ＩＬ−１０は、活性化マクロファージによりＩＬ−１２およびＴＮＦ−ガンマの合成（de Waal el al., 1991 ; Hart el ai, 1995; Chomarat el al. , 1995)を，そしてＴ細胞によりＩＦＮ−γの合成（Macatonia et al , 1993）を抑制する調節サイトカインである。
Ｄ．  腸疾患関連関節炎
【００８８】
腸疾患関連関節炎（ＥＡ）は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、例えばクローン病または潰瘍性結腸炎と組合せて起こる。それは、脊椎および仙腸骨関節にも影響を及ぼし得る。腸疾患関連関節炎は、通常は下肢、例えば膝または踝における末梢関節を冒す。それは一般に少数のまたは限定数の関節のみに関連し、腸症状に密接に従い得る。これは、潰瘍性結腸炎患者の約１１％およびクローン病患者の２１％で起こる。滑膜炎は、一般的に、自己限定性および非変形性である。
【００８９】
腸疾患関連関節症は、ＧＩ病状との関連を共有するリウマチ学的症状の収集物を含む。これらの症状としては、細菌（例えば、赤痢菌、サルモネラ菌、カンピロバクター、エルシニア種、クロストリジウム・ディフィシル）、寄生生物（例えば、糞線虫 Slrongyloides stercoralis、無鉤条虫 Taenia saginata、ランブル鞭毛虫 Giardia lamblia、ヒト回虫 Ascaris lumbricoides、クリプトスポリジウム種）のための反応性（すなわち、感染関連性）関節炎、ならびに炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に関連した脊椎関節症が挙げられる。他の症状および障害としては、腸バイパス（空回腸）、関節炎、腹腔疾患、ウィップル病および膠原性結腸炎が挙げられる。
【００９０】
腸疾患関連関節症の正確な原因は不明である。消化管の炎症は、浸透性を増大して、抗原性物質、例えば細菌抗原の吸収を生じる。これらの関節原性抗原は、次に、筋骨格組織（例えば腱付着部および滑膜）中に局在し、したがって炎症性応答を引き出し得る。代替的には、自己免疫応答は、分子模倣物により誘導され得るが、この場合、これらの抗原に対する宿主の免疫応答は、滑膜中の自己抗原と交差反応する。
【００９１】
特に興味深いのは、反応性関節炎とＨＬＡ−Ｂ２７（ＨＬＡクラスＩ分子）との間の強力な関連である。潜在的に関節原性の、細菌由来抗原ペプチドは、Ｂ２７分子の抗原提示溝中に適合して、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生じる。ＨＬＡ−Ｂ２７トランスジェニックラットは、関節炎および腸炎症を伴う腸疾患関連関節症の特徴を現す。
Ｅ．  潰瘍性結腸炎
【００９２】
潰瘍性結腸炎は、大腸の内層中の、潰瘍と呼ばれる炎症および腫れ物を生じる疾患である。炎症は、通常は、直腸および結腸の下部で起こるが、しかしそれは全結腸に影響を及ぼし得る。潰瘍性結腸炎は、稀に、末端回腸と呼ばれる末端区域以外の小腸に作用する。潰瘍性結腸炎は、結腸炎または直腸炎とも呼ばれ得る。炎症は、しばしば結腸を空にして、下痢を引き起こす。潰瘍は所々に生じ、そこでは、炎症は、結腸を裏打ちしている細胞を殺害している；潰瘍は出血させ膿を産生する。
【００９３】
潰瘍性結腸炎は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）であるが、これは、小腸および結腸において炎症を引き起こす疾患に関する一般名である。潰瘍性結腸炎は診断が難しいが、それは、症候が他の腸障害に、ならびに別の型のＩＢＤ、クローン病に似ているためである。クローン病は、腸壁内のより深部に炎症を引き起こすため、潰瘍性結腸炎とは異なる。さらにまた、クローン病は、通常は小腸で起こるが、しかしそれは、口腔、食道、胃、十二指腸、大腸、盲腸および肛門でも起こり得る。
【００９４】
潰瘍性結腸炎は、任意の年齢の人々において起こり得るが、しかし最も多いのは、１５〜３０歳で開始し、最も低頻度であるのは５０〜７０歳である。小児および青年は、時として、当該疾患を発症する。潰瘍性結腸炎は、男性および女性に等しく作用し、いくつかの家族において遺伝すると思われる。何が潰瘍性結腸炎を引き起こるのかについての理論はたくさんあるが、しかし立証されてはいない。最も普及している理論は、身体の免疫系が、腸壁に進行中の炎症を引き起こすことにより、ウイルスまたは細菌と反応する、というものである。潰瘍性結腸炎を有する人々は免疫系の異常を有するが、しかしこれらの異常が当該疾患の原因であるか結果であるか、医者は分からない。潰瘍性結腸炎は、情動ストレスあるいはある種の食物または食物製品に対する感受性により引き起こされないが、しかしこれらの因子が症候の引き金になる人々もいる。
【００９５】
潰瘍性結腸炎の最も一般的症候は、腹部痛および血便である。患者は、疲労、体重減少、食欲減退、直腸出血および体液および栄養素の損失も経験し得る。患者の約半数は、軽症症候を有する。その他は、頻繁な発熱、血便、悪心および重症腹部痙攣を蒙る。潰瘍性結腸炎は、関節炎、眼の炎症、肝疾患（肝炎、肝硬変および原発性硬化性胆管炎）、骨粗鬆症、皮膚発疹および貧血のような問題も引き起こし得る。問題が結腸の外側で起こる確かな理由は、誰も分からない。これらの合併症は、免疫系が身体の他の部分における炎症を誘発する場合に起こり得る、と科学者は考えている。これらの問題のいくつかは、結腸炎が処置されると無くなる。
【００９６】
十分な身体検査および一連の試験は、潰瘍性結腸炎を診断するために必要とされ得る。血液試験は、結腸および直腸の出血を示し得る貧血を検査するために実行され得る。血液試験は、高白血球数も曝露し得るが、これは、身体のどこかにある炎症の徴候である。糞便試料を試験することにより、結腸または直腸における出血または感染を医者は検出し得る。どちらの試験に関しても、医者は、内視鏡（コンピューターおよびＴＶモニターに接続された長い柔軟性の光源付の管）を肛門に挿入して、結腸および直腸の内側を見る。結腸壁上のあらゆる炎症、出血または潰瘍を、医者は観察できる。検査中、医者は生検を実行するが、これは、顕微鏡で観察するために結腸の内層から組織の試料を採取することを伴う。結腸のバリウム注腸ｘ線も必要とされ得る。この手順は、結腸をバリウム白亜質溶液で充填することを包含する。バリウムはｘ線フィルム上で白色を示し、存在し得る任意の潰瘍または他の異常を含めた結腸の明瞭な観察を医者ができるようにする。
【００９７】
潰瘍性結腸炎のための処置は、疾患の重篤度によって決まる。大半の人々は医薬品で処置される。重症例では、患者は、罹患結腸を除去するための外科手術を必要とし得る。外科手術は、潰瘍性結腸炎の唯一の治療法である。その症候がある種の食物により誘発される人の中には、香料をたっぷり入れた食物、生鮮果実および野菜、または乳糖（ラクトース）のような彼等の腸を損なう食物を回避することにより、その症候を制御し得る人もいる。人々は各々、潰瘍性結腸炎を別様に経験し、したがって処置は各個体に関して調整される。情動的および心理学的支援が重要である。数ヶ月の間または数年間も継続する寛解  −症候が消える期間−  を有する人も中にはいる。しかしながら、大半の患者の症候は、最終的には元に戻る。疾患のこの変化パターンは、処置が手助けした時をいつも告げることができるわけではないことを意味する。潰瘍性結腸炎を有する人の中には、症状を監視するための定期的受診とともに、しばらくの間、医学的介護を必要とする人もいる。
【００９８】
治療の目的は、寛解を誘導し、保持すること、そして潰瘍性結腸炎を有する人々の生活の質を改善することである。いくつかの型の薬剤が利用可能である：
・  アミノサリチル酸製剤  −  ５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）を含有する薬剤は、炎症を制御するのに役立つ。スルファサラジンは、スルファピリジンと５−ＡＳＡの組合せであり、寛解を誘導し、保持するために用いられる。スルファピリジン構成成分は、抗炎症性５−ＡＳＡを腸に運搬する。しかしながら、スルファピリジンは、悪心、嘔吐、胸焼け、下痢および頭痛のような副作用をもたらし得る。その他の５−ＡＳＡ剤、例えばオルサラジン、メサラミンおよびバルサラジドは、異なる担体を有し、より少ない副作用を提供し、そしてスルファサラジンを摂取できない人に用いられ得る。５−ＡＳＡは、結腸中の炎症の位置によって、経口的に、注腸により、または坐薬で投与される。軽度または中等度の潰瘍性結腸炎を有するほとんどの人が、先ずこの群の薬剤で処置される。
・  コルチコステロイド  −  例えばプレドニソンおよびヒドロコルチゾンも、炎症を低減する。それらは、中等度〜重度の潰瘍性結腸炎を有するかまたは５−ＡＳＡ薬に応答しない人々に用いられ得る。コルチコステロイドはステロイドとしても知られており、炎症の位置によって、経口的に、静脈内に、注腸により、または坐薬で投与され得る。これらの薬剤は、体重増加、座瘡、顔面毛、高血圧、気分変動、ならびに感染の危険増大といったような副作用を引き起こし得る。この理由のため、それらは長期使用を推奨されない。
・  免疫調節剤  −  例えばアザチオプリンおよび６−メルカプト−プリン（６−ＭＰ）は、免疫系に作用することにより炎症を低減する。それらは、５−ＡＳＡまたはコルチコステロイドに応答しなかった、あるいはコルチコステロイドに依存性がある患者に用いられる。しかしながら、免疫調節剤は、緩徐作用性であり、十分な利益が認められるまでに６ヶ月を要する。これらの薬剤を摂取している患者は、合併症、例えば膵炎および肝炎、白血球数低減ならびに感染の危険増大に関して監視される。シクロスポリンＡは、６−ＭＰまたはアザチオプリンとともに用いられて、静脈内コルチコステロイドに応答しない人々における活動性の、重症潰瘍性結腸炎を処置し得る。
【００９９】
他の薬剤は、患者をリラックスさせるため、あるいは疼痛、下痢または感染を軽減するために投与され得る。
【０１００】
時折、症候は、入院しなければならないほど重症である。例えば、ヒトは、重度の出血または脱水を引き起こす重度の下痢を示す。このような症例では、医者は、下痢なら瓶日血液、体液および無機塩の損失を停止しようとする。患者は、特別な食事、静脈を介した栄養補給、医薬品または時として外科手術を必要とし得る。
【０１０１】
潰瘍性結腸炎患者の約２５〜４０％は、大量出血、重度疾病、結腸の破裂、または癌の危険のため、最終的に、結腸除去を受けなければならない。時として、医学的処置が失敗した場合、あるいはコルチコステロイドまたは他の薬剤の副作用が患者の健康を脅かす場合には、医者は結腸を除去することを推奨する。結腸および直腸を除去するための外科手術は、直腸結腸切除として既知であり、以下のうちの１つが後に続く：
・  回腸造瘻術（この場合、外科医は、ストーマ（瘻）と呼ばれる腹腔中の小開口部を作る）は、回腸と呼ばれる小腸の末端にそれを付着させる。老廃物は、小腸を通って運ばれて、ストーマを介して身体を出る。ストーマは、ほぼ四半分のサイズで、通常はベルトライン近くの腹部の下方右部分に位置する。嚢が開口部の上に着けられて、老廃物を収集し、患者は必要に応じて嚢を空にする。
・  回腸肛門吻合術、または貫通手術は、抗紋の部分を保存するため、患者が正常な腸運動を有するのを可能にする。この手術では、外科医は、結腸の疾患部分および直腸の内側を除去して、直腸の外側筋肉を残す。次に、外科医は、回腸を直腸および肛門の内側に付着させて、嚢を作る。老廃物は嚢中に保存され、普通どおりに肛門を通過する。腸運動は、手順の前より高頻度で且つ水気が多い。嚢の炎症（嚢炎）は、考え得る合併症である。
【０１０２】
すべての手術が、すべての人に適切であるというわけではない。どの手術を受けるかは、疾患の重症度、ならびに患者の要求、期待およびライフスタイルによって決まる。この決定に直面した人は、彼らの医者に、結腸手術患者を助けて働く看護士（ストーマ療法士）に、そして他の結腸手術患者に話すことにより、できるだけ多くの情報を得るべきである。患者支援機構は、支援団体およびその他の情報源に人を向け得る。
【０１０３】
潰瘍性結腸炎を有するほとんどの人が、外科手術を必要とするわけではない。しかしながら外科手術が必要になった場合、術後に、結腸炎が治癒され、ほとんどの人が普通の活動的生活を続ける、ということを知ることで安心感を見出す。
Ｆ．  クローン病
【０１０４】
免疫抑制が試みられてきた別の障害は、クローン病である。クローン病症候群としては、腸炎症、ならびに腸狭窄および瘻孔の発症が挙げられる；神経疾患は、しばしば、これらの症候を伴う。抗炎症薬、例えば５−アミノサリチル酸製剤（例えばメサラミン）またはコルチコステロイドが典型的には処方されるが、しかしいつも有効であるというわけではない（Botoman et al., 1998で再検討）。シクロスポリンによる免疫抑制は、時として、コルチコステロイドに対して耐性の、または不耐容性の患者に有益である（Brynskov et al., 1989）。
【０１０５】
それにもかかわらず、患者の９０％で外科的矯正が最終的には必要とされる；５０％が結腸切除を受けている（Leiper et al., 1998; Makowiec et al., 1998）。術後の再発率は高く、５０％が５年以内にさらなる外科手術を必要とする（Leiper et al., 1998; Besnard et al., 1998）。
【０１０６】
クローン病の病因に関する仮説の１つは、腸粘膜バリアの不全（おそらくは、遺伝的感受性および環境因子（例えば喫煙）に起因する）が、細菌および食物抗原を含めた腸管腔からの抗原に免疫系を曝す、というものである（例えば、Soderholm el ai , 1999; Hollander el ai, 1986; Hollander, 1992）。別の仮説は、病原体、例えばヨーネ菌（Mycobacterium paraliiberciilosis）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、異常大腸菌またはパラミクソウイルスによる持続腸感染が免疫応答を刺激する；あるいは、症候が、遍在性抗原、例えば正常腸微生物相、ならびに代謝産物およびそれらが産生する毒素に対する免疫応答調節不全に起因する、というものである（Sartor, 1997）。血清中のＩｇＡおよびＩｇＧ抗出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）抗体（ＡＳＣＡ）の存在は、小児クローン病の診断に非常に役立つことが判明した（Ruemmele el al. , 1998; Hoffenberg el ai, 1999）。
【０１０７】
クローン病では、免疫応答調節不全は、細胞媒介性免疫病理学の方向にそれる（Murch, 1998）。しかし免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、タクロリムスおよびメサラミンは、クローン病のコルチコステロイド耐性症例を処置するために用いられており、結果は様々である（Brynskov el al., 1989; Fellerman el ai, 1998）。
【０１０８】
クローン病に対する診断および処置ツールを開発するための近年の努力は、サイトカインの中心的役割に集中してきた（Schreiber, 1998; van Hogezand & Verspaget, 1998）。サイトカインは、細胞対細胞相互作用、細胞間連絡または他の細胞の行動に特定の影響を及ぼす小型分泌タンパク質または因子（５〜２０ｋＤ）である。サイトカインは、リンパ球、特にＴＨ１およびＴＨ２リンパ球、単球、腸マクロファージ、顆粒球、上皮細胞および繊維芽細胞により産生される（Rogler &. Andus, 1998; Galley & Webster, 1996で再検討）。いくつかのサイトカインは、前炎症性である（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１（αおよびβ）、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２または白血病阻害因子またはＬＩＦ）；他のものは、抗炎症性である（例えば、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１およびＴＧＦ−β）。しかしながら、ある炎症条件下では、それらの作用に重複および機能的冗長が存在し得る。
【０１０９】
クローン病の活動性奨励では、高レベルのＴＮＦ−αおよびＩＬ−６が血液循環中に分泌され、そしてＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＩＬ−８は粘膜細胞により局所的に過剰量で産生される（同上；Funakoshi et al., 1998）。これらのサイトカインは、骨発生、造血、ならびに肝臓、甲状腺および神経精神医学的機能を含めて生理学的系に広範囲に亘る作用を及ぼし得る。さらにまた、ＩＬ−１β／ＩＬ−１ｒａ比の不均衡は、前炎症性ＩＬ−１βに有利に、クローン病患者で観察されている（Rogler & Andus, 199S; Saiki el al., 1998; Dionne el al., 1998；しかしKuboyaina, 1998参照）。ある試験は、糞便試料におけるサイトカインプロフィールがクローン病のための有用な診断ツールであり得る、ということを示唆している（Saiki et al., 1998）。
【０１１０】
クローン病のために提唱されている処置としては、種々のサイトカインアンタゴニスト（例えば、ＩＬ−１ｒａ）、阻害剤（例えば、ＩＬ−１β変換酵素および酸化防止剤の）および抗サイトカイン抗体の使用が挙げられる（Rogler and Andus, 1998; van Hogezand & Verspaget, 1998; Reimund et al., 1998; Lueering et al, 1998; McAlindon et al, 1998）。特に、ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体が試みられており、クローン病の処置において多少の成功を有している（Targan et al, 1997; Stack et al. , 1997; van Dullemen et al, 1995）。
【０１１１】
クローン病の処置の別のアプローチは、炎症応答を誘導し、それを非病原性群集に置き換えることであり得る細菌群集を少なくとも部分的に根絶させることに集中してきた。例えば米国特許第５，５９９，７９５号は、ヒト患者におけるクローン病の防止および処置のための方法を開示する。それらの方法は、少なくとも１つの抗生物質および少なくとも１つの抗真菌剤で腸管を滅菌して、存在する植物相を根絶し、それらを、正常ヒトから採取された異なる、選択的な、良好に特性化された細菌と置き換える。蛹により存在する腸微生物相を少なくとも部分的に除去し、そして疾患スクリーニング済みのヒトドナーからの糞便接種物により、あるいはバクテロイデス属および大腸菌種を含む組成物により導入される新規の細菌群集と取り替えることにより、クローン病を処置する方法を、Borodyは教示した（米国特許第５，４４３，８２６号）。しかしながら、診断および／または処置が向けられ得るクローン病の原因は分かっていない。
Ｇ．  関節リウマチ
【０１１２】
ＲＡの正確な病因は依然として不明であるが、しかし関節疾患の最初の徴候は、滑膜内層に現われ、滑膜繊維芽細胞の増殖、ならびに関節縁での関節面へのそれらの付着を伴う（Lipsky, 1998）。その後、マクロファージ、Ｔ細胞およびその他の炎症細胞が関節に動員され、そこで、それらは多数の媒介物質、例えばサイトカイン、インターロイキン−１（これは慢性後遺症に関与して、骨および軟骨破壊をもたらす)、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）（これは、炎症において一役を果たす）を産生する（Dinarello, 1998; Arend & Dayer, 1995; van den Berg, 2001）。血漿中のＩＬ−１の濃度は、健常個体よりもＲＡ患者において有意に高く、そして特に注目すべきは、血漿ＩＬ−１レベルがＲＡ疾患活性と相関することである（Eastgate et al., 1988）。さらに、ＩＬ−１の滑液レベルは、ＲＡの種々の放射線学的および組織学的特徴と相関する（Kahle et al., 1992; Rooney et al, 1990）。
【０１１３】
正常関節では、これらのおよびその他の前炎症性サイトカインの作用は、種々の抗炎症性サイトカインおよび調節因子により平衡される（Burger & Dayer, 1995）。このサイトカイン平衡の意義は、終日、熱の周期的増大を示す若年ＲＡ患者において例証される（Prieur et al., 1987）。発熱の各ピーク後、ＩＬ−１の作用を遮断する因子が、血清および尿中に見出される。この因子は、単離され、クローン化され、そしてＩＬ−１遺伝子ファミリーの一成員であるＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）として同定されている（Hannum et al., 1990）。ＩＬ−１ｒａは、その名称が示すように、ＩＬ−１受容体との結合に関してＩＬ−１と競合し、その結果、ＩＬ−１の作用を遮断する天然受容体アンタゴニストである（Arend et al., 1998）。ＩＬ−１を有効に遮断するためには、１０〜１００倍余分量のＩＬ−１ｒａが必要とされ得る；しかしながら、ＲＡ患者から単離される滑膜細胞は、ＩＬ−１の作用に対抗するのに十分なＩＬ−１ｒａを産生するようには見えない（Firestein et al., 1994; Fujikawa et al., 1995）。
Ｈ．  全身性紅斑性狼瘡
【０１１４】
全身性紅斑性狼瘡のような自己免疫性疾患に関する原因も分かっていない。全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）は、自己抗体および免疫複合体を組織中に沈着し、組織損傷をもたらすことにより特性化される自己免疫性リウマチ疾患である（Kotzin, 1996）。ＭＳおよびＩ型真性糖尿病のような自己免疫性疾患に対比して、ＳＬＥは、潜在的に多臓器系に直接関与し、その臨床的症状発現は、多様で可変的である（Kotzin & O’Dell, 1995により再検討）。例えば、主に皮膚発疹および関節痛を実証し、自発性寛解を示し、そして医薬品をほとんど必要としない患者もいる。一方で、高用量のステロイドおよび細胞傷害薬、例えばシクロホスファミドによる治療を必要とする重度の且つ進行性の腎疾患を伴う患者もいる（Kotzin, 1996）。
【０１１５】
ＳＬＥの血清学的特質、ならびに利用可能な主な診断試験は、細胞核の構成要素、例えば二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓ−ＤＮＡ）および染色質に対する高血清レベルのＩｇＧ抗体である。これらの自己抗体、ＩｇＧ抗ｄｓＤＮＡ抗体は、狼瘡性糸球体腎炎（ＧＮ）の発症に大きな役割を果たす（Hahn & Tsao, 1993; Ohnishi et al., 1994）。糸球体腎炎は、腎臓の血液精製糸球体の毛管壁が、糸球体基底膜の上皮側での癒着により肥厚するようになる重篤な症状である。当該疾患は、しばしば、慢性且つ進行性で、最終的腎不全を引き起こし得る。
【０１１６】
自己抗体がこれらの自己免疫疾患において誘導される機序は、依然として不明である。診断および／または処置が向けられ得るＳＬＥの原因は分かっていないので、処置は、根元的原因に対するというよりむしろ、例えばマクロライド抗生物質により免疫応答を抑止することに向けられてきた（例えば、米国特許第４，８４３，０９２号）。
Ｉ．  過敏性腸症候群
【０１１７】
過敏性腸症候群（ＩＢＳ）は、腹部痛および腸習慣変化により特性化される機能的障害である。この症候群は、青年期に開始し、有意の能力障害と関連死得る。この症候群は、均質な障害ではない。むしろ、ＩＢＳの亜型は、優勢な病状  −下痢、便秘または疼痛に基づいて説明されてきた。発熱、体重減少および消化器出血といったような「警報」病状の非存在下で、限定ワークアップが必要とされる。一旦、ＩＢＳが診断されると、統合処置アプローチは、症候の重症度を効果的に低減し得る。ＩＢＳは一般的障害であるが、しかしその有病率は変化している。概して、ＩＢＳは、米国成人の約１５％を冒し、男性より女性においてしばしば約３倍多く生じる（Jailwala et al., 2000）。
【０１１８】
ＩＢＳは、毎年２４０万〜３５０万人の来診の主な原因となる。それは胃腸病学者が診る最も一般的な症状であるだけでなく、初診で診られる最も一般的な胃腸症状の１つでもある（Everhart et al., 1991; Sandler, 1990）。
【０１１９】
ＩＢＳは、費用の掛かる障害でもある。腸病状を有さない人と比較して、ＩＢＳを有する人は、就業日としての務めを３倍は果たせず、病気がひどくて働けないことを報告すると思われる（Drossman et al., 1993; Drossman et al., 1997）。さらに、ＩＢＳ患者は、腸障害を有さない人より数百ドル多い医療費が掛かる（Talley et al., 1995）。
【０１２０】
ＩＢＳ患者が経験する腹部痛および腸習慣変化の悪化および寛解を説明する特定の異常は無い。ＩＢＳの進化理論は、脳−腸軸の多重レベルでの調節不全を示唆する。運動不全、内臓過敏、中枢神経系（ＣＮＳ）の異常変調、および感染はすべて、関連づけられてきた。さらに、心理社会的因子は、重要な緩和的役割を果たす。異常腸運動は、ＩＢＳの病因における一因子であると長い間考えられてきた。食後に小腸を通る通過時間は、便秘優勢または疼痛優勢亜型を有する患者よりも、下痢優勢ＩＢＳ患者のほうが短いことが示されている（Cann et al., 1983）。
【０１２１】
絶食中の小腸についての試験では、別個の群発性収縮と長期伝播性収縮の両方の存在が、ＩＢＳ患者で報告されている（Kellow & Phillips, 1987）。彼等は、健常者より高頻度で不規則収縮を伴う疼痛も経験する（Kellow & Phillips, 1987; Horwitz & Fisher, 2001）。
【０１２２】
これらの運動知見は、ＩＢＳ患者における全症候複合体を説明しない；実際、これらの患者のほとんどが、実証可能な異常を有さない（Rothstein, 2000）。ＩＢＳ患者は、内臓痛に対する感受性増大を示す。直腸Ｓ字状結腸のバルーン拡張を伴う試験は、ＩＢＳ患者が対照被験体より非常に低い圧力および容積で、疼痛および鼓脹を経験する、ということを示している（Whitehead et al., 1990）。これらの患者は、身体刺激の正常知覚を保持する。
【０１２３】
