(57)【要約】本発明は、ヒト細胞株が産生する内因性Ｈ因子の量より高い収量で、組換えヒトＨ因子、更に特には配列番号１の配列で表わされる組換えヒトＨ因子、又は配列番号１の配列と少なくとも99％の相同性パーセンテージを有する変異体を製造する方法の実施のための該ヒト細胞株の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト細胞株が産生する内因性Ｈ因子の量より高い収量で組換えヒトＨ因子を製造する方法の実施のための該ヒト細胞株の使用。
【請求項２】
ヒト細胞株が産生する内因性Ｈ因子の量より高い収量で、配列番号１の配列で表される組換えヒトＨ因子又は配列番号１の配列と少なくとも99％の相同性を有する変異体を製造する方法の実施のための該ヒト細胞株の使用。
【請求項３】
収量が10mg/L培養培地より高い、具体的には30mg/L培養培地より高い、より具体的には50mg/L培養培地より高い、特に100mg/L培養培地より高い請求項１又は２に記載の細胞株の使用。
【請求項４】
配列番号１の配列で表される組換えヒトＨ因子のコドンが、ヒトＨ因子の天然コドンと比較して最適化されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
配列番号１の配列をコードする核酸が
(ｉ)配列番号２の配列、
(ii)配列番号２の配列と少なくとも75％、好ましくは少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列
で表される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
Ｈ因子の前駆体をコードする核酸が
−  配列番号５の配列で表され、Ｈ因子の天然シグナルペプチドをコードする核酸、
−  配列番号３の配列又は配列番号３の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列で表され、Ｈ因子のシグナルペプチドをコードする核酸、
−  Ｈ因子とは異なるタンパク質の天然シグナルペプチドをコードする核酸、又は
−  配列番号４の配列又は配列番号４の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列によりコードされるシグナルペプチドをコードする核酸
から選択される核酸を更に含んでなる、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
Ｈ因子の前駆体をコードする核酸が、
(ｉ)−  配列番号３の配列及び配列番号３の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択されるシグナルペプチドをコードする核酸、及び
−  配列番号２の配列又は配列番号２の配列と少なくとも75％、好ましくは少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される配列番号１の配列をコードする核酸
又は、
(ii)−  配列番号４の配列又は配列番号４の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択されるシグナルペプチドをコードする核酸、及び
−  配列番号２の配列及び配列番号２の配列と少なくとも75％、好ましくは少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される配列番号１の配列をコードする核酸
を含んでなり、該前駆体が配列番号１の配列で表されるＨ因子の発現を可能にする、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
Ｈ因子の前駆体をコードする核酸が、
(ｉ)配列番号３の配列で表される核酸及び配列番号２の配列で表される核酸、又は
(ii)配列番号４の配列で表される核酸及び配列番号２の配列で表される核酸
を含んでなる、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
Ｈ因子の前駆体をコードする核酸が
(ｉ)配列番号６の配列若しくは配列番号６の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列、又は
(ii)配列番号７の配列若しくは配列番号７の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列
で表され、該前駆体が配列番号１の配列で表されるＨ因子の発現を可能にする、請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
Ｈ因子前駆体をコードする核酸が、配列番号６の配列又は配列番号７の配列で表される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
(ｉ)配列番号２の配列、又は
(ii)配列番号２の配列と少なくとも75％、好ましくは少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列
で表される核酸を含んでなる、配列番号１の配列を有する組換えヒトＨ因子をコードする核酸。
【請求項１２】
−  配列番号３の配列及び配列番号３の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される、シグナルペプチドをコードする核酸、及び
−  配列番号２の配列又は配列番号２の配列と少なくとも75％、好ましくは85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される配列番号１の配列で表されるＨ因子をコードする核酸
を含んでなる、請求項１１に記載の組換えヒトＨ因子をコードする核酸。
【請求項１３】
配列番号６の配列又は配列番号６の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列で表される、請求項１２に記載の組換えヒトＨ因子をコードする核酸。
【請求項１４】
−  配列番号４の配列及び配列番号４の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択されるシグナルペプチドをコードする核酸、及び
−  配列番号２の配列又は配列番号２の配列と少なくとも75％、好ましくは85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される配列番号１の配列で表されるＨ因子をコードする核酸
を含んでなる、請求項１１に記載の組換えヒトＨ因子をコードする核酸。
【請求項１５】
配列番号７の配列又は配列番号７の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列で表される、請求項１４に記載の組換えヒトＨ因子をコードする核酸。
【請求項１６】
請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項１７】
ヒト細胞が産生する内因性Ｈ因子の量より高い収量で組換えヒトＨ因子を産生する、特に形質転換された、ヒト細胞。
【請求項１８】
10mg/L培養培地より高い、具体的には30mg/L培養培地より高い、更に具体的には50mg/L培養培地より高い、特に100mg/L培養培地より高い収量を有する、請求項１７に記載のヒト細胞。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載のベクターで形質転換されたヒト細胞。
【請求項２０】
ヒト細胞が産生する内因性Ｈ因子の量より高い収量で配列番号１の配列で表される組換えＨ因子を産生する、請求項１９に記載のヒト細胞。
【請求項２１】
PER.C6(登録商標)及びHEK 293Fから選択される、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のヒト細胞。
【請求項２２】
細胞クローンを形成する、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のヒト細胞。
【請求項２３】
(ｉ)ヒトＨ因子の前駆体をコードする核酸を含んでなるベクターで形質転換されたヒト細胞株を培養する工程を含んでなる、ヒト細胞株において、該細胞株が産生する内因性Ｈ因子の量より高い収量で配列番号１の配列で表される組換えヒトＨ因子の製造方法。
【請求項２４】
(ｉ)ヒトＨ因子の前駆体をコードする核酸を含んでなるベクターで細胞株を形質転換して、形質転換細胞株を取得する工程、
(ii)該形質転換細胞株を培養して、培養培地においてＨ因子の発現を得る工程
を含んでなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
(ｉ)ヒトＨ因子タンパク質の前駆体をコードする核酸を含んでなるベクターで細胞株を形質転換して、形質転換細胞株を取得する工程、
(ii)該形質転換細胞株を培養して、培養培地においてＨ因子の発現を得る工程
(iii)培養培地からヒトＨ因子を精製する工程、及び
(iv)任意に、工程(iii)で精製した内因性Ｈ因子と組換えＨ因子とを分離する工程
を含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ベクターが、配列番号１の配列で表されるヒトＨ因子の前駆体をコードする核酸を含んでなり、該核酸が
(ｉ)−  配列番号３の配列及び配列番号３の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択されるシグナルペプチドをコードする核酸、及び
−  配列番号２の配列及び配列番号２の配列と少なくとも75％、好ましくは少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される配列番号１の配列をコードする核酸、
又は、
(ii)−  配列番号４の配列及び配列番号４の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択されるシグナルペプチドをコードする核酸、及び
−  配列番号２の配列及び配列番号２の配列と少なくとも75％、好ましくは少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される配列番号１の配列をコードする核酸
を含んでなる、請求項２３〜２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞株がPER.C6細胞株又はHEK 293F細胞株である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【請求項２８】
90％より高い、好ましくは95％より高い純度を有することを特徴とする組換えＨ因子。
【請求項２９】
血漿Ｈ因子の生物活性を保存していることを特徴とする請求項２８に記載の組換えＨ因子。
【請求項３０】
C3転換酵素解離を促進する血漿Ｈ因子の生物活性を保存していることを特徴とする、請求項２９に記載の組換えＨ因子。
【請求項３１】
Ｉ因子を調節する血漿Ｈ因子の生物活性を保存していることを特徴とする、請求項２９に記載の組換えＨ因子。
【請求項３２】
活性成分として請求項２８〜３１のいずれか１項に規定する組換えＨ因子及び医薬上許容されるビヒクルを含んでなる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト細胞株において組換えヒトＨ因子を向上した収量で製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｈ因子は、平均レベル500mg/Lでヒト血漿に存在する血漿タンパク質である。このタンパク質は、主に、肝臓細胞が構成的に産生するが、他の細胞(例えば網膜色素の上皮細胞、内皮細胞、血小板又は間葉系幹細胞)も局所的に産生する。
Ｈ因子の主要な機能は代替補体経路の活性化の調節である。Ｈ因子は、この調節に次の３つの機序により関与する：(ｉ)Ｉ因子(タンパク質C3bを不活化させる)(iC3b)の活性の調節；(ii)C3bへの結合についてＢ因子との競合による代替C3転換酵素の形成阻害；(iii)代替経路(C3bBb)のC3転換酵素の解離促進(崩壊促進活性)。
Ｈ因子は、血液の流体相で、低レベルの活性化C3分子(C3b)を維持するためにか、又はグリコサミノグリカン、ヘパラン硫酸又はシアル酸などのポリアニオンを提示する細胞表面で、補体の活性化により誘導される細胞溶解に対して宿主細胞を保護するために作用し得る。
