(57)【要約】  ａ）微生物をその増殖の助けとなる培養培地中で培養するステップであって、この微生物が、対象酵素を生成するステップと、ｂ）培養中に培養培地にマンガン化合物を１回または複数回添加するステップと、を含む、フェドバッチ培養を用いた対象酵素の生成方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）微生物をその増殖の助けとなる培養培地中で培養するステップであって、前記微生物が、対象酵素を生成するステップと、
ｂ）前記培養中に前記培養培地にマンガン化合物を１回または複数回添加するステップと、
を含む、フェドバッチ培養を用いた対象酵素の生成方法。
【請求項２】
前記対象酵素がアミラーゼまたはプロテアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物が菌類または細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌がバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の株である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の株が、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株またはバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記マンガン化合物が、硫酸マンガン、炭酸マンガン、酢酸マンガン、および塩化マンガンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記マンガン化合物が、炭水化物と一緒に供給培地として添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記マンガン化合物が、前記培養中に連続的に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物が、前記対象酵素に加えて細胞外ＤＮアーゼを生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象酵素の収率が、培養中に前記マンガン化合物が添加されない培養と比較して増大される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
培養中に前記マンガン化合物が添加されない培養と比較して粘度が低減される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
培養終了時のＤＮＡの量が、培養中に前記マンガン化合物が添加されない培養と比較して低減される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象酵素が生成される発酵時のブロス粘度の低減方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌および菌類の微生物は、多種多様な治療剤（たとえば、ペニシリンおよびセファロスポリン）、医薬タンパク質（たとえば、インスリン）、酵素（たとえば、プロテアーゼおよびアミラーゼ）、および汎用化学品（たとえば、クエン酸）の商業生産に使用されるので、工業微生物学の中心的存在である。
【０００３】
高粘度での培養ブロスの培養は、同一条件（たとえば、同一の圧力、温度、通気、および撹拌）におけるより低粘度での培養と比較して、酸素移動が低減される。酸素が消費されるプロセスでは、培養培地中の同一酸素分圧を維持するために、多くの場合非常にコストのかかる通気および／または撹拌の増加により、粘度上昇を補償しなければならない。さもなければ、酸素消費量を低減しなければならず、その結果、多くの場合、それほど効果的でないプロセスがもたらされるので、所望の生成物の収率が低下する。
【０００４】
フェドバッチ培養において、粘度を低減する多くの試みがなされてきた。たとえば、国際公開第０３／０２９４３９号パンフレットには、パルス供給時間が休止時間よりも短い周期的パルス供給／休止法を用いて発酵時に炭水化物を添加することにより、ブロス粘度を低減する方法が開示されている。
【０００５】
培養培地中での微量元素としてのマンガン化合物の使用は、公知である。たとえば、Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５，２００２，ｐｐ．１１０−１１７を参照されたい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、培養中にマンガン化合物を添加することにより、培養培地のブロス粘度を有意に低減しうることを見いだした。したがって、本発明者らは、
ａ）微生物をその増殖の助けとなる培養培地中で培養するステップであって、この微生物が、対象酵素を生成するステップと、
ｂ）培養中に培養培地にマンガン化合物を１回または複数回添加するステップと、
を含む、フェドバッチ培養を用いた対象酵素の生成方法を特許請求する。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、培養中に培養培地にマンガン化合物が添加されるフェドバッチ培養を用いた対象酵素の生成方法を開示する。
【０００８】
マンガン化合物が添加されない培養と比較して、培養培地の粘度を低減しうることを見いだした。
【０００９】
また、培養中にマンガン化合物が添加されない培養と比較して、対象化合物の収率を増大させうることを見いだした。
【００１０】
対象酵素
本発明に関連する酵素は、発酵により取得可能な任意の酵素または異なる酵素の組合せでありうる。したがって、「酵素」が参照された場合、一般的には、単一の酵素および１種超の酵素の組合せの両方がこれに包含されることは、理解されるであろう。
【００１１】
酵素変異体（たとえば、組換え技術により生成される）が「酵素」という用語の意味に包含されることを理解されたい。
【００１２】
