(57)【要約】  本発明は、患者の疾病のインビトロ診断方法に関する。本発明によると、前記方法は、  ａ）前記患者から尿サンプルを得るステップと、  ｂ）前記サンプル中の、前記疾病の少なくとも１つのマーカー、並びに尿路上皮性の細胞及び／又は尿路上皮性の微粒子の少なくとも１つの特異的なマーカーを検出するステップと、  ｃ）前記疾病の前記少なくとも１つのマーカーの発現の閾値を、尿路上皮性の細胞及び／又は尿路上皮性の微粒子の前記少なくとも１つの特異的なマーカーによる前記疾病の前記マーカーの標準化により決定するステップとを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の疾病のインビトロ診断方法であって、
ａ）前記患者から尿サンプルを得るステップと、
ｂ）前記サンプル中の、前記疾病の少なくとも１つのマーカー、並びに尿路上皮性の細胞及び／又は尿路上皮性の微粒子の少なくとも１つの特異的なマーカーを検出するステップと、
ｃ）前記疾病の前記少なくとも１つのマーカーの発現の閾値を、尿路上皮性の細胞及び／又は尿路上皮性の微粒子の前記少なくとも１つの特異的なマーカーによる前記疾病の前記マーカーの標準化により決定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記ステップｂ）が、尿路上皮性の細胞及び／又は尿路上皮性の微粒子の前記少なくとも１つの特異的なマーカーの転写産物の検出、並びに前記疾病の前記少なくとも１つのマーカーの転写産物の検出を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップｂ）が、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、最終点ＰＣＲ、半定量的ＰＣＲ又はそれらの組み合わせを含む群から選択される核酸の増幅技術の手段により実施される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記疾病が、腎臓の線維症、腎臓の上皮細胞の表現型の変化、移植拒絶、癌、糸球体の疾患、管疾患、間質性疾患及び脈管性腎臓疾患を含む群から選択される腎臓の疾病である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記腎臓の疾病の前記少なくとも１つの特異的な遺伝マーカーが、ヒト遺伝子ＣＤ４５、ＣＤ６８、及びＶＩＭ、並びにこれらの遺伝子と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の配列相同性を有する遺伝子を含む群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記疾病が、尿に排出される細胞及び／又は微粒子の量を変更する疾病である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記尿に排出される細胞及び／又は微粒子の量を変更する疾病が、体節性及び局所性のヒアリノーシス、急性の管ネクローシス、上皮表現型の変化、急性の移植拒絶、シェーグレン症候群、サルコイドーシスを含む群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
尿路上皮性の細胞及び／又は尿路上皮性の微粒子の前記少なくとも１つの特異的なマーカーが、ヒト遺伝子ウロプラキン１Ａ、ウロプラキン１Ｂ、ウロプラキン２、ウロプラキン３Ａ、ウロプラキン３Ｂ、ウロプラキン３ＢＬ、Ｂｃａｓ１、ＣＥＰ１５２、ＣＲＡＢＰ２、ＤＮＡＳＥ１、ＫＲＴ２０、ＰＬＥＫＨＦ１、ＰＬＥＫＨＧ４Ｂ、ＲＣＮ１、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＵＬＴ２Ａ１、ＴＦＦ１、ＶＩＬＬ、ＺＮＦ７２０、及びこれらの遺伝子と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の配列相同性を有する遺伝子を含む群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
標準化された疾病の前記マーカーの発現の閾値を、疾患により変更されない遺伝子発現の閾値と比較するためのステップをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
患者に由来する尿サンプルから腎臓の上皮細胞の表現型の変化を検出するためのインビトロ診断キットであって、前記サンプル中の、ヒト遺伝子ＣＤ４５、ＣＤ６８及びＶＩＭを含む群から選択される疾病の少なくとも１つの特異的なマーカーを検出するための少なくとも一対のプライマーと、ウロプラキン１Ａを検出するための少なくとも一対のプライマーとを含むインビトロ診断キット。
【請求項１１】
腎臓の上皮表現型の変化である腎臓の疾病を検出するための、請求項１０に記載のインビトロ診断キットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、腎泌尿器外科の分野である。より具体的には、本発明は、泌尿器系の疾病をインビトロ診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓疾患は、腎臓の異なる構造上の区画である、脈管、糸球体、細管、又は間質に影響する可能性がある。これらの障害は急性及び／又は慢性の腎不全を誘発し、それらが最終的に進展すると、腎臓の機能的な単位が全体的に破壊され、細胞外マトリックスの拡張に置き換わる。即ち、腎臓の線維症を生じる。これらの腎臓疾患には、排泄管の閉塞、炎症、自己免疫、アレルギー、沈着症、高血圧症、糖尿病、血管症、虚血、毒性などの種々の対応する病因が含まれる。腎臓疾患は、本来の腎臓又は腎臓移植後の同種移植物に影響する可能性がある。フランスでは、毎年新たに３，０００ケースの移植（腎臓、心臓、肝臓、骨髄、肺など）が存在すると見積もられている。移植を受けた患者の計画的な追跡によって、線維症へと進展する腎疾患を早期段階で研究することが可能となった。上皮間充織移行（ＥＭＴ）マーカーの腎臓組織における発現によって、虚血や、免疫抑制剤、特にシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の拒絶又は毒性により生じる可能性がある腎臓組織における線維症の早期検出が可能となる（Ｓｌａｔｔｅｒｙ他、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２００５年８月；１６７（２）：３９５〜４０７；Ｈｅｒｔｉｇ他、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２００６年、Ｇａｌｉｃｈｏｎ他、Ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｐａｉｒ  ２０１１年；Ｇａｌｉｃｈｏｎ他、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２０１１年）。
