(57)【要約】  インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）において検出することができる、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はこれらの断片を含む、ワクチン組成物を記載する。前記断片は、配列番号１のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号１のポリペプチドを認識する免疫応答を生じさせることができる。
2014516028.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）において検出することができる、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその断片を含むワクチン組成物であって、前記断片は、配列番号１のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合に）、配列番号１のポリペプチドを認識する免疫応答を生じさせることができる、ワクチン組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の表面露出タンパク質の免疫原性断片を含み、前記断片はインフルエンザ菌において検出することができる、ワクチン組成物。
【請求項３】
配列番号１の１−１１又は１−２２位の１又は複数のアミノ酸が、欠失している、あるいは１又は複数のアミノ酸により置換されている、請求項１に記載のタンパク質に基づく免疫原性タンパク質を含む、ワクチン組成物。
【請求項４】
配列番号１の１−１１又は１−２２位の１又は複数のアミノ酸が、０〜２２個の任意のアミノ酸の配列により置換されている、請求項３に記載の組み換え免疫原性タンパク質を含む、ワクチン組成物。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、前記断片は、配列番号２のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号２のポリペプチドを認識する免疫応答を生じさせることができる、ワクチン組成物。
【請求項６】
配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、前記断片は、配列番号３のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号３のポリペプチドを認識する免疫応答を生じさせることができる、ワクチン組成物。
【請求項７】
配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、前記断片は、配列番号４のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号４のポリペプチドを認識する免疫応答を生じさせることができる、ワクチン組成物。
【請求項８】
配列番号５のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、前記断片は、配列番号５のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号５のポリペプチドを認識する免疫応答を生じさせることができる、ワクチン組成物。
【請求項９】
配列番号６のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、前記断片は、配列番号６のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号６のポリペプチドを認識する免疫応答を生じさせることができる、ワクチン組成物。
【請求項１０】
配列番号７のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、前記断片は、配列番号７のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号７のポリペプチドを認識する免疫応答を生じさせることができる、ワクチン組成物。
【請求項１１】
配列番号８のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、前記断片は、配列番号８のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号８のポリペプチドを認識する免疫応答を生じさせることができる、ワクチン組成物。
【請求項１２】
配列番号９のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、前記断片は、配列番号９のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号９のポリペプチドを認識する免疫応答を生じさせることができる、ワクチン組成物。
【請求項１３】
配列番号１０のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、前記断片は、配列番号１０のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号１０のポリペプチドを認識する免疫応答を生じさせることができる、ワクチン組成物。
【請求項１４】
配列番号１１のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、前記断片は、配列番号１１のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号１１のポリペプチドを認識する免疫応答を生じさせることができる、ワクチン組成物。
【請求項１５】
配列番号１２のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、前記断片は、配列番号１２のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号１２のポリペプチドを認識する免疫応答を生じさせることができる、ワクチン組成物。
【請求項１６】
配列番号１３のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、前記断片は、配列番号１３のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号１３のポリペプチドを認識する免疫応答を生じさせることができる、ワクチン組成物。
【請求項１７】
配列番号１４のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、前記断片は、配列番号１４のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号１４のポリペプチドを認識する免疫応答を生じさせることができる、ワクチン組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のタンパク質又は断片の少なくとも１つのダイマー、トリマー、又はマルチマーを含む、ワクチン組成物。
【請求項１９】
１又は複数の医薬的に許容されるアジュバント、ビヒクル、賦形剤、結合剤、担体、保存剤、緩衝剤、乳化剤、湿潤剤、又はトランスフェクション促進化合物をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
少なくとも１つの更なるワクチンを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
別の分子の免疫原性部分を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
前記別の分子の免疫原性部分が、インフルエンザ菌のタンパク質Ｄ又はＥ、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）のＭＩＤ、モラクセラ・カタラーリスのＵｓｐＡ１又はＵｓｐＡ２、及び任意の呼吸気管病原体の外膜タンパク質を含む群から選択される、請求項２１に記載のワクチン組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のタンパク質又は断片をコードする核酸配列、及びこれらの相同体、多形体、変性物、及びスプライス変異体を含む、ワクチン組成物。
【請求項２４】
少なくとも別の遺伝子と融合された、請求項２３に記載の核酸配列を含む、組み換え核酸配列を含む、ワクチン組成物。
【請求項２５】
請求項２３又は２４に記載の核酸配列を含むプラスミド又はファージを含む、ワクチン組成物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の少なくとも１つのプラスミドを含み、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のタンパク質又は断片を産生することができる非ヒト宿主であって、前記宿主が細菌、酵母及び植物の中から選択される宿主を含む、ワクチン組成物。
【請求項２７】
前記宿主が大腸菌である、請求項２６に記載のワクチン組成物。
【請求項２８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のタンパク質又は断片が、請求項２４に記載の組み換え核酸配列の使用により、少なくとも別のタンパク質と組み合わされる、融合タンパク質又はポリペプチドを含む、ワクチン組成物。
【請求項２９】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のタンパク質又は断片のダイマー、トリマー、又はマルチマーである、請求項２８に記載の融合タンパク質を含む、ワクチン組成物。
【請求項３０】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のタンパク質又は断片又はペプチドが、共有結合的に、あるいは任意の他の手段により、タンパク質、糖質、又はマトリックスと結合する、融合生成物を含む、ワクチン組成物。
【請求項３１】
配列番号１の全長にわたり、配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを含む、ワクチン組成物。
【請求項３２】
前記アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも９５％の同一性を有する、請求項３１に記載の単離されたポリペプチドを含む、ワクチン組成物。
【請求項３３】
配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載のワクチン組成物。
【請求項３４】
配列番号１の単離されたポリペプチドを含む、ワクチン組成物。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが、配列番号１のシグナルペプチド（アミノ酸１−２２）、又は当該シグナルペプチドの一部を欠失している、請求項３３又は３４に記載のワクチン組成物。
【請求項３６】
配列番号１のアミノ酸配列からの、又は請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のポリペプチドからの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む免疫原性断片を含む、ワクチン組成物であって、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号１のポリペプチド（又はそれぞれ請求項３３〜３５のポリペプチド）を認識する免疫応答を生じさせることができる、あるいはビトロネクチン及びラミニンと結合することができる、ワクチン組成物。
【請求項３７】
請求項３１〜３６のいずれか一項に記載のポリペプチド又は免疫原性断片を含むワクチン組成物であって、前記ポリペプチド又は免疫原性断片が、大きい融合タンパク質の一部である、ワクチン組成物。
【請求項３８】
請求項３１〜３７のいずれか一項に記載のポリペプチド又は免疫原性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む、ワクチン組成物。
【請求項３９】
配列番号１の全長にわたり、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド；又は前記単離されたポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド配列を含む、ワクチン組成物。
【請求項４０】
全コード領域にわたり、配列番号１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド；又は前記単離されたポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含む、ワクチン組成物。
【請求項４１】
配列番号１５の全長にわたり、配列番号１５と少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド；又は前記単離されたポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含む、ワクチン組成物。
【請求項４２】
前記単離されたポリヌクレオチドと配列番号１５との同一性が、少なくとも９５％である、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項４３】
配列番号１のポリペプチド、又は請求項３６又は３７に記載の免疫原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを含む、ワクチン組成物。
【請求項４４】
配列番号１５のポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチドを含む、ワクチン組成物。
【請求項４５】
配列番号１５の配列又はこの断片を有する標識されたプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、適切なライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる、配列番号１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを含む、ワクチン組成物を提供する。
【請求項４６】
請求項３８〜４５のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、発現ベクター又は生きた組み換え微生物を含む、ワクチン組成物。
【請求項４７】
請求項４６に記載の発現ベクターを含む生きた組み換え微生物を含む、ワクチン組成物。
【請求項４８】
請求項４７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞を含む、ワクチン組成物。
【請求項４９】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを発現する、請求項４８に記載の宿主の膜を含む、ワクチン組成物。
【請求項５０】
前記ポリペプチド又は前記免疫原性断片の産生のために十分な条件下で、請求項４８に記載の宿主細胞を培養し、そして培養培地からポリペプチドを回収することを含む、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載のワクチン組成物を製造する方法。
【請求項５１】
少なくとも１つの前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、そして任意の１つの前記ポリヌクレオチドの発現に十分な条件下で、前記宿主細胞を培養することを含む、請求項３８〜４５のいずれか一項に記載のワクチン組成物を製造する方法。
【請求項５２】
請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の有効量のポリペプチド又は免疫原性断片、及び医薬的に許容される賦形剤を含む、ワクチン組成物。
【請求項５３】
請求項３８〜４５のいずれか一項に記載の有効量のポリヌクレオチド、及び医薬的に許容される賦形剤を含む、ワクチン組成物。
【請求項５４】
前記組成物が、少なくとも１つの他のインフルエンザ菌抗原を含む、請求項５２又は５３に記載のワクチン組成物。
【請求項５５】
肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）からのニューモリシンと製剤化される、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項５６】
モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）からのＯｍｐ１０６と製剤化される、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項５７】
モラクセラ・カタラーリスからのＵｓｐＡ１及び／又はＵｓｐＡ２と製剤化される、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項５８】
モラクセラ・カタラーリスからのＨｌｙ３と製剤化される、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項５９】
モラクセラ・カタラーリスからのＯｍｐＣＤと製剤化される、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項６０】
モラクセラ・カタラーリスからのＤ１５と製剤化される、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項６１】
インフルエンザ菌からのＯｍｐ２６と製剤化される、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項６２】
インフルエンザ菌からのＰ６と製剤化される、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項６３】
インフルエンザ菌からのタンパク質Ｄと製剤化される、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項６４】
インフルエンザ菌からのＮｌｐＣ２と製剤化される、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項６５】
インフルエンザ菌からのＳｉｐ又はＰｉｌＡと製剤化される、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項６６】
感染の予防又は治療のための医薬の製造における、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のワクチンの使用。
【請求項６７】
前記感染が、インフルエンザ菌により引き起こされる、請求項６６に記載の使用。
【請求項６８】
前記インフルエンザ菌が、莢膜型又は無莢膜型である、請求項６７に記載の使用。
【請求項６９】
例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に罹患している小児及び大人において、中耳炎、副鼻腔炎又は下気道感染を予防又は治療するための、請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７０】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのタンパク質、断片、又はペプチド、及び１又は複数の医薬的に許容されるアジュバント、ビヒクル、賦形剤、結合剤、担体、保存剤、緩衝剤、乳化剤、湿潤剤、又はトランスフェクション促進化合物を含む、医薬。
【請求項７１】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のタンパク質、断片、又はペプチドの単離方法であって、
ａ）前記タンパク質、断片、又はペプチドをコードするＤＮＡを含むインフルエンザ菌又は大腸菌を増殖させ、細菌を回収し、そして外膜又は封入体を単離する工程；
ｂ）封入体を強力な可溶化剤で可溶化する工程；
ｃ）再生剤を添加する工程；及び
ｄ）得られる懸濁液をｐＨ８〜１０の緩衝液で透析する工程
を含む、前記方法。
【請求項７２】
前記可溶化剤が、グアニジン塩酸塩である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記再生剤が、アルギニンである、請求項７１又は７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記タンパク質、断片、又はペプチドが、賦形剤とともに製剤化される、請求項７１〜７３に記載の工程を含む、ワクチンを作製する方法。
【請求項７５】
請求項１〜４５及び５２〜６５のいずれか一項に記載の医薬的に有効量のワクチン組成物を投与することを含む、個体において感染を予防又は治療する方法。
【請求項７６】
前記感染が、インフルエンザ菌により引き起こされる、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記インフルエンザ菌が、莢膜型又は無莢膜型である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に罹患している小児及び大人において、中耳炎、副鼻腔炎又は下気道感染を予防又は治療するための、請求項７５〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術の分野
本発明は、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）において発見される病原性因子である、付着因子を有するラミニン及びビトロネクチン結合タンパク質（タンパク質Ｆ；ｐＦ）に関する。本発明はさらに、タンパク質Ｆを含んでなるワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
インフルエンザ菌ｂ型（Ｈｉｂ）及び無莢膜型インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）は、小児及び成人において様々な疾患を引き起す。Ｈｉｂは、４歳未満の小児において細菌性髄膜炎及び他の侵襲性感染症を引き起す一方で、ＮＴＨｉは、中耳炎、副鼻腔炎、喉頭蓋炎、気管気管支炎、及び肺炎の患者から単離されており、新生児敗血症の原因ともなり得る。ＮＴＨｉに対するワクチンは現在市販されていないが、Ｈｉｂに対して使用するいくつかのワクチンは存在する。これらのワクチンは、１８ヶ月未満の小児において、莢膜多糖に対する弱い免疫応答を克服するために、様々なタンパク質担体（髄膜炎菌外膜複合体、破傷風類毒素、無毒性変異ジフテリア毒素、ジフテリア類毒素）と結合させたＨｉｂ莢膜多糖であるポリリボシルリビトールリン酸からなる。Ｈｉｂ及びＮＴＨｉ感染後、インフルエンザ菌外膜タンパク質（ＯＭＰ）は宿主抗体の標的となることが示されているので、これらはポリリボシルリビトールリン酸の担体とも考えられる。ＯＭＰ  Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４、Ｐ５、及びＰ６、並びに９８ｋＤａのタンパク質に対する抗体は、同種及び異種の双方インフルエンザ菌株に対して生物活性を示すＰ１、Ｐ４、及びＰ６に対する抗体を用いたインフルエンザ菌感染に対するインビボ保護及びインビトロ殺菌アッセイにおいて、試験されている。他のＯＭＰに対する抗体からの異種保護の欠損は、様々なインフルエンザ菌株の中でもこれらのタンパク質が抗原的多様性を有することに一部は起因する。それ故、理想的な抗原は、細菌表面に露出し、且つ抗原的によく保存されているべきである。例えば、Ｈｉｂ及びＮＴＨｉ株の双方において、広く分布し、抗原的に保存されている４２ｋＤａ膜タンパク質（タンパク質Ｄ）は、単離され、クローンされ、配列決定されており、病原性因子且つ有効なワクチン候補であることが示されている（Janson et al., 1991 , Prymula et al., 2006）。
【０００３】
ＮＴＨｉ発病の最初の工程は、粘膜、基底膜、及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）への付着である。哺乳動物のＥＣＭを構成する二つの主な巨大分子のクラスは、構造的機能及び付着機能の双方を有する繊維タンパク質（例えば、ラミニン、コラーゲン、及びエラスチン）と、プロテオグリカンの形態においてタンパク質と結合するグリコサミノグリカンである［Heino et al., 2009］。ＥＣＭは、組織の物理的構造を安定化し、真核細胞付着、分化、移動、増殖、形状及び構造の制御に関与する。細菌のＥＣＭとの相互作用は、宿主組織の定着において重要な役割を果たし、ＥＣＭは、通常の状況下では病原体に暴露されない。しかしながら、機械的若しくは化学的損傷、又は毒素及び溶解酵素の活性を経た細菌／ウイルス感染による組織の損傷後、病原体はＥＣＭにアクセスすることができる。
【０００４】
ラミニンは、ヘテロトリマーであり、巨大な十字型形状の、α、β、及びγ鎖からなる約４００〜９００ｋＤａの糖タンパク質のファミリーである［Nguyen 2006］。異なるα、β、及びγ鎖が存在し、これらが結合して様々なラミニンアイソフォームとなる。上皮におけるラミニンの主要な役割は、細胞を基底膜に固定することである。いくつかの病原体、例えば結核菌（Mycobacterium tuberculosis）［Kinhikar et al., 2006］、及びモラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）［Tan et al., 2006］は、ラミニンと結合する。
【０００５】
ビトロネクチンは、ＥＣＭの別の重要な構成要素であり、肝臓で合成され、血漿中に分泌される［総説としてSingh et al., 2010bを参照のこと］。血中で循環するビトロネクチンの多くはモノマー（６５及び７５ｋＤａ）である一方で、血管外の細胞結合ビトロネクチンは、マルチマーである。ビトロネクチンは、血漿中に高濃度（２００〜７００μｇ／ｍｌ）で見い出され、様々なヒト組織中にも存在する。肝臓、扁桃腺、十二指腸、心臓、骨格筋、及び肺組織中に、特に高い量が観察される。
【０００６】
ビトロネクチンは、細胞移動、付着及び血管形成を含む多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす［Preissner et al., 1998］。ビトロネクチンのウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子−ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡ−ｕＰＡＲ）複合体とインテグリン受容体との相互作用は、古い組織分解（細胞周囲のタンパク質分解）、再組織化、及び創傷治癒に関与するプラスミノーゲン活性化系の一部である。それ故、ｕＰＡＲ−ビトロネクチン相互作用は、恒常性プロセスにおける重要な決定因子である［Smith et al., 2010］。
【０００７】
