(57)【要約】  本発明は、生物の生命に適合し海洋生態系（特に珊瑚礁の熱帯環境）を害しない日焼け止め自体の環境適合性組成物、特に人の健康を保護する日焼け止めに言及する。
2014521633.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む環境適合性日焼け止め組成物：
２，２’−メチレン−ビス−（６−（２H−ベンズニトラゾール−２−イル）−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノール、２−［４−（ジメチルアミン）−２−ヒドロキシベンゾイル］ヘキシルベンゾエート、エチルヘキシルトリアゾンから選択される１種又は２種以上のUVフィルター；
酢酸トコフェロール、トコフェロール、レチノール、緑茶から抽出されたポリフェノール化合物から選択される１種又は２種以上の抗酸化剤；
プロピレングリコールジカプリレート／ジカプレート、オリーブオイル、ビーズワックスから選択される１種又は２種以上の担体。
ただし、前記組成物は以下を含まない：
パラベンファミリーに属する防腐剤；
アスコルビン酸誘導体；
ビスエチルヘキシルオキシフェノールメトキシフェニルトリアジン、ケイヒ酸エステル、ベンゾフェノン、カンファー誘導体、チタニウムオキサイドから選択されるＵＶフィルター；
メラレウカエッセンシャルオイル、イランイラン花抽出物、バンボーサアルンジナシア（Bambousa Arundinacea）抽出物、カリテ（Karite）から選択される芳香剤。
【請求項２】
更にオレンジ、ラベンダー、グレープフルーツ、ガヴァ及びココナッツから選択される１種又は２種以上の芳香剤を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
更にソルビン酸を含む請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
２，２’−メチレン−ビス−（６−（２H−ベンズニトラゾール−２−イル）−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノール、２−［４−（ジメチルアミン）−２−ヒドロキシベンゾイル］ヘキシルベンゾエート、エチルヘキシルトリアゾンから選択される１種又は２種以上のUVフィルター；
酢酸トコフェロール、トコフェロール、レチノール、緑茶から抽出されたポリフェノール化合物から選択される１種又は２種以上の抗酸化剤；
プロピレングリコールジカプリレート／ジカプレート、オリーブオイル、ビーズワックスから選択される１種又は２種以上の担体；
水、
からなる請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
２，２’−メチレン−ビス−（６−（２H−ベンズニトラゾール−２−イル）−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノール、２−［４−（ジメチルアミン）−２−ヒドロキシベンゾイル］ヘキシルベンゾエート、エチルヘキシルトリアゾンから選択される１種又は２種以上のUVフィルター；
酢酸トコフェロール、トコフェロール、レチノール、緑茶から抽出されたポリフェノール化合物から選択される１種又は２種以上の抗酸化剤；
ソルビン酸；
プロピレングリコールジカプリレート／ジカプレート、オリーブオイル、ビーズワックスから選択される１種又は２種以上の担体；
水、
からなる請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
２，２’−メチレン−ビス−（６−（２H−ベンズニトラゾール−２−イル）−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノール及び／又は２−［４−（ジメチルアミン）−２−ヒドロキシベンゾイル］ヘキシルベンゾエート；
酢酸トコフェロール及び／又はトコフェロール；
ソルビン酸；
プロピレングリコールジカプリレート／ジカプレート、オリーブオイル、ビーズワックスから選択される１種又は２種以上の担体；
水；
オレンジ、ラベンダー、グレープフルーツ、ガヴァ及びココナッツから選択される１種又は２種以上の芳香剤からなる
請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
２，２’− メチレン−ビス−（６−（２H−ベンズニトラゾール−２−イル）−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノール及び／又は２−［４−（ジメチルアミン）−２−ヒドロキシベンゾイル］ヘキシルベンゾエート；
酢酸トコフェロール及び／又はトコフェロール；
ソルビン酸；
プロピレングリコールジカプリレート／ジカプレート、オリーブオイル、ビーズワックスから選択される１種又は２種以上の担体；