【０００３】
102,494塩基対(bp)及び23エキソンを有するHF1遺伝子(NCBI RefSeq: NG_007259.1)は、遺伝子座1q32(Chr1)のRCA(補体活性化調節因子)遺伝子群に存在する。オルタナティブスプライシングにより、HF1遺伝子から、一方が3696bpを有し、FHタンパク質をコードし、他方が1347bpを有し、FHL-1タンパク質(FHL様-1タンパク質)をコードする２つのmRNAが転写される。
Ｈ因子タンパク質(FH)(1213aa、155kDa)は、反復する20のSCR(短いコンセンサス反復)ドメイン(CCP又はSHUSHIとも呼ばれる)で構成される単鎖糖タンパク質である。FHL-1タンパク質(449アミノ酸、42kDa)は、最初の７つのSCRドメイン及び４つの疎水性Ｃ末端アミノ酸を有する。
天然には、ヒトＨ因子(FH)は、アミノ酸配列の402位に、チロシン(Ｙ)のヒスチジン(Ｈ)での置換を特徴とする多形性を有する。この置換自体は、HF1遺伝子レベルでの(ＴヌクレオチドがＣで置換された)ヌクレオチド置換の結果である。
【０００４】
SCRドメインは、非常に多くのタンパク質(例えば、FHファミリーのタンパク質(FHR1、FHR2、FHR3、FHR4)、RCAファミリーのタンパク質(CR1、CR2、C4 BP、CD55、CD46)又は病原体(ワクシニアウイルス等)のタンパク質)に存在する。
SCRドメインは、短い配列リンカー(ヒトFHについては３〜８アミノ酸)で分離された約60アミノ酸から構成される。SCRドメインは主にβ鎖からなり、該ドメインの各端部に分布する２つのＳ-Ｓ架橋を有する。配列相同性の分析により、４つの保存されたシステインが２つのドメイン内Ｓ-Ｓ架橋の形成に関与し、SCRドメインでトリプトファン(Ｗ)が高度に保存されていることが示される。
薬理学的上の治療的関心が大きいため、組換えヒトＨ因子の生産性を向上させることを目的として、タンパク質のインビトロ産生のための種々の系で多くの研究が行われてきた。組換えヒトＨ因子は、バキュロウイルス系(Sharma and Pangburn, Gene 1994, June 10: 143 (2): 301-2)及びCOS細胞(Sanchez-Corralら, Am. J. Hum. Genet., 71: 1285-1295, 2002)で産生されている。最近は、組換えヒトＨ因子は、光バイオリアクタ中でヒメツリガネ(Physcomitrella)ゴケにおいて(Buttner-Mainikら, Plant Biotechnol. J. 2010 Aug. 17)及び酵母ピキア・パストリス(Pichia pastoris)において(Schmidt CQら, Protein Expr. Purif. 2011 Apr. 76(2) 254-63)産生されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
多大な努力にもかかわらず、今日まで、組換えヒトＨ因子について達成された生産性は、ヒトにおける治療的使用に関しては必ずしも十分ではない。したがって、ヒトＨ因子を製造するための高性能な方法を開発する大きな必要性は依然として大きい。
本発明の目的の１つは、組換えヒトＨ因子を製造するためのヒト細胞株の使用を提案することである。
本発明の他の目的は、組換えヒトＨ因子の製造方法を提案することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ヒト細胞株が産生する内因性Ｈ因子の量より高い収量で組換えヒトＨ因子を製造する方法の実施のための該ヒト細胞株の使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、配列番号１の配列、又は配列番号１の配列と少なくとも99％、特には99.4％、特には99.7％の配列同一性を有する配列で表される組換えヒトＨ因子を製造する方法の実施のためのヒト細胞株の使用に関する。
このような配列で表されるタンパク質は、ヒトＨ因子のY402変異体若しくはH402変異体、又はヒトＨ因子の別の変異体(例えば、ウエブサイトhttp://www.uniprot.org/uniprot/P08603に記載された変異体)であり得る。
１つの実施形態では、本発明は、ヒト細胞株が産生する内因性Ｈ因子の量より高い収量で、配列番号１の配列で表される組換えヒトＨ因子を製造する方法の実施のための該ヒト細胞株の使用に関する。
配列番号１の配列で表される組換えヒトＨ因子は、402位のアミノ酸がチロシンであるY402変異体に相当する。
【０００７】
別の１つの実施形態では、本発明は、ヒト細胞株が産生する内因性Ｈ因子の量より高い収量で、配列番号13の配列で表される組換えヒトＨ因子を製造する方法の実施のための該ヒト細胞株の使用に関する。
配列番号13の配列で表される組換えヒトＨ因子は、402位のアミノ酸がヒスチジンであるH402変異体に相当する。
この細胞株は、Ｈ因子を産生しない株、Ｈ因子を検出できない量で産生する株、又は内因性Ｈ因子を産生する株であり得る。
細胞株が産生した内因性Ｈ因子の量は、細胞上清中で最小濃度５ng/mlのＨ因子を検出可能とするように注意深く選択した一対の抗体を用いるELISA法で測定される。
市販の検査キットも利用可能である(例えば、Kit HK342 Hycult)。
【０００８】
より具体的には、本発明は、ヒト細胞株が産生する内因性Ｈ因子の量より高い収量で、配列番号１の配列で表される組換えヒトＨ因子を製造する方法の実施のための、内因性Ｈ因子を産生するヒト細胞株の使用に関する。
「Ｈ因子を産生する株」とは、タンパク質を検出する標準的な方法(例えば、ELISA及びウェスタンブロット)により、その細胞上清中で内因性Ｈ因子の存在を検出することが可能である細胞株を意味する。
或る種のヒト細胞株(例えば、PER.C6(登録商標)細胞株又はHEK 293F株)は、内因性経路によりヒトＨ因子を産生する。しかしながら、これら細胞による内因性Ｈ因子の生産性は比較的低い；PER.C6(登録商標)細胞株については、48時間培養後で、約70μg/Lであり、HEK 293F細胞株については、7日の培養後で、約11μg/LのＨ因子が培地中に分泌される。
【０００９】
１つの有利な実施形態では、本発明は、収量が10mg/L培養培地より大きい、特には20mg/L培養培地より大きい、又は30mg/L培養培地より大きい、又は40mg/L培養培地より大きい、又は50mg/L培養培地より大きい、更に特には60mg/L培養培地より大きい、又は70mg/L培養培地より大きい、又は80mg/L培養培地より大きい、又は90mg/L培養培地より大きい、特には100mg/L培養培地より大きいヒト細胞株の使用に関する。
組換えＨ因子の製造に使用する製造モードが、次のモード：「バッチ」、「フェドバッチ」又は「濾過-保持を伴う培養」の１つであるか、又はこれら３つの製造モードの１つに由来するモードであるとき、「収量」とは、産生後(下流プロセス又はDSPと呼ばれる)に処理される最終培養培地の体積当たりの組換えＨ因子の製造量を意味する。
組換えＨ因子の製造に使用する製造モードが、「連続灌流培養」モード、又はこの製造モードに由来するものであるとき、「収量」とは、製造容器に当初に含めた培養培地の体積当たりのＨ因子の製造量を意味する。
【００１０】
「バッチ」製造モードは一定体積を特徴とする。種菌を培地に添加し、培養物を生育させる。製造に使用する株に特徴的な増殖曲線に従ってバイオマスが生育する。回転速度、曝気(O2及びCO2)又はpH調整は変更するが、培養の間に栄養培地は添加せず、何も抜き取らない。
例として、(当初体積と同一である)最終体積１リットルの培養培地で製造された組換えタンパク質の最終量10mgは、製造収量10mg/Lに相当する。
「フェドバッチ」製造モードは可変体積を特徴とする。製造は、最初は、所与の体積で通常バッチの形態で実施する。その後、細胞を所望の状態(安定な細胞生存、対数期、定常期)に維持するために、新鮮な培地を添加する。望ましい限界(例：グルコース濃度＜４g/L)を決して超えないように、「フィード」を適応させることが可能である。
「フィード」ストラテジは製造に使用する株に依存する。対数期では、バイオマスは迅速に蓄積し、また、少ない体積で生成物を非常に迅速に蓄積させることができる。静止相では、バイオマスは一定に維持され、少ない体積で生成物を漸増的に蓄積させることができる。
例として、最終体積1.5リットル(当初は１リットルである)の培養培地で製造された組換えタンパク質の最終量30mgは、製造収量20mg/Lに相当する。
【００１１】
製造モード「濾過-保持を伴う培養」(用語「XDプロセス」で知られる)は、一定体積でのバイオマスの増加を特徴とする。これは、新鮮培地の添加が組換えＨ因子(カットオフが組換えＨ因子のサイズより小さい濾過膜を用いて保持される)を含有しない同量の上清の抜き取りによって補償される、バッチモード及びフェドバッチモードでの混合モードである。抜き取った上清は廃棄する。こうして、体積は一定のままであるが、バイオマスは迅速に蓄積し、また組換えＨ因子を蓄積させることもできる。
例として、(培養培地の当初体積と同一である)最終体積１リットルの培養培地で製造された組換えタンパク質の最終量60mgは、製造収量60mg/Lに相当する。
「灌流を伴う培養」製造モードは、定体積及び一定バイオマスを特徴とする。濾過-保持モードと同様に、新鮮培地の添加は、同量の上清の抜き取りによって補償されるが、この製造モードでは、取り出された上清は組換えＨ因子を含むので廃棄されない。このことは、目的とするタンパク質の蓄積のない当初体積より多いDSPで処理すべき最終体積をもたらす。
例として、最終体積10リットル(当初は１リットルである)の培養培地で製造された組換えタンパク質の最終量90mgは、製造収量90mg/Lに相当する。
【００１２】
有利には、配列番号１の配列又は配列番号13の配列で表されるＨ因子をそれぞれコードする核酸は、コドンを最適化されている。
本発明は、ヒトＨ因子コドンの最適化により、幾つかのヒト細胞株における組換えヒトＨ因子の生産性を増大させることが可能となるという発明者らの予想外の知見に基づく。
コドン最適化の目的は、天然コドンを、当該アミノ酸を運ぶ転移RNA(tRNA)であって、検討している細胞タイプにおいて最も頻度の高いtRNAのコドンで置き換えることである。頻繁に遭遇するtRNAを動員することは、メッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳速度を高めるという主要な利点を有するので、最終力価を高めるという利点を有する(Carton JMら, Protein Expr Purif, 2007)。配列最適化はまた、リボソーム複合体による読取りを減速させ得るmRNAの二次構造の予測に影響を及ぼす。配列最適化はまたG/C比率に影響し、この比率は、mRNAの半減期に直接関係するので、それが翻訳される可能性にも関係する(Chechetkin, J. of Theoretical Biology 242, 2006, 922-934)。
コドン最適化は、哺乳動物、より具体的にはホモサピエンスのコドン利用頻度表を用いて、天然コドンを置き換えることにより実施し得る。合成遺伝子のサプライヤーが提供し、この配列最適化を可能にするアルゴリズム(DNA2.0, GeneArt, MWG, Genscript)がインターネット上に存在する。
【００１３】
より有利な実施形態では、配列番号１の配列をコードする核酸は、以下で表される：
(i)配列番号２の配列
(ii)配列番号２の配列と少なくとも75％、好ましくは少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列。
２つの核酸配列間の同一性パーセンテージは、以下の式から算出され得る：
(同一残基数×100)/(より短い配列中の残基数)
配列番号２の配列又は配列番号２の配列と少なくとも75％、好ましくは少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列は、ヒトＨ因子をコードする天然核酸配列に基づくコドン最適化により得られる配列である。
ヒトＨ因子のY402変異体をコードする天然核酸は、配列番号８で表される。
ヒトＨ因子のH402変異体をコードする天然核酸は、配列番号17で表される。
【００１４】
別の１つのより有利な実施形態では、核酸を更に含んでなるヒトＨ因子の前駆体をコードする核酸は、次から選択される：
−配列番号５の配列で表わされ、Ｈ因子の天然シグナルペプチドをコードする核酸、又は
