(57)【要約】化学発光のフラッシュ特性およびグロー特性を有する化合物を開示する。また、当該化合物を用いて光を生成し、酵素、抗原、および／または核酸を検出および／または定量する方法も開示する。また、これらの化合物に関するキットも開示する。2014516947.tif 000158
2014516947.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造を有する化合物：
2014516947.tif 000120
式中、
ＡおよびＢは独立して、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、２〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルキル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され、これらのうちの任意の１つは、置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、かつ
ＡおよびＢが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルケニル、ポリシクロアルケニル、ポリシクロヘテロアルキルおよびポリシクロヘテロアルケニルを形成する場合には、形成された基は、置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、あるいはＡおよびＢは一緒になって、ハロゲンにより置換されたポリシクロアルキルを形成し；
2014516947.tif 000121
であり；
Ｒ１は、１つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または１つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい３〜２０個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり；
Ｒ２は、Ｔ上に酸素アニオンを生じさせる酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり；かつ
Ｒ３は、水素または電子供与基であり；ただしＲ１が非置換の場合、Ｒ３は電子供与基であり；
ここで、
2014516947.tif 000122
である場合は
2014516947.tif 000123
である。
【請求項２】
ＡまたはＢのうちの少なくとも１つが、
2014516947.tif 000124
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ＡおよびＢが全体として、
2014516947.tif 000125
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１が、１つまたは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１が、１〜２個の炭素原子を含む直鎖アルキルまたは１〜２個の炭素原子を含む直鎖トリフルオロアルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ１が、メチルまたは１，１，１-トリフルオロエチルである、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
2014516947.tif 000126
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
2014516947.tif 000127
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
ＯＲ２が、ホスフェート、アセテート、１-ホスホ-２，３-ジアシルグリセリド、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、α-Ｄ-ガラクトシド、β-Ｄ-ガラクトシド、α-Ｄ-グルコシド、β-Ｄ-グルコシド、α-Ｄ-マンノシド、β-Ｄ-マンノシド、β-フルクトフラノシド、β-Ｄ-グルクロニド、または
2014516947.tif 000128
であり、式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ独立して、Ｈ、１〜４個の炭素原子を含む直鎖アルキル（分岐鎖または直鎖）、または３〜６個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ２が、
2014516947.tif 000129
である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ２がＥ-Ｌ-Ｎｕｃ-Ｚであり、式中、Ｅは求電子性原子を含む基であり、該原子は、Ｚ基の酵素的切断に際してＮｕｃ基の電子対によって攻撃され、隣接基関与によって化合物アニオンを放出し；Ｌは連結基であり；Ｎｕｃは求核原子であり；かつ、Ｚは酵素により切断可能な基であり、ここで
Ｅが、カルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり；
Ｌが、１〜４個の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、-（ＣＨ２）ｍ-Ｏ-（ＣＨ２）ｎ、-（ＣＨ２）ｍ-Ｓ-（ＣＨ２）ｎ-、または-（ＣＨ２）ｍ-ＮＲ６-（ＣＨ２）ｎ-からなる群より選択され、式中、ｍおよびｎは０〜３であり、ｍ＋ｎは２または３であり、式中、Ｒ６は、１〜１０個の炭素原子を含むアルキルであり、該連結基は、１〜２４個の炭素原子を含むアルキル、２〜２４個の炭素原子を含むアルケニル、１〜２４個の炭素原子を含み、かつ１〜２４個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、２〜２４個の炭素原子を含み、かつ１〜２４個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、６〜１０個の炭素を含むアリール、１〜２４個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または２〜２４個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾール、もしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換されていてもよく；
Ｎｕｃは酸素原子または硫黄原子であり；かつ
Ｚは、ホスホリル、アセチル、１-ホスホ-２，３-ジアシルグリセロシル、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α-Ｄ-ガラクトシル、β-Ｄ-ガラクトシル、α-Ｄ-グルコシル、β-Ｄ-グルコシル、α-Ｄ-マンノシル、β-Ｄ-マンノシル、β-フルクトフラノシル、β-Ｄ-グルコシドウランシル、または
2014516947.tif 000130
であり、式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ独立して、Ｈ、１〜４個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または３〜６個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｚが、
2014516947.tif 000131
である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
前記電子供与基が、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルキル、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルコキシ、または３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルコキシである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
前記電子供与基が、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキルまたは１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルコキシである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
前記電子供与基が、１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルキルまたは１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルコキシである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
前記電子供与基が、メチル、エチル、プロピル、ブチル、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシおよびブチルオキシからなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１７】
前記酵素部分によって切断可能な結合の切断により、２５℃で光が生成され、これが約１５分未満で最大に達する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
前記光の生成が約１０分未満で最大に達する、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
前記光の生成が約５分未満で最大に達する、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２０】
前記酵素部分によって切断可能な結合の切断により、３７℃で光が生成され、これが約１５分未満で最大に達する、請求項１に記載の化合物。
【請求項２１】
前記光の生成が約１０分未満で最大に達する、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
前記光の生成が約５分未満で最大に達する、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２３】
2014516947.tif 000132
2014516947.tif 000133
2014516947.tif 000134
2014516947.tif 000135
2014516947.tif 000136
2014516947.tif 000137
2014516947.tif 000138
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項２４】
（ａ）請求項１に記載の化合物を提供する工程；
（ｂ）該化合物を切断可能な酵素部分を含む酵素複合体を提供する工程；
（ｃ）該酵素複合体を該化合物と接触させて反応混合物を形成させる工程；ならびに、
（ｄ）該反応混合物に光を生成させる工程
を含む、光の生成方法。
【請求項２５】
２５℃での光の生成が約１５分未満で最大に達する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記光の生成が約１０分未満で最大に達する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記光の生成が約５分未満で最大に達する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
３７℃での光の生成が約１５分未満で最大に達する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記光の生成が約１０分未満で最大に達する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記光の生成が約５分未満で最大に達する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記酵素部分が加水分解酵素を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記加水分解酵素が、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、またはノイラミニダーゼである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記酵素部分が酵素である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記化合物の添加後に前記反応混合物により生成された光を検出する工程をさらに含み、該光の生成が前記酵素の存在を示し、該生成された光の量が試料中に存在する該酵素の量に相関し得、２５℃〜３７℃での該光の生成が約１５分未満で最大に達する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記光の生成が約１０分未満で最大に達する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記光の生成が約５分未満で最大に達する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記酵素部分が、抗原に結合可能な第１の抗体と、基質が分解されて光を生成するように前記化合物を切断可能な酵素とを含む酵素結合抗体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１の抗体が、前記酵素に共有結合または非共有結合で結合されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１の抗体が、標識に共有結合で結合されており、前記酵素が、該標識に非共有結合で結合可能な分子に共有結合で結合されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記標識がビオチンまたはビオチン誘導体であり、前記分子がアビジンまたはストレプトアビジンである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記標識がハプテンであり、前記分子がハプテンに結合可能な抗体である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
（ａ）抗原を含む疑いのある試料を提供する工程；
（ｂ）該抗原に結合可能な第２の抗体を含む固相を提供する工程；
（ｃ）該試料および酵素結合抗体を該固相と接触させて酵素複合体を形成させる工程；ならびに
（ｄ）前記化合物の添加後に前記反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該抗原の存在を示し、該生成された光の量が該試料中に存在する該抗原の量に相関し得、２５℃〜３７℃での該光の生成が約１５分未満で最大に達する、工程
をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記光の生成が約１０分未満で最大に達する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記光の生成が約５分未満で最大に達する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
未結合の酵素結合抗体を酵素複合体から除去する工程をさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記酵素部分が、抗原と、前記化合物が分解されて光を生成するように前記化合物を切断可能な酵素とを含む、酵素結合抗原である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４７】
前記抗原が前記酵素に共有結合または非共有結合で結合されている、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
抗原が標識に共有結合で結合されており、前記酵素が、該標識に非共有結合で結合可能な分子に共有結合で結合されている、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記標識がビオチンまたはビオチン誘導体であり、前記分子がアビジンまたはストレプトアビジンである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記標識がハプテンであり、前記分子がハプテンに結合可能な抗体である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
（ａ）抗原を含む疑いのある試料を提供する工程；
（ｂ）該抗原に結合可能な抗体を含む固相を提供する工程；
（ｃ）該試料および酵素結合抗原を該固相と接触させて酵素複合体を形成させる工程；ならびに
（ｄ）前記化合物の添加後に前記反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該抗原の存在を示し、該生成された光の量が、該試料中に存在する該抗原の量に相関し得、２５℃〜３７℃での該光の生成が約１５分未満で最大に達する、工程
をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記光の生成が約１０分未満で最大に達する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記光の生成が約５分未満で最大に達する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
未結合の酵素結合抗原を酵素複合体から除去する工程をさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記酵素部分が、核酸にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、化合物が分解されて光を生成するように該化合物を切断可能な酵素とを含む酵素結合オリゴヌクレオチドである、請求項３２に記載の方法。
【請求項５６】
前記オリゴヌクレオチドが前記酵素に共有結合または非共有結合で結合されている、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
オリゴヌクレオチドが標識に共有結合で結合されており、前記酵素が、該標識に非共有結合で結合可能な分子に共有結合で結合されている、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記標識がビオチンまたはビオチン誘導体であり、前記分子がアビジンまたはストレプトアビジンである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記標識がハプテンであり、前記分子がハプテンに結合可能な抗体である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
（ａ）核酸を含む疑いのある試料を提供する工程；
（ｂ）該核酸を固相に固定化する工程、
（ｃ）固定化された該核酸と酵素結合オリゴヌクレオチドを接触させて酵素複合体を形成させる工程；ならびに
（ｄ）前記化合物の添加後に前記反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該核酸の存在を示し、該生成された光の量が試料中に存在する核酸の量に相関し得、２５℃〜３７℃での該光の生成が約１５分未満で最大に達する工程
をさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
前記光の生成が約１０分未満で最大に達する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記光の生成が約５分未満で最大に達する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
未結合の酵素結合オリゴヌクレオチドを酵素複合体から除去する工程をさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記反応混合物が増強剤をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項６５】
前記増強剤が、ポリマー性第四級アンモニウム塩、ポリマー性第四級ホスホニウム塩、またはそれらの組み合わせを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記増強剤がアクセプター色素をさらに含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記アクセプター色素が、フルオレセイン、ローダミン、スルホローダミン、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ４０５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５４６、またはＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５５５である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ポリマー性第四級アンモニウム塩が、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム）、ポリ［ビニルベンジル（塩化ベンジルジメチルアンモニウム）］、ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリブチルアンモニウム）］、ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリペンチルアンモニウム）］またはそれらの組み合わせである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記ポリマー性第四級ホスホニウム塩が、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）とポリ（塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム）とを含むコポリマー、またはそれらの組み合わせである、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
ＡまたはＢのうちの少なくとも１つが、
2014516947.tif 000139
である、請求項２４に記載の方法。
【請求項７１】
ＡおよびＢが全体として、
2014516947.tif 000140
である、請求項２４に記載の方法。
【請求項７２】
Ｒ１が、１つまたは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルキルである、請求項２４に記載の方法。
【請求項７３】
Ｒ１が、１〜２個の炭素原子を含む直鎖アルキルまたは１〜２個の炭素原子を含む直鎖トリフルオロアルキルである、請求項２４に記載の方法。
【請求項７４】
Ｒ１が、メチルまたは１，１，１-トリフルオロエチルである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
2014516947.tif 000141
である、請求項２４に記載の方法。
【請求項７６】
2014516947.tif 000142