ＥＣＭの構成要素であることに加えて、ビトロネクチンは、先天性免疫応答の自己反応性を限定する補体活性化の最終経路の制御に関与する。膜傷害性複合体（ＭＡＣ）の形成は、二つの阻害因子である、膜タンパク質ＣＤ５９及びビトロネクチンの制御下にある。ビトロネクチンは、その膜結合部位においてＣ５ｂ−７複合体と結合し、それ故、細胞膜への複合体の挿入を阻害する。それ故、細胞溶解性のＭＡＣの形成は阻害され、細胞の溶解は防がれる［Preissner, 1991］。ビトロネクチンの存在下において、Ｃ５ｂ−７複合体はさらにＣ８及びＣ９と結合することができ、Ｃ５ｂ−８及びＣ５ｂ−９複合体を形成するが、後者は非溶解性である。さらに、ビトロネクチンは、Ｃ５ｂ−９と結合することにより、Ｃ９の孔形成重合を妨害する［Preissner et al., 1985］。上皮細胞への付着のための架け橋としてビトロネクチンを利用することに加えて、ＮＴＨｉを含むいくつかの病原体は、ヒト血清中での生存を増加させるために、ＭＡＣの阻害のための有効な補体制御因子としてビトロネクチンを利用する［Singh et al., 2010b］。中でも、いくつかの細菌外膜タンパク質、Ｍ．カタラーリス（M. catarrhalis）ユビキタス表面タンパク質（UspA2）［Singh et al., 2010］及びインフルエンザ菌タンパク質Ｅ［Hallstrom et al. 2009］は、ビトロネクチンと相互作用することが、近年示されている。
【０００８】
国際公開第２００７／０８４０５３号では、インフルエンザ菌において発見することができるタンパク質である、タンパク質Ｅと命名された表面露出タンパク質が記載される。タンパク質Ｅは、付着因子であり、ビトロネクチンとも結合する［Ronander 2009, Hallstrom 2009］。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
インフルエンザ菌が、上部及び下部気道における感染の主な原因であることが分かっているという事実を考慮すると、インフルエンザ菌に対して用いることができるワクチンの開発が、現在必要とされている。
【００１０】
本発明の目的は、それ故、インフルエンザ菌に対して有効な新しい種類のワクチンを提供することができるように、体内においてインフルエンザ菌が細胞と相互作用し、免疫系と相互作用する方法の更なる研究をすることである。
【００１１】
本発明の１つの態様によれば、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有する、インフルエンザ菌において検出することができる表面露出タンパク質又はこの断片を提供し、ここで前記断片は、配列番号１のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号１のポリペプチドを認識する免疫応答を生ずることができる。
【００１２】
別の態様によれば、本発明は、請求項１に記載の表面露出タンパク質の免疫原性断片を含むワクチン組成物であって、前記断片は、インフルエンザ菌において検出することができる、ワクチン組成物を提供する。
【００１３】
更なる態様によれば、本発明は、上述のタンパク質に基づく免疫原性タンパク質を含むワクチン組成物であって、配列番号１の１−１１又は１−２２位の１又は複数のアミノ酸が欠失している、あるいは１又は複数のアミノ酸で置換されている、ワクチン組成物を提供する。１つの実施形態では、配列番号１の１−１１又は１−２２位の１又は複数のアミノ酸は、０〜１１又は０〜２２個の任意のアミノ酸の配列により置換されている。
【００１４】
更なる態様によれば、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、ここで前記断片は、配列番号２のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号２のポリペプチドを認識する免疫応答を生ずることができる、ワクチン組成物を提供する。
【００１５】
なお更なる態様によれば、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、ここで前記断片は、配列番号３のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号３のポリペプチドを認識する免疫応答を生ずることができる、ワクチン組成物を提供する。
【００１６】
なお更なる態様によれば、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、ここで前記断片は、配列番号４のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号４のポリペプチドを認識する免疫応答を生ずることができる、ワクチン組成物を提供する。
【００１７】
更なる態様によれば、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、ここで前記断片は、配列番号５のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号５のポリペプチドを認識する免疫応答を生ずることができる、ワクチン組成物を提供する。
【００１８】
別の態様によれば、本発明は、配列番号６のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、ここで前記断片は、配列番号６のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号６のポリペプチドを認識する免疫応答を生ずることができる、ワクチン組成物を提供する。
【００１９】
なお更なる態様によれば、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、ここで前記断片は、配列番号７のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号７のポリペプチドを認識する免疫応答を生ずることができる、ワクチン組成物を提供する。
【００２０】
別の態様によれば、本発明は、配列番号８のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、ここで前記断片は、配列番号８のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号８のポリペプチドを認識する免疫応答を生ずることができる、ワクチン組成物を提供する。
【００２１】
なお更なる態様によれば、本発明は、配列番号９のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、ここで前記断片は、配列番号９のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号９のポリペプチドを認識する免疫応答を生ずることができる、ワクチン組成物を提供する。
【００２２】
更なる態様によれば、本発明は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、ここで前記断片は、配列番号１０のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号１０のポリペプチドを認識する免疫応答を生ずることができる、ワクチン組成物を提供する。
【００２３】
別の態様によれば、本発明は、配列番号１１のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、ここで前記断片は、配列番号１１のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号１１のポリペプチドを認識する免疫応答を生ずることができる、ワクチン組成物を提供する。
【００２４】
なお更なる態様によれば、本発明は、配列番号１２のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、ここで前記断片は、配列番号１２のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号１２のポリペプチドを認識する免疫応答を生ずることができる、ワクチン組成物を提供する。
【００２５】
更なる態様によれば、本発明は、配列番号１３のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、ここで前記断片は、配列番号１３のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号１３のポリペプチドを認識する免疫応答を生ずることができる、ワクチン組成物を提供する。
【００２６】
別の態様によれば、本発明は、配列番号１４のアミノ酸配列を有するペプチド又は断片を含むワクチン組成物であって、ここで前記断片は、配列番号１４のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号１４のポリペプチドを認識する免疫応答を生ずることができる、ワクチン組成物を提供する。
【００２７】
１つの態様によれば、本発明は、上記のタンパク質若しくは断片の少なくとも１つのダイマー、トリマー、又はマルチマーを含むワクチン組成物を提供する。
【００２８】
更なる態様によれば、本発明は、１又は複数の医薬的に許容されるアジュバント、ビヒクル、賦形剤、結合剤、担体、保存剤、緩衝剤、乳化剤、湿潤剤、又はトランスフェクション促進化合物をさらに含む、上記のワクチン組成物を提供する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの更なるワクチンを含む、上記のワクチン組成物を提供する。
【００３０】
更なる態様によれば、本発明は、別の分子の免疫原性部分を含む、上記のワクチン組成物を提供する。
【００３１】
更なる態様によれば、本発明は、別の分子の免疫原性部分が、インフルエンザ菌のタンパク質Ｄ、ｐｉｌＡ又はタンパク質Ｅ、モラクセラ・カタラーリスのＭＩＤ、モラクセラ・カタラーリスのＵｓｐＡ１又はＵｓｐＡ２、及びヒト又は動物において発見される任意の呼吸気管病原体の外膜タンパク質からなる群から選択される、上記のワクチン組成物を提供する。
【００３２】
更なる態様によれば、本発明は、上記のタンパク質又は断片をコードする核酸配列、及びこれらの相同体、多形体、変性物、及びスプライス変異体を含む、ワクチン組成物を提供する。
【００３３】
別の態様によれば、本発明は、少なくとも別の遺伝子と融合された、上記の核酸配列を含む、組み換え核酸配列を含む、ワクチン組成物を提供する。
【００３４】
更なる態様によれば、本発明は、上記の核酸配列を含む、プラスミド又はファージを含む、ワクチン組成物を提供する。
【００３５】
さらに別の態様では、本発明は、上記の少なくとも１つのプラスミドを含み、上記のタンパク質又は断片を産生することができる非ヒト宿主であって、前記宿主が細菌、酵母及び植物から選択される宿主を含む、ワクチン組成物を提供する。
【００３６】
更なる態様によれば、本発明は、大腸菌（E. coli）である、上記の宿主を含む、ワクチン組成物を提供する。
【００３７】
更なる態様によれば、本発明は、上記のタンパク質又は断片が、上記の組み換え核酸配列の使用により、少なくとも別のタンパク質と組み合わされる、融合タンパク質又はポリペプチドを含む、ワクチン組成物を提供する。
【００３８】
別の態様によれば、本発明は、上記のタンパク質又は断片のダイマー、トリマー、又はマルチマーである、上記の融合タンパク質を含む、ワクチン組成物を提供する。
【００３９】
１つ態様によれば、本発明は、上記のタンパク質又は断片又はペプチドが、共有結合的に、あるいは任意の他の手段により、タンパク質、糖質、又はマトリックスと結合する、融合生成物を含む、ワクチン組成物を提供する。
【００４０】
別の態様によれば、本発明は、配列番号１の全長にわたり、配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを含む、ワクチン組成物を提供する。
【００４１】
更なる態様によれば、本発明は、前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項３１に記載の単離されたポリペプチドを含む、ワクチン組成物を提供する。
【００４２】
更なる態様によれば、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、上記のワクチン組成物を提供する。
【００４３】
更なる態様によれば、本発明は、配列番号１の単離されたポリペプチドを含む、ワクチン組成物を提供する。
【００４４】
別の態様によれば、本発明は、前記ポリペプチドが配列番号１のシグナルペプチド（アミノ酸１−２２）を欠損している、上記のワクチン組成物を提供する。
【００４５】
１つの実施形態によれば、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列又は上記のポリペプチドからの少なくとも１５個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む免疫原性断片を含む、ワクチン組成物であって、前記断片は（必要であれば、担体と結合した場合）、配列番号１のポリペプチド（又はそれぞれ上記のポリペプチド）を認識する免疫応答を生じさせることができる、あるいはビトロネクチン及びラミニンと結合することができる、ワクチン組成物を提供する。
【００４６】
更なる態様によれば、本発明は、上記のポリペプチド又は免疫原性断片を含む、ワクチン組成物であって、前記ポリペプチド又は前記免疫原性断片が、大きい融合タンパク質の一部である、ワクチン組成物を提供する。
【００４７】
別の態様によれば、本発明は、上記のポリペプチド又は免疫原性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む、ワクチン組成物を提供する。
【００４８】
更なる態様によれば、本発明は、配列番号１の全長にわたり、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド；又は前記単離されたポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列を含む、ワクチン組成物を提供する。
【００４９】
別の態様によれば、本発明は、全コード領域にわたり、配列番号１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド；又は前記単離されたポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列を含む、ワクチン組成物を提供する。
【００５０】
更なる態様によれば、本発明は、配列番号１５の全長にわたり、配列番号１５と少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド；又は前記単離されたポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列を含む、ワクチン組成物を提供する。
【００５１】
別の態様によれば、本発明は、単離されたポリヌクレオチドと配列番号１５との同一性が、少なくとも９５％である、上記のワクチン組成物を提供する。
【００５２】
１つの実施形態によれば、本発明は、配列番号１のポリペプチド、又は上記の免疫原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを含む、ワクチン組成物を提供する。
【００５３】
更なる態様によれば、本発明は、配列番号１５のポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチドを含む、ワクチン組成物を提供する。
【００５４】
更なる態様によれば、本発明は、配列番号１５の配列又はこの断片を有する標識されたプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、適切なライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる、配列番号１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを含む、ワクチン組成物を提供する。
【００５５】
更なる態様では、本発明は、上記の単離されたポリヌクレオチドを含む、発現ベクター又は組み換えの生きた微生物を含む、ワクチン組成物を提供する。
【００５６】
なお更なる態様では、本発明は、上記の発現ベクターを含む組み換えの生きた微生物を含む、ワクチン組成物を提供する。
【００５７】
更なる態様によれば、本発明は、上記の発現ベクターを含む宿主細胞を含む、ワクチン組成物を提供する。
【００５８】
別の態様によれば、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを発現する、上記の宿主の膜を含む、ワクチン組成物を提供する。
【００５９】
更なる態様によれば、本発明は、前記ポリペプチド又は前記免疫原性断片の産生に十分な条件下で、上記の宿主を培養し、培養培地からポリペプチドを回収することを含む、上記のワクチン組成物を製造する方法を提供する。
【００６０】
１つの実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つの前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、任意の１つの前記ポリヌクレオチドの発現に十分な条件下で、前記宿主細胞を培養することを含む、上記のワクチン組成物を製造する方法を提供する。
【００６１】
別の実施形態では、本発明は、上記の有効量のポリペプチド又は免疫原性断片、及び医薬的に許容される賦形剤を含む、ワクチン組成物を提供する。
【００６２】
さらに別の実施形態では、本発明は、上記の有効量のポリヌクレオチド、及び医薬的に許容される賦形剤を含む、ワクチン組成物を提供する。
【００６３】
１つの態様によれば、本発明は、前記組成物が、少なくとも１つの他のインフルエンザ菌抗原を含む、上記のワクチン組成物を提供する。
【００６４】
更なる態様では、本発明は、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）からのニューモリシンと製剤化される、上記のワクチン組成物を提供する。
【００６５】
更なる態様によれば、本発明は、モラクセラ・カタラーリスからのＯｍｐ１０６と製剤化される、上記のワクチン組成物を提供する。
【００６６】
更なる態様によれば、本発明は、モラクセラ・カタラーリスからのＵｓｐＡ１及び／又はＵｓｐＡ２と製剤化される、上記のワクチン組成物を提供する。
【００６７】
１つの実施形態では、本発明は、モラクセラ・カタラーリスからのＨｌｙ３と製剤化される、上記のワクチン組成物を提供する。
【００６８】
別の実施形態では、本発明は、モラクセラ・カタラーリスからのＯｍｐＣＤと製剤化される、上記のワクチン組成物を提供する。
【００６９】
更なる態様では、本発明は、モラクセラ・カタラーリスからのＤ１５と製剤化される、上記のワクチン組成物を提供する。
【００７０】
別の態様では、本発明は、インフルエンザ菌からのＯｍｐ２６と製剤化される、上記のワクチン組成物を提供する。
【００７１】
別の態様では、本発明は、インフルエンザ菌からのＰ６と製剤化される、上記のワクチン組成物を提供する。
【００７２】
更なる態様では、本発明は、インフルエンザ菌からのタンパク質Ｄ又はＥと製剤化される、上記のワクチン組成物を提供する。
【００７３】
更なる態様では、本発明は、インフルエンザ菌からのＮｌｐＣ２と製剤化される、上記のワクチン組成物を提供する。
【００７４】
なお更なる態様では、本発明は、インフルエンザ菌からのＳｌｐ又はｐｉｌＡと製剤化される、上記のワクチン組成物を提供する。
【００７５】
１つの実施形態によれば、本発明は、感染の予防又は治療のための医薬の製造における、上記のワクチンの使用を提供する。
【００７６】
更なるの実施形態では、本発明は、前記感染が、インフルエンザ菌により引き起こされる、上記の使用を提供する。
【００７７】
更なる態様によれば、本発明は、前記インフルエンザ菌が、莢膜型又は無莢膜型である、上記の使用を提供する。
【００７８】
更なる態様によれば、本発明は、例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に罹患している小児及び成人において、中耳炎、副鼻腔炎又は下気道感染を予防又は治療するための、上記の使用を提供する。
【００７９】
別の態様によれば、本発明は、上記の少なくとも１つのタンパク質、断片、又はペプチド、及び１又は複数の医薬的に許容されるアジュバント、ビヒクル、賦形剤、結合剤、担体、保存剤、緩衝剤、乳化剤、湿潤剤、又はトランスフェクション促進化合物を含む、医薬を提供する。
【００８０】
さらに別の態様によれば、本発明は、上記のタンパク質、断片、又はペプチドの単離方法であって、
ａ）前記タンパク質、断片、又はペプチドをコードするＤＮＡを含むインフルエンザ菌又は大腸菌を培養し、細菌を回収し、そして外膜、外膜小嚢又は封入体を単離する工程；
ｂ）封入体を強力な可溶化剤で可溶化する工程；
ｃ）再生剤を添加する工程；及び
ｄ）得られる懸濁液をｐＨ８〜１０の緩衝液で透析する工程
を含む、方法を提供する。
【００８１】
更なる態様によれば、本発明は、前記可溶化剤が、グアニジン塩酸塩である、上記方法を提供する。
【００８２】
更なる態様によれば、本発明は、前記再生剤が、アルギニンである、上記方法を提供する。
【００８３】
別の態様によれば、本発明は、前記タンパク質、断片、又はペプチドが、賦形剤とともに製剤化される、上記のワクチンを作製する方法を提供する。
【００８４】
更なる態様によれば、本発明は、上記の医薬的に有効量のワクチン組成物を投与することを含む、個体において感染を予防又は治療する方法を提供する。
【００８５】
１つの実施形態では、前記感染が、莢膜型又は無莢膜型の双方のインフルエンザ菌により引き起こされ、さらに別の実施形態では、前記感染が、中耳炎、副鼻腔炎又は下気道感染からなる群から選択される。
【００８６】
１つの態様では、本発明は、上記のタンパク質、断片又はペプチドをコードする核酸配列、及びこれらの相同体、多形体、変性物、及びスプライス変異体に関する。１つの実施形態によれば、前記核酸配列は、少なくとも別の遺伝子に融合される。
【００８７】
別の態様では、本発明は、上記の核酸配列を含む、プラスミド又はファージに関する。
【００８８】
さらに別の実施形態では、本発明は、上記の少なくとも１つのプラスミドを含み、上記のタンパク質、断片又はペプチド及びこれらの相同体、多形体、変性物、及びスプライス変異体を産生することができる非ヒト宿主であって、前記宿主が細菌、酵母及び植物から選択される宿主に関する。１つの実施形態によれば、前記宿主は、大腸菌である。
【００８９】
さらに別の態様では、本発明は、上記のタンパク質、断片、又はペプチドが、上記の組み換え核酸配列の使用により、少なくとも別のタンパク質と組み合わされる、融合タンパク質又はポリペプチドを提供する。１つの実施形態では、前記融合タンパク質は、上記のタンパク質、断片、又はペプチドのダイマー、トリマー、又はマルチマーである。
【００９０】
１つの態様では、本発明は、上記のタンパク質又は断片又はペプチドが、共有結合的に、あるいは任意の他の手段により、タンパク質、糖質、又はマトリックスと結合する、融合生成物に関する。
【００９１】
本発明は、タンパク質Ｆ、特にタンパク質Ｆポリペプチド及びタンパク質Ｆポリヌクレオチド、これらの生産のための組み換え材料及び方法に関する。別の態様では、本発明は、中でも微生物病の予防及び治療を含む、かかるポリペプチド及びポリヌクレオチドを用いる方法に関する。更なる態様では、細菌感染に関連する疾患及びかかる感染に関連する障害を検出するための診断的アッセイ、例えばタンパク質Ｆポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現又は活性を検出するためのアッセイに関する。
【００９２】
開示される本発明の趣旨及び範囲内の様々な変更及び改変は、以下の記載及び本開示の他の部分を読むことにより、当業者に容易に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】２９ｋＤａのビトロネクチン結合インフルエンザ菌タンパク質は、ベート（bate）としてビトロネクチンを用いた１次元及び２次元ゲル電気泳動（２Ｄ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の双方において検出される。外膜小嚢（ＯＭＶ）を、ＣＯ2の非存在下（−）又は存在下（＋）で臨床分離ＮＴＨｉ３６５５から調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ナイロンフィルターにブロットした（左パネル）。ＣＯ2の存在下でインキュベートした培養物からのＯＭＶも、２Ｄ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（右パネル）。１次元及び２次元ゲルの双方について、二つの対応するゲルを並行に泳動した。１つのゲルを、ナイロンフィルターにブロットし（Ａ）、１つのゲルをクーマシーブルーで染色した（Ｂ）。ヒト血漿ビトロネクチンを添加し、続いて、フィルターをヤギ抗ビトロネクチンｐＡｂでプローブし、その後ＨＲＰ複合ロバ抗ヒツジｐＡｂを用いて検出した（Ａ：ｉ）。パネルＡ：ｉｉでは、二次抗体のバックグラウンド結合を排除するために、一次及び二次ｐＡｂのみ（ビトロネクチンなし）とインキュベートしたフィルターを示す。推定上のビトロネクチン結合タンパク質に対応するスポット（Ｂ）を、クーマシー染色したゲルから切り出し、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦにより配列決定した。ｐＦをパネルＡ：ｉ及びＢにおいて矢印で示す。
【００９４】
【図２】ＮＴＨｉ３６５５中のタンパク質Ｆ（配列番号１）のシグナルペプチドを含むＤＮＡ配列及び翻訳されるオープンリーディングフレーム。（Ａ）では、翻訳されるタンパク質配列とともにＤＮＡ配列を示し、（Ｂ）では、異なる予測される領域を示すｐＦの図を概説する。
【００９５】
【図３】タンパク質Ｆは、一連の様々なインフルエンザ菌株と大変に相同的である。ＧｅｎｅＢａｎｋにおいて見出されるＨＩ ０３６２に対応する様々なｐＦアミノ酸配列を、クラスター解析により比較した。
【００９６】
【図４】大腸菌において生産される組み換えｐＦ１２−２９３。インフルエンザ菌ＤＮＡは、鋳型として用い、Ｎ末端部分（アミノ酸ｐＦ１−１１）の予測されるグナルペプチドを除くｐＦのオープンリーディングフレームに対応する配列を、ＰＣＲにより増幅し、大腸菌の形質転換によりｐＥＴ２６にクローンし、続いて誘導、発現、及びＮｉ−レジンを用いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。（Ａ）では、クーマシー染色ゲルを示し、（Ｂ）では、ウサギ抗ｐＦ血清及びＨＲＰ複合ブタ抗ウサギｐＡｂを用いた、ｐＦとのウェスタンブロットを検出した。ＮＴＨｉ３６５５及びＭ．カタラーリスＢｃ５由来の外膜小嚢（ＯＭＶ）を、それぞれ陽性及び陰性対照としてインキュベートした。Ｍ．カタラーリスＯＭＶは、ウサギ抗血清の特異性を証明した。
【００９７】
【図５】タンパク質Ｆは、無莢膜型インフルエンザ菌の外膜において見出すことができる。（Ａ）臨床的ＮＴＨｉ単離物を用いたクーマシー染色したゲルを示す。（Ｂ）ｐＦの位置を示すウェスタンブロット。８つの異なる臨床的ＮＴＨｉ単離物からの外膜タンパク質（ＯＭＰ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、特異的なウサギ抗ｐＦ抗血清を用いてｐＦ発現を分析した。
