(57)【要約】  ｈＴＲＡＩＬタンパク質配列の機能的フラグメントであって、そのフラグメントがｈＴＲＡＩＬ９５より小さくない位置のアミノ酸から始まる当該機能的フラグメント、または少なくとも７０％の配列同一性を有する前記機能的フラグメントのホモログであるドメイン（ａ）；ならびに、腫瘍細胞に対する抗増殖性活性を有するエフェクターペプチドの配列である少なくとも１つのドメイン（ｂ）を含む融合タンパク質であって、当該ドメイン（ｂ）の配列がドメイン（ａ）のＣ末端またはＮ末端に付着されている、前記融合タンパク質。当該融合タンパク質は、がん疾患の処置のために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
―  ｈＴＲＡＩＬ９５より小さくない位置のアミノ酸から始まる可溶性ｈＴＲＡＩＬタンパク質配列の機能的フラグメント、または、少なくとも７０％の配列同一性を有する前記機能的フラグメントのホモログ、を含むドメイン（ａ）；および
―  腫瘍細胞に対する抗増殖性活性を有するエフェクターペプチドの配列である、少なくとも１つのドメイン（ｂ）
を含む融合タンパク質であって、
前記ドメイン（ｂ）の配列が、前記ドメイン（ａ）のＣ末端および／またはＮ末端に付着されている、前記融合タンパク質。
【請求項２】
ドメイン（ａ）が、ｈＴＲＡＩＬ９５からｈＴＲＡＩＬ１２１までの範囲（両端を含む）のアミノ酸から始まり、アミノ酸２８１で終わる可溶性ｈＴＲＡＩＬ（配列番号７８）タンパク質配列のフラグメントを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ドメイン（ａ）が、ｈＴＲＡＩＬ９５−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１９−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１２０−２８１およびｈＴＲＡＩＬ１２１−２８１からなる群から選択される、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ドメイン（ｂ）が、
―  ＦＧＦ−２受容体をブロックする、配列番号２６の１６アミノ酸ペプチド；
―  ヒトフェトプロテインの、配列番号２７の３４アミノ酸フラグメント；
―  ヒトフェトプロテインの、配列番号２８の８アミノ酸フラグメント；
―  ｐ２１ＷＡＦに由来する、配列番号２９のペプチド；
―  ＤＯＣ−２／ＤＡＢ２タンパク質からの、配列番号３０のペプチドＤＤ２；
―  Mycoplasma argininiからの、配列番号３１のアルギニンデイミナーゼ；
―  ｐ１６ペプチドの、配列番号３２のフラグメント；
―  アンテナペディアの１７アミノ酸の輸送ドメインと融合されたｐ１６ペプチドの、配列番号３３のフラグメント；
―  ＭＥＫ−１タンパク質の、配列番号３４のフラグメント；
―  ＴＣＬ１タンパク質のＰＨドメインの、配列番号３５のＮ末端フラグメント；
―  配列番号３６のヘキサペプチドＰｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ；
―  配列番号３７の１３アミノ酸のチューブリンフラグメント；
―  配列番号３８の１０アミノ酸のチューブリンフラグメント；
―  配列番号３９のメリチン；
―  ハチデフェンシンに由来する、配列番号４０の６アミノ酸ペプチドＣ２；
―  ＦＧＦ−２リガンドに結合する、配列番号４１の８アミノ酸ペプチド；
―  配列番号４２の１５アミノ酸のラシオグロッシンＬＬ２ペプチド；
―  ＳＨ３  ＲａｓＧＡＰドメインに結合する、配列番号４３の１３アミノ酸ペプチド；
―  Ｐｅｐ２７ペプチドの、配列番号４４のアナログ
からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）との間に、メタロプロテアーゼＭＭＰに認識される配列、ウロキナーゼｕＰＡに認識される配列およびそれらの組み合わせから選択されるプロテアーゼ切断部位を含むドメイン（ｃ）を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
メタロプロテアーゼＭＭＰに認識される配列が、配列番号４５であり、ウロキナーゼｕＰＡに認識される配列が、配列番号４６である、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
ドメイン（ｃ）が、互いに隣り合って位置するメタロプロテアーゼＭＭＰとウロキナーゼｕＰＡとにそれぞれ認識される配列の組み合わせである、請求項５または６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ドメイン（ｂ）が、
―  （ｄ１）アンテナペディアタンパク質ドメインの、配列番号４８のフラグメント、
―  （ｄ２）アンテナペディアタンパク質ドメインの、配列番号４９のフラグメント、
―  （ｄ３）細胞膜を介して輸送する、６、７、８、９、１０または１１個のＡｒｇ残基からなるポリアルギニン配列、
およびそれらの組み合わせ
からなる群から選択される輸送ドメイン（ｄ）とさらに繋がっている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
配列（ｄ）が、融合タンパク質のＣ末端またはＮ末端に位置する、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
輸送配列（ｄ）が、ドメイン（ｂ）と（ｃ）との間に位置する、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
配列（ｄ）が、融合タンパク質のＣ末端に位置する、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
ドメイン（a）、（ｂ）、（ｃ）および／または（ｄ）の間に、フレキシブルステリックリンカーをさらに含む、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
フレキシブルステリックリンカーが、配列番号４７、配列Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ、配列Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ、２個のグリシン残基Ｇｌｙ  Ｇｌｙ、システイン残基Ｃｙｓおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５および配列番号７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
組み換えタンパク質である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項に定義された融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド配列。
【請求項１７】
E. coliの遺伝子発現に最適化された、請求項１６に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１８】
配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４および配列番号７６からなる群から選択される、請求項１７に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９に定義された発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２１】
E. coli細胞である、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
薬学的に許容し得る担体との組み合わせにおいて、請求項１〜１５のいずれか一項に定義された融合タンパク質を活性成分として含む、医薬組成物。
【請求項２３】
非経口投与のための形態である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
哺乳動物（ヒトを含む）の新生物性疾患の処置における使用のための、請求項１〜１５のいずれか一項に定義された融合タンパク質。
【請求項２５】
抗新生物に有効な量の、請求項１〜１５のいずれか一項に定義された融合タンパク質または請求項２２もしくは２３に定義された医薬組成物を、これらを必要とする対象に投与することを含む、哺乳動物（ヒトを含む）のがん疾患を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療的な融合タンパク質、特に組み換え融合タンパク質の分野に関する。より具体的には、本発明は、可溶性ヒトＴＲＡＩＬタンパク質の配列と抗増殖性ペプチドの配列とのフラグメントを含む融合タンパク質、それらを含む医薬組成物、治療における、特に抗がん剤としての、それらの使用、ならびに、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、該ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、および、これらの発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインファミリーのメンバーであるＴＲＡＩＬタンパク質（腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド(Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis Inducing Ligand)）は、Ａｐｏ２Ｌ（Ａｐｏ２−リガンド）としても知られ、腫瘍細胞およびウイルスに感染した細胞におけるアポトーシスの強力なアクチベーターである。ＴＲＡＩＬは、体内において天然に存在するリガンドである。ＴＲＡＩＬタンパク質、そのアミノ酸配列、コードするＤＮＡ配列、および、タンパク質発現系は、EP0835305A1に初めて開示された。
【０００３】
ＴＲＡＩＬタンパク質は、アポトーシス促進性の表面ＴＲＡＩＬ受容体１および２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１／Ｒ２）に結合し、続くこれらの受容体の活性化により、その抗がん活性を発揮する。これらの受容体は、ＤＲ４およびＤＲ５（死受容体(death receptor)４および死受容体５）としても知られ、ＴＮＦ受容体ファミリーであり、様々なタイプのがん細胞に過剰発現されている。これらの受容体の活性化は、サプレッサー遺伝子ｐ５３に非依存的なアポトーシスの外部シグナリング経路を誘導することができ、それは、活性化されたカスパーゼ８により、実行型(executive)カスパーゼの活性化、それによって核酸の分解がもたらされる。ＴＲＡＩＬの活性化の間に放出されるカスパーゼ８はまた、Ｂｉｄタンパク質の放出と、それによるミトコンドリア経路の間接的な活性化とを引き起こすこともあり得る。Ｂｉｄタンパク質はミトコンドリアへ移行し、そこで、それがチトクロムｃの放出を刺激し、よって死受容体からのアポトーシスのシグナルが間接的に増幅される。
【０００４】
ＴＲＡＩＬは、このタンパク質に抵抗性のある健常細胞においてはアポトーシスを本質的に誘導せず、腫瘍細胞に対して選択的に作用する。したがって、血液悪性腫瘍および固形腫瘍を含む様々なタイプの広範な腫瘍細胞には作用するが、正常細胞には危害を加えず、潜在的に比較的わずかな副作用しか及ぼさない抗がん剤として、ＴＲＡＩＬの極めて大きな可能性が認識された。
【０００５】
ＴＲＡＩＬタンパク質は、２８１アミノ酸の長さを有するＩＩ型膜タンパク質である。プロテアーゼによる切断を受けるアミノ酸残基１１４−２８１を含むその細胞外領域は、２０ｋＤａサイズの可溶性ｓＴＲＡＩＬ分子を形成し、それもまた生物学的な活性がある。ＴＲＡＩＬおよびｓＴＲＡＩＬのいずれの形態も、標的細胞上に存在するＴＲＡＩＬ受容体との相互作用を介して、アポトーシスの引き金を引く能力がある。ＴＲＡＩＬ分子の可溶性部分の強い抗腫瘍性活性と、極めて低い全身毒性とが、細胞株テストを使用して実証された。また、ｈＴＲＡＩＬのアミノ酸１１４−２８１に相当するアミノ酸配列を有し、ＩＮＮのもと、デュラナミン(dulanermin)で知られる、組み換えヒト可溶性ＴＲＡＩＬ（ｒｈＴＲＡＩＬ）を用いたヒト臨床研究も、その良好な耐性と用量制限毒性がないこととを示した。
【０００６】
例えばEP 1 688 498において、ｈＴＲＡＩＬ１２２−２８１の組み換え円順列変異体に対して近年報告されたように、１１４−２８１より短いＴＲＡＩＬのフラグメントもまた、膜の死受容体と結合し、これらの受容体を介してアポトーシスを誘導することができる。
【０００７】
今までに報告された肝細胞に対する組み換えＴＲＡＩＬタンパク質の毒性効果は、修飾、すなわちポリヒスチジンタグの存在と関係しているように思われ、その上、タグがないＴＲＡＩＬは全身毒性がないことを示した。
【０００８】
しかしながら、さらなる調査および開発の過程において、多くのがん細胞がＴＲＡＩＬに対して本来の抵抗性または獲得抵抗性を示したように思われる（例えばWO2007/022214を参照）。ＴＲＡＩＬに対する抵抗性の機序は完全には理解されていないが、それが、細胞表面受容体レベルからシグナリング経路内の実行型カスパーゼに及ぶＴＲＡＩＬ誘導アポトーシス経路の様々なレベルで現れ得ると考えられる。この抵抗性が、抗がん剤としてのＴＲＡＩＬの有用性を制限する。
【０００９】
さらに、患者に対する臨床試験において、単独療法としてのＴＲＡＩＬの実際の有効性は低いことが証明された。この低効率性とＴＲＡＩＬに対する腫瘍の抵抗性とを克服するために、放射線治療剤および化学治療剤を用いた様々な併用療法が考案され、それによってアポトーシスの相乗効果が得られた（WO2009/002947；A. Almasan and A. Ashkenazi, Cytokine Growth Factor Reviews 14 (2003) 337-348；RK Srivastava, Neoplasis, Vol 3, No 6, 2001, 535-546、Soria JC et al., J. Clin. Oncology, Vol 28, No 9 (2010), p. 1527-1533）。選択された従来の化学治療剤（パクリタキセル、カルボプラチン）とモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体との組み合わせにおける、がん処置のためのｒｈＴＲＡＩＬの使用は、WO2009/140469に記載されている。しかしながら、かかる組み合わせの必要性は、従来の化学治療または放射線治療の周知の欠陥を暗示している。
【００１０】
さらに、ＴＲＡＩＬ治療に関連する問題は、その低い安定性および投与後の体内からの急速な排出であることが証明された。
【００１１】
血管新生インヒビターであるバソスタチンとメタロプロテアーゼ切断部位リンカーにより繋げられたＴＲＡＩＬ１１４−２８１との配列を含む構築された融合タンパク質は、腫瘍細胞においてアポトーシス誘導効果を呈するとして、A.I. Guo et al in Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology 2008, vol. 24(10), 925-930に記載された。
【００１２】
血管新生インヒビターであるカルレティキュリンとＴＲＡＩＬ１１４−２８１との配列を含む構築された融合タンパク質は、腫瘍細胞においてアポトーシス誘導効果を呈するとして、CN1609124Aに記載された。
CN 1256347Cは、キニノーゲンＤ５  ６０−１４８およびＴＲＡＩＬ１１４−２８１から構成される融合タンパク質を開示している。
【００１３】
ＧＧＧＳＧＧＳＧをコードするリンカーにより繋げられたＴＲＡＩＬ１１４−２８１のＮ末端またはＣ末端に付着された血管新生インヒビターであるキニノスタチン、バソスタチンおよびカンスタチンの配列を含む構築された融合タンパク質は、Feng Feng-Yi “Phase I and Clinical Trial of Rh-Apo2L and Apo2L-Related Experimental Study”, Ph.D. degree thesis, Chinese Peking Union Medical, 2006-10-01; http://www.lw23.com/lunwen_957708432において言及されている。
【００１４】
血管新生インヒビターであるタムスタチンのタムスタチン１８３−２３０とＴＲＡＩＬ１１４−２８１との配列を含む構築された融合タンパク質は、膵がん細胞のアポトーシス誘導を呈するとして、N.Ren et al in Academic Journal of Second Military Medical University 2008, vol. 28(5), 676-478に記載された。
【００１５】
US2005/244370および対応するWO2004/035794は、ＴＮＦファミリーのリガンドの他のメンバーであるＣＤ４０の、細胞表面結合ドメインとしての細胞外部分とペプチドリンカーによって繋げられたエフェクタードメインとして、ＴＲＡＩＬ９５−２８１の構築物を開示する。該構築物の活性化はそのＣＤ４０部分の結合を介すると書かれている。
【００１６】
Shin J.N. et al., Experimental Cell Research, vol. 312, no. 19, 2006, p. 3892-3898)は、腫瘍環境などのメタロプロテアーゼが病的に産生される領域において活性化され放出され得るＴＲＡＩＬの前形態(proform)として、連結部位に導入されたマトリックスメタロプロテアーゼ切断部位を有する、ｓＴＲＡＩＬとＩＬ−１８との構築された融合タンパク質を開示した。ＩＦＮ−ガンマとエンドスタチンとを有するｓＴＲＡＩＬの構築物もまた産生されたが、特徴付けもテストもされなかった。
【００１７】
がん治療における目標の１つは、腫瘍細胞増殖（成長）の阻害である。悪性の表現型を獲得した（変異、発がん物質の活性またはＤＮＡ修復の障害により）細胞は、正確な分化に対する能力を失い、浸潤する能力を獲得する。腫瘍細胞のクローンは、急速な成長と侵襲性とに関連する遺伝子を主に転写し、腫瘍細胞は、とりわけ、増殖の制御における混乱により特徴付けられる。
【００１８】
がん治療における腫瘍細胞増殖の阻害の有益な効果は知られている。がん治療としても、がん補助治療としても、増殖のプロセスを阻害または調節する物質の臨床用途への試みがなされている。
【００１９】
腫瘍細胞増殖の阻害は、例えば総説「Hallmarks of Cancer: The Next Generation」（Cell, 2011, 646-674）に記載されているように、様々な方法で達成することができる。抗がん治療において使用される抗増殖性タンパク質―トラスツズマブなど―ＨＥＲ２が過剰発現している乳がん患者に使用されるＨＥＲ２をブロックするモノクローナル抗体が知られている。ヒトがんの処置において臨床上有用であることが未だに見出されていない抗増殖性活性の多くのタンパク質もまた知られている。
【００２０】
例えば、抗増殖性活性のヒトフェトプロテインおよびそのフラグメントなどがよく知られている。個々のタンパク質のドメイン特性の詳細な研究によって、エストラジオール依存性細胞の成長阻害の原因となる３４アミノ酸領域内に位置する構造の存在が明らかとなった（Mizejewski et al, Mol. Cell. Endocrinol., 18:15-23, 1996）。この領域のカルボキシル末端は、８個の保存的アミノ酸から構成されており、最も重要なフラグメントである。そして、単独でがん細胞の成長を阻害することができる（Mizejewski G., Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 22: 73-98, 2007）。
【００２１】
抗増殖性特性のｐ２１ＷＡＦ１タンパク質もまた知られている。Ｄ１−ＣＤＫ４複合体に結合し阻害することによって細胞周期をＧ１期で止めるのと同等な能力を発揮するｐ２１ＷＡＦ１のアミノ酸配列に基づく短いペプチドが合成された（Ball et al, Current Biology, 7:71-80, 1996）。
【００２２】
タンパク質ＤＯＣ−２／ＤＡＢ２（Differentially expressed in Ovarian Cancer-2/Disabled 2）が前立腺がん細胞の増殖の強力なインヒビターであることもまた知られている。それは、ＭＡＰＫキナーゼ伝達経路のそれぞれの部分要素（ｃ−Ｓｒｃ、Ｇｒｂ２）の多くに結合することで、該経路を抑制することによって作用する（Zhou et al, J Biol Chem 276: 27793-27798, 2001, Zhou et al, J Biol Chem, 278: 6936-6941, 2003）。その本質的な成分は、ＤＯＣ−２／ＤＡＢ２のカルボキシ末端に存在するプロリンリッチなドメインである（Zhou et al, Cancer Res, 66: 8954 - 8958, 2006）。
【００２３】
ｐ１６タンパク質またはそのフラグメントによる、ＣＤＫ４―サイクリン結合の阻害は、一般に、新生組織形成のサプレッサーと見なされている（Fahraeus et al, Oncogene, 16: 587-596, 1998）。
【００２４】
キナーゼＥＲＫが腫瘍細胞増殖の度合いに影響を及ぼすこともまた知られている（Handra-Luca A., et al, American Journal of Pathology. 2003; 163: 957-967）。ＭＥＫ−１タンパク質のペプチドフラグメントがＥＲＫキナーゼの選択的な基質であることが知られており、よってそれは、その選択的インヒビターとして働くことができる（Bradley R. et al, The Journal of Biological Chemistry, 2002, 277, 8741-8748）。
【００２５】
Ａｋｔキナーゼ活性の選択的阻害が細胞増殖の阻害および腫瘍細胞の死をもたらすこともまた知られている（Hennessy B.T, et al, Nature Reviews Drug Discovery 2005, 4, 988 -1004）。
【００２６】
Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒのヘキサペプチドの抗増殖性特性が、Ｅ２ＦとＤＰとの結び付きの阻害およびＥ２ＦのＤＮＡへの結合の直接的阻害にあることもまた知られている（Janin Y. L., Amino Acids, 25: 1 - 40, 2003）。
【００２７】
有糸分裂において姉妹染色分体の分離を防止し、染色体の移動において障害を引き起こす、チューブリン繊維脱重合の阻害もまた、増殖プロセスの障害をもたらす（Xiao et al., J. Cell Mol. Med., 2010）。
【００２８】
ＴＲＡＩＬタンパク質の活性を有するメリチンタンパク質は、相乗効果を示した（Wang et al., JBC Journal of Biological Chemistry, 284, 3804-3813）。
【００２９】
テロメラーゼの活性、ならびにハチデフェンシンのフラグメントであるタンパク質およびそれらのアナログによるミトコンドリア膜におけるテロメラーゼの蓄積の阻害もまた知られている（Iwasaki et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 73:683-687, 2009）。
【００３０】
ハチLasioglossum laticepsの毒から単離され正に荷電したペプチドであるラシオグロッシン(lasioglossin)が腫瘍細胞に対して細胞毒性を発揮することもまた知られている（Cerovsky et al., Chembiochem, 2009, 10: 2089-2099）。
【００３１】
例えばＳＨ３ドメインからのタンパク質アプタマーによるＲａｓＧＡＰ―Ａｕｒｏｒａ  Ｂ相互作用の阻害が、がん細胞の増殖に阻害的影響を発揮することもまた知られている（Pamonsinlapatham P. et al., PLoS ONE 3 (8): e2902, 2008）。
【００３２】
例えばｐ１６ＩＮＫ４Ａ遺伝子産物のフラグメントであるｐ１６ペプチドによる、細胞周期依存性キナーゼ、例えばキナーゼＣＤＫ４の阻害に影響を与えることは、よく知られている（Derossi D, et al., J Biol Chem. 269:10444-10450, 1994）。