【０００３】
ＥＭＴは動的なプロセスであり、ＥＭＴの間に細胞は上皮の特徴を失い、そして間充織の特徴を獲得する。これらの変更は、細胞の形態と同様に、その働きにも影響する。ＥＭＴが腎尿細管細胞に達すると、ＥＭＴは線維症及び慢性腎不全へと進行する（Ｈｅｒｔｉｇ他、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２００８年）。従って、免疫抑制剤処置に順応するために、又は免疫抑制剤処置を変更するために移植を経験した患者の間で、この現象の出現をモニターする必要がある。
【０００４】
現在、何らかの腎臓の疾病の検出及びモニタリングのために実施される参照方法は、バイオプシーである。バイオプシーは、組織のコアを経皮的、経静脈的、又は外科的な手段により腎臓から取り出すことからなる。このサンプルは、次いで組織学的な検査に供されて、見込まれる疾病の徴候（糸球体性、管性、脈管性又は間質性の区画の、破壊、細胞浸潤又は肥大）が検出される。
【０００５】
しかしながら、この方法には多くの欠点がある。サンプルをとることに、患者のリスクがないわけではない。多くの合併症が観察されており、それは例えば、血尿、閉塞性の腎不全、さらには無尿、腎周囲領域における血腫、動脈性及び静脈性の瘻孔の出現、稀に出血、移植物の喪失、並びに死である。任意の侵襲性の措置に関連するリスクとは別に、バイオプシーが、腎臓の全体のコンディションを表していない領域において行われ、その結果、この標本抽出の措置が理由で、患者の真の状況が過小評価又は過大評価されることが起こりえる。
【０００６】
加えて、バイオプシーは規則正しく短いインターバルで行うことができないので、この方法では疾病の出現を早期に検出することもまた可能ではない。また他に、腎バイオプシーを行うことは、コスト高であり、複雑であり、侵襲性であり、また患者に痛みがある。
【０００７】
従って、早期の検出を可能とし、患者への見込まれるリスクができるだけ少ない、非侵襲性であり、単純であり、経済的で信頼のおける診断方法を見つける必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、これらの先行技術の欠点を克服することを目的とする。
【０００９】
より具体的には、少なくとも１つの実施形態において、腎臓の疾病の早期診断方法又は腎臓の影響を有する疾病の早期診断方法を提供することが本発明の課題である。
【００１０】
少なくとも１つの実施形態において、非侵襲性の診断方法を実施することが本発明の別の課題である。
【００１１】
少なくとも１つの実施形態において、信頼のおける正確な診断方法を実施することが本発明のさらに別の課題である。
【００１２】
本発明の少なくとも１つの実施形態において、単純に行われる診断方法を実施することが本発明の別の課題である。
【００１３】
少なくとも１つの実施形態において、より経済的な診断方法を実施することが本発明の別の課題である。
【００１４】
少なくとも１つの実施形態において、処置の有効性及び許容性を追跡する方法を実施することが本発明の別の課題である。
【００１５】
最後に、少なくとも１つの実施形態において、患者にとってコストが低い診断方法を実施することが本発明の別の課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
これらの課題及び本明細書の以下の記載で明示される他の課題は、全体的に又は少なくとも部分的に、患者の疾病のインビトロ診断方法により達成される。
【００１７】
本発明によると、係る方法は、
ａ）前記患者から尿サンプルを得るステップと、
ｂ）前記サンプル中の、前記疾病の少なくとも１つのマーカー、並びに尿路上皮性の細胞及び／又は尿路上皮性の微粒子の少なくとも１つの特異的なマーカーを検出するステップと、
ｃ）前記疾病の前記少なくとも１つのマーカーの発現の閾値を、尿路上皮性の細胞及び／又は尿路上皮性の微粒子の前記少なくとも１つの特異的なマーカーによる前記疾病の前記マーカーの標準化により決定するステップと
を含む。
【００１８】
従って、本発明は、尿に含有される細胞及び微粒子から遺伝物質を抽出して、疾病と関連した目的の遺伝子の発現を、疾病に影響されない尿細胞に特異的な遺伝子の発現と比較するために、尿に含有される細胞及び微粒子を使用することに依拠する。
【００１９】
実際、尿には、尿の排泄管の上皮の正常な更新から生じる、少量の尿路上皮性の細胞が含有される。また、尿には、特に腎臓の疾病の存在に応じて可変性であるものの、多くの白血球、腎尿細管の細胞又は糸球体の細胞、血液及び微粒子も含有される可能性がある。
【００２０】
用語「微粒子」は、活性化プロセス又はアポトーシスの間に大部分の細胞により放出される可能性がある複雑な小胞構造を意味すると理解される。それらは膜貫通タンパク質及び膜貫通レセプターを暴露するリン脂質の二重層膜により形成され、それらは母細胞に由来するサイトゾルの成分、例えば、酵素、転写因子、及びｍＲＮＡを含む。
【００２１】
用語「尿路上皮性の細胞」は、骨盤から尿道まで、ヒトの尿路上皮を形成する移行上皮細胞を意味すると理解される。これらの細胞は、円柱状、凧状、傘状、及びバルーン状の種々の形態を有する。
【００２２】
用語「尿路上皮性の細胞の特異的なマーカー」は、尿路上皮性の細胞又は尿路上皮性の微粒子により特異的に発現される遺伝子を意味し、細胞内であろうと又はその表面上であろうと、前記細胞によるこの遺伝子の合成のレベルが、腎細胞に影響する可能性がある疾病とは無関係であることを意味すると理解される。従って、この概念は、どのような細胞のタイプ、細胞の機能又は状態であろうと遍在性に発現されるハウスキーピング遺伝子の概念とは異なる。
【００２３】
分子生物学又は生化学の現行の方法を用いて患者の尿に含有される細胞及び微粒子から核酸及びタンパク質を抽出することは、稀ではあるが、可能である。サンプル中の細胞及び微粒子の量に関するバイアスを排除するために、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子、１８ＳリボソームＲＮＡ、サイクロフィリンＡ若しくはサイクロフィリンＢ、βカテニン、又は重ねてＨＰＲＴ（ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）などのハウスキーピング遺伝子の発現の関数として目的の遺伝子の発現を表すことは、一般的な慣行である（Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｓ．Ａ．  Ｂｕｓｔｉｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、２０００年、２５、１６９〜１９３）。
