(57)【要約】本発明は、電極の改変に有用な１，３−二置換フェロセンの新規構成物に関する。式（Ｉ）。【化１】2014532720.tif 000056【選択図】なし
2014532720.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式のフェロセン化合物
【化１】
2014532720.tif 000051
（式中、
Ｒ１は、水素、−Ｓ−Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、−Ｓ−Ｃ２〜Ｃ２０アルケニルまたは−Ｓ−Ｃ２〜Ｃ２０アルキニルであり、
Ｘは、−Ｃ１〜Ｃ２０アルキル−、−Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル−、−Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル−、−Ｘ１−ＣＯＮＨ−、−Ｘ１−ＣＯ２−または−Ｘ１−ＯＣＮＨ−であり、ここでＸ１は、ポリオキシアルキレン、ポリメチレン、オリゴフェニレンおよびポリフェニレン（エチニレン）からなる群から選択され、
Ｒ２は、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、および
Ｒ３は、−ＮＲ４Ｒ５、−ＣＯ２Ｒ５、−ＣＯＮＲ４Ｒ５または−ＮＲ５ＣＯ２−Ｒ６であり、
ここでＲ４は、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ここでＲ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、アリール（Ｃ２〜Ｃ６アルケニル）、ヘテロアリール（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）またはヘテロアリール（Ｃ２〜Ｃ６アルケニル）であり、ここで、それぞれは、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ３、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、アミノ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、ジＣ１〜Ｃ６アルキルアミノ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯ２（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）２または過酸化物感受性部分から選択される１〜４個の置換基で任意選択で置換されており、および
ここでＲ６は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、アリール（Ｃ２〜Ｃ６アルケニル）、ヘテロアリール（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）またはヘテロアリール（Ｃ２〜Ｃ６アルケニル）であり、ここで、それぞれは、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ３、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、アミノ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、ジＣ１〜Ｃ６アルキルアミノ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯ２（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）２または過酸化物感受性部分から選択される１〜４個の置換基で任意選択で置換されている）。
【請求項２】
Ｒ１が、水素または−Ｓ−Ｃ１〜Ｃ２０アルキルである、請求項１に記載のフェロセン化合物。
【請求項３】
Ｘが、−Ｃ１〜Ｃ２０アルキル−、−Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル−または−Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル−である、請求項１または２のいずれか一項に記載のフェロセン化合物。
【請求項４】
Ｘが、ノニレンである、請求項３に記載のフェロセン化合物。
【請求項５】
Ｘが、−Ｘ１−ＣＯＮＨ−、−Ｘ１−ＣＯ２−または−Ｘ１−ＯＣＮＨ−であり、ここでＸ１は、ポリオキシアルキレン、ポリメチレン、オリゴフェニレンおよびポリフェニレン（エチニレン）からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のフェロセン化合物。
【請求項６】
Ｘが−Ｘ１−ＣＯＮＨ−であり、Ｘ１はポリオキシアルキレンである、請求項５に記載のフェロセン化合物。
【請求項７】
Ｒ３が、−ＮＲ４Ｒ５、−ＣＯ２Ｒ５または−ＣＯＮＲ４Ｒ５である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のフェロセン化合物。
【請求項８】
Ｒ３が、−ＮＨ２、−ＣＯ２（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）または−ＣＯ２Ｈである、請求項７に記載のフェロセン化合物。
【請求項９】
Ｒ３が−ＣＯＮＲ４Ｒ５であり、Ｒ４は水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒ５はＣ１〜Ｃ６アルキル、アリール（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）またはヘテロアリール（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のフェロセン化合物。
【請求項１０】
Ｒ３が−ＮＲ５ＣＯ２−Ｒ６であり、Ｒ５は水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはアリール（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のフェロセン化合物。
【請求項１１】
Ｒ６が、アリール（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）またはＣ２〜Ｃ６アルケニルであり、それぞれは過酸化物感受性部分で任意選択で置換されている、請求項１０に記載のフェロセン化合物。
【請求項１２】
過酸化物感受性部分が、４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルである、請求項１１に記載のフェロセン化合物。
【請求項１３】
過酸化物感受性部分が
【化２】
2014532720.tif 000052
からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のフェロセン化合物。
【請求項１４】
Ｒ３が
【化３】
2014532720.tif 000053
である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のフェロセン化合物。
【請求項１５】
【化４】
2014532720.tif 000054
2014532720.tif 000055
である、請求項１に記載のフェロセン化合物。
【請求項１６】
（ｉ）任意選択の自己組織化単分子層（ＳＡＭ）、および
（ｉｉ）１，３−二置換フェロセンを含む電気活性活性部分（ＥＡＭ）
を含む電極を備える構成物。
【請求項１７】
前記１，３−二置換フェロセンが、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物を含む、請求項１６に記載の構成物。
【請求項１８】
前記１，３−二置換フェロセンが官能基をさらに含む、請求項１６に記載の構成物。
【請求項１９】
官能基が自壊的部分および過酸化物感受性部分を含む、請求項１８に記載の構成物。
【請求項２０】
前記電極が官能基をさらに含む、請求項１６〜１９のいずれかに記載の構成物。
【請求項２１】
前記官能基が捕捉リガンドを含む、請求項１８または２０のいずれかに記載の構成物。
【請求項２２】
前記官能基が、マレイミド、イミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、アルキルハライド、アリールハライド、α−ハロアシルおよびピリジルジスルフィドを含む部分からなる群から選択される、請求項１８または２０のいずれかに記載の構成物。
【請求項２３】
自己組織化単分子層（ＳＡＭ）をさらに含む、請求項１６〜２２のいずれかに記載の構成物。
【請求項２４】
ＳＡＭが非導電性オリゴマーまたは導電性オリゴマーである、請求項２３に記載の構成物。
【請求項２５】
自己組織化単分子層（ＳＡＭ）を含む電極を備えた構成物であって、前記ＳＡＭが次式：
アンカー−スペーサー１−ＥＡＭ−（スペーサー２）ｎ−ＦＧ    （Ｉ）
（式中、前記アンカーは環状ジスルフィド基を含み、
ＥＡＭは１，３−二置換フェロセンであり、
ＦＧは官能基であり、
スペーサー１はＳＡＭ形成種であり、
スペーサー２はリンカーであり、および
ｎ＝０または１である）
を有する化合物を含む構成物。
【請求項２６】
自己組織化単分子層（ＳＡＭ）を含む電極を備えた構成物であって、前記ＳＡＭが次式：
アンカー−スペーサー１−ＥＡＭ−スペーサー２−ＦＧ    （ＩＩ）
（式中、前記アンカーはジスルフィド基を介して前記電極基と結合しており、
ＥＡＭは１，３−二置換フェロセンであり、
ＦＧは官能基であり、
スペーサー１は絶縁性であるかまたは導電性であり、および
スペーサー２は任意選択のリンカーである）
を有する化合物を含む構成物。
【請求項２７】
検査試料中の１つまたは複数の標的分析物を検出する方法であって、
（ａ）捕捉結合リガンドが、存在する場合、検査試料中の標的分析物と特異的に結合して第１の複合体を形成するような条件下で、前記検査試料を捕捉結合リガンドと接触させるステップであって、前記捕捉結合リガンドが第１の固体支持体と結合しているステップと、
（ｂ）存在する場合、前記第１の複合体を可溶性捕捉リガンドと接触させて第２の複合体を形成するステップであって、前記可溶性捕捉リガンドが過酸化物生成系を含むステップと、
（ｃ）過酸化物が生成してアッセイ混合物を形成する条件下で、前記第２の複合体を前記過酸化物生成系のための基質と接触させるステップと、
（ｄ）アッセイ混合物を、（ｉ）電気活性活性部分（ＥＡＭ）の自己組織化単分子層（ＳＡＭ）または（ｉｉ）ＥＡＭおよび任意選択のＳＡＭを含む電極を備えた第２の固体支持体と接触させるステップであって、前記ＥＡＭが１，３−二置換フェロセン、自壊的部分および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含み、第１のＥ０を有しており、前記過酸化物が前記ＰＳＭと反応して前記ＥＡＭから前記ＳＩＭを放出し、第２のＥ０を有する前記ＥＡＭをもたらし、第２のＥ０を有するステップと、
（ｆ）第１のＥ０および第２のＥ０で前記ＥＡＭの電気化学的特性を測定するステップと、
（ｇ）前記電気化学的特性から前記標的分析物を検出するステップと
を含む方法。
【請求項２８】
検査試料中の１つまたは複数の標的分析物を検出する方法であって、
（ａ）検査試料を、過酸化物生成系を含む可溶性捕捉リガンドと接触させて、第１の複合体を形成させるステップと、
（ｂ）捕捉結合リガンドが標的分析物と特異的に結合して第２の複合体を形成するような条件下で、存在する場合、前記第１の複合体を捕捉結合リガンドと接触させるステップであって、前記捕捉結合リガンドが第１の固体支持体と結合しているステップと、
（ｃ）過酸化物が生成してアッセイ混合物を形成する条件下で、前記第２の複合体を前記過酸化物生成系のための基質と接触させるステップと、
（ｄ）アッセイ混合物を、（ｉ）電気活性活性部分（ＥＡＭ）の自己組織化単分子層（ＳＡＭ）または（ｉｉ）ＥＡＭおよび任意選択のＳＡＭを含む電極を備えた第２の固体支持体と接触させるステップであって、前記ＥＡＭが１，３−二置換フェロセン、自壊的部分および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含み、第１のＥ０を有し、前記過酸化物を前記ＰＳＭと反応して前記ＥＡＭから前記ＳＩＭを放出し、第２のＥ０を有する前記ＥＡＭをもたらし、第２のＥ０を有するステップと、
（ｆ）第１のＥ０および第２のＥ０で前記ＥＡＭの電気化学的特性を測定するステップと
（ｇ）前記電気化学的特性から前記標的分析物を検出するステップと
を含む方法。
【請求項２９】
ステップ（ｃ）の前に、第２の複合体を単離するステップをさらに含む、請求項２７または２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
１，３−二置換フェロセンが請求項１〜２０のいずれかに記載の化合物である、請求項２７または２８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的分析物のＥ０の変化を用いる、または２つのユニークな電位Ｅｏ１およびＥｏ２で定量可能な電気化学的信号をもたらすことによる、分析物を検出するための新規構成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
電子移動反応は、光合成または好気的呼吸（aerobic respiration）におよぶ様々な生物学的変換における重要なステップである。化学系と生物系の両方における電子移動反応の研究は、少数のパラメータに関して電子移動の速度を説明する膨大な知見と強力な理論的基礎の進展をもたらした。
【０００３】
タンパク質および他の生物学的分子における電子的トンネル効果は、レドックス中心の電子的相互作用が比較的弱い反応において起こる。半古典的理論反応は、電子移動についての反応速度は、以下の式にしたがって、推進力（−ΔＧ°）、核再構成パラメータ（λ）および遷移状態での反応物と生成物との間の電子的結合強度（ＨＡＢ）：
ｋＥＴ＝（４π３／ｈ２λｋＢＴ）１／２（ＨＡＢ）２ｅｘｐ［（−ΔＧ°＋λ）２／λｋＢＴ］
に依存すると予測している。
【０００４】
上記式の核再構成エネルギーλは、生成物の平衡核配置での反応物のエネルギーと定義される。極性溶媒における電子移動反応のためには、λへの支配的な寄与は、反応物の電荷分布の変化に応答する溶媒分子の再配向から生じる。λの第２の要素は、供与体および受容体の酸化状態の変化に起因する結合の長さおよび角度の変化によってもたらされる。
【０００５】
従来の研究は、新規センサーの基礎として再構成エネルギーλの変化を用いることを記載している。例えば、米国特許第６，０１３，４５９号、同第６，０１３，１７０号、同第６，２４８，２２９号および同第７，２６７，９３９号を参照されたい。これらのすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。これらの方法は一般に、分析物をレドックス活性複合体またはその近傍に結合させることを含む。レドックス活性複合体は、少なくとも１個の電気活性分子および標的分析物と結合する捕捉リガンドを含み、複合体は電極と結合する。分析物が結合すると、レドックス活性分子の再構成エネルギーは変化し、Ｅ０を変化させ検出を可能にする。
【０００６】
本発明の目的は、レドックス活性分子のＥ０の変化に対応する、バイオセンサーの遷移金属とシアノ配位子を使用するなどの、溶媒再構成エネルギーの変化を用いた標的分析物を検出するための構成物および方法を提供することである。
【０００７】
起電力（ＥＭＦ）は、ガルバーニ電池またはボルタ電池の２つの電極間の最大電位差であり、この場合、標準水素電極は、以下の電池については左側にある：
【０００８】
【表１】
2014532720.tif 000003
【０００９】
ＥＭＦは、電池の図式的スキームにおいて右側に配置された電極の電極電位と呼ばれるが、溶液間の液界を無視もしくは計算することができるとき、または液界がまったく存在しない場合にのみそう呼ばれる。
【００１０】
右側の電極の電極電位（酸化−還元電位と呼ばれることが多い）は、ネルンストの式によって与えられる。
【００１１】
【数１】
2014532720.tif 000004
【００１２】
この関係は、
【００１３】
【数２】
2014532720.tif 000005
【００１４】
が
【００１５】
【数３】
2014532720.tif 000006
【００１６】
に等しく設定され、ｐＨおよび
【００１７】
【数４】
2014532720.tif 000007
【００１８】
がゼロに等しいとき、式（２．２１）に従う。電極電位の記号の下付き文字では、酸化還元系の酸化成分および還元成分の記号が示されている。より複雑な反応では、特に、記号Ｅの後に電池の右半分で起こる全反応（「半電池」反応）を書くことが推奨され、今回のケースでは、
【００１９】
【数５】
2014532720.tif 000008
【００２０】
である。
【００２１】
量
【００２２】
【数６】
2014532720.tif 000009
【００２３】
は、標準電極電位と呼ばれる。これは、酸化還元系の成分の酸化能力または還元能力を特徴付ける。より正の標準電極電位で、系の酸化型は、より強い酸化剤であり、還元型は、より弱い還元剤である。同様に、より負の標準電位で、酸化還元系の還元成分は、より強い還元剤であり、酸化型は、より弱い酸化剤である。
【００２４】
標準電極Ｅ０は、ネルンストの式、式（１−２）におけるその標準的な使用法において、
【００２５】
【数７】
2014532720.tif 000010
【００２６】
と記載される。
Ｅ０がレドックス反応の標準電位である場合、Ｒは、一般気体定数（８．３１４ＪＫ−１ｍｏｌ−１）であり、Ｔは、ケルビン温度であり、ｎは、反応内に移される電子の数であり、Ｆは、ファラデー定数（９６，４８７クーロン）である。Ｅ０の負の側で、したがって酸化型は、還元される傾向があり、順反応（すなわち、還元）がより好都合である。電気活性種の酸化状態の変化から生じる電流は、ファラデー電流と呼ばれる。
【００２７】
以前の研究では、２つのユニークな電位、Ｅｏ１およびＥｏ２で定量可能な電気化学的信号をもたらす、遷移金属錯体に付着した官能基の変換を使用することが記載されている。例えば、すべてその全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第２０１１−００３３８６９号、および同第２０１２−０１８１１８６号を参照。この方法は一般に、電極以外の固体支持体上に、機能タグを有し得る結合リガンドのサンドイッチ内の分析物を結合するステップを含む。標的を結合した後、過酸化物生成部分または中間酵素および基質を添加し、それにより過酸化水素が生成する。レドックス活性複合体は、電極に結合され、過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む。酵素系から生成される過酸化物は、ＰＳＭと反応し、自壊的（self-immolative）部分（ＳＩＭ）を除去し、遷移金属錯体に付着した官能基を変換し、２つのユニークな電位、Ｅｏ１およびＥｏ２で定量可能な電気化学的信号をもたらす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２８】
【特許文献１】米国特許第６，０１３，４５９号
【特許文献２】米国特許第６，０１３，１７０号
【特許文献３】米国特許第６，２４８，２２９号
【特許文献４】米国特許第７，２６７，９３９号
【特許文献５】米国特許第２０１１−００３３８６９号
【特許文献６】米国特許第２０１２−０１８１１８６号
【特許文献７】米国特許出願第６１／０８７，０９４号
【特許文献８】米国仮出願第６１／４３４，１２２号
【特許文献９】米国仮出願第６１／５２３，６７９号
【特許文献１０】米国仮出願第６１／２３２，３３９号
【特許文献１１】米国特許公開第１２／８５３，２０４号
【特許文献１２】米国特許出願第１３／６５３９３１号
【特許文献１３】米国特許第６，９４２，７７１号
【特許文献１４】米国特許第７，３１２，０８７号
【特許文献１５】米国特許第６，７４０，５１８号
【特許文献１６】米国特許第７，３１２，０８７号
【特許文献１７】ＷＯ／１９９９／５７３１７
【特許文献１８】米国特許出願公開第２００８０２４８５９２号
【特許文献１９】米国公開第２００９００４１７９１号
【特許文献２０】米国公開第２０１００１４５０３６号
【特許文献２１】米国特許第７，７０５，０４５号
【特許文献２２】米国特許第７，２２３，８３７号
【特許文献２３】米国特許公開第１２／２５３，８２８号
【特許文献２４】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０３６３
【特許文献２５】ＷＯ／１９９８／５７１５９
【特許文献２６】米国特許出願第１２／２５３，８７５号
【特許文献２７】米国仮出願第６１／３３２，５６５号
【特許文献２８】米国仮出願第６１／３４７，１２１号
【特許文献２９】米国仮出願第６１／３６６，０１３号
【特許文献３０】米国特許第７，３８４，７４９号
【特許文献３１】米国特許公開第２００２０００９８１０号
【特許文献３２】米国特許第５，２７０，１６３号
【特許文献３３】米国特許第５，４７５，０９６号
【特許文献３４】米国特許第５，５６７，５８８号
【特許文献３５】米国特許第５，５９５，８７７号
【特許文献３６】米国特許第５，６３７，４５９号
【特許文献３７】米国特許第５，６８３，８６７号
【特許文献３８】米国特許第５，７０５，３３７号
【特許文献３９】ＰＣＴ  ＵＳ９７／２００１４
【特許文献４０】米国特許第７，０１８，５２３号
【特許文献４１】米国特許出願第０９／０９６５９３号
【特許文献４２】米国特許出願第６０／９８０，７３３号
【特許文献４３】「Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」という名称の米国仮出願
【特許文献４４】米国特許第５，６４４，０４８号
【特許文献４５】米国特許第５，３８６，０２３号
【特許文献４６】米国特許第５，６３７，６８４号
【特許文献４７】米国特許第５，６０２，２４０号
【特許文献４８】米国特許第５，２１６，１４１号
【特許文献４９】米国特許第４，４６９，８６３号
【特許文献５０】米国特許第５，２３５，０３３号
【特許文献５１】米国特許第５，０３４，５０６号
【特許文献５２】米国特許第５，６８１，７０２号
【非特許文献】
【００２９】
【非特許文献１】Ｎｅｙｈａｒｔら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ  １１８（１９９６）３７２４〜２９頁
【非特許文献２】Ｇａｒｄｎｅｒら、Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ａ  ５１（１９９５）５７〜６６頁
【非特許文献３】Ｃｈｅｎら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １０：３３３２〜３３３７頁（１９９４）
【非特許文献４】Ｌａｎｈａｒｄら、Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７８：１９５〜２０１頁（１９７７）
【非特許文献５】Ｄｅｉｎｈａｍｍｅｒら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １０：１３０６〜１３１３頁（１９９４）
【非特許文献６】Ｎａｐｉｅｒら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１９９７
【非特許文献７】Ｈ．Ｈｏｌｄｅｎ  Ｔｈｏｒｐｅ、ＣＨＩ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、１９９８年５月４〜５日
【非特許文献８】Ｃｕｒｔｉｓら、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２４：３８５〜３９７頁（１９８５）
【非特許文献９】Ｃａｌｌａｈａｎら、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１４：１４４３〜１４５３頁（１９７５）
【非特許文献１０】Ｌａｖａｌｌｅｅ  ａｎｄ  Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４：２５８３〜２５９９頁（１９７２）
【非特許文献１１】Ｊｗｏら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０１：６１８９〜６１９７頁（１９７９）
【非特許文献１２】Ｌｉら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．４：３６３１〜３６３４頁（２００２）
【非特許文献１３】Ｗｅｉら、Ｊ．Ｏｒｇ，Ｃｈｅｍ．６９：１４６１〜１４６９頁（２００４）
【非特許文献１４】Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら編、Ｐｅｒｇａｍｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７、１３．２章（７３〜９８頁）、２１．１章（８１３〜８９８頁）、および２１．３章（９１５〜９５７頁）
【非特許文献１５】ＣｏｔｔｏｎおよびＷｉｌｋｉｎｓｏｎ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９８８
【非特許文献１６】Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５版、Ｃｏｔｔｏｎ＆Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９８８、２６章
【非特許文献１７】Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ，Ａ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｅｌｓｃｈｅｎｂｒｏｉｃｈら、２版、１９９２、ＶＣＨ
【非特許文献１８】Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＩ，Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  １９８２−１９９４、Ａｂｅｌら編、７巻、７、８、１０＆１１章、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献１９】Ｒｏｂｉｎｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０４：１８８２〜１８９３頁（１９８２）
【非特許文献２０】Ｇａｓｓｍａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０８：４２２８〜４２２９頁（１９８６）
【非特許文献２１】Ｃｏｎｎｅｌｌｙら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９６：８７７〜９１０頁（１９９６）
【非特許文献２２】Ｇｅｉｇｅｒら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３：１〜９３頁
【非特許文献２３】Ｇｅｉｇｅｒら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４：８７頁
【非特許文献２４】Ｃｏｔｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｅｎｓｏｎ、１１７４頁
【非特許文献２５】Ｔｌａｉｓら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００９、７４、１８７６〜１８８５頁
【非特許文献２６】Ｓｅｌｌａ，Ｅ．；Ｓｈａｂａｔ，Ｄ．Ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｐｒｏｂｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｒｅｃｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｉａｃｅｔｏｎｅ  ｔｒｉｐｅｒｏｘｉｄｅ．、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００８、５７０１〜５７０３頁
【非特許文献２７】Ｌｏ，Ｌ．−Ｃｌ；Ｃｈｕ，Ｃ．−Ｙ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ．、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００３、２７２８〜２７２９頁
【非特許文献２８】Ｓａｇｉら、Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ａｌｄｏｌａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ；Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ｆｅｒｒｏｃｅｎｙｌａｍｉｎｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６、７８、１４５９〜１４６１頁
【非特許文献２９】Ｈｅｉｎｚｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｎｋｅｒ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２９７４〜２９８８頁（２００４）
【非特許文献３０】Ｈｅｉｎｚｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｎｋｅｒ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６〜７１頁（２００５）
【非特許文献３１】Ｈｏｌｌｅｍａｎ−Ｗｉｂｅｒｇ、Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ第３４版、ａｔ  １６２０
【非特許文献３２】Ｂｉｃｋｅｒｔら、Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ  １９８４、３、６５４〜６５７頁
【非特許文献３３】Ｆａｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００２、３０８〜３０９頁
【非特許文献３４】Ｐｉｃｈｏｎら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００４、５９８〜５９９頁
【非特許文献３５】Ｓｔｅｕｒｅｒら、Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ  ２００７、２６、３８５０〜３８５９頁
【非特許文献３６】Ｐｅｒｒｙ−Ｆｅｉｇｅｎｂａｕｍら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００９、７、４８２５〜４８２８頁
【非特許文献３７】１９９４  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ｃａｔａｌｏｇ、ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒｓ、１５５〜２００頁
【非特許文献３８】Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：１５５６〜１５６１頁（２００５）
【非特許文献３９】Ｓｉｄｈｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３２８、３３３〜３６３頁（２０００）
【非特許文献４０】Ｇｉｏｄａｎｏら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．７：１２４９〜５３頁（２００１）
【非特許文献４１】Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９（１０）：１９２５頁（１９９３）
【非特許文献４２】Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００頁（１９７０）
【非特許文献４３】Ｓｐｒｉｎｚｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９頁（１９７７）
【非特許文献４４】Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３４８７頁（１９８６）
【非特許文献４５】Ｓａｗａｉら、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５頁（１９８４）
【非特許文献４６】Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０頁（１９８８）
【非特許文献４７】Ｐａｕｗｅｌｓら、Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  ２６：１４１  ９１９８６頁）
【非特許文献４８】Ｍａｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１４３７頁（１９９１）
【非特許文献４９】Ｂｒｉｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１頁（１９８９）
【非特許文献５０】Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献５１】Ｅｇｈｏｌｍ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５頁（１９９２）
【非特許文献５２】Ｍｅｉｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８頁（１９９２）
【非特許文献５３】Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：５６６頁（１９９３）
【非特許文献５４】Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ３８０：２０７頁（１９９６）
【非特許文献５５】Ｄｅｎｐｃｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：６０９７頁（１９９５）
【非特許文献５６】Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ３０：４２３頁（１９９１）
【非特許文献５７】Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ１３：１５９７頁（１９９４）
【非特許文献５８】第２章および第３章、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ５８０、“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”、Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ
【非特許文献５９】Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５頁（１９９４）
【非特許文献６０】Ｊｅｆｆｓら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ３４：１７（１９９４）
【非特許文献６１】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：７４３頁（１９９６）
