(57)【要約】  本願発明は、乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）ドメイン含有ポリペプチド及び第二のポリペプチドを含んでいる融合タンパク質に関する。さらに、本発明は、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド、第二のポリペプチド、及び第三のポリペプチドを含んでいる融合タンパク質に関する。本発明の融合タンパク質の第二及び／又は第三のポリペプチドは、Ｆｃポリペプチド；アルブミンポリペプチド；サイトカイン標的ポリペプチド；又はセルピンポリペプチドである。本願発明はまた、さまざまな治療及び診断指標へのそのような分子の使用方法、及びそのような分子の製造方法にも関する。
2014528913.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の：
免疫グロブリンＦｃポリペプチド又は免疫グロブリンＦｃポリペプチドに由来するアミノ酸配列；
サイトカイン標的ポリペプチド又はサイトカイン標的ポリペプチドに由来する配列；
セルピンポリペプチド又はセルピンポリペプチドに由来する配列；又は
アルブミンポリペプチド又は血清アルブミンポリペプチドに由来するアミノ酸配列、
のうちの少なくとも１つから成る第二のポリペプチドに作動できるように連結された、少なくとも１つのヒトヒト乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）ドメイン含有ポリペプチドを含んでいる単離された融合タンパク質。
【請求項２】
次の：
免疫グロブリンＦｃポリペプチド；
サイトカイン標的ポリペプチド；
α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）ポリペプチド； 
α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃポリペプチド；並びに
ヒトアルブミン（ＨＳＡ）ポリペプチド、
のうちの少なくとも１つから成る第二のポリペプチドに作動できるように連結された、少なくとも１つのヒト分泌白血球プロテイナーゼインヒビタ（ＳＬＰＩ）ポリペプチドを含んでいる単離された融合タンパク質。
【請求項３】
次の：
免疫グロブリンＦｃポリペプチド；
サイトカイン標的ペプチド；
α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）ポリペプチド；
α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃポリペプチド；並びに
ヒトアルブミン（ＨＳＡ）ポリペプチド、
のうちの少なくとも１つから成る第二のポリペプチドに作動できるように連結された、少なくとも１つのヒトＥｌａｆｉｎポリペプチドを含んでいる単離された融合タンパク質。
【請求項４】
前記ヒトＳＬＰＩポリペプチドが、完全長のＳＬＰＩポリペプチドであるか、又はヒトＳＬＰＩポリペプチドに由来する、請求項２に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項５】
前記ＳＬＰＩポリペプチドが、配列番号１、２、及び３から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項６】
前記ヒトＥｌａｆｉｎポリペプチドが、完全長のＥｌａｆｉｎポリペプチドであるか、又はヒトＥｌａｆｒｎポリペプチドに由来する、請求項３に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項７】
前記Ｅｌａｆｉｎポリペプチドが、ところでは配列番号４、５、及び６から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３又は６に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項８】
前記免疫グロブリンＦｃポリペプチドが、ヒトＦｃポリペプチドである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項９】
前記ヒトのＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＭポリペプチド又はヒトＩｇＧポリペプチドである、請求項８に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ヒトＩｇＧ Ｆｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃポリペプチド、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃポリペプチド、又はヒトＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドである、請求項９に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１１】
前記免疫グロブリンＦｃポリペプチドが、配列番号７、８、９、１０、及び１１から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１２】
前記ＷＡＰドメイン含有ポリペプチドと免疫グロブリンＦｃポリペプチドが、ヒンジ領域、リンカー領域、又はヒンジ領域とリンカー領域の両方を介して作動できるように連結される、請求項１に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１３】
前記ＳＬＰＩポリペプチドと免疫グロブリンＦｃポリペプチドが、ヒンジ領域、リンカー領域、又はヒンジ領域とリンカー領域の両方を介して作動できるように連結される、請求項２〜４のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１４】
前記Ｅｌａｆｒｎポリペプチドと免疫グロブリンＦｃポリペプチドが、ヒンジ領域、リンカー領域、又はヒンジ領域とリンカー領域の両方を介して作動できるように連結される、請求項３又は６に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１５】
前記ヒンジ領域、リンカー領域、又はヒンジ領域とリンカー領域の両方が、ペプチド配列を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１６】
前記アルブミンポリペプチドが、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ポリペプチドであるか、又はＨＳＡポリペプチドに由来する、請求項１に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１７】
前記ＨＳＡポリペプチドが、配列番号１４のアミノ酸配列又は配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項２、３又は１６のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１８】
前記ＨＳＡポリペプチドが、ＨＳＡのドメイン３を含む、請求項２、３又は１６のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項１９】
前記ＷＡＰドメイン含有ポリペプチドが、アルブミン結合ポリペプチドを介してＨＳＡに作動できるように連結される、請求項１に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項２０】
前記アルブミン結合ポリペプチドが、抗体若しくは抗体断片であるか、又は抗体若しくは抗体断片に由来する、請求項１９に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項２１】
前記抗体又は抗体断片が、キメラ抗体又は抗体断片、ヒト化抗体又は抗体断片、或いは完全なヒト抗体又は抗体断片である、請求項２０に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項２２】
前記アルブミン結合ポリペプチドがペプチドである、請求項１９に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項２３】
前記アルブミン結合ポリペプチドが、連鎖球菌Ｇタンパク質のドメイン３又は連鎖球菌Ｇタンパク質のドメイン３に由来する配列である、請求項１９に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項２４】
前記ＷＡＰドメイン含有ポリペプチドが、ＨＳＡポリペプチドに共有結合により連結される、請求項１に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項２５】
前記ＷＡＰドメイン含有ポリペプチドが、ＨＳＡポリペプチドに非共有結合により連結される、請求項１に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項２６】
前記サイトカイン標的ポリペプチドが、サイトカイン受容体ポリペプチド又はサイトカイン受容体ポリペプチドの誘導体、サイトカイン受容体に結合するサイトカイン標的ポリペプチド、又はヒトサイトカインに結合するサイトカイン標的ポリペプチドである、請求項１、２、又は３のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項２７】
前記サイトカイン受容体が、ヒトサイトカイン受容体ポリペプチドである、請求項２６に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項２８】
前記ヒトサイトカイン受容体ポリペプチドが、複数のサブユニットを含む、請求項２７に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項２９】
前記ヒトサイトカイン受容体が、ＴＮＦα、ＩｇＥ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−６、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７、ＩＬ−１３、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３のｐ４０サブユニット、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７、又はＩＬ−３２の受容体である、請求項２７に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項３０】
前記サイトカイン標的ポリペプチドが、抗体又は抗体断片である、請求項２６に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項３１】
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全なヒト抗体である、請求項３０に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項３２】
前記ヒトサイトカインが、ＴＮＦα、ＩｇＥ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−６、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７、ＩＬ−１３、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３のｐ４０サブユニット、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７、又はＩＬ−３２である、請求項２６に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項３３】
前記サイトカインが、ヒトＴＮＦαである、請求項３２に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項３４】
前記ＡＡＴポリペプチドが、配列番号１３又は配列番号３８のアミノ酸配列を含む、請求項２又は項３に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項３５】
前記融合タンパク質が、セルピン、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド、及び免疫グロブリンＦｃポリペプチドを、該セルピン、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド、及び免疫グロブリンＦｃポリペプチドのうちの少なくとも２つが、ヒンジ領域、リンカー領域、又はヒンジ領域とリンカー領域の両方を介して作動できるように連結されるように含んでいる、請求項１に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項３６】
前記融合タンパク質が、ＡＡＴポリペプチド、ＳＬＰＩポリペプチド、及び免疫グロブリンＦｃポリペプチドを、該ＡＡＴポリペプチド、ＳＬＰＩポリペプチド、及び免疫グロブリンＦｃポリペプチドのうちの少なくとも２つが、ヒンジ領域、リンカー領域、又はヒンジ領域とリンカー領域の両方を介して作動できるように連結されるように含んでいる、請求項２に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項３７】
前記ヒンジ領域、リンカー領域、又はヒンジ領域とリンカー領域の両方が、ペプチド配列を含む、請求項３５又は３６に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項３８】
前記Ｆｃポリペプチドは、ＦｃＲｎ結合を増強するために修飾される、請求項１、２又は３のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項３９】
前記免疫グロブリンＦｃポリペプチドが、次の突然変異：Ｍｅｔ２５２Ｔｙｒ、Ｓｅｒ２５４Ｔｈｒ、Ｔｈｒ２５６Ｇｌｕ又はＭｅｔ４２８Ｌｅｕ、及びＡｓｎ４３４Ｓｅｒ、のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項４０】
前記融合タンパク質が、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、及び配列番号３７から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された融合タンパク質。
【請求項４１】
請求項１〜４０のいずれか１項に記載の融合タンパク質を投与することを含む、それを必要としている対象における異常なセリンプロテアーゼ発現又は活性に関連する疾患又は障害の症状を処置又は緩和する方法。
【請求項４２】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を投与することを含む、それを必要としている対象における炎症性疾患又は障害の症状を処置又は緩和する方法。
【請求項４３】
請求項１〜４２のいずれか１項に記載の融合タンパク質を投与することを含む、それを必要としている対象における感染性疾患又は障害の症状を処置又は緩和する方法。
【請求項４４】
前記対象がヒトである、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１１年６月２８日に出願された米国特許仮出願第６１／５０２０５２号；２０１１年１２月１日に出願された米国特許仮出願第６１／５６５６２５号；及び２０１２年４月２５日に出願された米国特許仮出願第６１／６３８１６８号；並びに２０１２年４月２６日に出願された米国特許仮出願第６１／６３８５１６号の利益を主張する。これらの出願それぞれの内容全体を参照により本明細書中に援用する。
本発明の分野
【０００２】
本願発明は、分子、特にポリペプチド、より特に乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）ドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来するアミノ酸配列と、第二のポリペプチドを含んでいる融合タンパク質に関する。さらに、本発明は、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来するアミノ酸配列、第二のポリペプチド、及び第三のポリペプチドを含んでいる融合タンパク質に関する。特に、本願発明は、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド及び第二のポリペプチドを含んでいる融合タンパク質、又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチド、第二のポリペプチド、及び第三のポリペプチドを含んでいる融合タンパク質に関し、ここで、本発明の融合タンパク質の第二及び第三のポリペプチドが、以下の：Ｆｃポリペプチド又はＦｃポリペプチドに由来するアミノ酸配列；アルブミンポリペプチド又はアルブミンポリペプチドに由来するアミノ酸配列；サイトカイン標的ポリペプチド又はサイトカイン標的ポリペプチドに由来するアミノ酸配列；及びセルピンポリペプチド又はセルピンポリペプチドに由来するアミノ酸配列、の少なくとも１種類である。本願発明はまた、さまざまな治療及び診断指標にそのような分子の使用方法、及びそのような分子の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
異常セリンプロテアーゼ活性又はプロテアーゼ対プロテアーゼ阻害物質の不均衡が、プロテアーゼ媒介性の組織破壊及び炎症反応に通じる。従って、異常セリンプロテアーゼ活性及び／又はプロテアーゼ対プロテアーゼ阻害物質の不均衡を標的とする治療薬と治療法の必要性が存在している。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書中に記載した融合タンパク質は、少なくとも乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）ドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来するアミノ酸配列（ポリペプチド１）及び第二のポリペプチド（ポリペプチド２）を含んでいる。さらに、本明細書中に記載した融合タンパク質は、乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）ドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来するアミノ酸配列（ポリペプチド１）、第二のポリペプチド（ポリペプチド２）、及び第三のポリペプチド（ポリペプチド３）を含んでいる。特に、本願発明は、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド及び第二のポリペプチド、又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチド、第二のポリペプチド、及び第三のポリペプチドを含んでいる融合タンパク質であって、そこで、該第二及び第三のポリペプチドが、次の：Ｆｃポリペプチド又はＦｃポリペプチドに由来するアミノ酸；アルブミンポリペプチド又はアルブミンポリペプチドに由来するアミノ酸配列；サイトカイン標的ポリペプチド又はサイトカイン標的ポリペプチドに由来するアミノ酸配列；及びセルピンポリペプチド又はセルピンポリペプチドに由来するアミノ酸配列、のうちの少なくとも１を含んでいる融合タンパク質に関する。
【０００５】
本明細書中で互換的に使用される場合、「融合タンパク質」と「融合ポリペプチド」という用語は、第二のポリペプチド又は少なくとも第二のポリペプチドに由来するアミノ酸配列に作動できるように連結されたＷＡＰドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来するアミノ酸配列を指す。融合タンパク質の個別化された要素は、例えば直接的な結合、中間体又はスペーサーペプチドの使用、リンカー領域の使用、ヒンジ領域の使用又はリンカーとヒンジ領域の両方の使用を含めたさまざまな方法のいずれでも連結できる。いくつかの実施形態において、リンカー領域は、ヒンジ領域の配列内に含まれていてもよいが、その代わりに、ヒンジ領域は、リンカー領域の配列内に含まれていてもよい。好ましくは、リンカー領域はペプチド配列である。例えば、リンカーペプチドは、０〜４０アミノ酸の範囲、例えば、０〜３５アミノ酸、０〜３０アミノ酸、０〜２５アミノ酸、又は０〜２０アミノ酸の範囲に含まれる。好ましくは、ヒンジ領域はペプチド配列である。例えば、ヒンジペプチドは、０〜７５アミノ酸の範囲、例えば０〜７０アミノ酸、０〜６５アミノ酸又は０〜６２アミノ酸の範囲に含まれる。融合タンパク質がリンカー領域及びヒンジ領域の両方を含む実施形態において、好ましくはリンカー領域及びヒンジ領域のそれぞれがペプチド配列である。これらの実施形態において、ヒンジペプチドとリンカーペプチドは一緒に、０〜９０アミノ酸の範囲、例えば、０〜８５アミノ酸又は０〜８２アミノ酸の範囲に含まれる。