【００２４】
しかしながら、この方法は、疾病の細胞特異性を考慮していない。そのため、厳格に細胞タイプに影響する疾病とリンクする遺伝子の発現の変更が、尿に存在する他の細胞タイプに由来するハウスキーピング遺伝子が強く発現されるとの事実によりマスクされ得る。
【００２５】
従って、本発明の寄与の１つは、影響を受けた細胞タイプとは無関係の遺伝子の発現により、目的の遺伝子の発現を標準化することである。この標準化のステップを使用して、腎臓起源の尿細胞の定量的及び定性的なバリエーションとは無関係の尿マーカーにより、疾病マーカーの発現の閾値が決定される。次に、このマーカーが、強く、又は反対に弱く発現するかどうかを知ることが可能である。この特徴によって、信頼のおける、正確で、厳格に患者の健康状態が反映された診断検査を得ることが可能となる。従って、本発明による方法を診断目的に使用して、疾病の進行をモニターすることができる。
【００２６】
加えて、尿サンプルで作業することには、多くの利点がある。
−  サンプルは、アクセスが容易である。
−  サンプルの収集は、非侵襲性及び無痛性である。
−  サンプルの収集は、経済的である。
【００２７】
また、この方法の単純さは、一般に使用されるものの他に、特殊な技術資格又は設備を使用することなく、全てのタイプの実験室で、この方法を実施することを可能とすることができる。この方法を実施するために何らかの特定の投資がないことから、分析のコストが減少する。
【００２８】
最終的に、この標準化の方法を適用して、腎臓の又は非腎臓の異なる疾病に応用することができる。但し、これらの疾病は、尿に排出される及び存在する、尿路上皮性の細胞及び／又は微粒子の発現及び／又は量を変更するものである。
【００２９】
さらに本発明は、ステップｂ）が、尿路上皮性の細胞及び／又は尿路上皮性の微粒子の前記少なくとも１つの特異的なマーカーの転写産物の検出、並びに前記疾病の前記少なくとも１つのマーカーの転写産物の検出を含む、インビトロ診断方法に関する。
【００３０】
転写産物の研究は、細胞のゲノムにおける遺伝子の存在を研究することよりも信頼性がある。実際、細胞のゲノムにおける遺伝子の存在は、前記細胞における遺伝子の発現とは必ずしも関連付けできるとは限らないことが知られている。というのも、特定の遺伝子の発現の制御は、多数のパラメータに支配されるからである。従って、転写産物の検出によって、より正確で、より信頼のおける結果を得ることが可能である。
【００３１】
本発明の別の課題は、ステップｂ）が、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、最終点ＰＣＲ、半定量的ＰＣＲ又はそれらの組み合わせを含む群から選択される核酸の増幅技術により実施される方法である。
【００３２】
用語「ＰＣＲ」（ポリメラーゼ連鎖反応）は、標的ＤＮＡの断片がインビトロで多数のコピーに複製される技術を意味すると理解される。用語「ＲＴ−ＰＣＲ」（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法）は、抽出されたメッセンジャーＲＮＡｓに由来する相補ＤＮＡのインビトロ合成を意味すると理解される。用語「定量的ＰＣＲ」は、リアルタイムＰＣＲとしても知られており、標的ＤＮＡの断片のインビトロ複製の技術であって、付加的にこの標的断片の初期量の測定を可能とする技術を意味すると理解される。「半定量的ＰＣＲ」は、幾つかのポイントでＰＣＲが中断され、ＤＮＡの初期量の評価が可能となることにおいて定量的ＰＣＲと区別できる。ＤＮＡ量が異常に低い場合に、このタイプのＰＣＲは有用である。「最終点ＰＣＲ」は、アガロースゲルにおけるバンドの比較によりＤＮＡの初期量を評価するため、ノーザンブロット技術を古典的ＰＣＲと関連させる。
【００３３】
これらの方法は、僅かなコストで実施され、診断検査の要求に適合し、速く、信頼のおける結果が与えられるという利点を有する。
【００３４】
さらに本発明は、ステップｂ）が、インサイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）又は蛍光によりマークされるハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、バイオチップハイブリダイゼーション、ノーザンブロット法又はサザンブロット法を含む群から選択される核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて実施されるインビトロ診断方法に関する。
【００３５】
また、本発明は、ステップｂ）が、核酸のシークエンシング方法に基づいて実施されるインビトロ診断方法に関する。
【００３６】
本発明のさらに別の課題は、疾病が、腎臓の線維症、腎臓の上皮細胞の表現型の変化、移植拒絶、癌、糸球体の疾患（糖尿病、膜外糸球体腎炎、微少変化群、体節性及び局所性のヒアリノーシスなど）、管疾患（急性の管ネクローシス、上皮間充織移行マーカーの発現、萎縮症、細胞の拒絶、排泄管の閉塞など）、間質性疾患（炎症、線維症）及び脈管性腎臓疾患（動脈性高血圧症、血栓性の微小血管障害、体液性拒絶など）を含む群から選択される腎臓の疾病であるインビトロ診断方法である。
【００３７】
用語「上皮間充織移行」（ＥＭＴ）は、通常は基底膜と相互作用し、極性をもつ上皮細胞が、遊走能力の増加、侵襲性の性質、アポトーシスへの抵抗性の増加及び細胞外マトリックス成分の大量増加を含む、間葉細胞の表現型を獲得することを可能にする多数の生化学的な形質転換を起こすことができる生物学的なプロセスを意味する（Ｋａｌｌｕｒｉ  Ｒ、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ＲＡ、「Ｔｈｅ  ｂａｓｉｃｓ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｔｏ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ」、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１１９（２００９年）１４２０〜１４２８）。上皮表現型の変化は、臨床の状況下で組織において研究することができる、ＥＭＴマーカー（例えば、管上皮におけるビメンチン及びβカテニン）である（Ｈｅｒｔｉｇ  Ａ．他．ｎ「Ｅａｒｌｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｇｒａｆｔ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ」、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９（２００８年）１５８４〜１５９１）。
【００３８】
