(57)【要約】  本開示は、全身性紅斑性狼瘡および他の自己免疫状態を処置する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）発現を増加させることを必要とする対象のインターロイキン−２（ＩＬ−２）発現を増加させる方法であって、マイクロＲＮＡ−３１の発現を増加させるか、またはＲｈｏＡの発現を減少させる有効量の組成物を前記対象に投与するステップを含み、インターロイキン−２（ＩＬ−２）発現を増加させることを必要とする前記対象は全身性紅斑性狼瘡を有する対象である方法。
【請求項２】
全身性紅斑性狼瘡を有する対象のＴ細胞においてインターロイキン−２（ＩＬ−２）発現を増加させる方法であって、マイクロＲＮＡ−３１の発現を増加させるか、またはＲｈｏＡの発現を減少させる有効量の組成物と前記Ｔ細胞を接触させるステップを含む方法。
【請求項３】
全身性紅斑性狼瘡を処置する方法であって、全身性紅斑性狼瘡の処置を必要とする対象に、前記自己免疫状態を処置するため、マイクロＲＮＡ−３１の発現を増加させるか、またはＲｈｏＡの発現を減少させる有効量の組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項４】
ＲｈｏＡの発現を減少させることを必要とする対象のＲｈｏＡの発現を減少させる方法であって、マイクロＲＮＡ−３１の発現を増加させる有効量の組成物を前記対象に投与するステップを含み、ＲｈｏＡの発現を減少させることを必要とする前記対象は全身性紅斑性狼瘡を有する対象である方法。
【請求項５】
全身性紅斑性狼瘡を有する対象のＴ細胞におけるＲｈｏＡの発現を減少させる方法であって、マイクロＲＮＡ−３１の発現を増加させる有効量の組成物と前記Ｔ細胞を接触させるステップを含む方法。
【請求項６】
全身性紅斑性狼瘡を有する前記対象が疾患フレアの症状を呈している、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
全身性紅斑性狼瘡を有する前記対象が疾患フレアの症状を呈していない、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記対象の症状がループス腎炎を含む、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｔ細胞がインビトロ活性化Ｔ細胞である、請求項２または請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物がマイクロＲＮＡ−３１の発現を増加させるヌクレオチド配列を含む核酸を含む、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物がＲｈｏＡの発現を減少させるヌクレオチド配列を含む核酸を含む、請求項１ないし請求項１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物がマイクロＲＮＡ−３１を含む、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が短干渉核酸（ｓｉＮＡ）を含む、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物がＲｈｏＡにハイブリダイズすることができるｓｉＮＡを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＲｈｏＡの発現の減少がＲｈｏＡ転写物の発現を減少させることを含む、請求項１ないし請求項１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ＲｈｏＡの発現の減少がＲｈｏＡタンパク質の発現を減少させることを含む、請求項１ないし請求項１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ＩＬ−２の発現の増加がＩＬ−２転写物の発現を増加させることを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
ＩＬ−２の発現の増加がＩＬ−２タンパク質の発現を増加させることを含む、請求項１、請求項２または請求項１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物の投与後のある時期に前記対象から採取したサンプル中のＩＬ−２の発現をアッセイするステップをさらに含む、請求項１ないし請求項１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物の投与後のある時期に前記対象から採取したサンプル中のＲｈｏＡの発現をアッセイするステップをさらに含む、請求項１ないし請求項１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記サンプルが血液サンプルを含む、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＩＬ−２の発現のアッセイするステップがＴ細胞におけるＩＬ−２転写物の発現をアッセイするステップを含む、請求項１９ないし請求項２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
ＩＬ−２の発現のアッセイするステップが前記サンプル中のＩＬ−２タンパク質の発現をアッセイするステップを含む、請求項１９ないし請求項２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
ＲｈｏＡの発現のアッセイするステップがＴ細胞におけるＲｈｏＡ転写物の発現をアッセイするステップを含む、請求項２０または請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
ＲｈｏＡの発現のアッセイするステップが前記サンプル中のＲｈｏＡタンパク質の発現をアッセイするステップとを含む、請求項２０または請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
化合物が投与された、全身性紅斑性狼瘡を有する対象におけるバイオマーカーの存在、非存在または量をアッセイするステップであって、前記バイオマーカーはマイクロＲＮＡ−３１、ＲｈｏＡまたはＩＬ−２から選択されるステップと；前記対象にその後投与される前記化合物の投薬レジメンまたは投与レジメンが、アッセイされた前記バイオマーカーの存在、非存在または量に基づき調整されるかどうかを決定するステップとを含む方法。
【請求項２７】
全身性紅斑性狼瘡を有する前記対象が疾患フレアの症状を呈している、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
全身性紅斑性狼瘡を有する前記対象が疾患フレアの症状を呈していない、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記化合物がステロイドまたは免疫抑制薬を含む、請求項２６ないし請求項２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記化合物がマイクロＲＮＡ−３１を増加させるか、またはＲｈｏＡを減少させる組成物を含む、請求項２６ないし請求項２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記化合物がＩＬ−２を含む、請求項２６ないし請求項２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
全身性紅斑性狼瘡の診断方法であって、全身性紅斑性狼瘡の疑いがある対象からサンプルを採取するステップと；前記サンプル中のマイクロＲＮＡ−３１またはＲｈｏＡの発現をアッセイするステップを含む方法。
【請求項３３】
全身性紅斑性狼瘡の疑いがある前記対象が疾患フレアの症状を呈していない、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
全身性紅斑性狼瘡の処置をモニターする方法であって、全身性紅斑性狼瘡の処置を受けている対象由来のサンプル中のマイクロＲＮＡ−３１またはＲｈｏＡの発現を検出するステップと；マイクロＲＮＡ−３１またはＲｈｏＡの前記発現を同じ対象由来の、前記処置より前または前記処置期間中の初期の時点に採取されたサンプル中の発現と比較するステップとを含み；処置より前または処置期間中の初期の時点に採取されたサンプルに対して処置期間中の後期の時点に採取されたサンプル中のマイクロＲＮＡ−３１の増加またはＲｈｏＡの減少から、前記処置の有効性が示され、それにより前記処置をモニターする方法。
【請求項３５】
全身性紅斑性狼瘡を有する対象を処置する方法であって、全身性紅斑性狼瘡の特定の処置の開始前に対象から採取したサンプル由来のマイクロＲＮＡ−３１またはＲｈｏＡの発現を、健常対象由来のサンプル中の発現を反映した標準範囲と比較するステップであって、マイクロＲＮＡ−３１の発現が前記標準範囲未満であることまたはＲｈｏＡの発現が前記標準範囲を上回ることから、全身性紅斑性狼瘡の処置に感受性があることが示されるステップと；前記対象が全身性紅斑性狼瘡の処置に感受性があることが確認された場合、マイクロＲＮＡ−３１、ＲｈｏＡにハイブリダイズするｓｉＮＡまたはＩＬ−２タンパク質を含む有効量の組成物で前記対象を処置するステップと；前記対象由来の処置後のサンプル中のマイクロＲＮＡ−３１またはＲｈｏＡの発現を検出するステップと；前記処置後のサンプル中のマイクロＲＮＡ−３１またはＲｈｏＡの発現を、前記特定の処置の開始前に採取した前記サンプル中の発現と比較するステップとを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
自己免疫状態は、高い罹病率、場合によっては、高い死亡率を伴う。自己免疫状態の症状は、仕事をする能力に影響し、その他の点で患者の生活の質に影響を与える恐れもある。
【背景技術】
【０００２】
免疫系の慢性的な活性化、および複数の免疫学的表現型を特徴とする多因子性自己免疫状態に全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）がある（Ｆａｉｒｈｕｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。同定された多くの分子の異常によって、ループスにおける特定の樹立細胞およびサイトカインの異常が説明される。ループス患者由来のＴ細胞は、いくつかのシグナル伝達の異常を示す（Ｎａｍｂｉａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；フジイ（Ｆｕｊｉｉ）ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｋｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｍｏｕｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０００３】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、主にＴ細胞で産生される多機能性サイトカインであり、Ｔ細胞の活性化、増殖および収縮に不可欠である（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＩＬ−２の産生がＳＬＥのＴ細胞において減少すること、およびＩＬ−２産生の転写または抑制に関わる転写制御因子がＳＬＥのＴ細胞において不均衡であることが報告されてきた（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｔｅｎｂｒｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｋａｔｓｉａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｊｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｈｅｒｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｓｏｌｏｍｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
自己免疫状態の診断、管理および処置に使用される方法および組成物の改良が大きく求められている。本開示は、全身性紅斑性狼瘡などの自己免疫状態を有する対象の処置、評価、診断および予後に応用できる方法および組成物を提供する。ある種の実施形態では、本明細書に提供する方法は、対象におけるマイクロＲＮＡ−３１の発現とＩＬ−２の発現との相関関係に基づく。
【０００５】
第１の態様では、本開示は、自己免疫状態を有し、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の発現の増加を必要とする対象のＩＬ−２の発現を増加させる方法を提供する。こうした方法は、マイクロＲＮＡ−３１の発現を増加させるか、またはＲｈｏＡの発現を減少させる有効量の組成物を対象に投与することを含む。ある種の実施形態では、それを必要とする対象は、全身性紅斑性狼瘡を有する対象である。他の実施形態では、それを必要とする対象は、作用機序、病因、ＩＬ−２の調節不全との相関関係、またはＴ細胞の制御不良、特に制御性Ｔ細胞の制御不良との相関関係の共有など、ＳＬＥと１つまたは複数の特徴を共有する別の自己免疫状態を有する対象である。
【０００６】
第２の態様では、本開示は、自己免疫状態を有する対象のＴ細胞においてインターロイキン−２（ＩＬ−２）の発現を増加させる方法を提供する。こうした方法は、マイクロＲＮＡ−３１の発現を増加させるか、またはＲｈｏＡの発現を減少させる有効量の組成物とＴ細胞を接触させることを含む。Ｔ細胞を接触させるのは、たとえば対象に組成物を投与することにより、インビボであってもよい。あるいは、Ｔ細胞を接触させるのは、たとえば細胞培養基に組成物を加えることにより、インビトロであってもよい。ある種の実施形態では、自己免疫状態を有する対象は、全身性紅斑性狼瘡を有する。他の実施形態では、それを必要とする対象は、作用機序、病因、ＩＬ−２の調節不全との相関関係、またはＴ細胞の制御不良、特に制御性Ｔ細胞の制御不良との相関関係の共有など、ＳＬＥと１つまたは複数の特徴を共有する別の自己免疫状態を有する対象である。
【０００７】
第３の態様では、本開示は、自己免疫状態を処置する方法であって、自己免疫状態を処置するため、マイクロＲＮＡ−３１の発現を増加させるか、またはＲｈｏＡの発現を減少させる有効量の組成物を、自己免疫状態の処置を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。ある種の実施形態では、自己免疫状態は全身性紅斑性狼瘡である。他の実施形態では、その状態は、作用機序、病因、ＩＬ−２の調節不全との相関関係、またはＴ細胞の制御不良、特に制御性Ｔ細胞の制御不良との相関関係の共有など、ＳＬＥと１つまたは複数の特徴を共有する別の自己免疫状態である。
【０００８】
第４の態様では、本開示は、自己免疫状態を有する対象のＲｈｏＡの発現を減少させる方法を提供する。こうした方法は、マイクロＲＮＡ−３１の発現を増加させる有効量の組成物を対象に投与することを含む。ある種の実施形態では、自己免疫状態は全身性紅斑性狼瘡である。他の実施形態では、状態は、作用機序、病因、ＩＬ−２の調節不全との相関関係、またはＴ細胞の制御不良、特に制御性Ｔ細胞の制御不良との相関関係の共有など、ＳＬＥと１つまたは複数の特徴を共有する別の自己免疫状態である。
【０００９】
第５の態様では、本開示は、自己免疫状態を有する対象のＴ細胞のＲｈｏＡの発現を減少させる方法を提供する。こうした方法は、マイクロＲＮＡ−３１の発現を増加させる有効量の組成物とＴ細胞を接触させることを含む。Ｔ細胞を接触させるのは、たとえば対象に組成物を投与することによりインビボであってもよい。あるいは、Ｔ細胞を接触させるのは、たとえば細胞培養基に組成物を加えることにより、インビトロであってもよい。ある種の実施形態では、自己免疫状態を有する対象は、全身性紅斑性狼瘡を有する。他の実施形態では、それを必要とする対象は、作用機序、病因、ＩＬ−２の調節不全との相関関係、またはＴ細胞の制御不良、特に制御性Ｔ細胞の制御不良との相関関係の共有など、ＳＬＥと１つまたは複数の特徴を共有する別の自己免疫状態を有する対象である。
【００１０】
本開示は、以下の実施形態が本開示の前述の態様のいずれか、および／または、本開示の以下の実施形態のいずれかに応用でき得ると考えている。ある種の実施形態では、対象はヒト対象である。他の実施形態では、対象は非ヒト対象である。ある種の実施形態では、対象は、全身性紅斑性狼瘡を有し、疾患フレア（ｄｉｓｅａｓｅ  ｆｌａｒｅ）の症状を呈しており、たとえば組成物の投与の前に疾患フレアの症状を呈している。他の実施形態では、対象は、全身性紅斑性狼瘡を有し、組成物の投与の前に疾患フレアの症状を呈していない。ある種の実施形態では、ＳＬＥの症状は、ループス腎炎を含む。ある種の実施形態では、対象は、別の自己免疫状態、たとえば作用機序、病因、ＩＬ−２の調節不全との相関関係、またはＴ細胞の制御不良、特に制御性Ｔ細胞の制御不良との相関関係の共有など、ＳＬＥと１つまたは複数の特徴を共有する状態を有する。ある種の実施形態では、その別の自己免疫状態は関節リウマチ（ＲＡ）またはＩ型糖尿病である。
【００１１】
ある種の実施形態では、組成物に接触したまたは作用を受けたＴ細胞は、活性化Ｔ細胞、たとえばインビトロまたはインビボでの活性化Ｔ細胞である。
【００１２】
前述のいずれかのある種の実施形態では、組成物は、マイクロＲＮＡ−３１の発現を増加させるヌクレオチド配列を含む核酸を含む。ある種の実施形態では、組成物は、ＲｈｏＡの発現を減少させるヌクレオチド配列を含む核酸を含む。他の実施形態では、組成物は、マイクロＲＮＡ−３１の発現を増加させるおよび／またはＲｈｏＡの発現を減少させるポリペプチドまたは有機小分子を含む。本開示は、発現を増加または減少させることにより、転写物および／またはタンパク質の発現が増加または減少する実施形態を考えている。
【００１３】
前述のいずれかのある種の実施形態では、組成物は、外部から加えられたマイクロＲＮＡ−３１を含む。こうしたマイクロＲＮＡ−３１は、天然のマイクロＲＮＡ−３１に相当しても、合成核酸を含んでもよい。ある種の実施形態では、組成物は、短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、たとえばマイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。ある種の実施形態では、組成物は、ＲｈｏＡにハイブリダイズすることができるｓｉＮＡを含む。
【００１４】
前述のいずれかのある種の実施形態では、ＲｈｏＡの発現の減少は、ＲｈｏＡ転写物の発現を減少させることを含む。他の実施形態では、ＲｈｏＡの発現の減少は、ＲｈｏＡタンパク質の発現を減少させることを含む。ある種の実施形態では、ＩＬ−２の発現の増加は、ＩＬ−２転写物の発現を増加させることを含む。他の実施形態では、ＩＬ−２の発現の増加は、ＩＬ−２タンパク質の発現を増加させることを含む。
【００１５】
前述のいずれかのある種の実施形態では、本方法は、１つまたは複数のアッセイのステップをさらに含む。たとえば、ある種の実施形態では、本方法は、組成物の投与後のある時期に対象から採取したサンプル中のＩＬ−２の発現をアッセイすることを含む。他の実施形態では、本方法は、組成物の投与後のある時期に対象から採取したサンプル中のＲｈｏＡの発現をアッセイすることをさらに含む。こうしたサンプルは、治療用組成物を投与する同じ医療提供者によりまたは同じ施設で採取されても、こうしたサンプルは、異なる医療提供者によりおよび／または異なる施設で採取されてもよい。
【００１６】
ある種の実施形態では、アッセイステップに使用されるサンプルは血液サンプルを含む。たとえば、アッセイは、全血サンプルを用いて行っても、あるいは、血液サンプルから分離したリンパ球を用いて行っても、あるいは、血清または血液の他の何らかの成分を用いて行ってもよい。当該サンプルは、使用される個々のアッセイに基づき調製される。他の実施形態では、アッセイステップに使用されるサンプルは、骨髄サンプルを含む。アッセイステップに使用されるサンプルに関わらず、ある種の実施形態では、ＩＬ−２の発現のアッセイは、Ｔ細胞などにおけるＩＬ−２転写物の発現をアッセイすることを含む。他の実施形態では、ＩＬ−２の発現のアッセイは、サンプル中のＩＬ−２タンパク質の発現をアッセイすることを含む。同様に、アッセイステップに使用されるサンプルに関わらず、ある種の実施形態では、ＲｈｏＡの発現のアッセイは、Ｔ細胞などにおけるＲｈｏＡ転写物の発現をアッセイすることを含む。他の実施形態では、ＲｈｏＡの発現のアッセイは、サンプル中のＲｈｏＡタンパク質の発現をアッセイすることを含む。
【００１７】
第６の態様では、本開示は１つの方法を提供する。本方法は、化合物が投与された、全身性紅斑性狼瘡などの自己免疫状態を有する対象において、マイクロＲＮＡ−３１、ＲｈｏＡまたはＩＬ−２から選択されるバイオマーカーの存在、非存在または量をアッセイすること；および対象にその後投与される化合物の投薬レジメンまたは投与レジメンを、アッセイされたバイオマーカーの存在、非存在または量に基づき調整するかどうかを決定することを含む。ある種の実施形態では、自己免疫状態は全身性紅斑性狼瘡である。他の実施形態では、自己免疫状態は、作用機序、病因、ＩＬ−２の調節不全との相関関係、またはＴ細胞の制御不良、特に制御性Ｔ細胞の制御不良との相関関係の共有など、ＳＬＥと１つまたは複数の特徴を共有する。
【００１８】
ある種の実施形態では、対象はヒト対象である。他の実施形態では、対象は非ヒト対象である。ある種の実施形態では、対象は、全身性紅斑性狼瘡を有し、疾患フレアの症状を呈している。他の実施形態では、対象は、全身性紅斑性狼瘡を有し、疾患フレアの症状を呈していない。ある種の実施形態では、ＳＬＥの症状は、ループス腎炎を含む。ある種の実施形態では、対象は、別の自己免疫状態、たとえば作用機序、病因、ＩＬ−２の調節不全との相関関係、またはＴ細胞の制御不良、特に制御性Ｔ細胞の制御不良との相関関係の共有など、ＳＬＥと１つまたは複数の特徴を共有する状態を有する。ある種の実施形態では、その別の自己免疫状態は関節リウマチ（ＲＡ）またはＩ型糖尿病である。
【００１９】
ある種の実施形態では、アッセイステップに使用されるサンプルは、血液サンプルを含む。たとえば、アッセイは、全血サンプルを用いて行っても、あるいは、血液サンプルから分離したリンパ球を用いて行っても、あるいは、血清または血液の他の何らかの成分を用いて行ってもよい。当該サンプルは、使用される個々のアッセイに基づき調製される。他の実施形態では、使用されるサンプルは、骨髄サンプルを含む。アッセイステップに使用されるサンプルに関わらず、ある種の実施形態では、ＩＬ−２の発現のアッセイは、Ｔ細胞などにおけるＩＬ−２転写物の発現をアッセイすることを含む。他の実施形態では、ＩＬ−２の発現のアッセイは、サンプル中のＩＬ−２タンパク質の発現をアッセイすることを含む。同様に、アッセイステップに使用されるサンプルに関わらず、ある種の実施形態では、ＲｈｏＡの発現のアッセイは、Ｔ細胞などにおけるＲｈｏＡ転写物の発現をアッセイすることを含む。他の実施形態では、ＲｈｏＡの発現のアッセイは、サンプル中のＲｈｏＡタンパク質の発現をアッセイすることを含む。
【００２０】
ある種の実施形態では、化合物は、ステロイドまたは免疫抑制薬を含む。他の実施形態では、化合物は本開示の組成物を含む。ある種の実施形態では、化合物は、マイクロＲＮＡ−３１の発現を増加させる、またはＲｈｏＡの発現を減少させる組成物を含む。ある種の実施形態では、化合物は、ＩＬ−２を含む。
【００２１】
ある種の実施形態では、調べられるバイオマーカーはマイクロＲＮＡ−３１である。他の実施形態では、調べられるバイオマーカーはＲｈｏＡである。他の実施形態では、調べられるバイオマーカーはＩＬ−２である。なお他の実施形態では、前述のバイオマーカーの１つまたは複数の組み合わせを調べる。バイオマーカーは、転写物レベルで調べても、あるいはタンパク質レベルで調べてもよい。
【００２２】
第７の態様では、本開示は、全身性紅斑性狼瘡などの自己免疫状態を診断する方法を提供する。本方法は、全身性紅斑性狼瘡などの自己免疫状態の疑いがある対象からサンプルを採取すること；およびサンプル中のマイクロＲＮＡ−３１またはＲｈｏＡの発現をアッセイすることを含む。
【００２３】
ある種の実施形態では、対象はヒト対象である。他の実施形態では、対象は非ヒト対象である。ある種の実施形態では、対象は、全身性紅斑性狼瘡を有し、疾患フレアの症状を呈している。他の実施形態では、対象は、全身性紅斑性狼瘡を有し、疾患フレアの症状を呈していない。ある種の実施形態では、ＳＬＥの症状は、ループス腎炎を含む。ある種の実施形態では、対象は、別の自己免疫状態、たとえば作用機序、病因、ＩＬ−２の調節不全との相関関係、またはＴ細胞の制御不良、特に制御性Ｔ細胞の制御不良との相関関係の共有など、ＳＬＥと１つまたは複数の特徴を共有する状態を有する。ある種の実施形態では、その別の自己免疫状態は関節リウマチ（ＲＡ）またはＩ型糖尿病である。
【００２４】
ある種の実施形態では、アッセイステップに使用されるサンプルは、血液サンプルを含む。たとえば、アッセイは、全血サンプルを用いて行っても、あるいは、血液サンプルから分離したリンパ球を用いて行っても、あるいは、血清または血液の他の何らかの成分を用いて行ってもよい。当該サンプルは、使用される個々のアッセイに基づき調製される。他の実施形態では、使用されるサンプルは、骨髄サンプルを含む。アッセイステップに使用されるサンプルに関わらず、ある種の実施形態では、ＩＬ−２の発現のアッセイは、Ｔ細胞などにおけるＩＬ−２転写物の発現をアッセイすることを含む。他の実施形態では、ＩＬ−２の発現のアッセイは、サンプル中のＩＬ−２タンパク質の発現をアッセイすることを含む。同様に、アッセイステップに使用されるサンプルに関わらず、ある種の実施形態では、ＲｈｏＡの発現のアッセイは、Ｔ細胞などにおけるＲｈｏＡ転写物の発現をアッセイすることを含む。他の実施形態では、ＲｈｏＡの発現のアッセイは、サンプル中のＲｈｏＡタンパク質の発現をアッセイすることを含む。
【００２５】
第８の態様では、本開示は、全身性紅斑性狼瘡などの自己免疫状態の処置をモニターする方法を提供する。本方法は、全身性紅斑性狼瘡などの自己免疫状態の処置を受けている対象由来のサンプル中のマイクロＲＮＡ−３１またはＲｈｏＡの発現を検出すること；およびマイクロＲＮＡ−３１またはＲｈｏＡの発現を、処置より前または処置期間中の初期の時点に採取された同じ対象由来のサンプル中の発現と比較することを含む。こうした方法では、処置より前または処置期間中の初期の時点に採取されたサンプルに対して処置期間中の後期の時点に採取されたサンプル中のマイクロＲＮＡ−３１の増加またはＲｈｏＡの減少から、処置の有効性が示され、それにより処置をモニターする。
【００２６】