【０００６】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質のＷＡＰドメインベースの部分及び第二のポリペプチドベースの部分は、中間結合（intermediate binding）ポリペプチドを通して非共有結合により連結できる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質のＷＡＰドメインベースの部分と第二のポリペプチドベースの部分は、非共有結合により連結されてもよい。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本発明による融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端方向へ又はＣ末端からＮ末端方向へ、以下の式のうちの１つを有している：
ポリペプチド１(a)−ヒンジm−ポリペプチド２(b)
ポリペプチド１(a)−リンカーn−ポリペプチド２(b)
ポリペプチド１(a)−リンカーn−ヒンジm−ポリペプチド２(b)
ポリペプチド１(a)−ヒンジm−リンカーn−ポリペプチド２(b)
ポリペプチド１(a)−ポリペプチド２(b)−ポリペプチド３(c)
ポリペプチド１(a)−ヒンジm−ポリペプチド２(b)−ヒンジm−ポリペプチド３(c)
ポリペプチド１(a)−リンカーn−ポリペプチド２(b)−リンカーn−ポリペプチド３(c)
ポリペプチド１(a)−ヒンジm−リンカーn−ポリペプチド２(b)−ヒンジm−リンカーn−ポリペプチド３(c)
ポリペプチド１(a)−リンカーn−ヒンジm−ポリペプチド２(b)−リンカーn−ヒンジm−ポリペプチド３(c)
式中、ｎは０〜２０の整数であり、ｍは１〜６２までの整数であり、そして、ａ、ｂ、及びｃは少なくとも１の整数である。これらの実施形態には、上記の式、及びその変形又は組み合わせのいずれもが含まれる。例えば、前記式のポリペプチドの順序には、ポリペプチド３(c)−ポリペプチド１(a)−ポリペプチド２(b)、ポリペプチド２(b)−ポリペプチド３(c)−ポリペプチド１(a)、又はその変形や組み合わせもまた含まれる。
【０００８】
いくつかの実施形態において、ポリペプチド１配列は、乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）ドメイン含有ポリペプチドを含んでいる。ＷＡＰドメインは、特徴的な４−ジスルフィドコア配置（４−ジスルフィドコアモチーフとも呼ばれる）内に見られる８つのシステインを含めた５０アミノ酸から成る進化的に保存された配列モチーフである。ＷＡＰドメイン配列モチーフは、多くのタンパク質におけるセリンプロテアーゼ阻害活性によって特徴づけられる機能的モチーフである。本明細書中で提供された融合タンパク質での使用に好適なＷＡＰドメイン含有ポリペプチドとしては、制限されることのない例によると、分泌型白血球プロテアーゼ阻害物質（ＳＬＰＩ）、Ｅｌａｆｉｎ、及びＥｐｐｉｎが挙げられる。
【０００９】
いくつかの実施形態において、ポリペプチド１配列は、分泌型白血球プロテアーゼ阻害物質（ＳＬＰＩ）ポリペプチド配列又はＳＬＰＩに由来するアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、ポリペプチド１配列は、例えば、ＷＡＰ２ドメイン又はその小部分などのＳＬＰＩタンパク質の一部を含む。好ましい実施形態において、ＳＬＰＩポリペプチド配列又はＳＬＰＩに由来するアミノ酸配列は、ヒトＳＬＰＩポリペプチド配列であるか又はヒトＳＬＰＩポリペプチド配列に由来する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列を有する完全長のヒトＳＬＰＩポリペプチド配列を含んでいる：
【化１】
2014528913.tif 000003
【００１１】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトＳＬＰＩポリペプチド配列を含んでいる。
【００１２】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、完全長のヒトＳＬＰＩポリペプチド配列の一部を含んでおり、そこで、該一部が以下のアミノ酸配列を有する：
【化２】
2014528913.tif 000004
【００１３】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトＳＬＰＩポリペプチド配列を含んでいる。
【００１４】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、完全長のヒトＳＬＰＩポリペプチド配列のＷＡＰ２ドメインを含んでおり、そこで、該ＷＡＰ２ドメインは以下のアミノ酸配列を有する：
【化３】
2014528913.tif 000005
【００１５】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトＳＬＰＩポリペプチド配列を含んでいる。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ＳＬＰＩポリペプチド配列又はＳＬＰＩポリペプチドに由来するアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ２８１８７．１、ＮＰ＿００３０５５．１、ＥＡＷ７５８６９．１、Ｐ０３９７３．２、ＡＡＨ２０７０８．１、ＣＡＢ６４２３５．１、ＣＡＡ２８１８８．１、ＡＡＤ１９６６１．１、及び／又はＢＡＧ３５１２５．１に示されているヒトＳＬＰＩポリペプチド配列の１若しくは複数に由来する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列を有する完全長のヒトエラフィンポリペプチド配列を含んでいる：
【化４】
2014528913.tif 000006
【００１８】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトエラフィンポリペプチド配列を含んでいる。
【００１９】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、完全長のヒトエラフィンポリペプチド配列の一部を含んでおり、そこで、該一部が以下のアミノ酸配列を有する： 
【化５】
2014528913.tif 000007
【００２０】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトエラフィンポリペプチド配列を含んでいる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、完全長のヒトエラフィンポリペプチド配列のＷＡＰドメインを含んでおり、そこで、該ＷＡＰドメインは以下のアミノ酸配列を有する：
【化６】
2014528913.tif 000008
【００２２】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトエラフィンポリペプチド配列を含んでいる。
【００２３】
いくつかの実施形態において、エラフィンポリペプチド配列又はエラフィンポリペプチドに由来するアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｐ１９９５７．３、ＮＰ＿００２６２９．１、ＢＡＡ０２４４１．１、ＥＡＷ７５８１４．１、ＥＡＷ７５８１３．１、Ｑ８ＩＵＢ２．１、及び／又はＮＰ＿５４２１８１．１に示されているヒトエラフィンポリペプチド配列の１若しくは複数に由来する。
【００２４】
いくつかの実施形態において、ポリペプチド１配列は、Ｅｐｐｉｎポリペプチド配列又はＥｐｐｉｎに由来するアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、ポリペプチド１配列は、例えば、ＷＡＰドメイン又はその小部分などのＥｐｐｉｎタンパク質の一部を含んでいる。好ましい実施形態において、Ｅｐｐｉｎポリペプチド配列又はＥｐｐｉｎに由来するアミノ酸配列は、ヒトＥｐｐｉｎポリペプチド配列に由来する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、Ｅｐｐｉｎポリペプチド配列又はＥｐｐｉｎポリペプチドに由来するアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｏ９５９２５．１、ＮＰ＿０６５１３１．１、ＡＡＨ４４８２９．２、ＡＡＨ５３３６９．１、ＡＡＧ００５４８．１、ＡＡＧ００５４７．１、及び／又はＡＡＧ００５４６．１に示されているヒトＥｐｐｉｎポリペプチド配列の１若しくは複数に由来する。
【００２６】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、１若しくは複数の突然変異を含んでいる。例えば、融合タンパク質は、融合タンパク質の非Ｆｃ部分、例えば、融合タンパク質のＳＬＰＩ部分に少なくとも１つのメチオニン（Ｍｅｔ）残基における突然変異を含んでいる。これらのＭｅｔ突然変異において、Ｍｅｔ残基は任意のアミノ酸によって置換される。例えば、Ｍｅｔ残基は、例えば、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）又はバリン（Ｖａｌ、Ｖ）などの疎水性側鎖を有するアミノ酸によって置換される。いかなる理論にも縛られることを望むものではないが、（単数若しくは複数の）Ｍｅｔ突然変異が、本発明の融合タンパク質の酸化とその後の阻害活性の不活性化を予防する。いくつかの実施形態において、Ｍｅｔ突然変異は、ＳＬＰＩポリペプチドの９８位である、例えば、Ｍｅｔ突然変異は、配列番号８のＭｅｔ９８Ｌｅｕ（Ｍ９８Ｌ）である。
【００２７】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、例えば、タンパク分解性切断部位を突然変異させることによって、タンパク質分解性切断を増やすか、そうでなければ、阻害するように修飾される。いくつかの実施形態において、タンパク質分解性切断部位の突然変異は、融合タンパク質のＳＬＰＩ部分の残基において生じる。例えば、タンパク質分解性切断部位の突然変異は、Ｓｅｒ１５、Ａｌａ１６、Ｇｌｕ１７、及びその組み合わせから選択される配列番号２のアミノ酸配列内の残基において生じる。
【００２８】
いくつかの実施形態において、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド融合タンパク質の第二のポリペプチド（ポリペプチド２）は、Ｆｃポリペプチド又はＦｃポリペプチドに由来する。これらの実施形態は、本明細書中ではまとめて「ＷＡＰ−Ｆｃ融合タンパク質」と呼ばれる。本明細書中に記載したＷＡＰ−Ｆｃ融合タンパク質は、少なくともＷＡＰドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来するアミノ酸配列、及びＦｃポリペプチド又はＦｃポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。
【００２９】
いくつかの実施形態において、ＷＡＰ−Ｆｃ融合タンパク質は、１つのＷＡＰドメイン含有ポリペプチドを含んでいる。他の実施形態において、ＷＡＰ−Ｆｃ融合タンパク質は、２つ以上ＷＡＰドメイン含有ポリペプチドを含んでおり、そして、これらの実施形態は、本明細書中ではまとめて「ＷＡＰ(a’)−Ｆｃ融合タンパク質」と呼ばれ、その中で、（ａ’）は少なくとも２の整数である。いくつかの実施形態において、ＷＡＰ(a’)−Ｆｃ融合タンパク質内のＷＡＰドメイン含有ポリペプチドは、同じアミノ酸配列を含み得る。
例えば、ＷＡＰ(a’)−Ｆｃ融合タンパク質のＷＡＰドメイン含有ポリペプチドは、ＳＬＰＩ又はＥｌａｆｉｎポリペプチドに由来し得るが、その両方に由来することはない（例えば、Ｅｌａｆｉｎ−Ｆｃ−Ｅｌａｆｉｎ又はＳＬＰＩ−Ｆｃ−ＳＬＰＩ）。他の実施形態において、ＷＡＰ(a’)−Ｆｃ融合タンパク質のＷＡＰドメイン含有ポリペプチドは、異なったアミノ酸配列を含み得る。例えば、融合タンパク質は、ＳＬＰＩ及びＥｌａｆｍの両方に由来するアミノ酸配列を組み込むことができる（例えば、ＳＬＰＩ−Ｆｃ−Ｅｌａｆｍ又はＥｌａｆｍ−Ｆｃ−ＳＬＰＩ）。
【００３０】
いくつかの実施形態において、ＷＡＰ−Ｆｃ融合タンパク質のＷＡＰドメイン含有ポリペプチドは、配列番号１〜６のアミノ酸配列のいずれかに由来する。いくつかの実施形態において、ＷＡＰ−Ｆｃ融合タンパク質のＷＡＰドメイン含有ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５又は６を有するアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも５０％と、６０％と、６５％持っている、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。
【００３１】
いくつかの実施形態において、ＷＡＰ−Ｆｃ融合タンパク質のＷＡＰドメイン含有ポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ２８１８７．１、ＮＰ＿００３０５５．１、ＥＡＷ７５８６９．１、Ｐ０３９７３．２、ＡＡＨ２０７０８．１、ＣＡＢ６４２３５．１、ＣＡＡ２８１８８．１、ＡＡＤ１９６６１．１、ＢＡＧ３５１２５．１．、Ｐ１９９５７．３、ＮＰ＿００２６２９．１、ＢＡＡ０２４４１．１、ＥＡＷ７５８１４．１、ＥＡＷ７５８１３．１、Ｑ８ＩＵＢ２．１、及び／又はΝΡ＿５４２１８１．１．、Ｏ９５９２５．１、ΝΡ＿０６５１３１．１、ΑΑΗ４４８２９．２、ＡＡＨ５３３６９．１、ＡＡＧ００５４８．１、ＡＡＧ００５４７．１、及び／又はＡＡＧ００５４６．１に示される配列であるか、又はそれらに由来する。
【００３２】
いくつかの実施形態において、ＷＡＰ−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、ヒトＦｃポリペプチド、例えばヒトＩｇＧ Ｆｃポリペプチド配列又はヒトＩｇＧ Ｆｃポリペプチド配列に由来するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド又はヒトＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド配列に由来するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃポリペプチド又はヒトＩｇＧ２ Ｆｃポリペプチド配列に由来するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃポリペプチド又はヒトＩｇＧ３ Ｆｃポリペプチド配列に由来するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド又はヒトＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド配列に由来するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＭ Ｆｃポリペプチド又はヒトＩｇＭ Ｆｃポリペプチド配列に由来するアミノ酸配列である。
【００３３】
本発明の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含んでいるいくつかの実施形態において、融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド配列を含んでいる：
【化７】
2014528913.tif 000009
【００３４】
本発明の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含んでいるいくつかの実施形態において、融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド配列を含んでいる。
【００３５】
本発明の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含んでいるいくつかの実施形態において、融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ２ Ｆｃポリペプチド配列を含んでいる：
【化８】
2014528913.tif 000010
【００３６】
本発明の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含んでいるいくつかの実施形態において、
融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトＩｇＧ２ Ｆｃポリペプチド配列を含んでいる。
【００３７】
本発明の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含んでいるいくつかの実施形態において、融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ３ Ｆｃポリペプチド配列を含んでいる：
【化９】
2014528913.tif 000011
【００３８】
本発明の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含んでいるいくつかの実施形態において、融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトＩｇＧ３ Ｆｃポリペプチド配列を含んでいる。
【００３９】
本発明の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含んでいるいくつかの実施形態において、融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド配列を含んでいる：
【化１０】
2014528913.tif 000012
【００４０】
本発明の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含んでいるいくつかの実施形態において、融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド配列を含んでいる。
【００４１】
本発明の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含んでいるいくつかの実施形態において、融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＭ Ｆｃポリペプチド配列を含んでいる：
【化１１】
2014528913.tif 000013
【００４２】
本発明の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含んでいるいくつかの実施形態において、融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトＩｇＭ Ｆｃポリペプチド配列を含んでいる。
【００４３】