本発明の別の課題は、その方法の間に前記患者が臓器移植を受ける方法であって、前記腎臓の疾病が、腎臓移植における間質性の線維症、管性の萎縮症又は上皮間充織移行の存在である方法である。
【００３９】
このように、本発明による方法は、腎臓における炎症、又はＥＭＴ誘発性の上皮表現型の変化などの、腎臓の疾病の出現の効果的で早期の検出を可能とする。
【００４０】
本発明のさらに別の課題は、前記腎臓の疾病の少なくとも１つの特異的な遺伝マーカーが、ヒト遺伝子ＣＤ４５（配列番号１）、ＣＤ６８（配列番号２）、及びＶＩＭ（配列番号３）、並びにこれらのヒト遺伝子と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の配列相同性を有する遺伝子を含む群から選択されるインビトロ診断方法である。
【００４１】
ヒト遺伝子ＣＤ４５を正確に表示すると、ＰＴＰＲＣ（タンパク質チロシンホスファターゼレセプタータイプＣ）とも記号化される。以下の記載において、ヒト遺伝子ＣＤ４５又はＰＴＲＰＣは、ＣＤ４５又はＰＴＰＲＣの記号で等しく指定される。
【００４２】
驚くことに、これらの遺伝子の発現は、臨床的に安定な腎臓移植を経験した患者の尿でかなり増加するが、その移植物のバイオプシーは上皮表現型の変化の存在を示すことを発明者は発見した。この過剰発現を、腎臓の同種移植物のバイオプシーにおける、上皮間充織移行及び管性−間質性の疾患の間に生じる上皮表現型の変化の存在と関連付けすることができる。なお、これらのバイオプシーは、移植後３月の計画的なスクリーニングとの関連で行われる。本発明において理解されるとおり、疾病の特異的なマーカーである僅か１つの遺伝子の発現を探索することは可能である。しかしながら、診断を改善するために、異なる遺伝子の組み合わせを探索することが好ましく、その遺伝子が尿に発現することによって、特定の腎臓の疾病の存在が考慮される。例えば、我々は、ウロプラキンにより標準化される、ＣＤ４５、又はＰＴＰＲＣ、及びＣＤ６８遺伝子の発現の研究を例証して、移植物における炎症細胞の存在を検出することができる。特定の腫瘍マーカーの発現を探索することも可能である。例証することができる例は、腎臓の癌のモニタリングとの関連において、明細胞癌のマーカー、ラセマーゼの探索、カベオリン−１（配列番号２９）、ＲＯＲ１（配列番号３０）、ＣＤ１０（配列番号３１）、ケラチン７、ビメンチン（配列番号３）、ＴＰ５３（配列番号２６）である。
【００４３】
ヌクレオチド配列間の「相同的な配列」又は「配列相同性」は、ＮＣＢＩサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｎ＆ＢＬＡＳＴ＿ＰＲＯＧＲＡＭＳ＝ｍｅｇａＢｌａｓｔ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＳＨＯＷ＿ＤＥＦＡＵＬＴＳ＝ｏｎ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ）において利用可能なアルゴリズムｂｌａｓｔｎを用いて、ソフトウェアＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用いてヌクレオチド配列のリニアコンパリソンにより決定される。
【００４４】
この分析に選択されるパラメータは、以下のものである。
−  データベース：ヒトゲノムのプラス転写物（ヒト  Ｇ＋Ｔ）、
−  環境配列のモデル又はサンプルの除外なし、
−  プログラムの最適化：ｂｌａｓｔｎ（幾分か類似する配列）、
−  短いクエリー＝インプット配列に対して自動的に調整されるパラメータ、
−  期待閾値＝１０、
−  ワードサイズ＝１１、
−  クエリー範囲における最大マッチ＝０。
【００４５】
スコアリングパラメータに関して、これらのパラメータは初期設定（マッチ／ミスマッチスコア＝２〜３、ギャップコスト＝エグズィステンス：５、エクステンション：２）に固定される。最終的に、如何なるフィルターも適用されない。
【００４６】
別の有利な実施形態によると、前記疾病は、尿に排出される細胞及び／又は微粒子の量を変更する疾病である。
【００４７】
好ましくは、尿に排出される細胞及び／又は微粒子の量を変更する前記疾病は、糸球体の疾患、例えば、体節性及び局所性のヒアリノーシス、管疾患、例えば、急性の管ネクローシス、上皮表現型の変化、細胞拒絶、及び間質性の疾患、例えば、急性の移植拒絶、シェーグレン症候群及びサルコイドーシスを含む群から選択される。
【００４８】
このように、疾病が遺伝子発現のプロフィール及び／又は尿に排出される細胞の量を変更する場合に、本発明による方法は、患者の尿サンプルの収集に基づいて、非腎臓疾患の進展の信頼のおけるスピーディーで非侵襲性の検出を可能とする。
【００４９】
管ネクローシスは、腎尿細管上皮壁が大幅に剥離することにより尿の管細胞の数が増加する形態をとる。体節性又は局所性のヒアリノーシスでは、尿に多量の有足細胞を伴う。白血球数の増加は、移植の急性拒絶の徴候である。
【００５０】
尿路上皮性の細胞の前記少なくとも１つの特異的なマーカーは、ヒト遺伝子ウロプラキン１Ａ（配列番号４）、ウロプラキン１Ｂ（配列番号５）、ウロプラキン２（配列番号６）、ウロプラキン３Ａ（配列番号７）、ウロプラキン３Ｂ（配列番号８）、ウロプラキン３ＢＬ（配列番号９）、Ｂｃａｓ１（配列番号１０）、ＣＥＰ１５２（配列番号１１）、ＣＲＡＢＰ２（配列番号１２）、ＤＮＡＳＥ１（配列番号１３）、ＫＲＴ２０（配列番号１４）、ＰＬＥＫＨＦ１（配列番号１５）、ＰＬＥＫＨＧ４Ｂ（配列番号１６）、ＲＣＮ１（配列番号１７）、ＳＥＭＡ５Ｂ（配列番号１８）、ＳＵＬＴ２Ａ１（配列番号１９）、ＴＦＦ１（配列番号２０）、ＶＩＬＬ（配列番号２１）、ＺＮＦ７２０（配列番号２２）、及びこれらの遺伝子と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の配列相同性を有する遺伝子を含む群から有利に選択される。
【００５１】
