(57)【要約】内在性マウスＩＬ−６遺伝子および／または内在性マウスＩＬ−６受容体遺伝子の置き換えを含むマウス、ならびに上記マウスを作製する方法および使用する方法について記載される。内在性ＩＬ−６Ｒα遺伝子座でのヒトエクトドメインをコードする配列によるマウスエクトドメインをコードする配列の置き換えを含むマウスが提供される。内在性マウスＩＬ−６遺伝子座での、ヒトＩＬ−６をコードする配列によるマウスＩＬ−６をコードする配列の置き換えを有するマウスを含む、マウスＩＬ−６調節エレメントの制御下にあるヒトＩＬ−６遺伝子を含むマウスもまた、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内在性マウスＩＬ−６遺伝子座でのヒトＩＬ−６をコードするヒト遺伝子による、ＩＬ−６をコードするマウス遺伝子の置き換えを含む、遺伝子改変されたマウスであって、ヒトＩＬ−６をコードする該ヒト遺伝子が、該内在性マウスＩＬ−６遺伝子座における内在性マウス調節エレメントの制御下にある、遺伝子改変されたマウス。
【請求項２】
ヒトＩＬ−６をコードする前記ヒト遺伝子が、ＣＴＤ−２３６９Ｍ２３細菌人工染色体のヒトＩＬ−６遺伝子のエクソン１〜エクソン５を含む、請求項１に記載の遺伝子改変されたマウス。
【請求項３】
マウスＩＬ−６Ｒαを発現する、請求項１に記載の遺伝子改変されたマウス。
【請求項４】
ヒトＩＬ−６Ｒα免疫グロブリンスーパーファミリードメインをコードする配列での、マウスＩＬ−６Ｒα免疫グロブリンスーパーファミリードメインをコードする配列の置き換えを含む内在性マウスＩＬ−６Ｒα遺伝子座からヒト化ＩＬ−６Ｒαを発現する、請求項１に記載の遺伝子改変されたマウス。
【請求項５】
形質細胞増加症、糸球体硬化症、糸球体腎炎、腎不全、高ガンマグロブリン血症、脾臓における巨核球の上昇、骨髄における巨核球の上昇、脾腫、リンパ節拡大、緻密で異常な形質細胞およびそれらの組合せから選択される特徴を示さない、請求項１に記載の遺伝子改変されたマウス。
【請求項６】
前記ヒト化ＩＬ−６Ｒαが、ヒトＩＬ−６Ｒαのヒト免疫グロブリンスーパーファミリードメインを含む、請求項４に記載の遺伝子改変されたマウス。
【請求項７】
前記ヒト化ＩＬ−６Ｒαが、マウス膜貫通ドメインおよびマウス細胞質ドメインを含む、請求項６に記載の遺伝子改変されたマウス。
【請求項８】
内在性マウスＩＬ−６Ｒα遺伝子のヒト化を含む遺伝子改変されたマウスであって、該ヒト化が、該内在性マウスＩＬ−６Ｒα遺伝子座での、ヒトＩＬ−６Ｒα免疫グロブリンスーパーファミリードメインをコードする配列による、マウスＩＬ−６Ｒα免疫グロブリンスーパーファミリードメインをコードする配列の置き換えを含み、そしてここで該ヒト化ＩＬ−６Ｒα遺伝子が、内在性マウス調節エレメントの制御下にある、遺伝子改変されたマウス。
【請求項９】
マウスエクソン１〜エクソン８を含む連続的なマウス配列が、ヒトＩＬ−６Ｒα免疫グロブリンスーパーファミリードメインをコードするヒトＩＬ−６Ｒα配列の連続的なゲノム断片で置き換えられる、請求項８に記載の遺伝子改変されたマウス。
【請求項１０】
前記免疫グロブリンスーパーファミリードメインをコードするヒトＩＬ−６Ｒα配列の前記連続的なゲノム断片が、ＣＴＤ−２１９２Ｊ２３細菌人工染色体に由来する、請求項９に記載の遺伝子改変されたマウス。
【請求項１１】
内在性マウスＩＬ−６遺伝子座での、ヒトＩＬ−６をコードするヒト遺伝子による、ＩＬ−６をコードするマウス遺伝子の置き換えを含むヒト化ＩＬ−６遺伝子をさらに含む、請求項８に記載の遺伝子改変されたマウス。
【請求項１２】
内在性マウスＩＬ−６遺伝子座での、ヒトＩＬ−６遺伝子によるマウスＩＬ−６遺伝子の置き換えを含む、請求項１１に記載の遺伝子改変されたマウス。
【請求項１３】
前記ヒト化ＩＬ−６遺伝子が、内在性マウス調節エレメントの制御下にある、請求項１１に記載の遺伝子改変されたマウス。
【請求項１４】
マウスＩＬ−６をコードするマウス遺伝子配列を、ヒトＩＬ−６遺伝子が内在性マウス調節エレメントの制御下にあるように、ヒトＩＬ−６をコードするヒト遺伝子で置き換える工程を含む、ヒト化マウスを作製する方法。
【請求項１５】
前記置き換えが、内在性マウスＩＬ−６遺伝子座にあり、ヒトＩＬ−６をコードする前記ヒト遺伝子が、内在性マウス調節配列に作動可能に連結する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
マウスＩＬ−６Ｒαの免疫グロブリンスーパーファミリードメインをコードするすべてのマウスエクソンを、ヒトＩＬ−６Ｒαの免疫グロブリンスーパーファミリードメインをコードするヒトゲノム断片で置き換えて、ヒト化ＩＬ−６Ｒα遺伝子を形成する工程を含み、ここで、該ヒト化ＩＬ−６Ｒα遺伝子が内在性マウス調節エレメントの制御下にある、ヒト化マウスを作製する方法。
【請求項１７】
前記置き換えが、内在性マウスＩＬ−６Ｒα遺伝子座にあり、前記ヒト化ＩＬ−６Ｒα遺伝子が、内在性マウス調節配列に作動可能に連結する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ヒト免疫グロブリンスーパーファミリードメインをコードする配列によるマウス免疫グロブリンスーパーファミリードメインをコードする配列の置き換えを含む、ヒト化ＩＬ−６Ｒα遺伝子を含む遺伝子改変されたマウスであって、該ヒト化ＩＬ−６Ｒα遺伝子が、マウス膜貫通配列およびマウス細胞質配列をさらに含み、該マウスが、ヒトＩＬ−６をコードする遺伝子をさらに含み、ヒトＩＬ−６およびヒト化ＩＬ−６Ｒαをコードする該遺伝子が、内在性マウス調節エレメントの制御下にある、遺伝子改変されたマウス。
【請求項１９】
マウスＩＬ−６Ｒαを発現せず、マウスＩＬ−６を発現しない、請求項１８に記載の遺伝子改変されたマウス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
内在性非ヒト動物ＩＬ−６および／またはＩＬ−６受容体遺伝子遺伝子の置き換えを有する非ヒト動物が提供される。非ヒト動物のＩＬ−６遺伝子および／またはＩＬ−６受容体遺伝子が、内在性非ヒト遺伝子座にて、ヒトＩＬ−６遺伝子および／またはヒト化ＩＬ−６受容体遺伝子（ヒト配列を含む）で置き換えられる。ヒトＩＬ−６遺伝子および／またはヒト化ＩＬ−６受容体遺伝子を有する非ヒト動物は、ヒトＩＬ−６についてのトランスジェニック非ヒト動物に特徴的である１つまたは複数の病変を示さない。
【背景技術】
【０００２】
背景
ヒトＩＬ−６遺伝子についてのトランスジェニックマウスは、当該技術分野で公知である。しかしながら、マウスゲノムへのヒトＩＬ−６導入遺伝子の無作為挿入は、ヒトＩＬ−６タンパク質の不十分に調節された発現をもたらし、それ自体かかるトランスジェニックマウスにおいて様々な病変（形質細胞増加症および糸球体腎炎が挙げられるが、これらに限定されない）が現れる。結果として、これらのマウスは有用性が限定されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
概要
ヒトまたはヒト化ＩＬ−６および／またはヒトまたはヒト化ＩＬ−６受容体を発現する非ヒト動物（例えばマウスおよびラット）が必要とされる。トランスジェニックｈＩＬ−６マウスにより示される１つまたは複数の病変を示さないかかるヒト化マウスが必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
１つの態様では、内在性ＩＬ−６遺伝子座および／またはＩＬ−６受容体遺伝子座での、ヒトまたはヒト化ＩＬ−６および／またはＩＬ−６受容体をコードする遺伝子による、内在性ＩＬ−６および／またはＩＬ−６受容体をコードする遺伝子の置き換えを含む遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。内在性ネズミＩＬ−６遺伝子座でのヒトＩＬ−６遺伝子による内在性ＩＬ−６遺伝子の置き換えを含み、および／またはヒトＩＬ−６受容体遺伝子（またはそのエクトドメイン（ectodomain）をコードするヌクレオチド配列）による内在性ＩＬ−６受容体遺伝子（またはそのエクトドメインをコードするヌクレオチド配列）の置き換えを含むネズミ動物が提供される。
【０００５】
１つの態様では、内在性ネズミＩＬ−６遺伝子座から、内在性ネズミプロモーターおよび／または内在性ネズミ調節エレメントの制御下で、ヒトＩＬ−６遺伝子を発現する遺伝子改変されたネズミ動物が提供される。
【０００６】
１つの態様では、内在性ネズミＩＬ−６受容体遺伝子座から、内在性ネズミプロモーターおよび／または内在性ネズミ調節エレメントの制御下で、ヒトＩＬ−６受容体遺伝子（またはヒトエクトドメインならびにマウス膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインをコードする遺伝子）を発現する遺伝子改変されたネズミ動物が提供される。
【０００７】
１つの態様では、ヒトＩＬ−６タンパク質を発現する遺伝子改変された動物（例えば、ネズミ動物、例えばマウスまたはラット）であって、ここで非ヒト動物は、形質細胞増加症、糸球体腎炎、糸球体硬化症、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、腸リンパ腫、腎臓リンパ腫、脾腫、リンパ節拡大、肝臓腫大、骨髄における巨核球、緻密で異常な形質細胞、肺または肝臓または腎臓への形質細胞の浸潤、腎臓におけるメサンギウム細胞増殖、ＩＬ−６の大脳過剰発現、白質における分岐型ミクログリア細胞、脳における反応性星状細胞増加症、腎不全、脾臓における巨核球の上昇（ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ）、筋肉消耗（例えば、腓腹筋消耗）、筋肉カテプシンＢおよびＢ＋Ｌの上昇（例えば、およそ２０倍および６倍）、およびそれらの組合せから選択される病変を示さない遺伝子改変された動物が提供される。
【０００８】
１つの実施形態では、非ヒト動物は、正常Ｂ細胞集団を含む。１つの実施形態では、正常Ｂ細胞集団は、野生型動物（例えば野生型マウス）と、数および免疫表現型がほぼ同じである。
【０００９】
１つの実施形態では、非ヒト動物はネズミ（例えば、マウスまたはラット）であり、約８００ｐｇ／ｍＬ未満、約７００、約６００ｐｇ／ｍＬ未満、約５００ｐｇ／ｍＬ未満、約４００ｐｇ／ｍＬ未満、約３００ｐｇ／ｍＬ未満または約２００ｐｇ／ｍＬ未満のレベルで血清中にヒトＩＬ−６（ｈＩＬ−６）を発現する。特定の実施形態では、ネズミ動物は、約５０〜約２００ｐｇ／ｍＬ以下、別の実施形態では、約７５〜１２５ｐｇ／ｍＬのレベルで、別の実施形態では約１００ｐｇ／ｍＬで血清中にｈＩＬ−６を発現する。
【００１０】
１つの態様では、ｈＩＬ−６および／またはｈＩＬ−６Ｒを発現する非ヒト動物であって、ここで非ヒト動物が、内在性非ヒトＩＬ−６遺伝子座および／または内在性非ヒトｈＩＬ−６Ｒ遺伝子座からｈＩＬ−６および／またはｈＩＬ−６Ｒを発現する非ヒト動物が提供される。特定の実施形態では、非ヒト動物はネズミ（例えば、マウスまたはラット）である。
【００１１】
１つの態様では、内在性マウスＩＬ−６遺伝子座からｈＩＬ−６を発現する遺伝子改変されたマウスであって、ここで内在性マウスＩＬ−６遺伝子がｈＩＬ−６遺伝子で置き換えられている遺伝子改変されたマウスが提供される。
【００１２】
１つの実施形態では、上記マウスは、細胞の表面にヒトエクトドメインを含むＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）を発現する細胞を含む。１つの実施形態では、細胞はリンパ球である。１つの実施形態では、リンパ球はＢ細胞である。
【００１３】
１つの実施形態では、エクソン１〜エクソン５および３’非翻訳配列を含む内在性マウスＩＬ−６遺伝子座における約６．８ｋｂが欠失し、ヒトＩＬ−６遺伝子のエクソン１〜エクソン５を含む約４．８ｋｂのヒトＩＬ−６遺伝子配列で置き換えられる。特定の実施形態では、ヒトＩＬ−６遺伝子は、ヒトＢＡＣ  ＣＴＤ−２３６９Ｍ２３のヒトＩＬ−６遺伝子のエクソン１〜エクソン５を含む。
【００１４】
１つの態様では、ヒトＩＬ−６遺伝子からＩＬ−６を発現する遺伝子改変されたマウスであって、その血清中にヒトＩＬ−６を発現する遺伝子改変されたマウスが提供される。
【００１５】
１つの実施形態では、マウス血清は、約２５〜約３００ｐｇ／ｍＬ、５０〜約２５０ｐｇ／ｍＬ、７５〜約２００ｐｇ／ｍＬまたは１００〜約１５０ｐｇ／ｍＬのヒトＩＬ−６の血清濃度を示す。特定の実施形態では、マウスの血清中のヒトＩＬ−６のレベルは約１００ｐｇ／ｍＬである。
【００１６】
１つの実施形態では、マウスの骨髄中の汎（ｐａｎ）Ｂ細胞特異的マーカーのレベルは、野生型マウスのレベルとほぼ同じである。１つの実施形態では、脾臓中の汎Ｂ細胞特異的マーカーのレベルは、野生型マウスのレベルとほぼ同じである。１つの実施形態では、汎Ｂ細胞特異的マーカーは、Ｂ２２０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、Ｌ２６およびＰａｘ−５（ＢＳＡＰ）から選択される。
