(57)【要約】  本出願が開示するＡＢＯ不適合移植およびＡＢＯ適合移植の評価および対応のための代替方法を提供することができるＡＢＯ抗体検出および特性解析のためのシステムおよび方法は、被験者の抗ＡＢＯ血液型抗原亜型抗体プロファイルを該被験者からの生体試料を用いて決定することを含む。この方法およびシステムを用いて、レシピエント被験者の決定された抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルをドナー血液製剤または組織製剤のＡＢＯ組織血液型またはＡＢＯ組織血液型亜型と比較することにより、レシピエント被験者に対するドナー血液製剤または組織製剤の適合性を評価することができる。被験者のＡＢＯ組織血液型亜型を明確にするために、決定された抗体プロファイルは、被験者のＡＢＯ組織血液型亜型を特定するためのＡＢＯ組織血液型亜型について、既知のＡＢＯ組織血液型抗原亜型プロファイルおよび／または既知の抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルと比較される。
2014525570.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者のＡＢＯ組織血液抗原亜型抗体プロファイルを特定する方法であって、
（ａ）前記被験者からの生体試料中の少なくとも１つのＡＢＯ組織血液型抗原亜型に特異的な抗体の有無を特定することと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの情報を用いて、前記被験者の前記ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルを作成することとを含み、
ステップ（ａ）は随意に、前記生体試料中の少なくとも１つの抗ＡＢＯ組織血液型抗原亜型抗体の量を定量化することを含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）が前記被験者からの生体試料中の最高１８までのＡＢＯ組織血液型抗原亜型に特異的な抗体の有無を特定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つのＡＢＯ組織血液型抗原亜型に特異的な抗体の有無を特定する前記ステップが、
（ａ）前記被験者からの生体試料を、複数の固定化ＡＢＯ組織血液型抗原を含有するグリカンマイクロアレイまたはマクロアレイに塗布することと、
（ｂ）前記生体試料中に存在する抗ＡＢＯ組織血液型抗原亜型抗体と、結合した抗原との間に結合複合体が形成されるように、前記グリカンマイクロアレイまたはマクロアレイと共に前記生体試料をインキュベートすることと、
（ｃ）前記結合複合体を検出して、対応する抗原を特定することとを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記固定化ＡＢＯ抗原亜型が、
ＡＩ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GlcpNAc-R、
ＡＩＩ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-GlcpNAc-R、
ＡＩＩＩ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-α-D-GalpNAc-R、
ＡＩＶ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GalpNAc-R、
ＡＶ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-Galp-R、
ＡＶＩ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-Glcp-R、
ＢＩ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GlcpNAc-R、
ＢＩＩ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-GlcpNAc-R、
ＢＩＩＩ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-α-D-GalpNAc-R、
ＢＩＶ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GalpNAc-R、
ＢＶ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-Galp-R、
ＢＶＩ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-Glcp-R、
ＨＩ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GlcpNAc-R、
ＨＩＩ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-GlcpNAc-R、
ＨＩＩＩ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)3)-α-D-GalpNAc-R、
ＨＩＶ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GalpNAc-R、
ＨＶ型α-L-Fucp-(1(R)2) -β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-Galp-R、および
ＨＶＩ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-Glcp-Rからなる群から選択され、
式中Ｒは、アミン；前記抗原亜型を前記マイクロアレイまたはマクロアレイに共有結合的に付着させるためのリンカー基；またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ニワトリ血清アルブミン（ＣＳＡ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）もしくはジフテリア毒素変異体の交差反応性物質１９７タンパク質（ＣＲＭ１９７）などのタンパク質である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記結合複合体を検出するステップが、
（ｉ）前記グリカンマイクロアレイまたはマクロアレイ上に固定化された前記結合複合体を、前記結合複合体および／または前記結合した抗ＡＢＯ組織血液型抗原亜型抗体に結合する標識した二次抗体と共にインキュベートすることと；
（ｉｉ）前記結合した標識した二次抗体を検出することとを含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記二次抗体が抗ヒト抗体であり、該抗ヒト抗体は抗ヒトＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよび／またはＩｇＡもしくはこれらの抗体の任意の組合せである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記二次抗体上の前記標識が別々にまたは集団的に検出されることができる、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記標識がフルオロフォアまたは発色団を含む、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記生体試料中の抗ＡＢＯ組織血液型抗原亜型抗体の有無を定性的に検出することを含む、請求項３〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記生体試料中の抗ＡＢＯ組織血液型抗原亜型抗体の量を定量的に検出することを含む、請求項３〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体試料が血漿または血清である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記被験者のＡＢＯ組織血液型抗原亜型抗体プロファイルを、ドナー組織製剤もしくは血液製剤のＡＢＯ組織血液型、ＡＢＯ組織血液型亜型またはＡＢＯ組織血液抗原亜型プロファイルと比較するステップをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ドナー組織製剤または血液製剤の適合性をレシピエント被験者に対して評価する方法であって、
（ａ）前記レシピエント被験者からの生体試料を用いて、抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルを決定することと、
（ｂ）前記ドナー血液製剤または組織製剤の前記ＡＢＯ組織血液型またはＡＢＯ組織血液型亜型を決定することと、
（ｃ）前記レシピエント被験者の決定された抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルと、前記ドナー血液製剤または組織製剤の前記ＡＢＯ組織血液型またはＡＢＯ組織血液型亜型との比較に基づいて、前記レシピエント被験者への供与のための前記ドナー組織製剤または血液製剤の適合性を決定することとを含む、方法。
【請求項１４】
前記抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルを決定するステップが、
（ａ）前記被験者からの前記生体試料を、複数の固定化ＡＢＯ抗原を含有するグリカンマイクロアレイまたはマクロアレイに塗布することと、
（ｂ）前記生体試料中に存在する抗ＡＢＯ組織血液型抗原亜型抗体と、前記結合した抗原との間に結合複合体が形成されるように前記生体試料を前記グリカンマイクロアレイまたはマクロアレイと共にインキュベートすることと、
（ｃ）前記結合複合体を検出して、対応する抗原を特定することとを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ドナー血液製剤または組織製剤のＡＢＯ組織血液型亜型を決定する前記ステップが、
（ａ）前記ドナーからの生体試料を、複数の固定化ＡＢＯ抗原を含有するグリカンマイクロアレイまたはマクロアレイに塗布することと、
（ｂ）前記ドナーの試料中に存在する抗ＡＢＯ組織血液型抗原亜型抗体と、結合した抗原との間に結合複合体が形成されるように、前記生体試料を第２のグリカンマイクロアレイまたはマクロアレイと共にインキュベートすることと、
（ｃ）前記結合複合体を検出して、対応する抗原を特定することと、
（ｄ）前記ドナー血液製剤または組織製剤中に存在する抗ＡＢＯ組織血液型抗原亜型抗体の量および／または含量に基づいて、前記ドナー血液製剤または組織製剤の前記ＡＢＯ組織血液型亜型を特定することとを含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記固定化ＡＢＯ抗原亜型が、
ＡＩ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GlcpNAc-R、
ＡＩＩ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-GlcpNAc-R、
ＡＩＩＩ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-α-D-GalpNAc-R、
ＡＩＶ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GalpNAc-R、
ＡＶ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-Galp-R、
ＡＶＩ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-Glcp-R、
ＢＩ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GlcpNAc-R、
ＢＩＩ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-GlcpNAc-R、
ＢＩＩＩ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-α-D-GalpNAc-R、
ＢＩＶ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GalpNAc-R、
ＢＶ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-Galp-R、
ＢＶＩ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-Glcp-R、
ＨＩ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GlcpNAc-R、
ＨＩＩ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-GlcpNAc-R、
ＨＩＩＩ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)3)-α-D-GalpNAc-R、
ＨＩＶ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GalpNAc-R、
ＨＶ型α-L-Fucp-(1(R)2) -β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-Galp-R、および
ＨＶＩ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-Glcp-Rからなる群から選択され、
式中Ｒは、前記抗原亜型を前記マイクロアレイまたはマクロアレイに共有結合的に付着させるためのリンカー基である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記結合複合体を検出する前記ステップが、
（ｉ）前記グリカンマイクロアレイまたはマクロアレイ上に固定化された前記結合複合体を、前記結合複合体および／または前記結合した抗ＡＢＯ組織血液型抗原亜型抗体に結合する標識した二次抗体と共にインキュベートすることと；
（ｉｉ）前記結合した標識した二次抗体を検出することとを含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記二次抗体が抗ヒト抗体であり、該抗ヒト抗体は抗ヒトＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよび／またはＩｇＡもしくはこれらの抗体の任意の組合せである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記二次抗体上の前記標識が別々にまたは集団的に検出されることができる、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記標識がフルオロフォアまたは発色団を含む、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記生体試料中の抗ＡＢＯ組織血液型抗原亜型抗体の有無を定性的に検出することを含む、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記生体試料中の抗ＡＢＯ組織血液型抗原亜型抗体の量を定量的に検出することを含む、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記生体試料が血漿または血清である、請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記レシピエント被験者が輸血レシピエントまたは移植レシピエントである、請求項１３〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
