(57)【要約】本発明は、ｓｉＲＮＡ又は他の薬剤を腫瘍に向けるためのタンパク質ナノ粒子システムを記載する。タンパク質システムの基礎は、ｓｉＲＮＡの核酸にいったんさらされると自己集合するエラスチン様ペプチドである。標準的な遺伝子工学法によって特異的なターゲティングペプチドをコアのＥＬＰ構造に融合する。これらのターゲティングペプチドは腫瘍細胞の表面上の受容体にナノ粒子の特異的な結合を付与し、腫瘍細胞へのナノ粒子の取り込みを可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
集合ドメイン（ＡＤ）と、細胞ターゲティングドメイン（ＣＴＤ）と、核酸結合ドメイン（ＮＢＤ）を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２】
さらに薬剤結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
核酸結合ドメイン（ＮＢＤ）がｓｉＲＮＡに結合する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
単離されたポリペプチドが配列番号５６を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ＮＢＤがカチオン性ドメインを含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ＮＢＤがオリゴリジンドメインを含み、前記オリゴリジンドメインがアミノ酸配列（Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＬｙｓＫ−Ｇｌｙ）を含み、Ｋが１より大きい整数である請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
Ｋが８に等しい請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ＮＢＤがオリゴアルギニンドメインを含み、前記オリゴアルギニンドメインがアミノ酸配列（Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＡｒｇＲ−Ｇｌｙ）を含み、Ｒが１より大きい整数である請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
Ｒが９に等しい請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ＤＢＤが、従来の薬剤又は試験中の薬剤に結合する請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ＡＤがエラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ＥＬＰがアミノ酸配列（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ）Ｎ（配列番号５７）を含み、ＸがＶａｌ、Ａｌａ及びＧｌｙを含むペプチドであり、Ｎが１以上の整数である請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
Ｎが６０に等しい請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
Ｘが、約５：２：３の比率でＶａｌ、Ａｌａ及びＧｌｙを含むペプチドである請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
ＣＴＤが、標的細胞の表面上に存在する生体分子と相互作用する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
ＣＴＤが、標的細胞の外表面上に存在する生体分子と相互作用する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
ＣＴＤが、標的細胞の内表面上に存在する生体分子と相互作用する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
ＣＴＤが配列番号１９を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
生体分子が細胞接着分子を含む請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
生体分子が受容体分子を含む請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
細胞接着分子がフィブロネクチン又はラミニンを含む請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２３】
単離されたポリヌクレオチドが配列番号５５を含む請求項２２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項２２に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現構築物。
【請求項２５】
請求項２２に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項２６】
請求項１に記載の１以上のポリペプチドを含むナノ粒子であって、溶液中で集合する前記ナノ粒子。
【請求項２７】
薬剤をさらに含む請求項２６に記載のナノ粒子。
【請求項２８】
薬剤がｓｉＲＮＡ分子である請求項２７に記載のナノ粒子。
【請求項２９】
ポリペプチドが配列番号５６を含む請求項２６に記載のナノ粒子。
【請求項３０】
標的細胞に対して薬剤を向ける方法であって、
凝集ドメイン（ＡＤ）、ヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）、及び細胞ターゲティングドメイン（ＣＴＤ）を含む１以上のポリペプチドを得ることと；
１以上のポリペプチドのＮＢＤに薬剤を接触させることと；
１以上のポリペプチドのＡＤを凝集させて集合ポリペプチドを生成することと；
集合ポリペプチドを標的細胞に接触させることと；
標的細胞の外側に存在する生体分子に集合ポリペプチドのＣＴＤを接触させることを含む、前記方法。
【請求項３１】
標的細胞に対して薬剤を向ける方法であって、
凝集ドメイン（ＡＤ）、薬剤結合ドメイン（ＤＢＤ）、及び細胞ターゲティングドメイン（ＣＴＤ）を含む１以上のポリペプチドを得ることと；
１以上のポリペプチドのＤＢＤに薬剤を接触させることと；
１以上のポリペプチドのＡＤを凝集させて集合ポリペプチドを生成することと；
集合ポリペプチドを標的細胞に接触させることと；
標的細胞の外側に存在する生体分子に集合ポリペプチドのＣＴＤを接触させることを含む、前記方法。
【請求項３２】
１以上のポリペプチドが配列番号５６を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
生体分子が標的細胞の内側に存在する請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
薬剤がｓｉＲＮＡ分子を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
細胞が腫瘍細胞を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
腫瘍細胞が、ヒト膀胱細胞、ヒト乳腺細胞、ヒト結腸細胞、ヒト肝臓細胞、ヒト肺細胞、ヒト神経芽腫細胞、ヒト卵巣細胞、ヒト膵臓細胞、ヒト前立腺細胞又はヒト皮膚細胞である請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
生体分子が細胞接着分子を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
生体分子が受容体分子を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
細胞接着分子がフィブロネクチン又はラミニンを含む請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる２０１０年１１月１日に出願された米国仮特許出願第６１／４３６、１２７号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は一般に医学及び分子生物学の分野に関する。特に、本発明は治療用分子の送達についてのポリペプチド及びその使用方法に関する。
【０００３】
癌、代謝性疾患及び感染性疾患、及びその他の疾患は特定の遺伝子の不適切な活性化が原因で生じる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して選択的に遺伝子を沈黙させる能力は、細胞から特定の遺伝子産物又はタンパク質を取り除くことを目的とした新しい部類の薬剤を創製することによって、疾患及び病気を治療する方法を革命的に変革する可能性を提供している。ＲＮＡｉは、腫瘍学、インフルエンザ、肝炎、糖尿病、黄斑変性、パーキンソン病、ハンチントン病、及び深刻な満たされない医学ニーズの多数の領域の前臨床モデルで納得の行くように実証されている。
【０００４】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二本鎖の使用に基づくＲＮＡ干渉は、有効な治療剤の迅速な開発に多数の利点を有する。標的タンパク質のｍＲＮＡ配列に基づいて、ｓｉＲＮＡ治療剤は相対的に速く設計することができる（従来の低分子薬剤を合成し、スクリーニングするのに要する時間に比べて）。さらに、ｓｉＲＮＡに基づく治療剤は、当該の標的ｍＲＮＡに対して大きな特異性を持つように設計することができる。
【０００５】
ｓｉＲＮＡを腫瘍に対して向ける幾つかの送達ビヒクルは臨床試験中であり、ＦＤＡによる認可は未だ受けていない（非特許文献１；非特許文献２）。これらの試験では、非標的化ナノ粒子によるｓｉＲＮＡの全身性投与によって用量依存性の腫瘍での蓄積及び標的遺伝子の発現のサイレンシングを生じることができた（非特許文献３）。これらの心強いデータにもかかわらず、これらのｓｉＲＮＡの標的となった遺伝子は、多数の腫瘍細胞よりは低レベルではあるが、あらゆる正常細胞で発現される（非特許文献４；非特許文献５）。非標的化ナノ粒子を使用することに対するさらなる一般的な欠点は、肝臓、腎臓及び脾臓におけるそれらの有意な蓄積であり、それは標的外れ効果の可能性を招き、他の臓器への治療有効負荷の有効用量を減らすことになる。
【０００６】
ＲＮＡは生体内ではＲＮＡヌクレアーゼによって迅速に分解され、ｓｉＲＮＡ薬剤は、循環血中でヌクレオチドの濃度を高めることができるナノ粒子に被包することによってこれらの酵素から保護されなければならない。ｓｉＲＮＡを使用することの短所は循環中におけるヌクレアーゼによるその迅速な分解である。哺乳類にて治療剤としてｓｉＲＮＡを使用する最初の難題は、標的遺伝子を発現する特定の組織及び臓器への無傷のｓｉＲＮＡの細胞内送達である。疾患を治療するためにｓｉＲＮＡを上手く使用するには２つの重要な因子が必須である：（１）特定の疾患の亢進に関与する特異的な遺伝的標的を選択すること及び（２）病んだ細胞に対してｓｉＲＮＡを直接向ける方法、である。癌の治療では、たとえば、ｓｉＲＮＡの標的として特定の癌遺伝子を選択すること及び腫瘍細胞に対してｓｉＲＮＡを直接向ける方法である。
しかしながら、これら必須のターゲティング因子は未だに達成されていない。従って、治療有効性を高めるための、細胞、特に癌細胞へのｓｉＲＮＡ（及び他の薬剤分子）の標的化送達のための試薬及び方法に対する当該技術におけるニーズが存在したままである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ、  Ｎａｔｕｒｅ、  ２００９、  ４５７：  ４２６−３３
【非特許文献２】Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｎａｔｕｒｅ、  ２００６、  ４４１  ：  １１１−４
【非特許文献３】Ｊｕｈａｓｚ  ｅｔ  ａｌ、  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ．、  ２００６、  １５：  １２９９−３０４
【非特許文献４】Ｃｅｒｑｕｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．、  ２００５、  １２：  １２８３−９４
【非特許文献５】Ｈｅｉｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ、  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．、  ２００７、  １０４：  ５７１５−２１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、治療用組成物に対してポリペプチド送達ビヒクルを提供することによって従来技術における欠陥を克服する。本発明のポリペプチド送達ビヒクルは一般に治療用分子との複合体にてエラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）を含む。たとえば、そのようなＥＬＰ組成物は、治療用の小分子、ポリペプチド又は核酸と複合体化したＥＬＰを含み得る。場合によっては、ＥＬＰは治療用分子と共有結合し得る。たとえば、ＥＬＰ組成物は、小分子と共有結合したＥＬＰドメイン又はペプチド結合によって治療用ポリペプチドに結合したＥＬＰ（すなわち、ＥＬＰ融合タンパク質）を含み得る。さらに場合によっては、ＥＬＰは治療用分子に結合するポリペプチドに融合し得る。同様に、ＥＬＰはたとえば、治療用分子に結合するアプタマーのような核酸アプタマーとともに複合体化し得るし、又はそれと共有結合し得る。
記載されるナノ粒子システムのモジュール型の性質は、化学合成技術又は組換えＤＮＡ技術のいずれかによって異なった薬物結合ペプチドの又はターゲティングペプチドの配列を分子の構造に容易に導入することができるという点で、現在のリポソーム又はナノ粒子の薬剤送達システムに有利な柔軟性を提供する。非限定例では、ナノ粒子ポリペプチドを調製するのに使用されるプラスミドベクターに本発明に係るポリペプチドをコードする核酸をクローニングすることができ、特定のターゲティング配列をその特定の実施形態に導入することができる。別の利点は製造の簡素性であり、その際、組換えベクター又は発現構築物を適切な細胞種に導入することができ（たとえば、ナノ粒子ポリペプチド用のＤＮＡ配列を持つプラスミドを細菌細胞に導入する）、ポリペプチドが多量に産生され、特異的な結合、とりわけ、ＤＮＡアフィニティカラムを用いて精製される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＥＬＰ薬剤送達ナノ粒子の構造及びドメインを示す図である。ＥＬＰ薬剤送達システムは、本明細書で提供されるとき、集合ドメイン（ＡＤ）、薬剤結合ドメイン（ＤＢＤ）、ヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）及び標的にされた細胞の生体分子と相互作用する細胞ターゲティングドメイン（ＣＴＤ）を含む。
【図２】溶液におけるＥＬＰ／ナノ粒子の集合を示す図である。各ポリペプチドのＡＤは大きなミセルへの集合を生じる。
【図３】試料粒子のヌクレオチド及びペプチドの配列を示す図である。ＥＬＰ１〜６０；Ｋ８配列（下線、太字）；Ｌ１ＣＡＭ配列（下線、太字、イタリック体）
【図４】Ｋ８ＥＬＰ（１〜６０）／ナノ粒子水溶液の精製を示す図である。ＥＬＰを含有するナノ粒子を単離するための逆転移サイクル法の間で精製された分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。レーン１はＳＴＤ、レーン２はＢＬＲ、レーン３はＢＬＲ＋Ｋ８ＥＬＰ１〜６０、レーン４は細胞破砕後、レーン５はＰＥＩ後、レーン６はホットスピン上清、レーン７はホットスピン沈殿。精製したＫ８／ＥＬＰ１〜６０は２５ｋＤａに近いサイズを示した。
【図５】ｓｉＲＮＡのＫ８ＥＬＰ１〜６０への凝集を示す図である。ナノ粒子に結合したｓｉＲＮＡのゲルシフト解析。ｓｉＲＮＡ（１００ピコモル）を連続希釈したナノ粒子と混合し、常温で３０分間インキュベートする。１Ｘ  ＴＡＥ緩衝液中１％のアガロースゲルにて１２０Ｖで３０分間、生成物を電気泳動分離に供する。ゲルはｓｉＲＮＡの視覚化のために臭化エチジウムを含有した。レーン１は分子ラダー、レーン２はｓｉＲＮＡ（１００ピコモル）、レーン３はｓｉＲＮＡ＋１：３２０のＫ８ＥＬＰ１〜６０、レーン４はｓｉＲＮＡ＋１：１６０のＫ８ＥＬＰ１〜６０、レーン５はｓｉＲＮＡ＋１：８０のＫ８ＥＬＰ１〜６０、レーン６はｓｉＲＮＡ＋１：４０のＫ８ＥＬＰ１〜６０、レーン７はｓｉＲＮＡ＋１：２０のＫ８ＥＬＰ１〜６０、レーン８は１：１０のＫ８ＥＬＰ１〜６０。レーン８は１．３３μｇのＫ８ＥＬＰ１〜６０を有する。
【図６】全身生物発光画像法によって、標識されたｓｉＲＮＡを含有するナノ粒子の腫瘍への局在化を示す。対照として標識した裸のｓｉＲＮＡ（Ｄｙ６７７−ｓｉＥＶＩ１）及び処理群としてＫ８ＥＬＰ１〜６０中の標識したｓｉＲＮＡ（Ｄｙ６７７−ＥＬＰ−ｓｉＥＶＩ１）を２匹のマウスにそれぞれ注入し、ビヒクル群とともに示す。飽和されない画像を得る露光時間で生物発光画像法を実施した。Ｄｙ６７７による非常によく似たＥｘ／Ｅｍを有するＣｙ５．５についてのパラメータを用いてさらに低い背景の自己発光に対するスペクトル不混合を行う。時点間で直接的な比較が行えるように、全時点（０．５、４、及び２４時間）での蛍光画像及びＢＬＩ画像はすべて同一尺度に置く。標識したｓｉＲＮＡを含有する基本的なＫ８ＥＬＰ（１〜６０）ナノ粒子は４時間以内で腫瘍に特異的に局在するのが見られ、腫瘍によって代謝されるので２４時間でシグナルが減衰する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
当業者に周知の従来の技法をオリゴヌクレオチド合成又は化学的ポリペプチド合成に用いた。製造元の仕様書に従って、又は本明細書で記載されるように当該技術で一般に達成されるように、酵素反応及び精製を行った。当該技術で周知の従来の方法に従って、及び本明細書全体を通して引用され、議論される種々の一般的な及びさらに特定の参考文献に記載されたように、技法及び手順を一般的に実施した。たとえば、あらゆる目的で参照によって本明細書に組み入れられるＳａｍｂｒｏｏｋら、２００１、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、及びＢｅｎｏｉｔｏｎ、Ｎ．Ｌ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第１版、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（２００５年８月１２日）を参照のこと。特定の定義が提供されない限り、本明細書で記載される分子生物学、遺伝子工学、分析化学、合成有機化学、及び医薬化学に関連した命名法並びにその実験室での手順及び技法は、当該技術で周知であり、一般的に使用される。標準的な技法を化学合成、化学分析、及び患者の治療に使用することができる。
【００１１】
文脈によって求められない限り、単数用語は複数を含むべきであり、複数用語は単数を含むべきである。
【００１２】
本開示に従って利用されるように、以下の用語は、特に指示されない限り、以下の意味を有するように理解されるべきである。
【００１３】
１．ポリペプチド
態様の１つでは、本発明は、核酸結合ドメイン（ＮＢＤ）、集合ドメイン（ＡＤ）及び細胞ターゲティングドメイン（ＣＴＤ）を含む単離されたポリペプチドを記載する。他の実施形態では、単離されたポリペプチドはさらに、薬剤結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む。特定の実施形態では、単離されたポリペプチドは以下の断片：ＡＤ、ＣＴＤ、ＮＢＤ及びＤＢＤを含む。本発明のポリペプチドのドメインは当業者に容易に明らかなように、任意の順序であり得る。本発明はさらに、複数のＡＤ、ＣＴＤ、ＮＢＤ及び／又はＤＢＤを含む単一のポリペプチドを記載する。
【００１４】
特定の実施形態では、本発明は、たとえば、エラスチン様ポリペプチドのような少なくとも１つのポリペプチドを含む組成物に関する。本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」は一般に複数のアミノ酸を伴った少なくとも１つのポリペプチドを含有するタンパク質分子を指すが、これに限定されない。タンパク質は、たとえば、二量体又は三量体又は他の三次構造のような１を超えるポリペプチドを含有し得る。一部の実施形態では、タンパク質は、３以上のアミノ酸を有するポリペプチド又は３〜１００のアミノ酸のペプチドを指す。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は相互交換可能に使用される。
【００１５】
特定の実施形態では、ポリペプチドのサイズは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００以上のアミノ酸分子残基、及びそれらで導出できる範囲を含み得る、又は多くとも若しくは少なくともそうである。さらに、それは、たとえば、エラスチンポリマーのような本明細書で提供されるポリペプチドに由来する隣接するアミノ酸のそのような長さを含有し得る。
【００１６】
本発明のポリペプチドは、標準の分子生物学の技法を介したタンパク質、ポリペプチド又はペプチドの発現、天然供給源からのポリペプチドの単離、又はポリペプチドの化学合成を含む当業者に既知の任意の技法によって作製され得る。種々の遺伝子についてのヌクレオチド及びタンパク質、ポリペプチド及びペプチドの配列は以前開示されており、当業者に既知のコンピュータ化したデータベースで見つけられ得る。そのようなデータベースの１つは、全米バイオテクノロジー情報センターのＧｅｎｂａｎｋ及びＧｅｎＰｅｐｔデータベース（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／のウェブサイトにて）である。これらの既知の遺伝子についてのコーディング領域は、本明細書で開示されるような又は当業者に既知であるような技法を用いて増幅され得るし、及び／又は発現され得る。或いは、タンパク質、ポリペプチド及びペプチドの種々の市販の調製物が当業者に既知である。
