(57)【要約】  本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて細胞のインピーダンススペクトルと電場電位とを並行して記録する装置および方法に関する。
2014533933.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて細胞のインピーダンスと電位とをモニタリングするためのシステムであって、
ａ）前記細胞と接触させるための少なくとも１個の電極と少なくとも１個の参照電極とを含む細胞基板と、
ｂ）電極間のインピーダンスを測定できる装置（インピーダンスアナライザ）と、
ｃ）電極間の電位差を測定するための装置（電位アナライザ）と、
ｄ）前記電極をインピーダンスアナライザと電位アナライザのいずれか一方に選択的に接続するためのスイッチとを含み、
該スイッチのオン抵抗が５０Ω未満、オフアイソレーションが−６０ｄＢ未満、クロストークアイソレーションが−６０ｄＢ未満であることを特徴とするシステム。
【請求項２】
前記スイッチのオン抵抗が１０Ω未満である、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記スイッチのオフアイソレーションが−７５ｄＢ未満である、先行する請求項のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項４】
前記スイッチのクロストークアイソレーションが−７５ｄＢ未満である、先行する請求項のいずれか１項に記載のスイッチ。
【請求項５】
前記細胞が興奮性の細胞、特に心臓細胞または神経細胞である、先行する請求項のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６】
前記スイッチが、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）またはフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）を用いたものである、先行する請求項のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７】
前記インピーダンスアナライザと前記電位アナライザがいずれもミリ秒の時間分解能を有し、前記スイッチが、１０００マイクロ秒未満の時間内に、インピーダンスアナライザと電位アナライザとの間で前記電極との接続を切り替えることができる、先行する請求項いずれか１項に記載のシステム。
【請求項８】
前記細胞と接触させるための少なくとも１個の電極が微小電極であり、前記細胞基板が微小電極アレイである、先行する請求項のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて細胞のインピーダンスと電位とをモニタリングする方法であって、
ｉ）ａ）前記細胞と接触させるための少なくとも１個の電極と少なくとも１個の参照電極とを含む細胞基板と、
ｂ）電極間のインピーダンスを測定できる装置（インピーダンスアナライザ）と、
ｃ）電極間の電位差を測定するための装置（電位アナライザ）と、
ｄ）前記電極をインピーダンスアナライザと電位アナライザのいずれか一方に選択的に接続するためのスイッチと
を含むシステムを用意する工程、および
ｉｉ）前記細胞のインピーダンスと電位とをそれぞれ測定するために、前記電極の接続先を前記インピーダンスアナライザと前記電位アナライザのいずれか一方に切り替える工程
を含み、
前記スイッチのオン抵抗が５０Ω未満、オフアイソレーションが−６０ｄＢ未満、クロストークアイソレーションが−６０ｄＢ未満であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記スイッチのオン抵抗が１０Ω未満である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記スイッチのオフアイソレーションが−７５ｄＢ未満、かつ／またはクロストークアイソレーションが−７５ｄＢ未満である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記インピーダンスアナライザと前記電位アナライザがいずれもミリ秒の時間分解能を有し、ミリ秒の時間分解能を有する前記アナライザ間で前記電極との接続を切り替えることができるスイッチにより、前記アナライザ間で前記電極との接続が１０００マイクロ秒未満の時間内に切り替わる、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
電位測定用の２つのサンプリングポイントの間でインピーダンスが測定されるように前記切替が行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記スイッチが、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）またはフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）を用いたものである、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１個の電極が微小電極であり、前記細胞基板が微小電極アレイである、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて細胞のインピーダンススペクトルと電場電位とを並行して記録する装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病、多発性硬化症（ＭＳ）、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、クロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）、種々の網膜変性症などの神経変性疾患のための薬剤開発プログラムは、病態メカニズムの複雑さゆえに、個体レベルの研究としての動物モデルに専ら依存しているが、これには非常に多くの費用、時間、および労力が必要とされる。一方、薬効や病態メカニズムの解析は、主に、免疫細胞化学的手法、分子生物学的手法および／またはタンパク質化学的手法といった細胞破砕を伴う手法により行われている。
【０００３】
生体電子工学的センサーおよび生体電子工学的センサーアレイを用いた細胞変化の非標識検出およびリアルタイムモニタリングは、医薬品有効成分（ＡＰＩ）開発の分野や医薬品安全性試験において、さらに特にテーラーメイド医療の分野において診断目的でも使用される新しい技術である。ＡＰＩ開発は、多くの費用と時間を要するプロセスであるが、臨床研究で失敗に終わる率が高く、特に神経変性疾患（例えばアルツハイマー病）や心疾患といった複雑な多因子遺伝病をターゲットとする場合にはその傾向が強い。したがって、初期の化合物スクリーニングと（前）臨床試験との間にはボトルネックがあり、複雑な疾患に特有の病態メカニズムを再現できる細胞／組織ベースのモデルであって、ハイスループットスクリーニング／ハイコンテントスクリーニング（ＨＴＳ／ＨＣＴ）での利用に好適で、活性の面はもちろん、望ましくない副作用が少ないという点でも最適な化合物を開発の初期段階で見出すことのできるモデルが切に求められている。
【０００４】
細胞や組織を用いる現行のスクリーニング法の主な欠点は、測定可能な範囲が限定されることの多い古典的なエンドポイントアッセイを利用していること（ターゲットが制限されることなど）である。これらの欠点を克服するために、細胞に影響を与えることなく細胞の変化をリアルタイムでモニタリングできる非標識検出法の確立に向けて、精力的な取り組みが行われてきた。電気インピーダンス分光法（ＥＩＳ）と電気生理学的記録（ＥＰＲ）という２つの主要な生体電子工学的手法は、製薬業界のスクリーニングプラットフォームでの利用に関して有望な手法である。
