(57)【要約】  組成物及び血管新生、転移、又は双方を阻害する方法におけるその使用が提供され、ここで、前記組成物は、pyrodach-4のようなホスファプラチンを含む。いくつかの実施形態において、組成物及び感受性及び耐性の癌を治療する方法におけるその使用が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生を阻害する方法において使用される組成物であって、
(a)式(I)を有する(1R,2R)-pyrodach-4
【化１】
2014502634.tif 000021
又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和物、
(b)式(II)を有する(1S,2S)-pyrodach-4
【化２】
2014502634.tif 000022
又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和物、又は
(c)これらの組合せ
を含み、
前記組成物が、それを必要としている対象に治療有効量で投与されたときに、前記対象の少なくとも1種の内皮細胞、癌細胞、又は双方において血管新生と関連した少なくとも1種の表面分子の遺伝子発現の変更を引き起こし、
前記内皮細胞、癌細胞、又は双方が、卵巣、脳、胃、膀胱、乳房、肺、又は膵臓の組織由来である、前記組成物。
【請求項２】
転移を阻害する方法において使用される組成物であって、
(a)式(I)を有する(1R,2R)-pyrodach-4
【化３】
2014502634.tif 000023
又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和物、
(b)式(II)を有する(1S,2S)-pyrodach-4
【化４】
2014502634.tif 000024
又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和物、又は
(c)これらの組合せ
を含み、
前記組成物が、それを必要としている対象に治療有効量で投与されたときに、前記対象の少なくとも1種の癌細胞においてE-カドヘリンの増加を引き起こし、
前記少なくとも1種の癌細胞が、卵巣、脳、胃、膀胱、乳房、肺、及び膵臓の癌細胞から選択される、前記組成物。
【請求項３】
血管新生を阻害する方法であって、
それを必要としている対象に、
(a)式(I)を有する(1R,2R)-pyrodach-4
【化５】
2014502634.tif 000025
又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和物、
(b)式(II)を有する(1S,2S)-pyrodach-4
【化６】
2014502634.tif 000026
又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和物、又は
(c)これらの組合せ
を含む組成物の治療有効量を投与するステップ
を含み、
投与される前記治療有効量が、前記対象の少なくとも1種の癌細胞において、血管新生と関連した少なくとも1種の表面分子の、遺伝子発現を変更するのに十分である、前記方法。
【請求項４】
前記少なくとも1種の癌細胞が、卵巣、脳、胃、膀胱、乳房、肺、及び膵臓の癌細胞から選択される、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも1種の癌細胞が、シスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチンのうちの少なくとも1種に耐性である、請求項3に記載の方法。
【請求項６】
投与される前記治療有効量が、前記対象の少なくとも1種の癌細胞において、p53上方制御性アポトーシス調節因子(PUMA)、ホスファターゼ・テンシンホモログ(PTEN)、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー6(Fas)、Fasリガンド(FasL)、カスパーゼ-3(CASP3)、カスパーゼ-9(CASP9)、及びBCL-2結合Xタンパク質(Bax)のうちの少なくとも1種の、遺伝子発現を上昇させるのにも十分である、請求項3に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも1種の癌細胞が、シスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチンのうちの少なくとも1種に耐性である、請求項4に記載の方法。
【請求項８】
投与される前記治療有効量が、血管内皮増殖因子受容体-2(VEGFR-2)表面分子の遺伝子発現を低下させるのに十分である、請求項3に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が、担体、希釈剤、補助剤、及びビヒクルから選択される少なくとも1種の薬学的に許容される成分をさらに含む、請求項3に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、又はこれらの組合せをさらに含む、請求項3〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象が哺乳動物である、請求項3〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象がヒトである、請求項3〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が、単離された、単量体のpyrodach-4を含む、請求項3に記載の方法。
【請求項１４】
転移を阻害する方法であって、
それを必要としている対象に、
(a)式(I)を有する(1R,2R)-pyrodach-4
【化７】
2014502634.tif 000027
又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和物、
(b)式(II)を有する(1S,2S)-pyrodach-4
【化８】
2014502634.tif 000028
又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和物、
(c)これらの組合せ
を含む組成物の治療有効量を投与するステップ
を含み、
投与される前記治療有効量が、前記対象の少なくとも1種の癌細胞においてE-カドヘリンを増加させるのに十分である、前記方法。
【請求項１５】
卵巣、脳、胃、膀胱、乳房、肺、及び膵臓の癌細胞から選択される少なくとも1種の癌細胞においてE-カドヘリンが増加される、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも1種の癌細胞が、シスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチンのうちの少なくとも1種に耐性である、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
投与される前記治療有効量が、前記対象の少なくとも1種の癌細胞において、p53上方制御性アポトーシス調節因子(PUMA)、ホスファターゼ・テンシンホモログ(PTEN)、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー6(Fas)、Fasリガンド(FasL)、カスパーゼ-3(CASP3)、カスパーゼ-9(CASP9)、及びBCL-2結合Xタンパク質(Bax)のうちの少なくとも1種の、遺伝子発現を上昇させるのにも十分である、請求項14に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が、担体、希釈剤、補助剤、及びビヒクルから選択される少なくとも1種の薬学的に許容される成分をさらに含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、又はこれらの組合せをさらに含む、請求項14〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が哺乳動物である、請求項14〜19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象がヒトである、請求項14〜19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物が、単離された、単量体のpyrodach-4を含む、請求項14に記載の方法。
【請求項２３】
血管新生及び転移を阻害する方法であって、
それを必要としている対象に、
(a)式(I)を有する(1R,2R)-pyrodach-4
【化９】
2014502634.tif 000029
又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和物、
(b)式(II)を有する(1S,2S)-pyrodach-4
【化１０】
2014502634.tif 000030
又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和物、
(c)式(III)を有するcis-pyrodach-4
【化１１】
2014502634.tif 000031
又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和物、又は
(d)これらの組合せ
を含む組成物の治療有効量を投与するステップ
を含み、
投与される前記治療有効量が、前記対象の少なくとも1種の癌細胞において血管内皮増殖因子受容体-2(VEGFR-2)の遺伝子発現を低下させE-カドヘリンを増加させるのに十分である、前記方法。
【請求項２４】
