(57)【要約】ライゲーションによる配列決定および／またはハイブリダイゼーションによる配列決定を使用する核酸配列決定法が提供される。【選択図】
2014531908.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの配列を決定するための方法であって、
（ａ）配列決定用プライマーを、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズさせること、
（ｂ）オリゴヌクレオチドプローブを前記一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズさせ、前記オリゴヌクレオチドプローブを前記配列決定用プライマーにライゲーションして、伸長ハイブリダイズ配列を形成すること、ここで、前記オリゴヌクレオチドプローブがそれに切断可能に結合されているテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を含み、前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、前記オリゴヌクレオチドプローブの末端ハイブリダイズヌクレオチドに直接結合されている切断可能なヌクレオチドを有する、
（ｄ）前記オリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドを同定し、前記一本鎖核酸中の相補的ヌクレオチドを同定すること、および随意に、
（ｅ）前記切断可能なヌクレオチドを切断することにより前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を除去すること、および、前記伸長ハイブリダイズ配列に伸長可能な末端を生成すること、とを含む方法。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、約１〜約１００のハイブリダイズ可能なヌクレオチドを有する核酸配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、前記ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドに対応する検出可能な標識を含み、前記ヌクレオチドを同定するステップが、前記標識を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドプローブの末端ハイブリダイズヌクレオチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、切断剤の認識部位を含み、前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を除去するステップが、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記末端ハイブリダイズヌクレオチドに直接結合されている前記切断可能な部分を、前記切断剤により切断することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記切断可能なヌクレオチドが、化学的に切断される連結であり、前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を除去するステップが、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記末端ハイブリダイズヌクレオチドに直接結合されている前記切断可能な部分を、化学反応剤により切断することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記切断可能なヌクレオチドが、光感受性連結であり、前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を除去するステップが、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記末端ハイブリダイズヌクレオチドに直接結合されている前記切断可能なヌクレオチドを、光を当てることにより切断することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、ステムおよびループ核酸構造である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、直鎖核酸構造である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記一本鎖核酸テンプレートに沿ってオリゴヌクレオチドプローブを逐次繰り返しハイブリダイズおよびライゲーションすることをさらに含み、各ライゲーション後に、前記ハイブリダイズおよびライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドが同定され、前記一本鎖核酸中の相補的ヌクレオチドが同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、前記オリゴヌクレオチドプローブの１つまたは複数のヌクレオチドに対応する１つまたは複数のプローブハイブリダイゼーション部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドプローブの前記１つまたは複数のヌクレオチドを同定することが、１つまたは複数の標識プローブを、前記オリゴヌクレオチドプローブの１つまたは複数のヌクレオチドに対応する１つまたは複数のプローブハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズさせ、前記１つまたは複数のヌクレオチドの存在を示す前記１つまたは複数の標識プローブを検出することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、前記オリゴヌクレオチドプローブの各ヌクレオチドに対応するプローブハイブリダイゼーション部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドプローブの各ヌクレオチドを同定するステップが、各プローブハイブリダイゼーション部位を、対応する標識プローブとハイブリダイズさせ、前記ヌクレオチドの存在を示す前記標識プローブを検出することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの配列を決定するための方法であって、
（ａ）配列決定用プライマーを、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズさせること、
（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドプローブ、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造、および第２のオリゴヌクレオチドプローブとを含む二重プローブ構造を、前記一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズさせ、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブを、前記配列決定用プライマーにライゲーションして、伸長ハイブリダイズ配列を形成すること、および
（ｃ）前記第１または第２のオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドを同定し、前記一本鎖核酸中の相補的ヌクレオチドを同定すること、とを含む方法。
【請求項１６】
前記第１または第２のオリゴヌクレオチドプローブが、約１〜約１００のハイブリダイズ可能なヌクレオチドを有する核酸配列である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、ステムおよびループ核酸構造である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記一本鎖核酸テンプレートに沿って二重プローブ構造を逐次繰り返しハイブリダイズおよびライゲーションさせることをさらに含み、各ライゲーション後に、前記ハイブリダイズおよびライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドが同定され、前記一本鎖核酸中の相補的ヌクレオチドが同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、前記第１または第２のオリゴヌクレオチドプローブの１つまたは複数のヌクレオチドに対応する１つまたは複数のプローブハイブリダイゼーション部位を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドプローブの前記１つまたは複数のヌクレオチドを同定することが、１つまたは複数の標識プローブを、前記第１または第２のオリゴヌクレオチドプローブの１つまたは複数のヌクレオチドに対応する１つまたは複数のプローブハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズさせ、前記１つまたは複数のヌクレオチドの存在を示す前記１つまたは複数の標識プローブを検出することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、前記第１または第２のオリゴヌクレオチドプローブの各ヌクレオチドに対応するプローブハイブリダイゼーション部位を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチドプローブの各ヌクレオチドを同定することが、各プローブハイブリダイゼーション部位を、対応する標識プローブとハイブリダイズさせ、前記ヌクレオチドの存在を示す前記標識プローブを検出することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
テンプレートハイブリダイズ核酸構造、およびオリゴヌクレオチドプローブの末端ハイブリダイズ可能ヌクレオチドに直接結合されている切断可能なヌクレオチドにより前記テンプレートハイブリダイズ核酸構造に結合されているテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を含む、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２４】
前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、標識を含む、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２５】
前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、前記オリゴヌクレオチドプローブの１つまたは複数のヌクレオチドに対応する１つまたは複数のプローブハイブリダイゼーション部位を含む、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２６】
前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、前記オリゴヌクレオチドプローブの各ヌクレオチドに対応するプローブハイブリダイゼーション部位を含む、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２７】
前記テンプレートハイブリダイズ核酸構造が、約１〜約１００ヌクレオチドを含む、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２８】
前記テンプレートハイブリダイズ核酸構造が、６ヌクレオチドを含む、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２９】
前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、ステムおよびループ核酸構造である、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３０】
前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、直鎖核酸構造である、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３１】
第１のオリゴヌクレオチドプローブ、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造、および第２のオリゴヌクレオチドプローブとを含む二重オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３２】
前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、前記第１または第２のオリゴヌクレオチドプローブの１つまたは複数のヌクレオチドに対応する１つまたは複数のプローブハイブリダイゼーション部位を含む、請求項３１に記載の二重オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３３】
前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、前記第１または第２のオリゴヌクレオチドプローブの各ヌクレオチドに対応するプローブハイブリダイゼーション部位を含む、請求項３１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３４】
前記第１または第２のオリゴヌクレオチドプローブが、約１〜約１００のヌクレオチドを含む、請求項３１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３５】
前記第１または第２のオリゴヌクレオチドプローブが、６ヌクレオチドを含む、請求項３１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３６】
前記テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、ステムおよびループ型核酸構造である、請求項３１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の利益に関する宣言
本発明は、ＮＩＨ助成金番号５Ｐ５０ＨＧ００５５５０−０２の支援の下になされたものである。連邦政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、核酸を配列決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
配列決定法は、公知である。例えば、以下の文献を参照されたい：Ｓｈｅｎｄｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｃｕｒａｔｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｐｏｌｏｎｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  ｅｖｏｌｖｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｏｍｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３０９，ｐ．１７２８−３２．２００５；Ｄｒｍａｎａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｕｎｃｈａｉｎｅｄ  ｂａｓｅ  ｒｅａｄｓ  ｏｎ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ＤＮＡ  ｎａｎｏａｒｒａｙｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３２７，ｐ．７８−８１．２００９；ＭｃＫｅｒｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｕｎｃｏｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｓｈｏｒｔ−ｒｅａｄ，ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ−ｂａｓｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．１９，ｐ．１５２７−４１．２００９；Ｒｏｄｒｉｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｎｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｈｏｒｔ  ｒｅａｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，ｖｏｌ．２８，ｅ１１８４０．２０１０；Ｒｏｔｈｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｄｅｖｉｃｅ  ｅｎａｂｌｉｎｇ  ｎｏｎ−ｏｐｔｉｃａｌ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４７５，ｐ．３４８−３５２．２０１１；Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｐｉｃｏｌｉｔｒｅ  ｒｅａｃｔｏｒｓ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４３７，ｐ．３７６−３８０．２００５；Ｒａｓｋｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ  ｃａｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｏｕｔｂｒｅａｋ  ｏｆ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ−ｕｒｅｍｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，Ｅｐｕｂ．２０１１；Ｈｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂｅｌｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  ａｍｉｎｏａｌｋｏｘｙｌ  ｇｒｏｕｐｓ，Ｎｕｃｌｅｏｓ．Ｎｕｃｌｅｏｔ．Ｎｕｃｌ．，ｖｏｌ．９２，ｐ．８７９−８９５．２０１０；Ｓｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｕｒ−ｃｏｌｏｒ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．１０２，Ｐ．５９２６−５９３１（２００５）；Ｏｌｅｊｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．；Ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｂｉｏｔｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ：ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｖｏｌ．９２，ｐ．７５９０−７５９４．１９９５；米国特許第５，７５０，３４号；米国特許出願公開第２００９／００６２１２９号��および米国特許出願公開第２００９／０１９１５５３号。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の実施形態は、ライゲーションによる配列決定および／またはハイブリダイゼーションによる配列決定を使用して、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法に関する。ある態様は、二本鎖伸長において核酸テンプレートにハイブリダイズおよび／またはライゲーションされるオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドの１つまたは複数または全ての検出を容易にするプローブを使用して、一本鎖核酸テンプレート等の核酸テンプレートに沿った二本鎖伸長のサイクルを繰り返すことを含む。１つの態様によると、オリゴヌクレオチドプローブにある複数のヌクレオチド、および核酸テンプレートにあるそれらの相補的ヌクレオチドを、単一のライゲーションサイクルの結果として識別することができる。本開示のあるオリゴヌクレオチドプローブは、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列を含む。すなわち、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列は、テンプレート核酸配列にハイブリダイズしない。テンプレート非ハイブリダイズ核酸は、オリゴヌクレオチドプローブの既知ヌクレオチドに対応する検出可能部分を含んでいてもよい。検出可能部分が、検出される。テンプレート非ハイブリダイズ核酸は、オリゴヌクレオチドプローブの既知ヌクレオチドに対応するプローブハイブリダイゼーション部位を含んでいてもよい。その後、検出可能部分を有するプローブが、プローブハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズされ、検出可能部分が検出される。ある態様によると、オリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドは、対応する検出可能部分を検出することにより識別され、したがって、テンプレート核酸の相補的ヌクレオチドが識別される。
【０００５】
更なるある態様によると、テンプレート非ハイブリダイズ核酸は、オリゴヌクレオチドプローブから取り除くことができ、その後、テンプレート非ハイブリダイズ核酸を有する更なるオリゴヌクレオチドプローブがライゲーションされてもよく、オリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドは、検出可能部分を検出することにより識別される。更なる態様によると、オリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションに好適なオリゴヌクレオチドプローブをいずれかの側に隣接させたテンプレート非ハイブリダイズ核酸を含んでいてもよい。
【０００６】
本開示によると、ライゲーションおよび検出のサイクルは、５’から３’方向または３’から５’方向のいずれかで、テンプレート核酸の長さ方向に沿って実施してもよい。その後、上記プロセスを、再び５’または３’方向のいずれかから開始して繰り返し、テンプレート核酸の更なるヌクレオチドを識別してもよい。上記プロセスは、必要に応じて、テンプレート核酸のヌクレオチドの幾つか、複数、または全てが識別されるまで繰り返してもよい。更なる態様によると、ライゲーションおよび検出のサイクルは、５’から３’方向および３’から５’方向の両方で並行して実施してもよい。１つの態様によると、ヌクレオチドは、５’末端でのライゲーションの結果として、または３’末端でのライゲーションの結果として、またはその両方の結果として識別されてもよい。本明細書に述べられている本開示のある実施形態では、異なる検出可能部分が、異なるオリゴヌクレオチドを区別することが可能であるため、２つ以上の異なるオリゴヌクレオチドを同時に識別することが可能な異なる検出可能部分が使用される。一例として、検出可能部分は、区別可能なほど十分に異なる波長を有していてもよい。この態様によると、区別可能な検出可能部分の数だけ、オリゴヌクレオチドを識別することができるだろう。
【０００７】
１つの態様によると、配列決定用プライマーは、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズされる。オリゴヌクレオチドプローブは、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズされ、配列決定用プライマーにライゲーションされて、伸長ハイブリダイズ配列を形成する。本開示の１つの態様によると、オリゴヌクレオチドプローブは、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を含む。テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造の１つの特徴は、単一のサイクルでは単一のライゲーションが生じるように、オリゴヌクレオチドプローブの複数ライゲーションを阻害または阻止することができるということである。テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造の別の特徴は、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が、オリゴヌクレオチドプローブに直接結合されているヌクレオチドを含み、当該ヌクレオチドは、テンプレート核酸にハイブリダイズしないため、オリゴヌクレオチドプローブの完全に一致したハイブリダイゼーションを促進するということである。したがって、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造の更なる特徴は、オリゴヌクレオチドプローブが、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズしないがオリゴヌクレオチドプローブは一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズするように、オリゴヌクレオチドプローブの末端ハイブリダイズヌクレオチドに直接に隣接および／または結合されていてもよいということである。オリゴヌクレオチドプローブとテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造とのそのような組み合わせは、テンプレート核酸にハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドの数が一定であり、幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブの末端ハイブリダイズヌクレオチドが、更なるライゲーションのために伸長可能である限り、バイアスを低減する。
