(57)【要約】  本発明は、中胚葉系列の前駆細胞およびその治療用途に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
中胚葉系列の前駆細胞であって、
前記細胞は、
（ａ）検出可能なレベルのＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ２７１を発現し、および、
（ｂ）検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない、
前駆細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の前駆細胞であって、
前記細胞は、患者での特定の損傷組織に移行することが可能であることを特徴とする、
前駆細胞。
【請求項３】
請求項２に記載の前駆細胞であって、
前記細胞は、検出可能なレベルのＣ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ１（ＣＸＣＲ１）を発現することを特徴とする、
前駆細胞。
【請求項４】
請求項２または３に記載の前駆細胞であって、
前記細胞は、検出可能なレベルのＣ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ２（ＣＸＣＲ２）を発現することを特徴とする、
前駆細胞。
【請求項５】
請求項２から４のいずれか一項に記載の前駆細胞であって、
前記の特定の組織は、心臓組織、網膜組織または骨組織であることを特徴とする、
前駆細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の前駆細胞であって、
前記の特定の組織は、心臓組織または骨組織であり、および、
前記細胞は、検出可能なレベルのＣ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）を発現することを特徴とする、
前駆細胞。
【請求項７】
請求項５に記載の前駆細胞であって、
前記の特定の組織は、網膜組織であり、および、
前記細胞は、検出可能なレベルのＣＸＣＲ４、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、形質転換成長因子β１（ＴＧＦ−β１）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、ＣＸＣＬ１２、ＣＤ１０９、ＣＤ１１９、活性化Ｂ細胞の核因子κ−軽鎖−エンハンサー（ＮＦκＢ）、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ３０４、ＣＤ３０９およびＣＤ３２５を発現することを特徴とする、
前駆細胞。
【請求項８】
請求項５に記載の前駆細胞であって、
前記の特有の組織は骨組織であり、および、
前記細胞は、検出可能なレベルのＴＧＦ−β３、骨形成タンパク質−６（ＢＭＰ−６）、ＳＯＸ−９、コラーゲン−２、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１２（ＣＣＬ１２）、ＣＣＬ７、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血小板由来成長因子−Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＩＧＦ−１、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＰＤＧＦ−Ｒα、ＰＤＧＦ−Ｒβ、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｃケモカイン受容体タイプ１（ＣＣＲ１）、ＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、ＣＸＣＬ１２およびＮＦκＢを発現することを特徴とする、
前駆細胞。
【請求項９】
先行する請求項のいずれか一項に記載の前駆細胞であって、
前記細胞は、患者での損傷組織において抗炎症効果を有することが可能であることを特徴とする、
前駆細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の前駆細胞であって、
前記細胞は、検出可能なレベルのＣＤ１２０ａ（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α受容体１）、ＣＤ１２０ｂ（ＴＮＦ−α受容体２）、ＣＤ５０（細胞間接着分子−３、ＩＣＡＭ−３）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ５８（リンパ球機能関連抗原−１、ＬＦＡ−１）、ＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ６２Ｐ（Ｐ−セレクチン）、ＣＤ１０６（血管細胞接着タンパク質、ＶＣＡＭ−１）、ＣＤ１０２（ＩＣＡＭ−２）、ＣＤ１６６（活性化白血球細胞接着分子）、ＣＤ１０４（インテグリンβ４）、ＣＤ１２３（インターロイキン−３受容体）、ＣＤ１２４（インターロイキン−４受容体）、ＣＤ１２６（インターロイキン−６受容体）、ＣＤ１２７（インターロイキン−７受容体）および線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）を発現することを特徴とする、
前駆細胞。
【請求項１１】
先行する請求項のいずれか一項に記載の前駆細胞であって、
前記細胞は、
（ｉ）インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、
（ｉｉ）ＩＧＦ−１受容体；
（ｉｉｉ）Ｃ−Ｃケモカイン受容体タイプ１（ＣＣＲ１）、
（ｉｖ）ストロマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）、
（ｖ）低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）、
（ｖｉ）Ａｋｔ１および
（ｖｉｉ）肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）および／または顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）
のうちの１つまたは複数を検出可能なレベルで発現することを特徴とする、
前駆細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の前駆細胞であって、
前記細胞は、（ｉ）から（ｖｉｉ）のうちの１つまたは複数を過剰発現することを特徴とする、
前駆細胞。
【請求項１３】
先行する請求項のいずれか一項に記載の前駆細胞であって、
前記細胞は、
（ｉ）血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、
（ｉｉ）形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）、
（ｉｉｉ）インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、
（ｉｖ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、
（ｖ）腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、
（ｖｉ）インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）および
（ｖｉｉ）インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）
のうちの１つまたは複数を検出可能なレベルで発現することを特徴とする、
前駆細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の前駆細胞であって、
前記細胞は、（ｉ）から（ｖｉｉ）のうちの１つまたは複数を過剰発現することを特徴とする、
前駆細胞。
【請求項１５】
先行する請求項のいずれか一項に記載の前駆細胞であって、
前記細胞は自己由来であることを特徴とする、
前駆細胞。
【請求項１６】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の前駆細胞であって、
前記細胞は同種異系であることを特徴とする、
前駆細胞。
【請求項１７】
集団であって、
請求項１から１６のいずれか一項に記載の、中胚葉系列の前駆細胞を２以上含む、
集団。
【請求項１８】
請求項１５に記載の集団であって、
前記集団は、請求項１から１６のいずれか一項に記載の細胞を、少なくとも約５×１０５細胞含むことを特徴とする、
集団。
【請求項１９】
医薬組成物であって、
（ａ）請求項１から１６のいずれか一項に記載の前駆細胞、または、請求項１７または１８に記載の集団、および、
（ｂ）薬学的に許容できる担体または希釈剤、
を含む、
医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１７または１８に記載の、中胚葉系列の前駆細胞の集団を生産する方法であって、
（ａ）単核細胞（ＭＣ）が中胚葉系列の前駆細胞に分化するのを誘導する条件下でＭＣを培養するステップ、および、
（ｂ）請求項１、３、４、６、７、８および１０から１４のいずれか一項に記載の発現パターンを有する前駆細胞を回収し、培養して、それにより、請求項１７または１８に記載の集団を生産するステップ、
を含むことを特徴とする、
方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、
前記ＭＣは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であることを特徴とする、
方法。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載の方法であって、
前記ステップ（ａ）は、前駆細胞の付着を可能にする条件下で、前記ＭＣを培養するステップを含むことを特徴とする、
方法。
【請求項２３】
請求項２０から２２のいずれか一項に記載の方法であって、
前記ステップ（ａ）および／またはステップ（ｂ）は、血小板溶解物とともに、ＭＳＣおよび／または前駆細胞を培養するステップを含むことを特徴とする、
方法。
【請求項２４】
請求項２０から２３のいずれか一項に記載の方法であって、
前記ステップ（ａ）および／または（ｂ）は、低酸素条件下でＭＳＣおよび／または前駆細胞を培養するステップを含むことを特徴とする、
方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、
前記低酸素条件は、約２０％未満の酸素（Ｏ２）であることを特徴とする、
方法。
【請求項２６】
請求項２０から２５のいずれか一項に記載の方法であって、
前記ＭＣは、患者または同種異系ドナーから得られることを特徴とする、
方法。
【請求項２７】
患者での損傷組織を修復する方法であって、
請求項１７または１８に記載の集団を患者に投与するステップ、
ここで、前記集団は、治療的に有効数の細胞を含み、
および、それにより、患者での損傷組織を治療するステップ、
を含む、
方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、
前記組織は、中胚葉由来であることを特徴とする、
方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、
前記組織は、心臓組織、網膜組織または骨組織であることを特徴とする、
方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、
前記方法は、
（ａ）損傷した心臓組織を修復するためであり、そして、前記集団は、治療的に有効量の請求項６に記載の細胞を含む、
（ｂ）損傷した網膜組織を修復するためであり、そして、前記集団は、治療的に有効量の請求項７に記載の細胞を含む、または、
（ｃ）損傷した骨組織を修復するためであり、そして、前記集団は、治療的に有効量の請求項８に記載の細胞を含む、ことを特徴とする、
方法。
【請求項３１】
請求項２７から３０のいずれか一項に記載の方法であって、
前記組織は、外傷または疾患により損傷していることを特徴とする、
方法。
【請求項３２】
請求項２７に記載の方法であって、
前記方法は、患者での、心臓の外傷または疾患、加齢黄斑変性、または、骨の外傷または疾患を治療するためであることを特徴とする、
方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、
前記の心臓の外傷または疾患は、心筋梗塞、左室肥大、右室肥大、塞栓、心不全、先天性心臓欠損、心臓弁膜症、不整脈および心筋炎から選択されることを特徴とする、
方法。
【請求項３４】
請求項３２に記載の方法であって、
前記の骨の外傷または疾患は、骨折、ソルター−ハリス骨折、若木骨折、骨棘、頭蓋骨癒合症、コフィン−ローリー症候群、進行性骨化性線維異形成症、線維性骨異形成症、フォング病（または爪膝蓋骨症候群）、低ホスファターゼ症、クリッペル−ファイル症候群、代謝性骨疾患、爪膝蓋骨症候群、変形性関節症、変形性骨炎（または骨パジェット病）、嚢胞性線維性骨炎（または線維性骨炎またはフォンレックリングハウゼン骨病）、恥骨骨炎、硬化性骨炎（または硬化性骨炎）、硬化性腸骨炎、離断性骨軟骨炎、骨形成不全症、骨軟化症、骨髄炎、骨減少症、大理石骨病、骨粗鬆症、骨壊死、骨萎縮性骨化過剰症（ｐｏｒｏｔｉｃ  ｈｙｐｅｒｏｓｔｏｓｉｓ）、原発性副甲状腺機能亢進症、腎性骨ジストロフィー、骨がん、転移性がんと関連する骨病変、ゴーハム・スタウト病、原発性副甲状腺機能亢進症、歯周病、および関節置換の無菌的弛みから選択されることを特徴とする、
