(57)【要約】  プレキシンＢ２が介在するアンギオジェニン活性を阻害する新規な組成物及び方法が本明細書に開示される。かかる組成物および方法は、例えば、がん治療、滲出型ＡＭＤの治療及び血管形成の阻害のために有用である。試験薬剤がプレキシンＢ２活性の変調剤であるかどうかを決定する方法も本明細書に開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プレキシンＢ２のＡＮＧ結合エピトープと特異的に結合し、該ＡＮＧ結合エピトープは配列番号１、２又は３のアミノ酸配列を有する、単離抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項１に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である、請求項１に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
完全長免疫グロブリン分子と、ｓｃＦｖと、Ｆａｂ断片と、Ｆａｂ’断片と、Ｆ（ａｂ’）２断片と、Ｆｖと、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）と、ジスルフィド結合で連結されたＦｖとからなる群から選択される、請求項１に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
約１０−７Ｍ以下の解離定数でプレキシンＢ２と結合する、請求項１に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
アンギオジェニンのプレキシンＢ２への結合を阻害する、請求項１に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
被検者のがんを治療する方法であって、請求項１に記載の単離抗体又はその抗原結合断片の治療上有効量を該被検者に投与するステップを含む、方法。
【請求項８】
前記がんは、前立腺がん又は脳のがんである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記がんは膠芽細胞腫である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
被検者の血管形成を阻害する方法であって、請求項１に記載の単離抗体又はその抗原結合断片の治療上有効量を該被検者に投与するステップを含む、方法。
【請求項１１】
前記被検者はがんを罹患している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記被検者は滲出型加齢性黄斑変性症（滲出型ＡＭＤ）を罹患している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
被検者の滲出型ＡＭＤを治療する方法であって、請求項１に記載の単離抗体又はその抗原結合断片の治療上有効量を該被検者に投与するステップを含む、方法。
【請求項１４】
アンギオジェニンと結合する、配列番号１、２又は３のアミノ酸配列を含む単離可溶性ポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号４の連続するアミノ酸５０個以下を含む、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
約１０−７Ｍ以下の解離定数でアンギオジェニンと結合する、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記抗体又はその抗原結合断片はアンギオジェニンのプレキシンＢ２への結合を阻害する、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
被検者のがんを治療する方法であって、請求項１４に記載のポリペプチドの治療上有効量を該被検者に投与するステップを含む、方法。
【請求項２０】
前記がんは前立腺がん又は脳のがんである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記がんは膠芽細胞腫である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
被検者の血管形成を阻害する方法であって、請求項１４に記載のポリペプチドの治療上有効量を該被検者に投与するステップを含む、方法。
【請求項２３】
前記被検者はがんを罹患している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記被検者は滲出型加齢性黄斑変性症（滲出型ＡＭＤ）を罹患している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
被検者の滲出型ＡＭＤを治療する方法であって、請求項１４に記載のポリペプチドの治療上有効量を該被検者に投与するステップを含む、方法。
【請求項２６】
被検者の前立腺がんを治療する方法であって、プレキシンＢ２の拮抗剤の治療上有効量を該被検者に投与するステップを含む、方法。
【請求項２７】
前記プレキシンＢ２の拮抗剤はアンギオジェニンのプレキシンＢ２への結合を阻害する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記プレキシンＢ２の拮抗剤はプレキシンＢ２と特異的に結合する抗体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記プレキシンＢ２の拮抗剤はプレキシンＢ２のｍＲＮＡに特異的な干渉核酸である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
被検者の血管形成を阻害する方法であって、プレキシンＢ２の拮抗剤の治療上有効量を該被検者に投与するステップを含む、方法。
【請求項３１】
前記プレキシンＢ２の拮抗剤はアンギオジェニンのプレキシンＢ２への結合を阻害する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記プレキシンＢ２の拮抗剤はプレキシンＢ２と特異的に結合する抗体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記プレキシンＢ２の拮抗剤はプレキシンＢ２タンパク質発現を阻害する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記被検者はがんを罹患している、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記がんは前立腺がん又は脳のがんである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記被検者は滲出型ＡＭＤを罹患している、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
被検者の滲出型ＡＭＤを治療する方法であって、プレキシンＢ２の拮抗剤の治療上有効量を該被検者に投与するステップを含む、方法。
【請求項３８】
前記プレキシンＢ２の拮抗剤はアンギオジェニンのプレキシンＢ２への結合を阻害する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記プレキシンＢ２の拮抗剤はプレキシンＢ２と特異的に結合する抗体である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記プレキシンＢ２の拮抗剤はプレキシンＢ２のｍＲＮＡに特異的な干渉核酸である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
ａ）プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片と、ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片と、試験薬剤とを含む試験反応混合物を形成すること、
ｂ）前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片と、前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片との間の複合体形成につながる条件下で前記試験反応混合物をインキュベーションすること、及び
ｃ）前記反応混合物中の前記複合体の量を測定すること、
を含み、
対照の反応混合物中の前記複合体の量と比較して、前記試験反応混合物中の前記複合体の量を減少させる試験薬剤はプレキシンＢ２活性の阻害剤である、
試験薬剤がプレキシンＢ２活性の阻害剤であるかどうかを決定する方法。
【請求項４２】
前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片は、配列番号１、２及び３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片は、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記試験薬剤は、抗体、タンパク質、ペプチド又は低分子物質である、請求項４１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４５】
前記対照反応混合物は、該対照反応混合物が試験薬剤を含まないことを除いて、前記試験反応混合物と実質的に同一である、請求項４１〜４４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４６】
前記対照反応混合物は、該対照反応混合物が試験薬剤のかわりにプラセボ薬剤を含むことを除いて、前記試験反応混合物と実質的に同一である、請求項４１〜４４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４７】
前記試験反応混合物は、前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片と、前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片とを含む混合物に、前記試験薬剤を添加することによって形成される、請求項４１〜４６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４８】
前記試験反応混合物は、前記試験薬剤と、前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片とを含む混合物に、前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片を添加することによって形成される、請求項４１〜４６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４９】
前記試験反応混合物は、前記試験薬剤と、前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片とを含む混合物に、前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片を添加することによって形成される、請求項４１〜４６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５０】
前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片は、前記試験反応混合物中の固体支持体に繋止される、請求項４１〜４９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５１】
繋止された前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片に前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片が結合することにつながる条件下で前記試験反応混合物がインキュベーションされる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片に結合しないＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片から、前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片に結合するＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片を単離するステップをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片に結合するＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片の量を検出することにより前記試験反応混合物中の複合体の量が測定される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片は、検出可能な原子団に連結される、請求項５０〜５３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５５】
前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片は、前記試験反応混合物中の固体支持体に繋止される、請求項４１〜４９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５６】
繋止された前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片に前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片が結合するのにつながる条件下で前記試験反応混合物がインキュベーションされる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片に結合しないプレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片から、前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片に結合するプレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片を単離するステップをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片に結合するプレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片の量を検出することにより前記試験反応混合物中の複合体の量が測定される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片は検出可能な原子団に連結される、請求項５５〜５８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６０】
前記試験薬剤は試験薬剤のライブラリのメンバーである、請求項４１〜５９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６１】
ａ）プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片と、ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片と、試験薬剤とを含む試験反応混合物を形成すること、
ｂ）前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片と、前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片との間の複合体形成につながる条件下で前記試験反応混合物をインキュベーションすること、
ｃ）前記試験反応混合物中の前記複合体の量を測定すること、
を含み、
対照の反応混合物中の複合体の量と比較して、前記試験反応混合物中の複合体の量を増大させる試験薬剤がプレキシンＢ２活性の増強剤である、
試験薬剤がプレキシンＢ２活性の増強剤であるかどうかを決定する方法。
【請求項６２】
前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片は、配列番号１、２及び３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片は、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項６１又は６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記試験薬剤は、抗体、タンパク質、ペプチド又は低分子物質である、請求項６１〜６３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６５】
前記対照反応混合物は、該対照反応混合物が試験薬剤を含まないことを除いて、前記試験反応混合物と実質的に同一である、請求項６１〜６４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６６】
