(57)【要約】  本発明による固有の蛍光共鳴エネルギー転移（ｉＦＲＥＴ）用探針を利用した標的タンパク質検出又はイメージ化顕微鏡装置は、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光及びｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射する光照射部、前記光照射部で照射される光をｉＦＲＥＴ用探針が導入した試料上に入射するようにする対物レンズ、及び標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光を試料上に照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第１発光信号と、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第２発光信号を検出する認識部を含み、ここでｉＦＲＥＴ用探針は、標的タンパク質に特異的な結合部位（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）又は前記結合部位を有する分子、及び標的タンパク質の固有蛍光（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）に対するアクセプター（ａｃｃｅｐｔｏｒ）機能を有する蛍光分子が直接又はリンカーを介して結合されたものである。【選択図】図２
2014520275.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固有の蛍光共鳴エネルギー転移（ｉＦＲＥＴ； ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）用探針を利用した標的タンパク質検出又はイメージ化顕微鏡装置であって、
前記ｉＦＲＥＴ用探針が、標的タンパク質に特異的な結合部位（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）又は前記結合部位を有する分子、及び標的タンパク質の固有蛍光（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）に対するアクセプター（ａｃｃｅｐｔｏｒ）機能を有する蛍光分子が直接又はリンカーを介して結合されたもので、
標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光及びｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射する光照射部と、前記光照射部で照射される光をｉＦＲＥＴ用探針が導入された試料上に入射するようにする対物レンズ、及び標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光を試料上に照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第１発光信号と、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第２発光信号を検出する認識部とを含む、顕微鏡装置。
【請求項２】
標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光を試料上に照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第１発光信号値と、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第２発光信号値とを分析して、第１発光信号値と第２発光信号値のレシオメトリック法（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）によって第３発光信号値を算出するレシオメトリックモジュール（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｍｏｄｕｌｅ）をさらに備えることを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
第１発光信号値、第２発光信号値、及び第３発光信号値は、試料の２次元の各地点に対応する２次元的な映像値であることを特徴とする、請求項２に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
第１光の波長範囲は２６０ｎｍ〜３００ｎｍであり、第２光の波長範囲は３００ｎｍ〜４００ｎｍであることを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
標的タンパク質の固有蛍光を発揮するアミノ酸はトリプトファン（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、チロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）又はこれらの組合であることを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
前記光照射部が、光源、及び前記光源からの標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光とｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を選択的にフィルタリングする励起フィルタモジュール（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ  ｍｏｄｕｌｅ）を備えることを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項７】
前記光源からの光の一部を反射によって励起フィルタモジュールに案内する一つ以上の第１平行光ミラー（ｃｏｌｌｉｍａｔｅ  ｍｉｒｒｏｒ）をさらに備え、
第１平行光ミラーが、第１特定波長値よりは長波長帯の光は透過させ、前記第１特定波長値より短波長帯の光は反射させることにより、前記第１特定波長値が、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光より長波長帯であることを特徴とする、請求項６に記載の顕微鏡装置。
【請求項８】
前記対物レンズが、前記試料の前端に配置される第１対物レンズ及び前記試料の後端に配置される第２対物レンズを含み、前記第１対物レンズは石英（Ｑｕａｒｔｚ）又は反射（ｒｅｆｌｅｃｔｉｎｇ）対物レンズであることができ、
前記第２対物レンズはｆｕｓｅｄ  ｓｉｌｉｃａ対物レンズであることを特徴とする、請求項６に記載の顕微鏡装置。
【請求項９】
光照射部から対物レンズを連結する光経路上に第２平行光ミラー（ｃｏｌｌｉｍａｔｅ  ｍｉｒｒｏｒ）が設置され、第２平行光ミラーが、第２特定波長値よりは長波長帯の光は透過させ、前記第２特定波長値より短波長帯の光は反射させることにより、前記第２特定波長値が、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光より長波長帯で、検出しようとするｉＦＲＥＴ用探針で生成される発光の波長帯よりは短波長であることを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項１０】