【００１７】
特定の実施形態では、ポリペプチドは精製され得る。一般に、「精製される」は、種々の他のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを取り除く分画化に供された、特定のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドについて、たとえば、当業者に既知であるタンパク質アッセイによって評価され得るような活性を組成物が実質的に保持する、特定のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドの組成物を指すであろう。
【００１８】
一部の実施形態では、タンパク質、たとえば、本発明のポリペプチドを精製することが望ましくてもよい。タンパク質の精製法は当業者に周知である。これらの技法には、一段階でのポリペプチド分画と非ポリペプチド分画への細胞環境の粗い分画化が関与する。他のタンパク質からポリペプチドを分離して、クロマトグラフィ法又は電気泳動法を用いて当該ポリペプチドをさらに精製し、部分的な又は完全な精製（又は均質への精製）を達成し得る。純粋なペプチド又はポリペプチドの調製に特に適する分析方法は、濾過、イオン交換クロマトグラフィ、排除クロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、アフィニティクロマトグラフィ、又は等電点電気泳動法である。ペプチドを精製する特に効率的な方法は高速タンパク質液体クロマトグラフィ又は均一ＨＰＬＣである。ＥＬＰ組成物の場合、タンパク質精製は、米国特許第６，８５２，８３４号に記載されたようなＥＬＰドメインの熱転移特性によっても助けられ得る。
【００１９】
タンパク質又はペプチドの精製の程度を定量する種々の方法は、本開示の観点で当業者に既知であろう。これらには、たとえば、活性分画の特定の活性を判定すること、又はＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析によって分画内でのポリペプチドの量を評価することが含まれる。分画の純度を評価するのに好まれる方法は、分画の比活性を計算し、当初に抽出物の比活性とそれを比較し、こうして純度の程度を計算することである。活性の量を表すのに使用される実際の単位は、当然、精製に続いて選択される、発現されたタンパク質又はペプチドが検出可能な活性を示すかどうかの特定のアッセイ法に左右されるであろう。
【００２０】
タンパク質の精製に使用するのに好適な種々の技法は当業者に周知である。これらには、たとえば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体等による又は熱変性による沈殿、その後の遠心；たとえば、イオン交換、ゲル濾過、逆相、ハイドロキシアパタイト及びアフィニティクロマトグラフィのようなクロマトグラフィ工程；等電点電気泳動法；ゲル電気泳動法；及びそのような及び他の技法の組み合わせが挙げられる。当該技術で一般に知られるように、種々の精製工程を実施する順序を変更してもよく、又は特定の工程が省略されてもよく、さらに実質的に精製されたタンパク質又はペプチドの調製のために好適な方法を結果的に生じてもよいと考えられる。
【００２１】
２．ポリヌクレオチド及び遺伝子の発現
本発明のポリペプチドは従来の生物学的技法によって調製することができる。態様の１つでは、本発明は、薬剤結合ドメイン（ＤＢＤ）、集合ドメイン（ＡＤ）及び細胞ターゲティングドメイン（ＣＴＤ）を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドを記載する。
【００２２】
本明細書で使用されるとき、用語「単離されたポリヌクレオチド」は、ゲノム、ｃＤＮＡ、若しくは合成起源又はその組み合わせのポリヌクレオチドを意味し、その供給源によって、「単離されたポリヌクレオチド」は、（１）「単離されたポリヌクレオチド」が天然で見い出されるポリヌクレオチドのすべて又は一部に関連しない、（２）天然では結合しないポリヌクレオチドに結合する、又は（３）さらに大きな配列の一部として天然には存在しない。
【００２３】
特定されない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’方向と呼ばれる。５’から３’への新生ＲＮＡ転写物の付加の方向は転写方向と呼ばれ；ＲＮＡと同一の配列を有するＤＮＡ鎖上の、ＲＮＡ転写物の５’から５’末端までである配列領域は「上流配列」と呼ばれ；ＲＮＡと同一の配列を有するＤＮＡ鎖上の、ＲＮＡ転写物の３’から３’末端までである配列領域は「下流配列」と呼ばれる。
【００２４】
用語「ポリヌクレオチド」は本明細書で使用されるとき、長さが少なくとも１０塩基であるヌクレオチドの高分子形態を意味する。特定の実施形態では、塩基はリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドであることができ、又はヌクレオチドのいずれかの型の修飾された形態であることができる。その用語には、ＤＮＡ又はＲＮＡの一本鎖及び二本鎖の形態が含まれる。
【００２５】
用語「オリゴヌクレオチド」は本明細書で使用されるとき、天然に存在する及び／又は天然に存在しないオリゴヌクレオチド結合によって一緒に連結される天然に存在する及び修飾されたヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは２００以下のヌクレオチドを一般に含むポリヌクレオチドのサブセットである。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さ１０〜６０のヌクレオチドである。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さ１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は３０〜４０の塩基である。オリゴヌクレオチドは、たとえば、アンチセンスＲＮＡとして使用するための一本鎖であることができ、又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）若しくは低分子（又は短鎖）ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）としての二本鎖であることができる。オリゴヌクレオチドは、たとえば、放射性標識、蛍光標識、抗原性標識又はハプテンのような検出可能な標識を含むことができる。
【００２６】
用語「天然に存在するヌクレオチド」にはデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドが挙げられる。用語「修飾されたヌクレオチド」には、修飾された又は置換された糖基などを持つヌクレオチドが挙げられる。用語「オリゴヌクレオチド結合」には、たとえば、ホスフェート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデート、ホスホロアミデートのようなオリゴヌクレオチド結合が挙げられる。たとえば、その開示のそれぞれがあらゆる目的で参照によって本明細書に組み入れられるＬａＰｌａｎｃｈｅら、１９８６，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９０８１；Ｓｔｅｃら、１９８４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７；Ｓｔｅｉｎら、１９８８，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９；Ｚｏｎら、１９９１，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ６：５３９；Ｚｏｎら、１９９１，ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ，ｐｐ．８７−１０８；Ｓｔｅｃら、米国特許第５，１５１，５１０号；Ｕｈｌｍａｎｎ及びＰｅｙｍａｎ，１９９０，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３を参照のこと。
【００２７】
別の態様では、本発明は、集合ドメイン（ＡＤ）、細胞ターゲティングドメイン（ＣＴＤ）及び薬剤結合ドメイン（ＤＢＤ）をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む組換え発現構築物を記載する。
【００２８】
用語「組換え発現構築物」は、コーディング情報を宿主細胞又は標的細胞に移すのに使用されるヌクレオチド（たとえば、核酸、プラスミド又はウイルス）を指すのに使用される。用語「組換え発現構築物」及び「ベクター」は相互交換可能に使用することができる。本発明の方法に好適なウイルスベクターには、たとえば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、単純性ヘルペスウイルス又はワクシニアウイルスに由来するものが挙げられる。
【００２９】
用語「発現ベクター」は、宿主細胞又は標的細胞の形質転換に好適であり、挿入された核酸配列の発現を指示する及び／又は制御する制御配列を含む核酸配列を含有するベクターを指す。用語「発現」には、転写及びイントロンが存在すればＲＮＡスプライシングのようなプロセシングが含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
本発明の発現ベクターは、制御配列に操作可能に連結されるコーディング配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡの配列を含むことができる。用語「制御配列」又は「制御要素」は本明細書で使用されるとき、それらが連結されるコーディング配列の発現及びプロセシングに影響を及ぼし得るポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は宿主生物によって異なり得る。特定の実施形態によれば、原核細胞用の制御配列には、プロモータ、リプレッサ、オペレータ、リボソーム結合部位、及び転写終結配列及びアンチセンスｍＲＮＡが含まれ得る。特定の実施形態によれば、真核細胞用の制御配列には、プロモータ、エンハンサ、及び転写終結配列、又はタンパク質の分解、ｍＲＮＡの分解、核の局在、核外搬出、細胞質保留、タンパク質のリン酸化、タンパク質のアセチル化、タンパク質のＳＵＭＯ化又はＲＮＡ阻害（ＲＮＡｉ）を調節する配列が含まれ得る。特定の実施形態では、「制御配列」には、リーダー配列及び／又は融合相手の配列が含まれ得る。「制御配列」は、それが連結されるコーディング配列の発現及びプロセシングを「制御配列」がもたらす場合、コーディング配列に「操作可能に連結される」。
【００３１】
通常、宿主細胞又は標的細胞で使用される発現ベクターは、ベクターの維持のための及び外来ヌクレオチド配列の発現のための配列を含有する。特定の実施形態ではまとめて「フランキング配列」と呼ばれるそのような配列は通常、以下のヌクレオチド配列：プロモータ、１以上のエンハンサ配列、転写終結配列、ドナーとアクセプタのスプライス部位を含有する完全なイントロン配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル配列、発現されるｓｉＲＮＡをコードする核酸を挿入するための１又は複数の制限エンドヌクレアーゼ部位を含むポリリンカー領域、及び選択可能なマーカー要素の１以上を含むであろう。
【００３２】
フランキング配列は、相同（すなわち、宿主細胞又は標的細胞と同一の種及び／又は株に由来する）、非相同（すなわち、宿主細胞又は標的細胞の種又は株以外の種に由来する）、ハイブリッド（すなわち、１を超える供給源に由来するフランキング配列の組み合わせ）、合成、又は天然であることができる。そのようなものとして、フランキング配列の供給源は、フランキング配列が宿主細胞又は標的細胞の機構にて機能的であり、それによって活性化され得るという条件で、原核生物又は真核生物、脊椎動物又は非脊椎生物、又は植物であることができる。
【００３３】
本発明のベクターで有用なフランキング配列は当該技術で周知の幾つかの方法によって得ることができる。通常、本明細書で有用なフランキング配列はマッピング及び／又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前特定されているので、適当な制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な組織供給源から単離することができる。場合によっては、フランキング配列の完全なヌクレオチド配列を知ることができる。フランキング配列はまた、核酸の合成又はクローニングのために本明細書で記載される方法を用いて合成することもできる。
【００３４】
フランキング配列のすべて又は一部のみが知られている場合、たとえば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）のような試験管内の増幅方法を用いて、及び／又は同一種又は別の種からの好適なオリゴヌクレオチド及び／又はフランキング配列の断片によるゲノムライブラリのスクリーニングによって、それを得ることができる。フランキング配列が知られていない場合、フランキング配列を含有するＤＮＡの断片は、たとえば、コーディング配列又はさらに別の遺伝子（単数）若しくは遺伝子（複数）を含有することができるＤＮＡのさらに大きな断片から単離することができる。単離は、適切なＤＮＡ断片を作出する制限エンドヌクレアーゼ消化、その後のアガロースゲル精製、キアゲンカラムクロマトグラフィ（カリフォルニア州、チャッツワース）、又は技量のある熟練者に既知の他の方法を用いた単離によって達成することができる。この目的を達成するのに好適な酵素の選択は当業者に容易に明らかである。
【００３５】
転写終結配列は通常、ポリペプチドのコーディング領域の３’から末端に位置し、転写を終結させるのに役立つ。普通、原核細胞における転写終結配列はＧ−Ｃリッチ断片にポリＴ配列が続く。配列はライブラリから容易にクローニングされ、又はさらにベクターの一部として商業的に購入される一方で、たとえば、本明細書で記載されるもののような核酸合成の方法を用いて容易にそれを合成することもできる。真核細胞は、転写終結シグナルとして及びエンドヌクレアーゼ切断に必要とされるポリＡシグナルとしての双方で機能する配列を有し、その後にポリＡ残基（普通、約２００Ａ残基から成る）の付加が続く。
【００３６】
本発明の発現及びクローニング用のベクターは通常、宿主生物によって認識され、遺伝子をコードする核酸に操作可能に連結されるプロモータを含有する。プロモータは構造遺伝子（一般に１００〜１０００ｂｐの範囲内）の開始コドンの上流（すなわち、５’）に位置する、構造遺伝子の転写を制御する非転写配列である。プロモータは従来、２つのクラス：誘導性プロモータ及び構成的プロモータのうちの１つに分けられる。誘導性プロモータは、たとえば、栄養物の存在若しくは非存在、又は温度変化のような培養条件における何らかの変化に対応するその制御下でＤＮＡからの転写レベルの上昇を開始する。構成的プロモータは、それに対して、連続的な遺伝子産物の作出を開始し、すなわち、遺伝子発現について実験的な制御はほとんどないか、又は全くない。種々の考えられる宿主細胞又は標的細胞によって認識される多数のプロモータが周知である。
【００３７】
哺乳類細胞で使用するのに好適なプロモータは周知であり、それには、たとえば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（たとえば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）のような真核生物ウイルスのゲノムに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。その他の好適な哺乳類プロモータには、非相同性の哺乳類プロモータ、たとえば、熱ショックプロモータ及びアクチンプロモータが挙げられる。
【００３８】
本発明の組換え発現ベクターの実践に有用な特定のプロモータには、ＳＶ４０早期プロモータ領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，  １９８１，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：  ３０４−１０）；ＣＭＶプロモータ、ラウス肉腫ウイルスの３’長い末端反復に含有されるプロモータ（Ｙａｍａｍｏｔｏ，  ｅｔ  ａｌ，  １９８０，  Ｃｅｌｌ  ２２：  ７８７−９７）；ヘルペスのチミジンキナーゼプロモータ（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９８１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７８：  １４４４−４５）；及びメタロチオニン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：  ３９−４２）が挙げられるが、これらに限定されない。関心かあるのはまた、組織特異性を呈し、トランスジェニック動物で利用されている以下の動物転写制御領域：膵臓の腺房細胞で活性があるエラスターゼＩ遺伝子の制御領域（Ｓｗｉｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｃｅｌｌ  ３８：  ６３９−４６；  Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ，  １９８６，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｉｎｔ．  Ｂｉｏｌ．  ５０：  ３９９４０９；  ＭａｃＤｏｎａｌｄ，  １９８７，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：  ４２５−５１５）；膵臓のβ細胞で活性があるインスリン遺伝子の制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，  １９８５，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：  １１５−２２）；精巣、乳腺、リンパの細胞及び肥満細胞で活性があるマウス乳癌ウイルスの制御領域（Ｌｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９８６，  Ｃｅｌｌ  ４５：  ４８５−９５）；骨髄細胞で活性があるβグロビン遺伝子の制御領域（Ｍｏｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：  ３３８−４０；  Ｋｏｌｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｃｅｌｌ  ４６：  ８９−９４）；脳の乏突起膠細胞で活性があるミエリン塩基性タンパク質遺伝子の制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ，  １９８７，  Ｃｅｌｌ  ４８：  ７０３−１２）；骨格筋で活性があるミオシン軽鎖−２遺伝子の制御領域（Ｓａｎｉ，  １９８５，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：  ２８３−８６）；視床下部で活性がある性腺刺激ホルモン遺伝子の制御領域（Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９８６，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：  １３７２−７８）；及び最も特には、リンパ系細胞で活性がある免疫グロブリン遺伝子の制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ，  １９８４，  Ｃｅｌｌ  ３８：  ６４７−５８；  Ａｄａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ，  １９８５，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：  ５３３−３８；  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９８７，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ７：  １４３６−４４）である。
【００３９】
好ましくは、本発明の発現ベクターのプロモータは標的細胞又は宿主細胞が由来する組織で活性がある。たとえば、細胞が肝臓細胞であれば、アルブミン遺伝子の制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，  １９８７，  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．  １  ：  ２６８−７６）；α−フェトタンパク質遺伝子の制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ５：  １６３９−４８；  Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９８７，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：  ５３−５８）又はα−１−アンチトリプシン遺伝子の制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．  １  ：  １６１−７１）を有利に使用してもよく、そのすべては肝臓で活性がある。