方法。
【請求項３５】
請求項３２から３４のいずれか一項に記載の方法であって、
前記方法は、
（ａ）心臓の外傷または疾患を治療するためであり、そして、前記集団は、治療的に有効量の請求項６に記載の細胞を含む、
（ｂ）加齢黄斑変性を治療するためであり、そして、前記集団は、治療的に有効量の請求項７に記載の細胞を含む、または、
（ｃ）骨の外傷または疾患を治療するためであり、そして、前記集団は、治療的に有効量の請求項８に記載の細胞を含む、
ことを特徴とする、
方法。
【請求項３６】
請求項２７から３５のいずれか一項に記載の方法であって、
前記集団は、患者または同種異系ドナー由来のＭＣを用いて生産されることを特徴とする、
方法。
【請求項３７】
請求項１７または１８に記載の集団であって、
患者での損傷組織の修復に用いるための、
集団。
【請求項３８】
請求項１７または１８に記載の集団であって、
治療が必要な患者での、心臓の外傷または疾患、加齢黄斑変性、または、骨の外傷または疾患の治療に用いるための、
集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中胚葉系列の前駆細胞およびその治療用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、多能性の、成体幹細胞である。ＭＳＣは分化して、骨組織内にみられる異なる特殊化細胞を形成する。例えば、それらは、軟骨細胞（コンドロサイト）、骨細胞（骨芽細胞）および脂肪細胞（アディポサイト）に分化することができる。
【０００３】
ＭＳＣは、様々な治療、例えば、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）および心筋梗塞の治療に用いられる。患者に投与された時点で、ＭＳＣは典型的に、損傷組織に移行し（または帰巣し）、そして、パラクリンシグナリングを介して、そして、損傷組織内の隣接細胞の生存、修復および再生を促進することにより、その治療効果を発揮する。
【０００４】
現在の治療は典型的に、ＭＳＣサブタイプの混合物の注入を伴い、そのうちのいくつかは興味対象の組織に効率的に移行しない。このことは大量の細胞投与を要し、オフターゲットの副作用および量に関連する副作用をもたらし得る。ＭＳＣは典型的に骨髄由来であり、したがって、大量に得ることは難しい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、驚くべきことに、特異的なマーカー発現パターンを有する、新しいクラスの中胚葉系列の前駆細胞（ＰＭＬ）を同定した。本発明のＰＭＬの同質な集団は、単核細胞（ＭＣ）、例えば、末梢血ＭＣから単離することができる。ＰＭＬは、損傷組織に効率的に移行して修復することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、中胚葉系列の前駆細胞を提供し、ここで、前記細胞は、（ａ）検出可能なレベルのＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ２７１を発現し、および、（ｂ）検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない。
【０００７】
また、本発明は、以下を提供する：
−本発明の前駆細胞を２以上含む集団；
−（ａ）本発明の前駆細胞または本発明の集団、および、（ｂ）薬学的に許容できる担体または希釈剤を含む医薬組成物；
−（ａ）単核細胞（ＭＣ）が中胚葉系列の前駆細胞に分化するのを誘導する条件下でＭＣを培養するステップ、および、（ｂ）本発明の発現パターンを有する前駆細胞を回収し、培養して、それにより、本発明の集団を生産するステップ、を含む、本発明の集団を生産する方法；
−本発明の集団を患者に投与するステップ（前記集団は、治療的に有効数の細胞を含む）、および、それにより、患者での損傷組織を修復するステップ、を含む、患者での損傷組織を修復する方法；および
−患者での損傷組織の修復に使用するための、本発明の集団。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明のＰＭＬでの、ＣＤ４４の存在およびＣＤ３４の不存在を確認するＲＴ−ＰＣＲゲルを示す。
【図２】本発明のＰＭＬのＦＡＣＳ分析の結果を示す。これは、細胞が少なくともＣＤ７３およびＣＤ９０に関してポジティブであり、ＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５に関してネガティブであることを確証する。
【図３】ＦＡＣＳ分析からのさらなる結果、すなわち、ＣＤ９０（上）およびＣＤ７３（下）に関するヒストグラムを示す。
【図４】染色された（図４ａ）および染色されていない（図４ｂ）細胞での、ＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５の欠如に関するＦＡＣＳヒストグラムを示す。
【図５】中胚葉系列の前駆細胞が、時間依存的およびＣＸＣＲ４依存的な様式で、骨折部位に移行することを示す。１０６  ＰＭＬ−Ｐ−Ａｃｔ−Ｌｕｃ（ＰＭＬ）（左カラム）、ＰＭＬ−ｆｌ−Ａｃｔ−Ｌｕｃ−ＣＸＣＲ４＋（ＣＸＣＲ４（＋））（中央カラム）、またはＰＭＬ−Ｐ−Ａｃｔ−Ｌｕｃ−ＣＸＣＲ４−（ＣＸＣＲ４（−））（右カラム）のいずれかの移植を受けた、脛骨骨折を有するマウスでの、骨折／移植後、１日（１列目）、３日（２列目）、７日（３列目）および１４日（４列目）に、生物発光（ＢＬＩ）を行なった。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本開示の産物および方法の異なる応用が、当技術分野における特定のニーズに適合され得ることが理解されよう。また、本明細書中で用いられる専門用語は、本発明の特定の実施態様を説明する目的のためのみであり、限定を意図しないことも理解されよう。
【００１０】
加えて、本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容が明確に別段の指示をしない限り、複数形の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」との言及は、「複数の細胞（ｃｅｌｌｓ）」を含み、「組織（ａ  ｔｉｓｓｕｅ）」との言及は、２以上のそのような組織を含み、「患者（ａ  ｐａｔｉｅｎｔ）」との言及は、２以上のそのような患者を含み、他も同様である。
【００１１】
上記または下記のいずれにせよ、本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体で参照により本明細書に援用される。
【００１２】
本発明のＰＭＬ
本発明は、中胚葉系列の前駆細胞（ＰＭＬ）を提供する。前記ＰＭＬは、検出可能なレベルのＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ２７１を発現するが、検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない。
【００１３】
本発明のＰＭＬは、非常に多くの利点を有する。重要な利点を本明細書に要約する。しかしながら、さらなる利点が以下の記述から明らかであろう。
【００１４】
本発明のＰＭＬは、患者での損傷組織を修復するために有利に用いられ得る。ＰＭＬは、効率的に損傷組織に移行し（または帰巣し）、組織において抗炎症効果を発揮することが可能である。このことは以下にさらに詳細に述べられる。ＰＭＬの最も重要な能力の一つは、負傷部位へ移行する（または帰巣する）ことであり、化学走性を含む。これはケモカイン−シグナリングに基づき、ローリング、付着および遊出のようなメカニズムを利用する。ＰＭＬの抗炎症効果は、損傷組織中の隣接細胞の生存、修復および再生を促進する。細胞はまた、血管新生因子、走化性因子および抗アポトーシス因子の分泌のような、パラクリン作用を発揮することができる。
【００１５】
以下にさらに詳細に述べるように、ＰＭＬは、単核細胞（ＭＣ）、例えばヒト個体から採取した末梢ＭＣから生産される。ＰＭＬはＭＣから生産されるので、それらは簡単に生産され得て（例えば末梢血から）、治療されるべき患者の自己由来であり得て、したがって、患者による免疫学的拒絶のリスクを回避する。
【００１６】
様々なＭＣサンプル（すなわち様々な血液サンプル）を得ることができるので、原理的には、単一の個体から、無制限数のＰＭＬを生産することが可能である。単一の個体から非常に多くの数のＰＭＬを生産することが確実に可能である。したがって、本発明のＰＭＬは、大量に作製することができる。
【００１７】
本発明のＰＭＬは、臨床的に意義のある条件で、例えば、微量のエンドトキシンおよび他の環境汚染物質、ならびに、ウシ胎仔血清のような動物産物の不存在下で生産される。このことは、本発明のＰＭＬを、特に患者への投与に適切にする。
【００１８】
本発明のＰＭＬはＭＣから生産されるので、それらは実質的に同質であり、自己由来であり得る。それらはまた、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）でしばしば生じるドナー間のばらつきを回避する。本発明のＰＭＬの非常に多くの集団は、化学療法または放射線療法のような任意の他の治療が始められる前に、患者から採取した単一サンプルから生産することができる。したがって、本発明のＰＭＬは、これらの治療の任意の有害作用を回避することができる。
【００１９】
本発明のＰＭＬは、早急に作ることができる。ＰＭＬは、３０日未満で、例えば約２２日で、ＭＣから生産することができる。
【００２０】
ＭＣからのＰＭＬの生産は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の使用にかかわるモラルおよび倫理的影響を回避する。
【００２１】
本発明のＰＭＬは典型的に、ヒトＭＣから生産される。したがって、本発明のＰＭＬは典型的にヒトである。
【００２２】
本発明のＰＭＬは、系列限定的マーカーの発現、構造上および機能上の特性を含む、当技術分野で知られている標準的な方法を用いて、中胚葉系列の前駆細胞として同定することができる。ＰＭＬは、中胚葉系列の前駆細胞の特性として知られる細胞表面マーカーを、検出可能なレベルで発現する。特に、以下にさらに詳細に述べるマーカーに加えて、ＰＭＬは、α−平滑筋アクチン、Ｉ型コラーゲンα鎖、ＧＡＴＡ６、Ｍｏｈａｗｋ、およびビメンチンを発現し得る（Ｓａｇｉ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．  ２０１２  Ｍａｒ  ２０；  ２１（５）：８１４−２８）。
【００２３】
本発明のＰＭＬは、インビトロで分化アッセイをうまく完了させて、それらが中胚葉系列であることを確認することができる。そのようなアッセイは、限定されないが、脂肪生成分化アッセイ、骨形成分化アッセイおよび神経分化アッセイを含む（Ｚａｉｍ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ  Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ２０１２  Ａｕｇ；９１（８）：１１７５−８６）。
【００２４】
本発明のＰＭＬは、幹細胞ではない。特に、それらは間葉系幹細胞（ＭＳＣ）ではない。それらは末期的に分化されている。インビトロで、例えば軟骨細胞または骨細胞に分化するのに適切な条件下にそれらをおくことができるが、それらはインビボでは分化しない。本発明のＰＭＬは、損傷組織に移行して損傷組織中でパラクリンシグナリングを発揮することにより、それらの効果を有する。特に、ＰＭＬは、好ましくは、損傷組織において抗炎症効果を誘導することが可能である。このことは以下にさらに詳細に述べられる。
【００２５】
本発明のＰＭＬは典型的に、紡錘形の形態により特徴付けられる。ＰＭＬは典型的に、線維芽細胞様であり、すなわち、それらは数個の長細い細胞突起を持つ小細胞体を有する。細胞は典型的に、約１０〜約２０μｍの直径である。
【００２６】
本発明のＰＭＬは、それらのマーカー発現パターンにより、公知のＰＭＬから区別される。本発明のＰＭＬは、検出可能なレベルのＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ２７１を発現する。本発明のＰＭＬは、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ２７１のうちの１つまたは複数、例えば全てを発現し得る。本発明のＰＭＬは、それらが、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ２７１のうちの１つまたは複数を、他のＰＭＬおよび／またはＭＳＣよりも多く発現する場合、過剰発現する。本発明のＰＭＬは、検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない。
【００２７】
ＣＤ２９（インテグリンβ４）は、極後期抗原の受容体と関連するインテグリンユニットである。それはα−３サブユニットと結合して、ネトリン−１およびリーリンと反応するα３β１複合体を作ることが知られている。
【００２８】
ＣＤ４４は、細胞間相互作用、細胞接着および遊走に関与する細胞表面糖タンパク質である。ヒトでは、ＣＤ４４抗原は、染色体１１上のＣＤ４４遺伝子によりコードされる。
【００２９】
エクト−５’−ヌクレオチダーゼ（エクト−５’−ＮＴ，ＥＣ  ３．１．３．５）としても知られるＣＤ７３は、多くのタイプのヒトおよびマウスがんにみられる、グリコシルフォスファチジルイノシトール連結の７０ｋＤａの細胞表面エクトエンザイムである。