である、請求項２４に記載の方法。
【請求項７７】
ＯＲ２が、ホスフェート、アセテート、１-ホスホ-２，３-ジアシルグリセリド、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、α-Ｄ-ガラクトシド、β-Ｄ-ガラクトシド、α-Ｄ-グルコシド、β-Ｄ-グルコシド、α-Ｄ-マンノシド、β-Ｄ-マンノシド、β-フルクトフラノシド、β-Ｄ-グルクロニド、または
2014516947.tif 000143
であり、式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ独立して、Ｈ、１〜４個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または３〜６個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである、請求項２４に記載の方法。
【請求項７８】
Ｒ２が、
2014516947.tif 000144
である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
Ｒ２がＥ-Ｌ-Ｎｕｃ-Ｚであり、式中、Ｅは求電子性原子を含む基であり、該原子は、Ｚ基の酵素的切断に際してＮｕｃ基の電子対によって攻撃され、隣接基関与によって化合物アニオンを放出し；Ｌは連結基であり；Ｎｕｃは求核原子であり；かつ、Ｚは酵素により切断可能な基であり；式中、
Ｅが、カルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり；
Ｌが、１〜４個の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、-（ＣＨ２）ｍ-Ｏ-（ＣＨ２）ｎ、-（ＣＨ２）ｍ-Ｓ-（ＣＨ２）ｎ-、または-（ＣＨ２）ｍ-ＮＲ６-（ＣＨ２）ｎ-からなる群より選択され、式中、ｍおよびｎは０〜３であり、ｍ＋ｎは２または３であり、式中、Ｒ６は、１〜１０個の炭素原子を含むアルキルであり、該連結基は、１〜２４個の炭素原子を含むアルキル、２〜２４個の炭素原子を含むアルケニル、１〜２４個の炭素原子を含み、かつ１〜２４個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、２〜２４個の炭素原子を含み、かつ１〜２４個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、６〜１０個の炭素を含むアリール、１〜２４個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または２〜２４個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾール、もしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換されていてもよく；
Ｎｕｃは酸素原子もしくは硫黄原子であり；かつ
Ｚは、ホスホリル、アセチル、１-ホスホ-２，３-ジアシルグリセロシル、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α-Ｄ-ガラクトシル、β-Ｄ-ガラクトシル、α-Ｄ-グルコシル、β-Ｄ-グルコシル、α-Ｄ-マンノシル、β-Ｄ-マンノシル、β-フルクトフラノシル、β-Ｄ-グルコシドウランシル、または
2014516947.tif 000145
であり、式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ独立して、Ｈ、１〜４個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または３〜６個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである、請求項２４に記載の方法。
【請求項８０】
Ｚが、
2014516947.tif 000146
である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記電子供与基が、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルキル、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルコキシ、または３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルコキシである、請求項２４に記載の方法。
【請求項８２】
前記電子供与基が、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキルまたは１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルコキシである、請求項２４に記載の方法。
【請求項８３】
前記電子供与基が、１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルキルまたは１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルコキシである、請求項２４に記載の方法。
【請求項８４】
前記電子供与基が、メチル、エチル、プロピル、ブチル、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシまたはブチルオキシからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項８５】
前記化合物が、
2014516947.tif 000147
2014516947.tif 000148
2014516947.tif 000149
2014516947.tif 000150
2014516947.tif 000151
2014516947.tif 000152
2014516947.tif 000153
である、請求項２４に記載の方法。
【請求項８６】
（ａ）請求項１に記載の化合物を提供する工程；
（ｂ）該化合物が分解されて光を生成するように該化合物を切断可能な酵素を含む疑いのある試料を提供する工程；
（ｃ）該試料を該化合物と接触させて反応混合物を形成させる工程；ならびに、
（ｄ）該化合物の添加後に該反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該酵素の存在を示し、該生成された光の量が該試料中に存在する該酵素の量に相関し得、２５℃〜３７℃での該光の生成が約１５分未満で最大に達する、工程
を含む、試料中の酵素の存在および／または量を決定するアッセイ方法。
【請求項８７】
（ａ）請求項１に記載の化合物を提供する工程；
（ｂ）抗原を含む疑いのある試料を提供する工程；
（ｃ）該抗原と、該化合物が分解されて光を生成するように該化合物を切断することができる酵素とを含む、酵素結合抗原を提供する工程；
（ｄ）該抗原に結合可能な抗体を含む固相を提供する工程；
（ｅ）該試料および酵素結合抗原を該固相と接触させて酵素複合体を形成させる工程；
（ｆ）該酵素複合体を該化合物と接触させて反応混合物を形成させる工程；ならびに、
（ｇ）該化合物の添加後に該反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該抗原の存在を示し、該生成された光の量が該試料中に存在する該抗原の量に相関し得、２５℃〜３７℃での該光の生成が約１５分未満で最大に達する、工程
を含む、試料中の抗原の存在および／または量を決定するアッセイ方法。
【請求項８８】
（ａ）請求項１に記載の化合物を提供する工程；
（ｂ）核酸を含む疑いのある試料を提供する工程；
（ｃ）該核酸を固相に固定化する工程；
（ｄ）該核酸にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、該化合物が分解されて光を生成するように該化合物を切断可能な酵素とを含む、酵素結合オリゴヌクレオチドを提供する工程；
（ｅ）固定化された該核酸と該酵素結合オリゴヌクレオチドを接触させて酵素複合体を形成させる工程；
（ｆ）該酵素複合体を該化合物と接触させて反応混合物を形成させる工程；ならびに、
（ｇ）該化合物の添加後に該反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該核酸の存在を示し、該生成された光の量が該試料中に存在する該核酸の量に相関し得、２５℃〜３７℃での該光の生成が約１５分未満で最大に達する、工程
を含む、試料中の核酸の存在および／または量を決定するアッセイ方法。
【請求項８９】
（ａ）請求項１に記載の化合物、および
（ｂ）緩衝液
を含む、試料中の分析物の存在および／または量を検出するためのキット。
【請求項９０】
以下の構造を有する化合物：
2014516947.tif 000154
式中、
ＡおよびＢは独立して、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、２〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルキル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され、これらのうちの任意の１つは、置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、ＡおよびＢが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく；
Ｒ１は、１つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または１つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい３〜２０個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり；
Ｒ２は、酸素アニオンを生じさせるよう酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり；かつ
Ｒ３は、水素または電子供与基である。
【請求項９１】
以下の構造を有する化合物：
2014516947.tif 000155
式中、
ＡおよびＢは独立して、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、２〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルキル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され、これらのうちの任意の１つは、置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、ＡおよびＢが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく；
Ｒ１は、１つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または１つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい３〜２０個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり；
Ｒ２は、酸素アニオンを生じさせるよう酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり；
Ｒ３は、水素または電子供与基であり；
Ｒ４およびＲ５は独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、シアノ、ニトロ、スルホネート、サルフェート、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルキル、２〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニル、１〜２０個の炭素原子を含むアルコキシ、６〜１４個の炭素原子を含むアリール、６〜１４個の炭素原子を含むアリールオキシ、２〜２１個の炭素原子を含むエステル、３〜３０個の炭素原子を含むトリアルキルアンモニウム、３〜３０個の炭素原子を含むトリアルキルホスホニウム、２〜２１個の炭素原子を含むアルキルアミド、７〜１５個の炭素原子を含むアリールアミド、２〜２１個の炭素原子を含むアルキルカルバモイル、７〜１５個の炭素原子を含むアリールカルバモイル、１〜２０個の炭素原子を含むアルキルスルホンアミド、６〜１４個の炭素原子を含むアリールスルホンアミド、３〜６０個の炭素原子を含むトリアルキルシリル、１８〜４２個の炭素原子を含むトリアリールシリル、７〜３２個の炭素原子を含むアルキルアリールシリル、１〜２０個の炭素原子を含むアルキルアミドスルホニル、６〜１４個の炭素原子を含むアリールアミドスルホニル、１〜２０個の炭素原子を含むアルキルスルホニル、６〜１４個の炭素原子を含むアリールスルホニル、２〜２０個の炭素原子を含むアルキルチオおよび６〜１４個の炭素原子を含むアリールチオからなる群より選択され；かつ
Ｘは、硫黄原子、酸素原子、または窒素原子である。
【請求項９２】
以下の構造を有する化合物：
2014516947.tif 000156
式中、
ＡおよびＢは独立して、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、２〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルキル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され、これらのうちの任意の１つは、置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、ＡおよびＢが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく；
Ｒ１は、１つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または１つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい３〜２０個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり；
Ｒ２は、酸素アニオンを生じさせるよう酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり；かつ
Ｒ３は、水素または電子供与基である。
【請求項９３】
2014516947.tif 000157
である化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、診断プラットフォームの検出試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
化学発光技術は、臨床診断プラットフォームにおける検出試薬として広範囲に使用されている。直接的な化学発光標識（アクリジニウムエステルまたはイソルミノール等）は、トリガー溶液添加後、速やかにフラッシュ化学発光信号を生成するため、検出時間が短い。酵素連結化学発光基質（１，２-ジオキセタンまたはルミノール等）は、添加後のインキュベーション時間は長いが、超高感度検出および大きな基質試薬安定性を得られる。フラッシュ化学発光信号ならびに／または超高感度検出および大きな基質試薬安定性を得られる酵素基質が必要とされる。
【発明の概要】
【０００３】
１つの態様では、本発明は、構造：
2014516947.tif 000003
を有する化合物を提供するもので、
式中、ＡおよびＢは独立して、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、２〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルキル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され、これらのうちの任意の１つは、置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、ＡおよびＢが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルケニル、ポリシクロアルケニル、ポリシクロヘテロアルキルおよびポリシクロヘテロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、またはＡおよびＢは一緒になって、ハロゲンにより置換されたポリシクロアルキルを形成し；
2014516947.tif 000004
であり；
Ｒ１は、１つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または１つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい３〜２０個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり；Ｒ２は、Ｔ上に酸素アニオンを生じさせる酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり；かつＲ３は、水素または電子供与基であり；ただしＲ１が置換されない場合、Ｒ３は電子供与基であり；
2014516947.tif 000005
である場合は
2014516947.tif 000006
である。
【０００４】
一部の実施形態では、ＡまたはＢのうちの少なくとも１つは、
2014516947.tif 000007
であり得る。
【０００５】
一部の実施形態では、ＡおよびＢは全体として、
2014516947.tif 000008
であり得る。
【０００６】
一部の実施形態では、Ｒ１は、１つまたは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルキルであり得る。
【０００７】
一部の実施形態では、Ｒ１は、１〜２個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても１〜２個の炭素原子を含む直鎖トリフルオロアルキルであってもよい。これらの実施形態の一部では、Ｒ１は、メチルであっても１，１，１-トリフルオロエチルであってもよい。
【０００８】
一部の実施形態では、
2014516947.tif 000009
であり得る。
【０００９】
一部の実施形態では、
2014516947.tif 000010
であり得る。
【００１０】
一部の実施形態では、ＯＲ２は、ホスフェート、アセテート、１-ホスホ-２，３-ジアシルグリセリド、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、α-Ｄ-ガラクトシド、β-Ｄ-ガラクトシド、α-Ｄ-グルコシド、β-Ｄ-グルコシド、α-Ｄ-マンノシド、β-Ｄ-マンノシド、β-フルクトフラノシド、β-Ｄ-グルクロニド、または
2014516947.tif 000011
であり得、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ独立して、Ｈ、１〜４個の炭素原子を含む直鎖アルキル（分岐状または直鎖）、または３〜６個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、Ｒ２は、
2014516947.tif 000012
であり得る。
【００１１】
一部の実施形態では、Ｒ２は、Ｅ-Ｌ-Ｎｕｃ-Ｚであり得、式中、Ｅは求電子性原子を含む基であり、該原子は、Ｚ基の酵素的切断に際してＮｕｃ基の電子対によって攻撃され、隣接基関与によって化合物アニオンを放出し；Ｌは連結基であり；Ｎｕｃは求核原子であり；Ｚは酵素により切断可能な基であり；式中
Ｅは、カルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり；Ｌは、１〜４個の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、-（ＣＨ２）ｍ-Ｏ-（ＣＨ２）ｎ、-（ＣＨ２）ｍ-Ｓ-（ＣＨ２）ｎ-、または-（ＣＨ２）ｍ-ＮＲ６-（ＣＨ２）ｎ-からなる群より選択され、式中、ｍおよびｎは０〜３であり、ｍ＋ｎは２または３であり、式中、Ｒ６は、１〜１０個の炭素原子を含むアルキルであり、該連結基は、１〜２４個の炭素原子を含むアルキル、２〜２４個の炭素原子を含むアルケニル、１〜２４個の炭素原子を含み、かつ１〜２４個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、２〜２４個の炭素原子を含み、かつ１〜２４個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、６〜１０個の炭素を含むアリール、１〜２４個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または２〜２４個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾール、もしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換されていてもよく；Ｎｕｃは酸素原子もしくは硫黄原子であり；かつ、Ｚは、ホスホリル、アセチル、１-ホスホ-２，３-ジアシルグリセロシル、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α-Ｄ-ガラクトシル、β-Ｄ-ガラクトシル、α-Ｄ-グルコシル、β-Ｄ-グルコシル、α-Ｄ-マンノシル、β-Ｄ-マンノシル、β-フルクトフラノシル、β-Ｄ-グルコシドウランシル（ｇｌｕｃｏｓｉｄｕｒａｎｓｙｌ）、または
2014516947.tif 000013
であり、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ独立して、Ｈ、１〜４個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または３〜６個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、Ｚは、
2014516947.tif 000014
であり得る。
【００１２】
一部の実施形態では、電子供与基は、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルキルであっても１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルコキシであっても３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルコキシであってもよい。
【００１３】
一部の実施形態では、電子供与基は、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルコキシであってもよい。
【００１４】
一部の実施形態では、電子供与基は、１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルコキシであってもよい。
【００１５】
一部の実施形態では、電子供与基は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシおよびブチルオキシからなる群より選択され得る。
【００１６】
一部の実施形態では、酵素部分によって切断可能な結合の切断により、２５℃で光が生成され、これは約１５分未満で最大に達し得る。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る；一方、他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【００１７】