好ましい実施形態では、対象酵素は、ヒドロラーゼ（国際生化学分子生物学連合（ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の命名法委員会（ｔｈｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）推奨の酵素命名法によれば、クラスＥＣ３）である。
【００１３】
好ましい実施形態では、次のヒドロラーゼ、すなわち、α−アミラーゼ（３．２．１．１）、β−アミラーゼ（３．２．１．２）、グルカン１，４−α−グルコシダーゼ（３．２．１．３）、セルラーゼ（３．２．１．４）、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ（３．２．１．６）、エンド−１，４−β−キシラナーゼ（３．２．１．８）、デキストラナーゼ（３．２．１．１１）、キチナーゼ（３．２．１．１４）、ポリガラクツロナーゼ（３．２．１．１５）、リゾチーム（３．２．１．１７）、β−グルコシダーゼ（３．２．１．２１）、α−ガラクトシダーゼ（３．２．１．２２）、β−ガラクトシダーゼ（３．２．１．２３）、アミロ−１，６−グルコシダーゼ（３．２．１．３３）、キシラン１，４−β−キシロシダーゼ（３．２．１．３７）、グルカンエンド−１，３−β−Ｄ−グルコシダーゼ（３．２．１．３９）、α−デキストリンエンド−１，６−α−グルコシダーゼ（３．２．１．４１）、スクロースα−グルコシダーゼ（３．２．１．４８）、グルカンエンド−１，３−α−グルコシダーゼ（３．２．１．５９）、グルカン１，４−β−グルコシダーゼ（３．２．１．７４）、グルカンエンド−１，６−β−グルコシダーゼ（３．２．１．７５）、アラビナンエンド−１，５−α−Ｌ−アラビノシダーゼ（３．２．１．９９）、ラクターゼ（３．２．１．１０８）、キトサナーゼ（３．２．１．１３２）、グルカン１，４−α−マルトヒドロラーゼ（３．２．１．１３３）、キシロースイソメラーゼ（５．３．１．５）、およびプロテアーゼ（３．４）が好ましい。
【００１４】
特定の好ましい実施形態では、以下のヒドロラーゼが好ましい。
【００１５】
アミラーゼ：
アミラーゼは、本発明に従って生成される所望の酵素でありうる。化学修飾またはタンパク質工学操作された突然変異体が包含される。本発明に係るアミラーゼの起源に対する限定要件は、存在しない。したがって、アミラーゼという用語は、天然のまたは野生型のアミラーゼだけでなく、アミラーゼ活性を呈するその任意の突然変異体、変種、断片など、さらには合成アミラーゼ、たとえば、シャッフルアミラーゼ、およびコンセンサスアミラーゼを包含する。そのような遺伝子工学操作されたアミラーゼは、当技術分野で一般に知られるように、たとえば、部位指向突然変異誘発により、ＰＣＲにより（ＰＣＲ反応において所望の突然変異を含有するＰＣＲ断片をプライマーの１つとして用いて）、またはランダム突然変異誘発により、調製可能である。アミラーゼには、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、およびマルトース生成アミラーゼが包含される。
【００１６】
α−アミラーゼは、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に由来するものであってもよく、たとえば、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．アミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．サルチリス（Ｂ．ｓｕｌｔｉｌｉｓ）、およびＢ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の株に由来するものであってもよい。他のα−アミラーゼとしては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種の株ＮＣＩＢ１２２８９、ＮＣＩＢ１２５１２、ＮＣＩＢ１２５１３、またはＤＳＭ９３７５に由来するα−アミラーゼ（これらはすべて、国際公開第９５／２６３９７号パンフレットに記載されている）、またはＴｓｕｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１５１（１９８８），ｐｐ．２５−３１に記載のα−アミラーゼが挙げられる。
【００１７】
他のα−アミラーゼとしては、糸状菌、好ましくは、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）やアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の株に由来するα−アミラーゼが挙げられる。
【００１８】
また、所望の酵素は、β−アミラーゼ、たとえば、Ｗ．Ｍ．Ｆｏｇａｒｔｙ  ａｎｄ  Ｃ．Ｔ．Ｋｅｌｌｙ，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５，ｐｐ．１１２−１１５，１９７９に開示される植物および微生物のβ−アミラーゼのいずれかであってもよい。
【００１９】
また、所望の酵素は、マルトース生成アミラーゼであってもよい。「マルトース生成アミラーゼ」（グルカン１，４−α−マルトヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１３３））は、アミロースおよびアミロペンチンをα配置のマルトースに加水分解することが可能である。対象のマルトース生成アミラーゼは、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の株ＮＣＩＢ１１８３７に由来するものである。マルトース生成α−アミラーゼは、米国特許第４，５９８，０４８号明細書、同第４，６０４，３５５号明細書、および同第６，１６２，６２８号明細書に記載されている。
【００２０】
市販のアミラーゼは、ＤＵＲＡＭＹＬ（商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（商標）、ＮＡＴＡＬＡＳＥ（商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ  ＬＣ（商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ  ＳＣ（商標）、ＬＩＱＵＩＺＹＭＥ−Ｘ（商標）、ＮＯＶＡＭＹＬ（商標）、およびＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（商標）およびＰＵＲＡＳＴＡＲ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．製）である。