従来の技法を用いて適合性を試験することをさらに含む、請求項１３〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記レシピエント被験者が前記ドナー血液製剤の輸血または前記ドナー組織製剤の移植の後に、前記グリカンマイクロアレイまたはマクロアレイを使用して、有害反応の指標として前記抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルの変化をスクリーニングすることで、有害反応をモニターされる、請求項１３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ドナー血液製剤による輸血またはドナー組織による移植の後に有害反応についてレシピエント被験者をモニターする方法であって、前記方法が、
（ａ）前記レシピエント被験者からの第１の生体試料を使用して第１の抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルを決定することと、
（ｂ）前記レシピエント被験者からの第２の生体試料を使用して第２の抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルを決定することと、
（ｃ）有害反応の指標として前記抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルの変化を特定するために、前記第１の抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルと、前記第２の抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルとを比較することと；随意に、
（ｄ）これらのステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すこととを含む、方法。
【請求項２８】
各抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルを決定する前記ステップが、
（ａ）複数の固定化ＡＢＯ抗原を含有するグリカンマイクロアレイまたはマクロアレイに前記生体試料を塗布することと、
（ｂ）前記生体試料中に存在する抗ＡＢＯ組織血液型抗原亜型抗体と、前記結合した抗原との間に結合複合体が形成されるように、前記生体試料を前記グリカンマイクロアレイまたはマクロアレイと共にインキュベートすることと、
（ｃ）前記結合複合体を検出して、対応する抗原を特定することとを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記固定化ＡＢＯ抗原亜型が、
ＡＩ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GlcpNAc-R、
ＡＩＩ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-GlcpNAc-R、
ＡＩＩＩ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-α-D-GalpNAc-R、
ＡＩＶ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GalpNAc-R、
ＡＶ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-Galp-R R、
ＡＶＩ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-Glcp-R、
ＢＩ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GlcpNAc-R、
ＢＩＩ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-GlcpNAc-R、
ＢＩＩＩ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-α-D-GalpNAc-R、
ＢＩＶ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GalpNAc-R、
ＢＶ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-Galp-R、
ＢＶＩ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-Glcp-R、
ＨＩ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GlcpNAc-R、
ＨＩＩ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-GlcpNAc-R、
ＨＩＩＩ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)3)-α-D-GalpNAc-R、
ＨＩＶ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GalpNAc-R、
ＨＶ型α-L-Fucp-(1(R)2) -β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-Galp-R、および
ＨＶＩ型α-L-Fucp-(1(R)2) -β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-Galp-Rからなる群から選択され、
式中Ｒは、前記抗原亜型を前記マイクロアレイまたはマクロアレイに共有結合的に付着させるためのリンカー基である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記結合複合体を検出する前記ステップが、
（ｉ）前記グリカンマイクロアレイまたはマクロアレイ上に固定化された前記結合複合体を、前記結合複合体および／または前記結合した抗ＡＢＯ組織血液型抗原亜型抗体に結合する標識した二次抗体と共にインキュベートすることと；
（ｉｉ）前記結合した標識した二次抗体を検出することとを含む、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記二次抗体が抗ヒト抗体であり、該抗ヒト抗体は抗ヒトＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよび／またはＩｇＡもしくはこれらの抗体の任意の組合せである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記二次抗体上の前記標識が別々にまたは集団的に検出されることができる、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記標識がフルオロフォアまたは発色団を含む、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記生体試料中の抗ＡＢＯ組織血液型抗原亜型抗体の有無を定性的に検出することを含む、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記生体試料中の抗ＡＢＯ組織血液型抗原亜型抗体の量を定量的に検出することを含む、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記生体試料が血液または血清である、請求項２７〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記レシピエント被験者が移植レシピエントまたは輸血レシピエントである、請求項２７〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
被験者の抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルを決定するためのアッセイキットであって、前記キットが、
（ａ）複数の固定化ＡＢＯ抗原を含有するグリカンマイクロアレイまたはマクロアレイと、
（ｂ）取扱説明書とを含む、キット。
【請求項３９】
固定化された陽性対照抗原をさらに含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
前記陽性対照抗原がα−Ｇａｌである、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
前記固定化ＡＢＯ抗原亜型が、
ＡＩ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GlcpNAc-R、
ＡＩＩ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-GlcpNAc-R、
ＡＩＩＩ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-α-D-GalpNAc-R、
ＡＩＶ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GalpNAc-R、
ＡＶ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-Galp-R、
ＡＶＩ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-Glcp-R、
ＢＩ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GlcpNAc-R、
ＢＩＩ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-GlcpNAc-R、
ＢＩＩＩ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-α-D-GalpNAc-R、
ＢＩＶ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GalpNAc-R R、
ＢＶ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-Galp-R、
ＢＶＩ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-Glcp-R、
ＨＩ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GlcpNAc-R、
ＨＩＩ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-GlcpNAc-R、
ＨＩＩＩ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)3)-α-D-GalpNAc-R、
ＨＩＶ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GalpNAc-R、
ＨＶ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GalpNAc-R、および
ＨＶＩ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-Glcp-Rからなる群から選択され、
式中Ｒは、前記抗原亜型を前記マイクロアレイまたはマクロアレイに共有結合的に付着させるためのリンカー基である、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載のアッセイキット。
【請求項４２】
（ｉ）洗浄液の容器および
（ｉｉ）前記抗ＡＢＯ抗原亜型抗体と、前記固定化抗原とから形成される結合複合体に特異的な標識した二次抗体の容器
のうちの１または複数をさらに含む、請求項３８〜４1のいずれか１項に記載のアッセイキット。
【請求項４３】
被験者のＡＢＯ組織血液型亜型を特定する方法であって、
（ａ）前記被験者からの生体試料を使用して抗ＡＢＯ組織血液型抗原亜型抗体プロファイルを決定することと、
（ｂ）前記被験者のＡＢＯ組織血液型亜型を特定するために、ＡＢＯ組織血液型亜型について、既知のＡＢＯ組織血液型抗原亜型プロファイルおよび／または既知の抗ＡＢＯ抗原亜型抗体のプロファイルと、決定された抗体プロファイルとを比較することとを含む、方法。
【請求項４４】
前記抗ＡＢＯ組織血液型抗原亜型抗体プロファイルを決定する前記ステップは、
（ａ）複数の固定化ＡＢＯ抗原を含有するグリカンマイクロアレイまたはマクロアレイに前記被験者からの生体試料を塗布することと、
（ｂ）前記生体試料中に存在する抗ＡＢＯ組織血液型抗原亜型抗体と、結合した抗原との間に結合複合体が形成されるように、前記生体試料を前記グリカンマイクロアレイまたはマクロアレイと共にインキュベートすることと、
（ｃ）前記結合複合体を検出して、対応する抗原を特定することとを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記固定化ＡＢＯ抗原亜型が、
ＡＩ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GlcpNAc-R、
ＡＩＩ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-GlcpNAc-R、
ＡＩＩＩ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-α-D-GalpNAc-R
ＡＩＶ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GalpNAc-R、
ＡＶ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-Galp-R、
ＡＶＩ型α-D-GalpNAc-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-Glcp-R、
ＢＩ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GlcpNAc-R、
ＢＩＩ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-GlcpNAc-R、
ＢＩＩＩ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-α-D-GalpNAc-R、
ＢＩＶ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GalpNAc-R、
ＢＶ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-Galp-R、
ＢＶＩ型α-D-Galp-(1(R)3)-[α-L-Fucp-(1(R)2)]-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-Glcp-R、
ＨＩ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GlcpNAc-R、
ＨＩＩ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-GlcpNAc-R、
ＨＩＩＩ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)3)-α-D-GalpNAc-R、
ＨＩＶ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-GalpNAc-R、
ＨＶ型α-L-Fucp-(1(R)2) -β-D-Galp-(1(R)3)-β-D-Galp-R、および
ＨＶＩ型α-L-Fucp-(1(R)2)-β-D-Galp-(1(R)4)-β-D-Glcp-Rからなる群から選択され、
式中Ｒは、前記抗原亜型を前記マイクロアレイまたはマクロアレイに共有結合的に付着させるためのリンカー基である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記結合複合体を検出する前記ステップが、
（ｉ）前記グリカンマイクロアレイまたはマクロアレイ上に固定化された前記結合複合体を、前記結合複合体および／または前記結合した抗ＡＢＯ組織血液型抗原亜型抗体に結合する標識した二次抗体と共にインキュベートすることと；