一部の実施形態では、酵素部分によって切断可能な結合の切断により、３７℃で光が生成され、これは約１５分未満で最大に達し得る。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る；一方、他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【００１８】
一部の実施形態では、化合物は、
2014516947.tif 000015
2014516947.tif 000016
2014516947.tif 000017
2014516947.tif 000018
2014516947.tif 000019
2014516947.tif 000020
2014516947.tif 000021
であり得る。
【００１９】
別の態様では、本発明は、化合物［１］を提供する工程；該化合物を切断可能な酵素部分を含む酵素複合体を提供する工程；該酵素複合体を該化合物と接触させて反応混合物を形成させる工程；ならびに、該反応混合物に光を生成させる工程を含む光の生成方法を提供する。
【００２０】
一部の実施形態では、２５℃での光の生成は、約１５分未満で最大に達し得る。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る；一方、他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【００２１】
一部の実施形態では、３７℃での光の生成は、約１５分未満で最大に達し得る。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る；一方、他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【００２２】
一部の実施形態では、酵素部分は、加水分解酵素を含み得る。これらの実施形態の一部では、加水分解酵素は、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼまたはノイラミニダーゼであり得る。
【００２３】
一部の実施形態では、酵素部分は、酵素であり得る。
【００２４】
これらの実施形態の一部では、方法は、化合物の添加後に反応混合物により生成された光を検出する工程をさらに含み得、光の生成は酵素の存在を示し、生成された光の量が試料中に存在する酵素の量に相関し得、２５℃〜３７℃での光の生成は約１５分未満で最大に達するものとする。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る；一方、他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【００２５】
一部の実施形態では、酵素部分は、抗原に結合可能な第１の抗体と、基質が分解されて光を生成するように該化合物を切断可能な酵素とを含む、酵素結合抗体であり得る。
【００２６】
これらの実施形態の一部では、第１の抗体は酵素に共有結合で結合されても非共有結合で結合されてもよい。これらの実施形態の一部では、第１の抗体は標識に共有結合で結合され得、酵素は標識に非共有結合で結合可能な分子に共有結合で結合される。これらの実施形態の一部では、標識はビオチンであってもビオチン誘導体であってもよく、分子はアビジンであってもストレプトアビジンであってもよい；一方、他の実施形態では、標識はハプテンであり得、分子はハプテンに結合可能な抗体であり得る。
【００２７】
これらの実施形態の一部では、方法は、抗原を含む疑いのある試料を提供する工程；抗原に結合可能な第２の抗体を含む固相を提供する工程；試料および酵素結合抗体を固相と接触させて酵素複合体を形成させる工程；ならびに、化合物の添加後に反応混合物により生成された光を検出する工程をさらに含み得、光の生成は、抗原の存在を示し、生成された光の量が試料中に存在する抗原の量に相関し得、２５℃〜３７℃での光の生成は約１５分未満で最大に達するものとする。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る；一方、他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【００２８】
これらの実施形態の一部では、方法は、未結合の酵素結合抗体を酵素複合体から除去する工程をさらに含み得る。
【００２９】
一部の実施形態では、酵素部分は、抗原と、化合物が分解されて光を生成するように化合物を切断可能な酵素とを含む、酵素結合抗原であり得る。
【００３０】
これらの実施形態の一部では、抗原は、酵素に共有結合で結合されても非共有結合で結合されてもよい。これらの実施形態の一部では、抗原は、標識に共有結合で結合され得、酵素は、標識に非共有結合で結合可能な分子に共有結合で結合される。これらの実施形態の一部では、標識はビオチンであってもビオチン誘導体であってもよく、分子はアビジンまたはストレプトアビジンである；一方、他の実施形態では、標識はハプテンであり得、分子はハプテンに結合可能な抗体である。
【００３１】
一部の実施形態では、方法は、抗原を含む疑いのある試料を提供する工程；抗原に結合可能な抗体を含む固相を提供する工程；試料および酵素結合抗原を固相と接触させて酵素複合体を形成させる工程；ならびに、化合物の添加後に反応混合物により生成された光を検出する工程をさらに含み得、光の生成は、抗原の存在を示し、生成された光の量が試料中に存在する抗原の量に相関し得、２５℃〜３７℃での光の生成は約１５分未満で最大に達するものとする。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る；一方、他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【００３２】
これらの実施形態の一部では、方法は、酵素複合体から未結合の酵素結合抗原を除去する工程をさらに含み得る。
【００３３】
一部の実施形態では、酵素部分は、核酸にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドおよび化合物が分解されて光を生成するように化合物を切断可能な酵素を含む酵素結合オリゴヌクレオチドであり得る。
【００３４】
これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチドは、酵素に共有結合で結合されても非共有結合で結合されてもよい。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチドは、標識に共有結合で結合され得、酵素は、標識に非共有結合で結合可能な分子に共有結合で結合される。これらの実施形態の一部では、標識はビオチンであってもビオチン誘導体であってもよく、分子はアビジンまたはストレプトアビジンである；一方、他の実施形態では、標識はハプテンであり得、分子はハプテンに結合可能な抗体である。
【００３５】
これらの実施形態の一部では、方法は、核酸を含む疑いのある試料を提供する工程；核酸を固相に固定化する工程、固定化された核酸と酵素結合オリゴヌクレオチドを接触させて酵素複合体を形成させる工程；ならびに、化合物の添加後に反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該核酸の存在を示し、生成された光の量が試料中に存在する核酸の量に相関し得、２５℃〜３７℃での光の生成は約１５分未満で最大に達する工程をさらに含み得る。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る；一方、他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【００３６】
これらの実施形態の一部では、方法は、未結合の酵素結合オリゴヌクレオチドを酵素複合体から除去する工程をさらに含み得る。
【００３７】
一部の実施形態では、反応混合物は、増強剤をさらに含み得る。これらの実施形態の一部では、増強剤はポリマー性第四級アンモニウム塩、ポリマー性第四級ホスホニウム塩、またはそれらの組み合わせを含み得る。これらの実施形態の一部では、ポリマー性第四級アンモニウム塩は、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム）、ポリ［ビニルベンジル（塩化ベンジルジメチルアンモニウム）］、ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリブチルアンモニウム）］、ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリペンチルアンモニウム）］またはそれらの組み合わせであり得る；一方、他の実施形態では、ポリマー性第四級ホスホニウム塩は、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）とポリ（塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム）とを含むコポリマー、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００３８】
これらの実施形態の一部では、増強剤はアクセプター色素をさらに含み得る。これらの実施形態の一部では、アクセプター色素は、フルオレセイン、ローダミン、スルホローダミン、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ４０５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５４６、またはＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５５５であり得る。
【００３９】
一部の実施形態では、ＡまたはＢのうちの少なくとも１つは、
2014516947.tif 000022
であり得る。
【００４０】
一部の実施形態では、ＡおよびＢは全体として、
2014516947.tif 000023
であり得る。
【００４１】
一部の実施形態では、Ｒ１は、１つまたは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルキルであり得る。
【００４２】
一部の実施形態では、Ｒ１は、１〜２個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても１〜２個の炭素原子を含む直鎖トリフルオロアルキルであってもよい。これらの実施形態の一部では、Ｒ１は、メチルであっても１，１，１-トリフルオロエチルであってもよい。
【００４３】
一部の実施形態では、
2014516947.tif 000024
であり得る；一方、他の実施形態では、
2014516947.tif 000025
であり得る。
【００４４】
一部の実施形態では、ＯＲ２は、ホスフェート、アセテート、１-ホスホ-２，３-ジアシルグリセリド、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、α-Ｄ-ガラクトシド、β-Ｄ-ガラクトシド、α-Ｄ-グルコシド、β-Ｄ-グルコシド、α-Ｄ-マンノシド、β-Ｄ-マンノシド、β-フルクトフラノシド、β-Ｄ-グルクロニド、または
2014516947.tif 000026
であり得、式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ独立して、Ｈ、１〜４個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または３〜６個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、Ｒ２は、
2014516947.tif 000027
であり得る。
一部の実施形態では、Ｒ２は、Ｅ-Ｌ-Ｎｕｃ-Ｚであり得、式中、Ｅは求電子性原子を含む基であり、該原子は、Ｚ基の酵素的切断に際してＮｕｃ基の電子対によって攻撃され、隣接基関与によって化合物アニオンを放出し；Ｌは連結基であり；Ｎｕｃは求核原子であり；Ｚは酵素により切断可能な基であり；式中
Ｅは、カルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり；
Ｌは、１〜４個の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、-（ＣＨ２）ｍ-Ｏ-（ＣＨ２）ｎ、-（ＣＨ２）ｍ-Ｓ-（ＣＨ２）ｎ-、または-（ＣＨ２）ｍ-ＮＲ６-（ＣＨ２）ｎ-からなる群より選択され、式中、ｍおよびｎは０〜３であり、ｍ＋ｎは２または３であり、式中、Ｒ６は、１〜１０個の炭素原子を含むアルキルであり、該連結基は、１〜２４個の炭素原子を含むアルキル、２〜２４個の炭素原子を含むアルケニル、１〜２４個の炭素原子を含み、かつ１〜２４個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、２〜２４個の炭素原子を含み、かつ１〜２４個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、６〜１０個の炭素を含むアリール、１〜２４個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または２〜２４個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾール、もしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換されていてもよく；
Ｎｕｃは酸素原子もしくは硫黄原子であり；かつ
Ｚは、ホスホリル、アセチル、１-ホスホ-２，３-ジアシルグリセロシル、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α-Ｄ-ガラクトシル、β-Ｄ-ガラクトシル、α-Ｄ-グルコシル、β-Ｄ-グルコシル、α-Ｄ-マンノシル、β-Ｄ-マンノシル、β-フルクトフラノシル、β-Ｄ-グルコシドウランシル、または
2014516947.tif 000028
であり、式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ独立して、Ｈ、１〜４個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または３〜６個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、Ｚは、
2014516947.tif 000029
であり得る。
【００４５】
一部の実施形態では、電子供与基は、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルキルであっても１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルコキシであっても３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルコキシであってもよい。
【００４６】
一部の実施形態では、電子供与基は、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルコキシであってもよい。
【００４７】
一部の実施形態では、電子供与基は、１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルコキシであってもよい。
【００４８】
一部の実施形態では、電子供与基は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシまたはブチルオキシからなる群より選択され得る。
【００４９】
一部の実施形態では、化合物は、
2014516947.tif 000030
2014516947.tif 000031
2014516947.tif 000032
2014516947.tif 000033
2014516947.tif 000034
2014516947.tif 000035
2014516947.tif 000036
であり得る。
【００５０】
別の態様では、本発明は、化合物［１］を提供する工程；化合物が分解されて光を生成するように化合物を切断可能な酵素を含む疑いのある試料を提供する工程；試料を化合物と接触させて反応混合物を形成させる工程；ならびに、化合物の添加後に反応混合物により生成された光を検出する工程であって、光の生成は酵素の存在を示し、生成された光の量が試料中に存在する酵素の量に相関し得、２５℃〜３７℃での光の生成は約１５分未満で最大に達する工程を含む、試料中の酵素の存在および／または量を決定するアッセイ方法を提供する。
【００５１】
一部の実施形態では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る；一方、他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【００５２】
別の態様では、本発明は、化合物［１］を提供する工程；抗原を含む疑いのある試料を提供する工程；抗原と、化合物が分解されて光を生成するように化合物を切断することができる酵素とを含む、酵素結合抗原を提供する工程；抗原に結合可能な抗体を含む固相を提供する工程；試料および酵素結合抗原を固相と接触させて酵素複合体を形成させる工程；該酵素複合体を該化合物と接触させて反応混合物を形成させる工程；ならびに、化合物の添加後に反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該抗原の存在を示し、生成された光の量が試料中に存在する抗原の量に相関し得、２５℃〜３７℃での光の生成は約１５分未満で最大に達する工程を含む、試料中の抗原の存在および／または量を決定するアッセイ方法を提供する。
【００５３】
一部の実施形態では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る；一方、他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【００５４】
別の態様では、本発明は、化合物［１］を提供する工程；核酸を含む疑いのある試料を提供する工程；核酸を固相に固定化する工程；核酸にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、化合物が分解されて光を生成するように化合物を切断可能な酵素とを含む、酵素結合オリゴヌクレオチドを提供する工程；固定化された核酸と酵素結合オリゴヌクレオチドを接触させて酵素複合体を形成させる工程；該酵素複合体を該化合物と接触させて反応混合物を形成させる工程；ならびに、化合物の添加後に反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該核酸の存在を示し、生成された光の量が試料中に存在する核酸の量に相関し得、２５℃〜３７℃での光の生成は約１５分未満で最大に達する工程を含む、試料中の核酸の存在および／または量を決定するアッセイ方法を提供する。
【００５５】
一部の実施形態では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る；一方、他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【００５６】
別の態様では、本発明は、化合物［１］；および緩衝液を含む試料中の分析物の存在および／または量を検出するためのキットを提供する。
【００５７】
一部の実施形態では、ＡまたはＢのうちの少なくとも１つは、
2014516947.tif 000037
であり得る。
【００５８】
一部の実施形態では、ＡおよびＢは全体として、
2014516947.tif 000038
であり得る。
【００５９】
一部の実施形態では、Ｒ１は、１つまたは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルキルであり得る。
【００６０】
一部の実施形態では、Ｒ１は、１〜２個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても１〜２個の炭素原子を含む直鎖トリフルオロアルキルであってもよい。
【００６１】
一部の実施形態では、Ｒ１は、メチルであっても１，１，１-トリフルオロエチルであってもよい。
【００６２】
一部の実施形態では、
2014516947.tif 000039
であり得る；一方、他の実施形態では、
2014516947.tif 000040
であり得る。
【００６３】
一部の実施形態では、ＯＲ２は、ホスフェート、アセテート、１-ホスホ-２，３-ジアシルグリセリド、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、α-Ｄ-ガラクトシド、β-Ｄ-ガラクトシド、α-Ｄ-グルコシド、β-Ｄ-グルコシド、α-Ｄ-マンノシド、β-Ｄ-マンノシド、β-フルクトフラノシド、β-Ｄ-グルクロニド、または
2014516947.tif 000041
であり得、式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ独立して、Ｈ、１〜４個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または３〜６個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、Ｒ２は、
2014516947.tif 000042
であり得る。
【００６４】
一部の実施形態では、Ｒ２は、Ｅ-Ｌ-Ｎｕｃ-Ｚであり得、式中、Ｅは求電子性原子を含む基であり、該原子は、Ｚ基の酵素的切断に際してＮｕｃ基の電子対によって攻撃され、隣接基関与によって化合物アニオンを放出し；Ｌは連結基であり；Ｎｕｃは求核原子であり；Ｚは酵素により切断可能な基であり；式中
Ｅは、カルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり；
Ｌは、１〜４個の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、-（ＣＨ２）ｍ-Ｏ-（ＣＨ２）ｎ、-（ＣＨ２）ｍ-Ｓ-（ＣＨ２）ｎ-、または-（ＣＨ２）ｍ-ＮＲ６-（ＣＨ２）ｎ-からなる群より選択され、式中、ｍおよびｎは０〜３であり、ｍ＋ｎは２または３であり、式中、Ｒ６は、１〜１０個の炭素原子を含むアルキルであり、該連結基は、１〜２４個の炭素原子を含むアルキル、２〜２４個の炭素原子を含むアルケニル、１〜２４個の炭素原子を含み、かつ１〜２４個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、２〜２４個の炭素原子を含み、かつ１〜２４個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、６〜１０個の炭素を含むアリール、１〜２４個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または２〜２４個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾール、もしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換され得；
Ｎｕｃは酸素原子もしくは硫黄原子であり；かつ
