(57)【要約】  治療有効量の、カロテンおよび少なくとも１種のフィトステロールの相乗的な組合せを含む、経口投与用の医薬組成物であって、前記医薬組成物における前記リコペン対前記フィトステロールの比が最大で約５：１であり、前記組成物が、細胞増殖の相乗的な抑制および抗炎症効果をもたらす、医薬組成物が開示されている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量の、カロテンおよび少なくとも１種のフィトステロールの組合せを含む、経口投与用の医薬組成物であって、前記医薬組成物における前記カロテン対前記フィトステロールの比が最大約５：１である医薬組成物。
【請求項２】
前記カロテンが、リコペン、β−カロテン、ルテインおよびアスタキサンチンからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記カロテンが、リコペンを含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
フィトエン、フィトフルエンおよび少なくとも１種のトコフェロールをさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記リコペン対前記少なくとも１種のフィトステロールの前記比が、約０．９：１から４．７：１の間である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記リコペン対前記少なくとも１種のフィトステロイドの前記比が、約４：１未満である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記リコペン対前記少なくとも１種のフィトステロイドの前記比が、約３：１未満である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記リコペン対前記少なくとも１種のフィトステロイドの前記比が、約０．０５：１から０．１：１の間である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項９】
約２から１０重量％の間の量の前記リコペンおよび約１から５重量％の量の前記少なくとも１種のフィトステロールを含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記リコペンが、約６重量％の量で存在し、前記少なくとも１種のフィトステロールが、少なくとも約３重量％の量で存在する、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
約１．０から５重量％のフィトエンおよびフィトフルエンを含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
トマト抽出物を含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記少なくとも１種のフィトステロールが、β−シトステロール、カンペステロール、β−オクタステロール、スチグマステロールおよびそれらの混合物からなる群から選択されるフィトステロールを含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記少なくとも１種のフィトステロールが、前記フィトステロールの混合物を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記リコペンが、トマトに由来する、菌類供給源に由来する、または合成物である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
治療有効量の、リコペンおよび少なくとも１種のフィトステロールの組合せを含む、経口投与用の医薬組成物であって、前記医薬組成物における前記リコペン対前記フィトステロールの比が最大約５：１であり、前記組合せが前立腺細胞増殖の相乗的な抑制をもたらす、医薬組成物。
【請求項１７】
前記リコペン対前記少なくとも１種のフィトステロールの前記比が、約０．９：１から４．７：１の間である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記リコペン対少なくとも１種の前記フィトステロイドの前記比が、約４：１未満である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記リコペン対少なくとも１種の前記フィトステロイドの前記比が、約３：１未満である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記リコペン対少なくとも１種の前記フィトステロイドの前記比が、約０．０５：１から０．１：１の間である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
約２から１０％の間の量の前記リコペンおよび約１から５重量％の量の前記少なくとも１種のフィトステロールを含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記リコペンが、約６重量％の量で存在し、前記少なくとも１種のフィトステロールが、少なくとも約３重量％の量で存在する、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
約１．０から５重量％のフィトエンおよびフィトフルエンを含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
トマト抽出物を含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記少なくとも１種のフィトステロールが、β−シトステロール、カンペステロール、β−オクタステロール、スチグマステロールおよびそれらの混合物からなる群から選択されるフィトステロールを含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記少なくとも１種のフィトステロールが、前記フィトステロールの混合物を含む、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
約６から１５重量％の量のリコペン、約１．０から５重量０％の量のフィトエンおよびフィトフルエン、約１．５から４重量０％の量のトコフェロール、約０．２から１．０重量％の量のβ−カロテン、約５０から９０重量％の量の脂肪酸、ならびに前記リコペン対前記少なくとも１種のフィトステロールの比が約５：１未満になる量の少なくとも１種のフィトステロールを含む、治療有効量のトマトオレオレジンを含む経口投与用の医薬組成物。
【請求項２８】
前記リコペン対前記少なくとも１種のフィトステロールの前記比が、前立腺細胞増殖の相乗的な抑制をもたらす、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記リコペン対前記少なくとも１種のフィトステロールの前記比が、約０．９：１から４．７：１の間である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記リコペン対前記少なくとも１種のフィトステロールの前記比が、約４：１未満である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記リコペン対前記少なくとも１種のフィトステロールの前記比が、約３：１未満である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記リコペン対前記少なくとも１種のフィトステロールの前記比が、約０．０５：１から０．１：１の間である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記少なくとも１種のフィトステロールが、β−シトステロール、カンペステロール、β−オクタステロール、スチグマステロールおよびそれらの混合物からなる群から選択されるフィトステロールの混合物を含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記医薬組成物における前記少なくとも１種のフィトステロールの濃度が、約２．０から５０．０重量％である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