【０００８】
テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、オリゴヌクレオチドプローブの１つまたは複数の既知ヌクレオチドに対応する１つまたは複数の検出可能部分を含む。１つのそのようなヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブの末端ハイブリダイズヌクレオチドである。この例示的な態様によると、オリゴヌクレオチドプローブのセットは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴの１つに対応する異なる検出可能部分を有する末端ハイブリダイズヌクレオチドとして、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴを含む。検出可能部分は、既知ヌクレオチドに対応するため、検出可能部分を検出することにより、上記セット内からの特定のオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションおよび／またはライゲーション、およびオリゴヌクレオチドプローブの末端ハイブリダイズヌクレオチドの同定が確認される。この手法は、オリゴヌクレオチドプローブ内の任意のヌクレオチドに使用することができ、末端ハイブリダイズヌクレオチドに限定されない。
【０００９】
幾つかの態様によると、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、オリゴヌクレオチドプローブの末端ハイブリダイズヌクレオチドに隣接および／または結合されている必要はないことが理解されるべきである。例示的な実施形態は、オリゴヌクレオチドプローブ内のヌクレオチドの１つに隣接および／または結合されているテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を含み、特定の検出可能部分は、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が結合されているハイブリダイズヌクレオチドの既知の特定のＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴに関連しているため、検出可能部分を検出することにより、上記セット内からの特定のオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションおよび／またはライゲーション、およびテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造が結合されているオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイズヌクレオチドの同定が確認されるようにされる。
【００１０】
更なる例示的な実施形態によると、検出可能部分を含むテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、それが同定することになるヌクレオチドに隣接および／または結合されている必要はない。例えば、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、末端ハイブリダイズヌクレオチドに隣接および／または結合されていてもよいが、検出可能部分は、ハイブリダイズされたおよび／またはライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブ内の既知位置にある既知のＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴを示す。この態様によると、オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドプローブに沿って特定の位置にある特定のヌクレオチドを示す特定の検出可能部分を用いて設計されている。例示的な態様として、Ｎ個のヌクレオチドの１つに隣接および／または結合され、オリゴヌクレオチドプローブ内の特定の位置にあるＮ個のヌクレオチドの１つを示すテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を含む、Ｎ個のヌクレオチドを有する１セットのオリゴヌクレオチドプローブが調製される。この態様によると、オリゴヌクレオチドプローブ内のいずれにあってもよい所望のヌクレオチドは、検出可能部分のハイブリダイゼーションおよび／またはライゲーション及び検出の所与のサイクルで同定される。更なる態様によると、オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドプローブのＮ個のヌクレオチドの各１つのために異なる検出可能部分を含んでいてもよい。この態様によると、オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションおよび／またはライゲーションは、オリゴヌクレオチドプローブの単一のハイブリダイゼーションおよび／またはライゲーションの結果として、オリゴヌクレオチドプローブのＮ個のヌクレオチドの各々の検出を可能にする。
【００１１】
テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、プローブハイブリダイゼーション部位を有する検出可能部分を含むプローブとハイブリダイズするための１つまたは複数のプローブハイブリダイゼーション部位を含んでいてもよく、各プローブハイブリダイゼーション部位は、オリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドに対応する。例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドプローブの既知の末端ハイブリダイズヌクレオチドに対応するプローブハイブリダイゼーション部位を有するテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を含んでいてもよい。検出可能部分を有するプローブを、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造にあるプローブハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズさせること、および検出可能部分を検出することにより、末端ハイブリダイズヌクレオチド、およびテンプレート核酸にある対応する相補的ヌクレオチドが同定される。
【００１２】
テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、複数のプローブハイブリダイゼーション部位を含んでいてもよく、各プローブハイブリダイゼーション部位は、オリゴヌクレオチドプローブの特定の位置にある特定のヌクレオチドに対応する。この態様によると、Ｎ個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの場合、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、Ｎ個のプローブハイブリダイゼーション部位を有していてもよく、各プローブハイブリダイゼーション部位は、オリゴヌクレオチドプローブに沿って特定の位置にある特定のヌクレオチドに対応する。更なる態様によると、Ｎ個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの場合、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、Ｎ個以下のプローブハイブリダイゼーション部位を有していてもよく、各プローブハイブリダイゼーション部位は、オリゴヌクレオチドプローブに沿って特定の位置にある特定のヌクレオチドに対応する。この態様によると、オリゴヌクレオチドプローブは、１、２、３、４、５、もしくは６個等の、または最大Ｎ個のプローブハイブリダイゼーション部位を有するテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を含んでいてもよく、オリゴヌクレオチドプローブを使用して、１個のヌクレオチド、Ｎ個のヌクレオチド、またはＮ個未満のヌクレオチドを検出することができる。本開示の実施形態は、単一のライゲーションステップまたはサイクルの結果として、オリゴヌクレオチドプローブの複数のヌクレオチドを検出および同定するための、本明細書に記載のプローブの使用を含む。
【００１３】
本開示の１つの態様によると、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、オリゴヌクレオチドプローブに切断可能に結合されている。テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、オリゴヌクレオチドプローブの末端ハイブリダイズヌクレオチドに直接結合されている切断可能なヌクレオチドを有する。この態様によると、そのような組み合わせは、所望の切断部位で切断して、既知の長さの正確なオリゴヌクレオチドプローブの生成を容易にし、それによりバイアスを低減させる。更なる態様によると、切断可能なヌクレオチドを切断することによりテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を除去し、伸長可能な末端を伸長ハイブリダイズ配列に生成する随意のステップが提供される。１つの態様によると、切断ステップは、ライゲーションに使用可能な伸長可能な末端を生成することができる。別の態様によると、オリゴヌクレオチドプローブの延長不能な末端を修飾して、ライゲーションに使用可能な伸長可能な末端にすることができる。この態様によると、その後、各ライゲーション後に、更なるオリゴヌクレオチドプローブを、一本鎖核酸テンプレートに沿って順に繰り返してハイブリダイズ及びライゲーションし、ハイブリダイズおよびライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドの１つまたは複数または全てが同定され、テンプレート核酸の相補的ヌクレオチドの１つまたは複数または全てが同定される。
【００１４】
テンプレート核酸テンプレートの各ヌクレオチドを配列決定するために、本明細書に記載のライゲーションおよび／またはハイブリダイゼーション法を、テンプレート核酸テンプレートの長さに沿って繰り返し、その後、以前に実施した配列決定と比較して、１つまたは複数のヌクレオチド分を変えて、テンプレート核酸の長さに沿って本方法を繰り返してもよい。このようにして、単一のヌクレオチドが、Ｎ個のヌクレオチド（一例として）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して同定され、ライゲーションおよび／またはハイブリダイゼーションが、ヌクレオチド１個分だけ変えてＮ−１回繰り返される。言い換えれば、各連続配列決定法の開始ヌクレオチドは、ヌクレオチド１個分だけが変わっており、それによりテンプレート核酸の連続ヌクレオチドの同定が可能になる。
【００１５】
本開示の方法の更なる態様によると、第１のオリゴヌクレオチドプローブ、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造、および第２のオリゴヌクレオチドプローブを含む二重プローブが提供される。１つの態様によると、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、第１のオリゴヌクレオチドプローブと第２のオリゴヌクレオチドプローブとの間にあり、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブは、その間にあるテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造と共に核酸テンプレートにハイブリダイズしてもよい。
【００１６】
配列決定用プライマーは、核酸テンプレートにハイブリダイズされる。二重プローブの第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブは各々、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズし、第１のオリゴヌクレオチドプローブは、配列決定用プライマーにライゲーションされて、伸長ハイブリダイズ配列を形成する。１つの態様によると、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、上述のように、第１のオリゴヌクレオチドプローブまたは第２のオリゴヌクレオチドプローブのいずれかのヌクレオチドに対応する検出可能部分を含む。更なる態様によると、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、上述のように、第１のオリゴヌクレオチドプローブまたは第２のオリゴヌクレオチドプローブのいずれかのヌクレオチドに対応する検出可能部分を含むプローブとハイブリダイズするためのプローブハイブリダイゼーション部位を含む。ある態様によると、第１のオリゴヌクレオチドプローブまたは第２のオリゴヌクレオチドプローブのいずれかのヌクレオチドは、上述のように、対応する検出可能部分を検出することにより同定され、したがって、一本鎖核酸の相補的ヌクレオチドが同定される。１つの態様によると、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、第１のオリゴヌクレオチドプローブまたは第２のオリゴヌクレオチドプローブまたはその両方の各ヌクレオチドのプローブハイブリダイゼーション部位を含んでいてもよい。この態様によると、第１のオリゴヌクレオチドプローブまたは第２のオリゴヌクレオチドプローブのいずれかまたはその両方の配列全体を、単一のライゲーションサイクルで決定することができる。更なる態様によると、第２のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーションに使用可能な伸長可能な末端を含む。或いは、第２のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーションに使用可能な伸長可能な末端を含むように修飾することができる。この態様によると、その後、更なる二重プローブを、一本鎖核酸テンプレートに沿って順に繰り返してハイブリダイズおよびライゲーションさせ、各ライゲーション後に、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブのいずれかのヌクレオチドが同定され、またはそれに加えて、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブのいずれかまたはその両方のヌクレオチドの各々が、各ライゲーションサイクルで同定される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明の先述のおよび他の特徴および利点は、例示的な実施形態の以下の詳細な説明を添付の図面と共に参照すると、更によく理解されるだろう。
【図１】本開示の１つの態様によるＤＮＡテンプレートに対するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列を示す模式図である。
【図１Ａ】本開示の別の態様によるＤＮＡテンプレートに対するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列を示す模式図である。
【図２】本開示の別の態様によるＤＮＡテンプレートに対するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列を示す模式図である。
【図２Ａ】本開示の別の態様によるＤＮＡテンプレートに対するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列を示す模式図である。
【図３】本開示の別の態様によるＤＮＡテンプレートに対するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列を示す模式図である。
【図４】本開示の別の態様によるＤＮＡテンプレートに対するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列を示す模式図である。
【図４Ａ】本開示の別の態様によるＤＮＡテンプレートに対するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列を示す模式図である。
【図５】本開示の別の態様によるＤＮＡテンプレートに対するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列を示す模式図である。
【図５Ａ】本開示の別の態様によるＤＮＡテンプレートに対するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列を示す模式図である。
【図６】オリゴヌクレオチドプローブのある位置にあるヌクレオチドおよびテンプレートＤＮＡにあるその相補的ヌクレオチドを同定するための、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列および検出可能部分を有するオリゴヌクレオチドプローブの使用を示す模式図である。
【図７】オリゴヌクレオチドプローブのある位置にあるヌクレオチドおよびテンプレートＤＮＡにあるその相補的ヌクレオチドを同定するための、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列および検出可能部分を有するバーコードプローブを有するオリゴヌクレオチドプローブの使用を示す模式図である。
【図８Ａ】実施例Ｉに記載の通り配列決定したＲｏｌｏｎｙの三色画像のグレイスケール写真である。ｓｓＤＮＡテンプレートの配列決定用プライマー部位下流の３番目の位置（左の画像）および９番目の位置（右の画像）の調査。凡例に示されている幾何学的形状は両画像で共通であり、Ｒｏｌｏｎｙを示す。２つの位置間の塩基の変化は、形状の変化により観察することができる。オリジナル画像の一部のみが、１６倍に拡大されて示されている。
【図８Ｂ】実施例Ｉに記載の通り配列決定したＲｏｌｏｎｙの三色画像のグレイスケール写真である。ｓｓＤＮＡテンプレートの配列決定用プライマー部位下流の９番目の位置（左の画像）および１５番目の位置（右の画像）の調査。凡例に示されている幾何学的形状は両画像で共通であり、Ｒｏｌｏｎｙを示す。２つの位置間の塩基の変化は、形状の変化により観察することができる。オリジナル画像の一部のみが、１６倍に拡大されて示されている。
【図９Ａ】実施例Ｉに記載の通り配列決定されたＲｏｌｏｎｙから３番目と９番目の位置間の塩基転移の割合を比較するヒストグラムである。例として、実施例Ｉで使用したテンプレートに基づくと、大半のＡ（配列決定用プライマーから３位）がＧ（９位）に変化することが予想されるだろう。
【図９Ｂ】実施例Ｉに記載の通り配列決定されたＲｏｌｏｎｙから９番目と１５番目の位置間の塩基転移の割合を比較するヒストグラムである。例として、実施例Ｉで使用したテンプレートに基づくと、大半のＧ（配列決定用プライマーから９位）がＡ（１５位）に変化することが予想されるだろう。
【図１０】オリゴヌクレオチドプローブのある位置にあるヌクレオチドおよびテンプレートＤＮＡにあるその相補的ヌクレオチドを同定するための、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列および検出可能部分を有するオリゴヌクレオチドプローブの使用を示す模式図である。
【図１１】オリゴヌクレオチドプローブのある位置にあるヌクレオチドおよびテンプレートＤＮＡにあるその相補的ヌクレオチドを同定するための、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列およびバーコードプローブを有するオリゴヌクレオチドプローブの使用を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の原理は、オリゴヌクレオチド配列の同一性を決定するために特に有利に応用することができる。本明細書で使用されている核酸化学、生化学、遺伝学、および分子生物学の用語および記号は、当技術分野の標準的専門書および教科書の記載に従うものとする：例えば、Ｋｏｍｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７５）；Ｓｔｒａｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）；Ｇａｉｔ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４）。
【００１９】
図１には、本明細書に記載の方法およびプローブのある実施形態の態様が示されている。図１によると、核酸テンプレートが提供されている。核酸テンプレートは、図１のＤＮＡテンプレートにより示されているような一本鎖ＤＮＡテンプレート等の一本鎖核酸テンプレートを含んでいてもよい。図１に示されているように、配列決定用プライマーＰ１が、配列決定用プライマーハイブリダイゼーション部位ＰＳ１にハイブリダイズされている。核酸テンプレートの配列決定用プライマーハイブリダイゼーション部位に隣接しているのは、第１のテンプレートヌクレオチドＮＴ１であり、その後ろにテンプレートヌクレオチドＮＴ２〜ＮＴ６がある。図１に示されているように、オリゴヌクレオチドプローブＬ１は、核酸テンプレートにハイブリダイズされており、それぞれＮＴ１〜ＮＴ６にハイブリダイズするヌクレオチドＮ１〜Ｎ６を含む。ヌクレオチドＮ１は、配列決定用プライマーの末端ヌクレオチドにライゲーションされる。Ｎ６は、Ｎ１および配列決定用プライマーＰ１から最も遠位にあるヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドプローブＬ１に接続されているのは、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨである。テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨは、切断可能なヌクレオチドＣ１を介して、オリゴヌクレオチドプローブＬ１のヌクレオチドＮ６に接続されている。切断可能なヌクレオチドＣ１は、オリゴヌクレオチドプローブＬ１から除去されるため、カット部位または切断部位と呼ばれる場合もある。テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨは、バーコードが、オリゴヌクレオチドプローブの特定の位置にある特定のヌクレオチドに対応するかまたはそれを識別する限り、バーコード部位とも呼ばれるプローブハイブリダイゼーション部位Ｂ１を含む。バーコードプローブＢＰ１は、バーコード部位またはプローブハイブリダイゼーション部位Ｂ１とハイブリダイズする。バーコードプローブＢＰ１は、検出可能部分または標識またはリポーターＲ１を含む。図１の実施形態によると、バーコード部位Ｂ１は、意図的に既知のヌクレオチドＮ１〜Ｎ６の１つに対応する。このようにして、バーコード部位Ｂ１がバーコードプローブＢＰ１にハイブリダイズし、検出可能部分または標識またはリポーターＲ１が検出されると、オリゴヌクレオチドプローブＬ１のヌクレオチドが同定される。バーコードプローブＢ１のハイブリダイゼーションおよび検出可能部分Ｒ１の検出は、バーコードが対応するヌクレオチド、したがって該ヌクレオチドがハイブリダイズされる相補的ヌクレオチドを同定する。
【００２０】
図１Ａは、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨが、バーコード部位とも呼ばれるプローブハイブリダイゼーション部位Ｂ１〜Ｂ６を含む、本開示の例示的な実施形態である。Ｂ１〜Ｂ６の各々は、オリゴヌクレオチドプローブＬ１の意図的に既知のヌクレオチドＮ１〜Ｎ６の１つに対応する。１つの態様によると、バーコード部位Ｂ１は既知ヌクレオチドＮ１に対応し、バーコード部位Ｂ２は既知ヌクレオチドＮ２に対応し、バーコード部位Ｂ３は既知ヌクレオチドＮ３に対応し、バーコード部位Ｂ４は既知ヌクレオチドＮ４に対応し、バーコード部位Ｂ５は既知ヌクレオチドＮ５に対応し、バーコードＢ６は既知ヌクレオチドＮ６に対応する。バーコード部位Ｂ１〜Ｂ６は、図１Ａに示されているように、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨに沿って順に配置されていてもよく、またはテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨに沿って無作為に配置されていてもよい。必要なのは、バーコード部位が、オリゴヌクレオチドプローブＬ１の特定の既知位置にある特定の既知ヌクレオチドに対応することであり、検出可能な標識が検出されると、バーコード部位とハイブリダイゼーションプローブおよび検出可能な標識とのハイブリダイゼーションにより、オリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドおよびその位置が同定され、したがってテンプレート核酸の相補的ヌクレオチドも同定される。
【００２１】
