(57)【要約】  本発明は、個体における早期肺癌の予後を、１種または複数のバイオマーカーを使用して決定するための方法に一部関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の対象の予後を判定するための方法であって、
外科的切除後の、ＮＳＣＬＣに罹患している対象から試験試料を得るステップと、
表１、表２または表３のそれぞれにおいて特定されている少なくとも３種以上のバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、
発現レベルを分析してリスクスコアを生成するステップとを含み、リスクスコアを使用して、対象の予後判定をもたらすことができる、方法。
【請求項２】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の対象の予後を判定するための方法であって、
外科的切除後の、ＮＳＣＬＣに罹患している対象から試験試料を得るステップと、
表１、表２および表３の少なくとも１種のバイオマーカーの試験試料における発現レベルを決定するステップと、
発現レベルを分析してリスクスコアを生成するステップとを含み、リスクスコアを使用して、対象の予後判定をもたらすことができる、方法。
【請求項３】
リスクスコアにより、対象を、高リスク群であり、アジュバント化学療法を受けることが有益になるか、または低リスク群であり、アジュバント化学療法を受けることが有益にならないかに分類する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
対象の予後が生存不良である、または予後が生存良好である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
表１、表２および表３において特定されている少なくとも１種のバイオマーカーが、ＣＢＸ７、ＳＴＸ１Ａ、およびＴＰＸ２を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
表１、表２および表３において特定されている少なくとも１種のバイオマーカーが、ＣＢＸ７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＳＴＸ１Ａ、ＫＬＫ６、ＴＰＸ２およびＵＣＫ２を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
表１、表２および表３において特定されている少なくとも１種のバイオマーカーが、ＣＢＸ７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＧＰＲ１１６、ＳＴＸ１Ａ、ＫＬＫ６、ＳＬＣ１６Ａ３、ＴＰＸ２、ＵＣＫ２、ＰＨＫＡ１を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
表１、表２および表３において特定されている少なくとも１種のバイオマーカーが、ＣＢＸ７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＧＰＲ１１６、ＫＣＮＪ１５、ＳＴＸ１Ａ、ＫＬＫ６、ＳＬＣ１６Ａ３、ＰＹＧＬ、ＴＰＸ２、ＵＣＫ２、ＰＨＫＡ１、またはＥＩＦ４Ａ３を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
表１、表２および表３において特定されている少なくとも１種のバイオマーカーが、ＣＢＸ７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＧＰＲ１１６、ＫＣＮＪ１５、ＰＴＰＮ１３、ＳＴＸ１Ａ、ＫＬＫ６、ＳＬＣ１６Ａ３、ＰＹＧＬ、ＬＤＨＡ、ＴＰＸ２、ＵＣＫ２、ＰＨＫＡ１、ＥＩＦ４Ａ３またはＴＫ１を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
表１、表２および表３において特定されている少なくとも１種のバイオマーカーが、ＣＢＸ７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＧＰＲ１１６、ＫＣＮＪ１５、ＰＴＰＮ１３、ＣＴＳＨ、ＳＴＸ１Ａ、ＫＬＫ６、ＳＬＣ１６Ａ３、ＰＹＧＬ、ＬＤＨＡ、ＩＴＧＡ５、ＴＰＸ２、ＵＣＫ２、ＰＨＫＡ１、ＥＩＦ４Ａ３、ＴＫ１、またはＣＣＮＡ２を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
外科的切除後の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の対象において予後を予測する方法であって、表１、表２および／または表３に列挙されている１種または複数のバイオマーカーの発現を決定するステップを含み、対照と比較した、表２および／または表３に列挙されている１種または複数のバイオマーカーの発現の増加、ならびに表１に列挙されている１種または複数のバイオマーカーの発現の減少を用いて、対象が、生存不良を有する高リスク群に入るか、生存良好を有する低リスク群に入るかを予測する、方法。
【請求項１２】
高リスク群の対象をアジュバント化学療法のために選択し、低リスク群の対象はアジュバント化学療法のために選択しない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＮＳＣＬＣの対象に対する療法を選択する方法であって、
切除を受けた、ＮＳＣＬＣに罹患している対象から試験試料を得るステップと、
表２において特定されている少なくとも２種以上のバイオマーカーの、試験試料における発現レベルを決定して、各遺伝子についての発現値を生成するステップと、
発現値を分析してリスクスコアを生成するステップとを含み、リスクスコアを使用して、対象を、血管新生阻害剤を投与するように選択するかどうかを分類することができる、方法。
【請求項１４】
血管新生阻害剤がアバスチンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＮＳＣＬＣ癌を有する対象を選択的に治療する方法であって、
外科的切除後の、ＮＳＣＬＣに罹患している対象から試験試料を得るステップと、
表１、表２または表３において特定されている少なくとも１種または複数のバイオマーカーの、または表１、表２または表３において特定されているバイオマーカーの任意の組み合わせの、試験試料における発現レベルを決定してリスクスコアを生成するステップと、
対象を、リスクスコアに基づいて高リスク群または低リスク群に分類するステップと、
高リスク群に属すると分類された対象にアジュバント療法を投与する、または低リスク群に属すると分類された対象にアジュバント療法を投与しないステップと
を含む方法。
【請求項１６】
表１、表２および／または表３において特定されている少なくとも３種のバイオマーカーの発現を決定するステップを含む、請求項１１、請求項１３または請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
表１、表２および／または表３において特定されている少なくとも４種のバイオマーカーの発現を決定するステップを含む、請求項１、請求項１１、請求項１３または請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
表１、表２および／または表３において特定されている少なくとも５種のバイオマーカーの発現を決定するステップを含む、請求項１、請求項１１、請求項１３または請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
表１、表２および／または表３において特定されている少なくとも６種のバイオマーカーの発現を決定するステップを含む、請求項１、請求項１１、請求項１３または請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
ＮＳＣＬＣがＩ期ＮＳＣＬＣまたはＩＩ期ＮＳＣＬＣ、またはそれらの組み合わせである、請求項１から請求項１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ＮＳＣＬＣが、扁平上皮癌および腺癌からなる群に特定される、請求項１から請求項２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
試験試料が新鮮細胞、凍結細胞、パラフィン固定包埋細胞である、請求項１から請求項２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
発現レベルを、ｑＮＰＡ、ｎａｎｏＳｔｒｉｎｇ、定量的ＰＣＲまたはアレイを用いて決定する、請求項１から請求項２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
発現を分析してリスクスコアを生成するステップを、統計的分析を用いて実施する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
統計的分析が、コックス回帰分析またはパラメトリック生存予測変数を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
対象がヒトである、請求項１から請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
表１、表２および／または表３において特定されている１種または複数のバイオマーカーの発現を測定するための複数の作用剤と、使用説明書とを含むためのキット。
【請求項２８】
肺癌の対象にアジュバント療法が有益であるかどうかを予測するためのキットであって、
表１、表２および／または表３において特定されている１種または複数のバイオマーカーの発現を測定するための複数の作用剤と、
発現を分析し、リスクスコアを生成して、患者にアジュバント療法が有益であるかどうかを予測するための手段と
を含むキット。
【請求項２９】
発現を測定するための作用剤が、特定されている遺伝子のｍＲＮＡと相補的なポリヌクレオチドのアレイを含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
発現を測定するための作用剤が、ｑＲＴ−ＰＣＲのための複数のＰＣＲプローブおよび／またはプライマーを含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３１】
表１、表２および表３において特定されている少なくとも１種のバイオマーカーが、ＣＢＸ７、ＳＴＸ１Ａ、およびＴＰＸ２を含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３２】
表１、表２および／または表３に示されている少なくとも２種のバイオマーカーの発現産物に対して相補的およびハイブリダイズ可能である１種または複数のポリヌクレオチドプローブを含むアレイ。
【請求項３３】
複数の単離された核酸配列を含む組成物であって、各単離された核酸配列が、バイオマーカーＣＢＸ７、ＳＴＸ１Ａ、およびＴＰＸ２のＲＮＡ産物とハイブリダイズする、前記３種の遺伝子のＲＮＡ発現のレベルを測定するために使用される、組成物。
【請求項３４】
ＮＳＣＬＣの対象の予後を予測するためのコンピュータ製品であって、
ＮＳＣＬＣを有する対象由来の試料における表１、表２および／または表において特定されている１種または複数のバイオマーカーの発現レベルに対応するデータを受け取るための手段と、
各遺伝子についての発現値を生成するための手段と、
予後に関連づけられる参照発現プロファイルを含むデータベースへの発現値の入力に基づいてリスクスコアを生成するための手段とを含み、リスクスコアにより、生存に関する予後を予測する、または対象を高リスク群または低リスク群に分類する、コンピュータ製品。
【請求項３５】
請求項１から請求項２５のいずれか一項に記載の方法で使用するための、請求項３４に記載のコンピュータ製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、予後判定およびオーダーメイド療法の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、２００７年には世界中で１５００万件の新規症例が診断された、最も一般的な癌である（Salomonら、Crit Rev Oncol Hematol.、19:183-232、1995、SEER-databese 05.2010）。肺癌は、発生率および死亡率が高いことにより、癌に関連した死亡の主な原因となっており、その死亡数は１年当たり９７５，０００件を超え、５年生存率は１５％である（Salomonら、上記）。肺癌は、小細胞肺癌、または非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に分類することができる。ＮＳＣＬＣが症例の約８０％を占める。ＮＳＣＬＣは、さらにいくつかの組織型に細分することができ、最も一般的なものは腺癌（４０％）および扁平上皮癌（２５％）である。