【００２１】
セルラーゼ：
好適なセルラーゼとしては、細菌起源または菌類起源のものが含まれる。化学修飾またはタンパク質工学操作された突然変異体が包含される。好適なセルラーゼとしては、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）に由来するセルラーゼ、たとえば、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、およびトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）から生成される菌類のセルラーゼが挙げられる。
【００２２】
リパーゼ：
好適なリパーゼとしては、細菌起源または菌類起源のものが挙げられる。化学修飾またはタンパク質工学操作された突然変異体が包含される。有用なリパーゼの例としては、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（同義語サーモマイセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ））に由来するリパーゼ、たとえば、Ｈ．ラヌギノサ（Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ．ラヌギノサス（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ））またはＨ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）に由来するものが挙げられる。他の有用なリパーゼは、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のリパーゼ、たとえば、Ｐ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、Ｐ．シュードアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）、Ｐ．スツッツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、またはＰ．ウィスコンシネンシス（Ｐ．ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）に由来するリパーゼである。他の有用なリパーゼは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から、たとえば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、またはＢ．プミラス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）から、取得される。
【００２３】
プロテアーゼ：
好適なプロテアーゼとしては、動物起源、植物起源、または微生物起源のものが挙げられる。微生物起源が好ましい。化学修飾またはタンパク質工学操作された突然変異体が包含される。本発明に係るプロテアーゼの起源に対する限定要件は、存在しない。したがって、プロテアーゼという用語は、天然のまたは野生型のプロテアーゼだけでなく、プロテアーゼ活性を呈するその任意の突然変異体、変種、断片など、さらには合成プロテアーゼ、たとえば、シャッフルプロテアーゼ、およびコンセンサスプロテアーゼを包含する。そのような遺伝子工学操作されたプロテアーゼは、当技術分野で一般に知られるように、たとえば、部位指向突然変異誘発により、ＰＣＲにより（ＰＣＲ反応において所望の突然変異を含有するＰＣＲ断片をプライマーの１つとして用いて）、またはランダム突然変異誘発により、調製可能である。
【００２４】
好ましい実施形態では、プロテアーゼは、酸性プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、またはメタロプロテアーゼである。
【００２５】
好ましい実施形態では、プロテアーゼは、スブチリシンである。スブチリシンは、Ａｓｐ３２、Ｈｉｓ６４、およびＳｅｒ２２１（スブチリシンＢＰＮ’の番号付け）で構成される触媒トライアドを使用するセリンプロテアーゼである。それは、ＮＣ−ＩＵＢＭＢ酵素分類：ＥＣ３．４．２１．６２に属する任意の酵素を包含する。
【００２６】
好ましい実施形態では、スブチリシンは、スブチリシンカールスバーグ、スブチリシンＢＰＮ’、スブチリシン１４７、スブチリシン３０９、およびスブチリシンＩ１６８からなる群から選択される。
【００２７】
好ましい市販のスブチリシンとしては、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）、ＥＳＰＥＲＡＳＥ（商標）、ＰＲＩＭＡＳＥ（商標）、ＤＵＲＡＬＡＳＥ（商標）、ＲＥＬＡＳＥ（商標）ＥＶＥＲＬＡＳＥ（商標）、ＯＶＯＺＹＭＥ（商標）、ＣＯＲＯＮＡＳＥ（商標）、ＰＯＬＡＲＺＹＭＥ（商標）、およびＫＡＮＮＡＳＥ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、ＭＡＸＡＴＡＳＥ（商標）、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）、ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ  ＯＸＰ（商標）、ＦＮ２（商標）、ＦＮ３（商標）、およびＦＮ４（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）、ならびにＢＬＡＰ  Ｘ（商標）（Ｈｅｎｋｅｌ）が挙げられる。
【００２８】
アミログルコシダーゼ：