【非特許文献６２】第６章および第７章、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ５８０、“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”、Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ
【非特許文献６３】Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．（１９９５）、１６９〜１７６頁
【非特許文献６４】Ｒａｗｌｓ、Ｃ  ＆  Ｅ  Ｎｅｗｓ  Ｊｕｎｅ２、１９９７、３５頁
【非特許文献６５】Ｓｃｈｉａｖｏら、ＪＢＣ２６６：２３７８４〜８７頁（１９９５）
【非特許文献６６】Ｓｃｈｉａｖｏら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ３３５：９９〜１０３頁（１９９３）
【非特許文献６７】Ｈａｌｌｓら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ３４：１９３４〜８頁（１９９６）
【非特許文献６８】Ｗｉｔｃｏｍｅら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ６５：３７８７〜９２頁（１９９９）
【非特許文献６９】Ａｎｎｅら、Ａｎａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ２９１：２５３〜６１頁（２００１）
【非特許文献７０】Ｇｒａｙら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：５３７頁（１９９６）
【非特許文献７１】Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ、１９８４、３、６５３頁
【非特許文献７２】Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２００９、４８、４４０６頁
【非特許文献７３】Ｃｏｍｍ．２００２、３２、２６６９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
レドックス活性分子のＥｏの変化に対応する溶媒再構成エネルギーの変化を用いるか、または２つのユニークな電位Ｅｏ１およびＥｏ２での定量可能な電気化学的信号を測定することによる標的分析物を検出するための上記方法はそれらの意図する目的には有用であるが、特に低濃度の標的分析物が関係する、より大きい信号増幅を提供する、改善された堅牢なレドックス活性複合体が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本発明は、標的分析物の検出に使用するためのバイオセンサーに関係する方法および構成物を提供する。
【００３２】
一態様では、本発明は、特定のＥ０を有する共有結合的に付着した電気活性複合体（ＥＡＭ）を含む電極を備えた固体支持体（本明細書では「基板」と称することがある）を含む構成物を提供する。基板は任意選択で電極のアレイを含むことができる。電極（複数可）はそれぞれＥＡＭを含み、これは、任意選択でレドックス活性捕捉複合体（ＲｅＡＭＣ）の一部であってよい。適切な遷移金属には、鉄、ルテニウムおよびオスミウムならびに本明細書で概説する他のものが含まれる。いくつかの実施形態では、ＥＡＭは少なくとも１個のシアノ配位子を含み、本発明において、２、３、４および５個も使用される。ＥＡＭ（ならびにＲｅＡＭＣおよび希釈剤ＳＡＭ形成種）は、アルキル基（置換アルキル基を含む）を含む付着リンカーを用いて電極と連結させることができる。
【００３３】
別の態様では、電極は任意選択で自己組織化単分子層（ＳＡＭ）種を含む。
【００３４】
追加的な態様では、本発明のＥＡＭ／ＲｅＡＭＣは、例えば２個の硫黄原子または環状ジスルフィドアンカー基などの二脚付着の使用を含む、「単脚」であっても「多脚」であってもよいアンカーリガンドを用いて電極に付着させる。
【００３５】
別の態様では、ＥＡＭは、前記ＥＡＭおよび捕捉リガンドを含むレドックス活性捕捉複合体（ＲｅＡＭＣ）の一部である。一態様では、捕捉リガンドは遷移金属のための配位原子を提供する。追加的な態様では、捕捉リガンドはＥＡＭからは分離されており、したがって電極は、ＥＡＭを含む第１の種と捕捉リガンドを含む第２の種を含む。
【００３６】
一態様では、捕捉リガンドはペプチドを含むタンパク質または炭水化物である。
【００３７】
追加的な態様では、本発明は、試料を、本明細書で概説するような電極を含む構成物と接触させるステップを含む、標的分析物を検出する方法を提供する。標的分析物の捕捉リガンドとの結合は、ＥＡＭのＥ０を変更する、例えば、標的分析物の存在または非存在を判定するために測定される第２のＥ０を発生する。
【００３８】
別の態様では、本発明は、第１の官能基を含む第１の種（通常ＳＡＭ形成種）を含む電極を提供するステップを含むバイオセンサーの作製方法を提供する。電極を第２の官能基を含む生体分子と接触させて（これは捕捉リガンドになる）、第１の種と生体分子との間に共有結合を形成させる。電極は、本発明のバイオチップを形成するための電気活性複合体（ＥＡＭ）も含む。いくつかの態様では、各分子上の官能基は、マレイミド、イミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、アルキルハライド、アリールハライド、α−ハロアシルおよびピリジルジスルフィドならびにシステインを含む部分からなる群から選択される（例えば、その第１の官能基はマレイミドを含み、その生体分子はシステインアミノ酸を含むタンパク質（例えば、ペプチド）である）。
【００３９】
追加的な態様では、本発明は次式：
アンカー−スペーサー１−ＥＡＭ−（スペーサー２）ｎ−ＣＬ
（式中、前記アンカーは環状ジスルフィド基を含み、
ＥＡＭは、溶媒アクセス可能なレドックス化合物を含む電気活性部分であり、
ＣＬは捕捉リガンドであり、
スペーサー１はＳＡＭ形成種であり、
スペーサー２はリンカーであり、
ｎ＝０または１である）
を有する化合物を含む。
【００４０】
追加的な態様では、本発明は次式：
アンカー−スペーサー１−ＥＡＭ−（スペーサー２）ｎ−ＣＬ    （Ｉ）
（式中、ＥＡＭは、遷移金属および少なくとも１つの電荷中和性配位子を含む電気活性部分である）を有する化合物を含む。この電荷中和性配位子は、ジチオカルバメート、ベンゼンジチオレート、シッフ塩基、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、カルボキシレート、アミン、チオレート、ホスフィン、イミダゾール、ピリジン、ビピリジン、テルピリジン、ｔａｃｎ、サレン、アカセン（acacen）、Ｃｐ、ピンサー、スコーピオネートおよびペンタアミンからなる群から選択することができる。
【００４１】
別の態様では、本発明は、自己組織化単分子層（ＳＡＭ）、（ｉｉ）自壊的部分（ＳＩＭ）および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む遷移金属錯体を含む共有結合的に付着した電気活性活性部分（ＥＡＭ）を含む電極を備えた第１の固体支持体の一部である構成物（ＥＡＭ）を提供する。ここで、前記ＥＡＭは第１のＥｏおよび自己組織化単分子層（ＳＡＭ）を有する。分析物に結合する捕捉結合リガンドは、電極以外の第２の固体支持体上にある。標的を結合した後、過酸化物生成部分または中間酵素および基質を添加し、それにより過酸化水素が生成する。レドックス活性複合体は電極と結合しており、過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含む。酵素系から生成される過酸化物は、ＰＳＭと反応し、自壊的部分（ＳＩＭ）を除去し、遷移金属錯体に付着した官能基を変換し、２つのユニークな電位Ｅｏ１およびＥｏ２で定量可能な電気化学的信号をもたらす。
【００４２】
一実施形態では、見かけ上の式量電位の過酸化物誘発変化（Ｅ−ＴＲＡＣＥ）を起こす代表的なフェロセン系ＥＡＭの反応機構は、以下のステップに従う：
ａ）電子求引性カルバメート連結ボロン酸エステル置換リガンドを含有する出発フェロセニルＥＡＭ、および
ｂ）出発化学種と別個のレドックス電位を生じさせる、フェロセン上に電子供与性アミノリガンドをもたらす過酸化物との反応。
【００４３】
別の態様では、本発明は、共有結合的に付着した電気活性複合体（ＥＡＭ）を含む電極を備えた構成物であって、前記ＥＡＭが１，３−二置換フェロセンを含む構成物を提供する。
【００４４】
本発明の一実施形態では、電極は金である。
【００４５】
本発明の別の実施形態では、ＥＡＭは１個の硫黄原子または２個の硫黄原子を介して前記電極に共有結合的に付着している。
【００４６】
本発明の別の実施形態では、ＥＡＭを、前記硫黄原子（複数可）を含む第１の末端基を有する付着リンカーを用いて、前記電極に付着させる。
【００４７】
本発明の別の実施形態では、付着リンカーは、ＥＡＭへの付着のための第２の末端基を含む。
【００４８】
本発明の別の実施形態では、付着リンカーはアルキル鎖である。
【００４９】
本発明の別の実施形態では、アルキル鎖は置換されている。
【００５０】
本発明の別の実施形態では、電極は、ＥＡＭおよび捕捉リガンドを含むレドックス活性捕捉複合体（ＲＥＡＭＣ）を含む。
【００５１】
本発明の別の実施形態では、ＥＡＭは、前記捕捉リガンドで官能化されている。
【００５２】
本発明の別の実施形態では、電極は金であり、前記ＲＥＡＭＣは、１個の硫黄原子または２個の硫黄原子を介して前記電極と共有結合的に付着している。
【００５３】
本発明の別の実施形態では、ＲＥＡＭＣは、前記硫黄原子（複数可）を含む第１の末端基を有する付着リンカーを用いて前記電極に付着させる。
【００５４】
本発明の別の実施形態では、付着リンカーは、ＥＡＭへの付着のための第２の末端基を含む。
【００５５】
本発明の別の実施形態では、付着リンカーはアルキル鎖である。
【００５６】
本発明の別の実施形態では、アルキル鎖は置換されている。
【００５７】
本発明の別の実施形態では、電極は、前記ＥＡＭを含む第１の種および捕捉リガンドを含む第２の種を含む。
【００５８】
本発明の別の実施形態では、捕捉リガンドはペプチド、酵素、酵素基質または炭水化物である。
【００５９】
本発明の別の実施形態では、構成物は、それぞれが、遷移金属および少なくとも１つのシアノ配位子を含む共有結合的に付着した遷移金属錯体を含む電極のアレイを備える。
【００６０】
別の態様では、本発明は、標的酵素を検出する方法であって、
ａ）存在する場合、標的酵素が、前記ＥＡＭが第２のＥ０を有するように前記捕捉リガンドを変更する条件下で、試料を、
ｉ）第１のＥ０を有する１，３−二置換フェロセンを含む電気活性部分（ＥＡＭ）；
ｉｉ）捕捉リガンド；
を含む電極を備えた構成物と接触させるステップと
ｂ）前記第２のＥ０を測定するステップと
を含む方法を提供する。
【００６１】
本発明の一実施形態では、構成物は、それぞれが：
ｉ）第１のＥ０を有する１，３−二置換フェロセンを含む電気活性部分（ＥＡＭ）；
ｉｉ）捕捉リガンド
を含む複数の電極を備えた支持体を含む。
【００６２】
別の態様では、本発明は、標的酵素を検出する方法であって：
ａ）存在する場合、標的酵素が、前記ＥＡＭが第２のＥ０を有するように前記捕捉リガンドを変更する条件下で、試料を：
ｉ）第１のＥ０を有する１，３−二置換フェロセンを含む電気活性部分（ＥＡＭ）；
ｉｉ）捕捉リガンド；
を含むＲＥＡＭＣを備えた構成物と接触させるステップと
ｂ）前記第２のＥ０を測定するステップと
を含む方法を提供する。
【００６３】
別の態様では、本発明は：
ａ）官能基を含む第１の種；および
ｂ）１，３−二置換フェロセンを含む電気活性複合体（ＥＡＭ）
を含む電極を備えた構成物を提供する。
【００６４】
本発明の一実施形態では、官能基はマレイミド基である。
【００６５】
別の態様では、本発明は、バイオセンサーの作製方法であって：
ａ）：ｉ）第１の官能基を含む第１の種；および
ｉｉ）１，３−二置換フェロセンを含む電気活性複合体（ＥＡＭ）
を含む電極を準備するステップと
ｃ）前記電極を第２の官能基を含む生体分子と接触させて前記第１の種と前記生体分子の共有結合を形成させるステップと
を含む方法を提供する。
【００６６】
本発明の一実施形態では、第１の官能基は、マレイミド、イミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、アルキルハライド、アリールハライド、α−ハロアシルおよびピリジルジスルフィドを含む部分からなる群から選択される。
【００６７】
本発明の一実施形態では、第１の官能基はマレイミドを含み、前記生体分子はシステインアミノ酸を含むタンパク質である。
【００６８】
本発明の一実施形態では、タンパク質はペプチドである。
【００６９】
別の態様では、本発明は、次式：
アンカー−スペーサー１−ＥＡＭ−（スペーサー２）ｎ−ＣＬ    （Ｉ）
（式中、前記アンカーは環状ジスルフィド基を含み、
ＥＡＭは１，３−二置換フェロセンであり、
ＣＬは捕捉リガンドであり、
スペーサー１はＳＡＭ形成種であり、
スペーサー２はリンカーであり、
ｎ＝０または１である）
を有する化合物を提供する。
【００７０】
別の態様では、本発明は、自己組織化単分子層（ＳＡＭ）を含む電極を備えた構成物であって、前記ＳＡＭが次式：
アンカー−スペーサー１−ＥＡＭ−スペーサー２−ＣＬ    （ＩＩ）
（式中、前記アンカーはジスルフィド基を介して前記電極基と連結しており、
ＥＡＭは１，３−二置換フェロセンであり、
ＣＬは捕捉リガンドであり、
スペーサー１は絶縁性であるかまたは導電性であり、
スペーサー２は任意選択のリンカーである）
を有する化合物を含む構成物を提供する。
【００７１】
別の態様では、本発明は、
ａ）次式：
アンカー−スペーサー１−ＥＡＭ−（スペーサー２）ｎ−ＣＬ    （Ｉ）
（式中、前記アンカーは環状ジスルフィド基を含み、
ＥＡＭは１，３−二置換フェロセンであり、
ＣＬは捕捉リガンドであり、
スペーサー１は絶縁性であるかまたは導電性であり、
スペーサー２はリンカーであり、
ｎ＝０または１である）
を有する化合物を準備するステップと、
ｂ）前記環状ジスルフィドを開環することによって前記化合物を電極と接触させて、前記アンカーの前記電極への付着を形成させるステップと
を含む方法を提供する。
【００７２】
本発明の一実施形態では、電極は自己組織化単分子層（ＳＡＭ）をさらに含む。
【００７３】
別の態様では、本発明は、検査試料中の標的分析物を検出する方法であって：
ａ）次式：
アンカー−スペーサー１−ＥＡＭ−（スペーサー２）ｎ−ＣＬ    （Ｉ）
（式中、前記アンカーは環状ジスルフィド基を含み、
ＥＡＭは１，３−二置換フェロセンであり、
ＣＬは捕捉リガンドであり、
スペーサー１は絶縁性であるかまたは導電性であり、
スペーサー２はリンカーであり、
ｎ＝０または１である）
を有する化合物を含む電極を準備するステップと、
ｂ）前記電極を前記検査試料と接触させるステップと；
ｃ）前記ＥＡＭの再構成エネルギーを測定することによって前記標的分析物の存在を決定するステップと
を含む方法を提供する。
【００７４】
別の態様では、本発明は、
（ｉ）任意選択の自己組織化単分子層（ＳＡＭ）；および
（ｉｉ）１，３−二置換フェロセンを含む電気活性活性部分（ＥＡＭ）
を含む電極を備える構成物を提供する。
【００７５】
一実施形態では、本発明は、前記１，３−二置換フェロセンが本明細書で開示する任意のフェロセン化合物を含む構成物を提供する。
【００７６】
一実施形態では、本発明は、前記１，３−二置換フェロセンが官能基をさらに含む構成物を提供する。
【００７７】
別の実施形態では、本発明は、その官能基が自壊的部分および過酸化物感受性部分を含む構成物を提供する。
【００７８】
一実施形態では、本発明は、前記電極が官能基をさらに含む構成物を提供する。
【００７９】
別の実施形態では、本発明は、前記官能基が捕捉リガンドを含む構成物を提供する。さらに別の実施形態では、前記官能基は、マレイミド、イミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、アルキルハライド、アリールハライド、α−ハロアシルおよびピリジルジスルフィドを含む部分からなる群から選択される。
【００８０】
一実施形態では、本発明は、自己組織化単分子層（ＳＡＭ）をさらに含む構成物を提供する。別の実施形態では、ＳＡＭは非導電性オリゴマーまたは導電性オリゴマーである。
【００８１】
別の態様では、本発明は、検査試料中の１つまたは複数の標的分析物を検出するための方法であって：
（ａ）捕捉結合リガンドが、存在する場合、検査試料中の標的分析物と特異的に結合して第１の複合体を形成するような条件下で、前記検査試料を捕捉結合リガンドと接触させるステップであって、その捕捉結合リガンドが第１の固体支持体と結合しているステップと；
（ｂ）存在する場合、前記第１の複合体を可溶性捕捉リガンドと接触させて第２の複合体を形成するステップであって、前記可溶性捕捉リガンドが過酸化物生成系を含むステップと；
（ｃ）過酸化物が生成してアッセイ混合物を形成する条件下で、前記第２の複合体を前記過酸化物生成系のための基質と接触させるステップと；
（ｄ）アッセイ混合物を、
（ｉ）電気活性活性部分（ＥＡＭ）の自己組織化単分子層（ＳＡＭ）または
（ｉｉ）ＥＡＭおよび任意選択のＳＡＭ
を含む電極を備えた第２の固体支持体と接触させるステップであって、前記ＥＡＭが１，３−二置換フェロセン、自壊的部分および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含み、第１のＥ０を有しており、前記過酸化物が前記ＰＳＭと反応して前記ＥＡＭから前記ＳＩＭを放出し、第２のＥ０を有する前記ＥＡＭをもたらし；第２のＥ０を有するステップと；
（ｆ）第１のＥ０および第２のＥ０での前記ＥＡＭの電気化学的特性を測定するステップと；
（ｇ）前記電気化学的特性から前記標的分析物を検出するステップと
を含む方法を提供する。
【００８２】
別の態様では、本発明は、検査試料中の１つまたは複数の標的分析物を検出するための方法であって：
（ａ）検査試料を、過酸化物生成系を含む可溶性捕捉リガンドと接触させて第１の複合体を形成させるステップと、
（ｂ）捕捉結合リガンドが標的分析物と特異的に結合して第２の複合体を形成するような条件下で、存在する場合、前記第１の複合体を捕捉結合リガンドと接触させるステップであって、その捕捉結合リガンドが第１の固体支持体と結合しているステップと；
（ｃ）過酸化物が生成してアッセイ混合物を形成する条件下で、前記第２の複合体を前記過酸化物生成系のための基質と接触させるステップと；
（ｄ）そのアッセイ混合物を、
（ｉ）電気活性活性部分（ＥＡＭ）の自己組織化単分子層（ＳＡＭ）または
（ｉｉ）ＥＡＭおよび任意選択のＳＡＭ
を含む電極を備えた第２の固体支持体と接触させるステップであって、
前記ＥＡＭが１，３−二置換フェロセン、自壊的部分および過酸化物感受性部分（ＰＳＭ）を含み、第１のＥ０を有し、前記過酸化物を前記ＰＳＭと反応して前記ＥＡＭから前記ＳＩＭを放出し、第２のＥ０を有する前記ＥＡＭをもたらし；第２のＥ０を有するステップと；
（ｆ）第１のＥ０および第２のＥ０で前記ＥＡＭの電気化学的特性を測定するステップと；
（ｇ）前記電気化学的特性から前記標的分析物を検出するステップと
を含む方法を提供する。
【００８３】
一実施形態では、上記したような方法は、ステップ（ｃ）の前に、第２の複合体を単離するステップをさらに含むものである。
【００８４】
別の実施形態では、上記したような方法は、１，３−二置換フェロセンが、本明細書が開示する任意のフェロセン化合物であるものである。
【００８５】
別の態様では、本発明は、式（ＩＩＩ）：
【００８６】
【化１】
2014532720.tif 000011
【００８７】
（式中、
Ｒ１は、水素、−Ｓ−Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、−Ｓ−Ｃ２〜Ｃ２０アルケニルまたは−Ｓ−Ｃ２〜Ｃ２０アルキニルであり；
Ｘは、−Ｃ１〜Ｃ２０アルキル−、−Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル−、−Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル−、−Ｘ１−ＣＯＮＨ−、−Ｘ１−ＣＯ２−または−Ｘ１−ＯＣＮＨ−であり、ここでＸ１は、ポリオキシアルキレン、ポリメチレン、オリゴフェニレンおよびポリフェニレン（エチニレン）からなる群から選択され；
Ｒ２は水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ３は−ＮＲ４Ｒ５、−ＣＯ２Ｒ５、−ＣＯＮＲ４Ｒ５または−ＮＲ５ＣＯ２−Ｒ６であり；
ここでＲ４は水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
ここでＲ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、アリール（Ｃ２〜Ｃ６アルケニル）、ヘテロアリール（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）またはヘテロアリール（Ｃ２〜Ｃ６アルケニル）であり、ここで、それぞれは、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ３、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、アミノ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、ジＣ１〜Ｃ６アルキルアミノ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯ２（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）２または過酸化物感受性部分から選択される１〜４個の置換基で任意選択で置換されており；
ここでＲ６は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、アリール（Ｃ２〜Ｃ６アルケニル）、ヘテロアリール（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）またはヘテロアリール（Ｃ２〜Ｃ６アルケニル）であり、ここで、それぞれは、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ３、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、アミノ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、ジＣ１〜Ｃ６アルキルアミノ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯ２（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）２または過酸化物感受性部分から選択される１〜４個の置換基で任意選択で置換されている）
のフェロセン化合物を提供する。
【００８８】
本発明の上記および他の態様は以下の説明に照らせば明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１Ａ】包括的概略図を用いた１，３−二置換フェロセンＳＡＭを示す一般的概略図である。
【図１Ｂ】アルキルチオールアンカーを有する１，３−二置換フェロセンＳＡＭを示す一般的概略図である。
【図２Ａ】図１の「隣り合った（side-by-side）」配置で用いられる希釈剤（個別の希釈剤は任意選択である）の典型的な例を表す図である。
【図２Ｂ】図１の「隣り合った（side-by-side）」配置で用いられる希釈剤（個別の希釈剤は任意選択である）の典型的な例を表す図である。
【図３】構築ブロックの一部および分析物の検出用の化合物を生成するための捕捉リガンドである官能基Ｙの例を示す図である。図３Ａは、シトクロムＰ４５０および類似体分析物に特異的な捕捉リガンドを示す。図３Ｂは、官能基として、分析物特異的ペプチドを含む捕捉リガンドの例を示す。図３Ｃは、マレイミド反応性官能基を有する化合物のいくつかの例を表す。
【図４】図１に示すような異なる可能的アンカーを有するいくつかの例示的化合物を表す図である。
【図５Ａ】本発明の適切な幾何学的配置のいくつかの概略図を表す図である。図５Ａは、リンカーが電極の一方の端に付着し、その他端が遷移金属（ＴＭ）のための配位原子を提供する配位子（Ｌ）で終わる状況を表す。捕捉基板（ＣＳ）は追加の配位子（示されていない）を提供し、複数の他の配位子は残る配位原子を提供する。酵素によって作用されると、捕捉基板は離脱基（Ｘ）をもたらす。これらの図は遷移金属が６個の配位原子を使用する状況を表しているが、金属に応じて他の複数の配位原子を使用できることに留意すべきである。同様に、これらの図は単一の配位原子を提供する配位子の使用を表しているが、多重配位原子（例えば、多座）配位子を提供する若干の配位子も使用することができる。図５はまた、捕捉基板とＥＡＭが電極に別個に付着する状況も表している。図５は、捕捉基板が遷移金属に配位原子を提供しないこと以外は同様の状況を表している。標的酵素の酵素活性の結果として溶液中のＥＡＭの電気化学的電位を変えることができるという点で、溶液相系は、図５と類似している可能性があること理解すべきである。
【図５Ｂ】本発明の適切な幾何学的配置のいくつかの概略図を表す図である。図５Ａは、リンカーが電極の一方の端に付着し、その他端が遷移金属（ＴＭ）のための配位原子を提供する配位子（Ｌ）で終わる状況を表す。捕捉基板（ＣＳ）は追加の配位子（示されていない）を提供し、複数の他の配位子は残る配位原子を提供する。酵素によって作用されると、捕捉基板は離脱基（Ｘ）をもたらす。これらの図は遷移金属が６個の配位原子を使用する状況を表しているが、金属に応じて他の複数の配位原子を使用できることに留意すべきである。同様に、これらの図は単一の配位原子を提供する配位子の使用を表しているが、多重配位原子（例えば、多座）配位子を提供する若干の配位子も使用することができる。図５はまた、捕捉基板とＥＡＭが電極に別個に付着する状況も表している。図５は、捕捉基板が遷移金属に配位原子を提供しないこと以外は同様の状況を表している。標的酵素の酵素活性の結果として溶液中のＥＡＭの電気化学的電位を変えることができるという点で、溶液相系は、図５と類似している可能性があること理解すべきである。
【図６】本発明のバイオチップを製造するための一般的なスキームを表す図である。
【図７】いくつかの例示的化合物を表す図である。同様の化合物は、例えばジスルフィド環状アンカー基などの異なるアンカーまたは異なるスペーサーで構成することができる。
【図８】１−１’および１−置換様式で、ＥＡＭとしてフェロセンを使用するいくつかの例示的化合物を表す図である。同様の化合物は、例えばジスルフィド環状アンカー基などの異なるアンカーまたは異なるスペーサーで構成することができる。同様の化合物は、ジスルフィド環状アンカー基などの異なるアンカーまたは異なるスペーサーで構成することができる。
【図９】過酸化物トリガー、自壊的基、フェロセンレドックス複合体およびチオレート化されたアンカーを含む４つの化合物を表す図である。
【図１０】１，１’−フェロセンＥＡＭ単分子層と１，３−フェロセンＥＡＭ単分子層の比較を示す図である。１，１’−フェロセンＥＡＭは、過酸化物感受性部分がＳＡＭ中に挿入されるようにする追加的な自由度を有する。１，３−フェロセンＥＡＭの場合、両方の置換基が同じシクロペンタジエニル環に連結されているので、強制的に「ｔｒａｎｓ」の幾何学的形状となる。
【図１１Ａ】再構成エネルギーを用いた一般的検出スキームに基づく捕捉リガンドへの標的結合の前後の金電極上のＥＡＭ単分子層を示す一般的概略図である。結合する前に、レドックス中心は水に十分溶媒和しており、標的結合後、水分子はレドックス中心から排除されて、レドックス電位の変化がもたらされる。
【図１１Ｂ】過酸化水素前後の金電極上の過酸化物感受性ＥＡＭ単分子層を示す一般的概略図である。過酸化物前では、トリガーと自壊的部分は連結されており損なわれていない。過酸化物後では、トリガーと自壊的部分は反応し、ＥＡＭから脱連結されている。
【図１２】２とのＳＡＭ試験比較のために、１，３−二置換フェロセン１〜４の構造を１，１’−二置換フェロセン５と一緒に示す図である。
【図１３】化合物１および２のための代表的な合成スキームを示す図である。
【図１４】化合物３および４のための代表的な合成スキームを示す図である。
【図１５】化合物２３および２４の作製を詳述する合成スキームを示す図である。
【図１６Ａ】オリゴメチレン、オリゴフェニレン、オリゴフェニレン（エチニレン）およびポリエチレングリコールを含むアンカーについて様々な選択肢を用いた、２３および２４と同様の化合物を詳述する合成スキームを示す図である。
【図１６Ｂ】アンカーとしてポリエチレングリコールを用いた２３および２４と同様の化合物を詳述する合成スキームを示す図である。
【図１７】その官能基中に代替の自壊的部分（ＳＩＭ）を有する新規化合物の作製を詳述する合成スキームを示す図である。
【図１８】過酸化水素（０．１Ｍ）への曝露および洗浄の前後でのリアルタイムで監視された２（下）および５（上）の純粋な（neat）ＳＡＭについてのＳＰＲセンサーグラムを示す図である。両方のプロットからのデータを差分モードで収集し、バックグラウンドバッファーからの応答に対して正規化した。
【図１９】典型的な１，１’−Ｆｃ化合物と１，３−Ｆｃ化合物との比較のための電気化学的応答の例を示す図である。図１９Ａは、ＰＳＭ（過酸化物感受性部分）およびＳＩＭ（自壊的部分）からなる未反応官能基を有する１，１’Ｆｃについての初期サイクリックボルタモグラムを示す。図１９Ｂは、過酸化水素との反応に続く１，１’ＥＡＭの応答を示す。ＰＳＭが反応しＳＩＭが除去されると現れる第２のピークは、著しいピーク分裂、および第１のピークからの小さいピーク分離を有している。図１９Ｃは、ＰＳＭ（過酸化物感受性部分）およびＳＩＭ（自壊的部分）からなる未反応官能基を有する１，３−Ｆｃについての初期サイクリックボルタモグラムを示す。図１９Ｄは、過酸化水素との反応に続く１，３−ＥＡＭの応答を示す。ＰＳＭが反応しＳＩＭが除去されると現れる第２のピークは、１９Ｂと比べて、ピーク分裂は有しておらず、第１のピークからのより大きいピーク分離を有している。
【図２０】過酸化物との反応前のＳＡＭにおける初期化合物の多重スキャニングに続く、典型的な１，１’−Ｆｃ化合物と１，３−Ｆｃ化合物との比較のための電気化学的応答の例を示す図である。図２０Ａは、多数回（２０回）スキャンした１，１’−Ｆｃの初期サイクリックボルタモグラムを示すものであり、ピーク電流の連続的な低下が示されており、これは、単分子層内の１−１’化合物が安定でないことを示唆している。図２０Ｂは、多数回（２０回）スキャンした１，３−Ｆｃの初期サイクリックボルタモグラムを示すものであり、ピーク電流が安定であることが示されており、これは、単分子層内の１，３−Ｆｃ化合物が非常に安定であることを示唆している。
【図２１】過酸化物との反応後のＳＡＭにおける最終化合物の多重スキャニングに続く、典型的な１，１’−Ｆｃ化合物と１，３−Ｆｃ化合物との比較のための電気化学的応答の例を示す図である。図２１Ａは、多数回（２０回）スキャンしたＦｃ１−１’のサイクリックボルタモグラムを示すものであり、ピーク電流の連続的な低下が示されており、これは、単分子層内の反応した１−１’−Ｆｃ化合物が安定でないことを示唆している。図２１Ｂは、多数回（２０回）スキャンした１，３−Ｆｃのサイクリックボルタモグラムを示すものであり、ピーク電流が安定であることが示されており、これは、単分子層内の１，３−Ｆｃ反応した化合物が非常に安定であることを示唆している。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
本発明は、観察されるＥ０の変化によって証明されるような、標的分析物とバイオセンサーの相互作用による再構成エネルギーλの変化に依存する電気化学的バイオセンサーの改善を対象とする。先に示されているように、再構成エネルギーの変化に依存するバイオセンサーが記載されている。本発明は、電気活性部分（ＥＡＭ）の遷移金属のためにシアノ配位子を使用するなどの驚くべき改善を示した。シアノ配位子はＥ０の変化の驚くべき増大を提供する。例えばＥ０の差分（delta）は他の荷電した配位子について見られるものより大きい。
【００９１】
Ｉ．再構成エネルギーの概説
本発明は、レドックス活性分子と電極との間の電子移動を容易にするまたは妨害するための、分析物の結合によるレドックス活性分子の再構成エネルギーの変化を用いて標的分析物を検出するための方法および構成物を提供する。本発明は、遷移金属イオンなどのレドックス活性分子が酸化されるか（電子を失う）、または還元される（電子を獲得する）と、分子構造ならびにその近接溶媒環境に変化が起こるという事実に基づいている。分子構造（結合の長さおよび角度）およびその分子を取り囲む溶媒分子の構成におけるこれらの変化は、新規の酸化状態をエネルギー的に安定化させる役目を果たす。これらの変化の合計が、レドックス反応の再構成エネルギーλを構成する。分子内変化は内圏再構成エネルギーλｉと称され、溶媒および環境の変化は外圏または溶媒再構成エネルギーλｏと称される。
【００９２】
本発明の目的のためには、主要な焦点は溶媒再構成エネルギーの変化であるが、本発明のいくつかの実施形態では、内圏再構成の変化も考慮することになる。電気活性分子（ＥＡＭ）を、対象分析物（例えば、タンパク質または細菌）に選択的に結合できる捕捉リガンド（ＣＬ）に付着させた場合の、レドックス反応の再構成エネルギーの変化を十分に利用することが本発明の目的である。ＥＡＭ−ＣＬの分析物との結合はＥＡＭの溶媒環境の変化をもたらし、それによってＥＡＭを含むレドックス反応のための再構成エネルギーは変化する。レドックス反応が電極とＥＡＭとの間の電子移動を含む場合では、標準電位Ｅ０は変化する。したがって、ＥＡＭ−ＣＬ複合体についてのＥ０の変化は、それが分析物と結合していることの表れである。本発明の目的は、結合の指標としてのＥ０の変化、したがって分析物の存在または非存在を検出することである。
【００９３】
電子移動を用いる分析物検出のための慣用的な手法は通常、ＥＡＭを、結合対（例えば、抗体および抗原）の１つのメンバーに付着した標識またはタグとして使用する。これらの方法では、酸化または還元による最少の溶媒再構成を有する電気活性分子を使用することによって、外圏溶媒効果が最少であるＥＡＭが選択される。そうしたＥＡＭは一般に、水との相互作用がほとんどない大きな疎水性配位子を含む。したがって、伝統的に使用される遷移金属イオンのための配位子は非極性で、一般に疎水性であり、しばしば有機環（例えば、ビピリジルおよびテルピリジル）を含有する。全電子移動反応の度合いが、所定の電極電位で測定（電流）されるので、そうしたＥＡＭが慣用的に選択される。
【００９４】
理論に拘泥するわけではないが、本発明に最も適したレドックス分子は、そのレドックス反応が水性環境中で大きな溶媒再構成エネルギーを有するものであると予想される。電荷の増減を安定化させるための溶媒再構成は、いくつかの現象に帰することができる。水などの極性溶媒では、レドックス分子上の電荷は、レドックス分子近傍の環境における極性溶媒分子の配向によって安定化される。極性分子は分子の異なる原子上で弱い電荷の変動を有するので、レドックス分子周りのそれらの配向性はその分子を安定化させる助けとなることができる。さらに、ＣＮ−などのいくつかの配位子はそれ自体が極性であり、原子上に部分電荷を有する。これらの極性配位子自体、周りの溶媒分子の配向を誘発する。荷電したレドックス分子の安定化（または不安定化）は、溶媒および／または他の分子とレドックス分子中の遷移金属の配位子との水素結合によっても起こる可能性がある。溶媒分子ならびにレドックス分子を取り囲む溶媒中の他の分子は、それらの供与体数または受容体数をもとにして特性評価し、比較することができる（参照により本明細書に組み込まれている、Ｎｅｙｈａｒｔら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ  １１８（１９９６）３７２４〜２９頁）。特定の溶媒、または好適な供与体もしくは受容体数を有する分子の溶媒への特定の添加剤の使用は、レドックス反応の溶媒再構成エネルギーに影響を及ぼす。さらに、レドックス分子の電荷の変化は、溶媒中の荷電したイオンによって安定化される。したがって、分析物結合による溶媒再構成変化の変化は、イオン上の電荷、イオンの濃度、イオンのサイズおよびイオンの疎水性を考慮しながら電解質を適切に選択することによって最大化することができる。