【０００５】
インピーダンス分光法は、細胞誘電分光法（ＣＤＳ）または電気インピーダンス分光法（ＥＩＳ）としても知られているが、所定の交流電流および／または交流電圧を印加することにより個々の細胞の受動的な電気的特性の周波数依存性変化を測定するために用いられる。インピーダンス分光法は非侵襲的な方法であるため、細胞の活動に影響を与えることなく長期的な測定を行うことが可能である。したがって、長時間にわたる複雑な物理的操作による影響を受けていない、リアルタイムの細胞の状態が反映された測定結果が得られる。この方法は、様々な生物学的課題や医学的課題の研究に十分に適したものである。インピーダンス分光法は、例えばＥＰ  ２  １０３  ９３３  Ａ１にさらに詳細に説明されている。
【０００６】
電気生理学的記録（ＥＰＲ）は、一般的には、生体細胞や生体組織の電気的特性を調べる方法の１つである。ＥＰＲは、イオンチャネル１個から、細胞全体、臓器全体に至るまで様々な規模での電圧、電圧変化または電流の測定に関わる。例えば、ニューロンの電気的活動、特に活動電位の動きを測定することができる。細胞外の電場電位は、細胞（例えば神経細胞や筋細胞）により細胞外で生じる電位であり、これらの電位は、通常、細胞外の微小電極によって測定される。
【０００７】
既存のスクリーニング手法を別の技術に適応させたりあるいは別の技術と置き換えることは、極めて有利ではあるものの、困難なプロセスである。しかし、その困難さは、１つの細胞サンプルまたは組織サンプルからできる限り多くの情報が得られるように測定プラットフォームを最適化することにより軽減される。したがって、ＥＩＳやＥＰＲのような検出法を組み合わせれば、新規のハイコンテントスクリーニングプラットフォームの有用性を大いに高められる可能性がある。さらに、ＥＩＳとＥＰＲという２つの技術プラットフォームを、主に光学／蛍光測定を利用する既存のスクリーニングシステムに組み込めば、ＡＰＩ開発プラットフォームが大幅に改善される可能性があり、１つの細胞／組織サンプルからの情報出力もさらに増える可能性がある。
【０００８】
また、ＥＩＳとＥＰＲという２つの手法を組み合わせて組み込むことにより、ＡＰＩ開発だけでなく、リスク評価および医薬品安全性試験においても大幅な改善が示される。市場に出た後に危険な副作用（例えば心不整脈）を示すような医薬品の承認が最小限に抑えられるよう、新規医薬品の承認はより制限的な規制方針（ＦＤＡやＥＭＡ）に従って行われるため、安全性試験の改善に対する需要は高く、特に心毒性の分野における需要は高い。このような需要から、例えば、自動パッチクランププラットフォームの開発や、微小電極を用いたＥＰＲ用システムの開発の強化が行われている。この領域において、複数の非標識リアルタイムモニタリング手法を組み合わせることにより、同一サンプルからそれぞれの検出法で取得したデータを活用して、電気発生性細胞に対する毒性作用／副作用に関するより広い見識を得ることができるため、試験対象のＡＰＩ／化合物／化学物質の安全性を向上させることが可能である。
【０００９】
インピーダンス分光法（ＥＩＳ）と電気生理学的記録（ＥＰＲ）はいずれも、細胞変化の非標識検出およびリアルタイムモニタリングに適した手法である。これらの基礎的手法をＨＴＳ／ＨＣＳプラットフォームに（特に、自動スクリーニングプラットフォームに必須の９６ウェルフォーマットおよび３８４ウェルフォーマットのタイタープレートに関するＡＮＳＩ適合性に関して）適用可能なシステム／装置へとさらに発展させるために、様々な試みが行われてきた。ＥＩＳシステムは、例えば、ＷＯ２００４／０１０１０３  Ａ２、ＤＥ２０２００５００７５４７  Ｕ１またはＷＯ２００６／１０４８３９  Ａ２に記載されている。開示されているシステムは、マルチウェルアレイとして設計されており、標準の９６ウェルＡＮＳＩフォーマットでの使用が可能であり、一部は市販されている。記載の装置はいずれも、インピーダンス測定に最適化された２電極構成になっている。「インピーダンス測定に最適化された」とは、電極の自己インピーダンスを低くするために電極領域が最大化されていることを意味し、これは主として櫛型電極として実現されている。
【００１０】
電気発生性細胞用のＥＰＲ多電極アレイのシステムおよび開発に関する報告もいくつかあり、心筋細胞に関しては、例えばＲｏｔｈｅｒｍｅｔら，Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１６：５１−５８（２００５）に、ニューロンに関しては、例えばＢｅｒｄｉｃｈｅｖｓｋｙら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７８（１）：５９−６４（２００９）に記載されている。ＥＩＳシステムは主に、２つの大面積電極を用いたシステムとして実現されているが、ＥＰＲシステムは、１つの培養ユニット内の複数の局所電場電位を高いＳＮ比（信号対ノイズ比）で記録するために、通常、細胞の大きさに近いサイズの微小電極を複数必要とする。したがって、ＥＰＲシステムは、通常、多電極アレイとして設計される。多電極アレイの使用は、心筋細胞における興奮の伝導経路および遅延に関する情報を取得するには好適であり、神経回路網の自発的活動および刺激による活動をモニタリングするには必須である。
【００１１】
ＷＯ２００９／１３７４４０に高速インピーダンスアナライザが記載されている。この開示の構成は、心筋細胞の拍動回数に対する薬剤の短期的効果を調べるＥＩＳ測定用の大型の櫛型電極を含む。この文献にはＥＰＲ測定に関する記載はない。したがって、このシステムによって得られるデータは、位置分解能および時間分解能に関して、ＥＰＲ信号から得られる情報に比肩するものではない（心筋細胞の場合は４ｋＨｚ、ニューロンの場合は通常４０ｋＨｚ以下）。イオンチャネルの形状および具体的な状態に関する情報を提供できるのはＥＰＲ信号のみである。さらに、上記文献の方法は心筋細胞に限定される。この方法では、大型の櫛型電極で信号を記録するため、チャンバー／ウェルの培養物全体の平均信号しか得られないからである。そのため神経回路網では使用できない。神経回路網で個々の活性化ニューロンの局所電場電位を記録するには高い空間分解能が必要とされるからである。
【００１２】
ＥＰＲ測定には、ＥＩＳ用の大型の櫛型電極の代わりに、接触面積が最小１０００μｍ２の範囲の微小電極が用いられる。このような典型的なＥＰＲ用微小電極は、自己インピーダンスが高く、ＥＩＳシステムの障害となるため、モニタリングする細胞や組織から適切な信号が得られるような高い感度を有する高精度インピーダンスアナライザが必要である。このような技術的制限により、これまで、ＥＰＲとＥＩＳの両方を１つのセンサーアレイに組み込むには、それぞれの検出法に対する電極セットを別個に用意する、具体的にはＥＩＳ用の櫛型電極とＥＰＲ用の１個以上の微小電極とを用意する以外に方法はなかった。
【００１３】
Ｘｉａｏら（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ２６：１４９３−１４９９，（２０１０））は、２つの機能を持つ細胞外バイオチップを用いて、心筋細胞に対するドキソルビシン毒性を評価した。この文献に記載のバイオチップ「Ｅｘｃｅｌｌ」は、ＥＩＳ用の櫛型電極とＥＰＲ測定用の微小電極の両方を含むものである。しかし、この文献の記載によれば、細胞外の電場電位および細胞−電極インピーダンスをモニタリングするシステムにおいて、インピーダンス測定に必要な刺激電圧が、微小電極領域（ＭＥＡ）での測定における電気的障害を引き起こした。したがって、検出操作は、インピーダンス検出とＭＥＡ検出の間にやや長い間断時間（５分間の検出サイクルにつきおよそ１分間）を設けて逐次的に行った。