【０００３】
ＮＳＣＬＣの現行の治療は主に腫瘍の形態、および、腫瘍を、腫瘍の進行の程度に対応する等級別のカテゴリー（ＩＡ期、ＩＢ期、ＩＩＡ期、ＩＩＢ期、ＩＩＩＡ期、ＩＩＩＢ期およびＩＶ期）に分類する腫瘍−節−転移（ＴＮＭ）に基づく病期分類システムに基づく。多くの病期分類システムが存在する（例えば、臨床的病期分類、それと対照して病理学的病期分類、ならびにInternational Association for the Study of Lung Cancer（IASLC）により発行されたものなどの病期分類ガイドラインの種々の版（Goldstrawら、J. Thorac. Oncol. 2、706-714、2007）。例えば、臨床的病期分類およびＴＮＭ病期分類推奨のＩＡＳＬＣ第６版による病期の発生頻度はＩ期が２３％、ＩＩ期が１９％、ＩＩＩ期が３７％、およびＩＶ期が２１％である（Goldstrawら、上記）。相対的な割合は、実質的に、ガイドラインおよび臨床的病期分類と病理学的病期分類のいずれを使用するかに応じて変化する可能性がある。
【０００４】
早期ＮＳＣＬＣ（ＩおよびＩＩ期）に対する標準の治療は外科手術であり、その後に、アジュバント療法、例えば、放射線療法、化学療法（ＩＩ期以降に対して）、進行したＮＳＣＬＣの病期に対してはベバシズマブおよび上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）が続く（Kutikovaら、Lung Cancer；50(2):143-154、2005）。米国およびヨーロッパにおけるＮＳＣＬＣを治療するための臨床的ガイドラインによりこれらの治療の選択肢が支持される（Mendelssohnら、2000；NCCN-Guidelines NSCLC V1、2010）。
【０００５】
早期肺癌についての現行のＴＮＭに基づく病期分類システムに基づいて、Ｉ期ＮＳＣＬＣ患者では、外科手術後５年以内に再燃する確率が３５％である（SEER-Database、２００８）。現行の治療ガイドラインでは、これらの患者に対してアジュバント化学療法は推奨されていない。ＴＮＭに基づくＩＩ期の患者の３０％では、アジュバント化学療法を伴わずに再燃が起こらない（ＳＥＥＲ−Ｄａｔａｂａｓｅ）、つまり、これらの患者は現行の治療ガイドライン（すなわち、ESMO（D’Addarioら、Annals of Oncology. 2009；20（補遺4）：iv68-iv70、2009）、NCCN V1-2010）に基づくと過剰な治療を受ける。これは、早期ＮＳＣＬＣの患者の６０％で外科手術後の再燃がないことを示す報告と対応する（Arriagadaら、NEJM、350:351-360、2004）。現在の臨床データに基づいて、早期ＮＳＣＬＣのアジュバント化学療法による治療により、アジュバント化学療法の利益の中央値は４％（ＮＳＣＬＣ  Ｍｅｔａ−Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐ）であり、これにより５年の時点で６０％から６４％に改善されるという証拠がもたらされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在の欠点に基づいて、ＮＳＣＬＣの患者に対する予後的および／または予測的なゲノムのサインを必要とする医学的合理性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、個体における早期肺癌の予後を、本明細書に記載の１種または複数のバイオマーカーを使用して決定するための方法に一部関する。これらの発見を用いて、早期肺癌の患者に対する適切な治療の決定を補助すること、例えばアジュバント療法を受けることが有益になる患者を特定することなどができる。
【０００８】
一態様では、本発明は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の対象の予後を判定するまたは該対象を分類するための方法であって、外科的切除後の、ＮＳＣＬＣに罹患している対象から試験試料を得るステップと、表１、表２および／または表３において特定されている少なくとも１種または複数のバイオマーカーの、または表１、表２および／または表３において特定されているバイオマーカーの任意の組み合わせの、試験試料における発現レベルを決定するステップと、発現レベルを分析してリスクスコアを生成するステップとを含み、リスクスコアを使用して、対象の予後判定をもたらすまたは対象を分類することができる、方法を包含する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の対象の予後を判定するまたは該対象を分類するための方法であって、外科的切除後の、ＮＳＣＬＣに罹患している対象から試験試料を得るステップと、表１、表２および表３の少なくとも１種のバイオマーカーの試験試料における発現レベルを決定するステップと、発現レベルを分析してリスクスコアを生成するステップとを含み、リスクスコアを使用して、対象の予後判定をもたらすまたは対象を分類することができる、方法を包含する。一実施形態では、表１、表２および表３において特定されている少なくとも１種のバイオマーカーは、ＣＢＸ７、ＳＴＸ１Ａ、およびＴＰＸ２を含む。別の実施形態では、表１、表２および表３において特定されている少なくとも１種のバイオマーカーは、ＣＢＸ７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＳＴＸ１Ａ、ＫＬＫ６、ＴＰＸ２およびＵＣＫを含む。さらに別の実施形態では、表１、表２および表３において特定されている少なくとも１種のバイオマーカーは、ＣＢＸ７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＧＰＲ１１６、ＳＴＸ１Ａ、ＫＬＫ６、ＳＬＣ１６Ａ３、ＴＰＸ２、ＵＣＫ２、ＰＨＫＡ１を含む。さらに別の実施形態では、表１、表２および表３において特定されている少なくとも１種のバイオマーカーは、ＣＢＸ７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＧＰＲ１１６、ＫＣＮＪ１５、ＳＴＸ１Ａ、ＫＬＫ６、ＳＬＣ１６Ａ３、ＰＹＧＬ、ＴＰＸ２、ＵＣＫ２、ＰＨＫＡ１、またはＥＩＦ４Ａ３を含む。さらに別の実施形態では、表１、表２および表３において特定されている少なくとも１種のバイオマーカーは、ＣＢＸ７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＧＰＲ１１６、ＫＣＮＪ１５、ＰＴＰＮ１３、ＳＴＸ１Ａ、ＫＬＫ６、ＳＬＣ１６Ａ３、ＰＹＧＬ、ＬＤＨＡ、ＴＰＸ２、ＵＣＫ２、ＰＨＫＡ１、ＥＩＦ４Ａ３またはＴＫ１を含む。さらに別の実施形態では、表１、表２および表３において特定されている少なくとも１種のバイオマーカーは、ＣＢＸ７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＧＰＲ１１６、ＫＣＮＪ１５、ＰＴＰＮ１３、ＣＴＳＨ、ＳＴＸ１Ａ、ＫＬＫ６、ＳＬＣ１６Ａ３、ＰＹＧＬ、ＬＤＨＡ、ＩＴＧＡ５、ＴＰＸ２、ＵＣＫ２、ＰＨＫＡ１、ＥＩＦ４Ａ３、ＴＫ１、またはＣＣＮＡ２を含む。
【００１０】
一実施形態では、本発明のリスクスコアを、対象を、肺癌に起因する死亡、遠隔転移（distance metastasis）または局所再燃の時間特異的確率にマッピングすることによって予後判定するために使用することができる。
【００１１】
別の実施形態では、リスクスコアにより、対象を、アジュバント化学療法を受けることが有益になる高リスク群またはアジュバント化学療法を受けることが有益にならない低リスク群に分類することができる。
【００１２】
別の態様では、本発明は、外科的切除後の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の対象において予後を予測する方法であって、新鮮凍結（ＦＦ）材料またはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）材料のいずれかの腫瘍試料由来のｍＲＮＡの発現プロファイルを決定するステップを含む方法を包含する。プロファイルは、表１、表２および／または表３に列挙されている１種または複数のバイオマーカーを含み、対照と比較した、表２および／または表３に列挙されている１種または複数のバイオマーカーの発現の増加、ならびに表１に列挙されている１種または複数のバイオマーカーの発現の減少を用いて、対象が、生存不良（poor survival）を有する高リスク群に入るか、生存良好（good survival）を有する低リスク群に入るかを予測する。本発明の方法では、高リスク群の対象をアジュバント化学療法のために選択し、低リスク群の対象はアジュバント化学療法のために選択せず、その後、状況に応じて治療する。
【００１３】
さらに別の実施形態では、本発明は、ＮＳＣＬＣの対象に対する療法を選択する方法であって、切除を受けた、ＮＳＣＬＣに罹患している対象から試験試料を得るステップと、表２において特定されている少なくとも２種以上のバイオマーカーの、試験試料における発現レベルを決定して、各遺伝子についての発現値を生成するステップと、発現値を分析してリスクスコアを生成するステップとを含み、リスクスコアを使用して、対象を、アバスチンなどの血管新生阻害剤を投与するように選択するかどうかを分類することができる、方法を包含する。
【００１４】
本発明の方法では、本発明は、表１、表２および／または表３において特定されている少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種または少なくとも１５種バイオマーカーの、またはそれらの任意の組み合わせの発現を決定するステップを包含する。例えば、表１、表２および表３のそれぞれから少なくとも任意の５種のバイオマーカーの発現を選択する（この実施形態におけるサインは少なくとも１５種のバイオマーカーを含む）。
【００１５】
一実施形態では、ＮＳＣＬＣはＩ期ＮＳＣＬＣ、ＩＩ期ＮＳＣＬＣ、またはそれらの組み合わせである。ＮＳＣＬＣは、扁平上皮癌および／または腺癌からなる群に特定することができる。
【００１６】
一実施形態では、対象とはヒトである。別の実施形態では、試験試料は、新鮮細胞、凍結細胞、ＦＦＰＥ細胞であってよい。別の実施形態では、発現レベルを、定量的ＰＣＲまたはアレイを用いて決定する。
【００１７】
さらに別の実施形態では、発現を分析してリスクスコアを生成するステップを、コックス回帰またはパラメトリック生存予測変数（parametric survival predictor）などの統計的分析を用いて実施する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、ＮＳＣＬＣ癌を有する対象を選択的に治療する方法であって、外科的切除後の、ＮＳＣＬＣに罹患している対象から試験試料を得るステップと、表１、表２および／または表３において特定されている少なくとも１種または複数のバイオマーカーの、または表１、表２および／または表３において特定されているバイオマーカーの任意の組み合わせの試験試料における発現レベルを決定してリスクスコアを生成するステップと、対象を、リスクスコアに基づいて高リスク群または低リスク群に分類するステップと、高リスク群に属すると分類された対象にアジュバント療法を投与する、または低リスク群に属すると分類された対象にアジュバント療法を投与しないステップとを含む方法を包含する。
【００１９】
