(57)【要約】  本発明は、ｅｘ−ｖｉｖｏにおいて分化させた胚性幹細胞を使用して、オリゴデンドロサイトの成熟及び生存、又はニューロン細胞のミエリン形成に作用する薬剤を同定する方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューロン細胞のミエリン形成に対する薬剤の作用を定量化する方法であって、
（ａ）オリゴデンドロサイト先駆細胞（ＯＰＣ）の集団を薬剤と接触させるステップであって、ＯＰＣは、胚性幹細胞からｅｘ−ｖｉｖｏにおいて分化させてある上記ステップと、
（ｂ）前記ＯＰＣ中のミエリン形成の少なくとも１つのマーカーを定量化するステップであって、それにより、ニューロン細胞のミエリン形成に対する薬剤の作用を定量化する上記ステップと
を含む上記方法。
【請求項２】
オリゴデンドロサイトの成熟、生存又はそれらの組合せに対する薬剤の作用を定量化する方法であって、
（ａ）胚性幹細胞からｅｘ−ｖｉｖｏにおいて分化させた、オリゴデンドロサイト先駆細胞（ＯＰＣ）、オリゴデンドロサイト又はそれらの組合せの集団を、薬剤と接触させるステップと、
（ｂ）オリゴデンドロサイト中の成熟、生存又はそれらの組合せの少なくとも１つのマーカーを定量化するステップであって、それにより、前記オリゴデンドロサイトの成熟、生存又はそれらの組合せに対する薬剤の作用を定量化するステップ上記と
を含む上記方法。
【請求項３】
前記ＯＰＣが、それらがミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を発現するよりも高い程度で、ｏｌｉｇ１及びｏｌｉｇ２を発現する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＯＰＣが、ｏｌｉｇ１、ｏｌｉｇ２のそれぞれ、又はそれらの組合せを発現する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＯＰＣが、Ｈｅｓ５をさらに発現する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記マーカーが、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、２’３’−環状ヌクレオチド−３０−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、Ｏ４及びプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
定量化する前記ステップを、少なくとも２つの突起を有するＯ４染色細胞の数、Ｏ４陽性細胞のパーセント、Ｏ４染色細胞当たりの突起の数、Ｏ４染色細胞当たりの突起の全長、Ｏ４染色細胞当たりの分枝点の数、ＭＢＰ陽性細胞の数を数えること、ＭＢＰ陽性細胞のパーセントを計算すること、又は染色細胞当たりのミエリン膜の面積若しくはＯ４染色突起の面積を測定することによって実施する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
前記薬剤が低分子である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
前記ＯＰＣが、ニューロン細胞を含む培養物中に存在する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
前記培養物がシュワン細胞を欠く、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ニューロン細胞を含む前記培養物中のニューロン細胞のミエリン形成の量を定量化するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ニューロン細胞中のミエリン形成の量を定量化する前記ステップを、前記ニューロン細胞中のコンタクチン関連タンパク質（Ｃａｓｐｒ１）の発現を解析することによって行う、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ニューロン細胞中のミエリン形成の量を定量化する前記ステップを、前記ニューロン細胞中のニューロフィラメント（ＮＦ）の発現を解析することによって行う、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ニューロン細胞中のミエリン形成の量を定量化する前記ステップを、前記ニューロン細胞とミエリン形成細胞との近位を解析することによって行う、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）の前に、胚性幹細胞を前記ＯＰＣにｅｘ−ｖｉｖｏにおいて分化させるステップをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１６】
分化させる前記ステップを、
（ａ）レチノイン酸及び増殖因子の存在下において、未分化のヒト胚性幹細胞を懸濁液中で培養して、神経球を生成するステップと、
（ｂ）接着性の基材上で、前記神経球を増殖因子と接触させるステップと
を含む方法により行う、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｂ）の後に、前記神経球を、前記増殖因子を欠いている培地中で接触させるステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
接触させる前記ステップを、２〜３日間行う、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
未分化のヒト胚性幹細胞を凝集させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記増殖因子が、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ又はそれらの組合せである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
懸濁液が、ノギンを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記接着性の基材が、マトリゲル又は細胞外マトリックス構成成分である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ａ）を、１０〜３０日間行う、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
増殖因子を欠く前記培地がノギンを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
細胞表面マーカーの発現に従って、前記ＯＰＣを選択するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞表面マーカーが、ＣＤ１４０又はＯ４である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
選択する前記ステップが、磁気選別（ＭＡＣＳ）又は蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）による、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、ｅｘ−ｖｉｖｏにおいて分化させた胚性幹細胞を使用して、オリゴデンドロサイトの成熟及び生存、又はニューロン細胞のミエリン形成に作用する薬剤を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミエリンは、脂肪性の物質であり、特定の軸索及び神経線維を包み込み、不可欠な絶縁体をなし、神経細胞の伝導を可能にし、それにより、電気的メッセージが脳へ及び脳から伝達される。
【０００３】
ミエリン形成における異常が、中枢神経系におけるいくつかの病態をもたらす恐れがある。これらには、例えば、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症）、先天性の白質ジストロフィー（例えば、ペリツェウス−メルツバッヘル病、白質の消失、副腎白質ジストロフィー）、感染性疾患（例えば、進行性多巣性白質脳症、炎症後の脱髄性病変）、神経変性疾患（例えば、多系統の変性）、血管疾患（血管性白質脳症、皮質下梗塞）、神経変性疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症［ＡＬＳ］、アルツハイマー病、パーキンソン病）、脱髄性の脳又は脊髄の外傷又は損傷が含まれ、恐らく、新生物（例えば、乏突起神経膠腫）も含まれる。
【０００４】
これらの病態の治療を、ＭＢＰ欠損シバラーマウスにおける実験（例えば、Ｙａｎｄａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６，７０２９−３４）によって示されているように、領域性のミエリンの修復の達成を、又は全体的なミエリンの修復の達成さえも、最終的に可能にすることができる細胞補充療法により行うことができる。
【０００５】
オリゴデンドロサイトは、５０個程度の突起を伸長し、これらの突起が、軸索の周囲を包んで、ミエリン鞘を形成する。ｉｎ−ｖｉｔｒｏ及びｉｎ−ｖｉｖｏにおいて、オリゴデンドロサイトの発達は、神経幹細胞から段階的に進行し、双極性の前駆体に、次いで、いくつかの主要な突起を有する多極性の先駆細胞に至り、続いて、これらの突起が、分岐し、成熟細胞の複数の枝を形成する（Ｒｏｇｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １４，２８７−３００；Ｇｒｉｎｓｐａｎ，２００２，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６１，２９７−３０６）。早期のオリゴデンドロサイト先駆体（ＯＰ）は、ＰＤＧＦ受容体を発現し、後に、分枝状の未熟オリゴデンドロサイトにおいて持続する、プレ−オリゴデンドロサイトに特異的なＯ４スルファチドマーカーを発現し、次いで、成熟過程の細胞は、ガラクトセレブロシド（Ｏ１、ＧａｌＣ）及び２’，３’環状ヌクレオチド３’ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）を発現し、最終段階で、ミエリン膜構成成分、例として、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）及びミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を合成する、有糸分裂後の成熟オリゴデンドロサイトになる。
【０００６】
最近まで、ヒトオリゴデンドロサイトの分化及び機能性のミエリン形成を解析する反応機構研究は、げっ歯類アッセイに基づいていた。しかし、げっ歯類とヒトとの間に、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）の遺伝子発現及び優性のシグナル伝達経路における顕著な差があることから、そのようなアッセイは、誤った結果をもたらす恐れがあることが示唆されている［Ｓｉｍ，Ｆ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｕｒｏｎ  Ｇｌｉａ  Ｂｉｏｌ  ５，４５−５５（２００９）］。
【０００７】
ヒト胚から得られた脳に由来するＯＰＣを使用する同時培養系が、最近になって記載された［Ｃｕｉ，Ｑ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｔｏ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ａｘｏｎ  ｓｉｇｎａｌｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６９，９３０−９４４］。しかし、再現性を欠き、入手が困難であることにより、ヒト胚の使用には問題がある。
【０００８】
米国特許出願第２０１００００３７５１号は、ヒト胚性幹細胞からのオリゴデンドロサイトの生成を教示している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様に従って、ニューロン細胞のミエリン形成に対する薬剤の作用を定量化する方法を提供し、この方法は、
（ａ）オリゴデンドロサイト先駆細胞（ＯＰＣ）の集団を薬剤と接触させるステップであって、ＯＰＣは、胚性幹細胞からｅｘ−ｖｉｖｏにおいて分化させてある上記ステップと、
（ｂ）ＯＰＣ中のミエリン形成の少なくとも１つのマーカーを定量化するステップであって、それにより、ニューロン細胞のミエリン形成に対する薬剤の作用を定量化する上記ステップと
を含む。
【００１０】
本発明の別の態様に従って、オリゴデンドロサイトの成熟、生存又はそれらの組合せに対する薬剤の作用を定量化する方法を提供し、この方法は、
（ａ）胚性幹細胞からｅｘ−ｖｉｖｏにおいて分化させたオリゴデンドロサイト先駆細胞（ＯＰＣ）、オリゴデンドロサイト又はそれらの組合せの集団を、薬剤と接触させるステップと、
（ｂ）オリゴデンドロサイト中の成熟、生存又はそれらの組合せの少なくとも１つのマーカーを定量化するステップであって、それにより、オリゴデンドロサイトの成熟、生存又はそれらの組合せに対する薬剤の作用を定量化する上記ステップと
を含む。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＯＰＣは、それらがミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を発現するよりも高い程度で、ｏｌｉｇ１及びｏｌｉｇ２を発現する。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＯＰＣは、ｏｌｉｇ１、ｏｌｉｇ２のそれぞれ、又はそれらの組合せを発現する。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＯＰＣは、Ｈｅｓ５をさらに発現する。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、マーカーは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、２’３’−環状ヌクレオチド−３０−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、Ｏ４及びプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）からなる群から選択されるポリペプチドである。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ミエリン形成、成熟、生存又はそれらの組合せに対する薬剤の作用の定量化を、少なくとも２つの突起を有するＯ４染色細胞の数、Ｏ４陽性細胞のパーセント、Ｏ４染色細胞当たりの突起の数、Ｏ４染色細胞当たりの突起の全長、Ｏ４染色細胞当たりの分枝点の数、ＭＢＰ陽性細胞の数を数えること、ＭＢＰ陽性細胞のパーセントを計算すること、又は染色細胞当たりのミエリン膜の面積若しくはＯ４染色突起の面積を測定することによって実施する。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、薬剤は、低分子である。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＯＰＣは、ニューロン細胞を含む培養物中に存在する。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ニューロン細胞は、ヒトニューロン細胞である。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ニューロン細胞は、げっ歯類ニューロン細胞である。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養物は、シュワン細胞を欠く。本発明のいくつかの実施形態によれば、シュワン細胞を、５’−フルオロ−２’−デオキシウリジン（ＦＵｄＲ）により排除する。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法は、ニューロン細胞を含む培養物中のニューロン細胞のミエリン形成の量を定量化するステップをさらに含む。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ニューロン細胞中のミエリン形成の量を定量化するステップは、ニューロン細胞中のコンタクチン関連タンパク質１（Ｃａｓｐｒ１）の発現を解析することによって評価する。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ニューロン細胞中のミエリン形成の量を定量化するステップを、ニューロン細胞中のニューロフィラメント（ＮＦ）の発現を解析することによって行う。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ニューロン細胞中のミエリン形成の量を定量化するステップは、ニューロン細胞とミエリン形成細胞との近位を解析することによって評価する。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法は、ステップ（ａ）の前に、胚性幹細胞をＯＰＣにｅｘ−ｖｉｖｏにおいて分化させることをさらに含む。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法は、細胞表面マーカーの発現に従って、ＯＰＣを選択するステップをさらに含む。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞表面マーカーは、ＣＤ１４０（ＰＤＧＦＲアルファ）又はＯ４である。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、選択するステップは、磁気選別又は蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）による。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、分化させることを、