水；
オレンジ、ラベンダー、グレープフルーツ、ガヴァ及びココナッツから選択される１種又は２種以上の芳香剤；
ヒドロキシエチルセルロース及び／又はＥＤＴＡ及び／又は水酸化ナトリウム、
からなる請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
２，２’−メチレン−ビス−（６−（２H−ベンズニトラゾール−２−イル）−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノール、２−［４−（ジメチルアミン）−２−ヒドロキシベンゾイル］ヘキシルベンゾエート及びエチルヘキシルトリアゾン；
酢酸トコフェロール；
ソルビン酸；
プロピレングリコールジカプリレート／ジカプレート、オリーブオイル及びビーズワックス；
水；
ヒドロキシエチルセルロース；
ＥＤＴＡ；
水酸化ナトリウム、
からなる請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＵＶフィルターを３〜６重量％含む濃度で存在する請求項１から６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
クリーム、ローション、軟膏、スプレー又はリップスティックの形態である請求項１から６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
海洋環境及び特に珊瑚礁に有害でないことを特徴とする、請求項１から１０のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は環境適合性日焼け止め組成物、特に珊瑚礁を参照して、海洋環境及びそこに生息する海洋生物に適合する日焼け止めに関する。
【背景技術】
【０００２】
珊瑚礁は、世界で最も生物学的に生産的で多様性のある生態系の中にあり、海洋生態学の多様性のホットスポットを示し、そして５億人の人々を直接支持している（Moberg and Folke 1999, Wilkinson 2004）。珊瑚礁の約６０％は、現在、いくつかの自然及び人為的影響によって絶滅の危機に直面している（Hughes et al 2003; Pandolfi et al 2003）。過去２０年間で、珊瑚白化現象（石珊瑚目の珊瑚内で宿主とする共生褐虫藻の減少）は、頻度そして空間広がりの両方で劇的に増加している（Hoegh-Guldberg 1999; Hughes et al 2003; Knowlton 2001）。この現象は、気温異常、過剰な紫外線（ＵＶ）又は光合成放射の改変された有効性、及び病原菌の存在と汚染に関連している（Brown et al 2000; Bruno et al 2007; Douglas 2003; Glynn 1996; Jones 2004）。
【０００３】
パーソナルケア製品及び化粧品用日光製品の生産と消費は、環境汚染に関連する潜在的に重要な因果関係ともに世界的に増加している。これらの製品の発売は、また海洋珊瑚礁地帯の観光事業の急速な拡張に関連する（Wilkinson 2004）。日焼け止め製品及び他のパーソナル製品に含まれる化学化合物は、海水で検出可能なレベルに到達し得る（Daughton and Ternes 1999; Giokas et al 2007）。これらの化合物は、環境に対して潜在的に有害であり得る。それ故、日焼け止め製品の使用は現在、最も人気のある観光地のいくつか、例えば、メキシコの海洋エコパークでは禁止されている（Xcaret 2007; Xel-ha 2007）。日焼け止めは脂溶性であるから、そのＵＶフィルターは、水生生物に蓄積し（Giokas et al, 2007）、そして他の生態異物化合物として報告された化合物と類似する効果を引き起こす（Balmer et al 2005; Daughton and Ternes 1999）。
【０００４】
日焼け止めに含まれるパラベン防腐剤及びいくつかのＵＶ吸収体は、エストロゲン活性を有する（Daughton and Ternes 1999; Schlumpf et al 2004）。加えて、日焼け止めの成分は、毒性の副産物へこれらの薬剤の変化に伴うのと一緒に、様々な光分解を受けるであろうことが証明されている（Giokas et al. 2007,及びその文献）。また、日焼け止めは、海洋バクテリアに影響があることが証明されている（Danovaro and Corinaldesi 2003）。最近、日焼け止めと硬い珊瑚の白化との間の強固な関係が世界中で特殊な試験を通じて観察された（Danovaro et al. 2008）。特にこの研究で、日焼け止めに使用されるいくつかのＵＶ吸収体及びいくつかの市販の日焼け止め構成成分の珊瑚への有害な影響は分析されている。
【０００５】
本発明の目的は、珊瑚礁の海洋生態系に環境適合性のある日焼け止め組成物質を提供することによって、上述の欠点を解決することである。
