(57)【要約】本発明は、カチオン交換クロマトグラフィの使用を介して免疫グロブリン組成物のアミド分解活性及び抗補体活性（ＡＣＡ）の含量を低減する方法を提供する。特定の実施形態では、本発明はカチオン交換溶出液の先行部分を回収することによって免疫グロブリン組成物の第ＸＩ因子及び／又は第ＸＩａ因子及び／又はＡＣＡの含量を低減する方法を提供する。本発明はまた、低減されたレベルのアミド分解活性、第ＸＩ因子及び／又は第ＸＩａ因子及び／又はＡＣＡの含量を有する免疫グロブリン組成物も提供する。2014525417.tif 000027
2014525417.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血漿由来の免疫グロブリン組成物にて第ＸＩ因子（ＦＸＩ）及び／又は第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）の含量を低減する方法であって
（ａ）ＩｇＧ免疫グロブリンとＦＸＩ及び／又はＦＸＩａとを含む血漿由来の免疫グロブリン組成物を提供するステップと、
（ｂ）６．０を超えないｐＨと１１ｍＳ／ｃｍを超えない導電率を含む第１の溶液条件下でクロマトグラフィカラム中に配置されたカチオン交換樹脂に血漿由来の免疫グロブリン組成物を接触させて、ＩｇＧ免疫グロブリンとＦＸＩ及び／又はＦＸＩａの少なくとも一部とをカチオン交換樹脂に結合させるステップと、
（ｃ）少なくとも７．５のｐＨと少なくとも１５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させることによってカチオン交換樹脂からＩｇＧ免疫グロブリンを溶出して、先行部分と遅行部分を含む溶出液を形成するステップと、
（ｄ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップと
を含み、溶出液の先行部分が溶出液の８０％以下を含む、方法。
【請求項２】
溶出緩衝液が少なくとも２０ｍＳ／ｃｍの導電率を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
溶出緩衝液が少なくとも２５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｃ）にてカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出する前に、６．０を超えないｐＨと１１ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を含む洗浄緩衝液によって、免疫グロブリンとＦＸＩ及び／又はＦＸＩａとが結合したカチオン交換樹脂を洗浄するステップをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
カチオン交換樹脂が弱いカチオン交換樹脂である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
弱いカチオン交換樹脂がカルボキシメチルカチオン交換樹脂である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
溶出緩衝液が７．５〜８．５の間のｐＨを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
溶出緩衝液が８．０±０．２のｐＨを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
溶出緩衝液が２００〜３００ｍＭの間の塩化ナトリウムを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
溶出緩衝液が２４０〜２６０ｍＭの間の塩化ナトリウムを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
溶出緩衝液が１００ｍＭ〜３００ｍＭの間のグリシンを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
溶出緩衝液が１７５ｍＭ〜２２５ｍＭの間のグリシンを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
溶出液の先行部分が溶出液の７０％以下から成る、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、７．０を上回るｐＨを有する溶出液とは別に７．０を超えないｐＨを有する溶出液を回収することを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、６．５を上回るｐＨを有する溶出液とは別に６．５を超えないｐＨを有する溶出液を回収することを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、６．０を上回るｐＨを有する溶出液とは別に６．０を超えないｐＨを有する溶出液を回収することを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、５．５を上回るｐＨを有する溶出液とは別に５．５を超えないｐＨを有する溶出液を回収することを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、５．０を上回るｐＨを有する溶出液とは別に５．０を超えないｐＨを有する溶出液を回収することを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、溶出液のｐＨをモニターすることを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
溶出液の先行部分を回収するステップが、
（ｉ）２８０ｎｍ（ＯＤ２８０）にて溶出液の光学密度をモニターする副ステップと、
（ｉｉ）溶出液のＯＤ２８０が少なくとも５０ｍＡＵの第１の閾値ＯＤ２８０よりも上昇したら回収を開始する副ステップと、
（ｉｉｉ）溶出液のＯＤ２８０が５００ｍＡＵを下回らない第２の閾値ＯＤ２８０よりも低下したら回収を停止する副ステップと
を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
第２の閾値ＯＤ２８０が１ＡＵを下回らない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
第２の閾値ＯＤ２８０が２ＡＵを下回らない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
洗浄緩衝液が５．０〜６．０の間のｐＨを含む、請求項４〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
洗浄緩衝液が５．５±０．２のｐＨを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｂ）でカチオン交換樹脂に結合したＦＸＩ及び／又はＦＸＩａの５０％未満が、ステップ（ｄ）で回収される溶出液の先行部分に存在する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ｂ）でカチオン交換樹脂に結合したＦＸＩ及び／又はＦＸＩａの２５％未満が、ステップ（ｄ）で回収される溶出液の先行部分に存在する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ｂ）でカチオン交換樹脂に結合したＦＸＩ及び／又はＦＸＩａの１０％未満が、ステップ（ｄ）で回収される溶出液の先行部分に存在する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ＦＸＩ及び／又はＦＸＩａの量が、ＦＸＩａ特異的な基質を用いたアミド分解活性アッセイを行うことによって決定される、請求項２５又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ（ａ）で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物が、画分Ｉの沈殿物、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物、画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物、画分ＩＶ−１、キストラー／ニッチェマンの沈殿物Ａ、キストラー／ニッチェマンの沈殿物Ｂ及びそれらの改変された沈殿物から成る群から選択される、懸濁された血漿画分沈殿物である、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ａ）で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物が、懸濁された画分ＩＩの沈殿物である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
血漿由来の免疫グロブリン組成物にて抗補体活性（ＡＣＡ）を低減させる方法であって、
（ａ）ＩｇＧ免疫グロブリンと第１の量のＡＣＡとを含む血漿由来の免疫グロブリン組成物を提供するステップと、
（ｂ）６．０を超えないｐＨと１１ｍＳ／ｃｍを超えない導電率を含む第１の溶液条件下でクロマトグラフィカラム中に配置されたカチオン交換樹脂に血漿由来の免疫グロブリン組成物を接触させて、カチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンと第１の量のＡＣＡの少なくとも一部とを結合させるステップと、
（ｃ）少なくとも７．５のｐＨと少なくとも１５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させることによってカチオン交換樹脂からＩｇＧ免疫グロブリンを溶出して、先行部分と遅行部分を含む溶出液を形成するステップと、
（ｄ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップと
を含み、溶出液の先行部分が溶出液の８０％以下を含む、方法。
【請求項３２】
溶出緩衝液が少なくとも２０ｍＳ／ｃｍの導電率を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
溶出緩衝液が少なくとも２５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（ｃ）にてカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出する前に、６．０を超えないｐＨと１１ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を含む洗浄緩衝液によって、免疫グロブリンとＡＣＡとが結合したカチオン交換樹脂を洗浄するステップをさらに含む、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
カチオン交換樹脂が弱いカチオン交換樹脂である、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
弱いカチオン交換樹脂がカルボキシメチルカチオン交換樹脂である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
溶出緩衝液が７．５〜８．５の間のｐＨを含む、請求項３１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
溶出緩衝液が８．０±０．２のｐＨを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
溶出緩衝液が２００〜３００ｍＭの間の塩化ナトリウムを含む、請求項３１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
溶出緩衝液が２４０〜２６０ｍＭの間の塩化ナトリウムを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
溶出緩衝液が１００ｍＭ〜３００ｍＭの間のグリシンを含む、請求項３１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
溶出緩衝液が１７５ｍＭ〜２２５ｍＭの間のグリシンを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
溶出液の先行部分が溶出液の７０％以下から成る、請求項３１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、７．０を上回るｐＨを有する溶出液とは別に７．０を超えないｐＨを有する溶出液を回収することを含む、請求項３１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、６．５を上回るｐＨを有する溶出液とは別に６．５を超えないｐＨを有する溶出液を回収することを含む、請求項３１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、６．０を上回るｐＨを有する溶出液とは別に６．０を超えないｐＨを有する溶出液を回収することを含む、請求項３１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、５．５を上回るｐＨを有する溶出液とは別に５．５を超えないｐＨを有する溶出液を回収することを含む、請求項３１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、５．０を上回るｐＨを有する溶出液とは別に５．０を超えないｐＨを有する溶出液を回収することを含む、請求項３１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、溶出液のｐＨをモニターすることを含む、請求項３１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
溶出液の先行部分を回収するステップが、
（ｉ）２８０ｎｍ（ＯＤ２８０）にて溶出液の光学密度をモニターする副ステップと、
（ｉｉ）溶出液のＯＤ２８０が少なくとも５０ｍＡＵの第１の閾値ＯＤ２８０よりも上昇したら回収を開始する副ステップと、
（ｉｉｉ）溶出液のＯＤ２８０が５００ｍＡＵを下回らない第２の閾値ＯＤ２８０よりも低下したら回収を停止する副ステップと
を含む、請求項３１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
第２の閾値ＯＤ２８０が１ＡＵを下回らない、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
第２の閾値ＯＤ２８０が２ＡＵを下回らない、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
洗浄緩衝液が５．０〜６．０の間のｐＨを含む、請求項３４〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
洗浄緩衝液が５．５±０．２のｐＨを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
ステップ（ｄ）で回収される溶出液の先行部分に存在するＩｇＧ免疫グロブリンの濃度に対するＡＣＡの濃度が、ステップ（ａ）で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物におけるＩｇＧ免疫グロブリンの濃度に対するＡＣＡの濃度よりも低い、請求項３１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
ステップ（ｄ）で回収される溶出液の先行部分に存在するＩｇＧ免疫グロブリンの濃度に対するＡＣＡの濃度が、ステップ（ａ）で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物におけるＩｇＧ免疫グロブリンの濃度に対するＡＣＡの濃度よりも少なくとも２５％低い、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ステップ（ｄ）で回収される溶出液の先行部分に存在するＩｇＧ免疫グロブリンの濃度に対するＡＣＡの濃度が、ステップ（ａ）で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物におけるＩｇＧ免疫グロブリンの濃度に対するＡＣＡの濃度よりも少なくとも５０％低い、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
ステップ（ｄ）で回収される溶出液の先行部分に存在するＩｇＧ免疫グロブリンの濃度に対するＡＣＡの濃度が、ステップ（ｄ）で回収される溶出液の遅行部分におけるＩｇＧ免疫グロブリンの濃度に対するＡＣＡの濃度よりも低い、請求項３１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
ステップ（ｄ）で回収される溶出液の先行部分に存在するＩｇＧ免疫グロブリンの濃度に対するＡＣＡの濃度が、ステップ（ｄ）で回収される溶出液の遅行部分におけるＩｇＧ免疫グロブリンの濃度に対するＡＣＡの濃度の５０％未満である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ステップ（ｄ）で回収される溶出液の先行部分に存在するＩｇＧ免疫グロブリンの濃度に対するＡＣＡの濃度が、ステップ（ｄ）で回収される溶出液の遅行部分におけるＩｇＧ免疫グロブリンの濃度に対するＡＣＡの濃度の２５％未満である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
ステップ（ａ）で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物が、画分Ｉの沈殿物、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物、画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物、画分ＩＶ−１、キストラー／ニッチェマンの沈殿物Ａ、キストラー／ニッチェマンの沈殿物Ｂ及びそれらの改変された沈殿物から成る群から選択される、懸濁された血漿画分沈殿物である、請求項３１〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
ステップ（ａ）で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物が、懸濁された画分ＩＩの沈殿物である、請求項６１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、あらゆる目的でその全体が参照によって明白に本明細書に組み入れられる２０１１年８月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／５２７，９７４号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
血漿由来の血液製剤を用いて種々の血液疾患だけでなく、他の起源の疾病も治療される。たとえば、ヒト血漿に由来する免疫グロブリン（ＩｇＧ）製品を使用して１９５２年に初めて免疫不全症が治療された。それ以来、ＩｇＧ製剤は、少なくとも３つの主要な医学的状態、すなわち（１）低い抗体レベルを特徴とする、免疫不全症、たとえばＸ連鎖無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症（原発性免疫不全症）、及び後天性の免疫不全状態（二次的免疫不全症）；（２）炎症性疾患及び自己免疫疾患；並びに（３）急性感染症にて広く使用されている。
【０００３】
血漿由来の生物治療剤を製造し、製剤化する場合、種々の安全上の対策が考慮されなければならない。これらの対策には、血液由来の病原体（たとえば、ウイルス性及び細菌性の病原体）、抗補体活性、及び献血血漿の使用で生じる他の望ましくない混入物を取り除く及び／又は不活化する方法が含まれる。高レベルのアミド分解活性の投与は望ましくない血栓塞栓症の事象を生じ得ることが研究によって示唆されている（Ｗｏｌｂｅｒｇ  ＡＳ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ｉｓ  ａ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ  ｉｎｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０００；６５：３０−３４（非特許文献1）；及びＡｌｖｉｎｇ  ＢＭ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｎｔａｃｔ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ：  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｎｄ  ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ  １９８０；  ９６：３３４−３４６（非特許文献2）；その開示はあらゆる目的でその全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０００４】
この懸念は、血栓塞栓症事象の報告の増加の後の、米国におけるＯｃｔａｇａｍ（登録商標）（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）の自発的撤退及び欧州委員会によるＯｃｔａｇａｍ（登録商標）及びＯｃｔａｇａｍ１０％の製造承認の差し止めによって注目された。血栓症事象の増加は、生物製剤における高レベルのアミド分解活性が原因であり、たとえば、第ＸＩ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩ因子及び第ＸＩＩａ因子のようなセリンプロテアーゼ及びセリンプロテアーゼ酵素前駆体不純物が原因であったと示唆されている（ＦＤＡ通知：Ｖｏｌｕｎｔａｒｙ  Ｍａｒｋｅｔ  Ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ−Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２３，  ２０１０  Ｏｃｔａｇａｍ  ［Ｉｍｍｕｎｅ  Ｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  （Ｈｕｍａｎ）］  ５％  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ（非特許文献3）；ＡＦＳＳＡＰＳによって２０１０年９月９日にオンラインで公表された、Ｏｃｔａｇａｍ  ５０  ｍｇ／ｍｌ，  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｏｕｒ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  −  Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ  Ｆｒａｎｃｅ  −  Ｍｉｓｅ  ｅｎ  ｑｕａｒａｎｔａｉｎｅ  ｄｅ  ｔｏｕｓ  ｌｅｓ  ｌｏｔｓ（非特許文献4）；欧州医薬品庁によって２０１０年９月２３日にオンラインで公表された、Ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ａｎｓｗｅｒｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｒｋｅｔｉｎｇ  ａｕｔｈｏｒｉｚａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｏｃｔａｇａｍ  （ｈｕｍａｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ５％  ａｎｄ  １０％）（非特許文献5））。
【０００５】
ＥＤＱＭ（欧州医薬品品質理事会）は、２０１２年１月１日の迅速な実施のために静脈内投与用のヒト正常免疫グロブリンに関するモノグラフの改訂版（０９１８）（非特許文献6）を公表し、免疫グロブリン製品における凝血促進活性の可能性に対処した。改訂版では、「調製方法には、血栓生成剤を取り除くことが示されている１種又は複数種のステップも含まれる。活性化された凝固因子及びその酵素前駆体並びにその活性化の原因となり得る処理ステップの特定が重要である。製造工程によって導入され得る他の凝血促進剤も考慮されるべきである。」と述べられている。
【０００６】
２０１１年３月１８日、Ｓｗｉｓｓｍｅｄｉｃは血栓塞栓症の有害事象が、ＦＤＡによる多数のＶｉｖａｇｌｏｂｉｎ製品ロットに関連して認められることを報告した。ＣＳＬによって製造されたＶｉｖａｇｌｏｂｉｎ（皮下注射用の１６０ｍｇ/ｍｌのヒト正常免疫グロブリン溶液）は、成人及び小児の原発性免疫不全症候群、骨髄腫、又は慢性リンパ性白血病のために代替療法として認可された。血栓塞栓症の有害事象のリスクは、この投与経路についてはこの時点まで知られていなかった。調査によって少なくとも一部のバッチにおいて凝血促進活性が示された。結果として、Ｖｉｖａｇｌｏｂｉｎは市場から撤退し、新しい製品Ｈｉｚｅｎｔｒａ（皮下注射用の２０％ヒト正常免疫グロブリン溶液）に置き換えられた。Ｖｉｖａｇｌｏｂｉｎについて報告された有害事象のために、現在、静注用免疫グロブリン製品についての要件と同様に、皮下投与用の免疫グロブリン製品は低レベルの凝血促進活性を有することという要件がある。
【０００７】
専用のセリンプロテアーゼは、一般に凝固因子として知られ、凝固カスケードの接触活性化と組織因子経路双方の不可欠な成分である。凝固経路の刺激の際、不活性の酵素前駆体であるセリンプロテアーゼ酵素前駆体が次のプロテアーゼ酵素前駆体の活性化を触媒する活性化プロテアーゼになり、結果的に活性化カスケードを生じる。この凝固カスケードが、最終的にトロンビン（第ＩＩａ因子）と第ＸＩＩＩａ因子の活性化をもたらし、それが、それぞれフィブリノーゲン（第Ｉ因子）をフィブリン（第Ｉａ因子）と交差フィブリンに変換し、フィブリン血栓を形成するように機能する。
【０００８】
固有の凝固経路としても知られる接触活性化経路は、それぞれプレカリクレインと第ＸＩＩ因子に由来するカリクレインと第ＸＩＩａ因子（ＦＸＩＩａ）の活性化で開始する。活性化されたセリンプロテアーゼＦＸＩＩａは第ＸＩ因子（ＦＸＩ）を切断し、酵素前駆体を活性化セリンプロテアーゼである第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）に変換し、それはその後の第Ｘａ因子（ＦＸａ）の活性化に関与する。
【０００９】
血漿由来のタンパク質組成物におけるセリンプロテアーゼ及びセリンプロテアーゼ酵素前駆体の存在に関する関心が高まっているために、免疫グロブリン製剤におけるこれらの混入物のレベル、特にＦＸＩ及びＦＸＩａのレベルを低減する方法に対する需要は、当技術分野において依然として存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｗｏｌｂｅｒｇ  ＡＳ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ｉｓ  ａ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ  ｉｎｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０００；６５：３０−３４
【非特許文献２】Ａｌｖｉｎｇ  ＢＭ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｎｔａｃｔ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ：  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｎｄ  ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ  １９８０；  ９６：３３４−３４６
【非特許文献３】ＦＤＡ通知：Ｖｏｌｕｎｔａｒｙ  Ｍａｒｋｅｔ  Ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ−Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２３，  ２０１０  Ｏｃｔａｇａｍ  ［Ｉｍｍｕｎｅ  Ｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  （Ｈｕｍａｎ）］  ５％  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
【非特許文献４】Ｏｃｔａｇａｍ  ５０  ｍｇ／ｍｌ，  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｏｕｒ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  −  Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ  Ｆｒａｎｃｅ  −  Ｍｉｓｅ  ｅｎ  ｑｕａｒａｎｔａｉｎｅ  ｄｅ  ｔｏｕｓ  ｌｅｓ  ｌｏｔｓ
【非特許文献５】Ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ａｎｓｗｅｒｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｒｋｅｔｉｎｇ  ａｕｔｈｏｒｉｚａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｏｃｔａｇａｍ  （ｈｕｍａｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ５％  ａｎｄ  １０％）
【非特許文献６】静脈内投与用のヒト正常免疫グロブリンに関するモノグラフの改訂版（０９１８）
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、幾つかある態様の中で特に、ＩｇＧ免疫グロブリン組成物のアミド分解性の内容物（たとえば、ＦＸＩ及び／又はＦＸＩａ）を減らす方法、及び市場で利用可能な匹敵する組成物よりも低レベルのアミド分解活性（たとえば、ＦＸＩ及び／又はＦＸＩａ）を有するＩｇＧ免疫グロブリン組成物を提供する。
【００１２】
第１の態様では、本発明は、血漿由来の免疫グロブリン組成物における第ＸＩ因子（ＦＸＩ）及び／又は第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）の含量を減らす方法を提供し、該方法は、（ａ）ＩｇＧ免疫グロブリンとＦＸＩ及び／又はＦＸＩａとを含む血漿由来の免疫グロブリン組成物を提供するステップと、（ｂ）６．０を超えないｐＨと、１１ｍＳ／ｃｍを超えない導電率を含む第１の溶液条件下でクロマトグラフィカラム中に配置されたカチオン交換樹脂に血漿由来の免疫グロブリン組成物を接触させて、ＩｇＧ免疫グロブリンとＦＸＩ及び／又はＦＸＩａの少なくとも一部とをカチオン交換樹脂に結合させるステップと、（ｃ）少なくとも７．５のｐＨと、少なくとも１５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させることによってカチオン交換樹脂からＩｇＧ免疫グロブリンを溶出して、先行部分と遅行部分を含む溶出液を形成するステップと、（ｄ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、溶出液の先行部分は溶出液の８０％を超えて含むことはない。
【００１３】
上で提供される方法の一実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２０ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。上で提供される方法の別の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２２ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。上で提供される方法の別の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。
【００１４】
上で提供される方法の一実施形態では、方法は、ステップ（ｃ）にてカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出する前に、６．０を超えないｐＨと、１１ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を含む洗浄緩衝液によって、免疫グロブリンとＦＸＩ及び／又はＦＸＩａとが結合したカチオン交換樹脂を洗浄するステップをさらに含む。
【００１５】
上で提供される方法の一実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。上で提供される方法のある特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチルカチオン交換樹脂である。
【００１６】
上で提供される方法の一実施形態では、溶出緩衝液は７．５〜８．５の間のｐＨを含む。上で提供される方法の別の実施形態では、溶出緩衝液は８．０±０．２のｐＨを含む。
【００１７】
上で提供される方法の一実施形態では、溶出緩衝液は２００〜３００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。上で提供される方法の別の実施形態では、溶出緩衝液は２４０〜２６０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
【００１８】
上で提供される方法の一実施形態では、溶出緩衝液は１００ｍＭ〜３００ｍＭのグリシンを含む。上で提供される方法の別の実施形態では、溶出緩衝液は１７５ｍＭ〜２２５ｍＭのグリシンを含む。
【００１９】
上で提供される方法の一実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液の７０％以下から成る。
【００２０】