【００１４】
したがって、Ｘｉａｏらが提案しているようにＥＩＳとＥＰＲに対してそれぞれ別個の測定回路と電極を備えても、測定間の干渉により並行モニタリングを実施することはできず、２つの測定法を利用するためにはやや長い間断時間を設ける必要がある。さらに、別個の電極セットを備えるということは、ＥＰＲ測定とＥＩＳ測定とで、細胞、細胞集団または組織サンプルの異なる領域を調べることを意味する。
【００１５】
位置的にも時間的にも同期した測定が行えるよう、ＥＰＲとＥＩＳとを適切に組み合わせて１つのセンサーアレイに組み込むことができれば望ましい。特に、ＥＰＲとＥＩＳとで同じ細胞サンプル、細胞集団サンプルまたは組織サンプルを測定することができれば、サンプルの状態に関してより完全な情報が示されるだろう。時間的に同期した測定を行うことができれば、環境条件を変化させた（例えば周囲の緩衝液への薬剤の添加）後のサンプルの状態に関して得られる情報を速やかに更新することができるため望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、当該技術分野において、上記の問題を克服することが求められており、具体的には、インピーダンススペクトルとＥＰＲ（特に電場電位）の両方を、位置的にも時間的にも同期して記録する方法および装置を提供することが求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて細胞、特に心臓細胞または神経細胞などの興奮性細胞のインピーダンスと電位とをモニタリングするシステムに関し、該システムは、前記細胞と接触させるための少なくとも１個の電極と少なくとも１個の参照電極とを含む細胞基板と、電極間のインピーダンスを測定できる装置（インピーダンスアナライザ）と、電極間の電位差を測定するための装置（電位アナライザ）とを含む。前記システムは、前記電極をインピーダンスアナライザと電位アナライザのいずれか一方に選択的に接続するためのスイッチをさらに含む。請求項に明記しているような、固有オン抵抗が低く、オフアイソレーション性能とクロストークアイソレーション性能の高いスイッチを用いることにより、同じ電極をインピーダンスアナライザと電位アナライザに交互に接続することが可能となり、当該技術分野でこれまで見られた電気的障害も発生しないことが分かった。前記システムは、インピーダンスアナライザと電位アナライザとを含み、特に、電極をこの２つのアナライザに交互に接続することができる本明細書で定義されたスイッチを含むため、このシステムを用いることで見事にｉｎ  ｖｉｔｒｏで調査しようとする細胞のインピーダンススペクトルと電場電位の両方を記録することができる。
【００１８】
本発明のシステムは、通常、少なくとも１つの記録チャンバーを含む細胞基板を含む。記録チャンバーは、通常、インピーダンス測定と電位測定の両方に供する細胞または器官型組織を含む。記録チャンバーは、細胞と接触させるための少なくとも１個の電極と少なくとも１個の参照電極とをさらに含む。
【００１９】
測定（例えばインピーダンス測定）中、参照電極は通常、培地と直接接触しているが、参照電極が培地と直接接触するための付加的な層を有するものであってもよい。この付加的な層はポリマーコーティングであってもよい。参照電極は培地と直接接触していることが好ましい。電極の材料は、必要な電気伝導率を有している材料であればどのような材料でもよい。インピーダンス測定および電位測定に用いられる電極に好適な材料は、当該技術分野において公知である。電極の材料としては、金、プラチナ、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）、銀、銅、イリジウムまたはこれらの合金が好ましい。電極の厚さは、使用する材料にもよるが、好ましくは１０ｎｍ〜１００μｍ、さらに好ましくは５０ｎｍ〜１０μｍ、最も好ましくは１００ｎｍ〜１μｍである。使用する細胞の種類／細胞培養モデルに対する感度およびＳＮ比を高めるためには、細胞と接触させるための電極のサイズは、１ｍｍ２以下であることが好ましく、１０，０００μｍ２以下であることがより好ましく、５００μｍ２以下であることが最も好ましい。参照電極上に付着した細胞からの信号の影響を最小限に抑えるため、参照電極のサイズは測定電極より数桁大きくなければならない。したがって、参照電極のサイズは、通常、細胞と接触させるための電極のサイズより大きく、例えば、好ましくは１０倍、より好ましくは１００倍、特に１０００倍の大きさである。参照電極のサイズは、好ましくは少なくとも５，０００μｍ２、より好ましくは少なくとも１００，０００μｍ２、最も好ましくは少なくとも１ｍｍ２、あるいはそれ以上である。参照電極のサイズは、好ましくは５０ｍｍ２以下、より好ましくは１０ｍｍ２以下であり、例えば５ｍｍ２以下または２ｍｍ２以下、あるいはそれ以下である。
【００２０】
前記電極は、通常、記録チャンバーの底面に取り付けられており、記録チャンバーは、マルチウェルプレートまたはマルチウェルフレームの形状であることが好ましい。前記電極は、半導体技術により記録チャンバーの底面に蒸着させることが可能である。例えば、シリコン酸化物、ポリエチレン（ＰＥ）、ガラス等の基質またはこれらと同等の基質の上に電極をスポット状に設けることができる。
【００２１】
細胞と接触させるための電極と参照電極とは、当該技術分野で公知の適当な方法（例えばパッシベーション層または位置的分離）により、互いに電気的に絶縁されている。
【００２２】
細胞と接触させるための電極は、細胞基板（すなわち記録チャンバー）の底面の参照電極の近傍に位置する１個以上の電極、特に微小電極アレイであってもよい。また、細胞と接触させるための電極は、スタンプ状またはピン状の付加的な電極であってもよく、少なくとも２方向に可動であり、細胞、器官型組織または培地への着脱が可能であるものが好ましい。細胞と接触させるための電極の少なくとも１個は微小電極であることが好ましく、細胞と接触している電極がすべて微小電極であることがより好ましい。微小電極のサイズは、好ましくは１０，０００μｍ２以下、より好ましくは５００μｍ２以下である。
【００２３】
好ましい細胞基板（すなわち本発明の記録チャンバー）は、市販のマルチウェルプレートまたは底面のないマルチウェルフレームを含む。生体分子スクリーニング学会（ＳＢＳ）の標準のフットプリントマルチプルプレートフォーマットを使用することがさらに好ましい。本発明の細胞基板は、底面のない標準のマルチウェルフレーム、すなわち３８４個の記録チャンバーを含む３８４ウェルプレート、１９２個の記録チャンバーを含む１９２プレートなどに基づいていることが好ましい。使用するマルチウェルフォーマットによって、細胞基板に組み込まれる１ウェル当たりの微小電極の数は異なっていてもよい。各記録チャンバーは、少なくとも１個の参照電極と、細胞と接触させるための少なくとも１個の電極とを含む。したがって、各記録チャンバーは少なくとも２個の電極を含む。好ましくは１ウェル当たり２個の電極を含み、例えば３８４マルチウェルプレートの場合、３８４×２個の電極が存在する。このような構成にすると、７６８個の電気的接続部を有するマルチウェルプレートを準備することが可能であり、このプレートもＡＮＳＩのマルチウェルプレート要件を満たすものである。また記録チャンバーは、例えば、９６マルチウェルプレートに１ウェル当たり２個、４個または８個の微小電極を含むものであってもよく、あるいは４８マルチウェルプレートに１ウェル当たり１６個の微小電極を含むものであってもよい。電極アレイのサイズは、前述の適切なウェルのサイズに適合させることが可能である。
【００２４】