ある種の実施形態では、対象はヒト対象である。他の実施形態では、対象は非ヒト対象である。ある種の実施形態では、対象は、全身性紅斑性狼瘡を有し、疾患フレアの症状を呈している。他の実施形態では、対象は、全身性紅斑性狼瘡を有し、疾患フレアの症状を呈していない。ある種の実施形態では、ＳＬＥの症状は、ループス腎炎を含む。ある種の実施形態では、対象は、別の自己免疫状態、たとえば作用機序、病因、ＩＬ−２の調節不全との相関関係、またはＴ細胞の制御不良、特に制御性Ｔ細胞の制御不良との相関関係の共有など、ＳＬＥと１つまたは複数の特徴を共有する状態を有する。ある種の実施形態では、その別の自己免疫状態は関節リウマチ（ＲＡ）またはＩ型糖尿病である。
【００２７】
ある種の実施形態では、アッセイステップに使用されるサンプルは、血液サンプルを含む。たとえば、アッセイは、全血サンプルを用いて行っても、あるいは、血液サンプルから分離したリンパ球を用いて行っても、あるいは、血清または血液の他の何らかの成分を用いて行ってもよい。当該サンプルは、使用される個々のアッセイに基づき調製される。他の実施形態では、使用されるサンプルは、骨髄サンプルを含む。アッセイステップに使用されるサンプルに関わらず、ある種の実施形態では、ＩＬ−２の発現のアッセイは、Ｔ細胞などにおけるＩＬ−２転写物の発現をアッセイすることを含む。他の実施形態では、ＩＬ−２の発現のアッセイは、サンプル中のＩＬ−２タンパク質の発現をアッセイすることを含む。同様に、アッセイステップに使用されるサンプルに関わらず、ある種の実施形態では、ＲｈｏＡの発現のアッセイは、Ｔ細胞などにおけるＲｈｏＡ転写物の発現をアッセイすることを含む。他の実施形態では、ＲｈｏＡの発現のアッセイは、サンプル中のＲｈｏＡタンパク質の発現をアッセイすることを含む。
【００２８】
第９の態様では、本開示は、全身性紅斑性狼瘡などの自己免疫状態を有する対象を処置する方法を提供する。本方法は、自己免疫状態の特定の処置の開始前に対象から採取したサンプル由来のマイクロＲＮＡ−３１またはＲｈｏＡの発現を、健常対象由来のサンプル中の発現を反映した標準範囲と比較することを含み、マイクロＲＮＡ−３１の発現が標準範囲未満であることまたはＲｈｏＡの発現が標準範囲を上回ることから、たとえば、全身性紅斑性狼瘡の処置に感受性があることが示される。本方法は、対象が全身性紅斑性狼瘡の処置に感受性があることが確認された場合、マイクロＲＮＡ−３１、ＲｈｏＡもしくはＩＬ−２タンパク質にハイブリダイズするｓｉＮＡ、または本開示の別の組成物を含む有効量の組成物で対象を処置すること；対象由来の処置後のサンプル中のマイクロＲＮＡ−３１またはＲｈｏＡの発現を検出すること；および処置後のサンプル中のマイクロＲＮＡ−３１またはＲｈｏＡの発現を特定の処置の開始前に採取したサンプル中の発現と比較することをさらに含む。
【００２９】
ある種の実施形態では、対象はヒト対象である。他の実施形態では、対象は非ヒト対象である。ある種の実施形態では、対象は、全身性紅斑性狼瘡を有し、疾患フレアの症状を呈している。他の実施形態では、対象は、全身性紅斑性狼瘡を有し、疾患フレアの症状を呈していない。ある種の実施形態では、ＳＬＥの症状は、ループス腎炎を含む。ある種の実施形態では、対象は、別の自己免疫状態、たとえば作用機序、病因、ＩＬ−２の調節不全との相関関係、またはＴ細胞の制御不良、特に制御性Ｔ細胞の制御不良との相関関係の共有など、ＳＬＥと１つまたは複数の特徴を共有する状態を有する。ある種の実施形態では、その別の自己免疫状態は関節リウマチ（ＲＡ）またはＩ型糖尿病である。
【００３０】
ある種の実施形態では、アッセイステップに使用されるサンプルは、血液サンプルを含む。たとえば、アッセイは、全血サンプルを用いて行っても、あるいは、血液サンプルから分離したリンパ球を用いて行っても、あるいは、血清または血液の他の何らかの成分を用いて行ってもよい。当該サンプルは、使用される個々のアッセイに基づき調製される。他の実施形態では、使用されるサンプルは、骨髄サンプルを含む。アッセイステップに使用されるサンプルに関わらず、ある種の実施形態では、ＩＬ−２の発現のアッセイは、Ｔ細胞などにおけるＩＬ−２転写物の発現をアッセイすることを含む。他の実施形態では、ＩＬ−２の発現のアッセイは、サンプル中のＩＬ−２タンパク質の発現をアッセイすることを含む。同様に、アッセイステップに使用されるサンプルに関わらず、ある種の実施形態では、ＲｈｏＡの発現のアッセイは、Ｔ細胞などにおけるＲｈｏＡ転写物の発現をアッセイすることを含む。他の実施形態では、ＲｈｏＡの発現のアッセイは、サンプル中のＲｈｏＡタンパク質の発現をアッセイすることを含む。
【００３１】
本開示は、前述の態様および実施形態の任意の１つまたは複数については、組み合わせることができる、および／または、発明を実施するための形態および実施例に記載の実施形態のいずれかと組み合わせることができると考えている。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ループス患者においてｍｉＲ−３１の発現が正常対照（ＮＣ）対象と比較して減少していることを示す。（Ａ）Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球におけるｍｉＲ−３１の発現は、Ｔａｑｍａｎ定量ＰＣＲにより決定した。結果は、平均値±ＳＥＭ平均値の標準誤差で示し、３例の健康なドナー由来のＢ細胞の発現に対して補正してある。（Ｂ）３２例のループス患者および１１例の正常対照由来のＴ細胞におけるｍｉＲ−３１の発現に関するＴａｑｍａｎ定量ＰＣＲによる独立した検証を示す（Ｐ＜０．０００１）。上記の結果は平均値±ＳＥＭで示す。Ｐ値は、マンホイットニーのＵ検定により決定した。
【図２】ｍｉＲ−３１の発現を示す。（Ａ）ｍｉＲ−３１模倣体または対照（Ｃｔｒｌ）のトランスフェクションから２４時間後の活性化原発Ｔ細胞におけるｍｉＲ−３１に関する発現のＴａｑｍａｎ定量ＰＣＲ解析である。（Ｂ）アンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）−３１または対照のトランスフェクションから２４時間後の活性化原発Ｔ細胞におけるｍｉＲ−３１の発現のＴａｑｍａｎ定量ＰＣＲ解析である。
【図３】ｍｉＲ−３１がＩＬ−２の発現およびＩＬ−２プロモーターの活性を制御することを示す実験結果である。（Ａ）原発Ｔ細胞をＰＭＡおよびイオノマイシンで刺激し、Ｔａｑｍａｎ定量ＰＣＲにより様々な時間でｍｉＲ−３１レベルを測定した。発現の補正には、ＲＮＵ４８レベルを使用した。各バーは、３回の独立した実験の平均である。（Ｂ）ｍｉＲ−３１模倣体または対照模倣体（Ｃｔｒｌ）と、アンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）−３１またはアンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）対照（Ｃｔｒｌ）とのトランスフェクションから２４時間後の活性化原発Ｔ細胞におけるＩＬ−２の発現に関する定量ＰＣＲ解析である。ヒストグラムは、ハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ１３Ａで補正した対照に対するｍＲＮＡ発現の倍率変化を示す。（Ｃ）ｍｉＲ−３１模倣体または対照模倣体と、アンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）−３１またはアンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）対照とをトランスフェクトした活性化原発Ｔ細胞の培養上清中のＩＬ−２レベルをＥＬＩＳＡにより検出した。ＢおよびＣの値は、４例の代表的な健康なドナーの平均値±ＳＥＭである。（Ｄ）ループス患者の活性化Ｔ細胞におけるＩＬ−２とｍｉＲ−３１との発現の線形相関解析である（ｎ＝１５）。（Ｅ）Ｊｕｒｋａｔ細胞にｍｉＲ−３１模倣体または対照模倣体と、ＩＬ−２プロモーター−ｌｕｃレポータープラスミドとを一緒にコトランスフェクトした。トランスフェクションの補正にはｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ｌｕｃを使用した。細胞は、刺激しないか、あるいはＰＭＡおよびイオノマイシンで２４時間刺激し、相対的プロモーター活性をデュアルルシフェラーゼアッセイにより測定した。各バーは、３回の独立した実験の平均である。（Ｆ）ｍｉＲ−３１は、用量依存的にＩＬ−２プロモーターのルシフェラーゼ活性を増強した。結果は、３回の代表的な実験の結果である。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図４】ｍｉＲ−３１がＲｈｏＡの発現の負の制御因子であることを明らかにする実験結果である。（Ａ）ｍｉＲ−３１模倣体あるいは対照模倣体をトランスフェクトした活性化Ｔリンパ球におけるＲｈｏＡのｍＲＮＡの発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲにより解析した。データは、３回の独立した実験のデータである。結果は、平均値±ＳＥＭで示す。（Ｂ）ｍｉＲ−３１模倣体または対照模倣体のトランスフェクションから４８時間後のＴ細胞（ｎ＝３）におけるＲｈｏＡタンパク質の発現に関するイムノブロット解析である。（Ｃ）ＳＬＥ患者（ｎ＝３２）および正常対照（ｎ＝１１）由来のＴ細胞におけるＲｈｏＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにより測定した。上記の結果は、平均値±ＳＥＭで示す。Ｐ値は、マンホイットニーのＵ検定により決定した。（Ｄ）ループス患者の原発Ｔ細胞におけるＲｈｏＡとｍｉＲ−３１との発現の線形相関解析である（ｎ＝３２）。
【図５】ＲｈｏＡに対するｓｉＲＮＡの作用を示す。（Ａ）ｓｉＲＮＡ−１、ｓｉＲＮＡ−２または対照のトランスフェクション後の原発Ｔ細胞におけるＲｈｏＡの発現に関する定量ＰＣＲ解析である。（Ｂ）ＲｈｏＡに対する２種のｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ−１およびｓｉＲ−２）または対照のトランスフェクション後の原発Ｔ細胞におけるＲｈｏＡの発現に関するイムノブロット解析である。上記の結果は、平均値±ＳＥＭで示す。Ｐ値は、マンホイットニーのＵ検定により決定した。
【図６】ｓｉＲＮＡによるＲｈｏＡのノックダウンがＩＬ−２産生およびＩＬ−２プロモーターの活性を制御することを示す実験結果である。（Ａ）ｍｉＲ−３１模倣体または対照模倣体および２種のｓｉＲＮＡの２４時間トランスフェクション後の活性化原発Ｔ細胞におけるＩＬ−２の発現に関する定量ＰＣＲ解析である。（Ｂ）ｍｉＲ−３１模倣体、対照模倣体または２種のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした活性化原発Ｔ細胞の培養上清中のＩＬ−２レベルをＥＬＩＳＡによりを検出した。ＡおよびＢの値は、３例の代表的な健康なドナーの平均値±ＳＥＭである。（Ｃ）ＩＬ−２プロモーターと、ＲｈｏＡのｓｉＲＮＡ、ｍｉＲ−３１模倣体または対照模倣体とを含むレポーターベクターを、トランスフェクションの補正に使用するｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ｌｕｃと共にコトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞のデュアルルシフェラーゼアッセイである。データは、ｍｉＲ−３１およびｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞の、３回の独立した実験の対照に対する相対ルシフェラーゼ活性で示す。
【図７】ＳＬＥ患者由来の活性化Ｔ細胞におけるｍｉＲ−３１、ＲｈｏＡおよびＩＬ−２の役割を明らかにする実験結果である。（Ａ）１５例のＳＬＥ患者および１０例の正常対照（ＮＣ）の活性化Ｔ細胞におけるｍｉＲ−３１の発現をＴａｑｍａｎ定量ＰＣＲにより検出した。（Ｂ）ＲｈｏＡの発現を上記のサンプルのＲＴ−ＰＣＲにより定量した。（Ｃ）１２例のＳＬＥ患者および１０例の正常対照由来の活性化Ｔ細胞の上清中のＩＬ−２タンパク質レベルをＥＬＩＳＡにより測定した。（Ｄ）ｍｉＲ−３１模倣体または対照模倣体のトランスフェクション後の、ＳＬＥ患者（ｎ＝３）に由来する活性化Ｔ細胞の培養上清中のＩＬ−２の発現に関するＥＬＩＳＡ解析である。上記の結果は、平均値±ＳＥＭで示す。Ｐ値は、マンホイットニーのＵ検定により決定した。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
表１は、図１Ｂに示した研究に利用した患者の臨床的特徴をまとめたものである。
【００３４】
表２は、図７に示した研究に利用した患者の臨床的特徴をまとめたものである。
【００３５】
（ｉ）概要
全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）は、免疫系の慢性的な活性化、および複数の免疫学的表現型を特徴とする多因子性自己免疫障害である。本開示の一部は、マイクロＲＮＡ−３１、ＲｈｏＡおよびＩＬ−２を介したシグナル伝達が関与する自己免疫疾患のメカニズムを同定したことに基づく。
【００３６】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子発現の重要な転写後制御因子として働く一本鎖非コードＲＮＡのクラスである（Ｄｅｎｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｇｒｅｇｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。動物では、ｍｉＲＮＡは通常、標的遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）と不完全な塩基対の形成を行い、翻訳阻害あるいはｍＲＮＡの分解により標的遺伝子発現を制御する（Ａｍｂｒｏｓ．２００４）。
【００３７】
理論に束縛されるものではないが、本開示の一部は、下記に記載の実施例に基づく。実施例は、ＳＬＥのＴ細胞で内在性ｍｉＲ−３１レベルの低発現が同定された研究を反映するものである。また、ｍｉＲ−３１は、活性化Ｔ細胞におけるＩＬ−２産生の正の制御因子であり、ＲｈｏＡの発現がｍｉＲ−３１の発現と逆相関することも分かった。こうした制御は、ＩＬ−２のプロモーター活性の制御を介して起こると思われる。さらに、ＲｈｏＡの発現は、健常ボランティアと比較してループスＴ細胞において非常に高かった。
【００３８】
（ｉｉ）定義
本開示のより詳細な説明を続ける前に、本開示は、特定の組成物またはプロセスステップに限定されるものではなく、したがって多様であってもよいことを理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「１つの（ａ、ａｎ）」および「前記（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、複数の意味を含むことに留意しなければならない。
【００３９】
他に記載がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本開示に関係する当業者が一般に理解しているのと同じ意味を持つ。たとえば、ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；およびｔｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓは、当業者にとって本開示に使用される用語の多くの一般的な辞書となる。
【００４０】
ここで、本明細書に使用される「および／または」は、明記した２つの特徴または要素の各々の、他方を含むあるいは含まない特徴または要素を個々に開示したものと見なすことができることを指摘しておくと都合がよい。たとえば「Ａおよび／またはＢ」は、本明細書に各々を個別に記載したかのように、（ｉ）Ａと、（ｉｉ）Ｂと、（ｉｉｉ）ＡおよびＢとをそれぞれ個々に開示したものと見なすことができる。
【００４１】
（ｉｉｉ）組成物
本明細書のこのセクションには、特許請求の範囲に記載されている方法のいずれかに使用される組成物を記載する。本開示は、機能的および／または構造的特徴の任意の組み合わせに基づき記載される、そうした本開示の任意の組成物が本明細書に記載の方法のいずれかにおいて使用されることを意図している。
【００４２】
本開示の一部は、マイクロＲＮＡ−３１と、ＲｈｏＡと、ＩＬ−２との間の正および負の相関関係ならびに機構の関連に基づく。これを踏まえて、本開示は、治療方法および診断方法など様々な方法においてインビボおよびインビトロで有用な組成物を提供する。本開示の組成物は、活性成分として核酸、ポリペプチドまたは有機小分子を含む組成物を含む。さらに、ある種の実施形態では、本開示の組成物は、ある核酸またはポリペプチドを含み、発現させる細胞が組み込まれた組成物など、細胞組成物である。
【００４３】
「本開示の組成物」という用語は、診断方法または治療方法に有用であるなど本方法に有用な任意のそうした組成物をいうのに使用される。本開示の任意の組成物は、本明細書に記載の方法のいずれに使用してもよい。さらに、本開示の組成物のいずれも、本明細書に記載の構造的および／または機能的特徴のいずれかを用いて説明することができる。
【００４４】
核酸
「核酸」は一般に、本明細書で使用する場合、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸塩基を含むこれらの誘導体またはアナログの分子（一本鎖、二本以上の鎖）をいう。核酸塩基は、たとえば、ＤＮＡ（たとえば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」またはシトシン「Ｃ」）またはＲＮＡ（たとえば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」またはＣ）に見られる天然のプリン塩基またはピリミジン塩基を含む。「核酸」という用語は、各々「核酸」の亜属としての「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語を包含する。本明細書に記載される核酸という用語は、以下に限定されるものではないが、マイクロＲＮＡ（天然または合成を問わず）、ｓｉＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡを含む。核酸は、少なくとも、多くても、またはおよそ３ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長、６ヌクレオチド長、７ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１１ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド長、１３ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長、２７ヌクレオチド長、２８ヌクレオチド長、２９ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、３１ヌクレオチド長、３２ヌクレオチド長、３３ヌクレオチド長、３４ヌクレオチド長、３５ヌクレオチド長、３６ヌクレオチド長、３７ヌクレオチド長、３８ヌクレオチド長、３９ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、４１ヌクレオチド長、４２ヌクレオチド長、４３ヌクレオチド長、４４ヌクレオチド長、４５ヌクレオチド長、４６ヌクレオチド長、４７ヌクレオチド長、４８ヌクレオチド長、４９ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、５１ヌクレオチド長、５２ヌクレオチド長、５３ヌクレオチド長、５４ヌクレオチド長、５５ヌクレオチド長、５６ヌクレオチド長、５７ヌクレオチド長、５８ヌクレオチド長、５９ヌクレオチド長、６０ヌクレオチド長、７０ヌクレオチド長、８０ヌクレオチド長、９０ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、１１０ヌクレオチド長、１２０ヌクレオチド長、１３０ヌクレオチド長、１４０ヌクレオチド長、１５０ヌクレオチド長、１６０ヌクレオチド長、１７０ヌクレオチド長、１８０ヌクレオチド長、１９０ヌクレオチド長、２００ヌクレオチド長、２５０ヌクレオチド長、３００ヌクレオチド長、３５０ヌクレオチド長、４００ヌクレオチド長、４５０ヌクレオチド長、５００ヌクレオチド長、５５０ヌクレオチド長、６００ヌクレオチド長、６５０ヌクレオチド長、７００ヌクレオチド長、７５０ヌクレオチド長、８００ヌクレオチド長、８５０ヌクレオチド長、９００ヌクレオチド長、９５０ヌクレオチド長、もしくは１０００ヌクレオチド長、または、これらから導き出せる任意の範囲の長さであってもよい。ある種の実施形態では、これらの長さは、核酸部分の機能部分の長さのみに相当し、任意のベクター配列または任意のコンジュゲート部分の長さを含まない。こうした長さは、プロセッシングを受けたｍｉＲＮＡもしくはｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ分子もしくはｓｉＮＡ分子、前駆体ｍｉＲＮＡもしくはｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡもしくはｓｉＮＡを含むベクター、対照核酸、ならびに他の分子、プローブおよびプライマーの長さをカバーする。ある種の実施形態では、核酸の長さに関わらず、この分子が天然の分子を含まないことが理解されよう。たとえば、外部から与えられた分子は、たとえば、内因性に生じる分子と比較して配列、長さ、修飾、鎖数、または他の何らかの特性が異なる。多くの実施形態では、ヒトのｍｉＲＮＡは１９〜２４ヌクレオチド長であるのに対し、ｍｉＲＮＡ前駆体は一般に６２〜１１０ヌクレオチドである。本明細書に記載の核酸は、別の核酸と同一または相補的な領域を有してもよい。相補的または同一の領域は、少なくとも５の連続する残基であってもよいことを意図しているが、相補的または同一の領域は、具体的には、その領域が少なくとも、多くても、またはおよそ５の連続するヌクレオチド、６の連続するヌクレオチド、７の連続するヌクレオチド、８の連続するヌクレオチド、９の連続するヌクレオチド、１０の連続するヌクレオチド、１１の連続するヌクレオチド、１２の連続するヌクレオチド、１３の連続するヌクレオチド、１４の連続するヌクレオチド、１５の連続するヌクレオチド、１６の連続するヌクレオチド、１７の連続するヌクレオチド、１８の連続するヌクレオチド、１９の連続するヌクレオチド、２０の連続するヌクレオチド、２１の連続するヌクレオチド、２２の連続するヌクレオチド、２３の連続するヌクレオチド、２４の連続するヌクレオチド、２５の連続するヌクレオチド、２６の連続するヌクレオチド、２７の連続するヌクレオチド、２８の連続するヌクレオチド、２９の連続するヌクレオチド、３０の連続するヌクレオチド、３１の連続するヌクレオチド、３２の連続するヌクレオチド、３３の連続するヌクレオチド、３４の連続するヌクレオチド、３５の連続するヌクレオチド、３６の連続するヌクレオチド、３７の連続するヌクレオチド、３８の連続するヌクレオチド、３９の連続するヌクレオチド、４０の連続するヌクレオチド、４１の連続するヌクレオチド、４２の連続するヌクレオチド、４３の連続するヌクレオチド、４４の連続するヌクレオチド、４５の連続するヌクレオチド、４６の連続するヌクレオチド、４７の連続するヌクレオチド、４８の連続するヌクレオチド、４９の連続するヌクレオチド、５０の連続するヌクレオチド、５１の連続するヌクレオチド、５２の連続するヌクレオチド、５３の連続するヌクレオチド、５４の連続するヌクレオチド、５５の連続するヌクレオチド、５６の連続するヌクレオチド、５７の連続するヌクレオチド、５８の連続するヌクレオチド、５９の連続するヌクレオチド、６０の連続するヌクレオチド、７０の連続するヌクレオチド、８０の連続するヌクレオチド、９０の連続するヌクレオチド、１００の連続するヌクレオチド、１１０の連続するヌクレオチド、１２０の連続するヌクレオチド、１３０の連続するヌクレオチド、１４０の連続するヌクレオチド、１５０の連続するヌクレオチド、１６０の連続するヌクレオチド、１７０の連続するヌクレオチド、１８０の連続するヌクレオチド、１９０の連続するヌクレオチド、２００の連続するヌクレオチド、２５０の連続するヌクレオチド、３００の連続するヌクレオチド、３５０の連続するヌクレオチド、４００の連続するヌクレオチド、４５０の連続するヌクレオチド、５００の連続するヌクレオチド、５５０の連続するヌクレオチド、６００の連続するヌクレオチド、６５０の連続するヌクレオチド、７００の連続するヌクレオチド、７５０の連続するヌクレオチド、８００の連続するヌクレオチド、８５０の連続するヌクレオチド、９００の連続するヌクレオチド、９５０の連続するヌクレオチド、または１０００の連続するヌクレオチドを意図している。ある種の実施形態では、使用される核酸分子の長さに関わらず、核酸分子はフラグメントであり、天然の分子の全長配列より短いものに相当することが理解されよう。
【００４５】
核酸は、以下に限定されるものではないが、プラスミドまたはウイルスなどベクターをさらに含んでもよい。ベクターは、プロセシング前の核酸分子あるいはプロセシング後の成熟分子（たとえば、プロセシング前またはプロセシング後のｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）をコードしてもよい。
【００４６】
本明細書に記載される場合、「合成核酸」は、天然の核酸の化学構造または配列を有さない核酸を意味する。したがって、「合成ｍｉＲＮＡ」という用語は、細胞から単離されたものではなく、人工的に製造されたものであるが、場合によって細胞内または生理条件下で機能することができる「合成核酸」をいうことが理解されよう。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「ストリンジェントな条件」または「ハイストリンジェンシー」とは、相補配列を含む１つまたは複数の核酸鎖間または鎖内でハイブリダイゼーションを可能にするが、ランダム配列のハイブリダイゼーションが起きない条件である。ストリンジェントな条件では、核酸と標的鎖との間にミスマッチが起きても、ごくわずかしか起きない。こうした条件は、周知であり、高い選択性を要求される用途に好ましい。非限定的な用途として、核酸、たとえば遺伝子またはその核酸セグメントの単離、または少なくとも１つの特異的ｍＲＮＡ転写物またはその核酸セグメントの検出、および同種のものが挙げられる。
【００４８】
ストリンジェントな条件は、たとえば約４２℃〜約７０℃の温度で約０．０２Ｍ〜約０．５ＭのＮａＣｌにより得られる、低塩濃度および／または高温の条件を含んでもよい。所望のストリンジェンシーの温度およびイオン強度は、特定の核酸の長さ、標的配列の長さおよび核酸塩基含有量、核酸の電荷組成（ｃｈａｒｇｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）、ならびにホルムアミド、テトラメチルアンモニウムクロリドまたはハイブリダイゼーション混合物中の他の溶媒の存在または濃度によりある程度決定されることが理解されよう。