【００４０】
本発明のベクターは高等な真核細胞で転写を高めるエンハンサ配列も含有することができる。エンハンサはＤＮＡのシス作用性要素であり、普通、長さ約１０〜３００ｂｐであり、転写を高めるようにプロモータにて作用する。エンハンサは方向性及び位置に相対的に無関係である。それらは、転写単位までの５’及び３’の双方で数キロ塩基の範囲内と同様にイントロンの範囲内で見つかっている。哺乳類遺伝子から利用可能な幾つかのエンハンサ配列が知られている（たとえば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質、インスリン、トランスサイレチン、及びＨＮＦ−６遺伝子からのエンハンサ）。ウイルスからのエンハンサも遺伝子の発現を高めるのに使用することができる。ＳＶ４０エンハンサ、サイトメガロウイルスの早期プロモータのエンハンサ、ポリオーマのエンハンサ、及びアデノウイルスのエンハンサは、真核細胞のプロモータの活性化のための例となるエンハンサ要素である。エンハンサは核酸分子の５’又は３’の位置でベクターにスプライスされ得るが、通常それはプロモータの５’部位に位置する。
【００４１】
本発明の発現ベクターは、たとえば、市販のベクターのような好都合な出発ベクターから構築することができる。そのようなベクターは所望のフランキング配列をすべて含有することができ、又は含有することができない。本明細書で記載されるフランキング配列の１以上がベクターにすでに存在しない場合、それらを個々に入手し、ベクターに連結することができる。フランキング配列のそれぞれを入手するのに使用される方法は当業者に周知である。
【００４２】
ベクターを構築し、たとえば、記載されたＥＬＰポリペプチドをコードする核酸分子をベクターの適切な部位に挿入した後、完成したベクターを好適な宿主細胞又は標的細胞に挿入することができる。記載されたＥＬＰポリペプチドをコードする発現ベクターすべてを選択された宿主細胞又は標的細胞に導入することは、たとえば、形質移入、感染、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、微量注入、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン法、又は上述のような他の既知の技法のような方法を含む周知の方法によって達成することができる。選択される方法は部分的には、使用される宿主細胞又は標的細胞の種類の機能である。これらの方法及び他の好適な方法は技量のある熟練者には周知であり、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙに述べられている。
【００４３】
用語「形質移入」は、細胞による外来の又は外因性のＤＮＡの取り込みを指すのに使用され、外因性のＤＮＡが細胞の内部に導入されていると、細胞は「形質移入されて」いる。多数の形質移入の技法が当該技術で周知であり、本明細書で開示される。たとえば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｄａｖｉｓら、１９８６，ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）；及びＣｈｕら、１９８１，Ｇｅｎｅ、１３：１９７を参照のこと。そのような技法を使用して好適な宿主細胞に外因性のＤＮＡを導入することができる。
【００４４】
他の実施形態では、本発明は、本発明の発現ベクターを含む、哺乳類細胞、たとえば、ヒト細胞を提供する。
【００４５】
３．集合ドメイン（ＡＤ）
特定の実施形態では、ＡＤはタンパク質に基づくポリマーである。他の実施形態では、ＡＤはエラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）を含む。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、用語「エラスチン様ポリペプチド」又は「エラスチン様反復」（ＥＬＰ）は相互交換可能に使用される。ＥＬＰは温度によって構造変化を受けるアミノ酸ポリマーの部類を指す。温度を上昇させることによって、溶解度が高い伸長した鎖から溶解度が大きく低下したきつく折り畳んだ集合体へのＥＬＰの転移（米国特許第６，８５２，８３４号を参照）。ＥＬＰは、たとえば、この相転移が起きる平均温度によって定義され得る。従って、本発明の特定の態様では、ＥＬＰは約３７℃を超える平均の相転移温度を有するであろう。一部のさらなる実施形態では、ＥＬＰは約３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、又は４６℃の転移温度のような生理学的範囲にて平均の相転移温度を有し得る。場合によっては、ＥＬＰは相転移が起きるのを超える温度範囲に基づいて定義され得る。たとえば、場合によっては、相転移は５℃未満の温度範囲を超えて起こるであろう。たとえば、相転移は約４℃、３℃、２℃、１℃以下の温度範囲で起き得る。
【００４７】
本発明の一部の特定の実施形態では、ＥＬＰドメインはそのアミノ酸配列によって定義され得る。たとえば、ＥＬＰドメインはアミノ酸配列ＶＰＧＸＧ（配列番号５７）の複数の反復を含んでもよく、Ｘはプロリン以外のアミノ酸である。たとえば、本発明のＥＬＰはＶＰＧＸＧ配列の１０〜５００の反復を含み得る。さらに特定な場合によっては、本発明のＥＬＰは５０〜３００又は８０〜２００の間のアミノ酸を含み得る。一部の実施形態では、ＥＬＰにおける「Ｘ」残基はすべて同じアミノ酸であるが、特定の他の場合では、ＥＬＰはポリマー全体を通してＸ位にて種々の異なった残基を含み得る。たとえば、場合によっては、たとえば、最初の５つの反復ではＸ＝Ｖａｌであり、次の２つの反復ではＸ＝Ａｌａであり残りの３つの反復ではＸ＝Ｇｌｙである（Ｖ５：Ａ２：Ｇ３で表す）ＶＰＧＸＧの１０反復を含むＥＬＰのように、Ｘはアラニン、バリン又はグリシンの残基であり得る。
【００４８】
ＥＬＰのようなタンパク質に基づいたポリマーは、広い範囲の生物医学的応用に好まれる特性を持つポリマーの部類である。ＥＬＰは、ヒトのトロポエラスチンに由来する（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ）（配列番号５７）の反復で構成される人工的なペプチドポリマーであり、「ゲスト残基」として知られるＸはプロリン以外のアミノ酸の混合物であり得る（Ｕｒｒｙ，  Ｄ．  Ｗ．  Ｐｒｏｇ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５７：  ２３−５７，  １９９２．）。有用な感熱性の生体物質としてのＥＬＰの意義は元々、Ｄ．Ｔ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｘｕ及びＤ．Ｗ．Ｕｒｒｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．７：５１−５７（１９９６）によって示唆された。
【００４９】
ＥＬＰは複数の理由でＡＤとして有用である。第１に、ＥＬＰは、それを超えるとバルク水から脱溶媒和し、相分離する特徴的な転移温度（Ｔｔ）にて水溶液中で逆相転移を受ける（Ｕｒｒｙ  Ｄ．Ｗ．，  １９９７，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂ  １０１  ：  １１００７−１１０２８．．）。組換えＥＬＰブロックコポリマーについては、この相転移挙動は、ブロック１つの脱溶媒和によって引き起こされるナノ構造への自己集合を促進する（Ｙａｍａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ，  ２００３，  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ４：  １６８０−１６８５；  Ｃａｐｐｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ，  １９９８，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５３：  １０５−１１７；  Ｄｒｅｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  ２００８，  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３０：６８７−６９４）。このことは、ポリペプチド／薬剤混合物に十分な両親媒性を付与し、ナノ構造へのその自己集合を引き起こすＥＬＰの能力を説明することができる（Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４：  １０５７−１０７３；  Ｍｅｇｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４：  １０７５−１０９１）。第２に、ＥＬＰは、非毒性であり（Ｕｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ，  １９９１，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ６：２６３−２８２；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １１６：  １７０−１７８）、生分解性であり、良好な薬物動態を示す（Ｃｈｉｌｋｏｔｉ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２，  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５４：  １０９３−１１１１）有用な生体高分子である。第３に、ＥＬＰは遺伝子工学によって作出することができるので、その組成、分子量及びポリ分散性を正確に制御することができる。第４に、ＥＬＰは大腸菌にて高い収率（約１００〜２００ｍｇ／Ｌ）で産出でき、その相転移挙動を利用して容易に迅速に生成することができるので（Ｍｅｙｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈｉｌｋｏｔｉ，  １９９９，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：  １１１２−１１１５）、高純度の臨床等級の物質が容易に且つ安価に得られる。構築の単純性は、ナノ粒子の製造及びｓｉＲＮＡの形成、ｃＧＭＰ産出についての重要な懸念及び品質制御に一貫性をもたらす。ＥＬＰの有用性及び安全性は糖尿病の治療についてのフェーズＩ臨床評価で実証されている（ＰｈａｓｅＢｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）。
【００５０】
本発明のさらなる態様では、たとえば、ＥＬＰの相転移特性、ＥＬＰの組成又はナノ粒子を変化させるようにＥＬＰドメインの配列を改変してもよいことが理解される。たとえば、場合によっては、ＥＬＰドメインは、配列（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ）（配列番号５７）を含み、Ｘはプロリン以外のアミノ酸を含む。Ｘ位にて異なったアミノ酸を置き換えることによって、ＥＬＰドメインの特性が改変され得る。たとえば、さらに低い転移温度が所望である場合、さらに疎水性の残基がＸにて代用され得る。逆に、転移温度を上げるには、疎水性の少ない残基がＸ位にて代用され得る。タンパク質にて生物機能を付与することにおける疎水性又はアミノ酸のハイドロパシー指標の重要性は当該技術で一般に理解されている（Ｋｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  １９８２，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１５７：  １０５−１３２）。アミノ酸の相対的なハイドロパシー性が得られるタンパク質の二次構造に寄与する、言い換えれば、タンパク質の他の分子、たとえば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原等との相互作用を規定することが受け入れられる。
【００５１】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されたように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り振られている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋３．０）；アスパラギン（＋２．０）；グルタミン（＋２．０）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。従って、Ｘ位のアミノ酸が高い親水性値を有する場合、ＥＬＰの転移温度は上昇し得るが、転移温度を下げるには、低い親水性値を持つアミノ酸を使用し得ることが理解されるであろう。
【００５２】
特定の実施形態では、反復方向指示型連結（ＲＤＬ）に基づく組換えＤＮＡクローニング法、従来の細菌培養発現（１４）によって達成される簡易生合成経路を介して遺伝子を送達するために単離されたポリペプチドを設計し、合成する。特定の実施形態では、ポリペプチドはアミノ酸配列（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ）ｎ（配列番号５７）を含み、ＸはＶａｌ、Ａｌａ、及びＧｌｙを含むペプチドであり、ｎは１以上の整数である。他の実施形態では、ｎは２、５、１０、２０、５０、１００以上である。さらに特定に実施形態では、Ｘは約５：２：３の比でＶａｌ、Ａｌａ、及びＧｌｙを含むペプチドである。特定の実施形態では、ｎは、ＥＬＰ（１〜６０）のように記される６０である。ＥＬＰ（１〜６０）は、Ｃｈｅｎら、２００７，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２５：６８３−６９１に記載されており、Ｍｅｙｅｒ及びＣｈｉｌｋｏｔｉ，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７，１１１２−１１１５に記載されたようなＥＬＰ（１〜３０）に由来し、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。反復方向指示型連結による以前の研究に従って他のブロックコポリマーを合成することができる。
【００５３】
ＥＬＰドメインにおけるＥＬＰ様反復の数を変えることによってＥＬＰドメイン、ＥＬＰの組成物及びナノ粒子の転移温度を改変し得ることも理解されるであろう。たとえば、ＥＬＰドメインによって付与される転移温度を上げるために、ＥＬＰ反復の数を減らしてもよい。逆に、ＥＬＰドメインにおけるＥＬＰ反復の数を増やすことは一般にＥＬＰドメイン、ＥＬＰの組成物又はナノ粒子の転移温度を下げるであろう。
【００５４】
特定の実施形態では、ペプチド又はポリペプチドは、参照配列又は参照配列の特定の領域と同一である又は類似するアミノ酸配列を含有し得る。特定の実施形態では、ペプチド又はポリペプチドは、特定のポリペプチドのアミノ酸配列に関して、又は特定のポリペプチドの領域の範囲内で、少なくとも又は多くとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、１００％の同一性を有する。場合によっては、ＥＬＰドメインの配列は、ヒトのエラスチンのドメインの配列にさらに密接に一致するように改変され得る。たとえば、ＥＬＰドメイン又はＥＬＰ組成物（たとえば、ＥＬＰ融合タンパク質）の免疫原性をさらに減らすためにそのような改変が為され得る。たとえば、本発明の一部の実施形態では、ＥＬＰドメインは、ヒトのエラスチン反復配列と少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５％同一であると定義され得る。
【００５５】
４．細胞ターゲティングドメイン
特定の且つ有利な実施形態では、本発明のポリペプチドは１以上の細胞ターゲティングドメイン（ＣＴＤ）を含む。組換えＤＮＡを含む従来の遺伝子工学技法を用いて、様々な細胞ターゲティングドメインのヌクレオチド配列を包含して、ポリペプチド又はナノ粒子のターゲティングに対するその効果を判定することができる。
【００５６】
本発明のポリペプチドはＡＤ及びＣＴＤを含む融合タンパク質を含むことができ、さらなる場合では、そのような融合タンパク質はＮＢＤも含むことができ、さらなる場合では、そのような融合タンパク質はＤＢＤも含むことができる。
【００５７】
本発明の一部の実施形態では、ポリペプチドは、抗体若しくはその特異的な結合部位、リガンド、サイトカイン、ケモカイン又は核酸アプタマーであるＣＴＤを含む。「特異的な結合部位」は抗原と相互作用する抗体のペプチドドメインとして定義される。そのようなドメインを本発明のＥＬＰ組成物に抱合させることができる。細胞ターゲティング抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗体断片、又はヒト化抗体が挙げられるが、これらに限定されない。別の例では、細胞ターゲティングリガンドは、ＶＥＧＦ、又は受容体結合に介在するアミノ酸であり得る。ＣＴＤは、たとえば、免疫細胞、癌細胞、又は特定の組織若しくは系列に由来する細胞のような特定の部類の細胞に優先的に結合することができる。本発明の特定の態様では、ＣＴＤはまたＥＬＰに基づく組成物の内部移行にも介在することができる。
【００５８】
本発明の特定の実施形態では、ＣＴＤは標的細胞の表面上に存在する生体分子と相互作用することができる。他の実施形態では、ＣＴＤは標的細胞の外表面に存在する生体分子と相互作用することができる。他の実施形態では、ＣＴＤは標的細胞の内表面に存在する生体分子と相互作用することができる。さらに他の実施形態では、ＣＴＤは細胞の外側に存在する生体分子と相互作用することができる。さらに他の実施形態では、ＣＴＤは細胞の内側に存在する生体分子と相互作用することができる。ナノ粒子が細胞膜に透過性であるようにナノ粒子は凝集することができる。そのような代替の実施形態では、ナノ粒子は細胞の内側の生体分子と接触することができる。
【００５９】
他の実施形態では、生体分子は受容体分子を含む。特定の実施形態では、生体分子は細胞接着分子を含む。他の特定の実施形態では、生体分子はフィブロネクチン又はラミニンを含む。特定の実施形態では、生体分子が標的細胞の外表面に存在するということは、生体分子のいずれかの部分が、全体で又は部分的に、いずれかで細胞の外側に暴露されていることを意味する。特定の実施形態では、本発明は、癌細胞の表面にて腫瘍生体マーカーを結合するＣＴＤを含むポリペプチドを記載する。
【００６０】
ＣＴＤは、どんな特定のポリペプチド配列にも限定されない。それは任意の所望の生体分子を標的とするように設計することができる。特異的な特定の実施形態では、生体分子は所望の細胞種にて特異的に発現される。非限定例として、ＣＴＤは、腫瘍細胞で発現されるが、非腫瘍細胞では発現されない生体分子を標的とするように設計された。特定の実施形態では、ポリペプチドのＣＴＤは腫瘍細胞に特異的なペプチドリガンドを含む。腫瘍特異的なＣＴＤポリペプチド配列の非限定例を表１に示す。一実施形態では、ＣＴＤはＬ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）を結合するペプチドリガンドを含む。特定の腫瘍細胞を標的とすることは、腫瘍を探索するＥＬＰナノ粒子にて送達される薬剤の特異的ターゲティングによって癌療法の副作用を減らすために有利である。特異的ターゲティングは、低濃度の薬剤を使用する一方で癌療法の有効性を維持する又は高めることができる。一実施形態では、ＣＴＤはペプチド配列（ＧＳＱＲＫＨＳＫＲＨＩＨＫＤＨＶ）（配列番号１９）を含む
【００６１】
【表１】
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【００６２】
本発明の別の態様では、薬剤を標的細胞に向ける方法が提供され、それは、集合ドメイン（ＡＤ）と、薬剤結合ドメイン（ＤＢＤ）と、細胞ターゲティングドメイン（ＣＴＤ）を含む１以上のポリペプチドを使用することと、１以上のポリペプチドのＤＢＤに薬剤を接触させることと、１以上のポリペプチドのＡＤを集合させて集合ポリペプチドを生成することと、集合ポリペプチドを標的細胞に接触させることと、標的細胞の外側に存在する生体分子に集合ポリペプチドのＣＴＤを接触させることを含む。用語「得ること」は生理的検体の物理的所有を要することを意味する。物質が取得される方法は、特定の過程に限定されない。特定の実施形態では、集合ポリペプチドは薬剤を含む。他の実施形態では、集合ポリペプチドは凝集し、ナノ粒子を形成することができる。他の実施形態では、集合ポリペプチドは薬剤とともに凝集し、ナノ粒子を形成することができる。
【００６３】
特定の実施形態では、本発明の方法は、所望の細胞に薬剤を向ける。ターゲティングにはどんな細胞も選択することができる。特定の実施形態では、標的細胞は、真核細胞であり、さらに好ましくは哺乳類細胞であり、最も好ましくは齧歯類又はヒトの細胞である。特定の実施形態では、標的細胞は腫瘍細胞である。本発明によって熟考される腫瘍細胞の非限定例は、ヒト膀胱細胞、ヒト乳腺細胞、ヒト結腸細胞、ヒト肝臓細胞、ヒト肺細胞、ヒト神経芽腫細胞、ヒト卵巣細胞、ヒト膵臓細胞、ヒト前立腺細胞、又はヒト皮膚細胞である。加えて、標的細胞は、本発明の方法によって治療されるべき患者を冒す疾患又は状態に基づいて選択することができる。
【００６４】
５．薬剤結合ドメイン（ＤＢＤ）