（ａ）懸濁液中で、レチノイン酸及び増殖因子の存在下において、未分化のヒト胚性幹細胞を培養して、神経球を生成するステップと、
（ｂ）接着性の基材上で、神経球を増殖因子と接触させるステップと
を含む方法により行う。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法は、ステップ（ｂ）の後に、神経球を、増殖因子を欠いている培地中で接触させるステップをさらに含む。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、接触させるステップを、２〜３日間行う。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、未分化のヒト胚性幹細胞を凝集させる。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、増殖因子は、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ又はそれらの組合せである。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、懸濁液は、ノギンを含む。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、接着性の基材は、マトリゲル又は細胞外マトリックス構成成分である。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ステップ（ａ）を、１０〜３０日間行う。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、増殖因子を欠く培地は、ノギンを含む。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法は、ニューロン細胞のミエリン形成をｉｎ−ｖｉｖｏにおいて上方制御することを示す薬剤を試験するステップをさらに含む。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法は、ニューロン細胞のミエリン形成をｉｎ−ｖｉｖｏにおいて下方制御することを示す薬剤を試験するステップをさらに含む。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法は、ニューロン細胞のミエリン形成を上方制御することが可能である薬剤を含む医薬組成物を製造するステップをさらに含む。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法は、ニューロン細胞のミエリン形成を下方制御することが可能である薬剤を含む医薬組成物を製造するステップをさらに含む。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法は、オリゴデンドロサイトの成熟又は生存をｉｎ−ｖｉｖｏにおいて上方制御することが可能である薬剤を試験するステップをさらに含む。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法は、オリゴデンドロサイトの成熟又は生存をｉｎ−ｖｉｖｏにおいて下方制御することが可能である薬剤を試験するステップをさらに含む。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法は、オリゴデンドロサイトの成熟又は生存を上方制御することが可能である薬剤を含む医薬組成物を製造するステップをさらに含む。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法は、オリゴデンドロサイトの成熟又は生存を下方制御することが可能である薬剤を含む医薬組成物を製造するステップをさらに含む。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態に従って、本発明の方法に従って同定した薬剤を含む医薬組成物を提供する。
【００４７】
別段に定義しない限り、本明細書において使用する技術用語／又は科学用語は全て、本発明が関係する当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載する方法及び材料に類似する又はそれらと同等である方法及び材料を、本発明の実施形態を実行又は試験する際に使用することができるが、例示的な方法及び／又は材料を、下記に記載する。矛盾する場合には、定義を含めて、特許明細書が優先する。さらに、材料、方法及び実施例は、例示のためのものに過ぎず、必然的な限定を意図しない。
【００４８】
特許又は出願のファイルは、有色の図面を少なくとも１つ含有する。有色の図面（単数又は複数）を有する、この特許又は特許出願の公開のコピーが、要請及び必要な料金の支払いに応じて、特許庁により提供される。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態を、例示の目的に限って、付随する図面及び画像を参照して本明細書に記載する。ここでは、図面を具体的に詳細に参照するが、示す詳細は、例であり、本発明の実施形態を例示的に論述するためのものであることを強く主張する。この点に関して、図面を伴う説明により、どのように本発明の実施形態を実行することができるかが当業者に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１Ａ】ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける典型的なオリゴデンドロサイトの分化に従うヒト胚性幹ＯＰＣ（ｈＥＳ−ＯＰＣ）を示す図である。増殖因子の除去に際して、ＯＰＣの、成熟オリゴデンドロサイトに向かう分化を示す概略図である。増殖因子（ＥＧＦ＋ｂＦＧＦ）を用いて生育したｈＥＳ−ＮＳＣ（神経幹細胞）を示す。
【図１Ｂ】ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける典型的なオリゴデンドロサイトの分化に従うヒト胚性幹ＯＰＣ（ｈＥＳ−ＯＰＣ）を示す図である。増殖因子の除去に際して、ＯＰＣの、成熟オリゴデンドロサイトに向かう分化を示す概略図である。増殖因子なしで３日間生育したｈＥＳ−ＯＰＣを示す。
【図１Ｃ】ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける典型的なオリゴデンドロサイトの分化に従うヒト胚性幹ＯＰＣ（ｈＥＳ−ＯＰＣ）を示す図である。増殖因子の除去に際して、ＯＰＣの、成熟オリゴデンドロサイトに向かう分化を示す概略図である。増殖因子なしで９日間生育したｈＥＳ−ＯＬ（オリゴデンドロサイト）を示す。
【図１Ｄ】ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける典型的なオリゴデンドロサイトの分化に従うヒト胚性幹ＯＰＣ（ｈＥＳ−ＯＰＣ）を示す図である。増殖因子の除去に際して、ＯＰＣの、成熟オリゴデンドロサイトに向かう分化を示す概略図である。増殖因子なしで１１日間生育したｈＥＳ−ＯＬを示す。
【図１Ｅ】ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける典型的なオリゴデンドロサイトの分化に従うヒト胚性幹ＯＰＣ（ｈＥＳ−ＯＰＣ）を示す図である。スキームに記載した各分化段階についての、代表的な形態学的状態を示す。ネスチン（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）により染色したｈＥＳ−ＮＳＣを示す。各分化段階が、代表的な細胞を拡大した挿入図を含有する。画像のスケールバー：１００μｍ、挿入図のスケールバー：２０μｍ。
【図１Ｆ】ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける典型的なオリゴデンドロサイトの分化に従うヒト胚性幹ＯＰＣ（ｈＥＳ−ＯＰＣ）を示す図である。スキームに記載した各分化段階についての、代表的な形態学的状態を示す。Ｏ４（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）により染色したｈＥＳ−ＯＰＣを示す。各分化段階が、代表的な細胞を拡大した挿入図を含有する。画像のスケールバー：１００μｍ、挿入図のスケールバー：２０μｍ。
【図１Ｇ】ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける典型的なオリゴデンドロサイトの分化に従うヒト胚性幹ＯＰＣ（ｈＥＳ−ＯＰＣ）を示す図である。スキームに記載した各分化段階についての、代表的な形態学的状態を示す。Ｏ４（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）により染色したｈＥＳ−ＯＬを示す。各分化段階が、代表的な細胞を拡大した挿入図を含有する。画像のスケールバー：１００μｍ、挿入図のスケールバー：２０μｍ。
【図１Ｈ】ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける典型的なオリゴデンドロサイトの分化に従うヒト胚性幹ＯＰＣ（ｈＥＳ−ＯＰＣ）を示す図である。スキームに記載した各分化段階についての、代表的な形態学的状態を示す。ＭＢＰ（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）により染色したｈＥＳ−ＯＬを示す。各分化段階が、代表的な細胞を拡大した挿入図を含有する。画像のスケールバー：１００μｍ、挿入図のスケールバー：２０μｍ。
【図１Ｉ】ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける典型的なオリゴデンドロサイトの分化に従うヒト胚性幹ＯＰＣ（ｈＥＳ−ＯＰＣ）を示す図である。オリゴデンドロサイト系列遺伝子のＲＴ−ＰＣＲを示す。ａ〜ｄは、図１Ａ〜Ｄに示す概略図に対応する。
【図２】ＣＮＳに特異的な遺伝子の発現に対する、ｈＥＳ−ＯＰＣ遺伝子プロファイルのクラスター化を示すヒートマップである。赤色の四角は、最初の（３日間の）分化の間に上方制御された遺伝子を示し、一方、緑色の四角は、最初の（３日間の）分化の間に下方制御された遺伝子を示す。このマップは、Ｃａｈｏｙ  ｅｔ  ａｌ，２００８，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２８，２６４−２７８の十分に特徴付けられた遺伝子プロファイルに対応するアストロサイト、ニューロン及びオリゴデンドロサイトに特異的な遺伝子に分けられている。
【図３Ａ】分化アッセイを使用した、ノギンの用量応答曲線を示す図である。１０日間分化させたｈＥＳ−ＯＰＣのＯ４染色を示す：対照群（３Ａ）、０．１５ｎＭノギン（３Ｂ）、及び１．５ｎＭノギン（３Ｃ）。
【図３Ｂ】分化アッセイを使用した、ノギンの用量応答曲線を示す図である。１０日間分化させたｈＥＳ−ＯＰＣのＯ４染色を示す：対照群（３Ａ）、０．１５ｎＭノギン（３Ｂ）、及び１．５ｎＭノギン（３Ｃ）。
【図３Ｃ】分化アッセイを使用した、ノギンの用量応答曲線を示す図である。１０日間分化させたｈＥＳ−ＯＰＣのＯ４染色を示す：対照群（３Ａ）、０．１５ｎＭノギン（３Ｂ）、及び１．５ｎＭノギン（３Ｃ）。
【図３Ｄ】分化アッセイを使用した、ノギンの用量応答曲線を示す図である。ＮＴ（３Ｄ）及びノギン（３Ｅ）で処理した細胞の解析のために使用したパラメータを示す。
【図３Ｅ】分化アッセイを使用した、ノギンの用量応答曲線を示す図である。ＮＴ（３Ｄ）及びノギン（３Ｅ）で処理した細胞の解析のために使用したパラメータを示す。
【図３Ｆ】分化アッセイを使用した、ノギンの用量応答曲線を示す図である。３つのパラメータ、すなわち、Ｏ４陽性細胞の数、並びにオリゴデンドロサイトの突起の数及び長さを統合することによって生成したノギンの用量応答曲線を示す。
【図４Ａ】ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける、ｈＥＳ由来ＯＰＣによるＤＲＧニューロンのミエリン形成を示す図である。ｈＥＳ−ＯＰＣとＤＲＧニューロンとの同時培養を示す概略図である。ＤＲＧニューロンを示す。
【図４Ｂ】ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける、ｈＥＳ由来ＯＰＣによるＤＲＧニューロンのミエリン形成を示す図である。ｈＥＳ−ＯＰＣとＤＲＧニューロンとの同時培養を示す概略図である。増殖因子なしで３日間生育したｈＥＳ−ＯＰＣを示す。
【図４Ｃ】ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける、ｈＥＳ由来ＯＰＣによるＤＲＧニューロンのミエリン形成を示す図である。ｈＥＳ−ＯＰＣとＤＲＧニューロンとの同時培養を示す概略図である。１日間同時培養したｈＥＳ−ＯＰＣとＤＲＧニューロンを示す。
【図４Ｄ】ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける、ｈＥＳ由来ＯＰＣによるＤＲＧニューロンのミエリン形成を示す図である。ｈＥＳ−ＯＰＣとＤＲＧニューロンとの同時培養を示す概略図である。１８日間同時培養したｈＥＳ−ＯＰＣとＤＲＧニューロンを示す。
【図４Ｅ】ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける、ｈＥＳ由来ＯＰＣによるＤＲＧニューロンのミエリン形成を示す図である。同時培養する前のＤＲＧニューロンのネットワーク（ＮＦ染色、赤色）を示す。スケールバー：１００μｍ。
【図４Ｆ】ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける、ｈＥＳ由来ＯＰＣによるＤＲＧニューロンのミエリン形成を示す図である。同時培養する前の、増殖因子なしで３日間生育したｈＥＳ−ＯＰＣを示す（Ｏ４染色、緑色）。スケールバー：１００μｍ。