【００９８】
【図６】ｐＦ欠損ＮＴＨｉ３６５５突然変異体は、表面にｐＦを発現しない。（Ａ）一次抗ｐＦウサギｐＡｂの非存在下におけるヤギ抗ウサギｐＡｂ−ＦＩＴＣを用いたバックグラウンド値を示すＮＴＨｉ３６５５野生型（ＷＴ）のフローサイトメトリープロファイル。（Ｂ）特異的な抗ｐＦｐＡｂにより判断されるＮＴＨｉ３６５５上でのタンパク質Ｆの発現。（Ｃ）抗ｐＦウサギｐＡｂの非存在下におけるＮＴＨｉ３６５５Δｐｆ突然変異体の蛍光。（Ｄ）ｐＦ欠損ＮＴＨｉ３６５５Δｐｆ突然変異体は、表面にｐＦを発現しなかった。ｃａｔ遺伝子を含むＮＴＨｉ３６５５Δｐｆ突然変異体は、材料及び方法に記載されるように操作した。得られる突然変異体及び野生型細菌を、培地中で一晩増殖させ、洗浄した。その後、示されるように一次及び検出ｐＡｂを添加し、その後氷上でインキュベートし、洗浄し、最終的にフローサイトメーターで分析した。抗ｐＦ抗血清をウサギ中で産生させた。組み換えｐＦ１２−２９３及びアジュバントで３回免疫付与後、得られるウサギ抗血清をｐＦ１２−２９３に対して免疫精製した。同様の結果有する３つのうちの１つの典型的な実験を示す。
【００９９】
【図７】組み換えｐＦ（アミノ酸１２−２９３）は、ビトロネクチンと結合し、ｐＦ発現ＮＴＨｉ３６５５は、ｐＦ欠損突然変異体ＮＴＨｉ３６５５Δｐｆと比べて著しく多くのビトロネクチンと結合する。（Ａ）ｐＦ１２−２９３に対するビトロネクチン結合は、近年公開された付着因子である組み換えインフルエンザ菌タンパク質Ｅ［Ronander et al., 2009］と比べて、僅かに優れた。（Ｂ）ｐＦを欠損したインフルエンザ菌突然変異体は、野生型細菌と比べて、ビトロネクチンに対する著しく減少した結合を有する。（Ａ）では、組み換えタンパク質を、マイクロタイタープレート中にコートし、ヒトビトロネクチン及びウサギ抗ビトロネクチンｐＡｂを用いてビトロネクチン結合について分析した。高ビトロネクチン結合Ｍ．カタラーリスタンパク質であるＵｓｐＡ２  ３０−５３９［Singh et al., 2010a］を、陽性対照としてインキュベートした。ＭＩＤ９６２−１２００は、Ｍ．カタラーリス株「Ｂｃ５」由来の組み換え発現タンパク質である陰性対照を示す。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、別の陰性対照である。（Ｂ）では、ＮＴＨｉ３６５５及びｐＦ突然変異体ＮＴＨｉ３６５５Δｐｆを［125Ｉ］−標識ビトロネクチンとインキュベートした。３０分後、細菌を洗浄し、γ−シンチレーションカウンターにおいて、測定に供した。データは、パネルＡ及びＢにおける各々独立した３回の実験を表す。
【０１００】
【図８】タンパク質Ｆ１２−２９３は、ＥＣＭタンパク質であるラミニンと結合する。組み換えｐＦ又はｐＥを、マイクロタイタープレートのプラスチック表面に結合させた。マウス肉腫ラミニンを添加し、その後ウサギ抗ラミニンｐＡｂ及び第二層としてＨＲＰ複合ヤギ抗ウサギｐＡｂを用いて検出した。ＢＳＡを陰性対照として含んだ。３回の独立した実験の平均値を示す。
【０１０１】
【図９】組み換えｐＦ１２−２９３は、上皮細胞と結合する。ＩＩ型肺胞上皮細胞株Ａ５４９を２４ウェルプレート中でコンフルエントになるまで増殖させ、洗浄し、ホルムアルデヒドで固定化した。その後、増加する濃度において組み換えｐＦ１２−２９３を細胞とインキュベートし、その後、広範な洗浄工程を行なった。タンパク質Ｆを抗ｐＦウサギ抗血清及び第二層としてＨＲＰ複合ヤギ抗ウサギｐＡｂを用いて検出した。３回の独立した実験のうち典型的な実験を示す。
【０１０２】
【図１０】ｐＦ欠損ＮＴＨｉ突然変異体は、ｐＦ発現野生型と比べた場合、上皮細胞への著しく減少した結合能力を有する。Ａ５４９上皮細胞を２４ウェルプレート中でコンフルエントになるまで増殖させた。細菌を［3Ｈ］−チミジンの存在下で３時間培養した。ＮＴＨｉ３６５５野生型（ＷＴ）又はｐＦ欠損突然変異体（Δｐｆ）を細胞に添加し、その後２時間インキュベートした。その後、細胞を３回洗浄し、トリプシン処理し、β−シンチレーションカウンターで測定した。異なる感染多重度（ＭＯＩ）を用いた。対データについてスチューデントのｔ検体によりｐ値を得た。３回の独立した実験についての平均値±ＳＤを示す。
【０１０３】
【図１１】図１２で実証されるｐＦの上皮細胞結合領域のマッピングに用いたペプチドのレイアウト。
【０１０４】
【図１２】大部分のｐＦアミノ酸残基２３−４８は、上皮細胞と結合する。（Ａ）Ｈ２９２及び（Ｂ）Ａ５４９上皮細胞株について結果を示す。細胞をＴ２５フラスコ中でコンフルエントになるまで増殖させ、トリプシン−ＥＤＴＡにより分離させ、その後洗浄した。その後、直接結合アッセイ（ＤＢＡ）を行った。［125Ｉ］−標識ペプチドをモル比で添加し、＋４℃で３０分間細胞とインキュベートした。放射活性をγ−シンチレーションカウンターで測定した。
【０１０５】
【図１３】抗ｐＦ４４−６８ｐＡｂは、フローサイトメトリーにより分析される場合、ＮＴＨｉ３６５５の表面のｐＦを認識する。ｐＦ発現ＮＴＨｉ３６５５野生型（Ａ及びＢ）をｐＦ欠損ＮＴＨｉ３６５５Δｐｆ突然変異体（Ｃ及びＤ）と比べた。（Ａ）及び（Ｃ）は、特異的な抗ｐＦ４４−６８ｐＡｂの非存在下でバックグラウンド値を示す。ｐＦ４４−６８を認識する抗体を、ＣｎＢｒ−セファロースカラムに結合したペプチドｐＦ４４−６８を用いて、抗ｐＦ１２−２９３抗血清から免疫精製した。ｐＦ４４−６８は、バイオインフォマティックスにより明らかにされた予測される免疫原性領域である（示されない）。示されるように一次及び検出ｐＡｂを添加後、氷上でインキュベーションし、洗浄し、そして最終的にフローサイトメーターで分析した。
【発明を実施するための形態】
【０１０６】
発明の詳細な説明
本発明を詳細に説明する前に、本願において、本発明は、本明細書に記載される実施形態及び工程の詳細に限定するものではないことが理解されることは重要である。言及される実施例は、本発明の説明であり、決して本発明を限定しない。本発明は、他の実施形態を可能にし、様々な方法において実施又は実行される。本明細書において用いられる表現及び用語は、説明のためのものであり、限定することを目的としないことは理解される。
【０１０７】
本願は、タンパク質Ｆ（ｐＦ）と名付けられた新しいインフルエンザ菌外膜タンパク質のクローニング及び発現を記載する。前記タンパク質は、ベート（bate）としてヒトビトロネクチンを用いて発見された。
【０１０８】
組み換えｐＦの収率を最大化するために、アミノ酸残基Ａ１２−Ｋ２９３からなる切断されたｐＦ断片を作製した。従って、アミノ酸ｐＦ１−１１を含む、Ｎ末端部分の予測されるシグナルペプチドを除去し、ベクターｐＥＴ２６（＋）由来の９つの残基に加えて、リーダーペプチドで置き換えた。切断されたｐＦをｐＦ１２−２９３と名付けた。
【０１０９】
本発明は、ヘモフィラス属（Haemophilus）外膜タンパク質ｐＦ及びｐＦ由来ペプチドｐＦ２３−４８（配列番号２）、ｐＦ４４−６８（配列番号３）、ｐＦ６４−８８（配列番号４）、ｐＦ８４−１０８（配列番号５）、ｐＦ１０４−１２８（配列番号６）、ｐＦ１２４−１４８（配列番号７）、ｐＦ１４４−１６８（配列番号８）、ｐＦ１６４−１８８（配列番号９）、ｐＦ１８４−２０９（配列番号１０）、ｐＦ２０４−２３０（配列番号１１）、ｐＦ２２５−２５５（配列番号１２）、ｐＦ２５０−２７５（配列番号１３）、ｐＦ２７０−２９３（配列番号１４）、及びこれらのダイマー、トリマー、又はオリゴマーを含む。特に、ｐＦの配列又は表面に露出している派生ペプチドは、高い優先順位が与えられる。
【０１１０】
従って、本発明のワクチン組成物は、免疫原性成分として、配列番号１のアミノ酸配列を有する全てのインフルエンザ菌において検出することができる表面露出タンパク質、及び／又は配列番号２〜１４のアミノ酸配列を有するペプチド、又はこれらの断片、相同体、機能的同等物、誘導体、変性物、又はヒドロキシル化、スルホン化、若しくはグリコシル化生成物、又は他の二次加工生成物を含む。前記ワクチン組成物はまた、免疫原性成分として本発明の融合タンパク質又はポリペプチド又は融合生成物を含んでもよい。前記免疫原性成分は、インフルエンザ菌に対する抗体又は他の免疫応答を誘導することができ、前記誘導された抗体は、対象の細胞へのインフルエンザ菌細菌の発病を阻害する。本発明のワクチン組成物の「免疫原性用量」は、投与前の標準的な免疫応答と比べて、投与後に検出可能な体液性及び／又は細胞性免疫応答を生じるものである。
【０１１１】
本発明のワクチン組成物に用いられる抗原を生成する核酸配列は、様々な手順により任意の幅広い様々な発現ベクターに挿入されてもよい。かかる手順は、当業者に知られている。
【０１１２】
ワクチン組成物は、既知の方法及び技術を用いて容易に作製され、様々な方法、好ましくは非経口的に又は鼻腔内に投与することができる。非経口的に又は鼻腔内投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及びかかる患者の体液と等張の製剤を作製する溶質を含んでもよい水性及び非水性滅菌注射溶液、並びに懸濁剤又は増粘剤を含んでもよい水性及び非水性滅菌懸濁液が挙げられる。活性免疫原性成分は、医薬的に許容される、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等の賦形剤としばしばと混合される。加えて、ワクチン組成物はまた、微量の補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、結合剤、担体、又は保存剤を含んでもよい。
【０１１３】
ワクチン組成物は、組成物の免疫原性を増進するために、アジュバント例えばフトイントのアジュバント、及び当業技術分野に知られている他の系を含んでもよい。
【０１１４】
ワクチン組成物の免疫原性成分、即ち本発明のタンパク質、断片、ペプチド、融合タンパク質若しくはポリペプチド、又は融合生成物は、中性の、又は塩形態としてワクチンに製剤化されてもよい。
【０１１５】
ワクチン組成物の用量は、ワクチンの特異的な活性に依存し、日常的な実験により容易に決定することができる。ワクチン組成物は、治療的に有効な量かつ免疫原性な量で投与され、前記量は患者に依存する。
【０１１６】
本発明は、以下により詳細に記載されるように、タンパク質Ｆポリペプチド及びポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は、インフルエンザ菌のタンパク質のポリペプチド及びポリヌクレオチドに関する。タンパク質Ｆポリペプチドは、シグナル配列を有し、細菌の表面に露出する。シグナルペプチドは、タンパク質Ｆポリペプチドの残基１−残基２２に位置する。
【０１１７】
本明細書で言及される「タンパク質Ｆ」とは、本明細書で議論される本発明のペプチド、免疫原性断片、融合物、ポリペプチド又はタンパク質のいずれかを意味する（例えば、シグナル配列を含む若しくは含まない、あるいはシグナルペプチドの１−１１位のアミノ酸（予測されるシグナルペプチドのＮ末端部分）又１−２２が欠失している、あるいは１又は複数のアミノ酸で置換される、配列番号１）。
【０１１８】
「タンパク質Ｆをコードするポリヌクレオチド」とは、任意の本明細書で議論される本発明のペプチド、免疫原性断片、融合物、ポリペプチド又はタンパク質のいずれかをコードする任意のポリヌクレオチドを意味する。
【０１１９】
本明細書では、用語「含む（comprising）」を、用語「からなる（consisting of）」と代替的に置換してもよい。
【０１２０】
当業者は、かかる配列が一般的にリボポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを有用に用いることができること認識するので、「ＤＮＡ」として下記の配列表に記載される配列は、本発明の１つの実施形態の例示であることを理解する。
【０１２１】
タンパク質Ｆの配列は、配列番号１（ＮＴＨｉ株３６５５由来）に示される。ｐＦの上皮細胞結合領域のマッピングに用いられるペプチドをコードするタンパク質Ｆの配列は、配列番号２〜１４（ＮＴＨｉ株３６５５由来）に示される。タンパク質Ｆポリヌクレオチドの配列は、配列番号１５に示される。
【０１２２】
ポリペプチド
本発明の１つの態様では、本明細書において、「タンパク質Ｆ」及び「タンパク質Ｆポリペプチド」と呼ばれるインフルエンザ菌（特に、無莢膜型インフルエンザ菌）のポリペプチド並びにこれらの生物学的に、診断的に、予防的に、臨床的に、又は治療的に有用な変異体、並びにこれらを含む組成物を提供する。
【０１２３】
本発明は、さらに、
（ａ）配列番号１〜１４の任意の配列と、少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、もっとも好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性又は厳密な同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、
（ｂ）配列番号１５の選択された配列の全長にわたり、配列番号１５の任意の配列と、少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、もっとも好ましくは少なくとも９７〜９９％の又は厳密な同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、又は
（ｃ）配列番号１〜１４の任意のアミノ酸配列と、少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、一層好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性若しくは厳密な同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
を提供する。
【０１２４】
配列番号１〜１４に提供されるタンパク質Ｆポリペプチドは、無莢膜型インフルエンザ菌株由来のタンパク質Ｆポリペプチドである。更なるタンパク質Ｆ配列は、図３に挙げられるインフルエンザ菌株から確認されている。
【０１２５】
本発明は、タンパク質Ｆポリペプチドの免疫原性断片、即ち、配列番号１〜１４から選択される対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドと同じ又は実質的に同じ免疫原性活性を有するタンパク質Ｆポリペプチドの隣接する部分も提供する。換言すると、前記断片（必要であれば、担体と結合した場合）は、タンパク質Ｆポリペプチドを認識する免疫応答を生じさせることができる。かかる免疫原性断片としては、例えば、Ｎ−末端リーダー配列を欠失したタンパク質Ｆポリペプチド、若しくはこれらの部分、及び／又は膜貫通ドメイン及び／又はＣ末端アンカードメインが挙げられる。好ましい態様では、本発明のタンパク質Ｆの免疫原性断片は、前記配列の全長にわたり、配列番号１〜１４から選択される配列と、少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、もっとも好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するポリペプチドの実質的に全ての細胞外ドメインを含む。
【０１２６】
断片は、本発明の任意のポリペプチドの任意のアミノ酸配列の全てではないが一部と完全に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。タンパク質Ｆポリペプチドと同様に、断片は、「独立（free-standing）」していてもよく、あるいはこれらが一部又は領域、最も好ましくは単一の大きいポリペプチド中の単一の連続する領域を形成する、大きいポリペプチド中に含まれてもよい。断片は、それ故、全長の天然の配列より短くてもよく、あるいは、大きいポリペプチド中に含まれる場合、全長の天然の配列又はより大きい融合タンパク質でもよい。
【０１２７】
好ましい断片としては、例えば、配列番号１〜１４から選択されるアミノ酸配列の一部を有する切断されたポリペプチド又はこれらの変異体、例えばアミノ末端及び／又はカルボキシル末端のアミノ酸配列を含む連続する一連の残基が挙げられる。宿主細胞において、又は宿主細胞により産生される本発明のポリペプチドの分解形態も好ましい。構造的又は機能的性質により特徴づけられる断片、例えばα−へリックス及びα−へリックス形成領域、β−シート及びβ−シート形成領域、ターン及びターン形成領域、コイル及びコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、両親媒性β領域、フレキシブル領域、表面形成領域、基質結合領域、及び高抗原指数領域を含む断片はさらに好ましい。
【０１２８】
更に好ましい断片としては、配列番号１〜１４から選択されるアミノ酸配列からの少なくとも１５、２０、３０、４０、５０又は１００個の隣接するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、又は配列番号１〜１４から選択されるアミノ酸配列からの少なくとも１５、２０、３０、４０、５０又は１００個の隣接する切断された又は欠失したアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが挙げられる。
【０１２９】
なおさらに好ましい断片は、Ｂ細胞エピトープ、例えば図１１に記載されるこれらの断片／ペプチドを含むものである。
【０１３０】
本発明の全長タンパク質Ｆの断片は、ペプチド合成により、対応する全長ポリペプチドを生産するために用いられてもよく；それ故、これらの断片を、全長タンパク質Ｆ、又は本発明のタンパク質Ｆ配列に基づく他のポリペプチドを生産するための中間体として用いられてもよい。
【０１３１】
数個の、５〜１０、１〜５、１〜３、１〜２又は１個のアミノ酸が任意の組み合わせで置換された、欠失した又は付加された変異体は、特に好ましい。
【０１３２】
本発明のポリペプチド又は免疫原性断片は、「成熟」タンパク質の形態でもよく、あるいは大きいタンパク質、例えば前駆体又は融合タンパク質の一部でもよい。分泌配列若しくはリーダー配列、プロ配列、精製を助ける配列、例えば複数のヒスチジン残基を含む追加のアミノ酸配列、又は組み換え生産の間の安定化のための追加の配列が含まれることは、しばしば有利である。さらに、最終分子の免疫原性能力を増加させるための外因性のポリペプチド又は脂質尾部又はポリヌクレオチド配列の付加も考慮される。
【０１３３】
１つの態様では、本発明は、本発明のポリペプチド又はこれらの断片、及び免疫グロブリンの様々なサブクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の重鎖又は軽鎖の定常領域の様々な部分を含む遺伝子改変した可溶性の融合タンパク質に関する。
【０１３４】
融合物がヒンジ領域で生じる、ヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ１の重鎖の定常部分は、免疫グロブリンとして好ましい。特定の実施形態では、血液凝固因子Ｘａで切断され得る切断配列を組み込むことにより、Ｆｃ部分を、簡単に除去することができる。
【０１３５】
さらに、本発明は、遺伝子操作によるこれらの融合タンパク質の調製のための方法、及び薬物スクリーニング、診断及び治療のためのこれらの使用に関する。本発明の更なる態様は、かかる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにも関する。融合タンパク質技術の例としては、国際公開第９４／２９４５８号、及び国際公開第９４／２２９１４号に見出すことができる。
【０１３６】
タンパク質は、化学的に結合されてもよく、あるいは非融合タンパク質と比べて増加したレベルで発現系において生産される組み換え融合タンパク質として発現されてもよい。融合パートナーは、ヘルパーエピトープ（免疫融合パートナー）、好ましくはヒトにより認識されるＴヘルパーエピトープの提供に役立ち、あるいは野生型の組み換えタンパク質よりも高い収率におけるタンパク質の発現に役立つ（発現エンハンサー）。好ましくは、前記融合パートナーは、免疫融合パートナー及び発現増進パートナーの両者である。
【０１３７】
融合パートナーとしては、インフルエンザ菌由来のタンパク質Ｄ（欧州特許第５９４６１０号）、インフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅ（欧州特許第１９７３９３３号）及び／又はインフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質ＮＳ１（ヘマグルチニン）が挙げられる。別の融合パートナーは、Ｏｍｐ２６として知られるタンパク質である（国際公開第９７／０１６３８号）。別の融合パートナーは、ＬｙｔＡとして知られるタンパク質である。好ましくは、分子のＣ末端部分が用いられる。ＬｙｔＡは、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼであるアミダーゼＬｙｔＡ、（ｌｙｔＡ遺伝子｛Gene, 43 (1986) page 265-272｝によりコードされる）ペプチドグリカン骨格において特定の結合を特異的に分解するオートリシンを合成する肺炎連鎖球菌由来である。ＬｙｔＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリン又はいくつかのコリンアナログ、例えばＤＥＡＥに対するアフィニティーに関与する。この特性は、融合タンパク質の発現に有用である大腸菌Ｃ−ＬｙｔＡ発現プラスミドの開発に用いられている。そのアミノ末端においてＣ−ＬｙｔＡ断片を含むハイブリッドタンパク質の精製は、｛Biotechnology: 10, (1992) page 795-798｝に記載される。残基１７８において開始するＣ末端、例えば残基１８８〜３０５に見出されるＬｙｔＡ分子の繰り返し部分を使用することが可能である。
【０１３８】
本発明は、前述のタンパク質Ｆの変異体及びペプチド、即ち同様の特徴を有する別のものにより置換される、保存的アミノ酸置換による指示物（referents）から変更するペプチドも含む。典型的なかかる置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びｌｉｅ間；Ｓｅｒ及びＴｈｒ間；酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕ間；Ａｓｎ及びＧｉｎ間；及び塩基性残基Ｌｙｓ及びＡｒｇ間；又は芳香族残基Ｐｈｅ及びＴｙｒ間である。
【０１３９】
本発明のポリペプチドは、任意の好適な方法で調製することができる。かかるポリペプチドとしては、単離された天然のポリペプチド、組み換え的に生産されるポリペプチド、合成的に生産されるポリペプチド、又はこれらの方法の組み合わせにより生産されるポリペプチドが挙げられる。かかるポリペプチドを調製する手段は、当該技術分野においてよく知られている。
【０１４０】
本発明のポリペプチドは無莢膜型インフルエンザ菌由来であることが最も好ましいが、しかしながら、分類学上同一の属の他の生物から得られてもよい。本発明のポリペプチドは、例えば、分類学上同一のファミリー又は目の生物から得られてもよい。
【０１４１】
ポリヌクレオチド
本発明の目的は、タンパク質Ｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、特に本明細書でタンパク質Ｆと称されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することである。
【０１４２】
本発明の特に好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、全長遺伝子を含む配列番号１５に記載される配列を含むタンパク質Ｆポリペプチドをコードする領域、又はこれらの変異体を含む。
【０１４３】
配列番号１５に提供されるタンパク質Ｆポリヌクレオチドは、無莢膜型インフルエンザ菌株３６５５からのタンパク質Ｆポリヌクレオチドである。図３に記載されるインフルエンザ菌株からのタンパク質Ｆをコードする遺伝子の他の配列は、決定されている。
【０１４４】
本発明の更なる態様としては、タンパク質Ｆポリペプチド及びポリヌクレオチド、特に無莢膜型インフルエンザ菌タンパク質Fポリペプチド及びポリヌクレオチドをコード及び／又は発現する単離された核酸分子、例えば、未加工のＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、Ｂ−ＤＮＡ及びＺ−ＤＮＡ等を提供する。本発明の更なる実施形態は、生物学的に、予防的に、診断的に、臨床的に、又は治療的に有用なポリヌクレオチド及びポリペプチド、並びにこれらの変異体、並びにこれらを含む組成物を含む。
【０１４５】
本発明の別の態様は、配列番号１〜１４の推定されるアミノ酸配列を有するタンパク質Ｆポリペプチドをコードする少なくとも１つの全長遺伝子を含む単離されたポリヌクレオチド、及びこれらに密接に関連するポリヌクレオチド、及びこれらの変異体に関する。
【０１４６】
本発明の別の好ましい実施形態では、配列番号１〜１４から選択されるアミノ酸配列を含む、あるいはからなる無莢膜型インフルエンザ菌由来のタンパク質Ｆポリペプチド、又はこれらの変異体に関する。
【０１４７】
本明細書で提供される情報、例えば配列番号１５に記載されポリヌクレオチド配列、を用いて、タンパク質Ｆポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドを標準的なクローニング及びスクリーニング方法、例えば、出発物質として無莢膜型インフルエンザ菌株３２２４Ａ（又は３６５５）細胞を用いた細菌からの染色体ＤＮＡ断片をクローニング及び配列決定し、その後全長クローンを得る方法を用いて得てもよい。
【０１４８】
さらに、配列番号１５に記載される各ＤＮＡ配列は、当業者によく知られているアミノ酸残基分子量値を用いて計算することができる推測される分子量を用いて、配列番号１に記載されるアミノ酸残基のおおよその数を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。
【０１４９】
開始コドン及び終始コドンの間の配列番号１５のポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号１のポリペプチドをコードする。
【０１５０】
更なる態様では、本発明は、
（ａ）配列番号１５からのポリヌクレオチド配列の全長にわたり、配列番号１５からの任意のポリヌクレオチド配列と、少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、もっとも好ましくは少なくとも９７〜９９％の又は厳密な同一性を有するポリヌクレオチド配列；又は
（ｂ）配列番号１〜１４（又はこれらの断片）からのアミノ酸配列の全長にわたり、配列番号１〜１４（又はこれらの断片）から選択される任意のアミノ酸配列と、少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、もっとも好ましくは少なくとも９７〜９９％又は１００％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
を含む、又はからなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０１５１】