（ｉｉ）前記結合した標識した二次抗体を検出することとを含む、請求項４４または４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年８月３０日出願の米国特許仮出願第６１／５２９，０８２号明細書に対する優先権および利点を主張する。その出願の全体を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
本出願は、「ＡＢＯ血液型」抗原亜型に対する抗体を特定する方法に関する。より具体的には、本出願は、抗ＡＢＯ抗原亜型抗体を検出して、特性を解析する方法に関連する。この方法は、例えば、臓器および細胞／島の移植ならびに輸血の分野で有用になり得る。この方法により、グリカンアレイを用いて、複数のＡＢＯ抗原亜型に向かう抗体の検出と正確な評価を同時に行うことができる。
【背景技術】
【０００３】
臨床環境では、臓器（および細胞）移植ならびに輸血のためのドナーとレシピエントの間のＡＢＯ適合性は、一般的に、抗体媒介性移植片拒絶反応および／または溶血を回避するために不可欠であると考えられている。これらの破壊的過程を生じ得る抗体は、自身の組織で発現されないＡＢＯ抗原に対してヒトが産生する既存の「自然」抗体である。ＡＢＯ組織血液型抗原は、多くの細胞および組織上で通常発現されるグリカン構造である（図１に模式的に表す）。通常は、個人のＡＢＯ血液型の決定およびＡＢＯ抗原に対するその抗体産生の評価は、末端抗原残基（図１）に焦点を合わせてきた。しかし、ＡＢＯ抗原は、常に、大きなグリカン構造の一部として認められ、その隣接する残基により、糖鎖抗原が亜型に分類されるのが可能になる。この３つの主要なＡＢＯ抗原の各々は、表１に表示される６つの亜型の１つとして存在する。
【０００４】
【表１】
2014525570.tif 000003
【０００５】
これらのＡＢＯ抗原亜型は、組織表面および赤血球表面に差次的に発現する（Ravn, V., Dabelsteen, E., APMIS, 108:1-28)(Oriol, R., Transplant. Proc., 1987, 19:4416-4420）。抗原亜型のうち、Ｖ型抗原を除くすべては、ヒト供給源から単離されている（Yamamoto, F., Immunohematology, 2004, 20:3-22）。これらの３つの主要なＡＢＯ抗原（Ａ、Ｂおよび「Ｈ」）の各々が６つの亜型のいずれか１つとして存在することを考慮すると、ＡＢＯ系には合計１８の主要な組織血液型抗原亜型が存在することになる。
【０００６】
抗原亜型に加えて、ＡＢＯ系は個人を血液型亜型に分類する。ＡＢＯ血液型亜型は、移植および輸血の適合性に関して重大な意味を持つことになり得、Ａ１およびＡ２の血液型亜型は、ＡＢＯ血液型亜型差異で最も知られている例と考えられている。これらの血液型亜型は、赤芽球／赤血球および組織の両方での抗原の生合成に関与する２つの異なるＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＧＴＡ）酵素アイソフォームによって作り出される。Ａ１およびＡ２の血液型亜型の場合、酵素ＧＴＡ１およびＧＴＡ２がＨ抗原構造のＡ抗原構造への変換に関与している。これらの２つの血液型亜型の抗原は、定性的かつ定量的に異なる。Ａ１個人の場合、Ａ型組織血液型抗原は、それらの赤血球表面および組織表面に高密度で存在する。加えて、Ａ１およびＡ２の個人は、ＡＢＯ抗原亜型が異なる割合で発現されることが示されている（Clausen, H., Levery, S. B., Nudelman, E.,ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1985, 82:1199-1203）。Ａ２個人の場合、ＡＩＩＩ型およびＡＩＶ型抗原は、一般的に、ＡＩ型およびＡＩＩ型抗原と比較して低濃度で存在する。このため、患者の血液型判定に関して言えば、時として明確さが欠如することになる。例えば、Ａ２個人のおよそ８％およびＡ２Ｂ個人の最高３５％までが、何らかの抗Ａ１抗体を示し、したがってこのために区別が複雑になり得る(Sapanara, N. L., Swami, V., Besa, E. C., Laboratory Medicine, 2004, 35:538-541)。Ａ２個人は、通常、この血液型亜型の比較的よく見られる性質のために、追加の試験で特定されることができるが、しかしＡ型個人の１％は稀な表現型を有している。この表現型により、検出が難しくかつ間違った血液型判定をもたらす恐れのある相違がもたらされることがある(Sapanara, N. L., Swami, V., Besa, E. C., Laboratory Medicine, 2004, 35:538-541）。
【０００７】
臓器移植におけるＡＢＯ適合性
臓器移植を成功させるためにドナーとレシピエントの間のＡＢＯ適合性が、通常、必要とされるのだが、ＡＢＯ適合ドナーを直ちに探すことができない場合、ＡＢＯ不適合ドナーからの臓器を意図的に移植することも想定され得る。現在、ＡＢＯ不適合移植を考慮するまたは計画する前に、レシピエントの抗体レベルは、購入した試薬を用いてドナーの血液型の赤血球を凝集検査（現在の「ゴールドスタンダード」検査）で測定される。この検査は、ＡＢＯ血液型亜型または抗原亜型の反応性についてのガイダンスを何ら提示しない。組織が異なれば、異なるＡＢＯ抗原亜型および異なるエピトープ密度が発現されるので、これらの抗原亜型に向かう抗体の有無、ならびに量およびアイソタイプに基づく移植決定により、ドナー−レシピエントの適合性と不適合性の評価および特性解析がより正確な方法で提供されることになる。より細密に解明することができるならば、リスクを変化させる意図的なＡＢＯ不適合性に着手することができ、ドナーとレシピエントの間の特異的抗原のマッチおよびミスマッチについてより正確に理解することが可能になる。これにより、稀なドナー臓器をより効率的に用いることが可能になる。ドナー−レシピエントＡＢＯ抗原亜型の適合性およびＡＢＯ血液型亜型とのその関連が報告されていないだけでなく、ヒト血清中の特定のＡＢＯ抗原亜型に向かう抗体レベルおよびアイソタイプの変種も報告されていない。現在のところ、１８のＡＢＯ抗原亜型の各々に向かう抗体および複数の抗体アイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ）を同時に測定する方法またはシステムで利用できるものはない。そのような方法は、臓器移植（および輸血）において、ドナー−レシピエント適合性、または不適合性の正確な程度および性質を決定する際の精度の改善に関して重大な意味を持つことになる。
【０００８】
ＡＢＯ抗原亜型を考慮することに加えて、個人のＡＢＯ血液型亜型も考慮されなければならない。ＡＢＯ適合移植の場合、ドナーおよびレシピエントのＡＢＯ血液型亜型の適合を慎重に行うことにより、偶発的な血液型亜型不適合を回避することが重要である（Gorodzinksy, F. P., Stechison, M. T., Poon, A., Arbus, G. S., CMA Journal, 1981, 125:871-873）。ＡＢＯ適合移植（すなわち、不注意な不適合移植を回避するため）、および意図的に計画されたＡＢＯ不適合移植の両方において、現在の技術では、ＡＢＯ不適合性の程度を正確に評価するには不十分である。種々の特定のＡＢＯ抗原亜型に向かう抗体レベルの定量的評価によって、現在用いられている諸方法（赤血球凝集反応技術）のように主観的な定性的評価よりも、正確なデータに基づく臨床決定が可能になる。
【０００９】
輸血におけるＡＢＯ適合性
臨床の場では、輸血の前に、ドナーとレシピエントの間のＡＢＯ適合性は、従来の方法を用いて確認される。一般的に、患者の血液型は、赤血球凝集反応を用いて確認される。その血液型判定は、レシピエントの赤血球（オモテ試験）上に、およびレシピエントの血清中に存在または非存在するＡＢＯ抗体（ウラ試験）上の両方に存在する抗原に基づいて決定される。次いで、これらの結果を適当なドナー血液製剤とマッチさせる。この場合、血液型判定で使用されたコアＡＢＯ抗原（構造１−３）に対する抗体のみが検出され；抗原亜型に向かう抗体は検査されない。このため、特定のＡＢＯ血液型亜型を有する患者の場合、問題になり得る。例えば、Ａ１血液をＡ２個人に輸血すると、重篤な合併症を引き起こし得る（Contreras, M. Hazlehurst, G. R.およびArmitage, S.E. Brit. J. Haematology 1983, 55: 657-663）。Ａ１およびＡ２の個人を特定するために現在、諸方法が存在するのだが、多くの他の血液型亜型が知られており、かつ十分に効果的な血液型判定方法が欠如しているために、それらの血液型亜型は、日常的に試験されていない。臨床では、ＡＢＯ血液型亜型不適合性は、予想外の血清反応として現れることが多い（Shaz, B. H., Transfusion Medicine and Hemostasis, Elsevier, New York, 2009）。これらの予想外の血清反応を回避するまたは最小限に抑えるために、より正確な検査およびレシピエントと血液製剤の間の適合が必要とされる。これは、「試行錯誤」を通して頻繁に行われているが、治療の遅れをもたらし得る（Chaudhari, C. N., Misra, R. N., Nagpal, A. K., MJAFI, 2008, 64:371-372）。緊急事態では、この遅れが、輸血の際にささいなミスマッチ問題をもたらし得る（Chaudhari, C. N., Misra, R. N., Nagpal, A. K., MJAFI, 2008, 64:371-372）。これらの予想外の血清反応の根本原因を正確に特定することにより、血液製剤と個々の患者とのより正確な適合が可能になり、「試行錯誤」による血液製剤の適切な適合で必要とされる時間と健康転帰における費用が減少する。
【００１０】
米国特許第７，８９７，３２８号明細書は、血液型判定でのＡＢＯ抗原亜型に向かう抗体の検出のためのビーズ系アッセイを開示している。この検出アッセイは、各々異なる血液型抗原でコーティングされたマイクロビーズの抗原亜型をフローサイトメトリーまたはルミネックス（商標）技術で使用して、複数の血液型抗原亜型に向かう抗体を検出する。しかし、開示されたアッセイは、検出のために非重複フルオロフォア／発色団を必要とするために同時に少数の相互作用だけを測定することに限定されている。
【００１１】
移植および輸血の両方での臨床用途のためにＡＢＯ抗原亜型特異的抗体の定量的評価を可能にする方法の必要性が依然として存在する。現在の技法は、ＡＢＯ抗原亜型に対する抗体の存在もしくは量もしくは性質（すなわち、アイソタイプなど）を明らかにしない。この情報がない場合、医師は「慎重」に行動し、患者の安全の目的で、潜在的なドナーを拒否することが多い。これにより、救命移植および安全な輸血を受けることから妨げられることもある。
【発明の概要】
【００１２】
本出願の一目的は、正確かつ網羅的なＡＢＯ抗体検出および特性解析のためのシステムおよび方法を提供することである。本システムおよび方法の一目的は、移植および輸血の臨床の場で、ドナーとレシピエントの間のＡＢＯ関連適合性および不適合性の検出、評価および対応のための改善された方法を提供することである。理想的には、本方法およびシステムは、移植前のドナーとレシピエントの適合において、および意図的な不適合移植を最も高い安全性で計画することにおいて改善された精度および効率を提供することができる。本方法およびシステムは、さらに、移植後、患者の抗体をモニターすることで、拒絶反応の初期段階で迅速に特定することができ、したがって抗体媒介性傷害からの破壊を防止するまたは最小限に抑えることができる。本方法およびシステムは、輸血の場合、レシピエント血液製剤とドナー血液製剤の間の適合の改善を容易にすることもできる。予想外の輸血反応および稀なＡＢＯ血液型を特定することにより、間違った血液製剤が個人に供給される症例数を減少させることになる。
【００１３】
本出願の一態様によれば、被験者のＡＢＯ組織血液抗原亜型抗体プロファイルを特定する、以下を含む方法を提供する：（ａ）前述の被験者からの生体試料中の少なくとも１つのＡＢＯ組織血液型抗原亜型に特異的な抗体の有無を特定すること；および（ｂ）ステップ（ａ）からの情報を用いて、被験者のＡＢＯ組織血液型抗体プロファイルを作成し、ステップ（ａ）は随意に、生体試料中の少なくとも１つの抗ＡＢＯ組織血液型抗原亜型抗体の量を定量化することを含む。一実施形態において、ステップ（ａ）は、前述の被験者からの生体試料中の最高１８までのＡＢＯ組織血液型抗原亜型に特異的な抗体の有無を特定することを含む。特定の実施形態において、この方法は、被験者のＡＢＯ組織血液型抗原亜型抗体プロファイルを、ドナーの血液製剤または組織製剤のＡＢＯ組織血液型、ＡＢＯ組織血液型亜型またはＡＢＯ組織血液抗原亜型プロファイルと比較するステップをさらに含む。
【００１４】
別の態様に従って、ドナー血液製剤または組織製剤がレシピエント被験者に適合するかを評価する方法を提供し、該方法は、前述のレシピエント被験者からの生体試料を用いて、抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルを決定することと；ドナー血液製剤または組織製剤のＡＢＯ組織血液型、ＡＢＯ組織血液型亜型またはＡＢＯ組織血液抗原亜型プロファイルを決定することと；レシピエント被験者の決定された抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルと、ドナー血液製剤または組織製剤のＡＢＯ組織血液型、ＡＢＯ組織血液型亜型またはＡＢＯ組織血液抗原亜型プロファイルとの比較に基づいて、前述のレシピエント被験者への供与にドナー血液製剤または組織製剤が適合するかを決定することとを含む。
【００１５】
別の態様に従って、ドナー血液製剤の輸血後、またはドナー組織の移植後、有害反応についてレシピエント被験者をモニターする方法を提供し、前述の方法は、前述のレシピエント被験者からの第１の生体試料を用いて、第１の抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルを決定することと；前述のレシピエント被験者からの第２の生体試料を用いて、第２の抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルを決定することと；有害反応の指標として抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルの変化を特定するために、第１の抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルと、第２の抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルとを比較することと；随意に、これらのステップを繰り返して、有害反応に関してレシピエント被験者をモニターし続けることとを含む。
【００１６】
特定の態様に従って、１８のすべてのＡＢＯ組織血液抗原亜型に向かう抗体について提案するグリカンマイクロアレイを用いて個人からの血清が分析される方法を提供する。グリカンマイクロアレイを用いると、ＡＢＯ抗原亜型に向かう抗体レベルの決定、ならびに抗体アイソタイプの定性的決定によるＡＢＯ抗体の検出および特性解析が可能になる。これにより、ＡＢＯ血液型亜型の知識と組み合わせて、抗体の相違を特定しかつ特性を解析することができる。理想的には、すべての利用できる血液製剤も、グリカンアレイを用いて評価されるべきである。これは不可欠ではないが、血液ドナーの血液型判定においてどのような相違でも特定するのに役立ち得る。
【００１７】
別の態様によれば、被験者のＡＢＯ組織血液型亜型を特定する方法を提供し、該方法は、前述の被験者からの生体試料を用いて、抗ＡＢＯ組織血液型抗原亜型抗体プロファイルを決定することと；前述の被験者のＡＢＯ組織血液型亜型を特定するために、ＡＢＯ組織血液型亜型について、既知のＡＢＯ組織血液型抗原亜型プロファイルおよび／または既知の抗ＡＢＯ抗原亜型抗体のプロファイルと、決定された抗体プロファイルとを比較することとを含む。
【００１８】