本明細書中に提供された融合タンパク質のいくつかの実施形態において、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド融合タンパク質の第二のポリペプチド（ポリペプチド２）は、サイトカイン標的ポリペプチド又はサイトカイン標的ポリペプチドに由来するものである。これらの実施形態は、本明細書中でまとめて「ＷＡＰ−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質」と呼ばれる。本明細書中に記載したＷＡＰ−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質は、少なくともＷＡＰドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来するアミノ酸配列、及びサイトカイン標的ポリペプチド、又はその誘導体を含んでいる。いくつかの実施形態において、ＷＡＰ−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質は、１つのＷＡＰドメイン含有ポリペプチドを含んでいる。他の実施形態において、ＷＡＰ−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質は、２つ以上ＷＡＰドメイン含有ポリペプチドを含んでおり、そして、これらの実施形態は、本明細書中でまとめて「ＷＡＰ(a’)−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質」と呼ばれ、その中で、（ａ’）は少なくとも２の整数である。いくつかの実施形態において、ＷＡＰ−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質内のそれぞれのＷＡＰドメイン含有ポリペプチドは、同じアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態において、ＷＡＰ(a’)−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質内のそれぞれのＷＡＰドメイン含有ポリペプチドは、異なったアミノ酸配列を含み得る。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ＷＡＰ−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質のＷＡＰドメイン含有ポリペプチドは、配列番号１〜６のアミノ酸配列のいずれか１つに由来する。いくつかの実施形態において、ＷＡＰ−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質のＷＡＰドメイン含有ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５又は６を有するアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ＷＡＰ−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質のＷＡＰドメイン含有ポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ２８１８７．１、ＮＰ＿００３０５５．１、ＥＡＷ７５８６９．１、Ｐ０３９７３．２、ＡＡＨ２０７０８．１、ＣＡＢ６４２３５．１、ＣＡＡ２８１８８．１、ＡＡＤ１９６６１．１、ＢＡＧ３５１２５．１、Ｐ１９９５７．３、ＮＰ＿００２６２９．１、ＢＡＡ０２４４１．１、ＥＡＷ７５８１４．１、ＥＡＷ７５８１３．１、Ｑ８ＩＵＢ２．１、及び／又はＮＰ＿５４２１８１．１．、Ｏ９５９２５．１、ＮＰ＿０６５１３１．１、ＡＡＨ４４８２９．２、ＡＡＨ５３３６９．１、ＡＡＧ００５４８．１、ＡＡＧ００５４７．１、及び／又はＡＡＧ００５４６．１に示されている配列であるか、又はそれらに由来する。
【００４６】
いくつかの実施形態において、ＷＡＰ−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質のサイトカイン標的ポリペプチドは、サイトカイン受容体又はサイトカイン受容体に由来するものである。好ましい実施形態において、サイトカイン標的ポリペプチド又はサイトカイン受容体に由来するアミノ酸配列は、ヒトサイトカイン受容体配列であるか、又はヒトサイトカイン受容体配列に由来する。他の実施形態において、サイトカイン標的ポリペプチドは、抗体又は抗体断片、例えば、抗サイトカイン抗体又は抗サイトカイン抗体断片である。抗体断片という用語には、一本鎖、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、及び単一ドメイン軽鎖抗体が含まれる。
好ましい実施形態において、サイトカイン標的ポリペプチド又は抗体若しくは抗体断片に由来するアミノ酸配列は、キメラ抗体配列、ヒト化抗体配列、又は完全なヒト抗体配列に由来する。他の実施形態において、サイトカイン標的ポリペプチドは、サイトカイン受容体に結合し、サイトカインの受容体への結合を妨げる。
【００４７】
ＷＡＰ−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質には、ＷＡＰ−Ｆｃ融合タンパク質の一部を組み込むことができる。例えば、抗体はＦｃポリペプチドを含んでいる。そのため、サイトカイン標的ポリペプチドがサイトカイン標的抗体であるいくつかの実施形態において、ＷＡＰ−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質には、ＷＡＰ−Ｆｃ融合タンパク質の一部を組み込む。さらに、治療的に有用なものである受容体融合タンパク質のほとんどが、Ｆｃ融合タンパク質である。これにより、ＷＡＰ−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質がＷＡＰ−サイトカイン受容体融合タンパク質であるいくつかの実施形態において、ＷＡＰ−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質には、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド部分及びサイトカイン受容体部分に加えて、Ｆｃポリペプチドを組み込むこともできる。
【００４８】
ＷＡＰ−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質がＦｃポリペプチド配列を含んでいるいくつかの実施形態において、該Ｆｃポリペプチド配列は、配列番号７、８、９、１０、又は１１を有するアミノ酸配列のいずれか１つに由来する。ＷＡＰ−サイトカイン標的融合タンパク質がＦｃポリペプチド配列を含んでいるいくつかの実施形態において、該Ｆｃポリペプチド配列は、配列番号７、８、９、１０、又は１１の配列のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。
【００４９】
いくつかの実施形態において、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチドとサイトカイン標的ポリペプチドは、リンカー領域、例えば、グリシン−セリンリンカー又はグリシン−セリンベースのリンカーを介して作動できるように連結されている。いくつかの実施形態において、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチドとサイトカイン標的ポリペプチドは、ヒンジ領域を介して作動できるように連結されている。いくつかの実施形態において、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチドとサイトカイン標的ポリペプチドは、リンカー領域及びヒンジ領域を介して作動できるように連結されている。他の実施形態において、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチドとサイトカイン標的ポリペプチドは、直接結合されている。
【００５０】
本明細書中に提供する融合タンパク質のいくつかの実施形態において、ＷＡＰドメイン含有融合タンパク質の第二のポリペプチド（ポリペプチド２）は、セルピンポリペプチドであるか、又はセルピンポリペプチドに由来する。これらの実施形態は、本明細書中ではまとめて「ＷＡＰ−セルピン融合タンパク質」と呼ばれる。本明細書中に記載したＷＡＰ−セルピン融合タンパク質は、少なくともＷＡＰドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来するアミノ酸配列、及びセルピンポリペプチド又はセルピンポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、ＷＡＰ−セルピン融合タンパク質のＷＡＰドメイン含有ポリペプチドは、配列番号１〜６のアミノ酸配列のいずれか１つに由来する。いくつかの実施形態において、ＷＡＰ−セルピン融合タンパク質のＷＡＰドメイン含有ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５又は６を有するアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。
【００５２】
いくつかの実施形態において、ＷＡＰ−セルピン融合タンパク質のＷＡＰドメイン含有ポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ２８１８７．１、ＮＰ＿００３０５５．１、ＥＡＷ７５８６９．１、Ｐ０３９７３．２、ＡＡＨ２０７０８．１、ＣＡＢ６４２３５．１、ＣＡＡ２８１８８．１、ＡＡＤ１９６６１．１、ＢＡＧ３５１２５．１、Ｐ１９９５７．３、ＮＰ＿００２６２９．１、ＢＡＡ０２４４１．１、ＥＡＷ７５８１４．１、ＥＡＷ７５８１３．１、Ｑ８ＩＵＢ２．１、及び／又はＮＰ＿５４２１８１．１、Ｏ９５９２５．１、ＮＰ＿０６５１３１．１、ＡＡＨ４４８２９．２、ＡＡＨ５３３６９．１、ＡＡＧ００５４８．１、ＡＡＧ００５４７．１、及び／又はＡＡＧ００５４６．１に示されている配列であるか、又はそれらに由来する。
【００５３】
本明細書中に記載したＷＡＰ−セルピン融合タンパク質は、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド、及びセルピンポリペプチド又はセルピンポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。セルピンは、プロテアーゼを阻害することができる１連のタンパク質として最初に同定された、類似構造を有するタンパク質の一群である。本明細書中に提供された融合タンパク質における使用に好適なセルピンタンパク質としては、制限されることのない例によると、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）、アンチトリプシン関連タンパク質（ＳＥＲＰＩＮＡ２）、α１抗キモトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ３）、カリスタチン（ＳＥＲＰＩＮＡ４）、単球好中球エラスターゼ阻害剤（ＳＥＲＰＩＮＢ１）、ＰＩ−６（ＳＥＲＰＩＮＢ６）、アンチトロンビン（ＳＥＲＰＩＮＣ１）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＳＥＲＰＩＮＥ１）、α２抗プラスミン（ＳＥＲＰＩＮＦ２）、補体１阻害物質（ＳＥＲＰＩＮＧ１）、及びニューロセルピン（ＳＥＲＰＩＮＩ１）が挙げられる。
【００５４】
いくつかの実施形態において、セルピンポリペプチド配列は、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）ポリペプチド配列又はＡＡＴに由来するアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、セルピンポリペプチド配列は、ＡＡＴタンパク質の一部を含んでいる。いくつかの実施形態において、セルピンポリペプチド配列は、少なくともＡＡＴタンパク質の反応部位ループ部分を含んでいる。本発明の融合タンパク質がセルピンポリペプチドを含んでいるいくつかの実施形態において、融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、ＡＡＴタンパク質の反応部位ループ部分を含んでいるか、又は少なくとも以下のアミノ酸配列を含んでいる：
【化１２】
2014528913.tif 000014
好ましい実施形態において、ＡＡＴポリペプチド配列又はＡＡＴに由来するアミノ酸配列は、ヒトＡＡＴポリペプチド配列であるか又はヒトＡＡＴポリペプチド配列に由来する。
本発明の融合タンパク質がセルピンポリペプチドを含んでいるいくつかの実施形態において、融合タンパク質のセルピンポリペプチドは、ＡＡＴタンパク質の反応部位ループ部分の修飾された変異型を含んでいるか、又は少なくとも以下のアミノ酸配列を含んでいる：
【化１３】
2014528913.tif 000015
【００５５】
ＷＡＰ−セルピン融合タンパク質のいくつかの実施形態において、セルピンポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する完全長のヒトＡＡＴポリペプチド配列を含んでいる：
【化１４】
2014528913.tif 000016
【００５６】
ＷＡＰ−セルピン融合タンパク質のいくつかの実施形態において、セルピンポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒトＡＡＴポリペプチド配列を含んでいる。
【００５７】
ＷＡＰ−セルピン融合タンパク質のいくつかの実施形態において、セルピンポリペプチドは、ＡＡＴポリペプチド配列又はＡＡＴポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいるか、又はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＢ５９４９５．１、ＣＡＪ１５１６１．１、Ｐ０１００９．３、ＡＡＢ５９３７５．１、ＡＡＡ５１５４６．１、ＣＡＡ２５８３８．１、ＮＰ＿００１００２２３５．１、ＣＡＡ３４９８２．１、ＮＰ＿００１００２２３６．１、ＮＰ＿０００２８６．３、ＮＰ＿００１１２１１７９．１、ＮＰ＿００１１２１１７８．１、ＮＰ＿００１１２１１７７．１、ＮＰ＿００１１２１１７６．１６、ＮＰ＿００１１２１１７５．１、ＮＰ＿００１１２１１７４．１、ＮＰ＿００１１２１１７２．１に示されているヒトＡＡＴポリペプチド配列の１若しくは複数に由来する。
【００５８】
いくつかの実施形態において、ＷＡＰ−セルピンドメイン融合タンパク質はまた、Ｆｃポリペプチド又はＦｃポリペプチドに由来するアミノ酸配列も含んでいる。これらの実施形態は、本明細書中ではまとめて「ＷＡＰ−Ｆｃ−セルピン融合タンパク質」と呼ばれる。これらの実施形態において、この専門用語によって特定の順序と解釈さるものではない。例えば、融合タンパク質の順序は、ＷＡＰ−Ｆｃ−セルピン、セルピン−ＷＡＰ−Ｆｃ、又はそれらの任意の変形若しくは組み合わせであり得る。本明細書中に記載したＷＡＰ−Ｆｃ−セルピン融合タンパク質は、少なくともＷＡＰドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来するアミノ酸配列、セルピンポリペプチド又はセルピンポリペプチドに由来するアミノ酸配列、及びＦｃポリペプチド又はＦｃポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。
【００５９】
ＷＡＰ−セルピンポリペプチド融合タンパク質がＦｃポリペプチド配列を含んでいるいくつかの実施形態において、Ｆｃポリペプチド配列は、配列番号７、８、９、１０、又は１１を有するアミノ酸配列のいずれか１つに由来する。ＷＡＰ−セルピン融合タンパク質がＦｃポリペプチド配列を含んでいるいくつかの実施形態において、Ｆｃポリペプチド配列は、配列番号７、８、９、１０、又は１１の配列のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。
【００６０】
いくつかの実施形態において、ＷＡＰ−セルピンドメイン融合タンパク質はまた、アルブミンポリペプチド又はアルブミンポリペプチドに由来するアミノ酸配列も含んでいる。これらの実施形態は、本明細書中ではまとめて「ＷＡＰ−アルブミン−セルピン融合タンパク質」と呼ばれる。これらの実施形態において、この専門用語によって特定の順序と解釈さるものではない。例えば、融合タンパク質の順序は、ＷＡＰ−アルブミン−セルピン、セルピン−アルブミン−ＷＡＰ、又はそれらの任意の変形若しくは組み合わせであり得る。本明細書中に記載したＷＡＰ−アルブミン−セルピン融合タンパク質は、少なくともＷＡＰドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来するアミノ酸配列、セルピンポリペプチド又はセルピンに由来するアミノ酸配列、及びアルブミンポリペプチド又はアルブミンポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。
【００６１】
ＷＡＰ−セルピンドメイン融合タンパク質がアルブミンポリペプチド配列を含んでいるいくつかの実施形態において、アルブミンポリペプチド配列は、本明細書中に記載した配列番号１４〜１５のアミノ酸配列のいずれか１つに由来する。セルピン−ＷＡＰドメイン融合タンパク質がアルブミンポリペプチド配列を含んでいる他の実施形態において、アルブミンポリペプチド配列は、配列番号１４又は１５のアミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。
【００６２】
本明細書中に提供した融合タンパク質のいくつかの実施形態において、ＷＡＰドメイン含有融合タンパク質の第二のポリペプチド（ポリペプチド２）は、アルブミンポリペプチドであるか又はアルブミンポリペプチドに由来する。これらの実施形態は、本明細書中ではまとめて「ＷＡＰ−アルブミン融合タンパク質」と呼ばれる。本明細書中に記載したＷＡＰ−アルブミン融合タンパク質は、少なくともＷＡＰドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来するアミノ酸配列、及びアルブミンポリペプチド又はアルブミンポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。加えて、本願発明は、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド−アルブミン結合ポリペプチド融合タンパク質に関し、そこで、該アルブミンは中間結合分子を介してＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに作動できるように連結されている。本明細書中では、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチドは、ヒト血清アルブミンに非共有結合しているか又は共有結合している。
【００６３】
いくつかの実施形態において、ＷＡＰ−アルブミン融合タンパク質のＷＡＰドメイン含有ポリペプチドは、配列番号１〜６のアミノ酸配列のいずれか１つに由来する。いくつかの実施形態において、ＷＡＰ−アルブミン融合タンパク質のＷＡＰドメイン含有ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５又は６を有するアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。
【００６４】
いくつかの実施形態において、ＷＡＰ−アルブミン融合タンパク質のＷＡＰドメイン含有ポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ２８１８７．１、ＮＰ＿００３０５５．１、ＥＡＷ７５８６９．１、Ｐ０３９７３．２、ＡＡＨ２０７０８．１、ＣＡＢ６４２３５．１、ＣＡＡ２８１８８．１、ＡＡＤ１９６６１．１、ＢＡＧ３５１２５．１、Ｐ１９９５７．３、ＮＰ＿００２６２９．１、ＢＡＡ０２４４１．１、ＥＡＷ７５８１４．１、ＥＡＷ７５８１３．１、Ｑ８ＩＵＢ２．１、及び／又はＮＰ＿５４２１８１．１、Ｏ９５９２５．１、ＮＰ＿０６５１３１．１、ＡＡＨ４４８２９．２、ＡＡＨ５３３６９．１、ＡＡＧ００５４８．１、ＡＡＧ００５４７．１、及び／又はＡＡＧ００５４６．１に示されている配列であるか、又はそれらに由来する。
【００６５】
本発明の融合タンパク質がアルブミンポリペプチド配列を含んでいるいくつかの実施形態において、融合タンパク質のアルブミンポリペプチド配列は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ポリペプチド又はＨＳＡに由来するアミノ酸配列である。本発明の融合タンパク質が融合タンパク質のアルブミンポリペプチド配列を含んでいるいくつかの実施形態において、融合タンパク質のアルブミンポリペプチド配列は、以下のアミノ酸配列を有するＨＳＡポリペプチド配列を含んでいる：
【化１５】
2014528913.tif 000017
【００６６】
本発明の融合タンパク質がアルブミンポリペプチド配列を含んでいるいくつかの実施形態において、融合タンパク質のアルブミンポリペプチド配列は、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％の＞、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒト血清アルブミンポリペプチド配列を含んでいる。
【００６７】
ＷＡＰアルブミン融合タンパク質のいくつかの実施形態において、アルブミンポリペプチド配列は、以下のアミノ酸配列を有するヒト血清アルブミンポリペプチド配列のドメイン３を含んでいる：
【化１６】
2014528913.tif 000018
【００６８】
ＷＡＰ−アルブミン融合タンパク質のいくつかの実施形態において、アルブミンポリペプチド配列は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％の＞、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヒト血清アルブミンポリペプチド配列を含んでいる。
