(57)【要約】  本開示は、メラノーマを治療するための試薬、方法、及びキットを提供する。試薬は、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）応答メラノーマ細胞を包含する。この細胞は、自食性及び非アポトーシス性のメラノーマ細胞であり、ＭＨＣクラスＩＩを発現する。別の態様において、試薬は、ＩＦＮ−γに応答し、非アポトーシス性であり、ＭＨＣクラスＩＩを発現するメラノーマ細胞をロードした、樹状細胞を包含する。【選択図】図２Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラノーマを有する被験体から採取したメラノーマ細胞に由来するメラノーマ特異的ペプチドを含む、被験体由来の樹状細胞集団であって、
前記メラノーマ特異的ペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＦＮ−γ又はＩＦＮ−γ模倣薬で処理された前記メラノーマ細胞から樹状細胞によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られ、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＦＮ−γ又はＩＦＮ−γ模倣薬で処理された前記メラノーマ細胞の６０％超は、自食性及び非アポトーシス性であり、
前記樹状細胞及び前記メラノーマ細胞は、同じ被験体に由来する、
樹状細胞集団。
【請求項２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＦＮ−γ又はＩＦＮ−γ模倣薬で処理された前記メラノーマ細胞の８０％超が、自食性及び非アポトーシス性である、
請求項１に記載の樹状細胞集団。
【請求項３】
請求項１に記載の哺乳類樹状細胞集団を含む、請求項１に記載の被験体のためのワクチン。
【請求項４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られた前記メラノーマ特異的ペプチドの実質的に全てが、細胞分裂することができないメラノーマ細胞に由来する、
請求項１に記載の樹状細胞。
【請求項５】
前記メラノーマ特異的ペプチドの実質的に全てが、照射されることにより細胞分裂することができないメラノーマ細胞に由来する、
請求項１に記載の樹状細胞。
【請求項６】
前記メラノーマ特異的ペプチドの実質的に全てが、染色体が核酸架橋剤で架橋されることにより細胞分裂することができないメラノーマ細胞に由来する、
請求項１に記載の樹状細胞。
【請求項７】
ＩＦＮ−γ及び照射で処理されたメラノーマ細胞に由来するメラノーマ特異的ペプチドを含む、
請求項１に記載の樹状細胞。
【請求項８】
メラノーマ特異的ペプチドであって当該メラノーマ特異的ペプチドの全てがＩＦＮ−γ及び照射で処理されたメラノーマ細胞に由来するメラノーマ特異的ペプチドを含む、
請求項１に記載の樹状細胞。
【請求項９】
自食性非アポトーシス性メラノーマ細胞が表面への接着により得られる、
請求項１に記載の樹状細胞集団。
【請求項１０】
前記メラノーマ特異的ペプチドの実質的に全てが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理されて細胞分裂することができないメラノーマ細胞に由来する、
請求項１に記載の樹状細胞。
【請求項１１】
被験体がヒトの被験体である、請求項１に記載の樹状細胞。
【請求項１２】
被験体がヒト以外の哺乳類である、請求項１に記載の樹状細胞。
【請求項１３】
メラノーマを有する被験体に由来する少なくとも１つの成熟樹状細胞を含むメラノーマワクチンであって、
前記少なくとも１つの成熟樹状細胞は、同じ被験体に由来する少なくとも１つのメラノーマ腫瘍細胞との接触により調製され、
前記少なくとも１つの成熟樹状細胞に接触する前記少なくともメラノーマ腫瘍細胞は、非分裂性、自食性、及び非アポトーシス性である、
メラノーマワクチン。
【請求項１４】
請求項１に記載の免疫刺激量の樹状細胞を請求項１に記載の被験体に投与すること、又は請求項１３に記載の免疫刺激量のワクチンを請求項１３に記載の被験体に投与することを含む、
メラノーマ特異的抗原に対する免疫応答の刺激方法。
【請求項１５】
刺激された前記免疫応答が、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、及びＢ細胞応答のうちの１つ又は複数を含む、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞応答、前記ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、又は前記Ｂ細胞応答が、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、細胞内サイトカイン染色アッセイ、テトラマーアッセイ、又は抗原特異的抗体産生の検出により測定することができる、
請求項１７に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫応答が２年全生存率（ＯＳ）を含む生存期間を含み、前記２年全生存率が少なくとも６０％である、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記投与が前記ワクチンの皮下注射を含む、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与が、週１回３ヶ月間、次に月１回５ヶ月間行われる前記ワクチンの注射を含む、
請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
同じ被験体由来のメラノーマ細胞及び樹状細胞を含む樹状細胞ワクチンの調製方法であって、
１つ又は複数のメラノーマ細胞を細胞分裂を妨げる薬剤で処理し、
前記１つ又は複数のメラノーマ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）又はＩＦＮ−γ模倣薬で処理し、
自食性及び非アポトーシス性であるメラノーマ細胞を選択し、
非自食性及びアポトーシス性であるメラノーマ細胞を除外し、
前記自食性及び非アポトーシス性であるメラノーマ細胞を１つ又は複数の自己樹状細胞に接触させ、
少なくとも１つのメラノーマ由来ペプチドを前記１つ又は複数の自己樹状細胞に取り込ませることを含む、
調製方法。
【請求項２１】
第１の被験体に由来するインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）処理メラノーマ細胞、及び同じ第１の被験体に由来する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含み、
前記メラノーマ細胞が自食性及び非アポトーシス性である、
組成物。
【請求項２２】
前記メラノーマ細胞がＭＨＣクラスＩＩ発現性である、
請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＡＰＣが樹状細胞、マクロファージ、又はＢ細胞である、
請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記メラノーマ細胞がメラノーマ特異的ペプチドを含み、
前記メラノーマ特異的ペプチドが前記ＡＰＣに含まれない、
請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記メラノーマ細胞がメラノーマ特異的ペプチドを含み、
前記メラノーマ特異的ペプチドのうちの少なくとも１つが前記ＡＰＣに取り込まれ、前記ＡＰＣに含まれる、
請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ＩＦＮ−γ処理メラノーマ細胞が前記ＡＰＣにロードされる、
請求項２１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ＩＦＮ−γ処理メラノーマ細胞が前記ＡＰＣにロードされない、
請求項２１に記載の組成物。
【請求項２８】
微小管結合タンパク質軽鎖３（ＬＣ３）分析試験によりメラノーマ細胞の自食作用が実証される、
請求項２１に記載の組成物。
【請求項２９】
７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＤＤ）試薬又はアネキシン試薬のうちの少なくとも１つを用いて前記メラノーマ細胞が非アポトーシス性であることが実証される、
請求項２１に記載の組成物。
【請求項３０】
メラノーマを有し、メラノーマ細胞を含む被験体における免疫応答の刺激方法であって、
前記被験体は前記第１の被験体と同じ被験体であり、請求項２１に記載の免疫効果量の組成物を投与することを含む、
刺激方法。
【請求項３１】
請求項１に記載のワクチン又は請求項２１に記載の組成物の製造方法であって、
少なくとも１つの自食性非アポトーシス性メラノーマ腫瘍細胞を少なくとも１つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）に接触させることを含み、
前記少なくとも１つの自食性非アポトーシス性メラノーマ腫瘍細胞が第１のヒト被験体に由来し、
前記少なくとも１つのＡＰＣが同じ第１のヒト被験体に由来する、
製造方法。
【請求項３２】
樹状細胞ワクチンの調製方法であって、
第１の被験体から得たメラノーマ細胞を、細胞分裂を妨げる薬剤で処理し、
前記メラノーマ細胞をＩＦＮ−γ又はＩＦＮ−γ模倣薬で処理し、
自食性及び非アポトーシス性であるメラノーマ細胞を選択し、
前記選択したメラノーマ細胞を同じ第１の被験体由来の自己樹状細胞に接触させることを含む、