Ｚは、ホスホリル、アセチル、１-ホスホ-２，３-ジアシルグリセロシル、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α-Ｄ-ガラクトシル、β-Ｄ-ガラクトシル、α-Ｄ-グルコシル、β-Ｄ-グルコシル、α-Ｄ-マンノシル、β-Ｄ-マンノシル、β-フルクトフラノシル、β-Ｄ-グルコシドウランシル、または
2014516947.tif 000043
であり、式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ独立して、Ｈ、１〜４個の炭素原子を含む直鎖アルキル（分岐状または直鎖）、または３〜６個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、Ｚは、
2014516947.tif 000044
であり得る。
【００６５】
一部の実施形態では、電子供与基は、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルキルであっても１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルコキシであっても３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルコキシであってもよい。
【００６６】
一部の実施形態では、電子供与基は、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルコキシであってもよい。
【００６７】
一部の実施形態では、電子供与基は、１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルコキシであってもよい。
【００６８】
一部の実施形態では、電子供与基は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシおよびブチルオキシからなる群より選択され得る。
【００６９】
一部の実施形態では、キットは、増強剤をさらに含み得る。これらの実施形態の一部では、増強剤はポリマー性第四級アンモニウム塩、ポリマー性第四級ホスホニウム塩、またはそれらの組み合わせを含み得る。これらの実施形態の一部では、ポリマー性第四級アンモニウム塩は、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム）、ポリ［ビニルベンジル（塩化ベンジルジメチルアンモニウム）］、ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリブチルアンモニウム）］、ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリペンチルアンモニウム）］またはそれらの組み合わせであり得る；一方、他の実施形態では、ポリマー性第四級ホスホニウム塩は、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）とポリ（塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム）とを含むコポリマー；またはそれらの組み合わせであり得る。
【００７０】
一部の実施形態では、増強剤はアクセプター色素をさらに含み得る。これらの実施形態の一部では、アクセプター色素は、フルオレセイン、ローダミン、スルホローダミン、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ４０５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５４６、またはＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５５５であり得る。
【００７１】
一部の実施形態では、酵素部分によって切断可能な化合物の結合の切断により、２５℃で光が生成され、これは約１５分未満で最大に達し得る。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る；一方、他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【００７２】
一部の実施形態では、酵素部分によって切断可能な化合物の結合の切断により、３７℃で光が生成され、これは約１５分未満で最大に達し得る。これらの一部では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る；一方、他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【００７３】
一部の実施形態では、化合物は、
2014516947.tif 000045
2014516947.tif 000046
2014516947.tif 000047
2014516947.tif 000048
2014516947.tif 000049
2014516947.tif 000050
であり得る。
【００７４】
別の態様では、本発明は、構造：
2014516947.tif 000051
を有する化合物を提供し、
式中、
ＡおよびＢは独立して、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、２〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルキル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され、これらのうちの任意の１つは、置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、ＡおよびＢが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく；
Ｒ１は、１つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または１つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい３〜２０個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり；
Ｒ２は、酸素アニオンを生じさせるよう酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり；かつ
Ｒ３は、水素または電子供与基である。
【００７５】
一部の実施形態では、ＡまたはＢのうちの少なくとも１つは、
2014516947.tif 000052
であり得る。
【００７６】
一部の実施形態では、ＡおよびＢは全体として、
2014516947.tif 000053
であり得る。
【００７７】
一部の実施形態では、Ｒ１は、１つまたは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルキルであり得る。
【００７８】
一部の実施形態では、Ｒ１は、１〜２個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても１〜２個の炭素原子を含む直鎖トリフルオロアルキルであってもよい。これらの実施形態の一部では、Ｒ１は、メチルであっても１，１，１-トリフルオロエチルであってもよい。
【００７９】
一部の実施形態では、ＯＲ２は、ホスフェート、アセテート、１-ホスホ-２，３-ジアシルグリセリド、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、α-Ｄ-ガラクトシド、β-Ｄ-ガラクトシド、α-Ｄ-グルコシド、β-Ｄ-グルコシド、α-Ｄ-マンノシド、β-Ｄ-マンノシド、β-フルクトフラノシド、β-Ｄ-グルクロニド、または
2014516947.tif 000054
であり得、式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ独立して、Ｈ、１〜４個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または３〜６個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、Ｒ２は、
2014516947.tif 000055
であり得る。
【００８０】
一部の実施形態では、Ｒ２は、Ｅ-Ｌ-Ｎｕｃ-Ｚであり得、式中、Ｅは求電子性原子を含む基であり、該原子は、Ｚ基の酵素的切断に際してＮｕｃ基の電子対によって攻撃され、隣接基関与によって化合物アニオンを放出し；Ｌは連結基であり；Ｎｕｃは求核原子であり；Ｚは酵素により切断可能な基であり；式中
Ｅは、カルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり；
Ｌは、１〜４個の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、-（ＣＨ２）ｍ-Ｏ-（ＣＨ２）ｎ、-（ＣＨ２）ｍ-Ｓ-（ＣＨ２）ｎ-、または-（ＣＨ２）ｍ-ＮＲ６-（ＣＨ２）ｎ-からなる群より選択され、式中、ｍおよびｎは０〜３であり、ｍ＋ｎは２または３であり、式中、Ｒ６は、１〜１０個の炭素原子を含むアルキルであり、該連結基は、１〜２４個の炭素原子を含むアルキル、２〜２４個の炭素原子を含むアルケニル、１〜２４個の炭素原子を含み、かつ１〜２４個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、２〜２４個の炭素原子を含み、かつ１〜２４個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、６〜１０個の炭素を含むアリール、１〜２４個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または２〜２４個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾール、もしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換されていてもよく；
Ｎｕｃは酸素原子もしくは硫黄原子であり；かつ
Ｚは、ホスホリル、アセチル、１-ホスホ-２，３-ジアシルグリセロシル、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α-Ｄ-ガラクトシル、β-Ｄ-ガラクトシル、α-Ｄ-グルコシル、β-Ｄ-グルコシル、α-Ｄ-マンノシル、β-Ｄ-マンノシル、β-フルクトフラノシル、β-Ｄ-グルコシドウランシル、または
2014516947.tif 000056
であり、式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ独立して、Ｈ、１〜４個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または３〜６個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、Ｚは、
2014516947.tif 000057
であり得る。
【００８１】
一部の実施形態では、電子供与基は、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルキルであっても１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルコキシであっても３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルコキシであってもよい。
【００８２】
一部の実施形態では、電子供与基は、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルコキシであってもよい。
【００８３】
一部の実施形態では、電子供与基は、１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルコキシであってもよい。
【００８４】
一部の実施形態では、電子供与基は、メチル、エチル、プロピル、メトキシ、エトキシ、およびプロピルオキシからなる群より選択され得る。
【００８５】
一部の実施形態では、酵素部分によって切断可能な結合の切断により、２５℃で光が生成され、これは約１５分未満で最大に達し得る。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る；一方、他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【００８６】
一部の実施形態では、酵素部分によって切断可能な結合の切断により、３７℃で光が生成され、これは約１５分未満で最大に達し得る。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る；一方、他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【００８７】
一部の実施形態では、化合物は、
2014516947.tif 000058
2014516947.tif 000059
である。
【００８８】
別の態様では、本発明は、構造：
2014516947.tif 000060
を有する化合物を提供し、
式中、
ＡおよびＢは独立して、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、２〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルキル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され、これらのうちの任意の１つは、置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、ＡおよびＢが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく；
Ｒ１は、１つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または１つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい３〜２０個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり；
Ｒ２は、酸素アニオンを生じさせるよう酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり；
Ｒ３は、水素または電子供与基であり；
Ｒ４およびＲ５は独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、シアノ、ニトロ、スルホネート、サルフェート、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルキル、２〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニル、１〜２０個の炭素原子を含むアルコキシ、６〜１４個の炭素原子を含むアリール、６〜１４個の炭素原子を含むアリールオキシ、２〜２１個の炭素原子を含むエステル、３〜３０個の炭素原子を含むトリアルキルアンモニウム、３〜３０個の炭素原子を含むトリアルキルホスホニウム、２〜２１個の炭素原子を含むアルキルアミド、７〜１５個の炭素原子を含むアリールアミド、２〜２１個の炭素原子を含むアルキルカルバモイル、７〜１５個の炭素原子を含むアリールカルバモイル、１〜２０個の炭素原子を含むアルキルスルホンアミド、６〜１４個の炭素原子を含むアリールスルホンアミド、３〜６０個の炭素原子を含むトリアルキルシリル、１８〜４２個の炭素原子を含むトリアリールシリル、７〜３２個の炭素原子を含むアルキルアリールシリル、１〜２０個の炭素原子を含むアルキルアミドスルホニル、６〜１４個の炭素原子を含むアリールアミドスルホニル、１〜２０個の炭素原子を含むアルキルスルホニル、６〜１４個の炭素原子を含むアリールスルホニル、２〜２０個の炭素原子を含むアルキルチオおよび６〜１４個の炭素原子を含むアリールチオからなる群より選択され；かつ
Ｘは、硫黄原子、酸素原子、もしくは窒素原子である。
【００８９】
一部の実施形態では、ＡまたはＢのうちの少なくとも１つは、
2014516947.tif 000061
であり得る。
【００９０】
一部の実施形態では、ＡおよびＢは全体として、
2014516947.tif 000062
2014516947.tif 000063
であり得る。
【００９１】
一部の実施形態では、Ｒ１は、１つまたは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルキルであり得る。
【００９２】
一部の実施形態では、Ｒ１は、１〜２個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても１〜２個の炭素原子を含む直鎖トリフルオロアルキルであってもよい。これらの実施形態の一部では、Ｒ１は、メチルであっても１，１，１-トリフルオロエチルであってもよい。
【００９３】
一部の実施形態では、ＯＲ２は、ホスフェート、アセテート、１-ホスホ-２，３-ジアシルグリセリド、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、α-Ｄ-ガラクトシド、β-Ｄ-ガラクトシド、α-Ｄ-グルコシド、β-Ｄ-グルコシド、α-Ｄ-マンノシド、β-Ｄ-マンノシド、β-フルクトフラノシド、β-Ｄ-グルクロニド、または
2014516947.tif 000064
であり得、式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ独立して、Ｈ、１〜４個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または３〜６個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、Ｒ２は、
2014516947.tif 000065
であり得る。
【００９４】
一部の実施形態では、Ｒ２は、Ｅ-Ｌ-Ｎｕｃ-Ｚであり得、式中、Ｅは求電子性原子を含む基であり、該原子は、Ｚ基の酵素的切断に際してＮｕｃ基の電子対によって攻撃され、隣接基関与によって化合物アニオンを放出し；Ｌは連結基であり；Ｎｕｃは求核原子であり；Ｚは酵素により切断可能な基であり；式中
Ｅは、カルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり；
Ｌは、１〜４個の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、-（ＣＨ２）ｍ-Ｏ-（ＣＨ２）ｎ、-（ＣＨ２）ｍ-Ｓ-（ＣＨ２）ｎ-、または-（ＣＨ２）ｍ-ＮＲ６-（ＣＨ２）ｎ-からなる群より選択され、式中、ｍおよびｎは０〜３であり、ｍ＋ｎは２または３であり、式中、Ｒ６は、１〜１０個の炭素原子を含むアルキルであり、該連結基は、１〜２４個の炭素原子を含むアルキル、２〜２４個の炭素原子を含むアルケニル、１〜２４個の炭素原子を含み、かつ１〜２４個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、２〜２４個の炭素原子を含み、かつ１〜２４個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、６〜１０個の炭素を含むアリール、１〜２４個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または２〜２４個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾール、もしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換されていてもよく；
Ｎｕｃは酸素原子もしくは硫黄原子であり；かつ
Ｚは、ホスホリル、アセチル、１-ホスホ-２，３-ジアシルグリセロシル、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α-Ｄ-ガラクトシル、β-Ｄ-ガラクトシル、α-Ｄ-グルコシル、β-Ｄ-グルコシル、α-Ｄ-マンノシル、β-Ｄ-マンノシル、β-フルクトフラノシル、β-Ｄ-グルコシドウランシル、または
2014516947.tif 000066
であり、式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ独立して、Ｈまたは１〜４個の炭素原子を含む直鎖アルキル（分岐状または直鎖）、または３〜６個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、Ｚは、
2014516947.tif 000067
であり得る。
【００９５】
一部の実施形態では、電子供与基は、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルキルであっても１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルコキシであっても３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルコキシであってもよい。
【００９６】
一部の実施形態では、電子供与基は、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルコキシであってもよい。
【００９７】
一部の実施形態では、電子供与基は、１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルコキシであってもよい。
【００９８】
一部の実施形態では、電子供与基は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシおよびブチルオキシからなる群より選択され得る。
【００９９】
一部の実施形態では、酵素部分によって切断可能な結合の切断により、２５℃で光が生成され、これは約１５分未満で最大に達し得る。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る；一方、他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【０１００】
一部の実施形態では、酵素部分によって切断可能な結合の切断により、３７℃で光が生成され、これは約１５分未満で最大に達し得る。一部の実施形態では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る；一方、他の実施形態では、生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【０１０１】
一部の実施形態では、化合物は、
2014516947.tif 000068
2014516947.tif 000069
であり得る。
【０１０２】
別の態様では、本発明は、構造：
2014516947.tif 000070
を有する化合物を提供し、
式中、
ＡおよびＢは独立して、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、２〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルキル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され、これらのうちの任意の１つは、置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、ＡおよびＢが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく；