【００３３】
Ｐｅｐ２７タンパク質の抗増殖性特性もまた知られており、細胞受容体によるその結合は、ヒスチジンキナーゼのリン酸化をもたらし、これによって、エフェクター因子ＶｎｃＲの脱リン酸化が引き起こされ、その結果として自己触媒経路および細胞死の阻害がもたらされる（Dong Gun Lee et al., Cancer Cell International 2005, 5:21）。
【００３４】
多くの抗増殖性物質は現在、臨床試験を含む調査の様々な段階にある。しかしながら、増殖の阻害を目的とした既知の治療は、よく知られている多くの不利益を抱えている。例えば、血栓塞栓性合併症、喀血および肺出血などの弊害がある。多くの抗増殖性薬物はまた、乏しいバイオアベイラビリティや有害な副作用も示す。
【００３５】
抗増殖性薬物の安全性は、長期間の使用と治療の選択性の欠如とから、特に重要である。有効な治療剤に対する強い必要性および腫瘍性疾患の性質は、かかる薬物群に対する簡素化された登録手続を余儀なくさせており、そのため、その薬物の全ての副作用および不利益を知ることは不可能である。とはいえ、速く増殖する全ての細胞を対象とする化学療法に反して、ペプチドの抗増殖性薬物は、タンパク質のリン酸化および脱リン酸化のカスケードを始動させることに関与するタンパク質キナーゼおよびホスファターゼ、または、細胞周期の正確な進行に携わっているそれらの基質もしくは他のタンパク質を対象としており、治療の毒性がいくらか低減されている。しかしながら、腫瘍細胞に対する選択性を確保しつつ、増殖を阻害することを対象とする抗がん治療は未だ知られていない。従って、毒物学的な特質が改善された新規の抗増殖性抗がん治療が必要とされている。
【発明の概要】
【００３６】
本発明は、ＴＲＡＩＬに由来するドメインと、抗増殖性活性があり、かつＴＲＡＩＬフラグメントを含まない短いエフェクターペプチドドメインとを含む新規融合タンパク質を提供することにより、この問題の解決手段を提供する。ここで、前記エフェクターペプチドは、ＴＲＡＩＬの作用を増強または補完する。
【００３７】
本発明によるタンパク質は、がん細胞を選択的な対象とし、該タンパク質の要素が、それらの効果を発揮し、特にエフェクターペプチドが腫瘍細胞増殖を阻害する。本発明のタンパク質の腫瘍環境への送達は、副作用のみならず、体内の健常細胞に対する毒性を最小限に抑え、投与の頻度を減らすことを可能にする。加えて、本発明によるタンパク質を使用する標的治療は、これまでに知られている非特異的な抗増殖性治療の、高毒性と高用量投与の必要性とによる低効率の問題を避けることを可能にする。
【００３８】
本発明の融合タンパク質は、多くの場合、可溶性ＴＲＡＩＬおよびその配列のフラグメントを含むその変異体よりも効き目があることが判明した。これまで、本発明の融合タンパク質に使用される既知のエフェクターペプチドは、好ましくない動態、非特異的プロテアーゼによる急速な分解、または経路の活性化の正しい順序（標的部位におけるエフェクターペプチドの適切な作用を可能にするのに必要である）の欠如により引き起こされる体内への蓄積のために、医学の分野ではほとんど使用されていなかった。融合タンパク質へのエフェクターペプチドの取り込みは、それらの作用が所望の部位への、それらの選択的な送達を可能にする。さらに、エフェクターペプチドの付着は、タンパク質の質量を増やし、その結果、半減期が延長し、腫瘍中のタンパク質貯留が増加し、その効率が増進する。加えて、新規の融合タンパク質はまた、多くの場合、ＴＲＡＩＬに対する自然抵抗性または誘導抵抗性にも打ち勝つ。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
図の説明
次に、本発明を、図面の図を参照して詳細に説明する。
【００４０】
【図１】図１は、例１、例２、例３、例４および例５に従う本発明の融合タンパク質の構造概略図を示す。
【００４１】
【図２】図２は、例６、例７、例８、例８Ａ、例９および例１０に従う本発明の融合タンパク質の構造概略図を示す。
【００４２】
【図３】図３は、例１１、例１２、例１３、例１４および例１５に従う本発明の融合タンパク質の構造概略図を示す。
【００４３】
【図４】図４は、例１６、例１７、例１８、例１９および例２０に従う本発明の融合タンパク質の構造概略図を示す。
【００４４】
【図５】図５は、例２１、例２２、例２３、例２４および例２５に従う本発明の融合タンパク質の構造概略図を示す。
【００４５】
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、特定の楕円率で表された、例１ａおよび例２ａの融合タンパク質（図６Ａ）、ならびに、例８ａの融合タンパク質およびｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（図６Ｂ）の円偏光二色性スペクトルを示す図である。
【００４６】
【図７】図７は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例２ａの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＨＣＴ１１６を負ったCrl:CD1-Foxn1nuマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
【００４７】
【図８】図８は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例２ａの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＨＣＴ１１６を負ったCrl:CD1-Foxn1nu 1マウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。
【００４８】
【図９】図９は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例２ａの本発明の融合タンパク質で処置された、肺がんＮＣＩ−Ｈ４６０−Ｌｕｃ２を負ったCrl:CD1-Foxn1nuマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
【００４９】
【図１０】図１０は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例２ａの本発明の融合タンパク質で処置された、肺がんＮＣＩ−Ｈ４６０−Ｌｕｃ２を負ったCrl:CD1-Foxn1nu 1マウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。
【００５０】
【図１１】図１１は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例８ａの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＨＣＴ１１６を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
【００５１】
【図１２】図１２は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例８ａの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＨＣＴ１１６を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。
【００５２】
【図１１ａ】図１１ａは、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例８ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＨＣＴ１１６を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
【００５３】
【図１２ａ】図１２ａは、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例８ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＨＣＴ１１６を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。
【００５４】
【図１３】図１３は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例８ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＳＷ６２０を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
【００５５】
【図１４】図１４は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例８ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＳＷ６２０を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。
【００５６】
【図１５】図１５は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例８ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＣｏｌｏ２０５を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
【００５７】
【図１６】図１６は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例８ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、結腸がんＣｏｌｏ２０５を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。
【００５８】
【図１７】図１７は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例８ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、肝がんＨｅｐＧ２を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
【００５９】
【図１８】図１８は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例８ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、肝がんＨｅｐＧ２を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。
【００６０】
【図１９】図１９は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例８ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、肺がんＮＣＩ−Ｈ４６０−Ｌｕｃ２を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍体積変化（初期ステージの％）を示す。
【００６１】
【図２０】図２０は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と比較した、例８ｂの本発明の融合タンパク質で処置された、肺がんＮＣＩ−Ｈ４６０−Ｌｕｃ２を負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおける腫瘍成長阻害値（％ＴＧＩ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本発明の詳細な説明
本発明は、以下：
―  ｈＴＲＡＩＬ９５より小さくない位置のアミノ酸から始まる可溶性ｈＴＲＡＩＬタンパク質の機能的な配列フラグメント、または、少なくとも７０％の配列同一性を有する当該機能的なフラグメントのホモログであるドメイン（ａ）、および、
―  腫瘍細胞に対する抗増殖性活性を有するエフェクターペプチドの配列であるドメイン（ｂ）を含む融合タンパク質に関し、
ここで、ドメイン（ｂ）の配列は、ドメイン（ａ）のＣ末端および／またはＮ末端に付着される。
【００６３】
「可溶性ｈＴＲＡＩＬの配列の機能的な可溶性フラグメント」という用語は、哺乳動物細胞において、該細胞の表面にあるその受容体に結合することで、アポトーシスシグナルを誘導する能力がある、可溶性ｈＴＲＡＩＬのかかるフラグメントのいずれをも意味するものと理解されるべきである。
【００６４】
ＴＲＡＩＬ配列の少なくとも７０％の相同性の存在が当該技術分野において知られているということもまた、当業者に十分理解されるだろう。
【００６５】
本発明の融合タンパク質におけるエフェクターペプチドのドメイン(ｂ)は、ｈＴＲＡＩＬタンパク質でも、ｈＴＲＡＩＬタンパク質のフラグメントの一部でもないことが理解されるべきである。
【００６６】
本発明に従う「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって共に繋がった複数のアミノ酸から作られる分子として理解されるべきである。それゆえに、本発明による「ペプチド」という用語は、オリゴペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を含む。
【００６７】
本発明において、ペプチドのアミノ酸配列は、ペプチドのＮ末端（Ｎ末）からそのＣ末端（Ｃ末）へ向かう方向に、当該技術分野で採用されている従来の方式で、提示されるだろう。それゆえに、いかなる配列も、その線状で提示されたものの左側にＮ末端を、右側にＣ末端を有する。
【００６８】
本発明の融合タンパク質は、ドメイン（ａ）のＣ末端および／またはＮ末端に付着された、エフェクターペプチドのドメイン（ｂ）の少なくとも１つを組み込む。
【００６９】
特定の態様において、ドメイン（ａ）は、ｈＴＲＡＩＬ９５からｈＴＲＡＩＬ１２１までの範囲（両端を含む）のアミノ酸で始まり、アミノ酸ｈＴＲＡＩＬ２８１で終わる、ｈＴＲＡＩＬ配列のフラグメントである。
【００７０】
具体的に、ドメイン（ａ）は、ｈＴＲＡＩＬ９５−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１９−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１２０−２８１およびｈＴＲＡＩＬ１２１−２８１に対応する配列からなる群から選択してもよい。ｈＴＲＡＩＬ９５−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１９−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１２０−２８１およびｈＴＲＡＩＬ１２１−２８１が、GenBankのアクセッションNo. P50591で公開されているｈＴＲＡＩＬの既知の配列において、それぞれ９５番、１１４番、１１９番、１２０番および１２１番でマークされたアミノ酸で始まり、最後のアミノ酸２８１で終わるヒトＴＲＡＩＬタンパク質のフラグメントを表すことは当業者にとって明白であろう。
【００７１】
他の具体的態様において、ドメイン（ａ）は、ｈＴＲＡＩＬ９５より小さくない位置のアミノ酸で始まり、アミノ酸ｈＴＲＡＩＬ２８１で終わる可溶性ｈＴＲＡＩＬタンパク質配列の機能的フラグメントのホモログであって、その配列は、少なくとも７０％、好ましくは８５％で、オリジナル配列と一致する。
【００７２】
この態様の具体的な変形において、ドメイン（ａ）は、ｈＴＲＡＩＬ９５−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１１６−２８１、ｈＴＲＡＩＬ１２０−２８１およびｈＴＲＡＩＬ１２１−２８１に対応する配列からなる群から選択されるフラグメントのホモログである。
【００７３】
ｈＴＲＡＩＬフラグメントのホモログは、このフラグメントのアミノ酸配列の変更／改変であると理解されるべきであり、ここで、１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、および、アミノ酸の１５％以下を含む、少なくとも１個のアミノ酸が変化しており、ここで、改変された配列のフラグメントは、ｈＴＲＡＩＬ配列の機能性すなわち、細胞表面の死受容体への結合能および哺乳動物細胞におけるアポトーシス誘導能を保存している。アミノ酸配列の改変は、例えば、アミノ酸の置換、欠失および／または付加を含んでもよい。
【００７４】
好ましくは、改変された配列を有するｈＴＲＡＩＬフラグメントのホモログは、ネイティブな(native)ｈＴＲＡＩＬのフラグメントと比較して、死受容体のＤＲ４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）またはＤＲ５（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）との改変された親和性を示す。
【００７５】
「改変された親和性」という用語は、上昇された親和性および／または受容体の選択性が変更された親和性を指す。
【００７６】
好ましくは、改変された配列を有するｈＴＲＡＩＬフラグメントのホモログは、ネイティブなｈＴＲＡＩＬのフラグメントと比較して、死受容体のＤＲ４およびＤＲ５との親和性が上昇したことを示す。
【００７７】
特に好ましくは、改変された配列を有するｈＴＲＡＩＬフラグメントのホモログは、死受容体ＤＲ４と比較して、死受容体ＤＲ５の親和性が上昇、すなわちＤＲ５／ＤＲ４選択性が上昇したことを示す。
【００７８】
また好ましくは、改変された配列を有するｈＴＲＡＩＬフラグメントのホモログは、死受容体ＤＲ１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ３）および／またはＤＲ２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ４）に対する親和性に関連して、該受容体ＤＲ４および／またはＤＲ５に対する選択性が上昇したことも示す。
【００７９】
死受容体のＤＲ４およびＤＲ５対する親和性ならびに／または選択性の上昇をもたらすｈＴＲＡＩＬの改変は、例えば刊行物、Tur V, van der Sloot AM, Reis CR, Szegezdi E, Cool RH, Samali A, Serrano L, Quax WJ. DR4-selective tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) variants obtained by structure-based design. J. Biol. Chem. 2008 Jul 18;283(29):20560-8（Ｄ２１８Ｈ突然変異が、ＤＲ４に対する選択性を上昇することを記載する）、または、Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP.Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis.2009 Jun;14(6):778-87（Ｄ２６９Ｈ突然変異が、ＤＲ４に対する親和性を低減することを記載する）から、当業者に知られている。ＤＲ１およびＤＲ２の受容体と比較した、ＤＲ４およびＤＲ５から選択された１つの受容体に対しての親和性の上昇、および該受容体ＤＲ４と比較したＤＲ５の親和性の上昇をもたらすｈＴＲＡＩＬ突然変異体は、WO2009077857およびWO2009066174の中でもまた記載されている。
【００８０】
好適な突然変異は、ネイティブなｈＴＲＡＬの位置における１３１、１４９、１５９、１９３、１９９、２０１、２０４、２０４、２１２、２１５、２１８および２５１からなる群から選択される１つまたは２つ以上の突然変異であり、特に、突然変異は、リジン、ヒスチジンもしくはアルギニンなどの塩基性アミノ酸、またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸などのアミノ酸の置換を含む。特に、WO2009066174に記載のとおり、Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１３１Ｋ、Ｒ１４９Ｉ、Ｒ１４９Ｍ、Ｒ１４９Ｎ、Ｒ１４９Ｋ、Ｓ１５９Ｒ、Ｑ１９３Ｈ、Ｑ１９３Ｋ、Ｎ１９９Ｈ、Ｎ１９９Ｒ、Ｋ２０１Ｈ、Ｋ２０１Ｒ、Ｋ２０４Ｅ、Ｋ２０４Ｄ、Ｋ２０４Ｌ、Ｋ２０４Ｙ、Ｋ２１２Ｒ、Ｓ２１５Ｅ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｋ、Ｓ２１５Ｄ、Ｄ２１８Ｙ、Ｄ２１８Ｈ、Ｋ２５１Ｄ、Ｋ２５１ＥおよびＫ２５１Ｑからなる群から選択される１つまたは２つ以上の突然変異を特定することができる。
【００８１】
好適な突然変異はまた、１９５、２６９および２１４からなる群から選択されるネイティブなｈＴＲＡＩＬの位置における１つまたは２つ以上の突然変異でもあり、特に突然変異は、リジン、ヒスチジンまたはアルギニンなどの塩基性アミノ酸のアミノ酸置換を含む。特に、WO2009077857に記載のとおり、Ｄ２６９Ｈ、Ｅ１９５ＲおよびＴ２１４Ｒからなる群から選択される、１つまたは２つ以上の突然変異を特定することができる。
【００８２】
具体的な態様において、ｈＴＲＡＩＬのフラグメントのホモログであるドメイン（ａ）は、WO2009066174に記載のような、ネイティブなＴＲＡＩＬ配列のＤ２１８Ｈ突然変異体、または、Gasparian ME et al. Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis. 2009 Jun; 14(6): 778-87に記載のような、ネイティブなＴＲＡＩＬ配列のＹ１８９Ｎ−Ｒ１９１Ｋ−Ｑ１９３Ｒ−Ｈ２６４Ｒ−Ｉ２６６Ｒ−Ｄ２６９Ｈ突然変異体から選択される。
【００８３】
本発明に従って、融合タンパク質は、エフェクターペプチドとして抗増殖性ペプチドを含み、それは、腫瘍細胞に対する抗増殖性活性、すなわち腫瘍細胞増殖に対する阻害効果を有する。
【００８４】
「腫瘍細胞増殖」が、腫瘍細胞周期における細胞分裂と成長とのステップに関するものであり、エフェクターペプチドが、腫瘍細胞の成長それ自体に対して抗増殖性活性を有することは理解されるべきである。
【００８５】
したがって、「腫瘍細胞増殖」の阻害効果は、血管新生のステップとしての内皮細胞増殖の阻害は包含しない。したがって、抗血管新生活性、すなわち内皮細胞の成長阻害活性を有するエフェクターペプチドは、本発明に従うエフェクターペプチドの範囲から除かれる。
【００８６】
具体的には、カルレティキュリン、タムスタチン１８３−２３０、キニノーゲンＤ５、バソスタチン、キニノスタチン(kininostatin)、エンドスタチンおよびカンスタチン(canstatin)からなる群から選択されるエフェクターペプチドは、本発明には包含されない。
【００８７】
本発明によると、エフェクターペプチドは、例えば以下の群から選択されるような様々な方法で腫瘍細胞に対してその抗増殖性効果を発揮することができる：
【００８８】
―  例えばＦＧＦ−２受容体（ｂＦＧＦ受容体、ＦＧＦ２受容体もしくはＦＧＦ−β受容体としても知られている塩基性線維芽細胞成長因子２受容体）またはＤＡＢ２タンパク質に由来するＤＤ２ペプチドをブロックすることによる、ＭＡＰＫキナーゼ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）伝達経路の抑制；
【００８９】
―  例えばヒトフェトプロテインまたはそのフラグメントによる、エストラジオール依存性細胞の成長の阻害；
【００９０】
―  サイクリンＤ１−ＣＤＫ４（サイクリン依存性キナーゼ４）複合体の阻害によるように、Ｇ１期で細胞周期を止めること；
【００９１】
―  Mycoplasma argininiからのアルギニンデイミナーゼによるような、アルギニンの酵素的分解；
【００９２】
―  ＣＤＫ４／５／６キナーゼ（サイクリン依存性キナーゼ）の阻害、またはＥＲＫキナーゼ（細胞外シグナル制御キナーゼ）活性化の阻害、またはＡｋｔキナーゼ（プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）、セリン／トレオニン特異的タンパク質キナーゼとしても知られる）共活性化の阻害などの、細胞周期キナーゼの阻害；
【００９３】
―  転写因子Ｅ２Ｆ（高等真核生物の転写因子（ＴＦ））とＤＰタンパク質（転写因子ＤＰ、Ｅ２Ｆの二量化パートナーとしても知られる）との結び付きの阻害；