上で提供される方法の一実施形態では、溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップは７．０を超えるｐＨを有する溶出液とは別に７．０を超えないｐＨを有する溶出液を回収することを含む。
【００２１】
上で提供される方法の一実施形態では、溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップは６．５を超えるｐＨを有する溶出液とは別に６．５を超えないｐＨを有する溶出液を回収することを含む。
【００２２】
上で提供される方法の一実施形態では、溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップは６．０を超えるｐＨを有する溶出液とは別に６．０を超えないｐＨを有する溶出液を回収することを含む。
【００２３】
上で提供される方法の一実施形態では、溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップは５．５を超えるｐＨを有する溶出液とは別に５．５を超えないｐＨを有する溶出液を回収することを含む。
【００２４】
上で提供される方法の一実施形態では、溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップは５．０を超えるｐＨを有する溶出液とは別に５．０を超えないｐＨを有する溶出液を回収することを含む。
【００２５】
上で提供される方法の一実施形態では、溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップは溶出液のｐＨをモニターすることを含む。
【００２６】
上で提供される方法の一実施形態では、溶出液の先行部分を回収するステップは、（ｉ）２８０ｎｍ（ＯＤ２８０）にて溶出液の光学密度をモニターする副ステップと、（ｉｉ）溶出液のＯＤ２８０が少なくとも５０ｍＡＵの第１の閾値ＯＤ２８０よりも上昇したら回収を開始する副ステップと、（ｉｉｉ）溶出液のＯＤ２８０が５００ｍＡＵを下回らない第２の閾値ＯＤ２８０よりも低下したら回収を停止する副ステップとを含む。ある特定の実施形態では、第２の閾値ＯＤ２８０は１ＡＵを下回らない。別のある特定の実施形態では、第２の閾値ＯＤ２８０は２ＡＵを下回らない。
【００２７】
上で提供される方法の一実施形態では、洗浄緩衝液は５．０〜６．０の間のｐＨを含む。上で提供される方法の別の実施形態では、洗浄緩衝液は５．５±０．２のｐＨを含む。
【００２８】
上で提供される方法の一実施形態では、ステップ（ｂ）でカチオン交換樹脂に結合したＦＸＩ及び／又はＦＸＩａの５０％未満が、ステップ（ｄ）で回収される溶出液の先行部分に存在する。
【００２９】
上で提供される方法の一実施形態では、ステップ（ｂ）でカチオン交換樹脂に結合したＦＸＩ及び／又はＦＸＩａの２５％未満が、ステップ（ｄ）で回収される溶出液の先行部分に存在する。
【００３０】
上で提供される方法の一実施形態では、ステップ（ｂ）でカチオン交換樹脂に結合したＦＸＩ及び／又はＦＸＩａの１０％未満が、ステップ（ｄ）で回収される溶出液の先行部分に存在する。
【００３１】
上で提供される方法の一実施形態では、ＦＸＩ及び／又はＦＸＩａの量はＦＸＩａ特異的な基質を用いたアミド分解活性アッセイを行うことによって決定される。
【００３２】
上で提供される方法の一実施形態では、ステップ（ａ）で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物は、画分Ｉの沈殿物、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物、画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物、画分ＩＶ−１、キストラー／ニッチェマンの沈殿物Ａ、キストラー／ニッチェマンの沈殿物Ｂ及びそれらの改変された沈殿物から成る群から選択される、懸濁された血漿画分沈殿物である。
【００３３】
上で提供される方法の一実施形態では、ステップ（ａ）で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物は懸濁された画分ＩＩ沈殿物である。
【００３４】
１つの態様では、本開示は、血漿由来の免疫グロブリン組成物における抗補体活性（ＡＣＡ）を減らす方法を提供し、該方法は、（ａ）ＩｇＧ免疫グロブリンと第１の量のＡＣＡとを含む血漿由来の免疫グロブリン組成物を提供するステップと、（ｂ）６．０を超えないｐＨと、１１ｍＳ／ｃｍを超えない導電率を含む第１の溶液条件下でクロマトグラフィカラム中に配置されたカチオン交換樹脂に血漿由来の免疫グロブリン組成物を接触させて、カチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンと第１の量のＡＣＡの少なくとも一部とを結合させるステップと、（ｃ）少なくとも７．５のｐＨと、少なくとも１５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させることによってカチオン交換樹脂からＩｇＧ免疫グロブリンを溶出して、先行部分と遅行部分を含む溶出液を形成するステップと、（ｄ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、溶出液の先行部分は溶出液の８０％以下を含む。
【００３５】
上で提供される方法の一実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２０ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。上で提供される方法の別の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２２ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。上で提供される方法の別の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。
【００３６】
上で提供される方法の一実施形態では、方法は、ステップ（ｃ）にてカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出する前に、６．０を超えないｐＨと、１１ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を含む洗浄緩衝液によって、免疫グロブリンとＡＣＡとが結合したカチオン交換樹脂を洗浄するステップをさらに含む。
【００３７】
上で提供される方法の一実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。上で提供される方法のある特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチルカチオン交換樹脂である。
【００３８】
上で提供される方法の一実施形態では、溶出緩衝液は７．５〜８．５の間のｐＨを含む。上で提供される方法の別の実施形態では、溶出緩衝液は８．０±０．２のｐＨを含む。
【００３９】
上で提供される方法の一実施形態では、溶出緩衝液は２００〜３００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。上で提供される方法の別の実施形態では、溶出緩衝液は２４０〜２６０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
【００４０】
上で提供される方法の一実施形態では、溶出緩衝液は１００ｍＭ〜３００ｍＭのグリシンを含む。上で提供される方法の別の実施形態では、溶出緩衝液は１７５ｍＭ〜２２５ｍＭのグリシンを含む。
【００４１】
上で提供される方法の一実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液の７０％以下から成る。
【００４２】
上で提供される方法の一実施形態では、溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップは７．０を超えるｐＨを有する溶出液とは別に７．０を超えないｐＨを有する溶出液を回収することを含む。
【００４３】
上で提供される方法の一実施形態では、溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップは６．５を超えるｐＨを有する溶出液とは別に６．５を超えないｐＨを有する溶出液を回収することを含む。
【００４４】
上で提供される方法の一実施形態では、溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップは６．０を超えるｐＨを有する溶出液とは別に６．０を超えないｐＨを有する溶出液を回収することを含む。
【００４５】
上で提供される方法の一実施形態では、溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップは５．５を超えるｐＨを有する溶出液とは別に５．５を超えないｐＨを有する溶出液を回収することを含む。
【００４６】
上で提供される方法の一実施形態では、溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップは５．０を超えるｐＨを有する溶出液とは別に５．０を超えないｐＨを有する溶出液を回収することを含む。
【００４７】
上で提供される方法の一実施形態では、溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップは溶出液のｐＨをモニターすることを含む。
【００４８】
上で提供される方法の一実施形態では、溶出液の先行部分を回収するステップは、（ｉ）２８０ｎｍ（ＯＤ２８０）にて溶出液の光学密度をモニターする副ステップと、（ｉｉ）溶出液のＯＤ２８０が少なくとも５０ｍＡＵの第１の閾値ＯＤ２８０よりも上昇したら回収を開始する副ステップと、（ｉｉｉ）溶出液のＯＤ２８０が５００ｍＡＵを下回らない第２の閾値ＯＤ２８０よりも低下したら回収を停止する副ステップとを含む。
【００４９】
上で提供される方法の一実施形態では、第２の閾値ＯＤ２８０は１ＡＵを下回らない。上で提供される方法の別の実施形態では、第２の閾値ＯＤ２８０は２ＡＵを下回らない。
【００５０】
上で提供される方法の一実施形態では、洗浄緩衝液は５．０〜６．０の間のｐＨを含む。上で提供される方法の別の実施形態では、洗浄緩衝液は５．５±０．２のｐＨを含む。
【００５１】
上で提供される方法の一実施形態では、ステップ（ｄ）で回収される溶出液の先行部分に存在するＩｇＧ免疫グロブリンの濃度に対するＡＣＡの濃度は、ステップ（ａ）で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物におけるＩｇＧ免疫グロブリンの濃度に対するＡＣＡの濃度よりも低い。
【００５２】
上で提供される方法の一実施形態では、ステップ（ｄ）で回収される溶出液の先行部分に存在するＩｇＧ免疫グロブリンの濃度に対するＡＣＡの濃度は、ステップ（ａ）で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物におけるＩｇＧ免疫グロブリンの濃度に対するＡＣＡの濃度よりも少なくとも２５％低い。
【００５３】
上で提供される方法の一実施形態では、ステップ（ｄ）で回収される溶出液の先行部分に存在するＩｇＧ免疫グロブリンの濃度に対するＡＣＡの濃度は、ステップ（ａ）で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物におけるＩｇＧ免疫グロブリンの濃度に対するＡＣＡの濃度よりも少なくとも５０％低い。
【００５４】
上で提供される方法の一実施形態では、ステップ（ｄ）で回収される溶出液の先行部分に存在するＩｇＧ免疫グロブリンの濃度に対するＡＣＡの濃度は、ステップ（ｄ）で回収される溶出液の遅行部分におけるＩｇＧ免疫グロブリンの濃度に対するＡＣＡの濃度よりも低い。
【００５５】
上で提供される方法の一実施形態では、ステップ（ｄ）で回収される溶出液の先行部分に存在するＩｇＧ免疫グロブリンの濃度に対するＡＣＡの濃度は、ステップ（ｄ）で回収される溶出液の遅行部分におけるＩｇＧ免疫グロブリンの濃度に対するＡＣＡの濃度の５０％未満である。
【００５６】
上で提供される方法の一実施形態では、ステップ（ｄ）で回収される溶出液の先行部分に存在するＩｇＧ免疫グロブリンの濃度に対するＡＣＡの濃度は、ステップ（ｄ）で回収される溶出液の遅行部分におけるＩｇＧ免疫グロブリンの濃度に対するＡＣＡの濃度の２５％未満である。
【００５７】
上で提供される方法の一実施形態では、ステップ（ａ）で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物は、画分Ｉの沈殿物、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物、画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物、画分ＩＶ−１、キストラー／ニッチェマンの画分Ａ、キストラー／ニッチェマンの画分Ｂ及びそれらの改変された沈殿物から成る群から選択される、懸濁された血漿画分沈殿物である。
【００５８】
上で提供される方法の一実施形態では、ステップ（ａ）で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物は懸濁された画分ＩＩ沈殿物である。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】実施例１で記載されるＣＭセファロースファストフロー（ｆｆ）クロマトグラフィステップのクロマトグラムを示す図である。番号１の線はＵＶの吸光度、番号２の線はｐＨ、番号３の線はカラムの出口での流出物の導電率を示す。２８０ナノメートルでの光学密度はＣＭセファロースｆｆカラムからのタンパク質の溶出の際の２つの画分の部分的な分離を示す。カラム出口でのｐＨは溶出の際のＵＶ吸光度の再上昇の開始直前に上がり始める。この時点で、Ｆ４及びＦ５（画分４及び画分５）としてクロマトグラムで示される２つの溶出画分が分離され、以下ではＥ１及びＥ２と名付けられる。
【図２】実施例２で記載されるＣＭセファロースｆｆ実行のクロマトグラフを示す図である。ＣＭセファロースｆｆからのＩｇＧ画分の溶出の際のｐＨ及びＯＤ２８０の経過を示す（出発物質：Ｃｏｈｎ画分ＩＩペースト経路ＩＩ；Ｐ２４７０１ＩＶ；吸着ステップ：ＦＩＸ；ＦＶＩＩ；ＡＴＩＩＩ）。
【図３】実施例１１で記載されるＣＭセファロースファストフロー（ｆｆ）クロマトグラフィステップのクロマトグラムを示す図である。番号１の線はＵＶの吸光度、番号３の線はｐＨ、番号２の線はカラムの出口での流出物の導電率を示す。
【図４】実施例１２で記載されるＣＭセファロースファストフロー（ｆｆ）クロマトグラフィステップのクロマトグラムを示す図である。番号１の線はＵＶの吸光度、番号３の線はｐＨ、番号２の線はカラムの出口での流出物の導電率を示す。
【図５】実施例１３で記載されるＣＭセファロースファストフロー（ｆｆ）クロマトグラフィステップのクロマトグラムを示す図である。番号１の線はＵＶの吸光度、番号３の線はｐＨ、番号２の線はカラムの出口での流出物の導電率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
Ｉ．序論
治療用の血漿由来の静注用免疫グロブリン組成物の広い用途を考えると、これら組成物の安全性を確保することが最重要である。血漿由来の免疫グロブリンを投与された患者における血栓塞栓症事象の発生と対となる、免疫グロブリン組成物のアミド分解性内容物についての懸念から、免疫グロブリンの製造中にセリンプロテアーゼ（たとえば、ＦＸＩａ及びＦＸＩＩａ）及びセリンプロテアーゼ酵素前駆体（たとえば、ＦＸＩ及びＦＸＩＩ）を効果的に減らす方法に対するニーズが強調されている。
【００６１】
本発明は、カチオン交換溶出液の先行部分のみを回収することによって有意な量のアミド分解活性（たとえば、ＦＸＩ及び／又はＦＸＩａ）及び／又は抗補体活性（ＡＣＡ）を免疫グロブリン組成物から取り除くことができるという驚くべき知見に少なくとも部分的に基づく。したがって本明細書では、血漿由来のタンパク質組成物の製造の間にセリンプロテアーゼ及びセリンプロテアーゼ酵素前駆体の濃度を下げるための方法が提供される。
【００６２】
１つの態様では、本発明は、カチオン交換樹脂からの単一段階溶出の間に、アミド分解活性（たとえば、少なくともＦＸＩ及び／又はＦＸＩａが寄与する）及び／又はＡＣＡの有意な画分の溶出に先立ってＩｇＧ免疫グロブリンが樹脂から放出されるという発見に基づく。具体的には、ＩｇＧ免疫グロブリンとアミド分解活性に寄与するタンパク質とが結合したカチオン交換樹脂を少なくとも７．０を上回るｐＨを有する溶出緩衝液に接触させたら、カラムから回収される最初の溶出液は低いｐＨ（たとえば、５．０未満のｐＨ）を有することが分かった。しばらくすると、カラムから回収される溶出液のｐＨは７．０より上にシフトする。驚くべきことに、低ｐＨを有する最初の溶出液は低レベルのアミド分解活性、ＦＸＩ及び／もしくはＦＸＩａ含量ならびに／又はＡＣＡ含量を含有する一方で、ｐＨのシフト後に回収された溶出液は有意により高いレベルのアミド分解活性、ＦＸＩ及び／もしくはＦＸＩａ含量ならびに／又はＡＣＡ含量を含有することが見いだされた。
【００６３】
従って、１つの態様では、本発明は、ＩｇＧ免疫グロブリンとアミド活性及び／又はＡＣＡとをカチオン交換樹脂に結合させ、単一段階溶出にてＩｇＧ免疫グロブリンとアミド活性及び／又はＡＣＡとを溶出し、低いＩｇＧ収率、高いアミド分解活性及び／又は高いＡＣＡ含量を特徴とする溶出液の遅行部分とは別に、高いＩｇＧ収率、低いアミド分解活性及び／又は低いＡＣＡ含量を特徴とする溶出液の先行部分を回収することによって、ＩｇＧ免疫グロブリン組成物からアミド分解活性（たとえば、第ＸＩ因子及び／又は第ＸＩａ因子）及び／又はＡＣＡの有意な画分を分離する方法に基づく。
【００６４】
数ある利点の中で特に、本発明の方法は、（１）単一段階溶出によるカチオン交換クロマトグラフィによってＩｇＧ免疫グロブリン組成物からアミド分解活性を取り除く単純な方法；（２）溶出液のｐＨをモニターすることに基づいて高いアミド分解活性（すなわち、高いＦＸＩ及び／又はＦＸＩａ含量）を有するＩｇＧ免疫グロブリンカチオン交換溶出液の画分を迅速に特定する単純な方法；（３）カチオン交換樹脂に負荷するタンパク質の濃度によって影響を受けない、大規模製造法への簡単な規模拡大を可能にする、ＩｇＧ免疫グロブリン組成物からアミド分解活性を取り除く方法；（４）ｐＨのモニタリングに基づく、さらなる処理に使用するＩｇＧ免疫グロブリンのカチオン交換溶出画分の迅速な決定を可能にする方法；（５）ＩｇＧ免疫グロブリンの収量の最小限の損失でアミド分解活性（たとえば、ＦＸＩ及び／又はＦＸＩａ含量）の有意な低下を可能にする方法；（６）発色基質（基質ＰＬ−１を含むが、これに限定されない）で測定される低いＩｇＧ凝集体濃度、低いＰＫＡ活性、低いアミド分解活性；高いＩｇＧ単量体濃度及びより望ましいＩｇＧサブクラスの分布を有するＩｇＧ免疫グロブリン組成物を製造する方法；（７）クロマトグラフィステップの溶出体積に基づいて、さらなる処理に使用するカチオン交換ＩｇＧ免疫グロブリンの溶出画分の迅速な決定を可能にする方法；（８）特定画分のタンパク質の吸光度に基づいて、さらなる処理に使用するＩｇＧ免疫グロブリンカチオン交換溶出画分の迅速な決定を可能にする方法；（９）大規模製造法において本発明の有利な特徴を利用する能力；（１０）同定及び定量のためのアミド分解活性の濃縮；（１１）単一段階溶出によるカチオン交換クロマトグラフィによってＩｇＧ免疫グロブリン組成物から抗補体活性（ＡＣＡ）を取り除く単純な方法；（１２）溶出液のｐＨのモニタリングに基づいて高い抗補体活性（ＡＣＡ）を有するＩｇＧ免疫グロブリンカチオン交換溶出液の画分を迅速に特定する単純な方法；（１３）カチオン交換樹脂に負荷するタンパク質の濃度によって影響を受けない、大規模製造法への規模拡大を可能にする、ＩｇＧ免疫グロブリン組成物から抗補体活性（ＡＣＡ）を取り除く方法；（１４）ＩｇＧ免疫グロブリンの収量の最小限の損失で抗補体活性（ＡＣＡ）の有意な低下を可能にする方法；（１５）低いＩｇＧ凝集体濃度、低い抗補体活性（ＡＣＡ）、高いＩｇＧ単量体濃度及びより望ましいＩｇＧサブクラスの分布を有するＩｇＧ免疫グロブリン組成物を製造する方法；並びに（１６）同定及び定量のための抗補体活性（ＡＣＡ）の濃縮を提供する。
【００６５】
ＩＩ．定義
本明細書で使用されるとき、「静注用ＩｇＧ」又は「ＩＶＩＧ」治療という用語は一般に、免疫不全、炎症性疾患及び自己免疫疾患のような多数の状態を治療するために患者に対してＩｇＧ免疫グロブリンの組成物を静脈内に、皮下に、又は筋肉内に投与する治療法を指す。ＩｇＧ免疫グロブリンは通常、血漿からプールされて調製される。抗体全体又は断片を使用することができる。ＩｇＧ免疫グロブリンは皮下投与のために（たとえば、１０％を超える）高い濃度で製剤化することができ、また筋肉内投与用に製剤化することができる。これは、特定の抗原（たとえば、ＲｈｏＤ因子、百日咳毒素、破傷風毒素、ボツリヌス毒素、狂犬病）に対して平均よりも高い力価で調製される特殊ＩｇＧ製剤の場合に特に一般的である。考察し易くするために、そのような皮下又は筋肉内投与用に製剤化されたＩｇＧ組成物も本出願では「ＩＶＩＧ」という用語に含められる。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、「アミド分解活性」という用語は、別のポリペプチドにおける少なくとも１つのペプチド結合の加水分解を触媒するポリペプチドの能力を指す。ＩｇＧ免疫グロブリン組成物についてのアミド分解活性プロフィールは、ＰＬ−１（広いスペクトル）、Ｓ−２２８８（広いスペクトル）、Ｓ−２２６６（ＦＸＩａ、顆粒性カリクレイン）、Ｓ−２２２２（ＦＸａ、トリプシン）、Ｓ−２２５１（プラスミン）、及びＳ−２３０２（カリクレイン、ＦＸＩａ及びＦＸＩＩａ）を含むがこれらに限定されない、ヒト血漿で見出されるプロテアーゼに対する様々な特異性を有する種々の発色基質によって、決定され得る。組成物のアミド分解活性を測定する方法は、たとえば、Ｍ．Ｅｔｓｃｈｅｉｄら（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ  ａｎｄ  ＦＸＩａ  ａｓ  ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ（治療用免疫グロブリンにおける不純物としてのカリクレイン及びＦＸＩａの特定：静注用血液製品の安全性及び制御に対する示唆)、Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ、２０１１；その開示はあらゆる目的についてその全体が参照によって本明細書に組み入れられる）に記載されたように当該技術で周知である。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、「抗補体活性」及び「ＡＣＡ」という用語は相互交換可能に使用され、タンパク質組成物、たとえば免疫グロブリンＩｇＧ組成物が、補体アッセイ、たとえば、その内容はあらゆる目的についてその全体が参照によって本明細書に組み入れられる"Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ"Ｎｏ．７４；Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，１９６５，並びにＥ．Ａ．Ｋａｂａｔ及びＭ．Ｍａｙｅｒ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；第２版、Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、１９６１に記載された方法に実質的に基づく方法にて、補体の能力を消費する能力を指す。補体活性の典型的な単位は、本明細書で記載される補体活性にて最適に感作された合計５×１０８個の赤血球のうち２．５×１０８個の溶解を生じる補体の量である。
【００６８】
一実施形態では、ＡＣＡは、補体源として機能するモルモット血清の様々な希釈と共にインキュベートされる、抗体で感作されたヒツジ赤血球の標準化された浮遊液を用いて測定される。溶血の程度を分光光度的に測定する。たとえば、免疫グロブリン製品の抗補体活性を測定するには、種々の量の免疫グロブリン製品とｍｌ当たり２Ｃ'Ｈ５０単位のモルモット血清を含有する試験溶液を調製する。ある特定の実施形態では、抗補体活性は、定義された量の試験物質（たとえば、１０ｍｇの免疫グロブリンＩｇＧ）を定義された量のモルモット補体（たとえば、２０Ｃ'Ｈ５０）と共にインキュベートすることによって測定し、残りの補体を滴定する。抗補体活性は補体対照（１００％とみなされる）に対する補体の消費率として表される。一実施形態では、ＡＣＡは、その内容はあらゆる目的についてその全体が参照によって本明細書に組み入れられる、欧州薬局方：静脈内投与用のヒト正常免疫グロブリン、欧州薬局方６．３，モノグラフ２．６．１７，４１６６-４１６８．欧州評議会，フランス、ストラスブール私書箱；で述べられる標準に従って測定される。
【００６９】
静脈内投与が意図される組成物の抗補体活性を低下させる方法は、文献（その内容はあらゆる目的についてその全体が参照によって本明細書に組み入れられるＳｃｈｕｌｔｚ，  Ｈ．  Ｅ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｗｉｃｋ，  Ｇ．，  Ｄｔｓｃｈ．  ｍｅｄ．  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒｉｆｔ  ８７  （１９６２），  １６４３；  Ｂａｒａｎｄｕｎ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．  ２８  （１９５７），  １５７；  Ｂａｒａｎｄｕｎ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．  ７  （１９６２），  １８７；  ａｎｄ  Ｓｔｅｐｈｅｎ，  Ｗ．，  Ｚ．  Ｋｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｋｌｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７  （１９６９），  ２８２）に記載されている。
【００７０】
本明細書で使用されるとき、「脱クリオ（cryo-poor）血漿」は、凍結に近い温度、たとえば、約１０℃未満の温度での血漿又はプール血漿の寒冷沈降（クリオ沈降）の後に形成される上清を指す。本発明の文脈では、血漿は相互交換可能に、回収血漿（すなわち、生体外で全血から分離された血漿）又は原料血漿（すなわち、プラズマフェレーシスを介して採取された血漿）を指す。クリオ沈降は一般に、たとえば、安全性と品質の問題についてすでにアッセイ済みの予め凍結されたプール血漿を融解することによって実施されるが、新鮮血漿も使用され得る。融解は通常、６℃を超えない温度で行う。低温での凍結血漿の完全な融解の後、冷所（たとえば、≦６℃）で遠心分離を行って液体上清から固体のクリオ沈降物を分離する。或いは、遠心分離ではなく濾過によって分離ステップを実施することができる。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、「Ｃｏｈｎプール」は血漿試料又は血漿試料のプールの分画に使用される出発物質を指す。Ｃｏｈｎプールには、予備処理ステップに供されてもよく又は供されなくてもよい全血漿、脱クリオ血漿試料、及び脱クリオ血漿試料のプールが含まれる。ある特定の実施形態では、Ｃｏｈｎプールは、予備処理ステップ、たとえば、固相（たとえば、水酸化アルミニウム、細かく分割された二酸化ケイ素等）への吸着、又はクロマトグラフィステップ（たとえば、イオン交換若しくはヘパリン親和性クロマトグラフィ）にて１種以上の血液因子が取り除かれている、脱クリオ血漿試料である。第８因子阻害剤バイパス活性（ＦＥＩＢＡ）、第ＩＸ因子複合体、第ＶＩＩ因子濃縮物、又はアンチトロンビンＩＩＩ複合体を含むがこれらに限定されない種々の血液因子を脱クリオ血漿試料から単離して、Ｃｏｈｎプールを形成し得る。
【００７２】
本明細書で使用されるとき、「溶出液の先行部分」はカチオン交換樹脂から溶出される免疫グロブリン組成物の第１の画分を指し、該画分は、高い免疫グロブリン収率および、溶出前の樹脂に結合した総アミド分解活性に比べて低下したアミド分解活性を特徴とする。溶出液の先行部分は、カチオン交換樹脂から放出される溶出液の第１の画分であり、それは免疫グロブリン組成物の第２の画分（「溶出液の遅行部分」と言う）の放出（すなわち、溶出）前に生じる。溶出液の遅行部分は、少量の免疫グロブリンしか（通常、カラムに結合した免疫グロブリンの２５％を超えない、好ましくは１０％を超えない）含有せず、溶出液の先行部分に比べて高い濃度のアミド分解活性を特徴とする。種々の実施形態では、溶出液の先行部分と遅行部分は、溶出液のｐＨ、タンパク質収率（たとえば、樹脂に結合したタンパク質の比率（％）として表される）、溶出液のタンパク質濃度（たとえば、光学密度によって決定されるような）、溶出液の体積等を含むがこれらに限定されない種々の特徴によって、定義され得る。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、「限外濾過（ＵＦ）」という用語は、静水圧が半透膜に対して液体を強制的に通過させる種々の膜濾過法を包含する。高分子量の懸濁された固体及び溶質は保持される一方で水及び低分子の溶質は膜を通過する。この分離方法は、高分子（１０３〜１０６ダルトン）溶液、特にタンパク質溶液を精製し、濃縮するために使用されることが多い。保持する分子のサイズに応じて多数の限外濾過膜が利用可能である。限外濾過は通常、１〜１０００ｋＤａの間の膜孔サイズ及び０．０１〜１０バールの操作圧を特徴とし、糖類や塩類のような小分子からタンパク質を分離するのに特に有用である。
【００７４】
本明細書で使用されるとき、「透析濾過」という用語は、限外濾過と同様の膜によって実施され、接線流濾過方式又は全量濾過方式のいずれかとして実行することができる。透析濾過の間、緩衝液をリサイクル槽に導入する一方で、濾液をユニット操作から取り除く。生成物が残余物（たとえば、ＩｇＧ免疫グロブリン）中にある工程では、透析濾過により生成物プールから成分が濾液に洗い出され、それによって緩衝液は交換され、望ましくない種の濃度が低下する。
【００７５】
本明細書で使用されるとき、「界面活性剤」（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）という用語は、本出願では、「界面活性剤」（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）又は「表面活性化剤」（ｓｕｒｆａｃｅ  ａｃｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）という用語と交換可能に使用される。界面活性剤は通常、両親媒性であり、すなわち、界面活性剤を有機溶媒及び水の双方に可溶性にする疎水性基（「尾部」）と親水性基（「頭部」）の双方を含有する有機化合物である。界面活性剤は、その頭部における外見上荷電した基の存在によって分類することができる。非イオン性界面活性剤はその頭部に電荷基を有さないが、イオン性界面活性剤はその頭部に正味電荷を持つ。両性イオン性界面活性剤は２つの相反して荷電した基を持つ頭部を含有する。一般的な界面活性剤のいくつかの例には、アニオン性（硫酸、スルホン酸又はカルボン酸のアニオンに基づく）；パーフルオロオクタノエート（ＰＦＯＡ又はＰＦＯ）、パーフルオロオクタンスルホネート（ＰＦＯＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸アンモニウム、及び他のアルキル硫酸塩、ラウレス硫酸ナトリウム（ラウリルエーテル硫酸ナトリウム又はＳＬＥＳとしても知られる）、スルホン酸アルキルベンゼン；カチオン系（四級アンモニウムカチオンに基づく）：臭化ヘキサドデシルトリメチルアンモニウムとしても知られる臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）及び他のアルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、ポリエトキシ化タロウアミン（ＰＯＥＡ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＴ）；長鎖脂肪酸及びその塩（カプリル酸塩、カプリル酸、ヘキサン酸塩、ヘキサン酸、ヘプタン酸、ナノン酸、デカン酸等を含む）；両性イオン系（両性）：ドデシルベタイン；コカミドプロピルベタイン；ココアンフォグリシネート；非イオン系：アルキルポリ（酸化エチレン）、アルキルフェノールポリ（酸化エチレン）、ポリ（酸化エチレン）の共重合体及びポリ（酸化プロピレン）（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒｓ又はＰｏｌｏｘａｍｉｎｅｓとして商業的に知られる）、オクチルグルコシドを含むアルキルポリグルコシド、デシルマルトシド、脂肪アルコール（たとえば、セチルアルコール及びオレイルアルコール）、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、等）、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤、及びドデシルジメチルアミンオキシドが挙げられる。
【００７６】
本出願で使用されるとき、「噴霧」という用語は、例えば、改変されたＣｏｈｎ画分Ｉ又はＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップのようなアルコール沈殿ステップの際に、液体物質を系へ、液体物質の微細液滴又はミストの形態で送達する手段を指す。噴霧は、スプレーヘッドまたはノズルを有し、液体から微細ミストを生成するように手動で又は自動で操作される容器（たとえば、スプレー瓶）のような任意の加圧装置によって達成され得る。通常、噴霧は、系の中での液体の迅速で均一な分配を確保するために、液体物質を受け入れる系を連続的に撹拌又はそれ以外の方式で混合しながら実施される。
【００７７】
