(57)【要約】  以下のアミノ酸配列、すなわち、  Ａ鎖：ｐＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ  Ｂ鎖：Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ；を有するヒトリラキシン−２を調製する方法であって、  下記工程、すなわち、  Ａ鎖とＢ鎖の合成に必要なアミノ酸に通常の保護基を提供し、この保護基ではシステインをトリチル保護アミノ酸（Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）として使用すること、  固相合成の後にＡおよびＢ鎖のそれぞれのクロマトグラフィー精製を達成すること、  続いて、ｐＨ７．９から８．４までの炭酸水素アンモニウム緩衝液中でそれぞれＡおよびＢ鎖のフォールディングと結合を同時に行うこと、ならびに、  その後、形成されたリラキシン−２を精製することを含むヒトリラキシン−２を調製する方法。
2014521680.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列、すなわち、
Ａ鎖：
ｐＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ
Ｂ鎖：
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ
を有するヒトリラキシン−２を調製する方法であって、
下記工程、すなわち、
Ａ鎖とＢ鎖の合成に必要なアミノ酸に通常の保護基を提供し、システインをトリチル保護アミノ酸（Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）として使用すること、
固相合成の後にそれぞれＡおよびＢ鎖のクロマトグラフィー精製を達成すること、
続いて、ｐＨ７．９から８．４までの炭酸水素アンモニウム緩衝液中で、それぞれＡおよびＢ鎖のフォールディングおよび結合を同時に行うこと、および
その後、形成されたリラキシン−２を精製すること
を含む、ヒトリラキシン−２を調製する方法。
【請求項２】
以下のアミノ酸誘導体、すなわち、
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｌ−ｐＧｌｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＨ
を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｃ末端としてのセリンを予めロードした樹脂担体、すなわちＦｍｏｃ保護ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｒ−ＰＨＰを、前記Ｂ鎖の合成に使用する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｃ末端としてのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）予めロードした樹脂担体を前記Ａ鎖の合成に使用する、請求項１から請求項３の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項５】
通常の補助剤および賦形剤に加えて、請求項１から請求項４のいずれかによって得られるヒトリラキシン−２を含有する薬剤。
【請求項６】
マンニトールなどの賦形剤と共に凍結乾燥した形態である、請求項５に記載の薬剤。
【請求項７】
水溶液中で再構成された、請求項６に記載の薬剤。
【請求項８】
リポソームでカプセル化した、請求項５に記載の薬剤。
【請求項９】
リポソームでカプセル化したリラキシン−２を含有する水溶液中で適用可能、または、リポソームでカプセル化したリラキシン−２を含有する軟膏剤の形で適用可能である、請求項８に記載の薬剤。
【請求項１０】
肺高血圧症、心腎症候群の他に腎および肝線維症も含む、心血管、肺、肝臓および腎系疾患の治療のため、
拡張期心不全および心筋肥大を含む急性および慢性心不全の治療のため、
糖尿病およびそれに続く疾患、特に糖尿病で生じる腎および心臓の損傷治療のため、
増殖性および炎症性心疾患、特に内皮および血管成長ならびに末梢動脈閉塞症の治療のため