調製方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法により調製された樹状細胞ワクチンを含む組成物。
【請求項３４】
請求項３３に記載の組成物をメラノーマを有する被験体に投与することを含む、メラノーマ特異的抗原に対する免疫応答の刺激方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２０１１年１０月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／５４９，６８１号及び２０１２年２月２日に出願された米国仮特許出願第６１／５９４，３０４号のパリ条約による優先権及び利益を主張する。これらの出願は、その全体が本明細書に完全に記載されているかのように、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本開示は、メラノーマの治療、治療に適した被験体のスクリーニング、組成物、方法、及びキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
癌は、癌に対して有効な免疫応答の欠如により分類される。免疫応答の欠如は、例えば、多くの腫瘍抗原が「自己抗原」であること、腫瘍細胞によるＭＨＣの発現が欠如し、結果として腫瘍細胞による腫瘍抗原の提示が欠如すること、マクロファージとこのマクロファージが免疫応答を低下させるサイトカインを発現している腫瘍との関連、並びにＴ制御細胞（Ｔｒｅｇｓ）の免疫抑制活性に起因する可能性がある。また、腫瘍に対する免疫応答の欠如は、腫瘍細胞が、自然免疫応答を刺激する分子、即ち、トール様受容体（ＴＬＲｓ）又はヌクレオチド結合性多量体ドメイン（ＮＯＤ）様受容体を刺激する分子を発現しない傾向にあることにも起因する。癌は、固形腫瘍、並びに白血病及び髄異形成症候群などの血液癌も包含する。
【０００４】
免疫系は、細胞性免疫、液性免疫、及び補体反応を包含する。細胞性免疫としては、細胞のネットワーク、並びに樹状細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、細胞傷害性リンパ球）及びＣＤ４＋Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）が関与する事象が挙げられる。樹状細胞（ＤＣ）は、ポリペプチド抗原を捕捉する。これらの抗原は、ＤＣの外部から捕捉されるか、感染微生物によりＤＣの内部で生合成される。ＤＣは、ポリペプチドを処理して約１０アミノ酸長のペプチドを生じさせ、このペプチドをＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩのどちらかに運んで複合体を形成させ、この複合体をＤＣの表面に輸送する。ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体を有するＤＣがＣＤ８＋Ｔ細胞に接触すると、結果としてＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化され、増殖する。ＭＨＣクラスＩＩの役割については、ＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド複合体を有するＤＣがＣＤ４＋Ｔ細胞に接触すると、結果としてＣＤ４＋Ｔ細胞が活性化され、増殖する（Ｍｕｎｚ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２２：８９−９３；  Ｍｏｎａｃｏ  （１９９５）  Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．  ５７：５４３−５４７；  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ  （２００２）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０５：２５２−２６２）。Ｔ細胞に抗原を提示する樹状細胞は、Ｔ細胞を「活性化」することができるが、この活性化されたＴ細胞が、効果的な免疫応答を開始できない可能性がある。ＣＤ８＋Ｔ細胞による効果的な免疫応答は、多くの場合、多くの相互作用のうちの１つまたは複数によりＤＣを予め刺激することを必要とする。これらの相互作用としては、ＣＤ４＋Ｔ細胞がＤＣに直接接触すること（ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ４０リガンドとＤＣのＣＤ４０受容体との接触による）又はＴＬＲアゴニストが樹状細胞のトール様受容体（ＴＬＲｓ）の１つに直接接触することが挙げられる。
【０００５】
液性免疫は、Ｂ細胞及び抗体に関連する。Ｂ細胞は、形質細胞に形質転換され、形質細胞は、抗体を発現及び分泌する。未感作Ｂ細胞は、抗原特異的Ｂ細胞がマーカーとなるＣＤ２７を発現するのに対し、ＣＤ２７を発現しないことで区別される（Ｐｅｒｅｚ−Ａｎｄｒｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ＰａｒｔＢ  ７８Ｂ  （Ｓｕｐｐｌ．  １）  Ｓ４７−Ｓ６０）。分泌された抗体は、次に、腫瘍細胞の表面上に存在する腫瘍抗原に結合する。その結果、感染細胞又は腫瘍細胞は、抗体で標識されることになる。抗体が感染細胞又は腫瘍細胞に結合すると、結合した抗体は感染細胞又は腫瘍細胞の死滅を媒介し、ＮＫ細胞により死滅がもたらされる。ＮＫ細胞は、Ｔ細胞が標的抗原を認識するように、特定の標的抗原を認識するものではないが、ＮＫ細胞は、抗体の定常領域に結合することができるため、抗体で標識された細胞を特異的に死滅させることができる。ＮＫ細胞による抗体の認識は、抗体のＦｃ領域に結合する（ＮＫ細胞の）Ｆｃ受容体を介して行われる。この種の死滅は、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）と呼ばれる。また、ＮＫ細胞は、ＡＤＣＣ機構とは関係のない細胞も死滅させることができ、このような死滅では、標的細胞内でＭＨＣクラスＩの発現が失われるか、不十分である必要がある（例えば、Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ  （２００８）  Ｂｌｏｏｄ  １１２：４６１−４６９参照）。
【０００６】
「遅延型過敏性反応」による技術は、主に細胞性免疫に関わる免疫応答と主に液性免疫に関わる免疫応答とを区別するのに使用することができる。遅延型過敏性反応からの陽性シグナルは、細胞性免疫を意味する（例えば、Ｒｏｙｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  ＡＡＰＳ  Ｊ．  Ｅ８３４−Ｅ８４６参照）。
【０００７】
自食作用は、恒常作用であり、これにより細胞質成分及び細胞小器官は、リソソームに移送されて分解される。また、自食作用は、細胞内病原体に対する自然免疫応答及び適応免疫応答と関連しており、これにより細胞内抗原は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子上にロードされてＣＤ４＋Ｔ細胞に認識される。
【０００８】
添付の特許請求の範囲を含め、本明細書中で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」のような単語の単数形は、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、それらの対応する複数形の言及を含む。本明細書で引用した全ての参考文献は、あたかも各個々の刊行物、特許、特許出願、及び配列表、並びに前述の刊行物及び特許文献中の図及び図面が、具体的かつ個々に参照により援用されることが示されるのと同じ程度に、参照により援用される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、第１の被験体から得たメラノーマ細胞を細胞分裂を妨げる薬剤で処理し、前記メラノーマ細胞をＩＦＮ−γ又はＩＦＮ−γ模倣薬で処理し、自食性非アポトーシス性メラノーマ細胞であるメラノーマ細胞を選択し、前記選択したメラノーマ細胞を同じ第１の被験体に由来する自己樹状細胞に接触させることを含む、樹状細胞ワクチンの調製方法を提供する。また、前記方法により調製された樹状細胞ワクチンを含む組成物を提供する。また、本開示は、メラノーマを有する被験体に前記組成物を投与することを含むメラノーマ特異的抗原に対する免疫応答の刺激方法を提供する。
【００１０】
メラノーマに罹患している所定の被験体に由来する哺乳類樹状細胞集団を含むワクチンであって、前記被験体はメラノーマ細胞を含み、前記被験体が含む前記メラノーマ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＦＮ−γ又はＩＦＮ−γ模倣薬で処理すると自食性及び非アポトーシス性となるメラノーマ細胞を含み、前記樹状細胞は、メラノーマ特異的ペプチド抗原を含み、前記メラノーマ特異的ペプチド抗原は、前記メラノーマ細胞から樹状細胞によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られ、前記樹状細胞に含まれる前記メラノーマ特異的ペプチドの６０％超が自食性及び非アポトーシス性であるメラノーマ細胞に由来し、前記樹状細胞に含まれる前記メラノーマ特異的ペプチドの４０％未満が非自食性及びアポトーシス性であるメラノーマ細胞に由来し、前記樹状細胞及び前記メラノーマ細胞は同じ被験体に由来するワクチンを提供する。前記自食性非アポトーシス性メラノーマ細胞は表面への接着により得られる、前記樹状細胞集団を提供する。