別の態様に従って、被験者の抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルを決定するためのアッセイキットを提供し、該キットは、複数の固定化ＡＢＯ抗原を含有するグリカンマイクロアレイまたはマクロアレイ；および取扱説明書を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＡＢＯ組織血液型抗原グリカン構造を表す。
【図２】グリカンマイクロアレイを用いるＡＢＯ抗体分析の模式図を表す。
【図３】本出願の一実施形態によるグリカンアレイがＡＢＯ不適合移植の前後に効果的に使用され得る臨床シナリオの略図を表す。
【図４】本出願の一実施形態によるグリカンアレイが予想外の輸血関連問題を特定する際に使用され得る臨床シナリオの略図を表す。
【図５】ＡＢＯ−ＳＡＭＡアレイの蛍光画像および対応するアレイの模式図を表す。このアレイを血液型Ｏ個人からの血漿と共にインキュベートし、次いで結合した抗体を抗ヒトＩｇＭ−ＤｙＬｉｇｈｔ６４９で検出した。
【図６】血液型Ｏ個人からのＩｇＧアイソタイプ血清抗体の分析の結果を表す。
【図７】血液型Ｏ個人からのＩｇＭアイソタイプ血清抗体の分析の結果を表す。
【図８】血液型Ａドナーからの心臓移植片を移植された２０名の血液型Ｏ乳児からのＩｇＧアイソタイプ血清抗体の分析の結果を表す。
【図９】血液型Ａ１個人（「分泌型」）からのＩｇＭアイソタイプ抗体の分析の結果を表す。
【図１０】血液型Ａ１個人（「非分泌型」）からのＩｇＭアイソタイプ抗体の分析の結果を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
別段に定義がない限り、本明細書で用いるすべての技術的および科学的な用語は、本明細書が属する技術分野の当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。
【００２１】
本明細書および特許請求の範囲で用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段に指示しない限り、複数の参照を含む。
【００２２】
本明細書で用いる場合、用語「含んでいる」とは、次に来るリストが包括的でなく、かつ他のさらなる項目、例えば、必要に応じて１または複数のさらなる特徴（単数または複数の）、構成成分（単数または複数の）および／または成分（単数または複数の）を含むこともありまたは含まないこともある。
【００２３】
本明細書で用いる場合、用語「ＡＢＯ血液型」とは、赤血球の表面に保有されたＡまたはＢの組織血液型抗原の有無によって決定される赤血球の遺伝性特性に基づくヒト血液のクラスをいう。４つのＡＢＯ血液型はＡ、Ｂ、ＡＢおよびＯであり、これらは、赤血球の表面のＡ抗原の存在、Ｂ抗原もしくはＡとＢ抗原の存在、またはＨ抗原のみの存在と共にＡとＢ抗原の非存在によってそれぞれ特性を明らかにされる。
【００２４】
本明細書で用いる場合、用語「ＡＢＯ抗原亜型」とは、Ａ、ＢおよびＨ（Ｏ）抗原の亜型をいう。上述のように、ＡＢＯ組織血液型抗原は、グリカン構造であり、これらの構造は、常に、大きなグリカン構造の一部として認められ、その隣接する残基により、糖鎖抗原が亜型に分類されるのが可能になる。これらのＡＢＯ抗原の各々は、上記の表１に表示される６つの亜型の１つとして存在する。さらなる抗原亜型が将来、特定されることもあり得る。本方法およびシステムを適用して、まだ特定されていない抗原亜型の有無または量に関した情報を活用することができる。
【００２５】
本明細書で用いる場合、用語「ＡＢＯ組織血液抗原亜型プロファイル」とは、組織または臓器上でもしくはそれらの内部で発現されるＡＢＯ組織血液抗原亜型をいう。プロファイルは、ＡＢＯ組織血液抗原亜型の少なくとも１つの有無についての情報を含むことができるが、全プロファイルは、組織または臓器上でもしくはそれらの内部で発現されるＡＢＯ組織血液抗原亜型の絶対量または相対量についての情報をさらに含むことができる。
【００２６】
本明細書で用いる場合、用語「抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイル」とは、被験者の試料中に存在する抗ＡＢＯ組織血液型抗原亜型抗体をいう。基本的なプロファイルは、抗ＡＢＯ抗原亜型抗体の少なくとも１つの有無についての情報を含むが、全プロファイルは、組織または被験者中に存在する抗体の絶対量または相対量についての情報をさらに含むことができる。プロファイルは、存在する抗ＡＢＯ抗原亜型抗体のアイソタイプについての情報をさらに含むことができる。一例において、抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルは、１８の主要なＡＢＯ組織血液型抗原亜型のうちの２つ以上などの２つ以上のＡＢＯ組織血液型抗原亜型に特異的な抗ＡＢＯ抗原亜型抗体の有無について、またはその絶対量もしくは相対量について、および／またはアイソタイプについての情報を含む。別の例において、抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルは、１８の主要なＡＢＯ組織血液型抗原亜型に特異的な抗ＡＢＯ抗原亜型抗体の有無について、またはその絶対量もしくは相対量についての情報を含む。
【００２７】
本明細書で用いる場合、用語「ＡＢＯ血液型亜型」を用いて、広いＡＢＯ血液型分類内の血液型亜型をいう。これらの血液型亜型は、ＡＢＯ抗原亜型プロファイル中の定性的差異および定量的差異によって特性を解析され得る。
【００２８】
本明細書で用いる場合、用語「リンカー基」とは、グリカン抗原をマイクロアレイ、マクロアレイまたはタンパク質の表面に共有結合させるために用いることができる１または複数の二官能基分子をいう。リンカー基は、グリカンの抗原性に影響を及ぼさない、または実質的に減少させない位置でグリカン抗原に付着している。
【００２９】
本明細書で用いる場合、用語「生体試料」とは、ＡＢＯ抗原亜型の抗原または抗ＡＢＯ抗原亜型抗体を含有する試料に由来する血液または組織をいい、以下を含むがこれらに限定されるものではない：臓器組織と赤血球［ＡＢＯ抗原亜型の抗原］および血清、血漿、血液（すなわち、全血）［抗ＡＢＯ抗原亜型抗体］。
【００３０】
本明細書に記述する方法およびシステムは、医師および他の臨床医がＡＢＯ適合性または不適合性を正確に評価し、その結果として、移植または輸血の境界をしっかりと確立することが可能なる方法を提供する。本方法およびシステムを用いることにより、不適合血液製剤および臓器／組織／細胞の意図しないまたは偶発的な使用に起因する有害反応を減少させることができ、かつ意図的な不適合を安全に使用し、したがって人命を救うことを可能にするのに役立つことになる。
【００３１】
本方法およびシステムは、ＡＢＯ抗原亜型が異なる個人において様々な密度および割合で発現し、かつ赤血球上および組織中で差次的に発現するという事実を活用する。これは、移植および輸血の適合のための重要な意味を有する。一実施形態において、本方法は、担体、例えば、グリカンマイクロアレイまたはマクロアレイに結合した複数のＡＢＯ組織血液型抗原を有する装置の使用を含む。次いで、この装置を使用して、ＡＢＯ抗原亜型に向かう抗体を定性的にまたは定量的に測定する。この方法は、現在利用できる方法が可能にするよりもより正確に移植適合性および輸血適合性が評価されることを可能にすることができるので、有用である。
【００３２】
一態様に従って、被験者の抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルを決定する免疫学的方法を提供する。この方法は、被験者から採取された生体試料内のＡＢＯ抗原亜型に対する抗体の有無を決定するステップを含む。一般的に、生体試料は血液、血清または血漿である。被験者の抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルを決定する際に、ＡＢＯ抗原亜型のすべてに対する抗体の有無を検査することは有利である。
【００３３】
本方法は、被験者からの生体試料を少なくとも１つのＡＢＯ抗原亜型と接触させることと、前述の少なくとも１つのＡＢＯ抗原亜型が生体試料中に存在する抗ＡＢＯ抗原亜型抗体に結合することで形成される結合複合体を検出することとを含む。次いで、結合複合体は、抗ＡＢＯ抗原亜型抗体の同一性が決定されるような方法で検出される。随意に、各抗ＡＢＯ抗原亜型抗体の量も決定される。好ましくは、少なくとも１つのＡＢＯ抗原亜型が担体上に固定化されている。
【００３４】
試料中の目的の標的抗体を検出するためのイムノアッセイは、競合的または非競合的のいずれかであり得る。いずれの場合にも、上述のＡＢＯ抗原亜型と、その特異的な抗体との間に形成される複合体の存在は、蛍光抗体分光法または比色分析などの当技術分野で周知の方法のいずれかによって検出されることができる。
【００３５】
一実施形態に従って、本方法は、各ＡＢＯ抗原亜型の位置がわかっているマイクロアレイまたはマクロアレイなどの固体表面に固定化されているＡＢＯ抗原亜型を用いて、行われる。この構成は、生体試料中に存在する抗ＡＢＯ抗原亜型抗体の同時検出および随意に定量化と特性解析（例えば、アイソタイプに関して）を容易にする。
【００３６】
移植におけるＡＢＯ適合
移植における適合の改善は、現在記述している方法を用いて、ＡＢＯ組織血液型抗原亜型に向かう抗体を測定することによって、およびドナー臓器上の抗原亜型発現の知識と組み合わせてこの情報を用いて、そのような移植の適合性の程度を決定することによって、達成される。現在利用可能な技法に基づいて、これらの抗体を測定するための好ましいプラットフォームは、グリカンマイクロアレイまたはマクロアレイである。このアプローチは、１８のＡＢＯ抗原亜型すべてに向かう抗体を測定することだけでなく、異なる抗体のアイソタイプを定量的に特定することも可能にする。
【００３７】
異なる細胞および組織は、異なるＡＢＯ抗原亜型を様々な量と密度で発現させる。これは、Ｌｅ遺伝子およびＳｅ遺伝子を含む種々の因子によって遺伝学的に決定される（Oriol, R., Transplantation Proceedings, 1987, 4416-4420）。ＡＢＯ抗原亜型は種々の組織表面で発現することが知られているが、ＡＢＯ抗原亜型の発現が同じ個人の異なる組織間で変わり得ることは、現在、臨床医によって認識されていない。ドナー組織の適合性を評価する際に現在行われているように、ドナーのＡＢＯ血液型だけを考慮すれば、ドナー組織上で発現されるＡＢＯ抗原亜型に関しての情報が少しも提供されないことになる。
【００３８】
本出願の一実施形態において、患者は、ＡＢＯグリカンアレイを用いて、ＡＢＯ不適合臓器移植への適合性を評価されることができる。ポテンシャルドナー臓器上のＡＢＯ抗原亜型発現が決定される。患者は、ＡＢＯ抗原亜型に向かう抗体を評価され、次いでこの評価によって、ドナー臓器上のこれらの抗原亜型の既知の発現と比較される。ドナー臓器上に存在するＡＢＯ抗原亜型に向かう抗体のレベルが低いことは、移植がうまく達成され得ることを示す。次いで、移植後、患者はドナー臓器上に存在するＡＢＯ抗原亜型に向かう抗体をモニターされる。どのような抗体の発生または抗体量の増加でも検出されると、適切な臨床的対策が行われ得る。治療的介入に続いて、抗体の再蓄積または抗体欠損の持続を時間とともにさらにモニターする場合、グリカンアレイは非常に有益な手段になる。
【００３９】
別の実施形態において、患者はこのグリカンアレイを用いて、ＡＢＯ適合移植の適合性を評価されることができる。この場合、患者の血清抗体を評価して、稀なＡＢＯ血液型亜型に潜在的に起因する予想外の血清反応を特定する。この評価は、グリカンアレイを使用し、１８のＡＢＯ抗原亜型に向かうどのような抗体の存在も特定して、特性を解析することにより成し遂げられる。ドナー臓器上に存在するＡＢＯ抗原亜型に向かう低レベルの抗体のみが存在することが重要である。ＡＢＯ適合移植において、この分析は、意図的なＡＢＯ不適合移植の場合よりもそれほど重要でない。しかし、稀には、予想外の抗体媒介性反応が生じて、慢性移植片損傷に関与すると考えられる。この方法によって、これらの反応の多数は前もって特定されることができ、およびどのようなリスクも最小限に抑えられる。理想的には、臓器ドナーからの血清も、ＡＢＯ抗原亜型に向かう抗体のレベルを評価されるべきである。これは不可欠なものではないが、このアプローチは予想外の血清反応を特定するのに役立ち、移植に先立つフェールセーフの役割を果たす。
【００４０】
輸血におけるＡＢＯ適合
輸血において適合の改善は、現在記述している方法を用いて、輸血に先立ちレシピエント中のＡＢＯ組織血液型抗原亜型に向かうレシピエントの血清抗体を測定することによって、達成される。次いで、この情報を用いると、予想外の輸血反応の正確な特定および病因に役立ち、および最も適合する血液製剤を特定する助けになり得る。ほとんどの場合、これらの相違は、稀なＡＢＯ血液型亜型に起因する。したがって、少数の稀な血液型亜型選択を特定するまたは絞り込む能力は、医師にとって有用である。この能力により、適合する血液製剤を特定するために必要とされる「試行錯誤」の量を減少させることになる。新しい血液型亜型は、特定され続ける。例えば、Ｐｒｕｓｓと同僚は、新しいＡ血液型変異体（Ａｗ１１）を報告しており、この変異体を有する患者は、複数の市販のシステム上で検出するのが困難な抗Ａ抗体レベルを有していた（Pruss, A., Heymann, G. A., Braun, J.,ら, Vox Sanguinis, 2006, 90:195-197）。現在記述している方法により、この相違は正確かつ迅速に特定されることができ、かつ患者に適合する血液製剤を供給することができる。
【００４１】
ＡＢＯグリカン構造の調製
上記のように、ＡＢＯ抗原亜型は、グリカンである。必要不可欠なアルケンアグリコンによるグリカンの合成は、これまでに報告されている（Meloncelli, P. J., Lowary, T. L., Carbohydr. Res., 2010, 345:2305-2322)(Meloncelli, P. J., Lowary, T. L., Aust. J. Chem., 2009, 62:558-574)(Meloncelli, P. J., West, L. J., Lowary, T. L., Carbohydr. Res., 2011, 346:1406-1426）。これらのグリカンを固体表面、例えばアレイの表面にうまく結合させるには、修飾が必要とされる。
【００４２】
一実施形態において、グリカン中のアルケン基を異なる官能基に変換させ、次いで、固体表面、例えばこの異なる官能基と反応する複数の基を有するアレイの表面に付着させることができる。特定の一実施形態において、アルケンをアミンに変換させ、次いで、固体表面、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含むがこれに限定されないアミン反応官能基を有するアレイ表面に付着させることができる。このアルケンのアミンへの変換により、グリカンの三次元形状に影響することなく、かつ固定化後、グリカンがその抗ＡＢＯ抗原亜型抗体によって選択的に結合されるように、その抗原性を保持することが可能である。
【００４３】
他の実施形態において、二官能基リンカーが用いられる。そのようなリンカー基は、グリカンの三次元形状に影響することなくグリカン類と反応し、それによって、固定化後、グリカンがその抗ＡＢＯ抗原亜型抗体によって選択的に結合されることができるようにその抗原性を保持することが可能である。
【００４４】
特定の実施形態において、リンカー基は、活性化ｐ−ニトロフェニルエステルリンカーである（図式１）。この実施形態において、ＡＢＯグリカン４をシステアミンと光化学的に反応させて、必要なアミン結合グリカン５をもたらす。次いで、これを、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（「ＤＭＡ」）中、ヘテロ二官能性リンカー６で処理して、アミン官能基を有する表面への結合に適している活性化エステルリンカー７を有するグリカンをもたらす。当業者は、この付着化学の多くの変種が可能であり、およびこれは限定することを目的としない図解例であると理解するであろう。この化学の実験的な詳細は、下記の実施例で説明する。
【００４５】
【化１】
2014525570.tif 000004
【００４６】
グリカンアレイ表面への結合