本発明の特定の態様では、ポリペプチドは薬剤結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む。ＤＢＤは薬剤を結合するポリペプチド配列を含むことができる。用語「剤」又は「薬剤」は、化合物、化合物の混合物、生体高分子、又は生体物質から作られる抽出物を示すのに本明細書で使用される。薬剤には、アルキル化剤、代謝拮抗物質、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤及びその他の抗癌剤が挙げられる。他の薬剤には、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ボルテゾニブ、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、サイクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア（カテゴリー化を必要とする）、イダルビシン、イマチニブ、メクロレタミン、メルカプトプリン、メソトレキセート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テニポシド、チオグアニン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビンが挙げられる。
【００６５】
特定の実施形態では、ＤＢＤは従来の薬剤又は試験中の薬剤を結合することができる。他の実施形態では、ＤＢＤは抗腫瘍剤を結合することができる。他の実施形態では、ポリペプチドは複数のＤＢＤを含む。
【００６６】
特定の実施形態では、ＤＢＤは治療剤を結合する。一部の実施形態では、治療剤は生物学的に活性のあるタンパク質である。好適なタンパク質には、特に、たとえば、エリスロポイエチン、インターフェロン、インスリン、モノクローナル抗体、血液因子、コロニー刺激因子、成長ホルモン、インターロイキン、増殖因子、治療用ワクチン、カルシトニン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及び酵素のような治療用タンパク質を含む、医学、農学及びその他の科学分野及び産業分野で関心のあるものが挙げられる。そのような治療用タンパク質の具体例には、限定しないで、補充療法で利用される酵素；動物にて成長を促進するための又は細胞培養にて細胞増殖を促進するためのホルモン；及び種々の応用、たとえば、バイオテクノロジー又は医学診断で使用される活性のあるタンパク質様物質が挙げられる。具体例には、スーパーオキシドジスムターゼ、インターフェロン、アスパラギナーゼ、グルタミナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼリボヌクレアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、パピン、インスリン、カルシトニン、ＡＣＴＨ、グルカゴン、ソマトシン、ソマトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、エリスロポイエチン、視床下部放出ホルモン、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドフリン、エンケファリン及びバゾプレッシンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の他の実施形態では、ＤＢＤは治療用ポリペプチドドメインを含む。本発明の特定の態様では、ＤＢＤはＥＬＰドメインに化学的に結合することができるが、特定に場合では、ＥＬＰドメイン及び治療用ポリペプチドドメインは融合タンパク質に含まれ得る。本発明で使用するための治療用ポリペプチドには、サイトカイン、ケモカイン、血管新生因子、抗血管新生因子が挙げられるが、これらに限定されない。特定の場合によっては、治療用ポリペプチドは、インターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＨＩＦ−１、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＮＦ−κＢ阻害配列、インターフェロンのコンセンサス配列、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、ＩＬ−８又はＶＥＧＦ特異的ｓｃＦｖのような単鎖抗体配列（ｓｃＦｖ）であり得る。本発明の特定の態様では、治療用ポリペプチドは、たとえば、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（Ｆｌｋ−ｌ／ＫＤＲ）又はＶＥＧＦＲ−３のような受容体タンパク質の細胞外ドメインを含むことができる。
【００６７】
特定の実施形態では、剤は診断剤又は造影剤である。本発明は画像化又は治療のための正確なターゲティングを可能にする。用語「造影剤」は、哺乳類における特定の生理又は病態生理を標的とするように設計され、生体内又は試験管内でのその投与の後、検出することができる化合物を意味する。造影剤の非限定例は蛍光標識である。他の標識は当該技術で周知である。
【００６８】
特定の実施形態では、ＤＢＤは核酸結合部分を含む。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは核酸に結合するカチオン性ドメインを含むＤＢＤドメインを含む。特定の実施形態では、核酸はｓｉＲＮＡ分子である。他の実施形態では、薬剤はｓｉＲＮＡ分子である。
【００６９】
６．核酸結合ドメイン（ＮＢＤ）
本発明の特定の態様では、ポリペプチドは核酸結合ドメイン（ＮＢＤ）を含む。特定の実施形態では、ポリペプチドはＤＢＤ及びＮＢＤの双方を含む。一部の実施形態では、ＤＢＤ及びＮＢＤは双方とも核酸を結合することができる。特定の実施形態では、ＮＢＤはｓｉＲＮＡ結合ドメインを含む。特定の場合では、ＮＢＤは、たとえば、共有結合を介してＥＬＰに抱合することができる。ポリペプチドのＮＢＤ及び他のドメインはスペーサーペプチドによって分離することができる。一部の他の場合では、ＮＢＤを含むポリペプチドはＮＢＤ、ＡＤ及びＣＴＤを含む融合タンパク質であり得る。
【００７０】
当該技術で既知の核酸結合ポリペプチドを本発明のＮＢＤに使用することができる。たとえば、ＮＢＤは、たとえば、鉄調節性タンパク質（ＩＲＰ）１又は２のＲＮＡ結合ドメインのような特定の核酸配列に結合することができる。特定の追加の場合では、ＮＢＤは、カチオン残基が豊富であるアミノ酸ポリマーのように、非特異的に核酸に結合することができる。たとえば、ＮＢＤは、たとえば、リジンのような生理的ｐＨで正に荷電する、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％以上の残基を有することができる。特定の例では、ＮＢＤは、アミノ酸配列ＶＫ又はＶＫＧの反復を含むことができる。たとえば、配列は、たとえば、４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、９６又は１００のＶＫ又はＶＫＧの反復を伴った核酸結合ドメインのような４〜１００のＶＫ又はＶＫＧの反復又はその混合物を有することができる。従って、ＧＡのような薬剤は本発明に従ってＮＢＤと複合体化することができる。
【００７１】
特定の実施形態では、ＮＢＤはオリゴリジンドメインを含み、それは順番に複数のリジン残基を含む。オリゴリジンドメインは核酸を結合する。特定の実施形態では、ＮＢＤは、ｎが４を超える整数であるアミノ酸配列（Ｋｎ）を含む。好まれる実施形態では、ｎは８である。特定の実施形態では、ＮＢＤはアミノ酸配列（Ｋ８）（配列番号５８）を含む。別の好まれる実施形態では、オリゴリジンドメインはアミノ酸配列Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ｋ８；配列番号５８）を含む。
【００７２】
他の実施形態では、ＮＢＤはオリゴアルギニンドメインを含み、それは、順番に複数のアルギニン残基を含む。特定の実施形態では、ＮＢＤは、ｎが４を超える整数であるアミノ酸配列（Ｒｎ）を含む。特定の実施形態では、ｎ＝９（Ｒ９；配列番号５９）。
【００７３】
特定の実施形態では、単離されたポリペプチドは、オリゴリジン（Ｋ８）又はオリゴアルギニン（Ｒ９）及び（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ）６０又は（ＶＰＧＸＧ）６０として表される６０回反復したペンタペプチド単位を伴ったＥＬＰブロックから構成され、Ｘは５：２：３の比率でＶａｌ、Ａｌａ及びＧｌｙである。
【００７４】
特定の実施形態では、薬剤はｓｉＲＮＡ分子を含む。特定の実施形態では、薬剤は癌遺伝子から発現されるＲＮＡの一部を認識する配列を持つヌクレオチドを含む。
【００７５】
本発明の一実施形態では、薬剤はＥＶＩ１遺伝子から発現されるＲＮＡの一部を認識する配列を持つヌクレオチドを含む。細胞内でのＥＶＩ１の発現の阻害は、細胞分裂の阻止及び／又はアポトーシスの活性化を引き起こす。本発明の一実施形態では、ヌクレオチドはワトソン／クリック配列相補性によってＥＶＩ１遺伝子配列に結合し、その発現を阻止する。ヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡのレベルでＥＶＩ１遺伝子の発現を阻害するのに十分な長さのＤＮＡオリゴヌクレオチドであり得る。別の実施形態では、ヌクレオチドは、ＲＮＡのプロセシング機構と関連してＥＶＩ１の発現を下方調節する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり得る。このｄｓＲＮＡはおよそ２０塩基対の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり得る。
【００７６】
特定の実施形態では、本出願は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）及びＲＮＡｉ構築物に関する。用語「ｄｓＲＮＡ」は本明細書で使用されるとき、ｓｉＲＮＡを含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が可能である二本鎖ＲＮＡ分子を指す。加えて、ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が特異的な、転写後の様態で遺伝子発現を阻止する、植物及び蠕虫にて認められた現象に最初に適用された用語である。ＲＮＡｉは試験管内又は生体内で遺伝子発現を阻害する又は低下させる有用な方法を提供する。
【００７７】
用語「低分子干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」又は「低分子干渉核酸」は本明細書で使用されるとき、細胞によって適切にプロセシングされる場合、ＲＮＡｉ又は遺伝子スプライシングに介在することが可能である核酸を指す。たとえば、ｓｉＲＮＡは、自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であることができ、アンチセンス領域は標的遺伝子に対する相補性を含む。ｓｉＲＮＡは、自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を有する一本鎖ヘアピンポリヌクレオチドであることができ、アンチセンス領域は標的遺伝子に対する相補性を含む。ｓｉＲＮＡは、２以上のループ構造と自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を含むステムを有する環状の一本鎖ポリヌクレオチドであることができ、アンチセンス領域は標的遺伝子に対する相補性を含み、環状ポリヌクレオチドは試験管内又は生体内でプロセシングを受けてＲＮＡｉに介在することが可能である活性のあるｓｉＲＮＡを生成することができる。ｓｉＲＮＡはまた、標的遺伝子に対する相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含むこともでき、一本鎖ポリヌクレオチドはさらに、たとえば、５’−リン酸又は５’，３’−二リン酸のような末端リン酸基を含むことができる。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、標的核酸に結合し、標的核酸の活性を変える非酵素性の核酸である。たとえば、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（又はＲＩＳＣ）のような１以上のタンパク質又はタンパク質複合体との相互作用によってｓｉＲＮＡの結合及び／又は活性を促進することができる。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖の単一の隣接配列に沿って標的配列に相補的である配列を含む。
【００７８】
任意で、本出願のｓｉＲＮＡは、生理的条件下（たとえば、細胞環境にて）にて、阻害される遺伝子（「標的遺伝子」）についてのｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部の核酸配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含有する。二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡｉに介在する能力を有する点で天然のＲＮＡに十分類似することのみを必要とする。従って、本出願は、遺伝子変異、株の多型現象、又は進化の多様性によって予測され得る配列の変異を認容することができる長所を有する。標的配列とｓｉＲＮＡ配列の間で認容されるヌクレオチドのミスマッチの数は、５塩基対に１以下、又は１０塩基対に１以下、又は２０塩基対に１以下、又は５０塩基対に１以下である。ｓｉＲＮＡ二本鎖の中心におけるミスマッチは最も重要であり、標的ＲＮＡの切断を本質的になくしてしまう。それに対して、標的ＲＮＡに相補的であるｓｉＲＮＡ鎖の３’末端におけるヌクレオチドは標的認識の特異性に十分には寄与しない。配列の比較及び配置のアルゴリズムによって、たとえば、初期設定のパラメータを用いてＢＥＳＴＦＩＴソフトウエアで実施されるようなスミス／ウォーターマンのアルゴリズムによりヌクレオチド配列間の差異比率を計算することによって配列同一性を最適化することができる。ｓｉＲＮＡと標的遺伝子の一部との間で９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を超える又はさらに１００％の配列同一性が好まれる。或いは、ＲＮＡの二本鎖領域は、ストリンジェントな条件下（たとえば、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃で１２〜１６時間ハイブリッド形成、その後洗浄）で、標的遺伝子の転写物の一部とハイブリッド形成することが可能であるヌクレオチド配列として機能的に定義することができる。
【００７９】
ｄｓＲＮＡの二本鎖構造は、単一の自己相補性ＲＮＡ、２本の相補性ＲＮＡ鎖、又はＤＮＡ鎖と相補性ＲＮＡ鎖によって形成することができる。任意で、ＲＮＡ二本鎖の形成は細胞の内側又は外側で開始することができる。細胞当たり少なくとも１コピーの送達を可能にする量でＲＮＡを導入することができる。二本鎖物質の用量（たとえば、細胞当たり少なくとも５、１０、１００、５００又は１０００コピー）は多ければ多いほど有効な阻害が得られるが、少ない用量も特定の適用には有用であり得る。ＲＮＡの二本鎖領域に相当するヌクレオチド配列が阻害にて標的とされるという点で、阻害は配列特異的である。
【００８０】
本明細書で記載されるように、主題のｓｉＲＮＡは、長さ約１９〜３０ヌクレオチド、長さ約２１〜２７ヌクレオチド、長さ約２１〜２５ヌクレオチド、又は長さ約２１〜２３ヌクレオチドの二本鎖領域を含む。ｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ複合体を動員し、特定の配列と対を為すことによって標的遺伝子転写物に複合体を導くと理解されている。その結果、タンパク質複合体におけるヌクレアーゼによって標的遺伝子転写物が分解される。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は３’ヒドロキシル基を含む。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ構築物は、たとえば、酵素ダイサーの存在下でさらに長い二本鎖ＲＮＡのプロセシングによって生成することができる。一実施形態では、ショウジョウバエの試験管内の系が使用される。この実施形態では、ｄｓＲＮＡはショウジョウバエの胚に由来する可溶性抽出物と組み合わせられ、それによって組み合わせを生じる。ｄｓＲＮＡが約２１〜約２７ヌクレオチドのＲＮＡ分子にプロセシングされる条件下で組み合わせを維持する。ｓｉＲＮＡ分子は当業者に既知の多数の技法を用いて精製することができる。たとえば、ゲル電気泳動法を用いてｓｉＲＮＡを精製することができる。或いは、たとえば、非変性カラムクロマトグラフィのような非変性の方法を用いてｓｉＲＮＡを精製することができる。加えて、クロマトグラフィ（たとえば、サイズ排除クロマトグラフィ）、グリセロール勾配遠心分離、抗体によるアフィニティ精製を用いてｓｉＲＮＡを精製することができる。
【００８１】
主題のｄｓＲＮＡ（たとえば、ｓｉＲＮＡ）の製造は、化学合成法によって又は組換え核酸法によって実施することができる。処理した細胞の内因性ポリメラーゼは生体内で転写に介在することができ、クローニングしたＲＮＡポリメラーゼは試験管内での転写に使用することができる。本明細書で使用されるとき、本出願のｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの分子はＲＮＡのみを含有する分子に限定される必要はないが、化学的に修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドをさらに包含する。たとえば、ｄｓＲＮＡはリン酸／糖の主鎖又はヌクレオシドのいずれかに修飾を含んで、たとえば、細胞性ヌクレアーゼへの感受性を低下させる、生体利用効率を改善する、製剤特性を改善する、及び／又は他の薬物動態特性を変化させる。説明するように、天然のＲＮＡのホスホジエステル結合を修飾して少なくとも１つの窒素又はイオウのヘテロ原子を含むことができる。ｄｓＲＮＡへの一般的な応答を回避する一方で特異的な遺伝的阻害を可能にするようにＲＮＡにおける修飾を誂えることができる。同様に、塩基を修飾してアデノシンデアミナーゼの活性を遮断することができる。ｄｓＲＮＡは酵素的に製造することができ、又は部分的な／全体的な有機合成によって製造することができ、修飾されたリボヌクレオチドを試験管内の酵素合成又は有機合成によって導入することができる。ＲＮＡ分子を化学的に修飾する方法はｄｓＲＮＡを修飾するのに適合させることができる。単に説明にて、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、ホスホジチオエート、キメラのメチルホスホネート／ホスホジエステル、ペプチド核酸、５−プロピル−ピリミジン含有のオリゴマー又は糖修飾（たとえば、２’−置換リボヌクレオシド、α−配置）によってｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの主鎖を修飾することができる。特定の場合では、本出願のｄｓＲＮＡは２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有のヌクレオチドを欠く。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子はホスホロチオエートセンス鎖を含む。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子はホスホジエステルアンチセンス鎖を含む。
【００８２】
特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡの少なくとも一方の鎖は、長さ約１〜約１０ヌクレオチド、長さ約１〜約５ヌクレオチド、長さ約１〜３ヌクレオチド、又は長さ約２〜４ヌクレオチドの３’−オーバーハングを有する。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、３’−オーバーハングを有する一方の鎖を含むことができ、他方の鎖は、３’末端にて平滑末端である（すなわち、３’−オーバーハングを有さない）。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、双方の鎖で３’−オーバーハングを含むことができる。オーバーハングの長さは各鎖について同一であっても異なっていてもよい。ｓｉＲＮＡの安定性をさらに高めるために、分解に対して３’−オーバーハングを安定化することができる。一実施形態では、たとえば、アデノシン又はグアノシンの分子のようなプリンヌクレオチドを含むことによってＲＮＡを安定化させる。或いは、修飾された類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、たとえば、２’−デオキシチミジンによるウリジンヌクレオチド３’オーバーハングの置換が認容され、ＲＮＡｉの効率に影響を及ぼさない。２’ヒドロキシルの非存在は、組織培養培地におけるオーバーハングのヌクレアーゼ耐性を十分に高め、生体内で有益であり得る。
【００８３】
別の特定の実施形態では、主題のｄｓＲＮＡは長い二本鎖ＲＮＡの形態であることもできる。たとえば、ｄｓＲＮＡは少なくとも２５、５０、１００、２００、３００又は４００の塩基である。場合によっては、ｄｓＲＮＡは長さ４００〜８００塩基である。任意でｄｓＲＮＡを細胞内で消化し、たとえば、細胞内でｓｉＲＮＡを作出する。しかしながら、多分、配列とは無関係なｄｓＲＮＡの応答により生じ得る有害な効果のために、生体内での長い二本鎖ＲＮＡの使用は必ずしも実践的ではない。そのような実施形態では、インターフェロン又はＰＫＲの効果を減らす局所送達の系及び／又は剤の使用が好まれる。
【００８４】
