(57)【要約】本発明は、生化学的および分子生物学的用途において用いられる水溶液の濾過のための、粘土鉱物を含む濾過装置に関する。具体的には、本発明は、粘土鉱物を含むフィルターを通した濾過による、水溶液からの望ましくないタンパク質の除去に関する。本発明は、上部容器と、粘土鉱物を含むフィルターとを含む濾過装置に関する。好ましくは、粘土鉱物は、モンモリロナイト粘土である。より好ましくは、モンモリロナイト粘土は、ベントナイト、有機粘土およびマカロイドまたはこれらの組み合わせ、誘導体もしくはアナログを含む群から選択される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
上部容器と、ベントナイト、有機粘土およびマカロイドまたはこれらの組み合わせ、誘導体もしくはアナログの群から選択されるモンモリロナイト粘土鉱物を含むフィルターとを含む濾過装置。
【請求項２】
前記粘土鉱物が、膜に固定化されている、または膜間にもしくはフィルター筐体内に収められており、前記膜（複数可）が、好ましくは、シリカ、ガラス繊維または有機膜から選択される、請求項１に記載の濾過装置。
【請求項３】
滅菌フィルター膜を追加的に含む、請求項１または２のいずれか一項に記載の濾過装置。
【請求項４】
濾液のリテーナを追加的に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の濾過装置。
【請求項５】
遠心濾過装置もしくは真空濾過装置である、または重力流によって機能する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の濾過装置。
【請求項６】
粘土鉱物を含むフィルターシステムを通して水溶液を濾過するステップを含む、水溶液からのタンパク質の除去のための方法。
【請求項７】
前記タンパク質が、プロテアーゼおよびヌクレアーゼを含む群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記粘土鉱物が、ベントナイト、有機粘土およびマカロイドを含む群から選択されるモンモリロナイト粘土である、またはこれらの組み合わせ、誘導体もしくはアナログである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記水溶液が、細胞溶解のため、または核酸の精製、特徴付けおよび／もしくは調製のためのバッファーである、請求項６、７または８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記粘土鉱物が、フィルター膜に固定化されている、または膜間にもしくはフィルター筐体内に収められている、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
滅菌フィルターを通して前記水溶液を濾過するステップを追加的に含む、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記粘土鉱物が予め膨潤されている、または前記粘土が乾燥している、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記濾過するステップが、真空フィルター装置もしくは遠心分離フィルター装置を用いてまたは重力流により行われる、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
水溶液からの望ましくないタンパク質の除去のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の濾過装置または請求項６〜１３のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の濾過装置を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学および生化学における用途のための溶液の濾過のための濾過装置および方法に関する。具体的には、本発明は、溶液からの望ましくないタンパク質の除去に関し、より具体的には、溶液からのヌクレアーゼおよびプロテアーゼの除去に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学的および分子生物学的技法において、生体分子、例えば、タンパク質および核酸の品質は、結果の精度および有意性等の実験の成績に大いに影響を及ぼす。それぞれヌクレアーゼおよびプロテアーゼによる核酸およびタンパク質の分解は、アッセイにおけるシグナル損失または反応における満足のいかない収量の主な原因である。多くの用途のため、プロテアーゼおよびヌクレアーゼ、特にリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）およびデオキシリボヌクレアーゼ（ｄｅｓｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）（ＤＮａｓｅ）等の分解酵素は、用いられるいかなるバッファーまたは実験器具、例えば、ガラス器具からも不活性化または除去される必要がある。