さらに別の態様では、本発明は、表１、表２および／または表３において特定されている１種または複数のバイオマーカーの発現を測定するための複数の作用剤と、使用説明書とを含むキットを包含する。さらに別の態様では、本発明は、肺癌の対象にアジュバント療法が有益であるかどうかを予測するためのキットであって、表１、表２および／または表３において特定されている１種または複数のバイオマーカーの発現を測定するための複数の作用剤と、発現を分析し、リスクスコアを生成して、患者にアジュバント療法が有益であるかどうかを予測するための手段とを含むキットを包含する。発現を測定するための作用剤は、特定されているバイオマーカーのｍＲＮＡと相補的なポリヌクレオチドのアレイを含んでよい。発現を測定する作用剤は、ｑＲＴ−ＰＣＲのための複数のＰＣＲプローブおよび／またはプライマーを含んでよい。キットは、表１、表２および表３において特定されている少なくとも１種のバイオマーカー、例えば、ＣＢＸ７、ＳＴＸ１Ａ、またはＴＰＸ２などを測定するための作用剤を含んでよい。
【００２０】
別の態様では、本発明は、表１、表２および／または表３に示されている少なくとも２種のバイオマーカーなどの発現産物に対して相補的およびハイブリダイズ可能である１種または複数のポリヌクレオチドプローブを含むアレイを包含する。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、複数の単離された核酸配列を含む組成物であって、各単離された核酸配列が、表１に示されているバイオマーカー、例えば、バイオマーカーＣＢＸ７、ＳＴＸ１ＡおよびＴＰＸ２のＲＮＡ産物とハイブリダイズする、前記３種の遺伝子のＲＮＡ発現のレベルを測定するために使用される、組成物を包含する。
【００２２】
さらに別の態様では、本発明は、ＮＳＣＬＣの対象の予後を予測する、またはＮＳＣＬＣの対象を分類するためのコンピュータ製品であって、ＮＳＣＬＣを有する対象由来の試料における、表１、表２および／または表３において特定されている１種または複数のバイオマーカーの発現レベルに対応するデータを受け取るための手段と、各遺伝子についての発現値を生成するための手段と、予後に関連づけられる参照発現プロファイルを含むデータベースへの発現値の入力に基づいてリスクスコアを生成するための手段とを含み、リスクスコアにより、生存に関する予後を予測するまたは対象を高リスク群または低リスク群に分類する、コンピュータ製品を包含する。
【００２３】
さらに別の態様では、本発明は、上記の方法のうちの任意の１つの方法で使用するためのコンピュータ製品を包含する。
【００２４】
「バイオマーカー」とは、対象における生物学的状態の指標として有用な分子である。本主題を参照して、本明細書に開示されているバイオマーカーは、発現の変化を示し、その存在を、予後判定、または、対象が、特定の治療を受けることが有益であるかどうかを予測することに用いることができる分子であってよい。対象のバイオマーカーは、バイオマーカーの発現の変化を検出することによって決定することができる。発現の変化により、ＤＮＡ遺伝子配列情報の、転写されたＲＮＡ（最初のスプライシングされていないＲＮＡ転写物もしくは成熟ｍＲＮＡ）またはコードされるタンパク質産物への変換が説明される。本明細書に開示されているバイオマーカーとしては、表１、２および３に列挙されているバイオマーカーのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられ、それらは転写されたＲＮＡまたはコードされるタンパク質産物であってよい。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】モジュール１、２および３の標準化スコアのペアワイズ散布図を示すグラフであり、これらが腫瘍に関して異なる情報を伝達することが実証されている。
【図２Ａ】３つのサイン（モジュール１、２、および３）を患者に、別々に、または組み合わせて、外科手術後５年に達するまで適用した場合の、それらの予後判定性能を示すカプラン・マイヤー全生存分析曲線を示すグラフである。
【図２Ｂ】３つのサイン（モジュール１、２、および３）を患者に、別々に、または組み合わせて、外科手術後５年に達するまで適用した場合の、それらの予後判定性能を示すカプラン・マイヤー全生存分析曲線を示すグラフである。
【図２Ｃ】３つのサイン（モジュール１、２、および３）を患者に、別々に、または組み合わせて、外科手術後５年に達するまで適用した場合の、それらの予後判定性能を示すカプラン・マイヤー全生存分析曲線を示すグラフである。
【図２Ｄ】３つのサイン（モジュール１、２、および３）を患者に、別々に、または組み合わせて、外科手術後５年に達するまで適用した場合の、それらの予後判定性能を示すカプラン・マイヤー全生存分析曲線を示すグラフである。
【図３Ａ】外科手術後５年に達するまでの、患者に対する、病期、組織像および年齢による層別化の下での、モジュール１の予後判定性能を示すカプラン・マイヤー全生存分析曲線を示すグラフである。
【図３Ｂ】外科手術後５年に達するまでの、患者に対する、病期、組織像および年齢による層別化の下での、モジュール１の予後判定性能を示すカプラン・マイヤー全生存分析曲線を示すグラフである。
【図３Ｃ】外科手術後５年に達するまでの、患者に対する、病期、組織像および年齢による層別化の下での、モジュール１の予後判定性能を示すカプラン・マイヤー全生存分析曲線を示すグラフである。
【図３Ｄ】外科手術後５年に達するまでの、患者に対する、病期、組織像および年齢による層別化の下での、モジュール１の予後判定性能を示すカプラン・マイヤー全生存分析曲線を示すグラフである。
【図３Ｅ】外科手術後５年に達するまでの、患者に対する、病期、組織像および年齢による層別化の下での、モジュール１の予後判定性能を示すカプラン・マイヤー全生存分析曲線を示すグラフである。
【図３Ｆ】外科手術後５年に達するまでの、患者に対する、病期、組織像および年齢による層別化の下での、モジュール１の予後判定性能を示すカプラン・マイヤー全生存分析曲線を示すグラフである。
【図４Ａ】外科手術後５年に達するまでの、患者に対する、病期、組織像および年齢による層別化の下での、モジュールモジュール２の予後判定性能を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図４Ｂ】外科手術後５年に達するまでの、患者に対する、病期、組織像および年齢による層別化の下での、モジュールモジュール２の予後判定性能を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図４Ｃ】外科手術後５年に達するまでの、患者に対する、病期、組織像および年齢による層別化の下での、モジュールモジュール２の予後判定性能を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図４Ｄ】外科手術後５年に達するまでの、患者に対する、病期、組織像および年齢による層別化の下での、モジュールモジュール２の予後判定性能を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図４Ｅ】外科手術後５年に達するまでの、患者に対する、病期、組織像および年齢による層別化の下での、モジュールモジュール２の予後判定性能を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図４Ｆ】外科手術後５年に達するまでの、患者に対する、病期、組織像および年齢による層別化の下での、モジュールモジュール２の予後判定性能を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図５Ａ】外科手術後５年に達するまでの、患者に対する、病期、組織像および年齢による層別化の下での、モジュール３の予後判定性能を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図５Ｂ】外科手術後５年に達するまでの、患者に対する、病期、組織像および年齢による層別化の下での、モジュール３の予後判定性能を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図５Ｃ】外科手術後５年に達するまでの、患者に対する、病期、組織像および年齢による層別化の下での、モジュール３の予後判定性能を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図５Ｄ】外科手術後５年に達するまでの、患者に対する、病期、組織像および年齢による層別化の下での、モジュール３の予後判定性能を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図５Ｅ】外科手術後５年に達するまでの、患者に対する、病期、組織像および年齢による層別化の下での、モジュール３の予後判定性能を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図５Ｆ】外科手術後５年に達するまでの、患者に対する、病期、組織像および年齢による層別化の下での、モジュール３の予後判定性能を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図６Ａ】外科手術後５年に達するまでの、患者に対する、病期、組織像および年齢による層別化の下での、複合スコアの予後判定性能を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図６Ｂ】外科手術後５年に達するまでの、患者に対する、病期、組織像および年齢による層別化の下での、複合スコアの予後判定性能を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図６Ｃ】外科手術後５年に達するまでの、患者に対する、病期、組織像および年齢による層別化の下での、複合スコアの予後判定性能を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図６Ｄ】外科手術後５年に達するまでの、患者に対する、病期、組織像および年齢による層別化の下での、複合スコアの予後判定性能を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図６Ｅ】外科手術後５年に達するまでの、患者に対する、病期、組織像および年齢による層別化の下での、複合スコアの予後判定性能を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図６Ｆ】外科手術後５年に達するまでの、患者に対する、病期、組織像および年齢による層別化の下での、複合スコアの予後判定性能を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図７Ａ】３８種の遺伝子一覧のサブセットとして構築されたいくつもの例示的なサインの予後判定性能を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図７Ｂ】３８種の遺伝子一覧のサブセットとして構築されたいくつもの例示的なサインの予後判定性能を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図７Ｃ】３８種の遺伝子一覧のサブセットとして構築されたいくつもの例示的なサインの予後判定性能を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図７Ｄ】３８種の遺伝子一覧のサブセットとして構築されたいくつもの例示的なサインの予後判定性能を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図７Ｅ】３８種の遺伝子一覧のサブセットとして構築されたいくつもの例示的なサインの予後判定性能を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図７Ｆ】３８種の遺伝子一覧のサブセットとして構築されたいくつもの例示的なサインの予後判定性能を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図８Ａ】肺癌の死亡百分率（１００％から生存を引いたものと等しい）を特許請求されたサインのリスクスコアの関数として示し、１年、２年、３年、４年および５年の経過観察時間におけるそのような予後判定を示すグラフである。
【図８Ｂ】肺癌の死亡百分率（１００％から生存を引いたものと等しい）を特許請求されたサインのリスクスコアの関数として示し、５年死亡率を腫瘍病期１期および２期によって層別化したリスクスコアの関数として示すグラフである。
【図９】Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒから公的に入手可能な、ＦＦＰＥ材料から得られたデータセットにおける生存能（survival performance）を示すカプラン・マイヤー生存分析曲線を示すグラフである。