「治療上有効な量若しくは用量」又は「十分な／有効な量若しくは用量」は、それが投与される目的である効果が生じる用量を意味する。正確な用量は治療の目的に左右されるであろうし、既知の技法を用いて当業者によって解明可能であろう（たとえば、  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  （ｖｏｌｓ．  １−３，  １９９２）；  Ｌｌｏｙｄ，  Ｔｈｅ  Ａｒｔ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ  （１９９９）；  Ｐｉｃｋａｒ，  Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ  （１９９９）；  ａｎｄ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００３，  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ｅｄ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓを参照のこと）。
【００７８】
ＩＩＩ．アミド分解活性の低減
１つの態様では、本開示は血漿由来の免疫グロブリンＩｇＧ組成物のアミド分解活性を低下させる（たとえば、ＦＸＩ／ＦＸＩａ及び／又はＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａの含量を減らす）ためのクロマトグラフィ法を提供する。同様に、本開示はまた、本明細書で提供される方法に従って調製される低レベルのアミド分解活性（たとえば、低レベルのＦＸＩ／ＦＸＩａ及び／又はＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ）を含有する血漿由来の免疫グロブリンＩｇＧ組成物も提供する。有利なことに、本明細書で記載される方法は改善された安全性プロフィールを持つ血漿由来の免疫グロブリンＩｇＧ組成物を提供する。具体的には、これらの方法によって提供される組成物は、現在製造されている免疫グロブリンＩｇＧ組成物に比べて望ましくない血栓塞栓症事象を引き起こす可能性が低い。
【００７９】
Ａ．分画法
本発明は、血漿由来の免疫グロブリン組成物に存在するアミド分解活性の大半がカチオン交換樹脂から溶出されて、１段階溶出によって生成される溶出液の遅行部分に入る一方で、画分の免疫グロブリン含量の大半は前記溶出液の先行部分に溶出するという発見に部分的に基づく。従って、溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収することによって、得られる免疫グロブリン製剤のアミド分解活性が有意に低減される。具体的には、本明細書で提供される方法に従って調製される免疫グロブリン製剤にて第ＸＩａ因子の含量、および従って第ＸＩａ因子の含量に関連するアミド分解活性が有意に低減されることが本明細書で示される。
【００８０】
従って一実施形態では、本発明は、血漿由来の免疫グロブリン組成物におけるアミド分解活性の量を低下させる方法を提供し、該方法は、（ａ）カチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンとアミド分解活性（すなわち、アミド分解活性を有するタンパク質混入物）とを結合させるステップと、（ｂ）任意で、タンパク質が結合したカチオン交換樹脂を洗浄緩衝液で洗浄して、緩く会合した混入物を取り除くステップと、（ｃ）ＩｇＧ免疫グロブリン及びアミド分解活性の単一段階溶出を実施するステップと、（ｄ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は出発組成物に比べて低下した量のアミド分解活性を有するＩｇＧ免疫グロブリン組成物を含み、溶出液の遅行部分は高い濃度のアミド分解活性を含有する。特定の実施形態では、アミド分解活性は組成物に存在する第ＸＩａ因子の活性である。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【００８１】
特定の実施形態では、本発明は、血漿由来の免疫グロブリン組成物にて第ＸＩ因子（ＦＸＩ）及び／又は第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）の量を減らす方法を提供するが、該方法は、（ａ）６．０を超えないｐＨ及び１１ｍＳ／ｃｍを超えない導電率を含む第１の溶液条件のもとでクロマトグラフィカラム中に配置されたカチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンとＦＸＩ及び／又はＦＸＩａとを含む血漿由来の免疫グロブリン組成物を接触させて、免疫グロブリンとＦＸＩ及び／又はＦＸＩａの少なくとも一部とをカチオン交換樹脂に結合させるステップと、（ｂ）少なくとも７．５のｐＨ及び少なくとも１５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させることによってカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出して、溶出液を形成するステップと、（ｃ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は出発組成物に比べて低下した量のアミド分解活性を有するＩｇＧ免疫グロブリン組成物を含み、溶出液の遅行部分は高い濃度のアミド分解活性を含有する。別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２０ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２２ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【００８２】
特定の一実施形態では、方法は、４．８〜５．６の間のｐＨ及び１１ｍＳ／ｃｍを超えない導電率を含む第１の溶液条件のもとでクロマトグラフィカラム中に配置されたカチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンとＦＸＩ及び／又はＦＸＩａとを含む血漿由来の免疫グロブリン組成物を接触させて、免疫グロブリンとＦＸＩ及び／又はＦＸＩａの少なくとも一部とをカチオン交換樹脂に結合させるステップと、（ｂ）少なくとも７．５のｐＨ及び少なくとも１５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させることによってカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出して、溶出液を形成するステップと、（ｃ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は出発組成物に比べて低下した量のアミド分解活性を有するＩｇＧ免疫グロブリン組成物を含み、溶出液の遅行部分は高い濃度のアミド分解活性を含有する。特定の実施形態では、第１の溶液のｐＨは５．２±０．３である。別の特定の実施形態では、第１の溶液のｐＨは５．２±０．２である。別の特定の実施形態では、第１の溶液のｐＨは５．２±０．１である。さらに別の特定の実施形態では、第１の溶液のｐＨは５．２である。さらに他の実施形態では、第１の溶液のｐＨは４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、又は６．０である。別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２０ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２２ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【００８３】
特定の一実施形態では、方法は、（ａ）６．０を超えないｐＨ及び１１ｍＳ／ｃｍを超えない導電率を含む第１の溶液条件のもとでクロマトグラフィカラム中に配置されたカチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンとＦＸＩ及び／又はＦＸＩａとを含む血漿由来の免疫グロブリン組成物を接触させて、免疫グロブリンとＦＸＩ及び／又はＦＸＩａの少なくとも一部とをカチオン交換樹脂に結合させるステップと、（ｂ）免疫グロブリンが樹脂から溶出されないような十分に低い導電率と５．１〜５．９の間のｐＨを有する緩衝液で免疫グロブリンとＦＸＩ及び／又はＦＸＩａとが結合した樹脂を洗浄するステップと、（ｃ）少なくとも７．５のｐＨ及び少なくとも１５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させることによってカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出して、溶出液を形成するステップと、（ｄ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は出発組成物に比べて低下した量のアミド分解活性を有するＩｇＧ免疫グロブリン組成物を含み、溶出液の遅行部分は高い濃度のアミド分解活性を含有する。特定の実施形態では、洗浄緩衝液のｐＨは５．５±０．３である。別の特定の実施形態では、洗浄緩衝液のｐＨは５．５±０．２である。別の特定の実施形態では、洗浄緩衝液のｐＨは５．５±０．１である。別の特定の実施形態では、洗浄緩衝液のｐＨは５．５である。さらに他の実施形態では、洗浄緩衝液のｐＨは５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、又は６．０である。別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２０ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２２ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【００８４】
特定の一実施形態では、方法は、（ａ）６．０を超えないｐＨ及び１１ｍＳ／ｃｍを超えない導電率を含む第１の溶液条件のもとでクロマトグラフィカラム中に配置されたカチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンとＦＸＩ及び／又はＦＸＩａとを含む血漿由来の免疫グロブリン組成物を接触させて、免疫グロブリンとＦＸＩ及び／又はＦＸＩａの少なくとも一部とをカチオン交換樹脂に結合させるステップと、（ｂ）７．８±０．４のｐＨ及び少なくとも２０ｍＳ／ｃｍの導電率を含む溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させることによってカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出して、溶出液を形成するステップと、（ｃ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は出発組成物に比べて低下した量のアミド分解活性を有するＩｇＧ免疫グロブリン組成物を含み、溶出液の遅行部分は高い濃度のアミド分解活性を含有する。特定の実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは７．８±０．３である。別の特定の実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは７．８±０．２である。別の特定の実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは７．８±０．１である。別の特定の実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは７．８である。さらに他の実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、７．０、７．１、７．２、７．３６、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、又は８．５である。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２２ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【００８５】
一般に、本明細書で提供される方法に使用される出発物質にはＩｇＧ免疫グロブリン及びアミド分解活性を含む任意の血漿画分又は血漿組成物が挙げられる。したがって、一実施形態では、血漿は当該技術で既知の精製スキームのいずれか１つに従って部分的に又は全体的に分画される。特定の実施形態では、血漿は分画されて、画分Ｉの沈殿物、画分ＩＩの沈殿物、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物、画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物、画分ＩＶ−１、キストラー／ニッチェマンの沈殿物Ａ、キストラー／ニッチェマンの沈殿物Ｂ又はそれらの改変された沈殿物を生じ、それらは本明細書で提供される方法に出発物質として使用され得る。
【００８６】
好ましい実施形態では、血漿は１種以上のエタノール沈殿ステップによって分画される。エタノール沈殿ステップを用いて、所望の免疫グロブリンを溶液から沈殿させる一方で少なくとも１つの非免疫グロブリンタンパク質を上清に保持してもよく、又は少なくとも１つの非免疫グロブリンタンパク質を溶液から沈殿させる一方で所望の免疫グロブリンを上清に保持してもよい。この様式で免疫グロブリンを分画する方法は当該技術で周知である。例示的エタノール沈殿物には、画分Ｉの沈殿物、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物、画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物、画分ＩＶ−１、キストラー／ニッチェマンの沈殿物Ａ、キストラー／ニッチェマンの沈殿物Ｂ及びそれらの改変された沈殿物が挙げられる。特に好ましい実施形態では、脱クリオ血漿に存在する免疫グロブリンが、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップ、Ａの沈殿ステップ、Ｂの沈殿ステップ及び画分ＩＩの沈殿ステップを含む４ステップエタノール法によって濃縮される。
【００８７】
一実施形態では、本明細書で提供されるアミド分解活性を低減する方法のための出発物質はプールしたヒト血漿（たとえば、脱クリオ血漿）のエタノール分画によって調製される。特定の一実施形態では、エタノール分画には、以下で記載されるように、脱クリオ血漿の画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿、懸濁した画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物の画分Ａの沈殿、懸濁した画分Ａ沈殿物の画分Ｂの沈殿、及び画分Ａ上清の画分ＩＩの沈殿が含まれる。別の特定の実施形態では、エタノール分画には、脱クリオ血漿の画分Ｉの沈殿、画分Ｉ上清の画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿、及び懸濁した画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の画分ＩＩの沈殿が含まれる。
【００８８】
本明細書で実証されるように、本明細書で提供される方法の有利な特徴は、大規模な製造手順に適用される際に保持される。ＩｇＧ免疫グロブリン組成物の調製に関して、大規模な製造とは少なくとも１００Ｌのプールした血漿（たとえば、脱クリオ血漿）出発物質を濃縮する方法を指す。一般に、大規模な免疫グロブリン製造方法はバッチ当たり１００Ｌ〜２０，０００Ｌのプールした血漿を分画するであろう。ある特定の実施形態では、大規模なＩｇＧ免疫グロブリン製造方法は少なくとも１００Ｌのプールした血漿（たとえば、脱クリオ血漿）の分画を指す。別の実施形態では、大規模なＩｇＧ免疫グロブリン製造方法は少なくとも５００Ｌのプールした血漿（たとえば、脱クリオ血漿）の分画を指す。別の実施形態では、大規模なＩｇＧ免疫グロブリン製造方法は少なくとも１，０００Ｌのプールした血漿（たとえば、脱クリオ血漿）の分画を指す。別の実施形態では、大規模なＩｇＧ免疫グロブリン製造方法は少なくとも５，０００Ｌのプールした血漿（たとえば、脱クリオ血漿）の分画を指す。さらに別の実施形態では、大規模なＩｇＧ免疫グロブリン製造方法は少なくとも１０，０００Ｌのプールした血漿（たとえば、脱クリオ血漿）の分画を指す。
【００８９】
一般に、上述の負荷条件、洗浄条件及び溶出条件の組み合わせすべてを含有する方法が企図される。さらに特定のクロマトグラフィ条件の組み合わせすべてを含有する方法が、以下で記載されるような溶出液の先行部分を定義および回収するためのすべての考えられるスキームと共に企図される。
【００９０】
１．カチオン交換溶出液の先行部分及び遅行部分
１つの態様では、本発明は、カチオン交換溶出液の先行部分を回収することによって、免疫グロブリン製剤に存在するアミド分解活性、特にＦＸＩａ混入物が寄与するアミド分解活性を低減する方法を提供する。有利なことに、カチオン交換クロマトグラフィステップの単一段階溶出によって形成される溶出液の先行部分が所望の免疫グロブリン含量の大半を含有する一方で、溶出液の遅行部分は望ましくないアミド分解活性の大半を含有することが、本明細書で示される。免疫グロブリンとアミド分解活性の溶出を完全に分離することはできないので、溶出液の先行部分と遅行部分の境界が定義されなければならない。この決定を行う際、以下の２つの主な考慮事項が考慮され得る：（ｉ）溶出液の先行部分と遅行部分がどのように定義されるかに応じて、より多い又はより少ないアミド分解活性が先行部分にて回収される、すなわち、溶出液の先行部分が溶出液全体のより小さな部分として定義されればされるほど、アミド分解活性のより大きな部分を免疫グロブリン含量から分離することができ、逆もまた同様である；及び（ｉｉ）溶出液の先行部分と遅行部分がどのように定義されるかに応じて、より多い又はより少ない免疫グロブリンの回収収量が先行部分に存在する、すなわち、溶出液の先行部分が溶出液全体のより小さな部分として定義されればされるほど、より少ない免疫グロブリンの収量が達成され、逆もまた同様である。
【００９１】
従って、当業者はその個々のニーズに基づいて、カチオン交換溶出液の先行部分と遅行部分の間の境界をどこに引くかについて決定するであろう。たとえば、研究目的又は特殊化した治療目的で小規模な精製を準備する場合、当業者は最終的な免疫グロブリンの収率を犠牲にしながら、溶出液のさらに小さな先行部分を回収することによって方法の分離力を最大化し得る。対照的に、大規模な製造（例えば、５００Ｌを超える脱クリオ血漿を処理する）を実施する場合、機会費用のために、組成物のアミド分解活性のより緩やかな低減を犠牲にして溶出液のより大きな先行部分を回収して、免疫グロブリンの回収収量を高めることになり得る。
【００９２】
種々の実施形態では、溶出液の先行部分と遅行部分は、溶出液のｐＨ、タンパク質収率（たとえば、樹脂に結合したタンパク質の比率（％）として表される）、溶出液のタンパク質の濃度（たとえば、光学密度によって決定されるような）、溶出液の体積等を含むがこれらに限定されない種々の特徴によって定義され得る。
【００９３】
ａ．溶出液のｐＨ
本明細書で提供される実施例にて実証されるように、カチオン交換溶出ステップの開始は、カラム負荷及び洗浄ステップ（一般に５．０〜６．０）よりも高いｐＨ（一般に＞７．０）を溶出緩衝液が有するにもかかわらず、カラムから出てくる溶液のｐＨが５．０を下回るｐＨまで低下することによって特徴付けられる。ｐＨのこの低下は低いアミド分解活性及び第ＸＩａ因子含量を有する免疫グロブリンＩｇＧ組成物の溶出と一致する（たとえば、それぞれ表４及び表１１を参照）。溶出の後の時点では、カラムから出てくる溶液のｐＨは６．０〜８．０を上回って鋭く上昇する。ｐＨにおけるこのシフトは溶出液のアミド分解活性及び第ＸＩａ因子含量の有意な上昇に一致する（たとえば、それぞれ表４及び表１１を参照）。従って、単一の高ｐＨの溶出緩衝液（一般に７．０より高い）の適用によって１段階溶出を行うが、溶出プロフィールは、ＩｇＧ免疫グロブリンが先ずカラムから溶出された後にアミド分解活性（たとえば、第ＸＩ因子及び／又は第ＸＩａ因子）が付随する、２段階溶出に類似している。従って、ある特定の実施形態では、溶出液の先行部分と遅行部分はカラム出口での溶出液のｐＨに基づいて定義される。
【００９４】
従って、１つの態様では、本発明は血漿由来の免疫グロブリン組成物におけるアミド分解活性の量を低減させる方法を提供し、該方法は、（ａ）カチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリン及びアミド分解活性（すなわち、アミド分解活性を有するタンパク質混入物）を結合させるステップと、（ｂ）任意で、タンパク質が結合したカチオン交換樹脂を洗浄緩衝液で洗浄し、緩く会合した混入物を取り除くステップと、（ｃ）ＩｇＧ免疫グロブリンとアミド分解活性との単一段階溶出を行うステップと、（ｄ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は７．０を超えないｐＨを有する溶出液の部分から成る。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は６．５を超えないｐＨを有する溶出液の部分から成る。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は６．０を超えないｐＨを有する溶出液の部分から成る。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は５．５を超えないｐＨを有する溶出液の部分から成る。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は５．０を超えないｐＨを有する溶出液の部分から成る。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６．０、５．９、５．８、５．７、５．６、５．５、５．４、５．３、５．２、５．１、５．０又はそれ未満を超えないｐＨを有する溶出液の部分から成る。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【００９５】
特定の実施形態では、本発明は、血漿由来の免疫グロブリン組成物にて第ＸＩ因子（ＦＸＩ）及び／又は第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）の量を低減する方法を提供し、該方法は、（ａ）６．０を超えないｐＨ及び１１ｍＳ／ｃｍを超えない導電率を含む第１の溶液条件のもとでクロマトグラフィカラム中に配置されたカチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンとＦＸＩ及び／又はＦＸＩａとを含む血漿由来の免疫グロブリン組成物を接触させて、免疫グロブリンとＦＸＩ及び／又はＦＸＩａの少なくとも一部とをカチオン交換樹脂に結合させるステップと、（ｂ）少なくとも７．５のｐＨ及び少なくとも１５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させることによってカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出して、溶出液を形成するステップと、（ｃ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は７．０を超えないｐＨを有する溶出液の部分から成る。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は６．５を超えないｐＨを有する溶出液の部分から成る。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は６．０を超えないｐＨを有する溶出液の部分から成る。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は５．５を超えないｐＨを有する溶出液の部分から成る。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は５．０を超えないｐＨを有する溶出液の部分から成る。さらに他の実施形態では、別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６．０、５．９、５．８、５．７、５．６、５．５、５．４、５．３、５．２、５．１、５．０又はそれ未満を超えないｐＨを有する溶出液の部分から成る。別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２０ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２２ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【００９６】
ｂ．溶出液の吸光度
免疫グロブリン組成物の大規模製造に特に良好に適合したさらに別の実施形態では、溶出液の先行部分と遅行部分はカチオン交換カラムから溶出される免疫グロブリンの濃度によって定義される。たとえば、大規模製造の間、免疫グロブリン組成物は、ピーク溶出物が高度に濃縮されるように十分に高いタンパク質負荷量（たとえば、樹脂１ｍｌ当たり８０ｍｇ超のタンパク質）でカチオン交換樹脂に負荷され得る。これらの例では、溶出液の先行部分は、ＯＤ２８０が閾値よりも低下する時点の前に溶出する溶出液の画分として定義することができる。この方式では、製造実行間の軽微な変動に関わりなく、ほぼ同一収量の免疫グロブリンを調製物の次から次へと再現良く回収することができる。実施例９で実証するように、大規模製造法へのこの回収スキームの適用は、ＴＧＡ及びアミド分解活性の含量が有意に低下したＩｇＧ免疫グロブリン組成物の高収率での回収をもたらす。
【００９７】
従って、１つの態様では、本発明は血漿由来の免疫グロブリン組成物にてアミド分解活性の量を低減する方法を提供し、該方法は、（ａ）カチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンとアミド分解活性（すなわち、アミド分解活性を有するタンパク質混入物）とを結合させるステップと、（ｂ）任意で、タンパク質が結合したカチオン交換樹脂を洗浄緩衝液で洗浄して、緩く会合した混入物を取り除くステップと、（ｃ）ＩｇＧ免疫グロブリン及びアミド分解活性の単一段階溶出を実施するステップと、（ｄ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は少なくとも０．５ＡＵのＯＤ２８０を有する溶出液の部分から成る。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は少なくとも１．０ＡＵのＯＤ２８０を有する溶出液の部分から成る。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は少なくとも１．５ＡＵのＯＤ２８０を有する溶出液の部分から成る。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は少なくとも２．０ＡＵのＯＤ２８０を有する溶出液の部分から成る。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は、少なくとも０．１ＡＵ、０．２ＡＵ、０．３ＡＵ、０．４ＡＵ、０．５ＡＵ、０．６ＡＵ、０．７ＡＵ、０．８ＡＵ、０．９ＡＵ、１．０ＡＵ、１．１ＡＵ、１．２ＡＵ、１．３ＡＵ、１．４ＡＵ、１．５ＡＵ、１．６ＡＵ、１．７ＡＵ、１．８ＡＵ、１．９ＡＵ、２．０ＡＵ又はそれ以上のＯＤ２８０を有する溶出液の部分から成る。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【００９８】
特定の実施形態では、本発明は、血漿由来の免疫グロブリン組成物にて第ＸＩ因子（ＦＸＩ）及び／又は第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）の量を低減する方法を提供し、該方法は、（ａ）６．０を超えないｐＨ及び１１ｍＳ／ｃｍを超えない導電率を含む第１の溶液条件のもとでクロマトグラフィカラム中に配置されたカチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンとＦＸＩ及び／又はＦＸＩａとを含む血漿由来の免疫グロブリン組成物を接触させて、免疫グロブリンとＦＸＩ及び／又はＦＸＩａの少なくとも一部とをカチオン交換樹脂に結合させるステップと、（ｂ）少なくとも７．５のｐＨ及び少なくとも１５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させることによってカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出して、溶出液を形成するステップと、（ｃ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は少なくとも２．０ＡＵのＯＤ２８０を有する溶出液の部分から成る。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は少なくとも１．５ＡＵのＯＤ２８０を有する溶出液の部分から成る。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は少なくとも１．０ＡＵのＯＤ２８０を有する溶出液の部分から成る。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は少なくとも０．５ＡＵのＯＤ２８０を有する溶出液の部分から成る。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は、少なくとも０．１ＡＵ、０．２ＡＵ、０．３ＡＵ、０．４ＡＵ、０．５ＡＵ、０．６ＡＵ、０．７ＡＵ、０．８ＡＵ、０．９ＡＵ、１．０ＡＵ、１．１ＡＵ、１．２ＡＵ、１．３ＡＵ、１．４ＡＵ、１．５ＡＵ、１．６ＡＵ、１．７ＡＵ、１．８ＡＵ、１．９ＡＵ、２．０ＡＵ又はそれ以上のＯＤ２８０を有する溶出液の部分から成る。別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２０ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２２ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【００９９】
ｃ．溶出液全体に対する比率（％）
免疫グロブリン組成物の大規模製造に特に良好に適合したさらに別の実施形態では、溶出液の先行部分と遅行部分は溶出液の総タンパク質含量に対する（たとえば、総タンパク質の体積の）比率として定義される。先行部分で回収する溶出液の比率（％）を予め定めることによって、免疫グロブリンの回収収率を厳密に制御することができる。溶出液の先行部分と遅行部分を定義するこの方法は、最少段階での収率を必要とする製造法に、ならびに、免疫グロブリン収率の低下によるコストをアミド分解活性ならびに第ＸＩ因子及び／又は第ＸＩａ因子の含量が低下した組成物を製造する利益と比較検討することに基づいて決定を行う方法に、特に有用である。この方式では、製造実行間の軽微な変動に関わりなく、ほぼ同一収量の免疫グロブリンを調製物の次から次へと再現良く回収することができる。実施例８で実証するように、この回収スキームの適用は、ＴＧＡ及びアミド分解活性の含量が有意に低下したＩｇＧ免疫グロブリン組成物の高収率の回収をもたらすことができる。
【０１００】
従って、１つの態様では、本発明は、血漿由来の免疫グロブリン組成物におけるアミド分解活性の量を低下させる方法を提供し、該方法は、（ａ）カチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンとアミド分解活性（すなわち、アミド分解活性を有するタンパク質混入物）とを結合させるステップと、（ｂ）任意で、タンパク質が結合したカチオン交換樹脂を洗浄緩衝液で洗浄して、緩く会合した混入物を取り除くステップと、（ｃ）ＩｇＧ免疫グロブリン及びアミド分解活性の単一段階溶出を実施するステップと、（ｄ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は溶出液全体の８０％以下から成る。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の７０％〜８０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６０％〜８０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％〜８０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の７０％〜７５％の間である。さらに別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の７５％〜８０％の間である。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、又は８０％である。別の実施形態では、溶出液の先行部分（すなわち、回収された又はプールされた関心対象の画分）は溶出液全体の７０％以下である。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６０％〜７０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％〜７０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６０％〜６５％の間である。さらに別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６５％〜７０％の間である。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、又は７０％である。別の実施形態では、溶出液の先行部分（すなわち、回収された又はプールされた関心対象の画分）は溶出液全体の６０％以下である。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％〜６０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％〜５５％の間である。さらに別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５５％〜６０％の間である。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、又は６０％である。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【０１０１】
