(57)【要約】本発明は、Ｔヘルパー２型（Ｔｈ２）介在性疾患の処置のための方法および薬学的組成物に関する。より詳細には、本発明は、Ｔヘルパー２型（Ｔｈ２）介在性疾患、特にアレルギー性喘息の処置における使用のためのＳｕｖ３９ｈ１−ＨＰ１ａサイレンシング経路阻害剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔヘルパー２型（Ｔｈ２）介在性疾患の処置における使用のためのＳｕｖ３９ｈ１−ＨＰ１αサイレンシング経路阻害剤。
【請求項２】
Ｈ３Ｋ９−ヒストンメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１阻害剤；Ｈ３Ｋ９−ヒストンメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１遺伝子の発現阻害剤、ＨＰ１α遺伝子の発現阻害剤およびＨＰ１αへのＨ３Ｋ９ｍｅ３の結合阻害剤から成る群より選択される、請求項１記載の使用のためのＳｕｖ３９ｈ１−ＨＰ１αサイレンシング経路阻害剤。
【請求項３】
ケトシン（chaetocin）である、請求項１または２記載の使用のためのＳｕｖ３９ｈ１−ＨＰ１αサイレンシング経路阻害剤。
【請求項４】
Ｔヘルパー２型（Ｔｈ２）介在性疾患が、移植片免疫疾患（慢性ＧＶＨＤ）、自己免疫疾患（特に器官非特異的自己免疫疾患）およびＴｈ２型アレルギー疾患から成る群より選択され、典型的に例証される疾患が、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、全身性進行性強皮症、関節リウマチ、間質性膀胱炎、橋本病、バセドー病、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、萎縮性胃炎、悪性貧血、アジソン病、天疱瘡、類天疱瘡、水晶体ブドウ膜炎（lenticular uveitis）、交感性眼炎、原発性胆汁性肝硬変、活動性慢性肝炎、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発動脈炎、リウマチ熱、糸球体腎炎（ループス腎炎、ＩｇＡ腎症（IgA nephtopathy）など）、アレルギー性脳炎、アトピー性アレルギー疾患（例えば、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、花粉症、蕁麻疹、食物アレルギーなど）、オーメン症候群、春季カタルおよび好酸球増加症候群である、前記請求項のいずれか記載の使用のためのＳｕｖ３９ｈ１−ＨＰ１αサイレンシング経路阻害剤。
【請求項５】
Ｔヘルパー２型（Ｔｈ２）介在性疾患が喘息またはアレルギー性喘息である、前記請求項のいずれか記載の使用のためのＳｕｖ３９ｈ１−ＨＰ１αサイレンシング経路阻害剤。
【請求項６】
複数の被験物質にＳｕｖ３９ｈ１−ＨＰ１αサイレンシング経路を阻害する能力があるかどうかを試験すること、および該経路を阻害できる物質を選択することからなるステップを含む、Ｔｈ２介在性疾患の処置のための薬物をスクリーニングするための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、Ｔヘルパー２型（Ｔｈ２）介在性疾患の処置のための方法および薬学的組成物に関する。
【０００２】
発明の背景：
抗原に遭遇後に、ＣＤ４＋ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞の分化は、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７またはＴｒｅｇを含めた異なる種類のエフェクターＴリンパ球を産生する別個の発生プログラムをたどる。各サブタイプは、系列指令的な転写因子およびシグネチャーサイトカインの特異的発現によって特徴づけられる。近年、Ｔｈ表現型の安定性および柔軟性が免疫応答に重要であることが認識されている。共通前駆細胞からのＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞の分化は、それぞれマスターレギュレーターであるＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ−３との間の交差拮抗作用によって起こり、サイトカイン遺伝子の相互排他的な発現に繋がる。Ｔｈ１細胞は、細胞内病原体の排除に重要なＩＦＮγを産生する一方で、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３を産生し、体液性免疫および細胞外病原体の排除に重要である。これらのＴｈ２サイトカインは、喘息を含めたアレルギー疾患の病態生理に重要な役割を果たす。
【０００３】
喘息は、肺気道の炎症および気管支反応亢進を伴う慢性疾患であり、下気道の可逆性閉塞に繋がる。診断の状況で、気管支反応亢進は、メタコリンまたはヒスタミンに曝露後の気管支気流量減少によって証明される。気道閉塞を誘発する天然トリガーには、呼吸アレルゲン、冷気、運動、上気道ウイルス感染、およびタバコの煙が挙げられる。アレルゲンを用いた気管支誘発は、気管支気流の即時型早期免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）介在性減少に続き、多くの患者における４〜８時間の気管支気流減少を伴う後期ＩｇＥ介在性反応を誘導する。喘息気道は、肺過膨張、平滑筋肥大、網状板での線維症、粘膜浮腫、上皮細胞脱落、繊毛細胞破壊、および粘液腺分泌過多を示す。顕微鏡的に、喘息は、気管支組織、気管支分泌物、および粘液中の好酸球、マスト細胞、好中球、リンパ球、および形質細胞数の増加の存在によって特徴づけられる。Ｔｈ２パターンのサイトカインを産生する活性化ＣＤ４ Ｔリンパ球は、疾患表現型の開始、発展および維持に中心的であるように見える。例えば、これらの細胞によって産生されるサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９およびＩＬ−１３を含む）は、炎症細胞による浸潤およびメディエーター放出、ならびにＩｇＭからＩｇＥへのアレルゲン特異的抗体のアイソタイプスイッチをレギュレーションする。非造血細胞の活性、例えば杯細胞による粘液分泌過多も、Ｔｈ２サイトカインによってレギュレーションされる。
【０００４】
従って、Ｔｈ２免疫応答をモデュレーションするための方法は、Ｔｈ２介在性疾患の処置のために大いに望ましい。
【０００５】
Ｔｈ１表現型およびＴｈ２表現型は細胞分裂を経て遺伝的に伝えることができるので、エピジェネティック修飾がＴ細胞の分化をレギュレーションすると提唱されている。関心を引くことに、コミットされた（committed）Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞においていくつかのヒストンＨ３およびＨ４の修飾のレベルとサイトカイン遺伝子の活性またはサイレンシングとの間に相関が観察された。その上、転写因子のローカス中の活性（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）マークと不活性（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）マークとの組合せが、それらの転写能を形作ると提唱された。しかし、エピジェネティックマークの確立の根底にある実際の経路がＴ細胞分化に持つ意味を実証するためにそれらの経路が直接操作されることはなかった。
【０００６】
発明の概要：
本発明は、Ｔヘルパー２型（Ｔｈ２）介在性疾患、特にアレルギー性喘息の処置における使用のためのＳｕｖ３９ｈ１−ＨＰ１αサイレンシング経路阻害剤に関する。
【０００７】
発明の詳細な説明：
本発明者らは、Ｔｈ２細胞のコミットメントを維持するエピジェネティック経路を同定する。Ｔｈ２細胞において、サイレンシングされたＴｈ１遺伝子（ＩｆｎｇおよびＴｂｘ２１）のレギュレーション領域は、高レベルの抑制性ヒストンマークＨ３Ｋ９ｍｅ３および低レベルの活性Ｈ３Ｋ９ａｃマークを担持する。この位置でのメチル化とアセチル化との間の均衡は、Ｈ３Ｋ９−ヒストンメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１を欠損しているＴｈ２細胞で障害を有していた。それにもかかわらず、これらの細胞は、依然として完全に正常なＴｈ２プロファイルを提示した。Ｓｕｖ３９ｈ１欠損Ｔｈ２細胞は、Ｔｈ１条件で再培養した場合にのみ、野生型とは対照的にＩｆｎｇ遺伝子およびＴｂｘ２１遺伝子を再発現した。Ｔｈ２細胞での安定なＴｈ１遺伝子サイレンシングは、Ｓｕｖ３９ｈ１依存的にＴｈ１遺伝子プロモーターに動員されたＨ３Ｋ９ｍｅ３結合性ヘテロクロマチンタンパク質１−αの発現を必要とした。Ｔｈ２アレルギー性喘息のマウスモデルでは、Ｓｕｖ３９ｈ１の欠失は、Ｔｈ１応答への傾斜および肺病態の軽減も招いた。本発明者らは、Ｓｕｖ３９ｈ１−ＨＰ１αサイレンシング経路がＴｈ１遺伝子をエピジェネティックにロック（lock away）してＴｈ２細胞系列の忠実度をin vitroとin vivoの両方で維持するので、Ｓｕｖ３９ｈ１の阻害がＴｈ２介在性疾患の処置に特に適切でありうると結論付ける。
【０００８】
従って、本発明は、Ｔヘルパー２型（Ｔｈ２）介在性疾患の処置における使用のためのＳｕｖ３９ｈ１−ＨＰ１αサイレンシング経路阻害剤に関する。
【０００９】
本明細書に使用されるような用語「ＨＰ１α」は、当技術分野におけるその一般的な意味を持ち、メチル化リシン残基を介してヒストンタンパク質に結合することができる単一のＮ末端クロモドメインと、ホモ二量体化およびいくつかのクロマチン関連非ヒストンタンパク質残基との相互作用を担うＣ末端クロモシャドウドメイン（ＣＳＤ）とを有するヘテロクロアチン（heterochroatin）タンパク質１αを表す（Saunders WS, Chue C, Goebl M, Craig C, Clark RF, Powers JA, Eissenberg JC, Elgin SC, Rothfield NF, Earnshaw WC. Molecular cloning of a human homologue of Drosophila heterochromatin protein HP1 using anti-centromere autoantibodies with anti-chromo specificity. J Cell Sci. 1993 Feb;104 ( Pt 2):573-82）。該タンパク質は、クロモボックスタンパク質ホモログ５、ＨＰ１Ｈα、抗原ｐ２５、ＨＰ１αホモログ、ヘテロクロマチンタンパク質１−α、ヘテロクロマチンタンパク質１ホモログα、およびクロモボックスホモログ５（ＨＰ１αホモログ、Drosophila）としても公知である。
【００１０】
本明細書に使用されるような用語「Ｓｕｖ３９ｈ１」または「Ｈ３Ｋ９−ヒストンメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１」は、当技術分野におけるその一般的な意味を持ち、ヒストンＨ３のＬｙｓ−９をメチル化するヒストンメチルトランスフェラーゼ「斑入りサプレッサー３−９ホモログ１（suppressor of variegation 3-9 homolog 1）（Drosophila）」を表す（Aagaard L, Laible G, Selenko P, Schmid M, Dorn R, Schotta G, Kuhfittig S, Wolf A, Lebersorger A, Singh PB, Reuter G, Jenuwein T (Jun 1999). "Functional mammalian homologues of the Drosophila PEV-modifier Su(var)3-9 encode centromere-associated proteins which complex with the heterochromatin component M31". EMBO J 18 (7): 1923-38.）。該ヒストンメチルトランスフェラーゼは、ＭＧ４４、ＫＭＴ１Ａ、ＳＵＶ３９Ｈ、ヒストン−リシンＮ−メチルトランスフェラーゼＳＵＶ３９Ｈ１、Ｈ３−Ｋ９−ＨＭＴａｓｅ １、ＯＴＴＨＵＭＰ００００００２４２９８、Ｓｕ（ｖａｒ）３−９ホモログ１、リシンＮ−メチルトランスフェラーゼ１Ａ、ヒストンＨ３−Ｋ９メチルトランスフェラーゼ１、斑入り位置効果３−９ホモログ、ヒストン−リシンＮ−メチルトランスフェラーゼ、またはＨ３リシン−９特異的タンパク質１としても公知である。この用語は、ＳＵ（ＶＡＲ）３−９などのＳｕｖ３９ｈ１の全てのオルソログを包含する。
【００１１】
