(57)【要約】本発明は、チアジンレッドRを用いて、βシート凝集タンパク質リガンドを同定するためのアッセイ法を提供する。2014520270.tif 000005
2014520270.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含むβシート凝集タンパク質リガンドの同定のための方法:
(a)βシート凝集タンパク質をチアジンレッドR（Thiazine Red R）及び一つの化合物と接触させる工程、
(b)工程(a)の混合物におけるチアジンレッドRの蛍光を測定する工程であって、ブランクと比較した、工程(a)の混合物におけるチアジンレッドRの蛍光の減少が、βシート凝集タンパク質リガンドを示す、工程。
【請求項２】
βシート凝集タンパク質が、タウタンパク質、Aβペプチド、及びαシヌクレインタンパク質から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
βシート凝集タンパク質が、タウタンパク質またはAβ40ペプチド、好ましくはヒトタウタンパク質またはヒトAβ40ペプチドである、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
チアジンレッドRの蛍光が、励起531nm／発光595nmで測定される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
βシート凝集タンパク質が、組換えによって作製されたβシート凝集タンパク質である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ブランクが、βシート凝集タンパク質及びチアジンレッドRを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
試験化合物のIC50を決定するために、前記化合物が、工程(a)の混合物に、増加する濃度で添加される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
βシート凝集タンパク質リガンドの同定のための、チアジンレッドRの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、βシートを形成する凝集タンパク質に結合するリガンドの同定のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー患者の脳におけるタウタンパク質凝集体は、神経変性疾患の進行と非常によく相関し、神経変性プロセスの早期の画像マーカーとして有用であり得る。タウの凝集体を示す他の神経変性疾患も存在する。アミロイドβの画像化と組み合わせて、タウオパチーは、アルツハイマー病から区別されうる。これは、診断及び患者の階層化にとって価値のあるツールであろう。タウの画像化は、タウの病理学及び神経変性をターゲットにするプロジェクトのための有用なバイオマーカーであろう。
【０００３】
したがって、アルツハイマー病患者または他のタウオパチーにおけるタウ凝集体の、特定の画像化のためのPET(陽電子放出断層撮影)画像法リガンドを同定するための方法の必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の方法は、βシート凝集体に結合したチアジンレッドR（Thiazine Red R）（CAS番号2150−33−6）が、βシート凝集体を形成するモノマーに結合したチアジンレッドR と比較して、蛍光の強い増加を示すという発見に基づく。
【０００５】
「βシート凝集タンパク質」なる用語は、本明細書では、βシート構造を有する凝集体を形成するタンパク質をさすために用いられる。タウタンパク質、αシヌクレインタンパク質、及びAβペプチドが、βシート構造を有する凝集体を形成する。
【０００６】
本明細書で使用される「タンパク質」なる用語は、アミノ酸のポリマーをいい、長さの特定はない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質断片が、ポリペプチドの定義に含まれる。「タンパク質」なる用語は、「ポリペプチド」なる用語と交換可能に用いられる。
【０００７】
「タウタンパク質」なる用語は、本明細書では、任意の動物、例えばヒトを含む哺乳類、種からの天然配列のタウタンパク質、及びタウ変異体(以下でさらに定義される)をさすために使用される。タウポリペプチドは、ヒトの組織型を含む種々の源から単離されるか、組換え及び／または合成法によって調製され得る。
【０００８】
天然のまたは組換えで作製されたタウタンパク質が、このアッセイで使用されうる。「組換えタンパク質」は、異種細胞での発現によって単離され、精製され、または同定されたタンパク質であり、当該細胞は、宿主細胞でタンパク質の発現を起こすように操作された組換え発現ベクターにより、過渡的にまたは安定的に、形質導入されるかまたは遺伝子導入されている。組換え型タウは、例えば、大腸菌（E.coli）などの原核細胞、例えば分裂酵母（S.pombe）などの酵母、または例えばHEK293細胞、Sf9昆虫細胞などの真核細胞において作製されうる。好ましくは、Sf9昆虫細胞は、組換え型タウの高発現のために使用される。アッセイで用いられるタウタンパク質は、精製されうる。本明細書で使用される「精製」なる用語は、天然の環境から、または組換え作製源から取り出され、単離または分離され、かつ他の成分、例えば、天然には関連し合っている膜及びミクロソームを少なくとも60％、さらに好ましくは少なくとも80％含まないポリペプチドをさす。
【０００９】