−配列番号３の配列又は配列番号３の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列で表わされ、Ｈ因子のシグナルペプチド(最適化された天然PS)をコードする核酸、又は
−Ｈ因子とは異なるタンパク質の天然シグナルペプチドをコードする核酸、又は
−配列番号４(PCT/FR2011/050544)の配列又は配列番号４の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列によりコードされるシグナルペプチドをコードする核酸。
ヒトＨ因子とは異なるタンパク質の天然シグナルペプチドは、真核生物、具体的には哺乳動物、更に特にはヒトにおいて分泌される全てのタンパク質のシグナルペプチド(例えば、免疫グロブリン、EPOのような成長因子、インスリンのようなホルモン、トリプシノゲンのような酵素、プロトロンビンのような凝固因子のシグナルペプチド)から選択されるシグナルペプチドであり得る。
【００１５】
配列番号３の配列又は配列番号３の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列は、配列番号５の配列に基づくコドン最適化により得られる配列である。
配列番号４の配列又は配列番号４の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列で表わされる核酸は、人工的なシグナルペプチドをコードする。
シグナルペプチドの存在により、培養培地中で組換えタンパク質のより良好な分泌が得られる。
【００１６】
１つの実施形態では、シグナルペプチドをコードする核酸及びヒトＨ因子をコードする核酸を含んでなるヒトＨ因子の前駆体をコードする核酸の全体は、コドンを最適化されている。
１つの特定の実施形態では、組換えヒトＨ因子の前駆体をコードする核酸は、以下：
−シグナルペプチドをコードし、配列番号３の配列又は配列番号３の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される核酸、又は
−配列番号１の配列で表されるＨ因子をコードし、配列番号２の配列又は配列番号２の配列と少なくとも75％、好ましくは85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される核酸、
を含んでなるか、又は該核酸により構成され、配列番号１の配列で表されるＨ因子の発現を可能にする。
【００１７】
更に特には、組換えヒトＨ因子の前駆体をコードする核酸は、配列番号３の配列で表される核酸及び配列番号２の配列で表される核酸を含んでなるか又は該核酸からなる。
なお更に特には、Ｈ因子の前駆体をコードする核酸は、配列番号６の配列又は配列番号６の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列で表される。
１つの特に有利な実施形態では、Ｈ因子の前駆体をコードする核酸は、配列番号６の配列で表される。
配列番号６の配列は、天然シグナルペプチドを含んでなるヒトＨ因子の前駆体のコドン最適化に対応する。
【００１８】
別の１つの実施形態では、組換えヒトＨ因子の前駆体をコードする核酸は、以下：
−シグナルペプチドをコードし、配列番号３の配列又は配列番号３の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される核酸、又は
−配列番号13の配列で表されるＨ因子をコードし、配列番号14の配列又は配列番号14の配列と少なくとも75％、好ましくは85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される核酸、
を含んでなるか、又は該核酸により構成され、配列番号13の配列で表されるＨ因子の発現を可能にする。
【００１９】
更に特には、組換えヒトＨ因子の前駆体をコードする核酸は、配列番号３の配列で表される核酸及び配列番号14の配列で表される核酸を含んでなるか又は該核酸からなる。
なお更に特には、Ｈ因子の前駆体をコードする核酸は、配列番号15の配列又は配列番号15の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列で表される。
【００２０】
別の１つの実施形態では、組換えヒトＨ因子の前駆体をコードする核酸は、以下の核酸を含んでなるか又は該核酸により構成される：
−ヒトＨ因子をコードし、コドンを最適化されている核酸、及び
−ヒトＨ因子の天然シグナルペプチドに相当しないが、ヒトＨ因子の天然シグナルペプチドより良好であるか又は該天然シグナルペプチドに類似する分泌能をもたらす人工的シグナルペプチドをコードする核酸。
別の１つの特定の実施形態では、組換えヒトＨ因子の前駆体をコードする核酸は、以下：
−シグナルペプチドをコードし、配列番号４の配列又は配列番号４の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される核酸、又は
−配列番号１の配列をコードし、配列番号２の配列又は配列番号２の配列と少なくとも75％、好ましくは少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される核酸、
を含んでなるか、又は該核酸により構成され、配列番号１の配列で表されるＨ因子の発現を可能にする。
【００２１】
更に特には、組換えヒトＨ因子の前駆体をコードする核酸は、配列番号４の配列で表される核酸及び配列番号２の配列で表される核酸を含んでなるか又は該核酸により構成される。
なお更に特には、組換えヒトＨ因子の前駆体をコードする核酸は、配列番号７の配列又は配列番号７の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列で表され、該前駆体は配列番号１の配列で表されるＨ因子の発現を可能にする。
１つの特に有利な実施形態では、Ｈ因子の前駆体をコードする核酸は、配列番号７の配列で表される。
【００２２】
別の１つの実施形態では、組換えヒトＨ因子の前駆体をコードする核酸は、以下：
−シグナルペプチドをコードし、配列番号４の配列又は配列番号４の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される核酸、又は
−配列番号13の配列で表されるＨ因子をコードし、配列番号14の配列又は配列番号14の配列と少なくとも75％、好ましくは85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される核酸、
を含んでなるか、又は該核酸により構成され、配列番号13の配列で表されるＨ因子の発現を可能にする。
【００２３】
更に特には、組換えヒトＨ因子の前駆体をコードする核酸は、配列番号４の配列で表される核酸及び配列番号14の配列で表される核酸を含んでなるか又は該核酸により構成される。
なお更に特には、Ｈ因子の前駆体をコードする核酸は、配列番号24の配列又は配列番号24の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列で表される。
配列番号５の配列で表される核酸及び配列番号８の配列で表される核酸を含んでなるか又は該核酸により構成されるヒトＨ因子の前駆体をコードする核酸は、本発明で説明したようなY402変異体をコードする最適化核酸の生産性のコントロールとして使用できる。
更に特には、このコントロール核酸は、配列番号９の配列で表される核酸であり得る。
【００２４】
配列番号５の配列で表される核酸及び配列番号17の配列で表される核酸を含んでなるか又は該核酸により構成されるヒトＨ因子の前駆体をコードする核酸は、本発明に説明したようなH402変異体をコードする最適化核酸のコントロールとして使用できる。
更に特には、このコントロール核酸は、配列番号18の配列で表される核酸であり得る。
本発明の１つの有利な実施形態では、上記のヒトＨ因子は、PER.C6(登録商標)細胞株又はHEK 293F細胞株で製造される。
【００２５】
PER.C6(登録商標)細胞株は、アデノウイルスDNAフラグメントAd5(E1A遺伝子及びE1B遺伝子の両方を含む)がベクターで当該細胞に挿入されているヒト初代網膜細胞に由来する。このアデノウイルスDNAフラグメントは、p53を阻害するタンパク質E1Bのおかげで、該フラグメントが挿入されている細胞に不死をもたらすことができる。タンパク質E1Bについては、ウイルスプロモーターhCMVに対する向性を有し、そのトランス活性化及び該ウイルスプロモーターの３'末端に挿入された遺伝子配列(Ｈ因子であり得る)の増強を可能にする。
PER.C6(登録商標)細胞株は、内因的に、ヒトＨ因子のH402変異体及びY402変異体の両方を産生する。
本発明は、特には、PER.C6(登録商標)細胞株が産生する内因性Ｈ因子の量より高い収量で配列番号１の配列で表わされる組換えヒトＨ因子を製造する方法の実施のための該PER.C6(登録商標)細胞株の使用に関する。
更に特には、本発明は、配列番号１の配列で表わされる組換えヒトＨ因子を製造する方法の実施のためのPER.C6(登録商標)細胞株の使用であって、Ｈ因子の前駆体をコードする核酸が配列番号６、７又は９で表わされる使用に関する。
【００２６】
本発明はまた、特には、HEK 293F細胞株が産生する内因性Ｈ因子の量より高い収量で配列番号１の配列で表わされる組換えヒトＨ因子を製造する方法の実施のための該HEK 293F細胞株の使用に関する。
HEK293 F細胞株は、内因性経路では、ヒトＨ因子のY402変異体のみを産生する。
更に特には、本発明は、配列番号１の配列で表わされる組換えヒトＨ因子を製造する方法の実施のためのHEK 293F細胞株の使用であって、Ｈ因子の前駆体をコードする核酸が配列番号６又は７で表わされる使用に関する。
本発明はまた、組換えヒトＨ因子を製造する方法の実施のためのヒト細胞株(例えば、PER.C6(登録商標)又はHEK 293F細胞株)の使用であって、Ｈ因子の前駆体をコードする核酸が、ヒトＨ因子の人工若しくは天然のイントロン又は別のヒト遺伝子のイントロン及びヒトＨ因子の天然エキソンを含んでなるゲノム核酸である使用に関する。
【００２７】
本発明はまた、組換えヒトＨ因子(例えば、配列番号１の配列で表されるＨ因子のY402変異体又は配列番号13の配列で表されるＨ因子のH402変異体)をコードする核酸に関する。
配列番号１及び配列番号13はＨ因子のシグナルペプチドの配列に対応する配列を含まない。
１つの実施形態では、本発明は、以下の配列：
(i)配列番号２の配列、又は
(ii)配列番号２の配列と少なくとも75％、好ましくは少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列
で表される核酸を含んでなる、配列番号１の配列を有する組換えヒトＨ因子をコードする核酸に関する。
【００２８】
１つの特定の実施形態では、本発明は、以下の核酸：
−シグナルペプチドをコードし、配列番号３の配列又は配列番号３の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される核酸、及び
−配列番号１の配列で表されるＨ因子をコードし、配列番号２の配列又は配列番号２の配列と少なくとも75％、好ましくは85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される核酸
を含んでなるか又は該核酸により構成される、配列番号１の配列の組換えヒトＨ因子をコードする核酸に関する。
更に特には、配列番号１の配列の組換えヒトＨ因子をコードする核酸は、配列番号６の配列又は配列番号６の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列で表される。
【００２９】
別の１つの実施形態では、本発明は、以下の核酸：
−シグナルペプチドをコードし、配列番号４の配列又は配列番号４の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される核酸、及び
−配列番号１の配列で表されるＨ因子をコードし、配列番号２の配列又は配列番号２の配列と少なくとも75％、好ましくは85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される核酸
を含んでなるか又は該核酸により構成される、配列番号１の配列の組換えヒトＨ因子をコードする核酸に関する。
更に特には、配列番号１の配列の組換えヒトＨ因子をコードする核酸は、配列番号７の配列又は配列番号７の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列で表される。