【図４Ｇ】ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける、ｈＥＳ由来ＯＰＣによるＤＲＧニューロンのミエリン形成を示す図である。１日間同時培養したｈＥＳ−ＯＰＣ（Ｏ４染色、緑色）とＤＲＧニューロン（ＭＢＰ染色、赤色）を示す。スケールバー：１００μｍ。
【図４Ｈ】ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける、ｈＥＳ由来ＯＰＣによるＤＲＧニューロンのミエリン形成を示す図である。１８日間同時培養したｈＥＳ−ＯＰＣ（ＭＢＰ染色、赤色）とＤＲＧニューロン（ＮＦ染色、緑色）を示す。挿入図：ＣＡＳＰＲ（緑色）及びＭＢＰ（赤色）を染色した。スケールバー：１００μｍ、挿入図のスケールバー：２０μｍ。
【図５Ａ】ミエリン形成アッセイを使用した、ガンマセクレターゼ阻害剤Ｘの用量応答曲線を示す図である。対照（５Ａ）及び１００ｎＭのＧＳＩ−Ｘ（５Ｂ）からの９６ウエルのうちの１ウエルの、ニューロフィラメント（緑色）及びＭＢＰ（赤色）の染色の概観を示す。
【図５Ｂ】ミエリン形成アッセイを使用した、ガンマセクレターゼ阻害剤Ｘの用量応答曲線を示す図である。対照（５Ａ）及び１００ｎＭのＧＳＩ−Ｘ（５Ｂ）からの９６ウエルのうちの１ウエルの、ニューロフィラメント（緑色）及びＭＢＰ（赤色）の染色の概観を示す。
【図５Ｃ】ミエリン形成アッセイを使用した、ガンマセクレターゼ阻害剤Ｘの用量応答曲線を示す図である。３つのパラメータ、すなわち、ＭＢＰ染色の面積、ＩＯＤ、及びＭＢＰ陽性細胞の数を統合することによって生成した、ＧＳＩ−Ｘの用量応答曲線を示す。
【図５Ｄ】ミエリン形成アッセイを使用した、ガンマセクレターゼ阻害剤Ｘの用量応答曲線を示す図である。ＮＴ及びＧＳＩ−Ｘ処理の解析のために使用したパラメータを示す。ｉｍａｇｅ−ｐｒｏ  ｐｌｕｓソフトウエアによる同定前のＭＢＰ染色を示す。スケールバー：１００μｍ。
【図５Ｅ】ミエリン形成アッセイを使用した、ガンマセクレターゼ阻害剤Ｘの用量応答曲線を示す図である。ＮＴ及びＧＳＩ−Ｘ処理の解析のために使用したパラメータを示す。ｉｍａｇｅ−ｐｒｏ  ｐｌｕｓソフトウエアにより同定し、解析したＭＢＰ染色を示す。スケールバー：１００μｍ。
【図５Ｆ】ミエリン形成アッセイを使用した、ガンマセクレターゼ阻害剤Ｘの用量応答曲線を示す図である。ＮＴ及びＧＳＩ−Ｘ処理の解析のために使用したパラメータを示す。ＭＢＰ染色（赤色）とニューロフィラメント染色（緑色）とが同時局在する領域の同定を示す。スケールバー：１００μｍ。
【図６】ｈＥＳ−ＯＰＣの分化及びミエリン形成アッセイの概略図を示す。
【図７Ａ】Ｏ４によりＭＡＣＳ選別した後の、Ｏ４＋細胞の数の増加を示す図である。選別前の細胞（７Ａ）、Ｏ４により選別した細胞（７Ｂ）、及び陰性細胞（７Ｃ）における、Ｏ４（ＡＰＣ：緑色のドット）、Ａ２Ｂ５（ＰＥ：紫色のドット）、及びＯ４且つＡ２Ｂ５（ＡＰＣ＋ＰＥ：黄色のドット）のシグナル伝達のＦＡＣＳ解析を示す。
【図７Ｂ】Ｏ４によりＭＡＣＳ選別した後の、Ｏ４＋細胞の数の増加を示す図である。選別前の細胞（７Ａ）、Ｏ４により選別した細胞（７Ｂ）、及び陰性細胞（７Ｃ）における、Ｏ４（ＡＰＣ：緑色のドット）、Ａ２Ｂ５（ＰＥ：紫色のドット）、及びＯ４且つＡ２Ｂ５（ＡＰＣ＋ＰＥ：黄色のドット）のシグナル伝達のＦＡＣＳ解析を示す。
【図７Ｃ】Ｏ４によりＭＡＣＳ選別した後の、Ｏ４＋細胞の数の増加を示す図である。選別前の細胞（７Ａ）、Ｏ４により選別した細胞（７Ｂ）、及び陰性細胞（７Ｃ）における、Ｏ４（ＡＰＣ：緑色のドット）、Ａ２Ｂ５（ＰＥ：紫色のドット）、及びＯ４且つＡ２Ｂ５（ＡＰＣ＋ＰＥ：黄色のドット）のシグナル伝達のＦＡＣＳ解析を示す。
【図７Ｄ】Ｏ４によりＭＡＣＳ選別した後の、Ｏ４＋細胞の数の増加を示す図である。選別前の細胞（７Ｄ）及びＯ４により選別した細胞（７Ｅ）の、細胞を播種した４８時間後のＯ４染色（緑色）及びＤＡＰＩ染色（青色）を示す。スケールバー：１００μｍ。
【図７Ｅ】Ｏ４によりＭＡＣＳ選別した後の、Ｏ４＋細胞の数の増加を示す図である。選別前の細胞（７Ｄ）及びＯ４により選別した細胞（７Ｅ）の、細胞を播種した４８時間後のＯ４染色（緑色）及びＤＡＰＩ染色（青色）を示す。スケールバー：１００μｍ。
【図７Ｆ】Ｏ４によりＭＡＣＳ選別した後の、Ｏ４＋細胞の数の増加を示す図である。Ｏ４により選別する前（褐色のバー）及びＯ４により選別した後（緑色のバー）のＯ４＋細胞のパーセントのＣｅｌｌｏｍｉｃｓ解析を示す。
【図８Ａ】ＤＲＧニューロンの軸索と、選別前及び選別後のｈＯＰＣとの同時培養を示す図である。培養物を、同時培養の９日後に固定し、ＮＦ（緑色）、ＭＢＰ（赤色）、及びＤＡＰＩ（青色）により染色した。ｈＥＳ−ＯＰＣを加えないＤＲＧ（８Ａ）、ＤＲＧの軸索とＯ４により選別しなかったｈＥＳ−ＯＰＣとの同時培養物（８Ｂ）、又はＤＲＧの軸索とＯ４により選別したｈＯＰＣとの同時培養物（８Ｃ）の２５個の画像のモンタージュを示す。画像のスケールバー：６６０μｍ。
【図８Ｂ】ＤＲＧニューロンの軸索と、選別前及び選別後のｈＯＰＣとの同時培養を示す図である。培養物を、同時培養の９日後に固定し、ＮＦ（緑色）、ＭＢＰ（赤色）、及びＤＡＰＩ（青色）により染色した。ｈＥＳ−ＯＰＣを加えないＤＲＧ（８Ａ）、ＤＲＧの軸索とＯ４により選別しなかったｈＥＳ−ＯＰＣとの同時培養物（８Ｂ）、又はＤＲＧの軸索とＯ４により選別したｈＯＰＣとの同時培養物（８Ｃ）の２５個の画像のモンタージュを示す。画像のスケールバー：６６０μｍ。
【図８Ｃ】ＤＲＧニューロンの軸索と、選別前及び選別後のｈＯＰＣとの同時培養を示す図である。培養物を、同時培養の９日後に固定し、ＮＦ（緑色）、ＭＢＰ（赤色）、及びＤＡＰＩ（青色）により染色した。ｈＥＳ−ＯＰＣを加えないＤＲＧ（８Ａ）、ＤＲＧの軸索とＯ４により選別しなかったｈＥＳ−ＯＰＣとの同時培養物（８Ｂ）、又はＤＲＧの軸索とＯ４により選別したｈＯＰＣとの同時培養物（８Ｃ）の２５個の画像のモンタージュを示す。画像のスケールバー：６６０μｍ。
【図８Ｄ】ＤＲＧニューロンの軸索と、選別前及び選別後のｈＯＰＣとの同時培養を示す図である。培養物を、同時培養の９日後に固定し、ＮＦ（緑色）、ＭＢＰ（赤色）、及びＤＡＰＩ（青色）により染色した。図８Ａ〜Ｃと同じであるが、１つの視野のみの拡大であり、矢印は、ミエリン線維を指し示す。画像のスケールバー：１００μｍ。
【図８Ｅ】ＤＲＧニューロンの軸索と、選別前及び選別後のｈＯＰＣとの同時培養を示す図である。培養物を、同時培養の９日後に固定し、ＮＦ（緑色）、ＭＢＰ（赤色）、及びＤＡＰＩ（青色）により染色した。図８Ａ〜Ｃと同じであるが、１つの視野のみの拡大であり、矢印は、ミエリン線維を指し示す。画像のスケールバー：１００μｍ。
【図８Ｆ】ＤＲＧニューロンの軸索と、選別前及び選別後のｈＯＰＣとの同時培養を示す図である。培養物を、同時培養の９日後に固定し、ＮＦ（緑色）、ＭＢＰ（赤色）、及びＤＡＰＩ（青色）により染色した。図８Ａ〜Ｃと同じであるが、１つの視野のみの拡大であり、矢印は、ミエリン線維を指し示す。画像のスケールバー：１００μｍ。
【図８Ｇ】ＤＲＧニューロンの軸索と、選別前及び選別後のｈＯＰＣとの同時培養を示す図である。培養物を、同時培養の９日後に固定し、ＮＦ（緑色）、ＭＢＰ（赤色）、及びＤＡＰＩ（青色）により染色した。図８Ｄ〜Ｆそれぞれの挿入図の拡大であり、矢印は、ミエリン線維を指し示す。
【図８Ｈ】ＤＲＧニューロンの軸索と、選別前及び選別後のｈＯＰＣとの同時培養を示す図である。培養物を、同時培養の９日後に固定し、ＮＦ（緑色）、ＭＢＰ（赤色）、及びＤＡＰＩ（青色）により染色した。図８Ｄ〜Ｆそれぞれの挿入図の拡大であり、矢印は、ミエリン線維を指し示す。
【図８Ｉ】ＤＲＧニューロンの軸索と、選別前及び選別後のｈＯＰＣとの同時培養を示す図である。培養物を、同時培養の９日後に固定し、ＮＦ（緑色）、ＭＢＰ（赤色）、及びＤＡＰＩ（青色）により染色した。図８Ｄ〜Ｆそれぞれの挿入図の拡大であり、矢印は、ミエリン線維を指し示す。
【図９Ａ】Ｏ４により選別した同時培養物中のＭＢＰ＋細胞及びミエリン線維のパーセントの増加を、それぞれの細胞処理について、８つのウエルから得られた３９２個の視野のＣｅｌｌｏｍｉｃｓ画像解析に基づいて示すグラフである。ＤＲＧのみ（青色：左のバー）、選別前の細胞（褐色：中央のバー）、及びＯ４により選別した細胞（緑色：右のバー）の％ＭＢＰ＋細胞を示す。
【図９Ｂ】Ｏ４により選別した同時培養物中のＭＢＰ＋細胞及びミエリン線維のパーセントの増加を、それぞれの細胞処理について、８つのウエルから得られた３９２個の視野のＣｅｌｌｏｍｉｃｓ画像解析に基づいて示すグラフである。９Ａと同じであるが、ＭＢＰ＋細胞の％に代えて、ミエリン線維の数（ＮＦ標識とＭＢＰ標識との間の重複）を数えた。
【図１０Ａ】ＣＤ１４０＋によるＭＡＣＳ選別の後の、ＣＤ１４０＋細胞の数の増加を示す図である。選別前の細胞（図１０Ａ）、ＣＤ１４０ａにより選別した細胞（図１０Ｂ）、及びＣＤ１４０ａ−細胞（図１０Ｃ）中のＣＤ１４０ａ（ＰＥ：紫色のドット）のＦＡＣＳ解析を示す。
【図１０Ｂ】ＣＤ１４０＋によるＭＡＣＳ選別の後の、ＣＤ１４０＋細胞の数の増加を示す図である。選別前の細胞（図１０Ａ）、ＣＤ１４０ａにより選別した細胞（図１０Ｂ）、及びＣＤ１４０ａ−細胞（図１０Ｃ）中のＣＤ１４０ａ（ＰＥ：紫色のドット）のＦＡＣＳ解析を示す。
【図１０Ｃ】ＣＤ１４０＋によるＭＡＣＳ選別の後の、ＣＤ１４０＋細胞の数の増加を示す図である。選別前の細胞（図１０Ａ）、ＣＤ１４０ａにより選別した細胞（図１０Ｂ）、及びＣＤ１４０ａ−細胞（図１０Ｃ）中のＣＤ１４０ａ（ＰＥ：紫色のドット）のＦＡＣＳ解析を示す。
【図１０Ｄ】ＣＤ１４０＋によるＭＡＣＳ選別の後の、ＣＤ１４０＋細胞の数の増加を示す図である。選別前の細胞（図１０Ｄ）、及びＣＤ１４０ａにより選別した、選別後の細胞播種の２４時間後の細胞（図１０Ｅ）のＯ４染色（緑色）、ＣＤ１４０染色（赤色）及びＤＡＰＩ染色（青色）を示す。
【図１０Ｅ】ＣＤ１４０＋によるＭＡＣＳ選別の後の、ＣＤ１４０＋細胞の数の増加を示す図である。選別前の細胞（図１０Ｄ）、及びＣＤ１４０ａにより選別した、選別後の細胞播種の２４時間後の細胞（図１０Ｅ）のＯ４染色（緑色）、ＣＤ１４０染色（赤色）及びＤＡＰＩ染色（青色）を示す。
【図１０Ｆ】ＣＤ１４０＋によるＭＡＣＳ選別の後の、ＣＤ１４０＋細胞の数の増加を示す図である。選別の９日後のＯ４の標識化：選別前の細胞（図１０Ｆ）及びＣＤ１４０ａにより選別した細胞（図１０Ｇ）を示す。
【図１０Ｇ】ＣＤ１４０＋によるＭＡＣＳ選別の後の、ＣＤ１４０＋細胞の数の増加を示す図である。選別の９日後のＯ４の標識化：選別前の細胞（図１０Ｆ）及びＣＤ１４０ａにより選別した細胞（図１０Ｇ）を示す。スケールバー：１００μｍ。
【図１０Ｈ】ＣＤ１４０＋によるＭＡＣＳ選別の後の、ＣＤ１４０＋細胞の数の増加を示す図である。ＣＤ１４０ａによる選別の２４時間後及び９日後のＯ４＋細胞のパーセントのＣｅｌｌｏｍｉｃｓ解析を示す。
【図１１Ａ】ＣＤ１４０ａによる選別の前及び後のＤＲＧニューロンの軸索とｈＯＰＣとの同時培養を示す図である。培養物を、同時培養の９日後に固定し、ＮＦ（緑色）、ＭＢＰ（赤色）、及びＤＡＰＩ（青色）により染色した。選別前の細胞（図１１Ａ）又はＣＤ１４０ａにより選別した細胞（図１１Ｃ）を加えたＤＲＧの４９個の画像のモンタージュを示し、各同時培養物の１つの視野の拡大をそれぞれ、図１１Ｂ及び１１Ｄに示す。スケールバー：６６０μｍ。
【図１１Ｂ】ＣＤ１４０ａによる選別の前及び後のＤＲＧニューロンの軸索とｈＯＰＣとの同時培養を示す図である。培養物を、同時培養の９日後に固定し、ＮＦ（緑色）、ＭＢＰ（赤色）、及びＤＡＰＩ（青色）により染色した。選別前の細胞（図１１Ａ）又はＣＤ１４０ａにより選別した細胞（図１１Ｃ）を加えたＤＲＧの４９個の画像のモンタージュを示し、各同時培養物の１つの視野の拡大をそれぞれ、図１１Ｂ及び１１Ｄに示す。スケールバー：１００μｍ。
【図１１Ｃ】ＣＤ１４０ａによる選別の前及び後のＤＲＧニューロンの軸索とｈＯＰＣとの同時培養を示す図である。培養物を、同時培養の９日後に固定し、ＮＦ（緑色）、ＭＢＰ（赤色）、及びＤＡＰＩ（青色）により染色した。選別前の細胞（図１１Ａ）又はＣＤ１４０ａにより選別した細胞（図１１Ｃ）を加えたＤＲＧの４９個の画像のモンタージュを示し、各同時培養物の１つの視野の拡大をそれぞれ、図１１Ｂ及び１１Ｄに示す。スケールバー：６６０μｍ。
【図１１Ｄ】ＣＤ１４０ａによる選別の前及び後のＤＲＧニューロンの軸索とｈＯＰＣとの同時培養を示す図である。培養物を、同時培養の９日後に固定し、ＮＦ（緑色）、ＭＢＰ（赤色）、及びＤＡＰＩ（青色）により染色した。選別前の細胞（図１１Ａ）又はＣＤ１４０ａにより選別した細胞（図１１Ｃ）を加えたＤＲＧの４９個の画像のモンタージュを示し、各同時培養物の１つの視野の拡大をそれぞれ、図１１Ｂ及び１１Ｄに示す。スケールバー：１００μｍ。
【図１１Ｅ】ＣＤ１４０ａによる選別の前及び後のＤＲＧニューロンの軸索とｈＯＰＣとの同時培養を示す図である。培養物を、同時培養の９日後に固定し、ＮＦ（緑色）、ＭＢＰ（赤色）、及びＤＡＰＩ（青色）により染色した。９日間の同時培養の後の、選別前の細胞及びＣＤ１４０ａ＋細胞のＭＢＰ＋細胞のパーセントのＣｅｌｌｏｍｉｃｓ解析を示す。
【図１２Ａ】ヒトオリゴデンドロサイトの生存に対するＩＦＮ−Ｙの作用を示す図である。培養物を、１４日間生育した。Ｏ４（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて標識した未処理の細胞を示す。
【図１２Ｂ】ヒトオリゴデンドロサイトの生存に対するＩＦＮ−Ｙの作用を示す図である。培養物を、１４日間生育した。死標識（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて標識した未処理の細胞を示す。
【図１２Ｃ】ヒトオリゴデンドロサイトの生存に対するＩＦＮ−Ｙの作用を示す図である。培養物を、１４日間生育した。Ｏ４（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて標識したＩＦＮ−Ｙ処理細胞を示す。スケールバー：１００μｍ。
【図１２Ｄ】ヒトオリゴデンドロサイトの生存に対するＩＦＮ−Ｙの作用を示す図である。培養物を、１４日間生育した。死標識（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）を用いて標識したＩＦＮ−Ｙ処理細胞を示す。
【図１２Ｅ】ヒトオリゴデンドロサイトの生存に対するＩＦＮ−Ｙの作用を示す図である。培養物を、１４日間生育した。死細胞のパーセントの統計学的解析を示す。
【図１２Ｆ】ヒトオリゴデンドロサイトの生存に対するＩＦＮ−Ｙの作用を示す図である。培養物を、１４日間生育した。Ｏ４＋細胞の数の統計学的解析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、ｅｘ−ｖｉｖｏにおいて分化させた胚性幹細胞を使用して、オリゴデンドロサイトの成熟及び生存、又はニューロン細胞のミエリン形成に作用する薬剤を同定する方法に関する。
【００５２】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明の出願が、必ずしも以下の説明に記載する詳細及び実施例により例示する詳細に限定されるとは限らないことを理解されたい。本発明は、その他の実施形態が可能であり、又は種々の方法で実行若しくは実施することが可能である。
【００５３】
最近まで、ヒトオリゴデンドロサイトの分化及び機能性のミエリン形成を解析する反応機構研究は、げっ歯類アッセイに基づいていた。ヒト胚から得られた脳に由来するＯＰＣを使用する同時培養系が、最近になって記載された。しかし、再現性を欠き、入手が困難であることにより、ヒト胚の使用には問題がある。
【００５４】
本発明は一つには、新規の、ヒトに特異的な分化及びミエリン形成のアッセイに基づき、このアッセイを使用して、オリゴデンドロサイト（Ｏｌ）、それらの先駆体、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）、及びさらに、ニューロン細胞軸索と相互作用する際のそれらの機能に作用する薬物について、定量的にスクリーニングすることができる。このアッセイは、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞からｅｘ−ｖｉｖｏにおいて分化させる、Ｏｌ又はＯＰＣの再現性のある細胞系の使用に基づく。細胞系は、液体窒素中に保存し、必要に応じて解凍することができる。