第２平行光ミラーが、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光、又は両方を反射させて対物レンズを介して第１光又は第２光を試料に入射させ、試料に照射された第１光から来由するｉＦＲＥＴ用探針で生成される第１発光、又は、試料に照射された第２光から来由するｉＦＲＥＴ用探針で生成される第２発光が、第２平行光ミラーを透過して認識部に入射されて、それぞれ第１発光信号又は第２発光信号として検出されることを特徴とする、請求項９に記載の顕微鏡装置。
【請求項１１】
光照射部が、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光及びｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を一定の時間間隔で交互に照射するものであり、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光を試料上に照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第１発光信号値と、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第２発光信号値からレシオメトリック法によって第３発光信号値がレシオメトリックモジュールで一定の時間間隔で算出されて蓄積され、時間に伴う標的タンパク質の位置、量又は両方の変化を確認することができることを特徴とする、請求項２に記載の顕微鏡装置。
【請求項１２】
時間に伴う標的タンパク質の変化が、動画として算出されることを特徴とする、請求項１１に記載の顕微鏡装置。
【請求項１３】
試料が、標的タンパク質自体、溶液、細胞、血液、尿、水、土壌、空気、食品、廃棄物、動植物組職又は生物体自体であることを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項１４】
請求項１〜請求項１３のうち一つの項に記載された顕微鏡装置を利用した標的タンパク質検出又はイメージ化の方法であって、前記ｉＦＲＥＴ用探針を標的タンパク質を含有する試料内に導入する第１ステップと、
標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光及びｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を交互に第１ステップで製造された試料に照射する第２ステップ、及び
標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光を試料上に照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第１発光信号値と、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第２発光信号値を分析して、第１発光信号値と第２発光信号値のレシオメトリック法によって第３発光信号値を算出する第３ステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光及びｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を一定の時間間隔で交互に照射し、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光を試料上に照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第１発光信号値と、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第２発光信号値からレシオメトリック法によって第３発光信号値が一定の時間間隔で算出されて蓄積され、時間に伴う標的タンパク質の変化を確認することができることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
時間に伴う標的タンパク質の変化が動画として算出されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光共鳴エネルギー転移 (ｉＦＲＥＴ ；ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ) 用探針を利用したタンパク質検出又はイメージ化顕微鏡装置、及びこれを利用したタンパク質検出又はイメージング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
誘電体チップ等のバイオチップの蛍光分析をはじめとする様々な生体医学分野において、蛍光を利用した微細試料の詳細観察のために、光学装備である蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）顕微鏡が広く使用されている。蛍光顕微鏡は、マイクロ対象物である試料に光を照射し、照射された光によって試料で励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）及び蛍光放出の過程を経て放出される蛍光を捕捉して、マイクロ対象物のイメージ等の情報を観測する装置である。通常、蛍光顕微鏡利用の際に測定を可能にするためには、測定される試料上に多様な探針子又はレポーターが挿入される。一方、生命科学に関連する多くの分野で、様々な物質が生体内又は生体外で生体物質を分析するための探針子又はレポーターとして活用されている。このような探針子又はレポーターシステムは、特定の基質自体、又は基質が酵素反応によって分解又は変形して現われる着色、発色、発光を測定する方法と、蛍光や着色能を有する物質自体を観察するものとに大別することができる。
【０００３】
前者の各方法は、目的とするタンパク質に融合された形態でタンパク質の発現量、プローモーターの強さの測定、組換え菌体の選別等の細胞内の観察だけではなく、ウエスタン／ノーザンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）等の細胞外観察にも活用されており、代表的な例としては、アルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、キサンチンオキシダーゼ（ｘａｎｔｈｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）等の酵素と、基質としてルミノール（ｌｕｍｉｎｏｌ）、ルシゲニン（ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ）、 アクリジニウムエステル（ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｅｓｔｅｒ）、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ジオキシゼニン（ｄｉｏｘｉｇｅｎｉｎ）等の化合物が利用されている。