前記対照反応混合物は、該対照反応混合物が試験薬剤のかわりにプラセボ薬剤を含むことを除いて、前記試験反応混合物と実質的に同一である、請求項６１〜６４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６７】
前記試験反応混合物は、前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片と、前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片とを含む混合物に、前記試験薬剤を添加することによって形成される、請求項６１〜６６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６８】
前記試験反応混合物は、前記試験薬剤と、前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片とを含む混合物に、前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片を添加することによって形成される、請求項６１〜６６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６９】
前記試験反応混合物は、前記試験薬剤と、前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片とを含む混合物に、前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片を添加することによって形成される、請求項６１〜６６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７０】
前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片は、前記試験反応混合物中の固体支持体に繋止される、請求項６１〜６９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７１】
繋止された前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片に前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片が結合することにつながる条件下で前記試験反応混合物がインキュベーションされる、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片に結合しないＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片から、前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片に結合するＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片を単離するステップをさらに含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片に結合するＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片の量を検出することにより前記試験反応混合物中の複合体の量が測定される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片は、検出可能な原子団に連結される、請求項７０〜７３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７５】
前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片は、前記試験反応混合物中の固体支持体に繋止される、請求項６１−６９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７６】
繋止された前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片に前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片が結合するのにつながる条件下で前記試験反応混合物がインキュベーションされる、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片に結合しないプレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片から、前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片に結合するプレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片を単離するステップをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片に結合するプレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片の量を検出することにより前記試験反応混合物中の複合体の量が測定される、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片は検出可能な原子団に連結される、請求項７５〜７８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８０】
前記試験薬剤は試験薬剤のライブラリのメンバーである、請求項６１〜７９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８１】
ａ）配列番号１、２又は３からなる群から選択される配列を有するエピトープを含むポリペプチドを試験薬剤に接触させること、及び
ｂ）前記試験薬剤が前記エピトープに結合するかどうかを決定することを含み、
前記エピトープに結合する試験薬剤はプレキシンＢ２活性の阻害剤である、
試験薬剤がプレキシンＢ２活性の阻害剤であるかどうかを決定する方法。
【請求項８２】
前記試験薬剤は、抗体、タンパク質、ペプチド又は低分子物質である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記ポリペプチドは固体支持体に付着している、請求項８１又は８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記エピトープに結合しない試験薬剤から前記エピトープに結合する試験薬剤を単離するステップをさらに含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記試験薬剤は検出可能な原子団に連結される、請求項８３又は８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記試験薬剤は固体支持体に付着している、請求項８１又は８２に記載の方法。
【請求項８７】
前記試験薬剤に結合しないポリペプチドから前記試験薬剤に結合するポリペプチドを単離するステップをさらに含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記ポリペプチドは検出可能な原子団に連結される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記試験薬剤は、試験薬剤のライブラリのメンバーである、請求項８１〜８８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本件出願は、２０１１年３月２８日出願の米国仮出願第６１／４６８，２７１号と、２０１１年１０月６日出願の米国仮出願第６１／５４３，９９２号とに基づく優先権を主張する。いずれの出願の内容も引用によりその全体が本明細書に取り込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明はプレキシンＢ２活性の変調剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、米国国立衛生研究所グラントＣＡ１０５２３１による米国政府の支援で完成された。米国政府は本発明につき一定の権利を有する。
【０００４】
小さい分泌タンパク質であるアンギオジェニン（以下、「ＡＮＧ」という。）は、さまざまな腫瘍の確立、成長及び転移への関与が疑われてきた血管形成の強力な誘導剤である。そのためＡＮＧ活性の阻害は、がんと、滲出型加齢黄斑変性（以下、「ＡＭＤ」という。）のようなその他の血管形成関連疾患との治療のための魅力的な治療戦略である。しかし、血管形成及びがんの両方におけるＡＮＧの重要な役割にもかかわらず、アンギオジェニンに結合してその血管形成活性及び腫瘍促進活性に介在するレセプターは不明のままである。ＡＮＧレセプターの同定及び特徴づけは、がん治療と、ＡＮＧ介在性血管形成の阻害との新規治療標的を提供するであろう。
【０００５】
そこで、ＡＮＧ活性の阻害、血管形成防止及びがん治療のための新規な組成物及び方法を開発するために、ＡＮＧレセプターを同定及び特徴づけすることには大変な必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書で実証されるとおり、プレキシンＢ２は、ＡＮＧの血管形成及びがん促進活性を介在するＡＮＧレセプターである。また本明細書に説明されるのは、ＡＮＧ結合に寄与するプレキシンＢ２エピトープである。したがって、プレキシンＢ２へのＡＮＧの結合の阻害剤（例えば、抗プレキシンＢ２抗体）を含む、プレキシンＢ２拮抗薬は、例えば、がん（例えば、前立腺がん又は脳のがん）の治療と、血管形成阻害と、血管形成関連疾患（例えば滲出型ＡＭＤ）の治療とに有用である。
【０００７】
一部の実施態様では本発明は、ＡＮＧ結合に寄与するプレキシンＢ２エピトープと特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片に関する。例えば一部の実施態様では、前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１、２又は３のアミノ酸配列を有するプレキシンＢ２のエピトープと結合する。一部の実施態様では前記抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である。一部の実施態様では前記抗体又はその抗原結合断片は、完全長免疫グロブリン分子か、ｓｃＦｖか、Ｆａｂ断片か、Ｆａｂ’断片か、Ｆ（ａｂ’）２か、Ｆｖか、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）か、ジスルフィド結合連結Ｆｖかである。一部の実施態様では前記抗体又はその抗原結合断片は、約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ又は１０−９Ｍ以下の解離定数でプレキシンＢ２と結合する。一部の実施態様では前記抗体又はその抗原結合断片は、ＡＮＧのプレキシンＢ２との結合、及び／又は、プレキシンＢ２発現細胞のＡＮＧ誘導性増殖を阻害する。
【０００８】
一部の実施態様では本発明は、配列番号１、２及び／又は３のアミノ酸配列を含む、ＡＮＧと結合する単離可溶性ポリペプチドに関する。一部の実施態様では前記ポリペプチドは、配列番号４の連続するアミノ酸２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００個以下を含む。一部の実施態様では前記ポリペプチドは、免疫グロブリン定常ドメイン（例えばヒト免疫グロブリン定常ドメイン）をも含む。一部の実施態様では前記ポリペプチドは、約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ又は１０−９Ｍ以下の解離定数でＡＮＧと結合する。一部の実施態様では前記ポリペプチドは、プレキシンＢ２発現細胞のＡＮＧ誘導性増殖を阻害する。
【０００９】
一部の実施態様では本発明は、抗体か、その抗原結合断片か、前記説明のポリペプチドかを含む医薬組成物に関する。
【００１０】
一部の実施態様では本発明は、がん（前立腺がん又は脳のがんを含む）がんの治療、血管形成の阻害、及び／又は、滲出型ＡＭＤの治療を被験者（例えばこれらを必要とする被験者）行う方法であって、該被験者に、抗体か、その抗原結合断片か、前記説明のポリペプチドかの治療上有効量を投与するステップを含む、方法に関する。
【００１１】
一部の実施態様では本発明は、プレキシンＢ２発現細胞のＡＮＧ誘導性増殖を阻害する方法であって、抗体か、その抗原結合断片か、前記説明のポリペプチドかに前記細胞を接触させることを含む、方法に関する。
【００１２】
一部の実施態様では本発明は、前記説明の抗体を産生させる方法であって、哺乳類（例えばマウス）に配列番号１、２及び／又は３のアミノ酸配列を含むポリペプチド（例えば可溶性ポリペプチド）を投与することを含む、方法に関する。一部の実施態様では前記ポリペプチドは、配列番号４の連続するアミノ酸２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００個以下を含む。一部の実施態様では、前記哺乳類はヒト免疫グロブリン可変領域を有する。
【００１３】
一部の実施態様では本発明は、前記説明の抗原又はその抗原結合断片を同定する方法であって、配列番号１、２及び／又は３のアミノ酸配列を含むポリペプチドに前記説明の抗体又はその抗原結合断片を接触させることを含む、方法に関する。一部の実施態様では、前記抗体又はその抗原結合断片は、抗体又はその抗原結合断片のライブラリの一部である。
【００１４】
一部の実施態様では本発明は、前立腺がんの治療、血管形成の阻害、及び／又は、滲出型ＡＭＤの治療を被験者（例えばこれらを必要とする被験者）に行う方法であって、プレキシンＢ２拮抗薬（例えば、抗体又はその抗原結合断片か、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡのような干渉核酸か、低分子物質か）の治療上有効量を前記被験者に投与するステップを含む、方法に関する。一部の実施態様では前記プレキシンＢ２拮抗薬は、ＡＮＧのプレキシンＢ２への結合か、プレキシンＢ２が介在するＡＮＧの核内移行かを阻害する。一部の実施態様では、前記プレキシンＢ２拮抗薬はプレキシンＢ２のタンパク質発現を阻害する。
【００１５】
一部の実施態様では本発明は、前記説明の抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコード化する単離核酸に関する。一部の実施態様では前記単離核酸は、ベクターか、細胞（例えば、前記説明の抗体又はその抗原結合断片を発現する細胞）かに含まれる。
【００１６】
一部の実施態様では本発明は、前記説明の抗体、その抗原結合断片、ポリペプチド及び／又は医薬組成物を含むキットに関する。
【００１７】
一部の実施態様では本発明は、試験薬剤がプレキシンＢ２活性の変調剤（例えば、阻害剤又は増強剤）かどうかを決定する方法に関する。一部の実施態様では前記方法は、プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片と、ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片と、試験薬剤とを含む試験反応混合物を作成することを含む。一部の実施態様では前記方法は、前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片と、ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片との間で複合体が形成されることにつながる条件下で、前記試験反応混合物をインキュベーションするステップを含む。一部の実施態様では前記方法は、前記試験反応混合物中の前記複合体の量を測定するステップを含む。一部の実施態様では、対照反応混合物中の前記複合体の量と比較して前記試験反応混合物中の前記複合体の量を減少させる試験薬剤は、プレキシンＢ２活性の阻害剤である。一部の実施態様では、前記試験反応混合物中の前記複合体の量を測定するステップを含む。一部の実施態様では、対照反応混合物中の前記複合体の量と比較して前記試験反応混合物中の前記複合体の量を増大させる試験薬剤は、プレキシンＢ２活性の増強剤である。
【００１８】
一部の実施態様では、前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片は、配列番号１、２及び３からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施態様では、前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
一部の実施態様では前記試験薬剤は、抗体、タンパク質、ペプチド又は低分子物質である。一部の実施態様では、前記試験薬剤は試験薬剤のライブラリのメンバーである。
【００２０】
一部の実施態様では前記対照反応混合物は、該対照反応混合物は試験薬剤を含まないことを除いて、前記試験反応混合物と実質的に同一である。一部の実施態様では前記対照反応混合物は、該対照反応混合物が試験薬剤のかわりにプラセボ剤を含むことを除いて、前記試験反応混合物と実質的に同一である。