【００９５】
理論に拘泥するわけではないが、レドックス分子／捕捉リガンド複合体、ＥＡＭ−ＣＬと分析物の結合によって、レドックス分子を安定化させる現象が破壊されるため、選択した溶媒系における、レドックス分子の安定化を最大化する（すなわち、その溶媒再構成エネルギーを最大化する）ことが好ましい。そうした条件下では、Ｅ０の変化によって証明される再構成エネルギーの変化は、最適であると予想される。ＣＬの分析物との結合は、溶媒環境の最適構成には不都合である、分析物（例えば、タンパク質）の表面上または裂け目もしくはポケットの中の環境中へＥＡＭを「強制的に入れる（force）」ことになると予想される。一実施形態では、結合は、立体障害のため、ＥＡＭ近傍の水分子の抜け出し（shedding）を引き起こすと予想される。
【００９６】
理論に拘泥するわけではないが、結合によって溶媒再構成エネルギーが増大するかまたは減少するかどうか（およびＥ０がより正の電位へ移動するかまたはより負の電位へ移動するかどうか）は、ＥＡＭの具体的な電荷に依存することに留意すべきである。監視されているＥＡＭレドックス反応が、ＥＡＭ３＋へのＥＡＭ２＋酸化などのＥＡＭの電荷の増大をもたらす場合、ＥＡＭ−ＣＬの束縛された環境は、束縛されていないＥＡＭ−ＣＬより、再構成によってより不安定化される。したがって、Ｅ０はより正の電位へ移動することが予想される。あるいは、監視されているＥＡＭレドックス反応が、ＥＡＭ−へのＥＡＭ２−酸化などのＥＡＭの電荷の減少をもたらす場合、束縛されていないＥＡＭ−ＣＬは束縛されたＥＡＭ−ＣＬより、再構成によってより不安定化される。したがって、Ｅ０は、より正でない（less positive）電位へ移動することが予想される。
【００９７】
理論に拘泥するわけではないが、本発明において利用できる２つの一般的機序が存在する。第１の機序は、レドックス標識に起因する内圏変化に関する。この実施形態では、立体的にＥＡＭに近接した捕捉リガンドとの標的分析物の結合は、ＥＡＭの小極性配位子の１つまたは複数が、標的分析物によって供給される１つまたは複数の配位原子で置き換えられるようにし、これは、少なくとも２つの理由のため、内圏再構成エネルギーの変化を引き起こす。第１に、小極性配位子を推定上より大きな配位子と交換すると、一般に、金属から水をより多く排除し、必要な溶媒再構成エネルギーを低下させる（すなわち、内圏λｉ効果）ことになる。第２に、比較的小さいレドックス活性分子への全体的に大きな標的分析物の接近は、金属イオンの第１または第２の配位圏内の水を立体的に排除することになり、また溶媒再構成エネルギーも変化させることになる。
【００９８】
あるいは、本発明は、置換的に不活性な配位子＋外圏効果に依存する。この実施形態では、標的分析物配位原子による金属イオン上の極性配位子の交換。むしろ、この実施形態では、極性配位子は効果的に不可逆的に金属イオンと結合し、溶媒再構成エネルギーの変化が、標的分析物の結合の結果としての金属イオンの第１または第２の配位圏中の水の排除の結果として得られ、本質的に水は排除される（すなわち、外圏λｏ効果）。
【００９９】
本発明は、標的分析物を検出するための、新規アーキテクチャを有する化合物およびこれらの化合物の使用方法を提供する。
【０１００】
いくつかの実施形態では、標的分析物は捕捉リガンドと結合する。いくつかの実施形態では、標的分析物は酵素であってよく、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第６１／０８７，０９４号に記載されているように、Ｅ０の変化は酵素的事象の結果によるものである。
【０１０１】
Ｅ−ＴＲＡＣＥアッセイの概要
特に有用な一実施形態では、提供されるアッセイは、２０１１年１月１９日に出願された米国仮出願第６１／４３４，１２２号および２０１１年８月１５日に出願された同第６１／５２３，６７９号の優先権の利益を主張する、２０１２年１月１９日に出願されたＯｈｍｘの米国特許公開第２０１２０１８１１８６号、および２００９年８月７日に出願された米国仮出願第６１／２３２，３３９号の優先権の利益を主張する、２０１０年８月９日に出願された米国特許公開第１２／８５３，２０４号、ならびに２０１２年１０月１７日に出願された米国特許出願第１３／６５３９３１号に記載されているＥ−ＴＲＡＣＥアッセイに部分的に基づく。これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。Ｅ−ＴＲＡＣＥアッセイは、基本的に、電気化学的検出のための代用標的として過酸化物を産生するオキシダーゼタグ付き二次抗体を有する電気化学的プラットホームでのサンドイッチアッセイである。
【０１０２】
一実施形態では、試料中の標的分析物の比率を求めるための単回測定法は、酵素誘発レドックス変化化学的脱離（Ｅ−ＴＲＡＣＥ）反応、または溶液中でＨ２Ｏ２を検出する標準的なイムノアッセイ光学検査を使用して、電気化学的測定によって、本明細書に記載の方法に従って実施することができ、以下のステップで記述される：
ステップ１：一次抗体を用いた修飾：電気化学的プラットフォームの表面を、過酸化物のＥ−ＴＲＡＣＥ検出用センシング分子（ＥＡＭ）を含むように修飾する。さらに、第２の固体支持体を捕捉プローブで修飾する。この捕捉プローブ、例えば、抗体は、標的（例えば、ヘモグロビンおよび糖化ヘモグロビンを含めたヘモグロビン）のすべての変異型に選択的および同等に結合する。本明細書の定義では、用語「選択的に結合する」は、所定の標的（例えば、ヘモグロビンＡ１ｃを含む総ヘモグロビン）に結合することを意味し、「同等に結合する」は、タンパク質（例えば、ヘモグロビン）および糖化タンパク質（例えば、ヘモグロビンＡ１ｃ）の両方に非選択的に、を意味する。
【０１０３】
ステップ２：標的の添加：この一次結合が起こり、二次支持体の表面上のほとんどすべての結合部位を飽和させると仮定される。このことの重要性は、異なる総標的濃度を有する試料は、表面に結合した標的分析物の代表的な比率を依然として生じることになることである。
【０１０４】
ステップ３：検出抗体の添加：ある特定の実施形態では、二次抗体が表面に導入され、固定された標的分析物にのみ結合する。これは、ＥＬＩＳＡ様サンドイッチ複合体は、標的分析物によって占有された部位にのみ形成し、非標的によって占有された部位には形成しないことを意味する。
【０１０５】
ステップ４：信号伝達および検出：標的分析物に選択的に結合する抗標的抗体を、過酸化物生成系、例えば、オキシダーゼ酵素（ＳＯｘ）で標識する。オキシダーゼ標識は、基質を酸化し、過酸化水素を生成する。生成される過酸化水素は、固体状態プラットフォームの電気化学的な表面と反応して電気化学的信号をもたらす。
【０１０６】
信号の量はサンドイッチ複合体の数と直接相関し、次いでこれは、どれだけの標的分析物が表面上で固定されたかということに依存する。観察される信号は、試料中の標的分析物の比（パーセンテージ）の評価を提供する。
【０１０７】
ＩＩ．試料
標的分析物は一般に、試料中に存在する。当業者が理解することになるように、試料溶液は、それだけに限らないが、体液（それだけに限らないが、実質的に任意の生物の血液、尿、血清、リンパ、唾液、肛門分泌物および膣分泌物、汗および精液を含み、哺乳動物試料が好適であり、ヒト試料が特に好適である）；環境試料（それだけに限らないが、空気、農業、水、および土壌の試料を含む）；植物材料；生物兵器剤試料；研究試料、精製試料、生の試料などを含めた任意の数のものを含むことができる。当業者が理解することになるように、実質的に任意の実験的操作を試料に対して行うことができる。いくつかの実施形態では、貯蔵された（例えば、凍結および／またはアーカイブされた）またはフレッシュな組織からの標的試料を利用する。パラフィン包埋試料は、多くの実施形態で特に有用であり、その理由は、これらの試料が診断および予後などの試料と関連した追加のデータの存在に起因して非常に有用であり得るためである。本明細書に記載の固定組織試料およびパラフィン包埋組織試料は、貯蔵可能またはアーカイバル組織試料を指す。ほとんどの患者由来病理標本は、組織分析および後続のアーカイバル貯蔵が可能になるように日常的に固定またはパラフィン包埋される。
【０１０８】
ＩＩＩ．固体支持体
標的分析物は、電極を備える固体支持体を使用して検出される。本明細書で「基板」もしくは「固体支持体」または他の文法的均等物とは、捕捉リガンドの付着または会合に適切な別個の個々の部位を含有するように修飾することができる任意の材料を意味する。適当な基板としては、金などの金属表面、以下に定義される電極、ガラスおよび改質ガラスまたは機能化ガラス、繊維ガラス、テフロン、セラミック、雲母、プラスチック（アクリル樹脂、ポリスチレン、およびスチレンと他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリウレタン、テフロン（登録商標）、およびこれらの誘導体などを含む）、ＧＥＴＥＫ（ポリプロピレンオキシドと繊維ガラスのブレンド）など、多糖、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、ケイ素および変性ケイ素を含めたシリカまたはシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス、ならびに様々な他のポリマーがあり、プリント回路板（ＰＣＢ）材料が特に好適である。
【０１０９】
本システムは、アレイフォーマット、すなわち、アドレス可能な検出電極（本明細書で一般に、「パッド」「アドレス」、または「マイクロロケーション」と呼ばれる）のマトリックスが存在するアレイフォーマットにおいて特定の有用性を見出す。本明細書で「アレイ」とは、アレイフォーマット内の複数の捕捉リガンドを意味し、アレイのサイズは、アレイの組成および最終用途に依存することになる。約２つの異なる捕捉基板〜何千を含有するアレイを作製することができる。
【０１１０】
好適な実施形態では、検出電極は、基板上に形成される。さらに、本明細書での考察は一般に、金電極の使用を対象とするが、当業者が理解することになるように、他の電極も同様に使用することができる。基板は、本明細書に概説する、および引用参考文献における多種多様な材料を含むことができる。
【０１１１】
一般に、好適な材料は、プリント回路板材料を含む。回路板材料は、導電層で被覆され、リソグラフィー技法、特にフォトリソグラフィー技法を使用して処理されて、電極およびインターコネクト（時にインターコネクションまたはリードと当技術分野で呼ばれる）のパターンが形成された絶縁基板を含むものである。絶縁基板は一般に、常にではないが、ポリマーである。当技術分野で知られているように、１つまたは複数の層を使用して「２次元」（例えば、一面内にすべての電極およびインターコネクション）、または「三次元」（電極が一表面上にあり、インターコネクトが反対側へとボードを通過する場合がある、もしくは電極が複数の表面上にある）ボードを作製することができる。三次元システムは、「スルーボード」インターコネクションが作製されるように、ドリル加工またはエッチング、その後の銅などの金属での電気めっきの使用をしばしば利用する。回路板材料は、銅箔などの基板に既に付着した箔が備わっていることが多く、追加の銅が必要に応じ（例えば、インターコネクション用に）、例えば、電気めっきによって加えられている。次いで銅表面は、接着層を付着させるために、例えばエッチングによって粗面化される必要がある場合がある。
【０１１２】
したがって、好適な実施形態では、本発明は、複数の電極、好ましくは金電極を備える基板を含むバイオチップ（時に「チップ」と本明細書で呼ばれる）を提供する。電極の数は、アレイについて概説した通りである。各電極は、好ましくは本明細書に概説した自己組織化単分子層を備える。好適な実施形態では、単分子層形成化学種の１つは、本明細書に概説した捕捉リガンドを含む。さらに、各電極は、一端で電極に取り付けられ、電極を制御することができるデバイスに最終的に取り付けられたインターコネクションを有する。すなわち、各電極は、独立してアドレス可能である。
【０１１３】
最後に、本発明の構成物は、マイクロ流体コンポーネントおよびロボットコンポーネントを含めた多種多様な追加のコンポーネント（例えば、米国特許第６，９４２，７７１号および同第７，３１２，０８７号、および関連ケースを参照。これらの両方は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）、ならびに信号処理技法を利用するコンピューターを含む検出システム（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，７４０，５１８号を参照）を含むことができる。
【０１１４】
Ｅ−ＴＲＡＣＥ法について、タンパク質およびこれらの糖化された対応するタンパク質に非選択的に結合する結合リガンドは、第２の固体支持体に任意選択により結合していてもよい。限定することなく、微粒子、磁性微粒子、ビーズ、およびマイクロチャネルを含めた任意の適当な第２の固体支持体を使用することができる。
【０１１５】
ＩＶ．センサーの幾何学形状
本発明は、電極の表面上か、またはいくつかの場合、溶液中でのレドックス活性分子の電気化学的電位Ｅ０の変化をもとにした標的分析物を検出するための方法および構成物を対象とする（本明細書での説明の大部分は固相アッセイを対象とするが、当業者が理解することになるように、本発明は溶液においても用いることができ、本明細書でのそうした説明は溶液相アッセイにも適用可能なものとして適用されるものとする）。
【０１１６】
一般に、本発明を以下のように説明することができる。レドックス活性分子は、通常、本明細書で説明するようなリンカーを介して電極の表面に付着されている。さらに、電極は任意選択で、本明細書で説明するような自己組織化単分子層（ＳＡＭ）を含むこともできる。レドックス活性分子の空間的近傍において、捕捉リガンドもやはり、一般に、本明細書で説明するような３つの方法の１つで付着されている。標的分析物の導入および／または結合はレドックス活性分子の電気化学的電位の変化をもたらし、次いでこれは、本明細書で説明するような様々な方法で検出される。
【０１１７】
センサーについては３つの基本的幾何学形状があるが、本明細書での説明はそのように限定されるものではない。一実施形態では、遷移金属イオンおよびその遷移金属のための配位原子を提供する配位子（いくつかの実施形態では、その少なくとも１つはシアノ配位子である）を含む電気活性部分（ＥＡＭ）は、電極に付着している。さらに、標的分析物に特異的に結合する捕捉リガンド（「結合リガンド」と称されることもある）もやはり、電極に付着する。両方の種は一般に、本明細書で説明するような付着リンカーを用いて電極に付着される。２つの種は、それらが空間的に近接しており、その結果、標的分析物の結合によってＥＡＭのＥ０が変化するような仕方で電極に付着される。以下で説明する単分子層形成種を含む第３の種も任意選択で電極上に存在してよいことに留意すべきである。この実施形態では、ＥＡＭ種は式（Ｉａ）を有することができ、捕捉リガンド種は式（Ｉｂ）を有することができ、希釈剤種は式（Ｉｃ）を有することができる：
ＡＧ−スペーサー１−ＥＡＭ  （Ｉａ）
ＡＧ−スペーサー１−ＣＬ    （Ｉｂ）
ＡＧ−スペーサー１−ＴＧｎ  （Ｉｃ）
（式中、ＡＧはアンカー基であり、ＥＡＭは溶媒アクセス可能レドックス複合体を含む電気活性部分であり、スペーサー１は本明細書で説明するＳＡＭ形成種であり、ＣＬは捕捉リガンドであり、ＴＧは末端基であり、ｎは０または１である）。
【０１１８】
第２の実施形態では、ＥＡＭの遷移金属のための配位原子の１つは、「レドックス活性部分複合体」を形成する捕捉リガンド、またはＲｅＡＭＣによって提供される。この実施形態では、その配位原子は、実際に捕捉リガンドの一部（例えば、捕捉リガンドがペプチドである場合、アミノ基は配位原子を提供することができる）であっても、また、捕捉リガンドに付着させるために用いられるリンカー（例えば、ピリジンリンカー等）の一部であってもよい。ＲｅＡＭＣは単一の種として付着されており、上述したように、以下で説明する単分子層形成種を含む追加的な種も任意選択で電極上に存在していてよい。この実施形態では、本発明は式（ＩＩ）：
ＡＧ−スペーサー１−ＥＡＭ−（スペーサー２）ｎ−ＣＬ    （ＩＩ）
（式中、ＡＧはアンカー基であり、ＥＡＭは溶媒アクセス可能レドックス複合体を含む電気活性部分であり、ＣＬは捕捉リガンドであり、スペーサー１は本明細書で説明するＳＡＭ形成種であり、スペーサー２はリンカーであり、ｎ＝０または１である）
を有する化合物を提供する。
【０１１９】
第３の実施形態では、ＲｅＡＭＣは単一の種であるが、捕捉リガンドは配位原子を提供せず；むしろ、ＲｅＡＭＣのＥＡＭに空間的に近接しているが、それとははっきりと異なっている。やはり、以下で説明する単分子層形成種を含む第３の種も、任意選択で電極上に存在していてよい。この実施形態では、本発明は式（ＩＩＩ）：
【０１２０】
【化２】
2014532720.tif 000012
【０１２１】
（式中、ＡＧはアンカー基であり、ＥＡＭは溶媒アクセス可能レドックス複合体を含む電気活性部分であり、ＣＬは捕捉リガンドであり、スペーサー１は本明細書で説明するＳＡＭ形成種であり、Ｓ２およびＳ３は、ＥＡＭおよびＣＬと一緒にＡＧと連結して分岐構造を形成する２つの連結部である。Ｓ２とＳ３は異なっていても同じであってもよい）
を有する化合物を提供する。
この配置の一例を以下に示す：
【０１２２】
【化３】
2014532720.tif 000013
【０１２３】
（式中、Ｍ＝遷移金属であり、Ｌｎ＝アンカーおよび捕捉リガンドと共有結合的に連結されている配位する配位子であり、ｎ＝０または１であり、Ｌ＝配位する配位子である）。
【０１２４】
Ｖ．電極
一態様では、本発明は、電極に付着したこれらのリガンドアーキテクチャを提供する。本明細書で「電極」とは、電子デバイスに接続されているとき、電流または電荷を検知し、それを信号に変換することができる構成物を意味する。好適な電極は、当技術分野で公知であり、これらとして、それだけに限らないが、金；白金；パラジウム；ケイ素；アルミニウムを含めたある特定の金属およびこれらの酸化物；酸化白金、酸化チタン、酸化スズ、インジウムスズ酸化物、酸化パラジウム、酸化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化モリブデン（Ｍｏ２Ｏ６）、酸化タングステン（ＷＯ３）、および酸化ルテニウムを含めた金属酸化物電極；ならびに炭素（ガラス状炭素電極、グラファイト、および炭素ペーストを含む）がある。好適な電極には、金、ケイ素、炭素、および金属酸化物電極が含まれ、金が特に好適である。
【０１２５】
本明細書に記載の電極は、平面として表されており、これは、電極の可能なコンホメーションのうちの１つであるだけであり、概略的な目的のためだけである。電極のコンホメーションは、使用される検出方法によって変化することになる。例えば、平板電極は光学的検出方法のため、または核酸のアレイを作製する場合、したがって合成と検出の両方にアドレス可能な配置が必要となる場合に好都合である可能性がある。あるいは、単一のプローブ分析のために、電極は、ＳＡＭ、ＥＡＭおよび捕捉リガンドなどのシステムの成分がその内表面に結合されている管の形態であってよい。これは、核酸を含む最大の表面積が、少容量の試料に曝露されるようにする。
【０１２６】
本発明の電極は一般に、バイオチップカートリッジ内に組み込まれており、多種多様な配置をとることができ、作用電極および参照電極、インターコネクト（「スルーボード」インターコネクトを含む）、ならびにマイクロ流体コンポーネントを含むことができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第７，３１２，０８７号を参照。
【０１２７】
バイオチップカートリッジは、生体分子のアレイを含む基板を含み、様々な方法で配置することができる。例えば、チップは、試薬を導入および除去するための入口ポートおよび出口ポートを有する反応チャンバーを含むことができる。さらに、カートリッジは、試料を導入し、試薬を添加し、反応を行うことができるように、マイクロ流体コンポーネントを有するキャップまたは蓋を含むことができ、次いで試料は、検出用アレイを備える反応チャンバーに添加される。
【０１２８】
好適な実施形態では、バイオチップは複数のアレイ位置を有する基板を含む。本明細書で「基板」もしくは「固体支持体」または他の文法的均等物とは、捕捉リガンドの付着または会合に適切な別個の個々の部位を含有するように修飾することができる任意の材料を意味する。適当な基板としては、金などの金属表面、以下に定義される電極、ガラスおよび改質ガラスまたは機能化ガラス、繊維ガラス、テフロン、セラミック、雲母、プラスチック（アクリル樹脂、ポリスチレン、およびスチレンと他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリウレタン、テフロン（登録商標）、およびこれらの誘導体などを含む）、ＧＥＴＥＫ（ポリプロピレンオキシドと繊維ガラスのブレンド）など、多糖、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、ケイ素および変性ケイ素を含めたシリカまたはシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス、ならびに様々な他のポリマーがあり、プリント回路板（ＰＣＢ）材料が特に好適である。
【０１２９】
本システムは、アレイフォーマット、すなわち、アドレス可能な検出電極（本明細書で一般に、「パッド」、「アドレス」、または「マイクロロケーション」と呼ばれる）のマトリックスが存在するアレイフォーマットにおいて特に有用性が見られる。本明細書で「アレイ」とは、アレイフォーマット内の複数の捕捉リガンドを意味し、アレイのサイズは、アレイの組成および最終用途に依存することになる。約２つの異なる捕捉基板〜何千を含有するアレイを作製することができる。
【０１３０】
好適な実施形態では、検出電極は、基板上に形成される。さらに、本明細書での考察は一般に、金電極の使用を対象とするが、当業者が理解することになるように、他の電極も同様に使用することができる。基板は、本明細書に概説する、および引用参考文献における多種多様な材料を含むことができる。
【０１３１】
一般に、好適な材料は、プリント回路板材料を含む。回路板材料は、導電層で被覆され、リソグラフィー技法、特にフォトリソグラフィー技法を使用して処理されて、電極およびインターコネクト（時にインターコネクションまたはリードと当技術分野で呼ばれる）のパターンが形成された絶縁基板を含むものである。絶縁基板は一般に、常にではないが、ポリマーである。当技術分野で知られているように、１つまたは複数の層を使用して「二次元」（例えば、一面内にすべての電極およびインターコネクション）、または「三次元」（電極が一表面上にあり、インターコネクトが反対側へとボードを通過する場合がある、もしくは電極が複数の表面上にある）ボードを作製することができる。三次元システムは、「スルーボード」インターコネクションが作製されるように、ドリル加工またはエッチング、その後の銅などの金属での電気めっきの使用をしばしば依存する。回路板材料は、銅箔などの基板に既に付着した箔が備わっていることが多く、追加の銅が必要に応じ（例えば、インターコネクション用に）、例えば、電気めっきによって加えられている。次いで銅表面は、接着層を付着させるために、例えばエッチングによって粗面化される必要がある場合がある。
【０１３２】
したがって、好適な実施形態では、本発明は、複数の電極、好ましくは金電極を備える基板を含むバイオチップ（時に「チップ」と本明細書で呼ばれる）を提供する。電極の数は、アレイについて概説した通りである。各電極は、好ましくは本明細書に概説した自己組織化単分子層を備える。好適な実施形態では、単分子層形成化学種の１つは、本明細書に概説した捕捉リガンドを含む。さらに、各電極は、一端で電極に取り付けられ、電極を制御することができるデバイスに最終的に取り付けられたインターコネクションを有する。すなわち、各電極は、独立してアドレス可能である。
【０１３３】
最後に、本発明の構成物は、マイクロ流体コンポーネントおよびロボットコンポーネントを含めた多種多様な追加のコンポーネント（例えば、米国特許第６，９４２，７７１号および同第７，３１２，０８７号および関連ケースを参照されたい。これらの両方は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）、ならびに信号処理技法を利用するコンピューターを含む検出システム（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込込まれている米国特許第６，７４０，５１８号を参照されたい）を含むことができる。
【０１３４】
Ａ．自己組織化単分子層スペーサー
いくつかの実施形態では、電極は任意選択でＳＡＭをさらに含む。本明細書で「単分子層」または「自己組織化単分子層」または「ＳＡＭ」は、表面上に自発的に化学吸着された分子の相対的に秩序あるアセンブリーを意味し、ここで分子は、互いにほぼ平行に、かつ表面に対しておおよそ垂直に配向している。分子のそれぞれは、表面に接着する官能基、および単分子層内で隣接分子と相互作用して相対的に秩序あるアレイを形成する部分を含む。「混合」単分子層は、異種の単分子層を含み、すなわちこの場合、少なくとも２種の異なる分子が単分子層を構成する。本明細書に概説したように、単分子層を使用すると、表面への生体分子の非特異的結合の量が低減し、核酸の場合では、電極からのオリゴヌクレオチドの距離の結果としてオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの効率が増大する。したがって、単分子層は、電極表面から離して標的酵素を維持することを促進する。さらに、単分子層は、電極の表面から離して電荷担体を保持する機能を果たす。したがって、この層は、電極とＲｅＡＭとの間、または電極と溶媒内の荷電種との間の電気的接触を防止するのに役立つ。このような接触は、直接「短絡」または試料中に存在し得る荷電種を介した間接短絡をもたらし得る。したがって、単分子層は、存在する「ホール」が最小限であるように、電極表面上で、均一層でしっかりとパックされていることが好ましい。したがって、単分子層は、電極への溶媒接近性を遮断する物理的バリアとして機能を果たす。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、単分子層は、導電性オリゴマーを含む。本明細書で「導電性オリゴマー」とは、好ましくは線状の、実質的に導電性のオリゴマーを意味し、これらのうちのいくつかの実施形態は、「分子ワイヤー」と文献において呼ばれている。本明細書で「実質的に導電性の」とは、オリゴマーが１００Ｈｚで電子を移動させることができることを意味する。一般に、導電性オリゴマーは、導電性オリゴマーの単量体ユニット同士間のように、実質的に重なり合うπ軌道、すなわち、共役π軌道を有するが、導電性オリゴマーは、１つまたは複数のシグマ（σ）結合も含有することができる。さらに、導電性オリゴマーは、付随するＥＡＭ内に電子を注入し、または付随するＥＡＭから電子を受け取るその能力によって機能的に定義することができる。さらに、導電性オリゴマーは、本明細書に定義される絶縁体より導電性である。さらに、本発明の導電性オリゴマーは、それ自体電子を供与または受容することができる電気活性ポリマーと区別されるべきである。
【０１３６】
導電性オリゴマーのより詳細な説明は、その全体が参照により本明細書に組み込まれているＷＯ／１９９９／５７３１７に見つかる。特に、ＷＯ／１９９９／５７３１７の１４〜２１頁の構造１〜９に示された導電性オリゴマーは、本発明において用途を見出す。いくつかの実施形態では、導電性オリゴマーは、以下の構造を有する：
【０１３７】
【化４】
2014532720.tif 000014
【０１３８】
さらに、単分子層中の導電性オリゴマーの少なくともいくつかの末端は、電子的に露出している。本明細書で「電子的に露出している」とは、末端にごく接近してＥＡＭを配置した際、かつ適切な信号で開始した後、ＥＡＭの存在に依存する信号が検出され得ることを意味する。導電性オリゴマーは、末端基を有していても、有していなくてもよい。したがって、好適な実施形態では、追加の末端基はまったく存在せず、導電性オリゴマーは、１つの末端基、例えば、アセチレン結合などで末端をなす。あるいは、いくつかの実施形態では、末端基が付加され、時に「Ｑ」と本明細書で表される。末端基は、いくつかの理由で、例えば、ＥＡＭを検出するために導電性オリゴマーの電子利用可能性（electronic availability）に寄与するのに、または他の理由、例えば、非特異的結合を防止するためにＳＡＭの表面を変更するのに使用することができる。例えば、負に帯電した表面を形成するために末端に負に帯電した基が存在する場合があり、その結果、標的分析物がＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸である場合、核酸は、表面に反発され、または表面上に留まることを防止されて、ハイブリダイゼーションが促進される。好適な末端基としては、−ＮＨ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨや、−ＣＨ３などのアルキル基、および（ポリ）エチレングリコールなどの（ポリ）アルキルオキシドがあり、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２Ｈ、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３Ｈ、および−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）４Ｈが好適である。
【０１３９】
一実施形態では、異なるタイプの末端基を有する導電性オリゴマーの混合物を使用することが可能である。したがって、例えば、末端基のいくつかは、検出を促進することができ、いくつかは、非特異的結合を防止することができる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、電極は、好ましくは電極表面上で単分子層の形態で不動態化剤をさらに備える。いくつかの分析物については、分析物結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）の効率は、結合リガンドが電極から離れているとき増大し得る。さらに、単分子層が存在すると、表面への非特異的結合を減少させることができる（それは、本明細書に概説した末端基の使用によってさらに促進され得る）。不動態化剤層は、結合リガンドおよび／または分析物を電極表面から離して維持することを促進する。さらに、不動態化剤は、電極の表面から離して電荷担体を保持する機能を果たす。したがって、この層は、電極と電子伝達部分との間、または電極と溶媒内の荷電種との間の電気的接触を防止するのに役立つ。このような接触は、直接「短絡」または試料中に存在し得る荷電種を介した間接短絡をもたらし得る。したがって、不動態化剤の単分子層は、存在する「ホール」が最小限であるように、電極表面上で、均一層でしっかりとパックされていることが好ましい。あるいは、不動態化剤は、単分子層の形態でなくてもよいが、導電性オリゴマーのパッキングまたは他の特性に役立つように存在し得る。
【０１４１】
したがって、不動態化剤は、電極への溶媒接近性を遮断する物理的バリアとして機能を果たす。したがって、不動態化剤自体は、実際には、（１）導電分子であっても、（２）非導電すなわち、絶縁分子であってもよい。したがって、一実施形態では、不動態化剤は、電極への電荷の移動を遮断し、または減少させる末端基を含む、または含まない、本明細書に記載の導電性オリゴマーである。導電性であり得る他の不動態化剤としては、−−（ＣＦ２）ｎ−−、−−（ＣＨＦ）ｎ−−、および−−（ＣＦＲ）ｎ−−のオリゴマーがある。好適な実施形態では、不動態化剤は、絶縁体部分である。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、単分子層は、絶縁体を含む。「絶縁体」は、好ましくは線状の、実質的に非導電のオリゴマーである。本明細書で「実質的に非導電」とは、絶縁体を通じた電子移動速度が、導電性オリゴマーを通じた電子移動速度より遅いことを意味する。別の言い方をすれば、絶縁体の電気抵抗は、導電性オリゴマーの電気抵抗より高い。しかし、−−（ＣＨ２）１６分子などの絶縁体であると一般にみなされるオリゴマーでさえ依然として、たとえ遅い速度でも電子を移動させることができることに留意されるべきである。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、絶縁体は、約１０−７Ω−１ｃｍ−１以下の伝導率、Ｓを有し、約１０−８Ω−１ｃｍ−１が好適である。参照により本明細書に組み込まれている、Ｇａｒｄｎｅｒら、Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ａ  ５１（１９９５）５７〜６６頁。
【０１４４】
一般に、絶縁体は、シグマ結合を有するアルキルまたはヘテロアルキルオリゴマーまたは部分であるが、任意の特定の絶縁体分子は、芳香族基または１つもしくは複数の共役結合を含有することができる。本明細書で「ヘテロアルキル」とは、少なくとも１つのヘテロ原子、すなわち、窒素、酸素、硫黄、リン、ケイ素、またはホウ素が鎖内に含まれているアルキル基を意味する。あるいは、絶縁体は、電子移動を好ましくは実質的に阻害し、または遅延させる機能を果たす１つまたは複数のヘテロ原子または結合が付加された導電性オリゴマーとかなり同様である場合がある。好ましくは、アルキルまたはヘテロアルキル鎖は、約４〜約１８個の原子の長さ、より好ましくは約６〜約１６個の原子の長さである。
【０１４５】
絶縁体を含む不動態化剤は、電極上の部分または導電性オリゴマーのパッキング、絶縁体の親水性または疎水性、絶縁体の柔軟性、すなわち、回転、ねじり、または縦方向の柔軟性を変更するために、本明細書で定義されるＲ基で置換することができる。例えば、分枝状アルキル基を使用することができる。さらに、絶縁体を含む不動態化剤の末端は、単分子層の露出面に影響を与えるための、時に末端基（「ＴＧ」）と本明細書で呼ばれる追加の基を含有することができる。例えば、帯電基、中性の基、または疎水性基の付加を行って、試料からの非特異的結合を阻害し、または分析物の結合の動態に影響を与えるなどができる。例えば、ある特定の標的分析物の結合を助長もしくは妨害し、または表面に反発し、もしくは表面上に留まるのを防止するための荷電表面を形成するために、末端に荷電基が存在する場合がある。
【０１４６】
不動態化剤の長さは、必要に応じて変化する。一般に、不動態化剤の長さは、上記に概説したように、導電性オリゴマーの長さと同様である。さらに、導電性オリゴマーは、不動態化剤と基本的に同じ長さであり、またはこれらより長い場合があり、結合リガンドが溶媒によりアクセス可能である状態をもたらす。
【０１４７】
単分子層は、絶縁体を含む単一タイプの不動態化剤を含み、または異なるタイプを含むことができる。適当な絶縁体は、当技術分野で公知であり、これらとして、それだけに限らないが、−−（ＣＨ２）ｎ−−、−−（ＣＲＨ）ｎ−−、および−−（ＣＲ２）ｎ−−、エチレングリコール、または酸素の代わりに他のヘテロ原子、すなわち、窒素または硫黄を使用する誘導体（硫黄誘導体は、電極が金である場合、好適でない）がある。好ましくは、絶縁体は、金に付着するためのチオールまたはジスルフィド末端を有する−−（ＣＨ２）ｎ−−の形態のものである。絶縁体の代替の末端がオリゴエチレングリコール、−−ＯＨまたは−−ＣＯＯＨなどの親水基で終わっていることも好ましい。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、電極は、金属表面であり、必ずしもインターコネクト、または電気化学を行う能力を有する必要はない。
