(57)【要約】  本発明は、セルラーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。本発明はまた、このポリヌクレオチドを含む核酸構築物、ベクター、および宿主細胞と、さらにはこのポリペプチドを産生および使用する方法と、に関する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％、たとえば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するポリペプチド、
（ｂ）低ストリンジェンシー条件下、中ストリンジェンシー条件下、中〜高ストリンジェンシー条件下、高ストリンジェンシー条件下、もしくは非常に高いストリンジェンシー条件下で配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列もしくはその全長相補配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列もしくはそのゲノムＤＮＡ配列に対して少なくとも６０％、たとえば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、または
（ｄ）１つ以上（たとえば複数）の位置に置換、欠失、および／もしくは挿入を含む、配列番号２の成熟ポリペプチドの変異体、ならびに
（ｅ）セルラーゼ活性を有する、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリペプチドの断片、
からなる群から選択される、セルラーゼ活性を有する単離されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
低ストリンジェンシー条件下、低〜中ストリンジェンシー条件下、中ストリンジェンシー条件下、中〜高ストリンジェンシー条件下、高ストリンジェンシー条件下、または非常に高いストリンジェンシー条件下で（ｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）またはそのゲノムＤＮＡ配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の全長相補配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列またはそのゲノムＤＮＡ配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２を含むかまたはそれからなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２の成熟ポリペプチドを含むかまたはそれからなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記成熟ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸１〜４２８である、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号２の断片であり、この断片がセルラーゼ活性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項１０】
洗剤組成物である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
発現宿主内で前記ポリペプチドの産生を誘導する１つ以上の制御配列に機能可能に連結された請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む、核酸構築物または発現ベクター。
【請求項１３】
前記ポリペプチドの産生を誘導する１つ以上の制御配列に機能可能に連結された請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞。
【請求項１４】
（ａ）前記ポリペプチドの産生を助長する条件下で、前記ポリペプチドをその野生型形態で産生する細胞を培養することと、
（ｂ）前記ポリペプチドを回収することと、
を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドの産生方法。
【請求項１５】
（ａ）前記ポリペプチドの産生を助長する条件下で請求項１４に記載の宿主細胞を培養することと、
（ｂ）前記ポリペプチドを回収することと、
を含む、セルラーゼ活性を有するポリペプチドの産生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列リストの参照
本出願は、参照により本明細書に組み込まれるコンピューター可読形式の配列リストを含有する。
【０００２】
本発明は、セルラーゼ活性を有するポリペプチドと、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、に関する。本発明はまた、このポリヌクレオチドを含む核酸構築物、ベクター、および宿主細胞と、さらにはこのポリペプチドを産生および使用する方法と、に関する。
【背景技術】
【０００３】
テレベラ・ラピダリア（Ｔｅｒｅｂｅｌｌａ  ｌａｐｉｄａｒｉａ）（Ｌｉｎａｅｕｓ，１７６７）は、海洋環境中でのみ生息する多毛類動物である。標本は、典型的には、長さ３〜９ｃｍおよび直径４〜５ｍｍである。
【０００４】
Ｔ．ラピダリア（Ｔ．ｌａｐｉｄａｒｉａ）は、砂粒子を結合一体化して棲管住環境にする棲管形成動物である。それは、その多数の溝付き髭を用いて、有機材料、藻類、およびまたは小動物を捕捉する。テレベラ・ラピダリア（Ｔｅｒｅｂｅｌｌａ  ｌａｐｉｄａｒｉａ）は、広い生態学的分布を有する海洋種であり、潮間帯および深さ３０〜４０ｍまでの潮下帯で、砂、泥質砂、泥などの可動性基層中に見いだしうるうえに、岩層などの剛性基層上にも見いだしうる。
【０００５】
多くの砂食およびデトリタス食の多毛類のように、テレベラ属（Ｔｅｒｅｂｅｌｌａ）は、強力な消化性バイオ界面活性剤系を有し、消化器系により産生される酵素は、中性ｐＨまたはその近傍の界面活性剤環境中で効率的に作用するように明らかに進化してきた。
【０００６】
本発明は、セルラーゼ活性を有するポリペプチドと、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、
（ａ）配列番号２の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）そのゲノムＤＮＡ配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の全長相補配列と中ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列またはそのゲノムＤＮＡ配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコード化されるポリペプチド、
（ｄ）１つ以上（たとえば複数）の位置に置換、欠失、および／または挿入を含む、配列番号２の成熟ポリペプチドの変異体、および
（ｅ）セルラーゼ活性を有する、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）のポリペプチドの断片、
からなる群から選択される、セルラーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
【０００８】
本発明はまた、
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜４２８に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する触媒ドメイン、
（ｂ）（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１２〜１２９５、（ｉｉ）そのゲノムＤＮＡ配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の全長相補配列と中ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる触媒ドメイン、
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド１２〜１２９５またはそのゲノムＤＮＡ配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる触媒ドメイン、
（ｄ）１つ以上（たとえば複数）の位置に置換、欠失、および／または挿入を含む、配列番号２のアミノ酸１〜４２８の変異体、および
（ｅ）セルラーゼ活性を有する、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）のＧＨ９触媒ドメインの断片、
からなる群から選択される、ＧＨ９触媒ドメインを含む単離されたポリペプチドに関する。
【０００９】
本発明はまた、本発明に係るポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドと、このポリヌクレオチドを含む核酸構築物、組換え発現ベクター、組換え宿主細胞と、このポリペプチドの産生方法と、に関する。
【００１０】
本発明はまた、本発明に係るセルロースを含む組成物、特定的には、洗剤組成物ならびにテキスタイル処理用組成物ならびにパルプおよび紙処理用組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、還元糖アッセイによりＰＡＳＣを用いて決定されたセルラーゼのｐＨ最適値を示している。酵素は、広いｐＨ最適値を呈し、この酵素の最適ｐＨは、６であった。活性は、ｐＨ６〜９で最大活性の８０％超であった。菱形はＰＡＳＣ＋酵素、三角はＰＡＳＣ−酵素である。
【図２】図２は、０．１Ｍリン酸Ｎａ（ｐＨ７）中で０．２％ＡＺＣＬ−ＨＥ−セルロースに対して決定されたテレベラ・ラピダリア（Ｔｅｒｅｂｅｌｌａ  ｌａｐｉｄａｒｉａ）の温度プロファイルを示している。
【図３】図３は、２つの市販品ＥｎｄｏｌａｓｅおよびＷｈｉｔｅｚｙｍｅと比較したテレベラ属（Ｔｅｒｅｂｅｌｌａ）セルラーゼの洗濯性能（Ｕ３３Ｍ５と記された棒）を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
セルラーゼ：  「セルラーゼ」という用語は、β−１，４−グルカン中の２つのグルコシル残基を結合するβ−１，４−結合の加水分解を触媒するエンドβ−１，４−グルカナーゼ活性（ＥＣ３．２．１．４）を意味する。本発明の目的では、セルラーゼ活性は、実施例に記載の手順に従って決定される。
【００１３】
本発明に係るポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチドのセルラーゼ活性の少なくとも２０％、たとえば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％を有する。
【００１４】
エンドグルカナーゼ：  「エンドグルカナーゼ」という用語は、セルロース、セルロース誘導体（たとえばカルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロース）、リケニン中の１，４−β−Ｄ−グルコシド結合、混合β−１，３グルカンたとえば穀物β−Ｄ−グルカンまたはキシログルカンおよびセルロース系成分を含有する他の植物材料中のβ−１，４結合のエンド加水分解を触媒するエンド−１，４−（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４）を意味する。エンドグルカナーゼ活性は、還元糖アッセイにより決定される基質粘度の低下または還元末端の増加を測定することにより決定可能である（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ２４：４５２−４８１）。本発明の目的では、エンドグルカナーゼ活性は、ｐＨ５、４０℃で、Ｇｈｏｓｅ，１９８７，Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．５９：２５７−２６８の手順に従って、基質としてカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を用いて決定される。
【００１５】
対立遺伝子変異体：  「対立遺伝子変異体」という用語は、同一染色体座を占有する遺伝子の２つ以上の代替形態のいずれかを意味する。対立遺伝子変異は、突然変異により天然に生じ、集団内に多型をもたらしうる。遺伝子突然変異は、サイレントでありうるか（コードポリペプチドの変化なし）、または改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしうる。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるポリペプチドである。
【００１６】
結合ドメイン：  「セルロース結合ドメイン」という用語は、セルロース基質のアモルファス領域への酵素の結合を媒介する酵素の領域を意味する。セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）は、典型的には、エンド−グルカナーゼのＮ末端またはＣ末端に見いだされる。
【００１７】
触媒ドメイン：  「触媒ドメイン」という用語は、酵素の触媒機構を含有する酵素の領域を意味する。
【００１８】
ｃＤＮＡ：  「ｃＤＮＡ」という用語は、真核細胞または原核細胞から得られる成熟したスプライシングされたｍＲＮＡ分子から逆転写により調製可能なＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在しうるイントロン配列が欠如している。初期一次ＲＮＡ転写物は、成熟したスプライシングされたｍＲＮＡとして出現する前にスプライシングをはじめとする一連の工程によりプロセシングされるｍＲＮＡの前駆体である。
【００１９】
コード配列：  「コード配列」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般的には、ＡＴＧ、ＧＴＧ、ＴＴＧなどの開始コドンで始まるかつＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡなどの停止コドンで終わるオープンリーディングフレームにより決定される。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの組合せでありうる。
【００２０】
制御配列：  「制御配列」という用語は、本発明に係る成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な核酸配列を意味する。各制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して同一起源（すなわち同一遺伝子由来）であっても外来起源（すなわち異なる遺伝子由来）であってもよく、または互いに同一起源であっても外来起源であってもよい。そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターを含むが、これらに限定されるものではない。最低限でも、制御配列は、プロモーターならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、制御配列とポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード領域とのライゲーションを促進する特定の制限部位を導入する目的で、リンカーと共に提供されうる。
【００２１】
発現：  「発現」という用語は、限定されるものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌をはじめとするポリペプチドの産生に関与する任意の工程を含む。
【００２２】
発現ベクター：  「発現ベクター」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、かつその発現を提供する制御配列に機能可能に結合された、線状または環状のＤＮＡ分子を意味する。
【００２３】
断片：  「断片」という用語は、成熟ポリペプチドまたは成熟ドメインのアミノ末端および／またはカルボキシル末端から１つ以上（たとえば複数）のアミノ酸が欠失したポリペプチドまたは触媒ドメインを意味する。ただし、この断片は、セルラーゼ活性を有する。一態様では、断片は、配列番号２のアミノ酸３〜４２８を含有する断片のように少なくとも３００個のアミノ酸残基を含有する。
【００２４】
高ストリンジェンシー条件：  「高ストリンジェンシー条件」という用語は、１２〜２４時間の標準的サザンブロッティング手順に続いて、少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブに対して、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ剪断および変性サケ精子ＤＮＡ、および５０％ホルムアミド中、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。最後に、６５℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて担体材料をそれぞれ１５分間３回洗浄する。
【００２５】
宿主細胞：  「宿主細胞」という用語は、本発明に係るポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクターによるトランスフォーメーション、トランスフェクション、トランスダクションなどを受けやすい任意の細胞型を意味する。「宿主細胞」という用語は、複製中に起こる突然変異に起因して親細胞と同一でない親細胞の任意の後代を包含する。
【００２６】
単離された：  「単離された」という用語は、天然に存在しない形態のまたは環境中の物質を意味する。単離された物質の例としては、限定されるものではないが、（１）天然に存在しない任意の物質、（２）天然で会合している天然に存在する成分の１つ以上またはすべてから少なくとも部分的に分離された任意の物質、限定されるものではないが、任意の酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチド、補因子など、（３）天然に見いだされる物質に対して人間の手により修飾された任意の物質、または（４）天然で会合している他の成分に対する物質の量の増加（たとえば、物質をコードする遺伝子の多重コピー、物質をコードする遺伝子と天然で会合しているプロモーターよりも強力なプロモーターの使用）により修飾された任意の物質が挙げられる。単離された物質は、発酵ブロスサンプル中に存在していてもよい。
【００２７】
低ストリンジェンシー条件：  「低ストリンジェンシー条件」という用語は、１２〜２４時間の標準的サザンブロッティング手順に続いて、少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブに対して、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ剪断および変性サケ精子ＤＮＡ、および２５％ホルムアミド中、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。最後に、５０℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて担体材料をそれぞれ１５分間３回洗浄する。
【００２８】
成熟ポリペプチド：  「成熟ポリペプチド」という用語は、翻訳および任意の翻訳後修飾、たとえば、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端トランケーション、グリコシル化、リン酸化などを行った後の最終形態のポリペプチドを意味する。一態様では、成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜４２８である。宿主細胞が、同一ポリヌクレオチドにより発現される２つ以上の異なる成熟ポリペプチド（すなわち、異なるＣ末端および／またはＮ末端アミノ酸を有する）の混合物を産生しうることは、当技術分野で公知である。
【００２９】
成熟ポリペプチドコード配列：  「成熟ポリペプチドコード配列」という用語は、セルラーゼ活性を有する成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。一態様では、成熟ポリペプチドコード配列は、配列番号１のヌクレオチド１２〜１２９５またはそのゲノムＤＮＡ配列である。
【００３０】
中ストリンジェンシー条件：  「中ストリンジェンシー条件」という用語は、１２〜２４時間の標準的サザンブロッティング手順に続いて、少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブに対して、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ剪断および変性サケ精子ＤＮＡ、および３５％ホルムアミド中、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。最後に、５５℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて担体材料をそれぞれ１５分間３回洗浄する。
【００３１】
中〜高ストリンジェンシー：  「中〜高ストリンジェンシー条件」という用語は、１２〜２４時間の標準的サザンブロッティング手順に続いて、少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブに対して、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ剪断および変性サケ精子ＤＮＡ、さらには３５％ホルムアミド中、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。最後に、６０℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて担体材料をそれぞれ１５分間３回洗浄する。
【００３２】
核酸構築物：  「核酸構築物」という用語は、天然に存在する遺伝子から単離された、または他の点では天然に存在しないと思われる形で核酸のセグメントを含有するように修飾された、または１つ以上の制御配列を含む合成された、一本鎖または二本鎖のいずれかの核酸分子を意味する。
【００３３】
機能可能に連結された：  「機能可能に連結された」という用語は、制御配列がコード配列の発現を誘導するように制御配列がポリヌクレオチドのコード配列に対して適切な位置に配置された構成を意味する。
【００３４】
精製された：  「精製された」という用語は、天然で会合している少なくとも１つの成分から分離されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドを意味する。たとえば、ポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した場合、少なくとも１％の純度、たとえば、少なくとも５％の純度、少なくとも１０％の純度、少なくとも２０％の純度、少なくとも４０％の純度、少なくとも６０％の純度、少なくとも８０％の純度、少なくとも９０％の純度、少なくとも９５％の純度でありうる。また、ポリヌクレオチドは、アガロース電気泳動により決定した場合、少なくとも１％の純度、たとえば、少なくとも５％の純度、少なくとも１０％の純度、少なくとも２０％の純度、少なくとも４０％の純度、少なくとも６０％の純度、少なくとも８０％の純度、少なくとも９０％の純度、少なくとも９５％の純度でありうる。
【００３５】
配列同一性：  ２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性は、「配列同一性」というパラメーターにより記述される。
【００３６】
本発明の目的では、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、ニードルマン・ブンシュアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて、たとえば、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）（好ましくはバージョン５．０．０以降）のＮｅｅｄｌｅプログラム中に実装されているものを用いて、決定される。使用されるパラメーターは、ギャップオープンペナルティー１０、ギャップ伸長ペナルティー０．５、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＥＭＢＯＳＳバージョンのＢＬＯＳＵＭ６２）置換行列である。「最長同一性」と記されるＮｅｅｄｌｅの出力（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）は、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される。
（同一残基数×１００）／（アライメントの長さ−アライメント中の全ギャップ数）
【００３７】
本発明の目的では、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，ｓｕｐｒａ）（好ましくはバージョン５．０．０以降）のＮｅｅｄｌｅプログラム中に実装されているニードルマン・ブンシュアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，ｓｕｐｒａ）を用いて、決定される。使用されるパラメーターは、ギャップオープンペナルティー１０、ギャップ伸長ペナルティー０．５、およびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＥＭＢＯＳＳバージョンのＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４）置換行列である。「最長同一性」と記されるＮｅｅｄｌｅの出力（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）は、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される。
（同一デオキシリボヌクレオチド数×１００）／（アライメントの長さ−アライメント中の全ギャップ数）
【００３８】
サブ配列：  「サブ配列」という用語は、成熟ポリペプチドコード配列の５’末端および／または３’末端から１つ以上（たとえば複数）のヌクレオチドが欠失したポリヌクレオチドを意味する。ただし、このサブ配列は、セルラーゼ活性を有する断片をコードする。一態様では、サブ配列は、少なくとも９００個のヌクレオチド（たとえば、配列番号１のヌクレオチド９〜１２９３）を含有する。
【００３９】