【００１７】
１つの態様では、ｈＩＬ６を発現する遺伝子改変されたマウスであって、形質細胞増加症、脾腫、リンパ節拡大、緻密で異常な形質細胞およびそれらの組合せから選択される特徴を示さない遺伝子改変されたマウスが提供される。
【００１８】
１つの実施形態では、上記マウスは、野生型マウスとほぼ同じ重量（体重当たり）である脾臓を含む。１つの実施形態では、マウスのリンパ節は、野生型マウスとほぼ同じ重量（体重当たり）である。１つの実施形態では、マウスの形質細胞は、ヒトＩＬ−６を過剰発現するマウスに特徴的な形質細胞増加症（plasmocytosis）を示さない。
【００１９】
１つの実施形態では、上記マウスは、糸球体腎炎を示さない。
【００２０】
１つの実施形態では、上記マウスは、野生型マウスに匹敵するメサンギウム細胞レベルを示す。
【００２１】
１つの態様では、内在性マウスＩＬ−６遺伝子座からｈＩＬ６を発現する遺伝改変マウスであって、ここで内因性マウスＩＬ−６遺伝子は、ｈＩＬ−６遺伝子で置き換えられており、該マウスが、形態学的に検出可能な神経病変、反応性星状細胞増加症およびそれらの組合せから選択される特徴を示さない遺伝子改変されたマウスが提供される。１つの実施形態では、上記マウスは、野生型マウス脳と形態学的に区別できない脳を含む。１つの実施形態では、上記マウスは、野生型マウスのレベル以下である反応性星状細胞増加症のレベルを示す脳組織を含む。
【００２２】
１つの実施形態では、上記マウスは、ニューロンにヒトＩＬ−６を発現しない。１つの実施形態では、上記マウスは、野生型マウスにおける活性化星状細胞レベルに匹敵する活性化星状細胞レベルを含む。
【００２３】
１つの実施形態では、上記マウスは、その白質に分岐型ミクログリア細胞を含み、ここで分岐型ミクログリア細胞は、野生型マウスにおける分岐型ミクログリア細胞の量に等価な量で存在する。
【００２４】
１つの実施形態では、上記マウスは、反応性星状細胞増加症を示さない。１つの実施形態では、上記マウスの白質は、野生型マウスの白質と形態学的に区別できない。１つの実施形態では、上記マウスの白質は、反応性星状細胞の組織化学的染色に関して、野生型マウス白質と組織学的に区別できない。
【００２５】
１つの実施形態では、上記マウスは、野生型マウス脳と形態学的に区別できない脳を含む。１つの実施形態では、上記マウスは、野生型マウスのレベル以下である反応性星状細胞増加症のレベルを示す脳組織を含む。
【００２６】
１つの態様では、内在性マウスＩＬ−６遺伝子座からｈＩＬ６を発現する遺伝子改変されたマウスであって、ここで内在性マウスＩＬ−６遺伝子は、ｈＩＬ−６遺伝子で置き換えられており、該マウスは、約５０％以上分の寿命の短縮、腎不全、高ガンマグロブリン血症、脾臓における巨核球の上昇、骨髄における巨核球の上昇、脾臓の形質細胞増加症、胸腺の形質細胞増加症、リンパ節の形質細胞増加症、糸球体腎炎、糸球体硬化症およびそれらの組合せから選択される特徴を示さない遺伝子改変されたマウスが提供される。
【００２７】
１つの実施形態では、上記マウスは、２０週を超える寿命を有する。１つの実施形態では、上記マウスは、３０週、４０週または５０週を超える寿命を有する。１つの実施形態では、上記マウスは、同じ系統の野生型マウスの寿命とほぼ等しい寿命を示す。
【００２８】
１つの実施形態では、上記マウスは、野生型マウスのおおよその脾性巨核球レベル以下である、脾臓における巨核球のレベルを示す。
【００２９】
１つの実施形態では、上記マウスは、異常かつ緻密に配置された形質細胞様細胞を本質的に欠如するリンパ系器官を含む。
【００３０】
１つの実施形態では、上記マウスは、野生型マウスにおけるガンマグロブリン血清レベルに等価なガンマグロブリン血清レベルを示す。１つの実施形態では、マウスの血清中のα１−グロブリンおよびβ−グロブリンのレベルは、同じ系統の野生型マウスのα１−グロブリンおよびβ−グロブリン血清レベルに等価である。
【００３１】
１つの態様では、内在性マウスＩＬ−６遺伝子座からヒトＩＬ−６を発現する遺伝子改変されたマウスであって、ここで内在性マウスＩＬ−６遺伝子がｈＩＬ−６遺伝子で置き換えられており、該マウスは、筋肉消耗、同じ系統の野生型マウスと比較した場合のカテプシンＢレベルの上昇、同じ系統の野生型マウスと比較した場合のカテプシンＡ＋Ｂレベルの上昇、同じ系統の野生型マウスと比較した場合の肝臓重量の増加、およびそれらの組合せから選択される特徴を示さない遺伝子改変されたマウスが提供される。
【００３２】
１つの実施形態では、マウスの肝臓の重量は、１２週で約８００〜９００ｍｇである。
【００３３】
１つの実施形態では、上記マウスは、その寿命を通して、野生型マウスで観察されるおおよそのレベル以下であるカテプシンＢレベルを示す。１つの実施形態では、上記マウスは、その寿命を通して、野生型マウスで観察されるおおよそのレベル以下であるカテプシンＡ＋Ｂレベルを示す。
【００３４】
１つの実施形態では、成体としての上記マウスは、同じ系統の野生型マウスの重量の約１０％以内である腓腹筋重量を示す。１つの実施形態では、成体としての上記マウスは、野生型マウスの重量とほぼ同じである腓腹筋重量を示す。
【００３５】
１つの態様では、ヒトＩＬ−６タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むマウスであって、ここでヒトＩＬ−６タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、全体または一部において、内在性マウスＩＬ−６タンパク質をコードする内在性ヌクレオチド配列を置き換える、マウスが提供される。
【００３６】
１つの態様では、キメラヒト／マウスＩＬ−６Ｒα遺伝子を形成するための、内在性マウスＩＬ−６受容体遺伝子座でのヒトＩＬ−６Ｒαのエクトドメイン配列によるマウスＩＬ−６Ｒαエクトドメインの置き換えを含むマウスが提供される。
【００３７】
１つの実施形態では、キメラＩＬ−６Ｒα遺伝子は、内在性マウスＩＬ−６Ｒα遺伝子座にあるマウスプロモーターおよび／またはマウス調節エレメントの制御下にある。
【００３８】
１つの実施形態では、約３５．４ｋｂのマウスＩＬ−６Ｒαエクトドメインをコードする配列は、約４５．５ｋｂのヒトＩＬ−６Ｒエクトドメインをコードする配列で置き換えられる。
【００３９】
１つの実施形態では、ヒトＩＬ−６Ｒエクトドメインをコードする配列は、エクソン１〜エクソン８において最初の（ＡＴＧ）コドンを包含する。
【００４０】
１つの実施形態では、置き換えられるマウスＩＬ−６Ｒα配列は、エクソン１〜エクソン８を包含する連続的な配列を含む。特定の実施形態では、エクソン１〜エクソン８およびイントロン８の一部が欠失される。
【００４１】
１つの態様では、内在性マウスＩＬ−６遺伝子座でのヒトＩＬ−６をコードするヒト遺伝子による、ＩＬ−６をコードするマウス遺伝子の置き換えを含む遺伝子改変されたマウスであって、ここでヒトＩＬ−６をコードするヒト遺伝子は、内在性マウスＩＬ−６遺伝子座における内在性マウス調節エレメントの制御下にある遺伝子改変されたマウスが提供される。
【００４２】
１つの実施形態では、ヒトＩＬ−６をコードするヒト遺伝子は、ＢＡＣ  ＩＤ  ＣＴＤ−２３６９Ｍ２３のヒトＩＬ−６遺伝子である。
【００４３】
１つの実施形態では、上記マウスは、マウスＩＬ−６Ｒαを発現する。１つの実施形態では、上記マウスはヒトＩＬ−６Ｒαを発現する。１つの実施形態では、ヒト化ＩＬ−６Ｒαはヒトエクトドメインを含む。１つの実施形態では、ヒト化ＩＬ−６Ｒαは、マウス膜貫通ドメインおよびマウス細胞質ドメインを含む。１つの実施形態では、上記マウスは、エクトドメインのヒト化を含むが、膜貫通ドメインおよび／または細胞質ゾルドメインのヒト化を含まないヒト化ＩＬ−６Ｒαを発現する。
【００４４】
１つの実施形態では、上記マウスは、形質細胞増加症、糸球体硬化症、糸球体腎炎、腎不全、高ガンマグロブリン血症、脾臓における巨核球の上昇、骨髄における巨核球の上昇、脾腫、リンパ節拡大、緻密で異常な形質細胞、およびそれらの組合せから選択される特徴を示さない。
【００４５】
１つの態様では、内在性マウスＩＬ−６Ｒα遺伝子のヒト化を含む遺伝子改変されたマウスであって、ここでヒト化は、内在性マウスＩＬ−６Ｒα遺伝子座でのヒトＩＬ−６Ｒαエクトドメインをコードする配列によるマウスＩＬ−６Ｒαエクトドメインをコードする配列の置き換えを含む遺伝子改変されたマウスが提供される。
【００４６】
１つの実施形態では、マウスエクソン１〜エクソン８を含む連続的なマウス配列は、ヒトＩＬ−６ＲαエクトドメインをコードするヒトＩＬ−６Ｒα配列の連続的なゲノム断片で置き換えられる。１つの実施形態では、エクトドメインをコードするヒトＩＬ−６Ｒα配列の連続的なゲノム断片は、ＢＡＣ  ＣＴＤ−２１９２Ｊ２３由来である。
【００４７】
１つの実施形態では、上記マウスは、ヒト化ＩＬ−６遺伝子をさらに含む。１つの実施形態では、上記マウスは、内在性マウスＩＬ−６遺伝子座でのヒトＩＬ−６遺伝子によるマウスＩＬ−６遺伝子の置き換えを含む。１つの実施形態では、ヒト化ＩＬ−６遺伝子は、内在性マウス調節エレメントの制御下にある。
【００４８】
１つの態様では、マウスＩＬ−６をコードするマウス遺伝子配列を、ヒトＩＬ−６をコードするヒト遺伝子で置き換える工程を含む、ヒト化マウスを作製する方法が提供される。
【００４９】
１つの実施形態では、置き換えは、内在性マウスＩＬ−６遺伝子座にあり、ヒトＩＬ−６をコードするヒト遺伝子は、内在性マウス調節配列に作動可能に連結する。
【００５０】
１つの態様では、マウスＩＬ−６Ｒαのエクトドメイン配列をコードするマウスエクソンを、ヒトＩＬ−６Ｒαのエクトドメイン配列をコードするヒトゲノム断片で置き換えて、ヒト化ＩＬ−６Ｒα遺伝子を形成する工程を含む、ヒト化マウスを作製する方法が提供される。
【００５１】
１つの実施形態では、置き換えは、内在性マウスＩＬ−６Ｒα遺伝子座にあり、ヒト化ＩＬ−６Ｒα遺伝子は、内在性マウス調節配列に作動可能に連結する。
【００５２】
１つの態様では、ヒトエクトドメイン配列によるマウスエクトドメインをコードする配列の置き換えを含むヒト化ＩＬ−６Ｒα遺伝子を含む遺伝子改変されたマウスであって、ここでヒト化ＩＬ−６Ｒα遺伝子は、マウス膜貫通配列およびマウス細胞質配列を含み、該マウスは、ヒトＩＬ−６をコードする遺伝子をさらに含み、ヒトＩＬ−６をコードする遺伝子は、内在性マウスＩＬ−６調節エレメントの制御下にある遺伝子改変されたマウスが提供される。
【００５３】
１つの実施形態では、上記マウスは、完全マウスＩＬ−６Ｒαを発現することが不可能であり、かつマウスＩＬ−６を発現することが不可能である。
【００５４】
様々な態様では、本明細書中に記載される遺伝子改変されたマウスは、それらの生殖系列において遺伝子改変を含む。
【００５５】
１つの態様では、本明細書中で記載されるようなマウス由来の組織、細胞または膜断片が提供される。
【００５６】
１つの実施形態では、組織または細胞は、ヒトＩＬ−６タンパク質を発現するが、マウスＩＬ−６タンパク質を発現しないマウスに由来するものである。１つの実施形態では、組織または細胞は、ヒト化ＩＬ−６Ｒαタンパク質を発現するが、マウスＩＬ−６Ｒαタンパク質を発現しないマウスに由来するものである。１つの実施形態では、ヒト化ＩＬ−６Ｒαタンパク質は、ヒトエクトドメインおよびマウス膜貫通ドメインおよびマウス細胞質ゾルドメインを含む。１つの実施形態では、組織または細胞は、ヒトＩＬ−６、ヒト化ＩＬ−６Ｒαを発現し、かつマウスＩＬ−６を発現せず、かつマウスエクトドメインを含むＩＬ−６Ｒαを発現しないマウスに由来するものである。
【００５７】
１つの態様では、ヒト化ＩＬ−６Ｒα（ヒトエクトドメインおよびマウス膜貫通ドメインおよびマウス細胞質ドメイン）およびヒトＩＬ−６を保有するマウス細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ複合体が提供される。
【００５８】
１つの態様では、本明細書中に記載されるような遺伝子改変を含むマウス胚が提供される。
【００５９】
１つの態様では、本明細書中に記載されるような遺伝子改変を含むドナー細胞を含むマウス宿主胚が提供される。
【００６０】
１つの態様では、本明細書中に記載されるような遺伝子改変を含む多能性または全能性非ヒト動物細胞が提供される。１つの実施形態では、細胞はネズミ細胞である。１つの実施形態では、細胞はＥＳ細胞である。
【００６１】
１つの態様では、マウス卵であって、ここで該マウス卵は、異所性マウス染色体を含み、ここで該異所性マウス染色体は、本明細書中に記載されるような遺伝子改変を含むマウス卵が提供される。
【００６２】