【０００３】
バッファー等の水溶液は、ＲＮａｓｅおよび／またはＤＮａｓｅのコンタミネーションを含むことが多く、これらは、分子生物学的または生化学的用途で更に使用するためには除去される必要がある。特にＲＮＡを扱う場合、ＲＮａｓｅコンタミネーションが、反応バッファー中に存在しないことを確かめる必要がある。
【０００４】
ＤＮＡと比較すると、ＲＮＡは、より一層損傷し易く分解し易い。これは、極端なｐＨまたは金属イオンの存在下および高温の条件において容易に劣化する。しかし、ＲＮＡ分解の主要な理由は、ＲＮａｓｅが典型である。従って、ＲＮＡ取り扱いの際にはヌクレアーゼに対し適切に防御することが非常に重要である。ＲＮａｓｅは、細胞および組織試料ならびに皮膚分泌物および空中を浮遊する微生物によりシステムに導入される。合理的な予防措置に従って、Ｂｌｕｍｂｅｒｇ  １９８７年（非特許文献１）において概説される通り、ＲＮＡによる作業中にＲＮａｓｅフリーの環境を得る必要がある。ＲＮａｓｅを不活性化するための数通りのアプローチが存在するが、大部分は不十分である。一部のＲＮａｓｅは高温において低い活性を示すため、加熱は一つの可能性である。残念ながら、温度を低下させると通常、活性を完全に回復させてしまう。一部のＲＮａｓｅは、オートクレーブ、極端なｐＨ値および尿素、ＥＤＴＡまたはＳＤＳにさえ耐える。このように、ＲＮａｓｅの不活性化は、複雑な事業であると思われる。
【０００５】
ＲＮａｓｅを除去するため、ガラス器具を１８０℃で８時間以上ベーキングすることができる。プラスチック器具をクロロホルムでリンスすることができる。別のアプローチは、ガラスまたはプラスチック器具をＤＥＰＣ溶液（０．１％）において２時間３７℃でインキュベートし、後にＤＥＰＣ処理水で数回リンスし、これを１５分間オートクレーブすることである（Ｂｌｕｍｂｅｒｇ  １９８７年）。
【０００６】
ＤＥＰＣは高価且つ恐らく発癌性であるため、ＤＥＰＣによる作業は推奨できない。更に、実験器具のベーキングまたはＤＥＰＣによる処理は、時間がかかる。オートクレーブすることができない実験器具は、Ｈ２Ｏ２の３％溶液中で１０分間インキュベートし、後にＤＥＰＣ処理水でリンスすることによりクリーニングされる。
【０００７】
更に、ＲＮａｓｅフリーバッファー溶液は、ＤＥＰＣで処理し、それに続いてこのバッファー溶液をオートクレーブすることにより得ることができる。ＤＥＰＣ処理後のバッファー溶液のオートクレーブは、溶液中のＤＥＰＣの破壊に必要である。しかし、この方法は、アミノ基を含有するバッファーに利用することはできない。更に、多くのバッファーは、オートクレーブすることができない。オートクレーブ単独では、バッファー溶液におけるＲＮａｓｅの破壊に十分ではない。
【０００８】
従って、多くの通常のバッファー溶液におけるＲＮａｓｅの除去または破壊に利用できる適切な方法はない。
【０００９】
ＲＮａｓｅ感受性作業分野のためのクリーニング溶液が、市販されている。具体例は、ＲＮａｓｅＺａｐ（Ａｍｂｉｏｎ）、ＲＮａｓｅ  Ａｗａｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｅｘｉｔｕｓ  Ｐｌｕｓ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）およびＬｉｃｅｎｓｅ  ｔｏ  ｋｉｌｌ（ＢｉｏＤｅｌｔａ）である。このような市販の溶液は通常、極端なｐＨの変性効果を用いる。ｐＨが回復すると、タンパク質はリフォールディングすることができるため、阻害効果は永続的ではない。異なるアプローチにおいて、変性および阻害作用物質の組み合わせ、例えば、ＥＤＴＡ、ＳＤＳおよびタンパク質ＲＮａｓｅ阻害剤が用いられる。阻害効果は、ＲＮａｓｅの不可逆的崩壊を生じないであろう。ＲＮａｓｅ阻害剤の使用は、効果的だが費用がかかる。
【００１０】
特許文献１は、ヌクレアーゼ阻害剤を用いることによりヌクレアーゼを阻害および／または不活性化するための方法および組成物を開示する。このようなヌクレアーゼ阻害剤は、抗ヌクレアーゼ抗体および非抗体ヌクレアーゼ阻害剤を含む。