尿に存在する細胞の間で、尿路上皮性の細胞のみが、これらの遺伝子を発現する。これらの遺伝子は、腎臓の疾病とは無関係に、尿路上皮性の細胞及び／又は微粒子により特異的に常に発現される。これらの遺伝子は、生物体の各細胞の核に含有される遺伝物質に天然で存在する。しかしながら、それらの遺伝子は、生物体の全ての細胞で同じ様式では発現されない。換言すれば、全ての遺伝子が、ヒトの体を形成する全ての細胞で、ＤＮＡからｍＲＮＡに転写され、そして次に、ｍＲＮＡからタンパク質へと翻訳されるとは限らない。しかしながら、これらの遺伝子が、尿に含有される細胞及び微粒子の間で、尿路上皮性の細胞により特異的に発現されること、及びそのような様式で常に発現されることを本発明者等は発見した。従って、本発明者等は、特異的に腎細胞に影響する疾病又はそれらの遺伝子の尿中の量を変更する疾病とリンクした、標準化遺伝子の選択の参照を制定する。本発明者等は、上述の遺伝子が他の細胞タイプにおいて実際には検出可能であることが強調されることを望む。これは、例えば、トータルＤＮＡ中のある遺伝子の存在に関する単純な探索に基づく場合であり、ある細胞タイプにより発現される複数の遺伝子中のある遺伝子の存在に関する場合ではない。これらの遺伝子は、他のタイプの細胞によっても発現される可能性がある。しかしながら、本発明における発明者等の興味は、患者の尿サンプル中に見つけることができる全ての細胞タイプの間で、尿路上皮性の細胞のみが、疾病のコンディションとは独立して、これらの遺伝子を発現するとの事実に関する。結果的に、本発明において理解されるとおり、尿路上皮性の細胞又は尿路上皮性の微粒子の特異的なマーカーの概念は、ハウスキーピング遺伝子の概念と区別されるべきである。実際、ハウスキーピング遺伝子は、それらの細胞タイプ及びそれらの機能が何であれ、全ての細胞で発現される遺伝子である。これに対して、用語「尿路上皮性の細胞の特異的なマーカー」は、尿サンプル中に見つけることができる全ての細胞の間で、尿路上皮性の細胞によってのみ発現される遺伝子に対応する。
【００５２】
また、これらの遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子（１８Ｓ  ＲＮＡ、ＧＡＰＤＨなど）による本方法の標準化と関連して、優れた統計学的な相関関係（ｐ値＜０．０１）を得るために使用できる遺伝子として本発明者により同定された。各遺伝子に関して得られたｐ値は、以下の表１に示される。
【００５３】
【表１】
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【００５４】
好ましくは、尿路上皮性の細胞又は尿路上皮性の微粒子の前記少なくとも１つの特異的なマーカーは、ヒト遺伝子ＵＰＫ１Ａ、ＵＰＫ１Ｂ、ＵＰＫ２及びＵＰＫ３Ａ、並びにこれらの遺伝子と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の配列相同性を有する遺伝子を含む遺伝子の群から選択される。
【００５５】
用語「標準化」は、測定又は操作の誤差、及び生物学的なバリエーションの独立性に関するバイアスの排除を意味すると理解される。従って、標準化のステップによって、より信頼のおける結果を生むことが可能となる。調査される疾病により影響を受けた細胞に特異的な遺伝子を用いる標準化によって、尿サンプル中のこれら同じ細胞の比率に関するバイアスが排除される。実際、尿の定量的及び定性的な組成は、尿の流速が理由で又は疾患が理由で固定されない。従って、患者の疾病の真の進行を間違って評価するリスクは、現実的なものであり、このリスクが患者の治療上の処置に有害であることを証明できるだろう。
【００５６】
例えば、定量的ＰＣＲ技術が使用された場合に、標準化は、以下の２つのステップでの対数スケール（生の結果に対応する）からリニアスケールへの移行で構成される。
（１）Ｃｐ尿路上皮性の細胞の特異的なマーカー−Ｃｐ疾病マーカー＝ΔＣｐ、
Ｃｐ又は交点は、装置による蛍光シグナルの検出前の増幅のサイクル数である。
（２）標準化された疾病マーカーの発現のレベル＝２ΔＣｐ
【００５７】
ゲルでの移動を実施して、古典的ＰＣＲに続くアガロースゲルでの移動のケース又はノーザンブロット及びサザンブロット技術のケースと同様の結果を示す場合に、オペレーターは、各々の移動したバンドの光学密度を何らかの通常のソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｊ（商標）、ＵＮ−ＳＣＡＮ−ＩＴ  Ｇｅｌ（商標））で測定し、その報告を作成し、患者における目的の遺伝子の発現の閾値を決定しなければならない。発現の閾値は、次に以下のとおり計算される。
標準化された疾病マーカーの発現レベル＝疾病マーカーの光学密度／尿路上皮性の細胞マーカーの光学密度
【００５８】
本発明の別の課題は、腎臓の疾病の前記マーカーの発現の閾値を、疾患により変化しない発現の閾値と比較するためのステップをさらに含む、インビトロ診断方法である。
【００５９】
健常患者との比較によって、通常発現される遺伝子の発現の制御における、疾病の正又は負の影響を記録することが可能である。これは以下のとおり行われる。
遺伝子の制御＝２（ΔＣｐ患者−ΔＣｐ健常人）
【００６０】
健常患者との比較とは別に、本発明の方法に基づいて移植又は疾病状態の進行をモニターすることが可能である。患者の以前の結果を保持すること及びそれらの結果を参照として使用することは実際に可能である。この内部標準化によって、個人間の差によるバイアスが排除される。また、患者の医学的な追跡、及び疾病又は移植のモニタリングも可能となる。
【００６１】
さらに、本発明は、患者に由来する尿サンプルから疾病を検出するためのインビトロ診断キットを含み、このキットは、前記サンプル中の疾病の少なくとも１つの特異的なマーカーを検出するための少なくとも一対のプライマーと、前記サンプル中の尿路上皮性の細胞の少なくとも１つの特異的なマーカーを検出するための少なくとも一対のプライマーとを含む。
【００６２】
有利には、前記疾病は、腎臓の線維症又は腎臓の上皮細胞の表現型の変化であり、かつ腎臓の疾病の前記少なくとも１つの特異的なマーカーは、ヒト遺伝子ＣＤ４５、ＣＤ６８及びＶＩＭを含む群から選択される。
【００６３】
好適な実施形態において、尿路上皮性の細胞の前記少なくとも１つの特異的なマーカーは、ヒト遺伝子ウロプラキン１Ａ、ウロプラキン１Ｂ、ウロプラキン２、ウロプラキン３Ａ、ウロプラキン３Ｂ、ウロプラキン３ＢＬ、Ｂｃａｓ１、ＣＥＰ１５２、ＣＲＡＢＰ２、ＤＮＡＳＥ１、ＫＲＴ２０、ＰＬＥＫＨＦ１、ＰＬＥＫＨＧ４Ｂ、ＲＣＮ１、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＵＬＴ２Ａ１、ＴＦＦ１、ＶＩＬＬ、ＺＮＦ７２０、及びこれらのヒト遺伝子と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の配列相同性を有する遺伝子を含む群から選択される。
【００６４】
本発明の別の課題は、腎臓の疾病の検出のためのインビトロ診断キットの使用であって、前記腎臓の疾病が線維症又は腎臓の上皮細胞の表現型の変化であるインビトロ診断キットの使用に関する。
【００６５】
本発明の他の特性及び利点は、単純な例示及び非網羅的な例の様式で与えられる以下の好適な実施形態の記載から、並びに添付される図面から、さらに明らかに示される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ＥＭＴスコアと、ＧＡＰＤＨで標準化されたビメンチン（ＶＩＭ）についての尿ＰＣＲの結果との相関関係を示すグラフである。
【図２】ウロプラキン１Ａ遺伝子ＵＰＫ１Ａにより結果が標準化された場合の、同じＥＭＴスコアと同じビメンチン（ＶＩＭ）についての尿ＰＣＲの結果との相関関係を示す図である。
