(57)【要約】  ペプチド断片からタンパク質を組み立てる方法。当該方法は、単純かつ確実な方法でタンパク質を作製することが可能で、産業スケールに適用可能である。当該方法は、治療又は診断に関連するタンパク質の製造に使用され得る。また、本発明は、当該合成方法を実施するためのキット及び自動化デバイス、あるいは試験及び／又は診断キットにも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド断片を組み合わせてｎ個のペプチド断片とチオール基を担持するｎ−１個以上のアミノ酸を含有するポリペプチドを製造する方法であって、当該ポリペプチドが、
Ａ１−Ｃ１−Ａ２−Ｃ２−Ａ３−…−Ｃｉ−１−Ａｉ−…．−Ｃｎ−１−Ａｎ  （Ｉ）
（式中、
Ａ１、Ａ２、Ａ３、…Ａｉ…、Ａｎがペプチド断片であり；
Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、…Ｃｉ−１、…Ｃｎ−１がチオール基を担持するアミノ酸残基であり；
ｎが３〜５０の整数であり；そして
ｉが２〜ｎの整数である）
で表され、以下の工程：
（ａ１）Ｙ−Ａ１−ＳＥＡｏｆｆ（ＩＩ１）断片を調製する１つ以上の工程、ここでＡ１はペプチド断片であり、当該断片のＣ末端が、ＳＥＡｏｆｆと呼ばれる環式ｂｉｓ（２−スルファニルエチル）アミノ基
【化１】
2014532075.tif 000023
を担持し、そしてＹは固相支持体の基と反応してＡ１と固相支持体との間に結合を形成する断片である；
（ｂ）Ｙ−Ａ１−ＳＥＡｏｆｆ（ＩＩ１）と、□−Ｙ’と表記される固相支持体とを反応させる１つ以上の工程、ここで□は固相支持体自体を表し、Ｙ’は、以下の式
【化２】
2014532075.tif 000024
に従いＹと反応してＺ基を形成する反応基を表す；
（ａ２）Ｈ−Ｃ１（ＰＧ１）−Ａ２−ＳＥＡｏｆｆ（ＩＩ２）断片を調製する１つ以上の工程、ここでＣ１、Ａ２及びＳＥＡｏｆｆは上記で定義したものであり、（ＰＧ１）は、Ｈ又はアミノ酸Ｃ１のチオールの保護基を表す；
（ｃ１）式（ＩＩＩ１’）のチオエステルペプチドを調製する１つ以上の工程、当該工程は、以下の式
【化３】
2014532075.tif 000025
に従い、ｂｉｓ（２−スルファニルエチル）アミノペプチド□−Ｚ−Ａ１−ＳＥＡｏｆｆ（ＩＩＩ１）と、チオールＲ−ＳＨとを、任意で環式ジスルフィドの還元剤の存在下で反応させ、ここで、Ｒは置換された又はされていないアルキル又はアリールラジカルであってもよい；
（ｄ１）以下の式
【化４】
2014532075.tif 000026
に従い、芳香族チオールＡｒＳＨの存在下、ＰＧ１がＨでない場合、ＰＧ１が除去される条件下、（ＩＩＩ’１）を、ペプチド断片（ＩＩ２）と縮合させる１つ以上の工程；
（ａｎ−１）Ｃｎ−１（ＰＧｎ−１）−Ａｎ断片を調製する１つ以上の工程、ここで（ＰＧｎ−１）は、Ｈ又はアミノ酸Ｃｎ−１のチオールの保護基を表す；
（ｄｎ−１）芳香族チオールＡｒＳＨの存在下、ＰＧｎ−１がＨでない場合、ＰＧｎ−１が除去される条件下、Ｃｎ−１（ＰＧｎ−１）−Ａｎと□−Ｚ−Ａ１−Ｃ１−Ａ２−…Ｃｉ−１Ａｉ−…Ｃｎ−２Ａｎ−１ＳＥＡｏｆｆ（ＩＩＩｎ−１）を縮合させて、□−Ｚ−Ａ１−Ｃ１−Ａ２−…Ｃｉ−１Ａｉ−…Ｃｎ−１Ａｎ（ＩＶｎ）を得る１つ以上の工程；
を含む当該方法。
【請求項２】
更に：
（ｅ）前記固相支持体からペプチドＡ１−Ｃ１−Ａ２−…Ｃｉ−１Ａｉ−…Ｃｎ−１Ａｎ（Ｉ）を切り離す工程；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固相支持体□が、樹脂、特にポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、セルロース、ポリエチレン、ポリエステル、ラテックス、ポリアミド、ポリジメチルアクリルアミド、合成又は天然疎水性ポリマー、ガラスビーズ、シリカゲルを基礎とする樹脂から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
Ｃ１，．．．Ｃｉ…Ｃｎがシステインである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＰＧ１，．．．ＰＧｉ…ＰＧｎがｔｅｒｔ−ブチルスルフェニル基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって：
Ｙ’がアザイドから選択される基を含み、Ｙがアルキン基を含む基から選択される、又は
Ｙ’がアルキン基を含み、Ｙがアザイド基を含む基から選択される、又は
Ｙ’がアルデヒド基を含み、ＹがＨであり、Ａ１のＮ末端アミノ酸が、システイン、セリン又はスレオニンから選択され、又は
Ｙ’がアルデヒド基を含み、ＹがＳｃｈｉｆｆ塩基を形成するＮＨ２基を含む；
当該方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、Ｒが、１〜１２個の炭素原子を有し、直鎖又は分岐鎖で、置換され若しくは置換されていないアルキルラジカル、又は置換され若しくは置換されていないＣ６−Ｃ１２アリールから選択される、当該方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、ｉ＝２，…ｎ−２のいずれの場合も、以下の工程
（ｃｉ）任意で環式ジスルフィドの還元剤の存在下、チオールＲ−ＳＨの作用により、□−Ｚ−Ａ１−Ｃ１−…Ｃｉ−１ＡｉＳＥＡｏｆｆ（ＩＩＩｉ）を□−Ｚ−Ａ１−Ｃ１−…Ｃｉ−１−ＡｉＳＲ（ＩＩＩ’ｉ）に変換する１つ以上の工程；
（ｄｉ）（ＰＧｉ）が水素又はアミノ酸Ｃｉのチオールの保護基を表す場合、Ｃｉ（ＰＧｉ）Ａｉ＋１ＳＥＡｏｆｆを□−Ｚ−Ａ１−Ｃ１−…Ｃｉ−１Ａｉ−ＳＲ（ＩＩＩ’ｉ）と縮合して、□−Ｚ−Ａ１−Ｃ１−…ＣｉＡｉ＋１ＳＥＡｏｆｆ（ＩＩＩｉ＋１）を得る工程；
を含む、当該方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法であって、ｉ＝２，…ｎ−２のいずれの場合も、当該方法の工程ｄｉ）が、ＳＥＡｏｆｆに影響を与えずにｉｎ  ｓｉｔｕで選択的にＰＧｉを除去する条件下で実施され、当該反応の溶媒が、ｐＨ４〜９の、芳香族チオールを含有する水性緩衝剤である、当該方法。
【請求項１０】
医薬品を製造する方法であって；
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により１つ以上のポリペプチドを製造する工程；及び
当該ポリペプチドを医薬として許容される担体と組み合わせる工程；
を含む、当該方法。
【請求項１１】
固相支持体であって、ペプチドがグラフトされ、以下の式：（ＩＩＩ１）
□−Ｚ−Ａ１−ＳＥＡｏｆｆ（ＩＩＩ１）
（式中、
Ａ１はペプチド断片であり、当該断片のＣ末端が、ＳＥＡｏｆｆと呼ばれる環式ｂｉｓ（２−スルファニルエチル）アミノ基
【化５】
2014532075.tif 000027
を担持し、□は固相支持体を表し、そしてＺはＡ１と□の間を連結する基を表す）
で表される、当該固相支持体。
【請求項１２】
ポリペプチド合成キットであって、１つ以上の受容部を備えた１つ以上の支持部を備え、その上部又は内部に、１つ以上の請求項１１に記載のグラフトされた固相支持体が配置される、当該キット。
【請求項１３】
ペプチドを合成するための自動化されたデバイスであって、
内部にペプチドがグラフトされ、以下の式□−Ｚ−Ａ１−ＳＥＡｏｆｆ（ＩＩＩ１）に対応する固相支持体が配置された１つ以上の受容部であって、個別に：
ペプチド（ＩＩｉ）Ｃｉ（ＰＧｉ）Ａｉ＋１ＳＥＡｏｆｆ、及び：
１つ以上のチオールＲ−ＳＨ、及び任意で環式ジスルフィドの還元剤：
カップリング活性化剤、及び；
洗浄産物；
を含有する当該受容部；
生産物の試料を取り出し、分別する機械的手段；並びに
これらの機械的手段の制御された利用を可能とするデータ処理手段；
を備える、当該デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド断片からタンパク質を組み立てる新規方法に関する。当該方法は、単純かつ確実な方法でタンパク質を作製することが可能で、自動化が可能で、産業スケールに適用可能である。当該方法は、治療又は診断に関連するタンパク質の製造に使用され得る。また、本発明は、当該合成方法を実施するためのキット及び自動化デバイス、あるいは試験及び／又は診断キットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
固相上にアミノ酸を積み重ねることによりポリペプチドを合成する従来の方法は、合成されるポリペプチドが巨大な場合、低収量により限定的となる。化学的ライゲーションにより２つのポリペプチドを結合してより長いポリペプチドを生産する技術は、斯かる限定を克服する公知の方法である。
【０００３】
ポリペプチドの完全な合成は、完全に規定された構造を有する、又は転写後修飾等の天然修飾若しくは非天然修飾を担持する、タンパク質を調製するのに頻繁に使用されるようになっている。前記化学ライゲーション法は、この需要に応えるものであるが、それらの使用及び産業的利用は、限定的であることが証明されている。
【０００４】
一般に、これらの方法において、ライゲーションにより組み立てられたポリペプチドの間の結合は、ネイティブ、即ち当該ポリペプチドの天然の構造のものに対応するのが望ましい。
【０００５】
現在、ネイティブライゲーションの主要な方法は、例えば国際出願ＷＯ  ９６／３４８７８及びＷＯ  ９８／２８４３４に記載のＫｅｎｔ  ａｎｄ  Ｄａｗｓｏｎの方法である。当該方法は、（Ｃ−末端）チオエステルペプチド及びシステイニル−ペプチドの間の化学選択的反応に基づくものである。しかしながら、この方法の大きな欠点は、複雑な化学的方法を要求するチオエステルペプチドの生産である。これらの方法は、分離困難で取得される最終生産物の純度に影響する異なるチオエステルの混合物を不可避的に生産し、不可避的な収量の減少をもたらす、競合的な反応を防ぐことが出来ない。
【０００６】
他の反応は、国際出願ＷＯ  ０１／６８５６５及びＷＯ  ０１／８７９２０に記載される、いわゆるＳｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーションである。この方法は、ホスフィノチオエステルとアザイドの反応、及び組み合わせられた反応物の加水分解によるアミド結合の形成を含む。しかしながら、当該方法は、産業スケールへの適用が困難である。
【０００７】
国際出願ＷＯ  ２００７／０３７８１２に記載される他の方法は、脱炭酸縮合（ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｖｅ  ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）反応におけるα−ケト酸とＮ−アルコキシアミンの反応に基づく。しかしながら、当該ケト酸は、製造が困難で、ペプチドに含ませるのが困難である。故に、当該第三の方法は、複雑な有機合成を実施する方法を有しないペプチド合成の研究施設において利用するのが困難である。
【０００８】
Ｏ．  Ｍｅｌｎｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｒｇ．  Ｌｅｔｔ．，  １２（２２），  ５２３８−４１  （２０１０）による報告及び出願ＦＲ−２９５２０５８、並びにＨｏｕ，  Ｗ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｘ．，  Ｌｉ，  Ｆ．  ａｎｄ  Ｌｉｕ，  Ｃ．Ｆ．  Ｐｅｐｔｉｄｙｌ  Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈｙｌ）−ａｍｉｄｅｓ  ａｓ  Ｔｈｉｏｅｓｔｅｒ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．  Ｏｒｇ．  Ｌｅｔｔ．  １３，  ３８６−３８９  （２０１１）による仕事は、ペプチド−ｂｉｓ（スルファニルエチル）アミノ断片によるペプチドのネイティブライゲーションを記載する。しかしながら、当該方法は、現在までに、３つ以上の断片を組み合わせることによるペプチドの合成に使用されたことがない。
【０００９】
出願ＷＯ２０１１／０５８１８８は、固相ペプチド合成の終了の際、アザイド基が備えられたＮ末端結合を導入することを含む、生成技術を記載する。Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ−Ｂｅｒｔｏｚｚｉ反応又は付加環化（ＣｕＡＡＣ，  ＳＰＡＡＣ）を使用して、ホスフィン又はアルキンを用いて予め官能化した水適合性樹脂上に標的ペプチドをグラフトすることが可能である。当該ペプチドは、樹脂の洗浄により当該樹脂と共有結合が解けた切断されたペプチドを除去した後、穏和な条件下での結合の開裂により（塩基、求核、又は光照射）最終的に放出される。しかしながら、当該文献には、ペプチドのライゲーションによりタンパク質の合成を実施するための当該グラフト手段の使用が、全く想定されていない。
【００１０】