【００３０】
ＣＤ９０（またはＴｈｙ−１）は、２５〜３７ｋＤａの、重度にＮ−グリコシル化された、単一のＶ様免疫グロブリンドメインを有するグリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型の保存された細胞表面タンパク質である。それは当初、胸腺細胞抗原として発見された。
【００３１】
ＣＤ１０５（またはエンドグリン）は、細胞表面上にあるＩ型膜糖タンパク質であり、ＴＧＦβ受容体複合体の一部である。
【００３２】
低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）またはｐ７５ＮＴＲとしても知られるＣＤ２７１は、低親和性ニューロトロフィン受容体および腫瘍壊死因子受容体のスーパーファミリーに属する。
【００３３】
ＣＤ１４は先天性の免疫系の構成要素であり、２つの形態で存在する。それは、グリコシルフォスファチジルイノシトール尾部により膜中に固定されているか（ｍＣＤ１４）、または可溶性形態で現れる（ｓＣＤ１４）かのいずれかである。可溶性ＣＤ１４は、ｍＣＤ１４のシェディング後に現れるか（４８ｋＤａ）、または細胞内ベシクルから直接分泌される（５６ｋＤａ）かのいずれかである。
【００３４】
ＣＤ３４は細胞表面糖タンパク質であり、細胞間接着因子としての機能を果たす。例えば、それは、幹細胞の、骨髄細胞外マトリックスへの付着または間質細胞への直接の付着を仲介する。
【００３５】
ＣＤ４５は、赤血球（ｅｔｈｒｏｃｙｔｅｓ）および血小板を除く造血細胞にあるタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）である。ＣＤ４５は、マウスでの一般的な白血球抗原；Ｔ２２０およびＢ２２０とも呼ばれる。タンパク質チロシンキナーゼは、ホスホチロシン残基の脱リン酸化を触媒する、受容体様で細胞質誘導酵素のファミリーを構成し、相同な触媒ドメインにより特徴付けられる。
【００３６】
当技術分野で知られている標準的な方法は、上記に（および以下に）記述する様々なマーカーの検出可能な発現、低い発現またはそれらの欠如を判定するために用いられ得る。適切な方法は、限定されないが、免疫細胞化学、イムノアッセイ、フローサイトメトリー、例えば蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えば逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む。適切なイムノアッセイは、限定されないが、ウェスタンブロッティング、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）、酵素増幅イムノアッセイ技術、放射性アレルゲン吸着（ＲＡＳＴ）テスト、ラジオイムノアッセイ、ラジオバインディングアッセイおよび免疫蛍光を含む。ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡおよびＲＴ−ＰＣＲは、すべて定量的であり、したがって、存在するならば様々なマーカーの発現レベルを測定するために用いることができる。ＦＡＣＳの使用を実施例に開示する。本明細書に記述される、様々なマーカーの全てに関する抗体および蛍光標識抗体は市販されている。
【００３７】
本発明のＰＭＬは、好ましくは、患者での特定の損傷組織に移行することが可能である。換言すれば、損傷組織を有する患者にその細胞が投与されると、その細胞は損傷組織に移行する（または帰巣する）ことが可能である。このことは、標準的な経路、例えば静脈を介してその細胞を注入することができ、それから、損傷部位を標的化することができることを意味するので、利点である。その細胞は損傷組織に送達される必要はない。損傷は、以下にさらに詳細に述べる外傷または疾患に起因してよい。
【００３８】
本発明のＰＭＬが損傷組織に移行する能力は、当技術分野で知られている標準的なアッセイを用いて測定され得る。適切な方法は、限定されないが、ゲノムの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（レポーター遺伝子を伴うまたは伴わないＲＴ−ＰＣＲ）および標識技術を含む。
【００３９】
ＲＴ−ＰＣＲは、患者内の本発明のＰＭＬをトレースする最も直接的で単純な方法である。形質導入された導入遺伝子または個々のドナーマーカーをこの目的のために用いることができ、移植細胞特異的シグナルが様々な患者試験で得られている。結果は通常、半定量的である。
【００４０】
あるいは、本発明のＰＭＬは、目的の色素、例えば蛍光色素で染色してよく、色素からのシグナルを介して患者内でモニターしてよい。そのような標識の特定の方法を実施例に開示する。
【００４１】
移行（または帰巣）は典型的に、損傷組織に到達する細胞数を測定することにより決定される。それはまた、肺（損傷組織よりもむしろ）に蓄積した細胞数を観測することにより、間接的に測定してよい。
【００４２】
患者での特定の損傷組織に移行することができる本発明のＰＭＬは、好ましくは、（ａ）Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ１（ＣＸＣＲ１）を検出可能なレベルで発現し、または過剰発現し、および／または（ｂ）ＣＸＣＲ２を検出可能なレベルで発現し、または過剰発現する。本発明のＰＭＬは、さらに好ましくは、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２を検出可能なレベルで発現、または過剰発現する。損傷組織は、様々な可溶性炎症性因子、例えば、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）およびインターロイキン−８を放出し、これらの因子は、結合性ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２に結合するが、本発明のＰＭＬ（および他の炎症性細胞）を損傷組織に向けることができる。
【００４３】
本発明のＰＭＬは、他のＰＭＬおよび／またはＭＳＣより多くのＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２を生産する場合、ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２を過剰発現している。ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２の発現は、上述のように測定され得る。本発明の、網膜に帰巣する細胞は、検出可能なレベルのＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２を発現しない。このことは、以下にさらに詳細に述べられる。
【００４４】
本発明のＰＭＬが移行することができる特定の損傷組織は、好ましくは、心臓組織、網膜組織または骨組織である。網膜組織は、好ましくは黄斑である。
【００４５】
特定の損傷組織が心臓組織または骨組織である場合、本発明のＰＭＬは、好ましくは、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）を検出可能なレベルで発現し、または、過剰発現する。本発明のＰＭＬは、他のＰＭＬおよび／またはＭＳＣよりも多くのＣＸＣＲ４を発現する場合、ＣＸＣＲ４を過剰発現している。特定の損傷組織が心臓組織または骨組織である場合、本発明のＰＭＬは、さらに好ましくは、（ａ）ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ４；（ｂ）ＣＸＣＲ２およびＣＸＣＲ４；または（ｃ）ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＣＸＣＲ４を検出可能なレベルで発現し、または過剰発現する。ＣＸＣＲ４の発現は、上述のように測定され得る。
【００４６】
損傷した心臓組織は、炎症性ケモカインおよびサイトカイン、例えばストロマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を放出する。加えて、心筋梗塞は、ＶＥＧＦおよびエリスロポエチン（ＥＰＯ）のレベルを増加させる。ＣＸＣＲ４はそのリガンドＳＤＦ−１に結合し、したがって、ＣＸＣＲ４を発現する本発明のＰＭＬは、損傷した心臓組織により生産されるＳＤＦ−１の勾配に向かって移行する。骨など他の損傷組織もまた、ＳＤＦ−１を放出する。
【００４７】
特定の損傷組織が、黄斑のような網膜組織である場合、本発明のＰＭＬは、好ましくは、検出可能なレベルのＣＸＣＲ４、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、形質転換成長因子β１（ＴＧＦ−β１）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、ＣＸＣＬ１２、ＣＤ１０９、ＣＤ１１９、活性化Ｂ細胞の核因子κ−軽鎖−エンハンサー（ＮＦκＢ）、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ３０４、ＣＤ３０９およびＣＤ３２５を発現する。本発明の、網膜に帰巣するＰＭＬは、好ましくは、これらの因子のうちの１つまたは複数、または実に全てを、過剰発現する。ＰＭＬは、他のＰＭＬおよび／またはＭＳＣよりも多くの因子を発現する場合、これらの因子を過剰発現している。細胞マーカーに関する定量アッセイは上述のとおりである。
【００４８】
また、本発明の、網膜に帰巣するＰＭＬは、好ましくは、検出可能なレベルの色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を発現し、またはＰＥＤＦを過剰発現する。これらのマーカーの検出可能な発現は、上述のように測定され得る。本発明のＰＭＬは、他のＰＭＬおよび／または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）よりも多くのＰＥＤＦを発現する場合、ＰＥＤＦを過剰発現している。
【００４９】
特異的な損傷組織が骨組織である場合、本発明のＰＭＬは、好ましくは、検出可能なレベルのＴＧＦ−β３、骨形成タンパク質−６（ＢＭＰ−６）、ＳＯＸ−９、コラーゲン−２、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１２（ＣＣＬ１２）、ＣＣＬ７、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血小板由来成長因子−Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＩＧＦ−１、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＰＤＧＦ−Ｒα、ＰＤＧＦ−Ｒβ、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｃケモカイン受容体タイプ１（ＣＣＲ１）、ＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、ＣＸＣＬ１２およびＮＦκＢを発現する。本発明の骨に帰巣するＰＭＬは、好ましくは、これらの因子のうちの１つまたは複数、または実に全てを、過剰発現する。ＰＭＬは、他のＰＭＬおよび／またはＭＳＣよりも多くの因子を発現する場合、これらの因子を過剰発現している。これらのマーカーの検出可能な発現は、上述のように測定され得る。
【００５０】
本発明のＰＭＬは、好ましくは、患者の損傷組織において抗炎症効果を有することが可能である。また、本発明のＰＭＬが抗炎症効果を有する能力は、当技術分野で知られている標準的なアッセイを用いて測定され得る。適切な方法は、限定されないが、サイトカインの分泌に関する酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、増強された混合白血球反応、および、フローサイトメトリーにより測定される共刺激分子と成熟マーカーの上方制御を含む。用いられ得る特定の方法を実施例に開示する。測定されるサイトカインは典型的に、インターロイキン、例えばインターロイキン−８（ＩＬ−８）、セレクチン、接着分子、例えば細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、および化学誘引タンパク質、例えば単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）である。これらのサイトカインに関するアッセイは市販されている。
【００５１】
抗炎症性ＰＭＬは、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ１２０ａ（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α受容体１）、ＣＤ１２０ｂ（ＴＮＦ−α受容体２）、ＣＤ５０（細胞間接着分子−３、ＩＣＡＭ−３）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ５８（リンパ球機能関連抗原−１、ＬＦＡ−１）、ＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ６２Ｐ（Ｐ−セレクチン）、ＣＤ１０６（血管細胞接着タンパク質、ＶＣＡＭ−１）、ＣＤ１０２（ＩＣＡＭ−２）、ＣＤ１６６（活性化白血球細胞接着分子）、ＣＤ１０４（インテグリンβ４）、ＣＤ１２３（インターロイキン−３受容体）、ＣＤ１２４（インターロイキン−４受容体）、ＣＤ１２６（インターロイキン−６受容体）、ＣＤ１２７（インターロイキン−７受容体）および線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）を発現する。抗炎症性ＰＭＬは、好ましくは、これらの因子のうちの１つまたは複数、または実に全てを、過剰発現する。ＰＭＬは、他のＰＭＬおよび／またはＭＳＣよりも多くの、１つまたは複数の因子を発現する場合、これらの因子を過剰発現している。これらのマーカーの検出可能な発現は、上述のように測定され得る。