【００５５】
本発明により、ｈＥＳ由来のＯＰＣ（ｈＥＳ−ＯＰＣ）の、ＯＰＣのＯｌへの成熟、それらの生存及びミエリン形成を上方制御する薬剤を定量的にスクリーニングするための使用が可能になる。
【００５６】
そのようなｈＥＳ−ＯＰＣの細胞系に対する、１つの薬剤（ノギン）の作用の定量化を、Ｏ４陽性細胞の数、突起及び分枝点の数を数えることによって実施した（例２）。
【００５７】
低分子薬剤（ガンマセクレターゼ阻害剤）の作用の定量化を、ｈＥＳ−ＯＰＣを後根神経節（ＤＲＧ）ニューロン細胞軸索と同時培養し、ＭＢＰ陽性線維とニューロフィラメント陽性線維との同時局在する数を、未処理の細胞と比較して数えることによって実施した（例３及び４）。
【００５８】
したがって、本発明の一態様に従って、ニューロン細胞のミエリン形成に対する薬剤の作用を定量化する方法を提供し、この方法は、
（ａ）オリゴデンドロサイト先駆細胞（ＯＰＣ）の集団を薬剤と接触させるステップであって、ＯＰＣは、胚性幹細胞からｅｘ−ｖｉｖｏにおいて分化させてある上記ステップと、
（ｂ）ＯＰＣ中のミエリン形成の少なくとも１つのマーカーを定量化するステップであって、それにより、ニューロン細胞のミエリン形成に対する薬剤の作用を定量化する上記ステップと
を含む。
【００５９】
本明細書で使用する場合、用語「ミエリン」は、特定の軸索及び神経線維を包み込み、不可欠な絶縁体をなし、神経細胞の伝導を可能にし、それにより、電気的メッセージが脳へ及び脳から伝達される脂肪性の物質を指す。
【００６０】
句「ニューロン細胞のミエリン形成」は、オリゴデンドロサイト（すなわち、そこから伸長する突起）の、ニューロン細胞軸索の周囲を包み、ミエリン鞘を形成する能力を指す。
【００６１】
本明細書で使用する場合、用語「ＯＰＣの成熟」は、ＯＰＣの、ミエリン形成性のオリゴデンドロサイトへの成熟又は分化のプログラムを指す。
【００６２】
本明細書で使用する場合、用語「生存」は、細胞が死を回避する任意のプロセスを意味する。また、生存という用語は、本明細書で使用する場合、壊死、アポトーシスにより証明されるような細胞の喪失の阻止、又はその他の機構の細胞の喪失の阻止も指す。生存の増加は、本明細書で使用する場合、未処理の対照と比べて、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、１００％又は２００％以上の細胞の死亡率の減少を示す。生存率を、培養物中の、死細胞に特異的な染料（例えば、ヨウ化プロピジウム）を用いて染色することが可能な細胞を数えることによって測定することができる。
【００６３】
本発明のこの態様のアッセイにおいて使用する細胞は、胚性幹細胞からｅｘ−ｖｉｖｏにおいて分化させてあるオリゴデンドロサイト先駆細胞を含む。
【００６４】
本発明のこの態様のＯＰＣは、ミエリン形成の表現型に分化する（すなわち、ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおけるミエリン形成を増加させる）可能性を有するが、さらなる処理（例えば、そのさらなる分化を誘導する薬剤の存在下に置くこと）がない場合、ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおけるミエリン形成は可能でないことが理解されるであろう。
【００６５】
本発明のこの態様では、また、ＯＰＣは、以下の機能性の表現型：有糸分裂の表現型（すなわち、３回以上継代して培養すると、分裂及び拡大増殖することができる表現型）及び遊走能力も有し得る。
【００６６】
ＯＰＣは、細長く、双極性又は多極性の形態学的状態を含むことができる。典型的には、ＯＰＣは、ブロモデオキシウリジン（ＢｕｄＲ）を組み込むことができ、このことは、有糸分裂の顕著な特色である。
【００６７】
ＯＰＣマーカー発現の例として、これらに限定されないが、ＰＤＧＦ受容体、Ｏ４スルファチドマーカー、Ｎｋｘ２．２、Ｓｏｘ１０、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（ＯＳＰ）、２’，３’−環状ヌクレオチド−３’−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、大腸腺腫症（ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉ）（ＡＰＣ）；ＮＧ２（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、Ａ２Ｂ５、ＧＤ３（ガングリオシド）、ネスチン、ビメンチン、及びＥ−又はＰＳＡ−ＮＣＡＭが挙げられる。
【００６８】
特定の実施形態によれば、本発明のこの態様のＯＰＣは、同一アッセイにおいて測定される場合、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を発現するよりも高い程度で、Ｏｌｉｇ１及びＯｌｉｇ２を発現する。そのようなアッセイは、免疫組織化学的検査、ＲＴ−ＰＣＲ及び／又はウエスタンブロット解析による解析を含む。
【００６９】
本明細書で使用する場合、用語「より高い程度で」は、２倍〜２０倍の間を意味する。
【００７０】
別の実施形態によれば、本発明のこの態様のＯＰＣは、ｏｌｉｇ１、ｏｌｉｇ２のそれぞれ、及びＨｅｓ５を発現する。
【００７１】
言及したように、本発明のこの態様のＯＰＣは、胚性幹細胞（ＥＳＣ）からｅｘ−ｖｉｖｏにおいて分化させる。
【００７２】
例えば、（ＷＯ２００６／０４０７６３に記載されているように）ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚盤胞又は後期の胚盤胞期から単離することができる。ヒト胚盤胞は典型的には、ヒト生体内着床前胚又は生体外受精（ＩＶＦ）胚から得られる。それに代わって、単一細胞のヒト胚を、胚盤胞期まで拡大増殖することもできる。ヒトＥＳ細胞を単離するために、透明帯を、胚盤胞から除去し、内部細胞塊（ＩＣＭ）を、免疫手術により単離し、この場合、栄養外胚葉細胞を、溶解させ、完全なままのＩＣＭから、穏やかなピペット操作により除去する。次いで、ＩＣＭの成長を可能にする適切な培地を含有する組織培養フラスコ中に、ＩＣＭを蒔く。９〜１５日後に、ＩＣＭ由来の成長物を、機械的な解離又は酵素分解のいずれかにより解離させて凝集塊を得、次いで、細胞を、新鮮な組織培養培地上に再度蒔く。未分化の形態学的状態を示すコロニーを、マイクロピペットにより個々に選択し、機械的に解離させ凝集塊を得、再度蒔く。次いで、結果として得られたＥＳ細胞を、１〜２週間に１回定期的に分割する。ヒトＥＳ細胞を調製する方法に関するさらなる詳細については、Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．［米国特許第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５，１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３，１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７８４４，１９９５］；Ｂｏｎｇｓｏ  ｅｔ  ａｌ，［Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  ４：７０６，１９８９］；Ｇａｒｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，［Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．６９：８４，１９９８］を参照されたい。
【００７３】
また、商業的に入手可能な幹細胞も、本発明のこの態様に関して使用することができることが理解されるであろう。ヒトＥＳ細胞は、ＮＩＨヒト胚性幹細胞登録簿（＜ｈｔｔｐ：／／ｅｓｃｒ．ｎｉｈ．ｇｏｖ＞）から購入することができる。商業的に入手可能な胚性幹細胞系の非限定的な例が、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＳＡ０１、ＴＥ０３（Ｉ３）、ＴＥ０４、ＴＥ０６（Ｉ６）、ＨＥＳ−１、ＨＥＳ−２、ＨＥＳ−３、ＵＣ０１、ＵＣ０６、ＷＡ０１、ＷＡ０７及びＷＡ０９である（また、以下の実施例のセクションの例１も参照されたい）。
【００７４】
また、本発明が使用する幹細胞は、ヒト胚性生殖（ＥＧ）細胞及び人工多能性幹細胞（Ｉｐｓ）から得ることもできる。妊娠約８〜１１週のヒト胎児からあらゆる当業者に公知の実験室的技法を使用して得られた原始生殖細胞から、ヒトＥＧ細胞を調製する。生殖隆起を、解離させ、小塊に切断し、その後、これらの小塊を、機械的な解離により脱凝集させ、細胞を得る。次いで、ＥＧ細胞を、適切な培地を有する組織培養フラスコ中で生育する。細胞を、培地を毎日置き換えて、ＥＧ細胞と一致する細胞の形態学的状態が観察されるまで、典型的には、７〜３０日後又は継代１〜４回後まで培養する。ヒトＥＧ細胞を調製する方法に関する追加の詳細については、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６，１９９８］及び米国特許第６，０９０，６２２号を参照されたい。
【００７５】
本発明に従って使用する幹細胞は、それらの起源にかかわらず、少なくとも５０％精製されている、７５％精製されている、又は少なくとも９０％精製されている。ヒト胚性幹細胞系を使用する場合、ヒトＥＳ細胞のコロニーを、それらのフィーダー層（Ｘ線を照射した線維芽細胞様細胞）から、例として、機械的及び／又は酵素的な手段により分離して、実質的に純粋な幹細胞集団を得る。
【００７６】
ヒト幹細胞が得られたら、それらを処理して、ＯＰＣに分化させることができる。例示的な方法を、下記の材料及び方法のセクションに記載する。しかし、提示する方法は、ＯＰＣを生成するための追加の方法も企図し、これらの方法は、当技術分野で公知であることが理解されるであろう。
【００７７】
したがって、本明細書下記の例１に記載するように、細胞又はそれらの凝集体を、レチノイン酸を含む分化条件に付すことができ、したがって、神経球の形成が可能になる。使用する培地を、使用する幹細胞に従って選択する。したがって、例えば、ＥＳ細胞の生育に適している培地は、例えば、支援する酵素及びホルモンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｅｗｉｓ、ＭＯ）又はアルファＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、米国）であり得る。これらの酵素は、例えば、インスリン（ＡｃｔＲａｐｉｄ；Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、デンマーク）、プロゲステロン及び／又はアポトランスフェリン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）であり得る。その他の成分を、実施例のセクションの例１に列挙する。
【００７８】
本明細書で使用する場合、句「レチノイン酸」は、ニューロン細胞の分化を誘導することが可能である、ビタミンＡの（合成又は天然の）活性な形態を指す。本発明に従って使用することができるレチノイン酸の形態の例として、これらに限定されないが、レチノイン酸、レチノール、レチナール、１１−シス−レチナール、全トランス型レチノイン酸、１３−シスレチノイン酸及び９−シス−レチノイン酸（全てが、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｅｗｉｓ、ＭＯにおいて入手可能である）が挙げられる。
【００７９】
本発明のいくつかの実施形態では、レチノイン酸を、１〜５０μＭの濃度範囲で使用する。
【００８０】
培地に、増殖因子をさらに補充することができ、これらの増殖因子は、培養期間の少なくとも一部において存在して、細胞増殖を促し、ニューロン細胞のグリア系列への分化を促進することができる。本発明のこの態様のある実施形態によれば、そのような増殖因子として、例えば、ＥＧＦ（５〜５０ｎｇ／ｍｌ）及びｂＦＧＦ（５〜５０ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、Ｂｉｏｔｅｓｔ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、ドイツ）が挙げられる。
【００８１】
本明細書で使用する場合、句「神経球」は、ニューロン細胞、オリゴデンドロサイト及びアストロサイト、並びにその他のグリア細胞に分化することができる神経幹細胞及び早期の多分化能前駆体を主として含有する準求形のクラスター又は球体を指す。
【００８２】
円熟した神経球が形成されるまで、細胞を培養する。
【００８３】
本明細書で使用する場合、句「円熟した神経球」は、神経球であって、それらの中で、神経幹細胞が、分化して、オリゴデンドロサイト系列の後天的なマーカー（例えば、Ｓｏｘ１０、Ｎｋｘ２．２．、ＮＧ２、Ａ２Ｂ５）を有する特殊化したオリゴデンドロサイト前駆体になっているものもあり、一方、分化して、神経前駆体又はアストロサイト前駆体になっているものもある神経球を指す。
【００８４】
本発明のある実施形態によれば、細胞を、例えば、１０〜３０（例えば、２０〜３０）日間培養することが可能であり、この期間の終わりに、脱離した神経球が形成される。次いで、球体、又はそこから解離した細胞を、接着性の基材（例えば、マトリゲル、又は細胞外マトリックス構成成分（例えば、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチン））に接着させ、増殖因子を伴うさらなる拡大増殖に付し、最終的には、増殖因子を除去した後に、カチオン性の接着性基材（例えば、フィブロネクチン（ＦＮ）を伴うポリ−Ｄ−リシン又はポリオルニチン）上で分化させる。
【００８５】
高分化したミエリン形成細胞の生成を回避するために、ＯＰＣを、この段階で、増殖因子の非存在下で３、４又は５日超にわたり放置しない。
【００８６】
神経膠球体の形成の後（若しくはそれと同時）にか、又は接着性の基材上での培養の後に、細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）活性を阻害することが可能な薬剤と共にインキュベートすることができる。
【００８７】
本明細書で使用する場合、用語「ＢＭＰ活性を下方制御することが可能な薬剤」は、ＢＭＰの機能（すなわち、活性及び／又は発現）を少なくとも部分的に低下させることができる薬剤を指す。
【００８８】
ＢＭＰ低下剤は、シスチンノット含有ＢＭＰアンタゴニストを含み、これらは、シスチン環のサイズに基づいて、３つのサブファミリー、すなわち、ＣＡＮ（８員環）、ｔｗｉｓｔｅｄ  ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ（９員環）、並びにコーディン及びノギン（１０員環）に分けられる。ＣＡＮファミリーは、追加のシステイン残基の保存されている配置に基づいてさらに分けられ、グレムリン及びＰＲＤＣ；ケルベロス及びｃｏｃｏ；ＤＡＮ；ＵＳＡＧ−１及びスクレロスチンを含む。
【００８９】
その他のＢＭＰ阻害剤として、これらに限定されないが、コーディン様ＢＭＰ阻害剤（ＣＨＬ２）、ニューラリン（Ｎｅｕｒａｌｉｎ）（また、コーディンに相同でもある）：分泌型のＢＭＰ結合阻害剤としての挙動を示す；インヒビン（ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する）；フォリスタチン（インヒビンに結合する）；ＧＤＦ３：複数の状況において古典的ＢＭＰシグナル伝達を遮断する、それ自体のサブファミリー（ＴＧＦ−β）の阻害剤；Ｃｒｏｓｓｖｅｉｎｌｅｓｓ−２（ｈＣＶ−２）：ＢＭＰ機能阻害剤；エクトジン（Ｅｃｔｏｄｉｎ）（Ｑｉａｇｅｎｅ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡにおいて入手可能である）：スクレロスチンに相同であり、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６及びＢＭＰ７の活性を阻害する；結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）：ＢＭＰ受容体アンタゴニスト；ＢＭＰ−３：ＢＭＰ受容体アンタゴニスト；並びにｇｐ１３０シグナル伝達サイトカインが挙げられる。