【００３０】
別の１つの実施形態では、本発明は、以下の核酸：
−シグナルペプチドをコードし、配列番号３の配列又は配列番号３の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される核酸、及び
−配列番号１の配列で表されるＨ因子をコードし、配列番号14の配列又は配列番号14の配列と少なくとも75％、好ましくは85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される核酸
を含んでなるか又は該核酸により構成される、配列番号13の配列の組換えヒトＨ因子をコードする核酸に関する。
更に特には、配列番号13の配列の組換えヒトＨ因子をコードする核酸は、配列番号15の配列又は配列番号15の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列で表される。
【００３１】
別の１つの実施形態では、本発明は、以下の核酸：
−シグナルペプチドをコードし、配列番号４の配列又は、配列番号４の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される核酸、及び
−配列番号１の配列で表されるＨ因子をコードし、配列番号14の配列又は配列番号14の配列と少なくとも75％、好ましくは85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される核酸
を含んでなるか又は該核酸により構成される、配列番号13の配列の組換えヒトＨ因子をコードする核酸に関する。
更に特には、配列番号１の配列の組換えヒトＨ因子をコードする核酸は、配列番号24の配列又は配列番号24の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列で表される。
【００３２】
本発明において、配列番号16は、配列番号４及び配列番号19により構成される。
本発明において、配列番号21は、配列番号４及び配列番号20により構成される。
本発明において、配列番号22は、配列番号３及び配列番号20により構成される。
本発明において、配列番号23は、配列番号３及び配列番号19により構成される。
本発明において、配列番号19は、最適化FH 402H配列２に相当する。
本発明において、配列番号20は、最適化FH 402Y配列２に相当する。
本発明はまた、上記の核酸を含んでなるか又は該配列により構成される発現ベクターに関する。
【００３３】
本発明はまた、ヒト細胞が産生する内因性Ｈ因子の量より高い収量で組換えヒトＨ因子を産生する、特に形質転換された、ヒト細胞に関する。
１つの好ましい実施形態では、本発明は、10mg/L培養培地より大きい、特には30mg/L培養培地より大きい、更に特には50mg/L培養培地より大きい、特には100mg/L培養培地より大きい収量を有するヒト細胞に関する。
１つの特定の実施形態では、本発明は、上記のベクターにより形質転換されたヒト細胞に関する。
１つの更に特定の実施形態では、本発明は、ヒト細胞が産生する内因性Ｈ因子の量より高い収量で、配列番号１の配列で表わされる組換えＨ因子を産生する該ヒト細胞に関する。
１つのより更に特定の実施形態では、本発明のヒト細胞は、PER.C6(登録商標)及びHEK 293Fから選択される。
１つの特定の実施形態では、本発明のヒト細胞は、細胞クローンを形成する。
【００３４】
本発明はまた、ヒトＨ因子の前駆体をコードする核酸を含んでなるベクターで形質転換されたヒト細胞株を培養する工程を含んでなる、ヒト細胞株において、該細胞株が産生する内因性Ｈ因子の量より高い収量で配列番号１の配列で表される組換えヒトＨ因子の製造方法に関する。
このような核酸を含んでなるベクターは、当事者に公知の真核細胞株用発現ベクターであり得る。
細胞株の形質転換は、エレクトロポレーション技法、AMAXAヌクレオフェクションタイプの技法、「遺伝子銃」又は当事者に公知の他のトランスフェクション剤、例えば、リポソーム又はポリマーのカチオン性試薬(Fectin又はPEI試薬)を用いる技法により行い得る。
【００３５】
１つの特定の実施形態では、本発明による方法は、以下の工程を含んでなる：
(i)ヒトＨ因子の前駆体をコードする核酸を含んでなる発現ベクターで細胞株を形質転換して、形質転換細胞株を取得する工程、
(ii)該形質転換細胞株を培養して、培養培地においてＨ因子の発現を得る工程。
前記発現ベクターは、目的タンパク質を安定的に産生する細胞の樹立の間にトランスフェクト細胞の選択を可能にするために、抗生物質耐性遺伝子を含み得る。
１つのより特定の実施形態では、本発明による方法は、以下の工程を含んでなる：
(i)ヒトＨ因子タンパク質の前駆体をコードする核酸を含んでなるベクターで細胞株を形質転換して、形質転換細胞株を取得する工程、
(ii)該形質転換細胞株を培養して、培養培地においてＨ因子の発現を得る工程、
(iii)培養培地からヒトＨ因子を精製する工程、及び
(iv)任意に、工程(iii)で精製した内因性Ｈ因子と組換えＨ因子とを分離する工程。
【００３６】
ヒトＨ因子は、１、２又はそれより多い工程でクロマトグラフィー技法により精製する。１工程での精製は、イオン交換カラム又はアフィニティーカラム(ヘパリン、Ｈ因子リガンド又は抗Ｈ因子抗体)であり得る。２工程での精製は、カチオン交換カラムでのクロマトグラフィー工程に続くアニオン交換カラムでのクロマトグラフィー工程、又はアニオン交換カラムでのクロマトグラフィー工程に続くカチオン交換カラムでのクロマトグラフィー工程、又はイオン交換カラムでのクロマトグラフィー工程に続くアフィニティーカラムでのクロマトグラフィー工程、又はアフィニティーカラムでのクロマトグラフィー工程に続くイオン交換カラムでのクロマトグラフィー工程であり得る。２より多い工程での精製は、これら異なるタイプのクロマトグラフィーの組合せにより行い得る。透析濾過、限外濾過又はゲル濾過工程を追加的に行い得る。この精製後の生成物の純度は、99％の精製生成物に達し得る。
【００３７】
更に特には、細胞株を形質転換するベクターは、配列番号１の配列で表わされるヒトＨ因子の前駆体をコードする核酸を含んでなり、該核酸は
(i)−配列番号３の配列及び配列番号３の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択されるシグナルペプチドをコードする核酸、及び
−配列番号２の配列及び配列番号２の配列と少なくとも75％、好ましくは少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される配列番号１の配列をコードする核酸、
又は、
(ii)−配列番号４の配列及び配列番号４の配列と少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択されるシグナルペプチドをコードする核酸、及び
−配列番号２の配列及び配列番号２の配列と少なくとも75％、好ましくは少なくとも85％、具体的には90％、特には95％の配列同一性を有する配列から選択される配列番号１の配列をコードする核酸
を含んでなる。
【００３８】
１つの有利な実施形態では、細胞株を形質転換するベクターは、核酸を含んでなり、該核酸は以下：
(i)配列番号３の配列で表される核酸及び配列番号２の配列で表される核酸、又は
(ii)配列番号４の配列で表される核酸及び配列番号２の配列で表される核酸
を含んでなる。
１つのより有利な実施形態では、細胞株を形質転換するベクターは、核酸を含んでなり、該核酸は以下：
(i)配列番号６の配列で表わされる組換えヒトＨ因子の前駆体をコードする核酸、又は
(ii)配列番号７の配列で表わされる組換えヒトＨ因子の前駆体をコードする核酸
を含んでなる。
本発明による方法において使用される細胞株は、PER.C6(登録商標)又はHEK 293F細胞株であり得る。
【００３９】
本発明の１つの更なる目的は、90％より高い、好ましくは95％より高い純度を有する組換えＨ因子を供給することである。
１つの特定の実施形態では、該組換えヒトＨ因子は、ヒト血漿Ｈ因子の生物活性を保存している。
ヒト血漿Ｈ因子の生物活性は、Ｉ因子の活性調節、代替C3転換酵素の形成阻害、C3転換酵素の解離促進を含む。
上記生物活性を測定する方法は、当事者に公知である。
１つのより特定の実施形態では、該組換えヒトＨ因子は、C3転換酵素の解離を促進するヒト血漿Ｈ因子の生物活性を保存している。
解離したC3転換酵素の量は、添加したFHの濃度の関数として決定し得る。IC50は、Ｓ字状曲線について算出した等式から決定する。
１つの別のより特定の実施形態では、該組換えヒトＨ因子は、Ｉ因子の活性を調節するヒト血漿Ｈ因子の生物活性を保存している。
【００４０】
本発明はまた、有効成分として、ウエブサイトhttp://www.uniprot.org/uniprot/P08603で言及された組換えヒトＨ因子の変異体のみを含んでなる医薬組成物に関する。
具体的には、本発明はまた、配列番号１の配列で表わされる組換えヒトＨ因子のY402変異体のみを含んでなり、ヒトＨ因子のH402変異体を含まない医薬組成物に関する。
組換えヒトＨ因子のY402変異体は、内因的にY402変異体のみを産生するHEK 293F細胞株により産生され得る。
組換えY402変異体の製造はまた、内因的にY402変異体及びH402変異体の両方を産生するPER.C6(登録商標)細胞株を用い、続いてH402変異体からY402変異体を分離することを可能にする精製又は分離により実行し得る。PER.C6(登録商標)細胞株はまた、内因的にH402変異体を産生しないように改変し得る。
本発明はまた、ヒトＨ因子のH402変異体のみを含んでなり、配列番号１の配列で表わされるY402変異体を含まない医薬組成物に関する。
組換えヒトＨ因子のH402変異体は、PER.C6(登録商標)細胞株又はHEK 293F細胞株により産生され得る。Y402変異体からH402変異体を分離をするために、精製又は分離が必要である。PER.C6(登録商標)及びHEK 293F細胞株はまた、内因的にY402変異体を産生しないように改変し得る。
【００４１】
本発明はまた、有効成分としてH402変異体及びY402変異体を含んでなる医薬組成物に関する。
本発明に従う医薬組成物はまた、医薬上許容されるビヒクルを含んでなる。
本発明はまた、99.5％より多い１つのヒトＨ因子変異体及び0.5％未満の別のヒトＨ因子変異体を含んでなる医薬組成物に関する。
本発明を下記に示す図及び実施例で説明する。これら図及び実施例は、決して、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、PER.C6(登録商標)及びHEK 293F細胞中の内因性Ｈ因子のアッセイを表す。
【図２】図２は、安定的な様式で組換えＨ因子(この場合、Ｈ因子のH402変異体の例)を発現する安定PER.C6(登録商標)プールの作製を表す。
【図３】図３は、バッチモードにおける安定PER.C6(登録商標)プールでの組換えＨ因子(H402)の製造の動力学を表す。
【図４】図４は、HEK 293F細胞において、７日間のバッチモードで製造された組換えＨ因子のELISAアッセイを表す。
【図５】図５は、安定PER.C6(登録商標)プールにおいて、７日間のバッチモードで製造された組換えＨ因子のELISAアッセイを表す。
【図６Ａ】図6Aは、PER.C6(登録商標)及びHEK 293F細胞の上清において製造された組換えＨ因子のSDS-PAGE分析を表す。
【図６Ｂ】図6Bは、PER.C6(登録商標)及びHEK 293F細胞の上清において製造された組換えＨ因子のウェスタンブロット分析を表す。
【図６Ｃ】図6Cは、還元剤(DTT)での処理前後のクーマシーブルー染色SDS-PAGEにおける、PERC6及びHEK細胞で製造された精製組換えヒトＨ因子の電気泳動プロフィールと精製ヒト血漿因子(バッチLFB)の電気泳動プロフィールとの比較を説明する。
【図６Ｄ】図6Dは、抗Ｈ因子ポリクローナル抗体(The Binding Site, ref.: PC030)を用いるウェスタンブロットによる、PERC6及びHEK細胞において製造された精製組換えヒトＨ因子と精製ヒト血漿Ｈ因子(バッチLFB)の分析を説明する。
【図７Ａ】図7Aは、ヘパリンカラム精製に続く透析濾過工程を表す。