【０００４】
しかし、これらが細胞内で発現される場合、生体内代謝経路を撹乱させて成長を阻害したり、細胞死滅を誘導する等の危険性があるという欠点を持つ。また、前記酵素らの触媒特性に起因する問題だけでなく、使用される基質の低い安定性は、実験誤差の主な原因となり、これらの大部分が生物素材ではない化学合成物であるため細胞に有害となる可能性があり、生体内で持続的な観察が難しいという欠点も常在する。したがって、前述した探針子又はレポーターの大部分は、生体内よりは生体外の探針に主に利用されている。
【０００５】
したがって、前記の問題点を改善するために、タンパク質自体が探針子として作用するレポーターに関する研究が活発に進められてきた。タンパク質自体が探針子である代表的な例としては、特定波長の光を受けて吸収し、活性化された蛍光団が低いエネルギーを有する定常状態に戻る過程で放出されるエネルギーが光の形態で現われる特性を持つ蛍光タンパク質を挙げることができる。代表的な例としては、クラゲ（ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ）のＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａから由来した緑色蛍光を発するＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と、Ｄｉｓｃｏｃｏｓｏｍａ種から由来したＤｓＲｅｄ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が挙げられる。
【０００６】
前記蛍光タンパク質は、基質や補助因子なしにタンパク質自体が蛍光を発するので、前者の場合のように代謝撹乱及び細胞生理学的因子に対する干渉が少なく、前者の酵素が活用される多くの探針分野とそれ以外の分野、すなわち、酵素及び基質が有する短所によって適用しにくい分野でも活用が可能である。特に、タンパク質が特定波長の光によって生成する固有の波長を持つ蛍光を介して、細胞や生物体を破壊することなく正常な生理機能を維持する、生きている状態で特定タンパク質の移動と活性経路、細胞分裂及び分化過程等のように、細胞内部で起きる複雑な変化を直接モニタリングするにおいて、現存するいかなる方法よりも優れた要素として認められている。
【０００７】
また、タンパク質工学技術を活用して、野生型蛍光タンパク質と異なる波長の光を放出するように改良された赤色蛍光タンパク質(ＲＦＰ)、黄色蛍光タンパク質(ＹＦＰ)、青緑色蛍光タンパク質(ＣＦＰ)、青色蛍光タンパク質(ＢＦＰ)等を組み合わせて活用する場合には、複数の現象を同時に観察することができ、異なる波長の光を放出する蛍光タンパク質が隣接したり融合された形態で発現したときに起きるＦＲＥＴ現象を活用して、試料内の特定物質の存在有無の探索、タンパク質間の相互作用の観察等の研究目的に多様に活用され得る長所を持つ。
【０００８】
一方、蛍光共鳴エネルギー転移とは、短波長の蛍光タンパク質（ｓｈｏｒｔｅｒ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｄｙｅ）であるエネルギー供与体（ｄｏｎｏｒ）が外部からエネルギーを吸収すると、供与体の励起エネルギーが光エネルギーとして放出される代わりに、所定の距離の中に位置した（＜１０ｎｍ）長波長の蛍光タンパク質（ｌｏｎｇｅｒ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｄｙｅ）であるエネルギー受容体（ａｃｃｅｐｔｏｒ）に無発光で（ｒａｄｉａｔｉｏｎｌｅｓｓ）伝達され、受容体の長波長の蛍光のみが放出される現象をいう。（非特許文献１）は、ＦＲＥＴの原理を利用してカルモジュリン（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）とカルモジュリン結合ペプチド（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）間の相互作用を分析しながら、新しい概念のタンパク質相互作用分析システムを開発した。蛍光タンパク質は、互いに異なる固有の波長領域の光を吸収して励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）され、そのエネルギーが光又は熱として発散されると、基底状態に回復しながら蛍光タンパク質毎に独特の波長帯の光を発散（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）する。蛍光共鳴エネルギー転移の原理は、互いに異なる２つの蛍光タンパク質が１０〜１００Å内にある場合、短波長の蛍光タンパク質が励起した後に放出する光が長波長の蛍光タンパク質の励起を誘導し、蛍光を発散する現象である。すなわち、相互作用を調べようとする２つのタンパク質の後に互いに異なる２つの蛍光タンパク質をそれぞれ付着させた後、タンパク質の相互作用によって２つの蛍光タンパク質が１０〜１００Å以内に近づいたときに起きる蛍光共鳴エネルギー転移現象による蛍光を探知することにより、タンパク質の相互作用を分析することができるのである。
【０００９】
例えば、４８８ｎｍ波長の光で励起する蛍光タンパク質は、５２０ｎｍ波長帯の蛍光を発散し、これはまた対をなした他の蛍光タンパク質を刺激する波長として作用するようになり、６３０ｎｍ波長帯の蛍光を発散する。したがって、４８８ｎｍで励起させて６３０ｎｍ波長帯の蛍光を探知することで、２つのタンパク質の相互作用を分析することができる。このシステムは、生きている細胞内でタンパク質の動的な相互作用の分析が可能であるという長所があるが、２つの蛍光タンパク質の距離が非常に近い場合にのみ探知が可能であり、微妙な蛍光波長の変化を感知するためにはタンパク質の過剰発現が必要とされる場合がある。
【００１０】
前述の問題点を解決するために、最近、タンパク質固有の蛍光を利用しようとする研究が進められており、アミノ酸の中の一つであるトリプトファンをＦＲＥＴに応用できることが報告され（非特許文献２）、トリプトファン結合ドメイン及びこれを検出することができる蛍光部分を利用してＦＲＥＴを測定する多重結合トリプトファンバイオセンサー技術が知られている（特許文献１）。
【００１１】
しかし、現在まで知られているタンパク質固有の蛍光を利用したＦＲＥＴ技術に用いられる探針は、タンパク質自体と蛍光分子の発光波長が互いに重畳し、不必要な信号が測定され、これにより測定結果の敏感度と特異性が阻害されるという欠点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国公開特許公報  第2008／0311047号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Miyawaki et al., Nature, 1997, 388:882-887