【００９０】
また、ＢＭＰ遺伝子の発現を下方制御するオリゴヌクレオチド阻害剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）も、本発明のこの態様に従って使用することができることが理解されるであろう。幹細胞の遺伝子を改変する方法が、当技術分野で周知である。
【００９１】
本発明のこの態様の一実施形態では、ＢＭＰを阻害するために使用する薬剤は、ノギンである（例えば、１０〜１００ｎｇ／ｍｌ、例えば、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＮＭから入手可能な、ノギン−Ｆｃのキメラとして使用されるノギン、５０ｎｇ／ｍｌ）。言及したように、ノギンは、任意の培養のステップにおいて、レチノイン酸処理の後に、及び場合により、レチノイン酸処理と共に使用することができる。
【００９２】
神経球形成の後の、ＢＭＰ阻害剤を用いる処理の時期及び期間により、細胞の分化レベルが影響を受ける。ノギンとの培養の量及びタイミングを、特定の分化段階でＯＰＣが生成されるように調節することができる。
【００９３】
また、ノギンを、神経球（Ｎｅｕｒｏ  Ｓｐｈｅｒｅ）（ＮＳ）が円熟する間に添加することもできる。
【００９４】
本発明のアッセイのために使用する細胞は、用時生成してもよく、又は凍結細胞であってもよい。典型的には、細胞が凍結されている場合、それらを、増殖因子（例えば、ｂＦＧＦ及びＥＧＦ）を含む培地中で解凍する。典型的には、細胞を、解凍した後に、増殖因子の非存在下で少なくとも１日間培養してから、アッセイを開始する。
【００９５】
本発明のアッセイを使用して試験することができる薬剤は、低分子薬剤、化学物質、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド薬剤（例えば、ｓｉＲＮＡ薬剤）を含む。また、ミエリン形成に作用することがすでに公知である薬剤も、それらの最適な用量を定量化するために、このアッセイ中で使用することができることが理解されるであろう。
【００９６】
細胞を薬剤と接触させることを、当技術分野で公知の任意のｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける方法により実施することができ、これらの方法には、例えば、薬剤が細胞と直接接触するように、薬剤を細胞に添加する方法が含まれる。本発明のいくつかの実施形態によれば、対象の細胞を、薬剤と共にインキュベートする。細胞をインキュベートするために使用する条件を、細胞の変化、例として、特定の遺伝子の転写及び／又は翻訳の速度の変化を、薬剤が誘導するのを可能にする期間／細胞濃度／薬剤濃度／細胞と薬剤との間の比等について選択し、これらの変化を解析する。特定の実施形態によれば、細胞を薬剤と少なくとも３日、５日、７日、１０日、１４日間、又は少なくとも２１日間接触させる。
【００９７】
薬剤の作用の定量化は、薬剤がミエリン形成に作用することが可能であるか又は可能でないかどうかを単に決定するのとは対照的に、ミエリン形成に作用する薬剤の能力を、数値を使用して段階付けることを可能にすることを指す。
【００９８】
ミエリン形成の表現型を示す細胞数を解析することによってか、又は特定の細胞数に関するミエリン形成の量を（例えば、ミエリン形成マーカーの発現レベルを決定することにより）定量化することによって、定量を決定することができる。
【００９９】
アッセイを定量的に実施するためには、細胞を播種する場合に、同じ数の細胞が、それぞれのアッセイ用の皿及びウエルに添加されるように注意を払うべきである。特定の実施形態によれば、９６ウエルプレートを使用して、ＯＰＣを培養する。９６ウエルプレートの１つのウエル中に播種するＯＰＣの例示的な数は、少なくとも５０００個である。別の実施形態によれば、９６ウエルプレートのそれぞれの皿又はウエルを、マトリゲル及びＰＤＬでコートする。
【０１００】
一実施形態によれば、ミエリン形成のマーカーの発現レベルを解析することによって、薬剤の定量的評価を行うことができる。そのようなマーカーは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ガラクトセレブロシド及び／又はプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）を含む。典型的には、ヒトオリゴデンドロサイトにおける、これらのマーカーのうちのいずれかの発現の増加により、ＯＰＣのミエリン形成の可能性の増加（発現する細胞の総数の増加及び／又は発現レベルの増加のいずれか）をもたらす薬剤が示される。
【０１０１】
ＲＴ−ＰＣＲ解析、ウエスタンブロット解析及び免疫組織化学的検査を含めた、当技術分野で公知の方法を使用して、上記で特定したマーカー（及び／又は本明細書下記においてさらに記載するような追加のマーカー）の発現レベルの定量的測定を行うことができる。
【０１０２】
ミエリン形成のマーカーを定量化する別の方法は、ＯＰＣの突起の数を数えること及び／若しくはＯＰＣの突起の長さを測定すること、並びに／又はＯＰＣ中の分枝点の数を数えることによる方法である。ＯＰＣを認識する抗体、例として、Ｏ４、２’−５’環状ヌクレオチド３’ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）、並びに転写因子のｏｌｉｇ１及びｏｌｉｇ２を認識する抗体を使用して、この方法を実施することができる。
【０１０３】
好ましい実施形態によれば、追加の細胞パラメータ、及びミエリン形成マーカーの発現を研究することができるように、免疫組織化学的な方法を使用する。
【０１０４】
典型的には、この方法は、マーカーを特異的に認識する抗体の使用を必要とし、抗体は、検出可能なマーカーを含む。そのようなマーカーとして、これらに限定されないが、蛍光部分、ペルオキシダーゼ部分、ビオチン部分及びリン光部分が挙げられる。提示するアッセイの状況において使用することができる抗体の例を、本明細書下記の実施例のセクションに示す。抗ガラクトセレブロシド抗体が、例えば、Ｓｉｇｍａから商業的に入手可能である。
【０１０５】
ＯＰＣのミエリン形成の可能性に対する薬剤の作用を定量的に解析するために、典型的には、ミエリン形成のマーカーを発現する、特定の視野中の細胞のパーセントを推定する。場合によっては、ミエリン形成のマーカー及び核のマーカーの両方を同時発現する細胞のみを数える（例えば、ＤＡＰＩ）。
【０１０６】
１ウエル当たり又は１視野当たりの細胞の総数を数えるための多くの方法が、これらに限定されないが、ＤＡＰＩ染色又はヘキスト染色を含めて、当技術分野で公知である。
【０１０７】
本発明の特定の実施形態によれば、Ｏ４／ＭＢＰ陽性の突起の数を、それらの突起がＯ４／ＭＢＰ細胞体につながっている場合にのみ、数え、測定する。別の実施形態によれば、ＯＰＣの突起の長さを数える。それに代わって又は加えて、Ｏ４又はＭＢＰに陽性の細胞体１つ当たりの分枝点の数も数える。
【０１０８】
本発明のＯＰＣ中のミエリン形成のマーカーの解析に加えて（又はそれに代わって）、また、本発明者らは、ＯＰＣの機能活性（すなわち、ミエリン形成の可能性）を直接測定することができるようなアッセイ系に、ニューロン細胞を添加することも企図する。
【０１０９】
本発明は、あらゆるニューロン細胞を、それらに、オリゴデンドロサイトによるミエリン形成が生じ得る限り企図する。
【０１１０】
特定の実施形態によれば、マウス後根神経節細胞を使用する。そのような細胞を、マウス胚（例えば、胎生１３日（Ｅ１３））から解離させ、プレート上に播種することができる。ニューロン細胞を、適切な培地（例えば、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ）培地）中で生育することができる。
【０１１１】
本発明のいくつかの実施形態では、培養物からシュワン細胞及び線維芽細胞を排除するようにニューロン細胞を処理し、例えば、１０μＭウリジン／１０μＭ５’−フルオロ２’−デオキシウリジン（Ｓｉｇｍａ）を用いる処理を行って、線維芽細胞及びシュワン細胞を排除する。
【０１１２】
十分なニューロン細胞が得られたら、それらの上に、ＯＰＣ（好ましくは、増殖因子を除いてから１〜３日が経過しているＯＰＣ）を播種することができる。特定の実施形態によれば、ＶｉｔＣ（例えば、５０μｇ／ｍｌ）を補充したＮＢ／Ｎ２Ｂ２７培地（１ｖ／１ｖ）を使用して、同時培養を行うことができる。
【０１１３】
播種の後（例えば、１２〜２４時間後）に、薬剤を培養物に添加することができ、適切な量の時間（例えば、４〜４５日）が経過したら、培養物を解析する。
【０１１４】
この実施形態によれば、（例えば、ミエリン線維を形成するＭＢＰ陽性又はＯ４陽性の細胞により鞘で覆われているニューロン細胞の数を数えることによって）ミエリンにより包まれているニューロン細胞の数を数える。
【０１１５】
ノードに隣接することが公知のタンパク質、例として、コンタクチン関連タンパク質を陽性に染色する細胞を可視化することができ、また、Ｃａｓｐｒ１（コンタクチン関連タンパク質１）を数えることもできる。そのようなタンパク質の発現は、ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおけるミエリン形成により、ミエリンのインターノード及びパラノードの構造が再生されることを示唆しており、これは、パラノードにおけるＣａｓｐｒの凝縮は、軸索に沿う迅速な電流の伝導に必要なランビエ絞輪の機能性の構成を示すからである。例えば、本明細書下記の例３を参照されたい。
【０１１６】
また、ニューロン細胞中のミエリン形成の量の定量化は、ニューロン細胞とミエリン形成細胞との近位を解析することによって実施することもできる。
【０１１７】
したがって、ニューロフィラメントタンパク質を陽性に染色するニューロン細胞は、それらがＭＢＰ又はＯ４に陽性の細胞中で、鞘で覆われていることが明らかである場合にのみ数えることができる。例えば、本明細書下記の例４を参照されたい。
【０１１８】
コンピュータプログラムを使用して、免疫組織化学的解析から得られたデータを統合することができることが理解されるであろう。そのようなプログラムは、商業的に入手可能であり、又は組織内で当業者が作ることができる。
【０１１９】
本発明者らは、ミエリン産生細胞の濃縮を、ＣＤ１４０ａ（ＰＤＧＦＲＡ）陽性ｈＥＳＣ由来ＯＰＣ又はＯ４陽性ｈＥＳＣ由来ＯＰＣについて選択することによって実施することができることを見出すに至った。
【０１２０】
典型的には、これらの細胞表面タンパク質を特異的に認識することが可能な抗体を使用して選択を行うが、本発明は、追加の薬剤、例として、ポリヌクレオチド又は低分子も企図する。
【０１２１】
公知の細胞を選別する手順を使用して、例として、蛍光標識細胞分取装置（ＦＡＣＳ）を使用することによって、濃縮を行うことができる。
【０１２２】
本明細書で使用する場合、用語「フローサイトメトリー」は、（例えば、標識した抗体を物質に結合させることにより）物質を標識し、物質を含有する流体の流れに、光ビームの通過をもたらし、試料から放射された光を一連のフィルター及びミラーにより構成要素の波長に分離し、光を検出することによって、試料中の物質（例えば、特定のマーカーを含むＯＰＣ）の比率を決定するアッセイを指す。
【０１２３】
多数のフローサイトメーターが、例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  ＤｉｃｋｉｎｓｏｎのＦＡＣＳｃａｎ及びＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を含めて、商業的に入手可能である。ＦＡＣＳ解析のために使用することができる抗体が、Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ  Ｓ，Ｂｏｕｍｅｌｌ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ，［Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｖ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；１９９５］に教示されており、広く商業的に入手可能である。
【０１２４】
ＣＤ１４０ａ抗体又はＯ４抗体を、磁気部分に（直接的に、又はコグネイト結合分子を通して間接的に）つなぐ場合、不均一な細胞集団を、磁気活性化細胞分離により、細胞について濃縮することができる。
【０１２５】
ＣＤ１４０ａ抗体又はＯ４抗体を親和性部分につなぐ場合、不均一な細胞集団を、コグネイト結合分子を用いる親和性精製により、ＣＤ１４０ａ＋細胞又はＯ４＋細胞について濃縮することができる。したがって、例えば、ＣＤ１４０ａ抗体又はＯ４抗体をビオチンにつなぐ場合、不均一な細胞集団から、ストレプトアビジンのビーズ又はカラムを用いて精製することによって、ＣＤ１４０ａ＋細胞又はＯ４＋細胞を枯渇させることができる。続いて、ＣＤ１４０ａ＋細胞又はＯ４＋細胞を回収することができる。例えば、ＣＤ１４０ａ抗体又はＯ４抗体を、抗体又は抗体のＦｃにつなぐ場合、不均一な細胞集団から、プロテインＡのビーズ又はカラムを用いて精製することによって、ＣＤ１４０ａ＋細胞又はＯ４＋細胞を枯渇させることができる。続いて、ＣＤ１４０ａ＋細胞又はＯ４＋細胞を回収することができる。
【０１２６】
本発明のこの態様の分化させた細胞は典型的には、接着性のクラスターとして生育することから、細胞を選別する前に、不均一な細胞集団を、分散化剤を使用して分散させるべきであることが理解されるであろう。
【０１２７】
分散化剤の例として、これらに限定されないが、ディスパーゼ、コラーゲナーゼ、ａｃｃｕｔａｓｅ及びトリプシンが挙げられる。それに代わって又は加えて、また、摩砕を実施して、細胞の分散を増加させることもできる。
【０１２８】
ここに記載するアッセイにおいて、新規の候補薬剤が、ＯＰＣのミエリン形成の可能性、それらの成熟又は生存を上方制御することが可能であることを示したら、その最適な用量を、同じｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける試験を使用して試験することができる。また、候補薬剤のミエリン形成の可能性は、ミエリン形成の低下と関連がある疾患についての動物モデル、例として、多発性硬化症についての動物モデル（例として、抗原を用いて処理して、実験的自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）マウスとなしたマウス）において試験することもできる。
【０１２９】
薬剤のミエリン形成促進、成熟又は生存の可能性を裏付けるに至ったら、薬剤を、商業的な量で合成することができ、及び／又は前記を含む医薬組成物を、本明細書下記の記載に従って合成することができる。
【０１３０】
本明細書で使用する場合、「医薬組成物」は、本明細書に記載する活性成分のうちの１つ又は複数の、その他の化学的構成成分、例として、生理学的に適切な担体及び賦形剤との調製物を指す。医薬組成物の目的は、化合物の生物への投与を促進することである。
【０１３１】
本明細書では、用語「活性成分」は、ミエリン形成、成熟又は生存を上方制御して、生物学的作用を担う薬剤を指す。
【０１３２】
以下、句「生理学的に許容できる担体」及び「薬学的に許容できる担体」は、互換的に使用することができ、生物に対して顕著な刺激性をもたらすことがなく、投与化合物の生物学的な活性及び特性を抑止することがない担体又は希釈剤を指す。アジュバントが、これらの句の下に含まれる。
【０１３３】