この減少を説明するために、多数の理論が提唱されている。例えば、内臓における受容体は、膨張または管腔内内容物に応答して感受性増大を示し得る。脊髄の背角におけるニューロンは、興奮性増大を示し得る。さらに、感覚のＣＮＳプロセシングの変更が関与し得る（Drossman et al., 1997）。対照被験体と比較して、ＩＢＳ患者は、重要な疼痛中心である前帯状皮質の、痛みを伴う直腸刺激に応答した活性化増大を示す、ということを、機能的磁気共鳴画像処理試験は近年示している（Mertz et al., 2000）。
【０１２４】
漸増的に、感染性腸炎とその後のＩＢＳ発症との間の関係を、証拠が示唆している。炎症性サイトカインが、一役を果たし得る。確証済み細菌性胃腸炎歴を有する患者の調査では（Neal et al., 1997）、２５％が腸習慣の持続的変動を報告した。症候の持続性は、急性感染時点での心理的ストレスのためであり得る（Gwee et al., 1999）。
【０１２５】
小腸における細菌過剰増殖は、ＩＢＳ症候においてある役割を有し得る、ということを近年のデータは示唆している（Pimentel et al., 2000）。水素呼気試験に関して照会された２０２名のＩＢＳ患者のうちの１５７名（７８％）が、細菌過剰増殖に関して陽性であった、という試験知見を有した。追跡調査試験を受けた４７名の被験者のうち、２５名（５３％）が、抗生物質処置による症候（すなわち、腹部痛および下痢）の改善を報告した。
【０１２６】
ＩＢＳは、一連の症候を伴って存在し得る。しかしながら、腹部痛および腸習慣変動は、依然として主な特徴である。腹部不快感は、しばしば、痙攣性として記載され、左下四半分に位置するが、しかし重症度および位置は大きく異なり得る。患者は、下痢、便秘または下痢と便秘の交互エピソードを報告し得る。下痢性症候は、典型的には、小容量、軟便として記載され、糞便は、時として、粘液排泄物を伴う。患者は、鼓脹、切迫糞便、不完全排便および腹部膨張も報告することがある。上部胃腸症候、例えば胃食道逆流、消化不良または悪心も存在し得る（Lynn & Friedman, 1993）。
【０１２７】
症候の持続性は、さらなる試験に関する適応症というわけではない；それはＩＢＳの一特質であり、それ自体、当該症候群の予期される症候である。その症候が悪化しているか、または変化している患者では、さらに広範な診断評価が示される。さらなる試験のための適応症としては、警報症候の存在、５０歳以後の症候の発症、ならびに結腸癌の家族歴も挙げられる。試験は、腹部および骨盤の結腸鏡、コンピューター断層撮影、ならびに小腸および大腸のバリウム試験を含み得る。
Ｊ．  若年性関節リウマチ
【０１２８】
小児における関節炎の最も一般的な型に関する用語である若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）は、滑膜の慢性炎症および肥厚により特性化される疾病の一ファミリーに適用される。当該用語は、欧州で若年性慢性関節炎および／または若年性特発性関節炎として言及される疾病のファミリーと重複するが、しかし完全に同義であるというわけではない。
【０１２９】
Jarvis（1998）およびその他（Arend, 2001）は、成人および小児におけるリウマチ様疾患の病因は、生得および適応免疫の間の複雑な相互作用を包含する、ということを提唱した。この複雑性は、疾患病因を解明することの難しさの核心にある。
【０１３０】
生得および適応免疫系はともに、多数の細胞型、細胞表面の巨大なアレイおよび分泌タンパク質、ならびに陽性および陰性フィードバックの相互連結ネットワークを用いる（Lo et al., 1999）。さらに、分けて考えることができるが、免疫系の生得および適応側面は機能的に交差され（Fearon & Lockley, 1996）、そしてこれらの交差点で生じる病理学的事象は、成人および小児型の慢性関節炎の病原についてのわれわれの理解と非常に関連があると思われる（Warrington et al., 2001）。
【０１３１】
多関節性ＪＲＡは、手の小関節を含めて、多関節（４またはそれ以上）における炎症および滑膜増殖により特性化される別個の臨床的亜型である（Jarvis, 2002）。その多関節関与および経時的に急速に進行するその能力の両方のため、ＪＲＡのこの亜型は重症である。臨床的に異なるが、しかし多関節性ＪＲＡは均質ではなく、患者は、疾患症状発現、開始年齢、予後および治療的応答が変わる。これらの差異は、この疾患で起こり得る免疫および炎症性攻撃の性質の変動範囲を反映すると大いに考えられる（Jarvis, 1998）。
Ｋ．  シェーグレン症候群
【０１３２】
主なシェーグレン症候群（ＳＳ）は、慢性、緩徐進行性、全身性の自己免疫性疾患であり、これは、主に中年女性（女性対男性比  ９：１）を冒すが、しかし小児を含めた全年齢で認められ得る（Jonsson et al., 2002）。それはリンパ球浸潤および外分泌腺の破壊（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋リンパ球およびＢ細胞を含めた単核球により浸潤される）により特性化される（Jonsson et al., 2002）。さらに、腺外（全身性）症状発現は、患者の３分の１に認められる（Jonsson et al., 2001）。
【０１３３】
腺性リンパ球浸潤は、進行性特徴であり（Jonsson et al., 1993）、これは、広範囲に亘る場合、器官の大部分を取り替え得る。興味深いことに、腺性浸潤物が唾液腺における異所性リンパ様微細構造（異所性胚中心として示される）に非常によく似ている患者もいる（Salomonsson et al., 2002; Xanthou & Polihronis, 2001）。ＳＳにおいて、異所性ＧＣは、濾胞性樹状細胞および活性化内皮細胞の網状構造を有する増殖中の細胞のＴおよびＢ細胞凝集物と定義される。標的組織内に形成されるこれらのＧＣ様構造は、自己抗体（抗Ｒｏ／ＳＳＡおよび抗Ｌａ／ＳＳＢ）の産生を伴う機能的特性も表現する（Salomonsson & Jonsson, 2003）。
【０１３４】
他の全身性自己免疫性疾患、例えばＲＡでは、異所性ＧＣに関して重要な因子が同定されている。ＧＣを有するリウマチ様滑膜組織は、ケモカインＣＸＣＬ１３、ＣＣＬ２１およびリンホトキシン（ＬＴ）−β（濾胞性中心およびマントル帯Ｂ細胞で検出される）を産生することが示された。これらの分析物の多変数回帰分析は、リウマチ様滑膜炎における孤立性サイトカイン予測ＧＣとして、ＣＸＣＬ１３およびＬＴ−βを同定した（Weyand & Goronzy, 2003）。近年、唾液腺におけるＣＸＣＬ１３およびＣＸＣＲ５は、ＢおよびＴ細胞を動員し、したがってＳＳにおけるリンパ系新生および異所性ＧＣ形成に寄与することにより、炎症過程において不可欠な役割を果たすことが示されている（Salomonsson & Larsson, 2002）。
Ｌ．  早期関節炎
【０１３５】
異なる炎症性関節症の臨床的提示は、疾患の経過における早期に似ている。その結果、糜爛性関節損傷をもたらす重症且つ持続性滑膜炎を発症する危険性がある患者を、関節炎がより自己限定性である患者と区別することはしばしば困難である。このような識別は、適切に療法を標的にして、糜爛性疾患を有する者を攻撃的に処置して、より自己限定性疾患を有する患者における不必要な毒性を回避するために重要である。リウマチ関節（ＲＡ）のような糜爛性関節症を診断するための一般的な臨床的判定基準は、早期疾患には余り有効ではなく、疼痛関節点数よび急性期応答のような疾患活動性の伝統的マーカーは、不十分な結果を示すと思われる患者を適切に同定できない（Harrison & Symmons et al., 1998）。滑膜に生じる病理学的事象を反映するパラメーターは、ほとんど有意の予後値を有すると思われる。
【０１３６】
早期炎症性関節炎における不十分な結果の予測子を同定するための近年の努力は、ＲＡ特異的自己抗体、特にシトルリン化ペプチドに向けられる抗体の存在を同定して、早期炎症性関節炎群における糜爛性および持続性疾患と関連づけた。これに基づいて、環状シトルリン化ペプチド（ＣＣＰ）が開発されて、患者血清中の抗ＣＣＰ抗体の同定を手助けした。このアプローチを用いて、抗ＣＣＰ抗体の存在は、ＲＡに対して特異的且つ感受性であることが示され、ＲＡを他の関節症と区別し得るし、これらの結果が臨床的に明らかになる前に、持続性糜爛性滑膜炎を潜在的に予測し得る（Schellekens et al., 2000）。抗ＣＣＰ抗体がしばしば臨床症候の何年も前に検出可能であるということは重要であり、これは、それらが無症状性免疫事象を反映し得ることを示唆している（Nielen et al., 2004; Rantapaa-Dahlqvist et al., 2003）。
【０１３７】
異なる炎症性関節症の臨床的提示は、疾患の経過における早期に似ている。その結果、糜爛性関節損傷をもたらす重症且つ持続性滑膜炎を発症する危険性がある患者を、関節炎がより自己限定性である患者と区別することはしばしば困難である。このような識別は、適切に療法を標的にして、糜爛性疾患を有する者を攻撃的に処置して、より自己限定性疾患を有する患者における不必要な毒性を回避するために重要である。リウマチ関節（ＲＡ）のような糜爛性関節症を診断するための一般的な臨床的判定基準は、早期疾患には余り有効ではなく、疼痛関節点数よび急性期応答のような疾患活動性の伝統的マーカーは、不十分な結果を示すと思われる患者を適切に同定できない（Harrison et al., 1998）。滑膜に生じる病理学的事象を反映するパラメーターは、ほとんど有意の予後値を有すると思われる。
【０１３８】
早期炎症性関節炎における不十分な結果の予測子を同定するための近年の努力は、ＲＡ特異的自己抗体、特にシトルリン化ペプチドに向けられる抗体の存在を同定して、早期炎症性関節炎群における糜爛性および持続性疾患と関連づけた。これに基づいて、環状シトルリン化ペプチド（ＣＣＰ）が開発されて、患者血清中の抗ＣＣＰ抗体の同定を手助けした。このアプローチを用いて、抗ＣＣＰ抗体の存在は、ＲＡに対して特異的且つ感受性であることが示され、ＲＡを他の関節症と区別し得るし、これらの結果が臨床的に明らかになる前に、持続性糜爛性滑膜炎を潜在的に予測し得る。抗ＣＣＰ抗体がしばしば臨床症候の何年も前に検出可能であるということは重要であり、これは、それらが無症状性免疫事象を反映し得ることを示唆している（Nielen et al., 2004; Rantapaa-Dahlqvist et al., 2003）。
Ｍ．  乾癬
【０１３９】
乾癬は、米国の人口の２〜２．６％、または５８０万〜７５０万人を冒す鱗屑形成および炎症の慢性皮膚疾患である。当該疾患はすべての年齢層に生じるが、しかし主に成人を冒す。それは、男性および女性でほぼ等しいと思われる。感染は、皮膚細胞が皮膚の表面下のそれらの起源から急速に生じて、表面に積み上げた後、それらが成熟する機会を有する場合に起こる。通常は、この動き（代謝回転とも呼ばれる）は約１ヶ月を要するが、しかし乾癬では、それはたった２〜３日で起こり得る。その典型的形態では、乾癬は、銀色の鱗屑で覆われた厚く、赤色（炎症性）の皮膚のパッチを生じる。これらのパッチは、時としてプラークと呼ばれ、通常は、痒く、痛みを感じる。それらは、非常にしばしば、肘、膝、足のその他の部分、頭皮、下位背部、顔面、掌および足裏に生じるが、しかしそれらは身体の皮膚のどこにでも生じ得る。当該疾患は、指爪、足指の爪、ならびに生殖器の柔組織および口腔内側も冒し得る。罹患関節周囲の皮膚がひび割れることは珍しくないが、しかし乾癬を有する約１００万人が、関節炎の症候を生じる関節炎症を経験する。この症状は、乾癬性関節炎と呼ばれる。
【０１４０】
乾癬は、特にＴ細胞と呼ばれる白血球型を含む免疫系により追い込まれる皮膚障害である。普通は、Ｔ細胞は感染および疾患に対して身体を保護するのに役立つ。乾癬の場合、Ｔ細胞は、間違いにより動かされ、それらが他の免疫応答を誘発するほど活性になり、これが、炎症を、そして皮膚細胞の急速な代謝回転をもたらす。症例の約３分の１において、乾癬の家族歴が認められる。調査人等は、乾癬に冒された多数の家族を試験して、疾患に結びつく遺伝子を同定した。乾癬を有する人は、彼等の皮膚が悪化する時期があり、次いで改善することに気づき得る。突然の再発を引き起こし得る条件としては、感染、ストレスおよび皮膚を乾燥する気候の変化が挙げられる。さらにまた、ある種の医薬品、例えばリチウムおよびβ遮断薬（高血圧のために処方される）は、突発を誘発するかまたは当該疾患を悪化させ得る。
Ｎ．  多発性硬化症
【０１４１】
多発性硬化症（ＭＳと略され、播種性硬化症または播種性脳脊髄炎としても知られている）は、免疫系が中枢神経系を攻撃して、脱髄をもたらす自己免疫性症状である。疾患開始は、通常は、青年期に起こり、女性においてより一般的である。それは、２〜１５０／１００，０００の範囲の有病率を有する。ＭＳは、Jean-Martin Charcotにより１８６８年に最初に記載された。
【０１４２】
ＭＳは、互いと交通する脳および脊髄中の神経細胞の能力を冒す。神経細胞は、活動電位と呼ばれる電気シグナルを、ミエリンと呼ばれる絶縁物質にくるまれている軸索と呼ばれる長い繊維に送ることにより連絡する。ミエリンが失われると、軸索はもはやシグナルを有効に伝達できない。多発性硬化症という名称は、脳および脊髄の白質に置ける瘢痕（硬化−プラークまたは病変としてよりよく知られている）を指し、これは主にミエリンで構成される。疾患過程に関与する機序については多くが知られているが、しかし原因は依然として不明である。理論は、遺伝学または感染を包含する。異なる環境危険因子も見出されている。
【０１４３】
ほとんどすべての神経学的症候が当該疾患に伴って現われ、しばしば、身体的および認知性能力障害に進行する。ＭＳはいくつかの形態をとり、新規の症候は、別個の発作で生じるか（再発型）、または経時的に徐々に蓄積する（進行型）。発作の間には、症候が完全に消えることもあるが、しかし特に疾患が進むと、恒久的神経学的問題がしばしば起こる。
【０１４４】
ＭＳに関する既知の治癒法はない。発作後に機能を元に戻し、新規の発作を防止し、そして能力障害を防止するために、処置が試みられた（下記の詳細な考察を参照）。ＭＳ薬は、副作用を有するかまたは十分に耐容されず、科学的試験の支持が無いにもかかわらず、多数の患者が代替的処置を追及する。予後は、予測するのが難しい；それは、疾患の亜型、個々の患者の疾患特質、初期症候、ならびに時間が経過した時に人が経験する能力障害の程度によって決まる。患者の余命は、非罹患集団とほぼ同じである。
【０１４５】
ＭＳの症候は、通常は、悪化（再発、増悪、発作）の一時的急性期間に、神経学的機能の漸次進行性劣化において、または両方の組合せにおいて現われる。
【０１４６】
ＭＳの最も一般的提示は、臨床的単離症候（ＣＩＳ）である。ＣＩＳでは、患者は脱髄を示唆する発作を有するが、しかし多発性硬化症に関する判定基準を満たさない。ＣＩＳを経験している人の３０〜７０％が、後にＭＳを発症するに過ぎない。当該疾患は、通常は、知覚的（症例の４６％）、視覚的（３３％）、小脳性（３０％）および運動性（２６％）症候を伴って存在する。多数の稀な初期症候も報告されており、例えば失語症、精神病および癲癇である。先ず医学的注意を求める患者は、一般に多数の症候を呈する。ＭＳの初期徴候および症候は、しばしば、一過性で、軽度で、そして自己限定性である。これらの徴候および症候は、しばしば、ヒトが医学的注意を求めるよう促さないし、時として、一旦ＭＳの診断がなされたら、単に遡及的に確認される。ＭＳの症例は、他の原因のために実施される神経学的検査の間に、時として、偶然に確認される。このような症例は、無症状性ＭＳとして言及される。
【０１４７】
ＭＳを有する人は、知覚の変化（知覚鈍麻および知覚異常）、筋肉衰弱、筋肉痙攣または運動困難；協調および平衡困難（運動失調）；発語（構音障害）または嚥下（嚥下障害）における問題、視覚問題（眼振または視神経炎）、疲労、急性または慢性疼痛、ならびに膀胱および腸困難を含めて、ほとんどあらゆる神経学的症候または徴候を蒙り得る。種々の程度の認知障害ならびに抑うつまたは不安定気分の情動的症候も、一般的である。能力障害進行および症候重症度の主な臨床的測定法は、綜合障害度評価尺度（Expanded Disability Status Scale）またはＥＤＳＳである。
【０１４８】
多発性硬化症再発は、しばしば予測不可能で、警告なしに、そして明白な誘発因子なしに起こる。しかしながらいくつかの発作は、共通の引き金が先行する。再発は、春および夏の間はより高頻度に起こる。普通の風邪、インフルエンザまたは胃腸炎のような感染症は、再発の危険を増大する。ストレスも発作を誘発し得る。妊娠は、再発に対する感受性に影響を及ぼし得るので、例えば最終三半期の間、保護を提案する。しかしながら、出産後の最初の数ヶ月間は、再発の危険が増大する。全体的に、妊娠は、長期能力障害に影響を及ぼすようには思われない。多数の潜在的引き金が検査されており、ＭＳ再発率に影響を及ぼさないことが判明している。インフルエンザ、Ｂ型肝炎、水疱瘡、破傷風または結核に関するワクチン接種が再発の危険を増大する、という証拠は無い。身体的外傷は、再発を誘発しない。通常の周囲温度より高い温度への曝露は、ウートホフ現象として既知の作用である現存症候を悪化し得る。しかしながら、ウートホフ減少は確立された再発の引き金ではない。
【０１４９】
いくつかの亜型または進行パターンが、記載されている。亜型は、将来的経過を予測するための試みにおいて、疾患の過去の経過を用いる。それらは、予後のためだけでなく、治療的決定のためにも重要である。１９９６年に、米国国立多発性硬化症協会は、４つの亜型定義を標準化した：再発−寛解型、二次性進行型、原発性進行型および進行性再発型。
【０１５０】
再発−寛解亜型は、予測不可能な再発と、その後の数ヶ月〜数年の疾患活動の新規の徴候を伴わない相対的に静かな期間（寛解）により特性化される。発作中に蒙る欠損は、回復し得るか、または後遺症を残し得る。これは、ＭＳを有する個体の８５〜９０％の初期経過を説明する。欠損が発作間で常に回復する場合、これは、時として、良性ＭＳと呼ばれる。
【０１５１】
二次性進行型ＭＳは、初期再発−寛解型ＭＳを有する個体を説明するが、この個体はその後、寛解の如何なる限定期間もなしに、急性発作間に進行性神経学的低下を示し始める。不定期の再発および小寛解が現われ得る。疾患開始と、再発−寛解型から二次性進行型ＭＳへの転換との間の中央値時間は、１９年である。
【０１５２】
原発性進行亜型は、その初期ＭＳ症候後に寛解を有さない個体の約１０〜１５％を説明する。それは、開始からの能力障害の進行により特性化され、寛解および改善を伴わないか、またはあっても不定期で且つ小さい。原発性進行亜型に関する開始年齢は、他の亜型より遅い。
【０１５３】
進行性再発型ＭＳは、開始から、着実な神経学的低下を有するが、しかし明らかな追加発作も蒙る個体を説明する。これは、すべての亜型のうち最も一般的でない。
【０１５４】
非標準行動を有する症例も説明されている。時として、多発性硬化症の境界型として言及されるのは、例えばデビック病、バロー同心円性硬化症、シルダーび漫性硬化症およびマールブルグ型多発性硬化症である。多発性硬化症は、小児では異なる症状を呈する。これらがＭＳの非典型的変形か、あるいは異なる疾患であるか、論争されている。
【０１５５】
多発性硬化症は、その徴候および症候が多数の他の医学的問題と類似し得るため、診断が難しい。医学協会は、開業医のための診断過程を容易にし、標準化する診断判定基準を作成した。歴史的に、シューマッハおよびポーサー判定基準が、ともに評判がよかった。現在、マクドナルド判定基準は、時間および空間的でのＭＳ病変の普及の臨床、実験室および放射線学データを用いた実証に集中している。他の考え得る症状が除外されるまで、診断はなされ得ないし、解剖学的におよび早晩、分離される脱髄性事象の証拠が存在する。
【０１５６】
個体がＭＳに特徴的な神経学的症候の別個の症状を蒙っている場合、臨床データ単独で、ＭＳの診断には十分であり得る。１回だけの発作後に医学的注意を求める人もいるため、他の試験が、診断を早め、容易にし得る。最も一般に用いられる診断ツールは、神経画像処理、脳脊髄液の分析および誘発電位である。脳および脊椎の磁気共鳴画像処理は、脱髄の区域（病変またはプラーク）を示す。ガドリニウムは、活動性プラークを目立たせるための対比物として静脈内投与され、そして排除により、評価時点で症候に関係のない歴史的病変の存在を実証する。腰椎穿刺から得られる脳脊髄液の試験は、脳神経系の慢性炎症の証拠を提供し得る。脳脊髄液は、ＭＳを有する人の７５〜８５％に見出される炎症マーカーであるオリゴクローナル帯域に関して試験される。ＭＳを有する人の神経系は、このような経路の脱髄のため、しばしば視神経および感覚神経の刺激に余り活発に応答しない。これらの脳応答は、視覚的および感覚的誘発電位を用いて検査され得る。
【０１５７】
ＭＳは、一般に、ウイルス病因を有し得る初期の引き金を伴う免疫媒介性障害であると考えられるが、しかしこの概念は、長年議論されており、依然としてそれに反対する人もいる。損傷は、患者自身の免疫系により引き起こされると考えられる。おそらくは、それ自体の構造と類似の構造を有する分子への曝露の結果、免疫系は神経系を攻撃する。
【０１５８】
ＭＳ病変は、最も一般的には、小脳の脳室、脳幹、脳底神経節および脊髄に近接する白質域；ならびに視神経に関連する。白質細胞の機能は、処理がなされる灰白質域と身体の残り部分との間のシグナルを運ぶことである。末梢神経系が稀に関与する。
【０１５９】
さらに具体的には、ＭＳは、ニューロンが電気シグナルを運ぶのを手助けするミエリン鞘として既知である脂肪層を作り、保持するのに関与する細胞である乏突起膠細胞を破壊する。ＭＳは、ミエリンを薄くするかまたは完全に無くし、疾患が進むと、ニューロンの伸長または軸索の切断（横切断）を引き起こす。ミエリンが失われると、ニューロンはもはや電気シグナルを有効に伝達できない。再髄鞘形成と呼ばれる修復過程は、疾患の早期に起こるが、しかし乏突起膠細胞は細胞の髄鞘を完全に再構築できない。瘢痕様プラークが損傷軸索周囲に構築されるまで、反復的発作は、継続的な有効再髄鞘形成をより少なくする。４つの異なる病変パターンが記載されている。
【０１６０】
脱髄とは別に、当該疾患の他の病理学的特質は炎症である。ＭＳの厳密に免疫学的な説明によれば、炎症過程は、リンパ球の一種であるＴ細胞により引き起こされる。リンパ球は、身体の防御において重要な役割を果たす細胞である。ＭＳでは、Ｔ細胞は、神経系へのＴ細胞の進入を防止すべき毛細管系である血液脳関門を介して脳に進入できる。関門を形成する密な接合部の完全性を低減する感染またはウイルスにより誘発されない限り、血液脳関門は、普通はこれらの種類の細胞に対して透過性でない。血液脳関門がその完全性を回復すると、通常は、感染またはウイルスが掃去された後、Ｔ細胞は脳の内側に閉じ込められる。Ｔ細胞は、ミエリンを異物と認識して、あたかもそれが侵襲ウイルスであるかのようにそれを攻撃する。これが炎症過程を誘発して、他の免疫細胞ならびに可溶性因子、例えばサイトカインおよび抗体を刺激する。漏れが血液脳関門に生じて、これが順次、多数の他の損傷作用、例えば腫脹、マクロファージの活性化、ならびにサイトカインおよびその他の破壊的タンパク質のさらなる活性化を引き起こす。
【０１６１】
多発性硬化症に関する既知の治癒法は無いが、しかしいくつかの治療が有用であると立証されている。治療の主な目標は、発作後の機能を回復し、新規の発作を防止し、そして能力障害を防止することである。任意の医学的処置を用いる場合と同様に、ＭＳの管理に用いられる医薬品は、いくつかの副作用を有する。支持的、比較的、置換的な科学的試験の欠点にもかかわらず、代替的処置を求める患者もいる。
【０１６２】
症候性発作中、メチルプレドニソロンのような静脈内コルチコステロイドの高用量投与は、急性再発のための通例の療法である。この種の処置の目標は、直ぐに発作を終わらせて、患者の継続する欠損をより少なくさせることである。一般的に症候を軽減するために短期間で有効であるが、しかしコルチコステロイド処置は、長期回復に有意の影響を及ぼすとは思われない。潜在的副作用としては、骨粗鬆症および記憶障害が挙げられるが、後者は可逆的である。
【０１６３】
疾患修飾性処置は費用が掛かり、これらのほとんどが頻繁な（毎日ということにもなる）注射を要する。１〜３ヶ月間隔でＩＶ注入を要する者もいる。再発−寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）の最早期臨床提示は、臨床的単離症候（ＣＩＳ）である。最初の発作の間のインターフェロンによる処置は、患者が臨床的ＭＳを発症する機会を低減し得る、ということをいくつかの試験が示している。
【０１６４】
２００７年の試験と同様に、６つの疾患修飾性処置が、ＲＲＭＳに関して異なる国の監督機関により認可されている。３つがインターフェロンである：インターフェロンβ１a（商品名：アボネックス、シンノベックス、レシゲンおよびレビフ）の２つの処方物、およびインターフェロンβ１ｂ（米国の商品名：ベタセロン、欧州および日本：ベタフェロン）のうちの１つ。第四の医薬品は、グラチラマー酢酸塩（コパキソン）である。第五の医薬品であるミトキサントロンは、癌化学療法にも用いられる免疫抑制剤で、米国でのみ認可されており、主として二次性進行性ＭＳのためのものである。第六番目は、ナタリズマブ（タイサブリとして市販）である。６つの医薬品はすべて、発作回数を低減し、能力障害への進行を遅らせるのに適度に有効であるが、しかしそれらの有効率は異なり、それらの長期作用の試験は未だなされていない。免疫調節薬（ミトキサントロン以外のすべて）間の比較は、再発率低減および能力障害進行の停止の点から見て、最も有効であるのはナタリズマブである、ということを示している；ＭＳの重症度を低減することも示されている。ミトキサントロンは、それらすべてのうちで最も有効であり得る；しかしながら、その使用は重度の心臓毒性により制限されるので、それは一般的に長期療法とみなされない。
【０１６５】
インターフェロンおよびグラチラマー酢酸塩は、グラチラマー酢酸塩に関する１日１回からアボネクスに関する週１回（しかし、筋肉内）までの種々の高頻度の注射により送達される。ナタリズマブおよびミトキサントロンは、月１回間隔でＩＶ注射により投与される。
【０１６６】
進行性ＭＳの処置は、再発−寛解型ＭＳより難しい。ミトキサントロンは、二次性進行型および進行性再発型経過を有する患者において陽性作用を示す。それは、短期追跡調査において、患者における疾患の進行および再発の頻度を低減するに際して適度に有効である。原発性進行型ＭＳの経過を修正することが立証された処置はない。
【０１６７】
任意の医学的処置を用いる場合、これらの処置はいくつかの副作用を有する。最も一般的なものの１つは、グラチラマー酢酸塩およびインターフェロン処置に関する注射部位での刺激作用である。経時的に、注射部位での目に見える表面のくぼみは、脂肪組織萎縮として既知の脂肪組織の局所的破壊のため、発達し得る。インターフェロンは、インフルエンザと類似の症候を生じる；グラチラマーを摂取している患者の中には、潮紅、胸苦しさ、心悸亢進、息切れおよび不安により症状発現される注射後反応を経験する患者もいて、これらの症状は通常は３０分未満継続する。さらに危険であるのは、インターフェロンおよびミトキサントロンからの肝臓損傷、ミトキサントロンの免疫抑制作用および心臓毒性、ならびにナタリズマブと進行性多病巣性白質脳症のいくつかの症例との間の推定上の関連である。