【非特許文献２】Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 4562-4588
【非特許文献３】Lakowicz, J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd ed., New York:Plenum Press, 1999
【非特許文献４】Patterson et al., Anal. Biochem. 284: 438, 2000
【非特許文献５】Patterson et al., J. of Cell Sci. 114: 837, 2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
そこで、本発明者らは、従来広範囲に活用されている探針システムが有する根本的な問題を解決しようと持続的な研究を重ねた結果、タンパク質固有の蛍光を利用する新しい蛍光分子を確認し、これらを標的タンパク質の結合部位と結合した探針システムを開発し、ｉＦＲＥＴ用探針を利用したタンパク質検出又はイメージ化顕微鏡装置及びこれを利用したタンパク質検出又はイメージング方法を開発し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の目的は、固有の蛍光共鳴エネルギー転移（ｉＦＲＥＴ）用探針を利用した標的タンパク質検出又はイメージ化顕微鏡装置、及び本発明による顕微鏡装置を利用した標的タンパク質検出又はイメージ化の方法を提供することにある。
【００１６】
前記目的を達成するため、本発明は、固有の蛍光共鳴エネルギー転移（ｉＦＲＥＴ）用探針を利用した標的タンパク質検出又はイメージ化顕微鏡装置であって、前記ｉＦＲＥＴ用探針は、標的タンパク質に特異的な結合部位（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）又は前記結合部位を有する分子と、標的タンパク質の固有蛍光（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）に対するアクセプター（ａｃｃｅｐｔｏｒ）機能を有する蛍光分子が直接又はリンカーを介して結合されたもので、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光及びｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射する光照射部と、前記光照射部で照射される光をｉＦＲＥＴ用探針が導入された試料上に入射するようにする対物レンズ、及び標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光を試料上に照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第１発光信号と、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第２発光信号を検出する認識部とを含む、顕微鏡装置を提供する。
【００１７】
前記顕微鏡装置は、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光を試料上に照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第１発光信号値と、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第２発光信号値を分析し、第１発光信号値と第２発光信号値のレシオメトリック法によって第３発光信号値を算出するレシオメトリックモジュール（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｍｏｄｕｌｅ）をさらに備えることが好ましい。
【００１８】
また、本発明は、本発明による顕微鏡装置を利用した標的タンパク質検出又はイメージ化の方法であって、前記ｉＦＲＥＴ用探針を標的タンパク質を含有する試料内に導入する第１ステップ、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光及びｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を交互に第１ステップで製造された試料に照射する第２ステップ、及び標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光を試料上に照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第１発光信号値と、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第２発光信号値を分析して、第１発光信号値と第２発光信号値のレシオメトリック法によって第３発光信号値を算出する第３ステップとを含むことを特徴とする方法を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に従ってｉＦＲＥＴ用探針を使用すれば、従来のＦＲＥＴ方法と異なりタンパク質内のアミノ酸を蛍光供与体として使用するので、標的タンパク質に人為的な標識（蛍光タンパク質等）が不要であるだけでなく、一つの蛍光物質のみを使用してもよく、ｉＦＲＥＴ用探針はタンパク質固有の蛍光と分離した発光波長を有するので高い特異性と敏感度を有し、様々なタンパク質の量、活性及び機作等をより容易かつ正確に分析することができ、前記標的タンパク質に関連する疾病の診断及び治療剤の開発に利用できる。
【００２０】
したがって、本発明による顕微鏡装置を使用すれば、ｉＦＲＥＴ用探針が結合された標的タンパク質検出又はイメージ化の方法を容易に行うことができ、本発明による標的タンパク質の検出又はイメージ化の方法によって、標的タンパク質の量、標的タンパク質の活性、標的タンパク質の作用機序若しくは移動経路を確認又は追跡することができる。
【００２１】
また、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光及びｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を標的タンパク質含有試料に照射して、正確な標的タンパク質の定量分析が可能で、また一定間隔で第１光及び第２光を交互に試料に照射すれば、標的タンパク質の挙動を動画でも観察することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の第１実施例で固有の蛍光共鳴エネルギー転移（ｉＦＲＥＴ）用探針を利用した標的タンパク質検出又はイメージ化顕微鏡装置についての構成図である。
【図２】本発明の第２実施例での顕微鏡装置についての構成図である。
【図３】本発明の第３実施例での顕微鏡装置についての構成図である。
【図４】本発明に使用される試料上に内在するｉＦＲＥＴ用探針を介した光の励起及び発散過程を示した図面である。