【０１４９】
Ｂ．アンカー基
本発明は、アンカー基を含む化合物を提供する。本明細書で「アンカー」または「アンカー基」とは、本発明の化合物を電極に付着させる化学基を意味する。
【０１５０】
当業者が理解することになるように、アンカー基の組成は、これが付着している表面の組成に応じて変化することになる。金電極の場合では、ピリジニルアンカー基およびチオール系アンカー基の両方が特定の用途を見出す。
【０１５１】
導電性オリゴマーの共有結合は、使用される電極および導電性オリゴマーに応じて様々な方法で達成することができる。一般に、構造１で「Ａ」と以下で表されるいくつかのタイプのリンカーが使用され、ここで、Ｘは導電性オリゴマーであり、ハッチングされた面は電極である：
【０１５２】
【化５】
2014532720.tif 000015
【０１５３】
この実施形態では、Ａは、リンカーまたは原子である。「Ａ」の選択は、電極の特性に部分的に依存することになる。したがって例えば、Ａは、金電極が使用される場合、硫黄部分であり得る。あるいは、金属酸化物電極が使用される場合、Ａは、酸化物の酸素に付着したケイ素（シラン）部分であり得る（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １０：３３３２〜３３３７頁（１９９４）；Ｌｅｎｈａｒｄら、Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７８：１９５〜２０１頁（１９７７）を参照。これらの両方は、参照により明白に組み込まれている）。炭素系電極が使用される場合、Ａは、アミノ部分（好ましくは第１級アミン；例えば、Ｄｅｉｎｈａｍｍｅｒら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １０：１３０６〜１３１３頁（１９９４）を参照）であり得る。したがって、好適なＡ部分として、それだけに限らないが、シラン部分、硫黄部分（アルキル硫黄部分を含む）、およびアミノ部分が挙げられる。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、電極は、炭素電極、すなわち、ガラス状炭素電極であり、付着機構は、アミン基の窒素を介するものである。代表的な構造は、その全体においてであるが、特に、中で記載された構造、および異なるアンカー基の記述、および付随する本文について参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２００８０２４８５９２号の構造１５に表されている。やはり、追加の原子、すなわち、リンカーおよび／または末端基が存在する場合がある。
【０１５５】
上記の通り参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００８０２４８５９２号の構造１６では、酸素原子は、金属酸化物電極の酸化物に由来する。Ｓｉ原子は、他の原子も含有することができ、すなわち、置換基を含有するケイ素部分であり得る。他の電極へのＳＡＭの他の付着機構は、当技術分野で公知である。例えば、インジウムスズ酸化物電極への付着についてＮａｐｉｅｒら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１９９７、およびまたインジウムスズ酸化物電極へのリン酸塩の化学吸着（Ｈ．Ｈｏｌｄｅｎ  Ｔｈｏｒｐｅ、ＣＨＩ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、１９９８年５月４〜５日による講演）を参照。
【０１５６】
好適な一実施形態では、インジウム−スズ−酸化物（ＩＴＯ）が電極として使用され、アンカー基は、ホスホネート含有種である。
【０１５７】
１）．ピリジニルアンカー基
一態様では、本発明は、本発明の化合物を表面に付着させるためのピリジンおよびその誘導体の使用を提供する。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、アンカーは式（ＩＩ）：
【０１５９】
【化６】
2014532720.tif 000016
【０１６０】
の構造を有するピリジル基を含む。ここで、この環上の炭素は、本明細書で定義するようなＲ基で任意選択で独立に置換されていてよい。ピリジンは、６員環中の１個のＣＨ基が窒素原子で置き換えられている、構造的にベンゼンに関連する複素環式芳香族有機化合物である。ピリジンは配位化学における配位子として使用することができる。配位子として、これは通常「ｐｙ」と略される。本発明は、ピリジンの窒素原子上の孤立電子対が金属表面と結合する能力を利用する。ピリジンベースの化合物の１つの利点は、それらが空気中で安定であるということである。Ｃｕｒｔｉｓら、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２４：３８５〜３９７頁（１９８５）；Ｃａｌｌａｈａｎら、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１４：１４４３〜１４５３頁（１９７５）；Ｌａｖａｌｌｅｅ  ａｎｄ  Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４：２５８３〜２５９９頁（１９７２）；およびＪｗｏら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０１：６１８９〜６１９７頁（１９７９）。これらのすべては参照により組み込まれている。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、ピリジル基は、以下に示すように、
【０１６２】
【化７】
2014532720.tif 000017
【０１６３】
アセチレン基で分離された２つのピリジル基を含むビピリジル基（ビスピリジルアセチレン、ＢＰＡ）を含む。
【０１６４】
この実施形態では、どちらの環上の炭素も、本明細書で定義するようなＲ基で任意選択で独立に置換されていてよい。環の１つは、本明細書で定義するかまたはいくつかの図で示すようなスペーサーとの結合を含むことになり、ピリジル基に付着した２つ以上のスペーサーが存在していてよい（例えば、ｎ＝１または複数であり、いくつかの実施形態では２に特に用途が見られる）。
【０１６５】
２）．硫黄アンカー基
単一部分として構造１で表されているが、導電性オリゴマーは、１つを超える「Ａ」部分で電極に付着される場合があり、「Ａ」部分は、同じであっても異なっていてもよい。したがって、例えば、電極が金電極である場合、「Ａ」は、硫黄原子または部分であり、構造２、３、および４に以下で一般に表されているものなど、複数の硫黄原子を使用して電極に導電性オリゴマーを付着させることができる。当業者が理解することになるように、他のこのような構造を作製することができる。構造２、３、および４では、Ａ部分は、単に硫黄原子であるが、置換硫黄部分も使用することができる。
【０１６６】
したがって、例えば、電極が金電極である場合、「Ａ」は、構造６に以下で一般に表されているものなどの硫黄原子または部分であり、構造２、３、および４に以下で一般に表されているものなど、複数の硫黄原子を使用して電極に導電性オリゴマーを付着させることができる。当業者が理解することになるように、他のこのような構造を作製することができる。構造２、３、および４では、Ａ部分は、単に硫黄原子であるが、置換硫黄部分も使用することができる。
【０１６７】
【化８】
2014532720.tif 000018
【０１６８】
構造４と同様に、電極に付着した３つの硫黄部分を含む単一炭素原子で終端する導電性オリゴマーを有することが可能であり得ることにも留意されるべきである。
【０１６９】
別の態様では、本発明は、共役チオールを含むアンカーを提供する。共役チオールアンカーを有するいくつかの例示的な錯体を図４に示す。いくつかの実施形態では、アンカーは、アルキルチオール基を含む。
【０１７０】
別の態様では、本発明は、金電極などの電極上で分析物を検出するための電気活性部分の構築においてアンカー基として機能を果たす共役多脚チオ含有化合物を提供する。すなわち、スペーサー基（これらは、ＥＡＭ、ＲｅＡＭＣ、または「空の」単分子層形成種に付着され得る）は、２個以上の硫黄原子を使用して付着される。これらの多脚アンカー基は、本明細書に記載するように、線状または環式とすることができる。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、アンカー基は、金表面に付着する２個の硫黄原子を含有し、線状の「二脚」であるが、いくつかの場合では、他の多脚性（multipodality）（例えば、「三脚」）を有する系も含むことが可能であり得る。このような多脚アンカー基は、安定性の増大を示し、かつ／または立体的に要求の厳しい頭部基を有するチオール含有アンカーからＳＡＭを調製するためのより大きいフットプリントを可能にする。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、アンカーは、環状ジスルフィド（「二脚」）を含む。しかしいくつかの場合では、他の多脚性（例えば、「三脚」）を有する環系アンカー基を含むことが可能であり得る。環の原子の数は、例えば、５〜１０に変化する場合があり、また、以下に論じるように、多環アンカー基を含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、アンカー基は、以下に示すように、頂点窒素原子および分子内ジスルフィド結合を有する７員環である［１，２，５］−ジチアゼパン単位を含む。
【０１７４】
【化９】
2014532720.tif 000019
【０１７５】
構造（ＩＩＩａ）において、環の炭素原子は、さらに置換され得ることにも留意されるべきである。当業者が理解することになるように、他員環も含められる。さらに、多環環状構造体を使用することができ、これは、他の環状アルカン（環状ヘテロアルカンを含む）または芳香族環構造体で置換された、上記に示した［１，２，５］−ジチアゼパンなどの環状ヘテロアルカンを含むことができる。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、アンカー基、およびスペーサーの一部は、以下に示す構造を有する。
【０１７７】
【化１０】
2014532720.tif 000020
【０１７８】
本明細書で「Ｒ」基は、ＥＡＭの遷移金属成分の末端の配位する配位子を有する共役オリゴフェニルエチニレン単位を含めた、任意の置換基とすることができる。
【０１７９】
アンカーは、参照により本明細書に組み込まれているＬｉら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．４：３６３１〜３６３４頁（２００２）に記載されている、二脚中間体（Ｉ）（Ｒ＝Ｉである式ＩＩＩの化合物）から合成される。参照により本明細書に組み込まれている、Ｗｅｉら、Ｊ．Ｏｒｇ，Ｃｈｅｍ．６９：１４６１〜１４６９頁（２００４）も参照。
【０１８０】
硫黄原子の数は、本明細書に概説したように変化し得、特定の実施形態では、スペーサー１つ当たり１個、２個、および３個を利用する。
【０１８１】
Ｃ．電気活性部分
アンカー基に加えて、本発明は、電気活性部分を含む化合物を提供する。本明細書で「電気活性部分（ＥＡＭ）」または「遷移金属錯体」または「レドックス活性分子」または「電子伝達部分（ＥＴＭ）」とは、１つまたは複数の電子を可逆的または半可逆的に移動させることができる金属含有化合物を意味する。電子ドナーおよびアクセプター能力は、相対的である、すなわち、ある特定の実験条件下で電子を失うことができる分子は、異なる実験条件下で電子を受容することができることが理解されるべきである。
【０１８２】
可能な遷移金属錯体の数は非常に多く、電子伝達化合物の当業者は、本発明においていくつかの化合物を利用することができることが理解されるべきである。本明細書で「遷移金属」とは、その原子が部分殻または閉殻の電子を有する金属を意味する。本発明で使用するのに適した遷移金属としては、それだけに限らないが、カドミウム（Ｃｄ）、銅（Ｃｕ）、コバルト（Ｃｏ）、パラジウム（Ｐｄ）、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、オスミウム（Ｏｓ）、レニウム（Ｒｅ）、白金（Ｐｔ）、スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）、タングステン（Ｗ）、およびイリジウム（Ｉｒ）がある。すなわち、第一系列の遷移金属、白金金属（Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、およびＰｔ）が、Ｆｅ、Ｒｅ、Ｗ、Ｍｏ、およびＴｃとともに、本発明において特定の用途を見出す。特に好適なものは、ルテニウム、オスミウム、鉄、白金およびパラジウムを含む、酸化状態の変化によって配位部位の数を変えない金属であり、オスミウム、ルテニウムおよび鉄が特に好ましく、多くの実施形態において、オスミウムが特に用いられる。いくつかの実施形態では、鉄は好ましくない。一般に、遷移金属は、ＴＭまたはＭと本明細書に表されている。
【０１８３】
遷移金属および配位する配位子は、金属錯体を形成する。本明細書で「配位子」または「配位する配位子」（本明細書では、図面中で「Ｌ」と表されている）とは、１つまたは複数の中心原子またはイオンに配位共有結合によってその電子の１つまたは複数を一般に供与し、または１つまたは複数の中心原子またはイオンと共有結合によってその電子を共有する原子、イオン、分子、または官能基を意味する。
【０１８４】
金属の他の配位部位は、捕捉リガンド（リンカーを用いて直接または間接に）へもしくは電極（以下でより完全に説明されるように、しばしばスペーサーを用いて）へか、またはその両方へ遷移金属錯体を付着させるために使用される。したがって、例えば、遷移金属錯体が結合配位子と直接連結されている場合、金属イオンの配位部位の１つ、２つまたはそれ以上が、結合配位子によって（または、間接的に連結されている場合、リンカーによって）供給される配位原子で占有されていてよい。さらに、または代替的に、金属イオンの配位部位の１つまたは複数は、遷移金属錯体を電極に付着させるために用いられるスペーサーで占有されていてよい。例えば、遷移金属錯体が、以下でより完全に説明されるように、結合配位子とは別個に電極に付着している場合、金属のすべての配位部位（ｎ）から１を除いた部位（ｎ−１）が極性配位子を含むことができる。
【０１８５】
適当な小極性配位子は一般に、「Ｌ」と本明細書で表され、本明細書でより完全に記載されるように、２つの一般的なカテゴリーに分類される。一実施形態では、小極性配位子は、一般に劣った脱離基として、または良好なシグマドナーとしてのこれらの特性、および金属の素性に起因して、金属イオンに有効に、不可逆的に結合される。これらの配位子は、「置換不活性」と呼ばれる場合がある。あるいは、以下でより完全に記載されるように、小極性配位子は、標的分析物が結合すると、分析物が金属の１つまたは複数の配位原子を提供し、これらの良好な脱離基特性または劣ったシグマドナー特性に起因して、小極性配位子を有効に置き換えることができるように、金属イオンに可逆的に結合することができる。これらの配位子は、「置換的に不安定」と呼ばれる場合がある。配位子は、双極子を形成することが好ましく、その理由は、それが、高溶媒再配置エネルギーに寄与することになるためである。
【０１８６】
遷移金属錯体の構造のいくつかを以下に示す：
【０１８７】
【化１１】
2014532720.tif 000021
【０１８８】
Ｌは、金属イオンの結合のための配位原子を提供する共配位子である。当業者が理解することになるように、共配位子の数および性質は、金属イオンの配位数に依存することになる。単座、二座、または多座共配位子を、任意の位置で使用することができる。したがって例えば、金属の配位数が６である場合、導電性オリゴマーの末端からのＬ、核酸から寄与されるＬ、およびｒは、合計６になる。したがって、金属の配位数が６である場合、ｒは、０（すべての配位原子が他の２つの配位子によって提供される場合）から、すべての共配位子が単座であるとき、４の範囲となり得る。したがって一般に、ｒは、金属イオンの配位数および他の配位子の選択に応じて０〜８となる。
【０１８９】
一実施形態では、金属イオンの配位数は６であり、導電性オリゴマーに付着した配位子および核酸に付着した配位子はともに、少なくとも二座であり、すなわち、ｒは、好ましくは、０、１（すなわち、残りの共配位子が二座である）、または２（２つの単座共配位子が使用される）である。当技術分野で理解されることになるように、共配位子は、同じであっても異なっていてもよい。適当な配位子は、２つのカテゴリー、すなわち、配位原子として窒素、酸素、硫黄、炭素、またはリン原子（金属イオンに応じて）を使用する配位子（一般に、シグマ（σ）ドナーと文献で呼ばれる）、およびメタロセン配位子などの有機金属配位子（一般に、パイ（π）ドナーと文献で呼ばれ、Ｌｍと本明細書で表す）に分類される。適当な窒素供与配位子は、当技術分野で周知であり、これらとしては、それだけに限らないが、シアノ（Ｃ≡Ｎ）、ＮＨ２；ＮＨＲ；ＮＲＲ’；ピリジン；ピラジン；イソニコチンアミド；イミダゾール；ビピリジン、およびビピリジンの置換誘導体；テルピリジン、および置換誘導体；フェナントロリン、特に１，１０−フェナントロリン（ｐｈｅｎと省略される）、およびフェナントロリンの置換誘導体、例えば、４，７−ジメチルフェナントロリンおよびジピリドール［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジン（ｄｐｐｚと省略される）など；ジピリドフェナジン；１，４，５，８，９，１２−ヘキサアザトリフェニレン（ｈａｔと省略される）；９，１０−フェナントレンキノンジイミン（ｐｈｉと省略される）；１，４，５，８−テトラアザフェナントレン（ｔａｐと省略される）；１，４，８，１１−テトラ−アザシクロテトラデカン（ｃｙｃｌａｍと省略される）、ならびにイソシアニドがある。縮合誘導体を含めた置換誘導体も使用することができる。いくつかの実施形態では、ポルフィリン、およびポルフィリンファミリーの置換誘導体を使用することができる。例えば、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら編、Ｐｅｒｇａｍｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７、１３．２章（７３〜９８頁）、２１．１章（８１３〜８９８頁）、および２１．３章（９１５〜９５７頁）を参照。これらのすべては、参照により本明細書に明白に組み込まれている。当技術分野で理解されることになるように、ドナー（１）が金属に結合し、ドナー（２）が周囲媒体（溶媒、タンパク質など）との相互作用に利用可能である任意の配位子ドナー（１）−架橋−ドナー（２）を、特にドナー（１）およびドナー（２）が、シアノ（Ｃがドナー（１）であり、Ｎがドナー（２）であり、パイシステムがＣＮ三重結合である）と同様に、パイシステムによってカップリングされている場合、本発明において使用することができる。一例は、ビピリミジンであり、これは、ビピリジンと酷似して見えるが、媒体と相互作用するために、「裏面」にＮドナーを有する。追加の共配位子としては、それだけに限らないが、シアネート、イソシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）、チオシアネート、イソニトリル、Ｎ２、Ｏ２、カルボニル、ハロゲン化物、アルコキシド、チオレート、アミド、リン化物、ならびに硫黄含有化合物、例えば、スルフィノ、スルホニル、ス��ホアミノ、およびスルファモイルなどがある。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、異なる金属と錯体形成するために、複数のシアノが共配位子として使用される。例えば、７つのシアノがＲｅ（ＩＩＩ）に結合し、８つがＭｏ（ＩＶ）およびＷ（ＩＶ）に結合する。したがって、６つ以下のシアノ、および１つまたは複数のＬを有するＲｅ（ＩＩＩ）、または７つ以下のシアノおよび１つもしくは複数のＬを有するＭｏ（ＩＶ）もしくはＷ（ＩＶ）を、本発明において使用することができる。Ｗ（ＩＶ）系を有するＥＡＭは、より不活性であり、調製するのがより容易であり、より好都合な還元電位であるので、他のものに対する特別な利点を有する。一般に、ＣＮ／Ｌ比がより大きいと、より大きいシフトを与えることになる。炭素、酸素、硫黄、およびリンを使用する適当なシグマ供与配位子は、当技術分野で公知である。例えば、適当なシグマ炭素ドナーは、参照により本明細書に組み込まれているＣｏｔｔｏｎおよびＷｉｌｋｉｎｓｏｎ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９８８に見出される。例えば、３８頁を参照。同様に、適当な酸素配位子には、クラウンエーテル、水、および当技術分野で公知の他のものが含まれる。ホスフィンおよび置換ホスフィンも適当である。ＣｏｔｔｏｎおよびＷｉｌｋｉｎｓｏｎの３８頁を参照。酸素、硫黄、リン、および窒素供与配位子は、ヘテロ原子が配位原子として機能を果たすことが可能になる様式で付着される。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、有機金属配位子が使用される。レドックス部分として使用するための純粋有機化合物、および複素環置換基または環外置換基としてドナー原子を含むδ結合有機配位子を有する様々な遷移金属配位錯体に加えて、π結合有機配位子を有する多種多様な遷移金属有機金属化合物が利用可能である（参照により本明細書に明白に組み込まれている、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５版、Ｃｏｔｔｏｎ＆Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９８８、２６章；Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ，Ａ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｅｌｓｃｈｅｎｂｒｏｉｃｈら、２版、１９９２、ＶＣＨ；およびＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＩ，Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  １９８２−１９９４、Ａｂｅｌら編、７巻、７、８、１０＆１１章、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓを参照）。このような有機金属配位子には、シクロペンタジエニドイオン［Ｃ５Ｈ５（−１）］などの環式芳香族化合物、およびビス（シクロペンタジエニル）金属化合物（すなわち、メタロセン）のクラスを生じるインデニリド（−１）イオンなどの様々な環置換誘導体および環縮合誘導体が含まれる。例えば、参照により組み込まれている、Ｒｏｂｉｎｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０４：１８８２〜１８９３頁（１９８２）；およびＧａｓｓｍａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０８：４２２８〜４２２９頁（１９８６）を参照。これらのうちで、フェロセン［（Ｃ５Ｈ５）２Ｆｅ］ならびにその誘導体は、原型的な例であり、これらは、多種多様な化学的（参照により組み込まれているＣｏｎｎｅｌｌｙら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９６：８７７〜９１０頁（１９９６））、ならびに電気化学的（参照により組み込まれているＧｅｉｇｅｒら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３：１〜９３頁；およびＧｅｉｇｅｒら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４：８７頁）電子移動反応または「レドックス」反応において使用されている。第１列、第２列、および第３列遷移金属のメタロセン誘導体は、核酸のリボース環またはヌクレオシド塩基に共有結合的に付着されるレドックス部分としての潜在的な候補である。他の潜在的に適当な有機金属配位子には、ビス（アレーン）金属化合物を生じるベンゼンなどの環式アレーン、ならびに環置換誘導体および環縮合誘導体が含まれ、これらのうちでビス（ベンゼン）クロムが原型的な例である。他の非環式π結合配位子、例えば、アリル（−１）イオンまたはブタジエンなどは、潜在的に適当な有機金属化合物を生じ、すべてのこのような配位子は、π結合配位子およびδ結合配位子と併せて、金属炭素結合が存在する有機金属化合物の一般的なクラスを構成する。架橋有機配位子、および追加の非架橋配位子を有し、かつ金属−金属結合を有する、および有さない化合物の様々な二量体およびオリゴマーの電気化学的試験は、核酸分析における潜在的な候補レドックス部分である。共配位子の１つまたは複数が有機金属配位子であるとき、配位���は一般に、有機金属配位子の炭素原子の１つを介して付着されるが、結合は、複素環配位子の他の原子を介している場合がある。好適な有機金属配位子には、置換誘導体を含めたメタロセン配位子、およびメタロセノファンが含まれる（Ｃｏｔｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、上記の１１７４頁を参照）。例えば、メチルシクロペンタジエニルなどのメタロセン配位子の誘導体は、ペンタメチルシクロペンタジエニルなどの複数のメチル基を有するものが好適であり、メタロセンの安定性を増大させるのに使用することができる。好適な実施形態では、メタロセンの２つのメタロセン配位子のうちの１つのみが誘導体化されている。本明細書に記載するように、配位子の任意の組合せを使用することができる。好適な組合せとしては、ａ）すべての配位子が窒素供与配位子であること、ｂ）すべての配位子が有機金属配位子であること、およびｃ）導電性オリゴマーの末端の配位子がメタロセン配位子であり、核酸によって提供される配位子が窒素供与配位子であり、他の配位子が、必要な場合、窒素供与配位子もしくはメタロセン配位子、または混合物であることが含まれる。一般的な法則として、非大環状キレーターを含むＥＡＭは、金属イオンに結合されて非大環状キレート化合物を形成し、その理由は、金属が存在すると、複数のプロ配位子が一緒に結合して複数の酸化状態を与えることが可能になるためである。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、窒素供与プロ配位子が使用される。適当な窒素供与プロ配位子は、当技術分野で周知であり、これらとしては、それだけに限らないが、ＮＨ２；ＮＨＲ；ＮＲＲ’；ピリジン；ピラジン；イソニコチンアミド；イミダゾール；ビピリジンおよびビピリジンの置換誘導体；テルピリジンおよび置換誘導体；フェナントロリン、特に１，１０−フェナントロリン（ｐｈｅｎと省略される）、およびフェナントロリンの置換誘導体、例えば４，７−ジメチルフェナントロリンおよびジピリドール［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジン（ｄｐｐｚと省略される）など；ジピリドフェナジン；１，４，５，８，９，１２−ヘキサアザトリフェニレン（ｈａｔと省略される）；９，１０−フェナントレンキノンジイミン（ｐｈｉと省略される）；１，４，５，８−テトラアザフェナントレン（ｔａｐと省略される）；１，４，８，１１−テトラ−アザシクロテトラデカン（ｃｙｃｌａｍと省略される）、ならびにイソシアニドがある。縮合誘導体を含めた置換誘導体も使用することができる。金属イオンを配位的に飽和させず、別のプロ配位子の付加を必要とする大環状配位子は、本目的に関して非大環状とみなされることに留意されるべきである。当業者が理解することになるように、いくつかの「非大環状」配位子を共有結合的に付着させて配位的に飽和した化合物を形成することが可能であるが、それは、環状骨格を欠いている。
【０１９３】
自壊的部分
本発明のＥＡＭは、ＥＡＭが、存在するとき第１のＥ０、および以下に記載するように除去されているとき第２のＥ０を有するようにＥＡＭに共有結合的に付着している少なくとも１つの自壊的部分を含む。
【０１９４】
用語「自壊的スペーサー」は、２つの化学部分を共有結合的に連結して通常安定なトリパータイト分子にすることができる二官能性化学部分を指す。自壊的スペーサーは、第１の部分への結合が切断される場合、第２の部分から自発的に分離することができる。本発明では、自壊的スペーサーは、過酸化物感受性部分、例えば、ホウ素部分をＥＡＭに連結する。過酸化物に曝露されると、ホウ素部分が除去され、スペーサーが崩壊する。一般的に言えば、非可逆性の繰り返しの結合転位反応が電子供与性アルコール官能基（すなわち、キノンメチドモチーフ）によって開始される任意のスペーサーを、酸化条件下でアルコールを生成する誘発部分として機能を果たすホウ素基を用いて設計することができる。あるいは、ホウ素部分は、遷移金属のプロキレーターである配位子中の潜在フェノール酸素をマスクすることができる。酸化されると、配位子は、ＳＡＭ中で変換され、ＥＡＭ形成を開始する。例えば、見本のキレート配位子は、鉄に結合するサリチルアルデヒドイソニコチノイルヒドラゾンである。
【０１９５】
当業者が理解することになるように、多種多様な自壊的部分を、多種多様なＥＡＭおよび過酸化物感受性部分とともに使用することができる。自壊的リンカーは、米国公開第２００９００４１７９１号、同第２０１００１４５０３６号、ならびに米国特許第７，７０５，０４５号、および同第７，２２３，８３７号を含めたいくつかの参考文献に記載されており、これらのすべては、その全体が、特に自壊的スペーサーの開示について参照により明白に組み込まれている。
【０１９６】
自壊的スペーサーは、単一単量体ユニット、または同じ単量体のポリマー（ホモポリマー）もしくは異なる単量体のポリマー（ヘテロポリマー）を含むことができる。あるいは、自壊的スペーサーは、参照により本明細書に組み込まれている以前の出願「Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」、ＵＳ１２／２５３，８２８、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０３６３に列挙された化学反応に類似した切断後にＥＡＭの環境を変化させる、ＳＡＭ中のＥＡＭへの隣接基とすることができる。
【０１９７】
過酸化物感受性部分
自壊的スペーサーは、本発明の過酸化物感受性部分（ＰＳＭ、時にＰＯＭと本明細書で呼ばれる）およびＥＡＭを接合する。一般に、過酸化物感受性部分はホウ素を含むことができる。例えば、適切な１，２−ジオール化合物は、ボロン酸部分とエステルを形成して過酸化物感受性部分を提供することができる。ホウ素を含有する過酸化物感受性部分のいくつかの例を以下に示す：
【０１９８】
【化１２】
2014532720.tif 000022
【０１９９】
さらに、過酸化物感受性部分は、参照により本明細書に組み込まれているＴｌａｉｓらの文献（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００９、７４、１８７６〜１８８５頁）に記載されている
【０２００】
【化１３】
2014532720.tif 000023
【０２０１】
などの非ホウ素含有構造を含む。
【０２０２】
例えば、本明細書の図は、フェロセン誘導体の使用を表し、この場合、過酸化物は、ｐ−置換ピナコールホウ酸エステルを含むカルバミン酸ベンジルからアミンへの変換を誘発する。この自己排除基（self-eliminating group）は、過酸化水素の存在下でアミン官能化フルオロフォアを生成するために以前に記載されている（Ｓｅｌｌａ，Ｅ．；Ｓｈａｂａｔ，Ｄ．Ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｐｒｏｂｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｒｅｃｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｉａｃｅｔｏｎｅ  ｔｒｉｐｅｒｏｘｉｄｅ．、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００８、５７０１〜５７０３頁；およびＬｏ，Ｌ．−Ｃｌ；Ｃｈｕ，Ｃ．−Ｙ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ．、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００３、２７２８〜２７２９頁。これらはともに、参照により組み込まれている）。他のこのような基（アリールホウ酸エステルおよびアリールボロン酸）も、ＳｅｌｌａおよびＬｏにおいて記載されている。さらに、フェロセニルアミンは、これらの対応するカルバメート誘導体と比較してより低い電位（約１５０ｍＶ）でレッドクス挙動を呈することが知られている（本明細書に組み込まれている、Ｓａｇｉら、Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ａｌｄｏｌａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ；Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ｆｅｒｒｏｃｅｎｙｌａｍｉｎｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６、７８、１４５９〜１４６１頁を参照）。
【０２０３】
ＥＡＭのいくつかの例を本明細書で説明する。
【０２０４】
フェロセンベースのＥＡＭ
いくつかの実施形態では、ＥＡＭは置換１，１’−フェロセンを含む。フェロセンは空気中で安定である。これは、捕捉リガンドとアンカー基の両方で容易に置換することができる。フェロセン上の捕捉リガンドとの標的タンパク質の結合によって、これは、フェロセン周りの環境を変えるだけでなく、シクロペンタジエニル環がスピンするのを阻止することになり、これはエネルギーを約４ｋＪ／ｍｏｌ変えることになる。ＷＯ／１９９８／５７１５９；Ｈｅｉｎｚｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｎｋｅｒ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２９７４〜２９８８頁（２００４）；Ｈｅｉｎｚｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｎｋｅｒ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６〜７１頁（２００５）；およびＨｏｌｌｅｍａｎ−Ｗｉｂｅｒｇ、Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ第３４版、ａｔ  １６２０、すべてが参照により組み込まれている。
【０２０５】
【化１４】
2014532720.tif 000024
【０２０６】