【００５２】
本発明のＰＭＬは、さらに好ましくは、患者での損傷組織に移行して、損傷組織において抗炎症効果を有することができる。このことは、損傷を効率的に修復することを可能にし、投与が必要な細胞数を減少させる。
【００５３】
本発明のＰＭＬは、上述のものに加えて、様々な異なる他のマーカーを発現する。これらのいくつかは、ＰＭＬが損傷組織に移行する能力を助け、そこで抗炎症効果を有する。任意の本発明のＰＭＬは、さらに、（ｉ）インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、（ｉｉ）ＩＧＦ−１受容体；（ｉｉｉ）Ｃ−Ｃケモカイン受容体タイプ１（ＣＣＲ１）、（ｉｖ）ストロマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）、（ｖ）低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）、（ｖｉ）Ａｋｔ１および（ｖｉｉ）肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）および／または顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のうちの１つまたは複数を、検出可能なレベルで発現し得る。
【００５４】
ＩＧＦ−１受容体は、ＩＧＦ−１勾配に向かう移行能力を促進する。ＩＧＦ−１が移行を増大させるメカニズムの一つは、細胞表面上のＣＸＣＲ４を上方制御することによるものであり、それは、ＳＤＦ−１シグナリングに対して細胞をさらに感受性にさせる。このことは上述されている。
【００５５】
ＣＣＲ１はＣＣＬ７（以前はＭＣＰ３として知られていた）に対する受容体であり、ＭＳＣの帰巣および生着能力を高め（したがって、本発明のＰＭＬと同じ効果を有することが期待され得る）、そして、パラクリンシグナリングを介して、負傷した心筋での毛管密度を増大させることができる。
【００５６】
ＨＩＦ−１αは、酸素送達を増大させかつ適応性の生存促進性の応答を促進する、パスウェイを活性化する。多くのＨＩＦ−１αの標的遺伝子の中には、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、エンドセリンおよびＶＥＧＦ（その受容体Ｆｌｋ−１を伴う）がある。ＨＩＦ−１αを発現または過剰発現するＰＭＬは、例えば、より多くの治療サブタイプを促進し得る様々な血管原性成長因子のパラクリン刺激の発現を上方制御する。以下にさらに詳細に述べるように、本発明のＰＭＬは、低酸素条件下（２０％未満の酸素）、例えば約２％または約０％酸素の条件下でそれらを培養することにより、より多くの治療サブタイプに事前調整することができる。
【００５７】
Ａｋｔ１は、グルコース代謝、細胞増殖、アポトーシス、転写および細胞遊走のような複数の細胞のプロセスにおいて重要な役割を果たす細胞内セリン／トレオニンタンパク質キナーゼである。Ａｋｔ１の過剰発現は、ラットのＭＳＣがアポトーシスを受けるのを防ぐことが示されており、本発明のＰＭＬにおいても同様の効果を有する。アポトーシスからの防御は、ＰＭＬの治療効果を高める。
【００５８】
ＭＳＣによるＨＧＦの過剰発現は、カルシニューリン仲介のパスウェイおよび血管新生を介したアポトーシスの阻害により、虚血後の心不全を防ぐことが示されている。ＨＧＦおよびＧ−ＣＳＦは、この点について相乗効果を示す。また、ＨＧＦおよびその受容体ｃ−ｍｅｔを高発現するＭＳＣは、ホルモンのパラクリンおよびオートクリンシグナリングを介して獲得される、損傷組織への高い移行能力を有する。ＨＧＦおよび／またはＧ−ＣＳＦを発現する本発明のＰＭＬに関しても同様である。
【００５９】
ＰＭＬは、上記の（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうちの１つまたは複数を過剰発現し得る。本発明のＰＭＬは、（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうちの１つまたは複数を、他のＰＭＬおよび／または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）よりも多く発現する場合、過剰発現している。細胞マーカーに関する定量分析は上述される。これらのマーカーの検出可能な発現およびそれらの発現レベルは、上述のように測定され得る。
【００６０】
任意の本発明のＰＭＬは、（ｉ）血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、（ｉｉ）形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）、（ｉｉｉ）インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、（ｉｖ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、（ｖ）腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、（ｖｉ）インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）および（ｖｉｉ）インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）のうちの１つまたは複数を、検出可能なレベルで発現し得る。ＶＥＧＦを過剰発現する細胞由来の馴化培地は、ハムスターモデルにおいて心不全を緩和することが示されている。それ故に、ＶＥＧＦを発現または過剰発現する本発明のＰＭＬは、損傷した心臓組織の同様の効果を有する。
【００６１】
ＰＭＬは、（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうちの１つまたは複数を過剰発現し得る。本発明のＰＭＬは、（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうちの１つまたは複数を、他のＰＭＬおよび／または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）よりも多く発現する場合、過剰発現している。細胞マーカーに関する定量分析は上述される。これらのマーカーの検出可能な発現およびそれらの発現レベルは、上述のように測定され得る。
【００６２】
上記の（ｉ）〜（ｖｉｉ）の定義の両方のセットでは、（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうちの１つまたは複数の任意の組み合わせが発現または過剰発現され得る。例えば、（ｉ）〜（ｖｉｉ）の各定義に関して、ＰＭＬは、（ｉ）；（ｉｉ）；（ｉｉｉ）；（ｉｖ）；（ｖ）；（ｖｉ）；（ｖｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉ）および（ｉｖ）；（ｉ）および（ｖ）；（ｉ）および（ｖｉ）；（ｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉ）および（ｖ）；（ｉｉ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉｉ）および（ｖ）；（ｉｉｉ）および（ｖｉ）；（ｉｉｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｖ）および（ｖｉ）；（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ、）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）およびｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）およびｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；または（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）を検出可能なレベルで発現、または過剰発現し得る。（ｉ）〜（ｖｉｉ）の各定義に関する組み合わせは、本リストから独立に選択可能である。
【００６３】
上述の任意のマーカーに加えて、本発明のＰＭＬは、好ましくは、ＬＩＦおよび／または血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体もまた、検出可能なレベルで発現、または過剰発現する。ＰＤＧＦ受容体は、好ましくはＰＤＧＦ−Ａ受容体および／またはＰＳＤＧＦ−Ｂ受容体である。これらの受容体を高発現するＭＳＣは、血小板が活性化されている部位、例えば創傷および血栓性血管へ効率的に移行することができる。その受容体を発現または過剰発現しているＰＭＬについても同様である。
【００６４】
本発明のＰＭＬは、好ましくは自己由来である。換言すれば、細胞は、好ましくは、その細胞が投与される患者由来である。あるいは、ＰＭＬは、好ましくは同種異系である。換言すれば、細胞は、好ましくは、その細胞が投与される患者と免疫学的に適合する患者由来である。
【００６５】
本発明のＰＭＬは、単離され、実質的に単離され、精製され、または実質的に精製されてよい。ＰＭＬは、任意の他の構成要素、例えば培養培地、本発明の他の細胞、または他の細胞種から完全にフリーである場合、単離され、または精製されている。ＰＭＬは、担体または希釈剤、例えば、その使用目的を妨げない培地と混合される場合、実質的に単離されている。あるいは、本発明のＰＭＬは、成長マトリックスに存在してよく、または、後述のように表面上に固定化されてよい。
【００６６】
本発明のＰＭＬは、抗体に基づく技術を含む様々な技術を用いて単離してよい。細胞は、ＰＭＬ上に存在するこれらの表面マーカー（上記参照）へのモノクローナル抗体の結合に基づく、ネガティブおよびポジティブ選択技術を用いて単離してよい。それ故に、ＰＭＬは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）および磁気ビーズ分離を含む、任意の抗体に基づく技術を用いて分離してよい。
【００６７】
以下にさらに詳細に述べるように、ＰＭＬは、エクスビボで処置されてよい。したがって、細胞は、治療薬または診断薬がロードまたはトランスフェクトされてよく、それから、本発明の方法で治療的に用いられてよい。
【００６８】
本発明の集団
本発明はまた、２以上の本発明のＰＭＬの集団を提供する。任意の数の細胞が、集団に存在してよい。本発明の集団は、好ましくは、少なくとも約５×１０５の本発明のＰＭＬを含む。集団は、さらに好ましくは、少なくとも約１×１０６、少なくとも約２×１０６、少なくとも約５×１０６、少なくとも約１×１０７、少なくとも約２×１０７、少なくとも約５×１０７、少なくとも約１×１０８または少なくとも約２×１０８の本発明のＰＭＬを含む。ある場合には、集団は、少なくとも約１．０×１０７、少なくとも約１．０×１０８、少なくとも約１．０×１０９、少なくとも約１．０×１０１０、少なくとも約１．０×１０１１または少なくとも約１．０×１０１２の本発明のＰＭＬ、またはそれ以上を含んでよい。
【００６９】
本発明の集団は、後述のように治療に有利である。大量の本発明のＰＭＬを含む集団を生産するこの能力は、本発明の重要な利点の一つである。本発明は、全てではなくてもほとんどが目的の組織に効率的に移行して、そこで抗炎症効果を有する細胞の集団での患者の治療を可能にする。このことは、少ない細胞の投与量の使用を可能にし、オフターゲットの副作用および量に関連する副作用を回避する。
【００７０】
本発明の集団は、本発明のＰＭＬに加えて、他の細胞を含んでよい。しかしながら、集団内の少なくとも７０％の細胞は、好ましくは本発明のＰＭＬである。さらに好ましくは、集団内の細胞の少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％は、本発明のＰＭＬである。
【００７１】
本発明の集団は、好ましくは同質である。換言すると、集団内の全てのＰＭＬは、好ましくは、遺伝子型的に、および表現型的に同一である。集団は、好ましくは、上記で定義されるように自己由来または同種異系である。
【００７２】
しかしながら、集団は、半同種異系であってもよい。半同種異系の集団は、典型的に、集団が投与される患者と免疫学的に適合する２以上の患者由来の単核細胞から生産される。換言すれば、集団内の全ての細胞は、好ましくは、遺伝学的に同一、または十分に遺伝学的に同一であり、その集団は、集団が投与される患者と免疫学的に適合する。本発明のＰＭＬは患者由来であり得るので、それらは、治療される患者の自己由来であり得る（すなわち、その患者と遺伝学的に同一であり、または、十分に遺伝学的に同一であり、その患者への投与に適合する）。
【００７３】
本発明の集団は、単離され、実質的に単離され、精製され、または実質的に精製されてよい。集団は、培地および他の細胞のような任意の他の構成要素から完全にフリーである場合、単離され、または精製されている。集団は、担体または希釈剤、例えば、その使用目的を妨げない培養培地と混合される場合、実質的に単離されている。他の担体および希釈剤は、以下にさらに詳細に述べられる。実質的に単離され、または実質的に精製された集団は、本発明のＰＭＬ以外の細胞を含まない。一部の実施態様では、本発明の集団は、成長マトリックスに存在してよく、または後述のように表面上に固定化されてよい。