【０００６】
発明の概要
市販の日焼け止めは、珊瑚礁の海洋環境に対して全ての潜在的に有害性のある様々な化学化合物、合成及び天然化合物を含む。本発明者らは驚くべきことに、物質単独及びそれらの間の組み合わせがこの型の海洋環境で害を引き起こさず、同時に太陽放射線から皮膚を遮蔽（sreening）する高い効果があるいくつかの物質を選んだ。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、２，２−メチレン−ビス−（６−（２Ｈ−ベンゾトリアゾール−２−イル）−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノール（IUPAC名はMBBT）、２−［４−（ジエチルアミン）−２−ヒドロキシベンゾイル］ヘキシルベンゾエート（ＩＵＰＡＣ名はＤＨＨＢ）、エチルヘキシルトリアゾン（ＩＵＰＡＣ名はＥＨＴ）から選択される１種又は２種以上のＵＶフィルターを含み、酢酸トコフェロール、トコフェロール、レチノール、緑茶から抽出されるポリフェノール化合物から選択される１種又は２種以上の抗酸化剤、及びパラベンファミリーに属する防腐剤を含まない環境適合性日焼け止め組成物である。
【０００８】
本発明の利点、特徴及びオペレーションモードは、下記の詳細に記載のいくつかの実施態様についての詳細な説明で明らかであるところ、それらは例として与えられているのであって限定することを目的とするものではない。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】扱われた系及びコントロール系（コントロール）で珊瑚の小さな塊（「生存するポリプと一緒の小さい枝上のもの」）に囲まれた水中のウイルス濃縮因子。試験された異なる扱いの様々な分類は、ａ）芳香剤、ｂ）クリーム、ｃ）抗酸化剤、ｄ）ＵＶフィルター、e）コントロールを示す。
【図２】扱われた系及びコントロール系で珊瑚の小さな塊に囲まれた水中の原核生物濃縮因子。試験された異なる扱いの様々な分類は、ａ）芳香剤、ｂ）クリーム、ｃ）抗酸化剤、ｄ）ＵＶフィルター、e）コントロールを示す。
【図３】培養試験中小さな塊に囲まれた水中に放出された総褐虫藻。試験された異なる扱いで様々な分類は、ａ）芳香剤、ｂ）クリーム、ｃ）抗酸化剤、ｄ）ＵＶフィルター、e）コントロールを示す。
【図４】日焼け防止めクリームの追加後褐虫藻の放出ダメージレベル。パネルは試験された扱いの異なる分類異、ａ）芳香剤、ｂ）クリーム、ｃ）抗酸化剤、ｄ）ＵＶフィルター、e）コントロール示す。
【図５】異なる培養時間の珊瑚の小さな塊。パネルａとｂは培養の０〜７２時間後のコントロール系を示す。パネルｃとｄは培養の０〜７２時間後の扱われた珊瑚の小さな塊を示す。
【図６】ＵＶ試験フィルターの光安定性。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、珊瑚礁の海洋生態系に環境適合する日焼け止め組成物に関する。
【００１１】
本願明細書において、定義として、珊瑚礁の「海洋生態系に環境適合する」は全体として海洋生物又はその群落又は生息環境に損傷も変化も引き起こさない製品を意味する。環境適合性製品は、それゆえに環境及び生物多様性の健康を保護するとして制限なしに使用できる。ここで報告された試験の中で、様々な化学物質にされた海洋生物の健康条件が、絶対的に無害の構成物を選ぶため評価された。生物分解性の製品の記載（いくつかの市販の製品に関連する記述）は環境に有害の可能性があり、そしてそれゆえに環境適合性でない可能性があり、生物分解性の概念として化合物の分解時間のみに関係する。
【００１２】
本発明の組成物は、ＭＢＢＴ、ＤＨＨＢ及びＥＨＴから選択される１種又は２種以上のＵＶフィルター；
酢酸トコフェロール、トコフェロール、レチノール、抹茶から抽出されるポリフェノール化合物から選択される１種又は２種以上の抗酸化剤を含み、パラベンファミリーに属する防腐剤を含まない。
【００１３】
本願明細書において、「パラベン」は、化粧品産業で防腐剤として使用される４−ヒドエロキシ安息香酸のエステル類を意味する。最も一般的なパラベンは、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン及びブチルパラベンである。
【００１４】
抹茶から抽出されるポリフェノールの例は、シグマで市販されているポリフェノン−６０（ＣＡＳ番号１３８９８８−８８−２）である。
【００１５】
ある態様において、本発明の組成物は、オレンジ、ラベンダー、グレープフルーツ、グアバ及びココナッツから選択される海洋環境に適合可能な１種又は２種以上の芳香剤を含んでよい。
【００１６】
本発明に適した芳香剤の例は、ＦＡＲＯＴＴＩ  ＳＲＬ会社から販売されており、グアバやココナッツ、天然ラベンダー、天然グレープフルーツ等であり、好ましくは製品の０．３％以下の濃度である。