の、請求項１から請求項４のいずれかによって得られるリラキシン−２。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、リラキシン−２の全合成のための化学方法に関し、リラキシン−２をガレヌス的に加工して高純度形にし、薬剤として使用するために提供する。
【背景技術】
【０００２】
リラキシン−２は、インスリンファミリーに属する天然ペプチドホルモンであり（ＳｃｈｗａｂｅおよびＭｃＤｏｎａｌｄ  １９７７年；ＲｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔおよびＨｕｍｂｅｌ  １９７８年）、ヒトの血液流体から単離することができる（ＷｉｌｋｉｎｓｏｎおよびＢａｔｈｇａｔｅ  ２００７年）。しかしながら、これは莫大な消費を意味し、望ましい必要な収率を提供せず、さらに、匹敵する品質および純度の材料を提供するのは困難であろう。
【０００３】
人体におけるリラキシン−２の生理機能は、心血管および／または腎系ならびに血管の血管拡張調節を制御することである（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ２００４年）。これは、Ｇタンパク質共役受容体と相互作用する（図１参照）。
【０００４】
１９９０年代まで、リラキシンは生殖および妊娠ホルモンであるとしか考えられていなかった。すなわち、リラキシンは、妊娠の第１三半期にその最も高い血漿濃度に達し、胚の着床および泌尿生殖器結合組織の再構築に重要な機能を果たすと考えられていた。
【０００５】
２０００年以来、科学者は、リラキシンの心血管系作用、特に慢性心不全における役割に対処してきた。
【０００６】
構成的に発現する内因性の心臓および血管リラキシン系の存在が、研究によって初めて示された（Ｄｓｃｈｉｅｔｚｉｇら、２００６年）。心筋リラキシン系は、心不全の刺激状態に存在するので、血中リラキシン濃度の著しい増加が見られるが、血行動態が改善すると急速に低下する。
したがって、得られた結果により、１）機能的に関連のある内因性心血管リラキシン系の存在、および２）心不全におけるリラキシンの代償性役割が示唆される。
インスリンのように、リラキシン−２は、２つのジスルフィド架橋によって相互連結した２つの異なるポリペプチド鎖（ＡおよびＢ）からなっている（Ｂｏｕｒｅｌｌら、１９９０年）。
【０００７】
（ヒト由来リラキシン−２のアミノ酸配列）
Ａ鎖：
ｐＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ
【０００８】
（線形Ａ鎖の分子量：２６５６．２Ｄａ（理論上））
【０００９】
Ｂ鎖：
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ
【００１０】
（線形Ｂ鎖の分子量：３３１２．９Ｄａ（理論上））
【００１１】
ヒトリラキシン−２分子のジスルフィド架橋：
Ａ鎖内：
Ｃｙｓ−１０とＣｙｓ−１５
Ａ鎖とＢ鎖の架橋：
Ａ鎖のＣｙｓ−１１とＢ鎖のＣｙｓ−１１
Ａ鎖のＣｙｓ−２４とＢ鎖のＣｙｓ−２３
ジスルフィド架橋分子の分子量：５９６３．１Ｄａ（理論上）
５９６２．５（ＥＳＩ−ＭＳ）
【００１２】
現在まで、十分な純度のリラキシン−２およびリラキシンファミリーの他のペプチドを調製することは、組換え合成によってのみ可能であったが、この方法は、ペプチドには面倒であり、収率が低いという特徴を有している（Ｂｒｅｅｃｅら、１９９５年；Ｔａｎｇら、２００３年）。
【００１３】
現在までずっと、全化学合成は、多くの反応工程と高い消費を伴っていたため、高収率を得ることができなかった（ＢｕｌｌｅｓｂａｃｈおよびＳｃｈｗａｂｅ  １９９１年；Ｓａｍｕｅｌら、２００７年；Ｂａｒｌｏｓら、２０１０年）。
【００１４】
薬剤を調製するためには、どんな場合でも、純度、収率、再現性、経済効率、および消費に関する要求に合致する最適化した合成戦略を開発することが必要である。
【００１５】
従来の合成戦略は、リラキシン−２分子の、３つのジスルフィド架橋の選択的導入に基づいており、一方では莫大な化学的消費を意味し、他方では各ジスルフィド架橋が生じた後にクロマトグラフィー精製方法を必要とする。
【００１６】
これにより、予想される産物で毎回少なからぬ物質を損失する結果となる。
産物の品質および経済面を考慮すると、現在まで実施されてきた合成戦略では不十分である。
【００１７】