γ−カロテン、δ−カロテンおよびビタミンＥをさらに含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記リコペン対前記少なくとも１種のフィトステロールの前記比が、約０．１：１から３：１の間である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
約６から１５重量％の量のリコペン、少なくとも約０．０１重量％の量のリン脂質、約２から６重量％の量のモノグリセリドおよびジグリセリドの混合物、ならびに約１から１．５重量％の量の少なくとも１種のフィトステロールを含むトマトオレオレジンを調製するステップであって、前記リコペン対前記少なくとも１種のフィトステロールの比が少なくとも約５．５：１であるステップ、ならびに
前立腺細胞増殖の相乗的な抑制を提供するために、前記リコペン対前記少なくとも１種のフィトステロールの比を約５：１未満に低下させるために十分な追加量の前記少なくとも１種のフィトステロールを加えるステップ
を含む、経口投与用の医薬組成物を生成する方法。
【請求項３８】
前記リコペン対前記少なくとも１種のフィトステロールの前記比を約４：１未満に低下させるために十分な追加量の前記少なくとも１種のフィトステロールが加えられる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記リコペン対前記少なくとも１種のフィトステロールの前記比を約３：１未満に低下させるために十分な追加量の前記少なくとも１種のフィトステロールが加えられる、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主にトマトにおいて見出される特定のカロテノイドに関する。より詳細には、本発明は、トマトを含めた様々な食品において一般的に見出される、特定のカロテノイドおよびフィトステロールの組合せに関する。さらにより詳細には、本発明は、医薬組成物に使用され、特に前立腺細胞増殖抑制において相乗性を示すこれらの化合物の組合せに関する。
【背景技術】
【０００２】
カロテノイドは、黄色から赤色までを含み多岐にわたる色によって特徴付けられる色素の一群である。カロテノイドは、一般的には多種多様な植物原料によって生成され、最も一般的にはトマト、ニンジン、トウガラシなどの植物に関連する。
【０００３】
リコペン、およびその前駆物質であるフィトエンおよびフィトフルエンは、トマトにおいて一般的に見出され、リコペンはトマトに関連する明赤色の主要な供給源である。フィトエンは、フィトフルエン、リコペンおよび他のカロテノイドの前駆物質であり、またトマトにおいて高濃度で見出される。リコペンは、通例、人体の血漿に存在する。カロテノイドは、抗酸化性を有し、結果的に、心血管疾患および癌の潜在的な危険性を低下させるだけではなく、ヒトの様々な生理学的活性に対する加齢による変性の影響を遅延および／または好転させることを含めて、多くの有益な健康効果をもたらすことが知られている。
【０００４】
フィトステロール（植物ステロール）は、ステロイドアルコールの一群、すなわち植物中に天然に存在するフィトケミカルであり、動物性生成物におけるコレステロールに相当するものである。その構造は、いくつかの変更を伴うコレステロールの構造に類似する。これらの変更は、側鎖に及び、二重結合および／またはメチル基もしくはエチル基の付加を含む。最も一般的な食物のフィトステロールはβ−シトステロール、カンペステロールおよびスチグマステロールである。西洋人の食事はβ−シトステロールを８０ｍｇ／日含有する。フィンランド人の食事では、１４０−１７５ｍｇ／日含有する（Ｖａｌｓｔａら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（２００４年）、９２、６７１−６７８頁参照）のに対して、ベジタリアンおよび日本人の食事は、それぞれ３４５ｍｇ／日および４００ｍｇ／日含有する。フィトステロールの最適な食物供給源は、未精製植物油、種子、堅果および豆果である。植物油の加工（精製および脱臭など）は、フィトステロールの含有量を減少させるが、減少量は油の種類により変動する。しかし、精製油の水素化はフィトステロールの含有量にほとんど影響を及ぼさない。
【０００５】
植物ステロールおよび植物スタノールは、効果的に血漿ＬＤＬコレステロールを減少させ、アテローム性動脈硬化の危険性を低下させる（１）。さらに、他の代謝プロセスに対する植物ステロールおよび植物スタノールの潜在的な効果は、依然解明されていない（２）。
【０００６】
フィトステロールは、体内で内因的に合成されないので、腸管吸収による食事のみに由来する。哺乳類の組織における血漿フィトステロール値は、通常はきわめて低いが、コレステロールと比較して、主に腸管からの吸収に乏しく、肝臓からの排泄がより速いためである（３）。コレステロール（３５−７０％）と比較して、植物ステロールおよび植物スタノール（０．０２−３．５％）の吸収は低いが、少量が血中で見出され、特定の生理学的機能に影響を与えることができる。フィトステロールの腸管吸収は選択的である；動物において、カンペステロールはβ−シトステロールよりもよく吸収されるが、スチグマステロールはごくわずかにしか吸収されない。通常の条件下において、１６０−３６０ｍｇ／日の日常的な食物を摂取したとしても、ヒトの血漿中で、フィトステロールは０．３−１．７ｍｇ／ｄｌしか見出されていない。健常成人における総血漿植物ステロール濃度は、７μｍｏｌ／Ｌから２４μｍｏｌ／Ｌの範囲に及び、総血漿ステロール濃度の１％未満を占める（４）。他の研究者は、血中において検出できるフィトステロールはβ−シトステロールおよびカンペステロールの２種のみであったことを報告している（１、５）。
【０００７】
本明細書の実施例２で示されている手順に従って測定した以下の表１で示されているように、トマトオレオレジンにおいて最も一般的なフィトステロールは、β−シトステロール、カンペステロールおよびスチグマステロールである。
【０００８】
【表１】
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【０００９】
非特異的免疫系の重要な部分を形成する炎症プロセスは、微生物因子および他の潜在的に有害な環境因子にさらされた際の、宿主防御に不可欠である一連の複雑な化学変化および細胞変化によって特徴付けられる。有害物質に対する宿主防御において、マクロファージは重要な役割を担い、自己免疫疾患、感染症および炎症性障害を含めた様々な疾患プロセスに関与する。ＬＰＳおよびＩＦＮ−γなどの炎症性刺激は、マクロファージを活性化して、ＴＮＦαおよびＩＬ−１βなどの様々な炎症誘発性サイトカイン、ならびに、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）および誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）によってそれぞれ合成されるＰＧＥ２および一酸化窒素（ＮＯ）を含めた他の炎症性メディエーターを産生する。これらのすべてが宿主防御に重要であるが、それらの放出が増えると、炎症状況を促進し、酸化ストレス関連損傷を細胞に引き起こすことがある。多くの症例において、炎症は不適切に誘発され、および／または宿主に有害になる程度まで持続することがある。そのような症例において、特に、非感染性炎症疾患の症例において、炎症プロセスの１つ以上の側面が発現することを抑制または予防する必要が生じ得る。
【００１０】
きわめて多くの様々な化学的メディエーターが、炎症プロセスの発現および制御に関与することが示されている。いくつかの異なる研究所による近年の研究は、一酸化窒素（ＮＯ）を、様々な種類の関節炎、胃腸管疾患、中枢神経系の炎症状態および特定の種類の喘息を含めた様々な急性および慢性の炎症性障害の重要な修飾因子として関連付けている。結果的に、ＮＯ産生を抑制すると、これらの炎症性障害を処置および／または管理するために有用な治療機序を提供できることが提示されている。さらに、ＮＯ合成の抑制は、本来まったく炎症ではないいくつかの状態または状況において有用であることも示されている。したがって、例えば、ＮＯ合成の抑制は、２型糖尿患者の四肢組織において、運動中に、グルコース摂取を低下させることが見出されている。