図２は、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨが、プローブハイブリダイゼーション部位ＰＨＳを含む、本開示の例示的な実施形態である。プローブハイブリダイゼーション部位ＰＨＳにハイブリダイズされるのは、バーコード部位Ｂ１を含むハイブリダイゼーションプローブである。図１と同様に、バーコードプローブＢＰ１は、バーコード部位Ｂ１とハイブリダイズする。バーコードプローブＢＰ１は、検出可能部分または標識またはリポーターＲ１を含む。図２の実施形態によると、バーコード部位Ｂ１は、ヌクレオチドＮ１〜Ｎ６の１つに対応する。バーコードプローブＢ１のハイブリダイゼーションおよび検出可能な部分Ｒ１の検出により、バーコードが対応するヌクレオチドが同定される。
【００２２】
図２Ａは、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨが、プローブハイブリダイゼーション部位ＰＨＳを含む、本開示の例示的な実施形態である。プローブハイブリダイゼーション部位ＰＨＳにハイブリダイズされるのは、複数のバーコード部位Ｂ１〜Ｂ６を含むハイブリダイゼーションプローブである。図１Ａと同様に、Ｂ１〜Ｂ６の各々は、オリゴヌクレオチドプローブＬ１のヌクレオチドＮ１〜Ｎ６の１つに対応する。１つの態様によると、バーコード部位Ｂ１はヌクレオチドＮ１に対応し、バーコード部位Ｂ２はヌクレオチドＮ２に対応し、バーコード部位Ｂ３はヌクレオチドＮ３に対応し、バーコード部位Ｂ４はヌクレオチドＮ４に対応し、バーコード部位Ｂ５はヌクレオチドＮ５に対応し、バーコードＢ６はヌクレオチドＮ６に対応する。バーコード部位Ｂ１〜Ｂ６は、図１Ｂに示されているように、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨに沿って順に配置されていてもよく、またはテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨに沿って無作為に配置されていてもよい。必要なのは、バーコード部位が、オリゴヌクレオチドプローブＬ１の特定の既知位置にある特定の既知ヌクレオチドに対応することであり、検出可能な標識が検出されると、バーコード部位とハイブリダイゼーションプローブおよび検出可能な標識とのハイブリダイゼーションにより、オリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドおよびその位置が同定され、したがってテンプレート核酸の相補的ヌクレオチドも同定される。
【００２３】
図３は、ハイブリダイズされた部分または二本鎖、および非ハイブリダイズ部分を有するテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨを含む、本開示の例示的な実施形態である。非ハイブリダイズ部分は、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨのハイブリダイズされた部分を形成するハイブリダイズされた二本鎖に結合されたひと続きの１つまたは複数の非対合ヌクレオチドであることを特徴とする。１つの態様によると、ハイブリダイズされた部分および非ハイブリダイズ部分を有するテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨは、一本鎖核酸により形成されていてもよく、一本鎖核酸の末端部分は、それらがハイブリダイズするように相補性である。一本鎖核酸の中間部分は、非対合ヌクレオチドを含む。この態様によると、ステムおよびループまたはヘアピンと呼ばれる構造が提供されており、図３にはＳＬとして示されている。ステム部分Ｓは、ハイブリダイズされた構造を含み、ループ部分Ｌは一本鎖核酸を含み、一本鎖核酸ループ部分Ｌの各末端は、鎖のヌクレオチドが対合するステムＳに接続されている。ステムおよびループＳＬは、ハイブリダイズされた部分および中間の非ハイブリダイズ部分を有していればよいだけであることが理解されるべきである。そのような構造は、当業者に知られているバルジ、ミスマッチ、エルボー、非対合セクション、ジャンクション、およびスタック等の種々の二次構造を示す場合がある。図３に示されているように、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨのステムは、切断可能なヌクレオチドＣ１により、オリゴヌクレオチドプローブＬ１のヌクレオチドＮ６に接続されている。切断可能なヌクレオチドＣ１は、オリゴヌクレオチドプローブＬ１から除去されるため、カット部位または切断部位と呼ばれる場合もある。ステムおよびループＳＬの構成であるテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨは、検出可能部分または標識またはリポーターＲ１を含む。検出可能部分または標識またはリポーターＲ１は、ステムまたはループＳＬ構造の任意の位置にあってよい。１つの例示的な位置は、図３に示されるように、ステム部分の末端ヌクレオチドにある。検出可能部分または標識またはリポーターＲ１は、オリゴヌクレオチドプローブＬ１のヌクレオチドＮ１〜Ｎ６の１つに対応する。１つの態様によると、検出可能部分または標識またはリポーターＲ１は、オリゴヌクレオチドプローブＬ１の末端ハイブリダイズヌクレオチドであるヌクレオチドＮ６に対応する。したがって、検出可能部分または標識またはリポーターＲ１の検出により、オリゴヌクレオチドプローブＬ１のＮ６等の対応するヌクレオチドが同定される。本開示の１つの態様によると、ステムおよびループＳＬ構造は、オリゴヌクレオチドプローブＬ１以外でのハイブリダイゼーションを防止する。このようにして、オリゴヌクレオチドプローブの長さは厳密である。
【００２４】
図４は、図３について述べたような、ステム等のハイブリダイズされた部分、およびループ等のハイブリダイズされていない部分を有するテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨを含む、本開示の例示的な実施形態である。図４に示されているように、一本鎖核酸ループ部分Ｌは、バーコード部位とも呼ばれるプローブハイブリダイゼーション部位Ｂ１を含む。バーコードプローブＢＰ１は、バーコード部位またはプローブハイブリダイゼーション部位Ｂ１とハイブリダイズする。バーコードプローブＢＰ１は、検出可能部分または標識またはリポーターＲ１を含む。図４の実施形態によると、バーコード部位Ｂ１は、ヌクレオチドＮ１〜Ｎ６の１つに対応する。バーコードプローブＢＰ１のハイブリダイゼーションおよび検出可能な部分Ｒ１の検出により、バーコードが対応するヌクレオチドが同定される。
【００２５】
図４Ａは、図４について述べたような、ステム等のハイブリダイズされた部分、およびループ等のハイブリダイズされていない部分を有するテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨを含む、本開示の例示的な実施形態である。図４Ａに示されているように、一本鎖核酸ループ部分Ｌは、バーコード部位とも呼ばれるプローブハイブリダイゼーション部位Ｂ１〜Ｂ６を含む。Ｂ１〜Ｂ６の各々は、オリゴヌクレオチドプローブＬ１のヌクレオチドＮ１〜Ｎ６の１つに対応する。１つの態様によると、バーコード部位Ｂ１はヌクレオチドＮ１に対応し、バーコード部位Ｂ２はヌクレオチドＮ２に対応し、バーコード部位Ｂ３はヌクレオチドＮ３に対応し、バーコード部位Ｂ４はヌクレオチドＮ４に対応し、バーコード部位Ｂ５はヌクレオチドＮ５に対応し、バーコードＢ６はヌクレオチドＮ６に対応する。バーコード部位Ｂ１〜Ｂ６は、図４Ａに示されているように、一本鎖核酸ループ部分Ｌに沿って順に配置されていてもよく、または一本鎖核酸ループ部分Ｌに沿って無作為に配置されていてもよい。必要なのは、バーコード部位が、オリゴヌクレオチドプローブＬ１の特定の既知位置にある特定の既知ヌクレオチドに対応することであり、検出可能な標識が検出されると、バーコード部位とハイブリダイゼーションプローブおよび検出可能な標識とのハイブリダイゼーションにより、オリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドおよびその位置が同定され、したがってテンプレート核酸の相補的ヌクレオチドも同定される。
【００２６】
図５は、図４について述べたような、ステム等のハイブリダイズされた部分、およびループ等のハイブリダイズされていない部分を有するテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨを含む、本開示の例示的な実施形態である。図５に示されているように、末端ハイブリダイズ遠位鎖ＴＨＤＳは、ステムおよびループ構造ＳＬが、オリゴヌクレオチドプローブＬ１と末端ハイブリダイズ遠位鎖ＴＨＤＳとの間に存在するように、ステムＳに結合されている。
【００２７】
図５Ａは、図４Ａについて述べたような、ステム等のハイブリダイズされた部分、およびループ等のハイブリダイズされていない部分を有するテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨを含む、本開示の例示的な実施形態である。図５Ａに示されているように、末端ハイブリダイズ遠位鎖ＴＨＤＳは、ステムおよびループ構造ＳＬが、オリゴヌクレオチドプローブＬ１と末端ハイブリダイズ遠位鎖ＴＨＤＳとの間に存在するように、ステムＳに結合されている。
【００２８】
図６は、核酸テンプレートの配列決定用プライマーハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズした配列決定用プライマーＰ１が示されている、本開示の例示的な実施形態である。オリゴヌクレオチドプローブには、核酸テンプレートにハイブリダイズし、配列決定用プライマーＰ１にライゲーションするための既知ヌクレオチドがＮ６位に導入されている。図６の例示的な実施形態では、各オリゴヌクレオチドプローブは、ステム位置の末端ヌクレオチドに結合されている検出可能部分を有するステムおよびループ構造の形態であるテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を含む。検出可能部分は、ステム位置の「Ｕ−Ｔ」塩基対に結合されていることを示している。「Ｕ−Ｔ」塩基対は、オリゴヌクレオチドプローブに結合されている。特定のヌクレオチドが示されているが、これらは模式的に例示されているものに過ぎず、当業者であれば、本開示に基づくステムおよびループ構造を形成する任意の特定の核酸配列を設計する方法を理解するだろう。各オリゴヌクレオチドプローブにおいて、Ｎ６位のヌクレオチドは既知であり、検出可能部分は、Ｎ６位の既知ヌクレオチドに対応する。図６に示されているように、異なる検出可能部分が、オリゴヌクレオチドプローブのＮ６位のＡ、Ｃ、Ｔ、およびＧの各々に対応する。図６では、ＣＹ５は、あるプローブではＡに対応し、ＴＲは、異なるプローブではＣに対応し、ＦＩＴＣは異なるプローブではＴに対応し、ＣＹ３は異なるプローブではＧに対応する。核酸テンプレートにハイブリダイズし、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブは、その後、検出可能部分で検出することができる。例えば、図６では、ＣＹ３の検出は、Ｎ６位にＧを有するオリゴヌクレオチドプローブが、テンプレート核酸にハイブリダイズおよびライゲーションしたことを示す。したがって、Ｎ６位のＧに相補性であるＣが、核酸テンプレートのＮＴ６位にあることが同定される。
【００２９】
図７は、核酸テンプレートの配列決定用プライマーハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズした配列決定用プライマーＰ１が示されている、本開示の例示的な実施形態である。オリゴヌクレオチドプローブには、核酸テンプレートにハイブリダイズし、配列決定用プライマーＰ１にライゲーションするための既知ヌクレオチドがＮ６位に導入されている。図７の例示的な実施形態では、各オリゴヌクレオチドプローブは、検出可能部分を含むバーコードプローブとハイブリダイズすることができるプローブハイブリダイゼーション部位またはバーコード部位を有する、一本鎖核酸ループ部分を有するステムおよびループ構造の形態のテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を含む。ステム位置は、オリゴヌクレオチドプローブに接続されている「Ｕ−Ｔ」塩基対を含む。特定のヌクレオチドが示されているが、これらは模式的に例示されているものに過ぎず、当業者であれば、本開示に基づいて、ステムおよびループ構造を形成し、１つまたは複数のプローブハイブリダイゼーション部位またはバーコード部位を含む、任意の特定の核酸配列を設計する方法を理解するだろう。各オリゴヌクレオチドプローブでは、Ｎ６位のヌクレオチドは既知であり、バーコードプローブの検出可能部分は、Ｎ６位の既知ヌクレオチドに対応する。図７に示されているように、異なる検出可能部分が、オリゴヌクレオチドプローブのＮ６位のＡ、Ｃ、Ｔ、およびＧの各々に対応する。図７では、バーコードプローブのＣＹ５は、１つのプローブでＡに対応し、バーコードプローブのＴＲは、別のプローブでＣに対応し、バーコードプローブのＦＩＴＣは、別のプローブでＴに対応し、バーコードプローブのＣＹ３は、別のプローブではＧに対応する。核酸テンプレートにハイブリダイズし、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブは、その後、プローブハイブリダイゼーション部位またはバーコード部位にハイブリダイズするバーコードプローブの検出可能部分で検出することができる。例えば、図７では、ＣＹ３の検出は、Ｎ６位にＧを有するオリゴヌクレオチドプローブが、テンプレート核酸にハイブリダイズおよびライゲーションしたことを示す。したがって、Ｎ６位のＧに相補性であるＣが、核酸テンプレートのＮＴ６位にあることが同定される。
【００３０】
図１０は、核酸テンプレートの配列決定用プライマーハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズした配列決定用プライマーＰ１が示されている、本開示の例示的な実施形態である。オリゴヌクレオチドプローブには、核酸テンプレートにハイブリダイズし、配列決定用プライマーＰ１にライゲーションするための既知ヌクレオチドがＮ６位に導入されている。図１０の例示的な実施形態では、各オリゴヌクレオチドプローブは、末端ヌクレオチドのステム位置に結合されている検出可能部分を有するステムおよびループ構造の形態のテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を含む。検出可能部分は、ステム位置の「Ｕ−Ａ」塩基対に結合されていることを示す。「Ｕ−Ａ」塩基対は、オリゴヌクレオチドプローブに結合されている。特定のヌクレオチドが示されているが、これらは模式的に例示されているものに過ぎず、当業者であれば、本開示に基づいてステムおよびループ構造を形成する任意の特定の核酸配列を設計する方法を理解するだろう。各オリゴヌクレオチドプローブでは、Ｎ６位のヌクレオチドは既知であり、検出可能部分は、Ｎ６位の既知ヌクレオチドに対応する。図１０に示されているように、異なる検出可能部分が、オリゴヌクレオチドプローブのＮ６位のＡ、Ｃ、Ｔ、およびＧの各々に対応する。図１０では、ＣＹ５は、１つのプローブでＡに対応し、ＴＲは、別のプローブでＣに対応し、ＦＩＴＣは、別のプローブでＴに対応し、ＣＹ３は、別のプローブでＧに対応する。核酸テンプレートにハイブリダイズし、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブは、その後、検出可能部分で検出することができる。例えば、図１０では、ＣＹ３の検出は、Ｎ６位にＧを有するオリゴヌクレオチドプローブが、テンプレート核酸にハイブリダイズおよびライゲーションしたことを示す。したがって、Ｎ６位のＧに相補性であるＣが、核酸テンプレートのＮＴ６位にあることが同定される。
【００３１】
図１１は、核酸テンプレートの配列決定用プライマーハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズした配列決定用プライマーＰ１が示されている、本開示の例示的な実施形態である。オリゴヌクレオチドプローブには、核酸テンプレートにハイブリダイズし、配列決定用プライマーＰ１にライゲーションするための既知ヌクレオチドがＮ６位に導入されている。図１１の例示的な実施形態では、各オリゴヌクレオチドプローブは、検出可能部分を含むバーコードプローブとハイブリダイズすることができるプローブハイブリダイゼーション部位またはバーコード部位を有する、一本鎖核酸ループ部分を有するステムおよびループ構造の形態のテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を含む。ステム位置は、オリゴヌクレオチドプローブに接続されている「Ｕ−Ａ」塩基対を含む。特定のヌクレオチドが示されているが、これらは模式的に例示されているものに過ぎず、当業者であれば、本開示に基づいてステムおよびループ構造を形成し、１つまたは複数のプローブハイブリダイゼーション部位またはバーコード部位を含む任意の特定の核酸配列を設計する方法を理解するだろう。各オリゴヌクレオチドプローブでは、Ｎ６位のヌクレオチドは既知であり、バーコードプローブの検出可能部分は、Ｎ６位の既知ヌクレオチドに対応する。図１１に示されているように、異なる検出可能部分が、オリゴヌクレオチドプローブのＮ６位のＡ、Ｃ、Ｔ、およびＧの各々に対応する。図１１では、バーコードプローブのＣＹ５は、１つのプローブでＡに対応し、バーコードプローブのＴＲは、別のプローブでＣに対応し、バーコードプローブのＦＩＴＣは、別のプローブでＴに対応し、バーコードプローブのＣＹ３は、別のプローブでＧに対応する。核酸テンプレートにハイブリダイズし、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブは、その後、プローブハイブリダイゼーション部位またはバーコード部位にハイブリダイズするバーコードプローブの検出可能部分で検出することができる。例えば、図１１では、ＣＹ３の検出は、Ｎ６位にＧを有するオリゴヌクレオチドプローブが、テンプレート核酸にハイブリダイズおよびライゲーションしたことを示す。したがって、Ｎ６位のＧに相補性であるＣが、核酸テンプレートのＮＴ６位にあることが同定される。
【００３２】
標的ポリヌクレオチド
オリゴヌクレオチドまたはテンプレートオリゴヌクレオチドとも呼ばれる、本明細書に記載の方法により配列決定される標的ポリヌクレオチドは、当業者に知られている様々な方法で調製することができる。１つの態様によると、標的ポリヌクレオチドは、一本鎖核酸である。標的ポリヌクレオチドの長さは、様々であってよい。ある態様によると、標的ポリヌクレオチドの長さは、約１ヌクレオチド〜約２５０，０００のヌクレオチドの長さであってもよい。例示的な標的ポリヌクレオチドは、長さが約１ヌクレオチド〜約１００，０００ヌクレオチド、長さが約１ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、長さが約１ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド、長さが約４ヌクレオチド〜約２，０００ヌクレオチド、長さが約６ヌクレオチド〜約２，０００ヌクレオチド、長さが約１０ヌクレオチド〜約１，０００ヌクレオチド、長さが約２０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドであってもよく、重複の有無は問わず、その間の任意の範囲または値であってもよい。
【００３３】
配列決定用のテンプレートは、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、および合成または天然オリゴヌクレオチド等の、ポリヌクレオチドの幾つかの線形または環状供給源から調製することができる。
【００３４】
例示的テンプレートは、５’−ＰＯ４−ＧＴＴ  ＣＣＴ  ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＡＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＡＣ  ＴＴＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＣＣＣ  ＧＧ−３’−ＯＨの形態の合成オリゴヌクレオチドであり、Ｎ部分は、同定するｓｓＤＮＡテンプレートを表わし、ＧＴＴ  ＣＣＴ  ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  Ａ及びＡＣ  ＴＴＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＣＣＣ  ＧＧは、配列決定用プライマーハイブリダイゼーション部位（ＰＳ１）として使用されることになるアダプターを表わす。本開示の態様によると、配列決定は、５’から３’方向または３’から５’方向のいずれか、または両方向から同時に達成することができる。ある態様によると、テンプレート核酸の複数コピーが、当業者に知られている方法を使用して調製される。１つの態様によると、ｓｓＤＮＡ  Ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅ  ＩＩ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社  ＃ＣＬ９０２５Ｋ）またはＣｉｒｃｌｉｇａｓｅ  Ｉ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社  ＃ＣＬ４１１５Ｋ）等の他のｓｓＤＮＡリガーゼを使用して、またはｄｓＤＮＡリガーゼ（例えば（Ｔ３、Ｔ４、Ｔ７、および他のｄｓＤＮＡリガーゼ）とブリッジオリゴ（５’−ＡＴＧＡＧＧＡＡＣＣＣＧＧＧＧＣＡＧ−３’−ＰＯ４）との組み合わせを使用するテンプレート特異的ライゲーションにより、ｓｓＤＮＡテンプレートを環状化することができる。化学ライゲーション法も記載されている（Ｄｏｌｉｎｎａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【００３５】
１つの態様によると、１０ｐｍｏｌのｓｓＤＮＡテンプレートを、Ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅ  ＩＩを使用し、製造業者の推奨に従って環状化する。環状化の後、２０ユニットのエキソヌクレアーゼＩ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ社  ＃Ｘ８０１Ｌ）および１００ユニットのエキソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ社  ＃Ｘ８０２Ｌ）を反応に添加して、全ての残留線形テンプレートを消化する。次に、高い処理能力、強い置換活性、および低いエラー率を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して、環状ｓｓＤＮＡテンプレートに対してローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）を実施する。ローリングサークル増幅法は、当業者に知られており、それらには、Ｄｒｍａｎａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｕｎｃｈａｉｎｅｄ  ｂａｓｅ  ｒｅａｄｓ  ｏｎ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ＤＮＡ  ｎａｎｏａｒｒａｙｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３２７，ｐ．７８−８１（２００９）が含まれる。１つの態様によると、１ｐｍｏｌの環状化テンプレートを、２０ユニットのｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ社  ＃Ｐ７０２Ｌ）と共に使用する。また、ｄＮＴＰ（典型的には、１ｍＭ）およびＲＣＡプライマー（典型的には、１ｐｍｏｌ）が必要である。例示的なＲＣＡプライマーは、５’−ＡＡＴＧＡＧＧＡＡＣＣＣＧＧＧＧＣＡ＊Ｇ＊Ｃの形態を有するはずであり、＊は、ホスホロチオエート結合を表わし、それにより、最後の３’ヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合を保持し、ＲＣＡがｐｈｉ２９  ３’−＞５’エキソヌクレアーゼ活性の影響を受けにくくなることが示されている。しかしながら、特に、使用したポリメラーゼが、３’−＞５’エキソヌクレアーゼ活性を有してしない場合、例示的なＲＣＡプライマーは、そのようなホスホロチオエート結合を含んでいなくともよい。或いは、例示的なＲＣＡプライマーは、５’−Ａ＊Ａ＊ＴＧＡＧＧＡＡＣＣＣＧＧＧＧＣＡＧＣ等、ＲＣＡプライマーの５’側にホスホロチオエート結合を有していてもよい。ｐｈｉ２９を添加する前に、アニーリング反応を実施して、ＲＣＡ効率を増加させることが多い（９５℃で１分間、その後２分間４℃に冷却する）。その後、反応物を、３０℃で１時間インキュベートする（１５分から６時間のインキュベーション時間としてもよい）。ｐｈｉ２９は、４℃〜４０℃で活性であるため（９０％活性低下）、他の温度を使用することができる。その後、反応物を４℃に冷却し、ＲＣＡ産物（Ｒｏｌｏｎｙと呼ぶ）が、冷却ＰＢＳに回収され、必要になるまで４℃で保管することができる。この方法で調製したローリングサークル増幅産物は、数か月の間安定しており、配列決定技術アッセイのテンプレートとして使用することができる。
【００３６】