さらなる特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡは低分子のヘアピン（ｓｈＲＮＡ）構造の形態である。ｓｈＲＮＡは外因性に合成することができ、又は生体内でＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータから転写することによって形成することができる。好ましくは、そのようなｓｈＲＮＡは、標的遺伝子を確実に連続して及び安定して抑制するように細胞内で又は動物にて操作される。細胞内でヘアピンＲＮＡをプロセシングすることによってｓｉＲＮＡを作出できることは当該技術で既知である。
【００８５】
特定の実施形態では、本発明で提供されるような薬剤は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の種である。用語「低分子干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」は本明細書で使用されるとき、たとえば、Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ、４１１：４２８−４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１，Ｎａｔｕｒｅ、４１１：４９４−４９８；及びＫｒｅｕｔｚｅｒら、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／４４８９５；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚら、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／３６６４６；Ｆｉｒｅ，国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／３２６１９；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋら、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／０１８４６；Ｍｅｌｌｏ及びＦｉｒｅ，国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／２９０５８；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ，国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／０７４０９；並びにＬｉら、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／４４９１４に記載されたようなＲＮＡ干渉又は「ＲＮＡｉ」が可能である二本鎖核酸分子を指す。本明細書で使用されるとき、ｓｉＲＮＡ分子はＲＮＡのみを含有するものに限定される必要はないが、ＲＮＡｉ能又はその活性を有する化学的に修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドをさらに含むことができる。
【００８６】
ＲＮＡ干渉は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が介在する動物における配列特異的な転写後の遺伝子のサイレンシングの過程を指す（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｎａｔｕｒｅ  ３９１  ：８０６）。細胞における高分子ｄｓＲＮＡの存在は、「ダイサー」と呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性を刺激する。ダイサーは高分子ｄｓＲＮＡの、ｄｓＲＮＡの小片であるｓｉＲＮＡへのプロセシングに関与する（Ｂｅｒｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３）。ダイサー活性に由来する低分子干渉ＲＮＡは通常、長さ２１〜２３のヌクレオチドであり、約１９塩基対の二本鎖を含む。ダイサーは、翻訳制御に関与する保存された構造の前駆体ＲＮＡからの２１及び２２のヌクレオチドの小分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の切り出しにも関与している（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：８３４）。ＲＮＡｉの反応はまた、一般にＲＮＡ誘導のサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるｓｉＲＮＡを含有するエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とし、それは、ｓｉＲＮＡに相同な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断に介在する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のガイド配列に相補的な領域の中ほどで起きる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ，  ２００１，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １５：  １８８）。
【００８７】
低分子干渉ＲＮＡが介在するＲＮＡｉは種々の系で検討されている。ＦｉｒｅらはＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて初めてＲＮＡｉを観察した（１９９８，  Ｎａｔｕｒｅ  ３９１  ：８０６）。Ｗｉａｎｎｙ及びＧｏｅｔｚはマウスの胚におけるｄｓＲＮＡが介在するＲＮＡｉを記載した（１９９９，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２：７０）。ＨａｍｍｏｎｄらはｄｓＲＮＡを形質移入したショウジョウバエの細胞でＲＮＡｉを記載した（２０００，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：２９３）。Ｅｌｂａｓｈｉｒらは、ヒトの胎児性腎細胞及びＨｅＬａ細胞を含む哺乳類の培養細胞における合成の２１ヌクレオチドＲＮＡの導入によって誘導されたＲＮＡｉを記載した（２００１，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１１  ：４９４）。
【００８８】
ショウジョウバエの胚溶解物における最近の研究は、効率的なＲＮＡｉ活性に介在するのに必須であるｓｉＲＮＡの長さ、構造、化学組成、及び配列についての特定の要件を明らかにした。これらの研究は、２つのヌクレオチド３’−オーバーハングを含有する場合、２１ヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ二本鎖で最も活性があることを示している。さらに、２’−デオキシヌクレオチド又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドによるｓｉＲＮＡの一方又は両方の置換はＲＮＡｉ活性を破壊する一方で、デオキシヌクレオチドによる３’−末端ｓｉＲＮＡヌクレオチドの置換は認容されることが示された。ｓｉＲＮＡ二本鎖の中心における配列のミスマッチもＲＮＡｉ活性を破壊することが示された。加えて、これらの研究はまた、標的ＲＮＡにおける切断部位の位置は３’末端ではなくｓｉＲＮＡのガイド配列の５’末端によって規定されることを示している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２０：６８７７）。その他の研究は、ｓｉＲＮＡ二本鎖の標的に相補的な鎖における５’−リン酸がｓｉＲＮＡ活性に必要とされ、ｓｉＲＮＡにおけるＳ’−リン酸部分を維持するのに細胞でＡＴＰが利用されることを示している（Ｎｙｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｃｅｌｌ  １０７：３０９）。しかしながら、５’−リン酸を欠くｓｉＲＮＡ分子が、外因性に導入される場合、活性があるということは、ｓｉＲＮＡ構築物の５’−リン酸化が生体内で起こり得ることを示唆している。
【００８９】
本発明の薬剤は、自己相補性のセンス及びアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であることができ、その際、アンチセンス領域はヌクレオチド配列の一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は核酸配列又はその一部に相当するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＲＮＡ分子は２つの別々のオリゴヌクレオチドから作ることができ、その際、一方の鎖はセンス鎖であり、他方はアンチセンス鎖であり、アンチセンス鎖とセンス鎖は自己相補性である。核酸系リンカー又は非核酸系リンカーによって連結される自己相補性のセンス領域とアンチセンス領域を有する単一のオリゴヌクレオチドからもｓｉＲＮＡ分子を作ることができる。ｓｉＲＮＡ分子は、実質的に対称性の二本鎖、非対称性の二本鎖、ヘアピン又は非対称性のヘアピン二次構造を形成することができるポリヌクレオチドであり得る。ｓｉＲＮＡ分子はまた、ヌクレオチド配列又はその一部と相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含むこともでき、その際、一本鎖ポリヌクレオチドは、たとえば、Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００２，Ｃｅｌｌ、１１０：５６３−５７４及びＳｃｈｗａｒｚら、２００２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ：Ｃｅｌｌ、１０：５３７−５６８で議論されたような５’，３’−二リン酸又は５’−リン酸のような末端リン酸基をさらに含むことができる。
【００９０】
特定の実施形態では、本発明に係るｓｉＲＮＡ分子及びその他の薬剤は、対象への投与のためのリポソーム及びナノ粒子を含む送達用ビヒクル；キャリア及び希釈剤及びその塩を含むことができ；医薬組成物中に存在することができる。特に、ｓｉＲＮＡは本発明に係るＥＬＰナノ粒子と関連して送達される。核酸分子を送達する方法は、たとえば、Ａｋｈｔａｒら、１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．２：１３９；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５，Ｍａｕｒｅｒら、１９９９，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１６：１２９−１４０；Ｈｏｆｌａｎｄ及びＨｕａｎｇ，１９９９，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１３７：１６５−１９２；並びにＬｅｅら、２０００，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．７５２：１８４−１９２に記載されており、そのすべてが参照によって本明細書に組み入れられる。Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、米国特許第６，３９５，７１３号及びＳｕｌｌｉｖａｎら、ＰＣＴ  ＷＯ９４／０２５９５はさらに、細胞及び組織への核酸分子の送達の一般的な方法を記載している。核酸分子を細胞に実際に送達するのにこれらのプロトコールを利用することができる。イオン導入法による、又は他の送達ビヒクル、たとえば、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル及び生体接着性ミクロスフェアへの取り込みによる、又はタンパク質様ベクター（たとえば、Ｏ’Ｈａｒｅ及びＮｏｒｍａｎｄ、国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／５３７２２を参照）によるリポソームにおける被包を含むが、これらに限定されない当業者に既知の種々の方法によって核酸分子を細胞に投与することができる。
【００９１】
或いは、核酸／ビヒクルの組み合わせを直接注入又は輸液ポンプの使用によって局所に送達することができる。核酸分子の直接送達は、皮下、筋肉内又は経皮であれ、標準の針及びシリンジの方法を用いて行うことができ、又はＣｏｒｎｙら、１９９９，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５：２３３０−２３３７及びＢａｒｒｙら、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／３１２６２に記載されたもののような針なし法によって行うことができる。当該技術における多数の例が浸透圧ポンプによるオリゴヌクレオチドの送達方法（Ｃｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９９８，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２５７：  １３５−１３８，  Ｄ’Ａｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９９８，  Ｍｏｌ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５：  １５１−１６４，  Ｄｒｙｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９９８，  Ｊ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １５７：  １６９−１７５，  Ｇｈｉｒｎｉｋａｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９９８，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２４７：２１−２４を参照）又は直接注入（Ｂｒｏａｄｄｕｓ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７，  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  Ｆｏｃｕｓ  ３，  ａｒｔｉｃｌｅ  ４）を記載している。他の送達経路には、経口送達（たとえば、錠剤又は丸薬の形態で）及び／又はクモ膜下送達（Ｇｏｌｄ，  １９９７，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ７６：  １１５３−１１５８）が挙げられるが、これらに限定されない。核酸の送達及び投与のさらに詳細な記載は、そのすべてが参照によって本明細書に組み入れられるＳｕｌｌｉｖａｎら、ＰＣＴ  ＷＯ９４／０２５９５，Ｄｒａｐｅｒら、ＰＣＴ  ＷＯ９３／２３５６９，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、ＰＣＴ  ＷＯ９９／０５０９４及びＫｌｉｍｕｋらＰＣＴ  ＷＯ９９／０４８１９に提供されている。
【００９２】
或いは、本発明のポリペプチドは真核細胞のプロモータから細胞内で発現させることができる（たとえば、Ｉｚａｎｔ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：３４５；  ＭｃＧａｒｒｙ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，  １９８６，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：３９９；  Ｓｃａｎｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９９１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：  １０５９１−５；  Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ，  １９９２，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．  Ｄｅｖ．  ２：３−１５；  Ｄｒｏｐｕｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ，  １９９２，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６：  １４３２−４１；  Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ，  １９９１，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５：５５３１−４；  Ｏｊｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  １９９２，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０８０２−６；  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９９２，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０：４５８１−９；  Ｓａｒｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９９０，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：  １２２２−１２２５；  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９９５，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３：２２５９；  Ｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：  ４５を参照のこと）。当業者は、適切なＤＮＡ／ＲＮＡベクターを用いて核酸を真核細胞にて発現させることができることを認識するであろう。酵素的核酸による一次転写物からの放出によってそのような核酸の活性を増強することができる（Ｄｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  ＰＣＴ  ＷＯ  ９３／２３５６９，  ａｎｄ  Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ，  ＰＣＴ  ＷＯ  ９４／０２５９５；  Ｏｈｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ，  １９９２，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．  ２７：  １５−６；  Ｔａｉｒａ  ｅｔ  ａｌ，  １９９１，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９：５１２５−３０；  Ｖｅｎｔｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，  １９９３，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１  ：３２４９−５５；  Ｃｈｏｗｒｉｒａ  ｅｔ  ａｌ，  １９９４，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：２５８５６）。
【００９３】
本発明の別の態様では、本発明のポリペプチドは、ＤＮＡ／ＲＮＡベクターに挿入された転写単位（たとえば、Ｃｏｕｔｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  ＴＩＧ  １２：５１０を参照）から発現させることができる。組換えベクターはＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターであることができる。ｓｉＲＮＡを発現するウイルスベクターは、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス又はアルファウイルスに基づくが、これらに限定されないウイルスに基づいて構築することができる。別の実施形態では、ｐｏｌＩＩＩに基づく構築物を用いて本発明の核酸分子を発現させる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，米国特許第５，９０２，８８０号及び同第６，１４６，８８６号を参照）。ｓｉＲＮＡ分子を発現することが可能である組換えベクターは上述のように送達され、標的細胞にて生き残ることができる。或いは、核酸分子の一時的な発現を提供するウイルスベクターを使用することができる。そのようなベクターは必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現されると、ｓｉＲＮＡ分子は標的のｍＲＮＡと相互作用し、ＲＮＡｉ反応を生じる。ｓｉＲＮＡを発現するベクターの送達は、対象から外植した標的細胞への投与の後、対象への再導入によって、又は所望の標的細胞への導入を可能にする他の手段によって、たとえば、静脈内投与又は筋肉内投与のような全身性であり得る（概説については、Ｃｏｕｔｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ，  １９９６，  ＴＩＧ．  １２：５１０を参照のこと）。
【００９４】