【図５】本発明の顕微鏡装置を利用した標的タンパク質検出又はイメージング過程を時系列的に示した順序図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の前記目的、特徴及び他の長所は、添付図面を参照して本発明の好ましい実施例を詳細に説明することでさらに明らかになるであろう。記述される実施例は、発明の説明のために例示的に提供されるものであり、本発明の技術的範囲を限定するものではない。
【００２４】
本発明に、ｉＦＲＥＴ用探針を利用したタンパク質検出又はイメージ化顕微鏡装置をなす各構成要素は、必要に応じて一体型で製造されたり、それぞれ分離して製造してもよい。また、使用形態に応じて一部の構成要素を省略して使用可能である。
本発明で使用される用語「ＦＲＥＴ」とは、互いに異なる発光波長帯の２つの蛍光物質との間で発生する非放射性（ｎｏｎ−ｒａｄｉａｔｉｖｅ）エネルギー転移現象であって、励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）した状態の蛍光供与体の励起準位エネルギーが蛍光アクセプターに伝達されて蛍光受容体から発光（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）が観察されたり、蛍光供与体の蛍光減少（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）が観察される現象を意味する（非特許文献３）。
【００２５】
ＦＲＥＴは、一般に蛍光供与体から放出される波長が蛍光受容体の吸光スペクトラムと重なり、光子（ｐｈｏｔｏｎ）の出現なしに発生するため、共鳴エネルギー転移といわれ、これは蛍光供与体と蛍光受容体との間の長距離双極子の相互作用による結果である。ＦＲＥＴのエネルギー転移の効率は、蛍光供与体の発光スペクトラムと蛍光受容体の吸光スペクトラムが重なる範囲と、蛍光供与体の量子効率、蛍光供与体と蛍光受容体の転移双極子（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｄｉｐｏｌｅｓ）の相対的方向（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）、そして蛍光供与体と蛍光受容体との間の距離によって変わってくる。したがって、ＦＲＥＴのエネルギー転移効率は、蛍光供与体と蛍光受容体の距離と相対的方向によって異なって現われるが、Ｆｏｒｓｔｅｒの数式によれば次の通り表現される。
【００２６】
Ｅ＝Ｒ０６  ／（Ｒ６＋Ｒ０６）    （数式１）
【００２７】
前記式中、ＥはＦＲＥＴ効率を示し、Ｒは蛍光供与体と蛍光受容体との間の距離であり、蛍光物質によって差はあるが、通常２−９ｎｍ以と定義される。また、Ｒ０はＦＲＥＴ効率が５０％になる蛍光供与体と蛍光受容体との間の距離をいい、一般にフォルスター距離 (Ｆｏｒｓｔｅｒ  ｄｉｓｔａｎｃｅ)又はフォルスター半径（Ｆｏｒｓｔｅｒ  ｒａｄｉｕｓ）と呼ばれる。Ｒ０は次の数式２で表現される。
【００２８】
Ｒ０＝０．２１１［ｋ２ｎ−４ＱＤＪ（λ）］１／６（ｉｎÅ）    （数式２）
【００２９】
前記式中、ｋ２は方向係数（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）で通常２／３で計算し、蛍光供与体発光と蛍光受容体吸光の相対的方向に応じて０〜４の範囲の値を有する。ｎは媒質の屈折率であって、通常２５℃の水は約１．３３４であり、Ｑｎは蛍光供与体の量子効率である。Ｊ（λ）は蛍光供与体の発光と蛍光受容体の吸光スペクトラム像の重複（ｏｖｅｒｌａｐ）程度であって、Ｍ−１ｃｍ−１ｎｍ４の単位値を有する（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。
【００３０】
本発明で使用される用語「蛍光供与体」とは、タンパク質の固有蛍光を発揮に関与するアミノ酸である。大部分のタンパク質は、固有蛍光（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を発揮するが、この際、芳香族環構造を有するアミノ酸が関与するものと知られている。その例としては、トリプトファン（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、チロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、及びフェニルアラニン（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）等が挙げられる。このようなトリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンは、２６０〜３００ｎｍ波長の光によって励起して２９０〜４００ｎｍの波長の光を発光し、その光が４４０ｎｍ波長まで影響を及ぼすものと知られている。
【００３１】
本発明で使用される用語「蛍光アクセプター」及び「蛍光受容体」は混用され、タンパク質の固有蛍光によって励起して発光する蛍光分子を意味する。
【００３２】
本発明によるｉＦＲＥＴ用探針１５５は、標的タンパク質に特異的な結合部位又は前記結合部位を有する分子（以下「結合分子」と略称する）１５６とｉＦＲＥＴアクセプター機能を有する蛍光分子１５８を含み、前記結合分子と蛍光分子が直接又はリンカーを介して結合されている。前記結合分子部位は、ｉＦＲＥＴ用探針が標的タンパク質に特異的な結合をするように誘導する（図３参照）。
【００３３】
本発明によるタンパク質の固有蛍光に対するアクセプター機能を有する蛍光分子１５８は、前記タンパク質の固有蛍光を現わすアミノ酸であるトリプトファン、チロシン及び／又はフェニルアラニンの発光波長である３００〜４００ｎｍの光によって励起することが好ましく、タンパク質固有の蛍光と分離される波長である４５０ｎｍ以上の発光波長を有することがさらに好ましい。
【００３４】
ｉＦＲＥＴ用探針が発光する光を確認又は追跡時、ｉＦＲＥＴ用探針が発光する全ての領域の波長帯を測定することができるが、ｉＦＲＥＴ用探針が放出する光のうち４５０ｎｍ又はそれ以上の長波長の光を測定するのが好ましい。細胞あるいは組職（ｔｉｓｓｕｅ）には、２６０〜４００ｎｍの光によって蛍光を出す細胞自家蛍光（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）物質である核酸、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈやコラーゲン、あるいは細胞タンパク質等が存在し、これらが生成する蛍光の発光波長が主に３００〜４５０ｎｍにわたって存在する。よって、本発明のｉＦＲＥＴ用探針は、細胞イメージングに使用されたり細胞抽出物あるいは組職染色（ｔｉｓｓｕｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）に使用される場合、これらの干渉を避けるために、本発明のｉＦＲＥＴ用探針は発光領域が４５０ｎｍ以上であることが好ましい。
【００３５】