現在まで、化学合成は、市場に産物を供給することはできないと言われてきた。現在まで、化学合成は、アミノ酸の欠失による高不純物濃度および高コストを伴ってきた。したがって、絶えず増加する難題に対処して副作用のないガレヌス製剤を得るために、リラキシン−２の高純度形を提供することが望ましい。
【００１８】
リラキシン−２の組換え合成は、異なる製造者によって実施され、産物は、前臨床および臨床検査ならびに試験用に提供された。しかしながら、生産費用が経済的合理性のある開発の妨げとなっている。
【００１９】
多数の研究によって、リラキシンの作用は、かつてオーファン受容体ＬＧＲ７と呼ばれたＧタンパク質共役受容体（ＲＸＦＰ１）によって媒介されるということが示されている（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ２００４年）。受容体ＲＸＦＰ１を担持するクローン細胞を用いた試験において、本発明者らは、生理的変動を制御した閉ループに生じ、リラキシンと同定された血漿中で効率的なペプチド濃度を検出することができた。したがって、このような因子の生理学的分泌機序からの逸脱に基づく疾患の治療には、局所標的に適応した形で投与される、高純度の有効成分の供与が含まれていなければならず、このことは以下に述べられており、本発明はこのことに関する。
【００２０】
高純度形のリラキシン−２の調製およびその適用は困難であるので、まずそれぞれの状態および治療の目的に適応しなければならない。したがって、ある種の疾患については、それぞれの疾患に適応した全身および局所適用を可能にするガレヌス形を見つけなければならない。リラキシン−２のこのような製剤は、高純度形でも、まだ入手可能になっていない。したがって、今日の規制に対して十分に純粋であり、対応するガレヌス形で提供することができ、商業的に製造することができ、かつ最も高い要求に対応する高純度形と見なすことができる有効成分が入手可能でなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明の目的は、その後の産物（リラキシン−２）を形成する反応で、等モル量で合成に使用する抽出物（Ａ鎖＋Ｂ鎖）のために、十分な量のリラキシン−２を効率よく調製することができる方法を提供することである。
【００２２】
解決する必要のある別の技術的問題は、高純度形でリラキシンを提供する薬剤および多くの用途のためのガレヌス製剤の作成である。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明によれば、これらの目的は、以下のアミノ酸配列、
Ａ鎖：
ｐＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ
Ｂ鎖：
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ
を有するヒトリラキシン−２を調製するための方法によって達成され、
本発明による方法は、以下の工程、すなわち、
Ａ鎖とＢ鎖の合成に必要なアミノ酸に通常の保護基を提供し、この保護基ではシステインをトリチル保護アミノ酸（Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）として使用すること、固相合成の後にそれぞれＡおよびＢ鎖のクロマトグラフィー精製を達成すること、続いてｐＨ７．９から８．４までの炭酸水素アンモニウム緩衝液中でそれぞれＡおよびＢ鎖のフォールディングと結合とを同時に行うこと、ならびに、その後、形成されたリラキシン−２を精製することを含む。
【００２４】
本発明による方法では、特に、以下のアミノ酸誘導体を固相合成に使用する。
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｌ−ｐＧｌｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＨ。
【００２５】
本発明によれば、Ｂ鎖を合成するために、Ｃ末端としてのセリンを予めロードした樹脂担体、すなわちＦｍｏｃ保護ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｒ−ＰＨＰを使用するのが好ましい。同様に、Ａ鎖の合成のために、Ｃ末端としてのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）を予めロードした樹脂担体を使用することができる。