【０１６８】
疾患修飾処置は、疾患の進行速度を低減するが、しかしそれを停止しない。多発性硬化症が進行すると、総体的症状は増大する傾向がある。当該疾患は、一連の進行性機能障害および能力傷害を生じる種々の症候および機能的欠損と関連する。したがって、これらの欠損の管理は非常に重要である。薬剤療法および神経リハビリテーションはともに、いくつかの症候の苦しみを和らげることを示したが、しかしどちらも疾患進行に影響を及ぼさない。神経学的欠損を有する任意の患者に関する場合、能力傷害を限定し、克服するためには総合的なアプローチが重要である；しかしながら、ＭＳを有する人は、何らかの点でほぼあらゆる健康専門職または医療施設からの援助を必要とし得るため、「コアチーム」を特定するのが特に難しい。同様に、各症候に関して、異なる処置選択肢が存在する。したがって、処置は、患者および医者の両者によって、個別化されるべきである。
【０１６９】
ほとんどの慢性疾患に関する場合と同様に、支持的、比較的、置換的な科学的試験の欠点にもかかわらず、代替的処置を求める患者もいる。例は、食事レジメン、漢方薬、例えば症候を軽減するのに役立つための医療用大麻の使用、ならびに高圧酸素添加である。武道、例えば太極拳、リラクゼーション療法、例えばヨガ、または一般的運動の療法的実施は、疲労を和らげると思われるが、しかし認知機能に影響を及ぼさない。
Ｏ．  尋常性天疱瘡
【０１７０】
メルク・マニュアルに記載されているように、尋常性天疱瘡は、表皮内水疱および見かけ上健康な皮膚および粘膜における広範な糜爛により特性化される、普通でない潜在的に致命的な自己免疫性疾患である。診断は、直接免疫蛍光試験を用いた皮膚生検による。処置は、コルチコステロイド、および時として免疫抑制剤を用いる。
【０１７１】
尋常性天疱瘡は、通常は中年または高齢患者に起こり、稀に小児に起こる。一変形である傍腫瘍性天疱瘡は、老年患者に生じて、悪性疾患（主にリンパ細網）を伴う；結果は好ましくない。
【０１７２】
当該疾患は、表皮中の細胞間接着分子デスモグレイン−１およびデスモグレイン−３に対して向けられる自己抗体の存在により特性化される。それらは、表皮細胞間の接着および細胞シグナル伝達に関与するＣａ依存性カドヘリンである。棘細胞離開は、自己抗体結合によるデスモグレインの機能の直接的阻害に起因するか、または細胞−細胞接着の下方調節および水疱の形成を生じる自己抗体誘導性細胞シグナル伝達に起因する。これらの自己抗体は、活動性疾患の間は、血清および皮膚の両方に存在する。層化扁平上皮の任意の領域、例えば粘膜表面が冒される。一般に既知の処置レジメンは、薬剤、例えばコルチコステロイド、免疫抑制剤を、血漿分離交換法およびＩＶ免疫グロブリンとともに、またはそれらを含めて、用いることを包含する。したがって、このように、デスモグレイン代用物として作用し得る、そして侵害性自己抗体と結合し、前記抗体がデスモグレインを攻撃して前記症状に関連した症候を引き起こさないようにする薬剤が求められている。罹患基患者の血清中に存在する各々別個の自己抗体に関する親和性を有するリガンドのパネルでの処置を伴うＰＶの処置における抗原代用物の組合せに対する要求も存在する。したがって本発明は、抗原Ａに対する抗原代用物Ａを、抗原Ｂに対する抗原代用物Ｂと組合せて、抗原Ｃに対シル抗原代用物Ｃと組合せて・・・等として用いることを含む組合せ処置を包含する。リガンドまたは抗原代用物は、例えば米国特許第２００７／０００３９５４号に記載されたスクリーニング方法を用いて見出され得る。任意数の自己抗体が見出され得るし、したがって、ＰＶにおいて存在するこのような自己抗体に応答性の自己抗体に対する任意数の高親和性リガンドが、症状または疾患を処置するために用いられ得る。疾患状態または症状と相関するかまたはそれとともに存在する未知の自己抗体と応答性または反応性である高親和性リガンドも、抗デスモグレイン３のような既知の自己抗体に対して本明細書中で同定されるリガンドと組合せて用いられ得る。
【０１７３】
本発明は、尋常性天疱瘡および天疱瘡関連疾患または症状に関連したミトコンドリア自己抗体およびその他のケラチノサイト自己抗体と結合するペプトイドおよびペプトイド様部分、例えば環状ペプトイドおよび／またはその他のオリゴマーを含めたリガンドのスクリーニングおよび／または検出方法も包含する。本明細書中で用いられるスクリーニング方法は、尋常性天疱瘡あるいは天疱瘡関連疾患または症状を有するか、有することが疑われる患者の生物学的流体（血清等）中の既知の自己抗体ならびに未知の自己抗体に対して向けられ得る。スクリーニング方法は、支持体上のリガンドのライブラリーに対して溶液中の既知の抗体をスクリーニングする方法を用い得る。一旦、リガンドが選択リガンドと同定されれば、このリガンドは、支持体上のまたは溶液中の自己抗体に対して査定され／実証されて、リガンド抗体複合体のＫｄまたは結合親和性を決定し得る。同様に、特定のリガンドまたはペプトイドが、尋常性天疱瘡のような自己免疫性障害と関連する既知の自己抗体のパネルに対してスクリーニングされ得る。
【０１７４】
関連抗体に関する高親和性リガンド（抗原代用物）を含む処置とともに、侵害性Ｔ細胞、あるいは自己抗体の任意の免疫学的供給源または触媒を除去する組合せ処置も求められている。係属中出願米国特許出願第１２／７８９，７１１号に記載された方法に従った自己免疫性障害に関連したＴ細胞またはＢ細胞を見出す方法を、上記初期スクリーニングで見出されたリガンドを用いてこのようなＴ細胞（またはＢ細胞）を除去する方法と組合せて、そしてさらに、本明細書中に開示される方法に従って見出される高親和性抗原代用物で患者を処置することにより自己抗体が天然抗原を攻撃しないようにする方法と組合せて包含する自己免疫性疾患および症状の処置への診断的および治療的の両アプローチの組合せも求められている。
ＩＩ．  自己免疫性疾患における診断的決定
【０１７５】
本発明は、一態様では、上記したような自己免疫性疾患に関する診断を提供し得る。これは、症候が重なり合う種々の疾患を医者がより容易に見分け、したがって、患者の症候に関する根元的生理学的基礎を正しく同定して、早期介入および疾患管理を始めることができるようにする。実際、多数の自己免疫性疾患に関する処置は、進行を遅らせ、症候に取り組むが、しかし疾患を防止または治癒するわけではないため、これらの疾患に関する早期診断を提供する能力は、より重症な症候の開始を遅らせるために重要である。さらに、時として不正確な診断に起因する「試行錯誤」を伴うことなく、患者に彼等の症候に取り組むための正しい薬剤を提供し得ることは、看護の経費を優位に提言し、患者の不快カンおよび考え得る危害を回避する。
【０１７６】
本発明の抗原代用物を用いる診断検定の場合、当該検定は、血液または血清試料を用いて、関連自己抗体の存在に関して試験する。自己抗体およびＴ細胞を検出するために二元的戦略を用いる検定では、これらの検定は、Ｔ細胞含有患者試料を用いる。その中のＴ細胞の優勢のため、最も一般的に利用される生物学的試料は血液または血清である。しかしながら、他の試料、例えば涙液、唾液、痰、脳脊髄液、精液または尿も同様に有用であることを示し得る。
【０１７７】
被験体における自己反応性Ｔ細胞または自己抗体の存在を査定するに際して、観察される反応性パターンは標準と比較される。標準は、罹患および正常被験体に関して確立されたペプトイド結合の既知のパターンに頼り得るし、したがって、反応対照、すなわち陽性反応のために必要な試薬および条件が存在することを示す対照以外のあらゆるものをユーザーが提供する必要がない。代替的には、既知の健常または罹患状態の実際の人からの同様の試料を含む実対照を試験するよう選択し得る。さらに、経時的に同一被験体からの一連の試料を試験して、疾患進行の指標としての自己抗体または自己反応性Ｔ細胞の増大傾向を調べることもある。
【０１７８】
本発明による自己抗体または自己反応性Ｔ細胞を検出するための多数の異なる方法がある。一検定型は、例えば酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射定量測定検定、蛍光免疫検定、化学発光検定、生物発光検定、ＦＡＣＳ、ＦＲＥＴおよびウエスタンブロット等のような形式を含めて、抗体ベースの検定を包含するかまたはモデルにする。種々の免疫検出方法のステップは、科学文献、例えばDoolittle and Ben-Zeev ( 1999), Gulbis and Galand (1993), De Jager el al. ( 1993)およびNakamura et ai. ( 1987)に記載されている。概して、このような検定は、支持体上に配置されるペプトイドの使用を伴う。ペプトイドは、従来、自己反応性Ｔ細胞集団に関する関連リガンドとして同定されているし、またはその代わりに、それに関する全体的Ｔ細胞結合パターンが疾患または健康を予測する非特性化ペプトイドのアレイの一部であり得る。
【０１７９】
固体支持体は、カラムマトリックス、ビーズ、フィルター、膜、スティック、プレートまたはウェルの形態であり得るし、試料は、固定化ペプトイドに適用される。試料と接触後、望ましくない（非特異的に結合された）構成成分は、支持体から洗い落とされて、ペプトイドと複合体を形成する自己抗体またはＴ細胞を残し、これが次に、種々の手段、例えば支持体と結合されるＴ細胞（例えばＣＤ４、ＣＤ８）上の表面マーカーを認識するか、あるいは自己抗体または標識化ペプトイド（単数または複数）を認識する抗体のその後の付加を用いて検出される。
【０１８０】
有効な条件下で、ペプトイド−Ｔ細胞またはペプトイド−自己抗体複合体の形成を可能にするのに十分な時間の間、選定生物学的試料をペプトイドと接触することは、一般的に、単に、試料をペプトイドと接触し、混合物を、Ｔ細胞または自己抗体がペプトイドを結合するのに十分長い時間の間、インキュベートするということである。この後、試料−ペプトイド組成物、例えばプレート、フィルターまたはブロットは、一般的に、あらゆる非特異的結合細胞種または細胞屑を除去するために洗浄されて、固定化ペプトイドと特異的に結合された細胞または自己抗体だけを検出させる。
【０１８１】
該して、生物学的複合体形成の検出は当該技術分野で周知であり、多数のアプローチの適用により達成され得る。これらの方法は、一般的に、標識またはマーカー、例えば放射性、蛍光、生物学的および酵素的タグのどれかの検出を基礎にしている。このような標識の使用に関する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号および第４，３６６，２４１号が挙げられる。もちろん、当該技術分野で既知であるように、二次結合リガンド、例えば二次抗体および／またはビオチン／アビジンリガンド結合配列の使用により、さらなる利点が見出され得る。
【０１８２】
種々の他の形態が意図され、当業者に周知である。本発明を容易に適用し得るよう意図した３つの特定の検定を、以下で考察する。
Ａ．  ＥＬＩＳＡ
【０１８３】
イムノアッセイは、その最も単純且つ直接的意味で、結合検定である。本発明において特定の使用を見出すあるイムノアッセイは、当業界で既知の種々の型の酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）である。
【０１８４】
一例示的ＥＬＩＳＡでは、本発明のペプトイドは、選定表面、例えばポリスチレン微量滴定プレート中のウェル上に固定される。次いで、自己抗体またはＴ細胞を含有することが疑われる試験組成物が、ウェルに付加される。結合し、洗浄して非特異的結合複合体を除去した後、結合Ｔ細胞または結合自己抗体が検出され得る。検出は、検出可能標識に連結された別のペプトイドの付加により達成され得る。この型の検定は、簡単な「サンドイッチＥＬＩＳＡ」と類似するが、但し、標識化剤の結合は、Ｔ細胞受容体の抗原結合部位、または自己抗体の結合部位（単数または複数）に直接である。検出は、任意のＴ細胞特異的表面抗原を結合する、例えば概してＴ細胞に独特である構造またはＴ細胞の特定のクラスを認識する、あるいは任意の抗体と結合する標識化抗体の付加によっても達成され得る。任意に、抗体は標識されず、その後、一次抗体（Ｆｃ）に関して結合親和性を有する二次抗体が付加され、二次抗体は検出可能標識と結合される。
【０１８５】
別の例示的ＥＬＩＳＡでは、Ｔ細胞を含有することが疑われる試料は、ウェル表面に固定され、次いで、本発明の標識化ペプトイドと接触される。結合し、洗浄して非特異的結合免疫複合体を除去した後、結合標識化ペプトイドが検出される。
【０１８６】
用いられる形態に関係なく、ＥＬＩＳＡは、ある特徴を、例えばコーティングすること、インキュベートし、結合すること、洗浄して非特異的結合種を除去すること、そして結合免疫複合体を検出することを同様に有する。ペプトイドの簡単且つ検出可能な化学的性質のため、それらは、特定の化学反応により支持体に結合され得る。
【０１８７】
「免疫複合体形成を可能にするのに有効な条件下」は、当該条件が、好ましくは、Ｔ細胞または自己抗体を、ＢＳＡ、ウシγグロブリン（ＢＧＧ）またはリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／トゥイーンのような溶液で希釈することを包含する、ということを意味する。これらの付加剤は、非特異的バックグラウンドの低減を手助けする傾向もある。「適切な条件」は、さらにまた、インキュベーションが、有効な結合を可能にするのに十分な温度または時間で実施されることを意味する。インキュベーションステップは、典型的には、約１〜２〜４時間で、好ましくは２５℃〜２７℃台の温度であり、または約４℃で一晩であり得る。
【０１８８】
ＥＬＩＳＡにおけるすべてのインキュベーションステップ後、接触表面は選択されて、非複合物質が除去される。好ましい洗浄手順は、ＰＢＳ／トゥイーンまたはホウ酸塩緩衝液のような溶液で洗浄することを包含する。試験試料と元々結合されていた物質との間の特定の免疫複合体の形成、そしてその後の洗浄後、等しく微量の免疫複合体の生成が確定され得る。
【０１８９】
検出は、適切な色原性物質とのインキュベーション時に発色する酵素を利用し得る。したがって、例えば、免疫複合体の発現に好都合な時間および条件下で（例えば、ＰＢＳ−トゥイーンのようなＰＢＳ含有溶液中で室温で２時間のインキュベーション）、免疫複合体をウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたは水素ペルオキシダーゼ共役抗体またはペプトイドと接触させるかまたは一緒にインキュベートすることを望む。
【０１９０】
標識化抗体またはペプトイドとインキュベートし、その後、洗浄して非結合物質を除去した後、例えば、尿素、またはブロモクレゾールパープル、または２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン）−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）、またはＨ２Ｏ２（酵素標識としてペルオキシダーゼの場合）のような色原性物質とともにインキュベートすることにより、標識の量が定量される。定量は、その場合、例えば可視スペクトル分光光度計を用いて、生じた色の程度を測定することにより達成される。
Ｂ．  量子ドット
【０１９１】
自己免疫疾患を処置するための抗原代用物の使用と、自己免疫疾患に関連したＴ細胞またはＢ細胞を除去する方法の使用との組合せに関連して、本発明は、本発明のある態様において細胞集団を標識するために量子ドットを有益に使用する。量子ドットは、その励起子が、３つの空間次元のすべてにおいて限定される半導体である。その結果、それらは、バルク半導体の特性と別個の分子の特性との間にある特性を有する。それらは、その後ベル研究所にいたLouis E. Brusにより発見された。研究者達は、トランジスター、太陽電池、ＬＥＤおよびダイオードレーザーで量子ドットを試験した。彼等は、医療用画像処理のための作用物質としての量子ドットも発明し、それらをクビットとして用いることを希望している。
【０１９２】
量子ドットを製造するにはいくつかの方法がある。概して、量子ワイヤ、ウェルおよびドットは、化学的方法により産生されるナノ結晶における、または最先端のリソグラフ技術により製造されるナノデバイスにおけるエピタクシー技術の進歩により、発展している。
【０１９３】
コロイド半導体ナノ結晶は、伝統的化学製法と同様に、溶液中に溶解された前駆体化合物から合成される。コロイド量子ドットの合成は、前駆体、有機界面活性剤および溶媒からなる３成分系を基礎にしている。反応媒質を十分に高い温度に加熱すると、前駆体は化学的にモノマーに転化する。一旦モノマーが十分な高レベル過飽和に達したら、ナノ結晶成長が核形成過程に伴って開始する。成長過程中の温度は、ナノ結晶成長に関する最適条件を決定するに際しての重要な因子の１つである。それは、合成過程中の原子の再配列およびアニーリングを可能にするのに十分に高くなければならないが、一方、結晶成長を促進するのに十分に低くなければならない。ナノ結晶成長中に厳しく制御されるべき別の重要因子は、モノマー濃度である。ナノ結晶の成長過程は、２つの異なる状況、すなわち「集中」と「脱集中」で起こり得る。高モノマー濃度では、臨界サイズ（ナノ結晶が成長も収縮もしないサイズ）は相対的に小さく、ほぼすべての粒子の成長を生じる。この状況では、小さい方の粒子は大きいものより速く成長し（大きい結晶は小さい結晶より成長するためにより多くの原子を必要とするため）、サイズ分布の「集中」を生じて、ほぼ単分散性の粒子を産生する。存在する平均ナノ結晶サイズが常に臨界サイズよりわずかに大きいようモノマー濃度が保持される場合、サイズ集中は最適である。モノマー濃度が成長中に激減される場合、臨界サイズは存在する平均サイズより大きくなり、そして分布は、オストワルド熟成の結果として「脱集中する」。
【０１９４】
セレン化カドミウム、硫化カドミウム、ヒ化インジウムおよびリン化インジウムを含めて、多数の異なる半導体を産生するためのコロイド法がある。これらの量子ドットは、１００〜１００，０００個という少ない原子を量子ドット容積内に含有し、直径は１０〜５０原子である。これは、約２〜１０ナノメートルに対応し、そして直径１０ｎｍでは、ほぼ３００万量子ドットが、末端と末端を接して整列されて、ヒトの親指の幅以内にはめ込まれる。
【０１９５】
大量の量子ドットが、コロイド合成により合成され得る。コロイド合成は明らかに安価で、卓上式条件で生じ得るという利点を有する。それは、合成の種々の形態すべてのうち最小毒性であることが認められている。
【０１９６】
自己組織化量子ドットは、典型的には、１０〜５０ｎｍのサイズである。リソグラフ的にパターン化されたゲート電極により、または半導体ヘテロ構造中の二次元電子ガス上のエッチングにより限定される量子ドットは、１００ｎｍを超える横方向寸法を有し得る。
【０１９７】
いくつかの量子ドットは、より大きな帯域ギャップを有する別の物質に埋められたある物質の小領域である。これらは、いわゆるコア−外殻構造で、例えばコア中にＣｄＳｅおよび外殻中にＺｎＳを有し、あるいはormosilと呼ばれる特別な形態のシリカからである。
【０１９８】
量子ドットは、井戸の厚みでの単層波動のため、時として量子井戸構造で自発的に生じる。
【０１９９】
それが格子整合されない基板上で物質が増殖される場合、自己組織化量子ドットは、分子線エピタキシー（ＭＢＥ）および有機金属気相エピタキシー（ＭＯＶＰＥ）中にある条件下で自発的に核となる。その結果生じる歪みが、二次元「湿潤層」の上部に粘着歪みを生じた島を作る。島は、その後、埋められて量子ドットを形成する。この加工方法は、量子暗号（すなわち単一光子源）および量子計算における適用のための潜在的能力を有する。この方法の主な限界は、加工経費と、個々のドットの位置決定全体の制御の欠如である。
【０２００】
個々の量子ドットは、遠隔ドープ量子井戸または横方向量子ドットと呼ばれる半導体へテロ構造中に存在する二次元電子またはホールガスから作られ得る。試料表面は、レジストの薄層で被覆される。横方向パターンは次に、電子線リソグラフィーによりレジストにおいて限定される。次いで、エッチングにより、または電子ガスと電極との間の外部電圧の適用を可能にする金属電極を蒸着する（リフトオフ法）ことにより、このパターンは、電子またはホールガスに移され得る。このような量子ドットは、主に、電子またはホール輸送、すなわち電流を伴う実験および適用に関して興味の的である。
【０２０１】
量子ドットのエネルギースペクトルは、幾何学的サイズ、形状および閉じ込め電位の強度を制御することにより工学処理され得る。さらにまた、原子に対比して、トンネルバリアにより量子ドットを伝導リードに接続することは相対的に容易であり、これが、それらの研究のためのトンネル分光法の技術の適用を可能にする。量子ドットにおける閉じ込めは、静電位からも生じる（外部電極、ドーピング、歪みまたは不純物により生成される）。
【０２０２】
量子ドットの高次アレイも、電気化学的技法により自己組織化され得る。電解質−金属界面でイオン反応を引き起こすことにより鋳型が作られ、これが、金属上に量子ドットを含むナノ構造の自発的集合を生じ、これは次に、選定基板上のこれらのナノ構造をメサ形エッチングするためのマスクとして用いられる。
【０２０３】
慣用的小規模量子ドット製造は、「高温デュアルインジェクション」と呼ばれる製法に頼っており、これは、大量の量子ドットを要する大半の商業的用途のためには実用的でない。大量の一貫した高品質量子ドットを作成するための再生産可能な方法は、分子クラスターの完全性が保持され、前加工シード鋳型として作用する条件下での分子クラスター化合物の存在下で、化学的前駆体からナノ粒子を生成することを包含する。クラスター化合物の個々の分子は、ナノ粒子成長が開始され得るシードまたは核生成点として作用する。この方法では、適切な核生成部位は分子クラスターにより当該系中に既に提供されているため、高温核生成ステップはナノ粒子成長を開始する必要がない。この方法の有意の利点は、それが高拡張性であるという点である。
【０２０４】
現代の生物学的分析では、種々の種類の有機染料が用いられる。しかしながら、毎年、さらなる柔軟性がこれらの染料に要求されるようになっており、伝統的染料は期待にこたえられないことがしばしばある。この目的のために、量子ドットは、いくつかの論点に関して伝統的有機染料より優れていることが判明している役割を手早く充填しているが、最も直ちに明らかなものの１つは、明るさ（高量子収率のため）ならびにその安定性（光漂白を非常に低くする）である。量子ドットは、伝統的蛍光レポーターより２０倍明るく、１００倍以上安定している、と見積もられている。単一粒子追跡に関して、量子ドットの不規則明滅は小さな欠点である。
【０２０５】
高感受性細胞画像処理のための量子ドットの使用は、過去１０年に亘って大きな進歩を示している。例えば量子ドットの光安定性改良は、高分解能三次元画像に再構築され得る多数の連続焦点面画像の獲得を可能にする。量子ドットプローブの並外れた光安定性を利用する別の用途は、長時間に亘る分子および細胞の実時間追跡である。４ヶ月以上の間、マウスのリンパ節における量子ドットを、研究者は観察することができた。
【０２０６】
半導体量子ドットは、前標識化細胞のin vitro画像処理のためにも用いられている。実時間で単一細胞移動を画像処理する能力は、いくつかの研究領域、例えば胚発生、癌転移、幹細胞治療法およびリンパ球免疫学に重要であると予測される。
Ｃ．  検出キット
【０２０７】
さらなる実施形態では、本発明は、上記の併用方法とともに用いるための検出キットに関する。本発明によるペプトイドまたは環状ペプトイドまたはその他のリガンドが、キットに包含される。したがってキットは、適切な容器手段中に、自己抗体を結合するかまたは自己抗体および自己反応性Ｔ細胞を結合し、任意に検出試薬および／または支持体に連結される１つ以上のリガンド（ペプトイド）を含む。キットは、好ましくは、このような自己免疫疾患に関連した自己抗体と結合するリガンドを含む。したがって本発明は、２つの別個のスクリーニング方法（その１つは量子ドットまたは他の同様の手段を用いて、Ｔ細胞または自己抗体の産生に関連する他の細胞に対する高親和性リガンドを見出す方法；他方、このような自己免疫性障害に関連した自己抗体（単数または複数）に対する抗原代用物として作用する高親和性リガンドを用いる方法）により見出される２つの別個のリガンドを用いるキットに関する。この場合、薬剤も診断剤として用いられる。
【０２０８】
ペプトイドまたは他のリガンドが固体支持体と前結合されるある実施形態では、支持体が提供され、例としてはカラムマトリックス、ビーズ、スティックまたは微量プレートのウェルが挙げられる。キットの免疫検出試薬は、所定のペプトイドまたは抗体と会合されるかまたは連結される検出可能な標識を含めて、種々の形態のうちのいずれか１つをとり得る。この場合の例示的抗体は、Ｔ細胞受容体上の表面抗原に関して結合親和性を有する者である。
【０２０９】
キットの容器手段は、一般的に、その中にペプトイドが入れられ得るか、好ましくは適切にアリコート化される、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器またはその他の容器手段を包含する。本発明のキットは、典型的には、ペプトイド、抗体を含入するための手段、ならびに商業的販売のためにきっちり密閉する任意のその他の試薬容器も包含する。このような容器は、その中に所望のバイアルが保持される射出または吹き込み成形プラスチック容器を包含し得る。
環状ペプトイド
【０２１０】
本発明人等は、基板の外表面に同時に環状分子／線状分子を合成するために用いられ得る戦略を発見した。さらに、記載される方法は、マイクロアレイ上の表示のための環状ペプトイドライブラリーの作成に適している。これらのアレイは、疾患特異的抗体と結合するペプトイドの発見のために、ならびにその他の目的のために有用である。当該方法は、一般的に、付着残基（例えば、Ｆｍｏｃ保護化Ｃｙｓ）および開始ペプトイド残基（例えば，ｉｖＤｄｅ保護化ベータアラニン残基）を含む溶液でペプトイドプライムＲｉｎｋアミドビーズを処置することを伴う。保護基は、残基のアミンを保護し、除去されて、環状および線状分子の同時合成を可能にする。付着残基は、アレイ基板（例えばマレイミド活性化顕微鏡スライド）に分子を添付するかまたは固定するために後のステップで用いられる官能基化または活性化アレイ基板（例えばシステインのチオール基）とカップリングされ得る反応器を提供する。したがって、線状化合物をほとんどまたは全く有さない純粋に環状の分子のアレイを作成するために、環化ペプトイドだけが付着残基を含有する。
【０２１１】