また、テンプレートは、生物学的供給源に由来するｄｓＤＮＡを使用して調製することができる。まず、ゲノムＤＮＡを、この目的のために市販されている幾つかの抽出キットの１つを使用して、抽出することになるだろう。その後、機械的（Ｃｏｖａｒｉｓ社製の集束電気音響、ネブライザー、超音波処理、ボルテックス）または酵素的（例えば、Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ）断片化を使用して、ｄｓＤＮＡは任意の長さまたは特定の長さに断片化されるだろう。１００〜１０００ヌクレオチドの断片サイズを維持することが実際的であるが、任意のサイズを使用することができる。製造業者の指示書に従って、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ社  ＃Ｙ９１４−ＨＣ−Ｌ）の混合物を使用して、断片化されたｄｓＤＮＡの末端を１段階で修復およびリン酸化する。３’−＞５’エキソヌクレアーゼ活性を有しており、鎖置換活性が低いかまたは活性がない他のＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。ＤＮＡリガーゼ、典型的にはＴ３（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ社  ＃Ｌ６０１Ｌ）またはＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ社  ＃Ｌ６０３−ＨＣ−Ｌ）を使用して、ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドから構成されるアダプターをｄｓＤＮＡに付加する。反応は、製造業者指示書に従って、室温で２０分間実施する。アダプターは、Ａｄ１  ５’−ＧＴＴＣＣＴＣＡＴＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡ、Ａｄ２  ５’−ＴＣＴＴＣＡＧＡＧＡＡＴＧＡＧ、Ａｄ３  ５’−ＣＣＧＧＧＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴ、およびＡｄ４  ５’−ＡＣＴＴＣＡＧＣＴＧＣＣの形態であってもよく、ライゲーションする前に、Ａｄ１−Ａｄ２が共にアニーリングされ、Ａｄ３−Ａｄ４が共にアニーリングされる。ライゲーションの後、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ大型断片（ＮＥＢ  ＃Ｍ０２７５Ｌ）等と共にＤＮＡポリメラーゼを使用して、５’突出末端を付加する。次に、５’−ＰＯ４−ＧＴＴＣＣＴＣＡＴＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡおよび５’−ビオチン−ＣＣＧＧＧＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴの形態のＰＣＲプライマーを使用して制限ＰＣＲ（典型的には、６〜８回のサイクル）を実施し、複数コピーを生成する。その後、５’ビオチンを、ｄｓＤＮＡの一方の末端でストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社  ＃６５３０５）に結合させ、テンプレートがビーズに結合されている以外、上述のようにＣｉｒｃｌｉｇａｓｅ  ＩＩ反応を実施することにより、他方の末端が回収されることを可能にする。これは、反応物を６５℃で２時間インキュベートすることにより実施され、それにより５’−ＰＯ４を有するＤＮＡ鎖の脱アニーリングおよび環状化が可能になるだろう。エキソヌクレアーゼ消化の後、環状ｓｓＤＮＡテンプレートは、上記で考察したようなローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）用に準備が整う。また、アダプターは、Ａｄ５  ５’−ＧＡＡＧＴＣＴＴＣＴＴＡＣＴＣＣＴＴＧＧＧＣＣＣＣＧＴＣＡＧＡＣＴＴＣおよびＡｄ６  ５’−ＧＴＴＣＣＧＡＧＡＴＴＴＣＣＴＣＣＧＴＴＧＴＴＧＴＴＡＡＴＣＧＧＡＡＣの形態であってもよく、Ａｄ５およびＡｄ６は各々、ライゲーションされるこヘアピン構造をｄｓＤＮＡの各側に形成し、事実上、ＲＣＡ用に準備が整っている環状ｓｓＤＮＡ産物を作成する。プルダウンアッセイを使用して、各ヘアピンの１つを保持するが、各ヘアピンの２つは保持していないテンプレートを選択することができる。この場合、５’−ビオチン−ＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＧＡＧＧＡＡＡ−Ｃ３ｓｐの形態の１つのループに相補的なオリゴヌクレオチドは、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズに結合することになる。次に、上述のように、ＲＣＡプライマー（５’−ＡＣＧＧＧＧＣＣＣＡＡＧＧＡＧＴＡ＊Ａ＊Ｇ）を使用して、ＲＣＡを実施することができる。
【００３７】
他の増幅方法を使用することができる。一般的に、「増幅」は、プライマーを使用した酵素的合成のラウンドを繰り返すことにより、アレイの核酸分子またはビーズに結合された核酸分子のコピーを産生することを含む。「Ｉｎ  ｓｉｔｕ」増幅は、増幅が、溶液中ではなく支持体またはビーズに配置されているテンプレート核酸分子で起こることを示していた。Ｉｎ  ｓｉｔｕ増幅法は、米国特許第６，４３２，３６０号に記載されている。
【００３８】
ポリメラーゼの選択は、温度、鎖置換、およびプルーフリーディング等の様々な特性に応じて様々なものがある。増幅は、上述のように等温性であってもよく、以下の文献に記載されている多重置換増幅（ＭＤＡ）等の類似の応用であってもよい：Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｖｏｌ．９９，ｐ．５２６１−５２６６．２００２；更にＤｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ａｎｄ  ｐｈａｇｅ  ＤＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｙ−ｐｒｉｍｅｄ  ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．１１，ｐ．１０９５−１０９９．２００１；更にＡｖｉｅｌ−Ｒｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｏｒ  ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ  ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｖｏｌ．７，ｐ．３１２．２００６。また、増幅は、以下の文献により広く使用されることになった従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等、異なる温度群によるサイクルで実施することができる：Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：  Ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌｅ  ５１，ｐ．２６３−２７３．１９８６。ゲノム増幅に、より応用可能なバリエーションは、以下の文献に記載されている；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｖｏｌ．８９，ｐ．５８４７−５８５１．１９９２；およびＴｅｌｅｎｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｐｒｉｍｅｄ  ＰＣＲ：ｇｅｎｅｒａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｖｏｌ．１３，ｐ．７１８−７２５．１９９２。他の方法には、以下のものが含まれる：Ｍｉｔｒａ  ａｎｄ  Ｃｈｕｒｃｈ，Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｎｙ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌｅ  ２７，ｐａｇｅｓ  ｅ３４．１９９９に記載されているポロニーＰＣＲ；Ｓｈｅｎｄｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｃｕｒａｔｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｐｏｌｏｎｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  ｅｖｏｌｖｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｏｍｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３０９，ｐ．１７２８−３２．２００５；およびＷｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｇｅｎｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｂｙ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ＰＣＲ，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．３，ｐ．５４５−５５０．２００６に記載のエマルジョンＰＣＲ（ｅＰＣＲ）。任意の増幅法を逆転写ステップと組み合わせて、ＲＮＡの増幅は演繹的に可能になる。ある態様によると、増幅は絶対に必要だとは限らない。というのは、十分な感受性を有するプローブ、リポーター、および検出系を使用すれば、上述のテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を使用する単一分子の検出が可能であるからである。ある系の感受性を調節する方法には、励起供給源（例えば、照明）および検出（例えば、光検出器、光電子増倍管）を選択することが含まれる。シグナルレベルを調節する方法には、リポーターのスタッキングを可能にするプローブが含まれ、高光度リポーター（例えば、量子ドット）を使用することもできる。
【００３９】
本開示に有用な増幅法は、核酸を、ハイブリダイゼーションおよび鎖延長を促進する条件下で核酸に特異的にハイブリダイズする１つまたは複数のプライマーと、接触させることを含んでいてもよい。核酸を増幅する例示的な方法には、以下のものが含まれる：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、以下の文献を参照：Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１  Ｐｔ  １：２６３およびＣｌｅａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １：２４１；および米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号）、アンカーＰＣＲ、ＲＡＣＥ  ＰＣＲ、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、以下の文献を参照：Ｌａｎｄｅｇｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：３６０−３６４）、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１８７４）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１１７３）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、再帰的ＰＣＲ（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ＰＣＲ）（Ｊａｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２６１９；およびＷｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：７７９０）、米国特許第６，３９１，５４４号、第６，３６５，３７５号、第６，２９４，３２３号、第６，２６１，７９７号、第６，１２４，０９０号、および第５，６１２，１９９号に記載の増幅法、または当業者に周知の技術を使用した任意の他の核酸増幅法。例示的な実施形態では、本明細書に開示されている方法は、ＰＣＲ増幅法を使用する。
【００４０】
ある例示的な実施形態では、核酸配列を増幅するための方法が提供される。核酸を増幅するための例示的な方法には、以下のものが含まれる：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１  Ｐｔ  １：２６３およびＣｌｅａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １：２４１；および米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号）、アンカーＰＣＲ、ＲＡＣＥ  ＰＣＲ、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、以下の文献を参照：Ｌａｎｄｅｇｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：３６０−３６４）、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１８７４）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１１７３）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、再帰的ＰＣＲ（Ｊａｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２６１９；およびＷｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：７７９０）、米国特許第６，３９１，５４４号、第６，３６５，３７５号、第６，２９４，３２３号、第６，２６１，７９７号、第６，１２４，０９０号、および第５，６１２，１９９号に記載の増幅法、等温増幅法（例えば、ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）、超分岐ローリングサークル増幅法（ＨＲＣＡ）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅法（ＨＤＡ）、ＰＷＧＡ）、または当業者に周知の技術を使用した任意の他の核酸増幅法。
【００４１】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、ＤＮＡの相補鎖の同時プライマー伸長により、特定のＤＮＡ配列をｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅するための反応を指す。言いかえれば、ＰＣＲは、プライマー結合部位により隣接された標的核酸の複数のコピーまたは複製を製作するための反応であり、そのような反応は、下記ステップの１つまたは複数を繰り返すことを含む：（ｉ）標的核酸を変性させるステップ、（ｉｉ）プライマーをプライマー結合部位にアニーリングさせるステップ、および（ｉｉｉ）ヌクレオシド三リン酸の存在下で核酸ポリメラーゼによりプライマーを伸長させるステップ。通常、上記反応は、サーマルサイクラー機器にて、各ステップに最適化された異なる温度で繰り返される。各ステップの特定の温度、継続期間、およびステップ間の変化率は、当業者に周知の多くの要因に依存する。例えば、以下の文献に例示されている：ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ａｎｄ  ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、それぞれ１９９１年および１９９５年）。例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用する従来のＰＣＲでは、二本鎖標的核酸は、９０℃を超える温度で変性され、プライマーは、５０〜７５℃の範囲の温度でアニーリングされ、プライマーは、６８〜７８℃の範囲の温度で伸長されてもよい。
【００４２】
用語「ＰＣＲ」は、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、およびアセンブリＰＣＲ等を含む、上記反応の派生形態を包含するが、これらに限定されない。反応容積は、数百ナノリットル、例えば２００ｎＬ〜数百マイクロリットルの範囲であり、例えば２００μＬである。「逆転写ＰＣＲ」または「ＲＴ−ＰＣＲ」は、標的ＲＮＡを相補的一本鎖ＤＮＡに変換する逆転写反応がまず実施され、その後それが増幅されるＰＣＲを意味する。例えば、Ｔｅｃｏｔｔらの米国特許第５，１６８，０３８号を参照されたい。「リアルタイムＰＣＲ」は、反応が進行すると共に、反応生成物、つまりアンプリコンの量がモニターされるＰＣＲを意味する。リアルタイムＰＣＲには、主に反応生成物のモニターに使用される検出化学が異なる多くの形態がある。例えば、Ｇｅｌｆａｎｄらの米国特許第５，２１０，０１５号（「Ｔａｑｍａｎ」）；Ｗｉｔｔｗｅｒらの米国特許第６，１７４，６７０号および第６，５６９，６２７号（挿入色素）；Ｔｙａｇｉら（米国特許第５，９２５，５１７号（分子ビーコン）。リアルタイムＰＣＲの検出化学は、Ｍａｃｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０：１２９２−１３０５（２００２）に概説されている。「ネステッドＰＣＲ」は、第１のＰＣＲのアンプリコンが、少なくとも１つが第１のアンプリコンの内部位置に結合する新しいセットのプライマーを使用する第２のＰＣＲの試料となる２段階ＰＣＲを意味する。本明細書で使用される場合、ネステッド増幅反応に関する「初期プライマー」は、第１のアンプリコンの生成に使用されるプライマーを意味し、「第２のプライマー」は、第２のまたはネステッドアンプリコンの生成に使用される１つまたは複数のプライマーを意味する。「多重ＰＣＲ」は、複数の標的配列（または単一の標的配列と１つまたは複数の基準配列）が、同じ反応混合物中で同時に実施されるＰＣＲを意味する。例えば、Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７３：２２１−２２８（２色リアルタイムＰＣＲ）。通常、増幅される配列毎に異なるセットのプライマーが使用される。「定量ＰＣＲ」は、試料または標本中の１つまたは複数の特定の標的配列の含有量を測定するためのＰＣＲを意味する。定量ＰＣＲの技術は、以下の文献に例示されているように当業者に周知である：Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２６：１１２−１２６（１９９９）；Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：９４３７−９４４７（１９８９）；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２１：２６８−２７９（１９９６）；Ｄｉｖｉａｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１２２：３０１３−３０２０（１９９２）；およびＢｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：９４３７−９４４６（１９８９）等。
【００４３】
一般的に、本明細書に記載の標的ポリヌクレオチド、テンプレートヌクレオチド、テンプレート非ハイブリダイズ核酸またはプローブは、用語「核酸分子」、「核酸配列」、「核酸断片」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」を含み、同義的に使用され、これらに限定されないが、種々の長さ、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体を有していてもよいヌクレオチドのポリマー形態を含むことが意図されている。異なるポリヌクレオチドは、異なる三次元構造を有する場合があり、既知または未知の種々の機能を果たすことができる。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、以下のものが含まれる：遺伝子、遺伝子断片、エキソン、イントロン、遺伝子間ＤＮＡ（限定ではないが、ヘテロクロマチンＤＮＡを含む）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、単離ＤＮＡ配列、単離ＲＮＡ配列、核酸プローブ、およびプライマー。本明細書に記載の方法に有用なオリゴヌクレオチドは、天然核酸配列およびその変異体、人工核酸配列、またはそのような配列の組み合わせを含んでいてもよい。
【００４４】
ポリヌクレオチドは、典型的には、４つのヌクレオチド塩基の特定の配列からなる：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；およびチミン（Ｔ）（ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合は、チミン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ））。したがって、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表記である。或いは、この用語は、ポリヌクレオチド分子自体に適用されてもよい。このアルファベット表記は、機能性ゲノム科学および相同性探索等のバイオインフォマティクス応用に使用される、中央処理装置を有するコンピューターのデータベースに入力することができる。任意に、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の非標準的ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、および／または修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００４５】
修飾ヌクレオチドの例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ジアミノプリン、Ｓ２Ｔ、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｄ４６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトシン（wybutoxosine）、シュードウラシル、キューオシン（queosine）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピルウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン等。また、核酸分子は、塩基部分（例えば、典型的には相補的ヌクレオチドと水素結合を形成するために使用可能な１つまたは複数の原子、および／または非典型的には相補的ヌクレオチドと水素結合を形成することが不能な１つまたは複数の原子にて）、糖部分、またはリン酸塩骨格が修飾されていてもよい。また、核酸分子は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）等のアミン反応性部分の共有結合による結合を可能にするために、アミノアリル−ｄＵＴＰ（ａａ−ｄＵＴＰ）およびアミノヘキシルアクリルアミド−ｄＣＴＰ（ａｈａ−ｄＣＴＰ）等のアミン修飾基を含んでいてもよい。
【００４６】
オリゴヌクレオチド配列は、天然供給源から単離されてもよく、または商業的供給者から購入してもよい。ある例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、ホスホラミダイトリンカーの１つまたは複数を使用して、および／または当業者に知られているライゲーション法による配列決定により調製することができる。また、オリゴヌクレオチド配列は、任意の好適な方法で調製することができる：例えば、本明細書の下記に記載のものならびにＢｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ（（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９）に記載のもの等の標準的ホスホラミダイト法、またはＭａｔｔｅｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５）によるトリエステル法により、または当技術分野で知られている市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置またはハイスループット高密度アレイ法のいずれかを使用する他の化学的方法により（米国特許第５，６０２，２４４号、第５，５７４，１４６号、第５，５５４，７４４号、第５，４２８，１４８号、第５，２６４，５６６号、第５，１４１，８１３号、第５，９５９，４６３号、第４，８６１，５７１号、および第４，６５９，７７４号を参照。これらの文献は、あらゆる目的のため、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。また、あらかじめ合成されているオリゴヌクレオチドを、様々な業者から商業的に取得してもよい。
【００４７】