【００２１】
一部の実施態様では前記試験反応混合物は、前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片と、前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片とを含む混合液に前記試験薬剤を添加することにより作成される。一部の実施態様では前記試験反応混合物は、前記試験薬剤と、前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片とを含む混合液に、前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片を添加することにより作成される。一部の実施態様では前記試験反応混合物は、前記試験薬剤と、前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片とを含む混合液に、前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片を添加することにより作成される。
【００２２】
一部の実施態様では、前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はＡＮＧ結合断片は、前記試験反応混合物中の固体支持体に繋止される。一部の実施態様では前記試験薬剤は、前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片と、前記繋止されたプレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片との結合につながる条件下でインキュベーションされる。一部の実施態様では前記方法は、前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片に結合していないＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片から、前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はＡＮＧ結合断片に結合しているＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片を単離するステップを含む。一部の実施態様では、前記試験反応混合物中の複合体の量は、前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片に結合しているＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片の量を検出することにより測定される。一部の実施態様では、前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片は、検出可能な原子団（例えば、蛍光原子団、発光原子団、放射性原子団等）に（例えば直接的か間接的かのいずれかで結合して）連結される。
【００２３】
一部の実施態様では、前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片は、前記試験反応混合物中の固体支持体に繋止される。一部の実施態様では、前記試験反応混合物は、前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片と、前記繋止されたＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片との結合につながる条件下でインキュベーションされる。一部の実施態様では前記方法は、前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片と結合していないプレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片から、前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片と結合しているプレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片を単離するステップをも含む。一部の実施態様では、前記試験反応混合物中の複合体の量は、前記ＡＮＧポリペプチド又はそのプレキシンＢ２結合断片と結合しているプレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片の量を検出することにより測定される。一部の実施態様では、前記プレキシンＢ２ポリペプチド又はそのＡＮＧ結合断片は、検出可能な原子団に連結される。
【００２４】
一部の実施態様では本発明は、試験薬剤が、プレキシンＢ２活性の阻害剤かどうかを決定する方法であって、配列番号１、２又は３からなるグループから選択される配列を有するエピトープを含むポリペプチドを試験薬剤に接触させること、及び、前記試験薬剤が前記エピトープに結合するかどうかを決定することを含み、前記エピトープに結合する試験薬剤はプレキシンＢ２活性の阻害剤である、方法に関する。一部の実施態様では前記試験薬剤は、抗体、タンパク質、ペプチド又は低分子物質である。一部の実施態様では、前記試験薬剤は、試験薬剤のライブラリのメンバーである。
【００２５】
一部の実施態様では、前記ポリペプチドが固体支持体に付着している。一部の実施態様では、前記方法は、前記エピトープに結合していない試験薬剤から、前記エピトープに結合している試験薬剤を単離するステップも含む。一部の実施態様では、前記試験薬剤は検出可能な原子団に連結される。
【００２６】
一部の実施態様では、前記試験薬剤が固体支持体に付着している。一部の実施態様では、前記方法は、前記試験薬剤に結合していないポリペプチドから前記試験薬剤に結合しているポリペプチドを単離するステップをも含む。一部の実施態様では、前記ポリペプチドは検出可能な原子団に連結される。一部の実施態様では、前記ポリペプチドは検出可能な原子団に連結される。一部の実施態様では、前記試験薬剤は試験薬剤のライブラリのメンバーである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】（配列番号１、２及び３としてそれぞれ同定される）プレキシンＢ２のＡＮＧ結合エピトープ３個のアミノ酸配列。
【図２】ヒトプレキシンＢ２のアミノ酸配列（配列番号４）。
【図３】ヒトＡＮＧのアミノ酸配列（配列番号５）。
【図４】内皮細胞でのＡＮＧの核内移行は細胞密度依存性があることを示す実験結果。（Ａ）ＨＵＶＥ細胞は本図に表示された密度で培養され、０．１μｇ／ｍＬのＡＮＧとともに２時間インキュベーションされた。核内ＡＮＧは、抗ＡＮＧモノクローナル抗体２６−２Ｆと、Ａｌｅｘａ４８８標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体とにより検出された。（Ｂ）１２５Ｉ−ＡＮＧの核内移行。１２５Ｉ−ＡＮＧが、異なる密度で培養されたＨＵＶＥ細胞とともに２時間インキュベーションされた。核内分画が単離され、１２５Ｉ−ＡＮＧの量はガンマカウンターにより測定された。（Ｃ）ＨＵＶＥ細胞が本図に表示された密度で培養され、１μｇ／ｍＬのＡＮＧとともに４８時間インキュベーションされた。細胞数はコールターカウンターにより測定された。
【図５】ＬＮＣａＰ細胞へのＡＮＧの効果を示す実験結果。（Ａ）ＨＵＶＥ及びＬＮＣａＰ細胞が本図に表示された密度で培養され、０．１μｇ／ｍＬのＡＮＧとともに２時間インキュベーションされた。核内ＡＮＧは、２６−２Ｆ及びＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体を用いる間接蛍光法により検出された。（Ｂ）ＬＮＣａＰ細胞がフェノールレッド不含チャコール／デキストラン処理（ステロイド不含）ＦＢＳ中で２日間培養され、ＤＨＴ（１０ｎＭ）か、ＡＮＧ（０．１μｇ／ｍＬ）か、これら２種類の物質の混合物かで本図に表示された時間刺激された。（Ｃ）用量依存性。ＡＮＧが前記細胞に添加され、４日間培養された。細胞数はコールターカウンターを用いて測定された。
【図６】ＡＮＧのＬＮＣａＰ細胞への結合を示す実験結果。（Ａ）サブコンフルエントなＬＮＣａＰ細胞が１２５Ｉ−ＡＮＧとともに４℃で３０分間インキュベーションされ、結合したＡＮＧはガンマカウンターにより測定された。（Ｂ）（Ａ）に説明される実験で得られた結果のスキャチャードプロット。
【図７】プレキシンＢ２がＡＮＧ結合分子であることを示す実験結果。（Ａ）総数２．５×１０８個のＬＮＣａＰ細胞由来の細胞膜が調製され、可溶化され、ＲＮａｓｅＡ−セファロースカラムを通過させて非特異的タンパク質が除去された。前記ＲＮａｓｅＡカラムからの素通り分画は、３等分され、非アフィニティセファロースカラムと、ＡＮＧ−セファロースカラムと、０．１ｍｇの遊離ＡＮＧとともにインキュベーションされた後のＡＮＧ−セファロースとにそれぞれ装架された。結合した物質は低ｐＨバッファーで溶出され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された。（Ｂ）左側のパネルの真ん中のレーンのバンドが切り出され、トリプシン分解されて、ペプチドの分子量の質量分析測定に供された。合計１６本のペプチドがプレキシンＢ２と適合することが示された。（Ｃ）プレキシンＢ２は、ヤギ抗ヒトプレキシンＢ２抗体（サンタ・クルーズ、ｓｃ３４５０７、５μｇ／ｍＬ）を用いる免疫蛍光法により検出され、核はＤＡＰＩで染色された（中央のパネル）。（Ｄ）Ｆｌａｇタグが付いた（Ｃ末端）ＡＮＧがＬＮＣａＰ細胞の可溶化細胞膜とともに室温３０分間インキュベーションされた。ＡＮＧ−プレキシンＢ２複合体は抗ＡＮＧモノクローナル抗体２６−２Ｆ又は抗ＦｌａｇＩｇＧにより免疫沈降され、抗プレキシンＢ２ＩｇＧにより検出された（上のパネル）。別の実験では、前記複合体は抗プレキシンＢ２ＩｇＧで沈降され、抗ＡＮＧポリクローナル抗体Ｒ１１３で検出された（下のパネル）。
【図８】プレキシンＢ２特異的ｓｉＲＮＡがＬＮＣａＰ細胞におけるＡＮＧの核移行を阻害することを示す実験結果。ＬＮＣａＰ細胞は、最終濃度６０ｎＭの対照ｓｉＲＮＡ又はプレキシンＢ２特異的ｓｉＲＮＡ（サンタ・クルーズ）でトランスフェクションされた。（Ａ）対照及びｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞内でのプレキシンＢ２ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析（トランスフェクション後４８時間）。（Ｂ）プレキシンＢ２タンパク質のウェスタンブロッティング法による検出（トランスフェクション後７２時間）。（Ｃ−Ｈ）ＬＮＣａＰ細胞は、リポフェクタミン２０００存在下、対照及びプレキシンＢ２ｓｉＲＮＡで７２時間トランスフェクションされ、その後、１μｇ／ｍＬのＡＮＧとともに２時間インキュベーションされた。ＡＮＧは免疫蛍光法により検出され（Ｃ及びＦ）、核はＤＡＰＩで染色された（Ｄ及びＧ）。合成画像はＥ及びＨに示された。
【図９】ＨｅＬａ、ＬＮＣａＰ、ＨＵＶＥ及びＣＯＳ−７細胞でのプレキシンＢ２発現を示す実験結果。（Ａ）本図に表示された密度で培養されたＨｅＬａ、ＬＮＣａＰ及びＨＵＶＥ細胞でのプレキシンＢ２ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析。（Ｂ）完全長ヒトプレキシンＢ２ｃＤＮＡがｐＣＩ−Ｎｅｏベクターにクローン化され、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションされた。安定的トランスフェクタントが選択され、ＲＴ−ＰＣＲ法によりヒト（外来遺伝子）及びサル（内在）プレキシンＢ２ｍＲＮＡについて解析された。（Ｃ）サルタンパク質も認識するヤギ抗ヒトプレキシンＢ２抗体を用いるプレキシンＢ２タンパク質のウェスタンブロッティング解析。
【図１０】プレキシンＢ２ｃＤＮＡをトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞内でのＡＮＧの核移行を示す実験結果。ベクター（Ａ−Ｃ）と、プレキシンＢ２（Ｄ−Ｆ）とでトランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞が１μｇ／ｍＬのＡＮＧと２時間インキュベーションされた。ＡＮＧは免疫蛍光法で検出された（Ａ及びＤ）。核はＤＡＰＩで染色された（Ｂ及びＥ）。合成画像はＣ及びＦに示される。（Ｇ）ベクター及びプレキシンＢ２のトランスフェクタントが本図に表示された濃度のＡＮＧと２時間インキュベーションされた。細胞は溶解され、細胞溶解物（タンパク質６０μｇ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、リン酸化ＡＫＴ及び全ＡＫＴについてそれぞれの抗体を用いるウェスタン解析とに供された。
【図１１】プレキシンＢ２がトランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞内でのＡＮＧの核内移行をネオマイシンが阻害することを示す実験結果。プレキシンＢ２トランスフェクタントは本図に表示された濃度のネオマイシンで１０分間処理され、その後、１μｇ／ｍＬのＡＮＧと２時間インキュベーションされた。ＡＮＧが免疫蛍光法で検出された（上段のパネル）。核がＤＡＰＩで染色された（中段のパネル）。合成画像が下段のパネルに示された。
【図１２】ＡＮＧ結合ドメインを同定する実験結果。（Ａ）野生型プレキシンＢ２及び欠失突然変異体の遺伝子構造。（Ｂ）さまざまなプレキシンＢ２のＣＯＳ−７細胞トランスフェクタントにおけるＡＮＧの核内移行。野生型プレキシンＢ２ｃＤＮＡか、異なる欠失突然変異体かのｐＣＩ−Ｎｅｏベクターコンストラクトが作成され、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションされた。前記トランスフェクタントは１μｇ／ｍＬのＡＮＧと２分間インキュベーションされた。ＡＮＧは免疫蛍光法で検出された（上段のパネル）。核はＤＡＰＩで染色された（中段のパネル）。合成画像は下段のパネルに示された。代表的なＡＮＧ核内染色像は矢印で表された。
【図１３】抗プレキシンＢ２抗体がＡＮＧ活性を阻害することを示す実験結果。（Ａ）抗プレキシンＢ２抗体はＬＮＣａＰ細胞でのＡＮＧの核内移行を阻害する。（Ｂ）抗プレキシンＢ２抗体は、ＨＵＶＥＣ管形成アッセイにおけるＡＮＧ誘導性血管形成を阻害する。（Ｃ）抗プレキシンＢ２抗体はＡＮＧ誘導性ＬＮＣａＰ細胞増殖を阻害する。
【図１４】前立腺がんでのプレキシンＢ２発現を増強する実験結果。（Ａ）ヒト前立腺がん（上２段）、ＢＰＨ（下２段）及び正常前立腺（右）の組織におけるプレキシンＢ２のＩＨＣ染色像。（Ｂ）正常及び前立腺がんサンプルでのヒトプレキシンＢ２染色の強拡大像。（Ｃ及びＤ）野生型（ＷＴ）及びＭＰＡＫＴマウス由来前立腺でのマウスプレキシンＢ２のＩＨＣ及びＩＦ染色。
【図１５−１】増強された抗プレキシンＢ２抗体はマウスにおける腫瘍増殖を阻害することを示す実験結果。（Ａ）６０μｇ／マウス１匹のプレキシンＢ２ポリクローナル抗体又はＰＢＳ対照を連日皮下注射で治療された、ＰＣ−３細胞腫瘍を移植された無胸腺マウスの無増悪生存率を示すグラフ。（Ｂ）（Ａ）で説明されたＰＣ−３細胞腫瘍を移植された無胸腺マウスの腫瘍の大きさを示すグラフ。
【図１５−２】増強された抗プレキシンＢ２抗体はマウスにおける腫瘍増殖を阻害することを示す実験結果。（Ｃ）（Ａ）で説明されたＰＣ−３細胞腫瘍を移植された無胸腺マウスの写真。（Ｄ）（Ａ）で説明されたＰＣ−３細胞腫瘍を移植された無胸腺マウスから切除された腫瘍の写真。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
概説
本明細書に開示されるのは、がんの治療と、血管形成の阻害と、滲出型ＡＭＤのような血管形成関連疾患の治療とのための新規組成物及び方法である。
【００２９】
アンギオジェニン（ＡＮＧ）は腫瘍の確立、成長及び転移に関与が疑われている血管形成の重要なメディエーターである。残念ながら、ＡＮＧの血管形成活性及び腫瘍促進活性の阻害に基づく治療法の開発は、ＡＮＧレセプターがこれまで不明という事実により妨げられてきた。
【００３０】
本明細書に開示されるとおり本発明の発明者は、プレキシンＢ２が、ＡＮＧの血管形成効果及び腫瘍促進効果を介在するＡＮＧレセプターであることを発見した。本明細書に開示されるとおり本発明の発明者は、ＡＮＧが前記プレキシンＢ２レセプターに結合する部位を同定し、これらの結合部位に特異的な抗プレキシンＢ２抗体は、プレキシンＢ２／ＡＮＧ相互作用の阻害と、ＡＮＧ活性の阻害とを行うことができることを実証した。
【００３１】
したがって一部の実施態様では、本発明は、プレキシンＢ２阻害を通じてＡＮＧ関連疾患（例えばがん又は滲出性ＡＭＤ）の治療のための組成物及び／又は方法に関する。一部の実施態様ではプレキシンＢ２を阻害する組成物は、例えば、ＡＮＧ又はプレキシンＢ２に結合する抗体、その抗原結合断片又はポリペプチドを含む。ＡＮＧのプレキシンＢ２への結合を阻害する薬剤は、例えば、プレキシンＢ２のＡＮＧ結合エピトープ（例えば、配列番号１、２及び／又は３のアミノ酸配列を含むエピトープ）と結合する抗体又はその抗原結合断片と、ＡＮＧと結合するポリペプチド（例えば、配列番号１、２及び／又は３のアミノ酸配列を含むポリペプチド）とを含む。