【００７４】
集団は典型的に、インビトロで培養される。細胞を培養する技術は、当業者によく知られている。細胞は、血清無しの培地中で、３７℃、５％ＣＯ２の標準的な条件下で培養してよい。細胞は、好ましくは、以下にさらに詳細に述べる低酸素条件下で培養される。細胞は、平板のウェル、例えば標準的な６ウェルプレートを含む、任意の適切なフラスコまたは容器内で培養してよい。そのようなプレートは、Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＶＷＲ  ｓｕｐｐｌｉｅｒｓ、Ｎｕｎｃ、ＳｔａｒｓｔｅｄｔまたはＦａｌｃｏｎから市販される。ウェルは典型的に、約１ｍｌ〜約４ｍｌの容量を有する。
【００７５】
中に集団が収容され、または培養されるフラスコ、容器またはウェルは、ＰＭＬのハンドリングを促進するために変更してよい。例えば、フラスコ、容器またはウェルは、例えば、成長マトリックスを含むことにより、細胞の培養を促進するために変更してよい。フラスコ、容器またはウェルは、ＰＭＬの付着を可能にするために、または表面へのＰＭＬの固定化を可能にするために、変更してよい。１つまたは複数の表面は、細胞外マトリックスタンパク質、例えばラミニンまたはコラーゲン、または、細胞に結合して表面（単数または複数）上にそれらを固定化または捕捉する任意の他の捕捉分子で被覆してよい。
【００７６】
集団は、本明細書に記載の任意の技術を用いて、エクスビボで修飾してよい。例えば、集団は、治療薬または診断薬がトランスフェクトされ、またはロードされてよい。集団は、それから、以下にさらに詳細に述べる治療方法で使用してよい。
【００７７】
本発明のＰＭＬの生産方法
本発明はまた、本発明の集団、すなわち２以上の本発明のＰＭＬの集団を生産するための方法を提供する。その方法は、単核細胞（ＭＣ）がＰＭＬへ分化するのを誘導する条件下でＭＣを培養するステップを含む。その方法は、以下のＰＭＬを回収し、培養するステップを含む：
（ａ）検出可能なレベルのＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ２７１を発現し、検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない；
（ｂ）検出可能なレベルのＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２７１およびＣＸＣＲ１を発現し、検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない；
（ｃ）検出可能なレベルのＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２７１およびＣＸＣＲ２を発現し、検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない；
（ｄ）検出可能なレベルのＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２７１、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２を発現し、検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない；
（ｅ）検出可能なレベルのＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２７１、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ４を発現し、検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない（これらの細胞は、心臓帰巣および骨帰巣のＰＭＬである）；
（ｆ）検出可能なレベルのＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２７１、ＣＸＣＲ２およびＣＸＣＲ４を発現し、検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない（これらの細胞は、心臓帰巣および骨帰巣のＰＭＬである）；
（ｇ）検出可能なレベルのＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２７１、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＣＸＣＲ４を発現し、検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない（これらの細胞は、心臓帰巣および骨帰巣のＰＭＬである）；
（ｈ）検出可能なレベルのＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２７１、ＣＸＣＲ４、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、形質転換成長因子β１（ＴＧＦ−β１）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、ＣＸＣＬ１２、ＣＤ１０９、ＣＤ１１９、活性化Ｂ細胞の核因子κ−軽鎖−エンハンサー（ＮＦκＢ）、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ３０４、ＣＤ３０９およびＣＤ３２５を発現し、検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない（これらの細胞は、網膜帰巣のＰＭＬである）；または
（ｉ）検出可能なレベルのＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２７１、ＴＧＦ−β３、骨形成タンパク質−６（ＢＭＰ−６）、ＳＯＸ−９、コラーゲン−２、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１２（ＣＣＬ１２）、ＣＣＬ７、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血小板由来成長因子−Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＩＧＦ−１、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＰＤＧＦ−Ｒα、ＰＤＧＦ−Ｒβ、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｃケモカイン受容体タイプ１（ＣＣＲ１）、ＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、ＣＸＣＬ１２およびＮＦκＢを発現し、検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない（これらの細胞は、骨帰巣のＰＭＬである）。
【００７８】
回収細胞は、本発明の細胞に関して上述の因子のいずれかを過剰発現し得る。上記の（ａ）〜（ｉ）のうちのいずれか一つに加えて、その方法は、好ましくは、以下のＰＭＬを回収し、培養するステップを含む：
（ｊ）ＣＤ１２０ａ（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α受容体１）、ＣＤ１２０ｂ（ＴＮＦ−α受容体２）、ＣＤ５０（細胞間接着分子−３、ＩＣＡＭ−３）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ５８（リンパ球機能関連抗原−１、ＬＦＡ−１）、ＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ６２Ｐ（Ｐ−セレクチン）、ＣＤ１０６（血管細胞接着タンパク質、ＶＣＡＭ−１）、ＣＤ１０２（ＩＣＡＭ−２）、ＣＤ１６６（活性化白血球細胞接着分子）、ＣＤ１０４（インテグリンβ４）、ＣＤ１２３（インターロイキン−３受容体）、ＣＤ１２４（インターロイキン−４受容体）、ＣＤ１２６（インターロイキン−６受容体）、ＣＤ１２７（インターロイキン−７受容体）および線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）を検出可能なレベルで発現する；
（ｋ）  （ｉ）インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、（ｉｉ）ＩＧＦ−１受容体；（ｉｉｉ）Ｃ−Ｃケモカイン受容体タイプ１（ＣＣＲ１）、（ｉｖ）ストロマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）、（ｖ）低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）、（ｖｉ）Ａｋｔ１および（ｖｉｉ）肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）および／または顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のうちの１つまたは複数を検出可能なレベルで発現する；
（ｌ）  （ｋ）の（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうちの１つまたは複数を過剰発現する；
（ｍ）  （ｉ）血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、（ｉｉ）形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）、（ｉｉｉ）インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、（ｉｖ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、（ｖ）腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、（ｖｉ）インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）および（ｖｉｉ）インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）のうちの１つまたは複数を検出可能なレベルで発現する、
（ｎ）  （ｍ）の（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうちの１つまたは複数を過剰発現する。
【００７９】
単核細胞（ＭＣ）およびそれらを単離する方法は、当技術分野で知られている。ＭＣは、骨髄から単離される初期のＭＣであってよい。ＭＣは、好ましくは末梢血ＭＣ（ＰＢＭＣ）、例えば、リンパ球、単球および／またはマクロファージである。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）のような親水性多糖類を用いて血液から単離することができる。例えば、ＰＢＭＣは、実施例に開示するように、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）（市販の密度培地）を用いて血液から単離してよい。
【００８０】
培養する前に、ＭＣを間葉系幹細胞濃縮カクテルに曝してよい。そのカクテルは、好ましくは、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ６６ｂ（それらは不要な細胞上に存在する）および赤血球の構成要素を認識する抗体を含む。そのようなカクテルは、不要な細胞を赤血球と架橋してイムノロゼット（ｉｍｍｕｎｏｒｏｓｅｔｔｅ）を形成し、必要なＭＣから除去され得る。好ましいカクテルはＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（登録商標）である。
【００８１】
ＭＣが間葉系細胞（主に中胚葉由来の組織）に分化するのを誘導するのに適切な条件は、当技術分野で知られている。例えば、適切な条件は、Ｃａｐｅｌｌｉ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（Ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｌｙｓａｔｅ  ａｌｌｏｗｓ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｒａｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｓｍａｌｌ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ａｓｐｉｒａｔｅｓ  ｏｒ  ｍａｒｒｏｗ  ｆｉｌｔｅｒ  ｗａｓｈｏｕｔｓ．Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００７．４０：ｐ．７８５−７９１）に開示されている。これらの条件は、ＭＣが本発明によるＰＭＬに分化するのを誘導するために用いてもよい。
【００８２】
その方法は、好ましくは、ＭＣがＰＭＬに分化するのを誘導するために、ＭＣを血漿溶解物とともに培養するステップを含む。血小板溶解物とは、これらの血小板の溶解により放出された血小板に含まれる天然の成長因子の組み合わせをいう。溶解は、化学的方法（すなわちＣａＣｌ２）、浸透圧的方法（蒸留Ｈ２Ｏの使用）により、または凍結融解方法により、達成することができる。血小板溶解物は、米国特許第５，１９８，３５７号に記載のように、全血由来であることができる。血小板溶解物は、好ましくは、実施例に記載のように調製される。血漿溶解物は、好ましくは、ヒト血漿溶解物である。