ある例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、当技術分野で知られている様々なマイクロアレイ技術を使用して調製することができる。あらかじめ合成されたオリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチド配列を、支持体に結合させてもよく、または以下の文献に示されている、光に基づく方法、フローチャネルおよびスポッティング法、インクジェット法、ピンに基づく方法、およびビーズに基づく方法を使用してｉｎ  ｓｉｔｕで合成してもよい：ＭｃＧａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１３５５５；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＤＮＡ  Ａｒｒａｙｓ  Ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．２０：１１１，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９８）；Ｄｕｇｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．Ｓ２１：１０；Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ｍａｋｉｎｇ  Ｔｈｅｍ  ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔｈｅｍ  Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００３；米国特許出願公開第２００３／００６８６３３号および第２００２／００８１５８２号；米国特許第６，８３３，４５０号、第６，８３０，８９０号、第６，８２４，８６６号、第６，８００，４３９号、第６，３７５，９０３号、および第５，７００，６３７号；ならびに国際公開第０４／０３１３９９号、国際公開第０４／０３１３５１号、国際公開第０４／０２９５８６号、国際公開第０３／１０００１２号、国際公開第０３／０６６２１２号、国際公開第０３／０６５０３８号、国際公開第０３／０６４６９９号、国際公開第０３／０６４０２７号、国際公開第０３／０６４０２６号、国際公開第０３／０４６２２３号、国際公開第０３／０４０４１０号、および国際公開第０２／２４５９７号。
【００４８】
固相支持体
ある例示的な実施形態では、本明細書に記載の１つまたは複数のテンプレート核酸配列、つまりオリゴヌクレオチド配列は、支持体に固定されている（例えば、固体および／または半固体支持体）。ある態様では、オリゴヌクレオチド配列は、本明細書に記載のホスホラミダイトリンカーの１つまたは複数を使用して支持体に結合させることができる。好適な支持体には、これらに限定されないが、スライド、ビーズ、チップ、粒子、ストランド、ゲル、シート、チューブ、球体、容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、およびプレート等が含まれる。種々の実施形態では、固体支持体は、生物学的、非生物学的、有機的、無機的、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。実質的に平坦な支持体を使用する場合、支持体は、例えば、トレンチ、溝、ウエル、または化学的障壁（例えば、疎水性コーティング等）を有する領域に物理的に分離されていてもよい。
【００４９】
ある例示的な実施形態では、支持体はマイクロアレイである。本明細書で使用される場合、用語「マイクロアレイ」は、１つの実施形態では、固定されたハイブリダイゼーションプローブを各々含有する空間的に規定されている重複しない領域または部位のアレイが存在する実質的に平坦な表面を有する固相支持体を含む一種のアッセイを指す。「実質的に平坦な」は、プローブ部位等の、表面にある目的の特徴または物体が、表面の上または下に伸長し、その寸法が表面の寸法と比べて小さい容積を占めていてもよいことを意味する。例えば、光ファイバー束の面に配置されているビーズは、プローブ部位の実質的に平坦な表面を生成し、または多孔性の平坦な基材に配置または合成されているオリゴヌクレオチドは、実質的に平坦な表面を生成する。更に、空間的に規定されている部位は、その位置の固定されているプローブの位置および同一性が既知であるかまたは決定可能であるという点で、「アドレス可能」であってもよい。
【００５０】
マイクロアレイに固定されたオリゴヌクレオチドには、アッセイ反応にてまたはアッセイ反応から生成される核酸が含まれる。典型的には、マイクロアレイのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一本鎖であり、通常は５’末端または３’末端により固相支持体に共有結合で結合されている。ある例示的な実施形態では、プローブは、本明細書に記載の切断可能なリンカーの１つまたは複数を介して固定されている。マイクロアレイの核酸を含有する非重複領域の密度は、典型的には１ｃｍ２当たり１００個超、より典型的には１ｃｍ２当たり１０００個超である。核酸プローブに関するマイクロアレイ技術は、以下の例示的な文献に概説されている：Ｓｃｈｅｎａ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，２０００）；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：４０４−４１０（１９９８）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，２１：１−６０（１９９９）；ならびにＦｏｄｏｒらの米国特許第５，４２４，１８６号；第５，４４５，９３４号；および第５，７４４，３０５号。
【００５１】
オリゴヌクレオチドを支持体に固定するための方法は、当技術分野で公知である（ビーズ：Ｄｒｅｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：８８１７，Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：６３０，Ａｌｂｒｅｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８９：４０、およびＬａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８８）１６：１０８６１；ニトロセルロース：Ｒａｎｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｇｅｎｅ  ２１：７７；セルロース：Ｇｏｌｄｋｏｒｎ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９１７１；ポリスチレン：Ｒｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕ．Ｋ．；テフロン−アクリルアミド：Ｄｕｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６９：１０４；ポリプロピレン：Ｐｏｌｓｋｙ−Ｃｙｎｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．３１：１４３８；ナイロン：Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：３３４５；アガロース：Ｐｏｌｓｋｙ−Ｃｙｎｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９８５）３１：１４３８；およびセファクリル：Ｌａｎｇｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｇｅｎｅ  ３６：２０１；ラテックス：Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：２９１１）。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語「結合させる」は、共有結合相互作用および非共有相互作用を両方とも指す。共有結合相互作用は、１対の電子（つまり、単結合）、２対の電子（つまり、二重結合）または３対の電子（つまり、三重結合）を共有することにより形成される２つの原子またはラジカル間の化学的連結である。共有結合相互作用は、当技術分野では、電子対相互作用または電子対結合としても知られている。非共有相互作用には、これらに限定されないが、ファンデルワールス相互作用、水素結合、弱い化学結合（つまり、近距離非共有結合力による）、疎水的相互作用、およびイオン結合等が含まれる。非共有相互作用の概説は、Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，３ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９４に見出すことができる。
【００５３】
配列決定用プライマー
本開示による配列決定用プライマーは、標的ポリヌクレオチドの既知結合領域に結合可能であり、本開示のオリゴヌクレオチドプローブのライゲーションを促進可能なものである。配列決定用プライマーは、例えば、ＤＮＡＷｏｒｋｓまたはＧｅｎｅ２Ｏｌｉｇｏ等のコンピュータープログラムの助力を用いて設計することができる。結合領域は、長さが様々であってもよいが、配列決定用プライマーとハイブリダイズするのに十分な長さであるべきである。標的ポリヌクレオチドは、複数の異なる結合領域を有していてもよく、それにより標的ポリヌクレオチドの異なる区画の配列決定が可能になる。配列決定用プライマーは、ライゲーションの連続サイクル中にハイブリダイズを維持するように、非常に安定した二本鎖を形成するように選択されている。配列決定用プライマーは、ライゲーションが、５’から３’方向に、または３’から５’方向に、または両方向に進行することができるように選択することができる。配列決定用プライマーは、それらのハイブリダイゼーション効率を増強するために、またはそれらの安定性を向上させるために、または一方の末端もしくは他方の末端からの伸長を防止するために、修飾されたヌクレオチドまたは結合を含有していてもよい。
【００５４】
１つの態様によると、一本鎖ＤＮＡテンプレート（ｓｓＤＮＡ）は、上述のようなＲＣＡにより調製され、配列決定用プライマーと共に使用される。或いは、一本鎖テンプレートは、エマルジョン中のビーズまたはナノ粒子に結合されており、ｅＰＣＲにより増幅される。結果は、単一の増幅されたｓｓＤＮＡテンプレートを有するクローンビーズである。
【００５５】
幾つかのテンプレートヌクレオチド配列を並行して同定するためには、テンプレートを、ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４で希釈し、ビオチン−ストレプトアビジン、アジド−アルキン（例えば、クリック化学）、ＮＨＳ−エステル、またはシリル化（例えば、アルデヒド−、エポキシ−、アミノ−シラン）等の種々の結合方法を使用して、パターン化基材または非パターン化基材のいずれかに結合させる。１つの態様によると、ｒｏｌｏｎｙを、ＳｉＯ２固体表面等のパターン化表面に結合させ、１％アミノシラン（容積／容積）で処理し、ある期間（典型的には、５分〜２時間）相互作用させる。その後、あらゆる未結合テンプレートを、洗浄１緩衝液を使用して洗い流す。
【００５６】
次に、配列決定用プライマー（Ｐ１）を調製し、配列決定用プライマーハイブリダイズ部位ＰＳ１にハイブリダイズさせる。ある態様によると、テンプレートの既知配列にハイブリダイズすることができる配列決定用プライマーを調製することができる。或いは、テンプレート調製中に、既知核酸配列を有するアダプターを、当業者に知られている方法および本明細書に記載の方法に従って、ライゲーション、増幅、転位、または組換えにより未知核酸配列に付加する。更に、或いは、あるレベルの縮重を有する配列決定用プライマーを使用して、テンプレートに沿ってある複数の位置にハイブリダイズさせることができる。１つの態様によると、プライマー縮重を使用して、プライマーがテンプレートに沿って半無作為にハイブリダイズさせることができる。プライマー縮重は、プライマーがテンプレートの長さに沿ってある間隔でハイブリダイズすることを容易にするように、当業者に知られている統計的手法に基づいて選択される。この態様によると、１００塩基毎、２００塩基毎、２０００塩基毎、１００，０００塩基毎等のＮ塩基毎の結合を容易にするある縮重を有するプライマーを設計することができる。テンプレートの長さに沿ったプライマーの結合は、プライマーのデザイン、およびプライマーデザインがテンプレートの長さに沿ってＮ塩基毎に結合する統計的可能性に基づく。配列決定用プライマーＰ１は、ライゲーションにより伸長されることになるため、配列決定用プライマーＰ１の末端基は、ＤＮＡリガーゼによりオリゴヌクレオチドプローブ（Ｌ１）に共有結合で結合される準備が整っているように典型的には合成される。ライゲーションが、配列決定用プライマーＰ１の５’末端とオリゴヌクレオチドプローブＬ１の３’末端の間で生じる場合、リン酸基（５’−ＰＯ４）は、配列決定用プライマーＰ１に存在しなければならなず、ヒドロキシル基（３’−ＯＨ）は、オリゴヌクレオチドプローブＬ１に存在しなければならない。その逆もまた同様である。配列決定用プライマーＰ１を配列決定用プライマーハイブリダイズ部位ＰＳ１にハイブリダイズするために、５×ＳＳＰＥ緩衝液で希釈した１ｕＭの配列決定用プライマーＰ１が使用される。その後、混合物を、室温を超える温度で数分間インキュベートして、適切なアニーリングを促進する（典型的には、２５〜５５℃の温度で１〜５分間）。
【００５７】
オリゴヌクレオチドプローブ
本開示によるオリゴヌクレオチドプローブは、約１ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドを有するものである。例示的なオリゴヌクレオチドプローブは、約１ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチド、約３ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチド、約５ヌクレオチド〜約１２ヌクレオチド、または約６ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドを含む。例示的なオリゴヌクレオチドプローブは、約６ヌクレオチドを含む。１つの態様によると、本開示によるオリゴヌクレオチドプローブは、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズすることが可能であるべきである。更なる態様によると、本開示によるオリゴヌクレオチドプローブは、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズし、配列決定用プライマーまたは伸長二本鎖にライゲーションして、次のライゲーションサイクルのための伸長二本鎖を生成することが可能であるべきである。また更なる態様によると、第１のプローブが、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズし、配列決定用プライマーまたは伸長二本鎖にライゲーションして、次のライゲーションサイクルのための伸長二本鎖を生成することが可能であり、第２のプローブが、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズ可能である、オリゴヌクレオチドプローブの組み合わせを使用することができる。本開示によるプローブは、検出可能部分を含んでいてもよく、または検出可能にすることが可能であってもよい。オリゴヌクレオチドプローブは、例えば、ＤＮＡＷｏｒｋｓまたはＧｅｎｅ２Ｏｌｉｇｏ等のコンピュータープログラムの助力を用いて設計してもよい。
【００５８】
本開示によるオリゴヌクレオチドプローブは、単一ライゲーションサイクルでの複数ライゲーションを防止する末端部分を含んでいてもよい。また、本開示によるオリゴヌクレオチドプローブは、伸長可能な末端がまだ存在していない場合、更なるライゲーション用の伸長可能な末端を生成または含むように修飾が可能であるべきである。本開示によるオリゴヌクレオチドプローブは、一本鎖核酸テンプレートと完全に一致した二本鎖を形成する必要はないが、完全な一致した二本鎖が好例である。その代わり、オリゴヌクレオチドプローブは、プローブのヌクレオチドと本明細書に記載の方法により同定される相補的ヌクレオチドとの間に完全な一致を有する必要があるのみである。
【００５９】
オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションおよびライゲーション
オリゴヌクレオチドプローブを一本鎖テンプレート核酸にハイブリダイズおよびライゲーションするための方法は、当業者に公知である。「ハイブリダイゼーション」は、２つの一本鎖ポリヌクレオチドが非共有結合で結合して、安定した二本鎖ポリヌクレオチドを形成するプロセスを指す。また、用語「ハイブリダイゼーション」は、３本鎖ハイブリダイゼーションを指す場合がある。その結果生じる（通常は）二本鎖ポリヌクレオチドは、「ハイブリッド」または「二本鎖」である。「ハイブリダイゼーション条件」には、典型的には、約１Ｍ未満の、より通常は約５００ｍＭ未満の、更により通常は約２００ｍＭ未満の塩濃度が含まれるだろう。ハイブリダイゼーション温度は、５℃と低い場合があるが、典型的には２２℃超、より典型的には約３０℃超、多くの場合は約３７℃を超える。ハイブリダイゼーションは、通常、ストリンジェントな条件下、つまりプローブがその標的部分配列にハイブリダイズする条件下で実施される。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、環境によって異なる。より長い断片の場合、特異的ハイブリダイゼーションには、より高いハイブリダイゼーション温度が必要となる場合がある。相補鎖の塩基組成および長さ、有機溶媒の存在、および塩基ミスマッチの程度を含む他の要因がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす場合があるため、パラメーターの組み合わせは、いずれか１つのみの絶対的な手段よりも重要である。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおいて、特異的配列のＴｍよりも約５℃低くなるように選択される。例示的なストリンジェントな条件には、ｐＨ７．０〜８．３および少なくとも２５℃の温度、少なくとも０．０１Ｍ〜１Ｍ未満のＮａイオン濃度（または他の塩）の塩濃度、が含まれる。例えば、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｎａリン酸塩、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）および２５〜３０℃の温度の条件は、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションに好適である。ストリンジェントな条件については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈｅ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，１ｓｔ  Ｅｄ．，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９９）を参照されたい。「特異的に〜にハイブリダイズする」または「〜に特異的にハイブリダイズする」または類似表現は、その配列が複雑な混合（例えば、全細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合、分子がストリンジェント条件下で１つまたは複数の特定のヌクレオチド配列に実質的に、またはそれにのみ結合、二本鎖化、またはハイブリダイズすることを指す。
【００６０】
ライゲーションは、酵素的または化学的のいずれかで達成することができる。「ライゲーション」は、テンプレートで進む反応において、２つ以上の核酸、例えばオリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドの末端間に共有結合または連結を形成することを意味する。結合または連結の性質は、幅広く様々であってもよく、ライゲーションは、酵素的にまたは化学的に実施することができる。本明細書で使用される場合、ライゲーションは、通常は酵素的に実施され、１つのオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドの５’炭素と、別のオリゴヌクレオチドの３’炭素と間にリン酸ジエステル結合が形成される。様々なテンプレートで進むライゲーション反応が、以下の文献に記載されている：Ｗｈｉｔｅｌｙらの米国特許第４，８８３，７５０号；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒらの米国特許第５，４７６，９３０号；Ｆｕｎｇらの米国特許第５，５９３，８２６号；Ｋｏｏｌの米国特許第５，４２６，１８０号；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎらの米国特許第５，８７１，９２１号；Ｘｕ  ａｎｄ  Ｋｏｏｌ（１９９９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：８７５；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９７９）６８：５０；Ｅｎｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，１５：３（１９８２）；およびＮａｍｓａｒａｅｖの米国特許出願公開第２００４／０１１０２１３号。
【００６１】
化学ライゲーション法は、以下の文献に開示されている：Ｆｅｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，８：４０７−４１４（１９８９）およびＳｈａｂａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：４２４７−４２５１（１９９１）。酵素ライゲーション法では、リガーゼが使用される。多数のリガーゼが当業者に知られており、以下の文献に参照されている：Ｌｅｈｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８６：７９０−７９７（１９７４）；Ｅｎｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅｓ，ｐａｇｅｓ  ３−３０  ｉｎ  Ｂｏｙｅｒ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｖｏｌ．１５Ｂ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２）等。例示的なリガーゼには、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ，大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、およびＰｆｕリガーゼ等が含まれる。リガーゼを使用するためのあるプロトコールは、製造業者により開示されており、更に以下の文献に開示されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）；ｂａｒａｎｙ，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１：５−１６（１９９１）；Ｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５：７３−７６（１９９２）。
【００６２】
ライゲーションが１００％の効率でない場合、ライゲーションしなかった伸長二本鎖が更なるライゲーションステップに関与しないように、それらをキャッピングすることが望ましい場合がある。ある態様によると、キャッピングは、アルカリホスファターゼを使用して、５’リン酸（５’ＰＯ）を除去することにより実施することができる。例としては、配列決定用のオリゴヌクレオチドプローブのライゲーション後、その反応緩衝液１００μＬ中１０ユニットの仔ウシ小腸アルカリホスファターゼ（ＮＥＢ社、＃Ｍ０３９３Ｌ）等の溶液中に、アルカリホスファターゼを添加することにより未反応５’ＰＯを除去する。反応物を室温で１５分間インキュベートする。他のアルカリホスファターゼは好適である。また、キャッピングは、エキソヌクレアーゼ活性を欠損するポリメラーゼを使用して、５’−＞３’方向に末端ヌクレオチドを付加する（したがって、プライマーの３’末端をキャッピングする）ことにより実施することができる。末端ヌクレオチドは様々であるが、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）およびアシクロヌクレオチド（ａｃｙＮＴＰ）が最も多く用いられる。また、非テンプレートヌクレオチドを、末端ヌクレオチドとして使用することができる。ポリメラーゼ伸長によるキャッピングは、反応に通常使用されるｄＮＴＰが、ＤＮＡポリメラーゼまたは末端トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）が複数のヌクレオチドを付加することを防止する末端ＮＴＰ（例えば、ｄｄＮＴＰ）により置き換えられていること以外は記載のように実施し、ＤＮＡポリメラーゼを使用してポリヌクレオチド配列を増幅する。例としては、配列決定用のオリゴヌクレオチドプローブのライゲーション後、１ｍＭ  ｄｄＮＴＰおよびその反応緩衝液１００μＬ中２０ユニットの末端トランスフェラーゼ（ＮＥＢ社  ＃Ｍ０３１５Ｌ）を含むキャッピング混合物を添加する。反応物を室温で１５分間インキュベートする。或いは、キャッピングは、理想的には長さが６〜９ｍｅｒのオリゴヌクレオチドをキャッピング末端とライゲーションさせることにより実施することができる。キャッピングは、５’ＰＯの代わりに５’ヒドロキシル（５’ＯＨ）、反対側では３’ＯＨの代わりに３’ＰＯ、末端ＮＴＰ（ｄｄＮＴＰ、逆方向ｄｄＮＴＰ、ａｃｙＮＴＰ）、または末端炭素スペーサ（例えば、Ｃ３スペーサ）を有するオリゴの形態であってもよい。この方法は、キャッピングしようとするポリヌクレオチド配列の５’末端または３’末端のキャッピングにも同様に有効であろう。ライゲーションによるキャッピングは、オリゴヌクレオチドプローブのライゲーションについて記載されているように実施される。例としては、配列決定用のオリゴヌクレオチドプローブのライゲーション後、１００μＬ反応容積当たり１２００ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼを有するライゲーション緩衝液に添加された１ｕＭの５’または３’がキャップされたオリゴヌクレオチドを含むキャッピング混合物が添加される。反応物を室温で１５分間インキュベートする。