好適なアミログルコシダーゼとしては、菌類起源のもの、特定的には、糸状菌または酵母、たとえば、タラロマイセス・エメルソニー（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、およびアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）に由来するものが挙げられる。化学修飾またはタンパク質工学操作された突然変異体が包含される。
【００２９】
他の好ましいヒドロラーゼは、カルボヒドロラーゼ、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、およびリガーゼである。
【００３０】
微生物
本発明に係る対象酵素を発現する微生物は、発酵槽中で培養可能な任意の微生物でありうる。
【００３１】
本発明に係る微生物は、細菌株、たとえば、グラム陽性株、たとえば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ジオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オーシャノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、もしくはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の株、またはグラム陰性株、たとえば、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、もしくはウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）の株でありうる。
【００３２】
一態様では、株は、バチルス・アルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ファーマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ロータス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、またはバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の株、特定的には、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）またはバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【００３３】
他の態様では、株は、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）、またはストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ｓｕｂｓｐ．  Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）の株である。
【００３４】
他の態様では、株は、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、またはストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）の株である。
【００３５】
微生物は、菌類株であってもよい。たとえば、株は、酵母株、たとえば、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、もしくはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の株、または糸状菌株、たとえば、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ボトリオスパエリア属（Ｂｏｔｒｙｏｓｐａｅｒｉａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、カエトミジウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｄｉｕｍ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クラビセプス属（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、コクリオボラス属（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）、コプリノプシス属（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ）、コプトテルメス属（Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ）、コリナスカス属（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、クリフォネクトリア属（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ディプロディア属（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）、エキシジア属（Ｅｘｉｄｉａ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、ハロマスチゴトイデス属（Ｈｏｌｏｍａｓｔｉｇｏｔｏｉｄｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、イルペックス属（Ｉｒｐｅｘ）、レンチヌラ属（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）、レプトスパエリア属（Ｌｅｐｔｏｓｐａｅｒｉａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、メラノカルパス属（Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ）、メリピラス属（Ｍｅｒｉｐｉｌｕｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、マイセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス属、