【図３】ＥＭＴスコアと、ＧＡＰＤＨで標準化されたＣＤ６８についての尿ＰＣＲの結果との相関関係を表すグラフである。
【図４】これらの結果がウロプラキン１Ａ遺伝子ＵＰＫ１Ａにより標準化された場合の、同じＥＭＴスコアと同じＣＤ６８についての尿ＰＣＲの結果との相関関係を示す図である。
【図５】ＥＭＴスコアと、ＧＡＰＤＨで標準化されたＣＤ４５の尿ＰＣＲの結果との相関関係を表す図である。
【図６】これらの結果がウロプラキン１Ａ遺伝子ＵＰＫ１Ａにより標準化された場合の、同じＥＭＴスコアと同じＣＤ４５についての尿ＰＣＲの結果との相関関係を表す図である。
【図７】本発明の方法による用語「腎臓」及び「細胞間ジャンクション」に対応する同定された遺伝子の数を表すグラフである。
【図８】標準化の方法による用語「腎臓」及び用語「細胞間ジャンクション」に関する遺伝子の拡大の有意性を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
本発明の一般原則は、疾病のマーカー又は疾病マーカーとして指定される疾病の現象と関連した遺伝子の発現を、参照遺伝子の発現と比較することに依拠している。尿路上皮性の細胞におけるこの参照遺伝子の発現のレベルは、疾病により影響を受けた細胞からは独立している。このマーカーは、尿路上皮性の細胞の特異的なマーカーと指定される。
【００６８】
実施例１：本発明の方法に基づいた腎臓移植の上皮表現型の変化の診断
本発明による診断法の感度を評価するために、臓器移植を経験し、ＣｓＡで処置された患者で腎バイオプシーが行われる。同時に、この患者の尿のサンプルが収集される。これらのサンプルにおいて、腎臓の上皮細胞の表現型の変化と関連したマーカーについて、定量的ＰＣＲにより探索がなされる。本発明による方法の優位性を実証するために、定量的ＰＣＲの結果は、本発明による方法に準拠した尿路上皮性の参照遺伝子、並びに文献に記載された古典的な方法に準拠したハウスキーピング遺伝子により標準化される。
【００６９】
移植患者での対照のバイオプシーは、Ｔｅｎｏｎ病院（パリ）の解剖病理学研究室により分析された。当業者に周知の免疫組織化学法により、ＥＭＴマーカーであるビメンチン及びβ−カテニンのタンパク質発現に関して探索がなされる。ＥＭＴスコアは、ＥＭＴマーカー、即ちビメンチン及びβ−カテニンを発現する尿細管のパーセンテージの関数として決定される（Ｈｅｒｔｉｇ他、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２００６年）。これらのスコアは、以下のとおり表される。
−  スコア＝０：ＥＭＴなし。
−  スコア＝１：バイオプシーにおける尿細管の＜１０％がＥＭＴマーカーを提示する。
−  スコア＝２：バイオプシーにおける尿細管の１０〜２４％がＥＭＴマーカーを提示する。
−  スコア＝３：バイオプシーにおける尿細管の２５〜５０％がＥＭＴマーカーを提示する。
−  スコア＝４：バイオプシーにおける尿細管の＞５０％がＥＭＴマーカーを提示する。
【００７０】
スコアが２以上の場合に、患者はＥＭＴ陽性であると考えられる。
【００７１】
１．尿の収集及び細胞ライセートの調製
これらの患者から、５０ｍｌの新鮮な尿がＦａｌｃｏｎ（登録商標）チューブに収集される。尿に赤血球が存在することを予防するために、収集はバイオプシーに先立つ３週間の間に行われる。尿感染の痕跡がなく、移植前に何らかの残留尿を有していない患者が選択される。日々の最初の排尿は、使用されない。
【００７２】
尿サンプルは、２０００ｒｐｍで２０分間、周囲温度又は室温（Ｔａｍｂ）で遠心分離される。２ｍｌの容量の上清が−８０℃で貯蔵される。残りの上清は廃棄される。細胞及びミネラルを含有する細胞ペレットは、１５ｍｌの容量の緩衝液ＰＢＳ１Ｘに入れられる。細胞懸濁液は、細片を取り出すために再び１０分間、２０００ｒｐｍ、Ｔａｍｂで遠心分離される。上清が廃棄され、ペレットは、チューブを傾倒させることにより排液され、次に１５０μｌの溶解緩衝剤ＲＬＴに１容量％のβ−メルカプトエタノール（１４．３Ｍ溶液）を補充したものに再懸濁された。緩衝剤ＲＬＴは、Ｑｉａｇｅｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによるＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔにおいて提供される。本ステップで、このようにして得られたライセートは、−８０℃で保つことができるか、又は直接使用してＲＮＡを抽出することができる。
【００７３】
２．ＲＮＡの抽出
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、尿サンプルに存在する細胞から抽出される。一般に、疾病、線維症又はＥＭＴを示すマーカーは、これらの現象が出現する場合にのみ発現される。従って、それらマーカーの転写を研究することは、それらのゲノム中での存在を捜すことに比べて、より妥当である。
【００７４】
ＲＮＡは、製造者から提供されるプロトコールによりＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、本明細書の上述の記載のとおり調製される細胞ライセートから抽出される。より具体的には、手本とするプロトコールは、プロトコール「顕微解剖により得られる組織」である。簡単に説明すると、７０％の容量の無菌エタノールが、ホモジナイズしたライセートにプロトコールの表示にしたがって添加される。ライセートは、キットに備わるＲＮｅａｓｙ（登録商標）カラムに全体又は一部が入れられる。カラムは、１５秒間、１０，０００ｒｐｍを超える回転速度で、４℃で遠心分離される。フロースルーは、廃棄される。カラムは、キットに備わる緩衝剤ＲＷ１で洗浄される。ＲＮＡが、溶出され、次に１４μｌのＲＮＡｓｅを含まない水に回収される。
【００７５】
３．相補ＤＮＡ合成
上述の抽出されたＲＮＡの逆転写は、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標）逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ）により達成される。簡単に説明すると、前もって作出されたＲＮＡ溶液は、キットに備わっているｇＤＮＡ  Ｗｉｐｅｏｕｔ緩衝剤に添加され、次に４２℃で２分間インキュベーションされる。このステップによって、残留するゲノムＤＮＡが排除される。逆転写混合物（ＲＴプライマー混合物）は、核塩基、逆転写酵素（Ｑｕａｎｔｉｓｃｒｉｐｔ（登録商標）逆転写酵素）、及び反応緩衝剤（Ｑｕａｎｔｉｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ緩衝剤）を含有する。その混合物は、ＲＮＡ溶液に添加される。混合物は、４２℃で１５分間インキュベーションされ、逆転写が達成される。混合物は、次に逆転写酵素を非活性化するために、９５℃で３分間インキュベーションされる。このように準備される相補ＤＮＡの溶液は、分析前に保存するか、又は１／１０に希釈することができる。