【００６３】
本開示によると、特定のセットのオリゴヌクレオチドプローブＬ１を使用して、ｓｓＤＮＡテンプレートとハイブリダイズさせ、ＤＮＡリガーゼにより配列決定用プライマーＰ１と共有結合で結合される。オリゴヌクレオチドプローブＬ１を、ライゲーション緩衝液で調製し（典型的には、１ｕＭ）、１００μＬ反応容積当たり６０００ユニットのＴ３  ＤＮＡリガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ社  ＃Ｌ６０１Ｌ）または１２００ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ社  ＃Ｌ６０３−ＨＣ−Ｌ）を使用してライゲーションする。反応物を、室温で数分〜数時間インキュベートする（典型的には、１５℃〜３５℃の温度で、５分〜２時間）。その後、酵素およびあらゆる未ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブＬ１を洗浄１緩衝液で洗い流す。
【００６４】
ハイブリダイゼーション条件
ある例示的な実施形態では、用語「アニーリング」および「ハイブリダイゼーション」は、本明細書で使用される場合、同義的に使用され、安定した二本鎖の形成を意味する。１つの態様では、安定した二本鎖とは、二本鎖の鎖Ｔｍより約５℃低い温度または約５度高い温度のいずれかの温度、および低一価塩濃度、例えば０．２Ｍ未満または０．１Ｍまたは当業者に知られている塩濃度未満の条件下でストリンジェントに洗浄しても、二本鎖構造が破壊されないことを意味する。用語「完全に一致する」は、二本鎖に関して使用される場合、二本鎖を構成するポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド鎖が、互いに二本鎖構造を形成し、各鎖の全てのヌクレオチドが、他方の鎖のヌクレオチドとワトソン‐クリック型塩基対合することを意味する。用語「二本鎖」は、これらに限定されないが、デオキシイノシン、２−アミノプリン塩基を有するヌクレオシド、およびＰＮＡ等のヌクレオシド類似体の対合が使用される場合があることを含む。２つのオリゴヌクレオチド間の二本鎖の「ミスマッチ」は、二本鎖中の１対のヌクレオチドが、ワトソン−クリック結合で対合しないことを意味する。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「ハイブリダイゼーション条件」は、典型的には、約１Ｍ未満の、より通常は約５００ｍＭ未満の、更により通常は約２００ｍＭ未満の塩濃度を含むだろう。ハイブリダイゼーション温度は、５℃と低くもできるが、典型的には２２℃超、より典型的には約３０℃超、多くの場合は約３７℃を超える。ハイブリダイゼーションは、通常、ストリンジェントな条件下、つまりプローブがその標的部分配列に特異的にハイブリダイズする条件下で実施される。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、環境によって異なる。より長い断片の場合、特異的ハイブリダイゼーションには、より高いハイブリダイゼーション温度が必要となる場合がある。相補鎖の塩基組成および長さ、有機溶媒の存在、および塩基ミスマッチの程度を含む他の要因がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす場合があるため、パラメーターの組み合わせは、いずれか１つのみの絶対的な手段よりも重要である。
【００６６】
一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列のＴｍよりも約５℃低くなるように選択される。例示的なストリンジェントな条件には、ｐＨ７．０〜８．３および少なくとも２５℃の温度にて、少なくとも０．０１Ｍ〜１Ｍ未満のＮａイオン濃度（または他の塩）の塩濃度が含まれる。例えば、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｎａリン酸塩、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）および２５〜３０℃の温度の条件は、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションに好適である。ストリンジェントな条件については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈｅ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，１ｓｔ  Ｅｄ．，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９９）を参照されたい。本明細書で使用される場合、用語「特異的に〜にハイブリダイズする」または「〜に特異的にハイブリダイズする」または類似の用語は、ある分子が、ストリンジェントな条件下で１つまたは複数の特定のヌクレオチド配列に実質的に結合、二本鎖化、またはハイブリダイズすることを指す。
【００６７】
テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列
本開示のある態様によると、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列は、オリゴヌクレオチドプローブに結合されている。テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列は、検出可能部分、標識、またはリポーターを含んでいてもよい。テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列は、検出可能部分、標識、またはリポーターを有するプローブとハイブリダイズするためのプローブハイブリダイゼーション部位を含んでいてもよい。テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列は、直鎖核酸配列であってもよく、またはテンプレート非ハイブリダイズ核酸配列は、ステムおよびループ構造であってもよい。
【００６８】
直鎖核酸配列を製作する方法は、当業者に知られている。直鎖核酸配列は、核酸配列との１つまたは複数のまたは複数のプローブハイブリダイゼーション部位を含むように設計されており、プローブハイブリダイゼーション部位は、プローブ核酸配列に相補的であるように選択されているため、プローブとプローブハイブリダイゼーション部位とのハイブリダイゼーションがもたらされる。１つの態様によると、直鎖核酸配列は、ヌクレオチドの配列を選択し、その後、以下の文献に記載されている方法およびアルゴリズム等を使用して、ワトソン‐クリック型塩基対合を決定することにより設計することができる：Ｚｕｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，ＲＮＡ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐ．１１−４３，Ｊ．Ｂａｒｃｉｓｚｅｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｂ．Ｆ．Ｃ．Ｃｌａｒｋ，ｅｄｓ．，ＮＡＴＯ  ＡＳＩ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，ＮＬ（１９９９）。塩基対合を形成する可能性が高い配列の場合、ヌクレオチドを変更することができる。プローブは、検出可能部分、標識、またはリポーターを含んでおり、したがって、プローブが、対応するプローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズすると、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列は、検出可能部分、標識、またはリポーターを含むことになるだろう。
【００６９】
ステムおよびループ型核酸構造を製作する方法は、当業者に知られている。ループ構造は、核酸配列との１つまたは複数のまたは複数のプローブハイブリダイゼーション部位を含むように設計されており、プローブハイブリダイゼーション部位は、プローブ核酸配列に相補的であるように選択されいるため、それによりプローブとプローブハイブリダイゼーション部位とのハイブリダイゼーションがもたらされる。１つの態様によると、ステムおよびループ構造は、ヌクレオチドの配列を選択し、その後、以下の文献に記載されている方法およびアルゴリズム等を使用して、ワトソン‐クリック型塩基対合を決定することにより設計することができる：Ｚｕｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，ＲＮＡ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐ．１１−４３，Ｊ．Ｂａｒｃｉｓｚｅｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｂ．Ｆ．Ｃ．Ｃｌａｒｋ，ｅｄｓ．，ＮＡＴＯ  ＡＳＩ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，ＮＬ（１９９９）。塩基対合を形成する可能性が高い配列の場合、ヌクレオチドを変更することができる。プローブは、検出可能部分、標識、またはリポーターを含んでおり、したがって、プローブが、対応するプローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズすると、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列は、検出可能部分、標識、またはリポーターを含むことになるだろう。
【００７０】
プローブは、検出可能部分、標識、またはリポーターを含んでおり、したがって、プローブが、対応するプローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズすれば、テンプレート非ハイブリダイズ核酸配列は、検出可能部分、標識、またはリポーターを含むことになるだろう。ステムおよびループ構造は、ステムおよびループ構造に直接結合されている検出可能部分、標識、またはリポーターを含んでいてもよい。検出可能部分、標識、またはリポーターを核酸配列に結合する方法は、当業者に公知である。
【００７１】
検出可能部分
ある例示的な実施形態では、検出可能部分、標識、またはリポーターは、本明細書に記載の１つまたは複数のヌクレオチドを検出するために用いることができる。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、蛍光部分および発色部分等の検出可能部分を直接的または間接的に結合させることを含む様々な方法で標識することができる。当業者であれば、標識ＤＮＡに関する文献を参照することができる。検出可能部分の例には、以下のものが含まれる：種々の放射性部分、酵素、補欠分子団、蛍光マーカー、発光マーカー、生物発光マーカー、金属粒子、タンパク質−タンパク質結合対、およびタンパク質−抗体結合対等。蛍光部分の例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、シアニン、ダンシルクロリド、フィコシアニン、およびフィコエリトリン等。生物発光マーカーの例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ルシフェラーゼ（例えば、細菌性、ホタル、およびコメツキムシ等）、ルシフェリン、およびエクオリン等。視覚的に検出可能なシグナルを有する酵素系の例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ（glucorinidase）、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、およびコリンエステラーゼ等。また、識別可能なマーカーには、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈ等の放射性化合物が含まれる。識別可能なマーカーは、様々な業者から市販されている。
【００７２】
蛍光標識、ならびにそれらのヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドとの結合は、以下の文献を含む多数の概説に記載されている：Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｎｉｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，２００２）；Ｋｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｎａｋ，ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１）；およびＷｅｔｍｕｒ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２６：２２７−２５９（１９９１）。本発明に適用可能な特定の方法は、以下の例示的な文献に開示されている：米国特許第４，７５７，１４１号、第５，１５１，５０７号、および第５，０９１，５１９号。１つの態様では、例えば、以下の文献に開示されているもの等の、１つまたは複数の蛍光色素が、標識標的配列の標識として使用される：米国特許第５，１８８，９３４号（４，７−ジクロロフルオレセイン色素）；第５，３６６，８６０号（スペクトル的に分析可能なローダミン色素）；第５，８４７，１６２号（４，７−ジクロロローダミン色素）；第４，３１８，８４６号（エーテル置換フルオレセイン色素）；第５，８００，９９６号（エネルギー移動色素）；Ｌｅｅらの第５，０６６，５８０号（キサンチン色素）；および第５，６８８，６４８号（エネルギー移動色素）等。また、標識は、以下の特許および特許広報に開示されるように、量子ドットを用いて実施することができる：米国特許第６，３２２，９０１号、第６，５７６，２９１号、第６，４２３，５５１号、第６，２５１，３０３号、第６，３１９，４２６号、第６，４２６，５１３号、第６，４４４，１４３号、第５，９９０，４７９号、第６，２０７，３９２号、第２００２／００４５０４５号、および第２００３／００１７２６４号。本明細書で使用される場合、用語「蛍光標識」は、１つまたは複数の分子の蛍光吸収および／または発光特性により情報を伝達するシグナル伝達部分を含む。そのような蛍光特性には、蛍光強度、蛍光寿命、発光スペクトル特徴、およびエネルギー移動等が含まれる。
【００７３】
ヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド配列に容易に組み込まれる市販の蛍光性ヌクレオチド類似体には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：Ｃｙ３−ｄＣＴＰ、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ、Ｃｙ５−ｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ピスカタウエイ、ニュージャージー州）、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ｄＵＴＰ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（商標）−５−ｄＵＴＰ、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（商標）−７−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＦＬ−１４−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−１４−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＴＲ−１４−ｄＵＴＰ、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＧＲＥＥＮ（商標）−５−ｄＵＴＰ、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮＲ（商標）４８８−５−ｄＵＴＰ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（商標）−１２−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭ  ６３０／６５０−１４−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭ  ６５０／６６５−１４−ｄＵＴＰ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）４８８−５−ｄＵＴＰ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）５３２−５−ｄＵＴＰ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）５６８−５−ｄＵＴＰ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）５９４−５−ｄＵＴＰ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）５４６−１４−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ＵＴＰ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（商標）−５−ＵＴＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（商標）−７−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭ  ＦＬ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭ  ＴＲ−１４−ＵＴＰ、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＧＲＥＥＮ（商標）−５−ＵＴＰ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）４８８−５−ＵＴＰ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）５４６−１４−ＵＴＰ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ社、ユージーン、オレゴン州）等。或いは、上記のフルオロフォアおよび本明細書で言及されているものは、例えば、ホスホロアミダイト（phosphoroamidite）またはＮＨＳ化学を使用して、オリゴヌクレオチド合成中に付加することができる。他のフルオロフォアを有するヌクレオチドをカスタム合成するためのプロトコールは、当技術分野で公知である（Ｈｅｎｅｇａｒｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３４５を参照）。２−アミノプリンは、合成中にオリゴヌクレオチド配列に直接組み込むことができる蛍光性塩基である。核酸は、ＤＡＰＩ、ＹＯＹＯ−１、臭化エチジウム、およびシアニン色素（例えば、ＳＹＢＲグリーン）等の挿入色素で、事後的に染色することもできる。
【００７４】
合成後結合に使用可能な他のフルオロフォアには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）４０５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）６４７、ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、ダンシル，リサミンローダミンＢ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ４８８，Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ、ローダミン６Ｇ、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｇｒｅｅｎ、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｒｅｄ、テトラメチルローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ社、ユージーン、オレゴン州）から入手可能）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ピスカタウエイ、ニュージャージー州）等。また、これらに限定されないが、以下のものを含むＦＲＥＴタンデムフルオロフォアを使用することができる：ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＰＥ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＰＥ−Ａｌｅｘａ色素（６１０、６４７、６８０）、およびＡＰＣ−Ａｌｅｘａ色素等。
【００７５】
金属銀または金粒子を使用して、蛍光標識ヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド配列からのシグナルを増強してもよい（Ｌａｋｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３４：６２）。
【００７６】
また、ビオチンまたはその誘導体を、ヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド配列の標識として使用し、その後、検出可能に標識されたアビジン／ストレプトアビジン誘導体（例えば、フィコエリトリン結合ストレプトアビジン）または検出可能に標識された抗ビオチン抗体と結合させてもよい。ジゴキシゲニンを標識として組み込み、その後、検出可能に標識された抗ジゴキシゲニン抗体（例えば、フルオレセイン化抗ジゴキシゲニン）と結合させてもよい。アミノアリル−ｄＵＴＰまたはアミノヘキシルアクリルアミド−ｄＣＴＰ残基を、オリゴヌクレオチド配列に組み込み、その後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）誘導体化蛍光色素と結合させてもよい。一般的に、検出可能に標識された結合パートナーが結合して、検出が可能になる限り、任意の種類の結合対を検出オリゴヌクレオチドに組み込むことができる。本明細書で使用される場合、抗体という用語は、あらゆるクラスの抗体分子、またはＦａｂ等の、そのあらゆる部分断片を指す。
【００７７】
オリゴヌクレオチド配列に好適な他の標識には、以下のものが含まれ得る：フルオレセイン（ＦＡＭ、ＦＩＴＣ）、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ダンシル、ビオチン、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、ヘキサヒスチジン（６×Ｈｉｓ）、およびリン光体アミノ酸（例えば、Ｐ−ｔｙｒ、Ｐ−ｓｅｒ、Ｐ−ｔｈｒ）等。１つの実施形態では、抗体の各々が検出可能な標識で誘導体化されている以下のハプテン／抗体対が検出に使用される：ビオチン／α−ビオチン、ジゴキシゲニン／α−ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）／α−ＤＮＰ、５−カルボキシフルオレスセイン（ＦＡＭ）／α−ＦＡＭ。
【００７８】
ある例示的な実施形態では、ヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド配列は、例えば、特に以下の文献に記載されているような捕捉剤とその後結合するハプテンを用いて間接的に標識されていてもよい：米国特許第５，３４４，７５７号、第５，７０２，８８８号、第５，３５４，６５７号、第５，１９８，５３７号、および４，８４９，３３６号、ならびに国際公開第９１／１７１６０号等。様々なハプテン−捕捉剤対が使用可能である。例示的なハプテンには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ビオチン、ｄｅｓ−ビオチンおよび他の誘導体、ジニトロフェノール、ダンシル、フルオレセイン、ＣＹ５、ならびにジゴキシゲニン等。ビオチンの場合、捕捉剤は、アビジン、ストレプトアビジン、または抗体であってもよい。抗体は、他のハプテンの捕捉剤として使用してもよい（多数の色素−抗体対が市販されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージーン、オレゴン州）。
【００７９】
ある態様によると、本明細書に記載の検出可能な部分は、スペクトル的に分析可能である。複数の蛍光標識に関して「スペクトル的に分析可能な」とは、標識の蛍光発光バンドが、十分に分離しており、つまり十分に非重複性であり、それぞれの標識に結合されている分子タグが、それぞれの標識で発生する蛍光シグナルに基づき、標準的な光検出システムで、例えば、以下の文献に記載のシステムにより例示されているバンドパスフィルターおよび光電増倍管のシステム等を使用することにより、識別することができることを意味する：米国特許第４，２３０，５５８号；もしくは第４，８１１，２１８等、またはＷｈｅｅｌｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｐｇｓ．２１−７６，ｉｎ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５）。１つの態様では、フルオレセインおよびローダミン等のスペクトル的に分析可能な有機色素は、最大発光波長が、少なくとも２０ｎｍ離れて分離されており、別の態様では少なくとも４０ｎｍ離れて分離されていることを意味する。別の態様では、スペクトル的に分析可能なキレートランタニド化合物および量子ドット等は、最大発光波長が、少なくとも１０ｎｍ離れて分離されており、更なる態様では少なくとも１５ｎｍ離れて分離されていることを意味する。