本明細書では、用語「賦形剤」は、活性成分の投与をさらに促進するために、医薬組成物に添加する不活性な材料を指す。賦形剤の例として、非限定的に、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖及び種々のタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、並びにポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１３４】
薬物の製剤化及び投与についての技法を、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎに見出すことができ、これは、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１３５】
本発明のアッセイを使用して同定した薬剤を、幹細胞からのミエリン形成細胞のｅｘ−ｖｉｖｏにおける生成において使用することができる。それに代わって、薬剤を、ミエリン形成の欠如と関連がある疾患を患っている患者に直接投与することもできる。そのような疾患として、これらに限定されないが、多発性硬化症、急性播種性脳脊髄炎、横断性脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、ギラン−バレー症候群、橋中央ミエリン溶解、遺伝性脱髄性疾患、例として、白質ジストロフィー及びシャルコーマリートゥース（Ｃｈａｒｃｏｔ  Ｍａｒｉｅ  Ｔｏｏｔｈ）が挙げられる。
【０１３６】
本明細書で使用する場合、用語「約」は、±１０％を指す。
【０１３７】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、及びそれらの同根語は、「〜に限定されないが、〜を含む」を意味する。
【０１３８】
「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という用語は、「〜を含み、且つ〜に限定される」を意味する。
【０１３９】
用語「〜から本質的になる（ｃｏｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、追加の成分、ステップ及び／又は部分が、請求する組成、方法又は構造の基本的な及び新規の特徴を実質的に変化させることがない場合にのみだけ、組成、方法又は構造が、追加の成分、ステップ及び／又は部分を含むことができることを意味する。
【０１４０】
本出願全体を通して、本発明の種々の実施形態を、範囲フォーマットとして提示することができる。範囲フォーマットとしての記載は単に、好都合且つ簡潔に記載するためのものであり、本発明の範囲に対する確固たる限定と解釈してはならないことを理解すべきである。したがって、範囲の記載により、可能な部分範囲及びその範囲内の個々の数値を全て具体的に開示しているとみなすべきである。例えば、範囲の記載、例として、１〜６は、部分範囲、例として、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等、並びにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５及び６を具体的に開示しているとみなすべきである。このことは、範囲の広さにかかわらず適用される。
【０１４１】
数値の範囲を本明細書において示す場合は常に、示す範囲内で言及される数（分数又は整数）であればいずれも含まれることを意味する。第１の示す数と第２の示す数「との間の範囲に及ぶ（ｒａｎｇｉｎｇ／ｒａｎｇｅｓ）」という句と、第１の示す数「から」第２の示す数「までの範囲に及ぶ（ｒａｎｇｉｎｇ／ｒａｎｇｅｓ）」という句とを、本明細書においては互換的に使用し、それらの句は、第１の示す数及び第２の示す数、並びにそれらの間の分数及び整数の数値の全てを含むことを意味する。
【０１４２】
本明細書で使用する場合、用語「方法」は、所与のタスクを達成するための様式、手段、技法及び手順を指し、それらは、これらに限定されないが、化学、薬理学、生物学、生化学及び医学の技術の熟練家に公知である様式、手段、技法及び手順、又はそうした熟練家により公知の様式、手段、技法及び手順から容易に開発される様式、手段、技法及び手順のいずれかを含む。
【０１４３】
本発明の特定の特徴は、明確にするために、別個の実施形態の文脈で記載されているが、これらはまた、組み合わせて、単一の実施形態としてもたらすこともできることを理解されたい。逆に、本発明の種々の特徴は、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で記載されているが、これらはまた、別個に若しくは任意の適切な部分的な組合せとしてもたらしても、又は適切であれば、本発明の任意のその他の記載実施形態中でもたらしてもよい。種々の実施形態の文脈で記載されている特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしでも作動する限り、それらの実施形態の不可欠な特徴であるとみなしてはならない。
【０１４４】
本発明の種々の実施形態及び態様を、上記に記述し、下記の特許請求の範囲のセクションに請求するが、これらの実施形態及び態様は、以下の実施例における実験により支持される。
【実施例】
【０１４５】
ここでは、以下の実施例を参照する。これらの実施例は、上記の説明と一緒になって、本発明のいくつかの実施形態を非限定的に例証する。
【０１４６】
一般に、本明細書において使用する命名法及び本発明において活用する実験室手順は、分子的技法、生化学的技法、微生物学的技法及び組換えＤＮＡ技法を含む。そのような技法は、文献に十分に説明されている。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）“Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）を参照されたい。方法論が、米国特許第４，６６６，８２８号；第４，６８３，２０２号；第４，８０１，５３１号；第５，１９２，６５９号及び第５，２７２，０５７号；“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；“Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”ｂｙ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），“Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）に記載されている。利用可能なイムノアッセイが、特許及び科学文献に広範に記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；第３，８３９，１５３号；第３，８５０，７５２号；第３，８５０，５７８号；第３，８５３，９８７号；第３，８６７，５１７号；第３，８７９，２６２号；第３，９０１，６５４号；第３，９３５，０７４号；第３，９８４，５３３号；第３，９９６，３４５号；第４，０３４，０７４号；第４，０９８，８７６号；第４，８７９，２１９号；第５，０１１，７７１号及び第５，２８１，５２１号；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”  Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）、及び“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ，“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい。これらは全て、本明細書に完全に記載されているかのごとく、参照により組み込まれている。その他の一般的な参考文献が、本記載全体を通して示されている。それらの中の手順は、当技術分野で周知であると考えられ、読者の利便性のために提供されている。それらの中に含有される全ての情報が、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１４７】
材料及び方法
アッセイのために使用する細胞の生成
ヒトＥＳ細胞系を、ヒト新生児包皮線維芽細胞（ＨＥＦ）のフィーダー層上、５％ＣＯ２中、３７℃で培養した。増殖培地（ＥＳ１）は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ）、１４％ノックアウト血清代替品（ＫＳＲ）、非必須アミノ酸（１／１００）、１００ｍＭベータ−メルカプトエタノール（これらの３つは全て、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ製）、１ｍＭピルビン酸Ｎａ、２μｇ／ｍｌヘパリン（Ｓｉｇｍａ）及び８ｎｇ／ｍｌヒト組換え塩基性ＦＧＦ（ＦＧＦ−２；Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ）からなった。播種の５日後に、ｈＥＳ細胞コロニーを、１．２ｍｇ／ｍｌコラーゲナーゼＩＶ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を用いて、３７℃で４５〜９０分かけて脱離させた。凝集体を、上記に従ってさらに培養するか、又は（Ｉｚｒａｅｌ  ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３４，３１０−３２３（２００７））の記載に従って分化させた。
【０１４８】
ステップ１−移行：この移行段階では、ｈＥＳ細胞コロニーを、組織培養プレート、５０％（ｖ／ｖ）ＥＳ１培地と５０％（ｖ／ｖ）のＩＴＴＳＰＰ／Ｂ２７培地とからなる培地Ｔ（移行）中に移動させた。ＩＴＴＳＰＰ／Ｂ２７はそれ自体が、２％Ｂ２７補充物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する１体積のＤＭＥＭ／Ｆ１２と、２５μｇ／ｍｌヒトインスリン（ＡｃｔＲａｐｉｄ、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、５０μｇ／ｍｌヒトアポ−トランスフェリン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）、６．３ｎｇ／ｍｌプロゲステロン、１０μｇ／ｍｌプトレシン、５０ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム及び４０ｎｇ／ｍｌトリヨードチロニン（Ｔ３）（全て、Ｓｉｇｍａ製）を含有する１体積のＤＭＥＭ／Ｆ１２との、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを伴う混合物である。培地Ｔに、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒ−ヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び４ｎｇ／ｍｌ  ｒ−ヒトｂＦＧＦを補充した。１日が経過したら、非接着性のｈＥＳ細胞のコロニー及び凝集体の大部分を、６ｃｍの細菌用（非接着性）プレートに移動させ、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒ−ヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び２ｎｇ／ｍｌ  ｒ−ヒトｂＦＧＦを補充したＴ培地中で生育した。
【０１４９】
ステップ２：全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）処理：培地を、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ及び１０ｍＭ  ＡＴＲＡを添加したＩＴＴＳＰＰ／Ｂ２７に切り換えた。培地を、７日間毎日交換した。
【０１５０】
ステップ３：懸濁培養：神経球（ＮＳ）の円熟を可能にする、このステップの間に、培養を、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦを有するＩＴＴＳＰＰ／Ｂ２７培地中で１８日間継続した。培地を、２日に１回交換した。
【０１５１】
神経幹細胞の増殖及び分化
ステップ４：マトリゲルへの接着１：球体／クラスターを、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で１：３０に希釈したＢＤ製マトリゲル（増殖因子を低下させたマトリゲル、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により室温（ＲＴ）で１．５時間コートしてある６ウエル組織培養プレートに移動させた。培地は、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦを有するＩＴＴＳＰＰ／Ｂ２７であり、１日後に、あらゆる非接着性の凝集体を廃棄した。培地を、７〜９日間２日に１回交換した。
【０１５２】
ステップ５：マトリゲルへの接着２：線維芽細胞及び上皮細胞を含有しない神経球／クラスターを選択し、新しいマトリゲルプレート上に拾った。神経球（１０個以下のＮＳ）を、（Ｃａ＋及びＭｇ２＋を含有しない）ＰＢＳ中の０．０２５％トリプシン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、３７℃で２〜３分かけて脱離させ、部分的に解離させた（継代１）。トリプシンを、ＩＴＴＳＰＰ／Ｂ２７中の１体積のトリプシン阻害剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び４体積の２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡにより中和した。細胞を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製遠心分離機中、１２００ｒｐｍで５分間スピンした。解離した小さなクラスターを、マトリゲルコートプレート（１：１〜１：３の比）上の２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦを有するＩＴＴＳＰＰ／Ｂ２７（ステップ４）中に再播種した。２〜３週間後に、細胞を、上記に従って、トリプシン処理により解離し（継代２）、結果として得られたｈＥＳ−ＮＳ細胞を、ポリ−Ｄ−リシン（ＰＤＬ、１００μｇ／ｍｌ）及びマウスラミニン（２０μｇ／ｍｌ）、又はＰＤＬ（２０μｇ／ｍｌ）及びフィブロネクチン５μｇ／ｍｌでコートしたプレート上の２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦを有するＩＴＴＳＰＰ／Ｂ２７中に播種し、１日置いた。新たに播種する度に、１μｇ／ｍｌマウスラミニン（Ｓｉｇｍａ）を、培地に添加した。
【０１５３】
ステップ６及び７：ポリ−Ｄ−リシン上での拡大増殖：１日後に、培地を、０．５％（ｖ／ｖ）Ｎ２補充物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％（ｖ／ｖ）Ｂ２７補充物質を有するＤＭＥＭ／Ｆ１２からなるＮ２／Ｂ２７培地に交換した。増殖因子のＥＧＦ及びｂＦＧＦをそれぞれ、１０ｎｇ／ｍｌで添加した。７〜１４日後に、細胞を、ＰＤＬプレートから、トリプシン処理により分割して（１：２又は１：３、継代２（Ｐ２））、単層を得た。１週後に、細胞を、トリプシンを用いて収集し、０．５×１０６個の細胞のアンプルとして凍結した（Ｐ３）。指定があれば、さらなる継代を、週１回実施した。
【０１５４】
ステップ８：ＧＦの除去：異なる継代時に、最終の分化を、増殖因子を除去することによって開始した。増殖因子を除去する場合は常に、１μｇ／ｍｌマウスラミニン、５０ｎｇ／ｍｌノギン及び５０μｇ／ｍｌビタミンＣを、Ｎ２／Ｂ２７培地に添加した。細胞を、増殖因子のｂＦＧＦ及びＥＧＦを補充したＮ２／Ｂ２７培地中に解凍した。分割し、９６ウエルプレート中に播種する１日前に、増殖因子を除去した。
【０１５５】
分化アッセイ：ノギンの用量応答