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ピロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ポイトラシア属（Ｐｏｉｔｒａｓｉａ）、シュードプレクタニア属（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｃｔａｎｉａ）、シュードトリコニムファ属（Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、シタリジウム属（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、トリコファエア属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ）、バーティシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ボルバリエラ属（Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ）、もしくはキシラリア属（Ｘｙｌａｒｉａ）の株であってもよい。
【００３６】
他の態様では、株は、サッカロマイセス・カールスバーゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ディアスタティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、またはサッカロマイセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）の株である。
【００３７】
他の態様では、株は、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギウス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ラックノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クィーンズランディカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナタム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｚｏｎａｔｕｍ）、フザリウム・バクトリディオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウェレンセ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サンブキナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍ���ｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、イルペックス・ラクテウス（Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、チエラビア・アクロマチカ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｃｈｒｏｍａｔｉｃａ）、チエラビア・アルボマイセス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｌｂｏｍｙｃｅｓ）、チエラビア・アルボピロサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｌｂｏｐｉｌｏｓａ）、チエラビア・アウストラレインシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｕｓｔｒａｌｅｉｎｓｉｓ）、チエラビア・フィメティ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｆｉｍｅｔｉ）、チエラビア・ミクロスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）、チエラビア・オビスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｏｖｉｓｐｏｒａ）、チエラビア・ペルビアナ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｐｅｒｕｖｉａｎａ）、チエラビア・セトサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｅｔｏｓａ）、チエラビア・スペデドニウム（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｐｅｄｅｄｏｎｉｕｍ）、チエラビア・スブテルモフィラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｕｂｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマ・ハージアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）のまたはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）の株である。
【００３８】
これらの種の株は、いくつかの微生物株保存機関、たとえば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ：Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）、オランダ微生物株保存センター（ＣＢＳ：Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）、および農業県究極特許菌株保存機関（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），北方地域研究センター（ＮＲＲＬ：Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）で、一般に容易に利用できる。
【００３９】
発酵