【図１０Ａ】ＦＦ／ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘとＦＦＰＥ／ｑＮＰＡ、ならびにＦＦ／ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘとＦＦＰＥ／ｎａｎｏＳｔｒｉｎｇを比較したペアワイズ散布図を示すグラフである。
【図１０Ｂ】ＦＦ／ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘとＦＦＰＥ／ｑＮＰＡ、ならびにＦＦ／ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘとＦＦＰＥ／ｎａｎｏＳｔｒｉｎｇを比較したペアワイズ散布図を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、早期肺癌を有する個体の予後判定または分類のために用いることができる方法に一部基づく。本発明は、疾患再発のリスクが高く、アジュバント療法が推奨される可能性がある患者、ならびに再発リスクが低く、アジュバント療法が有益でない可能性がある患者を特定することをさらに含む。一例では、本明細書に記載されている予後判定および予測方法は、肺癌試験試料における複数のバイオマーカーの示差的な発現に基づく。本発明のバイオマーカーとしては３８種の遺伝子（ＣＢＸ７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＧＰＲ１１６、ＫＣＮＪ１５、ＰＴＰＮ１３、ＣＴＳＨ、ＰＰＦＩＢＰ２、ＣＤ３０２、ＳＦＴＰＢ、ＨＳＤ１７Ｂ６、ＤＬＣ１、ＡＤＲＢ２、ＰＡＲＭ１、ＫＬＲＢ１、ＭＳ４Ａ１、ＳＴＸ１Ａ、ＫＬＫ６、ＳＬＣ１６Ａ３、ＰＹＧＬ、ＬＤＨＡ、ＩＴＧＡ５、ＶＥＧＦＣ、ＥＥＦ１Ａ２、ＴＰＸ２、ＵＣＫ２、ＰＨＫＡ１、ＥＩＦ４Ａ３、ＴＫ１、ＣＣＮＡ２、ＧＧＨ、ＣＣＮＢ１、ＭＥＬＫ、ＨＭＭＲ、ＥＩＦ２Ｓ１、ＴＥＡＤ４、ＨＭＧＡ１、ＲＩＭＳ２、Ｈ２ＡＦＺ）、またはそれらの組み合わせを挙げることができ、これらは生物学的機能を含めた基準に基づいて３つのモジュール（表１、２、および３）に分割することができる。表１（本明細書ではモジュール１とも称される）は、腫瘍抑制に関与する遺伝子を含み、表２（本明細書ではモジュール２とも称される）は、血管新生に関与する遺伝子を含み、表３（本明細書ではモジュール３とも称される）は、増殖に関与する遺伝子を含む。
【００２７】
血管新生または増殖に関与するマーカー（それぞれ表２および表３）などの一部のバイオマーカーは、早期肺癌において対照（例えば、早期肺癌の患者（Ｉ期およびＩＩ期）におけるこれらの遺伝子の平均の発現）と比較して過剰発現しているが、腫瘍抑制に関与する他のバイオマーカーは対照（例えば、早期肺癌の患者（Ｉ期およびＩＩ期）におけるこれらの遺伝子の平均の発現）と比較して過小発現している（表１）ことが発見された。
【００２８】
バイオマーカー
本発明のバイオマーカー（複数可）は、表１、表２、および／または表３に列挙されている１種または複数のバイオマーカー、またはそれらの遺伝子産物を含む。本発明は、表１、表２、および／または表３に列挙されているバイオマーカーが示差的に発現しているという発見に基づく。表１、表２、および／または表３において特定されている１種または複数のバイオマーカーの発現プロファイルレベルを分析することによって、早期肺癌の個体の予後を決定することが可能である。
【００２９】
一例では、本発明の方法は、表１の１種または複数のバイオマーカーを測定するステップを含む。例えば、本発明の方法では、表１の少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種または少なくとも１５種のバイオマーカーを測定する。一例では、表１の１種の遺伝子、ＣＢＸ７の発現レベルを測定する。別の例では、表１の２種のバイオマーカー、ＣＢＸ７およびＴＭＰＲＳＳ２の発現レベルを測定する。さらに別の例では、表１の３種のバイオマーカー、ＣＢＸ７、ＴＭＰＲＳＳ２およびＧＰＲ１１６の発現レベルを測定する。さらに別の例では、表１の４種のバイオマーカー、ＣＢＸ７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＧＰＲ１１６およびＫＣＮＪ１５の発現レベルを測定する。さらに別の例では、表１の５種のバイオマーカー、ＣＢＸ７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＧＰＲ１１６、ＫＣＮＪ１５およびＰＴＰＮ１３の発現レベルを測定する。
【００３０】
【表１】
2014516531.tif 000002
【００３１】
別の例では、本発明の方法は、表２の１種または複数のバイオマーカーを測定するステップを含む。例えば、本発明の方法では、表２の少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種または少なくとも８種のバイオマーカーの発現を測定する。一例では、表２の１種の遺伝子、ＳＴＸ１Ａの発現レベルを測定する。一例では、表２の２種のバイオマーカー、ＳＴＸ１ＡおよびＫＬＫ６の発現レベルを測定する。別の例では、表２の３種のバイオマーカー、ＳＴＸ１Ａ、ＫＬＫ６およびＳＬＣ１６Ａ３の発現レベルを測定する。別の例では、表２の４種のバイオマーカー、ＳＴＸ１Ａ、ＫＬＫ６、ＳＬＣ１６Ａ３およびＰＹＧＬの発現レベルを測定する。さらに別の例では、表２の５種のバイオマーカー、ＳＴＸ１Ａ、ＫＬＫ６、ＳＬＣ１６Ａ３、ＰＹＧＬおよびＬＤＨＡの発現レベルを測定する。
【００３２】
【表２】
2014516531.tif 000003
【００３３】
別の例では、本発明の方法は、表３の１種または複数のバイオマーカーを測定するステップを含む。例えば、本発明の方法では、表３の少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種または少なくとも１５種のバイオマーカーを測定する。一例では、表３の１種の遺伝子、ＴＰＸ２の発現レベルを測定する。別の例では、表３の２種のバイオマーカー、ＴＰＸ２およびＵＣＫ２の発現レベルを測定する。別の例では、表３の３種のバイオマーカー、ＴＰＸ２、ＵＣＫ２およびＰＨＫＡ１の発現レベルを測定する。別の例では、表３の４種のバイオマーカー、ＴＰＸ２、ＵＣＫ２、ＰＨＫＡ１およびＥＩＦ４Ａ３の発現レベルを測定する。さらに別の例では、表３の５種のバイオマーカー、ＴＰＸ２、ＵＣＫ２、ＰＨＫＡ１、ＥＩＦ４Ａ３およびＴＫ１の発現レベルを測定する。
【００３４】
【表３】
2014516531.tif 000004
【００３５】
本発明のバイオマーカーは、発現のレベルまたは遺伝子産物が早期肺癌の個体の予後判定のための予測的なマーカーまたはバイオマーカーとしての機能を果たす、表１、表２および表３において特定されているバイオマーカーの任意の組み合わせも含んでよい。一例では、表１、表２および表３の各表から１種ずつ選択した遺伝子、例えば、ＣＢＸ７、ＳＴＸ１ＡおよびＴＰＸ２の発現レベルを測定する。別の例では、表１、表２および表３のそれぞれから２種ずつ選択したバイオマーカー、例えば、表１のＣＢＸ７およびＴＭＰＲＳＳ２、表２のＳＴＸ１ＡおよびＫＬＫ６ならびに表３のＴＰＸ２およびＵＣＫ２の発現レベルを測定する。表１、２および３からのバイオマーカーの種々の組み合わせ例については以下の表４を参照されたい。表４に示されている組み合わせが限定として解釈されることは意図しておらず、表１〜３に示されているバイオマーカーを任意に組み合わせることができる。
【００３６】
【表４】
2014516531.tif 000005
【表４−１】
2014516531.tif 000006
【表４−２】
2014516531.tif 000007
【００３７】
別の例では、表１、表２、および表３のそれぞれから、少なくとも任意の３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種の遺伝子を選択する。例えば、一実施形態では、少なくとも１５種のバイオマーカーを選択し、そこでは、表１から任意の５種のバイオマーカーを選択し（例えば、ＣＢＸ７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＧＰＲ１１６、ＫＣＮＪ１５およびＰＴＰＮ１３またはＣＢＸ７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＣＴＳＨ、ＰＰＦＩＢＰ２およびＣＤ３０２；またはＳＦＴＰＢ；ＨＳＤ１７Ｂ６；ＤＬＣ１；ＡＤＲＢ２およびＰＡＲＭ１）、表２から任意の５種のバイオマーカーを選択し（例えば、ＳＴＸ１Ａ、ＫＬＫ６、ＳＬＣ１６Ａ３、ＰＹＧＬおよびＬＤＨＡまたはＳＬＣ１６Ａ３、ＰＹＧＬ、ＩＴＧＡ５、ＶＥＧＦＣ、およびＥＥＦ１Ａ２またはＳＴＸ１Ａ、ＫＬＫ６、ＳＬＣ１６Ａ３、ＰＹＧＬおよびＬＤＨＡ）、表３から任意の５種のバイオマーカーを選択する（ＴＰＸ２、ＵＣＫ２、ＰＨＫＡ１、ＥＩＦ４Ａ３、およびＴＫ１またはＣＣＮＡ２、ＧＧＨ、ＣＣＮＢ１、ＭＥＬＫおよびＨＭＭＲまたはＥＩＦ２Ｓ１、ＴＥＡＤ４、ＨＭＧＡ１、ＲＩＭＳ２、およびＨ２ＡＦＺ）。
【００３８】
別の実施形態では、本発明のバイオマーカーは、以下の遺伝子のうちの任意の１種、または以下の遺伝子の任意の組み合わせを含む：ＣＢＸ７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＧＰＲ１１６、ＫＣＮＪ１５、ＰＴＰＮ１３、ＣＴＳＨ、ＰＰＦＩＢＰ２、ＣＤ３０２、ＳＦＴＰＢ、ＨＳＤ１７Ｂ６、ＤＬＣ１、ＡＤＲＢ２、ＰＡＲＭ１、ＫＬＲＢ１、ＭＳ４Ａ１、ＳＴＸ１Ａ、ＫＬＫ６、ＳＬＣ１６Ａ３、ＰＹＧＬ、ＬＤＨＡ、ＩＴＧＡ５、ＶＥＧＦＣ、ＥＥＦ１Ａ２、ＴＰＸ２、ＵＣＫ２、ＰＨＫＡ１、ＥＩＦ４Ａ３、ＴＫ１、ＣＣＮＡ２、ＧＧＨ、ＣＣＮＢ１、ＭＥＬＫ、ＨＭＭＲ、ＥＩＦ２Ｓ１、ＴＥＡＤ４、ＨＭＧＡ１、ＲＩＭＳ２、Ｈ２ＡＦＺ。別の実施形態では、本発明のバイオマーカーは、以下の遺伝子のうちの少なくとも１５種、２０種、２５種、３０種、３５種、３６種、３７種または３８種を含む：ＣＢＸ７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＧＰＲ１１６、ＫＣＮＪ１５、ＰＴＰＮ１３、ＣＴＳＨ、ＰＰＦＩＢＰ２、ＣＤ３０２、ＳＦＴＰＢ、ＨＳＤ１７Ｂ６、ＤＬＣ１、ＡＤＲＢ２、ＰＡＲＭ１、ＫＬＲＢ１、ＭＳ４Ａ１、ＳＴＸ１Ａ、ＫＬＫ６、ＳＬＣ１６Ａ３、ＰＹＧＬ、ＬＤＨＡ、ＩＴＧＡ５、ＶＥＧＦＣ、ＥＥＦ１Ａ２、ＴＰＸ２、ＵＣＫ２、ＰＨＫＡ１、ＥＩＦ４Ａ３、ＴＫ１、ＣＣＮＡ２、ＧＧＨ、ＣＣＮＢ１、ＭＥＬＫ、ＨＭＭＲ、ＥＩＦ２Ｓ１、ＴＥＡＤ４、ＨＭＧＡ１、ＲＩＭＳ２、Ｈ２ＡＦＺ。特定の実施形態では、以下の３７種のバイオマーカーを選択する：ＣＢＸ７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＧＰＲ１１６、ＫＣＮＪ１５、ＰＴＰＮ１３、ＣＴＳＨ、ＰＰＦＩＢＰ２、ＣＤ３０２、ＳＦＴＰＢ、ＨＳＤ１７Ｂ６、ＤＬＣ１、ＡＤＲＢ２、ＰＡＲＭ１、ＫＬＲＢ１、ＭＳ４Ａ１、ＳＴＸ１Ａ、ＫＬＫ６、ＳＬＣ１６Ａ３、ＰＹＧＬ、ＬＤＨＡ、ＩＴＧＡ５、ＶＥＧＦＣ、ＴＰＸ２、ＵＣＫ２、ＰＨＫＡ１、ＥＩＦ４Ａ３、ＴＫ１、ＣＣＮＡ２、ＧＧＨ、ＣＣＮＢ１、ＭＥＬＫ、ＨＭＭＲ、ＥＩＦ２Ｓ１、ＴＥＡＤ４、ＨＭＧＡ１、ＲＩＭＳ２、Ｈ２ＡＦＺ。
【００３９】
一例では、発現プロファイルは、表１、表２、および／または表３に列挙されている１種または複数のバイオマーカーのｍＲＮＡのレベルを示す値のセットであってよい。別の例では、発現プロファイルは、表１、表２、および／または表３に列挙されているバイオマーカーによりコードされる１種または複数のタンパク質またはポリペプチドを示す値のセットを含んでよい。
【００４０】
試料の調製
外科的切除を受けた、早期肺癌を有する個体から取得した任意の適切な細胞の試験試料を使用して、本発明の複数のバイオマーカーの発現を決定することができる。早期肺癌の種類および分類は変動してよい。肺癌はＩ期および／またはＩＩ期の肺癌であってよい。試験試料は扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌を含めた非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であってよく、また、サブグループに関係なく全ての組織型（histotype）であってよい。