本明細書に使用されるような用語「Ｓｕｖ３９ｈ１−ＨＰ１αサイレンシング経路」は、Bannister, A. J. et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature 410, 120-124, doi:10.1038/35065138によって最初に記載された経路を表す。本発明の状況で、Ｓｕｖ３９ｈ１はＨ３Ｋ９をトリメチル化し、転写機構の結合を立体的に阻害する、または多様なクロマチン修飾因子を誘引する、ＨＰ１α動員に繋がり、ヘテロクロマチンの維持および拡大を可能にし、最終的に、サイトカインＩＦＮγおよびマスターレギュレーターＴｂｅｔをコードする遺伝子などのＴｈ１遺伝子の発現の発現をロックする。特に本発明者らは、Ｉｆｎｇローカスのプロモーターおよびいくつかのエンハンサー内の抑制性Ｈ３Ｋ９トリメチル化の重大な部分がＳｕｖ３９ｈ１によって確立されることを示す。Ｓｕｖ３９ｈ１欠損Ｔｈ２細胞におけるこのトリメチル化の欠失は、Ｈ３Ｋ９アセチル化（活性マーク）の蓄積およびＨＰ１αの欠失に繋がる。その上、Ｓｕｖ３９ｈ１の不在下でＨ３Ｋ９ａｃは、Ｉｆｎｇの調節エレメントだけでなくＴｂｘ２１（Ｔｂｅｔをコードする）のプロモーターにも蓄積する。これは、潜在的に、通常はＳｕｖ３９ｈ１によって抑制部位に動員されるヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）が欠失することが原因で起こる。アセチル化の増加は、残りのＨ３Ｋ９ｍｅ３へのＨＰ１αの結合を妨害する。従って、Ｓｕｖ３９ｈ１の酵素活性とＨＤＡＣの動員との両方の欠如が、Ｔｈ１遺伝子へのＨＰ１α結合の欠如に繋がる。これは、安定にサイレンシングされたＩｆｎｇおよびｔｂｘ２１のロック解除を招くことによって、Ｔｈ２表現型の忠実度を損なう。
【００１２】
本発明によると、Ｓｕｖ３９ｈ１−ＨＰ１αサイレンシング経路阻害剤は、Ｈ３Ｋ９−ヒストンメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１阻害剤；Ｈ３Ｋ９−ヒストンメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１遺伝子の発現阻害剤、ＨＰ１α遺伝子の発現阻害剤およびＨＰ１αへのＨ３Ｋ９ｍｅ３の結合阻害剤から成る群より選択される。
【００１３】
用語「Ｈ３Ｋ９−ヒストンメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１阻害剤」は、Ｈ３Ｋ９−ヒストンメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１によるヒストンＨ３のＬｙｓ−９のメチル化を阻害する能力を有する任意の天然または非天然化合物を表す。
【００１４】
化合物の阻害活性は、Greiner D. Et al. Nat Chem Biol. 2005 Aug;1(3):143-5またはEskeland, R. et al. Biochemistry 43, 3740-3749 (2004)に記載されているような様々な方法を用いて決定することができる。
【００１５】
本発明の状況で、Ｈ３Ｋ９−ヒストンメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１の阻害剤は、好ましくは、Ｓｕｖ３９ｈ２のような他のヒストンメチルトランスフェラーゼに比べてＨ３Ｋ９−ヒストンメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１に選択的である。「選択的」によって、阻害剤の親和性が他のヒストンメチルトランスフェラーゼに対する親和性より少なくとも１０倍、好ましくは２５倍、より好ましくは１００倍、いっそう好ましくは５００倍高いことが意味される。
【００１６】
典型的には、Ｈ３Ｋ９−ヒストンメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１阻害剤は、有機小分子である。用語「有機小分子」は、医薬品に一般に使用される有機分子に匹敵する大きさの分子を表す。この用語は、生物学的高分子（例えばタンパク質、核酸など）を除く。好ましい有機小分子は、大きさが最大約５０００Da、より好ましくは最大２０００Da、最も好ましくは最大約１０００Daに及ぶ。
【００１７】
特定の一態様では、Ｈ３Ｋ９−ヒストンメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１阻害剤は、Greiner D, Bonaldi T, Eskeland R, Roemer E, Imhof A. Identification of a specific inhibitor of the histone methyltransferase SU(VAR)3-9. Nat Chem Biol. 2005 Aug;1(3):143-5. Epub 2005 Jul 17.; Weber, H. P., et al., The molecular structure and absolute configuration of chaetocin. Acta Cryst., B28, 2945-2951 (1972); Udagawa, S., et al., The production of chaetoglobosins, sterigmatocystin, O-methylsterigmatocystin, and chaetocin by Chaetomium spp. and related fungi. Can. J. microbiol., 25, 170-177 (1979).; Gardiner, D. M., et al., The epipolythiodioxopiperazine (ETP) class of fungal toxins: distribution, mode of action, functions and biosynthesis. Microbiol., 151, 1021-1032 (2005)によって記載されたようなケトシン（chaetocin）（ＣＡＳ２８０９７−０３−２）である。例えば、ケトシンはSigma Aldrichから市販されている。
【００１８】
別の態様では、Ｈ３Ｋ９−ヒストンメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１阻害剤はアプタマーである。アプタマーは、分子認識に関して抗体の代替物に相当するクラスの分子である。アプタマーは、高い親和性および特異性で実質的に任意のクラスのターゲット分子を認識する能力を有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチド配列である。そのようなリガンドは、Tuerk C. and Gold L., 1990に記載されているようなランダム配列ライブラリーの試験管内進化法（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment）（ＳＥＬＥＸ）を経て単離することができる。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成によって入手できる。このライブラリーでは、各メンバーは、最終的に化学修飾された独特な配列の直鎖オリゴマーである。このクラスの分子の可能な修飾、使用および利点は、Jayasena S.D., 1999に総説されている。ペプチドアプタマーは、２ハイブリッド法によってコンビナトリアルライブラリーより選択されるE. coliチオレドキシンＡ（Colas et al., 1996）などのプラットフォームタンパク質によって提示される、コンフォメーションが制約された抗体可変領域から成る。
【００１９】
本発明に使用するための発現阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物に基づきうる。アンチセンスＲＮＡ分子およびアンチセンスＤＮＡ分子を含めたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｈ３Ｋ９−ヒストンメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１またはＨＰ１αのｍＲＮＡに結合することによってその翻訳を直接遮断し、それ故にタンパク質の翻訳を阻止またはｍＲＮＡの分解を増加させ、それ故にＨ３Ｋ９−ヒストンメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１またはＨＰ１αの細胞内レベルを、それ故に活性を、減少させるように作用するであろう。例えば、少なくとも約１５塩基長であって、Ｈ３Ｋ９−ヒストンメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１またはＨＰ１αをコードするｍＲＮＡ転写体配列の独特な領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば従来のホスホジエステル技法によって合成し、例えば静脈内注射または注入によって投与することができる。配列が公知の遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためにアンチセンス技法を使用するための方法は、当技術分野において周知である（例えば米国特許第６，５６６，１３５号；第６，５６６，１３１号；第６，３６５，３５４号；第６，４１０，３２３号；第６，１０７，０９１号；第６，０４６，３２１号；および第５，９８１，７３２号参照）。
【００２０】
低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、本発明における使用のための発現阻害剤としても機能しうる。Ｈ３Ｋ９−ヒストンメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１またはＨＰ１αの遺伝子発現は、Ｈ３Ｋ９−ヒストンメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１またはＨＰ１α遺伝子発現が特異的に阻害される（すなわちＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉ）ように、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または低分子二本鎖ＲＮＡの産生を引き起こすベクターもしくは構築物と対象または細胞を接触させることによって減少させることができる。配列が公知の遺伝子に関して、適切なｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択するための方法は当技術分野において周知である（例えばTuschl, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002)；米国特許第６，５７３，０９９号および第６，５０６，５５９号；ならびに国際公開公報第０１／３６６４６号、第９９／３２６１９号、および第０１／６８８３６号参照）。本発明のｓｉＲＮＡのホスホジエステル結合の全てまたは部分は、有利に保護される。この保護は、一般に、当技術分野によって公知の方法を用いて化学経路を介して実施される。ホスホジエステル結合は、例えばチオールもしくはアミン官能基によって、またはフェニル基によって保護することができる。本発明のｓｉＲＮＡの５’および／または３’末端も、例えばホスホジエステル結合を保護するための上記技法を用いて、有利に保護される。ｓｉＲＮＡ配列は、有利には、少なくとも１２塩基長の連続ジヌクレオチドまたはそれらの誘導体を含む。
【００２１】
この核酸配列に関連して本明細書に使用されるような用語「ｓｉＲＮＡ誘導体」は、エリスロポエチンまたはそのフラグメントと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、一例として少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９８％の同一パーセンテージを有する核酸を表す。
【００２２】
本明細書に使用されるような、二つの核酸配列の間の「同一パーセンテージ」は、比較対象の二配列の最良のアライメントで得られる、該配列の間で同一な核酸のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは、純粋に統計的であり、これら二配列の間の差異は、核酸酸配列全体にランダムに分布する。本明細書に使用されるような「最良のアライメント」または「最適なアライメント」は、決定された同一パーセンテージ（下記参照）が最高になるアライメントを意味する。二つの核酸配列間の配列比較は、普通、予め最良のアライメントに従ってアライメントされたこれらの配列を比較することによって実現され；この比較は、局所類似性領域を同定および比較するために比較セグメントで実現される。比較を行うべき最良の配列アライメントは、手作業以外に、SMITHおよびWATERMAN（Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981）によって開発された全体的相同性アルゴリズム（global homology algorithm）を用いることによって、NEDDLEMANおよびWUNSCH（J. Mol. Biol., vol.48, p:443, 1970）によって開発された局所的相同性アルゴリズムを用いることによって、PEARSONおよびLIPMAN（Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988）によって開発された類似性方法を用いることによって、そのようなアルゴリズムを用いたコンピューターソフトウェア（Wisconsin Genetics software Package（Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA）中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ）を使用することによって、ＭＵＳＣＬＥ多重アライメントアルゴリズム（Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol. 32, p:1792, 2004）を使用することによって実現することができる。最良の局所的アライメントを得るために、好ましくはＢＬＡＳＴソフトウェアを使用することができる。二つの核酸配列の間の同一パーセンテージは、最適にアライメントされたこれら二つの配列を比較することによって決定され、これらの核酸配列は、これらの二つの配列の間で最適なアライメントを得るために参照配列に関して付加または欠失を含むことができる。同一パーセンテージは、これらの二つの配列の間で同一の位置の数を決定すること、およびこの数を、比較された位置の総数で割り算すること、および得られた結果に１００を掛け算してこれら二つの配列間の同一パーセンテージを得ることによって計算される。