【００１１】
ある場合には、前記メラノーマ特異的ペプチドの８０％超が、自食性及び非アポトーシス性であるメラノーマ細胞に由来し、前記メラノーマ特異的ペプチドの２０％未満が、非自食性及びアポトーシス性であるメラノーマ細胞に由来する、ワクチンを開示する。
【００１２】
ある場合には、前記メラノーマ特異的ペプチドの９０％超が、自食性及び非アポトーシス性であるメラノーマ細胞に由来し、前記メラノーマ特異的ペプチドの１０％未満が、非自食性及びアポトーシス性であるメラノーマ細胞に由来する、ワクチンを開示する。
【００１３】
ある場合には、前記メラノーマ特異的ペプチドの実質的に全てが、細胞分裂することができないメラノーマ細胞に由来する、ワクチンを開示する。
【００１４】
ある場合には、前記メラノーマ特異的ペプチドの実質的に全てが、照射されることにより細胞分裂することができないメラノーマ細胞に由来する、ワクチンを開示する。
【００１５】
ある場合には、前記メラノーマ特異的ペプチドの実質的に全てが、染色体が核酸架橋剤で架橋されることにより細胞分裂することができないメラノーマ細胞に由来する、ワクチンを開示する。
【００１６】
ある場合には、前記メラノーマ特異的ペプチドの全てが、ＩＦＮ−γ処理メラノーマ細胞又はＩＦＮ−γ模倣薬処理メラノーマ細胞であるメラノーマ細胞に由来する、ワクチンを開示する。
【００１７】
ある場合には、前記メラノーマ特異的ペプチドの全てが、ＩＦＮ−γ処理メラノーマ細胞でもなく、ＩＦＮ−γ模倣薬処理メラノーマ細胞でもないメラノーマ細胞に由来する、ワクチンを開示する。
【００１８】
ある場合には、自食性及び非アポトーシス性であるメラノーマ細胞に由来する第１の数のメラノーマ特異的ペプチドがあり、非自食性及びアポトーシス性であるメラノーマ細胞に由来する第２の数のメラノーマ特異的ペプチドがあり、前記第１の数及び前記第２の数はどちらも、Ｓ−１００、ＨＭＢ−４５、Ｍｅｌ−２、Ｍｅｌａｎ−Ａ、Ｍｅｌ−５、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＲＴ−１、又はチロシナーゼのうちの１つであるメラノーマ特異的抗原の数に相当し、前記６０％超は前記第１の数に由来し、前記４０％未満は前記第２の数に由来する、ワクチンを開示する。
【００１９】
ある場合には、自食性及び非アポトーシス性であるメラノーマ細胞に由来する第１の数のメラノーマ特異的ペプチドがあり、非自食性及びアポトーシス性であるメラノーマ細胞に由来する第２の数のメラノーマ特異的ペプチドがあり、前記第１の数及び前記第２の数はどちらも、Ｓ−１００、ＨＭＢ−４５、Ｍｅｌ−２、Ｍｅｌａｎ−Ａ、Ｍｅｌ−５、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＲＴ−１、又はチロシナーゼのうちの２つであるメラノーマ特異的抗原の数に相当し、前記６０％超は前記第１の数に由来し、前記４０％未満は前記第２の数に由来する、ワクチンを開示する。
【００２０】
ある場合には、自食性及び非アポトーシス性であるメラノーマ細胞に由来する第１の数のメラノーマ特異的ペプチドがあり、非自食性及びアポトーシス性であるメラノーマ細胞に由来する第２の数のメラノーマ特異的ペプチドがあり、前記第１の数及び前記第２の数はどちらも、Ｓ−１００、ＨＭＢ−４５、Ｍｅｌ−２、Ｍｅｌａｎ−Ａ、Ｍｅｌ−５、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＲＴ−１、又はチロシナーゼのうちの３つであるメラノーマ特異的抗原の数に相当し、前記６０％超は前記第１の数に由来し、前記４０％未満は前記第２の数に由来する、ワクチンを開示する。その他の実施形態は、列挙した抗原のうちの４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つを使用する。また、全く異なるメラノーマ特異的抗原の使用も包含する。
【００２１】
ある場合には、前記メラノーマ特異的ペプチドの実質的に全てが、ＩＦＮ−γ処理メラノーマ細胞であるメラノーマ細胞に由来する、ワクチンを開示する。
【００２２】
ある場合には、前記メラノーマ特異的ペプチドの実質的に全てが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理されて細胞分裂することができないメラノーマ細胞に由来する、ワクチンを開示する。また、所定の被験体がヒトの被験体である前記ワクチンも含む。
【００２３】
更に、本開示は、所定の被験体がヒト以外の哺乳類である、ワクチンを提供する。
【００２４】
前記ワクチンの免疫刺激量を被験体に投与することを含む、メラノーマ特異的抗原に対する免疫応答の刺激方法を開示する。
【００２５】
刺激された前記免疫応答が、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、及びＢ細胞応答のうちの１つ又は複数を含む、方法を開示する。
【００２６】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞応答、前記ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、又は前記Ｂ細胞応答が、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、細胞内サイトカイン染色アッセイ、テトラマーアッセイ、又は抗原特異的抗体産生の検出により測定することができる、方法を開示する。
【００２７】
前記免疫応答が２年全生存率（ＯＳ）を含む生存期間を含み、前記２年全生存率が少なくとも６０％である、方法を開示する。
【００２８】
更に、前記投与が前記ワクチンの皮下注射を含む、前記方法を提供する。
【００２９】
前記投与が、週１回３ヶ月間、次に月１回５ヶ月間行われる前記ワクチンの注射を含む、方法を開示する。
【００３０】
樹状細胞ワクチンの調製方法を開示する。
【００３１】
同じ被験体由来のメラノーマ細胞及び樹状細胞を含む樹状細胞ワクチンの調製方法であって、１つ又は複数のメラノーマ細胞が細胞分裂を妨げる薬剤で処理され、前記１つ又は複数のメラノーマ細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏでインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）又はＩＦＮ−γ模倣薬で処理され、自食性及び非アポトーシス性であるメラノーマ細胞が選択され、非自食性及びアポトーシス性であるメラノーマ細胞が除外され、前記自食性及び非アポトーシス性であるメラノーマ細胞が１つ又は複数の自己樹状細胞に提供されるか、又は前記自食性及び非アポトーシス性であるメラノーマ細胞に由来するペプチドが１つ又は複数の自己樹状細胞に提供される、調製方法を開示する。
【００３２】
第１の被験体由来の少なくとも１つのインターフェロン（ＩＦＮ）−γ処理メラノーマ細胞及び同じ第１の被験体由来の少なくとも１つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む組成物であって、前記メラノーマ細胞は、自食性、非アポトーシス性、及びＭＨＣクラスＩＩ発現性である、組成物を開示する。別の態様において、ＩＦＮ−γ処理メラノーマ細胞がＡＰＣにロードされる前記組成物、及びＩＦＮ−γ処理メラノーマ細胞がＡＰＣにロードされない前記組成物を包含する。別の態様において、メラノーマ細胞が、ステージI、ステージII、ステージIII、又はステージIＶのメラノーマを有する被験体に由来する前記組成物を含む。また、ＡＰＣが少なくとも１つの樹状細胞を含む、前記組成物、関連キット、及び関連方法を検討する。
【００３３】
一つの態様において、本開示の医薬組成物、試薬、及び関連方法には、ＩＦＮ−γ処理後、７−ＡＡＤ陰性及びアネキシンＶ陰性である癌細胞の調製が用いられる。この集団は、限定されない例を挙げると、例えば、約９９％７−ＡＡＤ陰性及び約９９％アネキシンＶ陰性、９５％以上７−ＡＡＤ陰性及び９５％以上アネキシンＶ陰性、又は９０％以上７−ＡＡＤ陰性及び９０％以上アネキシンＶ陰性とすることができる。
【００３４】
さらに、微小管結合タンパク質軽鎖３（ＬＣ３）分析試験により自食作用が実証される前記組成物、及び７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）試薬又はアネキシン試薬のうちの少なくとも１つを用いて前記細胞が非アポトーシス性であることが実証される前記組成物を含む。
【００３５】
方法の態様において、第１の被験体から少なくとも１つのメラノーマ細胞を除去すること、前記第１の被験体から少なくとも１つのＡＰＣを除去すること、及び前記メラノーマ細胞を前記ＡＰＣに接触させることを含む前記組成物の製造方法、並びに前記組成物を被験体に投与することを含む、被験体又は患者においてメラノーマに対する免疫応答を刺激する方法を提供する。
【００３６】
前記患者由来の前記メラノーマ細胞が非アポトーシス性、自食性であり、前記メラノーマ細胞がＭＨＣクラスＩＩを発現することで添加したＩＦＮ−γに応答する方法、及び前記メラノーマ細胞が、抗原提示細胞にロードされる前に照射される前記方法を開示する。
【００３７】
前記メラノーマ細胞がＩＦＮ−γによるアポトーシス促進効果に非感受性であることを判断すること、及び１つ又は複数の前記組成物を被験体に投与することを含む、メラノーマ患者におけるメラノーマの処理方法を開示する。
【００３８】