変異体：  「変異体」という用語は、１つ以上の位置に１つ以上（たとえば複数）のアミノ酸残基の改変、すなわち、置換、挿入、および／または欠失を含む、セルラーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。置換とは、位置を占有するアミノ酸を異なるアミノ酸と交換することを意味し、欠失とは、位置を占有するアミノ酸を除去することを意味し、かつ挿入とは、位置を占有するアミノ酸に近接してアミノ酸を追加することを意味する。
【００４０】
非常に高いストリンジェンシー条件：  「非常に高いストリンジェンシー条件」という用語は、１２〜２４時間の標準的サザンブロッティング手順に続いて、少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブに対して、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ剪断および変性サケ精子ＤＮＡ、および５０％ホルムアミド中、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。最後に、７０℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて担体材料をそれぞれ１５分間３回洗浄する。
【００４１】
非常に低いストリンジェンシー条件：  「非常に低いストリンジェンシー条件」という用語は、１２〜２４時間の標準的サザンブロッティング手順に続いて、少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブに対して、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ剪断および変性サケ精子ＤＮＡ、および２５％ホルムアミド中、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。最後に、４５℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて担体材料をそれぞれ１５分間３回洗浄する。
【００４２】
セルラーゼ活性を有するポリペプチド
一実施形態では、本発明は、配列番号２の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、たとえば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、単離されたポリペプチドに関する。ただし、このポリペプチドは、セルラーゼ活性を有する。一態様では、ポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチドに対して、１０個以下のアミノ酸、たとえば、９個のアミノ酸、８個のアミノ酸、７個のアミノ酸、６個のアミノ酸、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸、または１個のアミノ酸が異なる。
【００４３】
本発明に係るポリペプチドは、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列もしくはその対立遺伝子変異体を含むかもしくはそれらからなり、またはセルラーゼ活性を有するそれらの断片である。他の態様では、ポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチドを含むかまたはそれからなる。他の好ましい態様では、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜４２８を含むかまたはそれからなる。
【００４４】
他の実施形態では、本発明は、非常に低いストリンジェンシー条件下、低ストリンジェンシー条件下、中ストリンジェンシー条件下、中〜高ストリンジェンシー下、高ストリンジェンシー条件下、または非常に高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）そのゲノムＤＮＡ配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の全長相補配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、セルラーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【００４５】
配列番号１のポリヌクレオチドまたはそのサブ配列、さらには配列番号２のポリペプチドまたはその断片は、当技術分野で周知の方法に従って、異なる属または種の株からセルロース活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを同定およびクローニングするための核酸プローブを設計すべく使用しうる。特定的には、そのようなプローブは、含まれる対応する遺伝子を同定および単離するために、標準的サザンブロッティング手順に続いて、対象の細胞のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションに使用可能である。そのようなプローブは、全配列よりもかなり短くすることが可能であるが、少なくとも１５ヌクレオチド長、たとえば、少なくとも２５、少なくとも３５、または少なくとも７０ヌクレオチド長にすべきである。好ましくは、核酸プローブは、少なくとも１００ヌクレオチド長、たとえば、少なくとも２００ヌクレオチド長、少なくとも３００ヌクレオチド長、少なくとも４００ヌクレオチド長、少なくとも５００ヌクレオチド長、少なくとも６００ヌクレオチド長、少なくとも７００ヌクレオチド長、少なくとも８００ヌクレオチド長、または少なくとも９００ヌクレオチド長である。ＤＮＡおよびＲＮＡプローブは両方とも、使用可能である。プローブは、典型的には、対応する遺伝子を検出するために標識される（たとえば、32Ｐ、3Ｈ、35Ｓ、ビオチン、またはアビジンを用いて）。そのようなプローブは、本発明に包含される。
【００４６】
そのような他の株から調製されるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーは、以上に記載のプローブにハイブリダイズする、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、ＤＮＡに関して、スクリーニングしうる。そのような他の株からのゲノムＤＮＡまたは他のＤＮＡは、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動または他の分離技術により分離しうる。ライブラリーからのＤＮＡまたは分離されたＤＮＡは、ニトロセルロースまたは他の好適な担体材料上に移動および固定しうる。配列番号１またはそのサブ配列と相同的なクローンまたはＤＮＡを同定するために、担体材料は、好ましくは、サザンブロットで使用される。
【００４７】
本発明の目的では、ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドが、非常に低い〜非常に高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１、（ｉｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列、（ｉｉｉ）もしくはそれらのゲノムＤＮＡ配列、（ｉｖ）それらの全長相補配列、または（ｖ）それらのサブ配列、に対応する標識核酸プローブにハイブリダイズすることの指標となる。これらの条件下で核酸プローブがハイブリダイズする分子は、たとえば、Ｘ線フィルムを用いて検出可能である。
【００４８】
一態様では、核酸プローブは、配列番号１のヌクレオチド１２〜１２９５である。他の態様では、核酸プローブは、配列番号２のポリペプチド、その成熟ポリペプチド、またはそれらの断片をコードするポリヌクレオチドである。他の態様では、核酸プローブは、配列番号１またはそのゲノム配列である。
【００４９】
少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブに対して、非常に低いストリンジェンシー条件は、最適には１２〜２４時間の標準的サザンブロッティング手順に続いて、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ剪断および変性サケ精子ＤＮＡ、および２５％ホルムアミド中、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションとして定義される。最後に、４５℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて担体材料をそれぞれ１５分間３回洗浄する。
【００５０】
少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブに対して、低ストリンジェンシー条件は、最適には１２〜２４時間の標準的サザンブロッティング手順に続いて、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ剪断および変性サケ精子ＤＮＡ、および２５％ホルムアミド中、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションとして定義される。最後に、５０℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて担体材料をそれぞれ１５分間３回洗浄する。
【００５１】
少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブに対して、中ストリンジェンシー条件は、最適には１２〜２４時間の標準的サザンブロッティング手順に続いて、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ剪断および変性サケ精子ＤＮＡ、および３５％ホルムアミド中、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションとして定義される。最後に、５５℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて担体材料をそれぞれ１５分間３回洗浄する。
【００５２】
少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブに対して、中〜高ストリンジェンシー条件は、最適には１２〜２４時間の標準的サザンブロッティング手順に続いて、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ剪断および変性サケ精子ＤＮＡ、さらには３５％ホルムアミド中、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションとして定義される。最後に、６０℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて担体材料をそれぞれ１５分間３回洗浄する。
【００５３】
少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブに対して、高ストリンジェンシー条件は、最適には１２〜２４時間の標準的サザンブロッティング手順に続いて、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ剪断および変性サケ精子ＤＮＡ、および５０％ホルムアミド中、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションとして定義される。最後に、６５℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて担体材料をそれぞれ１５分間３回洗浄する。
【００５４】
少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブに対して、非常に高いストリンジェンシー条件は、最適には１２〜２４時間の標準的サザンブロッティング手順に続いて、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ剪断および変性サケ精子ＤＮＡ、および５０％ホルムアミド中、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションとして定義される。最後に、７０℃で２×ＳＳＣ、０．２％のＳＤＳを用いて担体材料をそれぞれ１５分間３回洗浄する。
【００５５】
他の実施形態、本発明は、配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列またはそのゲノムＤＮＡ配列に対して、少なくとも６０％、たとえば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる、セルラーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
【００５６】
他の実施形態では、本発明は、１つ以上（たとえば複数）の位置に置換、欠失、および／または挿入を含む、配列番号２の成熟ポリペプチドの変異体に関する。好ましくは、アミノ酸変化は、副次的性質、すなわち、タンパク質のフォールディングおよび／もしくは活性に有意な影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換もしくは挿入、小さい欠失、典型的には１〜約３０個のアミノ酸の欠失、小さいアミノもしくはカルボキシル末端伸長、たとえば、アミノ末端メチオニン残基、約２０〜２５残基までの小さいリンカーペプチド、または正味電荷もしくは他の機能、たとえば、ポリヒスチジントラクト、抗原エピトープ、もしくは結合ドメインを変化させることにより精製を促進する小さい伸長である。
【００５７】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン、およびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、およびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン）、ならびに小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、およびメチオニン）の群に含まれる。一般に比活性を変化させないアミノ酸置換は、当技術分野で公知であり、たとえば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。通常の置換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、およびＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【００５８】
他の選択肢として、アミノ酸変化は、ポリペプチドの物理化学的性質が変化するような性質である。たとえば、アミノ酸変化は、ポリペプチドの熱安定性の向上、基質特異性の改変、ｐＨ最適値の変化などでありうる。
【００５９】
ポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位指向突然変異誘発やアラニンスキャニング突然変異誘発などの当技術分野で公知の手順に従って同定可能である（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）。後者の技術では、分子中のすべての残基に単一のアラニン突然変異を導入し、得られた突然変異分子をセルラーゼ活性に関して試験して分子の活性に重要なアミノ酸残基を同定する。Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８もまた、参照されたい。また、酵素または他の生物学的相互作用の活性部位は、推定接触部位アミノ酸の突然変異と組み合わせて、核磁気共鳴、結晶解析、電子回折、光親和性標識などの技術により決定されるように、構造の物理的解析により決定可能である。たとえば、ｄｅ  Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４、Ｗｌｏｄａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４を参照されたい。また、必須アミノ酸が何であるかは、関連ポリペプチドとのアライメントから推測可能である。
【００６０】
配列番号２のアミノ酸１〜４２８の配列中の必須アミノ酸は、位置Ａｓｐ５６、Ａｓｐ６９、およびＧｌｕ２１６に位置する。したがって、これらの位置は、置換や欠失を行うべきでない。
【００６１】
単一または複数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入は、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７、Ｂｏｗｉｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２１５２−２１５６、国際公開第９５／１７４１３号パンフレット、または国際公開第９５／２２６２５号パンフレットにより開示されるように、関連スクリーニング手順に続いて、突然変異誘発、組換え、および／またはシャフリングの公知の方法を用いて、試験可能である。使用可能な他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（たとえば、Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３７、米国特許第５，２２３，４０９号明細書、国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）、および領域指向突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４６：１４５、Ｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８  ＤＮＡ  ７：１２７）が挙げられる。
【００６２】
突然変異誘発／シャフリング方法は、宿主細胞により発現されたクローン化突然変異ポリペプチドの活性を検出するために、ハイスループット自動スクリーニング方法と組み合わせることが可能であるＮｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコードする突然変異ＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収して、当技術分野の標準的方法を用いて迅速に配列決定することが可能である。これらの方法は、ポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性の迅速な決定を可能にする。
【００６３】
一実施形態では、配列番号２の成熟ポリペプチド中に導入されるアミノ酸置換、欠失、および／または挿入の数は、１０以下、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９である。
【００６４】
ポリペプチドは、一方のポリペプチドの領域が他方のポリペプチドの領域のＮ末端またはＣ末端で融合されたハイブリッドポリペプチドであってもよい。
【００６５】
ポリペプチドは、他のポリペプチドが本発明に係るポリペプチドのＮ末端またはＣ末端で融合された融合ポリペプチドまたは切断可能融合ポリペプチドであってもよい。融合ポリペプチドは、他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを本発明に係るポリヌクレオチドに融合することにより生成される。融合ポリペプチドを生成する技術は、当技術分野で公知であり、インフレームであるようにかつ融合ポリペプチドの発現が同一のプロモーターおよびターミネーターの制御下にあるように、ポリペプチドをコードするコード配列をライゲートすることを含む。融合ポリペプチドはまた、融合ポリペプチドが翻訳後に形成されるインテイン技術を用いて構築することも可能である（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：２５７５−２５８３、Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９）。
【００６６】
融合ポリペプチドは、２つのポリペプチド間に切断部位をさらに含むことが可能である。融合タンパク質が分泌されると、この部位は、切断されて２つのポリペプチドを放出する。切断部位の例としては、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５６８−５７６、Ｓｖｅｔｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：２４５−２５１、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ−Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３４８８−３４９３、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：４９８−５０３、およびＣｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：３７８−３８１、Ｅａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：５０５−５１２、Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：９８２−９８７、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：２４０−２４８、およびＳｔｅｖｅｎｓ，２００３，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｗｏｒｌｄ  ４：３５−４８に開示される部位が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６７】
セルラーゼ活性を有するポリペプチドの供給源
本発明に係るセルラーゼ活性を有するポリペプチドは、任意の属の微生物から取得しうる。本発明の目的では、所与の供給源との関連で本明細書で用いられる「から取得される」という用語は、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが、供給源によりまたは供給源からのポリヌクレオチドが挿入された株により生成されることを意味するものとする。一態様では、所与の供給源から取得されるポリペプチドは、細胞外に分泌される。
【００６８】
ポリペプチドは、細菌ポリペプチドであってもよい。たとえば、ポリペプチドは、グラム陽性細菌ポリペプチド、たとえば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ジオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オーシャノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、もしくはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のセルラーゼ活性を有するポリペプチド、またはグラム陰性細菌ポリペプチド、たとえば、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、もしくはウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）のポリペプチドであってもよい。
【００６９】
一態様では、ポリペプチドは、バチルス・アルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ファーマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ロータス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、またはバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のポリペプチドである。
【００７０】
他の態様では、ポリペプチドは、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）、またはストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ｓｕｂｓｐ．  Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）のポリペプチドである。
【００７１】
他の態様では、ポリペプチドは、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、またはストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）のポリペプチドである。
【００７２】