文献Ｍ．Ｖｉｌｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８  （２００１）  ６７３−６７９は、精製技術を開示しており、当該技術は、ペプチド合成の終了時、Ｎ末端残基をアルデヒド基と反応させて、チアゾリジン又はオキサゾリジン環を形成することにより、Ｎ末端にシステイン又はスレオニンを有するペプチドが樹脂上にグラフトされる工程を含む。当該グラフトされたペプチドは洗浄され、その後、樹脂から切り離される。しかしながら、当該文献には、ペプチドのライゲーションによりタンパク質の合成を実施するための当該グラフト手段の使用が、全く想定されていない。
【００１１】
文献ＵＳ７８８４１８２及びＳｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−ＰＮＡ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｂｙ  Ｓｅｍｉ−Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｃａｐｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｅｘｃｅｓｓ  Ｒｅａｃｔａｎｔｓ，  Ｍａｒｔｉｊｎ  Ｃ．  ｄｅ  Ｋｏｎｉｎｇ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ２００４，  ８５０−８５７は、固相支持体を使用したペプチドのライゲーションを記載している。著者らは、チアゾリジン結合を形成してこの支持体上にＨ−Ｃｙｓ−Ａ−ＳＲペプチド（Ｒ＝アルキル）を結合させて、支持されるチオエステル基とＨ−Ｃｙｓ−Ｂペプチドとの間にネイティブライゲーションＮＣＬを実施している。Ｈ−Ｃｙｓ−Ａ−ＳＲペプチドは、合成が困難である。当該方法は、チアゾリジンの形成の過程で環化反応又は重合が起こるリスクが高い。なぜなら２つの末端が反応性だからである。最終的に、この方法は、支持体上で２つ以上のライゲーション実施されるべきことを許容しない。
【００１２】
文献ＦＲ  ２９５２０５８は、液相中のペプチドを、Ｃ末端からＮ末端方向にライゲーションする方法を記載する。当該方法は、
−ＳＥＡペプチドの使用
−任意で後でＳＥＡに変換されるＳＥＡｏｆｆペプチドの使用
を含む。
【００１３】
文献ＵＳ  ２００２／０１３２９７５は、固相において連続したペプチド断片のネイティブライゲーションによりペプチドを組み立てる方法を記載する。当該合成は、Ｎ末端からＣ末端へ、又は逆方向に実施されてもよい。当該方法は：
−Ｎ末端にシステイン、Ｃ末端にＣＯＳ−基を担持するペプチドの使用
−当該ＣＯＳ基を、樹脂に支持されたペプチドのＣ末端で−ＣＯＳＲチオエステルに変換すること
−次のペプチド断片の末端システイン上で各ライゲーションを実施するために樹脂で支持されたペプチドのＣ末端チオエステル官能性を使用すること
に基づく。
【００１４】
しかしながら、当該チオ酸ペプチド（即ちＣＯＳ−基を担持するペプチド）、例えば出願ＵＳ  ２００２／０１３２９７５において出発生産物として記載されているもの等は、合成により調製するのが困難で、精製するのも困難で、そしてそれらは不安定である。更に、当該チオ酸基をチオエステルに活性化する工程は、特にペプチド配列中の遊離しステインが存在する場合、困難である。システインもアルキル化されるリスクがあるからである。最後に、当該ＳＥＡｏｆｆ基とは対照的に、チオ酸基は、ブロックされない反応性基である。これは、特にＣａｎｎｅ，  Ｌ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １９９９，  １２１，  ８７２０−８７２７で報告されており、著者らは、チオ酸基の還元的反応性に起因して環状の副産物が顕著に形成されることを見出している。
【００１５】
従来技術の方法と比較して、本発明の方法は、ＳＥＡｏｆｆ基のチオエステルへの変換の効率が優れているという利益を有し、当該反応の条件はより穏和で、副産物の形成を引き起こさない。更に、ＳＥＡｏｆｆは、他の反応性基、特に出願ＵＳ  ２００２／０１３２９７５に記載のチオ酸と対照的に、ライゲーション条件下でブロックされる系である。最後に、ＳＥＡｏｆｆ断片は、Ｆｍｏｃ／ｔｅｒｔ−ブチルストラテジーにより固相中で容易に合成されるが、チオ酸ペプチドはそのようにできない。
【００１６】
産業スケールで完全な合成によりペプチドの合成の実施を可能とする方法を利用するためには、単純で、安価で、高純度の生産物の取得が可能で、産業衛生的に許容可能である方法を見つけることが必要となる。
【００１７】
故に、所望の長さ及び特性を有するペプチド鎖を合成出来る、収束的で産業利用が可能な完全な合成の方法、特に、Ｎ末端からＣ末端への組み立てを含む、方法、実行の単純性の品質及び取得されるペプチド又はポリペプチドの純度を提供する方法を見出すことが必須となっている。実際に、Ｎ末端からＣ末端への組み立ては、Ｃ末端からＮ末端の組み立てという逆の公知のストラテジーよりもはるかに有利である。なぜならその場合、当該方法は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）における主要な不純物であるアセチル化Ｎ切断ペプチドを除去することによりペプチド断片の「自己純化」を可能とするからである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、溶液中の複数のライゲーションに関連する困難を克服することを可能とする。当該方法は、非常に大きいタンパク質の合成を可能とする。当該方法は、自動化及び産業スケールへの拡張が容易である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
ペプチドチオエステルの形成及びネイティブライゲーション等の単純な方法を含む固相合成の方法における複数のペプチド断片の組み立てが、収束的で、自動化可能で、産業利用可能で、要求される純度の基準に適合する、完全な合成の方法を導き得ることが見出された。
【００２０】
本発明は、ペプチド断片を組み合わせてｎ個のペプチド断片とチオール基を担持するｎ−１個以上のアミノ酸を含有するポリペプチドを製造する方法を提案するものであって、当該ポリペプチドが、
Ａ１−Ｃ１−Ａ２−Ｃ２−Ａ３−  …  −Ｃｉ−１−Ａｉ−…．  −Ｃｎ−１−Ａｎ  （Ｉ）
（式中、
Ａ１、Ａ２、Ａ３、…  Ａｉ  …、Ａｎがペプチド断片であり；
Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、…  Ｃｉ−１、…  Ｃｎ−１がチオール基を担持するアミノ酸残基であり；
ｎが３〜５０の整数であり；そして
ｉが２〜ｎの整数である）
で表され、以下の工程：
（ａ１）Ｙ−Ａ１−ＳＥＡｏｆｆ  （ＩＩ１）断片を調製する１つ以上の工程、ここでＡ１はペプチド断片であり、当該断片のＣ末端が、ＳＥＡｏｆｆと呼ばれる環式ｂｉｓ（２−スルファニルエチル）アミノ基
【化１】
2014532075.tif 000002
を担持し、そしてＹは固相支持体の基と反応してＡ１と固相支持体との間に結合を形成する断片である；
（ｂ）Ｙ−Ａ１−ＳＥＡｏｆｆ（ＩＩ１）と、□−Ｙ’と表記される固相支持体とを反応させる１つ以上の工程、ここで□は固相支持体自体を表し、Ｙ’は、以下の式
【化２】
2014532075.tif 000003
に従いＹと反応してＺ基を形成する反応基を表す；
（ａ２）Ｈ−Ｃ１（ＰＧ１）−Ａ２−ＳＥＡｏｆｆ  （ＩＩ２）断片を調製する１つ以上の工程、ここでＣ１、Ａ２及びＳＥＡｏｆｆは上記で定義したものであり、（ＰＧ１）は、Ｈ又はアミノ酸Ｃ１のチオールの保護基を表す；
（ｃ１）式（ＩＩＩ１’）のチオエステルペプチドを調製する１つ以上の工程、当該工程は、以下の式
【化３】
2014532075.tif 000004
に従い、ｂｉｓ（２−スルファニルエチル）アミノペプチド□−Ｚ−Ａ１−ＳＥＡｏｆｆ  （ＩＩＩ１）と、チオールＲ−ＳＨとを、任意で環式ジスルフィドの還元剤の存在下で反応させ、ここで、Ｒは置換された又はされていないアルキル又はアリールラジカルであってもよい；
（ｄ１）以下の式
【化４】
2014532075.tif 000005
に従い、芳香族チオールＡｒＳＨの存在下、ＰＧ１がＨでない場合、ＰＧ１が除去される条件下、（ＩＩＩ’１）を、ペプチド断片（ＩＩ２）と縮合させる１つ以上の工程；
（ａｎ−１）Ｃｎ−１（ＰＧ  ｎ−１）−Ａｎ断片を調製する１つ以上の工程、ここで（ＰＧｎ−１）は、Ｈ又はアミノ酸Ｃｎ−１のチオールの保護基を表す；
（ｄｎ−１）芳香族チオールＡｒＳＨの存在下、ＰＧｎ−１がＨでない場合、ＰＧｎ−１が除去される条件下、Ｃｎ−１（ＰＧ  ｎ−１）−Ａｎと□−Ｚ−Ａ１−  Ｃ１−Ａ２−…Ｃｉ−１Ａｉ−…Ｃｎ−２Ａｎ−１ＳＥＡｏｆｆ  （ＩＩＩｎ−１）を縮合させて、□−Ｚ−Ａ１−  Ｃ１−Ａ２−…Ｃｉ−１Ａｉ−…Ｃｎ−１Ａｎ  （ＩＶｎ）を得る１つ以上の工程；
を含む。
【００２１】
本発明の特定の態様において、前記方法は、更に：
（ｅ）前記固相支持体からペプチドＡ１−Ｃ１−Ａ２−…Ｃｉ−１Ａｉ−…Ｃｎ−１Ａｎ  （Ｉ）を切り離す工程；
を含む。
【００２２】
本発明の一つの態様において、固相支持体□が、樹脂、特にポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、セルロース、ポリエチレン、ポリエステル、ラテックス、ポリアミド、ポリジメチルアクリルアミド、合成又は天然疎水性ポリマー、ガラスビーズ、シリカゲルを基礎とする樹脂から選択される。
【００２３】
本発明の一つの態様において、Ｃ１，．．．Ｃｉ…Ｃｎがシステインである。
【００２４】
本発明の一つの態様において、ＰＧ１，．．．  ＰＧｉ…  ＰＧｎがｔｅｒｔ−ブチルスルフェニル基である。
【００２５】
本発明の一つの態様において：
Ｙ’がアザイドから選択される基を含み、Ｙがアルキン基を含む基から選択される、又は
Ｙ’がアルキン基を含み、Ｙがアザイド基を含む基から選択される、又は
Ｙ’がアルデヒド基を含み、ＹがＨであり、Ａ１のＮ末端アミノ酸が、システイン、セリン又はスレオニンから選択され、又は
Ｙ’がアルデヒド基を含み、ＹがＳｃｈｉｆｆ塩基を形成するＮＨ２基を含む。
【００２６】
本発明の一つの態様において、Ｒが、１〜１２個の炭素原子を有し、直鎖又は分岐鎖で、置換され若しくは置換されていないアルキルラジカル、又は置換され若しくは置換されていないＣ６−Ｃ１２アリールから選択される。
【００２７】
本発明の一つの態様において、前記方法は、ｉ＝２，…ｎ−２のいずれの場合も、以下の工程
（ｃｉ）任意で環式ジスルフィドの還元剤の存在下、チオールＲ−ＳＨの作用により、□−Ｚ−Ａ１−Ｃ１−  …Ｃｉ−１ＡｉＳＥＡｏｆｆ  （ＩＩＩｉ）を□−Ｚ−Ａ１−  Ｃ１−  …Ｃｉ−１−ＡｉＳＲ  （ＩＩＩ’ｉ）に変換する１つ以上の工程；
（ｄｉ）（ＰＧｉ）が水素又はアミノ酸Ｃｉのチオールの保護基を表す場合、Ｃｉ（ＰＧｉ）Ａｉ＋１ＳＥＡｏｆｆを□−Ｚ−Ａ１−  Ｃ１−  …Ｃｉ−１Ａｉ−ＳＲ  （ＩＩＩ’ｉ）と縮合して、□−Ｚ−Ａ１−Ｃ１−  …ＣｉＡｉ＋１ＳＥＡｏｆｆ  （ＩＩＩｉ＋１）を得る工程；
を含む。
【００２８】
本発明の一つの態様において、ｉ＝２，…ｎ−２のいずれの場合も、前記方法の工程ｄｉ）が、ＳＥＡｏｆｆに影響を与えずにｉｎ  ｓｉｔｕで選択的にＰＧｉを除去する条件下で実施され、当該反応の溶媒が、ｐＨ４〜９の、芳香族チオールを含有する水性緩衝剤である。
【００２９】
本発明の他の目的は、固相支持体であって、ペプチドがグラフトされ、以下の式：（ＩＩＩ１）
□−Ｚ−Ａ１−ＳＥＡｏｆｆ  （ＩＩＩ１）
（式中、
Ａ１はペプチド断片であり、当該断片のＣ末端が、ＳＥＡｏｆｆと呼ばれる環式ｂｉｓ（２−スルファニルエチル）アミノ基
【化５】
2014532075.tif 000006
を担持し、□は固相支持体を表し、そしてＺはＡ１と□の間を連結する基を表す）
で表される、当該固相支持体である。
【００３０】
そのような固相支持体は、ポリペプチド合成キットにおいて使用される。そのようなポリペプチド合成キットは、通常、１つ以上の受容部を備えた１つ以上の支持部を備え、その上部又は内部に、１つ以上のグラフトされた固相支持体（ＩＩＩ１）が配置される。
【００３１】
本発明の他の目的は、本発明の合成方法の自動化された実施を可能とする、ペプチドを合成するための自動化されたデバイスである。そのようなデバイスは、内部にペプチドがグラフトされ、以下の式□−Ｚ−Ａ１−ＳＥＡｏｆｆ  （ＩＩＩ１）に対応する固相支持体が配置された１つ以上の受容部を含む。
【００３２】
当該受容部は、個別に：
ペプチド（ＩＩｉ）  Ｃｉ（ＰＧ  ｉ）Ａｉ＋１ＳＥＡｏｆｆ、及び：
１つ以上のチオールＲ−ＳＨ、及び任意で環式ジスルフィドの還元剤：
カップリング活性化剤、及び；
洗浄産物；
を含有する受容部も有する。
【００３３】
そのような自動化されたデバイスは、生産物の試料を取り出し、分別する機械的手段、並びにこれらの機械的手段の制御された利用を可能とするデータ処理手段を備える。
【００３４】
