(57)【要約】  本実施形態は、過分極１３Ｃジアルキルコハク酸塩化合物および過分極１３Ｃジアルキルフマル酸塩化合物の調製、およびＴＣＡ回路のリアルタイム、インビボ代謝イメージングにおけるそれらの使用を開示する。別の実施形態では、過分極ジエチル１−１３Ｃコハク酸塩およびジエチル１，４−１３Ｃコハク酸塩を含む組成物が提供される。【選択図】図１Ａ。
2014520606.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2014520606.tif 000010
を有する過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩化合物を含む組成物であって、
式中、Ｒが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、またはｔ−ブチルから選択される組成物。
【請求項２】
前記過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩が、過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩が、過分極ジエチル１，４−１３Ｃコハク酸塩を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
式ＩＩ：
【化２】
2014520606.tif 000011
を有する過分極ジアルキル１３Ｃフマル酸塩化合物を含む組成物であって、
式中、Ｒが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、またはｔ−ブチルから選択される組成物。
【請求項５】
前記過分極ジアルキル１３Ｃフマル酸塩が、過分極ジエチル１，４−１３Ｃフマル酸塩を含む請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
患者の代謝イメージング方法であって、
前記患者に診断に有効な量の過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩を含む組成物を投与すること、および
前記患者の過分極代謝産物を検出すること
を含む方法。
【請求項７】
前記過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩が、過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩を含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記代謝産物が、ＴＣＡ回路の代謝産物である請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記検出工程からデータを取得し、生成データを既存データと比較し、疾患状態を判定することをさらに含む請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記既存データが、ベースラインスペクトルに相当する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記疾患状態が、疾患の無い場合の前記患者のＴＣＡ回路から生成される場合に比べ、前記患者のＴＣＡ回路から少なくとも１つの異なる代謝産物および／または異なる量の同じ代謝産物を生成する疾患である請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記疾患状態が癌である請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記疾患状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および筋萎縮性側索硬化症の内の１つまたは複数から選択される神経変性疾患である請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記疾患状態が心臓疾患である請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記既存データが、前記疾患状態の患者のＴＣＡ回路代謝産物を反映しており、前記患者が治療を受けた後で前記検出を行う請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記既存データが前記患者の癌性の状態のＴＣＡ回路代謝産物を反映しており、前記患者が化学療法を受けた後で前記検出を行う請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
患者の代謝イメージング方法であって、
前記患者に診断に有効な量の過分極ジアルキル１３Ｃフマル酸塩を含む組成物を投与すること、および
前記患者の過分極代謝産物を検出すること
を含む方法。
【請求項１８】
前記過分極ジアルキル１３Ｃフマル酸塩が、過分極ジエチル  １，４−１３Ｃフマル酸塩を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記代謝産物が、ＴＣＡ回路の代謝産物である請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記検出工程からデータを取得し、生成データを既存データと比較し、疾患状態を判定することをさらに含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記疾患状態が癌である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記疾患状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および筋萎縮性側索硬化症の内の１つまたは複数から選択される神経変性疾患である請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記疾患状態が心臓疾患である請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年７月１日出願の米国特許仮出願特許第６１／５０４，１５２号、および２０１１年１１月９日出願の米国仮出願特許第６１／５５７，８７９号の優先権を主張する。これらの特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、ＮＩＨ許可番号１Ｒ２１ＣＡ１１８５０９および１Ｒ０１ＮＳ０４８５８９、ならびにＮＣＩ認可番号５Ｒ０１ＣＡ１２２５１３に基づく政府の支援により行われた。米国政府は本発明に対し一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
クレブストリカルボン酸回路（「ＴＣＡ回路」）および酸化的リン酸化は、代謝エネルギー産生の中核をなすものである。ＴＣＡ回路は、細胞のミトコンドリア中で起こり、ほとんどの細胞で大部分のアデノシン三燐酸（＞９０％）を作り出す。正常細胞では、ＴＣＡ回路の主要エネルギー源は、ブドウ糖の解糖から生成されるピルビン酸塩である。
【０００４】
多くの疾患状態では、ＴＣＡ回路が不安定である。癌では、コハク酸塩脱水素酵素およびフマル酸塩水添加酵素癌遺伝子は、ＴＣＡ回路を障害する。ＴＣＡ回路は、種々のエントリーポイントを持つことができる。特に癌では、広範囲のエネルギー基質がＴＣＡ回路で使われる（例えば、クエン酸塩およびグルタミン酸塩／グルタミン）。さらに、多くの神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および筋萎縮性側索硬化症）では、ＴＣＡ回路が変質するという証拠がある。さらに、アデノシン三燐酸（「ＡＴＰ」）は、心臓収縮、活性イオン勾配の維持、および他の生体機能のための主要エネルギー源である。心臓のＡＴＰ産生の大部分は、ＴＣＡ回路の結果として得られ、ＴＣＡ回路により制御されており、また、ＴＣＡ回路は心臓の多くの疾患状態において変質している。
【０００５】
疾患および正常組織の間の代謝の差の多くは、代謝造影剤の使用により検査可能であり、また、おそらく可能であろう。現状では、代謝イメージングは、２−［１８Ｆ］フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−ブドウ糖（「ＦＤＧ−ブドウ糖」）の取り込みの陽電子放出断層撮影（「ＰＥＴ」）測定、または磁気共鳴分光法（「ＭＲＳ」）により行われる。しかし、ＦＤＧ−ブドウ糖によるＰＥＴイメージングは、ブドウ糖の取り込みおよびリン酸化のレベルのみを測定し、その後のブドウ糖の代謝については何も明らかにしない。ＭＲＳでは、正常な環境下での、組織／臓器の代謝プロファイルの定常状態のみを測定でき、ＭＲＳの低い信号対雑音比のために長い検査時間が必要となる。