無莢膜型インフルエンザ菌以外の種からのホモログ及びオーソログを含む本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、配列番号１５から選択される任意の配列又はこれらの断片からなる又は配列を含む標識された又は検出可能なプローブを用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（例えば、４５〜６５℃の温度範囲、及び０．１〜１％のＳＤＳ濃度を用いて）、適切なライブラリーをスクリーニングし、そして前記ポリヌクレオチド配列を含む全長遺伝子及び／又はゲノムクローンを単離する工程を含む方法により得てもよい。
【０１５２】
本発明は、配列番号１５に記載されるコーディング配列（オープンリーディングフレーム）とその全長にわたり同一のポリヌクレオチド配列を提供する。
【０１５３】
成熟ポリペプチド又は断片についてのコーディング配列、及びそれ自体で、別のコーディング配列、例えばリーダーをコードする配列、分泌配列、プレタンパク質配列、プロタンパク質配列、又はプレプロタンパク質配列を含むリーディングフレーム中の成熟ポリペプチド又は断片についてのコーディング配列も、本発明により提供される。本発明のポリヌクレオチドはまた、例えば、限定することなく、少なくとも１つの非コーディング５’及び３’配列、例えば転写されるが翻訳されない配列、停止シグナル（例えばｒｈｏ依存的及びｒｈｏ非依存的停止シグナル）、リボソーム結像部位、Ｋｏｚａｋ配列、ｍＲＮＡ安定化する配列、イントロン、及びポリアでニル化シグナルを含む、少なくとも１つの非コーディング配列を含んでもよい。該ポリヌクレオチド配列は、更なるアミノ酸をコードする更なるコーディング配列を含んでもよい。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするためのマーカー配列がコードされてもよい。本発明の特定の実施形態では、ｐＱＥベクター（Qiagen, Inc.）において提供され、マーカー配列は、Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86: 821 - 824 (1989) に記載されるヘキサヒスチジンペプチド、又はＨＡペプチドタグ（Wilson et al., Cell 37: 767 (1984) であり、これらの双方は、これらと融合したポリペプチド配列を精製に有用である。本発明のポリヌクレオチドはまた、限定することなく、構造遺伝子、及び遺伝子発現を制御するためのその天然に関連する配列を含むポリヌクレオチドを含む。
【０１５４】
配列番号１〜１４のタンパク質Ｆポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５の配列をコードする対応する（又は配列番号１５中に含まれる）ポリヌクレオチドと同一でもよい。
【０１５５】
あるいは、これは遺伝子コードの余剰（縮重）の結果として、配列番号１〜１４のポリペプチドもコードする任意の配列でもよい。
【０１５６】
本明細書で用いられる、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、本発明のポリペプチド、具体的には細菌のポリペプチド、及びより具体的には配列番号１〜１４の任意に配列に記載されるアミノ酸配列を有する無莢膜型インフルエンザ菌タンパク質のポリペプチド、又はこれらの断片をコードする配列を含むリヌクレオチドを含む。該用語はまた、コーディング及び／又は非コーディング配列を含んでもよい、更なる領域とともに、ポリペプチドをコードする単一の連続する領域、又は不連続の領域を含むポリヌクレオチド（例えば、統合されたファージ、統合された挿入配列、統合されたベクター配列、統合されたトランスポゾン配列により、又はＲＮＡ編集若しくはゲノムＤＮＡ再編成に起因して分断されたポリヌクレオチド）を含む。
【０１５７】
本発明はさらに、配列番号１〜１４の任意の配列の推測されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体をコードする本明細書に記載されるポリヌクレオチドの変異体に関する。本発明のポリヌクレオチドの断片は、例えば、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成するために用いられてもよい。
【０１５８】
Ｂ細胞エピトープをコードするこれらのポリヌクレオチド、例えば図１１に記載される断片／ペプチド、及び組み換え体、前記ポリヌクレオチド断片を含むキメラ遺伝子は、好ましい断片である。
【０１５９】
さらに特に好ましい実施形態は、任意の組み合わせで、いくつかの、数個の、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１又は０個のアミノ酸残基が置換、修飾、欠失、及び／又は付加される、配列番号１〜１４からの任意の配列のタンパク質Ｆポリペプチドのアミノ酸配列を有するタンパク質Ｆ変異体をコードするポリヌクレオチドである。タンパク質Ｆポリペプチドの特性及び活性（例えば、本明細書の実施例の欄に記載されるこれらの特性）を改変しない、サイレントな置換、付加及び欠失は、これらの中でも特に好ましい。
【０１６０】
本発明の更に好ましい実施形態は、配列番号１〜１４の任意の配列に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのこれらの全長にわたり少なくとも８５％の同一性を有するポリヌクレオチド、及びかかるポリヌクレオチドと相補的であるポリヌクレオチドである。あるいは、タンパク質Ｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、その全長にわたり少なくとも９０％の同一である領域を含むポリヌクレオチド、及びこれらと相補的であるポリヌクレオチドは、最も好ましい。これに関して、これらと、これらの延長にわたり少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチドは、特に好ましい。さらに、少なくとも９７％の同一性を有するものは、少なくとも９５％の同一性を有するものよりもより好ましく、少なくとも９９％の同一性を有するものは、少なくとも９８％及び少なくとも９９％の同一性を有するものよりもより好ましい。
【０１６１】
好ましい実施形態は、配列番号１５から選択されるＤＮＡ配列によりコードされる成熟ポリペプチド成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能又は活性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【０１６２】
本発明の特定の好ましい実施例によれば、特に、ストリンジェントな条件下でタンパク質Ｆポリヌクレオチド配列、例えば配列番号１５のポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。
【０１６３】
本発明は、さらに、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。これに関して、本発明は、特に、ストリンジェントな条件下で、本明細書に記載されるポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で用いられるように、用語「ストリンジェントな条件」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、配列間で少なくとも９５％及び好ましくは少なくとも９７％同一性の同一性を有する場合にのみ生じるハイブリダイゼーションを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の特定の例としては、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣＩ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌの変性させ切断したサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、４２℃で一晩のインキュベーション、及び続く６５℃における０．１ｘＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション支持体の洗浄である。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、よく知られており、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), particularly Chapter 11に例示される。本発明により提供されるポリヌクレオチド配列との溶液ハイブリダイゼーションも用いられる。
【０１６４】
本発明はまた、配列番号１５の対応する配列に示される前記ポリヌクレオチド配列又はこれらの断片の配列を有するプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１５の任意の配列に示されるポリヌクレオチド配列についての完全な遺伝子を含む適切なライブラリーをスクリーニングすること、及び前記ポリヌクレオチド配列を単離することにより得られるポリヌクレオチド配列からなる、又は含むポリヌクレオチドを提供する。かかるポリヌクレオチドを得るための有用な断片としては、例えば本明細書の他の場所で完全に記載されるプローブ及びプライマーが挙げられる。
【０１６５】
本発明のポリヌクレオチドアッセイに関して、本明細書の他の場所で議論されるように、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、タンパク質Ｆをコードする全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離するために、及びタンパク質Ｆ遺伝子と高い同一性、特に高い配列同一性を有するｃＤＮＡ及び他の遺伝子のゲノムクローンを単離するために、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡについてのハイブリダイゼーションプローブとして用いられてもよい。かかるプローブは、一般的には、少なくとも１５個のヌクレオチド残基又は塩基対を含む。好ましくは、かかるプローブは、一般的に、少なくとも３０個のヌクレオチド残基又は塩基対を有し、少なくとも５０個のヌクレオチド残基又は塩基対を有してもよい。特に好ましいプローブは、少なくとも２０個のヌクレオチド残基又は塩基対を有し、３０個未満のヌクレオチド残基又は塩基対を有する。
【０１６６】
タンパク質Ｆ遺伝子のコーディング領域は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するために配列番号１５に提供されるＤＮＡ配列を用いてスクリーニングすることにより単離されてもよい。本発明の遺伝子のものと相補的な配列を有する標識されたオリゴヌクレオチドは、従って、プローブがハイブリダイズするライブラリーのメンバーを決定するために、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするために用いられる。
【０１６７】
全長ＤＮＡを得るための、又は短いＤＮＡを伸長するために利用可能且つ当業者によく知られているいくつかの方法、例えばｃＤＮＡ端の迅速増幅（Rapid Amplification of cDNA ends）（ＲＡＣＥ）の方法に基づくもの（例えば、Frohman, et al., PNAS USA 85: 8998-9002, 1988を参照のこと）が存在する。例えば、マラソン（商標）技術により例証される近年の技術の改変（Clontech Laboratories Inc.）は、長いＤＮＡについての探索を著しく単純化している。マラソン（商標）技術では、ｃＤＮＡは、選択された組織から抽出されたｍＲＮＡ及びｃＤＮＡは、各末端上にライゲートした「アダプター」配列から調製される。遺伝子特異的及びアダプター特異的オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを用いて、ＤＮＡの「欠失している」５’末端を増幅するために行われる。ＰＣＲ反応は、「ネステッド」プライマー、即ち増幅された生成物内にアニールするように設計されたプライマー（典型的には、アダプター配列のさらに３’にアニールするアダプター特異的プライマー、及び選択された遺伝子配列のさらに５’にアニールする遺伝子特異的プライマー）を用いて調製される。この反応の生成物は、この反応の生成物は、従って、ＤＮＡ配列決定、又は完全な配列を与えるために、生成物を存在するＤＮＡに直接結合させること、若しくは５’プライマーの設計のための新しい配列情報を用いて別個の全長ＰＣＲを行なうことのいずれかにより構築される全長ＤＮＡにより分析され得る。
【０１６８】
本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、例えばポリヌクレオチドアッセイに関して本明細書でさらに議論されるように、疾患、特にヒトの疾患の治療及び診断の発見のための研究試薬及び材料として用いられてもよい。
【０１６９】
配列番号１５の配列に由来するオリゴヌクレオチドである本発明のポリヌクレオチドは、感染組織において細菌において転写される全体又は部分において本明細書で同定されるポリペプチドであるか否かを決定するために、本明細書に記載される方法、好ましくはＰＣＲに用いられてもよい。かかる配列が、病原体が到達した感染のステージ及び感染の種類の診断において有用であることは、認識される。
【０１７０】
本発明は、更なるアミノ末端又はカルボキシ末端のアミノ酸、又は成熟ポリペプチド内のアミノ酸を加えた成熟タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する（例えば、成熟形態が二以上のポリペプチド鎖を有する場合）。かかる配列は、前駆体から成熟形態へのタンパク質の加工において役割を果たし、タンパク質輸送を可能にし、タンパク質半減期を長く又は短くし、あるいはタンパク質Ｆの操作、又はアッセイ、又は生産等を容易にしてもよい。一般的、インビボの場合、更なるアミノ酸は、細胞内酵素により成熟タンパク質から離れて処理されてもよい。
【０１７１】
本発明のそれぞれ及び全てのポリヌクレオチドにについて、それと相補的なポリヌクレオチドを提供する。これらの相補的なポリヌクレオチドは、これらが相補的である各ポリヌクレオチドと完全に相補的であることが好ましい。
【０１７２】
１又は複数のプロ配列と融合したポリペプチドの成熟形態を有する前駆体タンパク質は、ポリペプチドの不活性な形態でもよい。プロ配列が除去される場合、かかる不活性な前駆体は、一般的に活性化される。プロ配列のいくつか、又は全ては、活性化の前に除去されてもよい。一般的に、このような前駆体は、プロタンパク質と呼ばれる。
【０１７３】
ヌクレオチドについての標準的なＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ／Ｕ表現に加えて、用語「Ｎ」は、本発明の特定のポリヌクレオチドを記載するのに用いられてもよい。「Ｎ」は、隣接するヌクレオチド位置と組み合わせた場合、正確なリーディングフレームにおいて読まれる場合、かかるリーディングフレーム中の早過ぎる停止コドンを生じる効果を有する核酸ではないことが好ましい場合を除き、「Ｎ」は４つのＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオチドのいずれかがＤＮＡ又はＲＮＡ配列においてかかる指定された位置において現れることを意味する。
【０１７４】
要するに、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、リーダー配列が加わった成熟タンパク質（プレタンパク質と称され得る）、プレタンパク質のリーダー配列ではない１又は複数のプロ配列を有する成熟タンパク質の前駆体、又はポリペプチドの活性化形態及び成熟形態を生産す加工工程中に一般的に除去されるリーダー配列及び１又は複数のプロ配列を有する、プロタンパク質に対する前駆体であるプレプロタンパク質をコードしても良い。
【０１７５】
本発明の態様に従って、治療又は予防目的、特に遺伝子免疫付与のための、本発明のポリヌクレオチドの使用を提供する。
【０１７６】
遺伝子免疫において、本発明のポリヌクレオチドの使用は、好ましくは、好適な送達方法、例えばプラスミドＤＮＡの筋肉への直接注入（Wolff et al., Hum Mol Genet (1992) 1 : 363, Manthorpe et al., Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419）、特定のタンパク質担体と複合体化したＤＮＡの送達（Wu et al., J Biol Chem. (1989) 264: 16985）、リン酸カルシウムとのＤＮＡの共沈（Benvenisty & Reshef, PNAS USA, (1986) 83: 9551）、リポソームの様々な形態中のＤＮＡのカプセル化（Kaneda et al., Science (1989) 243: 375）、粒子衝突（Tang et al., Nature (1992) 356: 152, Eisenbraun et al., DNA Cell Biol (1993) 12: 791）、及びクローンされたレトロウイルスベクターを用いたインビボ感染（Seeger et al., PNAS USA (1984) 81 : 5849）を用いる。
【０１７７】
ベクター、宿主細胞、発現系
本発明は、組み換え技術による、本発明のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞、及び／又は本発明のポリペプチドの生産にも関する。細胞遊離翻訳システムも、本発明のＤＮＡコンストラクトに由来するＲＮＡを用いたかかるタンパク質の生産のために用いることができる。
【０１７８】
本発明の組み換えポリペプチドは、発現系を含む遺伝子操作宿主細胞から当業者によくしられている方法により調製されてもよい。従って、更なる態様では、本発明は、及び組み換え技術による、本発明のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む発現系、かかる発現系で遺伝子操作された宿主細胞、及び本発明のポリペプチドの生産に関する。
【０１７９】
本発明のポリペプチドの組み換え生産のために、宿主細胞は、発現系、又はこれらの部分、又は本発明のポリヌクレオチドを組み込むために、遺伝子操作され得る。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、多くの標準的な実験室マニュアル、例えばBASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) and Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) に記載される方法、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（transvection）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、トランスダクション、スクレープ・ローディング（scrape loading）、衝撃導入（ballistic introduction）、及び感染により、達成される。
【０１８０】
適切な宿主の代表的な例としては、細菌の細胞、例えば、レンサ球菌（streptococci）、ブドウ球菌（staphylococci）、腸球菌（enterococci）、大腸菌（E. coli）、ストレプトマイセス属（streptomyces）、藍藻（cyanobacteria）、枯草菌（Bacillus subtilis）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、インフルエンザ菌、及びモラクセラ・カタラーリスの細胞の細胞；真菌細胞、例えば、酵母、クルイベロミセス属（Kluveromyces）、サッカロミケス属（Saccharomyces）、ピチア属（Pichia）、担子菌（basidiomycete）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）及びアスペルギルス属（Aspergillus）の細胞；昆虫細胞、例えばショウジョウバエ（Drosophila）Ｓ２及びスポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ９の細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３、ＣＶ−１及びボウズ・メラノーマ（Bowes melanoma）細胞；並びに植物細胞、例えば裸子植物又は被子植物の細胞が挙げられる。
【０１８１】
大変に様々な発現系を、本発明のポリペプチドの生産に用いることができる。中でも、かかるベクターとしては、染色体、エピソーマル、及びウイルス由来ベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ピコルナウイルス、レトロウイルス、及び／又はαウイルス等のウイルス由来のベクター、これらの組み合わせ由来のベクター、例えばプラスミド、及び／又はバクテリオファージ遺伝因子、例えばコスミド、及び／又はファージミドが挙げられる。発現系コンストラクトは、発現を制御及び生じさせる調節領域を含んでもよい。一般的に、宿主において、ポリヌクレオチドを維持、増殖、若しくは発現、及び／又はポリペプチドを発現するために好適な任意の系又はベクターが、この点に関して、発現のために用いられてもよい。適切なＤＮＡ配列は、例えば、MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL（上記）に記載されるような、任意の様々な既知の及び日常作業の技術により発現系に挿入されてもよい。
【０１８２】
真核生物の組み換え発現系において、小胞体の内腔、ペリプラズム間隙、又は細胞外環境に翻訳されたタンパク質の分泌のために、適切な分泌シグナルを、発現されるポリペプチドに組み込んでもよい。これらのシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であってもよく、これらは、異種のシグナルであってもよい。
【０１８３】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト、及びレクチンクロマトグラフィーを含む、既知の方法により、組み換え細胞培養物から回収及び精製することができる。最も好ましくは、金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）が精製のために用いられる。再折り畳みのための既知の技術が、細胞内合成、単離、及び／又は精製の間にポリペプチドが変性される場合、活性立体配座を再生するために用いられる。
【０１８４】
前記発現系は、組み換えの生きた微生物、例えばウイルス又は細菌でもよい。対象の遺伝子は、生ウイルス又は細菌のゲノムに挿入されてもよい。接種及びこの生ベクターを用いたインビボ感染は、抗原のインビボ発現及び免疫応答の誘導を導く。この目的のために用いられるウイルス及び細菌は、例えば、ポックスウイルス（例えば；ワクシニア、鶏痘、カナリア痘）、αウイルス（シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、ライノウイルス）、ヘルペスウイルス（水痘・帯状疱疹ウイルス等）、リステリア、サルモネラ、赤痢菌、ＢＣＧ、レンサ球菌である。これらのウイルス及び細菌は、毒性を有し、生ワクチンを得るために、様々な方法において、弱毒化される。かかるワクチンはまた、本発明の一部を形成する。
【０１８５】
診断試験、予後試験、血清型検査、突然変異試験
本発明は、診断試薬としてしようのための、タンパク質Ｆポリヌクレオチド、及び本発明のポリペプチドの使用にも関する。真核細胞、特に哺乳動物、及び特にはヒトにおけるタンパク質Ｆポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドの検出は、疾患の診断、疾患のステージ、又は薬物に対する感染生物の応答を診断する方法を提供する。真核細胞、特に哺乳動物、及び特にはヒト、特にタンパク質Ｆ遺伝子又はタンパク質を含む生物で感染した、若しくは感染が疑われるものは、様々な既知の技術、及び本明細書で提供される方法により、核酸又はアミノ酸レベルで検出されてもよい。
【０１８６】
予後診断、診断、又は他の分析のためのポリペプチド及びポリヌクレオチドは、推定的に感染した、及び／又は感染した固体の身体の材料から得てもよい。任意のこれらの起源からのポリヌクレオチド、特にＤＮＡ又はＲＮＡは、検出のために直接用いられてもよく、あるいは分析の前にＰＣＲ又は他の増幅技術を用いて酵素的に増幅されてもよい。ＲＮＡ、特にｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、及びゲノムＤＮＡは、同様に用いられてもよい。固体に存在する感染又は寄生生物の種及び株の増幅、特性決定を用いることは、生物の選択されたポリヌクレオチドの遺伝子型の分析により行なわれてもよい。欠失及び挿入は、関連生物、好ましくは、同一の属の異なる種、又は同一の種の異なる株から選択された基準配列の遺伝子型と比較において、増幅された生成物のサイズの変化により検出することができる。点突然変異は、標識されたタンパク質Ｆポリヌクレオチド配列に対する、増幅されたＤＮＡのハイブリダイズにより同定することができる。完全に、又は著しく一致した配列は、不完全に、又はより一致していない二重鎖から、ＤＮＡ又はＲＮＡについて、それぞれＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅ消化により、あるいは、融解温度、又は再生動態における違いを検出することにより、識別することができる。ポリヌクレオチド配列の差異は、基準配列と比べて、ゲル中のポリヌクレオチド配列の電気泳動的移動性における変化により検出してもよい。これは、変性剤を用いて、又は用いずに行なってもよい。ポリヌクレオチドの差異は、直接的なＤＮＡ又はＲＮＡ配列決定により検出してもよい。例えば、Myers et al., Science, 230: 1242 (1985) を参照のこと。特定の位置における配列変化は、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮａｓｅ、Ｖ１及びＳ１保護アッセイ、又は化学的切断方法により明らかにされてもよい。例えば、Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 4397-4401 (1985) を参照のこと。
【０１８７】
別の実施形態では、タンパク質Ｆヌクレオチド配列又はこの断片を含むタンパク質Ｆヌクレオチド配列のアレイを、例えば遺伝的突然変異、血清型、分類学的分類又は同定の効率的なスクリーニングを行なうために構築することができる。アレイ技術法は、よく知られており、一般的適用性を有し、遺伝子発現、遺伝的連鎖、及び遺伝的多様性を含む分子遺伝学における様々な課題に取り組むために用いることができる（例えば，Chee et al., Science, 274: 610 (1996) を参照のこと）。  