特定の実施形態では、本発明は、血漿由来の免疫グロブリン組成物にて第ＸＩ因子（ＦＸＩ）及び／又は第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）の量を低減する方法を提供し、該方法は、（ａ）６．０を超えないｐＨ及び１１ｍＳ／ｃｍを超えない導電率を含む第１の溶液条件のもとでクロマトグラフィカラム中に配置されたカチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンとＦＸＩ及び／又はＦＸＩａとを含む血漿由来の免疫グロブリン組成物を接触させて、免疫グロブリンとＦＸＩ及び／又はＦＸＩａの少なくとも一部とをカチオン交換樹脂に結合させるステップと、（ｂ）少なくとも７．５のｐＨ及び少なくとも１５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させることによってカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出して、溶出液を形成するステップと、（ｃ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は溶出液全体の８０％以下から成る。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の７０％〜８０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６０％〜８０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％〜８０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の７０％〜７５％の間である。さらに別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の７５％〜８０％の間である。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、又は８０％である。別の実施形態では、溶出液の先行部分（すなわち、回収された又はプールされた関心対象の画分）は溶出液全体の７０％以下である。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６０％〜７０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％〜７０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６０％〜６５％の間である。さらに別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６５％〜７０％の間である。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、又は７０％である。別の実施形態では、溶出液の先行部分（すなわち、回収された又はプールされた関心対象の画分）は溶出液全体の６０％以下である。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％〜６０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％〜５５％の間である。さらに別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５５％〜６０％の間である。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、又は６０％である。別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２０ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２２ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【０１０２】
ｄ．溶出液全体の体積
免疫グロブリン組成物の大規模製造に特に良好に適合したさらに別の実施形態では、溶出液の先行部分と遅行部分は、カチオン交換カラムのサイズに対する溶出液ピークの体積として（たとえば、規定数のカラム容積によって）定義される。先行部分で回収する溶出液の体積を予め定めることによって、免疫グロブリンの回収収率を厳密に制御することができ、再現可能である。溶出液の先行部分と遅行部分を定義するこの方法は、最少段階での収率を必要とする製造法に、ならびに、免疫グロブリン収率の低下によるコストをアミド分解活性ならびに第ＸＩ因子及び／又は第ＸＩａ因子の含量が低下した組成物を製造する利益と比較検討することに基づいて決定を行う方法に、特に有用である。この方式では、製造実行間の軽微な変動に関わりなく、ほぼ同一収量の免疫グロブリンを調製物の次から次へと再現良く回収することができる。実施例１１〜１３で実証するように、この回収スキームの適用は、ＴＧＡ及びアミド分解活性の含量が有意に低下したＩｇＧ免疫グロブリン組成物の高収率の回収をもたらすことができる。
【０１０３】
一実施形態では、先行部分の開始はベースラインの吸光度によって定義される。一部の実施形態では、先行部分の回収は溶出液のピークの吸光度が第１の閾値と交差したら開始する。一実施形態では、先行部分の回収は溶出液のＯＤ２８０が少なくとも２．０ＡＵに達したら開始する。特定の実施形態では、先行部分の回収は溶出液のＯＤ２８０が少なくとも１．５ＡＵに達したら開始する。別の特定の実施形態では、先行部分の回収は溶出液のＯＤ２８０が少なくとも１．０ＡＵに達したら開始する。別の特定の実施形態では、先行部分の回収は溶出液のＯＤ２８０が少なくとも０．５ＡＵに達したら開始する。さらに他の特定の実施形態では、先行部分の回収は溶出液のＯＤ２８０が少なくとも０．１ＡＵ、０．２ＡＵ、０．３ＡＵ、０．４ＡＵ、０．５ＡＵ、０．６ＡＵ、０．７ＡＵ、０．８ＡＵ、０．９ＡＵ、１．０ＡＵ、１．１ＡＵ、１．２ＡＵ、１．３ＡＵ、１．４ＡＵ、１．５ＡＵ、１．６ＡＵ、１．７ＡＵ、１．８ＡＵ、１．９ＡＵ、２．０ＡＵ、またはそれ以上に達したら開始する。
【０１０４】
一部の実施形態では、先行部分の回収をいったん開始したら、溶出液の遅行部分の回収（又は廃棄）に切り替わる前に、規定数のカラム容積にて回収される。一実施形態では、溶出液の５を超えないカラム容積（ＣＶ）を先行部分にて回収する。別の実施形態では、溶出液の４を超えないＣＶを先行部分にて回収する。別の実施形態では、溶出液の３を超えないＣＶを先行部分にて回収する。別の実施形態では、溶出液の２．７を超えないＣＶを先行部分にて回収する。別の実施形態では、溶出液の２．５を超えないＣＶを先行部分にて回収する。別の実施形態では、溶出液の２を超えないＣＶを先行部分にて回収する。別の実施形態では、溶出液の１を超えないＣＶを先行部分にて回収する。さらに他の実施形態では、溶出液の０．５を超えないＣＶ、０．６を超えないＣＶ、０．７を超えないＣＶ、０．８を超えないＣＶ、０．９を超えないＣＶ、１．０を超えないＣＶ、１．１を超えないＣＶ、１．２を超えないＣＶ、１．３を超えないＣＶ、１．４を超えないＣＶ、１．５を超えないＣＶ、１．６を超えないＣＶ、１．７を超えないＣＶ、１．８を超えないＣＶ、１．９を超えないＣＶ、２．０を超えないＣＶ、２．１を超えないＣＶ、２．２を超えないＣＶ、２．３を超えないＣＶ、２．４を超えないＣＶ、２．５を超えないＣＶ、２．６を超えないＣＶ、２．７を超えないＣＶ、２．８を超えないＣＶ、２．９を超えないＣＶ、３．０を超えないＣＶ、３．１を超えないＣＶ、３．２を超えないＣＶ、３．３を超えないＣＶ、３．４を超えないＣＶ、３．５を超えないＣＶ、３．６を超えないＣＶ、３．７を超えないＣＶ、３．８を超えないＣＶ、３．９を超えないＣＶ、４．０を超えないＣＶ、４．１を超えないＣＶ、４．２を超えないＣＶ、４．３を超えないＣＶ、４．４を超えないＣＶ、４．５を超えないＣＶ、４．６を超えないＣＶ、４．７を超えないＣＶ、４．８を超えないＣＶ、４．９を超えないＣＶ、５．０を超えないＣＶ、５．１を超えないＣＶ、５．２を超えないＣＶ、５．３を超えないＣＶ、５．４を超えないＣＶ、５．５を超えないＣＶ、５．６を超えないＣＶ、５．７を超えないＣＶ、５．８を超えないＣＶ、５．９を超えないＣＶ、６．０を超えないＣＶ又はそれ以上を超えないカラム容積を先行部分で回収する。
【０１０５】
従って、１つの態様では、本発明は、血漿由来の免疫グロブリン組成物におけるアミド分解活性の量を低下させる方法を提供し、該方法は、（ａ）カチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンとアミド分解活性（すなわち、アミド分解活性を有するタンパク質混入物）とを結合させるステップと、（ｂ）任意で、タンパク質が結合したカチオン交換樹脂を洗浄緩衝液で洗浄して、緩く会合した混入物を取り除くステップと、（ｃ）ＩｇＧ免疫グロブリン及びアミド分解活性の単一段階溶出を実施するステップと、（ｄ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は溶出液全体の４を超えないカラム容積（ＣＶ）から成る。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の２．５ＣＶ〜３．０ＣＶの間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の２．０ＣＶ〜３．０ＣＶの間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の２．０ＣＶ〜３．５ＣＶの間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の２．０ＣＶ〜４．０ＣＶの間である。さらに別のある特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の２．５ＣＶ〜３．５ＣＶの間である。さらに別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の０．５ＣＶ、０．６ＣＶ、０．７ＣＶ、０．８ＣＶ、０．９ＣＶ、１．０ＣＶ、１．１ＣＶ、１．２ＣＶ、１．３ＣＶ、１．４ＣＶ、１．５ＣＶ、１．６ＣＶ、１．７ＣＶ、１．８ＣＶ、１．９ＣＶ、２．０ＣＶ、２．１ＣＶ、２．２ＣＶ、２．３ＣＶ、２．４ＣＶ、２．５ＣＶ、２．６ＣＶ、２．７ＣＶ、２．８ＣＶ、２．９ＣＶ、３．０ＣＶ、３．１ＣＶ、３．２ＣＶ、３．３ＣＶ、３．４ＣＶ、３．５ＣＶ、３．６ＣＶ、３．７ＣＶ、３．８ＣＶ、３．９ＣＶ、４．０ＣＶ、４．１ＣＶ、４．２ＣＶ、４．３ＣＶ、４．４ＣＶ、４．５ＣＶ、４．６ＣＶ、４．７ＣＶ、４．８ＣＶ、４．９ＣＶ、５．０ＣＶ、５．１ＣＶ、５．２ＣＶ、５．３ＣＶ、５．４ＣＶ、５．５ＣＶ、５．６ＣＶ、５．７ＣＶ、５．８ＣＶ、５．９ＣＶ、又は６．０ＣＶである。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【０１０６】
特定の実施形態では、本発明は、血漿由来の免疫グロブリン組成物にて第ＸＩ因子（ＦＸＩ）及び／又は第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）の量を低減する方法を提供し、該方法は、（ａ）６．０を超えないｐＨ及び１１ｍＳ／ｃｍを超えない導電率を含む第１の溶液条件のもとでクロマトグラフィカラム中に配置されたカチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンとＦＸＩ及び／又はＦＸＩａとを含む血漿由来の免疫グロブリン組成物を接触させて、免疫グロブリンとＦＸＩ及び／又はＦＸＩａの少なくとも一部とをカチオン交換樹脂に結合させるステップと、（ｂ）少なくとも７．５のｐＨ及び少なくとも１５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させることによってカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出して、溶出液を形成するステップと、（ｃ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は溶出液全体の４を超えないカラム容積（ＣＶ）から成る。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の２．５ＣＶ〜３．０ＣＶの間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の２．０ＣＶ〜３．０ＣＶの間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の２．０ＣＶ〜３．５ＣＶの間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の２．０ＣＶ〜４．０ＣＶの間である。さらに別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の２．５ＣＶ〜３．５ＣＶの間である。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の０．５ＣＶ、０．６ＣＶ、０．７ＣＶ、０．８ＣＶ、０．９ＣＶ、１．０ＣＶ、１．１ＣＶ、１．２ＣＶ、１．３ＣＶ、１．４ＣＶ、１．５ＣＶ、１．６ＣＶ、１．７ＣＶ、１．８ＣＶ、１．９ＣＶ、２．０ＣＶ、２．１ＣＶ、２．２ＣＶ、２．３ＣＶ、２．４ＣＶ、２．５ＣＶ、２．６ＣＶ、２．７ＣＶ、２．８ＣＶ、２．９ＣＶ、３．０ＣＶ、３．１ＣＶ、３．２ＣＶ、３．３ＣＶ、３．４ＣＶ、３．５ＣＶ、３．６ＣＶ、３．７ＣＶ、３．８ＣＶ、３．９ＣＶ、４．０ＣＶ、４．１ＣＶ、４．２ＣＶ、４．３ＣＶ、４．４ＣＶ、４．５ＣＶ、４．６ＣＶ、４．７ＣＶ、４．８ＣＶ、４．９ＣＶ、５．０ＣＶ、５．１ＣＶ、５．２ＣＶ、５．３ＣＶ、５．４ＣＶ、５．５ＣＶ、５．６ＣＶ、５．７ＣＶ、５．８ＣＶ、５．９ＣＶ、又は６．０ＣＶである。別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２０ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２２ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【０１０７】
ＩＶ．抗補体活性（ＡＣＡ）の低減
１つの態様では、本開示は血漿由来の免疫グロブリンＩｇＧ組成物の抗補体活性（ＡＣＡ）含量を低下させるクロマトグラフィ法を提供する。同様に、本開示は、本明細書で提供される方法に従って調製される低レベルの抗補体活性（ＡＣＡ）を含有する血漿由来の免疫グロブリンＩｇＧ組成物も提供する。有利なことに、本明細書で提供される方法は改善された安全性プロフィールを持つ血漿由来の免疫グロブリンＩｇＧ組成物も提供する。特に、これらの方法によって提供される組成物は、現在製造されている免疫グロブリンＩｇＧ組成物に比べて抗補体活性に関連する有害反応を起こす可能性が低い（たとえば、Ｂｕｃｈａｃｈｅｒ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．  ２０１０  Ａｐｒ；  ９８（３  Ｐｔ  １）：ｅ２０９−１８を参照のこと。その内容はあらゆる目的でその全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。
【０１０８】
Ａ．分画法
本発明は、血漿由来の免疫グロブリン組成物に存在する抗補体活性（ＡＣＡ）の大半がカチオン交換樹脂から溶出されて、１段階溶出によって生成される溶出液の遅行部分に入る一方で、画分の免疫グロブリン含量の大半が前記溶出液の先行部分で溶出するという発見に部分的に基づく。従って、溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収することによって、得られる免疫グロブリン製剤の抗補体活性が有意に低下する。具体的には、本明細書で提供される方法に従って調製される免疫グロブリン組成物ではＡＣＡ含量が有意に低下することが本明細書で示される。
【０１０９】
従って、一実施形態では、本発明は血漿由来の免疫グロブリン組成物にて抗補体活性（ＡＣＡ）の量を低減する方法を提供し、該方法は、（ａ）カチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンと抗補体活性（すなわち、抗補体活性を有するタンパク質混入物）とを結合させるステップと、（ｂ）任意で、タンパク質が結合したカチオン交換樹脂を洗浄緩衝液で洗浄して、緩く会合した混入物を取り除くステップと、（ｃ）ＩｇＧ免疫グロブリン及びＡＣＡの単一段階溶出を実施するステップと、（ｄ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は出発組成物と比べて低下した量のＡＣＡを有するＩｇＧ免疫グロブリン組成物を含み、溶出液の遅行部分は高濃度のＡＣＡ活性を含有する。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【０１１０】
特定の実施形態では、本発明は血漿由来の免疫グロブリン組成物にて抗補体活性（ＡＣＡ）の量を低減する方法を提供し、該方法は、（ａ）６．０を超えないｐＨ及び１１ｍＳ／ｃｍを超えない導電率を含む第１の溶液条件のもとでクロマトグラフィカラム中に配置されたカチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンと第１の量のＡＣＡとを含む血漿由来の免疫グロブリン組成物を接触させて、免疫グロブリンと第１の量のＡＣＡの少なくとも一部とをカチオン交換樹脂に結合させるステップと、（ｂ）少なくとも７．５のｐＨ及び少なくとも１５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させることによってカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出して、溶出液を形成するステップと、（ｃ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は出発組成物と比べて免疫グロブリンＩｇＧの濃度に対して低濃度のＡＣＡを有するＩｇＧ免疫グロブリン組成物を含み、溶出液の遅行部分は免疫グロブリンＩｇＧの濃度に対して高濃度のＡＣＡ活性を含有する。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２０ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２２ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。
【０１１１】
特定の一実施形態では、方法は、（ａ）４．８〜５．６の間のｐＨ及び１１ｍＳ／ｃｍを超えない導電率を含む第１の溶液条件のもとでクロマトグラフィカラム中に配置されたカチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンと第１の量のＡＣＡとを含む血漿由来の免疫グロブリン組成物を接触させて、免疫グロブリンと第１の量のＡＣＡの少なくとも一部とをカチオン交換樹脂に結合させるステップと、（ｂ）少なくとも７．５のｐＨ及び少なくとも１５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させることによってカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出して、溶出液を形成するステップと、（ｃ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は出発組成物と比べて免疫グロブリンＩｇＧの量に対して少ない量のＡＣＡを有するＩｇＧ免疫グロブリン組成物を含み、溶出液の遅行部分は免疫グロブリンＩｇＧの量に対して多い量のＡＣＡ活性を含有する。特定の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは５．２±０．３である。別の特定の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは５．２±０．２である。別の特定の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは５．２±０．１である。さらに別の特定の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは５．２である。さらに他の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、又は６．０である。別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２０ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２２ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【０１１２】
特定の一実施形態では、方法は、（ａ）６．０を超えないｐＨ及び１１ｍＳ／ｃｍを超えない導電率を含む第１の溶液条件のもとでクロマトグラフィカラム中に配置されたカチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンと第１の量のＡＣＡとを含む血漿由来の免疫グロブリン組成物を接触させて、免疫グロブリンと第１の量のＡＣＡの少なくとも一部とをカチオン交換樹脂に結合させるステップと、（ｂ）免疫グロブリンが樹脂から溶出されないように十分に低い導電率と５．１〜５．９の間のｐＨを有する緩衝液で免疫グロブリンとＡＣＡとが結合した樹脂を洗浄するステップと、（ｃ）少なくとも７．５のｐＨ及び少なくとも１５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させることによってカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出して、溶出液を形成するステップと、（ｄ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は出発組成物と比べて免疫グロブリンＩｇＧの濃度に対して低濃度のＡＣＡを有するＩｇＧ免疫グロブリン組成物を含み、溶出液の遅行部分は免疫グロブリンＩｇＧの濃度に対して高濃度のＡＣＡ活性を含有する。特定の実施形態では、洗浄緩衝液のｐＨは５．５±０．３である。別の特定の実施形態では、洗浄緩衝液のｐＨは５．５±０．２である。別の特定の実施形態では、洗浄緩衝液のｐＨは５．５±０．１である。別の特定の実施形態では、洗浄緩衝液のｐＨは５．５である。さらに他の実施形態では、洗浄緩衝液のｐＨは５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、又は６．０である。別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２０ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２２ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【０１１３】
特定の一実施形態では、方法は、（ａ）６．０を超えないｐＨ及び１１ｍＳ／ｃｍを超えない導電率を含む第１の溶液条件のもとでクロマトグラフィカラム中に配置されたカチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンと第１の量のＡＣＡとを含む血漿由来の免疫グロブリン組成物を接触させて、免疫グロブリンと第１の量のＡＣＡの少なくとも一部とをカチオン交換樹脂に結合させるステップと、（ｂ）７．８±０．４のｐＨ及び少なくとも２０ｍＳ／ｃｍの導電率を含む溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させることによってカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出して、溶出液を形成するステップと、（ｃ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は出発組成物と比べて免疫グロブリンＩｇＧの濃度に対して低濃度のＡＣＡを有するＩｇＧ免疫グロブリン組成物を含み、溶出液の遅行部分は免疫グロブリンＩｇＧの濃度に対して高濃度のＡＣＡ活性を含有する。特定の実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは７．８±０．３である。別の特定の実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは７．８±０．２である。別の特定の実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは７．８±０．１である。別の特定の実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは７．８である。さらに他の実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは７．０、７．１、７．２、７．３６、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、又は８．５である。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２２ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【０１１４】
一般に、本明細書で提供される方法に使用される出発物質には、ＩｇＧ免疫グロブリンと抗補体活性とを含む任意の血漿の画分又は組成物が挙げられる。したがって、一実施形態では、血漿は当該技術で既知の精製スキームのいずれか１つに従って部分的に又は全体的に分画される。特定の実施形態では、血漿は分画されて画分Ｉの沈殿物、画分ＩＩの沈殿物、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物、画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物、画分ＩＶ−１、キストラー／ニッチェマンの沈殿物Ａ、キストラー／ニッチェマンの沈殿物Ｂ及びそれらの改変された沈殿物を生じ、それらは本明細書で提供される方法に出発物質として使用され得る。
【０１１５】
好ましい実施形態では、血漿は１種以上のエタノール沈殿ステップによって分画される。エタノール沈殿ステップを用いて、所望の免疫グロブリンを溶液から沈殿させる一方で少なくとも１つの非免疫グロブリンタンパク質を上清に保持してもよく、又は少なくとも１つの非免疫グロブリンタンパク質を溶液から沈殿させる一方で所望の免疫グロブリンを上清に保持してもよい。この様式で免疫グロブリンを分画する方法は当該技術で周知である。例示的エタノール沈殿物には、画分Ｉの沈殿物、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物、画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物、画分ＩＶ−１、キストラー／ニッチェマンの沈殿物Ａ、キストラー／ニッチェマンの沈殿物Ｂ及びそれらの改変された沈殿物が挙げられる。特に好ましい実施形態では、脱クリオ血漿に存在する免疫グロブリンが、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップ、Ａの沈殿ステップ、Ｂの沈殿ステップ及び画分ＩＩの沈殿ステップを含む４ステップエタノール法によって濃縮される。
【０１１６】
本明細書で実証されるように、本明細書で提供される方法の有利な特徴は大規模な製造手順に適用される際に保持される。ＩｇＧ免疫グロブリン組成物の調製に関して、大規模な製造とは少なくとも１００Ｌのプールした血漿（たとえば、脱クリオ血漿）出発物質を濃縮する方法を指す。一般に、大規模な免疫グロブリン製造方法はバッチ当たり１００Ｌ〜２０，０００Ｌのプールした血漿を分画するであろう。ある特定の実施形態では、大規模なＩｇＧ免疫グロブリン製造方法は少なくとも１００Ｌのプールした血漿（たとえば、脱クリオ血漿）の分画を指す。別の実施形態では、大規模なＩｇＧ免疫グロブリン製造方法は少なくとも５００Ｌのプールした血漿（たとえば、脱クリオ血漿）の分画を指す。別の実施形態では、大規模なＩｇＧ免疫グロブリン製造方法は少なくとも１，０００Ｌのプールした血漿（たとえば、脱クリオ血漿）の分画を指す。別の実施形態では、大規模なＩｇＧ免疫グロブリン製造方法は少なくとも５，０００Ｌのプールした血漿（たとえば、脱クリオ血漿）の分画を指す。さらに別の実施形態では、大規模なＩｇＧ免疫グロブリン製造方法は少なくとも１０，０００Ｌのプールした血漿（たとえば、脱クリオ血漿）の分画を指す。
【０１１７】
一実施形態では、本明細書で提供される抗補体活性（ＡＣＡ）を低下させる方法に使用される出発物質は、プールしたヒト血漿（たとえば、脱クリオ血漿）のエタノール分画によって調製される。特定の一実施形態では、エタノール分画には、以下で記載されるように、脱クリオ血漿の画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿、懸濁した画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物の画分Ａの沈殿、懸濁した画分Ａ沈殿物の画分Ｂの沈殿、及び画分Ａ上清の画分ＩＩの沈殿が含まれる。別のある特定の実施形態では、エタノール分画には、脱クリオ血漿の画分Ｉの沈殿、画分Ｉ上清の画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿、及び懸濁した画分ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物の画分ＩＩの沈殿が含まれる。
【０１１８】
一般に、上述の負荷条件、洗浄条件及び溶出条件の組み合わせすべてを含有する方法が企図される。さらに特定のクロマトグラフィ条件の組み合わせすべてを含有する方法が、以下で記載されるような溶出液の先行部分を定義および回収するすべての考えられるスキームと共に企図される。
【０１１９】
１．カチオン交換溶出液の先行部分及び遅行部分
１つの態様では、本発明は、カチオン交換溶出液の先行部分を回収することによって、免疫グロブリン製剤に存在する抗補体活性（ＡＣＡ）を低減する方法を提供する。有利なことに、カチオン交換クロマトグラフィステップの単一段階溶出によって形成される溶出液の先行部分が所望の免疫グロブリン含量の大半を含有する一方で、溶出液の遅行部分は望ましくないＡＣＡの大半を含有することが、本明細書で示される。免疫グロブリンとＡＣＡの溶出を完全に分離することはできないので、溶出液の先行部分と遅行部分の境界が確定されなければならない。この決定を行う際、以下の２つの主な考慮事項が考慮され得る：（ｉ）溶出液の先行部分と遅行部分がどのように定義されるかに応じて、より多い又はより少ないＡＣＡが先行部分にて回収される、すなわち、溶出液の先行部分が溶出液全体のより小さな部分として定義されればされるほど、ＡＣＡのより大きな部分を免疫グロブリン含量から分離することができ、逆もまた同様である；及び（ｉｉ）溶出液の先行部分と遅行部分がどのように定義されるかに応じて、より多い又はより少ない免疫グロブリンの回収収量が先行部分に存在する、すなわち、溶出液の先行部分が溶出液全体のより小さな部分として定義されればされるほど、より少ない免疫グロブリンの収量が達成され、逆もまた同様である。
【０１２０】
従って、当業者はその個々のニーズに基づいて、カチオン交換溶出液の先行部分と遅行部分の間の境界をどこに引くかについて決定するであろう。たとえば、研究目的又は特殊化した治療目的で小規模な精製を準備する場合、当業者は最終的な免疫グロブリンの収率を犠牲にしながら、溶出液のさらに小さな先行部分を回収することによって方法の分離力を最大化し得る。対照的に、大規模な製造（例えば、５００Ｌを超える脱クリオ血漿を処理する）を実施する場合、機会費用のために、組成物のＡＣＡのより緩やかな低減を犠牲にして溶出液のより大きな先行部分を回収して、免疫グロブリンの回収収量を高めることになり得る。
【０１２１】
種々の実施形態では、溶出液の先行部分と遅行部分は、溶出液のｐＨ、タンパク質収率（たとえば、樹脂に結合したタンパク質の比率として表される）、溶出液のタンパク質の濃度（たとえば、光学密度によって決定されるような）、溶出液の体積等を含むがこれらに限定されない種々の特徴によって定義され得る。
【０１２２】
ａ．溶出液のｐＨ
本明細書で提供される実施例にて実証されるように、カチオン交換溶出ステップの開始は、カラム負荷及び洗浄ステップ（一般に５．０〜６．０）よりも高いｐＨ（一般に７．０超）を溶出緩衝液が有するにもかかわらず、カラムから出てくる溶液のｐＨが５．０を下回るｐＨまで低下することによって特徴付けられる。ｐＨのこの低下は低いＡＣＡを有する免疫グロブリンＩｇＧ組成物の溶出と一致する（たとえば、それぞれ表３、表１１、及び表１５を参照）。溶出の後の時点では、カラムから出てくる溶液のｐＨは６．０〜８．０を上回って鋭く上昇する。ｐＨにおけるこのシフトは溶出液のＡＣＡ含量の有意な上昇に一致する（たとえば、それぞれ表３、表１１及び表１５を参照）。従って、単一の高ｐＨの溶出緩衝液（一般に７．０より高い）の適用によって１段階溶出を行うが、溶出プロフィールは、ＩｇＧ免疫グロブリンが先ずカラムから溶出された後に抗補体活性が付随する、２段階溶出に類似している。従って、ある特定の実施形態では、溶出液の先行部分と遅行部分はカラム出口での溶出液のｐＨに基づいて定義される。