本発明の他の目的は、ｎ個のペプチド断片及びｎ−１個以上のチオール基を担持するアミノ酸を有するポリペプチドがグラフトされた固相支持体であって、以下の式（ＩＶｎ）□−Ｚ−Ａ１−  Ｃ１−Ａ２−…Ｃｉ−１Ａｉ−…Ｃｎ−１Ａｎで表される。
【００３５】
そのような固相支持体は、ポリペプチドと他の分子の間の親和性試験を実施するのに使用されてもよい。
【００３６】
これらのグラフトされた固相支持体を生物学的親和性試験に使用するためには、ペプチド鎖Ａ１−  Ｃ１−Ａ２−…Ｃｉ−１Ａｉ−…Ｃｎ−１Ａｎが、生物学的に関連する元の立体構造を有するように折りたたまれるのが一般に望ましい。従って、当該鎖は、合成工程後、一般にシステインがペアになってジスルフィド架橋を形成する条件下で折りたたまれる。
【００３７】
本発明の尚も他の目的は、１つ以上の受容領域を備えた１つ以上の支持部を備え、又は内部に、ｎ個のペプチド断片及びｎ−１個以上のチオール基を担持するアミノ酸を有する１つ以上のポリペプチドがグラフトされた１つ以上の固相支持体が配置され、以下の式（ＩＶｎ）□−Ｚ−Ａ１−  Ｃ１−Ａ２−…Ｃｉ−１Ａｉ−…Ｃｎ−１Ａｎに対応する。
【００３８】
本発明の尚も他の目的は、少なくとも：
−上記方法により１つ以上のポリペプチドを製造すること、及び
−それを医薬として許容される支持体と組み合わせること
を含む、医療製品を製造する方法である。
【００３９】
以下の記載で本発明をより詳細にかつ非限定的に説明する。
【００４０】
「ペプチド又はポリペプチド」は、本願の文脈中、ペプチド結合で互いに接続した、（２個以上の）アミノ酸残基の直鎖を意味する。本願の文意において、「ペプチド又はポリペプチド」は、例えば、これらの用語の通常許容される意味に照らして、オリゴペプチド、ペプチド又はタンパク質であってもよい。本発明のポリペプチド中に存在するアミノ酸残基は、タンパク質構成性（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ）である、又はない、アミノ酸残基から選択されてもよい。好ましくは、それらはタンパク質構成性の２０種類のアミノ酸残基から選択される。
【００４１】
ポリペプチドの表記は、Ｎ末端からＣ末端に進行する。ポリペプチド鎖を構成するアミノ酸残基は、通常の一文字又は三文字コードに従い表記されてもよい。アミノ酸残基は、式−ＮＨ−（ＣＨ−Ｒ）−（Ｃ＝Ｏ）−で表されるポリペプチド断片であり、ここで、Ｒは側鎖を表し、異なるアミノ酸はこの部分が相違する。
【００４２】
「ペプチド断片」は、本願の文脈において、１つ以上のアミノ酸残基を含むポリペプチドの部分を意味する。本願の文意において、「ポリペプチド断片」は、例えば：当該ポリペプチド断片が当該ポリペプチドのＣ末端もＮ末端も含まない場合、一連のアミノ酸残基であり（例えば−ＡＨＧ−又は−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−）；あるいは当該ポリペプチド断片が当該ポリペプチドのＮ末端を含む場合、そのＮ末端に基を有する一連のアミノ酸残基であり（例えばＨ−ＡＨＧ−又はＨ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−）；あるいは当該ポリペプチド断片が当該ポリペプチドのＣ末端を含む場合、そのＣ末端に基を有する一連のアミノ酸残基である（例えば−ＡＨＧ−ＯＨ又は−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ）。
【００４３】
各ペプチドは、２０種類のタンパク質構成性のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基のみを含むのが好ましいことが理解される。しかしながら、好ましい態様において、配列の内部の位置におけるペプチド断片Ａｉは、１つ以上の非タンパク質構成性アミノ酸残基を含んでもよく、また１つ以上のペプチド断片Ａ２  …  Ａｉ  …  Ａｎ−１は、１つ以上の改変アミノ酸を担持してもよく、当該改変は、本願方法が実施される前に実施されてもよい。非限定的な例において、前記アミノ酸の改変は、特に、カルボン酸の残基（ビオチン、アセチル器、アミノオキシ酢酸残基、フルオロフォア、例えばテトラメチルローダミン、金属のキレート剤、例えば１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、脂質、例えばパルミチン酸、ポリマー、例えばα−メトキシ−オメガ−カルボキシポリ（エチレングリコール）等）から選択されるラジカルから選択されてもよい。また、当業者に知られるタンパク質構成性アミノ酸の翻訳後修飾（メチル化、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、硫酸化、水酸化、カルボキシメチル化、固相中に組み込まれるための安定な保護基の担持等）、又は任意で医薬製品（ベクターとなるタンパク質）から選択されてもよい。
【００４４】
具体的に、修飾アミノ酸の存在は、前記ポチペプチドが他の分子（蛍光マーカー等）と相互作用をすることを可能とするように機能化するものであるが、他の種類の機能化が提供されてもよい。
【００４５】
単純な方法において、修飾は、非タンパク質構成性アミノ酸、特にタンパク質構成性アミノ酸の誘導体を使用して導入され、件の断片の固相合成の過程で修飾が導入される。例えば、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（ビオチン）−ＯＨ、即ち側鎖にビオチンを担持するリシンを使用して、断片の合成を実施することが可能である。当該断片は、その後、タンパク質構成性アミノ酸の断片を使用するのと同様に、組立てに使用される。
【００４６】
ポリペプチドＡ１，…Ａｉ，  Ａｎのアミノ酸残基は、任意で、側鎖に担持される基の保護基により一時的に又は持続的に保護されてもよく、それらの性質は、速算の反応性基に依存して様々で、当業者によく知られている。
【００４７】
本発明の態様において、ペプチド断片Ａｉは２〜６００アミノ酸残基、好ましくは５〜１００アミノ酸残基、より好ましくは８〜５０のアミノ酸残基を有する。
【００４８】
式（ＩＩ）のポリペプチドは、例えば、通常のペプチド合成方法、特に固相合成の方法により取得されてもよい。また、従来のネイティブライゲーションの手段により取得されてもよい。
【００４９】
ｂｉｓ（２−スルファニルエチル）アミノペプチド：Ｙ−Ａ１−ＳＥＡｏｆｆの調製（本発明の工程ａ１））は、Ｍｅｌｎｙｋ，  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．、ｂｉｓ（２−スルファニルエチル）アミノネイティブペプチドライゲーション、Ｏｒｇ．  Ｌｅｔｔ．，  １２（２２），  ５２３８−４１（２０１０）、及びＦＲ−２９５２０５８に記載の方法により実施されてもよい。本発明の態様において、前記Ｃ−末端アミノ酸は、ＳＥＡがグラフトされたポリマー樹脂をアミノ酸のハライド又はアミノ酸及び活性化剤と接触させるように持ち込むことにより、ＳＥＡ（ｂｉｓ（２−スルファニルエチル）アミノ）がグラフトされたポリマー樹脂Ｐの支持体とカップリングさせられる。活性化剤は、好ましくは、ＰｙＢＯＰ登録商標（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスフォニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＢＯＰ、ＰｙＢｒｏＰ登録商標（ブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、又はＨＡＴＵ（２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートメタンアミニウム）、より好ましくはＰｙＢｒｏＰ及びＨＡＴＵから選択される。当該態様は、出発ペプチド断片の調製の下記例において、より詳細に記載される。そして、Ａ１−ＳＥＡ−Ｐは、基Ｙにより機能化され、ポリマーＰから切り離される。
【００５０】
本発明の方法は、官能化ペプチドを□−Ｙ’と表記される固相支持体と反応させることを含み、□は固相支持体自体、Ｙ’は、以下のダイアグラム１：
【化６】
2014532075.tif 000007
に記載されるように、Ｙと反応してＺ基を形成出来る反応性基を表す。
【００５１】
前記固相支持体は、不溶性又は可溶性顆粒（ビーズ）の形態のポリマーが好ましい。例えばポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、セルロース、ポリエチレン、ポリエステル、ラテックス、ポリアミド、ポリジメチルアクリルアミド、及びそれらに由来する樹脂を基礎とする樹脂を使用出来る。また、固相支持体として、シリカゲル又はガラスビーズを使用することも出来る。
【００５２】
有利な場合、固相支持体は、合成親水性ポリマー、例えばＰＥＧＡ、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ登録商標、ＳＰＯＣＣ（超浸透性有機組み合わせ化学）、又は天然糖類ポリマー、例えばアガロース又はセファロース等から選択されて使用される。
【００５３】
これらの樹脂は、アザイド、アルキン、好ましくは真正アルキン又は末端アルキン、シクロオクチンから選択される基を有する基Ｙ’がグラフトされ、そしてＹは、それ自体、アルキン、好ましくは真正アルキン又は末端アルキン、及びアザイドから選択される。
【００５４】
変法において、これらの樹脂は、アルデヒド基を有する基Ｙ’がグラフトされ、ＹはＨであり、Ａ１のＮ末端アミノ酸は、システイン、セリン又はスレオニン、又はＳｃｈｉｆｆ塩基を形成出来るＮＨ２基、例えばヒドラジノカルボニル基Ｈ２ＮＮＨＣＯ、又はより一般的には、ヒドラジン又はＨ２ＮＯの誘導体、即ちヒドロキシルアミンの誘導体から選択される。
【００５５】
より具体的には、本発明の好ましい態様は：
Ｙ’がアルキンを含むとき、Ｙはアザイドであり、
Ｙ’がアザイドを含むとき、Ｙはアルキンであり、
Ｙ’がアルデヒドであるとき、ＹはＨであり、Ａ１のＮ末端アミノ酸は、システイン、セリン又はスレオニンから選択され、又は
Ｙ’がアルデヒドであるとき、ＹはＳｃｈｉｆｆ塩基を形成出来るＮＨ２基、例えばヒドラジノカルボニル基Ｈ２ＮＮＨＣＯ、又はより一般的には、ヒドラジン又はＨ２ＮＯの誘導体、即ちヒドロキシルアミンの誘導体から選択される。
【００５６】
ペプチド断片と固相担体との間の結合は、適切な官能基、リンカーによりなされる。故に、まず、Ｎ末端ペプチド断片は、合成されるポリペプチドのＮ末端に対応するアミノ酸により、固相のリンカーである官能基上に固定され（ＳＥＡｏｆｆの形態のペプチド断片のＣ末端を切り離す）、これが第一のプライマーを構成し、次のペプチド断片が、下記の連続反応に従い添加される。
【００５７】
最初の変法において、ｂｉｓ（２−スルファニルエチル）アミノペプチドがグラフトされた固相：□−Ｚ−Ａ１−ＳＥＡｏｆｆ  （ＩＩＩ１）は、ＷＯ２０１１／０５８１８８に記載の方法により調製される。
【００５８】
ペプチドＡ１−ＳＥＡｏｆｆは、一般式Ｘ１−Ｌ−Ｘ２に対応する化合物と反応させられ、式中、Ｘ１は、以下の群：−Ｎ３及び−Ｃ≡ＣＨから選択される。
【００５９】
上記式中、Ｌは、スペーサー基であり、Ｘ２はペプチドＡ１のＮＨ２基と反応する官能基を含む基であり、上記ライゲーション条件下で耐性であり、ペプチド鎖を分解しない条件下で開裂可能である。そのような基Ｘ２は、ＷＯ２０１１／０５８１８８に詳細に記載されている。
【００６０】
前記ペプチドＡ１は、その末端の酸基及びＳＥＡｏｆｆ前駆基を介して、固相により支持される。支持されたペプチドＡ１を化合物Ｘ１−Ｌ−Ｘ２との接触に持ち込むことは、ペプチドＡ１の末端ＮＨ２基と基Ｘ２との間の共有結合の形成をもたらし、化合物Ｘ１−Ｌ’−Ａ１を形成し、ここで、Ｘ１は、上記と同じで、Ｌ’は、-Ｌ−Ｘ２とペプチドＡ１のＮ末端の縮合により形成されるリンカーアームを意味する。当該ＳＥＡｏｆｆ基は、固相からペプチドＸ１−Ｌ’−Ａ１を切り離した後にのみ形成される。
【００６１】
通常、Ｌ’は１〜５０個の炭素原子を有するアルカンジ−イル鎖であって、非限定的に以下：水酸基、アミン基、エステル基、チオエステル基、エーテル基、アミド基、ＮＯ２基、ＳＯ２基、ハロゲン基、任意で置換されたアリール基から選択され得る１つ以上の基であり、当該アルカンジ−イル鎖は、任意で、以下：エーテル橋（−Ｏ−）、アミン橋（−ＮＨ−）、エステル橋（−ＣＯＯ−）、アミド橋（−ＣＯＮＨ−）、尿素橋（−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−）、ウレタン橋（−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−）から選択される１つ以上の基により遮られる。
【００６２】
次に、反応性基Ｘ１は、安定な官能性を担持する固相支持体と反応する。そのような支持体は、ＷＯ２０１１／０５８１８８に記載されている。具体的には、Ｘ１は−Ｃ≡ＣＨで表され、以下の官能基の一つを担持する固相支持体が選択される。
□−Ｎ３
□−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−Ｎ３