１つの態様では、ヒトＩＬ−６遺伝子または、ヒトまたはヒト化ＩＬ−６Ｒα遺伝子を含むように遺伝子改変されるマウス、胚、卵または細胞は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０ＣｒおよびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統由来であるマウス由来のものである。別の実施形態では、上記マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統から成る群から選択される１２９系統である（例えば、Festingら（１９９９年）  Revised  nomenclature  for  strain  129  mice、Mammalian  Genome、１０巻：８３６頁を参照、同様にAuerbachら（２０００年）  Establishment  and  Chimera  Analysis  of  129/SvEv-  and  C57BL/6-Derived  Mouse  Embryonic  Stem  Cell  Linesを参照）。特定の実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、上記の１２９系統と上記のＣ５７ＢＬ／６系統との混合物である。別の特定の実施形態では、上記マウスは、上記の１２９系統の混合物、または上記のＢＬ／６系統の混合物である。特定の実施形態では、混合物の１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の実施形態では、上記マウスは、ＢＡＬＢ系統（例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統）である。さらに別の実施形態で、上記マウスは、ＢＡＬＢ系統と別の上記の系統との混合物である。１つの実施形態では、上記マウスは、ＳｗｉｓｓまたはＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスである。
【００６３】
本明細書中に記載される態様および実施形態はそれぞれ、実施形態または態様の文脈から明確にまたは明瞭に排除されない限りは、一緒に使用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、ヒト（上部）およびマウス（下部）のＩＬ−６ゲノム遺伝子座の図（原寸に比例しない）を提供する。エクソンＩ、エクソンＩＩ、エクソンＩＩＩ、エクソンＩＶおよびエクソンＶ（ヒトおよびマウスの両方で）は、図の右側に塗りつぶした四角で示される。選択した推定上の調節領域は、図の左側に白抜きの四角で示される。
【００６５】
【図２】図２は、野生型マウス、ヒト化エクトドメインＩＬ−６Ｒマウス、ならびにヒト化ＩＬ−６遺伝子およびヒト化ＩＬ−６Ｒ遺伝子を有するマウスにおけるテレピンの存在下または非存在下での急性期応答（ｍＳＡＡレベル）を示す。
【００６６】
【図３】図３は、抗マウスＩＬ−６Ｒ抗体の非存在下または存在下での野生型マウスにおけるテレピン依存的急性期応答（ＳＡＡ）（左）、および抗ヒトＩＬ−６Ｒ抗体の非存在下または存在下でのヒト化ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒマウスにおけるテレピン依存的急性期応答（右）を示す。
【００６７】
【図４】図４は、野生型およびヒト化ＩＬ−６マウスの脾性Ｂ細胞に関するＦＡＣＳ分析（汎Ｂ細胞マーカー）を示す。
【００６８】
【図５】図５は、野生型およびヒト化ＩＬ−６マウスの脾性Ｔ細胞に関するＦＡＣＳ分析（Ｔヘルパー細胞および細胞傷害性Ｔ細胞）を示す。
【００６９】
【図６】図６は、野生型およびヒト化ＩＬ−６マウスの脾性細胞に関するＦＡＣＳ分析（Ｌｙ６Ｇ／Ｃ（Ｇｒ１））を示す。
【００７０】
【図７】図７は、野生型およびヒト化ＩＬ−６マウスの脾性細胞に関するＦＡＣＳ分析（ＮＫ細胞および顆粒球（Ｌｙ６Ｇｈｉ＋／ＣＤ１１ｂｈｉ＋）を示す。
【００７１】
【図８】図８は、野生型およびヒト化ＩＬ−６マウスの血液Ｂ細胞に関するＦＡＣＳ分析（汎Ｂ細胞マーカー）を示す。
【００７２】
【図９】図９は、野生型およびヒト化ＩＬ−６マウスの血液Ｔ細胞に関するＦＡＣＳ分析（Ｔヘルパー細胞および細胞傷害性Ｔ細胞）を示す。
【００７３】
【図１０】図１０は、野生型およびヒト化ＩＬ−６マウスの血液骨髄性細胞に関するＦＡＣＳ分析（Ｇｒ１＋細胞）を示す。
【００７４】
【図１１】図１１は、野生型およびヒト化ＩＬ−６マウスの血液骨髄性細胞に関するＦＡＣＳ分析（ＣＤ１１ｂ対Ｌｙ６Ｇ／Ｃ（Ｇｒ１））を示す。
【００７５】
【図１２】図１２は、野生型およびヒト化ＩＬ−６マウスの血液骨髄性細胞に関するＦＡＣＳ分析（ＤＸ５細胞対ＣＤ１１ｂ細胞）を示す。
【００７６】
【図１３】図１３は、野生型およびヒト化ＩＬ−６マウスに関する骨髄ＩｇＭ／ＣＤ２４／Ｂ２２０のＦＡＣＳ分析を示す。上部：骨髄における正常な進行。下部：野生型、ｈＩＬ−６ヘテロ接合体およびｈＩＬ−６ホモ接合体に関するＦＡＣＳ分析（ＩｇＭ染色）。
【００７７】
【図１４】図１４は、野生型およびヒト化ＩＬ−６マウスに関する骨髄ＩｇＭ／ＣＤ２４／Ｂ２２０のＦＡＣＳ分析を示す。上部：骨髄における正常な進行。下部：野生型、ｈＩＬ−６ヘテロ接合体およびｈＩＬ−６ホモ接合体に関するＦＡＣＳ分析（ＣＤ２４染色）。
【００７８】
【図１５】図１５は、野生型およびヒト化ＩＬ−６マウスに関する骨髄ＣＤ４３およびＢ２２０のＦＡＣＳ分析を示す。上部：骨髄における正常な進行。下部：野生型、ｈＩＬ−６ヘテロ接合体およびｈＩＬ−６ホモ接合体に関するＦＡＣＳ分析（ＣＤ４３染色）。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
詳細な説明
ＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒ
ＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）は、免疫グロブリンを合成するようにＢ細胞を誘導することに関与するＢ細胞刺激因子（ＢＳＦ−２、またはＢ細胞刺激因子２、同様にＢＣＤＦ、またはＢ細胞分化因子）に対する受容体として長い間特徴付けられた（Yamasakiら（１９８８年）  Cloning  and  Expression  of  the  Human  Interleukin-6(BSF-2/IFNβ2)Receptor、Science  ２４１巻：８２５〜８２８頁）。ＩＬ−６は、最初は、ヒト線維芽細胞をｄｓＲＮＡポリ（Ｉ）ポリ（Ｃ）で処理して、抗ウイルス応答を誘導することによる、インターフェロン−βと称されるウイルス誘導性タンパク質に関する研究中のその発見の結果として、インターフェロン−β２と記載された（Weissenbachら（１９８０年）  Two  interferon  mRNAs  in  human  fibroblasts:  In  vitro  translation  and  Escherichia  coli  cloning  studies、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ７７巻（１２号）：７１５２〜７１５６頁、Kellerら（１９９６年）  Molecular  and  Cellular  Biology  of  Interleukin-6  and  Its  Receptor、Frontiers  in  Bioscience  １巻：ｄ３４０〜３５７頁）。
【００８０】
ヒトｃＤＮＡは、１９マー（ｍｅｒ）のシグナル配列および、チロシンキナーゼドメインを欠如する約８２個のアミノ酸の細胞質ドメインを有する４６８アミノ酸タンパク質をコードする（同上文献を参照）。タンパク質のＮ末端（エクトドメイン）は、約９０個のアミノ酸のＩｇスーパーファミリードメイン、Ｉｇスーパーファミリードメインと膜との間の２５０アミノ酸ドメイン、約２８個のアミノ酸の膜貫通スパン（transmembrane  span）を有する（同上文献を参照）。受容体のエクトドメインは、そのリガンドＩＬ−６を結合し、それが膜におけるｇｐ１３０との会合を誘発して、この複合体がシグナル伝達を行い、細胞質ドメインは、シグナルを伝達しないと報告されている（Tagaら（１９８９年）  Interleukin-6  Triggers  the  Association  of  Its  Receptor  with  a  Possible  Signal  Transducer,  gp  130、Cell  ５８巻：５７３〜５８１頁）。実際に、細胞質ドメインを欠如するＩＬ−６Ｒの可溶性形態は、ＩＬ−６と会合して、細胞の表面でｇｐ１３０を結合して、シグナルを効果的に伝達する（同上文献）。
【００８１】
タンパク質レベルでのｈＩＬ−６ＲおよびｍＩＬ−６Ｒの相同性はほんの約５４％に過ぎず、膜貫通ドメインが約７９％の相同性を有するのに対して、細胞質ドメインは、約５４％の相同性を有する（Sugitoら（１９９０年））。
【００８２】
ＩＬ−６Ｒに対する天然リガンドであるＩＬ−６はまず、ＨＴＬＶ−１形質転換Ｔ細胞の培養物から単離された（Hiranoら（１９８５年）  Purification  to  homogeneity  and  characterization  of  human  B  cell  differentiation  factor  (BCDF  or  BSFp-2)、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８２巻：５４９０〜５４９４頁を参照）。ＩＬ−６遺伝子に関するヒト  ｃＤＮＡは、少なくとも二度、ＢＳＦ−２として一度（Hiranoら（１０８６年）  Complementary  DNA  fro  a  novel  human  interleukin  (BSF-2)  that  induces  B  lymphocytes  to  produce  immunoglobulin、Nature  ３２４巻：７３〜７６頁を参照）、またＩＦＮβ  ２として一度（Zilbersteinら（１９８６年）  Structure  and  expression  of  cDNA  and  genes  for  human  interferon-beta-2,  a  distinct  species  inducible  by  growth-stimulatory  cytokines、EMBO  ５巻：２５２９〜２５３７頁を参照）、クローニングされたが、その後、組換えヒトＩＬ−６は検出可能なＩＦＮ活性を示さないことが実証されている。
【００８３】
ヒトＩＬ−６は、マウスＩＬ−６とほんの約４２％の相同性を示す１８４アミノ酸のタンパク質であるが、ヒト遺伝子およびマウス遺伝子のゲノム構成（genomic  organization）は基本的に同じであり、ヒト遺伝子およびマウス遺伝子のプロモーター領域は、高度に保存される４００ｂｐストレッチを共有する（Tanabeら（１９８８年）  Genomic  Structure  of  the  Murine  IL-6  Gene:  High  Degree  Conservation  of  Potential  Regulatory  Sequences  between  Mouse  and  Human、J.  Immunol.  １４１巻（１１号）：３８７５〜３８８１頁を参照）。
【００８４】