【００２３】
ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ）もまた、本発明に使用するための発現阻害剤として機能しうる。
【００２４】
リボザイムもまた、本発明に使用するための発現阻害剤として機能しうる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒可能な酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機作は、リボザイム分子と相補的ターゲットＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションに続くエンドヌクレアーゼ的切断を伴う。従って、Ｈ３Ｋ９−ヒストンメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１またはＨＰ１αのｍＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ的切断を特異的および効率的に触媒する、操作されたヘアピンまたはハンマーヘッド型モチーフリボザイム分子が、本発明の範囲内で有用である。任意の潜在的ＲＮＡターゲット内の特異的リボザイム切断部位は、最初は、リボザイム切断部位（典型的には以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣが含まれる）に対してターゲット分子をスキャンすることによって同定される。同定した後、その切断部位を含むターゲット遺伝子領域に対応するリボヌクレオチド長約１５から２０の間の短いＲＮＡ配列に、オリゴヌクレオチド配列を不適切にするおそれがある、二次構造などの予測される構造特徴があるかどうか評価することができる。
【００２５】
発現阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドとリボザイムとの両方は、公知の方法によって調製することができる。これらには、例えば、固相ホスホルアマダイト（phosphoramadite）化学合成などによる化学合成技法が挙げられる。または、アンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のin vitroまたはin vivo転写によって産生させることができる。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターが組込まれている多種多様なベクターに組込むことができる。本発明のオリゴヌクレオチドに対する様々な改変は、細胞内安定性および半減期を増大させる一手段として導入することができる。可能な改変には、非限定的に、分子の５’および／もしくは３’末端へのリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加、またはオリゴヌクレオチド骨格内への、ホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートもしくは２’−Ｏ−メチルの採用が挙げられる。
【００２６】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびリボザイムは、単独で、またはベクターと共同でin vivo送達することができる。「ベクター」は、その最も広い意味で、細胞への、好ましくはＨ３Ｋ９−ヒストンメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１またはＨＰ１αを発現している細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはリボザイム核酸の導入を促進する能力がある任意の媒体である。好ましくは、ベクターは、そのベクターの不在下で生じるであろう分解度よりも低い分解度で核酸を細胞に輸送する。一般に、本発明に有用なベクターには、非限定的に、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはリボザイム核酸配列の挿入または組込みによって操作された、プラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルスまたは細菌起原から得られた他の媒体が挙げられる。ウイルスベクターが好ましい種類のベクターであり、ウイルスベクターには、非限定的に以下のウイルス由来の核酸配列が挙げられる：モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳ガンウイルス、およびラウス肉腫ウイルスなどのレトロウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン−バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；およびレトロウイルスなどのＲＮＡウイルス。ここに挙げないが当技術分野で公知の他のベクターも難なく採用することができる。
【００２７】
好ましいウイルスベクターは、可欠遺伝子が、関心が持たれる遺伝子と交換された非細胞変性真核生物ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスには、レトロウイルス（例えばレンチウイルス）が挙げられ、その生活環は、ゲノムウイルスＲＮＡからＤＮＡへの逆転写に続くホスト細胞ＤＮＡへのプロウイルス組込みを伴う。レトロウイルスは、ヒト遺伝子治療試験のために承認されている。複製欠損（すなわち所望のタンパク質の合成を指令する能力があるが、感染粒子を製造する能力がない）レトロウイルスが最も有用である。そのような遺伝的に変更されたレトロウイルス発現ベクターは、遺伝子のin vivo高効率トランスダクションに一般的な有用性を持つ。複製欠損レトロウイルスを生産するための標準プロトコール（プラスミドに外因性遺伝材料を組込む段階、パッケージング細胞系にプラスミドをトランスフェクションする段階、パッケージング細胞系によりリコンビナントレトロウイルスを生産する段階、組織培養培地からウイルス粒子を収集する段階、およびターゲット細胞にウイルス粒子を感染させる段階が含まれる）は、Kriegler, 1990およびMurry, 1991に提供されている。
【００２８】
ある特定の適用に好ましいウイルスは、遺伝子治療におけるヒトへの使用について既に承認されている二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスおよびアデノ随伴（ＡＡＶ）ウイルスである。実際に、それぞれ異なる組織向性を有する１２種の異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１〜１２）が公知である（Wu, Z Mol Ther 2006; 14:316-27）。リコンビナントＡＡＶは、依存性パルボウイルスＡＡＶ２から得られる（Choi, VW J Virol 2005; 79:6801-07）。アデノ随伴ウイルス１〜１２型は、複製欠損するように操作することができ、広範囲な細胞型および種に感染する能力がある（Wu, Z Mol Ther 2006; 14:316-27）。このウイルスは、さらに、熱および脂質溶媒安定性；造血細胞を含めた多様な系列の細胞における高いトランスダクション頻度；ならびに重感染阻害が欠如することで、複数系列のトランスダクションが可能なことなどの利点を有する。報告によれば、アデノ随伴ウイルスは、部位特異的にヒト細胞ＤＮＡに組込むことによって、挿入突然変異誘発の可能性およびレトロウイルス感染の挿入遺伝子発現の特徴の可変性を最小化することができる。加えて、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、組織培養において選択圧の不在下で１００回を超える継代にわたり追跡されたが、これは、アデノ随伴ウイルスのゲノムへの組込みが相対的に安定な事象であることを意味している。アデノ随伴ウイルスは、また、染色体外でも機能できる。
【００２９】
他のベクターにはプラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは、当技術分野で広範囲にわたり記載されており、当業者に周知である。例えばSambrook et al., 1989を参照されたい。この２、３年にプラスミドベクターは、抗原をコードする遺伝子を細胞にin vivo送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されてきた。プラスミドベクターは、多くのウイルスベクターが持つのと同じ安全上の懸念を持たないので、ＤＮＡワクチンにとって特に有利である。しかし、これらのプラスミドは、ホスト細胞と適合性のプロモーターを有するので、プラスミド内に作動的にコードされた遺伝子からペプチドを発現することができる。いくつかの一般に使用されるプラスミドには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣｌ９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０、およびｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。他のプラスミドは、当業者に周知である。追加的にプラスミドは、特異的ＤＮＡフラグメントを除去および付加するために制限酵素およびライゲーション反応を用いて特別設計することができる。プラスミドは、多様な非経口経路、粘膜経路および局所経路によって送達することができる。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下、または他の経路によって注射することができる。ＤＮＡプラスミドは、また、鼻腔内スプレーまたは点鼻薬、直腸坐剤によって、および経口的に投与することができる。ＤＮＡプラスミドは、また、遺伝子銃を用いて表皮または粘膜表面内に投与することができる。プラスミドは、水溶液の状態で、金粒子上で乾燥させて、または非限定的にリポソーム、デンドリマー、コクリエート（cochleate）およびマイクロカプセル化を含めた別のＤＮＡ送達系と共同して与えることができる。
【００３０】
好ましい一態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはリボザイム核酸配列は、異種調節領域、例えば異種プロモーターのコントロール下にある。プロモーターは、ミュラーグリア細胞、ミクログリア細胞、内皮細胞、周皮細胞およびアストロサイトに特異的でありうる。例えば、ミュラーグリア細胞での特異的発現は、適切な場合、グルタミンシンセターゼ遺伝子プロモーターによって得ることができる。プロモーターは、また、例えばＣＭＶプロモーターなどのウイルスプロモーターまたは任意の合成プロモーターでありうる。
【００３１】
特定の一態様では、Ｈ３Ｋ９−ヒストンメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１の遺伝子発現阻害剤はトリプトライドではない。
【００３２】