【００１７】
保存期間を長くするために、ある態様において組成物は保存剤としてソルビン酸を含むところ、それは、ここで報告された試験から、他の化合物と共に珊瑚礁に対して有害性は示されなかった。
【００１８】
前記組成物は、例えば、クリーム、ローション、軟膏、スプレー、リップスティック等の異なる化粧品フォームで調製することができた。選択されたＵＶフィラー、抗酸化剤、芳香剤及び保存剤は、決定された化粧品フォームを製造するのに適した異なる担体（試験結果に従って）と一緒に混合された。
【００１９】
好ましくは、皮膚軟化機能を有する担体が使われ、プロピレングリコールジカプリレート／ジカプレート、オリーブオイル、ビーズワックスを含むグループから選択される。
【００２０】
プロピレングリコールジカプリレート／ジカプレート（ＣＡＳ番号：６８５８３−５１−７）は、プロピレングリコールの誘導体であり、プロピレングリコールと脂肪酸のジエステルで、特にプロピレングリコールジカプリレートとプロピレングリコールジカプレートの混合物である。この製品はＬａｂｒａｆａｃの名前で市販されている。
【００２１】
本発明に適するビーズワックス（ＣＡＳ番号：８０１２−８９−３）は、例えばＡｐｉｆｉｌの名前で市販されている。
【００２２】
実験例のセクションで報告されたデータは、フィルターのＭＢＢＴ、ＤＨＨＢ、抗酸化剤の酢酸トコフェロール及びトコフェロール、及び芳香剤のグアバ、ココナッツが、珊瑚に優れた環境適合性を有する化合物であることを証明する。
【００２３】
好ましくは、本発明の組成は、それゆえＭＢＢＴ又はＤＨＨＢ、酢酸トコフェリル又はトコフェリル及び随意的にグアバ及びココナッツの芳香剤を含むであろう。
【００２４】
本発明は、特に珊瑚礁に関連する海洋環境及び海洋生物の生息に適合できる日焼け止めとして使用する組成物で使用するのに適合した化合物の選択に基づいている。
【００２５】
日焼け止めとして一般に使用される化合物の大部分が、これらの環境に有害なことが証明されている。化合物としては、例えば以下のものである：
パラベンファミリーに属する防腐剤；
アスコルビン酸；
ビスエチルヘキシルオキシフェノールメトキシフェニルトリアジン（ＢＥＭＴ）、ケイ皮酸エステル、ベンゾフェノン、カンファー誘導体、酸化チタニウムから選択されるＵＶフィルター；
メラレウカエッセンシャルオイル、イランイラン花抽出物、バンボーサアルンジナシア（Bambousa Arundinacea）抽出物、カリテ（Karite）から選択される芳香剤；
動物由来脂質から選択される担体；
アルガンオイル
【００２６】
ある態様において、日焼け止め組成物は以下を含む：
２，２’−メチレン−ビス−（６−（２H−ベンズニトラゾール−２−イル）−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノール、２−［４−（ジメチルアミン）−２−ヒドロキシベンゾイル］ヘキシルベンゾエート、エチルヘキシルトリアゾンから選択される１種又は２種以上のUVフィルター；
酢酸トコフェリル、トコフェリル、レチノール、緑茶から抽出されたポリフェノール化合物から選択される１種又は２種以上の抗酸化剤；
プロピレングリコールジカプリレート／ジカプレート、オリーブオイル、ビーズワックスから選択される１種又は２種以上の担体。
そして前記組成物は以下を含まない：
パラベンファミリーに属する防腐剤及びアスコルビン酸誘導体；
ビスエチルヘキシルオキシフェノールメトキシフェニルトリアジン、ケイヒ酸エステル、ベンゾフェノン、カンファー誘導体、チタニウムオキサイドから選択されるＵＶフィルター；
メラレウカエッセンシャルオイル、イランイラン花抽出物、バンボーサアルンジナシア（Bambousa Arundinacea）抽出物、カリテ（Karite）から選択される芳香剤；
動物由来脂質及びアルガンオイルから選択される担体。
【００２７】
ある態様において、非常に高い環境適合性を持ち、それらは更にソルビン酸及び／又はオレンジ、ラベンダー、グレープフルーツ、グアバ及びココナッツから選択される１種又は２種以上の芳香剤を含む。
【００２８】
更に高い環境適合性の具体例として、組成物は以下から本質的になる：
２，２’−メチレン−ビス−（６−（２H−ベンズニトラゾール−２−イル）−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノール、２−［４−（ジメチルアミン）−２−ヒドロキシベンゾイル］ヘキシルベンゾエート、エチルヘキシルトリアゾンから選択される１種又は２種以上のUVフィルター；
酢酸トコフェリル、トコフェロール、レチノール、緑茶から抽出されたポリフェノール化合物から選択される１種又は２種以上の抗酸化剤；
プロピレングリコールジカプリレート／ジカプレート、オリーブオイル、ビーズワックスから選択される１種又は２種以上の担体；