「天然配列のタウ」とは、調製の様式にかかわらず、天然のタウポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをさす。天然配列のタウは、自然界から単離され得るか、または組換え及び／もしくは合成法によって調整されうる。「天然配列のタウ」なる用語は、特に、天然起源の切断型または分泌型、天然起源の変異型（例えば、選択的スプライス型）、及び天然起源の、タウの対立遺伝子変異体を包含する。NCBIデーターベースのヒトのタウポリペプチドの識別子は、NP_005901(Seq.Id.No.1)である。
【００１０】
「タウ変異体」なる用語は、天然配列のタウのアミノ酸配列の変異体をさし、天然の配列における一つ以上のアミノ酸置換及び／または欠失及び／または挿入を含む。アミノ酸配列の変異体は、天然配列のタウのアミノ酸配列と、一般に、少なくとも約75%、好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約85%、さらにより好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%の配列相同性を有する。
【００１１】
「Aβペプチド」なる用語は、本明細書中、任意の動物、例えばヒトを含む哺乳類、種からの天然配列のAβペプチド、及びAβペプチドの変異体（以下でさらに定義される）をさすように使用される。Aβペプチドは、ヒトの組織型を含む種々の源から単離され得るか、または組換え及び／もしくは合成法により調製され得る。
【００１２】
天然のまたは組換えにより作製されたAβペプチドが、本アッセイで使用され得る。「組換えタンパク質」は、異種細胞での発現によって単離され、精製され、または同定されたタンパク質であり、当該細胞は、宿主細胞でタンパク質の発現を起こすように操作された組換え発現ベクターにより、過渡的にまたは安定的に、形質導入されるかまたは遺伝子導入されている。組換えAβペプチドは、例えば、大腸菌（E.coli）などの原核細胞、例えば分裂酵母（S.pombe）などの酵母、または例えばHEK293細胞、Sf9昆虫細胞などの真核細胞において作製されうる。アッセイで用いられるAβペプチドは、精製されうる。本明細書で使用される「精製」なる用語は、天然の環境から、または組換え作製源から取り出され、単離または分離され、かつ他の成分、例えば、天然には関連し合っている膜及びミクロソームを少なくとも60％、より好ましくは少なくとも80％含まないポリペプチドをさす。
【００１３】
「天然の配列のAβペプチド」は、調製の様式にかかわらず、天然のAβペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをさす。「Aβペプチド」にはいくつかの天然発生する型が在り、ヒトの型は、Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42及びAβ43と呼ばれることに注目されたい。最も顕著な型はAβ42であり、（N末端から始まる）以下のアミノ酸配列を有する。
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Aβ41、Aβ40、Aβ39においては、C末端のアミノ酸A、IA及びVIAがそれぞれ欠損している。Aβ43型においては、追加のスレオニン残基が、上記の配列（Seq.ID.No.3）のC末端に含まれている。本アッセイに使用される好ましいAβペプチドは、Seq.ID.No.4のアミノ酸配列を有するAβ40である。
【００１４】
天然配列のAβペプチドは、自然界から単離され得るか、組換え及び／または合成法によって調製されうる。「天然配列のAβペプチド」なる用語は、特に、天然起源の切断型または分泌型、天然起源の変異型、及び天然起源の、Aβペプチドの対立遺伝子変異体を包含する。「Aβペプチド変異体」なる用語は、天然配列のAβペプチドのアミノ酸配列の変異体をさし、天然の配列における一つ以上のアミノ酸置換及び／または欠失及び／または挿入を含む。アミノ酸配列の変異体は、天然配列のAβペプチドのアミノ酸配列と、一般に、少なくとも約75%、好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約85%、さらにより好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%の配列相同性を有する。
【００１５】
「αシヌクレインタンパク質」なる用語は、本明細書中、任意の動物、例えばヒトを含む哺乳類、種からの天然配列のαシヌクレインタンパク質、及びαシヌクレインの変異体（以下でさらに定義される）をさすように使用される。αシヌクレインポリペプチドは、ヒトの組織型を含む種々の源から単離され得るか、または組換え及び／もしくは合成法により調製され得る。
【００１６】
天然のまたは組換えにより作製されたαシヌクレインタンパク質が、本アッセイで使用され得る。「組換えタンパク質」は、異種細胞での発現によって単離され、精製され、または同定されたタンパク質であり、当該細胞は、宿主細胞でタンパク質の発現を起こすように操作された組換え発現ベクターにより、過渡的にまたは安定的に、形質導入されるかまたは遺伝子導入されている。組換えαシヌクレインは、例えば、大腸菌（E.coli）などの原核細胞、例えば分裂酵母（S.pombe）などの酵母、または例えばHEK293細胞、Sf9昆虫細胞などの真核細胞において作製されうる。好ましくは、Sf9昆虫細胞が、組換えαシヌクレインの高発現のために使用される。アッセイで用いられるαシヌクレインタンパク質は、精製されうる。本明細書で使用される「精製」なる用語は、天然の環境から、または組換え作製源から取り出され、単離または分離され、かつ他の成分、例えば、天然には関連し合っている膜及びミクロソームを少なくとも60％、より好ましくは少なくとも80％含まないポリペプチドをさす。