【００８３】
好ましい実施態様では、本発明の方法のステップ（ａ）は、ＭＣが中胚葉系列の前駆細胞に分化するのを誘導するのに十分な時間、血小板溶解物を含む培地中でＭＣを培養するステップを含む。十分な時間は、典型的に、約１５〜約２５日、好ましくは約２２日である。培地は、好ましくは、容量で約２０％またはそれ未満、例えば容量で約１５％またはそれ未満、または、容量で約１０％またはそれ未満の血小板溶解物を含む。培地は、好ましくは、容量で約５％〜約２０％、例えば容量で約１０％〜約１５％の血小板溶解物を含む。培地は、好ましくは、容量で約１０％の血小板溶解物を含む。
【００８４】
別の好ましい実施態様では、本発明の方法のステップ（ａ）は、間葉系の濃縮カクテルにＭＣを曝すステップ、およびそれから、ＭＣが中胚葉系列の前駆細胞に分化するのを誘導するのに十分な時間、血小板溶解物を含む培地中でＭＣを培養するステップを含む。十分な時間は、典型的に、約１５〜約２５日、好ましくは約２２日である。
【００８５】
ステップ（ａ）では、培地は好ましくは最小必須培地（ＭＥＭ）である。ＭＥＭは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈを含む様々な供給源から市販される。培地は、好ましくは、ヘパリン、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトアビジン（Ｐ／Ｓ）のうちの１つまたは複数をさらに含む。Ｌ−グルタミンは、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販される）で置き換えてよい。
【００８６】
上述のように、本発明のＰＭＬのいくつかは、検出可能なレベルのＣＸＣＲ４を発現する。ＣＸＣＲ４の発現はサイトカイン依存的であり、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、Ｆｌｔ−３リガンド、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）およびＩＬ−３に細胞を曝すと増加する。培地は、（ｉ）ＳＣＦ、（ｉｉ）ＩＬ−６、（ｉｉｉ）Ｆｌｔ−３リガンド、（ｉｖ）肝細胞増殖因子および（ｖ）ＩＬ−３、例えば、（ｉ）；（ｉｉ）；（ｉｉｉ）；（ｉｖ）；（ｖ）；（ｉ）および（ｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉ）および（ｉｖ）；（ｉ）および（ｖ）；（ｉｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉ）および（ｖ）；（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉｉ）および（ｖ）；（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；または（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）のうちの１つまたは複数を含んでよい。（ｉ）〜（ｖ）のいずれかは、約１０〜約１５０ｎｇ／ｍｌで存在してよい。
【００８７】
ステップ（ａ）は、好ましくは、ＰＭＬが付着するのを可能にする条件下で、ＭＣを培養するステップを含む。適切な条件は、上記にさらに詳細に記載されている。
【００８８】
ステップ（ａ）では、ＭＣは、好ましくは低酸素条件下で培養される。ＭＣは、好ましくは、約２０％未満の酸素（Ｏ２）で、例えば、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満または約１％未満の酸素（Ｏ２）で培養される。ＭＣは、好ましくは、約０％〜約１９％Ｏ２で、例えば、約１％〜約１５％Ｏ２、約２％〜約１０％Ｏ２または約５％〜約８％Ｏ２で培養される。ＭＣは、最も好ましくは、約０％Ｏ２で培養される。上記に示される％酸素（または％Ｏ２）に関する数字は、例えば細胞インキュベーターにより、培養中に細胞に供給されるガス中の酸素の容量での％に関する。酸素の一部はインキュベーター内に漏れ得て、または、ドアーが開いているときに入り得ることが可能である。
【００８９】
ステップ（ａ）では、ＭＣは、最も好ましくは、血小板溶解物の存在下および低酸素条件下で培養される。この組み合わせは、損傷組織内の自然状態を模倣し、したがって、より健康でより治療的に強力な細胞をもたらす。従来の細胞培養は、２０％または２１％酸素（およそ大気の含有量）で行われるが、ヒト体内に、この酸素レベルを有する場所はない。肺内の上皮細胞は、この酸素レベルを「見る」が、酸素が溶解して肺を去る時点で、１７％付近に減少する。それから、組織の大部分でさらにいっそう、約１〜２％に減少するが、関節内の軟骨のような無血管組織では０．１％という低さになる。
【００９０】
ステップ（ｂ）では、その方法は、さらに、上述の必須マーカー発現パターンを有するＰＭＬを回収し、培養することを含む。必須マーカー発現パターンを有するＰＭＬは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）および磁気ビーズ分離を含む、任意の、抗体に基づく技術を用いて回収してよい。ＦＡＣＳが好ましい。
【００９１】
ステップ（ａ）に関して開示された、ＰＭＬを培養するステップに関する任意の方法は、ステップ（ｂ）に等しく適用する。特に、細胞は、ステップ（ａ）に関して上述のように、血小板溶解物存在下および低酸素条件下で、ステップ（ｂ）において培養される。
【００９２】
上述から明らかなように、本発明の方法は、臨床的に意義のある条件、すなわち、微量のエンドトキシンおよび他の環境汚染物質、例えば、リポ多糖類、リポペプチドおよびペプチドグリカンなどの不存在下で行われる。このことは、本発明のＰＭＬを、特に患者への投与に適切にする。
【００９３】
ＭＣは、好ましくは、患者または同種異系ドナーから得られる。本発明はまた、患者への投与に適切な、本発明の集団を生産するための方法を提供し、ここで、その方法は、ＭＣが中胚葉系列の前駆細胞に分化するのを誘導する条件下で、患者由来のＭＣを培養するステップ、および、（ｂ）上記定義の発現パターンを有する前駆細胞を回収し、培養して、それにより、患者への投与に適切な本発明の集団を生産するステップ、を含む。集団は患者の自己由来であり、したがって、移植のときに拒絶されない。本発明はまた、患者への投与に適切でありかつ本方法で生産される、本発明の集団を提供する。
【００９４】
あるいは、本発明は、患者への投与に適切な本発明の集団を生産するための方法を提供し、ここで、その方法は、細胞が投与される患者と免疫学的に適合する異なる患者由来のＭＣを、ＭＣが中胚葉系列の前駆細胞に分化するのを誘導する条件下で培養するステップ、および、（ｂ）上記定義の発現パターンを有する前駆細胞を回収し、培養して、それにより、患者への投与に適切な本発明の集団を生産するステップ、を含む。集団は患者と同種異系であり、したがって移植のときの拒絶の可能性を減らす。本発明はまた、患者への投与に適切でありかつ本方法で生産される、本発明の集団を提供する。
【００９５】
薬剤、方法および治療用途
本発明のＰＭＬは、ヒトまたは動物の体の治療方法で用いてよい。したがって、本発明は、治療によるヒトまたは動物の体の治療方法での使用のための、本発明のＰＭＬまたは本発明の集団を提供する。特に、本発明は、患者での損傷組織を修復するための、本発明のＰＭＬの使用に関する。本発明はまた、患者での、心臓の外傷または疾患、加齢黄斑変性、または、骨の外傷または疾患を治療するための、本発明のＰＭＬの使用に関する。
【００９６】
本発明は、本発明の集団を患者に投与するステップ（前記集団は、治療的に有効数の細胞を含む）、および、それにより、患者での損傷組織を治療するステップ、を含む、患者での損傷組織を修復する方法を提供する。本発明はまた、患者での損傷組織の修復での使用のための本発明の集団を提供する。本発明はまた、患者での損傷組織を修復するための薬剤の製造での本発明の集団の使用を提供する。
【００９７】
組織は、好ましくは中胚葉由来である。組織は、さらに好ましくは、心臓組織、網膜組織または骨組織である。
【００９８】
組織への損傷は、外傷または疾患に起因し得る。外傷または疾患は、好ましくは、患者での、心臓の外傷または疾患、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、または、骨の外傷または疾患である。本発明は、したがって、本発明の集団を患者に投与するステップ（前記集団は、治療的に有効数の細胞を含む）、および、それにより、患者での、心臓の外傷または疾患、加齢黄斑変性、または、骨の外傷または疾患を治療するステップ、を含む、患者での、心臓の外傷または疾患、加齢黄斑変性、または、骨の外傷または疾患を治療する方法を提供する。本発明はまた、患者での、心臓の外傷または疾患、加齢黄斑変性、または、骨の外傷または疾患の治療での用途のための、本発明の集団を提供する。本発明はまた、患者での、心臓の外傷または疾患、加齢黄斑変性、または、骨の外傷または疾患を治療するための薬剤の製造での、本発明の集団の使用を提供する。
【００９９】
心臓の外傷または疾患は、好ましくは、心筋梗塞（ＭＩ）、左室肥大、右室肥大、塞栓、心不全、先天性心臓欠損（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｈｅａｒｔ  ｄｅｆｉｃｉｔ）、心臓弁膜症、不整脈、および、心筋炎から選択される。
【０１００】
ＭＩは、心筋により放出されるＶＥＧＦおよびＥＰＯのレベルを増大させる。さらに、ＭＩは、炎症性反応と関連し、また、梗塞組織は、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、インターロイキン（ＩＬ−６）およびＫＣ／Ｇｒｏ−αも放出する。ＣＣＬ７（以前はＭＣＰ３として知られていた）、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２は、心筋梗塞（ＭＩ）の後に心臓内で著しく上方制御され、梗塞心筋へのＭＳＣの帰巣および生着の制御に関与し得る。
【０１０１】
心筋梗塞マウスモデルでは、ＩＬ−８は、まず、ＭＩ後の最初の２日に、遺伝子発現を高度に上方制御することが示された。驚くべきことに、ＩＬ−８発現は、主に梗塞領域および境界領域で増加し、残りの心筋では、非常に少なかった。ＣＸＣＲ２を活性化することにより、ＭＩＦは、ケモカイン様の機能を示し、そして、炎症性細胞動員およびアテローム発生の主なレギュレーターとしての役割を果たす。
【０１０２】
ＡＭＤは、乾燥ＡＭＤまたは湿潤ＡＭＤであってよい。乾燥ＡＭＤは、網膜の下の網膜色素上皮層の萎縮により生じ、それは、眼の中央部での光受容体（杆体および錐体）の喪失を介して失明を引き起こす。湿潤ＡＭＤは、ブルッフ膜を介した、脈絡毛細管板での異常な血管増殖（脈絡膜血管新生）に起因して失明を引き起こし、最終的に、黄斑下での血液およびタンパク質の漏出をもたらす。湿潤ＡＭＤは、黄斑での色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）のレベルの減少と関連する。湿潤ＡＭＤの処置で用いられるＰＭＬは、好ましくは、ＰＥＤＦを検出可能なレベルで発現し、またはＰＥＤＦを過剰発現する。
【０１０３】
骨の疾患または外傷は、好ましくは、骨折、ソルター−ハリス骨折、若木骨折、骨棘、頭蓋骨癒合症、コフィン−ローリー症候群、進行性骨化性線維異形成症、線維性骨異形成症、フォング病（Ｆｏｎｇ  Ｄｉｓｅａｓｅ）（または爪膝蓋骨症候群）、低ホスファターゼ症、クリッペル−ファイル症候群、代謝性骨疾患、爪膝蓋骨症候群、変形性関節症、変形性骨炎（または骨パジェット病）、嚢胞性線維性骨炎（または線維性骨炎またはフォンレックリングハウゼン骨病）、恥骨骨炎、硬化性骨炎（ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ  ｏｓｔｅｉｔｉｓ）（または硬化性骨炎（ｏｓｔｅｉｔｉｓ  ｃｏｎｄｅｎｓａｎｓ））、硬化性腸骨炎、離断性骨軟骨炎、骨形成不全症、骨軟化症、骨髄炎、骨減少症、大理石骨病、骨粗鬆症、骨壊死、骨萎縮性骨化過剰症（ｐｏｒｏｔｉｃ  ｈｙｐｅｒｏｓｔｏｓｉｓ）、原発性副甲状腺機能亢進症、腎性骨ジストロフィー、骨がん、転移性がんと関連する骨病変、ゴーハム・スタウト病（Ｇｏｒｈａｍ  Ｓｔｏｕｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）、原発性副甲状腺機能亢進症、歯周病、および、関節置換の無菌的弛み（ａｓｅｐｔｉｃ  ｌｏｏｓｅｎｉｎｇ）から選択される。骨がんは、ユーイング肉腫、多発性骨髄腫、骨肉腫（骨の巨大な腫瘍）、骨軟骨腫または破骨細胞腫であり得る。骨病変をもたらす転移性がんは、乳がん、前立腺がん、腎臓がん、肺がん、および／または、成人Ｔ細胞白血病であり得る。
【０１０４】