一例として、本発明で使用されるｉＦＲＥＴ用探針で、タンパク質の固有蛍光に対するアクセプター機能を有する蛍光分子１５８として下記化学式Ｉの１−ナフチルジアミン（１−ｎａｐｈｔｈｙｌｄｉａｍｉｎｅ）を使用する場合、ＬＥＤ（ｌｉｇｈｔ−ｅｍｉｔｔｉｎｇ  ｄｉｏｄｅ）に効果的に検出可能で蛍光探針子で使用することができ、励起波長が３４０ｎｍ〜３８０ｎｍで、発光波長が４００ｎｍ〜６００ｎｍでるため公知の蛍光体と比べて発光（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）波長帯が高くて細胞の自家蛍光と分離して測定されることができる。
【００３６】
【化１】
2014520275.tif 000003
【００３７】
一方、本発明で使用される用語「試料」とは、標的タンパク質を含有するか含有していると推定されて分析が行われる観察対象物を意味し、標的タンパク質自体、細胞、血液、尿、水、土壌、空気、食品、廃棄物、動植物組職及び生物体自体のうちいずれか一つ以上から収集されたものであることができるが、これに限定されるものではない。
【００３８】
標的タンパク質に本発明によるｉＦＲＥＴ用探針を処理する場合、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する光を照射して発光するｉＦＲＥＴ用探針を確認するために、通常の蛍光物質処理条件を利用することができ、好ましくは水、緩衝溶液、炭素数１〜６の低級アルコール及びこれらの混合物で構成された群から選択された媒質内、あるいはバイオチップや（極）微細粒子相、あるいは細胞や組職（ｔｉｓｓｕｅ）を対象に行われることができる。
【００３９】
以下、添付された図面を参照して本発明の実施例による標的タンパク質検出又はイメージ化顕微鏡装置及びこれを利用した標的タンパク質検出又はイメージ化の方法を詳細に説明することにする。
【００４０】
標的タンパク質検出又はイメージ化顕微鏡装置１００の全体的な構成の説明
まず、図１を参照して、本発明の一実施例による顕微鏡装置１００は、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光及びｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射する光照射部１１０、前記光照射部１１０で照射される光をｉＦＲＥＴ用探針が導入された試料１５０上に入射するようにする対物レンズ１４０、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光を試料上に照射してｉＦＲＥＴ用探針１５５で生成される第１発光信号と、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射してｉＦＲＥＴ用探針１５５で生成される第２発光信号を検出する認識部１６０を含む。試料１５０が置かれる試料ステージ１５２は、ｘ、ｙ、ｚの３方向に運動をすることにより試料１５０の３次元駆動を可能にする。
【００４１】
本発明の顕微鏡装置は、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光を試料上に照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第１発光信号値と、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第２発光信号値を分析して、第１発光信号値と第２発光信号値のレシオメトリック法によって第３発光信号値を算出するレシオメトリックモジュール１７０（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｍｏｄｕｌｅ）をさらに備えるのが好ましい。レシオメトリックモジュール１７０は、モジュール駆動及び計算用プログラムを備えることができる。
【００４２】
光照射部１１０から生成された標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光１４２及びｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光１４２は、対物レンズ１４０で集光されて試料１５０に伝達され、試料１５０内で標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光を試料上に照射してｉＦＲＥＴ用探針１５５で生成される第１発光１４６と、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射してｉＦＲＥＴ用探針１５５で生成される第２発光１４６とは、認識部１６０で認識される。
【００４３】
試料１５０には、一般に標的タンパク質１５４及び前記標的タンパク質に結合されたｉＦＲＥＴ用探針１５５が含まれ得る。ｉＦＲＥＴ用探針１５５は、標的タンパク質に特異的な結合分子１５６とｉＦＲＥＴアクセプター機能を有する蛍光分子１５８が直接又はリンカーを介して結合されたもので、前記結合分子部位は、ｉＦＲＥＴ用探針が標的タンパク質に特異的に結合されるように誘導して、ｉＦＲＥＴを介して標的タンパク質の定量を可能にするだけでなく、ｉＦＲＥＴ用探針が標的タンパク質と共に移動するようにして標的タンパク質の挙動を確認できるようにする。
【００４４】
したがって、第１発光信号値、第２発光信号値、及び第３発光信号値は、試料の２次元の各地点に対応する２次元的な映像値であり得る。
一方、本発明は、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光１４２ａ(図４)及びｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光１４２ｂ(図４)を、標的タンパク質及びこれに結合したｉＦＲＥＴ用探針が含有された試料１５０に交互に照射することを特徴とする。
【００４５】
ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光１４２ｂは、標的タンパク質内のアミノ酸を励起せずにｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を直接励起させる光である。
【００４６】
モジュール１７０（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｍｏｄｕｌｅ）は、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光を試料上に照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第１発光信号値と、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第２発光信号値を分析して、第１発光信号値と第２発光信号値のレシオメトリック法によって第３発光信号値を算出することができる。
【００４７】
第３発光信号値は、測定試料（例：細胞、検液等）に存在するｉＦＲＥＴ用探針（第２発光信号値）の量に対する標的タンパク質に結合したｉＦＲＥＴ用探針の量（第１発光信号値）の比であって、測定の時間的空間的変化に関係なく常に基準値（第２発光信号値）が提供され、標的タンパク質とｉＦＲＥＴ用探針の結合を定量化を可能にする。また、レシオメトリック法を用いれば、試料に照射される光の量が変わっても補正可能である。