【００９４】
―  チューブリン繊維の結び付き／重合の阻害；
―  テロメラーゼ活性の阻害；
【００９５】
―  ＲａｓＧＡＰ（GTPase-activator protein for Ras-like GTPases）−Ａｕｒｏｒａ  Ｂキナーゼ相互作用またはヒスチジンキナーゼ活性化の阻害；および
―  細胞膜を介してイオンバランスを崩すこと。
【００９６】
本発明の一態様において、ドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドは、ＭＡＰＫキナーゼ伝達経路を抑制することができるペプチドであってもよい。例としては、ＦＧＦ−２受容体の遮断に関与し、その結果、腫瘍成長が阻害されるＦＧＦ−２受容体の結合ドメインのアナログである。具体的に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表の配列番号２６で示される１６アミノ酸ペプチドであり得る。
【００９７】
本発明のこの態様の他のエフェクターペプチドは、ＤＯＣ−２／ＤＡＢ２タンパク質のフラグメントであり得る。具体的に、かかるエフェクターペプチドは、１８アミノ酸ペプチドＤＤ２―添付の配列表の配列番号３０で示されるＤＯＣ−２／ＤＡＢ２のカルボキシ末端上に存在するプロリンリッチドメインであり、それは、ＭＡＰＫキナーゼのそれぞれの部分要素（ｃ−Ｓｒｃ、Ｇｒｂ２）の多くに結合することによって、ＭＡＰＫキナーゼの伝達経路の抑制に加担する。
【００９８】
本発明の他の態様において、ドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドは、エストラジオール依存性細胞の成長を阻害することができるペプチド、例えばヒトフェトプロテインまたはそのフラグメントであってもよい。具体的に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表の配列番号２７で示されるヒトアルファ−フェトプロテインの３４アミノ酸フラグメントであり得る。この態様の他のエフェクターペプチドは、ヒトアルファ−フェトプロテインの８アミノ酸フラグメントであり得、添付の配列表の配列番号２８で示され、配列番号２７のＣ末端フラグメントに局在する。
【００９９】
本発明の他の態様において、ドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドは、サイクリンＤ１−ＣＤＫ４複合体の阻害によるように、細胞周期をＧ１期で止めることができるペプチドであってもよい。具体的に、かかるエフェクターペプチドは、トロイの(trojan)ｐ１６ペプチドまたはそのフラグメントであり得、キナーゼのＣＤＫ４およびＣＤＫ６の活性を阻害する。具体的に、かかるエフェクターペプチド―ｐ１６ＩＮＫ４Ａ遺伝子産物のフラグメント―は、添付の配列表の配列番号３２で示される。かかるエフェクターペプチドはまた、トロイのｐ１６ペプチドの他のフラグメント―添付の配列表の配列番号３３で示される、アンテナペディアの１７アミノ酸輸送ドメインと融合したｐ１６ＩＮＫ４Ａ遺伝子産物のフラグメント（Derossi D, AH Joliot, G Chassaings, A Prochiantz, J Biol Chem. 269:10444-10450,1994）でもあり得る。
【０１００】
本発明の他の態様において、ドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドは、Mycoplasma argininiからのアルギニンデイミナーゼによるように、アルギニンを酵素的に分解することができるペプチドであってもよい。具体的に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表の配列番号３１で示される。
【０１０１】
本発明の他の態様において、ドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドは、ＣＤＫ４／５インヒビターなどの、細胞周期キナーゼを阻害することができるペプチドであってもよい。具体的に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表の配列番号２９で示されるｐ２１ＷＡＦ１タンパク質の２０アミノ酸フラグメントなどの、ｐ２１ＷＡＦ１タンパク質のフラグメントであり得る。
【０１０２】
この態様の他のエフェクターペプチドは、ペプチド―ＥＲＫ活性化のインヒビターであり得る。具体的に、かかるエフェクターペプチドは、添付の配列表の配列番号３４で示されるような、ＭＥＫ−１タンパク質のフラグメントであり得る。
【０１０３】
この態様の他のエフェクターペプチドは、ペプチド―Ａｋｔキナーゼのコアクチベーターであり得る。具体的に、かかるエフェクターペプチド―ＴＣＬ１タンパク質のＰＨドメインのＮ末端フラグメント―添付の配列表の配列番号３５で示される。
【０１０４】
本発明の他の態様において、ドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドは、転写因子Ｅ２ＦとＤＰタンパク質との結び付きを阻害することができるペプチドであってもよい。具体的に、かかるエフェクターペプチド―ヘキサペプチドＰｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ―は、添付の配列表の配列番号３６で示される。ドメイン（ｂ）の他のエフェクターペプチドは、ＦＧＦ−２結合ドメインのアナログであるペプチドであり得る。具体的に、かかるエフェクターペプチド―ＦＧＦ−２受容体をブロックする８アミノ酸ペプチド―は、添付の配列表の配列番号４１で示される。
【０１０５】
本発明の他の態様において、ドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドは、チューブリン繊維の結び付き／重合を阻害することができるペプチドであってもよい。かかるエフェクターペプチドは、ヘテロ二量体構造の形成に関与するチューブリンのフラグメントであり得、チューブリン繊維の重合の阻害に寄与する。具体的に、かかるエフェクターペプチド―チューブリンの１３アミノ酸フラグメント―は、添付の配列表の配列番号３７で示され、他のエフェクターペプチド―チューブリンの１０アミノ酸フラグメント―は、添付の配列表の配列番号３８で示される。
【０１０６】
本発明の他の態様において、ドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドは、テロメラーゼ活性を阻害することができるペプチドであってもよい。かかるエフェクターペプチドは、テロメラーゼ活性の阻害に関与するハチデフェンシンの配列に基づくペプチドであり得る。具体的に、かかるエフェクターペプチド―ハチデフェンシンの配列に基づく６アミノ酸Ｃ２ペプチド―は、添付の配列表の配列番号４０で示される。この態様の他のエフェクターペプチドは、ハチ毒に存在するラシオグロッシンというペプチドであり得る。具体的に、かかるエフェクターペプチド―ラシオグロッシンＬＬ−２―は、添付の配列表の配列番号４２で示される。
【０１０７】
本発明の他の態様において、ドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドは、ＲａｓＧＡＰ−Ａｕｒｏｒａ  Ｂ相互作用またはヒスチジンキナーゼ活性化を阻害することができるペプチドであってもよい。具体的に、かかるエフェクターペプチド―ＲａｓＧＡＰのＳＨ３ドメインに結合する１３アミノ酸ペプチド―は、添付の配列表の配列番号４３で示される。この態様の他のエフェクターペプチドは、細胞受容体に結合した後、ヒスチジンキナーゼリン酸化を引き起こし、次にエフェクター因子ＶｎｃＲの脱リン酸化をもたらすペプチドであり得る。具体的に、かかるエフェクターペプチド―Ｐｅｐ２７ペプチドのアナログ―は、添付の配列表の配列番号４４で示される。
【０１０８】
本発明の他の態様において、ドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドは、細胞膜を介するイオンバランスを崩すことができるペプチドであってもよい。具体的に、かかるエフェクターペプチド―メリチン―は、添付の配列表の配列番号３９で示される。
【０１０９】
本発明の融合タンパク質の特定の態様において、エフェクターペプチドは、以下からなる群から選択される：
【０１１０】
―  配列番号２６（ＦＧＦ−２受容体をブロックする１６アミノ酸ペプチド）、
―  配列番号２７（アルファ−フェトプロテインのフラグメント）、
―  配列番号２８（アルファ−フェトプロテインのＣ末端フラグメント）、
―  配列番号２９（ｐ２１ＷＡＦ１タンパク質のフラグメント）、
―  配列番号３０（ＤＡＣ−２／ＤＡＢ−２タンパク質からのＤＤ２タンパク質）、
―  配列番号３１（アルギニンデイミナーゼ）、
―  配列番号３２（ｐ１６ペプチドのフラグメント）、
―  配列番号３３（アンテナペディアの１７アミノ酸輸送ドメインと融合されたｐ１６ペプチドのフラグメント）、
―  配列番号３４（ＭＥＫ−１のフラグメント）、
―  配列番号３５（ＴＣＬ１タンパク質のＰＨドメインのフラグメント）、
―  配列番号３６（Ｅ２Ｆのヘキサペプチドインヒビター）、
―  配列番号３７（チューブリン重合のインヒビター）、
―  配列番号３８（チューブリン重合のインヒビター）、
―  配列番号３９（メリチン）、
―  配列番号４０（合成のＣ２テロメラーゼインヒビター）、
―  配列番号４１（ＦＧＦ−２Ｒとの相互作用の８アミノ酸インヒビター）、
―  配列番号４２（ラシオグロッシンＬＬ−２）、
―  配列番号４３（Ａｕｒｏｒａ  ＲＧ２７キナーゼのインヒビター）、および
―  配列番号４４（Ｐｅｐ２７のアナログ）。
【０１１１】
がん細胞の表面に存在するＴＲＡＩＬ受容体と結合している状態で、融合タンパク質は、二重の効果を発揮するだろう。ＴＲＡＩＬの機能的フラグメントまたはその機能性を保持したホモログであるドメイン（ａ）は、その知られたアゴニスト活性、すなわち細胞表面上にある死受容体への結合およびアポトーシスの外因性経路の活性化、を発揮するであろう。融合タンパク質のドメイン（ｂ）のエフェクターペプチドは、腫瘍細胞の増殖を阻害することによるＴＲＡＩＬドメインの活性と並行して、細胞内部にその作用を潜在的に発揮することができるであろう。
【０１１２】
融合タンパク質が、プロテアーゼに認識される切断配列を含む場合、エフェクターペプチドは、予め、腫瘍環境で過剰発現されるメタロプロテイナーゼまたはウロキナーゼによりＴＲＡＩＬのフラグメントから切断されるであろう。
【０１１３】
本発明の融合タンパク質において、ＴＲＡＩＬの抗腫瘍効果は、細胞の増殖に影響を及ぼす他の要素の活性化、例えば、エストラジオール依存性細胞の成長の阻害、サイクリンＤ１−ＣＤＫ４複合体の阻害、ＭＡＰＫキナーゼ伝達経路の抑制、アルギニンの酵素的分解、ＣＤＫ４／５／６キナーゼ阻害、ＥＲＫキナーゼ活性化の阻害、Ａｋｔキナーゼ共活性化の阻害、転写因子Ｅ２ＦとＤＰタンパク質との結び付きの阻害、チューブリン繊維結び付きの阻害、テロメラーゼ活性の阻害、ＲａｓＧＡＰ−Ａｕｒｏｒａ  Ｂの相互作用またはヒスチジンキナーゼ活性化の阻害などにより、潜在的に増強されたであろう。
【０１１４】
本発明の態様の１つにおいて、ドメイン（ａ）およびドメイン（ｂ）は、細胞環境、特に腫瘍細胞環境に存在するプロテアーゼに認識される切断部位の配列を含む、少なくとも１つのドメイン（ｃ）によって繋がっている。少なくとも１つのドメイン（ｃ）によるドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）との繋がりは、ドメイン（ａ）とドメイン（ｂ）との間に、１つ以上のドメイン（ｃ）、具体的には１つまたは２つのドメイン（ｃ）が存在してもよいことを意味する。
【０１１５】
プロテアーゼ切断部位は、以下から選択することができる：
―  メタロプロテアーゼＭＭＰに認識される配列、具体的には、配列番号４５に指定される（Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ／ＰＬＧＬＡＧＥＰ）、または、（Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ／ＰＬＧＩＡＧＥ）、または、（Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ／ＰＬＧＬＡＧＥＰ）；
【０１１６】
―  ウロキナーゼｕＰＡに認識される配列、具体的には、配列番号４６に指定されるＡｒｇ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ａｒｇ（ＲＶＶＲ）またはそのフラグメント、ここで、付着しているその配列の最後のアミノ酸とともに配列番号４６を形成する、
および、それらの組み合わせ。
【０１１７】
本発明の態様の１つにおいて、プロテアーゼ切断部位は、任意の順序で互いに隣り合わせに位置する、メタロプロテアーゼＭＭＰに認識される配列とウロキナーゼｕＰＡに認識される配列との組み合わせである。
【０１１８】
一態様において、ドメイン（ｃ）は、配列番号４５／配列番号４６などのＭＭＰ／ｕＰＡの組み合わせ、または、配列番号４６／配列番号４５などのｕＰＡ／ＭＭＰの組み合わせである。
【０１１９】
プロテアーゼであるメタロプロテアーゼＭＭＰおよびウロキナーゼｕＰＡは、腫瘍環境において過剰発現される。プロテアーゼに認識される配列の存在は、ドメイン（ｂ）からドメイン（ａ）の切断、すなわちエフェクタードメイン（ｂ）の放出、ひいてはその活性化を可能にする。
【０１２０】
プロテアーゼ切断部位の存在は、エフェクターペプチドの即座の放出を可能にすることによって、細胞中に存在するプロテアーゼによる融合タンパク質の無作為分解が起こる前に、ペプチドをその作用場所へ輸送する機会を増やす。
【０１２１】
加えて、輸送ドメイン（ｄ）は、本発明の融合タンパク質のエフェクターペプチドのドメイン（ｂ）に付着してもよい。
【０１２２】
ドメイン（ｄ）は、例えば、以下からなる群から選択されてもよい：
（ｄ１）６、７、８、９、１０または１１個のＡｒｇ残基からなり、細胞膜を介して輸送する、ポリアルギニン配列、
【０１２３】
（ｄ２）細胞膜を介して輸送するドメインとしての、アンテナペディアタンパク質ドメインのフラグメント（配列番号４８）、
【０１２４】
（ｄ３）細胞膜を介して輸送するドメインとしての、アンテナペディアタンパク質ドメインの他のフラグメント（配列番号４９）、
および、それらの組み合わせ。
【０１２５】
ドメイン（ｄ１）、（ｄ２）および（ｄ３）の組み合わせは、特に、（ｄ１）／（ｄ２）、（ｄ１）／（ｄ３）または（ｄ１）／（ｄ２）／（ｄ３）の組み合わせを含んでもよい。
【０１２６】
さらに、ドメイン（ｄ１）、（ｄ２）および（ｄ３）の組み合わせは、互いに隣り合って位置し、かつドメイン（ｂ）の一端に連結されたドメイン、および／または、ドメイン（ｂ）の異なる末端に繋がったドメインを含んでもよい。
【０１２７】
融合タンパク質がドメイン（ｂ）に付着された輸送ドメイン（ｄ）およびドメイン（ａ）と（ｂ）との間の切断部位のドメイン（ｃ）の両方を有する場合、ドメイン（ｃ）は、その構築物の切断後も輸送ドメイン（ｄ）がドメイン（ｂ）に付着されたままであるように位置することは理解されるべきである。換言すると、融合タンパク質が輸送ドメイン（ｄ）と切断部位のドメイン（ｃ）との両方を有する場合、ドメイン（ｄ）は、ドメイン（ｂ）とドメイン（ｃ）との間に位置するか、または、ドメイン（ｄ）の付着場所とは反対のドメイン（ｂ）の末端に位置する。
【０１２８】
本発明は、ドメイン（ｄ）がドメイン（ｃ）とドメイン（ａ）との間に位置するかかるバリアントを含まない。それは、その構築物の切断後も、輸送ドメインがＴＲＡＩＬドメインに付着したままである場合である。
【０１２９】
アンテナペディアタンパク質ドメインのフラグメント（配列番号４８）を構成する移行ドメインは、アンテナペディアタンパク質ドメインの他のフラグメント（配列番号４９）と同様に、細胞膜を介して移行することができ（Derossi D, AH Joliot, G Chassaings, A Prochiantz, J Biol Chem. 269:10444-10450 (1994)）、腫瘍細胞コンパートメントにエフェクターペプチドを導入するために使用することができる。
【０１３０】
細胞膜を介して輸送する配列（ｄ１）は、いくつかのアルギニン残基からなり、標的細胞の細胞質に細胞膜を介してエフェクターペプチドを移行する、当該技術分野において知られている任意の配列であってもよい（D., Hea, H., Yangb, Q., Lina, H., Huang, Arg9-peptide facilitates the internalization of an anti-CEA immunotoxin and potentiates its specific cytotoxicity to target cells, The international Journal of Biochemistry & Cell Biology 37 (2005) 192-205; Shiroh Futaki et al JBC, Vol. 276, No. 8, Issue of February 23, pp. 5836-5840, 2001）。
【０１３１】
他の有用な細胞透過性ペプチドは、F. Said Hassane et al Cell. Mol. Life Sci. DOI 10.1007/s00018-009-0186-0に記載されている。
【０１３２】
融合タンパク質の主な機能的要素および切断部位ドメインはさておき、本発明の融合タンパク質は、グリシン−システイン−アラニンのフレキシブルステリックリンカー（スペーサー）の天然の配列（単数または複数）を含んでもよい。かかるリンカー／スペーサーは良く知られており、文献に記載されている。融合タンパク質の配列へのそれらの組み込みは、宿主細胞におけるその過剰発現のプロセスによって産生されるタンパク質の正確な折り畳み(folding)を提供することを目的としている。
【０１３３】
具体的に、フレキシブルステリックリンカーは、システイン残基とアラニン残基との組み合わせである配列番号４７であってもよい。他の態様において、フレキシブルステリックリンカーは、例えば、フラグメントＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ／ＧＧＧＳＧ、または、ステリックリンカーとして作用するその任意のフラグメント（例えばＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ／ＧＧＧ）など、グリシン残基とセリン残基との組み合わせであってもよい。
【０１３４】
他の態様において、フレキシブルステリックリンカーは、配列番号４７からなるリンカーと、例えばフラグメントＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ／ＧＧＧＳＧまたはステリックリンカーとして作用するその任意のフラグメント（例えばフラグメントＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ／ＧＧＧ）などの、グリシン残基とセリン残基とからなるリンカーとの任意の組み合わせであってもよい。かかる場合、ステリックリンカーは、例えばＣｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ／ＣＡＡＣＡＡＡＣＧＧＧなどの、グリシン残基、システイン残基およびアラニン残基の組み合わせであってもよい。
【０１３５】
他の態様において、フレキシブルステリックリンカーは、配列Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ／ＧＧＧＣＡＡＡＣＡＡＣＧＳＧ（配列番号７７）またはその任意の組み合わせであってもよい。
【０１３６】
一態様において、フレキシブルステリックリンカーはまた、システイン残基のみなど、単一のアミノ酸残基からも選択されてもよい。
【０１３７】
本発明の具体的な態様は、抗増殖性エフェクターペプチドとして、配列番号２７で表されるヒトフェトプロテインの３４アミノ酸フラグメントを含む、配列番号１、配列番号４、配列番号５および配列番号６で表されるタンパク質からなる群から選択される融合タンパク質である。
【０１３８】
本発明の他の具体的態様は、抗増殖性エフェクターペプチドとして、配列番号２８で表されるヒトフェトプロテインの８アミノ酸フラグメントを含む、配列番号２、配列番号３および配列番号７で表されるタンパク質からなる群から選択される融合タンパク質である。
【０１３９】
本発明の他の具体的態様は、エフェクターペプチドとして、配列番号２９で表されるｐ２１ＷＡＦに由来するペプチドを含む、配列番号８および配列番号９で表されるタンパク質からなる群から選択される融合タンパク質である。
【０１４０】
本発明の他の具体的態様は、エフェクターペプチドとして、配列番号２６で表されるＦＧＦ−２受容体に結合するドメインの１６アミノ酸アナログを含む、配列番号１０で表される融合タンパク質である。
【０１４１】
本発明の他の具体的態様は、エフェクターペプチドとして、配列番号３０で表されるＤＯＣ−２／ＤＡＢ２からのＤＤ２を含む、配列番号１１で表される融合タンパク質である。
【０１４２】
本発明の他の具体的態様は、エフェクターペプチドとして、配列番号３１で表されるMycoplasma argininiからのアルギニンデイミナーゼを含む、配列番号１２で表される融合タンパク質である。
【０１４３】
本発明の他の具体的態様は、エフェクターペプチドとして、配列番号３２で表されるｐ１６ペプチドのフラグメントを含む、配列番号１３で表される融合タンパク質である。
【０１４４】
本発明の他の具体的態様は、エフェクターペプチドとして、配列番号３３で表されるアンテナペディアの１７アミノ酸の輸送ドメインと融合したｐ１６ペプチドのフラグメントを含む、配列番号１３で表される融合タンパク質である。
【０１４５】
本発明の他の具体的態様は、エフェクターペプチドとして、配列番号３４で表されるＭＥＫ−１タンパク質のフラグメントを含む、配列番号１４で表される融合タンパク質である。
【０１４６】
本発明の他の具体的態様は、エフェクターペプチドとして、配列番号３５で表されるＴＣＬ１タンパク質のＰＨドメインのＮ末端フラグメントを含む、配列番号１５で表される融合タンパク質である。
【０１４７】
本発明の他の具体的態様は、エフェクターペプチドとして、配列番号３６で表されるヘキサペプチドＰｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒを含む、配列番号１６で表される融合タンパク質である。
【０１４８】
本発明の他の具体的態様は、エフェクターペプチドとして、配列番号３７で表されるチューブリンの１３アミノ酸フラグメントを含む、配列番号１７で表される融合タンパク質である。
【０１４９】
本発明の他の具体的態様は、エフェクターペプチドとして、配列番号３８で表されるチューブリンの１０アミノ酸フラグメントを含む、配列番号１８で表される融合タンパク質である。
【０１５０】
本発明の他の具体的態様は、エフェクターペプチドとして、配列番号３８で表されるメリチンを含む、配列番号１９で表される融合タンパク質である。
【０１５１】
本発明の他の具体的態様は、エフェクターペプチドとして、配列番号４０で表されるハチデフェンシンの配列に基づく６アミノ酸ペプチドＣ２を含む、配列番号２０で表される融合タンパク質である。
【０１５２】
本発明の他の具体的態様は、エフェクターペプチドとして、配列番号４１で表されるＦＧＦ−２リガンドに結合する８アミノ酸ペプチドを含む、配列番号２１で表される融合タンパク質である。
【０１５３】
本発明の他の具体的態様は、エフェクターペプチドとして、配列番号４２で表される１５アミノ酸ペプチドであるラシオグロッシンＬＬ２を含む、配列番号２２で表される融合タンパク質である。
【０１５４】
本発明の他の具体的態様は、エフェクターペプチドとして、配列番号４３で表されるＲａｓＧＡＰのＳＨ３ドメインに結合する１３アミノ酸ペプチドを含む、配列番号２３で表される融合タンパク質である。
【０１５５】
本発明の他の具体的態様は、エフェクターペプチドとして、配列番号４４で表されるＰｅｐ２７ペプチドのアナログを含む、配列番号２５で表される融合タンパク質である。
【０１５６】
前述の代表的な融合タンパク質の構造の詳細な説明は、図１〜５および以下の例において示される。
【０１５７】