【００３２】
定義
便宜上、本明細書、実施例及び請求の範囲で用いられる一部の用語がここに集められる。
【００３３】
本明細書に用いられる用語「投与する（administering）は、医薬用薬剤又は組成物を被験者に提供することを意味し、医療専門職による投与と、自己投与とを含むが、これらに限定されない。かかる薬剤は、例えば、本明細書に説明される、抗体か、その抗原結合断片か、ポリペプチドかのようなプレキシンＢ２拮抗剤を含む場合がある。
【００３４】
用語「薬剤」は、化合物、低分子物質、化合物の混合物及び／又は（核酸、抗体、抗体断片、タンパク質又はペプチドのような）生体高分子を意味するように本明細書では用いられる。薬剤は、本明細書で以下に説明されるスクリーニングアッセイにより特定の活性を有するものとして同定される場合がある。かかる薬剤の活性は、被験者の体内で局所的又は全身的に作用する、生物学的、生理学的又は薬理学的に活性のある（単数又は複数の）物質である、「治療用薬剤」として前記薬剤が適するようにする場合がある。
【００３５】
「アミノ酸」という用語は、アミノ官能基及び酸官能基の両方を含み、天然アミノ酸のポリマーに含まれる場合がある、天然又は合成のいずれを問わず、全ての分子を含むことを意図する。代表的なアミノ酸は、天然アミノ酸と、その類縁体、誘導体及び同族体と、変形側鎖を有するアミノ酸類縁体と、以上のいずれかの全ての立体異性体とを含む。
【００３６】
本明細書で用いられる用語「抗体」は、無傷な抗体と、その抗原結合断片との両方を指す場合がある。無傷な抗体とは、ジスルフィド結合で連結される少なくとも２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記される。）と、重鎖定常領域とを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬと略記される。）と、軽鎖定常領域とを含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域と、これを挟むフレームワーク領域と呼ばれるより保存性が高い領域とに分けられる。ＶＨ及びＶＬ領域のそれぞれは、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列する３個のＣＤＲ及び４個のＦＲでできている。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系のさまざまな細胞（例えば、エフェクター細胞）と、古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）とを含む宿主組織又は因子と、免疫グロブリンとの結合に介在する場合がある。用語「抗体」は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）、単鎖抗体及び抗原結合抗体断片を含む。本明細書で用いられるところの「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的に含まれない抗体を指す。しかし、単離抗体は、他の関連抗原に対するなんらかの交差反応性を有する場合がある。
【００３７】
本明細書で用いられる用語である、抗体「抗原結合断片」及び「抗原結合部」は、抗原に結合する能力を保持する抗体の１種類以上の断片を指す。抗体の「抗原結合断片」という用語に含まれる結合断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦＶ、ｓｃＦＶ、Ｆｄ、低分子二重特異性抗体（diabodies）、単鎖抗体、ＮＡＮＯＢＯＤＩＥＳ（登録商標）、単離ＣＤＲＨ３その他の、無傷な抗体の可変領域の少なくとも一部を保持する抗体断片を含む。これらの抗体断片は、従来の組換え技術及び／又は酵素技術を用いて取得することができ、無傷の抗体と同じやり方で抗原結合についてスクリーニングできる。
【００３８】
「ＣＤＲ」及びその複数形である「ＣＤＲｓ」という用語は、抗体又は抗体断片の相補性決定領域（ＣＤＲ）を指し、これは抗体又は抗体断片の結合特性を決定する。多くの場合、３個のＣＤＲｓ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）が軽鎖可変領域に存在し、３個のＣＤＲｓ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）が重鎖可変領域に存在する。ＣＤＲｓは、抗体分子の機能活性に寄与し、足場又はフレームワーク領域を含むアミノ酸配列から分離される。さまざまなＣＤＲｓのなかでも、ＣＤＲ３配列、特にＣＤＲＨ３は、一番多様性が高く、そのため、抗体特異性に最も強力に寄与する。ＣＤＲｓを決定するために少なくとも以下の２種類の技術がある。（１）種を超えた配列多様性に基づくアプローチ（すなわち、引用にその全体が取り込まれる、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. (1987))と、（２）抗原―抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（引用にその全体が取り込まれる、Chothiaら、Nature, 342:877 (1989)）とである。
【００３９】
用語「エピトープ」は、抗体との特異的結合が可能なタンパク質のデターミナントを意味する。エピトープは、アミノ酸又は糖側鎖のような、化学的に活性のある分子表面の原子団からなるのが通常である。一部のエピトープは、配列番号１、２及び３に提供される配列のような、抗体が結合できる特定のアミノ酸配列によって規定できる。
【００４０】
本明細書で用いられる用語「ヒト化抗体」とは、ヒト以外の哺乳類由来の少なくとも１個のCDRと、ヒト抗体のＦＲ領域及び定常領域とを有する抗体を指す。ヒト化抗体は、人体における前記ヒト化抗体の抗原性は低下するので、本発明の治療用薬剤の有効成分として有用である。
【００４１】
用語「単離ポリペプチド」は、一部の実施態様では、組換えＤＮＡ又はＲＮＡから調製されるか、人工合成されるか、これらのなんらかの組合せかのポリペプチドであって、（１）自然界で通常存在するタンパク質とは会合していないか、（２）正常に存在する細胞から単離されるか、（３）同じ細胞出所源由来の他のタンパク質を含まないように単離されるか、（４）異なる生物種由来の細胞で発現されるか、あるいは、（５）自然界に存在しないかであるポリペプチドを指す。
【００４２】
用語「単離核酸」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は人工合成由来か、これらのなんらかの組合せかのポリヌクレオチドであって、（１）自然界で前記「単離核酸」が存在する細胞とは会合していないか、（２）自然界では連結されないポリペプチドと操作可能に連結されているかである、ポリヌクレオチドを指す。
【００４３】
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」は、同一エピトープに特異的に結合する実質的に均一な抗体集団から得られる抗体を指す、すなわち、前記集団を構成する個々の抗体が、微量存在するかもしれない天然に存在する突然変異が存在しうることを除いて同一である。修飾語の「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという当該抗体の特徴を示し、なんらかの特定の方法によって当該抗体を製造することが必要であると解するべきではない。
【００４４】
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、交換可能なように用いられる。これらの用語は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのいずれかか、これらの類縁体かの、いずれかの長さのヌクレオチドのポリマー形状を指す。ポリヌクレオチドは、なんらかの３次元構造を有する場合があり、既知又は未知のいずれかの機能を果たす場合がある。以下は限定的でないポリヌクレオチドの例である。遺伝子又は遺伝子断片のコーディング領域又は非コーディング領域と、連関解析により定義される（単数又は複数の）遺伝子座と、エキソンと、イントロンと、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、トランスファーＲＮＡと、リボソームＲＮＡと、ｃＤＮＡと、組換えポリヌクレオチドと、分岐型ポリヌクレオチドと、プラスミドと、ベクターと、いずれかの長さの単離ＤＮＡと、いずれかの長さの単離ＲＮＡと、核酸プローブと、プライマーと。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類縁体のような修飾ヌクレオチドを含む場合がある。存在する場合には、前記ヌクレオチド構造の修飾が、ポリマーの集合前後で除去される場合がある。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分により分断される場合がある。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーションのようにさらなる修飾を施される場合がある。「組換え」ポリヌクレオチドという用語は、自然界に存在しないか、自然界に存在しない配置で他のポリヌクレオチドと連結されるかのいずれかである、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、半合成又は合成のポリヌクレオチドを意味する。
【００４５】
本明細書で用いられるところの文言「薬学的に受容可能な担体」は、問題の化合物をある器官又は身体の一部から別の器官又は身体の一部へ搬送又は輸送することに関与する、液体又は固体賦形剤（solid filler）、希釈剤、添加剤又は溶媒のような、薬学的に受容可能な材料、組成物又は賦形剤（vehicle）、溶媒内封材（solvent encapsulating material）を意味する。
【００４６】
本明細書で用いられるところの「特異的結合」とは、抗体が所定の抗原に結合できることか、ポリペプチドがその所定の結合パートナーに結合できることかを指す。典型的には、ある抗体又はポリペプチドは、約１０−７Ｍ以下のＫＤに相当する親和性でその所定の抗原又は結合パートナーに特異的に結合し、非特異的かつ無関係な抗原／結合パートナー（例えばＢＳＡ、カゼイン）に結合するときの親和性より、少なくとも１０倍低いか、少なくとも１００倍低いか、少なくとも１０００倍低い（ＫＤで表される）親和性で前記所定の抗原／結合パートナーと結合する。
【００４７】
本明細書で用いられる用語「被験者」は、処置又は治療のために選ばれた人間か、人間以外の動物かを意味する。
【００４８】
本明細書で用いられる文言「治療上有効量」及び「有効量」は、いずれかの医学的処置に適用可能な合理的な利益／リスク比で、被験者の細胞の少なくともサブ集団に所望の治療効果をあげるのに有効な薬剤の量を意味する。
【００４９】
被験者の疾患を「治療する」、あるいは、疾患を有する被験者を「治療する」とは、該疾患の少なくとも１つの徴候が軽減するか、増悪を防止するために、例えば薬物の投与のような薬学的処置を被験者に施すことを指す。
【００５０】
抗プレキシンＢ２抗体
一部の実施態様では本発明は、プレキシンＢ２と特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片と、その使用とに関する。一部の実施態様では前記抗体は、配列番号１、２及び／又は３のアミノ酸配列を有するプレキシンＢ２のエピトープに結合し、ＡＮＧがプレキシンＢ２に結合するのを阻害できる。かかる抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の場合があり、例えば、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全なヒト抗体の場合がある。
【００５１】
ポリクローナル抗体は、適当な被験者（例えばマウス）をポリペプチド免疫原（例えば配列番号１、２及び／又は３の配列を有するポリペプチド）で免疫することにより調製される場合がある。免疫された前記被験者でのポリペプチド抗体力価は、不動化されたポリペプチドを用いる酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）のような標準的な技術により経時的に監視される場合がある。希望する場合には、前記抗原に向けられた抗体は、前記哺乳類から（例えば、血液から）単離され、ＩｇＧ画分を得るために、プロテインＡクロマトグラフィーのような周知技術によりさらに精製される場合がある。
【００５２】
免疫化後適当な時間経過後、例えば、前記抗体力価が最高のとき、抗体産生細胞が前記被験者から得られ、Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497により初めて説明された（Brown et al. (1981) J. Immunol. 127:539-46、Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83、Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. 76:2927-31及びYeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75をも参照せよ。)ハイブリドーマ法か、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72）か、ＥＢＶハイブリドーマ法（Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）か、トリオーマ（trioma）法かのような標準的な技術を用いてモノクローナル抗体を調製するのに用いられる場合がある。モノクローナル抗体ハイブリドーマを作成する技術は周知である（一般的には、Kenneth, R. H. in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980)、Lerner, E. A. (1981) Yale J. Biol. Med. 54:387 402、Gefter, M. L. et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:231 36を参照せよ。）。簡潔には、不死化細胞株（典型的にはミエローマ）が、上記説明のとおり免疫原で免疫化された哺乳類由来のリンパ球（典型的には脾臓細胞）と融合され、得られたハイブリドーマ細胞の上清が、前記ポリペプチド抗原と結合するモノクローナル抗体、好ましくは、特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定するためにスクリーニングされる。
【００５３】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製する代替策として、プレキシンＢ２、及び／又は、配列番号１の配列を有するポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリ（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリ又は抗体イーストディスプレイライブラリ）を、適当なポリペプチド（例えば、配列番号１の配列を有するポリペプチド）でスクリーニングすることにより同定及び単離される場合がある。
【００５４】
また、キメラ抗体又はヒト化抗体のような、プレキシンＢ２及び／又は、配列番号１の配列を有するポリペプチドに特異的組換え抗体は、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作成することができる。かかるキメラ抗体及びヒト化抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号及び第５，５６５，３３２号の各明細書、Better et al. (1988) Science 240:1041-1043、Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443、Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526、Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:214-218、Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005、Wood et al. (1985) Nature 314:446-449及びShaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559、Morrison,  S. L. (1985) Science 229:1202-1207、Oi et al. (1986) Biotechniques 4:214、Winter U.S. Patent 5,225,539、Jones et al. (1986) Nature 321:552-525、Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534及びBeidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060に説明される方法を用いる組換えＤＮＡ技術により作成することができる。