前記少なくとも1種の癌細胞が、卵巣、脳、胃、膀胱、乳房、肺、及び膵臓の癌細胞から選択される、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも1種の癌細胞が、シスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチンのうちの少なくとも1種に耐性である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物が、担体、希釈剤、補助剤、及びビヒクルから選択される少なくとも1種の薬学的に許容される成分をさらに含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、又はこれらの組合せをさらに含む、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記対象が哺乳動物である、請求項23〜27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象がヒトである、請求項23〜27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
血管新生又は転移を阻害する方法であって、対象由来の組織又は試料の細胞を、
(a)式(I)を有する(1R,2R)-pyrodach-4
【化１２】
2014502634.tif 000032
(b)式(II)を有する(1S,2S)-pyrodach-4
【化１３】
2014502634.tif 000033
(c)式(III)を有するcis-pyrodach-4
【化１４】
2014502634.tif 000034
及び薬学的に許容されるこれらの塩
から選択される化合物と接触させるステップを含む方法。
【請求項３１】
前記組織又は試料が腫瘍由来である、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象が哺乳動物である、請求項30又は31に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象がヒトである、請求項30又は31に記載の方法。
【請求項３４】
増殖性細胞においてアポトーシス細胞死を誘導する方法であって、前記増殖性細胞を、
(a)式(I)を有する(1R,2R)-pyrodach-4
【化１５】
2014502634.tif 000035
(b)式(II)を有する(1S,2S)-pyrodach-4
【化１６】
2014502634.tif 000036
(c)式(III)を有するcis-pyrodach-4
【化１７】
2014502634.tif 000037
及び薬学的に許容されるこれらの塩
から選択される化合物と接触させるステップを含む方法。
【請求項３５】
前記増殖性細胞が、増殖性疾患を有する対象から又は前記対象において得られる、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
前記対象が哺乳動物である、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
前記対象がヒトである、請求項35に記載の方法。
【請求項３８】
前記増殖性細胞が、卵巣、脳、胃、膀胱、乳房、肺、及び膵臓の癌細胞から選択される、請求項34〜37のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ホスファプラチン(phoshaplatin)の抗血管新生、抗転移、及びアポトーシス促進の特性;組成物及び血管新生の阻害、転移の阻害、アポトーシスの促進、又はこれらの組合せのためのそれらの使用;並びに組成物及び耐性及び進行癌の治療のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
毎年数千万人が癌と診断され、毎年数百万人が世界中で優位を占める死因であるこの疾患から死亡しているので、新規抗癌療法の価値を過小評価することはできない。癌が診断されると、その患者の治療結果は、例えば、癌が早期に診断されたかどうか、癌が身体全体にわたって広がっているかどうか、及び癌が既知の化学療法レジメンに耐性であるか又は耐性になっているかどうかといった因子に大きく依存する。
【０００３】
白金ベースの抗癌薬であるシスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチンは、卵巣癌、精巣癌、非小細胞肺癌、及び大腸癌等の多様な癌を治療するために広く使用されている。これらの化合物は、広範囲の多岐にわたる癌を治療するために、放射線療法を含む他の治療レジメンと組み合わせて使用してもよい。白金化合物を利用したアジュバント治療様式における近年の臨床試験により、多種多様な他の癌を有効に治療するための白金化合物の潜在可能性が強調されている。例えば、近年の躍進的な研究により、糖尿病薬であるロシグリタゾンが、複数の型の癌を治療するためにカルボプラチンと組み合わせて有効に使用され得ることが示唆されている。これにより、絶えず拡大している白金ベースの抗癌薬の用途に今や新たな次元が追加された。大部分のアジュバント療法は、主として、癌又は放射線の薬と他の癌の薬との組合せに限定されているからである。したがって、白金ベースの新しい抗癌薬、並びに白金ベースの抗癌薬の新しい適用法に対する継続した必要性が残されている。
【０００４】
シスプラチンなどの従来の白金化学療法剤は、特に高用量で、主に転写阻害を通して及び複製阻害プロセスを通して細胞周期のG2期にアポトーシスを開始させる。鎖内及び鎖間の双方の様式による、グアニン及びアデニン塩基のN7位を介したDNAへの共有結合は、アポトーシス(プログラム細胞死)につながる細胞応答のカスケードの始動において鍵となる分子事象であると考えられている。シスプラチンの細胞及び分子金属生化学の複雑性、並びに細胞毒性の分子機序についての理解において、数多くの難題が一つに結びつけられた。簡単に説明すると、白金化DNA(platinated DNA)が細胞毒性の開始の中心にあることが示された。白金が結合したDNAは、高移動度タンパク質(HMG)によって隔離され、したがって、ヌクレオチド除去修復(NER)酵素による修復に影響を及ぼす。さらに、これらの白金-DNA付加物は、p53転写因子を活性化して、ヒストンリン酸化を誘発し、クロマチン凝縮を開始させると考えられている。
【０００５】
白金ベースの化学療法剤は、癌を治療するために広く使用されているにもかかわらず、多数の患者におけるそれらの適用は、腎毒性、神経毒性、聴器毒性、骨髄抑制等の重度の副作用、及び白金金属薬に対する耐性獲得の理由で限定されている。例えば、かなりの百分率の患者がシスプラチン治療に耐性になる。カルボプラチンでは、シスプラチンよりもいくらか毒性が低減されるが、耐性は緩和されない。現在、オキサリプラチンは、大腸癌の治療に承認されているが、その耐性はほとんど調査されていない。
【０００６】
当技術分野には、従来の白金ベースの化学療法剤に対する耐性の発生についての分子レベルでの理解及びこうした耐性を解決する方法がない。理解は不完全であるが、結合した白金をDNAから除去することによってDNA損傷を修復する能力が、この耐性の機序に主に寄与していると考えられている。上述のことを考慮して、DNA修復機構の作用を受けにくい薬剤の開発を含む、白金薬に対する耐性を解決する方法に対する継続した必要性がある。
【０００７】
種々の実施形態において、米国特許第7,700,649号(Bose)及び米国第12/722,189号(Bose)は、新しいクラスの白金錯体、即ち、白金金属中心を有するピロホスファト(pyrophosphato)錯体に関与する、合成の経路及び癌の治療方法を開示することによって、当技術分野におけるこれらの必要性のうちのいくつかを満たしている。開示されている化合物及び方法は、DNAに共有結合せず、それ故にDNA修復に基づく耐性を無効にする、一クラスの白金抗腫瘍剤を作製することに基づいた薬剤開発戦略の一部である。この戦略は、従来の白金薬開発アプローチからのパラダイムシフトであり、そこでは、DNA結合が、より効率的な白金抗癌剤の開発における中心的なテーマである。
【０００８】
ピロホスファト白金錯体の中で、米国特許第7,700,649号(Bose)及び米国出願番号第12/722,189号(Bose)に開示されているのは、「dach-2」及び「pyrodach-2」とも呼ばれる、ラセミ体のtrans-(±)-1,2-シクロヘキサンジアミン(ピロホスファト)白金(II)、並びに、「dach-4」及び「pyrodach-4」とも呼ばれる、ラセミ体のtrans-(±)-1,2-シクロヘキサンジアミン-trans-ジヒドロキソ(ピロホスファト)白金(IV)である。これらのラセミ錯体は、数種の癌の治療に効果的であることが見出された。しかし、これらの代替の使用を含む、これらの化合物についての多くは未知のままである。したがって、出願人の以前の出願は、当技術分野の現況を進捗させたが、それでもやはり、こうした白金錯体の新しい治療的使用に対する継続した必要性が残されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第7,700,649号
【特許文献２】米国第12/722,189号
【発明の概要】
【００１０】
本出願は、この継続した必要性を満たし、ホスファプラチンの有用性をさらに拡大させるものである。種々の実施形態において、提供されるのは、血管新生の阻害、転移の阻害、アポトーシスの促進、又はこれらの組合せにおいて使用されるホスファプラチンを含む組成物である。加えて提供されるのは、癌を治療するための新規なアプローチにおいてホスファプラチン、及びホスファプラチンを含む組成物を使用する方法であり、このとき、治療は、癌の発生及び発達に関与する特定の細胞間相互作用を標的とし得る。例えば、本出願は、新しい血管の発生又は既存の血管の再成長若しくは再構築を標的とする選択肢を提供する。いくつかの実施形態において、癌細胞に関係した血管の発生を標的としてもよく、同様に、腫瘍の発生に貢献する状態をもたらす内皮細胞に関係した血管の成長又は再構築を標的としてもよい。もう一つの例として、本出願は、転移を予防又は阻害する選択肢を提供し、それにより、治療を患部に限局及び隔離するより良い選択肢をもたらす。
【００１１】
本明細書中に開示の種々の実施形態は、血管新生、転移、又は双方の阻害において使用されるホスファプラチンを含む組成物を詳述している。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、
(a)式(I)を有する(1R,2R)-pyrodach-4
【化１】
2014502634.tif 000002
【００１２】