別の態様において、前記メラノーマ細胞がＩＦＮ−γによるアポトーシス促進効果に非感受性であることを判断すること、及び１つ又は複数の前記組成物を被験体に投与することを含む、メラノーマ患者においてメラノーマに対する免疫応答を刺激又は促進する方法を提供する。また、免疫応答が、１つ又は複数の液性免疫応答、細胞性免疫応答、及び自然免疫応答である、前記方法を提供する。
【００３９】
キットの態様において、本開示は、被験体において腫瘍抗原に対する免疫応答を試験するためのキットであって、被験体が１つ又は複数の上記方法で処理され、キットが液性免疫応答、細胞性免疫応答、又は自然免疫応答を検出する試薬を含む、キットを提供する。
【００４０】
定義
免疫刺激量とは、これに限定されるものではないが、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を測定可能な量まで増加させる量、ＩＣＳアッセイの結果を測定可能な量まで増加させる量、テトラマーアッセイの結果を測定可能な量まで増加させる量、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の血集団を測定可能な量まで増加させる量、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の血集団を測定可能な量まで増加させる量であるか、又は適切な対照と比較した時に、増加量が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１，５倍、２．０倍、３．０倍等である量とすることができる。適切な対照とは、対照ワクチンであり、樹状細胞がメラノーマ細胞をロードしていないか、又はメラノーマ細胞由来のペプチドをロードしていない対照ワクチンとすることができる。
【００４１】
「メラノーマ特異的抗原」という語は、メラノーマとの関連が濃厚な抗原であり、他の癌に関連するのではなくメラノーマに特有であると考えられる抗原を包含する。さらに、「メラノーマ特異的抗原」という語は、メラノーマとの関連が濃厚な抗原であり、乳癌、結腸直腸癌等の他の種類の癌とも関連している抗原を包含する。
【００４２】
本開示のためにメラノーマ細胞に照射するといった文脈における「照射した」とは、好ましくはγ線の照射であるが、ｘ線、電子線、中性子線、陽子線、電磁放射線、可視光線、紫外線等の照射も包含する。一つの態様において、照射は、メラノーマ細胞の細胞分裂を妨げる機能を果たす。別の態様において、照射は、細胞分裂を妨げるだけでなく、細胞タンパク質を変性させる。照射の代わりとして、本開示では、物理的破壊、例えば、超音波処理、キャビテーション、脱水、イオン枯渇、又は１つもしくは複数の塩への暴露による毒性により、メラノーマ細胞の細胞分裂を妨げる。
【００４３】
本開示にいて、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）は、自食作用を誘導する。代用として又は追加して、ｍＴＯＲ阻害剤等の自食作用誘導剤及びｍＴＯＲ非依存性試薬を使用することができる。本開示に適したｍＴＯＲ阻害剤としては、例えば、ラパマイシン、タモキシフェン、トリン１、テムシロリムス、エベロリムス、ＩＫＫ刺激、ＭＡＰＫキナーゼ阻害剤、ＭＥＫ１／２阻害剤、脱水、飢餓により誘導されるＪＮＫ１等のストレス活性化分子が挙げられる。ｍＴＯＲ非依存性試薬としては、リチウム、カルバマゼピン、及びバルプロ酸で誘導される低イノシトール三リン酸（ＩＰ３）レベル、又はミノキシジル等のＬ型カルシウムチャネルアンタゴニストに暴露することで生じる低細胞内カルシウムが挙げられる。その他のｍＴＯＲ非依存性試薬としては、カルパイン（カルパスタチン）、スフィンゴリピド（Ｓ１Ｐ）、及び、例えば飢餓又は低酸素状態により誘導されるような過酸化水素等の活性酸素の化学的阻害が挙げられる。これらの試薬のうちの１つ又は複数は、ＩＦＮ−γの代わりに又はＩＦＮ−γ模倣薬の代わりに使用するために提供される。例えば、Ｒａｖｉｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）  Ｐｈｙｓ．  Ｒｅｖｓ．  ９０：１３８３−１４３５を参照。
【００４４】
「メラノーマ特異的ペプチドの６０％超」におけるような「％」という語は、ペプチド分子の数を意味し、抗原的に異なる別のペプチドの数を意味するものではない。「メラノーマ特異的ペプチドの８０％超」におけるような「％」という語は、ペプチド分子の数を意味し、抗原的に異なる別のペプチドの数を意味するものではない。「メラノーマ特異的ペプチドの４０％未満」におけるような「％」という語は、ペプチド分子の数を意味し、抗原的に異なるペプチドの数を意味するものではない。「メラノーマ特異的ペプチドの２０％未満」におけるような「％」という語は、ペプチド分子の数を意味し、抗原的に異なるペプチド等の数を意味するものではない。
【００４５】
「メラノーマ特異的ペプチドの６０％超」におけるような「ペプチド」という語は、ペプチド分子、オリゴペプチド分子、及びポリペプチド分子の数の和を意味する。「メラノーマ特異的ペプチドの８０％超」におけるような「ペプチド」という語は、ペプチド分子、オリゴペプチド分子、及びポリペプチド分子の数の和を意味する。「メラノーマ特異的ペプチドの４０％未満」におけるような「ペプチド」という語は、ペプチド分子、オリゴペプチド分子、及びポリペプチド分子の数の和を意味する。「メラノーマ特異的ペプチドの２０％未満」におけるような「ペプチド」という語は、ペプチド分子、オリゴペプチド分子、及びポリペプチド分子等の数の和を意味する。
【００４６】
「自食性及び非アポトーシス性にバイアスが掛かった」という語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＦＮ−γで処理した際に、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％が自食性及び非アポトーシス性である癌細胞、例えばメラノーマ細胞を意味する。様々なメラノーマ細胞を言及するのに使用する専門用語における以下の相違に注意されたい：自食性及び非アポトーシス性である細胞は、非自食性及びアポトーシス性である細胞と同じではない。
【００４７】
１つ又は複数の癌細胞に由来するペプチドといった文脈における「由来する」とは、以下を包含する。癌細胞は、例えば、ホモジナイザー又は浸透圧破裂により破壊することができ、粗抽出物を生じる。粗抽出物のペプチド、オリゴペプチド、及びポリペプチドを樹状細胞に暴露させた後に、樹状細胞によりペプチドを処理することができる。また、由来するは、癌細胞が生存しているか、癌細胞が照射処理されても依然として代謝的に活性であるか、又は癌細胞が核酸架橋剤で処理されても依然として代謝的に活性である無傷癌細胞を、樹状細胞に与えることを含む。「由来する」は、樹状細胞に取り込まれることで癌細胞に由来することになる、癌細胞残屑、遊離癌細胞タンパク質、及び照射癌細胞の混合物を含む。
【００４８】
「投与」とは、ヒト、哺乳類、哺乳類被験体、動物、獣医学的被験体、プラセボ被験体、研究被験体、実験被験体、細胞、組織、臓器、又は生体液に適用される場合、これに限定されるものではないが、外因性リガンド、試薬、プラセボ、小分子、薬剤、治療剤、診断剤、又は組成物を、被験体、細胞、組織、臓器、又は生体液等と接触させることを意味する。「投与」は、例えば、治療方法、薬物動態的方法、診断方法、研究方法、プラセボ的方法、及び実験的方法を意味することができる。細胞の処理は、試薬と細胞との接触、また、流体が細胞と接触している場合の試薬と流体との接触を包含する。また、「投与」は、試薬、診断剤、結合組成物による、又は別の細胞による、例えば細胞の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏでの処理を包含する。
【００４９】
「アゴニスト」とは、リガンド及び受容体に関連する場合、受容体を刺激する、分子、分子の組み合わせ、複合体、又は試薬の組み合わせを含む。例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のアゴニストは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦの変異体もしくは誘導体、ＧＭ−ＣＳＦのペプチド模倣物、ＧＭ−ＣＳＦの生物学的機能を模倣する小分子、又はＧＭ−ＣＳＦ受容体を刺激する抗体を包含することができる。アンタゴニストとは、リガンド及び受容体に関連する場合、受容体を阻害するか、対抗するか、下方制御するか、及び／又は脱感作させる、分子、分子の組み合わせ、又は複合体を含む。「アンタゴニスト」は、受容体の構成的活性を阻害する任意の試薬を包含する。構成的活性とは、リガンド／受容体相互作用が存在しない時に現れる活性である。また、「アンタゴニスト」は、受容体の刺激された（又は制御された）活性を阻害又は妨害する任意の試薬を包含する。一例として、ＧＭ−ＣＳＦ受容体のアンタゴニストとしては、限定を示唆するものではないが、リガンド（ＧＭ−ＣＳＦ）に結合してリガンドが受容体に結合するのを防ぐ抗体、受容体に結合してリガンドが受容体に結合するのを防ぐ抗体、又は抗体が受容体を不活性なコンフォメーションでロックする場合が挙げられる。
【００５０】
明示的に別段の定めをした場合を除き、又は文脈上そうでないとする指示がない限り、「発現」という語は、以下を包含する。発現は、ｍＲＮＡの生合成、ポリペプチドの生合成、例えば、翻訳後修飾によるポリペプチドの活性化、又は細胞内部位の変化もしくはクロマチンへの動員による発現の活性化を包含する。言い換えれば、「発現増加」は、生合成の増加、リン酸化反応に起因する活性の増加、又は細胞質ゾルから核への移動に起因する活性の増加を包含する。