【０００６】
つい最近では、分子の過分極を使ったインビボリアルタイム代謝イメージング、すなわち、生きているヒトまたは非ヒト動物の代謝イメージングへの道が開かれた。過分極を使えば、従来の磁気共鳴イメージング（「ＭＲＩ」）およびＭＲＳを使って，１０，０００倍を超える感度増強が可能となる。核磁気共鳴（「ＮＭＲ」）活性核（例えば、１３Ｃ、１５Ｎ、３１Ｐ）の核分極を高めると、核の励起および基底核スピン状態の間の占有数の差が増加し、磁気共鳴シグナル強度が増幅される。分極（シグナル増強）は、過分極分子の代謝物に保持される可能性もある。さらに、ＰＥＴと異なり、過分極プロセスは非放射性である。
【０００７】
過分極を得るために最も広く使われている方法は、動的核分極（「ＤＮＰ」）およびパラ水素誘起分極（「ＰＨＩＰ」）である。いくつかの化合物が過分極状態にされ、過分極代謝イメージングを使って調査されている。例えば、１−１３Ｃピルビン酸塩、１，４−１３Ｃフマル酸塩、１３Ｃコハク酸塩、１３Ｃ２−ヒドロキシエチルプロピオン酸塩、および２，２，３，３−テトラフルオロプロピル−ｌ−１３Ｃプリオピオン酸塩−ｄ２，２，３，３（「ＴＦＰＰ」）がインビボでの適用に関し調査されている。しかし、全てのこれらの化合物は、臨床診療で使用されるには、生理的な障壁がある。例えば、１−１３Ｃピルビン酸塩は、ピルビン酸塩のアラニン、乳酸塩、および重炭酸塩への代謝を追跡するために使用可能であるが、ＴＣＡ回路代謝については何も明らかにしない。１３Ｃコハク酸塩に対しては、最適過分極を行わせるために分極の移動を酸性（ｐＨ≦３）またはアルカリ性（ｐＨ≧＞９）条件下で行う必要がある。さらに、１３Ｃコハク酸塩は、多くの生体膜をわずかしか通過せず、特に、代謝に関与するＴＣＡ回路酵素に到達するために必要なミトコンドリアの膜の通過がほとんど行えない。１３Ｃ２−ヒドロキシエチルプロピオン酸塩は有毒で、代謝されない。ＴＦＰＰは、それほど水溶性ではなく、２０％エタノール水溶液で注入の必要がある。
【０００８】
（１）ＴＣＡ回路により代謝され、（２）診断用インビボ造影剤として使用可能である、過分極化合物が必要である。
【発明の概要】
【０００９】
一実施形態では、組成物は、式Ｉ
【化１】
2014520606.tif 000003
の過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩化合物を含み、
式中、Ｒは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、またはｔ−ブチルから選択できる。
【００１０】
別の実施形態では、過分極ジエチル１−１３Ｃコハク酸塩およびジエチル１，４−１３Ｃコハク酸塩を含む組成物が提供される。
【００１１】
一実施形態では、患者の代謝イメージング方法が提供され、その代謝イメージング方法は、
患者の診断に有効な量の過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩を含む組成物を投与すること、および患者の過分極代謝産物を検出することを含む。
【００１２】
別の実施形態では、式II： 
【化２】
2014520606.tif 000004
の過分極ジアルキル１３Ｃフマル酸塩化合物を含む組成物が提供され、
式中、Ｒは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、またはｔ−ブチルから選択できる。
【００１３】
一実施形態では、過分極ジエチル１，４−１３Ｃフマル酸塩を含む組成物が提供される。
【００１４】
一実施形態では、患者の代謝イメージング方法が提供され、その代謝イメージング方法は、
患者の診断に有効な量の過分極ジアルキル１３Ｃフマル酸を含む組成物を投与すること、および患者の過分極代謝産物を検出することを含む。
【００１５】
添付の図では、以下の詳細説明と一緒に、請求発明の実施形態の例を説明する化学式、化学構造、および実験データが示される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】ロジウムビスホスフィン触媒とパラ水素（ｐＨ２）を使ってジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２フマル酸塩からジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩への水素添加の一例を示す図である。
【図１Ｂ】１３Ｃ原子への分極の移動のための高周波ヘテロ核パルスを形成のためのジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の結合定数の一例を示す。
【図１Ｃ】低磁場下で適用される高周波パルスを使ってｐＨ２から１３Ｃ核への分極の移動の一例を示す図である。
【図１Ｄ】３Ｍ１−１３Ｃ酢酸塩ファントムに比較して、２０ｍＭ過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩シグナルの大きさの一例を示す。
【図２Ａ】１０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩を尾静脈注射により受けたマウスで見られる１３Ｃ  ＭＲＳの時間分解スタックプロットの一例を示す。
【図２Ｂ】図２Ａのスタックプロットのｔ＝２６で得られた１３Ｃ  ＭＲＳの関心領域の拡大図を示す。
【図２Ｃ】１０（μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩を尾静脈注射により受けたマウスで見られる１３Ｃ  ＭＲＳ時間分解スタックプロットの一例を示す。
【図２Ｄ】図２Ｃのスタックプロットのｔ＝１８で得られた１３Ｃ  ＭＲＳの関心領域の拡大図を示す。
【図３Ａ】２０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩を腹膜注射により受けたマウスで見られる１３Ｃ  ＭＲＳ時間分解スタックプロットの一例を示す。
【図３Ｂ】２０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩を腹膜注射により受けたマウスで見られる１３Ｃ  ＭＲＳ時間分解スタックプロットの一例を示す。
【図４】３−ニトロプロピオン酸塩の注射を受ける前（スペクトルＡ）および受けた後（スペクトルＢ）のマウスの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の１３Ｃ  ＭＲＳスペクトルの一例を示す。
【図５Ａ】１０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の静脈注射後のマウスの１３Ｃ  ＦＩＳＰ像（６０°フリップ角）のオーバーレイの一例を示す。
【図５Ｂ】１０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の静脈注射後のマウスの１３Ｃ  ＦＩＳＰ像（６０°フリップ角）のオーバーレイの一例を示す。
【図５Ｃ】２０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の腹膜注射後のマウスの１３Ｃ  ＦＩＳＰ像（６０°フリップ角）のオーバーレイの一例を示す。
【図５Ｄ】２０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の腹膜注射後のマウスの１３Ｃ  ＦＩＳＰ像（６０°フリップ角）のオーバーレイの一例を示す。
【図６Ａ】３種の異なる腫瘍を有するマウス：腎癌（ＲＥＮＣＡ）（左の像）、リンパ腫Ａ２０（中央の像）、および４Ｔ１乳癌（右の像）における１０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩静脈注射後の過分極ジエチルコハク酸塩の体内分布の１３Ｃ  ＦＩＳＰ像の比較を示す。
【図６Ｂ】３種の異なる腫瘍を有するマウス：腎癌（ＲＥＮＣＡ）（左の像）、Ａ２０リンパ腫（中央の像）、および４Ｔ１乳癌（右の像）における過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の静脈注射後のヒートマップ図による過分極シグナルの大部分を示す１３Ｃ  ＣＳＩ像の比較である。