【００６３】
Ｘ１がＮ３を表す場合、アルキン基で官能化された固相支持体は、例えば、好ましくは真正アルキンから選択されてもよく、より複雑な、又は複雑ではない分子、例えばＷＯ２０１１／０５８１８８に例示された□−ＮＨ−ＣＯ（ＮＨ２）ｍ−Ｃ≡Ｃ−Ｈ、シクロオクチン基等に存在する。
【００６４】
Ｘ１と固相支持体との間の反応は、化学選択的条件下で実施され、Ｘ１とペプチドＡ１のアミノ酸との間で競合的な反応は起こらない。
【００６５】
第二の変法において、ｂｉｓ（２−スルファニルエチル）アミノペプチドがグラフトされた固相支持体：□−Ｚ−Ａ１−ＳＥＡｏｆｆ  （ＩＩＩ１）は、Ｍ．Ｖｉｌｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８  （２００１）  ６７３−６７９に記載の方法により調製されてもよい。
【００６６】
本方法において、チアゾリジン又はオキサゾリジン結合は、固相担体が担持するアルデヒド基と、ペプチドＡ１のＮ末端のシステイン、セリン又はスレオニンとの間で、下記ダイアグラム２のように形成される。
【化７】
2014532075.tif 000008
【００６７】
当該ダイアグラムにおいて、Ｌ’は固相担体とアルデヒド基との間のスペーサーアームを表し、Ａ’１はペプチドＡ１のＮ末端システイン、セリン又はスレオニンと形成するペプチド残基を粗指す。好ましくは、Ｌ’は１〜５０個の炭素原子を含むアルカンジ−イル鎖であり、非限定的に：水酸基、アミン基、エステル基、チオエステル基、エーテル基、アミド基、ＮＯ２基、ＳＯ２基、ハロゲン基、任意で置換されたアリール基から選択され得る１つ以上の基を含み、当該アルカンジ−イル鎖は、任意で、以下：エーテル橋（−Ｏ−）、アミン橋（−ＮＨ−）、エステル橋（−ＣＯＯ−）、アミド橋（−ＣＯＮＨ−）、尿素橋（−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−）、ウレタン橋（−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−）から選択される１つ以上の基により遮られる。
【００６８】
実際に、当該変法において、グラフトは、ペプチドと官能化固相支持体との間の直接反応により実施されてもよい。唯一要求されるのは、ペプチドＡ１のＮ末端の位置に、システイン、セリン又はスレオニン残基が存在することである。所望の最終ペプチドは、Ｎ末端の位置にこれらのアミノ酸の１つを有し、当該方法は、配列の修飾無しで当該ペプチドに対して実施されてもよい。あるいは、前記標的配列のＮ末端の位置に、これらの３つの残基の１つを添加することを提供することが必要である。
【００６９】
全てのケースにおいて、固相支持体とＡ１を接続するリンカーアームＺは、変形工程ｃｉ）と縮合工程ｄｉ）の遂行の条件下で耐性でなければならない。更に、ポリペプチド（Ｉ）の放出を可能とする条件下で、それにダメージを与えずに開裂されなければならない。
【００７０】
本発明は、更に、下記断片Ｈ−Ｃｉ−１（ＰＧｉ−１）−Ａｉ−ＳＥＡｏｆｆ  （ＩＩｉ）の調製に基づき（ｉ  ＝  ２，…ｎ−１）、式中、Ｃｉ−１、Ａｉ及びＳＥＡｏｆｆは、上記で定義した通りであり、（ＰＧｉ−１）はチオール又はアミノ酸Ｃｉ−１の保護基又はＨを意味する。
【化８】
2014532075.tif 000009
【００７１】
式のペプチドは、Ｎ末端に水素原子と残基Ｃｉ−１（ＰＧｉ−１）を有する。Ｃｉ−１残基は、チオール基を有するアミノ酸残基である。当該チオール基は、特に、βアミノチオール基（残基Ｃｉ−１が好ましくはシステイン残基を表す場合）、γアミノチオール基（残基Ｃｉ−１が好ましくはホモシステイン残基を表す場合）、又はセレノシステインであってもよい。
【００７２】
下記全体で、特定の態様において、Ｃｉ−１は、システイン残基（Ｃｙｓ）を表すものであってもよい。
【００７３】
本発明の好ましい変法において、Ｃｉ−１のチオール基は、保護基ＰＧｉ−１により保護される。好ましくはＰＧｉ−１は保護基（ＳＲ’）を表し、アミノ酸Ｃｉ−１のチオール上にジスルフィド残基を形成し、Ｒ’はＣ１−Ｃ６アルキル基を表し、特にＳＲ’は、ｔｅｒｔ−ブチルスルフェニル基、又はＣ６−Ｃ１２アリールスルフェニル、又はアラルキルスルフェニル基、例えばフェニルスルフェニル又はベンジルスルフェニルを表す。
【００７４】
各ペプチド断片Ａｉは、上記操作の実施の前に、本発明の方法により、又は他のペプチド合成方法により調製されてもよい。
【００７５】
本発明は、特に、固相担体上にグラフトされ、ＳＥＡｏｆｆ基を担持するペプチドの、チオエステルペプチド□−Ｚ−Ａ１−Ｃ１−Ａ２−…Ｃｉ−２−Ａｉ−１−ＳＲ  （Ｉ  ＝  ２，…ｎ）  （ＩＩＩ’ｉ−１）への変形ｃｉ）、及びそれらの、以下の一般式：
【化９】
2014532075.tif 000010
（式中
ＡｉはＣ末端がｂｉｓ（２−スルファニルエチル）アミノ基
【化１０】
2014532075.tif 000011
いわゆるＳＥＡｏｆｆを担持するペプチド断片を表し、
Ｃｉ−１はチオール基を担持するアミノ酸残基を表す）
に対応する環式ジスルフィド状態のｂｉｓ（２−スルファニルエチル）アミノ基を担持するペプチド（又はポリペプチド）との縮合反応（ｄｉに基づく。
【００７６】
ＳＥＡｏｆｆは、非反応性環式ジスルフィドを意味し、後述のＳＥＡｏｎ構造-Ｎ［（ＣＨ２）２−ＳＨ］２、反応性ジスルフィドと対となる。
【００７７】
この特定の工程は、Ｄｈｅｕｒ，  Ｊ．，  Ｏｌｌｉｖｉｅｒ，  Ｎ．，  Ｖａｌｌｉｎ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｍｅｌｎｙｋ，  Ｏ．  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｌｋｙｌｔｈｉｏｅｓｔｅｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎ，Ｓ−Ａｃｙｌ  Ｓｈｉｆｔ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｓ（２−ｓｕｌｆａｎｙｌｅｔｈｙｌ）ａｍｉｄｏ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ７６，  ３１９４−３２０２  （２０１１）において他の化合物で記載されている。
【００７８】
この合成工程は、少なくとも１つの工程ｃｉ）  （Ｉ  ＝  ２，…ｎ−１）の、任意で環式ジスルフィドの還元剤の存在下、チオールＲ−ＳＨの反応による、□−Ｚ−Ａ１−  …Ｃｉ−１Ａｉ−ＳＥＡｏｆｆ  （ＩＩＩｉ）の□−Ｚ−Ａ１−  …Ｃｉ−１−Ａｉ−ＳＲ  （ＩＩＩ’ｉ）への変換に基づく。
【００７９】
Ｉ＝ｎの場合、ＳＥＡｏｆｆのＳＲへの変換は不要で、Ｃ末端ペプチド断片-Ｃｎ−１（ＰＧｎ−１）Ａｎとの縮合反応ｄｎ）は直接実施されてもよい。
【００８０】
当該変形は、ＰＧｉがＨでない場合除去される条件下、芳香族チオールＡｒＳＨの存在下、□−Ｚ−Ａ１−…Ｃｉ−１Ａｉ−ＳＲ  （ＩＩＩ’ｉ）とＣｉ（ＰＧ  ｉ）−Ａｉ＋１−ＳＥＡｏｆｆ  （ＩＩｉ＋１）との縮合工程ｄｉ）が続き、□−Ｚ−Ａ１−…Ｃｉ−１Ａｉ−ＣｉＡｉ＋１−ＳＥＡｏｆｆ  （ＩＩＩ’ｉ＋１）が形成される。
【００８１】
ｉ  ＝  ｎ−１の場合、前記縮合工程は、ＳＥＡ基を担持しないペプチド-Ｃｎ−１（ＰＧｎ-１）Ａｎと実施され、ＳＥＡｏｆｆのＳＲへの変換は必要でないが、全体の合成が自動デバイスを使用して実施される場合、他の縮合と同様の残りの実施条件が、特に芳香族チオールＡｒＳＨの存在下、ＰＧｎ−１がＨでない場合除去される条件下、特に実施されてもよい。
【００８２】
Ｒで表されるアルキル基は、ハロゲン原子（例えばＦ）、又はＣＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＣＯＮＨ２、ＯＨ、ＳＨ、アルキルオキシ、アルキルチオ、メルカプトアルキルチオ基、エステルの残基又はポリエチレングリコール残基の残基から選択される１つ以上の基で、又は任意で置換されたフェニル、又は採用される反応に干渉しない他の有機基で、任意で置換された、１〜１２個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキル基、又は、Ｃ６−Ｃ１２アリールである。工程ｃｉ）で使用される一般式Ｒ−ＳＨのチオールは、例えばＨＳＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、ＨＳＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３Ｈ、ＨＳＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、ＨＳＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＳＨ又はＨＳＣＨ２Ｐｈである。
【００８３】
変法において、チオールＲ−ＳＨが充分に還元的である場合、環式ジスルフィドの追加の還元剤の存在は必須ではない。
【００８４】
工程ｄｉ）で使用される芳香族チオールは、好ましくは、ジスルフィド結合の還元化合物から選択され、好ましくは、チオフェノール及び／又は芳香環の置換により得られる誘導体、例えば４−カルボキシメチルチオフェノールから選択される。あるいは、ジチオスレイトール、ベンジルメルカプタン等の非芳香族チオールが、芳香族チオールの代わりに使用されてもよい。もちろん、これらのチオールの混合物も適している。
【００８５】
工程ｃｉ）に使用されるＳＥＡｏｆｆの還元剤は、環式ジスルフィドの還元剤から選択されてもよい。特に、ホスフィン（例えばｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン）、又は他の環式ジスルフィドの還元剤、例えばチオール（例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ））から選択されてもよい。
【００８６】
好ましくは、前記縮合工程は、過剰のＣｉ（ＰＧ  ｉ）−Ａｉ＋１−ＳＥＡｏｆｆ又はＣｎ−１（ＰＧｎ−１）−Ａｎの存在下で実施される。
【００８７】
前記ライゲーション反応は、好ましくは水性媒体、例えばｐＨ４〜９のリン酸緩衝剤中で実施される。好ましくは、当該反応はｐＨ５〜９、好ましくは５．５〜８．５、より好ましくはｐＨ５．５〜７．５、理想的には７．０付近で実施される。
【００８８】
前記縮合反応は、好ましくは、０〜５０℃、理想的には約３７℃の温度で実施される。当該反応の期間は、選択する試薬及びその他の反応の条件に依存して調整される。適切な期間は、反応中の液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリーの結果に従い調整されてもよい。適切な期間は、数時間から数日である。
【００８９】
好ましくは、前記固相支持体の洗浄が、２つの縮合工程の間に実施され、未反応の過剰のペプチド残基が除去され、それは任意で回収又は再利用される。
【００９０】
任意で、ポリペプチドを構成するアミノ酸の側鎖の脱保護が、当業者に周知の方法により実施される。
【００９１】
本発明において、複数のペプチド断片を組み立てる方法は、図１に示すダイアグラムに表されてもよい。
【００９２】
本発明において、前記方法は、連結基Ｚを介して固相支持体□上にグラフトされた複数のペプチド部品の調製をもたらし、当該ペプチド部品は、チオール基を担持するアミノ酸残基を有し、即ちｎ個のペプチド断片Ａｉ、及びチオール基を担持するｎ−１個以上のアミノ酸Ｃｉからなるペプチド部品であり、以下の式□−Ｚ−Ａ１−Ｃ１−Ａ２−Ｃ２−Ａ３−  …  −Ｃｉ−１−Ａｉ−…．  −Ｃｎ−１−Ａｎ（ＩＶｎ）で表される。式中、Ａ１，  Ａ２，  Ａ３，  …  Ａｉ  …，  Ａｎはペプチド断片であり、Ｃ１，  Ｃ２，  Ｃ３  …  Ｃｉ−１  …  Ｃｎ−１はチオール基を担持するアミノ酸残基であり、ｎは３〜５０、好ましくは３〜２０、より好ましくは３〜１０であり、ｉは２〜ｎの整数である。
【００９３】
従って、本発明は、ｎ−１回のペプチド組立て工程を含む。好ましくは、ｎ−１回のペプチド組立て工程は、任意で環式ジスルフィドの還元剤の存在下、チオールＲ−ＳＨの作用による、□−Ｚ−Ａ１−Ｃ１−Ａ２−…Ｃｉ−１Ａｉ−ＳＥＡｏｆｆの□−Ｚ−Ａ１−  Ｃ１−Ａ２−…Ｃｉ−１−Ａｉ−ＳＲへの変換、その後の、ＰＧｉが除去される条件下、芳香族チオールＡｒＳＨの存在下、□−Ｚ−Ａ１−  Ｃ１−Ａ２−…Ｃｉ−１Ａｉ−ＳＲをＣｉ（ＰＧ  ｉ）−Ａｉ＋１−ＳＥＡｏｆｆと縮合して、□−Ｚ−Ａ１−  Ｃ１−Ａ２−…Ｃｉ−１Ａｉ−ＣｉＡｉ＋１−ＳＥＡｏｆｆを得ることに基づく。
【００９４】
しかしながら、当業者に知られた他のライゲーション方法を使用してペプチド（ＩＶｎ）の合成に採用されるペプチド組立ての１つ以上の工程が実施されることを排除しない。
【００９５】
具体的には、上記のように、工程ｎ−１は、ＳＥＡｏｆｆとＣｎ−１（ＰＧｎ−１）−Ａｎの直接反応によるＳＥＡライゲーションであってもよい。
【００９６】