【００５１】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）とは、抗原をＴ細胞に提示するために使用される免疫系の細胞である。ＡＰＣとしては、樹状細胞、単球、マクロファージ、辺縁帯クッパー細胞、小グリア細胞、ランゲルハンス細胞、Ｔ細胞、及びＢ細胞が挙げられる（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｐｉｎｔｏ  ａｎｄ  Ｍｏｒｅｎｏ  （２００５）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３５：１０９７−１１０５を参照）。樹状細胞は、少なくとも２つの系統で生じる。第１の系統は、ｐｒｅ−ＤＣ１、骨髄ＤＣ１、及び成熟ＤＣ１を包含する。第２の系統は、ＣＤ３４++ＣＤ４５ＲＡ-初期前駆多能性細胞、ＣＤ３４++ＣＤ４５ＲＡ+細胞、ＣＤ３４++ＣＤ４５ＲＡ++ＣＤ４+ＩＬ−３Ｒａｌｐｈａ++ｐｒｏ−ＤＣ２細胞、ＣＤ４+ＣＤ１１ｃ-形質細胞様ｐｒｅ−ＤＣ２細胞、リンパ球様ヒトＤＣ２形質細胞様由来ＤＣ２、及び成熟ＤＣ２を包含する。（例えば，Ｇｉｌｌｉｅｔ  ａｎｄ  Ｌｉｕ  （２００２）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９５：６９５−７０４；  Ｂａｕｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６６：５０００−５００７；  Ａｒｐｉｎａｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｂｌｏｏｄ  ９５：２４８４−２４９０；  Ｋａｄｏｗａｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９４：８６３−８６９；  Ｌｉｕ  （２００２）  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６３：１０６７−１０７１；  ＭｃＫｅｎｎａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９：１７−２７；  Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｂｌｏｏｄ  １０４：２２３５−２２４６；  Ｒｏｓｓｉ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ  （２００５）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７５：１３７３−１３８１；  Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  ａｎｄ  Ｐａｌｕｃｋａ  （２００５）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５：２９６−３０６を参照）。
【００５２】
「有効量」とは、これに限定されるものではないが、病状又は疾患の症状又は兆候を、軽減させ、快復せ、和らげ、予防し、又は診断することができる量を包含する。明示的に又は文脈からそうではないと記載しない限り、“有効量”は、病状を軽減するのに十分な最少量に限定されるものではない。病気又は疾患の重症度、並びに病気又は疾患を予防し、治療し、又は和らげるための治療の能力は、限定を示唆するものではないが、バイオマーカー又は臨床パラメーターにより測定することができる。
【００５３】
バイオマーカーとしては、ポリペプチド、ポリペプチドの位置（例えば、小胞、細胞内、膜結合型）、核酸、血球数、血清、尿、又は脳脊髄液中の代謝物レベル、腫瘍細胞数、癌幹細胞数、腫瘍レベルが挙げられる。腫瘍レベルは、ＲＥＣＩＳＴ基準により決定することができる（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ．  ４５：２２８−２４７）。発現マーカーは、ｍＲＮＡの遺伝子発現又は遺伝子増幅、抗原の発現、及びポリペプチドの発現を包含する。臨床パラメーターとしては、無増悪生存率（ＰＦＳ）、６ヶ月ＰＦＳ、無病生存率（ＤＦＳ）、無増悪期間（ＴＴＰ）、遠隔転移期間（ＴＤＭ）、及び全生存率が挙げられるが、限定を示唆するものではない。
【００５４】
「標識」されている組成物は、分光光学的方法、光化学的方法、生化学的方法、免疫化学的方法、同位体方法、又は化学的方法により直接又は間接的に検出することができる。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ、１２５Ｉ、安定同位体、エピトープタグ、蛍光染料、高電子密度試薬、基質、又は酵素、例えば酵素結合免疫測定において用いられるもの、又は蛍光体（ｆｌｕｏｒｅｔｔｅｓ）が挙げられる（例えば、Ｒｏｚｉｎｏｖ  ａｎｄ  Ｎｏｌａｎ  （１９９８）  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ５：７１３−７２８を参照）。
【００５５】
免疫応答の評価方法
本開示はまた、免疫応答を特徴付けるためのＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）、及びテトラマーアッセイを提供する（例えば、Ｐａｒｄｏｌｌの米国特許出願公開第２００７／０１９００２９号明細書；  Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ  （２００８）  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａ．  ２００８  ７３：１００１−１００９；  Ｖｏｌｌｅｒｓ  （２００８）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  １２３：３０５−３１３；  Ｌａｌｖａｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８６：８５９−８６５；  Ｗａｌｄｒｏｐ  （１９９７）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．９９：１７３９−１７５０；  Ｈｕｄｇｅｎｓ  （２００４）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８８：１９−３４；  Ｇｏｕｌｄｅｒ  （２００１）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５：１３３９−１３４７；  Ｇｏｕｌｄｅｒ  （２０００）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９２：１８１９−１８３１；  Ａｎｔｈｏｎｙ  （２００３）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２９：２６０−２６９；  Ｂａｄｏｖｉｎａｃ  ａｎｄ  Ｈａｒｔｙ  （２０００）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３８：１０７−１１７を参照）。患者において免疫応答は、客観的反応（ＲＥＣＩＳＴ基準）、全生存率、無増悪生存率（ＰＦＳ）、無病生存率、遠隔転移期間、６ヶ月ＰＦＳ、１２ヶ月ＰＦＳ等を含め、腫瘍の臨床試験で使用されるエンドポイントにより評価することができる。
【００５６】
ワクチン
本開示の樹状細胞ワクチンは、皮内経路、結節内経路、粘膜経路、皮下経路、又はこれらの任意の組み合わせにより投与することができる。１回の投与量は、約１０×１０３樹状細胞、２０×１０３細胞、５０×１０３細胞、１００×１０３細胞、２００×１０３細胞、５００×１０３細胞、１×１０６細胞、２×１０６細胞、２０×１０６細胞、５０×１０６細胞、１００×１０６細胞、２００×１０６細胞、５００×１０６細胞、１×１０９細胞、２×１０９細胞、５×１０９細胞、１０×１０９細胞等を含むことができる。投与回数は、例えば、週に１回、週に２回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月に１回等とすることができる。投与を行う日の合計日数は、１日、２日、又は３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０日等とすることができる。当然のことながら、どの投与においても同じ日に２回以上の注射を含む可能性がある。一つの態様において、本開示は、腫瘍細胞全体を樹状細胞にロードすることを含み、樹状細胞にロードされたメラノーマ細胞由来タンパク質のうちの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％が、腫瘍細胞全体に帰する。限定されない実施形態において、樹状細胞ワクチンは、フラスコ、バイアル、ボトル、シリンジ、カテーテル、カニューレ等に収められる。投与に関して、投与される樹状細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％が、成熟樹状細胞である。
【００５７】
ワクチンの均質性