損傷組織が心臓組織または骨組織である場合は、集団内のＰＭＬは、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２７１、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＣＸＣＲ４を発現し、検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない。損傷組織が骨組織である場合は、集団内のＰＭＬは、さらに好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２７１、ＴＧＦ−β３、骨形成タンパク質−６（ＢＭＰ−６）、ＳＯＸ−９、コラーゲン−２、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１２（ＣＣＬ１２）、ＣＣＬ７、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血小板由来成長因子−Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＩＧＦ−１、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＰＤＧＦ−Ｒα、ＰＤＧＦ−Ｒβ、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｃケモカイン受容体タイプ１（ＣＣＲ１）、ＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、ＣＸＣＬ１２およびＮＦκＢを発現し、検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない。
【０１０５】
損傷組織が網膜組織である場合は、集団内のＰＭＬは、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２７１、ＣＸＣＲ４、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、形質転換成長因子β１（ＴＧＦ−β１）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、ＣＸＣＬ１２、ＣＤ１０９、ＣＤ１１９、活性化Ｂ細胞の核因子κ−軽鎖−エンハンサー（ＮＦκＢ）、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ３０４、ＣＤ３０９およびＣＤ３２５を発現し、検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない。
【０１０６】
全ての例において、本発明のＰＭＬは、好ましくは、患者または同種異系ドナー由来である。本発明のＰＭＬが患者に由来することは、患者の免疫系によりＰＭＬ自体が拒絶されないことを確実にするであろう。ドナーとレシピエント間の任意の違いは、損傷組織の少なくとも一部が修復される前にではないが、最終的にＰＭＬのクリアランスをもたらす。
【０１０７】
本発明は、患者に、治療的に有効数の本発明のＰＭＬを、患者に投与することに関する。治療的に有効数は、損傷、疾患または外傷の症状のうちの１つまたは複数を改善する数である。治療的に有効数は、好ましくは、損傷組織を修復する数、または、疾患または外傷を治療する数である。適切な数は、以下にさらに詳細に述べられる。
【０１０８】
本発明のＰＭＬは、任意の適切な患者に投与してよい。患者は一般に、ヒト患者である。患者は、幼児、子供または大人であってよい。患者は、損傷組織を有することが知られていてよく、または、損傷組織を有する疑いがある。患者は、関連のある疾患または外傷を起こしやすくてよく、または、そのリスクがあってよい。例えば、患者は、遺伝学的に心不全にかかりやすくてよい。
【０１０９】
本発明は、損傷組織を修復するため、または疼痛緩和を与えるための、他の方法および物質と組み合わせて用いてよい。ある場合には、本発明のＰＭＬは、損傷組織を修復する目的または疼痛緩和を与える目的の他の物質と、同時に、連続して、または、別々に投与してよい。ＰＭＬは、損傷組織のための現存の治療と組み合わせて用いてよく、および、例えば、そのような治療と単にミックスしてよい。したがって、本発明は、損傷組織の現存の治療の有効性を高めるために用いてよい。
【０１１０】
本発明は、好ましくは、治療薬および／または診断薬がロードまたはトランスフェクトされたＰＭＬの用途に関する。治療薬は、損傷組織の修復を補助してよい。蛍光分子のような診断薬は、患者でのＰＭＬの位置を特定するのを補助してよい。ＰＭＬは、当技術分野で知られている任意の方法を用いてロードまたはトランスフェクトされてよい。ＰＭＬのローディングは、インビトロまたはエクスビボで行われてよい。それぞれの場合において、ＰＭＬは、培地で薬剤と単純に接触してよい。あるいは、ＰＭＬは、リポソームのようなデリバリービヒクルを用いて、薬剤がロードされてよい。そのようなビヒクルは当技術分野で知られている。
【０１１１】
ＰＭＬのトランスフェクションは、インビトロまたはエクスビボで行なわれてよい。あるいは、安定したトランスフェクションは、ＭＣ段階に行なわれてよく、導入遺伝子を発現するＰＭＬがそれから分化するのを可能にする。ＰＭＬは、薬剤をコードする核酸でトランスフェクトされる。例えば、薬剤をコードするウイルス粒子または他のベクターを用いてよい。これを行うための方法は、当技術分野で知られている。
【０１１２】
その核酸は、ＰＭＬでの薬剤の発現を増大させる。核酸分子は、好ましくは、薬剤をコードする配列に作動可能に連結され、かつ、ＰＭＬにおいて活性であり、または、ＰＭＬにおいて誘導され得る、プロモーターを含む。
【０１１３】
特に好ましい実施態様では、薬剤をコードする核酸は、ウイルス粒子を介して送達されてよい。ウイルス粒子は、効率的なトランスフェクションを確実にするための標的化分子を含んでよい。標的化分子は、典型的に、その分子が、ウイルスをＰＭＬに標的化することができるように、ウイルス表面上に全体的に、または部分的に与えられる。
【０１１４】
任意の適切なウイルスを、そのような実施態様で用いてよい。ウイルスは、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス、または、単純ヘルペスウイルスであってよい。特に好ましい実施態様では、ウイルスはレンチウイルスであってよい。レンチウイルスは、遺伝子を送達する用途に適切な修飾ＨＩＶウイルスであってよい。レンチウイルスは、ＳＩＶ、ＦＩＶ、またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＱＩＡ）に基づくベクターであってよい。ウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）であってよい。本発明で用いられるウイルスは、好ましくは複製欠損型である。
【０１１５】
ウイルス粒子を使用する必要はない。従来のプラスミドＤＮＡまたはＲＮＡトランスフェクションなど、本発明のＰＭＬをトランスフェクトすることが可能な任意のベクターを用いてよい。
【０１１６】
核酸コンストラクトの取り込みは、様々な公知のトランスフェクション技術、例えばトランスフェクション剤の使用を含む技術によって、増強され得る。これらの試薬の例は、カチオン剤、例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストラン、および、リポフェクタント（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｎｔ）、例えば、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ）、フュージーン（ｆｕｇｅｎｅ）およびトランスフェクタム（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）を含む。
【０１１７】
細胞は、適切な条件下でロードまたはトランスフェクトされてよい。細胞および薬剤またはベクターは、例えば、５分〜１０日間、好ましくは１時間〜５日間、さらに好ましくは５時間〜２日間、およびさらにより好ましくは１２時間〜１日、接触してよい。
【０１１８】
本発明はまた、上述の薬剤がロードまたはトランスフェクトされたＰＭＬを提供する。そのようなＰＭＬは、本発明の治療的実施態様で用いてよい。
【０１１９】
一部の実施態様では、ＭＣは、患者から回収して、本発明を用いてＰＭＬに変換して、インビトロでロードまたはトランスフェクトして、そしてそれから、その同一患者に戻してよい。そのような例では、本発明で用いられるＰＭＬは自己由来細胞であり、その患者と完全一致である。好ましい例では、本発明で用いられる細胞は、患者から回収されて、エクスビボで用いられ、その後にその同一患者に戻される。
【０１２０】
［医薬組成物および投与］
本発明は、（ａ）本発明のＰＭＬまたは本発明の集団、および、（ｂ）薬学的に許容できる担体または希釈剤を含む医薬組成物をさらに提供する。その組成物は、本明細書に記載の任意のＰＭＬまたは集団を含んでよく、および、一部の実施態様では、本明細書に記載の核酸分子、ベクター、またはウイルスを含んでよい。本発明は、有効量の本発明の医薬組成物を患者に投与するステップを含む、患者での損傷組織を修復する方法を提供する。上述の任意の治療的実施態様は、本実施態様に等しく適用する。
【０１２１】
本発明の様々な組成物は、任意の適切な方法を用いて製剤化されてよい。標準的な薬学的に許容できる担体および／または賦形剤での細胞の製剤化は、製剤分野での常法を用いて行なってよい。製剤の厳密な性質は、投与される細胞および所望の投与経路を含む様々な因子に依存する。適切な製剤タイプは、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡに完全に記載されている。
【０１２２】
細胞は、任意の経路で投与してよい。適切な経路は、限定されないが、静脈内、筋肉内、腹腔内または他の適切な投与経路を含む。損傷組織が網膜組織である場合は、細胞は、眼に投与してよい。損傷組織が心臓組織である場合は、細胞は、心内膜心筋、心筋上（ｅｐｉｍｙｏｃａｒｄｉａｌ）、心室内、冠動脈内、逆行性冠状静脈洞、動脈内、心膜内または静脈内の経路を介して投与してよい。損傷組織が骨である場合は、細胞は、骨内経路を介して、または、骨折のような外傷、または疾患の部位へ、投与してよい。細胞は、好ましくは静脈内投与される。
【０１２３】
組成物は、生理的に許容できる担体または希釈剤とともに調製してよい。典型的に、そのような組成物は、細胞の液体懸濁液として調製される。細胞は、薬学的に許容でき、かつ、活性成分と適合する、賦形剤と混合してよい。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール等およびそれらの組み合わせである。
【０１２４】
加えて、必要に応じて、本発明の医薬組成物は、少量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／または、効果を高めるアジュバントを含んでよい。組成物は、好ましくは、ヒト血清アルブミンを含む。
【０１２５】
適切な担体または希釈剤の一つは、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ  Ａ（登録商標）である。これは、静脈内投与のための、滅菌の、非発熱性の等張液である。各１００ｍＬは、５２６ｍｇの塩化ナトリウム、ＵＳＰ（ＮａＣｌ）；５０２ｍｇのグルコン酸ナトリウム（Ｃ６Ｈ１１ＮａＯ７）；３６８ｍｇの酢酸ナトリウム三水和物、ＵＳＰ（Ｃ２Ｈ３ＮａＯ２・３Ｈ２Ｏ）；３７ｍｇの塩化カリウム、ＵＳＰ（ＫＣｌ）；および３０ｍｇの塩化マグネシウム、ＵＳＰ（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）を含む。それは、抗菌剤を含まない。ｐＨは水酸化ナトリウムで調整される。ｐＨは７．４（６．５〜８．０）である。
【０１２６】
ＰＭＬは、投与製剤と適合する方法で、かつ治療的に有効量で投与される。投与されるべき量は、治療されるべき対象、対象の免疫系の能力および所望の修復度合に依存する。投与が必要なＰＭＬの正確な量は、熟練者の判断に依存してよく、および、各対象に特有であってよい。
【０１２７】
任意の適切な細胞数を、対象に投与してよい。例えば、患者のｋｇあたり少なくとも、または、約、０．５×１０６、１．５×１０６、４．０×１０６または５．０×１０６の細胞を投与してよい。例えば、少なくとも、または、約、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９の細胞を投与してよい。目安として、投与される本発明の細胞数は、１０５〜１０９、好ましくは１０６〜１０８であってよい。典型的に、最大で２×１０８までのＰＭＬが、各患者に投与される。本発明の集団に関して上述された、任意の具体的な数を投与してよい。細胞が投与され、または存在するような場合は、細胞の生存を促進するための培地が存在してよい。ある場合には、本発明の細胞は、凍結アリコート中に与えられてよく、ＤＭＳＯのような物質が、凍結中の生存を促進するために存在してよい。そのような凍結細胞は、典型的に、解凍されて、それから、維持または投与のいずれかのために、バッファー中または培地中に置かれる。
【０１２８】
以下の実施例は、本発明を説明する。
【実施例】
【０１２９】
材料および方法
【０１３０】
患者から血液を採取した時点で、中胚葉起源の前駆細胞を、衛生的条件下で、幹細胞実験室において調製した；細胞または他の材料を含む開放容器は、ラミナーフローフード下で取り扱った。それぞれの調製ステップで、サンプルを抜き取り、幹細胞数および生存率を決定した。
【０１３１】
単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）１．０７３密度遠心分離により全血から単離し、α−ＭＥＭ−ＰＬ中で５日間培養した。付着した細胞を回収して、それらの免疫表現型を、フローサイトメトリー分析により、多くの細胞マーカー（以下参照）に関する免疫蛍光染色により決定した。適切なアイソタイプコントロールを、それぞれの染色方法のために用いた。
【０１３２】