他の態様では、本発明は、（ａ）転写開始領域（たとえば、真核細胞のｐｏｌＩ、ＩＩ又はＩＩＩの開始領域）、（ｂ）転写終結領域（たとえば、真核細胞のｐｏｌＩ、ＩＩ又はＩＩＩの終結領域）及び（ｃ）本発明の少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供し、その際、前記配列は、ｓｉＲＮＡ分子の発現及び／又は送達を可能にする様態で、前記開始領域及び前記終結領域と操作可能に連結される。ベクターは任意で、本発明のｓｉＲＮＡをコードする配列の５’側又は３’側に操作可能に連結されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；及び／又はイントロン（介在配列）を含むことができる。
【００９５】
ｓｉＲＮＡ分子の転写は、真核細胞のＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌＩ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）、又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）についてのプロモータから推進される。ｐｏｌＩＩ又はｐｏｌＩＩＩプロモータからの転写物はあらゆる細胞で高レベルにて発現され；所与の細胞型における所与のｐｏｌＩＩプロモータのレベルは、近傍に存在する遺伝子調節配列（エンハンサ、サイレンサ等）の性質に左右される。原核細胞のＲＮＡポリメラーゼ酵素が適当な細胞で発現されるという条件で、原核細胞のＲＮＡポリメラーゼプロモータも使用される（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ，  １９９０，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：６７４３−７；  Ｇａｏ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ  １９９３，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１  ：２８６７−７２；  Ｌｉｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９９３，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２１７：４７−６６；  Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ，  １９９０，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １０：４５２９−３７）。数人の研究者らは、そのようなプロモータから発現させた核酸分子が哺乳類細胞で機能できることを実証している（たとえば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ，  １９９２，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．  Ｄｅｖ．  ２：３−１５；  Ｏｊｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  １９９２，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：  １０８０２−６；  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９９２，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０：４５８１−９；  Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ，  １９９３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：６３４０−４；  Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９９２，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １１  ：４４１１−８；  Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ，  １９９３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ  ９０：８０００−４；  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９９５，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３：２２５９；  Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｃｅｃｈ，  １９９３，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：  １５６６）。さらに具体的には、Ｕ６核内低分子（ｓｎＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びアデノウイルスＶＡＲＮＡをコードする遺伝子に由来するもののような転写単位は、細胞にて、たとえば、ｓｉＲＮＡのような所望のＲＮＡ分子を高濃度で生成するのに有用である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９９５，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  ２３：２２５９；  Ｃｏｕｔｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ，  １９９６，  ＴＩＧ  １２：５１０，  Ｎｏｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，  １９９４，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２２：２８３０；  Ｎｏｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，６２４，８０３；  Ｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ４：４５；  Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＰＣＴ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＷＯ  ９６／１８７３６）。哺乳類細胞への導入のために、プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（たとえば、アデノウイルス又はアデノ関連ウイルスのベクター）又��ウイルスＲＮＡベクター（たとえば、レトロウイルス又はアルファビリスのベクター）（概説については、Ｃｏｕｔｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ，  １９９６，  ＴＩＧ  １２：５１０を参照）を含むが、これらに限定されない種々のベクターに上記ＳｉＲＮＡ転写単位を組み入れることができる。
【００９６】
本発明の実践に有用である発現ベクターには、ヘアピンループを含有するｓｉＲＮＡ分子の発現を可能にする様態で、小さなヌクレオチドのスペーサー配列によって分離されたｓｉＲＮＡ分子の２つの相補性配列をコードする核酸配列を含む発現ベクターが挙げられる。一般に、有用な発現ベクターは、（ａ）転写開始領域、（ｂ）転写終結領域及び（ｃ）小さなヌクレオチドのスペーサー配列によって分離されたｓｉＲＮＡ分子の２つの相補性配列をコードする核酸配列を含み、その際、配列は、小さなヘアピンループを含有するｓｉＲＮＡ分子の発現及び／又は送達を可能にする様態で、開始領域及び終結領域に操作可能に連結される。
【００９７】
特定の実施形態では、本発明は、薬学上許容可能な希釈剤、キャリア、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤と一緒に、本明細書で提供されるようなポリペプチド、ナノ粒子又は薬剤の治療上有効量を含む医薬組成物を提供する。本発明はさらに、本明細書で提供されるようなポリペプチド、ナノ粒子又は薬剤を含む医薬組成物を提供する。特に、本発明に従って、ＥＬＰナノ粒子と関連してｓｉＲＮＡ及び他の薬剤が送達される。
【００９８】
許容可能な製剤材料は、採用される投与量及び濃度にて受入者に対して非毒性である。医薬組成物は、たとえば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明性、色、等張性、臭い、無菌性、安定性、溶解又は放出の速度、吸収又は浸透を改変する、維持する又は保存するために製剤材料を含有することができる。好適な製剤材料には、アミノ酸（たとえば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン）；抗菌剤；抗酸化剤（たとえば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝液（たとえば、ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩又はその他の有機酸）；増量剤（たとえば、マンニトール又はグリシン）；キレート剤（たとえば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（たとえば、カフェニン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）；充填剤；単糖類、二糖類及び他の炭水化物（たとえば、グルコース、マンノース又はデキストリン）；タンパク質（たとえば、アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン）；着色剤、香味剤及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（たとえば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成性の対イオン（たとえば、ナトリウム）；保存剤（たとえば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロヘキシジン、ソルビン酸、又は過酸化水素）；溶媒（たとえば、グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール）；糖アルコール（たとえば、マンニトール又はソルビトール）；懸濁剤；界面活性剤又は湿潤剤（たとえば、プルロニクス、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０のようなポリソルベート、トリトン、トリメタミン、レシチン、コレステロール又はチロキサパル）；安定性向上剤（たとえば、スクロース又はソルビトール）；等張性向上剤（たとえば、アルカリ金属ハロゲン化合物、好ましくは塩化ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトール又はソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤及び／又は医薬補助剤が挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮのＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８．ｓｕｐ．ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと。
【００９９】
７．ナノ粒子
別の態様では、本発明は、集合ドメイン（ＡＤ）と細胞ターゲティングドメイン（ＣＴＤ）に核酸結合ドメイン（ＮＢＤ）及び／又は薬剤結合ドメイン（ＤＢＤ）を加えて含む１以上のポリペプチドを含むナノ粒子を記載する。特定の実施形態では、ナノ粒子はさらに薬剤を含む。他の実施形態では、ナノ粒子はさらにｓｉＲＮＡ分子を含む。
【０１００】
ナノ粒子は通常、ヌクレオチド又は薬剤を結合し且つ血中で分子を安定化するシェル構造に化学的に基づく。ナノ粒子は、糖、デキストリン、リン酸カルシウム、キトサン、ペプチド及び／又は可塑性ポリマーを含むことが多い。抗癌剤送達のための薬剤を負荷したナノ粒子は好ましくは、以下の特性：（１）高い収率及び純度で数工程にて合成するのに容易であること；（２）１００ｎｍ未満のサイズで単分散性の薬剤負荷ナノ粒子に集合すること；（３）多様な薬剤のカプセル化が可能であること；（４）好都合な薬物動態及び腫瘍蓄積を示すこと；（５）制御された又は調節可能な動態で薬剤を放出すること；（６）治療応答を導くこと；及び（７）非毒性成分に分解し、有害な毒性なしで体内からのクリアランスを可能にすること、を有する。癌療法には多数の異なったナノ規模の送達系が提案されているが、そのほとんどは、これらの系を臨床実践に移行させるのに決定的であるこれらの基準を満たしていない。
【０１０１】
一実施形態では、本発明は、薬剤の接着に際してほぼ単分散の１００ｎｍより小さいサイズのナノ粒子に集合し、生分解性であり、良好な薬物動態と腫瘍蓄積を示し、低毒性であり、標的ペプチドを用いたｓｉＲＮＡを腫瘍細胞に送達するマウスの腫瘍モデルで優れた生体内有効性を示すポリペプチドのナノ粒子の第１の例を記載する。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ｓｉＲＮＡ、オリゴ（リジン）／ｓｉＲＮＡ（コア）及びＥＬＰ／抗受容体ペプチド（シェル）と混合する際、コア／シェルのナノ粒子を形成するであろう。
【０１０２】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは溶液中で容易に集合し、ナノ粒子を形成する。用語「集合する」は、粒子が形成されるように塊に一体となる又は集まることとして定義される。溶液はどんな種類でも構わない。溶液は水性であり得る。本発明のＥＬＰポリペプチドは可逆性の逆温度転移を受け；転移温度（Ｔｔ）未満ではそれらは構造的に乱れ、水に高度に可溶性であるが、温度がＴｔを超えて上昇すると、はっきりした（２〜３度）無秩序〜秩序の転移を示し、ポリペプチドの脱溶媒和及び集合を招く。十分なサイズに達するとＥＬＰの集合体は、遠心によって溶液から容易に取り出し、単離することができる。重要なことに、そのような相転移は可逆性であり、ＥＬＰの集合体は、温度がＥＬＰのＴｔ未満に戻されると緩衝溶液にて完全に再溶解することができる。
【０１０３】
集合によって生じた本発明のナノ粒子はサブユニットを作ろうとして、ブロックの反復（約５０〜１００ｎｍ）の数に応じて、定義されたサイズのミセルに組織化する（図２）。ナノ粒子ポリペプチドのモジュール型の性質は、異なったドメイン配列、たとえば、細胞ターゲティングリガンドを含有するものがＥＬＰを調製するのに使用されるプラスミドベクターに容易にクローニングすることができるという点で、現在のリポソーム又はナノ粒子の薬剤送達系に対して柔軟性の長所を提供する。
【０１０４】
特定の実施形態では、ナノ粒子は単一のポリペプチドを含む。これは、それ自体のＡＤと相互作用する（分子内集合）単一ポリペプチドであり得る。他の実施形態では、ナノ粒子は複数のペプチドを含む。この実施形態では、ポリペプチドのＡＤは異なったポリペプチドのＡＤドメインと相互作用する（分子間集合）。他の実施形態では、ナノ粒子はキメラである。
【０１０５】
本発明の一部のさらなる態様では、ナノ粒子は本発明のポリペプチドとの複合体にて治療剤を含み、ＮＢＤは核酸と複合体化する。たとえば、本発明のナノ粒子は、治療用の核酸と複合体化したＮＢＤを含むポリペプチドを含み得る。本発明のナノ粒子は、ＤＮＡ又はＲＮＡの分子を含み得る。たとえば、本発明のナノ粒子で使用され得る核酸には、ＤＮＡ発現ベクター、ＲＮＡ発現ベクター、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー及びリボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。ナノ粒子の核酸は場合によっては、遺伝子療法に使用され得る治療用の核酸であり得る。たとえば、治療用の核酸は、癌細胞にてアポトーシスを誘導し得るし、又は遺伝性障害を正すように変異遺伝子の機能を回復し得る。本発明の一部の態様では、結合した核酸を含むナノ粒子は、ナノ粒子の転移温度を超える温度にて、結合した核酸の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５パーセント以上を放出するであろうということが技量のある熟練者によって理解されるであろう。
【０１０６】
その上さらなる実施形態では、本発明のポリペプチドを核酸分子と混合することを含むナノ粒子を作製する方法が提供される。場合によっては、可溶性ナノ粒子を用いて核酸によって細胞に形質移入し得る。しかしながら、本発明の特定の態様では、細胞に形質移入するために、ナノ粒子は不溶性形態に移行し得る。ナノ粒子は、細胞をナノ粒子に接触させる前又は後のいずれかで、不溶性形態（すなわち、凝集体）に移行し得る。特定の場合によっては、熱の適用（すなわち、ナノ粒子の温度を上昇させることによって）によってナノ粒子を不溶性形態に移行させ得る。ナノ粒子の形成はＭｅｒｉｓｋｏ−Ｌｉｖｅｒｓｉｄｇｅら、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．（２００８）３６：４３に一般的に記載されている。
【０１０７】
特定の実施形態では、ナノ粒子は薬剤との会合に際して１００ｎｍ未満のサイズである。このサイズ範囲内での物体が固形腫瘍内で蓄積することを多数の試験が示しているので、ナノ規模の送達ビヒクル（直径１０〜１００ｎｍ）への臨床的に認可された薬剤の包装は癌療法にとって特に関心がある。これは、腫瘍の血液及びリンパの脈管系の異常性から生じる高い透過性及び保持（ＥＰＲ）の効果により生じると考えられる。
【０１０８】
本発明はＥＬＰ／ナノ粒子に限定されない。本発明の他の実施形態は、（１）ヌクレオチド分子を運ぶことができる、（２）従来の化学療法剤を運ぶことができる又はできない、（３）特定の腫瘍種を標的とする又は腫瘍の転移を阻止するペプチド分子を収容することができるリポソーム、ポリデキストラン又は他のポリマーを利用することができる。
【０１０９】
リポソーム組成物は組織への送達のために追加の物質を含み得ることが熟考される。たとえば、本発明の特定の実施形態では、脂質又はリポソームは赤血球凝集ウイルス（ＨＶＪ）と会合し得る。これは、細胞膜との融合を円滑にし、リポソーム被包ＤＮＡの細胞への侵入を促進することが示されている（Ｋａｎａｄａ  ｅｔ  ａｌ；．，  １９８９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：  ３７５−３７８）。別の例では、核の非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と併せて脂質又はリポソームが複合体化され得るし、又は採用され得る（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６６：３３６１−３３６４）。その上さらなる実施形態では、脂質はＨＶＪ及びＨＭＧ−１の双方と併せて複合体化され得るし、又は採用され得る。
【０１１０】
本発明の別の実施態様では、循環血から薬剤を保護し、標的組織で薬剤を濃縮することができるリポソーム又はナノ粒子の中に薬剤が被包される。特定の実施形態では、薬剤はヌクレオチドである。リポソームは、ヌクレオチドを取り囲む層を形成する脂質表面分子である。通常カチオン性リポソームを使用して負に荷電したヌクレオチドを被包する。
【０１１１】
本発明のさらなる実施形態では、追加のターゲティングリガンドは薬剤を含有するリポソーム又はナノ粒子と会合し、腫瘍細胞上のその標的受容体はアポトーシス破壊を受ける。リポソームをポリエチレングリコールで被覆して（すなわち、ペグ化）、循環にてリポソームの寿命を延ばすことができる。同様に、ナノ粒子をそのように被覆することができる。
【０１１２】
ターゲティング分子は標的細胞の表面上で受容体を特異的に結合するアプタマーと呼ばれる有機化学リンカーであり得る。アプタマーはリポソームの脂質又はナノ粒子のポリマーに共有結合することができる。腫瘍細胞にリポソーム又はナノ粒子を向けるのに使用することができる他の分子は、腫瘍細胞の表面上の特異的な受容体に向けられたペプチド、タンパク質、又は抗体である。
【０１１３】
本発明の特定の態様は、細胞をナノ粒子に接触させることによって薬剤を細胞に送達する方法に関する。そのような方法は試験管内、生体外又は生体内での核酸の送達を含み得ることが理解されるであろう。従って、場合によっては、本発明のナノ粒子はヒトに投与され得る。
【０１１４】
用語「医薬組成物」は本明細書で使用されるとき、薬学上許容可能なキャリア、賦形剤又は希釈剤及び化合物、ペプチドを含む組成物、又は患者に適切に投与されると所望の治療効果を誘導することが可能である本明細書で記載されるような組成物を指す。
【０１１５】
用語「治療上有効な量」は、哺乳類において治療応答を生じると判定される、本発明の医薬組成物又は本発明のスクリーニング法で特定される化合物の量を指す。そのような治療上有効な量は、本明細書に記載される方法を用いて当業者によって容易に確定される。
【０１１６】