【００１１】
いくつかの天然生成物を含めた、他の数種の化合物も、ＮＯ産生を抑制することが示されている。この群は、ルテイン［Ｒａｆｉ  Ｍ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ  Ｎｕｔｒ  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ．、２００７年３月；５１（３）：３３３−４０頁；Ｃｈｏｉ，Ｊ．Ｓ．  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．２００６年６月；２２（６）：６６８−７１頁］およびリコペン［Ｒａｆｉ，  Ｍ．Ｍ．ら、Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．、２００７年１月；７２（１）：Ｓ０６９−７４頁］などの化合物を含む。しかし、多くの天然生成物のＮＯ抑制剤の有効性および作用強度は、特に高くはないと判明している。したがって、改善された天然起源のＮＯ産生抑制組成物の必要性が存在する。
【００１２】
別のきわめて重要な炎症性メディエーターは、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）であり、マクロファージ、好中球およびリンパ球を含めた様々な細胞種によって産生されるサイトカインである。ＴＮＦ−αは、炎症プロセスの初期段階において重要な地位を占め、幅広い炎症誘発性遺伝子の産生および活性化の刺激の原因となる。したがって、炎症誘発の重要な役割の観点において、ＴＮＦ−αは明らかに、抗炎症剤の重要な潜在的治療標的である。
【００１３】
活性酸素種（ＲＯＳ）およびアラキドン酸（ＡＡ）代謝物の無制御な産生は、心血管疾患および癌の発病に寄与する。アテローム性プラークまたは腫瘍に浸潤した炎症細胞は、ＲＯＳおよびエイコサノイドの主な発生源である。したがって、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２（−））、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）および一酸化窒素（＊ＮＯ）などのＲＯＳ値に対する、オリーブオイル由来のフィトステロールであるβ−シトステロールの効果が研究されている（６）。ホルボールエステル（ＰＭＡ）刺激マクロファージ（ＲＡＷ２６４．７細胞）によるＡＡの放出およびエイコサノイドの産生も研究されている。β−シトステロールは、ＰＭＡにより誘導されるＯ２（−）および（Ｈ２Ｏ２）の産生を減少させることが示され、プレインキュベーションの３−６時間後にその効果が働いた。β−シトステロールは、ＰＭＡにより誘導される＊ＮＯ放出も減少させ、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）値の低下に相関する（６）。
【００１４】
前立腺癌および良性前立腺過形成（ＢＰＨ）は、男性において、前立腺の生理学的機能に影響を与え、尿機能を損なう、加齢に関連した状態である。男性が加齢するにつれて、前立腺は徐々に肥大化して、（ａ）微弱なおよび／または間欠的な尿流によって例示される閉塞性症状、排尿後の膀胱における残尿感、排尿終了時の滴下または漏出ならびに／または（ｂ）尿意切迫、頻尿および遺尿症によって例示される刺激性症状を引き起こす。閉塞性および刺激性の泌尿器症状は、一般的に下部尿路症状（ＬＵＴＳ）と呼ばれる。前立腺癌、ＢＰＨおよびＬＵＴＳの症状に関する現在の処置は、薬物療法からなり、極端な症例では大手術を必要とする。使用される２つの主な薬物分類は、α−ブロッカーおよび５−α−還元酵素阻害剤であり、持続的な有効性を得るために、無期限で服用すべきである。手術が行われる場合、結果は通常奏功するが、そのような手術に伴う一定の危険性がある。
【００１５】
米国特許出願公開第２００５／００３１５５７号（「５５７公開」）は、β−カロテン、ルテインおよびリコペンを含有する経口組成物について記載し、太陽光線の防止用に、潜在的に加えられる材料としてフィトエンおよびフィトフルエンを含む。この公開は、特定量のフィトエンまたはフィトフルエンが、ルテイン、またはα−カロテン、アスタキサンチン、α−クリプトキサンチン、β−クリプトキサンチン、ゼアキサンチン、フィトエン、フィトフルエン、γ−カロテンおよびニューロスポリンからなるフィトケミカルのリストのいずれかと比較して、好ましいことを指摘していない。’５５７公開は、組成物におけるそのリストの構成要素のいずれかを含む理由を示していない。
【００１６】
疫学的研究および実験研究は、食物のフィトステロールが、西洋社会において最も多い、大腸癌、乳癌および前立腺癌などの癌からの保護を提供できることを示唆している。フィトステロールがこの保護を提供することによる、実行可能な機序は、膜構造、腫瘍および宿主組織の機能、腫瘍増殖およびアポトーシスを調節する信号伝達経路（８）ならびに宿主の免疫機能（９）に対するフィトステロールの効果を含む。宿主によるコレステロール代謝、β−シトステロール補充も、腫瘍細胞膜におけるコレステロールおよび他の脂質を減少させる（１０）。さらに、以下の表２は、数種のインビトロ研究またはヒト癌細胞株に対するフィトステロールの効果に関する結果を要約している：
【００１７】
【表２】
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【００１８】
２つの一般的なフィトケミカルであるレスベラトロールおよびβ−シトステロールがヒト前立腺癌増殖を抑制することにより実行可能な機序を特定するために、さらなる研究が行われた（１４）。これらの研究において、ヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３細胞）は５０μＭのレスベラトロールまたは１６μＭのβ−シトステロールが単独で、または組み合わせて最長５日間補充された（１４）。２つの化合物の組合せは、一方の化合物単独よりも優れた増殖抑制を引き起こした。これらのデータに基づいて、これらのフィトケミカルは、アポトーシスを刺激し、細胞周期の様々な位置で細胞を停止させることにより、腫瘍増殖抑制を誘導でき、該機序は、ＲＯＳおよびプロスタグランジンの産生の変化に関与できると結論を出した（１４）。
【００１９】
さらなる報告も、フィトステロールおよびω−３脂肪酸（ｎ−３）の組合せは、心血管疾患の危険因子をさらに低下させると指摘した（１５）。
【００２０】
植物ステロールおよび植物スタノールは、炭化水素カロテノイドの血漿濃度を低下させるが、含酸素カロテノイドおよびトコフェロールの血漿濃度は低下させないと報告されている（３，１６）。ある報告において、サラダドレッシングにおける植物ステロールエステル（ＰＳＥ）が血漿脂質および血漿カロテノイドを修飾する能力が、栄養制限食、体重維持食、等カロリー食を与えられた男性２６名女性２７名で測定された（１７）。ＰＳＥ３．６ｇの摂取は、ＬＤＬコレステロール（９．７％）およびトリグリセリド（７．３％）の減少を引き起こしたが、ＨＤＬコレステロールの変化は観察されなかった。ＰＳＥの摂取に伴って、総血漿カロテノイドは９．６％減少した。特に、β−カロテン、α−カロテンおよびβ−クリプトキサンチンは有意に減少した。すべての食事に対して血漿カロテノイドは通常の範囲内のままであった。別の研究において、データは、遊離植物ステロールおよびＰＳＥが、β−カロテンのバイオアベイラビリティを約５０％、α−トコフェロールのバイオアベイラビリティを約２０％低下させることを指摘する（１８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／００３１５５７号
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ｖａｌｓｔａら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（２００４年）、９２、６７１−６７８頁