本発明のシステムの細胞基板は、通常、記録チャンバーの電極、接続パッドなどを蒸着できる基板を含む。電極、導線および接続パッドが蒸着された基板は、通常、マルチウェルアレイの形態である。前記基板の材料は、ガラス、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス、ケイ素、セラミック、ポリマー、ポリメチレン、ポリプロピレン、ポリスチロール、ポリエステル、ポリカーボネートなどの、電極や導線のスパッタリングに適した材料であってもよい。前記基板の厚さは、通常約１００μｍ〜数ミリメートル、例えば０．１ｍｍ〜２ｍｍの範囲であり、基板の作製に用いる所望の材料によって異なる。基板としてガラスを使用する場合、基板の厚さは１ミリメートル未満から数ミリメートルの範囲であってよい。基板がポリマーである場合、電極を蒸着させた数百μｍの薄膜として使用することができる。電極、導線および接続／接地パッドは、底部の基板と一体化していることが好ましい。さらに、基板の電気的構成を保護するために、基板表面に薄膜を有していてもよい。
【００２５】
本発明のシステムは、好ましくは秒単位、より好ましくはミリ秒単位、最も好ましくはマイクロ秒単位の高い時間分解能でのインピーダンス測定が可能な市販または特注のインピーダンスアナライザシステムを含む。１００ｍＶ未満、より好ましくは１５ｍＶ未満、特に１０ｍＶ未満の低電圧レベルでのインピーダンス測定に適したインピーダンスアナライザが好ましい。これにより、サンプルに与える影響を最小限に抑えられる。さらに、インピーダンスアナライザは、適当なＳＮ比を保証するために、５００Ｈｚで１００ｋΩ〜１ＭΩといった高い自己インピーダンスを示す微小電極を用いた上記の電圧レベルのインピーダンス測定を、好ましくは少なくとも０．１％の精度で行うのに適したものでなければならない。このような装置は当該技術分野で公知である。好適なインピーダンスアナライザは、例えばＳｃｉｏＳｐｅｃ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社より入手可能であり、例としてはＳｃｉｏＳｐｅｃ  ＩＣＸ−５またはＳｃｉｏＳｐｅｃ  ＳＣＸ−３が挙げられる。適当な性能を有するインピーダンスアナライザとしては、さらに、例えばＡｇｉｌｅｎｔ  ４２９４Ａ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）およびＳｏｌａｒｔｒｏｎ  １２６０Ａ＋１２９６Ａ  高インピーダンス誘電体インターフェース（Ｓｏｌａｒｔｒｏｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ社）が挙げられる。インピーダンスアナライザは、通常、データ処理システム（例えばパーソナルコンピューターシステム）に接続される。
【００２６】
本発明に記載のシステムは、電極間の電位差を測定するための装置、すなわち電位アナライザをさらに含み、該電位アナライザは、好ましくは秒単位、より好ましくはミリ秒単位、最も好ましくはマイクロ秒単位の高い時間分解能を有する。好適な電位アナライザとしては、例えば高速電圧計が挙げられ、多チャネル電圧計が好ましく、多チャネル電圧計には通常、アナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）が使用されている。各チャネル、すなわち各電極に対してＡＤＣを１つずつ使用してもよいが、複数のチャネルが１つのＡＤＣに多重化されていることが好ましい。ＡＤＣのサンプリング速度は、１つのＡＤＣ当たりのチャネル数にもよるが、通常少なくとも１ＭＨｚ、好ましくは少なくとも２ＭＨｚ、さらに好ましくは少なくとも１０ＭＨｚ、特に少なくとも１００ＭＨｚである。デジタル分解能は、好ましくは少なくとも１２ビット、より好ましくは１４ビット、さらに好ましくは１６ビット、特に２４ビットである。好適なアナログ−デジタル変換器は当該技術分野で公知であり、例えば、Ａｎａｌｏｇ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社（ＡＤ  ７６６７、ＡＤ  ７６２６、ＡＤ  ９４４６）またはＴｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（ＡＤ  ５４８２）より入手可能である。
【００２７】
好ましい一実施形態において、本発明のシステムはマルチプレクサをさらに含み、該マルチプレクサはインピーダンスアナライザに接続していることが好ましい。前記マルチプレクサは多重化を行うデバイスである。多重化とは、細胞と接触させるための電極の２個以上を１つのインピーダンスアナライザに接続することをいう。多重化により、細胞と接触させるための電極毎に、例えばウェル毎に個々のインピーダンスアナライザを用意する必要がなくなる。細胞と接触させるための電極を複数個並行して測定に用いる場合、例えば９６マルチウェルプレート、１９２マルチウェルプレートまたは３８４マルチウェルプレートに含まれるすべての電極を測定に用いる場合は、一般に、マルチプレクサの使用が適している。前記マルチプレクサは、通常、時分割多重化方式を採用しており、すなわち、インピーダンスアナライザを細胞と接触させるための電極の１個に接続した後、順次別の電極に接続するという方式を採用している。前記マルチプレクサは、インピーダンスアナライザの測定経路に配置される電子回路素子であるため、信号の変化（歪み）ができるだけ低く抑えられたものであることが好ましい。具体的には、１００ｍＶ未満、特に１５ｍＶ未満、例えば１０ｍＶ未満の電圧範囲で、５００Ｈｚで少なくとも１ｋΩ〜１０ＭΩの自己インピーダンスを有する電極、より好ましくは５００Ｈｚで１００ｋΩ〜１ＭΩの自己インピーダンスを有する電極の信号と、１０−７〜１０−１０Ａの電流フローとが多重化される必要がある。前記マルチプレクサのオン抵抗は、１０Ω未満であることが好ましく、２Ω未満、特に０．５Ω未満であることがより好ましい。オフアイソレーションは、−６０ｄＢ未満であることが好ましく、−７５ｄＢ未満、特に−９０ｄＢ未満であることが好ましい。クロストーク（チャネル間）は、−６０ｄＢ未満であることが好ましく、−７５ｄＢ未満、特に−９０ｄＢ未満であることがより好ましい。さらに、前記マルチプレクサは、高速のスイッチング特性を提供する必要があり、好ましくはマイクロ秒単位のスイッチング特性を提供する必要がある。スイッチング時間は、１００ｎｓ未満、特に５０ｎｓ未満であることが好ましい。好適な装置としては、例えば、Ａｎａｌｏｇ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社（米国）のＡＤＧ７３１またはＡＤＧ７２５が挙げられる。
【００２８】
終始スクリーニングにおいて細胞に適した環境を提供するために、特に、細胞を用いた化合物（薬剤または毒性成分）の試験の実施に適した環境を提供するために、本願のシステムは、加湿環境（例えば３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気）も提供できる自動液体操作システムをさらに含んでいてもよい。好適な液体操作ロボットシステムとしては、例えばＴＥＣＡＮ  Ｔｒａｄｉｎｇ社（スイス）のＦｒｅｅｄｏｍ  ＥＶＯ（登録商標）；Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社のＢｉｏｍｅｋ（登録商標）  Ａｓｓａｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ  ｓｙｓｔｅｍｓ；またはＱｉａｇｅｎ社のＢｉｏｒｏｂｏｔ  ８０００が挙げられる。
【００２９】