ポリペプチドはまた、菌類ポリペプチドであってもよい。たとえば、ポリペプチドは、酵母ポリペプチド、たとえば、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、もしくはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）のポリペプチド、または糸状菌ポリペプチド、たとえば、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ボトリオスパエリア属（Ｂｏｔｒｙｏｓｐａｅｒｉａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、カエトミジウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｄｉｕｍ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クラビセプス属（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、コクリオボラス属（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）、コプリノプシス属（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ）、コプトテルメス属（Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ）、コリナスカス属（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、クリフォネクトリア属（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ディプロディア属（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）、エキシジア属（Ｅｘｉｄｉａ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、ハロマスチゴトイデス属（Ｈｏｌｏｍａｓｔｉｇｏｔｏｉｄｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、イルペックス属（Ｉｒｐｅｘ）、レンチヌラ属（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）、レプトスパエリア属（Ｌｅｐｔｏｓｐａｅｒｉａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、メラノカルパス属（Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ）、メリピラス属（Ｍｅｒｉｐｉｌｕｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、マイセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ピロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ポイトラシア属（Ｐｏｉｔｒａｓｉａ）、シュードプレクタニア属（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｃｔａｎｉａ）、シュードトリコニムファ属（Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、シタリジウム属（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、トリコファエア属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ）、バーティシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ボルバリエラ属（Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ）、もしくはキシラリア属（Ｘｙｌａｒｉａ）のポリペプチドであってもよい。
【００７３】
他の態様では、ポリペプチドは、サッカロマイセス・カールスバーゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ディアスタティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、またはサッカロマイセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）のポリペプチドである。
【００７４】
他の態様では、ポリペプチドは、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギウス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ラックノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クィーンズランディカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナタム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｚｏｎａｔｕｍ）、フザリウム・バクトリディオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウェレンセ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サンブキナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノ���（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、イルペックス・ラクテウス（Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、チエラビア・アクロマチカ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｃｈｒｏｍａｔｉｃａ）、チエラビア・アルボマイセス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｌｂｏｍｙｃｅｓ）、チエラビア・アルボピロサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｌｂｏｐｉｌｏｓａ）、チエラビア・アウストラレインシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｕｓｔｒａｌｅｉｎｓｉｓ）、チエラビア・フィメティ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｆｉｍｅｔｉ）、チエラビア・ミクロスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）、チエラビア・オビスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｏｖｉｓｐｏｒａ）、チエラビア・ペルビアナ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｐｅｒｕｖｉａｎａ）、チエラビア・セトサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｅｔｏｓａ）、チエラビア・スペデドニウム（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｐｅｄｅｄｏｎｉｕｍ）、チエラビア・スブテルモフィラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｕｂｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマ・ハージアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）のポリペプチドである。
【００７５】
他の態様では、ポリペプチドは、多毛類動物などの海洋生物、たとえば、テレベラ・ラピダリア（Ｔｅｒｅｂｅｌｌａ  ｌａｐｉｄａｒｉａ）などのテレベラ属（Ｔｅｒｅｂｅｌｌａ）の種に由来する。
【００７６】
以上に挙げた種に対して、本発明が、知られている種名にかかわらず、完全世代および不完全世代の両方ならびに他の分類学的等価世代、たとえば、アナモルフを包含することは、理解されよう。当業者であれば、適切な等価世代が何であるかは、容易にわかるであろう。
【００７７】
これらの種の株は、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、独国微生物・細胞培養株保存機関（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）（ＤＳＭＺ）、菌類培養株中央局（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＣＢＳ）、農業研究局特許培養株保存機関北部研究センター（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）（ＮＲＲＬ）などのいくつかの培養株保存機関で一般に容易に利用可能である。ポリペプチドは、以上に挙げたプローブを用いて、自然界（たとえば、土壌、コンポスト、水など）から単離された微生物を含む他の供給源から同定および取得しうる。自然の生息地から微生物を単離する技術は、当技術分野で周知である。次いで、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、他の微生物のゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリーまたは混合ＤＮＡサンプルを同様にスクリーニングすることにより取得しうる。プローブを用いてポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出した後、当業者に周知の技術を利用することにより、ポリヌクレオチドを単離またはクローニングすることが可能である（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，ｓｕｐｒａを参照されたい）。
【００７８】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、以上に記載したように、本発明に係るポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００７９】
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離またはクローニングするために使用される技術は、当技術分野で公知であり、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡまたはそれらの組合せからの単離を含む。ゲノムＤＮＡからのポリヌクレオチドのクローニングは、たとえば、発現ライブラリーの周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または抗体スクリーニングを用いて、共有される構造上の特徴を有するクローン化ＤＮＡ断片を検出することにより、行うことが可能である。たとえば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，ＰＣＲ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ライゲーション活性化転写（ＬＡＴ）、ポリヌクレオチドベース増幅（ＮＡＳＢＡ）などの他の核酸増幅手順を使用することが可能である。ポリヌクレオチドは、テレベラ属（Ｔｅｒｅｂｅｌｌａ）または関連生物の株からクローニングしうるので、ポリヌクレオチドのポリペプチドコード領域の対立遺伝子変異体または種変異体でありうる。
【００８０】
本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾は、このポリペプチドに実質的に類似したポリペプチドを合成するために必要でありうる。このポリペプチドに「実質的に類似した」という用語は、このポリペプチドの天然に存在しない形態を意味する。これらのポリペプチドは、いくらか工学操作されているという点で、その天然源から単離されたポリペプチドと異なりうる。たとえば、比活性、熱安定性、ｐＨ最適値などが異なる変異体でありうる。変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列もしくはそのゲノムＤＮＡ配列として提示されるポリヌクレオチドに基づいて（たとえば、それらのサブ配列）、および／またはポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらさないが、酵素の産生が意図された宿主生物のコドン使用頻度に対応する、ヌクレオチド置換を導入することにより、または異なるアミノ酸配列を生じうるヌクレオチド置換を導入することにより、構築しうる。ヌクレオチド置換の一般的な説明については、たとえば、Ｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２：９５−１０７を参照されたい。
【００８１】
核酸構築物
本発明はまた、制御配列に適合可能な条件下で好適な宿主細胞内でコード配列の発現を誘導する１つ以上の制御配列に機能可能に連結された本発明に係るポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。
【００８２】
ポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を提供すべくさまざまな方法で操作可能である。ベクター中への挿入前のポリヌクレオチドの操作は、発現ベクターに依存して、望ましいこともあれば必要なこともある。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドを改変する技術は、当技術分野で周知である。
【００８３】
制御配列は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現するための宿主細胞により認識されるポリヌクレオチドであるプロモーター配列でありうる。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、突然変異プロモーター、トランケートプロモーター、およびハイブリッドプロモーターを含めて、選択された宿主細胞内で転写活性を示す任意のポリヌクレオチドでありうる。また、宿主細胞に対して同種または異種の細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から取得しうる。
【００８４】
細菌宿主細胞内で本発明に係る核酸構築物の転写を誘導するのに好適なプロモーターの例は、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペロン、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｒｃプロモーター（Ｅｇｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｇｅｎｅ  ６９：  ３０１−３１５）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、および原核生物β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３７３１）、さらにはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５）から取得されるプロモーターである。さらなるプロモーターは、“Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ”ｉｎ  Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，２４２：７４−９４、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，ｓｕｐｒａに記載されている。
【００８５】
糸状菌宿主細胞内で本発明に係る核酸構築物の転写を誘導するのに好適なプロモーターの例は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）アルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）Ｄａｒｉａ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）Ｑｕｉｎｎ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、リゾムコール・ミエヘイＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、リゾムコール・ミエヘイＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−キシロシダーゼの遺伝子から取得されるプロモーター、さらにはＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（非翻訳リーダーが、トリオースリン酸イソメラーゼをコードするアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）遺伝子からの非翻訳リーダーにより置き換えられた、中性α−アミラーゼをコードするアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）遺伝子からの修飾プロモーター、例としては、非翻訳リーダーが、トリオースリン酸イソメラーゼをコードするアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の遺伝子からの非翻訳リーダーにより置き換えられた、中性α−アミラーゼをコードするアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）遺伝子からの修飾プロモーターが挙げられるが、これらに限定されるものではない）、ならびにそれらの突然変異プロモーター、トランケートプロモーター、およびハイブリッドプロモーターである。
【００８６】
酵母宿主では、有用なプロモーターは、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メタロチオネイン（ＣＵＰ１）、およびサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から取得される。酵母宿主細胞用の他の有用なプロモーターは、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８により記載されている。
【００８７】
制御配列はまた、転写を終了するように宿主細胞により認識される好適な転写ターミネーター配列でありうる。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’末端に機能可能に連結される。選択された宿主細胞内で機能する任意のターミネーターを本発明に使用しうる。
【００８８】
糸状菌宿主細胞用の好ましいターミネーターは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、およびフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼの遺伝子から取得される。
【００８９】
酵母宿主細胞用の好ましいターミネーターは、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）シトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から取得される。酵母宿主細胞用の他の有用なターミネーターは、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ｓｕｐｒａにより記載されている。
【００９０】
制御配列はまた、好適なリーダー配列でありうる。これは、転写時、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域である。リーダー配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’末端に機能可能に連結される。選択された宿主細胞内で機能する任意のリーダー配列を使用しうる。
【００９１】
糸状菌宿主細胞用の好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から取得される。
【００９２】
酵母宿主細胞用の好適なリーダーは、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α因子、およびサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から取得される。
【００９３】
制御配列はまた、ポリヌクレオチドの３’末端に機能可能に連結された配列であるポリアデニル化配列でありうる。これは、転写時、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして宿主細胞により認識される。選択された宿主細胞内で機能する任意のポリアデニル化配列を使用しうる。
【００９４】
糸状菌宿主細胞用の好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ、およびアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼの遺伝子から取得される。
【００９５】
酵母宿主細胞用の有用なポリアデニル化配列は、Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．１５：５９８３−５９９０により記載されている。
【００９６】
制御配列はまた、ポリペプチドのＮ末端に連結されたシグナルペプチドをコードする、かつポリペプチドを細胞の分泌経路中に誘導する、シグナルペプチドコード領域でありうる。ポリヌクレオチドのコード配列の５’末端は、本質的に、ポリペプチドをコードするコード配列のセグメントに翻訳リーディングフレーム内で天然に連結されたシグナルペプチドコード配列を含有しうる。他の選択肢として、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来起源のシグナルペプチドコード配列を含有しうる。コード配列が天然にシグナルペプチドコード配列を含有しない場合、外来シグナルペプチドコード配列が必要とされうる。他の選択肢として、外来シグナルペプチドコード配列は、ポリペプチドの分泌を増強するために天然シグナルペプチドコード配列を単純に置き換えうる。しかしながら、選択された宿主細胞の分泌経路中に発現されたポリペプチドを誘導する任意のシグナルペプチドコード配列が使用しうる。
【００９７】
細菌宿主細胞用の有効シグナルペプチドコード配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＮＣＩＢ１１８３７マルトース生成アミラーゼ、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）スブチリシン、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）β−ラクタマーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α−アミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｒｓＡの遺伝子から取得されるシグナルペプチドコード配列である。さらなるシグナルペプチドは、Ｓｉｍｏｎｅｎ  ａｎｄ  Ｐａｌｖａ，１９９３，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５７：１０９−１３７により記載されている。
【００９８】
糸状菌宿主細胞用の有効シグナルペプチドコード配列は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）エンドグルカナーゼＶ、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ、およびリゾムコール・ミエヘイＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼの遺伝子から取得されるシグナルペプチドコード配列である。
【００９９】
酵母宿主細胞用の有用なシグナルペプチドは、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α因子およびサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼの遺伝子から取得される。他の有用なシグナルペプチドコード配列は、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ｓｕｐｒａにより記載されている。
【０１００】
制御配列はまた、ポリペプチドのＮ末端に位置するプロペプチドをコードするプロペプチドコード配列でありうる。得られるポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（またはいくつかの場合にはチモーゲン）として知られる。プロポリペプチドは、一般的には不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒切断または自己触媒切断により活性ポリペプチドに変換可能である。プロペプチドコード配列は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）、リゾムコール・ミエヘイＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、およびサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α因子の遺伝子から取得しうる。
【０１０１】
シグナルペプチド配列およびプロペプチド配列の両方がポリペプチドのＮ末端に存在する場合、プロペプチド配列は、ポリペプチドのＮ末端に隣接して位置し、シグナルペプチド配列は、プロペプチド配列のＮ末端に隣接して位置する。
【０１０２】
宿主細胞の増殖に対してポリペプチドの発現を調節する調節配列を添加することが望ましいこともある。調節系の例は、調節化合物の存在をはじめとする化学的または物理的な刺激に対する反応で遺伝子の発現のオンオフの切換えを引き起こすものである。原核系の調節系は、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレーター系を含む。酵母では、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系を使用可能である。糸状菌では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼプロモーター、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡ  α−アミラーゼプロモーター、およびアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼプロモーターを使用可能である。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核系では、この調節配列は、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および重金属により増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。これらの場合、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、調節配列に機能可能に連結されるであろう。
【０１０３】
発現ベクター
本発明はまた、本発明に係るポリヌクレオチドと、プロモーターと、転写および翻訳停止シグナルと、を含む組換え発現ベクターに関する。種々のヌクレオチドおよび制御配列を連結一体化することにより、１つ以上の便利な制限部位を含んでそのような部位でポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能にしうる組換え発現ベクターを生成しうる。他の選択肢として、ポリヌクレオチドまたはその配列を含む核酸構築物を発現用の適切なベクター中に挿入することにより、ポリヌクレオチドを発現しうる。発現ベクターの形成では、コード配列は、コード配列が発現用の適切な制御配列に機能可能に連結されるようにベクター中に位置する。