【００４１】
一般に、細胞または組織試料の試験試料は、癌の対象から、生検または外科的切除によって得る。外科的切除は、治癒的または非治癒的／ＲＯであってよい。細胞、組織、または体液の試料は、針穿刺吸引生検によって取り出すことができる。このためには、シリンジに取り付けた細い針を、皮膚を通して対象の臓器または組織内に挿入する。一般には、超音波またはコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）画像法を用いて対象の領域に針を誘導する。針が組織に挿入されたら、シリンジで真空を創り出し、その結果、針を通して細胞または体液を吸引し、シリンジ内に収集することができる。細胞または組織の試料は、切開生検またはコア生検によって取り出すこともできる。このためには、円錐状、円柱状、またはほんの少しの組織を対象の領域から取り出す。この種類の生検の誘導にはＣＴ画像法、超音波、または内視鏡が一般に使用される。より詳細には、癌性の病変全体を、切除生検または外科的切除によって取り出すことができる。本発明では、試験試料は、一般には、外科的切除の一部として取り出された細胞の試料である。
【００４２】
例えば組織の試験試料は、後で使用するために、例えば、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ；Ａｕｓｔｉｎ  Ｔｅｘ．）内で貯蔵することもでき、急速冷凍し、−８０℃で貯蔵することもできる。生検組織試料は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、または酢酸／エタノールなどの固定液を用いて固定することもできる。固定した組織試料はワックス（パラフィン）または可塑性樹脂に包埋することができる。包埋した組織試料（または凍結した組織試料）は切って薄い切片にすることができる。固定したまたはワックス包埋した組織試料からＲＮＡまたはタンパク質を抽出することもできる。
【００４３】
癌の対象は、一般に、霊長類などの哺乳動物の対象である。例示的な実施形態では、対象はヒトである。
【００４４】
細胞の試料または組織の試料を癌の対象から取り出したら、それを、当技術分野で周知であり、下に記載されている技法を用いてＲＮＡまたはタンパク質を単離するために加工してもよい。
【００４５】
一例では、ＲＮＡを、種々の方法、例えば、チオシアン酸グアニジン溶解、その後のＣｓＣｌ遠心分離（Chirgwinら、Biochemistry 18:5294-5299、1979）によって、組織または細胞試料から抽出することができる。単細胞のＲＮＡは、単細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製するための方法に記載の通り得ることができる（例えば、Dulac、Curr. Top. Dev. Biol. 36:245、1998；Jenaら、J. Immunol. Methods 190:199、1996を参照されたい）。ＲＮＡ試料を、特定の種についてさらに濃縮することができる。一実施形態では、例えば、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、ＲＮＡ試料から単離することができる。具体的には、ポリ−Ｔオリゴヌクレオチドを固体支持体上に固定化して、ｍＲＮＡに対する親和性リガンドとして機能させることができる。この目的のためのキット、例えば、ＭｅｓｓａｇｅＭａｋｅｒキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．）が市販されている。一実施形態では、ＲＮＡ集団を、表１〜３において詳説されている対象の配列について濃縮することができる。濃縮は、例えば、プライマー特異的ｃＤＮＡ合成、またはｃＤＮＡの合成および鋳型指向性ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に基づく多数回の線形増幅によって実現することができる（例えば、Wangら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9717、1989を参照されたい）。
【００４６】
バイオマーカーの発現の検出
一例では、方法は、被験癌患者の腫瘍試料からの、表１、表２、および／または表３に列挙されている１種または複数のバイオマーカー、またはそれらの遺伝子産物の発現を決定するステップを含む。表１、表２、および／または表３に列挙されているバイオマーカーのそれぞれの遺伝子配列は、当技術分野で公知の方法、例えば、遺伝子またはその遺伝子産物を特異的に検出するために使用することができる作用剤を使用して検出することができる。
【００４７】
例示的な検出剤は、本明細書に開示されている遺伝子に対応する核酸とハイブリダイズする核酸プローブ、およびこれらの遺伝子のコード産物に結合する抗体である。表１、表２、および／または表３に列挙されているバイオマーカーは、対立遺伝子変異体および他のファミリーメンバーを含めた天然に存在する配列も包含するものとする。本発明のバイオマーカーは、暗号の縮退によって生じる、列挙されている配列と相補的な配列、および十分に相同な配列、およびストリンジェントな条件下で表１、表２、および／または表３に列挙されているバイオマーカーとハイブリダイズする配列も包含する。
【００４８】
一実施形態では、方法は、ヌクレオチド配列、例えば、少なくとも１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２５ヌクレオチドまたは４０ヌクレオチド、ならびに表１、表２、および／または表３に列挙されている核酸配列のコード配列の一部と相補的であるコード配列の全てに至るまで、またはほぼ全てを含む核酸プローブを用意するステップと、癌性細胞を有する哺乳動物から組織試料を得るステップと、核酸プローブを、ＮＳＣＬＣの患者から取得した生検材料から得たＲＮＡとストリンジェントな条件下で接触させるステップと（例えば、ノーザンブロットまたはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイにおいて）、プローブとＲＮＡのハイブリダイゼーションの量を決定するステップとを含む。
【００４９】
ハイブリダイゼーションの条件は、当業者に公知であり、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley and Sons、N.Y.（1989）、6.3.1-6.3.6に見いだすことができる。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、摂氏約４５度でのハイブリダイゼーション、その後、０．２×ＳＳＣ、０．１パーセントＳＤＳ中、摂氏５０〜６５度での１回または複数回洗浄である。「十分に相同」とは、バイオマーカーのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が、第２のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と十分にまたは最低限に同一または等価である（例えば、同様の側鎖を有するアミノ酸残基）アミノ酸残基またはヌクレオチドを含有し、したがって、第１のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と第２のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が共通の構造ドメインまたは構造モチーフおよび／または共通の機能活性を共有することを意味する。例えば、一般的な構造ドメインを共有し、ドメインのアミノ酸配列にわたって少なくとも約５０パーセントの相同性、少なくとも約６０パーセントの相同性、少なくとも約７０パーセント、少なくとも約８０パーセント、および少なくとも約９０〜９５パーセントの相同性を有するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が、本明細書では十分に相同であると定義される。さらに、少なくとも約５０パーセント相同、少なくとも約６０〜７０パーセント相同、少なくとも約７０〜８０パーセント、少なくとも約８０〜９０パーセント、および少なくとも約９０〜９５パーセント相同であり、一般的な機能活性を共有するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が、本明細書では十分に相同であると定義される。
【００５０】
２つの配列間の配列の比較および相同性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して実現することができる。配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、KarlinおよびAltschul（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77に改変されたKarlinおよびAltschul（1990）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Altschulら（1990）J. MoI. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施して、本発明のＴＲＬ核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施して、表１、表２、および／または表３に列挙されているバイオマーカーによりコードされるタンパク質配列と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較する目的でギャップ挿入されたアラインメントを得るために、Altschulら、（1997）Nucleic Acids Research 25(17):3389-3402に記載の通り、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期状態のパラメータを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、MyersおよびMiller、CABIOS（1989）のＡＬＩＧＮアルゴリズムである。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表（PAM1 20 weight residue table）、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用することができる。
【００５１】
ＲＮＡの濃縮および／または増幅の間に、またはその後に、核酸を標識することができる。例えば、検出可能な標識とコンジュゲートしたｄＮＴＰ、例えば、蛍光標識したｄＮＴＰの存在下で逆転写を行うことができる。別の実施形態では、ｃＤＮＡまたはＲＮＡプローブを、検出可能な標識の不在下で合成することができ、その後、例えば、ビオチン化したｄＮＴＰまたはｒＮＴＰを組み入れること、またはいくつかの同様の手段（例えば、ビオチンのプソラレン誘導体をＲＮＡと光架橋すること）によって標識することができ、その後、標識したストレプトアビジン（例えば、フィコエリトリンとコンジュゲートしたストレプトアビジン）または等価物を添加する。
【００５２】
対象の蛍光部分または標識としては、クマリンおよびその誘導体（例えば、７−アミノ−４−メチルクマリン、アミノクマリン）；Ｂｏｄｉｐｙ  ＦＬおよびｃａｓｃａｄｅ  ｂｌｕｅなどのボディピー色素；フルオレセインおよびその誘導体（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、Ｏｒｅｇｏｎ  ｇｒｅｅｎ）；ローダミン色素（例えば、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、テトラメチルローダミン）；エオシンおよびエリスロシン；シアニン色素（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）；ＦｌｕｏｒＸ、ランタニドイオンの大環状キレート（例えば、ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｙｅ（商標））；チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体、ＴＯＴＡＢ、ダンシルなどの蛍光エネルギー移動色素が挙げられる。本発明の装置またはアッセイで検出されることが望ましい要素と連結する官能性を有する、または、そのような官能性を組み入れるように修飾することができる個々の蛍光化合物も利用することができる（例えば、Kricka、1992、Nonisotopic DNA Probe Techniques、Academic Press San Diego；Calif. を参照されたい）。化学発光標識としては、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノールが挙げられる。