本発明のシステムは、前記電極をインピーダンスアナライザと電位アナライザのいずれか一方に選択的に接続するためのスイッチをさらに含む。前記スイッチは、第１のスイッチング状態において、対極と細胞と接触させるための電極とをインピーダンスアナライザに接続するのに適したものでなければならない。これは、インピーダンスアナライザの対極入力に対極が接続され、細胞と接触させるための電極の少なくとも１個が、好ましくはマルチプレクサを介して、インピーダンスアナライザの入力に接続されることを意味する。細胞と接触させるための電極すべてがインピーダンスアナライザの入力に接続されることが好ましく、マルチプレクサを介して接続されることがより好ましい。前記スイッチがこの位置にある時、インピーダンスアナライザによりインピーダンス測定を行うことができる。前記スイッチは、第２のスイッチング状態において、電極の接続先を電位アナライザに切り替えることができる。すなわち、対極を接地に切り替えて、細胞と接触させるための電極の少なくとも１個、好ましくはすべてを、好ましくは前置増幅装置を介して、電位アナライザの入力への接続に切り替えることができる。第２のスイッチング状態では、電位アナライザにより、参照電極と細胞と接触させるための電極の少なくとも１個との間の電位差を測定することができる。細胞外の電場電位は、通常マイクロボルトの範囲にあるので、低ノイズ増幅器を用いて前増幅を行うことが好ましい。増幅器（前置増幅器）のノイズレベルは、好ましくは２５ｎＶ／√Ｈｚ未満、より好ましくは１０ｎＶ／√Ｈｚ未満、特に５ｎＶ／√Ｈｚ未満である。ノイズレベルは、当該技術分野で公知のノイズレベルと同様に定義される。増幅器の同相入力範囲値は、好ましくは少なくとも１０７Ω、より好ましくは１０１０Ω、特に１０１２Ωである。前記前置増幅器に適した演算増幅器および／または計装用増幅器は当該技術分野で公知であり、例としては、Ｔｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＴＬＣ  ２２７４のＯＰＶまたはＡｎａｌｏｇ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社のＯＰＡ  ４２２８のＯＰＶが挙げられる。
【００３０】
本発明のシステムのスイッチは、２つのアナライザ、すなわちインピーダンスアナライザと電位アナライザとの間で電極の接続先を切り替えることができるものであり、低スイッチングノイズ特性を有するものが好ましい。本発明のシステムで使用されるスイッチのオン抵抗は５０Ω未満である。オン抵抗は、スイッチが「オン状態」すなわち閉状態の時の電気抵抗に相当する。特定の理論に縛られることを望むものではないが、インピーダンス測定信号に対する影響を少なくし、かつ細胞と接触させるための電極としてＥＰＲ測定にも適した電極を用いてインピーダンス測定を適切に行うためには、スイッチのオン抵抗が低いことが重要であると考えられる。オン抵抗は、１０Ω未満であることが好ましく、５Ω未満、特に２Ω未満であることがより好ましい。本明細書におけるオン抵抗（ＲＯＮ）は、当該技術分野で知られているように、閉状態のスイッチのオーム抵抗値であり、図７に示すような方法で測定することができる。ＲＯＮの測定は、通常、２５℃で１０ｍＡの電流ｌＯＳを印加して行われる。
【００３１】
さらに、本願のシステムのスイッチ（スイッチング要素）は、低オン抵抗と共に、高クロストーク（チャネル間）アイソレーションおよび高オフアイソレーションも提供するものでなければならない。このような特性により、スイッチング要素が原因で起こる信号の変化が最小限に抑えられる。本願のシステムのスイッチ（スイッチング要素）のクロストークアイソレーションとオフアイソレーションはいずれも、通常−６０ｄＢ未満、好ましくは−７５ｄＢ未満、特に−９０ｄＢ未満である。本明細書におけるオフアイソレーションは、当該技術分野で知られているように、開（オフ）状態のスイッチにより生じる不要な信号結合を指標とするものである。オフアイソレーションは、図８に示されるような方法で、式：オフアイソレーション（ｄＢ）＝２０ｌｏｇ（ＶＳ／ＶＯＵＴ）より求めることができる。通常、オフアイソレーションの測定は２５℃、信号周波数１０ＭＨｚで行われる。
【００３２】
本明細書におけるクロストークアイソレーションは、当該技術分野で知られているように、寄生容量によりチャネル間で結合した不要な信号を指標とするものである。クロストークアイソレーションは、図９に示されるような方法で、式：クロストークアイソレーション（ｄＢ）＝２０ｌｏｇ（ＶＳ／ＶＯＵＴ）より求めることができる。通常、クロストークアイソレーションの測定は２５℃、信号周波数１０ＭＨｚで行われる。
【００３３】
本発明に係るスイッチング要素は、好ましくは２％以下、好ましくは０．５％以下、特に０．１％以下の低歪み特性を提供するものである。本明細書における（信号の）歪みは、当該技術分野で知られているように、出力信号の歪みである。歪みは、例えば、所定の範囲のアナログ信号で測定した際のオン抵抗に対するオン抵抗の最大値と最小値の差として求めることができる。前記スイッチは、高い時間分解能、すなわち短い切替時間（ｔＯＮおよびｔＯＦＦ）で電極の接続先の切替が可能であることが好ましく、切替時間は、ミリ秒範囲、例えば１０００マイクロ秒未満であることが好ましく、マイクロ秒範囲であることがより好ましい。本明細書において、マイクロ秒範囲（分解能）とは、電極の切替時間が、好ましくは１０００マイクロ秒未満、より好ましくは１００マイクロ秒未満、さらにより好ましくは１０マイクロ秒未満、特に２マイクロ秒未満、例えば０．５マイクロ秒未満であることをいう。本明細書における切替時間は、当該技術分野で公知の切替時間と同義であり、図１０に示すような方法で求めることができる（切替時間ｔＯＮおよびｔＯＦＦ）。
【００３４】
本願のシステムのスイッチの遮断から接続までの遅延時間は、少なくとも１ｎｓであることが好ましく、１〜１０ｎｓであることがより好ましい。遮断から接続までの遅延時間（ｔＤ）は、当該技術分野で公知の遮断から接続までの遅延時間と同義であり、図１１に示すような方法で求めることができる。
【００３５】
前記スイッチは、好ましくは少なくとも２０ｋＨｚ、より好ましくは少なくとも５０ｋＨｚ、特に少なくとも１００ｋＨｚの頻度で、電極と接続するアナライザを切り替えることができる。好適な超高速スイッチングデバイスは当該技術分野で公知であり、例として、ＭＡＸＩＭ  ４６１９、ＡＤＧ  ７７４またはＡＤＧ  ７９４が挙げられる。さらに好適なデバイスとしては、高速でのスイッチングデータパスルーティングが可能で、数百の電極／チャネルの測定パスをマイクロ秒（未満）スケールで測定制御することができるものが挙げられ、例えばＡＴＸＭＥＧＡ（Ａｔｍｅｌ社）、Ｃｙｃｌｏｎｅ／Ａｒｉａ（Ａｌｔｅｒｒａ社）およびＳｐａｒｔａｎ（Ｘｉｌｉｎｘ社）が挙げられる。前記スイッチは、当該技術分野で公知のデジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）またはフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）を用いたもの、特に一体化したものが好ましい。これらのデバイスは、開発コストを抑えつつ所望の用途に合わせた設定や機能面の更新が容易に行える集積回路を用いた、プログラム可能な高並列デバイスとして知られている。このようなデバイスを使用することにより、多くの並列接続の切替を高頻度かつ短時間で行うことができる。信号処理の制御に適したデバイスとしては、例えば、ＡＳＩＣまたはＦｕｓｉｏｎ−Ｍｉｘｅｄ−Ｓｉｇｎａｌ−ＦＰＧＡ（Ｍｉｃｒｏｓｅｍｉ社）に基づくものが挙げられる。
【００３６】
別段の定めがない限り、スイッチおよびその他のデバイスの電気的パラメータはすべて２５℃で測定するものとする。
【００３７】