【０１８８】
従って、別の態様では、本発明は、
（ａ）  本発明のポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１５の任意のヌクレオチド配列、又はこれらの断片；
（ｂ）  （ａ）の配列に相補的なヌクレオチド配列；
（ｃ）  本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号１〜１４の任意のポリペプチド、又はこれらの断片；又は
（ｄ）  本発明のポリペプチドに対する抗体、好ましくは配列番号１〜１４の任意のポリペプチドに対する抗体
を含む診断キットに関する。
【０１８９】
かかるキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）は、実質的な成分を含んでもよいことは、理解される。かかるキットは、中でも、疾患、又は疾患に対する感受性を診断するのに用いられる。
【０１９０】
本発明は、診断試薬として、本発明のポリヌクレオチドの使用にも関する。本発明のポリヌクレオチドの突然変異形態、好ましくは疾患又は病原性に関する配列番号１５の任意の配列の検出は、添加され得、又はポリヌクレオチドの過小発現、過剰発現、又は改変された発現に起因する、疾患の診断、疾患の経過の予後診断、疾患ステージ又は疾患の感受性の決定を明らかにする診断ツールとして提供される。生物、特にかかるポリヌクレオチドの突然変異を有する感染生物は、様々な技術、例えば本明細書の多の部分で記載されるものにより、ポリヌクレオチドレベルにおいて検出されてもよい。
【０１９１】
本発明のポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドにおける突然変異又は多形（対立遺伝子変異）を有する生物からの細胞は、例えば血清型決定を可能にする様々な技術によりポリヌクレオチド又はポリペプチドレベルにおいて検出され得る。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを、ＲＮＡにおける突然変異を検出するために用いることができる。自動検出システム、例えば、ＧｅｎｅＳｃａｎと組み合わせてＲＴ−ＰＣＲを用いることは、特に好ましい。ＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを、同一の目的であるＰＣＲのために用いてもよい。一例として、タンパク質Ｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的なＰＣＲプライマーは、突然変異を同定及び分析するために用いることができる。
【０１９２】
本発明は、さらに５’及び／又は３’末端から除去された１、２、３又は４個のヌクレオチドを含むプライマーを提供する。これらのプライマーは、中でも、固体由来のサンプル、例えば生体材料から単離されたタンパク質ＦＤＮＡ及び／又はＲＮＡを増幅するために用いられてもよい。該ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチド配列の解明のための様々な技術に供されてもよいように、該プライマーは、感染した個体から単離されたポリヌクレオチドを増幅するために用いられてもよい。このようにして、ポリヌクレオチド配列における突然変異は、感染又はそのステージ若しくは経過を診断及び／又は予後診断に、あるいは感染因子を血清型決定及び／又は分類するために検出及び利用してもよい。
【０１９３】
本発明は、さらに、好ましくは細菌感染、より好ましくは無莢膜型インフルエンザ菌により引き起される感染疾患を診断する方法であって、個体由来のサンプル、例えば身体材料から、配列番号１５の任意の配列の配列を有するポリヌクレオチドの発現の増加したレベルを決定することを含む、方法を提供する。タンパク質Ｆポリヌクレオチドの増加した又は減少した発現は、ポリヌクレオチドの定量のための当該技術分野において既知の方法、例えば、増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、ノーザンブロッティング、分光測定、及び他のハイブリダイゼーション法のうちの任意の１つを用いて測定することができる。
【０１９４】
加えて、通常の対照サンプルと比べて、タンパク質Ｆポリペプチドの過剰発現を検出するための本発明の診断的アッセイは、例えば、感染の存在を検出するために用いられてもよい。
【０１９５】
宿主由来のサンプル、例えば身体材料中で、タンパク質Ｆポリペプチドのレベルを決定するために用いることができるアッセイ技術は、当業者によく知られている。かかるアッセイ法としては、放射性イムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、抗体サンドイッチアッセイ、抗体検出、及びＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。
【０１９６】
本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドアレイ、好ましくは高密度アレイ又はグリッドの構成要素として用いられてもよい。これらの高密度アレイは、診断及び予後診断目的のために特に有用である。例えば、様々な遺伝子を含み、及びさらに本発明のポリヌクレオチドを含む一連の各スポットは、個体中の特定のポリヌクレオチド配列又は関連配列の存在を決定するために、身体のサンプルから得られる又は由来するプローブを用いて、プロービング、例えば、ハイブリダイゼーション又は核酸増幅に用いられてもよい。かかる存在は、病原体、特に無莢膜型インフルエンザ菌の存在を示し得、疾患の又は疾患の経過の診断及び／又は予後診断に有用であり得る。配列番号１５の任意のポリヌクレオチド配列のいくつかの変異体を含むグリッドは、好ましい。配列番号１〜１４の任意のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列のいくつかの変異体は、好ましい。
【０１９７】
抗体
本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチド又はこれらの変異体、又はこれらを発現する細胞を、かかるポリペプチド又はポリヌクレオチドに免疫特異的な抗体を生産するための免疫原として、それぞれ用いることができる。用語「免疫特異的」とは、先行技術における他の関連するポリペプチドに対するこれらのアフィニティーよりも、本発明のポリペプチドに対して実質的に優れたアフィニティーを有する抗体を意味する。
【０１９８】
本発明の特定の好ましい実施形態では、タンパク質Ｆポリペプチド又はポリヌクレオチドに対する抗体を提供する。
【０１９９】
本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドに対する抗体は、日常作業のプロトコールを用いて、動物、好ましくは非ヒトに、本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチド、又はこのいずれか又は双方のエピトープを有する断片、このいずれか又は双方を発現する細胞を投与することにより、得ることができる。モノクローナル抗体の調製のために、連続細胞株培養物により生産される抗体を提供する当該技術分野における任意の技術を用いることができる。様々な技術の例としては、例えばKohler, G. and Milstein, C, Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pg. 77-96 in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985) に記載されるものが挙げられる。
【０２００】
一本鎖抗体の生産のための技術（米国特許第４，９４６，７７８号）は、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドに対する一本鎖抗体を生産するために適応させることができる。また、遺伝子導入マウス又は他の生物、又は動物、例えば、多の哺乳動物は、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドに対して免疫特異的なヒト化抗体を発現させるために用いられてもよい。
【０２０１】
あるいは、ファージディスプレー技術は、抗タンパク質Ｆを加工するためのスクリーニングされたヒト由来のリンパ球のＰＣＲ増幅されたｖ−遺伝子のレパートリーから、又は天然のライブラリーのいずれかから、本発明のポリペプチドに対する結合活性を有する抗体遺伝子を選択するために用いてもよい（McCafferty, et al., (1990), Nature 348, 552-554; Marks, et al., (1992) Biotechnology 10, 779- 783）。これらの抗体のアフィニティーは、例えば鎖シャッフリング（Clackson et al., (1991 ) Nature 352: 628）により改良することができる。
【０２０２】
上記の抗体を、例えばアフィニティークロマトグラフィーにより、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを精製するための、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドを発現するクローンを単離又は同定するために、用いてもよい。
【０２０３】
中でも、タンパク質Ｆポリペプチド又はタンパク質Ｆポリヌクレオチドに対する抗体を、感染、時に細菌感染を跳梁するために用いてもよい。
【０２０４】
ポリペプチド変異体としては、抗原的に、エピトープ的に、免疫学的に同等の変異体形態が挙げられる。
【０２０５】
好ましくは、これらの該抗体又は変異体は、固体における免疫原性を弱めるために改変される。例えば、固体がヒトである場合、該抗体は、最も好ましくは、「ヒト化」され、例えば、Jones et al. (1986), Nature 321, 522-525 or Tempest et al., (1991) Biotechnology 9, 266-273 に記載されるように、ハイブリドーマ由来抗体の領域を決定する相補性が、ヒトモノクローナル抗体に移植される。
【０２０６】
アンタゴニスト及びアゴニスト−アッセイ及び分子
本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドはまた、例えば、細胞、細胞遊離調製物、化学ライブラリー、及び天然物の混合物中の小分子物質及びリガンドの結合を評価するために用いられてもよい。これらの物質及びリガンドは、天然の物質及びリガンドでもよく、あるいは、構造的又は機能的模倣物でもよい。例えば、Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5 (1991) を参照のこと。
【０２０７】
スクリーニング法は、候補化合物に直接又は間接的に関連する標識により、ポリペプチド若しくはポリヌクレオチド、又はポリペプチド又はポリヌクレオチドを有する細胞若しくは膜、又はポリペプチドの融合タンパク質に対する候補化合物の結合を単純に測定してもよい。あるいは、スクリーニング法は、標識された競合物との競合に関してもよい。さらに、これらのスクリーニング法は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む細胞に好適な検出系を用いて、候補化合物がポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性化又は阻害により生成されるシグナルをもたらすか否か試験してもよい。活性化の阻害剤は、一般的に、既知のアゴニストの存在下で試験され、候補化合物の存在によるアゴニストによる活性化の効果が観察される。恒常的に活性なポリペプチド及び／又は恒常的に発現されるポリペプチド及びポリヌクレオチドは、アゴニスト又は阻害剤の非存在下で、候補化合物が、状況次第で、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性化の阻害をもたらすか否か試験することにより、逆アゴニスト又は阻害剤についてのスクリーニング法において用いられてもよい。さらに、スクリーニング法は、候補化合物を本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む溶液と混合して混合物を形成し、混合物中のタンパク質Fポリペプチド及び／又はポリヌクレオチド活性を測定し、そして標準と混合物のタンパク質Fポリペプチド及び／又はポリヌクレオチド活性を比較する工程を単に含んでもよい。融合タンパク質、例えば前述のように、Ｆｃ部分とタンパク質Fポリペプチドから作られるものを、本発明のポリペプチド、並びに系統学的に及び／又は機能的に関連するポリペプチドのアンタゴニストを同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイに用いることができる（D. Bennett et al., J Mol Recognition, 8:52-58 (1995); and K. Johanson et al., J Biol Chem, 270(16):9459-9471 (1995) を参照のこと。）。
【０２０８】
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び本発明のポリペプチドと結合及び／又は相互作用する抗体を、細胞中のｍＲＮＡ及び／又はポリペプチドの生産に関する添加された化合物の効果を検出するためのスクリーニング法を設定するための用いてもよい。例えば、ＥＬＩＳＡアッセイは、当該技術分野において知られている標準的な方法により、モノクローナル及びポリクローナル抗体を用いたポリペプチドの分泌された又は細胞に関連するレベルを測定するために構築されてもよい。これは、好適に操作された細胞又は組織からポリペプチドの生産を阻害又は促進し得る試薬（それぞれアンタゴニスト又はアゴニストと称される）を発見するために用いることができる。本発明はまた、タンパク質Ｆポリペプチド又はポリヌクレオチドの作用を促進（アゴニスト）又は妨害（アンタゴニスト）するもの、特に静菌性及び／又は殺菌性であるこれらの化合物を特定するために、化合物のスクリーニングのための方法を提供する。該スクリーニングのための方法は、ハイスループット技術に関し得る。例えば、アゴニスト又はアンタゴニストについてスクリーニングするために、タンパク質Ｆポリペプチドを含む、合成反応混合物、細胞内区画、例えば膜、細胞外皮、若しくは細胞壁、又はこれらの任意の調製物、及びかかるポリペプチドのリガンド又は標識された基質は、タンパク質Ｆアゴニスト又はアンタゴニストであり得る候補分子の非存在又は存在下でインキュベートされる。タンパク質Ｆポリペプチドを刺激する又は拮抗する候補分子の能力は、標識されたリガンドの減少した結合、又はかかる基質からの生成物の減少した生産に反映される。
【０２０９】
むやみ、即ちタンパク質Ｆポリペプチドの効果を誘導することなく結合する分子は、優れたアンタゴニストである可能性が高い。よく結合し、場合によっては、基質からの生成物生産の速度を増加させる、シグナル変換を増加させる、又は化学チャネル活性を増加させる分子は、アゴニストである。場合によっては、基質からの生成物生産、シグナル変換又は化学チャネル活性の速度又はレベルの検出は、レポーターシステムを用いることにより向上し得る。これに関連して有用であり得るレポーターシステムは、限定しないが、比色分析の生成物に変換された標識された基質、タンパク質Ｆポリヌクレオチド又はポリペプチド活性の変化に応答するレポーター遺伝子、及び当該技術分野において知られている結合アッセイが挙げられる。
【０２１０】
タンパク質Ｆアゴニストについてのアッセイの別の例は、競合的阻害アッセイのために適切な条件下での、タンパク質Ｆと、タンパク質Ｆ結合分子、組み換えタンパク質Ｆ結合分子、天然基質若しくはリガンド、又は基質若しくはリガンド模倣物を有する潜在的なアゴニストを組み合わせた競合アッセイである。タンパク質Ｆを、結合分子と結合する、又は生成物に変換されるいくつかのタンパク質Ｆ分子が、潜在的なアンタゴニスト．の有効性を評価するために、正確に決定され得るように、例えば放射活性又は比色分析用化合物により標識することができる。
【０２１１】
潜在的なアンタゴニストとしては、中でも小有機分子ペプチド、ポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドと結合し、これによりその活性又は発現を阻害又は消滅させる抗体が挙げられる。潜在的なアンタゴニストは、小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、例えば密接に関連するタンパク質、又は結合分子、例えば、タンパク質Ｆに誘導される活性を引き起さず、これにより結合からタンパク質Ｆポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを除くことによりタンパク質Ｆポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドの作用又は発現を防ぐ結合分子上の同一の部位と結合する抗体でもよい。
【０２１２】
潜在的なアンタゴニストとしては、ポリペプチドと結合し、ポリペプチドの結合部位を占める小分子が挙げられ、これにより、通常の生物学的活性が妨害されるように、細胞の結合分子と結合することを防ぐ。小分子の例としては、限定しないが、小有機分子、ペプチド、又はペプチド様分子が挙げられる。他の潜在的なアンタゴニストとしては、アンチセンス分子が挙げられる（Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991 ); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE 発現, CRC Press, Boca Raton, FL (1988), for a description of these molecules を参照のこと。）。好ましい潜在的なアンタゴニストとしては、タンパク質Ｆの関連化合物、及びタンパク質Ｆの変異体が挙げあれる。
【０２１３】
更なる態様では、本発明は、一般的に、本発明のポリペプチド又はこれらの断片、及び様々なサブクラスの免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の重鎖又は軽鎖の定常領域の様々な部分を含む遺伝子操作された可溶性融合タンパク質に関する。融合物がヒンジ領域で生じる、ヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ１の重鎖の定常部分が、免疫グロブリンとして好ましい。特定の実施形態では、Ｆｃ部分は、血液凝固因子Ｘａで切断され得る切断配列を組み込むことにより、単純に除去される。
【０２１４】
さらに、本発明は、遺伝子操作によるこれらの融合タンパク質の調製のための方法、及び薬剤スクリーニング、診断、及び治療のためのこれらの使用に関する。本発明の更なる態様としては、かかる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにも関する。融合タンパク質技術の例は、国際特許出願である、国際公開第９４／２９４５８号及び国際公開第９４／２２９１４号に見ることができる。
【０２１５】
本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列の各々は、抗細菌化合物の発見及び開発に用いられてもよい。発現において、コードされたタンパク質は、抗細菌剤のスクリーニングの標的として用いることができる。加えて、コードされたタンパク質のアミノ末端領域をコードするポリヌクレオチド配列、又はシャイン・ダルガノ若しくは各ｍＲＮＡの翻訳促進配列を、目的のコーディング配列の発現を制御するためのアンチセンス配列を拘置するために用いることができる。
【０２１６】
本発明はまた、病原体と真核細胞、好ましくは哺乳動物の感染の後遺症に起因する宿主との初期の物理的相互作用を妨害するための、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニスト又はアンタゴニストの使用を提供する。特に、本発明の分子は、細菌、特にグラム陽性細菌及び／又はグラム陰性細菌の、真核生物、好ましくは哺乳動物の内在デバイス上細胞外マトリックスタンパク質、又は創傷中の細胞外マトリックスタンパク質への付着の予防に用いられ、組織損傷を媒介する真核生物、好ましくは哺乳動物の細胞外マトリックスタンパク質と組織損傷を仲介する細菌のタンパク質Ｆタンパク質との細菌付着を妨害する、及び／又は内在デバイスの埋め込み又は他の外科技術以外により開始される感染における病原性の通常の進行を妨害する。
【０２１７】
本発明のさらに別の態様によれば、タンパク質Ｆアゴニスト及びアンタゴニスト、好ましくは静菌性又は殺菌性アゴニスト及びアンタゴニストを提供する。
【０２１８】
本発明のアンタゴニスト及びアゴニストは、疾患を予防、阻害及び治療するために用いられてもよい。
【０２１９】
更なる態様では、本発明は、本発明のポリペプチドのミモトープに関する。ミモトープは、ペプチド配列である。ミモトープは、天然のペプチドを認識する抗体により認識されることができ、あるいは好適な担体と結合した場合天然のペプチドを認識する抗体を生ずることができる、天然のペプチドと（配列的又は構造的に）十分に同様のペプチド配列である。
【０２２０】
ペプチドミモトープは、選択されたアミノ酸の付加、欠失又は置換により特定の目的のために設計されてもよい。従って、ペプチドは、タンパク質担体との結合を容易にするために、修飾されてもよい。例えば、末端のシステインを含むためのいくつかの化学的結合方法は好ましい。加えて、遊離の未結合のペプチドの末端が担体タンパク質の表面と結合し続けるように、ペプチドの結合末端の遠位に疎水性末端を含むように、タンパク質担体と結合したペプチドは好ましい。これにより、構造においてペプチドを示すことは、全体の天然の分子上で発見されるペプチドと大変似ている。例えば、ペプチドは、Ｎ末端のシステイン及びＣ末端の疎水性アミド化尾部を有するために改変されてもよい。あるいは、アミノ酸の１又は複数のＤ−ステレオアイソマー形態（インベルソ配列）の付加又は置換は、例えばペプチドの安定性を増大させるために、有用な誘導体を作製するために行なわれてもよい。ミモトープは、配列方向が逆であることを特徴とする、天然のペプチド配列のレトロ配列であってもよい。ミモトープは、特徴としてレトロ−インベルソであってもよい。レトロな、インベルソな、及びレトロ−インベルソなペプチドは、国際公開第９５／２４９１６号及び国際公開第９４／０５３１１号に記載される。
【０２２１】
あるいは、ペプチドミモトープは、ファージディスプレー技術（欧州特許第０５５２２６７号Ｂ１）等の技術を用いて、本発明のポリペプチドとのこれら自身の結合を可能にする抗体を用いて同定されてもよい。この技術は、天然のペプチドの構造を模倣する多数のペプチド配列を生成し、それ故、抗天然ペプチド抗体と結合することができるが、天然のポリペプチドと著しく相同の配列を必ずしも共有しなくてもよい。
【０２２２】
ワクチン
本発明の別の態様は、個体、特に哺乳動物、好ましくはヒトにおける免疫応答を誘導するための方法であって、感染、具体的には細菌感染、及び最も具体的には無莢膜型インフルエンザ菌感染から前記個体を保護するための抗体及び／又はＴ細胞免疫応答を産生するのに十分な、タンパク質Ｆポリヌクレオチド及び／又はポリペプチド、又はこれらの断片若しくは変異体を個体に接種することを含む、方法に関する。また、これよりかかる免疫応答は、細菌複製を遅くさせる方法も提供される。本発明の更に別の態様は、前記個体、好ましくはヒトを個体内で既に確立された疾患であろうとなかろうと、疾患から保護する、抗体及び／又は例えば、サイトカイン産生Ｔ細胞、又は細胞毒性Ｔ細胞を誘導するＴ細胞等を生成する、免疫応答を誘導するために、インビボにおいてタンパク質Ｆポリヌクレオチド及び／又はポリペプチド、又はこれらの断片若しくは変異体を発現するために、タンパク質Ｆポリヌクレオチド及び／又はポリペプチド、又はこれらの断片若しくは変異体の発現を指示する核酸ベクター、配列又はリボザイムをかかる個体に送達することを含む、個体における免疫応答を誘導する方法に関する。所望の細胞への遺伝子投与の１つの例は、粒子又は他のもの上のコーティングとして、それを促進させることによる。かかる核酸ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイム、修飾核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−タンパク質複合体、又はＲＮＡ−タンパク質複合体を含んでもよい。
【０２２３】
本発明の更なる態様は、個体内で免疫応答誘導することができる個体、好ましくはヒトに導入される場合、かかる個体において、これらからコードされる前記タンパク質Ｆポリヌクレオチド、ポリペプチドに対する免疫応答を引き起す免疫原性組成物であって、前記組成物は、これらからコードされる組み換えタンパク質Ｆポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを含む、及び／又はこれらからコードされる前記タンパク質Ｆポリヌクレオチド、ポリペプチド又は本発明の他のポリペプチドをコード及び発現するＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む、免疫原性組成物に関する。免疫応答は、治療的又は予防的に用いられてもよく、抗体免疫及び／又はＣＴＬ又はＣＤ４＋Ｔ細胞に起因する細胞免疫等の細胞性免疫の形態をとってもよい。
【０２２４】
タンパク質Ｆポリペプチド又はこの断片は、それ自身により抗体を産生してもしなくてもよいが、第一のタンパク質を安定化し、抗原及び／又は免疫原性特性、好ましくは保護的特性を有する融合又は修飾タンパク質の生産することができる共タンパク質又は化学的部分と融合されてもよい。融合組み換えタンパク質は、好ましくは抗原性共タンパク質、例えばインフルエンザ菌由来のリポタンパク質又はタンパク質Ｄ（欧州特許第５９４６１０号）、インフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅ（欧州特許第１９７３９３３号）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、若しくはβ−ガラクトシダーゼ、又はタンパク質を安定化し、これらの生産及び精製を容易にする比較的大きな任意の他の共タンパク質をさらに含む。さらに、共タンパク質は、前記タンパク質を受容する生物の免疫系の一般化された刺激を提供する意味でのアジュバントとして作用してもよい。共タンパク質は、第一のタンパク質のアミノ末端又はカルボキシ末端のいずれかに取り付けてもよい。本発明のワクチン組成物では、タンパク質Ｆポリペプチド及び／又はポリヌクレオチド、又はこれらの断片、若しくはミモトープ、若しくは変異体は、ベクター、例えば上述のような生組み換えベクター、例えば生細菌ベクター中に存在してもよい。
【０２２５】