【００１１】
他のアプローチにおいて、鉱物粘土ベントナイトが、溶解産物からリボザイムの除去（Ｋａｉｓｅｒら、１９７１年、非特許文献２）、またはＲＮＡ単離におけるＲＮａｓｅ活性の阻害（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎら、１９６７年、非特許文献３）に用いられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２００５／０８３０８１号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５２巻：２０〜２４頁
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２３２巻（２号）：３８８〜４０２頁
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．１０２巻、１６８頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、上部容器と、粘土鉱物を含むフィルターとを含む濾過装置に関する。好ましくは、粘土鉱物は、モンモリロナイト粘土である。より好ましくは、モンモリロナイト粘土は、ベントナイト、有機粘土およびマカロイドまたはこれらの組み合わせ、誘導体もしくはアナログを含む群から選択される。
【００１５】
好ましくは、前記粘土鉱物は、膜に固定化されている、または膜間にもしくはフィルター筐体内に収められている。
【００１６】
本発明はまた、水溶液からの望ましくないタンパク質、例えば、プロテアーゼおよびヌクレアーゼ、特にＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅの除去のための、本発明に係る濾過装置または本発明に係る方法の使用に関する。
【００１７】
本発明の範囲内には、本発明に係る濾過装置を含むキットも含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、真空濾過における使用のための本発明に係る濾過用装置を模式的に示す。１：濾過前の水溶液；２：ＲＮａｓｅまたは他のタンパク質を除去するための粘土フィルター；３：例えば、微生物を除去するための滅菌フィルター；４：真空ポンプの接続部；５：濾液のリテーナ（ｒｅｔａｉｎｅｒ）。
【図２】図２は、遠心濾過における使用のための本発明に係る濾過用装置を模式的に示す。１：濾過前の水溶液；２：ＲＮａｓｅまたは他のタンパク質を除去するための粘土フィルター；３：例えば、微生物を除去するための滅菌フィルター；５：濾液のリテーナ。
【図３】図３は、濾過の結果における様々なｐＨ条件の効果を示す。上段（Ａ）：カラムにベントナイト溶液を適用、下段（Ｂ）：ベントナイトを適用せず。左から右に：ｐＨ３、ｐＨ５、ｐＨ７、ｐＨ１０、ｐＨ条件毎に（左から右に）：対照（ＲＮａｓｅを添加せず）、ＲＮａｓｅ濃度それぞれ１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌ。
【図４】図４は、カラムに適用した乾燥ベントナイト（Ａ）および予め膨潤させた（ｐｒｅ−ｓｗｏｌｌｅｎ）ベントナイト（Ｂ）の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、上部容器と、粘土鉱物を含むフィルターとを含む濾過装置に関する。好ましくは、粘土鉱物は、モンモリロナイト粘土である。より好ましくは、モンモリロナイト粘土は、ベントナイト、有機粘土およびマカロイドまたはこれらの組み合わせ、誘導体もしくはアナログを含む群から選択される。最も好ましくは、粘土鉱物は、ベントナイトである。
【００２０】
粘土は、主に微粒鉱物で構成された天然起源の材料である。粘土鉱床（ｄｅｐｏｓｉｔ）は、大部分は粘土鉱物（フィロケイ酸塩鉱物）で構成されている。
【００２１】
モンモリロナイトは、ケイ酸塩鉱物、特にフィロケイ酸塩型の層構造鉱物である。これは、好ましくは、（Ｎａ，Ｋ，Ｃａ）０．３３（Ａｌ，Ｍｇ）２（Ｓｉ４Ｏ１０）（ＯＨ）２・ｎＨ２Ｏなどの式を有する。ベントナイトは、アルミニウムモンモリロナイトであり、一方マカロイドは、マグネシウムモンモリロナイトである。有機粘土は、天然起源の粘土鉱物に由来する有機改変フィロケイ酸塩である。有機粘土は、例えばベントナイトを改変することにより製造される。例えば、本来の層間陽イオンは、四級アミン等の有機陽イオンと交換することができる。これにより、共有結合した有機部分を含む有機物親和性表面が生成される。好ましくは、アミンは、１２〜１８個の炭素原子の鎖長を有する。