水。
【００２９】
更に高い環境適合性の具体例として、組成物は以下から本質的になる：
２，２’−メチレン−ビス−（６−（２H−ベンゾトリアゾール−２−イル）−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノール、２−［４−（ジメチルアミン）−２−ヒドロキシベンゾイル］ヘキシルベンゾエート、エチルヘキシルトリアゾンから選択される１種又は２種以上のUVフィルター；
酢酸トコフェリル、トコフェロール、レチノール、緑茶から抽出されたポリフェノール化合物から選択される１種又は２種以上の抗酸化剤；
ソルビン酸；
プロピレングリコールジカプリレート／ジカプレート、オリーブオイル、ビーズワックスから選択される１種又は２種以上の担体；
水。
【００３０】
更にある態様において、組成物は以下から本質的になる：
２，２’−メチレン−ビス−（６−（２H−ベンゾトリアゾール−２−イル）−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノール及び／又は２−［４−（ジメチルアミン）−２−ヒドロキシベンゾイル］ヘキシルベンゾエート；
酢酸トコフェリル及び／又はトコフェロール；
ソルビン酸；
プロピレングリコールジカプリレート／ジカプレート、オリーブオイル、ビーズワックスから選択される１種又は２種以上の担体；
水；
オレンジ、ラベンダー、グレープフルーツ、ガヴァ及びココナッツから選択される１種又は２種以上の芳香剤。
【００３１】
更にある態様において、組成物は以下から本質的になる：
２，２’−メチレン−ビス−（６−（２H−ベンゾトリアゾール−２−イル）−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノール及び／又は２−［４−（ジメチルアミン）−２−ヒドロキシベンゾイル］ヘキシルベンゾエート；
酢酸トコフェロール及び／又はトコフェロール；
ソルビン酸；
プロピレングリコールジカプリレート／ジカプレート、オリーブオイル、ビーズワックスから選択される１種又は２種以上の担体；
水；
オレンジ、ラベンダー、グレープフルーツ、ガヴァ及びココナッツから選択される１種又は２種以上の芳香剤；
ヒドロキシエチルセルロース及び／又はＥＤＴＡ及び／又は水酸化ナトリウム。
【００３２】
更にある態様において、組成物は以下から本質的になる：
２，２’−メチレン−ビス−（６−（２H−ベンゾトリアゾール−２−イル）−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノール、２−［４−（ジメチルアミン）−２−ヒドロキシベンゾイル］ヘキシルベンゾエート及びエチルヘキシルトリアゾン；
酢酸トコフェリル；
ソルビン酸；
プロピレングリコールジカプリレート／ジカプレート、オリーブオイル及びビーズワックス；
水；
ヒドロキシエチルセルロース；
ＥＤＴＡ；
水酸化ナトリウム。
【００３３】
上述の全ての具体例は、個別に又は全体として試験された化合物からもっぱらなり、珊瑚礁に十分な環境適合性を有し（海洋生態系に潜在的に有害な他の化合物を加えなくても）、高い光安定性及び適切な化粧品処方の長期保存性を有する。
【００３４】
本発明の組成の中で、ＭＢＢＴ、ＤＨＨＢ及びＥＨＴは組成の３〜６重量％を含むパーセンテージで存在することができる。
実施例
【００３５】
以下の実施例は単に説明するためのものであり、本発明を限定するものではない（例えば、ＳＰＦやＵＶＡ／ＵＶＢ吸光度率は、製品の名目上のＳＰＦに従って特別に処方されなければならないように、重量及び濃度は単なる指標である）。各化合物の量は、重量パーセントで表される。
【００３６】
（例１）
ある具体的な態様において、本発明は、クリームの形態で以下の処方を有する。
【００３７】
【表１】
2014521633.tif 000003
【００３８】
（例２）
ある具体的な態様において、本発明は、クリームの形態で以下の処方を有する。
【００３９】
【表２】
2014521633.tif 000004
【００４０】
（例３）
ある具体的な態様において、本発明は、クリームの形態で以下の処方を有する。
【００４１】
【表３】
2014521633.tif 000005
【００４２】
（例４）
組成物の調製
組成物は、下記に示す方法で調製される。
表１中に示した相１及び３は、スターラーを用いて６５度で一緒に溶解する。相２は常に連続して撹拌しながら、同じ温度で別々に溶解する。同じ温度に到達すると、相２は相１と３を加え、全体を６５度で同じ時間混合する。均一なコンシステンシーを有する製品を得るために、室温で混合され、最後に、それから相４を加える。このように調製された３種類の組成物は、本願明細書の実施例のセクションで記載されているように試験された。
【００４３】
【表４】
2014521633.tif 000006