【００６９】
いくつかの実施形態において、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチドは、中間アルブミン結合ポリペプチドを介してヒト血清アルブミンに連結される。アルブミン結合ポリペプチドは、抗体若しくは抗体断片又は抗体若しくは抗体断片に由来するものであることができる。好ましい実施形態において、アルブミン結合ポリペプチド又は抗体若しくは抗体断片に由来するアミノ酸配列は、キメラ抗体配列、ヒト化抗体配列、又は完全なヒト抗体配列に由来する。抗体断片という用語には、一本鎖、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、及び単一ドメイン軽鎖抗体が含まれる。加えて、アルブミン結合ポリペプチドはアルブミン結合ペプチドであり得る。本願発明の別の実施形態は、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド−アルブミン結合ポリペプチド融合物であり、そこで、該アルブミン結合ポリペプチドは、連鎖球菌（Streptococcal）Ｇタンパク質のドメイン３であるか、又は連鎖球菌Ｇタンパク質のドメイン３に由来する配列である。他の実施形態において、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチドとヒト血清アルブミンは、直接結合される。
【００７０】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、１若しくは複数の突然変異を含んでいる。例えば、融合タンパク質は、融合タンパク質の非Ｆｃ部分、例えば、融合タンパク質のＳＬＰＩ部分に少なくとも１つのメチオニン（Ｍｅｔ）残基における突然変異を含んでいる。これらのＭｅｔ突然変異において、Ｍｅｔ残基は任意のアミノ酸によって置換される。例えば、Ｍｅｔ残基は、例えば、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）又はバリン（Ｖａｌ、Ｖ）などの疎水性側鎖を有するアミノ酸によって置換される。いかなる理論にも縛られることを望むものではないが、（単数若しくは複数の）Ｍｅｔ突然変異が、本発明の融合タンパク質の酸化とその後の阻害活性の不活性化を予防する。いくつかの実施形態において、Ｍｅｔ突然変異は、ＳＬＰＩポリペプチドの９８位である。例えば、配列番号８のアミノ酸配列内の残基で生じるＭｅｔ突然変異は、Ｍｅｔ９８Ｌｅｕ（Ｍ９８Ｌ）である。
【００７１】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、例えば、タンパク分解性切断部位を突然変異させることによって、タンパク質分解性切断を増やすか、そうでなければ、阻害するように修飾される。いくつかの実施形態において、タンパク質分解性切断部位の突然変異は、融合タンパク質のＳＬＰＩ部分の残基において生じる。例えば、タンパク質分解性切断部位の突然変異は、Ｓｅｒ１５、Ａｌａ１６、Ｇｌｕ１７、及びその組み合わせから選択される配列番号２のアミノ酸配列内の残基において生じる。
【００７２】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、融合タンパク質のＦｃエフェクター機能を変更するか、そうでなければ、調節するように修飾されてはいるが、変更のない融合タンパク質と比較して結合及び阻害機能を同時に持ち続けている。Ｆｃエフェクター機能としては、制限されることのない例によると、Ｆｃ受容体結合性、Ｆｃ受容体結合時の炎症誘発性メディエータ放出の予防、食作用、修飾された抗体依存性細胞媒介細胞障害作用（ＡＤＣＣ）、修飾された補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）、ＦｃポリペプチドのＡｓｎ２９７残基（Ｋａｂａｔ付番のＥＵインデックス、Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest）における修飾されたグリコシル化反応が挙げられる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、Ｆｃ受容体結合性に影響を及ぼすように突然変異されるか、そうでなければ、修飾される。いくつかの実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、ＦｃＲｎ結合を増強するように修飾される。ＦｃＲｎへの結合を増強するＦｃポリペプチド突然変異の例は、Ｍｅｔ２５２Ｔｙｒ、Ｓｅｒ２５４Ｔｈｒ、Ｔｈｒ２５６Ｇｌｕ（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５６Ｔ、Ｔ２５６Ｅ）（Ｋａｂａｔ付番、Dall'Acqua et al 2006, J. Biol Chem Vol 281(33) 23514-23524）、又はＭｅｔ４２８Ｌｅｕ及びＡｓｎ４３４Ｓｅｒ（Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ）（Zalevsky et al 2010 Nature Biotech, Vol. 28(2) 157-159）（Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological InterestのＥＵインデックス）である。
【００７３】
本明細書中に提供される融合タンパク質及びその変異型は、例えば、ヒト好中球エラスターゼ（ＮＥ）、炎症反応中に好中球によって分泌されるケモトリプシン折り畳みセリンプロテアーゼなどのセリンプロテアーゼを阻害することによって、阻害活性を提供した。本明細書中に提供された融合タンパク質は、セリンプロテアーゼ発現、又はセリンプロテアーゼ、例えば、ヒトセリンプロテアーゼとの結合、そうでなければ、相互作用による活性を、完全に又は部分的に低減するか、そうでなければ、調節する。セリンプロテアーゼの生物学的機能の低減又は調節は、完全に又は部分的に、融合タンパク質と、ヒトセリンプロテアーゼタンパク質、ポリペプチド、及び／又はペプチドとの相互作用によるものである。融合タンパク質の存在下でセリンプロテアーゼ発現又は活性のレベルが、本明細書中に記載した融合タンパク質との相互作用、例えば、結合がない場合のセリンプロテアーゼ発現又は活性のレベルと比較して、少なくとも９５％、例えば、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％減少するとき、融合タンパク質がセリンプロテアーゼの発現又は活性を完全に阻害すると見なされる。融合タンパク質の存在下でセリンプロテアーゼの発現又は活性のレベルが、本明細書中に記載した融合タンパク質との相互作用、例えば、結合がない場合のセリンプロテアーゼの発現又は活性のレベルと比較して、９５％未満、例えば、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％又は９０％減少するとき、融合タンパク質がセリンプロテアーゼの発現又は活性をに部分的に阻害したと見なされる。
【００７４】
本明細書中に記載した融合タンパク質は、さまざまな治療学的、診断的、及び予防的適応症で有用である。例えば、融合タンパク質は、対象のさまざまな疾患及び障害を治療するのに有用である。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した融合タンパク質は、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠乏、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、アレルギー性喘息、嚢胞性繊維症、肺癌、例えば、心臓移植後の虚血／再潅流損傷を含めた虚血再灌流障害、心筋梗塞、関節炎、関節リウマチ、敗血症性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、乾癬、Ｉ型及び／又はＩＩ型糖尿病、細菌感染症、真菌感染症、ウイルス感染症、肺炎、敗血症、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、創傷治癒、全身性エリテマトーデス、及び多発性硬化症から選択される疾患又は障害に罹患しているか又はその危険性が高いと判断された対象の疾患又は障害の症状を治療、緩和する、それらの進行を改善する及び／又は遅らせるのに有用である。
【００７５】
本明細書中に提供される融合タンパク質及びその変異型は、セリンプロテアーゼを阻害することによって、阻害活性を提供した。本明細書中に提供された融合タンパク質は、セリンプロテアーゼ発現、又はセリンプロテアーゼ、例えば、ヒトセリンプロテアーゼとの結合、そうでなければ、相互作用による活性を、完全に又は部分的に低減するか、そうでなければ、調節する。セリンプロテアーゼの生物学的機能の低減又は調節は、完全に又は部分的に、融合タンパク質と、ヒトセリンプロテアーゼタンパク質、ポリペプチド、及び／又はペプチドとの相互作用によるものである。融合タンパク質の存在下でセリンプロテアーゼ発現又は活性のレベルが、本明細書中に記載した融合タンパク質との相互作用、例えば、結合がない場合のセリンプロテアーゼ発現又は活性のレベルと比較して、少なくとも９５％、例えば、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％減少するとき、融合タンパク質がセリンプロテアーゼの発現又は活性を完全に阻害すると見なされる。融合タンパク質の存在下でセリンプロテアーゼの発現又は活性のレベルが、本明細書中に記載した融合タンパク質との相互作用、例えば、結合がない場合のセリンプロテアーゼの発現又は活性のレベルと比較して、９５％未満、例えば、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％又は９０％減少するとき、融合タンパク質がセリンプロテアーゼの発現又は活性をに部分的に阻害したと見なされる。
【００７６】
本発明による医薬組成物は、修飾された融合タンパク質や他の変異型を含めた本発明の融合タンパク質を、好適な担体と共に含んでいる。これらの医薬組成物は、例えば、診断キットなどのキットに含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１Ａ】本発明によるＷＡＰドメイン含有ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質のいくつかの実施形態の略図である。ＷＡＰドメイン含有ポリペプチドは、融合タンパク質内の任意の位置に配置できる。２つ以上のＷＡＰドメイン含有ポリペプチドを組み込んだこれらの融合タンパク質の変異型もまた示されている。
【図１Ｂ】Ｅｌａｆｍ−Ｆｃ１（レーン１）、及びＳＬＰＩ−Ｆｃ１（レーン２、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ）を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【図１Ｃ】Ｅｌａｆｍ−Ｆｃ及びＳＬＰＩ−Ｆｃ融合タンパク質による好中球エラスターゼ活性の阻害を示すグラフである。
【図１Ｄ】Ｅｌａｆｍ−Ｆｃ−ＳＬＰＩから成る融合タンパク質を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【図１Ｅ】Ｅｌａｆｍ−Ｆｃ−ＳＬＰＩによる好中球エラスターゼ活性の阻害を示すグラフである。血清由来ＡＡＴはＮＥ阻害の対照として示されている。
【図１Ｆ】１０ｍｇ／ｋｇタンパク質を投与したラット（試験タンパク質につき３匹）においてＳＬＰＩ−Ｆｃと比較した、遺伝子組み換えＳＬＰＩの経時的血清中濃度を示すグラフである。ＳＬＰＩ−Ｆｃの半減期は、遺伝子組み換えＳＬＰＩの半減期より実質的に長い。
【００７８】
【図２Ａ】本発明のＷＡＰドメイン含有ポリペプチド−サイトカイン標的融合タンパク質のいくつかの実施形態の略図である。ＷＡＰドメイン含有ポリペプチドは、抗体の重鎖、軽鎖、又は両方に融合されることができる。ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド−サイトカイン受容体融合タンパク質もまた示されている。
【図２Ｂ】Ｄ２Ｅ７抗体（レーン１）、重鎖に融合した−ＳＬＰＩを有するＤ２Ｅ７抗体（レーン２）、及び軽鎖に融合したＳＬＰＩを有するＤ２Ｅ７抗体（レーン３）を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【図２Ｃ】重鎖又は軽鎖のいずれかのＳＬＰＩに融合したＤ２Ｅ７抗体による好中球エラスターゼ活性の阻害を示すグラフである。血清由来ＡＡＴが正の対照として示されている一方で、Ｄ２Ｅ７抗体単独はＮＥ阻害の負の対照として示されている。
【００７９】
【図３Ａ】セルピン−Ｆｃ−ＷＡＰ融合タンパク質のいくつかの実施形態の略図である。
【図３Ｂ】ＡＡＴ−Ｆｃ−Ｅｌａｆｉｎ（レーン１）及びＡＡＴ−Ｆｃ−ＳＬＰＩ（レーン２）を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【図３Ｃ】ＡＡＴ−Ｆｃ−Ｅｌａｆｉｎ融合タンパク質及びＡＡＴ−Ｆｃ−ＳＬＰＩ融合タンパク質による好中球エラスターゼ活性の阻害を示すグラフである。ＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質及び血清由来ＡＡＴが比較のために含まれている。
【００８０】
【図４】ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド−ＨＳＡ融合タンパク質のいくつかの実施形態の略図である。  発明の詳細な説明
【００８１】
乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）ドメインは、４つのジスルフィド結合を形成する規定された位置の８つの保存されたシステインを特徴とする約５０アミノ酸のモチーフである（Ranganathan et al 1999 J. Mol. Graphics Modell. 17, 134-136）。ＷＡＰドメインの最もよく特徴づけされている機能は、セリンプロテアーゼ阻害である。いくつかのＷＡＰドメイン含有タンパク質が、複数の上皮；体表の自然免疫防御にかかわっている（Abe et al 1991 J. Clin. Invest. 87(6): 2207-15; Maruyama et al 1994 J Clin Invest. 94(l):368-375; Si-Tahar et al 2000 Gastroenterology 118(6): 1061-71; King et al 2003 Reproductive Biology and Endocrinology 1 : 116）。これらのタンパク質のいくつかが、抗菌作用を有することが示された。代表的なＷＡＰドメイン含有タンパク質は、分泌型白血球プロテアーゼ阻害物質（ＳＬＰＩ）、Ｅｌａｆｉｎ、及びＥｐｐｉｎである。
【００８２】
ＳＬＰＩ及びＥｌａｆｉｎの遺伝子は、ｔｒａｐｐｉｎ遺伝子ファミリーのメンバーである。ｔｒａｐｐｉｎ遺伝子のメンバーによってコードされるタンパク質は、Ｎ末端のトランスグルタミナーゼドメイン基質とＣ末端のＷＡＰドメインを特徴とする（Schalkwijk et al 1999 Biochem. J. 340:569-577）。ＳＬＰＩ及びＥｌａｆｉｎは、好中球セリンプロテアーゼの阻害物質であるが、わずかに異なった標的プロテアーゼをさらに有する。ＳＬＰＩ及びＥｌａｆｉｎは共に好中球エラスターゼの強力な阻害物質である一方で、ＳＬＰＩはまた、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−３ではなく、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｇも阻害し、そして、Ｅｌａｆｉｎは、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｇではなく、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−３を阻害する（Eisenberg, et al. 1990 J. Biol. Chem. 265, 7976-7981, Rao et al 1993 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 8, 612-616, Ying et al 2001 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 83-89）。加えて、Ｅｌａｆｉｎは、内在性血管エラスターゼ（ＥＶＥ）、つまり、罹患血管組織によって産生されるセリンプロテアーゼを阻害する（Rabinovitch, M. 1999 Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 277, L5-L12; Cowan, et al 1996 J. Clin. Invest. 97, 2452-2468）。
【００８３】
炎症及び傷害中、好中球から放出されたプロテアーゼは、通常、ＥＣＭ分解、走化性ペプチドの産生、ＭＭＰ活性化、及びタンパク分解性と炎症誘発性サイトカインシグナリングカスケードの誘導を介して炎症反応を増幅する役割を果たす。ＳＬＰＩ及びＥｌａｆｉｎは、局所炎症部位において余分な炎症を予防し、且つ、タンパク分解性破壊から組織を保護する役割を果たす炎症性シグナル伝達の内因性調節物質に相当する。
【００８４】
多数のインビトロ及びインビボにおいて、ＳＬＰＩ及びＥｌａｆｉｎの両方が、ボード（board）抗炎症特性を維持することを実証した（Doumas et al. 2005. Infect Immun 73, 1271-1274; Williams et al 2006 Clin Sci (Lond) 110, 21-35, Scott et al 2011 Biochem. Soc. Trans. 39(5) 1437-1440; Shaw and Wiedow, 2011 Biochem. Soc. Trans. 39, 1450-1454）。これらのタンパク質の消炎作用の多くがプロテアーゼ阻害によるが、ＳＬＰＩ及びＥｌａｆｉｎの両者には、直接的なプロテアーゼ阻害とは別の抗炎症能力がある。例えば、両者とも細菌性ＬＰＳに結合し、ＣＤ１４へのその結合、及びマクロファージによる下流シグナル伝達を防ぐ（Ding et al 1999 Infect. Immun. 67 4485-4489, McMichael et al 2005 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 32 443-452）。ＬＰＳに晒したヒト単球を使用した試験では、ＬＰＳに晒した単球において、ＳＬＰＩがＴｏｌｌ様受容体及びＮＦ−κＢ活性化、及びその後のＩＬ−８及びＴＮＦα産生シグナル伝達を阻害することが示された（Lentsch et al 1999 Am. J. Pathol. 154, 239-247; Taggart et al 2005 J. Exp. Med. 202, 1659-1668）。ＳＬＰＩ欠損マウスは、ＬＰＳ誘発エンドトキシンショックに対してより高い感受性を有し、より高い死亡率であった（Nakamura et al 2003 J. Exp. Med. 197, 669-674）。同様に、Ｅｌａｆｉｎを過剰発現したマウスは、ＬＰＳ抗原投与後に、野生型マウスに比べて、低い炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦα、ＭＩＰ−２、及びＭＣＰ−１を含む）しか示さなかった（Sallenave et al 2003 Infect. Immun. 71, 3766-3774）。
【００８５】