例示的な実施において、本開示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのロードに由来するメラノーマペプチドを含有する樹状細胞を含むワクチンであって、ワクチンが、樹状細胞（メラノーマペプチドを含有するＤＣ及びメラノーマペプチドを含有しないＤＣの集合体）を含み、樹状細胞／メラノーマ細胞の比率が、少なくとも５／９５、１０／９０、２０／８０、３０／７０、４０／６０、５０／５０、６０／４０、７０／３０、８０／２０、９０／１０、９５／５、９８／２９９／１等であるワクチンを提供する。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのロードに由来するメラノーマペプチドを含有する樹状細胞を含むワクチンであって、ワクチンが、樹状細胞（メラノーマペプチドを含有するＤＣ及びメラノーマペプチドを含有しないＤＣの集合体）を含み、［樹状細胞］／［ＤＣでもメラノーマでもない細胞］の比率が、少なくとも５／９５、１０／９０、２０／８０、３０／７０、４０／６０、５０／５０、６０／４０、７０／３０、８０／２０、９０／１０、９５／５、９８／２、及び９９／１等であるワクチンを提供する。本開示は、第１の区画にメラノーマ細胞を含み、第２の区画に樹状細胞を含む、区画された容器を示す。２つの区画は、膜、フィルター、バルブ、導管、連結器により隔てることができ、これによりメラノーマ細胞が樹状細胞に接触するのを防ぐが、手動による移送、又は膜の除去もしくはバルブの開放によりメラノーマ細胞が樹状細胞に接触できるようにし、メラノーマ細胞、メラノーマ細胞片、及び／又はメラノーマペプチドを樹状細胞にロードできるようにする。
【００５８】
インターフェロン−γ模倣薬
本開示は、模倣薬、例えば、模倣ペプチド９５−１３２等のインターフェロン−γ模倣薬を包含する（Ａｈｍｅｄ  （２００７）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７８：４５７６−４５８３；  Ｆｕｌｃｈｅｒ  （２００８）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ。  ５８２：１５６９−１５７４）。本開示は、全体的な目的が、自食性及び非アポトーシス性であるメラノーマ細胞に富んだメラノーマ細胞集団を得ることである、ＩＦＮ−γ模倣薬を提供する。ＩＦＮ模倣薬は、例えば、インターフェロン−γと同じアゴニスト活性を有する抗体を包含する。
【００５９】
メラノーマ細胞の不活性化
本開示は、癌細胞を、例えば、照射又は核酸架橋剤により不活性化させる、組成物及び方法を提供する。一例として、架橋剤は、ＤＮＡを架橋するが、タンパク質は未修飾のままにすることができる。核酸アルキル化剤は、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルであってもよい。幾つかの実施形態において、核酸標的化化合物は、ＵＶＡ照射により活性化されたソラレン化合物である。例えば、核酸標的化合物は、４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（本明細書中で「Ｓ−５９」とも称する）であってもよい。細胞は、１５０マイクロモーラーのソラレンＳ−５９及び３Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡ光線（ＦＸ１０１９照射装置、バクスター・フェンバル社、ラウンドレーク、イリノイ州）で不活性化することができる。Ｓ−５９での不活性化は光化学処理と呼ばれ、細胞を完全に不活性化する。様々な濃度の核酸架橋剤について、細胞の不活性化における有効性、例えば、細胞分裂の妨害における有効性を検証してもよい。Ｓ−５９は、核酸を架橋するが、無傷タンパク質を未修飾のままにするという機能により、識別することができる。細胞は、０、１、１０、１００、及び１０００ｎＭのソラレンＳ−５９を含有する５ｍＬの生理食塩水中で浮遊させることができる。各サンプルは、以下のように照射することができる。Ｓ−５９は、１００ｎＭの濃度で添加することができる。サンプルには、約２Ｊ／ｃｍ２の放射線量でＵＶＡ照射することができる（ＦＸ１０１９照射装置、バクスター・フェンバル、ラウンドレーク、イリノイ州）。次に、各サンプルを１５ｍＬチューブに移し、遠心分離し、上清を除去し、その後、５ｍＬの生理食塩水で洗浄し、遠心分離し、上清を除去し、最終ペレットを０．５ｍＬの生理食塩水に懸濁した（Ｄｕｂｅｎｓｋｙの米国特許７，８３３，７７５号明細書及びＤｕｂｅｎｓｋｙの米国特許７，６９１，３９３号明細書）。
【００６０】
非アポトーシス性であるメラノーマ細胞の富化
メラノーマ細胞集団は、例えば、非アポトーシス性自食性細胞を非自食性及びアポトーシス性である細胞から分離する手法を用いることにより、非アポトーシス性であるメラノーマ細胞を富化することができる。分離は、自食性非アポトーシス性細胞が表面に接着することにより行われ、他の細胞は浮遊している。また、非アポトーシス性メラノーマ細胞が富化された集団は、ホスファチジルセリンに特異的な抗体を用いてアポトーシス性細胞を除去することにより得ることができる。固定化抗体により細胞を除去する手法が利用できる（Ｏｎｏｄｅｒａ  （１９９８）  Ｔｈｅｒ．  Ａｐｈｅｒ．  ２：３７−４２）。ホスファチジルセリンに特異的な抗体は市販されている（例えば、ＥＤミリポア社、ビレリカ、マサチューセッツ州）。また、メラノーマ細胞のバルク集団は、蛍光抗ホスファチジルセリン抗体で標識することができる。標識されたアポトーシス性メラノーマ細胞は、フローサイトメトリー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫磁気分離法で除去される（例えば、Ｈｏｅｐｐｅｎｅｒ  （２０１２）  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９５：４３−５８；  Ｄａｉｎｉａｋ  （２００７）  Ａｄｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｅｎｇ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １０６：１−１８を参照）。
【００６１】
アポトーシス阻害剤
アポトーシス阻害剤Ｚ−ＶＡＤ（Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ）は、例えば、エンゾライフサイエンス社（エクセター、英国）、Ｒ＆Ｄシステムズ社（ミネアポリス、ミネソタ州）、トクリスバイオサイエンス社（ブリストル、英国）、バイオモル社（プリマスミーティング、ペンシルベニア州）、及びＥＭＤケミカルズ社（ギブスタウン、ニュージャージー州）から購入することができる。Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋは、合成ペプチドのＺ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ２Ｆである。カスパーゼは、プロテアーゼファミリーのシステイン−アスパラギン酸特異的メンバーである。カスパーゼは、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ等の死滅受容体ライゲーション、ＤＮＡ損傷、ストレス、血清飢餓、及び細胞の種類によってはインターフェロンにより活性化される。カスパーゼは、核フラグメンテーション、クロマチン凝縮、細胞質の完全性の喪失を含めた、高度に調節されたアポトーシスの過程において、重要な役割を果たす。汎カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（カルボベンゾキシ−バリル−アラニル−アスパルチル−［Ｏ−メチル］−フルオロメチルケトン）は、カスパーゼプロテアーゼの触媒部位に不可逆的に結合し、アポトーシス誘導におけるカスパーゼプロテアーゼの機能を阻害する。ＩＦＮ−γに応答してアポトーシスを行う細胞の能力を阻害することは、洗浄により浮遊アポトーシス性細胞を除去する選択工程を経ずに、非アポトーシス性であるが自食性である細胞を生成する手段となり得る。
【００６２】
本開示の一つの実施形態において、腫瘍細胞は、腫瘍細胞を樹状細胞又は別のタイプの抗原提示細胞（ＡＰＣ）にロードする前にＩＦＮ−γで処理する。別の実施形態において、腫瘍細胞は、腫瘍細胞を樹状細胞又は別のタイプのＡＰＣにロードする前にＩＦＮ−γで処理しない。
【００６３】
本開示は、薬剤、試薬、キット（診断キットを含む）を提供する。これらの薬剤、試薬、及びキットは、樹状細胞、抗体、又は抗原を含む。また、少なくとも１つの樹状細胞及び少なくとも１つの抗原を含む組成物の投与方法、抗体形成の刺激方法、ＡＤＣＣの刺激方法、補体依存性細胞傷害の刺激方法、並びに患者の適性の判断、臨床試験又は通常の治療に即した患者の試験対象／除外基準の決定、及び薬剤又は試薬に対する応答の予測のための方法及びキットを提供する。補体依存性細胞傷害については説明されている（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ８：１０８３−１０９２；  Ｃｈｅｓｏｎ  （２０１０）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ８：３５２５−３５３０を参照）。本開示の医薬組成物、試薬、及び関連方法は、ＣＤ８３陽性樹状細胞を包含する。ＣＤ８３は、ＩＦＮ−γ処理癌細胞をロードすることにより誘発される。本開示のＣＤ８３の態様において、ＣＤ８３は、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、６％、７％、８％、９％、１０％等で誘発される。別の態様において、樹状細胞のＣＤ８３が、ＩＦＮ−γ処理癌細胞をロードすることにより検出可能に誘導されない、ＤＣ試薬又はＤＣ関連方法を除外する。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、ＩＦＮ−γで処理する前（左側）及びＩＦＮ−γで７２時間処理した後（右側）の培養腫瘍細胞のグラフを示す。処理後、培養腫瘍細胞は、浮遊性、非自食性及びアポトーシス性であるか、又は接着性、自食性及び非アポトーシス性である。浮遊性細胞では、アポトーシスのマーカーであるホスファチジルセリンの発現が見られる。浮遊性細胞では、ＭＨＣクラスＩＩの発現が比較的少ないが、接着性細胞では、ＭＨＣクラスＩＩの過剰発現が見られる。