【００２２】
好ましくは、前記粘土鉱物は、膜に固定化されている、または膜間にもしくはフィルター筐体内に収められている。孔径が粘土鉱物の保持に十分である限り、いかなる種類の膜を用いてもよい。膜は、シリカもしくはガラス繊維等の無機膜、またはポリエーテルスルホン、ナイロン、テフロン（登録商標）、セルロースおよびセルロース誘導体（例えば、酢酸セルロース、ニトロセルロース）等の有機膜を含む。他の材料は、当業者であれば明らかである。
【００２３】
他の適した膜材料は、例えば、混合型のセルロースエーテルおよびエステル、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリアミド−イミド（ＰＡＩ）、ポリエステル、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＯＨ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、これらの混合物および／またはブレンド、またはこれらのコポリマーを含むが、これらに限定されない。
【００２４】
膜は、多層複合膜を含めて、均一構造であっても不均一構造であってもよい。本発明の濾過装置が、装置当たり１枚より多くの膜を含む場合、膜は、同じものであっても異なっていてもよい。複数の濾過装置を、マルチウェルプレートにおけるようなプレートと組み合わせて、並行してまたはそれに続いて用いてもよい。
【００２５】
本発明に関して、膜は、好ましくは、多孔性膜を表すことができる。孔径は、好ましくは、約０．００５μｍ〜約１００μｍ、より好ましくは、約０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８および９μｍならびにこれらの値のうちいずれか２個の間の範囲を含む、約０．０１〜約１０μｍ、最も好ましくは、約０．１〜約１μｍの範囲内に収まる。
【００２６】
膜の厚さは、使用目的（例えば、真空濾過または遠心分離機において濾過装置をスピンすることによる濾過）に十分な機械的安定性を付与するよう選ばれている限り、決定的に重要ではない。厚さ範囲は、例えば、利用する膜材料（複数可）に依存してよく、当業者により容易に決定することができる。数ナノメートルから最大数センチメートル、例えば、約２０ｎｍ〜約５ｃｍ、好ましくは、約１００ｎｍ〜約１ｃｍ、より好ましくは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００および９００μｍならびにこれらの値のうちいずれか２個の間の範囲を含む、約１μｍ〜約１ｍｍに及ぶ厚さを有する膜を用いることが好ましい。
【００２７】
粘土鉱物は、例えば、ピペッティングによりフィルター膜に添加することができる。これは、溶液としてまたは乾燥もしくは予め膨潤させた粘土として添加することができるが、好ましくは、前記装置が、濾過対象の懸濁物、液体および／または溶液（複数可）と接触される前に、装置に添加される。
【００２８】
濾過装置は、１または複数の追加的なフィルターおよび／または分離媒体を追加的に含むことができる。適した追加的なフィルター媒体は、滅菌フィルター膜、即ち、濾過対象の溶液からの微生物の除去に使用されるフィルター膜であり得る。滅菌フィルターは、特に、約０．２〜０．４５μｍの孔径を有することができる。濾過対象の液体から濾過することにより、滅菌膜を用いて、微生物学的な生物等の細胞を除去することができる。適した分離媒体は、例えば、塩または他の混入物の更なる除去に用いることのできるゲル（浸透）クロマトグラフィー媒体であり得る。適したゲル（浸透）クロマトグラフィー媒体は、高度に架橋された親水性および多孔性特性を有する粒子である。適したゲル（浸透）クロマトグラフィー媒体の例は、ＳｅｐｈａｄｅｘまたはＳｅｐｈａｒｏｓｅのような改変多糖、架橋ポリアクリルアミド、アガロースゲル、ガラス、デキストランまたはシリカゲルである。
【００２９】
１または複数の単一フィルターおよび／または１または複数の分離媒体の組み合わせの場合、これらは互いに直接的に接触していても、フリットまたは膜のような適した区画化媒体により隔てられていてもよく、区画化媒体は、前記区画化媒体の上に位置するフィルターまたは分離媒体により保留されない、あらゆる物質に対して浸透性となるべきである。
【００３０】
濾過装置は、好ましくは、濾液のリテーナを追加的に含むことができる。
【００３１】