又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和物、
(b)式(II)を有する(1S,2S)-pyrodach-4
【化２】
2014502634.tif 000003
【００１３】
又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和物、
(c)式(III)を有するcis-pyrodach-4
【化３】
2014502634.tif 000004
【００１４】
又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和物、又は
(d)これらの組合せ
を含んでいてもよい。
【００１５】
いくつかの実施形態において、提供される組成物は、担体、希釈剤、補助剤(adjuvant)、及びビヒクルから選択される少なくとも1種の薬学的に許容される成分をさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、シスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチンのうちの1種以上も含んでいてもよい。特定の実施形態において、該組成物は、増殖性細胞においてアポトーシス細胞死を誘導するために投与される。
【００１６】
種々の実施形態において、さらに提供されるのは、提供された該組成物を使用して、血管新生、転移、又は双方を阻害する意図された方法であり、前記方法は、それを必要としている対象に、提供された組成物の治療有効量を投与することを含む。いくつかの実施形態において、投与される該有効量は、該対象の少なくとも1種の内皮細胞、癌細胞、又は双方において少なくとも1種の細胞表面分子の遺伝子発現を変更するのに十分である。好適な細胞の例としては、卵巣、脳、胃、膀胱、乳房、肺、及び膵臓の組織の内皮細胞又は癌細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、癌細胞は、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、又はこれらの組合せに対して耐性であってもよい。少なくとも1種の細胞表面分子の非限定的な例は、E-カドヘリンであり、このとき、投与される該有効量は、該対象の少なくとも1種の癌細胞においてE-カドヘリンを増加させるために投与される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載の1種以上の化学物質又は組成物の、投与される治療有効量は、血管内皮増殖因子受容体-2(VEGFR-2)表面分子の遺伝子発現を低下させるのに十分である。いくつかの実施形態において、投与される該治療有効量は、p53上方制御性アポトーシス調節因子(PUMA)、ホスファターゼ・テンシンホモログ(PTEN)、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー6(Fas)、Fasリガンド(FasL)、カスパーゼ-3(CASP3)、カスパーゼ-9(CASP9)、BCL-2結合Xタンパク質(Bax)、又はこれらの組合せの遺伝子発現を上昇させるのに十分である。種々の実施形態のうちのいくつかにおいて、投与される該有効量は、該対象の少なくとも1種の癌細胞においてE-カドヘリンを増加させるのに十分である。いくつかの実施形態において、該対象の少なくとも1種の癌細胞において、E-カドヘリンが増加すると同時に、血管内皮増殖因子受容体-2(VEGFR-2)の遺伝子発現が低下する。
【００１８】
本発明及びその多数の実施形態のより完全な評価は、以下のような添付の図面と共に考慮されたときに以下の詳細な説明を参照することによってより良く理解されるようになるので、容易に得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】A (R,R)-pyrodach-4; B (S,S)-pyrodach-4; C cis-pyrodach-4; D (R,R)-pyrodach-2; E (S,S)-pyrodach-2;及びF cis-pyrodach-2についての構造を示す図である。
【図２】pyrodach-4でA2780細胞を24時間処理する前及び後のE-カドヘリンタンパク質(下左)について染色された細胞の免疫蛍光画像の比較を示す図であり、pyrodach-4がE-カドヘリンを増加させ得ることを示している。
【図３】遺伝子機能の特定、遺伝子を経路に分類するための遺伝子対の機能的関連性の評価、薬剤標的の特定、及び薬剤の作用機序の決定(株におけるpyrodach-4の効果等)に使用され得る、プールされたスクリーンに関連したステップを説明する図である。
【図４】A2780細胞における、p-53阻害剤(ピフィスリン-α(PFT-α)、15μM)及びPI3K阻害剤(LY294002、30μM)の非存在下及び存在下でpyrodach-4及びシスプラチンによって誘導されるアポトーシス細胞死の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を示す図である。
【図５】A2780/C30細胞における、p-53阻害剤(PFT-α、15μM)及びPI3K阻害剤(LY294002、30μM)の非存在下及び存在下でpyrodach-4及びシスプラチンによって誘導されるアポトーシス細胞死の酵素結合免疫吸着(ELISA)を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本開示の特定の実施形態についてこれから説明する。しかし、本発明は、異なる形態で実施されてもよく、本明細書中に記載の実施形態に限定されるものとして解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的且つ完全となるように提供され、当業者に本発明の範囲を完全に伝えることになるものである。
【００２１】
他に定めがない限り、本明細書中で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者のうちの一人によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのみのものであり、本発明を限定することが意図されるものではない。本明細書及び添付の特許請求の範囲の中で使用される場合、単数形「一」及び「該」は、文脈から他に明確な指示がない限り、複数形を同様に含むことが意図される。
【００２２】
本明細書及び特許請求の範囲の中で使用される場合、成分の量、分子量、反応条件等の特性を表している全ての数値は、他に指示がない限り、全ての例において、表示の値の±10%までを意味することが意図される「約」という用語によって修飾されているものとして理解されることになる。加えて、本明細書及び特許請求の範囲の中のいずれの範囲の開示も、範囲それ自体、及びその中に包含される任意のもの、並びに終点を含むものとして理解されることになる。他に指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載の数値の特性は、本発明の実施形態において得られることが求められる所望の特性に依存して変化し得る近似値である。本発明の広い範囲を記載している数値の範囲及びパラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に記載の数値の値は可能な限り正確に報告されている。しかし、いずれの数値の値も、それらのそれぞれの測定において見出される誤差から必然的に生じる一定の誤差を本質的に含んでいる。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「ホスファプラチン」という用語は、一般に、単一の二座ピロホスファト配位子で配位された白金錯体を指す。ホスファプラチンは、以下の一般構造(A)及び(B)を有し得る:
【化４】
2014502634.tif 000005
【００２４】
式中、L1及びL2は、(NH3;置換又は非置換脂肪族アミン;及び置換又は非置換芳香族アミンから独立に選択される)中性配位子、又は白金金属中心に配位された、末端基L1及びL2を有する(置換又は非置換脂肪族又は芳香族のジアミンから選択される)単一の二座中性配位子を表し、L3及びL4は、白金金属中心に配位された、(水酸化物、酢酸、酪酸、及びα-ヒドロキシ酸、アミン又はこれらの荷電化学種から選択される)配位子である。ピロホスファト配位子は、中性(図示せず)又は荷電性(図示)であってもよい。荷電性のとき、ピロホスファト配位子は、Z+によって表される対イオンと共に存在する。Z+の例としては、限定されるものではないが、水素;アルカリ金属、例えばナトリウム及びカリウム;並びに一価の有機部分等が挙げられる。好ましくは、Z+は、薬学的に許容される塩をもたらす対イオンである。荷電性か又は中性かどうかにかかわらず、(A)によって表される白金(II)錯体の一般構造は平面四角形であり、(B)によって表される白金(IV)錯体の一般的な構造は八面体である。(A)によって表されるホスファプラチンの非限定的な例は、ジアンミン(ジヒドロゲンピロホスファト)白金(II);1,2-エタンジアミン(ジヒドロゲンピロホスファト)白金(II);及び(trans-1,2-シクロヘキサンジアミン)(ジヒドロゲンピロホスファト)白金(II)である。(B)によって表されるホスファプラチンの非限定的な例は、cis-ジアンミン-trans-ジヒドロキソ(ジヒドロゲンピロホスファト)白金(IV);1,2-エタンジアミン-trans-ジヒドロキソ(ジヒドロゲンピロホスファト)白金(IV);及び(trans-1,2-シクロヘキサンジアミン)-trans-ジヒドロキソ(ジヒドロゲンピロホスファト)白金(IV)である。いくつかの実施形態において、本出願は、(B)によって表されるホスファプラチン錯体を目的とし、このとき、末端基L1及びL2を有する二座配位子は、cis配置又は区別可能な2種のtrans配置のうちの一つにある1,2-シクロヘキサンジアミンである。しかし、本発明は、異なる形態で実施されてもよく、こうした実施形態に限定されるものとして解釈されるべきではない。
【００２５】