好ましくは、本発明のペプチドを生産する方法の全ての工程は、ｃｉ）、ｄｉ）、ｉ  ＝  １，  …ｎ−２、任意で  ｃｎ−１）、そしてｄｎ−１）の工程の連続で実施される。
【００９７】
ポリペプチドの製造において、好ましくはそれを樹脂から切り離す前、１つ以上の化学処理、例えば、当業者に知られた方法、例えばホモシステインのアルキル化によるメチオニンへの変換、又はシステインの脱硫、又はセレノシステインの脱セレン化によるアラニンへの変換等が実施されることが想定される。
【００９８】
好ましくは、前記方法の後、固相支持体とペプチド（Ｉ）との間の結合を、ペプチド（Ｉ）が放出される条件下で開裂させる工程が行われる。
【化１１】
2014532075.tif 000012
【００９９】
開裂手段は、リンカーアームＺの性質に依存して異なる。特に、ＷＯ２０１１／０５８１８８の教示を踏まえ、リンカーアームＺの性質に依存して、スペーサーアームＺのＸ２部分とペプチド（Ｉ）との間の共有結合を、求核攻撃により、又はアルカリ若しくは酸性条件下、又はＵＶ照射により、開裂することにより、ペプチド（Ｉ）を放出させることが出来る。
【０１００】
スペーサーアームＺがペプチドＡ１のセリン又はｎ−末端スレオニンからのシステインと固相担体が担持するアルデヒド基との重合の結果、チアゾリジン、又はそれぞれオキサゾリジン、環を形成する場合、Ｍ．Ｖｉｌｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８  （２００１）  ６７３−６７９の教示に従い、最終的なペプチドは、好ましくは、Ｏ−メチルヒドロキシルアミンによる処理で放出させられる。
【０１０１】
後者の条件も、形成されるＺがＳｃｈｉｆｆ塩基である場合、適用可能である。
【０１０２】
本発明の他の目的は、ペプチドがグラフトされた固相支持体であり、以下の式：□−Ｚ−Ａ１−ＳＥＡｏｆｆ  （ＩＩＩ１）に対応する。式中、Ｚ、□、Ａ１及びＳＥＡｏｆｆは、上記と同じものを意味する。そのような第一のペプチド断片Ａ１がグラフトされた支持体は、複雑なポリペプチドの合成を開始できる。我々は、特に、一般的興味のある、しばしば、生物学的関心のあるペプチドのＮ末端配列として使用されるペプチドＡ１の配列がグラフトされた固相支持体の産業的又は半産業的調製を想定する。例えば、我々は、以下の種類の配列：タンパク質の局在及び分泌のシグナルペプチド、マーカーペプチド（例えば蛍光）、ヒスチジンタグ等の精製タグ、ユビキチン化シグナルを担持するペプチド等；を示し得る。
【０１０３】
そのような第一のペプチド、特に関心のあるペプチドがグラフトされた固相支持体は、ポリペプチド合成用のキットとして使用され得る。そのようなキットにおいて、それは、受容部、例えば連続的なライゲーション反応がその中で実施され得るマルチウェルプレートのウェル等を有する支持部と組み合わせられてもよい。それは、ライゲーション反応を実施するための上記のもののような合成試薬と組み合わせられてもよい。
【０１０４】
本発明の他の目的は、本発明の合成方法の自動化された実施を可能とするペプチド合成用の自動化デバイスである。そのようなデバイスは、内部にペプチドがグラフトされた固相支持体：□−Ｚ−Ａ１−ＳＥＡｏｆｆ（ＩＩＩ１）が置かれた１つ以上の受容部を備える。Ａ１は、特に上記関心のあるペプチドから選択されてもよい。
【０１０５】
受容部は、上記ペプチド（ＩＩｉ）  Ｃｉ（ＰＧ  ｉ）Ａｉ＋１ＳＥＡｏｆｆを含んでもよく、別の受容部が、異なる配列のペプチドをそれぞれ含むものであってもよい。
【０１０６】
受容部は：
−チオールＲ−ＳＨ及び任意で環式ジスルフィドの還元剤、
−カップリング活性化剤、及び
−洗浄産物
のために提供されてもよい。
【０１０７】
このような自動化デバイスは、試料を別の受容部から取り出す機械的手段及び固相支持体を含有する受容部注のこれらの試料を分配する手段を備えてもよい。斯かる手段は、循環する液体のパイプ及びバルブのセットからなり、任意で微小流体回路（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｃｉｒｃｕｉｔ）中に、又はサンプリングピペットを備えたヒンジ中に配置されてもよい。当該自動化デバイスは、これらの機械的手段のコントロールされた実行を可能とし、連続的な反応の実施を可能とする、データ処理手段（ソフトウエア）を備えてもよい。
【０１０８】
本発明の他の目的は、ｎ個のペプチド断片Ａｉ及びｎ−１個のチオール基を担持するアミノ酸Ｃｉを有するポリペプチドがグラフトされた固相支持体であり、以下の式（ＩＶｎ）：□−Ｚ−Ａ１−  Ｃ１−Ａ２−…Ｃｉ−１Ａｉ−…Ｃｎ−１Ａｎ  （ＩＶｎ）で表される。式中、Ｚ、□、Ａｉ、Ｃｉ、ｉ、ｎ及びＳＥＡｏｆｆは、上記と同じ意味である。実際に、連続的ライゲーション及びアミノ酸の側鎖の脱保護、及びペプチド鎖の折り畳みの終了後、固相支持体は、生物学的試験、特に何らかの種類の分子に対する合成されたポリペプチドの親和性試験の実施に使用されてもよい。
【０１０９】
本発明の他の目的は、上部にｎ個のペプチド断片とｎ−１個のチオール基を担持するアミノ酸を有する１つ以上のポリペプチドがグラフトされた１つ以上の固相支持体が置かれた１つ以上の受容部を有する１つ以上の支持部を有する試験又は診断キットからなり、当該グラフトされた固相支持部は、式（ＩＶｎ）：□−Ｚ−Ａ１−  Ｃ１−Ａ２−…Ｃｉ−１Ａｉ−…Ｃｎ−１Ａｎ  （ＩＶｎ）に対応する。
【０１１０】
従って、前記試験キットは、生物活性分子のスクリーニング又は診断試験に使用されてもよい。当該診断キットは、同一又は異なるポリペプチドがグラフトされた固相支持体が上部に蓄積された幾つかの個別の受容部を有する診断キットを想定し得る。例えば、同一又は異なるポリペプチドがグラフトされた固相支持体は、マルチウェルプレートのウェルの中に置かれ、試験又は診断支持体を形成してもよい。
【０１１１】
好ましくは、試験を実施するために、固相支持体上にグラフトされるポリペプチドは、二次元又は三次元構造の形成を促進する媒体と接触させられる。例えば、Ｅ．Ｃ．Ｂ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ２００６，  ４５，  ３２８３−３２８７の教示に従い、前記ポリペプチドは、ｐＨ８のリン酸緩衝剤と接触させられ、空気を放出させられ、又は当該ペプチドは、ｐＨが９に等しい水溶液と接触させられてもよい。他の有用な折り畳み方法は、ＧＳＨ、ＧＳＳＧのペアの使用である（グルタチオンにＧＳＨ、酸化グルタチオンにＧＳＳＧ）。
【０１１２】
前記試験又は診断キットは、更に、ポリペプチドと試験される分子との間の相互作用を検出する手段を含んでもよい。
【０１１３】
本発明の尚も他の目的は、
−上記方法により１つ以上のポリペプチドを製造する工程、及び
−それを医薬として許容される支持体と組み合わせる工程
を含む、医薬製品を製造する方法である。
【０１１４】
実際に、本発明の方法は、治療活性、特にワクチン性を有するポリペプチドを合成することを目的に利用されてもよい。それらを医薬として許容される支持体と組み合わせる工程は、当業者により技術常識に基づいて、かつポリペプチドの性質（特に溶解性）及び選択される投与方法に関連して実施される。
【０１１５】
本発明の他の特徴及び利点は、下記本発明の好ましい態様の記載、及び添付図面を参照して明示されるが、これらは例示である。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】本発明のペプチド合成方法の一般的なダイアグラムを示す。
【図２】実施例Ｉのペプチド１１ａ、Ｈ−ＧＩＬＫＥＰＶＱＧＡ−ＣＨＨＬＥＰＧＧ−ＣＨＨＬＥＰＡＧ−ＣＩＬＫＥＰＶＨＧＡ−ＮＨ２を合成する方法のダイアグラムを示す。
【図３】ペプチド４のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図４】ペプチド４のＭＳスペクトルを示す。
【図５】ペプチド５．１ａのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図６】ペプチド５．１ａのＭＳスペクトルを示す。
【図７】ペプチド８．２のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図８】ペプチド８．２のＭＳスペクトルを示す。
【図９】ペプチド８．３のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１０】ペプチド８．３のＭＳスペクトルを示す。
【図１１】ペプチド１１ａのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１２】ペプチド１１ａのＭＳスペクトルを示す。
【図１３】精製したペプチド１１ａのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１４】ペプチド１６ａのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１５】ペプチド１６ａのＭＳスペクトルを示す。
【図１６】ペプチド１９のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１７】ペプチド１９のＭＳスペクトルを示す。
【図１８】ペプチド２１のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１９】ペプチド２１のＭＳスペクトルを示す。
【図２０】ペプチド２３．１のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２１】ペプチド２３．１のＭＳスペクトルを示す。
【図２２】ペプチド２６．１のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２３】ペプチド２６．１のＭＳスペクトルを示す。
【図２４】ペプチド２９のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２５】ペプチド２９のＭＳスペクトルを示す。
【実施例】
【０１１７】
Ｉ−ペプチド１１の合成
Ｈ−ＧＩＬＫＥＰＶＱＧＡ−ＣＨＨＬＥＰＧＧ−ＣＨＨＬＥＰＡＧ−ＣＩＬＫＥＰＶＨＧＡ−ＮＨ２
ペプチド１１ａは、図２に示すダイアグラムに従い、４つのペプチド断片の連続ライゲーションにより調製される。
【０１１８】
Ｉ−Ａ−    Ｎ３−Ｅｓｏｃ−ＧＩＬＫＥＰＶＱＧＡ−ＳＥＡｏｆｆ（ペプチド４）の調製
Ｎ３−Ｅｓｏｃ基はＷＯ２０１１／０５８１８８に記載されている。
【化１２】
2014532075.tif 000013
【０１１９】
図２のＸ１はＧＩＬＫＥＰＶＱＧＡである。
【０１２０】
Ｎ３−Ｅｓｏｃ−ＧＩＬＫＥＰＶＱＧＡ−ＳＥＡｏｆｆの調製は、以下のダイアグラム３に例示される。
【化１３】
2014532075.tif 000014
【０１２１】
手順
−ぺプチジル樹脂２  Ｈ−ＧＩＬＫ（Ｂｏｃ）Ｅ（ｔＢｕ）ＰＶＱ（Ｔｒｔ）ＧＡ−ＳＥＡ−ＰＳの合成
固相支持体ＳＥＡ−ＰＳ（ＰＳ＝ポリスチレン）は、出願ＦＲ−２９５２０５８に記載される。
【０１２２】
当該ペプチジル樹脂は、０．２５  ｍｍｏｌのスケールで合成され、Ｏｌｌｉｖｉｅｒ，  Ｎ．；  Ｄｈｅｕｒ，  Ｊ．；  Ｍｈｉｄｉａ，  Ｒ．；  Ｂｌａｎｐａｉｎ，  Ａ．；  Ｍｅｌｎｙｋ，  Ｏ．  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１０，  １２，  ５２３８−４１に記載のプロトコルに従う。
【０１２３】
合成後、当該樹脂をＣＨ２Ｃｌ２  （２  ｘ  ２  ｍｉｎ）及びＤＭＦ  （２  ｘ  ２  ｍｉｎ）で連続して洗浄し、次の工程に使用する。
【０１２４】
−断片Ｎ３−ＥＳＯＣ−ＧＩＬＫＥＰＶＱＧＡ−ＳＥＡｏｆｆ  ４の合成
活性化アームＮ３−Ｅｓｏｃ−ＯＮｐ（ダイアグラム３）は、ＷＯ２０１１／０５８１８８に記載の手順に従い合成される。２−［２−（２−アザイド−エトキシ）−エチルスルホニル］−エチルと４−ニトロフェニル（１４５ ｍｇ，  ０．４ ｍｍｏｌ，  １．５  ｅｑ）の混合物を最小の量のＤＭＦに溶解し、樹脂に直接移す。Ｎ−メチルモルホリン（５５ μＬ，  ０．５ ｍｍｏｌ，  ２  ｅｑ）を添加する。当該反応混合物を常温のアルゴン大気中で１２時間撹拌する。当該樹脂をＤＭＦ  （２  ｘ  ２  ｍｉｎ）、ＣＨ２Ｃｌ２  （２  ｘ  ２  ｍｉｎ）及びＥｔ２Ｏ  （２  ｘ  ２  ｍｉｎ）で連続して洗浄し、真空下で乾燥させる。
【０１２５】
最後の側鎖の脱保護及びペプチドの樹脂からの切り離しは、ＴＦＡ／ＴＩＳ／ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ  混合物（２０ ｍＬ，  ９２．５／２．５／２．５／２．５％  ｖ／ｖ）を１．５ ｈ作用させて実施される。当該ペプチドはジエチルエーテル／ヘプタンの冷却混合物（２００ ｍＬ，  １：１  ｖ／ｖ）から沈殿させられ、そして最小量の水に溶解させられ、凍結乾燥させられる。
【０１２６】