【００１７】
「天然配列のαシヌクレイン」は、調製の様式にかかわらず、天然のαシヌクレインポリペチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをさす。天然配列のαシヌクレインは、自然界から単離され得るか、または組換え及び／もしくは合成法により調製され得る。「天然配列のαシヌクレイン」なる用語は、特に、天然起源の切断型または分泌型、天然起源の変異型（例えば、選択的スプライス型）、及び天然起源の、αシヌクレインの対立遺伝子変異体を包含する。ヒトのαシヌクレインポリペプチドのアミノ酸配列は、Seq.Id.No2で与えられる。
【００１８】
「αシヌクレイン変異体」なる用語は、天然配列のαシヌクレインのアミノ酸配列の変異体をさし、天然配列における一つ以上のアミノ酸置換及び／または欠失及び／または挿入を含む。アミノ酸配列の変異体は、天然配列のαシヌクレインのアミノ酸配列と、一般に、少なくとも約75%、好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約85%、さらにより好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%の配列相同性を有する。
【００１９】
「化合物」なる用語は、本明細書中、本発明のアッセイに関連して述べられる「試験化合物」または「トレーサー候補化合物」の文脈で使用される。そのようなものとして、これらの化合物は、合成または天然の源由来の有機化合物または無機化合物を含む。化合物は、これに限られないが、比較的低い分子量で特徴づけられるポリヌクレオチド、脂質、またはホルモン類似体のような、無機化合物または有機化合物を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】凝集タンパク質及びモノマータンパク質に対するチアジンレッドRの飽和分析を示す。凝集タンパク質のそれぞれには、チアジンレッドのための二つの異なる結合部位が存在する。Kdは、両方の結合部位(Kd1、Kd2)に対して決定される。図1A:タウ
【図１Ｂ】凝集タンパク質及びモノマータンパク質に対するチアジンレッドRの飽和分析を示す。凝集タンパク質のそれぞれには、チアジンレッドのための二つの異なる結合部位が存在する。Kdは、両方の結合部位(Kd1、Kd2)に対して決定される。図1B:Aβ
【図１Ｃ】凝集タンパク質及びモノマータンパク質に対するチアジンレッドRの飽和分析を示す。凝集タンパク質のそれぞれには、チアジンレッドのための二つの異なる結合部位が存在する。Kdは、両方の結合部位(Kd1、Kd2)に対して決定される。図1C:αシヌクレイン
【発明を実施するための形態】
【００２１】
実験の部
大腸菌から精製された組換えヒト微小管関連タウタンパク質が、アラキドン酸（100μM）のpH8のトリス10mM溶液を用いて、37℃24時間で、5μMの濃度で凝集される。合成Aβ40は、アラキドン酸（100μM）のpH8のトリス10mMを用いて、37℃で3日間、150rpmで振動させて、凝集される。
【００２２】
大腸菌から精製された、ヒト組換えαシヌクレインは、アラキドン酸（100μM）のpH8のトリス10mM溶液を用いて、37℃で5日間、150rpmで振動させて、凝集される。
【００２３】
凝集タンパク質に対するチアジンレッドの飽和分析は、凝集タンパク質に対するチアジンレッドの親和性(Kd)を決定するために行われる。表1は、凝集したタウ、Aβ、及びαシヌクレインに対するチアジンレッドの親和定数を示す。結果は、チアジンレッドに対し、各凝集タンパク質に、異なる親和性を有する二つの結合部位が存在することを示している。
【００２４】
チアジンレッドは、置換物化合物の添加によって阻害され得る蛍光シグナルを誘発するために、各凝集タンパク質結合部位に対するKdに対応する濃度で加えられる。
【００２５】
凝集タンパク質のチアジンレッド結合部位に対する置換物化合物の親和性を決定するために、このアッセイでは、化合物は、0.3nM〜10000nMの範囲で、異なる濃度で加えられる。
【００２６】
同時に、化合物の自己蛍光が、凝集タンパク質と共に、しかしチアジンレッド無しで、測定される。負の対照として、リガンド及び凝集タンパク質を用い、正の対照として、チアジンレッド、公知の活性を有する参照化合物、及び凝集タンパク質を用いる。
【００２７】
アッセイは、Perkin Elmer OptiPlate 384、blackにおいて、45ulのアッセイ容量で行い、アッセイバッファーは、CaCl2、MgCl2を含まないDPBS（GIBOCO N.14020）である。試験される化合物は、DMSOで希釈し、2μlをアッセイに加える（最終的に5% DMSO）。アッセイは、凝集タンパク質（競合条件）の添加によって始める。プレートを、短い時間振動させ（Sterico variomag teleshakeで1分間）、室温で30分インキュベートする。測定は、En:Vision(Perkin Elmer)、励起531nm/発光595nmで行う。
【００２８】
表1は、凝集タウ、Aβ、及びαシヌクレインの高親和性結合部位に対する異なる化合物の親和性定数を示す。
【００２９】
前述の発明が、理解を明確にする目的で、説明及び実例によっていくらか詳細に記載されたが、記載及び実例は、発明の範囲を限定させるものと解釈されるべきでない。本明細書で引用されるすべての特許及び科学文献の開示は、その全体が参照により、明確に組み入れられる。
【００３０】
【表１】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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