【図７Ｂ】図7Bは、PERC6細胞が産生した組換えヒトＨ因子の一工程カチオン交換クロマトグラフィー(SP-Sepharose)における精製工程のクーマシーブルー染色SDS-PAGE分析を説明する。開始上清(トラック２)、精製工程中に得た異なる画分(トラック３〜７、トラック３：酸性化上清、トラック４：保持されなかった画分(FNA)、トラック５：洗浄、トラック６：溶出液SP、トラック７：溶出液NaCl ２Ｍ)及び精製、濃縮及び濾過された最終産物(組換えヒトFH Y402)(トラック８：120.6kDaのメインバンド、98.4％)を堆積させた。最終産物はまた、還元条件下でも堆積させた(トラック９：143.5kDaのメインバンド、93.9％)。トラック１及び10は質量コントロールである。
【図７Ｃ】図7Cは、HEK細胞が産生した組換えヒトＨ因子の二工程イオン交換クロマトグラフィー(SP-Sepharose後のQ-Sepharose)における精製工程のクーマシーブルー染色SDS-PAGE分析を説明する。開始上清(トラック２)、精製工程中に得た異なる画分(トラック３〜７及び10〜14：トラック３：酸性化上清、トラック４：保持されなかった画分(FNA) 第１クロマトグラフィー、トラック５：洗浄 第１クロマトグラフィー、トラック６：溶出液 第１クロマトグラフィー、トラック７：溶出液２Ｍ NaCl 第１クロマトグラフィー、トラック10：溶出液 第１クロマトグラフィー、トラック11：保持されなかった画分(FNA) 第２クロマトグラフィー、トラック12：洗浄 第２クロマトグラフィー、トラック13：溶出液 第２クロマトグラフィー、トラック14：溶出液２Ｍ NaC1 第２クロマトグラフィー)及び精製、濃縮及び濾過された最終産物(組換えヒトFH Y402)(トラック15)を堆積させた。最終産物はまた、還元条件下でも堆積させた(トラック16)。トラック１、８、９及び17は質量コントロールである。
【図８Ａ】図8Aは、組換えヒトＨ因子(Y402変異体又はH402変異体)を含むPER.C6(登録商標)及びHEK 293F細胞の上清(Sn)の存在下におけるC3転換酵素の解離促進活性の測定を表す。
【図８Ｂ】図8Bは、PER.C6(登録商標)及びHEK 293F細胞において製造された精製組換えヒトＨ因子並びにヒト血漿Ｈ因子のC3転換酵素の解離促進活性の測定を説明する。
【図９Ａ】図9Aは、分子ふるいによりPERC6及びHEK細胞において製造した精製組換えヒトＨ因子の分析を説明する。PERC6において製造した95μgの精製組換えヒト因子を、ゲル濾過カラム(GE Healthcare, Superdex 200 10/300 GL, ref.: 17-5175-01)に別々に注入した。ヒトＨ因子に対応するサイズ377〜378kDaの主ピーク(99％)が観察される。
【図９Ｂ】図9Bは、分子ふるいによりPERC6及びHEK細胞において製造した精製組換えヒトＨ因子の分析を説明する。HEK細胞において製造した50μgの精製組換えヒトＨ因子を、ゲル濾過カラム(GE Healthcare, Superdex 200 10/300 GL, ref.: 17-5175-01)に別々に注入した。ヒトＨ因子に対応するサイズ377〜378kDaの主ピーク(97％)が観察される。
【図１０Ａ】図10Aは、PERC6において製造した精製組換えヒトＨ因子のキャピラリー等電点電気泳動を説明する。
【図１０Ｂ】図10Bは、HEKにおいて製造した精製組換えヒトＨ因子のキャピラリー等電点電気泳動を説明する。
【図１１Ａ】図11Aは、非還元条件下でのSDSゲルキャピラリー電気泳動による、PERC6及びHEK細胞において製造した精製組換えヒトＨ因子の分析を説明する。
【図１１Ｂ】図11Bは、還元条件下(図11B)でのSDSゲルキャピラリー電気泳動による、PERC6及びHEK細胞において製造した精製組換えヒトＨ因子の分析を説明する。
【図１２Ａ】図12Aは、ヒト組換えFH PERC6及びHEKのＩ因子並びに製剤化ヒト血漿Ｈ因子(form. FH)又はPBS１×緩衝液中のヒト血漿Ｈ因子(FH dess)の補因子活性の分析を説明する。10μgのタンパク質C3b及び140ngのＩ因子を、漸増量のＨ因子(50、100、250、500及び1000ng)の存在下で37℃にて30分間インキュベートする。C3b分子のα'鎖及びβ鎖に対応するバンド並びにα'鎖の切断フラグメントα'1及びα'2に対応するバンドを定量化するために、SDS-PAGEで種々のサンプルを堆積させる。次いで、不活化C3b分子のパーセンテージを、α'鎖の総量に対する切断α'鎖の全量の比から算出する。
【図１２Ｂ】図12Bは、ヒト組換えFH PERC6及びHEKのＩ因子並びに製剤化ヒト血漿Ｈ因子(form. FH)又はPBS１×緩衝液中のヒト血漿Ｈ因子(FH dess)の補因子活性の分析を説明する。10μgのタンパク質C3b及び140ngのＩ因子を、漸増量のＨ因子(50、100、250、500及び1000ng)の存在下で37℃にて30分間インキュベートする。C3b分子のα'鎖及びβ鎖に対応するバンド並びにα'鎖の切断フラグメントα'1及びα'2に対応するバンドを定量化するために、SDS-PAGEで種々のサンプルを堆積させる。次いで、不活化C3b分子のパーセンテージを、α'鎖の総量に対する切断α'鎖の全量の比から算出する。
【図１２Ｃ】図12Cは、ヒト組換えFH PERC6及びHEKのＩ因子並びに製剤化ヒト血漿Ｈ因子(form. FH)又はPBS１×緩衝液中のヒト血漿Ｈ因子(FH dess)の補因子活性の分析を説明する。10μgのタンパク質C3b及び140ngのＩ因子を、漸増量のＨ因子(50、100、250、500及び1000ng)の存在下で37℃にて30分間インキュベートする。C3b分子のα'鎖及びβ鎖に対応するバンド並びにα'鎖の切断フラグメントα'1及びα'2に対応するバンドを定量化するために、SDS-PAGEで種々のサンプルを堆積させる。次いで、不活化C3b分子のパーセンテージを、α'鎖の総量に対する切断α'鎖の全量の比から算出する。
【図１２Ｄ】図12Dは、ヒト組換えFH PERC6及びHEKのＩ因子並びに製剤化ヒト血漿Ｈ因子(form. FH)又はPBS１×緩衝液中のヒト血漿Ｈ因子(FH dess)の補因子活性の分析を説明する。10μgのタンパク質C3b及び140ngのＩ因子を、漸増量のＨ因子(50、100、250、500及び1000ng)の存在下で37℃にて30分間インキュベートする。C3b分子のα'鎖及びβ鎖に対応するバンド並びにα'鎖の切断フラグメントα'1及びα'2に対応するバンドを定量化するために、SDS-PAGEで種々のサンプルを堆積させる。次いで、不活化C3b分子のパーセンテージを、α'鎖の総量に対する切断α'鎖の全量の比から算出する。
【図１３】図13は、ヒト血漿Ｈ因子(PB03又はLP03)又は組換えＨ因子(PERC6又はHEK)によるヒツジ赤血球の溶解抑制の用量応答曲線を示す。
【実施例】
【００４３】
実施例１：材料及び方法
1.1  ヒトＨ因子をコードする核酸の最適化
分子クローニングに必要な制限部位を回避し、ホモサピエンスについて最適化するため、合成遺伝子の供給業者のアルゴリズムにより配列最適化を実施した。
【００４４】
1.2  安定プールを作製するための、Ｈ因子配列を含むpcDNA2001neoベクターのPER.C6(登録商標)細胞へのトランスフェクション
安定プールにおけるトランスフェクションを、空(＝Ｈ因子配列を含まない)pcDNA2001neoベクターと並行して行う。安定プールのトランスフェクションは、下記の新規プロトコールに従って行う。
【００４５】
エレクトロポレーションは、以下のベクターを用いて行う：
【表１】
2014532401.tif 000002
【００４６】
MD1Yは、配列番号９の配列で表される核酸を含むベクターを示す。
MD2Yは、配列番号６の配列で表される核酸を含むベクターを示す。
MD3Yは、配列番号７の配列で表される核酸を含むベクターを示す。
MD1Hは、配列番号18の配列で表される核酸を含むベクターに対応する。
MD2Hは、配列番号15の配列で表される核酸を含むベクターに対応する。
MD3Hは、配列番号24の配列で表される核酸を含むベクターに対応する。
【００４７】
−  細胞の予備培養
安定プールトランスフェクション用細胞(クリオチューブ内で無血清培地中に保存した懸濁状態の細胞から開始する懸濁培養に由来する)は、Permab培地(Hyclone, ThermoFisher Scientific)中、撹拌下に適応させたPER.C6 SF細胞である。これを、125rpmで撹拌しながら３週間培養した。
エレクトロポレーションの２日前に、Permab培地の完全置換により細胞を5E5vc/mLで懸濁状態にした。体積は、エレクトロポレーションの間に計画されたキュベット数に合わせた。
エレクトロポレーション当日、細胞濃度及び生存度を測定する。細胞は、対数増殖期でなければならず、90％を越える生存度でなければならない。
エレクトロポレーションの前に、Permab培地(３mMのL-グルタミン)を周囲温度に予め加温する。
【００４８】
−  エレクトロポレーション
下記の工程を６つのキュベットで行う：
−60mLをT150中に予め等分し(すなわち、キュベット当たり10mL)、37℃に予め加温する
下記の工程を各キュベットで行う：
−6E6 vcを300ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄する
−細胞を再懸濁し、チューブを約10回振盪させる
−周囲温度の400μLのPermab培地(３mM L-グルタミン)を添加する(細胞を15分間を超えて放置しない)
−滅菌1.5mLエッペンドルフチューブに８μgのDNAを加える
−８μgのDNAに400μLの細胞懸濁物に慎重に添加する
−DNA/細胞懸濁物を４mmエレクトロポレーションキュベットに移す。キュベットの底に泡が無いことを確認する。
−エレクトロポレーションチャンバーにキュベットを移した後、以下のBioRad Gene Pulser Xcellプログラムを適用する：
電圧(Ｖ)           250
パルス幅(ms)        ５
パルス数            １
パルス間隔(ｓ)      ０
キュベット(mm)      ４
−表面に浮遊する白色凝集体(細胞残渣)を除去し、１mLピペットを用いて細胞懸濁物を慎重に取り出す。細胞を、37℃に予め加温した60mLの培地に直接加える。沈殿物の形成を回避するために、添加は滴加で行わない。
−PER.C6(登録商標)安定プールを作製するための６キュベットが得られるまで、以下の工程を再び始める。
【００４９】
＞安定プールの選択及び作製
トランスフェクションの48時間後、トランスフェクションの効率を評価する。細胞培養物を再懸濁し、１mLについて計数を行う。生存細胞濃度/開始濃度(6E5 vc/mL)により、生存度のパーセンテージ範囲が得られる。
容器に5E5 vc/mLを、培地の完全置換並びにPermab(３mM L-グルタミン)及びG418の添加により播種する。全ての細胞を300ｇにて５分間遠心分離した後、選択培地を添加する。
選択培地の完全な更新により、細胞を週２回(月曜日及び金曜日)継代する。体積及び容器を、各継代で3E5 vc/mLの濃度が得られるように適合させる。２〜３週間後、細胞生存度は向上する。細胞生存度が約50％に達すると、攪拌条件下での培養を開始し得る。この場合、開始濃度は5E5 vc/mLである。培養物が85％より高い生存度に達すると、凍結保存を5E6 vc/アンプルで行う。
【００５０】
組換えＨ因子の製造用バッチ培養物の播腫：
バッチに使用する容器の容量は250mlであり、当初の稼働容量は30mlである。容器容量の変化は、自動的に、このプロトコールに述べる体積及び値の改変に繋がる。
細胞を、培養培地の完全な更新により1E6 vc/mlの濃度で播腫する。細胞を、培地の更新も添加も無しで、125rpmで撹拌しながら36.5℃にて７日間インキュベートする。生存度、細胞密度及び組換えＨ因子の製造を測定するため、培養の３日目と７日目との間に毎日サンプルを採取する。
７日目に、細胞を3000ｇで15分間遠心分離する。細胞堆積物を除去し、組換えＨ因子を含む細胞上清を0.22μmで濾過し、次に−20℃で凍結させる。
【００５１】
1.3  組換えＨ因子の一過性製造のためのHEK 293F細胞への一過性トランスフェクション
細胞の予備培養：
一過性トランスフェクションの前日に、HEK 293F細胞を7E5 vc/mlの細胞濃度で継代培養する。
一過性トランスフェクション：