【００２６】
本発明は、通常の補助剤および賦形剤に加えて、本発明による方法によって得られるヒトリラキシン−２を含有する薬剤にも関する。本薬剤は、マンニトールなどの賦形剤を含有していてもよく、凍結乾燥形であってもよい。用途に関して、特に静脈用途に関しては、水溶液中で再構成された形であるほうがよい。
【００２７】
本発明によって処方された薬剤は、さらにリポソームでカプセル化した形であってもよい。本発明によって処方された薬剤は、リポソームでカプセル化したリラキシン−２を含有する水溶液中で適用可能な形で提供されるか、または、リポソームでカプセル化したリラキシン−２を含有する軟膏剤の形で適用可能であってもよい。
【００２８】
本発明は、肺高血圧症、心腎症候群の他に腎および肝線維症も含む、心血管、肺、肝臓および腎系疾患の治療のため、拡張期心不全および心筋肥大を含む急性および慢性心不全の治療のため、糖尿病およびそれに続く疾患、特に糖尿病で生じる腎および心臓損傷の治療のため、増殖性および炎症性心疾患、特に内皮および血管成長ならびに末梢動脈閉塞症の治療のための、本発明による方法によって得られるリラキシン−２にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】リラキシン−２シグナル伝達の説明：リラキシン−２（ＲＬＸ）は、Ｇタンパク質共役受容体ＲＸＦＰ１（ＬＧＲ７）と相互作用し、それによって細胞内ＮＯおよびｃＡＭＰ濃度に影響を及ぼすことができる。
【図２】あらかじめ精製したＡおよびＢ鎖（ＡおよびＣ）の分析的ＨＰＬＣ特性ならびに関連するＥＳＩ質量スペクトル（ＢおよびＤ）。
【図３】０（Ａ）、１（Ｂ）、３（Ｃ）および８（Ｄ）日後の最終産物リラキシン−２に対する２つの鎖の反応速度。
【図４】最終産物リラキシン−２（Ａ）のＨＰＬＣ特性および関連するＥＳＩ質量スペクトル（Ｂ）。
【図５】ジスルフィド架橋したリラキシン−２。Ｃｙｓ−１０とＣｙｓ−１５との間のＡ鎖の内部架橋。Ｃｙｓ−１１（Ａ鎖）とＣｙｓ−１１（Ｂ鎖）、ならびにＣｙｓ−２４（Ａ鎖）とＣｙｓ−２３（Ｂ鎖）との間のＡ鎖とＢ鎖の架橋。最終産物の測定分子量は、５９６２．７Ｄａである。
【図６】ｃＡＭＰアッセイで、化学合成によって調製したリラキシン−２のバッチ（ＡＺ０１およびＡＺ０２）は、組換えで調製したリラキシン−２のバッチに匹敵する活性を有している。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下の非限定的実施例を用いて本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００３１】
高純度リラキシン−２の化学合成
従来の合成戦略は、リラキシン−２分子中の、３つのジスルフィド架橋の選択的導入に基づいている。これは一方では莫大な化学的消費を意味し、他方では各ジスルフィド架橋が生じた後に必要であるクロマトグラフィー精製方法を必要とし、予想される産物に次々に少なからぬ物質の損失を生じる。
【００３２】
最適化合成の典型例では、アミノ酸配列を有するリラキシン−２は、初めはＡ鎖およびＢ鎖という２つの鎖において別々に得られ、ピログルタミン酸（Ｌ−ｐＧｌｕ−ＯＨ）がＡ鎖のＮ末端に導入される。本来のグルタミンは、閉環によって修飾されてラクタムを形成し、ラクタムは一方ではエドマン配列決定をブロックし、他方では生理活性にとって重要である。さらに、Ａ鎖は、１０位および１５位にそれぞれシステインを有しており、ジスルフィド架橋により内部結合してシスチンを形成する。両システインは、酸に不安定な直交性側鎖としてトリチル基を抱えている。
【００３３】
Ａ鎖の合成は、段階的固相合成によってＦｍｏｃ（９−フルオレニル−メトキシカルボニル）保護されたアミノ酸で達成するのが好ましく、固体担体としてＦ−ｍｏｃ−Ｌ‐システイン（０．５４ｍｍｏｌ／ｇ、１００〜２００ｍｅｓｈ）を負荷したＷａｎｇ樹脂上で実施する（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、１９８５年）。Ｆｍｏｃアミノ酸の活性化は、Ｆｍｏｃアミノ酸を１０倍モル過剰で使用し、室温でＮ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）中に１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、０．