本発明に係る濾過装置は、濾過対象の体積に応じて異なる寸法を有することができる。特に、濾過対象の体積がより大きい場合、本発明の濾過装置の上部容器（従って、存在する場合はリテーナも同様に）の容量は、好ましくは約５０μｌ〜１００ｌ、より好ましくは約０．１ｍｌ〜５０ｌの範囲内、更により好ましくは約０．５ｍｌ〜１ｌの範囲内に収まることができる。
【００３２】
好ましくは、遠心濾過装置は、標準反応チューブ、例えば、ガラスまたはプラスチック製の、例えば、０．５ｍｌ、１．５ｍｌおよび２ｍｌの容量を有する微量遠心チューブまたは１５ｍｌまたは５０ｍｌの容量を有する標準円錐形もしくは丸底チューブ、例えば、ポリプロピレンまたはポリスチレンチューブと組み合わせた使用に適した寸法を有する。また、例えば、５００ｍｌまたは１ｌの容量を有する標準フラスコと組み合わせた使用に適した寸法を有する真空濾過装置が好ましくなり得る。好ましくは、より大きな体積、例えば、５０ｍｌを上回る体積、特に、１００ｍｌ超から最大数百ｍｌまたは数リットルの体積は、真空濾過により濾過され、より大きな体積のための濾過装置は、真空濾過装置である。より小さな体積、例えば、約１０μｌ〜５０ｍｌの範囲は、好ましくは、遠心濾過装置を用いた遠心分離により濾過される。このように、濾過装置は、一実施形態においては遠心濾過装置であってもよく、または別の実施形態においては真空濾過装置であってもよく、または更に別の実施形態においては重力流によって機能するものでもよい。真空濾過装置は、好ましくは、真空ポンプとの接続部を含むことができる。
【００３３】
本発明はまた、粘土鉱物を含むフィルターシステム、好ましくは、上に詳細に記載されている本発明のフィルター装置を通して（水）溶液を濾過するステップを含む、溶液、特に水溶液からの、タンパク質、特に望ましくないタンパク質の除去のための方法に関する。濾過対象の溶液、好ましくは水溶液と接触される前にモンモリロナイト粘土を既に含む本発明の濾過装置を用いると、濾過に先立ち溶液にこのような粘土を添加する追加的なステップは必要とされない。モンモリロナイト粘土は、例えば、これを膜に固定化する、またはこれを膜間に配置することにより濾過装置において固着することができるため、この操作を行わなければ小孔径、例えば、約０．２〜０．４５μｍのフィルターを詰まらせてしまう、および／または更により大きい孔径、例えば、約１μｍ〜１００μｍ超のフィルターを通過してしまうモンモリロナイト粘土粉末を用いてもよい。
【００３４】
望ましくないタンパク質は、プロテアーゼおよびヌクレアーゼを含む群から選択され得る。ヌクレアーゼは、例えば、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）またはデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）であり得る。例えば、ＲＮＡによる作業を行う場合、ＲＮａｓｅの除去が望ましく重要である。
【００３５】
好ましくは、本発明の方法において用いられる粘土鉱物は、モンモリロナイト粘土であり得る、より好ましくは、ベントナイト、有機粘土およびマカロイドを含む群から選択される、またはこれらの組み合わせ、誘導体もしくはアナログであり得る。最も好ましくは、粘土鉱物はベントナイトである。
【００３６】
好ましくは、望ましくないタンパク質の除去対象の溶液、特に水溶液は、核酸含有細胞の溶解、および／または例えば、核酸のような生体分子の精製、ホモジナイズ、特徴付け、改変、検出および／または調製に用いることのできる液体、好ましくは水性、組成物またはバッファーである。濾過対象の溶液の例は、溶解溶液、純水を含む洗浄溶液、溶出溶液、結合溶液、試料安定化溶液、抽出溶液、沈殿溶液、ゲルローディング溶液または増幅反応、メチル化反応および／もしくはマーキング反応に用いられる溶液、ならびに／または分子生物学用途において用いられると想定されるその他の液体である。濾過対象の溶液は、飲料ではなく、好ましくは、アルコール飲料ではなく、最も好ましくは、ワインではないことが好ましい。
【００３７】
粘土鉱物は、好ましくは、フィルター膜に固定化されていてもよく、または膜間にもしくはフィルター筐体内に収められていてもよい。方法の別の好ましい実施形態において、粘土鉱物は、例えば、濾過前にピペッティングすることによりフィルター膜に添加される。
【００３８】
水溶液からの望ましくないタンパク質の除去のための方法は、滅菌フィルターを通して水溶液を濾過するステップを追加的に含むことができる。これは、特に、前記溶液から微生物、例えば、細菌または真菌を除去するためのものである。
【００３９】