本発明によると、融合タンパク質とは、２つもしくは３つ以上のタンパク質またはそのフラグメントを含む単一のタンパク質分子が、化学的リンカーを追加せずに、それら各ペプチド鎖内のペプチド結合を介して共有結合されることを意味する。
【０１５８】
融合タンパク質はまた、代わりに、タンパク質構築物またはキメラタンパク質としても記載することができる。本発明によると、「構築物」または「キメラタンパク質」という用語は、使用される場合、上で定義された融合タンパク質を指すものとして理解されるべきである。
【０１５９】
当業者にとって、このように定義された融合タンパク質が、ペプチドおよびタンパク質の化学合成の既知の方法によって合成され得ることは明らかであろう。
【０１６０】
融合タンパク質は、化学的ペプチド合成の方法、特に、好適な樹脂を担体として使用する固相におけるペプチド合成の技術を使用して、合成することができる。かかる技術は、従来型であり、当技術分野において知られ、とりわけ、例えばBodanszky and Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer- Verlag, New York, Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Companyのような研究論文に記載されている。
【０１６１】
融合タンパク質は、ペプチドの化学合成の方法により、連続したタンパク質として合成することができる。あるいは、タンパク質の個々のフラグメント（ドメイン）を別々に合成し、次に、一方のペプチドフラグメントのアミノ末端を、もう一方のペプチドのカルボキシル末端から縮合させることによって、ペプチド結合を介して１つの連続したペプチドに化学結合させてもよい。かかる技術は従来周知である。
【０１６２】
結果として生じたペプチドの構造を検証するために、ペプチドの分子量を決定するための高分解能質量分析技術などの、ペプチドのアミノ酸組成を分析する、既知の方法を使用してもよい。ペプチド配列を確認するために、ペプチドを連続的に分解してアミノ酸の配列を同定するタンパク質シーケンサーもまた使用することができる。
【０１６３】
しかしながら、好ましくは、本発明の融合タンパク質は、宿主細胞において融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の遺伝子発現の方法によって生成された、組み換えタンパク質である。
【０１６４】
本発明のさらなる側面は、ポリヌクレオチド配列、特に、上で定義された融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列である。
【０１６５】
好ましくは、ポリヌクレオチド配列、特に、本発明に従う、上で定義された融合タンパク質をコードするＤＮＡは、E. coliにおける発現に最適化された配列である。
【０１６６】
本発明の他の側面はまた、ポリヌクレオチド配列、特に上で定義された本発明のＤＮＡ配列を含む発現ベクターでもある。
【０１６７】
本発明の他の側面はまた、上で定義された発現ベクターを含む宿主細胞でもある。
【０１６８】
本発明の融合タンパク質の発現にとって好ましい宿主細胞は、E. coli細胞である。
【０１６９】
融合タンパク質を含む、組み換えタンパク質の生成のための方法は、周知である。簡潔には、この技術は、ポリヌクレオチド分子、例えば標的タンパク質のアミノ酸配列をコードし、宿主における標的タンパク質の発現に向かわせるＤＮＡ分子、の生成にある。ポリヌクレオチド分子をコードする標的タンパク質を、次に、該ポリペプチドの有効な発現を確保する適切な発現ベクターに取り込む。次に、組み換え発現ベクターを、形質移入／形質転換用の宿主細胞に導入し、結果として、形質転換された宿主細胞が産生される。この後に標的タンパク質を過剰発現させるために形質転換した細胞を培養し、得られたタンパク質を精製し、タンパク質の発現または精製に使用されたタグ配列を切断により任意に切り取る。
【０１７０】
発現と精製とに好適な技術は、例えば、研究論文Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), and A. Staron et al., Advances Mikrobiol., 2008, 47, 2, 1983-1995に記載されている。
【０１７１】
コスミド、プラスミドまたは改変されたウイルスは、宿主細胞におけるＤＮＡ配列の導入および複製のための発現ベクターとして使用することができる。典型的には、プラスミドが、発現ベクターとして使用される。好適なプラスミドは周知であり、市販されている。
【０１７２】
本発明の発現ベクターは、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子、および、好適な宿主細胞に取り込まれた該コード配列の転写と翻訳とに必要な調節配列を含む。調節配列の選択は、宿主細胞のタイプに依存し、当業者によって容易に実施することができる。かかる調節配列の例は、転写のプロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列であり、コード配列の前に挿入される転写開始シグナル、およびコード配列の後に挿入される転写終結配列を含む。また、使用する宿主細胞およびベクターに依るが、複製起点、追加のＤＮＡ制限部位、エンハンサーおよび転写の誘導を可能にする配列などの他の配列を発現ベクターに導入してもよい。
【０１７３】
発現ベクターはまた、マーカー遺伝子配列も含むことができ、それは、形質転換細胞に明確な表現型を与え、形質転換細胞の特異的な選択を可能にする。さらに、該ベクターはまた、挿入された標的タンパク質のコード配列を含む組み換えプラスミドにより形質転換された細胞と、挿入のないプラスミドを取り込んだ細胞を区別すること可能にする、第２のマーカー配列も含んでもよい。ほとんどの場合、典型的な抗生物質抵抗性マーカーを使用するが、当該分野で知られている任意の他のレポーター遺伝子を使用してもよく、細胞の中のその存在(in vivo)によって、オートラジオグラフィー技術、分光光度法または生物発光および化学発光を使用して容易に判定することができる。例えば、宿主細胞に依るが、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子を使用してもよい。
【０１７４】
さらに、発現ベクターは、適切な細胞区画、例えば折り畳みが促進される周辺質、にタンパク質を輸送するシグナル配列を含んでもよい。加えて、Ｎ末端に付着されるＨｉｓＴａｇまたはＣ末端に付着されるＧＳＴなどのラベル／タグをコードする配列が存在してもよく、それは、続く、ニッケルカラムでの親和性クロマトグラフィーによる、親和性の原理を使用して産生されるタンパク質の精製を促進する。その溶解性を増大させる配列だけでなく、宿主細胞におけるタンパク質分解からタンパク質を保護する追加の配列もまた、存在してもよい。
【０１７５】
標的タンパク質の配列に付着された補助的な要素は、その活性をブロックするか、または、例えば毒性などにより、別の理由で有害となり得る。かかる要素は除去されなければならず、酵素的または化学的な切断によって達成され得る。具体的には、６−ヒスチジンタグのＨｉｓＴａｇまたは親和性クロマトグラフィーによるタンパク質精製を可能にするために付着されたこのタイプの他のマーカーは、可溶性ＴＲＡＩＬタンパク質の肝毒性に対して記載されたその効果のために、除去されるべきである。原核細胞：Escherichia coliまたはBacillus subtilisなどの細菌性細胞、Saccharomyces cervisiaeまたはPichia pastorisなどの酵母、および真核細胞株（昆虫、哺乳動物、植物）を含む、様々な周知の宿主細胞に基づく異種発現系を使用してよい。
【０１７６】
好ましくは、培養および遺伝子操作が容易であることと、得られる産生物が大量であることとのために、E. coli発現系がを使用する。したがって、本発明の融合タンパク質をコードする標的配列を含むポリヌクレオチド配列は、E. coliにおける発現に最適化されるであろう。すなわち、それは、コード配列の中に、先端技術において知られている配列の可能な変異体から選択される、E. coliにおける発現に最適なコドンを含むであろう。さらに、発現ベクターは、コード配列に付着された、E. coliに好適な前記要素を含むであろう。
【０１７７】
したがって、本発明の好ましい態様において、本発明の融合タンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチド配列は、E. coliにおける発現に最適化され、以下からなるポリヌクレオチド配列の群から選択される： 
【０１７８】
配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０および配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４ならびに配列番号７６。
【０１７９】
これらはそれぞれ、以下のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードする：
【０１８０】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５および配列番号７５。
【０１８１】
好ましい態様において、本発明はまた、発現ベクターなどで形質転換されたE. coli細胞だけでなく、上で示された配列番号５０から配列番号７４および配列番号７６のポリヌクレオチド配列の群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、E. coliの形質転換に好適な発現ベクターも提供する。
【０１８２】
形質転換、すなわち細菌性宿主細胞、具体的にはE. coliへのＤＮＡ配列の導入は、例えば、低温（４℃）でのカルシウムイオンによる処置の後、熱ショック（３７−４２℃で）に供するか、または電気穿孔によって、ＤＮＡを取り込ませるよう調製されたコンピテント細胞に対して通常実施される。かかる技術は周知であり、通常、発現系の製造業者によって決定されるか、またはManiatis et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, N.Y., 1982などの、文献および実験室での作業のためのマニュアルの中に記載されている。
【０１８３】
E. coli発現系における本発明の融合タンパク質の過剰発現の手順は、以下にさらに記載されるであろう。
【０１８４】
本発明はまた、活性成分としての、上で定義された本発明の融合タンパク質、ならびに好適な、薬学的に許容し得る担体、希釈剤および従来型の補助成分を含む医薬組成物も提供する。医薬組成物は、担体もしくは希釈剤の中に溶解されるか、または分散された、本発明の融合タンパク質と薬学的に許容し得る補助的な成分との有効量を含み、好ましくは、単位剤形で処方された医薬組成物、または、複数回の用量を含む処方物の形態であろう。他の成分、担体および希釈剤だけでなく、医薬品形態およびそれらの処方の方法も、当業者に知られており、文献に記載されている。例えば、それらは、研究論文Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. 20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, USAに記載されている。
【０１８５】
用語「薬学的に許容し得る担体、希釈剤および補助成分」は、当該技術分野で知られている、任意の溶媒、分散媒、界面活性剤、抗酸化剤、安定剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤を含む。本発明の医薬組成物は、経口、非経口、吸入、局所のための液状の、固形のおよびエアロゾルの形態などの、選択される投与経路および所望の剤形、ならびに、選択される形態が、注入によるように投与経路のために殺菌されたものである必要があるべきかどうかに依存して、様々なタイプの担体、希釈剤および賦形剤を含んでもよい。本発明に従い、医薬組成物の投与の好ましい経路は、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、腫瘍内などの注入経路を含む非経口であるか、または、単発または連続的な静脈内点滴による。
【０１８６】
一態様において、本発明の医薬組成物は、直接腫瘍に注入することによって投与してもよい。他の態様において、本発明の医薬組成物は、静脈内に投与してもよい。さらに他の態様において、本発明の医薬組成物は、皮下または腹腔内に投与することができる。非経口投与のための医薬組成物は、必要ならば、適切なｐＨに緩衝され、体液と等浸透圧の、薬学的に許容し得る水性または非水性培地における水溶液または分散液であってよく、抗酸化剤、緩衝剤、静菌性剤、および該組成物をレシピエントの組織または血液に適合させる可溶性物質もまた含んでもよい。当該組成物に含まれてもよい他の成分は、例えば、水、エタノールなどのアルコール、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなどのポリオール、トリグリセリド、植物油、リポソームなどの脂質である。妥当な流動性および該物質の粒子サイズは、レシチンなどのコーティング物質、ならびに、ヒドロキシプロピルセルロースポリソルベートおよび同類のものなどの界面活性剤により提供されてよい。
【０１８７】
液体非経口組成物に好適な等張化剤は、例えば、グルコースなどの糖および塩化ナトリウムならびにそれらの組み合わせである。
【０１８８】
あるいは、注入または点滴による投与のための医薬組成物は、例えば、パイロジェンフリー滅菌水などの好適な担体において、使用直前に再構成するための凍結乾燥粉末などの粉末形態であり得る。
【０１８９】
非経口投与のための本発明の医薬組成物はまた、溶液、スプレーまたはエアロゾルを含む経鼻投与の形態も有してもよい。好ましくは、鼻腔内投与のための形態は、水性溶液であり、鼻の分泌物と類似の特徴を維持するように、約５．５から約６．５までのｐＨに維持するために、等張であるか、または緩衝化されているであろう。さらに、それは、周知の鼻腔内用調製物におけるような保存剤または安定化剤を含むことができる。
【０１９０】
本組成物は、１種または２種以上の成分の酸化を遅らせる様々な抗酸化剤を含んでもよい。さらに、微生物の作用を防止するために、本組成物は、例えば非限定的に、パラベン類、クロロブタノール、チメロサール、ソルビン酸、およびこのタイプの類似の知られている物質を含む様々な抗菌剤および抗真菌剤を含んでもよい。一般に、本発明の医薬組成物は、例えば少なくとも約０．０１ｗｔ％の活性成分を含むことができる。より具体的に、本組成物は、活性成分を、本組成物単位の１重量％から７５重量％まで、または例えば２５重量％から６０重量％までの量において含んでもよいが、示された値に限定されるものではない。人間を含む患者に投与される本発明による組成物の用量の実際の量は、体重、病気の重篤度、処置される疾患のタイプ、先のまたは同時の治療的介入、患者および投与経路などの、物理的および生理学的な要因により決定することができる。好適な単位用量、全用量および本組成物中の活性成分の濃度は、処置する医師により決定されるべきである。
【０１９１】
本組成物は、例えば、患者の体重１ｋｇあたり約１マイクログラム〜約１０００ｍｇの用量において、例えば体重１ｋｇあたり５ｍｇ〜１００ｍｇの範囲において、または体重１ｋｇあたり５ｍｇ〜５００ｍｇの範囲において、投与してもよい。融合タンパク質およびそれを含む組成物は、抗がん性または抗腫瘍性を呈し、がん性疾患の処置のために使用することができる。本発明はまた、上で定義される本発明の融合タンパク質の、ヒトを含む哺乳動物におけるがん疾患を処置するための使用をも提供する。本発明はまた、ヒトを含む哺乳動物における新生物／がん疾患を処置する方法を提供し、該方法は、かかる処置を必要とする対象に、上で定義されたような本発明の融合タンパク質の、抗新生物／抗がんに有効な量を、任意に適切な医薬組成物の形態において、投与することを含む。
【０１９２】
本発明の融合タンパク質は、白血病、肉芽種症、ミエローマなどの血液悪性腫瘍および他の血液悪性腫瘍の処置のために使用することができる。融合タンパク質はまた、乳がん、非小細胞肺がんを含む肺がん、結腸がん、膵がん、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、腎臓がん、脳腫瘍および同類のものなどの固形腫瘍の処置のためにも使用されことができる。がんの処置における融合タンパク質の適切な投与経路は、具体的に、本発明の融合タンパク質を注入または点滴の形態において、この投与経路に適切な組成および形態において、投与することからなる、非経口経路である。本発明は、以下の基本手順および具体的な融合タンパク質の例において、より詳細に記載されるであろう。
【０１９３】
融合タンパク質の過剰発現のための基本手順
プラスミドの調製
標的融合タンパク質のアミノ酸配列を、それをコードし、かつEscherichia coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡ配列を生成するための鋳型として使用した。かかる手順により、Escherichia coliにおける標的タンパク質の合成のさらなるステップの効率を増大させることができる。その結果得られたヌクレオチド配列を、次いで、自動合成した。加えて、制限酵素ＮｄｅＩの切断部位（リーディング鎖の５’末端において）およびＸｈｏＩの切断部位（リーディング鎖の３’末端において）を、生じた標的タンパク質をコードする得られた該遺伝子に加えた。これらを、ベクターｐＥＴ２８ａ（Novagen）の中に該遺伝子をクローニングするために使用した。それらはまた、該タンパク質をコードする遺伝子を他のベクターにクローニングするためにも使用してもよい。この構築物から発現される標的タンパク質は、Ｎ末端において、トロンビンに認識される部位の手前に置かれ、続く親和性クロマトグラフィーによるその精製に役立つ、ポリヒスチジンタグ（６ヒスチジン）を任意に備え得る。いくつかの標的は、いかなるタグもなく、具体的にヒスチジンタグもなく、発現され、続いて、それらを、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅで精製した。得られた構築物の正確さを、先ず、酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを使用する単離プラスミドの制限分析により確認し、その後、標的タンパク質の全リーディングフレームを自動シークエンシングすることにより確認した。シークエンシングのために使用したプライマーは、ベクター中に存在するＴ７プロモーター（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’）およびＴ７ターミネーター（５’−ＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ−３’）の配列に相補的であった。得られたプラスミドを、製造業者の推奨に従って形質転換された市販のE. coli株において、標的融合タンパク質を過剰発現させるために使用した。選択培地（ＬＢ寒天、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、１％グルコース）上で得られたコロニーを、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）および１％グルコースが補充されたＬＢ液体培地中で終夜培養物を調製するために使用した。振盪培養器における約１５ｈの成長の後、その培養物を、適切な培養に植菌するために使用した。
【０１９４】
融合タンパク質の過剰発現および精製―基本手順Ａ
カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）および１００μＭの硫酸亜鉛を有するＬＢ培地に、終夜培養物を植菌した。その培養物を、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）が０．６０−０．８０に達するまで、３７℃でインキュベートした。その後、ＩＰＴＧを、０．２５−１ｍＭの範囲の最終濃度まで添加した。２５℃で振盪しながらのインキュベーション（３．５−２０ｈ）の後、培養物を２５ｍｉｎ、６，０００ｇで遠心分離した。細菌ペレットを、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾールを含むｐＨ７．４の緩衝液中で再懸濁した。懸濁液を、氷上で８分間超音波処理した（４０％の振幅、１５秒パルス、１０ｓのインターバル）。得られた抽出物を、４０分間、２００００ｇ、４℃における遠心分離により清澄化した。Ｎｉ−セファロース（GE Healthcare）樹脂を、緩衝液での平衡化により前処置し、これを、細菌性細胞抽出物の調製のために使用した。その樹脂を、次いで、抽出物の遠心分離後に得られた上清と共に４℃で終夜インキュベートした。その後、それをクロマトグラフィーカラム中にロードし、１５〜５０容積の緩衝液（５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４）で洗浄した。得られたタンパク質を、０．５ＭのＮａＣｌを有する５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．４）中のイミダゾール勾配を使用してカラムから溶出させた。得られた画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。適切な画分を組み合わせて、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのＬ−アルギニン、０．１ｍＭのＺｎＳＯ４、０．０１％のＴｗｅｅｎ  ２０に対して、４℃で終夜透析し、同時に、Ｈｉｓｔａｇが存在している場合は、Ｈｉｓｔａｇをトロンビン（１：５０）で切断した。切断の後、トロンビンを、ベンズアミジンセファロース（登録商標）樹脂を使用する精製によりＨｉｓｔａｇを伴って発現した標的融合タンパク質から、分離した。Ｈｉｓｔａｇなしで発現した標的融合タンパク質の精製は、ＳＰセファロースで実施した。その産物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分析した（Maniatis et al, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982）。
【０１９５】
融合タンパク質の過剰発現および精製―基本手順Ｂ
カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）および１００μＭの硫酸亜鉛を有するＬＢ培地に、終夜培養物を植菌した。培養物を、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）が０．６０−０．８０に達するまで、３７℃でインキュベートした。その後、ＩＰＴＧを、最終濃度が０．５−１ｍＭの範囲になるまで添加した。２５℃で振盪しながらの２０ｈのインキュベーション後に、培養物を２５ｍｉｎ、６，０００ｇで遠心分離した。過剰発現後の細菌性細胞を、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、５ｍＭのベータ−メルカプトエタノール、０．５ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）を含む緩衝液（ｐＨ７．８）中、フレンチプレスにて破壊した。得られた抽出物を、５０分間、８０００ｇでの遠心分離により清澄化した。Ｎｉ−セファロース樹脂を、得られた上清と共に終夜インキュベートした。次いで、タンパク質が結合した樹脂を、クロマトグラフィーカラム中に充填した。未結合のタンパク質を含む画分を洗い流すために、カラムを、１５〜５０容積の緩衝液（５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、５ｍＭのベータ−メルカプトエタノール、０．５ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）（ｐＨ７．８））で洗浄した。その後、ベッドに特異的に結合しているタンパク質の大部分を洗い流すために、カラムを、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、１０％グリセロール、０．５ｍＭのＰＭＳＦを含む緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。得られた画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（Maniatis et al, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982）。標的タンパク質を含む画分を組み合わせて、タンパク質がヒスチジンタグを伴って発現された場合に、トロンビン（タンパク質４ｍｇあたり１Ｕ、８ｈ、１６℃で）で切断し、ポリヒスチジンタグを除去した。次いで、その画分を、処方緩衝液（５００ｍＭのＬ−アルギニン、５０ｍＭのＴｒｉｓ、２．５ｍＭのＺｎＳＯ４（ｐＨ７．４））に対して透析した。