【図６Ｃ】３種の異なる腫瘍を有するマウス：腎癌（ＲＥＮＣＡ）（左の像）、Ａ２０リンパ腫（中央の像）、および４Ｔ１乳癌（右の像）に対する図６Ｂの１３Ｃ  ＣＳＩ像内の個別のボクセルの代謝プロファイルの比較である。
【図７Ａ】ＲＥＮＣＡ腫瘍（左の像）および乳腺腫瘍（右の像）を有する２匹のマウスの静脈注射後の過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の体内分布を示す１３Ｃ  ＦＩＳＰ像の比較である。
【図７Ｂ】ＲＥＮＣＡ腫瘍（上段の像）および乳腺腫瘍（下段の像）を有する２匹のマウスの静脈注射後の過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の体内分布を示す１３Ｃ  ＣＳＩ像の比較である。
【図７Ｃ】ＲＥＮＣＡ腫瘍（左の像）および乳腺腫瘍（右の像）を有する２匹のマウスの静脈注射後の過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の代謝を示す平均１３Ｃ  ＣＳＩ像の比較である。
【図８Ａ】ラットの頭部の動脈注射により送達した２０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の体内分布を示す１３Ｃ  ＦＩＳＰ像である。
【図８Ｂ】ラットの頭部の動脈注射により送達した２０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の体内分布を示す１３Ｃ  ＣＳＩスペクトルである。
【図８Ｃ】２０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の動脈注射後のラット頭部の１３Ｃ  ＭＲスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本実施形態は、過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩および過分極ジアルキル１３Ｃフマル酸塩化合物の調製、およびＴＣＡ回路のリアルタイムインビボ代謝イメージングでのそれらの使用に関し開示する。
【００１８】
一実施形態では、式Ｉ：
【化３】
2014520606.tif 000005
の過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩化合物を含む組成物が提供され、
式中、Ｒは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、またはｔ−ブチルから選択できる。一実施形態では、Ｒ＝メチルである。一実施形態では、Ｒ＝エチルである。一実施形態では、Ｒ＝ｎ−プロピルである。一実施形態では、Ｒ＝ｉ−プロピルである。一実施形態では、Ｒ＝ｎ−ブチルである。一実施形態では、Ｒ＝ｉ−ブチルである。一実施形態では、Ｒ＝ｔ−ブチルである。別の実施形態では、過分極ジエチル１３Ｃコハク酸塩を含む組成物が提供される。特定の実施形態では、過分極ジエチル１３Ｃコハク酸塩は、過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩を含む。中性の分子であるジエチルコハク酸塩は、生理的なｐＨで使用可能で、生体膜を通過する。ジエチルコハク酸塩は、組織培養で細胞中に取り込むことができ、ＴＣＡ回路で代謝される。さらに、ジエチルコハク酸塩は無毒である。
【００１９】
一実施形態では、過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩は、患者の代謝イメージングに有用である。一実施形態では、過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩を使った患者の代謝イメージング方法が提供され、その代謝イメージング方法は、患者に診断に有効な量の過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩を含む組成物を投与すること、および患者の過分極代謝産物を検出することを含む。
【００２０】
別の実施形態では、式ＩＩの過分極ジアルキル１３Ｃフマル酸塩化合物を含む組成物が提供され、
【化４】
2014520606.tif 000006
式中、Ｒは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、またはｔ−ブチルから選択できる。一実施形態では、Ｒ＝メチルである。一実施形態では、Ｒ＝エチルである。一実施形態では、Ｒ＝ｎ−プロピルである。一実施形態では、Ｒ＝ｉ−プロピルである。一実施形態では、Ｒ＝ｎ−ブチルである。一実施形態では、Ｒ＝ｉ−ブチルである。一実施形態では、Ｒ＝ｔ−ブチルである。
【００２１】
別の実施形態では、過分極ジエチル１３Ｃフマル酸塩含む組成物が提供される。特定の実施形態では、過分極ジエチル１３Ｃフマル酸塩は、過分極ジエチル１，４−１３Ｃフマル酸塩を含む。ジエチルフマル酸塩は、中性の分子であり、生理的なｐＨで使用でき、生体膜を通過する。ジエチルフマル酸塩は、組織培養で細胞に取り込むことができ、ＴＣＡ回路で代謝される。さらに、ジエチルフマル酸塩は無毒である。
【００２２】
一実施形態では、過分極ジアルキル１３Ｃフマル酸塩は、患者の代謝イメージングに有用である。一実施形態では、過分極ジアルキル１３Ｃフマル酸塩を使った患者の代謝イメージング方法が提供され、この代謝イメージング方法は、診断に有効な量の過分極ジアルキル１３Ｃフマル酸塩を含む組成物を患者に投与すること、および患者の過分極代謝産物を検出することを含む。
【００２３】
用語の「患者」は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方を含む。語句の「診断に有効な量」は、診断法、装置、またはアッセイに使用する場合、診断法、装置、またはアッセイに必要な所望の診断効果または所望の生物活性を得るのに充分である、過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩または過分極ジアルキル１３Ｃフマル酸塩の量を意味する。このような量は、診断法、装置、またはアッセイにおいて、生物学的または医学上の応答を誘発するのに充分であると思われ、この応答には、研究者または臨床医により探究されている患者またはインビトロもしくはインビボの組織またはシステムの生物学的または医学上の応答を含んでもよい。診断に有効な量を構成する過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩または過分極ジアルキル１３Ｃフマル酸塩の量は、使われる診断法、装置、またはアッセイ、投与用組成物、投与時間、投与経路、化合物の排出速度、投与持続期間、本発明の化合物と一緒に、または同時に組み合わせて使用される薬剤および他の化合物、および、患者が診断薬投与の対象の場合、患者の年齢、体重、総体的な健康、性別、および食事、などの因子に応じて変化してもよい。このような診断に有効な量は、自身の知識、先行技術、および本開示を考慮して当業者により通常の方法で決定されうる。
【００２４】
一実施形態では、過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩は、ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２フマル酸塩の水素添加により調製できる。図１Ａは、ロジウムビスホスフィン触媒とｐＨ２を使ってジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２フマル酸塩に水素添加し、ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩を得る例を図示したものである。
【００２５】
ＰＨＩＰは、ｐＨ２ガスを使って、１３Ｃ−（または１５Ｎ−）標識した不飽和の有機分子（アルキンまたはアルケン）を水素化する。触媒は、スピン状態を無秩序させることなく、１つの単位として化合物に移動するのに使用される。
【００２６】
特にジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩では、スピン秩序が、高周波パルスを使って１Ｈ核から１３Ｃ標識カルボニルに移動できる。パルス幅、振幅、およびプロトンと炭素高周波パルス間のタイミングの変化は、１３Ｃに移動される分極の割合に影響する。１３Ｃ原子への分極の移動に関する高周波ヘテロ核パルスの生成のためのジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の結合定数の例を図１Ｂに示す。図１Ｃは、低磁場で印加される高周波パルスを使ったｐＨ２から１３Ｃ核への分極の移動例の模式図を示す。分極割合は、パルスシーケンスを系統的に変えることにより、０．１９±０．０６％から２．１％に増加した（ボルツマン分極に比べて５，０００倍のシグナル増強）。図ＩＤは、３Ｍ１−１３Ｃ酢酸塩ファントムのシグナルに比べて、２０ｍＭ過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩のシグナルの大きさの一例を示す。各スペクトルは、単一パルスを使った４．７Ｔ  ＭＲスキャナ、および４５°フリップ角を使った取得方法で得た。
【００２７】
１３Ｃ化合物に対するＰＨＩＰ分極は、Ｔ１で定義される時間で緩和する。６秒毎の単一１０°パルスの合計で３２スキャンと合計３．２分の時間を使って分極炭素シグナルの減衰を計測することにより、シリンジ中およびインビボでの過分極ジエチル１３Ｃコハク酸塩のスピン格子緩和時間を４．７Ｔ  ＭＲスキャナで測定した。標識したカルボニルのＴ１は、２０ｍＭ過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の９：１の比率の水：Ｄ２Ｏ溶液で、インビボで３８±４秒、およびシリンジ中で５４±２秒である。分極が１００％水中で起こる場合、Ｔ１は、かなり低い（インビボで２４ｓ）。全てのインビボ実験で、９：１の水：Ｄ２Ｏ混合溶媒を使った。９：１の水：Ｄ２Ｏ触媒溶液中の２０ｍＭジエチル１３Ｃフマル酸塩のｐＨは、８である。水素添加後のｐＨは６である。
【００２８】
過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩を、本明細書で開示のように合成し、分極し、画像処理した。水溶液中の過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の結合定数を実験的に決定し、ヘテロ核高周波パルスシーケンスを生成後、ジエチルコハク酸塩を水溶液中でＰＨＩＰにより過分極させることにより、ボルツマン分極に比較し５，０００倍のシグナル増強が得られる。４分間で、過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩へ完全に変換された過分極溶液が生成できる。
【００２９】
ジエチルコハク酸塩中の過分極１３Ｃ−標識カルボニルのＴ１は、インビボで３８ｓであると測定されたが、これは、シグナルの３分間にわたる測定を可能とする。１３Ｃ  ＭＲＳおよびＭＲＩは、２０ｍＭ過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の正常なマウスへの尾静脈および腹腔内の注射を使ってインビボで行われた。過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の代謝が、全ての注射で認められた。１３Ｃ  ＭＲＳ  ＴＣＡ回路代謝物ファントムに基づいて、過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩のスペクトルピークが、リンゴ酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、およびアスパラギン酸塩に割り当てられた。
【００３０】
ジエチル１３Ｃコハク酸塩の代謝は、コハク酸塩脱水素酵素の既知の不可逆的阻害剤である３−ニトロプロピオン酸塩に動物を暴露後、変化した。
【００３１】
これらの結果により、ＰＨＩＰ誘導過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩は超高速インビボＭＲＩおよびＭＲＳを高信号対雑音比で可能とし、また、複数の酵素触媒反応を可視化可能にすることが示された。
【００３２】
ジアルキル１３Ｃコハク酸塩およびジアルキル１３Ｃフマル酸塩は、ＰＨＩＰまたはＤＮＰ法により過分極化できる。本明細書で開示のジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の例では、過分極化を、ＰＨＩＰ法を使って行った。２０種の過分極ジエチル１３Ｃコハク酸塩の試料が、たった１日のインビボイメージング実験で作成できる。しかし、添付請求項の範囲をこのような詳細な実施形態に限定する、または多少なりとも制限する意図はない。臨床的目的には、どちらの分極方法も使用可能である。
【００３３】
一実施形態では、過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩およびジアルキル１３Ｃフマル酸塩は、正常な動物に対する癌動物モデルの代謝の研究に有用でありうる。別の実施形態では、過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩およびジアルキル１３Ｃフマル酸塩は、神経変性疾患動物モデルに対する正常な動物の代謝の比較に有用でありうる。別の実施形態では、過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩およびジアルキル１３Ｃフマル酸塩は、心臓疾患動物モデルに対する正常な動物の代謝の比較に有用でありうる。
【００３４】
過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩およびジアルキル１３Ｃフマル酸塩は、臨床的代謝イメージングおよび分光測定法、ならびに動物モデルの疾患および正常組織の両方のＴＣＡ回路代謝の差異の探査に有用である可能性があり、異なるタイプの癌および腫瘍特異的癌遺伝子発現、神経変性障害、ならびに心臓疾患のリアルタイム代謝フィンガープリント法を提供する。
【００３５】
一実施形態では、過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩またはジアルキル１３Ｃフマル酸塩は、患者に投与し、引き続いてＭＲＩ／ＭＲＳをことにより、過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩またはジアルキル１３Ｃフマル酸塩の患者の正常なＴＣＡ回路代謝のベースラインスペクトルを確立できる。一実施形態では、患者が健康なときに、ベースラインスペクトルが確立される。従って、その後の過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩またはジアルキル１３Ｃフマル酸塩の患者への投与を行うことによって、例えば、疾患状態を示しているベースラインスペクトルからの偏位を測定できる。別の実施形態では、患者は、既に、既知の、または患者の正常な過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩またはジアルキル１３Ｃフマル酸塩のＴＣＡ回路代謝を変えると疑われる疾患であると診断されている。このケースでは、患者に対し、その後に、過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩またはジアルキル１３Ｃフマル酸塩の投与を行うことにより、例えば、疾患の進行を計測する、または治療の有効性を判定することができる。別の実施形態では、過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩またはジアルキル１３Ｃフマル酸塩を患者に投与して、患者のコース治療に関し、医療従事者を先導でき、例えば、医療従事者が癌患者のために薬剤または照射量を選択するのを支援することができる。例えば、腫瘍が極めて還元的な腫瘍であるように見える（すなわち、低ＴＣＡ回路代謝）場合は、より高い照射用量を使用した方が良い可能性がある。
【００３６】
また別の実施形態では、ベースラインスペクトルは、研究対象の患者とは別の、健康な、または病気の患者の検体を反映してもよい。従って、過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩またはジアルキル１３Ｃフマル酸塩の患者への投与を行って、例えば、疾患状態を示す、または疾患状態の非存在を示すベースラインスペクトルからの偏位、または類似性を判定できる。
【００３７】