【０１２３】
従って、１つの態様では、本発明は血漿由来の免疫グロブリン組成物における抗補体活性（ＡＣＡ）の量を低減させる方法を提供し、該方法は、（ａ）カチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリン及び抗補体活性（すなわち、抗補体活性を有する混入物）を結合させるステップと、（ｂ）任意で、免疫グロブリンＩｇＧ及びＡＣＡが結合したカチオン交換樹脂を洗浄緩衝液で洗浄し、緩く会合した混入物を取り除くステップと、（ｃ）ＩｇＧ免疫グロブリンとＡＣＡとの単一段階溶出を行うステップと、（ｄ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は７．０を超えないｐＨを有する溶出液の部分から成る。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は６．５を超えないｐＨを有する溶出液の部分から成る。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は６．０を超えないｐＨを有する溶出液の部分から成る。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は５．５を超えないｐＨを有する溶出液の部分から成る。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は５．０を超えないｐＨを有する溶出液の部分から成る。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６．０、５．９、５．８、５．７、５．６、５．５、５．４、５．３、５．２、５．１、５．０又はそれ未満を超えないｐＨを有する溶出液の部分から成る。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、本発明は、血漿由来の免疫グロブリン組成物にて抗補体活性（ＡＣＡ）の量を低減する方法を提供し、該方法は、（ａ）６．０を超えないｐＨ及び１１ｍＳ／ｃｍを超えない導電率を含む第１の溶液条件のもとでクロマトグラフィカラム中に配置されたカチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンと第１の量のＡＣＡとを含む血漿由来の免疫グロブリン組成物を接触させて、免疫グロブリンとＡＣＡの少なくとも一部とをカチオン交換樹脂に結合させるステップと、（ｂ）少なくとも７．５のｐＨ及び少なくとも１５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させることによってカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出して、溶出液を形成するステップと、（ｃ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は７．０を超えないｐＨを有する溶出液の部分から成る。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は６．５を超えないｐＨを有する溶出液の部分から成る。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は６．０を超えないｐＨを有する溶出液の部分から成る。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は５．５を超えないｐＨを有する溶出液の部分から成る。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は５．０を超えないｐＨを有する溶出液の部分から成る。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６．０、５．９、５．８、５．７、５．６、５．５、５．４、５．３、５．２、５．１、５．０、またはそれ未満を超えないｐＨを有する溶出液の部分から成る。特定の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは５．２±０．３である。別の特定の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは５．２±０．２である。別の特定の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは５．２±０．１である。さらに別の特定の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは５．２である。さらに他の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、又は６．０である。別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２０ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２２ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【０１２５】
ｂ．溶出液の吸光度
免疫グロブリン組成物の大規模製造に特に良好に適合したさらに別の実施形態では、溶出液の先行部分と遅行部分はカチオン交換カラムから溶出される免疫グロブリンの濃度によって定義される。たとえば、大規模製造の間、免疫グロブリン組成物は、ピーク溶出物が高度に濃縮されるように十分に高いタンパク質負荷量（たとえば、樹脂１ｍｌ当たり８０ｍｇ超のタンパク質）でカチオン交換樹脂に負荷され得る。これらの例では、溶出液の先行部分は、ＯＤ２８０が閾値よりも低下する時点の前に溶出する溶出液の画分として定義することができる。この方式では、製造実行間の軽微な変動に関わりなく、ほぼ同一収量の免疫グロブリンを調製物の次から次へと再現良く回収することができる。実施例９で実証されるように、大規模製造法へのこの回収スキームの適用は、抗補体活性（ＡＣＡ）含量が有意に低下したＩｇＧ免疫グロブリン組成物の高収率での回収をもたらす。
【０１２６】
従って、１つの態様では、本発明は血漿由来の免疫グロブリン組成物にて抗補体活性（ＡＣＡ）の量を低減する方法を提供し、該方法は、（ａ）カチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンと抗補体活性（すなわち、抗補体活性を有する混入物）とを結合させるステップと、（ｂ）任意で、タンパク質が結合したカチオン交換樹脂を洗浄緩衝液で洗浄して、緩く会合した混入物を取り除くステップと、（ｃ）ＩｇＧ免疫グロブリン及びＡＣＡの単一段階溶出を実施するステップと、（ｄ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は少なくとも０．５ＡＵのＯＤ２８０を有する溶出液の部分から成る。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は少なくとも１．０ＡＵのＯＤ２８０を有する溶出液の部分から成る。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は少なくとも１．５ＡＵのＯＤ２８０を有する溶出液の部分から成る。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は少なくとも２．０ＡＵのＯＤ２８０を有する溶出液の部分から成る。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は、少なくとも０．１ＡＵ、０．２ＡＵ、０．３ＡＵ、０．４ＡＵ、０．５ＡＵ、０．６ＡＵ、０．７ＡＵ、０．８ＡＵ、０．９ＡＵ、１．０ＡＵ、１．１ＡＵ、１．２ＡＵ、１．３ＡＵ、１．４ＡＵ、１．５ＡＵ、１．６ＡＵ、１．７ＡＵ、１．８ＡＵ、１．９ＡＵ、２．０ＡＵ又はそれ以上のＯＤ２８０を有する溶出液の部分から成る。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【０１２７】
特定の実施形態では、本発明は、血漿由来の免疫グロブリン組成物にて抗補体活性（ＡＣＡ）の量を低減する方法を提供し、該方法は、（ａ）６．０を超えないｐＨ及び１１ｍＳ／ｃｍを超えない導電率を含む第１の溶液条件のもとでクロマトグラフィカラム中に配置されたカチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンと第1の量のＡＣＡとを含む血漿由来の免疫グロブリン組成物を接触させて、免疫グロブリンと第1の量のＡＣＡの少なくとも一部とをカチオン交換樹脂に結合させるステップと、（ｂ）少なくとも７．５のｐＨ及び少なくとも１５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させることによってカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出して、溶出液を形成するステップと、（ｃ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は少なくとも０．５ＡＵのＯＤ２８０を有する溶出液の部分から成る。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は少なくとも１．０ＡＵのＯＤ２８０を有する溶出液の部分から成る。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は少なくとも１．５ＡＵのＯＤ２８０を有する溶出液の部分から成る。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は少なくとも２．０ＡＵのＯＤ２８０を有する溶出液の部分から成る。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は、少なくとも０．１ＡＵ、０．２ＡＵ、０．３ＡＵ、０．４ＡＵ、０．５ＡＵ、０．６ＡＵ、０．７ＡＵ、０．８ＡＵ、０．９ＡＵ、１．０ＡＵ、１．１ＡＵ、１．２ＡＵ、１．３ＡＵ、１．４ＡＵ、１．５ＡＵ、１．６ＡＵ、１．７ＡＵ、１．８ＡＵ、１．９ＡＵ、２．０ＡＵ又はそれ以上のＯＤ２８０を有する溶出液の部分から成る。特定の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは５．２±０．３である。別の特定の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは５．２±０．２である。別の特定の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは５．２±０．１である。さらに別の特定の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは５．２である。さらに他の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、又は６．０である。別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２０ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２２ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【０１２８】
ｃ．溶出液全体に対する比率（％）
免疫グロブリン組成物の大規模製造に特に良好に適合したさらに別の実施形態では、溶出液の先行部分と遅行部分は溶出液の総タンパク質含量に対する（たとえば、総タンパク質の体積の）比率（％）として定義される。先行部分で回収する溶出液の比率（％）を予め定めることによって、免疫グロブリンの回収収率を厳密に制御することができる。溶出液の先行部分と遅行部分を定義するこの方法は、最少段階での収率を必要とする製造法に、ならびに、免疫グロブリン収率の低下によるコストを抗補体活性（ＡＣＡ）の含量が低下した組成物を製造する利益と比較検討することに基づいて決定を行う方法に、特に有用である。この方式では、製造実行間の軽微な変動に関わりなく、ほぼ同一収量の免疫グロブリンを調製物の次から次へと再現良く回収することができる。実施例８で実証されるように、この回収スキームの適用は、抗補体活性の含量が有意に低下したＩｇＧ免疫グロブリン組成物の高収率の回収をもたらすことができる。
【０１２９】
従って、１つの態様では、本発明は、血漿由来の免疫グロブリン組成物における抗補体活性（ＡＣＡ）の量を低下させる方法を提供し、該方法は、（ａ）カチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンと抗補体活性（すなわち、抗補体活性を有する混入物）とを結合させるステップと、（ｂ）任意で、タンパク質が結合したカチオン交換樹脂を洗浄緩衝液で洗浄して、緩く会合した混入物を取り除くステップと、（ｃ）ＩｇＧ免疫グロブリン及ＡＣＡの単一段階溶出を実施するステップと、（ｄ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は溶出液全体の８０％以下から成る。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の７０％〜８０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６０％〜８０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％〜８０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の７０％〜７５％の間である。さらに別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の７５％〜８０％の間である。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、又は８０％である。別の実施形態では、溶出液の先行部分（すなわち、回収された又はプールされた関心対象の画分）は溶出液全体の７０％以下である。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６０％〜７０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％〜７０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６０％〜６５％の間である。さらに別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６５％〜７０％の間である。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、又は７０％である。別の実施形態では、溶出液の先行部分（すなわち、回収された又はプールされた関心対象の画分）は溶出液全体の６０％以下である。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％〜６０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％〜５５％の間である。さらに別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５５％〜６０％の間である。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、又は６０％である。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【０１３０】
特定の実施形態では、本発明は、血漿由来の免疫グロブリン組成物にて抗補体活性（ＡＣＡ）の量を低減する方法を提供し、該方法は、（ａ）６．０を超えないｐＨ及び１１ｍＳ／ｃｍを超えない導電率を含む第１の溶液条件のもとでクロマトグラフィカラム中に配置されたカチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンと第１の量の抗補体活性（ＡＣＡ）とを含む血漿由来の免疫グロブリン組成物を接触させて、免疫グロブリンと第１の量のＡＣＡの少なくとも一部とをカチオン交換樹脂に結合させるステップと、（ｂ）少なくとも７．５のｐＨ及び少なくとも１５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させることによってカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出して、溶出液を形成するステップと、（ｃ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は溶出液全体の８０％以下から成る。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の７０％〜８０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６０％〜８０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％〜８０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の７０％〜７５％の間である。さらに別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の７５％〜８０％の間である。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、又は８０％である。別の実施形態では、溶出液の先行部分（すなわち、回収された又はプールされた関心対象の画分）は溶出液全体の７０％以下である。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６０％〜７０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％〜７０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６０％〜６５％の間である。さらに別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６５％〜７０％の間である。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、又は７０％である。別の実施形態では、溶出液の先行部分（すなわち、回収された又はプールされた関心対象の画分）は溶出液全体の６０％以下である。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％〜６０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％〜５５％の間である。さらに別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５５％〜６０％の間である。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、又は６０％である。特定の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは５．２±０．３である。別の特定の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは５．２±０．２である。別の特定の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは５．２±０．１である。さらに別の特定の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは５．２である。さらに他の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、又は６．０である。別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２０ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２２ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【０１３１】
ｄ．溶出液全体の体積
免疫グロブリン組成物の大規模製造に特に良好に適合したさらに別の実施形態では、溶出液の先行部分と遅行部分は、カチオン交換カラムのサイズに対する溶出液ピークの体積として（たとえば、規定数のカラム容積によって）定義される。先行部分で回収する溶出液の体積を予め定めることによって、免疫グロブリンの回収収率を厳密に制御することができ、再現可能である。溶出液の先行部分と遅行部分を定義するこの方法は、最少段階での収率を必要とする製造法に、及び免疫グロブリン収率の低下によるコストを抗補体活性（ＡＣＡ）の含量が低下した組成物を製造する利益と比較検討することに基づいて決定を行う方法に、特に有用である。この方式では、製造実行間の軽微な変動に関わりなく、ほぼ同一収量の免疫グロブリンを調製物の次から次へと再現良く回収することができる。実施例１１〜１３で実証するように、この回収スキームの適用は、抗補体活性の含量が低下したＩｇＧ免疫グロブリン組成物の高収率での回収をもたらすことができる。
【０１３２】
一実施形態では、先行部分の開始はベースラインの吸光度によって定義される。一部の実施形態では、先行部分の回収は溶出液のピークの吸光度が第１の閾値と交差したら開始する。一実施形態では、先行部分の回収は溶出液のＯＤ２８０が少なくとも０．５ＡＵに達したら開始する。特定の実施形態では、先行部分の回収は溶出液のＯＤ２８０が少なくとも１．０ＡＵに達したら開始する。別の特定の実施形態では、先行部分の回収は溶出液のＯＤ２８０が少なくとも１．５ＡＵに達したら開始する。別の特定の実施形態では、先行部分の回収は溶出液のＯＤ２８０が少なくとも２．０ＡＵに達したら開始する。さらに他の特定の実施形態では、先行部分の回収は溶出液のＯＤ２８０が少なくとも０．１ＡＵ、０．２ＡＵ、０．３ＡＵ、０．４ＡＵ、０．５ＡＵ、０．６ＡＵ、０．７ＡＵ、０．８ＡＵ、０．９ＡＵ、１．０ＡＵ、１．１ＡＵ、１．２ＡＵ、１．３ＡＵ、１．４ＡＵ、１．５ＡＵ、１．６ＡＵ、１．７ＡＵ、１．８ＡＵ、１．９ＡＵ、２．０ＡＵ又はそれ以上に達したら開始する。
【０１３３】
一部の実施形態では、先行部分の回収をいったん開始したら、溶出液の遅行部分の回収（又は廃棄）前に、規定数のカラム容積にて回収される。一実施形態では、溶出液の５を超えないカラム容積（ＣＶ）を先行部分にて回収する。別の実施形態では、溶出液の４を超えないＣＶを先行部分にて回収する。別の実施形態では、溶出液の３を超えないＣＶを先行部分にて回収する。別の実施形態では、溶出液の２．７を超えないＣＶを先行部分にて回収する。別の実施形態では、溶出液の２．５を超えないＣＶを先行部分にて回収する。別の実施形態では、溶出液の２を超えないＣＶを先行部分にて回収する。別の実施形態では、溶出液の１を超えないＣＶを先行部分にて回収する。さらに他の実施形態では、溶出液の０．５を超えないＣＶ、０．６を超えないＣＶ、０．７を超えないＣＶ、０．８を超えないＣＶ、０．９を超えないＣＶ、１．０を超えないＣＶ、１．１を超えないＣＶ、１．２を超えないＣＶ、１．３を超えないＣＶ、１．４を超えないＣＶ、１．５を超えないＣＶ、１．６を超えないＣＶ、１．７を超えないＣＶ、１．８を超えないＣＶ、１．９を超えないＣＶ、２．０を超えないＣＶ、２．１を超えないＣＶ、２．２を超えないＣＶ、２．３を超えないＣＶ、２．４を超えないＣＶ、２．５を超えないＣＶ、２．６を超えないＣＶ、２．７を超えないＣＶ、２．８を超えないＣＶ、２．９を超えないＣＶ、３．０を超えないＣＶ、３．１を超えないＣＶ、３．２を超えないＣＶ、３．３を超えないＣＶ、３．４を超えないＣＶ、３．５を超えないＣＶ、３．６を超えないＣＶ、３．７を超えないＣＶ、３．８を超えないＣＶ、３．９を超えないＣＶ、４．０を超えないＣＶ、４．１を超えないＣＶ、４．２を超えないＣＶ、４．３を超えないＣＶ、４．４を超えないＣＶ、４．５を超えないＣＶ、４．６を超えないＣＶ、４．７を超えないＣＶ、４．８を超えないＣＶ、４．９を超えないＣＶ、５．０を超えないＣＶ、５．１を超えないＣＶ、５．２を超えないＣＶ、５．３を超えないＣＶ、５．４を超えないＣＶ、５．５を超えないＣＶ、５．６を超えないＣＶ、５．７を超えないＣＶ、５．８を超えないＣＶ、５．９を超えないＣＶ、６．０を超えないＣＶ又はそれ以上のカラム容積を先行部分で回収する。
【０１３４】
従って、１つの態様では、本発明は、血漿由来の免疫グロブリン組成物における抗補体活性の量を低下させる方法を提供し、該方法は、（ａ）カチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンと抗補体活性（すなわち、抗補体活性を有する質混入物）とを結合させるステップと、（ｂ）任意で、タンパク質が結合したカチオン交換樹脂を洗浄緩衝液で洗浄して、緩く会合した混入物を取り除くステップと、（ｃ）ＩｇＧ免疫グロブリン及びＡＣＡの単一段階溶出を実施するステップと、（ｄ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は溶出液全体の４を超えないカラム容積（ＣＶ）から成る。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の２．５ＣＶ〜３．０ＣＶの間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の２．０ＣＶ〜３．０ＣＶの間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の２．０ＣＶ〜３．５ＣＶの間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の２．０ＣＶ〜４．０ＣＶの間である。さらに別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の２．５ＣＶ〜３．５ＣＶの間である。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の０．５ＣＶ、０．６ＣＶ、０．７ＣＶ、０．８ＣＶ、０．９ＣＶ、１．０ＣＶ、１．１ＣＶ、１．２ＣＶ、１．３ＣＶ、１．４ＣＶ、１．５ＣＶ、１．６ＣＶ、１．７ＣＶ、１．８ＣＶ、１．９ＣＶ、２．０ＣＶ、２．１ＣＶ、２．２ＣＶ、２．３ＣＶ、２．４ＣＶ、２．５ＣＶ、２．６ＣＶ、２．７ＣＶ、２．８ＣＶ、２．９ＣＶ、３．０ＣＶ、３．１ＣＶ、３．２ＣＶ、３．３ＣＶ、３．４ＣＶ、３．５ＣＶ、３．６ＣＶ、３．７ＣＶ、３．８ＣＶ、３．９ＣＶ、４．０ＣＶ、４．１ＣＶ、４．２ＣＶ、４．３ＣＶ、４．４ＣＶ、４．５ＣＶ、４．６ＣＶ、４．７ＣＶ、４．８ＣＶ、４．９ＣＶ、５．０ＣＶ、５．１ＣＶ、５．２ＣＶ、５．３ＣＶ、５．４ＣＶ、５．５ＣＶ、５．６ＣＶ、５．７ＣＶ、５．８ＣＶ、５．９ＣＶ、又は６．０ＣＶである。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【０１３５】
特定の実施形態では、本発明は、血漿由来の免疫グロブリン組成物にて抗補体活性（ＡＣＡ）の量を低減する方法を提供し、該方法は、（ａ）６．０を超えないｐＨ及び１１ｍＳ／ｃｍを超えない導電率を含む第１の溶液条件のもとでクロマトグラフィカラム中に配置されたカチオン交換樹脂にＩｇＧ免疫グロブリンと第１の量のＡＣＡとを含む血漿由来の免疫グロブリン組成物を接触させて、免疫グロブリンと第１の量のＡＣＡの少なくとも一部とをカチオン交換樹脂に結合させるステップと、（ｂ）少なくとも７．５のｐＨ及び少なくとも１５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させることによってカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出して、溶出液を形成するステップと、（ｃ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含み、ここで、溶出液の先行部分は溶出液全体の４を超えないカラム容積（ＣＶ）から成る。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の２．５ＣＶ〜３．０ＣＶの間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の２．０ＣＶ〜３．０ＣＶの間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の２．０ＣＶ〜３．５ＣＶの間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の２．０ＣＶ〜４．０ＣＶの間である。さらに別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の２．５ＣＶ〜３．５ＣＶの間である。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の０．５ＣＶ、０．６ＣＶ、０．７ＣＶ、０．８ＣＶ、０．９ＣＶ、１．０ＣＶ、１．１ＣＶ、１．２ＣＶ、１．３ＣＶ、１．４ＣＶ、１．５ＣＶ、１．６ＣＶ、１．７ＣＶ、１．８ＣＶ、１．９ＣＶ、２．０ＣＶ、２．１ＣＶ、２．２ＣＶ、２．３ＣＶ、２．４ＣＶ、２．５ＣＶ、２．６ＣＶ、２．７ＣＶ、２．８ＣＶ、２．９ＣＶ、３．０ＣＶ、３．１ＣＶ、３．２ＣＶ、３．３ＣＶ、３．４ＣＶ、３．５ＣＶ、３．６ＣＶ、３．７ＣＶ、３．８ＣＶ、３．９ＣＶ、４．０ＣＶ、４．１ＣＶ、４．２ＣＶ、４．３ＣＶ、４．４ＣＶ、４．５ＣＶ、４．６ＣＶ、４．７ＣＶ、４．８ＣＶ、４．９ＣＶ、５．０ＣＶ、５．１ＣＶ、５．２ＣＶ、５．３ＣＶ、５．４ＣＶ、５．５ＣＶ、５．６ＣＶ、５．７ＣＶ、５．８ＣＶ、５．９ＣＶ、又は６．０ＣＶである。特定の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは５．２±０．３である。別の特定の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは５．２±０．２である。別の特定の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは５．２±０．１である。さらに別の特定の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは５．２である。さらに他の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、又は６．０である。別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２０ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２２ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【０１３６】
Ｖ．脱クリオ血漿の調製
濃縮したＩｇＧ組成物の調製に使用される出発物質は一般に、回収血漿（すなわち、生体外で全血から分離された血漿）又は原料血漿（すなわち、プラズマフェレーシスを介して採取された血漿）のいずれかから成る。精製工程は通常、安全性と品質の問題についてすでにアッセイ済みの予め凍結されたプール血漿を融解することで開始する。融解は通常、６℃を超えない温度、好ましくは−１℃〜６℃の間で行われる。低温での凍結血漿の完全な融解の後、冷所（たとえば、６℃以下、好ましくは２．５±３．５℃）で遠心分離を行い、液体上清から固体のクリオ沈殿物を分離する。或いは、分離ステップは遠心分離ではなく濾過によって実施することができる。次いで、液体上清（新鮮な融解血漿から遠心分離によって低温不溶性タンパク質を取り除いた後の「脱クリオ血漿」とも呼ばれる）を次のステップで処理する。第８因子阻害剤バイパス活性（ＦＥＩＢＡ）、第ＩＸ因子複合体、第ＶＩＩ因子濃縮物又はアンチトロンビンＩＩＩ複合体の単離のためにこの時点で種々の追加のステップが利用され得る。たとえば、免疫グロブリン含有溶液をさらに濃縮するのに先立って、１種以上の血液因子を脱クリオ血漿から吸着させてもよい。
【０１３７】
ＶＩ．脱クリオ血漿の分画
ＩｇＧ免疫グロブリン組成物を調製するために、一般に脱クリオ血漿を分画して、存在する他のタンパク質及び不純物から所望の免疫グロブリンを分離する。アルコール（たとえば、エタノール）分画、高分子（たとえば、ＰＥＧ）沈殿、脂肪酸及びエステル（たとえば、カプリレート）沈殿、クロマトグラフィ等を含む血漿の分画のための多数の方法が当該技術で既知である。これらの分画方法の例には、非限定的に、Ｃｏｈｎ分画（Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９４６，  ６８（３）：  ４５９−４７５；  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ７２：４６５−４７４  （１９５０））、Ｏｎｃｌｅｙ分画（Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９４９，  ７１（２）：  ５４１−５５０）、Ｄｅｕｔｓｃｈ精製（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １６４：１０９−１１８）、Ｈｏｐｐｅ精製（Ｍｕｎｃｈ  Ｍｅｄ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ  １９６７  （３４）：  １７４９−１７５２）、Ｆａｌｋｓｖｅｄｅｎ精製（スウェーデン特許第３４８９４２号）、Ｆａｌｋｓｖｅｄｅｎ及びＬｕｎｄｂｌａｄ精製（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ、１９８０）、Ｌｅｂｉｎｇ精製（Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  ２００３  （８４）：１９３−２０１）、Ｔａｎａｋａ精製（Ｂｒａｚ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  ２０００  （３３）３７−３０））、Ｔｅｓｃｈｎｅｒ精製（Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ，  ２００７  （９２）：４２−５５）、Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ分画（Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ  ３７：８６６−８７３）、Ｋｉｓｔｌｅｒ／Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ分画（Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．  ７：４１４−４２４  （１９６２））、Ｂａｒｕｎｄｅｒｎ精製（Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．  ７：１５７−７４  （１９６２））、Ｋｏｂｌｅｔ精製（Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．  １３：９３−１０２  （１９６７））、米国特許第５，１２２，３７３号又は同第５，１７７，１９４号にて開示された精製手順が挙げられ、その開示はあらゆる目的でその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【０１３８】