本発明は、工業規模の任意のフェドバッチ発酵に、たとえば、少なくとも５０リットル、好ましくは少なくとも１００リットル、より好ましくは少なくとも５００リットル、さらにより好ましくは少なくとも１０００リットル、特定的には少なくとも５０００リットルの培養培地を有する任意の発酵に、有用でありうる。
【００４０】
微生物は、当技術分野で公知の任意の方法により発酵させうる。発酵培地は、ダイズ粕、ダイズタンパク質、ダイズタンパク質加水分解物、綿実粕、コーンスティープリカー、酵母エキス、カゼイン、カゼイン加水分解物、ジャガイモタンパク質、ジャガイモタンパク質加水分解物、糖蜜などの複合窒素源および／または炭素源を含む複合培地でありうる。発酵培地は、既知組成培地、たとえば、国際公開第９８／３７１７９号パンフレットに規定されたものでありうる。
【００４１】
発酵は、炭素律速条件を用いて行われうる。炭素律速条件とは、微生物の増殖が炭素源の添加により制御されることを意味する。
【００４２】
微生物が対象酵素に加えて細胞外ＤＮアーゼを生成する場合、本発明に係る方法は有用でありうる。ＤＮアーゼは、天然ＤＮアーゼであってもよいし、ＤＮアーゼのコピーが、対象微生物に挿入されていてもよい。
【００４３】
多くのＤＮアーゼは、機能するために二価カチオンを必要とすることが知られている。本発明によれば、培養終了時のＤＮＡ量は、微生物が対象酵素に加えて細胞外ＤＮアーゼを生成する場合、マンガン化合物が添加されない培養と比較して少量でありうる。
【００４４】
好ましい実施形態では、対象酵素の収率は、培養中にマンガン化合物が添加されない培養と比較して増大され、特定的には、対象酵素の収率は、培養の３日後、培養中にマンガン化合物が添加されない培養と比較して増大される。
【００４５】
好ましい実施形態では、粘度は、培養中にマンガン化合物が添加されない培養と比較して低減され、特定的には、粘度は、培養の５時間後、培養中にマンガン化合物が添加されない培養と比較して低減され、特定的には、粘度は、培養の１０時間後、培養中にマンガン化合物が添加されない培養と比較して低減され、特定的には、粘度は、培養の１５時間後、培養中にマンガン化合物が添加されない培養と比較して低減され、特定的には、粘度は、培養の２０時間後、培養中にマンガン化合物が添加されない培養と比較して低減され、特定的には、粘度は、培養の２５時間後、培養中にマンガン化合物が添加されない培養と比較して低減される。
【００４６】
マンガン化合物
マンガン化合物は、当技術分野で公知の任意のマンガン化合物でありうる。マンガン化合物は、特定的には、硫酸マンガン、炭酸マンガン、酢酸マンガン、および塩化マンガンからなる群から選択されうる。
【００４７】
マンガン化合物の添加
マンガン化合物は、培養中に個別に添加してもよいし、またはマンガン化合物は、発酵中に供給培地として炭水化物と一緒に添加してもよい。
【００４８】
特定の培養に対して培養中にマンガン化合物を添加する最良の方法をいかに最適化するかは、当業者であればわかるであろう。すなわち、マンガン化合物は、１回または複数回添加されうる。マンガン化合物は、培養中に１回添加されうるか、または培養中に２回添加されうるか、または培養中に３回添加されうるか、または培養中に４回添加されうるか、または培養中に５回添加されうるか、またはその他の回数で添加されうる。
【００４９】
また、マンガン化合物は、発酵中に連続的に添加してもよい。
【００５０】
好ましい実施形態では、マンガン化合物は、培養開始直後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始１時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始２時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始３時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始４時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始５時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始６時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始７時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始８時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始９時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始１０時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始１１時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始１２時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始１３時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始１４時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始１５時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始１６時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始１７時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始１８時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始１９時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始２０時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始２１時