【非特許文献２】Ｒａｆｉ  Ｍ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ  Ｎｕｔｒ  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ．、２００７年３月；５１（３）：３３３−４０頁
【非特許文献３】Ｃｈｏｉ，Ｊ．Ｓ．  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．２００６年６月；２２（６）：６６８−７１頁
【非特許文献４】Ｒａｆｉ，  Ｍ．Ｍ．ら、Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．、２００７年１月；７２（１）：Ｓ０６９−７４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
上記の報告された研究にもかかわらず、カロテノイド、例えばリコペンを含む治療用の医薬組成物の必要性は残る。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明によれば、治療有効量の、少なくとも１種のカロテノイド、好ましくはリコペン、β−カロテン、ルテインまたはアスタキサンチン、最も好ましくはリコペンおよび少なくとも１種のフィトステロールの相乗的な組合せを含む、経口投与用の医薬組成物であって、医薬組成物における、リコペンなどのカロテノイド対少なくとも１種のフィトステロールの比が最大で約５：１である、医薬組成物が発見された。好ましくは、この組成物は、フィトエン、フィトフルエンおよびトコフェロールをさらに含む。好ましい実施形態において、リコペン対少なくとも１種のフィトステロールの比は約０．９：１から４．７：１の間である。好ましくは、リコペン対少なくとも１種のフィトステロールの比は約４．０：１未満、より好ましくは、約３．５：１未満、最も好ましくは約３：１未満である。
【００２５】
本発明の医薬組成物の一実施形態によれば、組成物は約２から１０重量％の間の量のリコペンを、１から５重量％の量の少なくとも１種のフィトステロールと組み合わせて含む。
【００２６】
本発明の医薬組成物の別の実施形態によれば、リコペンが約６−１５重量％の量でトマトオレオレジン中に存在し、少なくとも１種のフィトステロールが少なくとも約１重量％の量で存在する。好ましくは、医薬組成物は、約１．０から５重量％、好ましくは約１．５から３重量％のフィトエンおよび／またはフィトフルエンの組合せを含む。好ましくは、医薬組成物は、トマト抽出物（オレオレジン）を含む。好ましい実施形態において、少なくとも１種のフィトステロールは、β−シトステロール、カンペステロール、β−オクタステロール、スチグマステロールおよびそれらの混合物を含む。好ましくは、少なくとも１種のフィトステロールは、これらのフィトステロールの混合物を含む。
【００２７】
本発明の別の実施形態に従って、治療有効量の、リコペンおよび少なくとも１種のフィトステロールの相乗的な組合せを含む経口投与用の医薬組成物であって、医薬組成物におけるリコペン対少なくとも１種のフィトステロールの比が最大で約５：１であり、組合せが前立腺細胞増殖の相乗的な抑制をもたらす、医薬組成物が発見された。好ましい実施形態において、リコペン対少なくとも１種のフィトステロールの比は、約０．９：１から４．７：１の間である。好ましくは、リコペン対少なくとも１種のフィトステロールの比は、約４．０：１未満、より好ましくは約３．５：１未満、最も好ましくは約３：１未満である。
【００２８】
本発明の医薬組成物の一実施形態によれば、組成物は、約２から１０重量％の間の量のリコペンを、１から５重量％の量の少なくとも１種のフィトステロールと組み合わせて含む。
【００２９】
本発明の医薬組成物の別の実施形態によれば、リコペンが約６−１５重量％の量でトマトオレオレジン中に存在し、少なくとも１種のフィトステロールが少なくとも約１重量％の量で存在する。好ましくは、医薬組成物は約１．０から５重量％、好ましくは約１．５から３重量％のフィトエンおよびフィトフルエンの組合せを含む。好ましくは、医薬組成物は、トマト抽出物（オレオレジン）を含む。好ましい実施形態において、少なくとも１種のフィトステロールは、β−シトステロール、カンペステロール、β−オクタステロール、スチグマステロールおよびそれらの混合物を含む。好ましくは、少なくとも１種のフィトステロールは、これらのフィトステロールの混合物を含む。
【００３０】
本発明の別の実施形態に従って、約６から１５重量％の量のリコペン、約１．０から５．０重量％の量のフィトエンおよび／またはフィトフルエン、約１．５から４．０重量％の量のトコフェロール、約０．２から１．０重量％の量のβ−カロテン、約５０から９０重量％の量の総脂肪酸含有量、ならびにリコペン対少なくとも１種のフィトステロールの比が約５：１未満となる量の少なくとも１種のフィトステロールを含む、治療有効量のトマトオレオレジンを含む経口投与用の医薬組成物が発見された。好ましい実施形態において、リコペン対少なくとも１種のフィトステロールの比は、前立腺細胞増殖の相乗的な抑制をもたらす。好ましくは、リコペン対少なくとも１種のフィトステロールの比が約０．９：１から４．７：１の間、より好ましくは約４：１未満、より好ましくは約３：１未満であり、好ましい実施形態において、約０．０５：１から２．１：１の間である。好ましい実施形態において、少なくとも１種のフィトステロールは、β−シトステロール、カンペステロール、β−オクタステロール、スチグマステロールおよびそれらの混合物を含む。
【００３１】
本発明の医薬組成物の一実施形態によれば、医薬組成物における少なくとも１種のフィトステロールの濃度は約２．０から５０重量０％である。
【００３２】
本発明の医薬組成物の別の実施形態によれば、組成物は、γ−カロテン、δ−カロテンおよびビタミンＥをさらに含む。
【００３３】
本発明の医薬組成物の別の実施形態によれば、リコペン対少なくとも１種のフィトステロールの比は約０．１：１から３：１の間である。
【００３４】
本発明によれば、約６から１５重量％の量のリコペン、少なくとも約０．０１重量％の量のリン脂質、約２から６重量％の量のモノグリセリドおよびジグリセリドの混合物、ならびに約１から１．５重量％の量の少なくとも１種のフィトステロールを含むオレオレジンを含むトマト抽出物を調製するステップであって、リコペン対少なくとも１種のリン脂質の比が約２：１であるステップ、ならびに前立腺細胞増殖の相乗的な抑制をもたらすために、リコペン対少なくとも１種のフィトステロールの比を約３：１未満、好ましくは約０．１から３：１の間に低下させるために十分な追加量の少なくとも１種のフィトステロールを加えるステップを含む、経口投与用の医薬組成物を生成する方法が発見された。
【００３５】
本発明の別の実施形態によれば、本発明の医薬組成物のリコペンおよびフィトステロールの成分は、好ましくは天然に存在し、好ましくはトマトからパルプとして抽出される。トマトのパルプが適切に抽出されて、本発明の組成物に変換できるオレオレジンを、そこにさらなる量のフィトステロールを取り込むことなどにより生成され、次いで微小ビーズまたは乾燥粉末原料に加工できる。様々な実施形態において、これらの組成物は、ソフトゲルカプセルもしくは「ハードシェル」カプセルに適切にカプセル化され、または場合によって錠剤もしくは必要に応じてサシェの束などに構成される。
【００３６】
したがって、本発明の一実施形態に従って、表１に記載の知られているトマトオレオレジンと比較して、現在以下の通りのフィトステロール値を含むトマトオレオレジンが現在提供できる（再度、本明細書の実施例２で説明された手順に従って測定された。）。
【００３７】
【表３】
2014513075.tif 000005
【００３８】
本発明の別の実施形態によれば、本発明の組成物を含むトマトオレオレジンは、リコペンおよびフィトステロールに加え、フィトエンおよびフィトフルエン成分、ならびに１種以上のβ−カロテン、γ−カロテンおよびδ−カロテン、トコフェラール、ならびにリン脂質を含有できる。
【００３９】