【０１０４】
組換え発現ベクターは、便利に組換えＤＮＡ手順に付すことが可能である、かつポリヌクレオチドの発現を引き起こすことが可能である、任意のベクター（たとえば、プラスミドまたはウイルス）でありうる。ベクターの選択は、典型的には、ベクターとベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存するであろう。ベクターは、線状または閉環状のプラスミドであってもよい。
【０１０５】
ベクターは、自律的複製ベクター、すなわち、染色体外要素として存在し、その複製が染色体複製に依存しないベクター、たとえば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体であってよい。ベクターは、自己複製を保証するためのなんらかの手段を含有していてもよい。他の選択肢として、ベクターは、宿主細胞に導入された時、ゲノム中に組み込まれて、組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってよい。さらに、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡまたはトランスポゾンを一緒に含有する単一のベクターもしくはプラスミドまたは２つ以上のベクターもしくはプラスミドを使用してもよい。
【０１０６】
ベクターは、好ましくは、トランスフォーム細胞、トランスフェクト細胞、トランスデュース細胞、または類似の細胞の容易な選択を可能にする１つ以上の選択可能マーカーを含有する。選択可能マーカーは、産物が、殺生物剤、またはウイルス耐性、重金属耐性、栄養要求体に対する原栄養性などを提供する、遺伝子である。
【０１０７】
細菌性選択可能マーカーの例は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）もしくはバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来するｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン耐性、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性、テトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーである。酵母宿主細胞用の好適なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３である。糸状菌宿主細胞で使用するための選択可能マーカーとしては、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、さらにはそれらの等価体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞で使用するのに好ましいのは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）のａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子、およびストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ｂａｒ遺伝子である。
【０１０８】
ベクターは、好ましくは、宿主細胞のゲノム中へのベクターの組込みまたはゲノムとは独立して細胞内でのベクターの自律複製を可能にする要素を含有する。
【０１０９】
宿主細胞ゲノム中への組込みでは、ベクターは、相同的または非相同的組換えによるゲノム中への組込みのために、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列またはベクターの任意の他のエレメントに依拠しうる。他の選択肢として、ベクターは、染色体中の正確な位置での宿主細胞のゲノム中への相同的組換えによる組込みを誘導すべく、追加のポリヌクレオチドを含有しうる。正確な位置での組込みの可能性を増加させるために、組込みエレメントは、相同的組換えの可能性を向上させるように対応する標的配列に対して高度の配列同一性を有する十分な数の核酸、たとえば、１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対、および８００〜１０，０００塩基対を含有すべきである。組込みエレメントは、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的な任意の配列でありうる。さらに、組込みエレメントは、非コードまたはコードポリヌクレオチドでありうる。一方、ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノム中に組み込まれうる。
【０１１０】
自律複製のために、ベクターは、対象の宿主細胞内でベクターの自律複製を可能にする複製起点をさらに含みうる。複製起点は、細胞内で機能する自律複製を媒介する任意のプラスミドレプリケーターでありうる。「複製起点」または「プラスミドレプリケーター」という用語は、ｉｎ  ｖｉｖｏでプラスミドまたはベクターの複製を可能にするポリヌクレオチドを意味する。
【０１１１】
細菌性複製起点の例は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）での複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、およびｐＡＣＹＣ１８４ならびにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）での複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０、およびｐＡＭβ１の複製起点である。
【０１１２】
酵母宿主細胞で使用するための複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組合せ、およびＡＲＳ４とＣＥＮ６との組合せである。
【０１１３】
糸状菌細胞で有用な複製起点の例は、ＡＭＡ１およびＡＮＳ１である（Ｇｅｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ  ９８：６１−６７、Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：９１６３−９１７５、国際公開第００／２４８８３号パンフレット）。ＡＭＡ１遺伝子の単離およびこの遺伝子を含むプラスミドまたはベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号パンフレットに開示される方法に従って達成可能である。
【０１１４】
ポリペプチドの産生を増加させるために、本発明に係るポリヌクレオチドの２つ以上のコピーを宿主細胞内に挿入しうる。ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノム中に組み込むことにより、またはポリヌクレオチドと共に増幅可能選択可能マーカー遺伝子を組み込むことにより、取得可能であり、この場合、選択可能マーカー遺伝子の増幅されたコピーつまりポリヌクレオチドの追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択可能作用剤の存在下で細胞を培養することにより、選択可能である。
【０１１５】
以上に記載のエレメントをライゲートして本発明に係る組換え発現ベクターを構築するために使用される手順は、当業者に周知である（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，ｓｕｐｒａを参照されたい）。
【０１１６】
宿主細胞
本発明はまた、本発明に係るポリペプチドの産生を誘導する１つ以上の制御配列に機能可能に連結された本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞に関する。ポリヌクレオチドを含む構築物またはベクターは、構築物またはベクターが染色体内組込み体としてまたは先に記載の自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞内に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製中に起こる突然変異に起因して親細胞と同一でない親細胞の任意の後代を包含する。宿主細胞の選択は、かなりの程度まで、ポリペプチドをコードする遺伝子およびその供給源に依存するであろう。
【０１１７】
宿主細胞は、本発明に係るポリペプチドの組換え産生に有用な任意の細胞、たとえば、原核細胞または真核細胞でありうる。
【０１１８】
原核宿主細胞は、任意のグラム陽性細菌またはグラム陰性菌細菌でありうる。グラム陽性細菌としては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ジオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オーシャノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。グラム陰性細菌としては、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、およびウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１１９】
細菌宿主細胞としては、限定されるものではないが、バチルス・アルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ファーマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ロータス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の細胞をはじめとする任意のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞でありうる。
【０１２０】
細菌宿主細胞はまた、限定されるものではないが、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）、およびストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ｓｕｂｓｐ．  Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）の細胞をはじめとする任意のストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞でありうる。
【０１２１】
細菌宿主細胞はまた、限定されるものではないが、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、およびストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）の細胞をはじめとする任意のストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞でありうる。
【０１２２】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内へのＤＮＡの導入は、プロトプラストトランスフォーメーション（たとえば、Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，１９７９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５を参照されたい）により、コンピテント細胞（たとえば、Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：８２３−８２９、またはＤｕｂｎａｕ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９−２２１を参照されたい）、エレクトロポレーション（たとえば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ  ａｎｄ  Ｄｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：７４２−７５１を参照されたい）、またはコンジュゲーション（たとえば、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｅ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５２７１−５２７８を参照されたい）を用いて、行いうる。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内へのＤＮＡの導入は、プロトプラストトランスフォーメーション（たとえば、Ｈａｎａｈａｎ，１９８３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０を参照されたい）またはエレクトロポレーション（たとえば、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６１２７−６１４５を参照されたい）により、行いうる。ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞内へのＤＮＡの導入は、プロトプラストトランスフォーメーションおよびエレクトロポレーション（たとえば、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４９：３９９−４０５を参照されたい）、コンジュゲーション（たとえば、Ｍａｚｏｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３５８３−３５８５を参照されたい）、またはトランスダクション（たとえば、Ｂｕｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：６２８９−６２９４を参照されたい）により、行いうる。シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）細胞内へのＤＮＡの導入は、エレクトロポレーション（たとえば、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６４：３９１−３９７を参照されたい）またはコンジュゲーション（たとえば、Ｐｉｎｅｄｏ  ａｎｄ  Ｓｍｅｔｓ，２００５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：５１−５７を参照されたい）により、行いうる。ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞内へのＤＮＡの導入は、ナチュラルコンピテンス（たとえば、Ｐｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ，１９８１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５−１２９７を参照されたい）、プロトプラストトランスフォーメーション（たとえば、Ｃａｔｔ  ａｎｄ  Ｊｏｌｌｉｃｋ，１９９１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ  ６８：１８９−２０７を参照されたい）、エレクトロポレーション（たとえば、Ｂｕｃｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３８００−３８０４を参照されたい）、またはコンジュゲーション（たとえば、Ｃｌｅｗｅｌｌ，１９８１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅ��．４５：４０９−４３６を参照されたい）により、行いうる。しかしながら、宿主細胞内にＤＮＡを導入するための当技術分野で公知の任意の方法を使用可能である。
【０１２３】
宿主細胞はまた、真核細胞、たとえば、哺乳動物、昆虫、植物、または菌類の細胞でありうる。
【０１２４】
宿主細胞は、菌類細胞でありうる。本明細書で用いられる「菌類」は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、および接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫにより定義される）、さらには菌界卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ｓｕｐｒａ，ｐａｇｅ  １７１で引用されている）およびすべての栄養胞子形成菌（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ｓｕｐｒａ）を含む。
【０１２５】
菌類宿主細胞は、酵母細胞でありうる。本明細書で用いられる「酵母」は、有子嚢胞子酵母（エンドミセス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、有担子胞子酵母、および不完全菌類（Ｆｕｎｇｉ  Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ）に属する酵母（不完全酵母菌綱（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））を含む。酵母の分類は将来変更される可能性があるので、本発明の目的では、酵母は、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｆ．Ａ．，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，Ｓ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，Ｒ．Ｒ．，ｅｄｓ，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．９，１９８０）に記載されるように定義されるものとする。
【０１２６】
酵母宿主細胞は、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、またはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の細胞、たとえば、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、サッカロマイセス・カールスバーゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ディアスタティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、またはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の細胞でありうる。
【０１２７】
菌類宿主細胞は、糸状菌細胞でありうる。「糸状菌」は、細分類の真菌門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）および菌界卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ｓｕｐｒａにより定義される）のすべての糸状形態を含む。糸状菌は、一般的には、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合ポリサッカリドで構成される菌糸体壁により特徴付けられる。栄養成長は、菌糸伸長により、炭素異化は、偏性好気性である。これとは対照的に、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母による栄養成長は、単細胞葉状体の発芽により、炭素異化は、発酵性でありうる。
【０１２８】
糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブジェルカンデラ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオラス属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、マイセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレウロタス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の細胞でありうる。
【０１２９】
たとえば、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギウス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ブジェルカンデラ・アダスタ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ  ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベッセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ラックノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クィーンズランディカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナタム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｚｏｎａｔｕｍ）、コプリナス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、コプリナス・ヒルスタス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フザリウム・バクトリディオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウェレンセ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サンブキナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓ���ｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラディアタ（Ｐｈｌｅｂｉａ  ｒａｄｉａｔａ）、プレウロタス・エリンギイ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハージアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）の細胞でありうる。
【０１３０】
菌類細胞は、それ自体公知のように、プロトプラストの形成、プロトプラストのトランスフォーメーション、および細胞壁の再生を含む過程により、トランスフォームされうる。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の宿主細胞のトランスフォーメーションに好適な手順は、欧州特許第２３８０２３号明細書、Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４、およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１４１９−１４２２に記載されている。フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の種をトランスフォームするのに好適な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ  ７８：１４７−１５６および国際公開第９６／００７８７号パンフレットにより記載されている。酵母は、Ｂｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ  Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，ｐｐ１８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３、およびＨｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２０により記載された手順を用いてトランスフォームしうる。
【０１３１】
産生方法
配列番号１として同定されるヌクレオチド配列に基づいて、Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ（ＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ  ＢｉｏＰａｒｋ，Ｊｏｓｅｆ−Ｅｎｇｅｒｔ−Ｓｔｒ．１１，９３０５３，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）やＤＮＡ２．０（ＤＮＡ２．０，１４３０  Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｓｕｉｔｅ  Ｅ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ９４０２５，ＵＳＡなどのいくつかの販売業者から合成遺伝子を入手しうる。発現ベクター中への直接クローニングを容易にすべく、制限部位や相同的組換え領域などの追加のＤＮＡ配列を組み込むように、合成遺伝子を設計しうる。
【０１３２】
他の選択肢として、（配列番号３）や（配列番号４）などの合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、単純ＰＣＲ反応により、配列番号１の遺伝子から全長オープンリーディングフレームを増幅することが可能である。次いで、遺伝子を発現ベクター中に、たとえば、以上に記載の発現ベクター中にクローニングし、そして宿主細胞中で、たとえば、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）中で、発現することが可能である。
【０１３３】
本発明はまた、（ａ）ポリペプチドの産生を助長する条件下で、ポリペプチドをその野生型形態で産生する細胞を培養することと、（ｂ）ポリペプチドを回収することと、を含む、本発明に係るポリペプチドの産生方法に関する。好ましい態様では、細胞は、テレベラ属（Ｔｅｒｅｂｅｌｌａ）の細胞である。より好ましい態様では、細胞は、テレベラ・ラピダリア（Ｔｅｒｅｂｅｌｌａ  ｌａｐｉｄａｒｉａ）の細胞である。
【０１３４】