【００４４】
手順と実験データ
３．１．試験地域
フィールドアクティビティは、インドネシア、シラデン（Ｓｉｌａｄｅｎ）島、オノン（Ｏｎｏｎｇ）リゾートの海洋生物学研究所で実施した。その試験地域は、世界で最も重要な海洋保護地域の１つと考えられているブナケン（Ｂｕｎａｋｅｎ）自然公園に位置する。ブナケン自然公園は、おおよそフィリピン、インドネシア及びグレートバリアリーフを含む造礁珊瑚の生物多様性三角地帯の中央に位置する。全部で約６０５の褐虫藻珊瑚種はその珊瑚三角地帯で記録され（Veron et al., 2009）、その６６％は、共通するその地帯の全ての生態地域である。この多様性は、世界の総種の７６％に等しい。約４５０種の珊瑚種は、これまでインドネシア諸島で確認されている。ブナケン自然公園と付近の水は、多様性造礁性（リーフを作る）珊瑚群落を支え、硬質珊瑚の３９０種以上、６３属及び１５ファミリーを構成し、また、まだ記されていないいくつかの種を含む。珊瑚は、深さ、傾斜角度及び他の環境因子に関連して広く分布した異なる群落型を形成する。その地域は、世界的に珍しいと考えられるおおよそ２０種を含む珊瑚種の広く並んだ様々な地域的に重要な集団を支える。
【００４５】
ブナケン自然公園は、地域内多様性の異例のレベルを示す。最も豊富な場所は、インド太平洋地域全体の造礁珊瑚種全種お２５〜３０％以上を宿す。特に試験地域では、最近の調査で造礁珊瑚は、総珊瑚種の約９０％を数えたことが、浅いリーフから礁原の頂点に傾斜する浅水域で最も高い珊瑚の多様性が発生するのと一緒に報告された。これは、傾斜角度、他の要因との暴露及び照度の変化により生産される比較的より高い生息地異種に関連すると思われる。この試験地域で、ミドリイシ属の多くの固有種の発生が、最近報告された（Wallace et al., 2001）。ミドリイシ属は、リーフに囲まれたシラデン島でより大きい分類上のグループの１つである。ミドリイシ属は、世界中で認められる１１４種及びインドネシア諸島で確認されている９１種と一緒に、最も多様性の造礁性珊瑚種である（Wallace, 1999）。ミドリイシ属のような「生体構造の種」は、生命維持に必要な生態系要素であり、そしてそれらの豊富さの中の変化は、全リーフ群落の重大な力学である（Connel et al., 1997）。ミドリイシ属は、種の組成物の中で主要な役割と多くの現代のインドネシアリーフの豊富さを演じる（Suharsono, 1992）。
【００４６】
３．２．試験デザイン
現場での試験は、イシサンゴミドリイシ属の小さな塊（すなわち、約３〜６ｃｍの小さな枝状のもの）で実施した。その小さな塊を、存在する環境適合性日焼け止めクリームの組成物中に潜在的に含まれる既存の濃度の様々な成分の存在する中のミクロコスモスで培養した。特に珊瑚の小さな塊（それぞれ３０００以上のポリプを含む）は、リーフスロープの端の約３ｍに位置する同じコロニーからスキューバダイバーによって集められた。小さな塊のサンプリングは、ピンセットにより実施した。その小さな塊をウイルスと原核生物を取り除くため、０．０２μｍのフィルターで海水と一緒にろ過洗浄した。各ミクロコスモスは、２Ｌのろ過された海水で満たされた滅菌ポリエチレン袋（Whirl-pack, Nasco, Fort Atkinson, WI, 米国）中で浸された一連の小さな塊（n=3）のレプリケートを準備した。それぞれポジティブ及びネガティブコントロールと一緒に２０成分を試験するために、合計２７ミクロコスモスが準備された。取り扱い一覧、使用された化合物の濃度及びこのコントロール系が表２で報告される。ミクロコスモスを７２時間、当地の温度と光条件で培養した。
【００４７】
【表５】
2014521633.tif 000007
【００４８】
ネガティブ及びポジティブコントロール系（コントロール）の両方が使用された。ネガティブコントロールは、抗生物質ミトマイシンＣが使用された系であり、その物質は、現在販売されている全てのクリームの使用で起こるようなウイルス感染を引き起こす。したがって、それは、化合物の望ましくない反応のレベルを示すために提供する。ＢＬＫ  ＰＧ及びＢＬＫで示されたポジティブコントロールは、いかなる化合物も追加しない単なるミクロコスモスである。
【００４９】
【表６】
2014521633.tif 000008
【００５０】
３．３．ウイルス及び原核生物数の決定
珊瑚の小さな塊に囲まれた海水のサブサンプル（１５ｍＬ）を、実験開始時（Ｔ０）と培養後３及び６時間で集めた。サブサンプリングの後、海水は固定液を使用しない無菌テストチューブに移し、そしてウイルス及び原核生物の数の研究室の定量化分析まで−２０℃で保存した。
【００５１】