ヒトＩＬ−６遺伝子は約５ｋｂである（Yasukawaら（１９８７年）  Structure  and  expression  of  human  B  cell  stimulatory  factor-2  (BSC-2/IL-6)  gene、EMBO  J.  ６巻（１０号）：２９３９〜２９４５頁）のに対して、マウスＩＬ−６遺伝子は約７ｋｂである（Tanabeら（１９８８年）  Genomic  Structure  of  the  Murine  IL-6  Gene:  High  Degree  Conservation  of  Potential  Regulatory  Sequences  between  Mouse  and  Human、J.  Immunol.  １４１巻（１１号）：３８７５〜３８８１頁）。マウスおよびヒトのＩＬ−６遺伝子は、調節に重要な高度に保存された５’−フランキング配列を共有すると報告されている。ヒトおよびマウスのＩＬ−６ゲノム遺伝子座の概略図を図１に示す（原寸に比例しない）。エクソンＩ、エクソンＩＩ、エクソンＩＩＩ、エクソンＩＶおよびエクソンＶ（ヒトおよびマウスの両方で）は、図の右側に塗りつぶした四角で示される。選択した推定上の調節領域は、図の左側に白抜きの四角で示される。ヒトに関する推定上の調節領域は、左から右へ、グルココルチコイドエレメント（−５５７〜−５５２）、ＩＦＮエンハンサーコア配列（−４７２〜−４６８）、グルココルチコイドエレメント（−４６６〜−４６１）、ＡＴリッチ領域（−３９５〜−３３４）コンセンサスＡＰ−１結合部位（−３８３〜−２７７）、ＩＦＮエンハンサーコア配列（−２５３〜−２４８）、ＧＧＡＡＡ含有モチーフ（−２０５〜−１９２）、ｃ−ｆｏｓ  ＳＲＥ相同性配列（−１６９〜−８２）（ＩＦＮエンハンサーコア配列、ｃＡＭＰ応答エレメント、ＧＧＡＡＡモチーフ、ＣＣＡＡＴボックス、およびＧＣリッチ領域を含有）、およびＡＰ−１結合部位（−６１〜−５５）、およびＣＣＡＡＴボックス（−３４〜−３０）である。マウスに関する推定上の調節領域は、左から右へ、ＧＣリッチ領域（−５５３〜−５３６）、グルココルチコイドエレメント（−５２１〜−５１６および−５００〜−４９５）、Ｚ−ＤＮＡストレッチ（−４４７〜−３９６）、ＩＦＮエンハンサーコア配列をオーバーラップするＡＰ−１結合部位（−２７７〜−２８８）、ＩＦＮエンハンサーコア配列をオーバーラップするＧＧＡＡＡモチーフ（−２１０〜−１９５）、ｃ−ｆｏｓ  ＳＲＥ相同性領域（−１７１〜−８２）（ｃＡＭＰ応答エレメント、ＩＦＮエンハンサーコア配列をオーバーラップするＧＧＡＡＡモチーフ、およびＧＣリッチ領域を含有）、およびＡＰ−１結合部位（−６１〜−５５）である。マウスコドンＩ〜Ｖは、それぞれ長さ１９、１８５、１１４、１５０および１６５を有する。マウスイントロン長は、Ｉ〜ＩＩ（１６２ｂｐ）、ＩＩ〜ＩＩＩ（１２５３ｂｐ）、ＩＩＩ〜ＩＶ（２９８１ｂｐ）、ＩＶ〜Ｖ（１２８１ｂｐ）である。ヒトコドンＩ〜Ｖは、長さ１９、１９１、１１４、１４７および１６５を有する。ヒトイントロン長は、Ｉ〜ＩＩ（１５４）、ＩＩ〜ＩＩＩ（１０４７）、ＩＩＩ〜ＩＶ（７０６）、ＩＶ〜Ｖ（１７３７）である。ゲノム構成データは、Tanabeら（１９８８年）およびYasukawaら（１９８７年）  Structure  and  expression  of  human  B  cell  stimulatory  factor-2  (BSF-2/IL-6)  gene、EMBO  J.  ９巻（１０号）：２９３９〜２９４５頁に由来する。
【００８５】
マウスおよびヒトのＩＬ−６遺伝子は、それらの５’−フランキング配列の類似性に基づいて同様に調節されるようであると仮定することが合理的であり得る。種々の細胞型は、ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮβ、血清、ポリ（Ｉ）ポリ（Ｃ）およびシクロヘキシミドに応答してＩＬ−６発現の増強を示す（Tanabeら（１９８８年）を参照）。ヒトにおけるＩＬ−６は、急性期応答、造血、Ｂ細胞分化、Ｔ細胞活性化、種々の細胞型（例えば、肝細胞、線維芽細胞、内皮細胞、ニューロン、下垂体細胞、リンパ腫、骨髄腫、乳癌、ＮＫ細胞、マクロファージ、破骨細胞等）の成長および／または分化および／または活性化を媒介する（例えば、Heinrichら（１９９０年）、Kishimotoら（１９８９年）およびKellerら（１９９６年）、Sugitaら（１９９０年）  Functional  Murine  Interleukin  Receptor  with  Intracisternal  A  Particle  Gene  Product  at  its  Cytoplasmic  Domain、J.  Exp.  Med.  １７１巻：２００１年〜２００９年で概説される）。
【００８６】
しかしながら、実際に、ヒトＩＬ−６についてのトランスジェニックマウスは、一連の実質的なおよび消耗性の病変を示し、それは、ＩＬ−６遺伝子の重大な多面発現作用を反映している。ヒトＩＬ−６遺伝子、およびμエンハンサー（Ｅμ）を含有する６．６ｋｂ断片を含むトランスジェニックマウスは、高濃度のｈＩＬ−６および極めて高いＩｇＧ１レベル（野生型マウスを１２０倍〜４００倍上回る）を生成し、それは、形質細胞増加症、メサンギウム増殖性糸球体腎炎および高い骨髄巨核球レベルを伴うＩＬ−６調節解除を反映している（Suematsuら（１９８９年）  IgG1  plasmacytosis  in  interleukin  6  transgenic  mice、Proc.  Natl  Acad.  Sci.  USA  ８６巻：７５４７〜７５５１頁）。ＩＬ−６および／またはＩＬ−６Ｒの異常調節は、骨髄腫、形質細胞腫（plastocytomas）、関節リウマチ、キャッスルマン病、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、心臓粘液腫、形質細胞（plams  cell）新形成、乾癬および他の障害に関連する（Kishimoto,  T.  （１９８９年）  The  Biology  of  Interleukin-6、Blood  ７４巻（１号）：１〜１０頁、Sugitaら（１９９０年）、同様にHiranoら（１９９０年）  Biological  and  clinical  aspects  of  interleukin  6、Immunology  Today  １１巻（１２号）：４４３〜４４９頁）を参照）。ＩＬ−６はまた、パラクリンおよび／またはオートクリン機序により前立がん癌患者のアンドロゲン枯渇処置中に前立腺内アンドロゲンのレベルを維持することに関係しており、去勢抵抗性前立腺腫瘍成長を潜在的に提供する（Chunら（２００９年）  Interleukin-6  Regulates  Androgen  Synthesis  in  Prostate  Cancer  Cells、Clin.  Cancer  Res.  １５巻：４８１５〜４８２２頁）。
【００８７】
ヒトタンパク質は、２１２アミノ酸タンパク質として、成熟形態では、２８アミノ酸シグナル配列の切断後の１８４アミノ酸タンパク質としてコードされる。それは、２つのＮ−グリコシル化部位および２つのＯ−グリコシル化部位を含有し、ヒトＩＬ−６は、幾つかの細胞ではリン酸化される。マウスタンパク質は、２１１アミノ酸タンパク質として、成熟形態では、２３アミノ酸シグナル配列の切断後の１８７アミノ酸タンパク質としてコードされる。Ｏ−グリコシル化部位が存在するが、Ｎ−グルコシル化部位は存在しない（ＩＬ−６に関する概説、例えば、Heinrichら（１９９０年）  Interleukin-6  and  the  acute  phase  response、Biochem.  J.  ２６５巻：６２１〜６３６頁を参照）。
【００８８】
ＩＬ−６機能は多面発現作用である。ＩＬ−６受容体は、活性化Ｂ細胞に見出されるが、休止Ｂ細胞では見出されないと報告されている。対比して、ＩＬ−６Ｒは、休止Ｔ細胞に見出され、Ｔ細胞分化、活性化および増殖（ＩＬ−２存在下での細胞傷害性Ｔリンパ球へのＴ細胞の分化を含む）を促進することができると報告されている。
【００８９】
ヒト化ＩＬ−６／ＩＬ−６ＲエクトドメインマウスおよびＩＬ−６媒介性急性期応答
ヒトにおいて、ＩＬ−６は、急性期応答を誘導する。ヒト肝細胞を用いた初期研究により、ＩＬ−６が、用量依存的および時間依存的様式で、例えばＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）および血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）などの急性期タンパク質を誘導することが確証された（Heinrichら（１９９０年）Interleukin-6  and  the  acute  phase  response、Biochem.  J.  ２６５巻（６２１〜６３６頁に概説）。したがって、ヒト化ＩＬ−６遺伝子およびヒト化ＩＬ−６Ｒ遺伝子を含む非ヒト動物（例えば、マウスまたはラット）は、ヒトＩＬ−６により媒介される急性期応答を測定するための有用な系である。かかる動物はまた、物質がＩＬ−６媒介性急性期応答を誘導するかどうかを、本明細書中に記載されるようなヒト化ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ動物をその物質に曝露すること、および１つまたは複数の急性期応答タンパク質（またはＲＮＡ）のレベルを測定することにより決定するのに有用である。１つの実施形態では、ヒト化動物は、ヒトＩＬ−６Ｒのアンタゴニストの存在下で物質に曝露され、１つまたは複数の急性期応答タンパク質（またはＲＮＡ）のレベルが測定され、ここでヒトＩＬ−６Ｒアンタゴニストの存在下での急性期応答タンパク質（またはＲＮＡ）のレベルの低減は、ヒトＩＬ−６Ｒ媒介性急性期応答を示す。
【００９０】
ヒトＩＬ−６は、ヒトＩＬ−６ＲおよびマウスＩＬ−６Ｒの両方を結合させることができ、マウスＩＬ−６は、マウスＩＬ−６Ｒを結合するが、ヒトＩＬ−６Ｒを結合しない（ｍＩＬ−６のｈＩＬ−６Ｒへの結合は検出可能ではないのに対して、ｈＩＬ−６は、ｍＩＬ−６Ｒを結合するのにｍＩＬ−６と競合することができる；Coulieら（１９８９年）  High-and  low-affinity  receptors  for  murine  interleukin  6.  Distinct  distribution  on  B  and  T  cells、Eur.  J.  Immunol.  １９巻：２１０７〜２１１頁）、同様に例えばPetersら（１９９６年）  The  Function  of  the  Soluble  Interleukin  6(IL-6)  Receptor  in  Vivo:  Sensitization  of  Human  Soluble  IL-6  Receptor  Transgenic  Mice  Towards  IL-6  and  Prolongation  of  the  Plasma  Half-life  of  IL-6、J.  Exp.  Med.  １８３巻：１３９９〜１４０６頁を参照）。したがって、マウスにおいてｈＩＬ−６Ｒを保有するヒト細胞（例えば、異種間移植で）は、ＩＬ−６媒介性機能（ＩＬ−６血球細胞またはリンパ球発達（例えば、造血、Ｂ細胞活性化、Ｔ細胞活性化等）の役割を含むがこれらに限定されない）を実行するのに内在性ｍＩＬ−６に依存することはできない。
【００９１】
野生型マウスＩＬ−６遺伝子およびヒトＩＬ−６Ｒ遺伝子を含む（しかし、マウスＩＬ−６Ｒ遺伝子は含まない）混合ｉｎ  ｖｉｖｏ系では、急性期応答誘導物質は、急性期応答を示す検出可能レベルの急性期タンパク質を誘導すると予測されない。しかしながら、ヒト化ＩＬ−６遺伝子およびヒト化エクトドメイン配列を含むＩＬ−６Ｒ遺伝子を含む本明細書中に記載されるようなヒト化マウスは、急性期応答誘導物質に応答して、血清中で急性期応答タンパク質を示す。急性期誘導物質テレピンの存在下または非存在下で急性期タンパク質に関して試験されたＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒについて野生型のマウスは、急性期タンパク質においてテレピン依存的増加を示した。ヒト化ＩＬ−６遺伝子を有するが、ＩＬ−６Ｒを有さないマウスは、テレピンの存在下で急性期応答を示さなかった。しかし、ヒトＩＬ−６遺伝子およびヒト化エクトドメインを有するＩＬ−６Ｒ遺伝子の両方を保有するマウスは、強力な急性期応答を示した（図２）。ＩＬ−６媒介性急性期応答は、適切な抗ＩＬ−６Ｒ抗体の、十分に高い抗体用量で急性期応答を抑止する能力から明らかなように、野生型マウス（図３、上部）およびヒト化ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒエクトドメインマウス（図３、下部）の両方でＩＬ−６依存的であった。したがって、ＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒの二重ヒト化は、血清急性期タンパク質に関して、野生型ＩＬ−６媒介性急性期応答を再現する。
【００９２】
遺伝子改変されたマウス
ヒトＩＬ−６および／またはヒト化ＩＬ−６受容体を内在性マウス遺伝子座から発現する遺伝子改変されたマウスであって、ここで内在性マウスＩＬ−６遺伝子および／または内在性マウスＩＬ−６受容体遺伝子が、ヒトＩＬ−６遺伝子および／またはヒトＩＬ−６受容体のエクトドメインをコードする配列を含むヒト配列で置き換えられている遺伝子改変されたマウスが提供される。遺伝子改変されたマウスは、マウスプロモーターおよび／またはマウス調節エレメントの制御下にあるヒトＩＬ−６および／またはヒト化ＩＬ−６受容体をヒト化内在性遺伝子座から発現する。内在性マウス遺伝子座での置き換え（複数可）は、当該技術分野で公知のＩＬ−６トランスジェニックマウスで観察される一連の実質的な病変をもたらさない様式で、ヒトＩＬ−６およびヒト化ＩＬ−６受容体を発現する非ヒト動物を提供する。
【００９３】
ヒトＩＬ−６を発現するトランスジェニックマウスは、当該技術分野で公知である。しかしながら、それらは一般に、それらの有用性を厳しく制限する重大な病変に悩まされる。本明細書に記載されるようなヒト化マウスは、内在性マウスＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒα遺伝子座における内在性マウス調節エレメントの制御下でヒトＩＬ−６および／またはヒト化ＩＬ−６受容体を発現する。一方で、これらのマウスは、当該技術分野で公知のトランスジェニックマウスとは異なるこれらの遺伝子に関する発現パターンを示す。