本発明はまた、（ａ）ポリペプチドの産生を助長する条件下で本発明に係る組換え宿主細胞を培養することと、（ｂ）ポリペプチドを回収することと、を含む、本発明に係るポリペプチドの産生方法に関する。
【０１３５】
宿主細胞は、当技術分野で周知の方法を用いて、ポリペプチドの産生に好適な栄養培地中で培養される。たとえば、細胞は、振盪フラスコ培養により、ならびに好適な培地中でかつポリペプチドの発現および／または単離を可能にする条件下で行われる実験室用または工業用の発酵槽内での小スケールまたは大スケールの発酵（連続発酵、バッチ発酵、フェドバッチ発酵、または固形発酵を含む）により、培養しうる。培養は、当技術分野で公知の手順を用いて、炭素源および窒素源および無機塩を含む好適な栄養培地中で行われる。好適な培地は、供給業者から入手可能であるか、または発表された組成（たとえば、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のカタログにあるもの）に従って調製しうる。ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合、ポリペプチドは、培地から直接回収可能である。ポリペプチドが分泌されない場合、細胞溶解物から回収可能である。
【０１３６】
ポリペプチドは、ポリペプチドに特異的な当技術分野で公知の方法を用いて検出しうる。この検出方法は、特異的抗体の使用、酵素産物の形成、または酵素基質の消失を含みうる。たとえば、酵素アッセイを用いてポリペプチドの活性を決定しうる。
【０１３７】
ポリペプチドは、当技術分野で公知の方法を用いて回収しうる。たとえば、ポリペプチドは、限定されるものではないが、遠心分離、濾過、抽出、スプレー乾燥、蒸発、または沈殿をはじめとする従来の手順により、栄養培地から回収しうる。
【０１３８】
ポリペプチドは、限定されるものではないが、実質的に純粋なポリペプチドが得られるように、クロマトグラフィー（たとえば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、電気泳動手順（たとえば、分取等電点フォーカシング）、溶解度差（たとえば、硫安沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または抽出（たとえば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．−Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照されたい）をはじめとする当技術分野で公知のさまざまな手順により、精製しうる。
【０１３９】
代替態様では、ポリペプチドを回収せずに、ポリペプチドを発現する本発明に係る宿主細胞をポリペプチドの供給源として使用する。
【０１４０】
植物
本発明はまた、回収可能量でポリペプチドまたはドメインを発現および産生するように本発明に係るポリヌクレオチドを含む単離された植物、たとえば、トランスジェニック植物、植物体各部、または植物細胞に関する。ポリペプチドまたはドメインは、植物または植物体各部から回収しうる。他の選択肢として、ポリペプチドまたはドメインを含有する植物または植物体各部は、食品または飼料の品質を向上させるために、たとえば、栄養価、嗜好性、およびレオロジー性を向上させるために、または抗栄養因子を破壊するために、そのまま使用してもよい。
【０１４１】
トランスジェニック植物は、双子葉（双子葉植物）または単子葉（単子葉植物）でありうる。単子葉植物の例は、イネ科草本、たとえば、牧草（ブルーグラス、イチゴツナギ属（Ｐｏａ））、飼料草、たとえば、ウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、寒地型牧草、たとえば、ヌカボ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）、ならびに穀草、たとえば、コムギ、エンバク、ライムギ、オオムギ、イネ、ソルガム、およびメイズ（トウモロコシ）である。
【０１４２】
双子葉植物の例は、タバコ、マメ科植物、たとえば、ルピナス、ジャガイモ、サトウダイコン、エンドウ、インゲン、およびダイズ、ならびにアブラナ科植物（アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ））、たとえば、カリフラワー、ナタネ、および近縁型生物アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）である。
【０１４３】
植物体各部の例は、茎、カルス、葉、根、果実、種子、および塊茎、さらにはこれらの各部を構成する個々の組織、たとえば、表皮、葉肉、柔組織、維管束組織、分裂組織である。葉緑体、アポプラスト、ミトコンドリア、空胞、ペルオキシソーム、細胞質などの特定の植物細胞区画もまた、植物体各部であるとみなされる。さらに、組織の起源にかかわらず、いずれの植物細胞も、植物体各部であるとみなされる。同様に、本発明に係る利用を容易にすべく単離された特定の組織や細胞などの植物体各部、たとえば、胚、胚乳、アリューロン、および種皮も、植物体各部とみなされる。
【０１４４】
このほかに本発明の範囲内に包含されるのは、そのような植物、植物体各部、および植物細胞の後代である。
【０１４５】
ポリペプチドまたはドメインを発現するトランスジェニック植物または植物細胞は、当技術分野で公知の方法に従って作製しうる。簡単に言えば、植物または植物細胞は、ポリペプチドまたはドメインをコードする１つ以上の発現構築物を植物宿主ゲノム中または葉緑体ゲノム中に組み込んで、得られた修飾植物または植物細胞を成長させてトランスジェニック植物または植物細胞にすることにより、作製される。
【０１４６】
発現構築物は、便宜上、ポリペプチドまたはドメインをコードするポリヌクレオチドを、選択された植物または植物体各部におけるポリヌクレオチドの発現に必要とされる適切な調節配列に機能可能に連結して含む、核酸構築物である。さらに、発現構築物は、発現構築物が組み込まれた宿主細胞の同定に有用な選択可能マーカーと、対象の植物中への構築物の導入に必要なＤＮＡ配列と、を含みうる（後者は、使用されるＤＮＡ導入方法に依存する）。
【０１４７】
調節配列、たとえば、プロモーター配列およびターミネーター配列ならびに任意選択でシグナル配列またはトランジット配列の選択は、たとえば、ポリペプチドまたはドメインがいつ、どこで、どのように発現されることが望まれるかに基づいて、決定される。たとえば、ポリペプチドまたはドメインをコードする遺伝子の発現は、構成的もしくは誘導的でありうるか、または進行的、期特異的、もしくは組織特異的でありうる。また、遺伝子産物は、種子や葉などの特定の組織または植物体各部を標的としうる。調節配列は、たとえば、Ｔａｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ８６：５０６により記載されている。
【０１４８】
構成的発現では、３５Ｓ−ＣａＭＶ、メイズユビキチン１、またはイネアクチン１プロモーターを使用しうる（Ｆｒａｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２１：２８５−２９４、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：１１５５−１１６５）。器官特異的プロモーターは、たとえば、種子、ジャガイモ塊茎、果実などの貯蔵シンク組織由来（Ｅｄｗａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｒｕｚｚｉ，１９９０，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２４：２７５−３０３）もしくは分裂組織などの代謝シンク組織由来（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：８６３−８７８）のプロモーター、イネ由来のグルテリン、プロラミン、グロブリン、アルブミンプロモーターなどの種子特異的プロモーター（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９：８８５−８８９）、ビシア・ファバ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ）由来のレグミンＢ４および未知種子タンパク質遺伝子のビシア・ファバ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ）プロモーター（Ｃｏｎｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５２：７０８−７１１）、種子油体タンパク質由来のプロモーター（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９：９３５−９４１）、ブラシカ・ナパス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来の貯蔵タンパク質ｎａｐＡプロモーター、またはたとえば国際公開第９１／１４７７２号パンフレットに記載の当技術分野で公知の任意の他の種子特異的プロモーターでありうる。さらに、プロモーターは、イネもしくはトマト由来のｒｂｃプロモーターなどの葉特異的プロモーター（Ｋｙｏｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：９９１−１０００）、クロレラウイルスアデニンメチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター（Ｍｉｔｒａ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：８５−９３）、イネ由来のａｌｄＰ遺伝子プロモーター（Ｋａｇａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４８：６６８−６７４）、またはジャガイモｐｉｎ２プロモーターなどの創傷誘導性プロモーター（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：５７３−５８８）でありうる。同様に、プロモーターは、温度、乾燥、塩分変化などの非生物的処理により誘導しうるか、またはプロモーターを活性化する外的適用物質、たとえば、エタノール、エストロゲン、植物ホルモン、たとえば、エチレン、アブシジン酸、およびジベレリン酸、ならびに重金属により誘導しうる。
【０１４９】
また、プロモーターエンハンサーエレメントを用いて、植物でポリペプチドまたはドメインのより高い発現を達成しうる。たとえば、プロモーターエンハンサーエレメントは、プロモーターとポリペプチドまたはドメインをコードするポリヌクレオチドとの間に配置されたイントロンでありうる。たとえば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ｓｕｐｒａには、発現を促進するためのイネアクチン１遺伝子の第１のイントロンの使用が開示されている。
【０１５０】
発現構築物の選択可能マーカー遺伝子および任意の他の部分は、当技術分野で利用可能なものから選択しうる。
【０１５１】
核酸構築物は、アグロバクテリウム媒介トランスフォーメーション、ウイルス媒介トランスフォーメーション、マイクロインジェクション、粒子照射、バイオリスティックトランスフォーメーション、およびエレクトロポレーションをはじめとする当技術分野で公知の従来技術により、植物ゲノム中に組み込まれる（Ｇａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２９３、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，１９９０，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：５３５、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：２７４）。
【０１５２】
現在、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）媒介遺伝子移入は、トランスジェニック双子葉植物の形成に最適な方法であり（レビューについては、Ｈｏｏｙｋａｓ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ，１９９２，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：１５−３８を参照されたい）、単子葉植物をトランスフォームするためにも使用可能であるが、この植物に対しては、他のトランスフォーメーション法を使用することが多い。現在、トランスジェニック単子葉植物の形成に最適な方法は、胚性カルスまたは発生胚の粒子照射（トランスフォーミングＤＮＡで被覆された微細な金またはタングステン粒子）である（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，１９９２，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２：２７５−２８１、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：１５８−１６２、Ｖａｓｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：６６７−６７４）。単子葉植物のトランスフォーメーションの代替方法は、Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１：４１５−４２８により記載されたプロトプラストトランスフォーメーションに基づく。本開示に従って使用される追加のトランスフォーメーション法としては、米国特許第６，３９５，９６６号明細書および同第７，１５１，２０４号明細書（両方ともそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものが挙げられる。
【０１５３】
トランスフォーメーション後、当技術分野で周知の方法に従って、発現構築物が組み込まれた形質転換体を選択し、全植物体に再生する。多くの場合、トランスフォーメーション手順は、たとえば、２つの個別のＴ−ＤＮＡ構築物によるコトランスフォーメーションまたは特異的リコンビナーセによる選択遺伝子の部位特異的切除を用いて、再生中または後続の世代のいずれかで、選択遺伝子の選択的除去を行うように設計される。
【０１５４】
本発明に係る構築物による特定の植物遺伝子型の直接的トランスフォーメーションに加えて、トランスジェニック植物は、構築物を有する植物を構築物が欠如している第２の植物に交配することにより作製しうる。たとえば、ポリペプチドまたはドメインをコードする構築物は、所与の品種の植物をなんら直接トランスフォームする必要なく、交配により特定の植物品種に導入することが可能である。したがって、本発明は、本発明に従ってトランスフォームされた細胞から直接再生された植物だけでなく、そのような植物の後代をも包含する。本明細書で用いられる場合、後代は、本発明に従って作製された親植物の任意の世代の子孫を意味しうる。そのような後代は、本発明に従って作製されたＤＮＡ構築物を含みうる。交配の結果として、出発系をドナー植物系で他花受粉することにより植物系にトランスジーンが導入される。そのような工程の例は、米国特許第７，１５１，２０４号明細書に記載されているが、これらに限定されるものではない。
【０１５５】
植物は、戻し交配転換の過程により形成しうる。たとえば、植物は、戻し交配転換された遺伝子型、系統、純系、または雑種として参照される植物を含む。
【０１５６】
遺伝子マーカーは、一方の遺伝的背景から他方の遺伝的背景への本発明に係る１つ以上のトランスジーンの遺伝子移入を支援すべく使用しうる。マーカー支援選択は、表現型変異に起因する誤差を回避すべく使用可能であるという点で、従来の育種と比べて利点を提供する。さらに、遺伝子マーカーは、特定の交配の個々の後代中のエリート生殖質の相対次数に関するデータを提供しうる。たとえば、所望の形質を有する以外に非作物学的に望ましい遺伝的背景を有する植物をエリート親に交配する場合、対象の形質を有するだけでなく所望の生殖質の割合が比較的大きい後代を選択すべく、遺伝子マーカーを使用しうる。このようにして、特定の遺伝的背景に１つ以上の形質を遺伝子移入するのに必要とされる世代数は、最小化される。
【０１５７】
本発明はまた、（ａ）ポリペプチドまたはドメインの産生を助長する条件下で、ポリペプチドまたはドメインをコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物または植物細胞を培養することと、（ｂ）ポリペプチドまたはドメインを回収することと、を含む、本発明に係るポリペプチドまたはドメインの産生方法に関する。
【０１５８】
洗剤組成物
一実施形態では、本発明は、１つ以上の追加のクリーニング組成物成分と組み合わせて本発明に係る酵素を含む洗剤組成物に関する。追加成分の選択は、当業者の技能の範囲内であり、以下に示される例示的成分（ただし、これらに限定されるものではない）をはじめとする従来の成分を含む。
【０１５９】
成分の選択は、テキスタイルの保護のために、クリーニングされるテキスタイルのタイプ、汚れのタイプおよび／または程度、クリーニングが行われる温度、ならびに洗剤製品の配合を考慮することを含みうる。以下に挙げられた成分は、特定の機能に従って一般的な見出しにより分類されているが、これは、当業者であればわかるであろうが、成分が追加の機能を含みうるので、限定要件とみなすべきはでない。
【０１６０】
本発明に係る酵素
本発明の一実施形態では、本発明に係るポリペプチドは、洗浄／洗濯液１リットルあたり、０．００１〜１００ｍｇのタンパク質、たとえば０．０１〜１００ｍｇのタンパク質、好ましくは０．００５〜５０ｍｇのタンパク質、より好ましくは０．０１〜２５ｍｇのタンパク質、さらにより好ましくは０．０５〜１０ｍｇのタンパク質、最も好ましくは０．０５〜５ｍｇのタンパク質、さらに最も好ましくは０．０１〜１ｍｇのタンパク質に対応する量で洗剤組成物に添加されうる。
【０１６１】
本発明に係る洗剤組成物の酵素は、従来の安定剤、たとえば、ポリオール、たとえば、プロピレングリコールもしくはグリセロール、糖もしくは糖アルコール、乳酸、ホウ酸、またはホウ酸誘導体、たとえば、芳香族ホウ酸エステル、またはフェニルボロン酸誘導体、たとえば、４−ホルミルフェニルボロン酸を用いて安定化しうる。また、組成物は、たとえば、国際公開第９２／１９７０９号パンフレットおよび国際公開第９２／１９７０８号パンフレットに記載されるように配合しうる。
【０１６２】
また、本発明に係るポリペプチドは、国際公開第９７／０７２０２号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に開示される洗剤配合物に組み込みうる。
【０１６３】
界面活性剤
洗剤組成物は、アニオン性および／またはカチオン性および／または非イオン性および／または半極性および／または双性イオン性またはそれらの混合物であってもよい１種以上の界面活性剤を含みうる。特定の実施形態では、洗剤組成物は、１種以上の非イオン性界面活性剤と１種以上のアニオン性界面活性剤との混合物を含む。界面活性剤は、典型的には、約０．１重量％〜６０重量％、たとえば、約１％〜約４０％または約３％〜約２０％または約３％〜約１０％のレベルで存在する。界面活性剤は、所望のクリーニング用途に基づいて選択され、当技術分野で公知の任意の従来型の界面活性剤を含む。洗剤で使用することが当技術分野で公知の任意の界面活性剤を利用しうる。
【０１６４】
洗剤は、その中に含む場合、通常、約１重量％〜約４０重量％、たとえば、約５％〜約３０％、たとえば、約５％〜約１５％または約２０％〜約２５％のアニオン性界面活性剤を含有するであろう。アニオン性界面活性剤の例としては、スルフェートおよびスルホネート、特定的には、線状アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）、ＬＡＳの異性体、分岐状アルキルベンゼンスルホネート（ＢＡＢＳ）、フェニルアルカンスルホネート、α−オレフィンスルホネート（ＡＯＳ）、オレフィンスルホネート、アルケンスルホネート、アルカン−２，３−ジイルビス（スルフェート）、ヒドロキシアルカンスルホネートおよびジスルホネート、アルキルスルフェート（ＡＳ）、たとえば、ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）、脂肪アルコールスルフェート（ＦＡＳ）、第一級アルコールスルフェート（ＰＡＳ）、アルコールエーテルスルフェート（ＡＥＳまたはＡＥＯＳまたはＦＥＳ、また、アルコールエトキシスルフェートまたは脂肪アルコールエーテルスルフェートとしても知られる）、第二級アルカンスルホネート（ＳＡＳ）、パラフィンスルホネート（ＰＳ）、エステルスルホネート、スルホン化脂肪酸グリセロールエステル、メチルエステルスルホネート（ＭＥＳ）を含むα−スルホ脂肪酸メチルエステル（α−ＳＦＭｅまたはＳＥＳ）、アルキルまたはアルケニルコハク酸、ドデセニル／テトラデセニルコハク酸（ＤＴＳＡ）、アミノ酸の脂肪酸誘導体、スルホコハク酸またはスルホ石鹸のジエステルおよびモノエステル、ならびにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１６５】
洗剤は、その中に含む場合、通常、約１重量％〜約４０重量％のカチオン性界面活性剤を含有するであろう。カチオン性界面活性剤の例としては、アルキルジメチルエハノールアミンクアット（ＡＤＭＥＡＱ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ジメチルジステアリルアンモニウムクロリド（ＤＳＤＭＡＣ）、およびアルキルベンジルジメチルアンモニウム、ならびにそれらの組合せ、アルキル第四級アンモニウム化合物、アルコキシル化第四級アンモニウム（ＡＱＡ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１６６】
洗剤は、その中に含む場合、通常、約０．２重量％〜約４０重量％、たとえば、約０．５％〜約３０％、特定的には、約１％〜約２０％、約３％〜約１０％、たとえば、約３％〜約５％または約８％〜約１２％の非イオン性界面活性剤を含有するであろう。非イオン性界面活性剤の例としては、アルコールエトキシレート（ＡＥまたはＡＥＯ）、アルコールプロポキシレート、プロポキシル化脂肪アルコール（ＰＦＡ）、アルコキシル化脂肪酸アルキルエステル、たとえば、エトキシル化および／またはプロポキシル化脂肪酸アルキルエステル、アルキルフェノールエトキシレート（ＡＰＥ）、ノニルフェノールエトキシレート（ＮＰＥ）、アルキルポリグリコシド（ＡＰＧ）、アルコキシル化アミン、脂肪酸モノエタノールアミド（ＦＡＭ）、脂肪酸ジエタノールアミド（ＦＡＤＡ）、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド（ＥＦＡＭ）、プロポキシル化脂肪酸モノエタノールアミド（ＰＦＡＭ）、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、またはグルコサミンＮ−アシルＮ−アルキル誘導体（グルカミドＧＡまたは脂肪酸グルカミドＦＡＧＡ）、さらにはＳＰＡＮおよびＴＷＥＥＮという商品名で入手可能な製品、ならびにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１６７】
洗剤は、その中に含む場合、通常、約１重量％〜約４０重量％の半極性界面活性剤を含有するであろう。半極性界面活性剤の例としては、アミンオキシド（ＡＯ）、たとえば、アルキルジメチルアミンオキシド、Ｎ−（ココアルキル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシドおよびＮ−（獣脂−アルキル）−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミドおよびエトキシル化脂肪酸アルカノールアミド、ならびにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１６８】
洗剤は、その中に含む場合、通常、約１重量％〜約４０重量％の双性イオン性界面活性剤を含有するであろう。双性イオン性界面活性剤の例としては、ベタイン、アルキルジメチルベタイン、およびスルホベタイン、ならびにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１６９】
ヒドロトロープ
ヒドロトロープは、水性溶液中に疎水性化合物を（または反対に非極性環境中に極性物質を）可溶化する化合物である。典型的には、ヒドロトロープは、親水性および疎水性の両方の特性（界面活性剤から知られるようないわゆる両親媒性）を有するが、ヒドロトロープの分子構造は、一般的には、自然自己会合に有利でない（たとえば、Ｈｏｄｇｄｏｎ  ａｎｄ  Ｋａｌｅｒ（２００７），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ＆  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２：１２１−１２８によるレビューを参照されたい）。ヒドロトロープは、ミセル相、ラメラ相、または他の明確に規定されたメソ相を形成する界面活性剤および脂質に見いだされるような自己会合が起こる臨界濃度を示さない。その代わりに、多くのヒドロトロープは、アグリゲートのサイズが濃度の増加と共に増加する連続タイプのアグリゲーション過程を示す。しかしながら、多くのヒドロトロープは、水と油と界面活性剤とポリマーとの混合物を含めて、極性および非極性の特性の物質を含有する系の相挙動、安定性、およびコロイド性を変化させる。ヒドロトロープは、典型的に、医薬、パーソナルケア、食品から技術的用途までの産業にわたり使用される。洗剤組成物中でのヒドロトロープの使用により、たとえば、相分離や高粘度などの望ましくない現象を引き起こすことなく界面活性剤のより濃厚な配合物を可能にする（水の除去により液体洗剤をコンパクト化するプロセスの場合など）。
【０１７０】
洗剤は、０〜５重量％、たとえば約０．５〜約５％または約３％〜約５％のヒドロトロープを含有しうる。洗剤で使用することが当技術分野で公知の任意のヒドロトロープを利用しうる。ヒドロトロープの例としては、ナトリウムベンゼンスルホネート、ナトリウムｐ−トルエンスルホネート（ＳＴＳ）、ナトリウムキシレンスルホネート（ＳＸＳ）、ナトリウムクメンスルホネート（ＳＣＳ）、ナトリウムシメンスルホネート、アミンオキシド、アルコールおよびポリグリコールエーテル、ナトリウムヒドロキシナフトエート、ナトリウムヒドロキシナフタレンスルホネート、ナトリウムエチルヘキシルスルフェート、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１７１】
ビルダーおよびコビルダー