Ｒ１は、１つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または１つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい３〜２０個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり；
Ｒ２は、酸素アニオンを生じさせるよう酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり；かつ
Ｒ３は、水素または電子供与基である。
【０１０３】
一部の実施形態では、ＡまたはＢのうちの少なくとも１つは、
2014516947.tif 000071
であり得る。
【０１０４】
一部の実施形態では、ＡおよびＢは全体として、
2014516947.tif 000072
であり得る。
【０１０５】
一部の実施形態では、Ｒ１は、１つまたは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルキルであり得る。
【０１０６】
一部の実施形態では、Ｒ１は、１〜２個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても１〜２個の炭素原子を含む直鎖トリフルオロアルキルであってもよい。これらの実施形態の一部では、Ｒ１は、メチルであっても１，１，１-トリフルオロエチルであってもよい。
【０１０７】
一部の実施形態では、ＯＲ２は、ホスフェート、アセテート、１-ホスホ-２，３-ジアシルグリセリド、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、α-Ｄ-ガラクトシド、β-Ｄ-ガラクトシド、α-Ｄ-グルコシド、β-Ｄ-グルコシド、α-Ｄ-マンノシド、β-Ｄ-マンノシド、β-フルクトフラノシド、β-Ｄ-グルクロニド、または
2014516947.tif 000073
であり得、式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ独立して、Ｈ、１〜４個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または３〜６個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、Ｒ２は、
2014516947.tif 000074
であり得る。
【０１０８】
一部の実施形態では、Ｒ２は、Ｅ-Ｌ-Ｎｕｃ-Ｚであり得、式中、Ｅは求電子性原子を含む基であり、該原子は、Ｚ基の酵素的切断に際してＮｕｃ基の電子対によって攻撃され、隣接基関与によって化合物アニオンを放出し；Ｌは連結基であり；Ｎｕｃは求核原子であり；Ｚは酵素により切断可能な基であり；式中
Ｅは、カルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり；
Ｌは、１〜４個の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、-（ＣＨ２）ｍ-Ｏ-（ＣＨ２）ｎ、-（ＣＨ２）ｍ-Ｓ-（ＣＨ２）ｎ-、または-（ＣＨ２）ｍ-ＮＲ６-（ＣＨ２）ｎ-からなる群より選択され、式中、ｍおよびｎは０〜３であり、ｍ＋ｎは２または３であり、式中、Ｒ６は、１〜１０個の炭素原子を含むアルキルであり、該連結基は、１〜２４個の炭素原子を含むアルキル、２〜２４個の炭素原子を含むアルケニル、１〜２４個の炭素原子を含み、かつ１〜２４個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、２〜２４個の炭素原子を含み、かつ１〜２４個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、６〜１０個の炭素を含むアリール、１〜２４個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または２〜２４個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾール、もしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換されていてもよく；
Ｎｕｃは酸素原子もしくは硫黄原子であり；かつ
Ｚは、ホスホリル、アセチル、１-ホスホ-２，３-ジアシルグリセロシル、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α-Ｄ-ガラクトシル、β-Ｄ-ガラクトシル、α-Ｄ-グルコシル、β-Ｄ-グルコシル、α-Ｄ-マンノシル、β-Ｄ-マンノシル、β-フルクトフラノシル、β-Ｄ-グルコシドウランシル、または
2014516947.tif 000075
であり、式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ独立して、Ｈ、１〜４個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または３〜６個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、Ｚは、
2014516947.tif 000076
であり得る。
【０１０９】
一部の実施形態では、電子供与基は、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルキルであっても１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルコキシであっても３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルコキシであってもよい。
【０１１０】
一部の実施形態では、電子供与基は、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルコキシであってもよい。
【０１１１】
一部の実施形態では、電子供与基は、１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルキルまたは１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルコキシである。
【０１１２】
一部の実施形態では、電子供与基は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシおよびブチルオキシからなる群より選択され得る。
【０１１３】
一部の実施形態では、酵素部分によって切断可能な結合の切断により、２５℃で光が生成され、これは約１５分未満で最大に達し得る。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る；一方、他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【０１１４】
一部の実施形態では、酵素部分によって切断可能な結合の切断により、３７℃で光が生成され、これは約１５分未満で最大に達し得る。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る；一方、他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【０１１５】
一部の実施形態では、化合物は、
2014516947.tif 000077
2014516947.tif 000078
2014516947.tif 000079
であり得る。
【０１１６】
別の態様では、本発明は、構造：
2014516947.tif 000080
を有する化合物を提供する。
【０１１７】
別の態様では、本発明は、構造：
2014516947.tif 000081
を有する化合物を提供する工程；該化合物を切断可能な酵素部分を含む酵素複合体を提供する工程；該酵素複合体を該化合物と接触させて反応混合物を形成させる工程；ならびに、該反応混合物に光を生成させる工程を含む光の生成方法を提供するが；ただし、酵素複合体が固相を含み、抗原が固相に固定化され、抗原がタンパク質である場合、固相は膜またはマイクロアッセイではないものとする。
【０１１８】
一部の実施形態では、２５℃〜３７℃での光の生成は、約１５分未満で最大に達し得る。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る；一方、他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【０１１９】
一部の実施形態では、酵素部分は、アルカリホスファターゼであり得る。
【０１２０】
これらの実施形態の一部では、方法は、化合物の添加後に反応混合物により生成された光を検出する工程をさらに含み得、光の生成は、アルカリホスファターゼの存在を示し、生成された光の量が試料中に存在するアルカリホスファターゼの量に相関し得、２５℃〜３７℃での光の生成は約１５分未満で最大に達する。これらの一部では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る；一方、他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【０１２１】
一部の実施形態では、酵素部分は、抗原に結合可能な第１の抗体を含むアルカリホスファターゼ連結抗体であり得る。
【０１２２】
これらの実施形態の一部では、第１の抗体はアルカリホスファターゼに共有結合で結合されても非共有結合で結合されてもよい。これらの実施形態の一部では、第１の抗体は標識に共有結合で結合され得、アルカリホスファターゼは標識に非共有結合で結合可能な分子に共有結合で結合され得る。これらの実施形態の一部では、標識はビオチンであってもビオチン誘導体であってもよく、分子はアビジンであってもストレプトアビジンであってもよい；一方、他の実施形態では、標識はハプテンであり得、分子はハプテンに結合可能な抗体であり得る。
【０１２３】
これらの実施形態の一部では、方法は、抗原を含む疑いのある試料を提供する工程；抗原に結合可能な第２の抗体を含む固相を提供する工程；試料およびアルカリホスファターゼ連結抗体を固相と接触させて酵素複合体を形成させる工程；ならびに、化合物の添加後に反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該抗原の存在を示し、生成された光の量が試料中に存在する抗原の量に相関し得、２５℃〜３７℃での光の生成は約１５分未満で最大に達する工程をさらに含み得る。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る；一方、他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【０１２４】
これらの実施形態の一部では、方法は、酵素複合体から未結合アルカリホスファターゼ連結抗体を除去する工程をさらに含み得る。
【０１２５】
一部の実施形態では、酵素部分は、抗原を含むアルカリホスファターゼ連結抗原であり得る。
【０１２６】
これらの実施形態の一部では、抗原はアルカリホスファターゼに共有結合で結合されても非共有結合で結合されてもよい。これらの実施形態の一部では、抗原は標識に共有結合で結合され得、アルカリホスファターゼは標識に非共有結合で結合可能な分子に共有結合で結合され得る。これらの実施形態の一部では、標識はビオチンであってもビオチン誘導体であってもよく、分子はアビジンであってもストレプトアビジンであってもよい；一方、他の実施形態では、標識はハプテンであり得、分子はハプテンに結合可能な抗体であり得る。
【０１２７】
これらの実施形態の一部では、方法は、抗原を含む疑いのある試料を提供する工程；抗原に結合可能な抗体を含む固相を提供する工程；試料およびアルカリホスファターゼ連結抗原を固相と接触させて酵素複合体を形成させる工程；ならびに、化合物の添加後に反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該抗原の存在を示し、生成された光の量が試料中に存在する抗原の量に相関し得、２５℃〜３７℃での光の生成は約１５分未満で最大に達する工程をさらに含み得る。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る；一方、他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【０１２８】
これらの実施形態の一部では、方法は、酵素複合体から未結合のアルカリホスファターゼ連結抗原を除去する工程をさらに含み得る。
【０１２９】
一部の実施形態では、酵素部分は、核酸にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むアルカリホスファターゼ連結オリゴヌクレオチドであり得る。
【０１３０】
これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチドは、アルカリホスファターゼに共有結合で結合されても非共有結合で結合されてもよい。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチドは標識に共有結合で結合され得、アルカリホスファターゼは標識に非共有結合で結合可能な分子に共有結合で結合され得る。これらの実施形態の一部では、標識はビオチンであってもビオチン誘導体であってもよく、分子はアビジンであってもストレプトアビジンであってもよく、一方、他の実施形態では、標識はハプテンであり得、分子はハプテンに結合可能な抗体であり得る。
【０１３１】
これらの実施形態の一部では、方法は、核酸を含む疑いのある試料を提供する工程；核酸を固相に固定化する工程；固定化された核酸とアルカリホスファターゼ連結オリゴヌクレオチドを接触させて酵素複合体を形成させる工程；ならびに、化合物の添加後に反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該核酸の存在を示し、生成された光の量が試料中に存在する核酸の量に相関し得、２５℃〜３７℃での該光の生成が約１５分未満で最大に達する工程をさらに含み得る。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る；一方、他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【０１３２】
これらの実施形態の一部では、方法は、未結合の酵素結合オリゴヌクレオチドを酵素複合体から除去する工程をさらに含み得る。
【０１３３】
一部の実施形態では、反応混合物は、増強剤をさらに含み得る。
【０１３４】
これらの実施形態の一部では、増強剤はポリマー性第四級アンモニウム塩、ポリマー性第四級ホスホニウム塩、またはそれらの組み合わせを含み得る。これらの実施形態の一部では、ポリマー性第四級アンモニウム塩は、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム）、ポリ［ビニルベンジル（塩化ベンジルジメチルアンモニウム）］、ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリブチルアンモニウム）］、ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリペンチルアンモニウム）］またはそれらの組み合わせであり得る；一方、他の実施形態では、ポリマー性第四級ホスホニウム塩は、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）とポリ（塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム）とを含むコポリマー、またはそれらの組み合わせである。
【０１３５】
これらの実施形態の一部では、増強剤はアクセプター色素をさらに含み得る。これらの実施形態の一部では、アクセプター色素は、フルオレセイン、ローダミン、スルホローダミン、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ４０５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５４６、またはＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５５５であり得る。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】４-Ｍｅ-３-ＯＢｎ-ベンズアルデヒドの２工程合成を示す。
【図２】４-Ｍｅ-Ｐｈｅホスホネートの２工程、１ポット合成を示す。
【図３】ホーナー・エモンズカップリング、続いて脱ベンジル法による４-Ｍｅ-Ｐｈｅエノールエーテルの２工程合成を示す。
【図４】４-Ｍｅ-Ｐｈｅエノールエーテルから開始した４-Ｍｅ-Ｐｈｅジオキセタンの２工程合成を示す。
【図５】市販ＣＳＰＤ（登録商標）およびＣＤＰ-Ｓｔａｒ（登録商標）（共にＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、サンディエゴ、カリフォルニア）と共に、本発明のフラッシュ基質である基質Ａ、基質Ｂおよび基質Ｃの構造を示す。
【図６】２５℃で実施した基質ＡおよびＢ、ＣＳＰＤおよびＣＤＰ-Ｓｔａｒの速度論的評価の結果を示す。
【図７】２５℃で実施した精製アルカリホスファターゼ感度曲線を示す。感度は、信号対雑音比２のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）濃度として定義する。
【図８】２５℃で実施したＩＬ-６免疫アッセイにおける基質Ａ、ＣＳＤＰ、およびＣＤＰ-Ｓｔａｒの速度論的評価を示す。
【図９】ＣＤＰ-Ｓｔａｒ／Ｓａｐｐｈｉｒｅ-ＩＩおよび基質Ａの様々な時点、２５℃での信号対雑音比を示す。
【図１０】３７℃で実施したＩＬ-６免疫アッセイにおける基質Ａ、ＢおよびＣの速度論的評価を示す。
【図１１】免疫アッセイ系における３７℃での基質Ａ、Ｂ、Ｃおよび競合者の基質の信号と信号対雑音との速度論比較を示す。
【図１２】ＩＬ-６免疫アッセイ系における感度の比較を示す。
【図１３】基質Ａの貯蔵安定性試験の結果を示す。
【図１４】ビオチン標識アルカリホスファターゼと結合したストレプトアビジン標識トシル基活性化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ-２８０を用いて基質Ａ、ＢおよびＣ、ＣＤＰ-Ｓｔａｒ／Ｅｍｅｒａｌｄ-ＩＩ、競合者のフラッシュ（Ｆｌａｓｈ）基質Ｄ、および競合者のグロー（Ｇｌｏｗ）基質Ｅの速度論的評価の結果を示す。
【図１５】至適読み込み時点および室温で可変量のビオチン標識アルカリホスファターゼと結合したストレプトアビジン標識トシル基活性化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ-２８０の感度曲線を示す。
【図１６】信号を２分目に読み込んだ、至適読み込み時点、室温で可変量のビオチン標識アルカリホスファターゼと結合したストレプトアビジン標識トシル基活性化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ-２８０の感度曲線を示す。
【図１７】Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅカルボン酸および基質Ａ／Ｅｍｅｒａｌｄ-ＩＩＩ、基質Ｂ、およびＣＤＰ-Ｓｔａｒ／Ｅｍｅｒａｌｄ  ＩＩを使用して３７℃で測定した光の放射速度論対、信号対雑音を示す。
【図１８】基質Ａ／Ｅｍｅｒａｌｄ-ＩＩＩ、基質Ｂ、およびＣＤＰ-Ｓｔａｒ／Ｅｍｅｒａｌｄ-ＩＩを使用して抗ｃＴｎｌと結合したＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅカルボン酸ビーズ上で、３７℃で実施したヒト心臓トロポニン（ｃＴｎｌ）免疫アッセイにおける性能を示す。
【図１９】基質Ａを使用したＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅカルボン酸、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ-２８０、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ-２７０ビーズに基づくｃＴｎｌ免疫アッセイにおいて３７℃で測定したｃＴｎｌ感度曲線を示す。
【図２０】各読み込み時点で基質Ａ、ＢおよびＣ、ＣＤＰ-Ｓｔａｒ／Ｅｍｅｒａｌｄ-ＩＩ、およびＶｅｎｄｏｒ  Ｘの基質Ｄを併用したＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ-２７０エポキシビーズに基づくｃＴｎｌ免疫アッセイの性能を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１３７】
発明の詳細な説明
本発明を詳細に記載する前に、本発明は本明細書において開示される実施形態に限定されていないことを理解されたい。さらに、方法およびキットは、様々な工程または構成要素を「含む」という用語で記載される（「含むが、これらに限定されない」という意味として解釈される）が、方法およびキットはまた、様々な工程および構成要素からも「本質的に成る」または「成る」ことができ、かかる用語は閉じたメンバーの群を本質的に定義すると解釈されるべきである。最後に、本明細書および添付の特許請求の範囲内で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に指示しない限り複数の指示物を含むものとする。
【０１３８】
定義：
アクセプター色素は、光を放射する別の分子からエネルギー（特に光）を受け取り、次には、検出可能なエネルギー（やはり好ましくは光）を放射することができる分子を指す。
【０１３９】
分析物は、分析手順において決定される物質または化学物質の組成を指す。本明細書において使用される場合、この用語は、抗原または抗体を含むが、これらに限定されない。
【０１４０】
抗原は、抗体が結合できる物質を指す。
【０１４１】
抗体は、脊椎動物の血液または他の体液中に見出され、外来物を同定し中和するために免疫系によって使用されるガンマグロブリンタンパク質を指す。本明細書において使用される時、この用語は、抗原を結合することができる任意のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体またはその断片を含むが、これらに限定されない。
【０１４２】
増強剤は、１，２-ジオキセタン酵素基質の酵素的切断およびその後の分解からもたらされる特異的な光エネルギー産生を増加させ、観察されたこの光産生が増強剤のない状態で観察されたものを超える、水溶性物質を指す。
【０１４３】
酵素は化学反応を触媒するタンパク質を指す。
【０１４４】
ハプテンは、大きな担体（タンパク質等）に結合された場合のみ免疫反応を誘発できる低分子を指す。
【０１４５】
加水分解酵素またはヒドロラーゼは、化学結合の加水分解を触媒し、酵素のＥＣ番号分類においてＥＣ３として分類される酵素を指す。
【０１４６】
核酸は、単鎖または二重鎖ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその断片を指す。
【０１４７】
オリゴヌクレオチドは短い核酸ポリマーを指す。本明細書において使用される時、この用語は、２〜１０００の核酸を含む核酸ポリマーを含むが、これらに限定されない。
【０１４８】
本発明は、１，２-ジオキセタンである化合物を提供する。本発明は、１つまたは複数の本発明の化合物を使用する方法も提供する。提供される方法は、光の生成方法である。光の生成を使用して、試料中の酵素、抗原または核酸を含む１つまたは複数の分析物の存在および／または量を決定することができる。本発明は、試料中の１つまたは複数の分析物の存在および／または量を検出するためのキットも提供する。別の態様では、本発明は、光の生成のためのキットを提供する。キットは、１つまたは複数の本発明の化合物を含む。これらの化合物、方法およびキットは、当技術分野で認められているアッセイにおいて有用である。