【００５５】
プレキシンＢ２、及び／又は、配列番号１、２及び／又は３の配列を有するポリペプチドに特異的なヒトモノクローナル抗体は、マウスの免疫系ではなくヒトの免疫系の一部を遺伝するトランスジェニックマウス又はトランスクロモゾームマウスを用いて作成することができる。例えば、再構成されたヒト重鎖（μ及びγ鎖）及びκ軽鎖の免疫グロブリン配列をコード化するヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座と、内在性のμ及びκ鎖遺伝子材を不活性化させる標的化突然変異とを含む「ＨｕＭＡｂマウス」（Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856 859）がある。したがって、前記マウスはマウスＩｇＭ又はκの発現が低下し、免疫化に反応して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖の外来遺伝子がクラススイッチ及び体細胞突然変異を起こして高親和性のヒトＩｇＧκモノクローナル抗体を生成する（上記Lonberg, N. et al. (1994)、Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49 101、Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65 93及び Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y Acad. Sci 764:536 546に総説。）ＨｕＭの調製は、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287 6295、Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647 656、Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:3720 3724、Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117 123、Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821 830、Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912 2920、Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474): 856 859、Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49 101、Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579 591、Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65 93、Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536 546、Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845 851に説明される。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，７８９，６５０号、第５，８７７，３９７号、第５，６６１，０１６号、第５，８１４，３１８号、第５，８７４，２９９号、第５，７７０，４２９号及び第５，５４５，８０７号の各明細書を参照せよ。
【００５６】
一部の実施態様では、本発明の抗体は、配列番号１、２及び／又は３のアミノ酸配列を有するプレキシンＢ２のエピトープと、１０−６、１０−７、１０−８又は１０−９Ｍ以下の解離定数で結合できる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロッティング法及びＲＩＡ法を含む、前記抗体の結合能を評価するための標準的なアッセイが当業者に知られている。前記抗体の結合速度論（例えば、結合親和性）は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）解析のような当業者に知られた標準的なアッセイにより評価することができる。一部の実施態様では、前記抗体のプレキシンＢ２との結合は、ＡＮＧのプレキシンＢ２結合能を実質的に阻害する。過剰なポリペプチドがリガンドに結合しているレセプターの数を（試験管内競合結合アッセイ測定で）少なくとも約２０％、４０％、６０％又は８０％、８５％又は９０％低下させるとき、本明細書では、ある抗体はＡＮＧのプレキシンＢ２との結合を実質的に阻害するとする。
【００５７】
可溶性プレキシンＢ２レセプターポリペプチド
一部の実施態様では本発明は、プレキシンＢ２のＡＮＧ結合エピトープを含む（すなわち、配列番号１、２及び／又は３のアミノ酸配列を含む）単離ポリペプチドに関する。かかるポリペプチドは、例えば、ＡＮＧのプレキシンＢ２結合を阻害し、プレキシンＢ２のＡＮＧ結合エピトープと特異的に結合する抗体の同定及び／又は精製をするのに有用な場合がある。一部の実施態様では本発明のポリペプチドはプレキシンＢ２ではない。一部の実施態様では、本発明のポリペプチドは、天然のプレキシンＢ２タンパク質（例えば、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質）の連続するアミノ酸１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５又は２０個以下を含む。一部の実施態様では本発明のポリペプチドは配列番号１、２又は３からなる。一部の実施態様では本発明のポリペプチドは、配列番号４に列挙されるプレキシンＢ２アミノ酸配列の第１６５−４４１番目のアミノ酸を含む。
【００５８】
一部の実施態様では本発明のポリペプチドはＡＮＧに結合できる。一部の実施態様では前記ポリペプチドは、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ又は１０−９Ｍ以下の解離定数でＡＮＧと結合する。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロッティング法及びＲＩＡを含む、前記ポリペプチドの結合能を評価する標準的なアッセイは当業者に知られており、適切なアッセイが実施例に説明される。前記ポリペプチドの結合速度論（例えば結合親和性）は、Ｂｉａｃｏｒｅ解析のような当業者に知られた標準的なアッセイによっても評価できる。一部の実施態様では前記ポリペプチドのＡＮＧへの結合は、ＡＮＧのプレキシンＢ２結合能を実質的に阻害する。本明細書でもちいられるところでは、あるポリペプチドがＡＮＧのプレキシンＢ２接着を実質的に阻害するのは、（試験管内競合結合アッセイ測定で）過剰のポリペプチドがリガンドと結合しているレセプターの数を少なくとも約２０％、４０％、６０％又は８０％、８５％又は９０％低下させるときである。
【００５９】
一部の実施態様では、本発明のポリペプチドは、標準的なタンパク質精製技術を用いる適切な精製計画により、細胞又は組織の出所源から単離することができる。別の実施態様では、本発明のポリペプチドは組換えＤＮＡ技術により作成される。代替的には、本発明のポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用いて化学的に合成することができる。
【００６０】
一部の実施態様では本発明のポリペプチドは、配列番号１、２及び／又は３と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。したがって別の実施態様では、本発明のポリペプチドは、配列番号１、２及び／又は３と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％以上の同一性があるアミノ酸配列を含む。一部の実施態様では前記ポリペプチドは、配列番号４の第１６５−４４１番目のアミノ酸と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の同一性があるアミノ酸配列を含む。
【００６１】
一部の実施態様では本発明のポリペプチドは、１カ所以上（例えば、１，２、３、４、５、６、７、８、９、１０カ所又はそれ以上）の保存的配列修飾を除いて、配列番号１、２及び／又は３と同一のアミノ酸配列を含む。本明細書で用いられる用語「保存的配列修飾」とは、前記アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響又は変更しないアミノ酸修飾を指す意図である。かかる保存的修飾は、アミノ酸の置換、追加及び欠失を含む。修飾は、部位特異的突然変異生成法及びＰＣＲを介する突然変異生成法のような当業者に知られた標準的な技術によって抗体に導入される場合がある。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されるアミノ酸置換をいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは本発明の技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐型側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって本明細書で説明される前記ポリペプチドの１種類以上のアミノ酸残基が、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置換される場合があり、変えられた抗体は、本明細書に説明される機能的アッセイを用いて機能を保持していることについてテストされる場合がある。
【００６２】
２本のアミノ酸配列又は２本の核酸配列の同一性の百分率を決定するためには、前記配列は、最適な比較目的のために（例えば、最適なアライメントのために第１及び第２のアミノ酸配列又は第１及び第２の核酸配列の一方又は両方にギャップが導入される場合があり、比較の目的で同一性のない配列は無視される場合がある）アライメントがとられる。対応するアミノ酸の位置又は核酸の位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第１の配列での位置を第２の配列の対応する位置で同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドが占めているとき、前記分子はその位置で同一であるという。前記２本の配列の間の同一性の百分率は、前記２本の配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した前記配列が共有する同じ位置の数の関数である。
【００６３】
本発明はキメラタンパク質又は融合タンパク質も提供する。本明細書で用いられる「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」とは、自然界では連結されない別のポリペプチドに連結された本発明のポリペプチド（例えば、配列番号１、２及び／又は３を含む）をいう。例えば、前記別のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に直接ペプチド結合で融合されたり、間接的に化学的リンカーを介して融合されたりのいずれかの場合がある。一部の実施態様では本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、ヒトＩｇＧ定常ドメインのようなＩｇＧ定常ドメイン）に連結される。
【００６４】
本発明のキメラポリペプチド又は融合ポリペプチドは、標準的な組換えＤＮＡ技術で作成できる。例えば、ライゲーション用の平滑末端又は突出末端、適切な末端を用意するための制限酵素消化、付着末端を適切な埋め込み、望ましくない結合を避けるためのアルカリフォスファターゼ処理、酵素的ライゲーションのような従来技術を用いることにより、例えば異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片が読み枠を合わせてライゲーションされる。別の実施態様では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来技術により合成される場合がある。代替的には、遺伝子断片のＰＣＲ増幅が、アンカープライマーを用いて２本の連続する遺伝子断片の間で相補的な突出を生成させ、その後、アニーリング及び再増幅されて、キメラ遺伝子配列を作出する（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons: 1992を参照せよ。）。さらに、既に融合原子団をコード化する発現ベクターが多数商業的に入手可能である。
【００６５】
本明細書に説明されるポリペプチドは、本発明のポリペプチドの単数又は複数をコード化するポリヌクレオチドの発現により原核生物又は真核生物の宿主で産生される場合がある。代替的には、かかるペプチドは化学的方法で合成される場合がある。異種ポリペプチドの組換え宿主での発現、ポリペプチド化学合成及び試験管内翻訳の方法は、当業者に周知で、引用により本明細書にとりこまれる、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N. Y.、Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.、Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91:501、Chaiken I. M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11:255、Kaiser et al. (1989) Science 243:187、Merrifield, B. (1986) Science 232:342、Kent, S. B. H. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:957及び Offord, R. E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishingにさらなる説明がある。
【００６６】
一部の実施態様では、プレキシンＢ２ｍＲＮＡを特異的な標的とする阻害性ＲＮＡ分子（例えば、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ分子、リボザイム又は３本鎖（triplex）分子）が本発明の方法で用いられる。かかる分子は、例えば、血管形成の阻害、滲出型ＡＭＤの治療及び／又は、前立腺がんを含むがんの治療の方法で有用である。
【００６７】