一般に、ホスファプラチンは、容易には加水分解されず、中性pHの水溶液に可溶性であり、中性pHの水溶液中で安定である。さらに、ホスファプラチンは、癌細胞系において、一般的な細胞毒性を示し、シスプラチン及びカルボプラチンのうちの1種又は双方に耐性である細胞系において有効である。したがって、ホスファプラチンは、既知の白金の癌の薬剤と比較して、癌細胞の死を誘導するのに有効、場合によってはより有効であり、患者への投与に好適な溶液中で望ましい安定性及び溶解性を示す。本発明のホスファプラチンに関して本明細書中で使用される場合、「安定」とは、6〜8の範囲に及ぶpHの水溶液中で2日及び6日の間からの期間維持されたときの加水分解に対する錯体の耐性を指す。
【００２６】
シスプラチンとは異なり、カルボプラチン、及び関連した白金ベースの抗癌薬であるホスファプラチンは、DNAに共有結合しない。シスプラチン、カルボプラチン、及び関連した白金抗癌剤に対する耐性は、ヌクレオチド除去修復酵素を含む多様な酵素による、DNA損傷の効率的な修復から生じると考えられている。しかし、ホスファプラチンはDNAに共有結合しないので、DNA修復機構に起因するホスファプラチンに対する耐性はなさそうである。データより、細胞のホスファプラチンの結合はシスプラチンよりも少ないが、依然としてホスファプラチンは高い細胞毒性を示すことが示唆されている。
【００２７】
データより、特定のホスファプラチンのラセミ混合物、例えばpyrodach-2及びpyrodach-4は、癌の治療における使用に有効であると同時に、鏡像異性的に純粋な、鏡像異性的に過剰な、又は鏡像異性的に富化された錯体を使用して、細胞毒性の増強及びより高い有効性が達成され得ることも示唆されている。
【００２８】
「鏡像異性体過剰率」という用語は、一般的に理解されるその定義に従って本明細書中で使用されている。即ち、混合物中にそれぞれモル量MA及びMBで存在し得るA及びBの2種の鏡像異性体について、該混合物中により高いモル量で存在する鏡像異性体の鏡像異性体過剰率Eは、%E = |(MA - MB) / (MA + MB) ×100|という関係式によって表すことができ、ここで、E > 0%である。鏡像異性体A及びBの「ラセミ混合物」は、「rac」及び/又は「(±)」のような略語によって表される(又は鏡像異性体に対するいかなる言及も単に欠けている)こともあるが、MA = MBであるのでE = 0%を有する。さらなる例示として、MA = 60%及びMB = 40%であるA及びBからなる混合物は、20%と等しいAの鏡像異性体過剰率を有する。同一の混合物は、代替において、Bの各分子(該混合物の40%)が該混合物中のAの分子(該混合物の40%)と対にされて、対になっていない過剰なAの分子(該混合物の20%)が残り得るので、鏡像異性的に純粋なA20%と組み合わせたA及びBのラセミ混合物80%からなる混合物とみなすことができる。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、2種の鏡像異性体であるA及びBを有する分子に関しての「鏡像異性的に純粋な」という用語は、鏡像異性体A又はBのうち実質的に1種のみを含むがAとBの両方は含まない化合物又は組成物を指す。「鏡像異性的に純粋な」錯体の場合、97% ≦ E ≦ 100%である。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「鏡像異性的に富化された」という用語は、その最も広義の意味において、化合物又は組成物が鏡像異性体の一方であるA又はBのいずれかが鏡像異性的に過剰であるように、2種の鏡像異性体であるA及びBを有する分子を含む化合物又は組成物を指す。したがって、「A及びBの鏡像異性的に富化された混合物」とは、Aが鏡像異性的に過剰である混合物又はBが鏡像異性的に過剰である混合物を指してもよく、ここで、A又はBのいずれかについて0% < E ≦ 100%である。実例として、A又はBのいずれかの鏡像異性体過剰率は、0.01%超、1%超、10%超、25%超、50%超、75%超、90%超、98%超、99%超、99.9%超であってもよく、又はさらに100%と等しくてもよい。
【００３１】
種々の実施形態において、本明細書において提供されるのは、安定な、単量体のホスファプラチン錯体(及び1種以上の前記錯体の治療有効量を含む組成物)である。いくつかの実施形態において、前記錯体及び組成物は、血管新生を阻害する方法において使用されてもよい。いくつかの実施形態において、前記錯体及び組成物は、転移を阻害する方法において使用されてもよい。いくつかの実施形態において、前記錯体及び組成物は、アポトーシスを促進する方法において使用されてもよい。いくつかの実施形態において、前記錯体及び組成物は、シスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチンのうちの1種以上による治療に耐性の癌が挙げられるがこれに限定されない、癌を治療する方法において使用されてもよい。
【００３２】
組成物
種々の実施形態において、提供されるのは、以下の式IV、V、VI及びVIIによる、1種以上の単離された単量体の白金(II)又は(IV)錯体を含む組成物である:
【化５】
2014502634.tif 000006
【化６】
2014502634.tif 000007
【００３３】
式中、R1及びR2は、NH3、置換又は非置換脂肪族アミン、及び置換又は非置換芳香族アミンからそれぞれ独立に選択され;式中、R1及びR2は、式IVにおいて同時にNH3にはならず;式中、R3は、置換又は非置換脂肪族又は芳香族ジアミンから選択され;式中、Sは、水酸化物、酢酸、酪酸、及びα-ヒドロキシ酸から独立に選択される。さらに提供されるのは、1種以上の(on or more)薬学的に許容される前記錯体の塩又は溶媒和物を含む組成物である。
【００３４】
式(VI)及び(VII)のホスファプラチンは、ピロリン酸塩及び1,2-シクロヘキサンジアミン配位子に配位された白金を有し、このジアミン配位子のキラル炭素中心1及び2における2個のアミノ(-NH2)基についての可能なcis及びtransの幾何学的配置のために、4種の立体異性体として存在し得る。これらの立体異性体は、(1R,2R)、(1S,2S)、(1R,2S)、及び(1S,2R)の立体配置を示す。該trans配位子(trans-1,2-シクロヘキサンジアミン)は、それぞれ(1R,2R)及び(1S,2S)の配置を有する2種の鏡像異性体をもたらす。該cis異性体は、原則として、(1R,2S)及び(1S,2R)の鏡像異性体を包含するが、これらの2種のcis異性体は、同等な、構造的且つ化学的に互いに区別できない、重ねることができる鏡像である。したがって、該cis異性体の2種の鏡像異性体は、以下では単に「cis異性体」と称されることになり、単一の式で参照される。
【００３５】
種々の実施形態のうちのいくつかにおいて、提供される組成物は、pyrodach-4の1種以上の鏡像異性体を有するが、当業者は、他のホスファプラチン(pyrodach-2等)が同様の有用性を有し得るので、本出願がこれらに限定されないことを認識するであろう。したがって、提供される組成物は、
(a)式(I)を有する、鏡像異性的に純粋な(1R,2R)-pyrodach-4;
【化７】
2014502634.tif 000008
【００３６】
(b)式(II)を有する、鏡像異性的に純粋な(1S,2S)-pyrodach-4;
【化８】
2014502634.tif 000009
【００３７】
(c)式(I)を有する(1R,2R)-pyrodach-4と式(II)を有する(1S,2S)-pyrodach-4とを等量有するpyrodach-4のラセミ混合物;
【化９】
2014502634.tif 000010
【００３８】
(d)式(I)を有する(1R,2R)-pyrodach-4又は式(II)を有する(1S,2S)-pyrodach-4のいずれかが鏡像異性的に過剰である、鏡像異性的に富化されたpyrodach-4;
【化１０】
2014502634.tif 000011
【００３９】
(e)式(III)を有するcis-pyrodach-4
【化１１】
2014502634.tif 000012
【００４０】
(f)(a)〜(e)のいずれかの薬学的に許容される塩;
(g)(a)〜(e)のいずれかの薬学的に許容される溶媒和物;又は
(h)これらの組合せ
を含んでいてもよい。
【００４１】
式(I)及び(II)の錯体における1,2-シクロヘキサンジアミン配位子上のアミノ基を参照すれば、(1R,2R)及び(1S,2S)の立体化学はtrans配置にあるアミノ基を表すのに対して、式(III)の錯体において、(1R,2S)及び(1S,2R)の立体化学はcis配置にあるアミノ基を表す。
【００４２】
鏡像異性的に富化されたpyrodach-4混合物は、(1R,2R)-鏡像異性体又は(1S,2S)-鏡像異性体のいずれかについて0よりも高い鏡像異性体過剰率を有するものとして特徴付けられてもよい。該鏡像異性体過剰率は、変化してもよく、例示の実施形態において、0.01%超、1%超、10%超、25%超、50%超、75%超、90%超、98%超、99%超、99.9%超であってもよく、又はさらに100%と等しくてもよい。例示の実施形態において、該鏡像異性体過剰率は、(1R,2R)-鏡像異性体についてのものであってもよい。さらなる例示の実施形態において、該鏡像異性体過剰率は、(1S,2S)-鏡像異性体についてのものであってもよい。
【００４３】
非限定的な例として、式(IV)〜(VII)の化合物は、ヨウ化カリウムの添加によりK2PtCl4をK2PtI4に変換することによって調製され得るcis-(1,2-シクロヘキサンジアミン)ジクロロ白金(II)などの出発物質から合成することができる。次いで、K2PtI4は、例えばcis-1,2-シクロヘキサンジアミン、trans-(1R,2R)-1,2-シクロヘキサンジアミン、trans-(1S,2S)-1,2-シクロヘキサンジアミン、又はこれらの混合物などの望ましい立体化学を有する1,2-シクロヘキサンジアミンと反応させてもよい。結果として生じた(1,2-シクロヘキサンジアミン)ジヨード白金(II)錯体は、次いで、in situで2当量の硝酸銀を加えることによって、対応する(1,2-シクロヘキサンジアミン)ジアクアプラチナ(II)錯体((1,2-cyclohexanediamine)diaquaplatinum(II) complex)に変換してもよい。次いで、該ジアクア化学種[Pt(1,2-シクロヘキサンジアミン)(H2O)2]は、塩化カリウムの添加によってcis-ジクロロ[Pt(1,2-シクロヘキサンジアミン)Cl2]錯体に変換してもよい。