別の実施形態では、過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩およびジアルキル１３Ｃフマル酸塩は、標的癌療法に対する早期応答を観察する機会を提供できる。順調な結果は、（回復された）ＴＣＡ回路の中間体の外観（順調でない場合には、主に解糖性腫瘍の外観）により示される。さらに別の実施形態では、過分極ジアルキル１３Ｃコハク酸塩およびジアルキル１３Ｃフマル酸塩は、秒から分の時間スケールと前例のない化学的特異性およびＭＲ感度で、ＴＣＡ回路代謝の局部状態を示し、これらを調べ、さらに疾患の治療をモニターするのに有用でありうる。
【００３８】
実施例
特定の実施形態が実施例の形で以下に記載される。本発明の全ての可能な適用を示すのは不可能である。従って、実施形態は、かなり詳細に記載されているが、添付の請求項の範囲をこれらの詳細内容、またはいずれかの特定の実施形態に限定する、またはこれらを多少なりとも制限する意図はない。
【００３９】
実施例１：ＰＨＩＰ誘導過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の調製
パラ水素の調製
市販の超純粋な水素（Ｇｉｌｍｏｒｅ、Ｓｏｕｔｈ  Ｅｌ  Ｍｏｎｔｅ、ＵＳＡ）を、顆粒状水和酸化第二鉄（ＩＯＮＥＸ−タイプＯ−Ｐ触媒；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ、ＵＳＡ）上を３６〜５５°Ｋの温度でゆっくり通過させることにより触媒的にｐＨ２へ変換した。ガスをｐＨ２に変換後、３３ｂａｒの圧力下、室温で７Ｌのアルミニウムボンベに貯蔵した。ｐＨ２の品質は、高解像度ＮＭＲにより９７％超であることが特定された。各バッチを２日以内に使用したが、その間、測定可能な収率の減少はなかった。
【００４０】
ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２フマル酸塩の合成
攪拌子を備えた１５０ｍｌの乾燥した丸底フラスコ中に、１ｇ（８．４４ｍｍｏｌ）の１−１３Ｃフマル酸を加えた。６０ｍｌの無水エタノールおよび３．２ｍｌ（２５．２ｍｍｏｌ）のクロロトリメチルシラン（３８６５２９、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をシリンジを使って反応物に加えた。反応物を不活性雰囲気下、室温で一晩攪拌した。２０ｍｌの飽和重炭酸ナトリウムで反応を停止させた。反応混合物が中性になるまで固形重炭酸塩を加えた。反応混合物を濾過し、過剰重炭酸塩を除去した。エタノールをロータリーエバポレーターを使って除去した。ジクロロメタン（３ｘ２５ｍｌ）を使って、ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２フマル酸塩を水溶液から抽出した。有機層を合わせて、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過した。ジクロロメタンを留去した。純粋なジエチル３−１３Ｃ  ４，５−ｄ２フマル酸塩を無色液体として単離した。１．１０ｇ（７５％収率）。１Ｈ（ＣＤ２Ｃ１２、５００ＭＨｚ）δ ４．２３（複合四重線、Ｊ＝７．１、１．５、１．６Ｈｚ、４Ｈ）、１．２９（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、６Ｈ）。プロトンデカップル１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃ１２、１２５ＭＨｚ）δ １６５．４３（ｓ）、１３３．６（六重線、Ｊ＝２５Ｈｚ、ｔＪ＝２５Ｈｚ）、６１．８（ｓ）、１４．４３（ｓ）．
【００４１】
水素添加触媒
所望のスピン秩序を保持しながら急速水素添加が行えるように開発された水溶性ロジウム触媒を、２つの成分を混合することにより新しく調製した。ビスホスフィンリガンド、ｌ、４−ビス−［（フェニル−３−プロパンスルホン酸）ホスフィン］ブタン二ナトリウム塩（Ｑ３６３３３、Ｉｓｏｔｅｃ、ＯＨ、ＵＳＡ）を９：１の水：Ｄ２Ｏに溶解して８．２５ｍＭ濃度とし、続いて、真空およびアルゴンパージを使って酸素を除去した。ロジウム触媒成分を最小限のアセトン中のビス（ノルボルナジエン）ロジウム（Ｉ）テトラフルオロボラート（カタログ番号４５−０２３０、Ｓｔｒｅｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＭＡ）の溶液として反応混合物中に導入し、５．５ｍＭの濃度を得た。得られた溶液に激しく振盪を加え、室温下、減圧とアルゴンパージによりアセトンを除去した。ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２フマル酸塩の無水化合物を触媒溶液中に注入することにより添加した。溶液をシリンジに吸い込むことにより触媒溶液でシリンジを２回洗浄し、それを触媒溶液中に再注入して、全てのジエチルフマル酸塩をシリンジから取り出した。ジエチルフマル酸塩の溶液および触媒を０．４５μｍの酢酸セルロースシリンジフィルター（ＶＷＲ、２８１４５−４８１）を通して濾過した。濾過溶液を素早く３０ｍｌプラスチックシリンジに入れ、所望の量の造影剤前駆物質を、各実験（４ｍｌ）での分極装置の反応チャンバーへの注入用として使用した。
【００４２】
パラ水素を使って高レベルの１３Ｃ分極を作るための使用に適した設備の完全な説明は、Ｈｏｖｅｎｅｒ、Ｊ．Ｂ．；Ｃｈｅｋｍｅｎｅｖ、Ｅ．Ｙ．；Ｈａｒｒｉｓ、Ｋ．Ｃ．；Ｐｅｒｍａｎ、Ｗ．Ｈ．；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｌ．Ｗ．；Ｒｏｓｓ、Ｂ．Ｄ．；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ、Ｐ．ＭＡＧＭＡ  ２００９、２２、１１１−２１、およびＨｏｖｅｎｅｒ、Ｊ．Ｂ．；Ｃｈｅｋｍｅｎｅｖ、Ｅ．Ｙ．；Ｈａｒｒｉｓ、Ｋ．Ｃ．；Ｐｅｒｍａｎ、Ｗ．Ｈ．；Ｔｒａｎ、Ｔ．Ｔ．；Ｒｏｓｓ、Ｂ．Ｄ．；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ、Ｐ．ＭＡＧＭＡ  ２００９、２２、１２３−３４に示されている。これら両文献は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４３】
でほとんどの水素化は、１２ｂａｒのパラ水素ガスおよび反応チャンバーからの過分極化合物の除去用の１５ｂａｒの窒素を使って、６０℃で行った。これらの条件下で水素添加を完遂した。一定分量の水素添加反応をＶａｒｉａｎ  １１．７Ｔ  ＮＭＲ装置で解析し、１３Ｃ分光測定を行った。触媒およびジエチルｌ３Ｃフマル酸塩溶液の１３Ｃ分光測定は、水素添加の前後で異なる。１６７．４ｐｐｍ（ジエチルフマル酸塩に相当）から１７５．７ｐｐｍ（ジエチルコハク酸塩に相当）へのカルボニルの化学シフトの変化は容易に判断できる。試験した反応のいずれにも１６７．４ｐｐｍの共鳴は認められなかった。０．５ｍｌの分取量の過分極水素化１３Ｃ試薬をマウスの尾静脈に注射した。いくつかの実験で、１ｍｌの分取量の過分極水素化試薬をマウスの腹腔内の空洞中に注射した。
【００４４】
実施例２：ジエチル１３Ｃコハク酸塩の代謝イメージングに使用する代表的な条件
ＭＲスキャナおよびコイル
他に断らない限り、全てのＭＲＩイメージングおよび動物またはファントムのＭＲＳを１Ｈ／１３Ｃ用全身マウスボリュームコイル（ＤｏｔｙＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＳｏｕｔｈＣａｒｏｌｉｎａ、ＵＳＡ）を使って、動物用４．７Ｔ  水平ボアＭＲスキャナ（ＢｒｕｋｅｒＡｖａｎｃｅ、ＢｒｕｋｅｒＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った。ラットの調査では、１Ｈ／１３Ｃ二重共鳴４ｃｍＩＤソレノイド型ボリュームコイルを利用して１３Ｃ過分極インビボイメージングおよび分光測定を行った。
【００４５】
動物
異なる組の動物を使って下記の実施例における過分極ジエチルコハク酸塩による代謝イメージングの有用性を示す。全ての動物実験は、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓのＩＡＣＵＣによる承認を得た。全動物は、フェースマスク当たり０．８Ｌ／分の酸素と共に２．０〜２．５％イソフルランガスを使って麻酔した。平均体重２５グラムの雄ＢＡＬＢ／ｃマウスをＨａｒｌａｎ  Ｓ／Ｄから購入した。これらのマウスの内１３匹をそのまま使用し、下記の実施例中で正常マウスとして記載される。他のＢＡＬＢ／ｃマウスに、３種のマウス癌株：ＲＥＮＣＡ（腎癌）、Ａ２０リンパ腫、および４Ｔ１（乳癌）の内の１種由来の５ｘｌ０６細胞を移植した。これらの動物は、下記の実施例で、同種移植腫瘍を有するマウスとして記載される。尾静脈注射に関しては、２フィートのＰＥ５０の延長部に取り付けられた３０ゲージ管（ＭＶＴ−１、Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、外側の尾静脈にカテーテル処理した。尾部温水浴により、カニューレ挿入の成功に必須の血管拡張を行った。鎮静状態のマウスをＭＲスキャナボア内の加熱クレードル中に置いた。