一般に、本明細書で提供される方法は、上で概要を述べた精製スキームのいずれにも適応する。したがって、一実施形態では、上で言及される精製スキームのいずれかに従って脱クリオ血漿を部分的に又は全体的に分画する。特定の実施形態では、上述の教示で開示される１種以上の精製ステップに従って脱クリオ血漿を分画して、分画中間組成物を生じる。さらに特定の実施形態では、脱クリオ血漿を分画して画分Ｉの沈殿物、画分ＩＩの沈殿物、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物、画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物、画分ＩＶ−１、キストラー／ニッチェマンの沈殿物Ａ、キストラー／ニッチェマンの沈殿物Ｂ及びそれらの改変された沈殿物を生じる。
【０１３９】
好ましい実施形態では、１種以上のエタノール沈殿ステップによって脱クリオ血漿が分画される。エタノール沈殿ステップを用いて、所望の免疫グロブリンを溶液から沈殿させる一方で少なくとも１つの非免疫グロブリンタンパク質を上清に保持してもよく、又は少なくとも１つの非免疫グロブリンタンパク質を溶液から沈殿させる一方で所望の免疫グロブリンを上清に保持してもよい。この様式で免疫グロブリンを分画する方法は当該技術で周知である。例示的エタノール沈殿物には、画分Ｉの沈殿物、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物、画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物、画分ＩＶ−１、キストラー／ニッチェマンの沈殿物Ａ、キストラー／ニッチェマンの沈殿物Ｂ及びそれらの改変された沈殿物が挙げられる。特に好ましい実施形態では、脱クリオ血漿に存在する免疫グロブリンが、以下に記載されるように、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップ、Ａの沈殿ステップ、Ｂの沈殿ステップ及び画分ＩＩの沈殿ステップを含む４ステップエタノール法によって濃縮される。
【０１４０】
ＶＩＩ．例示的分画スキーム
当業者は、多数の異なる出発物質（たとえば、異なる血漿画分）を用いてアミド分解活性（たとえば、第ＸＩ因子及び／又は第ＸＩａ因子の含量）及び／又は抗補体活性（ＡＣＡ）を低減するために本明細書で提供される方法を実施し得ることを十分に理解するであろうが、例示的分画スキームを以下に提供する。例示的分画スキームでは４つのエタノール沈殿反応を用いて画分ＩＩ沈殿が調製され、これが再懸濁された後、本明細書で提供される出発物質として使用され得る。得られる濃縮されたＩｇＧ免疫グロブリン組成物は、たとえば、アニオン交換クロマトグラフィ、限外／透析濾過、ウイルス不活化及び／又は除去ステップ、および当該技術で周知である他の濃縮ステップのような技法を用いる下流の処理によってさらに濃縮され得る。
【０１４１】
従って、一実施形態では、本発明はＩｇＧ免疫グロブリン組成物を製造する方法を提供し、該方法は（ａ）脱クリオ血漿画分を提供するステップと、（ｂ）１７％〜２３％（ｖ／ｖ）の間の最終濃度、６．５〜７．３の間のｐＨ及び−８℃〜−２℃の間の温度にて脱クリオ血漿画分とエタノールを混合することによる第１の沈殿反応にて脱クリオ血漿画分から免疫グロブリンを沈殿させ、それによって第１の沈殿物と第１の上清を形成するステップと、（ｃ）第１の沈殿物に存在する免疫グロブリンを再懸濁し、それによって第１の懸濁液を形成するステップと、（ｄ）１７％〜２３％（ｖ／ｖ）の間の最終濃度、６．８〜７．６の間のｐＨ及び−８℃〜−２℃の間の温度にて脱クリオ血漿画分とエタノールを混合することによる第２の沈殿反応にて第１の懸濁液から免疫グロブリンを沈殿させ、それによって第２の沈殿物と第２の上清を形成するステップと、（ｅ）第２の沈殿物に存在する免疫グロブリンを再懸濁し、それによって第２の懸濁液を形成するステップと、（ｆ）１４％〜２０％（ｖ／ｖ）の間の最終濃度、５．０〜５．８の間のｐＨ及び−８℃〜−２℃の間の温度にて脱クリオ血漿画分とエタノールを混合することによる第３の沈殿反応にて第２の懸濁液から免疫グロブリンを沈殿させ、それによって第３の沈殿物と第３の上清を形成するステップと、（ｇ）２２％〜２８％（ｖ／ｖ）の間の最終濃度、６．７〜７．５の間のｐＨ及び−８℃〜−２℃の間の温度にて脱クリオ血漿画分とエタノールを混合することによる第４の沈殿反応にて第３の上清から免疫グロブリンを沈殿させ、それによって第４の沈殿物と第４の上清を形成するステップと、（ｈ）第４の沈殿物を再懸濁し、第３の懸濁液を形成するステップと、（ｉ）６．０を超えないｐＨ及び１１ｍＳ／ｃｍを超えない導電率を含む第１の溶液条件のもとでクロマトグラフィカラム中に配置されたカチオン交換樹脂に第３の懸濁液を接触させて、ＩｇＧ免疫グロブリンと（ｉ）ＦＸＩ及び／又はＦＸＩａの一部ならびに（ｉｉ）第１の量の抗補体活性（ＡＣＡ）の少なくとも１つとをカチオン交換樹脂に結合させるステップと、（ｊ）少なくとも７．５のｐＨ及び少なくとも１５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させることによってカチオン交換樹脂からＩｇＧ免疫グロブリンを溶出して、先行部分と遅行部分を含む溶出液を形成するステップと、（ｋ）溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップとを含む。特定の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは５．２±０．３である。別の特定の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは５．２±０．２である。別の特定の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは５．２±０．１である。さらに別の特定の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは５．２である。さらに他の実施形態では、第１の溶液条件のｐＨは４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、又は６．０である。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２０ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２２ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。さらに別の特定の実施形態では、溶出緩衝液は少なくとも２５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。好ましい実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。特定の実施形態では、弱いカチオン交換樹脂はカルボキシメチル（ＣＭ）樹脂である。
【０１４２】
Ａ．上流分画スキームＩ
第１の例示的上流精製スキームでは、免疫グロブリンＩｇＧを含有する血漿を以下で記載するようなアルコール分画（たとえば、エタノール分画）に供する。一実施形態では、この第１の上流分画スキームは、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップ、画分Ａの沈殿ステップ及び画分Ｂの沈殿ステップの後に画分ＩＩの沈殿ステップを含み、これにより、アミド分解活性（たとえば、第ＸＩ／ＸＩａ因子）及び／又は抗補体活性（ＡＣＡ）の低減のための本明細書で提供されるカチオン交換クロマトグラフィ法のための出発物質を最終的に提供する。
【０１４３】
以下で記載される画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ、画分Ａ、画分Ｂ及び画分ＩＩの沈殿ステップのそれぞれについての沈殿条件（たとえば、エタノール濃度、ｐＨ、温度、分離法）の組み合わせすべてを含有する方法が企図される。さらに、以下で記載されるように、溶出液の先行部分を定義および回収するためのすべての考えられるスキームと共に特定の沈殿条件のすべての組み合わせを含有する方法が企図される。
【０１４４】
１．画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿
一実施形態では、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿は、１７％〜２３％（ｖ／ｖ）の間の最終濃度にて６．５〜７．３の間のｐＨで脱クリオ血漿にエタノールを添加することによって形成される。次いで撹拌しながら混合物を−８℃〜−２℃でインキュベートする。得られた画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物を混合物の遠心分離又は濾過によって画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの上清から分離することができ、それは一般に冷所で実施される。免疫グロブリン含量の大半は画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物に存在し、それを再懸濁してさらに濃縮することができる。
【０１４５】
特定の一実施形態では、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップにおけるエタノールの最終濃度は２０±３％（ｖ／ｖ）である。別の実施形態では、エタノールの最終濃度は２０±２％（ｖ／ｖ）である。別の実施形態では、エタノールの最終濃度は２０±１％（ｖ／ｖ）である。さらに別の実施形態では、エタノールの最終濃度は２０％（ｖ／ｖ）である。さらに他の実施形態では、エタノールの最終濃度は１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、又は２３％（ｖ／ｖ）である。
【０１４６】
特定の一実施形態では、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップのｐＨは６．９±０．４である。別の実施形態では、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップのｐＨは６．９±０．３である。別の実施形態では、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップのｐＨは６．９±０．２である。別の実施形態では、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップのｐＨは６．９±０．１である。さらに別の実施形態では、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップのｐＨは６．９である。さらに他の実施形態では、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップのｐＨは６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、又は７．３である。
【０１４７】
特定の一実施形態では、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップの温度は−５±３℃である。別の実施形態では、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップの温度は−５±２℃である。実施形態では、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップの温度は−５±１℃である。さらに実施形態では、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップの温度は−５℃である。他の実施形態では、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップの温度は−８℃、−７℃、−６℃、−５℃、−４℃、−３℃又は−２℃である。
【０１４８】
特定の実施形態では、酢酸ナトリウム三水和物、氷酢酸、及び注射用水を含有する再懸濁緩衝液（ｐＨ４．０）及び変性エチルアルコール（処方ＳＤＡ−３Ａ）の添加によって、脱クリオ血漿は６．９±０．２のｐＨに調整され、アルコールの濃度は２０％（ｖ／ｖ）と算出される。緩衝液は十分に混合しながら必要とされる量のアルコールと共に添加される。アルコールは脱クリオ血漿に添加する前に−１５℃以下の温度に冷却される。懸濁槽を−５℃±２℃に冷却しながら緩衝液及びアルコールを血漿に添加する。添加が完了した後、溶液のｐＨを確認し、必要に応じてｐＨ４．０の緩衝液又は重炭酸ナトリウム溶液で６．９±０．２に調整する。次いで得られた画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの懸濁液を遠心分離して上清から沈殿物を分離する。
【０１４９】
２．画分Ａの沈殿
ＩｇＧの含量及び純度をさらに濃縮するために、一実施形態では、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物を再懸濁し、第２の沈殿ステップ（画分Ａの沈殿）を実施する。画分Ａの沈殿は、１７％〜２３％（ｖ／ｖ）の間の最終濃度にて６．８〜７．６の間のｐＨで画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの懸濁液にエタノールを添加することによって実施される。次いで混合物を−８℃〜−２℃の間で撹拌しながらインキュベートする。得られた画分Ａの沈殿物を、混合物の遠心分離又は濾過によって画分Ａの上清から分離することができ、それは一般に冷所で実施される。免疫グロブリン含量の大半は画分Ａの沈殿物に存在し、それを再懸濁し、さらに濃縮することができる。
【０１５０】
特定の一実施形態では、画分Ａの沈殿ステップにおけるエタノールの最終濃度は２０±３％（ｖ／ｖ）である。別の実施形態では、エタノールの最終濃度は２０±２％（ｖ／ｖ）である。別の実施形態では、エタノールの最終濃度は２０±１％（ｖ／ｖ）である。さらに別の実施形態では、エタノールの最終濃度は２０％（ｖ／ｖ）である。さらに他の実施形態では、エタノールの最終濃度は１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、又は２３％（ｖ／ｖ）である。
【０１５１】
特定の一実施形態では、画分Ａの沈殿ステップのｐＨは７．２±０．４である。別の実施形態では、画分Ａの沈殿ステップのｐＨは７．２±０．３である。別の実施形態では、画分Ａの沈殿ステップのｐＨは７．２±０．２である。別の実施形態では、画分Ａの沈殿ステップのｐＨは７．２±０．１である。さらに別の実施形態では、画分Ａの沈殿ステップのｐＨは７．２である。さらに他の実施形態では、画分Ａの沈殿ステップのｐＨは６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、又は７．６である。
【０１５２】
特定の一実施形態では、画分Ａの沈殿ステップの温度は−５±３℃である。別の実施形態では、画分Ａの沈殿ステップの温度は−５±２℃である。別の実施形態では、画分Ａの沈殿ステップの温度は−５±１℃である。さらに別の実施形態では、画分Ａの沈殿ステップの温度は−５℃である。さらに他の実施形態では、画分Ａの沈殿ステップの温度は−８℃、−７℃、−６℃、−５℃、−４℃、−３℃又は−２℃である。
【０１５３】
特定の一実施形態では、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物は、酢酸ナトリウム三水和物、氷酢酸、及び注射用水を含有する冷却された再懸濁緩衝液（ｐＨ４．０）に懸濁され、混合される。懸濁液をＷＦＩで希釈して１．０±０．３％（ｗ／ｖ）の計算上のタンパク質濃度を達成する。懸濁液が均質になるまで撹拌を継続する。緩衝液（ｐＨ４．０）又は０．２５Ｍのリン酸二ナトリウムで溶液を７．２±０．２のｐＨに調整し、２０％（ｖ／ｖ）の計算上のアルコール濃度にする。溶液に添加する前にアルコールを−１５℃以下の温度に冷却する。槽を−５±２℃に冷却しながら、冷却アルコールを添加する。添加が完了した後、懸濁液のｐＨを確認し、必要に応じて７．２±０．２に調整する。次いで、形成された沈殿物（画分Ａの沈殿物と呼ぶ）を濾過して上清から沈殿物を分離する。
【０１５４】
３．画分Ｂの沈殿
ＩｇＧの含量及び純度をさらに濃縮するために、一実施形態では、画分Ａの沈殿物を再懸濁し、第３の沈殿ステップ（画分Ｂの沈殿）を実施する。画分Ｂの沈殿は、１４％〜２０％（ｖ／ｖ）の間の最終濃度にて５．０〜５．８の間のｐＨで画分Ａの懸濁液にエタノールを添加することによって実施される。次いで撹拌しながら、混合物を−８℃〜−２℃の間でインキュベートする。混合物の遠心分離又は濾過によって、得られた画分Ｂの沈殿物を画分Ｂの上清から分離することができ、それは一般に冷所で実施される。免疫グロブリン含量の大半は画分Ｂの上清に存在し、それを回収し、さらに濃縮することができる。
【０１５５】
特定の一実施形態では、画分Ｂの沈殿ステップにおけるエタノールの最終濃度は１７±３％（ｖ／ｖ）である。別の実施形態では、該エタノールの最終濃度は１７±２％（ｖ／ｖ）である。別の実施形態では、該エタノールの最終濃度は１７±１％（ｖ／ｖ）である。さらに別の実施形態では、該エタノールの最終濃度は１７％（ｖ／ｖ）である。さらに他の実施形態では、該エタノールの最終濃度は１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％（ｖ／ｖ）である。
【０１５６】
特定の一実施形態では、画分Ｂの沈殿ステップのｐＨは５．４±０．４である。別の実施形態では、画分Ｂの沈殿ステップのｐＨは５．４±０．３である。別の実施形態では、画分Ｂの沈殿ステップのｐＨは５．４±０．２である。別の実施形態では、画分Ｂの沈殿ステップのｐＨは５．４±０．１である。さらに別の実施形態では、画分Ｂの沈殿ステップのｐＨは５．４である。さらに他の実施形態では、画分Ｂの沈殿ステップのｐＨは５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、又は５．８である。
【０１５７】
特定の一実施形態では、画分Ａの沈殿ステップの温度は−５℃±３℃である。別の実施形態では、画分Ａの沈殿ステップの温度は−５℃±２℃である。別の実施形態では、画分Ａの沈殿ステップの温度は−５℃±１℃である。さらに別の実施形態では、画分Ａの沈殿ステップの温度は−５℃である。さらに他の実施形態では、画分Ａの沈殿ステップの温度は−８℃、−７℃、−６℃、−５℃、−４℃、−３℃又は−２℃である。
【０１５８】
特定の実施形態では、画分Ａの沈殿物は冷却した注射用水（ＷＦＩ）に懸濁され、少なくとも１時間撹拌される。沈殿物が十分に懸濁されたら、酢酸ナトリウムを含有する緩衝液を加える。懸濁液が均質になるまで撹拌を継続する。ｐＨ４．０の緩衝液（１０９ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム三水和物、２４０ｇ／Ｌの氷酢酸及びＷＦＩ）又は０．２５Ｍのリン酸二ナトリウムでｐＨを５．４±０．２に調整する。１．２±０．３％（ｗ／ｖ）のタンパク質濃度を達成するように計算上の冷却ＷＦＩで、懸濁液を希釈する。懸濁液が均質になるまで撹拌を継続する。事前に−１５℃に冷却したアルコールを添加することによって、アルコール含量を計算上１７％（ｖ／ｖ）である濃度にする。槽を−５±２℃に冷却しながら、冷却アルコールを添加する。必要に応じてｐＨ４．０の緩衝液又は０．２５Ｍのリン酸二ナトリウムでｐＨを５．４±０．２に再調整する。デプスフィルターを用いた濾過によって、形成された沈殿物すなわち画分Ｂの沈殿物を分離する。画分Ｂの濾液（すなわち、上清）をさらなる濃縮のために回収する。
【０１５９】
Ｂ．上流分画スキームＩＩ
第２の例示的上流精製スキームでは、以下に記載されるように、免疫グロブリンＩｇＧを含有する血漿をアルコール分画（たとえば、エタノール分画）に供する。一実施形態では、この第１の上流分画スキームは、画分Ｉの沈殿ステップ及び画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップの後に画分ＩＩの沈殿ステップを含み、これにより、アミド分解活性（たとえば、第ＸＩ／ＸＩａ因子）及び／又は抗補体活性（ＡＣＡ）の低減のための本明細書で提供されるカチオン交換クロマトグラフィ法のための出発物質を最終的に提供する。
【０１６０】
以下で記載される画分Ｉ、画分ＩＩ＋ＩＩＩ及び画分ＩＩの沈殿ステップのそれぞれについての沈殿条件（たとえば、エタノール濃度、ｐＨ、温度、分離法）の組み合わせすべてを含有する方法が企図される。さらに、以下で記載されるように溶出液の先行部分を定義および回収するすべての考えられるスキームと共に、特定の沈殿条件の組み合わせすべてを含む方法が企図される。
【０１６１】
１．画分Ｉの沈殿
一実施形態では、画分Ｉの沈殿は、６％〜１０％（ｖ／ｖ）の最終濃度にて６．７〜７．３のｐＨで脱クリオ血漿にエタノールを添加することによって形成される。次いで、撹拌しながら−４℃〜２℃で混合物をインキュベートする。混合物の遠心分離又は濾過によって、得られた画分Ｉの沈殿物を画分Ｉの上清から分離することができ、それは一般に冷所で実施される。免疫グロブリン含量の大半は画分Ｉの上清に存在し、それを回収してさらに濃縮することができる。
【０１６２】
特定の一実施形態では、画分Ｉの沈殿ステップにおけるエタノールの最終濃度は８±２％（ｖ／ｖ）である。別の実施形態では、エタノールの最終濃度は８±１％（ｖ／ｖ）である。さらに別の実施形態では、エタノールの最終濃度は８％（ｖ／ｖ）である。さらに他の実施形態では、エタノールの最終濃度は６％、７％、８％、９％、又は１０％（ｖ／ｖ）である。
【０１６３】
特定の一実施形態では、画分Ｉの沈殿ステップのｐＨは７．０±０．４である。別の実施形態では、画分Ｉの沈殿ステップのｐＨは７．０±０．３である。別の実施形態では、画分Ｉの沈殿ステップのｐＨは７．０±０．２である。別の実施形態では、画分Ｉの沈殿ステップのｐＨは７．０±０．１である。さらに別の実施形態では、画分Ｉの沈殿ステップのｐＨは７．０である。さらに他の実施形態では、画分Ｉの沈殿ステップのｐＨは６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、又は７．３である。
【０１６４】
特定の一実施形態では、画分Ｉの沈殿ステップの温度は−１±３℃である。別の実施形態では、画分Ｉの沈殿ステップの温度は−１±２℃である。別の実施形態では、画分Ｉの沈殿ステップの温度は−１±１℃である。さらに別の実施形態では、画分Ｉの沈殿ステップの温度は−１℃である。さらに他の実施形態では、画分Ｉの沈殿ステップの温度は−４℃、−３℃、−２℃、−１℃、０℃、１℃又は２℃である。
【０１６５】
特定の実施形態では、脱クリオ血漿は７．０±０．１のｐＨに調整され、アルコール濃度は計算上８％（ｖ／ｖ）である。ｐＨ及びアルコール濃度を調整するのに使用される液体は十分に撹拌しながら添加される。沈殿反応の温度を下げ、全体を通して−１±１℃で保持する。次いで、得られた画分Ｉの懸濁液を遠心分離し、又は濾過して上清から沈殿物を分離する。
【０１６６】
２．画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿
ＩｇＧの含量及び純度をさらに濃縮するために、一実施形態では、画分Ｉの上清を第２の沈殿ステップ（画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿）の材料として使用する。画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿は、２２％〜２８％（ｖ／ｖ）の最終濃度にて６．７〜７．３のｐＨで画分Ｉの上清にエタノールを添加することによって実施される。次いで撹拌しながら、混合物を−１０℃〜−４℃の間でインキュベートする。得られた画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物を、混合物の遠心分離又は濾過によって画分ＩＩ＋ＩＩＩの上清から分離することができ、それは一般に冷所で実施される。免疫グロブリン含量の大半は画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物に存在し、それを再懸濁してさらに濃縮することができる。
【０１６７】
特定の一実施形態では、画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップにおけるエタノールの最終濃度は２５±３％（ｖ／ｖ）である。別の実施形態では、エタノールの最終濃度は２５±２％（ｖ／ｖ）である。別の実施形態では、エタノールの最終濃度は２５±１％（ｖ／ｖ）である。さらに別の実施形態では、エタノールの最終濃度は２５％（ｖ／ｖ）である。さらに他の実施形態では、エタノールの最終濃度は２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、又は２８％（ｖ／ｖ）である。
【０１６８】
特定の一実施形態では、画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップのｐＨは７．０±０．４である。別の実施形態では、画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップのｐＨは７．０±０．３である。別の実施形態では、画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップのｐＨは７．０±０．２である。別の実施形態では、画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップのｐＨは７．０±０．１である。さらに別の実施形態では、画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップのｐＨは７．０である。さらに他の実施形態では、画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップのｐＨは６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、又は７．４である。
【０１６９】
特定の一実施形態では、画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップの温度は−７±３℃である。別の実施形態では、画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップの温度は−７±２℃である。別の実施形態では、画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップの温度は−７±１℃である。さらに別の実施形態では、画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップの温度は−７℃である。さらに他の実施形態では、画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿ステップの温度は−１０℃、−９℃、−８℃、−７℃、−６℃、−５℃又は−４℃である。
【０１７０】
特定の実施形態では、画分Ｉの上清は７．０±０．１のｐＨに調整され、アルコール濃度は計算上２５％（ｖ／ｖ）である。ｐＨ及びアルコール濃度を調整するのに使用される液体は十分に撹拌しながら添加される。沈殿反応の温度を下げ、全体を通して−６±２℃で保持する。次いで、得られた画分ＩＩ＋ＩＩＩの懸濁液を遠心分離し、又は濾過して上清から沈殿物を分離する。
【０１７１】
Ｃ．画分ＩＩの沈殿
ＩｇＧの含量及び純度をさらに濃縮するために、一実施形態では、第４（上流分画スキームＩの後）又は第３（上流分画スキームＩＩの後）のアルコール沈殿ステップ（画分ＩＩの沈殿）を実施する。画分ＩＩの沈殿は、画分Ｂの濾液又は画分ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物懸濁液のｐＨを６．７〜７．５の間に調整し、エタノールを２２％〜２８％（ｖ／ｖ）の間の最終濃度まで添加することによって実施される。次いで、混合物を撹拌しながら−１３℃〜−２℃の間でインキュベートする。混合物の遠心分離又は濾過によって、得られた画分ＩＩの沈殿物を画分Ｂの上清から分離することができ、それは一般に冷所で実施される。免疫グロブリン含量の大半は画分ＩＩの沈殿物に存在し、それを再懸濁してさらに濃縮することができる。
【０１７２】
特定の一実施形態では、画分ＩＩの沈殿ステップにおけるエタノールの最終濃度は２５±３％（ｖ／ｖ）である。別の実施形態では、エタノールの最終濃度は２５±２％（ｖ／ｖ）である。別の実施形態では、エタノールの最終濃度は２５±１％（ｖ／ｖ）である。さらに別の実施形態では、エタノールの最終濃度は２５％（ｖ／ｖ）である。さらに他の実施形態では、エタノールの最終濃度は２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、又は２８％（ｖ／ｖ）である。
【０１７３】
特定の一実施形態では、画分ＩＩの沈殿ステップのｐＨは７．１±０．４である。別の実施形態では、画分ＩＩの沈殿ステップのｐＨは７．１±０．３である。別の実施形態では、画分ＩＩの沈殿ステップのｐＨは７．１±０．２である。別の実施形態では、画分ＩＩの沈殿ステップのｐＨは７．１±０．１である。さらに別の実施形態では、画分ＩＩの沈殿ステップのｐＨは７．１である。さらに他の実施形態では、画分ＩＩの沈殿ステップのｐＨは６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、又は７．５である。
【０１７４】
特定の一実施形態では、画分ＩＩの沈殿ステップの温度は−５±３℃である。別の実施形態では、画分ＩＩの沈殿ステップの温度は−５±２℃である。別の実施形態では、画分ＩＩの沈殿ステップの温度は−５±１℃である。さらに別の実施形態では、画分ＩＩの沈殿ステップの温度は−５℃である。別の特定の実施形態では、画分ＩＩの沈殿ステップの温度は−１０±３℃である。別の実施形態では、画分ＩＩの沈殿ステップの温度は−１０±２℃である。別の実施形態では、画分ＩＩの沈殿ステップの温度は−１０±１℃である。さらに別の実施形態では、画分ＩＩの沈殿ステップの温度は−１０℃である。さらに他の実施形態では、画分ＩＩの沈殿ステップの温度は−１３、−１２、−１１、−１０、−９、−８℃、−７℃、−６℃、−５℃、−４℃、−３℃又は−２℃である。
【０１７５】
特定の実施形態では、画分Ｂの濾液のｐＨは１．０Ｍの重炭酸ナトリウム溶液を用いて７．１±０．２に調整される。混合しながら追加のアルコールを加えて２５％（ｖ／ｖ）の計算上の濃度にする。ｐＨを確認し、必要に応じて１Ｍの重炭酸ナトリウム又はｐＨ４．０の緩衝液を用いて７．３±０．２に再調整する。アルコール添加の完了後、−５±２℃の温度にて少なくとも２時間、懸濁液を撹拌する。撹拌が完了した後、必要に応じてｐＨを７．３±０．２に再調整する。懸濁液を遠心分離し、沈殿物、すなわち画分ＩＩの沈殿物を分離する。
【０１７６】
Ｄ．カチオン交換クロマトグラフィ
免疫グロブリン組成物をさらに濃縮するために、一実施形態では、画分ＩＩの沈殿物を水又はイオン強度の低い緩衝液に再懸濁し、カチオン交換クロマトグラフィに供してもよい。一実施形態では、６．０を下回るｐＨで画分ＩＩの沈殿物を水又はイオン強度の低い緩衝液に再懸濁する。通常、再懸濁した画分ＩＩの沈殿物のｐＨは５．２±０．２であり、懸濁液の導電率は低く、通常１ｍＳ／ｃｍを超えない。次に、画分ＩＩの懸濁液を濾過して非可溶性物質を取り除いた後、６．０を下回るｐＨで平衡化したカチオン交換樹脂に負荷する。免疫グロブリンをカチオン交換樹脂（たとえば、カチオン交換カラム）に負荷した後、６．０を下回るｐＨを有する洗浄緩衝液で樹脂を洗浄し得る。免疫グロブリンを溶出するには、次いで、少なくとも１５ｍＳ／ｃｍ（たとえば、少なくとも１５０ｍＭのＮａＣｌ又は同等のその塩の塩濃度を伴う）の導電率及び７．０を上回るｐＨを有する溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させる。特定の実施形態では、カチオン交換クロマトグラフィを実施するのに先立って、懸濁した画分ＩＩの沈殿物を溶媒・界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理に供する。本明細書で提示される例示的分画スキームの再懸濁した画分ＩＩの沈殿物を、本明細書で提供されるカチオン交換法の出発物質として使用するが、ＩｇＧ免疫グロブリンとアミド分解活性（たとえば、ＦＸＩ及び／又はＦＸＩａ）及び／又は抗補体活性（ＡＣＡ）とを含有する任意の血漿由来の免疫グロブリン組成物（すなわち、画分）を本明細書で提供される方法にて使用してもよいことが、十分に理解されるであろう。
【０１７７】