順番に図に言及している以下の詳細な記載を参照すれば、本発明の主題はよりよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１Ａ】β−シトステロール（−○−）およびβ−シトステロールと０．４μＭのリコペンの組合せ（−●−）を用いた処置に起因するＬＮＣａＰ細胞の制御率に基づく、細胞増殖抑制に関するグラフである。
【図１Ｂ】β−カンペステロール（−○−）およびβ−カンペステロールと０．４μＭのリコペンの組合せ（−●−）を用いた処置に基づくＬＮＣａＰ細胞の制御率に起因する、細胞増殖抑制に関するグラフである。
【図１Ｃ】β−オクトステロール（−○−）およびβ−オクトステロール０．４μＭとリコペンの組合せ（−●−）を用いた処置に基づくＬＮＣａＰ細胞の制御率に起因する、細胞増殖抑制に関するグラフである。
【図１Ｄ】β−スチグマステロール（−○−）およびβ−スチグマステロールと０．４μＭのリコペンの組合せ（−●−）を用いた処置に基づくＬＮＣａＰ細胞の制御率に起因する、細胞増殖抑制に関するグラフである。
【図１Ｅ】数種の濃度でリコペンを用いた処置に起因するＬＮＣａＰ細胞の制御率に基づく、細胞増殖抑制に関するグラフである。
【図２】リコペン、およびフィトステロールであるカンペステロールの組合せの存在下における、インビトロでのヒトアンドロゲン依存性前立腺癌細胞増殖の相乗的な抑制に関するグラフである。これらの実験において、ＬＮＣａＰ細胞が０．５％血漿中で２４時間プレインキュベートされ、次いで、増殖（チミジンの取り込みを測定することにより定量された。）が１ｎＭのＤＨＴにより刺激された。刺激された細胞は、指示濃度のフィトステロール（０．４μＭ）単独、リコペン（０．４μＭ）単独またはフィトステロールおよびリコペンの組合せを用いて３日間処理された。提示されているデータは、４連で行われた非依存性実験２−３件の平均値±ＳＥである。
【図３Ａ】５．５を超えるリコペン／フィトステロール比を有するＬｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ（登録商標）という製品の、一酸化窒素(ＮＯ)産生の抑制率に関するグラフである。
【図３Ｂ】３．６および３．６８のリコペン／フィトステロール比を有するＬｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ（登録商標）およびフィトステロールの混合物の、一酸化窒素(ＮＯ)産生の抑制率に関するグラフである。
【図３Ｃ】１．１７および１．５８のリコペン／フィトステロール比を有するＬｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ（登録商標）およびフィトステロールの混合物の、一酸化窒素(ＮＯ)産生の抑制率に関するグラフである。
【図４Ａ】５．５を超えるリコペン／フィトステロール比を有するＬｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ（登録商標）という製品の、ＴＮＦ−α産生の抑制率に関するグラフである。
【図４Ｂ】３．６および３．６８のリコペン／フィトステロール比を有するＬｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ（登録商標）およびフィトステロールの混合物の、ＴＮＦ−α産生の抑制率に関するグラフである。
【図４Ｃ】１．１７および１．５８のリコペン／フィトステロール比を有するＬｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ（登録商標）およびフィトステロールの混合物の、ＴＮＦ−α産生の抑制率に関するグラフである。
【図５Ａ】フィトステロール単独の、一酸化窒素(ＮＯ)産生の抑制率に関するグラフである。
【図５Ｂ】様々なリコペン／フィトステロール比を有するＬｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ（登録商標）およびフィトステロールの混合物の、一酸化窒素(ＮＯ)産生の抑制率に関するグラフである。
【図６Ａ】フィトステロール単独の、ＴＮＦ−α産生の抑制率に関するグラフである。
【図６Ｂ】様々なリコペン／フィトステロール比を有するＬｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ（登録商標）およびフィトステロールの混合物の、ＴＮＦ−α産生の抑制率に関するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本明細書は、本発明を詳細に示し、明確に主張する特許請求の範囲で終わるが、本発明は以下の記載からよりよく理解されるはずであると考えられている。
【００４２】
「約」、「通例」、「実質的に」などの用語は、絶対的なものではないが先行技術に読め（ｒｅａｄ  ｏｎ）ないように用語または数値を修飾すると解釈されるものである。そのような用語は、当業者によってそれらの用語が理解されるように、状況およびそれらが修飾する用語によって定義されるものである。これには、少なくとも、数値を測定するために使用される所定の技術に対する、予想される実験誤差、技術誤差および器械誤差が含まれる。
【００４３】
本明細書で使用されているすべての割合、部分および比は、特別の定めのない限り、組成物全体の重量に対してのものである。それらが表示材料に関連するように上記すべての重量は、活性値に基づいており、したがって特別の定めのない限り、市販の原料に含まれ得る溶媒または副産物を含まない。行われたすべての測定は、特別の指定のない限り、２５℃および標準圧である。すべての温度は、特別の定めのない限り、摂氏温度である。
【００４４】
本明細書で使用されている数の範囲は、詳細に開示されていようといまいと、その範囲内に含有される数の各数および部分集合を含むことが意図されている。さらに、これらの数の範囲は、その範囲における数のあらゆる数または部分集合を対象とした特許請求の範囲の裏付けを提供すると解釈されるべきである。例えば、１から１０の開示は、２から８、３から７、５、６、１から９、３．６から４．６、３．５から９．９などの範囲を裏付けると解釈されるべきである。本明細書に挙げられているすべての範囲は、２つの数値の「間」の範囲を挙げるものを含めた終点を含む。
【００４５】
本発明の個別の特徴または限定に対するすべての言及は、特別の定めがない、または言及が行われる文脈によって明らかに反対が意味されない限り、対応する複数の特徴または限定およびその逆を含むものとする。したがって、特別の指示がない限り、本明細書で使用されている「ａ」および「ａｎ」は、例えば「ａ  ｐｈｙｔｏｓｔｅｒｏｌ」が１種以上のフィトステロールを意味できるように、複数を含む。
【００４６】
本明細書で使用されている方法またはプロセスステップのすべての組合せは、特別の定めがない、または言及される組合せが行われる文脈によって明らかに反対が意味されない限り、あらゆる順で行われ得る。
【００４７】
本発明の医薬組成物および対応する方法は、本明細書に記載されている本発明の本質的な要素および限定、ならびにさらなる、もしくは場合による材料、成分もしくは限定、またはそこに記載の他に有用なものを含むことができ、それらからなることができ、または本質的にそれらからなることができる。本明細書で使用されている「含む」は、挙げられている要素、または構造もしくは機能がそれらと同等なもの、さらに他のあらゆる要素または挙げられていない要素を意味する。「有する」および「含む」という用語も、文脈が他に示唆しない限り、制約がないものとして解釈される。
【００４８】
本発明は、トマトから、発酵から、または藻類もしくは菌類によってなどの合成供給源または他の天然供給源を含めて、多種多様な供給源に由来する、リコペンなどのカロテンならびに１種以上の治療用のフィトステロールを含む医薬組成物を提供する。本明細書で検討されたように、リコペンおよびその前駆物質であるフィトエンおよびフィトフルエンは、トマトの果実から生成されるオレオレジン中に見出され得る。適切なトマトの果実は、非遺伝子組換え植物または遺伝子組換え植物によって生産され、好ましくは高濃度のリコペンを含有する一方で、上で言及されたように、フィトステロールも含む。しかし、これらの知られている組成物におけるフィトステロールの値は低く、リコペンおよびフィトステロールの比は約５：１以上になる。したがって、これらのトマトオレオレジンに由来する本発明の組成物を調製するには、リコペン対フィトステロールの比を低下させるために、さらなるフィトステロール（複数可）が加えられなければならない。次いで、本発明の組成物が調製される場合、好ましくはソフトゲルカプセルに包み込まれ、大豆油、カボチャ種子油、ブドウ種子油などによって例示される食用油をさらに含むことができる。適切に送達するさらなる方法も本明細書において検討されており、当業者によく知られている。