それらの抗プロテアーゼ活性及び消炎活性に加えて、ＳＬＰＩ及びＥｌａｆｉｎには、ウイルス、細菌、及び真菌を含めた多くの種類の病原菌に対する抗感染機能がある。ＳＬＰＩ及びＥｌａｆｉｎの両者は、グラム陽性及びグラム陰性種に対して抗菌性を実証した。ＳＬＰＩは、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）やエシェリキア・コリ（Escherichia coli）に加えて、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）やスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）などの上気道に一般的な病原性種に対して有効であることがわかった。その一方で、ＥｌａｆｉｎはＰｓ．エルギノーサ及びＳ．アウレウスに対して殺菌活性も示す（Hiemstra, et al 1996 Infect. Immun. 64, 4520-4524; Wiedow et al 1998 Biochem. Biophys. Res. Commun. 248, 904-909; Simpson et al 2001 Hum. Gene Ther. 12, 1395-1406; Meyer-Hoffert et al. 2003 Exp. Dermatol. 12, 418-425; Simpson et al 1999 FEBS Lett. 452, 309-313）。ＳＬＰＩは、病原菌であるアスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）及びカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）に対して殺真菌活性を有することが実証された（Tomee et al 1997 J. Infect. Dis. Π '6:1 '40-747; Chattopadhyay et al 2004 Infect. Immun. 72: 1956-1963）。ＳＬＰＩはまた、抗ＨＩＶ活性を有することも示された（McNeely et al 1995 J. Clin. Investig. 96:456-464; McNeely et al 1997 Blood 90: 1141-1149; Hocini et al 2002 Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7:515-518; Pillay et al 2001 J. Infect. Dis. 183:653-656）。
【００８６】
報告されている試験に基づいて、組み換えヒトＳＬＰＩが、アレルギー性喘息、肺気腫、嚢胞性繊維症、ＡＡＴ欠乏、ＣＯＰＤ、ＡＲＤＳ、関節炎、細菌感染症、真菌感染症、及びウイルス感染症、脊髄損傷、創傷治癒、及び心臓移殖後の虚血／再潅流損傷の治療に有用である可能性があることが示唆された（Lucey, E.C., Stone, P.J., Ciccolella, D.E., Breuer, R., Christensen, T.G., Thompson, R.C., and Snider, G.L. (1990). Recombinant human secretory leukocyte -protease inhibitor: in vitro properties, and amelioration of human neutrophil elastase-induced emphysema and secretory cell metaplasia in the hamster. J Lab Clin Med 115, 224-232; Stolk, J., Rudolphus, A., and Kramps, J.A. (1991). Lipopolysaccharide-induced alveolar wall destruction in the hamster is inhibited by intratracheal treatment with r-secretory leukocyte protease inhibitor. Ann N Y Acad Sci 624, 350-352; Stromatt, S.C. (1993). Secretory leukocyte protease inhibitor in cystic fibrosis. Agents Actions Suppl 42, 103-110; Watterberg, K.L., Carmichael, D.F., Gerdes, J.S., Werner, S., Backstrom, C, and Murphy, S. (1994). Secretory leukocyte protease inhibitor and lung inflammation in developing bronchopulmonary dysplasia. J Pediatr 125, 264-269; McNeely, T.B., Dealy, M., Dripps, D J., Orenstein, J.M., Eisenberg, S.P., and Wahl, S.M. (1995). Secretory leukocyte protease inhibitor: a human saliva protein exhibiting anti-human immunodeficiency virus 1 activity in vitro. J Clin Invest 96, 456-464; Fath, M.A., Wu, X., Hileman, R.E., Linhardt, R.J., Kashem, M.A., Nelson, R.M., Wright, CD., and Abraham, W.M. (1998). Interaction of secretory leukocyte protease inhibitor with heparin inhibits proteases involved in asthma. J Biol Chem 273, 13563-13569; Jin, F., Nathan, C.F., Radzioch, D., and Ding, A. (1998). Lipopolysaccharide-related stimuli induce expression of the secretory leukocyte protease inhibitor, a macrophage-derived lipopolysaccharide inhibitor. Infect Immun 66, 2447-2452; Song, X., Zeng, L., Jin, W., Thompson, J., Mizel, D.E., Lei, K., Billinghurst, R.C., Poole, A.R., and Wahl, S.M. (1999). Secretory leukocyte protease inhibitor suppresses the inflammation and joint damage of bacterial cell wall-induced arthritis. J Exp Med 190, 535-542; Wright, CD., Havill, A.M., Middleton, S.C., Kashem, M.A., Lee, P.A., Dripps, D.J., O'Pviordan, T.G., Bevilacqua, M.P., and Abraham, W.M. (1999). Secretory leukocyte protease inhibitor prevents allergen-induced pulmonary responses in animal models of asthma. J Pharmacol Exp Ther 289, 1007-1014; Ashcroft, G.S., Lei, K., Jin, W., Longenecker, G., Kulkarni, A.B., Greenwell-Wild, T., Hale-Donze, H., McGrady, G., Song, X.Y., and Wahl, S.M. (2000). Secretory leukocyte protease inhibitor mediates non-redundant functions necessary for normal wound healing. Nat Med 6, 1147-1153; Mulligan, M.S., Lentsch, A.B., Huber-Lang, M., Guo, R.F., Sarma, V., Wright, CD., Ulich, T.R., and Ward, P.A. (2000). Anti-inflammatory effects of mutant forms of secretory leukocyte protease inhibitor. Am J Pathol 156, 1033-1039; Forteza, R.M., Ahmed, A., Lee, T., and Abraham, W.M. (2001). Secretory leukocyte protease inhibitor, but not alpha-1 protease inhibitor, blocks tryptase-induced bronchoconstriction. Pulm Pharmacol Ther 14, 107-110; Pillay, K., Coutsoudis, A., Agadzi-Naqvi, A.K., Kuhn, L., Coovadia, H.M., and Janoff, E.N. (2001). Secretory leukocyte protease inhibitor in vaginal fluids and perinatal human immunodeficiency virus type 1 transmission. J Infect Dis 183, 653-656; Feuerstein, G. (2006). Inflammation and stroke: therapeutic effects of adenoviral expression of secretory Leukocyte Protease Inhibitor. Front Biosci 11, 1750-1757; Weldon, S., McGarry, N., Taggart, C.C, and McElvaney, N.G. (2007). The role of secretory leucoprotease inhibitor in the resolution of inflammatory responses. Biochem Soc Trans 35, 273-276; Nishimura, J., Saiga, H., Sato, S., Okuyama, M., Kayama, FL, Kuwata, FL, Matsumoto, S., Nishida, T., Sawa, Y., Akira, S., Yoshikai, Y., Yamamoto, M., and Takeda, K. (2008). Potent antimycobacterial activity of mouse secretory leukocyte protease inhibitor. J Immunol 180, 4032-4039; Schneeberger, S., Hautz, T., Wahl, S.M., Brandacher, G., Sucher, R., Steinmassl, O., Steinmassl, P., Wright, CD., Obrist, P., Werner, E.R., Mark, W., Troppmair, J., Margreiter, R., and Amberger, A. (2008). The effect of secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI) on ischemia/reperfusion injury in cardiac transplantation. Am J Transplant 8, 773-782; Ghasemlou, N., Bouhy, D., Yang, J., Lopez- Vales, R., Haber, M., Thuraisingam, T., He, G., Radzioch, D., Ding, A., and David, S. (2010). Beneficial effects of secretory leukocyte protease inhibitor after spinal cord injury. Brain 133, 126-138; Marino, R., Thuraisingam, T., Camateros, P., Kanagaratham, C, Xu, Y.Z., Henri, J., Yang, J., He, G., Ding, A., and Radzioch, D. (2011). Secretory leukocyte protease inhibitor plays an important role in the regulation of allergic asthma in mice. J Immunol 186, 4433-4442）。
【００８７】
ＳＬＰＩ及びＥｌａｆｉｎの遺伝子組み換えバージョンが、ヒトに投与されるものを作り出した。実際には、遺伝子組み換えのＥｌａｆｉｎが、現在、様々なタイプの血管障害の炎症性成分を処置するためにヒト臨床試験で評価されている（ｒｅｆ）。ＳＬＰＩ及びＥｌａｆｉｎの両者の遺伝子組み換えバージョンは、非常に短い血清中半減期を示す（＜３時間、Bergenfeldt et al 1990 Scand J Clin Lab Invest. 50(7):729-37、ＷＯ／２０１１／１０７５０５）。短かい半減期は、これらのタンパク質の治療用途にとって重大な制限に当たる。これにより、これらのバージョンのタンパク質を用いた有効な処置には、頻繁な投薬（１日に複数回の投与）を必要とするだろう。
【００８８】
本発明の融合タンパク質は、ＳＬＰＩ及びＥｌａｆｉｎの治療的有効性を高めるために作り出された。遺伝子組み換えＳＬＰＩ及びＥｌａｆｉｎの半減期を延長するために、Ｆｃ及びアルブミン融合タンパク質を作製した。一部のタンパク質、タンパク質ドメイン又はペプチドへのＦｃドメイン又はアルブミンの融合が、それらの半減期を延長する場合があることは知られていたが（Jazayeri, J. A., and Carroll, G.J. (2008). Fc-based cytokines : prospects for engineering superior therapeutics. BioDrugs 22, 11-26; Huang, C. (2009). Receptor-Fc fusion therapeutics, traps, and MIMETIBODY technology. Curr Opin Biotechnol 20, 692-699; Kontermann, R.E. (2009). Strategies to extend plasma half-lives of recombinant antibodies. BioDrugs 23, 93-109; Schmidt, S.R. (2009). Fusion-proteins as biopharmaceuticals-applications and challenges. Curr Opin Drug Discov Devel 12, 284-295）、本明細書中に記載した試験の前には、ＳＬＰＩ又はＥｌａｆｉｎに融合されたＦｃドメイン又はアルブミンが、好中球エラスターゼを阻害するそれらの能力を無効にするか、又は血清中半減期を延長する所望の効果を有するかどうか、知られていなかった。本明細書中に記載した試験は、本発明の融合タンパク質が強力なＮＥ阻害できること、及び長い血清中半減期を示すことを実証している。本発明のこれらの融合タンパク質は、ＳＬＰＩ又はＥｌａｆｉｎのこれまでの未修飾バージョンを超えるより効果的な治療薬を提供する。
【００８９】
いくつかの実施形態において、ＷＡＰドメイン融合タンパク質は、サイトカイン標的タンパク質に融合されたＳＬＰＩ又はＥｌａｆｉｎポリペプチド配列を含んでいる。
【００９０】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した融合タンパク質は、少なくともＷＡＰドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来するアミノ酸配列、及びサイトカイン標的ポリペプチド又はサイトカイン標的ポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。例えば、本発明は、ヒトサイトカイン受容体又はその誘導体に融合されたＷＡＰドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来する配列を提供する。本発明の別の実施形態は、サイトカイン標的抗体、例えば、抗サイトカイン抗体、又はサイトカイン標的抗体に由来する配列、例えば、抗サイトカイン抗体、又はサイトカイン標的抗体の断片に由来する配列、例えば、抗サイトカイン抗体の断片に融合されたＷＡＰドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来する配列を提供する。例えば、本発明は、サイトカイン標的ポリペプチドに融合されたＷＡＰドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来する配列を提供するが、そこで、該サイトカイン標的ポリペプチドが以下のヒトサイトカイン：ＴＮＦα、ＩｇＥ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−６、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７、ＩＬ−１３、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３のｐ４０サブユニット、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７、又はＩＬ−３２のいずれかに結合する。
【００９１】
例えば、いくつかの実施形態において、サイトカイン標的ポリペプチドは、ＴＮＦαを標的とし、以下のＴＮＦα標的ポリペプチドに由来する又は以下のＴＮＦα標的ポリペプチドに由来する配列のいずれかを含んでいる：Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標）、Ｃｉｍｉｚａ（登録商標）、又はＥｎｂｒｅｌ（登録商標）。
【００９２】
例えば、いくつかの実施形態において、サイトカイン標的ポリペプチドは、ＩｇＥを標的とし、以下のＩｇＥ標的ポリペプチド又は以下のＩｇＥ標的ポリペプチドに由来する配列のいずれかを含んでいる：Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）又はＦｃεＲＩ。
【００９３】
例えば、いくつかの実施形態において、サイトカイン標的ポリペプチドは、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３の共有されたｐ４０サブユニットを標的とし、Ｓｔｅｌａｒａ（登録商標）ポリペプチド又はＳｔｅｌａｒａ（登録商標）ポリペプチドに由来する配列を含んでいる。
【００９４】
例えば、サイトカイン標的ポリペプチドＳｔｅｌａｒａ（登録商標）は、ＩＬ−１３を標的とし、ＣＤＰ７７６６ポリペプチド又はＣＤＰ７７６６ポリペプチドに由来する配列を含んでいる。
【００９５】
本発明は、サイトカイン標的ポリペプチドに融合されたＷＡＰドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来する配列を提供するが、そこで、該サイトカイン標的ポリペプチドは、以下のＴＮＦα、ＩｇＥ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−６、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７、ＩＬ−１３、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３のｐ４０サブユニット、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７、又はＩＬ−３２のヒトサイトカイン受容体のいずれかに結合しており、それにより、受容体とサイトカインの間の結合を妨げる。
【００９６】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した融合タンパク質は、少なくともＳＬＰＩポリペプチド又はＳＬＰＩに由来するアミノ酸配列、及びサイトカイン標的ポリペプチド又はサイトカイン標的ポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。例えば、本発明は、サイトカイン標的ポリペプチドと融合されたＳＬＰＩを提供するが、そこで、該サイトカイン標的ポリペプチドが以下のヒトサイトカイン：ＴＮＦα、ＩｇＥ、ＩＬ−６、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１３、ＩＬ−２３、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３のｐ４０サブユニット、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７、又はＩＬ−３２、のいずれかに結合する。