いくつかの他の実施形態では、ＥＡＭは１，３−二置換フェロセンを含む。１，３−二置換フェロセンは公知であるが（Ｂｉｃｋｅｒｔら、Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ  １９８４、３、６５４〜６５７頁；Ｆａｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００２、３０８〜３０９頁；Ｐｉｃｈｏｎら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００４、５９８〜５９９頁；およびＳｔｅｕｒｅｒら、Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ  ２００７、２６、３８５０〜３８５９頁を参照されたい）、ＳＡＭにおけるこのクラスの分子の電気化学的研究は文献に報告されていない。シクロペンタジエニル（Ｃｐ）環の回転が両方のＣｐ置換基をエクリプス配座で配置することができる１，１’−二置換フェロセンと対照的に、１，３−二置換フェロセン位置異性体は、これらのＣｐ基間に硬直した幾何学的形状を強制する分子アーキテクチャを提供する。したがって、アンカー基、例えば金アンカーのための有機硫黄基ならびに捕捉リガンド、例えば受容体基、タンパク質捕捉リガンドおよび／または酵素反応性部分を有する１，３−二置換フェロセンは、受容体が、限られた自由度で、溶液／ＳＡＭ界面で示されるＳＡＭベースの電気化学的バイオセンシング用途に適している（図１を参照されたい。ここで、Ｘはアンカー基であり、Ｙは捕捉リガンドを含むことができる）。化合物１〜５などの１，３−二置換フェロセンの代表例を図１２に示す。アンカーリガンドと捕捉リガンドの両方を付着させるための１，３−二置換フェロセンの例を以下に示す：
【０２０７】
【化１５】
2014532720.tif 000025
【０２０８】
１，３−二置換フェロセンおよび捕捉リガンド、例えば過酸化物感受性部分を含むＥＡＭをＳＡＭの形成のために使用する場合、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）挙動について驚くべき予想外の増進が見られる。例えば、アルカリ条件下での過酸化水素へのボロネートの曝露により、１，３−二置換フェロセンに付着したカルバメート連結ベンジルボロン酸エステルが分解すると、ＳＡＭ厚さの変化による大きな負の角度シフトがＳＰＲによって観察される。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、合成をより簡単にするために、アンカーおよび捕捉リガンドを同じリガンドへ付着させる。いくつかの実施形態では、アンカーおよび捕捉リガンドを異なるリガンドへ付着させる。
【０２１０】
本明細書で開示する新規なアーキテクチャを構築するのに使用できる多くの配位子が存在する。それらには、これらに限定されないが、カルボキシレート、アミン、チオレート、ホスフィン、イミダゾール、ピリジン、ビピリジン、テルピリジン、ｔａｃｎ（１，４，７−トリアザシクロノナン）、サレン（Ｎ，Ｎ’−ビス（サリチリデン）エチレンジアミン）、アカセン（Ｎ，Ｎ’−エチレンビス（アセチルアセトンイミネート（−））、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、Ｃｐ（シクロペンタジエニル）、ピンサー配位子およびスコーピオネートが含まれる。いくつかの実施形態では、好適な配位子はペンタアミンである。
【０２１１】
ピンサー配位子は特異的なタイプのキレート配位子である。ピンサー配位子自体が金属中心周りを包んで、その金属の反対側上で結合をもたらし、またその中間にも結合をもたらす。金属コア電子上に対するピンサー配位子化学の効果は、アミン、ホスフィンおよび混合供与体配位子と類似している。これは、そこで金属の活性を調整することができるユニークな化学的状況を生み出す。例えば、ピンサー配位子を収容するため、複合体の立体性（sterics）に対するそうした高い必要性があるので、金属が関与できる反応は限られており、選択的なものである。
【０２１２】
スコーピオネート配位子は、ｆａｃの形で金属と結合する三座配位子を指す。最もよく知られているクラスのスコーピオネートはトリス（ピラゾリル）ヒドロボロネートまたはＴｐ配位子である。Ｃｐ配位子はＴｐとアイソローバル（isolobal）である。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、以下の拘束（restraint）が望ましい：金属錯体は、溶媒との密接な接触を可能にする小極性配位子を有するべきである。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、有機金属配位子が使用される。レドックス部分として使用するための純粋有機化合物、および複素環置換基または環外置換基としてドナー原子を含むδ結合有機配位子を有する様々な遷移金属配位錯体に加えて、π結合有機配位子を有する多種多様な遷移金属有機金属化合物が利用可能である（参照により本明細書に明白に組み込まれている、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５版、Ｃｏｔｔｏｎ＆Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９８８、２６章；Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ，Ａ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｅｌｓｃｈｅｎｂｒｏｉｃｈら、２版、１９９２、ＶＣＨ；およびＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＩ，Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  １９８２〜１９９４頁、Ａｂｅｌら編、７巻、７、８、１０および１１章、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。）。このような有機金属配位子には、シクロペンタジエニドイオン［Ｃ５Ｈ５（−１）］などの環式芳香族化合物、およびビス（シクロペンタジエニル）金属化合物（すなわち、メタロセン）のクラスを生じるインデニリド（−１）イオンなどの様々な環置換誘導体および環縮合誘導体が含まれる。例えば、参照により組み込まれている、Ｒｏｂｉｎｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０４：１８８２〜１８９３頁（１９８２）；およびＧａｓｓｍａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０８：４２２８〜４２２９頁（１９８６）を参照されたい。これらのうちで、フェロセン［（Ｃ５Ｈ５）２Ｆｅ］ならびにその誘導体は、原型的な例であり、これらは、多種多様な化学的（参照により組み込まれているＣｏｎｎｅｌｌｙら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９６：８７７〜９１０頁（１９９６））、ならびに電気化学的（参照により組み込まれているＧｅｉｇｅｒら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３：１〜９３頁；およびＧｅｉｇｅｒら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４：８７頁）電子移動反応または「レドックス」反応において使用されている。第１列、第２列、および第３列遷移金属のメタロセン誘導体は、核酸のリボース環またはヌクレオシド塩基に共有結合的に付着されるレドックス部分としての潜在的な候補である。他の潜在的に適当な有機金属配位子には、ビス（アレーン）金属化合物を生じるベンゼンなどの環式アレーン、ならびに環置換誘導体および環縮合誘導体が含まれ、これらのうちでビス（ベンゼン）クロムが原型的な例である。他の非環式π結合配位子、例えば、アリル（−１）イオンまたはブタジエンなどは、潜在的に適当な有機金属化合物を生じ、すべてのこのような配位子は、π結合配位子およびδ結合配位子と併せて、金属炭素結合が存在する有機金属化合物の一般的なクラスを構成する。架橋有機配位子、および追加の非架橋配位子を有し、かつ金属−金属結合を有する、および有さない化合物の様々な二量体およびオリゴマーの電気化学的試験は、核酸分析における潜在的な候補レドックス部分である。
【０２１５】
共配位子の１つまたは複数が有機金属配位子であるとき、配位子は一般に、有機金属配位子の炭素原子の１つを介して付着されるが、結合は、複素環配位子の他の原子を介している場合がある。好適な有機金属配位子には、置換誘導体を含めたメタロセン配位子、およびメタロセノファンが含まれる（Ｃｏｔｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｅｎｓｏｎ、上記の１１７４頁を参照）。例えば、メチルシクロペンタジエニルなどのメタロセン配位子の誘導体は、ペンタメチルシクロペンタジエニルなどの複数のメチル基を有するものが好適であり、メタロセンの安定性を増大させるのに使用することができる。好適な実施形態では、メタロセンの２つのメタロセン配位子のうちの１つのみが誘導体化されている。
【０２１６】
本発明で特に有用なのは、メタロセン、特に、少なくとも第１の自壊的部分が付着されたフェロセンであるＥＡＭであるが、いくつかの実施形態では、１つを超える自壊的部分が以下に記載されるように付着される（本明細書に広く記載されているように、自壊的部分を有する他のＥＡＭも使用することができることにも留意されるべきである）。いくつかの実施形態では、１つを超える自壊的部分がフェロセンに付着されているとき、これらはすべて、シクロペンタジエニル環の１つに付着されている。いくつかの実施形態では、自壊的部分は、異なる環に付着されている。いくつかの実施形態では、シクロペンタジエニル環の１つまたは両方を、１つの部位が電極への付着に使用される限り、自壊的部分で飽和させることが可能である。
【０２１７】
さらに、ＥＡＭは一般に、電極にＥＡＭを付着させるのに使用される導電性オリゴマーにＥＡＭが付着するための付着部分を有する。一般に、要求されるわけではないが、フェロセンなどのメタロセンの場合では、図１に一般に表されているように、自壊的部分（複数可）は、シクロペンタジエニル環の１つに付着され、付着部分は、他の環に付着されるが、同じ環への付着も行うことができる。当業者が理解することになるように、自壊的部分および少なくとも１つの付着リンカーの任意の組合せを使用することができ、いずれかの環に使用することができる。
【０２１８】
自壊的部分（複数可）および付着部分（複数可）に加えて、フェロセンは、少なくとも自壊的基の存在または非存在下でＥ０を変更することを含めた様々な理由で付加され得る追加の置換基を含むことができる。適当な置換基は、「Ｒ」基として、関連し、組み込まれている参考文献でしばしば表され、参照により本明細書に組み込まれている、２００８年１０月１７日に出願された米国特許出願第１２／２５３，８２８号；２００８年１０月１７日に出願された米国特許出願第１２／２５３，８７５号；２０１０年５月７日に出願された米国仮特許出願第６１／３３２，５６５号；２０１０年５月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／３４７，１２１号；および２０１０年７月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／３６６，０１３号に列挙されている。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、以下に表すように、ＥＡＭは、過酸化物感受性部分がＥＡＭに直接付着され、２つのユニークな電位Ｅｏ１およびＥｏ２で定量可能な電気化学的信号をもたらす場合、自壊的部分を含まない。過酸化物感受性部分が過酸化物に曝露されるとき。以下に示すように、一実施形態では、過酸化物感受性部分がＥＡＭ（この場合、フェロセン）に直接付着することが可能であり、その結果、フェロセンは、ピナコールボロン酸エステル部分が付着しているとき第１のＥ０１、および例えば、過酸化物の存在下で除去されると第２のＥ０２を有する。一般に、ＰＳＭ（過酸化物感受性分子）ピナコールボロネートは、以下に示すように、１，１’置換でフェロセン上のアンカーに付着されている。
【０２２０】
【化１６】
2014532720.tif 000026
【０２２１】
以下に示すものなどの好適な実施形態では、ＥＡＭは、過酸化物感受性部分がＥＡＭに直接付着され、２つのユニークな電位Ｅｏ１およびＥｏ２で定量可能な電気化学的信号をもたらす場合、自壊的部分を含まない。過酸化物感受性部分が過酸化物に曝露されている場合。以下に示すように、一実施形態は、過酸化物感受性部分がＥＡＭ（この場合、フェロセン）に直接付着されるようにし、その結果、ピナコールボロン酸エステル部分が付着されている場合、フェロセンは第１のＥｏ１を有し、例えば過酸化物の存在下で除去されると第２のＥｏ２を有する。ＰＳＭ（過酸化物感受性分子）ピナコールボロネートは、以下に示すように、ユニークな１，３置換でフェロセン上のアンカーに付着され得る。
【０２２２】
【化１７】
2014532720.tif 000027
【０２２３】
本発明の一態様では、フェロセン化合物は式（ＩＩＩ）：
【０２２４】
【化１８】
2014532720.tif 000028
【０２２５】
（式中、Ｒ１は、水素、−Ｓ−Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、−Ｓ−Ｃ２〜Ｃ２０アルケニルまたは−Ｓ−Ｃ２〜Ｃ２０アルキニルであり、
Ｘは、−Ｃ１〜Ｃ２０アルキル−、−Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル−、−Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル−、−Ｘ１−ＣＯＮＨ−、−Ｘ１−ＣＯ２−または−Ｘ１−ＯＣＮＨ−であり、ここでＸ１は、ポリオキシアルキレン、ポリメチレン、オリゴフェニレンおよびポリフェニレン（エチニレン）からなる群から選択され、
Ｒ２は水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ３は−ＮＲ４Ｒ５、−ＣＯ２Ｒ５、−ＣＯＮＲ４Ｒ５または−ＮＲ５ＣＯ２−Ｒ６であり、
ここでＲ４は水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ここでＲ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、アリール（Ｃ２〜Ｃ６アルケニル）、ヘテロアリール（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）またはヘテロアリール（Ｃ２〜Ｃ６アルケニル）であり、ここで、それぞれは、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ３、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、アミノ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、ジＣ１〜Ｃ６アルキルアミノ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯ２（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）２または過酸化物感受性部分から選択される１〜４個の置換基で任意選択で置換されており、
ここでＲ６は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、アリール（Ｃ２〜Ｃ６アルケニル）、ヘテロアリール（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）またはヘテロアリール（Ｃ２〜Ｃ６アルケニル）であり、ここで、それぞれは、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ３、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、アミノ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、ジＣ１〜Ｃ６アルキルアミノ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯ２（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）２または過酸化物感受性部分から選択される１〜４個の置換基で任意選択で置換されている）
の化合物である。
【０２２６】
本発明の一実施形態では、本開示は、Ｒ１が水素または−Ｓ−Ｃ１〜Ｃ２０アルキルである式（ＩＩＩ）のフェロセン化合物を提供する。
【０２２７】
別の実施形態では、本開示は、Ｒ１が水素である、式（ＩＩＩ）を参照して上述したようなフェロセン化合物を提供する。
【０２２８】
他の実施形態では、本開示は、Ｒ１が−Ｓ−Ｃ６〜Ｃ１２アルキルである、式（ＩＩＩ）を参照して上述したような化合物を提供する。
【０２２９】
他の実施形態では、本開示は、Ｘが−Ｃ１〜Ｃ２０アルキル−、−Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル−または−Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル−である、式（ＩＩＩ）を参照して上述したようなフェロセン化合物を提供する。別の実施形態では、Ｘは−Ｃ１〜Ｃ２０アルキル−である。別の実施形態では、Ｘは−Ｃ５〜Ｃ１１アルキル−である。
【０２３０】
他の実施形態では、本開示は、Ｘがノニレンである、式（ＩＩＩ）を参照して上述したようなフェロセン化合物を提供する。
【０２３１】
さらに別の実施形態では、本開示は、Ｘが−Ｘ１−ＣＯＮＨ−、−Ｘ１−ＣＯ２−または−Ｘ１−ＯＣＮＨ−であり、Ｘ１がポリオキシアルキレン、ポリメチレン、オリゴフェニレンおよびポリフェニレン（エチニレン）からなる群から選択される、式（ＩＩＩ）を参照して上述したようなフェロセン化合物を提供する。
【０２３２】
別の実施形態では、本開示は、Ｘが−Ｘ１−ＣＯＮＨ−であり、Ｘ１がポリオキシアルキレンである、式（ＩＩＩ）を参照して上述したようなフェロセン化合物を提供する。
【０２３３】
他の実施形態では、本開示は、Ｒ３が−ＮＲ４Ｒ５、−ＣＯ２Ｒ５または−ＣＯＮＲ４Ｒ５である、式（ＩＩＩ）を参照して上述したようなフェロセン化合物を提供する。別の実施形態では、Ｒ３は−ＮＨ２である。追加の実施形態では、Ｒ３は−ＣＯ２（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）または−ＣＯ２（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）である。
【０２３４】
さらに別の実施形態では、本開示は、Ｒ３が−ＣＯＮＲ４Ｒ５であり、Ｒ４が水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒ５がＣ１〜Ｃ６アルキル、アリール（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）またはヘテロアリール（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）である、式（ＩＩＩ）を参照して上述したようなフェロセン化合物を提供する。
【０２３５】
他の実施形態では、本開示は、Ｒ３が−ＮＲ５ＣＯ２−Ｒ６であり、Ｒ５が水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはアリール（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）である、式（ＩＩＩ）を参照して上述したようなフェロセン化合物を提供する。
【０２３６】
さらに別の実施形態では、本開示は、Ｒ６が、それぞれが過酸化物感受性部分で任意選択で置換されているアリール（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）またはＣ２〜Ｃ６アルケニルである、式（ＩＩＩ）を参照して上述したようなフェロセン化合物を提供する。さらに別の実施形態では、過酸化物感受性部分は４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルである。
【０２３７】
別の実施形態では、本開示は、Ｒ６が、過酸化物感受性部分で任意選択で置換されているヘテロアリール（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）である、式（ＩＩＩ）を参照して上述したようなフェロセン化合物を提供する。さらに別の実施形態では、過酸化物感受性部分は４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルである。一実施形態では、Ｒ６のヘテロアリール部分はピリジンである。別の実施形態では、Ｒ６はピリジニルメチルである。そうしたものは参照により本明細書に組み込まれている、Ｐｅｒｒｙ−Ｆｅｉｇｅｎｂａｕｍらの文献（Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００９、７、４８２５〜４８２８頁）に記載されている。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｒ３が：
【０２３９】
【化１９】
2014532720.tif 000029
【０２４０】
（式中、ＰＳＭは過酸化物感受性部分である）
である、式（ＩＩＩ）を参照して上述したようなフェロセン化合物を提供する。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、本開示は、過酸化物感受性部分が
【０２４２】
【化２０】
2014532720.tif 000030
【０２４３】
からなる群から選択される、式（ＩＩＩ）を参照して上述したようなフェロセン化合物を提供する。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｒ３が、
【０２４５】
【化２１】
2014532720.tif 000031
【０２４６】
である、式（ＩＩＩ）を参照して上述したようなフェロセン化合物を提供する。
【０２４７】
他の特定の実施形態では、本開示は、以下のものである：
【０２４８】
【化２２】
2014532720.tif 000032
【０２４９】
フェロセン化合物を提供する。
【０２５０】
Ｄ．スペーサー基
いくつかの実施形態では、ＥＡＭまたはＲｅＡＭＣは、付着リンカーの電極との会合を可能にする官能性部分を一般にさらに含む付着リンカーまたはスペーサー（「スペーサー１」）を介して、アンカー基（これは電極に付着している）と共有結合的に付着している。例えば米国特許第７，３８４，７４９号を参照されたい。これはその全体が参照により、特に付着リンカーの考察のため本明細書に組み込まれている。金電極の場合、硫黄原子を、官能基（本発明の目的のためには、この付着は共有結合であると考えられる）として使用できることに留意すべきである。本明細書で「スペーサー」または「付着リンカー」とは、電極の表面から離れて、レドックス活性複合体を保持する部分を意味する。いくつかの実施形態では、スペーサーは本明細書で概説するような導電性オリゴマーであるが、適切なスペーサー部分は、以下で概説するような不動態化剤および絶縁体を含む。いくつかの場合、スペーサー分子はＳＡＭ形成種である。スペーサー部分は実質的に非導電性であってよいが、好ましくは（しかし要求されるわけではない）、レドックス活性分子と電極（ＨＡＢ）との間の電子結合が、電子移動の速度を制限しないものである。
【０２５１】
さらに、ＲｅＡＭＣが使用される場合、捕捉リガンドの配位原子と捕捉リガンド自体との間に付着リンカーを用いることができる。同様に、付着リンカーは分岐していてもよい。さらに、それらがＲｅＡＭＣ中に会合されていない場合、付着リンカーは、捕捉リガンドを電極に付着させるために使用することができる。付着リンカーの一方の末端はＥＡＭ／ＲｅＡＭＣ／捕捉リガンドと連結しており、他方の末端（しかし、当業者が理解することになるように、いずれについても正確な末端である必要はない）は電極に付着されている。レドックス活性分子を含む導電性オリゴマーの共有結合性付着（および他のスペーサー分子の付着）は、使用される電極および導電性オリゴマーに応じて、様々な仕方で遂行することができる。例えば米国特許公開第２００２０００９８１０号の構造１２〜１９および添付文書を参照されたい。これはその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２５２】
一般に、スペーサーの長さは、すべてその全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第６，０１３，４５９号、同第６，０１３，１７０号および同第６，２４８，２２９号ならびに同第７，３８４，７４９号において、導電性ポリマーおよび不動態化剤について概説されている通りである。当業者が理解することになるように、スペーサーがあまり長くなってくると、レドックス活性分子と電極との間の電子的結合は急速に低下してくることになる。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、ＥＡＭまたはＲｅＡＭＣは、付着リンカーまたはスペーサー（「スペーサー２」）を介して捕捉リガンドまたは官能基に共有結合的に付着している。スペーサー２は、これらに限定されないが、長鎖（例えば、Ｃ３〜Ｃ２０）アルキル、長鎖アルケニル、長鎖アルキニル、ポリマー鎖（ポリエチレングリコールなど）、または柔軟性を提供し単分子層から離れる方へ捕捉リガンドを延長させ、より効果的な標的結合を可能にするいくつかの他の長鎖部分などのリンカーである。
【０２５４】
Ｅ．捕捉リガンド
本発明において、様々な分子を捕捉リガンドとして使用することができる。本明細書では、「捕捉リガンド」、「結合リガンド」、「捕捉結合リガンド」、「捕捉結合種」または「捕捉プローブ」は、標的分析物と結合することになる、標的分析物の存在を探るために使用される化合物を意味する。一般に、捕捉リガンドは、検出のために、標的分析物の電極への付着を可能にする。以下でより完全に概説するように、標的分析物の捕捉プローブへの付着は直接的（すなわち、標的分析物が捕捉リガンドと結合する）であっても間接的（１つまたは複数の捕捉延長リガンドが使用される）であってもよい。本明細書で「共有結合的に付着した（covalently attached）」とは、２つの部分が、σ結合、π結合および配位結合を含む少なくとも１つの結合によって付着されていることを意味する。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、結合は特異的であり、捕捉リガンドは結合対の一部である。本明細書で「特異的に結合する（specifically bind）」とは、リガンドが、検査試料の分析物と他の成分または混入物とを区分するのに十分な特異性を伴って分析物に結合することを意味する。しかし、当業者が理解することになるように、高度には特異的でない結合を用いて分析物を検出することができ、例えばそのシステムは異なる捕捉リガンド、例えば異なるリガンドのアレイを使用することができ、特定の任意の分析物の検出は、「電子鼻」が機能する方法と同様の、結合リガンドのパネルとの結合のその「印（signature）」によってである。これは、化学的分析物の検出において特に有用性が見出される。その結合は、非特異的結合を除去するための洗浄ステップを含むアッセイの条件下で、結合されたまま残るのに十分でなければならない。この結合は、非特異的結合を除去するための洗浄ステップを含むアッセイの条件下で、結合されたまま残るのに十分でなければならない。一般に、分析物と結合リガンドの脱会合定数（disassociation constant）は少なくとも１０−４〜１０−６Ｍ−１の範囲となり、好適な範囲は１０−５〜１０−９Ｍ−１であり、特に好適な範囲は１０−７〜１０−９Ｍ−１である。当業者が理解することになるように、捕捉リガンドの組成は、標的分析物の組成に依存することになる。多種多様の分析物に対する捕捉リガンドは公知であるか、または公知の技術を用いて容易に見出すことができる。例えば、分析物が一本鎖の核酸である場合、捕捉リガンドは相補的核酸であってよい。同様に、分析物は核酸結合タンパク質であってよく、捕捉結合リガンドは一本鎖かまたは二本鎖の核酸である。あるいは、分析物が一本鎖または二本鎖の核酸である場合、結合リガンドは核酸結合タンパク質であってよい。分析物がタンパク質である場合、結合リガンドはタンパク質または小分子を含む。好適な結合リガンドタンパク質にはペプチドが含まれる。例えば、分析物が酵素である場合、適切な結合リガンドは基質および阻害剤を含む。当業者が理解することになるように、会合する任意の２つの分子を分析物としても、また結合リガンドとしても使用することができる。適切な分析物／結合リガンド対には、これらに限定されないが、抗体／抗原、受容体／リガンド、タンパク質／核酸、酵素／基質および／または阻害剤、炭水化物（糖タンパク質および糖脂質を含む）／レクチン、タンパク質／タンパク質、タンパク質／小分子および炭水化物が含まれ、これらの結合パートナーも適切な分析物−結合リガンド対である。これらは、野生型配列であっても誘導体配列であってもよい。好適な実施形態では、結合リガンドは、成長ホルモン受容体、グルコーストランスポーター（特にＧＬＵＴ４受容体）、トランスフェリン受容体、上皮成長因子受容体、低密度リポタンパク質受容体、高密度リポタンパク質受容体、上皮成長因子受容体、レプチン受容体、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５およびＩＬ−１７受容体を含むインターロイキン受容体、ヒト成長ホルモン受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受��体、ＥＰＯ受容体、ＴＰＯ受容体、毛様体神経栄養因子受容体、プロラクチン受容体ならびにＴ細胞受容体などの多量体を形成することが公知である細胞表面受容体の一部（特に細胞外部分）である。本明細書で説明されるように、捕捉リガンドは、共有結合を介して配位リガンドおよび／またはアンカーと結合することができる。捕捉結合リガンドの付着方法は一般に当技術分野で公知のようにして行われることになるが、付着リンカーおよび捕捉結合リガンドの組成に依存することになる。一般に、捕捉結合リガンドは、次いで付着のために使用することができる、それぞれでの官能基の使用によって付着リンカーに付着される。付着のために好適な官能基は、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基およびチオール基である。次いで、これらの官能基を直接か、または本明細書で「Ｚ」と表されることがあるリンカーを使用して付着させることができる。リンカーは当技術分野で公知であり、例えばホモまたはヘテロ二官能性リンカーが周知である（参照により本明細書に組み込まれている、１９９４  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙカタログ、ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒｓ、１５５〜２００頁を参照されたい。）。好適なＺリンカーには、これらに限定されないが、アルキル基（置換アルキル基およびヘテロ原子部分を含むアルキル基を含む）が含まれ、短いアルキル基、エステル、アミド、アミン、エポキシ基およびエチレングリコールならびに誘導体が好ましい。Ｚは、スルホンアミドを形成するスルホン基であってもよい。
【０２５６】
このような仕方で、タンパク質、レクチン、核酸、有機小分子、炭水化物等を含む捕捉結合リガンドを付加することができる。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片を捕捉リガンドとして使用する。本明細書で「抗体」とは、抗原と特異的に結合することができる免疫グロブリンと呼ばれるグリコシル化タンパク質のファミリーのメンバーを意味する。「抗体」という用語は、全抗体の修飾によって作製されるか、または組み換えＤＮＡ技術を用いてデノボ合成されたものおよびその誘導体である、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、一本鎖抗体（例えばＦｖ）、キメラ抗体、ヒト化およびヒト抗体等を含む当技術分野で知られているような完全長抗体ならびに抗体断片が含まれる。しかし、いくつかの実施形態では、全抗体は好ましくない。その理由は、抗体がかさばり過ぎており、トランスデューサーとの干渉をもたらす可能性があるからである。したがって、いくつかの実施形態では、抗体断片およびミミトープ(mimitopes)が捕捉リガンドとして使用される。本明細書で「エピトープ」とは、抗原の実際の抗体認識部位を意味する。この用語は、「抗原決定因子」または「抗原決定部位」とも互換的に使用される。本明細書で「ミミトープ」または「ミモトープ」とは、生物学的に重要な部位、例えばエピトープまたは酵素活性部位もしくは受容体結合部位の空間的構造を有するペプチドを意味する。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、捕捉リガンドは、これに限定されないがアビマーを含む抗体代替物を含む。本明細書で「アビマー」とは、インビトロでのエキソンシャッフリングおよびファージディスプレイによって、ヒト細胞外受容体ドメインの大きなファミリーからもたらされるタンパク質を意味する。それは、一般に結合および阻害特性を有する多ドメインタンパク質である。参照により本明細書に組み込まれている、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：１５５６〜１５６１頁（２００５）を参照されたい。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、捕捉リガンドはオリゴマーペプチドを含む。これらのペプチドは、これらに限定されないが、ファージディスプレイ、Ｓｉｄｈｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３２８、３３３〜３６３頁（２０００）および１ビーズ１ペプチド法を含む当技術分野で公知の技術を用いて得ることができる。例えば、ペプチドはバイオパニング法を用いて得ることができる。Ｇｉｏｄａｎｏら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．７：１２４９〜５３頁（２００１）；これは参照により本明細書に組み込まれている。標的分析物が核酸または核酸結合タンパク質である場合、捕捉リガンドは核酸であってよい。あるいは、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，２７０，１６３号、同第５，４７５，０９６号、同第５，５６７，５８８号、同第５，５９５，８７７号、同第５，６３７，４５９号、同第５，６８３，８６７号、同第５，７０５，３３７号および関連特許に一般的に記載されているように、核酸「アプタマー」を、事実上すべての標的分析物と結合するように開発することができる。同様に、組み合わせ化学法をもとにした結合パートナーの開発に関連する広範な文献がある。この実施形態では、捕捉リガンドが核酸である場合、好適な構成物および技術は、参照により本明細書に組み込まれている、ＰＣＴ  ＵＳ９７／２００１４に概説されている。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、捕捉リガンドはアプタマーを含む。本明細書で「アプタマー」とは、ワトソン−クリック塩基対合または三重鎖形成（triplex formation）以外の機序によって、選択された非オリゴヌクレオチド分子または分子の基を特異的に認識できる一本鎖、部分的に一本鎖、部分的に二本鎖または二本鎖のヌクレオチド配列、有利には複製可能なヌクレオチド配列を意味する。本明細書で開示するアプタマーには、これらに限定されないが、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチドならびに骨格修飾、分岐点および非ヌクレオチド残基、基または架橋を含むヌクレオチドを含む、規定された配列セグメントおよび配列が含まれる。本発明のアプタマーには、部分的におよび完全に一本鎖および二本鎖のヌクレオチド分子および配列、合成ＲＮＡ、ＤＮＡおよびキメラヌクレオチド、ハイブリッド、二重鎖、ヘテロ二重鎖ならびに任意のリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはそのキメラ対応物および／またはアプタマー分子または配列の全てもしくは一部を増幅、転写または複製するのに必要な対応相補配列、プロモーターまたはプライマーアニーリング配列が含まれる。アプタマーは、可溶性分子、不溶性分子または固定され選択された分子（例えば、リガンド、受容体およびエフェクター分子）に特異的に結合することができる。あるいは、「アプタマー」という用語は、特異的結合と明らかに異なる機序によって、化学的に不活性な（chemically bland）表面を形状特異的に認識することができるヌクレオチドを含む。本発明のアプタマーは、選択された標的分子（例えば、リガンドまたは受容体）の化学的同一性より、むしろ、化学的に不活性な表面（例えば、ケイ素チップまたは炭素ナノ構造体）を含む構造的形状または表面の特徴を特異的に認識するように選択することができる。アプタマーは、分子それ自体、あるいは、ヌクレオチド分子または分子の基を含む配列セグメント、例えば規定された配列セグメントまたは合成ヘテロポリマー、多価ヘテロポリマーハイブリッド構造もしくはアプタマー多分子デバイスを含むアプタマー配列であってよい。