【００７６】
４．定量的ＰＣＲ
定量的ＰＣＲを使用して、細胞中の転写産物の初期量が評価される。これによって、遺伝子が過剰制御されるのか、又は過小制御されるのかを決定することが可能となる。
【００７７】
簡単に説明すると、反応混合物が調製される。この混合物は次のものを含有する。
−  ５μｌのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ２Ｘ（Ｒｏｃｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）／ウェル、
−  ０．２５μｌの各プライマーを１０μＭ（Ｒｏｃｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）／ウェル、
−  １．５μｌの滅菌水／ウェル。
この反応混合物７μｌが、９６ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の１ウェルあたりに入れられる。各患者の３μｌの相補ＤＮＡが、１／１０に希釈され、各ウェルに添加される。プレートは、次に１５００ｇで２分間遠心分離され、次に増幅のため、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０オートマトン（Ｒｏｃｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に導入される。
【００７８】
使用されるプライマー対は、Ｒｏｃｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより供給される。
【００７９】
【表２】
2014532394.tif 000004
【００８０】
ビメンチンは、中間径フィラメントのファミリーに属するタンパク質である。その遺伝子記号はＶＩＭである。ビメンチンは、細胞骨格に関与する。ＣＤ４５又はＰＴＰＲＣは、通常は白血球により発現される膜貫通タンパク質チロシンホスファターゼである。ＣＤ６８は、通常はマクロファージ及び単球により発現される糖タンパク質である。
【００８１】
我々の目的の遺伝子のケースでは、ビメンチン（ＶＩＭ）、ＣＤ６８及びＣＤ４５（ＰＴＰＲＣ）の遺伝子は、特に移植物の線維化疾患の間に、尿細管及び／又は腎臓の間質において過剰制御されるように見える。また、これらは腎バイオプシーにＥＭＴが存在することにより免疫組織化学で顕在化される。ＧＡＰＤＨ遺伝子は、参照ハウスキーピング遺伝子として使用され、全てのタイプの有核細胞において区別なく発現される。ウロプラキン１Ａ遺伝子は、尿路上皮性の細胞に特異的な参照遺伝子として使用される。
【００８２】
以下は増幅プログラムである。
−  １のプレインキュベーションサイクル（９５℃で５分間）、
−  ４５の増幅サイクル（６０℃で１５秒間、７２℃で１５秒間）、
−  １の融解曲線（９６℃で５秒間、６０℃で１分間、次いで０．０６℃／秒での緩徐な加温を９６℃に達するまで、１０取得／℃）。
−  １の冷却サイクル（４０℃で３０秒間）。
【００８３】
増幅させたＤＮＡを含有するプレートは、オートマトンから取り出され、次に４℃で保存される。生データは、標準化のためオートマトンから回収される。
【００８４】
５．標準化
定量的ＰＣＲの間にＤＮＡの初期量を計算するため使用される参照方法により、生データが標準化される。簡単に説明すると、各患者の結果を、標準化し、次に以下のとおり直線化した。
−  ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）との関連：
ＣｐＧＡＰＤＨ−Ｃｐ目的の遺伝子＝ΔＣｐ、
目的の遺伝子／ＧＡＰＤＨ＝２ΔＣｐ
−  尿路上皮性の細胞の特異的なマーカーであるウロプラキンとの関連：
ＣｐＵＰＫ−Ｃｐ目的の遺伝子＝ΔＣｐ、
目的の遺伝子／ウロプラキン＝２ΔＣｐ
【００８５】
Ｃｐは、装置による蛍光シグナルの検出前の増幅サイクルの数である。
【００８６】
６．結果
図１及び図２は、ＥＭＴスコアとの関係におけるビメンチン遺伝子の定量的ＰＣＲの結果の相関関係を表す。図１において、相関係数Ｒ２は非常に低く、回帰線の勾配はゼロである。従って、ビメンチンの発現を腎細胞における上皮表現型の変化の存在と決定的に関連付けることは不可能である。しかしながら、本発明の方法に準拠したウロプラキンによる結果の標準化によって、回帰係数は有意に改善される。さらにまた、回帰線の勾配は正となることから、ビメンチン遺伝子の発現と次第に高くなるＥＭＴスコアは、明らか且つ明解に相関する。従って、これらの結果は、バイオプシーの結果と合致する。
【００８７】
同様に、図３によると、ＣＤ６８の発現とＥＭＴの存在に関する回帰線の勾配は、非常に低い。このことは、ＣＤ６８の発現が、腎臓における上皮表現型の変化の出現と関連付けされないことを意味するだろう。目下の事情では、ＣＤ６８の発現は、腎臓の線維化疾患で正に制御される（Ａｎｄｅｒｓ他、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．、２０１１年）。従って、ハウスキーピング遺伝子による標準化の古典的な方法によって、偽陰性が導かれることは明らかである。
【００８８】
これに対して、図４は、ウロプラキンによる標準化が検査をかなり改善することを示す。回帰直線の勾配は正となり、ＣＤ６８の発現は上皮表現型の変化の現象の間に正に制御される。結果は、対照のバイオプシーにおける解剖病理学的な検査と一致する。
【００８９】
ＣＤ４５（ＰＴＰＲＣ）の発現に関して、腎臓組織におけるＣＤ４５（ＰＴＰＲＣ）の過剰発現は、腎臓の同種移植の好ましくない進展と関連する（Ｓｃｈｅｒｅｒ他、Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、２００９年）。図５と図６との比較は、標準化がウロプラキンで行われる場合に、尿を用いるＰＣＲ検査がかなり改善されることを示す。
【００９０】
結論として、ＧＡＰＤＨと関連させた結果の標準化によって、ＥＭＴを示す患者と「健常」患者との間で何らかの有効な識別が可能になることはなく、このことは研究される目的の遺伝子が何であれ該当する。それぞれ図１及び図３の回帰線の勾配がゼロ及び負であることにより示されるとおり、ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子による標準化によって偽陰性が導かれる。従って、臨床の専門家は、このタイプの分析の結果に頼ることができない。従って、バイオプシーの確認に頼ることは、依然として不可避である。