本明細書で使用されるとき、「実質的に純粋」は、存在する優勢な種である（すなわち、モル基準で、それが組成物中で他のどんな個々の種よりも豊富である）物体種を意味する。特定の実施形態では、実質的に精製された分画が組成物であり、その際、物体種は存在する全高分子種の少なくとも約５０パーセント（モル基準又は重量若しくは数の基準で）を含む。特定の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物に存在する全高分子種の約８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％を超えるものを含む。特定の実施形態では、物体種は本質的に均質に精製され（従来の検出方法では組成物にて混入する種を検出することはできない）、組成物は単一の高分子種から本質的に成る。
【０１１７】
用語「患者」にはヒト対象及び動物対象が含まれる。
【０１１８】
最適な医薬組成物は、たとえば、投与の意図される経路、送達形式及び所望の投与量に応じて当業者によって決定することができる。たとえば、上記ＲＥＭＩＮＧＴＯＮのＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳを参照のこと。そのような組成物は、本発明の物理的状態、安定性、生体内での放出速度、及び生体内でのクリアランス速度に影響を与え得る。
【０１１９】
医薬組成物における主なビヒクル又はキャリアには、非経口投与用組成物で共通する他の物質で場合によって補完される注射用水、生理的食塩水溶液又は人工の脳脊髄液が挙げられるが、これらに限定されない。中性の緩衝化食塩水又は血清アルブミンと混合した生理食塩水はさらなる例となるビヒクルである。医薬組成物は、ｐＨ約７．０〜８．５のトリス緩衝液又はｐＨ約４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含むことができ、それはさらにソルビトール又は好適なその代用物を含むことができる。本発明の医薬組成物は、凍結乾燥したケーキ又は水溶液の形態で所望の程度の純度を有する選択された組成物を任意の製剤化剤（上記ＲＥＭＩＮＧＴＯＮのＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ）と混合することによって保存のために調製することができる。さらに、たとえば、スクロースのような適当な賦形剤を用いてナノ粒子を凍結乾燥物として製剤化することができる。
【０１２０】
製剤の成分は、投与される部位に許容可能である濃度で存在する。緩衝液は、生理的なｐＨ又はやや低いｐＨ、通常、約５〜約８の範囲のｐＨの範囲内で組成物を維持するのに有利に使用される。
【０１２１】
本発明の医薬組成物は非経口で送達することができる。非経口投与が熟考される場合、本発明で使用するための治療用組成物は発熱物質を含まない、本発明の所望のナノ粒子を含む非経口で許容可能な水溶液の形態であり得る。調製には、その後、デポー注射を介して送達することができる生成物の制御放出又は徐放性放出を提供することができる、たとえば、注射可能なミクロスフェア、生体浸食可能な粒子、ポリマー化合物（たとえば、ポリ酢酸又はポリグリコール酸）、ビーズ又はリポソームのような剤との所望の分子の製剤化が関与し得る。ヒアルロン酸による製剤化は、循環での持続する持続時間を助長する効果を有する。埋め込み可能な薬剤送達用具を用いて所望の分子を導入することができる。
【０１２２】
本発明の医薬組成物は、たとえば、経口でのように、消化管を介して送達することができる。そのような薬学上許容可能な組成物の調製は当該技術の技量の範囲内である。この方法で投与されるナノ粒子は、たとえば、錠剤及びカプセルのような固形剤形の配合で習慣的に使用されるキャリアとともに又はキャリアなしで製剤化することができる。カプセルは、生物利用効率が最大化され、前全身性分解が最少化される時点で消化管にて製剤の活性部分を放出するように設計することができる。追加の剤を含めて、本明細書で開示されるナノ粒子の吸収を円滑にすることができる。希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤及び結合剤も採用することができる。
【０１２３】
医薬組成物は、錠剤の製造に好適である非毒性の賦形剤との混合物にて本明細書で開示される有効量のナノ粒子を含むことができる。無菌水、又は別の適当なビヒクルに錠剤を溶解することによって、単位用量形態で溶液を調製することができる。好適な賦形剤には、たとえば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム又は重炭酸ナトリウム、ラクトース、若しくはリン酸カルシウムのような不活性希釈剤；又はたとえば、デンプン、ゼラチン若しくはアカシアのような結合剤；又は、たとえば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸若しくはタルクのような潤滑剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】
徐放性送達又は制御送達の製剤にて本発明のナノ粒子又は化合物を含む製剤を含む追加の医薬製剤は当業者に明らかである。たとえば、リポソームキャリア、生体浸食性の微粒子又は多孔性のビーズ及びデポーのような種々の他の徐放性送達又は制御送達の手段を製剤化する技法も当業者に既知である。たとえば、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマー微粒子の制御放出を記載しているＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照のこと。徐放性製剤は、成形物品の形態、たとえば、フィルム又はマイクロカプセルにおける半透過性ポリマーマトリクス、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ酢酸（米国特許第３，７７３，９１９号及び欧州特許第０５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：  ５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１  ，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  １５：  １６７−２７７）  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｒ，  １９８２，  Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈ．  １２：  ９８−１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，上記）、又はポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）を含むことができる。徐放性組成物はまた、当該技術で既知の幾つかの方法によって調製することができるリポソームを含むこともできる。たとえば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：３６８８−３６９２；欧州特許第０３６，６７６号；同第０８８，０４６号及び同第１４３，９４９号を参照のこと。
【０１２５】
生体内での投与に使用される医薬組成物は通常、無菌である。特定の実施形態では、無菌の濾過膜を介した濾過によってこれを達成することができる。特定の実施形態では、組成物が凍結乾燥される場合、この方法を用いた無菌化は、凍結乾燥及び再構築の前又は後のいずれかで実施することができる。特定の実施形態では、非経口投与用の組成物は凍結乾燥した形態又は溶液にて保存することができる。特定の実施形態では、非経口組成物は一般に、無菌のアクセスポートを有する容器、たとえば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルの中に入れられる。
【０１２６】
本発明の医薬組成物はいったん製剤化されると、溶液、懸濁液、ジェル、エマルジョン、固形物として、又は脱水した若しくは凍結乾燥した粉末として無菌バイアルにて保存することができる。そのような製剤は、すぐ使用できる形態又は投与に先立って再構築される形態（たとえば、凍結乾燥させた）のいずれかで保存することができる。
【０１２７】
本発明の医薬組成物は単独で投与することができ、又は他の治療剤との併用で、特に他の抗癌剤との併用で投与することができる。そのような剤には一般に放射線療法又は化学療法が挙げられる。化学療法には、たとえば、以下の剤：アントラサイクリン、タキソール、タモキシフェン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、及び当業者に既知の他の薬剤の１以上による治療が関与し得る。
【０１２８】
本発明のナノ粒子を細胞に導入することは、当該技術で既知の方法又は本明細書で記載されるような方法によって達成することができる。たとえば、ナノ粒子の局所送達は直接注入によって達成することができる（Ｈｅｆｔｉ，  １９９４，  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２５：１４１８−３５．）。
【実施例】
【０１２９】
以下の実施例は、上述の方法及び有利な結果の特定の態様を説明する。以下の実施例は、限定を目的にするのではなく説明を目的として示される。
【０１３０】
本明細書で記載される本発明については、腫瘍特異的な受容体のリガンドを含有するＥＬＰに基づいたナノ粒子へのｓｉＲＮＡの製剤化を記載する実施例が提供される。これらのナノ粒子の物理化学的特性を評価する一連のアッセイは、ｓｉＲＮＡの有無の双方で実施して、粒度及びゼータ電位（表面電荷）、ｓｉＲＮＡの取り込み効率及び血清安定性を判定する。本明細書で記載される基本的なナノ粒子は、ゲスト残基ＸａａがＶａｌ：Ａｌａ：Ｇｌｙ［５：２：３］である６０回の５量体の反復を有するように操作した。このナノ粒子は、それが体温で高い溶解性を示し、濃度／時間曲線下面積（ＡＵＣ）（１３）によって分かる長い血漿循環を有するように、Ｔｔ＝６０℃を持つ親水性ポリマー（ＭＷ＝２４．５ｋＤ）である。オリゴリジン（Ｋ８；配列番号５８）又はオリゴアルギニン（Ｒ９；配列番号５９）の断片をナノ粒子のＮ末端に付加してｓｉＲＮＡの連結部位を提供し、ポリマーに十分な両親媒性を付与する。この断片はそれぞれリジン又はアルギニンの８つ又は９つの薬剤結合点を提供し、ナノ粒子のＮ末端でクラスター化した。
【０１３１】
実施例１．培養ヒト癌細胞において受容体を標的とし、ｓｉＲＮＡを負荷したＥＬＰに基づくナノ粒子の調製並びに物理化学的な及び試験管内での性状分析
ｍＲＮＡレベル（ｑＰＣＲ）及びタンパク質レベル（ウエスタンブロット）でのその標的遺伝子を下方調節するｓｉＲＮＡの能力もこれらの細胞株にて調べる。ｓｉＲＮＡが負荷され、ヌクレアーゼ分解からそれを保護し、受容体が介在するエンドサイトーシスを介した卵巣癌細胞による取り込みを促進するＥＬＰ含有のナノ粒子の能力は、以下の試験によって確認される。
【０１３２】
以下の構造：（ｉ）ｓｉＲＮＡ凝集のためのオリゴ（リジン）；（ｉｉ）非クロマトグラフィ精製及びナノ粒子の安定性のためのＸの置換比がＶ５：Ａ２：Ｇ３であるエラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）ブロック／（ＶＰＧＸＧ）ｎ（配列番号５７）を持つモジュール型のカチオン性トリブロック生体高分子の小さなライブラリを、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、肺癌及び皮膚癌の細胞を標的とするために遺伝的に操作した。これによってプラスミドＫ８ＥＬＰ（１〜６０）／ｐＥＴ２５ｂを形成した。この組換えアプローチは、従来の合成ポリマーに比べて、簡単なモジュール型の交換により、有害な有機溶媒の使用を伴わずに、生体高分子構造の正確な制御及び分子量を提供した。組換え生体高分子は、ｓｉＲＮＡとの混合に際して、コア／シェルのナノ粒子、オリゴ（リジン）ｓｉＲＮＡ（コア）及びＥＬＰ／抗受容体ペプチド（シェル）を形成した。
【０１３３】
ヒトＬ１ＣＡＭタンパク質（ＮＭ＿０００４２５．３）の抗−Ｌ１ＣＡＭ配列（ＧＳＱＲＫＨＳＫＲＨＩＨＫＤＨＶ）（配列番号１９）をＫ８ＥＬＰ（１〜６０）／ｐＥＴ２５ｂ＋細菌発現プラスミドのＸｂａｌ／Ｈｉｎｄｌｌｌ部位にてクローニングした。ＤＮＡ配列決定によって正しい方向のクローニングを確認した。これによってＬＫ８ＥＬＰプラスミドを形成し、発現されたペプチドをＬＫ８ＥＬＰと名付けた。この発現プラスミドを大腸菌に導入し、一晩増殖させた。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（１ｍＭ）を加えてタンパク質産生を刺激した。ＥＬＰの熱感受性を利用した非クロマトグラフィＩＴＣ法を介してＥＬＰ含有ナノ粒子を精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって生体高分子の純度を確認し、２５ｋＤａの予想サイズを有する単一のタンパク質バンドを得た（図４のレーン７を参照）。
【０１３４】
Ｋ８ＥＬＰ（１〜６０）／ｐＥＴ２５ｂ＋細菌発現プラスミドにて、腫瘍特異的なＣＴＤペプチドを発現する追加のヌクレオチドもクローニングする。これらの追加のＣＴＤペプチドをコードするヌクレオチド配列を表５に示す。得られたポリペプチドはそれぞれ、ＬＫ８ＥＬＰについて記載されたように調べる。
【０１３５】
実施例２．ナノ粒子の物理化学的凝集アッセイ
ゲルシフトアッセイ及びスキャチャード型分析によって精製Ｋ８ＥＬＰポリペプチドへのｓｉＲＮＡの静電凝集を確認した。細胞輸送試験のために、５’センス鎖にてＤＹ５４７（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）又は他の好適な蛍光標識によってｓｉＲＮＡを標識する。標識したｓｉＲＮＡを０．２〜２Ｎ／Ｐ（生体高分子のカチオン性リジンアミンとｓｉＲＮＡのアニオン性リン酸基のモル比）で混合し、１Ｘトリス塩基、酢酸及びＥＤＴＡ（ＴＡＥ）、５％グルコースの緩衝液にて室温で３０分間インキュベートした。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−１００スピン遠心分離によって生体高分子／ｓｉＲＮＡナノ粒子をｓｉＲＮＡから分離した。蛍光分析分光光度アッセイによって遊離のｓｉＲＮＡ及び凝集したｓｉＲＮＡの濃度を定量した。ナノ粒子と結合したｓｉＲＮＡを保持するが、遊離のｓｉＲＮＡを流してしまうＭｉｃｒｏｃｏｎ−１００を介した遠心分離に混合物を供した。蛍光分析分光光度計及びＤＹ５４７  ｓｉＲＮＡ（Ｅｘ／Ｅｍ５４７／５７４）の既知の濃度の検量線を用いて、遊離のｓｉＲＮＡ及び結合したｓｉＲＮＡの濃度を決定した。ｓｉＲＮＡに対する生体高分子の親和性定数（Ｋｄ）はスキャチャードプロット解析によって算出し、低いマイクロモル範囲が得られた。ＣＴＤを伴ったＫ８ＥＬＰポリペプチドすべてについてこの調製を行う。
【０１３６】
ナノ粒子に結合したｓｉＲＮＡのゲルシフト解析によってＫ８ＥＬＰ（１〜６０）ナノ粒子の物理化学的特徴を解析した。このアッセイでは、ｓｉＲＮＡ（１００ピコモル）を連続希釈したナノ粒子と混合し、常温で３０分間インキュベートした。１Ｘ  ＴＡＥ緩衝液にて１％アガロースゲル上での１２０Ｖ、３０分間の電気泳動分離に生成物を供した。ゲルはｓｉＲＮＡの視覚化のために臭化エチジウムを含有した。Ｋ８ＥＬＰ（１〜６０）ナノ粒子によって凝集したｓｉＲＮＡは上手く離れない（図５、レーン８）。ＣＴＤを伴ったＫ８ＥＬＰポリペプチドすべてについてこのゲルシフト解析も行う。動的光散乱及び走査電子顕微鏡によってもＫ８ＥＬＰ（１〜６０）ナノ粒子の物理化学的特徴を評価し、狭い分布で１００ｎｍを下回る平均サイズを示した。ゼータ電位及びＲＮＡ分解酵素保護によってもＫ８ＥＬＰ）ナノ粒子の物理化学的特徴を評価する。
【０１３７】
ゲル易動度、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びナノ粒子からのｓｉＲＮＡの放出に関する蛍光分析分光光度法によって、１００％ヒト血清におけるナノ粒子の安定性も評価する。
【０１３８】
実施例３．細胞ターゲティングドメインの結合アッセイ
ＬＫ８ＥＬＰのＬ１ＣＡＭの腫瘍細胞を結合する能力を免疫沈降アッセイによって調べる。ＣＴＤを含有する他のＫ８ＥＬＰペプチドもすべて評価する。プロテインＧを事前に被覆したプロテインＧＭａｇｎａＢｉｎｄビーズ（イリノイ州、ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ、カタログ番号２１３５６）は、各親和性標的の精製にすぐ使用できる手段を提供した。プロテインＧと抗体との間の高い親和性の相互作用は、たとえば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の試料負荷緩衝液又は８Ｍのグアニジン／ＨＣｌ、ｐＨ１．５にて煮沸することのような非常に過酷な条件を除いて、効率的には解離しない。遠心分離又は重力法にて磁気ビーズを選択し、沈殿物へのナノ粒子の非特異的な包含を回避する。
【０１３９】
黄色いヤギ（テキサス州、モンゴメリーのＢｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にて標準的なポリクローナル抗体の産生法によって抗受容体抗体を調製する。受容体結合ペプチドをスカシガイのタンパク質に結合させ、繰り返しヤギに注射する。８週間後、ヤギから抗血清を単離し、腫瘍細胞から単離したタンパク質を標的とするウエスタンブロット解析によって抗腫瘍細胞結合を確認する。
【０１４０】
１０μｇのヤギ抗ヒト受容体抗体とともに４℃にて一晩、ＥＬＰナノ粒子（試料当たり０．７５ｍｇ）をインキュベートする。プロテインＧＭａｇｎａＢｉｎｄビーズを９６深穴プレート（ウェル当たり０．５ｍｇ又は０．２５ｍｇ）に加える。磁気スタンドを用いて、０．１％ツイーン２０を含有するトリス緩衝化生理食塩水でビーズを洗浄し、ナノ粒子試料／抗体の混合物とともに１時間インキュベートし、３回洗浄し、次いで９６℃にて１０分間、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元試料緩衝液で溶出する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって溶出液を分解し、抗受容体抗体によるウエスタンブロットによって解析する。
【０１４１】
実施例４．腫瘍へのナノ粒子の局在化
動物全身の生物発光画像化（ＢＬＩ）によって非侵襲性に腫瘍のサイズ及び局在をモニターする。一方は腫瘍特異的受容体（ＬＫ８ＥＬＰ（１〜６０））に対するリガンドを含有し、他方はこのペプチドＫ８ＥＬＰ（１〜６０）を欠く２つの異なったナノ粒子製剤を、蛍光標識（Ｄｙ６７７）を標識したｓｉＲＮＡを含んで調製した。担癌マウスの群（ｎ＝３）は、３種の用量レベル（ｓｉＲＮＡに関して１、３又は１０ｍｇ）のうちの１つでの各ナノ粒子製剤の単回静脈注射を受けた。投与後の３つの時点（０．５、４及び２４時間）にて、動物全身の生物発光画像化によって双方のＫ８ＥＬＰ（１〜６０）ナノ粒子の腫瘍局在化を測定した。
【０１４２】
１００，０００個のＳＫＯＶ３ｉｐ２．１ｕｃ−Ｄ３転移性ヒト卵巣腫瘍細胞を左卵巣の嚢内に片側性にマウス（２０ｇ）に注射した。他の癌を標的とするＣＴＤペプチドについては、卵巣腫瘍細胞ではなく相当する腫瘍細胞株を注射する（表２を参照）。調べる癌の種類に基づいて注射の部位も変わるであろう（たとえば、肺、結腸、脳の中に注射する）。ＩＶＩＳスペクトル上のＢＬＩ画像化によって注射後１週間で腫瘍の存在を確認した。以下の励起／放射フィルターを用い、自動露出によって：ＥＸ：６０５ｎｍ；ＥＭ：６４０、６６０、６８０、７００、７２０、７４０、７６０、７８０ｎｍ；及びＥＸ：６７５；ＥＭ：７２０、７４０、７６０、７８０ｎｍを用いて、蛍光画像化を行った。
【０１４３】
【表２】
2014504150.tif 000003
【０１４４】
２匹のマウスにそれぞれ、対照として標識した裸のｓｉＲＮＡ（Ｄｙ６７７−ｓｉＥＶＩ１）及び処理群としてＫ８ＥＬＰ（ｌ−６０）（Ｄｙ６７７−ＥＬＰ−ｓｉＥＶＩ１）における標識したｓｉＲＮＡを注射し、図６におけるビヒクル群とともに結果を示した。飽和されない画像を得る露出時間で生物発光画像化を実施した。Ｃｙ５．５についてのパラメータを用いて低バックグランド自己蛍光に対するスペクトルの不混合を行ったが、それはＤｙ６７７による非常に類似するＥｘ／Ｅｍを有する。時点（０．５、４及び２４時間）すべてについて蛍光画像及びＢＬＩ画像すべてを、時点間で直接的な比較ができるように同一尺度に置いた。標識したｓｉＲＮＡを含有する基本的なＫ８ＥＬＰ（１〜６０）ナノ粒子は４時間以内に腫瘍に特異的に局在化するのが見られ、腫瘍によって代謝されたので、２４時間でシグナルが減衰した（図６を参照）。
【０１４５】
実施例５．ｓｉＲＮＡの腫瘍への送達
ｍＲＮＡ（ｑＰＣＲ）及びタンパク質（ウエスタンブロット）のレベルで標的遺伝子を下方調節するｓｉＲＮＡの能力も表２に従って癌細胞にて調べる。ＲＮＡ干渉の構成を５’ＲＡＣＥ法によって測定する。原理の証明に使用されるｓｉＲＮＡは癌遺伝子の転写因子ＥＶＩ１のものである。剖検の際、マウスから腫瘍を切除し、イソチオシアン酸グアニジニウムＴＲＩＺｏｌ溶液にて保存し、凍結する。製造元の指示書に従ってＴＲＩＺｏｌ法（カリフォルニア州、カールスバットのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてマウスの腫瘍から全ＲＮＡを単離する。ランダムプライマー及びＡＭＶ逆転写酵素を用いて逆転写に続いてＰＣＲを行う。
【０１４６】
ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）：ＰＣＲアッセイを行って、本明細書で記載されるｓｉＲＮＡ試薬の存在下でＥＶＩ１遺伝子発現における変化を検出する。これらのアッセイについては、使用したＰＣＲ反応条件は９５℃の融解温度にて６０秒間；９５℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間及び７２℃にて３０秒間の熱サイクルを２５〜３０回、並びに７２℃にて６０秒間の伸長である。