【００４９】
ハイブリダイゼーションのこれらの範囲、組成および条件は、単に非限定的な例として記載されるものであり、特定のハイブリダイゼーション反応の所望のストリンジェンシーは、多くの場合、１つまたは複数の陽性対照または陰性対照と比較して経験的に決定されることが理解されよう。想定される用途に応じて、種々のハイブリダイゼーション条件を採用して、標的配列に対して様々な程度の核酸の選択性を達成することができる。１つの非限定的な例では、ストリンジェントな条件下で核酸にハイブリダイズしない関連する標的核酸の同定または単離は、低温および／または高イオン強度でのハイブリダイゼーションにより達成することができる。こうした条件は、「ローストリンジェンシー」または「ローストリンジェント条件」と呼ばれており、ローストリンジェンシーの非限定的な例として、約２０℃〜約５０℃の温度範囲、約０．１５Ｍ〜約０．９ＭのＮａＣｌで行われるハイブリダイゼーションが挙げられる。ローストリンジェント条件またはハイストリンジェント条件は、個々の用途に合わせてさらに変更してもよい。
【００５０】
ｓｉＮＡ
ｓｉＮＡとは、配列特異的ＲＮＡｉを媒介することができる核酸分子のクラス、たとえば短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短干渉オリゴヌクレオチド、短干渉核酸、短干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）、および他のものをいう。さらに、本明細書で使用する場合、ＲＮＡｉという用語は、配列特異的ＲＮＡ干渉、たとえば転写後遺伝子サイレンシング、すなわちエピジェネティクスを説明するのに使用される他の用語と同等であることを意図している。たとえば、ｓｉＮＡ分子を使用すると、転写後レベルおよび転写前レベルのどちらか一方あるいは両方で遺伝子をエピジェネティックに発現抑制することができる。１つの非限定的な例では、この技術のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現のエピジェネティックな制御は、ｓｉＮＡがクロマチン構造の修飾を媒介して遺伝子発現を変化させることによって引き起こされ得る。このため、ｓｉＮＡを使用してポリペプチドまたはタンパク質のレベルを治療的に調節することができる。こうした制御は、直接的なものでも、あるいは、たとえば、それ自体が目的のタンパク質のリプレッサーであるタンパク質の発現を阻害することによる間接的なものでもよい。
【００５１】
ｓｉＮＡは、自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であってもよく、アンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその一部に相当するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡは、２つの別々のオリゴヌクレオチドから構築することができ、ここで、一方の鎖はセンス鎖であり、他方はアンチセンス鎖であり、アンチセンス鎖とセンス鎖とは自己相補的である。いくつかの実施形態では、各鎖は、他方の鎖のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含み、たとえばアンチセンス鎖およびセンス鎖は二重鎖または二本鎖構造を形成し、たとえば二本鎖領域は、約１塩基対、約２塩基対、約３塩基対、約４塩基対、約５塩基対、約６塩基対、約７塩基対、約８塩基対、約９塩基対、約１０塩基対、約１１塩基対、約１２塩基対、約１３塩基対、約１４塩基対、約１５塩基対、約１６塩基対、約１７塩基対、約１８塩基対、約１９塩基対、約２０塩基対、約２１塩基対、約２２塩基対、約２３塩基対、約２４塩基対、または約２５以上の塩基対である。
【００５２】
アンチセンス鎖は、標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含んでもよく、センス鎖は、標的核酸配列またはその一部に相当するヌクレオチド配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｓｉＮＡは、単一のオリゴヌクレオチドから構築することができ、この場合、ｓｉＮＡの自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域は、核酸を用いたリンカーまたは非核酸を用いたリンカーによって連結されている。ｓｉＮＡは、自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を含むポリヌクレオチドであってもよく、この場合、アンチセンス領域は、別の標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその一部に相当するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡは、２つ以上のループ構造と自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を含むステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであってもよく、この場合、アンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその一部に相当するヌクレオチド配列を有し、かつ、環状ポリヌクレオチドはインビボあるいはインビトロでプロセシングを受けて、ＲＮＡｉを媒介することができる活性なｓｉＮＡ分子となり得る。
【００５３】
いくつかの実施形態では  ｓｉＮＡは、ＲＮＡの２本の鎖を含む。ある種の実施形態では  ｓｉＮＡは、ＤＮＡの２本の鎖を含む。ｓｉＮＡは、場合によっては、ＲＮＡの１本の鎖およびＤＮＡの１本の鎖を含むハイブリッドであってもよい。また、一方の鎖または両方の鎖は、ＲＮＡとＤＮＡとの混合物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｓｉＮＡの鎖（たとえば、ｓｉＲＮＡの鎖）は、約５〜約６０ヌクレオチド長（たとえば、約６ヌクレオチド、約７ヌクレオチド、約８ヌクレオチド、約９ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１１ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド、約１３ヌクレオチド、約１４ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１６ヌクレオチド、約１７ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２１ヌクレオチド、約２２ヌクレオチド、約２３ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約２６ヌクレオチド、約２７ヌクレオチド、約２８ヌクレオチド、約２９ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約３１ヌクレオチド、約３２ヌクレオチド、約３３ヌクレオチド、約３４ヌクレオチド、約３５ヌクレオチド、約３６ヌクレオチド、約３７ヌクレオチド、約３８ヌクレオチド、約３９ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド  ４１ヌクレオチド、約４２ヌクレオチド、約４３ヌクレオチド、約４４ヌクレオチド  ４５ヌクレオチド  ４６ヌクレオチド  ４７ヌクレオチド  ４８ヌクレオチド、約４９ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約５１ヌクレオチド、約５２ヌクレオチド、約５３ヌクレオチド、約５４ヌクレオチド、約５５ヌクレオチド、約５６ヌクレオチド、約５７ヌクレオチド、約５８ヌクレオチドまたは約５９ヌクレオチド）であってもよい。ｓｉＮＡ鎖は、場合によっては、６０ヌクレオチドを超えてもよい。
【００５４】
また、ｓｉＮＡは、標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含んでもよく（たとえば、この場合、こうしたｓｉＮＡ分子は、標的核酸配列またはその一部に相当するヌクレオチド配列のｓｉＮＡ分子内に存在を必要としない）、この場合、一本鎖ポリヌクレオチドは、末端リン酸基、たとえば５’−ホスフェートまたは５’，３’−ジホスフェートをさらに含んでもよい。
【００５５】
ある種の実施形態では、ｓｉＮＡ分子は、別のセンス配列およびアンチセンス配列またはセンス領域およびアンチセンス領域をさらに含んでもよく、この場合、センス領域およびアンチセンス領域は、当該技術分野において公知のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドのリンカー分子により共有結合されている、あるいは、イオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、および／またはスタッキング相互作用により交互に非共有結合されている。ある種の実施形態では、ｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子の発現の阻害を引き起こすように標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ｓｉＮＡの１つまたは複数のヌクレオチドは、非修飾の標準ｓｉＮＡ（たとえば、ネイティブなｓｉＮＡ）と比較して、別のヌクレオチドで置換されている、修飾塩基である、欠失している、および／または挿入されている（たとえば、ｓｉＮＡの１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチドが置換されている、修飾塩基である、欠失している、および／または挿入されている）。こうした修飾ｓｉＮＡのインビボまたはインビトロでの機能は、標準ｓｉＮＡの場合と同じであることもあれば、変化することもある（たとえば、増大または低下する）。変化した機能は典型的には検出可能であり、場合によっては、標準ｓｉＮＡにより誘導される機能の１００倍以内で増大するか（たとえば、２倍増大、４倍増大、６倍増大、８倍増大、１０倍増大、１５倍増大、２０倍増大、２５倍増大、３０倍増大、３５倍増大、４０倍増大、４５倍増大、５０倍増大、５５倍増大、６０倍増大、６５倍増大、７０倍増大、７５倍増大、８０倍増大、８５倍増大、９０倍増大、９５倍増大）、または１００倍以内で低下する（たとえば、２分の１、４分の１、６分の１、８分の１、１０分の１、１５分の１、２０分の１、２５分の１、３０分の１、３５分の１、４０分の１、４５分の１、５０分の１、５５分の１、６０分の１、６５分の１、７０分の１、７５分の１、８０分の１、８５分の１、９０分の１、９５分の１に低下）。ある種の実施形態では、本開示の方法は、ｓｉＮＡを含む組成物を投与することを含む。言い換えれば、ｓｉＮＡ分子を外部から細胞に加える、あるいは、患者に投与する。こうした外部から加えたｓｉＮＡ分子はその導入後に発現する。理論に束縛されるものではないが、ある種の実施形態では、外部から加えたｓｉＮＡ分子は、転写物またはタンパク質の内因性発現の上方制御に資する。他の実施形態では、特定の分子の発現がｓｉＮＡ分子を外部から加えることにより増加し、それにより特定の分子の過剰発現が細胞である。
【００５７】
マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（本明細書では同義で「ｍｉＲＮＡ」ともいう）は、非コード制御ＲＮＡのクラスである。天然のｍｉＲＮＡは、一般に約１５〜３０ヌクレオチド長、前駆体マイクロＲＮＡとしては最大８０〜１２０ヌクレオチド長である。「ｍｉＲＮＡ」という用語は一般に、一本鎖分子をいうが、特定の実施形態では、同じ一本鎖分子の別の領域もしくは別の核酸と部分的に相補的（鎖の全長と１０〜５０％相補的）、実質的に相補的（鎖の全長と５０％超相補的だが、１００％未満相補的）、または完全に相補的な領域または追加の鎖をさらに包含する。このため、ｍｉＲＮＡは、一本鎖分子、二本鎖分子または部分的な一本鎖分子を包含し得る。たとえば、前駆体ｍｉＲＮＡは、最大１００％相補的な自己相補的領域を有してもよい。
【００５８】
多くのマイクロＲＮＡは、多くの種において高度に保存されているが、一部では種特異的である。マイクロＲＮＡは、主にその制御標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に結合することにより転写後に遺伝子発現を制御する。マイクロＲＮＡは、細胞増殖、分化およびアポトーシスのほか、他の細胞経路、分子経路、および発生経路に関係している。一部のｍｉＲＮＡはゲノム配列または遺伝子に由来することが理解されよう。この関連では、簡潔にするため、「遺伝子」という用語は、あるｍｉＲＮＡの前駆体ｍｉＲＮＡをコードするゲノム配列をいうのに使用する。しかしながら、いくつかの実施形態は、ｍｉＲＮＡの発現に関与するｍｉＲＮＡのゲノム配列、たとえばプロモーターまたは他の調節配列を含むことがある。「組換え体」という用語を使用することもあり、これは一般に、インビトロで操作された分子、またはそうした分子の複製産物もしくは発現産物をいう。
【００５９】
ネイティブなｍｉＲＮＡは、複雑なＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ：ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）のリボタンパク質複合体の認識成分として働く制御ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子は、プロセッシングを受けた成熟ｍｉＲＮＡ分子より長い。ゲノムマイクロＲＮＡは、個々の遺伝子、複数のマイクロＲＮＡの遺伝子クラスターなどの多様な形態として存在するか、またはタンパク質をコードする遺伝子のイントロン内に存在する。ｍｉＲＮＡは最初に一次転写物、すなわちＲＮＡ転写物からなる平均約１．２Ｋｂのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして転写されるか、またはタンパク質をコードする長い転写物のイントロン内に転写される。
【００６０】
ｐｒｉ−ｍｉＲは、細胞核内でＤｒｏｓｈａ酵素によりプロセッシングを受けて、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡまたは前駆体ｍｉＲＮＡと呼ばれる短い、およそ７０〜１２０ヌクレオチドのステムループ構造になる。その後こうしたｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、細胞質でエンドヌクレアーゼＡｒｇｏｎａｕｔ、ダイサーおよびその他との相互作用によりプロセッシングを受けて成熟した機能性ｍｉＲＮＡになりＲＩＳＣ複合体が生成される。
【００６１】
マイクロＲＮＡは一般に、制御標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内の部分的な相補配列と塩基対を形成することにより翻訳を阻害するか、またはｍＲＮＡの分解を促進する。個々のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）がいくつかのｍｉＲＮＡの標的となることもあれば、単一のｍｉＲＮＡが複数の標的ｍＲＮＡを制御することもある。マイクロＲＮＡは、関連する機能を持つタンパク質をコードする一連の遺伝子を協調的に制御して、遺伝子制御に複雑性および可能性をもたらすことができる。
【００６２】
マイクロＲＮＡは、標識しても、アレイ解析に使用しても、あるいは診断、治療または予後に応用してもよい。このＲＮＡは、細胞により内因性に産生されてきたこともあるし、あるいは、化学的にまたは組換え技術により合成または生成されてきたこともある。マイクロＲＮＡは、単離および／または精製することができる。本明細書では、多くの場合、ヒトｍｉＲＮＡ分子は、接頭辞「ｈｓａ−ｍｉＲ−」を用いて引用する。他に記載がない限り、本出願に言及するｍｉＲＮＡは、ヒト配列であり、非ヒトｍｉＲＮＡ配列は、これらの配列から決定し、調製することができる（たとえば、非ヒト対象の用途の場合）。
【００６３】
いくつかの実施形態では、既知のヒトｍｉＲＮＡに相当しないｍｉＲＮＡを使用してもよい。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡの１つまたは複数のヌクレオチドは、非修飾の標準ｍｉＲＮＡ（たとえば、ネイティブなｍｉＲＮＡ）と比較して別のヌクレオチドで置換されている、修飾塩基である、欠失している、および／または挿入されている（たとえば、ｍｉＲＮＡの１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、または２０ヌクレオチドが置換されている、修飾塩基である、欠失している、および／または挿入されている）。こうした修飾ｍｉＲＮＡのインビボまたはインビトロでの機能は、標準ｍｉＲＮＡの場合と同じであることもあれば、変化（たとえば、増大または低下）することもある。変化した機能は典型的には検出可能であり、場合によっては、標準ｍｉＲＮＡにより誘導される機能の１００倍以内で増大するか（たとえば、２倍増大、４倍増大、６倍増大、８倍増大、１０倍増大、１５倍増大、２０倍増大、２５倍増大、３０倍増大、３５倍増大、４０倍増大、４５倍増大、５０倍増大、５５倍増大、６０倍増大、６５倍増大、７０倍増大、７５倍増大、８０倍増大、８５倍増大、９０倍増大、９５倍増大）、または１００倍以内で低下する（たとえば、２分の１、４分の１、６分の１、８分の１、１０分の１、１５分の１、２０分の１、２５分の１、３０分の１、３５分の１、４０分の１、４５分の１、５０分の１、５５分の１、６０分の１、６５分の１、７０分の１、７５分の１、８０分の１、８５分の１、９０分の１、９５分の１に低下）。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞またはサンプル中のマイクロＲＮＡ−３１の発現レベルのアッセイに基づく。発現をアッセイする場合、本開示は、内因性発現レベルを判定することを考えているだけでなく、治療介入後の発現をアッセイすることも考えており、その場合、ある種の実施形態では、内因性発現と、外部から導入された核酸の発現との組み合わせを評価してもよい。
【００６６】
核酸修飾
下記に記載した修飾のいずれも、必要に応じて核酸、たとえばｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡに適用することができる。ｍｉＲＮＡ−３１などの特定の核酸を含む核酸は、核酸修飾をさらに含んでもよいことを理解すべきである。修飾の例として、ＲＮＡ骨格、糖または塩基の変更、およびこれらの様々な組み合わせが挙げられる。ｍｉＲＮＡまたは他の核酸においては任意の好適な数の骨格結合（ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）、糖および／または塩基を修飾してもよい（たとえば、独立に約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、最大１００％の骨格結合、糖および／または塩基を修飾するか；または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の骨格結合、糖および／または塩基を修飾する）。非修飾ｍｉＲＮＡのヌクレオシドは、塩基のアデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシルのいずれか１つがβ−Ｄ−リボ−フラノースの１’炭素に結合したものである。
【００６７】
修飾塩基は、１’位のアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル以外のヌクレオチドの塩基である。修飾塩基の非限定的な例として、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、プソイドウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（たとえば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（たとえば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（たとえば、５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（たとえば６−メチルウリジン）、プロピンおよび同種のものが挙げられる。修飾塩基の他の非限定的な例としては、ニトロピロリル（たとえば、３−ニトロピロリル）、ニトロインドリル（たとえば、４−ニトロインドリル、５−ニトロインドリル、６−ニトロインドリル）、ヒポキサンチニル、イソイノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンゾイミダゾール、４−メチルベンゾイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリル、３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナプタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニルおよび同種のものが挙げられる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、たとえば、核酸は、リン酸骨格が修飾された修飾核酸分子を含んでもよい。骨格修飾の非限定的な例として、ホスホロチオエート修飾、ホスホロジチオアート修飾、メチルホスホネート修飾、ホスホトリエステル修飾、モルホリノ修飾、アミデートカルバメート修飾、カルボキシメチル修飾、アセトアミデート修飾、ポリアミド修飾、スルホネート修飾、スルホンアミド修飾、スルファマート修飾、ホルムアセタール修飾、チオホルムアセタール修飾、および／またはアルキルシリル修飾が挙げられる。場合によっては、ヌクレオシドに自然に発生するリボース糖部を、ヘキソース糖、多環式ヘテロアルキル環またはシクロヘキセニル基で置換する。場合によっては、ヘキソース糖は、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロースまたはこれらの誘導体である。ヘキソースは、Ｄ−ヘキソース、グルコースあるいはマンノースでもよい。場合によっては、多環式ヘテロアルキル基は、環に１個の酸素原子を含む二環式環であってもよい。場合によっては、多環式ヘテロアルキル基は、ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［３．２．１］オクタンまたはビシクロ［３．３．１］ノナンである。
【００６９】
ニトロピロリル核酸塩基およびニトロインドリル核酸塩基は、ユニバーサル塩基として知られる化合物クラスのメンバーである。ユニバーサル塩基は、オリゴヌクレオチド二重鎖の融解挙動または活性に実質的に影響を与えることなく、４種の天然塩基のいずれにも取って代わることができる化合物である。３−ニトロピロリル核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド二重鎖は、天然の核酸塩基に見られ、安定化に役立つ水素結合相互作用とは異なり、スタッキング相互作用のみで安定化し得る。ニトロピロリル核酸塩基では大きな水素結合相互作用が存在しないため、特定の相補的塩基に対する特異性が失われる。さらに、４−ニトロインドリル、５−ニトロインドリルおよび６−ニトロインドリルも、４種の天然塩基に対して特異性をほとんど示さない。１−（２’−０−メチクベタ．−Ｄ−リボフラノシル）−５−ニトロインドールの調製の手順は、Ｇａｕｂｅｒｔ，Ｇ．；Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００４，４５，５６２９に記載されている。他のユニバーサル塩基として、ヒポキサンチニル、イソイノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニルおよびこれらの構造誘導体が挙げられる。
【００７０】
ジフルオロトリルは、ユニバーサル塩基として働く非天然核酸塩基である。ジフルオロトリルは、天然核酸塩基チミンのイソスターである。しかしながら、ジフルオロトリルは、チミンと異なり、天然塩基のいずれにも著しい選択性を示さない。ユニバーサル塩基として働く他の芳香族の化合物には、４−フルオロ−６−メチルベンゾイミダゾールおよび４−メチルベンゾイミダゾールがある。さらに、比較的疎水性のイソカルボスチリリル誘導体３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリル、および３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリルも、天然塩基のみを含むオリゴヌクレオチド配列と比較してオリゴヌクレオチド二重鎖をごくわずかに不安定化させるユニバーサル塩基である。他の非天然核酸塩基として、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナプタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニル、およびこれらの構造誘導体が挙げられる。ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンゾイミダゾール、４−メチルベンゾイミダゾールおよび上述の他の非天然塩基の合成手順など、より詳細な考察については、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．，５９：７２３８−７２４２（１９９４）を参照されたい。
【００７１】
また、核酸を含む組成物は、修飾された、すなわち非天然のヌクレオシド間結合を含む核酸を含む。こうした非天然のヌクレオシド間結合は、たとえば、細胞取り込みの増大、他のオリゴヌクレオチドまたは核酸標的に対する親和性の向上、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増強などの望ましい特性があるため、天然形態よりも選択されることが多い。本発明のオリゴマー化合物は、１つまたは複数の修飾ヌクレオシド間結合を有してもよい。本明細書に定義するように、修飾ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドには、リン原子を保持するヌクレオシド間結合、およびリン原子を有さないヌクレオシド間結合が含まれる。
【００７２】