さらに本発明は、細胞、好ましくは興奮性細胞、具体的には心臓細胞または神経細胞のインピーダンスと電位とをモニタリングする方法に関し、該方法は、上述したシステムを用意する工程、および細胞のインピーダンスと電位とを測定する工程を含む。電極の接続先は、先に定義したようなスイッチにより、２つのアナライザ、すなわちインピーダンスアナライザと電位アナライザとの間で切り替えられる。
【００３８】
本発明の方法において、インピーダンスアナライザと電位アナライザの時間分解能はいずれも低いことが好ましく、ミリ秒の時間分解能であることがより好ましい。このような構成において、電極と接続するアナライザの切替に要する時間は、好ましくは１０００マイクロ秒未満、好ましくは１０マイクロ秒未満、特に２マイクロ秒未満、例えば０．５マイクロ秒未満である。好ましい切替頻度は上述した通りである。
【００３９】
特に好ましい一実施形態において、本発明のシステムは、電位測定（ＥＰＲ）用の２つのサンプリングポイントの間でインピーダンスが測定されるように電極の接続先を切り替えることが可能であり、本発明の方法はそのような切替を実施することを含む。通常、ＥＰＲ測定は特定のサンプリング速度、例えば１ｋＨｚ〜１ＭＨｚ、好ましくは２ｋＨｚ〜１００ＭＨｚ、特に４ｋＨｚ〜１００ｋＨｚのサンプリング速度で行われる。さらに、マルチプレクサ（ＭＵＸ）は、通常、電圧計と共に使用され、通常、アナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）と共に使用される。したがって、２つのサンプリングポイントの間には、サンプリングの速度および所要時間に応じて一定の時間間隔が生じる。この間隔を利用してＥＩＳ測定を行うことが好ましい。例えば、一般的な回路構成において、１６チャネルＭＵＸを内蔵した少なくとも１０ＭＨｚのＡＤＣが含まれ、サンプリング周波数が４ｋＨｚである場合、２つのサンプリング間には約２５０マイクロ秒の時間間隔が生じる。１６チャネルの多重化により、１チャネル当たりのデジタル化ウィンドウはおよそ２５マイクロ秒である。これは、ＥＩＳに利用できる時間枠が２００マイクロ秒より長いことを意味する。同様に、２０ｋＨｚのサンプリング速度では、サンプリングポイント間に５０マイクロ秒の時間間隔が生じることから、ＥＩＳに利用できる時間枠はおよそ３０マイクロ秒である。したがって、本発明のシステムを用いることにより、特に該システムのスイッチが、マイクロ秒の時間分解能、特に５マイクロ秒未満、さらに好ましくは２マイクロ秒未満の時間分解能で電極と接続するアナライザを切り替えることができる場合、ＥＰＲ測定用の２つのサンプリングポイントの間でＥＩＳ測定を行うことが可能となる。これにより、途切れのないＥＰＲのデータストリームが得られる。この周波数による個々のインピーダンス値、あるいはインピーダンススペクトルも記録することが可能であり、これらはＥＰＲのサンプリング周波数によってのみ制限される。このような構成により、見事に、途切れることなく、ほぼ同時にＥＰＲとＥＩＳの両方の測定が行われる。
【００４０】
本発明のシステムおよび方法において、少なくとも１個の電極が当該技術分野で公知の微小電極であることが好ましく、細胞基板が当該技術分野で公知の微小電極アレイであることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】電気生理学的記録（ＥＰＲ）および電気化学的インピーダンス分光法（ＥＩＳ）のそれぞれの測定回路を同じ微小電極に接続した際に生じる、当該技術分野で公知の干渉例を示した図である。
【図２】測定におけるアーティファクトを除去するための回路構成を示した図である。
【図３】マルチウェルアレイにおける本発明のシステムの使用を示したものである。
【図４】マルチウェルアレイで本発明のシステムを使用することにより得られるデータを示したものである。
【図５】多電極−マルチウェルアレイにおける本発明のシステムの使用を示したものである。
【図６】途切れなく並行して記録を行うための、高速ＤＳＰ／ＦＰＧＡで制御された構成における本発明のシステムの使用を示したものである。
【図７】オン抵抗測定のための試験回路を示したものである。
【図８】オフアイソレーション測定のための試験回路を示したものである。
【図９】クロストークアイソレーション測定のための試験回路を示したものである。
【図１０】切替時間を測定するための試験回路を示したものである。
【図１１】遮断から接続までの遅延時間を測定するための試験回路を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
添付図面を参照しながら、本発明についてさらに説明する。以下の実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４３】
本願においては、インピーダンス分光法（ＥＩＳ）と電気生理学的記録（ＥＰＲ）という２つの手法を組み合わせて１つのシステムに組み込んでいる。これにより、ＡＮＳＩ適合９６マルチウェルタイタープレートまたはＡＮＳＩ適合３８４マルチウェルタイタープレートを用いることが好ましくかつ有利であるハイスループットスクリーニング／ハイコンテントスクリーニング（ＨＴＳ／ＨＣＳ）システムが提供される。インピーダンス分光法と電気生理学的記録は、同じ微小電極を共通で利用する。すなわち、２つのアナライザはいずれも同じ電極、すなわち、少なくとも１個の参照電極（接地電極または対極ともいう）および細胞と接触させるための電極（作用電極ともいう）に接続される。これにより、接続数は最小限に抑えられる。さらに、同じ電極から記録するため、同じ細胞／細胞集団から得られる電場電位のデータと局所的なＥＩＳデータとの間には直接的な相関関係がある。１つの記録チャンバーにより多くの電極を、例えばマイクロアレイの形態にして設ける場合、ＥＰＲに用いられる複数の電極の少なくとも１個はＥＩＳで使用される。
【００４４】
本発明のシステムの好ましい一実施形態を図１に示す。作用電極と参照電極はいずれもＥＰＲに使用される。ＥＰＲは、主として増幅器および電圧計を含む受動方式の検出法である。同じ電極がインピーダンス分光法でも使用される。インピーダンス分光法は、電極に交流電圧を印加する能動方式の検出法である。モニタリング対象の細胞／細胞集団に影響を与えることのないよう、注入電荷はｍＶの範囲に抑える必要があり、使用する微小電極のサイズによっても異なるが、１００ｍＶ未満に抑えることが好ましく、１０ｍＶ未満に抑えることがより好ましい。
【００４５】
ＥＰＲとＥＩＳは相対する性質を持つものであるため、図１に示すように、両方のデータ測定を同時に行うことは不可能である。それどころか、２つの測定回路を同時に接続して作動させれば（この場合、直径２００μｍの円形の微小金電極を使用）、互いに干渉および障害の原因となる。片方の測定が行われていなくても、それぞれの回路が接続されているだけで、ＥＰＲ増幅回路に許容できない干渉が発生する可能性があり（図１Ｂ参照）、逆もまた同様で、測定を行っていないＥＰＲ回路により、培養細胞の固有インピーダンス測定において障害が起こる可能性もある（図１Ｃ参照）。
【００４６】
詳細には、ＥＰＲストリームを取得した後、同じ培養チャンバーを用いて、あるいは少なくとも電気的に接続している別のコンパートメントを用いてＥＩＳ測定を開始する場合、注入した交流電流（通常ｍＶの範囲の電位）により、電流が印加されている間（図１Ｂの１．９〜２．３秒の時点）のみならず、ＥＩＳの記録後、さらには記録前であっても障害が発生する。一般に、ＥＩＳ測定は、ＥＩＳ取得に必要な時間ウィンドウに関係なく、ＥＰＲ測定に数秒の時間幅の障害をもたらす。ＥＰＲ測定と並行して取得することができるＥＩＳデータから分かるように、ＥＰＲの記録が行われていない時でも、接続しているＥＰＲ回路によって大きなアーティファクトが発生している（図１Ｃ）。このような障害は、細胞に対応した培地や緩衝液といった水性環境中で微小電極が高い自己インピーダンスを示すことに加えて、それぞれのもう一方の検出法で使用されるさらなる電気デバイスへの接続が遮蔽されていないことが原因であると考えられる。