【００９１】
結果を標準化するための参照遺伝子としてウロプラキンが使用される場合に、検査はかなり改善される。図２、図４及び図６によると、ビメンチン、ＣＤ６８、及びＣＤ４５（ＰＴＰＲＣ）の発現は、腎臓におけるＥＭＴ現象において正に制御される。このことは、患者のバイオプシーにおける免疫組織化学で事実上観察されてきたことに対応する。従って、本発明による方法は、患者の現実の状況を反映する。また、本発明による方法によって、腎臓における上皮表現型の変化の出現の、正確で信頼のおけるモニタリング及び診断も可能となる。
【００９２】
従って、本発明による方法によって、信頼のおける、正確で、患者の現実の状況と合致する結果が得られることは明らかである。さらにまた、この方法は、患者に対して無痛性であり、迅速で、単純で、実施するために経済的である。さらに、臓器移植を経験した患者におけるＥＭＴの出現のモニタリングに完全に適している。
【００９３】
実施例２：移植物のバイオプシーにおいて上皮表現型の変化を示すか又は示さない２６患者の尿中の発現遺伝子の検出、並びに、標準化の古典的な方法及び本発明による方法で得られた結果の比較
臨床的に安定な２６患者は尿サンプルを有し、このサンプルは移植物のバイオプシー前に実施例１に記載のとおり採取された。分析された２６患者のうち、１２患者はＥＭＴの徴候を示さなかったが、１４患者はＥＭＴの徴候を示した。細胞ペレットを、これらの尿サンプルから実施例１に記載のとおり調製した。これらの細胞ペレットを、次にＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｇｍｂｈに送付し、ＲＮＡの抽出、相補ＤＮＡの逆転写、増幅、又はＤＮＡ蛍光マーカーの取り込み、品質管理、及びＡｇｉｌｅｎｔ（登録商標）の相補ＤＮＡマイクロアレイにおけるハイブリダイゼーションを行った。これらのマイクロアレイは、ヒト遺伝子の全体性を表す遺伝子発現の定量的な研究をなすため使用される。従って、各患者のトランスクリプトームを、マイクロアレイで分析した。換言すれば、１マイクロアレイは１患者に対応する。遺伝子の発現のレベルは、各マイクロアレイに存在する内部蛍光標準での調整後の蛍光強度で表現される。これらは生データである。ここで、中央値は、相補ＤＮＡマイクロアレイで分析された遺伝子のリストの中央値に位置する遺伝子において放射され、記録される明度に対応する。
【００９４】
中央値による標準化によって、マイクロアレイの各々の調製に関するバイアスが排除される。マイクロアレイの調製に関するバイアスの例は、患者のＤＮＡに導入される蛍光マーカーの量、又はマイクロアレイが暴露される温度である。中央値による標準化は、所定の患者について相補ＤＮＡマイクロアレイで検査した各遺伝子に以下の式を適用することにより行われる。
標準化した値＝（生の値）／（マイクロアレイで検査した全ての遺伝子の値の中央値）
【００９５】
二項ファミリーの一般化したリニアモデルを、Ｒソフトウェアを用いて作った。
モデル＜−ｇｌｍ（ＥＰＣ〜ｘ，ファミリー＝二項，オフセット＝血液＋ＳＦＮ）
式中：
−  モデルは、モデルであり、
−  ＥＰＣは、予測されたバイナリーカテゴリー変数である（バイオプシーにおける上皮表現型の変化の存在又は非存在を示す）、
−  ｘは、このモデルにおいて別々に検査した相補ＤＮＡマイクロアレイで検査した各遺伝子を表す、
−  血液及びＳＦＮの共変数は、それぞれ、所定の個人の相補ＤＮＡマイクロアレイにより産出される発現の測定値に基づくヘモグロビン遺伝子の平均値及びストラティフィンの平均値である。
【００９６】
血液及びストラティフィンを共変数とすることによって、血液及び／又は非腎臓の上皮細胞による、収集されたサンプルの混入を考慮することが可能となる。
【００９７】
ｘをモジュールに導入することによるＥＭＴ変数の予測の改善の有意性（ｐ値）は、以下のコマンドにより与えられる。
ａｎｏｖａ（モデル，検査＝「Ｃｈｉｓｑ」）［２，５］。
得られたｐ値が＜０．０５である遺伝子を、各々の標準化の方法に選択し、ＤＡＶＩＤソフトウェア（ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ）による拡大の機能研究についての遺伝子のリストとして使用した。相補ＤＮＡマイクロアレイで評価した遺伝子の全体性を、参照リスト（バックグラウンド）として使用した。これらの結果は、図７及び図８、並びに以下の表３に表される。
【００９８】
【表３】
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【００９９】
本発明者等は、第一に、研究される器官に関連して本発明による標準化の方法を実施することにより得られた結果の一貫性を評価するために、ＵＰ＿ＴＩＳＳＵＥデータベースにおける用語「腎臓」の拡大の観察、及び、第二に、研究される疾病（このケースではＥＭＴ）に関連した結果の一貫性を評価するために、ＧＯＴＥＲＭ＿ＣＣ＿ＦＡＴデータベースにおける「細胞間ジャンクション」（ＧＯ：０００５９１１〜細胞間ジャンクション）の拡大を行った。
【０１００】
表３、並びに表３から得られた図７及び図８は、ウロプラキン１Ａによる標準化が使用されることで、これらの２つの用語に対して最も有意な拡大が得られることを示しており、ボンフェローニ法による補正が複数の検査を考慮して適用される場合、拡大はウロプラキン１Ａによる標準化に対して単独で依然として有意である。ウロプラキン１Ａによる標準化は、腎バイオプシーにおける上皮表現型的な変化の存在と関連するので、これらの２つの用語に属する遺伝子の最大数を識別する。
【０１０１】
７．適用
このように、本発明による方法は、表現型の変化の出現の早期検出において、その有効性が実証された。ＥＭＴの検出における他の適用を、本発明の方法により得ることができる。腎臓移植の急性拒絶の検出を、本発明による方法に基づいて診断することができる。このケースにおいて、調査される疾病マーカーは、腎臓における免疫細胞の活性化に関するマーカーであり、例えば、グランザイムＢ（配列番号２３）、パーフォリン（配列番号２４）、インターフェロン又はＦａｓリガンド（配列番号２５）である。
【０１０２】
何らかの腎臓疾患を診断するために、本発明による方法に基づいた管細胞、有足細胞又は炎症細胞の検出を使用し得る。また、患者における腎臓癌の進行を、マーカーＴＰ５３（配列番号２６）、ＭＩＢ１（配列番号２７）、ＡｇＮＯＲ、ＣＤ４４（配列番号２８）、ラセマーゼ、ＣＤ１０（配列番号３１）、ケラチン７、ビメンチン、カベオリン−１（配列番号２９）及びｒｏｒ１（配列番号３０）の検出に基づいた本発明による方法によってモニターし得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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