複数の固定化グリカンを含むグリカンアレイは、種々の方法を使用して作られてきた。これまでに作られたアレイのいずれも、本方法およびシステムに必要とされる複数の固定化ＡＢＯ抗原亜型抗原を含むように設計されていなかった。しかし、当業者が容易に認識するように、同様の技法を本出願のグリカンアレイの製造で使用することができる。例として、グリカンアレイは、ストレプトアビジン被覆プレート上に固定化されているビオチン化グリコシド（Bochner, B. S., Alvarez, R. A., Mehta,ら, J. Biol. Chem. 2005, 280:4307-4312）を使用して、およびアミノ反応Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化マイクロガラス表面に固定化されている末端アミンを有するグリカン（Blixt, O., Head, S., Mondala, T.,ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2004, 101:17033-17038）を使用して調製されてきた。
【００４７】
特定の非限定的な実施形態に従って、ＡＢＯ抗原亜型の抗原グリカンは、ピン方式マイクロアレイ装置を使用してガラスアレイ表面に付着される。グリカンを表面に堆積することができる多数の装置があり、この例は限定するように設計されていないことを当業者は理解するであろう。一実施形態において、末端アミンを含むように官能基を有する（例えば、図式１の構造５）少なくとも１つおよび１８ものＡＢＯ抗原亜型の抗原は、例えば、これに限定されるものではないがＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（図式２）のアミン反応基を有するスライドガラスに付着することができる。この例では、ＡＢＯグリカンは、水に溶けた緩衝液として調製される。この緩衝液は付着の効率を促進することができるが、必須ではないことを当業者は認識する。
【００４８】
【化２】
2014525570.tif 000005
【００４９】
別の実施形態において、少なくとも１つおよび１８ものＡＢＯ抗原亜型の抗原は、市販のマイクロアレイプリンタを使用して、二官能基リンカーを介してグリカンアレイ表面に印刷される。この例では、ＡＢＯグリカンは、ＤＭＡに溶けた溶液として調製される（図式３）。
【００５０】
【化３】
2014525570.tif 000006
【００５１】
別の実施形態において、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのタンパク質に結合した少なくとも１つおよび１８ものＡＢＯ抗原亜型の抗原は、例えば、これに限定されるものではないがエポキシドのアミン反応基を有するスライドガラスに付着することができる（図式４）。この例では、ＡＢＯグリカン−ＢＳＡ結合体は、水に溶けた緩衝液として調製される。この緩衝液は付着の効率を促進することができるが、必須ではないことを当業者は認識するであろう。
【００５２】
【化４】
2014525570.tif 000007
【００５３】
固定化用のグリカン−タンパク質結合体を調製する際に使用されることができる他のタンパク質としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ニワトリ血清アルブミン（ＣＳＡ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）またはジフテリア毒素変異体の交差反応性物質１９７タンパク質（ＣＲＭ１９７）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
別の実施形態において、ビオチンに結合した少なくとも１つおよび１８ものＡＢＯ抗原亜型の抗原は、ストレプトアビジン被覆スライドまたはプレートに付着することができる。この場合、ビオチン化抗原は、標準ビオチン化技法を用いて調製される。
【００５５】
決定方法ならびに移植および輸血の適合方法
本発明の一実施形態において、本方法は、複数のＡＢＯ抗原亜型に向かう血清抗体を同時に測定できる装置に依存する。加えて、この装置は、これらの抗原に対する抗体アイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ）を同時に測定することができる。しかし、これらの抗体のすべてを同時に検出することができるが、これらの抗体アイソタイプの１つまたは２つだけの検出を限定するように意図されてないことを当業者は理解するであろう。
【００５６】
ＡＢＯ組織血液型抗原の化学構造を図１に示す。ＡＢＯ血液型抗原は、これらの抗原をグリカンモチーフの残部に結びつける結合の型によって、さらに分類されることができる。表１に示すように、６つの異なるファミリーが特定されており、「還元末端」β−ガラクトース残基が結合される単糖残基とその位置に基づいてＩ型〜ＶＩ型と称される。すべての型は、ＡＢＯ抗体プロファイルおよび抗ＡＢＯ抗原亜型抗体プロファイルの検出と特性解析のための有用な抗原として本発明の範囲内に含まれることが意図されている。もちろん、当業者は、これらの糖鎖抗原のより小さいサブセットも一般的に使用することができることを認識するであろう。
【００５７】
一実施形態において、グリカンマイクロアレイまたはマクロアレイは、ＡＢＯ組織血液型抗原のための固体支持体として使用される。他の固体支持体も使用することができ、したがってこの記述は、限定することを意図していない。このグリカンマイクロアレイまたはマクロアレイは、一般的に、化学修飾されたガラス表面であるが、これに限定されるものではない。当業者は、表面および官能化法の多くの変種が可能であると理解するであろう。
【００５８】
血清抗体レベルを決定する方法を、本特許の一般的方法の節に示し、図２に模式的に表す。この模式図は、限定することを意図せず、当業者は、上記技法の変種が可能であると理解するであろう。結合した血清抗体の検出は、標識した二次抗体を必要とする。二次抗体は、結合した血清抗体に結合する。例えば、二次抗体は、抗ヒト抗体（すなわち、任意のヒト抗体を認識して、それに結合するもの）であり得る、または特定のアイソタイプの任意のヒト抗体に特異性を有する抗体であり得、抗ヒトＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよび／またはＩｇＡ抗体もしくはこれらの抗体の任意の組合せであり得るが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
二次抗体は、例えば、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的な方法によって検出可能な標識を用いて、標識されることができる。本発明の一実施形態において、この標識は、フルオロフォアである。別の実施形態では、この標識は、発色団または発色団を生成する酵素である。蛍光指示薬の場合、検出は、蛍光アレイリーダーを使用して成し遂げることができる。発色団または発色団を生成する酵素の場合、色彩強度を記録することができるどのような装置でも適しており、フラットベッドスキャナーを含むがこれに限定するものではない。任意の数の標識および検出技法が可能であり、および上記が限定することを意図していないことを当業者は理解するであろう。
【００６０】
本出願の別の態様に従って、上述の１または複数のＡＢＯ抗原亜型グリカンと、ＡＢＯ抗原亜型グリカンおよびＡＢＯ抗原亜型グリカンに特異的な抗体によって形成された結合複合体を検出するための試薬とを含むイムノアッセイキットを提供する。イムノアッセイキットは、さらに、取扱説明書および／または細菌感染症を有すると思われる被験者からの体液の試料を採取するための容器もしくは他の手段を含み得る。
【００６１】
一実施形態において、イムノアッセイキットは、例えば上述のマイクロアレイまたはマクロアレイの表面などの固体表面に固定化されたＡＢＯ抗原亜型グリカンを含む。随意に、マイクロアレイまたはマクロアレイは、陽性対照を含む。例えば、マイクロアレイまたはマクロアレイは、検査されるすべての試料中に存在することが知られている抗体によって認識される固定化抗原を含むことができる。そのような抗原の一例は、α−Ｇａｌエピトープ(α−Ｇａｌ−（１→３）−β−Ｇａｌ−（１→（３）４）−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ）である。これは、非霊長哺乳類および新世界ザルの糖脂質および糖タンパク質上で見出だされる（異種移植および癌免疫療法でのα−Ｇａｌエピトープおよび抗−α−Ｇａｌ抗体。Galili U. Immunol Cell Biol., 2005, 83:674-86. Review）。すべてのヒトは、α−Ｇａｌに特異的な抗体を産生することが知られている。イムノアッセイアレイ上で固定化されたこの抗原を含むことによって、対照抗原が固定化されているアレイ上の位置で結合複合体が形成されていることを示すシグナルの存在に注目することによって、このアッセイが適切に機能していることを確認することが可能である。
【００６２】
一代替実施形態において、その上に非ヒト由来の固定化抗原を有するイムノアッセイアレイを用いて、非ヒト臓器の移植への患者の適格性を評価することができる。
【００６３】
ＡＢＯ適合および不適合移植におけるＡＢＯ交差適合の例
ＡＢＯ血清抗体レベルを決定するためのシナリオを下記の実施例の各々でさらに詳細に示す。移植において、ドナーとレシピエントの間のＡＢＯ適合性は、通常、予備成形された「自然」ＡＢＯ抗体に起因する抗体媒介性拒絶反応を予防するために不可欠であると考えられている。だが、多くの移植は、ＡＢＯ血液型バリアを越えて行われてきた。ＡＢＯ抗原グリカンアレイは、潜在的ＡＢＯ不適合移植を最大の成功の可能性で特定することに最適である。
【００６４】
限定することを意図していないが、図３に示す例により、ＡＢＯ不適合移植の前後で如何にグリカンレイを効果的に使用できるかを示す要点を臨床フローチャートで示す。この例では、血液型Ｏ乳児は、心臓移植を必要とする。患者は最初に、移植の前にＡＢＯ血液型抗原亜型に特異的な抗体プロファイルを評価するために、グリカンを用いてスクリーニングされ、３通りの異なる結果が示される。第１の経路では、患者は、どのような抗体除去戦略も必要なく、ＡＢＯ不適合（血液型ＡもしくはＢもしくはＡＢのドナー）心臓移植またはＡＢＯ適合（血液型Ｏのドナー）心臓移植のいずれかを受けることができる。同様に、第２の経路では、患者は血液型Ａ（ＡＢＯ不適合）の心臓を受け取ることを妨げられることはなく、およびドナー心臓がＩＩ型構造のみを発現するので抗体除去を必要としないが、しかし血液型Ｂの心臓（ＡＢＯ不適合）は、移植前、移植時、ならびに場合により移植後も、抗体除去およびリンパ球の減少および／または形質細胞の減少を伴う。患者がすべてのＡおよびＢの抗原亜型（第３の経路）に対する抗体を持っている場合、ＡＢＯ不適合移植は、移植前、移植時、ならびに場合により移植後も、抗体除去およびリンパ球の減少および／または形質細胞の減少を伴う。移植後、ＡＢＯ抗体レベルを測定するために、患者は、グリカンアレイを用いて拒絶反応の徴候を注意深くモニターされる。アレイの結果（多くの例のうちわずかに３例が示した）により、臨床医は他の介入も考慮し、正しい措置方針、抗体除去の有無に向かう。この場合、抗ＡＩＩ型抗体の上昇は、差し迫った心臓移植片の拒絶反応の初期の徴候である。この方法論により、これらの徴候を従来の技法を用いるよりもはるかに早く検出することができる。初期の臨床介入により、拒絶反応のリスクが大幅に減少する。
【００６５】
輸血におけるＡＢＯ適合の例
限定することを意図していないが、図４に示す例により、輸血のＡＢＯ適合を改善する方法の要点を示す。この場合、ＡＢＯ適合輸血に対して反応を起こす血液型Ａの患者は、血液試料を採取され、およびＡＢＯ組織血液型抗原亜型に向かう血清抗体が本明細書に記述するグリカンアレイを介して測定される。ＡＩ型に対する抗体が検出された場合（第１の経路）、その反応の原因を迅速に特定することが可能であり、次いでより適した血液製剤の輸血を開始することができる。抗Ａ抗体が検出されない場合（第２の経路）、その反応はおそらく非ＡＢＯミスマッチから生ずる。輸血の反応の原因となるＡＢＯ抗体を急速に除外するためにグリカンアレイを使用することにより、実際の原因を発見するのに要する時間を大幅に減少させ、患者が正しい血液製剤および他の適切な介入を受けることが可能になる。
【００６６】
本明細書に記述する本発明についてより良い理解を得るために、以下の実施例を記載する。これらの実施例が例示目的だけであることを理解されたい。したがって、これらの実施例は、多少なりとも本発明の範囲を限定してはならない。
【実施例】
【００６７】
一般的方法
ＡＢＯグリカンの合成
必要不可欠なアルケンアグリコンによるグリカンの合成をすでに報告されている諸方法を用いて成し遂げた（Meloncelli, P. J., Lowary, T. L., Carbohydr. Res., 2010, 345:2305-2322)(Meloncelli, P. J., Lowary, T. L., Aust. J. Chem., 2009, 62:558-574)(Meloncelli, P. J., West, L. J., Lowary, T. L., Carbohydr. Res., 2011, 346:1406-1426）。活性化エステルリンカーによるグリカンの合成の一般的方法を以下に示す。ステップの各々の収率を表２に示す。
【００６８】
【表２】
2014525570.tif 000008
【００６９】
アミンＩＩの調製のための基本手順
オクテニルグリコシドＩ（１当量）とシステアミン塩酸塩（６当量）を乾燥ＣＨ３ＯＨ（０．５ｍＬ)中に取り込んだ。この溶液を脱気して、アルゴン雰囲気下に置いて照射した（３０分）。溶液を濃縮して、Ｃ１８フラッシュクロマトグラフィーにかけた（１％ＣＨ３ＣＯＯＨ（水性）→３：７  １％ＣＨ３ＣＯＯＨ（水性）：ＣＨ３ＯＨ）。濃縮によりアミンＩＩが無色のガラスとして得られた。
【００７０】
半エステルＩＩＩ調製の基本手順
ＣＨ３ＯＨ（２０ｍL）に溶けたアミンＩＩ（１当量）の溶液をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４００（ＯＨ）を用いて中和し、濾過して、濃縮し、次いで減圧下で乾燥した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（２ｍＬ）に溶けたアミンの溶液をホモ二官能性アジピン酸ジ−ｐ−ニトロフェニルエステルリンカー（５当量）で処置し（Wu, X.; Ling, C.-C.; Bundle, D. R., Org. Lett., 2004, 6:4407-4410）、撹拌した（室温で４時間）。次いでこの溶液を濃縮して、Ｃ１８フラッシュクロマトグラフィーにかけて（１％ＣＨ３ＣＯＯＨ（水性）→１：１  １％ＣＨ３ＣＯＯＨ（水性）：ＣＨ３ＯＨ）、不安定な淡黄色の固体として半エステルＩＩＩを得た。
【００７１】
ＡＩ型半エステル７
1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 8.32-8.26 (2H, m, Ph), 7.41-7.34 (2H, m, Ph), 5.23 (1H, d, J1´´,2´´3.8 Hz, H1´´), 5.15 (1H, d, J1´´´,2´´´ 3.8 Hz, H1´´´), 4.57 (1H, d, J1´,2´ 7.2, H1´), 4.36 (1H, q, J5´´,6´´ 6.7, H5´´), 4.29 (1H, dd, J2´´´,3´´´ 10.6 Hz, J1´´´,2´´´ 3.8 Hz, H2´´´), 4.25-4.17 (2H, m, H5´´´, H1), 4.09 (1H, d, J3´,4´ 2.7 Hz, H4´), 3.95-3.62, 3.52-3.31 (23H, 2×m, H2´´, H2´, H2, H3´´´, H3´´, H3´, H3, H4´´´, H4´´, H4, H5´´´, H5´, H5, H6´´´, H6´, H6, CH2O, CH2NH), 2.68-2.64 (2H, m, CH2COO), 2.63-2.59 (2H, m, CH2S), 2.55-2.50 (2H, m, CH2S), 2.27-2.22 (2H, m, NHCOCH2), 1.97 (6H, s, CH3CO), 1.82-1.69 (4H, m, COCH2(CH2)2CH2COO), 1.59-1.48 (4H, m, OCH2(CH2)6CH2S),1.41-1.24 (8H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.20 (3H, d, J5´´,6´´ 6.7 Hz, H6´´)。エレクトロスプレーイオン化質量分析：m/z 計算値 [C50H80N4O25S]Na+：1191.4725。実測値：1191.4720。