ＨＰ１αへのＨ３Ｋ９ｍｅ３の結合阻害剤は、有機小分子、アプタマーまたはポリペプチドより選択することができる。特定の一態様では、ポリペプチドは、ＨＰ１αの機能的等価物でありうる。本明細書に使用されるような「ＨＰ１αの機能的等価物」は、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３に結合することによってＨＰ１αへのＨ３Ｋ９ｍｅ３の結合を阻止する能力のある化合物である。用語「機能的等価物」には、ＨＰ１αのフラグメント、突然変異体、および変異タンパク質（mutein）が挙げられる。従って、用語「機能的等価物」には、アミノ酸配列を、例えば１個または複数のアミノ酸の欠失、置換または付加によって変更することにより、タンパク質アナログがＨ３Ｋ９ｍｅ３に結合する能力を保持するが、Ｔｈ１遺伝子の発現をロックする能力を失うことによって得られる、任意のＨＰ１α等価物が含まれる。アミノ酸置換は、例えばアミノ酸配列をコードするＤＮＡの点突然変異によって作ることができる。特に、機能的等価物は、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３と相互作用するＨＰ１αの全部または一部を含む。当業者に明らかなように、本発明のポリペプチドは、任意の適切な手段によって産生することができる。本発明による使用に十分な量の機能的等価物を産生するために、本発明のポリペプチドを収容するリコンビナントホスト細胞を適切な条件下で培養することによって、発現を好都合に達成することができる。好ましくは、ポリペプチドは、リコンビナント手段によって、コードする核酸分子からの発現によって産生される。多様な異なるホスト細胞でのクローニングおよびペプチドの発現のためのシステムは、周知である。
【００３３】
本明細書に使用されるような用語「対象」は、げっ歯類、ネコ、イヌ、および霊長類などの哺乳類を示す。好ましくは、本発明による対象はヒトである。
【００３４】
用語「処置する」または「処置」は、その最も広い意味で、そのような用語が適用される障害もしくは状態、またはそのような障害もしくは状態の一つもしくは複数の症状の進行を後退させること、軽減すること、阻害すること、またはそれを予防することを表す。
【００３５】
本明細書に使用されるような用語「Ｔヘルパー２型（Ｔｈ２）介在性疾患」は、Ｔ細胞からＴｈ２サブタイプへの分化における過剰産生またはバイアスに起因するものを含めた、Ｔｈ２サイトカインの過剰産生によって特徴づけられる疾患を意味する。そのような疾患には、例えば、感染症に伴う感染悪化（例えばLeishmania major、Mycobacterium leprae、Candida albicans、Toxoplasma gondi、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスなど）ならびにアナフィラキシー性過敏反応、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、春季カタル、湿疹、蕁麻疹および食物アレルギーなどのアレルギー障害が挙げられる。より詳細には、Ｔｈ２介在性疾患には、非限定的に移植片免疫疾患（慢性ＧＶＨＤ）、自己免疫疾患（特に器官非特異的自己免疫疾患）およびＴｈ２型アレルギー疾患が挙げられる。典型的に例証される疾患は、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、全身性進行性強皮症、関節リウマチ、間質性膀胱炎、橋本病、バセドー病、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、萎縮性胃炎、悪性貧血、アジソン病、天疱瘡、類天疱瘡、水晶体ブドウ膜炎（lenticular uveitis）、交感性眼炎、原発性胆汁性肝硬変、活動性慢性肝炎、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発動脈炎、リウマチ熱、糸球体腎炎（ループス腎炎、ＩｇＡ腎症（IgA nephtopathy）など）、アレルギー性脳炎、アトピー性アレルギー疾患（例えば、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、花粉症、蕁麻疹、食物アレルギーなど）、オーメン症候群、春季カタルおよび好酸球増加症候群である。
【００３６】
特定の一態様では、本発明によるＳｕｖ３９ｈ１−ＨＰ１αサイレンシング経路阻害剤は、喘息、特にアレルギー性喘息の処置のために使用される。
【００３７】
本発明のさらなる一目的は、Ｔヘルパー２型（Ｔｈ２）介在性疾患の処置のための方法であって、それを必要とする対象に本発明のＳｕｖ３９ｈ１−ＨＰ１αサイレンシング経路阻害剤を投与することを含む方法に関する。
【００３８】
好ましくは、治療有効量のＳｕｖ３９ｈ１−ＨＰ１αサイレンシング経路阻害剤。
【００３９】
「治療有効量」によって、任意の医学処置に適用されうる合理的な利益／リスク比でＴヘルパー２型（Ｔｈ２）介在性疾患を処置するために十分な量のＳｕｖ３９ｈ１−ＨＰ１αサイレンシング経路阻害剤が意味される。
【００４０】
本発明の化合物および組成物の合計１日使用量は、担当の医師によって健全な医学的判断の範囲内で決定されることが理解されている。任意の特定の対象に特異的な治療有効用量レベルは、処置される障害およびその障害の重症度；採用される特定の化合物の活性；採用される特定の組成物、対象の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事；投与時間、投与経路、および採用される特定の化合物の排泄速度；処置期間；採用された特定のポリペプチドと組合せてまたは同時に使用される薬物；ならびに医学分野で周知の類似の因子を含めた多様な要因に依存する。例えば化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために必要な用量未満のレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで薬用量を徐々に増加させることは、十分に当該技術の熟練の範囲内である。しかし、製品の１日薬用量は、成体１人あたり０．０１〜１，０００mg/日の広い範囲にわたり変動しうる。好ましくは、組成物は、処置されるべき対象の症状に薬用量を調整するために活性成分０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０および５００mgを含有する。医薬は、典型的には活性成分約０．０１mg〜約５００mg、好ましくは活性成分１mg〜約１００mgを含有する。有効量の薬物は、通常、１日あたり０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg体重、特に１日あたり約０．００１mg/kg〜７mg/kg体重の薬用量レベルで供給される。
【００４１】
本発明のＳｕｖ３９ｈ１−ＨＰ１αサイレンシング経路阻害剤は、下記に定義するような薬学的組成物の形態で投与することができる。典型的には、本発明のＳｕｖ３９ｈ１−ＨＰ１αサイレンシング経路阻害剤は、薬学的に許容されうる担体、希釈剤、佐剤またはビヒクルをさらに含む薬学的組成物に製剤化することができる。一態様では、本発明は、上記本発明のＳｕｖ３９ｈ１−ＨＰ１αサイレンシング経路阻害剤、および薬学的に許容されうる担体、希釈剤、佐剤またはビヒクルを含む薬学的組成物に関する。一態様では、本発明は、有効量の本発明のＳｕｖ３９ｈ１−ＨＰ１αサイレンシング経路阻害剤またはその薬学的に許容されうる塩、および薬学的に許容されうる担体、希釈剤、佐剤またはビヒクルを含む薬学的組成物である。薬学的に許容されうる担体には、例えば、目的とする投与形態に関して適切に選択され、従来の薬務と整合性のある、薬学的希釈剤、賦形剤または担体が挙げられる。
【００４２】
薬学的に許容されうる担体は、化合物の生物学的活性を不当に阻害しない不活性成分を含有しうる。薬学的に許容されうる担体は、生体適合性である、例えば、対象に投与したときに無毒、非炎症性、非免疫原性であるか、または他の望ましくない反応もしくは副作用を回避するべきである。標準的な薬学的製剤化技法を採用することができる。
【００４３】
本明細書に使用されるような薬学的に許容されうる担体、佐剤、またはビヒクルには、所望の特定の剤形に適合するような、任意および全ての溶媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散または懸濁補助剤、界面活性剤、等張化剤、増粘または乳化剤、保存料、固体結合剤、滑沢剤などが挙げられる。任意の従来の担体媒質が、任意の望ましくない生物学的作用を生成すること、またはさもなければ薬学的に許容されうる組成物の任意の他の成分（一つまたは複数）と有害に相互作用することなどによって本明細書記載の化合物と不適合性である場合を除き、その使用は、本発明の範囲内に入ると考えられる。
【００４４】
薬学的に許容されうる担体として役立ちうる物質のいくつかの例には、非限定的に、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（ヒト血清アルブミンなど）、緩衝物質（ｔｗｉｎ ８０、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、またはソルビン酸カリウムなど）、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質（硫酸プロタミン、リン酸一水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、もしくは亜鉛塩など）、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ろう、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、羊毛脂、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプンなどのデンプン；セルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオ脂および坐剤用ろうなどの賦形剤；ラッカセイ油、綿実油；ベニバナ油；ゴマ油；オリーブ油；トウモロコシ油およびダイズ油などの油；プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質不含の水；等張食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール、およびリン酸緩衝溶液、ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の無毒で適合性の滑沢剤、ならびに着色料、放出剤、コーティング剤、甘味料、香味剤および香料、保存料および抗酸化剤も、製薬担当者の判断により組成物中に存在しうる。
【００４５】
本明細書記載の組成物は、処置される疾患の重症度に応じて、経口、非経口、吸入スプレーにより、局所、直腸、鼻腔内、口内、膣内または植込まれたリザーバーを介して、投与することができる。本明細書に使用されるような用語「非経口」には、非限定的に、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、くも膜下腔内、肝臓内、病巣内および頭蓋内の注射または注入技法が挙げられる。具体的には、組成物は、経口、腹腔内または静脈内投与される。
【００４６】
本明細書記載の組成物の無菌注射用剤形は、水性または油性懸濁物でありうる。これらの懸濁物は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて、当技術分野で公知の技法に従って製剤化することができる。無菌注射用製剤は、また、無毒の非経口的に許容されうる希釈剤または溶媒中の、例えば１，３−ブタンジオール溶液としての、無菌注射用溶液または懸濁物でありうる。採用できる、許容されうるビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル溶液および等張塩化ナトリウム溶液である。加えて伝統的に無菌の固定油が、溶媒または懸濁媒として採用される。このために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含めた任意の無刺激の固定油を採用することができる。オレイン酸およびそれのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、注射剤の調製に有用であり、オリーブ油またはヒマシ油などの薬学的に許容されうる天然油、特にそれらのポリオキシエチル化された種類のものも同様である。これらの油溶液または懸濁物は、また、カルボキシメチルセルロースなどの長鎖アルコール性希釈剤もしくは分散剤、またはエマルションおよび懸濁物を含めた、薬学的に許容されうる剤形の製剤化に一般に使用される類似の分散剤を含有しうる。Tween、Spanなどの他の通常使用される界面活性剤および、薬学的に許容されうる固体、液体または他の剤形の製造に通常使用される他の乳化剤またはバイオアベイラビリティー強化剤も、製剤化のために使用することができる。
【００４７】
本明細書記載の薬学的組成物は、非限定的に、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤または液剤を含めた、任意の経口的に許容されうる剤形で経口投与することができる。経口使用用の錠剤の場合、通常使用される担体には、非限定的に、ラクトースおよびトウモロコシデンプンが挙げられる。典型的にはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤も添加される。カプセル剤形での経口投与のために有用な希釈剤には、ラクトースおよび乾燥トウモロコシデンプンが挙げられる。水性懸濁剤が経口使用のために必要な場合、活性成分が乳化剤および懸濁化剤と混合される。所望により、ある特定の甘味料、香味料または着色料も添加することができる。