【０１４９】
１つの態様では、本発明は、１，２-ジオキセタンであり得る化合物を提供する。これらとしては、下記に示す各置換基を有する構造［１］〜［４］を有するものが挙げられるが、これらに限定されない：
2014516947.tif 000082
式中、
ＡおよびＢは独立して、直鎖アルキル、直鎖アルケニル、分岐状アルキル、分岐状アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルケニル、ポリシクロアルキル、ポリシクロアルケニル、ポリシクロヘテロアルキルおよびポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され得、これらのうちの任意の１つは、置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、ＡおよびＢが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルケニル、ポリシクロアルケニル、ポリシクロヘテロアルキルおよびポリシクロヘテロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、またはＡおよびＢは一緒になってハロゲンにより置換されたポリシクロアルキルを形成し；
2014516947.tif 000083
であり；
Ｒ１は、１つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または１つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい３〜２０個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり得；
Ｒ２は、Ｔ上に酸素アニオンを生じさせる酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり得；かつ
Ｒ３は、水素または電子供与基であり得；ただしＲ１が置換されない場合、Ｒ３は電子供与基であるものとし；
2014516947.tif 000084
である場合、それは、
2014516947.tif 000085
であり得る。
【０１５０】
2014516947.tif 000086
式中、
ＡおよびＢは独立して、直鎖アルキル、直鎖アルケニル、分岐状アルキル、分岐状アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルケニル、ポリシクロアルキル、ポリシクロアルケニル、ポリシクロヘテロアルキルおよびポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され得、これらのうちの任意の１つは、置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、ＡおよびＢが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく；
Ｒ１は、１つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または１つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい３〜２０個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり得；
Ｒ２は、酸素アニオンを生じさせるよう酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり得；かつ
Ｒ３は、水素または電子供与基であり得る。
【０１５１】
2014516947.tif 000087
式中、
ＡおよびＢは独立して、直鎖アルキル、直鎖アルケニル、分岐状アルキル、分岐状アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルケニル、ポリシクロアルキル、ポリシクロアルケニル、ポリシクロヘテロアルキルおよびポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され得、これらのうちの任意の１つは、置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、ＡおよびＢが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく；
Ｒ１は、１つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または１つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい３〜２０個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり得；
Ｒ２は、酸素アニオンを生じさせるよう酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり得；
Ｒ３は、水素または電子供与基であり得；
Ｒ４およびＲ５は独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、シアノ、ニトロ、スルホネート、サルフェート、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルキル、２〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニル、１〜２０個の炭素原子を含むアルコキシ、６〜１４個の炭素原子を含むアリール、６〜１４個の炭素原子を含むアリールオキシ、２〜２１個の炭素原子を含むエステル、３〜３０個の炭素原子を含むトリアルキルアンモニウム、３〜３０個の炭素原子を含むトリアルキルホスホニウム、２〜２１個の炭素原子を含むアルキルアミド、７〜１５個の炭素原子を含むアリールアミド、２〜２１個の炭素原子を含むアルキルカルバモイル、７〜１５個の炭素原子を含むアリールカルバモイル、１〜２０個の炭素原子を含むアルキルスルホンアミド、６〜１４個の炭素原子を含むアリールスルホンアミド、３〜６０個の炭素原子を含むトリアルキルシリル、１８〜４２個の炭素原子を含むトリアリールシリル、７〜３２個の炭素原子を含むアルキルアリールシリル、１〜２０個の炭素原子を含むアルキルアミドスルホニル、６〜１４個の炭素原子を含むアリールアミドスルホニル、１〜２０個の炭素原子を含むアルキルスルホニル、６〜１４個の炭素原子を含むアリールスルホニル、２〜２０個の炭素原子を含むアルキルチオおよび６〜１４個の炭素原子を含むアリールチオからなる群より選択され得；かつ
Ｘは、硫黄原子、酸素原子、もしくは窒素原子である。
【０１５２】
2014516947.tif 000088
式中、
ＡおよびＢは独立して、直鎖アルキル、直鎖アルケニル、分岐状アルキル、分岐状アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルケニル、ポリシクロアルキル、ポリシクロアルケニル、ポリシクロヘテロアルキルおよびポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され得、これらのうちの任意の１つは、置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、ＡおよびＢが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく；
Ｒ１は、１つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または１つもしくは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい３〜２０個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであり得；
Ｒ２は、酸素アニオンを生じさせるよう酵素部分によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基であり得；かつ
Ｒ３は、水素または電子供与基であり得る。
【０１５３】
化合物［１］の一部の実施形態では、ＡおよびＢは独立して、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、２〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルキル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され得、これらのうちの任意の１つは、置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、ＡおよびＢが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルケニル、ポリシクロアルケニル、ポリシクロヘテロアルキルおよびポリシクロヘテロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、またはＡおよびＢは一緒になってハロゲンにより置換されたポリシクロアルキルを形成する。
【０１５４】
化合物［２］〜［４］の一部の実施形態では、ＡおよびＢは独立して、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、２〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルキル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群より選択され得、これらのうちの任意の１つは、置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよく、ＡおよびＢが一緒になってシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルを形成する場合には、形成された基は置換されていなくてもよく、または１つもしくは複数の電子活性基、可溶化基、もしくは光増強基により置換されていてもよい。
【０１５５】
電子活性基の例としては、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、シアノ、ニトロ、スルホネート、サルフェート、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルキル、２〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロアルケニル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、３〜２０個の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルキル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキル、４〜６０個の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニル、１〜２０個の炭素原子を含むアルコキシ、６〜１４個の炭素原子を含むアリール、６〜１４個の炭素原子を含むアリールオキシ、２〜２１個の炭素原子を含むエステル、３〜３０個の炭素原子を含むトリアルキルアンモニウム、３〜３０個の炭素原子を含むトリアルキルホスホニウム、２〜２１個の炭素原子を含むアルキルアミド、７〜１５個の炭素原子を含むアリールアミド、２〜２１個の炭素原子を含むアルキルカルバモイル、７〜１５個の炭素原子を含むアリールカルバモイル、１〜２０個の炭素原子を含むアルキルスルホンアミド、６〜１４個の炭素原子を含むアリールスルホンアミド、３〜６０個の炭素原子を含むトリアルキルシリル、１８〜４２個の炭素原子を含むトリアリールシリル、７〜３２個の炭素原子を含むアルキルアリールシリル、１〜２０個の炭素を含むアルキルアミドスルホニル、６〜１４個の炭素原子を含むアリールアミドスルホニル、１〜２０個の炭素原子を含むアルキルスルホニル、６〜１４個の炭素原子を含むアリールスルホニル、２〜２０個の炭素原子を含むアルキルチオおよび６〜１４個の炭素原子を含むアリールチオが挙げられる。
【０１５６】
電子活性基は、電子供与基および電子求引基を含む。電子供与基の例としては、アルキル、アルコキシ、非置換および置換アミノ基等が挙げられるが、これらに限定されない。電子求引基としては、ハロゲン、シアノ、ニトロ、カルボキシ、エステル、カルボキサミド基等が挙げられるが、これらに限定されない。可溶化基としては、カルボキシ、スルホネート、サルフェート、トリアルキルアンモニウム、トリアルキルホスホニウム基等が挙げられるが、これらに限定されない。可溶化基としては、ヒドロキシ、カルボキシ、ホスフェート、スルホネート、サルフェート、トリアルキルアンモニウム、トリアルキルホスホニウム等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５７】
可溶化基の例としては、カルボン酸基、マロン酸基、ヒドロキシル基、サルフェート基、スルホネート基、ホスフェート基およびアンモニウム基；ポリ（エトキシ）ｎ基［-（Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ２-）ｎ］（式中、ｎ＝１〜３０、カルボン酸基、マロン酸基、ヒドロキシル基、サルフェート基、スルホネート基、ホスフェート基およびアンモニウム基を末端とする）；ポリ［-Ｏ-（ＣＨ２-）ｎ］（式中、ｎ＝１〜３０、カルボン酸基、マロン酸基、ヒドロキシル基、サルフェート基、スルホネート基、ホスフェート基およびアンモニウム基を末端とする）が挙げられる。
【０１５８】
光増強基の例としては、アルキルアンモニウム基、アルキルホスホニウム基、アルキルスルホニウム基；アルキルアリールアンモニウム基、アルキルアリールホスホニウム基およびアルキルアリールスルホニウム基；またはアリールアンモニウム基、アリールホスホニウム基およびアリールスルホニウム基；およびポリ（アルキルアンモニウム）基、ポリ（アルキルホスホニウム）基、ポリ（アルキルスルホニウム）基；ポリ（アルキルアリールアンモニウム）基、ポリ（アルキルアリールホスホニウム）基およびポリアルキルアリールスルホニウム基；またはポリ（アリールアンモニウム）基、ポリ（アリールホスホニウム）基およびポリ（アリールスルホニウム）基等のカチオン性部分またはポリカチオン性部分が挙げられる。
【０１５９】
ハロゲン基としては、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素原子が挙げられる。
【０１６０】
化合物［１］〜［４］の一部の実施形態では、ＡまたはＢのうちの少なくとも１つは、
2014516947.tif 000089
であり得る。化合物［１］の一部の実施形態では、ＡおよびＢは全体として、
2014516947.tif 000090
であり得る。化合物［２］〜［４］の一部の実施形態では、ＡおよびＢは全体として、
2014516947.tif 000091
2014516947.tif 000092
であり得る。
【０１６１】
化合物［１］〜［４］の一部の実施形態では、Ｒ１は、１つまたは複数のハロゲン原子により置換されていてもよい１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルキルであり得る。他の実施形態では、Ｒ１は、１〜２個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても１〜２個の炭素原子を含む直鎖トリフルオロアルキルであってもよい。他の実施形態では、Ｒ１は、メチルであっても１，１，１-トリフルオロエチルであってもよい。
【０１６２】
一部の実施形態では、化合物［１］は、光を放射できる、ヘテロアリール環を含むが、これに限定されない、アリール環化合物または縮合多環式化合物であり得るＴを有する。Ｔは、光の産生を妨害せず、それが結合しているジオキセタン環の４-炭素原子の原子価を満たすように、選択される。Ｔは、対応するジオキセタン分解断片がエネルギーを吸収し、励起状態を形成し、その励起状態から断片が光学的に検出可能なエネルギーを放射して基底状態に戻ることを可能にする多数の光放射性の発蛍光団形成性蛍光発色団基のいずれかを示す。Ｔはまた、酵素によって切断可能な結合を含む、酵素により切断可能な基により置換されて、ジオキセタン環に結合された電子濃厚部分（例えば酸素アニオン、硫黄アニオンまたは窒素アニオン）を、直接的または後続のｐＨ調整のいずれかによって産出する。
【０１６３】
一部の実施形態では、Ｔはアリール（フェニル等）であり得、電子活性基、可溶化基または光増強基により置換され得る。
【０１６４】
一部の実施形態では、Ｔは、酵素によって切断された場合に縮合多環式部分を電子濃厚にし、次にジオキセタン化合物を光の放射のために分解可能にする結合を含む、酵素的に切断可能な不安定な環置換基を有する縮合多環含有発蛍光団部分であり得る。
【０１６５】
その残基がこの発蛍光団部分の形成に使用できる縮合多環式化合物の中には、９〜約３０の環炭素原子（両端を含める）を含有する縮合多環式芳香族炭化水素環の発蛍光化合物が含まれ、例えばナフタレン：
2014516947.tif 000093
ペンタレン、アズレン、ヘプタレン、ａｓ-インダセン、ｓ-インダセン、ビフェニレン、ペリレン、アセナフチレン、フェナントレン、アントラセン、アセフェナントリレン、アセアントリレン、トリフェニレン、ピレン、クリセン、ナフタセン等に加えて、１つまたは複数の非不安定置換基、例えば、１〜２０個の炭素原子（両端を含む）を有する分岐状または直鎖アルキル基（例えばメチル、ｎ-ブチルまたはデシル）、１〜７個の炭素原子（両端を含む）を有する分岐状または直鎖ヘテロアルキル基（例えばメトキシ、ヒドロキシエチルまたはヒドロキシプロピル）；１もしくは２つの環を有するアリール基（例えばフェニル）；１もしくは２つの環を有するヘテロアリール基（例えばピロリルまたはピラゾリル）；環内に３〜７個の炭素原子（両端を含む）を有するシクロアルキル基（例えばシクロヘキシル）；環内に３〜６個の炭素原子（両端を含む）を有するヘテロシクロアルキル基（例えばジオキサン）；１もしくは２つの環を有するアラルキル基（例えばベンジル）；１もしくは２つの環を有するアルカリール基（例えばトリル）；電子求引基（１〜７個の炭素原子（両端を含む）を有するペルフルオロアルキル基等、例えばトリフルオロメチル）；ハロゲン；ＣＯ２Ｈ、Ｚ'ＣＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＮＯ２、Ｚ'ＮＯ２、ＣＮ、またはＺ'ＣＮ（式中、Ｚ'は１〜７個の炭素原子（両端を含む）を有する分岐状または直鎖アルキル基、例えばメチル基、または１もしくは２つの環を有するアリール基（例えばフェニル）である）；電子供与基（例えば分岐状または直鎖のＣ１〜Ｃ７アルコキシ基、例えばメトキシまたはエトキシ）：１もしくは２つの環を有するアラルコキシ基（例えばフェノキシ）；分岐状または直鎖のＣ１〜Ｃ７アルコキシ基（例えばメトキシまたはエトキシ）；１もしくは２つの環を有するアラルコキシ基（例えばフェノキシ）；分岐状または直鎖のＣ１〜Ｃ７ヒドロキシアルキル基（例えばヒドロキシメチルまたはヒドロキシエチル）；１もしくは２つの環を有するヒドロキシアリール基（例えばヒドロキシフェニル）；分岐状または直鎖のＣ１〜Ｃ７アルキルエステル基（例えばアセテート）；１もしくは２つの環を有するアリールエステル基（例えばベンゾアート）；または１もしくは２つの環を有するヘテロアリール基（例えばベンゾオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイミダゾールまたはベンゾトリアゾール）により置換されたその誘導体が包含される。
【０１６６】
さらに、Ｔによって示される発蛍光団部分の縮合多環式部分は、縮合多環式芳香族複素環の蛍光化合物、例えば、ベンゾ［ｂ］チオフェン、ナフト［２，３-ｂ］チオフェン、チアントレン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサチン、キノリン、イソキノリン、フェナントリジン、フェナジン、フェノキサジン、フェノチアジン、フェナントロリン、プリン、４Ｈ-キノリジン、フタラジン、ナフチリジン、インドール、インドリジン、クロマン、イソクロマン、インドリン、イソインドリン等の残基でもあり得、非置換であるかまたは上記の非不安定置換基の１つまたは複数により置換され、９〜約３０の環原子（両端を含む）を含有し、その大部分は炭素原子である。
【０１６７】
化合物［１］の一部の実施形態では、
2014516947.tif 000094
は、
2014516947.tif 000095
であり得、一方、他の実施形態では、
2014516947.tif 000096
は、
2014516947.tif 000097
であり得る。
【０１６８】
化合物［１］〜［４］の一部の実施形態では、ＯＲ２は、ホスフェート、アセテート、１-ホスホ-２，３-ジアシルグリセリド、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、α-Ｄ-ガラクトシド、β-Ｄ-ガラクトシド、α-Ｄ-グルコシド、β-Ｄ-グルコシド、α-Ｄ-マンノシド、β-Ｄ-マンノシド、β-フルクトフラノシド、β-Ｄ-グルクロニド、または
2014516947.tif 000098
であり得、式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ独立して、Ｈ、１〜４個の炭素原子を含む直鎖アルキル（分岐状または直鎖）であっても３〜６個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルであってもよい。これらの実施形態の一部では、Ｒ２は、
2014516947.tif 000099
であり得る。
【０１６９】
化合物［１］〜［４］の一部の実施形態では、Ｒ２（酵素的に切断可能な置換基）は、一般式：
2014516947.tif 000100
（式中、Ｍ＋は、カチオン（アルカリ金属（例えばナトリウムまたはカリウム）、アンモニウム、またはＣ１-７アルキル、アラルキルもしくは芳香族第四級アンモニウムカチオン、Ｎ（ＤＲ３）４＋（式中、各Ｄ３はアルキル、例えばメチルまたはエチル、アラルキル、例えばベンジルであり得るか、または複素環系（例えばピリジニウム）、および特にジナトリウム塩の一部を形成し得る）等）を示す）によって示されるリン酸エステル基であり得る。かかる第四級アンモニウムカチオンは、ポリマー性骨格にそれらの四級化基の１つを通して連結され得、すなわち
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（式中、ｎは１より大きい）、またはポリ第四級アンモニウム塩（すなわちイオネンポリマー）の一部であり得る。
【０１７０】
化合物［１］〜［４］の一部の実施形態では、Ｒ２は、Ｅ-Ｌ-Ｎｕｃ-Ｚであり得、式中、Ｅは求電子性原子を含む基であり、該原子は、Ｚ基の酵素的切断に際してＮｕｃ基の電子対によって攻撃され、隣接基関与によって化合物アニオンを放出し；Ｌは連結基であり；Ｎｕｃは求核原子であり；Ｚは酵素により切断可能な基であり；式中
Ｅは、カルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり得；