５０００個のｈＥＳ−ＯＰＣを、マトリゲル及びＰＤＬでコートした９６ウエル黒色透明プレート（ＣＩ−３６０３、Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウエル中に播種した。実験のために使用する培地は、０．５％（ｖ／ｖ）Ｎ２補充物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％（ｖ／ｖ）Ｂ２７補充物質、Ｇｌｕｔａｍａｘ、並びに１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ＩＬ）を有するＤＭＥＭ／Ｆ１２を含んだ。播種する２４時間前に、細胞から、増殖因子を除いた。播種の１２時間後に、ノギン（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ、イスラエル）を、用量を増加させて、培地に補充して、１０日間分化させた。ノギンの用量は、０．１％ＤＭＳＯ及び５０μｇ／ｍｌビタミンＣの存在下において３．１６倍（１０の平方根）に希釈して、１５ｎＭ〜０．０１５ｎＭ（４５０ｎｇ／ｍｌ〜０．４５ｎｇ／ｍｌ）の間の範囲に及んだ。０．１％ＤＭＳＯ及び５０μｇ／ｍｌビタミンＣの存在下においてノギンを有さない試料を、陰性の対照として用いた。培地を、培地の２／３を補給することによって２日に１回交換した。第１０日に、ウエルを、さらなるＯ４染色及びＤＡＰＩ染色のために、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を使用して固定した。
【０１５６】
ＤＲＧニューロンとｈＥＳ−ＯＰＣとの同時培養
マウスＤＲＧニューロンの精製：マウス胎生１３日（Ｅ１３）から得られたＤＲＧ解離細胞を、マトリゲル及びＰＤＬでコートした１２ウエルプレート上に播種する（３０，０００個の細胞／ウエル）か、又は９６ウエル黒色透明プレート（ＣＩ−３６０３、Ｇｅｔｔｅｒ）上に播種し（７０００個の細胞／ウエル）、ＮＢ培地中で２週間生育してから、ｈＥＳ−ＯＰＣを添加した。ＮＢ培地は、Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）及び５０ｎｇ／ｍｌ  ＮＧＦ（Ａｌｏｍｏｎｅ  ｌａｂｓ）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｇｉｂｃｏ）からなる。ＤＲＧ培養の第１週において、細胞を、１０μＭウリジン／１０μＭ５’−フルオロ２’−デオキシウリジン（Ｓｉｇｍａ）を含有するＮＢ培地を用いて２回（各２日）処理して、線維芽細胞及びシュワン細胞を排除した。
【０１５７】
ｈＥＳ−ＯＰＣとの同時培養：２週間のＤＲＧニューロンの培養の後に、ＧＦの非存在下で３日間生育した５０，０００個（１２ウエルプレート上）又は１０，０００個（９６ウエルプレート上）のｈＥＳ由来ＯＰＣを、ＤＲＧニューロン上に播種した。同時培養を、５０μｇ／ｍｌ  ＶｉｔＣを補充したＮＢ／Ｎ２Ｂ２７培地（１ｖ／１ｖ）中で実施し、ＮＧＦは、ｈＥＳ−ＯＰＣを添加する２日前に、ＤＲＧニューロンを培養する培地から抜いた。分化及びミエリン形成を評価するために、異なる時点で、同時培養物を固定し、ＲＮＡ抽出及び免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）を実施した。
【０１５８】
ミエリン形成アッセイ−ガンマセクレターゼ阻害剤Ｘの用量応答：増殖因子（ＥＧＦ及びｂＦＧＦ）を除いてから１日が経過したｈＥＳ−ＯＰＣを、ＤＲＧニューロンの上部に播種した。播種の１２時間後に、ガンマセクレターゼ阻害剤Ｘ（ＧＳＩ−Ｘ、ＭＢＳ５６５７７１、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、用量を増加させて、培地に補充して、２１日間分化させた。ＧＳＩ−Ｘの用量は、０．１％ＤＭＳＯ及び５０μｇ／ｍｌビタミンＣの存在下において３．１６倍（１０の平方根）して、１ｎＭ〜１μＭの間の範囲に及んだ。０．１％ＤＭＳＯ及び５０μｇ／ｍｌビタミンＣを有し、ＧＳＩを有さないウエルを、対照として用いた。培地を、培地の２／３を補給することによって２日に１回交換した。第２１日に、ウエルを、さらなるＭＢＰ染色、ニューロフィラメント−１６０ｋｄ染色及びＤａｐｉ染色のために、４％ＰＦＡを使用して固定した（下記に詳述する）。
【０１５９】
遺伝子発現解析
ＲＮＡ及び遺伝子の発現解析：全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離し、ｃＤＮＡを、逆転写酵素のＲＴ  Ｍ−ＭＬＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ）又はＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて転写した。ＰＣＲ反応を、Ｓｕｐｅｒ  Ｔｈｅｒｍ  Ｔａｑポリメラーゼを用いて実施した。指定の遺伝子のそれぞれについての、プライマーのオリゴデオキシヌクレオチド配列を、本明細書下記の表１に示す。ＰＣＲ条件は、以下に従った：増幅：９４℃、２分、次いで、９４℃、３０秒で３０サイクル（ただし、ＧＡＰＤＨについては、２２サイクル）；５２〜５８℃、３０秒；７２℃、１分。増幅されたＤＮＡバンドを、ＵＶ光下で撮影し、スキャンし、それらの強度を、ＡｌｐｈａＥａｓｅスポット密度ソフトウエアを使用して定量化した。ゲル上に充填するＰＣＲ反応物の量を変化させることによって、バンド強度が直線の範囲内にあることを検証した。
【０１６０】
【表１】
2014528706.tif 000002
【０１６１】
マイクロアレイ：全ＲＮＡを、ＲＮｎｅａｓｙマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して抽出した。全ＲＮＡの質を、ＲＮＡ６０００Ｎａｎｏ  ＬａｂＣｈｉｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ、米国）並びにＢｉｏ−ａｎａｌｙｚｅｒマイクロチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ、及び米国）を使用して評価した。ＲＮＡ抽出物の２つの独立した生物学的複製物を、各実験条件について使用して、ハイブリダイゼーションのために、ｃＤＮＡ及びビオチン標識ｃＲＮＡを調製した。ＤＮＡマイクロアレイ解析を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ製のヒト遺伝子１．０ＳＴアレイを用いて、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの標準的なプロトコール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に従って実施した。誘導倍率解析を、Ｃｒｏｗｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅにおいて、ＭＡＳ５統計学的アルゴリズムを用いて実施した。
【０１６２】
免疫染色：細胞を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を使用して固定し、ＰＢＳを用いて洗浄し、染色するまで４℃に保った。非特異的な染色を、正常ヤギ血清（ＰＢＳ中の５％ｗ／ｖ）を用いてＲＴで３０分間ブロックした。１％ヤギ血清中で希釈した一次のマウスモノクローナル（ｍＭｃ）抗体及びウサギポリクローナル抗体を、本明細書下記の表２に記載する。続いて、全てを、核蛍光染料のＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ、０．０５μｇ／ｍｌ）により染色した。全てのカバーガラスを、Ｍｏｗｉｏｌ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中にマウントした。ＤＶＣ−１３１０Ｃデジタルカメラ（ＤＶＣ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７０ＦＬＡ顕微鏡を使用し、画像を、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて処理し、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ−Ｐｌｕｓソフトウエア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）を用いて解析して、色に特異的なピクセルの積分光学濃度（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｏｐｔｉｃ  Ｄｅｎｓｉｔｙ）（ＩＯＤ）及びＭＢＰ陽性線維の長さを測定した。ＨＳＣ  Ｓｃａｎ−Ａｒｒａｙ  ＶＴＩ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ、Ｔｈｅｒｍｏ−ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して、スキャンし、Ｏ４陽性細胞の画像を、神経プロファイリングモジュールを使用することによって処理した。両側スチューデントｔ検定及び分散分析による統計学的解析は、Ｉｎｓｔａｔ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）又はＪＭＰ５．０ソフトウエア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いた。
【０１６３】
【表２】
2014528706.tif 000003
【０１６４】
Ｏ４マイクロビーズを用いる磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）：１０７個のｈＯＰＣを、コンジュゲート抗Ｏ４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、１３０−０９４−５４３、１０μｌ）と共に、製造元のプロトコールに従って、４℃で１５分間インキュベートした。細胞を、２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＰＨ７．２及び０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加することによって洗浄し、３００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を完全に吸引し、最高１０７個の細胞を、５００μｌの緩衝液中に再懸濁させた。
【０１６５】
磁気分離を、ＭＳカラム及びｍｉｎｉＭＡＣＳ分離器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、製造元のプロトコールに従って実施した。
【０１６６】
ＣＤ１４０ａ＋を用いる磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）：１０７個のｈＯＰＣを、ヒト抗アルファＰＤＧＦＲ−ＰＥ−１００Ｔ（ＢＤ、ＰＭＧ５５６００２、１０μｌ）と共に、製造元のプロトコールに従って、４℃で１５分間インキュベートした。細胞を、２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＰＨ７．２及び０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加することによって洗浄し、３００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を完全に吸引し、最高１０７個の細胞を、８０μｌの緩衝液中に再懸濁させた。
【０１６７】
抗ＰＥマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、１３０−０４８−８０１、２０μｌ）を、１０７個の細胞に添加し、４℃で１５分間インキュベートした。細胞を、２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＰＨ７．２及び０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加することによって洗浄し、３００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を完全に吸引し、最高１０８個の細胞を、５００μｌの緩衝液中に再懸濁させた。
【０１６８】
磁気分離を、ＬＳカラム及びｍｉｎｉＭＡＣＳ分離器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、製造元のプロトコールに従って実施した。
【０１６９】
選別前の細胞、選別した細胞及び陰性の細胞集団のＦＡＣＳ解析：選別前の細胞、選別した細胞及び陰性の細胞集団の１×１０５個（１００μｌ）を、ＦＡＣＳ解析のために、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に移動させた。各試料（１０〜２０μｌ）について、一次抗体（抗Ｏ４−ＡＰＣ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、１３０−０９５−８９１）を添加し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ用緩衝液（０．２〜２％のＢＳＡ又はＨＳＡを有するＣａ２＋及びＭｇ２＋を含有しないＰＢＳ）を添加することによって洗浄して、細胞懸濁液を１．３ｍｌとした。細胞を、１６８０ＲＰＭ（３００ｇ）、４℃で５分間遠心分離し、２００μｌのＦＡＣＳ用緩衝液中に再懸濁させ、ＦＡＣＳ用チューブにそれらのメッシュを通過させて入れ、フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）上で、製造元のプロトコールに従って解析した。
【０１７０】
（例１）
ミエリン形成アッセイにおいて使用する細胞の生成及び特徴付け
神経の球体を、ＥＧＦを有する懸濁液中で発生させ、生育する段階的なプロトコールにより、ヒトＥＳ細胞を分化させた。次いで、神経の球体の細胞を、非神経組織から、マトリゲル細胞外マトリックスに付着させ、ＥＧＦを用いて増殖することによって分離した。オリゴデンドロサイトの機能に対する薬物の作用を検討するためには、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ又はｉｎ−ｖｉｖｏにおいて単純な手順により分化させることができるヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞の十分に特徴付けられたプールを使用することが重要である。トリプシンを用いて解離させた神経の球体の細胞を、ポリＤ−リシンでコートしたプレート上で、増殖因子のＥＧＦ及びｂＦＧＦの存在下において２〜３回継代して増殖すると、さらなる分化の研究に利用可能な神経幹細胞（ＮＳＣ）系が得られる。それぞれの系が、神経の球体のプールの解離から得られる。
【０１７１】
ｉｎ−ｖｉｔｒｏ及びｉｎ−ｖｉｖｏにおいて、ＣＮＳ  ＯＬが、ＮＳＣから、図１Ａ〜Ｄに要約するように、一連の形態学的なステップを通って発生し、こうした発生は、特定のマーカーの発現に対応する。ＮＳＣのプールにおいて、増殖因子を取り払うと、ヒトＥＳ細胞から得られるＯＰＣは、異なる段階を通って進行する（図１Ｅ−Ｉ）。増殖因子を用いて処理した、ＥＳに由来する細胞は、中間径フィラメントであるネスチンを発現する、薄い双極性の神経前駆体を含有し、ネスチンにより、げっ歯類及びヒトのＮＳＣが特徴付けられる（図１Ａ及び１Ｅ）。これらの細胞は、オリゴデンドロサイト系列及び運動ニューロン前駆体を特徴付ける、転写因子のｏｌｉｇ１及びｏｌｉｇ２をすでに発現している（図１Ｉ）。増殖因子を除去すると、細胞は、それらの表面に特異的なスルファチドを獲得し、このスルファチドは、Ｏ４モノクローナル抗体により認識される。分化の開始の３日後には、Ｏ４陽性細胞は、非常に少数の突起しか有さない（図１Ｂ及び１Ｆ）。同じ細胞において、ミエリン形成のプロセスを正に制御する転写因子であるＳＯＸ１０のｍＲＮＡが検出され、ミエリンの構成成分であるプロテオリピドタンパク質ＰＬＰのｍＲＮＡも検出された（図１Ｉ）。後に、増殖因子を取り払ってからおよそ１０〜１１日が経過すると、細胞は、より厚い、細胞質の突起を有し、軸索の周囲のミエリン鞘の堅固な包みに関与する、ミエリン塩基性タンパク質であるＭＢＰを発現する（図１Ｄ、１Ｈ及び１Ｉ）。