【０１９６】
さらに、この説明において、ヒスチジンタグと共に当初発現され、続いて該タグを除去されたタンパク質は、例の番号において、ａ）と表される。ヒスチジンタグなしで当初から発現されたタンパク質は、例の番号において、ｂ）と表される。
【０１９７】
例１．配列番号１の融合タンパク質
配列番号１のタンパク質は、２０３アミノ酸の長さおよび２３．３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、配列ＴＲＡＩＬ１１４−２８１配列のＮ末端に、ヒトフェトプロテインの３４アミノ酸フラグメント（配列番号２７）が、エフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列との間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、ウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）が組み込まれている。
【０１９８】
融合タンパク質の構造を、図１に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示される配列番号１および配列番号５０である。
【０１９９】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号５０）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従い行った。
過剰発現を、E. coli BL21 (DE3)または Tuner(DE3)pLysSの株（Novagen）を使用して、基本手順Ａに従って行った。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２００】
例２．配列番号２の融合タンパク質
配列番号２のタンパク質は、１７８アミノ酸の長さおよび２０．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、配列ＴＲＡＩＬ１１４−２８１のＮ末端に、ヒトフェトプロテインの８アミノ酸フラグメント（配列番号２８）が、エフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬの配列との間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、ウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）が組み込まれている。
【０２０１】
その融合タンパク質の構造を、図１に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示される配列番号２および配列番号５１である。
【０２０２】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２）は、そのコードＤＮＡ配列（配列番号５１）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、E. coli BL21 (DE3)株（Novagen）を使用して、基本手順Ｂに従って実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２０３】
例３．配列番号３の融合タンパク質
配列番号３のタンパク質は、１７９アミノ酸の長さおよび２０．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、配列ＴＲＡＩＬ１２１−２８１のＮ末端に、ヒトフェトプロテインの８アミノ酸フラグメント（配列番号２８）が、エフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬの配列との間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、メタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列(配列番号４５)およびウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）が、この順に、隣同士に組み込まれている。
【０２０４】
融合タンパク質の構造を、図１に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示される配列番号３および配列番号５２である。
【０２０５】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号３）は、そのコードＤＮＡ配列（配列番号５２）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、E. coli BL21 (DE3)株（Novagen）を使用して、基本手順Ａに従って実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２０６】
例４．配列番号４の融合タンパク質
配列番号４のタンパク質は、２０４アミノ酸の長さおよび２３．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、配列ＴＲＡＩＬ１２１−２８１のＮ末端に、ヒトフェトプロテインの３４アミノ酸フラグメント（配列番号２７）が、エフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬの配列との間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、メタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列(配列番号４５)およびウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）が、この順に、隣同士に組み込まれている。
【０２０７】
融合タンパク質の構造を、図１に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示される配列番号４および配列番号５３である。
【０２０８】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号４）は、そのコードＤＮＡ配列（配列番号５３）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、E. coli BL21DE3pLysSRIL株（Stratagene）またはTuner (DE3)株（Novagen）を使用して、基本手順Ｂに従って実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２０９】
例５．配列番号５の融合タンパク質
配列番号５のタンパク質は、２３０アミノ酸の長さおよび２６ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、配列ＴＲＡＩＬ９５−２８１のＮ末端に、ヒトフェトプロテインの３４アミノ酸フラグメント（配列番号２７）が、エフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列との間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、ウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）およびメタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列(配列番号４５)が、この順に、隣同士に組み込まれている。
【０２１０】
融合タンパク質の構造を、図１に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示される配列番号５および配列番号５４である。
【０２１１】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号５）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号５４）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、E. coli Tuner (DE3)株（Novagen）を使用して、基本手順Ａに従って実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２１２】
例６．配列番号６の融合タンパク質
配列番号６のタンパク質は、２３８アミノ酸の長さおよび２６．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、配列ＴＲＡＩＬ９５−２８１のＮ末端に、ヒトフェトプロテインの３４アミノ酸フラグメント（配列番号２７）が、エフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬ配列との間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、メタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列(配列番号４５)およびウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）が、この順に、隣同士に組み込まれている。ＴＲＡＩＬの配列とメタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列との間に、融合タンパク質は、追加して、フレキシブルシステイン−アラニンリンカー（配列番号４７）を含む。
【０２１３】
融合タンパク質の構造を、図２に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示される配列番号６および配列番号５５である。
【０２１４】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号６）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号５５）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、E. coli Tuner(DE3)株（Novagen）を使用して、基本手順Ａに従って実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２１５】
例７．配列番号７の融合タンパク質
配列番号７のタンパク質は、２１３アミノ酸の長さおよび２４．１ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、配列ＴＲＡＩＬ９５−２８１のＮ末端に、ヒトフェトプロテインの８アミノ酸フラグメント（配列番号２８）が、エフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬの配列との間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、メタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列(配列番号４５)およびウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）が、この順に、隣同士に組み込まれている。ＴＲＡＩＬの配列とメタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列との間に、融合タンパク質は、追加して、フレキシブルシステイン−アラニンリンカー（配列番号４７）を含む。
【０２１６】
融合タンパク質の構造を、図２に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表において示される配列番号７および配列番号５６である。
【０２１７】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号７）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号５６）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現は、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、E. coli Tuner (DE3)株（Novagen）を使用して、基本手順Ａに従って実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２１８】
例８．配列番号８の融合タンパク質
配列番号８のタンパク質は、１９１アミノ酸の長さおよび２３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、配列ＴＲＡＩＬ１２１−２８１のＮ末端に、ｐ２１ＷＡＦタンパク質に由来するペプチドの２０アミノ酸フラグメント（配列番号２９）が、エフェクターペプチドとして付着されている。加えて、エフェクターペプチドのＣ末端に、輸送配列としてアンテナペディアタンパク質ドメインのフラグメント（配列番号４９）が付着されており、これは、細胞膜の透過および細胞への融合タンパク質の輸送の助けとなる。輸送配列とＴＲＡＩＬの配列との間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、ウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）およびメタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列(配列番号４５)が、この順に、隣同士に組み込まれている。
【０２１９】
融合タンパク質の構造を、図２に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示される配列番号８および配列番号５７である。
【０２２０】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号８）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号５７）を生成するための鋳型として使用した。１つがＨｉｓ  ｔａｇとトロンビンに認識される部位とを発現することができ、もう１つがいずれのタグもなく発現させることができる、２バージョンのＤＮＡコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、E. coli Tuner (DE3)株（Novagen）を使用して、基本手順Ａに従って実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２２１】
例８Ａ．配列番号７５の融合タンパク質
配列番号７５のタンパク質は、２１２アミノ酸の長さおよび２４.１３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、配列ＴＲＡＩＬ１２０−２８１のＮ末端に、ｐ２１ＷＡＦタンパク質に由来するペプチドの２０アミノ酸フラグメント（配列番号２９）が、エフェクターペプチドとして付着されている。加えて、エフェクターペプチドのＣ末端に、輸送配列としてアンテナペディアタンパク質ドメインのフラグメント（配列番号４９）が付着されており、これは、細胞膜の透過および細胞への融合タンパク質の輸送の助けとなる。輸送配列とＴＲＡＩＬの配列との間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、ウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）およびメタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列(配列番号４５)が、この順に、隣同士に組み込まれている。加えて、メタロプロテアーゼ切断部位とＴＲＡＩＬ配列との間に、融合タンパク質は、追加して、フレキシブルリンカー（配列番号７７）を含む。
【０２２２】
融合タンパク質の構造を、図２に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示される配列番号７５および配列番号７６である。
【０２２３】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号７５）を、のそのコードＤＮＡ配列（配列番号７６）を生成するための鋳型として使用した。１つがＨｉｓ  ｔａｇとトロンビンに認識される部位とを発現することができ、もう１つがいずれのタグもなく発現させることができる、２バージョンのＤＮＡコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、E. coli Tuner (DE3)株（Novagen）を使用して、基本手順Ａに従って実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２２４】
例９．配列番号９の融合タンパク質
配列番号９のタンパク質は、２３１アミノ酸の長さおよび２６．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、配列ＴＲＡＩＬ９５−２８１のＮ末端に、ｐ２１ＷＡＦタンパク質に由来するペプチドの２０アミノ酸フラグメント（配列番号２９）が、エフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬの配列との間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、メタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列(配列番号４５)およびウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）が、この順に、隣同士に組み込まれている。ＴＲＡＩＬの配列と切断部位の配列との間に、融合タンパク質は、追加して、フレキシブルシステイン−アラニンリンカー（配列番号４７）を含む。加えて、エフェクターペプチドのＣ末端に、細胞膜の透過および細胞への融合タンパク質の輸送の助けとなる輸送配列として、アンテナペディアタンパク質ドメインのフラグメント（配列番号４９）が付着されている。
【０２２５】
融合タンパク質の構造を、図２に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表において示される配列番号９および配列番号５８である。
【０２２６】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号９）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号５８）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、E. coli Rosetta (DE3)株（Novagen）を使用して、基本手順Ａに従って実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２２７】
例１０．配列番号１０の融合タンパク質
配列番号１０のタンパク質は、２００アミノ酸の長さおよび２２．８ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、配列ＴＲＡＩＬ１２０−２８１のＮ末端に、ＦＧＦ−２受容体に結合するドメインのペプチドアナログの１６アミノ酸フラグメント（配列番号２６）が、エフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬの配列との間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、ウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）およびメタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列(配列番号４５)が、この順に、隣同士に組み込まれている。ＴＲＡＩＬの配列と切断部位の配列との間に、融合タンパク質は、追加して、フレキシブルシステイン−アラニンリンカー（配列番号４７）を含む。加えて、切断部位の配列とフレキシブルリンカーの配列との間、ならびにフレキシブルリンカーの配列とＴＲＡＩＬドメインとの間に、３量体構造の安定化の助けになる２個のグリシン残基からなるリンカーが組み込まれている。
【０２２８】
融合タンパク質の構造を、図２に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示される配列番号１０および配列番号５９である。
【０２２９】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１０）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号５９）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、融合タンパク質の過剰発現を、前記基本手順に従って行った。過剰発現を、E. coli BL21 (DE3)株（Novagen）を使用して、基本手順Ａに従って実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２３０】
例１１．配列番号１１の融合タンパク質
配列番号１１のタンパク質は、２３３アミノ酸の長さおよび２６．５ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、配列ＴＲＡＩＬ９５−２８１のＮ末端に、ＤＯＣ−２／ＤＡＢ２に由来するペプチドＤＤ２の１８アミノ酸フラグメント（配列番号３０）が、エフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬの配列との間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、メタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列(配列番号４５)およびウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）が、この順に、隣同士に組み込まれている。エフェクターペプチドの配列は、そのＮ末端に、７Ａｒｇ残基からなるポリアルギニン輸送ドメインが付着されている。輸送配列は、細胞膜の透過および細胞への融合タンパク質の輸送の助けとなる。ＴＲＡＩＬの配列と切断部位の配列との間に、融合タンパク質は、追加して、フレキシブルシステイン−アラニン−グリシンリンカーＣＡＡＣＡＡＡＣＧＧＧを含む。
【０２３１】
融合タンパク質の構造を、図３に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示される配列番号１１および配列番号６０である。
【０２３２】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１１）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号６０）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、前記基本手順に従って融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、E. coli BL21 (DE3) または Tuner(DE3)pLysSの株（Novagen）を使用して、基本手順Ａに従って実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２３３】