【００４９】
本発明の組成物は、多数の有益な治療効果を有することが示されている。本明細書のデータは最初に、前立腺細胞増殖抑制に関する、重要な予期しない相乗的な影響を実証する。したがって、癌処置におけるその使用は、かなり重要な適用である。さらに、これらの組成物は、炎症状態の軽減に対する、予期しない相乗的な影響を有することも示されている。当然ながら、これは、組成物の潜在的な使用分野全体を増大させる。最終的に、これらの組成物は、ＬＤＬコレステロールの酸化においてなど、様々な心血管状態の処置に対する適用も有する。
【００５０】
本発明の最も好ましい実施形態は、フィトステロールとともに、カロテンとしてリコペンを含むが、本出願人は、他のカロテン、特にリコペンのものと類似した構造を有するカロテンも使用できることを見出した。したがって、これらは、リコペンに加えて、β−カロテン、ルテインおよびアスタキサンチンを含む。したがって、本出願人は、これらのさらなるカロテンが、上で論じられた抗炎症効果などの、類似した相乗効果を有することを見出した。したがって、本開示の残りにおいて、リコペンが強調されているが、特にβ−カロテン、ルテインおよびアスタキサンチンを含めたこれらのさらなるカロテンは、本明細書で強調されているリコペンの代わりに使用できることが理解される。
【００５１】
リコペンおよびフィトステロールの成分は、好ましくはトマトの果実から抽出物に加工される。成分は、トマトパルプから水を除去することにより濃縮でき、それによって、リコペン、フィトエンおよびフィトフルエンの成分などのより高いフィトステロール濃縮物、ならびにβ−カロテン、γ−カロテン、δ−カロテン、ビタミンＥおよびリン脂質などを含有する粘度の高いパルプを生成する。粘度の高いパルプは、オレオレジンへとさらに適切に加工され、次いで、それが加工されてオレオレジン乳化剤を形成できる。トマトオレオレジン抽出物は、大豆油またはカボチャ種子油を含むソフトゲルカプセル内にカプセル化できる。トマト抽出物は、場合によって、必要に応じてサシェの束に詰められる、または適切なキャリア（オレオレジンは液体であり、乾燥できない。）に分散される微小ビーズへと配合でき、場合によってカプセル化または錠剤化できる粉末へと加工できる。
【００５２】
リコペンの好ましい供給源の非限定的実施例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８３７，３１１号下のトマトパルプから高リコペンオレオレジンを回収するためのプロセスに従って、ＬｙｃｏＲｅｄ  Ｌｔｄ．、Ｂｅａｒ  Ｓｈｅｂａ、イスラエルによって提供されている液体である油分散型のＬｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ（登録商標）として知られるトマトオレオレジン製品を含む。
【００５３】
したがって、高リコペンオレオレジンは、トマト自体を従来の方法で前処理することによってトマトパルプから調製できる。トマトに熱処理を施し、つぶしたトマトを、上澄みおよび少なくとも２０００ｐｐｍ、好ましくは１６００から４５００ｐｐｍのリコペンを含有するパルプに分離し、好ましくは８５％以下の水分含有量でパルプに溶媒抽出を施して、リコペンを含有するオレオレジンを抽出し、消費したパルプを分離し、リコペン抽出物を溶媒から分離して、リコペンおよび他の油溶性フィトケミカルを含有するオレオレジンを得て、溶媒を回収する。このように、オレオレジンは、リコペン対少なくとも１種のフィトステロールの比が少なくとも約４：１になるように、約１から１．５重量％の量の少なくとも１種のフィトステロールとともに、約６％から１５重量％のリコペン、約１．０から５重量％のフィトエンおよび／またはフィトフルエン、約１．５から４重量％のトコフェロール、約０．２から１重量％のβ−カロテン、約５０から７０重量％の総脂肪酸を含有する。前立腺細胞増殖の相乗的な抑制をもたらすために、次いで、本発明の医薬組成物は、リコペン対少なくとも１種のフィトステロールの比を４：１未満、最も好ましくは３：１未満に低下させるため、十分な追加量の少なくとも１種のフィトステロールを加えることにより、このオレオレジンから生成できる。これらの組成物は、リン脂質を少なくとも約０．０１％、好ましくは約９．０から４．５％、ならびにモノグリセリドおよびジグリセリドの混合物を少なくとも約０．０１％、好ましくは約２から６％含むこともできる。
【００５４】
したがって、６から１５％のリコペンおよび０．６から１．１％のフィトステロールを含有する、Ｌｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ（商標登録）という製品などの知られている組成物と一致して、これらの組成物についてのリコペン対フィトステロールの比は、以下のように５．５から２５．０の範囲である。
【００５５】
【表４】
2014513075.tif 000006
【００５６】
一方、フィトステロールは、本発明に従ってこれらと同一の組成物に加えられ、したがって６から１５％のリコペンおよび１．６から６．５％のフィトステロールを含有するので、そのときリコペン対フィトステロールの比は、以下のように０．９から約４．７または約５．０未満の範囲のはずである。
【００５７】
【表５】
2014513075.tif 000007
【００５８】
本発明の医薬組成物を調製するさらに別の方法は、フィトステロール含有油を用い、リコペン供給源をそのフィトステロール組成物に加える。したがって、フィトステロールは、フィトステロールを約９５％含有する油状組成物の形態にできる。したがって、典型的なフィトステロール油のフィトステロールのうちには、最大約１０％のブラシカステロール、１５から３０％のカンペステロール、１５から３０％のスチグマステロール、および少なくとも約４０％のβ−シトステロールが含まれる。このフィトステロール油組成物に、リコペンまたはリコペン供給源を加えることができる。リコペン供給源は、上で論じたトマトオレオレジンによって、または発酵によって得られる純粋なリコペンもしくは合成供給源由来のリコペンによって得ることができる。いずれにしても、組成物全体が好ましくは約５から１０％のリコペンを含むように、十分なリコペンがフィトステロール油に加えられるべきである。したがって、組成物の残り９０から９５％は、通例、上で論じた量の特定のフィトステロールを含めたフィトステロール油を含む。この点について、組成物全体におけるリコペン対フィトステロールの比は、約０．０５：１から約０．１：１など、通例、上で論じたものよりもかなり低いはずである。
【００５９】
同様に、本明細書に記載されている、治療有効量の、リコペンおよび少なくとも１種のフィトステロールの相乗的な組合せを含む経口投与用の医薬組成物、ならびに、約６から１５重量％の量のリコペン、少なくとも約０．０１重量％の量のリン脂質、約２から６重量％の量のモノグリセリドおよびジグリセリドの混合物、ならびにリコペン対少なくとも１種のフィトステロールの比が約５：１未満、好ましくは約４：１未満、より好ましくは約３：１未満など約３．５：１未満であり、リコペン対少なくとも１種のフィトステロールの比が、本明細書で詳細に検討された前立腺細胞増殖の相乗的な抑制をもたらす量の、少なくとも１種のフィトステロールを含むオレオレジンを含む治療有効量のトマト抽出物を含む経口投与用の医薬組成物は、当業者によく知られている従来の方法によって調製できる。
【００６０】
したがって、例示された配合および本明細書に記載されている比を含む、本発明の相乗的な医薬組成物は、知られているかいないかにかかわらず、当業者による様々な効果的な配合または製造方法のいずれかにより調製できる。