タンパク質Ｆポリペプチド、例えば細菌外膜小嚢又は「ブレブ（blebs）」についての非生ベクターも好ましい。ＯＭブレブは、グラム陰性細菌の二層膜の外膜に由来し、Ｃ．トラコマチス（C. trachomatis）及びＣ．シタッシ（C. psitiaci）を含む多くのグラム陰性細菌において実証されている（Zhou, L et al. 1998. FEMS Microbiol. Lett. 163:223-228）。ブレブを生産することが報告されている細菌の病原体の非排他的な例としては、百日咳菌（Bordetella pertussis）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、ブルセラ・メリテンシス（Brucella melitensis）、ブルセラ・オヴィス（Brucella ovis）、大腸菌（Esherichia coli）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）及びエルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）が挙げられる。
【０２２６】
ブレブは、これらの天然立体配座において、外膜タンパク質を提供する利点を有し、従って、特にワクチンに有用である。ブレブは、外膜において１又は複数の分子の発現を調節するために、細菌を改変することによりワクチン用途のために改良され得る。従って、外膜における所望の免疫原性タンパク質、例えばタンパク質Ｆポリペプチドの発現は、（例えば、プロモーターを改変することにより）導入又は上方制御され得る。代わりに、又は加えて、適切（例えば、未保護の抗原又は免疫優性であるが、可変タンパク質である）、有害（例えば、毒性分子、例えばＬＰＳ、又は自己免疫応答の潜在的な誘導物質）でもない外膜でもなく分子の発現は、下方制御され得る。これらの手法を、より詳細に以下に記載する。
【０２２７】
タンパク質Ｆ遺伝子の非コーディングフラング領域は、遺伝子の発現において重要な調節エレメントを含む。この制御は、転写及び翻訳の双方において行なわれる。遺伝子のオープンリーディングフレームの上流又は下流のいずれかのこれらの領域の配列は、ＤＮＡ配列決定により得ることができる。この配列情報は、潜在的な制御モチーフ、例えば、異なるプロモーターエレメント、ターミネータ配列、誘導可能な配列エレメント、リプレッサー、相変異に関与するエレメント、シャイン−ダルガノ配列、制御に関与する潜在的な二次構造を有する領域、及び制御モチーフ又は配列の他の種類の決定を可能にする。この配列は、本発明の更なる態様である。
【０２２８】
この配列情報は、タンパク質Ｆ遺伝子の自然の発現の調節を可能にする。遺伝子発現の上方制御は、プロモーター、シャイン−ダルガノ配列、潜在的なリプレッサー、又はオペレーターエレメント、又は関与する任意の他のエレメントを改変することにより達成されてもよい。
【０２２９】
同様に、発現の下方制御は、同様の種類の改変により達成され得る。あるいは、相変異配列を変更することにより、遺伝子の発現は、相変異制御下に置かれ得、あるいは、この調節から分離されてもよい。別の手法では、遺伝子の発現は、発現を制御することが可能な１又は複数の誘導可能エレメントの制御下に置かれ得る。かかる制御の例としては、限定しないが、温度シフトによる誘導、選択される糖質又はこれらの誘導体、微量元素、ビタミン、共因子、金属イオン等の誘導基質の添加等が挙げられる。
【０２３０】
上述のようなかかる改変は、いくつかの様々な方法により導入され得る。遺伝子発現に関与する配列の改変は、ランダム突然変異誘発、その後所望の表現型について選択により、インビボにおいて行なうことができる。別の手法は、目的の領域を単離すること、及びランダム突然変異誘発又は部位特異的な置換、挿入、又は欠失突然変異誘発することによりこれを改変することからなる。改変された領域は、その後、相同組み換えにより細菌ゲノムに再導入され、遺伝子発現に関する効果を評価することができる。別の手法では、目的の領域の既知の配列は、天然の制御配列の全て又は一部を置換又は欠失するために用いることができる。この場合、目的の制御配列は、別の遺伝子からの制御配列、様々な遺伝子からの制御配列の組み合わせ、合成制御領域、又は任意の他の制御領域を含むように、又は野生型制御配列の選択された部分を欠失するように単離され、改変される。これらの改変された配列は、従って、ゲノムへの相同組み換えを解して細菌に再導入され得る。遺伝子発現の上方制御に用いることができる好ましいプロモーターの非排他的な例としては、髄膜炎菌又は淋菌由来のｐｏｒＡ、ｐｏｒＢ、ＩｂｐＢ、ｔｂｐＢ、ｐ１１０、１ｓｔ、ｈｐｕＡＢ；Ｍ．カタラーリス由来のｏｍｐＣＤ、ｃｏｐＢ、ＩｂｐＢ、ｏｍｐＥ、ＵｓｐＡ１；ＵｓｐＡ２；ＴｂｐＢ；又はインフルエンザ菌由来のｐ１、ｐ２、ｐ４、ｐ５、ｐ６、ＩｐＤ、ｐＥ、ｔｂｐＢ、Ｄ１５、Ｈｉａ、Ｈｍｗ１、Ｈｍｗ２が挙げられる。
【０２３１】
１つの例では、遺伝子の発現を、そのプロモーターを強力なプロモーターと交換することにより（遺伝子の上流配列を単離、この配列のインビトロ改変、及び相同組み換えによりゲノムへの再導入より）、改変することができる。上方制御された発現は、細菌及び細菌から生産される（又は作られる）外膜小嚢の双方において得ることができる。
【０２３２】
他の例では、所望の手法を、ワクチン適用のための改良された特性を有する組み換え細菌株を作製するために用いることができる。これらは、限定しないが、弱毒化した株、選択された抗原発現が減少した株、免疫応答を妨害する遺伝子をノックアウトした（又は発現を減少させた）株、免疫優性のタンパク質の発現を調節した株、外膜小嚢の放出を調節した株でもよい。
【０２３３】
従って、本発明は、その改変された上流領域が、外膜に位置するタンパク質Ｆタンパク質の発現レベルを改変する異種の制御エレメントを含む、タンパク質Ｆ遺伝子の改変された上流領域を提供する。本発明のこの態様による上流領域は、タンパク質Ｆ遺伝子の配列上流を含む。上流領域は、タンパク質Ｆ遺伝子のすぐ上流から開始し、通常、ＡＴＧ開始コドンから約１０００ｂｐ未満上流の遺伝子の位置まで続く。ポリシストロンの配列（オペロン）に位置する遺伝子の場合、上流領域は、目的の遺伝子の直前、又はオペロンにおける最初の遺伝子の直前から開始し得る。好ましくは、本発明のこの態様の改変された上流領域は、ＡＴＧの５００〜７００ｂｐ上流に位置する異種のプロモーターを含む。
【０２３４】
タンパク質Ｆ遺伝子の発現を上方制御するための開示された上流領域の使用、相同組み換えによるこれを達成するための方法（例えば、本明細書に参照により組み込まれる国際公開第０１／０９３５０号に記載される）、この目的に公的な上流配列を含むベクター、及びそのように改変された宿主細胞は、全て本発明の更なる態様である。
【０２３５】
従って、本発明は、改変された細菌ブレブにおけるタンパク質Ｆポリペプチドを提供する。本発明は、さらに非生膜型ブレブベクターを生産することができる改変された宿主細胞を提供する。本発明は、異種の調節エレメントを含む改変された上流領域を有するタンパク質Ｆ遺伝子を含む核酸ベクターをさらに提供する。
【０２３６】
本発明による宿主細胞及び細胞ブレブを調製するための方法は、本発明によりさらに提供される。
【０２３７】
本発明は、組成物、特にワクチン組成物、及び本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを含む方法、及び免疫刺激ＤＮＡ配列、例えばSato, Y. et al. Science 273: 352 (1996) に記載のものも提供する。
【０２３８】
本発明はまた、インフルエンザ菌での感染の動物モデルにおける、かかる遺伝子による免疫付与実験において用いられるポリヌクレオチドコンストラクト中で細菌細胞表面タンパク質の非可変領域をコードすることを示す、所望のポリヌクレオチド又はこれらの特定の断片を用いる方法を提供する。かかる実験は、予防的又は治療的免疫応答を引き起すことができるタンパク質エピトープを同定するのに特に有用である。この手法は、哺乳動物、特にヒトにおける細菌感染、特にインフルエンザ菌感染の予防剤又は治療処置の開発のために、感染に首尾よく抵抗又は除去する動物の必要な臓器由来の特定の値のモノクローナル抗体のその後の調製を可能にすると考えられる。
【０２３９】
本発明はまた、本発明の免疫原性組み換えポリペプチド及び／又はポリヌクレオチド、及び好適な担体、例えば医薬的に許容される担体を含むワクチン製剤を含む。かかるポリペプチド及びポリヌクレオチドは、胃で分解されるので、各々は、好ましくは、例えば皮下、筋肉内、静脈内、又は皮内投与を含む、非経口で投与される。非経口投与に好適な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌化合物及び製剤を個体の体液、好ましくは血液と等張にする溶質を含む水性及び非水性滅菌注射溶液；及び懸濁剤又は増粘剤を含んでもよい水性及び非水性滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単位用量又は複数用量容器、例えば密閉されたアンプル及びバイアルにおいて提供されてもよく、使用の直前に滅菌液体担体を添加することのみが要求される凍結乾燥状態で保存されてもよい。
【０２４０】
本発明のワクチン製剤は、製剤の免疫原性を増幅するためのアジュバント系を含んでもよい。好ましくは、アジュバント系は、ＴＨ１型の応答を優先的に生ずる。
【０２４１】
免疫応答は、体液性又は細胞媒介免疫応答の二つの極端なカテゴリー（それぞれ抗体及び細胞性因子により伝統的に特徴付けられる保護の機構）に大きく区別することができる。応答のこれらのカテゴリーは、ＴＨ１型応答（細胞媒介応答）、及びＴＨ２型免疫応答（体液性応答）と名付けられる。
【０２４２】
極度のＴＨ１型免疫応答は、抗原特異的なハプロタイプ限定細胞毒性Ｔリンパ球、及びナチュラルキラー細胞応答により特徴付けることができる。マウスにおいて、ＴＨ１型応答は、しばしばｌｇＧ２ａサブタイプの抗体の産生により特徴付けられる一方で、ヒトにおいて、これらはｌｇＧ１型抗体に対応する。ＴＨ２型免疫応答は、マウスｌｇＧ１、ＩｇＡ、及びＩｇＭを含む免疫グロブリンアイソタイプの産生により特徴付けられる。
【０２４３】
これらの二種類の免疫応答の発達の駆動力は、サイトカインであると考えられている。高いレベルのＴＨ１型サイトカインは、抗原を産生する細胞媒介免疫応答の誘導を好む傾向がある一方で、高いレベルのＴＨ２型サイトカインは、抗原に対する体液性免疫応答の誘導を好む傾向がある。
【０２４４】
ＴＨ１及びＴＨ２型免疫応答の区別は絶対的ではない。実際、個体は、圧倒的なＴＨ１又は圧倒的なＴＨ２であるように記載される免疫応答を支持する。しかしながら、Mosmann and Coffman (Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173) によるマウスＣＤ４＋ｖｅＴ細胞クローンにおいて記載されるものの用語においてサイトカインのファミリーを考慮することが便利である。伝統的に、ＴＨ１型応答は、Ｔ−リンパ球によるＩＮＦ−γ及びＩＬ−２サイトカインの産生に関連する。他のサイトカインは、Ｔ−細胞、例えばＩＬ−１２により産生されないＴＨ１型免疫応答の誘導に、しばしば直接的に関連する。これに対して、ＴＨ２型応答は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６及びＩＬ−１３の分泌に関連する。
【０２４５】
特定のワクチンアジュバントは、ＴＨ１又はＴＨ２型サイトカイン応答のいずれかの刺激に特に適していることが知られている。伝統的に、ワクチン接種又は感染後の免疫応答のＴＨ１：ＴＨ２バランスの最も優れた指標としては、抗原での再刺激後、インビトロにおいてＴリンパ球によるＴＨ１又はＴＨ２サイトカインの産生の直接的な測定、及び／又は抗原特異的抗体応答のｌｇＧ１：ｌｇＧ２ａ比の測定が挙げられる。
【０２４６】
従って、ＴＨ１型アジュバントは、高レベルのＴＨ１型サイトカインを産生するために、インビトロにおいて抗原で再刺激された場合に単離されたＴ−細胞母集団を優先的に刺激し、ＴＨ１型アイソタイプに関連するＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球及び抗原特異的免疫グロブリン応答の双方を促進するものである。
【０２４７】
ＴＨ１細胞応答の優先的な刺激を可能にするアジュバントは、国際公開第９４／００１５３号及び国際公開第９５／１７２０９号に記載される。
【０２４８】
３脱−Ｏ−アセチル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）は、１つのかかるアジュバントである。これは、英国特許第２２２０２１１号（Ｒｉｂｉ）から知られている。化学的に、これは、３脱−Ｏ−アセチル化モノホスホリル脂質Ａと４，５又は６アセチル化鎖との混合物であり、Ribi Immunochem, Montana により製造される。３脱−Ｏ−アセチル化モノホスホリル脂質Ａの好ましい形態は、欧州特許第６８９４５４号Ｂ１に開示される（SmithKline Beecham Biologicals SA）。
【０２４９】
好ましくは、３Ｄ−ＭＰＬの粒子は、０．２２ミクロン膜で滅菌濾過されるのに十分小さい（欧州特許第０６８９４５４号）。
【０２５０】
３Ｄ−ＭＰＬは、１用量当たり１０ｇ〜１００ｇの範囲で、好ましくは２５〜５０ｇで存在する一方で、抗原は、典型的に、１用量当たり２〜５０ｇの範囲で存在する。
【０２５１】
別の好ましいアジュバントは、Quillaja Saponaria Molinaのバルクに由来するＱＳ２１、Ｈｐｌｃ精製無毒性画分を含む。任意で、これは、３脱−Ｏ−アセチル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）と、任意で担体と一緒に混合されてもよい。
【０２５２】
ＱＳ２１の生産の方法は、米国特許第５，０５７，５４０号に記載される。
【０２５３】
ＱＳ２１を含む非反応原性アジュバント製剤は、既に記載されている（国際公開第９６／３３７３９号）。ＱＳ２１及びコレステロールを含むかかる製剤は、抗原と一緒に製剤化される場合、好結果のＴＨ１刺激アジュバントであることが示されている。
【０２５４】
ＴＨ１細胞応答の優先的な刺激剤であるさらなるアジュバントとしては、免疫調節性オリゴヌクレオチド、例えば国際公開第９６／０２５５５号に記載されるような非メチル化ＣｐＧ配列が挙げられる。
【０２５５】
様々なＴＨ１アジュバント、例えば上述のものの組み合わせは、ＴＨ１細胞応答の優先的な刺激剤であるアジュバントを提供するので、考慮される。例えば、ＱＳ２１は、３Ｄ−ＭＰＬと一緒に製剤化することができる。ＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬの比は、典型的に、１：１０〜１０：１；好ましくは１：５〜５：１、及びしばしば実質的に１：１の程度である。最適な相乗効果のための好ましい範囲は、２．５：１〜１：１３Ｄ−ＭＰＬＱＳ２１である。
【０２５６】
好ましくは、担体は、本発明のワクチン組成物中に存在する。該担体は、水中油型エマルジョン、又はアルミニウム、例えばリン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム等でもよい。
【０２５７】
好ましい水中油型エマルジョンとしては、代謝可能な油、例えばスクアレン、αトコフェロール、及びＴｗｅｅｎ  ８０が挙げられる。特に好ましい態様では、本発明のワクチン組成物中の抗原は、かかるエマルジョンにおいてＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬと組み合わされる。加えて、水中油型エマルジョンは、ｓｐａｎ  ８５及び／又はレクチン及び／又はトリカプリリンを含んでもよい。
【０２５８】
典型的に、ヒトへの投与のために、ＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬは、１用量あたり、１ｇ〜２００ｇの範囲で、例えば１０〜１００ｇ、好ましくは１０ｇ〜５０ｇでワクチン中に存在する。典型的に、水中油型は、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のαトコフェロール、及び０．３〜３％のｔｗｅｅｎ  ８０を含む。好ましくは、スクアレン：αトコフェロールの比は、１以下であり、これは、より安定なエマルジョンを提供する。Ｓｐａｎ  ８５は、１％のレベルで存在してもよい。場合によっては、本発明のワクチンは安定剤をさらに含むことが有利であり得る。
【０２５９】
無毒性の水中油型エマルジョンは、好ましくは、無毒性油、例えばスクアラン又はスクアレン、乳化剤、例えばＴｗｅｅｎ  ８０を水性担体中に含む。水性担体は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水でもよい。
【０２６０】
水中油型エマルジョン中のＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ及びトコフェロールを含む特に有効なアジュバント製剤は、国際公開第９５／１７２１０号に記載される。
【０２６１】
本発明は、タンパク質Ｆポリペプチド及びポリヌクレオチドを参照して記載される一方で、これは、天然のポリペプチド及びポリヌクレオチド、及び組み換えポリペプチド又はポリヌクレオチドの免疫原性特性に実質的に影響を与えない付加、欠失、又は置換を有する同様のポリペプチド及びポリヌクレオチドの断片を網羅することは、理解される。好ましい断片／ペプチドは、図１１に示される。
【０２６２】
本発明は、他の抗原、特に中耳炎を治療するのに有用な抗原と組み合わせて、本発明のワクチン製剤を含む多価のワクチン組成物を提供する。かかる多価ワクチン組成物は、以下に記載されるようなＴＨ−１誘導アジュバントを含んでもよい。
【０２６３】
好ましい実施形態では、本発明のポリペプチド、断片、及び免疫原は、１ 又は複数の以下の群の抗原：ａ）１又は複数の肺炎球菌莢膜多糖（プレーン又は担体タンパク質と結合している）；ｂ）Ｍ．カタラーリス感染に対して宿主を保護することができる１又は複数の抗原；ｃ）肺炎連鎖球菌感染に対して宿主を保護することができる１又は複数のタンパク質抗原；ｄ）１又は複数の更なる無莢膜型インフルエンザ菌タンパク質抗原；ｅ）ＲＳＶに対して宿主を保護することができる１又は複数の抗原；及びｆ）インフルエンザウイルスに対して宿主を保護することができる１又は複数の抗原と併せて製剤化される。群ａ）及びｂ）；ｂ）及びｃ）；ｂ）、ｄ），及びａ）及び／又はｃ）；ｂ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、及びａ）及び／又はｃ）の組み合わせは、好ましい。かかるワクチンは、広範囲の中耳炎ワクチンとして有利に用いられてもよい。
【０２６４】
該肺炎球菌莢膜多糖抗原は、好ましくは、血清型１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆから（最も好ましくは血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ及び２３Ｆから）選択される。
【０２６５】
好ましい肺炎球菌タンパク質抗原は、肺炎球菌の外側表面上に露出する（肺炎球菌の生活環の少なくとも一部において、宿主の免疫系により認識され得る）肺炎球菌タンパク質、又は肺炎球菌により分泌又は放出されるタンパク質である。最も好ましくは、該タンパク質は、毒素、付着因子、2-成分シグナル変換器、又は肺炎連鎖球菌のリポタンパク質又はこれらの断片である。特に好ましいタンパク質としては、限定しないが、ニューモリシン（好ましくは化学的処理又は突然変異誘発により解毒化される）［Mitchell et al. Nucleic Acids Res. 1990 Jul 11 ; 18(13): 4010 "Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.", Mitchell et al. Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23; 1007(1 ): 67-72 "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties"、国際公開第９６／０５８５９号（A. Cyanamid）、国際公開第９０／０６９５１号（Paton et al）、国際公開第９９／０３８８４号（NAVA）］；ＰｓｐＡ及びこの膜貫通欠損変異体（国際公開第９２／１４４８８号；国際公開第９９／５３９４０号；米国特許第５８０４１９３号−Briles et al）；ＰｓｐＣ及びこの膜貫通欠損変異体（国際公開第９９／５３９４０号；国際公開第９７／０９９９４号−Briles et al）；ＰｓａＡ及びこの膜貫通欠損変異体（Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec;64(12):5255- 62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae"）；肺炎球菌塩素結合タンパク質及びこの膜貫通欠損変異体；ＣｂｐＡこの膜貫通欠損変異体（国際公開第９７／４１１５１号；国際公開第９９／５１２６６号）；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Infect. Immun. 1996 64:3544）；ＨＳＰ７０（国際公開第９６／４０９２８号）；ＰｃｐＡ（Sanchez-Beato et al. FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14）；Ｍ様タンパク質、ＳＢ特許出願欧州特許出願第０８３７１３０号；及び付着因子１８６２７（ＳＢ特許出願欧州特許出願第０８３４５６８号）が挙げられる。
【０２６６】
さらに好ましい肺炎球菌タンパク質抗原は、国際公開第９８／１８９３１号に開示されるもの、具体的には、国際公開第９８／１８９３０号及びＰＣＴ／ＵＳ９９／３０３９０で選択されるものである。
【０２６７】
（特に中耳炎の予防のための）混合ワクチンに含むことができる好ましいモラクセラ・カタラーリスタンパク質抗原としては、ＯＭＰ１０６［国際公開第９７／４１７３１号（Antex）及び国際公開第９６／３４９６０号（PMC）］；ＯＭＰ２１；ＬｂｐＡ及び／又はＬｂｐＢ［国際公開第９８／５５６０６号（PMC）］；ＴｂｐＡ及び／又はＴｂｐＢ［国際公開第９７／１３７８５号及び国際公開第９７／３２９８０号（ＰＭＣ）］；ＣｏｐＢ［Helminen ME, et al. (1993) Infect. Immun. 61 :2003-2010］；ＵｓｐＡ１及び／又はＵｓｐＡ２［国際公開第２００７／０１８４６３号（Arne Forsgren AB）、国際公開第９３／０３７６１号（University of Texas）］；ＯｍｐＣＤ；ＨａｓＲ（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３８２４）；ＰｉｌＱ（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３８２３）；ＯＭＰ８５（ＰＣＴ／ＥＰＯＯ／０１４６８）；Ｉｉｐｏ０６（英国特許第９９１７９７７．２号）；Ｉｉｐｏ１０（英国特許第９９１８２０８．１号）；ｌｉｐｏ１１（英国特許第９９１８３０２．２号）；ｌｉｐｏ１８（英国特許第９９１８０３８．２号）；Ｐ６（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３０３８）；Ｄ１５（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３８２２）；ＯｍｐｌＡＩ（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０６７８１）；Ｈｌｙ３（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３２５７）；及びＯｍｐＥが挙げられる。
【０２６８】
（特に中耳炎の予防のための）混合ワクチンに含むことができる好ましい更なる無莢膜型インフルエンザ菌タンパク質抗原としては、フィンブリンタンパク質［（米国特許第第５７６６６０８号−Ohio State Research Foundation）］及びこれらからのペプチドを含む融合物［ｅｇ  ＬＢ１（ｆ）ペプチド 融合物；米国特許第第５８４３４６４号（OSU）又は国際公開第９９／６４０６７号］；ＯＭＰ２６［国際公開第９７／０１６３８号（Cortecs）］；Ｐ６［欧州特許第２８１６７３号（State University of New York）］；タンパク質Ｄ（欧州特許第５９４６１０号）；タンパク質Ｅ（欧州特許第１９７３９３３号）；ＴｂｐＡ及び／又はＴｂｐＢ；Ｈｉａ；Ｈｓｆ；Ｈｉｎ４７；Ｈｉｆ；Ｈｍｗ１；Ｈｍｗ２；Ｈｍｗ３；Ｈｍｗ４；Ｈａｐ；Ｄ１５（国際公開第９４／１２６４１号）；Ｐ２；Ｐ５（国際公開第９４／２６３０４号）；ＮｌｐＣ２（ＢＡＳＢ２０５）［国際公開第０２／３０９７１号］；Ｓｉｐ（ＢＡＳＢ２０３）［ＷＯ０２／３０９６０］；及びｉＯＭＰ１６８１（ＢＡＳＢ２１０）［国際公開第０２／３４７７２号］が挙げられる。
【０２６９】
好ましいインフルエンザウイルス抗原としては、全体の、生、又は不活性ウイルス、卵若しくはＭＤＣＫ細胞、又はＶｅｒｏ細胞において増殖された分割されたインフルエンザウイルス、又は（R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920に記載されるような）全体のフルビロソーム（flu virosomes）、又はこれらの精製された若しくは組み換えタンパク質、例えばＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、又はＭタンパク質、又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【０２７０】
好ましいＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）抗原としては、Ｆ糖タンパク質、Ｇ糖タンパク質、ＨＮタンパク質、又はこれらの誘導体が挙げられる。
【０２７１】
組成物、キット及び投与
本発明の更なる態様では、単細胞生物又は多細胞生物に投与のためのタンパク質Ｆポリヌクレオチド及び／又はタンパク質Ｆポリペプチドを含む組成物を提供する。
【０２７２】
本発明は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド及び／又はポリペプチド、又はこれらのアゴニスト又はアンタゴニストを含む組成物にも関する。本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは、細胞、組織、又は生物を含む使用のために、非滅菌若しくは滅菌担体、例えば個体への投与に好適な医薬的に許容される担体と組み合わせて用いてもよい。かかる組成物は、例えば媒体添加剤、又は治療的有効量の本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチド、及び医薬的に許容される担体若しくは賦形剤を含む。かかる担体は、限定することなく、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びこれらの組み合わせを含んでもよい。製剤は、投与の様式に合わせるべきである。本発明は、さらに、本発明の上述の組成物の１又は複数の成分を充填した１又は複数の容器を含む診断及び／又は医薬パック及びキットに関する。