濾過対象の水溶液を、濾過前に、例えば、遠心力または真空を加える前に、前記粘土上でインキュベートすることが好ましくなり得る。好ましくは、インキュベーション時間は、１〜３０分間、例えば、１分間、２分間、５分間、１０分間または１５分間の範囲内に収まる。
【００４０】
本発明の一部の実施形態において、乾燥粘土鉱物が用いられる。
【００４１】
本発明の方法の他の実施形態において、粘土鉱物は、予め膨潤させる、例えば、水またはバッファーにおいて予め膨潤させる。特定の実施形態において、予め膨潤させた粘土鉱物は、濾過前に膜上で乾燥させる。
【００４２】
本発明の方法および本発明に係る濾過装置の使用は、特定のバッファーまたは溶液の濾過に限定されない。通常用いられるバッファーおよびその好ましいｐＨ範囲は、当業者にとって公知のものである。このようなバッファーは、とりわけ、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ａｃｅｓ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＴＡＰＳＯ、Ｔｒｉｚｍａ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＴＥＡ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＨＥＰＢＳ、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＤ、ＴＡＢＳ、ＡＭＰＳＯ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＡＭＰ、ＣＡＰＳ、ＣＡＢＳ、フタレート、アセテート、Ｔｒｉｓ、ホスフェートおよびシトレートのバッファーおよびこれらの混合物を含む群から選択され得る。一実施形態において、バッファーまたは水溶液は、１０ｖｏｌ．−％以下、好ましくは、５ｖｏｌ．−％以下、より好ましくは、１ｖｏｌ．−％以下、更により好ましくは、０，１ｖｏｌ．−％以下のメタノール、エタノールおよび／またはイソプロパノールを含有し、最も好ましくは、メタノール、エタノールおよび／またはイソプロパノールを含有しない。
【００４３】
好ましくは、予め膨潤させるために用いられるバッファーは、約ｐＨ２〜ｐＨ１１の範囲内、より好ましくは、約ｐＨ３〜ｐＨ１０の範囲内のｐＨを有する。これは、更により好ましくは、約ｐＨ３〜ｐＨ７未満または約ｐＨ７超〜ｐＨ１１の範囲内、更になおより好ましくは、約ｐＨ４〜ｐＨ６、例えば、ｐＨ４．５〜ｐＨ５．５または約ｐＨ８〜ｐＨ１０．５の範囲内であり得る。バッファーは、約１０のｐＨを有することが特に好ましくなり得る。
【００４４】
好ましくは、濾過対象のバッファーは、約ｐＨ２〜ｐＨ１１の範囲内、より好ましくは、約ｐＨ３〜ｐＨ１０の範囲内のｐＨを有する。これは、更により好ましくは、約ｐＨ３〜ｐＨ７未満または約ｐＨ７超〜ｐＨ１１の範囲内、更になおより好ましくは、約ｐＨ４〜ｐＨ６、例えば、ｐＨ４．５〜ｐＨ５．５またはｐＨ８〜ｐＨ１０．５の範囲内に収まり得る。特に好ましくは、バッファーは、約１０のｐＨを有することができる。
【００４５】
バッファーは、例示的な実施形態において、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオールに基づくバッファー（トリスヒドロキシメチルアミノメタン、Ｔｒｉｓ）、好ましくは、ｐＨ１０前後のＴｒｉｓバッファーであり得る。
【００４６】
溶液および／またはバッファーは、例えば、無機塩および有機塩を含む塩、錯化剤、界面活性剤、洗剤、カオトロピック剤、アルコールのような有機溶媒または酸、着色料、プライマーまたはヌクレオチドの群から独立的に選択される、１または複数の追加的な成分を含み得る。
【００４７】
好ましくは、粘土鉱物は、濾過においてフィルター膜を通過しない、即ち、濾液中に粘土鉱物が存在しないことが好ましい。しかし、一部の実施形態において、残留粘土鉱物は、追加的な遠心分離ステップまたは濾過ステップにより濾液から除去することができる。
【００４８】
本発明の一部の実施形態において、例えば、オートクレーブ、プレベーキングおよび／またはＤＥＰＣでリンスすることにより、不必要なタンパク質の除去に用いるガラス器具またはプラスチック器具を前処理することが追加的に必要となり得る。特に、濾液を保持および／または貯蔵するためのリテーナは、無菌且つ望ましくないタンパク質を含有しない必要がある。
【００４９】
望ましくないタンパク質の除去のための方法における濾過は、好ましくは、真空フィルター装置または遠心分離フィルター装置、例えば、スピンカラムまたは重力流利用を用いて行われる。
【００５０】