【００５３】
バイオマーカー遺伝子産物の発現の検出
表１、表２および／または表３に列挙されている１種または複数のバイオマーカーによりコードされるタンパク質産物の存在の検出は、当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いることによって行うことができる。例えば、特定の対象のタンパク質を検出するために用いることができる対象の作用剤、例えば抗体の使用。本発明において有用なポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体を作出するための方法は当業者に公知であり、例えば、Dymeckiら、（J. Biol. Chem. 267:4815、1992）；BoersmaおよびVan Leeuwen、（J. Neurosci. Methods 51:317、1994）；Greenら、（Cell 28:477、1982）；およびArnheiterら、（Nature 294:278、1981）において見ることができる。一実施形態では、免疫測定法を用いて細胞試料中のタンパク質のレベルを定量化することができる。本発明は、特定のアッセイ手順に限定されず、したがって、均一な手順と不均一な手順のどちらも含むものとする。本発明に従って行うことができる例示的な免疫測定法としては、蛍光偏光免疫測定法（ＦＰＩＡ）５蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、比濁分析阻害免疫測定法（nephelometric inhibition immunoassay）（ＮＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、および放射免疫測定法（ＲＩＡ）が挙げられる。指標部分、または標識基を対象抗体に付着させ、多くの場合アッセイ装置および適合する免疫測定法の手順の利用可能性によって規定される、方法の種々の使用の必要性に合致するように選択することができる。上記の種々の免疫測定法の実施において用いられる一般的な技法は当業者に公知である。あるいは、ポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を電気泳動により分離することを含み、分離したタンパク質を染色した後、各タンパク質の相対量を、その光学濃度を評価することによって数量化することができるウエスタンブロット分析などの他の方法を用いることができる。あるいは、ドットブロットアッセイ、ＦＡＣＳまたは免疫組織学的検査などの他の方法を使用することができる。
【００５４】
組織試料を、ホルマリン、グルタルアルデヒド、メタノールなどの試薬を用いて固定する。次いで、試料を、マーカーポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体（例えば、モノクローナル抗体）と一緒にインキュベートする。この抗体は、その後に結合を検出するために標識とコンジュゲートすることができる。試料を、免疫複合体が形成されるのに十分な時間インキュベートする。次いで、抗体の結合を、この抗体とコンジュゲートした標識によって検出する。抗体を標識していない場合、例えば、抗マーカーポリペプチド抗体のアイソタイプに対して特異的である第２の標識抗体を用いることができる。使用することができる標識の例としては、放射性核種、蛍光剤、化学発光体、酵素などが挙げられる。
【００５５】
酵素を使用する場合、酵素の基質を試料に加えて、着色または蛍光産物をもたらすことができる。コンジュゲートに使用するための適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼなどが挙げられる。市販されていない場合、そのような抗体−酵素コンジュゲートは、当業者に公知の技法によって容易に作出される。
【００５６】
さらに別の実施形態では、本発明では、本発明のマーカーポリペプチドに対して生じる抗体のパネルを使用することが意図されている。
【００５７】
ｍＲＮＡの検出
本発明の重要な態様は、外科的切除後の、早期肺癌に罹患している対象から取得した肺癌の腫瘍生検材料における、表１、表２および／または表３において特定されている１種または複数のバイオマーカーの発現レベルを測定することである。発現レベルを分析し、リスクスコアを生成するために使用することができる。
【００５８】
一例では、異なる試料集団におけるｍＲＮＡのレベルを比較するための遺伝子発現プロファイリングに逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いることができる。該方法は、当技術分野で公知の任意の技法を用いて、例えば、Ｑｉａｇｅｎなどの商業的な製造者からの精製キット、緩衝液セットおよびプロテアーゼを、製造者の説明書または完全なＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＴ）に従って使用することによってｍＲＮＡを単離することを含む。逆転写ステップでは、一般には、発現プロファイリングの状況および目的に応じて特異的なプライマー、ランダムな六量体、またはオリゴ−ｄＴプライマーを使用して刺激し、次いで、得られたｃＤＮＡをその後のＰＣＲ反応において鋳型として使用することができる。次いで、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲを、例えば、市販の設備を使用して実施することができる。
【００５９】
ＲＴ−ＰＣＲ技法のごく最近の変形はリアルタイム定量的ＰＣＲであり、これは、二重標識した蛍光発生プローブ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）によってＰＣＲ産物の蓄積を測定するものである。リアルタイムＰＣＲは、正規化のために各標的配列に対する内部の競合剤を使用する定量的競合的ＰＣＲ、およびＲＴ−ＰＣＲのために、試料中に含めた正規化遺伝子、またはハウスキーピング遺伝子を使用する定量的比較的ＰＣＲのどちらにも適合する。さらなる詳細については、例えば、Heldら、Genome Research 6:986-994（1996）を参照されたい。
【００６０】
別の例では、表１、表２および／または表３において特定されているバイオマーカーのうちの１種または複数に対応する１種または複数のプローブを含むマイクロアレイを使用する。上記の方法により、アレイ表面に、標識した標的核酸のハイブリダイゼーションパターンが生じる。得られた、標識した核酸のハイブリダイゼーションパターンは、種々のやり方で、標的核酸の特定の標識に基づいて選択される特定の検出様式で可視化または検出することができる。代表的な検出手段としては、シンチレーション計数、オートラジオグラフィー、蛍光測定、熱量測定、光放出測定、光散乱などが挙げられる。
【００６１】
一例では、検出方法では、市販されているアレイスキャナー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆ．）、例えば、４１７Ａｒｒａｙｅｒ、４１８Ａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ、またはＡｇｉｌｅｎｔ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙ．Ｓｃａｎｎｅｒを利用する。このスキャナーは、インターフェースおよび使いやすいソフトウェアツールを伴うシステムコンピュータで制御される。出力は、種々のソフトウェアアプリケーションに直接インポートすることができる、または種々のソフトウェアアプリケーションから直接読み取ることができる。
【００６２】
本発明で使用される場合、比較するための対照は、当業者が決定することができる。一態様では、カットオフ値としての機能を果たす値を選択することによって対照を決定する。例えば、値は、例えば、生存良好の試験試料と生存不良（bad survival）の試験試料；または個体にアジュバント療法が有益になる試験試料とそれが有益にならない試験試料；または、個体に血管新生阻害剤または増殖の阻害剤などの特定の薬物を投与することが有益になる試験試料を区別する値であってよい。アジュバント療法が有益である可能性がある患者とは、全生存、長期生存、無再発生存、および無遠隔再発生存（distant recurrence-free survival）などの当技術分野において通常使用される測定値を含めた患者の状態の任意の測定値が改善されることを意味する。
【００６３】
遺伝子発現のレベルを決定するための他の方法としては、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって開発されたＭａｓｓＡＲＲＡＹに基づく遺伝子発現プロファイリング方法および遺伝子発現の連続分析（serial analysis of gene expression）（ＳＡＧＥ）（Velculescuら、Science 270:484-487（1995）；およびVelculescuら、Cell 88:243-51（1997）が挙げられる。
【００６４】
ＦＦＰＥ材料における遺伝子発現のレベルを決定するためのさらに他の方法は、ｑＮＰＡ（商標）技術（ＨＴＧ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ａｒｉｚｏｎａ）およびｎａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）技術（Ｓｅａｔｔｌｅ）であり、この方法ではＲＮＡ抽出も増幅も必要ない。ｑＮＰＡ技術を用いて、ＦＦＰＥ試料をまずＨＴＧ溶解緩衝液に曝露させ、次いで、本明細書に記載のバイオマーカーのｍＲＮＡと相補的なヌクレアーゼ保護プローブを溶液に加える。プローブが可溶性であり架橋した対象のＲＮＡバイオマーカーの全てとハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、Ｓ１ヌクレアーゼを加え全ての非特異的な一本鎖核酸を破壊し、化学量論的な量のバイオマーカー−ｍＲＮＡプローブ２重鎖を生じさせる。次いで、塩基加水分解により、２重鎖からプローブを遊離させる。次いで、プローブをプログラムされたＡｒｒａｙＰｌａｔｅに移し、検出リンカーを加え、プローブと検出リンカーの両方をアレイ上に捕捉する。次いで、ＡｒｒａｙＰｌａｔｅを洗浄し、ＨＲＰ標識した検出プローブを加え、インキュベートする。次いで、アレイプレートを洗浄し、化学発光基質を加える。最後に、ＡｒｒａｙＰｌａｔｅを画像処理し、全てのウェル中のバイオマーカーのそれぞれの発現を測定する。Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ技術を用い、バイオマーカーｍＲＮＡ当たり、溶液中のｍＲＮＡとハイブリダイズする塩基プローブを２〜５０種使用する。レポータープローブによりシグナルが運ばれ、捕捉プローブにより、データ収集のために複合体を固定化することが可能になる。ハイブリダイゼーション後、過剰なプローブを除去し、プローブ／標的複合体をアラインメントし、計数カートリッジ内に固定化する。
【００６５】
本発明の方法では、上記の１種または複数のバイオマーカーの発現レベルを、下記の通り測定し、分析し、リスクスコアを生成するために使用する。発現閾値を、例えば、生存良好を有する個体および生存不良（bad survival）を有する個体を選択するために、予後判定的に使用することができる。
【００６６】