細胞生存率は、１％トリパンブルー溶液で評価した。細胞は、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，  Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により計数される。細胞は、また、マイコプラズマ、生殖不能（グラム染色により評価される）、エンドトキシン、同一性、純度、および、生存率、および、染色体異常を除外するための核型分析に関して試験した。
【０１３３】
以下は、細胞をどのようにして実際に得たかを要約する。
１．  ２０ｍｌの末梢血を患者から採取した。
２．  １１．５ｍｌの残存血液を、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ（登録商標）１．０７３を通過させた。
３．  これを遠心分離して単核細胞を得て、これらを、以下のいずれか：
４ａ．  ０％酸素中で８日間、培養下で増殖させた、または
４ｂ．  ロゼット分離（Ｒｏｓｅｔｔｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）を行い、それから、０％酸素中で８日間、培養下で増殖させた。
５．  培地を交換し、０％酸素中で１４日間、細胞を培養した。
６．  細胞を回収して、ＦＡＣＳを行なった。
【０１３４】
様々なマーカーを、ＲＴ−ＰＣＲおよびＦＡＣＳ分析を用いて調べた。調べた主なマーカーは、ＣＤ１４、ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２７１、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２およびＣＤ１８４であった。
【０１３５】
以下は、用いられた実際のプロトコルである。
【０１３６】
［多血小板血漿（ＰＲＰ）の調製］
１．  血液サンプルを、２本の１５ｍｌファルコンチューブに、それぞれ>８ｍｌに分けた。
２．  １２０×ｇで１５分、ブレーキなし、室温で（ＲＴ）遠心分離した。
３．  多血小板血漿（ＰＲＰ）の上清を、新しい１５ｍｌファルコンチューブに移した。
４．  移したＰＲＰ量を記録した。
５．  ＰＲＰ量を、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で置換した。
【０１３７】
［培養培地の調製］
１．  Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ機器を用いた自動血液分析のために、０．３ｍｌのＰＲＰをエッペンドルフチューブに移した。理論上の血小板の最大数を計算した。
理論上の血小板の最大数＝血小板濃度×ＰＲＰ量
２．  凍結保存（−８０℃）のために、０．２５ｍｌのＰＲＰをエッペンドルフチューブに移した。
３．  残存ＰＲＰを、１６１０×ｇ、１０分、ＲＴ、ブレーキ付きで遠心分離した。
４．  血小板フリー血漿（ＰＦＰ）の上清を別のファルコンチューブ内へ取り出し、血小板ペレットを、１×１０９細胞／ｍｌの濃度を与える量のＰＦＰで再懸濁した（理論上の血小板の最大数（１．５×１０９を目標とする）を用いて１×１０９を獲得する）。
５．  凍結保存（−８０℃）のために、残存ＰＦＰを０．２５ｍｌアリコートでエッペンドルフチューブ内に移した。
６．  ＰＲＰファルコンチューブの蓋を、パラフィルムで包んだ。
７．  ファルコンチューブを、液体窒素中に５分間浸した。
８．  ファルコンチューブを、解凍するまで３７℃のウォーターバスに浸した。
９．  ステップ７およびステップ８を、さらに３回繰り返した。
１０．  αＭＥＭ、５Ｕ／ｍｌのヘパリン、２ｍＭのグルタマックス（ｇｌｕｔａｍａｘ）、１％のＰ／Ｓに対して１０％のＰＬを加えることにより（すなわち、１．５ｍｌのＰＬを１３．５ｍｌの培地に加える）、培養培地を作製した。
【０１３８】
［ＭＮＣの単離］
１．  希釈血液サンプル量（１６．５ｍｌ）を、新しい５０ｍｌファルコンチューブ内へ混合した。
２．  血液サンプルを、さらに、ＨＢＳＳで約３３ｍｌに、１：２希釈した。
３．  １５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ  １．０７３を、２本の新しい５０ｍｌファルコンチューブに加えた。
４．  希釈血液サンプルを、チューブを傾けてサンプルをゆっくりチューブの壁に対して排出させることにより、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅの上部に注意深く層化した。
５．  これを、４００×ｇ、３５分、ブレーキ無し、ＲＴで遠心分離した。
６．  柔らかいパスツールピペットを用いて、混濁単核細胞層を乱さずに、出来る限り多くの上清（ＨＢＳＳ）を捨てた。
７．  透明なＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅの上部に存在する混濁単核細胞層を、新しい５０ｍｌチューブに吸引して、プールした。
８．  移したＭＮＣの量を、１０ｍｌピペットにそれを吸引することにより、記録した。
９．  その半量を、新しい５０ｍｌチューブに移した。
１０．  ＨＢＳＳを含む少なくとも３倍のサンプル量、すなわち約１３ｍｌで、両チューブ内でＭＮＣを希釈した。
１１．  両チューブを、５００×ｇ、１５分、ブレーキ付き、ＲＴで遠心分離した。
１２．  上清を捨てた。
１３．  チューブのうちの一つを、およそ１００万ＭＮＣ／ｍｌ、約５ｍｌに再懸濁した。
【０１３９】
［Ｒｏｓｅｔｔｅ−Ｓｅｐ濃縮］
１．  ２つめのＭＮＣペレットを、最初の０．７５ｍｌアリコート由来の６６０μＬ全血で再懸濁した。
２．  ３３μＬのＲｏｓｅｔｔｅ−Ｓｅｐを加えて、ピペッティングにより混合した。
３．  これを、２０分間、室温でインキュベートした。
４．  ７００μＬのＨＢＳＳを、合計サンプル量約１．４ｍｌまで加えることにより、サンプルを１：２希釈した。
５．  １ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを、新しい１５ｍｌファルコンチューブに加えた。
６．  希釈血液サンプルを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅの上部に注意深く層化した。
７．  これを、４００×ｇ、３５分、ブレーキ無し、ＲＴで遠心分離した。
８．  その上清を、１ｍｌシングルチャンネルピペットでそれを吸引することにより捨てた。
９．  Ｆｉｃｏｌｌ上部の混濁細胞層を、新しい１５ｍｌファルコンチューブに移した。
１０．  富化細胞の量を記録して、それらをＨＢＳＳを含む少なくとも３倍のサンプル量、すなわち約３ｍｌで希釈した。
１１．  細胞を、５００×ｇ、１５分、ブレーキ付き、ＲＴで、遠心分離した。
１２．  上清を捨てた。
１３．  ペレットを０．５ｍｌに再懸濁した。
【０１４０】
［細胞培養］
１．  細胞を、自己由来または同種異系のいずれかの血小板溶解培地に、１．０×１０５細胞のシーディング密度でまいた。
２．  これを、適切な培地量で上いっぱいまで満たした。
３．  細胞を、３７℃、０％Ｏ２、５％ＣＯ２で、８日間インキュベートした。
４．  培地を８日目に換えて、細胞を１４日目までインキュベートした。
５．  コロニーを拾って新しい培養容器に移した。同種異系の血小板溶解培地を加えた。
６．  細胞の培養および継代を、およそ５×１０５〜１×１０６の細胞が得られるまで続けた。
７．  細胞を回収してフローサイトメトリーにより分析し、そして、必要に応じて、細胞を凍結保存した。
【０１４１】
［帰巣および抗炎症性テスト］
本発明により生産された細胞を、マウスにおいて、特定の損傷組織へ帰巣して、そこで抗炎症効果を誘導する、それらの能力に関して試験した。帰巣については、細胞は蛍光剤で標識して、マウス体内でのそれらの位置を、生物発光を用いて決定した。
【０１４２】
抗炎症効果については、インターロイキン（例えばＩＬ−８）、セレクチン、接着分子（例えばＩＣＡＭ−１）および化学誘引タンパク質（例えばＭＣＰ−１およびＴＮＦ−α）を含む、様々な炎症性マーカーに関する酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を行なった。
【０１４３】
結果
［全ての細胞］
本発明により生産された、中胚葉系列の前駆細胞の全てが、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ２７１を発現したが、ＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しなかった。ＣＤ４４の存在およびＣＤ３４の不存在を示す、例示的なＲＴ−ＰＣＲゲルを図１に示す。
【０１４４】
例示的なＦＡＣＳの結果のセットを、図２〜図４に示す。これらは、細胞が、少なくともＣＤ７３およびＣＤ９０に関してポジティブで、ＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５に関してネガティブであることを確証する。
【０１４５】
細胞は典型的に、１０〜２０μｍの直径である。細胞は典型的に、紡錘形の形態を有し、線維芽細胞様である（すなわち、それらは数個の長細い細胞突起を持つ小細胞体を有する）。
【０１４６】
［帰巣する細胞］
特定の損傷組織に帰巣することが可能な細胞は、ケモカイン受容体タイプ１および２（ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２）を発現することが示された。
【０１４７】
損傷した心臓組織および骨組織に帰巣することが可能な細胞は、ＣＸＣＲ４を発現することが示された。図５は、ＣＸＣＲ４ポジティブの細胞は、損傷した骨に帰巣することが可能であることを示す。図５に示される実験による結果を以下に要約する。
【表１】
2014520523.tif 000002
【０１４８】
上記の表は、ＢＬＩシグナルの半定量的分析を示す。光子／秒／ｃｍ２／ｓｒとして測定される骨折脛骨部位の関心領域（ＲＯＩ）でのシグナルを、対側の非骨折脛骨における同じＲＯＩ内にみられるバックグラウンドシグナルを差し引くことにより標準化した。ａはＣＸＣＲ４グループに対してｐ<．０５；ｂはＣＸＣＲ４グループに対してｐ<．０１；ｃは、ＰＭＬに対してｐ<．０５である（Ｔｕｋｅｙ事後テストによる）。略称：ＡＮＯＶＡ、分散分析；ＰＭＬ、中胚葉系列の前駆細胞。
【０１４９】
損傷した網膜組織に帰巣することができる細胞は、ＣＸＣＲ４、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、形質転換成長因子β１（ＴＧＦ−β１）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、ＣＸＣＬ１２、ＣＤ１０９、ＣＤ１１９、活性化Ｂ細胞の核因子κ−軽鎖−エンハンサー（ＮＦκＢ）、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ３０４、ＣＤ３０９およびＣＤ３２５を発現することが示された。
【０１５０】
損傷した骨組織に帰巣することが可能な細胞、および、その細胞は、検出可能なレベルのＴＧＦ−β３、骨形成タンパク質−６（ＢＭＰ−６）、ＳＯＸ−９、コラーゲン−２、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１２（ＣＣＬ１２）、ＣＣＬ７、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血小板由来成長因子−Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＩＧＦ−１、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＰＤＧＦ−Ｒα、ＰＤＧＦ−Ｒβ、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｃケモカイン受容体タイプ１（ＣＣＲ１）、ＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、ＣＸＣＬ１２およびＮＦκＢを発現する。
【０１５１】
［抗炎症効果］
本発明により生産された細胞は、以下の抗炎症性マーカー：ＣＤ１２０ａ（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α受容体１）、ＣＤ１２０ｂ（ＴＮＦ−α受容体２）、ＣＤ５０（細胞間接着分子−３、ＩＣＡＭ−３）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ５８（リンパ球機能関連抗原−１、ＬＦＡ−１）、ＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ６２Ｐ（Ｐ−セレクチン）、ＣＤ１０６（血管細胞接着タンパク質、ＶＣＡＭ−１）、ＣＤ１０２（ＩＣＡＭ−２）、ＣＤ１６６（活性化白血球細胞接着分子）、ＣＤ１０４（インテグリンβ４）、ＣＤ１２３（インターロイキン−３受容体）、ＣＤ１２４（インターロイキン−４受容体）、ＣＤ１２６（インターロイキン−６受容体）、ＣＤ１２７（インターロイキン−７受容体）および線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）を発現することが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
2014520523.tif 000007
【図５】
2014520523.tif 000008
【国際調査報告】
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