リンを含む好適な修飾ヌクレオシド間結合には、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合がある。中にリン原子を含む他の修飾オリゴヌクレオチド骨格（ヌクレオシド間結合）としては、たとえば、通常の３’−５’結合を有するキラルホスホロチオエート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート、たとえば３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネート、ホスフィナート、ホスホルアミデート、たとえば３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、ならびにボラノホスフェート、これらの２’−５’結合アナログ、ならびに１つまたは複数のヌクレオチド間結合が３’−３’、５’−５’または２’−２’結合である逆極性を有するものが挙げられる。逆極性を有するオリゴヌクレオチドは、最も３’側のヌクレオチド間結合に単一の３’−３’結合、すなわち脱塩基（核酸塩基が欠損しているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する）であり得る単一の逆向きのヌクレオシド残基を含む。様々な塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。
【００７３】
ヌクレオチドアナログは、「ロックド」核酸をさらに含んでもよい。ある種の組成物を用いると、内在性核酸を特定の構造に本質的に「アンカーする（ａｎｃｈｏｒ）」または「ロックする（ｌｏｃｋ）」ことができる。配列をアンカーする（ａｎｃｈｏｒ）と、核酸ｓｉＮＡ複合体の解離を防ぐのに役立ち、したがって内在性配列のコピーを防止するだけでなく、内在性配列の標識、修飾および／またはクローニングを可能にすることもできる。ロックド構造は、遺伝子発現を制御する（すなわち転写または複製を阻害または増強する）ことができる、あるいは、内在性核酸配列を標識するまたは他の方法で修飾することが可能な安定な構造として使用することができる、あるいは、内在性配列を単離する、すなわちクローニングするために使用することができる。
【００７４】
核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡのみを含む分子に限定する必要はなく、化学修飾ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含する。非ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドの割合は、１％〜１００％（たとえば、核酸の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％が非ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドであるか；または約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％または約２０％が非ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドである）。ある種の実施形態では、核酸は、２’−ヒドロキシル（２’−ＯＨ）を含むヌクレオチドを欠損している。ある種の実施形態では、核酸は、ある機能を媒介するため２’−ヒドロキシ基を有するヌクレオチドの存在を必要としないため、核酸は、リボヌクレオチド（たとえば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を含まなくてもよい。しかしながら、ある機能を支援するためリボヌクレオチドの存在を必要としないこうした核酸分子は、結合したリンカー、あるいは、２’−ＯＨ基を持つ１つもしくは複数のヌクレオチドを含む他の結合もしくは連結された基、部分または鎖を有してもよい。場合によっては、核酸分子は、ヌクレオチド位の約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％にリボヌクレオチドを含んでもよい。
【００７５】
バイオマーカー
本明細書に提供するのは、マイクロＲＮＡ（本明細書では「ｍｉＲＮＡ」ともいう）バイオマーカーおよび他のバイオマーカーである。本方法に使用される特定のバイオマーカーとしては、ｍｉＲＮＡ−３１、ＲｈｏＡおよびＩＬ−２が挙げられる。バイオマーカーの使用については、本出願の後のセクションでより詳細に考察する。本開示は、タンパク質レベルおよび／または転写物レベルを検出することを考えている。例として、転写物レベルを検出するプローブおよびプライマーを使用し、さらにタンパク質レベルを検出する抗体を使用して、バイオマーカーを検出することができる。
【００７６】
コンジュゲート
ある種の実施形態では、本開示は、ヌクレオチド配列を含む核酸を活性成分として含む組成物を投与することを含む。言い換えれば、ある種の実施形態では、本開示の方法は、細胞への導入後に発現する外来性核酸分子の投与を含む。ある種の実施形態では、こうした核酸は、得られるオリゴマー化合物の活性、細胞分布または細胞取り込みを高める１つまたは複数の部分またはコンジュゲートに付加してもよい。一実施形態では、こうした修飾核酸組成物は、コンジュゲート基を官能基、たとえばヒドロキシル基またはアミノ基に共有結合することにより調製する。本開示のコンジュゲート基として、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬理学的特性を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態特性を改善する基が挙げられる。典型的なコンジュゲート基としては、コレステロール、炭水化物、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素が挙げられる。薬理学的特性を増強する基としては、核酸の取り込みを促進する基、分解に対する耐性を高める基、および／またはＲＮＡとのハイブリダイゼーションを強化する基が挙げられる。薬物動態特性を改善する基としては、取り込み、分布、代謝または排泄を改善する基が挙げられる。代表的なコンジュゲート基は、その開示内容全体を本明細書に援用する、１９９２年１０月２３日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号パンフレットに開示されている。コンジュゲート部分として、脂質部分、たとえばコレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル、たとえば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖、たとえば、ドデカンジオール残基またはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１，１０，１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質、たとえば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８���）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、またはオクタデシルアミン部分もしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）があるが、これに限定されるものではない。
【００７７】
さらに、本開示の核酸化合物は、オリゴマー化合物の能動もしくは受動輸送、局在化、または区画化（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）を促進する１つまたは複数の部分を結合またはコンジュゲートしていてもよい。細胞局在化として、以下に限定されるものではないが、核、核小体または細胞質内への局在化が挙げられる。区画化としては、以下に限定されるものではないが、核、核小体、ミトコンドリアなどの細胞コンパートメントへの任意の誘導、または細胞膜への埋め込みが挙げられる。
【００７８】
リボザイム
本開示の組成物はリボザイムを含んでもよい。リボザイムは、それらが相補的領域を有するｍＲＮＡなどの一本鎖核酸を切断することができる、リボヌクレアーゼ活性を持つ触媒的ＲＮＡ分子である。このため、リボザイム（たとえば、ハンマーヘッド型リボザイム；Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１に記載）を使用してｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断することにより、ｍＲＮＡによりコードされたタンパク質の翻訳を阻害することができる。たとえば、ＲｈｏＡをコードする核酸分子に対して特異性を有するリボザイムは、ＲｈｏＡのヌクレオチド配列に基づき設計することができる。
【００７９】
使用する組成物を含む特定の核酸に関わらず、本開示は、ｍｉＲＮＡ−３１の発現を増加させる核酸を含む組成物、およびＲｈｏＡの発現を減少させる核酸を含む組成物を考えている。特に好適な組成物は、ＩＬ−２の発現を増加させるために使用することができる。一部の核酸組成物は、たとえば、マイクロＲＮＡ−３１の内因性発現を増加させる働きをすることができることが理解されよう。一方、ある種の実施形態では、マイクロＲＮＡ−３１の発現の増加は、たとえば実施例に記載されているように、細胞への導入時に発現が可能な形でマイクロＲＮＡ−３１を細胞に外部から与えることにより行う。発現時に内在性マイクロＲＮＡ−３１の配列を模倣する配列を含む、外部から与えられる分子（一本鎖、二本鎖、部分二本鎖等）の投与は、マイクロＲＮＡ−３１模倣体と呼ぶこともあり、これはｓｉＮＡ分子の一例でもある。ある種の実施形態では、マイクロＲＮＡ−３１模倣体は、天然のヒトマイクロＲＮＡ−３１またはプレ−マイクロＲＮＡ−３１の配列に相当する配列を含むオリゴヌクレオチド（一本鎖、二本鎖、部分二本鎖等）を含む。
【００８０】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、たとえばＲｈｏＡにハイブリダイズするｓｉＲＮＡなどＲｈｏＡの発現を阻害するｓｉＮＡを含む。別の実施形態では、本開示の組成物は、マイクロＲＮＡ−３１の内因性発現を増加させるｓｉＮＡを含む。他の実施形態では、本開示の組成物は、外部から供給された核酸の発現によりマイクロＲＮＡ−３１の発現が増加したように、マイクロＲＮＡ−３１の配列（天然の配列あるいはその修飾変異体）に相当するヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
【００８１】
核酸組成物は、当該技術分野においてよく知られた方法を用いて単離、作製および／または送達することができる。一実施形態では、本開示の組成物は、マイクロＲＮＡ−３１の発現を増加させる、またはＲｈｏＡの発現を減少させる核酸であって、好適な宿主内で核酸を発現する発現ベクターの一部である核酸を含む。特に、こうした核酸は、プロモーター、たとえば、異種プロモーターを有してもよく、前記プロモーターは、誘導性または構成的プロモーターであり、任意に組織特異的プロモーターである。
【００８２】
核酸の対象への送達は、直接送達でもよく、この場合、対象を核酸または核酸を運ぶベクターに直接接触させ、あるいは、間接的送達でもよく、この場合、最初にインビトロで細胞を核酸で形質転換し、次いで対象に移植する。これらの２つのアプローチは、それぞれインビボ遺伝子治療またはエキソビボ遺伝子治療として知られている。このため、ある種の実施形態では、開示には、細胞組成物の使用が含まれる。
【００８３】
単離された核酸および／または組換え核酸、たとえばｍｉＲＮＡ遺伝子産物は、いくつかの標準的技術を用いて得ることができる。たとえば、ｍｉＲＮＡ遺伝子産物は、いくつかの方法の１つを用いて化学的に合成することができる。１つの方法では、ｍｉＲＮＡ遺伝子産物は、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイト、および従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて化学的に合成する。合成ＲＮＡ分子または合成試薬の供給者業者には、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．，ＵＳＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ｐａｒｔ  ｏｆ  Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，ＵＳＡ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖａ．，ＵＳＡ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ）およびＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）があるが、これに限定されるものではない。
【００８４】
あるいは、ｍｉＲＮＡ遺伝子産物などの核酸は、任意の好適なプロモーターを用いて組換え環状または直鎖ＤＮＡプラスミドから発現させることもできる。プラスミドからＲＮＡを発現させるのに好適なプロモーターとして、Ｕ６またはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列、またはサイトメガロウイルスプロモーターがあるが、これに限定されるものではない。組換えプラスミドは、癌細胞にｍｉＲＮＡ遺伝子産物を発現させるため誘導性プロモーターまたは調節可能なプロモーターをさらに含んでもよい。
【００８５】
組換えプラスミドから発現するｍｉＲＮＡ遺伝子産物などの核酸遺伝子産物は、標準的な技術により培養細胞発現系から単離することができる。
【００８６】
たとえば、ｍｉＲＮＡ遺伝子産物の発現に好適なプラスミドの選択、核酸配列をプラスミドに挿入して遺伝子産物を発現させる方法、および組換えプラスミドを目的の細胞に送達する方法は、多くの刊行物から検討することができる。たとえば、開示内容全体を本明細書に援用するＺｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ９：１３２７−１３３３（２００２）；Ｔｕｓｃｈｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：４４６−４４８（２００２）；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−５５３（２００２）；ミヤギシ（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ）ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４９７−５００（（２００２）；Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８（２００２）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００−５０５（２００２）；およびＰａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５−５０８（２００２）を参照されたい。
【００８７】
ｍｉＲＮＡ遺伝子産物はまた、組換えウイルスベクターから発現させることもできる。ｍｉＲＮＡ遺伝子産物は、２つの別の組換えウイルスベクターから発現させても、あるいは同じウイルスベクターから発現させてもよいことを意図している。組換えウイルスベクターから発現したＲＮＡは、標準的な技術により培養細胞発現系から単離しても、インビトロまたはインビボで細胞に感染させるため直接使用してもよい。
【００８８】
組換えウイルスベクターは、ｍｉＲＮＡ遺伝子産物、およびＲＮＡ配列の発現に好適な任意のプロモーターをコードする配列を含んでもよい。好適なプロモーターとして、たとえば、Ｕ６またはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列、またはサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。
【００８９】
ｍｉＲＮＡ遺伝子産物のコード配列（またはその相補配列）を組み込むことができるのであれば、どのようなウイルスベクターも使用することができ、たとえば、アデノウイルス（ＡＶ）；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（たとえば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルスおよび同種のもの由来のベクターがあるが、これに限定されるものではない。ウイルスベクターのトロピズムは、必要に応じて、ベクターを他のウイルス由来のエンベロープタンパク質または他の表面抗原でシュードタイプ化することにより、あるいは、別のウイルスカプシドタンパク質を代わりに使用することにより変えることができる。
【００９０】
真核細胞のトランスフェクション方法には、細胞の核または前核への核酸の直接注入；エレクトロポレーション；リポソームによる導入または親油性材料を介した導入；受容体を介した核酸送達、遺伝子銃または粒子加速法（ｂｉｏｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｏｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）；リン酸カルシウム沈殿、およびウイルスベクターを介したトランスフェクションがあるが、これに限定されるものではない。
【００９１】
たとえば、細胞にリポソーム導入化合物（すなわち、たとえば、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルスルフェート、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）またはリポフェクチンなどの等価物をトランスフェクトしてもよい。使用する核酸の量は、本発明の実施にとって重要ではない。許容可能な結果は、０．１〜１００マイクログラムの核酸／１０５細胞を用いて達成することができる。たとえば、１０５当たり３マイクログラムのＤＯＴＡＰ中にプラスミドベクター約０．５マイクログラムの比率である。
【００９２】
前述は、本開示の組成物、特に核酸を用いた組成物の詳細な説明を提供するものである。ある種の実施形態では、特許請求の範囲に記載されている方法に使用される組成物は、配列番号１、配列番号２または配列番号３のヌクレオチド配列を含むまたはそれらからなる核酸を含み、任意にベクターの一部として提供される。ある種の実施形態では、核酸は、天然の核酸配列の機能部分に相当するｓｉＮＡ分子などのオリゴヌクレオチドであるヌクレオチド配列を含む。加えて、本開示の組成物は、活性作用物質が抗体などのポリペプチドまたは有機小分子である組成物を含む。化合物のクラスのどれを製剤化し、組成物または医薬組成物として投与してもよい。
【００９３】
ポリペプチドおよびペプチドフラグメント：ある種の実施形態では、本化合物は、ポリペプチドまたはペプチドフラグメントである。例示的ポリペプチドまたはペプチドフラグメントとして、野生型配列のほか、変異体配列が挙げられる。変異体ポリペプチドは、特定の野生型ポリペプチドと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００９４】
ポリペプチドおよびペプチドフラグメントに加えて、本発明はさらに、前記ポリペプチドおよびフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸も考えている。核酸という用語は、本明細書で使用する場合、等価物としてのフラグメントを含むことを意図しており、こうしたフラグメントは、それが由来する全長核酸配列と実質的に同じ機能を有する。等価なヌクレオチド配列は、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加または欠失だけ異なる配列、たとえば対立遺伝子変異体を含み、したがって、たとえば、ネイティブなヌクレオチド配列のヌクレオチド配列と異なる配列を含む。等価な配列は、遺伝コードの縮重により既知の野生型配列または変異体配列と異なる配列を含む。等価な配列は、ストリンジェントな条件（すなわち、約１Ｍの塩中で形成されるＤＮＡ二重鎖の融解温度（Ｔｍ）より約２０〜２７℃低い温度に相当）下でネイティブなヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる例として、６５℃で０．２×ＳＳＣの洗浄ステップが挙げられる。等価なヌクレオチド配列は、ネイティブなヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチドの活性を保持するポリペプチドをコードすることが理解されよう。
【００９５】
本明細書に記載の方法に使用される等価なヌクレオチド配列は、あるヌクレオチド配列と少なくとも６０％同一である配列をさらに含む。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ネイティブな配列のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一である。
【００９６】
遺伝コードの縮重により特定のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と異なる配列を有する核酸も、本発明の範囲内にある。こうした核酸は、機能的に等価ペプチドをコードするが、遺伝コードの縮重により配列の点で当該技術分野において公知の野生型配列と異なる。たとえば、２つ以上のトリプレットで指定されるアミノ酸がいくつかある。同じアミノ酸を規定するコドン、すなわち同義コドン（たとえば、ＣＡＵおよびＣＡＣは各々ヒスチジンをコードする）は、アミノ酸配列に影響を与えない「サイレント」突然変異となることがある。しかしながら、アミノ酸配列の変化に確実につながるＤＮＡ配列多型が存在することもと予想される。当業者であれば、ポリペプチドをコードする核酸の１つまたは複数のヌクレオチドのこれらの変化（ヌクレオチドの最大約３〜５％）が、天然の対立遺伝子の変化により特定の種の個体間に存在する場合があることを理解するであろう。
【００９７】
抗体：例示的化合物は抗体をさらに含む。抗体は、特定のエピトープに対して非常に高い親和性および特異性を有することがある。理論に束縛されるものではないが、抗体は、細胞内のタンパク質およびシグナル伝達経路の活性を阻害または増強することにより、細胞、組織または生体に特定の作用を発揮または誘導することができる。
【００９８】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、標準的なプロトコルを用いて作製することができる（たとえば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ｅｄ．ｂｙ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ：１９８８）を参照されたい）。哺乳動物、たとえばマウス、ハムスターまたはウサギは、免疫原性のあるペプチドで免疫することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与するための技術として、キャリアとのコンジュゲーションまたは当該技術分野において周知の他の技術がある。タンパク質の免疫原性部分は、アジュバントの存在下で投与してもよい。免疫の進行は、血漿または血清中の抗体価の検出によりモニターすることができる。標準的なＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイを、抗原としての免疫原と共に使用して抗体のレベルを評価してもよい。抗体は、特定のタンパク質に対して免疫特異的である場合があること、特定のファミリーのタンパク質に対して免疫特異的である場合があること、あるいは、免疫特異性が低く、関連ファミリーのタンパク質の複数のタンパク質と交差反応する場合があることに留意されたい。免疫特異的である抗体は、非相同的タンパク質と実質的に交差反応しない。実質的に交差反応しないとは、抗体の有する非相同的タンパク質に対する結合親和性が、抗体が免疫特異的であるタンパク質に対する抗体の結合親和性より少なくとも１桁、一層好ましくは少なくとも２桁、なお一層好ましくは少なくとも３桁低いことを意味する。
【００９９】
また、ＩＬ−２またはＲｈｏＡの発現を検出する抗体などの抗体は、診断方法に特に有用であることも指摘したい。
【０１００】
ペプチド模造物：他の実施形態では、本発明は、作用物質がペプチド模倣物であることを考えている。ペプチド模造物は、ペプチドおよびタンパク質に基づくまたは誘導された化合物である。ペプチド模造物は、非天然型アミノ酸、コンフォメーションの拘束（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｔｒａｉｎｔ）、イソステリックな置換（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）および同種のものを用いて既知のタンパク質のアミノ酸配列の構造的な修飾により得ることができる。本ペプチド模造物は、ペプチドと非ペプチド合成構造との間に構造空間の連続体を構成する。
【０１０１】
例示的ペプチド模造物は、非加水分解性であるような（たとえば、プロテアーゼ、または対応するペプチドを分解する他の生理的条件に対する安定性を増加させる）、特異性および／または効力を増加させるような、さらに細胞内局在のため細胞透過性を増加させるような特質を有してもよい。説明を目的として、本発明のペプチドアナログは、たとえば、ベンゾジアゼピン（たとえば、Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８を参照されたい）、置換ガマラクタム環（Ｇａｒｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８，ｐ１２３）、Ｃ−７模倣体（Ｈｕｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８，ｐ．１０５）、ケト−メチレン偽ペプチド（Ｅｗｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２９：２９５；およびＥｗｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ９ｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＩＬ，１９８５）、β−ターンジペプチドコア（ナガイ（Ｎａｇａｉ）ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２６：６４７；およびサトー（Ｓａｔｏ）ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ  １：１２３１）、β−アミノアルコール（Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ１２６：４１９；およびＤａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １３４：７１）、ジアミノケトン（Ｎａｔａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １２４：１４１）、およびメチレンアミノ修飾（Ｒｏａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８，ｐ１３４）を用いて作製することができる。さらに、一般には、Ｓｅｓｓｉｏｎ  ＩＩＩ：Ａｎａｌｙｔｉｃ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ，ｉｎ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８）を参照されたい。