【００９７】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した融合タンパク質は、少なくともＥｌａｆｉｎポリペプチド又はＥｌａｆｉｎに由来するアミノ酸配列、及びサイトカイン標的ポリペプチド又はサイトカイン標的ポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。例えば、本発明は、サイトカイン標的ポリペプチドと融合されたＥｌａｆｉｎを提供するが、そこで、該サイトカイン標的ポリペプチドが以下のヒトサイトカイン：ＴＮＦα、ＩｇＥ、ＩＬ−６、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１３、ＩＬ−２３、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３のｐ４０サブユニット、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７、又はＩＬ−３２、のいずれかに結合する。
【００９８】
いくつかの実施形態において、サイトカイン標的ポリペプチドは、サイトカイン受容体に結合し、受容体とサイトカインの間の結合を妨げる。例えば、本発明は、サイトカイン受容体標的抗体に融合されたＷＡＰドメイン含有ポリペプチドを含んでいる。例えば、本発明は、サイトカイン標的ポリペプチドに融合されたＳＬＰＩを提供しりが、そこで、該サイトカイン標的ポリペプチドは、以下のヒトサイトカイン：ＴＮＦα、ＩｇＥ、ＩＬ−６、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１３、ＩＬ−２３、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３のｐ４０サブユニット、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７、又はＩＬ−３２、のいずれかの受容体に結合する。例えば、本発明は、サイトカイン標的ポリペプチドに融合されたＥｌａｆｉｎを提供するが、そこで、該サイトカイン標的ポリペプチドが、以下のヒトサイトカイン：ＴＮＦα、ＩｇＥ、ＩＬ−６、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１３、ＩＬ−２３、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３のｐ４０サブユニット、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７、又はＩＬ−３２、のいずれか１つの受容体に結合する。
【００９９】
例えば、いくつかの実施形態において、サイトカイン標的ポリペプチドは、ＩＬ−６受容体を標的とし、Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標）ポリペプチド、又はＡｃｔｅｍｒａ（登録商標）ポリペプチドに由来する配列を含んでいる。例えば、サイトカイン標的ポリペプチドＡｃｔｅｍｒａ（登録商標）は、ＩＬ−６受容体を標的とし、トシリズマブポリペプチド又はトシリズマブポリペプチドに由来する配列を含んでいる。
【０１００】
タンパク質治療による炎症性サイトカイン及び免疫刺激物質の標的化が、多数の炎症状における臨床的成功を実証した。サイトカイン標的作用物質に使用される最も一般的なタンパク質は、可溶性サイトカイン受容体、並びにモノクローナル抗体及びその断片である。ＴＮＦα標的生物製剤、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標）、Ｃｉｍｉｚａ（登録商標）及びＥｎｂｒｅｌ（登録商標）、並びにＩＬ−１２／２３ｐ４０標的抗体、Ｓｔｅｌａｒａ（登録商標）によって証明されるように、サイトカインを標的化する顕著な欠点は、これらの患者における感染症の危険性の増大である。これは、患者で免疫抑制にをもたらす炎症性サイトカインの標的化の共通した問題になる。先に触れたとおり、ＳＬＰＩ及びＥｌａｆｉｎは、抗感染症活性及び消炎活性の両方が実証されているところが興味深い。これにより、本願発明のＷＡＰドメイン含有ポリペプチド−サイトカイン標的ポリペプチド融合タンパク質は、異常なサイトカイン活性を抑制できる一方で、感染症の危険を緩和する。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した融合タンパク質は、少なくとも以下の成分：ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来するアミノ酸配列、セルピンポリペプチド又はセルピンに由来するアミノ酸配列、及びＦｃポリペプチド又はＦｃポリペプチドに由来するアミノ酸配列、を含んでいる。例えば、本発明は、任意の機能的な組み合わせで一緒に作動できるように連結された、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド、セルピンポリペプチド、及びヒトＩｇＧ１−Ｆｃ、ＩｇＧ２−Ｆｃ、ＩｇＧ３−Ｆｃ、ＩｇＧ４−Ｆｃ又はＩｇＭ−Ｆｃ誘導体を提供する。いくつかの実施形態において、セルピンポリペプチドは、ヒトＡＡＴであるか、又はＡＡＴに由来する。本発明のＷＡＰ−Ｆｃ−セルピン融合タンパク質は、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド又はセルピンポリペプチドのみから構成された融合タンパク質を超える、高い抗プロテアーゼ、抗感染性、及び抗炎症性を有すると予想される。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した融合タンパク質は、少なくともＷＡＰドメイン含有ポリペプチド又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに由来するアミノ酸配列、及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ポリペプチド又はＨＳＡポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。本発明の更なる実施形態は、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド−アルブミン結合ポリペプチド融合タンパク質を含んでいて、そこで、該アルブミン結合ポリペプチドはＷＡＰドメイン含有ポリペプチドとＨＳＡの結合に関与する。その結果、本発明は、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチド及びＨＳＡポリペプチド、又はＷＡＰドメイン含有ポリペプチド若しくはＨＳＡポリペプチドに由来する配列の共有結合及び非共有結合の両方を含んでいる。例えば、本発明は、ヒトＨＳＡ、ＨＳＡ誘導体、又はＨＳＡ結合ペプチド又はポリペプチドに融合されたＷＡＰドメイン含有ポリペプチドを提供する。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した融合タンパク質は、少なくともＳＬＰＩポリペプチド又はＳＬＰＩに由来するアミノ酸配列及びＨＳＡポリペプチド又はＨＳＡポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。例えば、本発明は、ＨＳＡ若しくはＨＳＡに由来する断片、又はアルブミン結合ポリペプチドに融合されたＳＬＰＩを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した融合タンパク質は、少なくともＥｌａｆｉｎポリペプチド又はＥｌａｆｉｎに由来するアミノ酸配列、及びＨＳＡポリペプチド又はＨＳＡポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含んでいる。例えば、本発明は、ＨＳＡ若しくはＨＳＡに由来する断片、又はアルブミン結合ポリペプチドに融合されたＥｌａｆｉｎを提供する。
【０１０４】
本明細書中に記載した融合タンパク質及び融合タンパク質誘導体は、制限されることのない例によると、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠乏、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、例えば、心臓移植後の虚血／再潅流損傷を含めた虚血再灌流障害、アレルギー性喘息、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、嚢胞性繊維症、Ｉ型及び／又はＩＩ型糖尿病、欠乏症、細菌感染症、真菌感染症、及びウイルス感染症、脊髄損傷、創傷治癒、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、肺動脈高血圧（ＰＡＨ）、慢性血栓塞栓性肺高血圧症、及び心臓移植後の虚血／再潅流損傷を含めたさまざまな適応症を処置するのに有用であると予想される。
【０１０５】
別に明記しない限り、本発明に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は、複数の存在を含み、そして複数形の用語は、単数の存在を含む。一般に、本明細書中に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、並びにタンパク質化学及びオリゴヌクレオチド化学又はポリヌクレオチド化学、並びにハイブリダイゼーションに関して利用される用語、並びにそれらの技術は、当該分野において周知であり、そして当該分野において一般的に使用される。標準的な技術が、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、及び組織培養並びに形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に使用される。酵素反応及び精製技術は、製造業者の指示書に従って行なわれるか、当該分野において一般的に実行されるように行なわれるか、又は本明細書中に記載されるように行われる。上述の技術及び手順は、一般に、当該分野で周知である従来の方法に従って行なわれ、そして本明細書全体を通して引用され、そして議論される種々の一般的、且つ、より具体的な参考文献に記載されるように行われる。例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual（2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)）を参照のこと。本明細書中に記載される分析化学、合成有機化学、並びに医化学及び薬化学に関して利用される用語、並びにそれらの実験室手順及び技術は、周知であり、そして当該分野において一般的に使用される。標準的な技術は、化学合成、化学分析、薬学的な調製、処方、及び送達、並びに患者の処置に使用される。
【０１０６】
本発明に従う治療的実体の投与が、改善された輸送、送達、耐性などを提供するために処方物中に組み込まれる、適切な担体、賦形剤、及び他の薬剤と一緒に投与されることが、認識される。多くの適切な処方物が、全ての薬剤師において公知である処方集において見出され得る：Remington's Pharmaceutical Sciences（15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)）、特にその中のBlaug, Seymourによる第８７章。これらの処方物としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン又はアニオン）含有小胞（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））、ＤＮＡ結合体、無水物吸着ペースト、水中油型エマルション及び油中水型エマルション、エマルションカルボワックス（carbowax）（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及びカルボワックスを含む半固体混合物が挙げられる。任意の前述の混合物は、本発明に従う処置及び治療において適切であり得るが、処方物中の活性成分は、処方によって不活化されず、そして生理学的に適合性であり、且つ投与経路に関して許容され得る。Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2): 1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci. 89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)、並びに薬剤師に公知である処方物、賦形剤、及び担体に関連するさらなる情報に関する本明細書中の引用を参照のこと。
【０１０７】
本発明の融合タンパク質を含む本発明の治療用製剤は、対象における異常セリンプロテアーゼ活性に関連している疾患又は障害に関する症状を処置するか、又は緩和するために使用される。本発明はまた、対象における異常セリンプロテアーゼ活性に関連している疾患又は障害に関する症状を処置する方法又は緩和する方法を提供する。治療レジメンは、対象における異常セリンプロテアーゼ活性に関連している疾患又は障害を罹患する（又は疾患又は障害を発症する危険性がある）対象（例えば、ヒト患者）を、さまざまな臨床的及び／又は実験的手順のいずれかを含めた標準的な方法を使用して同定することによって実施される。患者という用語は、ヒト及び動物の対象を含んでいる。対象という用語は、ヒトと他の哺乳動物を含んでいる。
【０１０８】
処置の効力は、特定の対象における異常セリンプロテアーゼ活性に関連している疾患又は障害を診断するか、又は処置するための任意の公知の方法に関連して決定される。対象における異常セリンプロテアーゼ活性に関連している疾患又は障害の１つ以上の症状の緩和は、融合タンパク質が臨床上の利益を提供することを示す。
【０１０９】
所望の特異性を有する融合タンパク質のスクリーニングのための方法としては、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び当該分野において公知である免疫学的に媒介される技術が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
本明細書中に記載した融合タンパク質は、セリンプロテアーゼなどの標的の局在性及び／又は定量化に関連する分野において公知の方法において使用され得る（例えば、適切な生理学的サンプル内のそれらの標的のレベルの測定に使用するため、診断方法において使用するため、上記タンパク質の画像化に使用するためなど）。本明細書中に互換的に使用される「生理学的サンプル」及び「生物学的サンプル」という用語は、対象から分離された組織、細胞、及び生体液、並びに対象体内に存在していた組織、細胞、及び体液を含むことを意図する。そのため、「生理学的サンプル」及び「生物学的サンプル」という用語の語法の中に含まれるのは、血液、及び血清、血漿又はリンパを含めた血液の画分又は成分である。
【０１１１】
所定の実施形態において、標的結合ドメインを含めた、所定の標的、又はその誘導体、断片、アナログ若しくはホモログに対して特異的な融合タンパク質が、薬理学的に活性な化合物（以下、本明細書中で「治療薬」と呼ばれる）として利用される。
【０１１２】
本発明の融合タンパク質は、イムノアフィニティー、クロマトグラフィー又は免疫沈降などの標準的な技術を使用して特定の標的を単離するために使用され得る。検出は、その融合タンパク質を検出可能な物質にカップリングする（すなわち、物理的に結合する）ことによって促され得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生体発光材料、及び放射性材料が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリスリンが挙げられ；発光材料の例としては、ルミノールが挙げられ；生体発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられ、そして適切な放射性材料の例としては、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ又は3Ｈが挙げられる。
【０１１３】
本発明の融合タンパク質の治療有効量は、一般に、治療対象を達成するのに必要とされる量に関連する。上に記載されるように、これは、特定の場合において、上記標的の機能することを妨害する、融合タンパク質とその標的との間の結合相互作用であり得る。さらに、投与されるのに必要とされる量は、その特定の標的に対する上記融合タンパク質の結合親和性に依存し、そしてその量はまた、投与される融合タンパク質がその抗体が投与される他の対象の自由体積（ｆｒｅｅ ｖｏｌｕｍｅ）から枯渇する速度に依存する。本発明の融合タンパク質又はその断片の治療的に有効な投薬のための一般的な範囲は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約２５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得るが、これに限定されない。一般的な投薬頻度は、例えば、１日２回〜月に１回の範囲であり得る。
【０１１４】
融合タンパク質断片が使用される場合、標的に特異的に結合する最も小さい阻害性断片が、好ましい。例えば、上記標的を結合する能力を保持するペプチド分子が、設計され得る。このようなペプチドは、化学的に合成され得るか、そして／又は組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。（例えば、Marasco et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照のこと）。処方物はまた、処置される特定の適応に必要であるような１種より多い活性化合物（好ましくは、互いに不利に影響しない補完的な活性を有する化合物）を含み得る。代替的か、又はそれに加えて、上記組成物は、その機能を増強する薬剤（例えば、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、化学療法剤、増殖阻害剤、抗炎症剤又は抗感染症剤など）を含み得る。このような分子は、意図される目的に対して有効である量で、組み合わせにおいて安定に存在する。
【０１１５】
上記活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術、又は界面重合によって調製されるマイクロカプセル中に捕捉され得、そのマイクロカプセルは、例えば、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル）又はマクロエマルションにおいて、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース−マイクロカプセル又はゼラチン−マイクロカプセル、及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）である。
【０１１６】
インビボ投与のために使用される処方物は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。
【０１１７】
持続放出調製物が、調製され得る。持続放出調製物の適切な例としては、上記融合タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、成形された物品の形態（例えば、フィルム、又はマイクロカプセル）である。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性のエチレン−ビニルアセテート、分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア））、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−ビニルアセテート及び乳酸−グリコール酸などのポリマーが、１００日間以上にわたって分子の放出を可能にする一方で、特定のヒドロゲルは、より短い期間にわたってタンパク質を放出する。
医薬組成物
【０１１８】