一旦研究室に搬入すると、水の試料はすぐに処理した。概略を説明するに、２００μLの海水を、０．０２μｍのポア・フィルタ（Ａｎｏｄｉｓｃフィルター；直径２５ｍｍ、Ａｌ２Ｏ３；Ｗｈａｔｍａｎ）を通じて予めろ過されたＭＩＬＬＩＱ水で１：１０に希釈し、２０μＬのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（原液希釈１：２０；Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）で着色した。フィルターを１５分間、暗闇で培養し、５０％リン酸緩衝液（６．７ｍＭ、ｐＨ７．８）及び０．２５％アスコルビン酸を含む５０％グリセロールを含有する少量のアンチフェードと一緒にグラススライドに取り付けた（Shibata et al. 2006; Helton et al. 2006; Wen et al. 2004）。スライドを、顕微鏡解析まで−２０℃で保存した。ウイルス及び原核生物の数は、落射蛍光顕微鏡（倍率、×１０００、Zeiss Axioplan）で少なくとも１０光場、すなわち、複製ごとに少なくとも２００細胞又はウイルスで検査することによって得られた。ウイルス（及び原核生物）濃縮は、ウイルス（及び原核生物）の数（abundance）と試験終了時のウイルス（及び原核生物）の数との間の比率で計算された。
【００５２】
３．４  褐虫藻数
珊瑚の小さな塊で囲まれた海水のサブサンプル（５０ｍＬ）を培養の試験開始時（Ｔ０）及び６、１２、２４、３６、４８及び７２時間後に集めた。サブサンプルは、３％のグルタアルデヒドで固定し、それから約６．０ｍＬの各レプリケートを２．０μｍのポリカーボネートのフィルターを通じてろ過した。フィルターをグラススライドに取り付け、褐虫藻を標準及びＵＶ光を使用する落射蛍光顕微鏡（Zeiss Axioplan, Carl Zeiss Inc., Jena, ドイツ；×４００及び×１０００）で数えた。色、自己蛍光、及びグロス細胞構造に基づいて、小さな塊から放出又は抽出された褐虫藻を、ａ）健康（H、茶／明るい黄色、無傷／良い状態の褐虫藻）；ｂ）青白い（Ｐ，淡黄色、空胞のある、部分的に退化された褐虫藻；透明（Ｔ，色素形成の不足、空の褐虫藻；Misa and Hidaka 2003）として分類した。
【００５３】
３．５  珊瑚白化現象の定量化
珊瑚白化現象のレベルを定量するために（Siebeck et al. 2006）、比色分析を珊瑚のデジタル写真で実施し、試験開始時及び培養後６、１２、２４、３６、４８及び７２時間後に撮った。写真は、背景の目盛りメーターと一緒にCanon PowerShot A620デジタルカメラで同一の照度下で撮影した。写真の分析をカラー合成［シアン、マジェンダ、イエロー、ブラック（ＣＭＹＫ）］の写真編集ソフトウェア（Adobe Photoshop CS2）で連続的にによりを測定した。異なるカラー合成（ＣＭＹＫ）の百分率の変化は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）で分析した。試験化合物による白化効果をランク付けするために、Ｂｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓの相似行列を準備し、そして扱われた珊瑚のＣＭＹＫカラー合成の変化の多次元尺度分析を、Ｐｒｉｍｅｒ５．０ソフトウェア（Primer-E Ltd., Plymouth、イギリス）を使用して実施した。白化の速度をＰｒｉｍｅｒ５．０ソフトウェア（Primer-E Ltd）のＳＩＭＰＥＲツールを使用して扱われた珊瑚とコントロール珊瑚との間のＣＭＹＫカラー合成の相違として測した。
【００５４】
４．結果
４．１ウイルス及び原核生物の数
ウイルスの数は、培養試験中、約１桁で著しく増加した。ウイルス濃縮は、ＢＬＫＰＧ及びＤ０８系で１．９から３７．４の範囲であった（表１）。試験終了時のウイルスの数はＢＬＫ  ＰＧ及びＤ１５系でそれぞれ０．４４から３１．２×１０５ウイルス／ｍＬの範囲であった。原核生物の数は、培養試験中１桁から２桁で増加した。原核生物濃縮因子は、広範囲で変動した（表２）。Ｄ１１系でその濃縮因子が７８．１６であったのに対し、最も低い濃縮因子（１．８８）は、ＢＬＫ  ＰＧ系で観察された。培養後ウイルスと原核生物の間の数（ＶＰＲ）の比率のわずかな減少は、ＶＰＲは長い間安定なままＤ０７及びＢＬＫ系を除く全ての系で観察された。ＶＰＲはＤ２２系で１０倍まで減少した。
【００５５】
４．２．褐虫藻の数
培養の開始時に、ミクロコスモスで、褐虫藻の放出は見出されなかった。褐虫藻の数は、考えられた全てのミクロコスモスでゆっくり時間をかけて増加した。原核生物の最終的な数は、それぞれＤ１１系（Ｊｏｙｆｕｌ  ６００２９ＭＣを植菌した）及びＤ１８系（２−ホスホ−Ｌ−アスコルビックアシッドトリソディウム塩を摂取した）で、０．８５から４．４５×１０４細胞／ｍｌの範囲で、珊瑚の小さな塊で囲まれた水中で見出された（表３ａ,ｂ,ｃ,ｄ,ｅ）。
【００５６】