【００４７】
微小電極の自己インピーダンスが、通常、１００Ｈｚで１０５〜１０６Ωと高いことを考慮すると、ｎＡの範囲、さらにはｐＡの範囲の電流測定が可能なインピーダンスアナライザの必要性は高い。これが、ＥＰＲ回路のような他の電子素子に接続されているＥＩＳ回路が、その電子素子に対して（特にその電子素子が遮蔽も接地もされていない場合に）高い感受性を示す原因であるかもしれない。
【００４８】
ＥＰＲ測定とＥＩＳ測定との間で発生するこのような干渉を防ぐために、本願においては、先に定義したようなスイッチにより、電極をインピーダンスアナライザと電位アナライザのいずれか一方に選択的に接続する。片方のアナライザが電極と接続している時、使用していないもう一方のアナライザ、すなわちインピーダンスアナライザまたは電位アナライザの入力は接地されていることが好ましい。これにより、電極の切替時または非接続時に発生しうる荷電または電圧パルスから、感受性の高い増幅器が保護される。
【００４９】
好ましい一実施形態において、本発明のシステムで使用されるスイッチは、ＤＳＰ／ＦＰＧＡ（デジタル信号プロセッサおよび／またはフィールドプログラマブルゲートアレイ）を用いており、特にＤＳＰ／ＦＰＧＡスイッチとして一体化している。また、前記スイッチは、スイッチングノイズを低減させるために、当該技術分野で公知の大容量（μＣ）素子または同様のデバイスと組み合わせたものであればより好ましい（図２参照）。この低ノイズスイッチにより、それぞれの測定を行う際に、参照電極および細胞と接触させるための電極を対応するアナライザに接続し、好ましくはもう一方のアナライザの入力を接地することにより、いずれの測定においても障害を発生させずに操作することができる。例えば、測定電極の接続先がＥＩＳ回路に切り替わると、参照電極の接続先はインピーダンスアナライザの対極接続に切り替えられる。そして、ＥＰＲの増幅器の過充電を避けるために、増幅器の入力は接地に切り替えられる。逆の場合は、測定電極の接続先がＥＰＲ回路に切り替わると、参照電極の接続先は接地へと切り替えられる。大容量μＣにより低ノイズスイッチングが保証され、かつ／または、適当なＤＳＰ／ＦＰＧＡにより、短い秒数で、好ましくはミリ秒、特にマイクロ秒の範囲内ですべてのパスの同期スイッチングが保証される。ＥＰＲの増幅回路の過充電を避けるためには、参照電極の接続先がインピーダンスアナライザの対極接続に切り替わる直前に、増幅器の入力が接地されなければならない。これにより、交流電圧の印加を必要とするインピーダンススペクトルの記録中は、ＥＰＲストリームが確実に中断される。ＥＰＲストリームが中断している間は、データにギャップが生じることになるが、接地することにより別の回路による障害を受けることなく、ギャップはゼロ電場電位で埋められる（図２Ｂ）。ＥＰＲストリームが中断している間に記録される対応のインピーダンスデータには、ＥＰＲ回路による干渉に起因する障害は認められない（図２Ｃ）。
【００５０】
使用する高精度インピーダンスアナライザおよび測定パラメータによるが、インピーダンススペクトルの取得により、ＥＰＲストリームにギャップ（ゼロ電場電位）が生じる。このギャップは上述したスイッチに起因すると同時に該スイッチにより制御されるものであることから、タイムスタンプデータを、コンピュータワークステーションに代表される電子データ処理システムへ転送することが可能であり、このデータを用いて、例えば周波数解析などのギャップが通常除去されるデータ解析を行ってもよい。したがって、上述のスイッチを用いて短時間スケールの多電極同期スイッチングを行えば、いずれの方法においても、図１に示すような測定によるアーティファクトは除去することが可能である（図２ＢおよびＣ参照）。
【００５１】
同じ電極上でＥＰＲとＥＩＳの両方を利用するための実験構成を図３に示す。この実験構成では前述の好ましい９６マルチウェルアレイを使用している。図に示すように、９６ウェルプレートの各ウェルに少なくとも１個の測定電極と１個の参照電極とを有するアレイを使用している。各測定電極と各参照電極は低ノイズスイッチ（ＬＮＳ）に接続され、各ＬＮＳはＥＰＲ測定パスとＥＩＳ測定パスの両方に接続されている。ＥＰＲパスは、細胞で発生するマイクロボルト範囲の電位を、通常適当な係数（例えば７００〜１２００）で増幅して細胞の信号の周波数帯域付近のノイズを除去する電場電位増幅（ＦＰＡ）回路からなる。その後、ＦＰＡパスは多重化され（ＭＵＸ）、アナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）によりデジタル化される。参照電極（ＣＥ）の接続先は、ＥＰＲパスでは接地に切り替えられ、ＥＩＳパスではインピーダンスアナライザ（ＩｍｐＡ）の対極接続に切り替えられる。データの収集および解析はパーソナルコンピューター（ＰＣ）にて行われる。
【００５２】
ＭＵＸは、通常、ＦＰＡパスの後に配置される。このように配置することで、ＭＵＸをＦＰＡの前に配置した時よりもクロストークおよびノイズが一層低減される。各電極にＦＰＡ回路が１つずつ存在することが好ましい。使用するＭＵＸおよびＡＤＣならびに所望の最大サンプリング周波数によるが、通常、１つのＡＤＣで３０〜６０チャネルが多重化される。
【００５３】
ＥＩＳ測定パスは、高精度インピーダンスアナライザ（ＩｍｐＡ）に接続された低ノイズマルチプレクサからなる。ＩｍｐＡは、自己インピーダンスの高い（１００Ｈｚで１０５〜１０６Ω）複数個の電極のインピーダンススペクトルを、低電圧振幅（好ましくは１００ｍＶ未満、特に１０ｍＶ未満）において適当な時間範囲、好ましくはミリ秒範囲、より好ましくはマイクロ秒範囲で測定できるものでなければならない。適当な性能を有するインピーダンスアナライザとしては、例えばＡｇｉｌｅｎｔ  ４２９４  Ａ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）およびＳｏｌａｒｔｒｏｎ  １２６０Ａ＋１２９６Ａ  高インピーダンス誘電体インターフェース（Ｓｏｌａｒｔｒｏｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ社）が挙げられ、適当なアナライザとしてＳｃｉｏＳｐｅｃ  ＩＳＸ−０３も同様に挙げられる。
【００５４】
すべての要素の同期スイッチングには、高性能大容量ＤＳＰ／ＦＰＧＡを使用する。このようなシステムを用いることで、双方の測定パスのスイッチングを厳密に制御することが可能となり、また、パーソナルコンピューター上でのデータ解析用にスイッチング情報（タイムスタンプ）を加えることも可能となる。
【００５５】
図４に示すように、９６個の電極すべてでＥＰＲストリームを連続的に記録することが可能であるが、ＥＩＳスペクトルを取得する際には、これに同期して各ウェルのＥＰＳストリームが低ノイズスイッチにより中断される。インピーダンススペクトルの取得にかかる時間は、使用するインピーダンスアナライザや、取得するパラメータ（周波数帯域、周波数点の数、取得周波数当たりの積分（平均）時間など）によって異なる。例えば、ＳｃｉｏＳｐｅｃ  ＩＳＸ−３を用いて、５１個の周波数点を１ｋＨｚ〜５ＭＨｚの間に等間隔で分配した場合、取得にかかる時間は５００ミリ秒である。この時間ウィンドウの間、ＥＰＳストリームは中断される。９６ウェルすべての測定を行うために、スイッチングとインピーダンススペクトルの取得とが連続して行われる。したがって、９６ウェルプレート全体の測定時間は１分未満である。（低ノイズスイッチから得られた）ギャップ位置データとインピーダンススペクトルは、各電極／各ウェルにおける細胞の寄与（相対インピーダンス）を判定する解析ソフトウェアにより解析される（図４右）。ＥＰＲストリームは、ギャップを除外しながら解析され、その結果、例えば、１分当たりの収縮頻度および（毎分）平均の信号形状を求めることができる。