洗剤組成物は、約０〜６５重量％、たとえば、約５％〜約５０％の洗剤ビルダーもしくはコビルダーまたはそれらの混合物を含有しうる。食器洗浄洗剤では、ビルダーのレベルは、典型的には４０〜６５％、特定的には５０〜６５％である。ビルダーおよび／またはコビルダーは、特定的にはＣａおよびＭｇとの水溶性錯体を形成するキレート化剤でありうる。衣類洗剤で使用することが当技術分野で公知の任意のビルダーおよび／またはコビルダーを利用しうる。ビルダーの例としては、ゼオライト、ジホスフェート（ピロホスフェート）、トリホスフェートたとえば三リン酸ナトリウム（ＳＴＰまたはＳＴＰＰ）、カーボネート、たとえば、炭酸ナトリウム、可溶性シリケート、たとえば、メタケイ酸ナトリウム、層状シリケート（たとえば、Ｈｏｅｃｈｓｔ製のＳＫＳ−６）、エタノールアミン、たとえば、２−アミノエタン−１−オール（ＭＥＡ）、イミノジエタノール（ＤＥＡ）および２，２’，２”−ニトリロトリエタノール（ＴＥＡ）、およびカルボキシメチルイヌリン（ＣＭＩ）、ならびにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１７２】
洗剤組成物はまた、０〜５０重量％、たとえば、約５％〜約４０％の洗剤コビルダーまたはその混合物を含有しうる。洗剤組成物は、コビルダーを単独でまたはビルダーたとえばゼオライトビルダーと組み合わせて含みうる。コビルダーの例としては、ポリアクリレートのホモポリマーまたはそのコポリマー、たとえば、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）またはコポリ（アクリル酸／マレイン酸）（ＰＡＡ／ＰＭＡ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらなる例としては、シトレート、キレート化剤、たとえば、アミノカルボキシレート、アミノポリカルボキシレート、およびホスホネート、ならびにアルキルまたはアルケニルコハク酸が挙げられるが、これらに限定されるものではない。追加の特定例としては、２，２’，２”−ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エテイレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、イミノジコハク酸（ＩＤＳ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、グルタミン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＧＬＤＡ）、１−ヒドロキシエタン−１，１−ジイルビス（ホスホン酸）（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンテトラキス（メチレン）テトラキス（ホスホン酸）（ＥＤＴＭＰＡ）、ジエチレントリアミンペンタキス（メチレン）ペンタキス（ホスホン酸）（ＤＴＰＭＰＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＥＤＧ）、アスパラギン酸−Ｎ−一酢酸（ＡＳＭＡ）、アスパラギン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＳＤＡ）、アスパラギン酸−Ｎ−モノプロピオン酸（ＡＳＭＰ）、イミノジコハク酸（ＩＤＡ）、Ｎ−（２−スルホメチル）アスパラギン酸（ＳＭＡＳ）、Ｎ−（２−スルホエチル）アスパラギン酸（ＳＥＡＳ）、Ｎ−（２−スルホメチル）グルタミン酸（ＳＭＧＬ）、Ｎ−（２−スルホエチル）グルタミン酸（ＳＥＧＬ）、Ｎ−メチルイミノ二酢酸（ＭＩＤＡ）、α−アラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（α−ＡＬＤＡ）、セリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＥＤＡ）、イソセリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＩＳＤＡ）、フェニルアラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＰＨＤＡ）、アントラニル酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＮＤＡ）、スルファニル酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＬＤＡ）、タウリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＴＵＤＡ）、およびスルホメチル−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＭＤＡ）、Ｎ−（ヒドロキシエチル）−エチリデンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエタノールグリシン（ＤＥＧ）、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）（ＤＴＰＭＰ）、アミノトリス（メチレンホスホン酸）（ＡＴＭＰ）、ならびにそれらの組合せおよび塩が挙げられる。さらなる例示的ビルダーおよび／またはコビルダーは、たとえば、国際公開第０９／１０２８５４号パンフレット、米国特許第５９７７０５３号明細書に記載されている。
【０１７３】
漂白系
洗剤は、漂白系を含みうる。衣類洗剤で使用することが当技術分野で公知の任意の漂白系を利用しうる。好適な漂白系成分としては、漂白触媒、光漂白剤、漂白活性化剤、過酸化水素源たとえば過炭酸ナトリウムおよび過ホウ酸ナトリウム、前形成過酸、およびそれらの混合物が挙げられる。好適な前形成過酸としては、ペルオキシカルボン酸および塩、過炭酸および塩、過イミド酸および塩、ペルオキシ一硫酸および塩、たとえばＯｘｏｎｅ（Ｒ））、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。漂白系の例としては、たとえば、過ホウ酸のナトリウム塩（通常、一水和物または四水和物）などのアルカリ金属塩、過炭酸塩、過硫酸塩、過リン酸塩、過ケイ酸塩をはじめとする無機塩を、過酸形成漂白活性化剤と組み合わせて含みうる、過酸化物に基づく漂白系が挙げられるが、これに限定されるものではない。漂白活性化剤とは、本明細書では、過酸化水素のような過酸素漂白剤と反応して過酸を形成する化合物を意味する。こうして形成された過酸は、活性化漂白剤を構成する。ここで使用するのに好適な漂白活性化剤としては、エステル、アミド、イミド、またはアンヒドリドのクラスに属するものが挙げられる。好適な例は、テトラアセチルアチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、ナトリウム３，５，５トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホネート、ジペルオキシドデカン酸、４−（ドデカノイルオキシ）ベンゼンスルホネート（ＬＯＢＳ）、４−（デカノイルオキシ）ベンゼンスルホネート、４−（デカノイルオキシ）ベンゾエート（ＤＯＢＳ）、４−（３，５，５−トリメチルヘキサノイルオキシ）ベンゼンスルホネート（ＩＳＯＮＯＢＳ）、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、および４−（ノナノイルオキシ）ベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ）、ならびに／または国際公開第９８／１７７６７号パンフレットに開示されるものである。対象の漂白活性化剤の特定のファミリーは、欧州特許第６２４１５４号明細書に開示されており、そのファミリーでとくに好ましいのは、アセチルトリエチルシトレート（ＡＴＣ）である。ＡＴＣまたはＴｒｉａｃｉｎのような短鎖トリグリセリドは、最終的にクエン酸およびアルコールに分解するので環境にやさしいという利点を有する。さらに、アセチルトリエチルシトレートおよびトリアセチンは、貯蔵時、製品中で良好な加水分解安定性を有し、効率的な漂白活性化剤である。最後に、ＡＴＣは、洗濯添加剤に良好なビルダー能を提供する。他の選択肢として、漂白系は、たとえば、アミド型、イミド型、またはスルホン型のペルオキシ酸を含みうる。漂白系はまた、６−（フタロイルアミノ）過カプロン酸（ＰＡＰ）などの過酸を含みうる。漂白系はまた、漂白触媒を含みうる。いくつかの実施形態では、漂白剤成分は、次式：
【化１】
2014531895.tif 000003
を有する有機触媒、
（ｉｉｉ）およびそれらの混合物、
からなる群から選択される有機触媒でありうる。式中、各Ｒ1は、独立して、９〜２４個の炭素を含有する分岐状アルキル基または１１〜２４個の炭素を含有する線状アルキル基であり、好ましくは、各Ｒ1は、独立して、９〜１８個の炭素を含有する分岐状アルキル基または１１〜１８個の炭素を含有する線状アルキル基、より好ましくは、各Ｒ1は、独立して、２−プロピルヘプチル、２−ブチルオクチル、２−ペンチルノニル、２−ヘキシルデシル、ｎ−ドデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ヘキサデシル、ｎ−オクタデシル、ｉｓｏ−ノニル、イソデシル、ｉｓｏ−トリデシル、およびイソペンタデシルからなる群から選択される。他の例示的な漂白系は、たとえば、国際公開第２００７／０８７２５８号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２４４号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２５９号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２４２号パンフレットに記載されている。好適な光漂白剤は、たとえば、スルホン化亜鉛フタロシアニンでありうる。
【０１７４】
ポリマー
洗剤は、０〜１０重量％、たとえば、０．５〜５％、２〜５％、０．５〜２％、または０．２〜１％のポリマーを含有しうる。洗剤で使用することが当技術分野で公知の任意のポリマーを利用しうる。ポリマーは、以上に挙げたコビルダーとして機能しうるか、または再付着防止性、繊維保護性、防汚性、染料転写防止性、グリースクリーニング性、および／または消泡性を提供しうる。いくつかのポリマーは、以上に挙げた性質の２つ以上および／または以下に挙げるモチーフの２つ以上を有しうる。例示的なポリマーとしては、（カルボキシメチル）セルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＧ）、エトキシル化ポリ（エチレンイミン）、カルボキシメチルイヌリン（ＣＭＩ）、およびポリカルボキシレート、たとえば、ＰＡＡ、ＰＡＡ／ＰＭＡ、ポリアスパラギン酸、およびラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー、疎水変性ＣＭＣ（ＨＭ−ＣＭＣ）およびシリコーン、テレフタル酸とオリゴマーグリコールとのコポリマー、ポリエチレンテレフタレートとポリオキシエテンテレフタレートとのコポリマー（ＰＥＴ−ＰＯＥＴ）、ＰＶＰ、ポリ（ビニルイミダゾール）（ＰＶＩ）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）（ＰＶＰＯまたはＰＶＰＮＯ）、およびポリビニルピロリドン−ビニルイミダゾール（ＰＶＰＶＩ）が挙げられる。さらに例示的なポリマーとしては、スルホン化ポリカルボキシレート、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシド（ＰＥＯ−ＰＰＯ）、およびジクアテルニウムエトキシスルフェートが挙げられる。他の例示的なポリマーは、たとえば、国際公開第２００６／１３０５７５号パンフレットに開示されている。以上に挙げたポリマーの塩も利用可能であると考えられる。
【０１７５】
布染色剤
本発明に係る洗剤組成物はまた、染料や顔料などの布染色剤を含みうる。この布染色剤は、洗剤組成物中に配合した場合、前記布が、前記洗剤組成物を含む洗浄／洗濯液に接触した時、布上に堆積可能であるので、可視光の吸収／反射を介して前記布の色調を変化させる。蛍光増白剤は、少なくともいくらかの可視光を発する。これとは対照的に、布染色剤は、可視光スペクトルの少なくとも一部を吸収するので、表面の色調を変化させる。好適な布染色剤としては、染料および染料−クレーコンジュゲートが挙げられる。また、顔料をも含んでいてもよい。好適な染料としては、小分子染料および高分子染料が挙げられる。好適な小分子染料としては、たとえば、国際公開第２００５／０３２７４号パンフレット、国際公開第２００５／０３２７５号パンフレット、国際公開第２００５／０３２７６号パンフレット、および欧州特許第１８７６２２６号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ダイレクトブルー、ダイレクトレッド、ダイレクトバイオレット、アシッドブルー、アシッドレッド、アシッドバイオレット、ベーシックブルー、ベーシックバイオレット、およびベーシックレッドのＣｏｌｏｕｒ  Ｉｎｄｅｘ（Ｃ．Ｉ．）分類に分類される染料またはそれらの混合物からなる群から選択される小分子染料が挙げられる。洗剤組成物は、好ましくは、約０．００００３ｗｔ％〜約０．２ｗｔ％、約０．００００８ｗｔ％〜約０．０５ｗｔ％、さらには約０．０００１ｗｔ％〜約０．０４ｗｔ％の布染色剤を含む。組成物は、０．０００１ｗｔ％〜０．２ｗｔ％の布染色剤を含みうる。これは、組成物が単位用量パウチの形態である場合、とくに有利でありうる。好適な染色剤はまた、たとえば、国際公開第２００７／０８７２５７号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２４３号パンフレットにも記載されている。
【０１７６】
（追加の）酵素
洗剤添加剤さらには洗剤組成物は、１つ以上の追加の酵素、たとえば、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、たとえば、ラッカーゼおよび／またはペルオキシダーゼを含みうる。
【０１７７】
一般的には、所定の酵素の性質は、所定の洗剤（すなわち、ｐＨ最適値、他の酵素および非酵素成分との適合性など）に適合すべきであり、また、酵素は、有効量で存在すべきである。
【０１７８】
セルラーゼ：  好適なセルラーゼとしては、細菌起源または菌類起源のものが挙げられる。化学修飾またはタンパク質工学操作された突然変異体が包含される。好適なセルラーゼとしては、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）に由来するセルラーゼ、たとえば、米国特許第４，４３５，３０７号明細書、米国特許第５，６４８，２６３号明細書、米国特許第５，６９１，１７８号明細書、米国特許第５，７７６，７５７号明細書、および国際公開第８９／０９２５９号パンフレットに開示されている、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｋｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、およびフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から産生される菌類のセルラーゼが挙げられる。
【０１７９】
とくに好適なセルラーゼは、カラーケア効果を有するアルカリ性セルラーゼまたは中性セルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は、欧州特許第０４９５２５７号明細書、欧州特許第０５３１３７２号明細書、国際公開第９６／１１２６２号パンフレット、国際公開第９６／２９３９７号パンフレット、国際公開第９８／０８９４０号パンフレットに記載のセルラーゼである。他の例は、セルラーゼ変異体、たとえば、国際公開第９４／０７９９８号パンフレット、欧州特許第０５３１３１５号明細書、米国特許第５，４５７，０４６号明細書、米国特許第５，６８６，５９３号明細書、米国特許第５，７６３，２５４号明細書、国際公開第９５／２４４７１号パンフレット、国際公開第９８／１２３０７号パンフレット、および国際出願第ＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９号パンフレットに記載のものである。
【０１８０】
市販のセルラーゼとしては、Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ（商標）、およびＣａｒｅｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、Ｃｌａｚｉｎａｓｅ（商標）、およびＰｕｒａｄａｘ  ＨＡ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）、ならびにＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王株式会社）が挙げられる。
【０１８１】
プロテアーゼ：  好適なプロテアーゼとしては、動物起源、植物起源、または微生物起源のものが挙げられる。微生物起源が好ましい。化学修飾またはタンパク質工学操作された突然変異体が包含される。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼ、好ましくは微生物アルカリプロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼでありうる。アルカリプロテアーゼの例は、スブチリシン、特定的には、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のもの、たとえば、スブチリシンノボ、スブチリシンカールスバーグ、スブチリシン３０９、スブチリシン１４７、およびスブチリシン１６８である（国際公開第８９／０６２７９号パンフレットに記載されている）。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン（たとえば、ブタ起源またはウシ起源のもの）、ならびに国際公開第８９／０６２７０号パンフレットおよび国際公開第９４／２５５８３号パンフレットに記載のフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）のプロテアーゼである。
【０１８２】
有用なプロテアーゼの例は、国際公開第９２／１９７２９号パンフレット、国際公開第９８／２０１１５号パンフレット、国際公開第９８／２０１１６号パンフレット、および国際公開第９８／３４９４６号パンフレットに記載の変異体、特定的には、次の位置：２７、３６、５７、７６、８７、９７、１０１、１０４、１２０、１２３、１６７、１７０、１９４、２０６、２１８、２２２、２２４、２３５、および２７４の１つ以上に置換を有する変異体である。
【０１８３】
好ましい市販のプロテアーゼ酵素としては、Ａｌｃａｌａｓｅ（商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）、プライマーゼ（商標）、Ｄｕｒａｌａｓｅ（商標）、Ｅｓｐｅｒａｓｅ（商標）、またＫａｎｎａｓｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、Ｍａｘａｔａｓｅ（商標）、Ｍａｘａｃａｌ（商標）、Ｍａｘａｐｅｍ（商標）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ  ＯｘＰ（商標）、ＦＮ２（商標）およびＦＮ３（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）が挙げられる。
【０１８４】
リパーゼおよびクチナーゼ：
好適なリパーゼおよびクチナーゼとしては、細菌起源または菌類起源のものが挙げられる。化学修飾またはタンパク質工学操作された突然変異体が包含される。例としては、サーモマイセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）由来のリパーゼ、たとえば、欧州特許第２５８０６８号明細書および欧州特許第３０５２１６号明細書に記載のＴ．ラヌギノサス（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）（旧名フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ））由来のリパーゼ、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）由来のクチナーゼ、たとえば、国際公開第９６／１３５８０号パンフレットに記載のＨ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来のクチナーゼ、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のリパーゼ、たとえば、Ｐ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）またはＰ．シュードアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（欧州特許第２１８２７２号明細書）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）（欧州特許第３３１３７６号明細書）、Ｐ．スツッツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）（英国特許第１，３７２，０３４号明細書）、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の種の株ＳＤ７０５（国際公開第９５／０６７２０号パンフレットおよび国際公開第９６／２７００２号パンフレット）、Ｐ．ウィスコンシネンシス（Ｐ．ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）（国際公開第９６／１２０１２号パンフレット）由来のリパーゼ、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のリパーゼ、たとえば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｄａｒｔｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１３１：２５３−３６０）、Ｂ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（特開昭６４−７４４９９２号公報）、またはＢ．プミラス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）（国際公開第９１／１６４２２号パンフレット）由来のリパーゼが挙げられる。
【０１８５】
他の例は、リパーゼ変異体、たとえば、国際公開第９２／０５２４９号パンフレット、国際公開第９４／０１５４１号パンフレット、欧州特許第４０７２２５号明細書、欧州特許第２６０１０５号明細書、国際公開第９５／３５３８１号パンフレット、国際公開第９６／００２９２号パンフレット、国際公開第９５／３０７４４号パンフレット、国際公開第９４／２５５７８号パンフレット、国際公開第９５／１４７８３号パンフレット、国際公開第９５／２２６１５号パンフレット、国際公開第９７／０４０７９号パンフレット、国際公開第９７／０７２０２号パンフレット、国際公開第００／０６００６３号パンフレット、国際公開第２００７／０８７５０８号パンフレット、および国際公開第２００９／１０９５００号パンフレットに記載のものである。
【０１８６】
好ましい市販のリパーゼ酵素としては、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（商標）、Ｌｉｐｏｌａｓｅ  Ｕｌｔｒａ（商標）、およびＬｉｐｅｘ（商標）、Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）、Ｌｉｐｏｌｅｘ（商標）、Ｌｉｐｏｃｌｅａｎ（商標）、Ｌｉｐｏｐｒｉｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）が挙げられる。他の市販のリパーゼとしては、Ｌｕｍａｆａｓｔ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔ  Ｉｎｃ）、Ｌｉｐｏｍａｘ（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔ  Ｉｎｃ）、およびＳｏｌｖａｙ製のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種のリパーゼが挙げられる。
【０１８７】
アミラーゼ：  好適なアミラーゼ（αおよび／またはβ）としては、細菌起源または菌類起源のものが挙げられる。化学修飾またはタンパク質工学操作された突然変異体が包含される。アミラーゼとしては、たとえば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から取得されるα−アミラーゼ、たとえば、より詳細には英国特許第１，２９６，８３９号明細書に記載されるバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の特定の株から取得されるものが挙げられる。
【０１８８】
有用なアミラーゼの例は、国際公開第９４／０２５９７号パンフレット、国際公開第９４／１８３１４号パンフレット、国際公開第９６／２３８７３号パンフレット、および国際公開第９７／４３４２４号パンフレットに記載の変異体、特定的には、次の位置、すなわち、１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１８１、１８８、１９０、１９７、２０２、２０８、２０９、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８、および４４４の１つ以上に置換を有する変異体である。
【０１８９】
市販のアミラーゼは、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）、Ｎａｔａｌａｓｅ（商標）、Ｄｕｒａｍｙｌ（商標）、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（商標）、Ｆｕｎｇａｍｙｌ（商標）、およびＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、Ｒａｐｉｄａｓｅ（商標）およびＰｕｒａｓｔａｒ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．製）である。