【０２７３】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、及び他の化合物は、単独で、又は他の化合物、例えば治療的化合物と併せて用いられてもよい。
【０２７４】
医薬組成物は、中でも、例えば局所、経口、肛門、膣、静脈、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内経路による投与を含む、有効的で簡便な方法で投与されてもよい。
【０２７５】
治療において又は予防として、活性剤は、注射用組成物、例えば好ましくは等張の滅菌水性懸濁物として個体に投与されてもよい。
【０２７６】
更なる態様では、本発明は、医薬的に許容される担体又は賦形剤と組み合わせて、例えば、本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチド、アゴニスト若しくはアンタゴニストペプチド、又は小分子化合物の可溶化形態等の治療的有効量のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。かかる担体としては、限定することなく、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びこれらの組み合わせが挙げられる。本発明は、さらに、本発明の上述の組成物の１又は複数の成分を充填した１又は複数の容器を含む医薬パック及びキットに関する。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、及び他の化合物は、単独で、又は他の化合物、例えば治療的化合物と併せて用いられてもよい。
【０２７７】
該組成物は、投与経路、例えば全身性又は経口経路に適合する。全身性頭語の好ましい形態としては、注射、典型的に静脈注射が挙げられる。他の注射経路、例えば皮下、筋肉内、又は腹腔内経路を用いることができる。全身性投与の代替の方法としては、浸透剤、例えば胆汁酸塩、又はフシジン酸又は他の界面活性剤を用いた経粘膜及び経皮投与が挙げられる。加えて、本発明のポリペプチド又は他の化合物が腸溶製剤又はカプセル剤で製剤化することができる場合、経口投与は、可能であり得る。これらの化合物の投与は、軟膏、ペースト、ゲル、溶液、粉末等の形態において局所的でも及び／又は局在させてもよい。
【０２７８】
哺乳動物、特にヒトへの投与のために、活性剤の１日の投与レベルは、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、典型的には約１ｍｇ／ｋｇであることが予測される。医師は、いずれにせよ、個体に最も好適であり、特定の個体の年齢、体重及び応答により変化する実際の用量を決定する。上記の用量は、平均の場合の典型例である。もちろん、高い又は低い用量範囲がふさわしい個別の例は存在し、これらは、本発明の範囲内である。
【０２７９】
要求される用量範囲は、ペプチドの選択、投与経路、製剤の性質、対象の状態の性質、及び主治医の判断に依存する。好適な用量は、しかしながら、対象１ｋｇあたり０．１〜１００ｇの範囲である。
【０２８０】
ワクチン組成物は、都合よく、注射用形態に変換される。従来のアジュバントは、免疫応答を増大させるために用いられてもよい。ワクチン接種のための好適な単位用量は、０．５−５μｇ／ｋｇの抗原であり、かかる用量は、好ましくは、１〜３回、１〜３週間の間隔で投与される。示される用量範囲において、好適な個体へのこれらの投与を妨げる有害な毒性効果は、本発明の化合物を用いて観察されなかった。
【０２８１】
必要とされる用量における広いバリエーションは、しかしながら、入手可能の様々な化合物、及び投与の様々な経路による異なる効果の観点から予測される。例えば、経口投与は、静脈注射による投与よりも高い用量が要求されることが予測される。これらの用量レベルにおける変化は、当該技術分野において理解されるように、最適化のために標準的な経験的日常業務を用いて調節され得る。
【０２８２】
配列データベース、有形的表現媒体、アルゴリズム
ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、これらの2-及び3-次元構造を決定するため、そして同様のホモロジーの更なる配列を同定するための、有益な情報源を形成する。これらの手法は、コンピューター読み取り可能な媒体において配列を蓄え、既その後既知の巨大分子構造プログラムにおいて蓄えられたデータを用いる、又はよく知られている検索ツール、例えばGCGプログラムパッケージを用いて配列データベースを検索することにより、容易に促進される。
【０２８３】
特性配列又は鎖、特に遺伝子配列又はコードされるタンパク質配列の解析のための方法も、本発明により提供される。配列解析の好ましい方法としては、例えば、配列相同性解析、例えば同一性及び類似性解析、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質構造解析、配列アセンブリー、分岐解析、配列モチーフ解析、オープンリーディングフレーム決定、核酸ベースコーリング（nucleic acid base calling）、コドン出現頻度解析、核酸ベーストリミング、及び配列決定クロマトグラムピーク解析が挙げられる。
【０２８４】
コンピューターに基づく方法はまた、ホモロジー決定を行なうために提供される。この方法は、コンピューター読み取り可能な媒体において本発明のポリヌクレオチドの配列を含む第一のポリポリヌクレオチド配列を提供すること；及びホモロジーを決定するために、前記第一のポリヌクレオチド配列と少なくとも１つの第二のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を比較する工程を含む。
【０２８５】
コンピューターに基づく方法はまた、ホモロジー決定を行なうために提供されてもよく、前記方法は、コンピューター読み取り可能な媒体において本発明のポリペプチドの配列を含む第一のポリペプチド配列を提供すること；及びホモロジーを決定するために、前記第一のポリペプチド 配列と少なくとも１つの第二のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を比較する工程を含む。
【０２８６】
本明細書中で引用される特許及び特許出願を限定することなく含む、全ての刊行物及び参考文献は、個々の個別の刊行物又は参考文献が、十分に説明され、参照により本明細書に組み込まれることが、あたかも特別に及び個別に示されるように、これらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。本願が優先権を主張する任意の特許出願はまた、刊行物及び参考文献に対して、上述の態様でその全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【０２８７】
定義 
当業者に知られるように、「同一性」とは、場合によっては、配列を比較することにより決定される、二以上のポリペプチド 配列、又は二以上のポリヌクレオチド配列間の関係性である。当該技術分野において、「同一性」とは、場合によっては、かかる配列の鎖間の一致により決定される、ポリペプチド又はポリヌクレオチド 配列間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、限定しないが、(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991 ; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)）に記載されるものを含む、既知の方法により、容易に計算することができる。同一性を決定する方法は、試験される配列間で最も大きな一致を与えるように設計される。さらに、同一性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータープログラムにおいて体系化される。配列間の同一性を決定するコンピュータープログラム法は、限定することなく、GCG プログラムパッケージのＧＡＰプログラム（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ（Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)）、及びFASTA（Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988)）を含む。プログラムのBLASTファミリーは、ＮＣＢＩ及び他の起源（BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)）から公的に入手可能である。よく知られているSmith Watermanアルゴリズムも、同一性を決定するために用いられてもよい。
【０２８８】
ポリペプチド配列比較のためのパラメータとしては、
アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)
比較マトリックス：Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 10915-10919 (1992)からのBLOSSUM62
ギャップペナルティー：８    ギャップ長ペナルティー：２
が挙げられる。
【０２８９】
これらのパラメータを用いる有用なプログラムは、Genetics Computer Group, Madison WIから「ギャップ」プログラムとして公的に入手可能である。前述のパラメータは、（エンドギャップについてはペナルティーがないことに加えて）ペプチド比較のための初期パラメータである。
【０２９０】
ポリヌクレオチド配列比較のためのパラメータとしては、
アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)
比較マトリックス：一致＝＋１０、不一致＝０
ギャップペナルティー：５０
ギャップ長ペナルティー：３
Genetics Computer Group, Madison WIから「ギャップ」プログラムとして入手可能である。これらは、核酸比較のための初期パラメータである。
【０２９１】
ポリヌクレオチド及びポリペプチドについての「同一性」の好ましい意味は、場合によっては、以下の（１）及び（２）に与えられる。（１）ポリヌクレオチドの実施形態としては、配列番号１５の基準配列と少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７又は１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列であって、前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号１５の基準配列と同一でもよく、あるいは基準配列と比べて特定の整数のヌクレオチド改変を含んでもよく、前記改変は、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、転移及び転換を含む置換、又は挿入からなる群から選択され、そして前記改変は、基準ヌクレオチド配列の５’又は３’末端の位置、又は基準配列若しくは基準配列内の１又は複数の隣接する群におけるヌクレオチド中のいずれかに点在しているこれらの末端位置のいずれかにおいて生じ、前記ヌクレオチド改変の数は、配列番号１５中のヌクレオチドの総数に、１００により割られる％同一性を定義する整数を掛け、配列番号１５中の前記ヌクレオチドの総数からその積を引くこと、又は
ｎn≦ｘn−（ｘn・ｙ）
［式中、ｎnはヌクレオチド改変の数であり、ｘnは配列番号１５のヌクレオチドの総数であり、ｙは、５０％に対して０．５０、６０％に対して０．６０、７０％に対して０．７０、８０％に対して０．８０、８５％に対して０．８５、９０％に対して０．９０、９５％に対して０．９５、９７％に対して０．９７、１００％に対して１．００であり、・は乗算演算子の記号であり、ここで、ｘnとｙの任意の非整数の積は、ｘnから引く前に近い整数に切り捨てられる］
により決定される、ポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを更に含む。配列番号１〜１４のポリペプチドをコードするポリペプチドの改変は、このコーディング領域におけるナンセンス、ミスセンス、又はフレームシフト突然変異を作製し得、これによりかかる改変後、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを改変し得る。
【０２９２】
例として、本発明のポリヌクレオチド配列は、配列番号１５の基準配列と同一、即ち１００％の同一であってもよく、あるいは、これは、％同一性が１００％未満であるような基準配列と比べて、特定の整数の核酸改変を含んでもよい。かかる改変は、少なくとも１つの核酸欠失、転移及び転換を含む置換、又は挿入からなる群から選択され、そして前記改変は、基準ポリヌクレオチド配列の５’又は３’末端の位置、又は基準配列若しくは基準配列内の１又は複数の隣接する群における核酸中のいずれかに点在しているこれらの末端位置のいずれかにおいて生じる。前記核酸改変の数は、配列番号１５中のヌクレオチドの総数に、１００により割られる％同一性を定義する整数を掛け、配列番号１１中の前記核酸の総数からその積を引くこと、又は
ｎn≦ｘn−（ｘn・ｙ）
［式中、ｎnは核酸改変の数であり、ｘnは配列番号１５の核酸の総数であり、ｙは、７０％に対して０．７０、８０％に対して０．８０、８５％に対して０．８５等であり、・は乗算演算子の記号であり、ここで、ｘnとｙの任意の非整数の積は、ｘnから引く前に近い整数に切り捨てられる］
により決定される。
（２）ポリペプチドの実施形態としては、配列番号１〜１４のポリペプチド基準配列と少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７又は１００％の同一性を有するポリペプチド配列であって、前記ポリペプチド配列は、配列番号１〜１４の基準配列と同一でもよく、あるいは基準配列と比べて特定の整数のポリペプチド改変を含んでもよく、前記改変は、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、保存的及び非保存的置換を含む置換、又は挿入からなる群から選択され、そして前記改変は、基準ポリペプチド配列のアミノ末端又はカルボキシ末端の位置、又は基準配列若しくは基準配列内の１又は複数の隣接する群におけるアミノ酸中のいずれかに点在しているこれらの末端位置のいずれかにおいて生じ、前記アミノ酸改変の数は、配列番号１〜１４中のアミノ酸の総数に、１００により割られる％同一性を定義する整数を掛け、配列番号１〜１４中の前記ポリペプチドの総数からその積を引くこと、又は
ｎa≦ｘa−（ｘa・ｙ）
［式中、ｎaはアミノ酸改変の数であり、ｘaは配列番号１〜１４のアミノ酸の総数であり、ｙは、５０％に対して０．５０、６０％に対して０．６０、７０％に対して０．７０、８０％に対して０．８０、８５％に対して０．８５、９０％に対して０．９０、９５％に対して０．９５、９７％に対して０．９７、１００％に対して１．００であり、・は乗算演算子の記号であり、ここで、ｘaとｙの任意の非整数の積は、ｘaから引く前に近い整数に切り捨てられる］
により決定される、ポリペプチド配列を含む、単離されたポリペプチドを更に含む。
【０２９３】
例として、本発明のポリヌクレオチド配列は、配列番号１〜１４の基準配列と同一、即ち１００％の同一であってもよく、あるいは、これは、％同一性が１００％未満であるような基準配列と比べて、特定の整数のアミノ酸改変を含んでもよい。かかる改変は、少なくとも１つのアミノ酸欠失、保存的及び非保存的置換を含む置換、又は挿入からなる群から選択され、そして前記改変は、基準ポリヌクレオチド配列のアミノ末端又はカルボキシ末端の位置、又は基準配列若しくは基準配列内の１又は複数の隣接する群におけるアミノ酸中のいずれかに点在しているこれらの末端位置のいずれかにおいて生じる。前記アミノ酸改変の数は、配列番号１〜１４中のヌクレオチドの総数に、１００により割られる％同一性を定義する整数を掛け、配列番号１〜１４中の前記アミノ酸の総数からその積を引くこと、又は
ｎa≦ｘa−（ｘn・ｙ）
［式中、ｎaはアミノ酸改変の数であり、ｘnは配列番号１５のアミノ酸の総数であり、ｙは、７０％に対して０．７０、８０％に対して０．８０、８５％に対して０．８５等であり、・は乗算演算子の記号であり、ここで、ｘaとｙの任意の非整数の積は、ｘaから引く前に近い整数に切り捨てられる］
により決定される。
【０２９４】
生物に関連して、本明細書で用いられる場合、「個体」とは、限定することなく、後生生物、哺乳動物、オービッド（ovid）、ウシ科、類人猿、霊長類を含む多細胞真核生物を意味する。
【０２９５】
「単離された」とは、その天然の状態から「ヒトの手によって」改変されたこと、即ち、天然に存在する場合、その元の環境から変更又は回収された、あるいはその双方であることを意味する。例えば、生きている生物中に自然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは、「単離」されていないが、その天然の状態の共存する材料から分離された同一のポリヌクレオチド又はポリペプチドは、本明細書で用いられる用語のように「単離」されている。さらに、形質転換、遺伝子操作、又は任意の他の組み換え法により生物に導入されるポリヌクレオチド又はポリペプチドは、その生物が生きていても生きていなくてもよい、前記生物中に未だ存在していたとしても、「単離」されている。
【０２９６】
「ポリヌクレオチド」とは、一般的に一本鎖、及び二本鎖領域を含む、未改変ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又は改変ＤＮＡ若しくはＤＮＡでもよい、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。
【０２９７】
「変異体」とは、基準ポリヌクレオチド又はポリペプチドと異なるが、重要な特性は保持しているポリヌクレオチド又はポリペプチドを意味する。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、別の基準ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なる。変異体のヌクレオチド配列の変化は、基準ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変えても変えなくてもよい。ヌクレオチドは、アミノ酸置換、付加、欠失、下記のように、基準配列によりコードされるポリペプチドにおける融合物及び切断物をもたらしてもよい。ポリペプチドの典型的な変異体は、別の基準ポリペプチドとアミノ酸配列が異なる。一般的に、違いは、基準ポリペプチド変異体の配列及び変異体が、全体的にほぼ類似であり、多くの領域において同一であるように、限定される。変異体及び参照ポリペプチドは、任意の組み合わせの１又は複数の置換、欠失によりアミノ酸配列が異なってもよい。置換された又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによりコードされるものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチド及びポリペプチドの変異体は、例えば天然の対立遺伝子変異体でもよく、天然に知られていない変異体でもよい。ポリヌクレオチド及びポリペプチドの非天然の変異体は、突然変異誘発技術又は直接合成により作製されてもよい。
【０２９８】
「疾患」とは、例えば、小児及び子供の中耳炎、高齢者の肺炎、副鼻腔炎、院内感染、及び感染病、聴力喪失を含む慢性中耳炎、中耳の液体貯留、聴覚神経損傷、言語学習遅滞、上部気道の感染、及び中耳の炎症を含む細菌による感染により引き起される、あるいは感染に関連した任意の疾患を意味する。
【実施例】
【０２９９】
実施例
下記の実験は、他の場所で詳細に記載されることが予測される場合を除いて、当業者によく知られており、日常作業である標準的な技術を用いて行なった。実施例は例証されるが、本発明を限定しない。本研究は、ベート（bate）としてビトロネクチンを用いて発見されたインフルエンザ菌のタンパク質Ｆ（ｐＦ）と称される新規のビトロネクチン結合外膜タンパク質、及び新規の切断された組み換えタンパク質Ｆ（ｐＦ）の単離、精製、特性決定、クローニング及び発現を記載する。
【０３００】
材料及び方法
細菌、試薬、及び上皮細胞株
無莢膜型インフルエンザ菌株ＮＴＨｉ３６５５は、臨床的単離物、及びR. Munson（Ohio State University, Colombus, Ohio）からの親切な贈り物である。臨床的なＮＴＨｉ単離物は、上部気道感染を有する患者（Skane County, Sweden）からの鼻咽頭のスワブにより得られた。インフルエンザ菌をＮＡＤ及びヘミンを添加した脳心臓浸出物（ＢＨＩ）培地（Difco Laboratories, Detroit, MI）中で（Sigma, St. Louis, MO）、又は記載されるようにチョコレート血液アガープレート上で（Ronander et al., 2009）一晩培養した。
【０３０１】
Ａ５４９（ＣＣＬ−１８５）及びＨ２９２上皮細胞株はＡＴＣＣから得た。双方の細胞株をＲＰＭＩ１６４０において、１０％ＦＣＳ、３７℃且つ５％ＣＯ2で維持した。
【０３０２】
二次元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
外膜小嚢（ＯＭＶ）及び外膜タンパク質を記載されるように精製した（Ronander et al., 2008, Schaar et al., 2010）。ＯＭＶをIPGphor IEFシステム（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて等電点電気泳動（ＩＥＦ）に供した（Ronander et al., 2008）。ゲルキャリブレーションのために、標準を用いた（cat. no. 161 -0320; Bio-Rad）。２−Ｄポリアクリルアミドゲルを１２０ｍＡで一晩、イモビロン−ＰＶＤＦフィルター（0.45 mm; Millipore, Bedford, MA）にエレクトロブロットした。クーマシーブルーで染色された２Ｄ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥのスポットをゲルから切り出し、記載されるように、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦにより配列決定した（Schaar et al., 2010）。
【０３０３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び膜上のタンパク質の検出（ウェスタンブロット；イムノブロット）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、Novex（San Diego, CA）社の試薬及びブロッティング装置を用いて、１０％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを用いて、１５０定電圧において、行なった（Vidakovics et al., 2010）。ゲルをクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０（Bio-Rad, Sundbyberg, Sweden）を用いて染色した。電気泳動転写後、イモビロン−Ｐ膜を、５％乳粉末を含む０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）中でブロッキングした。洗浄後、膜を室温で、２％乳粉末を含む、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中でヒトビトロネクチン（Ｓｉｇｍａ）（０．５ｐｇ／ｍｌ）とインキュベートした。同一の実験では、１／１，０００に希釈したＨＲＰ複合マウス抗ヒトビトロネクチンを洗浄後に添加した。インキュベーション後、Ｆｌｕｏｒ−ＳＭａｘにおいて、又はＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）を用いて現像を行なった。
【０３０４】
大腸菌における組み換えｐＦ１２−２９３のＤＮＡクローニング及びタンパク質発現
ＮＴＨｉ３６５５からの染色体ＤＮＡは、ｐＦコーディング配列を単離するための鋳型として用いた。制限酵素部位ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩをＰＣＲにより、ｐＦ１２−２９３をコードするＤＮＡの隣接する領域に組み込んだ。発現ベクターによりコードされる６個のヒスチジン残基を融合するために、ｐＦ１２−２９３停止コドンを突然変異誘発した。得られたＰＣＲ産物をｐＥＴ２６（＋）（Novagen, Darmstadt, Germany）とライゲートした。ｐＦをコードするプラスミドを用いて宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。組み換えｐＦ１２−２９３を生産するために、細菌をイソプロピルβ−Ｄ−ｌ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で３．５時間誘導した。遠心分離後、細菌のペレットを１ｍｇ／ｍｌのリゾチームと氷上でインキュベートし、超音波処理し、その後遠心分離した。可溶性タンパク質は、製造者により奨められるように、ニッケルレジンを含むカラム上で、天然の条件下で精製した。
【０３０５】
抗体及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ） 
特異的な抗ｐＦ抗血清を生産するために、完全な及び不完全はフロイントアジュバント（Ronander et al. 2008）を用いた標準的な手順に従った組み換えｐＦ１２−２９３を用いて、ウサギに筋肉内に３回（２週間間隔）免疫付与した。得られたポリクローナル抗体（ｐＡｂ）をＣｎＢｒ−セファロースと結合したｐＦ１２−２９３を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより単離した。加えて、抗ｐＦ４４−６８ｐＡｂを、ＣｎＢｒ−セファロースと結合した特異的なｐＦ４４−６８ペプチドを用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより単離した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−結合ブタ抗ウサギポリクローナル免疫グロブリンは、Dakopatts（Gentofte, Denmark）に由来した。組み換えの切断されたモラクセラ・カタラーリス（非ｌｇＤ結合）ＩｇＤ結合タンパク質（ＭＩＤ）９６２−１２００を陰性対照として用いた（Nordstrom et al., 2002）。
【０３０６】
マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）を記載（Ronander et al., 2009）のように、組み換えｐＦ１２−２９３を用いて免疫付与した。特異的なマウス抗ｐＦｐＡｂをＥＬＩＳＡにより分析した。手短に言えば、５０μｇの組み換えｐＦ１２−２９３を４℃で一晩、マイクロタイタープレートにコートした。洗浄後、マウス血清を添加し、室温でインキュベートした。３０分、さらに洗浄後、ＨＲＰ複合ウサギ抗マウスポリクローナル抗体を添加し、ＯＤ540における吸光度を読み取った。