粗ペプチド４（３０ ｍｇ，  ０．０２ ｍｍｏｌ）をリン酸ナトリウム緩衝剤（２０ ｍＬ，  ０．２Ｍ，  ｐＨ  ＝  ７．２）に溶解し、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルアゾジカルボキサミド（ＴＭＡＤ）  （６．８ ｍｇ，  ０．０４ ｍｍｏｌ，  ２  ｅｑ）の存在下２０分間酸化する。反応混合物を逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）  （Ｃ１８  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌカラム（ｄ  ＝  １ ｃｍ，  Ｌ  ＝  ２０ ｃｍ，  １２０  Å，  ５ μｍ），  ＵＶ検出（・・・２１５ ｎｍ），  緩衝剤Ａ：  Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （１：０．０５％  ｖ／ｖ），  緩衝剤Ｂ：  ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （４：１：０．０５％  ｖ／ｖ／ｖ），  勾配：緩衝剤Ｂ  （５分以内０〜２０％、その後６０分以内２０〜４２％，  ６ ｍＬ／ｍｉｎ））で直接精製する。解析の結果を図３に示す。
【０１２７】
ＬＣ−ＭＳ解析
ＬＣ−ＭＳ：緩衝剤Ａ：  Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （１：０．０５％  ｖ／ｖ），  緩衝剤Ｂ：  ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （４：１：０．０５％  ｖ／ｖ／ｖ）。Ｃ１８  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨカラム（３００  Å，  ３．５  μｍ，  ４．６  ｘ  １５０ ｍｍ）上のＲＰ−ＨＰＬＣ、線形勾配３０分以内０−１００％  Ｂ流速１ ｍＬ／ｍｉｎ，  ＥＬＳ検出。
【０１２８】
ＭＳ：陽性エレクトロスプレーイオン化モード、コーン電圧３０Ｖ、四重極解析器。結果を図４に示す。
【０１２９】
Ｉ−Ｂ−ペプチジル樹脂Ｐ−１−（１，２，３−トリアゾリル）−Ｅｓｏｃ−ＧＩＬＫＥＰＶＱＧＡ−ＳＥＡｏｆｆの調製、Ｐ＝  ＰＥＧＡ  ８００，  ５．１
Ｐ−１−（１，２，３−トリアゾリル）−Ｅｓｏｃ−ＧＩＬＫＥＰＶＱＧＡ−ＳＥＡｏｆｆの調製は、下記ダイアグラム４に例示される。
【化１４】
2014532075.tif 000015
【０１３０】
手順
アミノメチルＰＥＧＡ  ８００  （０．４ ｍｍｏｌ／ｇ）を、ＷＯ２０１１／０５８１８８に記載の手順に従いペンチン酸とカップリングさせる。得られたアルキン樹脂（２  ｅｑ）を、１．６７ｍｌのＨＥＰＥＳ  １００ ｍＭ緩衝剤ｐＨ  ＝  ７．５とメタノールの９：１混合物中のアザイドペプチド４（１０ μｍｏｌ）溶液に添加する。得られた懸濁物をアルゴン（３０分）でバブリングして脱酸素処理し、塩酸アミノグアニジン（１．１ ｍｇ，  １  ｅｑ），  トリス（ハイドロキシプロピル）トリアゾリルメチル−アミン（ＴＨＰＴＡ）（２６０ ｍｇ，  ６０  ｅｑ），  五水和硫酸銅  （７５ ｍｇ，  ３０  ｅｑ）及びアスコルビン酸ナトリウム（１１９ ｍｇ，  ６０  ｅｑ）を添加し、当該懸濁物をアルゴンでバブリングしながら室温で３０分間撹拌する。当該ペプチジル樹脂５．１を、大量の：水（脱イオン）、ＥＤＴＡ  ２５０ ｍＭ  ｐＨ  ４．２の溶液、水、メタノール、ＤＭＦ及び最後に水で連続的に洗浄する。
【０１３１】
グラフトは、少量のペプチジル樹脂を５０ ｍＭのＣＡＰＳ溶液、ｐＨをソーダで１１．７に調整したもので処理し  （２  ｘ  ３０  ｍｉｎ）、その後ＴＦＡでｐＨを３に酸性化することにより調整される。
【０１３２】
５．１ａのＨＰＬＣ及びＭＳ解析
ＨＰＬＣ：緩衝剤Ａ：  Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （１：０．１％  ｖ／ｖ），緩衝剤Ｂ：  ＣＨ３ＣＮ／ＴＦＡ  （１：０．１％  ｖ／ｖ／ｖ）。結果を図５に示す。Ｃ１８  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌカラム（３００  Å，  ５  μｍ，  ４．６  ｘ  ２５０ ｍｍ）上のＲＰ−ＨＰＬＣ、線形勾配２０分以内２５−４５％  Ｂ流速１ ｍＬ／ｍｉｎ，  ＤＡＤ検出。結果を図６に示す。
【０１３３】
Ｉ−Ｃ−樹脂５．１のチオエステル樹脂６．１への変換
ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）３００  ｍｍｏｌ／Ｌを、０．２  Ｍ  リン酸緩衝剤ｐＨ  ＝  ７．３中で調製する。そして３−メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）（１０  ｖｏｌ％，  ０．１ ｍＬ，  １．１４ ｍｍｏｌ）を添加する。取得される溶液は、ｐＨ＝４に調整される。
【０１３４】
上記溶液（Ｖ  ＝２  ００ μＬ）を樹脂５．１（４．５μｍｏｌ）に添加し、フリットを備えたシリンジに充填する。当該反応混合物を３７℃で２４時間撹拌する。当該樹脂を、ｐＨ＝７．２の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝剤中で調製した３−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ，５００ ｍｍｏｌ／Ｌ）の溶液で洗浄する。
【０１３５】
Ｉ−Ｄ−ペプチド７．１  Ｈ−Ｃ（ＳｔＢｕ）ＨＨＬＥＰＧＧ−ＳＥＡｏｆｆのライゲーション  ペプチジル樹脂５．２の合成  サイクル１
本実験は、グローブボックス（［Ｏ２］  ＜５０  ｐｐｍ）中で実施される。前記ペプチド７．１（９．４ ｍｇ，  ０．００６８ ｍｍｏｌ，  １．５  ｅｑ）を、上記ＭＰＡＡ  （２７０ μＬ  ５００ ｍｍｏｌ／Ｌ，  リン酸緩衝剤ｐＨ  ＝  ７．２）の溶液に溶解し、ペプチジル樹脂６．１に移す。当該反応混合物を、３７℃で２４時間撹拌する。反応後、当該樹脂を排水し、緩衝剤Ａ  （Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ）（１／０．０５％  ｖ／ｖ，  ３ｘ  ３００ μＬ  ｘ  ２  ｍｉｎ）で洗浄する。
【０１３６】
ＬＣ−ＭＳ解析：８．２のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム。図７参照：最大ピーク８．２は、ダイマーの形態で単離された産物８．２（ジスルフィド）を表す。このダイマーは、塩基性媒体中の産物の開裂の過程で、空気中で酸化されることにより形成される。
【０１３７】
ＬＣ−ＭＳ：緩衝剤Ａ：  Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （１／０．０５％  ｖ／ｖ），緩衝剤Ｂ：  ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （４／１／０．０５％  ｖ／ｖ／ｖ）．  ＲＰ−ＨＰＬＣ  ｏｎ  ａ  Ｃ１８  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨカラム（３００  Å，  ３．５  μｍ，  ４．６  ｘ  １５０ ｍｍ）  上のＲＰ−ＨＰＬＣ、線形勾配３０分以内０−１００％  Ｂ  、流速＝  １  ｍＬ／ｍｉｎ，  ＥＬＳ検出。ＭＳ：陽性エレクトロスプレーイオン化モード、コーン電圧３０Ｖ、四重極解析器。図８参照。最大のピークは、ダイマーの形態で単離された産物８．２（ジスルフィド）を表す。
【０１３８】
Ｉ−Ｅ−ペプチジル樹脂５．２の樹脂６．２への変換
ペプチジル樹脂５．２は、上記５．１を６．１に変換するプロトコールを使用して、ＭＰＡの樹脂６．２チオエステルに変換される。
【０１３９】
Ｉ−Ｆ−ペプチジル樹脂５．３の合成  サイクル２
ペプチド７．２（Ｘ  ＝  Ａｌａ，  ９．５ ｍｇ，  ０．００６８ ｍｍｏｌ，  １．５  ｅｑ）を、ペプチジル樹脂５．２に使用したのと厳密に同一の合成プロトコル（サイクル１）を使用して、ペプチジル樹脂６．２と反応させる。
【０１４０】
ＬＣ−ＭＳ解析：８．３のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム  図９参照。
ＬＣ−ＭＳ：緩衝剤Ａ：  Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （１／０．０５％  ｖ／ｖ），緩衝剤Ｂ：  ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （４／１／０．０５％  ｖ／ｖ／ｖ）。Ｃ１８  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨカラム（３００  Å，  ３．５  μｍ，  ４．６  ｘ  １５０ ｍｍ）上のＲＰ−ＨＰＬＣ、線形勾配３０分以内０−１００％  Ｂ  、流速＝  １  ｍＬ／ｍｉｎ，  ＥＬＳ検出。ＭＳ：陽性エレクトロスプレーイオン化モード、コーン電圧３０Ｖ、四重極解析器。図１０参照。
【０１４１】
Ｉ−Ｇ−  ペプチドＨ−ＣＩＬＫＥＰＶＨＧＡ−ＮＨ２（ペプチド９）の合成
本ペプチドの合成は、Ｏｌｌｉｖｉｅｒ，  Ｎ．；  Ｄｈｅｕｒ，  Ｊ．；  Ｍｈｉｄｉａ，  Ｒ．；  Ｂｌａｎｐａｉｎ，  Ａ．；  Ｍｅｌｎｙｋ，  Ｏ．  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１０，  １２，  ５２３８−４１に記載されている。
【０１４２】
Ｉ−Ｈ−  ペプチド１１ａの合成：
本反応は、グローブボックス（［Ｏ２］  ＜５０  ｐｐｍ）中、窒素大気下で実施される。３００ ｍｍｏｌ／ＬのＴＣＥＰの溶液を、０．２Ｍリン酸緩衝剤ｐＨ  ＝  ７．３中で調製する。そして３−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ  ８４ ｍｇ，  ０．５ ｍｍｏｌ）を添加する。取得されるＴＣＥＰ／ＭＰＡＡのｐＨを、６．５に調整する。
【０１４３】
ペプチド９（４．６ ｍｇ，  ０．００６８ ｍｍｏｌ，  １．５  ｅｑ）を上記ＴＣＥＰ／ＭＰＡＡ溶液（１１０ μＬ）中に溶解し、ペプチジル樹脂５．３に移す。当該反応媒体を３７℃で２４時間撹拌する。ライゲーション反応後、ペプチジル樹脂１０を排水し、緩衝剤Ａ  （Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （１／０．０５％  ｖ／ｖ）  （３  ｘ  ３００ μＬ  ｘ  ２  ｍｉｎ）で洗浄する。
【０１４４】
ペプチジル樹脂１１の開裂は、グローブボックス（［Ｏ２］  ＜５０  ｐｐｍ）中で実施される。当該ペプチジル樹脂１１は、ＮａＯＨ  （５００ μＬ，  １０−２  Ｍ）の溶液を添加して、１５分間３７℃で撹拌することにより開裂する。ビーズを濾過し、洗浄し、濾液を凍結乾燥する。
【０１４５】
ペプチド１１ａは、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）  （Ｃ１８  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌカラム（ｄ  ＝  １ ｃｍ，  Ｌ  ＝  ２０ ｃｍ，  １２０  Å，  ５ μｍ），  ＵＶ検出（・・・２１５ ｎｍ），  緩衝剤Ａ：  Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （１：０．０５％  ｖ／ｖ），  緩衝剤Ｂ：  ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （４：１：０．０５％  ｖ／ｖ／ｖ），  勾配：緩衝剤Ｂ  （５分以内０〜２０％、その後６０分以内２０〜４２％，  ６ ｍＬ／ｍｉｎ））で直接精製される。４．２ｍｇのペプチド１１が取得される（Ｙｌｄ＝２１％）。
【０１４６】
ＬＣ−ＭＳ解析  ペプチド１１ａのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム  図１１参照
ＬＣ−ＭＳ：緩衝剤Ａ：  Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （１／０．０５％  ｖ／ｖ），緩衝剤Ｂ：  ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （４／１：０．０５％  ｖ／ｖ／ｖ）。Ｃ１８  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨカラム（３００  Å，  ３．５  μｍ，  ４．６  ｘ  １５０ ｍｍ）上のＲＰ−ＨＰＬＣ、線形勾配３０分以内０−１００％  Ｂ、流速１ ｍＬ／ｍｉｎ、ＥＬＳ検出。ＭＳ：陽性エレクトロスプレーイオン化モード、コーン電圧３０Ｖ、四重極解析器。質量スペクトルを図１２に示す。
【０１４７】
精製したペプチド１１ａのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを図１３に示す。