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始２２時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始２３時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始２４時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始２５時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始２６時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始２７時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始２８時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始２９時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始３０時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始３１時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始３２時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始３３時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始３４時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始３５時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始３６時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始３７時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始３８時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始３９時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始４０時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始４１時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始４２時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始４３時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始４４時間後に添加され始めうるか、またはマンガン化合物は、培養開始４５時間後に添加され始めうる。
【００５１】
マンガン化合物は、典型的には、１０〜１００ｍｇ／リットル開始培養培地／日の量で添加されうる（ＭｎＳＯ４、１Ｈ２Ｏとして計算される）。より詳細については、実施例１を参照されたい。
【００５２】
粘度
粘度は、剪断応力または引張り応力のいずれかにより変形されている流体の抵抗力の指標である。日常用語では、粘度は、「濃度」または「内部摩擦」である。したがって、水は、「希薄」であり、より低粘度を有し、一方、ハチミツは、「濃厚」であり、より高粘度を有する。簡単に言えば、流体の粘性が小さくなるほど、移動し易さ（流動性）は大きくなる。
【００５３】
粘度は、流動に対する流体の内部抵抗を記述し、流体摩擦の指標と考えられうる。
【００５４】
動的粘度のＳＩ物理単位は、パスカル・秒（Ｐａ・ｓ）（Ｎ・ｓ／ｍ2またはｋｇ／（ｍ・ｓ）と等価）である。１Ｐａ・ｓの粘度を有する流体を２枚のプレート間に配置して、１パスカルの剪断応力で一方のプレートを側方に押進すると、１秒間にプレート間の層の厚さに等しい距離を移動する。２０℃の水は、０．００１００２Ｐａ・ｓの粘度を有する。
【００５５】
対象化合物の回収
本発明のさらなる態様は、発酵ブロスの下流処理に関する。発酵プロセスの終了後、対象化合物用に開発された標準的技術を用いて、対象酵素を発酵ブロスから回収しうる。適用される下流の関連処理技術は、対象化合物の性質に依存する。
【００５６】
発酵ブロスからの対象酵素の回収プロセスは、典型的には、以下の工程、すなわち、
１）ブロスの前処理（たとえば、フロキュレーション）
２）ブロスからの細胞および他の固体材料の除去（一次分離）
３）濾過
４）濃縮
５）安定化および標準化
のいくつかまたはすべてを含む（ただし、これらに限定されるものではない）。
【００５７】
以上に列挙した単位操作のほかに、いくつかの他の回収手順および工程、たとえば、ｐＨ調整、温度変化、結晶化、活性炭による対象化合物を含む溶液の処理、クロマトグラフィーの使用、および種々の吸着剤の使用を適用しうる。
【００５８】
以下の実施例で本発明をさらに説明するが、これにより、特許請求される本発明の範囲をなんら限定しようとするものではない。
【実施例】
【００５９】
実施例１
Ｍｎ++の連続添加を含むバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のフェドバッチ発酵
以下で説明されるように、対象アミラーゼを生成するいくつかのフェドバッチ式バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）発酵を行った。
【００６０】
アミラーゼ配列は、配列番号１（シグナル配列を含む）に開示される。
【００６１】
当技術分野で公知の方法により、すべての培地を滅菌した。とくに記載がないかぎり、水道水を使用した。以下の処方で参照される成分濃度は、接種前のものである。
【００６２】
第１の接種培地：
ＳＳＢ４寒天：
ダイズペプトンＳＥ５０ＭＫ（ＤＭＶ）  １０ｇ／ｌ、
スクロース  １０ｇ／ｌ、
リン酸水素二ナトリウム、２Ｈ２Ｏ  ５ｇ／ｌ、
リン酸二水素カリウム  ２ｇ／ｌ、
クエン酸  ０．２ｇ／ｌ、