【０３０７】
ｐＦ欠損インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ３６５５Δｐｆ）の製造
ＮＴＨｉ３６５５から単離したゲノムＤＮＡを鋳型として用いた。ｐｆの５’及び３’末端を増幅し、オーバーラップ伸長によりＰＣＲを用いることによりクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子を含むカセットと融合させた（Riesbeck et al. , 1999）。特異的な取り込み配列（ＡＡＧＴＧＣＧＧＴ）を隣接するプライマーの１つに含めた。記載されるように得られたＰＣＲ産物をＮＴＨｉ３６５５に変換し（Poje et al., 2003）、その後クロラムフェニコールを含むプレート上で選択した。
【０３０８】
フローサイトメトリー分析
一晩の培養物からの細菌をＯＤ600が０．８になるまで、培地中で増殖させた。その後、ＮＴＨｉ株を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄し、その後、標準的なプロトコールに従って、精製されたウサギ抗ｐＦ抗血清とインキュベートした［Samuelsson et al., 2007］。洗浄後、細菌をＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギ二次ｐＡｂｓ（Dakopatts）とインキュベートし、その後フローサイトメトリー分析（EPICS(R)XL-MCL, Coulter, Hialeah, FL）をした。
【０３０９】
上皮細胞、付着アッセイ、及びペプチド結合実験
上皮細胞株を２４ウェルプレート中でコンフルエントになるまで培養した。細菌を上述の通り補完したＢＨＩ中で培養し、３６℃で3Ｈ−チミジンでパルスした。４時間後、細菌を、１０％ＦＣＳ、０．２％グルコース、０．０２％ゼラチンを添加したＲＰＭＩ（反応媒体）で一度洗浄した。培養培地を上皮細胞から除去し、感染の多重度（ＭＯＩ）の異なる細菌（２０μｌ）を三式添加した。その後、反応媒体を添加し、５分間８００ｒｐｍで遠心分離した。３６℃で５％ＣＯ2において９０分後、ＰＢＳで３回洗浄し、トリプシン−バーゼン（Sigma）を添加した。三式のウェルをプールし、ＰＢＳで洗浄し、シンチレーションバイアルに移し、βカウンター（Wallac）において測定した。
【０３１０】
全ｐＦ配列（図１１）を網羅する一連の合成ペプチドをクロラミンＴ法（Greenwood et al., 1963）を用いて、［125ヨウ素］標識で標識した（タンパク質１モルあたり、０．０５モルのヨウ素）。ペプチドの大部分は、チロシン残基を含むが、しかし場合によっては、追加のチロシン残基がＣ末端に付加された。上皮細胞を３７℃で４５分、ＰＢＳ、２％ＢＳＡ中で、放射性標識したタンパク質とインキュベートした。その後、細胞を同一の緩衝液で洗浄し、γ−シンチレーションカウンターにおいて測定した。
【０３１１】
結果
タンパク質Ｆ（ｐＦ）は、インフルエンザ菌の新規のビトロネクチン結合タンパク質である。
無莢膜型インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）のビトロネクチン結合タンパク質を明らかにするために、外膜小嚢（ＯＭＶ）をＮＴＨｉ３６５５から単離した。ＣＯ2の存在下又は非存在下においてインキュベートした培養物から回収されたＯＭＶをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。二つのゲルを並行して泳動し、一方をナイロンフィルターにブロット（図１Ａ（ｉ）、左パネル）、他方をクーマシーブルーで染色した（図１Ｂ、左パネル）。フィルターをビトロネクチンとインキュベートし、その後抗ビトロネクチンｐＡｂ及び二次ＨＲＰ複合ｐＡｂを用いて検出した。最も強いシグナルがＣＯ2でインキュベートした細菌からのＯＭＶでえられ（図１Ａ（ｉ）、左パネル）、これは我々に同一のＯＭＶ調製を用いた２Ｄ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なうことを促した。図１Ａ（ｉ）（右パネル）に見られるように、ビトロネクチンでの明らかなシグナルが、ＣＯ2の存在下で培養した細菌からのＯＭＶを用いた２Ｄ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥに関して得られた。検出抗体が偽陽性バックグラウンドを与えないことを確かめるために、フィルターをビトロネクチンの非存在下において抗体を用いてプローブした（図１Ａ（ｉｉ））。ビトロネクチン結合スポットが２Ｄ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１Ａ（ｉ）、右パネル）において明らかになった場合、対応するスポットは、クーマシー染色２Ｄ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１Ｂ、右パネル）において明らかになった。いくつかのスポットは、配列決定のために送られ、最も有望なスポットの１つは、矢印により示されるようにＨＩ０３６２に対応する２９ｋＤａタンパク質であることがあきらかになった（図１Ａ（ｉ）及びＢ）。新しいビトロネクチン結合タンパク質は、タンパク質Ｆ（ｐＦ）と指定され、さらなる分析のために選択された。
【０３１２】
タンパク質ＦのＤＮＡ配列及びオープンリーディングフレーム 
ＮＴＨｉ３６５５中のタンパク質ＦをコードするＤＮＡは、配列決定され、詳細に分析された。完全なｐＦ配列は、２９３個のアミノ酸（図２Ａ）からなり、２２個のアミノ酸の長さであるシグナルペプチドを有する（図２Ｂ）（Nielsen et al., 1997）。該シグナルペプチドの後に、予測される付着ドメイン及びＣ末端における金属結合領域が続く。
【０３１３】
ＧｅｎｅＢａｎｋにおいて利用可能な他のｐＦ配列との相同性を比較するために、クラスター分析を行なった（図３）。見出された１５個の異なるｐＦ配列の中でも、１１個の株がＮＴＨｉ３６５５の公開配列を含む１００％保存された配列を有した。４個の株が、ＮＴＨｉ３６５５においてｐＦと９９％の同一性を有した。従ってｐＦは、他の公開された配列との比較から判断されるように、驚くほどに保存されていた。
【０３１４】
タンパク質Ｆのクローニング及び大腸菌における発現
ｐＦを発現するために、ＮＴＨｉ３６５５ゲノム配列が鋳型として用いられた。シグナルペプチド（ｐＦ１−２２）の遠位のＮ−末端の疎水性部分（１１アミノ酸）を除くオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）についてコードするＤＮＡは、増幅され、発現ベクターｐＥＴ２６にクローニングされ、形質転換された。得られる組み換えタンパク質をｐＦ１２−２９３と命名した。誘導後、ｐＦ１２−２９３をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。純粋なタンパク質を溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。６個のヒスチジンからなるＣ−末端タグを含む、得られる組み換えｐＦは、図４Ａ（左から２番目のレーン）に示される。最終生成物は、約３３ｋＤａに対応するサイズに移動した。
【０３１５】
組み換え生産されたタンパク質Ｆ（ｐＦ１２−２９３）は、ウサギ抗血清により検出され、ｐＥは、分析された全ての臨床的単離物中に存在する。ｐＦが免疫原性を有し、ウサギにおいてポリクローナル抗体応答を引き起すか否かを調査するために、動物を組み換えｐＦ１２−２９３で免疫付与した。全６週間にわたる３回の免疫付与後、特異的な抗ｐＦ抗血清を回収した。ＮＴＨｉ３６５５の外膜中のＰＦの存在が調査された。外膜小嚢（ＯＭＶｓ）を細胞上清から回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。組み換えｐＦ１２−２９３及びモラクセラ・カタラーリスからのＯＭＶをゲル上でインキュベートした（図４Ａ）。図４Ｂに見られるように、ウサギ抗血清は、組み換えｐＦ１２−２９３及びＮＴＨｉ３６５５からのＯＭＶ調製における天然のｐＦの双方を認識した一方で、交差反応性は、陰性対照としてインキュベートされたモラクセラのＯＭＶを用いて見られなかった。加えて、マウスをｐＦにより免疫付与し、これらの動物は、抗体応答を生成し、組み換えｐＦに対する即ち特異的なポリクローナル抗体がＥＬＩＳＡにおいて検出された（データは示されない）。
【０３１６】
ワクチンの観点から、全ての臨床的ＮＴＨｉ単離物がｐＦをタンパク質レベル．において発現することは重要である。これを調べるために、外膜タンパク質を一連の鼻咽頭のＮＴＨｉ単離物から単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ブロッティングした（図５）。ウェスタンブロットを特異的な抗ｐＦ抗血清を用いて行なった。タンパク質Ｆを抗血清により迅速に検出し、ｐＦを実験室において用いられる通常の増殖条件において、全ての臨床単離物において恒常的に発現させた。ウェスタンブロットは、分析される全ての株において、同一のサイズを有する単一のバンドとして移動したｐＦを示した（図５Ｂ）。要約すると、ｐＦは、免疫原性を有し、全ての臨床的ＮＴＨｉ単離物において発見された。
【０３１７】
ヘモフィラス属タンパク質Ｆは、表面露出外膜タンパク質である。ｐＦがＮＴＨｉ３６５５の表面に位置することを確かめるために、ｐｆ欠損突然変異体をクロラムフェニコールに対する耐性をもたらすクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする遺伝子カセットの導入により作製した。ｃａｔ遺伝子カセットをＰＣＲ及びオーバーラッピング伸長によりｐＦの５’−及び３’−フランキング領域と融合させた。ｐＦ発現の非存在は、クロマトグラフィーにより組み換えｐＦ１２−２９３に対して生成された抗ｐＦ抗血清を用いたウェスタンブロットにより確認された（示されない）。タンパク質Ｆ発現を、フローサイトメトリーによりさらに分析した（図６）。図６Ｂに見られるように、ｐＦは、抗ｐＦｐＡｂを用いて分析した場合、ＦＩＴＣ複合二次検出抗体のみからなるバックグラウンド対照と比べて、ＮＴＨｉ３６５５に関する強く発現された（図６Ａ）。興味深いことに、ｐｆ遺伝子が突然変異誘発された場合、表面露出ｐＦは、ＮＴＨｉ３６５５野生型と比べて、明確に消失した（図６Ｂ）。ｐＦ欠損ＮＴＨｉ３６５５Δｐｆ突然変異体に対するバックグラウンド対照は、図６Ｃに示される。これらの実験は、従って、ｐＦが、インフルエンザ菌の細菌細胞表面に位置することを証明した。
【０３１８】
タンパク質Ｆは、ビトロネクチン及びラミニンの双方と結合する外膜タンパク質である
ビトロネクチンは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の重要な構成要素であり、補体タンパク質（Ｃ）９の結合を維持し、それによるＭＡＣの中和により、膜傷害性複合体（ＭＡＣ）の形成を阻害することにより補足カスケードの恒常性を維持する役割も担う（Singh et al., 2010b）。ｐＦがビトロネクチンと結合する能力を有するか否かを試験するために、組み換えｐＦ１２−２９３をマイクロタイタープレート上にコートし、ＥＬＩＳＡにおいて全長ビトロネクチンとの結合についてＥＬＩＳＡにおいて試験した。十分に特性決定されたＵｓｐＡ２（Singh et al., 2010a）及びｐＥ（Hallstrom et al., 2009）を陽性対照として、Ｍ．カタラーリス  ＭＩＤ９６２−１２００を非ビトロネクチン結合陰性対照としてインキュベートした（Nordstrom et al., 2002）。興味深いことに、ｐＦは、ｐＥとくらべて、ビトロネクチンと僅かに強く結合する一方で、ＵｓｐＡ２は、強力な結合剤である（図７Ａ）。対称的に、ＭＩＤ９６２−１２００は、ＥＬＩＳＡにおいてビトロネクチンと結合しなかった。
【０３１９】
ｐＦ依存的なビトロネクチン結合の役割を更に調査するために、ｐＦを欠損したＮＴＨｉ３６５５Δｐｆ突然変異体を、直接結合アッセイにおいて、［125Ｉ］−ビトロネクチンとインキュベートした。興味深いことに、ｐＦ欠損突然変異体ＮＴＨｉ３６５５Δｐｆは、野生型と比較した場合、ビトロネクチン対して４０％減少した結合を示した（図７Ｂ）。
【０３２０】
多くの細菌種が上皮細胞に関する標的分子としてＥＣＭタンパク質であるラミニンを使用する。組み換えタンパク質Ｆがラミニンと結合するか否かを試験するために、組み換えｐＦ１２−２９３をマイクロタイタープレートにコートし、ラミニンを添加し、抗ラミニンｐＡｂを用いて特異的に検出した。用量応答が見られ、ｐＦは、タンパク質Ｅと比べて、ラミニンに僅か強く結合した（図８）。まとめると、ヘモフィルス属のｐＦは、ビトロネクチン及びラミニンの双方と結合し、従って、ＮＴＨｉ病原性において、重要な病原性因子である。
【０３２１】
タンパク質Ｆは、上皮細胞に付着し、活性結合ドメインは、タンパク質ＦのＮ末端部分内（アミノ酸ｐＦ２３−４８）に位置する。いくつかのビトロネクチン結合タンパク質は、上皮細胞との付着物の役割も果たす、即ち、しばしば付着因子としては働く多機能な外膜タンパク質である（Singh et al., 2010b）。ｐＦが上皮細胞との細菌結合を促進することができるかどうか試験するために、組み換えｐＦ１２−２９３をプラスチック表面に付着させた上皮細胞に添加した。最大０．１２μＭまでの増加した濃度のｐＦ１２−２９３が細胞に添加され、その後、抗ｐＦウサギ抗血清及び二次ＨＲＰ複合検出抗体（図９）を用いて検出した場合、用量応答が観察された。
【０３２２】
付着因子としてｐＦの重要性を更に証明するために、ｐＦ欠損突然変異体ＮＴＨｉ３６５５ΔｐｆをｐＦ発現天然のＮＴＨｉ３６５５野生型と比較した。興味深いことに、５０及び１００の感染の多重度において上皮細胞を用いて分析した場合、ｐＦ突然変異体は、園結合能力を５０％超喪失し（図１０）、ｐＦは重要なＮＴＨｉ付着因子であることをさらに証明した。従って、ｐＦが、上皮細胞との結合において重要な役割を果たし、細菌の付着因子として考えることができる。
【０３２３】
一連の合成ペプチドを、上皮細胞表面への結合に関与するｐＦの正確な結合領域を分析するために作製した（図１１）。ペプチドはヨウ素で標識され、二つの異なる上皮細胞株とインキュベートした。図１２にみることができるように、Ｎ末端のペプチド（ｐＥ２３−４８）は、Ｈ２９２（図１２Ａ）及びＡ５４９上皮細胞（図１２Ｂ）の双方と著しく結合した。結論として、主要な上皮結合部位は、該分子のＮ末端部分内に位置した。
【０３２４】
Ｎ−末端のｐＦ４４−６８は、表面に露出し、特異的抗体により検出され得る。
上皮細胞結合部位ｐＦのＮ末端部分に位置する可能性が高いので、該分子のこの部分は、表面に露出する。バイオインフォマティックスは、ｐＦ２３−４８が免疫原性を有しないことを明らかにした（示されない）。これに対して、ｐＦ４４−６８は、分析により免疫原性を有するとして判断された。それ故、ペプチドｐＦ４４−６８をＣｎＢｒ−セファロースと結合させ、その後起源としてｐＦ１２−２９３抗血清を用いた特異的な抗ｐＦ４４−６８ｐＡｂを吸着させた。ＮＴＨｉ３６５５野生型及びｐＦ欠損突然変異体の双方を、得られた抗ｐＦ４４−６８ウサギｐＡｂとインキュベートした。その後、ＦＩＴＣ−結合ヤギ抗ウサギ検出抗体を添加し、その後フローサイトメトリー分析をした。図１３Ｂに見ることができるように、ｐＦ発現ＮＴＨｉ３６５５を抗ｐＦ４４−６８ｐＡｂを用いて容易に検出することができる。これに対して、ｐＦ欠損突然変異体ＮＴＨｉ３６５５Δｐｆ突然変異体は、抗ｐＦ４４−６８ｐＡｂを用いて検出できなかった（図１３Ｄ）。抗ｐＦ４４−６８ｐＡｂの非存在下でインキュベートされた細菌は、また示さず、二次ｐＡｂと結合しないことを証明した（図１３Ａ及びＣ）。まとめると、ｐＦのＮ末端部分は、配列ｐＦ４４−６８に対する抗体による認識により、表面に発見され得る。
【０３２５】
参考文献
Greenwood FC, Hunter WM and Glover JS. The Preparation of 1-131 - Labelled Human Growth Hormone of High Specific Radioactivity. Biochem J 1963; 89: 114-23. 
Hallstrom T, Blom AM, Zipfel PF, Riesbeck K. Nontypeable Haemophilus influenzae protein E binds vitronectin and is important for serum resistance. J Immunol. 2009 Aug 15; 183(4):2593-601. Epub 2009 Jul 27. PubMed PMID: 19635912. 
Heino J, Kapyla J. Cellular receptors of extracellular matrix molecules. Curr Pharm Des 2009; 15: 1309-17. 
Nielsen, H., J. Engelbrecht, S. Brunak, and G. von Heijne. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering 10: 1 .
Nordstrom T, Forsgren A and Riesbeck K. The immunoglobulin D-binding part of the outer membrane protein MID from Moraxella catarrhalis comprises 238 amino acids and a tetrameric structure. J Biol Chem 2002; 277:34692-9. 
Janson, H., L.-O. Heden, A. Grubb, M. Ruan, and A. Forsgren. 1991 . Protein D, an immunoglobulin D-binding protein of Haemophilius influenzae: cloning, nucleotide sequence, and expression in Escherichia coli. Infect. Immun. 59:119. 
Kinhikar AG, Vargas D, Li H, et al. Mycobacterium tuberculosis malate synthase is a laminin-binding adhesin. Mol Microbiol 2006;60:999-1013. 
Nguyen NM, Senior RM. Laminin isoforms and lung development: all isoforms are not equal. Dev Biol 2006;294:271 -9. 
Poje G, J.R. Redfield, Transformation of Haemophilus influenzae, Methods. Mol. Med. 71 (2003) 57-70. 
Preissner, K. T., E. R. Podack, and H. J. Muller-Eberhard. 1985. The membrane attack complex of complement: relation of C7 to the metastable membrane binding site of the intermediate complex C5b-7. J. Immunol. 135:445-451 . 
Preissner, K. T. 1991 . Structure and biological role of vitronectin. Annu. Rev. Cell. Biol. 7:275-310. 
Preissner, K.T. and Seiffert, D. (1998). Role of vitronectin and its receptors in haemostasis and vascular remodeling. Thromb Res 89, 1 -21 . 
Prymula R, Peeters P, Chrobok V, Kriz P, Novakova E, Kaliskova E, Kohl I, Lommel P, Poolman J, Prieels JP, Schuerman L. (2006). Pneumococcal capsular polysaccharides conjugated to protein D for prevention of acute otitis media caused by both Streptococcus pneumoniae and non-typable Haemophilus influenzae: a randomised double-blind efficacy study. Lancet 367, 740-8. 
Riesbeck K, Chen D, Kemball-Cook G, McVey JH, George AJ, Tuddenham EG, Dorling A, Lechler Rl. Expression of hirudin fusion proteins in mammalian cells: a strategy for prevention of intravascular thrombosis. Circulation. 1998;98(24):2744-52. PubMed PMID: 9851962. 
Ronander E, Brant M, Janson H, Sheldon J, Forsgren A and Riesbeck K. Identification of a novel Haemophilus influenzae protein important for adhesion to epithelial cells. Microbes Infect 2008; 10:87-96. 
Ronander E, Brant M, Eriksson E, Morgelin M, Hallgren O, Westergren- Thorsson G, Forsgren A, Riesbeck K. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J Infect Dis. 2009 Feb15;199(4):522-31 . PubMed PMID: 19125675. 
Samuelsson M, Hallstrom T, Forsgren A, Riesbeck K. Characterization of the IgD binding site of encapsulated Haemophilus influenzae serotype b. J Immunol. 2007;178(10):6316-9. PubMed PMID: 17475860. 
Schaar V, De Vries SP, Perez Vidakovics ML, Bootsma HJ, Larsson L, Hermans PW, Bjartell A, Morgelin M, Riesbeck K. Multicomponent Moraxella catarrhalis outer membrane vesicles induce an inflammatory response and are internalized by human epithelial cells. Cell Microbiol. 2010 Nov 2. doi: 10.11 11/j.1462-5822.2010.01546.x. PubMed PMID: 21044239. 
Singh B, Blom AM, Unal C, Nilson B, Morgelin M, Riesbeck K. Vitronectin binds to the head region of Moraxella catarrhalis ubiquitous surface protein A2 and confers complement-inhibitory activity. Mol Microbiol. 2010 Mar;75(6): 1426-44. Epub 2010 Feb 19. PubMed PMID: 20199596. 
Singh B, Su YC, Riesbeck K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol Microbiol. 2010 Nov;78(3):545-60. doi: 10.11 11/j.1365-2958.2010.07373.x. Epub 2010 Sep 27. PubMed PMID: 20807208. 
Smith, H.W. and Marshall, C.J. Regulation of cell signalling by uPAR. (2010). Nat Rev Mol Cell Biol 11 , 23-36. 
Tan TT, Forsgren A and Riesbeck K. The respiratory pathogen Moraxella catarrhalis binds to laminin via ubiquitous surface proteins A1 and A2. J Infect Dis 2006; 194:493-7. 
Vidakovics ML, Jendholm J, Morgelin M, Mansson A, Larsson C, Cardell LO, Riesbeck K. B cell activation by outer membrane vesicles-a novel virulence mechanism. PLoS Pathog. 2010 Jan 15;6(1 ):e1000724. PubMed PMID: 20090836; PubMed Central PMCID: PMC2799554.
【図１Ａ】
2014516028.tif 000003
【図１Ｂ】
2014516028.tif 000004
【図２】
2014516028.tif 000005
【図３】
2014516028.tif 000006
【図４】
2014516028.tif 000007
【図５】
2014516028.tif 000008
【図６】
2014516028.tif 000009
【図７】
2014516028.tif 000010
【図８】
2014516028.tif 000011
【図９】
2014516028.tif 000012
【図１０】
2014516028.tif 000013
【図１１】
2014516028.tif 000014
【図１２】
2014516028.tif 000015
【図１３】
2014516028.tif 000016
【配列表】
2014516028000001.app
【国際調査報告】
2014516028.tif 000017
2014516028.tif 000018
2014516028.tif 000019
2014516028.tif 000020
2014516028.tif 000021
2014516028.tif 000022
2014516028.tif 000023