HEK 293F細胞の細胞密度及び生存度を、トランスフェクション当日に測定する。30E6 vc/mlに対応する培養物体積を遠心分離する。上精を除去し、細胞堆積物を28mlのF17培養培地(Invitrogen)に採取し、250mlコニカルフラスコに移して、37℃にてインキュベートする。
２:１の比のトランスフェクション剤/DNA複合体の形成：トランスフェクション剤(Fectin又はPEI)及びＨ因子配列の１つを含むベクターpCEP4に対応するDNAを、下記のとおりに、OptiMEM培地(Invitrogen)中に調製する：
−30μgのDNAを１mlのOptiMEMに添加
−60μlのFectin又は60μlのPEIを１mlのOptiMEMに添加
これら２つの調製物を別々に周囲温度で５分間インキュベートし、次にトランスフェクション剤を含む溶液を、DNAを含む溶液に慎重に添加する。この混合物を周囲温度で25分間インキュベートし、予め調製したおいた28mlのHEK 293F細胞に添加する。
次に、細胞を125rpmで撹拌しながら37℃でインキュベートする。
【００５２】
ポジティブトランスフェクションコントロール：GFP(緑色蛍光タンパク質)を発現するベクターもまた、同条件下でトランスフェクトする。トランスフェクションの24時間後、トランスフェクションの効率を、蛍光顕微鏡観察により測定する(細胞総数に対するGFP発現細胞数の割合)。
増殖コントロール：HEK 293F細胞を、同条件下に発現ベクター無しでトランスフェクトする。このコントロールにより、トランスフェクション後の生存度の測定が可能になり、外因性タンパク質(組換えＨ因子)の一過性製造に関連する毒性が存在するかどうかを決定することが可能になる。
Ｈ因子の一過性製造：
細胞を、培養培地の添加も更新もなく、７日間培養状態に維持する。細胞密度及び生存度を５日目と７日目の間に毎日測定する。
７日目に、細胞を3000ｇで15分間遠心分離する。細胞堆積物を除去し、組換えＨ因子を含む細胞上清を0.22μmで濾過し、次に−20℃で凍結させる。
【００５３】
1.4  細胞生存度の試験
細胞密度及び生存度を、自動細胞培養分析装置(Cedex, Innovatis - Roche Applied Science)を用いて測定する。生存度の測定は、トリパンブルーを取り込んだ細胞の計数に基づく。
【００５４】
1.5  組換えヒト因子の特徴決定
SDS-PAGE：
−サンプル調製：１μg当量のタンパク質をLaemli ２×緩衝液と混合する(v/v)。混合物を95℃で５分間加熱してタンパク質を変性させる。
次に、線形ゲル10％Bis-Tris/HCl pH6.4のウェルにタンパク質を堆積させる。泳動は、MOPS緩衝液(50mM MOPS、50mM Tris塩基、0.1％ SDS、１mM EDTA、pH7.7)の存在下で行う。タンパク質を、200ボルトの定電圧で60分間分離する。
クーマシーブルー染色：
泳動後、ゲルを、蒸留水で３×５分間洗浄し、次いでクーマシーブルー溶液で一晩染色する。過剰な染料を蒸留水での継続的洗浄により除去する。次に、ゲルの写真を撮像装置で撮影す。
【００５５】
ウェスタンブロットによる検出：
泳動後、ゲルを、40mMのアミノ-6-ヘキサン酸を含む緩衝液(Tris 25mM pH9.8)に移す。
半乾燥転写装置(TE77、Amersham Pharmacia)で、下記のとおり、アノードからカソードに挟む：
−Tris 0.3Ｍ緩衝液(pH10.4)中でプレインキュベートした６枚のワットマン紙
−Tris 25mM緩衝液(pH10.4)中でプレインキュベートした３枚のワットマン紙
−Tris 25mM緩衝液(pH10.4)中でプレインキュベートした１枚のニトロセルロース膜(RPN 303E, GE Healthcare)
−40mMのアミノ-6-ヘキサン酸を含む緩衝液(Tris 25mM pH9.8)中でプレインキュベートしたゲル
−40mMのアミノ-6-ヘキサン酸を含む緩衝液(Tris 25mM pH9.8)中でプレインキュベートした９枚のワットマン紙
【００５６】
転写は、0.8mA/cm2膜の定電流密度で60分間行う。
転写後、膜は、１％のBSA及び0.1％のTween 20を含むPBS緩衝液中で一晩４℃で飽和させる。次に、膜を、0.1％のTween 20を含む生理食塩水で洗浄する。Ｈ因子は、周囲温度で60分間インキュベートした濃度0.5μg/mlの抗Ｈ因子モノクローナル抗体(MCA 508G, Serotec)を、続いて周囲温度で60分間インキュベートした濃度80ng/mlのペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG二次抗体を用いて検出する。次に、標識タンパク質を、化学発光酵素キットを用いて顕現させ、光子検出器を備えた画像化装置を用いて検出する。
【００５７】
1.6  ELISAによる培養培地中のヒトＨ因子のアッセイ
緩衝液及び溶液：
１-被覆緩衝液：PBS
１リットルのWFI中でPBS緩衝液(pH7.4)用の１袋の塩(Sigma: P-3813又は同品質の塩)の内容物を溶解させる。
２-被覆抗体：ヒツジ抗ヒトＨ因子免疫グロブリン(The Binding Site-Ref.:PC030)
抗体を、3.5〜5.5μg/mlの濃度が得られるように、被覆緩衝液に即座に希釈する。
３-飽和緩衝液：PBS緩衝液-BSA １％(w/v)
１プレートにつき、15mlのPBS緩衝液に0.15ｇのBSA(BSA：Sigma - Ref.: A7030又はJackson Immuno Research Laboratories、Ref.: 001-000-162又は同品質のBSA)を溶解させる。
４-洗浄緩衝液：PBS緩衝液-Tween 20 0.1％(v/v)
１mlのTween 20を１リットルのPBSに加える。
【００５８】
５-希釈緩衝液：PBS緩衝液-Tween 20 0.1％(v/v)-BSA 0.1％(w/v)
標準物質、アッセイ用サンプル及び検出抗体の希釈用緩衝液。洗浄緩衝液に1/10で飽和緩衝液を溶解させる。
６-標準溶液：ヒトＨ因子キャリブレーターNL(The Binding Site, Ref.:RP030)
供給者が示す体積のWFIに凍結乾燥物を取り、30分間待ち、その後20μlのアリコートに分け、−70℃で凍結させる。
100ng/mlの保存溶液を得るために、標準物質を(700mg/Lのstdについて)1/7000に希釈する：すなわち、
1/70の第１の予備希釈：５μlのStd＋345μlの希釈緩衝液、
1/100の第２の予備希釈：５μlの第１予備希釈物＋495μlの希釈緩衝液。
次に、希釈緩衝液に二倍希釈する(７点)。
ブランクは、希釈緩衝液を用いて行う。
７-サンプル
サンプルは、前記範囲の第１点の濃度に近い濃度が得られるように予備希釈する。次に二倍希釈する(８点)。
【００５９】
８-抗Ｈ因子モノクローナル抗体：精製抗ヒトＨ因子マウスモノクローナル免疫グロブリン(SEROTEC - Ref.: MCA508G)
抗体を、希釈緩衝液に1/5000に即座に希釈する。すなわち、１プレートにつき：10mlの希釈緩衝液に２μl。
９-検出抗体：ペルオキシダーゼ標識抗抗マウスIgGヤギ免疫グロブリン(Jackson Immuno Research Laboratories, Ref.: 115-035-062)
抗体を、希釈緩衝液に1/10000(1/50、次いで1/200)に即座に希釈する。すなわち、１プレートにつき：
1/50：98μlの希釈緩衝液に２μl、次いで1/200：10mlの希釈緩衝液に50μl。
10-検出溶液：TMBキット
ペルオキシダーゼ基質(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)溶液及び過酸化物溶液を即座に混合する(体積/体積)。
11-停止溶液：４Ｎ又は２Ｍ硫酸(Fisher Scientific, Ref.: 0379D)。
【００６０】
手順
＞固相の感作
マイクロタイタープレートに、ウェル当たり100μlの希釈した被覆抗体を分配する。
接着性フィルムで覆う。
＋４℃で一晩インキュベートし、プレートを倒置して空にする。
＞固相の飽和
ウェル当たり120μlの飽和溶液を分配する。
接着性フィルムで覆う。
20℃で１時間インキュベートする。
洗浄緩衝液で３回洗浄する。
【００６１】
＞抗原捕捉
ウェル当たり100μlの希釈緩衝液(ブランク)、各希釈率の標準物及びサンプルを分配する。
接着性フィルムで覆う。
20℃で1.5時間インキュベートする。
洗浄緩衝液で５回洗浄する。
＞モノクローナル抗体による抗原認識
ウェル当たり100μlのモノクローナル抗体を分配する。
接着性フィルムで覆う。
20℃で1.5時間インキュベートする。
洗浄緩衝液で５回洗浄する。
【００６２】
＞HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)接合体による標識
ウェル当たり100μlの検出抗体を分配する。
接着性フィルムで覆う。
20℃で１時間インキュベートする。
洗浄緩衝液で５回洗浄する。
＞酵素反応
一定間隔で、強い光から離して、ウェル当たり100μlのTMB(基質を含む)を分配する。
周囲温度で５〜15分間インキュベートする。
この時間は、全てのアッセイポイントで同じでなければならない。
＞反応の停止
一定間隔で、ウェル当たり100μlの４ＮのH2SO4を分配する。
450nmでの光学密度(CD)を読み取る。
【００６３】
結果の利用
標準曲線の線形回帰直線は、ペア(log(450nmでのOD−ODブランク)、log(Ｈ因子の濃度(ng/ml)))で定義される。
この結果は、標準物質の範囲について得られた直線の線形部分において、全く同一のサンプルについて得られた全ての結果の平均値である。
【００６４】
1.7  精製組換えヒトＨ因子の特徴決定
PER.C6(登録商標)株において製造した組換えヒトＨ因子は、一工程のイオン交換クロマトグラフィーで精製する。
HEK293株において産生する精製された組換えヒトＨ因子は、二工程のイオン交換クロマトグラフィーで精製する。
PER.C6(登録商標)又はHEK293細胞により製造した組換えＨ因子の精製工程のSDS-PAGE分析結果を図7B及び7Cに示す。
精製組換えヒトＨ因子の存在は、上記1.5節に従い、クーマシーブルー染色したSDS-PAGEゲル及びウェスタンブロットにより明らかにされる。
SDS-PAGE又はウェスタンブロットによる精製組換えヒトＨ因子の分析結果をそれぞれ図6C及び6Dに示す。
こうして精製した組換えヒトＨ因子は、下記で説明する分子ふるい、キャピラリー等電点電気泳動又はSDSゲルキャピラリー電気泳動により分析する。
【００６５】
分子ふるい
１．手順
50〜100μgの組換えヒトＨ因子を、PBS １×緩衝液で事前に平衡化したSuperdex 200 10/300 GL濾過ゲル(GE Healthcare, ref.: 17-5175-01)のカラムに注入する。分離は、UV検出器(GE Healthcare, Akta Prime)に連結したFPLC装置で0.4ml/分の定流速で行う。
分子ふるいによる分析結果を図9A及び9Bに示す。
２．結果
HEK 293F細胞株で製造した精製組換えFHを用いて得たクロマトグラムは、27.88分の保持時間(FHに対応する)を有する主ピークを有する(図9A)。
PER.C6細胞株で製造した精製組換えFHを用いて得たクロマトグラムは、27.89分の保持時間(FHに対応する)を有する主ピーク及び21.07分(組換えFHの凝集形態に対応する)で出現する小ピークを有する(図9B)。
【００６６】
キャピラリー等電点電気泳動
１．手順
組換えFHのアイソフォームは、Advanced cIEF Starterキット(Beckman Coulter, A80976)及びUV検出器(Beckman Coulter)を備えるPA800キャピラリー電気泳動装置を用いるキャピラリー電気泳動により決定する。
75μgの分析すべき組換えFHの各サンプルを、Zeba Desalt Spinカラム(Pierce)での遠心分離により脱塩し、周囲温度でSpeedvac内で乾燥させ、次いで５〜10mg/mlのタンパク質濃度が得られるように或る体積の超純水に取る。
次いで、10μlの各サンプルを、200μlの３Ｍ尿素、12μlのPharmalyte 3-10キャリア両性電解質、20μlのカソード安定剤、２μlのアノード安定剤及び２μlの4.1〜10の間のpIマーカーで構成される240μlの混合物と混合する。