【０１４８】
ＩＩ−  ペプチドＨ−ＣＨＨＬＥＰＧＧ−ＣＩＬＫＥＰＶＨＧＡ−ＮＨ２  １６ａの合成
ＩＩ−Ａ−  樹脂１２の合成：Ｐａｌ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ  ５−アミノ−５−オキソペンタン酸
以下に合成ダイアグラム５を示す。
【化１５】
2014532075.tif 000016
【０１４９】
手順：グルタール酸無水物（Ｐｅｎｔａｎｅｄｉｏｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）（１２９ ｍｇ，  １ ｍｍｏｌ，  １０  ｅｑ）を最小量のＤＭＦ中に溶解し、Ｐａｌ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂（２６３ ｍｇ，  ０．１ ｍｍｏｌ，  ・・＝  ０．４３ ｍｍｏｌ／ｇ，  １  ｅｑ）に直接移す。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）  （１９７ μＬ，  １ ｍｍｏｌ，  １０  ｅｑ）を添加する。当該反応媒体を、室温でアルゴン大気下１．５時間撹拌する。当該樹脂をＤＭＦ  （２  ｘ  ２  ｍｉｎ）、ＣＨ２Ｃｌ２  （２  ｘ  ２  ｍｉｎ）で連続して洗浄し、排水する。遊離アミンの非存在を評価するために、ＴＮＢＳ試験を実施する。
【０１５０】
ＩＩ−Ｂ−  樹脂１３：ＰＡＬ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ  Ｎ−（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）アミドの合成
本合成は、下記ダイアグラム６に従い実施される：
【化１６】
2014532075.tif 000017
【０１５１】
手順：１，３−ジアミノ−２−プロパノール（９９ ｍｇ，  １ ｍｍｏｌ，  １０  ｅｑ）及びベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）  （１１４ ｍｇ，  ０．２ ｍｍｏｌ，  ２  ｅｑ）を、最少量のＤＭＦに溶解し、樹脂１２に直接移す。ＤＩＥＡ  （１９１ μＬ，  １ ｍｍｏｌ，  １０  ｅｑ）を添加する。当該反応混合物を室温のアルゴン大気中で２時間撹拌する。樹脂１３を、ＤＭＦ  （２  ｘ  ２  ｍｉｎ）、ＣＨ２Ｃｌ２  （２  ｘ  ２  ｍｉｎ）で連続して洗浄し、排水する。遊離アミンの存在を評価するために、ＴＮＢＳ試験を実施する。
【０１５２】
ＩＩ−Ｃ−  チアゾリジンペプチジル樹脂１５の合成
本合成は、下記ダイアグラム７に従い実施される：
【化１７】
2014532075.tif 000018
【０１５３】
手順：酸化剤過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）  （１．２ ｍｇ，  ５．７ μｍｏｌ，  ４  ｅｑ）を、最小量の０．１Ｍリン酸緩衝剤ｐＨ７．２に溶解し、樹脂１７（７．２ ｍｇ，  ２．９ μｍｏｌ，  ２  ｅｑ）に移す。当該反応培地を、室温で１５分間撹拌する。そして過剰の酸化剤を、エタノールアミン（１．４ μＬ，  ２２．９ μｍｏｌ，  １６  ｅｑ）を樹脂に添加することにより中和する。撹拌後、樹脂１４を０．１Ｍリン酸緩衝剤ｐＨ６で洗浄する。
【０１５４】
操作はグローブボックス（［Ｏ２］  ＜５０  ｐｐｍ）中で実施される。ペプチド７．１  （２ ｍｇ，  １．４ μｍｏｌ，  １  ｅｑ）を、Ｖ  ＝  ７２ μＬの０．１Ｍリン酸緩衝剤ｐＨ６中で調製したＭＰＡＡ  ５００ ｍｍｏｌ／Ｌの溶液に溶解する。当該ペプチドの溶液を、上記樹脂１５に移す。当該反応混合物を、３７℃で２４時間撹拌する。過剰のアルデヒドを、Ｖ  ＝  ２００ μＬのメチルヒドロキシルアミン（１４ ｍｍｏｌ／Ｌ、酢酸アンモニウム緩衝剤ｐＨ  ＝  ４．５中で調製）で中和する。撹拌後、樹脂１５を排水し、リン酸緩衝剤ｐＨ７．２（３＊  ３００ ｍＬ  ｘ  ２  ｍｉｎ）で洗浄する。
【０１５５】
ＩＩ−Ｄ−  ペプチド９  Ｈ−ＣＩＬＫＥＰＶＨＧＡ−ＮＨ２のライゲーション  ペプチジル樹脂１６の合成
本合成は、下記ダイアグラム８に従い実施される：
【化１８】
2014532075.tif 000019
【０１５６】
手順：操作はグローブボックス（［Ｏ２］  ＜５０  ｐｐｍ）中で実施される。ＴＣＥＰ  ３００ ｍｍｏｌ／Ｌの溶液を、０．２  Ｍリン酸緩衝剤ｐＨ  ＝  ７．２中で調製する。そして、３−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）  （８４ ｍｇ，  ０．５ ｍｍｏｌ）を添加する。得られたＴＣＥＰ／ＭＰＡＡ溶液のｐＨを６．５に調整する。
【０１５７】
ペプチド９（３ｍｇ，２．１μｍｏｌ，１．５ｅｑ）を、Ｖ＝７０μＬの前記ＴＣＥＰ／ＭＰＡＡに溶解し、ペプチジル樹脂１５に移す。当該反応媒体を、３７℃で２４時間撹拌する。ライゲーション反応後、樹脂１６を排水し、緩衝剤Ａ：Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ（１：０．０５％ｖ／ｖ）（３ｘ３００μＬｘ２ｍｉｎ）で洗浄する。
【０１５８】
ＩＩ−Ｅ−  ペプチジル樹脂１６の開裂  ペプチドＨ−ＣＨＨＬＥＰＧＧ−ＣＩＬＫＥＰＶＨＧＡ−ＮＨ２ １６ａの合成
本合成は、下記ダイアグラムに従い実施される：
【化１９】
2014532075.tif 000020
【０１５９】
手順：操作はグローブボックス（［Ｏ２］  ＜５０  ｐｐｍ）中で実施される。ペプチジル樹脂１６を、Ｖ  ＝  ５００μＬのメチルヒドロキシルアミン（３００ｍｍｏｌ／Ｌ、リン酸緩衝剤ｐＨ  ＝  ３中で調製）を添加して、３７℃で３時間撹拌することにより開裂させる。撹拌後、樹脂１５を排水し、リン酸緩衝剤ｐＨ７．２（３＊  ３００ ｍＬ  ｘ  ２  ｍｉｎ）で洗浄する。ビーズを濾過し、洗浄し、濾液を凍結乾燥する。
【０１６０】
ペプチド１６ａ  Ｈ−ＣＨＨＬＥＰＧＧ−ＣＩＬＫＥＰＶＨＧＡ−ＮＨ２のＬＣ−ＭＳ解析ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム
ＬＣ−ＭＳ：緩衝剤Ａ：  Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （１：０．０５％  ｖ／ｖ），緩衝剤Ｂ：  ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （４：１：０．０５％  ｖ／ｖ／ｖ）。Ｃ１８  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨカラム（３００  Å，  ３．５  μｍ，  ４．６  ｘ  １５０ ｍｍ）上のＲＰ−ＨＰＬＣ、線形勾配Ａ／Ｂ：３０分以内０−１００％  Ｂ、流速１ ｍＬ／ｍｉｎ、ＥＬＳ検出。ＭＳ：陽性エレクトロスプレーイオン化モード、コーン電圧３０Ｖ、四重極解析器。図１４は、取得されたＲＰ−ＨＰＬＣスペクトルを例示する。ＲｓＭＰＡＡとマークしたピークは、ＭＰＡＡの残基を表す。当該質量スペクトルを、図１５に示す。
【０１６１】
ＩＩＩ−  ペプチドＨ−ＡＡＡＡＡＫＤＹＩＲＮ−  ＣＩＩＧＫＧＲＳＹＫＧＴＶＳＩＴＫＳＧＩＫ−ＣＱＰＷＳＳＭＩＰＨＥＨＳＦＬＰＳＳＹＲＧＫＤＬＱＥＮＹ−  ＣＲＮＰＲＧＥＥＧＧＰＷＣＦＴＳＮＰＥＶＲＹＥＶＣＤＩＰＱＣＳＥＶＫ（ビオチン）−ＮＨ２ ２９の合成
ＩＩＩ−Ａ−  断片Ｎ３−ＥＳＯＣ−ＡＡＡＡＡＫＤＹＩＲＮ−ＳＥＡｏｆｆの合成
本合成は、下記ダイアグラムに従い実施される。
【化２０】
2014532075.tif 000021
【０１６２】
−ペプチジル樹脂１７  Ｈ−ＡＡＡＡＡＫ（Ｂｏｃ）Ｄ（ＯｔＢｕ）Ｙ（ｔＢｕ）ＩＲ（Ｐｂｆ）Ｎ（Ｔｒｔ）−ＳＥＡ−ＰＳ（ＰＳ＝ポリスチレン）の合成
本ペプチジル樹脂は、Ｏｌｌｉｖｉｅｒ，  Ｎ．；  Ｄｈｅｕｒ，  Ｊ．；  Ｍｈｉｄｉａ，  Ｒ．；  Ｂｌａｎｐａｉｎ，  Ａ．；  Ｍｅｌｎｙｋ，  Ｏ．  Ｏｒｇａｎｉｃ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１０，  １２，  ５２３８−４１に記載のプロトコルに従い、０．２５ ｍｍｏｌのスケールで合成される。
【０１６３】
合成後、当該樹脂は、ＣＨ２Ｃｌ２  （２  ｘ  ２  ｍｉｎ）及びＤＭＦ  （２  ｘ  ２  ｍｉｎ）で連続して洗浄され、次の段階に使用される。
【０１６４】
−断片Ｎ３−ＥＳＯＣ−ＡＡＡＡＡＫＤＹＩＲＮ−ＳＥＡｏｆｆの合成
活性化アームＮ３−Ｅｓｏｃ−ＯＮｐは、ＷＯ２０１１／０５８１８８に記載の手順に従い合成される。２−［２−（２−アザイド−エトキシ）−エチルスルホニル］−エチルと４−ニトロフェニルの混合炭酸塩（１４５ ｍｇ，  ０．４ ｍｍｏｌ，  １．５  ｅｑ）が、最小量のＤＭＦ中に溶解され、そして樹脂１７に直接移される。Ｎ−メチルモルホリン（５５ μＬ，  ０．５ ｍｍｏｌ，  ２  ｅｑ）が添加される。当該反応混合物を室温でアルゴン大気中１２時間撹拌する。樹脂１８をＤＭＦ  （２  ｘ  ２  ｍｉｎ）、ＣＨ２Ｃｌ２  （２  ｘ  ２  ｍｉｎ）及びＥｔ２Ｏ  （２  ｘ  ２  ｍｉｎ）で連続して洗浄し、真空下で乾燥させる。
【０１６５】
最後の側鎖の脱保護及びペプチドの樹脂からの切り離しは、ＴＦＡ／ＴＩＳ／ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ混合物（２０ ｍＬ，  ９２．５／２．５／２．５／２．５％  ｖ／ｖ）を１．５時間作用させて実施される。当該ペプチドは、ジエチルエーテル／ヘプタンの冷却混合物（２００ ｍＬ，  １：１  ｖ／ｖ）から沈殿させられ、そして最小量の水に溶解させられ、凍結乾燥させられる。
【０１６６】
粗ペプチド１９  （１００ ｍｇ，  ０．０５ ｍｍｏｌ）をリン酸ナトリウム緩衝剤（２６ ｍＬ，  ０．２  Ｍ，  ｐＨ  ＝  ７．２）に溶解し、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルアゾジカルボキサミド（ＴＭＡＤ）  （１８．４ ｍｇ，  ０．１ ｍｍｏｌ，  ２  ｅｑ）の存在下２０分間酸化する。反応混合物を逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）  （Ｃ１８  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌカラム（ｄ  ＝  １ ｃｍ，  Ｌ  ＝  ２０ ｃｍ，  １２０  Å，  ５ μｍ），  ＵＶ検出（・・・２１５ ｎｍ），  緩衝剤Ａ：  Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （１：０．０５％  ｖ／ｖ），  緩衝剤Ｂ：  ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （４：１：０．０５％  ｖ／ｖ／ｖ），  勾配：緩衝剤Ｂ  （５分以内０〜２０％、その後６０分以内２０〜４２％，  ６ ｍＬ／ｍｉｎ））で直接精製する。２３ｍｇのペプチド１９が取得される（Ｙｌｄ＝２３％）。
【０１６７】
ＬＣ−ＭＳ解析：１９のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム
ＬＣ−ＭＳ：緩衝剤Ａ：  Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （１／０．０５％  ｖ／ｖ），緩衝剤Ｂ：  ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （４／１／０．０５％  ｖ／ｖ／ｖ）。Ｃ１８  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨカラム（３００  Å，  ３．５  μｍ，  ４．６  ｘ  １５０ ｍｍ）上のＲＰ−ＨＰＬＣ、線形勾配３０分以内０−１００％  Ｂ  、流速＝  １  ｍＬ／ｍｉｎ，  ＥＬＳ検出。ＭＳ：陽性エレクトロスプレーイオン化モード、コーン電圧３０Ｖ、四重極解析器。
【０１６８】
図１６は、取得されたＲＰ−ＨＰＬＣスペクトルを示す。質量スペクトルを図１７に示す。
【０１６９】
ＩＩＩ−Ｂ−  ペプチド２９の合成
本合成は、下記ダイアグラムに従い実施される。
【化２１】
2014532075.tif 000022
【０１７０】
シクロオクチン固相支持体へのペプチド１９のグラフト  支持体２０の調製