本発明はまた、既に上に詳細に記載されている通り、特に、単離または精製のような核酸処理手順における使用が企図される場合、溶液、好ましくは、水溶液、特に液体組成物またはバッファーから望ましくないタンパク質、例えば、プロテアーゼおよびヌクレアーゼ、特に、ＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅ、好ましくはＲＮａｓｅの除去のための本発明に係る濾過装置または本発明に係る方法の使用に関する。
【００５１】
本発明の範囲内には、上に記載されている濾過装置を含むキットも含まれる。キットは、一部の実施形態において、水溶液からの、望ましくないタンパク質、例えば、プロテアーゼおよびヌクレアーゼ、特に、ＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅの除去に用いることができる。更に、キットは、上述の水性および／または非水性溶液、特に、液体組成物および／またはバッファー；例えば、チューブまたはカラムのような１または複数の同一または異なるプラスチック消耗品；好ましくは酵素処理後に濾過装置により除去される１または複数の酵素、例えばＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅ；および／またはキットを用いるための説明書を含み得る。
【００５２】
本発明の装置および方法の利点は、望ましくないタンパク質を単に阻害する代わりに、水溶液からこれらの望ましくないタンパク質、好ましくはヌクレアーゼ、最も好ましくはＲＮａｓｅを除去することである。
【実施例】
【００５３】
（実施例１）
スピンカラムにおけるベントナイト濾過によるＲＮａｓｅ除去および／または阻害のための最適条件の決定
ＲＮｅａｓｙスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に、１００μｌの水性ベントナイト溶液（水および次のバッファーに溶解：フタル酸水素カリウムｐＨ３；酢酸ナトリウムｐＨ５；ＭＯＰＳ  ｐＨ７；Ｔｒｉｓ  ｐＨ１０；ベントナイト濃度：１００ｍｇ／ｍｌ）それぞれ（対照：ベントナイトなしの溶液）を充填した。遠心分離（３分間、１４０００ｇ）により流体を除去した。１００μｌのＲＮａｓｅ溶液（それぞれ１ｍｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ濃度を有する；対照：ＲＮａｓｅなし；ストック溶液：１００ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ）を、ピペッティングによりベントナイト処理カラムに添加し、１５分間インキュベートした。次に、カラムを３分間１４０００ｇで遠心分離した。後に、異なるｐＨ（フタル酸水素カリウムｐＨ３；酢酸ナトリウムｐＨ５；ＭＯＰＳ  ｐＨ７；Ｔｒｉｓ  ｐＨ１０）に緩衝した８μｌのＲＮＡ含有溶液（約４μｇ  ＲＮＡに相当）を、２μｌの各フロースルーに添加し、１５分間、室温でインキュベートした。ＲＮＡマーカーの添加後、ホルムアルデヒドアガロースゲルにより溶液を分離した。ゲル電気泳動の結果は、添付の図３に示す。
【００５４】
図３における染色したゲルの像は、全ｐＨ値において、最高濃度のＲＮａｓｅにおいてＲＮＡの完全な分解が観察されたことを実証する（図３における左から右のＲＮａｓｅ濃度：第一のレーン：対照（ＲＮａｓｅ添加せず）、続いて１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅを適用）。他のＲＮａｓｅ濃度において、ｐＨ５における分解は観察されず、ｐＨ１０における僅かな分解、ｐＨ３における中程度の分解およびｐＨ７における強い分解が観察された。ベントナイトなしの対照実験において、ＲＮａｓｅが添加されなかった場合（対照）を除いて、分解が常に観察された。従って、ベントナイトによる濾過の最適ｐＨ条件は、約５のｐＨのような微酸性ｐＨおよびｐＨ１０前後である。
【００５５】
それにもかかわらず、本発明の方法を用いることにより、検査したあらゆるｐＨにおいてＲＮＡ分解の低下を観察することができる。
【００５６】
加えて、予め膨潤させることの効果を決定した。図４は、ベントナイト溶液（図４におけるＢ）の代わりに乾燥ベントナイト（図４におけるＡ）を用いても、差が観察できなかったことを例示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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