【００４８】
第３発光信号値は、次のような式によって算出できる。
【００４９】
第３発光信号値＝第１発光信号値÷第２発光信号値        （数式３）
【００５０】
レシオメトリック法によって、第２発光信号値を基準値（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）として使用して第１発光信号値の強さを第３発光信号値に換算することにより、ｉＦＲＥＴ用探針の偏在化（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）による測定誤差を最小化し、鮮明なイメージが得られ、標的タンパク質の量と質に対する薬物結合の定量的測定、標的タンパク質の空間的移動追跡等が可能である。
【００５１】
第３発光信号値は、従来のレシオメトリック法ソフトウェアを使用して算出できる。
【００５２】
光照射部１１０で、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光の波長範囲は２６０ｎｍ〜３００ｎｍであり、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光の波長範囲は３００ｎｍ〜４００ｎｍであることが好ましい。
【００５３】
光照射部１１０は、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光とｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を交互に照射することができるレーザー電源調節装置であることができる。
【００５４】
図２を参照して本発明の第２実施例による顕微鏡装置１００'を説明すれば次のとおりである。下記では第１実施例１００と比較して異なった部分についてのみ説明し、同一部分については省略する。
【００５５】
光照射部１１０は、図２に示されるように、光源１１１、及び前記光源からの標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光とｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を選択的にフィルタリングする励起フィルタモジュール１３０（ｅｘｉｔａｔｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ  ｍｏｄｕｌｅ）を備えることができる。
【００５６】
前記光源は、Ｘｅ／Ｈｇ（キセノン／水銀）ランプであってもよい。水銀蒸気にキセノンガスを利用する方式のメタルハライドランプは、発光効率を高めることができ消費電力を２０％以下に減少させることができる。
光照射部１１０は、前記光源からの光の一部を反射によって励起フィルタモジュールに案内する一つ以上の第１平行光ミラー１２１（ｃｏｌｌｉｍａｔｅ  ｍｉｒｒｏｒ）をさらに備えることができる。
【００５７】
第１平行光ミラー１２１は、第１特定波長値（＞６００ｎｍ）よりは長波長帯の光は透過させ、前記第１特定波長値より短波長帯の光は反射させることにより、光源からフィルタへの過度な熱伝達を遮断することによりフィルタの損傷を防止し、赤外線吸収フィルタ等で代替も可能である。前記第１特定波長値は、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光より長波長帯であるものである。第１平行光ミラー１２１は、光源１１１で生成される広範囲な波長の光のうち本発明には適用する必要のない波長領域を１次的に除去する。すなわち、６００ｎｍ以下の波長帯域の光を励起フィルタモジュール１３０に送るようにする。
【００５８】
励起フィルタモジュール１３０は、複数の光ウィンドウ１３５、１３６が設置された光分離板１３４、第１平行光ミラー１２１からの反射光を受信する光流入部１３１、及び光を出す光排出部１３２を含む。
【００５９】
励起フィルタモジュール１３０は、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光１４２ａ(図４)と、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光１４２ｂ(図４)を選択的に透過させることができるが、これは光分離板１３４を周期的に回転駆動する過程によって標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光を透過する第１光ウィンドウ１３５及びｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を透過する第２光ウィンドウ１３６が、光流入部１３１と光排出部１３２を連結する光路上に配置されることができる。光排出部１３２から出る光成分は、光連結ライン１３７を介して光ノズル１３８に吐出されることができる。光連結ライン１３７は、フレキシブルな材質で構成されることにより、光ノズル１３８の自由な位置選定を可能にする。あるいは、適切な方法で光排出部１３２と第２平行光ミラーを水平配列することも可能である。
【００６０】
対物レンズ１４０は、試料１５０から放出される光を集光して像を形成するようにする。対物レンズ１４０は、例えば、石英又は石英ガラス(ｆｕｓｅｄ  ｓｉｌｉｃａ)で製造することができる。
【００６１】
図２に示されるように、光照射部１１０から対物レンズ１４０を連結する光経路上に第２平行光ミラー（ｃｏｌｌｉｍａｔｅ  ｍｉｒｒｏｒ）１２５を設置することができる。この時、第２平行光ミラー１２５は、第２特定波長値よりは長波長帯の光は透過させて、前記第２特定波長値より短波長帯の光は反射させ、前記第２特定波長値は、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光より長波長であり、検出しようとするｉＦＲＥＴ用探針で生成される発光の波長帯よりは短波長のものである。第２特定波長値は４００ｎｍであることが好ましく、これはタンパク質の吸収波長が２６０〜３００ｎｍ、ｉＦＲＥＴ用探針の吸収波長が３００〜４００ｎｍで、ｉＦＲＥＴ用探針の最終発光波長が４００ｎｍ以上であるためである。第２平行光ミラー１２５は、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光、又は両方を反射させて対物レンズ１４０を介して第１光又は第２光を試料に入射させることができる。一方、試料に照射された第１光に来由するｉＦＲＥＴ用探針で生成される第１発光、又は、試料に照射された第２光に来由するｉＦＲＥＴ用探針で生成される第２発光は、第２平行光ミラー１４０を透過して認識部１６０に入射され、それぞれ第１発光信号又は第２発光信号として検出され得る。
【００６２】