いくつかの場合、放出された褐虫藻の数は、コントロール系よりも扱われた系のほうが低かった。Ｄ１５、Ｄ１６、Ｄ１７及びＤ１８系だけで放出された細胞の数は、ＢＬＫ系（Ｐ＜０．０１）よりもきわめて高いことが統計分析で明らかとなった。全ての他の化合物において、有意差はコントロール系と試験系（Ｄ１５、Ｄ１６、Ｄ１７及びＤ１８を除く）との間で見出されなかった。試験された前記化合物の存在により、珊瑚からの褐虫藻放出の速度が増大されないことを示唆するものである。
【００５７】
顕微鏡による分析の間、観察された褐虫藻を、材料及び方法のセクションで記載したように、３つの主なグループ（健康、青白い及び透明）に分けた。培養の終わりで、各グループは、珊瑚の小さな塊に囲まれた水中で異なる数を示した（表４）。青白い及び透明の褐虫藻は、全ての実験系で、総放出褐虫藻の平均４４％及び５０％に相当する主要集団であった。健康な褐虫藻は、いつも０から２１％の範囲で、より小さな分画を示した。
【００５８】
健康細胞の低い数は、ネガティブコントロール（ＢＬＫ）を含む全ての検討された系において、試験の培養時間が褐虫藻に対する高いレベルのダメージを引き起こすことを示唆する。
【００５９】
４．３．珊瑚白化現象
ミクロコスモス（コントロール系を含む）の全てのレプリケートにおいて、珊瑚粘液の放出（褐虫藻及び珊瑚組織を含む）が、培養の最初の４８時間以内に観察された。この観察は、セクション４．２．で報告された褐虫藻の放出の結果に従うものである。珊瑚断片による粘液放出は、サンプリング及びミクロコスモスの準備の間起こされる機械的ストレスに関連する可能性があった。すべてのミクロコスモス（ＢＬＫ系も含まれる）において、７２時間培養後、色のわずかな変化が、培養によって誘発されたストレスの結果のように潜在的に起こされた珊瑚の小さな塊で観察された。最も明白な変化は、全ての４色チャネルが培養の終了時にはっきりと変わるＤ１８系及びＭＩＴＯ系で観察された。Ｄ０５、Ｄ０８及びＢＬＫ  ＰＧ系において、４色のチャネルのうち３つは、変化を見せた。全ての他の系において、２又は１色のチャネルは、わずかな変化を見せた。Ｄ０１、Ｄ０４、Ｄ０５、Ｄ１３、Ｄ１４、Ｄ１９、Ｄ２０及びＢＬＫ系は、１色のチャネルのみ変化を見せたのに対し、Ｄ０３、Ｄ０９、Ｄ１０、Ｄ１１，Ｄ２１系は、２色チャネルで変化を見せた。他の実験系において、色の変化は試験された小さな塊で感知されなかった。
【００６０】
４．４長波長紫外線にさらされた日焼け止めクリームの光安定性（〜２７５ｋＪ／ｍ２）
２ｍｇ／ｃｍ２のクリームをスライドガラス（５×５ｃｍ）に広げ、長波長紫外線にさらした。
・長波長紫外線の吸光度、３２０−４００ｎｍ（ＤＨＢＢフィルターに対応するピーク）は、中波長紫外線、２９０−３２０ｎｍ（ＥＨＴフィルターに対応するピーク）に関して高すぎる。長波長紫外線の吸光度は、中波長紫外線の吸光度の約１／３のはずである。
・広範囲スペクトルフィルターのスペクトル、２９０〜３２０ｎｍ、ＭＢＢＴは、ＤＨＨＢ及びＥＨＴより低い消滅係数のため、視認できないので、後の吸光度によってカバーされる。ＭＢＢＴは、最大及び最小ピークを除く広範囲スペクトルとして現れるはずである。
・現在のところ、得られた吸光度は、高及び低ＳＰＦの日焼け止めクリームの範囲内に収まる。
・結果によると、フィルターは高い光安定性があると結論付けることができる。
【００６１】
４．５珊瑚礁の試験生成物の試験環境適合性に使用された判断基準の概要
各グループの化合物（例えば、主成分クリーム、香料、抗酸化剤及びフィルター）の最も環境適合性のある生成物を選ぶために、以下の判断基準を選択した。
珊瑚白化レベル
共生褐虫藻の放出度合い
褐虫藻健康条件
コントロール群と一緒の培養培地におけるウイルス増殖
【００６２】
【表７】
2014521633.tif 000009
【００６３】
【表８−１】
2014521633.tif 000010
【表８−２】
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【００６４】
【表９−１】
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【表９−２】
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【００６５】
【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【００６６】
参考文献
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2014521633.tif 000018
【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【国際調査報告】
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