【０２６１】
一実施形態では、可溶性捕捉リガンドは、過酸化物生成システムを含む。本明細書の定義では、「過酸化物生成システム（peroxide generating system）」または「過酸化物生成システム（peroxide-generating system）」という用語は、その酵素基質から、あるいは次いで過酸化物を生成する別の酵素のために、中間体、例えば補助因子または別の酵素基質を生成する中間酵素成分から、過酸化物を直接生成する酵素を意味する。一例では、過酸化物生成部分は、過酸化物を生成する酵素とすることができる。グルコースオキシダーゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼなどを含めた多種多様なこのような酵素が公知である。多種多様な適当なオキシダーゼ酵素が当技術分野で公知である（それだけに限らないが、グルコースオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）、およびコリンオキシダーゼを含めた、ＥＣ１．１．３．４として分類される任意のグルコースオキシダーゼ酵素を参照）。それだけに限らないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種、マウスなどを含めた、細菌、真菌、および動物（哺乳動物を含む）を含めて、多種多様な生物に由来するグルコースオキシダーゼ酵素が周知である。ＥＣ１．３．３．６．として分類されるアシルＣｏＡオキシダーゼも有用である。
【０２６２】
あるいは、過酸化物生成システムは、中間酵素成分を含むことができる。例えば、可溶性捕捉リガンドは、ひいては酵素基質と反応することによって過酸化物を生成する、可溶性アポオキシダーゼ（apo-oxidase）酵素のリン酸化前駆体（すなわち、アポ−ＤＡＡＯに結合するＦＡＤに変換されるＦＡＤＰ）からの必要な補助因子の生成を触媒するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）などの酵素を含有することができる。このストラテジーは、アポ酵素、リン酸化補助因子、およびオキシダーゼ酵素基質の濃度が、表面に固定された標的に対して高い場合、標的結合イベントのカスケード増幅を可能にする。
【０２６３】
一実施形態では、過酸化物生成システムは過酸化物生成酵素である。過酸化物生成酵素の例には、これらに限定されないが、グルコースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）、コリンオキシダーゼおよびアシルＣｏＡオキシダーゼが含まれる。
【０２６４】
追加的な実施形態では、過酸化物生成システムは、アルカリホスファターゼまたは他の任意のホスファターゼなどの過酸化物生成システムの中間酵素成分である。
【０２６５】
一実施形態では、標的分析物はＡＴＰであり、過酸化物生成部分はグリセロール−３−オキシダーゼである。
【０２６６】
別の実施形態では、標的分析物はＮＡＤＨであり、過酸化物生成部分はＮＡＤＨオキシダーゼ（ＮＡＯＸ）である。
【０２６７】
ＶＩ．本発明の構成物を作製する方法
当業者が理解することになるように、この構成物は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて作製することができる。例えば、米国特許第６，０１３，４５９号、同第６，２４８，２２９号、同第７，０１８，５２３号、同第７，２６７，９３９号、米国特許出願第０９／０９６５９３号および同第６０／９８０，７３３号ならびに「Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」という名称の米国仮出願の開示を参照されたい。これは参照により本明細書に組み込まれている。
【０２６８】
一実施形態では、捕捉リガンドの付着のための官能基を含む種を含む電極を使用し、構成物が作製された後、相補性官能基を有する捕捉リガンドを加え、表面への捕捉リガンドの基本的に自発性の付加をもたらす。当業者が理解することになるように、使用できる多種多様の官能基／相補性官能基が存在する。適切な官能基には、これらに限定されないが、マレイミド、イミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、アルキルハライド、アリールハライド、α−ハロアシルおよびピリジルジスルフィドが含まれる。一般に、それぞれ対応／相補性官能基スルフヒドリル、アミン、アミン、スルフヒドリル、スルフヒドリル、スルフヒドリルおよびスルフヒドリル。当業者が理解することになるように、これらの官能基の配向性をスイッチすることもできる。例えば、スルフヒドリルが付着リンカー上に存在し、マレイミドを生体分子に付加させて捕捉リガンドとして使用する。本明細書で述べるように、付着させる方法は２つの成分上に存在する反応基に依存する。例示的な実施形態では、本発明のハプテンの反応性官能基および反応性部分の官能基は、それらの間に共有結合を形成することができる求電子体（electrophile）と求核体（nucleophile）を含む。あるいは、反応性官能基は、適切な波長の光を照射されて初めて化学的に反応性となる光活性化可能基を含む。一般に、反応性官能基と反応パートナーとの共役反応は、反応性官能基または反応パートナーの１つまたは複数の原子が、２つの成分を付着させる新規な連結部に組み込まれるようにする。官能基および連結部の選択された例を表１に示す。ここで、求電子基と求核基の反応によって共有結合が得られる。
【０２６９】
【表２】
2014532720.tif 000033
【０２７０】
2014532720.tif 000034
【０２７１】
官能基および相補性官能基は、場合によっては、柔軟性または立体的剛性あるいは他の理由のためにリンカーを含むこともできる。
【０２７２】
図は官能基および相補性官能基の存在を表しているが、いくつかの場合、その付加はこれらの基からの原子の喪失をもたらし、これは、官能基および相補性官能基全体が最終構成物中に存在する場合の状況を表すことを意味するものではないことに留意すべきである。
【０２７３】
さらに、図は「単官能性」リンカー、例えばマレイミドの使用を表している。ホモかまたはヘテロの二官能基を使用する追加のステップを含むことも可能である（参照により本明細書に組み込まれている、１９９４  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙカタログ、ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｃｒｏｓｓ  ｌｉｎｋｅｒｓ、１５５〜２００頁を参照されたい。）。例えば、一方の端に硫黄原子を含み、他端にアミノ基を含む付着リンカーを、アミンと反応する二官能性リンカーと反応させ、続いてアミノ基を含む捕捉リガンドを加えることができる。
【０２７４】
別の実施形態では、各成分を合成し、それらを、通常同時に電極に加えることによって本発明の構成物を作製する。すなわち、一実施形態では、付着リンカー（硫黄原子などの付着官能性部分を有する）、リガンド、遷移金属および結合リガンドを含むＲＥＡＭＣを作製し、（任意選択でＳＡＭ形成種と一緒に）電極に加える。同様に、二成分系または三成分系が図１Ｂにおいて実施されており、付着リンカーおよび付着官能基を有するＥＡＭを含む第１の種、捕捉リガンドを有する付着リンカーを含む第２の種、任意選択のＳＡＭ形成種の第３の種が、電極に対して、通常同時に加えられる。いくつかの場合、これらの成分を逐次的に加えることができ、いくつかの場合、任意選択で加熱しながら、追加のＳＡＭ形成種（および／または他の成分）を加える合成後ステップを、電極への良好なパッキングを確実にするために実施することができる。
【０２７５】
本発明の構成物は、様々な研究、臨床、品質管理または現場試験設定（field testing setting）において使用することができる。本明細書で提供する例は、例示のためだけのものであり、本発明の範囲を限定しようとするものでは全くない。さらに、本明細書で引用したすべての文献は、その中の関連するすべての内容について参照により本明細書に組み込まれている。
【０２７６】
ＶＩＩ．本発明の構成物を使用する方法
Ａ．標的分析物および試料
一態様では、本発明は、標的分析物の検出において有用な方法および構成物を提供する。本明細書で「標的分析物」もしくは「分析物」または文法的均等物とは、検出しようとするものであり、結合種、例えば以下で定義する捕捉リガンドと結合できる任意の分子または化合物を意味する。適切な分析物には、これらに限定されないが、化学小分子、例えばこれらに限定されないが農薬、殺虫剤、毒素、治療薬および乱用薬物、ホルモン、抗生物質、抗体、有機材料等を含む環境的もしくは臨床的な化学物質または汚染物質あるいは生体分子が含まれる。適切な生体分子には、これらに限定されないが、タンパク質（酵素、免疫グロブリンおよび糖タンパク質を含む）、核酸、脂質、レクチン、炭水化物、ホルモン、全細胞（原核細胞（病原性細菌など）および哺乳動物腫瘍細胞を含む真核細胞を含む）、ウイルス、胞子等が含まれる。特に好適な分析物は、酵素を含むタンパク質；薬物、細胞；抗体；抗原；細胞膜抗原および受容体（神経受容体、ホルモン受容体、栄養受容体および細胞表面受容体）またはこれらのリガンドである。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、標的分析物はシトクロムＰ４５０、アビジン／ストレプトアビジン、ＳＥＢ、ＰＳＡ−（プロテアーゼ）、トリプシン／キモトリプシン（プロテアーゼ）、炭疽菌胞子および大腸菌（E.col.）Ｏ１５７：Ｈ７である。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、標的分析物はタンパク質である。当業者が理解することになるように、本発明を使用して検出され得る多数の可能なタンパク質性標的分析物が存在する。本明細書で「タンパク質」または文法的均等物とは、天然に存在しないアミノ酸およびアミノ酸類似体、ならびにペプチド模倣構造を含有するタンパク質を含めた、タンパク質、オリゴペプチドならびにペプチド、誘導体ならびに類似体を意味する。側鎖は、（Ｒ）配置であっても、（Ｓ）配置であってもよい。好適な実施形態では、アミノ酸は、（Ｓ）またはＬ配置にある。以下に論じるように、タンパク質が捕捉リガンドとして使用される場合、試料混入物による分解を遅延させるためにタンパク質類似体を利用することが望ましい場合がある。適当なタンパク質標的分析物としては、それだけに限らないが、（１）それだけに限らないが、例えば、ヒトアルブミン、アポリポタンパク質（アポリポタンパク質Ｅを含む）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、コルチゾール、α−フェトプロテイン、チロキシン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、抗トロンビンに対する抗体、医薬品（抗てんかん薬（フェニトイン、プリミドン、カルバリエゼピン、エトスクシミド、バルプロ酸、およびフェノバルビトール）、心臓作用薬（ジゴキシン、リドカイン、プロカインアミド、およびジソピラミド）、気管支拡張剤（テオフィリン）、抗生物質（クロラムフェニコール、スルホンアミド）、抗うつ剤、免疫抑制剤、乱用薬物（アンフェタミン、メタンフェタミン、カンナビノイド、コカイン、およびオピエート）を含む）に対する抗体、ならびに任意の数のウイルス（オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス）、アデノウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、レオウイルス、トガウイルス（例えば、風疹ウイルス）、パルボウイルス、ポックスウイルス（例えば、痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス）、エンテロウイルス（例えば、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス）、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ、およびＣを含む）、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス）、ロタウイルス、ノーウォークウイルス、ハンタウイルス、アレナウイルス、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）、レトロウイルス（ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩを含む）、パポバウイルス（例えば、パピローマウイルス）、ポリオーマウイルス、およびピコルナウイルスなどを含む）ならびに細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ；Ｖｉｂｒｉｏ、例えば、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば、腸内毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、例えば、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓ．ｔｙｐｈｉ；マイコバクテリウム、例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、例えば、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ；コリネバクテリウム、例えば、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ���Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；スタフィロコッカス（ブドウ球菌）属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、例えば、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ；Ｙｅｒｓｉｎｉａ、例えば、Ｇ．ｌａｍｂｌｉａ、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、例えば、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ；Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、例えば、Ｔ．ｐａｌｌａｄｉｕｍ；などを含めた対象とする多種多様な病原性および非病原性原核生物を含む）に対する抗体を含めた免疫グロブリン、特にＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、ならびに特に治療的または診断的に関連した抗体；（２）それだけに限らないが、クレアチンキナーゼ、乳酸脱水素酵素、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、トロポニンＴ、ミオグロビン、フィブリノーゲン、コレステロール、トリグリセリド、トロンビン、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）を含めた心疾患のインジケータまたは処置として使用される酵素；アミラーゼ、リパーゼ、キモトリプシン、およびトリプシンを含めた膵臓病インジケータ；コリンエステラーゼ、ビリルビン、およびアルカリホスファターゼを含めた肝機能酵素およびタンパク質；アルドラーゼ、前立腺酸性ホスファターゼ、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ならびにＨＩＶプロテアーゼなどの細菌酵素およびウイルス酵素を含めた酵素（および他のタンパク質）；（３）ホルモンおよびサイトカイン（これらの多くは、細胞受容体のリガンドとして機能を果たす）、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ−１〜ＩＬ−１７を含む）、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１および−２を含む）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βを含む）、ヒト成長ホルモン、トランスフェリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、低密度リポタンパク質、高密度リポタンパク質、レプチン、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、繊毛様神経栄養因子、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、カルシトニン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、コルチゾール、エストラジオール、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、プロゲステロン、テストステロンなど；ならびに（４）他のタンパク質（α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原ＣＥＡを含む）がある。
【０２７９】
さらに、抗体が検出され得る生体分子のいずれも同様に直接検出することができ、すなわち、ウイルスまたは細菌性細胞、治療薬、および乱用薬物などの検出を直接行うことができる。適当な標的分析物には、それだけに限らないが、乳癌（ＣＡ１５−３、ＣＡ５４９、ＣＡ２７．２９）、ムチン様癌関連抗原（ＭＣＡ）、卵巣癌（ＣＡ１２５）、膵癌（ＤＥ−パン−２）、ならびに結腸直腸癌および膵癌（ＣＡ１９、ＣＡ５０、ＣＡ２４２）のマーカーを含めた炭水化物が含まれる。当業者が理解することになるように、本方法を使用して多数の分析物を検出することができ、基本的に、以下に記載される結合リガンドを作製することができる任意の標的分析物を、本発明の方法を使用して検出することができる。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、標的分析物はＭＲＳＡに関連するタンパク質である。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）（多剤耐性黄色ブドウ球菌またはオキサシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＯＲＳＡ）とも称される）はヒトにおける治療困難な感染症に関与している。ＭＲＳＡは、ペニシリンおよびセファロスポリンを含むβ−ラクタムと呼ばれる大集団の抗生物質に対して耐性のある黄色ブドウ球菌の菌種である。この生物はしばしば、市中感染型（Community-Associated）ＭＲＳＡ（ＣＡ−ＭＲＳＡ）または医療ケア関連（Health Care-Associated）ＭＲＳＡ（ＨＡ−ＭＲＳＡ）と下位分類されるが、この区別は複雑である。一部の著者はＭＲＳＡ感染症罹患患者に関する基準によってＣＡ−ＭＲＳＡを定義しているが、他の著者は細菌自体の遺伝的特徴によってＣＡ−ＭＲＳＡを定義している。ＣＡ−ＭＲＳＡ菌種は１９９０年代後半に最初に報告されており、これらの場合は、医療ケア環境への曝露の欠如によって定義されている。その数年内に、ＣＡ−ＭＲＳＡ感染症が、より古く、より研究がなされている医療ケア関連菌種とは異なるＭＲＳＡの菌種によって引き起こされることが明らかになった。この新規なＣＡ−ＭＲＳＡ菌種は、米国内で急速に広がっており、市中の緊急治療室でこうした感染症のための医療ケアを求める個人の間では、培養皮膚感染症の最も一般的な原因となってきている。これらの菌種は、運動選手、拘置所や刑務所の留置者、兵士、先住アラスカ人や先住アメリカ人およびスラム街（inner city）の子供たちにおける皮膚感染症も一般に引き起こす。ＭＲＳＡは、一般的な細菌黄色ブドウ球菌の耐性変種である。これは、メチシリン、ジクロキサシリン、ナフシリンおよびオキサシリンを含むβ−ラクタマーゼ耐性β−ラクタム抗生物質での治療を生き延びる能力を増進させている。ＭＲＳＡは、病院型（院内で起る）感染症において特に厄介である。病院では、開放創、侵襲的装置および弱まった免疫系を有する患者は、一般人より高い感染症のリスクがある。適切な衛生手順に従っていない病院スタッフは、患者から患者へ細菌を移す可能性がある。ＭＲＳＡ感染症を有するまたはＭＲＳＡ保菌状態（colonization）である患者への訪問者は、必要であれば、提供された手袋、ガウンおよびマスクを使用し、病院の隔離プロトコルに従うように忠告される。そうしたプロトコルに従わない訪問者は、カフェテリア、トイレおよびエレベーターへ細菌を拡散させる可能性がある。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、ＭＲＳＡ関連タンパク質はペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）である。ＰＢＰ２’は、ｍｅｃＡ遺伝子によってコードされるタンパク質であり、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の細胞膜中に存在する。ＰＢＰ２’の調製は、Ｈａｒｄｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓａｎｔａ  Ｍａｒｉａ、ＣＡ）によって配布されているＰＢＰ２’キットのためのＭＲＳＡ  Ｌａｔｅｘ  Ｔｅｓｔに記載されているプロトコルなどの、当技術分野で公知の方法を用いて実施することができる。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、その標的はＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質であり、捕捉リガンドは、ＰＢＰ２ａと結合することができる部分である。本明細書で「核酸」もしくは「オリゴヌクレオチド」または文法的均等物とは、一緒に共有結合している少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は一般にリン酸ジエステル結合を含むことになるが、以下で概説するように、いくつかの場合、例えば、ホスホルアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９（１０）：１９２５頁（１９９３）およびそこに参照されているもの；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００頁（１９７０）；Ｓｐｒｉｎｚｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９頁（１９７７）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３４８７頁（１９８６）；Ｓａｗａｉら、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５頁（１９８４）、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０頁（１９８８）；およびＰａｕｗｅｌｓら、Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  ２６：１４１  ９１９８６頁））、ホスホロチオエート（Ｍａｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１４３７頁（１９９１）；および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１頁（１９８９）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）ならびにペプチド核酸骨格および結合（Ｅｇｈｏｌｍ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５頁（１９９２）；Ｍｅｉｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８頁（１９９２）；Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：５６６頁（１９９３）；Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ３８０：２０７頁（１９９６）を参照されたい、これらのすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）を含む代替の骨格を有することができる核酸類似体が含まれる。他の類似体核酸には、陽性骨格（positive backbone）（Ｄｅｎｐｃｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：６０９７頁（１９９５）；非イオン性骨格（米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号および同第４，４６９，８６３号；Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ３０：４２３頁（１９９１）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０頁（１９８８）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ１３：１５９７頁（１９９４）；第２章および第３章、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５頁（１９９４）；Ｊｅｆｆｓら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ３４：１７（１９９４）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：７４３頁（１９９６））および米国特許第５，２３５，０３３号、同第５，０３４，５０６号ならびに第６章および第７章、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋに記載されているものを含む非リボース骨格を有するものが含まれる。１つまたは複数の炭素環系の糖を含む核酸も、核酸の定義に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．（１９９５）、１６９〜１７６頁を参照されたい）。いくつかの核酸類似体はＲａｗｌｓ、Ｃ＆Ｅ  Ｎｅｗｓ  Ｊｕｎｅ２、１９９７、３５頁に記載されている。これらのすべては、参照により本明細書に明白に組み込まれている。ＥＴＭの付加を容易にする、または生理学的環境におけるそうした分子の安定性および半減期を増大させるために、リボース−ホスフェート骨格のこれらの修飾を行うことができる。当業者が理解することになるように、これらの核酸類似体はすべて、本発明において用途を見出すことができる。さらに、天然由来の核酸と類似体の混合物を、例えば導電性オリゴマーまたはＥＡＭ付着の部位で作製することができ、類似体構造を用いることができる。あるいは、異なる核酸類似体の混合物、および天然由来の核酸と類似体の混合物を作製することができる。核酸は、指定されているように、一本鎖であっても二本鎖であってもよい、あるいは二本鎖配列または一本鎖配列の両方の部分を含むことができる。核酸はゲノムとｃＤＮＡの両方のＤＮＡ、ＲＮＡまたはハイブリッドであってよく、この核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組合せ、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサタニン、ヒポキサタニン、イソシトシン、イソグアニン等を含む塩基の任意の組合せを含む。好適な実施形態は、米国特許第５，６８１，７０２号に全般的に記載されているように、これが非特異的ハイブリダイゼーションを低減させるので、標的配列ではなく、他のプローブに対して相補的であるように指定された核酸において、イソシトシンおよびイソグアニンを使用する。本明細書で用いる「ヌクレオシド」という用語は、ヌクレオチドならびにヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体、およびアミノ修飾ヌクレオシドなどの修飾ヌクレオシドを含む。さらに、「ヌクレオシド」は、非天然由来の類似体構造を含む。したがって、例えば、それぞれが塩基を含有するペプチド核酸の個々の単位を、本明細書ではヌクレオシドと称する。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、核酸標的分析物は好ましくない。
【０２８４】
一般に、試料を本発明の構成物に加える。一態様では、本発明は、試料中の標的酵素を検出する方法を提供する。本明細書で「試料」または「検査試料」とは、１つまたは複数の検出しようとする分析物を含む構成物を意味する。試料は、様々な成分、すなわち異なるタンパク質を含む異種性のものであってよい。あるいは、試料は１つの成分を含む同種性のもであってよい。試料は天然由来材料、生物学的材料または人工的材料であってよい。この材料は、天然型であっても変性型であってもよい。試料は、単一の細胞もしくは複数の細胞、血液試料、組織試料、皮膚試料、尿試料、水試料または土壌試料であってよい。いくつかの実施形態では、試料は、単一細胞の内容物または複数細胞の内容物を含む。試料は、真核生物、原核生物、哺乳動物、ヒト、酵母または細菌などの生体からのものであっても、また試料はウイルスからのものであってもよい。試料は何ら処理なしで、または必要に応じて、処理して使用することができる。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、検査試料中に含まれる標的分析物を、存在する場合、標的分析物が捕捉結合リガンドと結合する条件下で、本発明の構成物に加える。これらの条件は、一般に生理的条件である。一般に、複数のアッセイ混合物が異なる濃度で並行して実行されて、様々な濃度に対する反応差が得られる。一般に、これらの濃度の１つは、陰性対照、すなわち、ゼロ濃度または検出レベル未満のものとして機能を果たす。さらに、任意の様々な他の試薬をスクリーニングアッセイに含めることができる。これらには、最適な結合を促進し、かつ／または非特異的もしくはバックグラウンド相互作用を低減するのに使用され得る、塩、中性タンパク質、例えば、アルブミン、界面活性剤などのような試薬が含まれる。アッセイの効率を他の方法で改善する試薬、例えば、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤なども使用することができる。成分の混合物を、要求される結合をもたらす任意の順序で添加することができる。当業者が理解することになるように、本方法を使用して多数の分析物を検出することができ、基本的に、以下に記載される捕捉リガンドを作製することができる任意の標的分析物を、本発明の方法を使用して検出することができる。
【０２８６】
さらに、当業者は、信号の損失によるアッセイにおいて本発明の構成物を使用することも可能であることを理解されよう。例えば、第１の測定をレドックス活性分子が阻害される場合に行い、次いで、標的分析物の導入の結果としてシステムを変更し、溶媒阻害分子が溶媒アクセス可能になるようにし、信号の損失をもたらす。当業者が理解することになるように、これはいくつかの方法で行うことができる。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、標的分析物が存在する場合、第１の測定を行う。次いで、例えば高い塩濃度または熱的条件を用いることによって、標的分析物を除去し、次いで第２の測定を行う。信号の損失の定量化は、アッセイの基礎としての役目を果たすことができる。あるいは、標的分析物は酵素であってよい。この実施形態では、レドックス活性分子は、酵素基質または類似体の存在によって溶媒阻害性にされるが、好ましくは１つまたは複数のリガンドとして、レドックス活性分子に共有結合的に付着することは必要ないことが好ましい。標的酵素が導入されたら、酵素は基質と会合して基質を切断する、あるいはその基質を立体的に変え、その結果、レドックス活性分子が溶媒アクセス可能になるようにする。次いでこの変化を検出することができる。この実施形態は、単一の酵素分子が複数の溶媒アクセス可能分子をもたらすことができるので、信号の増幅が得られるという点で有利である。これは、酵素、特にスカベンジャープロテアーゼまたはカルボヒドラーゼを分泌する、細菌または他の病原体の検出において特に用途を見出すことができる。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、標的分析物はプロテアーゼである。プロテアーゼは６つの群、すなわち：セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、金属プロテアーゼおよびグルタミン酸プロテアーゼに分類される。一般に、プロテアーゼは、タンパク質のアミノ酸配列に応じて特異的ペプチド結合（例えば、限定タンパク質分解に特異的なセグメント）を切断するか、または完全タンパク質をアミノ酸に分解する（非限定タンパク質分解）ことができる。その活性は、タンパク質の機能を破壊するかまたは消化してその主成分にする破壊的変化である可能性があり、それは、機能の活性化であっても、またシグナル伝達経路におけるシグナルであってもよい。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、標的酵素はエンドペプチダーゼである。本明細書で「エンドペプチダーゼ」とは、タンパク質基質の一方の末端または両方の末端からペプチド結合を切断するエクソペプチダーゼとは対照的に、タンパク質基質内のペプチド結合を切断するペプチダーゼを意味する。エンドペプチダーゼは触媒的機序をもとにして下位クラス、すなわち：セリンエンドペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、金属エンドペプチダーゼおよび他のエンドペプチダーゼに分けられる。
【０２９０】
（１）セリンエンドペプチダーゼ