【００４４】
他の好適な反応条件を使用し得ることが理解されるであろう。非限定的な例において、出発の1,2-シクロヘキサンジアミン-白金(II)錯体を、過剰なピロリン酸塩と反応させた。その温度は、約35℃から約45℃までであってもよく、又は35℃と45℃の間の任意の好ましいより狭い範囲であってもよい。良好な結果は、40℃で得られている。いくつかの例において、この反応は、約13時間から約16時間まで続行させてもよく、又は13時間と16時間の間の任意の好ましいより狭い範囲であってもよい。良好な結果は、15時間の反応時間で得られている。いくつかの例において、pHは、約6から約7まで、約7から約8まで、及び約8から約9までであり得る。良好な結果は、約8のpHで得られている。
【００４５】
この水性反応混合物は、ピロリン酸塩の沈澱物が形成されないように濃縮してもよい。該水性反応混合物は、任意の好適な様式で濃縮されてもよいことが理解されるであろう。例えば、該水性反応混合物は、回転蒸発によって濃縮してもよい。
【００４６】
その上で、該反応混合物のpHは、好適な酸の添加によって2未満のpHまで急速に低下させてもよい。いくつかの例において、該pHを低下させるために硝酸を使用してもよい。いくつかの実施形態において、該pHは、約1から約2の間の範囲内にある。良好な結果は、pH1で得られている。
【００４７】
いくつかの例において、該反応混合物は、該反応混合物の濃縮後に、5℃と室温(25℃±2℃)の間の温度まで冷却してもよい。他の例において、該方法は、該反応混合物のpHを低下させた後に、該反応混合物を5℃と室温の間の温度まで冷却することも含む。
【００４８】
式(V及びVII、並びにI〜III)による白金(IV)錯体を調製するために、ヒドロキソ配位子を付加するのにさらなるステップが必要とされる。したがって、上記のステップに加えて、該反応混合物を約30℃から約60℃までの温度で約12時間から約18時間の間にわたり約7から約9までのpHで維持した後に、該反応混合物に、過酸化水素、及び場合によっては、酢酸塩、酪酸塩、及びα-ヒドロキシ酸の塩の群から選択される試薬を添加してもよい。該反応混合物の濃縮の前に過酸化水素と共に加えてもよい任意選択の試薬は、酢酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、アミン、及びα-ヒドロキシ酸のナトリウム塩から選択してもよい。他の例において、該反応混合物の濃縮の前に過酸化水素と共に加える任意選択の試薬は、酢酸カリウム、酪酸カリウム、任意の単座アミン、例えば、アンモニア、イソプロピルアミン等、及びα-ヒドロキシ酸のカリウム塩から選択してもよい。
【００４９】
種々の実施形態のうちのいくつかにおいて、提供される組成物は、担体、希釈剤、補助剤、及びビヒクルから選択される少なくとも1種の薬学的に許容される成分をさらに含んでいてもよく、これは、一般に、不活性で毒性がなく、ホスファプラチンと非反応性である、固体若しくは液体の増量剤、希釈剤、又はカプセル化物質を指す。これらの型の添加物は、当技術分野においてよく知られており、治療方法に関してさらに後述する。
【００５０】
種々の実施形態のうちのいくつかにおいて、提供される組成物は、シスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチンのうちの1種以上をさらに含んでいてもよい。
【００５１】
本明細書中の他の所で説明しているように、式(I)及び(II)の錯体のラセミ混合物は、血管新生において重要な役割を果たすことが知られている、血管内皮増殖因子受容体2(VEGFR-2)の遺伝子発現を抑制するそれらの能力のために、抗血管新生剤になる望みがあることが示されている。式(I)及び(II)の錯体のラセミ混合物は、発現の欠失が数種類の型の癌において腫瘍の悪性度と相関することが知られている、E-カドヘリンを増加させるそれらの能力のために、抗転移剤になる望みがあることも示されている。さらに、式(I)及び(II)の錯体のラセミ混合物は、アポトーシス促進遺伝子であるPUMA、PTEN、Fas、FasL、及びBaxの発現を刺激するのと同様に、可能な少なくとも2種のアポトーシス促進シグナル伝達経路を始動させるそれらの能力のために、アポトーシス促進剤になる望みがあることが示されている。前記効果を有するこうした錯体の能力は、シスプラチンに耐性のものを含む、癌細胞においても示されている。こうした研究の前進及びホスファプラチンの有用性、並びにpyrodach-4と[鏡像異性的に純粋な式(I)及び(II)の錯体、鏡像異性的に濃縮された式(I)及び(II)の錯体の混合物、並びに式(III)の錯体等が挙げられるが、これらに限定されない]関連したホスファプラチンとの間の類似性を考慮して、他のホスファプラチンは、単独で又は組成物中で、血管新生の阻害、転移の阻害、アポトーシスの促進、又はこれらの組合せに有用であってもよいことが意図される。
【００５２】
したがって、種々の実施形態のうちのいくつかにおいて、提供される組成物は、血管新生の予防若しくは阻害において使用される抗血管新生剤、転移の予防若しくは阻害において使用される抗転移剤、又は双方であってもよい。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、新しい血管の発生又は既存の血管の再成長若しくは再構築を標的とするのに有用であってもよい。種々の実施形態のうちのいくつかにおいて、提供される組成物は、アポトーシスの促進において使用されるアポトーシス促進剤であってもよい。
【００５３】
医薬品の製造
種々の実施形態のうちのいくつかにおいて、提供される組成物は、血管新生の阻害、転移の阻害、又は双方に有用であってもよい。該組成物は、アポトーシスの促進に有用であってもよい。上述のことを考慮して、いくつかの実施形態において、さらに提供されるのは、
血管新生を阻害するための医薬品の製造における;転移を阻害するための医薬品の製造における;血管新生及び転移を阻害するための医薬品の製造における;又はアポトーシスを促進するための医薬品の製造における、
(a)式(I)を有する、鏡像異性的に純粋な(1R,2R)-pyrodach-4;
【化１２】
2014502634.tif 000013
【００５４】
(b)式(II)を有する、鏡像異性的に純粋な(1S,2S)-pyrodach-4;
【化１３】
2014502634.tif 000014
【００５５】
(c)式(I)を有する(1R,2R)-pyrodach-4と式(II)を有する(1S,2S)-pyrodach-4とを等量有するpyrodach-4のラセミ混合物;
【化１４】
2014502634.tif 000015
【００５６】
(d)式(I)を有する(1R,2R)-pyrodach-4又は式(II)を有する(1S,2S)-pyrodach-4のいずれかが鏡像異性的に過剰である、鏡像異性的に富化されたpyrodach-4;
【化１５】
2014502634.tif 000016
【００５７】
(e)式(III)を有するcis-pyrodach-4
【化１６】
2014502634.tif 000017
【００５８】
(f)(a)〜(e)のいずれかの薬学的に許容される塩;
(g)(a)〜(e)のいずれかの薬学的に許容される溶媒和物;又は
(h)これらの組合せ
の使用である。いくつかの実施形態において、前記医薬品は、シスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチンのうちの1種以上に耐性であるものを含む、癌を治療するのに有用であり得る。
【００５９】
方法
なおさらなる実施形態において、上記の錯体、組成物、又は双方は、治療の方法において単独で又は他の薬学的に許容される成分と共に使用されてもよい。提供される方法は、それを必要としている対象に、上記の錯体又は組成物の治療有効量を投与することを含む。該対象は、例えば、ヒトを含む、哺乳動物のような動物であってもよい。こうした方法は、対象の内皮細胞、対象の癌細胞、又は双方において血管新生を阻害又は予防するのに有用であり得ることが意図される。したがって、こうした方法は、卵巣、脳、胃、膀胱、乳房、肺、又は膵臓の癌のような、癌を治療するのに有用であり得る。いくつかの実施形態において、該錯体及び/又は組成物は、シスプラチン、カルボプラチン、及び/又はオキサリプラチンのような、既知の白金-金属薬を用いた、並行又は連続した治療を必要とする併用療法において使用され得ることが意図される。該錯体及び/若しくは組成物は、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンのうちの1種以上による治療に耐性の癌を治療するために使用され得ること、並びに/又は他の治療クラス若しくは標的療法と組み合わせて使用され得ることがさらに意図される。さらにより特定の実施形態において、本明細書中に記載の方法を用いて本明細書において利用される組成物は、単離された、単量体のpyrodach-4を含み得る。特定の実施形態において、本明細書中に記載のいずれの化学物質又は組成物の治療有効量も、対象の少なくとも1種の癌細胞において、p53上方制御性アポトーシス調節因子(PUMA)、ホスファターゼ・テンシンホモログ(PTEN)、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー6(FAS)、Fasリガンド(FasL)、カスパーゼ-3(CASP3)、カスパーゼ-9(CASP9)、及びBCL-2結合Xタンパク質(Bax)のうちの少なくとも1種の、遺伝子発現を上昇させるのにも十分なレベルで投与される。さらにより特定の実施形態において、本明細書中に記載の化学物質及び組成物は、卵巣、脳、胃、膀胱、乳房、肺、及び膵臓の細胞から選択される少なくとも1種の癌細胞においてE-カドヘリンを増加させるために、個別に又は組合せで適用され得る。
【００６０】