５Ｍ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、２Ｍ）を添加した［（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート］（ＨＢＴＵ、１００ｍｍｏｌ／ｌ）で実施する。アシル化反応を、典型的に４５分間実施する。Ｆｍｏｃの切断を、ＮＭＰ中２０％のピペリジンで達成する。２つの鎖の合成尺度は、それぞれ０、１ｍＭである。以下のアミノ酸誘導体を合成に使用する。Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｌ−ｐＧｌｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＨ。Ｂ鎖の合成は、Ａ鎖の合成に対応する。しかしながら、使用した樹脂担体は、Ｃ末端としてのセリンで予めロードしたもの、すなわち、Ｆｍｏｃ保護ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｒ−ＰＨＰ、０．１９ｍｍｏｌ／ｇである。
【００３４】
Ａ鎖の合成のために、Ｃ末端としてのシステインで予めロードした樹脂担体、すなわちＦｍｏｃＬ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｗａｎｇ樹脂、０．５４ｍｍｏｌ／ｇを使用する。
Ａ鎖の配列：
ｐＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ
ＭＷ：２，６５６．２Ｄａ
Ｂ鎖の配列：
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ
ＭＷ：３，３１２．９Ｄａ
【００３５】
２つの鎖の合成は、室温でメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）原理によってＡＢＩ  ４３３上で段階的固相合成において、もっぱらＦｍｏｃ化学で達成する。
【００３６】
トリフルオロ酢酸（９４％ＴＦＡ）、エタンジチオール（３％ＥＤＴ）および脱塩水（３％）でペプチジル樹脂から樹脂担体を切断した後、トリチルは酸に不安定なので、両鎖は遊離チオール（ＳＨ）基を有する。したがって、得られた生のペプチドを、以下の組換え用クロマトグラフィー工程でさらに精製する（図２参照）。
【００３７】
Ａ鎖とＢ鎖の結合のために、水（Ａ鎖）、および５０％アセトニトリル（Ｂ鎖）でこれらをあらかじめ溶解する。Ａ鎖とＢ鎖の結合を可能にするために、これらをＮＨ４ＨＣＯ３溶液０．１Ｍ中ＥＤＴＡ２ｍＭからなる、ｐＨ７．９〜８．４の緩衝系に移す。緩衝系をあらかじめヘリウムで脱気させ（３０分）、無酸素の反応環境を生じさせる。
【００３８】
溶解したペプチド鎖は等モル濃度（０．１ｍｇ／ｍｌ）である。反応のためには、酸化還元ペアーとしてのシスチンとシステインの添加を、使用したペプチド（Ａ鎖＋Ｂ鎖）１ｍｇにつきシスチン２ｍｇおよびシステイン２ｍｇの濃度で達成することが極めて重要である。ここで、反応混合物を数日間、温度０℃の窒素シール下で中程度に撹拌する。
【００３９】
経験によって、数日後および遅くとも９日後にフォールディング反応を停止することができる。このフォールディング緩衝液中の反応を、可能な異性体構造無しで続行する。反応動態学的特性をｔ（開始）からｔ（終了）まで記録する。ｐＨ４の濃縮ＴＦＡを用いて反応を停止する（図３参照）。
【００４０】
このとき、得られる産物を反応混合物から勾配溶出法による分取クロマトグラフィーによって脱塩し、分画し、回収する。産物を含有する画分を結合し、続いて、真空下で乾燥する（図４参照）。
【００４１】
保存のために産物を凍結乾燥し、−２０℃で保存する。温度４℃での凍結乾燥形の高純度リラキシン−２製剤の高い安定性が、対応する分析論によって証明されているが、そこでは新材料が数か月間保存した材料と比較されている。このような保存期間の後、代謝物が小量のみ現れる。
【００４２】
Ａ鎖とＢ鎖を各４０ｍｇ使用して結合すると、９８％を超える純度のリラキシン−２産物が１６〜２４ｍｇ得られる（図４、５参照）。これは、フォールディングおよび精製工程後の２０〜３０％の収率に対応している。
【実施例２】
【００４３】
リラキシン−２の新製剤の調製