ペプトイドを環化するために、環化残基は、末端ペプトイド残基とカップリングして環状ペプトイドを形成し得る側鎖を含む（例えばグルタミン酸またはアスパラギン酸）。対応する線状ペプトイド鎖は、環化残基を有さない。保護基の除去後、両鎖はペプトイド鎖の合成または重合のための部位として役立つ。これらの方法は、Pei手法において必要であるような、ライブラリー構築の各ステップでの２つの合成操作を実行する必要を排除する。一旦線状ペプトイドが合成されれば、ビーズ（単数または複数）は、ペプトイドライブラリーのＮ末端窒素を有する環化残基の側鎖基のカップリングを促進する条件に曝露される。線状ペプトイド鎖は環化残基を欠くため、それは環化しない。
【０２１２】
本発明の一態様は、１ビーズ−１化合物ライブラリーをスクリーニング後のヒットの配列を確定する能力である。環状ペプチドまたはペプトイドは遊離Ｎ末端を欠くため、エドマン・シーケンシングは用いられ得ない。さらに、ペプトイドは、ペプチドと同様に、タンデム質量分光分析（Paulick et al., 2006）によりシーケンシングされ得るが、しかし環状分子は多数の位置で断片で、ＭＳ／ＭＳスペクトルの解釈を非常に難しくする。この問題は、合成環状ペプチドライブラリーの開発を制限してきた。各ビーズが、同一ペプチド配列を含有する線状および環状分子の両方を含有する「２化合物−１ビーズ」アプローチを開発することにより、近年、Peiと共同研究者等はこの問題を検討した（Joo et al., 2006）。言い換えれば、線状分子は環状分子をコードする。これは、示差的保護化カルボン酸側鎖を有するグルタミン酸残基が付着される２つの異なるドメイン（内部および表面曝露）にビーズを分けるために異なる溶媒が用いられるLam（Liu et al., 2001）の戦略を用いて成し遂げられた。次に、同一ペプチド鎖は、内部および外部Ｇｌｕ残基の両方から伸長された。最後に、表面曝露Ｇｌｕ側鎖だけが脱保護化されて、ペプチドの末端アミノ基でそれらを環化させた。内部層中のペプチドは依然として線状のままで、したがってコード鎖として役立った。
【０２１３】
本発明の実施形態は、タンパク質フィンガープリントおよびライブラリースクリーニングのための有用なプラットホームであるマイクロアレイの作成のために仕立てられる別個の１ビーズ−２化合物戦略に関する（MacBeath et al., 1999; Uttamchandani et al., 2005）。当該方法は、その両方が当該ペプトイドを含有するが、その一方だけが環化を支持するための環化残基ならびに環状ペプトイド分子のみと活性化または官能基化基板との特異的共役を可能にする付着残基の両方を含有する２つの鎖を作成するために示差的脱保護化を用いる（Reddy and Kodadek, 2005）（図１）。線状分子は基板とカップリングしないが、しかしタンデムＭＳベースのシーケンシングを支持するために存在する。
環状ペプトイドライブラリーおよびアレイ
【０２１４】
一例において、７：１の比のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨおよびｉｖＤｄｅ−β−Ａｌａ−ＯＨをβ−Ａｌａ−プライムＲｉｎｋアミド残基に付加した。この比率は、単一ビーズからのタンデムＭＳシーケンシングのために十分な線状ペプトイドを提供するために経験的に最適化したが、しかし、できるだけ多くの環状ペプトイドも生成する。Ｆｍｏｃの選択的脱保護化後、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨを再びＣｙｓに付着し、その後、このＦｍｏｃを除去した後に、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−２−ＰｈｉＰｒ）−ＯＨを付加した。この時点で、ＦｍｏｃおよびｉｖＤｄｅ保護基の両方を除去し、両鎖上でペプトイド合成を実行した。ペプトイド残基、例えばメチルアミン（Ｎａｌａ）、アリルアミン（Ｎａｌｌ）、イソブチルアミン（Ｎｌｅｕ）、２−メトキシエチルアミン（Ｎｍｅａ）、エタノールアミン（Ｎｈｓｅ）、ピペロニルアミン（Ｎｐｉｐ）、フルフリルアミン（Ｎｆｆａ）、ベンジルアミン（Ｎｐｈｅ）および１，４−ジアミノブタン（Ｎｌｙｓ）を、慣用的サブモノマー化学を用いて組入れた。ペプトイドは、マイクロ波（１０００  Ｗ）支援合成プロトコールを用いて合成され得る。ビーズは、ペプトイド合成反応容器中に等しく分布され、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で膨潤され、そして各反応容器は２Ｍブロモ酢酸および３．２Ｍジ−イソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）で処理される。カップリングは、電子レンジ中で実施され得る。ビーズをＤＭＦで洗浄後、各容器は、マイクロ波中でカップリングされ得る別個の第一級アミンで処理され得る。ビーズは洗浄され、プールされ、無作為化されて、ペプチド合成容器中に等しく再分布され、そして所望の長さが達成されるまで、当該手順が反復され得る。
【０２１５】
次に、Ｇｌｕ側鎖上の２−ＰｈｉＰｒ保護基が、１％ＴＦＡで選択的に除去される。最後に、Kirshenbaumと共同研究者等の方法を用いて、大環状化が実行される（ＰｙＢＯＰ（３当量）、ＨＯＢｔ（３当量）およびＤＩＰＥＡ（１０当量）(Shin et al., 2007)）。線状分子は環状分子中に存在する２つの残基を欠いており、したがって各々から得られる質量ピークは容易に区別され、分析および配列決定を助長し得る、ということに留意されたい。
【０２１６】
この手法の有効性を確定するために、個々のビーズを分離し、酸で処理して、ビーズから分子を切断し、その後、ＨＰＬＣ、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ分析を施した。ほとんどすべての場合において、特定のビーズ上のペプトイドの配列は、線状分子のタンデムＭＳ分析により容易に決定され得る、ということを本発明人等は見出した。分子のいくつかに関しては、質量分光法およびＨＰＬＣ分析は、線状出発物質が明瞭に検出可能であるので、Ｃｙｓ−Ｇｌｕ含有分子の環化は明らかに不完全である、ということを示した。これは意外ではなかったが、それは、環状ライブラリーの作成における一般的問題が、すべての配列が等価効率で環化されるというわけではないためであった（Marthandan et al., 2005）。Ｎ末端残基の性質は環化に最大作用を及ぼす、と推測される。実際、ＭＳ／ＭＳによる５０より多くのペプトイドの分析は、Ｎ末端残基がＮｍｅａである場合、環化収率はほとんど定量的である、ということを明示した。したがって、好ましい末端残基のうちの１つはＮｍｅａである。
【０２１７】
多数の環状ペプトイドが作られ得るが、この場合、結合標的を用いて環状ペプトイドのこの領域の「適合」を改良するよう努力して、残基の側鎖における適度の変更が導入され得る。環状ペプトイドの変異体は、疾患または症状に対するin vivo検定またはin vitro検定での活性に関して査定され得る。
【０２１８】
環状ペプトイドの変異体または類似体も用いられ得る、ということが本発明において意図される。配列変異体は、同定環状ペプトイドにおいて保存的置換を成すことにより生成され得る。置換変異体は典型的には、分子内の１つ以上の部位でのあるペプチド残基の別のものへの交換を含有し、そして他の機能または特性の損失を伴わずに、分子の１つ以上の特性、特に標的に関する分子の親和性を変調するよう意図され得る。
【０２１９】
ペプトイドは、修飾化非天然および／または普通でないアミノ酸を用い得る。化学合成は、このような残基を当該化合物中に組入れるために用いられ得る。非天然残基としては、例えばＡａｄ（２−アミノアジピン酸）、ＥｔＡｓｎ（Ｎ−エチルアスパラギン）、Ｂａａｄ（３−アミノアジピン酸）、Ｈｙｌ（ヒドロキシリシン）、Ｂａｌａ（ベータ−アラニン）、Ａｈｙｌ（アロ−ヒドロキシリシンプロピオン酸）、Ａｂｕ（２−アミノ酪酸）、３Ｈｙｐ（３−ヒドロキシプロリン）、４Ａｂｕ（４−アミノ酪酸）、４Ｈｙｐ（４−ヒドロキシプロリンピペリジン酸）、Ａｃｐ（６−アミノカプロン酸）、Ｉｄｅ（イソデスモシン）、Ａｈｅ（２−アミノヘプタン酸）、Ａｉｌｅ（アロ−イソロイシン）、Ａｉｂ（２−アミノイソ酪酸）、ＭｅＧｌｙ（Ｎ−メチルグリシン）、Ｂａｉｂ（３−アミノイソ酪酸）、Ｍｅｌｌｅ（Ｎ−エチルイソロイシン）、Ａｐｍ（２−アミノピメリン酸）、ＭｅＬｙｓ（６−Ｎ−メチルリシン）、Ｄｂｕ（２，４−ジアミノ酪酸）、ｅＶａｌ（Ｎ−エチルバリン）、Ｄｅｓ（デスモシン）、Ｎｖａ（ノルバリン）、Ｄｐｍ（２，２’−ジアミノピメリン酸）、Ｎｌｅ（ノルロイシン）、Ｄｐｒ（２，３−ジアミノプロピオン酸）、Ｏｒｎ（オルニチン）およびＥｔＧｌｙ（Ｎ−エチルグリシン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２０】
上記の変異体のほかに、本発明は、本発明のペプトイドの重要部分を模倣するために、構造的に類似する化合物が処方され得る、ということも意図する。このようなペプトイド化合物は、ペプチドと同様に用いられ得るし、その機能的等価物であり得る。タンパク質二次および三次構造の素子を模倣するある模倣物は、Johnson et al. (1993)に記載されている。ペプチド模倣物の使用の背後にある根元的論理的根拠は、タンパク質のペプチド主鎖は主に分子相互作用を助長するようにアミノ酸側鎖を配向するために存在する、ということである。一態様では、ペプトイドはしたがって、天然分子と同様の分子相互作用を可能にするよう設計される。
【０２２１】
ペプトイドまたは環状ペプトイド中のアミン窒素上のＲ基は、本明細書中に一般的にまたは具体的に記載されるような任意のＲ基であり得る、ということが意図される。ペプトイドまたは環状ペプトイドは、例えば、米国特許出願第１０／１９０，３０８号（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）で提供されるようなペプトイド鎖に沿って置換基を有し得る。
【０２２２】
「付着する」または「付着される」という用語は、本明細書中で用いる場合、２つ以上の構成成分を一緒に保持するために、結合、連結、力または結びにより連結されるかまたは１つにされることを指し、これは、例えば第一分子が第二分子または物質と直接的に結合される場合、そして１つ以上の中間分子が第一分子と第二分子または物質との間に配置される実施形態のような直接または間接的付着を包含する。
【０２２３】
「保護基」は、分子と結合され、分子中の一反応性部位を遮断するよう意図される部分であるが、しかし活性剤または脱保護試薬への選択的曝露時に空間的に除去され得る。保護基のいくつかの例は、文献中で既知である。特定の合成のための保護基（保護性基としても既知である）の適正な選択は、合成に用いられる全体的方法に支配される。活性剤としては、例えば電磁放射線、イオンビーム、電場、磁場、電子ビーム、Ｘ線等が挙げられる。脱保護試薬としては、例えば酸、塩基またはフリーラジカルが挙げられる。保護基は、モノマー、リンカー分子または予め生成された分子と結合して、モノマー、リンカー分子または予備生成分子上の反応性官能基を保護する物質であるが、これは電気化学的に生成された試薬のような活性剤への選択的曝露時に除去され得る。本発明の一実施形態に従って用いられ得る保護基は、好ましくはすべての酸および塩基不安定性保護基を包含する。例えばアミン基は、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）またはベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）（これは両方とも酸不安定性である）により、あるいは９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）（これは塩基不安定性である）により、保護され得る。付加的には、ホスホルアミダイト上のヒドロキシル基は、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）（これは酸不安定性である）により保護され得る。
【０２２４】
任意の非反応化脱保護化化学的官能基は、合成反応中に任意の点でキャッピングされて、このような分子でのさらなる結合を回避するかまたは防止し得る。基のキャッピング「ｃａｐ」は、例えば非反応化アミノ官能基と結合することにより官能基を脱保護化して、アミドを形成する。本発明の一実施形態で用いるのに適したキャッピング剤としては、無水酢酸、ｎ−アセチルイミジゾール、イソプロペニルフォルメート、フルオレスカミン、無水３−ニトロフタル酸および無水３−スルホプロピオン酸が挙げられる。
【０２２５】
本発明の一実施形態に従って用いられ得る付加的保護基としては、アミノ部分を保護するための酸不安定性基：ｔｅｒｔ‐ブチルオキシカルボニル、−ｔｅｒｔ−アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、１−メチルシクロブチルオキシカルボニル、２−（ｐ−ビフェニル）プロピル（２）オキシカルボニル、２−（ｐ−フェニルアゾフェニリル）プロピル（２）オキシカルボニル、アルファ、アルファ−ジメチル−３，５−ジメチルオキシベンジルオキシ−カルボニル、２−フェニルプロピル（２）オキシカルボニル、４−メチルオキシベンジルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、フルフリルオキシカルボニル、トリフェニルメチル（トリチル）、ｐ−トルエンスルフェニルアミノカルボニル、ジメチルホスフィノチオイル、ジフェニルホスフィノチオイル、２−ベンゾイル−ｌ−メチルビニル、ｏ−ニトロフェニルスルフェニルおよび１−ナフチリデン；アミノ部分を保護するための塩基不安定性基として：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、メチルスルホニルエチルオキシカルボニルおよび５−ベンズイソアゾリルメチレンオキシカルボニル；還元された場合に不安定であるアミノ部分を保護するための基として：ジチアスクシノイル、ｐ−トルエンスルホニルおよびピペリジノ−オキシカルボニル；酸化された場合に不安定であるアミノ部分を保護するための基として：（エチルチオ）カルボニル；多種多様な試薬に対して不安定であるアミノ部分を保護するための基として、適切な作用物質を、基の後の括弧内に列挙する：フタロイル（ヒドラジン）、トリフルオロアセチル（ピペリジン）およびクロロアセチル（２−アミノチオフェノール）；カルボン酸を保護するための酸不安定性基：ｔｅｒｔ−ブチルエステル；ヒドロキシル基を保護するための酸不安定性基：ジメチルトリチル；ならびにホスホトリエステル基を保護するための塩基不安定基：シアノエチルが挙げられる。
ペプトイドの精製
【０２２６】
ペプトイドを精製することが望ましいことがある。精製技法は、当業者に周知である。これらの技法は、典型的には、部分的なまたは完全な精製（または均質にするための精製）を達成するためにクロマトグラフィーおよび電気泳動技法を伴う。純ペプトイドの調製に特に適している分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；等電点電気泳動である。ペプトイドの精製の特に効率的な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィーであり、ＨＰＬＣであることさえある。
【０２２７】
本発明のある態様はペプトイドの精製に関するが、特定の実施形態では、ペプトイドの実質的精製に関する。「精製ペプトイド」という用語は、本明細書中で用いる場合、他の構成成分から単離可能な組成物を指すよう意図され、この場合、ペプトイドはその普通に得られる状態に比して任意の程度に精製される。したがって精製ペプトイドは、それが普通に生じ得る環境から遊離したペプトイドも指す。
【０２２８】
一般的に、「精製される」とは、種々の他の構成成分を除去するために分別に付されたペプトイド組成物を指し、この組成物は、その示された生物学的活性を実質的に保持する。「実質的に精製される」という用語が用いられる場合、この言い方は、その中のペプトイドが組成物の主要成分を構成し、例えば組成物の約５０重量％、約６０重量％、約７０重量％、約８０重量％、約９０重量％、約９５重量％またはそれ以上を構成する組成物を指す。
【０２２９】
ペプトイドの精製の程度を定量するための種々の方法は、本発明の開示にかんがみて、当業者に既知であろう。これらの例としては、例えば活性分画の比活性を確定すること、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析により分画内のペプトイドの量を査定することが挙げられる。分画の純度を査定するための好ましい方法は、分画の比活性を算定すること、それを初期抽出物の比活性と比較すること、したがって純度の程度を算定すること（本明細書中では「＿倍精製数」により査定される）である。活性の量を表すために用いられる実際の単位は、もちろん、精製を追跡するために選択される特定の検定技法によって、そしてペプトイドが検出可能な活性を示すか否かによって決まる。
ペプトイドアレイ
【０２３０】
「基板」という用語は、本明細書中で用いる場合、その上で処理が実行されて、基材の表面で分子を修飾するかまたは合成する基材、あるいはその上で分子のアレイが付着されて、スクリーニング方法に用いられる基材（アレイ基板）を示す。基板の例示的化学修飾としては、官能基化および／または本発明のペプトイドまたはこのようなペプトイドの開始剤と化学的にカップリングし得る基材の表面層上にペプトイドまたは開始剤残基またはペプトイドの基剤を沈着することを包含する。
【０２３１】
本発明の実施形態において有用な支持物質としては、例えばケイ素、生体適合性ポリマー、例えばポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）およびポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ガラス、ＳｉＯ２（例えば熱酸化物シリコンウエハー、例えば半導体産業により用いられるもの）、クオーツ、窒化ケイ素、機能性ガラス、金、プラチナおよびアルミニウムが挙げられる。官能基化表面としては、例えばアミノ官能基化ガラス、カルボキシ官能基化ガラス、ヒドロキシ官能基化ガラスおよびアミド官能基化ビーズが挙げられる。付加的には、支持体は、１つ以上のそうで被覆されて、分子付着または官能基化、反応性増大または低減、結合検出、あるいはその他の特殊用途のための表面を提供する。支持体物質および／または層（単数または複数）は、多孔質または非多孔質であり得る。例えば支持体は、多孔質ケイ素で構成され得る。さらに、支持体は、シリコンウエハーまたはチップ、例えば半導体デバイス加工産業に用いられるものであり得る。当業者は、適切な支持体物質を選択する方法を知っている。
【０２３２】
「官能基化」という用語は、本明細書中で用いる場合、基板表面に複数の官能基を提供するための固体基板の修飾に関する。「官能基化表面」とは、本明細書中で用いる場合、複数の官能基がその上に存在するよう修飾されている基板表面を意味する。「官能基」という用語は、本明細書中で用いる場合、その構造の特徴的化学反応に関与する分子構造内の原始の特定の基を示す。例示的官能基としては、炭化水素、ハロゲンを含有する基、酸素を含有する基、窒素を含有する基、ならびにリンおよびイオウを含有する基（すべて、当業者が同定可能である）が挙げられる。
【０２３３】
アレイ上に存在するペプトイドは、アレイと共有結合されるかまたは非共有結合され、そして切断可能リンカーによりアレイ支持体（例えば、ケイ素またはその他の相対的に平らな物質）に付着され得る。リンカー分子は、支持体と、合成されているペプトイドとの間に挿入される分子であり得るし、リンカー分子は、必ずしも官能基をその結果生じるペプチドに運搬しない（例えば、分子認識官能基）が、しかし代わりに、支持体表面とペプトイド官能基との間の距離を引き伸ばして、支持体の表面のペプトイド官能基の曝露を増強する。好ましくは、リンカーは、約４〜約４０原子長であるべきである。リンカー分子は、特に、例えば、２〜１０モノマー単位（ＰＥＧ）を含有するアリールアセチレン、エチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二酸、アミノ酸、およびその組合せであり得る。ジアミンの例としては、エチレンジアミンおよびジアミノプロパンが挙げられる。代替的には、リンカーは、ペプトイドのような合成されているものと同じ分子型であり得る。適切なリンカーの設計方法を、当業者は既知である。
【０２３４】
基板は、典型的には、化学的に修飾されて、１つ以上の官能基を付着する。「付着する」または「付着される」という用語は、本明細書中で用いる場合、２つ以上の構成成分を一緒に保持するために、結合、連結、力または結びにより連結されるかまたは１つにされることを指し、これは、例えば第一化合物が第二化合物または物質と直接的に結合される場合、そして１つ以上の中間化合物、特に分子が第一化合物と第二化合物または物質との間に配置される実施形態のような直接または間接的付着を包含する。
【０２３５】
特に、ポリマーアレイでは、ポリマーアレイを形成する選り抜きのポリマーと反応し得る選定官能基は、それらが表面に提示されるよう、官能基化基板表面に付着される。「提示する」という用語は、化合物または官能基に関して本明細書中で用いる場合、付着される場合に化合物または官能基の化学的反応性を保持するために実施される付着を意味する。したがって、表面に提示される官能基は、適切な条件下で、官能基を化学的に特性化する１つ以上の化学反応を実施し得る。
【０２３６】
同一表面に固定される２つより多いフィーチャーをアレイが含む実施形態では、アレイはアドレス可能な、と言及され得る。アレイ上の特定の予定位置（例えば「アドレス」）での領域（例えばアレイの「フィーチャー」または「スポット」）が特定の標的または標的のクラスを検出する（しかし一フィーチャーは、そのフィーチャーを有する非標的を付随的に検出し得る）よう、異なる部分（例えば異なるペプトイド）の多数の領域を有する場合、アレイは「アドレス可能」である。アレイフィーチャーは、典型的には、介入空間に織分離されるが、しかしそうされる必要はない。アレイの場合、「標的」は、種々の領域で基板と結合されるプローブ（「標的プローブ」）により検出されるべき移動相（典型的には流体）中の部分として言及される。しかしながら、「標的」または「プローブ」のどちらかは、他方により評価されるべきものであり得る（したがって、どちらか一方は、他方との結合により評価されるべき分析物、例えば抗体の未知の混合物であり得る）。
【０２３７】
一態様では、本発明は、高密度アレイの精製のための、「小分子プリンティング」として本明細書中で言及される方法、ならびにその結果生じる組成物を提供するが、この場合、小分子は、活性化基板上の化学基と相互作用する化学的部分を用いて、固体支持体に付着される。
【０２３８】
本発明のある態様は、環状ペプトイドのコレクションが支持体上に「プリントされ」て、高密度アレイを生成する方法を包含する。概して、この方法は、（１）固体支持体を提供すること（この場合、固体支持体は、化合物または化合物のコレクションの所望の化学基と相互作用し得る部分で官能基化されて、アレイ付着（単数または複数）を形成する）；（２）固体支持体に付着されるべき同一のまたは異なる環状ペプトイドの１つ以上の溶液を提供すること；（３）同一のまたは異なる環状ペプトイドの１つ以上の溶液を固体支持体に送達すること；ならびに（４）支持体上に環状ペプトイドを捕捉すること（それにより化合物のアレイが生成される）を包含する。
【０２３９】
当業者が理解するように、固体支持体と付着を形成し得る任意の所望の化学化合物が利用され得るが、しかし、スプリット−アンド−プール・ライブラリーまたは平行合成から生成されるそれらのペプトイドが利用される、というのが好ましい。当業者に理解されるように、スプリット−アンド−プール・ライブラリーは、化合物のより効率的な生成およびスクリーニングを可能にする。しかしながら、平行合成法により、ならびに伝統的方法により合成されるペプトイド分子も、本発明の組成物および方法に利用され得る。
【０２４０】
上記のように、平行合成方法の使用も適用可能である。平行合成技法は、伝統的に、それら自体の反応容器中に生成物の別個のアセンブリーを包含する。例えば、反応が起こり得る小容積の溶媒を保持し得る微小ウェルのｎ個の横列およびｍ個の縦の列を含有する微量滴定プレートが、利用され得る。したがって、反応体タイプＡのｎ個の変異体は、反応体タイプＢのｍ個の変異体と反応して、ｎ×ｍ個の化合物を生成し得る。
【０２４１】
その後、一旦所望の化合物が適切な方法を用いて提供されれば、所望の化合物の溶液が調製される。ある態様では、化合物は固体支持体上に合成され、その結果生じる合成ビーズは、その後、１個のビーズ／ウェルの密度で、ポリプロピレン微量滴定プレート中に分配される。典型的には、付着化合物は、次に、それらのビーズから放出されて、小容積の適切な溶媒中に溶解される。特定の一実施形態では、各ウェルから小容積の溶解化合物を拾い集めて、一連の官能基化ガラス基板上の限定位置に適切な容積の溶液を繰り返し送達するために、高精密転写アレイロボット（Schena et al., 1995; Shalon et al., 1996）（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）が用いられ得る。これが、アレイ基板上に化合物の顕微鏡的スポットを形成する。高精密アレイロボット（例えば、ＯｍｎｉＧｒｉｄ（登録商標）１００マイクロアレイ（Genomic Solutions））のほかに、化合物を送達するための他の手段、例えばインクジェットプリンター、圧電式プリンターおよび小容積ピペッティングロボット（これらに限定されない）が用いられ得る。
【０２４２】
各勘定ペプトイドは、支持表面への付着を媒介する共通の官能基を含有し得る。形成される付着は、強固な、例えば共有エステル、チオエステルまたはアミド結合である、というのが好ましい。連結の強固さに加えて、その他の考慮すべきこととしては、利用されるべき固体支持体、ならびに支持体に付着されるべき特定クラスの化合物が挙げられる。支持体としては、スライドグラス、ポリマー支持体またはその他の固体物質支持体、および可撓性膜支持体が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の実施形態で用いるのに適した支持体の例は、米国特許第５，６１７，０６０号およびＰＣＴ公告ＷＯ９８／５９３６０（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
【０２４３】
別の実施形態では、化合物は、イソチアネートまたはイソチオシアネートのような求電子種へのアレイされている化合物の官能基の求核性付加により付着さえる。イソシアネートまたはイソチオシアネートへの付加に際して有用であることが判明した官能基としては、第一級アルコール、第二級アルコール、フェノール、チオール、アニリン、ヒドロキサム酸、脂肪族アミン、第一級アミドおよびスルホンアミドが挙げられる。ある実施形態では、求核性付加反応は、ピリジンのような蒸気により触媒される。他の揮発性求核性試薬も、用いられ得る。ある実施形態では、求核性種としては、アミンが挙げられる。ある実施形態では、ヘテロアリール試薬が用いられる。