本発明の融合タンパク質又は可溶性キメラポリペプチド（本明細書中で「活性化合物」とも称される）、並びにその誘導体、フラグメント、アナログ及びホモログは、投与に適した医薬組成物中に組み込まれ得る。このような組成物は、代表的に、上記融合タンパク質及び医薬的に受容可能な担体を含む。本明細書中で使用される場合、用語「医薬的に受容可能な担体」は、医薬投与に適合性である、任意、且つ、全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを含むことが意図される。適切な担体は、Remington's Pharmaceutical Sciences（当該分野における標準的な参考の教科書）の最新版（本明細書中に参考として援用される）に記載される。このような担体又は希釈剤の好ましい例としては、水、食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソーム及び非水性ビヒクル（例えば、固定油）もまた、使用され得る。医薬的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は、当該分野において周知である。任意の従来の媒体又は薬剤が上記活性化合物と不適合である限りを除いて、上記組成物におけるその使用が企図される。補足の活性化合物もまた、上記組成物中に組み込まれ得る。
【０１１９】
本発明の医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように処方され得る。投与経路の例としては、非経口投与（例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与）、経口投与（例えば、吸入）、経皮投与（すなわち、局所投与）、経粘膜投与、及び直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用、又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は、以下の成分を含み得る：無菌の希釈剤（例えば、注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成の溶液）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコール又はメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；緩衝剤（例えば、酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩）及び張度の調整のための薬剤（例えば、塩化ナトリウム又はデキストロース）。ｐＨは、酸又は塩基（例えば、塩酸又は水酸化ナトリウム）を用いて調整され得る。非経口調製物は、ガラス製若しくはプラスチック製のアンプル、使い捨て可能な注射器又は複数用量バイアルに入れられ得る。
【０１２０】
注射可能な用途に適した医薬組成物としては、無菌の水溶液（水溶性である）又は分散物、及び無菌の注射可能な溶液又は分散物の即時調製のための無菌の粉末が挙げられる。静脈内投与について、適切な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（BASF,Parsippany,N.J.）又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合において、上記組成物は、無菌でなければならず、そしてその組成物は、容易な注射器通過性（syringeability）が存在する限りは流体であるはずである。それは、製造及び保管の条件下において安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌及び真菌）の汚染作用に対して保護されなければならない。上記担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動率は、例えば、コーティング剤（例えば、レシチン）の使用、必要とされる粒径の維持（分散物の場合）、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合において、組成物中に等張化剤（例えば、糖類、ポリアルコール（例えば、マンニトール）、ソルビトール、塩化ナトリウム）を含むことが、好ましい。注射可能な組成物の延長した吸収は、その組成物中に吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を含めることによってもたらされ得る。
【０１２１】
無菌の注射可能な溶液は、必要とされる量で活性化合物を、上に列挙される成分の１つ又はその組み合わせと一緒に適切な溶媒中に取り込み、必要とされる場合、次いで濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散物は、基礎の分散媒及び上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む無菌のビヒクル中に上記活性化合物を取り込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌の粉末の場合において、調製の方法は、活性成分に任意のさらなる所望の成分を加えた粉末を、その予め濾過滅菌した溶液から生じる、真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０１２２】
経口組成物は、一般に、不活性な希釈剤又は食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセル中に封入され得るか、又は錠剤へと圧縮され得る。経口の治療的投与の目的のために、上記活性化合物は、賦形剤と一緒に組み込まれ得、そして錠剤、トローチ剤、又はカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、含そう剤として使用するための流体担体を使用して調製され得、その流体担体中の化合物は、経口的に適用され、そしてスウィッシュ（swish）されて、吐き出されるか、又は嚥下される。医薬的に適合性の結合剤及び／又はアジュバント材料が、上記組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、任意の以下の成分、又は同様の性質の化合物を含み得る：バインダー（例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴム又はゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプン又は乳糖）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、又はトウモロコシデンプン）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム又はＳｔｅｒｏｔｅｓ；流動促進剤（glidant）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロース又はサッカリン）；又は香味剤（例えば、ペパーミント、メチルサリチレート、又はオレンジ香味料）。
【０１２３】
吸入による投与について、化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素などの気体）を含む加圧された容器若しくはディスペンサー、又は噴霧器からエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０１２４】
全身投与はまた、経粘膜手段又は経皮手段によるものであり得る。経粘膜投与又は経皮投与に関して、透過されるべき障壁に適切な浸透剤が、上記処方物において使用される。このような浸透剤は、一般に、当該分野において公知であり、そしてその浸透剤としては、例えば、経粘膜投与については、洗浄剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレー又は坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与に関して、上記活性化合物は、一般に、当該分野において公知であるような、軟膏（ointment）、軟膏（salve）、ゲル、又はクリーム中に処方される。
【０１２５】
上記化合物はまた、直腸送達のために坐剤（例えば、従来の坐剤の基剤（例えば、カカオ脂及び他のグリセリド）を用いる）又は保留浣腸の形態で調製され得る。
【０１２６】
１つの実施形態において、上記活性化合物は、その化合物を、身体からの迅速な排泄に対して保護する担体を用いて調製される（例えば、インプラント及びマイクロカプセル化した送達システムを含む制御放出処方物）。生分解性の、生体適合性ポリマーが、使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当業者にとって明らかである。その材料はまた、Alza Corporation及びNova Pharmaceuticals,Incから市販され得る。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体によって感染症細胞を標的化するリポソームが挙げられる）もまた、医薬的に受容可能な担体として使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知である方法に従って調製され得る。
【０１２７】
経口組成物又は非経口組成物を投与の容易さ及び投薬の均一性のために投薬単位形態で処方するとこは、特に有益である。本明細書中で使用されるような投薬単位形態とは、処置される対象に対する統一された投薬として適した物理的に別個の単位をいう；必要とされる医薬担体と共同して所望の治療効果をもたらすために算出される所定の量の活性化合物を含む各単位。本発明の投薬単位形態についての明細は、上記活性化合物の独特な特徴及び達成されるべき特定の治療効果、並びに個体の処置のためにこのような活性化合物を調合する分野における固有の制限によって決定付けられる。
【０１２８】
上記医薬組成物は、投与のための指示書と一緒に容器、パック、又はディスペンサー中に含まれ得る。
【０１２９】
本発明は、以下の実施例においてさらに記載され、特許請求の範囲において記載される本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【０１３０】
実施例１：ＳＬＰＩ−Ｆｃ及びエラフィン−Ｆｃ融合タンパク質と変異型
代表的ではあるが、制限されることのない本発明によるＡＡＴ−Ｆｃ融合タンパク質の例には以下の配列が含まれるが、そこで、融合タンパク質のＳＬＰＩ又はＥｌａｆｉｎポリペプチド部分を太字で示し、ＷＡＰドメインに下線を引き、融合タンパク質のＩｇＧ−Ｆｃポリペプチド部分をイタリック体にし、ＳＬＰＩ内のＭｅｔ９８Ｌｅｕ（ＭＬ）突然変異を四角で囲み、ＦｃＲｎ結合を増強するＦｃ突然変異Ｍｅｔ２５２Ｔｙｒ、Ｓｅｒ２５４Ｔｈｒ、Ｔｈｒ２５６Ｇｌｕ（ＹＴＥ）又はＭｅｔ４２８Ｌｅｕ、Ａｓｎ４３４Ｓｅｒ（ＬＳ）を太字にして、四角で囲み、灰色で陰影をつけた。これらの例はヒンジ配列及び／又はリンカー配列を含んでいるが、本発明の融合タンパク質は、長さ及び／又は柔軟性の点で好適な任意のヒンジ配列及び／又はリンカー配列を使用して作製できる。あるいは、融合タンパク質は、ヒンジ及び／又はリンカー配列を使用せずに作製できる。例えば、ポリペプチド成分を直接結合することができる。
【０１３１】
代表的なＳＬＰＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＳＬＰＩ−ｈＦｃである。以下に示すように、融合タンパク質のＳＬＰＩポリペプチド部分を太字で示し（配列番号２）、ＷＡＰドメインに下線を引き、そして、融合タンパク質のＩｇＧ−Ｆｃポリペプチド部分をイタリック体にした（配列番号７）。
ＳＬＰＩ−ｈＦｃ１（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、長ヒンジ）（配列番号１６）
【化１７】
2014528913.tif 000019
【０１３２】
代表的なＳＬＰＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＳＬＰＩ−ｈＦｃ２（ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、長ヒンジ）である。以下に示すように、融合タンパク質のＳＬＰＩポリペプチド部分を太字で示し（配列番号２）、ＷＡＰドメインに下線を引き、そして、融合タンパク質のＩｇＧ−Ｆｃポリペプチド部分をイタリック体にした（配列番号８）。
ＳＬＰＩ−ｈＦｃ２（ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、長ヒンジ）（配列番号１７）
【化１８】
2014528913.tif 000020
【０１３３】
代表的なＳＬＰＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＳＬＰＩ−ＭＬ−ｈＦｃ１である。以下に示すように、融合タンパク質のＳＬＰＩポリペプチド部分を太字で示し（配列番号３９）、ＷＡＰドメインに下線を引き、融合タンパク質のＩｇＧ−Ｆｃポリペプチド部分をイタリック体にし、そして、ＳＬＰＩ内のＭｅｔ９８Ｌｅｕ（ｍＬ）突然変異を四角で囲んだ（配列番号７）。
ＳＬＰＩ−ＭＬ−ｈＦｃ１（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、Ｍｅｔ９８Ｌｅｕ）（配列番号１８）
【化１９】
2014528913.tif 000021
【０１３４】
代表的なＳＬＰＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＳＬＰＩ−ｈＦｃ１−ＹＴＥである。
以下に示すように、融合タンパク質のＳＬＰＩポリペプチド部分を太字で示し（配列番号３９）、ＷＡＰドメインに下線を引き、融合タンパク質のＩｇＧ−Ｆｃポリペプチド部分をイタリック体にし（配列番号４０）、そして、Ｆｃ突然変異群Ｍｅｔ２５２Ｔｙｒ、Ｓｅｒ２５４Ｔｈｒ、Ｔｈｒ２５６Ｇｌｕ（ＹＴＥ）を四角で囲み、太字にし、灰色で陰影をつけた。
ＳＬＰＩ−ｈＦｃ１−ＹＴＥ、（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、Ｍｅｔ２５２Ｔｙｒ、Ｓｅｒ２５４Ｔｈｒ、Ｔｈｒ２５６Ｇｌｕ）（配列番号１９）
【化２０】
2014528913.tif 000022
【０１３５】
代表的なＳＬＰＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＳＬＰＩ−ｈＦｃ１−ＬＳである。以下に示すように、融合タンパク質のＳＬＰＩポリペプチド部分を太字で示し（配列番号３９）、ＷＡＰドメインに下線を引き、融合タンパク質のＩｇＧ−Ｆｃポリペプチド部分をイタリック体にし（配列番号４１）、そして、ＦｃＲｎ結合を増強するＭｅｔ４２８Ｌｅｕ、Ａｓｎ４３４Ｓｅｒ（ＬＳ）を四角で囲み、太字にし、灰色で陰影をつけた。
ＳＬＰＩ−ｈＦｃ１−ＬＳ（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、Ｍｅｔ４２８Ｌｅｕ、Ａｓｎ４３４Ｓｅｒ）
【化２１】
2014528913.tif 000023
【０１３６】
代表的なＥｌａｆｉｎ−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｅｌａｆｉｎ−ｈＦｃ１である。以下に示すように、融合タンパク質のＥｌａｆｉｎポリペプチド部分を太字で示し（配列番号５）、ＷＡＰドメインに下線を引き、融合タンパク質のＩｇＧ−Ｆｃポリペプチド部分をイタリック体にし（配列番号４１）、ＦｃＲｎ結合を増強するＡｓｎ４３４Ｓｅｒ（ＬＳ）を四角で囲み、太字にし、灰色で陰影をつけた。
Ｅｌａｆｉｎ−ｈＦｃ１（ヒトＩｇＧ１）
【化２２】
2014528913.tif 000024
【０１３７】
代表的なＳＰＬＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＳＬＰＩ−ｈＦｃ１−ＳＬＰＩである。以下に示すように、融合タンパク質のＳＬＰＩポリペプチド部分を太字で示し（配列番号３９）、ＷＡＰドメインに下線を引き、そして、融合タンパク質のＩｇＧ−Ｆｃポリペプチド部分をイタリック体にした（配列番号７）。
ＳＬＰＩ−ｈＦｃ１−ＳＬＰＩ（ヒトＩｇＧ１）
【化２３】
2014528913.tif 000025
【０１３８】
代表的なＥｌａｆｍ−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｅｌａｆｉｎ−ｈＦｃ１−エラフィンである。以下に示すように、融合タンパク質のＥｌａｆｉｎポリペプチド部分を太字で示し（配列番号５）、ＷＡＰドメインに下線を引き、そして、融合タンパク質のＩｇＧ−Ｆｃポリペプチド部分をイタリック体にした（配列番号７）。
エラフィン−ｈＦｃ１−Ｅｌａｆｉｎ（ヒトＩｇＧ１）
【化２４】
2014528913.tif 000026
【０１３９】
代表的なＥｌａｆｍ−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｅｌａｆｉｎ−ｈＦｃ１−ＳＬＰＩである。以下に示すように、融合タンパク質のＳＬＰＩポリペプチド（配列番号３９）部分を太字で示し、ＷＡＰドメインに下線を引き、融合タンパク質のＥｌａｆｉｎ（配列番号５）ポリペプチド部分を太字のイタリック体にし、ＷＡＰドメインに下線を引き、そして、融合タンパク質のＩｇＧ−Ｆｃポリペプチド部分をイタリック体にした（配列番号７）。
エラフィン−ｈＦｃ１−ＳＬＰＩ（ヒトＩｇＧ１）
【化２５】
2014528913.tif 000027
【０１４０】
代表的なＳＬＰＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＳＬＰＩ−ｈＦｃ１−Ｅｌａｆｉｎである。以下に示すように、融合タンパク質のＳＬＰＩ（配列番号３９）部分を太字で示し、ＷＡＰドメインに下線を引き、融合タンパク質のＥｌａｆｉｎ（配列番号５）ポリペプチド部分を太字のイタリックで示し、ＷＡＰドメインに下線を引き、そして、融合タンパク質のＩｇＧ−Ｆｃポリペプチド部分をイタリック体にした（配列番号７）。
ＳＬＰＩ−ｈＦｃ１−Ｅｌａｆｉｎ（ヒトＩｇＧ１）
【化２６】
2014528913.tif 000028
【０１４１】
これらの代表的なＳＬＰＩ−Ｆｃ及びＥｌａｆｉｎ−Ｆｃ融合タンパク質を、以下の技術を使用して作製した。
【０１４２】
ヒトＳＬＰＩ及びＥｌａｆｉｎをコードする遺伝子を、ヒト脾臓ｃＤＮＡ（Zyagen）からＰＣＲ増幅した。ＳＬＰＩ、Ｅｌａｆｉｎ又はＦｃ領域をコードする遺伝子内の特異的点突然変異を、オーバーラップＰＣＲによって作り出した。ＳＬＰＩ又はＥｌａｆｉｎコード遺伝子を、ヒンジ領域をコードする遺伝子を有するフレーム内にクローニングし、それに続いて、ＳＬＰＩ又はＥｌａｆｉｎ遺伝子挿入部位の上流に哺乳動物分泌シグナル配列を含んでいる哺乳動物発現ベクター内にヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又はＩｇＭのＣＨ２ドメイン、そして、ＣＨ３ドメインをクローニングした。場合によっては、リンカー配列又はＳＬＰＩ若しくはＥｌａｆｉｎのいずれかをコードする遺伝子を、ＣＨ３ドメインの３’末端に対してフレーム内にクローニングして、ＳＬＰＩ−Ｆｃ−ＳＬＰＩ、Ｅｌａｆｉｎ−Ｆｃ−Ｅｌａｆｉｎ、ＳＬＰＩ−Ｆｃ−Ｅｌａｆｉｎ、又はＥｌａｆｉｎ−Ｆｃ−ＳＬＰＩを作り出したこれらのベクターをさらに修飾した。これらの発現ベクターを、哺乳動物細胞（具体的には、ＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞）内にトランスフェクトし、３７℃にて８％のＣＯ2中で数日間培養した。遺伝子組み換えＳＬＰＩ−Ｆｃ及びＥｌａｆｉｎ−Ｆｃ融合タンパク質を、発現細胞上清からプロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。図１Ｂは、Ｅｌａｆｉｎ−Ｆｃ（配列番号２１、レーン１）及びＳＬＰＩ−Ｆｃ（配列番号１６、レーン２）融合タンパク質の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。図１Ｄは、Ｅｌａｆｍ−Ｆｃ−ＳＬＰＩ（配列番号２４）の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。タンパク質を、クマシーブルーで染色することによって可視化した。
【０１４３】