【００４６】
腹腔内の（ｉ．ｐ．）カテーテルの必要なマウス実験では、麻酔マウスに、２つの方法：開腹術または針穿刺の内の１つを行った。開腹術には、マウスを仰臥位にして、小さな（２〜４ｍｍ）皮膚および腹膜を通る正中矢状腹部切開が含まれた。２フィートＰＥ５０カテーテルの先端を、直接可視化の下、腹腔内の腔中に配置した。絹糸縫合によりカテーテルを皮膚に固定し、創傷を閉じた。あるいは、目視なしの経皮的穿刺後、１８ゲージニードルを通してＰＥ５０カテーテルを通過させることによりｉ．ｐ．アクセスを行った。腹部皮膚を上に持ち上げて、内蔵傷害を回避した。ニードルをカテーテルから抜き出してしまえば、縫合して漏出を防ぐ必要はない。いずれかの方法の後に、マウスを注意深く回内し、磁石の中に配置した。
【００４７】
分極の測定
プラスチックシリンジで、単一スキャンパルスの１３Ｃ分光測定法を使ってジエチル１３Ｃコハク酸塩の分極を測定し（分極の２５ｓ〜４０ｓ後）、４５°のパルス角度を使ってＭＲスキャナでシーケンスを取得する。４．７Ｔでの熱分極３Ｍ  １−１３Ｃ酢酸塩ファントムの単一スキャンスペクトルを基準として、過分極度を下式に従って定量化した。
【数１】
2014520606.tif 000007
式中、１／２４６，６００は、２９８°Ｋおよび４．７Ｔでのボルツマン分布に従う１３Ｃ核分極に相当する。時間ゼロでＰＨＩＰ分極器により生成される過分極度は、過分極剤の送達時間およびスピン格子緩和時間Ｔ１を使って、以下のように逆算される。
【数２】
2014520606.tif 000008
報告した％過分極は、Ｐｔ＝０を意味する。
【００４８】
１Ｈ  ＭＲＩ
炭素過分極像とマウス解剖像の同時位置合わせを可能とする二重チューニングボリュームコイルを使って、マウスのプロトン解剖像を得た。ＲＡＲＥ（緩和促進高速収集法（ｒａｐｉｄ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ））トリパイロット（ｔｒｉ−ｐｉｌｏｔ）を使って動物を配置し、一連のスライス厚さ（４．５、７．５、または１５．２ｍｍ）を使った冠状断イメージング（ｃｏｒｏｎａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ）を行い、さらに、６または７ｃｍのＦＯＶ使ってＭＳＭＥ（マルチスライスマルチエコー）を行って、炭素過分極像の同時位置合わせを行った。シングルボクセルプロトンＭＲＳ（（ＰＲＥＳＳ）ポイント・リゾルブド・スペクトロスコピイ（ｐｏｉｎｔ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）データ取得手法を使って磁場の均一性を調節し、目的ボクセル（０．７ｘ０．７ｘ０．７ｃｍ）を動物の腎臓のすぐ後方に配置した。規定どおりに、１５Ｈｚ未満の非抑制水シグナル（ｕｎｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ  ｗａｔｅｒ  ｓｉｇｎａｌ）を得た。１３Ｃ  ＭＲＳ実験のピーク分解能を得るために、シム調整を行った。
【００４９】
１３Ｃ  ＭＲＳ
過分極試薬（１３Ｃジエチルコハク酸塩）の２〜３回の注射を連続的に行い、過分極１３Ｃ  ＭＲシグナルの急速減衰の使用を最適化し、解剖学的分布およびジエチルｌ３Ｃコハク酸塩の代謝の両方の情報を得た。パルスおよび取得手法（バンド幅２５，０００Ｈｚおよび取得サイズ２，０４８）を使い、過分極ジエチル１３Ｃコハク酸塩のマウスへの注射後、励起用非選択的ガウス高周波パルスを使って、３０°のパルス角度により毎７〜８秒で約１分間にわたり連続１３Ｃ  ＭＲＳを取得した。
【００５０】
１３Ｃ  ＦＩＳＰ像の採取の前後で分光測定を行った。既知のｐＨでのＤ２Ｏ／水の溶液中の代謝物の化学シフト値を実験的に求めることにより１３Ｃ分光測定のピークの帰属を決定した。ベースライン補正（バーンスタイン多項式フィッティング）、５Ｈｚのラインブロードニング、マニュアル整相を使用し、１７６．４ｐｐｍの大きなジエチルコハク酸塩ピークを基準として、ＦＩＤ生データをＸｗｉｎＮＭＲまたはＭｅｓｔｒａＮｏｖａで処理した。
【００５１】
１３Ｃ  ＣＳＩ
１ｍｓガウスパルス、２００ｍｓ  ＴＲ、８ｘ８または１６ｘ１６マトリックス、２．６４ｃｍ〜４ｃｍの範囲のＦＯＶ、９〜１２ｍｍのスライス厚さを使って、１３Ｃ  ＣＳＩを行った。ＣＳＩを３ＤｉＣＳＩソフトウェア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｑｕｉ  Ｚｈａｏ）を使って処理した。ＣＳＩを同一中心配置、ＦＯＶ、およびスライス厚さを使って１Ｈ  ＭＲＩ像上に重ねた。
【００５２】
１３Ｃ  ＭＲＩ
Ｂｒｕｋｅｒ  ＴＲＵＥ  ＦＩＳＰシーケンスを使って１３Ｃイメージングを行った。イメージングシーケンスでは、ＴＲ＝３．３ｍｓ、ＴＥ＝１．６ｍｓ、４平均、３２ｘ３２マトリックス、および５２、０８３Ｈｚのバンド幅を使用した。全イメージングを、Ｄｏｔｙボリュームコイルを使って４．７Ｔ  ＭＲスキャナにより行った。シーケンスでは、８０、６０、または４０°のフリップ角を使った。ＭＲ  Ｂｒｕｋｅｒスキャナの勾配の立ち上がり時間は、２５０μｓであった。６または７ｃｍのＦＯＶ、１５．２ｍｍの寸法の１〜２スライスを使って冠状断イメージング行い、常に、プロトン像と同じとなるように中心スライスを選択した。像をＰａｒａｖｉｓｉｏｎ  ３．０．２ソフトウェアで擬似カラーに変換した。特定の強度を超えるピクセルのみを使ってシグナルからノイズを取り除いた（図５Ａおよび５Ｂを参照）。この像をプロトン像の上に重ねた。
【００５３】
１３Ｃ  ＮＭＲ分光測定法
試料の０．５％のメタノールを化学シフト用基準として含む約３０ｍＭの濃度のＤ２Ｏと水の溶液の、異なるＴＣＡ回路代謝物を含む約３０試料に関して、１１．７Ｔ  Ｖａｒｉａｎの装置を使って１３Ｃプロトンデカップル分光測定を行った。試料のｐＨを３５６ｍＭ  ＫＯＨ溶液と５０ｍＭリン酸塩緩衝液を使ってｐＨ７．５に調整し、ｐＨメーターを使って測定した。全ての分光測定は、６４〜２５６のトランジエント、６０°フリップ角、１０ｓの緩和遅延で行い、全スペクトルを、メタノールピークを基準として比較した。試料の代謝物およびｐＨに対するカルボニルの帰属の一部を表１に示す。
【表１】
2014520606.tif 000009
【００５４】
実施例３：正常なマウスにおける過分極ジエチル１３Ｃコハク酸塩の代謝
１０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩を尾静脈へ注射した１３匹のマウス、および２０μｍｏｌの過分極ジエチルコハク酸塩を腹膜注射した３匹のマウスを使って、過分極ジエチル１３Ｃコハク酸塩の代謝をリアルタイムで検出した。マウスの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩代謝の代表的１３Ｃ  ＭＲＳの例を図２Ａ〜２Ｄならびに図３Ａおよび３Ｂに示す。
【００５５】
他に断らない限り、示した全ての分光測定法では、単一３０°パルスおよび５〜９秒毎の取得シーケンスを使って、データを集めた。時間値を、生データのタイムスタンプ、ならびにパルスおよび取得シーケンスが完了するのに要する時間量（約５ｓ）に基づいて、決定した。この時間値は、過分極化合物の注射から分光測定実施の間の経過時間に相当する。過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩からの代謝産物（最大ピーク、標識ＤＳ）を過分極物質の注射後５秒以内に検出し、それが、約１分間持続した。代謝物は、ほぼ瞬時に認めることができ、代謝は、容易にモニターできる。４種の異なる共鳴は、リンゴ酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、およびアスパラギン酸塩に割り当てられる。全スペクトルは、ジエチルコハク酸塩ピーク（１７６．４ｐｐｍ）を基準とし、また、これはファントム実験による１３Ｃ標識メタノールを基準にしている。過分極化合物が注射されない場合は、ほとんどの動物で、単一トランジエントによる１３Ｃ分光測定法におけるシグナルは認められなかった。いくつかの非注射マウスにおける単一トランジエントを使った１３Ｃスペクトルは、３０〜３５ｐｐｍ近傍に脂質ピークがある。