例１２．配列番号１２の融合タンパク質
配列番号１２のタンパク質は、５９０アミノ酸の長さおよび６６．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、配列ＴＲＡＩＬ１２１−２８１のＮ末端に、Mycoplasma argininiからのアルギニンデイミナーゼ（配列番号３１）が、エフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬの配列との間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、メタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列(配列番号４５)およびウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）が、この順に、隣同士に組み込まれている。ＴＲＡＩＬの配列とメタロプロテアーゼ切断部位の配列との間に、融合タンパク質は、追加して、グリシン残基とセリン残基とからなるフレキシブルリンカーＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙを含む。ウロキナーゼ切断部位の配列とエフェクタータンパク質の配列との間に、融合タンパク質は、追加して、フレキシブルグリシンセリンリンカーＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙを含む。
【０２３４】
融合タンパク質の構造を、図３に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示される配列番号１２および配列番号６１である。
【０２３５】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１２）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号６１）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、前記基本手順に従って融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、E. coli BL21 (DE3) 株（Novagen）を使用して、基本手順Ａに従い実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２３６】
例１３．配列番号１３の融合タンパク質
配列番号１３のタンパク質は、１８７アミノ酸の長さおよび２１．６ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列のＮ末端に、ｐ１６タンパク質からの１０アミノ酸ペプチド（配列番号３２）が、エフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬドメインのＮ末端との間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、ウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）およびメタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列(配列番号４５)が、この順に、隣同士に組み込まれている。エフェクターペプチドの配列は、そのＣ末端に、アンテナペディアタンパク質ドメインフラグメントのフラグメントからなる輸送配列（配列番号４９）が付着されている。輸送配列は、細胞膜の透過および細胞への融合タンパク質の輸送の助けとなる。
【０２３７】
融合タンパク質の構造を、図３に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示される配列番号１３および配列番号６２である。
【０２３８】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１３）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号６３）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、前記基本手順に従って融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、E. coli B.21 (DE3)株（Novagen）またはBL21DE3pLysSRIL株（Stratagene）を使用して、基本手順Ｂに従い実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２３９】
例１４．配列番号１４の融合タンパク質
配列番号１４のタンパク質は、２０３アミノ酸の長さおよび２３．６ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列のＣ末端に、ＭＥＫ−１タンパク質の１３アミノ酸フラグメント―ＥＲＫ活性化のインヒビター（配列番号３４）が、エフェクターペプチドとして付着されている。ＴＲＡＩＬのＣ末端とエフェクターペプチドドメインとの間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、メタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列(配列番号４５)およびウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）が、この順に、隣同士に組み込まれている。エフェクターペプチドの配列は、そのＮ末端に、アンテナペディアタンパク質ドメインフラグメントからなる輸送配列（配列番号４８）が付着されている。輸送配列は、細胞膜の透過および細胞への融合タンパク質の輸送の助けとなる。ＴＲＡＩＬの配列と切断部位の配列との間に、融合タンパク質は、追加して、フレキシブルグリシン−システインリンカーＧＳを含む。
【０２４０】
融合タンパク質の構造を、図３に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示される配列番号１４および配列番号６３である。
【０２４１】
前記配列のアミノ酸配列（配列番号１４）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号６３）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、前記基本手順に従って融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、E. coli BL21 (DE3) 株（Novagen）またはBL21DE3pLysSRIL株（Stratagene）を使用して、基本手順Ｂに従い実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２４２】
例１５．配列番号１５の融合タンパク質
配列番号１５のタンパク質は、２０５アミノ酸の長さおよび２４ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ｈＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列のＮ末端に、ＴＣＬ１タンパク質のＰＨドメインの１５アミノ酸Ｎ末端フラグメント―ＡＫＴコアクチベーターとして作用する（配列番号３５）が、エフェクターペプチドとして付着されている。ＴＲＡＩＬドメインとエフェクターペプチドとの間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、メタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列(配列番号４５)およびウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）が、この順に、隣同士に組み込まれている。エフェクターペプチドの配列は、そのＮ末端に、アンテナペディアタンパク質ドメインフラグメントのフラグメントからなる輸送配列（配列番号４８）が付着されている。輸送配列は、細胞膜の透過および細胞への融合タンパク質の輸送の助けとなる。ＴＲＡＩＬの配列と切断部位の配列との間に、融合タンパク質は、追加して、フレキシブルグリシン−システインリンカーＧＳを含む。
【０２４３】
融合タンパク質の構造を、図３に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示される配列番号１５および配列番号６４である。
【０２４４】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１５）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号６４）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、前記基本手順に従って融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、E. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)の株（Novagen）を使用して、基本手順Ｂに従い実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２４５】
例１６．配列番号１６の融合タンパク質
配列番号１６の融合タンパク質は、１８３アミノ酸の長さおよび２１．２ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列のＮ末端に、Ｅ２Ｆのインヒビターとして作用するヘキサペプチド（配列番号３６）が、エフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬドメインとの間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、ウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）およびメタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列(配列番号４５)が、この順に、隣同士に組み込まれている。加えて、エフェクターペプチドの配列は、そのＣ末端に、アンテナペディアタンパク質ドメインフラグメントのフラグメントからなる輸送配列（配列番号４９）が付着されている。輸送配列は、細胞膜の透過および細胞への融合タンパク質の輸送の助けとなる。
【０２４６】
融合タンパク質の構造を、図４に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示される配列番号１６および配列番号６５である。
【０２４７】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１６）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号６５）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、前記基本手順に従って融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、E. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)の株（Novagen）を使用して、基本手順Ｂに従い実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２４８】
例１７．配列番号１７の融合タンパク質
配列番号１７の融合タンパク質は、１９０アミノ酸の長さおよび２２．３ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ１１２１−２８１配列のＮ末端に、チューブリンの１３アミノ酸フラグメント（配列番号３７）が、エフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬドメインのＮ末端との間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、ウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）およびメタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列(配列番号４５)が、この順に、隣同士に組み込まれている。加えて、エフェクターペプチドの配列は、そのＣ末端に、６個のアルギニン残基からなる輸送配列が付着されている。輸送配列は、細胞膜の透過および細胞への融合タンパク質の輸送の助けとなる。
【０２４９】
融合タンパク質の構造を、図４に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示される配列番号１７および配列番号６６である。
【０２５０】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１７）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号６６）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、前記基本手順に従って融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、E. coli BL.21 (DE3)またはTuner (DE3)の株（Novagen）を使用して、基本手順Ｂに従い実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２５１】
例１８．配列番号１８の融合タンパク質
配列番号１８の融合タンパク質は、１８７アミノ酸の長さおよび２１．７ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列のＮ末端に、チューブリンの１０アミノ酸フラグメント（配列番号３８）が、エフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬドメインのＮ末端との間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、ウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）およびメタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列(配列番号４５)が、この順に、隣同士に組み込まれている。加えて、エフェクターペプチドの配列は、そのＣ末端に、６個のアルギニン残基からなる輸送配列が付着されている。輸送配列は、細胞膜の透過および細胞への融合タンパク質の輸送の助けとなる。
【０２５２】
融合タンパク質の構造を、図４に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示される配列番号１８および配列番号６７である。
【０２５３】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１８）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号６７）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を包含するプラスミドを生成し、前記基本手順に従って融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、E. coli BL21 (DE3)またはTuner (DE3)の株（Novagen）を使用して、基本手順Ｂに従い実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２５４】
例１９．配列番号１９の融合タンパク質
配列番号１９のタンパク質は、１９６アミノ酸の長さおよび２２．５４ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ｈＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列のＮ末端に、メリチン（配列番号３９）が、エフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬドメインのＮ末端との間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、ウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）およびメタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列(配列番号４５)が、この順に、隣同士に組み込まれている。
【０２５５】
融合タンパク質の構造を、図４に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示される配列番号１９および配列番号６８である。
【０２５６】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号１９）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号６８）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、前記基本手順に従って融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、E. coli BL21 (DE3) または Tuner(DE3)の株（Novagen）を使用して、基本手順Ｂに従い実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２５７】
例２０．配列番号２０の融合タンパク質
配列番号２０のタンパク質は、１８４アミノ酸の長さおよび２１．４ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ｈＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列のＮ末端に、ハチデフェンシンに由来する６アミノ酸ペプチドＣ２（配列番号４０）が、エフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチドとＴＲＡＩＬドメインのＮ末端との間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、ウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）およびメタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列(配列番号４５)が、この順に、隣同士に組み込まれている。加えて、エフェクターペプチドの配列は、そのＣ末端に、６個のアルギニン残基からなる輸送配列が付着されている。輸送配列は、細胞膜の透過および細胞への融合タンパク質の輸送の助けとなる。
【０２５８】
融合タンパク質の構造を、図４に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示される配列番号２０および配列番号６９である。
【０２５９】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２０）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号６９）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、前記基本手順に従って融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、E. coli BL21 (DE3) または Tuner(DE3)の株（Novagen）を使用して、基本手順Ｂに従い実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２６０】
例２１．配列番号２１の融合タンパク質
配列番号２１のタンパク質は、１８９アミノ酸の長さおよび２１．４ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ｈＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列のＮ末端に、ＦＧＦ−２リガンドに結合する８アミノ酸ペプチドの２つの繰り返し配列（配列番号４１）が、エフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチド配列の間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、ウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）およびメタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列(配列番号４５)が、この順に、隣同士に組み込まれている。加えて、２つ目のエフェクターペプチドとＴＲＡＩＬドメインの配列との間に、３量体構造の安定化の助けになる、２個のグリシン残基からなるリンカーが組み込まれている。
【０２６１】
融合タンパク質の構造を、図５に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示される配列番号２１および配列番号７０である。
【０２６２】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２１）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号７０）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、前記基本手順に従って融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、E. coli BL21 (DE3) または Tuner(DE3)の株（Novagen）を使用して、基本手順Ｂに従い実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２６３】
例２２．配列番号２２の融合タンパク質
配列番号２２のタンパク質は、１８８アミノ酸の長さおよび２１．６ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ１１９−２８１配列のＮ末端に、１５アミノ酸ペプチドのラシオグロッシンＬＬ２（配列番号４２）が、エフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチド配列とＴＲＡＩＬドメインのＮ末端の間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、ウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）およびメタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列(配列番号４５)が、この順に、隣同士に組み込まれている。
【０２６４】
融合タンパク質の構造を、図５に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示される配列番号２２および配列番号７１である。
【０２６５】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２２）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号７１）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、前記基本手順に従って融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、E. coli BL21 (DE3) または Tuner(DE3)の株（Novagen）を使用して、基本手順Ｂに従い実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２６６】