高レベルのアミド分解活性（たとえば、ＦＸＩ／ＦＸＩａ）及び／又は抗補体活性（ＡＣＡ）はカチオン交換樹脂からＩｇＧと同時に溶出されることが分かっている。有意な量のこれら不純物を所望の免疫グロブリンから分離できないことによって、高いアミド分解活性及び／又は高い抗補体活性を伴った最終的なＩｇＧ組成物が生じる。免疫グロブリン医薬製剤における高いアミド分解活性に起因している血栓塞栓事象及び高い抗補体活性に起因している有害な反応の高いリスクを考えると、多数のＩｇＧ製品に存在するアミド分解活性（たとえば、ＦＸＩ及び／又はＦＸＩａ）及び／又は抗補体活性（ＡＣＡ）の原因となる不純物の除去が、当技術分野で必要とされ続けている。有利なことに、７．０を超えるｐＨを有する緩衝液を用いてカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出すると、アミド分解活性及び抗補体活性（ＡＣＡ）は溶出液の遅行部分にのみ溶出することが見出された。特に、溶出液の遅行部分におけるアミド分解活性及びＡＣＡの溶出は、６．０を下回るｐＨから７．０を上回るｐＨへの溶出液のｐＨのシフトに一致している。したがって、溶出液の先行部分は高濃度の免疫グロブリンと低濃度のアミド分解活性及びＡＣＡとを含有する一方で、溶出液の遅行部分は、より低濃度の免疫グロブリンと、より高いアミド分解活性及びＡＣＡとを有する。従って、本明細書で提供される方法の好ましい実施形態では、カチオン交換溶出液の先行部分が溶出液の遅行部分とは別に回収される。
【０１７８】
特定の実施形態では、カチオン交換樹脂は弱いカチオン交換樹脂である。例示的弱いカチオン交換樹脂には、カルボン酸リガンドを伴うもの、たとえば、カルボキシメチル（ＣＭ）樹脂が挙げられる。好ましい実施形態では、本明細書で提供される方法にて使用されるカチオン交換樹脂は、カルボキシメチル樹脂、たとえば、ＣＭ−セファロースである。
【０１７９】
一実施形態では、画分ＩＩの沈殿物は４．８〜５．６の間のｐＨにて冷水又はイオン強度の低い緩衝液に再懸濁される。特定の実施形態では、再懸濁に使用される水又は緩衝液のｐＨは５．２±０．３である。別の特定の実施形態では、再懸濁に使用される水又は緩衝液のｐＨは５．２±０．２である。別の特定の実施形態では、再懸濁に使用される水又は緩衝液のｐＨは５．２±０．１である。さらに別の特定の実施形態では、再懸濁に使用される水又は緩衝液のｐＨは５．２である。さらに他の実施形態では、再懸濁に使用される水又は緩衝液のｐＨは４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、又は６．０である。
【０１８０】
一実施形態では、カチオン交換樹脂は４．６〜５．６の間のｐＨに事前に平衡化される。特定の実施形態では、樹脂は４．６〜５．５の間のｐＨに事前に平衡化される。別の特定の実施形態では、樹脂はｐＨ５．０±０．４に事前に平衡化される。別の特定の実施形態では、樹脂はｐＨ５．０±０．３に事前に平衡化される。別の特定の実施形態では、樹脂はｐＨ５．０±０．２に事前に平衡化される。別の特定の実施形態では、樹脂はｐＨ５．０±０．１に事前に平衡化される。別の特定の実施形態では、樹脂はｐＨ５．０に事前に平衡化される。さらに他の特定の実施形態では、樹脂はｐＨ４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、又は６．０に事前に平衡化される。
【０１８１】
一実施形態では、清浄化した画分ＩＩの懸濁液をカチオン交換樹脂に負荷した後、免疫グロブリンが樹脂から溶出されないような十分に低い導電率と５．１〜５．９の間のｐＨを有する緩衝液で樹脂を洗浄する。特定の実施形態では、洗浄緩衝液のｐＨは５．５±０．３である。別の特定の実施形態では、洗浄緩衝液のｐＨは５．５±０．２である。別の特定の実施形態では、洗浄緩衝液のｐＨは５．５±０．１である。別の特定の実施形態では、洗浄緩衝液のｐＨは５．５である。さらに他の実施形態では、洗浄緩衝液のｐＨは５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、又は６．０である。
【０１８２】
一実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは７．５より高い。別の実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは７．４〜８．２の間である。特定の実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは７．８±０．３である。別の特定の実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは７．８±０．２である。別の特定の実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは７．８±０．１である。別の特定の実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは７．８である。さらに他の実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは７．０、７．１、７．２、７．３６、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、又は８．５である。
【０１８３】
特定の一実施形態では、溶出緩衝液の導電率は少なくとも１０ｍＳ／ｃｍである。好ましい実施形態では、溶出緩衝液の導電率は少なくとも１５ｍＳ／ｃｍである。別の好ましい実施形態では、溶出緩衝液の導電率は少なくとも２０ｍＳ／ｃｍである。特定の実施形態では、溶出緩衝液の導電率は１０ｍＳ／ｃｍ〜４０ｍＳ／ｃｍの間である。別の実施形態では、溶出緩衝液の導電率は１５ｍＳ／ｃｍ〜３０ｍＳ／ｃｍの間である。別の実施形態では、溶出緩衝液の導電率は２０ｍＳ／ｃｍ〜３０ｍＳ／ｃｍの間である。別の実施形態では、溶出緩衝液の導電率は２５ｍＳ／ｃｍ〜３０ｍＳ／ｃｍの間である。さらに他の実施形態では、溶出緩衝液の導電率は約５ｍＳ／ｃｍ、又は約６ｍＳ／ｃｍ、７ｍＳ／ｃｍ、８ｍＳ／ｃｍ、９ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ、１１ｍＳ／ｃｍ、１２ｍＳ／ｃｍ、１３ｍＳ／ｃｍ、１４ｍＳ／ｃｍ、１５ｍＳ／ｃｍ、１６ｍＳ／ｃｍ、１７ｍＳ／ｃｍ、１８ｍＳ／ｃｍ、１９ｍＳ／ｃｍ、２０ｍＳ／ｃｍ、２１ｍＳ／ｃｍ、２２ｍＳ／ｃｍ、２３ｍＳ／ｃｍ、２４ｍＳ／ｃｍ、２５ｍＳ／ｃｍ、２６ｍＳ／ｃｍ、２７ｍＳ／ｃｍ、２８ｍＳ／ｃｍ、２９ｍＳ／ｃｍ、３０ｍＳ／ｃｍ、３１ｍＳ／ｃｍ、３２ｍＳ／ｃｍ、３３ｍＳ／ｃｍ、３４ｍＳ／ｃｍ、３５ｍＳ／ｃｍ、３６ｍＳ／ｃｍ、３７ｍＳ／ｃｍ、３８ｍＳ／ｃｍ、３９ｍＳ／ｃｍ、４０ｍＳ／ｃｍ、またはそれ以上である。
【０１８４】
一実施形態では、溶出液の先行部分（すなわち、回収された又はプールされた関心対象の画分）は溶出液全体の８０％以下である。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の７０％〜８０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６０％〜８０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％〜８０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の７０％〜７５％の間である。さらに別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の７５％〜８０％の間である。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、又は８０％である。
【０１８５】
別の実施形態では、溶出液の先行部分（すなわち、回収された又はプールされた関心対象の画分）は溶出液全体の７０％以下である。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６０％〜７０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％〜７０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６０％〜６５％の間である。さらに別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６５％〜７０％の間である。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、又は７０％である。
【０１８６】
別の実施形態では、溶出液の先行部分（すなわち、回収された又はプールされた関心対象の画分）は溶出液全体の６０％以下である。特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％〜６０％の間である。別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％〜５５％の間である。さらに別の特定の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５５％〜６０％の間である。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液全体の５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、又は６０％である。
【０１８７】
別の実施形態では、溶出液の先行部分及び遅行部分は溶液のｐＨによって定義される。一実施形態では、先行部分は７．０を超えないｐＨを有する溶出液である。別の実施形態では、先行部分は６．５を超えないｐＨを有する溶出液である。別の実施形態では、先行部分は６．０を超えないｐＨを有する溶出液である。別の実施形態では、先行部分は５．５を超えないｐＨを有する溶出液である。別の実施形態では、先行部分は５．０を超えないｐＨを有する溶出液である。さらに他の実施形態では、先行部分は７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６．０、５．９、５．８、５．７、５．６、５．５、５．４、５．３、５．２、５．１、５．０又はそれ未満を超えないｐＨを有する溶出液である。
【０１８８】
一実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液のＯＤ２８０が２．０ＡＵよりも低下する時点の前にカチオン交換樹脂から溶出する溶出液の画分として定義される。別の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液のＯＤ２８０が１．５ＡＵよりも低下する時点の前にカチオン交換樹脂から溶出する溶出液の画分として定義される。別の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液のＯＤ２８０が１．０ＡＵよりも低下する時点の前にカチオン交換樹脂から溶出する溶出液の画分として定義される。別の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液のＯＤ２８０が０．５ＡＵよりも低下する時点の前にカチオン交換樹脂から溶出する溶出液の画分として定義される。さらに他の実施形態では、溶出液の先行部分は溶出液のＯＤ２８０が２．０ＡＵ、１．９ＡＵ、１．８ＡＵ、１．７ＡＵ、１．６ＡＵ、１．５ＡＵ、１．４ＡＵ、１．３ＡＵ、１．２ＡＵ、１．１ＡＵ、１．０ＡＵ、０．９ＡＵ、０．８ＡＵ、０．７ＡＵ、０．６ＡＵ、０．５ＡＵ、０．４ＡＵ、０．３ＡＵ、０．２ＡＵ、０．１ＡＵ、またはそれ未満よりも低下する時点の前にカチオン交換樹脂から溶出する溶出液の画分として定義される。ある特定の実施形態では、溶出液の先行部分は、溶出液のＯＤ２８０が閾値を、たとえば０．１ＡＵ、０．２ＡＵ、０．３ＡＵ、０．４ＡＵ、０．５ＡＵ、０．６ＡＵ、０．７ＡＵ、０．８ＡＵ、０．９ＡＵ、１．０ＡＵ、１．１ＡＵ、１．２ＡＵ、１．３ＡＵ、１．４ＡＵ、１．５ＡＵ、１．６ＡＵ、１．７ＡＵ、１．８ＡＵ、１．９ＡＵ、２．０ＡＵまたはそれ以上よりも上昇した後でカチオン交換樹脂から溶出する溶出液の部分としてさらに定義される。
【０１８９】
Ｅ．限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）
ＩｇＧ組成物は限外濾過／透析濾過によってさらに濃縮され得る。一実施形態では、限外濾過によってＩｇＧ組成物を２％〜１０％（ｗ／ｖ）の間のタンパク質濃度に濃縮し得る。ある特定の実施形態では、限外濾過は、開口チャンネルスクリーンを持つカセットにて行われ、限外濾過膜は、１００ｋＤａを超えない、又は９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０ｋＤａもしくはそれ未満を超えない公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）を有する。好ましい実施形態では、限外濾過膜は５０ｋＤａ以下のＮＭＷＣＯを有する。
【０１９０】
その内容があらゆる目的で全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願公開番号２０１０／０３３００７１に記載されているように、開口チャンネル膜を用い、かつ特別に設計した後洗浄及び製剤化を製造工程の終了間際に行って、収率及び保存安定性に影響を及ぼすことなく、最先端のＩＶＩＧ（たとえば、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ（登録商標）ＬＩＱＵＩＤ）に比べてタンパク質濃度が約２倍高い（２００ｍｇ/ｍｌ）ＩｇＧ組成物が得られ得る。市販の限外濾過膜のほとんどは、大多数のタンパク質の損失なしで２００ｍｇ/ｍｌのＩｇＧの濃度に到達することはできない。これらの膜は早期に閉塞するので、適切な後洗浄を行うのは難しい。従って、開口チャンネル膜の構成が使用される必要がある。開口チャンネル膜を用いる場合でさえ、有意にタンパク質を損失することなく（２％未満の損失）必要とされる濃度を得るために、特別に設計された後洗浄手順を用いなければならない。一層さらに驚くべきことは、２００ｍｇ/ｍｌの高いタンパク質濃度が低ｐＨの保存ステップのウイルス不活化能に影響を及ぼさないという事実である。
【０１９１】
限外濾過ステップが完了したら、静脈内投与又は筋肉内投与に好適な溶液に対する透析濾過を介して濃縮物をさらに濃縮してもよい。ある特定の実施形態では、透析濾過溶液は安定化剤及び／又は緩衝剤を含み得る。好ましい実施形態では、安定化剤及び緩衝剤は、適切な濃度、たとえば、０．２０Ｍ〜０．３０Ｍ又は０．２２Ｍ〜０．２８Ｍ又は０．２４Ｍ〜０．２６Ｍ、又は２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、若しくは３．０の濃度でのグリシンである。好ましい実施形態では、透析濾過緩衝液は０．２５Ｍのグリシンを含有する。
【０１９２】
通常、最小交換体積は、元々の濃縮体積の少なくとも約３倍又は元々の濃縮体積の少なくとも４、５、６、７、８、９倍、若しくはそれ以上である。ＩｇＧ溶液は、３％〜２５％の間（ｗ／ｖ）、若しくは３％〜７％の間、若しくは６％〜１８％（ｗ／ｖ）の間、若しくは７％〜１６％（ｗ／ｖ）の間、若しくは８％〜１４％（ｗ／ｖ）の間、若しくは９％〜１２％の間の最終タンパク質濃度に、又は、５％、若しくは６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％若しくはそれ以上の最終濃度に濃縮され得る。一実施形態では、濃縮された溶液に後洗浄画分を加えることなく少なくとも２３％の最終タンパク質濃度が達成される。別の実施形態では、濃縮された溶液に後洗浄画分を加えることなく少なくとも２４％の最終タンパク質濃度が達成される。さらに別の実施形態では、濃縮された溶液に後洗浄画分を加えることなく少なくとも２５％の最終タンパク質濃度が達成される。通常、濃縮工程の終了時、溶液のｐＨは約４．６〜５．１であろう。
【０１９３】
例示的実施形態では、１Ｍの塩酸を用いてＩｇＧ組成物のｐＨを５．２±０．２に調整し、限外濾過（１００ｋＤａ以下の公称分子量カットオフ）によって５±１ｇ％タンパク質に濃縮する。次いで透析濾過溶液（０．０２ＭのＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ）によって濃縮物を透析濾過する。透析濾過物を５±２℃に冷却する。２．０Ｍのトリスを用いて溶液のトリス緩衝液濃度を０．０２５Ｍに調整し、ｐＨを７．８±０．２に再調整する。
【０１９４】
Ｆ．アニオン交換クロマトグラフィ
一実施形態では、次いで平衡化したＡＮＸセファロース（登録商標）４ファストフローカラムにタンパク質を負荷し、血漿由来の混入物を取り除く。負荷が完了した後、平衡化緩衝液（２５ｍＭのトリス、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８±０．２）でカラムを洗浄する。負荷ステップ及び洗浄ステップからのカラムフロースルー（ＩｇＧ溶液）をプールする。
【０１９５】
Ｇ．ウイルスの不活化及び／又は除去
ある特定の実施形態では、濃縮された免疫グロブリン組成物の調製のために本明細書で提供される方法にはさらに、少なくとも１種の、好ましくは少なくとも２種の、最も好ましくは少なくとも３種のウイルス不活化又は除去ステップが含まれる。本明細書で提供される方法と共に採用され得るウイルス不活化又は除去ステップの非限定例には、溶媒・界面活性剤処理（双方ともその全体があらゆる目的で参照によって本明細書に組み入れられるＨｏｒｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  １９９４  （５  Ｓｕｐｐｌ  ３）：Ｓ２１−Ｓ２８  ａｎｄ  Ｋｒｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ２００３  （４３）：１０２３−１０２８）、ナノ濾過（双方ともその全体があらゆる目的で参照によって本明細書に組み入れられるＨａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  １９８９  （５６）２３０−２３６  ａｎｄ  Ｙｕａｓａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  １９９１  （７２  （ｐｔ  ８））：２０２１−２０２４）及び高温での低ｐＨインキュベート（Ｋｅｍｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  １９９１  （３１）４２３−４２７  ａｎｄ  Ｌｏｕｉｅ    ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  １９９４  （２２）：１３−１９）が挙げられる。
【０１９６】
ウイルスの不活化及び除去ステップは、製造工程の間に生成される任意の中間体免疫グロブリン分画に対して実施され得る。たとえば、一実施形態では、ウイルスの不活化又は除去ステップは、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの懸濁液、画分Ａの懸濁液、画分Ｂの濾液、画分ＩＩの懸濁液、カチオン交換溶出液、アニオン交換溶出液等に対して実施され得る。
【０１９７】
一実施形態では、ウイルスの不活化又は除去ステップは画分ＩＩの懸濁液に対して実施される。好ましい実施形態では、画分ＩＩの懸濁液を溶媒・界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理に供する。
【０１９８】
１．溶媒・界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理
血漿由来の生成物に存在し得る種々のウイルス性混入物を不活化するために、１種以上の免疫グロブリン製造中間体を溶媒・界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理に供し得る。好ましい実施形態では、画分ＩＩの沈殿物を再懸濁し、Ｓ／Ｄ処理する。血漿由来の画分の界面活性剤処理の方法は当該技術で周知である（概説についてはＰｅｌｌｅｔｉｅｒ  ＪＰ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  ２００６；１９（１）：２０５−４２を参照）。一般に、本明細書で提供される方法と併せて標準のＳ／Ｄ処理が使用され得る。たとえば、Ｓ／Ｄ処理の例示的プロトコールが以下で提供される。
【０１９９】
手短には、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０及びリン酸トリ（ｎ−ブチル）（ＴＮＢＰ）を、それぞれ約１．０％、０．３％及び０．３％の最終濃度にて、清浄化したＰｐｔＧ濾液に加える。次いで、約１８℃〜約２５℃の間の温度にて少なくとも約１時間、混合物を撹拌する。
【０２００】
一実施形態では、Ｓ／Ｄ試薬（たとえば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０及びＴＮＢＰ）を流体添加（fluent addition）ではなく噴霧によって添加する。他の実施形態では、界面活性剤試薬は免疫グロブリン中間体溶液に固体として加えてもよく、それを混合してＳ／Ｄ成分の迅速な分配を確実にする。ある特定の実施形態では、流体添加におけるような局所的一極集中が起きないように、濾液の非局在化表面領域にわたって固体をまき散らすことによって固体試薬を添加することが好ましい。別の実施形態では、ＳＤ試薬が濃縮された形態又は希釈された形態ですでに存在する槽に免疫グロブリン含有の溶液をポンプで入れることによって処理の改善を実現する。
【０２０１】
２．ナノ濾過
本明細書で提供される免疫グロブリン組成物のウイルス負荷量をさらに低減するために、適切なナノ濾過装置を用いて免疫グロブリン中間体画分をナノ濾過してもよい。ある特定の実施形態では、ナノ濾過装置は１５ｎｍ〜２００ｎｍの間又は約１５ｎｍ〜約２００ｎｍの間の平均孔サイズを有するであろう。この用途に好適なナノフィルターの例には、非限定的に、ＤＶＤ、ＤＶ５０、ＤＶ２０（Ｐａｌｌ）、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  ＮＦＰ、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  ＮＦＲ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｐｌａｎｏｖａ１５Ｎ、２０Ｎ、３５Ｎ及び７５Ｎ（Ｐｌａｎｏｖａ）が挙げられる。特定の実施形態では、ナノフィルターは、１５ｎｍ〜７２ｎｍの間若しくは約１５ｎｍ〜約７２ｎｍの間、又は１９ｎｍ〜３５ｎｍの間若しくは約１９ｎｍ〜約３５ｎｍの間、又は、１５ｎｍ、１９ｎｍ、３５ｎｍ、若しくは７２ｎｍ、若しくは約１５ｎｍ、約１９ｎｍ、約３５ｎｍ、若しくは約７２ｎｍの平均孔サイズを有し得る。好ましい実施形態では、ナノフィルターはＡｓａｈｉ  ＰＬＡＮＯＶＡ３５Ｎ又はその同等物のように３５ｎｍ又は約３５ｎｍの平均孔サイズを有するであろう。
【０２０２】
任意で、限外濾過／透析濾過を行ってナノ濾液をさらに濃縮し得る。一実施形態では、開口チャンネル膜を用い、かつ特別に設計した後洗浄及び製剤化を製造工程の終了間際に行って、高い濃度の免疫グロブリン組成物を生じる。
【０２０３】
ナノ濾過に続いて、限外濾過によって及び／又は透析濾過によって調整した緩衝組成物によって濾液をさらに濃縮し得る。一実施形態では、限外濾過によってナノ濾液を０．５％〜１０％又は約０．５％〜約１０％（ｗ／ｖ）のタンパク質濃度に濃縮し得る。ある特定の実施形態では、限外濾過は開口チャンネルスクリーンを伴ったカセットにて実施され、限外濾過膜は、１５０ｋＤａ若しくは約１５０ｋＤａを下回るか又は１４０、１３０、１２０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０ｋＤａ若しくは約１４０、約１３０、約１２０、約１００、約９０、約８０、約７０、約６０、約５０、約４０、約３０ｋＤａ若しくはそれ未満を下回る公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）を有する。一実施形態では、限外濾過膜は５０ｋＤａを超えないＮＭＷＣＯを有する。
【０２０４】
３．低ｐＨでのインキュベート
特定の実施形態では、免疫グロブリン含有溶液を処理して組成物のウイルス負荷量を減らすか又は不活化させてもよい。一実施形態では、このことは、組成物のｐＨを低ｐＨ、たとえば、６．０又は約６．０を下回るｐＨに調整し、組成物を放出する前に少なくとも約１週間インキュベートすることによって達成される。好ましい実施形態では、バルク溶液のｐＨはインキュベート前に５．５又は約５．５を下回るように調整される。さらに好ましい実施形態では、溶液のｐＨはインキュベート前に５．０又は約５．０を下回るように下げられる。ある特定の実施形態では、溶液のｐＨはインキュベート前に6．０若しくは約６．０を下回るように又は５．９、５．８、５．７、５．６、５．５、５．４、５．３、５．２、５．１、５．０、４．９、４．８、４．７、４．６、４．５、４．４、４．３、４．２、４．１、４．０又は約５．９、約５．８、約５．７、約５．６、約５．５、約５．４、約５．３、約５．２、約５．１、約５．０、約４．９、約４．８、約４．７、約４．６、約４．５、約４．４、約４．３、約４．２、約４．１、約４．０、若しくはそれ未満を下回るように下げられる。
【０２０５】
特定の実施形態では、次いで溶液を少なくとも１週間、又は少なくとも２、３、４週間以上、又は少なくとも１、２、３ヵ月以上インキュベートする。好ましい実施形態では、組成物は、２０℃を上回る又は２５℃を上回る又は３０℃を上回る温度でインキュベートされる。ある特定の実施形態では、組成物は、２０℃、又は２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、またはそれ以上の温度でインキュベートされる。
【０２０６】
４．凍結乾燥及び熱処理
さらに他の実施形態では、本発明は当該技術で既知の方法に従って凍結乾燥された凍結乾燥免疫グロブリン組成物を提供する。たとえば、Ｓ／Ｄ処理又はナノ濾過のような他のウイルス不活化又は除去ステップに予め供されていてもよいこれらの凍結乾燥組成物のウイルス活性を、凍結乾燥組成物の熱処理によってさらに低減させることができる。血液因子におけるウイルス負荷の不活化のための熱処理は当該技術で周知である（たとえば、Ｐｉｓｚｋｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ．  １９８７  Ｊｕｌ  １５；４７（２）：２３５−４１；  Ｐｉｓｚｋｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｓｔｕｄ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓ．  １９８９；（５６）：４４−５４；  Ｅｐｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｒｉｃｋｅ，  Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．  １９９０  Ｍａｒ；  １１４（３）：３３５−４０を参照）。
【０２０７】
Ｈ．製剤化
透析濾過ステップが完了したら、溶液のタンパク質濃度は透析濾過緩衝液によって、約３％〜約２０％（ｗ／ｖ）の間、若しくは３％〜７％の間、若しくは約６％〜約１８％（ｗ／ｖ）の間、若しくは約７％〜約１６％（ｗ／ｖ）の間、若しくは約８％〜約１４％（ｗ／ｖ）の間、若しくは約９％〜約１２％の間の最終濃度に、又は、約５％、若しくは６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、若しくはそれ以上の最終濃度に調整される。好ましい実施形態では、溶液のタンパク質の最終濃度は約９％〜約１１％の間、さらに好ましくは約１０％である。
【０２０８】
製剤化されたバルク溶液を、約０．２２ミクロンを超えない、たとえば、約０．２ミクロンの絶対孔サイズを持つ膜フィルターを介して濾過することによって、さらに無菌化する。次いで、適当な封止のための最終容器に溶液を無菌的に分配し、試料を試験に利用する。
【０２０９】
一実施形態では、ＩｇＧ組成物を、透析濾過緩衝液によって約１０．２±０．２％（ｗ／ｖ）の濃度にさらに調整する。必要に応じてｐＨを約４．４〜約４．９に調整する。最終的に溶液を無菌濾過し、３０℃又は約３０℃にて３週間インキュベートする。
【０２１０】
例示的実施形態では、得られたＩｇＧ溶液をＮａＣｌ（最大０．１５Ｍ）、グリシン（最大０．３Ｍ）、グルコース（最大０．１１Ｍ）及びヒトアルブミン（最大３ｍｇ／ｍｌ）で安定化する。１Ｍの塩酸を用いてｐＨを７．０±０．２に調整する。次いで限外濾過によって溶液を所望の濃度に濃縮し、１Ｍの塩酸又は１Ｍの水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７．１５±０．１に再調整する。０．２ミクロンの孔サイズのフィルター又は同等物を用いてバルク溶液を無菌濾過する。
【０２１１】
無菌ＩｇＧ溶液を容器に無菌的に分配し、凍結乾燥用に栓をし、凍結乾燥し、無菌条件下で封をし、蓋をする。
【実施例】
【０２１２】
ＶＩＩＩ．実施例
幾つかある利点の中で特に、実施例１〜７は、（１）カチオン交換樹脂（たとえば、ＣＭセファロース）からの免疫グロブリンの段階溶出がタンパク質の二峰性分布を生じ、ここで、アミド分解活性（ＰＬ−１）はＩｇＧより遅く溶出され、これによって、ＩｇＧ収量の最小限の損失でアミド分解活性を取り除くことが可能になることと；（２）カチオン交換樹脂（たとえば、ＣＭセファロース）からのアミド分解活性（ＰＬ−１）の溶出が、本明細書で提供される方法に係る溶出の際のＣＭカラムにおけるｐＨシフトに相関しかつおそらくそれによって引き起こされることと；（３）カチオン交換樹脂（たとえば、ＣＭセファロース）に負荷されるタンパク質の量が、樹脂１ｍｌ当たり少なくとも６０〜１２０ｍｇのタンパク質の範囲にわたって、アミド分解活性（ＰＬ−１）の除去に影響しないことと；（４）おそらくカラム上部でのｐＨ平衡がすでに乱れているために、カラム出口でのｐＨのモニタリング及び上昇が現れた時の溶出の停止が、アミド分解活性（ＰＬ−１）の部分的な除去をもたらすことと；（５）３ＣＶ未満の最初の溶出プールを回収することによって、ＩｇＧ収率の最小限の損失（１０％以下）でアミド分解活性を有意に低減することができること、したがってＣＭセファロース溶出ステップの体積をモニターすることが、本明細書で提供される方法に従って調製される免疫グロブリン組成物のアミド分解活性を有意に低減するための簡単な方法であることと；（６）ＣＭセファロース溶出ステップの「第１のピーク」を回収することによって、より低いＩｇＧ凝集体濃度、より低いＰＫＡ活性、より低いＰＬ−１活性、より高いＩｇＧ単量体濃度及びより望ましいＩｇＧサブクラスの分布を有する組成物を達成することができることを実証する。
【０２１３】
さらに、実施例８及び９は少なくとも、（１）溶出液の最後の２５％部分を分離することによってＣＭクロマトグラフィにてＦＸＩａ及び高いＴＧＡの原因となるタンパク質を分離することができることと；（２）上述の利点が大規模製造工程にて再現できることと；（３）ＯＤをモニターすることによって大規模製造工程にて作製したカチオン交換（すなわち、ＣＭセファロース）溶出液をプールすることができ、たとえば、溶出液のＯＤが２．０を下回るまで第１のプールにて溶出液を回収してもよく、これにより、高いＦＸＩａ及びＴＧＡ値の原因となる望ましくないタンパク質の有意な分離を提供することを実証する。
【０２１４】
実施例１
本実施例は、改変キストラー／ニッチェマンのアルコール分画に従って調製された画分ＩＩの免疫グロブリン組成物に由来する高いＴＧＡ、ＦＸＩａ及び短縮されたＮＡＰＴＴの値の原因となる望ましくないタンパク質の分布を記載する。これらの不純物はカチオン交換クロマトグラフィステップ（たとえば、ＣＭセファロースファストフロークロマトグラフィ）の溶出中に分離することができる。
【０２１５】
本実施例は、カチオン交換クロマトグラフィの溶出の際のアミド分解性含量（たとえば、ＦＸＩ及び／又はＦＸＩａ）の有意な低減を実証する。この方法によって有意に少ないＴＧＡ及びＦＸＩａ活性を含有する免疫グロブリンの最終製品を生じる。この低減は、主なＩｇＧ画分（溶出液の先行部分で見出される）からアミド分解活性（溶出液の遅行部分に存在する）を効果的に分離するＣＭ溶出液ステップの特定の画分によって達成される。本実施例は、カチオン交換溶出液を先行部分と遅行部分に分けることによってＩｇＧ含量の大部分から望ましくない微量のタンパク質を分離することを示す。さらに、本実施例はこの工程が大規模製造に有効であり、経済的に実現可能であることを実証した。
【０２１６】
手短には、画分ＩＩの沈殿物を以下のように調製した。プールしたヒト血清のクリオ調製の後、ｐＨ６．９での２０％アルコールによる沈殿によって画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの沈殿物を形成した。沈殿物Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの再懸濁の後、ｐＨ７．２にて最終濃度２０％までアルコールを加え、沈殿物Ａを形成する。遠心分離によって沈殿物Ａの分離を行った。懸濁した沈殿物Ａの１７％アルコールによる沈殿によって画分Ｉ＋ＩＩＩ（懸濁液Ｂの沈殿物とも言う）を形成する。濾過又は遠心分離によって沈殿物を回収する。次いで懸濁液Ｂの濾液を処理して画分ＩＩを形成し、これは部分的に精製されたガンマグロブリン（たとえば、ＩｇＧ）血漿タンパク質画分を含有する。
【０２１７】
次いで画分ＩＩの清浄化した懸濁液を溶媒・界面活性剤（ＳＤ）の混合物で処理し、ＣＭセファロースｆｆカラムに負荷する。残りのＳＤ試薬を洗い流した後、樹脂に結合したＩｇＧ画分を溶出する。その後、免疫グロブリン溶液を限外濾過し／透析濾過し、次いでアニオン交換器に負荷して微量の不純物を取り除く。さらなる濃縮ステップの後、最終的な製剤化に続いて凍結乾燥を行う。
【０２１８】