このクラスは、明確に異なる２つのファミリーを含む。哺乳動物酵素、例えばキモトリプシン、トリプシンもしくはエラスターゼまたはカリクレインを含むキモトリプシンファミリー、および細菌酵素、例えばスブチリシンを含むスブチリシンファミリーである。全体的な三次元（３Ｄ）構造は２つのファミリーで異なるが、これらは同じ活性部位の幾何学的形状を有しており、触媒作用は同じ機序によって進行する。セリンエンドペプチダーゼは、基質残基と相互作用する種々の酵素サブサイト中でのアミノ酸置換に関連する、異なった基質特異性を示す。いくつかの酵素が基質で拡大された相互作用部位を有するのに対して、他の酵素はＰ１基質残基に限定された特異性を有する。
【０２９１】
（２）システインエンドペプチダーゼ
このファミリーには、植物プロテアーゼ、例えばパパイン、アクチニジンもしくはブロメライン；リソソームカテプシンならびにカテプシンＢ、Ｌ、Ｓ、Ｈ、Ｊ、ＮおよびＯを含むいくつかの哺乳動物カテプシン；細胞質カルパイン（カルシウム活性化された）ならびにいくつかの寄生虫プロテアーゼ（例えば、トリパノソーマ、住血吸虫属）およびインターロイキン変換酵素（ＩＣＥ）を含むカスパーゼが含まれる。
【０２９２】
（３）アスパラギン酸エンドペプチダーゼ
アスパラギン酸エンドペプチダーゼの大部分はペプシンファミリーに属する。ペプシンファミリーには、消化酵素、例えばペプシンおよびキモシンならびにリソソームカテプシンＤおよびプロセシング酵素、例えばレニンおよび特定の真菌プロテアーゼ（ペニシロペプシン、リゾプスペプシン、エンドチアペプシン）が含まれる。第２のファミリーは、ウイルスエンドペプチダーゼ、例えばレトロペプシンとも称されるＡＩＤＳウイルス（ＨＩＶ）からのプロテアーゼを含む。
【０２９３】
セリンおよびシステインプロテアーゼと対照的に、アスパラギン酸エンドペプチダーゼによる触媒作用は、共有結合性中間体を含まないが、四面体中間体は存在する。求核攻撃は：１つ目は水分子から２つのカルボキシル基のダイアド（diad）へ、２つ目はダイアドから基質のカルボニル酸素へ、同時ＣＯ−−ＮＨ結合切断をともなった２つの同時プロトン移動によって達成される。
【０２９４】
（４）金属エンドペプチダーゼ
金属エンドペプチダーゼは、細菌、菌類ならびにより高度な生物において見られる。これらは、その配列およびその構造は広く異なるが、その大多数の酵素は、触媒的に活性な亜鉛原子を含む。いくつかの場合、活性を失うことなく、亜鉛をコバルトまたはニッケルなどの別の金属で置き換えることができる。細菌サーモリシンは十分特性評価されており、その結晶学的構造は、亜鉛が、２つのヒスチジンおよび１つのグルタミン酸によって結合されていることを示している。多くの酵素は、亜鉛について２つのヒスチジンリガンドを提供する配列ＨＥＸＸＨを含み、一方で、第３のリガンドは、グルタミン酸（サーモリシン、ネプリライシン、アラニルアミノペプチダーゼ）かまたはヒスチジン（アスタシン）である。他のファミリーは、明確に異なるモードのＺｎ原子の結合を示す。切断可能な結合のカルボニル基への亜鉛結合水分子の攻撃の後、触媒機序は非共有結合性の四面体中間体の形成をもたらす。この中間体は、グルタミン酸プロトンの離脱基への移動によってさらに分解する。
【０２９５】
特に関心のあるものは、アデノシンデアミナーゼ、アンジオテンシン変換酵素、カルシニューリン、メタロ−β−ラクタマーゼ、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ５、腎ジペプチダーゼおよびウレアーゼを含む金属酵素である。
【０２９６】
一実施形態では、金属エンドペプチダーゼは、ＭＭＰ−１〜ＭＭＰ−１０、特にＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７およびＭＭＰ−９を含むマトリックスメタロプロテアーゼである。
【０２９７】
（５）細菌／毒素エンドペプチダーゼ
通常細菌由来である毒素エンドペプチダーゼは、宿主生物に対して破壊的な、時には致命的な影響を有する可能性がある。より良好な公知の細菌エンドペプチダーゼ毒素のいくつかを以下の表２に挙げる。
【０２９８】
【表３】
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【０２９９】
Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒（ＢｏＮＴ、血清型Ａ〜Ｇ）およびＣ．ｔｅｔａｎｉ  ｔｅｔａｎｕｓ神経毒（ＴｅＮＴ）は、エンドペプチダーゼである細菌毒素の２つの例である。ＢｏＮＴは、幼児および食物経由のボツリヌス中毒症に最も一般的に関連するものであり、本来、神経毒、および腸内にある間に毒素分子に保護と安定性を提供すると考えられている１つまたは複数の付随タンパク質を含む大きな複合体として存在する。創傷中の増殖型Ｃ．ｔｅｔａｎｉから合成されるＴｅＮＴは、他の任意のタンパク質成分と複合体を形成しないようである。
【０３００】
ＢｏＮＴは、シナプス小胞と神経シナプス膜のドッキングを制御する低分子タンパク質を特異的に切断する高度に特異的な亜鉛依存性エンドプロテアーゼである。ＢｏＮＴ  ＡおよびＢｏＮＴ  Ｅは２５−ｋＤシナプトソーム関連タンパク質（ＳＮＡＰ−２５）を特異的に切断し、ＢｏＮＴ  Ａは残基Ｑ１９７とＲ１９８との間を切断する。ＳＮＡＰ−２５は、神経伝達物質放出の制御に関与するシナプス前原形質膜タンパク質である。異なるタンパク質イソ型をコードする２つの代替の転写変異体が、ヒトのこの遺伝子ＳＮＡＰ２５Ａ（ジェンバンク受託番号ＮＰ＿００３０７２）およびＳＮＡＰ２５Ｂ（ジェンバンク受託番号ＮＰ＿５７０８２４）について記載されている。ＢｏＮＴ  Ｃは膜タンパク質シンタキシンおよびＳＮＡＰ−２５を切断する。ＢｏＮＴ  Ｂ、Ｄ、ＦおよびＧは、細胞内小胞結合膜結合タンパク質（ＶＡＭＰ、シナプトブレビンとも称される）に対して特異的である。その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｓｃｈｉａｖｏら、ＪＢＣ２６６：２３７８４〜８７頁（１９９５）；Ｓｃｈｉａｖｏら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ３３５：９９〜１０３頁（１９９３）を参照されたい。
【０３０１】
いくつかのインビトロでのアッセイが、固定された合成ペプチド基質の切断をもとにして開発されている。Ｈａｌｌｓら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ３４：１９３４〜８頁（１９９６）；Ｗｉｔｃｏｍｅら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ６５：３７８７〜９２頁（１９９９）およびＡｎｎｅら、Ａｎａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ２９１：２５３〜６１頁（２００１）。
【０３０２】
ＢｏＮＴおよびＴｅＮＴをプラスミドにコードするか（ＴｅＮＴ、ＢｏＮＴ／Ａ、Ｇおよび、場合によりＢ）またはバクテリオファージにコードし（ＢｏＮＴ／Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）、神経毒を、１５０ｋＤａの不活性ポリペプチドとして合成する。ＢｏＮＴおよびＴｅＮＴは、溶解細菌細胞から放出され、次いで、神経毒ポリペプチド中の露出したループのタンパク質分解的切断によって活性化される。各活性神経毒分子は、単一の鎖間ジスルフィド結合によって連結された重鎖（１００ｋＤａ）と軽鎖（５０ｋＤａ）からなる。ＢｏＮＴとＴｅＮＴ両方の重鎖は、２つのドメイン：その分子のＮ末端半分内に位置する毒素転座に必要な領域と、重鎖のＣ末端内に位置する細胞結合ドメインを含む。ＢｏＮＴとＴｅＮＴの両方の軽鎖は、分子の亜鉛依存性プロテアーゼ活性に必要な亜鉛結合モチーフを含む。
【０３０３】
ＢｏＮＴおよびＴｅＮＴの細胞内標的は、シナプス小胞のシナプス前原形質膜へのドッキングおよび融合に求められる、したがって神経伝達物質の放出に必須である一群のタンパク質である。ＢｏＮＴは、末梢神経系に関係する運動ニューロンのシナプス前膜上の受容体と結合する。これらのニューロン中の標的タンパク質のタンパク質分解はアセチルコリンの放出を阻害し、それによって筋肉収縮を阻止する。ＢｏＮＴ／Ｂ、Ｄ、ＦおよびＧは小胞結合膜タンパク質およびシナプトブレビンを切断し、ＢｏＮＴ／ＡおよびＥはシナプトソーム結合タンパク質ＳＮＡＰ−２５を標的とし、ＢｏＮＴ／ＣはシンタキシンおよびＳＮＡＰ−２５を加水分解する。ＴｅＮＴは中枢神経系に影響を及ぼし、２つの種類のニューロンに入ることによってそうなる。ＴｅＮＴはまず運動ニューロンのシナプス前膜上の受容体と結合するが、次いで逆行性小胞輸送によって脊髄へ遊走し、そこで神経毒は抑制性介在ニューロンに入ることができる。これらのニューロンにおける小胞結合膜タンパク質とシナプトブレビンの切断は、グリシンおよびγ−アミノ酪酸の放出を妨害し、次いでこれは筋肉収縮を誘発する。ＢｏＮＴまたはＴｅＮＴ中毒の対照的な臨床症状（それぞれ弛緩性麻痺およびけいれん性麻痺）は、影響を受けた特異的ニューロンおよびブロックされた神経伝達物質の種類の直接的な結果である。
【０３０４】
特に関心のあるものは、ＢｏＮＴ／ＬＣ（血清型Ｃ）、特にＢｏＮＴＣ／ＬＣ（他のＬＣ血清型と比較して）である。第１に、ヒトの神経細胞内部で長い半減期を有しているので、ＢｏＮＴＣ／ＬＣは、特に重大な生物テロの脅威を突きつけるものである。第２に、ＢｏＮＴＣ／ＬＣについてのインビトロでのアッセイは現在存在しない。その理由は、このＬＣプロテアーゼは、細胞膜が機能することを要求しそうであるためである。神経細胞環境において、ＢｏＮＴＣ／ＬＣは、シナプス前膜へのシナプス小胞融合に求められるシンタキシン、膜タンパク質を切断する。
【０３０５】
他の例には、エルシニア毒性因子ＹｏｐＪおよびＹｏｐＴならびにサルモネラＡｖｒＡが含まれる。他の標的分析物には、これらに限定されないが：凝固因子レベル（出血または血栓状態）、糞便エラスターゼ（例えば嚢胞性線維症または慢性膵炎における膵臓の外分泌活性）、ＰＳＡ、ＶＥＧＦおよびＥＧＦＲ（直腸癌における腫瘍応答）、ＭＭＰ−９（食道癌の腫瘍マーカーおよび初期脳梗塞マーカー）、ＭＭＰ−１３（初期脳梗塞マーカー）、カテプシンＢ（癌）、カテプシンＧ（肺気腫、関節リウマチ、炎症）、プラスミノーゲン活性化因子（血栓症、慢性炎症、癌）、ウロキナーゼ（癌）が含まれる。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、標的分析物はトロポニン（心臓トロポニンＩおよびＴ）である。トロポニンは、骨格筋および心臓筋肉（平滑筋ではない）における筋肉収縮に不可欠な３つの調節タンパク質の複合体である。トロポニンは骨格筋と心臓筋肉の両方の中に見られるが、特定のバージョンのトロポニンは筋肉の種類によって異なる。トロポニンの２つのサブタイプ（心臓トロポニンＩおよびＴ）は、心臓筋肉（心筋）への損傷の非常に感度の高い特異的な指標である。これらは、胸痛を有する患者における不安定狭心症と心筋梗塞症（心臓発作）を識別するために、血液において測定される。心筋梗塞症罹患患者は損傷を受けた心臓筋肉領域を有しており、そのため、血液中の高い心臓トロポニンレベルを有することになる。同様に、別の実施形態は競合型アッセイを利用する。この実施形態では、結合リガンドは、検出が所望される実際の分子と同じである、すなわち、結合リガンドは実際には標的分析物または類似体である。結合リガンドの結合パートナーは表面に付加され、その結果、レドックス活性分子は溶媒阻害性となり、電子移動が起こり、信号が発生する。次いで、電極と結合している同じかまたは類似した標的分析物を含む実際の検査試料を加える。検査試料分析物は結合パートナーと競合することになり、表面上の結合パートナーの損失を引き起こし、信号の減少をもたらす。類似の実施形態は、標的分析物（または類似体）が、好ましくはより大きい部分（「ブロッキング部分」）に共有結合的に付着することを利用する。分析物ブロッキング部分複合体は、標的分析物と結合する結合リガンドと結合し、レドックス活性分子を溶媒阻害性にする役目を果たす。検査試料標的分析物の導入は分析物ブロッキング部分複合体と競合する役目を果たし、より大きい複合体を放出し、より溶媒アクセス可能な分子をもたらす。本発明は、ＡＣ検出方法を用いて分析物を検出するための装置をさらに提供する。この装置は、少なくとも第１の測定または試料電極および第２の測定または対向電極を有する試験チャンバーを備える。３つの電極システムも有用である。第１および第２の測定電極は検査試料受け入れ領域と接触しており、その結果、液体検査試料の存在下で、２つの電極は電気的に接触することができる。
【０３０７】
一実施形態では、この方法は、全タンパク質の割合として糖化タンパク質を決定するために使用される。本方法は、特定の実施形態、すなわち、糖化ヘモグロビン（例えばヘモグロビンＡ１Ｃ）と総ヘモグロビンの比の単回測定検出によって例示される。しかし、例示した方法を拡張して、広範囲の糖化血清タンパク質（例えば、フルクトサミン）、または糖化アルブミンに適用することができ、３種すべては可能性がある糖尿病マーカーとして使用される。しかし、これは、すべての他の可能性がある糖化タンパク質、例えば、アルブミン、免疫グロブリン、リポタンパク質、フィブリノーゲン、調節タンパク質、および凝固因子などを含むように拡張することもできる。より詳細には、これらのタンパク質として、α２−マクログロブリン、３つのタイプ−α、β、およびγのものである他のグロブリン、αアンチトリプシン、トランスフェリン、プロトロンビン、ＭＢＬまたはＭＢＰ、プレアルブミン、α１アンチトリプシン、α１酸性糖タンパク質、α１フェトプロテイン、ハプトグロビン、α２マクログロブリン、セルロプラスミン、転移Ｃ３／Ｃ４β２ミクログロブリン（Transferring C3/C4 Beta 2 microglobulin）、βリポタンパク質、γグロブリンタンパク質、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を挙げることができる。
【０３０８】
他の実施形態では、上述した方法は、タンパク質がヘモグロビンであり、糖化タンパク質が糖化ヘモグロビンであるものである。別の実施形態では、タンパク質はヘモグロビンであり、糖化タンパク質はヘモグロビンＡ１ｃである。さらに別の実施形態では、糖化タンパク質は、糖化血清タンパク質、フルクトサミン、および糖化アルブミンである。
【０３０９】
さらに別の実施形態では、第１の測定電極は、本明細書で説明するものなどのスペーサーを介し、好ましくは導電性オリゴマーを介して共有結合的に付着したレドックス活性複合体を含む。あるいは、第１の測定電極は、共有結合的に付着したレドックス活性分子および結合リガンドを含む。この装置は、試験チャンバー、すなわち測定電極と電気的に接続された電圧源をさらに備える。電圧源は、必要なら、ＡＣ電圧およびＤＣ電圧を供給できることが好ましい。
【０３１０】
一実施形態では、装置は、入力信号と出力信号を比較できるプロセッサをさらに備える。プロセッサは、電極にカップリングされ、出力信号を受信するように構成されており、こうして標的分析物の存在を検出する。
【０３１１】
Ｂ．開始
一態様では、本発明は、標的分析物を検出する方法を提供する。検査試料中に含まれる標的分析物を、存在する場合、その標的分析物が捕捉リガンドと結合する条件下で、溶媒アクセス可能レドックス活性複合体かまたは溶媒アクセス可能レドックス活性分子と捕捉リガンドの混合物を含む電極に加える。これらの条件は一般に生理学的条件である。通常、種々の濃度に対する差分的応答を得るために、複数のアッセイ混合物を異なる濃度で並行して実行する。一般に、これらの濃度の１つは陰性対照、すなわちゼロ濃度または検出レベル以下としての役目を果たす。さらに、様々な他の任意の試薬をスクリーニングアッセイに含めることができる。これらには、最適な結合を促進し、かつ／または非特異的もしくはバックグラウンド相互作用を低減するのに使用され得る、塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤などのような試薬が含まれる。アッセイの効率を他の方法で改善する試薬、例えば、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤なども使用することができる。成分の混合物を、要求される結合をもたらす任意の順序で添加することができる。
【０３１２】
いくつかの実施形態では、標的分析物は、抗原−抗体、酵素−基質（またはいくつかの阻害剤）のタンパク質−タンパク質相互作用または受容体−リガンド相互作用におけるなどのように、可逆的に、すなわち非共有結合的に捕捉リガンドと結合することになる。
【０３１３】
好適な実施形態では、標的分析物は、不可逆的に、例えば共有結合的に結合リガンドと結合することになる。例えば、いくつかの酵素−阻害剤相互作用は不可逆的であると考えられる。あるいは、分析物は最初に可逆的に結合し、続くシステムの操作で共有結合性付着がもたらされる。例えば、結合後の化学的架橋は、当業者が理解することになるように行うことができる。例えば、ペプチドは、マレイミド安息香酸、メチルジチオ酢酸、メルカプト安息香酸、Ｓ−ピリジルジチオプロピオネート等の様々な二官能性薬剤を用いて架橋させることができる。あるいは、標的分析物および結合リガンドの上の機能的に反応性の基を、共有結合性付着を形成するように誘導することができる。分析物が結合部分に結合すると、溶媒アクセス可能レドックス活性分子は溶媒阻害性になる。本明細書で「溶媒阻害レドックス活性分子」とは、溶媒阻害レドックス活性分子の溶媒再構成エネルギーが、溶媒アクセス可能レドックス活性分子の溶媒再構成エネルギーより低いことを意味する。上述したように、これはいくつかの仕方で起こり得る。いくつかの実施形態では、標的分析物は、溶媒アクセス可能レドックス活性分子がその小極性配位子の少なくとも１個、好ましくは数個を失うように配位原子を提供する。あるいは、いくつかの実施形態では、レドックス活性分子への標的分析物の近接は配位子交換をもたらさず、むしろ、金属イオンを取り囲む領域（すなわち、第１および第２の配位圏）から溶媒を排除し、そうすることによって所要溶媒再構成エネルギーを効果的に低下させる。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、所要溶媒再構成エネルギーは、レドックス活性分子のＥ０の約１００ｍＶの低下をもたらすのに十分に低下する。それは、少なくとも約２００ｍＶの低下をもたらすのが好ましく、少なくとも約３００〜５００ｍＶの低下をもたらすのが特に好ましい。
【０３１５】
いくつかの実施形態では、所要溶媒再構成エネルギーは少なくとも１００ｍＶ低下する。少なくとも約２００ｍＶ低下するのが好ましく、少なくとも約３００〜５００ｍＶ低下するのが特に好ましい。
【０３１６】
いくつかの実施形態では、所要溶媒再構成エネルギーは、溶媒アクセス可能レドックス活性分子と電極との間の電子移動の速度に対して、溶媒阻害レドックス活性分子と電極との間の電子移動（ｋＥＴ）の速度変化をもたらすのに十分に低下する。一実施形態では、この速度変化は約３倍超であり、少なくとも約１０倍が好ましく、少なくとも約１００倍以上が特に好ましい。溶媒再配置エネルギーの判定は、当業者が理解するように行われる。簡単に言えば、マーカス理論に概説されているように、電子移動速度（ｋＥＴ）がいくつかの異なる原動力（または自由エネルギー、−ΔＧ°）で求められ、速度が自由エネルギーと等しくなる点がλである。これは、溶媒再配置エネルギーと等価であるほとんどの場合で扱うことができる。参照により本明細書に組み込まれている、Ｇｒａｙら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：５３７頁（１９９６）を参照。標的分析物の存在を示す溶媒阻害レドックス活性分子は、電子移動を開始し、溶媒阻害レドックス活性分子と電極との間の電子移動に特徴的な信号を検出することによって検出される。電子移動は一般に、電子的に開始され、電圧が好適である。電位が、修飾核酸プローブを含有する試料に印加される。印加電位の正確な制御およびバリエーションは、ポテンシオスタット、ならびに３電極システム（１つの参照電極、１つの試料電極、および１つの対電極）または２電極システム（１つの試料電極および１つの対電極）を介してのものとすることができる。これにより、レドックス活性分子の選択に部分的に依存し、使用される導電性オリゴマーに部分的に依存するシステムのピーク電子移動電位に印加電位をマッチングさせることが可能になる。好ましくは、開始および検出は、溶媒アクセス可能レドックス活性分子の溶媒再配置エネルギーと溶媒阻害レドックス活性分子の溶媒再配置エネルギーとの間の相対的差異を最大にするように選ばれる。
【０３１７】
Ｃ．検出
レドックス活性分子と電極との間の電子移動は、様々な方法で検出することができ、それだけに限らないが、アンペロメトリー、ボルタンメトリー、電気容量、およびインピーダンスを含めた電子検出が好適である。これらの方法としては、ＡＣまたはＤＣ電流に基づく時間または周波数依存法、パルス法、ロックイン技法、およびフィルタリング（高域通過、低域通過、帯域通過）がある。いくつかの実施形態では、必要なことは、電子移動の検出であり、他の実施形態では、電子移動速度を求めることができる。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、アンペロメトリー、ボルタンメトリー、電気容量、およびインピーダンスを含めた電子検出が使用される。適当な技法としては、それだけに限らないが、電解重量法；クーロメトリー（定電位クーロメトリーおよび定電流クーロメトリーを含む）；ボルタンメトリー（サイクリックボルタンメトリー、パルスボルタンメトリー（ノーマルパルスボルタンメトリー、矩形波ボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、オスターヤング矩形波ボルタンメトリー、および定電量パルス技法）；ストリッピング分析（陽極ストリッピング分析、陰極ストリッピング分析、矩形波ストリッピングボルタンメトリー）；コンダクタンス測定（電解コンダクタンス、直接分析）；時間依存電気化学分析（クロノアンペロメトリー、クロノポテンシオメトリー、サイクリッククロノポテンシオメトリーおよびアンペロメトリー、ＡＣポログラフィー（polography）、クロノ電流測定、およびクロノクーロメトリー）；ＡＣインピーダンス測定；電気容量測定；ＡＣボルタンメトリー、ならびに光電気化学がある。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、電子移動の監視は、アンペロメトリー検出を介するものである。この方法の検出では、検査試料中で、本発明の構成物を含有する電極と補助（対）電極との間に電位（別個の参照電極と比較して）を印加する。異なる効率の電子移動が、標的分析物の存在または非存在下の試料中で誘導される。アンペロメトリー的に電子移動を測定するためのデバイスは、高感度電流検出を伴い、電圧電位を制御する手段、通常ポテンシオスタットを含む。この電圧は、レドックス活性分子の電位を参照して最適化される。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、代替の電子検出モードが利用される。例えば、電位差（またはボルタンメトリー）測定は、非ファラデー（正味の電流がまったく流れない）プロセスを伴い、ｐＨ検出器および他のイオン検出器で伝統的に利用される。同様のセンサーがレドックス活性分子と電極との間の電子移動を監視するのに使用される。さらに、絶縁体の他の特性（抵抗など）および導体の他の特性（伝導率、インピーダンス、および電気容量など）を使用して、レドックス活性分子と電極との間の電子移動を監視することができる。最後に、電流（電子移動など）を生成する任意のシステムは、小磁場も生成し、いくつかの実施形態では、それを監視することができる。
【０３２１】
いくつかの実施形態では、標的を添加する前に有機溶媒中でシステムを運転することによって、システムを較正して電極上の溶媒アクセス可能レドックス活性分子の量を求めることができる。これは、センサーまたはシステムの内部対照として機能を果たすのにかなり重要である。これにより、同様の、しかし異なる対照システムを利用するのではなく、検出に使用される同じ分子で、標的を添加する前の予備測定が可能になる。したがって、検出に使用される実際の分子は、任意の実験の前に定量化することができる。水の非存在下、すなわち、アセトニトリルなどの有機溶媒中でシステムを運転すると、水が除外され、任意の溶媒再配置効果が実質的に無効になる。これにより、電極表面上にある分子の実際数を定量化することが可能になる。次いで、試料を添加することができ、出力信号を求めることができ、結合／非結合分子の比を求めることができる。これは、従前の方法に対する有意な利点である。本発明の構成物中で観察される高速の電子移動の一利点は、時間分解能により、電子電流に基づくモニターの信号対雑音結果が大いに増強され得ることであることが理解されるべきである。本発明の高速の電子移動は、電子移動開始と完了との間の高い信号および定型的遅延の両方をもたらす。電子移動のパルス開始および検出の「ロックイン」増幅器を使用するなどにより特定の遅延信号を増幅することによって、信号対雑音の数桁の改善を実現することができる。理論に拘泥するわけではないが、電極と結合した標的分析物は、直列の抵抗およびコンデンサと同様の仕方で応答することができるようである。また、レドックス活性分子のＥ０は、標的分析物結合の結果として、シフトすることもできる。さらに、電子移動の速度をもとにして、溶媒アクセス可能レドックス活性分子と溶媒阻害レドックス活性分子を識別することができ、次いでこれを、いくつかの仕方で、標的分析物の検出に利用することができる。したがって、当業者が理解することになるように、任意の数の開始検出システムを本発明において使用することができる。
【０３２２】
いくつかの実施形態では、電子移動は、直流（ＤＣ）技法を使用して開始および検出される。上述したように、レドックス活性分子のＥ０は、標的分析物が結合した際の溶媒再配置エネルギーの変化の結果としてシフトし得る。したがって、溶媒アクセス可能レドックス活性分子のＥ０で行われる測定および溶媒阻害分子のＥ０で行われる測定により、分析物の検出が可能になる。当業者が理解することになるように、いくつかの適当な方法を、電子移動を検出するのに使用することができる。
【０３２３】
いくつかの実施形態では、電子移動は、交流電流（ＡＣ）法を使用して開始される。第１の入力電気信号が、好ましくは、少なくとも試料電極（本発明の錯体を含有する）および対電極を介してシステムに印加されて、電極と第２の電子伝達部分との間で電子移動が開始される。電圧が参照電極及び作用電極に印加される３電極システムも使用することができる。この実施形態では、第１の入力信号は、少なくとも１つのＡＣ成分を含む。ＡＣ成分は、可変振幅および周波数のものであり得る。一般に、本方法で使用するために、ＡＣ振幅は、約１ｍＶ〜約１．１Ｖの範囲であり、約１０ｍＶ〜約８００ｍＶが好適であり、約１０ｍＶ〜約５００ｍＶが特に好適である。ＡＣ周波数は、約０．０１Ｈｚ〜約１０ＭＨｚの範囲であり、約１Ｈｚ〜約１ＭＨｚが好適であり、約１Ｈｚ〜約１００ｋＨｚが特に好適である。
【０３２４】
いくつかの実施形態では、第１の入力信号は、ＤＣ成分およびＡＣ成分を含む。すなわち、試料電極と対電極との間のＤＣオフセット電圧が、第２の電子伝達部分の電気化学電位によって掃引される。掃引は、システムの最大応答が見られるＤＣ電圧を識別するのに使用される。これは一般に、レドックス活性分子の電気化学電位またはほぼ電気化学電位である。この電圧が求まると、掃引ＤＣオフセット電圧または１つもしくは複数の均一なＤＣオフセット電圧を使用することができる。約−１Ｖ〜約＋１．１ＶのＤＣオフセット電圧が好適であり、約−５００ｍＶ〜約＋８００ｍＶが特に好適であり、約−３００ｍＶ〜約５００ｍＶがとりわけ好適である。ＤＣオフセット電圧の上で、可変振幅および周波数のＡＣ信号成分が印加される。レドックス活性分子がＡＣ摂動に応答するのに十分低い溶媒再配置エネルギーを有する場合、電極とレドックス活性分子との間の電子移動に起因してＡＣ電流が生成される。
【０３２５】
いくつかの実施形態では、ＡＣ振幅は変更される。理論によって束縛されることなく、振幅が増大すると、原動力が増大すると思われる。したがって、振幅がより高いと、過電位がより高くなり、電子移動の速度がより速くなる。したがって、一般に、同じシステムにより、任意の単一周波数で、その周波数でより高い過電位を使用することによって、応答の改善（すなわち、より高い出力信号）が得られる。したがって、振幅を高い周波数で増大させて、システムを通る電子移動の速度を増大させ、より大きい感度をもたらすことができる。さらに、上述したように、電子移動の速度に基づいて溶媒アクセス可能レドックス活性分子と溶媒阻害レドックス活性分子とを区別することが可能になり得、それは次に、周波数または過電位に基づいてその２つを区別するのに使用することができる。
【０３２６】
いくつかの実施形態では、システムの測定は、少なくとも２つの別々の振幅または過電位で行われ、複数の振幅での測定が好適である。上述したように、振幅変化の結果としての応答変化は、システムの同定、較正、および定量化の基盤を形成することができる。
【０３２７】
いくつかの実施形態では、ＡＣ周波数が変更される。異なる周波数で、異なる分子は、異なる様式で応答する。当業者が理解することになるように、周波数を上げると一般に、出力電流が増大する。しかし、周波数が、電子が電極とレドックス活性分子との間を移動することができる速度より大きい場合、周波数がより高いと、出力信号が喪失または減少する。ある時点で、周波数は、溶媒阻害レドックス活性分子さえも通る電子移動の速度より大きくなり、次いで出力信号も低下する。
【０３２８】
さらに、ＡＣ技法を使用すると、共有結合的に付着されている核酸以外の実体に起因する任意の単一周波数におけるバックグラウンド信号を有意に低減すること、すなわち、望まれない信号を「ロックアウトする」または「フィルタリングする」ことが可能になる。すなわち、溶液中の電荷担体またはレドックス活性分子の周波数応答は、その拡散係数によって制限される。したがって、高い周波数で、電荷担体は、電極にその電荷を移動させるように十分急速に拡散しない場合があり、かつ／または電荷移動動態は、十分速くない場合がある。このことは、保護層単分子層を利用しない、または部分的もしくは不十分な単分子層を有する、すなわち、溶媒が電極にアクセス可能である実施形態においてとりわけ重要である。上記に概説したように、ＤＣ技法では、電極が溶媒にアクセス可能である「ホール」が存在すると、システムを「短絡する」溶媒電荷担体がもたらされ得る。しかし、本ＡＣ技法を使用して、単分子層が存在しても、存在しなくても、溶液中の１つまたは複数の電荷担体の周波数応答を防止する１つまたは複数の周波数を選ぶことができる。血液などの多くの生体液は、アンペロメトリー検出法を妨害し得るかなりの量のレドックス活性分子を含有するので、このことはとりわけ重要である。
【０３２９】
いくつかの実施形態では、システムの測定は、少なくとも２つの別々の周波数で行われ、複数の周波数での測定が好適である。複数の周波数は、スキャンを含む。好適な実施形態では、周波数応答は、少なくとも２、好ましくは少なくとも約５、より好ましくは少なくとも約１０の周波数で求められる。
【０３３０】
Ｄ．信号処理
入力信号を送信して電子移動を開始した後、出力信号が受信または検出される。出力信号の存在および規模は、入力信号の過電位／振幅；入力ＡＣ信号の周波数；電子伝達部分同士間の介在媒体の組成、すなわちインピーダンス；ＤＣオフセット；システムの環境；および溶媒に依存することになる。所与の入力信号において、出力信号の存在および規模は、金属イオンの酸化状態の変化を生じさせるのに要求される溶媒再配置エネルギーに一般に依存することになる。したがって、ＡＣ成分およびＤＣオフセットを含む入力信号を送信すると、電子は、電極とレドックス活性分子との間で移動され、溶媒再配置エネルギーが十分低いとき、周波数は範囲内であり、振幅は十分であり、出力信号をもたらす。
【０３３１】
いくつかの実施形態では、出力信号は、ＡＣ電流を含む。上記に概説したように、出力電流の規模は、いくつかのパラメータに依存することになる。これらのパラメータを変更することによって、システムをいくつかの方法で最適化することができる。
【０３３２】
一般に、本発明において生成されるＡＣ電流は、約１フェムトアンペア〜約１ミリアンペアの範囲であり、約５０フェムトアンペア〜約１００マイクロアンペアの電流が好適であり、約１ピコアンペア〜約１マイクロアンペアが特に好適である。
【０３３３】
Ｅ．装置
本発明は、ＡＣ検出法を使用して分析物を検出するための装置をさらに提供する。装置は、少なくとも第１の測定電極または試料電極、および第２の測定電極または対電極を有する試験チャンバーを含む。３電極システムも有用である。第１のおよび第２の測定電極は、検査試料受容領域と接触しており、その結果、液体検査試料の存在下で、２つの電極は、電気的接触していることができる。
【０３３４】
さらに別の実施形態では、第１の測定電極は、本明細書に記載されたものなどの、スペーサーを介し、好ましくは導電性オリゴマーを介して共有結合的に付着されたレドックス活性複合体を備える。あるいは、第１の測定電極は、共有結合的に付着されたレドックス活性分子および結合リガンドを備える。
【０３３５】
装置は、試験チャンバーに、すなわち測定電極に電気的に接続された電圧源をさらに備える。好ましくは、電圧源は、必要な場合、ＡＣ電圧およびＤＣ電圧を供給することができる。
【０３３６】
一実施形態では、装置は、入力信号と出力信号を比較することができるプロセッサをさらに備える。プロセッサは、電極にカップリングされ、出力信号を受信するように構成されており、こうして標的分析物の存在を検出する。
【０３３７】
化学的定義
本明細書で使用する以下の用語および表現は表示された意味を有する。
【０３３８】
本明細書で使用する用語に、表記された置換基とその親部分との間の結合次数を表示するために単一ダッシュ記号「−」または二重ダッシュ記号「＝」を先行させるか、かつ／またはそれを後続させることができる。単一ダッシュ記号は単結合を表示し、二重ダッシュ記号は二重結合を表示する。単一ダッシュ記号または二重ダッシュ記号の非存在下では、置換基とその親部分との間に単結合が形成されており、さらに、ダッシュ記号が別のものを表示していない限り、置換基は「左から右」へ読まれるようになっていることを理解すべきである。例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニルオキシと−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜Ｃ６アルキルは同じ官能基を表し、同様に、アリールアルキルと−アルキルアリールは同じ官能基を表す。
【０３３９】
本明細書で用いる「アルケニル」という用語は、別段の指定のない限り、２〜１０個の炭素を含み、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む直鎖または分枝鎖炭化水素を意味する。アルケニルの代表例には、これらに限定されないが、エテニル、２−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、３−ブテニル、４−ペンテニル、５−ヘキセニル、２−ヘプテニル、２−メチル−１−ヘプテニル、３−デセニルおよび３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニルが含まれる。
【０３４０】
本明細書で用いる「アルコキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子部分に付加された本明細書で定義するようなアルキル基を意味する。アルコキシの代表例には、これらに限定されないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２−プロポキシ、ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシおよびヘキシルオキシが含まれる。
【０３４１】
本明細書で用いる「アルキル」という用語は、別段の指定のない限り、１〜１０個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖炭化水素を意味する。アルキルの代表例には、これらに限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、３−メチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、２，３−ジメチルペンチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニルおよびｎ−デシルが含まれる。「アルキル」基が他の２つの部分間の連結基である場合、それは直鎖であっても分枝鎖であってもよく；その例には、これらに限定されないが、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＣ（ＣＨ３）−および−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２−が含まれる。
【０３４２】
本明細書で用いる「アルキニル」という用語は、２〜１０個の炭素原子を含み、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む直鎖または分枝鎖炭化水素基を意味する。アルキニルの代表例には、これらに限定されないが、アセチレニル、１−プロピニル、２−プロピニル、３−ブチニル、２−ペンチニルおよび１−ブチニルが含まれる。
【０３４３】
本明細書で用いる「アリール」という用語は、フェニル（すなわち、単環式アリール）、あるいは少なくとも１つのフェニル環を含む二環式環系または芳香族二環式環系の中に炭素原子だけを含む芳香族二環式環を意味する。二環式アリールは、アズレニル、ナフチル、または単環式シクロアルキル、単環式シクロアルケニルまたは単環式ヘテロシクリルと縮合したフェニルであってよい。二環式アリールは、二環式系のフェニル部内に含まれる任意の炭素原子、またはナフチルもしくはアズレニル環内の任意の炭素原子を介して親分子部分に付着されている。二環式アリールの縮合単環式シクロアルキルまたは単環式ヘテロシクリル部は、１つまたは２つのオキソおよび／またはチア基で任意選択で置換されている。特定の実施形態では、二環式アリールは、（ｉ）ナフチルまたは（ｉｉ）５もしくは６員の単環式シクロアルキル、５もしくは６員の単環式シクロアルケニルまたは５もしくは６員の単環式ヘテロシクリルのいずれかと縮合したフェニル環であり、その縮合したシクロアルキル、シクロアルケニルおよびヘテロシクリル基は、独立にオキソまたはチアである１つもしくは２つの基で任意選択で置換されているものである。
【０３４４】
本明細書で用いる「シアノ」および「ニトリル」という用語は、−ＣＮ基を意味する。
【０３４５】
本明細書で用いる「シクロアルキル」という用語は、単環式または二環式のシクロアルキル環系を意味する。単環式環系は３〜８個の炭素原子を含む環状炭化水素基であり、そうした基は飽和であっても不飽和であってもよいが芳香族ではない。特定の実施形態では、シクロアルキル基は完全に飽和されている。単環式シクロアルキルの例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルが含まれる。二環式シクロアルキル環系は架橋型単環式環または縮合二環式環である。架橋型単環式環は、単環式環の２個の非隣接炭素原子が１個〜３個の追加の炭素原子のアルキレン架橋（すなわち、−（ＣＨ２）ｗ−の形態の架橋基、ここでｗは１、２または３である）によって連結されている単環式シクロアルキル環を含む。二環式環系の代表例には、これらに限定されないが、ビシクロ［３．１．１］ヘプタン、ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［２．２．２］オクタン、ビシクロ［３．２．２］ノナン、ビシクロ［３．３．１］ノナンおよびビシクロ［４．２．１］ノナンが含まれる。縮合二環式シクロアルキル環系は、フェニル、単環式シクロアルキル、単環式シクロアルケニル、単環式ヘテロシクリルまたは単環式ヘテロアリールのいずれかと縮合した単環式シクロアルキル環を含む。架橋型または縮合二環式シクロアルキルは、単環式シクロアルキル環中に含まれる任意の炭素原子を介して親分子部分に付着されている。シクロアルキル基は、独立にオキソまたはチアである１つもしくは２つの基で任意選択で置換されている。
【０３４６】
本明細書で用いる「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉまたは−Ｆを意味する。
【０３４７】
本明細書で用いる「ハロアルキル」という用語は、本明細書で定義するようなアルキル基を介して親分子部分に付加されている少なくとも１つの本明細書で定義するようなハロゲンを意味する。ハロアルキルの代表例には、これらに限定されないが、クロロメチル、２−フルオロエチル、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチルおよび２−クロロ−３−フルオロペンチルが含まれる。
【０３４８】
本明細書で用いる「ヘテロアリール」という用語は、単環式ヘテロアリールまたは少なくとも１つの複素芳香族環を含む二環式環系を意味する。単環式ヘテロアリールは５もしくは６員環であってよい。５員環は、２つの二重結合ならびに１、２、３もしくは４個の窒素原子および任意選択の１個の酸素または硫黄原子からなる。６員環は、３つの二重結合および１、２、３もしくは４個の窒素原子からなる。５もしくは６員のヘテロアリールは、ヘテロアリール中に含まれる任意の炭素原子または任意の窒素原子を介して親分子部分に連結されている。二環式ヘテロアリールは、フェニル、単環式シクロアルキル、単環式シクロアルケニル、単環式ヘテロシクリルまたは単環式ヘテロアリールと縮合した単環式ヘテロアリールからなる。単環式ヘテロアリールの代表例には、これらに限定されないが、フリル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピロリル、テトラゾイル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、トリアジニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾオキサチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、シンノリニル、５，６−ジヒドロキノリン−２−イル、５，６−ジヒドロイソキノリン−１−イル、フロピリジニル、インダゾリル、インドリル、イソキノリニル、ナフチリジニル、キノリニル、プリニル、５，６，７，８−テトラヒドロキノリン−２−イル、５，６，７，８−テトラヒドロキノリン−３−イル、５，６，７，８−テトラヒドロキノリン−４−イル、５，６，７，８−テトラヒドロイソキノリン−１−イル、チエノピリジニル、４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾリルおよび６，７−ジヒドロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４（５Ｈ）−オニルが含まれる。特定の実施形態では、ヘテロシクリル基は、独立にオキソまたはチアである１つもしくは２つの基で任意選択で置換されている。
【０３４９】
本明細書で用いる「ヘテロシクリル」という用語は、単環式複素環または二環式複素環を意味する。単環式複素環は、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から独立に選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含み、その環が飽和されているまたは不飽和であるが芳香族ではない３、４、５、６または７員環である。３または４員環は、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される１個のヘテロ原子を含む。５員環は、ゼロまたは１つの二重結合ならびにＯ、ＮおよびＳからなる群から選択される１、２または３個のヘテロ原子を含むことができる。６または７員環は、ゼロ、１つまたは２つの二重結合ならびにＯ、ＮおよびＳからなる群から選択される１、２または３個のヘテロ原子を含む。単環式複素環は、単環式複素環に含まれる任意の炭素原子または任意の窒素原子を介して親分子部分に連結されている。単環式複素環の代表例には、これらに限定されないが、アゼチジニル、アゼパニル、アジリジニル、ジアゼパニル、１，３−ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、１，３−ジチオラニル、１，３−ジチアニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オキサジアゾリニル、オキサジアゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピロリニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、チアジアゾリニル、チアジアゾリジニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、チオモルホリニル、１，１−ジオキシドチオモルホリニル（チオモルホリンスルホン）、チオピラニルおよびトリチアニルが含まれる。二環式複素環は、フェニル、単環式シクロアルキル、単環式シクロアルケニル、単環式複素環または単環式ヘテロアリールと縮合した単環式複素環である。二環式複素環は、二環式環系の単環式複素環部中に含まれる任意の炭素原子または任意の窒素原子を介して親分子部分に連結されている。二環式ヘテロシクリルの代表例には、これらに限定されないが、２，３−ジヒドロベンゾフラン−２−イル、２，３−ジヒドロベンゾフラン−３−イル、インドリン−１−イル、インドリン−２−イル、インドリン−３−イル、２，３−ジヒドロベンゾチエン−２−イル、デカヒドロキノリニル、デカヒドロイソキノリニル、オクタヒドロ−１Ｈ−インドリルおよびオクタヒドロベンゾフラニルが含まれる。ヘテロシクリル基は、独立にオキソまたはチアである１つもしくは２つの基で任意選択で置換されている。
【０３５０】
本明細書で用いる「飽和された（saturated）」という用語は、その参照化学構造が任意の多重炭素−炭素結合を含まないことを意味する。例えば、本明細書で定義するような飽和されたシクロアルキル基にはシクロヘキシル、シクロプロピルなどが含まれる。
【０３５１】
本明細書で用いる「不飽和の（unsaturated）」という用語は、その参照化学構造が、少なくとも１つの多重炭素−炭素結合を含むが、芳香族ではないことを意味する。例えば、本明細書で定義するような不飽和シクロアルキル基には、シクロヘキセニル、シクロペンテニル、シクロヘキサジエニルなどが含まれる。
【実施例】
【０３５２】
［実施例１］
化合物２００〜２０６の合成
【０３５３】
【化２３】
2014532720.tif 000036
【０３５４】
１００ｍＬ丸底フラスコに、１−ウンデカンチオール（１．４９７３ｇ、７．９５ｍｍｏｌ）および無水メタノール（３０ｍＬ）を加えた。無水ジクロロメタン（５ｍＬ）を加えて溶解を促進した。２，２−ジチオジピリジン（１．７５４７ｇ、７．９６ｍｍｏｌ）を粉末として加え、続いてトリエチルアミン（１．１５ｍＬ、８．２７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物をアルゴンで脱酸素し、次いでアルゴンの陽圧下、室温で２４時間撹拌した。反応内容物をロータリーエバポレーターで乾燥し、溶離液でシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して化合物２００（１．８４９４ｇ、７８％）を得た。
【０３５５】
【化２４】
2014532720.tif 000037
【０３５６】
１００ｍＬシュレンクフラスコに、２００（１．８５２８ｇ、６．２３ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）と一緒に加えた。１−メルカプトウンデカン酸（１．５１０８ｇ、６．９２ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（０．７７１０ｇ、６．３１ｍｍｏｌ）を固体として反応フラスコに加え、次いで追加のテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）を加えた。反応内容物をアルゴンで脱酸素し、アルゴンの陽圧下、室温で１６時間撹拌した。反応内容物をロータリーエバポレーターで乾燥し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物２０１（１．０２０７ｇ、４０％）を得た。
【０３５７】
【化２５】
2014532720.tif 000038
【０３５８】
２５０ｍＬ丸底フラスコに、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．１４３５ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（１００ｍＬ）と一緒に加えた。内容物を手短く超音波浴に入れて溶解を促進し、次いで化合物２０１（０．５０７８ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を一挙にジクロロメタン溶液（１０ｍＬ）として加えた。ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．２８７６ｇ、１．３９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１０ｍＬ）を２３分間かけて滴下添加し、続いてアルゴンを３０分間バブリングさせて脱酸素した。内容物をアルゴンの陽圧下、室温で１７時間撹拌した。反応内容物をろ過してジシクロヘキシル尿素沈殿物を除去し、ロータリーエバポレーターで２０〜２５ｍＬに濃縮し、次いでシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物２０２（０．３８９２ｇ、６２％）を得た。
【０３５９】
【化２６】
2014532720.tif 000039
【０３６０】
２５ｍＬ丸底フラスコに、Ｂｏｃ−Ｄ−２，４−ジアミノ酪酸（０．３０８０ｇ、１．４１ｍｍｏｌ）および無水マレイン酸（０．１４１５ｇ、１．４４ｍｍｏｌ）を氷酢酸（８ｍＬ）と一緒に加えた。反応内容物をアルゴンの陽圧下、室温で４．５時間撹拌した。反応内容物を真空ラインで乾燥して、すべての揮発分を除去して化合物２０３（０．４４９０ｇ）を得た。この物質をさらに精製することなくそのまま使用した。推定純度は１Ｈ  ＮＭＲデータベースで６５％である。
【０３６１】
【化２７】
2014532720.tif 000040
【０３６２】
１００ｍＬシュレンクフラスコに、２０３（０．２９１９ｇ、０．９２ｍｍｏｌ）を無水トルエン（４０ｍＬ）およびトリエチルアミン（４００μＬ、２．８９ｍｍｏｌ）と一緒に加えた。フラスコにディーンスターク装置を取り付け、側部アーム部（side arm）を無水トルエンで満たした。この装置全体をアルゴンでフラッシュし、フラスコを４．５時間激しく還流させた。反応内容物をロータリーエバポレーターで乾燥して黄褐色／褐色の油状物を得た。この油状物を水（２０ｍＬ）に溶解し、クエン酸（５０ｍＬ水溶液）で酸性化した。粗生成物の抽出をジクロロメタン／メタノール（９：１）で実施した。この有機溶液をロータリーエバポレーターで濃縮し、次いでシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物２０４（０．２６４７ｇ、９６％）を得た。
【０３６３】
【化２８】
2014532720.tif 000041
【０３６４】
２５ｍＬ丸底フラスコに、アルゴン下でＨＣｌ（ジオキサン中４Ｍ、１０ｍＬ；４０ｍｍｏｌ）を加えた。内容物を氷水浴中で冷却し、次いで化合物２０４を入れた予備冷却した２５ｍＬ丸底フラスコに移した。内容物をアルゴン下、０℃で４５分間撹拌し、次いで室温に温め、さらに２時間撹拌した。すべての溶媒と過剰ＨＣｌを真空ラインで除去し、粗製残留物を、溶離液として水を用いてＤｏｗｅｘ１Ｘ２−１００陰イオン交換樹脂に通して化合物２０５（０．２００４ｇ、９８％）を得た。
【０３６５】
【化２９】
2014532720.tif 000042
【０３６６】
５０ｍＬシュレンクフラスコに２０２（０．０２２０ｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）および無水アセトニトリル（６ｍＬ）を加えた。２０３（０．０１０５ｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（８．５μＬ、０．０４９ｍｍｏｌ）を順次加え、不均一内容物をアルゴン下、室温で撹拌した。３０分後、追加のジイソプロピルエチルアミン（８．５μＬ、０．０４９ｍｍｏｌ）を反応混合物に加えて２０３の溶解を促進した。ジメチルアセトアミド（１．５ｍＬ）を滴下添加して均一溶液を得た。内容物をアルゴンでフラッシュし、室温で１７時間撹拌した。反応内容物を真空ラインでポンピングして乾燥させ、次いでジクロロメタンに溶解し、クエン酸水溶液で洗浄した。ジクロロメタン（４×２０ｍＬ）で抽出し、続いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけて化合物２０６（０．０１１４ｇ、４５％）を得た。
【０３６７】
［実施例２］
１，３−二置換フェロセンＥＡＭ
一連の１，３−二置換フェロセン誘導体（１〜４）を、金の上でのＳＡＭ形成のために、異なる官能性部分および有機硫黄アンカー基を用いて合成した（図１２）。
【０３６８】
【化３０】
2014532720.tif 000043
【０３６９】
１〜４の合成を、６（Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ、１９８４、３、６５３頁）から出発する図１３および図１４で示す。中間体１０（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２００９、４８、４４０６頁）および１４（Ｃｏｍｍ．２００２、３２、２６６９頁）は上述したようにして調製した。図１９Ｃは、１のウンデカンチオールでの希薄ＳＡＭについての代表的なサイクリックボルタモグラム（ＣＶ）を示す（Ａｕ電極で、１０Ｖ／Ｓｅｃの走査速度）。ＣＶは、２８０ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）の見掛け（apparent formal）電位（Ｅ０’）で単一の可逆的レドックス波を含み、酸化的ピーク電流と還元的ピーク電流の比は１近傍であり、２９ｍＶのピーク分裂は、当技術分野で公知の正常に挙動する電気活性フェロセンＳＡＭと一致する。
【０３７０】
１，３−二置換フェロセンと同様に官能化された１，１’−二置換位置異性体との溶液／ＳＡＭ界面での官能基反応性を比較するため、２および５の純粋な単分子層を金スライド上に調製した。どちらの化合物も、アミン保護基としてカルバメート結合ベンジルボロン酸エステルを含む。過酸化水素でボロネート酸化し、続いてアルカリ加水分解し、これらの官能基に、プログラム化された分解（programmed disassembly）（Ｌｏ，Ｌ．−Ｃ．；Ｃｈｕ，Ｃ．−Ｙ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００３、２７２８〜２７２９頁を参照されたい）を施すと、キノンメチドおよび二酸化炭素を放出して、カルバメート窒素を第一級アミンに転換させる（すなわち、２＋Ｈ２Ｏ２→３）。したがって、２および５のＳＡＭ中のボロン酸エステル基が溶液／ＳＡＭ界面で同等に示されると、過酸化水素への曝露はこれらの保護基（ＭＷ＝２６２）を取り外し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で監視できる各ＳＡＭの膜厚に同じような変化をもたらすことになる。金と結合した成分の分子量を減少させると、ＳＰＲ角度における負のシフトがもたらされる。図１８は、過酸化水素（０．１Ｍ）への曝露前後での、２（Ａ）および５（Ｂ）のＳＡＭについてのリアルタイムのＳＰＲセンサーグラムを示す。洗浄後、２について観察された共鳴角度の変化は、過酸化物で１０分後−７０ｍｄｅｇである。対照的に、５のＳＡＭは、２０分間の反応および洗浄後で−２０ｍｄｅｇの変化に過ぎない。２についてのより大きいシフトは、硬直した１，３−フェロセンアーキテクチャのため、より反応性の官能基が溶液に曝露されている５より、秩序あるＳＡＭによって合理的に説明することができる。
【０３７１】
［実施例３］
１，３−二置換フェロセンＥＡＭ２１〜２４
以下の略語を用いた：ＤＣＭ、ジクロロメタン；ＨＯＡｃ、酢酸；ＰＰｈ３、トリフェニルホスフィン；ＴＨＦ、テトラヒドロフラン；ＥＤＣ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド；ＫＯＨ、水酸化カリウム；ＴＦＡ、トリフルオロ酢酸；ＴＥＳ、トリエチルシラン；ＤＰＰＡ、ジフェニルホスホリルアジド；ＴＥＡ、トリエチルアミン；ＤＢＴＣ、ジ−ｎ−ジブチルスズジラウレート；ＮａＨ、水素化ナトリウム；ＭｅＩ、ヨードメタン；ＤＭＡＰ、ジメチルアミノピリジン。
【０３７２】
別の一連の１，３−二置換フェロセン誘導体（２１〜２４、図１５）を、金の上でのＳＡＭ形成のために異なる官能性部分および有機硫黄アンカー基を用いて合成した。ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の化合物６（０．２１５ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）の０℃溶液に、水素化ホウ素ナトリウム（０．１１４ｇ、３．００ｍｍｏｌ）を加えた。ＭｅＯＨ（６ｍＬ）を１５分間かけて徐々に加えた。反応物を撹拌し、１時間室温に温めた。反応物を減圧下で濃縮し、粗製残留物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に溶解し、ブライン（３×１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧下で濃縮して粗製固体を得た。カラムクロマトグラフィーで精製して７をオレンジ色固体（１９７ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ、９１％）として得た。
【０３７３】
ＡｃＯＨ（３５ｍＬ）中の化合物７（０．５３５ｇ、１．８６ｍｍｏｌ）およびアジ化ナトリウム（０．７２６ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）の溶液を６０℃で２０時間撹拌した。反応物をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、ＮａＨＣＯ３（ａｑ）（３×１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧下で濃縮して粗製褐色油状物を得た。カラムクロマトグラフィーで精製して８をオレンジ色油状物（０．４４１ｇ、１．４１ｍｍｏｌ、７６％）として得た。
【０３７４】
ＴＨＦ（２５ｍＬ）中の化合物８（０．４３０ｇ、１．３７ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（０．４３１ｇ、１．６４ｍｍｏｌ）の溶液を６０℃で２０時間撹拌した。反応物を減圧下で濃縮して粗製油状物を得、これをカラムクロマトグラフィーで精製して９をダークオレンジ色油状物（０．３７１ｇ、１．２９ｍｍｏｌ、９４％）として得た。
【０３７５】
トルエン（４０ｍＬ）中の１１−メルカプトウンデカン酸（２．７０ｇ、１２．４ｍｍｏｌ）、塩化トリチル（４．１４ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（５．１７ｍｍｏｌ、２８．７ｍｍｏｌ）の溶液を室温で２０時間撹拌した。反応物を減圧下で濃縮し、粗製残留物をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解し、Ｈ２Ｏ（３×１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧下で濃縮して粗製黄色油状物を得た。カラムクロマトグラフィーで精製して１０を白色固体（４．１４ｇ、７３％）として得た。
【０３７６】
ＤＣＭ（３０ｍＬ）中の化合物９（０．３５５ｇ、１．２４ｍｍｏｌ）および１０（０．５７１ｇ、１．２４ｍｍｏｌ）の０℃溶液に、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドＨＣｌ（０．２４９ｇ、１．３０ｍｍｏｌ）を加えた。５時間撹拌した後、反応物を減圧下で濃縮して粗製褐色油状物を得た。カラムクロマトグラフィーで精製して１１を粘性のオレンジ色油状物（０．７２４ｇ、０．９９ｍｍｏｌ、８０％）として得た。
【０３７７】
ＥｔＯＨ（３０ｍＬ）中の化合物１１（０．７２０ｇ、０．９９ｍｍｏｌ）の溶液にＨ２Ｏ（３ｍＬ）中の水酸化カリウム（０．３３３ｇ、５．９３ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応物を７０℃に加熱した。２４時間撹拌した後、反応物を減圧下で濃縮して粗製残留物を得た。粗製残留物をＨ２Ｏ（１００ｍＬ）に溶解し、ｐＨ＝４．０に酸性化し、ＤＣＭ（４×１００ｍＬ）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧下で濃縮してオレンジ色油状物を得た。オレンジ色油状物をカラムクロマトグラフィーで精製して１２を明るい黄色の固体（０．５８９ｇ、０．８４ｍｍｏｌ、８５％）として得た。
【０３７８】
【化３１】
2014532720.tif 000044
【０３７９】
ＤＣＭ（５ｍＬ）中の化合物１２（０．１３０ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）およびトリエチルシラン（５９１μＬ、３．７ｍｍｏｌ）の溶液にＤＣＭ（５ｍＬ）中のＴＦＡ（０．５ｍＬ）の溶液を加えた。反応物を１６時間撹拌し、濃縮して粗製オレンジ色油状物を得た。カラムクロマトグラフィーで精製して１を黄色油状物（０．０７８ｇ、０．１７ｍｍｏｌ、９２％）として得た。
【０３８０】
ＴＨＦ（３０ｍＬ）中の化合物１２（０．４５６ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）の溶液にジフェニルホスホリルアジド（１６８μＬ、０．７８ｍｍｏｌ）を加え、続いてトリエチルアミン（１３６μＬ、０．９８ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を２０時間撹拌し、減圧下で濃縮して粗製赤色油状物を得た。カラムクロマトグラフィーで精製して１３を赤色／オレンジ色固体（０．４００ｇ、０．５５ｍｍｏｌ、８５％）として得た。
【０３８１】
トルエン（３０ｍＬ）中の化合物１３（０．２９８ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）および１４（０．１０６ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）の溶液にジ−ｎ−ブチルスズジラウレート（１２μＬ、０．００２ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を１００℃で４時間撹拌し、減圧下で濃縮して粗製褐色油状物を得た。カラムクロマトグラフィーで精製して１５を明るい黄色の油状物（０．３０５ｇ、０．３３ｍｍｏｌ、８０％）として得た。
【０３８２】
【化３２】
2014532720.tif 000045
【０３８３】
ＤＣＭ（２ｍＬ）中の化合物１５（０．１３４ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＭ（２ｍＬ）中のトリフルオロ酢酸（２００μＬ）、トリエチルシラン（１１５μＬ、０．７２ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応物を室温で３時間撹拌し、減圧下で濃縮して粗製褐色油状物を得た。カラムクロマトグラフィーで精製して２を黄色固体（０．０７２ｇ、０．１０ｍｍｏｌ、７２％）として得た。
【０３８４】
【化３３】
2014532720.tif 000046
【０３８５】
ＴＨＦ（３ｍＬ）中の化合物１５（０．０６５ｇ、０．０７ｍｍｏｌ）の０℃溶液に、ヨードメタン（３４μＬ、０．７０ｍｍｏｌ）を加え、続いて水素化ナトリウム（０．０１７ｇ、０．７０ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を１．５時間撹拌し、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）でクエンチした。粗生成物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）に溶解し、Ｈ２Ｏ（３×５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮して粗製黄色油状物を得た。カラムクロマトグラフィーで精製して２１を黄色油状物（０．０４５ｇ、０．０５ｍｍｏｌ、６８％）として得た。
【０３８６】
【化３４】
2014532720.tif 000047
【０３８７】
化合物２２を、ヨードメタンを塩化ベンジルで置き換えたこと以外は２１と同じ手順にしたがって得た。
【０３８８】
【化３５】
2014532720.tif 000048
【０３８９】
ＤＣＭ（１ｍＬ）中の化合物２１（０．０４０ｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）の溶液にＤＣＭ（１ｍＬ）中のトリフルオロ酢酸（１００μＬ）およびトリエチルシラン（３４μＬ、０．２１ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応物を室温で３時間撹拌し、減圧下で濃縮して粗製褐色油状物を得た。カラムクロマトグラフィーで精製して２３を黄色油状物（０．０２４ｇ、０．０３３ｍｍｏｌ、７９％）として得た。
【０３９０】
【化３６】
2014532720.tif 000049
【０３９１】
化合物２４を、２３と同じ手順にしたがって得た。
【０３９２】
［実施例４］
１，３−二置換フェロセンＥＡＭ３１
図１６Ｂに示すように、ＤＣＭ（２５ｍＬ）中の２５（０．２５９ｇ、０．９０ｍｍｏｌ）の０℃溶液に、ＢＯＣ−グリシン（０．２６９ｇ、１５３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（０．２３５ｇ、１．５３ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（０．３１１ｇ、１．６２ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を１９時間撹拌し、減圧下で濃縮した。カラムクロマトグラフィーで精製して２６を暗黄色油状物（０．３９７ｇ、０．８９ｍｍｏｌ、９９％）として得た。
【０３９３】
エタノール（３０ｍＬ）中の２６（０．３９７ｇ、０．８９ｍｍｏｌ）の溶液にＨ２Ｏ（３ｍＬ）中の水酸化カリウム（０．３０１ｇ、５．３６ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応物を７０℃で１８時間撹拌し、減圧下で濃縮した。粗製物をＨ２Ｏ（１００ｍＬ）およびＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解し、ＨＣｌ（ａｑ）でｐＨ＝４に酸性化した。粗製物をＤＣＭ（３×１００ｍＬ）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィーで精製して２７を黄色油状物（０．２３５ｇ、０．５６ｍｍｏｌ、６３％）として得た。
【０３９４】
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の２７（０．２３５ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）の溶液にジフェニルホスホリルアジド（１４６μＬ、０．６８ｍｍｏｌ）を加え、続いてトリエチルアミン（１１８μＬ、０．８５ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を４０時間撹拌し、減圧下で濃縮した。カラムクロマトグラフで精製して２８を赤色油状物（０．１５５ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）として得た。
【０３９５】
トルエン（４ｍＬ）中の２８（０．１５５ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）の溶液に１４（０．０９０ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を加え、続いてジ−ｎ−ブチルスズジラウレート（１２μＬ、０．００２ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を１００℃で３時間撹拌し、減圧下で濃縮した。カラムクロマトグラフで精製して２９を黄色油状物（０．１６９ｇ、０．２６ｍｍｏｌ、７４％）として得た。
【０３９６】
ＤＣＭ（１ｍＬ）中の２９（０．０３１ｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）の溶液にＤＣＭ（０．５ｍＬ）中のトリエチルシラン（３８μＬ、０．２４ｍｍｏｌ）およびＴＦＡ（０．５ｍＬ）の溶液を加えた。溶液を２時間撹拌し、減圧下で濃縮した。粗製物をＨ２Ｏ（５０ｍＬ）に溶解し、ｐＨ＝１０に塩基性化し、ＤＣＭ（３×５０ｍＬ）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィーで精製して３０を淡黄色固体（０．０１９ｇ、０．０３５ｍｍｏｌ、７３％）として得た。
【０３９７】
【化３７】
2014532720.tif 000050
【０３９８】
ＴＨＦ（１ｍＬ）中のＰＥＧチオール酸（０．０４６ｇ、０．１００ｍｍｏｌ）の溶液にＨＡＴＵ（０．０３３ｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）を加え、続いて３０（０．０４３ｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を１時間撹拌し、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）を加えた。溶液を２１時間撹拌し、減圧下で濃縮した。カラムクロマトグラフで精製して３１を淡黄色固体（０．０１９ｇ、０．０１９ｍｍｏｌ、２４％）として得た。
【０３９９】
本発明の範囲を逸脱することなく、対応する例示形態を参照して上述したようにして例示実施形態に種々の改変を加えることができるが、上記説明に含まれ添付の図面で示されたすべての事柄は限定するものではなく、むしろ例示と解釈されるべきものとする。したがって、本発明の広さおよび範囲は、上述した例示実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、本明細書に添付される以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物によってのみ定義されるべきものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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