【００９４】
内在性非ヒト遺伝子座での、かつ内在性プロモーターおよび／または調節エレメントの制御下での相同ヒト遺伝子またはヒト配列またはオルソロガスヒト遺伝子またはヒト配列による非ヒト動物における非ヒト遺伝子の置き換えは、典型的なノックアウトプラス導入遺伝子動物とは実質的に異なり得る性質および特徴を有する非ヒト動物を生じ得る。典型的なノックアウトプラス導入遺伝子動物では、内在性遺伝子座は除去または損傷され、完全ヒト導入遺伝子は、動物のゲノムに挿入されて、おそらくそのゲノムへ無作為に組み込まれる。通常、組み込まれた導入遺伝子の位置は不明である。ヒトタンパク質の発現は、ヒト遺伝子の転写および／またはタンパク質アッセイおよび／または機能性アッセイにより測定される。ヒト配列の上流および／または下流にヒト導入遺伝子を含むことは、動物のゲノムにおいてその導入遺伝子がどこで終結する（wind  up）としても、導入遺伝子の発現および／または調節に適した支持を提供するのに十分であると明白に仮定される。しかし、多くの場合、ヒト調節エレメントを有する導入遺伝子は、非生理的であるか、または別の方法では不満足である様式で発現し、実際には動物に有害であり得る。対比して、本発明者らは、内在性調節エレメントの制御下で、内在性遺伝子座での、ヒト配列による置き換えが、ヒト化動物の生理機能の状況で、置き換えられた遺伝子に関する生理機能が有意義かつ適当である有用なヒト化動物を生じる生理的に適当な発現パターンおよびレベルを提供する。
【００９５】
６９５ｂｐのマウスＩＬ−６遺伝子の発現を駆動するＭＨＣクラスＩプロモーターＨ２およびβ−グロビンイントロンを有する構築物を注入したマウス受精卵は、比較的高いレベル（野生型マウスと比較した場合）でマウスＩＬ−６を構成的に発現するマウスを作製すると報告されている（Woodrofeら（１９９２年）  Long-Term  Consequences  of  Interleukin-6  Overexpression  in  Transgenic  Mice、DNA  and  Cell  Biology  １１巻（８号）：５８７〜５９２頁を参照）。しかし、これらのマウスは、腸、リンパ節および腎臓、ならびに脾性アミロイド沈着物と関連したリンパ腫を発症する傾向にある。それらはまた、異常Ｂ細胞成熟を示し（Woodrofeら、同上文献を参照）、その結果Ｂ細胞機能の研究が損なわれる。対比して、マウスＩＬ−６遺伝子座でのヒトＩＬ−６遺伝子によるマウスＩＬ−６遺伝子の置き換えを含む本明細書中に記載されるようなマウスは、これらのリンパ腫を発症する傾向になく、該マウスは、明白に正常Ｂ細胞集団を示す。
【００９６】
ＩｇＭエンハンサーとカップリングさせたｈＩＬ−６遺伝子を含有する６．６ｋｂ（ＢａｍＨＩ−Ｐｖｕ  ＩＩ断片）長のヒトＤＮＡの無作為挿入による、ｈＩＬ−６についてのトランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）が報告されている（Suematsuら（１９８９年）  IgG1  plasmocytosis  in  interleukin  6  transgenic  mice、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８６巻：７５４７〜７５５１頁を参照）。上記マウスは、血清中で８００ｐｇ／ｍＬ〜２０，０００ｐｇ／ｍＬでｈＩＬ−６を発現し、野生型マウスは通常、ほんの約１００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６を発現する。上記マウスは、年を取るにつれ、血清Ｉｇの増加（野生型マウスを１２０倍〜４００倍上回る）およびアルブミンの減少を示す。上記マウスは、非常に重い形質細胞増加症を患い、脾腫およびリンパ節拡大、ならびに骨髄中での形質細胞の提示および巨核球の増加を示す。検査すると、拡大したリンパ節であるようなものが、代わって緻密で異常な形質細胞の塊となったものである。脾臓および胸腺はともに、形質細胞の大量増殖を示し、これらがまた、肺、肝臓および腎臓の一部を浸潤する。これらのマウスにおける腎臓はまた、メサンギウム増殖性糸球体腎炎に特有なＩＬ−６刺激メサンギウム細胞増殖を示す。同様に、ゲノムに無作為に挿入されたマウスＨ−２Ｌｄプロモーターにより駆動されるトリムｈＩＬ−６  ｃＤＮＡについてのトランスジェニックマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）は、重篤な形質細胞増加症を示す（Suematsuら（１９９２年）  Generation  of  plasmacytomas  with  the  chromosomal  translocation  t(12;  15)  in  interleukin  6  transgenic  mice、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８９巻：２３２〜２３５頁を参照）。ｈＩＬ−６を過剰発現するＣ５７ＢＬ／６マウスは、移植可能な形質細胞腫を発症しない（それらは形質細胞増加症を示さない）が、ＢＡＬＢ／ｃマウスに戻し交配されたトランスジェニックＢＬ／６マウスは発症すると報告されている。
【００９７】
グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）遺伝子プロモーターにより駆動されるｈＩＬ−６  ｃＤＮＡの無作為遺伝子導入は、マウス中枢神経系でｈＩＬ−６過剰発現をもたらし、それがまた、重大な病変につながると報告されている（Campbellら（１９９３年）Neurologic  disease  induced  in  transgenic  mice  by  cerebral  overexpression  of  interleukin  6、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ９０巻：１００６１〜１００６５頁を参照）。これらのマウスは、広範な神経病変および反応性星状細胞増加症を示し、それは明らかにＣＮＳ許容性転写遺伝子座での、ＩＬ−６導入遺伝子の無作為組込みの結果としての制御の喪失に起因するＣＮＳにおけるＩＬ−６発現により生じる。マウス受精卵（Ｆ１  Ｃ５７ＢＬ／６×ＢＡＬＢ／ｃ）に微量注入した、β−グロビン  ３’−ＵＴＲに連結し、かつニューロン特異的エノラーゼプロモーターにより駆動されるｈＩＬ−６  ｃＤＮＡの発現により、正常な寿命を有し、かつ明白な神経学的欠陥を伴わずに、ニューロンではｈＩＬ−６を発現したが、他の場所では発現しないマウスを作製した（Fattorら（１９９４年）  IL-6  Expression  in  Neurons  of  Transgenic  Mice  Causes  Reactive  Astrocytosis  and  Increase  in  Ramified  Microglial  Cells  But  No  Neuronal  Damage、Eur.  J.  Neuroscience  ７巻：２４４１〜２４４９頁を参照）が、該マウスは、脳全体にわたるプロセスの増加を伴って高レベル（野生型よりも２０〜３０倍高い）の活性化および拡大した星状細胞、ならびに白質における分岐型ミクログリア細胞の１０〜１５倍の増加を示した。したがって、ＩＬ−６の脳発現は、反応性星状細胞増加症から、明らかでかつ深刻な神経病変に及ぶ状態につながると報告されている。
【００９８】
β−グロビン  ３’−ＵＴＲおよびマウスＭＴ−１プロモーターに連結した６３９ｂｐのｈＩＬ−６  ｃＤＮＡのＣ５７ＢＬ／６×「ＤＢＡＩＩ」マウスのＦ１交配の受精卵への微量注入により、ｈＩＬ−６遺伝子が無作為に組み込まれたトランスジェニックマウスが作製されて、若年で腎不全で死亡する脆弱なかつ病的なマウスを作製したと報告されている（Fattoriら（１９９４年）  Blood,  Development  of  Progressive  Kidney  Damage  and  Myeloma  Kidney  in  Interleukin-6  Transgenic  Mice、Blood  ６３巻（９号）：２５７０〜２５７９頁を参照）。トランスジェニックマウスは、１２〜２０週で止息し、血漿中のα１グロブリンおよびβグロブリンのレベルの上昇、高ガンマグロブリン血症、脾臓（野生型よりも３倍高い）および骨髄における巨核球の上昇、異常かつ緻密に配置された形質細胞様細胞を特徴とするリンパ器官（脾臓、胸腺およびリンパ節）の形質細胞増加症、および多発性骨髄腫と類似して糸球体硬化症につながる糸球体腎炎を示した。
【００９９】
Ｈ−２Ｌｄ駆動ｈＩＬ−６  ｃＤＮＡのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの受精卵への微量注入は、体重をマッチさせた対照と比較した場合にトランスジェニックマウスにおいて有意に低い腓腹筋重量を幾分特徴とする、マウスにおけるＩＬ−６依存的筋肉消耗を引き起こし、差異は、ＩＬ−６アンタゴニストによる処置により改善されたことであった（Tsujinakaら（１９９６年）  Interleukin  6  Receptor  Antibody  Inhibits  Muscle  Atrophy  and  Modulates  Proteolytic  Systems  in  Interleukin  6  Transgenic  Mice、J.  Clin.  Invest.  ９７巻（１号）：２４４〜２４９頁を参照）。１２週で、これらのマウスは、６００，０００ｐｇ／ｍＬを超える血清ｈＩＬ−６レベルを示した。トランスジェニックマウスはまた、約８６２ｍｇであった対照肝臓と比較した場合に、約１，２４２ｍｇの重さがある肝臓を有した。ＩＬ−６アンタゴニストで処置したトランスジェニックマウスは、約８８８ｍｇの重さがある肝臓を有した。筋肉カテプシンＢおよびＢ＋Ｌは、対照よりもトランスジェニックマウスにおいて有意に高く（２０倍および６．２倍）、ＩＬ−６アンタゴニストで処置したトランスジェニックマウスにおいて除かれた現象である。カテプシンＢおよびＬ  ｍＲＮＡは、野生型マウスと比較した場合に、それぞれ約２７７％および２５７％であると推定され、その違いは、ＩＬ−６アンタゴニスト処置により有意に低減された。
【０１００】
マウスＭＨＣクラスＩ  Ｈ−２Ｌｄプロモーターにより駆動されるｈＩＬ−６ミニ遺伝子、およびニワトリβ−アクチンプロモーターにより駆動されるｈＩＬ−６Ｒミニ遺伝子、およびｇｐ１３０遺伝子を含むマウスは、ｈＩＬ−６トランスジェニックマウスに特有の病変（例えば、高ガンマグロブリン血症、脾腫、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、肺リンパ様浸潤）ならびに心室拡大を示した（Hirotaら（１９９５年）  Continuous  activation  of  gp130,  a  signal-transducing  receptor  component  for  interleukin  6-related  cytokines,  causes  myocardial  hypertrophy  in  mice、Proc.  Natl  Acad.  Sci.  USA  ９２巻：４８６２〜４８６６頁）。心室拡大は、ｇｐ１３０の連続的な活性化により媒介されると考えられる（同上文献）。ＩＬ−６の役割は、サイトカイン受容体複合体を強化するのを助長して、ＩＬ−６シグナルを伝達することに関与するシグナル伝達構成要素であるｇｐ１３０の二量体化を誘導すると報告されている（Paonessaら（１９９５年）  Two  distinct  and  independent  sites  on  IL-6  trigger  gp130  dimer  formation  and  signalling、EMBO  J.  １４巻（９号）：１９４２〜１９５１頁）。活性化複合体は、２：２：２の化学量論を示す２つのＩＬ−６（各ＩＬが、１つのＩＬ−６Ｒαに結合する）および２つのｇｐ１３０（各ＩＬ−６が、２つの独立したｇｐ１３０結合部位を含有する）で構成される六量体であると考えられ、ここで、サイトカイン受容体複合体形成の一般のモデルと一致して（Stahl,  N.およびYancopoulos,  G.（１９９３年）  The  Alphas,  Betas,  and  Kinases  of  Cytokine  Receptor  Complexes、Cell  ７４巻：５８７〜５９０頁、Davisら（１９９３年）  LIFRβ  and  gp130  as  Heterodimerizing  Signal  Transducers  of  the  Tripartite  CNTF  Receptor、Science  ２６０巻：１８０５〜１８０８頁、Murakamiら（１９９３年）  IL-6-Induced  Homodimerization  of  gp130  and  Associated  Activation  of  a  Tyrosine  Kinase、Science  ２６０巻：１８０８〜１８１０頁を参照）、ｇｐ１３０の二量体化が、ＪＡＫ−Ｔｙｋチロシンキナーゼの活性化、ｇｐ１３０およびＳＴＡＴファミリー転写因子および他の細胞内基質のリン酸化を引き起こす（同上文献、Stahl,  N.（１９９４年）  Association  and  Activation  of  Jak-Tyk  Kinases  by  CNTF-LIF-OSM-IL-6β  Receptor  Components、Science  ２６３巻：９２〜９５頁）。