一方、光照射部が標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光及びｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を一定の時間間隔で交互に照射する場合、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光を試料上に照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第１発光信号値（Ａ１、Ａ２、Ａ３，…）と、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第２発光信号値（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３，…）から、レシオメトリック法によって第３発光信号値（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３，…）がレシオメトリックモジュールで一定の時間間隔で算出され蓄積されるため、時間に伴う標的タンパク質の位置、量又は両方の変化を確認することができる。したがって、 時間に伴う標的タンパク質の変化が動画としても算出され得る。これにより、 時間に伴う標的タンパク質の細胞内の位置と空間的移動、量的変化、活性変化、薬物の結合程度、又は上記した全ての変化を確認することができる。
【００６３】
それ以外には、通常の蛍光測定法に用いられる技術、例えばフィルタ方式及びモノクロム方式の蛍光分光器に使用される技術を適用することができる。
【００６４】
図３を参照して本発明の第３実施例による顕微鏡装置１００"を説明すれば次のとおりである。下記では第２実施例１００'と比べて異なる部分についてのみ説明し、同一部分については説明を省略する。
【００６５】
本実施例では、光源１１１からの光の一部を反射によって励起フィルタモジュール１３０に案内する第１波長選択ミラー（ｄｉｃｈｒｏｉｃ  ｍｉｒｒｏｒ）１２６を備えることができる。前記第１波長選択ミラー１２６は、第１平行光ミラー１２１と同様に第１特定波長値（６００ｎｍ）よりは長波長帯の光は透過させ、前記第１特定波長値より短波長帯の光は反射させることにより、広範囲な波長の光のうち本発明には適用する必要のない波長領域を１次的に除去する。
【００６６】
励起フィルタモジュール１３０の光排出部１３２を介して出る光成分は、リレーレンズシステム（ｒｅｌａｙ  ｌｅｎｓ  ｓｙｓｔｅｍ）１４４、第２波長選択ミラー１４６、対物レンズ１４０'、及び第３波長選択ミラー１４８を経て認識部１６０で検出される。
【００６７】
リレーレンズシステム１４４は、励起フィルタモジュール１３０を介してフィルタリングされた光を第２波長選択ミラー１４６、又は対物レンズ１４０'に集中させる。第２波長選択ミラー１４６は、入射される全ての波長の光を反射する。
【００６８】
対物レンズ１４０'は、試料１５０の前端に配置される第１対物レンズ１４１及び試料１５０の後端に配置される第２対物レンズ１４５を含む。第１対物レンズ１４１は、石英（Ｑｕａｒｔｚ）又は反射（ｒｅｆｌｅｃｔｉｎｇ）対物レンズであることができ、励起作用を容易にするように試料１５０上に光を集中させる。
【００６９】
一方、第２対物レンズ１４５は、試料１５０から出る光成分のうち３４０ｎｍ以上の光を透過させると共に、試料１５０の拡大を可能にする。前記第２対物レンズ１４５は、ｆｕｓｅｄ  ｓｉｌｉｃａで製造されることが好ましい。
【００７０】
第３波長選択ミラー１４８は、３１０ｎｍ波長以下の光をフィルタリングして除去する。これによって光源１１１から供給される過程中に残存し得る不必要な光成分を除去することにより認識部１６０での残像を最小化する。
【００７１】
一方、第３波長選択ミラー１４８を経た光が認識部１６０に到達する前に別途の排出フィルタ（ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ）１４９を備えることができる。
【００７２】
顕微鏡装置１００を利用した細胞タンパク質イメージング方法の説明
以下、図２、図４及び図５を参照して本発明の実施例による顕微鏡装置を利用した標的タンパク質イメージング方法を説明する。
まず、光源１１１では可視光線又は非可視光線を含む全領域の光を生成する（Ｓ１０）。
【００７３】
生成された光は、第１平行光ミラー１２１及び励起フィルタモジュール１３０を経る過程によって、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光１４２ａ(図４)及びｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光１４２ｂ(図４)に分離される（Ｓ２０）。
【００７４】
前記Ｓ２０ステップでフィルタリングにより分離選択された波長の光は、対物レンズ１４０を介して集光される（Ｓ３０）。この場合に、多様な倍率調整によって分解能を向上させることができる。
【００７５】
対物レンズ１４０から試料１５０上に照射された光成分が、試料１５０に内在するｉＦＲＥＴ用探針１５５を介して励起されて可視光領域の波長で発光する（Ｓ４０）。ここで、前記ｉＦＲＥＴ用探針１５５を励起させる光は、標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光１４２ａ(図４)及びｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光１４２ｂ(図４)が交互に繰り返されるものであってもよい。
【００７６】
認識部１６０は、ｉＦＲＥＴ用探針１５５で生成される発光信号を検出する（Ｓ５０）。認識部１６０は、ＣＣＤカメラモジュールであり得る。前記ＣＣＤカメラモジュールは、密閉された空間にある集光装置の配列を有し、入射される光子エネルギーのパターンを離散的なアナログ信号に変換するようにする。
【００７７】
標的タンパク質内のアミノ酸を励起する波長帯の第１光を試料上に照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第１発光信号値と、ｉＦＲＥＴ用探針の蛍光分子を励起する波長帯の第２光を照射してｉＦＲＥＴ用探針で生成される第２発光信号値は、レシオメトリック法を行って第３発光信号値を算出する（Ｓ６０）。
【００７８】
本発明によるイメージ化の方法は、自動化ワークステーションによって行われることが好ましい。
【００７９】
ｉＦＲＥＴ用探針に関連し、同日付けで出願された本発明者の韓国出願（ｉＦＲＥＴ用探針及びその用途）は、本発明の明細書の一部に統合される。
【００８０】
以上で本発明の好ましい実施例について説明したが、本発明は上述した特定の実施例に限定されない。すなわち、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者であれば、添付された特許請求の範囲の思想及び範疇を逸脱することなく本発明についての多数の変更及び修正が可能であり、そのような全ての適切な変更及び修正の均等物も本発明の範囲に属するものとみなすべきものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2014520275.tif 000010
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