【図２Ａ】図２Ａ−Ｄは、樹状細胞へのロードに使用したＩＦＮ−γ処理自己腫瘍細胞の特徴を示す。自己メラノーマ腫瘍細胞は、１５％ＦＢＳ／ＥＣＳのＲＰＭＩ中で１０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−γで７２時間処理した後、又は処理せずに、採取し、１００Ｇｙで照射し、凍結保存した。次に、細胞は、ＡＩＭＶ中で解凍し、ＤＣに抗原をロードする前に、フローサイトメトリー用サンプル及び免疫ブロッティングに用いる細胞溶解物を調製するためのサンプルを採取した。４つの独立した自己メラノーマ細胞株の例を示す（図２Ａ）。
【図２Ｂ】４つの独立した自己メラノーマ細胞株の例を示す（図２Ｂ）。
【図２Ｃ】４つの独立した自己メラノーマ細胞株の例を示す（図２Ｃ）。
【図２Ｄ】自己腫瘍細胞のＩＦＮ−γ処理による主要組織適合遺伝子複合体の誘導（図２Ｄ）。腫瘍細胞は、１０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−γで７２時間処理した後、又は処理せずに、採取し、その後ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩを分析した。陽性集団を識別するために、対照アイソタイプ抗体を使用した。黒点データは、平均蛍光強度の中央値＋／−９５％信頼区間を意味する。Ｎ（サンプル数）＝６５。一つの態様において、本開示は、樹状細胞にロードするための非自己腫瘍細胞を除外し、かつ、樹状細胞にロードするための非自己腫瘍細胞の使用方法を除外する。
【図３Ａ】図３Ａ及び３Ｂは、インターフェロン−γで処理した又は処理していない自己メラノーマ細胞株をロードした樹状細胞の表現型を示す。４つの自己メラノーマ細胞株のセットは、１０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−γで７２時間処理した後、又は処理せずに、照射し、凍結保存した。次に、細胞は、ＡＩＭＶ中で解凍し、自己樹状細胞と約２４時間融合させた後、採取し、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、及びＭＨＣクラスＩＩの発現をフローサイトメトリーで分析した（図３Ａ）。
【図３Ｂ】図３Ｂにデータを集約した。平均値±ＳＤ（標準偏差）を示す（ｎ＝４）。
【図４Ａ】図４Ａ及び４Ｂは、投与量の調整に使用した樹状細胞の表現型を示す。ＩＦＮ−γ処理及び照射を行った自己腫瘍細胞をロードする前のＤＣサンプル（ＡＴＣロード前ＤＣ、Ｎ＝５３）及びロードした後のＤＣサンプル（ＡＴＣロード後ＤＣ、Ｎ＝６５）について、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、及びＭＨＣクラスＩＩの発現をフローサイトメトリーで評価した。ＦＡＣＳキャリバー（Ｃａｌｉｂｅｒ）（登録商標）ビーズを使用してフローサイトメーター機器初期設定を設定し、その後、設定は、データ収集の間中一定に保たれた（図４Ａ）。
【図４Ｂ】図４Ｂにおいて、発現の割合（％）及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）±ＳＤの値を、ＡＴＣロード前とＡＴＣロード後とで比較した。＊ｐ＝０．０１９、＊＊Ｐ＝０．０００９。
【図５Ａ】図５Ａ−５Ｃは、インターフェロン−γ処理メラノーマ細胞が起こす自食作用を示す。市販のメラノーマ細胞株のセットを、５％ＦＢＳ／ＲＭＰＩ中で１０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−γと共に７２時間インキュベートした。ＳＫ−５−Ｍｅｌ細胞培養液の位相差顕微鏡写真をインキュベーション期間の終了時に撮影した（図５Ａ）ところ、自食胞を思わせる小胞を有する巨細胞が見られた。
【図５Ｂ】自食胞形成の確認は、ＩＦＮ−γ処理前に、ＧＦＰ−ＬＣ３Ｂ構築物のトランスフェクションにより行った（図５Ｂ）。
【図５Ｃ】ＩＦＮ−γ処理後の自食作用の誘導は、ＬＣ３Ｂの抗体を用いたウェスタンブロッティングで確認した（図５Ｃ）。このＬＣ３Ｂの抗体は、自食性の血管形成と関連することが示されているＬＣ３の速移動型（ｆａｓｔｅｒ  ｍｉｇｒａｔｉｎｇ  ｆｏｒｍ）を認識する。
【図６Ａ】図６Ａ及び６Ｂは、インターフェロン−γに応答して誘導されたアポトーシス及び自食作用を表す。ＳＫ−５−Ｍｅｌ細胞は、１０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−γと共に７２時間インキュベートした後、非接着性集団及び接着性集団を収集し、７-ＡＡＤ及びアネキシン−Ｖを用いてフローサイトメトリーでアポトーシス及び自食作用を分析した（図６Ａ）。
【図６Ｂ】エンゾ社製Ｃｙｔｏ−ＩＤ（登録商標）オートファジー検出色素を用いて、フローサイトメトリーでメーカー提供の色素の平均強度ピークシフトを測定することにより自食作用を測定した（図６Ｂ）。
【図６Ｃ】５％ＦＢＳ／ＲＰＭＩの場合と比較したピークシフトの倍率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）を、自食作用の誘導の陽性対照としての無血清の場合と共に図６Ｃに示す。
【図７Ａ】図７は、カスパーゼ活性阻害後の自食作用の誘導により、メラノーマ細胞でのＩＦＮ−γに応答した自食作用の誘導が影響を受けなかったことを示す。ＳＫ−５−Ｍｅｌ細胞は、２０ｕＭの汎カスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ又はその対照化合物ｚ−ＦＡの存在下、１０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−γで７２時間処理した。細胞を採取し、図６Ｃと同様にフローサイトメトリーで自食作用を分析した。
【図７Ｂ】図７は、カスパーゼ活性阻害後の自食作用の誘導により、メラノーマ細胞でのＩＦＮ−γに応答した自食作用の誘導が影響を受けなかったことを示す。ＳＫ−５−Ｍｅｌ細胞は、２０ｕＭの汎カスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ又はその対照化合物ｚ−ＦＡの存在下、１０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−γで７２時間処理した。細胞を採取し、図６Ｃと同様にフローサイトメトリーで自食作用を分析した。
【図８】図８は、１０ｕＭの自食作用阻害剤３−メチルアデニン（３−ＭＡ）の存在下、１０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−γと共に７２時間インキュベートしたＳＫ−５−Ｍｅｌ細胞を示す。その後、細胞は採取し、フローサイトメトリーでアポトーシス及びＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）の発現を分析した。
【図９】図９は、ＭＨＣクラスＩＩ又はアポトーシスの変化を分析した、患者の腫瘍検体（Ｎ＝３６）から生成された腫瘍細胞株由来のＩＦＮ−γ処理細胞を示す。示したデータは、平均蛍光強度±ＳＥの平均値（ａｖｅｒａｇｅ）である。
【図１０】図１０は、フローサイトメトリーでＭＨＣクラスＩＩ又はアポトーシスを分析した、患者特異的ワクチン免疫療法のための樹状細胞へのロードに使用したサンプル由来のＩＦＮ−γ処理細胞を示す（Ｎ＝５４）。ＭＨＣクラスＩＩ平均蛍光強度における倍率変化及びアポトーシス細胞（アネキシン−Ｖ陽性）の割合（％）を示す。
【図１１】図１１は、自食性非アポトーシス性インターフェロン−γ処理腫瘍細胞をロードした樹状細胞を受けた患者において、ＭＨＣクラスＩＩの誘導とアポトーシスの欠如（インターフェロン−γ耐性）との相関関係が、より良好な無増悪生存率と関連することを示す（図１１）。
【図１２】図１２は、自食性非アポトーシス性インターフェロン−γ処理腫瘍細胞をロードした樹状細胞を受けた患者において、ＭＨＣクラスＩＩの誘導とアポトーシスの欠如（インターフェロン−γ耐性）との相関関係が、より良好な全生存率と関連することを示す（図１２）。
【図１３】図１３は、３試験からの生存曲線を示す。プロット（カプラン・マイヤー  プロット）は、臨床試験期間中に生存していた被験者の割合（％）を示す段階的曲線である。各群は、ＤＣ−５４（黒丸）、ＴＣ−７４（黒四角）、ＴＣ−２４（黒三角）、及びＤＣ−１８（線）で示す。ＴＣ−２４において最も生存率が低かった。次に生存率が低かったのは、ＴＣ−７４であった。ＴＣ−２４は、２４人の被験者を対象とした試験における腫瘍細胞ワクチンを意味する。ＤＣ−５４は、５４人の被験者が治療を受け、ワクチンが照射自己腫瘍細胞と共培養した自己樹状細胞（ＤＣ）を含む、樹状細胞ワクチンを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
自己樹状細胞の生成