本発明の阻害性ＲＮＡ分子は、細胞と接触されるか、個体に投与されるかの場合がある。代替的には、これらをコード化するコンストラクトが、細胞と接触されるが、個体に導入される。アンチセンスコンストラクト、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ干渉コンストラクト又はｓｉＲＮＡ２本鎖ＲＮＡ分子が、関心のあるタンパク質、例えばプレキシンＢ２タンパク質の発現に干渉するために用いられる場合がある。典型的には、プレキシンＢ２ｍＲＮＡ配列（例えば、配列番号４）の相補体の少なくとも１５、１７、１９又は２１個のヌクレオチドがアンチセンス分子に十分である。典型的には、標的配列の少なくとも１９、２１、２２又は２３後のヌクレオチドがＲＮＡ干渉分子には十分である。前記ＲＮＡ干渉分子は、ヌクレオチド２個の３’突出末端を有する場合がある。前記ＲＮＡ干渉分子がコンストラクトから、例えば、ヘアピン分子又は所望のプレキシンＢ２配列の逆反復から細胞内で発現される場合には、内在性の細胞機構が前記突出末端を作出するであろう。阻害性ＲＮＡ分子は、化学合成か、試験管内転写か、ＲＮａｓｅＩＩＩ又はダイサーによる長鎖ｄｓＲＮＡの消化かによって調製される場合がある。これらは、トランスフェクション、エレクトロポレーションその他の当業者に知られた方法により細胞内に導入される場合がある。Hannon, GJ, 2002, RNA Interference, Nature 418: 244-251、Bernstein E et al., 2002, The rest is silence. RNA 7: 1509-1521、Hutvagner G et al., RNAi: Nature abhors a double-strand. Curr. Opin. Genetics & Development 12:  225-232、Brummelkamp, 2002, A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296: 550-553、Lee NS, Dohjima T, Bauer G, Li H, Li M-J, Ehsani A, Salvaterra P, and Rossi J. (2002) Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nature Biotechnol. 20:500-505、Miyagishi M, and Taira K. (2002). U6-promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nature Biotechnol. 20:497-500、Paddison PJ, Caudy AA, Bernstein E, Hannon GJ, and Conklin DS. (2002). Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes & Dev. 16:948-958、Paul CP, Good PD, Winer I, and Engelke DR. (2002). Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nature Biotechnol. 20:505-508、Sui G, Soohoo C, Affar E-B, Gay F, Shi Y, Forrester WC, and Shi Y. (2002).  A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(6):5515-5520、Yu J-Y, DeRuiter SL, and Turner DL. (2002). RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):6047-6052を参照せよ。
【００６８】
アンチセンス又はＲＮＡ干渉分子は、試験管内で細胞に、あるいは、生体内で例えば腫瘍又は哺乳類の低酸素組織に送達される場合がある。当業者に知られた典型的な送達手段が用いられる場合がある。例えば、引用により全体が本明細書にとりこまれる、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０９／０３６２２３、ＰＣＴ／ＵＳ０９／０６１３８１、ＰＣＴ／ＵＳ０９／０６３９２７、ＰＣＴ／ＵＳ０９／０６３９３１及びＰＣＴ／ＵＳ０９／０６３９３３の各明細書に説明される方法及び組成物を用いて、干渉ＲＮＡは前進的に送達される場合がある。一部の実施態様では、ｓｉＲＮＡは局所的に送達される。例えば、本明細書に説明されるｓｉＲＮＡががん治療に用いられるとき、腫瘍への送達は、例えば、引用により全体が本明細書にとりこまれる、Takahashi et al., Journal of Controlled Release 116:90-95 (2006)及びKim et al., Journal of Controlled Release 129:107-116 (2008)に説明される、腫瘍内注射により達成される場合がある。代替的には、本明細書に説明される干渉ＲＮＡが滲出型ＡＭＤの治療に用いられるとき、例えば、引用により全体が本明細書にとりこまれる、Reich et al., Mol Vis., 9:210-216 (2003)に説明されるように眼に直接送達される場合がある。
【００６９】
核酸分子
本発明の別の局面は、本明細書に説明される抗体、その抗原結合断片及び／又はポリペプチドをコード化する核酸分子に関する。前記核酸は、例えば、細胞全体、細胞溶解物又は部分精製又は実質的に精製された形状で存在する場合がある。
【００７０】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学的技術を用いて得ることができる。例えば、本明細書に説明される核酸分子は、標準的なＰＣＲ技術を用いてクローン化されたり、化学合成されたりする場合がある。ハイブリドーマにより発現される抗体をコード化する核酸については、該抗体の軽鎖及び／又は重鎖をコード化するｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技術により得られる場合がある。（例えば、ファージ又はイーストのディスプレイ技術を用いる）免疫グロブリン遺伝子ライブラリから得られる抗体については、該抗体をコード化する核酸は前記ライブラリから回収できる。
【００７１】
ＶＨ及びＶＬセグメントをコード化するＤＮＡがいったん得られると、これらのＤＮＡ断片は、例えば可変領域遺伝子を、完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子又はｓｃＦＶ遺伝子に変換するために、標準的な組換えＤＮＡ技術によりさらに操作される場合がある。これらの操作では、ＶＨ又はＶＬをコード化するＤＮＡ断片が、抗体定常領域又はフレキシブルリンカーのような別のタンパク質をコード化する別のＤＮＡ断片に操作可能に連結される。この文脈で用いられる「操作可能に連結される」という用語は、前記２本のＤＮＡ断片は、該２本のＤＮＡ断片によりコード化されるアミノ酸配列の読み枠がずれないように合体されることを意味する意図である。
【００７２】
ＶＨ領域をコード化する単離ＤＮＡは、該ＶＨ領域をコード化するＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコード化する別のＤＮＡ分子と操作可能に連結することにより完全長重鎖遺伝子に変換される。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当業者に知られており（例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照せよ。）、これらの領域を含むＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅法により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤの定常領域の場合があり、最も好ましいのはＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子には、ＶＨをコード化するＤＮＡが重鎖ＣＨ１定常領域のみをコード化する別のＤＮＡ分子と操作可能に連結される場合がある。
【００７３】
ＶＬ領域をコード化する単離ＤＮＡは、該ＶＬ領域をコード化するＤＮＡを軽鎖定常領域ＣＬをコード化する別のＤＮＡ分子と装荷可能に連結される場合がある。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当業者に知られており（例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照せよ。）、これらの領域を含むＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅法により得ることができる。前記軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ定常領域の場合があるが、最も好ましいのはカッパ定常領域である。
【００７４】
一部の実施態様では本発明は、本明細書に説明される単離核酸分子を含むベクターに関する。本明細書で用いられる用語「ベクター」は、核酸分子であって、該核酸分子に連結されている別の核酸を運搬できる核酸分子を指す。１つのタイプのベクターは「プラスミド」で、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされる場合がある、環状２本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルス系ベクターで、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされる場合がある。ある種のベクター（例えば、細菌由来の複製開始点を有する細菌ベクターと、エピソーム系哺乳類ベクターとのような）は、該ベクターが導入される宿主細胞内で自律的に複製できる。その他のベクター（例えば、非エピソーム系哺乳類ベクター）は、宿主細胞内に導入されるとき該宿主細胞のゲノムにインテグレーションされて、宿主ゲノムとともに複製される場合がある。さらに、一部のベクターは遺伝子発現を制御できる。かかるベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（あるいは簡単に、「発現ベクター」）と呼ばれる。
【００７５】
一部の実施態様では本発明は、本明細書に説明される核酸（例えば、抗体、その抗原結合断片及び／又はポリペプチドをコード化する核酸分子）に関する。前記細胞は、例えば、原核生物、真核生物、哺乳類、鳥類、マウス及び／又はヒトの場合がある。一部の実施態様では、前記細胞はハイブリドーマである。一部の実施態様では本発明の核酸は、プロモーターのような転写制御エレメントと操作可能に連結される。一部の実施態様では、前記細胞は本発明の核酸を転写し、それにより、本明細書に説明される、抗体、その抗原結合断片及び／又はポリペプチドを発現する。前記核酸分子は前記細胞のゲノムにインテグレーションされるか、染色体外にとどまるかの場合がある。
【００７６】
その他のプレキシンＢ２阻害剤
本発明の一部の実施態様は、血管形成を阻害する方法、及び／又は、前立腺がん又は滲出型ＡＭＤの予防又は治療する方法に関する。これらの方法は、プレキシンＢ２の活性及び／又は発現を低下させる薬剤、及び／又は、プレキシンＢ２のＡＮＧとの結合を阻害する薬剤を投与することを含む。プレキシンＢ２の活性を変調するのに用いられる場合がある薬剤は、抗体（例えば、配列番号１、２又は３に結合する抗体）と、プレキシンＢ２に特異的な、タンパク質、ペプチド、低分子物質及び阻害性ＲＮＡ分子例えば、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００７７】
一部の実施態様では、プレキシンＢ２を変調するいかなる薬剤でも、本発明の方法を実行するために用いることができる。かかる薬剤は、本明細書に説明されるものか、当業者に知られているものか、ルーティンのスクリーニングアッセイを通じて同定されるものかの場合がある。
【００７８】
一部の実施態様では、本発明の方法に有用な薬剤を同定するのに用いられるアッセイは、プレキシンＢ２と、１種類以上のアッセイ成分との間の反応を含む。その他の成分は、試験化合物（例えば、薬剤となる可能性のある物質）か、試験化合物及びＡＮＧの組合せかのいずれかの場合がある。かかるアッセイを通じて同定される薬剤は、例えば、前立腺がん又は滲出型ＡＭＤの予防又は治療、及び／又は、血管形成の阻害に有用な場合がある。
【００７９】
本発明の方法に用いられる薬剤は、天然及び／又は合成化合物の体系的ライブラリを含む、いずれかの入手可能な出所源から得られる場合がある。薬剤は、生物学的ライブラリと、ペプトイドライブラリ（ペプチドの官能基を有するが、酵素分解耐性で生物活性のある、新規非ペプチド骨格を有する分子のライブラリ、例えばZuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678-85を参照せよ。）と、空間的にアドレス割り当て可能な（spacially addressable）平行な固相又は液相ライブラリと、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法と、「１ビーズ玉１化合物」型ライブラリ法と、アフィニティクロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ法とを含む、当業者に知られたコンビナトリアルライブラリ方法の多数のアプローチのいずれかによって得られる場合もある。前記生物学的ぅｂ及びペプトイドライブラリのアプローチは、ペプチドライブラリに限定されるが、他の４つのアプローチは、化合物のペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリ又は低分子物質ライブラリに適用可能である（Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145）。
【００８０】
分子ライブラリの合成方法の例は、例えば、DeWitt et al.  (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909、Erb et al. (1994)  Proc. Natl. Acad. Sci. USA  91:11422、Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678、Cho et al. (1993) Science 261:1303、Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059、Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061及びGallop et al. (1994) J. Med. Chem.  37:1233のような文献に見いだすことができる。
【００８１】
薬剤のライブラリは、溶液（例えば、Houghten, 1992, Biotechniques 13:412-421）、ビーズ玉（Lam, 1991, Nature 354:82-84）、チップ（Fodor, 1993, Nature 364:555-556）、細菌及び／又は胞子（Ladner, USP 5,223,409）、プラスミド（Cull et al, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869）又はファージ（Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390、Devlin, 1990, Science 249:404-406、Cwirla et al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci.  87:6378-6382、Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310、Ladner前出）に存在する場合がある。
【００８２】
本発明の方法に有用な薬剤は、例えば、プレキシンＢ２活性を変調させる候補又は試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを用いて同定される場合がある。例えば、プレキシンＢ２のＡＮＧへの結合阻害能についてスクリーニングされる場合がある。
【００８３】
プレキシンＢ２活性を変調させる化合物を同定するために用いられる前記アッセイ系の基本原理は、プレキシンＢ２及びＡＮＧを含む反応混合物をプレキシンＢ２がＡＮＧに結合できるのに十分な条件及び時間で調製することを含む。ある薬剤を変調活性について試験するためには、前記反応混合物は前記試験化合物の存在下及び非存在下で調製される。前記試験化合物は、前記反応混合物に最初から含まれる場合か、プレキシンＢ２及びＡＮＧの添加の後の時点で添加される場合かがある。対照反応混合物は、前記試験化合物なしか、プラセボとともにかでインキュベーションされる。その後、プレキシンＢ２及びＡＮＧの間のなんらかの複合体形成が検出される。対照反応で複合体が形成されるが、前記試験化合物を含む反応混合物ではかかる複合体形成が少ないか、全くないかの場合には、プレキシンＢ２及びＡＮＧの相互作用を前記化合物が干渉することが示される。
【００８４】
プレキシンＢ２のＡＮＧとの相互作用を変調させる化合物のアッセイは、不均質又は均質なフォーマットで実行される場合がある。不均質アッセイは、プレキシンＢ２又はＡＮＧのいずれかを固相上に繋止して、反応終了時に前記固相に繋止された複合体を検出することを含む。均質アッセイでは、反応全体が液相で実施される。いずれのアプローチでも、反応物質を添加する順番は、試験される化合物についての異なる情報を得るために変更される場合がある。例えば、プレキシンＢ２及びＡＮＧの間の相互作用と（例えば競合により）干渉する試験化合物は、試験物質の存在下で反応を行うことにより、すなわち、プレキシンＢ２及びＡＮＧの前か同時に該試験物質を前記反応混合物に添加することにより、同定できる。代替的には、予め形成された複合体を破壊する試験化合物、例えば、前記複合体から成分の１つを外す、より高い結合定数の化合物は、複合体が形成された後で前記反応混合物に該試験化合物を添加することにより試験できる。さまざまなフォーマットは以下に簡潔に説明される。
【００８５】
不均質アッセイ系では、プレキシンＢ２又はＡＮＧのいずれかが固体表面又はマトリックス上に繋止される一方、他方の対応する繋止されない成分は、直接的又は間接的のいずれかで標識される場合がある。実際には、マイクロタイタープレートが本アプローチにしばしば用いられる。繋止される分子種は、当業者に周知であることが典型的な、非共有結合又は共有結合のいずれかの多数の方法により固定化される場合がある。非共有結合的な付着は、しばしば単に、固体支持体をプレキシンＢ２又はＡＮＧの溶液でコーティングして乾燥させることにより達成できる。代替的には、繋止されるべきアッセイ成分に特異的な固定化抗体がこの目的のために用いられる場合がある。