ヒト好中球エラスターゼ（ＮＥ）活性を観察するために、蛍光ミクロプレートアッセイを使用した。阻害活性を、以下のアッセイを使用した残留ＮＥ活性の同時に起こる減少によって評価した。このアッセイバッファーは、１００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４、５００ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０００５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で構成されている。ヒトＮＥを、５ｎＭ（しかし、１〜２０ｎＭでも使用できる）の終濃度で使用する。アッセイでは、蛍光ペプチド基質ＡＡＶＰ−ＡＭＣを１００μΜの終濃度で使用する。Molecular Devices製のＧｅｍｉｎｉ ＥＭプレートリーダを使用して、それぞれ３７０ｎｍ及び４４０ｎｍの励起及び発光波長、及び４２０ｎｍのカットオフを使用してアッセイ動態を読みとった。アッセイを、室温にて１０分間読みとり、そして、５〜１０秒毎にスキャンした。毎秒のＶｍａｘは残留ＮＥ活性に相当し、そしてそれを阻害物質の各濃度に対してプロットした。Ｘ軸との切片は、アッセイにおいて開始濃度のＮＥを完全に不活化するのに必要である阻害物質の濃度を示している。これらのアッセイにおいて、ヒト血清由来ＡＡＴ（ｓｄＡＡＴ）を、ＮＥ阻害の正の対照として使用した。Ｅｌａｆｍ−Ｆｃ及びＳＬＰＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＮＥへの強力な阻害を示している（図１Ｃ）。Ｅｌａｆｍ−Ｆｃ−ＳＬＰＩ融合タンパク質もまた、ＮＥの強力な阻害物質であった（図１Ｅ）。
【０１４４】
さらに、Ｅ．コリ（E.coli）の産生した未修飾ＳＬＰＩと比較して、ＳＬＰＩ−Ｆｃ融合タンパク質はラットにおいてより長い血清中半減期を示し（図１Ｆ）、本発明の融合タンパク質が、多くのヒト炎症状を処置するための、薬物動力学的特性を改善し、且つ、未修飾バージョンのＳＬＰＩ及びＥｌａｆｉｎを超える優れた治療学的フォーマットであることを実証している。
実施例２：ＳＬＰＩ−ＴＮＦα標的分子融合タンパク質
【０１４５】
本明細書中に示した試験は、抗ＴＮＦα抗体又はＴＮＦα受容体の誘導体に融合されたヒトＳＬＰＩを含めた遺伝子組み換えＳＬＰＩ誘導体のいくつもの制限されることのない例を記載している。これらの例を以下に提供して、本発明の様々な特徴を更に例示している。実施例はまた、本発明を実施するために有用な方法論も例示している。これらの実施例は、請求の範囲に記載した本発明を限定するものではなく、そして、限定することを意図したものでもない。
【０１４６】
以下の融合タンパク質は、（ｉ）抗ＴＮＦα抗体Ｄ２Ｅ７（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ又はＨｕｍｉｒａ（登録商標）としても知られている）又は（ｉｉ）２型ＴＮＦα受容体（ＴＮＦＲ２−ＥＣＤ）の細胞外ドメイン、からの又はそれらに由来するサイトカイン標的ポリペプチド配列を含んでいる。融合タンパク質のＳＬＰＩポリペプチド部分は太字にし、ＷＡＰドメインには下線を引き、抗体定常領域（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、又はＣＬ）をイタリック体にし、そして、Ｄ２Ｅ７−ＶＨ、Ｄ２Ｅ７−ＶＫ、及びＴＮＦＲ２−ＥＣＤは灰色で陰影をつけ、且つ、太字で表示した。これらの実施例がヒンジ配列及び／又はリンカー配列を含んでいるのに対して、本発明の融合タンパク質は、長さ及び／又は柔軟性が好適な任意のヒンジ配列及び／又はリンカー配列を使用して作製できる。あるいは、融合タンパク質は、ヒンジ及び／又はリンカー配列を使用しなくても作製できる。例えば、ポリペプチド成分は、直接結合できる。
【０１４７】
代表的なＳＬＰＩ−ＴＮＦα標的分子融合タンパク質は、Ｄ２Ｅ７−軽鎖−ＳＬＰＩ（Ｇ3Ｓ）2リンカーである。以下に示すように、融合タンパク質のＳＬＰＩポリペプチド部分を太字で表示し（配列番号２）、ＷＡＰドメインに下線を引き、抗体定常領域（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、又はＣＬ）をイタリック体にし（配列番号４３）、そして、Ｄ２Ｅ７−ＶＫに灰色で陰影をつけ、且つ、太字にした（配列番号４２）。
Ｄ２Ｅ７−軽鎖−ＳＬＰＩ（Ｇ3Ｓ）2リンカー
【化２７】
2014528913.tif 000029
【０１４８】
代表的なＳＬＰＩ−ＴＮＦα標的分子融合タンパク質は、Ｄ２Ｅ７−軽鎖−ＳＬＰＩ ＡＳＴＧＳリンカーである。以下に示すように、融合タンパク質のＳＬＰＩポリペプチド部分を太字で表示し（配列番号２）、ＷＡＰドメインに下線を引き、抗体定常領域（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、又はＣＬ）をイタリック体にし（配列番号４３）、そして、Ｄ２Ｅ７−ＶＫに灰色で陰影をつけ、且つ、太字にした（配列番号４２）。
Ｄ２Ｅ７−軽鎖−ＳＬＰＩ ＡＳＴＧＳリンカー
【化２８】
2014528913.tif 000030
【０１４９】
代表的なＳＬＰＩ−ＴＮＦα標的分子融合タンパク質は、Ｄ２Ｅ７の−重鎖−ＳＬＰＩ（Ｇ3Ｓ）2リンカーである。以下に示すように、融合タンパク質のＳＬＰＩポリペプチド部分を太字で表示し（配列番号２）、ＷＡＰドメインに下線を引き、抗体定常領域（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、又はＣＬ）をイタリック体にし（配列番号４５）、そして、Ｄ２Ｅ７−ＶＨに灰色で陰影をつけ、且つ、太字にした（配列番号４４）。
Ｄ２Ｅ７−重鎖−ＳＬＰＩ（Ｇ3Ｓ）2リンカー
【化２９】
2014528913.tif 000031
【０１５０】
代表的なＳＬＰＩ−ＴＮＦα標的分子融合タンパク質は、Ｄ２Ｅ７−重鎖−ＳＬＰＩ ＡＳＴＧＳリンカーである。以下に示すように、融合タンパク質のＳＬＰＩポリペプチド部分を太字で表示し（配列番号２）、ＷＡＰドメインに下線を引き、抗体定常領域（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、又はＣＬ）をイタリック体にし（配列番号４５）、そして、Ｄ２Ｅ７−ＶＨに灰色で陰影をつけ、且つ、太字にした（配列番号４４）。
Ｄ２Ｅ７−重鎖−ＳＬＰＩ ＡＳＴＧＳリンカー
【化３０】
2014528913.tif 000032
【０１５１】
代表的なＳＬＰＩ−ＴＮＦ標的分子融合タンパク質は、ＴＮＦＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ１−ＳＬＰＩ（Ｇ3Ｓ）2リンカーである。以下に示すように、融合タンパク質のＳＬＰＩポリペプチド部分を太字にし（配列番号２）、ＷＡＰドメインに下線を引き、Ｆｃポリペプチド部分をイタリック体にし（配列番号４７）、そして、ＴＮＦＲ２−ＥＣＤに灰色で陰影をつけ、且つ、太字にした（配列番号４６）。
ＴＮＦＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ１−ＳＬＰＩ（Ｇ3Ｓ）2リンカー
【化３１】
2014528913.tif 000033
【０１５２】
代表的なＳＬＰＩ−ＴＮＦα標的分子融合タンパク質は、ＴＮＦＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ１−ＳＬＰＩ ＡＳＴＧＳリンカーである。以下に示すように、融合タンパク質のＳＬＰＩポリペプチド部分を太字にし（配列番号２）、ＷＡＰドメインに下線を引き、Ｆｃポリペプチド部分をイタリック体にし（配列番号４７）、そして、ＴＮＦＲ２−ＥＣＤに灰色で陰影をつけ、且つ、太字にした（配列番号４６）。
ＴＮＦＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ１−ＳＬＰＩ ＡＳＴＧＳリンカー
【化３２】
2014528913.tif 000034
【０１５３】
これらの代表的なＳＬＰＩ−ＴＮＦα標的分子融合タンパク質を、以下の技術を使用して作製した。
【０１５４】
抗ＴＮＦα抗体（Ｄ２Ｅ７）の可変重（ＶＨ）領域及び可変κ（ＶＫ）領域をコードする遺伝子を、遺伝子合成で作り出した。Ｄ２Ｅ７−ＶＨ遺伝子を、ＶＨドメイン挿入部位の上流に哺乳動物分泌シグナル配列を含んでいる哺乳動物発現ベクター内にＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインから成るヒトＩｇＧ１抗体重鎖定常領域をコードする遺伝子を伴ったフレーム内にクローニングした（Ｄ２Ｅ７−ＨＣ）。Ｄ２Ｅ７−ＶＫ遺伝子を、ＶＫドメイン挿入部位の上流に哺乳動物分泌シグナル配列を含んでいる哺乳動物発現ベクター内のヒト抗体κ軽鎖定常（ＣＬ）ドメインを伴ったフレーム内にクローニングした（Ｄ２Ｅ７−ＬＣ）。ＳＬＰＩコード遺伝子及び隣接５’リンカー配列を、先に記載した哺乳動物発現ベクター内のＤ２Ｅ７重鎖遺伝子（Ｄ２Ｅ７−ＨＣ−ＳＬＰＩ）のＣＨ３ドメイン又はＤ２Ｅ７軽鎖遺伝子（Ｄ２Ｅ７−ＬＣ−ＳＬＰＩ）のＣＬドメインのいずれかのコード配列の３’末端のフレーム内にクローニングした。ＴＮＦα受容体２（ＴＮＦＲ２−ＥＣＤ）の細胞外ドメインを、遺伝子合成によって作り出し、そして、ＴＮＦＲ２−ＥＣＤ挿入部位の上流に哺乳動物分泌シグナル配列を含んでいる哺乳動物発現ベクター内のヒンジ領域をコードする遺伝子を伴ったフレーム内にクローニングし、それに続いて、ヒトＩｇＧ１（ｈＦｃ１）のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインをクローニングした。ＳＬＰＩコード遺伝子及び隣接５’リンカー配列を、哺乳動物発現ベクター内のＴＮＦＲ２−ＥＣＤ−ｈＦｃ１をコードする遺伝子の３’末端のフレーム内にクローニングした（ＴＮＦＲ２−ＥＣＤ−ｈＦｃ１−ＳＬＰＩ）。
【０１５５】
Ｄ２Ｅ７−ＨＣ−ＳＬＰＩ発現ベクターを、哺乳動物細胞（具体的には、ＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞）内にＤ２Ｅ７−ＬＣ又はＤ２Ｅ７−ＬＣ−ＳＬＰＩ発現ベクターのいずれかと同時にトランスフェクトして、それぞれ重鎖のＣ末端又は重鎖と軽鎖の両方のＣ末端に融合したＳＬＰＩを有するＤ２Ｅ７抗体を作り出した。Ｄ２Ｅ７−ＬＣ−ＳＬＰＩを、哺乳動物細胞内にＤ２Ｅ７−ＨＣ発現ベクターと同時にトランスフェクトして、軽鎖のＣ末端に融合したＳＬＰＩを有するＤ２Ｅ７抗体を作り出した。ＴＮＦＲ２−ｈＦｃ１−ＳＬＰＩ発現ベクターを、哺乳動物細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、３７℃にて８％のＣＯ2中で数日間培養した。
【０１５６】
遺伝子組み換えＳＬＰＩ−ＴＮＦα標的融合タンパク質を、発現細胞上清からプロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。図２Ｂは、Ｄ２Ｅ７抗体単独（レーン１）、軽鎖に融合したＳＬＰＩを有するＤ２Ｅ７抗体（配列番号２７、Ｄ２Ｅ７重鎖と同時トランスフェクトした、レーン２）、及び重鎖に融合したＳＬＰＩを有するＤ２Ｅ７抗体（配列番号２９、Ｄ２Ｅ７軽鎖と同時トランスフェクトした、レーン３）の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。矢印は、修飾（ＳＬＰＩ融合）及び未修飾（ＳＬＰＩなし）重鎖及び軽鎖を意味する。タンパク質を、クマシーブルーで染色することによって可視化した。
【０１５７】
精製したＳＬＰＩ−ＴＮＦα標的分子融合タンパク質を、好中球エラスターゼを阻害するそれらの能力を測定することによって、活性について試験した。これらのアッセイにおいて、ヒト血清由来ＡＡＴ（ｓｄＡＡＴ）を正の対照として使用した。（図２Ｃ）。血清由来ＡＡＴと比較して、Ｄ２Ｅ７−抗体−ＳＬＰＩ融合タンパク質は、同様の好中球エラスターゼ阻害を示し、ＳＬＰＩの阻害能力が、抗体とそれが融合することによって支障をきたさないことを示唆している。ＮＥ阻害アッセイを、先に記載したように実施した。
実施例３：ＡＡＴ−Ｆｃ−ＳＬＰＩ及びＡＡＴ−Ｆｃ−Ｅｌａｆｉｎ
【０１５８】
本明細書中に示した試験は、ＷＡＰドメイン含有タンパク質を融合したヒトＡＡＴを含めた遺伝子組み換えＡＡＴ誘導体のいくつもの制限されることのない例を記載している。これらの例を以下に提供して、本発明の様々な特徴を更に例示している。実施例はまた、本発明を実施するために有用な方法論も例示している。融合タンパク質のＡＡＴポリペプチド部分を太字にし、且つ、灰色で陰影をつけ、Ｆｃ部分をイタリック体にし、ＳＬＰＩ及びＥｌａｆｉｎ部分を太字にし、そして、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに下線を引いた。これらの実施例がヒンジ配列及び／又はリンカー配列を含んでいるのに対して、本発明の融合タンパク質は、長さ及び／又は柔軟性が好適な任意のヒンジ配列及び／又はリンカー配列を使用して作製できる。あるいは、融合タンパク質は、ヒンジ及び／又はリンカー配列を使用しなくても作製できる。例えば、ポリペプチド成分を、直接結合できる。
【０１５９】
代表的なＡＡＴ−Ｆｃ−ＳＬＰＩ融合タンパク質は、ＡＡＴ−ｈＦｃ１−ＳＬＰＩ（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ）である。以下に示すように、融合タンパク質のＡＡＴポリペプチド部分を太字で示し、且つ、灰色で陰影をつけ（配列番号１３）、Ｆｃ部分をイタリック体にし（配列番号７）、ＳＬＰＩ部分を太字にし（配列番号２）、そして、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに下線を引いた（配列番号３）。
ＡＡＴ−ｈＦｃ１−ＳＬＰＩ（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ）
【化３３】
2014528913.tif 000035
【０１６０】
代表的なＡＡＴ−Ｆｃ−Ｅｌａｆｉｎ融合タンパク質は、ＡＡＴ−ｈＦｃ１−エラフィンである。以下に示すように、融合タンパク質のＡＡＴポリペプチド部分を太字で示し、且つ、灰色で陰影をつけ（配列番号１３）、Ｆｃ部分をイタリック体にし（配列番号７）、Ｅｌａｆｉｎ部分を太字にし（配列番号５）、そして、ＷＡＰドメイン含有ポリペプチドに下線を引いた（配列番号６）。
ＡＡＴ−ｈＦｃ１−エラフィン（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ）
【化３４】
2014528913.tif 000036
【０１６１】
ＳＬＰＩとＥｌａｆｉｎをコードした遺伝子を、ヒト脾臓ｃＤＮＡ（Zyagen）からＰＣＲ増幅した。これらの遺伝子及び隣接リンカー配列を、哺乳動物分泌遺伝子がＡＡＴ遺伝子の前にある、ＡＡＴ及びＩｇ Ｆｃ領域をコードする遺伝子を含む哺乳動物発現ベクター内のフレーム中にクローニングした。これらの発現ベクターを、哺乳動物細胞（具体的には、ＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞）内にトランスフェクトし、３７℃にて８％のＣＯ2中で数日間培養した。遺伝子組み換えＡＡＴ−Ｆｃ−ＷＡＰドメイン融合タンパク質を、発現細胞上清からプロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。中性ｐＨ付近のバッファーを、プロテインＡ樹脂からＡＡＴ−Ｆｃ−ＷＡＰドメイン融合タンパク質を溶出するのに使用した（Ｇｅｎｔｌｅ Ａｇ／Ａｂ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、Thermo Scientific）。図３Ｂは、精製した融合タンパク質：ＡＡＴ−Ｆｃ−Ｅｌａｆｉｎ（配列番号３３、レーン１）及びＡＡＴ−Ｆｃ−ＳＬＰＩ（配列番号３２、レーン２）の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０１６２】
精製したＡＡＴ−Ｆｃ−ＷＡＰドメイン融合タンパク質を、好中球エラスターゼを阻害するそれらの能力を測定することによって活性について試験した。これらのアッセイにおいて、ヒト血清由来ＡＡＴ（ｓｄＡＡＴ）を、正の対照として使用した。（図３Ｃ）。血清由来ＡＡＴと比較して、ＡＡＴ−Ｆｃ−ＷＡＰ標的分子融合タンパク質は、好中球エラスターゼのＮＥ阻害の高い能力を示した。ＮＥ阻害アッセイを、先に記載したように実施した。
実施例４：ＳＬＰＩ−アルブミン及びエラフィン−アルブミン
【０１６３】
本明細書中に示した試験は、アルブミンポリペプチドを融合したヒトＳＬＰＩを含めた遺伝子組み換えＡＡＴ誘導体のいくつもの制限されることのない例を記載している。これらの例を以下に提供して、本発明の様々な特徴を更に例示している。実施例はまた、本発明を実施するために有用な方法論も例示している。これらの実施例は、請求の範囲に記載した本発明を限定するものではなく、そして、限定することを意図したものでもない。ＡＡＴ部分を太字にし、アルブミン部分をイタリック体にし、そして、ＷＡＰドメインに下線を引いた。これらの実施例はリンカー配列を含んでいるが、本発明の融合タンパク質は、長さ及び／又は柔軟性に好適な任意のリンカー配列を使用して作製できる。あるいは、融合タンパク質は、リンカー配列を使用せずに作製できる。
【０１６４】
代表的なＳＬＰＩ−アルブミン融合タンパク質は、ＳＬＰＩ−ＨＳＡである。以下に示すように、ＳＬＰＩ部分を太字にし（配列番号２）、アルブミン部分をイタリック体にした（配列番号１４）。
ＳＬＰＩ−ＨＳＡ
【化３５】
2014528913.tif 000037
【０１６５】
代表的なＳＬＰＩ−アルブミン融合タンパク質は、ＳＬＰＩ−ＨＳＡドメイン３である。以下に示すように、ＳＬＰＩ部分を太字にし（配列番号２）、そして、アルブミン部分をイタリック体にした（配列番号１５）。
ＳＬＰＩ−ＨＳＡドメイン３
【化３６】
2014528913.tif 000038
【０１６６】
代表的なＳＬＰＩ−アルブミン融合タンパク質は、Ｅｌａｆｉｎ−ＨＳＡである。以下に示すように、Ｅｌａｆｍ部分を太字にし（配列番号５）、アルブミン部分をイタリック体にし（配列番号１４）、そして、ＷＡＰドメインに下線を引いた。
ＳＬＰＩ−ＨＳＡ
【化３７】
2014528913.tif 000039
【０１６７】
代表的なＥｌａｆｉｎ−アルブミン融合タンパク質は、Ｅｌａｆｉｎ−ＨＳＡドメイン３である。以下に示すように、Ｅｌａｆｍ部分を太字にし（配列番号５）、アルブミン部分をイタリック体にし（配列番号１５）、そして、ＷＡＰドメインに下線を引いた（配列番号６）。
エラフィン−ＨＳＡドメイン３
【化３８】
2014528913.tif 000040
【０１６８】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をコードする遺伝子を、ヒト肝臓ｃＤＮＡ（Zyagen）からＰＣＲ増幅した。ＨＳＡ又はＨＳＡのドメイン３をコードする遺伝子を、ＳＬＰＩ又はＥｌａｆｍの上流に哺乳動物分泌シグナル配列を含んでいる、ＳＬＰＩ又はＥｌａｆｍコード遺伝子の３’末端へとフレーム内にクローニングした哺乳動物発現ベクターを作製した。
【０１６９】
これらの発現ベクターを、哺乳動物細胞（具体的には、ＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞）内にトランスフェクトし、８％のＣＯ2中で３７℃にて数日間培養した。遺伝子組み換えＳＬＰＩ−ＨＳＡ及びＥｌａｆｍ−ＨＳＡ融合タンパク質を、フェニル−セファロースを使用して発現細胞上清から精製した。
他の実施形態
【０１７０】
本発明は、その詳細な説明に関連して記載されているが、上述の説明は、例示を目的とし、且つ添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点、及び変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１Ａ】
2014528913.tif 000041
【図１Ｂ】
2014528913.tif 000042
【図１Ｃ】
2014528913.tif 000043
【図１Ｄ】
2014528913.tif 000044
【図１Ｅ】
2014528913.tif 000045
【図１Ｆ】
2014528913.tif 000046
【図２Ａ】
2014528913.tif 000047
【図２Ｂ】
2014528913.tif 000048
【図２Ｃ】
2014528913.tif 000049
【図３Ａ】
2014528913.tif 000050
【図３Ｂ】
2014528913.tif 000051
【図３Ｃ】
2014528913.tif 000052
【図４】
2014528913.tif 000053
【手続補正書】
【提出日】平成26年3月20日(2014.3.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014528913000001.app
【国際調査報告】
2014528913.tif 000054
2014528913.tif 000055
2014528913.tif 000056