【００６１】
これらの方法は、最も典型的には、最初に、上記のＬｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ（商標登録）というトマト抽出物、すなわちオレオレジンを入手すること、次に、必須のさらなるフィトステロール供給源を追加すること、続いて、食用油で希釈することを必要とし、望ましい濃度のリコペン、フィトエン、フィトフルエン、ルテインおよびフィトステロールが生じる。さらに、本明細書で使用されている「本質的にそれらからなる」は、本発明の組成物が、具体的に特定されているが、本発明の目的に関して効果がごくわずか、または中立的である成分以外の成分を含有することを意味する。したがって、Ｌｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ（商標登録）というトマト抽出物は、本発明の組成物において、具体的に特定されている成分以外の、多くの成分を含有できるが、前記トマト抽出物は、本発明の目的に影響を及ぼす成分、または特定の成分比以外本質的に含有しないことがよく知られている。様々な他の溶液、混合物または他の原料が、さらなる加工の前、途中または後で生じた望ましい希釈トマト抽出物に加えられ得ることも、本明細書で検討されている。例えば、希釈トマト抽出物は、ソフトゲルカプセルにされることに加えて、次いでさらに希釈され、熱処理され、包装されてインスタントまたは濃縮された液体を形成することができ、または希釈トマト抽出物は、熱処理され、続いて、再構成可能な粉末、例えば適切なキャリアを用いて粉末乾燥され、乾燥混合され、または凝集された再構成可能な粉末として加工および包装され得る。
【００６２】
本明細書で検討されているように、本発明に使用するためのフィトステロールは、β−シトステロール、カンペステロール、β−オクタステロールおよびスチグマステロールならびにそれらの混合物からなる群から選択される１種以上のフィトステロールを含む。
【００６３】
本明細書において開示されている医薬組成物と使用するための、例えば少なくとも約０．０１重量％の量のリン脂質は、例えばホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、セラミド−ホスホリルコリン（スフィンゴミエリン）、セラミドホスホリルエタノールアミンおよびセラミドホスホリルグリセロールを含む。
【００６４】
本明細書で使用されているように、本明細書で開示されている組成物と使用するための「モノグリセリドおよびジグリセリドの混合物」は、例えば、１−パルミトイル−２−オレオイル−グリセロール、１−ステリル−１−オレオイル−グリセロール、ならびに１−パルミトイル−２−ステアリル−グリセロールを含む。
【００６５】
本発明は特定の実施例に関して記載されているが、これらの実施形態は、本発明の原理および適用の例示にすぎないことが理解される。したがって、例示的実施形態に多数の改変が行われ、添付した特許請求の範囲により定義された本発明の精神および範囲を逸脱せずに他の措置が考案され得ることを理解されたい。
【実施例】
【００６６】
［実施例１］フィトステロールおよびリコペンの併用抗癌効果
本研究の目標は、ヒト前立腺癌細胞増殖に対する、様々なフィトステロール単独の、および低濃度のリコペンとの組合せの効果を測定することであった。
【００６７】
方法：
細胞培養および細胞増殖のアッセイ：ＬＮＣａＰ、ヒトアンドロゲン依存性前立腺癌細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｗｅｌｌ、ＭＤ）から購入した。細胞は、０．６μｇ／ｍｌのインスリンを含有するＲＰＭＩ１６４０において増殖した。すべての培地にＬ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ナイスタチン（１２．５μｇ／ｍｌ）および１０％ＦＣＳが補充された。細胞は、９６−および６−マルチウェルプレート（それぞれ４−７×１０３および１．７×１０５細胞／ウェル）上の、３％ＦＣＳまたは３％ＤＣＣのフェノールレッド不含の培地を含有し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有する培地に播種された。１日後、さらに１日インキュベートするために、培地を、０．５％ＦＣＳまたは０％の培地へと交換した。次いで、培地を、指示された濃度の微量養分（フィトステロール、カロテノイド、リン脂質など）を含有する培地に交換し、１−３日間インキュベートし続けた。インキュベーションが延長されている間、作用物質が継続して存在することを確実にするため、培地は、新しいカロテノイドを含有する培地に毎日取り替えられた。リコペンを２ｍＭの濃度のテトラヒドロフランに溶解し、−２０℃で保存した。実験の直前に、細胞培養培地に保存溶液が加えられた。培地におけるリコペンの最終濃度は、２−プロパノールおよびｎ−ヘキサンでの抽出の後で、分光測光法により測定された：ジクロロメタン［３Ｈ］チミジンの取り込みアッセイを９６−マルチウェルプレートで行った。細胞は、１．２５−２．５０ｕＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジン（μＣｉ／ウェル中、比放射能５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）で１時間から４時間インキュベートされた。ヌクレオチドの取り込みを、非標識チミジン（０．５μｍｏｌ）を加えることにより停止した。次いで、細胞を、トリプシン処理し、セルハーベスター（Ｉｎｏｔｅｃｈ）を使用してガラスファイバーフィルターの上に採集した。放射能を、放射能画像解析器（ＢＡＳ１０００、Ｆｕｊｉ）により測定した。
【００６８】
カロテノイドの分解を予防するために、薄明りの下ですべての手順を行った。
【００６９】
結果：ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞を、図１に示されている生理学的濃度（０−５０μＭ）のフィトステロールの存在下でインキュベートした。単独で試験した場合、β−シトステロールは、用量依存的に前立腺癌細胞増殖を抑制した（図１Ａの白丸）のに対して、試験した他のフィトステロールであるカンペステロール、β−オクタステロールおよびスチグマステロール（それぞれ図１Ｂ−１Ｄの白丸）は、試験された濃度で、細胞増殖抑制に対していかなる効果も有さなかった。しかし、０．４μＭ濃度のリコペン（単独では、この濃度でインビトロでの増殖を抑制しなかった（図１Ｅの通り）。）との組合せで、試験されたフィトステロール４種のすべてが、インビトロの前立腺細胞増殖に関する実質的な相乗的抑制を示した。さらに、図１Ｅに関しては、リコペンが単独で試験されたときに得られた結果がそこに示されている。
【００７０】
図１Ａ−１Ｅ。ＬＮＣａＰ細胞を、０．５％血漿中で２４時間プレインキュベートし、次いで１ｎＭのＤＨＴにより増殖（チミジン取り込み）を刺激した。刺激された細胞を、指示された濃度のフィトステロール単独、または０．４μＭのリコペンとの組合せで３日間処理した。提示されているデータは、４連で行われた非依存性実験２−３件の平均値±ＳＥである。
【００７１】
［実施例２］フィトステロールおよびリコペンの組合せに対する抗炎症効果が研究された。本研究の目標は、炎症状態に対するフィトステロールおよびリコペンの効果を測定することであった。
【００７２】
方法：