アッセイしたＲＮＡの量の差異と使用したＲＮＡの質の変動性をどちらも補正する（正規化する）必要がある。したがって、アッセイでは、一般には、ＧＡＰＤＨおよびＣｙｐｌなどの周知のハウスキーピング遺伝子を含めた特定の正規化遺伝子の発現を測定し、組み入れる。あるいは、正規化は、アッセイしたバイオマーカーまたはその大きなサブセットの全ての平均または中央値のシグナル（Ｃｔ）に基づいてよい（全体的な正規化手法）。遺伝子ごとに、測定された正規化された患者の腫瘍ｍＲＮＡの量を、肺癌組織の参照セットにおいて見いだされる量と比較する。この参照セット内の肺癌組織の数（Ｎ）は、異なる参照セット（全体として）が基本的に同じように挙動することを確実にするために十分多くあるべきである。この条件に合致する場合、特定のセット内に存在する個々の肺癌組織の同一性は、アッセイしたバイオマーカーの相対的な量に対する有意な影響力を持たなくなる。
【００６７】
本発明の方法では、各バイオマーカーの発現を測定し、一般には、それを発現値に変換する。次いで、これらの発現値を使用して、加重平均することによってリスクスコアを生成する。リスクスコアを、較正データベースにより、パラメトリック式またはノンパラメトリックなデータ駆動モデルのいずれかによって死亡、転移または再燃のリスクに関連づける。このデータベースは、既知の発現値、リスクスコアおよび臨床的経過観察を有する試料の参照セットから構築される。リスクスコア較正は、各モジュール（表１、２または３）に対して別々に利用可能であってもよく、組織像、腫瘍病期分類または他の特性、例えば、患者の年齢などによって定義される特定の疾患サブタイプに特異的であってもよい。治療応答予測のために、特定の療法で治療する（または治療しない）患者について別々の較正式またはデータベースを構築する。複合的なリスクスコア（特定の加重を伴う表１、２、または３のモジュールの組み合わせ）も、それ自体の較正式またはデータベースと一緒に用いることができる。プロトコールを作成する臨床判断を、上記の較正されたリスクスコアまたは予測された生存または事象（再燃または転移）までの時間に従って行うことができる。
【００６８】
算出されたリスクスコアは、対象に対する適切な治療方針を決定するためにも用いることができる。高リスクスコア（すなわち、短い生存時間または予後不良）を有する対象は、アジュバント療法を受けることが有益である可能性がある。アジュバント療法は、適切な化学療法剤、例えば、パラプラチン（カルボプラチン）、プラチノール（シスプラチン）、タキソテール（ドセタキセル）、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ベプシド（エトポシド）、ジェムザール（ゲムシタビン）、イフェックス（イホスファミド）、カンプトサー（イリノテカン）、タキソール（パクリタキセル）、アリムタ（ペメトレキセド）およびハイカムチン（トポテカン）および／または放射線療法を含んでよい。負のリスクスコア（すなわち、長い生存時間または予後良好）を有する対象は、追加的な治療は有益でない可能性がある。
【００６９】
別の例では、特定の表の遺伝子セットを使用して生成したリスクスコアを使用して、特定の療法の方針を決定することができる。例えば、表２のバイオマーカーの分析に基づく個体のリスクスコアが高い場合、個体は、アバスチン、スラフィニブ（srafinib）、スニチニブまたはパゾパニブなどの血管新生阻害剤を含むアジュバント療法を受けることが有益である可能性がある。あるいは、表３のバイオマーカーの分析に基づく個体のリスクスコアが高い場合、個体はトポイソメラーゼ阻害剤（Ｉ＆ＩＩ）、タキサン、アントラサイクリン、抗チューブリン、代謝拮抗薬またはアルキル化剤などの抗増殖剤を含むアジュバント療法を受けることが有益である可能性がある。
【００７０】
データ分析
試料の分析操作を容易にするために、デバイスからリーダーによって得られるデータを、デジタルコンピュータを使用して分析することができる。一般には、コンピュータは、デバイスからデータを受け取り、保管するため、ならびに集めたデータを分析し、報告するため、例えば、バックグラウンドの引き算、制御が適正に実施されたことを検証すること、シグナルを正規化すること、蛍光データを解釈してハイブリダイズした標的の量を決定すること、バックグラウンドの正規化などのために適切にプログラムされる。
【００７１】
キット
本発明は、さらに、本明細書に記載のバイオマーカーの発現レベルを決定するためのキットを提供する。キットは、肺癌の対象の予後を決定するために有用であり得る。キットは、表１〜３において特定されているバイオマーカーのいずれかの、それらの任意の組み合わせのプローブを含むマイクロアレイおよび／またはプローブを付着させることができる任意の他の固体支持体を含んでよく、固体支持体を用いて、試験試料の遺伝子発現を測定することができる。一実施形態では、キットは、コンピュータシステムのメモリにロードすることができる発現プロファイル分析ソフトウェアを含み、測定された発現値をリスクスコアに変換することができるコンピュータ可読の媒体を含む。キットは、核酸対照、緩衝液、および使用説明書をさらに含んでよい。
【００７２】
当業者には、本発明の実施において使用することができる、本明細書に記載のものと同様または同等である多くの方法および材料が理解されよう。実際に、本発明は、記載されている方法および材料に決して限定されない。本発明では、以下の用語が下で定義されている。
(実施例)
【実施例１】
【００７３】
肺患者のコホートのＮｏｖａｒｔｉｓデータセットと種々の公開データセットの組み合わせを試験した。患者の選択基準および臨床的特性についての記載は、公開データセットについてはそれぞれの原著論文に見いだすことができる（以下を参照されたい）。Ｎｏｖａｒｔｉｓデータセットについては、外科的切除を受けたＮＳＣＬＣ患者から４１２の患者試料を採取した。ＣＴ−スキャン、疑わしいリンパ節（ＣＴで＞１ｃｍ）のＦＤＧ−ＰＥＴおよびＭＲＩを含めた標準の病期分類手順を実施した。ＮＳＣＬＣ組織学的検査を実施して、ＮＳＣＬＣが扁平上皮癌、腺癌またはＢＡＣなどの他のものであるかを決定した。ＴＮＭに基づく病期分類も実施して、ＮＳＣＬＣがＩ期であるかＩＩ期であるかを定義した。新鮮凍結組織をゲノム分析のためにバンキングした。主要評価項目は全生存であった。全生存とは、最初の外科手術からの時間（年単位）を指し、少なくとも３年、例えば５年間などの無再燃または無再発である期間によって定義することができる。
【００７４】
本実施例で使用した公開データセット：
【００７５】
【表５】
2014516531.tif 000008
【表５−１】
2014516531.tif 000009
【００７６】
データセットの参考文献は以下を含む：
Bhattacharjee AらProc Natl Acad Sci U S A 98:13790-5、2001；Takeuchiら（2006）J Clin Oncol 24:1679-88；Raponiら（2006）Cancer Res 66:7466-72；Luら（2006）PLoS Med 3:e467；Sheddenら（2008）Nat Med 14:822-7；Houら（2010）PLoS One 5:e10312；Wilkersonら（2010）Clin Cancer Res 16:4864-75；Zhuら（2010）J Clin Oncol 28:4417-24
【００７７】
公開データセットの遺伝子発現マイクロアレイの処理
分析のためのデータセットを準備する手順は、Wirapatiら、2008 Breast Cancer Research 10:R65に記載されている手順と同様であり、以下の通り簡潔に概説される：
１．遺伝子発現データについては、原著者により提供された、正規化または前処理した発現値を改変せずに使用した
２．マイクロアレイプラットフォーム内のプローブまたはプローブセットを、同じ参照配列データベース（ＲｅｆＳｅｑバージョン３９）に再マッピングした
３．早期（Ｉ期およびＩＩ期）の患者のみを本実施例に用い、全てのデータセットから全部でｎ＝８３４であった（Ｉ期はｎ＝５７１、ＩＩ期はｎ＝２６３）。全ての組織型が含まれるが、大部分は腺癌（ｎ＝５８５）または扁平上皮癌（ｎ＝２２６）であり、他の組織型はｎ＝２３のみである。
【００７８】
サイン遺伝子を、包括的な遺伝子発現およびＮｏｖａｒｔｉｓにより新しく生成された肺癌データセット（２つのコホート、全部で患者４１２人、未発表）および公的に入手可能な遺伝子発現データセットからなる臨床データベースの大規模総合分析によって特定した。サイン遺伝子を選択し、それらを、他の種類の癌との発現パターンの類似性および生物学的機能を含めた基準に基づいて３つのモジュール（表１、２、および３）に群分けした。公的に入手可能なデータセットは、予後判定性能を下で概説されている方法を用いてそれぞれ独立に検証することができるように選択した。
【００７９】
バイオマーカーサイン（表１、２、および／または３に明記されているバイオマーカーのセット）を適用する際に、欠けている遺伝子は無視した。生のスコアを、特定のプラットフォームに存在していた遺伝子の発現値を平均することによって各サインに割り当てた。生のスコアの平均を引き算し、標準偏差で割ることによって標準化スコアを出した。平均および標準偏差を各データセットについて別々に決定した。各患者について３つの異なるスコアを出した。それらはモジュール１、２、または３と称され、それぞれ表１、２、または３の遺伝子セットに対応する。
【００８０】
３つのモジュールからのスコアから同様の情報はもたらされなかったことを実証するために、図１においてスコアのペアワイズ分布の散布図を作成した。モジュール１とモジュール３は、それらの腫瘍抑制（モジュール１）および増殖（モジュール３）における生物学的関与に従って、ほぼ反対方向に作用している。これらの２つのモジュールにより非常に類似した予後情報をもたらすことができるが、正確に検出するために発現の相互関係が技術的に重要であった。したがって、一方のモジュールの値が低いことは、他方のモジュールの値が高ければ、単に平均の発現が低いと解釈される（検出の技術的不全ではなく）。モジュール２については、モジュール１および３とわずかな相関が示されたが、興味深い非対称のパターンが伴った。モジュール１と２の両方の値が低い可能性はあるが、両方の値が高い可能性は低い。他方では、モジュール２の値が高いことは、モジュール３の値が高いことを必要とすると思われるが、逆は真ではない（すなわち、モジュール３の値が高い腫瘍の一部ではモジュール２の値が低い場合がある）。
【００８１】
サインの予後判定性能の評価
モジュールスコアのそれぞれの臨床的な有用性を示すために、カプラン・マイヤー曲線（KaplanおよびMeier J. Am. Statist. Assoc. 53:457-481、1953）を用い、定量的スコアを使用して生存分析を実施して、患者を四分位数（患者の２５％を含有する群）に分けた。
【００８２】
図２Ａ〜Ｃには、３つのサイン（モジュール１、２、および３）を別々に適用した場合のそれらの予後判定性能が、外科手術後５年に達するまでの患者の全生存のカプラン・マイヤー生存分析によって示されている。患者をスコアの四分位数に従ってＱ１、Ｑ２、Ｑ３、およびＱ４の４群にカテゴリー化し、これらは、それぞれ第１四分位数、第２四分位数、第３四分位数、および第４四分位数に対応する。このカテゴリー化により、リスクの変化をスコアの関数として考察することが可能になる。選択した曲線の対をコックス回帰分析を使用して比較し、その結果は、ハザード比（ＨＲ）およびその９５％信頼区間、および効果なしに対する仮説検定のｐ値（ＨＲ＝１）を示している。各曲線の右側の数は５年生存のパーセントである。最初の３つのパネルでは、各サインはそれ自体の予後判定値を有することが実証されている。図２Ｄ（「組み合わせ」）には、３つのモジュールの単純な組み合わせ（−モジュール１＋モジュール２＋モジュール３）によって得られるリスクスコアの結果が示されている。
【００８３】
３つのスコアを組み合わせた予後判定システムの例は、図２Ｄにも示されている。スコアは単に合計し、モジュール１については−１を掛けて効果の方向を逆にした。いくつかの個々のモジュールに対する劇的な改善は見られなかったが、スコアに応じたリスクの漸次的移行はいっそう大きかった。
【００８４】
要約すると、個々のサイン（モジュール１、２または３）、ならびにそれらの組み合わせ（モジュール１、２および３）について、患者のサブグループの生存（または同等に、疾患関連死亡率）を区別する能力が示された。全ての場合において、少なくとも最も遠い四分位数の間に実質的かつ統計的に有意な差異が観察される。