【０１９０】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：  好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼとしては、植物起源、細菌起源、または菌類起源のものが挙げられる。化学修飾またはタンパク質工学操作された突然変異体が包含される。有用なペルオキシダーゼの例としては、コプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）由来のペルオキシダーゼ、たとえば、Ｃ．シネレウス（ｃｉｎｅｒｅｕｓ）由来のもの、およびその変異体、たとえば、国際公開第９３／２４６１８号パンフレット、国際公開第９５／１０６０２号パンフレット、および国際公開第９８／１５２５７号パンフレットに記載のものが挙げられる。
【０１９１】
市販のペルオキシダーゼとしては、Ｇｕａｒｄｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）が挙げられる。
【０１９２】
洗剤酵素は、１つ以上の酵素を含有する個別の添加剤を添加することにより、またはこれらの酵素をすべて含む組合せ添加剤を添加することにより、洗剤組成物に組み込みうる。本発明に係る洗剤添加剤、すなわち、個別の添加剤または組合せ添加剤は、たとえば、顆粒、液体、スラリーなどとして配合可能である。好ましい洗剤添加剤配合物は、顆粒、特定的には非発塵性顆粒、液体、特定的には安定化液体、またはスラリーである。
【０１９３】
非発塵性顆粒は、たとえば、米国特許第４，１０６，９９１号明細書および同第４，６６１，４５２号明細書に開示されるように作製され得、任意選択で、当技術分野で公知の方法により被覆されうる。ワックス被覆材料の例は、１０００〜２００００の平均モル重量を有するポリ（エチレンオキシド）生成物（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、１６〜５０個のエチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール、アルコールが１２〜２０個の炭素原子を含有する、かつ中で１５〜８０個のエチレンオキシド単位が存在するエトキシル化脂肪アルコール、脂肪アルコール、脂肪酸、ならびに脂肪酸のモノおよびジおよびトリグリセリドである。流動床技術による用途に好適なフィルム形成性被覆材料の例は、英国特許第１４８３５９１号明細書に与えられている。液体酵素調製物は、たとえば、確立された方法に従って、プロピレングリコールなどのポリオール、糖または糖アルコール、乳酸またはホウ酸を添加することにより、安定化されうる。保護された酵素は、欧州特許第２３８，２１６号明細書に開示される方法に従って調製されうる。
【０１９４】
補助材料
衣類洗剤で使用することが当技術分野で公知の任意の洗剤成分を利用することも可能である。他の任意選択の洗剤成分としては、単独または組合せのいずれかで、防食剤、収縮防止剤、再汚染防止剤、防皺剤、殺細菌剤、結合剤、防食剤、崩壊剤／破砕剤、染料、酵素安定剤（ホウ酸およびボレート、ＣＭＣ、および／またはプロピレングリコールなどのポリオール）、クレーを含む柔軟仕上げ剤、充填剤／加工助剤、蛍光増白剤／光学増白剤、増泡剤、泡（石鹸泡）制御剤、香料、汚れ懸濁剤、軟化剤、石鹸泡抑制剤、変色防止剤、およびウィッキング剤、が挙げられる。衣類洗剤で使用することが当技術分野で公知の任意の成分を利用しうる。そのような成分の選択は、十分に当業者の技能の範囲内にある。
【０１９５】
分散剤  −  本発明に係る洗剤組成物はまた、分散剤をも含有可能である。特定的には、粉末洗剤は、分散剤を含みうる。好適な水溶性有機材料としては、ホモもしくはコポリマー酸またはそれらの塩が挙げられる。このポリカルボン酸は、２個以下の炭素原子により互いに分離された少なくとも２つのカルボキシル基を含む。好適な分散剤は、たとえば、Ｐｏｗｄｅｒｅｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ７１，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．に記載されている。
【０１９６】
染料転写阻害剤  −  本発明に係る洗剤組成物は、１つ以上の染料転写阻害剤をも含みうる。好適な高分子染料転写阻害剤としては、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールとのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン、およびポリビニルイミダゾール、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。染料転写阻害剤は、当該組成物中に存在する場合、組成物重量基準で約０．０００１％〜約１０％、約０．０１％〜約５％、さらには約０．１％〜約３％のレベルで存在しうる。
【０１９７】
蛍光増白剤  −  本発明に係る洗剤組成物は、好ましくは、蛍光増白剤や光学増白剤などクリーニングされる物品の色調を整えうる追加成分を含有する。増白剤は、存在するのであれば、好ましくは約０．０１％〜約０．５％のレベルである。衣類洗剤組成物で使用するのに好適な任意の蛍光増白剤は、本発明に係る組成物で使用可能である。最も一般的に使用される蛍光増白剤は、ジアミノスチルベン−スルホン酸誘導体、ジアリールピラゾリン誘導体、およびビスフェニル−ジスチリル誘導体のクラスに属するものである。ジアミノスチルベン−スルホン酸誘導体型の蛍光増白剤の例としては、４，４’−ビス−（２−ジエタノールアミノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネート、４，４’ビス−（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２．２’−ジスルホネート、４，４’ビス−（２−アニリノ−４（Ｎ−メチル−Ｎ−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネート、４，４’ビス−（４−フェニル−２，１，３−トリアゾール−２−イル）スチルベン−２，２’−ジスルホネート、４，４’ビス−（２−アニリノ−４（１−メチル−２−ヒドロキシ−エチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネート、および２−（スチルビル−４”−ナフト−１，２’：４，５）−１，２，３−トリゾール−２”−スルホネートのナトリウム塩が挙げられる。好ましい蛍光増白剤は、Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ  ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能なＴｉｎｏｐａｌ  ＤＭＳおよびＴｉｎｏｐａｌ  ＣＢＳである。Ｔｉｎｏｐａｌ  ＤＭＳは、４，４’−ビス−（２−モルホリノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベンジスルホネートのジナトリウム塩である。Ｔｉｎｏｐａｌ  ＣＢＳは、２，２’−ビス−（フェニルスチリル）ジスルホネートのジナトリウム塩である。同様に好ましいのは、蛍光増白剤であり、Ｐａｒａｍｏｕｎｔ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａにより供給されるＰａｒａｗｈｉｔｅ  ＫＸが市販されている。本発明で使用するのに好適な他の蛍光剤としては、１−３−ジアリールピラゾリンおよび７−アルキルアミノクマリンが挙げられる。好適な蛍光増白剤レベルは、約０．０１から、０．０５から、約０．１から、さらには約０．２ｗｔ％から、０．５さらには０．７５ｗｔ％の上限レベルまでのより低いレベルを含む。
【０１９８】
防汚性ポリマー  −  本発明に係る洗剤組成物はまた、綿系およびポリエステル系の布などの布からの汚れの除去、特定的には、ポリエステルに系の布からの疎水性汚れの除去を支援する１つ以上の防汚性ポリマーをも含みうる。防汚性ポリマーは、たとえば、ノニオン性もしくはアニオン性のテレフタレート系ポリマー、ポリビニルカプロラクタムおよび関連コポリマー、ビニルグラフトコポリマー、ポリエステルポリアミドである。たとえば、Ｃｈａｐｔｅｒ  ７  ｉｎ  Ｐｏｗｄｅｒｅｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ７１，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．を参照されたい。他のタイプの防汚性ポリマーは、コア構造とそのコア構造に結合された複数のアルコキシレート基とを含む両親媒性アルコキシル化グリースクリーニングポリマーである。コア構造は、国際公開第２００９／０８７５２３号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されるポリアルキルエンイミン構造またはポリアルカノールアミン構造を含みうる。さらに、ランダムグラフトコポリマーも、好適な防汚性ポリマーである。好適なグラフトコポリマーは、国際公開第２００７／１３８０５４号パンフレット、国際公開第２００６／１０８８５６号パンフレットおよび国際公開第２００６／１１３３１４号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に、より詳細に記載されている。他の防汚性ポリマーは、置換ポリサッカリド構造、特定的には、変性セルロース誘導体などの置換セルロース系構造、たとえば、欧州特許第１８６７８０８号明細書または国際公開第２００３／０４０２７９号パンフレット（両方とも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものである。好適なセルロース系ポリマーとしては、セルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、セルロースアミド、およびそれらの混合物が挙げられる。好適なセルロース系ポリマーとしては、アニオン変性セルロース、非イオン変性セルロース、カチオン変性セルロース、双性イオン変性セルロース、およびそれらの混合物が挙げられる。好適なセルロース系ポリマーとしては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシルエチルセルロース、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、エステルカルボキシメチルセルロース、およびそれらの混合物が挙げられる。
【０１９９】
再付着防止剤  −  本発明に係る洗剤組成物は、１つ以上の再付着防止剤、たとえば、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリオキシエチレンおよび／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アクリル酸のホモポリマー、アクリル酸とマレイン酸とのコポリマー、およびエトキシル化ポリエチレンイミンをも含みうる。以上の防汚性ポリマーの下に記載されたセルロース系ポリマーはまた、再付着防止剤としても機能しうる。
【０２００】
他の好適な補助材料としては、収縮防止剤、防皺剤、殺細菌剤、結合剤、担体、染料、酵素安定剤、柔軟仕上げ剤、充填剤、泡制御剤、ヒドロトロープ、香料、顔料、石鹸泡抑制剤、溶媒、および液体洗剤用構造剤および／または構造弾性化剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２０１】
洗剤製品の配合
本発明に係る洗剤組成物は、任意の便利な形態、たとえば、棒剤、均一錠剤、２つ以上の層を有する錠剤、１つ以上の区画を有するパウチ、規則的またはコンパクトな粉末、顆粒、ペースト、ゲル、または規則的もしくはコンパクトもしくは濃縮な液体でありうる。
【０２０２】
洗剤配合形態：  層（同一相または異なる相）、パウチ、対機械供給単位の形態。
【０２０３】
パウチは単一または多区画として構成することが可能である。それは、組成物の保持に好適な任意の形態、形状、および材料でありうる。たとえば、水に接触する前にパウチから組成物を放出させないものでありうる。パウチは、内部空間を取り囲む水溶性フィルムから作製される。前記内部空間は、パウチの区画に分割することが可能である。好ましいフィルムは、高分子材料、好ましくはフィルム状またはシート状に形成されたポリマーである。好ましいポリマー、コポリマー、またはそれらの誘導体は、所定のポリアクリレートおよび水溶性アクリレートコポリマー、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ナトリウムデキストリン、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マルトデキストリン、ポリメタクリレート、最も好ましくはポリビニルアルコールコポリマーおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）である。好ましくは、フィルム中のポリマーたとえばＰＶＡのレベルは、少なくとも約６０％である。好ましい平均分子量は、典型的には、約２０，０００〜約１５０，０００である。フィルムはまた、グリセロール、エチレングリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、およびそれらの混合物のような可塑剤が加えられたポリラクチドおよびポリビニルアルコール（Ｃｈｒｉｓ  Ｃｒａｆｔ  Ｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｏｆ  Ｇａｒｙ，Ｉｎｄ．，ＵＳにより販売されているＭ８６３０という商品名で知られる）などの加水分解性かつ水溶性のポリマーブレンドを含むブレンド組成物であってもよい。パウチは、水溶性フィルムにより分離された固体衣類クリーニング組成物もしくは部分成分および／または液体クリーニング組成物もしくは部分成分を含んでいてもよい。液体成分用の区画は、固体を含有する区画とは組成が異なることもある。参照：（米国特許出願公開第２００９／００１１９７０Ａ１号明細書）。
【０２０４】
洗剤成分は、水溶性パウチ内または錠剤の異なる層内の区画により、互いに物理的に分離することが可能である。それにより、成分間の貯蔵時有害相互作用を回避することが可能である。また、各区画の異なる溶解プロファイルにより、洗浄／洗濯溶液中の所定の成分の遅延溶解を引き起こすことが可能である。
【０２０５】
定義／形態の特徴
単位用量でない液体洗剤またはゲル洗剤は、典型的には、少なくとも２０重量％、かつ９５％までの水、たとえば、約７０％までの水、約６５％までの水、約５５％までの水、約４５％までの水、約３５％までの水を含有して、水性でありうる。限定されるものではないが、アルカノール、アミン、ジオール、エーテル、およびポリオールを含む他のタイプの液体は、水性の液体またはゲルに組み込みうる。水性の液体またはゲルの洗剤は、０〜３０％の有機溶媒を含有しうる。
【０２０６】
液体洗剤またはゲル洗剤は、非水性でありうる。
【０２０７】
顆粒洗剤配合物
顆粒洗剤は、国際公開第０９／０９２６９９号パンフレット、欧州特許第１７０５２４１号明細書、欧州特許第１３８２６６８号明細書、国際公開第０７／００１２６２号パンフレット、米国特許第６４７２３６４号明細書、国際公開第０４／０７４４１９号パンフレット、または国際公開第０９／１０２８５４号パンフレットに記載されるように配合しうる。他の有用な洗剤配合物は、国際公開第０９／１２４１６２号パンフレット、国際公開第０９／１２４１６３号パンフレット、国際公開第０９／１１７３４０号パンフレット、国際公開第０９／１１７３４１号パンフレット、国際公開第０９／１１７３４２号パンフレット、国際公開第０９／０７２０６９号パンフレット、国際公開第０９／０６３３５５号パンフレット、国際公開第０９／１３２８７０号パンフレット、国際公開第０９／１２１７５７号パンフレット、国際公開第０９／１１２２９６号パンフレット、国際公開第０９／１１２２９８号パンフレット、国際公開第０９／１０３８２２号パンフレット、国際公開第０９／０８７０３３号パンフレット、国際公開第０９／０５００２６号パンフレット、国際公開第０９／０４７１２５号パンフレット、国際公開第０９／０４７１２６号パンフレット、国際公開第０９／０４７１２７号パンフレット、国際公開第０９／０４７１２８号パンフレット、国際公開第０９／０２１７８４号パンフレット、国際公開第０９／０１０３７５号パンフレット、国際公開第０９／０００６０５号パンフレット、国際公開第０９／１２２１２５号パンフレット、国際公開第０９／０９５６４５号パンフレット、国際公開第０９／０４０５４４号パンフレット、国際公開第０９／０４０５４５号パンフレット、国際公開第０９／０２４７８０号パンフレット、国際公開第０９／００４２９５号パンフレット、国際公開第０９／００４２９４号パンフレット、国際公開第０９／１２１７２５号パンフレット、国際公開第０９／１１５３９１号パンフレット、国際公開第０９／１１５３９２号パンフレット、国際公開第０９／０７４３９８号パンフレット、国際公開第０９／０７４４０３号パンフレット、国際公開第０９／０６８５０１号パンフレット、国際公開第０９／０６５７７０号パンフレット、国際公開第０９／０２１８１３号パンフレット、国際公開第０９／０３０６３２号パンフレット、国際公開第０９／０１５９５１号パンフレット、国際公開第２０１１０２５６１５号パンフレット、国際公開第２０１１０１６９５８号パンフレット、国際公開第２０１１００５８０３号パンフレット、国際公開第２０１１００５６２３号パンフレット、国際公開第２０１１００５７３０号パンフレット、国際公開第２０１１００５８４４号パンフレット、国際公開第２０１１００５９０４号パンフレット、国際公開第２０１１００５６３０号パンフレット、国際公開第２０１１００５８３０号パンフレット、国際公開第２０１１００５９１２号パンフレット、国際公開第２０１１００５９０５号パンフレット、国際公開第２０１１００５９１０号パンフレット、国際公開第２０１１００５８１３号パンフレット、国際公開第２０１０１３５２３８号パンフレット、国際公開第２０１０１２０８６３号パンフレット、国際公開第２０１０１０８００２号パンフレット、国際公開第２０１０１１１３６５号パンフレット、国際公開第２０１０１０８０００号パンフレット、国際公開第２０１０１０７６３５号パンフレット、国際公開第２０１００９０９１５号パンフレット、国際公開第２０１００３３９７６号パンフレット、国際公開第２０１００３３７４６号パンフレット、国際公開第２０１００３３７４７号パンフレット、国際公開第２０１００３３８９７号パンフレット、国際公開第２０１００３３９７９号パンフレット、国際公開第２０１００３０５４０号パンフレット、国際公開第２０１００３０５４１号パンフレット、国際公開第２０１００３０５３９号パンフレット、国際公開第２０１００２４４６７号パンフレット、国際公開第２０１００２４４６９号パンフレット、国際公開第２０１００２４４７０号パンフレット、国際公開第２０１００２５１６１号パンフレット、国際公開第２０１００１４３９５号パンフレット、国際公開第２０１００４４９０５号パンフレット、国際公開第２０１０１４５８８７号パンフレット、国際公開第２０１０１４２５０３号パンフレット、国際公開第２０１０１２２０５１号パンフレット、国際公開第２０１０１０２８６１号パンフレット、国際公開第２０１００９９９９７号パンフレット、国際公開第２０１００７６２９２号パンフレット、国際公開第２０１００６９７４２号パンフレット、国際公開第２０１００６９７１８号パンフレット、国際公開第２０１００６９９５７号パンフレット、国際公開第２０１００５７７８４号パンフレット、国際公開第２０１００５４９８６号パンフレット、国際公開第２０１００１８０４３号パンフレット、国際公開第２０１０００３７８３号パンフレット、国際公開第２０１０００３７９２号パンフレット、国際公開第２０１１０２３７１６号パンフレット、国際公開第２０１０１４２５３９号パンフレット、国際公開第２０１０１１８９５９号パンフレット、国際公開第２０１０１１５８１３号パンフレット、国際公開第２０１０１０５９４２号パンフレット、国際公開第２０１０１０５９６１号パンフレット、国際公開第２０１０１０５９６２号パンフレット、国際公開第２０１００９４３５６号パンフレット、国際公開第２０１００８４２０３号パンフレット、国際公開第２０１００７８９７９号パンフレット、国際公開第２０１００７２４５６号パンフレット、国際公開第２０１００６９９０５号パンフレット、国際公開第２０１００７６１６５号パンフレット、国際公開第２０１００７２６０３号パンフレット、国際公開第２０１００６６４８６号パンフレット、国際公開第２０１００６６６３１号パンフレット、国際公開第２０１００６６６３２号パンフレット、国際公開第２０１００６３６８９号パンフレット、国際公開第２０１００６０８２１号パンフレット、国際公開第２０１００４９１８７号パンフレット、国際公開第２０１００３１６０７号パンフレットと国際公開第２０１００００６３６号パンフレットに記載されている。
【０２０８】
組成物の作製方法
本発明はまた、組成物の作製方法に関する。
【０２０９】
使用
本発明はまた、その組成物の使用方法に関する。
衣類／テキスタイル／布（家庭用衣類洗濯、工業用衣類洗濯）
硬質表面クリーニング（ＡＤＷ、洗車、工業表面）
【０２１０】
洗剤での使用。本発明に係るポリペプチドは、洗剤組成物に添加されうるので、洗剤組成物の成分になりうる。
【０２１１】
本発明に係る洗剤組成物は、たとえば、汚れた布の前処理に好適な洗濯添加剤組成物を含む手洗い用もしくは機械用の衣類洗剤組成物およびリンス添加柔軟仕上げ剤組成物として配合されうるか、または一般家庭用硬質表面クリーニング操作で使用するための洗剤組成物として配合されうるか、または手洗い用もしくは機械用の食器洗浄操作のために配合されうる。
【０２１２】
特定の態様では、本発明は、本明細書に記載の本発明に係るポリペプチドを含む洗剤添加剤を提供する。
【０２１３】
遺伝子は、任意の原核生物源、真核生物源、または他の供給源から取得されうる。
【０２１４】
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、それらは、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきでない。
【実施例】
【０２１５】
株
セルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＴ．ラピダリア（Ｔ．ｌａｐｉｄａｒｉａ）遺伝子を発現するために、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＭＴ３５６８株を使用した。Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＭＴ３５６８は、ｐｙｒＧ遺伝子を用いてＡ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子を破壊することにより、ｐｙｒＧ栄養要求性が回復された、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＪａＬ３５５のａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）破壊遺伝子誘導体である（国際公開第２００２／４０６９４号パンフレット）。
【０２１６】
培地および溶液
ＬＢプレートは、１０ｇのバクト−トリプトン、５ｇの酵母エキス、１０ｇの塩化ナトリウム、１５ｇのバクト寒天、および１リットルまでの脱イオン水で構成されていた。
【０２１７】
ＬＢ培地は、１０ｇのバクト−トリプトン、５ｇの酵母エキス、および１０ｇの塩化ナトリウム、ならびに１リットルまでの脱イオン水で構成されていた。
【０２１８】
ＹＰ培地は１０ｇの酵母エキス、２０ｇのバクトペプトン、および１リットルまでの脱イオン水で構成されていた。
【０２１９】
ＳＯＣ培地：  ２０ｇのバクト−トリプトン、５ｇの酵母エキス、および０．５ｇのＮａＣｌを１リットルの水中に溶解させる。１０ｍｌの２５０ｍＭ  ＫＣｌを添加し、ｐＨを７．０に調整する。培地をオートクレーブ処理する。６０℃に冷却した後、１８ｍｌの無菌濾過２０％グルコースおよび５ｍｌの２Ｍ  ＭｇＣｌ２溶液を添加する。
【０２２０】
ＣＯＶＥ培地        ２０ｍｌ塩溶液
２０ｇ寒天
２１８ｇソルビトール
Ｈ2Ｏ  ａｄ  １ｌ
オートクレーブ処理してから添加：
５０ｍｌ２０％グルコース
１０ｍＭ  ＮａＮＯ3。
【０２２１】
塩溶液：            ２６ｇ  ＫＣｌ
２６ｇ  ＭｇＳＯ4７Ｈ2Ｏ
７６ｇ  ＫＨ2ＰＯ4
５０ｍｌ微量元素溶液
Ｈ2Ｏ  ａｄ  １ｌ
【０２２２】
スクロース培地：      ２０ｍｌ塩溶液
３４２ｇスクロース
Ｈ2Ｏ  ａｄ  １ｌ
オートクレーブ処理してから添加：
１０ｍＭ  ＮａＮＯ3
【０２２３】
ＳＴ                  ０．６Ｍソルビトール
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．０
【０２２４】
ＳＴＣ                １．２Ｍソルビトール
１０ｍＭ  ＣａＣｌ2
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５。
【０２２５】
ＰＥＧ                Ｈ2Ｏ中６０％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧ４０００（ＢＤＨ）
溶解するまでマイクロ波オーブン中で１０〜２０秒、
ＲＴに冷却してから添加
１０ｍＭ  ＣａＣｌ2
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５
【０２２６】
上層寒天：            ２０ｍｌ塩溶液
３４２ｇスクロース
６ｇ低融点アガロース
（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １−８００−３４１−１５７４）
数滴の４Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを６に調整することが重要である
Ｈ2Ｏ  ａｄ  １Ｌ
オートクレーブ処理
使用前、沸騰させてから約４０°に冷却する
Ａｍｄｓ選択：  １０ｍＭアセトアミドｏｇ１５ｍＭ  ＣｓＣｌを添加
【０２２７】
ａｍｄＳ選択プレート  ２０ｇ寒天
２０ｍｌ塩溶液
３４２ｇスクロース
数滴の４Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを６に調整する
Ｈ2Ｏ  ａｄ  １ｌ
オートクレーブ処理
１０ｍｌ  １Ｍアセトアミド
１５ｍｌ  １Ｍ  ＣｓＣｌ
【０２２８】
方法
温度最適値
適切な希釈度の５０μＬのサンプルを０．１Ｍリン酸Ｎａ中の７５０μＬのＡＺＣＬ−ＨＥ−セルロースと混合した。サンプルをサーモミキサー（１４００ｒｐｍ撹拌、２０分間）中２０〜８０℃にわたる温度でインキュベートした。インキュベーション後、未加水分解基質を遠心分離により除去し、各サンプルから２００μＬの上清を９６孔マイクロタイタープレートに移動した。ＰｏｗｅｒＷａｖｅマイクロタイタープレートリーダーを用いて、６００ｎｍの吸光度を決定した。活性を吸光度単位として表現した。