提供される組成物は、個々の患者の臨床状態、投与の部位及び方法、投与の日程計画、患者の年齢、性別、体重並びに医師に知られている他の因子を考慮に入れて、グッドメディカルプラクティス(good medical practice)に従って投与及び調剤され得る。治療の投与は、病院又は他の医療施設において医療関係者によって実施され得る。したがって、本明細書中の目的のための薬学的な「治療有効量」は、当技術分野において知られているような考慮点によって決定される。この量は、生存率の改善若しくはより速い回復、又は症状の改善若しくは消失及び当業者によって適切な尺度として選択されるような他の指標等が挙げられるがこれらに限定されない、改善を達成するのに有効でなければならない。
【００６１】
提供される組成物は、単独で又は組合せ療法として、哺乳動物及びヒトを含む、動物に投与されてもよいことが意図される。さらに、該組成物は、特に広い治療枠にわたって投与されてもよいことが意図される。当然、当業者は、治療投与量は、投与される錯体、投与される組成物、及び投与される錯体又は組成物を受け入れる対象によって変化し得ることを認めるであろう。投与は、単回投与又は数日間にわたる反復投与であり得る。一実例として、該組成物は、1日(one more days)に、1、2、3、4、5、6回、又はより多くの投与で投与され得ることが意図される。該錯体は、例えばポンプ又は点滴によって、1日以上にわたって連続的に投与され得ることも意図される。他の一実例として、該組成物は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10日間、又はそれよりも多い日数の間、投与され得ることが意図される。
【００６２】
使用の方法において、提供される組成物は多様な方法で投与され得ることが意図される。ホスファプラチンは、それらの錯体の優れた溶解性を利用して水溶液中で単独で、又は薬学的に許容される担体、希釈剤、補助剤及びビヒクルと組み合わせて有効成分として、投与され得ることに留意しなければならない。該組成物は、経口、皮下又は、静脈内、動脈内、筋肉内、腹膜内、扁桃内、及び鼻腔内の投与並びに髄腔内及び注入の技術を含む、非経口で投与され得ることも意図される。該組成物のインプラントも有用であり得る。
【００６３】
該組成物が非経口で投与されるときには、これらは、一般に、注射用の単位剤形(例えば、溶液、懸濁液、エマルション)に製剤化されることになる。注射に好適な医薬製剤としては、無菌の水溶液又は分散液、及び無菌の注射液又は分散液中に再構成するための無菌の粉末等が挙げられる。該担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等)、これらの好適な混合物、及び植物油等を含む、溶媒又は分散媒であってもよい。
【００６４】
適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持され得る。綿実油、胡麻油、オリーブ油、大豆油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、又はピーナッツ油及びエステル、例えば、ミリスチン酸イソプロピルのような非水性ビヒクルは、該組成物の溶媒系として使用され得る。さらに、抗微生物性保存剤、酸化防止剤、キレート化剤、及び緩衝液を含む、組成物の安定性、無菌性、及び等張性を高める種々の添加物が添加され得る。微生物の作用の防止は、多様な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等によって確実にされ得る。多くの場合において、等張化剤、例えば、糖、塩化ナトリウム等を含むのが望ましいであろう。注射用医薬形態の遅延式吸収は吸収を遅らせる作用剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらされ得る。しかし、使用されるいかなるビヒクル、希釈剤、又は添加物も、ホスファプラチン錯体と適合可能でなければならないはずである。
【００６５】
無菌注射用溶液は、所望により、1種以上の他の成分と共に、必要な量の適切な溶媒中にホスファプラチン錯体を組み込むことによって調製され得る。
【実施例】
【００６６】
記載の実施形態は、以下の実施例を参照することによってより良く理解されることになり、これは、実例として示されており、当業者が理解するであろうことは限定されることを意味するものではない。
【００６７】
I. 抗血管新生についての証拠
[実施例1]
特定のホスファプラチン(phosphoplatin)は、例えば腫瘍に関連したもののような血管新生の治療における望みがあることを示している。腫瘍の拡大及び増殖は、常に血管新生に依存している。血管新生を防ぐために、抗癌剤の開発において多様な戦略及び標的が採用された。中でもそれらは血管内皮増殖因子(VEGF)及びそれらの受容体(VEGFR)であり、これらは血管新生において重要な役割を果たすからである。ヒトの多くの癌は、VEGF及びその受容体VEGFR-2を過剰発現させている。VEGFR-2は、Flk1及びKDRとしても知られるが、糖タンパク質であり、7個の免疫グロブリン様細胞外ドメイン及び1個の細胞内チロシンキナーゼドメインを含む。
【００６８】
本出願において、本発明者らは、シスプラチンに感受性及び耐性のヒト卵巣癌細胞の双方においてVEGRF-2遺伝子発現がpyrodach-4によって50%も抑制されることを示している(表1)。この受容体は主に内皮細胞で発現されるので、本発明者らは、VEGFR-2遺伝子の抑制を裏付けるためにヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)細胞からのデータも示しており、これにより、ホスファプラチンは全ての型の癌において抗血管新生を示す能力があり得ることが示される。普遍的に、HUVECは、血管新生の試験のためのモデルとして役割を果たす。このデータを表1に示しており、実験法については下記の実施例2で述べている。
【表１】
2014502634.tif 000018
【００６９】
[実施例2]
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)及びヒト卵巣癌細胞における選択された遺伝子発現の定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による評価
定量的リアルタイムPCR実験を行い、一選びの標的遺伝子の発現を見積った。HUVEC細胞(Lonza Walkersville、Frederick、MD)を、販売会社によって推奨される標準プロトコルに従うことにより、37℃で5%のCO2を維持することによって加湿インキュベーター内で、0.1%のゼラチンでコーティングされたペトリ皿上で培養した。ヒト卵巣上皮癌細胞(A2780)及びシスプラチン耐性細胞(A2780/C30)を、シスプラチン(7μM)及びpyrodach-4(180μM)を含有する又は含有しないRPMI 1640中で0、3、12及び24時間培養した。さらに、2種の卵巣癌細胞系も、p53タンパク質の転写機能の阻害の効果を試験するために、PFT-α(15μM)の存在下でpyrodach-4で24時間処理した。HUVECを、シスプラチン(7μM)又はpyrodach-4(90又は180μM)を用いて又は用いずに、1時間から6時間までの範囲に及ぶ多様な持続時間にわたって処理した。
【００７０】
処理した癌細胞及び未処理の癌細胞をいずれも、10%のウシ胎児血清、2μmolのL-グルタミン、100unit/mLのペニシリン-ストレプトマイシン及び0.25unit/mLのインスリン溶液を含有するRPMI 1640培地中で5%のCO2と共に37℃で維持した。処理した細胞及び未処理の細胞の双方からRNAを単離した。処理した細胞は、ホスファプラチンにそのIC-50値濃度で、3時間から24時間までの、異なる時間間隔で曝露した後に、回収した細胞である。該RNA試料を、DNase-free RNase(QIAGEN Sciences)で処理して、DNAを除去した。次いで、High Capacity RNA-to-cDNAキット(Applied Biosystems)を製造業者の説明書に従って使用することにより、cDNAを合成した。RNAの量及び純度を、UV分光測定(NanoDrop 2000 Thermo Scientific、Wilmington、DE)によって決定した。1.9の最小吸光度比指数(260nmで測定された吸光度の280nmでのもの当たりの比)を許容される純度として使用した。単離したRNA試料を-80℃で保管して、RNAの完全性を維持するために凍結融解の繰り返しを最低限にした。標的遺伝子及び内在性対照(β-アクチン)についてTaqman(登録商標)遺伝子発現アッセイを使用して同一の反応ウェル内で二重リアルタイムPCRを行った。内在性対照は、標的mRNAを標準化するために使用される参照である。目的の遺伝子を検出するために必要とされるcDNAの最適濃度を決定するために、最初に異なるcDNA濃度を使用してこれらの連鎖反応を行った。標的遺伝子を青色色素(FAM、吸光度: 494nm、発光: 518nm)で標識し、一方、参照遺伝子を緑色色素(VIC、吸光度: 538nm、発光: 554nm)でタグ付けした。標的遺伝子についての閾値サイクル(Ct)値が、測定に使用したABI StepOnePlus(商標)機器による蛍光検出の感度が最も高い、17と32の間であるようにcDNA濃度を選択した。
【００７１】
qPCR反応の蛍光が検出システムの閾値蛍光をちょうど超える時点である、閾値サイクル数(Ct)を決定した。これらのCt値を使用して、標的遺伝子及び内在性対照のレベルを比較した。量的遺伝子発現は、これは、ΔCt = (Ct標的-Ct参照)及びΔΔCt = (ΔCt)時間X - (ΔCt)時間0(対照)を使用して、ΔCt値及びΔΔCt値から算出した、倍-変化(2-ΔΔCt )で報告される。(未処理の)対照試料の倍-発現は、ΔΔCt = 0の値から、したがって、20 = 1なので、不変のままである。
【００７２】
pyrodach-4で処理したHUVEC細胞の場合、注目すべき知見としては、VEGFR-2発現の50%もの抑制、並びにPUMA 10〜15倍;PTEN、4〜8倍;Fas、2〜5倍;FasL、2〜4倍;カスパーゼ-3及び-9 2〜3倍、及びBax 2〜3倍の過剰発現等が挙げられる。上述の他の遺伝子のレベルは、実験誤差の範囲内で不変のままであった。これらのさらなる遺伝子発現は、本発明者らの化合物に関する以前の文献で、部分的に、述べており、下記でさらに述べている。