【００５６】
図２Ａは、１０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩を尾静脈注射により受けたマウスの１３Ｃ  ＭＲＳ時間分解例のスタックプロットを示す。図２Ｂは、図２Ａのスタックプロットの内のｔ＝２６ｓに取得した１３Ｃ  ＭＲＳの対象領域の拡大図を示す。図２Ｃは、１０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩を尾静脈注射により受けたマウスの１３Ｃ  ＭＲＳ時間分解例のスタックプロットを示す。図２Ｄは、図２Ｃのスタックプロットの内のｔ＝１８ｓに取得した１３Ｃ  ＭＲＳの対象領域の拡大図を示す。
【００５７】
図３Ａは、２０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩を腹膜注射により受けたマウスの１３Ｃ  ＭＲＳ時間分解例のスタックプロットを示す。図３Ｂは、２０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩を腹膜注射により受けたマウスの１３Ｃ  ＭＲＳ時間分解例のスタックプロットを示す。観察されたインビボ代謝物の化学的同一性を判定するために、いくつかのＮＭＲ  １３Ｃプロトンデカップル分光測定実験を、特定のｐＨの水とＤ２Ｏ中の既知のＴＣＡ回路代謝物を含む、試料の化学シフト基準としてメタノール（４９．１ｐｐｍ）使用し、１１．７Ｔ  Ｖａｒｉａｎの装置で行った。何らかの理論に拘泥するつもりはないが、注射後、過分極ジエチル１３Ｃコハク酸塩は、細胞中のエステラーゼにより代謝を受け、その後、コハク酸塩、アスパラギン酸塩、リンゴ酸塩、およびフマル酸塩に代謝されると想定されている。共鳴パターン、ならびに、化学シフトによる一時的な帰属は、過分極ジエチル１３Ｃコハク酸塩は、インビボで代謝され、その代謝物は、３種以上の酵素触媒による生化学的反応を介して、かなりの割合の過分極１３Ｃ核を保持していることが強く示唆される。
【００５８】
実施例４：３−ニトロプロピオン酸塩による抑制
過分極ジエチルコハク酸塩の代謝の定量的データは、抑制された、または異常なＴＣＡ回路代謝を有することがわかっている疾患状態の画像診断に有用である。マウスの過分極ジエチル１３Ｃコハク酸塩の代謝をさらに調べるために、４匹のマウスへの３−ニトロプロピオン酸塩のｉ．ｐ．注射の前後で分光測定実験を行った。３−ニトロプロピオン酸塩は、コハク酸塩脱水素酵素の不可逆的阻害剤であることがわかっている。過分極ジエチル１３Ｃコハク酸塩の代謝は、３−ニトロプロピオン酸塩注射後、変化する。
【００５９】
図４は、マウスに３−ニトロプロピオン酸塩を注射する前（スペクトルＡ）および後（スペクトルＢ）の、マウス中の過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の１３Ｃ  ＭＲＳスペクトルの例を示す。マウスに、３−ニトロプロピオン酸塩の５ｍｇ／ｍｌ溶液の２００μｌの注射（ｉ．ｐ．注射）の前および２０分経過後に、ｉ．ｖ．により１０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩を注射した。５ｍｇ／ｍｌの３−ニトロプロピオン酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の水溶液を少量の５０％ＮａＯＨ溶液を使ってｐＨ＝８．５にした。化学シフトによれば、３−ニトロプロピオン酸塩で処理後、動物の低磁場コハク酸塩共鳴が顕著に減少する。３−ニトロプロピオン酸塩処理後、４匹のマウスの内３匹でコハク酸塩ピークが減少し完全に消失した。
【００６０】
実施例５：１３Ｃ  ＦＩＳＰインビボイメージング
マウス中の過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩およびその代謝物の相対的部位は、１３Ｃ  ＦＩＳＰイメージングを使って尾静脈経由、または腹膜内への注射により決定された。画像は９秒毎に１分間、ＴＲＵＥ  ＦＩＳＰシーケンスで、６０°と４０°フリップ角を使って取得された。過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩が注射されなかった場合は、１３Ｃ像は認められなかった。
【００６１】
図５Ａ〜５Ｄは、同じＦＯＶと中心スライス配置を使って動物のプロトン像上に重ねた１３Ｃ  ＦＩＳＰ像の擬似カラーによるオーバーレイの例を示す。図５Ａは、１０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の静脈注射後に取得したマウスの１３Ｃ  ＦＩＳＰ像（６０°フリップ角）のオーバーレイの例を示す。図５Ｂは、１０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の静脈注射後に取得したマウスの１３Ｃ  ＦＩＳＰ像（６０°フリップ角）のオーバーレイの例を示す。図５Ｃは、２０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の腹膜注射後に取得したマウスの１３Ｃ  ＦＩＳＰ像（６０°フリップ角）のオーバーレイの例を示す。図５Ｄは、２０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の腹膜注射後に取得したマウスの１３Ｃ  ＦＩＳＰ像（６０°フリップ角）のオーバーレイの例を示す。
【００６２】
オーバーレイ画像によれば、過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩がマウスの静脈内に注射されると、ＦＩＳＰ像が心臓の部位にある図５Ａと５Ｂで認められるように、心臓血管系を介して急速に進んで行き、過分極分子は膀胱および尿管に集まる（図５Ｂ）。腹腔内の注射では、過分極化合物およびその代謝物は、試験時間中、主に腹膜中にとどまる（図５Ｃと５Ｄ）。
【００６３】
実施例６：ＲＥＮＣＡ腫瘍、Ａ２０リンパ腫腫瘍、および４Ｔ１乳腺腫瘍中の過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の代謝
ＢＡＬＢ／ｃマウス同種移植腫瘍含有動物に１０μｍｏｌの過分極化合物を尾静脈経由で注射した。図６Ａは、３種の異なる腫瘍：腎癌（ＲＥＮＣＡ）（左の像）、リンパ腫Ａ２０（中央の像）、および４Ｔ１乳癌（右の像）、を有するマウスに１０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の静脈注射後の過分極ジエチルコハク酸塩の体内分布を示す１３Ｃ  ＦＩＳＰ像の比較である。図６Ｂは、３種の異なる腫瘍：ＲＥＮＣＡ（左の像）、Ａ２０リンパ腫（中央の像）、および４Ｔ１乳癌（右の像）を有するマウスに過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の静脈注射後の熱マップ投影図の使用による過分極シグナルのほぼ全体を示す１３Ｃ  ＣＳＩ像の比較である。図６Ｃは、３種の異なる腫瘍：ＲＥＮＣＡ（左の像）、Ａ２０リンパ腫（中央の像）、および４Ｔ１乳癌（右の像）を有するマウスに対する、図６Ｂの１３Ｃ  ＣＳＩ像内の個別ボクセルの代謝プロファイルの比較である。
【００６４】
実施例７：ＲＥＮＣＡ腫瘍および乳癌（４Ｔ１）腫瘍中の過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の体内分布および代謝