【０１０１】
ラットＰＥＰカルボキシキナーゼプロモーターにより駆動されるヒトｓＩＬ−６Ｒおよびマウスメタロチオネイン−１プロモーターにより駆動されるヒトＩＬ−６についてのトランスジェニックマウスは、ヒトＩＬ−６単独またはヒトｓＩＬ−６Ｒ単独についてのトランスジェニックマウスよりも顕著に小さいと報告されており（Petersら（１９９７年）  Extramedullary  Expansion  of  Hematopoietic  Progenitor  Cells  in  Interleukin  (IL-)-6-sIL-6R  Double  Transgenic  Mice、J.  Exp.  Med.  １８５巻（４号）：７５５〜７６６頁）、体脂肪の減少および体重の減少（２０〜２５ｇ対４０ｇ）に反映された。二重トランスジェニックマウスはまた、脾臓（spleena）および肝臓（しかし、骨髄ではない）の造血細胞の髄外増殖、ならびに脾臓における巨核球の上昇および全ての実質器官における形質細胞浸潤に明白に起因して、単一トランスジェニックマウスに関して報告されている正常臓器の重さと比較して、脾臓（５倍）および肝臓（２倍）の腫大を示すと報告されている（同上文献）。二重トランスジェニック（double  transgenics）はまた、単一トランスジェニックと比較して、顆粒球、マクロファージ、前駆細胞およびＢ細胞において約２００〜約３００倍の増加を伴う肝臓を示し、対比して、ＩＬ−６単一トランスジェニックマウスは、マクロファージ（１５倍）およびＢ細胞（４５倍）のより少ない増加を示した（同上文献）。極端な所見は、ｇｐ１３０シグナル伝達を活性化することにより、造血前駆細胞の成長および分化の刺激におそらく起因する（同上文献）。
【０１０２】
さらに、二重トランスジェニック（マウスメタロチオニンプロモーター駆動ｈＩＬ−６／ラットＰＥＰカルボキシキナーゼプロモーター駆動ｈＩＬ−６Ｒ）マウスは、ＩＬ−６が肝細胞増殖および病原性肝細胞形質転換の両方に関与するということを強力に示唆する持続性肝細胞増殖を伴って、ヒト結節性再生性過形成に一致すると報告される肝細胞過形成を示す（Maioneら（１９９８年）  Coexrpession  of  IL-6  and  soluble  IL-6R  causes  nodular  regenerative  hyperplasia  and  adenomas  of  the  liver、EMBO  J.  １７巻（１９号）５５８８〜５５９７頁）。肝細胞過形成が単一トランスジェニックｈＩＬ−６マウスでは観察されないと報告されており、ｈＩＬ−６はｍＩＬ−６Ｒを結合することができるので、二重トランスジェニック（ｄｏｕｂｌｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）が、可溶性ＩＬ−６Ｒ（本明細書では、可溶性ｈＩＬ−６Ｒ）に複合体形成するより高レベルのｈＩＬ−６（その複合体は、ＩＬ−６単独よりも強力な阻害剤である）をもたらし得るとみなされるまで、その所見は逆説的であるようであり得る（同上文献）。
【０１０３】
ヒトＩＬ−６に対してトランスジェニックであるマウスに対比して、内在性マウスＩＬ−６遺伝子座での置き換えを含むヒト化ＩＬ−６マウス（これは、マウス調節エレメントを保持するが、ＩＬ−６をコードする配列のヒト化を含む）は、従来技術のマウスの重篤な病変を示さない。ｈＩＬ−６に関してヘテロ接合性またはホモ接合性である遺伝子改変されたマウスは、全体として正常であった。
【０１０４】
実施例で記載されるようなヒト化ＩＬ−６遺伝子（ＭＡＩＤ７６０）を有するマウスは免疫表現型判定され、汎Ｂ細胞マーカー（ＣＤ４４５Ｒ（Ｂ２２０））を使用した脾性Ｂ細胞のＦＡＣＳ分析（リンパ球でゲートした）において正常なＢ細胞数を有することが分かった（図４）。脾臓に関して、野生型マウスは、Ｂ細胞６３％を示し、ｈＩＬ−６ヘテロ接合体マウスは、Ｂ細胞６３％を示し、内在性マウス遺伝子座でｈＩＬ−６に関してホモ接合性であるマウスは、Ｂ細胞６３％を示した。ＴＮＰ−ＫＬＨで免疫したホモ接合性ｈＩＬ−６マウスに関するＢ細胞数もまた、正常であった（野生型に関して６５％、およびｈＩＬ−６ホモ接合体に関して６１％）。
【０１０５】
脾性Ｔ細胞もまた、野生型とほぼ同じであった（図５）。Ｔヘルパー／Ｔ細胞傷害性に関する脾性Ｔ細胞の百分率は、野生型に関して２０％／４０％（１．４：１の比）、ｈＩＬ−６ヘテロ接合体に関して２３％／１４％（１．６：１の比）、ｈＩＬ−６ホモ接合体に関して２１％／１５％（１．４：１の比）であった（マーカーは、ＣＤ８ａ−ＡＰＣ、ＣＤ４−ＦＩＴＣであった）。ＴＮＰ−ＫＬＨで免疫したホモ接合性ｈＩＬ−６マウスは、野生型マウスに対して類似の脾性Ｔ細胞数を示した。即ち、野生型に関する２１％／１９％（１．１：１の比）と比較した場合、Ｔヘルパー／Ｔ細胞傷害性は２２％／２０％（同様に１．１：１の比）であった。
【０１０６】
ヒト化ＩＬ−６マウスはまた、ＦＡＣＳ分析（ＣＤ１１ｂおよびＤＸ５）に関してほぼ正常レベルの脾性ＮＫ細胞を示した（図７）。ｈＩＬ−６ヘテロ接合体は、ＮＫ細胞２．２％を示し、ｈＩＬ−６ホモ接合体は、ＮＫ細胞１．８％を示したのに対して、野生型マウスは、ＮＫ細胞２．４％を示した。ＴＮＰ−ＫＬＨによる免疫に続いて、ホモ接合体は、脾性ＮＫ細胞１．６％を示したのに対して、野生型マウスは、脾性ＮＫ細胞２．１％を示した。
【０１０７】
ヒト化ＩＬ−６マウスはまた、脾性Ｌｙ６Ｇ／Ｃ（Ｇｒ１）細胞の正常レベルを示した（図６）。ｈＩＬ−６ヘテロ接合体は、ＧＲ１＋細胞７．０％（Ｇｒ１ｈｉ  １．３％）を示し、ホモ接合体は、Ｇｒ１＋細胞６．８％（Ｇｒ１ｈｉ  ０．９％）を示したのに対して、野生型マウスは、Ｇｒ１＋細胞８．０％（Ｇｒ１ｈｉ  １．８％）を示した。免疫したＩＬ−６ホモ接合体（ＴＮＰ−ＫＬＨで免疫した）は、Ｇｒ１＋細胞１１％（Ｇｒ１ｈｉ  ４．０％）を示したのに対して、野生型マウスは、Ｇｒ１＋細胞１０％（Ｇｒ１ｈｉ  ３．０％）を示した。
【０１０８】
ヒト化ＩＬ−６マウスはまた、ＦＡＣＳ分析において正常な血液Ｂ細胞数およびＴ細胞数を示した（図８および図９）。汎Ｂ細胞マーカー（ＣＤ４４５Ｒ（Ｂ２２０））によるＦＡＣｓにより、ホモ接合性ｈＩＬ−６マウスは、野生型５３％と比較してＢ細胞５２％を示した。ヘテロ接合体は３８％を示した（２つの別の染色２９％および４７％の平均）。ＴＮＰ−ＫＬＨで免疫したホモ接合性ｈＩＬ−６マウスは、類似のＢ細胞数を与えた（野生型マウスに関する４５％と比較して、４３％）。
【０１０９】
ヒト化ＩＬ−６マウスは、ＣＤ８ａおよびＣＤ４染色により測定される場合にＦＡＣＳ分析において正常血液Ｔ細胞数を示した。ヘテロ接合性ｈＩＬ−６マウスは、Ｔヘルパー／Ｔ細胞傷害性数３９％／２６％（１．５：１の比）を示し、ホモ接合性ｈＩＬ−６マウスは、Ｔｈ／Ｔｃ数２４％／２０％（１．２：１の比）を示したのに対して、野生型マウスは、Ｔｈ／Ｔｃ数２６％／２０％（１．３：１の比）を示した。ＴＮＰ−ＫＬＨで免疫したホモ接合性ｈＩＬ−６マウスは、Ｔｈ／Ｔｃ数２９％／２１％（１．４：１の比）を有したのに対して、野生型の免疫マウスは、Ｔｈ／Ｔｃ数２８％／２３％（１．２：１）を有した。
【０１１０】
ヒト化ＩＬ−６マウスはまた、Ｌｙ６Ｇ／Ｃ（Ｇｒ１）およびＣＤ１１ｂ、ならびにＣＤ１１ｂおよびＤＸ５で染色したナイーブマウスおよび免疫マウス血液のＦＡＣＳ分析により測定される場合に、野生型マウスに類似した血中の骨髄性細胞数を示した（図１０、図１１、および図１２）。ヘテロ接合性ｈＩＬ−６マウスは、Ｇｒ＋細胞  １０．８％を示し、ホモ接合体が６．９％を示したのに対して、野生型マウスは、９．７％を示した。免疫したｈＩＬ−６ホモ接合体は、Ｍ１（１０１〜１０４のＬｙ６Ｇ／Ｃ（Ｇｒ））／Ｍ２（約１０２〜１０３のＬｙ６Ｇ／Ｃ（Ｇｒ）染色）数４３％／３４％を示したのに対して、野生型マウスは、４５％／３８％の数を有した。免疫したホモ接合性ｈＩＬ−６マウスに関するＣＤ１１ｂ（垂直軸）対Ｌｙ６Ｇ／Ｃ（水平軸）のＦＡＣＳプロットは、四つの区画（左上／右上／右下）における細胞パーセント１６％／８％／３％を示し、それらは免疫した野生型の四つの区画における数と一致した。
【０１１１】
ホモ接合性ＴＮＰ−ＫＬＨ−免疫ヒト化ＩＬ−６マウスは、免疫した野生型マウスに類似したＣＤ１１ｂ対ＤＸ５（ＮＫ）染色ＦＡＣＳプロットを示した。クアドラント分析血液ＦＡＣＳプロット（ＣＤ１１ｂ垂直軸、ＤＸ５（ＮＫ）水平軸）により、ｈＩＬ−６ホモ接合体に関して左上／右上／右下の数９．５％／１７％／１０％、および野生型マウスに関して６．５％／１７．３％／１４％が明らかとなった。
【０１１２】
ヒト化ＩＬ−６マウスは、野生型マウスで観察されるのと本質的に同じであるアイソタイプ応答を示した。初期および最終ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＭレベルは、野生型マウスで観察されるのとほぼ同じであった。１つの実験では、最終ＩｇＭは、ヒト化マウスでわずかに高く、最終ＩｇＧ３はまた、ヒト化マウスで上昇した。
【０１１３】
骨髄ＩｇＭ／ＣＤ２４／Ｂ２２０染色によるＦＡＣＳ分析に基づいた、ナイーブｈＩＬ−６マウスにおけるＢ細胞の発達は、野生型マウスにおける発達と本質的に区別できなかった（図１３）。免疫マウスの免疫表現型判定により、Ｂ細胞発達の進行における各種細胞型に関するマーカー集団はｈＩＬ−６マウスにおいて本質的に正常であることが明らかとなった。造血幹細胞、共通のリンパ系前駆体、プロＢ細胞、プレＢ細胞ならびに未熟および成熟Ｂ細胞からの細胞の進行は、ｈＩＬ−６マウスでは正常である（図１４および図１５）。
【実施例】
【０１１４】
（実施例１）ｈＩＬ−６遺伝子による内在性マウスＩＬ−６遺伝子の置き換え
ヒトＩＬ−６遺伝子のエクソン１〜エクソン４を含有する４．８ｋｂのヒトＩＬ−６遺伝子で、６．８ｋｂのネズミＩＬ−６遺伝子座を置き換えた。
【０１１５】
単一標的化工程においてヒトＩＬ−６遺伝子でマウスを置き換えるための標的化構築物は、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術を使用して構築した（Valenzuelaら（２００３年）  High-throughput  engineering  of  the  mouse  genome  coupled  with  high-resolution  expression  analysis、Nature  Biotech、２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照）。マウスおよびヒトのＩＬ−６  ＤＮＡは、それぞれ細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＲＰＣＩ−２３クローン３６８Ｃ３、およびＢＡＣ  ＣＴＤクローン２３６９Ｍ２３から得た。簡潔に述べると、エクソン１におけるＡＴＧから３’下流配列の１６ヌクレオチドを含むエクソン５まで伸長している４．８ｋｂのヒトＩＬ−６配列に隣接する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）上流および下流のマウスＩＬ−６ホモロジーアーム（ゲノム座標：ＮＣＢＩｈ  ３７．１：ｃｈ７：２２，７６６，８８２号〜２２，７７１，６３７号）およびｌｏｘＰが隣接した（floxed）ｎｅｏ選択カセットを含有して、ｇａｐ修復クローニングにより生成したＮｏｔＩ線状化標的化構築物をＦ１Ｈ４マウス胚性幹（ＥＳ）細胞（Ｃ５７ＢＬ／６×１２９  Ｆ１ハイブリッド）に電気穿孔した。正確に標的としたＥＳ細胞（ＭＡＩＤ７９０）を一過性Ｃｒｅ発現ベクターでさらに電気穿孔して、薬物選択カセットを除去した。薬物カセットのない、標的としたＥＳ細胞クローン（ＭＡＩＤ１４２８）を、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法により８−細胞段階マウス胚に導入した（米国特許第７，２９４，７５４号、同第７，５７６，２５９号、同第７，６５９，４４２号、およびPoueymirouら（２００７年）  F0  generation  mice  that  are  essentially  fully  derived  from  the  donor  gene-targeted  ES  cells  allowing  immediate  phenotypic  analyses  Nature  Biotech.  ２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照）。ヒト化ＩＬ−６遺伝子を保有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）は、対立遺伝子アッセイの変法を使用したマウス対立遺伝子の喪失およびヒト対立遺伝子の獲得に関する遺伝子型判定により同定された（Valenzuelaら（２００３年）を参照）。