【００５６】
１ウェル当たりの得られる情報量を拡張するために、各ウェルに少なくとも２個の測定用微小電極を組み込んでもよい。１ウェル当たりの測定電極を増やして、好ましくは細胞と接触させるための電極を１ウェル当たり２個、４個または８個、より好ましくは２個または４個、特に４個とし、１ウェル当たりの参照電極を１個とすることにより、より多くのデータポイントを取得して平均を求めることが可能となる。一方、各ウェルの電極アレイを用いて時空間解析を行うことにより、例えば、心筋細胞の興奮伝導（ＥＰＲ）や微小電極アレイ上の培養神経回路網の活動パターン（ＥＰＲ）が分かる。同様に、複数のインピーダンススペクトルから２Ｄインピーダンスマップを作成することも可能である。
【００５７】
図５は、１ウェル当たり４個の測定電極と１個の対極／参照電極とを含む９６ウェルプレートの適用例を示す。この例では、９６×４個の測定電極と、同数の低ノイズスイッチ（ＬＮＳ）および同数の電場電位増幅器（ＦＰＲ）パスとが存在し、ＦＰＲパスは、通常３０〜６０チャネルを有するマルチプレクサに接続されている。多重化されたＥＰＲストリームは、アナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）によってデジタル化される。インピーダンス関連のすべてのパスは多重化されて、適切な高精度インピーダンスアナライザ（ＩｍｐＡ）へと接続される（図５Ａ参照）。１ウェル当たり２個以上の測定電極が存在すること、および、１つのウェル内で複数のインピーダンスの同時測定が技術的に不可能であることから、１ウェル当たりのＥＰＲストリーム中のギャップは大きくなる（図５Ｂ）。このギャップの長さは、１つのインピーダンススペクトルの測定時間および１ウェル当たりの測定電極数によって異なる。例えば、１ｋＨｚ〜５ＭＨｚのインピーダンススペクトルの取得時間は５００ミリ秒である。これは、１ウェル当たりＥＰＲストリーム中のギャップは２秒であることを意味する。１つの高精度インピーダンスアナライザチャネルを使用して上述したパラメータを取得する場合、すべてのインピーダンススペクトルとＥＰＲストリームを取得するためのプレート全体の測定時間は約２００秒である。低ノイズスイッチのデータを考慮してデータ解析を行えば、（例えば毎分の）平均頻度および信号形状パラメータは求められる。ＥＰＲストリーム中のギャップを最小限に抑えるために、インピーダンススペクトルのパラメータを高周波数帯域に制限し、取得周波数を減らすことも考えられる。さらに、インピーダンススペクトルを最小化して、少なくとも１つの単独の周波数（例えば１００ｋＨｚ）に絞ってインピーダンス測定を行うことも可能である。このようにすれば、取得時間を短縮することが可能であり、例えば、ＳｃｉｏＳｐｅｃ  ＳＣＸ−３のような高精度インピーダンスアナライザを使用した場合は、取得時間を２５マイクロ秒まで短縮することができる。
【００５８】
さらにプレート（例えば９６ウェルプレート）全体の測定時間を短縮するために、ＦＰＧＡを用いた測定システムのような、並列チャネル高精度インピーダンスアナライザ（多チャネルインピーダンスアナライザ）を使用してもよい。少なくとも２以上の並列インピーダンス取得チャネルを用いることにより、取得時間をさらに短縮することができる。
【００５９】
１ウェル当たりの測定電極の増加により、１ウェル当たりのＥＰＳストリーム中のギャップは拡張される。例えば、１ウェル当たり６０個の測定電極を使用すれば、前述したような全スペクトルの取得に要する時間は３０秒となり、また、少なくとも１つのインピーダンス測定チャネルを使用すれば、９６ウェルプレート全体における取得時間は少なくとも５０分間になると考えられる。単周波数測定および並列インピーダンスチャネル取得を採用することにより、所要時間は５秒未満に短縮されるが、取得できるインピーダンスデータは大幅に制限されることになる。本願のシステムを使用して、図６に示すように、ギャップを設けずにＥＰＲストリームの取得に直接インピーダンススペクトルの取得を組み込むことにより、このような制限を回避することが可能となり、特に、ＥＰＲストリーム中のギャップを除去することが可能となる。
【００６０】
図６に示すシステムの改良は、ＦＰＲパスによる複数のＥＰＲストリームの増幅を並行して行うことに基づいているが、最終的にＡＤＣによって行われるアナログストリームのデジタル化は、通常多重化ストリームの形態で行われる。その結果、通常１６〜６４個の増幅ストリームが多重化され、各ストリームを個別にデジタル化する場合に使用される時間ウィンドウの１／３０〜１／６０で済む。例えば、ＥＰＳストリームを４ｋＨｚ（すなわち毎秒４０００回）でサンプリングする場合、取得時間は約２５０マイクロ秒である（図６Ａ）。３０チャネルの多重化を行い、少なくとも１０ＭＨｚでデジタル化を行えば、１つのデータポイントは１／１０マイクロ秒でデジタル化され、各チャネルは少なくとも５０マイクロ秒でデジタル化される。切替時間を含む安全ウィンドウを考慮すれば、２５０マイクロ秒の時間ウィンドウのうち約２５マイクロ秒が１チャネル当たりのＥＰＳのデジタル化に使用される。その結果、２００マイクロ秒より長い時間ウィンドウをインピーダンススペクトル記録に使用することができる。インピーダンス取得パラメータ（周波数点の数および周波数帯域）にもよるが、控え目に見積もっても、１０ｋＨｚを超える周波数帯域でのインピーダンススペクトルの取得が可能である。スペクトルの解像度のさらなる向上、およびスペクトルを取得する周波数帯域のさらなる拡張には、高速・高精度インピーダンスアナライザにおけるマルチサイン励起といった公知の手法があり、このようなアナライザの使用が好ましい。ＥＰＲストリームのギャップのない検出を保証するためには、インピーダンスデータの取得時間は、利用可能な時間、すなわち上記の例では２００マイクロ秒に制限される。これは、信号の安定性／ＳＮ比を向上させるために行う経時的な積分の実施は不可能または制限されることを意味しているかもしれない。インピーダンススペクトルは毎秒４０００回（４ｋＨｚのサンプリング周波数で）取得することができるため、平均に用いる測定数を毎秒数百から１０００に増やすことにより信号の質を向上させることができる。
【００６１】
ＥＰＳのサンプリング周波数を上げる必要がある場合（例えば神経回路網の活動のモニタリングが目的の場合）は、取得ウィンドウを短縮することができる。サンプリング速度が２０ｋＨｚの場合、取得ウィンドウは５０マイクロ秒の範囲である（図６Ｂ参照）。ＥＩＳ測定に適当な時間枠を確保するために、高速マルチプレクサを用いてＥＰＲ取得時間を３マイクロ秒より短くすることが好ましい。その結果、３０マイクロ秒より長い時間をＥＩＳ測定に利用することができる。控え目に見積もっても、７０ｋＨｚを超える周波数帯域でインピーダンス値またはインピーダンススペクトルを取得することが可能である。
【００６２】
したがって、高速切替可能な構成に基づく本願のシステムを使用することにより、ギャップのないＥＰＲストリームに加えて、特定の周波数帯域における個々の周波数のインピーダンス値または該周波数帯域全体のインピーダンススペクトルからなるデータを取得することが可能となり、上記の周波数帯域は必要とされるＥＰＲサンプリング周波数によってのみ決定される（図６Ｃ）。
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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