【０１０２】
本ペプチド模造物の作製のために行ってもよい様々な側鎖置換に加えて、本発明は、特に、ペプチド二次構造のコンフォメーションを固定した模倣体の使用を考えている。ペプチドのアミド結合に代わる多くの代用物が開発されてきた。アミド結合の代わり頻繁に利用される代用物として、以下のグループ（ｉ）トランス−オレフィン、（ｉｉ）フルオロアルケン、（ｉｉｉ）メチレンアミノ、（ｉｖ）ホスホンアミド、および（ｖ）スルホンアミドが挙げられる。
【０１０３】
加えて、ペプチド骨格のより顕著な修飾に基づくペプチド模造物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｉｅｔｉｃ）を使用してもよい。このカテゴリーに分類されるペプチド模造物としては、（ｉ）レトロインベルソ型アナログ、および（ｉｉ）Ｎ−アルキルグリシンアナログ（いわゆるペプトイド）が挙げられる。
【０１０４】
さらに、コンビナトリアルケミストリー法（たとえば、国際公開第９９／４８８９７号パンフレット）も、新たなペプチド模造物の開発に影響を与えている。たとえば、いわゆる「ペプチドモルフィング（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｏｒｐｈｉｎｇ）」戦略の一実施形態は、様々なペプチド結合の代用物を含むペプチドアナログのランダムライブラリーの作成に焦点を当てている。
【０１０５】
例示的実施形態では、ペプチド模倣物は、ペプチドのレトロインベルソ型アナログとして誘導することができる。レトロインベルソ型アナログは、サイトー（Ｓｉｓｔｏ）ら、米国特許第４，５２２，７５２号明細書により記載された方法など当該技術分野において公知の方法に従い作製することができる。一般的な手引きとして、典型的にはタンパク質分解を最も受けやすい部位を変化させるが、模倣物への切り換えに、分解を受けにくいアミド結合を用いるかは任意である。最終生成物またはその中間体は、ＨＰＬＣにより精製することができる。
【０１０６】
別の説明に役立つ実施形態では、ペプチド模倣物をペプチドのレトロエナチオ型（ｒｅｔｒｏ−ｅｎａｔｉｏ）アナログとして得ることができる。こうしたレトロエナンチオ型アナログは、市販されているＤ−アミノ酸（またはそのアナログ）および標準的な固相または液相ペプチド合成技術を用いて合成することができる。たとえば、好ましい固相合成法では、好適にアミノ保護された（ｔ−ブチルオキシカルボニル、Ｂｏｃ）残基（またはそのアナログ）を固体担体、たとえばクロロメチル樹脂に共有結合する。樹脂をジクロロメタン（ＤＣＭ）で洗浄し、ＢＯＣ保護基を、ＴＦＡを含むＤＣＭで処理して除去する。樹脂を洗浄して中和させ、次にＢｏｃ保護Ｄ−アミノ酸を、ジイソプロピルカルボジイミドとの結合により導入する。樹脂を再び洗浄し、このサイクルを残りのアミノ酸ごとに順に繰り返す。保護されたレトロエナンチオ型ペプチドの合成が終了したら、保護基を除去し、フッ化水素酸／アニソール／ジメチルスルフィド／チオアニソールで処理してペプチドを固体担体から切断する。最終生成物をＨＰＬＣにより精製して純粋なレトロエナンチオ型アナログを得る。
【０１０７】
なお別の説明に役立つ実施形態では、本ポリペプチドのいずれかのためにトランス−オレフィン誘導体を作製してもよい。トランスオレフィンアナログは、Ｙ．Ｋ．Ｓｈｕｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２８：３２２５の方法により、さらに当該技術分野において公知の他の方法によっても合成することができる。使用する試薬の性質に応じて、引用された手順、または利用可能な他の手順の変更が必要となる場合があることが理解されよう。
【０１０８】
さらに、上記の方法により合成された偽ジペプチドを他の偽ジペプチドに結合して、アミド官能基の代わりにいくつかのオレフィン官能基を有するペプチドアナログを作製することも可能である。
【０１０９】
ペプチド模倣物誘導体のなお別のクラスとして、ホスホネート誘導体がある。こうしたホスホネート誘導体の合成法は、公知の合成スキームから変更してもよい。たとえば、Ｌｏｏｔｓ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｅｓｃｏｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌｅｉｄｅｎ，１９８８，ｐ．１１８）；Ｐｅｔｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ９ｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＩＬ，１９８５）を参照されたい。
【０１１０】
多くの他のペプチド模倣物の構造も当該技術分野において公知であり、ペプチド模造物の設計用に容易に変更することができる。説明のため、ペプチド模倣物は、１−アザビシクロ［４．３．０］ノナン代用物（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：２８４７を参照）、またはＮ−アシルピペラズ酸（Ｘｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：８０を参照）、または規制されたアミノ酸アナログ（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅ）としての２−置換ピペラジン部分（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：１３４５−１３４８を参照）を包含してもよい。なお他の実施形態では、ある種のアミノ酸残基をアリール部分およびビアリール部分、たとえば、単環式もしくは二環式芳香族核または単環式もしくは二環式ヘテロ芳香族核、または二芳香族核、芳香族核、ヘテロ芳香族核または二ヘテロ芳香族核と置換してもよい。
【０１１１】
小さな有機分子または無機分子：ある種の実施形態では、本化合物は、小さな有機分子または無機分子である。小さな有機分子または無機分子は、特定のタンパク質またはタンパク質のクラスの機能を促進または抑制する。小さな有機分子または無機分子とは、分子量５０００ａｍｕ未満、好ましくは２５００ａｍｕ未満、一層好ましくは１５００ａｍｕ未満、なお一層好ましくは７５０ａｍｕ未満、５００ａｍｕ未満、または２５０ａｍｕ未満を有する炭素を含む分子を意味する。
【０１１２】
小さな有機分子または無機分子は、有機分子および／または化学化合物のライブラリーをスクリーニングして、所望の機能を有する化合物を特定することにより容易に同定することができる。あるいは、単一の化合物または少数の候補化合物を個別にまたは組み合わせてスクリーニングしてもよい。ある種の実施形態では、小分子（たとえば、無機分子または有機分子）は、ペプチド結合および／または糖結合を２以下もしくは１以下含む、または含まない非ペプチジル化合物である。
【０１１３】
ＲｈｏＡの小分子阻害剤は、本開示の組成物に使用することができる小分子の好例である。いくつかの小分子阻害剤が市販されている。これらは、それ自体作用物質として使用しても、別の小分子ＲｈｏＡ阻害剤を製造するため医薬品化学の出発点として使用してもよい。
【０１１４】
（ｉｖ）自己免疫状態
本開示は、本開示の組成物のいずれかを用いて自己免疫状態の診断、モニタリングおよび処置を行う方法を提供する。本明細書に記載の開示組成物のいずれも、本明細書に記載の自己免疫状態のいずれかを有するまたはその疑いがある対象に使用することができる。ある種の実施形態では、本明細書に提供する方法は、特定の自己免疫状態を有する対象におけるマイクロＲＮＡ−３１の発現とＩＬ−２の発現との間の相関関係に基づく。ある種の実施形態では、自己免疫状態は、ＳＬＥであるか、または作用機序、病因、ＩＬ−２の調節不全との相関関係、またはＴ細胞の制御不良、特に制御性Ｔ細胞の制御不良との相関関係の共有など、ＳＬＥと１つまたは複数の特徴を共有する別の自己免疫状態である。ある種の実施形態では、自己免疫状態は、全身性紅斑性狼瘡であり、フレア期間あるいは寛解期間のＳＬＥである。他の実施形態では、自己免疫状態は、ＩＬ−２の発現の減少および／またはマイクロＲＮＡ−３１の発現の減少と相関関係にある。ある種の実施形態では、ＳＬＥの症状または徴候はループス腎炎を含む。
【０１１５】
ある種の実施形態では、対象は、別の自己免疫状態、たとえば作用機序、病因、ＩＬ−２の調節不全との相関関係、またはＴ細胞の制御不良、特に制御性Ｔ細胞の制御不良との相関関係の共有など、ＳＬＥと１つまたは複数の特徴を共有する状態を有する。ある種の実施形態では、他の自己免疫状態は関節リウマチ（ＲＡ）、Ｉ型糖尿病、または自己免疫性甲状腺疾患である。ある種の実施形態では、他の自己免疫状態は強皮症である。ある種の実施形態では、自己免疫状態は、健常対象と比較してＩＬ−２の発現の減少と相関関係にある。
【０１１６】
上記の状態の症状を含む例示的自己免疫状態を以下に記載する。さらに、自己免疫状態の診断剤および治療剤の評価に使用する動物モデルの２、３の例も提供する。これらの動物モデルまたは当該技術分野において公知の他の動物モデルは、診断または処置の方法に使用される本開示の組成物の開発に使用することができる。「処置すること」とは、単回または複数回の投与にわたる組成物の投与により、状態の１つまたは複数の症状を緩和または解消することを意味する。本明細書で使用する場合、「症状」という用語は広義で使用され、患者により直接観察可能であるかまたは医療検査により観察可能であるかを問わず、ある状態の徴候および症状をいい、さらに、処置により軽減し得る疾患の下流合併症（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）もいう。
【０１１７】
全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）
多くの場合、ＳＬＥと略称される全身性紅斑性狼瘡は、身体のどの部位にも影響を及ぼし得る全身性の自己免疫状態である。ＳＬＥは、少なくともある程度抗体−免疫複合体の形成により引き起こされるＩＩＩ型過敏症反応である。
【０１１８】
ＳＬＥは、ほとんどの場合、心臓、関節、皮膚、肺、血管、肝臓、腎臓および神経系に有害な影響を及ぼす。疾患の経過は予測不可能であり、疾病の期間（フレアと呼ばれる）と寛解とが交互に起こる  本疾患は、男性より女性に９倍多く起こり、特に妊娠可能年齢の女性よく起こる。
【０１１９】
現在、ＳＬＥの治療法はなく、症状の管理は一般に、シクロホスファミド、コルチコステロイドおよび他の免疫抑制剤を用いた一般的な免疫抑制の使用に限定されてきた。
【０１２０】
ＳＬＥの一般的な症状としては、関節炎；疲労；全身不快感、不安または体調の悪さ（倦怠感）；関節痛および腫脹；筋痛；悪心および嘔吐；ならびに皮膚発疹が挙げられる。さらに、症状として、腹痛；血尿；圧力時または寒冷時の手指の変色；しびれおよび刺痛；ならびに皮膚の紅斑を挙げることもできる。一部患者では、ＳＬＥに肺または腎臓の障害がある。場合によっては、ＳＬＥの患者は、ループス腎炎と呼ばれる特定の腎臓状態を発症する。本開示は、治療を必要とする対象が、これらの症状の任意の１つまたは複数を有していもよいこと、およびこれらの症状の任意の１つまたは複数の改善に基づき、治療上の利益を測定できることを考えている。
【０１２１】
皮膚症候
皮膚症状は非常によく見られ、対象の３０％〜５０％が蝶型発疹とも呼ばれる古典的な頬部の発疹に罹患する。一部の患者は、皮膚に肥厚した赤色鱗状斑（円板状ループスと呼ばれる）が見られることもある。他の皮膚症候としては、脱毛；口、膣、鼻道および／または尿路の潰瘍；皮膚病変；ならびに眼周囲の繊細な組織の小さな断裂が挙げられる。
【０１２２】
筋骨格症候
関節痛はＳＬＥの一般的な症状であり、患者の９０％がその疾病の過程のある時点で関節痛および／または筋肉痛を報告すると推定される。関節リウマチとＳＬＥとの間の関連の可能性が示唆されてきた。
【０１２３】
血液症候
ＳＬＥ患者の最大５０％が貧血である。加えて、ＳＬＥ患者は、血清中のリン脂質に対する自己抗体の存在を特徴とする血栓障害、抗リン脂質抗体症候群の発生が増加するようである。抗リン脂質抗体症候群の特徴としては、部分トロンボプラスチン時間の延長および抗リン脂質抗体試験の陽性が挙げられ、これらの所見が認められると、「ループスアンチコアグラント陽性」と呼ばれる。
【０１２４】
心臓症候
ＳＬＥの心臓（Ｃａｒｄａｃ）症状として、心膜（心膜炎）、心筋（心筋炎）および心内膜（心内膜炎）など心臓の各部の炎症が挙げられる。ＳＬＥ患者では、高い頻度でアテローム性動脈硬化症が起こりやすく、存在する場合、一般集団で観察されるより進行が速い。
【０１２５】
肺症候
ＳＬＥ患者は、多くの場合、肺および胸膜の炎症の様々な症状を有する。こうした炎症は、胸膜炎、胸水貯留、ループス肺臓炎、慢性びまん性間質性（ｉｎｔｅｒｓｉｔｉｔｉａｌ）肺疾患、肺高血圧症、肺塞栓、肺出血および萎縮性肺症候群を引き起こす場合がある。
【０１２６】
腎臓症候
ループス腎炎は腎臓の炎症であり、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）の重度の合併症である。ＳＬＥは、Ｂ細胞およびＴ細胞の自然な自己反応性および免疫性の多臓器傷害を特徴とする。腎臓では、ループス腎炎は、機能を低下させる恐れがある。ループス腎炎の患者は、最終的に腎不全を発症し、透析または腎臓移植を必要とする場合がある。
【０１２７】
ＷＨＯは、生検結果に基づきループス腎炎を５つのクラスに分類した。この分類は、１９８２年に定義され、１９９５年に改訂された。クラスＩは、光学顕微鏡にて組織学的に正常であるが、電子顕微鏡にてメサンギウム沈着物が見られる微小メサンギウム性糸球体腎炎である。クラスＩＩは、メサンギウム性増殖性ループス腎炎が見られることに基づく。クラスＩＩＩは、巣状増殖性腎炎である。クラスＩＶは、びまん性増殖性腎炎である。クラスＶは膜性腎炎であり、極端な浮腫およびタンパク質の減少を特徴とする。クラスＶＩは、糸球体硬化症である。本開示は、クラスＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩのいずれかに分類されたループス腎炎を有する患者を処置することを考えている。ある種の実施形態では、患者は、クラスＩＩＩ以上、クラスＩＶ以上、またはクラスＶ以上に分類されたループス腎炎を有する。ある種の実施形態では、患者は、クラスＶＩに分類されたループス腎炎を有する。
【０１２８】
ループス腎炎の症状として、血尿、泡沫尿、高血圧、タンパク尿、体液貯留および浮腫が挙げられる。他の症状としては、腎線維症および／または腎不全の徴候および症状が挙げられる。ループス腎炎は、未処置で放置すると、腎不全、さらには末期腎臓病に至る場合がある。
【０１２９】
ループス腎炎は、血液検査または尿検査の使用のほか、腎生検により診断および／またはモニターすることができる。こうした検査は、処置中または処置後の症状の改善をモニターするために使用してもよい。ある種の実施形態では、処置は、これらの指標（ｉｎｄｉｃａ）の任意の１つまたは複数の改善を含む。例として、ループス腎炎は、尿中の血液量および／またはタンパク質量を評価することにより診断および／または判定することができる。処置は、尿中の血液量および／またはタンパク質量を、たとえば正常または正常に近いレベルに低下させることを含んでいてもよい。また、ループス腎炎は、血液中のクレアチニンレベルおよび／または尿素レベルを評価することにより、および／または、クレアチニンスコアに基づく糸球体濾過量の推定値により診断および／または判定してもよい。
【０１３０】
精神神経症候
米国リウマチ学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）は、全身性紅斑性狼瘡の１９の神経精神症候群を定義しており、これらは、中枢神経系および末梢神経系に対する作用により起こり得る。ＳＬＥ患者に最もよく見られる神経精神障害は頭痛である。他のよく見られる症状として、認知機能障害、気分障害、脳血管、痙攣、多発ニューロパチー、不安障害および精神病が挙げられる。頻度は低いものの、観察される他の症状として、急性錯乱、ギランバレー症候群、無菌性髄膜炎、自律神経障害、脱髄性症候群、単神経障害、舞踏病、重症筋無力症、ミエロパチー、脳ニューロパチーおよび神経叢障害が挙げられる。
【０１３１】
神経性症候
神経症状は、ＳＬＥの罹患率および死亡率を高める。ループスの神経症候は、神経精神全身性エリテマトーデス（ＮＰＳＬＥ）として知られている。この１つ局面が血液脳関門の上皮細胞の重度の損傷である。
【０１３２】
全身性症候
ＳＬＥの最もよく見られる全身性症状は疲労である。疲労は、貧血、甲状腺機能低下、疼痛、鬱、質の悪い睡眠および疾患活動性など様々な要因によると考えられる。
【０１３３】
米国リウマチ学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）は、臨床試験においてＳＬＥの定義を分類し、運用できるように１１の基準を設定した。この分類方式は、個別の診断スキームとして使用するためものではなく、臨床試験に使用するためのものであった。臨床試験の患者を特定するには、以下の１１症状のうち任意の４症状が２つの異なる時点で同時にまたは経時的に存在する場合、ＳＬＥとする：頬部（ｍｏｌａｒ）の発疹；円板状発疹；漿膜炎または心膜炎；口腔潰瘍（口頭または鼻咽頭を含む）；関節炎（特に２つ以上の末梢関節の非びらん性関節炎）；光線過敏症；血液学的障害、特に溶血性貧血、白血球減少症、リンパ球数減少症または血小板減少症；腎障害、特に尿中のタンパク円柱または細胞円柱；抗核抗体検査が陽性；免疫学的障害、特に抗Ｓｍ、抗二本鎖ＤＮＡまたは抗リン脂質の検査が陽性；および神経障害、特に痙攣または精神病。
【０１３４】
個々の患者を診断する場合、より包括的なアプローチが使用される。たとえば、抗リン脂質症候群の人の中には、ＳＬＥを有するが、上記の基準の４項目を有さない人がいる場合がある。さらに、ＳＬＥは、上記基準に列挙した以外の症状および特徴を呈することもある。
【０１３５】
ＳＬＥ患者の生活の質は、フレアの予防により改善することができる。フレアが差し迫っている警告的徴候としては、疲労の増加、疼痛、発疹、発熱、腹部不快感、頭痛および眩暈が挙げられる。警告的徴候の早期の認識、および医師との良好なコミュニケーションが、患者が活動的あり続け、疼痛を少なくし、受診を減らすのに役立つことがある。
【０１３６】
現在、ＳＬＥの処置の選択肢には、フレアの予防およびその重症度および持続期間の短縮のほか、個々の症状の管理がある。処置は、コルチコステロイド、抗マラリア薬、および非ステロイド系抗炎症剤を含む。ある種のループス腎炎は、数回の（ｂｏｕｔｓ  ｏｆ）細胞傷害性薬物、たとえばシクロホスファミドおよびミコフェノレートを必要とする。
【０１３７】
また、疾患修飾性抗リウマチ剤（ＤＭＡＲＤ）を使用して、フレアの発生、疾患のプロセスを抑制し、ステロイドの使用の必要性を低下させることもできる。一般に使用されるＤＭＡＲＤには、抗マラリア剤、たとえばプラキニル、および免疫抑制剤、たとえばメトテキサート（ｍｅｔｈｏｔｅｘａｔｅ）およびアザチオプリンがある。
【０１３８】
また、疾患の制御およびフレアの予防には、コルチコステロイドおよび免疫抑制剤も使用される。しかしながら、ステロイドの使用は、クッシング症候群および他の副作用を引き起こす恐れがある。
【０１３９】
ＳＬＥの人の大部分が様々な量の慢性疼痛に罹患しているため、疼痛管理のため様々な種類の薬物が使用されることが多い。疼痛管理は典型的には、市販薬、たとえば非ステロイド性抗炎症薬から始める。しかしながら、中等度の疼痛または激痛の管理には、温和または強いアヘン剤が必要とされることがある。
【０１４０】
ある種の実施形態では、本開示は、有効量の本開示の組成物を投与することによりＳＬＥを有する対象のＳＬＥを処置する、および／またはＩＬ−２レベルを高める方法を提供する。本開示の組成物の投与を使用して、ＳＬＥの１つまたは複数の症状を減少させる、および／またはフレアの頻度または重症度を低下させることができる。ある種の実施形態では、本開示の組成物の投与を使用して、ループス腎炎の患者のＳＬＥを処置する。こうした場合には、ＳＬＥの処置は、たとえばループス腎炎の症状を緩和することによりループス腎炎を処置することを含んでもよい。ある種の実施形態では、処置は、ＳＬＥの皮膚症状を処置することを含む。ある種の実施形態では、処置は、ループス腎炎の１つまたは複数の症状を緩和させる。ある種の実施形態では、処置は、透析の必要性を低下、遅延または解消することを含む。ある種の実施形態では、処置は、腎臓移植の必要性を低下、遅延または解消することを含む。ある種の実施形態では、処置は、ループス腎炎の腎不全または末期腎臓病への進行を遅延または予防することを含む。
【０１４１】
本発明は、ループス腎炎の処置を含むＳＬＥを処置する方法であって、単独、あるいは、１種もしくは複数種の他の薬剤、生物学的製剤、または他の治療方式と組み合わせた治療レジメンの一部として、本開示の組成物を投与することを含む方法を考えている。治療レジメンの一部として選択される他の方式は、患者の疾患の重症度、および主として標的となる特定の症状に応じて選択することができる。例として、ある種の実施形態では、本開示の組成物を、鎮痛薬または他の疼痛管理薬物（たとえば、関節炎の症状または他の症状に関連する疼痛の緩和に役立つため）、抗炎症性薬物、ステロイド、免疫抑制剤、抗マラリア剤、および細胞傷害性薬物の１つまたは複数と一緒に治療レジメンの一部として投与してもよい。組み合わせて使用できる作用物質および処置方式の別の例としては、食事、運動、ストレス管理、鍼治療および理学療法が挙げられる。他の特定の例として、ループス腎炎の症状の軽減に限定される作用物質および療法薬、たとえば降圧剤、タンパク質、カリウムおよび／もしくはナトリウムを減らした食事、細胞傷害性薬物、ならびに／または免疫抑制剤の使用が挙げられる。処置方法は、透析、腎臓移植、または１種もしくは複数種の他の腎不全の療法薬と組み合わせた処置を含む。
【０１４２】
本疾患の症状は動物モデルで再現することができ、そうしたモデルは、単独療法または併用療法の有効性を確認するために容易に使用される。このため、多くのマウスモデルが開発されてきた（Ｆｏｓｔｅｒ，Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｌｕｐｕｓ  Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ  Ｎｅｐｔｈｒｉｔｉｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｅｍｉｎ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９９９，１９（１）：１２−２４）。こうしたモデルは、宿主−移植片相互作用（Ｂｒｕｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｒｉｎｅ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｇｒａｆｔ−Ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｓ  ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｌｕｐｕｓ  Ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．，１９８８，１３０（３）：６３９−６４１）、トランスジェニックマウス（タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｌｕｐｕｓ  Ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ  ｂｙ  Ａｂｅｒｒａｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｅ−Ｓｅｌｅｃｔｉｎ  Ｇｅｎｅ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２００２，５２（３）：１７５−１８０）、および抗ＤＮＡ抗体（Ｙｕｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｎ，Ａｎｔｉ−ＤＮＡ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌｕｐｕｓ  Ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ  −  Ｔｈｅ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００８，７（４）：３１７−３２１）を利用する。これらおよび他の入手可能な動物モデルは、診断剤または治療剤の開発の過程で使用してもよい。加えて、インビトロ系、たとえばＳＬＥと以前診断されたことがある対象由来の血液サンプルおよび組織サンプルを使用してもよい。例示的組織サンプルとして、血液サンプル、骨髄サンプル、および血液サンプルからＴ細胞を分離した後に得られたＴ細胞の培養物が挙げられる。
【０１４３】
Ｉ型糖尿病
１型糖尿病（１型糖尿病、ＩＤＤＭ、または以前、若年性糖尿病と呼ばれた）は、膵臓のインスリン産生β細胞の自己免疫性破壊に起因する糖尿病の一形態である。その後インスリンが不足して血中および尿中のグルコースが増加する。古典的症状には、多尿、多飲、過食および体重減少がある。
【０１４４】
現在、１型糖尿病は一般に、インスリンで処置しないと死亡に至り、そうした処置を患者の生涯を通じて継続しなければならない。処置しても、痙攣、意識喪失、ならびに長期間の末梢神経および血管の損傷など、低血糖および高血糖の合併症が起こる恐れがある。
【０１４５】