【０１７２】
２つのＮＳＣ系を、ヒトｃＤＮＡマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）上における遺伝子発現レベルの解析によって、より十分に特徴付けた。ｃＤＮＡを、増殖因子の存在下又は非存在下で３日間生育したＮＳＣの二つ組の試料から得た。細胞中に発現した遺伝子を、相互に重複しない遺伝子のセットと比較し、ニューロン、アストロサイト及びオリゴデンドロサイトを特徴付けた。結果から、増殖因子の存在下において増殖したＮＳＣ（左のレーン）は、アストロサイト又はオリゴデンドロサイトのいずれかを特徴付ける２７個の遺伝子のうち４〜５個のみを発現するに過ぎないことが示されている。増殖因子を除去した後では、細胞は、分化し、アストロサイト又はオリゴデンドロサイトを特徴付ける２７個の遺伝子のうち２４個を発現する（図２）。対照的に、ニューロン細胞に特異的な遺伝子は、ｈＥＳに由来する細胞を、未分化の状態及び分化した状態のいずれにも隔離せず（図２）、このことは、本明細書において使用する、継代６時におけるＮＳＣ系は、ニューロン細胞前駆体ではなく、グリア前駆体を含有することを示している。
【０１７３】
（例２）
ＮＳＣの多分岐ＯＬへの分化：ノギンの作用の定量化
ＢＭＰシグナル伝達は、オリゴデンドロサイト系列の発生を負に制御し、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤であるノギンが、ＥＳ由来オリゴデンドロサイトの分化を促すことを示すに至った。オリゴデンドロサイトの分化に対する薬物の作用を定量化することができることの概念実証として、本発明者らは、分化を促すために使用されるべきノギンの最適濃度について探索した。５回継代時のＮＳＣを、９６ウエル皿のウエルに分配し、ノギンの非存在下、又は１：３．１６に段階希釈して、１５０ｎｇ／ｍｌ〜０．５ｎｇ／ｍｌ（４．７×１０−９〜１．５×１０−１１Ｍ）に変化させた濃度のノギンの存在下で、三つ組のアッセイにおいて分化させた。増殖因子なしで１０日が経過したら、細胞を、Ｏ４モノクローナル抗体を用いて染色し、核を、ＤＡＰＩを用いて対比染色した。増殖因子を除去してから、ノギンを添加すると、より長い、複数の突起を有するＯＬの出現が刺激され、それに対して、ノギンの非存在下では、双極性のＯ４陽性細胞が出現する（図３Ａ〜Ｃ）。高スループット顕微鏡法に続き、同じ装置（Ａｒｒａｙ−ｓｃａｎ  ＶＴＩ  ＨＳＣ、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）に付随するニューロン細胞プロファイリングのｂｉｏ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎを用いて解析を行った。図３Ｄ〜Ｅは、ＯＬの形態学的状態の異なるパラメータの定量化の例を示す。ＤＡＰＩを用いる核ＤＮＡ染色を使用して、１視野当たりの細胞数を定量化し、オリゴデンドロサイトを、Ｏ４を用いる染色により特徴付けた。小さく、濃密な、ＤＡＰＩで染色された顆粒（核断片又はアポトーシス細胞を示す。図３Ｄ〜Ｅの赤色の円）を退け、ＤＡＰＩを伴わないＯ４陽性染色細胞も退けた。同様に、Ｏ４陽性突起（緑色）も、Ｏ４細胞体につながる場合にのみ、数え、測定した。１つの突起が２つになる場所を、分枝点として数えた（図３Ｄ〜Ｅ、黄色の円）。Ｏ４陽性細胞体１つ当たりの突起の数、それらの長さ及び分枝点の数を数えた。図３Ｄ〜Ｅは、このアプリケーションを用いて得たＯ４陽性細胞の形態学的状態の具体例及び対応する測定を示す。細胞１つ当たりの突起数、１ウエル当たりの突起の全長、及び細胞１つ当たりの分枝点の数が、ノギンの濃度と相関することが見出された。したがって、提示するアッセイは、ノギンの作用を定量化することが可能であると結論付けることができる。ＥＣ５０曲線を、上記のパラメータを統合することによって生成し、１．５７＊１０−１０Ｍのノギンにより、最大の作用の５０％がもたらされることを見出した（図３Ｆ）。しかし、１ウエル当たりのＯ４陽性細胞の数は、ノギンにより処理しても変化しなかった。この結果から、ｈＥＳ由来のＯＰＣをｉｎ−ｖｉｔｒｏにおいて使用して、ＯＬの分化を調整する薬物又は化学物質についてスクリーニングすることができることが示されている。
【０１７４】
（例３）
ｈＥＳ由来ＯＰＣとマウス後根神経節ニューロンとの同時培養
ＣＮＳにおけるミエリン形成の反応機構の態様に取り組むために、精製ニューロンとオリゴデンドロサイトとの同時培養の系を使用した。
【０１７５】
ｈＥＳ由来ＯＰＣを、成熟オリゴデンドロサイトに分化させることができることから、本発明者らは、これらの細胞が、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ又はｉｎ−ｖｉｖｏにおいて、ニューロンのミエリンを形成することができるかどうかを調べた。
【０１７６】
ミエリン形成の標的として、マウス胚の後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンを使用した。ＤＲＧニューロンを、マウス胎生１３日（Ｅ１３）から得、マトリゲル及びＰＤＬでコートしたプレート上に播種した。ニューロンを、ＮＧＦの存在下において２週間培養し、第１週の間に、ＦｕＤＲで２回処理して、培養物からシュワン細胞を排除した。ニューロン、ｈＯＰＣ及び両方の同時培養物の写真を、図４Ｅ〜Ｈに示し、それらを、図４Ａ〜Ｄに図式化する。２週間後に、ニューロフィラメント陽性のニューロンの軸索のネットワークが形成された（図４Ｅ）が、ＭＢＰ陽性細胞は、ＤＲＧニューロンの培養物上にも培養物中のＤＲＧニューロン間にも観察されなかった。Ｏ４陽性ｈＯＰＣからＧＦを除いた３日後に、これを軸索のネットワークの上部に播種した。
【０１７７】
図４Ａ〜Ｄは、異なるタイプの培養物を示し、一方、免疫染色後の細胞を、図４Ｅ〜Ｈに示す：ＤＲＧニューロンのみ、増殖因子を除去した３日後のＮＳＣ、及び２４時間又は１８日間の同時培養物。ＯＰＣは、ニューロンと接触させた直後に、分枝した形態学的状態を獲得するが、１８日間接触させると、成熟ＯＬが、ＭＢＰを発現し、軸索を包んで、ミエリン線維を形成する。新たに形成されたミエリン形成性鞘のインターノードにおいて、ノードに隣接することが公知のタンパク質、例として、コンタクチン関連タンパク質、Ｃａｓｐｒ１（コンタクチン関連タンパク質１）が可視化された。図４Ｈの挿入図では、Ｃａｓｐｒ陽性染色（緑色）が、ミエリン線維の端部に観察された（矢印）。このことから、ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおけるミエリン形成により、ミエリンのインターノード及びパラノードの構造が再生されることが示唆されており、これは、パラノードにおけるＣａｓｐｒの凝縮は、軸索に沿う迅速な電流の伝導に必要なランビエ絞輪の機能性の構成を示すからである。
【０１７８】
（例４）
ＭＢＰ陽性細胞の形成に対するガンマセクレターゼ阻害剤Ｘの作用に関する用量応答研究
オリゴデンドロサイトの分化に対するこの阻害剤の作用を決定するために、同時培養による実験を三つ組で行い、培養物を、別のガンマセクレターゼ阻害剤（ガンマセクレターゼ阻害剤Ｘ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の段階希釈物を用いて処理した。
【０１７９】
２１日後に、ニューロンを、抗ニューロフィラメントＡｂを用いて染色し（図５Ａ及びＢ、緑色）、オリゴデンドロサイトを、抗ＭＢＰ抗体を用いて染色した（図５Ａ及びＢ、赤色）。細胞選択装置ＡＶＩＳＯに連結したＯｌｙｍｐｕｓ顕微鏡を用いて記録した自動写真の並置から、阻害剤により、ＭＢＰ染色が増加することが示されている（図５Ａ及びＢ）。積分し、正規化した面積の値、積分光学濃度（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）（ＩＯＤ）及びＭＢＰ陽性染色の数の解析を使用して、用量応答曲線を生成した（図５Ｃ）。ガンマセクレターゼ阻害剤の用量の対数が、典型的な用量応答曲線を示し、作用の最大半量（ＥＣ５０）は、２．２５×１０−８Ｍの濃度である。図５Ｄ〜Ｅは、ＭＢＰシグナルの自動認識（図５Ｄ：認識前及び図５Ｅ：認識後）を示し、ニューロフィラメントとＭＢＰ線維との重複画像の解析も示す（図５Ｆ）。
【０１８０】
（例５）
ＭＡＣＳ選別による、Ｏ４陽性ｈＥＳＣ由来ＯＰＣの濃縮
ｈＥＳ−ＯＰＣ培養物中のＯＰＣ及び未熟オリゴデンドロサイトの集団の収率を改善するために、細胞を、Ｏ４マイクロビーズ抗体を用いて選別した。選別を、増殖因子（ｂＦＧＦ及びＥＧＦ）を除き、ノギンを補充したｈＯＰＣに対して実施した。次いで、Ｏ４の発現を、ＩＨＣ技法及びＦＡＣＳ技法により検出した。図７Ａ〜Ｃは、Ｏ４＋細胞、Ｏ４＋とＡ２Ｂ５＋との二重陽性細胞、及びＡ２Ｂ５＋細胞のレベルを、３つの細胞条件、すなわち、選別する前の細胞（選別前の細胞）、Ｏ４により選別した細胞、及び陰性細胞について示す。図７Ａ〜Ｂに示すように、Ｏ４＋細胞のパーセントが、２４％から５６％まで増加した（２．３倍の増加）。Ｏ４により選別するその他の実験では、Ｏ４＋細胞集団が、９０％まで濃縮された（未表示）。確立した濃縮を、細胞を播種した４８時間後に、Ｏ４抗体を用いる染色によりさらに示した（図７Ｄ〜Ｅ）。％Ｏ４＋細胞の画像解析（図７Ｆ、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓを使用することによって実施した）と、ＦＡＣＳ解析（図７Ａ〜Ｃ、第１の４半分中の緑色の陽性のドット）とを比較することによって認めることができるように、ＦＡＣＳ及び免疫組織化学（Ｏ４染色及びＤＡＰＩ染色）の両方のパーセントが類似する。
【０１８１】
ミエリン形成を、Ｏ４により選別することによって改善することができるかどうかを試験するために、ｈＥＳＣ−ＯＰＣのミエリン形成能力を、Ｏ４により選別する場合と選別しない場合と比較した。図８に示すように、陰性対照の群においては、ＭＢＰ＋細胞は示されなかった（図８Ａ、８Ｄ及び８Ｇ：ＤＲＧのみ）。ｈＥＳＣ−ＯＰＣ細胞をＤＲＧに添加した場合、９日間の同時培養の後に、ＭＢＰ＋細胞が、ミエリン線維をほとんど有さないＤＲＧの軸索間に分布することを見出すことができる（図８Ｂ、８Ｅ及び８Ｈ）。しかし、Ｏ４により選別したｈＥＳＣ−ＯＰＣを、ＤＲＧニューロンの軸索と同時培養した場合には、ＭＢＰ＋細胞の数及びミエリン形成の増加が見出された（図８Ｃ、８Ｆ及び８Ｉ）。Ｏ４により選別した同時培養物において、％ＭＢＰ＋、及びミエリン線維の数（ＮＦ染色とＭＢＰ染色との間で重複する領域の数）の３〜４倍の増加が（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓを使用して）測定された（図９Ａ〜Ｂ）。
【０１８２】
（例６）
ＭＡＣＳ選別による、ＣＤ１４０ａ（ＰＤＧＦＲＡ）陽性ｈＥＳＣに由来するＯＰＣの濃縮
ｈＥＳ−ＯＰＣ培養物中のＯＰＣ前駆体集団の収率を改善するために、細胞を、オリゴデンドロサイト前駆体の早期のマーカーであるＣＤ１４０ａ（ＰＤＧＦＲａ）を用いて選別した。この選別を、増殖因子（ｂＦＧＦ及びＥＧＦ）を除き、ノギンを補充したｈＯＰＣに対して実施した。次いで、ＣＤ１４０ａの発現を、ＩＨＣ技法及びＦＡＣＳ技法により検出した。図１０Ａ〜Ｈは、各細胞集団、すなわち、選別する前の細胞（選別前の細胞）、ＣＤ１４０ａ＋により選別した細胞、及びＣＤ１４０ａ−細胞中のＣＤ１４０＋細胞のレベルを示す。図１０Ａ〜Ｂに示すように、ＣＤ１４０ａ＋細胞のパーセントが、２４．８％から５９．６％まで増加した（２．４倍の増加）。ＣＤ１４０ａ＋により選別した培養物のうちのほとんど（７０％超）が、ＣＤ１４０ａ陽性であったが、選別前の培養物と比較した場合、Ｏ４＋細胞の数は減少した（図１０Ｄ〜Ｅ）。このことから、増殖及び遊走の可能性を有する早期のＯＰＣ前駆体細胞を、ＣＤ１４０ａ抗体により選別することができることが実証されている。次に、これらの早期の前駆体を、成熟オリゴデンドロサイトに分化させることができることを、９日間の培養の後に、細胞を、Ｏ４抗体を用いて染色することによって実証した。図１０Ｈは、選別する前の画分と比べた、ＣＤ１４０ａ＋により選別した細胞中のＯ４陽性細胞のパーセントの増加を示す。ＣＤ１４０ａ＋集団からＯ４＋細胞集団を枯渇させた結果、早期のＯＰＣ亜集団のより高い濃縮が生じた（未表示）。
【０１８３】
次に、ＣＤ１４０ａ＋による選別により、細胞が、ミエリン形成性のＭＢＰ＋細胞になる可能性が改善されるかどうかを試験した。ｈＥＳＣ−ＯＰＣのミエリン形成能力を、ＣＤ１４０により選別する場合と選別しない場合との間で比較した。その目的で、選別する前の細胞又はＣＤ１４０ａ＋により選別した細胞を、ＤＲＧニューロンの軸索と同時培養した。図１１Ａ〜Ｄは、選別前の同時培養物中には、非常に少数のＭＢＰ＋細胞しか示されなかった（図１１Ａ〜Ｂ）が、より多くのＭＢＰ＋細胞が、ＣＤ１４０ａ＋細胞から発生した（図１１Ｃ〜Ｄ）ことを示す。図１１Ｄに示すように、ＣＤ１４０ａにより選別した集団において、ミエリン線維（ＮＦとＭＢＰとの間で重複する領域）の数が増加した。９日以内に、ＣＤ１４０ａ＋同時培養物中に、選別前の同時培養物に比べて４倍のＭＢＰ＋細胞の数を測定した（図１１Ｅ）。
【０１８４】
（例７）
ヒトオリゴデンドロサイト及びｈＥＳＣ−ＯＰＣの生存アッセイ
培養物中のヒトオリゴデンドロサイト又はその前駆細胞の生存を評価するために、特異的な死細胞の標識化（哺乳動物細胞のためのＬｉｖｅ／ｄｅａｄ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、分子プローブ、Ｌ３２２３）を使用した。分化したオリゴデンドロサイトの培養物及びオリゴデンドロサイト前駆体の培養物をそれぞれ、Ｏ４＋又はＣＤ１４０＋によるＭＡＣＳ選別によって選別して得た。組換えヒトＩＦＮ−Ｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｉｏｔｅｓｔ、２８５−ＩＦ−１００）の作用を、オリゴデンドロサイトの生存に関して試験した。１４日間の培養の後に、細胞を、死細胞の標識化（エチジウムヘテロ二量体１：赤色標識）及びＯ４の標識化（緑色）を用いて標識した。ＩＦＮ−Ｙにより、死細胞のパーセントが増加し、分化したオリゴデンドロサイトの数が減少することが見出された（図１２Ａ〜Ｆ）。そのようなアッセイからは、オリゴデンドロサイトの生存に対する試験化合物の作用に関する補完的な結果が得られる。
【０１８５】
本発明を、その特定の実施形態と共に記載してきたが、多くの代替形態、改変形態及び変更形態が当業者に明らかになるであろうことは明らかである。したがって、全てのそのような代替形態、改変形態及び変更形態を包含し、それらは、添付の特許請求の精神及び広い範囲に属することが意図される。
【０１８６】
本明細書において言及する刊行物、特許及び特許出願は全て、本明細書では、それらの全体が、それぞれの個々の刊行物、特許又は特許出願が参照により本明細書に組み込まれていることを具体的且つ個々に示すのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれている。さらに、本出願中のいずれの参考文献も、その引用又は特定により、そのような参考文献が、本発明の先行技術として利用可能であることを認めていると解釈してはならない。セクションの見出しの使用に及んでは、それらが、必然的な限定であると解釈してはならない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図２】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｆ】
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【図１０Ｈ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【配列表】
2014528706000001.app
【国際調査報告】
2014528706.tif 000071
2014528706.tif 000072
2014528706.tif 000073