【００４８】
または、本明細書記載の薬学的組成物は、直腸投与用の坐剤の形態で投与することができる。これらは、室温で固体であるが直腸温度で液体であって、従って直腸内で融解して薬物を放出する、適切な無刺激性賦形剤とその薬剤を混合することによって調製することができる。そのような物質には、非限定的に、カカオ脂、蜜ろうおよびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００４９】
特に処置のターゲットが、眼、皮膚、または下部消化管の疾患などの局所適用によって容易に到達可能な領域または器官を包含する場合、本明細書記載の薬学的組成物は、また、局所的に投与することができる。適切な局所製剤は、これらの領域または器官のそれぞれに関して容易に調製される。
【００５０】
下部消化管用の局所適用は、直腸坐剤製剤（上記参照）または適切な浣腸製剤の状態で実施することができる。局所経皮貼付剤も使用することができる。
【００５１】
局所適用のために、薬学的組成物は、一つまたは複数の担体中に懸濁または溶解された活性成分を含有する適切な軟膏の状態で製剤化することができる。本発明の化合物の局所投与用担体には、非限定的に、鉱物油、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ろうおよび水が挙げられる。または、薬学的組成物は、一つまたは複数の薬学的に許容されうる担体中に懸濁または溶解された活性成分を含有する適切なローションまたはクリームの状態で製剤化することができる。適切な担体には、非限定的に、鉱物油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルろう、セテアリールアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が挙げられる。
【００５２】
眼科使用のために、薬学的組成物は、ｐＨ調整済み等張無菌食塩水への微粒子化懸濁物として、または具体的には塩化ベンジルアルコニウム（benzylalkonium chloride）などの保存料を有するまたは有さないｐＨ調整済み等張無菌食塩水中の溶液として製剤化することができる。または、眼科使用のために、薬学的組成物は、ワセリンなどの軟膏の状態で製剤化することができる。
【００５３】
薬学的組成物は、また、呼吸器に投与することができる。呼吸器には、口腔咽頭および喉頭を含めた上気道、それに続く、気管に続く気管支および細気管支への分岐部などの下気道が挙げられる。肺送達組成物は、分散物内の活性成分が肺に到達でき、そこで例えば肺胞領域を経て活性成分が血液循環内に直接、容易に吸収されうるように、患者による分散物の吸入によって送達することができる。肺送達は、噴霧された製剤、エアロゾル化された製剤、ミセル製剤、および乾燥粉末に基づく製剤の使用を含めた異なるアプローチによって達成することができ；吸入による投与は、経口および／または経鼻でありうる。送達は、液体ネブライザー、エアロゾルに基づくインヘラー、および乾燥粉末分散装置を用いて達成することができる。定量式装置が好ましい。アトマイザーまたはインヘラーを使用する利点の一つは、その装置が自給式であるので混入の可能性が最小化されていることである。乾燥粉末分散装置は、例えば、乾燥粉末として容易に製剤化されうる薬物を送達する。本発明の薬学的組成物は、それ自体または適切な粉末担体と組合せて、凍結乾燥粉末または噴霧乾燥粉末として安定に保存することができる。吸入用の本発明の薬学的組成物の送達は、タイマー、用量カウンター、測時装置、または時間表示装置が含まれうる投薬タイミング部品によって仲介することができ、その部品は、装置内に組込まれると、エアロゾル医薬を投与する間の用量追跡、遵守のモニタリング、および／または患者への用量トリガーを可能にする。エアロゾル送達用の薬学的装置の例には、定量式インヘラー（ＭＤＩ）、乾燥粉末インヘラー（ＤＰＩ）、およびエアジェットネブライザーが挙げられる。
【００５４】
本発明の方法に使用するための化合物は、ユニット投薬剤形に製剤化することができる。用語「ユニット投薬剤形」は、処置を受けている対象についてのユニット投薬量として適切な物理的に分離したユニットであって、各ユニットが所望の治療効果を生成すると計算された所定量の活性物質を、場合により適切な薬学的担体と共同して含有するユニットを表す。ユニット投薬剤形は、１日１回投与用量または１日多回投与（例えば１日約１〜４回以上）の１回用でありうる。１日多回投与量が採用される場合、ユニット投薬剤形は、各用量が同じまたは異なりうる。
【００５５】
本発明のさらなる目的は、Ｔｈ２介在性疾患の処置のための薬物をスクリーニングするための方法であって、複数の被験物質にＳｕｖ３９ｈ１−ＨＰ１αサイレンシング経路を阻害する能力があるかどうかを試験すること、および該経路を阻害できる物質を選択することから成る段階を含む方法に関する。
【００５６】
特定の一態様では、本発明のスクリーニング方法は、複数の被験物質にＨ３Ｋ９−ヒストンメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１によるヒストンＨ３のＬｙｓ−９のメチル化を阻害する能力があるかどうかを試験すること、およびＨ３Ｋ９−ヒストンメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１によるヒストンＨ３のＬｙｓ−９のメチル化を阻害できる物質をポジティブ選択することから成る段階を含みうる。
【００５７】
被験物質がＨ３Ｋ９−ヒストンメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１によるヒストンＨ３のＬｙｓ−９のメチル化を阻害できるかどうかを判定することは、Greiner D. Et al. Nat Chem Biol. 2005 Aug;1(3):143-5またはEskeland, R. et al. Biochemistry 43, 3740-3749 (2004)に記載されたような様々な方法を用いて行うことができる。これらの方法は、Ｔｈ２介在性疾患の処置に有用でありうる薬物を開発するための被験物質を同定するためにハイスループットなスクリーニング技法を用いて行うことができる。ハイスループットなスクリーニング技法は、自動ロボットシステムを用いて複数のアッセイを実施するためにマルチウェルプレート（例えば９６、３８９、または１５３６ウェルプレート）を使用して実施することができる。従って、被験物質の大規模ライブラリーを高効率でアッセイすることができる。
【００５８】
特定の一態様では、本発明のスクリーニング方法は、ａ）複数の被験物質がＨＰ１αとＨ３Ｋ９ｍｅ３との間の相互作用を阻害する能力を決定すること、およびｂ）該相互作用を阻害する被験物質をポジティブ選択することから成る段階を含みうる。
【００５９】
タンパク質−タンパク質相互作用のスクリーニングに適切な任意の方法が適切である。典型的には、ポリペプチドは、検出可能な分子でラベルされる。該検出可能な分子は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段によって検出可能な任意の化合物または物質から成りうる。タンパク質−タンパク質相互作用を探索するために多様なアッセイが記載されている。例えば、ツーハイブリッドアッセイを行うことができる。または、Homogeneous Time Resolved Fluorescence（ＨＴＲＦ）アッセイなどの蛍光アッセイを行うことができる。
【００６０】
本発明の一態様によると、被験物質は、ペプチド、ペプチド模倣体、有機小分子、抗体、アプタマーまたは核酸から成る群より選択することができる。例えば、本発明による被験物質は、予め合成された化合物のライブラリー、または構造がデータベースから決定されている化合物のライブラリー、または新規合成された化合物のライブラリーより選択することができる。
【００６１】
次に、分化後のＴｈ２細胞をＴｈ１条件で培養したときに、Ｓｕｖ３９ｈ１−ＨＰ１αサイレンシング経路を阻害するとして選択された物質に該Ｔｈ２細胞をＴｈ１細胞に極性化する能力があるかどうか試験することができる。典型的には、該能力は、実施例に記載された方法により試験することができる。
【００６２】
以下の図面および実施例によって本発明をさらに例証する。しかし、これらの実施例および図面は、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈してはならない。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１ａ】Ｓｕｖ３９ｈ１がＴｈ２の安定性をin vivoでレギュレーションし、アレルギー性肺炎に影響することを示す図である：０および７日目に野生型またはＳｕｖ３９ｈ１欠損マウスにＯＶＡ／ミョウバンを腹腔内注射した。５５から６０日目までＯＶＡで鼻腔内免疫し、６１日目に屠殺し、分析に供した。（ａ）ＩＬ４またはＩＦＮγを産生しているＯＶＡ特異的脾臓細胞を、二色ＥＬＩＳｐｏｔ（左欄および中央欄）を用いて計数した。同じ動物から、Ｔ１／ＳＴ２を発現しＩＦＮγを産生しているＣＤ４＋脾臓細胞の総数をフローサイトメトリーによって計数した（右欄）。（ｂ）ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１の血清レベル（左欄）またはＩｇＧ２ｃの血清レベル（右欄）を、ＥＬＩＳＡを用いて定量した。ＰＢＳで免疫処置した対照値をバックグラウンドとして（ａ）および（ｂ）から差し引いた。（ｃ）過ヨウ素酸シッフ染色を用いて、ＯＶＡ免疫動物の肺内粘液陽性細胞数を定量した。示した全てのデータは、１群あたり６匹のマウスを用いた２回の独立した実験の代表を平均±ｓｅｍで表したものである。
【図１ｂ】Ｓｕｖ３９ｈ１がＴｈ２の安定性をin vivoでレギュレーションし、アレルギー性肺炎に影響することを示す図である：０および７日目に野生型またはＳｕｖ３９ｈ１欠損マウスにＯＶＡ／ミョウバンを腹腔内注射した。５５から６０日目までＯＶＡで鼻腔内免疫し、６１日目に屠殺し、分析に供した。（ａ）ＩＬ４またはＩＦＮγを産生しているＯＶＡ特異的脾臓細胞を、二色ＥＬＩＳｐｏｔ（左欄および中央欄）を用いて計数した。同じ動物から、Ｔ１／ＳＴ２を発現しＩＦＮγを産生しているＣＤ４＋脾臓細胞の総数をフローサイトメトリーによって計数した（右欄）。（ｂ）ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１の血清レベル（左欄）またはＩｇＧ２ｃの血清レベル（右欄）を、ＥＬＩＳＡを用いて定量した。ＰＢＳで免疫処置した対照値をバックグラウンドとして（ａ）および（ｂ）から差し引いた。（ｃ）過ヨウ素酸シッフ染色を用いて、ＯＶＡ免疫動物の肺内粘液陽性細胞数を定量した。示した全てのデータは、１群あたり６匹のマウスを用いた２回の独立した実験の代表を平均±ｓｅｍで表したものである。
【図１ｃ】Ｓｕｖ３９ｈ１がＴｈ２の安定性をin vivoでレギュレーションし、アレルギー性肺炎に影響することを示す図である：０および７日目に野生型またはＳｕｖ３９ｈ１欠損マウスにＯＶＡ／ミョウバンを腹腔内注射した。５５から６０日目までＯＶＡで鼻腔内免疫し、６１日目に屠殺し、分析に供した。（ａ）ＩＬ４またはＩＦＮγを産生しているＯＶＡ特異的脾臓細胞を、二色ＥＬＩＳｐｏｔ（左欄および中央欄）を用いて計数した。同じ動物から、Ｔ１／ＳＴ２を発現しＩＦＮγを産生しているＣＤ４＋脾臓細胞の総数をフローサイトメトリーによって計数した（右欄）。（ｂ）ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１の血清レベル（左欄）またはＩｇＧ２ｃの血清レベル（右欄）を、ＥＬＩＳＡを用いて定量した。ＰＢＳで免疫処置した対照値をバックグラウンドとして（ａ）および（ｂ）から差し引いた。（ｃ）過ヨウ素酸シッフ染色を用いて、ＯＶＡ免疫動物の肺内粘液陽性細胞数を定量した。示した全てのデータは、１群あたり６匹のマウスを用いた２回の独立した実験の代表を平均±ｓｅｍで表したものである。
【図２】ケトシン処置が、アレルゲン誘導肺病態の軽減を招くことを示す図である。０および７日目にマウスにＯＶＡ／ミョウバンを腹腔内注射した。１７日目にＯＶＡおよびＤＭＳＯ（ＯＶＡ＋ビヒクル）またはケトシン（ＯＶＡ＋ケトシン）でマウスを鼻腔内免疫し、２２日目に屠殺し、分析に供した。過ヨウ素酸シッフ染色を用いて、ＯＶＡ免疫動物の肺内粘液陽性細胞数（ピンク色に染色）を定量した。画像は倍率２００×である。示した全てのデータは、１群あたり６匹のマウスを用いた２回の独立した実験のプールを平均±ｓｅｍで表したものである。
【図３】図３は、グラフである。
【００６４】
実施例１：ＳＵＶ３９Ｈ１およびＨＰ１ａはＴｈ２細胞系列の忠実度をコントロールする
材料および方法