【００７３】
II.ホスファプラチンによる腫瘍抑制PTEN遺伝子の活性化についての証拠
[実施例3]
(実験法については上記の実施例2で述べている)
ホスファターゼ・テンシンホモログ(PTEN)は、腫瘍形成において重要な役割を果たしている。PTEN遺伝子は、10番染色体上に位置し、タンパク質及び脂質の双方のホスファターゼ活性を有する細胞質の酵素をコードしている。該遺伝子は、胃癌及び神経膠芽腫を含む多くの悪性の癌において変異又は欠失していることが多い。実際に、PTENの変異及び欠失は、ヒトの神経膠芽腫のうちの80%もを占める。神経膠芽腫におけるPTEN遺伝子の導入により、血管新生促進の刺激の存在下でさえも血管新生が阻害されることが示されている。
【００７４】
PTENは、ホスファチジルイノシトール-3,4,5-三リン酸(PIP3)をホスファチジルイノシトール-4,5-ビスホスフェート(PIP2)まで脱リン酸化する脂質ホスファターゼであり、したがって、抗アポトーシス性のホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3K)/Akt経路を負に調節する。近年、PI3Kキナーゼを標的とする異なる相の臨床試験において数種の薬剤を用いて、癌を治療するためにPI3K経路を阻害することに相当な労力が向けられている。しかし、PI3K活性の重度の調節解除は、糖尿病、統合失調症、パーキンソン病、及び他の多くの疾患を引き起こすことを含む、多様な重度の副作用につながる恐れがあるので、こうした戦略は、注意深く実行されなければならない。先に述べたように、PTENは、PI3Kに拮抗すること及びAktを負に制御することの双方によって作用する。したがって、Akt(PI3Kの下流)を発現抑制するはずである、PTENの活性化は、上述の副作用のうちの多くを生じさせることなく癌を治療するのにより戦略的であり得る。これは、この方法では、少なくとも三つの独立した経路によって(但し、これらの全てが受容体チロシンキナーゼ(RTK)を必要とするが)キナーゼが活性化され得るので、PI3Kが生命に不可欠なその機能を依然として提供することができるからである。
【００７５】
本発明者らは、感受性及び耐性の双方のヒト卵巣癌における、ホスファプラチンによって媒介される、PTENの顕著な過剰発現についての証拠を提供する。さらに、p53の阻害剤であるPTF-αが過剰発現を消失させたので、PTENのこの過剰発現はp53によって調節されている。A2780及びA2780/C30細胞をpyrodach-4で処理したときに、PTEN遺伝子の発現は、対照と比較して5.5倍及び2.3倍まで上昇した。
【表２】
2014502634.tif 000019
【００７６】
III.ホスファプラチンの抗転移特性についての証拠
[実施例4]
(Arc-1、cell-CAM 80/120、及びウボモルリンとしても知られる)E-カドヘリンの発現又は機能の欠失と、膀胱、乳房、肺及び膵臓の癌を含む数種の異なる型の癌における腫瘍の悪性度との間には強い相関がある。E-カドヘリンは、主に細胞間接着分子として機能し、癌腫の脱分化及び侵襲性を防ぐ。これに対して、N-カドヘリン(間葉カドヘリン)は、正反対の作用を示す:それは、細胞の可動性、移動、及び浸潤を促進する。E-カドヘリンがどのようにしてその発現及び機能を欠失するかについて知るべきことはまだ多くあるが、良性腫瘍から侵襲性の悪性腫瘍への移行を説明するために、上皮カドヘリンから間葉カドヘリンへの「カドヘリンスイッチ」の概念が提唱されている。侵襲性は、実際に、E-カドヘリンの機能又は発現を欠失している腫瘍細胞系においてE-カドヘリンを強制的に発現させることによって後退させることができる。
【００７７】
本発明において、本発明者らは、ヒト卵巣癌細胞においてpyrodach-4がE-カドヘリンの発現を上昇させるのみならず、その拡散率も低下させることを示す免疫蛍光データを示している。図2は、pyrodach-4でA2780細胞を24時間処理する前及び後のE-カドヘリンタンパク質について比較した免疫蛍光画像を示している。左パネルは、FITC(緑色)で標識されたその抗体に結合したE-カドヘリンを示している。中央及び右のパネルは、4'-6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、核染色)を含有するProlong(登録商標)Gold Antifade Reagentで染色された核、並びに左及び中央のパネルの重ね合わせを表している(詳細については、以下の実施例5を参照されたい)。
【００７８】
[実施例5]
直接的及び間接的なタンパク質の免疫蛍光標識
細胞を、マルチチャンバースライドシステム(Lab-Tek(商標)、Nunc、Denmark)上で培養した。これらの細胞を、IC50濃度以下のpyrodach-4で24時間処理した。未処理細胞を対照として使用したのに対して、一次抗体標識なしの処理細胞及び未処理細胞を陰性対照として使用した。細胞を、PBS中4%のホルムアルデヒドで室温で10分間固定し、PBS(Ca2+及びMg2+非含有)で洗浄して、ブロッキング緩衝液(5% FBS)中で室温で2時間ブロッキングした。次いで、抗体希釈緩衝液(1% BSA)中に1:1000希釈で希釈した、一次抗体と共に室温で1時間インキュベートを行った。Fas及びE-カドヘリンのタンパク質を、抗Fas(FITC標識化、Santa Cruz Biotechnology, Inc.、Santa Cruz、CA)及び抗E-カドヘリン(FITC標識化、BD Transduction Laboratories、Franklin Lakes、NJ)の蛍光でタグ付けされた抗体を使用して直接標識によって検出した。他のタンパク質、p53、BAX及びPUMAは、蛍光で標識された1:1000希釈の二次抗体(p53についてはテキサスレッド結合型抗マウスIgG、BAX及びPUMAについてはフルオレセイン結合型抗ウサギIgG、Vector Labs、Burlingame、CAから得られた)で間接的に検出した。二次抗体と共に第2のインキュベートを1時間行った後に、固定された細胞をPBSで注意深く1回洗浄して、Prolong(登録商標) Gold Antifade Reagent with DAPI(Invitrogen、Carlsbad、CA)で核を染色した。蛍光画像を得る前に、この染色を24時間キュア処理した。免疫染色した細胞の画像を、Nikon顕微鏡、SPOTカメラ及びSPOT Advanced画像化ソフトウェア(Westchester、OH)を使用して、400倍の倍率で得た。
【００７９】
IV. ホスファプラチンの抗耐性特性についての証拠
[実施例6]
白金ベースの化学療法剤は広く使用されているにもかかわらず、白金金属薬に対する特有の獲得された耐性によってそれらの適用は限定されている。例えば、かなりの百分率の患者がシスプラチン治療に耐性になる。現在の文献では、結合した白金をDNAから除去することによってDNA損傷を修復する能力が、この耐性の機序に主に寄与しているという仮説が支持されている。この仮説は、シスプラチン処理をした、患者から採取された癌細胞又は癌組織がヌクレオチド除去修復遺伝子(NER)、相同組換え修復(HRR)、及び複製後修復(PRR)の間の感受性の上昇を示すという多くの証拠によって支持されている。これらの遺伝子としては、NER(RAD2、RAD4、RAD10、RAD1、及びRAD14)、HRR(RAD57、RAD55、RAD51、RAD52、RAD54、及びRAD59)、及びPRR(RAD6、RAD18、及びRAD5)等が挙げられる。
【００８０】
本発明において、本発明者らは、ホスファプラチン治療に対する応答において検出可能な感受性を示したDNA損傷遺伝子は全くなかったことを示している。この結論は、酵母における、シスプラチン、pyrodach-2及びpyrodach-4の存在下での、NER、HRR、及びPRR遺伝子の感受性を評価するための、ゲノム全体の適応度アッセイに基づいている。シスプラチンは、DNA応答に関するそれらの遺伝子の発現を実際に誘導した。双方のホスファプラチン化合物のプロファイルは、DNA修復又は他のDNA代謝プロセスに関連する単一の遺伝子が変異体として何らかの感受性を示すことはなかったという点で独特であった。双方の化合物について、感受性が高い株は、以下の機能に著しく絞られた;1)鉄及び銅の輸送及び2)金属で制御される転写因子。さらに、pyrodach-2は、Torキナーゼ複合体の構成要素であるavo2の株において感受性を誘導した。全体として、これらのプロファイルにより、感受性が高い株が示されたのはごく少数であり、これらは、高用量でも、細胞によって許容されることが示唆された。詳細な実験については、実施例7で例示している。
【００８１】
[実施例7]
ゲノム全体での適応度アッセイの説明
酵母欠失コレクション中の約6000株を、マイクロアレイを使用して、それぞれの株に含まれている20bpのDNA「バーコード」又は「タグ」を検出することにより、単一の培養で試験することができる。時点全体又は条件全体でバーコード強度を比較して、それぞれの株の相対的な適応度を解析する。プールされたフィットネスアッセイ(pooled fitness assay)の開発は、ゲノム全体の遺伝子-欠失試験をより急速でより容易に行うことにより、酵母ゲノムの機能的注釈付けを非常に容易にし、酵母において薬剤作用を試験する高処理能力の方法の開発をもたらした。プールスクリーニングは、遺伝子機能の特定、遺伝子を経路にグループ分けするための遺伝子対の機能的関連性の測定、薬剤標的の特定、及び薬剤の作用の機序の決定に使用され得る。このプロセスは、以下の五つの主なステップを含む:プール細胞の一定分量の調製、プール培養、ゲノムDNAの単離及びバーコードのPCR増幅、アレイハイブリダイゼーション(又は次世代シーケンシング)、及びデータ解析。
【００８２】