【００８５】
臨床病理学的因子との関連におけるサインの性能
提唱されたサインにより、組織像、腫瘍病期分類および診断時の年齢などのよく確立された因子に新しい予後情報が付加されることを示すために、上記と同様の分析を実施したが、データを群に層別化した。この例示的な実施例では、各因子によって別々に層別化し、それらを、各群の標本サイズが十分になるように２つの主要な群に分けることのみを示した。以下の因子を考察する：
・腫瘍病期分類：Ｉ期対ＩＩ期
・組織像：腺癌対扁平上皮癌
・診断時の年齢：６５歳以下対６６歳超（これはデータにおける患者の年齢の中央値である）。
【００８６】
サイン（モジュール１、２、および３）のそれぞれ、および組み合わせが、それぞれ、図３Ａ〜Ｆ、図４Ａ〜Ｆ、図５Ａ〜Ｆおよび図６Ａ〜Ｆに別々に示されている。詳細には、図３Ａ〜Ｆには、病期、組織像および診断時の年齢による層別化の下でのモジュール１の予後判定性能が示されている。四分位数は図２の場合と同じである（すなわち、グループ分けを最初に、層別化の前に行う）。ここで、示されている通り、予後判定力は、各層の範囲内のままである。図４Ａ〜Ｆには、病期、組織像および診断時の年齢による層別化の下でのモジュール２の予後判定性能が示されている。図５Ａ〜Ｆには、病期、組織像および診断時の年齢による層別化の下でのモジュール３の予後判定性能が示されている。図６Ａ〜Ｆには、病期、組織像および診断時の年齢による層別化の下でのモジュール１、２、および３の複合スコアの予後判定性能が示されている。
【００８７】
ほとんどの場合、サイン（個別におよび組み合わせて）の予後判定力がなお観察された。これは、提唱されたサインにより、従来の因子を越えた追加的な予後判定がもたらされたことを示している。すなわち、サインは、存在する因子と高度に相関する単なる代理のマーカーではない。詳細には、同じ腫瘍病期の患者を、さまざまなリスクにさらに区別することができる。リスクの順序づけが逆転する可能性があるので、これは病期分類システムの単なる精密化ではない。例えば、Ｉ期におけるリスクが最も高い患者の群は、実際にはＩＩ期患者の生存の平均よりも生存が悪い。
【００８８】
臨床病理学的因子が存在する種々の状況における分析によっても、これらの因子もサインの適用に組み入れることができることが強調される。例えば、扁平上皮癌について、個々のサインでは実質的なリスク識別が示されなかったが、複合スコアにより、最上位の四分位数が残りの四分位数よりも実質的に悪い転帰を有することが示される。
【００８９】
図７Ａ〜Ｆには、表１、２、および／または３から遺伝子のサブセットを選択することによって得られる、特許請求されたサインのいくつかの例示的な変形の予後判定性能が示されている。生存に従って患者を区分する能力は、完全な遺伝子のセットを有さないものにはなかった。３種の遺伝子（表１、２および３のそれぞれから１種）で構成される最小のサインはすでにかなり良い性能であった（パネルＡ）。群間の区分は、遺伝子の数が増加するにつれ改善される（パネルＢ〜Ｄ）。任意に選択した１５種の遺伝子は性能がよい（パネルＥおよびＦ）。
【００９０】
個別化療法の意思決定
リスク予測システムでは、本実施例で用いたものと同様の臨床データおよび遺伝子発現データのデータベースを利用して、代替の治療（治療しないことを含む）の下でのリスクの予想を可能にする。このシステムは、AdjuvantOnline（Ravdinら 2001、J. Clin. Oncol. 19:980）と、特許請求された発明のスコアも包含する以外は同様である。
【実施例２】
【００９１】
表１、２および／または３に開示されているバイオマーカーの、肺癌の患者への典型的な適用。
【００９２】
１．小さく、手術可能な原発腫瘍を伴う肺癌と診断された患者は、病変を除去するために外科手術を受ける。腫瘍組織の一部を標準の病理学的手順、例えば、腫瘍サイズ、腫瘍組織型（例えば、腺癌、扁平上皮癌、または他の種類など）を決定することなどによって検査する。標準のガイドラインを用いて、腫瘍サイズ、リンパ節転移または他の遠位の部位への転移の存在に基づいて腫瘍病期分類を決定する。標準の臨床病理学的測定から得られた情報により、本発明の予後判定的かつ予測的な適用を改変し、増強することができるが、これは必要条件ではなく、不可欠な部分ではない。
【００９３】
２．特許請求された発明のために、腫瘍組織の一部を供給材料として、凍結組織、パラフィン包埋組織または新鮮組織のいずれかとして使用する。組織に対して全トランスクリプトームＲＮＡ抽出を実施する。
【００９４】
３．特定の遺伝子のセット（本発明において特許請求された）についてＲＮＡの相対的な数量の測定を、以下の手順のいずれかによって実施する：
・ｑＮＰＡ技術またはｎａｎｏＳｔｒｉｎｇ技術
・特定の遺伝子の定量的ＲＴ−ＰＣＲ
・選択されたプローブまたは全トランスクリプトームのいずれかを含有するマイクロアレイとのハイブリダイゼーション
・ＲＮＡのハイスループットな配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）、その後コンピュータによる選択および関連性のある遺伝子の定量化
【００９５】
４．それぞれについてのＲＮＡの相対的な存在量を、患者全てにわたって一定の発現を有することが予測される対照遺伝子のセットに対するコンピュータによる正規化手順（Popoviciら（2009）Selecting control genes for RT-QPCR using public microarray data. BMC Bioinformatics. 2009年2月2日;10:42）、または、存在する肺腫瘍からの同様の測定値のデータベースに対する正規化（McCallら（2010）Biostatistics. 2010年4月;11(2):242-53. Epub 2010年1月22日）のいずれかによって較正する。
【００９６】
５．相対的な存在量を対数転換し、セット内の多数の遺伝子からの加重平均を計算する。重みは単純に＋１または−１（遺伝子発現の変化の転帰に対する効果に応じて正のサインまたは負のサイン）（Sotiriouら（2006）J Natl Cancer Inst. 2006年2月15日;98(4):262-72.）であってもよく、特定の測定技法に対して較正した数であってよい。これらの加重平均は、その後のリスク算出において入力として使用する生のリスクスコアとみなされる。各サインモジュールはそれ自体のリスクスコアを有する。
【００９７】
６．リスクプロファイル計算器により、将来の任意の時点（外科手術の数年後に測定される）について、個々の患者の無病状態、無転移状態または生存のいずれかの確率の予想／予測がもたらされる。予想の信頼度は、参照データベースの分量および品質に左右される時間特異的な信頼区間によって特徴づけられる。短期の予想は、一般には、より多くのデータによって裏付けられており、したがって長期予測と比較してより信頼できる（信頼区間が狭いことによって示される通り）。リスクプロファイル計算器チャートの例が図８Ａに示されており、そこでは特定の患者について測定されたリスクスコアが肺癌死亡率に書き換えられている（参照データベースに基づき、最近接カプラン・マイヤー推定値を使用）。
【００９８】
７．リスク予想は、本発明によってもたらされるリスクスコア以外の情報、例えば、患者の年齢および性別、Ｋａｒｎｏｆｓｋｙ性能スコア、腫瘍サイズおよびリンパ節の状態などによって調節することができる。これらの因子を全て所与の患者についての特定のリスクプロファイルに組み込みことは、よく確立された生存回帰方法（Therneau TM、Grambsch PM（2000）Modelling survival data: extending the Cox model. Springer、New York）、例えば、
・パラメトリック回帰モデル（例えば指数関数モデルまたはＷｅｉｂｕｌｌモデルを使用する）
・セミパラメトリックな方法（コックス回帰）
・可能性のある因子の組み合わせのそれぞれについてのカプラン・マイヤーまたは保険統計的方法などの経験的な生存曲線推定
などを用いて行うことができる。
【００９９】
リスク予測を腫瘍の病期によってどのように調節するかの例が図８Ｂに示されている。予測通り、病期２期の患者は病期１期患者よりも５年死亡率が高い。しかし、リスクスコアが高い（標準化されたリスクスコア単位でゼロよりも高い）病期１期患者のサブセットは、病期２期患者の平均の死亡率（破線の曲線）と非常に類似した死亡率を示す。これは、病期１期（現行のガイドラインの下では治療されない）の患者の一部が実際には多くの病期２期患者（現行のガイドラインの下で治療される）と同様のリスクを有するので、病期分類単独によるアジュバント化学療法では不十分な場合があることを示している。
【０１００】
リスク予想は、疾患転帰の記録を持つ患者の過去の知見、臨床病理学的変数および特許請求された発明の測定値のデータベースに対して較正することができる。データベースは、新規の患者からの情報を用いて定期的に更新されてもよい。このシステムは、癌患者の生存を種々の臨床病理学的変数の関数として予想するために広く使用されているツールであるAdjuvantOnline（Ravdinら（2001）J Clin Oncol. 2001年2月15日;19(4):980-91）と同様である。我々は、このシステムを、ゲノム技術およびトランスクリプトーム技術から得られる多様式スコアを含むように拡張する。
【０１０１】
８．リスク計算器に入力する調節因子は、一般に使用されるアジュバント療法（例えば、白金ベースの化学療法など）または抗血管新生薬を含んでよい。この応答予測適用の筋書きでは、予想された、代替治療または治療なしの下での転帰の確率に対応する２つ以上のリスクプロファイルが提示される。
【実施例３】
【０１０２】
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍材料へのサインの適用。
【０１０３】
組織の調製およびそれぞれのプラットフォームに適した生データの前処理手順の後に、特許請求されたサイン（リスクスコアを導くための遺伝子のセットおよび式）を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ｑＮＰＡまたはｎａｎｏＳｔｒｉｎｇなどの技術プラットフォームからの発現データに直接適用することができる。
【０１０４】
図９には、Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒから公的に入手可能な、ＦＦＰＥ材料から得られたデータセット（Xieら 2011 Clin Cancer Res 17:5705-14;Gene Expression Omnibus accession GSE29013）における生存能（survival performance）が示されている。ここでは、一般に、ＦＦＰＥからのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータは質が低い（ノイズレベルが大きい、発現値の呼び出し不在数が多い）にもかかわらず、それでも有意な予後判定力が観察されている。
【０１０５】
サインリスクスコアにより、ＦＦＰＥを用いたｑＮＰＡデータおよびｎａｎｏＳｔｒｉｎｇデータにおいて新鮮凍結組織を用いたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘと同じ予後値を潜在的にもたらすことができるかどうかを評価するために、同じ肺癌患者由来の材料で比較した（未発表のデータ）。図１０Ａ〜Ｂには、ＦＦ／ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘとＦＦＰＥ／ｑＮＰＡ、ならびにＦＦ／ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘとＦＦＰＥ／ｎａｎｏＳｔｒｉｎｇを比較したペアワイズ散布図が示されている。高い相関（それぞれ０．８６および０．８７）が観察され、これは、特許請求されたサインが、技術プラットフォームの選択にも、組織の保存方法にも左右されないことを示している。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【国際調査報告】
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