マウス：Ｃ５７ＢＬ／６は、Charles River(Les Oncins, France）から入手し、Institut Curieの動物施設内に収容した。本発明者らは、T. Jenuwein12から親切にも贈与されたＳｕｖ３９ｈ１ノックアウトマウスを１２９ＳＶ×Ｃ５７ＢＬ／６雑種バックグラウンドで維持した。ＨＰ１αおよびＨＰ１γ突然変異マウス系列は、ＭＣＩ／ＩＣＳ（Mouse Clinical Institute - Institut Clinique de la Souris-, Illkirch, France; http://www-mci.u-strasbg.fr）で樹立され、１２９ＳＶ×Ｃ５７ＢＬ／６雑種バックグラウンドで維持されたものである。戦略の詳細は、要望により入手できる（プロジェクトＩＲ００００１０７３／Ｋ３１６）。ＨＰ１ａターゲティングベクターは、１）イントロン３中の３．９kbの５ホモロジーアーム、２）ＬｏｘＰ部位、１５６bpのイントロン３、エキソン３および１０３０bpのイントロン４を含む１．３kbのＬｏｘＰ導入（floxed）フラグメントならびにＦＲＴ部位によっても囲まれているＬｏｘＰ導入ｎｅｏ耐性カセット、ならびに３）イントロン４の３．４kbの３’ホモロジーアームを含む。この構築物をＥＳ細胞（ＭＣＩ−１２９ｓｖ／Ｐａｓ）内にエレクトロポレーションし、Ｇ−４１８耐性クローン７３３個を、５’および３’外部プライマーならびにＬｏｘＰ特異的プライマー対を用いたＰＣＲによってスクリーニングした。相同組換え陽性であって、挿入１個だけを有するクローン１個を単離し、それを５’外部プローブおよび２種のＮｅｏ特異的プローブを用いたサザンブロット分析によって確認した。このＥＳクローンの核型を正常と検証し、このクローンを野生型マウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ）に注射した。子に生殖細胞系列への伝達があるかどうかをＰＣＲによってスクリーニングした。次に、陽性マウスをＣＭＶ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスと交配し、ＬｏｘＰ導入配列を切り取り、野生型と戻し交配してＨＰ１α−／−マウスを得た。使用した全ての対照野生型マウスは、性別がマッチした同腹仔対照であった。
【００６５】
ＣＤ４＋Ｔ細胞の精製：脾臓およびリンパ節（腸間膜、鼠径部、腋窩および上腕）の単一細胞懸濁物をプールし、赤血球溶解後にＣＤ４＋Ｔ細胞を、Miltenyi ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotec）を使用したネガティブ選択によって精製した。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を得るために、FACSAria（BD）もしくはFacsVantage（BD）を使用してＣＤ４４ｌｏｗＣＤ８ｎｅｇ細胞をソーティングすること、またはＣＤ６２Ｌマイクロビーズ（Miltenyi Biotec）を使用したポジティブ選択のいずれかによってこれらの細胞をさらに精製した。０．５％ ＢＳＡおよび２mM ＥＤＴＡを含有する１×ＰＢＳ（Gibco）を使用して単離手順を行った。各ソーティング手順から得られた培養物は、類似の結果をもたらした。
【００６６】
ＣＤ４＋Ｔ細胞の培養：組織培養処理された９６ウェル平底プレート（Techno Plastic Products）に１×ＰＢＳ（Gibco）中の１mg/ml抗ＣＤ３ｅ（クローン１４５−２Ｃ１１、BD）および抗ＣＤ２８（クローン３７．５１、BD）を３７℃、５％ＣＯ２で１〜３時間コーティングした。次に、１×ＰＢＳでウェルを２回洗浄した。不偏培養条件のために、１０％ＦＣＳ（Gibco）、０．１mM ２−メルカプトエタノールおよびペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Gibco）中の１×１０６個/mlのＣＤ４＋Ｔ細胞をウェルに接種した。Ｔｈ１培養条件のために、培地は５ng/mlリコンビナントマウスＩＬ１２（R&D systems）および１０mg/ml抗ＩＬ４（クローン１１Ｂ．１１、BDまたはeBiosciences）を含有した。Ｔｈ２培養条件のために、培地は５０ng/mlリコンビナントマウスＩＬ４（R&D systems）ならびに１０mg/mlの抗ＩＬ１２（Ｃ１７．８、BDまたはeBiosciences）および抗ＩＦＮｇ（クローンＸＭＧ１．２、BDまたはeBiosciences）を含有した。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２中で培養した。３日後に細胞を新しいプレートに移植し、３０U/mlリコンビナントヒトＩＬ−２（Chiron）を添加した上記試薬の２×カクテルを培地に補充した。必要に応じて、上記サイトカイン添加培地中で細胞集団を３日毎にエクスパンションさせた。二次培養のために、初代培養物を計数し、上記条件で１×１０６個/mlを９６ウェルプレートに接種した。
【００６７】
フローサイトメトリー分析用の細胞染色：使用した全ての抗体はBDから購入し、例外として抗Ｔ−ｂｅｔ（４Ｂ１０）および抗Ｇａｔａ３（ＨＧ３−３１）はSanta Cruz Biotechnologyから購入した。全ての染色は丸底９６ウェルプレート（Corning Life Sciences）中で行った。細胞表面の染色は、１×ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡおよび２mM ＥＤＴＡ中にて４℃で２５分間行った。細胞内サイトカイン染色のために、細胞をＰＭＡ（２５ng/ml、Sigma）およびイオノマイシン（１mM、Sigma）で４時間、最後の２時間にはブレフェルジンＡ（５mg/ml）を添加して３７℃で再刺激した。細胞表面染色を行い、次に２％ホルムアルデヒドを用いて、細胞を室温で１０分間固定した。次に細胞を１×ＰＢＳ中で洗浄し、次に透過処理／洗浄緩衝液（BD）中で再懸濁することによって透過処理した。細胞を遠心分離し、透過処理／洗浄緩衝液中の抗ＩＦＮｇおよび抗ＩＬ４を用いて細胞内サイトカイン染色を４℃で２５分間行った。細胞内転写因子の染色のために細胞を固定し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する１×ＰＢＳを用いてその細胞を室温で５分間透過処理した。次に、細胞を洗浄し、５％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ中で染色を行った。二次抗マウスａｌｅｘａ ４８８または６４７（Molecular Probes）を使用して、Ｔ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ３一次抗体を検出した。マウスＩｇＧ１アイソタイプを対照として使用した。いくつかの実験については、蛍光団とコンジュゲーションしたＴ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ３特異的抗体を使用した（ebioscience）。ＣＦＳＥ実験のために、２．５μM ＣＦＳＥ（Molecular Probes）を有するＰＢＳ中で精製Ｔ細胞を３７℃で１０分間インキュベーションした。ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ ＩＩ（BD）でＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェアを使用して全てのＦＡＣＳ取得を行った。分析はＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Treestar）を使用して行った。
【００６８】
ウエスタンブロッティング：１×ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液（Invitrogen）および１×ＮｕＰＡＧＥ還元剤（Invitrogen）中で細胞ペレットを溶解させた。２５Ｕベンゾナーゼ（benzonase）ヌクレアーゼ（Novagen）で３０分間処理後、細胞２×１０５個からの溶解物を、１×ＭＯＰＳ泳動緩衝液（Invitrogen）を使用してＮｕＰＡＧＥビス／トリス４〜１２％勾配ゲル（Invitrogen）にロードした。転写後に、メンブランをＰＢＳ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ中の５％乳汁でブロッキングし、次に一次抗体およびペルオキシダーゼコンジュゲーション型二次抗体と共にインキュベーションした。結合した抗体は、SuperSignal West Dura Extended Duration基質（Thermo Scientific）を用いて、製造業者の指示に従って顕示させた。デンシトメトリーによってバンド強度を定量し、任意の単位として表現した。抗ＨＰ１α（Euromedex、２ＨＰ−２Ｇ９）、抗ＨＰ１γ（Euromedex、２ＭＯＤ−１Ｇ６）および抗ＨＰ１β（Euromedex、１ＭＯＤ−１Ａ９）。
【００６９】
クロマチン免疫沈降：野生型細胞のＣｈＩＰのために、４〜５週齢雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞を、上記ネガティブ選択によって精製した。Ｓｕｖ３９ｈ１欠損細胞および同腹仔細胞のＣｈＩＰのために、ＣＤ４＋ＣＤ４４ｌｏｗ細胞を上記のように調製した。ＣｈＩＰ分析は、本質的に他の箇所に記載されたように実施した３７。簡潔には、１％ホルムアルデヒド（wt/vol）中で細胞を室温で１０分間固定した。ホルムアルデヒドを０．１２５Ｍグリシンによって５分間クエンチした。次に、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、溶解させた。核の懸濁物を超音波処理してゲノムＤＮＡフラグメントの平均長２００〜５００bpを達成した。特異的抗体（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３（ａｂ８８９８ Abcam）、Ｈ３Ｋ９ａｃ（１７−６５７、Upstate）、ヒストン−Ｈ３（ａｂ１７９１ Abcam）、ＨＰ１α（０５−６８９、Upstate）およびウサギまたはマウスＩｇＧ（Upstate）をＤｙｎａｌプロテインＡビーズ（Invitrogen）と結合させた。抗Ｈ３Ｋ９ｍｅ３を用いたＣｈＩＰのために各試料からクロマチン５μgを、抗Ｈ３Ｋ９ａｃを用いたＣｈＩＰのために１０μgを、抗ＨＰ１αを用いたＣｈＩＰのために１５μgを採取した。脱クロスリンク後にＤＮＡを精製した。リアルタイムＰＣＲは、Ｓｙｂｒグリーン検出システム（Qiagen）を使用して三つ組で行った。プライマー配列を補足的な表１に挙げる。クロマチン免疫沈降は、独立して培養された細胞を用いて少なくとも３回行い、結果を投入ＤＮＡに対するパーセンテージとして表現し、平均を求めた。
【００７０】
アレルゲン誘導喘息：０日目および７日目にＳｕｖ３９ｈ１欠損細胞および野生型同腹仔対照に、Imjectミョウバン（Thermo Scientific）５０μlと混合したＰＢＳ、Imjectミョウバン単独またはＰＢＳ単独中の１０μg ＯＶＡ（Sigma）を腹腔内注射した。５５〜６０日目に、麻酔されたマウスをＰＢＳ ３０μl中の５０μg ＯＶＡまたはＰＢＳ単独で鼻腔内免疫した。６１日目にマウスを屠殺し、分析に供した。
【００７１】
総肺細胞の単離：右肺葉を切除し、小片に切断した（約１〜２mm２）。１，５００Ｕコラゲナーゼ２型（Worthington）および１０mg/mL ＤＮａｓｅ Ｉ（Roche）原液７５ulを含有する新鮮調製コラゲナーゼ消化溶液５mL中に小片を移した。一定に水平振盪しながら肺を３７Ｃで１時間消化した。肺消化物５mLを４０m篩に移し、無菌シリンジの先端で押し出した。遠心分離後に、ＡＣＫ溶解緩衝液を用いて赤血球を室温で１〜２分間溶解させた。総肺細胞を追加的に２回洗浄し、計数した。
【００７２】
肺の固定および組織学：左肺葉を慎重に切除し、ＰＢＳ中の３．７％ＰＦＡ中で一晩固定した。翌日、肺葉を７０％ＥＴＯＨ中に移動させた。肺試料を包埋し、切断し、細胞浸潤分析のためにヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で、そして杯細胞過形成分析のために過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）で染色した。Institut CurieのNikon Imaging CenterにあるEclipse 90i正立顕微鏡で画像を取得した。肺切片全体に関してImageJソフトウェア（NIH）を使用して粘液指数を計算した。
【００７３】
血清Ｉｇ：平底９６ウェルNunc-Immuno Plate（Thermo Scientific）にＰＢＳ中の１０μg/mL ＯＶＡまたは１／１０００ヤギ抗マウスＩｇ（Ｈ＋Ｌ）（Southern Biotechnologies、カタログ番号１０１０−０１）を４Ｃで一晩コーティングした。コーティング液を捨て、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ １５０μlを用いて３７Ｃで２時間ウェルをブロッキングした。ブロッキング緩衝液を捨てた後に、試料および標準を５０Ｌ／ウェルの分量で、４Ｃで一晩添加した。標準は、Southern Biotechnologies（マウスＩｇＧ１、クローン１５Ｈ６、ＰＢＳ中に１０ng/mLの出発希釈濃度）および（マウスＩｇＧ２ｃ、クローン６．３、出発希釈濃度１０ng/mL）から購入した。血清試料は、ＰＢＳに、ＩｇＧ２ｃについて１／１００、ＩｇＧ１について１／１，０００希釈した。ウェルをＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。どちらもSouthern Biotechnologies製の検出ＩｇＧ１（ヤギ抗マウスＩｇＧ１−ビオチン、０．５mg/mL）およびＩｇＧ２ｃ（ヤギ抗マウスＩｇＧ２ｃ−ビオチン、０．５mg/mL）を、ＰＢＳ ５０μl中に１／５０００で３７Ｃで２時間使用した。前回のようにウェルを３回洗浄し、ＰＢＳ ５０Ｌ中のストレプトアビジン−ＨＲＰ（R&D、１／２００希釈）を３７Ｃで３０分間添加した。３回洗浄後に、ＴＭＢ基質（Sigma）１５０Ｌを各ウェルに添加した。５０μl/ウェルの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止させた。プレートを４５０nmおよび５７０nmで読み取り、後者をバックグラウンド波長補正のために供した。