【０２４４】
支持体は、任意に洗浄され、乾燥され得るし、スクリーニング前に−２０℃で数ヶ月間保存され得る。
【０２４５】
本発明に利用されるアレイは、その間の値および範囲を含めて、約１０、１００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１２，５００〜２５，０００、５０，０００、７５，０００〜１００，０００の別個の環状ペプトイドを含み得る。
リンカー
【０２４６】
本発明は、リンカーを介して種々の基板および／または分子と接合されるペプトイドを含み得る。広範な種々のリンカーのいずれかがペプトイドの接合を実行するために利用され得る。あるリンカーは、一般的に、異なる薬理学的特質および能力に基づいて、他のリンカーに優先して選択される。特に、そのリンカーは、ペプトイドの遊離−ＯＨ基に付着される。
【０２４７】
架橋試薬は、２つの分子の官能基を一緒に結びつける分子架橋を形成するために用いられる。ペプトイドと併合するかまたはペプトイドを種々の基板とカップリングするために用いられる連結／カップリング作因しては、連関、例えばアビジン−ビオチン、アミド、エステル、チオエステル、エーテル、チオエーテル、ホスホエステル、ホスホルアミド、無水物、ジスルフィド、ならびにイオンおよび疎水性相互作用が挙げられる。
【０２４８】
例示的へテロ二官能性架橋剤は、２つの反応性基を有する：一方は第一級アミン基（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）と反応し、他方はチオール基（例えば、ピリジルジスルフィド、マレイミド、ハロゲン等）と反応する。第一級アミン反応性基により、架橋剤は表面または基板と反応し得るし、チオール反応性基により、チオール基を有する付着残基を含むペプトイド組成物と反応する。ジスルフィド結合含有リンカーの他州の型が、本明細書中に記載される方法に首尾よく用いられ得ることが知られている。
【０２４９】
別の架橋試薬はＳＭＰＴで、これは、隣接ベンゼン環およびメチル基により「立体的に障害される」ジスルフィド結合を含有する二官能性架橋剤である。ジスルフィド結合の立体障害性は、組織および血液中に存在し得るグルタチオンのようなチオレート陰イオンによる攻撃から結合を保護し、それによりin vivoでの付着作用物質の送達前に共役体の脱カップリングを防止するのに役立つという一機能を供する、と考えられる。ＳＭＰＴ架橋試薬は、多数のその他の既知の架橋試薬を用いる場合と同様に、システインまたは第一級アミンのＳＨのような官能基（例えば、リシンのイプシロンアミノ基）を架橋する能力を与える。架橋剤の別の考え得る型としては、切断可能なジスルフィド結合を含有するヘテロ二官能性光反応性フェニルアジド、例えばスルホスクシニミジル−２−（ｐ−アジドサリチルアミノ）エチル−１，３’−ジチオプロピオネートが挙げられる。Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミジル基は第一級アミノ基と反応し、そしてフェニルアジド（光分解時に）は非選択的に任意のアミノ酸残基と反応する。
【０２５０】
障害を受ける架橋剤のほかに、非障害リンカーも本発明に従って用いられ得る。保護化ジスルフィドを含有するかまたは生成すると考えられないその他の有用な架橋剤としては、ＳＡＴＡ、ＳＰＤＰおよび２−イミノチオエートが挙げられる（Wawrzynczak & Thorpe, 1988）。このような架橋剤の使用は、当業界でよく理解されている。別の実施形態は、可撓性リンカーの使用を包含する。米国特許第４，６８０，３３８号は、特にキレート化剤、薬剤、酵素、検出可能標識等との抗体共役体を形成するために、リガンドとアミン含有ポリマーおよび／またはタンパク質との共役体を産生するために有用な二官能性リンカーを記載する。米国特許第５，１４１，６４８号および第５，５６３，２５０号は、種々の低刺激性条件下で切断可能である不安定な結合を含有する切断可能共役体を開示する。このリンカーは、当該作用物質がリンカーと直接的に結合されて、切断が活性作用物質の放出を生じる場合に特に有用である。
【０２５１】
選択的に配置されるかまたは腫瘍環境内で活性である酵素に関する切断部位を含むペプチドリンカーも、意図される。このようなペプチドリンカーの例示的型は、ウロキナーゼ、プラスミン、トロンビン、因子ＩＸａ、因子Ｘａまたはメタロプロテイナーゼ、例えばコラゲナーゼ、ゼラチナーゼまたはストロメリシンにより切断されるものである。
診断方法
【０２５２】
試験試料中の構成成分（単数または複数）の検出により生成されるデータは、対照データと比較されて、試験試料中の標的（単数または複数）が正常であるか否かを確定し得る。対照データは、試料構成成分または試料条件に関して限定プロフィールを有することが知られている正常な細胞、試料または人からの比較可能な試料から得られるデータを指す。検出されている各構成成分に関して、正常または標準化試料からの構成成分の対照量が確定され得る。好ましくは、正常細胞または集団に認められるこれらの標的の量の変動を反映するよう、一構成成分の対照量は、正常細胞または人のような試料から採取される有意数の試料に基づいて決定される。
【０２５３】
特定構成成分の試験量が構成成分の対照量と比較して有意に増大されるかまたは低減される場合には、これは、試験試料が根元的欠陥を有するかまたは特定の試験物質または有機体を含有するという陽性指示であり、あるいは特定症状または疾患の診断に役立つ。例えば、生物学的経路構成成分の試験量が、対照量と比較して少なくとも５倍または１０倍以上増大されるかまたは低減される場合には、これは、試験試料が標準または対照試料と箱となるものであるか、あるいは生物学的または非生物学的系における変更を有する、ということを示している。アレイ上の、その間のすべての値および範囲を含めて、少なくとも１、５、１０％またはそれ以上の素子が、１０倍閾値を満たし得る。
【０２５４】
ある実施形態では、生物学的経路、例えばシグナル伝達経路の構成成分を検出するための方法は、以下の：支持体の表面に固定された複数の環状ペプトイドを含む支持体を提供すること（個の場合、環状ペプトイドは、試料の１つ以上の標的構成成分（単数または複数）と特異的に結合する）；試料を支持体と接触すること、そしてそれらの対応する捕捉剤と結合される生物学的経路の構成成分を検出することを包含し得る。いくつかの実施形態では、試験試料から生成されるデータは、対照と比較されて、試験試料における生物学的経路に任意の欠陥が存在するか否かを確定し得る。試料調製方法は、米国特許出願第２００２／０１３７１０６号（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
検出方法
【０２５５】
固体支持体上に捕捉されるかまたは結合された標的の検出方法は、一般的に、測光学的検出方法と非測光学的検出方法に分けられ得る。
【０２５６】
測光学的検出方法としては、吸光度、蛍光、屈折率、偏光または光散乱を検出するかまたは測定する方法が挙げられるが、これらに限定されない。吸光度に関する方法は、分析物の吸光度を直接的（バックグラウンドと比較して吸光度増大）または間接的（バックグラウンドと比較して吸光度低減を測定）に測定することを包含する。紫外線、可視光線および赤外線の測定は、すべて既知である。蛍光に関する測定も、直接的および間接的蛍光測定を包含する。蛍光に関する方法としては、例えばＥＬＩＳＡまたはサンドイッチ検定のような免疫学的方法における蛍光タグ付けを包含する。屈折率を測定することに関連した方法としては、例えば表面プラズモン共鳴（「ＳＰＲ」）、格子結合型方法（例えば、センサー均一格子カプラー、波長応答型光学センサー（「ＷＩＯＳ」）およびチャープ格子かプラー）、共鳴鏡および干渉計技術が挙げられる。偏光の測定に関する方法としては、例えば偏光解析法が挙げられる。光散乱法（ネフェロメトリー）も用いられ得る。
【０２５７】
非測光的検出方法としては、磁気共鳴画像法、気相イオン分光法、原子間力顕微鏡および多極結合型共鳴分光法が挙げられるが、これらに限定されない。磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）は、分子についての顕微鏡的化学的および物理的情報を得るために科学者が用いる分光学的技法である核磁気共鳴（ＮＭＲ）を基礎にしている。気相イオン分光計としては、質量分光計、イオン移動度計、および総イオン流測定装置が挙げられる。
【０２５８】
質量分光計は、イオンの質量対電荷比に翻訳され得るパラメーターを測定する。一般的に、当該イオンは単一電荷を保有し、質量対電荷比は、しばしば、単に質量と呼ばれる。質量分光計は、吸気装置、イオン化源、イオン光学アセンブリー、質量分析器および検出器を包含する。いくつかの異なるイオン化源が、質量分光計における支持体またはバイオチップの表面からの分析物を脱離し、イオン化するために用いられてきた。このような方法は、レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ、ＳＥＬＤＩ）、高速原子衝突、プラズマ脱離、および第二イオン質量分光計を包含する。このような質量分光計では、吸気装置は、支持体を留め付け、それをイオン化源と応答可能関係に、そして同時に、質量分光計、例えばイオン光学アセンブリー、質量分析計および検出器と連絡して配置し得る支持体界面を含む。標的の捕捉のために一般的に平坦表面を有し、検出機器に関する支持体としての容易な使用のために適合されるバイオアッセイに用いるための固体支持体は、一般的に、バイオチップと呼ばれる。
データの分析
【０２５９】
アレイ上の各ペプトイドと結合される当該試料構成成分（標的）（例えば、シグナル伝達構成成分、免疫学的構成成分、形質膜酵素媒介物質、細胞周期構成成分、発生周期構成成分または病原体構成成分）の量の定量により生成されるデータは、任意の適切な手段を用いて分析され得る。一実施形態では、データは、プログラム可能なデジタルコンピューターを用いて分析される。コンピュータープログラムは、一般的に、暗号を保存する読取り可能な媒体を含有する。ある種の暗号は、支持体上の各フィーチャーの位置、そのフィーチャーでの結合素子の同一性、ならびに支持体表面を洗浄するために用いられる溶離条件を包含するメモリーに充てられ得る。コンピューターは、支持体上の種々のアドレス可能な位置でのシグナルの強度に関する入力データとして受信する暗号も含有する。このデータは、各標的により生成されるシグナルの強度を含めて、検出される標的の数を示し得る。
【０２６０】
データ分析は、検出される標的（単数または複数）のシグナル強度（例えばピークの高さ）を確定するステップ、そして「外れ値」（予定統計学的分布から逸脱するデータ）を除去するステップを包含し得る。観察されるピークは正規化され、それにより、何らかの参照に比して各ピークの高さが算定される。例えば、参照は、機器および化学物質（例えば、エネルギー吸収分子）により発生されるバックグラウンドノイズであり、これは、ゼロスケールとして設定される。次いで、各標的に関して検出されるシグナル強度は、所望のスケールでの相対的強度の形で表示され得る。代替的には、標準からのピークが、検出される標的に関して観察されるシグナルの相対強度を算定するための参照として用いられ得るよう、試料に伴って標準が入れられ得る。
【０２６１】
検出器、例えば質量分光計により生成されるデータは、次に、コンピューターソフトウェアにより分析され得る。ソフトウェアは、検出器からのシグナルをコンピューター読取り可能形態に変換する暗号を含み得る。ソフトウェアは、シグナルの分析にアルゴリズムを適用して、シグナルが、標的に対応するシグナルにおける「ピーク」を表すか否かを確定する暗号も包含する。ソフトウェアは、試験試料からのシグナルを「正常」または標準試料の典型的シグナル特質と比較して、２つのシグナル間の適合の近さを確定するアルゴリズムを実行する暗号も包含し得る。ソフトウェアは、試験試料が標的（単数または複数）の正常プロフィールを有するか否か、またはそれが異常プロフィールであるか否かを示す暗号も含み得る。
症状または疾患状態
【０２６２】
１つ以上の試料構成成分（バイオマーカー）の結合プロフィールを用いて、試料が採取された被験体における症状または疾患状態を予測し、診断し、または査定し得る。疾患状態または症状としては、癌、自己免疫性疾患、炎症性疾患、感染性疾患、神経変性疾患、心臓血管性疾患、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、プリオン感染、生理学的状態、汚染状態、または全身健康状態が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法は、前疾患状態または疾患状態の重症度を含めて、異なる型の疾患状態間を識別するために結合プロフィールおよびペプトイドリガンドを用い得る。
【０２６３】
本発明は、特に、種々の動物モデルの使用を意図する。例えば癌の種々の動物モデルを用いて、候補ペプトイドが癌細胞増殖、転移または再発を抑制するか否か、あるいは他の薬剤の作用を免れるその能力に影響を及ぼすか否かを確定し得る。試験化合物によるこれらの動物の処理は、動物に適切な形態で当該化合物を投与することを包含する。投与は、臨床的または非臨床的目的のために利用され得る任意の経路、例えば経口、鼻、頬経路、または局所的経路（これらに限定されない）による。代替的には、投与は、経口、舌下、気管内滴注、気管支滴注、皮膚内、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射によるものであり得る。本発明は、本明細書中で特許請求されるスクリーニング方法により同定される環状ペプトイドから選択される高親和性リガンド、ならびに製薬上許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物も意図する。これらの組成物も、動物への試験化合物の投与のために、上記の手段のいずれかにより送達され得る。
細胞ベースのスクリーニングフォーマット
【０２６４】
細胞ベースのスクリーニング検定を用いて、標的特異的リガンド、例えば環状ペプトイドを同定し得る。示差的特質、例えば細胞表面受容体の存在または非存在を有し、それ以外は同一である細胞は、示差的に標識される（例えば２つの異なる着色量子ドット）。次いで、細胞は適切に１：１比で混合され、次いで、基板上に表示される分子のライブラリーに曝露される。適切にインキュベートし、洗浄した後、１つの色細胞のみと結合するビーズが選ばれる。ビーズは、細胞とその他の屑を除去するよう処理され、結合分子が適切な分析技法により同定される。この２色検定は、非常に高い特異性を要求する。ビーズ表示分子が標的以外の細胞表面の任意の他の分子を結合する場合には、両着色細胞は保持され、分子はヒットとして同定されない。Udugamasooriya et al. (2008)を参照。
【０２６５】
検定は、種々の異なるフォーマットを適応させるために修正され得る。例えば、３細胞型検定を用いて、高度関連分子と結合するリガンドを区別し得る。例えば、２つの受容体がほとんど同じである場合、受容体を有さないか、または１つの受容体を有するか、または他の関連受容体を有する細胞が提供される。各細胞型（無受容体、受容体１含有および受容体２含有）は、異なる作用物質（例えば、着色量子ドット）で標識される。細胞は、約１：１：１の比で一緒に混合され、ビーズライブラリーに曝露される。１つの色の細胞だけを結合するビーズが抜き取られ、それらが示す化学物質が特性化される。
【０２６６】
識別され得る構造の例としては、種々の免疫細胞の抗体またはＴ細胞受容体、成長因子受容体、細胞マトリックスタンパク質、レクチン、炭水化物、脂質、種々の病原体からの細胞表面抗原が挙げられる。付加的には、細胞は、細胞表面分子の組成が異なるが、しかし、それらの配列は異ならない。例えば、一細胞型に関して、２つの所定の細胞表面分子は、互いと関連して、これらの受容体が関連しない異なる細胞型には無いリガンドに関する独特の結合部位を提供する。標識化は、熱量定量、蛍光定量、生物発光または化学発光標識を利用し得る。
【０２６７】
検定は、２つ以上の別個の細胞集団のうちの１つのみに存在する細胞と結合するリガンドを同定するためにも修正され得る。例えば、健常個体または個体の群からのすべてのＣＤ４＋Ｔ細胞が、１つの着色染料で標識され得るし、自己免疫性疾患を有する個体からまたは個体の群からのＣＤ４＋Ｔ細胞は異なる着色染料で標識され得る。次にＴ細胞の２つの集団は、ビーズライブラリーと混合され、自己免疫患者からの細胞のみを保有するビーズが選択され得る。これらのＴ細胞は、自己免疫試料中に豊富であるだけで、健常個体から得られる細胞中には豊富でないはずであるため、これらの細胞は、自己抗体を結合し、疾患に関与するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を表示する自己免疫Ｔ細胞に関する候補である。
【０２６８】
別の用途では、２つ以上の細胞集団は、細胞表面の分子の組成および／または構成に変化を生じ得る遺伝子突然変異の存在または非存在においてのみ異なり得る。
キット
【０２６９】
本明細書中に記載される組成物のどれでもが、キット中に含まれ得る。非限定的一例では、環状ペプトイド、環状ペプトイドアレイおよび関連支持体（単数または複数）、緩衝液、リンカーおよび試薬が、キット中に提供される。キットはさらに、試料および／または試料構成成分を加工処理するための試薬を含み得る。キットは、アレイまたは試料の種々の構成成分を、例えば放射性胴囲対または蛍光体で標識するために用いられ得る試薬も含み得る。
【０２７０】
本明細書中に記載される本発明の方法を履行するためのキットが、具体的に意図される。いくつかの実施形態では、環状ペプトイドアレイの合成、加工処理および検出のためのキットが存在する。
【０２７１】
試料構成成分結合の検出のための試薬は、以下のうちの１つ以上を含み得る：環状ペプトイド；および／または検出試薬。
【０２７２】
キットの構成成分は、水性媒質中に、または凍結乾燥形態で包装され得る。キットの容器手段は、一般的に、その中に構成成分が入れられ得る、好ましくは適切に付着され得る、少なくとも１つのバイアル、試験管、プレート、フラスコ、ボトル、アレイ基板、注射器またはその他の容器手段を包含する。キット中に１つより多い構成成分が存在する場合（標識化試薬および標識は、一緒に包装され得る）、キットは、一般的に、その中に付加的構成成分が別々に入れられ得る、第二、第三またはその他の付加的な容器も含有する。しかしながら、構成成分の種々の組合せが、バイアル中に含まれ得る。本発明のキットは、典型的には、合成のための結合素子または試薬を含有するための手段、例えば、市販用の密閉式の任意のその他の試薬容器も包含する。このような容器としては、その中に所望のバイアルが保持される射出または吹き込み成形プラスチック容器を包含し得る。
【０２７３】
キットの構成成分が１つおよび／またはそれ以上の液体溶液中に提供される場合、液体溶液は、典型的には、滅菌性およびプロテイナーゼ無含有の水溶液である。いくつかの場合、タンパク質様組成物は、分解を防止するために凍結乾燥され、および／またはキットまたはその構成成分は、乾燥粉末、および／または錠剤として提供され、粉末は、適切な溶媒の付加により再構成され得る。溶媒は別の容器手段でも提供され得る、と意図される。
療法
【０２７４】
本発明は、抗原代用物として作用する高親和性リガンドでの患者の処置と組合せた処置の状況で自己反応性Ｔ細胞と特異的に結合するペプトイドの使用も意図する。本発明は、このような自己免疫疾患の処置における抗原代用物単独の使用にも関するし、あるいはこのような抗原代用物は、特定の自己免疫疾患または症状に関する他の既知の処置レジメンと組合せて用いられ得る。自己免疫疾患では、身体自体の免疫応答がそれ自体を攻撃する。最も多くは、この過程があるＴ細胞で開始して、宿主自体の抗原に感作するようになる（健常被験体では起こらない過程である）。すなわち、正常な免疫監視機構および活性に必要な他のＴ細胞に影響を及ぼすことなく、これらの自己反応性Ｔ細胞が選択的に低減または排除される場合には、自己免疫疾患症候は、完全に排除されない場合でも、少なくとも緩和されるはずである。本明細書中で特許請求され、開示される併用療法は、Ｔ細胞またはその他の抗体産生／触媒細胞を除去することにより、そして抗原代用物の使用を介して自己抗体による天然抗原の破壊を防止することにより、疾患のすべての症候を緩和するかまたは排除するために確実に用いられ得る。好ましい一実施形態では、抗原代用物は環状ペプトイドである。本発明は、免疫複合体が、Ｔ細胞と結合し、侵害性Ｔ細胞に免疫毒素を向けるペプトイドまたはリガンドから形成され、本明細書中に開示される方法に従って三井だされる高親和性抗原代用物と組合せて用いられて、自己免疫性症状または疾患を処置するこのような併用療法にも関する。本明細書中に開示される方法のすべてが、処置についての医者処方方法によって組合せて用いられ得る。
Ａ．  Ｔ細胞を排除するための接着ベースの方法
【０２７５】
一実施形態では、自己反応性Ｔ細胞に関して実証された特異性を有するペプトイドで被覆された支持体を用いて、自己免疫疾患に罹患している被験体の血液を「パンニング」し得る、ということが提唱される。このアプローチは、当該パラメーターを追跡し、癌療法のようなあの状況で、または幹細胞のコレクションにおいて適用されるのと同じ白血球搬出のための装置を用いる。
【０２７６】
さらに一般的には、白血球搬出は、白血球が血液の試料から分離される実験室手法である。これは、癌（白血病）を有する個体における非常に高い白血球数を低減するために、または輸血のために白血球を除去するために実行され得る。代替的には、顆粒球、マクロファージおよび単球だけが除去されて、リンパ球数は大きく変えられないままである。これは、潰瘍性結腸炎および関節リウマチのような自己免疫疾患のための処置として用いられるが、この場合、これらの細胞は炎症過程における活性部分の役割を果たす。
【０２７７】
ペプトイドは、血液が通過する支持体と結合されて、自己反応性Ｔ細胞を支持体と結合指せて、患者に戻る前に試料から除去される。これに対比して、ペプトイドと結合していないＴ細胞は、結合されず、患者に戻される。血液は静脈内ラインを介して患者から得られて、通常は反対側の腕で、同様にして戻される。血液は、典型的には、ポンプを用いて支持体を横断して推進される。当該手順のための典型的持続時間は、３〜４時間である。
【０２７８】
このような方法は、既知の自己抗体に対するリガンドのライブラリーをスクリーニングすることにより発見された抗原代用物での患者の処置と組合せて用いられ得る、ということが、本明細書中で意図される。このような抗体は、抗体ライブラリーの商業的供給元から市販されている。
Ｂ．  毒素および免疫複合体療法
【０２７９】
別の実施形態では、本発明の抗原代用物ペプトイドは、それらが結合するＴ細胞に特異的にペイロードを送達するターゲッティング剤であるＴ細胞ペプトイドと組合せて用いあれる。一実施形態では、ペイロードは毒素であり、これは、標準架橋化学を用いてペプトイドに付着され得る。毒素は、以下でさらに考察されるような、広範な種々の形態および作用を有する。別の選択肢は、Ｔ細胞に対するターゲッティングのために、エフェクターをペプトイドと連結することである。このような一免疫作用は、ＩｇＧ  Ｆｃ含有分子である。Ｆｃ含有分子についての考察も、下記で提供される。
【０２８０】
広範な種々のリンカーのいずれかを利用して、ペプトイドの結合を実行し得る。あるリンカーは、薬理学的特質および能力の違いに基づいて、一般的に他のリンカーを上回って選択されるが、しかし一般的には、当業者に既知の任意の連結／架橋剤を用いて、本発明のペプトイドを、毒素、例えばアビジン−ビオチン結合、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ホスホエステル結合、ホスホアミド結合、無水物結合、ジスルフィド結合、イオン性および疎水性相互作用と組合せ得る。
【表１】
2014504594.tif 000006
【０２８１】
例示的へテロ二官能性架橋剤は、２つの反応性基を含有する：一方は第一級アミン基（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）と反応し、他方はチオール基（例えば、ピリジルジスルフィド、マレイミド、ハロゲン等）と反応する。第一級アミン反応性基を介して、架橋剤は一方のタンパク質（例えば、選定抗体または断片）のリシン残基（単数または複数）と反応し、そしてチオール反応性基を介して、既に第一タンパク質と結びついた架橋剤は、他方のタンパク質（例えば、選択的作用物質）のシステイン残基（遊離スルフヒドリル基）と反応する。
【０２８２】
血中で合理的安定性を有する架橋剤が用いられる、ということは特殊である。ターゲッティングおよび治療／防止用作用物質を共役するために首尾よく用いられ得る多数の型のジスルフィド結合含有リンカーが既知である。立体障害性であるジスルフィド結合を含有するリンカーは、in vivoでより大きい安定性を与えて、作用部位に到達する前にターゲッティングペプチドの放出を防止することを立証し得る。
【０２８３】
別の架橋試薬はＳＭＰＴであって、これは、隣接ベンゼン環およびメチル基により「立体的に障害」されるジスルフィド結合を含有する二官能性架橋剤である。ジスルフィド結合の立体障害は、組織および血液中に存在し得るグルタチオンのようなチオレート陰イオンによる攻撃を防止するという機能を供して、それにより、標的部位への付着作用物質の送達前に共役体のデカップリングを防止するのに役立つ、と考えられる。
【０２８４】
ＳＭＰＴ架橋試薬は、多数の他の既知の架橋試薬を用いる場合と同様に、システインまたは第一級アミンのＳＨのような官能基（例えば、リシンのイプシロン・アミノ基）を架橋する能力を与える。別の考え得る型の架橋剤としては、切断可能ジスルフィド結合を含有するヘテロ二官能性光反応性フェニルアジド、例えばスルホスクシニミジル−２−（ｐ−アジドサリチルアミノ）エチル−１，３’−ジチオプロピオネートが挙げられる。Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミジル基は第一級アミノ基と反応し、そしてフェニルアジドは（光分解時に）任意のアミノ酸残基と非選択的に反応する。
【０２８５】
障害架橋剤のほかに、非障害リンカーも本明細書に従って用いられ得る。保護化ジスルフィドを含有するかまたは生成すると考えられないその他の有用な架橋剤としては、ＳＡＴＡ、ＳＰＤＰおよび２−イミノチオランが挙げられる（Wawrzynczak & Thorpe, 1986）。このような架橋剤の使用は、当業界では十分理解されている。別の実施形態は、可撓性リンカーの使用を包含する。
【０２８６】