プールされたフィットネスアッセイは、五つの主なステップを含む(図3)。第一に、欠失コレクションを固体培地上で配列された形式で培養して、結果として生じた細胞をプールし、凍結させて、増殖実験を開始するために使用することになる細胞の一定分量を作製する。次いで、細胞を所望の条件で、典型的には5〜20世代培養する。結果として生じた細胞試料からのバーコードを、ゲノムDNAの単離及びバーコードのPCR増幅によってハイブリダイゼーション用に調製する。これらのバーコードは、上流タグプライマーと下流タグプライマーとの間のクロストークを防ぐために2回の反応で増幅される。次いで、結果として生じたPCR産物を、タグアレイにハイブリッド形成させ、1種の細胞試料につき1枚のアレイが必要とされる。次いで、データを解析して、対の試料の間での株の表現における差を決定する。
【００８３】
pyrodach-2及び-4のゲノム全体の効果を解析するために、本発明者らは、二つのコレクションの株、ヘテロ接合体欠失変異株(機能的な遺伝子の量が2から1に減少)として1200個の必須遺伝子及び完全欠失(機能的な遺伝子の量が2から0に減少)として4800個の非必須遺伝子をスクリーニングした。双方の化合物を、化合物特有の感受性がある株を見つける可能性を高めるために、可能な限り最も高い用量(200μMの最終濃度)でスクリーニングした。
【００８４】
図3は、プールされたフィットネスアッセイの概要を示している。プールされた欠失株の適応度プロファイリングは、以下の六つの主なステップを含む:
1.  第1に、株を、ほぼ等しい存在量でプールする。
【００８５】
2.  このプールを、選択の条件及び対照条件において競合的に培養する。ある遺伝子がその処理条件に対して感受性である場合には、その欠失を有する株は、より遅く増殖することになり、対照の培養に対して相対的に少なくなる(紫色の株)。耐性の株は、より速く増殖することになり、過度に多くなる(図示せず)。
【００８６】
3.  プール培養の終了後に回収した細胞からゲノムDNAを単離し、ユニバーサルプライマーを用いてこのゲノムDNAからバーコードを増幅する。
【００８７】
4.  次いで、PCR産物を、タグ配列を検出するアレイにハイブリッド形成させ、2種の試料についてのタグ強度を得る。
【００８８】
5.  次いで、処理及び対照の試料を比較して、それぞれの株の相対的な適応度を決定する。紫色の株のみがその条件に感受性であると評されることに注意されたい。赤色の株は、処理中の青色の株よりも遅く増殖するが、この増殖の差は、対照において認められるものと一致するので、目的のものではない。
【００８９】
V. ホスファプラチンによって誘導される二つの並行したアポトーシス促進シグナル伝達経路についての、それらの抗癌活性における証拠
[実施例8]
2種以上のシグナル伝達経路を誘導することが可能な単一の抗腫瘍剤は、様々な理由で、癌を治療するのにより良好なアプローチである。第一に、多くの薬剤は、療法に応じて特有の遺伝子を活性化することによって治療に対する耐性を獲得する。作用剤が複数のシグナル伝達経路を活性化する場合には、クロストークしていない複数の遺伝子に対する耐性の獲得は、ありそうにないはずである。さらに、複数の機能を有する鍵酵素の完全な阻害は、多くの抗癌薬剤で通常認められるように、重症の副作用をもたらし得る。
【００９０】
本発明において、本発明者らは、ホスファプラチンが、抗血管新生及び抗転移の特性を与えることに加えて、可能性のある少なくとも2種のアポトーシス促進経路を始動させることを確認するデータを示している。第一に、本発明者らの化合物は、Fas、P53、Bax、PUMA、及びPTENのようなアポトーシス促進遺伝子の顕著な過剰発現を示す。これら全てのアポトーシス促進遺伝子が単一のシグナル伝達経路に属しているかどうかを試験するために、p53の阻害剤であるPFT-αの存在下で遺伝子発現を追跡した。表3は、このp53阻害剤の存在下及び非存在下における、数種の鍵となるアポトーシス促進遺伝子の発現を示している。表3から認められるように、p53の阻害剤の存在下において、Fasは、その非存在下におけるよりは低いが、有意な過剰発現を維持した。しかし、該阻害剤は、PUMA、PTEN及びBaxの発現を著しく抑制する。これらの結果により、Fasは、p53-依存性経路及びp53-非依存性経路の双方を起動することによって機能することが示唆される。さらに、PUMAも、p53-依存性様式及びp53非依存性様式の双方において機能する。したがって、p53及び/又はPTENの経路を閉鎖した後でも、pyrodach-4は、依然としてアポトーシスを開始させることが可能である。この結論を、p53阻害剤の存在下でELISAアッセイによってさらに検証する。
【表３】
2014502634.tif 000020
【００９１】
[実施例9]
ELISAを用いた細胞死検出アッセイによる、アポトーシスについての独立したシグナル伝達機構の検証
p53阻害剤がホスファプラチンのアポトーシス効果を完全には停止させないことを示唆する、この遺伝子発現データを裏付けるために、A2780及びA2780/C30の双方の癌細胞においてELISAを用いた細胞死実験を行った。これらの実験において、卵巣癌細胞を、阻害剤であるPFT-α(p53阻害剤)及びLY29400(PI3Kの阻害剤)の存在下及び非存在下でpyrodach-4で処理した。このデータは、図4及び5に示している。
【００９２】
図4は、A2780細胞における、p-53阻害剤(PFT-α、15μM)及びPI3K阻害剤(LY294002、30μM)の非存在下及び存在下でpyrodach-4及びシスプラチンによって誘導されるアポトーシス細胞死のELISAアッセイを示す。細胞を、化合物で24時間処理した。左から右への種々の処理群は以下の通りである:対照、7μMのシスプラチン、対照 + PFT-α、180μMのD4、180μMのD4 + PFT-α、180μMのD4 + LY294002。Tukey検定を使用して統計解析を行った。N = 3及びP < 0.05。図において、「*」は、未処理の対照から有意な値を示している。
【００９３】
図5は、A2780/C30細胞における、p-53阻害剤(PFT-α、15μM)及びPI3K阻害剤(LY294002、30μM)の非存在下及び存在下でpyrodach-4及びシスプラチンによって誘導されるアポトーシス細胞死のELISAアッセイを示す。左から右への種々の処理群は以下の通りである:対照、7μMのシスプラチン、対照 + PFT-α、180μMのD4、180μMのD4 + PFT-α、180μMのD4 + LY294002。RocheからのCell Death Detection ELISAを使用して、アポトーシスを定量化した。Tukey検定を使用して統計解析を行った。N = 3及びP < 0.05。図において、「*」は、未処理の対照から有意な値を示している。
【００９４】
図4及び5のy軸は、細胞死に比例した吸光度を表している。認められるように、p53及びLY-294002の存在下において、A2780についての細胞死においていくらかの減少があったが、全体の細胞死は、シスプラチンと比較してきわめて高いままであった。A2780/C30細胞は、シスプラチン処理に本当に抵抗性であり、細胞を7FMシスプラチンで処理したときに吸光度におけるわずかな上昇が認められたのに対して、pydodach-4は、明確に細胞死を示したことに注目されたい。該阻害剤が、耐性の卵巣細胞に対する影響を全く有さないことに注目することも興味深い。
【００９５】
これらの結果により、ホスファプラチンは、癌細胞を死滅させる際に複数の経路において機能しており、したがって、特定の経路を閉鎖する可能性がある内在的な機構は、本発明の化合物を用いた癌の治療に対して最小限の影響のみを有し得ることが示唆される。詳細については、実施例10で詳述している。
【００９６】
[実施例10]
ELISAを用いた細胞死検出アッセイ
A2780及びA2780/C30細胞を単層で培養し、トリプシン処理して、実施例5に記載のような補完されたRPMI 1640培地中に懸濁した。Fc/A2780及びFc/A2780/C30細胞試料における全ての処理は、同じものを三つずつで行った。ELISAを製造業者の説明書に従って行った。簡単に説明すると、それぞれの処理及び細胞について50,000細胞を播種して、4〜6時間接着させた。次いで、細胞を、培地のみ(未処理の試料)か、又は上記に示した濃度のpyrodach-4若しくはシスプラチンと共にのいずれかでインキュベートした。処理した細胞及び未処理の細胞のDNAを、(Roche Diagnostics、Mannheim、Germanyから購入した)ELISAキットを使用して、ヌクレオソームDNAについて試験した。溶解緩衝液を使用して細胞を30分間溶解させた。遠心処理後、10%(v/v)の上清を、抗-ヒストン-ビオチン及び抗-DNA-ペルオキシダーゼと共にインキュベートした。2時間のインキュベート後に、その沈殿物を3回洗浄して、基質溶液と共にインキュベートした。SPECTRA Max M2マルチチャネル蛍光プレートリーダー(Molecular Devices、Sunnyvale、CA)を使用して、各処理の型について405nm及び490nmで吸光度を測定した。処理した試料の吸光度を基質溶液に対して標準化した。Minitab 16を使用して、Tukey多重比較検定を用いた一元配置ANOVAを行った。P値 ≦ 0.05は有意であるとみなされた。
【００９７】
本出願は、本明細書中に記載の特定の例に限定されるものとみなされるべきではなく、むしろ、本発明の全ての側面を包含するものであると理解されるべきである。多様な修正、同等のプロセス、並びに本発明が適用され得る数多くの構造及び装置が、当業者には容易に明らかであろう。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載のことに限定されるとみなされるべきではない、多様な変更がなされ得ることを理解するであろう。
【図１】
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【図２】
2014502634.tif 000039
【図３】
2014502634.tif 000040
【図４】
2014502634.tif 000041
【図５】
2014502634.tif 000042
【国際調査報告】
2014502634.tif 000043
2014502634.tif 000044