【００８６】
関連するアッセイでは、アッセイ成分の一方又は両方がマトリックスに繋止できるようなドメインを添加する融合タンパク質が提供される場合がある。例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ／マーカー融合タンパク質か、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ／結合パートナーかが、グルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical、ミズーリ州、セントルイス）か、グルタチオンを誘導体化したマイクロタイタープレートかに吸着され、次に、これらが前記試験化合物と組み合わされるか、前記試験化合物と、非吸着のプレキシンＢ２又はＡＮＧのいずれかとが組み合わされるかされ、前記混合物が複合体形成につながる条件下（例えば、生理的条件下）でインキュベーションされる。インキュベーション後、前記ビーズ又はマイクロタイタープレートのウェルは、未結合のアッセイ成分を除去するために洗浄され、固相化された複合体は、例えば前記説明のとおり、直接的又は間接的のいずれかで評価される。代替的には、前記複合体は前記マトリックスから解離され、プレキシンＢ２結合又は活性のレベルが標準的な技術を用いて決定される場合がある。
【００８７】
均質アッセイは、プレキシンＢ２阻害剤を同定するためにも用いられる場合がある。これは典型的には、前記説明の反応と相似する反応で、試験化合物の存在下又は非存在下で液相で実施される。形成された複合体は、その後、未反応の成分から分離され、形成された複合体の量が決定される。不均質アッセイ系について言及したとおり、前記液相へ反応物質を添加する順番は、どの試験化合物が複合体形成を変調（阻害又は増強）し、どれが予め形成された複合体を破壊するかについての情報を引き出すことができる。
【００８８】
かかる均質アッセイでは、反応産物は、未反応のアッセイ成分から、差次的遠心、クロマトグラフィー、電気泳動及び免疫沈降を含むがこれらに限定されない多数の標準滴技術のいずれかによって分離される場合がある。差次的遠心では、分子の複合体は、これらの複合体のサイズ及び密度の違いに基づいて、複合体の沈降平衡が異なるために、一連の遠心ステップを通じて複合体を形成しない分子から分離される（例えば、Rivas, G., and Minton, A.P., Trends Biochem Sci 1993 Aug;18(8):284-7を参照せよ。）。標準的なクロマトグラフィー技術も、複合体を形成した分子を未形成の分子から分離するのに用いられる場合がある。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーは、分子をサイズに基づいて分離し、カラムのフォーマットでの適切なゲル濾過樹脂の使用を通じて、例えば、比較的大きい複合体が比較的小さい複合体を形成しない成分から分離される場合がある。同様に、複合体を形成しない分子と比較して複合体は相対的に荷電特性が異なることが、例えば、イオン交換クロマトグラフィー樹脂の使用を通じて、前記複合体を残りの個々の反応物質から差次的に分離するために活用される場合がある。かかる樹脂及びクロマトグラフィー技術は当業者に周知である（例えば、Heegaard, 1998, J Mol. Recognit. 11:141-148、Hage and Tweed, 1997, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl., 699:499-525を参照せよ。）。ゲル電気泳動も複合体分子を未結合の分子種から分離するために利用される場合がある（例えば、Ausubel et al (eds.), In: Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, New York. 1999を参照せよ。）。この技術では、タンパク質又は核酸複合体は、例えば、サイズ又は荷電に基づいて分離される。電気泳動の過程で結合相互作用を維持するために、還元剤非存在下での非変性ゲルが好ましいことが典型的であるが、具体的な相互作用物質に適する条件は、当業者に周知であろう。免疫沈降は、タンパク質−タンパク質複合体を溶液から単離するための別の一般的な技術である（例えば、Ausubel et al (eds.), In: Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, New York. 1999を参照せよ。）。この技術では、結合分子の１つに特異的な抗体と結合する全てのタンパク質は、該抗体を遠心により容易に回収可能なポリマービーズにコンジュゲートすることによって、溶液から沈澱される。前記結合したアッセイ成分は、（特異的タンパク質分解その他の前記複合体のタンパク質−タンパク質相互作用を邪魔しない当業者に周知の技術を通じて、）前記ビーズから脱離され、第２の免疫沈降ステップが実行され、今回は対応する異なる相互作用するアッセイ成分に特異的な抗体が用いられる。このやり方で、形成された複合体だけがビーズに結合したまま残るはずである。試験化合物の存在下又は非存在下での複合体形成の違いが比較でき、前記化合物がプレキシンＢ２及びＡＮＧの間の相互作用を変調する能力についての情報を提供する。
【００８９】
プレキシンＢ２発現の変調剤は、例えば、細胞が候補化合物と接触され、プレキシンＢ２ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現が測定される方法を用いて同定される場合もある。前記候補化合物の存在下でのｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルが、前記候補化合物の非存在下でのｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルと比較される。その後この比較に基づいて、前記候補化合物はプレキシンＢ２発現阻害剤として同定される場合がある。
【００９０】
医薬組成物
一部の実施態様では本発明は、組成物、例えば、本明細書で説明される少なくとも１種類の抗体か、その抗原結合断片か、ＡＮＧ結合ポリペプチドかを含む、薬学的に受容可能な担体とともに処方された医薬組成物に関する。１つの実施態様では、前記組成物は、本発明の薬剤の複数（例えば、２種類以上）の組合せを含む。
【００９１】
本発明の医薬組成物は、併用療法で、すなわち、他の薬剤との組合せで投与される場合もある。例えば、本発明の医薬組成物は、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））及びＡｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ（ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ）のような追加の血管形成阻害剤を含む場合もある。
【００９２】
以下に詳しく説明されるとおり、本発明の医薬組成物は、（１）経口投与剤、例えば、水薬（水性又は非水性の溶液又は懸濁液）、例えば、口腔内、舌下及び全身を目的とするような錠剤、ボーラス投与剤、粉末、下流、舌用ペーストか、（２）非経口投与、例えば、滅菌溶液又は懸濁液又は徐放製剤として、皮下注射、筋注、静注又は硬膜外注射による投与かに適合するものを含み、固体又は液体形状で投与するように特に処方される場合がある。
【００９３】
これらの製剤又は組成物の調製方法は、担体と、任意的に、１種類以上の補助成分とを本明細書に説明される薬剤に混合するステップを含む。一般的に、前記製剤は、液体担体か、微細に分割された固体担体か、あるいは、これらの両方かと、本明細書に説明される薬剤を均一によく混ぜ、必要な場合には、製品形状に成形することにより調製される。
【００９４】
非経口投与に適する本発明の医薬組成物は、水性又は非水性の薬学的に受容可能な滅菌等張液、散剤、懸濁液又は乳液か、糖、アルコール、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、意図する服用者の血液と等張な製剤にするための溶質又は懸濁又は増粘剤を含む場合がある、使用直前に滅菌注射溶液又は散剤に再構成される場合がある滅菌粉末かの１種類以上とともに本明細書に説明される１種類以上の薬剤を含む。
【００９５】
本発明の医薬組成物に用いられる場合がある、適当な水性又は非水性の担体の例は、水と、エタノールと、（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のような）ポリオールと、これらの適切な混合物と、オリーブ油のような植物油と、オレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルとを含む。例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用と、散剤の場合には所要の粒子径の維持と、界面活性剤の使用とにより、適切な流動性が維持される場合がある。
【００９６】
選択される投与経路にかかわらず、適当な水和形状で用いられる場合がある本発明の薬剤、及び／又は、本発明の医薬組成物は、当業者に知られた従来技術の方法により医薬として受容可能な剤形に製剤される。
【００９７】
治療方法
本明細書に開示されるのは、（例えば、前立腺がんか、膠芽細胞腫のような脳のがんかの）がんと、滲出型ＡＭＤとを含む、ＡＮＧ関連疾患の治療又は予防、及び／又は、血管形成阻害の新規治療方法である。
【００９８】
一部の実施態様では、本発明は、プレキシンＢ２発現又は活性か、ＡＮＧのプレキシンＢ２への結合かを阻害する薬剤の治療上有効量を被験者（例えば、必要とする被験者）に投与することを含む、がん性腫瘍（例えば固形腫）を含むがんの治療方法を提供する。一部の実施態様では、本発明は、血管形成を阻害する治療方法か、滲出型ＡＭＤ又はがんを含む、血管形成介在疾患の治療方法かを提供する。
【００９９】
本発明の医薬組成物は、経口経路と、例えばスプレー剤によるような経鼻経路と、経腸経路と、膣内経路と、非経口経路と、大槽内経路と、粉末、軟膏又はドロップによる、口腔内経路及び舌下経路を含む局所経路とを含む、いずれかの適切な投与経路により送達される場合がある。一部の実施態様では、前記医薬組成物は、（例えば経口又は非経口投与により）全身に送達される。一部の他の実施態様では、前記医薬組成物は、腫瘍への直接注射か、（滲出型ＡＭＤ治療の場合には）眼への直接注射かを通じて、局所的に送達される。
【０１００】
がんを治療するために用いられるとき、かかる方法は、例えば、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））及びＡｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ（ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ）を含む、１種類以上の化学療法剤及び／又は血管形成阻害剤とともに本明細書に説明される医薬組成物を投与することを含む場合がある。
【０１０１】
併用療法（conjunctive therapy）は、投与された第１薬剤の治療効果が完全に消失しないときに次の薬剤が投与されるやり方で、活性化合物の逐次、同時及び分離及び／又は共投与を行うことを含む。一部の実施態様では、第２薬剤は、第１薬剤とともに処方されるか、別の医薬組成物で処方される場合がある。
【０１０２】
一部の実施態様では本発明は、被験者（例えば、必要とする被検者）に本明細書で説明される薬剤の治療上有効量を投与することを含む、滲出型ＡＭＤの治療方法に関する。必要とする被検者は、例えば、滲出型ＡＭＤと診断されている被験者か、滲出型ＡＭＤに罹りやすい被検者か、以前の治療で治りにくかった被検者を含む、滲出型ＡＭＤの治療中の被検者かを含む場合がある。
【０１０３】
一部の実施態様では本発明は、被検者（例えば、必要とする被検者）に本明細書に説明される薬剤の治療上有効量を投与することを含む、がん性腫瘍（例えば固形腫）を含むがんの治療方法を提供する。必要とする被検者は、例えば、前がん性腫瘍、がんを含む腫瘍と診断された被験者か、以前の治療で治りにくかった被検者を含む、治療を受けている被検者かを含む場合がある。
【０１０４】
本発明の方法は、いずれのがん性又は前がん性腫瘍を治療するために用いられてもかまわない。一部の実施態様では、前記がん性腫瘍は、前立腺がん又は脳のがん（例えば、膠芽細胞腫）である。本発明の方法及び組成物によって治療される場合があるがんは、胆嚢、血液、骨、骨髄、脳、乳房、大腸、食堂、胃腸、歯肉、頭、腎臓、肝臓、肺、鼻咽喉、頸、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌又は子宮をも含むが、これらに限定されない。さらにがんは、限定されないが、具体的には以下の組織学的タイプの場合がある。新生物、悪性；癌腫；癌腫、未分化；巨細胞癌および紡錘体細胞癌；小細胞がん；乳頭状がん；扁平上皮がん；リンパ上皮がん；基底細胞がん；毛基質腫；移行上皮がん；乳頭状移行上皮がん；腺がん；ガストリノーマ、悪性；胆管がん；肝細胞がん；肝細胞がんと胆管がんの併発；索状（trabecular）腺がん；腺様嚢胞がん；腺腫様ポリープ内の腺がん；腺がん、大腸家族性ポリポーシス；充実性がん腫；類がん腫、悪性；気管支肺胞腺がん；乳頭状腺がん；色素嫌性がん；好酸性（acidophil）がん腫；好酸性がん；好塩基性がん；明細胞がん；顆粒細胞がん；濾胞状がん；乳頭状及び濾胞状がん；非被嚢性（nonencapsulating）硬化性がん腫；副腎皮質細胞がん；類内膜がん；皮膚付属器のがん；アポクリン腺がん；脂腺腺がん；耳道腺がん；粘液性類表皮がん；嚢胞腺がん；乳頭状嚢胞腺がん；乳頭状漿液性嚢胞腺がん；粘液性嚢胞腺がん；粘液性腺がん；印環細胞がん；浸潤性腺管がん；髄様がん；小葉がん；炎症性がん；パジェット病、乳房；腺房細胞がん；腺扁平上皮がん；扁平上皮化生を伴う腺がん；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫瘍、悪性；アンドロブラストーマ、悪性；セルトーリ細胞がん；ライディヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；パラガングリオーマ、悪性；乳房外パラガングリオーマ、悪性；褐色細胞腫；グロムス血管（ｇｌｏｍａｎｇｉｏ）肉腫；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑における悪性（ｍａｌｉｇ）黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；ｌｉｐｏ肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋腫；胚性横紋筋腫；胞巣状横紋筋腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽細胞腫；がん肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胚性がん腫；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛がん；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポージ肉腫；血管周囲細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞がん；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮歯牙（odonto）肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；グリオーマ、悪性；脳室上衣細胞腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽細胞腫；希乏突起グリオーマ；希乏突起神経膠芽細胞腫；未分化神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経原性腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆���細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ性；悪性リンパ腫、大細胞型、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞状；菌状息肉腫；その他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；肥満細胞性肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；及びヘアリー細胞白血病の場合がある。