サンプル調製物を、予めプログラムした方法Basic pH Gradient Separation Method metを用いるeCAPTMキャピラリー(Beckman Coulter, 477441)に注入する。pI値の関数としての泳動の線形性を検証するために、５つのマーカー(pI4.1〜10)の混合物を、解析シーケンスの開始時と終了時に注入する。
【００６７】
２．結果の分析及びpI値の算出
エレクトロフェログラムのピークの積分後、ソフトウエア32 Karatにより、サンプルのpI値は自動的に算出される。結果を図10A及び10Bに示す。
この分析により、実験pIが、6.12であるヒトFHの理論pIに近い値で僅かに変化する(PERC6及びHEKについてそれぞれ5.53〜6.01及び5.86〜6.13)幾つかのアイソフォームの存在が示された(下記表を参照)。
【表２】
2014532401.tif 000003
【００６８】
SDSゲルキャピラリー電気泳動：
１．手順
組換えFHの分子量は、SDS-MW Analysisキット(Beckman Coulter, 390953)及びUV検出器を備えるPA800キャピラリー電気泳動装置(Beckman Coulter)を使用するキャピラリー電気泳動により測定する。
200μgの分析すべき組換えFHの各サンプルを、150μlのサンプル緩衝液(100mM Tris-HCl pH9.0、１％ SDS)と混合し、Centricon YM-10(Millipore, PN 4205)で4000ｇにて10分間遠心分離する。この操作を２回繰り返し(150μlのサンプル緩衝液の添加及び4000ｇで５分間の遠心分離)、次いで体積をサンプル緩衝液で100μlとする。
非還元条件下での分析には、50μlのサンプルを取り、45μlのサンプル緩衝液、２μlの内部標準10kD、５μlの250mMヨード-アセトアミドと混合し、70℃で10分間加熱する。還元条件下の分析には、残る50μlを45μlのサンプル緩衝液、２μlの内部標準10kD、５μlの２-メルカプトエタノールと混合し、70℃で10分間加熱する。
標準分子量溶液も、85μlのサンプル緩衝液、２μlのSDS-MWサイズマーカー(10〜225kD)及び５μlの２-メルカプトエタノールを混合して調製する。
このように調製したサンプルは、予めプログラムした方法SDS MW Conditioning-PA800 plus-metを用いて50μm I.D. capillary bare-fused silica 2に注入して分析する。
標準の校正曲線に基づき、サンプルの分子量をソフトウエア32 Karatにより決定する。ピークの積分により、サンプルの各ピークが表すパーセンテージを計算できる。
【００６９】
２．結果の分析：
標準物質の校正曲線に基づき、サンプルの分子量は、ソフトウエア32 Karatにより決定する。ピークの積分により、サンプルの各ピークの割合を計算できる。結果を図11A及び11B並びに下記表に示す。
電気泳動プロフィールにより非常に大きなピーク(＞95％)の存在が示され、このピークは精製ヒトＨ因子に対応し、サイズが非還元条件下で173〜176kDaであり(図11A)、還元条件下で143〜148kDaである(図11B)。
【００７０】
【表３】
2014532401.tif 000004
【００７１】
1.8  組換えヒトＨ因子の生物活性の特徴決定
1.8.1．抗C3転換酵素活性(C3転換酵素崩壊促進活性)
緩衝液及び溶液
＞被覆緩衝液
0.1Ｍ炭酸緩衝液−pH9.6 
Na2CO3：500mlのWFI(注射用水)に5.3ｇ  0.1Ｍ
NaHCO3：500mlのWFIに4.2ｇ  0.1Ｍ
30mlのNa2CO3溶液を70mlのNaHCO3溶液に加え、必要であれば、pHを9.6に調整する。４℃で３カ月間保存する。
【００７２】
＞洗浄緩衝液
ａ)PBS緩衝液pH7.4(Sigma)＋Tween 20 0.1％(＝緩衝液Ａ)
100mlのPBS緩衝液pH7.4に0.1mlのTween 20を溶解させる。
＋４℃で保存する(最大２日)。
ｂ)リン酸ナトリウム緩衝液10mM、NaCl 25mM、pH7.2±0.05(＝緩衝液Ｂ)
１リットルのWFIに1.56ｇのNaH2PO4・2H2Oを溶解させる。
１リットルのWFIに3.58ｇのNa2HPO4・12H2Oを溶解させる。
約66mlのNa2HPO4溶液を34mlのNaH2PO4溶液に加える。pHを7.30に調整する。25mMの最終濃度が得られるに必要なNaClを添加する。この緩衝液は４℃で１カ月間保存できる。
この緩衝液は、飽和、希釈、洗浄緩衝液のベースとして役立つ。
洗浄緩衝液(＝緩衝液Ｃ)を得るためには：
0.1mlのTween 20を100mlの緩衝液Ｂに溶解させる。
＋４℃で保存する(最大２日)。
【００７３】
＞飽和緩衝液
緩衝液Ｂから十分な体積を準備する。１％のBSA(w/v)を添加する。
＋４℃で最大２日間保存する。
＞希釈緩衝液Ｄ
緩衝液Ｂを必要な体積で準備し、これにTween 20を0.05％の濃度で、BSAを４％(w/v)の濃度で添加する。
＋４℃で最大２日間保存する。
＞希釈緩衝液Ｅ
PBS pH7.4から開始し、これに0.1％のBSA(w/v)を添加して希釈緩衝液Ｅを調製する。
＋４℃で最大２日間保存する。
＞NiCl2 20mM、NaCl 25mMの溶液
100mlのNaCl 25mM溶液に十分な0.475ｇのNiCl2を秤量する(＋４℃で最大３カ月間保存する)。
【００７４】
＞基質緩衝液
クエン酸緩衝液0.1Ｍ＋H2O2 30％
クエン酸緩衝液：
１リットルのWFIに29ｇのクエン酸ナトリウム及び4.1ｇのクエン酸を溶解させる。
必要であれば、pHを5.5に調整する。
＋４℃で最大３カ月間保存する。
使用当日に、10μlのH2O2 30％を10mlのクエン酸緩衝液に即座に加え、遮光して保存する。
＞停止溶液
４Ｎ(２Ｍ)硫酸溶液を調製するか又は使用できる状態にする。
１リットルを調製する：100ml H2SO4 18Ｍ＋900mlのWFI。
周囲温度で最大６カ月間保存する。
【００７５】
手順
＞プレートの被覆
被覆緩衝液中での試験に必要な体積にC3bを希釈して、2.5μg/mlの最終濃度を得る(１つの96ウェルプレートにつき10ml)。例：１mg/mlのバッチD28449については、10mlの被覆緩衝液に25μlを希釈する。
100μlの調製溶液を各ウェルに分配する。
接着性材料でプレートを被う。
プレートを、＋34℃で１〜1.25時間、次いで＋４℃で一晩インキュベートする。
＞洗浄
マルチディストリビュータ・マイクロピペットを用いて手作業でプレートを洗浄する(３×280μlの洗浄緩衝液Ｃ)。この操作には自動洗浄機も使用できる。
倒置して空にする。
【００７６】
＞飽和
ウェル当たり300μlの飽和緩衝液を分配する。
＋34℃で１〜1.25時間インキュベートする。
倒置して空にする。
＞転換酵素生成工程
以下の溶液を調製する(１つの96ウェルプレートにつき10ml)：
-  NiCl2 20mM、NaCl 25mMの溶液：750μl(最終濃度NiCl2：1.5mM)
-  Ｂ因子 Calbiochem (１mg/ml)：40μl(最終濃度：４μg/ml)
-  Ｄ因子 Calbiochem (0.1mg/ml)：30μl(最終濃度：0.3μg/ml)
-  希釈緩衝液Ｄ：9180μl
100μl/ウェルを堆積させ、＋34℃で２時間インキュベートする。
【００７７】
＞洗浄
マルチディストリビュータ・マイクロピペットを用いて手作業でプレートを洗浄する(３×280μlの洗浄緩衝液Ｃ)。この操作には自動洗浄機も使用できる。
倒置して空にする。
＞所定の範囲のＨ因子の調製
所定の範囲のＨ因子は、プール血漿(ECQ1)及び参照バッチ又はアッセイすべきＨ因子を含む任意のサンプルから開始して調製する。ELISA抗原濃度又はOD280は、非独立連続希釈による当該範囲の確立のベースとして役立つ。アッセイの選択は以下のとおりである：
−プール血漿及び中間純度のサンプルについてはElisa技法。
−参照バッチ、PV又は再水和最終生成物についてはOD280測定
−最大＋34℃で32〜34分間インキュベートする。
【００７８】
＞洗浄
マルチディストリビュータ・マイクロピペットを用いて手作業でプレートを洗浄する(３×280μlの洗浄緩衝液3.3.2 b)。この操作には自動洗浄機も使用できる。
倒置して空にする。
＞抗ヒトＢ因子抗体のインキュベーション
10mlの希釈緩衝液Ｅについて、５μlの抗ヒトＢ因子抗体(Calbiochem ref. 341272)を添加し、次いで100μl/ウェルを分配する(1/2000に希釈)。
34℃で１〜1.25時間インキュベートする。
＞洗浄
マルチディストリビュータ・マイクロピペットを用いて手作業でプレートを洗浄する(３×280μlの洗浄緩衝液Ａ)。この操作には自動洗浄機も使用できる。
倒置して空にする。
【００７９】
＞ペルオキシダーゼ標識抗ヤギIgG(H+L)抗体のインキュベーション
希釈は、希釈緩衝液Ｅで行う：
−1/40に予備希釈(10μlの抗体＋390μlの緩衝液)
−1/500に希釈(20μlの予備希釈物＋9980μlの緩衝液)
100μl/ウェルを分配し、遮光して周囲温度で25〜30分間インキュベートする。
＞洗浄
マルチディストリビュータ・マイクロピペットを用いて手作業でプレートを洗浄する(３×280μlの洗浄緩衝液Ａ)。この操作には自動洗浄機も使用できる。
倒置して空にする。
＞酵素反応
一定間隔で、マルチチャネルピペットを用いてウェル当たり100μlのTMBを分配する。
プレートを、遮光して周囲温度で５〜15分間インキュベートする。
＞反応の停止
一定間隔で100μlの停止溶液を各ウェルに分配する。
＞読取り
穏やかに撹拌後、マイクロプレートリーダーで450nmにてプレートを即座に読み取る。
【００８０】
結果の利用
＞外れ値の排除
参照物質、ECQ又は他の任意のサンプルに関して所定範囲のＨ因子の各濃度について二連で得られた吸光度は、外れ値を排除した後、平均する。例えば、サンプル、参照物質又はECQの二連での値について、範囲当たり及び濃度レベル当たりの１点の排除が許容される。排除すべき点の選択により、得られたEC50の相関係数値(R2)及び95％信頼区間の精度を向上させることが可能となる。
【００８１】
＞Prismソフトウエア(Logi Labo)の利用
このソフトウエアにより、非線形モデルシステム(Ｓ字状曲線)において各サンプルのIC50値を決定することが可能となる。このモデルを計算する式は以下のとおりである：
Ｙ：ボトム＋(トップ−ボトム)/(１＋10^((Log IC50−Ｘ)×ヒルスロープ)
Ｘは濃度(μg/ml)の対数である。
Ｙは応答(OD)である。
Ｙは、ベースライン(ボトム)から始まり、Ｓ字形に従い頂上(トップ)に達する。ヒルスロープは、傾きである。
ECQ又はサンプルについて得た各希釈物の吸光度(所定範囲、二連で)の平均値は、対応する各濃度についてデータべースに書き込む。
データの分析には、選択したモデルに対する試験の偏差を推定する関数「Runs test」を補充する。
IC50の標準偏差は95％信頼区間について示す。
曲線を調べることで、全てのサンプルを可視化し、ECQと比較することが可能となる。
【００８２】
＞アッセイの受容基準
所定範囲の全てのサンプル(参照及びECQを含む)のΔODは、少なくとも0.35でなければならない。この値より低い値は、当該試験の自動的な排除をもたらす。
この条件を受容することで、それぞれのIC50値の決定が可能となる。
プール血漿のIC50の平均値は0.058μg/mlである。
このアッセイは、２標準偏差の許容範囲(平均値0.058±0.030μg/ml)で妥当である。新たなECQは全て、特性を決定するために、以前のECQと並行して、少なくとも10アッセイにわたって試験しなければならない。
参照物質のIC50の平均値及び信頼区間は、検証後に決定する。
相関係数値は、各サンプルについて少なくとも0.99でなければならない。
組換えヒトFHを含むPER.C6(登録商標)及びHEK 293F培養上清についての結果を図8A及び下記表に示す。
【００８３】
【表４】
2014532401.tif 000005
【００８４】
精製Ｈ因子の活性についての結果を図8B及び下記表に示す。
【表５】
2014532401.tif 000006
【００８５】
1.8.2  Ｉ因子の補因子活性：
＞手順