【００８０】
切断可能部分
本開示のある態様によると、切断可能なヌクレオチド部分は、切断可能な連結とも呼ばれ、オリゴヌクレオチドプローブをテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造から分離するために使用される。切断可能部分は当業者に知られており、化学薬品で処理することにより、または酸化環境または還元環境に置くことにより切断することができる化学的に切断容易なヌクレオシド間連結を含む。そのような切断可能部分には、硝酸銀の溶液等の種々の金属イオンにより切断することができるホスホロチオアート、ホスホロチオラートが含まれる。そのような切断可能部分には、酢酸を含む溶液等の酸性状態で切断することができるホスホロアミダートが含まれる。連結を切断することができる好適な化学薬品には、架橋ホスホロチオアート連結を切断することができ、ヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドからホスホラミダイトリンカーを除去し、切断部位のヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドにフリーなリン酸基を残すことができる化学薬品が含まれる。好適な化学薬品には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ＡｇＮＯ３、ＡｇＣＨ３ＣＯＯ、ＡｇＢｒＯ３、Ａｇ２ＳＯ４、またはＡｇ２＋、ＨｇＣｌ２、Ｉ２、Ｂｒ２、Ｉ−、およびＢｒ−等をもたらす任意の化合物。
【００８１】
また、切断可能部分には、当業者に知られているヌクレアーゼにより切断することができるものが含まれる。そのようなヌクレアーゼには、以下のものが含まれる：Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、およびＩＶ型等の制限エンドヌクレアーゼ；エンドヌクレアーゼＩ〜ＶＩＩＩ等のエンドヌクレアーゼ；リボヌクレアーゼ；ならびにＡＰエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素、ＡＰリアーゼ活性を有する酵素、およびウラシルＤＮＡグリコシラーゼ等のグリコシラーゼ活性を有する酵素等の他のヌクレアーゼ。
【００８２】
また、切断可能部分には、ある波長の光により切断することが可能なものが含まれる。そのような切断可能部分は、光感受性連結と呼ばれ、Ｏｌｅｊｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｂｉｏｔｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ：ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｖｏｌ．９２，ｐ．７５９０−７５９４（１９９５）に開示されている。そのような光感受性リンカーは、約２７５〜約３７５ｎｍの波長のＵＶを、約１分間等、数秒〜３０分間の期間照射することにより切断することができる。例示的な波長には、約３００ｎｍ〜約３５０ｎｍが含まれる。
【００８３】
また、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ等のあるヌクレオチドは、切断可能な連結として使用するために組み込む前に反応させて、ヌクレアーゼまたは化学薬品による更なる切断に対して特異的に感受性にすることができる。１つの態様によると、所与のテンプレート非ハイブリダイズ核酸の１つまたは複数のデオキシグアノシンは、配列決定反応に追加される前に、２−ニトロプロパンにより８−オキソ−デオキシグアノシンに酸化させることができ、その後、８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（例えば、Ｆｐｇ、ｈＯＧＧ１）を使用して切断することができる。同様に、デオキシシトシンは、亜硫酸水素塩または亜硝酸を使用して事前に反応させて、５−ヒドロキシシトシンを形成することができ、それは、その後、ｈＮＥＩＬ１等のあるＤＮＡグリコシラーゼにより処理することができる。切断することができる他のヌクレオチドには、ウラシル、デオキシウリジン、イノシン、およびデオキシイノシンが含まれる。
【００８４】
更なる実施形態には、ヌクレオチドを修飾して、より切断感受性にする第１のステップおよびその後ヌクレオチドが切断される第２のステップによる等の、２段階法で切断することができるヌクレオチドが含まれる。そのような系には、他のエンドヌクレアーゼを使用することができるが、典型的にはＵＤＧおよびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの組み合わせである、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ社（＃Ｙ９１８Ｌ）またはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社（＃Ｍ５５０５Ｌ）から市販されているＵＳＥＲシステムが含まれる。酵素ＵＤＧおよびエンドヌクレアーゼは、市販されている。また、修飾ヌクレオチドは、結合等のヌクレオチドの特徴が、切断を容易にするように修飾されている切断可能なヌクレオチドであってもよい。例には、脱塩基性塩基、脱ピリミジン性塩基、脱プリン塩基性塩基、ホスホロチオアート、ホスホロチオラート、および８−オキソ−デオキシグアノシンに酸化させることができるデオキシグアノシン等の酸化塩基が含まれる。
【００８５】
したがって、ヌクレオチド間結合は、化学薬品、熱による切断であってもよく、または光に基づく切断であってもよい。本明細書に記載の方法で使用される例示的な化学的に切断可能なヌクレオチド間連結には以下のものが含まれる：例えば、β−シアノエーテル、５’−デオキシ−５’−アミノカルバマート、３’デオキシ−３’−アミノカルバマート、尿素、２’シアノ−３’，５’−ホスホジエステル、３’−（Ｓ）−ホスホロチオアート、５’−（Ｓ）−ホスホロチオアート、３’−（Ｎ）−ホスホロアミダート、５’−（Ｎ）−ホスホロアミダート、α−アミノアミド、隣接ジオール、リボヌクレオシド挿入、２’−アミノ−３’，５’−リン酸ジエステル、アリルスルホキシド、エステル、シリルエーテル、ジチオアセタール、５’−チオ−フルマール、α−ヒドロキシ−メチル−ホスホン酸ビスアミド、アセタール、３’−チオ−フルマール、メチルホスホナート、およびホスホトリエステル。トリアルキルシリルエーテルおよびジアルコキシシラン等のヌクレオシド間シリル基は、フッ化物イオンを用いた処理により切断される。塩基により切断可能な部位には、β−シアノエーテル、５’−デオキシ−５’−アミノカルバマート、３’−デオキシ−３’−アミノカルバマート、尿素、２’−シアノ−３’，５’−ホスホジエステル、２’−アミノ−３’，５’−ホスホジエステル、エステル、およびリボースが含まれる。３’−（Ｓ）−ホスホロチオアートおよび５’−（Ｓ）−ホスホロチオアート等のチオ含有ヌクレオチド間結合は、硝酸銀または塩化第二水銀を用いた処理により切断される。酸により切断可能な部位には、３’−（Ｎ）−ホスホロアミダート、５’−（Ｎ）−ホスホロアミダート、ジチオアセタール、アセタール、およびホスホン酸ビスアミドが含まれる。α−アミノアミドヌクレオシド間結合は、イソチオシアナートを用いた処理により切断可能であり、チタンを使用して、２’−アミノ−３’，５’−ホスホジエステル−Ｏ−オルト−ベンジルヌクレオシド間結合を切断してもよい。隣接ジオール結合は、過ヨウ素酸塩を用いた処理により切断可能である。熱により切断可能な基には、アリルスルホキシドおよびシクロヘキセンが含まれ、光感受性連結には、ニトロベンジルエーテルおよびチミジン２量体が含まれる。化学的に切断可能な基、熱により切断可能な基、および光感受性基を含有する核酸を合成および切断する方法は、例えば、米国特許第５，７００，６４２号に記載されている。
【００８６】
このように、ヌクレオチド間結合は、酵素的切断を使用して切断することができる。本明細書に記載の核酸配列は、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含むように設計することができる。核酸を制限エンドヌクレアーゼと接触させて、切断をもたらすことができる。特異的結合および／または切断部位を有する多種多様な制限エンドヌクレアーゼが、例えばＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社（イプスウィッチ、マサチューセッツ州）から市販されている。種々の実施形態では、３’突出、５’突出、または平滑末端を生成する制限エンドヌクレアーゼを使用することができる。突出を生成する制限エンドヌクレアーゼを使用する場合、エキソヌクレアーゼ（例えば、ＲｅｃＪｆ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＴ、Ｓ１ヌクレアーゼ、Ｐ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、ＣＥＬ  Ｉヌクレアーゼ等）を使用して平滑末端を生成してもよい。例示的な実施形態では、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの結合部位および／または切断部位を含有する直交性プライマー／プライマー結合部位を使用して、一時的直交性プライマー結合部位を除去してもよい。
【００８７】
本明細書で使用される場合、用語「制限エンドヌクレアーゼ認識部位」は、これらに限定されないが、１つまたは複数の制限酵素が結合し、制限エンドヌクレアーゼ認識配列自体または制限エンドヌクレアーゼ認識配列の遠位にある配列のいずれかでＤＮＡ分子の切断をもたらす特定の核酸配列を含むことが意図されている。制限酵素には、これらに限定されないが、Ｉ型酵素、ＩＩ型酵素、ＩＩＳ型酵素、ＩＩＩ型酵素、およびＩＶ型酵素が含まれる。ＲＥＢＡＳＥデータベースは、制限酵素、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、および制限修飾に関与する関連タンパク質に関する情報の総合的データベースを提供する。ＲＥＢＡＳＥデータベースは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位および制限エンドヌクレアーゼ切断部位、イソシゾマー、商業的入手可能性、結晶構造、および配列データに関する情報の発表および未発表研究を両方とも含有している（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：Ｄ２３０を参照。この文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００８８】
ある態様では、本発明のプライマーは、ＩＩＳ型酵素が、制限エンドヌクレアーゼ認識配列に対して数個塩基対分３’方向の所で核酸を切断することを可能にする１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。本明細書で使用される場合、用語「ＩＩＳ型」は、その認識配列から離れた部位を切断する制限酵素を指す。ＩＩＳ型酵素は、それらの認識部位から０〜２０塩基対の範囲だけ離れた所で切断することが知られている。ＩＩｓ型エンドヌクレアーゼの例には、以下のものが含まれる：例えば、ＢｓｒＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｔＦ５Ｉ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＭｎｌＩ、ＢｃｉＶＩ、ＨｐｈＩ、ＭｂｏＩＩ、ＥｃｉＩ、ＡｃｕＩ、ＢｐｍＩ、ＭｍｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｃｇＩ、ＢａｅＩ、ＢｆｉＩ、ＴｓｐＤＴＩ、ＴｓｐＧＷＩ、ＴａｑＩＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、ＧｓｕＩ、ＰｐｉＩ、およびＰｓｒＩ等の３’突出を生成する酵素；例えば、ＢｓｍＡＩ、ＰｌｅＩ、ＦａｕＩ、ＳａｐＩ、ＢｓｐＭＩ、ＳｆａＮＩ、ＨｇａＩ、ＢｖｂＩ、ＦｏｋＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＦＩ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＡａｒＩ等の５’突出を生成する酵素；ならびに、例えば、ＭｌｙＩおよびＢｔｒＩ等の平滑末端を生成する酵素。ＩＩｓ型エンドヌクレアーゼは、市販されており、当技術分野で周知である（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、ビバリー、マサチューセッツ州）。ＩＩｓ型エンドヌクレアーゼを使用する認識部位、切断部位、および消化の条件に関する情報は、例えば、ウェブサイト：ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂｅｃｏｍｍ／ｅｎｚｙｍｅｆｉｎｄｅｒｓｅａｒｃｈ  ｂｙｔｙｐｅＩＩｓ．ａｓｐに見出すことができる。制限エンドヌクレアーゼ配列および制限酵素は当技術分野で周知であり、制限酵素は市販されている（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、イプスウィッチ、マサチューセッツ州）。
【００８９】
ある態様によると、切断可能部分は、オリゴヌクレオチド内にあってもよく、ｉｎ  ｓｉｔｕ合成中に導入されてもよい。幅広く様々な切断可能部分が、固相合成およびマイクロアレイオリゴヌクレオチド合成の技術分野で使用可能である（例えば、Ｐｏｎ，Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：４６５−４９６（１９９３）；Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９−１３４（１９９８）；米国特許第５，７３９，３８６号、第５，７００，６４２号、および第５，８３０，６５５号；ならびに米国特許出願公開第２００３／０１８６２２６号および第２００４／０１０６７２８号を参照）。
【００９０】
切断可能部位は、オリゴヌクレオチド骨格に沿って、例えば、リボース、ジアルコキシシラン、ホスホロチオアート、およびホスホロアミダートヌクレオチド間結合等のホスホジエステル基の１つの代わりに、修飾３’−５’ヌクレオチド間結合に位置していてもよい。また、切断可能なオリゴヌクレオチド類似体は、７−デアザグアノシン、５−メチルシトシン、イノシン、およびウリジン等の塩基または糖の１つに置換基またはその置換を含んでいてもよい。
【００９１】
１つの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチド内に含有されている切断可能部位は、ジアルコキシシラン、３’−（Ｓ）−ホスホロチオアート、５’−（Ｓ）−ホスホロチオアート、３’−（Ｎ）−ホスホロアミダート、５’−（Ｎ）ホスホロアミダート、およびリボース等の化学的に切断可能な基を含んでいてもよい。化学的に切断可能なオリゴヌクレオチドの合成および切断条件は、米国特許第５，７００，６４２号および第５，８３０，６５５号に記載されている。例えば、導入される切断可能部位の選択に応じて、まず、機能化ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシド２量体のいずれかを調製し、その後、オリゴヌクレオチド合成過程中に、伸長中のオリゴヌクレオチド断片に選択的に導入してもよい。ジアルコキシシランの選択的な切断は、フッ化物イオンを用いた処理により行ってもよい。ホスホロチオアートヌクレオチド間結合は、穏やかな酸化条件下で選択的に切断してもよい。ホスホロアミダート結合の選択的な切断は、８０％酢酸等の穏やかな酸性条件下で実施してもよい。リボースの選択的な切断は、希釈水酸化アンモニウムを用いた処理により実施してもよい。
【００９２】
別の実施形態では、切断不能なヒドロキシルリンカーは、米国特許出願公開第２００３／０１８６２２６号に記載のように、ホスホラミダイトまたはＨ−ホスホナートオリゴヌクレオチド合成前に、特殊なホスホラミダイトをヒドロキシル基に結合させることにより、切断可能なリンカーに変換することができる。オリゴヌクレオチド合成の完了時の化学的リン酸化剤の切断は、３’末端にホスファート基を保持するオリゴヌクレオチドを産出する。３’−リン酸末端は、化学薬品またはアルカリホスファターゼ等の酵素を用いた処理により３’ヒドロキシル末端に変換することができる。これは当業者により日常的に実施されている。
【００９３】
別の実施形態では、切断可能な連結部分は、ＴＯＰＳ（合成毎に２オリゴヌクレオチド、ｔｗｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｐｅｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）リンカーであってもよい（例えば、国際公開第９３／２００９２号）。例えば、ＴＯＰＳホスホラミダイトを使用して、固体支持体上で切断不能なヒドロキシル基を切断可能なリンカーに変換してもよい。ＴＯＰＳ試薬の好ましい実施形態は、ユニバーサルＴＯＰＳ（商標）ホスホラミダイトである。ユニバーサルＴＯＰＳ（商標）ホスホラミダイト調製、結合、および切断の条件は、例えば、Ｈａｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２（１５）：２９９８−３００４（１９９４）に詳細に記載されている。ユニバーサルＴＯＰＳ（商標）ホスホラミダイトは、長期間のアンモニアおよび／またはアンモニア／メチルアミン処理等の塩基性条件下で除去され、天然３’ヒドロキシオリゴヌクレオチドを生成する環式３’リン酸を生成する。
【００９４】
別の実施形態では、切断可能な連結部分は、アミノリンカーであってもよい。ホスホラミダイト連結を介してリンカーに結合されたその結果生じたオリゴヌクレオチドは、８０％酢酸で切断して、３’リン酸化オリゴヌクレオチドを産出することができる。
【００９５】
別の実施形態では、切断可能な連結部分は、オルト−ニトロベンジル光感受性リンカー等の光感受性リンカーであってもよい。固体支持体での光感受性オリゴヌクレオチドの合成および切断条件は、例えば、以下の文献に記載されている：Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６１：５２５−５２９（１９９６）、Ｋａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４：５０７−５１０（１９９９）、Ｋａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：４８７０−４８７１（１９９８）、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：７４６−７５３（１９９４）、Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：２３７０−２３８０（１９９７）、および米国特許第５，７３９，３８６号。また、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、およびＦｍｏｃ−アミノエチルカルボン酸リンカー等のオルト−ニトロベンジルに基づくリンカーは、商業的に取得することができる。
【００９６】
ある実施形態１
図１Ａ、２Ａ、４Ａ、および５Ａを参照すると、オリゴヌクレオチドＬ１は、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズし、配列決定用プライマーＰ１にライゲーションされるヘキサマーからなる。このヘキサマーは、Ｎヌクレオチドからなり、ヌクレオチドＮ１は、配列決定用プライマーＰ１に最も近位にあり、ヌクレオチドＮ６は最も遠位にある。ヌクレオチドＮ６は、切断可能部分Ｃ１を介してテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨに結合されている。ヘキサマーオリゴヌクレオチドプローブＬ１が使用される１つの態様によると、４０９６個のヘキサマーオリゴヌクレオチドプローブ（４＾６＝４０９６）は、全てのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）があらゆる可能な組み合わせのＮ位置の各々が既知であるように調製される。、。図１Ａ、２Ａ、４Ａ、および５Ａでは、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、相補的オリゴバーコードプローブＢＰ１〜ＢＰ６がハイブリダイズする６つのバーコード認識部位Ｂ１〜Ｂ６を有する。これは、ヌクレオチドＮ１〜Ｎ６全ての同定に関する情報を提供する。本開示のこの態様は、ヘキサマーの全てのヌクレオチドＮの同定を可能にし、この情報を、一本鎖核酸テンプレートの相補的に対合したヌクレオチドと関連させること可能にする。
【００９７】
図３および６を参照すると、オリゴヌクレオチドプローブ」Ｌ１は、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズし、配列決定用プライマーＰ１にライゲーションされるヘキサマーからなる。このヘキサマーは、Ｎヌクレオチドからなり、ヌクレオチドＮ１は、配列決定用プライマーＰ１に最も近位にあり、ヌクレオチドＮ６は最も遠位にある。ヌクレオチドＮ６は、切断部分Ｃ１を介してテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨに結合されている。テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨは、リポーター部分Ｒ１を含む。本開示のこの態様によると、合計２４個のオリゴヌクレオチドプローブが配列決定に必要である。既知ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴをＮ１位に有し、残るヌクレオチドＮ２〜Ｎ６が未知である４つのプローブが設計される。検出可能部分または標識またはリポーターＲ１は、各プローブが、Ｎ１位の既知ヌクレオチドを同定するように選択されている。既知ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴをＮ２位に有し、残るヌクレオチドＮ１およびＮ３〜Ｎ６が未知である４つのプローブが設計される。検出可能部分または標識またはリポーターＲ１は、各プローブが、Ｎ２位の既知ヌクレオチドを同定するように選択されている。このプローブ設計をＮ３〜Ｎ６の各々について繰り返し、合計２４個のオリゴヌクレオチドプローブＬ１を得る。つまり４つのオリゴの６セット、つまりＮ１〜Ｎ６の各位置について１セットである。この態様は、ヘキサマーの各ヌクレオチドの同定を可能にし、この情報を、一本鎖核酸テンプレートの相補的に対合したヌクレオチドと関連させること可能にする。
【００９８】
図１、２、４、５、７、および１１を参照すると、オリゴヌクレオチドプローブＬ１は、一本鎖核酸テンプレートにハイブリダイズし、配列決定用プライマーＰ１にライゲーションされるヘキサマーからなる。このヘキサマーは、Ｎヌクレオチドからなり、ヌクレオチドＮ１は、配列決定用プライマーＰ１に最も近位にあり、ヌクレオチドＮ６は最も遠位にある。ヌクレオチドＮ６は、切断部分Ｃ１を介してテンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨに結合されている。テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨは、バーコード認識部位Ｂ１を含む。合計２４個のオリゴヌクレオチドプローブＬ１が、配列決定に必要である。つまり、図３のように４つのオリゴの６セットで、各セットは、バーコード認識配列により特定のヌクレオチドＮ位に対応する（つまり、バーコードＢ１は、所与のセットのＮ１に対応し、バーコードＢ２は、第２のセットのＮ２に対応する等である）。２４個のオリゴヌクレオチドプローブＬ１の各々１つのヘキサマーは、ヌクレオチドの１つが（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）、所定のＮ位で既知であるように設計されており、したがってオリゴヌクレオチドプローブＬ１は、１セットの２４個オリゴヌクレオチドプローブ（４＊６＝２４）からなる。この態様は、ヘキサマーの全てのＮの同定を可能にし、この情報を、一本鎖核酸テンプレートの相補的に対合したヌクレオチドと関連させること可能にする。
【００９９】
図５および５Ａを参照すると、遠位ハイブリダイズ鎖は、複数のオリゴヌクレオチドプローブＬ１をテンプレートに直接アッセンブリするためのライゲーション部位としての役目を果たす。１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブＬ１鎖は、標識バーコードプローブを使用してハイブリダイゼーションにより配列決定する前に、テンプレートでライゲーションのサイクルを繰り返すにより形成される。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブＬ１鎖は、配列決定の前に、結合したテンプレートにて形成される。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブＬ１鎖は、各配列決定ステップ後に形成される。１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブＬ１鎖は、自己アッセンブリすることができ、つまり、５’−ＰＯ４を有する最大４０９６個のオリゴヌクレオチドプローブＬ１の等モル混合物が、ＤＮＡリガーゼの存在下でまたは化学ライゲーションでテンプレートにハイブリダイズされる。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブＬ１鎖は、連続的に、つまり、所与のオリゴヌクレオチドプローブＬ１を配列決定用プライマーＰ１にハイブリダイズおよびライゲーションさせ、その後、洗浄およびリン酸化または脱保護を行い、第２のオリゴヌクレオチドプローブＬ１を、ライゲーションされたＰ１−Ｌ１複合体にライゲーションすること等により形成される。