【０２２９】
比活性分析
ＰＡＳＣ（アモルファスセルロース、リン酸膨潤セルロース）に対する比活性
２０ｇＰＡＳＣ（アモルファスセルロース、リン酸膨潤セルロース）（１０％ｗ／ｖ）を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを４０ｍＬの０．１Ｍリン酸Ｎａ緩衝液中で再懸濁し、続いて類似の遠心分離工程を行った。不溶分を２０ｍＬの０．１Ｍリン酸Ｎａ緩衝液中に再懸濁させた。基質溶液を４０℃で５分間プレインキュベートし、５００μＬの酵素溶液を添加した。
【０２３０】
【表１】
2014531895.tif 000004
【０２３１】
サンプルを混合し、４０℃で２０分間インキュベートした。５００μＬの２％のＮａＯＨを添加することにより、反応を停止させた。サンプルを５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。１０００μＬの上清を５００μＬ  ＰＨＢＡＨ溶液と混合した。サンプルを１０分間煮沸してから冷却した。Ａ４１０をすべてのサンプルで測定した。酵素溶液を既知濃度（０〜５０ｍｇ／Ｌ）のグルコースで置き換えることにより、標準曲線を作成した。また、各酵素希釈液に対して、酵素ブランクを追加した（２％ＮａＯＨの添加後に酵素を添加した）。
【０２３２】
ＰＨＢＡＨ溶液
１００ｍＬ２％ＮａＯＨ中１ｇＰＨＢＡＨ。１００μＬのビスマス溶液を添加した。
ビスマス溶液
１ｍｏｌ硝酸ビスマス
１ｍｏｌＫ／酒石酸Ｎａ
３ｍｏｌＮａＯＨ（固体）
１００ｍＬ  Ｈ2Ｏ
【０２３３】
ＣＭＣ７ＬＦを用いて、カルボキシメチルセルロースに対する比活性を決定した。１％ＣＭＣのストック溶液を調製した。１５００μＬの基質を５００μＬの希釈酵素と混合した。サンプルを温和な水浴上４０℃で２０分間インキュベートした。２０分後、１０００μＬのＰＨＢＡＨ／ビスマス（１．５ｇＰＨＢＡＨ＋５ｇ酒石酸Ｋ／Ｎａ＋１００ｍＬ２％ＮａＯＨ）停止試薬を添加した。サンプルを１０分間煮沸してからただちに氷上で冷却した。吸光度を４１０ｎｍで読み取った。標準曲線もグルコース（０〜５０ｍｇ／Ｌ）を用いて混合した。
【０２３４】
洗濯性能
２４ＦＨおよび２５℃で汚れた洗剤（１／２用量のＬｉｑｕｉｄ  Ｐｅｒｓｉｌ  ｓｍａｌｌ  ＆  ｍｉｇｈｔｙ  ｎｏｎ−Ｂｉｏ中、５ｐｐｍカーボンブラック）を用いてｍｉｎｉ−ＴＯＭ中で再付着防止試験として洗濯性能を試験する。
【０２３５】
試験を２５０ｍｌビーカー中で行う。５×５ｃｍの８片の予備洗濯ｗｆｋ８０Ａ（予備洗濯手順については以下を参照されたい）を浴：１００ｍｌ、１，２５ｍＬ／Ｌ洗剤、２４ＦＨ（１３，４５°ｄＨ）（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋＝２：１、ＨＣＯ３なし）、洗剤のｐＨ、５ｐｐｍカーボンブラック、および酵素サンプルと共にビーカーに入れる。１２５〜１５０ｒｐｍ、２５°Ｃの温度でビーカーを３時間振盪する。布片を水道水で濯ぐ。
【０２３６】
８つの布片が存在する。１および２時間後、布片を充填物から取り出す。すなわち、３時間では６つの布片が含まれる。
【０２３７】
炭素：  ５０ｍＬの浴中に１００ｍｇのカーボンブラックを分散させて２ｍｇ／ｍＬの濃度を提供することにより、カーボンブラックのストック溶液を作製する。浴は、５ｐｐｍの炭素を含有する。すなわち、１リットルの浴あたり２，５ｍｌのストック溶液を添加する。洗剤溶液に添加する前さらには浴中への分配時、混合物を１／２時間撹拌する。
【０２３８】
試験／分析
汚れた洗剤中で１時間、２時間、および３時間のインキュベーション後、５００ｎｍで布片のＭａｃｂｅｔｈ  Ｃｏｌｏｒ−Ｅｙｅ測定。すべての場合について、布の２〜６層を貫通して測定を行う。大きい開口およびＤ６５昼光観測を用いて、各布片を２回（１回目は前面、２回目は背面）測定する。
【０２３９】
予備洗濯ｗｆｋ８０Ａ
糊抜き：  ＣＭＣおよび酵素なしの４ｇ／ＬのＩＥＣ  Ａ（商標）および１．２ｍｇ  ｅｐ／Ｌ（０，０９ｇ／Ｌまたは２，２％）Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ  Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて水道水中でＭｉｅｌｅ６０℃綿標準洗濯プログラムで洗濯する。
【０２４０】
予備洗濯：  ＣＭＣおよび酵素なしの４ｇ／ＬのＩＥＣ  Ａ（商標）を用いた水道水中での追加の濯ぎを有するＭｉｅｌｅ９５℃綿標準洗濯プログラムで洗濯する。
【０２４１】
濯ぎ：  脱イオン水中でのＭｉｅｌｅ標準濯ぎプログラムで濯ぐ。
【０２４２】
実施例１：  テレベラ属（Ｔｅｒｅｂｅｌｌａ）ＧＨ９セルラーゼの単離
海洋生物に基づくＤＮＡ配列決定プロジェクトにおいて、Ｒｉａ  ｄｅ  Ｆｏｒｍｏｓａ，Ｔｈｅ  Ａｌｇａｒｖｅ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐｏｒｔｕｇａｌから海洋多毛類動物テレベラ・ラピダリア（Ｔｅｒｅｂｅｌｌａ  ｌａｐｉｄａｒｉａ）を採取した。核酸物質を単離し、製造業者の使用説明書に従ってｉｌｌｕｍｉｎｅ  ＨＴＳ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓでＲＮＡ−ｓｅｐ技術を用いて、２つチャネルのテレベラ属（Ｔｅｒｅｂｅｌｌａ）ＲＮＡの配列決定を行った。配列番号１で開示されるヌクレオチド配列を有するＧＨ９ヒドロラーゼをプロジェクトで同定した。この遺伝子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＧＨ９セルラーゼの構造を有する４２８アミノ酸のポリペプチドをコードする。
【０２４３】
実施例２：  テレベラ属（Ｔｅｒｅｂｅｌｌａ）ＧＨ９セルラーゼの発現
発現構築物の調製
以下のプライマーを用いて、テレベラ属（Ｔｅｒｅｂｅｌｌａ）セルロースのコード配列をＰＣＲクローニングした。
ＴＬＧＨ９Ｆ  ＧＴＧＡＡＧＣＧＴＡＣＧＣＧＴＴＡＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＧＡＴＧＣＧＣＴＧＧ（配列番号３）
ＴＬＧＨ９Ｒ  ＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＣ（配列番号４）
【０２４４】
プライマーは、所定の発現ベクター中への単離された断片の組込みのためのＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有する。ＴＬＧＨ９Ｆの下線付き領域は、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）Ｂリパーゼシグナル−プレプロ領域とＧＨ９の予測成熟ペプチドとの間のインフレーム融合に使用されたＭｌｕＩ部位を表す。
【０２４５】
製造業者の説明書に従ってＣｌｏｎｔｅｃｈ（カタログ番号６３４９１３）のＭａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ増幅キットにより生成されたｃＤＮＡ断片。得られたｃＤＮＡ断片を鋳型として使用した。以上のプライマーを１００ｎｇのテレベラ・ラピダリア（Ｔｅｒｅｂｅｌｌａ  ｌａｐｉｄａｒｉａ）ｃＤＮＡで構成されるＰＣＲ反応で使用した。ｃＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）ｐＨ８．０中に１００ｎｇ／μｌに希釈した。ＰＴＣ−２００  ＤＮＡエンジン（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。Ｅｘｔｅｎｓｏｒ  Ｌｏｎｇ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ，Ｂｕｆｆｅｒ１，ＲｅｄｄｙＭｉｘ（商標）バージョン（ＡＢ  Ｇｅｎｅ  Ｌｔｄ．，Ｅｐｓｏｍ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）をＰＣＲ増幅に使用した。マスターミックスは、緩衝液、ｄＮＴＰ、および熱安定性ポリメラーゼブレンドを含有する。
【０２４６】
ＰＣＲ反応は、４０μｌの全体積中、２０μｌのＥｘｔｅｎｓｏｒ  Ｌｏｎｇ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ，Ｂｕｆｆｅｒ１，ＲｅｄｄｙＭｉｘ（商標）バージョン、１μｌのプライマーＴＬＧＨ９Ｆ（１００μＭ）、１μｌのプライマーＴＬＧＨ９Ｒ（１００μＭ）、１μｌのＴ．ラピダリア（Ｔ．ｌａｐｉｄａｒｉａ）ｃＤＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）、および１７μｌの脱イオン水で構成されていた。ＰＣＲ条件は、９５℃２分間を１サイクル、それぞれ９４℃１０秒間、５５℃３０秒間、および６８℃１分間を３０サイクル、ならびに６８℃１０分間を１サイクルであった。次いで、ＰＣＲ機から取り出すまで、サンプルを１０℃に維持した。
【０２４７】
４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭジナトリウムＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液を用いて、１．０％のアガロースゲル電気泳動により、反応産物を単離した。ここでは、製造業者の説明書に従って、ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＧＦＸ（登録商標）ＰＣＲ  ＤＮＡおよびＧｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｒｏｎｄｂｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、１．３ｋｂ産物バンドをゲルから切除して精製した。次いで、ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（商標）クローニングキットを用いて、ＭｌｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＤａｕ２２２中に断片をクローニングして、プラスミドｐＧＨ９−７−２を得た。
【０２４８】
使用したベクターは、ｐＤａｕ１０９に基づくアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）発現プラスミドｐＤａｕ２２２であった（（国際公開第２００５／０４２７３５号パンフレット）。ｐＤａｕ１０９からｐＤａｕ２２２を形成するために、以下のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフランキング挿入断片を用いて、以下のｐＤａｕ２２２のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ挿入断片を置き換えた。
ＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＧＡＣＣＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＣＴＴＧＣＧＴＴＧＣＡＧＣＣＡＣＴＣＣＴＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＴＡＣＧＣＧＴＧＣＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＡＡＧＣＴＴ（配列番号５）
【０２４９】
下線付き部分は、それぞれ、ＢａｍＨＩ、ＭｌｕＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を表す。ＫｅｘＢ切断部位を表すコドンは、ボールド体で示されている。挿入断片は、ＭｌｕＩクローニング部位を利用して、対象のシグナルなしコード領域とカンジダ・アナルチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎａｒｔｉｃａ）リパーゼＢ（ＣａｌＢ）分泌シグナルおよびプレプロ領域との融合を可能にする。ＣａｌＢ領域のＡＴＧ開始コドンは、ＮＡ２−ｔｐｉプロモーターからの発現に対して最適に配置される。ＭｌｕＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間への対象のコード領域の配置により、ＫｅｘＢプロセシングプロテアーゼにより成熟タンパク質にさらに切断される分泌タンパク質を得ることが可能である。ＡＴＧ開始コドンからの挿入断片の翻訳は、次のようになる。
ＭＫＬＬＳＬＴＧＶＡＧＶＬＡＴＣＶＡＡＴＰＬＶＫＲＴＲＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号６）
ＣａｌＢシグナルの切断可能領域は下線が付されており、ＫｅｘＢプロテアーゼ切断部位はボールド体で示される。示されたポリヒスチジンは、ＨｉｓタグＣ末端融合に利用可能であるか、または対象のコード領域に対する停止コドンの存在により発現から除外可能である。
【０２５０】
ＭｌｅＩ  ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＤａｕ２２２中へのｐＧＨ９−７−２遺伝子のクローニングは、ＮＡ２−ｔｐｉダブルプロモーターの制御下でテレベラ・ラピダリア（Ｔｅｒｅｂｅｌｌａ  ｌａｐｉｄａｒｉａ）オープンリーディングフレームの転写をもたらした。ＮＡ２−ｔｐｉは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からの非翻訳リーダーにより非翻訳リーダーが置き換えられたアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼをコードする遺伝子からの修飾プロモーターである。
【０２５１】
クローニングのために、単離されたＰＣＲ断片とＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでプリカットされた３００ｎｇのｐＤａｕ２２２とを１０μｌ脱イオン水中で２：１のモル比で混合導入した。アルミニウムシールをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応チューブキットから除去して、断片とベクターとを含有する１０μｌの混合物を添加し、注意深く混合した。混合物を室温で（約２５℃）３０分間インキュベートし、その後、チューブを氷に移した。Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ反応混合物を４０μｌ  ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）で希釈し、使用まで−２０℃で貯蔵した。
【０２５２】
製造業者の説明書を用いて、希釈反応混合物をコンピテントＦｕｓｉｏｎ  Ｂｌｕｅ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）にトランスフォームした。４μｌの希釈反応混合物を５０μｌの解凍コンピテント細胞と温和に混合し、の混合物を氷上で３０分間インキュベートした。４２℃の水浴中で細胞に４５秒間熱ショックを与え、その後、氷に１分間戻す。熱ショックを与えた後、２５０μｌのＳＯＣ培地を細胞に添加し、２２０ｒｐｍで振盪しながら混合物を３７℃で９０分間インキュベートした。２０μｌの細胞をＬＢ＋５０μｇ／ｍＬアンピシリン上に広げ、残り細胞を他のプレート上に広げ、そしてプレートを３７℃で一晩インキュベートした。
【０２５３】
翌日、複数のコロニーがＬＢプレート上に現れた。１０個のランダムコロニーを採取して、３ｍｌ  ＬＢ＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン中で一晩増殖し、製造業者の使用説明書に従って、５Ｐｒｉｍｅ製の「ＦＡＳＴＰｌａｓｍｉｄミニキット」を用いて、これらのコロニーからプラスミドＤＮＡを調製した。配列を確認するために、単離されたプラスミドの配列決定を行った（データは示されていない）。適正配列を有する１つのクローンを選択し、５０ｍｌ  ＬＢ＋５０μｇ／ｍｌアンピシリン中、２２５ｒｐｍ、３７℃で一晩インキュベートした。Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｐｒｅｐミディキット、カタログ番号：１２７４３を用いて、培養物からプラスミドＤＮＡを調製した。
【０２５４】
アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）発現宿主のトランスフォーメーション
以下のプロトコルを用いて、２．５μｇの調製済み発現構築物をアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＭＴ３５６８にトランスフォームした。
＊  寒天斜面（ＣＯＶＥ培地）に対象の株（ＭＴ３５６８）の胞子を接種し、株を３７℃で約６日間増殖させる（完全に胞子形成されるまで）。斜面は、冷所で約２ヶ月間貯蔵が可能である。
＊  ５〜１０ｍｌ  ＹＰ培地を斜面に添加し、胞子を懸濁させる。１００ｍｌスクロース培地を含有する５００ｍｌ  Ｎａｌｇｅｎｅプラスチック振盪フラスコに胞子懸濁液を移す。フラスコを３０℃で２０時間（２７０ｒｐｍ）インキュベートする。
＊  ｍｉｒａ  ｃｌｏｔｈ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍカタログ番号４７５８５５）に通して濾過することにより菌糸体を捕集し、２００ｍｌ  ０．６Ｍ  ＭｇＳＯ4を用いて洗浄する。プラスチックピペットを用いて、菌糸体から残存液体を搾り出す。
＊  １〜２ｇの菌糸体を１２５ｍｌ  Ｎａｌｇｅｎプラスチックエルレンマイヤーフラスコに移す。１５ｍｌ  １．２Ｍ  ＭｇＳＯ4、１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4  ｐＨ５．８を含有する７５０ｍｇ  Ｇｌｕｃａｎｅｘ（登録商標）２００Ｇ．（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）バッチＫＭ６２９００２を添加し、菌糸体を懸濁させる。氷上に５分間置く。１ｍｌ  １２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（無菌濾過）を添加する。
＊  懸濁液を３７℃で１，５〜２時間インキュベートし、顕微鏡法によりプロトプラスト化を頻繁にモニターする。
＊  プロトプラスト懸濁液をｍｉｒａ  ｃｌｏｔｈに通して２５ｍｌ  ＮＵＮＣチューブ（または類似物）中に濾過し、懸濁液に５ｍｌ  ＳＴを上置し（下層を混合しないように注意する）、そして遠心分離（２５００ｒｐｍ、１５分間、低加速）によりプロトプラストのバンドを形成する。Ｐ１０００ピペットを用いてプロトプラストの界面バンドを回収し、新鮮なチューブに移す。
＊  プロトプラストを２体積のＳＴＣで希釈し、続いて、遠心分離（２５００ｒｐｍ、５分間）を行う。プロトプラストをＳＴＣで２回洗浄し（再懸濁および遠心分離を用いて）、次いで、ＳＴＣ中に再懸濁させて約５×１０7プロトプラスト／ｍｌの濃度にする。ほとんどの場合に、４〜５ｍｌのＳＴＣ中に再懸濁すると、適正濃度を与えるであろう。
＊  各トランスフォーメーションに対して、ＤＮＡをチューブの底部に添加し、１００μｌのプロトプラストを添加する。１０分間インキュベートした後（ＲＴ）、２５０μｌのＰＥＧを添加し、チューブは手で温和に混合する。３０分間インキュベートした後（３７°）、４ｍｌの上層寒天（温度４０°）を添加する。プロトプラストを選択プレート上にプレーティングする。
＊  形質転換体がはっきりと目に見えて胞子形成が始めるまで、プレートを３７℃でインキュベートする。
【０２５５】
１６の形質転換体を採取し、７５０ｍｌ／ウェルのＹＰ＋２％グルコースを含有する深ウェルマイクロタイタープレート中、２６℃で４日間増殖した。ｔｒａｎｓｆｏｐｒｍａｎｔｓからの上清のマイクロタイタープレート中のＡＺＣＬＨｅセルロース上のセルロース活性を試験した。５０μｌ上清は、２００μｌ  ＡＺＣＬＨｅセルロース混合物（０．２Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７．０中の０．１％のＡＺＣＬＨｅセルロース）と共に一晩混合で、２６℃でインキュベートされた。すべての形質転換体の上清は、このアッセイで活性を有することから、テレベラ属（Ｔｅｒｅｂｅｌｌａ）ＧＨ９セルラーゼは、ＡＺＣＬ−Ｈｅ−セルロースに対して活性を有することが実証される。
【０２５６】
実施例３  −  セルラーゼの精製および特性解析
セルラーゼの精製
実施例２で作製された１つの形質転換体を２２５ｒｐｍの振盪フラスコ内の１リットルのＹＰ＋２％グルコース培地中、２６℃で４日間増殖し、クローン化セルロースを精製するために上清を収集した。
【０２５７】
培養ブロスを０．２μｍ  ＰＥＳ瓶−頂部フィルターに通して無菌濾過した。限外濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｍ  １０ｋＤａ  ＰＥＳ膜）を用いて８００ｍｌブロスを濃縮して２５０ｍｌ濃縮物とし、これを同体積の４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中、２Ｍ  （ＮＨ4）２ＳＯ4溶液と混合した。遠心分離により沈殿物を除去し、流体を１６ｍｌ  ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラムに充填した。結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中、１Ｍ  （ＮＨ4）2ＳＯ4溶液）で洗浄することにより、非結合材料を除去した。線形減少グラジエント（ＮＨ4）2ＳＯ4（１．０Ｍ→０．０Ｍ）により、溶出を行った。１０ｍｌの画分を捕集し、ＡＺＣＬ−ＨＥ−セルロースに対するエンドグルカナーゼ活性に関して分析した。
【０２５８】
０．２％  ＡＺＣＬ−ＨＥ−セルロースを用いて、活性分析を行った。簡潔に述べると、５０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液、ｐＨ７．５中の７５０μＬ基質スラリーを５０μＬサンプルと共にインキュベートした。十分な撹拌（１４００ｒｐｍ、４０℃）を行いながらサーモミキサー上でサンプルを２０分間インキュベートした。青色を発色するサンプルは、エンドグルカナーゼ陽性として取り扱った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、エンドグルカナーゼ陽性画分を純度に関して分析した。純物質として評価された画分をプールした。
【０２５９】
Ａ280を測定することにより、ならびにε＝１２７５９０Ｍ-1ｃｍ-1および４７６０１ｇ／ｍｏｌの理論分子量により、タンパク質濃度を決定した。ソフトウェアＧＰＭＡＷ（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＤＫ）を用いて、これらのパラメーターを計算した。
【０２６０】
推定純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥから目視観察に基づいて＞９５％の純度であった。見掛けの分子量は、５０ｋＤａであり、予想分子量と一致する値であった。
【０２６１】
精製調製物のタンパク質濃度は、０．７７ｍｇ／ｍＬと推定された。
【０２６２】
ｐＨ最適値
アモルファスセルロース（ＰＡＳＣ）および還元糖定量を用いて、ｐＨ最適値を決定した。最大活性は、ｐＨ６で観測されたが、酵素はまた、ｐＨ５〜９で＞５０％の活性を呈した（図１参照、誤記！参照源が見当たらない。）。
【０２６３】
比活性
【０２６４】
【表２】
2014531895.tif 000005
【０２６５】
したがって、試薬としてＰＨＢＡＨを用いて還元糖の遊離を測定することにより、ＣＭＣに対する活性を調べた。この分析から、２７０ＩＵ／ｍｇの比活性が明らかにされた。２００８−０７４９７−２０に記載のエンドグルカナーゼの多くは、ＣＭＣに対してかなり低い比活性を有する。しかしながら、ＣＭＣは、人工セルロース基質である。より「現実味のある」基質は、主にアモルファスセルロースからなると考えられるリン酸膨潤セルロースである。この基質に対して観測された比活性は、１１ＩＵ／ｍｇであった。比較として、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼに対しては、約８０ＩＵ／ｍｇと報告された（国際公開第９１１７２４３号パンフレット）。
【０２６６】
温度プロファイル
温度プロファイルを図２に示す。この酵素は、低温セルラーゼであるという徴候をなんら示さなかった。それとは対照的に、温度最適値は、６０℃であり、７０℃で、その最大活性の７０％を呈した。
【０２６７】
実施例４  −  洗濯性能
テレベラ属（Ｔｅｒｅｂｅｌｌａ）セルラーゼの洗濯性能を試験した。用いたのは、カーボンブラックが追加された洗剤溶液中で白色綿布を洗濯する再堆積防止試験であった。エンドグルカナーゼの添加により、こうしたいくらか強調された洗濯条件下で布に付着するカーボンブラックの量を低減可能であることが、すでに示されている。洗濯効果を最大化するために、３回の洗濯サイクルでテキスタイルを洗濯した。
【０２６８】
本発明に係るセルラーゼを試験し、市販のエンドグルカナーゼＥｎｄｏｌａｓｅ（著作権）（ＧＨ７）およびキシログルカナーゼＷｈｉｔｅｚｙｍｅ（著作権）（ＧＨ４４）（両方ともＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ  Ｄｅｎｍａｒｋで入手可能である）と比較した。
【０２６９】
試験結果から、Ｅｎｄｏｌａｓｅは、テキスタイル上へのカーボンブラックの堆積を防止する最も強力な能力を示すことを示された。ＷｈｉｔｅｚｙｍｅおよびＴ．ラピダリア（Ｔ．ｌａｐｉｄａｒｉａ）セルラーゼは、類似の応答を示した（図３参照）。
【０２７０】
本明細書で説明および特許請求された本発明は、本明細書に開示された特定の態様により範囲が限定されるものではない。なぜなら、これらの態様は、本発明のいくつかの態様を例示することが意図されるからである。いずれの均等物も、本発明の範囲内にあることが意図される。実際に、以上の説明から、本明細書に示されたおよび記載された態様に加えて、本発明の種々の変更態様が当業者に明らかになるであろう。そのような変更態様もまた、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。矛盾を生じた場合、定義を含む本開示が優先するものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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