FHの補因子活性は、C3bの液相切断アッセイで測定する。C3b(10μg)及びFI(140ng)を、単独で又はイミダゾール20mM、NaCl 75mM緩衝液(pH7.3)中体積100μlのFH(250ng)の存在下に、37℃で30分間インキュベートする。この反応を、DTTを補充したLaemmliサンプル緩衝液を添加して停止させ、次いで種々のサンプルを上記のようにポリアクリルアミドゲル電気泳動に供する。クーマシーブルーで染色した後、ゲルをスキャンし、Quantity-oneソフトウェアで分析して各トラックに存在する各バンドの相対強度を測定する。
【００８６】
【表６】
2014532401.tif 000007
【００８７】
＞結果：
C3bは、176kDaの分子量を有し、ジスルフィド架橋により結合した２つの鎖から構成される：101kDaのα'鎖及び75kDaのβ鎖。α'鎖は、Ｉ因子によりα'1(63kDa)及びα'2(39kDa)と呼ばれる２つのフラグメントに切断される；β鎖(75kDa)は変化しないままである。
得られた結果を比較できるようにするために、相対強度を、コントロールC3b単独のトラックに存在するβバンドの強度に対して標準化する。
その後、C3bの不活化パーセンテージを、全α'鎖(α'＋((α'1＋α'2)/２))に対する切断α'鎖((α'1＋α'2)/２)の比から算出する(図12)。
図12Dに示した結果の分析により、PER.C6及びHEK 293F株で製造した組換えFHはFIの類似の補因子活性を有し、この活性はヒト血漿FHの活性に匹敵することが示される。
【００８８】
実施例２：pCDNA2001nea-MD1を含んでなるベクターの構築
pCDNA2001neo-MD1ベクターは、ヒトＨ因子の天然配列に相当する配列番号８の配列で表される核酸を含んでなる。
Genscriptにより提供されたpUC57-MD1ベクターは、配列番号８の配列(MD1、ヒトＨ因子の天然配列)で表される核酸に対応する合成遺伝子を含む。NotI及びBamHI制限酵素によるpUC57-MD1ベクターの消化は、3000bp及び3700bpの２つのフラグメントを生じる。これら２つのフラグメントをゲル精製及びNucleospin抽出で分離する。
pCDNA2001-neoベクターをNotI及びBamHI制限酵素で消化する。これにより、25bp及び5533bpの２つのフラグメントが生じる。Nucleospinによる抽出及び脱リン酸化後、配列番号８の配列(MD1)で表される核酸に相当する3700bpフラグメントを、消化pCDNA2001-neoベクターに挿入する。
ライゲーション後、こうして得たベクターをTOP10細菌に形質転換する。
MD1に対応するDNAフラグメントの挿入は、プライマーCMV1(配列番号10  5'-CCATTGACGTCAATGGGAGTTTG-3')及びMD1-1rev(配列番号11  5'-GGTAAACACTTCACAACTTCACATATAG-3')を用いるPCRスクリーニング(758bpバンドが得られる)により検証する。次に、PCRスクリーニングで陽性である細菌クローンを配列決定して、発現ベクター内に含まれるＨ因子の転写の単一性を検証する。
【００８９】
実施例３：最適化Ｈ因子の核酸配列MD2及びMD3を含んでなるベクターpCDNA2001neo-MD2及びpCDNA2001neo-MD3の構築
ベクターpCDNA2001neo-MD2及びpCDNA2001neo-MD3は、それぞれ、ヒトＨ因子の最適化配列及び最適化シグナルペプチドMB7を伴うヒトＨ因子の最適化配列に対応する配列番号２及び配列番号３の配列で表される核酸を含んでなる。
Genscriptにより提供されたベクターpUC57-MD2及びpUC57-MD3は、それぞれ、配列番号２(MD2)及び配列番号３(MD3)の配列で表される核酸に対応する合成遺伝子を含む。これらをNotI及びBamHI制限酵素で消化する。これにより、3000bp及び3700bpの２つの核酸フラグメントが生じる。各ベクターについて、これら２つのフラグメントをゲル精製及びNucleospin抽出により分離する。
pCDNA2001-neoベクターをNotI及びBamHI制限酵素で消化する。これにより、25及び5533bpの２つのフラグメントが生じる。Nucleospinによる抽出及び脱リン酸化後、コーディング配列MD2又はMD3に対応する3700bpフラグメントを、消化pCDNA2001-neoベクターに挿入する。
ライゲーション後、こうして得たベクターをTOP10細菌に形質転換する。
MD2又はMD3フラグメントの挿入は、プライマーCMV1(配列番号10  5'-CCATTGACGTCAATGGGAGTTTG-3')/MD2-1rev(配列番号12  5'-TGTCACACTCGCGGTAGTTG-3')を用いりPCRスクリーニング(706bpバンドが得られる)により検証する。
【００９０】
実施例４：pCDNA2001neo-MD1又はpCDNA2001neo-MD2又はpCDNA2001neo-MD3でトランスフェクトした安定なPER.C6(登録商標)プールの作製(図２)
PER.C6(登録商標)細胞を、上記節(実施例1.2)に記載したプロトコールに従い、pCDNA2001neo-MD1ベクター又はpCDNA2001neo-MD2又はpCDNA2001neo-MD3ベクターでトランスフェクトして、安定なプールを作製する。
種々のベクターで形質転換した細胞間で生存度に有意差はない。
【００９１】
実施例５：PER.C6(登録商標)及びHEK 293F細胞の培養上清において製造した組換えＨ因子(Y402及びH402変異体)のELISAアッセイ(図３、４、及び５)
培養上清を、先ず1/500に希釈し、これを開始点として、二倍希釈系列を８点で準備する。この系列希釈物及びアッセイサンプルの各点を二連で準備する。アッセイは、上記節(実施例1.6)に記載したプロトコールに従って行う。
【００９２】
実施例６：培養上清中の組換えＨ因子又は精製組換えＨ因子(Y402及びH402変異体)のSDS-PAGE及びウェスタンブロットによる特徴決定
ELISAで決定した組換えＨ因子の濃度又は280nmでの吸光度の測定値(精製タンパク質)から開始して、１μgの組換えＨ因子に対応する体積をLaemmli ２×緩衝液で1/2に希釈し、95℃で５分間加熱し、次いで10％ポリアクリルアミドゲルの線形ゲルに堆積させる。泳動後、上記(実施例1.5)のとおり、クーマシーブルーでのタンパク質染色又はニトロセルロース膜への転写後の免疫標識(ウェスタンブロット)用にゲルを処理する。
【００９３】
実施例７：組換えヒトＨ因子(Y402及びH402変異体)のC3転換酵素解離促進活性の測定
ELISAで決定した組換えＨ因子の濃度又は280nmでの吸光度測定値(精製タンパク質)に基づき、組換えＨ因子を20μg/mlの最終濃度に希釈する。この管から開始し、以下の連続希釈で所定範囲の希釈物を調製する：1/2；1/10；1/4；1/4；1/4；1/4；1/40。Ｈ因子濃度が減少するこの希釈物を、96ウェルプレイトのウェル中に形成したC3転換酵素複合体に添加した後、＋34℃で32〜34分間インキュベートする。次いで、数回洗浄後、ウェルの底に固定された、C3分子と複合体を形成しているＢ因子を、ELISAタイプの免疫酵素反応によりアッセイする。その後、添加したＨ因子の濃度を関数として得られる吸収度の値を、上記(実施例1.8)のプロトコールに示したように処理する。細胞抽出上清で測定された活性又は精製後の活性を、それぞれ図8A(上清)及び図8B(精製後)に示し。
【００９４】
実施例８：組換えヒトFHのＩ因子補因子活性の測定
PERC6若しくはHEK株で製造した組換えヒトFH及び製剤化血漿FHの又はPBS １×緩衝液中(脱塩後)のＩ因子(FI)補因子活性を、1.8.2節に記述した方法で測定する。10μgのC3bタンパク質及び140ngのＩ因子を、漸増量(50、100、250、500及び1000ng)のＨ因子の存在下に37℃にて30分間インキュベートする。種々のサンプルをSDS-PAGEで堆積させ、C3b分子のα'及びβ鎖並びにα'鎖の切断フラグメントα'1及びα'2に対応するバンドを定量する。次に、不活化したC3b分子のパーセンテージをα'鎖全量に対する切断α'鎖の量の比から算出する。
結果を図12A、12B、12C及び12Dに示す。
【００９５】
実施例９：ヒツジ赤血球に対するヒトＨ因子の抗溶血活性についてのアッセイ試験(Sanchez-Corral試験)
この試験により、機能的Ｈ因子が涸渇又は欠乏している血清により誘導される溶解からヒツジ赤血球を保護する能力を評価することで、治療バッチの開発中に精製された組換えヒトＨ因子のＣ末端部分の機能的活性を測定することが可能になる。この試験は、溶血性尿毒症症候群患者の血漿に存在するＨ因子の抗溶血活性を測定する「Sanchez-Corral」法(P. Sanchez-Corral, C. Gonzalez-Rubio, S. Rodriguez de Cordoba and M. Lopez-Trascasa. Molecular Immunology 41 (2004) 81-84)から改変されたものである。
この点に関して、Ｈ因子が涸渇した血清及びヒトのプール血漿の混合液を等しい割合で調製して、特異的溶解の状態を創出する。精製組換えヒトＨ因子の添加により、補体が誘導する溶解に対してヒツジ赤血球は保護される(細胞溶解がみられなくなる)。
CFHが無い場合、赤血球の自発的溶解は30％である。
rCFHによるヒツジ赤血球の溶解阻害は、用量依存的であり、４μgの用量で100％阻害に達する。２つのrCFHに差は無く、阻害活性は血漿CFHの活性を十分に上回る。
【００９６】
下記のものを、40μlのヒツジ赤血球懸濁液(１×108赤血球/ml)に逐次添加する：20μlの反応緩衝液(Hepes 10mM、NaCl 144mM、MgCl2 ７mM、EGTA 10mM、pH7.2)、２μlのFH又はPBS、次に９μlのヒト血漿プール、続けてFHが涸渇した９μlのヒト血漿。37℃で30分間のインキュベーション後、400μlの冷HBS-EDTA緩衝液(Hepes 10mM、NaCl 144mM、EDTA ２mM、pH7.2)を添加して、反応を停止させる。1730ｇにて５分間の遠心分離後、200μlの上清を取り、マイクロタイタープレートに堆積させ、414nmでの吸光度を測定する。
パーセンテージ溶解を以下の式で決定する：
(OD414nm反応管−OD414nmブランク管)/(OD414nm 100％溶解)×100
「100％溶解」コントロールは、水の存在下で観察されるヒツジ赤血球の最大溶解に対応する。
ブランクコントロールは、反応緩衝液及び50mM EDTAを含んでなり、ヒツジ赤血球の自発的溶解に対応する。
この試験の結果を下記表及び図13に示す。
【００９７】
【表７】
2014532401.tif 000008
【図１０Ａ】
2014532401.tif 000009
【図１０Ｂ】
2014532401.tif 000010
【図１１Ａ】
2014532401.tif 000011
【図１１Ｂ】
2014532401.tif 000012
【図１】
2014532401.tif 000013
【図２】
2014532401.tif 000014
【図３】
2014532401.tif 000015
【図４】
2014532401.tif 000016
【図５】
2014532401.tif 000017
【図６Ａ】
2014532401.tif 000018
【図６Ｂ】
2014532401.tif 000019
【図６Ｃ】
2014532401.tif 000020
【図６Ｄ】
2014532401.tif 000021
【図７Ａ】
2014532401.tif 000022
【図７Ｂ】
2014532401.tif 000023
【図７Ｃ】
2014532401.tif 000024
【図８Ａ】
2014532401.tif 000025
【図８Ｂ】
2014532401.tif 000026
【図９Ａ】
2014532401.tif 000027
【図９Ｂ】
2014532401.tif 000028
【図１２Ａ】
2014532401.tif 000029
【図１２Ｂ】
2014532401.tif 000030
【図１２Ｃ】
2014532401.tif 000031
【図１２Ｄ】
2014532401.tif 000032
【図１３】
2014532401.tif 000033
【配列表】
2014532401000001.app
【国際調査報告】
2014532401.tif 000034
2014532401.tif 000035
2014532401.tif 000036
2014532401.tif 000037
2014532401.tif 000038
2014532401.tif 000039