【０１００】
図３、６、および１０を参照すると、オリゴヌクレオチドプローブＬ１は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）テンプレートにハイブリダイズされ、ＤＮＡリガーゼにより配列決定用プライマーに共有結合で連結される。合計２４個のオリゴヌクレオチドプローブＬ１が、ヘキサマーの６つのヌクレオチドの各々を配列決定するのに必要である。所与のＮ位の各ヌクレオチドの場合、検出可能部分または標識またはリポーターは、４つのフルオロフォアの１つであり、各セットは、電磁スペクトルの４つの異なる色で検出されるように、後に各ヌクレオチドの１つと関連づけられる（例えば、Ａは緑色、Ｃはオレンジ色、Ｇは青色、またはＴは赤色）。
【０１０１】
各セットのオリゴヌクレオチドプローブＬ１は、使用前に、等モル比になるように混合される（例えば、各２５μＭ）。テンプレートは、連続的に調査されるが（つまり、Ｎ１からＮ６まで）、そうである必要はない。既知のヌクレオチドＮ１を有するオリゴヌクレオチドプローブＬ１のセットは、ｓｓＤＮＡにハイブリダイズされ、ＤＮＡリガーゼによってＰ１に共有結合で結合される。検出時に、各色は、Ｎ１位のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）に関連づけられる。例として、所与のテンプレートで緑色のスペクトラムが検出される場合、Ｎ１では核酸Ａが同定され、一本鎖核酸テンプレートでは、相補的対合塩基Ｔが同定される。
【０１０２】
検出後、標識テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造ＴＮＨは、Ｃ１でそのヘキサマーから分離され、第２のラウンドのライゲーション中に共有結合で連結される準備が整った末端基が生成される。第２のラウンドのライゲーションでは、上述の、第１のラウンドで使用した同じセットのオリセットゴヌクレオチドプローブＬ１が使用される。それにより、ｓｓＤＮＡテンプレートのＮＴ７を識別することが可能になる。切断およびライゲーションの連続を必要なだけ繰り返すことができ、第３の連続後にはＮＴ１３が識別され、第４の連続後にはＮＴ１９が識別される等が可能になる。
【０１０３】
その後、既に伸長されている配列決定用プライマーＰ１を、変性条件を使用してテンプレートから剥離させる。これは、ＮａＯＨ、尿素、グアニジウムチオシアナート、ホルムアミド、またはジメチルスルホキシド等の変性剤を使用してまたは使用せずに、温度を増加させることにより達成することができる。典型的には、６５％ホルムアミドのＴＥ溶液が室温で使用され、１〜２分間インキュベートされる。その後、ホルムアミドおよび伸長されたプライマーを、洗浄１緩衝液で洗い流す。
【０１０４】
テンプレートヌクレオチド２（ＮＴ２）を同定するには、配列決定用プライマーＰ１をテンプレート核酸にハイブリダイズさせる。ヌクレオチドＮ２が既知である第２のセットのオリゴヌクレオチドプローブＬ１をライゲーションさせる。その後、一連の検出、切断、およびライゲーションを、同じセットのオリゴヌクレオチドプローブＬ１を使用して繰り返して、テンプレートヌクレオチド８（ＮＴ８）を同定する。これは、必要なだけ繰り返すことができ、第３の連続後にはＮＴ１４が識別され、第４の連続後にはＮＴ２０が識別される等が可能になる。
【０１０５】
剥離およびプロービングを繰り返して、残りのＮ３〜Ｎ６全ておよびｓｓＤＮＡテンプレートのそれらの対応するヌクレオチドを連続的に同定する。
【０１０６】
ある実施形態２
図１、２、４、５，７および１１を参照すると、オリゴヌクレオチドＬ１の部分が、ｓｓＤＮＡテンプレートにハイブリダイズされ、ＤＮＡリガーゼにより配列決定用プライマーに共有結合で連結される。合計２４個のオリゴヌクレオチドプローブＬ１が、配列決定に必要である。更に、所与のセットのためのリポーターＲ１は、４つのフルオロフォアの１つであり、各セットは、電磁スペクトルの４つの異なる色で検出され、後に各ヌクレオチドの１つと関連づけられる（例えば、Ａは緑色、Ｃはオレンジ色、Ｇは青色、またはＴは赤色）。
【０１０７】
各オリゴヌクレオチドプローブセットは、使用前に、等モル比になるように調製される（例えば、各１μＭ）。テンプレートは、連続的に調査してもよいが（つまり、Ｎ１からＮ６まで）、そうである必要はない。上記セットは、ｓｓＤＮＡにハイブリダイズされ、ＤＮＡリガーゼにより配列決定用プライマーＰ１に共有結合で結合される。
【０１０８】
その後、４つのＲ１標識プローブ（ＢＰ１）のセットを添加して、プローブハイブリダイゼーション部位Ｂ１とハイブリダイズさせる。各ＢＰのセットは、ヌクレオチドＮの１つの同定と特異的に関連するように設計されており、ＢＰ１は、ヌクレオチドＮ１を同定するために使用される４つのＲ１標識１２ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを含み、ＢＰ２は、ヌクレオチドＮ２を同定するために使用される４つのＲ１標識１２ｍｅｒオリゴヌクレオチドを含む等である。
【０１０９】
バーコードプローブＢＰ１のプローブハイブリダイゼーション部位Ｂ１へのハイブリダイゼーションは、任意の好適な緩衝液中で実施することができる。洗浄１緩衝液を使用することができるが、よりイオン性の緩衝液、特にＮａ＋（例えば、ＰＢＳ、５×ＳＳＰＥ、結合および洗浄用）またはＭｇ２＋（折り畳み用緩衝液）が好ましい。１つの例では、５×ＳＳＰＥ中１ｕＭの標識プローブを、数秒から数分間（典型的には、１分または２分間）テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造とハイブリダイズさせる。その後、未ハイブリダイズ標識プローブを、５×ＳＳＰＥを使用して洗い流し、残部を検出する。
【０１１０】
検出時に、各色は、Ｎ１位のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）に関連づけられる。例として、所与のテンプレートで緑色のスペクトラムが検出される場合、Ｎ１ではＡが同定され、それに対応して、ＮＴ１では相補的対合塩基Ｔが同定される。
【０１１１】
検出後、上記セットのＢＰ１を、ＴＥ緩衝液を使用して洗い流す。
【０１１２】
その後、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を、Ｃ１においてオリゴヌクレオチドヘキサマープローブＬ１から分離する。
【０１１３】
第２のラウンドのライゲーションでは、上述の、第１のラウンドで使用した同じセットの４つのＬ１が使用される。また、それを、上述の同じセットの４つのＢＰ１で調査する。それにより、ｓｓＤＮＡテンプレートのＮＴ７を同定することが可能になる。切断、ライゲーション、およびハイブリダイゼーションの連続を必要なだけ繰り返して、第３の連続後にはＮＴ１３が識別され、第４の連続後にはＮＴ１９が識別される等が可能である。
【０１１４】
その後、この伸長された配列決定用プライマーＰ１を、テンプレートから剥離する。
【０１１５】
テンプレートヌクレオチド２（ＮＴ２）を同定するには、配列決定用プライマーＰ１をテンプレート核酸にハイブリダイズさせる。異なるセットの４つのオリゴヌクレオチドプローブＬ１をライゲーションさせる。例えば、上記セットのＬ１は、Ｎ２を識別するように設計されている。その後、第１のセットＬ１と共に使用した４つのＢＰ１のセットを、上述のようにハイブリダイズさせる。上述にように、同定を実施する。これにより、ＮＴ２の同定が可能になる。その後、切断、ライゲーション、ハイブリダイゼーション、および検出の連続を、この同じセットのＬ１を使用して繰り返して、テンプレートのＮＴ８を識別する。これは、必要なだけ繰り返すことができ、第３の連続後にはＮＴ１４が識別され、第４の連続後にはＮＴ２０が識別される等が可能になる。
【０１１６】
剥離およびプロービングを繰り返して、ヘキサマーの残りのＮ３〜Ｎ６位、およびｓｓＤＮＡテンプレートのそれらの対応するヌクレオチドを連続的に同定する。
【０１１７】
ある実施形態３
図１Ａ、２Ａ、４Ａ、および５Ａを参照すると、オリゴヌクレオチドプローブＬ１の部分が、ｓｓＤＮＡテンプレートにハイブリダイズされ、実施例ＩＶに記載のように、ＤＮＡリガーゼにより配列決定用プライマーに共有結合で連結される。テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造は、プローブハイブリダイゼーション部位を含む。合計４０９６個のオリゴヌクレオチドプローブＬ１が、配列決定に必要である。更に、所与の各４つのオリゴヌクレオチドプローブのセットのリポーターＲ１は、４つのフルオロフォアの１つであり、各セットは、電磁スペクトルの４つの異なる色で検出され、後に各ヌクレオチドの１つと関連づけられる（例えば、Ａは緑色、Ｃはオレンジ色、Ｇは青色、またはＴは赤色）。
【０１１８】
Ｌ１セットは、使用前に、等モル比になるように混合される（例えば、各０．２μＭ）。テンプレートは、連続的に調査されるが（つまり、Ｎ１からＮ６まで）、そうである必要はない。上記セットは、終濃度は０．１ｕＭでｓｓＤＮＡにハイブリダイズされ、ＤＮＡリガーゼによりＰ１に共有結合で結合さる。
【０１１９】
その後、６セットの４つの標識バーコードプローブ（ＢＰ１〜ＢＰ６）を順次添加して、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造のＢ１〜Ｂ６をハイブリダイズさせる（合計２４個の標識ＢＰ）。各セットは、Ｎの１つの識別と特異的に関連するように設計されており、ＢＰ１は、ヌクレオチドＮ１を同定するために使用される４つのＲ１標識１２ｍｅｒオリゴヌクレオチドからなり、ＢＰ２は、ヌクレオチドＮ２を同定するために使用される４つのＲ１標識１２ｍｅｒオリゴヌクレオチドからなる等である。
【０１２０】
ＢＰ１とＢ１とのハイブリダイゼーションは、任意の好適な緩衝液中で実施することができる。洗浄１緩衝液を使用することができるが、よりイオン性の緩衝液、特にＮａ＋（例えば、ＰＢＳ、５×ＳＳＰＥ、結合および洗浄用）またはＭｇ２＋（折り畳み用緩衝液）が好ましい。１つの例では、５×ＳＳＰＥ中１μＭのＢＰ１の等モル混合物を、数秒から数分間（典型的には、１分または２分間）テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造とハイブリダイズさせる。その後、未ハイブリダイズＢＰ１を、５×ＳＳＰＥを使用して洗い流す。
【０１２１】
検出時に、各色は、Ｎ１位のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）に関連づけられる。例として、所与のテンプレートで緑色のスペクトラムが検出される場合、Ｎ１ではＡが同定され、それに対応して、ＮＴ１では相補的対合塩基Ｔが同定される。
【０１２２】
検出後、ＢＰ１のセットを、ＴＥ緩衝液を使用して洗い流す。その後、ＢＰ２をＢ２にハイブリダイズさせ、検出する。同じテンプレートで、Ｇに対応する青色スペクトラムが検出される場合、以前にＮＴ１で同定されたＡに続いて、ＮＴ２ではＣが同定される。洗浄、ハイブリダイゼーション、および検出ステップの連続を、残りのＮ３〜Ｎ６位について繰り返す。このようにして、本発明者らは、ＮＴ１〜ＮＴ６のヌクレオチドを同定する。
【０１２３】
その後、テンプレート非ハイブリダイズ核酸構造を、Ｃ１にといてオリゴヌクレオチドヘキサマープローブＬ１から分離する。
【０１２４】
第２のラウンドのライゲーションでは、上述の、第１のラウンドで使用した同じ４０９６セットのＬ１が使用される。また、これを、６セットのＢＰ１〜ＢＰ６を連続的に使用して調査する。これにより、ＮＴ７〜ＮＴ１２の同定が可能になるだろう。これは、必要なだけ繰り返すことができ、３連続の切断、ライゲーション、ハイブリダイゼーション、および検出が実施される場合、合計１８個のヌクレオチド、６連続が実施される場合、２４個のヌクレオチド、１０連続が実施される場合、６０個のヌクレオチドを同定すること等が可能である。
【０１２５】
緩衝液
緩衝液は全て、別様の指定がない限り、蒸留水または脱イオン水（ＤＩ水）で調製し、ｐＨは、必要に応じてＮａＯＨ、ＫＯＨ、またはＨＣｌを使用して室温で調整し、その後フィルター（０．２２〜０．４５μＭメッシュ）でまたはオートクレーブで滅菌する。１％アミノシラン（容積／容積）：１容積の３−アミノプロピルトリエトキシシラン（Ｐｉｅｒｃｅ社  ＃８０３７０またはＳｉｇｍａ社  ＃Ａ３６４８）を９９容積のＤＩ水またはアセトンに添加する。滅菌はしない。直ちに使用すること。結合および洗浄緩衝液：５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐｈ８．０、１．０Ｍ  ＮａＣｌ。折り畳み用緩衝液１：５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２。折り畳み用緩衝液２：２０ｍＭＴｒｉｓ塩基、１０ｍＭ酢酸、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１２．５ｍＭ酢酸マグネシウム。ライゲーション緩衝液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭ  ＡＴＰ、ｐＨ７．６。ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４：１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４。５×ＳＳＰＥ緩衝液：７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４。ＴＥ緩衝液：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０。洗浄１緩衝液：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、０．０１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（容積／容積）。
【実施例】
【０１２６】
実施例Ｉ
配列決定するＲｏｌｏｎｙテンプレートは、ＩＤＴ社に注文した合成テンプレートを使用して調製し、ＴＥに再懸濁して１００μＭにした。合成ｓｓＤＮＡ配列は、以下の通りだった：３ｐＡ、／５ＰＨＯＳ／ＧＴＴ  ＣＣＴ  ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  Ａ  ＮＮＡ  ＮＮＣ  ＮＮＧ  ＮＮＴ  ＮＮＡ  ＮＮＣ  ＣＮＮ  ＡＮＮ  ＴＮＮ  ＧＮＮ  ＣＮＮ  ＡＮＮ  ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＣＣＧ  Ｇ；３ｐＣ、／５ＰＨＯＳ／ＧＴＴ  ＣＣＴ  ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  Ａ  ＮＮＣ  ＮＮＧ  ＮＮＴ  ＮＮＡ  ＮＮＣ  ＮＮＧ  ＧＮＮ  ＣＮＮ  ＡＮＮ  ＴＮＮ  ＧＮＮ  ＡＮＮ  ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＣＣＧ  Ｇ；３ｐＧ、／５ＰＨＯＳ／ＧＴＴ  ＣＣＴ  ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  Ａ  ＮＮＧ  ＮＮＴ  ＮＮＡ  ＮＮＣ  ＮＮＧ  ＮＮＴ  ＴＮＮ  ＧＮＮ  ＣＮＮ  ＡＮＮ  ＴＮＮ  ＡＮＮ  ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＣＣＧ  Ｇ；３ｐＴ、／５ＰＨＯＳ／ＧＴＴ  ＣＣＴ  ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  Ａ  ＮＮＴ  ＮＮＡ  ＮＮＣ  ＮＮＧ  ＮＮＴ  ＮＮＡ  ＡＮＮ  ＴＮＮ  ＧＮＮ  ＣＮＮ  ＡＮＮ  ＡＮＮ  ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＣＣＧ  Ｇ。
【０１２７】
これらのｓｓＤＮＡテンプレートを、別々に、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製Ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅ  ＩＩキット、＃ＣＬ９０２５Ｋを使用して環状化した。１０ＵのＣｉｒｃｌｉｇａｓｅ  ＩＩ酵素を、１０ｐｍｏｌのテンプレートを含有する２０μＬの総反応容積に添加し、６０℃で１時間インキュベートした。８０℃で１０分間インキュベートすることにより、反応を終了させた。未環状化産物は、存在したとしても、２０ＵのエキソヌクレアーゼＩ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ社  ＃Ｘ８０１Ｌ）および１００ＵのエキソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ  ＩＩＩ）を添加することにより消化し、３７℃で４５分間インキュベートし、８０℃で１５分間インキュベートすることにより終了させた。環状産物を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製カラムおよび試薬（ＱＩＡｇｅｎ社  ＃２８００４）を使用して精製した。
【０１２８】
これらの環状化ｓｓＤＮＡテンプレートを、別々に、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼキット（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ社  ＃Ｐ７０２Ｌ）を使用してＲＣＡで増幅した。１０Ｕのｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを、およそ１ｐｍｏｌの環状化テンプレートおよび１ｐｍｏｌのＲＣＡプライマー（ＩＤＴ社：ＡＡＴ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＧＣＡ＊Ｇ＊Ｃ）を含有する５０μＬの総反応容積中で使用し、３０℃で２時間インキュベートした。４５０μＬの１×ＰＢＳを添加して反応を停止させた。Ｒｏｌｏｎｙは、必要になるまで４℃に維持した。
【０１２９】
５×２ｃｍのシリコン片を、シリコンウエハ（ＳＶＭ社）から切り出し、その後、１容積／容積％の３−アミノプロピルトリエトキシシラン（Ｓｉｇｍａ社  ＃Ａ３６４８）を含有する溶液に３０分間浸漬した。このアミノシラン処理シリコンを、蒸留水ですすぎ、圧搾空気を使用して乾燥した。２片の両面テープ（３Ｍ  Ｓｃｏｔｃｈ社）を、およそ１ｃｍ離して互いに平行に配置し、顕微鏡カバーガラス（ＶＷＲ社  ＃１６００４−３４４）をテープの上に載せて、直線フローセルを製作した。
【０１３０】
４つのＲｏｌｏｎｙテンプレートを混合し、１×ＰＢＳで１：１０に更に希釈した。およそ６０μＬを、フローセルにロードし、３０分間結合させた。その後、未結合Ｒｏｌｏｎｙを、５００μＬの洗浄１で洗浄した。
【０１３１】
１００ｕＬの配列決定用プライマー混合物［５×ＳＳＰＥ中２μＭの配列決定用プライマー（ＩＤＴ社：／５ＰＨＯＳ／ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＣＣＧ  ＧＧＴ）］をフローセルにロードし、その後、５０℃で１分間インキュベートし、室温で５分間冷却した。
【０１３２】
４つの標識オリゴヌクレオチドヘアピンプローブのセットを使用した。Ｎ３は既知であり、テンプレートのＮＴ３、ＮＴ９、およびＮＴ１５を調査するために使用した：Ｈｒｐ−Ｍ３Ａ、／５ＴＹＥ５６３／ＡＣ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＡＣＡ  ＧＣＧ／ｉｄｅｏｘｙＵ／ＮＮＮ  ＡＮＮ）；Ｈｒｐ−Ｍ３Ｃ、／５ＴＥＸ６１５／ＡＣ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＡＣＡ  ＧＣＧ／ｉｄｅｏｘｙＵ／ＮＮＮ  ＣＮＮ；Ｈｒｐ−Ｍ３Ｇ、／５６−ＦＡＭ／ＡＣ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＡＣＡ  ＧＣＧ／ｉｄｅｏｘｙＵ／ＮＮＮ  ＧＮＮ；Ｈｒｐ−Ｍ３Ｔ、／５ＴＹＥ６６５／ＡＣ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＡＣＡ  ＧＣＧ／ｉｄｅｏｘｙＵ／ＮＮＮ  ＴＮＮ。
【０１３３】
オリゴプローブは、等モル比で混合した。１００μＬのライゲーション混合物［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭ  ＡＴＰ、４ｕＭのオリゴプローブミックス、および１２００ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ社  ＃Ｌ６０３−ＨＣ−Ｌ）］をフローセルにロードし、室温で３０分間インキュベーションした。未ライゲーションオリゴプローブを、５００μＬの洗浄１を使用して洗浄した。
【０１３４】
フローセルを、Ｐｏｌｏｎａｔｏｒ  Ｇ．００７（Ｄｏｖｅｒ社、Ｄａｎａｈｅｒ社系列）で画像化して、ＮＴ３を識別した。
【０１３５】
画像化した後、５’リン酸化配列決定用プライマーからなる未ライゲーション部位を、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＮＥＢ社  ＃Ｍ０２９０Ｌ）を使用してキャッピングした。１００μＬのホスファターゼ混合物［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオトレイトール、および５０Ｕアルカリホスファターゼ］をフローセルにロードし、室温で３０分間インキュベートした。その後、酵素を、５００μＬの洗浄１で洗い流した。
【０１３６】
キャッピングした後、ヘアピン構造のデオキシウリジンを、１０×Ｕｒａｃｉｌ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ社  ＃Ｙ９１８Ｌ）を使用して切断した。１００μＬのウラシル切断混合物［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオトレイトール、４０ＵのＵＤＧ、および２００ＵのＥｎｄｏ  ＶＩＩＩ］をフローセルにロードし、室温で３０分間インキュベートした。その後、フローセルを５００μＬの洗浄１で洗浄した。
【０１３７】
ライゲーション、画像化、キャッピング、および切断を、同じセットのオリゴプローブを用いて、更に２回、上述のように繰り返して、ＮＴ９およびＮＴ１５を連続して識別した。結果は、図８Ａ、８Ｂ、９Ａ、および９Ｂに示されている。
【０１３８】
図８Ａは、実施例Ｉに記載のように配列決定したＲｏｌｏｎｙの三色画像のグレイスケール写真である。ｓｓＤＮＡテンプレートの配列決定用プライマー部位下流の３番目の位置（左の画像）および９番目の位置（右の画像）の調査。凡例に示されている幾何学的形状はＲｏｌｏｎｙを示し、両画像で共通である。２つの位置間の塩基の変化は、形状の変化により観察することができる。オリジナル画像の一部のみが、１６倍に拡大されて示されている。
【０１３９】
図８Ｂは、実施例Ｉに記載のように配列決定したＲｏｌｏｎｙの三色画像のグレイスケール写真である。ｓｓＤＮＡテンプレートの配列決定用プライマー部位下流の９番目の位置（左の画像）および１５番目の位置（右の画像）の調査。凡例に示されている幾何学的形状はＲｏｌｏｎｙを示し、両画像で共通である。２つの位置間の塩基の変化は、形状の変化により観察することができる。オリジナル画像の一部のみが、１６倍に拡大されて示されている。
【０１４０】
図９Ａは、実施例Ｉに記載のように配列決定されたＲｏｌｏｎｙから３番目と９番目の位置間の塩基転移の割合を比較するヒストグラムである。例としては、実施例Ｉで使用したテンプレートに基づくと、大半のＡ（配列決定用プライマーから３位）がＧ（９位）に変化することが予想されるだろう。
【０１４１】
図９Ｂは、実施例Ｉに記載のように配列決定されたＲｏｌｏｎｙから９番目と１５番目の位置間の塩基転移の割合を比較するヒストグラムである。例としては、実施例Ｉで使用したテンプレートに基づくと、大半のＧ（配列決定用プライマーから９位）がＡ（１５位）に変化することが予想されるだろう。
【図１】
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【図１Ａ】
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【図２】
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【図２Ａ】
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【図３】
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【図４】
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【図４Ａ】
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【図５】
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【図５Ａ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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