米国特許第４，６８０，３３８号は、アミン含有ポリマーおよび／またはタンパク質とのリガンドの複合体を産生するために、特にキレート化剤、薬剤、酵素、検出可能標識等との抗体複合体を生成するために有用な二官能性リンカーを記載する。米国特許第５，１４１，６４８号および第５，５６３，２５０号は、種々の低刺激性条件下で切断可能である不安定結合を含有する切断可能複合体を開示する。このリンカーは、当該作用物質がリンカーと直接的に結合され、切断が活性作用物質の放出を生じるのに特に有用である。好ましい使用は、遊離アミノまたは遊離スルフヒドリル基をタンパク質、例えば抗体、または薬剤に付加することを包含する。
【０２８７】
米国特許第５，８５６，４５６号は、ポリペプチド構成物質を連結して融合タンパク質、例えば一本鎖抗体を作るのに用いるためのペプチドリンカーを提供する。リンカーは、約５０アミノ酸長までであり、荷電アミノ酸（好ましくはアルギニンまたはリシン）の少なくとも１つの存在と、その後のプロリンを含有し、より大きい安定性および凝集低減により特性化される。米国特許第５，８８０，２７０号は、種々の免疫診断および分離技法に有用なアミノオキシ含有リンカーを開示する。
【０２８８】
細胞環境内に優先的に置かれるか細胞環境内で活性である酵素に関する切断部位を含むペプチドリンカーも、意図される。このようなペプチドリンカーの例示的型は、ウロキナーゼ、プラスミン、トロンビン、因子ＩＸａ、因子Ｘａまたはメタロプロテイナーゼ、例えばコラゲナーゼ、ゼラチナーゼまたはストロメリシンにより切断されるものである。
【０２８９】
しかしながら、ペプトイドは、ペプチドおよびタンパク質と比較して、より簡単でより有効な付着点の組入れのための、合成的である独特の機会も提供する。
１．  毒素
【０２９０】
種々の生物学的毒素が、本発明に従って用いられ得る。「毒素」という用語は、本明細書中で用いる場合、生物起源の毒素を指す。微生物により産生される毒素は、微生物病原性および／または宿主免疫応答の回避に関与する重要な病毒力決定因子である。生体毒素は、目的および機序において大いに異なっており、非常に複雑な（イモガイ（cone snail）の毒液は多数の小タンパク質を含有し、各々が特定の神経チャンネルまたは受容体を標的にする）、あるいは相対的に小さいタンパク質であり得る。生体毒素は、事実上、２つの主な機能を有する  −捕食（クモ、ヘビ、サソリ、クラゲ、大型ハチ）と防御（ハチ、アリ、シロアリ、ミツバチ、大型ハチ、ヤドクガエル）である。よりよく知られた型の生体毒素のいくつかとしては、シアノトキシン（シアノバクテリアにより産生される）、ヘモトキシン（赤血球を標的にし、破壊する；マムシ科、例えばガラガラヘビ）、ネクロトキシン（壊死を引き起こす；ドクイトグモ、「パフアダー」：クサリヘビ科（Bitis arietans））、神経毒（クロゴケグモ、サソリ、立方クラゲ目）が挙げられる。
【０２９１】
本発明による特に興味深いものは、ヒマ（トウゴマ）からの細胞毒素、例えばリシンである。さらにまた有用であるのは、細菌毒素、例えばクロストリジウム属：tetani（破傷風菌）(テタノスパスミン)、perfiingens（ウェルシュ菌）(アルファ毒素、腸毒素)、difficile（ディフィシル）(Ａ、Ｂ)、botulimim（ボツリヌス菌）(ボトックス)、ブドウ球菌属(黄色ブドウ球菌S. aureus  アルファ／ベータ／デルタ。エクスフォリアチン、毒性ショック症候群毒素、ＳＥＢ)、ならびに炭疽毒、リステリオリシンＯ、ストレプトリシン、ロイコシジン(パントン・バレンタイン型ロイコシジン)、コードファクター、ジフテリア毒素、志賀毒素、ベロ毒素／志賀様毒素(大腸菌)、大腸菌熱安定性腸毒素/腸毒素、コレラ毒素、百日咳毒、シュードモナス外毒素、細胞外アデニレート・シクラーゼ  Ｉ型 (スーパー抗原)、ＩＩ型(孔形成毒素)、ＩＩＩ型(ＡＢ毒素／ＡＢ５)、リポ多糖(脂質Ａ)、バシラス・スリンギエンシス・デルタ内毒素、クランピング因子Ａ、およびフィブロネクチン結合タンパク質Ａである。
【０２９２】
タンパク質の発色団支援光不活性化（ＣＡＬＩ）は、光を用いて、発色団（弾頭  warhead）から高反応性種（しばしば、一重項酸素）を生成することを包含する。反応性種は、標的タンパク質を損傷し、その生物学的機能を不活性化する。これらの分子は、タンパク質の機能をノックアウトするために用いられ得る。
【０２９３】
本発明人による実験は、ルテニウムベースの発色団が有効な弾頭であることを示している。ルテニウム発色団が細胞に進入し、標的を不活性化して、それによりin vivoおよびex vivoでの生きている細胞のＣＡＬＩ処置を可能にする、ということをそれらは実証した。
２．  Ｆｃ含有分子
【０２９４】
可変および定常領域の両方を有する４つのポリペプチド鎖（可変領域を有する２つの短いセグメントと、可変および定常領域の両方を有する２つの長いセグメント）から、二価抗体が作られる。長い鎖と短い鎖は、ジスルフィド結合を介して相互作用し、正常抗体の半分を造り上げ、可変部分は抗原結合に関与する（Ｆｖ、または断片可変部）。２つの抗体半分部分は、別個のジスルフィド結合を介して、Ｆｃ（断片、結晶化可能）部分で相互作用する。
【０２９５】
Ｆｃ部分は、例えば、種々の細胞受容体および免疫分子、例えば補体タンパク質との結合といったように、免疫細胞活性を調整するのに重要な役割を果たす。これを実行することにより、それは、異なる生理学的作用、例えばオプソニン作用、細胞溶解および肥満細胞、好塩基球および好酸球の脱顆粒を媒介する。本発明は、根絶のためにＴ細胞を標的にするために、抗体またはそのＦｃ含有断片を利用しようと試みている。
【０２９６】
用いられ得る一特定技法は、Popkov
et al. (2009)に記載されている。著者等は抗体を工学処理して、インテグリンα（ｖ）β（３）およびα（ｖ）β（５）アダプターリガンドを含有するようにして、これが、これらの標的を有する移植腫瘍に対する即効性の化学的にプログラムされたポリクローナル応答を、自己組織化マウントした。有意の治療的応答は、アジュバント療法に頼ることなく観察された。化学的にプログラムされた免疫応答は、抗体依存性細胞性細胞傷害および補体依存性細胞傷害により推進された。これは、それらの結合特異性を再指図することにより抗体を「ハイジャック」する小分子リガンドの能力を実証する。この方法は、抗原代用物で患者を処置することと組合せて用いられ得る。
Ｃ．  併用療法
【０２９７】
上記の療法は、自己免疫疾患の処置のための別の作用物質と組合せて投与され得る。作用物質を組合せることにより、単一療法に伴う毒性（もしあれば）を増大することなく、付加的作用が達成され得る。さらに、より多くの付加的作用（「相乗作用」）が観察され得る、ということが可能である。したがって、併用療法は、新規の治療レジメンを開発するための一般的方法である。
【０２９８】
ペプトイド処置は、他の作用物質（単数または複数）に先行し得るし、同時的であり得るし、および／または数分から数週間までの範囲の間隔で他の作用物質の後に続き得る。ペプトイド処置およびその他の作用物質（単数または複数）が適用され、投与される実施形態では、ペプトイド処置およびその他の作用物質（単数または複数）が被験体に及ぼす有益併用作用を依然として発揮し得るよう、各送達時間の間に有意期間が期限切れにならないことが一般的に保証される。例えば、このような場合、ペプトイド処置とともに、２、３、４またはそれ以上の薬剤使用法が、実質的に同時に（すなわち、約１分未満以内に）提供され得る、ということが意図される。他の態様では、実質的に同時に、約１分、約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約４５分、約６０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約３７時間、約３８時間、約３９時間、約４０時間、約４１時間、約４２時間、約４３時間、約４４時間、約４５時間、約４６時間、約４７時間、約４８時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７または約８週間以内またはそれ以上のうちに、そしてその中で得られる任意の範囲内で、ペプトイド投与の前および／または後に、つ以上の作用物質が投与され得る。
【０２９９】
ペプトイド処置および１つ以上の作用物質の種々の併用レジメンが、用いられ得る。このような組合せの非限定例を以下に示すが、この場合、ペプトイド処置は「Ａ」であり、第二作用物質は「Ｂ」である：
A/B/A  B/A/B  B/B/A  A/A/B  A/B/B  B/A/A  A/B/B/B  B/A/B/B
B/B/B/A  B/B/A/B  A/A/B/B    A/B/A/B    A/B/B/A    B/B/A/A
B/A/B/A  B/A/A/B  A/A/A/B    B/A/A/A    A/B/A/A    A/A/B/A
したがって、本発明のペプトイド療法は、上記の障害の処置のために用いられる他の療法と連係して用いられ得るが、しかし種々の抗炎症および免疫抑制処置を包含しない。
【０３００】
全身性コルチコステロイドの使用または過剰使用を回避し得る尋常性天疱瘡および類似の障害または症状の新規の処置を開発する必要性がある。ＰＶ抗体は、デスモグレイン３（Ｄｓｇ３）およびその他の自己抗原と反応する。細胞収縮、隣接細胞からの剥離、および丸め（rounding up）を引き起こす下流シグナル伝達事象が引き出される。ＰＶにおける棘細胞離開は、ｐ３８  ＭＡＰＫ、ラパマイシンの哺乳類標的（ｍＴＯＲ）、Ｓｒｃおよび上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を含むシグナル伝達キナーゼの阻害剤により遮断され得る。それは、他のチロシンキナーゼ、カルモジュリン、ホスホリパーゼＣおよび執行型カスパーゼによっても遮断され得る。したがって、本発明は、Ｔ細胞リガンド、自己抗体リガンド、ならびにこの段落で言及される標的／タンパク質の各々の阻害剤を含めてＰＶの発症および進行をもたらすか、あるいはそれに関与するか、および／または部分的に関与する下流シグナル伝達事象を抑制する薬剤の使用を包含する併用処置にも関する。本発明のリガンドと組合せて用いられる潜在的薬剤の具体例を、以下の表１に列挙する。
【表２】
2014504594.tif 000007
Ｖ．  実施例
【０３０１】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技法は、本発明の実行において良好に機能するために本発明人により発見された技法を表しており、したがって、その実行のための好ましい方式を構成するとみなされ得る、と当業者に理解されるべきである。しかしながら、本発明の開示にかんがみて、本発明の精神および範囲を逸脱しない限り、開示される具体的実施形態には多数の変更がなされ得るし、同様のまたは類似の結果が依然として得られる、と当業者は理解すべきである。
実施例１  −  方法
【０３０２】
ペプトイドライブラリー合成    ペプトイドライブラリーの設計に関する詳細は、以前に発表されている（Udugamasooriya
et al., 2008）。要するに、ライブラリーは、ＴｅｎｔａＧｅｌマクロビーズ（直径１４０〜１７０ミクロンＭ；置換：０．４８ｍｍｏｌ／樹脂１ｇ；Rapp Polymere）上に合成される。８つの異なるアミンを用いてライブラリーの合成を実行して、２６２，１４４の化合物の理論的多様性を生じる。電子レンジ（１０００Ｗ）支援合成プロトコール、ならびにスプリットおよびプール法を用いて、９−ｍｅｒライブラリーを合成する（Olivos et al., 2002）。ライブラリー合成の完了時に、９５％ＴＦＡ、２．５％トリイソプロピルシランおよび２．５％水の混合物でビーズを２時間処理して、側鎖保護基を除去して、次に、ＤＭＦ中の１０％ジイソプロピルエチルアミンで中和する。ビーズをジクロロメタンで洗浄し、乾燥して、使用するまで４℃で保存する。
【０３０３】
可溶性ペプトイドの再合成    標準マイクロ波支援プロトコール（Olivos et al., 2002）（１０００Ｗ電子レンジ、両者間で手短に混合しながら２×１５秒間に送達される１０％パワー）を用いて、KnorrアミドＭＢＨＡ樹脂（Novabiochem）上で、ペプトイドリガンドおよびごちゃ混ぜの対照ペプトイドの再合成を実行する。ビオチニル化およびビオチン−ＤＯＰＡペプトイドに関して、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ビオチニル−ＰＥＧ）−ＯＨ（Novabiochem）およびＦｍｏｃ−ＤＯＰＡ（Novabiochem）を、その後、Ｆｍｏｃ科学を用いる標準ペプチド合成プロトコール（Udugamasooriya et al., 2008）により、KnorrアミドＭＢＨＡ樹脂上でカップリングする。標準マイクロ波支援プロトコールを用いて、上記のような分子のペプトイド部分を作成する。ペプトイドは、９５％ＴＦＡ、２．５％トリイソプロピルシランおよび２．５％水で２時間、樹脂から切断され、ウォーターズ・ブリーズＨＰＬＣ系を用いて精製される。ＭＡＬＤＩ−Voyager ＤＥ  Ｐｒｏ質量分光計を用いて、ペプトイドの質量を検出した。
環状ペプトイドライブラリー合成
【０３０４】
本発明の種々の実施形態を例証する目的のために以下の実施例を示すが、それらは如何なる型式においても本発明を限定するものではない。本発明は、目的を実行し、前記の結果および利点を、ならびに本明細書に固有の目的、結果および利点を得るよう良好に適合される、と当業者は容易に理解する。本発明の実施例は、本明細書中に記載される方法とともに、好ましい実施形態を代表するものであり、例示的なものであって、本発明の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲により定義されるように、本発明の精神内に包含される本発明の変更および他の用途を、当業者が気づくであろう。
【０３０５】
材料および装置    得られる場合は、すべて市販の試薬を用い、さらに精製しなかった。Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−アミノエタノールは、CSPS Pharmaceuticalsから購入した。メチルアミンを、ＴＨＦ中の２Ｍ溶液として用いた。ポリスチレンＡＭ  ＲＡＭマクロビーズ（５００〜５６０μｍ；０．５２ｍｍｏｌ／ｇ）およびＲｉｎｋアミドＡＭ  ＬＬ（１００〜２００メッシュ、０．３５ｍｍｏｌ／ｇ）樹脂は、それぞれRapp PolymereおよびNovabiochemから得た。ＮＭＲスペクトルを、Varian３００ＭＨｚ分光計で記録した。０．１％ＴＦＡを伴う水／アセトニトリルの勾配溶液を用いたＣ１８逆相カラムを有するウォーター・バイナリＨＰＬＣ系で、分取ＨＰＬＣを実施した。ＭＳおよびタンデムＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を、それぞれマトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸を用いるVoyager-DEＰＲＯ生体分光計ワークステーションおよび４７００プロテオミクス分析器（Applied Biosystems）で実施した。ペプチドの合成は、New
Brunswick Scientific Innova ４０００インキュベータ振盪器中で実施した。マイクロ波条件下でのペプトイドの合成は、１０％パワーで１０００Ｗ  Whilpool電子レンジ（モデルＭＴ１１３０ＳＧ）中で実施した。標準ガラスペプチド合成容器（Chemglass）を、インキュベータ振盪器中および電子レンジ中での合成のために用いた。マイクロアレイは、ＳｐｏｔＡｒｒａｙ  ７２マイクロアレイプリンティングシステム（PerkinElmer）を用いて、マレイミド官能基化スライドグラス上で調製した。ハイブリダイズ化マイクロアレイを、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂスキャナーで走査した。
【化４】
2014504594.tif 000008
【０３０６】
ｉｖＤｄｅ−β−Ａｌａ−ＯＨの合成    ＥｔＯＨ中のΗ−β−Ａｌａ−ＯＨ（１．０２ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）およびｉｖＤｄｅ−ＯＨ（５ｍｌ、２２．９ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、ＴＦＡ（８８μＬ、１ｍｍｏｌ）を室温で付加した。次に、混合物を２４時間還流した。溶媒を真空蒸発させた後、粗生成物を、ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（０．１％ＴＦＡ）勾配を有するカラムクロマトグラフィーにより精製して、ｉｖＤｄｅ−β−Ａｌａ−ＯＨ（３．３ｇ、９７．６％）を得た。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ1.02(m, 12H), 1 .90-2.03 (m, 1 H), 2.39(s, 4H), 2.75 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.06 (br d, J = 6.0 Hz, 2H), 3.78 (q, Ｊ = 6.0 Hz, 2H); １３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３） δ 22.8, 28.4, 29.4, 30.2, 34.1 , 37.4, 39.6, 52.9, 107.4, 173.0, 177.2; ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）：ｍ/ｚ：Ｃ１６Ｈ２６ＮＯ４に関する理論値 296.2；実測値 296.5［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０３０７】
ビーズ上のペプトイドの環化反応    ビーズ上でのペプトイドの予備環化反応を、種々の条件下で試験した。良好な結果を生じるＰｙＢＯＰを用いる典型的手順を、以下に示す。環化収率はペプトイドの長さによって決まり、高収率は、少なくとも６モノマー単位を要する。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−２−ＰｈｉＰｒ）−ＯＨを、Ｆｍｏｃ化学を用いて、順次、Ｒｉｎｋ  アミドＡＭ樹脂とカップリングさせた。マイクロ波支援サブモノマープロトコールを用いて、ペプトイドの合成を実施した。２−ＰｈｉＰｒ基を、ＤＣＭ中の１％ＴＦＡおよび２％トリイソプロピルシランで２＊３０分間、脱保護した。ＤＣＭ中の５％ＤＩＰＥＡおよびＤＣＭで樹脂を十分に洗浄した後、ＤＭＦ中のＰｙＢＯＰ（３当量）、ＨＯＢｔ（３当量）およびＤＩＰＥＡ（１０当量）の条件下で、２＊１０時間、環化を実施した。ビーズからの切断後に、ＭＡＬＤ１−ＭＳおよびＨＰＬＣにより環状ペプトイドを確証した。
【０３０８】
コード化環状ペプトイドライブラリーの構築のための一般手順    ＤＭＦ中のポリスチレンＡＭ  ＲＡＭマクロビーズを、室温で１時間、膨潤させた。ＤＭＦを排液した後、ビーズを、２０％ピペリジンとともに３０分間インキュベートした。ビーズをＤＭＦ（８×３ｍＬ）で十分に洗浄し、次いで、ＤＭＦ中のＨＢＴＵ（５当量）、ＨＯＢｔ（５当量）およびＤＩＰＥＡ（１０当量）を用いて、２時間、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ（５当量）で処理した。ビーズをＤＭＦ（８×３ｍＬ）で十分に洗浄し、２０％ピペリジンとともに３０分間、インキュベートした後、それらをＤＭＦ（８×３ｍＬ）で十分に洗浄し、ついで、ＤＭＦ中のＨＢＴＵ（４．６当量）およびＮＭＭ（１０当量）を用いて、ｉｖＤｄｅ−β−Ａｌａ−ＯＨ（０．６当量）およびＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（４当量）で処理した。２時間後、ビーズをＤＭＦ（８×３ｍＬ）で十分に洗浄し、次いで、ＤＭＦ中のＡｃ２Ｏ（１０当量）およびＤＩＰＥＡ（１０当量）で１時間処理して、潜在的非反応アミンを遮断した。ビーズをＤＭＦ（８×３ｍＬ）で十分に洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジンの処置で３０分間選択的に除去した後、ＤＭＦ中のＨＢＴＵ（５当量）、ＨＯＢｔ（５当量）およびＤＩＰＥＡ（１０当量）を用いて、２時間、それらを再びＦｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ（５当量）とカップリンさせた。ビーズをＤＭＦ（８×３ｍＬ）で十分に洗浄し、２０％ピペリジンとともに３０分間インキュベートした後、それらを、ＤＭＦ中のＨＡＴＵ（３当量）、ＨＯＢｔ（３当量）およびＤＩＰＥＡ（１０当量）を用いて、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−２−ＰｈｉＰｒ）−ＯＨ（３当量）で処理した。２時間後、ビーズをＤＭＦ（８×３ｍＬ）で十分に洗浄し、次いで、ＤＭＦ中のＡｃ２Ｏ（１０当量）およびＤＩＰＥＡ（１０当量）で１時間処理して、潜在的非反応アミンを遮断した。ｉｖＤｄｅおよびＦｍｏｃ基を、２．５％ヒドラジンで２＊１０分および２０％ピペリジンで３０分の連続処理で除去した。ビーズをＤＭＦ（８×３ｍＬ）で十分に洗浄し、マイクロ波支援サブモノマープロトコールに基づいて、ブロモ酢酸および第一級アミン、例えばメチルアミン、アリルアミン、２−メトキシエチルアミン、Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−２−アミノエーテル、ピペロニルアミン、フルフリルアミン、ベンジルアミン、ｌ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−１，４−ジアミノブタンを用いることにより、７−ｍｅｒペプトイドからなるスプリットアンドミックス線状ペプトイドライブラリーを調製した。ＤＣＭ中の１％ＴＦＡおよび２％トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）で、２＊３０分間、２−ＰｈｉＰｒ基を選択的に脱保護した。ＤＣＭ中の５％ＤＩＰＥＡおよびＤＣＭで当該樹脂を十分に洗浄した後、ＤＭＦ中のＰｙＢＯＰ（３当量、〜３０ｍＭ）、ＨＯＢｔ（３当量、〜３０ｍＭ）およびＤＩＰＥＡ（１０当量）の条件下で２＊１０時間、環化を実行した。環化収率は、Ｎ末端の残基によって決まる。Ｎ末端のＮｍｅａからなる環状ペプトイドライブラリーは、非常に良好な結果をもたらし、ほぼ完全な環化を生じた。９５％ＴＦＡおよび５％ＴＩＳの条件下で、１．５時間、樹脂からの切断後に、ＭＳ、タンデムＭＳ（ＭＡＬＤＩ）��たはＨＰＬＣにより、環状ペプトイドを確証した。
【０３０９】
ビオチン標識化環状ペプトイドマイクロアレイおよびストレプトアビジンＣｙ３のハイブリダイゼーション    Ｎ末端にＮｍｅａを有するビオチン標識化環状ペプトイドからなるマイクロアレイを調製した。
【０３１０】
約２ｍＭ溶液の３倍連続希釈液で、マレイミド官能基化スライドグラス上に、ビオチン標識化環状ペプトイドをスポットした。マイクロアレイを、１×ＴＢＳＴ（５０ｍＭトリス／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．１％トゥイーン２０、ｐＨ８．０）で４℃で３０分間、平衡させた。マイクロアレイスライドを、ＴＢＳＴ中のストレプトアビジン−Ｃｙ３（１０μＬ、Sigma）およびＢＳＡ（５０μ、２ｍｇ／ｍＬ）（総量１ｍＬ溶液）とともに静かに振盪しながら、４℃で４５分間、インキュベートした。スライドをｌ×ＴＢＳＴ（３×５分）で４℃で洗浄し、次いで、遠心分離により乾燥した。ハイブリダイズ化マイクロアレイを、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂスキャナーで走査した。
【０３１１】
１０ペプトイドの型を調製した：β−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ（ビオチン）−シクロ（Ｇｌｕ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｎｍｅａ）（図３Ａ〜Ｃ参照）。この場合、ビオチン−Ｇｌｕは、側鎖共役化ビオチンを保有し、そしてＸは、図２に示されるアミンのうちの１つに由来した。当該分子を樹脂から切断し、ＨＰＬＣおよびタンデムＭＳにより分析した。各場合に、タンデム質量分光法により、本発明人等は、線状種を容易にシーケンシング氏得た。さらに、検出可能なＣｙｓ含有分子のすべてが、環状型であった。さらに、式１個Ａのペプトイドも、同様の方法で調製した。
【０３１２】
図３Ａ〜Ｃに示した５つのペプトイドの連続希釈を、ペギル化マレイミド活性化顕微鏡スライドグラス上に、自動操縦でスポットし（Marthandan et al., 2005）、次に、スライドを自動操縦で洗浄した。環状ペプトイドの固定化を実証するために、スライドをＣｙ３標識化ストレプトアビジンとともにインキュベートして、走査した。予測どおり、捕捉されるタンパク質の量は、スポットされたペプトイドの量が低減すると、低減したが、これは、蛍光が、実際に、ペプトイドによるタンパク質の特異的捕捉のためであることを確証している（図３Ｂ）。Ｃｙｓ残基がマレイミド誘導体化スライドに環状ペプトイドを保持することを実証するために、Ｃｙｓの存在および非存在に関する以外は同一である２つのフルオレセイン共役線状ペプトイドを、本発明人等は合成した。コレラをスライド上にスポットし、次いで、洗浄後に走査した。図３Ｃに示したように、Ｃｙｓ含有ペプトイドがスポットされた場合にのみ、検出可能蛍光を観察した。この試験は、それとＣｙｓ含有環状分子の混合物がスライド上にスポットされる場合には、洗浄コード分子（図１参照）がスライド上に保持されず、したがって、スクリーニング実験を妨げない、ということを確証する。
実施例２
【０３１３】
ＥＡＥにおける特異的自己反応性Ｔ細胞に関するスクリーニング    式１の抗原代用物を用い、そしてＴ細胞リガンドを用いる併用療法の目的のために、以下の実験を提供する。多発性硬化症（ＭＳ）（Noseworthy et al., 2000）  −  ミエリンタンパク質またはペプチドでの免疫化により、あるいはミエリン特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の受身移入により（Zamvil and Steinman, 1990）、齧歯類の遺伝的感受性系統にＥＡＥの同様の症状を誘導する。末梢で活性化されるようになった、そして前炎症性サイトカインを産生するミエリン特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭＳの疾患病因に大きな役割を果たす、ということをＥＡＥにおける試験は示す（Zamvil and Steinman, 1990）。さらに、これらのＴ細胞は、罹患個体の中枢神経系においてミエリン塩基性タンパク質を選択的に認識して、ミエリン鞘の破壊を、そして最終的には神経学的欠陥をもたらす、と考えられるＴ細胞受容体を発現する（Zamvil and Steinman, 1990）。したがって、自己反応性Ｔ細胞のみを特異的に標的にする治療戦略は、ＭＳに関して、ならびにその他のＴ細胞媒介性疾患に関して研究するために興味深い。第一ステップとして、本発明人等は、ＥＡＥにおいて自己反応性Ｔ細胞と高度に特異的結合を可能にする合成化合物の単離に集中した。