Ｄｏｍｍｅｒｈｏｌｔ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍ．，  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ２０１０，  ４９，  ９４２２−９４２５に記載の手順に従い調製された、ビシクロ［６．１．０］ノン−４−イン−９−イルメチルと４−ニトロフェニルの混合炭酸塩（１７６ ｍｇ，  ０．５６ μｍｏｌ，  ３  ｅｑ）が、最小量のＤＭＦ中に溶解され、そしてアミノメチルＰＥＧＡ１９００樹脂（０．４ ｍｍｏｌ／ｇ）に直接移される。Ｎ−メチルモルホリン（５５ μＬ，  ０．５ ｍｍｏｌ，  ２  ｅｑ）が添加される。当該反応混合物を室温でアルゴン大気中１２時間撹拌する。樹脂１８をＤＭＦ  （２  ｘ  ２  ｍｉｎ）、ＣＨ２Ｃｌ２  （２  ｘ  ２  ｍｉｎ）及びＥｔ２Ｏ  （２  ｘ  ２  ｍｉｎ）で連続して洗浄し、真空下で乾燥させる。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３７０ μＬ，  ３．３６ ｍｍｏｌ，  ６  ｅｑ）が添加される。当該反応媒体を、室温、アルゴン大気中、１６時間撹拌する。当該樹脂をＤＭＦ  （２  ｘ  ２  ｍｉｎ）、ＣＨ２Ｃｌ２  （２  ｘ  ２  ｍｉｎ）、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン、そしてＭｅＯＨ／ＤＭＦ／ＡｃＯＨ混合物（９：９：２）  （５  ｘ  ２  ｍｉｎ）、及びＭｅＯＨ  （２  ｘ  ２  ｍｉｎ）で連続して洗浄する。
【０１７１】
得られたアルキン樹脂（２ｅｑ）を、２．４ ｍｌの水（脱イオン）及び０．１％のＴＦＡを含有するアセトニトリルの８：２混合物中のアザイドピペリジン１９（８．２ μｍｏｌ）の溶液に添加する。当該懸濁物を室温で８０時間撹拌する。当該ペプチジル樹脂２０を、大量の０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリル、０．１％ＴＦＡを含有する水、水、ＭｅＯＨ，  ＤＭＦ，  ＭｅＯＨ、そして最後に水で連続して洗浄する。
【０１７２】
−ペプチジル樹脂２０の特定  溶液中のペプチドの切り離し及びペプチド２１の形成（Ｈ−ＡＡＡＡＡＫＤＹＩＲＮ−ＳＥＡｏｆｆ  ２１）
ＤＭＦ中に２０％ピペリジン，  ＭｅＯＨ／ＤＭＦ／ＡｃＯＨ  （９：９：２），  ＤＭＦ，  ＭｅＯＨ、及び最後に水。
【０１７３】
ＨＰＬ解析：２１のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム
緩衝剤Ａ：  Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （１：０．１％  ｖ／ｖ），緩衝剤Ｂ：  ＣＨ３ＣＮ／ＴＦＡ  （１：０．１％  ｖ／ｖ／ｖ）。Ｃ１８  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌカラム（３００  Å，  ５  μｍ，  ４．６  ｘ  ２５０ ｍｍ）上のＲＰ−ＨＰＬＣ、線形勾配２０分以内２５−４５％  Ｂ流速１ ｍＬ／ｍｉｎ，  ＤＡＤ検出。
【０１７４】
図１８は、取得されたＲＰ−ＨＰＬＣスペクトルを示す。産物２１の質量スペクトルは、図１９に示す。
【０１７５】
−ペプチド２２  Ｈ−Ｃ（ＳｔＢｕ）ＩＩＧＫＧＲＳＹＫＧＴＶＳＩＴＫＳＧＩＫ−ＳＥＡｏｆｆの合成
本ペプチドは、Ｏｌｌｉｖｉｅｒ，  Ｎ．；  Ｄｈｅｕｒ，  Ｊ．；  Ｍｈｉｄｉａ，  Ｒ．；  Ｂｌａｎｐａｉｎ，  Ａ．；  Ｍｅｌｎｙｋ，  Ｏ．  Ｏｒｇａｎｉｃ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１０，  １２，  ５２３８−４１に記載のプロトコルに従い、０．２５ｍｍｏｌのスケールで合成される。
【０１７６】
−ペプチド２５  Ｈ−Ｃ（ＳｔＢｕ）ＱＰＷＳＳＭＩＰＨＥＨＳＦＬＰＳＳＹＲＧＫＤＬＱＥＮＹ−ＳＥＡｏｆｆの合成
本ペプチドは、Ｏｌｌｉｖｉｅｒ，  Ｎ．；  Ｄｈｅｕｒ，  Ｊ．；  Ｍｈｉｄｉａ，  Ｒ．；  Ｂｌａｎｐａｉｎ，  Ａ．；  Ｍｅｌｎｙｋ，  Ｏ．  Ｏｒｇａｎｉｃ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１０，  １２，  ５２３８−４１に記載のプロトコルに従い、０．２５ｍｍｏｌのスケールで合成される。
【０１７７】
−ペプチド２７  Ｈ−ＣＲＮＰＲＧＥＥＧＧＰＷＣＦＴＳＮＰＥＶＲＹＥＶＣＤＩＰＱＣＳＥＶＫ（ビオチン）−ＮＨ２の合成
本ペプチドは、Ｏｌｌｉｖｉｅｒ，  Ｎ．；  Ｄｈｅｕｒ，  Ｊ．；  Ｍｈｉｄｉａ，  Ｒ．；  Ｂｌａｎｐａｉｎ，  Ａ．；  Ｍｅｌｎｙｋ，  Ｏ．  Ｏｒｇａｎｉｃ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１０，  １２，  ５２３８−４１に記載のプロトコルに従い、０．２５ｍｍｏｌのスケールで合成される。
【０１７８】
樹脂２０のチオエステル樹脂２１への変換
ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）２００ ｍｍｏｌ／Ｌが、ｐＨ７．２のグアニジン（６Ｍ）を含有する０．２Ｍリン酸緩衝剤中で調製される。そして３−メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）  （５  ｖｏｌ％，  ０．０５ ｍＬ，  ０．５８ ｍｍｏｌ）が添加される。取得される溶液のｐＨを、４に調整する。
【０１７９】
上記溶液（Ｖ  ＝  １５０ μＬ）を、樹脂２０（０．５μｍｏｌ）に添加し、フリットを備えたシリンジに充填する。当該反応混合物を３７℃で２４時間撹拌する。当該樹脂を、ｐＨ＝７．２のグアニジン（６Ｍ）を含有する０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝剤中で調製した３−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ，５００ ｍｍｏｌ／Ｌ）の溶液で洗浄する（３ｘ  １５０ μＬ  ｘ  １  ｍｉｎ）。
【０１８０】
−ペプチド２２  Ｈ−Ｃ（ＳｔＢｕ）ＩＩＧＫＧＲＳＹＫＧＴＶＳＩＴＫＳＧＩＫ−ＳＥＡｏｆｆのライゲーション  ペプチジル樹脂２３の合成
本実験は、グローブボックス（［Ｏ２］  ＜５０  ｐｐｍ）中で実施される。前記ペプチド２２（２．３ ｍｇ，  ０．７５ μｍｏｌ，  １．５  ｅｑ）を、上記ＭＰＡＡ（１５０ μＬ、３００ｍｍｏｌ／Ｌ，  グアニジン（６Ｍ）を含有する０．１Ｍリン酸緩衝剤ｐＨ  ＝  ７．２）の溶液に溶解し、ペプチジル樹脂２１に移す。当該反応混合物を、３７℃で２４時間撹拌する。反応後、当該樹脂を排水し、グアニジン（６Ｍ）を含有する０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ  ＝  ７．２（３ｘ  １５０ μＬ  ｘ  ２  ｍｉｎ）で洗浄する。
【０１８１】
ＬＣ−ＭＳ解析：ペプチジル樹脂２３から出発した塩基性媒体中のペプチドの切り離しの後に取得された２３．１のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを、図２０に示す。
ＬＣ−ＭＳ：緩衝剤Ａ：  Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （１／０．０５％  ｖ／ｖ），緩衝剤Ｂ：  ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （４／１／０．０５％  ｖ／ｖ／ｖ）  。Ｃ１８  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨカラム（３００  Å，  ３．５  μｍ，  ４．６  ｘ  １５０ ｍｍ）上のＲＰ−ＨＰＬＣ、線形勾配３０分以内０−１００％  Ｂ流速１ ｍＬ／ｍｉｎ，  ＥＬＳ検出。ＭＳ：陽性エレクトロスプレーイオン化モード、コーン電圧３０Ｖ、四重極解析器（図２１）。
【０１８２】
ペプチジル樹脂２３は、上記２０を２１に変換するのに使用したプロトコルを使用して、ＭＰＡのチオエステル樹脂２４に変換される。
【０１８３】
−ペプチド２５  Ｈ−Ｃ（ＳｔＢｕ）ＱＰＷＳＳＭＩＰＨＥＨＳＦＬＰＳＳＹＲＧＫＤＬＱＥＮＹ−ＳＥＡｏｆｆのライゲーション  ペプチジル樹脂２６の合成
ペプチド２５（３  ｍｇ，  ０．７５  μｍｏｌ，  １．５  ｅｑ）を、ペプチジル樹脂２３の合成に使用したのと厳密に同一の合成プロトコルを使用して（サイクル１）、ペプチジル樹脂２４と反応させる。
【０１８４】
ＬＣ−ＭＳ解析：ペプチジル樹脂２６から出発した塩基性媒体中のペプチドの切り離しの後に取得された２６．１のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを、図２２に示す。
【０１８５】
ＬＣ−ＭＳ：緩衝剤Ａ：  Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （１／０．０５％  ｖ／ｖ），緩衝剤Ｂ：  ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （４／１／０．０５％  ｖ／ｖ／ｖ）  。Ｃ１８  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨカラム（３００  Å，  ３．５  μｍ，  ４．６  ｘ  １５０ ｍｍ）上のＲＰ−ＨＰＬＣ、線形勾配３０分以内０−１００％  Ｂ流速１ ｍＬ／ｍｉｎ，  ＥＬＳ検出。ＭＳ：陽性エレクトロスプレーイオン化モード、コーン電圧３０Ｖ、四重極解析器（図２３）。
【０１８６】
−ペプチド２９の合成
本反応は、グローブボックス（［Ｏ２］  ＜５０  ｐｐｍ）中、窒素大気下で実施される。２００ ｍｍｏｌ／ＬのＴＣＥＰの溶液を、グアニジン（６Ｍ）を含有する０．２Ｍリン酸緩衝剤ｐＨ  ＝  ７．３中で調製する。そして３−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ  ３３ ｍｇ，  ０．２ ｍｍｏｌ）を添加する。取得されるＴＣＥＰ／ＭＰＡＡ溶液のｐＨを、６．５に調整する。
【０１８７】
ペプチド２７（３．４ ｍｇ，  ０．７５ μｍｏｌ，  １．５  ｅｑ）は、前記ＴＣＥＰ／ＭＰＡＡ  （１５０ μＬ）の溶液中に溶解され、ペプチジル樹脂２６に移される。当該反応媒体を、３７℃で２４時間撹拌する。ライゲーション反応後、当該ペプチジル樹脂２８を排水し、グアニジン（６Ｍ）を含有する０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ  ＝  ７．２で洗浄する。
【０１８８】
−ペプチジル樹脂２８の開裂  ペプチド２９の合成
操作はグローブボックス（［Ｏ２］  ＜５０  ｐｐｍ）中で実施される。ペプチジル樹脂２８を、ＮａＯＨ  （５００ μＬ，  １０−２  Ｍ）溶液を添加して、３７℃で５分間撹拌することにより開裂させる。ビーズを濾過し、洗浄し、濾液を凍結乾燥する。
【０１８９】
ＬＣ−ＭＳ解析
ペプチド２９のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム（図２４）
ＬＣ−ＭＳ：緩衝剤Ａ：  Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （１／０．０５％  ｖ／ｖ），緩衝剤Ｂ：  ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ  （４／１／０．０５％  ｖ／ｖ／ｖ）  。Ｃ１８  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨカラム（３００  Å，  ３．５  μｍ，  ４．６  ｘ  １５０ ｍｍ）上のＲＰ−ＨＰＬＣ、線形勾配３０分以内０−１００％  Ｂ流速１ ｍＬ／ｍｉｎ，  ＥＬＳ検出。ＭＳ：陽性エレクトロスプレーイオン化モード、コーン電圧３０Ｖ、四重極解析器（図２５）。
【０１９０】
当然、本発明は、本実施例や、本明細書中に記載され、代表される態様に限定されず、当業者の技術の範囲内で様々な変法が形成され得る。
【図１】
2014532075.tif 000028
【図２】
2014532075.tif 000029
【図３】
2014532075.tif 000030
【図４】
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【図５】
2014532075.tif 000032
【図６】
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【図７】
2014532075.tif 000034
【図８】
2014532075.tif 000035
【図９】
2014532075.tif 000036
【図１０】
2014532075.tif 000037
【図１１】
2014532075.tif 000038
【図１２】
2014532075.tif 000039
【図１３】
2014532075.tif 000040
【図１４】
2014532075.tif 000041
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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