ある種の実施形態では、本開示の組成物は、Ｉ型糖尿病の処置に、および／または、Ｉ型糖尿病を有する対象のＩＬ−２の発現を増加させるために使用してもよい。理論に束縛されるものではないが、こうした組成物の使用は、膵臓細胞への自己免疫攻撃を食い止めるのに役立ち、したがって外来性インスリンへの依存を低下または解消するのに資することがある。ある種の実施形態では、本開示の組成物は、インスリンと組み合わせて使用するが、こうした組成物の使用により、インスリン注射を必要とする頻度が低下し、および／または、患者の血糖レベルの上昇／下降の大きさが小さくなることがある。
【０１４６】
本疾患の症状は動物モデルで再現することができ、そうしたモデルは、単独療法または併用療法の有効性を確認するために容易に使用される。Ｉ型糖尿病の多くの動物モデルが存在し、そうした多数の入手可能なモデルが最近の概説にまとめられている（Ｒｅｅｓ（２００５）Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２２：３５９−３７０）。
【０１４７】
関節リウマチ
関節リウマチは、身体のどの部位の関節も侵し得る持続性の疾患であるが、最もよく見られるのは、手、手首および膝である。関節リウマチの場合、免疫系が誤って自身を攻撃し、関節の内膜を肥厚させる。その後、炎症が組織の周囲に広がり、最終的に軟骨および骨を破壊することがある。より重度の場合には、関節リウマチは、皮膚、眼および神経など身体の他の領域を侵すこともある。
【０１４８】
関節リウマチの症状として、疲労、発熱、発疹、関節炎症、疼痛、患部関節周囲の圧痛、こわばり、患部関節周囲の発赤および熱感、ならびに可動域の減少があるが、これに限定されるものではない。
【０１４９】
関節リウマチは、年齢を問わず発症するが、２５歳から５５歳に観察されるのが一般的である。関節リウマチは、男性より女性に２〜３倍よく見られる。関節リウマチは、関節炎の２番目に多い形態であり、米国単独で２１０万人が罹患している。
【０１５０】
一部の人は、関節リウマチにより、筋肉が衰弱して腱が収縮し、骨端部が破壊されるため、最終的に手足が変形する恐れがある。現在の療法薬として、疼痛、関節腫脹および炎症を抑制するための薬物がある。これらの薬物には、非ステロイド性抗炎症剤、コルチコステロイド、有糸分裂阻害剤（メトトレキサートおよびシクロホスファミド）、および炎症反応を全身的に抑制するための抗ＴＮＦα薬がある。他の処置としては、筋力および可動域を維持し、それにより能力障害を来す本疾患の作用を遅延させるのに役立つことを目的とした食事療法、運動療法および理学療法がある。
【０１５１】
本開示の方法は、関節リウマチの処置に、および／または、関節リウマチの患者のＩＬ−２の発現を増加させるのに使用することができる。ある種の実施形態では、本開示の方法を使用して、関節リウマチの１つまたは複数の症状を減少させる。言い換えれば、「処置すること」とは、関節リウマチの１つまたは複数の症状を減少させるか、またはゼロにすることを含むことを意図している。さらに、本開示は、本開示の組成物は、単独で投与しても、あるいは関節リウマチの１つまたは複数の症状を減少させるのに有用な他の作用物質と共に治療レジメンの一部として投与してもよいことも考えている。たとえば、本開示の組成物は、鎮痛薬、抗炎症薬、および関節リウマチ生物学的製剤（たとえば、ヒュミラ、シンポニー、レミケード等）と共に投与してもよい。
【０１５２】
本疾患の症状は動物モデルで再現することができ、そうしたモデルは、単独療法または併用療法の有効性を確認するために容易に使用される。関節リウマチの多くの動物モデルが、当該技術分野において存在する。非限定的な例として、ＢｉｏＭｅｄＣｏｄｅ  Ｈｅｌｌａｓ  ＳＡが、炎症状態の動物モデルを作製している。同社のモデルの多くは、ＲＡの有望な処置法の試験についてＦＤＡにより承認されている。そうしたモデルとして、Ｔｇ１９７マウスおよびＴｇ５４３３マウスがある。
【０１５３】
関節炎および関節リウマチの他の動物モデルとしては、以下の刊行物に記載されているモデルがあるが、これに限定されるものではない：Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｃｅｌｌ  ６３：１０９９−１１１２；Ｈａｑｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＰＮＡＳ  ８９：１２５３−１２５５；Ｋｅｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １０：４０２５−４０３１；Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ４０：１０１２−１０２９；Ｔｒｅｎｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １４６：８５７−８６８；Ｗｏｏｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １５４：６８８−７００。最近、ＢｉｎａおよびＷｉｌｄｅｒが、入手可能な多くの関節リウマチのモデルを概説した。Ｂｉｎａ  ａｎｄ  Ｗｉｌｄｅｒ，１９９９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｏｄａｙ  ５：３６７−３６９。
【０１５４】
自己免疫性甲状腺疾患
自己免疫性甲状腺疾患、たとえば、橋本甲状腺炎または慢性リンパ球性甲状腺炎とも呼ばれる自己免疫性甲状腺炎は、免疫系が自己の甲状腺を攻撃する状態である。頸部の前にある小さな腺である甲状腺が、慢性的に炎症を起こし、甲状腺ホルモントリヨードチロニンおよびチロキシンの産生を減少させる。これらのホルモンは、体内のほとんど至る所で使用されるため、自己免疫性甲状腺疾患は、広範で重篤な作用および多くの症状を有する恐れがある。
【０１５５】
軽度の自己免疫性甲状腺炎は、無症状である場合がある。しかしながら、より重篤な場合には、甲状腺が炎症により肥大することがある（甲状腺腫）。次第に、甲状腺は、損傷が大きくなり、疲労、体重増加、体の痛み、鬱および嗜眠など甲状腺機能低下症（不活発な甲状腺）の症状を来す恐れがある。慢性自己免疫性甲状腺疾患は、著しい甲状腺機能低下に進行する可能性がある。
【０１５６】
自己免疫性甲状腺疾患（ＡＩＴＤ）の分類には、橋本甲状腺炎（ＨＴ）または慢性自己免疫性甲状腺炎およびその変形、グレーブス病（ＧＤ）ならびに自己免疫性萎縮性甲状腺炎がある。ＨＴは、甲状腺腫の存在、血清中の甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）およびチログロブリン（Ｔｇ）に対する甲状腺自己抗体、ならびに様々な程度の甲状腺機能障害を特徴とする。ＨＴにおいて、自己反応性ＣＤ４＋Ｔリンパ球（Ｔｈ）がＢ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＴＬ）を甲状腺に補充する。疾患が進行すると、甲状腺細胞の死および甲状腺機能低下を来す。
【０１５７】
自己抗体および甲状腺特異的細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の両方が、自己免疫性の甲状腺細胞の減少に関与していると考えられてきた。ＧＤでは、ＴＳＨ−Ｒが最も重要な自己抗原である。これに対する抗体が甲状腺細胞に対するホルモンの作用を擬態し、チロキシンおよびトリヨードチロニンの自律産生を刺激して甲状腺機能亢進症を引き起こす。
【０１５８】
本開示の方法は、自己免疫性甲状腺疾患の処置に、および／または、自己免疫性甲状腺疾患の患者のＩＬ−２の発現を増加させるために使用してもよい。ある種の実施形態では、本開示の方法を使用して自己免疫性甲状腺疾患の１つまたは複数の症状を減少させる。言い換えれば、「処置すること」は、自己免疫性甲状腺疾患の１つまたは複数の症状を減少させるか、またはゼロにすることを含むことを意図している。さらに、本開示は、本開示の組成物は、単独で投与しても、あるいは、自己免疫性甲状腺疾患の１つまたは複数の症状を減少させるのに有用な他の作用物質と共に治療レジメンの一部として投与してもよいことも考えている。
【０１５９】
本疾患の症状は動物モデルで再現することができ、そうしたモデルは、単独療法または併用療法の有効性を確認するために容易に使用される。２つの例示的マウスモデルがＶｏｌｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｈｏｒｍ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ  ２５：６２３−６２７に記載されている。
【０１６０】
強皮症
強皮症は、線維症、血管の変質および自己抗体を特徴とする慢性自己免疫疾患である。２つの主要な形態：限局型全身性強皮症とびまん型全身性強皮症とがある。限局型全身性強皮症の皮膚症状は、手、腕および顔が侵される。この形態の強皮症の患者は、高い頻度で以下の合併症の１つまたは複数を有する：石灰沈着、レイノー現象、食道機能異常、手指硬化および毛細血管拡張症。
【０１６１】
びまん型全身性強皮症は、急速に進行し、皮膚の広範囲と、１つまたは複数の内臓、頻繁には、腎臓、食道、心臓および／または肺とが侵される。
【０１６２】
強皮症は、すべての器官の細動脈と呼ばれる細い血管が侵される。最初に、細動脈の内皮細胞が平滑筋細胞と共にアポトーシスにより次々に死んでいく。これらの細胞がコラーゲンおよび他の線維性物質と置き換わる。炎症細胞、特にＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞が、細動脈に浸潤し、さらに破壊を引き起こす。
【０１６３】
強皮症の皮膚症候は、痛みを伴うことがあり、患部領域の使用（たとえば、手、指、つま先、足等の使用）が損なわれる場合があり、変形する恐れもある。皮膚潰瘍が起こることがあり、こうした潰瘍は、感染症、あるいはさらには壊疽にも罹りやすい。潰瘍化した皮膚は、治癒が困難であるか、遅くなる場合がある。レイノー現象の患者など循環障害の患者では、皮膚潰瘍の治癒の難しさが特に増す恐れがある。ある種の実施形態では、本開示の方法を使用して、患者の強皮症を処置する、および／または、たとえば強皮症の皮膚症状など、ＩＬ−２の発現を増加させる。ある種の実施形態では、強皮症の処置は、指潰瘍などの皮膚潰瘍を処置することを含む。本開示の組成物の投与を使用すると、患部組織および／または患部臓器の強皮症の線維性症状および／または炎症症状を緩和することができる。
【０１６４】
強皮症は、皮膚症状／症候に加えて、心臓、腎臓、肺、関節および消化管が侵されることもある。ある種の実施形態では、強皮症の処置は、たとえば線維性症状および／または炎症症状を緩和することにより、これらの組織の任意の１つまたは複数の疾患の症状を処置することを含む。
【０１６５】
ある種の実施形態では、本開示の方法を使用して強皮症、たとえば強皮症と関連する肺線維症を処置する。本開示の組成物の投与を使用して肺の強皮症の線維性症状を緩和することができる。たとえば、本方法を使用して肺機能を改善する、および／または、強皮症による死亡のリスクを低下させることができる。
【０１６６】
ある種の実施形態では、本開示の組成物を使用して強皮症、たとえば強皮症と関連する腎線維症を処置する。投与を使用して腎臓の強皮症の線維性症状を緩和することができる。たとえば、本方法を使用して腎機能を改善する、タンパク尿を低下させる、高血圧を緩和する、および／または、致死性の腎不全を来す恐れがある腎クリーゼのリスクを低下させることができる。
【０１６７】
本開示の方法および組成物は、強皮症の処置に使用することができる。処置することができる例示的症状として、疼痛（関節痛を含む）、腫脹、皮膚潰瘍、皮膚刺激、発疹、可動域の減少、および日常作業を行う能力の低下があるが、これに限定されるものではない。処置することができる別の症状としては、肺機能（たとえば、肺機能を改善することができる）および腎機能が挙げられる。これらの症状のいずれかの改善は、たとえば、腫脹関節の数の減少、有痛性関節の数の減少、可動域の増加、潰瘍化した組織の治癒の進行、皮膚潰瘍の数の減少および／または重症度の低下、日常作業を行う能力の向上、皮膚障害の減少、疼痛薬または他の薬物への依存の低下、疼痛または生活の質に関する患者の自己評価の改善、肺機能の向上、高血圧の低下、タンパク尿の低下等により測定することができる。
【０１６８】
ある種の実施形態では、強皮症の処置方法は、強皮症に適した１種もしくは複数種の他の薬剤、生物学的製剤、または治療介入と共に治療レジメンの一部として本開示の組成物を投与することを含む。ある種の実施形態では、他の薬剤、生物学的製剤、または治療介入は、強皮症と関連する特定の症状に適している。例として、本開示の組成物は、１種または複数種の免疫抑制薬、たとえばメトトレキサート、シクロホスファミド、アザチオプリンおよびミコフェノレートと共に治療レジメンの一部として投与してもよい。
【０１６９】
さらに、処置方法は、食事療法、運動療法、ストレス管理、禁煙、鍼治療、マッサージおよび／または理学療法などの処置レジメンを含んでいてもよい。
【０１７０】
本疾患の症状は動物モデルで再現することができ、そうしたモデルを使用して単独療法または併用療法の有効性を容易に確認できる。例示的モデルとして、シクロスポリン（Ｄａｍｏｉｓｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ：Ａｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ．Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，４１（１−２）：２２−２６）またはブレオマイシンを用いた処置により強皮症が誘発される齧歯動物モデルのほか、トランスジェニックマウス、および移植片対宿主モデル（ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ），Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  Ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００５，１：１０１−１１９；Ｃｌａｒｋ，Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｉｎ  Ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２００５，７（２）：１５０−１５５）がある。
【０１７１】
本開示は、本開示の組成物のいずれも、前述の状態のいずれかの処置（たとえば、その１つまたは複数の症状を緩和するため）に、あるいは、ＩＬ−２の発現の調節不全と関連する自己免疫状態の処置に使用し得ると考えている。
【０１７２】
（ｖ）使用方法
（ａ）診断上の使用方法
ある種の実施形態では、本開示は、インビボおよび／またはインビトロで使用して自己免疫状態の対象の診断、モニタリングまたは予後に役立ち得る、あるいは、さらに薬物（たとえば、本開示の組成物を含む薬物があるが、これに限定されるものではない）の投薬量の改善に役立つように使用し得る診断方法を提供する。
【０１７３】
例示的な方法では、ある化合物（本開示の組成物を含む任意の化合物）で処置される対象のマイクロＲＮＡ−３１、ＲｈｏＡまたはＩＬ−２の１つまたは複数（１つ、２つ、３つ）から選択されるバイオマーカーをアッセイする。アッセイは、バイオマーカーの存在、非存在あるいは量に関するアッセイでもよい。好適なアッセイとして、サンプル中の転写物またはタンパク質の発現の検出に好適な定量ＰＣＲ、ＥＬＩＺＡおよび同種のものがある。アッセイは、細胞を用いて行っても、あるいはサンプル、たとえば血液サンプルを用いて行ってもよい。アッセイ結果に基づき、化合物のその後の投薬レジメンまたは投与レジメンを調整するかどうかを判定することができる。たとえば、マイクロＲＮＡ−３１刺激薬を１回または複数回投与した後、ＩＬ−２の発現の増加が観察されない場合、ＩＬ−２の発現の所望の増加を達成するため、投与の投薬量または頻度を増加させると有利である場合がある。
【０１７４】
別の例として、本開示は、全身性紅斑性狼瘡などの自己免疫状態を診断する方法を提供する。こうした方法の一部として、ＳＬＥなどの自己免疫状態の疑いがある対象からサンプルを採取する。このサンプルは、たとえば、骨髄サンプルでも、血液サンプルでも、あるいは血液サンプルから分離した細胞のサンプルでもよい。サンプルは、その状態を有する疑いがある対象が顕著な症状を経験している時期のほか、症状がそれほど急性でない期間に単離してもよい。サンプル採取後、サンプルについて、マイクロＲＮＡ−３１もしくはＲｈｏＡ、またはマイクロＲＮＡ３１、ＲｈｏＡもしくはＩＬ−２の任意の１つまたは複数の発現をアッセイする。アッセイは、タンパク質発現および転写物発現のアッセイを含む。
【０１７５】
別の例として、本開示は、全身性紅斑性狼瘡などの自己免疫状態の処置をモニターする方法を提供する。処置をモニターするには、処置を受けている対象のサンプルにおいてマイクロＲＮＡ−３１、ＩＬ−２および／またはＲｈｏＡの発現を検出する。この発現を、この特定の処置レジメンの開始前、あるいは、処置期間中の初期の時点に同じ対象から採取されたサンプル中のバイオマーカーの発現と比較する。１つまたは複数の期間にわたりマイクロＲＮＡ−３１および／またはＲｈｏＡおよび／またはＩＬ−２の発現の比較を行うことが、処置の進行をモニターする方法となる。後のサンプル中でマイクロＲＮＡ−３１が増加する、またはＲｈｏＡが減少すると、処置の有効性が示される。同様に後のサンプル中でＩＬ−２が増加すると、処置の有効性が示される。
【０１７６】
別の例として、本開示は、全身性紅斑性狼瘡などの自己免疫状態を有する対象を処置する方法を提供する。本方法は、特定の処置の開始前に対象から採取したサンプル由来のマイクロＲＮＡ−３１またはＲｈｏＡの発現を、健常対象由来のサンプル中の発現を反映した標準範囲と比較することを含む。マイクロＲＮＡ−３１の発現が標準範囲を下回るか、またはＲｈｏＡの発現が標準範囲を上回る場合、対象は、本開示の組成物を用いた処置に好適である可能性がある対象として特定される。次いで対象が処置に感受性があることが確認された場合、マイクロＲＮＡ−３１を含む組成物、ＲｈｏＡにハイブリダイズするｓｉＮＡ、ＩＬ−２タンパク質、または本開示の別の組成物を有効量で用いて対象を処置する。
【０１７７】
ある種の実施形態では、本方法は、同じ対象由来の処置後のサンプル中のマイクロＲＮＡ−３１またはＲｈｏＡの発現を検出すること、および処置後のサンプル中のマイクロＲＮＡ−３１またはＲｈｏＡの発現を特定の処置の開始前に採取したサンプル中の発現と比較することをさらに含む。
【０１７８】
ある種の実施形態では、特定の処置剤は、マイクロＲＮＡ−３１などのマイクロＲＮＡ−３１模倣体、ＲｈｏＡにハイブリダイズするｓｉＮＡ、またはＲｈｏＡの小分子阻害剤である。
【０１７９】
より一般的には、診断上の使用は、たとえば試験すべきサンプルを、任意に対照サンプルと共に、核酸またはタンパク質の検出に適した試薬と接触させることにより達成することができる。
【０１８０】
前述のいずれかのある種の実施形態では、ヒト患者またはヒト患者由来のサンプルを用いて診断アッセイを行う。好適な診断試薬として、マイクロＲＮＡ−３１またはＲｈｏＡの発現の検出に好適なプローブおよびプライマーのほか、ＲｈｏＡタンパク質の発現の検出に好適な抗体があるが、これに限定されるものではない。試薬は、アッセイの検出および定量を行い安くするため標識してもよく、検出は、二次試薬の使用に依存してもよい。
【０１８１】
（ｂ）治療上の使用法
ある種の実施形態では、本開示は、本開示の組成物を、たとえば、ヒト対象または非ヒト対象の処置に治療的に使用し得ると考えている。本明細書に記載の組成物のどれも、本明細書に記載の自己免疫状態のいずれかの処置に使用することができる。好適な組成物は、活性成分として核酸、ポリペプチドまたは小分子を含む。他の好適な組成物は、細胞組成物、たとえばマイクロＲＮＡ−３１を発現する細胞を含む。
【０１８２】
例示的な方法は、細胞を、マイクロＲＮＡ−３１の発現を増加させるか、またはＲｈｏＡの発現を減少させる組成物と接触させる、あるいは、それを対象に投与することを含む方法を含む。こうした組成物を使用すると、たとえば、自己免疫状態を有する対象のＩＬ−２の発現を増加させることができる。例示的組成物は、マイクロＲＮＡ−３１の発現を増加させるヌクレオチド配列を含む核酸またはＲｈｏＡの発現を減少させるヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
【０１８３】
処置することができる例示的状態には、自己免疫状態、たとえばＳＬＥまたは同じ作用機序または病因を持つ他の自己免疫状態があるが、これに限定されるものではない。ある種の実施形態では、本方法は、対象のＩＬ−２の発現を増加させることを含む。
【０１８４】
好適な組成物は、たとえば、配列番号１、配列番号２または配列番号３のヌクレオチド配列を含む核酸を含む。他の好適な組成物は、たとえば、ｓｉＮＡを含む核酸、マイクロＲＮＡ−３１を擬態する核酸、またはＲｈｏＡにハイブリダイズするｓｉＮＡを含む。核酸組成物は、一本鎖（ｓｔａｎｄｅｄ）でも、部分二本鎖でも、あるいは完全二本鎖でもよい。ある種の実施形態では、本組成物を投与すると、内在性マイクロＲＮＡの発現が増加する。他の実施形態では、本組成物の投与は、外来性マイクロＲＮＡ−３１分子、たとえば細胞への導入後にマイクロＲＮＡ−３１を発現するオリゴヌクレオチドの導入を含む。
【０１８５】
投与される個々の組成物に関わらず、患者には有効量が投与される。本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、疾患または障害の重症度および／または期間を短縮および／または軽減する；前記疾患または障害の進行を予防または遅延させる；前記疾患または障害の回復を引き起こす；前記疾患または障害と関連する１つまたは複数の症状の再発、発生または発症を予防または遅延させる、あるいは、別の療法薬の作用を増強または改善するのに十分な療法薬の量をいう。有効性の測定可能な徴候は、単回投与後に観察できないことがあることが理解されよう。
【０１８６】
ある状態または疾患「を処置すること」とは、その状態または疾患の少なくとも１つの症状を治癒させるほか、軽減することをいい、対象の医学的状態の症状の頻度を低下させる、またはその発症を遅延させる組成物を投与することを含む。
【０１８７】
ある種の実施形態では、処置の進行および有効性を処置中および／または処置後にモニターする。たとえば、自己免疫状態は、個々の状態に好適な方法、たとえば、血液検査、尿サンプル、疼痛および疲労の自己申告、疼痛薬の必要性の低下、Ｘ線、ＣＴスキャンおよび同種のものを用いてモニターすることができる。さらに、処置は、症状の改善、たとえば疼痛の減少（たとえば、患者が要求／使用する疼痛薬の減少）、酸素補給の依存の低下、食欲の改善、体重増加、疲労の減少、可動性の増加および同種のものの評価に基づきモニターしてもよい。さらに、処置の進行および有効性は、上述したようにバイオマーカーのマイクロＲＮＡ−３１、ＲｈｏＡまたはＩＬ−２の任意の１つまたは複数を用いてモニターしてもよい。
【０１８８】
本開示では、ある種の実施形態において、本開示の組成物を、１種もしくは複数種の他の作用物質、および／または１種もしくは複数種の他の処置方式と共に治療レジメンの一部として投与する。他のどの作用物質および／または処置方式を選択するのがよいかは、個々の疾患、患者の状態、患者の年齢、症状および同種のものによって異なってもよい。例として、他の好適な処置方式には、手術、透析、インスリン療法、食事、理学療法、禁煙、酸素療法、換気補助、鍼治療および同種のものがあるが、これに限定されるものではない。例として、他の好適な作用物質には、鎮痛薬、麻薬（など、疼痛管理のため）、抗炎症薬、免疫抑制剤、コルチコステロイド、抗マラリア剤および同種のものがあるが、これに限定されるものではない。これらの作用物質および／または方式の任意の１つまたは複数を治療レジメンの一部として使用することができる。
【０１８９】
作用物質および／または療法薬の組み合わせを含む処置方法のどれも、処置の個々の成分を同時に、連続的にまたは別々に投与することによって、こうした併用処置を達成することができる。
【０１９０】
ある種の実施形態では、治療方法は、本開示の組成物による処置後に対象のマイクロＲＮＡ−３１、ＲｈｏＡおよび／またはＩＬ−２の発現を評価するアッセイステップをさらに含む。こうしたアッセイステップは、好適な方法を用いてＲＮＡまたはタンパク質の発現を評価することができる。
【０１９１】
（ｖｉｉ）投薬量および投与
本開示の実施形態は、対象への組成物の投与の観点からおよび／または診断現場で使用するのに、有用な無菌医薬製剤を含む。さらに、様々な投与および送達の経路および方法も有用であり得る。本開示は、投与製剤および／または投与経路のいずれも、本開示の組成物のどれと一緒に使用してもよいと考えている。さらに、本開示は、様々な投与製剤および投与経路が他の作用物質、たとえば治療レジメンの一部として投与される作用物質にも適用できると考えている。
【０１９２】
様々な送達システムが知られており、本開示の組成物の投与に使用することができる。投与方法としては、非経口投与（たとえば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外投与、局所投与および粘膜投与（たとえば、鼻腔内経路および経口経路）があるが、これに限定されるものではない。投与は、全身性でも、あるいは局所性でもよい。製剤を併用療法の一部として投与する場合、本開示は、他の作用物質を同一の投与経路で投与しても、あるいは異なる投与経路で投与してもよいと考えていることに留意されたい。
【０１９３】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、薬学的に許容されるキャリアを含む。好ましい実施形態では、薬学的に許容されるキャリアは、注射用水（ＵＳＰ）、５％デキストロース溶液（Ｄ５Ｗ）または食塩水である。
【０１９４】
ある種の製剤では、水性製剤が利用され、他の製剤では、製剤は脂質性であってもよい。特定の実施形態では、活性医薬剤またはそれをコードする核酸を含む組成物は、水性製剤である。他の実施形態では、製剤は、脂質性である。
【０１９５】
本明細書に記載の活性医薬剤の溶液は、遊離塩基として調製しても、あるいは薬理学的に許容される塩として調製してもよい。いくつかの実施形態では、こうした作用物質はまた、界面活性剤、たとえばヒドロキシプロピルセルロースと好適に混合された水で調製してもよい。また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、これらの混合物、および油を用いて分散液を調製してもよい。保存および使用の通常の条件下、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するため防腐剤を含んでもよい。注射に使用するのに好適な医薬品形態には、無菌水溶液または分散液、および無菌の注射用溶液または分散液で必要に応じて調製される無菌粉末がある。この形態は、多くの場合、無菌で、シリンジ操作が容易である程度の流動性がある。この形態は、製造および保存の条件下で安定であり得、微生物、たとえば細菌および真菌の汚染作用から保護され得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールおよび同種のものによって行うことができる。