【００７２】
ＡＩＩ型半エステル８
1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 8.32-8.26 (2H, m, Ph), 7.41-7.34 (2H, m, Ph), 5.33 (1H, d, J1´´,2´´3.8 Hz, H1´´), 5.14 (1H, d, J1´´´,2´´´ 3.8 Hz, H1´´´), 4.52 (1H, d, J1´,2´ 7.6 Hz, H1´), 4.38 (1H, d, J1,2 8.3 Hz, H1), 4.34-4.29 (2H, m, H2´´´, H5´´), 4.16 (1H, dd, J5´´´,6´´´ 7.1 Hz, J5´´´,6´´´ 4.6 Hz, H5´´´), 4.10 (1H, d, J3´,4´ 2.7 Hz, H4´), 3.99 (1H, dd, J2´,3´ 9.8 Hz, J1´,2´ 7.6 Hz, H2´), 3.93-3.62 (17H, m, H2´´, H2, H3´´´, H3´´, H3´, H3, H4´´´, H4´´, H5´´´, H6´´´, H6´, H6, CH2O), 3.54-3.50 (1H, m, CH2NH), 3.47-3.41 (1H, m, CH2O), 3.37-3.33, 3.31-3.26 (3H, m, H5, H5´, CH2NH), 2.67-2.64 (2H, m, CH2COO), 2.64-2.59 (2H, m, CH2S), 2.55-2.50 (2H, m, CH2S), 2.27-2.22 (2H, m, NHCOCH2), 2.00 (3H, s, CH3CO), 1.96 (3H, s, CH3CO), 1.80-1.70 (4H, m, COCH2(CH2)2CH2COO), 1.60-1.48 (4H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.40-1.25 (8H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.21 (3H, d, J5´´,6´´ 6.6 Hz, H6´´)。エレクトロスプレーイオン化質量分析：m/z計算値[C50H80N4O25S]Na+：1191.4725。実測値：1191.4715。
【００７３】
ＡＩＩＩ型半エステル９
1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 8.30-8.26 (2H, m, Ph), 8.17 (1H, d, NH), 7.38-7.34 (2H, m, Ph), 5.19 (1H, d, J1´´,2´´ 4.0 Hz, H1´´), 5.14 (1H, d, J1´´´,2´´´ 4.0 Hz, H1´´´), 4.88 (1H, d, J1,2 3.6 Hz, H1), 4.64 (1H, d, J1´,2´ 7.1 Hz, H1´), 4.32-4.22 (4H, m, H2, H2´´´, H5´´, H5´´´), 4.19 (1H, d, J3,42.5 Hz, H4), 4.08 (1H, d, J3´,4´ 2.6 Hz, H4´), 3.96 (1H, dd, J2,311.2 Hz, J3,4 2.5 Hz, H3), 3.93-3.81, 3.78-3.60 (15H, 2×m, H2´, H2´´, H3´, H3´´, H3´´´, H4´´, H4´´´, H5, H6, H6´, H6´´´, CH2O), 3.49-3.46 (1H, m, H5´), 3.37-3.28 (3H, m, CH2NH, CH2O), 2.67-2.64 (2H, m, CH2COO), 2.63-2.59 (2H, m, CH2S), 2.54-2.50 (2H, m, CH2S), 2.27-2.22 (2H, m, NHCOCH2), 1.99 (3H, s, CH3CO), 1.98 (3H, s, CH3CO), 1.78-1.69 (4H, m, COCH2(CH2)2CH2COO), 1.59-1.51 (4H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.42-1.26 (8H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.23 (3H, d, J5´´,6´´6.5 Hz, H6´´)。エレクトロスプレーイオン化質量分析：m/z計算値[C50H80N4O25S]Na+：1191.4725。実測値：1191.4717。
【００７４】
ＡＩＶ型半エステル１０
1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 8.30-8.26 (2H, m, Ph), 7.40-7.35 (2H, m, Ph), 5.26 (1H, d, J1´´,2´´4.0 Hz, H1´´), 5.15 (1H, d, J1´´´,2´´´ 3.7 Hz, H1´´´), 4.56 (1H, d, J1´,2´ 7.5 Hz, H1´), 4.36-4.27 (2H, m, H2´´´, H5´´), 4.22-4.16 (2H, m, H1, H5´´´), 4.13-4.04 (3H, m, H2, H4, H4´), 3.97 (1H, dd, J2´,3´9.7 Hz, J1´,2´ 7.5 Hz, H2´), 3.90-3.81, 3.79-3.66 (13H, 2×m, H2´´, H3, H3´, H3´´´, H4´´, H4´´´, H6, H6´, H6´´´, CH2O), 3.59 (1H, dd, J2´´,3´´10.2 Hz, J3´´,4´´ 3.1 Hz, H3´´), 3.50 (1H, dd, J5´,6´ 6.0 Hz, J5´,6´ 6.0 Hz, H5´), 3.47-3.39 (2H, m, H5, CH2O), 3.38-3.32 (2H, m, CH2NH), 2.69-2.64 (2H, m, CH2COO), 2.64-2.59 (2H, m, CH2S), 2.55-2.50 (2H, m, CH2S), 2.28-2.23 (2H, m, NHCOCH2), 1.99 (6H, s, CH3CO), 1.79-1.69 (4H, m, COCH2(CH2)2CH2COO), 1.59-1.47 (4H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.41-1.26 (8H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.22 (3H, d, J5´´,6´´ 6.5 Hz, H6´´) 。エレクトロスプレーイオン化質量分析：m/z計算値[C50H80N4O25S]Na+：1191.4725。実測値：1191.4715。
【００７５】
ＡＶ型半エステル１１
1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 8.31-8.26 (2H, m, Ph), 7.39-7.35 (2H, m, Ph), 5.29 (1H, d, J1´´,2´´3.9 Hz, H1´´), 5.15 (1H, d, J1´´´,2´´´ 3.7 Hz, H1´´´), 4.67-4.61 (2H, m, H1´, H5´´), 4.32 (1H, dd, J2´´´,3´´´ 10.9 Hz, J1´´´,2´´´3.9 Hz, H2´´´), 4.23-4.20 (1H, m, H1), 4.17 (1H, dd, J5´´´,6´´´ 6.9 Hz, J5´´´,6´´´ 4.9 Hz, H5´´´), 4.13-4.06 (2H, m, H4, H4´), 4.01 (1H, dd, J2´,3´ 9.8 Hz, J1´,2´ 7.6 Hz, H2´), 3.93-3.79, 3.78-3.65, 3.62-3.46 (18H, 3×m, H2, H2´´, H3, H3´, H3´´, H3´´´, H4´´, H4´´´, H5, H6, H6´, H6´´´, CH2O), 3.38-3.32 (2H, m, CH2NH), 2.69-2.64 (2H, m, CH2COO), 2.64-2.59 (2H, m, CH2S), 2.56-2.50 (2H, m, CH2S), 2.28-2.22 (2H, m, NHCOCH2), 2.00 (3H, s, CH3CO), 1.79-1.69 (4H, m, COCH2(CH2)2CH2COO), 1.65-1.51 (4H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.41-1.26 (8H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.21 (3H, d, J5´´,6´´ 6.5 Hz, H6´´)。エレクトロスプレーイオン化質量分析：m/z計算値[C48H77N3O25S]Na+：1150.4459。実測値：1150.4456。
【００７６】
ＡＶＩ型半エステル１２
1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 8.32-8.26 (2H, m, Ph), 7.40-7.34 (2H, m, Ph), 5.34 (1H, d, J1´´,2´´3.9 Hz, H1´´), 5.15 (1H, d, J1´´´,2´´´ 3.7 Hz, H1´´´), 4.51 (1H, d, J1´,2´ 7.6 Hz, H1´), 4.34-4.28 (2H, m, H2´´´, H5´´), 4.26 (1H, d, J1,27.8 Hz, H1), 4.16 (1H, dd, J5´´´,6´´´ 7.0 Hz, J5´´´,6´´´4.6 Hz, H5´´´), 4.10 (1H, d, J3´,4´ 2.6 Hz, H4´), 4.00 (1H, dd, J2´,3´9.8 Hz, J1´,2´ 7.6 Hz, H2´), 3.93-3.61 (15H, m, H2, H2´´, H3´, H3´´, H3´´´, H4, H4´´, H4´´´, H6, H6´, H6´´´, CH2O), 3.56-3.50 (2H, m, H5´, CH2O), 3.45 (1H, dd, J2,3 9.1 Hz, J3,49.1 Hz, H3), 3.37-3.21 (3H, m, H5, CH2NH), 2.69-2.64 (2H, m, CH2COO), 2.64-2.58 (2H, m, CH2S), 2.55-2.50 (2H, m, CH2S), 2.27-2.23 (2H, m, NHCOCH2), 2.00 (3H, s, CH3CO), 1.80-1.69 (4H, m, COCH2(CH2)2CH2COO), 1.64-1.52 (4H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.42-1.25 (8H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.21 (3H, d, J5´´,6´´ 6.6 Hz, H6´´) 。エレクトロスプレーイオン化質量分析：m/z計算値[C48H77N3O25S]Na+：1150.4459。実測値：1150.4455。
【００７７】
ＢＩ型半エステル１３
1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 8.30-8.25 (2H, m, Ph), 7.41-7.34 (2H, m, Ph), 5.20 (1H, d, J1´´,2´´3.9 Hz, H1´´), 5.12 (1H, d, J1´´´,2´´´ 3.3 Hz, H1´´´), 4.59-4.54 (1H, m, H1´), 4.34 (1H, q, J5´´,6´´ 6.5 Hz, H5´´), 4.23-4.20 (1H, m, H1), 4.15 (1H, dd, J5´´´,6´´´ 6.6 Hz, J5´´´,6´´´ 4.8 Hz, H5´´´), 4.09 (1H, s, H4´), 3.92-3.62 (17H, H2, H2´, H2´´, H2´´´, H3, H3´, H3´´, H3´´´, H4´´, H4´´´, H6, H6´, H6´´´, CH2O), 3.53 (1H, dd, J5´,6´7.6 Hz, J5´,6´ 4.4 Hz, H5´), 3.44-3.27 (5H, m, H4, H5, CH2NH, CH2O), 2.66-2.63 (2H, m, CH2COO), 2.63-2.58 (2H, m, CH2S), 2.55-2.49 (2H, m, CH2S), 2.27-2.22 (2H, m, NHCOCH2), 1.97 (3H, s, CH3CO), 1.80-1.69 (4H, m, COCH2(CH2)2CH2COO), 1.58-1.43 (4H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.40-1.24 (8H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.17 (3H, d, J5´´,6´´ 6.5 Hz, H6´´)。エレクトロスプレーイオン化質量分析：m/z計算値[C48H77N3O25S]Na+：1150.4459。実測値：1150.4455。
【００７８】
ＢＩＩ型半エステル１４
1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 8.33-8.27 (2H, m, Ph), 7.41-7.36 (2H, m, Ph), 5.34 (1H, d, J1´´,2´´3.9 Hz, H1´´), 5.16 (1H, d, J1´´´,2´´´ 3.7 Hz, H1´´´), 4.54 (1H, d, J1´,2´ 7.3 Hz, H1´), 4.39 (1H, d, J1,2 8.4 Hz, H1), 4.30 (1H, q, J5´´,6´´ 6.6 Hz, H5´´), 4.15-4.11 (2H, m, H4´, H5´´´), 4.01-3.65 (17H, m, H2, H2´, H2´´, H2´´´, H3´, H3´´, H3´´´, H4, H4´´, H4´´´, H6, H6´, H6´´, CH2O), 3.63-3.55 (2H, m, H3, H5´), 3.48-3.42 (1H, m, CH2O), 3.38-3.34 (2H, m, CH2NH)), 3.33-3.27 (1H, m, H5), 2.70-2.65 (2H, m, CH2COO), 2.65-2.60 (2H, m, CH2S), 2.56-2.51 (2H, m, CH2S), 2.30-2.24 (2H, m, NHCOCH2), 1.97 (3H, s, CH3CO), 1.81-1.71 (4H, m, COCH2(CH2)2CH2COO), 1.60-1.50 (4H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.43-1.27 (8H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.21 (3H, d, J5´´,6´´ 6.6 Hz, H6´´)。エレクトロスプレーイオン化質量分析：m/z計算値[C48H77N3O25S]Na+：1150.4459。実測値：1150.4453。