【００７４】
ＥＬＩＳｐｏｔ：５０μg/mL ＯＶＡの存在下および不在下で脾臓細胞を１×１０６および０．５×１０６個／ウェルで２日間播種した。製造業者のプロトコール（R&D Systems、カタログ番号ＥＬＤ５２１７）に従って、二重ＩＦＮｇ／ＩＬ４ ＥＬＩＳｐｏｔを行った。
【００７５】
結果
抗原と遭遇後に、ＣＤ４＋ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞の分化は、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７またはＴｒｅｇを含めた異なる種類のエフェクターＴリンパ球を産生する別個の発生プログラムをたどる。各サブタイプは、系列指令的転写因子およびシグネチャーサイトカインの特異的発現によって特徴づけられる１、２。近年、Ｔｈ表現型の安定性および柔軟性が免疫応答に重要であることが認識されている３、４。
【００７６】
共通前駆細胞からのＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞の分化は、それぞれマスターレギュレーターであるＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ−３との間の交差拮抗作用によって起こり、サイトカイン遺伝子の相互排他的な発現に繋がる１、２、３。Ｔｈ１細胞は、細胞内病原体の排除に重要なＩＦＮγを産生する一方で、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３を産生し、体液性免疫および細胞外病原体の排除に重要である１。
【００７７】
Ｔｈ１表現型およびＴｈ２表現型は細胞分裂を経て遺伝的に伝えることができるので５、６、７、エピジェネティック修飾がＴ細胞の分化をレギュレーションすると提唱されている１、３、４、８。関心を引くことに、コミットされたＴｈ１およびＴｈ２細胞においていくつかのヒストンＨ３およびＨ４修飾のレベルとサイトカイン遺伝子の活性またはサイレンシングとの間に相関が観察された９。その上、転写因子のローカス中の活性（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）マークと不活性（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）マークとの組合せが、それらの転写能を形作ると提唱された１０。しかし、エピジェネティックマークの確立の根底にある実際の経路がＴ細胞分化に持つ意味を実証するためにそれらの経路が直接操作されることはなかった３。
【００７８】
興味深いことに、Ｔｈ細胞分化の際に転写不活性なヘテロクロマチンに主に関連する一つの重要なエピジェネティックマークであるヒストンＨ３のリシン９残基のトリメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）が果たす役割は、十分には研究されていない。メンバー２個のファミリーのヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴａｓｅ）であるＳｕｖ３９ｈ１およびＳｕｖ３９ｈ２１１、１２、１３（それぞれＫＭＴ１ＡおよびＫＭＴ１Ｂとしても知られている１４）は、挟動原体ヘテロクロマチンでのＨ３Ｋ９のトリメチル化を担う。今度はＨ３Ｋ９ｍｅ３は、ヒストン結合アダプターファミリーであるヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１α、βおよびγ）に対する結合部位として役立つことができる１５、１６、１７。ＨＰ１は、本来Drosophilaから同定され、それが斑入り位置効果優性サプレッサーとして遺伝子サイレンシングに作用する性質に基づき定義された１８。それ以来、いくつかのグループが、ＨＰ１抑制ループが哺乳類での導入遺伝子発現をサイレンシングできるという証拠を提供した１５、１７、１９、２０。現在の見解によると、Ｓｕｖ３９ｈ１が挟動原体領域内でＨ３Ｋ９をトリメチル化し、ＨＰ１の動員に繋がり、ＨＰ１が転写機構の結合を立体的に阻害するか、または多様なクロマチン修飾因子を誘引してヘテロクロマチンの維持および拡大を可能にすると提唱されている２１。Ｓｕｖ３９ｈ１は、また、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）および他のＨＭＴａｓｅと結合することができ、これは、Ｈ３Ｋ９の低アセチル化状態の維持を含めてＳｕｖ３９ｈ１介在性サイレンシングのメカニズムが複雑であることを示唆している２２、２３。
【００７９】
Ｔｈ細胞分化に果たすこのサイレンシング系の役割を研究するために、本発明者らは、Ｔｈ系列決定遺伝子プロモーター内のＨ３Ｋ９への翻訳後修飾を、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３（通常はサイレンシングに関連するマーク）およびＨ３Ｋ９ａｃ（活性遺伝子の典型的なマーク）に特異的な抗体を使用するクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）によって検討した。重要なことには、本発明者らは、他のヒストンマークと交差反応しないバッチの市販抗体をスクリーニングし、全ての他の被験マークと低い交差反応性を有する１バッチの抗Ｈ３Ｋ９ｍｅ３を同定した。抗Ｈ３Ｋ９ｍｅ３は、このマークが豊富に存在する挟動原体ヘテロクロマチンからメジャーサテライト配列を効果的に沈降させ、活性Ｇａｐｄｈ遺伝子のプロモーター領域は沈降させなかった。逆に、Ｈ３Ｋ９ａｃは、活性Ｇａｐｄｈ遺伝子のプロモーターと結合していたが、メジャーサテライトとは結合していなかった。
【００８０】
ＣＤ４＋Ｔｈのin vitro分化の間に、本発明者らは、７日目までに系列不適切なサイトカイン遺伝子（Ｔｈ１でのＩｌ４およびＴｈ２でのＩｆｎｇ）のプロモーターにおける抑制性Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の増加ならびに系列特定サイトカイン遺伝子のプロモーターでのＨ３Ｋ９ａｃの増加を観察した。最初Ｉｆｎｇプロモーターは、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞中にＩＬ４よりも高レベルのＨ３Ｋ９ｍｅ３を含有した。系列のコミットメントの間に、本発明者らは、（Ｔｈ２細胞における）サイレントなＩｆｎｇプロモーターで抑制性Ｈ３Ｋ９ｍｅ３が２．５倍に増加すること、および（Ｔｈ１細胞における）サイレントなＩＬ４プロモーターで４倍に増加することを観察した。同様に、活性ＩｆｎｇプロモーターでＨ３Ｋ９ａｃが５倍に増大すること、および活性Ｉｌ４プロモーターで最大３０倍に増大することを観察した。
【００８１】
次に本発明者らは、Ｔｈ１およびＴｈ２系列指令的な転写因子をコードする遺伝子のプロモーターでのＨ３Ｋ９修飾を検討した。ナイーブな細胞ではＴｂｘ２１（Ｔ−ｂｅｔをコードする）のプロモーターに高レベルの抑制性Ｈ３Ｋ９ｍｅ３マークがあったが、Ｔｈ１分化時にＨ３Ｋ９ｍｅ３が減少すると同時にＨ３Ｋ９ａｃは５倍に増加した。Ｔｈ２細胞では、Ｔｂｘ２１プロモーターでＨ３Ｋ９の過剰メチル化および低アセチル化状態が維持された。Ｔｈ２特定Ｇａｔａ３のプロモーターは、Ｔｈ１細胞においてＨ３Ｋ９ｍｅ３の約６倍の増加およびＴｈ２細胞においてＨ３Ｋ９ａｃの２倍の増加を示した。本発明者らの結果は、Ｔｈ１およびＴｈ２遺伝子プロモーターにおけるＨ３Ｋ９のトリメチル化とアセチル化との間の均衡が、系列特異的にレギュレーションされ、それぞれ遺伝子サイレンシングまたは遺伝子活性化と相関することを示している。
【００８２】
Ｈ３Ｋ９において観察された修飾は、もちろん、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞との間の遺伝子発現の差異の原因または結果のいずれかでありうる。これに取り組むために、本発明者らは、Ｈ３Ｋ９トリメチルトランスフェラーゼＳｕｖ３９ｈ１（精巣に限定するならば成体組織におけるＳｕｖ３９ｈ２の発現１１）を欠失するマウスを使用した。以前に報告されたように１２、２４、これらのマウスは正常に発育し、予測された比および表現型の造血細胞をリンパ系器官内に有した。次に本発明者らは、Ｓｕｖ３９ｈ１がＴｈ細胞極性化に果たす可能性のある役割を探究した。野生型（齢および性別がマッチする同腹仔対照）とＳｕｖ３９ｈ１欠損細胞との間で、Ｔｈ１またはＴｈ２培養条件での表面活性化マーカーのアップレギュレーションまたは細胞増殖にほとんど差異がなかった。次に本発明者らは、細胞内サイトカイン蓄積ならびにＴｈ１およびＴｈ２マスターレギュレーターであるＴｂｅｔおよびＧａｔａ３の発現をそれぞれ判断することによって、不偏（ＮＢ）条件、Ｔｈ１条件およびＴｈ２条件でＣＤ４＋Ｔ細胞の分化を７日間検討した。本発明者らは、野生型同腹仔細胞とＳｕｖ３９ｈ１欠損細胞との間に大きな差異を全く見出さなかった。従って、Ｓｕｖ３９ｈ１欠損細胞はin vitroで正常に極性化し、そのことは、分化時にＨ３Ｋ９のトリメチル化が反対のローカスのサイレンシングに関与しないことを示唆している。しかし、これらの細胞を最適濃度の極性化サイトカインおよび反対のサイトカインを中和する抗体と共にインキュベーションした高度に偏った条件で、これらの細胞は極性化した。従って本発明者らは、既に分化したＴｈ１またはＴｈ２細胞を反対の極性化条件でインキュベーションすることで反対のローカスのサイレンシングでの潜在的異常が明らかになる可能性があると考えた。
【００８３】
この可能性を試験するために、分化したＴｈ１またはＴｈ２細胞（初代培養７日目）を反対の極性化条件（Ｔｈ２細胞についてＴｈ１条件、およびＴｈ１についてＴｈ２条件）で２〜３日間再刺激した。本発明者らは、野生型Ｔｈ２細胞において、二次培養でＴｈ１細胞によるサイレンシング済みＴｈ１またはＴｈ２遺伝子誘導が低いにすぎないことを観察した。これは、Ｔｈ１／Ｔｈ２分化時の反対の系列遺伝子のサイレンシングがこれらの条件下で不可逆であることを示している。同様に、Ｓｕｖ３９ｈ１欠損Ｔｈ１細胞は、二次Ｔｈ２培養でＩＬ４もＧＡＴＡ３も発現しなかった。対照的に、Ｓｕｖ３９ｈ１欠損Ｔｈ２細胞を二次Ｔｈ１条件に曝露すると、サイレンシング済みＩＦＮγおよびＴ−ｂｅｔの両方が細胞のかなりの割合（約３０％）で誘導された。
【００８４】
Ｔｈ１条件で培養した場合にＳｕｖ３９ｈ１欠損Ｔｈ２細胞で観察された柔軟性の増加は、完全に分化したＴｈ２細胞でのサイレンシング異常が原因か、またはＴｈ２培養で取り組んでいない（uncommitted）細胞（Ｇａｔａ−３／ＩＬ４陰性）が残留し、Ｔｈ１条件下でＩＦＮγおよびＴ−ｂｅｔの発現が誘導されたことが原因でありうる。この問題に取り組むために、本発明者らは、二次Ｔｈ１再刺激後にＩＬ４またはＧＡＴＡ３の発現を維持したＴｈ２細胞にゲート設定し、それらの細胞のＩＦＮγまたはＴ−ｂｅｔレベルを検討した。二次Ｔｈ１培養でＩＦＮγおよびＴ−ｂｅｔを同時発現するＩＬ４およびＧＡＴＡ３陽性Ｔｈ２細胞の比率は、Ｓｕｖ３９ｈ１欠損細胞で増加した。従って、Ｓｕｖ３９ｈ１の不在下でのＩＦＮγおよびＴ−ｂｅｔのレベル増加は、分化したＩＬ４＋／ＧＡＴＡ３＋Ｔｈ２細胞の真の柔軟性が原因であって、Ｔｈ２培養物中の未分化Ｔ細胞が原因ではない。本発明者らは、分化したＴｈ２細胞においてＳｕｖ３９ｈ１がＴｈ１系列遺伝子をロックすることによってＴｈ２の柔軟性を制限していると結論付ける。
【００８５】
Ｔｈ１系列遺伝子ＩＦＮγおよびＴ−ｂｅｔの安定なサイレンシングに関与するメカニズムに取り組むために、本発明者らは、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３およびＨ３Ｋ９ａｃの両方に対する抗体を使用して、野生型Ｔｈ２細胞およびＳｕｖ３９ｈ１欠損Ｔｈ２細胞をＣｈＩＰによって分析した。重要なことには、Ｓｕｖ３９ｈ１欠損Ｔｈ２細胞集団は、ＩＬ４／ＧＡＴＡ３およびＩＦＮγ／Ｔ−ｂｅｔの発現に関して野生型Ｔｈ２細胞と識別不能であった。両集団は、また、ＧＡＴＡ３が実質的に細胞の１００％に発現していたことから、均質であった。予想通り、メジャーサテライトに関するＣｈＩＰ分析から、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３が野生型同腹仔の３分の１に減少したことが示された一方で、Ｈ３Ｋ９ａｃは検出されなかった。活性Ｇａｄｐｈ遺伝子に関するＣｈＩＰでは逆の結果、すなわちＨ３Ｋ９ｍ３の無シグナルおよび強いＨ３Ｋ９ａｃシグナルが得られ、これはＳｕｖ３９ｈ１欠損細胞で不変であった。