Ｌは、１〜４個の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、-（ＣＨ２）ｍ-Ｏ-（ＣＨ２）ｎ、-（ＣＨ２）ｍ-Ｓ-（ＣＨ２）ｎ-、または-（ＣＨ２）ｍ-ＮＲ６-（ＣＨ２）ｎ-からなる群より選択され得、式中、ｍおよびｎは０〜３であり、ｍ＋ｎは２または３であり、式中、Ｒ６は、１〜１０個の炭素原子を含むアルキルであり、該連結基は、１〜２４個の炭素原子を含むアルキル、２〜２４個の炭素原子を含むアルケニル、１〜２４個の炭素原子を含み、かつ１〜２４個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、２〜２４個の炭素原子を含み、かつ１〜２４個の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、６〜１０個の炭素を含むアリール、１〜２４個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または２〜２４個の炭素原子を含み、かつフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、１〜４個の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾール、もしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換することができ得る；
Ｎｕｃは酸素原子もしくは硫黄原子であり得；かつ
Ｚは、ホスホリル、アセチル、１-ホスホ-２，３-ジアシルグリセロシル、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α-Ｄ-ガラクトシル、β-Ｄ-ガラクトシル、α-Ｄ-グルコシル、β-Ｄ-グルコシル、α-Ｄ-マンノシル、β-Ｄ-マンノシル、β-フルクトフラノシル、β-Ｄ-グルコシドウランシル、または
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であり得、式中、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ独立して、Ｈ、１〜４個の炭素原子を含む直鎖アルキル、または３〜６個の炭素原子を含む分岐鎖アルキルである。これらの実施形態の一部では、Ｚは、
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であり得る。
【０１７１】
化合物［１］〜［４］の一部の実施形態では、電子供与基、Ｒ３は、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキル、３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルキル、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルコキシであっても３〜２０個の炭素原子を含む分岐状アルコキシであってもよい。他の実施形態では、Ｒ３は、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても１〜２０個の炭素原子を含む直鎖アルコキシであってもよい。他の実施形態では、Ｒ３は、１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルキルであっても１〜５個の炭素原子を含む直鎖アルコキシであってもよい。他の実施形態では、Ｒ３は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシおよびブチルオキシからなる群より選択される。
【０１７２】
化合物［１］〜［４］の一部の実施形態では、酵素部分によって切断可能な結合の切断により、２５℃で光が生成され得、これは約１５分未満で最大に達する。他の実施形態では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る。他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【０１７３】
化合物［１］〜［４］の一部の実施形態では、酵素部分によって切断可能な結合の切断により、３７℃で光が生成され得、これは約１５分未満で最大に達する。他の実施形態では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る。他の実施形態では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。
【０１７４】
一部の実施形態では、化合物［１］は、
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2014516947.tif 000105
2014516947.tif 000106
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であり得る。
【０１７５】
一部の実施形態では、化合物［２］は、
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であり得る。
【０１７６】
一部の実施形態では、化合物［３］は、
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であり得る。
【０１７７】
一部の実施形態では、化合物［４］は、
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であり得る。
【０１７８】
一部の実施形態では、本発明の化合物は、
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も含み得るが、これらに限定されない。
【０１７９】
別の態様では、本発明は、
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である化合物を提供する。
【０１８０】
上記の本明細書において開示される本発明の化合物のいずれかを、以下または上記の発明の概要に開示の方法およびキットにおいて使用することができる。
【０１８１】
別の態様では、本発明は、方法を提供する。方法は、上に規定される本発明化合物を提供する工程；該化合物を切断可能な酵素部分を含む酵素複合体を提供する工程；該酵素複合体を該化合物と接触させて反応混合物を形成させる工程；ならびに、反応混合物に光を生成させる工程を含み得る。
【０１８２】
これらの方法の１つの工程で、本発明の化合物が提供される。かかる化合物は、式［１］、［２］、［３］、または［４］を有し得、上または発明の概要に開示するその任意の実施形態を含み得る。
【０１８３】
これらの方法の別の工程では、酵素、抗原、抗体、核酸または分析物を含む疑いのある試料が提供される。酵素、抗原、核酸または分析物を含む疑いのある試料をアッセイし得る。試料は生物学的な起源であっても非生物学的な起源であってもよい。試料は、生物学的起源である場合、血液、血清、血漿、尿、糞便、唾液、粘液、精液、組織、組織抽出物、細胞培養培地、細胞、細胞抽出物等であり得る。
【０１８４】
これらの方法の別の工程では、上に規定される本発明の化合物を切断可能な酵素部分を含み得る酵素複合体が提供される。酵素部分は、酵素であっても酵素結合抗体であっても酵素結合抗原であっても酵素結合オリゴヌクレオチドであってもよい。酵素部分は、本発明の化合物を切断可能な酵素を含み得る。一部の実施形態では、酵素は加水分解酵素であり得る。加水分解酵素は、エステル結合を開裂し、ＥＣ３．１として分類される酵素または糖結合を開裂し、ＥＣ３．２として分類される酵素を含み、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼまたはノイラミニダーゼを含むが、これらに限定されない。
【０１８５】
一部の実施形態では、酵素部分は酵素であり得る。これらの実施形態では、試料中の酵素は酵素複合体を含む。酵素複合体を本発明の化合物と接触させて反応混合物を形成させ、反応混合物に光を生成させる。
【０１８６】
一部の実施形態では、光の放射が検出され得、かかる放射が酵素の存在を示し、放射された光の量が試料中に存在する酵素の量に相関し得る。
【０１８７】
一部の実施形態では、酵素部分は酵素結合抗体であり得る。酵素結合抗体は、抗原に結合可能な第１の抗体と、本発明の化合物を切断しその結果基質が分解され、光を生成することができる酵素を含む。これらの実施形態では、酵素結合抗体、抗原、および抗原に結合可能で固相上に固定化された第２の抗体は、酵素複合体を構成する。酵素複合体を本発明の化合物と接触させて反応混合物を形成させ、反応混合物に光を生成させる。
【０１８８】
一部の実施形態では、抗原を含む疑いのある試料を、第１の抗体および酵素を含む酵素結合抗体ならびに第２の抗体を含む固相と接触させ、そこで両抗体が抗原と結合することにより、本発明の化合物を切断しその結果基質が分解されて光を生成することができる酵素複合体を提供することができる。試料、酵素結合抗体および固相は任意の順序で組み合わせることができる。
【０１８９】
一部の実施形態では、方法は、酵素複合体の洗浄によって、未結合の酵素結合抗体を酵素複合体から除去する工程をさらに含み得る。これは、酵素複合体の構成要素と適合性のある緩衝液の添加および除去によって実行され得る。かかる緩衝液は診断技術分野において周知である。固相の追加の洗浄工程を実行し得る。
【０１９０】
第１の抗体、第２の抗体または両抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または組換え抗体であり得る。
【０１９１】
固相は、ビーズ、試験管、マルチウェルプレート、マイクロアレイ、ゲル、膜、微粒子、ナノ結晶、量子ドット等であり得る。これらの固相が作製される材料は診断技術分野において公知である。
【０１９２】
第２の抗体は、診断技術分野において公知の技法によって、固相に対する抗体の非共有結合によって固相上に固定化しても共有結合によって固相に固定化してもよい
【０１９３】
第１の抗体は酵素に共有結合で結合されても非共有結合で結合されてもよい。非共有結合で結合される場合、第１の抗体は標識に共有結合で結合され得、酵素は標識に非共有結合で結合可能な分子に共有結合で結合され得る。
【０１９４】
一部の実施形態では、標識はビオチンであってもビオチン誘導体であってもよく、分子はアビジンであってもストレプトアビジンであってもよい。ビオチン誘導体は置換を有するビオチン分子である。ビオチン構造の一部が欠損しているビオチン分子もビオチン誘導体と判断される。ビオチン誘導体は置換された合成ビオチンに加えて天然に存在するビオチンも含む。
【０１９５】
一部の実施形態では、標識はハプテンであり得、分子はハプテンに結合可能な抗体であり得る。ハプテンとしてのジゴキシゲニンおよび分子としての抗ジゴキシゲニンの使用は、診断技術分野において公知である。
【０１９６】
一部の実施形態では、酵素部分は酵素結合抗原であり得る。酵素結合抗原は、抗原、および本発明の化合物を切断可能な酵素を含む。これらの実施形態では、酵素複合体は、抗原と結合できる抗体を含む固相に結合された酵素結合抗原を含む。酵素複合体を上記に規定される本発明の化合物と接触させて反応混合物を形成させ、反応混合物に光を生成させる。
【０１９７】
一部の実施形態では、抗原を含む疑いのある試料を、酵素結合抗原、および抗原に結合可能な抗体を含む固相と接触させ得る。試料、酵素結合抗原および固相は任意の順序で組み合わせることができる。
【０１９８】
一部の実施形態では、方法は、酵素複合体の洗浄によって、未結合の酵素結合抗原を酵素複合体から除去する工程をさらに含み得る。これは、酵素複合体の構成要素と適合性のある緩衝液の添加および除去によって実行され得る。かかる緩衝液は診断技術分野において周知である。固相の追加の洗浄工程を実行し得る。
【０１９９】
抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または組換え抗体であり得る。
【０２００】
固相は、ビーズ、試験管、マルチウェルプレート、マイクロアレイ、ゲル、膜、微粒子、ナノ結晶、量子ドット等であり得る。これらの固相が作製される材料は診断技術分野において公知である。
【０２０１】
抗体は、固相に対する抗体の非共有結合によって固相に固定化しても共有結合によって固相に固定化してもよい。
【０２０２】
抗原は酵素に共有結合で結合されても非共有結合で結合されてもよい。非共有結合で結合される場合、抗原は標識に共有結合で結合され得、酵素は標識に非共有結合で結合可能な分子に共有結合で結合され得る。
【０２０３】
一部の実施形態では、上記のように、標識はビオチンであってもビオチン誘導体であってもよく、分子はアビジンであってもストレプトアビジンであってもよい。
【０２０４】
一部の実施形態では、標識はハプテンであり得、分子はハプテンに結合可能な抗体であり得る。ハプテンとしてのジゴキシゲニン、および分子としての抗ジゴキシゲニンの使用は、診断技術分野において公知である。
【０２０５】
一部の実施形態では、酵素部分は酵素結合オリゴヌクレオチドであり得る。酵素結合オリゴヌクレオチドは、ある種の核酸にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド、および本発明の化合物を切断可能な酵素を含む。これらの実施形態では、酵素複合体は、核酸を含む固相にハイブリダイズされた酵素結合オリゴヌクレオチドを含む。酵素複合体を本発明の化合物と接触させて反応混合物を形成させ、反応混合物に光を生成させる。
【０２０６】
一部の実施形態では、方法は、核酸を含む疑いのある試料を提供する工程；核酸を固相上に固定化する工程；固定化された核酸と酵素結合オリゴヌクレオチドを接触させて酵素複合体を形成させる工程；ならびに、１，２-ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物により生成された光を検出する工程をさらに含み得、光の生成は核酸の存在を示し、放射された光の量が試料中に存在する核酸の量に相関し得るものとする。
【０２０７】
一部の実施形態では、方法は、酵素複合体の洗浄によって、未結合の酵素結合オリゴヌクレオチドを酵素複合体から除去する工程をさらに含み得る。これは、酵素複合体の構成要素と適合性のある緩衝液の添加および除去によって実行され得る。かかる緩衝液は診断技術分野において周知である。固相の追加の洗浄を実行し得る。
【０２０８】
固相は、ビーズ、試験管、マルチウェルプレート、マイクロアレイ、ゲル、膜、微粒子、ナノ結晶、量子ドット等であり得る。これらが作製される材料は診断技術分野において公知である。
【０２０９】
オリゴヌクレオチドは酵素に共有結合で結合されても非共有結合で結合されてもよい。非共有結合で結合される場合、オリゴヌクレオチドは標識に共有結合で結合され得、酵素は標識に非共有結合で結合可能な分子に共有結合で結合され得る。
【０２１０】
一部の実施形態では、上記のように、標識はビオチンであってもビオチン誘導体であってもよく、分子はアビジンであってもストレプトアビジンであってもよい。
【０２１１】
一部の実施形態では、標識はハプテンであり得、分子はハプテンに結合可能な抗体であり得る。ハプテンとしてのジゴキシゲニンおよび分子としての抗ジゴキシゲニンの使用は、診断技術分野において公知である。
【０２１２】
この方法の別の工程において、試料を単独または酵素部分を含む複合体としてのいずれかで上記に規定される本発明の化合物と接触させて反応混合物を形成させる。
【０２１３】
一部の実施形態では、試料を本発明の化合物に添加し得、一方、他の実施形態では本発明の化合物を含む水溶液を試料に添加し得る。
【０２１４】
一部の実施形態では、反応混合物は増強剤をさらに含み得る。増強剤はＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）および他のミセル形成物質を含み得る。増強剤は、天然物質（ウシ血清アルブミン等）または類似タイプの生物学的またはタンパク質ベースの分子または化合物、無脂肪ウシ血清アルブミン、または増強物質によりもたらされる検出した化学光放射の増強を改善する任意の増強添加物であり得る。増強剤は、ポリマーであり得る。増強剤としての代表的なポリマーおよびそれらの効果については、出典明示によって本明細書に引用されている米国特許第５，１４５，７７２号および同第５，５４７，８３６号に説明されている。これらのポリマーは、単独で使用してもよく、やはり出典明示によって本明細書に引用されている米国特許第５，９９４，０７３号に開示の増強値をさらに改善するため、界面活性剤添加物と共に使用してもよい。増強剤はポリマー性第四級アンモニウム塩、ポリマー性第四級ホスホニウム塩、またはそれらの組み合わせを含み得る。ポリマー性第四級アンモニウム塩は、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム）、ポリ［ビニルベンジル（塩化ベンジルジメチルアンモニウム）］、ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリブチルアンモニウム）］、ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリペンチルアンモニウム）］またはそれらの組み合わせであり得る。ポリマー性第四級ホスホニウム塩は、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）とポリ（塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム）とを含むコポリマー、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０２１５】
一部の実施形態では、増強剤はアクセプター色素をさらに含み得る。これらの実施形態の中で、アクセプター色素は蛍光色素であり得る。これらの実施形態の一部では、蛍光色素は、フルオレセイン、ローダミン、スルホローダミン、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ４０５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５４６、またはＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５５５であり得る。これらの実施形態の一部では、蛍光色素はフルオレセインであり得る。
【０２１６】
これらの方法の別の工程において、反応混合物に光を生成させる。
【０２１７】
一部の実施形態では、光は肉眼により観察されるか、またはＸ線フィルムもしくは生成された光を検出および測定できる装置を使用して測定され得る。生成された光を検出および測定できる装置としては、照度計、フィルムを用いるカメラ、または電荷結合カメラが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１８】
一部の実施形態では、本発明の化合物の添加後に反応混合物により生成された光を検出し、その場合、光の生成は抗原の存在を示し、生成された光の量が試料中に存在する抗原の量に相関し得、２５℃〜３７℃での光の生成は約１５分未満で最大に達する。これらの実施形態の一部では、光の生成は約１０分未満で最大に達する。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約５分未満で最大に達する。
【０２１９】
別の態様では、本発明は、上記および本明細書において開示される様々な実施形態に規定される本発明の化合物および緩衝液を含む試料中の分析物の存在または量を検出するためのキットを提供する。
【０２２０】
一部の実施形態では、キットは上記のような増強剤をさらに含み得る。一部の実施形態では、キットは上記のようなアクセプター色素をさらに含み得る。
【０２２１】
別の態様では、本発明は、構造：
2014516947.tif 000119
を有する化合物を提供する工程；該化合物を切断可能な酵素部分を含む酵素複合体を提供する工程；該酵素複合体を該化合物と接触させて反応混合物を形成させる工程；ならびに、該反応混合物に光を生成させる工程を含む光の生成方法を提供するが、ただし、酵素複合体が固相を含み、抗原が固相に固定化され、抗原がタンパク質である場合、固相は膜またはマイクロアッセイではないものとする。
【０２２２】
一部の実施形態では、酵素部分は、アルカリホスファターゼであり得る。
【０２２３】
一部の実施形態では、酵素部分は、抗原に結合可能であるアルカリホスファターゼ連結抗体であり得る。
【０２２４】
一部の実施形態では、酵素部分は、アルカリホスファターゼ連結抗原であり得る。
【０２２５】
一部の実施形態では、酵素部分は、アルカリホスファターゼ連結オリゴヌクレオチドであり得る。
【０２２６】
一部の実施形態では、アルカリホスファターゼは、抗体、抗原またはオリゴヌクレオチドに非共有結合で結合され得る。これらの実施形態の一部では、抗体、抗原またはオリゴヌクレオチドは、標識に共有結合で結合され得、アルカリホスファターゼは、標識に非共有結合で結合可能な分子に共有結合で結合される。これらの実施形態の一部では、標識はビオチンであってもビオチン誘導体であってもよく、分子はアビジンまたはストレプトアビジンであり、一方、これらの他の実施形態では、標識はハプテンであり得、分子はハプテンに結合可能な抗体である。
【０２２７】
一部の実施形態では、方法は、抗原を含む疑いのある試料を提供する工程；抗原に結合可能な第２の抗体を含む固相を提供する工程；試料およびアルカリホスファターゼ連結抗体を固相と接触させて酵素複合体を形成させる工程；ならびに、化合物の添加後に反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該抗原の存在を示し、生成された光の量が試料中に存在する抗原の量に相関し得、２５℃〜３７℃での光の生成は約１５分未満で最大に達する工程をさらに含み得る。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。これらの実施形態の一部では、方法は、酵素複合体から未結合のアルカリホスファターゼ連結抗体を除去する工程をさらに含み得る。
【０２２８】
一部の実施形態では、方法は、抗原を含む疑いのある試料を提供する工程；抗原に結合可能な抗体を含む固相を提供する工程；試料およびアルカリホスファターゼ連結抗原を固相と接触させて酵素複合体を形成させる工程；ならびに、化合物の添加後に反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該抗原の存在を示し、生成された光の量が試料中に存在する抗原の量に相関し得、２５℃〜３７℃での光の生成は約１５分未満で最大に達する工程をさらに含み得る。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。これらの実施形態の一部では、方法は、酵素複合体から未結合のアルカリホスファターゼ連結抗原を除去する工程をさらに含み得る。
【０２２９】
一部の実施形態では、方法は、核酸を含む疑いのある試料を提供する工程；核酸を固相に固定化する工程、固定化された核酸とアルカリホスファターゼ連結オリゴヌクレオチドを接触させて酵素複合体を形成させる工程；ならびに、化合物の添加後に反応混合物により生成された光を検出する工程であって、該光の生成が該核酸の存在を示し、生成された光の量が試料中に存在する核酸の量に相関し得、２５℃〜３７℃での光の生成は約１５分未満で最大に達する工程をさらに含み得る。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約１０分未満で最大に達し得る。これらの実施形態の一部では、光の生成は、約５分未満で最大に達し得る。これらの実施形態の一部では、方法は、未結合の酵素結合オリゴヌクレオチドを酵素複合体から除去する工程をさらに含み得る。