【０１１６】
正確に標的としたＥＳ細胞クローンは、天然遺伝子座の喪失（ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｎａｔｉｖｅ  ａｌｌｅｌｅ）（ＬＯＮＡ）アッセイ（Valenzuelaら  ２００３年）により同定され、ここでは天然の非修飾Ｉｌ６遺伝子のコピー数は、欠失に関して標的としたマウスＩｌ６遺伝子における配列に特異的な２つのＴａｑＭａｎ（商標）定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）により決定した。ｑＰＣＲアッセイは、下記プライマープローブセットを含んでいた（５’から３’を記した）：上流フォワードプライマー、ＴＴＧＣＣＧＧＴＴＴ  ＴＣＣＣＴＴＴＴＣＴ  Ｃ（配列番号１）、上流リバースプライマー、ＡＧＧＧＡＡＧＧＣＣ  ＧＴＧＧＴＴＧＴＣ（配列番号２）、上流プローブ、ＦＡＭ−ＣＣＡＧＣＡＴＣＡＧ  ＴＣＣＣＡＡＧＡＡＧ  ＧＣＡＡＣＴ−ＢＨＱ（配列番号３）、下流フォワードプライマー、ＴＣＡＧＡＧＴＧＴＧ  ＧＧＣＧＡＡＣＡＡＡ  Ｇ（配列番号４）、下流リバースプライマー、ＧＴＧＧＣＡＡＡＡＧ  ＣＡＧＣＣＴＴＡＧＣ（配列番号５）、下流プローブ、ＦＡＭ−ＴＣＡＴＴＣＣＡＧＧ  ＣＣＣＴＴＣＴＴＡＴ  ＴＧＣＡＴＣＴＧ−ＢＨＱ（配列番号６）。ここで、ＦＡＭは、５−カルボキシフルオレセイン蛍光プローブを指し、ＢＨＱは、ブラックホールクエンチャー型の蛍光クエンチャーを指す（Biosearch  Technologies）。標的化ベクターを取り込み、ゲノムに組み込まれたＥＳ細胞クローンから精製したＤＮＡを、製造業者の提案に従って３８４ウェルＰＣＲプレート（ＭｉｃｒｏＡｍｐ（商標）光学３８４ウェル反応プレート、Life  Technologies）においてＴａｑＭａｎ（商標）遺伝子発現マスターミックス（Life  Technologies）と組み合わせて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ中で反復して（ｃｙｃｌｅｄ）、これによりＰＣＲの過程で蛍光データを収集して、域値サイクル（Ｃｔ）（集積した蛍光が予め設定した域値に達する分別ＰＣＲサイクル（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ＰＣＲ  ｃｙｃｌｅ））を決定する。上流および下流のＩｌ６特異的ｑＰＣＲおよび標的化されていない参照遺伝子に関する２つのｑＰＣＲを各ＤＮＡサンプルに関して実行した。各Ｉｌ６特異的ｑＰＣＲと各参照遺伝子ｑＰＣＲとの間のＣｔ値の差（ΔＣｔ）を算出して、続いて各ΔＣｔとアッセイしたサンプル全てに関する中央値ΔＣｔとの間の差を算出して、各サンプルに関してΔΔＣｔ値を得た。各サンプルにおけるＩｌ６遺伝子のコピー数を下記式から算出した：コピー数＝２・２−ΔΔＣｔ。ネイティブコピーの１つを喪失した正確に標的としたクローンは、１に等しいＩｌ６遺伝子コピー数を有する。ヒトＩＬ６遺伝子配列が、ヒト化対立遺伝子において欠失マウスＩｌ６遺伝子配列を置き換えたことの確認は、下記プライマー−プローブセット（５’から３’を記した）：ヒトフォワードプライマー、ＣＣＣＣＡＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＡＴＴＴＧ（配列番号７）、ヒトリバースプライマー、ＧＴＴＣＡＡＣＣＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＡＧ（配列番号８）およびヒトプローブ、ＦＡＭ−ＡＧＣＴＡＣＡＡＣＴＣＡＴＴＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＣＡＡ−ＢＨＱ（配列番号９）を含むＴａｑＭａｎ（商標）ｑＰＣＲアッセイにより確認された。
【０１１７】
同じＬＯＮＡアッセイを使用して、標的としたＥＳ細胞に由来するマウスに関する尾部生検標本（biopsy）から精製したＤＮＡをアッセイして、それらのＩｌ６遺伝子型を決定して、ヒト化Ｉｌ６対立遺伝子が生殖系列を通じて伝達されたことを確認した。置き換えに関してヘテロ接合性の２つの仔を交配して、ヒトＩＬ−６遺伝子による内在性マウスＩＬ−６遺伝子の置き換えに関してホモ接合性であるマウスを作製した。置き換えに関してホモ接合性である仔は表現型判定に使用される。
【０１１８】
マウス遺伝子座の上流接合部およびｈＩＬ−６遺伝子を含有する配列は、５’−ＡＡＴＴＡＧＡＧＡＧ  ＴＴＧＡＣＴＣＣＴＡ  ＡＴＡＡＡＴＡＴＧＡ  ＧＡＣＴＧＧＧＧＡＴ  ＧＴＣＴＧＴＡＧＣＴ  ＣＡＴＴＣＴＧＣＴＣ  ＴＧＧＡＧＣＣＣＡＣ  ＣＡＡＧＡＡＣＧＡＴ  ＡＧＴＣＡＡＴＴＣＣ  ＡＧＡＡＡＣＣＧＣＴ  ＡＴＧＡＡＣＴＣＣＴ  ＴＣＴＣＣＡＣＡＡＧ  ＴＡＡＧＴＧＣＡＧＧ  ＡＡＡＴＣＣＴＴＡＧ  ＣＣＣＴＧＧＡＡＣＴ  ＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧ  ＧＴＣＧＡＧＣＣＣＴ  ＧＴＧＴＧＡＧＧＧＡ  ＧＧＧＧＴＧＴＧＴＧ  ＧＣＣＣＡＧＧ（配列番号１０）内に存在するように設計され、ここでヒト遺伝子の最初のヌクレオチドの前の最後のマウスヌクレオチドは、ＣＣＧＣＴ中の「Ｔ」であり、ヒト配列の最初のヌクレオチドは、ＡＴＧＡＡ中の最初の「Ａ」である。ｈＩＬ−６遺伝子およびマウス遺伝子座を含有する配列の下流接合部は、５’−ＴＴＴＴＡＡＡＧＡＡ  ＡＴＡＴＴＴＡＴＡＴ  ＴＧＴＡＴＴＴＡＴＡ  ＴＡＡＴＧＴＡＴＡＡ  ＡＴＧＧＴＴＴＴＴＡ  ＴＡＣＣＡＡＴＡＡＡ  ＴＧＧＣＡＴＴＴＴＡ  ＡＡＡＡＡＴＴＣＡＧ  ＣＡＡＣＴＴＴＧＡＧ  ＴＧＴＧＴＣＡＣＧＣ  ＴＣＣＣＧＧＧＣＴＣ  ＧＡＴＡＡＣＴＡＴＡ  ＡＣＧＧＴＣＣＴＡＡ  ＧＧＴＡＧＣＧＡＣＴ  ＣＧＡＧＡＴＡＡＣＴ  Ｔ−３’（配列番号１１）内に存在するように設計され、ここで、ヒト配列の最後のヌクレオチドは、ＴＣＡＣＧ中の最後の「Ｇ」であり、マウス配列の最初のヌクレオチドは、ＣＴＣＣＣ中の最初の「Ｃ」であり、下流接合部領域はまた、ｌｏｘＰが隣接したユビキチンプロモーター駆動ｎｅｏカセットの除去用に３’末端にｌｏｘＰ部位を含有していた（その開始が示される）。マウスＩＬ−６遺伝子座とのｎｅｏカセットの接合部は、５’−ＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴ  ＴＡＴＣＣＴＡＧＧＴ  ＴＧＧＡＧＣＴＣＣＴ  ＡＡＧＴＴＡＣＡＴＣ  ＣＡＡＡＣＡＴＣＣＴ  ＣＣＣＣＣＡＡＡＴＣ  ＡＡＴＡＡＴＴＡＡＧ  ＣＡＣＴＴＴＴＴＡＴ  ＧＡＣＡＴＧＴＡＡＡ  ＧＴＴＡＡＡＴＡＡＧ  ＡＡＧＴＧＡＡＡＧＣ  ＴＧＣＡＧＡＴＧＧＴ  ＧＡＧＴＧＡＧＡ（配列番号１２）内に存在するように設計され、ここでＡＧＣＴＣ中の最後の「Ｃ」がｎｅｏカセットの最後のヌクレオチドであり、該カセットに続くマウスゲノムの最初のヌクレオチドは、ＣＴＡＡＧの最初の「Ｃ」である。
【０１１９】
（実施例２）ナイーブおよび免疫したｈＩＬ−６マウスの免疫表現型判定：Ｂ細胞
ｈＩＬ−６遺伝子の置き換えに関してホモ接合性のマウスをＢ細胞（ＤＣ４４５Ｒ（Ｂ２２０））に関して分析した。ナイーブおよび免疫（ＴＮＰ−ＫＬＨ）ｈＩＬ−６マウスの脾性細胞調製物由来のリンパ球でゲートした画分を染色して、フローサイトメトリーを使用して免疫表現型判定をした。ＦＡＣＳ分析により、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）−ＦＩＴＣ染色により測定される場合の脾性細胞調製物のＢ細胞の百分率がナイーブ野生型、ｈＩＬ−６ヘテロ接合体およびｈＩＬ−６ホモ接合体からの調製物に関してほぼ同じである（細胞の６３％）ことが示された。免疫したマウスに関して、Ｂ細胞は、野生型マウスでは脾臓細胞調製物の総細胞の約６５％を占めており、ｈＩＬ−６ホモ接合体では総細胞の約６１％を占めていた。ｈＩＬ−６マウス（ナイーブおよび免疫の両方）の脾臓は、野生型マウスにおける脾性Ｂ細胞集団とほぼ同じサイズであるＢ細胞の集団を含有する。
【０１２０】
野生型、ｈＩＬ−６ヘテロ接合体およびｈＩＬ−６ホモ接合体の骨髄をＢ細胞マーカー（ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）−ＡＰＣ、ＣＤ２４（ＨＳＡ）−ＰＥ、あるいは色素および／またはＩｇＭ（ＩｇＭ−ＦＩＴＣ）にコンジュゲートしたＣＤ４３で染色した。正常マウスの骨髄中のＢ細胞発達は、幹細胞から初期プロ（ｐｒｏ）−Ｂへ後期プロ−Ｂ細胞へ、大プレ（ｐｒｅ）−Ｂ細胞へ小プレ−Ｂ細胞へ未熟Ｂ細胞へ、最終的には成熟Ｂ細胞へと細胞が進行するにつれての、表面マーカーに反映される。共通のリンパ球前駆体であるプロ−Ｂ細胞は、ＣＤ４５Ｒを発現して、後の段階で、ＩｇＭを未熟Ｂ細胞として、後に成熟Ｂ細胞として発現する。したがって、ＣＤ４５Ｒ染色したＢ細胞および抗ＩｇＭ染色したＢ細胞は、Ｂ細胞発達に特徴的なパターンを示すはずである。ｈＩＬ−６ヘテロ接合体およびホモ接合体の骨髄は、野生型骨髄と本質的に区別できないＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）−ＡＰＣおよび抗ＩｇＭ−ＦＩＴＣ染色のパターンを呈しており、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）およびＩｇＭ、またはＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）単独で陽性に染色されたＢ細胞の集団を示した。ＦＡＣＳ染色により明らかとされるｈＩＬ−６マウスの骨髄中のＢ細胞亜集団は、野生型マウス由来のものと類似していた（表１、同様に図１３も参照）。
【０１２１】
【表１】
2014532416.tif 000002
【０１２２】
ＣＤ２４に対する染色（図１４を参照）により、表２で示される（正常）パターンが明らかとなり、骨髄中の正常な発達を示した。
【表２】
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【０１２３】
ＣＤ４３に対する染色（図１５を参照）により、表３で示される（正常）パターンが明らかとなり、骨髄中の正常な発達を示した。
【表３】
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【０１２４】
したがって、ナイーブｈＩＬ−６マウスの免疫表現型判定は、かかるマウスにおけるＢ細胞発達が本質的に正常であることを明らかにした。
【０１２５】
（実施例３）ｈＩＬ−６αエクトドメイン遺伝子配列による内在性マウスＩＬ−６Ｒαエクトドメイン遺伝子配列の置き換え
ヒトＩＬ−６Ｒα遺伝子のエクソン１〜エクソン８を含有する４５ｋｂのヒトＩＬ−６Ｒα遺伝子で、３５．４ｋｂのマウスＩＬ−６α遺伝子の遺伝子座を置き換えた。マウスエクソン９およびエクソン１０は保持され、エクソン１〜エクソン８のみがヒト化された。総計して、３５，３８４ｎｔのマウス配列が４５，０４７ｎｔのヒト配列で置き換えられた。
【０１２６】