【００８６】
本発明者らの分析から予想された通り、メチル化およびアセチル化のパターンはＴｈ２極性化を反映した（すなわち、サイレンシングされた遺伝子ではＨ３Ｋ９ｍｅ３、活性遺伝子ではＨ３Ｋ９ａｃのレベルがより高くなった）。Ｓｕｖ３９ｈ１欠損Ｔｈ２細胞において、Ｔｂｘ２１プロモーターでのＨ３Ｋ９ｍｅ３レベルが残存した一方で、この場合にアセチル化での再現性のある増加も観察された。野生型Ｔｈ２細胞では、抑制性Ｈ３Ｋ９ｍｅ３は、ＩＦＮγの適切な発現に不可欠な、５’および３’遺伝子フランキング配列を包含する調節エレメント（いわゆる保存された非コード領域（ＣＮＳ））にわたり不均一に広がっている１。Ｓｕｖ３９ｈ１欠損Ｔｈ２細胞は、全てではないがいくつかの調節エレメントでのＨ３Ｋ９ｍｅ３レベルの特異的減少を示した。Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の密度の顕著な減少がＩｆｎｇのプロモーターおよび隣接ＣＮＳ（＋５４kb）から、より強い減少がＣＮＳ（−５３kb）および隣接ＣＮＳ（−６kb）から観察された。同時に本発明者らは、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３が減少していたＩｆｎｇプロモーターおよびＣＮＳ領域内でＨ３Ｋ９の過剰アセチル化を観察した。注目すべきは、ヒストンＨ３に対する抗体を用いたＣｈＩＰは、Ｓｕｖ３９ｈ１欠損細胞における関心対象領域でのヌクレオソーム密度の顕著な変化を全く示さなかった。Ｓｕｖ３９ｈ１欠損Ｔｈ２細胞における抑制性Ｈ３Ｋ９修飾と活性Ｈ３Ｋ９修飾との間の不均衡が、ＩｆｎｇおよびＴｂｘ２１遺伝子プロモーターに制限された一方で、Ｓｔａｔ１およびＳｔａｔ４などの他のＴｈ１関連転写因子ならびにＴｈ２関連Ｓｔａｔ６は大きな変化を示さなかった。Ｓｕｖ３９ｈ１欠損細胞では、Ｔｈ２特定性のＩＬ４およびＧａｔａ３のプロモーターでＨ３Ｋ９ａｃの増加はなかった。従って、Ｔｈ２細胞においてＳｕｖ３９ｈ１欠損は、Ｔｈ１遺伝子ローカスでのＨ３Ｋ９ｍｅ３とＨ３Ｋ９ａｃとの間の不均衡を引き起こし、不完全なサイレンシングとＴｈ２からＴｈ１への柔軟性増加を招いた。Ｓｕｖ３９ｈ１はＨＤＡＣと結合することが知られているので２２、Ｔｈ２細胞におけるＳｕｖ３９ｈ１遺伝子ターゲット内のＨ３Ｋ９ａｃの増加が観察されたことは、このサイレンシング成分の欠失を反映しているおそれがある。これらの結果は、Ｓｕｖ３９ｈ１欠損Ｔｈ２細胞におけるＴｈ１遺伝子（ＩｆｎｇおよびＴｂｘ２１）の不完全なサイレンシングが、対応する遺伝子プロモーターでのＨ３Ｋ９ｍｅ３／Ｈ３Ｋ９ａｃ比の観察された不均衡の結果であることを示唆している。
【００８７】
ヘテロクロマチンにおけるＳｕｖ３９ｈ１とＨＰ１との間の公知の関係を考慮して２１、本発明者らは、標的欠失によってＨＰ１α欠損マウスを発生させることによって、Ｔｈ２細胞におけるＴｈ１遺伝子サイレンシングへのＨＰ１の潜在的関与を研究した。これらのマウスは正常に発育し、リンパ系器官内に予測された比および表現型の造血細胞を有した。ＨＰ１α欠損マウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、刺激すると野生型に匹敵する細胞表面活性化マーカーのアップレギュレーションおよび細胞分裂プロファイルを示した。Ｔｈ１またはＴｈ２条件で極性化させる７日間分化後に、本発明者らは、ＨＰ１α欠損細胞と野生型細胞との間に、細胞内サイトカインプロファイルまたはＴ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ３の発現レベルの差異を検出しなかった。本発明者らは、ＨＰ１α欠損ＣＤ４＋Ｔ細胞が、Ｓｕｖ３９ｈ１欠損細胞と同様に活性化、増殖またはＴｈ１／Ｔｈ２極性化に異常を有さないと結論付ける。
【００８８】
次に本発明者らは、ＨＰ１α欠損Ｔｈ１またはＴｈ２細胞を前回と反対の極性化条件下で再培養することによって、Ｔｈ２柔軟性に果たすＨＰ１αの推定上の役割を研究した。本発明者らは、Ｓｕｖ３９ｈ１を欠失する細胞での観察と同様に、野生型細胞に比べてＨＰ１α欠損Ｔｈ２細胞によるＩＦＮγ産生の顕著な増加を観察した。これらの二次培養でＩＦＮγを発現したＨＰ１α欠損マウスから、類似の比率（約２２％）のＩＬ４＋細胞もあった。ＨＰ１α欠損Ｔｈ１細胞は、対応する反対の実験でそれらの野生型等価物と同じように挙動した。本発明者らは、ＨＰ１α欠損Ｔｈ２細胞の二次Ｔｈ１培養においてＴ−ｂｅｔが野生型よりも大きく誘導されたことも観察した。従って、ＨＰ１αは、Ｔｈ２細胞でのＴｈ１遺伝子サイレンシングの維持に関与する。
【００８９】
三つのＨＰ１アイソフォームの間に高度な相同性があることから、本発明者らは、観察された効果がＨＰ１αに特異的かどうかを試験した。これを行うために、本発明者らは、ＨＰ１γ欠損マウス（ＨＰ１β欠損はマウスに致死的である２５）からの細胞を使用した。本発明者らは、ＨＰ１γ欠損Ｔｈ２細胞と野生型Ｔｈ２細胞との間にＩＦＮγ産生の差異を全く認めなかったが、これは、Ｔｈ２細胞でのＴｈ１遺伝子発現のサイレンシングの可逆性がＨＰ１αに特異的であることを示している。従って、ＨＰ１αは、Ｔｈ２細胞でのＴｈ１遺伝子ローカスの効果的なサイレンシングおよび（可能性があることにはＳｕｖ３９ｈ１を介した）Ｔｈ２からＴｈ１への柔軟性の制限に必要である。
【００９０】
本発明者らは、野生型Ｔｈ２細胞およびＳｕｖ３９ｈ１欠損Ｔｈ２細胞の両方におけるＴｈ１プロモーターへのＨＰ１α動員を直接測定することによってこの可能性を試験した。野生型Ｔｈ２細胞において、ＨＰ１αはサイレンシングされたＩｆｎｇおよびＴｂｘ２１プロモーターに実際に結合していた。しかし、Ｓｕｖ３９ｈ１欠損Ｔｈ２細胞では、この結合は顕著に減少した。これは、Ｔｈ２細胞でのＴｈ１遺伝子プロモーターへのＨＰ１α動員がＳｕｖ３９ｈ１依存性であることを示している。本発明者らは、Ｔｈ２系列へのコミットメントの際に、Ｓｕｖ３９ｈ１／ＨＰ１α経路によるサイレンシングがＴｈ１特定遺伝子をロックすることによってＴｈ２からＴｈ１への柔軟性を制限していると結論付ける。
【００９１】
最終的に本発明者らは、Ｓｕｖ３９ｈ１欠損Ｔｈ２細胞におけるＩｆｎｇおよびＴｂｘ２１ローカスのサイレンシング異常が系列へのコミットメントを損ない、柔軟性を増加させるならば、in vivoでＴｈ１応答に向けた移行が観察されるであろうと推論した。本発明者らは、厳密なＴｈ２型応答を促進してアレルゲン誘導肺病態を招く卵アルブミン（ＯＶＡ）誘導アレルギー性喘息モデルでこの可能性を研究した２６。予想通り、ＯＶＡへの野生型マウスの免疫学的感作は、脾臓におけるＩＬ４のＯＶＡ特異的産生および低レベルのＩＦＮγによって特徴づけられる抗原特異的Ｔｈ２応答の発生を招いた（図１ａ）。Ｓｕｖ３９ｈ１欠損マウスにおいて本発明者らは、ＩＬ４＋Ｔ細胞の産生に加えて、Ｔｈ２不安定性を示す大量のアレルゲン特異的ＩＦＮγ＋細胞およびＩＬ４／ＩＦＮγ二重産生細胞も観察した（図１ａ）。Ｓｕｖ３９ｈ１欠損マウスは、Ｔｈ２マーカーＴ１／ＳＴ２を発現しＩＦＮγを産生するＣＤ４＋Ｔ細胞数も増加していた（図１ａ；右欄）。Ｓｕｖ３９ｈ１欠損マウスでのＴｈ１応答増加の証拠は、さらに、血清中の異なるＩｇＧアイソタイプによって裏付けられた。本発明者らは、野生型マウスにおいて予想通り高レベルのＯＶＡ特異的ＩｇＧ１（Ｔｈ２応答誘導の代用マーカー）およびかろうじて検出可能なレベルのＴｈ１誘導ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ｃを血清中から見出した（図１ｂ）２７。Ｔｈ１方向に傾斜した応答に沿って、Ｓｕｖ３９ｈ１ ＫＯマウスの血清は、それらの野生型等価物に比べて増加したレベルのＩｇＧ２ｃを含有した（図１ｂ）。従って、本発明者らのin vitro結果に一致して、Ｓｕｖ３９ｈ１欠損マウスはin vivoでＴｈ２系列安定性の異常を示している。
【００９２】
Ｔｈ２柔軟性増加が病態生理学的結果を招いたかどうかを判定するために、本発明者らは、免疫処置されたマウスでの肺炎を評価した。強いＴｈ２介在性肺疾患の指標となる２８、野生型マウスのＯＶＡ免疫処置は、肺での強い好酸球浸潤および粘液産生を招いた（図１ｃ）。本発明者らは、Ｓｕｖ３９ｈ１欠損マウスにおいて好酸球浸潤および粘液産生の両方に顕著な減少を観察した。肺上皮がＳｕｖ３９ｈ１を発現した骨髄照射キメラでも類似の結果が得られたが、これは、野生型マウスとＳｕｖ３９ｈ１欠損マウスとの間の差異が造血区画に限定されていることを示している。本発明者らは、Ｔｈ２柔軟性の増加が厳密なＴｈ２モデルで傾斜したＴｈ１応答を引き起こし、（他者によって以前に示唆されたように２９、３０、３１）アレルゲン特異的炎症応答の軽減を招いたことを見出した。まとめると、これらの結果は、Ｓｕｖ３９ｈ１のサイレンシングがＴｈ２細胞同一性の安定性をin vivoでコントロールすることを示している。
【００９３】
結論として、本発明者らは、Ｔｈ１遺伝子をサイレンシングすることによってＴｈ２細胞の表現型安定性を維持することを担うエピジェネティック経路を同定した。Ｓｕｖ３９ｈ１−ＨＰ１αループは、構成的挟動原体ヘテロクロマチンに長い間関連づけられており、そこでヘテロクロマチンは安定でサイレントな環境を維持する１７、３２。しかし、これが挟動原体ヘテロクロマチンに限定されるかどうかは、まだ未調査のままである。本明細書で本発明者らは、これらの因子がＩｆｎｇおよびＴｂｘ２１などの造血遺伝子のレギュレーションの一因となりうることを示す。本発明者らは、Ｔｈ２細胞におけるＳｕｖ３９ｈ１の欠失が、サイレンシング済みＴｈ１ローカス内でＨ３Ｋ９の翻訳後修飾の恒常性の撹乱に繋がるモデルを示唆する。この活性Ｈ３Ｋ９ａｃマークの獲得と同時の抑制性Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の減少は、正常な極性化培養条件で結果を生じない。しかし、in vivo条件下で、この不均衡は、Ｔｈ２安定性の欠如およびキメラＴｈ２＋Ｔｈ１表現型の獲得に繋がる。以前に観察されたように３３、これは、潜在的にＴｂｅｔに対するＩｆｎｇローカスの許容性増加と、Ｈ３Ｋ９ａｃのレベル増加によるＨＰ１α抑制エレメントの反発との両方が原因である。本発明者らがＨＰ１α欠損細胞で類似の表現型を観察したことを考慮して、本発明者らは、ＨＰ１αがＳｕｖ３９ｈ１／Ｈ３Ｋ９ｍｅ３依存性分子ロックとして役立つと提唱する。Ｓｕｖ３９ｈ介在性サイレンシングメカニズムは、ＨＰ１αに加えて、ＫＡＰ１およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）のような多様な共リプレッサーおよびクロマチンを直接改変することができるＨＤＡＣを必要とすることが知られている１９、２２、３４、３５、３６。実際、Ｓｕｖ３９ｈ１ターゲット領域におけるＨ３Ｋ９ａｃの増加は、ＨＤＡＣの欠如を強く示唆している。Ｔｈ２細胞系列の場合、マルチマー性Ｓｕｖ３９ｈｌ／ＨＰｌａ「ロッキング」モジュールの正確なメカニズムが、Ｔｈ表現型の安定性および柔軟性のコントロールを解明するためのさらなる研究の主題であろう。
【００９４】
実施例２：ケトシン処置はアレルゲン誘導肺病態の軽減を招く
方法：
０および７日目に６〜８週齢雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにImjectミョウバン（Thermo Scientific）５０μlと混合したＰＢＳ中の１０mg ＯＶＡ（Sigma）を腹腔内注射した。１７〜２２日目に、麻酔されたマウスに０．２５mg/kgケトシン（Sigma）またはビヒクル（ＤＭＳＯ）と混合したＰＢＳ３０ul中の５０mg ＯＶＡを鼻腔内感作させた。２２日目にマウスを屠殺し、分析に供した。
【００９５】
結果：
アレルギー性喘息の病態がＳｕｖ３９ｈ１の阻害によって軽減されうるかどうかを判断するために、本発明者らは、ＯＶＡ誘導アレルギー性喘息のモデルを使用した。上記実験計画に示したようにマウスを処置した。このモデルにおいて、マウスは、気道内に粘液産生を招くアレルギー性応答を発生した。図２に、アレルゲン（ＯＶＡ）をケトシンと組合せて投与した場合よりも、ＯＶＡおよびビヒクル対照で処置されたマウスの方が、気道内粘液産生が有意に大きかったことを示す。これらの結果は、肺中Ｓｕｖ３９ｈ１の阻害がアレルギー性喘息病態を軽減することを示している。本発明者らは、ケトシン（chaeotocin）が喘息の処置に潜在的有用性を有すると結論付ける。
【００９６】
参考文献：
本出願にわたり、本発明が属する技術分野の水準を様々な参考文献が説明している。これによって、これらの参考文献の開示は、本開示への参照によって組み入れられる。
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図３】
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【国際調査報告】
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