ビタミン（塩酸チアミン  １１．４ｍｇ／ｌ、リボフラビン  ０．９５ｍｇ／ｌ、ニコチン酸アミド  ７．８ｍｇ／ｌ、カルシウムＤ−パントテネート  ９．５ｍｇ／ｌ、ピリドキサール−ＨＣｌ  １．９ｍｇ／ｌ、Ｄ−ビオチン  ０．３８ｍｇ／ｌ、葉酸  ２．９ｍｇ／ｌ）、
微量金属（ＭｎＳＯ４、Ｈ２Ｏ  ９．８ｍｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ  ３９．３ｍｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４、５Ｈ２Ｏ  ３．９ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４、７Ｈ２Ｏ  ８．２ｍｇ／ｌ）、
寒天  ２５ｇ／ｌ。
脱イオン水の使用。
ＮａＯＨを用いてｐＨ７．３〜７．４にｐＨ調整。
【００６３】
移動緩衝液：
Ｍ−９緩衝液（脱イオン水が使用される）：
リン酸水素二ナトリウム、２Ｈ２Ｏ  ８．８ｇ／ｌ、
リン酸二水素カリウム  ３ｇ／ｌ、
塩化ナトリウム  ４ｇ／ｌ、
硫酸マグネシウム、７Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ／ｌ。
【００６４】
接種振盪フラスコ培地（濃度は接種前のものである）：
ＰＲＫ−５０：
１１０ｇ／ｌ  ダイズ粗挽き粉、
リン酸水素二ナトリウム、２Ｈ２Ｏ  ５ｇ／ｌ、
滅菌前にＮａＯＨ／Ｈ３ＰＯ４を用いて８．０にｐＨ調整。
【００６５】
補充培地（濃度は接種前のものである）：
トリプトン（Ｄｉｆｃｏ製のカゼイン加水分解物）  ３０ｇ／ｌ、
硫酸マグネシウム、７Ｈ２Ｏ  ４ｇ／ｌ、
リン酸水素二カリウム  ７ｇ／ｌ、
リン酸水素二ナトリウム、２Ｈ２Ｏ  ７ｇ／ｌ、
硫酸二アンモニウム  ４ｇ／ｌ、
硫酸カリウム５ｇ／ｌ；
クエン酸  ０．７８ｇ／ｌ、
ビタミン（塩酸チアミン  ３４．２ｍｇ／ｌ、リボフラビン  ２．８ｍｇ／ｌ、ニコチン酸アミド  ２３．３ｍｇ／ｌ、カルシウムＤ−パントテネート  ２８．４ｍｇ／ｌ、ピリドキサール−ＨＣｌ  ５．７ｍｇ／ｌ、Ｄ−ビオチン  １．１ｍｇ／ｌ、葉酸  ２．５ｍｇ／ｌ）、
微量金属（ＭｎＳＯ４、Ｈ２Ｏ  ３９．２ｍｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ  １５７ｍｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４、５Ｈ２Ｏ  １５．６ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４、７Ｈ２Ｏ  ３２．８ｍｇ／ｌ）、
消泡剤（ＳＢ２１２１）  １．２５ｍｌ／ｌ、
滅菌前にＮａＯＨ／Ｈ３ＰＯ４を用いて６．０にｐＨ調整。
【００６６】
供給培地：
スクロース  ７０８ｇ／ｌ、または
スクロース  ７０８ｇ／ｌ  ＋  ２００ｍｇ／ｌ  硫酸マンガン、１Ｈ２Ｏ
【００６７】
接種工程の手順
最初に、ＳＳＢ−４寒天斜面上にて株を３７℃で１日増殖させた。
次いで、寒天をＭ−９緩衝液で洗浄し、得られた細胞懸濁液の光学濃度（ＯＤ）を６５０ｎｍで測定した。
ＯＤ（６５０ｎｍ）×ｍｌ細胞懸濁液＝０．１の接種物を接種振盪フラスコ（ＰＲＫ−５０）に接種した。
３７℃、３００ｒｐｍで振盪フラスコを２０時間インキュベートした。
振盪フラスコから増殖培養物を主発酵槽に接種することにより、主発酵槽（醗酵タンク）中での発酵を開始した。接種量は、補充培地の１１％（７２０ｍｌの補充培地に対して８０ｍｌ）であった。
【００６８】
発酵槽装置：
温度制御系、アンモニア水およびリン酸によるｐＨ調整手段、ならびに全発酵を通じて酸素飽和度を測定するための溶存酸素電極を備えた標準的実験用発酵槽を使用した。
【００６９】
発酵パラメーター：
温度：３８℃
アンモニア水およびリン酸を用いてｐＨを６．８〜７．２に維持した
制御：６．８（アンモニア水）、７．２  リン酸
通気：１．５リットル／ｍｉｎ／ｋｇブロス重量
撹拌：１５００ｒｐｍ
【００７０】
供給戦略：
０ｈｒ：０．０５ｇ／ｍｉｎ／ｋｇ接種後初期ブロス
８ｈｒ：０．１５６ｇ／ｍｉｎ／ｋｇ接種後初期ブロス
最後：０．１５６ｇ／ｍｉｎ／ｋｇ接種後初期ブロス
【００７１】
実験構成：
２０ｇ／ｌの硫酸マンガンＨ２Ｏを含有する１０ｍｌ／ｌのストック溶液を、７０８ｇ／ｌのスクロースを含有する標準的供給物中に無菌濾過することにより、硫酸マンガンを含有する供給物を調製した。この添加による１％の供給物の希釈は、補償しなかった。一定の攪拌を行いながら、培養を３日間行った。１日培養後、ブロス粘度をオフラインで測定した。
【００７２】
Ｍｎの添加：
最初のサンプルを採取する前の最初の２０ｈｒの間に添加されたＭｎの量は、６ｍｇ  Ｍｎであった。平均の添加は、１１．５ｍｇ／リットル開始体積／日であった。すべてのこれらの数値をｍｇ  Ｍｎとして計算する。ＭｎＳＯ４、１Ｈ２０の量は、３５．５ｍｇ／リットル開始体積／日であった。
【００７３】
結果：
表１は、Ｍｎ無添加の参照培養で見いだされた活性（３日目）と比較した相対活性［％］として与えられた収率を示している。
【００７４】
【表１】
2014521356.tif 000002
【００７５】
表２は、供給培地にＭｎが添加された発酵に対して２０時間培養後のオフラインサンプルの測定粘度を示している。
【００７６】
【表２】
2014521356.tif 000003
【００７７】
表３は、供給培地にＭｎが添加されない発酵に対して２０時間培養後のオフラインサンプルの測定粘度を示している。
【００７８】
【表３】
2014521356.tif 000004
【００７９】
結論：
培養中の培養物へのＭｎの添加は、測定粘度を調べることからわかるように、ブロス粘度に非常に有意な影響を及ぼす（表２および表３参照）。Ｍｎ添加による培養物のブロス粘度の低減は、より高い生産性をもたらすので、非常に望ましい（表１参照）。
【配列表】
2014521356000001.app
【国際調査報告】
2014521356.tif 000005
2014521356.tif 000006
2014521356.tif 000007
2014521356.tif 000008
2014521356.tif 000009