ガレヌス用途に好ましく適しているのは、（ｉ）滅菌水溶液、（ｉｉ）生理溶液中で用いてもよい、リポソームでカプセル化した有効成分および（ｉｉｉ）軟膏剤中に加工されている、リポソームでカプセル化した有効成分である。
【００４４】
例えば、ポリグリコラート／乳酸塩遊離粒子、ペグ化およびマイクロポンプなどを用いた多数の実験の後、驚くべきことに、ガレヌスの２つの形を適用できることが好ましいということがわかった。すなわち、
１．マンニトールで再構成した、凍結乾燥リラキシン−２、および、
２．リポソーム（ＲＯＶＩＳＯＭＥ（登録商標）が好ましいが他のものであってもよい）でのカプセル化（若干の代謝物を除いて有効成分が非常に安定しているので特に適した形である）。このような代謝物は、天然形として血漿中でも生じるが、窒素雰囲気中で機能することにより避けることができ、天然の内因性誘導体であるので副作用がない。
【００４５】
（１）水溶液
高純度有効成分の発明の適用によれば、生理水溶液中で使用することによって、短パルスのホルモンサージが達成されるかどうかがわかる。この目的のための有効成分に適した製剤は、静脈または好ましくは皮下注射用のそれぞれのアンプル中にあるのが好ましい。高純度産物は、まずアンプル中、またはペン注射用カートリッジ中で、凍結乾燥した有効成分として賦形剤、好ましくはマンニトールで調製して長期安定性を確保する。塩として２０ｍｇのマンニトールおよびアセタートで安定化した１０ｍｌアンプル（またはカートリッジ）中の凍結乾燥した治療単位を推奨するが、これによって１年より長期間の冷蔵庫温度での保存が可能になり、極めて大きく許容できる成分が含まれる。製剤を使用するために、注射の直前に、凍結乾燥物を生理学上許容できる溶液（例えば、０．９％生理食塩水を使用して）中で解凍する。
【００４６】
（２）リポソーム製剤
リラキシン−２のカプセル封入効率が異なる、様々なリポソーム製剤を選択した。２つの最も安定した製剤は、皮下注射の治療に後で使用するのに、および軟膏剤形として適している。
５．００％  ７０％を超えるホスファチジルコリン含有レシチン
１．６７％  イソプロパノール
１．００％  ポリソルベート２０
０．０１％  塩化ベンザルコニウム
０．１０％  ＥＤＴＡ
０．５０％  リラキシン−２
粒径：約１５０ｎｍ
ｐＨ：５．６
【００４７】
リポソーム製剤は、１か月を超える期間にわたり物理的に安定している。結果としてここから生じるものは、室温での最適保存温度で安定しているリポソーム製剤である（粒径一定でｐＨおよび匂いの変化無し）。
【００４８】
使用した原料はすべて医薬品規格に合致しており、レシチンは米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている。
静脈または皮下注射製剤の使用については、リポソーム製剤を、生理学上許容できる溶液（例えば、０．９％生理食塩水）で注射の直前に希釈するのが好ましい。
【実施例３】
【００４９】
リラキシン−２製剤の許容性および安全性
それぞれ高用量のリラキシン−２を用いて、凍結乾燥形を静脈内に試験し、リポソーム製剤を直接水溶液中で皮下注射試験し、塩基クリームを試験したところ、臨床適用の予想濃度の１０倍を上回る高用量は、いかなる重大な副作用も示さず、ラットの皮膚許容性に対する寛容性試験は、有害副作用が全く見られなかった。
【実施例４】
【００５０】
細胞モデル（生物検定）における効果
細胞モデルにおける研究によって、高純度リラキシンの使用は組換えペプチドの効果に匹敵する優れた効果を示すということがわかった。
【００５１】
合成ヒトリラキシン−２のアミノ酸配列は、天然ペプチドのアミノ酸配列と同一である。
天然受容体ＲＸＦＰ１を発現しているヒト胎生期腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３Ｔ）で、合成ｈＲｌｘ−２は、組換えヒトリラキシン−２と同じ効力でユウロピウム標識リラキシン−２を置換し、無傷の受容体活性を証明する。
【００５２】
リラキシン−２のために特に開発され（Ｈａｌｌｓら、２００９年）、ヒトＴＨＰ−１細胞で本発明者らが実施したｃＡＭＰアッセイで、合成および組換えヒトリラキシン−２は、同等の生理活性を示した（図６参照）。
【００５３】
心筋肥大株化細胞モデルで、合成ヒトリラキシン−２は組換えヒトリラキシン−２と同じ効力がある。このモデルで、リラキシンは、筋線維芽細胞への心臓線維芽細胞の分化、およびこれらの細胞による成長因子の分泌を阻害する（Ｄｓｃｈｉｅｔｚｉｇら、２００６年）。