【０２３０】
一部の実施形態では、固相は、ビーズ、試験管、マルチウェルプレート、マイクロアレイ、ゲル、膜、微粒子、ナノ結晶、量子ドット等であり得る。これらの固相が作製される材料は診断技術分野において公知である。
【０２３１】
一部の実施形態では、反応混合物は増強剤をさらに含み得る。増強剤はＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）および他のミセル形成物質を含み得る。増強剤は、天然物質（ウシ血清アルブミン等）または類似タイプの生物学的またはタンパク質ベースの分子または化合物、無脂肪ウシ血清アルブミン、または増強物質によりもたらされる検出された化学光放射の増強を改善する任意の増強添加物であり得る。増強剤は、ポリマーであり得る。増強剤として代表的なポリマーおよびそれらの効果については、米国特許第５，１４５，７７２号および同第５，５４７，８３６号に説明されている（これらについては、出典明示により援用する）。これらのポリマーは、単独で使用してもよく、または米国特許第５，９９４，０７３号（これについても出典明示により援用する）に開示されたように、増強値をさらに改善するため、界面活性剤添加物と共に使用してもよい。増強剤はポリマー性第四級アンモニウム塩、ポリマー性第四級ホスホニウム塩、またはそれらの組み合わせを含み得る。ポリマー性第四級アンモニウム塩は、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム）、ポリ［ビニルベンジル（塩化ベンジルジメチルアンモニウム）］、ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリブチルアンモニウム）］、ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリペンチルアンモニウム）］またはそれらの組み合わせであり得る。ポリマー性第四級ホスホニウム塩は、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）とポリ（塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム）とを含むコポリマー、またはそれらの組み合わせであり得る。これらの実施形態の一部では、増強剤はポリマー性第四級アンモニウム塩、ポリマー性第四級ホスホニウム塩、またはそれらの組み合わせを含み得る。これらの実施形態の一部では、ポリマー性第四級アンモニウム塩は、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム）、ポリ［ビニルベンジル（塩化ベンジルジメチルアンモニウム）］、ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリブチルアンモニウム）］、ポリ［ビニル（塩化ベンジルトリペンチルアンモニウム）］またはそれらの組み合わせであり得る。これらの実施形態の一部では、ポリマー性第四級ホスホニウム塩は、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム）とポリ（塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム）とを含むコポリマー、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０２３２】
一部の実施形態では、増強剤はアクセプター色素をさらに含み得る。これらの実施形態の一部では、アクセプター色素は、フルオレセイン、ローダミン、スルホローダミン、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ４０５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５４６、またはＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５５５であり得る。
【実施例】
【０２３３】
以下の実施例は、本発明を説明するが限定しないことを意図する。
【０２３４】
機器。
化学発光を測定するために、９６／３８４-ウェルＨｙｄｒｏＳｐｅｅｄｐｌａｔｅ洗浄器（ＴｅｃａｎＧｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．、スイス国）、Ｏｒｉｏｎ−ＩＩ  ９６／３８４-ウェルマイクロプレート照度計（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ハンツビル、アラバマ）を使用した。
【０２３５】
ビーズおよびマイクロプレート。
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ  Ｄｙｎａｌ  ＡＳ、ノルウェー国）、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ９６-ウェルポリスチレンマイクロプレート、平底、高結合、白色（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３９２２）、およびＣｏｒｎｉｎｇ  ９６-ウェルマイクロプレート、丸底、白色（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３３５５）を入手した。
【０２３６】
化学発光基質および増強剤。
ＣＳＰＤ（登録商標）およびＣＤＰ-Ｓｔａｒ（登録商標）をＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンディエゴ、カリフォルニアから入手した。
ＡＰ-５化学発光基質（アルカリホスファターゼ用）をＬｕｍｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．（サウスフィールド、ミシガン）から入手した。これは本明細書において競合者の基質Ｄまたは競合者のＡＰ基質Ｄ、競合者のフラッシュ基質Ｄ、またはＶｅｎｄｏｒ  Ｘの基質Ｄと称す。
ＬｕｍｉＧＬＯ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（商標）化学発光基質（ＨＲＰ用）をＫＰＬ，Ｉｎｃ．（ゲイザースバーグ、メリーランド）から入手した。これは本明細書において競合者のＨＲＰ基質または競合者のグロー基質Ｅと称す。
Ｓａｐｐｈｉｒｅ-ＩＩ（商標）発光増強剤（Ｓａｐｐｈｉｒｅ-ＩＩ）、Ｓａｐｐｈｉｒｅ-ＩＩＩ（商標）発光増強剤（Ｓａｐｐｈｉｒｅ-ＩＩＩ）、Ｅｍｅｒａｌｄ（商標）-ＩＩ発光増強剤（Ｅｍｅｒａｌｄ-ＩＩ）、およびＥｍｅｒａｌｄ（商標）-ＩＩＩ発光増強剤（Ｅｍｅｒａｌｄ-ＩＩＩ）をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、フォスターシティー、カリフォルニアから入手した。
【０２３７】
精製アルカリホスファターゼアッセイ。
１００μＬの基質製剤を、アルカリホスファターゼ（ＢＢＩ  ＢｉｏＺｙｍｅ，ＡＬＰＩ１２Ｇ）の連続希釈液１０μＬに添加し、基質添加後、白色マイクロタイタープレートを速度論的に２分読み込んだ。
【０２３８】
ストレプトアビジン被覆Ｍ-２８０トシル基活性化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）中でカップリングされたビオチニル化アルカリホスファターゼ。
１０μＬの洗浄したビーズを、ビオチニル化アルカリホスファターゼ（ＢｉｏＬａｂｓ，Ｎ７０２２Ｓ）の１０倍連続希釈液４０μＬと２５℃で４０分間インキュベートした。ドーナツ状の磁石（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ  Ａｍｂｉｏｎの磁石カタログ番号：ＡＭ１００５０）でビーズを２〜３分間分離し、１％ＢＳＡを含む１倍ＰＢＳで３回洗浄した。
１００μＬ基質製剤を添加し、基質添加後、プレートを速度論的に２分読み込んだ。
【０２３９】
抗体捕獲のための固体支持体としてマイクロプレートを使用するサンドイッチＥＬＩＳＡ。
ヒトＩＬ-６に対するモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＡＢ２０６）を９６-ウェルマイクロプレートに固定化して標準的なヒト組換えＩＬ-６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，２０６-ＩＬ）に結合させる。ビオチニル化抗ヒトＩＬ-６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＢＡＦ２０６）を添加し、これはプレート上で結合したヒト組換えＩＬ-６に結合し、次いで、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，１６-０５０-０８４）を添加した。化学検出とは独立して、免疫アッセイ手順は同一であった。基質製剤を洗浄したウェルに添加して、プレートを基質添加後３７秒速度論的に読み込んだ。
【０２４０】
抗体捕獲のための固体支持体としてＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を使用するトロポニンサンドイッチＥＬＩＳＡ。
ヒト血清（Ｓｉｇｍａ，Ｓ７０２３）中のヒト心臓トロポニンＩ（ＨｙＴｅｓｔ  Ｌｔｄ．，８Ｔ５３）５０μＬを、ＬＹＮＸ  Ｒａｐｉｄ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎキット（ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ，ＬＮＫ０１２ＡＰ）を使用してアルカリホスファターゼにコンジュゲートした５０μＬのマウスα-ヒト心臓トロポニンＩ（α-ｃＴｎＩ）、ＳＤＩＸ（クローンＴＰＣ６）抗体と共に２５℃で１０分間インキュベートした。
α-ヒト心臓トロポニンＩ（α-ｃＴｎＩ）モノクローナル抗体（ＨｙＴｅｓｔ  Ｌｔｄ．，４Ｔ２１，Ｍａｂ５６０）とカップリングさせた１００μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を上記試料と撹拌しながら３７℃で３０分間インキュベートした。ビーズをドーナツ状の磁石（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ  Ａｍｂｉｏｎの磁石カタログ番号：ＡＭ１００５０）で２〜３分間分離し、ＴＢＳ-Ｔｗｅｅｎ洗浄緩衝液で３回洗浄した。
１００μＬの基質製剤を添加し、プレートを基質添加後２分速度論的に読み込んだ。
【実施例１】
【０２４１】
基質Ａの合成
図１〜図４に概説する反応スキームによって基質Ａを作製した。
図１に示すように、４-Ｍｅ-３-ＯＢＮ-ベンズアルデヒドを作製した。１７．５６ｇの出発材料によって１３．６ｇの最終生成物を得た。４-Ｍｅ-３-ＯＢＮ-ベンズアルデヒドから開始して図２に示すように４-Ｍｅ-Ｐｈｅホスフェートを作製した。１３．６ｇの出発材料によって１７．７ｇの最終生成物を得た。図３に示す反応スキームによって４-Ｍｅ-Ｐｈｅホスフェートから開始して基質Ａのエノールエーテル前駆体を作製した。５．６ｇの出発材料によって２．１ｇの最終生成物を得た。基質Ａのエノールエーテル前駆体から開始して図４に示すように基質Ａを作製した。１．５ｇの出発材料によって１．３７ｇの最終生成物を得た。
本発明の化合物は、当業者にとって公知の変更を加えた上記反応スキームによって作製することができる。
【実施例２】
【０２４２】
マイクロタイタープレートにおいて２５℃で行ったジオキセタン基質の速度論試験
２５℃で実行する「精製アルカリホスファターゼアッセイ」プロトコルを使用してＣＳＤＰ、ＣＤＰ-Ｓｔａｒ、基質Ａおよび基質Ｂによる光の放射の速度論を検討した。
【０２４３】
図６は、観察した光の放射の経時変化の結果を示す。当該結果は、基質ＡおよびＢが５〜１０分で光の最大放射に到達したが、ＣＤＰ-Ｓｔａｒは３０〜６０分後に到達したことを示す。試験したすべての基質が、光の最大放射に到達後、数時間の信号安定性を示した。
【０２４４】
図７は、ＣＤＰ-Ｓｔａｒ、基質Ａ、基質ＢおよびＡＰ-５と共に様々な濃度のアルカリホスファターゼを使用して、所定時点で総放射を読み込み、実行した感度曲線を示す。感度を、信号対雑音比が２と等しいアルカリホスファターゼの最低濃度として定義した。ＣＤＰ-Ｓｔａｒ、基質Ａ、および基質Ｂの感度はＡＰ-５の感度の１０倍を超えることを見出した。
【実施例３】
【０２４５】
マイクロタイタープレートにおいて２５℃で行ったＩＬ-６免疫アッセイにおける基質Ａ、ＣＳＰＤ、およびＣＤＰ-Ｓｔａｒの速度論評価
「抗体捕獲のための固体支持体としてマイクロプレートを使用するサンドイッチＥＬＩＳＡ」プロトコルにおいて２５℃で、基質Ａ、ＣＳＤＰ、およびＣＤＰ-Ｓｔａｒによる光の放射の速度論を検討した。
【０２４６】
図８は、Ｓａｐｐｈｉｒｅ-ＩＩを併用したＣＳＰＤ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ-ＩＩＩを併用したＣＳＰＤ、およびＳａｐｐｈｉｒｅ-ＩＩを併用したＣＤＰ-Ｓｔａｒと比較時の基質Ａによる光放射の時間経過を示す。基質Ａによる光の最大放射は、ＣＳＰＤおよびＣＤＰ-Ｓｔａｒによる３０〜６０分に対して約５分時点である。
【０２４７】
図９は、Ｓａｐｐｈｉｒｅ-ＩＩおよび基質Ａを併用した２５℃でのＣＤＰ-Ｓｔａｒの信号対雑音比を示す。ＣＤＰ-Ｓｔａｒによると、最大性能のためにはこの基質を添加後１５分待つ必要がある。基質Ａの場合、早期グロー信号によって、アッセイの観察した時間経過にわたって安定した信号対雑音比が得られ、マイクロプレートＥＬＩＳＡにとって理想的なものとなった。
【実施例４】
【０２４８】
マイクロタイタープレートにおいて３７℃で行ったＩＬ-６免疫アッセイにおける基質Ａ、Ｂ、ＣおよびＣＤＰ-Ｓｔａｒの速度論的評価
「抗体捕獲のための固体支持体としてマイクロプレートを使用するサンドイッチＥＬＩＳＡ」プロトコルにおいて３７℃で、基質Ａ、Ｂ、ＣおよびＣＤＰ-Ｓｔａｒによる光放射の速度論を検討した。
【０２４９】
図１０は、適切な低い分析物濃度の代表的なものである免疫アッセイにおける２４ｐｇ／ｍｌのＩＬ-６の速度論を示す。Ｅｍｅｒａｌｄ-ＩＩを併用したＣＤＰ-Ｓｔａｒの光の最大放射到達時間は１５〜３０分であるが、基質Ａ、ＢおよびＣの光の最大放射到達時間は、それぞれ３分、２分および即時である。
【０２５０】
図１１は、競合者の基質Ｄと比較した基質Ａ、ＢおよびＣの信号（光放射）および信号対雑音についての速度論を示す。基質Ａ、ＢおよびＣについて観察された一定の信号対雑音比は検出時間中における柔軟性を可能にするため、これらの基質を使用する免疫アッセイはほとんどの機器形式と適合可能となる。
【実施例５】
【０２５１】
マイクロタイタープレート上３７℃で行った免疫アッセイ系における基質Ａ、Ｂ、およびＣの感度比較
「抗体捕獲のための固体支持体としてマイクロプレートを使用するサンドイッチＥＬＩＳＡ」プロトコルにおいて３７℃で、Ｅｍｅｒａｌｄ-ＩＩ、競合者のＡＰ基質Ｄ、および競合者のＨＲＰ基質と共に基質Ａ、基質Ｂ、基質Ｃ、ＣＤＰ-Ｓｔａｒを使用した場合の感度を検討した。
【０２５２】
図１２は、基質Ａ、ＢおよびＣがもたらす感度が、競合者のＡＰ基質Ｄおよび競合者のＨＲＰ基質で観察された感度の５〜８倍超であることを示す。感度は、信号対雑音２で検出した最低ｈＩＬ-６量と定義される。
【実施例６】
【０２５３】
基質Ａの貯蔵安定性
「精製アルカリホスファターゼアッセイ」プロトコルを使用して-２０℃、４℃、および３７℃で保存した基質Ａ試料による光の最大放射を検討した。これらの温度で保存した試料を、８０日間の経過を通して同じ日にアッセイした。
【０２５４】
図１３は、本試験の結果を示す。３７℃加速曲線の外挿に基づき、基質Ａのリアルタイム（４℃）安定性は、１４ヶ月間と推定される。
【実施例７】
【０２５５】
室温でのＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ-２８０ビーズ上の基質Ａ、ＢおよびＣの速度論的評価
ビオチン標識アルカリホスファターゼと結合したストレプトアビジン標識トシル基活性化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ-２８０ビーズを使用して、基質Ａ、基質Ｂ、基質Ｃ、Ｅｍｅｒａｌｄ-ＩＩを併用したＣＤＰ-Ｓｔａｒ、競合者のフラッシュ基質Ｄ、および競合者のフロー（Ｆｌｏｗ）基質Ｅの光放射速度論および信号対雑音を検討した。２０μｇのストレプトアビジン標識Ｄｙｎａｂｅａｄｓを０．０４ｎｇのビオチン標識アルカリホスファターゼと結合させた。評価は室温で行った。
【０２５６】
図１４は、この評価の結果を示す。基質Ｂは光の最大放射までの急傾斜を有する点で目立ち、観察時間経過全体を通して一定の信号対雑音を持続した。基質Ａの光の最大放射までの傾斜は基質Ｂの光の最大放射までの傾斜より緩慢であったが、基質Ｃの光の最大放射までの傾斜は非常に急速であった。
【実施例８】
【０２５７】
室温でのＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ-２８０ビーズ上における基質Ａ、ＢおよびＣの感度曲線
ビオチン標識アルカリホスファターゼと結合したストレプトアビジン標識トシル基活性化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ-２８０ビーズを使用する「ストレプトアビジン被覆Ｍ-２８０トシル基活性化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）でカップリングしたビオチニル化アルカリホスファターゼ」プロトコルを使用して、基質Ａ、基質Ｂ、基質Ｃ、Ｅｍｅｒａｌｄ-ＩＩを併用したＣＤＰ-Ｓｔａｒ、競合者のフラッシュ基質Ｄ、および競合者のグロー基質Ｅの感度を検討した。２０μｇのストレプトアビジン標識Ｄｙｎａｂｅａｄｓを可変量のビオチン標識アルカリホスファターゼと結合させた。各基質の至適読み込み時点および室温で評価を行った。
【０２５８】
図１５は、この評価の結果を示す。基質Ａにより、高い信号および信号対雑音比が得られる。基質Ｂにより、最高信号および高信号対雑音比が得られる。基質Ｃの感度は競合者のフラッシュ基質Ｄに類似していた。基質Ｂの性能は、評価したジオキセタンと同等以上である。
【０２５９】
基質Ａ、基質Ｂ、基質Ｃ、Ｅｍｅｒａｌｄ-ＩＩを併用したＣＤＰ-Ｓｔａｒ、競合者のフラッシュ基質Ｄ、および競合者のグロー基質Ｅの感度を上記のように検討し、信号を２分目に読み込んだ。
【０２６０】
図１６は、この評価の結果を示す。基質Ｂの性能は、至適読み込み時点での他の基質と同等以上である。
【実施例９】
【０２６１】
３７℃でのＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅカルボン酸ビーズ上の基質Ａ、基質ＢおよびＣＤＰ-Ｓｔａｒの光放射速度論および信号対雑音
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅカルボン酸ビーズを使用する「抗体捕獲のための固体支持体としてＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を使用するトロポニンサンドイッチＥＬＩＳＡ」プロトコルを使用して、Ｅｍｅｒａｌｄ-ＩＩＩを併用した基質Ａ、基質Ｂ、およびＥｍｅｒａｌｄ-ＩＩを併用したＣＤＰ-Ｓｔａｒの光の放射の速度論および信号対雑音を検討した。プロトコルを１６ｐｇ／ｍＬ  ｃＴｎｌを使用して３７℃で実行した。
【０２６２】
図１７は、この評価の結果を示す。信号対雑音比は基質製剤によって経時的に変動した。基質Ｂの信号対雑音比は最初の１０分間において一定した。
【実施例１０】
【０２６３】
至適読み込み時点および３７℃での免疫アッセイ性能
「抗体捕獲のための固体支持体としてＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を使用するトロポニンサンドイッチＥＬＩＳＡ」プロトコルを３７℃で使用して、Ｅｍｅｒａｌｄ-ＩＩＩを併用した基質Ａ、基質Ｂ、およびＥｍｅｒａｌｄ-ＩＩを併用したＣＤＰ-Ｓｔａｒの性能を検討した。
【０２６４】
図１８は、この評価の結果を示す。基質Ｂにより、最高の信号が得られ、その性能は高いバックグラウンドのために信号対雑音比において他の基質製剤試験と同様である。
【実施例１１】
【０２６５】
基質Ａを使用した免疫アッセイにおけるビーズおよび発光増強剤の評価
トシル基活性化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ-２８０、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅカルボン酸、およびＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ-２７０エポキシをα-ヒト心臓トロポニンＩ（α-ｃＴｎＩ）モノクローナル抗体（ＨｙＴｅｓｔ  Ｌｔｄ．，４Ｔ２１、Ｍａｂ５６０）とカップリングさせた。
【０２６６】
「抗体捕獲のための固体支持体としてＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を使用するトロポニンサンドイッチＥＬＩＳＡ」プロトコルを３７℃で使用して、Ｓａｐｐｈｉｒｅ-ＩＩＩを併用した基質ＡおよびＥｍｅｒａｌｄ-ＩＩＩを併用した基質のアッセイ性能を検討した。
【０２６７】
図１９は、この評価の結果を示す。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ-２７０エポキシビーズにより、最高のアッセイ性能が得られた。試験したすべてのビーズタイプについてＥｍｅｒａｌｄ-ＩＩＩ発光増強剤により、より高い信号および幾分良好な感度が得られた。Ｓ-ＩＩＩはＳａｐｐｈｉｒｅ-ＩＩＩを指し、Ｅ-ＩＩＩはＥｍｅｒａｌｄ-ＩＩＩを指す。
【実施例１２】
【０２６８】
トロポニンサンドイッチビーズ免疫アッセイ
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ-２７０エポキシをα-ヒト心臓トロポニンＩ（α-ｃＴｎＩ）モノクローナル抗体（ＨｙＴｅｓｔ  Ｌｔｄ．，４Ｔ２１，Ｍａｂ５６０）とカップリングさせた。「抗体捕獲のための固体支持体としてＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を使用するトロポニンサンドイッチＥＬＩＳＡ」プロトコルを３７℃で使用して、基質Ａ、基質Ｂ、基質Ｃ、Ｅｍｅｒａｌｄ-ＩＩを併用したＣＤＰ-ＳｔａｒおよびＶｅｎｄｏｒ  Ｘの基質Ｄの免疫アッセイにおける性能を検討した。
【０２６９】
図２０は評価の結果を示す。信号対雑音比２で、基質Ａ、ＢまたはＣにより、ヒト血清中ヒト心臓トロポニンＩ（ｃＴｎｌ）の０．１ｎｇ／ウェル程度の低い検出下限値およびダイナミックレンジ約３ログが得られた。Ｖｅｎｄｏｒ  Ｘの基質Ｄにより、ｃＴｎｌの検出下限値０．６ｎｇ／ウェルおよびダイナミックレンジ約３ログが得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
2014516947.tif 000179
2014516947.tif 000180
2014516947.tif 000181
2014516947.tif 000182
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