【００７９】
ＢＩＩＩ型半エステル１５
1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 8.31-8.26 (2H, m, Ph), 8.18 (1H, m, J 7.8 Hz, NH) 7.39-7.35 (2H, m, Ph), 5.21-5.19 (1H, m, H1´´), 5.14-5.13 (1H, m, H1´´´), 4.89 (1H, d, J1,23.5 Hz, H1), 4.65 (1H, d, J1´,2´ 6.9 Hz, H1´), 4.32-4.17 (4H, m, H2, H4, H5´´, H5´´´), 4.12 (1H, s, H4´), 3.98-3.60 (17H, m, H2´, H2´´, H2´´´, H3, H3´, H3´´, H3´´´, H4´´, H4´´´, H5, H6, H6´, H6´´´, CH2O), 3.53 (1H, dd, J5´,6´ 6.0 Hz, J5´,6´ 6.0 Hz, H5´), 3.38-3.30 (3H, m, CH2O, CH2NH), 2.68-2.64 (2H, m, CH2COO), 2.63-2.59 (2H, m, CH2S), 2.55-2.50 (2H, m, CH2S), 2.29-2.22 (2H, m, NHCOCH2), 1.99 (3H, s, CH3CO), 1.79-1.69 (4H, m, COCH2(CH2)2CH2COO), 1.61-1.51 (4H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.43-1.28 (8H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.22 (3H, d, J5´´,6´´ 6.5 Hz, H6´´) 。エレクトロスプレーイオン化質量分析：m/z計算値[C48H77N3O25S]Na+：1150.4459。実測値：1150.4452。
【００８０】
ＢＩＶ型半エステル１６
1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 8.31-8.26 (2H, m, Ph), 7.39-7.35 (2H, m, Ph), 5.25 (1H, d, J1´´,2´´4.1 Hz, H1´´), 5.14 (1H, d, J1´´´,2´´´ 3.5 Hz, H1´´´), 4.55 (1H, d, J1´,2´7.6 Hz, H1´), 4.30 (1H, q, J5´´,6´´ 6.5 Hz, H5´´), 4.21-4.14 (2H, m, H1, H5´´´), 4.13-4.05 (3H, m, H2, H4, H4´), 3.98 (1H, dd, J2´,3´ 9.5 Hz, J1´,2´ 7.6 Hz, H2´), 3.93-3.66 (15H, m, H2´´, H2´´´, H3, H3´, H3´´´, H4´´, H4´´´, H5´´´, H6, H6´, H6´´´, CH2O), 3.59 (1H, dd, J2´´,3´´10.2 Hz, J3´´,4´´ 3.0 Hz, H3´´), 3.53-3.48 (2H, m, H5, H5´), 3.44-3.39 (1H, m, CH2O), 3.38-3.33 (2H, m, CH2NH), 2.68-2.64 (2H, m, CH2COO), 2.64-2.59 (2H, m, CH2S), 2.55-2.51 (2H, m, CH2S), 2.27-2.23 (2H, m, NHCOCH2), 1.96 (3H, s, CH3CO), 1.80-1.69 (4H, m, COCH2(CH2)2CH2COO), 1.59-1.46 (4H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.41-1.25 (8H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.21 (3H, d, J5´´,6´´ 6.5 Hz, H6´´)。エレクトロスプレーイオン化質量分析：m/z計算値[C48H77N3O25S]Na+：1150.4459。実測値：1150.4455。
【００８１】
ＢＶ型半エステル１７
1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 8.31-8.25 (2H, m, Ph), 7.39-7.33 (2H, m, Ph), 5.28 (1H, d, J1´´,2´´3.8 Hz, H1´´), 5.14 (1H, d, J1´´´,2´´´ 3.5 Hz, H1´´´), 4.65 (1H, d, J1´,2´ 7.5 Hz, H1´), 4.60 (1H, q, J5´´,6´´ 6.5 Hz, H5´´), 4.23-4.19 (1H, m, H1), 4.17-4.14 (1H, m, H5´´´), 4.14-4.09 (2H, m, H4, H4´), 4.00 (1H, dd, J2´,3´ 9.5 Hz, J1´,2´ 7.5 Hz, H2´), 3.94-3.66 (20H, 2×m, H2, H2´´, H2´´´, H3, H3´, H3´´, H3´´´, H4´´, H4´´´, H5, H5´, H5´´´, H6, H6´, H6´´´, CH2O), 3.37-3.32 (2H, m, CH2NH), 2.68-2.63 (2H, m, CH2COO), 2.63-2.57 (2H, m, CH2S), 2.54-2.49 (2H, m, CH2S), 2.28-2.22 (2H, m, NHCOCH2), 1.80-1.68 (4H, m, COCH2(CH2)2CH2COO), 1.64-1.49 (4H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.41-1.26 (8H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.19 (3H, d, J5´´,6´´ 6.5 Hz, H6´´)。エレクトロスプレーイオン化質量分析：m/z 計算値[C46H74N2O25S]Na+：1109.4194。実測値：1109.4188。
【００８２】
ＢＶＩ型半エステル１８
1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 8.32-8.26 (2H, m, Ph), 7.40-7.35 (2H, m, Ph), 5.33 (1H, d, J1´´,2´´3.9 Hz, H1´´), 5.15 (1H, d, J1´´´,2´´´ 3.7 Hz, H1´´´), 4.52 (1H, d, J1´,2´ 7.5 Hz, H1´), 4.29 (1H, q, J5´´,6´´ 6.6 Hz, H5´´), 4.26 (1H, d, J1,2 7.8 Hz, H1), 4.14-4.09 (2H, m, H4´, H5´´´), 3.99 (1H, dd, J2´,3´ 9.6 Hz, J1´,2´ 7.5 Hz, H2´), 3.94 (1H, dd, J2´,3´ 9.5 Hz, J3´,4´ 2.8 Hz, H3´), 3.92-2.62 (15H, m, H2´´, H2´´´, H3´´, H3´´´, H4, H4´´, H4´´´, H5, H6, H6´, H6´´´, CH2O), 3.58-3.50 (2H, m, H5´, CH2O), 3.46 (1H, dd, J2,3 9.1 Hz, J3,4 9.1 Hz, H3), 3.38-3.32 (2H, m, CH2NH), 3.30-3.22 (1H, m, H2), 2.69-2.64 (2H, m, CH2COO), 2.64-2.59 (2H, m, CH2S), 2.55-2.50 (2H, m, CH2S), 2.27-2.22 (2H, m, NHCOCH2), 1.80-1.70 (4H, m, COCH2(CH2)2CH2COO), 1.64-1.52 (4H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.42-1.26 (8H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.19 (3H, d, J5´´,6´´ 6.6 Hz, H6´´)。エレクトロスプレーイオン化質量分析：m/z計算値[C46H74N2O25S]Na+：1109.4194。実測値：1109.4197。
【００８３】
ＨＩ型半エステル１９
1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 8.32-8.29 (2H, m, Ph), 7.40-7.34 (2H, m, Ph), 5.20 (1H, d, J1´´,2´´3.7 Hz, H1´´), 4.54-4.52 (1H, m, H1´), 4.30 (1H, q, J5´´,6´´ 6.6 Hz, H5´´), 4.27-4.24 (1H, m, H1), 3.91-3.63 (13H, m, H2, H2´, H2´´, H3, H3´, H3´´, H4´, H4´´, H6, H6´, CH2O), 3.52 (1H, dd, J5´,6´ 7.7 Hz, J5´,6´ 4.4 Hz, H5´), 3.45-3.37 (2H, m, H4, CH2O), 3.37-3.33 (2H, m, CH2NH), 3.32-3.28 (1H, m, H5), 2.68-2.64 (2H, m, CH2COO), 2.64-2.59 (2H, m, CH2S), 2.55-2.50 (2H, m, CH2S), 2.28-2.23 (2H, m, NHCOCH2), 1.97 (3H, s, CH3CO), 1.80-1.70 (4H, m, COCH2(CH2)2CH2COO), 1.58-1.47 (4H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.42-1.25 (8H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.19 (3H, d, J5´´,6´´ 6.6 Hz, H6´´)。エレクトロスプレーイオン化質量分析：m/z 計算値[C42H67N3O20S]Na+：988.3931。実測値：988.3925。
【００８４】
ＨＩＩ型半エステル２０
1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH8.32-8.27 (2H, m, Ph), 7.39-7.34 (2H, m, Ph), 5.21 (1H, d, J1´´,2´´2.9 Hz, H1´´), 4.50-4.47 (1H, m, H1´), 4.37 (1H, d, J1,2 8.4 Hz, H1), 4.17 (1H, q, J5´´,6´´ 6.6 Hz, H5´´), 3.91-3.52 (15H, m, H2, H2´, H2´´, H3, H3´, H3´´, H4, H4´, H4´´, H5´, H6, H6´, CH2O), 3.45-3.37 (1H, m, CH2O), 3.37-3.31 (3H, m, H5, CH2NH), 2.69-2.64 (2H, m, CH2COO), 2.64-2.59 (2H, m, CH2S), 2.56-2.50 (2H, m, CH2S), 2.28-2.23 (2H, m, NHCOCH2), 1.96 (3H, s, CH3CO), 1.80-1.70 (4H, m, COCH2(CH2)2CH2COO), 1.60-1.48 (4H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.41-1.25 (8H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.20 (3H, d, J5´´,6´´ 6.6 Hz, H6´´)。エレクトロスプレーイオン化質量分析：m/z 計算値[C42H67N3O20S]Na+：988.3931。実測値：988.3926。
【００８５】
ＨＩＩＩ型半エステル２１
1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 8.30-8.25 (2H, m, Ph), 8.01 (1H, d, J 7.1 Hz, NH), 7.39-7.33 (2H, m, Ph), 5.11 (1H, d, J1´´,2´´ 3.8 Hz, H1´´), 4.95 (1H, d, J1,23.5 Hz, H1), 4.58 (1H, d, J1´,2´ 7.1 Hz, H1´), 4.28-4.14 (3H, m, H2, H4, H5´´), 3.84-3.62 (12H, m, H2´, H2´´, H3´, H3´´, H4´, H4´´, H5, H6, H6´, CH2O), 3.53 (1H, dd, J5´,6´ 6.8 Hz, J5´,6´ 5.6 Hz, H5´), 3.37-3.31 (3H, m, CH2O, CH2NH), 2.68-2.63 (2H, m, CH2COO), 2.63-2.59 (2H, m, CH2S), 2.54-2.50 (2H, m, CH2S), 2.27-2.22 (2H, m, NHCOCH2), 1.97 (3H, s, CH3CO), 1.79-1.68 (4H, m, COCH2(CH2)2CH2COO), 1.59-1.50 (4H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.42-1.25 (11H, m, H6´´, OCH2(CH2)6CH2S)。エレクトロスプレーイオン化質量分析：m/z計算値[C42H67N3O20S]Na+：988.3931。実測値：988.3927。
【００８６】
ＨＩＶ型半エステル２２
1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH8.31-8.26 (2H, m, Ph), 7.49-7.34 (2H, m, Ph), 5.20 (1H, d, J1´´,2´´3.8 Hz, H1´´), 4.53 (1H, d, J1´,2´ 7.2 Hz, H1´), 4.27-4.21 (2H, m, H1, H5´´), 4.11-4.03 (2H, m, H2, H4), 3.89-3.63 (12H, m, H2´, H2´´, H3, H3´, H3´´, H4´, H4´´, H6, H6´, CH2O), 3.53-3.47 (2H, m, H5, H5´), 3.45-3.39 (1H, m, CH2O), 3.38-3.32 (2H, m, CH2NH), 2.69-2.64 (2H, m, CH2COO), 2.64-2.59 (2H, m, CH2S), 2.55-2.49 (2H, m, CH2S), 2.28-2.22 (2H, m, NHCOCH2), 1.96 (3H, s, CH3CO), 1.79-1.69 (4H, m, COCH2(CH2)2CH2COO), 1.59-1.48 (4H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.41-1.26 (8H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.23 (3H, d, J5´´,6´´ 6.5 Hz, H6´´) 。エレクトロスプレーイオン化質量分析：m/z計算値[C42H67N3O20S]Na+：988.3931。実測値：988.3929。
【００８７】
Ｈ型Ｖ半エステル２３