【００５４】
動物モデルでの実験結果に基づき（Ｔｅｉｃｈｍａｎら、２００９年；Ｓａｍｕｅｌら、２００６年；Ｓｃｈｏｎｄｏｒｆら、２００７年）、ヒトの治療のための合成ヒトリラキシン−２を、次のものに使用するのが好ましいということを推奨されたい。
【００５５】
うっ血性心不全（収縮機能が減少した）：急性および慢性の治療
急性心不全
心腎症状
心筋線維症／肥大および拡張期心不全（収縮機能が保存された）
肺高血圧症
肺、腎または、肝線維症
末梢動脈閉塞症
糖尿病
【００５６】
急性用量（ヒトうっ血性心不全の予備実験による定量）：１日当たり３０から１００μｇ／ｋｇを皮下注射で（体重７０ｋｇにつき１日当たり２．１から７．０ｍｇ用量を）２４から４８時間まで。
【００５７】
慢性用量（定量）：１日当たり１０から３０μｇ／ｋｇを皮下注射で（体重７０ｋｇにつき１日当たり０．７から２．１ｍｇを）数か月にわたる。
【００５８】
参考文献
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Ｓｃｈｗａｂｅ  Ｃ，ＭｃＤｏｎａｌｄ  ＪＫ．Ｒｅｌａｘｉｎ：ａ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９７７；１９７：９１４−９１５．
【００７０】
Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ＯＤ．Ｒｅｌａｘｉｎ’ｓ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｏｌｅｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ａｃｔｉｏｎｓ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２００４；２５：２０５−２３４．
【００７１】
Ｔａｎｇ  ＪＧ，Ｗａｎｇ  ＺＨ，Ｔｒｅｇｅａｒ  ＧＷ，Ｗａｄｅ  ＪＤ．Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ２  ｒｅｌａｘｉｎ  ｃｈａｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｏｌｄｉｎｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００３；４２：２７３１−２７３９．
【００７２】
Ｔｅｉｃｈｍａｎ  ＳＬ，Ｕｎｅｍｏｒｉ  Ｅ，Ｄｓｃｈｉｅｔｚｉｇ  Ｔ，Ｃｏｎｒａｄ  Ｋ，Ｖｏｏｒｓ  ＡＡ，Ｔｅｅｒｌｉｎｋ  ＪＲ，Ｆｅｌｋｅｒ  ＧＭ，Ｍｅｔｒａ  Ｍ，Ｃｏｔｔｅｒ  Ｇ．Ｒｅｌａｘｉｎ，ａ  ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ  ｖａｓｏｄｉｌａｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌ．Ｒｅｖ．２００９；１４：３２１−３２９．
【００７３】
Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ＴＮ，Ｂａｔｈｇａｔｅ  ＲＡ．Ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｌａｘｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆａｍｉｌｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２００７；６１２：１−１３．
【図１】
2014521680.tif 000003
【図２】
2014521680.tif 000004
【図３】
2014521680.tif 000005
【図４】
2014521680.tif 000006
【図５】
2014521680.tif 000007
【図６】
2014521680.tif 000008
【配列表】
2014521680000001.app
【国際調査報告】
2014521680.tif 000009
2014521680.tif 000010
2014521680.tif 000011
2014521680.tif 000012