マクロファージの単離および細胞培養−腹膜マクロファージを、４ｍｌのチオグリコール酸ブロス（４％）の腹膜腔内注射を収集前に４日間与えられた６−８週齢のオスのＩＣＲ（インプリンティング制御領域）マウス（Ｈａｒｌａｎ、イスラエル）の腹膜腔から採集した。腹腔内のマクロファージを、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を用いて３回洗浄され、必要があれば、純度９０％−９５％の収率で、赤血球の低張溶血を行った。マクロファージを、ＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞セクター）の解析により、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）に対する流動微小蛍光測定によるＦＩＴＣ（イソチオシアン酸フルオレセイン）−共役ラット抗マウスＦ４／８０（ＭＣＡ４９７Ｆ）（Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｏｘｆｏｒｄ、英国）を使用して特定した。各サンプルに関して、光散乱ゲート生存細胞１０，０００細胞が分析された。腹膜マクロファージは、９６−ウェルプレート（２×１０５細胞／ウェル）において、１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン；１００Ｕ／ｍｌのペニシリン；１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｂｅｉｔ−Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。Ｌｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ（登録商標）＋フィトステロールの混合物、リコペン、フィトステロールならびにリコペンおよびフィトステロールの組合せ（ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解され、超音波処理されている。）を細胞に加えた。１時間後、ＬＰＳ（リポ多糖）（１μｇ／ｍｌ）が加えられ、５％ＣＯ２の大気中で、マクロファージを３７ｏＣで２４時間培養した。適量のＤＭＳＯおよび／またはエタノールが、対照に加えられ、それぞれの試験管の抑制率が、その対照管に関連して計算された。
【００７３】
ＮＯ産生アッセイ−−グリース試薬および亜硝酸ナトリウムを標準物質として使用して、亜硝酸塩値をアッセイすることにより、細胞培養物の上清におけるＮＯ値が測定された。
【００７４】
ＴＮＦ−α産生−ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により、細胞培養物の上清におけるＴＮＦ−αの濃度が定量された。
【００７５】
統計的分析。データは、平均値±ＳＥＭとして提示された。スチューデントの対応のある両側ｔ検定を使用して、群間の、比較に対する統計的な有意性が測定された。
【００７６】
結果：
リコペン＋フィトステロールによる、ＮＯ産生およびＴＮＦ−α産生の相乗的な抑制（図３および４）
異なるＬｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ（商標登録）／フィトステロールの比を有する混合物の２つの群を試験した。
【００７７】
１つの群は３．６および３．６８のリコペン／フィトステロール比を有する２つの混合物を含み、第２群は１．１７、１．３および１．５８のリコペン／フィトステロール比を有する混合物を含んだ。
【００７８】
混合物の各群に対する結果が組み合わされた。結果は、ＮＯ産生（図３）およびＴＮＦ−α産生（図４）の抑制に関して％で表され、非依存性実験３件の平均値＋ＳＥＭであった。
【００７９】
ＮＯ産生およびＴＮＦ−α産生に対する、リコペン、フィトステロールおよび両方の混合物の用量反応効果が研究され、図３および４でそれぞれ提示されている。
【００８０】
フィトステロールは、研究された（図５Ａおよび６Ａ）すべての濃度において、ＮＯ産生またはＴＮＦ−α産生のいかなる抑制も引き起こさなかったが、Ｌｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ（商標登録）の濃度は、図３Ａで示されているＮＯ産生、図４Ａで示されているＴＮＦ−α産生の用量依存性抑制を引き起こした。Ｘ軸上のリコペンの濃度は、各試験管におけるＬｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ（商標登録）の含有量に起因するリコペンの濃度を表す。
【００８１】
両方の混合物群の用量依存性効果は、図３および４で提示されている。
【００８２】
各試験群におけるリコペンおよびフィトステロールの濃度は、計算され、Ｘ軸に沿って提示されている。提示されているフィトステロールの濃度は、各群の様々な混合物中におけるフィトステロールの平均濃度である。
【００８３】
図３および４に示されているように、ＮＯ産生およびＴＮＦ−α産生に関する、混合物の両方の群による有意の用量依存性抑制が存在し、１．１７から１．５８の間のリコペン／フィトステロール比を有する第２群における効果がより高い（図３Ｃおよび４Ｃ）。
【００８４】
両方の混合物が有意の（ｐ＜０．００１）相乗的な抑制効果を引き起こし、２μＭのリコペンにおけるものが最も顕著であった。
【００８５】
２μＭでは、３．６および３．６８のリコペン／フィトステロール比を有する混合物は、リコペン単独と比較して３．２５倍高い抑制（混合物およびリコペンにより、それぞれ１９．５＋３．７％および６＋２．１％のＮＯ産生抑制）を引き起こした。一方で、（１．１７−１．５８）のリコペン／フィトステロール比を有する混合物は、４倍高い抑制（混合物およびリコペンにより、それぞれ２４．１＋３％および６＋２．１％の抑制）を引き起こした。図６で提示されているように、ＴＮＦ−α産生の抑制に対して、類似した効果が得られた。
【００８６】
より高い比のフィトステロール（１．１７−１．５８）を含有した混合物による抑制および相乗効果は、より優れた抑制効果を有しており、混合物中のフィトステロール含有量が増加すると、ＮＯ産生の抑制効果も増大することを示唆した。
【００８７】
この仮定を検証するため、および結果を確固たるものにするために、様々な比のリコペン＋フィトステロールの混合物の効果を研究した。
【００８８】
リコペン＋フィトステロールによるＮＯ産生の相乗的な抑制（図５）：
マクロファージを、２μＭのリコペンおよび様々な濃度のフィトステロールの様々な組合せで、ＬＰＳを加える１時間前に、３７℃で１６時間インキュベートした。ＮＯ産生が測定され、抑制率が計算され、提示された。結果は、非依存性実験３件の平均値＋ＳＥＭである。
【００８９】
図４Ｂで示されているように、２つの方法で様々な組合せが表された。（１）リコペンおよびフィトステロールの濃度、ならびに（２）リコペン／フィトステロール比。リコペン／フィトステロールの組合せを用いたマクロファージのインキュベーションは、フィトステロールの値の上昇に伴って徐々に増大するＮＯ産生の抑制（図５Ｂ）およびＴＮＦ−α産生（図６Ｂ）を引き起こした。
【００９０】
様々な混合物に使用される、濃縮物中のフィトステロールは、ＮＯ産生（図５Ａ）またはＴＮＦ−α産生（図６Ａ）を抑制しなかったが、リコペンは２μＭで９．８＋＋２．１％のＮＯ抑制（図５Ｂ）および２３．２＋＋２．６％のＴＮＦ−α抑制（図６Ｂ）を引き起こした。
【００９１】
リコペン／フィトステロールの様々な組合せは、フィトステロール含有量の上昇に伴って徐々に増大する、有意の（ｐ＜０．００１）相乗的なＮＯ産生およびＴＮＦ−α産出の抑制を引き起こした。
【００９２】
結論：
フィトステロール単独は、ＮＯ産生またはＴＮＦ−α産生のいかなる抑制も引き起こさなかったが、それをリコペンまたはＬｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ（登録商標）に加えると、有意の（ｐ＜０．００１）相乗的なＮＯ産生の抑制を引き起こし、混合物中のフィトステロールの含有量を増加させることにより、より効率的になった。
【００９３】
本明細書における本発明は、特定の実施形態に関して記載されているが、これらの実施形態は、本発明の原理および適用の例示にすぎないことを理解されたい。したがって、例示的実施形態に多数の改変が行われ、添付した特許請求の範囲により定義された本発明の精神および範囲を逸脱せずに他の措置が考案され得ることを理解されたい。
【００９４】
本出願は、２０１１年４月７日に出願された米国特許出願第１３／０８１，６４３号の一部継続出願であり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【国際調査報告】
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