【０１９６】
使用する正確な用量および投与レジメンは、投与経路、処置される個々の疾患、患者の状態の重症度、使用する特定の組成物および同種のものによって異なる。効果的な用量は、インビトロ試験系または動物モデルの試験系から得られる用量反応曲線から外挿することができる。
【０１９７】
ある種の実施形態では、特にヒトへの投与を目的とした製剤の場合、製剤は、エンドトキシンおよび／または関連する発熱物質を実質的に含まないパイロジェンフリー製剤である。エンドトキシンとしては、微生物内に閉じ込められており、微生物が破壊されるかまたは死んだときにのみ放出されるトキシンが挙げられる。また、発熱物質としては、細菌および他の微生物の外膜由来の発熱を誘導する耐熱性物質（糖タンパク質）が挙げられる。これらの物質のどちらも、ヒトに投与すると、発熱、低血圧およびショックを引き起こす恐れがある。有害作用の可能性があるため、少量のエンドトキシンでも、静脈投与される医薬溶液から除去しなければならない。食品医薬品局（「ＦＤＡ」）は、作用物質の静脈内投与の場合、１回１時間、体重１キログラム当たり、１投与につき５エンドトキシン単位（ＥＵ）の上限を設定している（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｆｏｒｕｍ  ２６（１）：２２３（２０００））。治療用タンパク質を体重１キログラム当たり数百または数千ミリグラムの量で投与する場合、抗体と同様に、有害かつ危険なエンドトキシンは、微量でも除去しなければならない。ある特定の実施形態では、組成物中のエンドトキシンおよび発熱物質のレベルは、１０ＥＵ／ｍｇ未満、または５ＥＵ／ｍｇ未満、または１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．０１ＥＵ／ｍｇ未満または０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。
【０１９８】
化合物（たとえば本開示の組成物または他の薬剤）は、バイオマーカーを有するまたは本明細書に記載の状態の処置を必要とする、任意の適切な対象に投与してもよい。対象の非限定的な例として、哺乳動物、ヒト、類人猿、サル、有蹄動物（たとえば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、水牛、ラクダおよび同種のもの）、イヌ、ネコ、齧歯動物および同種のものが挙げられる。対象は雄でもあるいは雌でもよく、薬剤は、特定の年齢群の対象、たとえば若年、小児、青年、成人および同種のものに投与してもよい。ある種の実施形態では、本開示の組成物または他の薬剤は、活性成分として抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗体、小分子、核酸、核酸誘導体、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、ペプチド、ポリペプチドおよび同種のものを含む。プロセシング後のｍｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ、プロセシング前のｍｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ、またはプロセシング前もしくはプロセシング後のｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードするベクターなど、様々な形態のｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを送達してもよい。
【０１９９】
本明細書に示した方法は、以下に限定されるものではないが、有効量の核酸または核酸をコードする発現コンストラクトの送達を含む。医薬組成物の「有効量」は一般に、たとえば、疾患またはその症状の程度を軽減、緩和、最小化または限定するため、規定の所望の結果を検出可能に繰り返し達成するのに十分な量と定義される。いくつかの実施形態では、処置の有効性を評価し、毒性を制御するためバイオマーカーをモニターするステップが存在してもよい。
【０２００】
薬剤は、投薬製剤に適合するようにかつ治療上有効であり得るような量で、投与する。核酸の注射は、核酸および任意の関連する成分が、注射に必要とされる特定のゲージの針を通ることができる限り、シリンジ、または溶液の注射に使用される任意の他の方法により送達することができる。所定量の溶液を任意の深さで正確に複数回注射できるシリンジ系が、遺伝子治療用として記載されている（米国特許第５，８４６，２２５号明細書）。
【０２０１】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、マイクロＲＮＡ−３１の発現を増加させる、またはＲｈｏＡの発現を減少させる核酸を含む。ある種の実施形態では、こうした核酸を用いた組成物は、遺伝子治療として投与してもよい。遺伝子治療とは、発現した核酸または発現可能な核酸を対象に投与することにより行われる治療である。本開示のこの実施形態では、核酸（アンチセンス、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡなど）が産生され、予防効果または治療効果を媒介する。
【０２０２】
当該技術分野において利用可能な遺伝子治療方法のどれも、本開示に従い使用することができる。例示的な方法を以下に記載する。遺伝子治療方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９９１，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１；Ｍａｙ，１９９３，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１５５を参照されたい。使用することができる組換えＤＮＡ技術の当該技術分野における公知の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載されている。
【０２０３】
一実施形態では、核酸を用いた組成物を、好適な宿主内で核酸を発現する発現ベクターの一部として提供する。特に、こうした核酸は、プロモーター、たとえば、異種プロモーターを有し、前記プロモーターは、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターであり、任意に組織特異的プロモーターである。
【０２０４】
核酸の対象への送達は、直接送達でもよく、この場合、対象を核酸または核酸を運ぶベクターに直接接触させ、あるいは、間接的送達でもよく、この場合、最初にインビトロで細胞を核酸で形質転換し、次いで対象に移植する。このため、ある種の実施形態では、本開示の組成物は細胞組成物を含む。これらの２つのアプローチは、それぞれインビボ遺伝子治療またはエキソビボ遺伝子治療として知られている。好適なベクターとしてウイルスベクターがある。他の実施形態では、核酸は、裸の核酸として投与してもよい。さらに、ある種の実施形態では、核酸を用いた組成物は、形質導入／感染、ＤＥＡＥ−デキストランを介したトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよびイオントフォレーシスによって投与してもよい。
【０２０５】
（ｖｉｉｉ）製品
本開示は、本開示の組成物の入った１つまたは複数の容器を含む医療パックまたはキットを提供する。同様に、本開示は、実験室用および／または診断用に好適な医療パックまたはキットを提供する。本開示は、本明細書に記載の組成物のいずれも、たとえばマイクロＲＮＡ−３１の発現を増加させるヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物、またはＲｈｏＡの発現を減少させるヌクレオチド配列を含む核酸を含む組成物は、パッケージ化して、キットの一部として販売してもよいと考えている。例示的なこうしたキットは、医薬キットである。
【０２０６】
本開示はまた、本明細書に記載するような製剤を１つまたは複数の第１の容器に、および自己免疫状態、たとえばＳＬＥ、またはＳＬＥに類似した作用機序または病因を有する自己免疫状態（たとえば、ＩＬ−２の発現の減少と相関関係にある状態、またはＴ細胞の制御不良に起因する状態）の予防、管理または処置に有用な１種もしくは複数種の他の予防薬または治療薬を１つまたは複数の第２の容器に含む医療パックまたはキットも提供する。
【０２０７】
例示的実施形態では、本開示の製剤は、単回投与バイアル中に無菌製剤として製剤化される。こうした容器には任意に、医薬品または生物由来物質の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が添付されていてもよく、通知には、ヒト投与のための製造、使用または販売に関する当該機関による承認が示される。
【０２０８】
実験室用および／または診断用に販売されるキットの場合、キットは任意に、適切な使用、安全に関する事項および任意の使用制限を指示する通知を含んでもよい。さらに、実験室用および／または診断用に販売されるキットの場合には、キットは任意には、１種もしくは複数種の他の試薬、たとえば特定の診断用または実験室用に有用な陽性対照または陰性対照の試薬を含んでもよい。
【０２０９】
本開示は、上記の方法に使用することができるキットを提供する。一実施形態では、キットは、１つまたは複数の容器に本明細書に記載するような組成物を含む。別の実施形態では、キットは、１つまたは複数の容器に本明細書に記載するような組成物、およびＳＬＥ、または自己免疫状態、たとえばＳＬＥに類似した作用機序または病因を有する自己免疫状態（たとえば、ＩＬ−２の発現の減少と相関関係にある状態、またはＴ細胞の制御不良に起因する状態）の予防、管理または処置に有用な１種もしくは複数種の他の予防薬または治療薬を含む。好ましくは、キットは、障害を予防、処置、管理または軽減する（たとえば、記載の製剤を単独で、または別の予防薬または治療薬と組み合わせて使用して）ための説明書のほか、そうした使用の際の副作用および投薬量の情報をさらに含む。
【０２１０】
本開示は、パッケージ化され、ラベルが付けられた最終の医薬製品をさらに包含する。この製品は、適切な入れ物または容器、たとえばガラスバイアル、または密封された他の容器に適切な単位剤形を含む。非経口投与に好適な剤形の場合には、活性成分は無菌であり、投与に好適である。ある種の実施形態では、製剤は、静脈内投与に好適である。
【０２１１】
好ましい実施形態では、単位剤形は、静脈内送達、筋肉内送達、鼻腔内送達、経口送達、局所送達または皮下送達に好適である。このため、本開示は、好ましくは無菌で、各送達経路に好適な溶液を包含する。
【０２１２】
どの医薬製品にも言えることだが、パッケージング材料および容器は、保存および輸送中の製品の安定性を保護するように設計される。さらに、本開示の製品は、使用説明書、または医師、技術者または患者に問題の状態を適切に予防または処置する方法を助言する他の情報資料を含む。言い換えれば、本製品は、以下に限定されるものではないが、実際の用量、モニタリング手順等を含む投与レジメンを指示または推奨する説明手段、および他のモニタリングのための情報を含む。
【０２１３】
具体的には、本開示は、パッケージング材料、たとえば箱、ビン、チューブ、バイアル、容器、噴霧器、インサフレーター、点滴（ｉ．ｖ．）バッグ、封筒および同種のものと、前記パッケージング材料の中に含まれる医薬剤の少なくとも１つの単位剤形とを含む製品であって、前記医薬剤は本開示の組成物を含み、前記パッケージング材料は、前記組成物を使用して、ＳＬＥに関連する１つもしくは複数の症状、または別の自己免疫状態、たとえばＳＬＥに類似した作用機序もしくは病因を有する自己免疫状態（たとえば、ＩＬ−２の発現の減少と相関関係にある状態、またはＴ細胞の制御不良に起因する状態）またはそれらの１つもしくは複数の症状を、特定の用量を投与し、本明細書に記載するような特定の投与レジメンを用いることにより予防、管理、処置および／または軽減することができることを指示する説明手段を含む製品を提供する。
【０２１４】
本開示また、パッケージング材料、たとえば箱、ビン、チューブ、バイアル、容器、噴霧器、インサフレーター、点滴（ｉ．ｖ．）バッグ、封筒および同種のものと、前記パッケージング材料の中に含まれる各医薬剤の少なくとも１つの単位剤形とを含む製品であって、一方の医薬剤は本開示の組成物を含み、他方の医薬剤は本開示の組成物以外の予防薬または治療薬を含み、前記パッケージング材料は、前記薬剤を使用して、ＳＬＥに関連する１つもしくは複数の症状、または別の自己免疫状態、たとえばＳＬＥに類似した作用機序もしくは病因を有する自己免疫状態（たとえば、ＩＬ−２の発現の減少と相関関係にある状態、またはＴ細胞の制御不良に起因する状態）またはそれらの１つもしくは複数の症状を、特定の用量を投与し、本明細書に記載するような特定の投与レジメンを用いることにより処置、予防および／または軽減することができることを指示する説明手段を含む製品を提供する。
【０２１５】
ある種の実施形態では、特にヒトへの投与を目的とした製剤を含む医薬キットの場合、製剤は、エンドトキシンおよび／または関連する発熱物質を実質的に含まないパイロジェンフリー製剤である。エンドトキシンとしては、微生物内に閉じ込められており、微生物が破壊されるかまたは死んだときにのみ放出されるトキシンが挙げられる。また、発熱物質としては、細菌および他の微生物の外膜由来の発熱を誘導する耐熱性物質（糖タンパク質）が挙げられる。これらの物質のどちらも、ヒトに投与すると、発熱、低血圧およびショックを引き起こす恐れがある。有害作用の可能性があるため、少量のエンドトキシンでも、静脈投与される医薬溶液から除去しなければならない。食品医薬品局（「ＦＤＡ」）は、作用物質の静脈内投与の場合、１回１時間、体重１キログラム当たり、１投与につき５エンドトキシン単位（ＥＵ）の上限を設定している（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｆｏｒｕｍ  ２６（１）：２２３（２０００））。ある特定の実施形態では、組成物中のエンドトキシンおよび発熱物質のレベルは、１０ＥＵ／ｍｇ未満、または５ＥＵ／ｍｇ未満、または１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。
【実施例】
【０２１６】
次に、以下の例を参照しながら本開示を説明する。これらの例は、説明のみを目的として提供するものであり、本開示を決してこれらの例に限定するものとして解釈してはらならず、むしろ、本明細書に提供される教示の結果から明らかになるあらゆる変更例を包含するように解釈すべきである。一般的に言えば、本開示は、他に記載がない限り、分子生物学、化学、生化学、生物物理学、組換えＤＮＡ技術および免疫学の従来の技術を利用する。言うまでもなく、使用する特定の装置および試薬、大きさ、製造者等の具体的なリストおよび説明は、特に限定する記載がない限り、本開示を限定するものと見なしてはならないことが理解されよう。同様の機能を果たす他の装置および試薬を、いつでも代わりに用いてもよいこともさらに理解されよう。
【０２１７】
実施例１−マイクロＲＮＡ−３１の発現
我々は、３例の健常ボランティアのＰＢＭＣから単離したＴ細胞、Ｂ細胞および単球におけるｍｉＲ−３１の発現レベルを測定した。図１Ａに示すように、ｍｉＲ−３１はＴ細胞に選択的に発現したことから、ｍｉＲ−３１がＴ細胞の機能に役割を果たし得ることが示唆される。
【０２１８】
次いで、我々は、３２例のＳＬＥ患者および１１例の正常対照（ＮＣ）から採取したＴ細胞のｍｉＲ−３１の発現を調査し、図１Ｂに示すように、ＳＬＥ患者では対照と比較して、ｍｉＲ−３１が有意に下方制御されることが分かった（Ｐ＜０．０００１）。これらの研究に使用した対象に関する詳細な情報を表１に示す。
【０２１９】
【表１】
2014521600.tif 000002
【０２２０】
実施例２−マイクロＲＮＡ−３１の発現とＩＬ−２の発現との相関関係
ループス患者由来のＴ細胞は、ＳＬＥの病因に関与し得る多くのシグナル伝達の異常を示す（Ｋｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｍｏｕｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。以下の実験は、ＳＬＥにおけるＴ細胞関連サイトカインの不均一な発現に、ｍｉＲ−３１が果たす役割を調査した。こうした実験の一部として、マイクロＲＮＡ−３１模倣体を設計してマイクロＲＮＡ−３１の発現に使用し、アンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）−３１を設計してマイクロＲＮＡ−３１の発現の減少に使用した。適切なオリゴヌクレオチド対照も使用した。図２Ａおよび２Ｂに示すように、これらのコンストラクトを原発Ｔ細胞にトランスフェクトすると、マイクロＲＮＡ−３１の発現を効率的に増加させるか（模倣体の場合）、または減少させた（アンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）の場合）。原発Ｔ細胞におけるｍｉＲ−３１の異所性発現またはサイレンシングがうまくいったことは、ＴａｑＭａｎ定量ＰＣＲを用いて立証した。ＴａｑＭａｎ定量ＰＣＲからは、トランスフェクション後のｍｉＲ−３１の過剰発現または阻害により、ｍｉＲ−３１の発現がそれぞれ５０倍増加する、あるいは２５倍減少することが示された（図２）。ｍｉＲ−３１の発現の調節におけるこれらの試薬の有効性を踏まえ、これらの試薬を使用して上記の細胞のシグナル伝達をさらに研究した。
【０２２１】
経時的研究でＴＣＲとの結合がｍｉＲ−３１の発現に影響を与えるかどうかを評価するため、健康なドナーから新たに精製したＣＤ３＋Ｔリンパ球をＰＭＡおよびイオノマイシンで刺激した。図３Ａに示すように、ｍｉＲ−３１の発現が刺激後に誘導され、約１２時間後にピークに達した。
【０２２２】
ＴＣＲを介してＴ細胞を活性化するとＩＬ−２の誘導が増強されるとことから、ｍｉＲ−３１によるＩＬ−２産生の調節の可能性を評価した。この問題に対応するため、ヒト原発Ｔ細胞にｍｉＲ−３１模倣体または対照模倣体をトランスフェクトし、次いでＰＭＡおよびイオノマイシンで２４時間活性化した。細胞内のＩＬ−２のｍＲＮＡレベルおよび上清（ｓｕｐｅｒｎａｎｔ）中のＩＬ−２タンパク質レベルをそれぞれＲＴ−ＰＣＲおよびＥＬＩＳＡにより測定した。図３Ｂおよび３Ｃに示すように、ｍｉＲ−３１模倣体はｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルとの両方でＩＬ−２の発現を増加させたのに対し、阻害性オリゴヌクレオチドのアンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）−３１のトランスフェクションによる内在性ｍｉＲ−３１のサイレンシングは、ＩＬ−２の産生を減少させた。図３Ｄに示すように、これらの結果と整合して、活性化ループスＴ細胞（ｎ＝１５）のｍｉＲ−３１の発現レベルとＩＬ−２の発現レベルとの間に正の相関関係も観察された。
【０２２３】
ｍｉＲ−３１がＩＬ−２プロモーター活性を制御したかどうかを問うため、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。ＩＬ−２プロモーターをルシフェラーゼレポーターベクターにクローニングした（ＩＬ−２−ｌｕｃと呼ぶ）。ＩＬ−２−ｌｕｃおよびｍｉＲ−３１模倣体または対照とコトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞をＰＭＡおよびイオノマイシンで刺激した。図３Ｅに示すように、ｍｉＲ−３１は、ＩＬ−２プロモーター活性を増加させ、しかも用量依存性に増加させた（図３Ｆ）。以上を総合すると、上記のデータから、ｍｉＲ−３１が、ＩＬ−２プロモーターの活性の増強を介してＩＬ−２産生を促進することが示唆される。加えて、ＩＬ−２とｍｉＲ−３１との間の関係は、ループス患者由来の各サンプル中で一貫して観察された。
【０２２４】
実施例３−Ｔ細胞のＲｈｏＡ
ｍｉＲ−３１がＩＬ−２産生をどのように制御するかの分子機構に関する洞察を得るため、バイオインフォマティクスツールを使用して、ｍｉＲ−３１の有力な標的を同定した。ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ＰｉｃＴａｒおよびＭｉＲａｎｄａの解析を統合したｍｉＲＧｅｎデータベース（ｗｗｗ．ｄｉａｎａ．ｐｃｂｉ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／ｍｉＲＧｅｎ／ｖ３／ｍｉＲＧｅｎ．ｈｔｍｌ）から、予想されるｍｉＲ−３１標的のリストを得た。ＲｈｏＡは、Ｔ細胞の活性化に伴いＩＬ−２の遺伝子発現を調節することが報告されており（Ｈｅｌｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、この系においてｍｉＲ−３１の候補標的とした。
【０２２５】
ｍｉＲ−３１がＴ細胞のＲｈｏＡの発現を阻害するかどうかを評価するため、原発Ｔ細胞にｍｉＲ−３１模倣体または対照をトランスフェクトし、ＲｈｏＡの発現をＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロッティングにより測定した。ＲＴ−ＰＣＲから、ｍｉＲ−３１がＲｈｏＡのｍＲＮＡの発現を阻害することが立証された（図４Ａ）。ウエスタンブロッティング解析からは、ｍｉＲ−３１のトランスフェクションによりＲｈｏＡタンパク質が減少することが明らかになった（図４Ｂ）。ＳＬＥサンプル中のｍｉＲ−３１の発現レベルがＮＣ由来のサンプルと比較して著しく低かったことを踏まえて、我々は、ＲｈｏＡの発現がＳＬＥのＴ細胞において増加するかどうかを調査した。３２例のＳＬＥ患者および１１例のＮＣ由来のＴ細胞から、ＳＬＥのＴ細胞ではＲｈｏＡのｍＲＮＡが有意に上方制御されることが示された（図４Ｃ）。さらに、線形相関解析からは、ループス患者の原発Ｔ細胞においてＲｈｏＡのｍＲＮＡの発現がｍｉＲ−３１の発現と負に相関することが立証された（図４Ｄ）。以上を総合すると、上記のデータから、ｍｉＲ−３１はヒト原発Ｔ細胞でＲｈｏＡを標的としており、ループスＴ細胞ではＮＣと比較してＲｈｏＡのｍＲＮＡの発現が著しく高いことが示唆される。
【０２２６】
実施例４−ＲｈｏＡの発現の阻害
ｍｉＲ−３１がＲｈｏＡを介してＴ細胞のＩＬ−２の発現を制御するという仮説を試験するため、この系でＲｈｏＡの阻害作用を調査し、こうした阻害がｍｉＲ−３１の過剰発現と等価な作用を有するかどうかを評価した。ＲｈｏＡの発現をノックダウンするため、ＲＮＡ干渉技術を使用した。図５Ａおよび５Ｂに示すように、ＲｈｏＡのｓｉＲＮＡを４８時間トランスフェクトすると、ｍｉＲ−３１模倣体の過剰発現に観察されたのと同じようにＲｈｏＡのｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルが有意に低下した。
【０２２７】
次いでＲｈｏＡのｓｉＲＮＡまたはｍｉＲ−３１模倣体を原発Ｔ細胞に４８時間トランスフェクトし、ＰＭＡおよびイオノマイシンで２４時間刺激した。トランスフェクションおよび刺激の後、ＩＬ−２の発現を測定した。ｍｉＲ−３１模倣体の作用と一致して、ＲｈｏＡをノックダウンすると、ＩＬ−２のｍＲＮＡおよびそのタンパク質の発現が顕著に増加した（図６Ａおよび６Ｂ）。この追加評価から、ＲｈｏＡのノックダウンにより、ＩＬ−２プロモーターの活性が増強されたという結論が裏付けられる（図６Ｃ）。
【０２２８】
実施例５−活性化ループスＴ細胞におけるＩＬ−２の発現レベルの上昇
ｍｉＲ−３１が活性化Ｔ細胞で誘導され、ＲｈｏＡを標的とすることによりＩＬ−２産生を制御すると考えて、我々は、１５例のＳＬＥ患者および１０例の正常対照（ＮＣ）から単離した活性化Ｔ細胞においてｍｉＲ−３１、ＲｈｏＡおよびＩＬ−２の発現レベルを調査した。これらの研究に使用した対象に関する詳細な情報を表２に示す。こうした結果から、ＳＬＥ患者由来の活性化Ｔ細胞におけるｍｉＲ−３１およびＩＬ−２の発現は、ＮＣで観察されたものより低い一方、ＲｈｏＡの発現は高いことが明らかになった（図７Ａ、Ｂ、およびＣ）。
【０２２９】
この関係をさらに調査するため、ｍｉＲ−３１レベルを操作して、ＳＬＥ患者由来のＴ細胞におけるＩＬ−２産生に対する任意の作用を評価した。ループスＴ細胞にｍｉＲ−３１模倣体または対照模倣体をトランスフェクトした。ＰＭＡおよびイオノマイシンによる２４時間の刺激後、図７Ｄに示すように、ｍｉＲ−３１をトランスフェクトした活性化ループスＴ細胞においてＩＬ−２タンパク質の発現の増加が観察された。これは、ループス患者のＴ細胞で観察されたＩＬ−２産生の欠陥を、ｍｉＲ−３１を用いて修復したレベルと整合している。
【０２３０】
【表２】
2014521600.tif 000003
【０２３１】
材料および方法
以下に、前述の実施例１〜５を実施する際に利用するいくつかの材料および方法をまとめてある。
【０２３２】
患者および健常対照。ＳＬＥ患者サンプルはすべてＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｎｊｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）から取得し、ＳＬＥに関する米国リウマチ学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）の１９８２年改定基準の少なくとも４つに適合するものであった。ＳＬＥ活性は、ＳＬＥの疾患活動性  Ｉｎｄｅｘ（ＳＬＥＤＡＩ）により評価した。健常ボランティア由来の健常対照は、自己免疫疾患または免疫抑制療法の既往がなく、患者と年齢、性別および人種が一致していた。参加者はすべて中国人集団であった。各対象から採種した末梢血サンプル（１０ｍＬ）を、ａｃｉｄ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ｆｏｒｍｕｌａ  Ａ（ＡＣＤ−Ａ）を含むチューブに集めた。本研究は、ｔｈｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｒｅｎｊｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，  Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＪｉａｏＴｏｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅにより承認された。
【０２３３】