過分極ジエチルコハク酸塩を使って、２匹のマウスの異なる皮下腫瘍モデルの癌のイメージングを行った。ＰＨＩＰを使って、ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩を過分極させた。ほぼ生理的な濃度（１０〜２０μｍｏｌ）の過分極溶液を、乳癌（４Ｔ１）（Ｎ＝５）または腎腫瘍（ＲＥＮＣＡ）（Ｎ＝９）を有するＢＡＬＢ／ｃマウスに尾静脈経由で注射した。１Ｈ／１３Ｃ二重共鳴ボリュームコイル（Ｄｏｔｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＳＣ）を利用して、１３Ｃ過分極インビボイメージングおよびＣＳＩ分光測定を行った。６０°のフリップ角、ＦＯＶ６または７ｃｍ、および１５．２ｍｍのスライス厚さの条件で１３Ｃ  ＦＩＳＰを使用した。１３Ｃ  ＣＳＩの条件は、１ｍｓガウスパルス、２００ｍｓ  ＴＲ、８ｘ８またはｌ６ｘｌ６マトリックス、２．６４ｃｍ〜４ｃｍの範囲のＦＯＶ、８〜１２ｍｍのスライス厚さ、とした。３ＤｉＣＳＩソフトウェア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｑｕｉ  Ｚｈａｏ）を使ってＣＳＩを処理した。腫瘍内の化合物の流動速度を４ｃｍ  ＩＤソレノイドボリュームコイルおよび単一パルスを使って測定し、１３Ｃシーケンスを取得した。全１３Ｃイメージングおよび分光測定を水平ボアＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ４．７Ｔ動物スキャナで行った。
【００６５】
２種の腫瘍で、ジエチルコハク酸塩の異なる体内分布が観察された。図７Ａは、静脈注射後の２匹の異なるマウスのＲＥＮＣＡ腫瘍（左の像）および乳腺腫瘍（右の像）中の過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の体内分布を示す１３Ｃ  ＦＩＳＰ像の比較である。図７Ｂは、静脈注射後の２匹の異なるマウスのＲＥＮＣＡ腫瘍（上の像）および乳腺腫瘍（下の像）中の過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の体内分布を示す１３Ｃ  ＣＳＩ像の比較である。
【００６６】
１３Ｃ  ＣＳＩを使って両腫瘍でジエチルコハク酸塩の代謝が観察される。６４ｃｍ３のボリューム範囲のパルスおよびデータ取得を使い、我々の二重チューニング４ｃｍ  ＩＤソレノイドボリュームコイルを使用して化合物の流動速度を測定した。図８Ｃは、静脈注射後の２匹の異なるマウスのＲＥＮＣＡ腫瘍（左の像）および乳腺腫瘍（右の像）中の過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の代謝を示す平均１３Ｃ  ＣＳＩ像の比較である。
【００６７】
実施例８：過分極によるラット脳中のＴＣＡ回路代謝のイメージング
過分極ジエチルコハク酸塩を使って、ラット脳内の代謝を検出し、化合物が血液脳関門を通過することを示した。ＰＨＩＰを使って、ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩を過分極させた。正常な雄のＳｐｒａｑｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｎ＝３）の頚動脈に、ほぼ生理的な濃度（１０〜２０μｍｏｌ）の過分極溶液を注射した。１Ｈ／１３Ｃ二重共鳴４ｃｍ  ＩＤソレノイドボリュームコイルを利用して、１３Ｃ過分極インビボイメージングおよび分光測定を行った。６０°のフリップ角、ＦＯＶ６または７ｃｍ、および１５．２ｍｍのスライス厚さの１３Ｃ  ＦＩＳＰシーケンスを使って、化合物の体内分布を観察した。１ｍｓガウスパルス、２００ｍｓ  ＴＲ、８ｘ８または１６ｘ１６マトリックス、２．６４ｃｍ〜４ｃｍの範囲のＦＯＶ、８〜１２ｍｍのスライス厚さの条件で１３Ｃ  ＣＳＩを使用した。３ＤｉＣＳＩソフトウェア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｑｕｉ  Ｚｈａｏ）を使ってＣＳＩを処理した。腫瘍内の化合物の流動速度を単一パルスを使って測定し、１３Ｃシーケンスを取得した。全１３Ｃイメージングおよび分光測定を水平ボアＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ４．７Ｔ動物スキャナで行った。
【００６８】
過分極化合物のリアルタイム体内分布は、動脈注射によりジエチルコハク酸塩がラットの脳に送達されたことを示す。図８Ａは、頭部動脈注射経由でラットに送達された２０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の体内分布を示す１３Ｃ  ＦＩＳＰ像である。流入する血液からの過分極コハク酸塩シグナルは、注射後１分間まで１３Ｃイメージングおよび分光測定を可能とした。また、動物の脳内の過分極シグナルのほぼ全体が、１３Ｃ  ＣＳＩで観察される。図８Ｂは、頭部動脈注射によりラットに送達された２０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の体内分布を示す１３Ｃ  ＣＳＩスペクトルである。
【００６９】
ＴＣＡ回路代謝物が、投与後５ｓ以内に観察された。コイルにより局在化された脳の１３Ｃ  ＭＲ分光測定からは、過分極ジエチルコハク酸塩の注射由来の複数の下流ＴＣＡ回路代謝産物の形成が認められる。これらは、コハク酸塩、リンゴ酸塩、およびグルタミン酸塩として特定された。図８Ｃは、２０μｍｏｌの過分極ジエチル１−１３Ｃ  ２，３−ｄ２コハク酸塩の動脈注射後のラットの頭部の１３Ｃ  ＭＲスペクトルを示す。
【００７０】
明細書または請求項中で使用される限りにおいて、［用語］の「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が請求項の移行語として用いられる場合に解釈されるのと同様に、包括的であることが意図される。さらに、用語の「または（ｏｒ）」が用いられる場合（例えば、ＡまたはＢ）、「Ａまたは（ｏｒ）Ｂまたは（ｏｒ）両方」を意味することが意図されている。「ＡまたはＢのみであるが、両方ではない（ｏｎｌｙ  Ａ  ｏｒ  Ｂ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｂｏｔｈ）」が意図される場合、用語の「ＡまたはＢのみであるが、両方ではない（ｏｎｌｙ  Ａ  ｏｒ  Ｂ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｂｏｔｈ）」が用いられる。従って、本明細書で用語の「ｏｒ」の使用は、包括的であり、排他的な使用ではない。Ｂｒｙａｎ  Ａ．Ｇａｍｅｒ、Ａ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｌｅｇａｌ  Ｕｓａｇｅ  ６２４（２ｄ．Ｅｄ．１９９５）、を参照されたい。また、明細書または請求項中で使用される限りにおいて、用語の「ｉｎ」または「ｉｎｔｏ」は、「ｏｎ」または「ｏｎｔｏ」の意味を追加することが意図されている。さらに、用語の「約（ａｂｏｕｔ）」が数に関連して使われる場合には、その数の±１０％を含むことが意図されている。例えば、「約１０」は、９〜１１を意味する場合がある。
【００７１】
上述のように、本出願を実施形態の説明により例示し、また、実施形態をかなり詳細に説明してきたが、添付請求項の範囲をこのような詳細内容に制限、または多少なりとも限定する意図はない。追加の利点と修正は、当業者には自明であろう。従って、広範な態様を含む本出願は、特定の詳細内容、および示された例示的実施例に限定されない。一般的発明の概念の趣旨または範囲を逸脱することなく、このような詳細内容および実施例の変更を行うことができる。
【図１Ａ】
2014520606.tif 000012
【図１Ｂ】
2014520606.tif 000013
【図１Ｃ】
2014520606.tif 000014
【図１Ｄ】
2014520606.tif 000015
【図２Ａ】
2014520606.tif 000016
【図２Ｂ】
2014520606.tif 000017
【図２Ｃ】
2014520606.tif 000018
【図２Ｄ】
2014520606.tif 000019
【図３Ａ】
2014520606.tif 000020
【図３Ｂ】
2014520606.tif 000021
【図４】
2014520606.tif 000022
【図５Ａ−５Ｂ】
2014520606.tif 000023
【図５Ｃ−５Ｄ】
2014520606.tif 000024
【図６Ａ】
2014520606.tif 000025
【図６Ｂ】
2014520606.tif 000026
【図６Ｃ】
2014520606.tif 000027
【図７Ａ】
2014520606.tif 000028
【図７Ｂ】
2014520606.tif 000029
【図７Ｃ】
2014520606.tif 000030
【図８Ａ】
2014520606.tif 000031
【図８Ｂ】
2014520606.tif 000032
【図８Ｃ】
2014520606.tif 000033
【国際調査報告】
2014520606.tif 000034