次いで画分ＩＩの沈殿物を４℃でｐＨ５．２±０．２の冷水に溶解した。ＣＷＳＳによる清浄化の後、ＳＤ処理のために溶液を調整した。タンパク質濃度を２％に調整し、ＳＤインキュベートの間の温度を２０℃〜２５℃の範囲内に保持した。次いでタンパク質溶液を、平衡化したＣＭセファロースファストフローカラム（平衡化緩衝液：０．０２５Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０±０．２）に負荷した。負荷の後、３０カラム容量の酢酸緩衝液（０．０１Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５±０．２）でカラムを洗浄し、ＳＤ試薬を洗い流した後、吸着したタンパク質を溶出緩衝液（０．２５ＭのＮａＣｌ、０．２Ｍのグリシン、０．１％のＰＥＧ３３５０、２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．００）で溶出した。溶出液の第１の部分（Ｅ１）の回収はＯＤ４００ｍＡＵで開始し、正確に２．７カラム容積の後に停止した（図１）。溶出ピークの第２の画分（Ｅ２）はＯＤが再び４００ｍＡＵに低下するまで回収した。次いで、溶出した画分を残りの工程のために別々に処理した。
【０２１９】
次いで、Ｅ１及びＥ２の組成物をｐＨ５．２に調整し、透析濾過緩衝液（０．０２ＭのＮａＣｌ、０．０５％のＰＥＧ３３５０）に対して限外濾過／透析濾過して５％タンパク質（ｗ／ｖ）に濃縮した。組成物に０．０２５Ｍのトリスを加え、ｐＨを７．７に調整した。次いで緩衝液（０．０２５Ｍのトリス、０．０２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．７）で平衡化したＡＮＸセファロースファストフローカラムにＩｇＧ画分を負荷した。得られたＡＮＸフロースルーを回収し、８．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１６．５ｇ／Ｌのグリシン、２１．７ｇ／Ｌの無水グルコース及び１ｇ／Ｌのアルブミン（２０％）を添加した。次いでｐＨを調整し、限外濾過によってＥ１及びＥ２の組成物を１０％（ｗ／ｖ）タンパク質に濃縮した。濃縮の後、濃縮した溶液に再びＮａＣｌ及びグリシン（アルブミンは加えない）を添加し、無菌濾過の前に必要に応じてｐＨを７．１に調整する。
【０２２０】
クロマトグラフィステップの吸光度（ｍＡＵ）、導電率及びｐＨを示すクロマトグラフを図１にて提供する。見て分かるように、上述の溶出緩衝液による単一段階溶出は２ピークの溶出を生じる。特に、溶出緩衝液の添加の際、第１のピークがカラムから出てくるにつれて溶出液のｐＨは有意に低下し、次いで第２のピークの溶出と共に鋭く上昇する。記載されるように、溶出ピークは、第１の画分Ｅ１（図１で示す縦線の左）及び第２の画分（図１で示す縦線の右）にて２．７カラム容積を回収することによって分離した。
【０２２１】
溶出された画分（Ｅ１及びＥ２）を別々に処理して以下で記載されるように最終免疫グロブリン製剤を作製した。そうするために、画分Ｅ１及びＥ２のｐＨを５．２に調整し、試料を透析濾過緩衝液（０．０２ＭのＮａＣｌ、０．０５％のＰＥＧ３３５０）に対して透析濾過して組成物を５％のタンパク質濃度に濃縮した。透析濾過の後、各タンパク質溶液に０．０２５Ｍのトリスを加え、ｐＨを７．７に調整した。次いでＩｇＧ画分を平衡化したＡＮＸセファロースファストフローカラム（平衡化緩衝液：０．０２５Ｍのトリス、０．０２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．７）に負荷し、フロースルー画分を回収した。次いでＡＮＸフロースルーに８．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１６．５ｇ／Ｌのグリシン、２１．７ｇ／Ｌの無水グルコース及び１ｇ／Ｌのアルブミン（２０％）を添加した。次いで溶液のｐＨを７．００に調整し、限外濾過によって免疫グロブリン試料を１０％タンパク質に濃縮する。濃縮の後、ＮａＣｌ、グリシン及び無水グルコースを再び加え、無菌濾過の前に必要に応じてｐＨを７．１に調整する。
【０２２２】
クロマトグラフィステップの特徴決定を行うために質量収支を測定し、その結果を表１に示す。総タンパク質のほぼ１０％が溶出ピークの第２の部分で見いだされた。これが、プールした組成物を溶出液の２．７カラム容積の後に停止した場合に生じる、収量損失である。
【０２２３】
（表１）ＣＭクロマトグラフィ濃縮ステップの質量収支
2014525417.tif 000003
【０２２４】
次いで、２つのＣＭ溶出画分から調製した最終容器を、分子サイズ分布、抗補体活性、基質としてＰＬ−１及びＴＧＡの双方を用いたアミド分解活性、ＦＸＩａ活性及びＮＡＰＴＴ活性について分析した。結果を表２及び表３に示す。溶出されたＩｇＧ画分の第１及び第２の部分に由来する最終容器の生化学的な特徴決定により、溶出の第１の部分はＦＸＩａならびに高いＴＧＡ及び短縮されたＮＡＰＴＴの値の原因となる他の望ましくないタンパク質を本質的に含まないことが実証された。対照的に、ＦＸＩａ及びアミド分解活性は第２の部分で濃縮されており、ここでは、凝集体、及びオリゴ／二量体の含量もまたより高い。興味深いことに、溶出液の第１の部分ではＡＣＡ値が非常に低い一方で、溶出液の第２の部分ははるかに高い値を示している。
【０２２５】
（表２）２つの最終容器Ｅ１及びＥ２の分子サイズ分布の比較
2014525417.tif 000004
【０２２６】
（表３）２つの最終容器Ｅ１及びＥ２の生化学的特徴決定の比較
2014525417.tif 000005
【０２２７】
結論として、ＣＭセファロースｆｆカラムからの溶出の分割により、２つの画分が生じ、実質的にＦＸＩａを含まないＩｇＧ組成物の製造が可能になる。
【０２２８】
実施例２
製造規模の免疫グロブリン製剤に存在するアミド分解活性の量を減らすために、カチオン交換クロマトグラフィを溶出および分画するのに使用する条件を検討した。これらの検討の詳細を以下に提供する。
【０２２９】
一連の実験を行って、本明細書で記載されるＧａｍｍａｇａｒｄ ＳＩＤ製造法に従って下流工程の間にアミド分解活性を低減する／取り除くための好適な溶液を見いだした。手短には、Ｃｏｈｎ分画のペーストを４℃でｐＨ５．２±０．２の冷水に溶解した。ＣＷＳＳ濾過による清浄化の後、試料を無菌濾過して４℃で保存した又は即時の処理のために水で２％のタンパク質濃度に希釈した。次いで溶液を２０〜２５℃にし、溶媒／界面活性剤混合物（１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．３％のＴｗｅｅｎ８０；０．３％のＴＮＢＰ）と共に１時間インキュベートした後、タンパク質溶液を、平衡化したＣＭセファロースファストフローカラム（平衡化緩衝液：２５ｍＭのＮａ酢酸、ｐＨ５．０±０．２）に負荷した。負荷の後、酢酸緩衝液（０．０１ＭのＮａ酢酸、ｐＨ５．５±０．２）でカラムを洗浄し、溶出緩衝液（０．２５ＭのＮａＣｌ、０．２Ｍのグリシン、０．１％のＰＥＧ３３５０、２５ｍＭのトリス、ｐＨ７．８）で吸着しているＩｇＧを溶出する。ＣＭセファロースｆｆ実行の間、以下のパラメータをモニターしてＣＭ溶出液を分画する（定点にて）：ＯＤ２８０；ｐＨ；及びカラム容積（ＣＶ）での溶出容積。次いで溶出液を透析濾過緩衝液（０．０２ＭのＮａＣｌ、０．０５％のＰＥＧ３３５０）で限外濾過／透析濾過した、又は直ちに分析に使用した。１０％の最終容器組成物に相当するタンパク質の値でアミド分解活性を測定するためにも、この濃縮ステップを実施した。
【０２３０】
溶出の間、溶出液はＣＭ溶出緩衝液の導電率の値を迅速に達成した。しかしながら、図２に示すように、カラムの出口で測定された溶出液のｐＨは、溶出緩衝液が７．８のｐＨを有したという事実にもかかわらず、洗浄緩衝液で見られるように５．５から５  ０未満（４  ３〜４．８）に低下し、最初の４ＣＶについては変化しないままだった。約７．８へのｐＨの上昇が溶出液回収の終了時に見られた。カラム出口でのＯＤ２８０のモニタリングはこのｐＨシフトが第２のピークの放出に対応することを示し、そこでは（ＰＬ−１アッセイを介して測定される）アミド分解活性の大半が検出される。
【０２３１】
実施例３
実施例１及び実施例２で見られた二峰性のＣＭセファロース溶出現象及びｐＨシフトをさらに検討するために、別のＣＭセファロースファストフロークロマトグラフィ実験の間に個々の溶出画分を回収した。手短には、上述のようにＣＭセファロースファストフロークロマトグラフィを実施し、画分を回収して別々に分析した後、画分Ａ〜Ｎをプールし、限外濾過によって濃縮した。クロマトグラフィステップの出発物質はＣｏｈｎ画分ＩＩのペースト（Ｐ２５００１ｉｖＬＥ；ＦＩＸ及びＡＴ−ＩＩＩを吸着した）であった。５．２のｐＨを有する緩衝液でＣＭセファロースカラムを平衡化し、５．７のｐＨで洗浄を行った。クロマトグラフィステップの流速は０．６４ｃｍ／分で維持した。
【０２３２】
ｐＨシフトの後、増加した量のアミド分解活性（ＰＬ−１）が画分において見出される。濃縮されたプールにおいてさえ、低下したアミド分解活性が認められる。ＰＬ１活性が限外濾過／透析濾過の後で検出可能であるという事実は、ＣＭ溶出液の希釈によるか又は濃縮中のその生成によるかのどちらかである。
【０２３３】
表４に示すように、５．５を下回るｐＨで溶出する画分（画分Ａ〜Ｎ）は、高いｐＨ値で溶出する画分（画分Ｏ及びＰ）に比べてはるかに低濃度のアミド分解活性を含有した。アミド分解活性の定量は、画分Ａ〜Ｎを合わせたすべてよりも多い活性が画分Ｏ及びＰにて溶出されたことを示している。ｐＨシフトの後、増加量のアミド分解活性（ＰＬ−１）が画分で見出された。濃縮されたプールにおいてさえ、アミド分解活性の低下が認められる。ＰＬ１活性が限外濾過／透析濾過の後で検出可能であるという事実は、ＣＭ溶出液の希釈によるか又は濃縮中のその生成によるかのどちらかである。
【０２３４】
（表４）ＣＭセファロースｆｆ溶出画分の分析
2014525417.tif 000006
【０２３５】
実施例４
ＣＭセファロースｆｆ樹脂からのアミド分解活性溶出の境界をさらに定義するために、ＣＭ溶出液がｐＨの境界で定義される画分にて回収されることを除いては上記と同様に、別の実験を実施した。具体的には、カラム出口でモニターした規定のｐＨ（４．３、４．８、６．０、７．５）まで、ＣＭ溶出液を回収した。この実験では、クロマトグラフィステップの出発物質は、実施例３と同様に、Ｃｏｈｎ画分ＩＩのペースト（Ｐ２５００１ｉｖＬＥ；ＦＩＸ及びＡＴ−ＩＩＩを吸着した）であった。４．８のｐＨでＣＭセファロースカラムを平衡化し、５．３のｐＨで洗浄した。溶出液画分を限外濾過／透析濾過し、分析の前にトリスでｐＨを調整した。この実験では、溶出ステップの開始時に溶出液のｐＨは４．１に低下した。回収された溶出液の画分の分析を表５に示す。
【０２３６】
（表５）ＣＭセファロースｆｆ溶出液の画分の分析
2014525417.tif 000007
【０２３７】
実施例５
次に、単位ＣＭセファロース樹脂当たりのタンパク質の量の低下が図２で示すピーク分離をさらに向上させるかどうかを判定した。これを調べるために、樹脂１ｍｌ当たり１１８ｍｇのタンパク質から樹脂１ｍｌ当たり５７ｍｇのタンパク質に低下する範囲でタンパク質負荷量を低下させて、一連のＣＭセファロースｆｆクロマトグラフィ実行を行った。実施例２と同様に、実験用の出発物質はＣｏｈｎ画分ＩＩペースト経路ＩＩ；Ｐ２４７０１ＩＶであり、それは吸着による脱クリオ血漿からのＦＩＸ、ＦＶＩＩ及びＡＴＩＩＩの除去を含む（表６）。樹脂をｐＨ５．２で平衡化し、ｐＨ５．７で洗浄ステップを行った。実施例２のように、ＣＭセファロース溶出液をプールして、第１の部分（第１のピーク）及び第２の部分（第２の部分）とした。図２は、例示的クロマトグラフを提供するが、ここで、溶出液のＵＶ吸光度が２つのピークの間のおよそＯＤ２８０＝１．６±０．２にて底を打つ時に第１のプールが終了し、第２のプールが開始する。
【０２３８】
（表６）出発物質（Ｃｏｈｎ画分ＩＩペースト経路ＩＩ；Ｐ２４７０１ＩＶ）の分析
2014525417.tif 000008
【０２３９】
表７で示すように、樹脂のタンパク質負荷量を低下させることはピークの分離に効果を示さなかったが、回収に影響を有した。以前の実施例で提示された結果に一致して、各クロマトグラフィ実行の第１の溶出液プールには、非常に低レベルのアミド分解活性が存在する。
【０２４０】
（表７）タンパク質負荷量を変動させて行ったＣＭセファロースクロマトグラフィ精製の分析
2014525417.tif 000009
【０２４１】
実施例６
上述の実験の知見をさらに実証するために、様々な流速及び溶出プール形成スキームにてＣＭセファロースクロマトグラフィ精製を行った。手短には、高いアミド分解活性含量（６％タンパク質にて１００ナノモル／ｍｌ.分）を含有するＣｏｈｎ画分ＩＩペーストを本明細書で記載されるように処理して、ＡＮＸクロマトグラフィ前の画分とした。ＣＭセファロースの実行すべてについて、ＵＶが上昇し始めたら溶出液を回収し、３ＣＶの後又は４ＣＶの後に回収を停止した。
【０２４２】
以下のように、３種のＣＭセファロースクロマトグラフィ精製を行った。回収した溶出液画分を本明細書で記載されるように濃縮し、次いでＰＬ−１の値がＰＬ−１アッセイの検出限界を下回らないようにさらに濃縮した。
【０２４３】
第１の実行：ＣＭセファロース樹脂をすすぎ、１ｃｍ／分の流速で平衡化した。タンパク質負荷、洗浄及び溶出ステップの流速は０．６４ｃｍ／分で一定に保った。主要プールにて溶出液の３カラム容積（３ＣＶ）を回収した。
【０２４４】
第２の実行：ＣＭセファロース樹脂をすすぎ、１.２ｃｍ／分の流速で平衡化した。タンパク質負荷ステップの流速は０．６４ｃｍ／分であった。洗浄ステップの流速は最初の１．２カラム容積（ＣＶ）では０．６４ｃｍ／分、その後の２８．８ＣＶでは１．８ｃｍ／分であった。溶出ステップは０．６４ｃｍ／分で実施した。主要プールにて溶出液の３カラム容積（３ＣＶ）を回収した。
【０２４５】
第３の実行：ＣＭセファロース樹脂をすすぎ、１.２ｃｍ／分の流速で平衡化した。タンパク質負荷ステップの流速は０．６４ｃｍ／分であった。洗浄ステップの流速は最初の１．２カラム容積（ＣＶ）では０．６４ｃｍ／分、その後の２８．８ＣＶでは１．８ｃｍ／分であった。溶出ステップは０．６４ｃｍ／分で実施した。主要プールにて溶出液の４カラム容積を回収した。
【０２４６】
各ＣＭセファロースクロマトグラフィ実行の主要プールを濃縮し、アミド分解活性（ＰＬ−１）、総タンパク質濃度、及びＨＰＬＣプロフィールについて分析した。表８に示すように、洗浄ステップの速度を高めることは、主要プールにおけるアミド分解活性の量の低下を生じた（実行１と実行２を比較して）。３ＣＶではなく４ＣＶの回収によって、計画通りの総タンパク質収量（２．５５ｇ／Ｌ血漿 対 ２．５ｇ／Ｌ血漿；実行３と実行２を比較）が提供されたが、最終組成物に存在するアミド分解活性の総量は２倍超になった（３８４．７ＰＬ−１ナノモル／分・ｇタンパク質 対 １８８．５ＰＬ−１ナノモル／分・ｇタンパク質）。４ＣＶをプールすることはまた最終免疫グロブリン組成物の凝集体含量も高めた（０．５２％ 対 ０．１２％；実行３と実行２を比較）。注目すべきことに、実行２によって調製された組成物の最終的なアミド分解含量及び凝集体含量は上記で見られるものに一致している（表２、表４及び表５を参照）。
【０２４７】
（表８）洗浄の流速及び溶出液回収容積を変動させて実施したＣＭセファロースクロマトグラフィ精製の分析
2014525417.tif 000010
【０２４８】
実施例７
上で提供される結果が工業的な製造規模に拡大できることを実証するために３６０ｇのＣｏｈｎ画分ＩＩ出発物質を上記実験のように処理した。２．９ＣＶのＣＭセファロース溶出液を第１のプールで回収し、溶出液の残りを第２のプールで回収した。次いで、得られた溶出液プールを、本明細書で記載されるように、個体への投与に好適な最終容器組成物に処理した。このさらなる処理には、ＡＮＸクロマトグラフィ、限外濾過／透析濾過及び最終製剤からの凍結乾燥が含まれた。次いで各最終製剤の生化学的な特徴を分析し、結果を表９に提示する。
【０２４９】
（表９）２つの最終容器Ｅ１（溶出液の第１の部分：２．９ＣＶ）及びＥ２（溶出液の第２の部分：２．９ＣＶ超）の生化学的な特徴の比較
2014525417.tif 000011
【０２５０】
表９で示すように、ＣＭセファロース溶出の第１の部分に由来する最終組成物は、ＣＭセファロース溶出の第２の部分に由来する最終組成物よりも５０倍少ないアミド分解活性を含有した（４０２ナノモルＰＬ−１／分・ｇタンパク質 対 １８，４４６.６ナノモルＰＬ−１／分・ｇタンパク質）。ＣＭセファロース溶出の第１の部分に由来する最終組成物はまた、ＣＭセファロース溶出の第２の部分に由来する最終組成物に比べて少ないアルブミン（１．２％ 対 ２．３％）、α／βグロブリン（検出されず 対 ０．２％）、ＰＫＡ活性（＜０．６ＩＥ／ｍｌ 対 ４１．２ＩＥ／ｍｌ）及びＩｇＧ３（４．６％ 対 １０．８％）も含有した。さらに、ＣＭセファロース溶出の第１の部分に由来する組成物はＣＭセファロース溶出の第２の部分に由来する最終組成物よりもはるかに高いＩｇＧ単量体含量（９４．８１％ 対 ８７．８６％）を含有した。
【０２５１】
実施例８
上で提供される結果をさらに実証するために、画分ＩＩペースト（ＲＩ１０ＸＤ１４２；遠心分離した沈殿物Ａ）の一部を本明細書で提供される方法に従って調製した。次いでペーストを再懸濁し、本明細書で記載されるようにＣＭセファロースカチオン交換カラムに負荷し、上述のように溶出した。溶出液（総量：４７４３ｍｌ）を、溶出液全体の７５％（３５３０ｍｌ）を含有する第１の画分と溶出液全体の２５％（１２１３ｍｌ）を含有する第２の画分に分割した。次いで、第１と第２のＣＭセファロース溶出液画分を本明細書で記載されるように処理して最終容器に入れ、ＦＸＩａ、ＴＧＡ、ＮＡＰＴＴ、及びアミド分解（ＰＬ−１）活性、ＩｇＧ凝集体及びＡＣＡの含量について分析した。結果を表１０に提供する。上で提供される結果に一致して、ＣＭセファロース溶出液の第１のプールと第２のプールへの分離は、最終的な免疫グロブリン製剤におけるＦＸＩａ及びＴＧＡの活性の低減を生じた。
【０２５２】
（表１０）第１と第２のＣＭセファロース溶出画分の生化学的な特徴
2014525417.tif 000012
【０２５３】
実施例９
本明細書で提供される方法の規模拡大の実行可能性をさらに評価するために、大規模製造法からのＣＭセファロース溶出液をタンパク質含量、ｐＨ及びＦＸＩａ活性についてモニターした。手短には、およそ１９，０００Ｌの脱クリオ血漿を本明細書で記載されるように処理して約７０ｋｇのタンパク質を含有する約２２０ｋｇの画分ＩＩペーストを形成した。画分ＩＩペーストを再懸濁し、上述のようにＣＭセファロースカラムに負荷し、洗浄し、溶出した。溶出液の試料を回収し、各ＣＶ（およそ３５０Ｌ）の溶出の後、分析した。表１１に示すように、高いＦＸＩａ値は、溶出液のｐＨがシフトした後、ＣＭセファロース溶出の終了時にのみ見出された。溶出液のタンパク質濃度はＯＤ２８０にてモニターし、ＯＤ２８０が２．０を下回るまで溶出の第１の部分を回収し、プールした。次いで、ＯＤ２８０が０．２を下回るまで溶出液の第２の部分を回収し、別にプールした。次いで、表１２に示すように第１と第２の溶出液プールを分析し、比較した。注目すべきことに、ＩｇＧ収量の９８％がＣＭ溶出液の第１の部分で見いだされ、ＩｇＧ収量の２％がＣＭ溶出液の第２の部分で見いだされた。従って、溶出液のＯＤ２８０が２．０を下回った後ＣＭセファロース溶出プールの回収を終了することによって、ＩｇＧ収量の損失をできるだけ抑えながら、有意な量のＴＧＡ及びＦＸＩａの活性をこの製剤から取り除くことができる。
【０２５４】
（表１１）各カラム容積の溶出の後に採取されたＣＭセファロース溶出液の試料の生化学的な特徴
2014525417.tif 000013
【０２５５】
（表１２）第１と第２のＣＭセファロース溶出プールの生化学的な特徴
2014525417.tif 000014
【０２５６】
実施例１０
免疫グロブリン組成物のアミド分解含量を減らすための開示された方法をさらに評価するために、画分ＩＩの沈殿物を出発物質として用いて第２の大規模実験を行った。手短には、沈殿物Ａの分離が遠心分離ではなく濾過によって行われたことを除いては実施例１で記載されたのと同様に、画分ＩＩの沈殿物を調製した。
【０２５７】
実施例１で記載されたように、画分ＩＩの沈殿物をＣＭカチオンクロマトグラフィに供した。実施例１のように、ＣＭ溶出液を、２つのプール、すなわちＩｇＧ含量の大半を含有する先行部分（Ｅ１）とアミド分解活性の大半を含有する遅行部分（Ｅ２）に回収した。溶出液の第１の部分（Ｅ１）の回収はＯＤ４００ｍＡＵで開始し、正確に２．７カラム容積後に停止した。溶出ピークの第２の画分（Ｅ２）はＯＤが再び４００ｍＡＵに低下するまで回収した。次いで残りの工程のために、溶出した画分を別々に処理した。精製工程に関する質量収支を表１３に示す。
【０２５８】
（表１３）画分ＩＩの沈殿物からの第２の大規模精製に関する質量収支
2014525417.tif 000015
【０２５９】
実施例１と同様に、総タンパク質のほぼ１０％が溶出ピークの第２の部分で見出される。これが、溶出を２．７カラム容積の後に停止する場合の確定的な収量損失である。
【０２６０】
２つのＣＭ溶出画分（Ｅ１及びＥ２）から調製した最終容器を、分子サイズの分布、抗補体活性、アミド分解活性について基質ＳＮ１３ａによりならびにＴＧＡ、ＦＸＩａ、及びＮＡＰＴＴアッセイにより分析した。結果を表１４及び表１５に示す。
【０２６１】
（表１４）２つの最終容器の分子サイズの分布の比較
2014525417.tif 000016
【０２６２】
（表１５）２つの最終容器の追加の特徴の比較
2014525417.tif 000017
【０２６３】
溶出されたＩｇＧ画分の第１の部分及び第２の部分に由来する最終容器の生化学的な特徴は、溶出の第１の部分はＦＸＩａならびに高いＴＧＡ及び短縮されたＮＡＰＴＴの値の原因となる他の望ましくないタンパク質を本質的に含まないことを実証した。対照的に、ＦＸＩａ及びアミド分解活性は第２の部分で濃縮されており、ここでは、たとえ懸濁液Ａの分離が濾過によって行われているとしても、凝集体及びオリゴ／二量体の含量もまたより高い。興味深いことに、溶出液の第２の部分におけるＡＣＡ値が高い一方、溶出液の第１の部分におけるＡＣＡ値はずっと低い。
【０２６４】
この実験では、上流工程で懸濁液Ａの分離に濾過が使用されており、溶出液の第２の部分における残留ＦＸＩａははるかに少なく、かつこの溶出部分の最終容器のＴＧＡ値は正常範囲である。
【０２６５】
実施例１と共に総合すれば、ＣＭセファロースｆｆカラムからの溶出を２つの画分（Ｅ１及びＥ２）に分けることは、実質的にＦＸＩａを含まないＩｇＧ組成物の製造を可能にする。沈殿物Ａの分離が濾過によって行われる場合ＦＸＩａは有意に低いが、このことは、画分Ａの分離選択肢（すなわち、遠心分離及び濾過）の両方に当てはまる。
【０２６６】
実施例１１
本実施例は、皮下投与用の免疫グロブリン組成物の製造のために設計された大規模製造工程におけるカチオン交換クロマトグラフィによる凝血促進活性の分離に対する本方法の好適性を実証する。この実験の出発材料はヨーロッパで採取され、プールされたヒト起源の血漿から形成された画分ＩＩの沈殿物であり、これはクリオ沈殿され、吸着を介して抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）を回収するのに使用された。
【０２６７】
手短には、クリオ沈殿及びＡＴＩＩＩの吸着の後、８％アルコール及びｐＨ７．０での画分Ｉの沈殿物の沈殿によるフィブリノーゲン及び残りの凝固因子（たとえば、第ＸＩＩＩ因子）の分離と共に冷却アルコール分画を開始する。画分ＩＩ＋ＩＩＩを沈殿させ、アルブミンを分離するために上清のアルコール濃度を２５％に調整する。沈殿物ＩＩ＋ＩＩＩの再懸濁の後、アルコールをｐＨ約５．２にて１２％に加え、沈殿物ＩＩＩを形成する。沈殿物ＩＩＩの分離の後、０．０４ｇのＤＥＡＥセファデックス／ｇタンパク質を加え、Ｃｕｎｏ９０デプスフィルターで溶液を濾過し、精製されたγグロブリン画分を含有するＣｏｈｎ画分ＩＩを中性ｐＨにて２５％のアルコールによって沈殿する。
【０２６８】
４℃でｐＨ５．２±０．２において、冷水に画分ＩＩの沈殿物を溶解する。ＣＷＳＳ濾過による清浄化の後、ＳＤ処理のために溶液を２％のタンパク質濃度に調整する。ＳＤインキュベートの際の温度を２０〜２５℃の範囲内に保持する。タンパク質溶液を平衡化したＣＭセファロースファストフローカラム（平衡化緩衝液：０．０２５Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０±０．２）に負荷する。負荷の後、３０カラム容積の酢酸緩衝液（０．０１Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５±０．２）でカラムを洗浄してＳＤ試薬を洗い流した後、吸着したタンパク質を溶出緩衝液（０．２５ＭのＮａＣｌ、０．２Ｍのグリシン、０．１％のＰＥＧ３３５０、２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．００）で溶出する。溶出液の第１の部分（Ｅ１）の回収はＯＤ４００ｍＡＵで開始し、正確に２．７カラム容積の後、停止する。溶出ピークの第２の画分（Ｅ２）はＯＤが再び４００ｍＡＵに低下するまで回収する。溶出された画分を以下のステップに従って別々に処理して、最終バルクとする。
【０２６９】
溶出液画分のｐＨを５．２に調整し、濃度を５％に調整し、透析濾過緩衝液（０．０２ＭのＮａＣｌ、０．０５％のＰＥＧ３３５０）に対する透析濾過及びその後の１０％タンパク質への濃縮が行われる。０．０５５ｇのグリシン／ｇタンパク質を溶液に加え、無菌濾過の前にｐＨを７．０に調整する。
【０２７０】
カチオン交換洗浄と溶出ステップのクロマトグラムを図３に示す。番号１の線はＵＶ吸光度を、番号２の線は導電率を、番号３の線はカラム出口のｐＨを示す。２８０ｎｍでの光学密度はＣＭセファロースｆｆカラムからのタンパク質の溶出の際の２つの画分の部分的な分離を示す。溶出の際、カラム出口のｐＨはＵＶ吸光度の再上昇の開始の直後に上昇し始める。この時点で、２つの溶出液画分は分離された（本明細書ではＥ１及びＥ２と呼ばれるＦ４及びＦ５）。下流の精製実行についての質量収支を表１６に示す。
【０２７１】
（表１６）画分ＩＩの沈殿物からのＩｇＧの大規模精製についての質量収支
2014525417.tif 000018
【０２７２】
総タンパク質のほぼ１５％が溶出ピークの第２の部分（Ｅ２）で見られる。これが、２．７カラム容積後のＥ１回収の停止による収量損失である。２つのＣＭ溶出画分（Ｅ１及びＥ２）から調製された最終容器を、分子サイズの分布、抗補体活性、アミド分解活性について、基質ＳＮ１３ａによりならびにＴＧＡ、ＦＸＩａ、及びＮＡＰＴＴアッセイにより分析した。結果を表１７及び表１８に示す。
【０２７３】
（表１７）２つの最終容器の分子サイズの分布の比較
2014525417.tif 000019
【０２７４】
（表１８）２つの最終容器の追加の特徴の比較
2014525417.tif 000020
【０２７５】
ＣＭ−溶出液の第１の部分（Ｅ１）は、低い凝集体、二量体及び断片の含量、低いＦＸＩａ含量、正常血漿に近いＴＧＡ成績、検出限界を下回るＰＫＡ及びＳＮ−１３で測定したアミド分解活性を伴い、短縮されたＮＡＰＴＴを伴わない、最終バルクを生じた。ＦＸＩａ、ＰＫＫＡ及びＦＸＩａ様の活性は第２の部分で濃縮されており、ここでは、ＩｇのＧ重合体、断片及びオリゴ／二量体の含量もまたより高い。興味深いことに、溶出液の先行部分（Ｅ１）におけるＡＣＡ値は溶出液の遅行部分（Ｅ２）よりも低い。
【０２７６】
実施例１２
免疫グロブリン組成物のアミド分解性含量を減らすための開示された方法をさらに評価するために、出発材料として画分ＩＩの沈殿物を用いる別の大規模実験を行った。手短には、この実験の出発材料が、ヨーロッパで採取され、プールされたヒト起源の血漿から形成された画分ＩＩの沈殿物でありかつこれがクリオ沈殿され、吸着を介してＦＥＩＢＡ及び抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）を回収するのに使用されたことを除いては実施例１１で記載されたのと同様に、画分ＩＩの沈殿物を調製した。ＣＭセファロースカチオン交換クロマトグラフィ及び下流の処理も実施例１１で記載されたように行った。
【０２７７】
カチオン交換洗浄と溶出ステップのクロマトグラムを図４に示す。番号１の線はＵＶ吸光度を、番号２の線は導電率を、番号３の線はカラム出口のｐＨを示す。２８０ｎｍでの光学密度はＣＭセファロースｆｆカラムからのタンパク質の溶出の際の２つの画分の部分的な分離を示す。カラム出口のｐＨは溶出の間、ＵＶ吸光度の再上昇の開始の直後に上昇し始める。この時点で、２つの溶出液画分は分離された（Ｆ４及びＦ５、本明細書ではＥ１及びＥ２と呼ばれる）。下流の精製実行についての質量収支を表１９に示す。
【０２７８】
（表１９）画分ＩＩの沈殿物からのＩｇＧの大規模精製についての質量収支
2014525417.tif 000021
【０２７９】
実施例１１と同様に、総タンパク質のほぼ１５％が溶出ピークの第２の部分で見られる。これが、２．７カラム容積後のＥ１回収の停止による収量損失である。２つのＣＭ溶出画分（Ｅ１及びＥ２）から調製された最終容器を、分子サイズの分布、抗補体活性、アミド分解活性について、基質ＳＮ１３ａによりならびにＴＧＡ、ＦＸＩａ、及びＮＡＰＴＴアッセイにより分析した。結果を表２０及び表２１に示す。
【０２８０】
（表２０）２つの最終容器の分子サイズの分布の比較
2014525417.tif 000022
【０２８１】
（表２１）２つの最終容器の追加の特徴の比較
2014525417.tif 000023
【０２８２】
溶出の第１の部分がＦＸＩａならびに高いＴＧＡ及び短縮されたＮＡＰＴＴの値の原因となる他の望ましくないタンパク質を本質的に含まない一方で、ＰＫＫＡ、ＦＸＩａ及びＦＸＩａ様の活性は第２の部分で濃縮されており、ここでは、ＩｇＧの断片、重合体及びオリゴ／二量体の含量もまたより高いことが、溶出されたＩｇＧ画分の第１及び第２の部分に由来する安定化されたバルクの生化学的な特徴によって実証された。ＡＣＡ値は溶出液の第１の部分及び第２の部分のバルクにて有意に異なることはない。結果は全体として実施例１１の知見を裏付けている。
【０２８３】
実施例１３
免疫グロブリン組成物のアミド分解性含量を減らすための開示された方法をさらに評価するために、出発材料として画分ＩＩの沈殿物を用いて別の大規模実験を行った。手短には、この実験の出発材料が、米国で採取され、プールされたヒト起源の血漿から形成された画分ＩＩの沈殿物でありかつこれがクリオ沈殿され、吸着を介してＦＥＩＢＡ及び抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）を回収するのに使用されたことを除いては実施例１１で記載されたのと同様に、画分ＩＩの沈殿物を調製した。ＣＭセファロースカチオン交換クロマトグラフィ及び下流の処理も実施例１１で記載されたように行った。
【０２８４】
カチオン交換洗浄と溶出ステップのクロマトグラムを図５に示す。番号１の線はＵＶ吸光度を、番号２の線は導電率を、番号３の線はカラム出口のｐＨを示す。２８０ｎｍでの光学密度はＣＭセファロースｆｆカラムからのタンパク質の溶出の際の２つの画分の部分的な分離を示す。カラム出口のｐＨは溶出の間、ＵＶ吸光度の再上昇の開始の直後に上昇し始める。この時点で、２つの溶出液画分は分離された（Ｆ４及びＦ５、本明細書ではＥ１及びＥ２と呼ばれる）。下流の精製実行についての質量収支を表２２に示す。
【０２８５】
（表２２）画分ＩＩの沈殿物からのＩｇＧの大規模精製についての質量収支
2014525417.tif 000024
【０２８６】
実施例１１と同様に、総タンパク質のほぼ１５％が溶出ピークの第２の部分で見られる。これが、２．７カラム容積後のＥ１回収の停止による収量損失である。２つのＣＭ溶出画分（Ｅ１及びＥ２）から調製された最終容器を、分子サイズの分布、抗補体活性、ＰＫＫＡ、ＦＸＩａ様の活性について、基質ＳＮ１３ａにより及びＴＧＡ、ＦＸＩａ、及びＮＡＰＴＴアッセイにより再び分析した。結果を表２３及び表２４に示す。
【０２８７】
（表２３）２つの最終容器の分子サイズの分布の比較
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【０２８８】
（表２４）２つの最終容器の追加の特徴の比較
2014525417.tif 000026
【０２８９】
最終バルクの生化学的な特徴決定により、実施例１１及び１２の結果が確認された。溶出の第１の部分（Ｅ１）はＦＸＩａならびに高いＴＧＡ及び短縮されたＮＡＰＴＴの値の原因となる他の望ましくないタンパク質を本質的に含まない一方で、ＦＸＩａ及びアミド分解活性は第２の部分（Ｅ２）で濃縮されており、ここでは、たとえ懸濁液Ａの分離が濾過によって行われるとしても、断片、重合体及びオリゴ／二量体の含量もまたより高い。興味深いことに、溶出液の第１の部分の安定化されたバルクにおけるＡＣＡ値もまた、溶出液の第２の部分のバルクよりも低い。
【０２９０】
総合すると、上記実施例で提供された結果は、ＣＭセファロースｆｆカラムからの溶出液を２つの画分に分割することは凝血促進活性を実質的に含まない免疫グロブリン組成物の製造を可能にすることを実証している。このことは、様々な血漿の供給源（ＥＵ及びＵＳ）及び上流の処理スキームについて当てはまる。
【０２９１】
実施例１１〜１３で記載された免疫グロブリン製剤について測定された製品損失は実施例１〜１０で見られたものよりも高い。実施例１１〜１３では、２．７カラム容積の後の溶出液ピークの分割が総タンパク質の約１５％の損失を生じる。実施例１１〜１５では溶出液のｐＨシフトが遅く生じたので、遅い溶液の切り取りが、凝血促進活性の分離を有意に損なうことなく全体的な収率を改善するであろう。
【０２９２】
上記で示したデータは、カチオン交換クロマトグラフィの溶出液の分割が、実質的に低下した凝血促進活性を有する免疫グロブリン組成物の製造のための堅牢な方法であることを実証している。
【０２９３】
本明細書で記載された実施例及び実施形態は例証目的だけのためのものであり、それを考慮した種々の改変及び変更が当業者に提案され、本出願の精神と範囲及び添付の特許請求の範囲の中に含められるべきであることが理解される。本明細書で引用された出版物、特許及び特許出願はすべて、あらゆる目的でその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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