例２３．配列番号２３の融合タンパク質
配列番号２３のタンパク質は、１９３アミノ酸の長さおよび２１．６ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ１２１−２８１配列のＮ末端に、ＲａｓＧＡＰ−Ａｕｒｏｒａ  Ｂ相互作用のインヒビターとして作用する１３アミノ酸ペプチド（配列番号４３）が、エフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチド配列とＴＲＡＩＬドメインとの間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、ウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）およびメタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列(配列番号４５)が、この順に、隣同士に組み込まれている。加えて、エフェクターペプチドの配列は、そのＣ末端に、８個のアルギニン残基からなる輸送配列が付着されている。輸送配列は、細胞膜の透過および細胞への融合タンパク質の輸送の助けとなる。加えて、メタロプロテアーゼ切断部位の配列とＴＲＡＩＬドメインの配列との間に、３量体構造の安定化の助けになる、システイン残基が組み込まれている。
【０２６７】
融合タンパク質の構造を、図５に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示される配列番号２３および配列番号７２である。
【０２６８】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２３）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号７２）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、前記基本手順に従って融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、E. coli BL21 (DE3) または Tuner(DE3)の株（Novagen）を使用して、基本手順Ｂに従い実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２６９】
例２４．配列番号２４の融合タンパク質
配列番号２４のタンパク質は、２４３アミノ酸の長さおよび２７．８ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ９５−２８１配列のＣ末端に、アンテナペディアの１７アミノ酸輸送ドメイン（配列番号３３）が、エフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチド配列とＴＲＡＩＬドメインとの間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、メタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列(配列番号４５)およびウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）が、この順に、隣同士に組み込まれている。加えて、ＴＲＡＩＬの配列とメタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列との間に、フレキシブルシステイン−アラニンリンカー（配列番号４７）が組み込まれている。
【０２７０】
融合タンパク質の構造を、図５に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示される配列番号２４および配列番号７３である。
【０２７１】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２４）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号７３）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、前記基本手順に従って融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、E. coli Tuner(DE3)株（Novagen）を使用して、基本手順Ａに従い実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２７２】
例２５．配列番号２５の融合タンパク質
配列番号２５のタンパク質は、１９９アミノ酸の長さおよび２３．４ｋＤａの質量を有する融合タンパク質であり、ここで、ＴＲＡＩＬ１２０−２８１配列のＮ末端に、Ｐｅｐ２７ペプチドのアナログ（配列番号４４）が、エフェクターペプチドとして付着されている。エフェクターペプチド配列とＴＲＡＩＬドメインのＮ末端との間に、エフェクターペプチドが腫瘍環境において切断されるようにするため、ウロキナーゼｕＰＡに認識される切断部位の配列（配列番号４６）およびメタロプロテアーゼＭＭＰに認識される切断部位の配列(配列番号４５)が、この順に、隣同士に組み込まれている。
【０２７３】
融合タンパク質の構造を、図５に模式的に示す。そのアミノ酸配列およびE. coliにおける発現に最適化されたコドンを含むＤＮＡコード配列は、それぞれ、添付の配列表に示される配列番号２５および配列番号７４である。
【０２７４】
前記構造のアミノ酸配列（配列番号２５）を、そのコードＤＮＡ配列（配列番号７４）を生成するための鋳型として使用した。ＤＮＡのコード配列を含むプラスミドを生成し、前記基本手順に従って融合タンパク質の過剰発現を行った。過剰発現を、E. coli BL21 (DE3) またはE. coli Tuner (DE3)の株（Novagen）を使用して、基本手順Ｂに従い実施した。当該タンパク質は、前記基本手順に従って電気泳動により分離した。
【０２７５】
例２６．融合タンパク質の抗腫瘍活性の試験
融合タンパク質の抗腫瘍活性の試験を、腫瘍細胞株に対する細胞毒性アッセイにおいてin vitroで行い、マウスにおいてはin vivoで行った。比較目的のために、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１タンパク質およびプラシーボを使用した。
【０２７６】
１．円偏光二色性の測定
融合タンパク質の調製物の性質を、それらの構造の観点から、例１ａ、例２ａおよび例８ａについて、円偏光二色性（ＣＤ）により決定した。
【０２７７】
円偏光二色性は、タンパク質の二次構造および立体配座の決定のために使用する。ＣＤ法は、タンパク質構造の光学活性を利用し、光の偏光面の回転および楕円偏光の出現を明らかにする。遠紫外（ＵＶ）におけるタンパク質のＣＤスペクトルにより、ポリペプチド主鎖の立体配座に関する正確なデータが得られる。
【０２７８】
５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、８０ｍＭのサッカロース、５ｍＭのＤＴＴからなる緩衝液へ処方した後の、分析されるタンパク質の試料は、１２ｋＤａカットオフの透析バッグ（Sigma-Aldrich）中で透析した。透析を、タンパク質調製物に対して１００倍量（ｖ／ｖ）過剰の緩衝液中で４°Ｃで数時間撹拌しながら実施した。透析が完了した後、各調製物を、遠心分離し（２５０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ．、４°Ｃ）、上清を適切に回収した。このようにして得られた試料中のタンパク質濃度は、ブラッドフォード法により決定した。
【０２７９】
濃度範囲が０．１−２．７ｍｇ／ｍｌのタンパク質の円偏光二色性の測定を、光路長０．２ｍｍまたは１ｍｍの石英キュベット中、Jasco J-710分光偏光計で実施した。測定を、７ｌ／ｍｉｎで窒素を流しながら実施したので、波長範囲１９５ｎｍから２５０ｎｍまでの測定が可能であった。測定のパラメーター：−１ｎｍのスペクトル分解能；光線の半値幅１ｎｍ；感度２０ｍｄｅｇ、１つの波長での平均時間−８ｓ、スキャン速度１０ｎｍ／ｍｉｎ。
【０２８０】
結果は、３回の測定の平均として示した。ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１および例１ａ、例２ａおよび例８ａのタンパク質の円偏光二色性スペクトルを図６に示す。
【０２８１】
得られたスペクトルを、CDProソフトウェアを使用して１９３−２５０ｎｍの範囲で数値分析した。光電子倍増管での電圧が７００Ｖを超える点を、この波長範囲でのシグナル対ノイズ比が小さすぎるため、排除した。
【０２８２】
得られたデータを使用して、分析したタンパク質における特定の二次構造含量をCDProソフトウェアにより計算した（表１）。
【０２８３】
【表１】
2014513943.tif 000002
【０２８４】
対照分子（ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１）は、大多数がβシート構造型（波長２２０ｎｍでの楕円率が明らかに最小となる）であるタンパク質に特有のＣＤスペクトルを示す。これは、二次構造成分の計算と一致しており、αへリックス要素が極めて少ないことを示唆している。
【０２８５】
得られた結果はまた、ｈＴＲＡＩＬタンパク質の結晶構造からのデータとも一致し、本発明の例１ａ、例２ａおよび例８ａの融合タンパク質に特徴的であり、ベータの要素は、それら構造の３２−４４％を構成する。
【０２８６】
全ての態様の場合において、二色性スペクトルは、波長２２０ｎｍにおける１つの極小値により特徴付けられる。
【０２８７】
ＴＲＡＩＬに付着する小さいペプチドは、タンパク質の小さな部分を構成するものであって、必ずしも明確な二次構造を生じるものではないため、分析されるタンパク質は、元々のタンパク質から有意に異なるべきではない。
【０２８８】
２．In vitroにおける細胞株テスト
細胞株
【表２−１】
2014513943.tif 000003
【表２−２】
2014513943.tif 000004
【表２−３】
2014513943.tif 000005
【０２８９】
【表３】
2014513943.tif 000006
【０２９０】
ＭＴＴ細胞毒性テスト
ＭＴＴアッセイは、細胞の増殖、生存率および細胞毒性を測定するために使用される比色アッセイである。それは、ミトコンドリア酵素のスクシナート−テトラゾリウムレダクターゼ１による、黄色のテトラゾリウム塩のＭＴＴ（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）の、非水溶性紫染料のホルマザンへの分解にある。ＭＴＴの還元は、生細胞にしか生じない。データ分析は、対照細胞と比較して処置された集団の細胞数の５０％で還元が生じる濃度である、タンパク質のＩＣ５０濃度（単位ｎｇ／ｍＬ）の決定にある。結果は、GraphPad Prism 5.0ソフトウェアを使用して分析した。テストは、文献の記載（Celis, JE, (1998). Cell Biology, a Laboratory Handbook, second edition, Academic Press, San Diego; Yang, Y., Koh, LW, Tsai, JH., (2004); Involvement of viral and chemical factors with oral cancer in Taiwan, Jpn J Clin Oncol, 34 (4), 176-183）に従って実施した。
【０２９１】
細胞培養培地を、所定の密度（１００μＬあたり１０４−１０５細胞）に希釈した。その後、適切に希釈された１００μｌの細胞懸濁液を、９６ウェルプレートに３ウェルずつアプライした。このように調製した細胞を、使用した培地に応じて、５％または１０％のＣＯ２中３７℃で２４ｈインキュベートし、その後、細胞（１００μｌの培地中）に、テストされる様々な濃度のタンパク質を含む１００μｌの培地をさらに添加した。ｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１とｐ２１ＷＡＦエフェクタータンパク質との組み合わせの場合、モル比１：１のｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１とｐ２１ＷＡＦエフェクタータンパク質との混合物を含む１００μｌの培地を添加した。３−４回の細胞分裂に相当する、次の７２時間にわたって、標的タンパク質と共に細胞をインキュベーションした後、標的タンパク質を有する培地に、２０ｍｌのＭＴＴ希釈標準溶液［５ｍｇ／ｍｌ］を添加し、５％ＣＯ２中３７℃で３ｈインキュベーションを続けた。その後、ＭＴＴ溶液を有する培地を除去し、１００μｌのＤＭＳＯを添加してホルマザン結晶を溶解した。撹拌後、５７０ｎｍでの吸光度を測定した（参照フィルター６９０ｎｍ）。
【０２９２】
ＥＺ４Ｕ細胞毒性テスト
ＥＺ４Ｕ（Biomedica）テストを使用して、非接着性細胞株におけるタンパク質の細胞毒性活性をテストした。このテストは、テトラゾリウム塩の還元で形成されるホルマザンが水に可溶であるように、ＭＴＴ法を改変したものである。細胞生存率の研究は、タンパク質（タンパク質を７つの濃度で各３ウェルずつ）と共に細胞を連続７２時間インキュベーションした後に行った。これに基づいて、GraphPad Prism 5ソフトウェアを使用し、ＩＣ５０値を（２回の独立した実験の平均値として）決定した。対照細胞は、溶媒のみでインキュベートした。
【０２９３】
in vitro細胞毒性テストの結果は、溶媒のみで処置した対照細胞に対して融合タンパク質の細胞毒性効果が５０％のレベルで観察されたタンパク質濃度に相当するＩＣ５０値（ｎｇ／ｍｌ）としてまとめて示す。各実験は、３ウェルずつで実施した少なくとも２つの独立した実験の平均値を表す。タンパク質調製物に活性が無いと判断する基準としては、ＩＣ５０限度値２０００ｎｇ／ｍｌを採用した。ＩＣ５０値が２０００を超える融合タンパク質は不活性とみなした。
【０２９４】
このテストのために選択した細胞は、ＴＲＡＩＬタンパク質に対して自然抵抗性のある腫瘍細胞株（ＴＲＡＩＬに対する自然抵抗性の基準：ＴＲＡＩＬタンパク質のＩＣ５０＞２０００）のみならず、ＴＲＡＩＬタンパク質に感受性のある腫瘍細胞株や、従来の抗がん薬剤抵抗性がん株としてドキソルビシンに抵抗性のある株ＭＥＳ−ＳＡ／ＤＸ５も含んだ。
【０２９５】
未分化ＨＵＶＥＣ細胞株を、非がん細胞における融合タンパク質の効果／毒性の査定用の健常な対照細胞株として使用した。
【０２９６】
得られた結果により、本発明の特定の融合タンパク質を、ＴＲＡＩＬに自然抵抗性のある細胞に投与することにより、細胞株のＴＲＡＩＬに対する抵抗性を克服できる可能性が確認された。本発明の融合タンパク質を、ＴＲＡＩＬに感受性のある細胞に投与した場合、いくつかのケースでは、ＴＲＡＩＬのみの場合のＩＣ５０値と比べて融合タンパク質のＩＣ５０値が減少したことが示され、活性能力の明らかで強い相乗作用が観察された。さらに、標準的な抗がん薬剤のドキソルビシンに抵抗性のある細胞においても、本発明の融合タンパク質の細胞毒性活性が得られており、いくつかのケースでは、ＴＲＡＩＬのみの活性よりも高かった。
【０２９７】
非がん細胞株で得られた２０００を超えるＩＣ５０値は、健常細胞に対して本発明のタンパク質の使用に関連する毒性効果が無いことを示しており、本タンパク質の全身毒性の可能性が低いことを示唆している。
【０２９８】
モル比１：１のｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１と２０アミノ酸ｐ２１ＷＡＦ由来のエフェクターペプチド（特注の固相合成）との混合物からなる、ｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１とｐ２１ＷＡＦエフェクターペプチドとの組み合わせについて得られた結果は、例８ｂの融合タンパク質について得られた結果およびｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１単一分子とｐ２１ＷＡＦ由来エフェクターペプチド単一分子とについて得られた結果と比較して、その単一成分およびそれらの組み合わせに対して融合タンパク質の有利な特性を明らかにした。
【０２９９】
例８ｂの融合タンパク質は、Ａ５４９細胞株のＴＲＡＩＬに対する抵抗性を克服する。ＴＲＡＩＬ感受性細胞株の場合、例８ｂの融合タンパク質は、細胞毒性活性が、ｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１およびｐ２１ＷＡＦ由来ペプチドの単一分子より高いことを示す。
【０３００】
広範な腫瘍細胞株の一団に対する、選択されたタンパク質調製物の細胞毒性活性の決定
表４は、広範囲で最も頻度の高いがんに対応する種々の臓器由来の広範な腫瘍細胞の一団に対する、選択された本発明の融合タンパク質のin vitroでの細胞毒性活性テストの結果を表す。
【０３０１】
実験結果を、平均値±標準偏差（ＳＤ）として表す。全ての計算およびグラフは、GraphPad Prism 5.0ソフトウェアを使用して作成した。
【０３０２】
得られたＩＣ５０値により、融合タンパク質の高い細胞毒性活性が確認され、したがって、がんの処置における潜在的有用性が確認された。
【０３０３】
【表４−１】
2014513943.tif 000007
【０３０４】
【表４−２】
2014513943.tif 000008
【０３０５】
【表４−３】
2014513943.tif 000009
【０３０６】
【表４−４】
2014513943.tif 000010
【０３０７】
【表４−５】
2014513943.tif 000011
【０３０８】
【表４−６】
2014513943.tif 000012
【０３０９】
【表４−７】
2014513943.tif 000013
【０３１０】
【表４−８】
2014513943.tif 000014
【０３１１】
【表４−９】
2014513943.tif 000015
【０３１２】
【表４−１０】
2014513943.tif 000016
【０３１３】
【表４−１１】
2014513943.tif 000017
【０３１４】
２．異種移植におけるin vivoの融合タンパク質の抗腫瘍有効性
タンパク質調製物の抗腫瘍活性を、ヒト結腸がんＨＣＴ１１６、ヒト結腸がんＣｏｌｏ２０５、ヒト結腸がんモデルＳＷ６２０、ヒト肝がんモデルＨｅｐＧ２、ならびに、ヒト肺がんモデルＮＣＩ−Ｈ４６０およびＮＣＩ−Ｈ４６０−Ｌｕｃ２のマウスモデルにおいてテストした。
【０３１５】
当初ヒスチジンタグと共に発現し、該タグがその後取り除かれた、異種移植における抗腫瘍活性についてテストされたタンパク質は、例番号においてａ)と表す。当初からヒスチジンタグ無しで発現されたタンパク質は、例番号においてｂ）と表す。
【０３１６】
細胞
ＨＣＴ１１６（マウスではCrl:CD1-Foxn1nu 1）、Ｃｏｌｏ２０５、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ４６０−Ｌｕｃ２の細胞を、１０％のウシ胎児血清および２ｍＭのグルタミンを補充したＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Invitrogen, Cat.22600-134）を１：１の比率で混合したＲＰＭＩ１６４０培地（Hyclone, Logan, UT, USA）中で維持した。マウスへの移植の日に、トリプシン（Invitrogen）で細胞を洗浄して、細胞をサポートから剥離し、その後、細胞を１３００ｒｐｍ、４℃で８ｍｉｎ遠心分離し、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ培地）に懸濁し、カウントし、２５×１０６細胞／ｍｌの濃度に希釈した。
【０３１７】
その他に、ＨＣＴ１１６（マウスではCrl:SHO-PrkdcscidHrhr）を、１０％のウシ胎児血清および２ｍＭのグルタミンを補充したＭｃＣｏｙ’ｓ培地（Hyclone, Logan, UT, USA）中で維持した。マウスへの移植の日に、トリプシン（Invitrogen）で細胞を洗浄して、細胞をサポートから剥離し、その後、細胞を１３００ｒｐｍ、４℃で８ｍｉｎ遠心分離し、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ培地）に懸濁し、カウントし、２５×１０６細胞／ｍｌの濃度に希釈した。
【０３１８】
ＳＷ６２０細胞を、１０％のウシ胎児血清および２ｍＭのグルタミンを補充したＤＭＥＭ（HyClone, Logan, UT, USA）中で維持した。マウスへの移植の日に、トリプシン（Invitrogen）で細胞を洗浄して、細胞をサポートから剥離し、その後、細胞を１３００ｒｐｍ、４℃で８ｍｉｎ遠心分離し、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ培地）に懸濁し、カウントし、２５×１０６細胞／ｍｌの濃度に希釈した。
【０３１９】
ＨｅｐＧ２細胞を、１０％のウシ胎児血清および２ｍＭのグルタミンを補充したＭＥＭ（HyClone, Logan, UT, USA）中で維持した。マウスへの移植の日に、トリプシン（Invitrogen）で細胞を洗浄して、細胞をサポートから剥離し、その後、細胞を１３００ｒｐｍ、４℃で８ｍｉｎ遠心分離し、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ培地）に懸濁し、カウントし、２５×１０６細胞／ｍｌの濃度に希釈した。
【０３２０】
マウス
本発明のタンパク質の抗腫瘍活性の試験は、Charles River（Germany）から入手した７−９週齢ＣＤヌードマウス（Crl:CD1-Foxn1nu1）または４−６週齢Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにより行った。マウスは、食糧および脱塩水は（適宜）自由摂取として、特定病原体感染防止条件下で保持した。動物を使用した全ての実験は、ガイドライン：the New York Academy of Sciences' Ad Hoc Committee on Animal Research により発行された「Interdisciplinary Principles and Guidelines for the Use of Animals in Research, Marketing and Education」に従って行い、the IV Local Ethics Committee on Animal Experimentation in Warsaw (No. 71/2009)により認可された。
【０３２１】
実験の過程および評価
ヒト結腸がんモデル
ＣＤヌードマウス（Crl:CD1-Foxn1nu 1）のＨＣＴ１１６モデル
０日目に、マウスCrl:CD1-Foxn1nu 1に、０．２ｍｌのＨＢＳＳ緩衝液に懸濁した５×１０６のＨＣＴ１１６細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）により、右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍のサイズが、〜５５−６８ｍｍ３となったとき（８日目）、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜６３ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群に、例２ａの本発明の融合タンパク質の調製物（１０ｍｇ／ｋｇ）および比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。調製物を、５日間適用後２日の間をおくという、１０日間適用のスキームに従って、静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。治療群の平均腫瘍サイズが〜１０００ｍｍ３に達したとき、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。対照群には、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を与えた。
【０３２２】