【０１４７】
これらのアッセイでは、ＴＲＩＺｏｌを用いてマウスの腫瘍から全ＲＮＡを単離する。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アイオワ州、コーラルビル）から入手した標的特異的なプローブ及びプライマーを用いて定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行った。ＥＶＩ１及びβ−アクチンのｍＲＮＡについてのプライマー及びリポーターは、ＣｌｏｎｅＭａｎａｇｅｒプログラム（Ｓｃｉ−Ｅｄソフトウエア）を用いて設計し、正行及び逆行のプライマーの配列は以下に述べられる。ＰＣＲ鋳型のｃＤＮＡはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＶｅｒｓｏ  ｃＤＮＡ合成キットを用いて調製した。全ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを用いて、核酸濃度の３対数範囲にわたる試料濃度と増幅動態直線性の関係を実証することによってｑＰＣＲの試薬すべての有効性を確認する。Ｔａｑｍａｎユニバーサルマーカーミックス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）をＰＣＲ反応に用い、ＡＢＩプリズム７９００配列検出器を用いて増幅データを回収し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州、カールスバット）からの配列検出システムソフトウエア（ＳＤＳＶ２．０）を用いて解析する。特に述べない限り、ｍＲＮＡの存在量は、β−アクチンに対する標準化ΔＣＴ＝ＣＴ標的−ＣＴβ−アクチンによって算出し、未処理の腫瘍細胞におけるｍＲＮＡの存在量に対して測定する（ΔΔＣＴ＝ΔＣＴＥＶＩＲＮＡΔＴｓｉＧｉｏ）。
【０１４８】
癌細胞におけるＥＶＩ１のｍＲＮＡの存在量をβ−アクチンに対して標準化し、ＨＦＣ細胞に対して測定する。ＱＰＣＲの結果についての統計的な解析はＳｉｇｍａ  Ｓｔａｔのマン／ウィットニー順位和解析関数を用いて実施した。
【０１４９】
【表３】
2014504150.tif 000004
【０１５０】
５’−ＲＬＭ−ＲＡＣＥ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの改変を伴ったＧｅｎｅｒａｃｅｒマニュアルに従って、５’−ＲＬＭ−ＲＡＣＥを実施する。Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（５単位）を用いて、２〜８μｇの全ＲＮＡを２５０ｎｇのＧｅｎｅＲａｃｅｒＲＮＡアダプタ（５’−ＣＧＡＣＵＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＵＧＡＣＡＵＧＧＡＣＵＧＡＡＧＧＡＧＵＡＧＡＡＡ−３’）（配列番号６４）に３７℃にて１時間、直接連結した。フェノール抽出及びエタノール沈殿の後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＥＶＩ１遺伝子特異的な逆転写プライマー（５’−ＴＡＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＧＧＧＴＴＴＣＣ−３’）（配列番号６１）を用いて５５℃にて４５分間、逆転写し、その後、７０℃にて不活化した。Ｇｅｎｅｒａｃｅｒ５’プライマー（５’−ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ−３’）（配列番号６６）及びＥＶＩ１遺伝子特異的な逆転写プライマー（５’−ＴＡＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＧＧＧＴＴＴＣＣ−３’）（配列番号６１）を用いて５’−ＲＬＭ−ＲＡＣＥ−ＰＣＲを実施する。９５℃にて３分間（１サイクル）、９５℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間、７２℃にて１分間（４０サイクル）、７２℃にて１０分間（１サイクル）のＰＣＲ条件を用いて、ＡＢＩプリズム７９００配列検出器を用いてＰＣＲを行い、ＡＢＩからの配列検出システムソフトウエア（ＳＤＳＶ２．０）を用いて解析する。
【０１５１】
次いで、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ネスト化プライマー（５’−ＧＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＡ−３’）（配列番号６６）及びＥＶＩ１遺伝子特異的なネスト化プライマー（５’−ＴＡＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＧＧＧＴＴＴＣＣ−３’）（配列番号６１）を用いてネスト化ＰＣＲの２回目を行う。２％アガロースゲル上でＰＣＲ産物を流し、１μｇ／μｌ−１の臭化エチジウムで染色する。ＰＣＲ産物をゲルから切り出し、直接配列決定してＲＡＣＥバンドの同一性を確認する。細胞培養ＲＡＣＥ実験については、リポフェクトアミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２０ｎＭのＥＶＩ１のｓｉＲＮＡによって５００，０００個のＨＴ−１４４黒色腫細胞に形質移入する。形質移入の４８時間後、前述にようにＰＬＭ−ＲＡＣＥのためにＲＮＡを抽出する。
【０１５２】
ウエスタンブロット：マウス腫瘍（８０ｎｇ／レーン）からのタンパク質調製物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、常法によって免疫ブロットを行う。Ｌ１ＣＡＭの免疫ブロットにはＯＶＣＡＲ３細胞株を陽性対照として使用する。ビスクロロインドリルリン酸／ニトロブルーテトラゾリウム基質システムにおいてヤギ抗ヒト受容体（１／５０）、アルカリホスファターゼ（１／２０００）結合のウサギ抗ヤギを用いて免疫ブロットを行う。６０００ｄ．ｐ．ｉ．の解像度でＥｐｓｏｎスキャナーを用いてＬ１ＣＡＭについて濃度測定領域を得、ＭａｃＢＡＳｖ２．０定量ソフトウエア（コネチカット州、スタンフォードのＦｕｊｉ社）によってデータを解析する。試験ｓｉＲＮＡ分子としてＥＶＩ１を用いて、ＣＴＤを含有する各ペプチドを記載したように調べる。
【０１５３】
本明細書で引用された特許、特許出願、科学論文及びその他の情報源はすべて、本出願にてその全体が明白に述べられているかのように参照によって本明細書に明白に組み入れられる。
【０１５４】
前述の開示は特定の特別な実施形態を強調しており、それと同等の改変又は変更は添付のクレームで述べられるような本発明の精神及び範囲の中にあることが理解されるべきである。
【０１５５】
【表４】
2014504150.tif 000005
【０１５６】
【表５】
2014504150.tif 000006
【０１５７】
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２４．  Ｂａｅ，  Ｙ，  Ｂｕｒｅｓｈ，  ＲＡ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，  ＴＰ，  Ｃｈｅｎ  Ｔ−ＨＨ，  ａｎｄ  Ｆｕｒｇｅｓｏｎ，  ＤＹ．  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  
ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｎａｎｏｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉｃ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＨＳＰ９０  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ．  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００７  １２２：  １６−２３．  
２５．  Ｌｅｅ，  Ｓ．  Ｍ．；  Ｌｅｅ，  Ｅ．  Ｊ．；  Ｈｏｎｇ，  Ｈ．  Ｙ．；  Ｋｗｏｎ，  Ｍ．  Ｋ．；  Ｋｗｏｎ，  Ｔ．  Ｈ．；  Ｃｈｏｉ，  Ｊ．  Ｙ．；  Ｐａｒｋ，  Ｒ．  Ｗ．；  Ｋｗｏｎ，  Ｔ．  Ｇ．；  Ｙｏｏ，  Ｅ．  Ｓ．；  Ｙｏｏｎ，  Ｇ．  Ｓ．；  Ｋｉｍ，  Ｉ．  Ｓ．；  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，  Ｅ．；  Ｌｅｅ，  Ｂ．  Ｈ．  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｕｒｉｎｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．  Ｍｏｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００７，  ５，  １１−９．  
２６．  Ｓｈｕｋｌａ，  Ｇ．  Ｓ．；  Ｋｒａｇ，  Ｄ．  Ｎ．  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ｏｎ  ｆｒｅｓｈｌｙ  ｅｘｃｉｓｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ．  Ｏｎｃｏｌ．  Ｒｅｐ．  ２００５，  １３，  ７５７−６４．  ｃｅｌｌｓ．  
２７．  Ｂｅｄｉ，  Ｄ．，  Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ，  Ｔ．，  Ｆａｇｂｏｈｕｍ，  Ｏ．Ａ．，  Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，  Ｊ．Ｗ．，  Ｄｅｉｎｎｏｃｅｎｔｅｓ，  Ｐ．，  Ｂｉｒｄ，  Ｒ．Ｃ．，  Ｂｏｏｋｂｉｎｄｅｒ，  Ｌ．，  Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，  Ｖ．Ｐ．，  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｅｎｋｏ，  Ｖ．Ａ．  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｉｎｔｏ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｐｈａｇｅ−ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  （２０１１）  
２８．  Ｈｉｂｉｎｏ  Ｓ，  Ｓｈｉｂｕｙａ  Ｍ，  Ｅｎｇｂｒｉｎｇ  ＪＡ，  Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ  Ｍ，  Ｎｏｍｉｚｕ  Ｍ，  Ｋｌｅｉｎｍａｎ  ＨＫ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｌａｍｉｎｉｎ  ａｌｐｈａ５  ｃｈａｉｎ  ｇｌｏｂｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ＣＤ４４  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４；６４：４８１０−４８１６．  
２９．  Ｚｈａｎｇ，  Ｙ．；  Ｃｈｅｎ，  Ｊ．；  Ｈｕ，  Ｚ．；  Ｈｕ，  Ｄ．；  Ｐａｎ，  Ｙ．；  Ｏｕ，  Ｓ．；  Ｌｉｕ，  Ｇ．；  Ｙｉｎ，  Ｘ．；  Ｚｈａｏ，  Ｊ．；  Ｒｅｎ，  Ｌ．；  Ｗａｎｇ，  Ｊ．  Ｐａｎｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｌｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｙ．  Ｊ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ２００７  ，１２，  ４２９−４３５．  
３０．  Ｋｅｌｌｙ，  Ｋ．  Ａ．；  Ｊｏｎｅｓ，  Ｄ．  Ａ．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｌｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ２００３，  ５，  ４３７−４４．  
３１．  Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ  ＭＤ，  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  Ｅ．  Ｃｅｌｌ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｃａｎ  ｂｅ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅｄ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  １９８４；３０９：３０−３３．  
３２．  Ｄｕ，  Ｂ．；  Ｑｉａｎ，  Ｍ．；  Ｚｈｏｕ，  Ｚ．；  Ｗａｎｇ，  Ｐ．；  Ｗａｎｇ，  Ｌ．；  Ｚｈａｎｇ，  Ｘ．；  Ｗｕ，  Ｍ．；  Ｚｈａｎｇ，  Ｐ．；  Ｍｅｉ，  Ｂ．  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐａｎｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｏ  ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｙ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００６，  ３４２，  ９５６−６２．  
３３．  Ｉｗａｍｏｔｏ  Ｙ，  Ｒｏｂｅｙ  ＦＡ，  Ｇｒａｆ  Ｊ，  Ｓａｓａｋｉ  Ｍ，  Ｋｌｅｉｎｍａｎ  ＨＫ，  Ｙａｍａｄａ  Ｙ，  Ｍａｒｔｉｎ  ＧＲ．  ＹＩＧＳＲ，  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｐｅｎｔａｐｅｐｔｉｄｅ，  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  
１９８７；２３８：  １１３２−１１３４．  
３４．  Ｏｙａｍａ，  Ｔ．；  Ｓｙｋｅｓ，  Ｋ．  Ｆ．；  Ｓａｍｌｉ，  Ｋ．  Ｎ．；  Ｍｉｎｎａ，  Ｊ．  Ｄ．；  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，  Ｓ．  Ａ．；  Ｂｒｏｗｎ，  Ｋ．  Ｃ．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｒａｎｄｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｙ：  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．  ２００３，  ２０２，  ２１９−２３０．  
３５．  Ｈｏｆｆｍａｎ，  Ｊ．  Ａ．；  Ｇｉｒａｕｄｏ，  Ｅ．；  Ｓｉｎｇｈ，  Ｍ．；  Ｚｈａｎｇ，  Ｌ．；  Ｉｎｏｕｅ，  Ｍ．；Ｐｏｒｋｋａ，  Ｋ．；  Ｈａｎａｈａｎ，  Ｄ．；  
Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，  Ｅ．  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００３，  ４，  ３８３−３９１．  
３６．  Ｚｈａｎｇ，  Ｊ．；  Ｓｐｒｉｎｇ，  Ｈ．；  Ｓｃｈｗａｂ，  Ｍ．  Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ−  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｒａｎｄｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  ２００１，  １７１，  １５３−１６４．  
３７．  Ｓｉｌｌｅｔｔｉ，  Ｓ．；  Ｍａｉ，  Ｆ．；  Ｓｈｅｐｐａｒｄ，  Ｄ．；  Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，  Ａ．Ｍ．  Ｐ．  Ｐｌａｓｍｉｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｉｂａｓｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＬＩ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  （ＣＡＭ）  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  
ｈｏｍｏｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０００，  １４９，  １４８５−１５０１．  ３８．  Ａｉｎａ，  Ｏ．  Ｈ；  Ｍａｒｉｋ，  Ｊ．；  Ｇａｎｄｏｕｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ，  Ｒ．；  Ｌａｍ，  Ｋ．  Ｓ．  Ｎｅａｒ−Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｎｏｖｅｌ  ａｌｐｈａ３  −Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，  Ｍｏｌ．  Ｉｍａｇｉｎｇ  ２００５，  ４，  ４３９−４４７．  
３９．  Ｊｏｙｃｅ，  Ｊ．  Ａ．；  Ｌａａｋｋｏｎｅｎ，  Ｐ．；  Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ，  Ｍ．；  Ｂｅｒｇｅｒｓ，  Ｇ．；  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，  Ｅ．；  Ｈａｎａｈａｎ，  Ｄ．  Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００３，  ４，  ３９３−４０３．  
４０．  Ｒｏｍａｎｏｖ，  Ｖ．  Ｉ．；  Ｄｕｒａｎｄ，  Ｄ．  Ｂ．；  Ｐｅｔｒｅｎｋｏ，  Ｖ．  Ａ．  Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｈａｔ  ａｆｆｅｃｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ．  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２００１，  ４７，  ２３９−２５１．  
４１．  Ｎｅｗｔｏｎ．  Ｊ．Ｒ．；  Ｋｅｌｌｙ，  Ｋ．Ａ．；  Ｍａｈｍｏｏｄ，  Ｕ．；  Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ，  Ｒ．；  Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，  Ｓ．Ｌ．．  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈａｇｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ＰＣ−３  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ．  ８，  ７７２  −７８０．  
４２．  ＤｅＲｏｏｃｋ，  Ｉ．  Ｂ．；  Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，  Ｍ．  Ｅ．；  Ｓｒｏｋａ，  Ｔ．  Ｃ；  Ｌａｍ，  Ｋ．  Ｓ．；  Ｂｏｗｄｅｎ，  Ｇ．  Ｔ．；  Ｂａｉｒ，  Ｅ．  Ｌ．；  Ｃｒｅｓｓ，  Ａ．  Ｅ．  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００１，６１，  ３３０８−３３１３．  
４３．  Ｓｒｏｋａ，  Ｔ．  Ｃ；  Ｍａｒｉｋ，  Ｊ．；  Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，  Ｍ．  Ｅ．；  Ｌａｍ，  Ｋ．  Ｓ．；  Ｃｒｅｓｓ，  Ａ．  Ｅ．  Ｔｈｅ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｔｏ  ｂｌｏｃｋ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２００６，  ５，１５５６−１５６２．  
【図４】
2014504150.tif 000007
【図１】
2014504150.tif 000008
【図２】
2014504150.tif 000009
【図３】
2014504150.tif 000010
【図５】
2014504150.tif 000011
【図６】
2014504150.tif 000012
【配列表】
2014504150000001.app
【国際調査報告】
2014504150.tif 000013
2014504150.tif 000014
2014504150.tif 000015
2014504150.tif 000016
2014504150.tif 000017