単一標的化工程においてヒトＩＬ−６Ｒα遺伝子でマウスを置き換えるための標的化構築物は、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術を使用して構築した（Valenzuelaら（２００３年）  High-throughput  engineering  of  the  mouse  genome  coupled  with  high-resolution  expression  analysis、Nature  Biotech、２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照）。マウスおよびヒトのＩＬ−６Ｒα  ＤＮＡは、それぞれ細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＲＰＣＩ−２３クローン１２５Ｊ８、およびＢＡＣ  ＣＴＤクローン２１９２Ｊ２３から得た。簡潔に述べると、エクソン１におけるＡＴＧから３’下流配列の６９ヌクレオチドを有するエクソン８まで伸長している４５ｋｂのヒトＩＬ−６Ｒα配列に隣接する、上流および下流のマウスＩＬ−６ＲαホモロジーアームおよびｌｏｘＰが隣接したｎｅｏ選択カセットを含有して、ｇａｐ修復クローニングにより生成するＮｏｔＩ線状化標的化構築物をＦ１Ｈ４マウス胚性幹（ＥＳ）細胞（Ｃ５７ＢＬ／６×１２９  Ｆ１ハイブリッド）に電気穿孔した。正確に標的としたＥＳ細胞（ＭＡＩＤ７９４）を一過性Ｃｒｅ発現ベクターでさらに電気穿孔して、薬物選択カセットを除去した。薬物カセットのない、標的としたＥＳ細胞クローン（ＭＡＩＤ１４４２）を、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法により８−細胞段階マウス胚に導入した（米国特許第７，２９４，７５４号、同第７，５７６，２５９号、同第７，６５９，４４２号、およびPoueymirouら（２００７年）  F0  generation  mice  that  are  essentially  fully  derived  from  the  donor  gene-targeted  ES  cells  allowing  immediate  phenotypic  analyses  Nature  Biotech.  ２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照）。ヒト化ＩＬ−６Ｒα遺伝子を保有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）は、対立遺伝子アッセイの変法を使用したマウス対立遺伝子の喪失およびヒト対立遺伝子の獲得に関する遺伝子型判定により同定された（Valenzuelaら（２００３年）を参照）。
【０１２７】
正確に標的としたＥＳ細胞クローンは、天然遺伝子座の喪失（ＬＯＮＡ）アッセイ（Valenzuelaら（２００３年））により同定され、ここでは天然の非修飾Ｉｌ６遺伝子のコピー数は、欠失に関して標的としたマウスＩｌ６遺伝子における配列に特異的な２つのＴａｑＭａｎ（商標）定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）により決定した。ｑＰＣＲアッセイは、下記プライマー−プローブセットを含んでいた（５’から３’を記した）：上流フォワードプライマー、ＧＣＣＣＴＡＧＣＡＴ  ＧＣＡＧＡＡＴＧＣ（配列番号１３）、上流リバースプライマー、ＡＡＧＡＧＧＴＣＣＣ  ＡＣＡＴＣＣＴＴＴＧ  Ｃ（配列番号１４）、上流プローブ、ＣＣＣＡＣＡＴＣＣＡ  ＴＣＣＣＡＡＴＣＣＴ  ＧＴＧＡＧ（配列番号１５）、下流フォワードプライマー、ＧＡＧＣＴＴＧＣＣＣ  ＣＣＡＧＡＡＡＧＧ（配列番号１６）、下流リバースプライマー、ＣＧＧＣＣＡＣＡＴＣ  ＴＣＴＧＧＡＡＧＡＣ（配列番号１７）、下流プローブ、ＣＡＴＧＣＡＣＴＧＣ  ＣＣＣＡＡＧＴＣＴＧ  ＧＴＴＴＣＡＧＴ（配列番号１８）。標的化ベクターを取り込み、ゲノムに組み込まれた、ＥＳ細胞クローンから精製したＤＮＡを、製造業者の提案に従って３８４ウェルＰＣＲプレート（ＭｉｃｒｏＡｍｐ（商標）光学３８４ウェル反応プレート、Life  Technologies）においてＴａｑＭａｎ（商標）遺伝子発現マスターミックス（Life  Technologies）と組み合わせて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ中で反復して、これによりＰＣＲの過程で蛍光データを収集して、域値サイクル（Ｃｔ）（集積した蛍光が予め設定した域値に達する部分ＰＣＲサイクル）を決定する。上流および下流のＩＬ−６Ｒα特異的ｑＰＣＲおよび標的としていない参照遺伝子に関する２つのｐＰＣＲを、各ＤＮＡサンプルに関して実行した。各ＩＬ−６Ｒα−特異的ｑＰＣＲと各参照遺伝子ｑＰＣＲとの間のＣｔ値の差（ΔＣｔ）を算出して、続いて各ΔＣｔとアッセイしたサンプル全てに関する中央値ΔＣｔとの間の差を算出して、各サンプルに関してΔΔＣｔ値を得た。各サンプルにおけるＩｌ−６遺伝子のコピー数を下記式から算出した：コピー数＝２・２−ΔΔＣｔ。その天然のコピーの１つを喪失した正確に標的としたクローンは、１に等しいＩＬ−６Ｒα遺伝子コピー数を有する。ヒトＩＬ−６Ｒα遺伝子配列が、ヒト化対立遺伝子において欠失マウスＩＬ−６Ｒα遺伝子配列を置き換えたことの確認は、下記プライマー−プローブセット（５’から３’を記した）：ヒトフォワードプライマー、ＧＧＡＧＡＧＧＧＣＡ  ＧＡＧＧＣＡＣＴＴＡ  Ｃ（配列番号１９）、ヒトリバースプライマー、ＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣ  ＣＡＡＧＡＡＡＡＧ（配列番号２０）およびヒトプローブ、ＣＣＣＧＴＴＧＡＣＴ  ＧＴＡＡＴＣＴＧＣＣ  ＣＣＴＧＧ（配列番号２１）を含むＴａｑＭａｎ（商標）ｑＰＣＲアッセイにより確認された。
【０１２８】
同じＬＯＮＡアッセイを使用して、標的としたＥＳ細胞由来のマウスに関する尾部生検標本から精製したＤＮＡをアッセイして、それらのＩＬ−６Ｒα遺伝子型を決定して、ヒト化ＩＬ−６Ｒα対立遺伝子が生殖系列を通じて伝達されたことを確認した。置き換えに関してヘテロ接合性の仔を交配して、ヒトＩＬ−６Ｒα（エクトドメイン）遺伝子による内在性マウスＩＬ−６Ｒαの置き換えに関してホモ接合性であるマウスを作製した。置き換えに関してホモ接合性である仔は表現型判定に使用される。
【０１２９】
マウス遺伝子座およびｈＩＬ−６α遺伝子を含有する配列の上流接合部は、５’−ＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣ  ＴＧＣＴＣＴＣＧＣＴ  ＧＣＣＣＣＡＧＴＣＴ  ＧＣＣＧＧＣＣＧＣＣ  ＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣ  ＴＧＣＧＧＡＧＣＣＧ  ＣＴＣＴＧＣＣＧＣＣ  ＣＧＣＣＧＴＣＣＣＧ  ＣＧＴＡＧＡＡＧＧＡ  ＡＧＣＡＴＧＣＴＧＧ  ＣＣＧＴＣＧＧＣＴＧ  ＣＧＣＧＣＴＧＣＴＧ  ＧＣＴＧＣＣＣＴＧＣ  ＴＧＧＣＣＧＣＧＣＣ  ＧＧＧＡＧＣＧＧＣＧ  ＣＴＧＧＣＣＣＣＡＡ  ＧＧＣＧＣＴＧＣＣＣ  ＴＧＣＧＣＡＧＧＧＴ  ＡＡＧＧＧＣＴＴＣＧ  Ｇ（配列番号２２）内に存在するように設計され、ここでヒト遺伝子の最初のヌクレオチドの前の最後のマウスヌクレオチドは、ＧＡＡＧＣ中の「Ｃ」であり、ヒト配列の最初のヌクレオチドは、ＡＴＧＣＴ中の最初の「Ａ」である。ｈＩＬ−６遺伝子およびマウス遺伝子座を含有する配列の下流接合部は、５’−ＣＡＡＧＡＴＴＡＴＴ  ＧＧＡＧＴＣＴＧＡＡ  ＡＴＧＧＡＡＴＡＣＣ  ＴＧＴＴＧＡＧＧＧＡ  ＡＡＴＣＴＴＴＡＴＴ  ＴＴＧＧＧＡＧＣＣＣ  ＴＴＧＡＴＴＴＣＡＡ  ＴＧＣＴＴＴＴＧＡＴ  ＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣ  ＴＧＣＡＡＧＡＣＣＣ  ＧＧＧＣＴＣＧＡＴＡ  ＡＣＴＡＴＡＡＣＧＧ  ＴＣＣＴＡＡＧＧＴＡ  ＧＣＧＡＣＴＣＧＡＧ  ＡＴＡＡＣＴＴＣ−３’（配列番号２３）内に存在するように設計され、ここでヒト配列の最後のヌクレオチドは、ＣＡＡＧＡ中の最後の「Ａ」であり、マウス配列の最初のヌクレオチドは、ＣＣＣＧＧ中の最初の「Ｃ」である。下流接合部領域はまた、ｌｏｘＰが隣接するユビキチンプロモーター駆動ｎｅｏカセットの除去用に３’末端にｌｏｘＰ部位を含有していた。ｌｏｘｐ部位の最初のヌクレオチドは、ＡＴＡＡＣ中の最初の「Ａ」である。マウスＩＬ−６Ｒα遺伝子座とのｎｅｏカセットの接合部は、５’−ＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴ  ＴＡＴＣＣＴＡＧＧＴ  ＴＧＧＡＧＣＴＣＴＡ  ＣＴＣＣＡＴＡＴＧＣ  ＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧ  ＴＴＧＴＴＴＧＣＴＡ  ＣＧＡＴＡＣＧＧＴＧ  ＡＧＧＣＣＣＧＴＧＣ  ＧＡＡＧＡＧＴＧＧＣ  ＡＣＡＧＡＴＣＡＧＧ  ＡＧＧＣＴＴＡＴＧＴ  ＧＧＴＣＡＧＴＣＣＡ  ＣＡＧＴＡＴＧＧＣ（配列番号２４）内に存在するように設計され、ここでＡＧＣＴＣの最後の「Ｃ」は、ｎｅｏカセットの最後のヌクレオチドであり、カセットに続くマウスゲノムの最初のヌクレオチドは、ＴＡＣＴＣの最初の「Ｔ」である。
（項目１）
内在性マウスＩＬ−６遺伝子座でのヒトＩＬ−６をコードするヒト遺伝子による、ＩＬ−６をコードするマウス遺伝子の置き換えを含む、遺伝子改変されたマウスであって、ヒトＩＬ−６をコードする該ヒト遺伝子が、該内在性マウスＩＬ−６遺伝子座における内在性マウス調節エレメントの制御下にある、遺伝子改変されたマウス。
（項目２）
ヒトＩＬ−６をコードする前記ヒト遺伝子が、ＢＡＣ  ＩＤ  ＣＴＤ−２３６９Ｍ２３のヒトＩＬ−６遺伝子である、項目１に記載の遺伝子改変されたマウス。
（項目３）
マウスＩＬ−６Ｒαを発現する、項目１に記載の遺伝子改変されたマウス。
（項目４）
ヒト化ＩＬ−６Ｒαを発現する、項目１に記載の遺伝子改変されたマウス。
（項目５）
ヒト化ＩＬ−６Ｒαを発現する、項目１に記載の遺伝子改変されたマウス。
（項目６）
形質細胞増加症、糸球体硬化症、糸球体腎炎、腎不全、高ガンマグロブリン血症、脾臓における巨核球の上昇、骨髄における巨核球の上昇、脾腫、リンパ節拡大、緻密で異常な形質細胞およびそれらの組合せから選択される特徴を示さない、項目１に記載の遺伝子改変されたマウス。
（項目７）
前記ヒト化ＩＬ−６Ｒαが、ヒトエクトドメインを含む、項目４に記載の遺伝子改変されたマウス。
（項目８）
前記ヒト化ＩＬ−６Ｒαが、マウス膜貫通ドメインおよびマウス細胞質ドメインを含む、項目７に記載の遺伝子改変されたマウス。
（項目９）
内在性マウスＩＬ−６Ｒα遺伝子のヒト化を含む遺伝子改変されたマウスであって、該ヒト化が、該内在性マウスＩＬ−６Ｒα遺伝子座での、ヒトＩＬ−６Ｒαエクトドメインをコードする配列によるマウスＩＬ−６Ｒαエクトドメインをコードする配列の置き換えを含む、遺伝子改変されたマウス。
（項目１０）
マウスエクソン１〜エクソン８を含む連続的なマウス配列が、ヒトＩＬ−６ＲαエクトドメインをコードするヒトＩＬ−６Ｒα配列の連続的なゲノム断片で置き換えられる、項目９に記載の遺伝子改変されたマウス。
（項目１１）
前記エクトドメインをコードするヒトＩＬ−６Ｒα配列の前記連続的なゲノム断片が、ＢＡＣ  ＣＴＤ−２１９２Ｊ２３に由来する、項目１０に記載の遺伝子改変されたマウス。
（項目１２）
ヒト化ＩＬ−６遺伝子をさらに含む、項目９に記載の遺伝子改変されたマウス。
（項目１３）
内在性マウスＩＬ−６遺伝子座での、ヒトＩＬ−６遺伝子によるマウスＩＬ−６遺伝子の置き換えを含む、項目１２に記載の遺伝子改変されたマウス。
（項目１４）
前記ヒト化ＩＬ−６遺伝子が、内在性マウス調節エレメントの制御下にある、項目１２に記載の遺伝子改変されたマウス。
（項目１５）
マウスＩＬ−６をコードするマウス遺伝子配列を、ヒトＩＬ−６をコードするヒト遺伝子で置き換える工程を含む、ヒト化マウスを作製する方法。
（項目１６）
前記置き換えが、内在性マウスＩＬ−６遺伝子座にあり、ヒトＩＬ−６をコードする前記ヒト遺伝子が、内在性マウス調節配列に作動可能に連結する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
マウスＩＬ−６Ｒαのエクトドメイン配列をコードするマウスエクソンを、ヒトＩＬ−６Ｒαのエクトドメイン配列をコードするヒトゲノム断片で置き換えて、ヒト化ＩＬ−６Ｒα遺伝子を形成する工程を含む、ヒト化マウスを作製する方法。
（項目１８）
前記置き換えが、内在性マウスＩＬ−６Ｒα遺伝子座にあり、前記ヒト化ＩＬ−６Ｒα遺伝子が、内在性マウス調節配列に作動可能に連結する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
ヒトエクトドメイン配列によるマウスエクトドメインをコードする配列の置き換えを含む、ヒト化ＩＬ−６Ｒα遺伝子を含む遺伝子改変されたマウスであって、該ヒト化ＩＬ−６Ｒα遺伝子が、マウス膜貫通配列およびマウス細胞質配列をさらに含み、該マウスが、ヒトＩＬ−６をコードする遺伝子をさらに含み、ヒトＩＬ−６をコードする該遺伝子が、内在性マウスＩＬ−６調節エレメントの制御下にある、遺伝子改変されたマウス。
（項目２０）
完全マウスＩＬ−６Ｒαを発現することが不可能であり、マウスＩＬ−６を発現することが不可能である、項目１９に記載の遺伝子改変されたマウス。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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