【０３１４】
これを成し遂げるために、高特異性で内在性膜受容体と結合するペプトイドの単離のための彼等の研究室で以前に開発されたスクリーニング戦略（Simon et al., 1992）を本発明人等は適合した（Udugamasooriya
et al., 2008）。このプロトコールでは、標的受容体を発現するまたは発現しないが、しかし他の点では同一であると思われる細胞を、赤色および緑色量子ドットでそれぞれ標識する。次いで、２つの細胞型を混合し、その各々が独特のペプトイドを表示する数千の親水性ビーズとともにインキュベートする。次に、赤色標識細胞のみを結合し、緑色細胞を結合しないビーズを収集する。緑色細胞を排除し、「ヒット」とスコアされるために、細胞表面のすべての他の分子をペプトイドは無視しなければならないため、標的受容体と高度に特異的に結合することをこれは反映していると推測される（図１Ａ）。
【０３１５】
この２色スクリーニング技法を本発明の問題に当てはめるために、ミエリン塩基性タンパク質ペプチドＡｃｌ−１１（ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１）で免疫化することにより、ＥＡＥをＢ１０.ＰＬますに誘導した。このミエリンペプチドでの免疫化は、ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１特異的Ｖα２．３／Ｖβ８．２  ＴＣＲを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化および拡大を生じる（Ando et al., 1989）。臨床的に明白なＥＡＥの発症後、ＥＡＥおよび健常対照マウスを屠殺し（図５Ａ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。ＥＡＥマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞を、赤色発光量子ドットで標識し、対照マウスからのＴ細胞を緑色発光量子ドットで標識した。次いで、細胞を１：１の比で一緒に混合し、約３００，０００ペプトイドを含有するビーズ表示ペプトイドライブラリーとともにインキュベートした（図５Ｂ）。全集団における数百万の異なるＴ細胞はすべて低レベルで存在するはずであり、２つの集団はかなり類似している、と本発明人等は仮定した。主な違いは、ＥＡＥマウスにおいて自己抗原による免疫化に応答して拡大したＭＢＰ  Ａｃｌ−１１特異的自己反応性Ｔ細胞の数増大である。これは、ビーズが赤色細胞のみを結合することが判明した場合、これらは自己反応性Ｔ細胞であると大いに思われる、ということを示唆した（図１Ａ）。
【０３１６】
ペプトイドビーズとともにインキュベートした後、ＥＡＥマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞と特異的に結合するが、健常対照マウスからのＴ細胞とは結合しないことが観察された２つの推定ヒットペプトイドを、本発明人等は同定した（図１Ｂ、パネルｉおよびｉｉ）。ＥＡＥマウスおよび健常対照マウスの両方からのＣＤ４＋Ｔ細胞と非特異的に結合したペプトイドビーズを示している付加的写真が示されている（図１Ｂ、パネルｉｉｉ）。ヒットとスコアされた２つのビーズ上のペプトイドを、エドマン分解によりシーケンシングし（Alluri et al., 2003）、そしてそれらの推定構造を図１Ｃに示す。２つの「ヒット」は、何らかの配列類似性を有することが判明した。より詳細な特性化のために、本発明人等は、ペプトイドのうちの１つ（ＡＧ１２Ａ）に集中することに決定した。
【０３１７】
ＡＧ１２ＡペプトイドはＥＡＥ自己反応性Ｔ細胞に関するリガンドである。    ＡＧ１２Ａが自己反応性ＴＣＲと結合しているた否かを確定するために、トランスジェニックマウスの存在を本発明人等は利用したが、この場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞の大多数は、ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１特異的ＴＣＲ（Ｖα２．３／Ｖβ８．２  ＴＣＲ）を発現する（Goverman et al., 1993）。ＣＤ４＋Ｔ細胞をこれらのマウスから単離し、ＡＧ１２Ａとの結合に関して試験した。これを、いくつかの方法で実行した。先ず、ＡＧ１２Ａを、Ｔ細胞リガンドとして選択されない対照ペプトイドの場合と同様に、ビーズ上で再合成した（図６）。次に、ビーズを赤色量子ドット標識Ｔ細胞とともにインキュベートした。図１Ｄに示したように、ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１  ＴＣＲトランスジェニックマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、野生型ＣＤ４＋Ｔ細胞が結合しなかったような、ビーズ上に表示されたＡＧ１２Ａと結合した（図１Ｄ）。
【０３１８】
ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１特異的Ｔ細胞とのＡＧ１２Ａの結合をさらに精査するために、おるときノン中間体への、ペプトイドに付着されたジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）の酸化を包含する化学的架橋実験を本発明人等は実施した。この中間体は、次に、標的受容体タンパク質上の隣接求核性残基と架橋視得る（Burdine et al., 2004; Liu et al., 2006 ;Lim et al., 2007）。この化学は、それらが複合体でない限り、分子をカップリングしない、ということを広範な対照実験は示しているため、ＤＯＰＡ−ＡＧ１２Ａおよび受容体標的が近接している場合にのみ、架橋は観察される（Liu et al., 2006）。Ｖα２．３／Ｖβ８．２  ＴＣＲトランスジェニックマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞を、漸増濃度のビオチン標識化ＤＯＰＡ−ＡＧ１２Ａまたはビオチンで標識された対照ＤＯＰＡ−ペプトイドとともにインキュベートした。過ヨウ素酸ナトリウムで処理した後、次に細胞を蛍光色素共役ストレプトアビジン、ならびに異なる蛍光色素と共役された抗ＣＤ４＋抗体で染色した。ＣＤ４＋／ストレプトアビジン＋細胞の平均蛍光強度を算定することにより、Ｔ細胞と結合しているペプトイドを査定した。ＡＧ１２Ａは、約４０μＭのＫＤで、ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１特異的Ｔ細胞と結合することが判明した（図２Ａ〜Ｂ）。しかしながら、ビオチニル化ＡＧ１２Ａと野生型マウスから得たＴ細胞との間の相互関係は検出されず、ビオチニル化対照ペプトイドも、Ｖα２．３／Ｖβ８．２  ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞と結合しなかった（図２Ｂ）。
【０３１９】
ニュートラアビジンウマホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＮＡ−ＨＲＰ）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより、ペプトイド−細胞相互作用も分析した。ビオチン−ＤＯＰＡ−ＡＧ１２ＡをＴＣＲトランスジェニックＴ細胞とともにインキュベートした場合に、４５ｋＤａの見掛けの質量を有するビオチン含有生成物を検出した。が、しかし野生型マウスからのＣＤ４−またはＣＤ４＋Ｔ細胞を用いた場合は検出されなかった（図２Ｃ）。ＴＣＲαおよびβ鎖の分子量は、それぞれ約４５および４０ｋＤａであった（Zamvil and Steinman, 1990）が、これは、ＡＧ１２ＡとＴＣＲとの架橋を示唆している。さらに、α−Ｖα２  ＴＣＲ抗体でブロットを精査した場合、ＮＡ−ＨＲＰで検出された帯域と重複する約４５ｋＤａで生成物を観察したが、これはさらに、ＡＧ１２ＡがＭＢＰ  Ａｃｌ−１１特異的ＴＣＲと架橋することを示唆している（図２Ｃ）。
【０３２０】
ＡＧ１２Ａは抗原媒介性自己反応性Ｔ細胞増殖の特異的アンタゴニストである。    ペプトイド−ＴＣＲ結合が抗原特異的Ｔ細胞増殖を拮抗し得る、という可能性を試験するために、ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１  ＴＣＲトランスジェニックマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞を、漸増濃度のＡＧ１２Ａまたは対照ペプトイドとともにインキュベートし、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１ペプチドおよび抗原提示細胞で刺激した。ＣＳＦＥは、エステル形態デ細胞透過性であるが、しかしこれらの基は、化合物が一旦細胞に進入すると加水分解されて、それを細胞不透過性にする。したがって、細胞分裂は、蛍光団の細胞内濃度の希釈を生じる。５日間インキュベーション後、フローサイトメトリーを用いて細胞分裂を測定した。ＡＧ１２Ａは、約６０〜８０μＭのＩＣ５０で、用量依存的に、ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１自己反応性Ｔ細胞の増殖を抑制することが判明した（図３Ａ）。この増殖低減は、トランスジェニックＴ細胞を対照ペプトイドの存在下で刺激した場合には観察されなかった（図３Ａ）し、ＡＧ１２ＡもＢ細胞の増殖を抑制しなかった（図３Ｂ）。最も重要なことは、ＡＧ１２Ａは、ミエリン乏突起神経膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）３５〜５５特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の抗原刺激性増殖も抑制しなかった（図３Ｃ）、ということである。この実験は、ＡＧ１２Ａの作用が、ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１抗原を認識するＴ細胞に特異的であり、任意の活性化Ｔ細胞に関する何らかの一般的親和性によるものではない、ということを明白に実証している。
【０３２１】
ルテニウム−ペプトイド複合体を用いた自己反応性Ｔ細胞のex vivo不活性化    ＡＧ１２Ａにより示される４０ミクロンＭ  ＩＣ５０より良好な効力を有するアンタゴニスト（主なスクリーニングヒットの典型（Kodadek et al., 2004））は、実用のために望ましい。これを達成するために、ＡＧ１２Ａを、可視光とともに放射される場合に一重項酸素の生成のための効率的触媒であるルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピドリジル複合体と共役させた（Lee et al., 2008）。一重項酸素は、ほとんどのタンパク質を修飾し、不活性化する高反応性種であるが、これは、４０〜８０Åに過ぎない限定拡散半径を有する。したがって、ルテニウム「弾頭」の隣接周辺におけるタンパク質のみが影響を及ぼされる。ペプトイドリガンドにより標的タンパク質に送達されると、高特異的光誘発性タンパク質不活性化が達成される（Lee et al., 出版用に提出済み）。ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を、漸増濃度のＡＧ１２Ａ−ルテニウム複合体（図４Ａ）または対照ペプトイド−ルテニウム複合体（図６）とともにインキュベートして、細胞に可視光（＜３８０ｎｍカットオフフィルター）を照射した。１０分間照射後、細胞を、抗原提示細胞の存在下で、自己抗原ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１で活性化した。トリチウム化チミジン検定を用いて、細胞増殖を査定した。図４Ｂに示すように、ＡＧ１２Ａ−ルテニウム複合体は、１００ｎＭの濃度で、ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１特異的自己反応性Ｔ細胞の増殖を強力に抑制した（図４Ｂ）。これは、ペプトイド単独の活性を上回る訳７００倍の改善を表す。この抑制は、ＭＯＧ３５−５５ＴＣＲトランスジェニックマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞を用いた場合には観察されなかった（図４Ｃ）が、これも、ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１特異的自己反応性Ｔ細胞に関するＡＧ１２Ａの特異性を実証している。
【０３２２】
細胞を取り出し、光活性薬剤で処理し、紫外線に曝露して、患者に再注入し戻す循環光療法が存在する（Rostami et al., 1999; Besnier et al., 2002; Cavaletti et al., 2006）。したがって、ルテニウムトリス−ビピリジル−触媒化一重項酸素産生を誘発するために必要とされる青色光は生きている生物体に浸透できないが、しかしペプトイド−ルテニウム複合体による自己免疫性Ｔ細胞のex vivo不活性化は、実現可能な先例であると思われる。この理論を試験し、自己反応性Ｔ細胞がペプトイド−ルテニウム複合体および光による処置後に非応答性にされたことを確証するために、ＥＡＥの養子移入モデルを、本発明人等は用いた。ＣＤ４＋Ｔ細胞をＭＢＰ  Ａｃｌ−１１  ＴＣＲトランスジェニックマウスから単離し、ＡＧ１２Ａ−ルテニウム複合体または対照ペプトイド−ルテニウム複合体で処理し、照射し、抗原提示細胞の存在下でＭＢＰ  Ａｃｌ−１１ペプチドで刺激し、ナイーブレシピエントに注入し戻した。次に、これらの動物を、ＥＡＥの臨床徴候に関して観察した。予想通り、対照ペプトイド−ルテニウム複合体または無ペプトイドに曝露されていた抗原刺激自己反応性Ｔ細胞を注入された動物は、ＥＡＥを発症した（図４Ｄ）。Ｔ細胞が抗原で刺激されず、ペプトイドにも曝露されなかった場合、養子移入は、予想通り、いいＡＥを生じなかった。留意すべきは、抗原で刺激され、ＡＧ１２Ａ−ルテニウム複合体で処置されたＭＢＰ  Ａｃｌ−１１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞がレシピエント動物においてＥＡＥを誘導しなかった、ということである（図４Ｄ）。この実験は、ex vivoでの自己免疫性Ｔ細胞活性化の強力な光誘導性阻害剤としての自己反応性Ｔ細胞標的化ルテニウムペプトイド複合体の使用の実現可能性を実証している。
実施例３  −  尋常性天疱瘡
【０３２３】
本明細書中に記載される一般的方法に従って、アレイ上の１０，０００環状ペプトイドのライブラリーを生成した。ライブラリーを、標識化（または非標識化）天疱瘡自己抗体に対してスクリーニングして、あるリガンドが、支持体上の自己抗体と結合することが判明した。自己抗体は、例えば、Ding et al., "The Anti-Desmoglein 1 Autoantibodies in Pemphigus Vlugaris Sera are Pathogenic", The Journal of Investigative Dermatology,
vol 1 12, No. 5, pp739-743 ( 1999)に記載されているように、親和性精製抗デスモグレイン３自己抗体を得るために、デスモグレイン３の可溶性組換え細胞外ドメインを用いて、尋常性天疱瘡（ＰＶ）を有する患者の血清から得られる。特定のリガンドに関連する結合自己抗体を検出し、次いで、アレイ上のその位置から、抗原代用物の同一性を確定した。抗原代用物として作用する好ましい環状ペプトイドは、Ｒ１〜Ｒ５で置換される５−ｍｅｒを含むが、この場合、Ｒ１〜Ｒ５は、独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−ＯＨ、−ＯＲ（ここで、ＲはＣ１〜Ｃ６アルキルである）、−ＮＲ５Ｒ６から選択される少なくとも１つの部分で置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル；アリールまたはヘテロアリール、あるいはハロゲン、ＣＦ３、−ＯＨまたは−ＯＲから選択される少なくとも１つの部分で置換されるアリールまたはヘテロアリールからなる群から選択される。
【０３２４】
好ましい抗原代用物は、式Ｉの化合物を含む：
【化５】
2014504594.tif 000009
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、一般的に上記と同様であり、具体的には、右の構造で示される（化合物１ａ））。この化合物は、尋常性天疱瘡に関する自己抗体に関するリガンドである。上記の化合物は、Ｄｓｇ自己抗原に対する尋常性天疱瘡自己抗体に対して約１０−５Ｍの溶液中での結合親和性を有した。本明細書中に記載される手法に従って見出される付加的オリゴマーは、１０−５〜１０−９Ｍの溶液中での結合親和性（ＫＤ）を有する、と考えられる。この実施例では、支持体上の１０，０００の環状ペプトイドを、既知の尋常性天疱瘡自己抗体（Ｄｓｇ３）に対してスクリーニングして、好ましいヒットを見出したが、これは、溶液中の結合試験では、１０−５の結合親和性を有した。
実施例４  −  考察
【０３２５】
尋常性天疱瘡および／または落葉性天疱瘡のような自己免疫性疾患または症状に関する自己抗体と結合する合成分子を産生し得る組合せライブラリースクリーニングプロトコールを、本発明人等はここで実証した。尋常性天疱瘡および落葉性天疱瘡に関する自己抗原としては、それぞれデスモグレイン３およびデスモグレイン１が挙げられる。これらの自己抗原の各々に対する自己抗体は、抗デスモグレイン１（落葉性天疱瘡において病原性）および抗デスモグレイン３（尋常性天疱瘡において病原性）と呼ばれ、多数の変異体を含む。抗デスモグレイン１抗体は、尋常性天疱瘡でも見出される。したがって、本発明は、本明細書中で同定されるスクリーニングプロトコールを用いて自己免疫性疾患または障害に関連した自己抗体に対する高親和性リガンドを同定する方法を包含する。これらのリガンドは、高特異性を有する抗原特異性自己免疫性Ｔ細胞に対するリガンドと組合せても用いられ得る。
＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊                              
【０３２６】
本明細書中に開示され、特許請求される組成物および方法はすべて、本発明の開示にかんがみて、過度の実験を必要とせずに、製造され得るし、実行され得る。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して記載してきたが、本発明の概念、精神および範囲を逸脱しない限り、組成物および方法に対して、ならびに本明細書中に記載される方法のステップ、または一連のステップにおいて、変更が適用され得ることは、当業者には明らかである。さらに具体的には、化学的および生理学的に関連するある作用物質は、同一のまたは類似の結果が達成される一方で、本明細書に記載される作用物質に置換され得ることは、明らかである。当業者に明らかなこのような類似の置換基および修飾はすべて、添付の特許請求の範囲により定義されるように、本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると思われる。
ＶＩ．  参考文献
【０３２７】
以下の参考文献は、本明細書中に記述されるものを補足する例示手法的なまたは他の詳細をそれらが提供する程度に、参照により本明細書中で具体的に援用される。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年3月14日(2012.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
以下の図は、本明細書の一部を構成し、そして本発明のある態様をさらに実証するために包含される。本発明は、本明細書中に示される具体的実施形態の詳細な説明と組合せて、これらの図のうちの１つ以上を参照することにより、より良好に理解され得る。
【図１】各ビーズが環状ペプトイドおよび類似の線状コード鎖を保有するライブラリーを作成するために用いられる一般的戦略の模式図である。
【図２】１ビーズ２化合物戦略によるコード化環状ペプトイドライブラリーの合成。サブモノマーペプトイド合成に用いられるアミンを、図の下部に示す（１，４−ジアミノブタン中のアミンの１つ、およびエタノールアミン中のヒドロキシル基が保護された）。
【図３】マレイミド活性化スライドガラスへのＣｙｓ含有環状ペプトイドの付着（図３Ａ）。チオール側鎖の切断および脱保護化の前に各ビーズ上に作られる環状および線状分子の一般的構造。下段：スポッティング実験のために生成された５つのペプトイドの可変領域の配列（図３Ｂ）。５つのペプトイドの各々が活性化表面にスポットされているマイクロアレイの蛍光画像。各ペプトイドのＤＭＳＯ溶液（≒２ｍＭ）を２回スポットして、溶液を３倍希釈し、再びスポットして、という手順を実行した。洗浄および乾燥後、アレイをＣｙ３共役化ストレプトアビジンとハイブリダイズして、洗浄し、スライドを蛍光スキャナで走査した（詳細に関しては参考文献３０参照）。スポットは、擬似色の緑である（図３Ｃ）。Ｃｙｓは、マイクロアレイ上のペプトイドの保持に不可欠である。２つのペプトイドを合成した。各々が、配列：フルオレセイン−Ｎｌｙｓ−Ｎｓｅｒ−Ｎｌｅｕ−Ｎｓｅｒ−Ｎａｌｌ−Ｎｐｉｐ−Ｎｌｙｓ−Ｎｌｙｓを有した。１つのペプトイドはＣ末端システインも含有したが、しかし他のものは含有しなかった。２つのペプトイドを、マレイミド活性化スライドガラス上にスポットした。洗浄後、スライドを蛍光スキャナを用いて走査した。蛍光強度は、擬似色の青である。
【図４】ビーズ上でのモデルペプトイドの環化反応。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１４】
これを成し遂げるために、高特異性で内在性膜受容体と結合するペプトイドの単離のための彼等の研究室で以前に開発されたスクリーニング戦略（Simon et al., 1992）を本発明人等は適合した（Udugamasooriya et al., 2008）。このプロトコールでは、標的受容体を発現するまたは発現しないが、しかし他の点では同一であると思われる細胞を、赤色および緑色量子ドットでそれぞれ標識する。次いで、２つの細胞型を混合し、その各々が独特のペプトイドを表示する数千の親水性ビーズとともにインキュベートする。次に、赤色標識細胞のみを結合し、緑色細胞を結合しないビーズを収集する。緑色細胞を排除し、「ヒット」とスコアされるために、細胞表面のすべての他の分子をペプトイドは無視しなければならないため、標的受容体と高度に特異的に結合することをこれは反映していると推測される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１５】
この２色スクリーニング技法を本発明の問題に当てはめるために、ミエリン塩基性タンパク質ペプチドＡｃｌ−１１（ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１）で免疫化することにより、ＥＡＥをＢ１０.ＰＬますに誘導した。このミエリンペプチドでの免疫化は、ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１特異的Ｖα２．３／Ｖβ８．２  ＴＣＲを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化および拡大を生じる（Ando et al., 1989）。臨床的に明白なＥＡＥの発症後、ＥＡＥおよび健常対照マウスを屠殺し、ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。ＥＡＥマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞を、赤色発光量子ドットで標識し、対照マウスからのＴ細胞を緑色発光量子ドットで標識した。次いで、細胞を１：１の比で一緒に混合し、約３００，０００ペプトイドを含有するビーズ表示ペプトイドライブラリーとともにインキュベートした。全集団における数百万の異なるＴ細胞はすべて低レベルで存在するはずであり、２つの集団はかなり類似している、と本発明人等は仮定した。主な違いは、ＥＡＥマウスにおいて自己抗原による免疫化に応答して拡大したＭＢＰ  Ａｃｌ−１１特異的自己反応性Ｔ細胞の数増大である。これは、ビーズが赤色細胞のみを結合することが判明した場合、これらは自己反応性Ｔ細胞であると大いに思われる、ということを示唆した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１６】
ペプトイドビーズとともにインキュベートした後、ＥＡＥマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞と特異的に結合するが、健常対照マウスからのＴ細胞とは結合しないことが観察された２つの推定ヒットペプトイドを、本発明人等は同定した。ＥＡＥマウスおよび健常対照マウスの両方からのＣＤ４＋Ｔ細胞と非特異的に結合したペプトイドビーズを示している付加的写真が示されている。ヒットとスコアされた２つのビーズ上のペプトイドを、エドマン分解によりシーケンシングし（Alluri et al., 2003）、そしてそれらの構造を決定した（データは図示せず）。２つの「ヒット」は、何らかの配列類似性を有することが判明した。より詳細な特性化のために、本発明人等は、ペプトイドのうちの１つ（ＡＧ１２Ａ）に集中することに決定した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１７】
ＡＧ１２ＡペプトイドはＥＡＥ自己反応性Ｔ細胞に関するリガンドである。    ＡＧ１２Ａが自己反応性ＴＣＲと結合しているた否かを確定するために、トランスジェニックマウスの存在を本発明人等は利用したが、この場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞の大多数は、ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１特異的ＴＣＲ（Ｖα２．３／Ｖβ８．２  ＴＣＲ）を発現する（Goverman et al., 1993）。ＣＤ４＋Ｔ細胞をこれらのマウスから単離し、ＡＧ１２Ａとの結合に関して試験した。これを、いくつかの方法で実行した。先ず、ＡＧ１２Ａを、Ｔ細胞リガンドとして選択されない対照ペプトイドの場合と同様に、ビーズ上で再合成した。次に、ビーズを赤色量子ドット標識Ｔ細胞とともにインキュベートした。ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１  ＴＣＲトランスジェニックマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、野生型ＣＤ４＋Ｔ細胞が結合しなかったような、ビーズ上に表示されたＡＧ１２Ａと結合した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１８】
ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１特異的Ｔ細胞とのＡＧ１２Ａの結合をさらに精査するために、おるときノン中間体への、ペプトイドに付着されたジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）の酸化を包含する化学的架橋実験を本発明人等は実施した。この中間体は、次に、標的受容体タンパク質上の隣接求核性残基と架橋視得る（Burdine et al., 2004; Liu et al., 2006 ;Lim et al., 2007）。この化学は、それらが複合体でない限り、分子をカップリングしない、ということを広範な対照実験は示しているため、ＤＯＰＡ−ＡＧ１２Ａおよび受容体標的が近接している場合にのみ、架橋は観察される（Liu et al., 2006）。Ｖα２．３／Ｖβ８．２  ＴＣＲトランスジェニックマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞を、漸増濃度のビオチン標識化ＤＯＰＡ−ＡＧ１２Ａまたはビオチンで標識された対照ＤＯＰＡ−ペプトイドとともにインキュベートした。過ヨウ素酸ナトリウムで処理した後、次に細胞を蛍光色素共役ストレプトアビジン、ならびに異なる蛍光色素と共役された抗ＣＤ４＋抗体で染色した。ＣＤ４＋／ストレプトアビジン＋細胞の平均蛍光強度を算定することにより、Ｔ細胞と結合しているペプトイドを査定した。ＡＧ１２Ａは、約４０μＭのＫＤで、ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１特異的Ｔ細胞と結合することが判明した。しかしながら、ビオチニル化ＡＧ１２Ａと野生型マウスから得たＴ細胞との間の相互関係は検出されず、ビオチニル化対照ペプトイドも、Ｖα２．３／Ｖβ８．２  ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞と結合しなかった。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１９】
ニュートラアビジンウマホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＮＡ−ＨＲＰ）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより、ペプトイド−細胞相互作用も分析した。ビオチン−ＤＯＰＡ−ＡＧ１２ＡをＴＣＲトランスジェニックＴ細胞とともにインキュベートした場合に、４５ｋＤａの見掛けの質量を有するビオチン含有生成物を検出した。が、しかし野生型マウスからのＣＤ４−またはＣＤ４＋Ｔ細胞を用いた場合は検出されなかった。ＴＣＲαおよびβ鎖の分子量は、それぞれ約４５および４０ｋＤａであった（Zamvil and Steinman, 1990）が、これは、ＡＧ１２ＡとＴＣＲとの架橋を示唆している。さらに、α−Ｖα２  ＴＣＲ抗体でブロットを精査した場合、ＮＡ−ＨＲＰで検出された帯域と重複する約４５ｋＤａで生成物を観察したが、これはさらに、ＡＧ１２ＡがＭＢＰ  Ａｃｌ−１１特異的ＴＣＲと架橋することを示唆している。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２０】
ＡＧ１２Ａは抗原媒介性自己反応性Ｔ細胞増殖の特異的アンタゴニストである。    ペプトイド−ＴＣＲ結合が抗原特異的Ｔ細胞増殖を拮抗し得る、という可能性を試験するために、ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１  ＴＣＲトランスジェニックマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞を、漸増濃度のＡＧ１２Ａまたは対照ペプトイドとともにインキュベートし、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１ペプチドおよび抗原提示細胞で刺激した。ＣＳＦＥは、エステル形態デ細胞透過性であるが、しかしこれらの基は、化合物が一旦細胞に進入すると加水分解されて、それを細胞不透過性にする。したがって、細胞分裂は、蛍光団の細胞内濃度の希釈を生じる。５日間インキュベーション後、フローサイトメトリーを用いて細胞分裂を測定した。ＡＧ１２Ａは、約６０〜８０μＭのＩＣ５０で、用量依存的に、ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１自己反応性Ｔ細胞の増殖を抑制することが判明した。この増殖低減は、トランスジェニックＴ細胞を対照ペプトイドの存在下で刺激した場合には観察されなかったし、ＡＧ１２ＡもＢ細胞の増殖を抑制しなかった。最も重要なことは、ＡＧ１２Ａは、ミエリン乏突起神経膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）３５〜５５特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の抗原刺激性増殖も抑制しなかった、ということである。この実験は、ＡＧ１２Ａの作用が、ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１抗原を認識するＴ細胞に特異的であり、任意の活性化Ｔ細胞に関する何らかの一般的親和性によるものではない、ということを明白に実証している。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２１】
ルテニウム−ペプトイド複合体を用いた自己反応性Ｔ細胞のex vivo不活性化    ＡＧ１２Ａにより示される４０ミクロンＭ  ＩＣ５０より良好な効力を有するアンタゴニスト（主なスクリーニングヒットの典型（Kodadek et al., 2004））は、実用のために望ましい。これを達成するために、ＡＧ１２Ａを、可視光とともに放射される場合に一重項酸素の生成のための効率的触媒であるルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピドリジル複合体と共役させた（Lee et al., 2008）。一重項酸素は、ほとんどのタンパク質を修飾し、不活性化する高反応性種であるが、これは、４０〜８０Åに過ぎない限定拡散半径を有する。したがって、ルテニウム「弾頭」の隣接周辺におけるタンパク質のみが影響を及ぼされる。ペプトイドリガンドにより標的タンパク質に送達されると、高特異的光誘発性タンパク質不活性化が達成される（Lee et al., 出版用に提出済み）。ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を、漸増濃度のＡＧ１２Ａ−ルテニウム複合体または対照ペプトイド−ルテニウム複合体とともにインキュベートして、細胞に可視光（＜３８０ｎｍカットオフフィルター）を照射した。１０分間照射後、細胞を、抗原提示細胞の存在下で、自己抗原ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１で活性化した。トリチウム化チミジン検定を用いて、細胞増殖を査定した。ＡＧ１２Ａ−ルテニウム複合体は、１００ｎＭの濃度で、ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１特異的自己反応性Ｔ細胞の増殖を強力に抑制した。これは、ペプトイド単独の活性を上回る訳７００倍の改善を表す。この抑制は、ＭＯＧ３５−５５ＴＣＲトランスジェニックマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞を用いた場合には観察されなかったが、これも、ＭＢＰ  Ａｃｌ−１１特異的自己反応性Ｔ細胞に関するＡＧ１２Ａの特異性を実証している。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２２】
細胞を取り出し、光活性薬剤で処理し、紫外線に曝露して、患者に再注入し戻す循環光療法が存在する（Rostami et al., 1999; Besnier et al., 2002; Cavaletti et al., 2006）。したがって、ルテニウムトリス−ビピリジル−触媒化一重項酸素産生を誘発するために必要とされる青色光は生きている生物体に浸透できないが、しかしペプトイド−ルテニウム複合体による自己免疫性Ｔ細胞のex vivo不活性化は、実現可能な先例であると思われる。この理論を試験し、自己反応性Ｔ細胞がペプトイド−ルテニウム複合体および光による処置後に非応答性にされたことを確証するために、ＥＡＥの養子移入モデルを、本発明人等は用いた。ＣＤ４＋Ｔ細胞をＭＢＰ  Ａｃｌ−１１  ＴＣＲトランスジェニックマウスから単離し、ＡＧ１２Ａ−ルテニウム複合体または対照ペプトイド−ルテニウム複合体で処理し、照射し、抗原提示細胞の存在下でＭＢＰ  Ａｃｌ−１１ペプチドで刺激し、ナイーブレシピエントに注入し戻した。次に、これらの動物を、ＥＡＥの臨床徴候に関して観察した。予想通り、対照ペプトイド−ルテニウム複合体または無ペプトイドに曝露されていた抗原刺激自己反応性Ｔ細胞を注入された動物は、ＥＡＥを発症した。Ｔ細胞が抗原で刺激されず、ペプトイドにも曝露されなかった場合、養子移入は、予想通り、いいＡＥを生じなかった。留意すべきは、抗原で刺激され、ＡＧ１２Ａ−ルテニウム複合体で処置されたＭＢＰ  Ａｃｌ−１１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞がレシピエント動物においてＥＡＥを誘導しなかった、ということである。この実験は、ex vivoでの自己免疫性Ｔ細胞活性化の強力な光誘導性阻害剤としての自己反応性Ｔ細胞標的化ルテニウムペプトイド複合体の使用の実現可能性を実証している。
実施例３  −  尋常性天疱瘡
【手続補正１１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己抗体により特異的に認識される抗原代用物リガンドの同定方法であって、（１）尋常性天疱瘡から選択される自己免疫疾患に関連した自己抗体をリガンドライブラリーに曝露すること；（２）自己抗体と結合される少なくとも１つのリガンドを検出すること；そして（３）前記結合リガンドを同定することを包含する方法。
【請求項２】
前記リガンドが３−ｍｅｒ、４−ｍｅｒ、５−ｍｅｒ、６−ｍｅｒ、７−ｍｅｒ、８−ｍｅｒ、９−ｍｅｒまたは１０−ｍｅｒである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記リガンドが支持体と結合される請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記支持体がビーズ、チップ、フィルター、計量棒、膜、ポリマーマトリックスまたはウェルである請求項３記載の方法。
【請求項５】
抗原代用物で自己免疫疾患を有する患者を処置する方法であって、前記抗原代用物が請求項１記載の方法に従って同定されるリガンドを含む方法。
【請求項６】
次式：
【化１】
2014504594.tif 000034
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、独立して、水素；アルキル；アリル；メチル；エチル；ｎ−プロピル；イソプロピル；ｎ−ブチル；イソブチル；ｓｅｃ−ブチル；ｔｅｒｔ−ブチル；ペンチル；ヘキシル；イソペンチル；アリール；ヘテロアリール；フラニル；インドリル；チオフェニル；チアゾリル；イミダゾリル；イソキサゾイル；オキサゾイル；ピペロニル；ピラゾイル；ピロリル；ピラジニル；ピリジル；ピリミジル；ピリミジニル；プリニル；シンノリニル；ベンゾフラニル；ベンゾチエニル；ベンゾトリアゾリル；ベンゾキサゾリル；キノリン；イソキサゾリル；イソキノリン；シクロアルキル；アルケニル；シクロアルケニル；フェニル；ピリジル；メトキシエチル；（Ｒ）−メチルベンジル；Ｃ１−Ｃ６アルキル（これらの各々は、独立して、置換されないか、あるいはハロゲン（ＣＩ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ）、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＯＣｌ−Ｃ６アルキルまたは−ＳＨで置換され得る）；Ｃ２−Ｃ６アルキニル（置換されないか、またはＮＨ２；ＯＨまたはＳＨで置換される）から選択される）
の抗原代用物、またはその製薬上許容可能な塩。
【請求項７】
次式：
【化２】
2014504594.tif 000035
の請求項６記載の抗原代用物、またはその製薬上許容可能な塩。
【請求項８】
式Ｉの抗原代用物、および任意に次式：
【化３】
2014504594.tif 000036
（式中、ｎは０〜８であり；Ｌはリンカーであり；Ｙは毒素または抗体断片であり；ＺはＮＨ２、Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）２、ＯＨまたはＯ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）であり；そしてＲｌ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８（４より大きいｎの各値に関しては、数字順に次のＲ基を式Ｉまたは式ＩＩに付加する）は、水素；アルキル；アリル；メチル；エチル；ｎ−プロピル；イソプロピル；ｎ−ブチル；イソブチル；ｓｅｃ−ブチル；ｔｅｒｔ−ブチル；ペンチル；ヘキシル；イソペンチル；アリール；ヘテロアリール；フラニル；インドリル；チオフェニル；チアゾリル；イミダゾリル；イソキサゾイル；オキサゾイル；ピペロニル；ピラゾイル；ピロリル；ピラジニル；ピリジル；ピリミジル；ピリミジニル；プリニル；シンノリニル；ベンゾフラニル；ベンゾチエニル；ベンゾトリアゾリル；ベンゾキサゾリル；キノリン；イソキサゾリル；イソキノリン；シクロアルキル；アルケニル；シクロアルケニル；フェニル；ピリジル；メトキシエチル；（Ｒ）−メチルベンジル；Ｃ１−Ｃ６アルキル（置換されないか、あるいはＮＨ２、ＯＨまたはＳＨで置換される）；Ｃ２−Ｃ６アルキニル（置換されないか、またはＮＨ２；ＯＨまたはＳＨで置換される）であり得る）
を有するペプトイドを含む診断キット。
【請求項９】
自己免疫疾患を有する患者の処置方法であって、自己免疫疾患に対する抗原代用物、および任意に自己免疫疾患関連Ｔ細胞選択的リガンドの投与を包含する方法。
【請求項１０】
前記抗原代用物が、次式：
【化４】
2014504594.tif 000037
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、独立して、水素；アルキル；アリル；メチル；エチル；ｎ−プロピル；イソプロピル；ｎ−ブチル；イソブチル；ｓｅｃ−ブチル；ｔｅｒｔ−ブチル；ペンチル；ヘキシル；イソペンチル；アリール；ヘテロアリール；フラニル；インドリル；チオフェニル；チアゾリル；イミダゾリル；イソキサゾイル；オキサゾイル；ピペロニル；ピラゾイル；ピロリル；ピラジニル；ピリジル；ピリミジル；ピリミジニル；プリニル；シンノリニル；ベンゾフラニル；ベンゾチエニル；ベンゾトリアゾリル；ベンゾキサゾリル；キノリン；イソキサゾリル；イソキノリン；シクロアルキル；アルケニル；シクロアルケニル；フェニル；ピリジル；メトキシエチル；（Ｒ）−メチルベンジル；Ｃ１−Ｃ６アルキル（これらの各々は、独立して、置換されないか、あるいはハロゲン（ＣＩ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ）、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＯＣｌ−Ｃ６アルキルまたは−ＳＨで置換され得る）；Ｃ２−Ｃ６アルキニル（置換されないか、またはＮＨ２；ＯＨまたはＳＨで置換される）から選択される）
の化合物、またはその製薬上許容可能な塩から選択される請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が、以下の：
【化５】
2014504594.tif 000038
またはその製薬上許容可能な塩から選択される請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
自己免疫障害を有する患者の処置方法であって、束縛オリゴマーから選択される抗原代用物を投与することを包含する方法。
【請求項１３】
前記自己免疫障害が尋常性天疱瘡から選択される請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記束縛オリゴマーがペプトイドまたはペプトイド様部分から選択される請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記自己免疫障害が尋常性天疱瘡から選択される請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
束縛オリゴマーからなる群から選択される抗原代用物、および製薬上許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項１７】
自己免疫Ｔ細胞により特異的に認識される束縛オリゴマーの同定方法であって、以下の：
（ａ）健常被験体からの第一Ｔ細胞集団を提供すること（ここで、前記集団は第一検出可能標識で標識される）；
（ｂ）自己免疫疾患または障害を疑われるかまたはそれを有する被験体からの第二Ｔ細胞集団を提供すること（ここで、前記集団は第二検出可能標識で標識される）；
（ｃ）前記第一および第二Ｔ細胞集団を、複数の束縛リガンドまたは束縛リガンドおよび非束縛リガンドの組合せと接触させること；そして
（ｄ）前記第一および第二Ｔ細胞集団と、前記束縛リガンドまたは束縛リガンドおよび非束縛リガンドの組合せとの結合を査定すること
を包含する方法。
【請求項１８】
前記自己免疫疾患または障害が尋常性天疱瘡である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
自己免疫疾患または障害に罹患している被験体から自己免疫Ｔ細胞を取り出す方法であって、以下の：
（ａ）自己免疫Ｔ細胞と特異的に結合する束縛リガンドを提供すること（ここで、前記束縛リガンドは支持体と結合される）；
（ｂ）自己免疫Ｔ細胞と前記支持体結合束縛リガンドとの結合を可能にするのに十分な時間の間、前記被験体からのＴ細胞含有試料を前記支持体結合束縛リガンドと接触させること；そして
（ｃ）前記試料から前記支持体を分離すること
を包含する方法。
【請求項２０】
ステップ（ｃ）の前記試料を前記被験体に戻すことをさらに包含する請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記自己免疫疾患または障害が尋常性天疱瘡である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
束縛オリゴマーを含む自己免疫疾患または症状の処置のためのワクチン。
【請求項２３】
自己免疫疾患または障害に罹患している被験体から得られる自己免疫Ｔ細胞の殺害方法であって、以下の：
（ａ）自己免疫Ｔ細胞と特異的に結合する束縛リガンドを提供すること（ここで、前記リガンドは毒素と共役される）；
（ｂ）少なくとも１つの自己免疫Ｔ細胞と前記共役体との結合を可能にするのに十分な時間の間、前記被験体からのＴ細胞含有試料を前記共役体と接触させること（ここで、前記共役体は前記自己免疫Ｔ細胞の死を引き起こす）
を包含する方法。
【請求項２４】
前記試料がex vivoで処置される請求項２３記載の方法であって、その試料を前記被験体に戻すことをさらに包含する方法。
【請求項２５】
前記自己免疫疾患または障害が尋常性天疱瘡である請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
自己免疫疾患または障害に罹患している被験体から得られる自己免疫Ｔ細胞の殺害方法であって、以下の：
（ａ）自己免疫Ｔ細胞と特異的に結合する束縛リガンドを提供すること（ここで、前記束縛リガンドはＩｇＧ  Ｆｃ含有分子と共役される）；そして
（ｂ）少なくとも１つの自己免疫Ｔ細胞と前記共役体との結合を可能にするのに十分な時間の間、自己免疫Ｔ細胞集団を前記共役体と接触させること（ここで、前記共役体は、前記自己免疫Ｔ細胞に免疫エフェクターを動員して、その死を引き起こす）
を包含する方法。
【請求項２７】
前記自己免疫Ｔ細胞集団がex vivoで処置される請求項２６記載の方法であって、前記試料を前記被験体に戻すことをさらに包含する方法。
【請求項２８】
前記自己免疫疾患または障害が尋常性天疱瘡である請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記束縛オリゴマーがペプトイドまたはペプトイド様部分である請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
前記ＩｇＧ  Ｆｃ含有分子が抗体、一本鎖抗体またはＦｃ断片である請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
前記ＩｇＧ  Ｆｃ含有分子が抗体または一本鎖抗体であり、そして前記束縛リガンドが前記抗体の抗原結合部位に繋ぎとめられる請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記ＩｇＧ  Ｆｃ含有分子がＩｇＧ可変領域を欠くＦｃ断片であり、そして前記束縛リガンドが前記Ｆｃ断片のカルボキシ末端に繋ぎとめられる請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
自己抗体により特異的に認識される抗原代用物リガンドの同定方法であって、（１）自己免疫疾患に関連した自己抗体を束縛リガンドライブラリーまたは束縛および非束縛リガンドを有する組合せライブラリーに曝露すること；（２）自己抗体と結合される少なくとも１つのリガンドを検出すること；そして（３）前記結合リガンドを同定することを包含する方法。
【請求項３４】
前記束縛リガンドおよび任意の非束縛リガンドが３−ｍｅｒ、４−ｍｅｒ、５−ｍｅｒ、６−ｍｅｒ、７−ｍｅｒ、８−ｍｅｒ、９−ｍｅｒまたは１０−ｍｅｒである請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記束縛リガンドおよび任意の非束縛リガンドが支持体と結合される請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
前記支持体がビーズ、チップ、フィルター、計量棒、膜、ポリマーマトリックスまたはウェルである請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
自己免疫疾患を有する患者を抗原代用物で処置する方法であって、前記抗原代用物が請求項３３記載の方法に従って同定されるリガンドを含む方法。
【請求項３８】
それを必要とする患者における特定の自己免疫疾患または障害の処置方法であって、以下の：
（ａ）特定の自己免疫疾患または症状に関連した特定自己抗体に対してリガンドライブラリーをスクリーニングして、高親和性リガンドを見出すステップ；
（ｂ）前記特定自己免疫疾患または障害に関連した前記特定自己抗体に対する高親和性リガンドを同定するステップ；
（ｃ）前記ライブラリーから前記高親和性リガンドを単離するステップ；そして
（ｄ）単離高親和性リガンドで前記患者を処置するステップ
を包含する方法。
【請求項３９】
前記特定自己免疫疾患または障害が尋常性天疱瘡である請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
請求項３８に従って同定される高親和性リガンドを含む薬学的組成物。
【請求項４１】
前記高親和性リガンドが束縛オリゴマーである請求項４０記載の組成物。
【請求項４２】
前記束縛オリゴマーがペプトイド、ペプトイド様部分または環状ペプトイドから選択される請求項４１記載の組成物。
【請求項４３】
特定の自己免疫疾患または障害に関連した自己抗体に対する高親和性リガンドの同定方法であって、（１）特定の自己免疫疾患または障害に関連した自己抗体を選択するステップ、（２）前記自己抗体に対してリガンドのライブラリーをスクリーニングするステップ、そして（３）前記自己抗体と選択的に結合する高親和性リガンドを同定するステップを包含する方法。
【請求項４４】
請求項４３に従って同定される高親和性リガンドを含む診断用キット。
【請求項４５】
特定の自己免疫疾患または障害を有する患者を併用療法で処置する方法であって、（ａ）前記特定自己免疫疾患または障害に関連した自己抗体に関する特異性を有する薬学的有効量の高親和性リガンド、および（ｂ）前記特定自己免疫疾患または障害に関連したＴ細胞に関する特異性を有する薬学的有効量のリガンドを、前記患者に投与することを包含する方法。
【請求項４６】
ステップ（ｂ）がex vivoで実施される請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
ステップ（ａ）がex vivoで実施される請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
前記自己免疫疾患または障害が尋常性天疱瘡から選択される請求項４５記載の方法。
【請求項４９】
ステップ（ａ）における前記高親和性リガンドが束縛オリゴマーである請求項４５記載の方法。
【請求項５０】
前記束縛オリゴマーがペプトイド様部分、ペプトイドまたは環状ペプトイドから選択される請求項４９記載の方法。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2014504594.tif 000039
【図２】
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【図３】
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【図４】
2014504594.tif 000042
【国際調査報告】
2014504594.tif 000043
2014504594.tif 000044
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