1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH8.32-8.26 (2H, m, Ph), 7.39-7.34 (2H, m, Ph), 5.20 (1H, d, J1´´,2´´3.1 Hz, H1´´), 4.63 (1H, d, J1´,2´ 7.2 Hz, H1´), 4.34 (1H, q, J5´´,6´´6.5 Hz, H5´´), 4.37 (1H, d, J1,2 7.5 Hz, H1), 4.10 (1H, d, J3,42.4 Hz, H4), 3.91-3.47 (16H, m, H2, H2´, H2´´, H3, H3´, H3´´, H4´, H4´´, H5, H5´, H6, H6´, CH2O), 3.37-3.32 (2H, m, CH2NH), 2.70-2.64 (2H, m, CH2COO), 2.64-2.57 (2H, m, CH2S), 2.55-2.50 (2H, m, CH2S), 2.28-2.23 (2H, m, NHCOCH2), 1.80-1.69 (4H, m, COCH2(CH2)2CH2COO), 1.65-1.52 (4H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.42-1.26 (8H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.23 (3H, d, J5´´,6´´6.5 Hz, H6´´)。エレクトロスプレーイオン化質量分析：m/z 計算値[C40H64N2O20S]Na+：947.3665。実測値：947.3659。
【００８８】
ＨＶＩ型半エステル２４
1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 8.30-8.25 (2H, m, Ph), 7.39-7.33 (2H, m, Ph), 5.22 (1H, d, J1´´,2´´ 3.2 Hz, H1´´), 4.47 (1H, d, J1´,2´ 7.1 Hz, H1´), 4.25 (1H, d, J1,2 7.8 Hz, H1), 4.16 (1H, q, J5´´,6´´6.6 Hz, H5´´), 3.90-3.62 (12H, m, H2´, H2´´, H3´, H3´´, H4, H4´, H4´´, H6, H6´, CH2O), 3.56-3.49 (2H, m, H5´, CH2O), 3.47 (1H, dd, J2,39.2 Hz, J3,4 9.1 Hz, H3), 3.36-3.30 (3H, m, H5, CH2NH), 3.23 (1H, dd, J2,3 9.2 Hz, J1,2 7.8 Hz, H2), 2.69-2.63 (2H, m, CH2COO), 2.63-2.58 (2H, m, CH2S), 2.54-2.49 (2H, m, CH2S), 2.27-2.21 (2H, m, NHCOCH2), 1.79-1.69 (4H, m, COCH2(CH2)2CH2COO), 1.64-1.52 (4H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.41-1.26 (8H, m, OCH2(CH2)6CH2S), 1.19 (3H, d, J5´´,6´´6.6 Hz, H6´´)。エレクトロスプレーイオン化質量分析：m/z計算値[C40H64N2O20S]Na+：947.3665。実測値：947.3659。
【００８９】
ＡＢＯグリカンのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）結合体の調製の基本手順：
ＢＳＡ（２．５ｍｇ）をリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５（０．５ｍＬ）に溶解して、選択したモル比でグリカン（例えば７、図式１）のＰＮＰエステルを乾燥ＤＭＦ（２５μＬ）に溶解した。次いで、結果として生じた溶液を反応培地に液滴で注入し、室温で２４時間回転させて反応のままにしておいた。次いで、この混合物を４Ｌビーカー中で脱イオン水を５回替えて、透析した。各水の交換は少なくとも４時間持続させた。次いでこの溶液を凍結乾燥させて、白い固体を得た。ＢＳＡ上の抗原の数を決定するために、ＭＡＬＤＩ質量分析を行った（表３）。
【００９０】
【表３】
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【００９１】
抗原のグリカンマイクロアレイスライドへの結合
アミン官能基を有するマイクロアレイスライドをＡｒｒａｙｉｔ（Ｓｕｐｅｒａｍｉｎｅ２、ＳＭＭ２）から購入した。印刷する前に、これらのスライドをメタノールに溶かしたトリエチルアミン（３％）の溶液に浸漬した。次いで、スライドをメタノールで洗浄して、アルゴンガスの定常流で乾燥させた。ＡＢＯ組織血液型抗原亜型の調製は上述する。約１．７ｍｇの抗原をＤＭＡ（１２０μＬ）に取り込んで、その溶液を、ピン方式マイクロアレイ装置を用いてアレイスライド上に印刷した。これらのスライドを利用する前に、脱イオン水に浸漬し、続いてメタノールに浸漬することで洗浄した。
【００９２】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド官能基を有するマイクロアレイスライドは、Ｓｃｈｏｔｔ  ＡＧ（Ｓｌｉｄｅ  Ｈ）から購入した。ＡＢＯ組織血液型抗原亜型の調製は上述する。各抗原を、１００μＭまたは１０μＭのいずれかの最終抗原濃度で０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）３００ｍＭに溶解させた。マイクロアレイは、約０．６ｎＬの各溶液をピン方式ロボット堆積によって印刷し、各濃度のすべての抗原を３反復で印刷した。印刷したスライドは、湿度８０％の雰囲気中で３０分間反応させておき、続いて一晩乾燥させた。緩衝液（ホウ酸塩緩衝液５０ｍＭに混合したエタノールアミン５０ｍＭ）中に１時間浸漬させることによって残存するＮ−ヒドロキシスクシンイミド基をブロックした。使用前に、スライドを水に浸し、乾燥させ、乾燥機に室温で保存した。
【００９３】
エポキシド官能基を有するマイクロアレイスライドは、Ｓｃｈｏｔｔ  ＡＧ（Ｓｌｉｄｅ  Ｅ）から購入した。ＡＢＯ組織血液型抗原亜型ＢＳＡ結合体の調製は上述する。ほとんどの場合、Gildersleeve,ら, Curr. Protoc. Chem. Biol. 2010, 2, 37-53に記述されるように、アレイを調製した。各ＢＳＡ結合体を、０．００６％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および２．５％グリセロールを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に、１２５μｇ／ｍＬの最終濃度で溶解させた。マイクロアレイは、約０．６ｎＬの各溶液をピン方式ロボット堆積によって印刷し、各濃度のＢＳＡを３反復で印刷した。印刷したスライドは、湿度８０％の雰囲気中で３０分間反応させておき、続いて一晩乾燥させた。使用前に、スライドを水に浸し、乾燥させ、−２０℃で、乾燥状態で保存した。
【００９４】
抗体のハイブリダイゼーションおよび検出
複数のマイクロアレイを同時に反応させて処理することを可能にするために、マイクロアレイスライド（１カセット当たり最高４までのスライド）を９６ウェル型ハイブリダイゼーションカッセット（ＡＨＣ４×２４、Ａｒｒａｙｉｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に載せた。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄した後、１％ウシ血清アルブミン／ＰＢＳおよび／または３％ヒト血清アルブミン／ＰＢＳを用いて、マイクロアレイを室温で１時間ブロックした。希釈血漿（５０μＬ、ブロッキング緩衝液で１：２０〜１：１５０で希釈）または連続希釈した標準血清を室温で３０分間反応させた。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、蛍光色素（Ｄｙｌｉｇｈｔ５４９（商標）またはＤｙｌｉｇｈｔ６４９（商標））結合ヤギ抗ヒトＩｇＭ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）またはＩｇＡ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）を用いて、結合した抗体を検出した。マイクロアレイスライドをＮｉｍｂｌｅｇｅｎ（商標）ＭＳ２００マイクロアレイスキャナー（Ｒｏｃｈｅ  Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ，Ｉｎｃ．）上で２〜５μｍ解像度で、直ちに走査した。走査した画像をＩｍａｇｅｎｅ（商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｉｎｃ．）を使用して分析した。抗原特異的血漿抗体または血清抗体の濃度を標準血清で作成した標準曲線から得る。
【００９５】
実施例１：血液型Ｏ個人の評価
血液型Ｏ個人からの血漿を、グリカンアレイを使用して分析し、結合した抗体を抗ヒトＩｇＭ−ＤｙＬｉｇｈｔ６４９を用いて検出した。この実施例で使用したアレイは、図５の模式図に示すα−Ｇａｌ陽性対照を含む。図７の蛍光画像で認められるように、この血液型Ｏ個人は、１２のＡ抗原亜型およびＢ抗原亜型ならびにＨＶ型（ヒト組織中に非存在）のすべてに特異的な抗体を産生したが、他のすべてのＨ抗原亜型に対する抗体は欠如していた。上述のように、α−ＧａｌはＡＢＯ抗原に類似している非ヒト抗原であり、本明細書に示したα−Ｇａｌ抗原の部位に対応するシグナルは、該個人からの血漿試料中の抗α−Ｇａｌ抗体がアレイ上の固定化α-Ｇａｌ抗原と反応したことを示していた。
【００９６】
血液型Ｏ個人からの血漿を、ＡＢＯ抗原亜型に向かうＩｇＧ（図６）およびＩｇＭ（図７）の両アイソタイプ抗体用のグリカンアレイを使用して分析した。すべての血液型Ｏ個人は、ＡおよびＢの両抗原の６つの亜型のすべてに対して「自然」抗体を産生すると予想される。この患者において、ＡＩ型、ＩＩ型およびＶ型抗原に向かう極めて高いレベルのＩｇＧアイソタイプ抗体が認められたが、ＡＩＩＩ型、ＩＶ型およびＶＩ型に向かう低いレベルだが依然として有意なレベルの抗体が測定された。ＢＩ型抗原に向かう抗体は中程度のレベルであったが、残りのＢ抗原亜型の場合、抗体は極めて低いレベルであった。予想したように、Ｈ抗原に対するＩｇＧアイソタイプ抗体は、ＨＶ型（ヒト組織中に非存在）を除いて、検出できなかった。同様の傾向は、ＩｇＭアイソタイプ抗体で認められた。
【００９７】
ＡＢＯ抗体アイソタイプの中で確実に識別するアレイの能力をこれらの結果が実証し、この装置が確実なものであり、詳細な臨床情報を提供することができることを示している。
【００９８】
実施例２：グリカンアレイを使用することによる、移植前、移植後の抗体のモニタリング
ＡＢＯ抗原亜型Ｉ〜ＶＩ抗原は、分泌型依存的または非依存的な様式で組織および臓器中で差次的に発現する。ＡＢＯ不適合臓器移植の設定では、各抗原亜型に対する抗体の評価は、与えられた臓器にとって不可欠である。例えば、心臓では、ＩＩ型ＡＢＨ抗原構造だけが血管内皮で発現するので、ＡＢＯ不適合心臓移植の後にＩＩ型抗原に対する抗体（ドナー特異的抗体）を測定することが重要になる。
【００９９】
グリカンアレイは、ＡＢＯ不適合移植後、ドナー特異的抗体の有無を確実に確かめるための有用な手段である。これまで、従来の凝集アッセイは、ＡＢＯ不適合移植から数カ月および数年の間、患者のＡＢＯ抗体力価を追跡する唯一の方法であった。どのＡＢＯ抗原亜型抗体が実際に存在するかについての知識がないと、標準的な赤血球凝集試験によって検出されるドナー血液型に対する力価が予想外に高いと、これらの抗体を除去するための不必要で高額の介入をもたらす可能性がある。これは見当違いになり得る。すなわち、移植された臓器で発現する抗原に特異的でないことがある。
【０１００】
グリカンアレイを使用して、乳児期に血液型Ａのドナーから心臓移植を受けた２０名の血液型Ｏの患者からの血清を分析した。結果（図８）は、ドナー血液型に対する他の非損傷抗体が存在するにもかかわらず、心臓組織（すなわち、移植された臓器）中に発現したＡ抗原亜型（ＩＩ型）に対する抗Ａ  ＩｇＧ抗体の具体的な非存在（図８の矢印）を明確に示している。移植前および移植後のモニタリングのためにグリカンアレイを使用することにより、どのＡＢＯ抗原亜型特異的抗体が患者の血液中に存在するかの正確な図表が与えられ、したがって、移植された臓器にとって実際には有害でない抗体を除去するために不必要で費用のかかる介入の使用が減少する。ＡＢＯ抗体が存在すると、頻繁な抗体除去戦略が移植前および／または移植後に必要とされることが多い。グリカンアレイは、介入に続くドナー特異的抗体および介入の有効性をモニターする際の有用な手段にもなり得る。
【０１０１】
実施例３：ＡＢＯ適合移植および輸血におけるグリカンアレイの使用
血液型Ａの個人は、通常、自身の細胞および組織中で発現しないＢ抗原に対して自然抗体を発生するが、体中の細胞および組織で広く発現する自己抗原（Ａ）に対しては自然抗体を発生しない（図９）。だが、ＡＩ型抗原は、分泌腺依存的な様式で蓋上皮および腺上皮中でのみ発現する（Fujitani, N.,ら, Glycoconj. J. 2000, 17(5): 331-338;およびFujitani, N.,ら,J. Histochem. Cytochem. 2000, 48(12): 1649-1656）。赤血球は、通常、Ｉ型ＡＢＨ構造を合成しないが、分泌腺中のそれらの発現は循環する糖脂質が血漿から吸収されることに起因する（Clausen, H.およびS. Hakomori Vox Sang 1989, 56(1): p. 1-20）。したがって、このように、非分泌型である一部の個人は、自身の細胞および組織中で発現されないＡＩ型抗原に対する血清抗体を発生することもある（図１０）。これらの個人が血液型Ａ分泌型血液ドナーから赤血球輸血を受ける場合、輸血関連合併症が生じることもある。同様に、これらの個人が血液型Ａ分泌型ドナー（ＡＢＯ適合と考えられる）から臓器移植を受ける場合、急速または慢性の抗体媒介性拒絶反応が生じることもある。したがって、グリカンアレイは、輸血関連合併症の対処および移植結果の改善において有用な手段になり得る。
【０１０２】
実施例４：グリカンアレイを使用することによる血液型亜型の決定
小集団の血液型Ａ２の個人は、ＡＩＩＩ型およびＩＶ型に対する抗体を産生しない。なぜならばこれらの抗原亜型が発現されないからである。対照的に、血液型Ａ１の個人は、実施例３で示したように、非分泌型を除いて、どのようなＡ抗原亜型の抗原に対しても抗体を産生しない。グリカンアレイはこれらの抗原に対する抗体を確実に検出することができ、したがって、理論的に言えば、このアレイを用いて、血液型Ａ２対Ａ１個人を特定することができ得る。
【０１０３】
これらの実施例、すなわち健康被験者または患者から直接分離した血漿または血清を検査した結果は、ＡＢＯグリカンアレイを用いて取得することができる豊富な知識を示している。移植成功の予測および治療的介入の結果のモニタリングを目的としてこの知識を応用することは、医師にとって非常に有益である。
【０１０４】
本明細書に記述したすべての刊行物、特許および特許出願は、本発明が関連する技術分野での当業者のレベルを示し、ならびに刊行物、特許または特許出願の各々が参照によって組み込まれるよう具体的かつ個々に示されているかのように、同じ程度で参照によって本明細書に組み込まれるものとする。
【０１０５】
したがって、記述されている本発明は、さまざまに変わり得ることは明らかであろう。そのような変種は、本発明の精神および範囲からの逸脱とみなされるべきではなく、および当業者にとって明らかなようにそのような改変のすべては、以下に記載の請求項の範囲内に含まれることを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図５】
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【国際調査報告】
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