【０１０５】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の用量レベルは、特定の患者、組成物及び投与モードに対する所望の治療レスポンスを該患者に有毒にならないように達成するために効果的な有効成分の量を得るために変更される場合がある。
【０１０６】
選択された用量レベルは、用いられる特定の薬剤の活性と、投与経路と、投与時間と、用いられる特定の化合物の排出又は代謝の速度と、治療期間と、用いられる特定の化合物と併用される他の薬物、化合物及び／又は材料と、治療を施される患者の年齢、性別、体重、病状、一般的な健康状態及び既往症と、医学分野で周知のこれらに類する因子とを含むさまざまな因子に依存するであろう。
【０１０７】
本分野の通常の技量を有する医師又は獣医師は、所要の医薬組成物の有効量を容易に決定し処方することができる。例えば、医師又は獣医師は、所望の治療効果を達成するために必要なレベルより低いレベルで前記医薬組成物中に用いられる本発明の化合物の用量を処方及び／又は投与して、所望の効果が達成されるまで徐々に用量を増大させるかもしれない。
【０１０８】
実施例
これまで一般的に説明されてきた本発明は、以下の実施例を参酌することにより、一層容易に理解されるであろう。以下の実施例は、本発明の一部の局面及び実施態様を例示する目的だけのために含まれるものであり、本発明をなんらかの方法で制限することを意図するものではない。
【実施例１】
【０１０９】
前立腺がん細胞ではなく内皮細胞におけるＡＮＧレセプターの細胞密度依存的発現
ＡＮＧは血管形成タンパク質として当初同定されたため、これまでの努力は内皮細胞に集中している。しかし本明細書に説明されるとおり、内皮細胞でのＡＮＧ活性は厳格に細胞密度に依存する（図４）。免疫蛍光法は、ヒト臍帯静脈内皮（ＨＵＶＥ）細胞における外来ＡＮＧの核内移行は、低密度で培養された細胞だけで起こる（図４Ａ）。核内移行は細胞密度が増大すると低下し、コンフルエント細胞では停止した。ＨＵＶＥ細胞におけるＡＮＧの細胞密度依存性核内移行は、図４Ｂに示されるとおり、１２５Ｉ標識ＡＮＧを用いて確認された。これと首尾一貫して、ＡＮＧ誘導性ＨＵＶＥ細胞増殖も細胞密度依存性であった（図４Ｃ）。内皮細胞に対するＡＮＧ活性と細胞密度との逆相関は、細胞密度が増大するとき、ＡＮＧレセプターが内皮細胞において下向き調節されることを示す。
【０１１０】
ヒトＡＮＧは、ヒト前立腺がん、特に、アンドロゲン非依存性前立腺がんにおいて上向き調節される。マウスＡＮＧは、マウス前立腺限定ＡＫＴキナーゼトランスジェニック（ＭＰＡＫＴ）マウスのＡＫＴ誘導性前立腺上皮内新生物（ＰＩＮ）組織で最も高く上向き調節される遺伝子である。ＡＮＧは前立腺がん進行において二重の役割を果たす。ＡＮＧは腫瘍血管形成に介在するだけでなく、がん細胞増殖も直接刺激する。本明細書に説明されるとおり、内皮細胞と対照的に、ＬＮＣａＰヒト前立腺がん細胞におけるＡＮＧの核内移行は細胞密度依存性ではない（図５Ａ）。正常ではＬＮＣａＰ細胞は、フェノールレッド不含ステロイド不含培地中で培養されるとき、生存するが増殖しない（図５Ｂ）。図５Ｂに示すとおり、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）はＬＮＣａＰ細胞増殖を刺激した。ＡＮＧはアンドロゲン非存在下でもＬＮＣａＰ細胞増殖を刺激し、ＡＮＧはアンドロゲン欠乏を補償できることを示した。ＡＮＧ及びＤＨＴが同時に添加されるとき、相加的又は協働的効果は観察されなかったので、ＡＮＧ及びＤＨＴはＬＮＣａＰ細胞増殖を刺激するのに同一の作用機構を共有していることを示した。図５Ｃは、ＡＮＧがＬＮＣａＰ細胞増殖を用量依存的に刺激したことを示す。これらの結果は、ＡＮＧレセプターがＬＮＣａＰ細胞で発現しており、ＡＮＧレセプターの発現は、細胞密度が増大するとき、ＬＮＣａＰ細胞で下向き調節されないことを示す。
【実施例２】
【０１１１】
ＡＮＧ結合タンパク質としてのプレキシンＢ２の同定
ＡＮＧのＬＮＣａＰ細胞との結合の熱力学は標準的な放射性レセプターアッセイにより測定された。ＡＮＧはヨウ素−１２５で標識され、ＡＮＧを発現するＬＮＣａＰ細胞と４℃でインキュベーションされた。図６Ａは、１２５Ｉ−ＡＮＧのＬＮＣａＰ細胞との結合は飽和可能であることを示す。スキャチャード解析は、見かけのＫｄが０．４５ｎＭ及び１７０ｎＭの２種類のＡＮＧ結合部位を同定した（図６Ｂ）。
【０１１２】
推定されるＡＮＧレセプターを単離するためにＡＮＧ−セファロースカラムによるアフィニティクロマトグラフィー法が用いられた。ＬＮＣａＰ細胞総数２．５×１０８個から細胞膜が調製され、可溶化され、非特異的タンパク質を除去するためにＲＮａｓｅＡ−セファロースカラムを通過させた（ＲＮａｓｅＡとＡＮＧとは全体として５６％の相同性と３５％のアミノ酸同一性がある。しかし、ＲＮａｓｅＡは血管形成能がなく、ＬＮＣａＰ細胞表面に結合しない。）。前記ＲＮａｓｅＡカラムからの素通り分画は、３等分され、非アフィニティセファロースカラムと、ＡＮＧ−セファロースカラムと、０．１ｍｇの遊離ＡＮＧとともにインキュベーションされた後のＡＮＧ−セファロースとにそれぞれ装架された。結合した物質は低ｐＨバッファーで溶出され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された。図７Ａに示すとおり、見かけの分子量〜２００ｋＤａの主要バンドがＡＮＧ−セファロースカラムから溶出された（中央のレーン）。このバンドは、非アフィニティセファロースカラムからの溶出物にはみられず（左のレーン）、サンプルが遊離ＡＮＧとプレインキュベーションされたときには量が著しく減り（右のレーン）、このバンドがＡＮＧに特異的であることを示した。
【０１１３】
このバンドがゲルから切り出され、トリプシン分解ペプチドが質量分析測定に供された。ＮＣＢＩｎｒデータベースのＭａｓｃｏｔ検索は、ヒトプレキシンＢ２のペプチドに対して合計１６個のマッチがあることを明かにした（図７Ｂ）。プレキシンＢ２は、主に神経期限の細胞で発現する細胞表面タンパク質である。プレキシンファミリーのタンパク質はセマフォリンと相互作用して、血管形成、浸潤性増殖及びアポトーシスとともに、神経遊走及びパターン形成を変調する。
【０１１４】
ＬＮＣａＰ細胞におけるプレキシンＢ２発現が免疫蛍光法により検討された。図７Ｃに示すとおり、プレキシンＢ２は主に細胞表面で検出され、プレキシンＢ２が膜貫通タンパク質であることとつじつまがあった。ＡＮＧが生体内でプレキシンＢ２と会合するかどうかを知るために、免疫共沈降実験が実施された。この目的のために、ｆｌａｇタグがＡＮＧのＣ末端に添加され、融合タンパク質が調製され、大腸菌発現系から精製された。ＡＮＧ−ＦｌａｇはＬＮＣａＰ細胞の可溶化細胞膜画分とインキュベーションされ、免疫沈降−ウェスタンブロッティング解析に供された。プレキシンＢ２は、抗ＡＮＧモノクローナル抗体及び抗Ｆｌａｇ抗体の両方で沈降できた（図７Ｄ、上のパネル）。同様に、ＡＮＧは抗プレキシンＢ２抗体によって沈降できた（図７Ｄ、下のパネル）。これらの結果が、ＡＮＧは確かにプレキシンＢ２と結合できることを確認した。
【実施例３】
【０１１５】
プレキシンＢ２はＡＮＧの核内移行に介在する
合成ｓｉＲＮＡがＬＮＣａＰ細胞におけるプレキシンＢ２発現をノックダウンするために用いられた（図８）。ノックダウン効率は、ＲＴ−ＰＣＲ（図８Ａ）及びウェスタンブロッティング（図８Ｂ）解析の両方により決定された。図８Ｃは、ＬＮＣａＰ細胞におけるＡＮＧの核内移行がプレキシンＢ２をノックダウンした細胞では阻害されることを示す（図８Ｆ）。これらの結果はプレキシンＢ２がＡＮＧの核内移行に必須であることを実証した。
【０１１６】
前記説明のとおり、ＡＮＧの核内移行は内皮細胞では細胞密度依存的であるが、がん細胞では構成的である（図４）。そこで、異なる密度で培養されたＨＵＶＥ細胞におけるプレキシンＢ２の発現レベルが検討された。図９Ａは、ＨＵＶＥ細胞が１０％コンフルエントな状態で培養されたとき、該細胞でプレキシンＢ２ｍＲＮＡが検出可能であった。発現は３０％コンフルエントな状態で培養されたとき低下し、コンフルエントな状態が６０％に達したとき発現は消失した。これに対し、ＨｅＬａ細胞及びＬＮＣａＰ細胞では、９０％コンフルエントな状態でもプレキシンＢ２ｍＲＮＡは検出可能であった（図９Ａ）。これらの結果は、プレキシンＢ２がＡＮＧの機能的レセプターであることとつじつまがあう。
【０１１７】
ＡＮＧ活性を媒介するプレキシンＢ２の機能をさらに特徴付けるために、完全長プレキシンＢ２ｃＤＮＡがｐＣＩ−ｎｅｏベクターにクローニングされ、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションされた。ベクター対照（ｐＣＩ−ｎｅｏ）及びプレキシンＢ２（ｐＣＩ−Ｐｌｅｘｉｎ  Ｂ２）の安定的トランスフェクタントが選抜され、ヒトプレキシンＢ２に特異的なプライマーセットを用いるＲＴ−ＰＣＲ解析により外来遺伝子の発現が検出された（図９Ｂ）。低レベルのサルのプレキシンＢ２ｍＲＮＡがベクター及びプレキシンＢ２のトランスフェクタントの両方で検出された（図９Ｂ）。抗プレキシンＢ２のＩｇＧを用いるウェスタンブロッティングは、ＣＯＳ−７細胞のベクターによるトランスフェクタントでは低レベルのプレキシンＢ２タンパク質が検出され、プレキシンＢ２によるトランスフェクタントではより高いレベルが検出された（図９Ｃ）。プレキシンＢ２タンパク質は、９０％コンフルエントな状態のＨｅＬａ細胞及びＬＮＣａＰ細胞と、３０％コンフルエントな状態のＨＵＶＥ細胞とでも検出された（図９Ｃ）。
【０１１８】
つぎに、ベクター及びプレキシンＢ２によるＣＯＳ−７細胞のトランスフェクタントにおけるＡＮＧの核内移行が検討された。図１０は、プレキシンＢ２によるトランスフェクタントでは核内移行がはっきり起こったが、ベクターによるトランスフェクタントでは核内のＡＮＧは最少量しか検出されなかったことを示す。したがって、ＣＯＳ−７細胞におけるヒトプレキシンＢ２の発現は、ＡＮＧの核内移行を可能にし、プレキシンＢ２がＡＮＧの核内移行を媒介するのに十分であることを示す。
【０１１９】
ＡＮＧは、内皮細胞においてＡＫＴを活性化することは示されている。前記ＣＯＳ−７細胞のプレキシンＢ２によるトランスフェクタントにおけるＡＫＴのリン酸化状態が検討された。図１０Ｇは、ＡＮＧ処理がＣＯＳ−７細胞のプレキシンＢ２によるトランスフェクタントにおけるＡＫＴにおいてＡＫＴのリン酸化を誘導したが、対照のベクターによるトランスフェクタントでは誘導しなかったことを示す。これらの結果は、プレキシンＢ２がＡＮＧの機能的レセプターであり、ＡＮＧの核内移行及びＡＫＴのリン酸化の両方を媒介する役割を担っていること示唆する。
【０１２０】
ネオマイシンは、内皮細胞及びがん細胞におけるＡＮＧの核内移行をブロックすることが知られている。ＣＯＳ−７細胞のプレキシンＢ２によるトランスフェクタントに対するネオマイシンの効果が検討された。図１１は、ネオマイシンがＣＯＳ−７細胞のプレキシンＢ２によるトランスフェクタントにおけるＡＮＧの核内移行を用量依存的に阻害することを示す。したがって、ヒトのプレキシンＢ２ｃＤＮＡのトランスフェクションがＣＯＳ−７細胞をＡＮＧ応答性細胞に変換した。ＡＮＧの生物活性にとって必須であるＡＮＧの核内移行に関しては、ＣＯＳ−７細胞のプレキシンＢ２によるトランスフェクタントは、ＬＮＣａＰ細胞と、低密度で培養されたＨＵＶＥ細胞という、既知のＡＮＧ応答性細胞株２つと同様なやり方で挙動する。
【実施例４】
【０１２１】
プレキシンＢ２のＡＮＧ結合ドメイン
プレキシンＢ２は、大きな細胞外部分と、比較的小さな細胞内ドメインとを有する１回膜貫通タンパク質である（図１２Ａ）。前記細胞外部分は、１個のＳｅｍａドメインと、３個のＰＳＩドメインと、３個のＴＩＧドメインとで構成される。ＡＮＧ結合部位を決定するために、前記Ｓｅｍａドメイン又は前記３個のＰＳＩドメインのいずれかにが欠失した一連の欠失突然変異体が作成された（図１２Ａ）。これらの欠失突然変異体がＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションされ、これらのトランスフェクタントにおけるＡＮＧの核内移行が免疫蛍光法により判定された。図１２Ｂに示されるとおり、ＡＮＧの核内移行は、突然変異体２、３及び４でトランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞では起こったが、突然変異体１でトランスフェクションされた細胞では起こらなかったので、ＡＮＧはプレキシンＢ２のＳｅｍａドメインに結合することが示された。この方法によりＡＮＧの推定結合部位は、プレキシンＢ２のアミノ酸配列の第３１６番目と第４４９番目の残基の間の位置であった。この領域をカバーする一連のアミノ酸１８個のペプチドが化学的に合成され、これらのＡＮＧタンパク質への結合親和性がＥＬＩＳＡ法及び平衡透析法により検討された。アミノ酸配列ＧＴＳＳＥＹＤＳＩＬＶＥＩＮＫＲＶＫ（配列番号１）、ＬＤＫＶＨＡＫＭＥＡＮＲＮＡＣ（配列番号２）及びＲＤＧＬＲＧＴＡＶＬＱＲＧＧＬＮＬ（配列番号３）を有するペプチドがＡＮＧと結合でき、これらのアミノ酸配列がプレキシンＢ２のＡＮＧ結合エピトープであることを示した。
【実施例５】
【０１２２】
プレキシンＢ２のＡＮＧ結合エピトープに特異的な抗体はＡＮＧ活性を阻害する
見かけのＫｄ０．２ＭでＡＮＧと結合する配列番号１で表されるこのＡＮＧ結合ペプチド配列が、本明細書で説明されるポリクローナル抗プレキシンＢ２抗体を作成するのに用いられた。図１０Ａは、このアフィニティ精製抗プレキシンＢ２抗体を用いるＬＮＣａＰ細胞の処理がＡＮＧの核移行をブロックするが、未免疫ＩｇＧはＡＮＧの核移行には効果がないことを示す（図１３Ａ）。同様に、抗プレキシンＢ２抗体は、ＡＮＧが誘導する内皮の管形成（図１３Ｂ）と、ＬＮＣａＰ細胞の増殖（図１３Ｃ）とを阻害した。
【実施例６】
【０１２３】
プレキシンＢ２の発現レベルが、ヒト及びマウスの両方のがん組織で検討された。図１４Ａは、ヒト前立腺がん組織アレイにおけるプレキシンＢ２のＩＨＣ染色を示す。がん組織（上２段）は良性前立腺過形成（ＢＰＨ、下２段）より著しい強く染色された。前記アレイ上の２個の正常前立腺組織サンプル（右端）は染色されないか、非常に弱い染色であった。図１４Ｂは、正常組織と前立腺がん組織の強拡大像を示す。プレキシンＢ２はがん細胞の細胞表面に局在した（矢印）。プレキシンＢ２はＭＰＡＫＴマウスのＰＩＮ組織において過剰発現された（図１４Ｃ及びＤ）。ＩＨＣ及びＩＦの両方が、プレキシンＢ２は腺間血管の内皮細胞（図１４Ｃ及びＤの矢印）と、前記ＰＩＮ組織の腺上皮細胞とにおいて強く発現したが、野生型マウスでは発現は非常に弱かった。
【実施例７】
【０１２４】
無胸腺マウスにおけるＰＣ−３細胞腫瘍の異種移植増殖に対する前記プレキシンＢ２抗体の阻害活性が調べられた。マウス１匹あたり６０μｇのプレキシンＢ２抗体皮下注射連日処理は、ＰＣ−３細胞腫瘍の確立（３３μＬのマトリゲルを含む１００μＬ中細胞１×１０６個）を５０％阻害した（図１５Ａ）。対照群（ＰＢＳ処理）のマウス（ｎ＝６）全てで第１８日までに触診可能な腫瘍が発生した。しかし、プレキシンＢ２抗体処理されたマウスの半分は、実験終了時（第４０日）に腫瘍が発生しなかった。腫瘍を発生したマウスでも、腫瘍の成長速度は明確に遅い（図１５Ｂ−Ｄ）。ＰＢＳ処理された動物と、プレキシンＢ２抗体処理された動物での腫瘍重量の平均は、それぞれ、０．９６±０．２４ｇと、０．２±０．１６ｇであった。したがって、プレキシンＢ２のＩｇＧは無胸腺マウスにおけるＰＣ−３細胞腫瘍の増殖を７９％阻害した。
【０１２５】
引用による取り込み
本明細書で言及された全ての刊行物、特許及び特許出願は、それらの全体が、刊行物、特許及び特許出願のそれぞれが特異的かつ個別に引用により取り込まれるように示されたかのように、引用により取り込まれる。抵触する場合には、本明細書のいかなる定義も含めて本出願が優先するであろう。
【０１２６】
均等発明
当業者は、本明細書に説明された発明の具体的な実施態様の多くの均等発明を認識するか、ルーティンの実験しか用いないで確かめることができるであろう。かかる均等発明は、以下の請求の範囲に含まれることが意図される。
【図１】
2014516922.tif 000002
【図２】
2014516922.tif 000003
【図３】
2014516922.tif 000004
【図６】
2014516922.tif 000005
【図４】
2014516922.tif 000006
【図５】
2014516922.tif 000007
【図７】
2014516922.tif 000008
【図８】
2014516922.tif 000009
【図９】
2014516922.tif 000010
【図１０】
2014516922.tif 000011
【図１１】
2014516922.tif 000012
【図１２】
2014516922.tif 000013
【図１３】
2014516922.tif 000014
【図１４】
2014516922.tif 000015
【図１５−１】
2014516922.tif 000016
【図１５−２】
2014516922.tif 000017
【国際調査報告】
2014516922.tif 000018
2014516922.tif 000019
2014516922.tif 000020