ＣＤ３＋Ｔ細胞の単離。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ  Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）を用いた密度勾配遠心分離によりヘパリン加全血から分離した。ＣＤ３＋Ｔ細胞は、磁性ＣＤ３マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用い、製造者のプロトコルに従ってポジティブ選択により新鮮なＰＢＭＣから精製した。Ｔリンパ球の純度はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）による解析で＞９５％であった。
【０２３４】
細胞培養物および刺激条件。精製Ｔリンパ球は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し、３７℃、５％ＣＯ２条件下、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で様々な時間刺激した。Ｔ細胞白血病株Ｊｕｒｋａｔは、３７℃、５％ＣＯ２条件下、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で増殖させた。Ｊｕｒｋａｔ細胞も、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）で刺激した。
【０２３５】
ｍｉＲＮＡ模倣体、低分子干渉ＲＮＡおよびアンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびｍｉＲＮＡ模倣体は、Ｇｅｎｅｐｈａｒｍａ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）が合成した。（Ａｈｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）に言及されたＲｈｏＡのｓｉＲＮＡ配列は、以下の通りである：ＲｈｏＡ−ｓｉＲＮＡ−１：５’−ＡＡＧＡＴＴＡＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＡＧＧＣ−３’（配列番号１）；ＲｈｏＡ−ｓｉＲＮＡ−２：５’−ＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＧＧＡ  ＡＴＧＡＴＧＡＧ−３’（配列番号２）。ｍｉＲＮＡ−３１模倣体の配列は、以下の通りである：模倣体：５’−ＡＧＧＣＡＡＧＡＵＧＣＵＧＧＣＡＵＡＧＣＵ−３’（配列番号３）。アンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）−３１コンストラクトおよび対照コンストラクトは、Ｒｉｂｏ  ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｕａｎｇ  ｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）から注文した。アンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）−３１の配列は、以下の通りである：アンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）：５’−ＡＧＣＵＡＵＧＣＣＡＧＣＡＵＣＵＵＧＣＣＵ−３’（配列番号４）。機能獲得実験（通常ｍｉＲＮＡ−３１により阻害される標的遺伝子の、模倣体誘導性下方制御）および機能喪失実験（通常ｍｉＲＮＡ−３１により阻害される標的遺伝子の、アンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）誘導性上方制御）の組み合わせから、ｍｉＲＮＡと標的との関連性が立証され、ｍｉＲＮＡの機能解析が可能になった。前述の各オリゴヌクレオチドでは、使用したｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ−３１模倣体は二本鎖分子であり、アンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）は一本鎖分子であった。各オリゴヌクレオチドは、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞にトランスフェクトすることにより細胞に外来性に発現させた。
【０２３６】
トランスフェクション。ヒト原発Ｔ細胞は、ＲＰＭＩ  １６４０中で２時間静置し、次いで製造者のプロトコルに従いリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。トランスフェクションから６時間後、Ｔ細胞を新鮮な完全培地（１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地）に加えた。２４時間後、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２条件下、ＰＭＡおよびイオノマイシンで最大２４時間刺激した。ｍｉＲ−３１の阻害では、ヒト原発Ｔ細胞を無血清ｏｐｔｉ−ＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）に再懸濁し、５００ｎＭのアンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）−３１または対照としてスクランブルアンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）をトランスフェクトした。トランスフェクションから６時間後、５００ｎＭのアンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）を補充したＲＰＭＩ培地を加え、上記のように２４時間後に細胞を刺激した。
【０２３７】
定量ＰＣＲ。全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で単離した。ｍｉＲＮＡを定量するため、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＲＮＡ（２０ｎｇ）サンプルを逆転写した。リアルタイムＰＣＲには、製造者（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）推奨に従い、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡアッセイを使用した。発現値の補正のための内在性対照としてＲＮＵ４８（Ｕ４８）を使用した。ｍＲＮＡの定量ＲＴ−ＰＣＲ解析では、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社（Ｔａｋａｒａ），Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いて５００ｎｇの全ＲＮＡを逆転写した。ｃＤＮＡは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ；タカラバイオ株式会社（Ｔａｋａｒａ），Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いてリアルタイムＰＣＲにより増幅させ、リボソームタンパク質Ｌ１３Ａ（ＲＰＬ１３Ａ）を内部対照として使用してｃＤＮＡ量の補正を行った。ＴａｑＭａｎアッセイおよびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎアッセイは、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて２回ずつ実施した。相対的発現レベルは、２−ΔΔｃｔ法を用いて計算した。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを用いたリアルタイムＰＣＲには、以下のカスタムプライマーを使用した：ＲＰＬ１３Ａ、フォワード５’−ＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＡＧＡ−３’（配列番号５）、リバース５’−ＴＴＧＡＧＧＡＣＣＴＣＴＧＴＧＴＡＴＴＴＧＴＣＡＡ−３’（配列番号６）。ＲｈｏＡ、フォワード５’−ＴＣＴＴＣＧＧＡＡＴＧＡＴＧＡＧＣＡＣ−３’（配列番号７）、リバース５’−ＣＴＴＴＧＧＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＡＣＡＣ−３’（配列番号８）。ＩＬ−２、フォワード５’−ＴＧＣＣＡＣＡＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＣ−３’（配列番号９）、リバース５’−ＧＣＣＴＴＣＴＴＧＧＧＣＡＴＧＴＡＡＡＡ−３’（配列番号１０）。他のプライマーも市販されていた、および／または公開配列に一致する。別のプライマーも容易に作製することができる。
【０２３８】
レポーターコンストラクトのクローニング、一過性トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ。ＩＬ−２プロモーターレポーターコンストラクトの作製には、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。簡単に説明すると、８８４ｂｐのプロモーター領域（−５９〜＋８２５ｂｐ塩基）をゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。使用したプライマーは、フォワード５’−ＣＡＴＴＣＡＴＡＧＴＧＴＣＣＣＡＧＧＴＧ−３’（配列番号１１）、リバース５’−ＣＡＴＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＴＴＧＡＧ−３’（配列番号１２）であった。
【０２３９】
フォワードプライマーおよびリバースプライマーにはそれぞれＭｌｕ  Ｉ部位およびＸｈｏ  Ｉ部位を設け、ＰＣＲ産物を製造者の指示に従いｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃプラスミドにライゲートした。Ｊｕｒｋａｔ細胞を２４ウェルプレートに１×１０６細胞／ウェルで播種し、２時間後にトランスフェクトした。上述のＩＬ−２プロモーター、ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡを含むｐＧＬ３−ｂａｓｉｃルシフェラーゼレポータープラスミド（１ｕｇ）を、トランスフェクション効率の補正に使用する５０ｎｇのｐＲＬ−ｂａｓｉｃ−ｌｕｃベクターと共に、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＪｕｒｋａｔ細胞にコトランスフェクトした。２４時間の回復期間後、トランスフェクト細胞を未処理にしておくか、あるいはＰＭＡおよびイオノマイシンで２４時間刺激した。次いで、ルシフェラーゼ活性を、製造者のプロトコルに従いＣＥＮＴＲＯ  ＸＳ３  ＬＢ  ９６０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）機器を用いて行ったＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により評価した。ウミシイタケルシフェラーゼとホタルルシフェラーゼとの比率をウェルごとに得た。実験はすべて３回ずつ行った。
【０２４０】
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）。細胞培養上清中に分泌されたＩＬ−２タンパク質のＥＬＩＳＡは、市販されているキット（Ｘｉ  Ｔａｎｇ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）を用いて製造者のプロトコルに従い定量した。
【０２４１】
ウエスタンブロッティング。６ウェルプレートに、Ｔ細胞を５×１０６細胞／ウェルで播種し、ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを各ウェルにトランスフェクトして、ｍｉＲ−３１模倣体または対照模倣体の最終濃度を１００ｎＭ、ｓｉＲＮＡ  ＲｈｏＡまたは対照の最終濃度も１００ｎＭとした。トランスフェクションから６時間後、Ｔ細胞を新鮮な完全培地に加えた。トランスフェクションから２日後、細胞を溶解させ、タンパク質を抽出した。次いで上清を硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、表記の抗体でブロッティングし、Ｌｕｍｉｎｏｌ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で検出した。ＲｈｏＡおよびＴｕｂｌｉｎのウエスタンブロッティングは、マウス抗ＲｈｏＡ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，１：２００）およびウサギ抗Ｔｕｂｌｉｎ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，１：５，０００）を用いて行った。タンパク質バンドの定量には、ソフトウェアＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のボリュームツールを製造者のマニュアルに従い使用した。
【０２４２】
データ解析。データは、Ｐｒｉｓｍ  ４ソフトウェア、バージョン４．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を用いて解析した。２群間の遺伝子発現の比較にはノンパラメトリックマンホイットニー検定を使用し、レポーター遺伝子活性の比較には対応のないスチューデントｔ検定を使用した。Ｐ値（両側）が０．０５未満の場合に統計学的に有意とした。
【０２４３】
配列表
配列番号１（ＲｈｏＡ−ｓｉＲＮＡ−１）−ＡＡＧＡＴＴＡＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＡＧＧＣ
配列番号２（ＲｈｏＡ−ｓｉＲＮＡ−２）−ＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＧＧＡＡＴＧＡＴＧＡＧ
配列番号３（ｍｉＲＮＡ−３１模倣体）−ＡＧＧＣＡＡＧＡＵＧＣＵＧＧＣＡＵＡＧＣＵ
配列番号４（ｍｉＲＮＡ−３１のアンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ））−ＡＧＣＵＡＵＧＣＣＡＧＣＡＵＣＵＵＧＣＣＵ
配列番号５（ＲＰＬ１３Ａのフォワードプライマー）−ＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＡＧＡ
配列番号６（ＲＰＬ１３Ａのリバースプライマー）−ＴＴＧＡＧＧＡＣＣＴＣＴＧＴＧＴＡＴＴＴＧＴＣＡＡ
配列番号７（ＲｈｏＡのフォワードプライマー）−ＴＣＴＴＣＧＧＡＡＴＧＡＴＧＡＧＣＡＣ
配列番号８（ＲｈｏＡのリバースプライマー）−ＣＴＴＴＧＧＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＡＣＡＣ
配列番号９（ＩＬ−２のフォワードプライマー）−ＴＧＣＣＡＣＡＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＣ
配列番号１０（ＩＬ−２のリバースプライマー）−ＧＣＣＴＴＣＴＴＧＧＧＣＡＴＧＴＡＡＡＡ
配列番号１１（プロモーターのフォワードプライマー）−ＣＡＴＴＣＡＴＡＧＴＧＴＣＣＣＡＧＧＴＧ
配列番号１２（プロモーターのリバースプライマー）−ＣＡＴＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＴＴＧＡＧ
【０２４４】
参考文献
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Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃｅｌｌ  １４２（６）：９１４−９２９．
Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３３（４）：６０７−６１９．
Ｐａｕｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １１４３：２２６−２３９．
Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ６０（４）：１０６５−１０７５．
Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８４（１２）：６７７３−６７８１．
Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ６３（５）：１３７６−１３８６．
Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７（３）：１９８−２０３．
Ｓｔｉｔｔｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１（１１）：１０５７−１０６２．
Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３６（９）：１４９７−１５０７．
Ｃｕｒｔａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｂｌｏｏｄ  １１５（２）：２６５−２７３．
Ｔｈａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６（５８２４）：６０４−６０８．
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６（５８２４）：６０８−６１１．
Ａｈｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２８（３）：５０９−５２３．
Ｈｅｌｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ８２（２）：３６１−３６９．
Ｖａｌａｓｔｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｅｅ  １３７（６）：１０３２−１０４６．
Ｋａｔｓｉａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｖ  ５（２）：１１８−１２１．
Ｓｅｔｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０１（５）：７２３−７３５．
Ｆｏｎｔｅｎｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６（１１）：１１４２−１１５１．
Ｃｒｉｓｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｖ  ８（３）：１９０−１９５．
Ｇｏｍｅｚ−Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｖ  ９（１）：３４−３９．
Ｎａｍｂｉａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０（６）：２８７１−２８７６．
Ｎａｍｂｉａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ４８（７）：１９４８−１９５５．
Ｂｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ８１（１）：１６１−１６７．
Ｂｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ６７（６）：７７４−７７９．
Ｂｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３（１６）：９５４４−９５５１．
Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  ４（６）：２０３２−２０４２．
Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ３５（５）：８０４−８１０．
Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７０（５）：１９０６−１９１５．
Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｌｕｐｕｓ  １３（５）：３４８−３５２．
Ｈａｇｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １２（７）：１０３５−１０４１．
Ｂｌｅｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓ  ８６（１１）：１１３６−１１４８．
Ｐｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ．（２０００）Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ２（４）：２２２−２３２．
【０２４５】
援用
本明細書に言及された刊行物および特許はすべて、援用するために１つ１つの刊行物または特許を具体的に個々に示しているかのように、その全体を本明細書に援用する。
【０２４６】
本開示の特定の態様を考察してきたが、上記の明細書は例示であり、限定するものではない。本明細書および下記の特許請求の範囲を検討すると、本開示の多くの変更形態が当業者に明らかになるであろう。本開示の全範囲は、そうした変更形態と共に、特許請求の範囲をその均等物の全範囲と、本明細書とを参照して決定すべきである。
【図１】
2014521600.tif 000004
【図２】
2014521600.tif 000005
【図３】
2014521600.tif 000006
【図４】
2014521600.tif 000007
【図５】
2014521600.tif 000008
【図６】
2014521600.tif 000009
【図７】
2014521600.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成26年2月21日(2014.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2014521600000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年2月27日(2014.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）インターロイキン−２（ＩＬ−２）発現を増加させることを必要とする対象のインターロイキン−２（ＩＬ−２）発現を増加させる（インターロイキン−２（ＩＬ−２）発現を増加させることを必要とする前記対象は全身性紅斑性狼瘡を有する対象である）；
（ｉｉ）全身性紅斑性狼瘡を有する対象のＴ細胞においてインターロイキン−２（ＩＬ−２）発現を増加させる；
（ｉｉｉ）全身性紅斑性狼瘡を処置する；
（ｉｖ）ＲｈｏＡの発現を減少させることを必要とする対象のＲｈｏＡの発現を減少させる（ＲｈｏＡの発現を減少させることを必要とする前記対象は全身性紅斑性狼瘡を有する対象である）；または、
（ｖ）全身性紅斑性狼瘡を有する対象のＴ細胞におけるＲｈｏＡの発現を減少させる；
ための医薬を製造するための、マイクロＲＮＡ−３１の発現を増加させるか、またはＲｈｏＡの発現を減少させる有効量の組成物の使用。
【請求項２】
全身性紅斑性狼瘡を有する前記対象が疾患フレアの症状を呈している、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
全身性紅斑性狼瘡を有する前記対象が疾患フレアの症状を呈していない、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記対象の症状がループス腎炎を含む、請求項２または請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記Ｔ細胞がインビトロ活性化Ｔ細胞である、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記組成物がマイクロＲＮＡ−３１の発現を増加させるか、またはＲｈｏＡの発現を減少させるヌクレオチド配列を含む核酸を含む、請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記組成物がマイクロＲＮＡ−３１を含む、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記組成物が短干渉核酸（ｓｉＮＡ）を含む、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
前記組成物がＲｈｏＡにハイブリダイズすることができるｓｉＮＡを含む、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
ＲｈｏＡの発現の減少が、（ｉ）ＲｈｏＡ転写物、および／または、（ｉｉ）ＲｈｏＡタンパク質の発現を減少させることを含む、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
ＩＬ−２の発現の増加が、（ｉ）ＩＬ−２転写物、および／または（ｉｉ）ＩＬ−２タンパク質の発現を増加させることを含む、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
前記組成物の投与後のある時期に前記対象から採取したサンプル中の、（ｉ）ＩＬ−２、および／または、（ｉｉ）ＲｈｏＡの発現をアッセイするステップをさらに含む、請求項１ないし請求項１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
化合物が投与された、全身性紅斑性狼瘡を有する対象におけるバイオマーカーの存在、非存在または量をアッセイするステップであって、前記バイオマーカーはマイクロＲＮＡ−３１、ＲｈｏＡまたはＩＬ−２から選択されるステップと；前記対象にその後投与される前記化合物の投薬レジメンまたは投与レジメンが、アッセイされた前記バイオマーカーの存在、非存在または量に基づき調整されるかどうかを決定するステップとを含む方法。
【請求項１４】
前記化合物が、ステロイド、免疫抑制薬、マイクロＲＮＡ−３１を増加させるか、もしくはＲｈｏＡを減少させる組成物、またはＩＬ−２を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
全身性紅斑性狼瘡の診断方法であって、全身性紅斑性狼瘡の疑いがある対象から採取されたサンプル中のマイクロＲＮＡ−３１またはＲｈｏＡの発現をアッセイするステップを含む方法。
【国際調査報告】
2014521600.tif 000011
2014521600.tif 000012
2014521600.tif 000013