例２ａの本発明の融合タンパク質および比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を処置されたＨＣＴ１１６結腸がんを負ったCrl:CD1-Foxn1nuマウスにおいて得られた実験結果を、腫瘍体積の変化の図として図７に示し、対照のパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）を図８に示す。
【０３２３】
例２ａの本発明の融合タンパク質および比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を処置されたＨＣＴ１１６結腸がんを負ったCrl:CD1-Foxn1nuマウスにおいて得られた実験結果を、腫瘍体積の変化の図として図７に示し、対照のパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）を図８に示す。
【０３２４】
図７および８のグラフに示される実験の結果は、例２ａの本発明の融合タンパク質の投与が、実験２７日目における対照と比較して、ＴＧＩが７１．２％で腫瘍ＨＣＴ１１６成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用されたｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、ＴＧＩが４４％の水準であって、対照と比較して、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
【０３２５】
０日目に、Crl:CD1-Foxn1nu 1マウスに、０．２ｍｌのＨＢＳＳ緩衝液に懸濁した５×１０６のＨＣＴ１１６細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）により、右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍のサイズが、〜５０−１１０ｍｍ３となったとき（２３日目）、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜８５ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群に、例８ａの本発明の融合タンパク質の調製物（１０ｍｇ／ｋｇ）および比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。調製物を、１０日間毎日、静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。治療群の平均腫瘍サイズが〜１０００ｍｍ３に達したとき、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。対照群には、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を与えた。
【０３２６】
例８ａの本発明の融合タンパク質および比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を処置されたＨＣＴ１１６結腸がんを負ったCrl:CD1-Foxn1nuマウスにおいて得られた実験結果を、腫瘍体積の変化の図として図１１に示し、対照のパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）を図１２に示す。
【０３２７】
例８ａの本発明の融合タンパク質および比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を処置されたＨＣＴ１１６結腸がんを負ったCrl:CD1-Foxn1nuマウスにおいて得られた実験結果を、腫瘍体積の変化の図として図１１に示し、対照のパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）を図１２に示す。
【０３２８】
図１１および１２のグラフに示される実験の結果は、例８ａの本発明の融合タンパク質の投与が、実験３１日目における対照に対してＴＧＩ５３．３で、腫瘍ＨＣＴ１１６成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用されたｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、ＴＧＩが２１．８％の水準であって、対照と比較して、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
【０３２９】
Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウス
ＨＣＴ１１６モデル
０日目に、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスに、ＨＢＳＳ緩衝液：マトリゲルが３：１の混合物０．１ｍｌに懸濁した５×１０６のＨＣＴ１１６細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）により、右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍のサイズが、７１−４３２ｍｍ３となったとき（１３日目）、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜１８０ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群に、例８ｂの本発明の融合タンパク質の調製物（５０ｍｇ／ｋｇ）、および、処方緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｚｍａ  Ｂａｓｅ、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、８０ｍＭのサッカロース、ｐＨ８．０）に対する比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（６５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。調製物を、まず５日間毎日静脈内投与（ｉ．ｖ．）した後、２日の間をおいて、さらに５日間毎日投与するというスキームに従った。
【０３３０】
治療群の平均腫瘍サイズが、〜１０００ｍｍ３に達したとき、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。対照群には、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を与えた。
【０３３１】
例８ｂの本発明の融合タンパク質および比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を処置されたＨＣＴ１１６結腸がんを負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおいて得られた実験結果は、腫瘍体積の変化の図として図１１ａに、対照とのパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）を図１２ａに示す。
【０３３２】
図１１ａおよび１２ａのグラフに示される実験の結果は、例８ｂの本発明の融合タンパク質の投与が、実験２４日目における対照と比較して、ＴＧＩが７０％で腫瘍ＨＣＴ１１６成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用されたｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、ＴＧＩが３８％の水準であって、対照と比較して、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
【０３３３】
ＳＷ６２０モデル
０日目に、ＨＢＳＳ緩衝液：マトリゲルが３：１の混合物０．１ｍｌに懸濁した５×１０６個のＳＷ６２０細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）により、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍のサイズが２８０−３４０ｍｍ３に達したとき（１７日目）、マウスを、その群における腫瘍の平均サイズが〜３２０ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、例８ｂの本発明の融合タンパク質調製物（４０ｍｇ／ｋｇ）、および、処方緩衝液（５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、９５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、８０ｍＭのサッカロース、ｐＨ８．０）に対する比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（３０ｍｇ／ｋｇ）、を投与した。調製物を、隔日に６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。治療群の平均腫瘍サイズが〜１０００ｍｍ３となったとき、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。対照群には、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を与えた。
【０３３４】
例８ｂの本発明の融合タンパク質、および、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を処置されたＳＷ６２０結腸がんを負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおいて得られた実験結果は、腫瘍体積の変化の図として図１３に、対照との比率としての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）を図１４に示す。
【０３３５】
図１３および１４のグラフに示される実験の結果は、例８ｂの本発明の融合タンパク質の投与が、実験３１日目における対照と比較して、ＴＧＩが４４％で腫瘍ＳＷ６２０成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用されたｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、ＴＧＩが−９％の水準であって、対照と比較して、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
【０３３６】
Ｃｏｌｏ２０５モデル
０日目に、ＨＢＳＳ緩衝液：マトリゲルが３：１の混合物０．１ｍｌに懸濁した５×１０６個のＣｏｌｏ２０５細胞を、０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）を使用して、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍のサイズが１０８−１２８ｍｍ３となったとき（１３日目）、その群における腫瘍の平均サイズが〜１１５ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、例８ｂの本発明の融合タンパク質調製物（３０ｍｇ／ｋｇ）、および、処方緩衝液（５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、９５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、８０ｍＭのサッカロース、ｐＨ８．０）に対しての比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（３０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。調製物を、隔日に６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。治療群の平均腫瘍サイズが〜１０００ｍｍ３に達したとき、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。対照群には、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を与えた。
【０３３７】
例８ｂの本発明の融合タンパク質、および、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を処置されたＣｏｌｏ２０５結腸がんを負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおいて得られた実験結果は、腫瘍体積の変化の図として図１５に、対照とのパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）を図１６に示す。
【０３３８】
図１５および１６のグラフに示される実験の結果は、例８ｂの本発明の融合タンパク質の投与が、実験３３日目における対照と比較して、ＴＧＩが９７．６％で腫瘍Ｃｏｌｏ２０５成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用されたｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、ＴＧＩが１８．８％の水準であって、対照と比較して、腫瘍細胞増殖に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
【０３３９】
肝がんモデル
Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウス
ＨｅｐＧ２モデル
０日目に、ＨＢＳＳ緩衝液：マトリゲルが３：１の混合物０．１ｍｌに懸濁した７×１０６個のＨｅｐＧ２細胞を０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）を使用して、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍のサイズが〜３１３−３７４ｍｍ３となったとき（１９日目）、その群における腫瘍の平均サイズが〜３４０ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、例８ｂの本発明の融合タンパク質調製物（３０ｍｇ／ｋｇ）、および、対照としての処方緩衝液（５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、９５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、８０ｍＭのサッカロース、ｐＨ８．０）に対する比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（３０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。調製物を、隔日に６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。治療群の平均腫瘍サイズが〜１０００ｍｍ３に達したとき、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。対照群には、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を与えた。
【０３４０】
例８ｂの本発明の融合タンパク質、および、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を処置されたＨｅｐＧ２肝がんを負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおいて得られた実験結果は、腫瘍体積の変化の図として図１７に、対照とのパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）を図１８に示す。
【０３４１】
図１７および１８のグラフに示される実験の結果は、例８ｂの本発明の融合タンパク質の投与が、実験３３日目における対照と比較して、ＴＧＩが６５．７％で腫瘍ＨｅｐＧ２成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用されたｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、ＴＧＩが１２．６％の水準であって、対照と比較して、腫瘍細胞成長に対してわずかに阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
【０３４２】
肺がんモデル
マウス：Crl:CD1-Foxn1nu 1
ＮＣＩ−Ｈ４６０−Ｌｕｃ２モデル
０日目に、０．１ｍＬのＨＢＳＳ緩衝液に懸濁した５×１０６個のＮＣＩ−Ｈ４６０−Ｌｕｃ２細胞を０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）により、Crl:CD1-Foxn1nu 1マウスの右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍のサイズが〜２０−２３３ｍｍ３となったとき（１６日目）、その群における腫瘍の平均サイズが〜１１０ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、例２ａの本発明の融合タンパク質調製物（１０ｍｇ／ｋｇ）、および、対照としての処方緩衝液ｆ１６（１９ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、８１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、ｐＨ７．４）に対する比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。調製物を、隔日に６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。治療群の平均腫瘍サイズが〜１０００ｍｍ３に達したとき、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。対照群には、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を与えた。
【０３４３】
例２ａの本発明の融合タンパク質、および、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を処置されたＮＣＩ−Ｈ４６０−Ｌｕｃ２肺がんを負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおいて得られた実験結果は、腫瘍体積の変化の図として図９に、対照との比率としての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）を図１０に示す。
【０３４４】
図９および１０のグラフに示される実験の結果は、例２ａの本発明の融合タンパク質の投与が、実験３０日目における対照と比較して、ＴＧＩが８１．３％で腫瘍ＮＣＩ−Ｈ４６０−Ｌｕｃ２成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用されたｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、ＴＧＩが５３．１％の水準であって、対照と比較して、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
【０３４５】
マウス：Crl:SHO-PrkdcscidHrhr
ＮＣＩ−Ｈ４６０モデル
０日目に、０．１ｍＬのＨＢＳＳ緩衝液に懸濁した５×１０６個のＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を０．５×２５ｍｍ針付きシリンジ（Bogmark）により、Crl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスの右側に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍のサイズが〜１５０−１７８ｍｍ３となったとき（１３日目）、
その群における腫瘍の平均サイズが〜１６０ｍｍ３となるように無作為に選び、処置群に割り当てた。処置群には、例８ｂの本発明の融合タンパク質調製物ＴＲＰ５（３０ｍｇ／ｋｇ）、および、対照としての処方緩衝液（５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、９５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１０％のグリセロール、８０ｍＭのサッカロース、ｐＨ８．０）に対する比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１（３０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。調製物を、隔日に６回静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。治療群の平均腫瘍サイズが〜１０００ｍｍ３に達したとき、マウスの脊髄を損壊して屠殺した。対照群には、ｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を与えた。
【０３４６】
例８ｂの本発明の融合タンパク質、および、比較としてｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１を処置されたＮＣＩ−Ｈ４６０肺がんを負ったCrl:SHO-PrkdcscidHrhrマウスにおいて得られた実験結果は、腫瘍体積の変化の図として図１９に、対照とのパーセンテージとしての腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）を図２０に示す。
【０３４７】
図１９および２０のグラフに示される実験の結果は、例８ｂの本発明の融合タンパク質の投与が、実験２８日目における対照と比較して、ＴＧＩが６１％で腫瘍ＮＣＩ−Ｈ４６０成長阻害を引き起こしたことを示す。比較参照として使用されたｒｈＴＲＡＩＬ１１４−２８１については、ＴＧＩが１７．５％の水準であって、対照と比較して、腫瘍細胞成長に対してわずかな阻害効果が得られた。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ単独の場合と比較して、より強力な効果を発揮する。
【０３４８】
テストされた融合タンパク質は、マウスの体重減少（すなわち、体重基準値の１０％より低下）にみられる有意な副作用を引き起こさなかった。このことは本タンパク質の低い全身毒性を示す。
【図１】
2014513943.tif 000018
【図２】
2014513943.tif 000019
【図３】
2014513943.tif 000020
【図４】
2014513943.tif 000021
【図５】
2014513943.tif 000022
【図６Ａ】
2014513943.tif 000023
【図６Ｂ】
2014513943.tif 000024
【図７】
2014513943.tif 000025
【図８】
2014513943.tif 000026
【図９】
2014513943.tif 000027
【図１０】
2014513943.tif 000028
【図１１】
2014513943.tif 000029
【図１２】
2014513943.tif 000030
【図１１ａ】
2014513943.tif 000031
【図１２ａ】
2014513943.tif 000032
【図１３】
2014513943.tif 000033
【図１４】
2014513943.tif 000034
【図１５】
2014513943.tif 000035
【図１６】
2014513943.tif 000036
【図１７】
2014513943.tif 000037
【図１８】
2014513943.tif 000038
【図１９】
2014513943.tif 000039
【図２０】
2014513943.tif 000040
【配列表】
2014513943000001.app
【国際調査報告】
2014513943.tif 000041
2014513943.tif 000042
2014513943.tif 000043
2014513943.tif 000044