樹状細胞は、フィコール分離産物のプラスチック接着法（Ｃｈｏｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４：２７０９−２７１６；  Ｌｕｆｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．２６：４８９−５００；  Ｃｏｒｎｆｏｒｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ６０：１２３−１３１）により、抗生物質無添加のＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン社、グランドアイランド、ニューヨーク州）中で、ＩＬ−４（セルジェニックス社、フレイスバーグ、ドイツ）及びＧＭ−ＣＳＦ（バーレックス社、シアトル、ワシントン州）（ＤＣ培地）をそれぞれ１，０００ＩＵ／ｍＬずつ加えて生成した。次に、ＩＦＮ−γ処理照射自己腫瘍細胞をロードする前に、フラスコを６日間培養した。
【００６６】
ＩＦＮ−γ自己腫瘍細胞株の生成及び薬剤の調製
純粋腫瘍細胞は、Ｃｏｒｎｆｏｒｔｈらに従って生成した（Ｃｏｒｎｆｏｒｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ６０：１２３−１３１；  Ｄｉｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４：６５−６９；  Ｄｉｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ．  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．  １５：１６１−１６８）。次に、腫瘍細胞は、１，０００Ｕ／ｍＬのインターフェロン−γ（インターミューン社、ブリスベン、カリフォルニア州）と共に７２時間インキュベートし、セシウム源から１００Ｇｙ照射し、凍結保存した（Ｓｅｌｖａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  １２２：１３７４−１３８３；  Ｓｅｌｖａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ．  ２０：２８０−２９２）。ＩＦＮ−γ処理及び照射を行った腫瘍細胞は、凍結保存から起こし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次に培養樹状細胞（ＤＣ）に加え、その後、約２４時間インキュベートした。抗原ロードＤＣは、ラバー・ポリスマンで穏やかに剥がして採取し、凍結保存した。ＩＦＮ−γ処理腫瘍細胞又はＩＦＮ−γ未処理腫瘍細胞、及びロードＤＣの一定分量を、フローサイトメトリー評価及びトリパンブルー排除分析用に得た。
【００６７】
皮膚メラノーマの病期分類
本開示の薬剤または試薬は、メラノーマがステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、又はステージＩＶと診断されているメラノーマ患者に投与することができる（Ｍｏｈｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ａｎｎ．  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  （Ｓｕｐｐｌ．  ６）  ｖｉ１４−ｖｉ２１）。例えば、ステージＩは、局所転移又は遠隔転移の所見がない原発性メラノーマを有する患者を意味する。ステージＩＩは、リンパ系疾患又は遠隔転移の所見がない患者であり、更に、例えば、被覆上皮の潰瘍を有する１ｍｍ超２ｍｍ以下の厚さの病変、又は上皮潰瘍を有する２ｍｍ超４ｍｍ以下の厚さの病変で特徴付けられる患者を含む。ステージＩＩＩメラノーマは、病理学的に確認された局所リンパ節転移、又はイントランジット転移もしくは衛生転移を有する病変を含み、患者が、例えば、１つ、２つ、３つ、又は４つ以上の罹患リンパ節を有する可能性がある。ステージＩＶメラノーマは、遠隔転移の存在で定義され、転移は、遠位の皮膚、皮下組織、もしくはリンパ節のみにあるか、転移が肺転移に関連しているか、又は転移が他の全ての内臓部に関連している。
【００６８】
本開示は、予防手段である投与方法、即ち、メラノーマと未だ診断されていないか、又は診断されたことがない被験体への使用方法を包含する。被験体が早期にメラノーマと診断され、早期に治療が成功してメラノーマが根絶したことがあり（又は自然に完全寛解した経験があり）、根絶後、投与が予防的に用いられている投与方法を包含する。
【００６９】
腫瘍抗原
限定を示唆するものではないが、本開示のメラノーマ細胞は、Ｍａｇｅ、Ｍａｒｔ−１、Ｍｅｌ−５、ＨＭＢ４５、Ｓ１００、又はチロシナーゼのうちの１つ又は複数を発現する（Ｄｉｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ２６：４０７−４１５）。１つの態様において、腫瘍抗原の検出にＩＦＮ−γに暴露していない細胞を使用する一方、別の態様においては、腫瘍抗原の検出をＩＦＮ−γで処理した細胞で行う（例えば、Ｃｏｒｎｆｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ２６：３４５−３５１を参照）。その全体が参照により本明細書に援用されるＤｕｂｅｎｓｋｙらによる米国特許出願公開第２００７／０２０７１７１号明細書に開示されているように、１つ又は複数のメラノーマ抗原又は１つ又は複数の単離したメラノーマ抗原を含む組成物を発現するメラノーマ細胞を包含する。
【００７０】
アポトーシスの測定
アポトーシスは、ヨウ化プロピジウム及び７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）等の色素で染色すること、ミトコンドリア内膜電位の低下を測定すること、カスパーゼの活性化又は切断を測定することにより、多くの試薬、例えば、蛍光色素標識アネキシンで検出又は測定することができる。例えば、Ｇｅｏｒｇｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐａｒｔ  Ａ．  ５９Ａ：２３７−２４５を参照。アポトーシスの初期事象は、細胞膜の外面においてホスファチジルセリンへ暴露することであり、蛍光色素標識アネキシンで検出することができる。利用可能な方法により、生細胞、壊死細胞、初期アポトーシス細胞、及び後期アポトーシス細胞を区別することができる。本開示では、７−ＡＡＤアッセイによりアポトーシスではないとされるメラノーマ細胞、アネキシンＶアッセイによりアポトーシスではないとされるメラノーマ細胞、ＩＦＮ−γ処理後のアポトーシス用アッセイによりアポトーシスではないとされるメラノーマ細胞（Ｄｉｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ２６：４０７−４１５）、又はＢｃｌ−２、カスパーゼ−３、Ｐ５３、もしくはスルビビンのうちの１つ又は複数のバイオマーカーによりアポトーシスではないとされるメラノーマ細胞（Ｋａｒａｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．  ８：１２８−１３６）を使用する。本開示の医薬組成物、試薬、及び関連方法は、例えば、参照により本明細書に援用されるＨｅｒｌｙｎらの米国特許７，５４４，４６５号明細書、Ｔｈｏｒｐｅらの米国特許７，７１４，１０９号明細書に従ってアポトーシスが判断される、アポトーシス性のＩＦＮ−γ処理メラノーマ細胞を除外する。
【００７１】
自食作用の測定
自食作用は、多くのタンパク質及びいくつかの細胞小器官の分解に用いられる自然発生的な過程である。自食作用は、タンパク質及び細胞小器官の代謝回転、飢餓応答、細胞分化、細胞死等を媒介する。微小管結合タンパク質軽鎖３（ＬＣ３）は、自食作用をモニターするものである。１つの手法において、自食作用は、ＬＣ３−ＩからＬＣ３−ＩＩへの変換を含むＬＣ３の変換を測定することにより検出できる。ＬＣ３−ＩＩの量は、自食胞の数と相関する。詳細には、ＬＣ３は、細胞質性及び可溶性であるが、ＬＣ３−ＩＩは膜上に存在する。ＬＣ３−ＩＩは、脂質と結合するため、分子量が大きい。ＬＣ３プロセッシングは、例えば、ウェスタンブロットにより測定することができ、一方、自食作用、自食性小胞、及び自食胞は、顕微鏡検査で測定することができる。自食作用は、例えば、プロセッシング後のＬＣ３−ＩＩの検出、初期の自食性画分と後期の自食性画分との比率、又は自食体積により定量することができる。（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ａｎｄ  Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ  （２００７）Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ３：５４２−５４６：６３４−６４１、Ｔａｎｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４４５：７７−８８、Ｅｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ６：６３４−６４１）を参照。１つの態様において、本開示は、自食作用を、適切な自食性癌細胞を選択するためのスクリーニング手段として使用し、細胞は、１つ又は複数の特定の段階で自食作用が起こることにより選択できる。これらの自食作用の段階は、（１）自食胞による細胞質画分の隔離、（２）自食胞とリソソームとの融合によるオートリソソームの形成、及び（３）リソソーム内でのプロテアーゼによる自食胞の中身の分解、を含む。別の態様において、本開示は、主に第１段階を示す細胞、主に第２段階を示す細胞、主に第３段階を示す細胞、主に第１及び第２段階を示す細胞、主に第２及び第３段階を示す細胞、又は主に３つの段階全てを示す細胞を含む。さらに別の態様において、本開示は、第１段階を示す細胞、第２段階を示す細胞、第３段階を示す細胞、第１及び第２段階を示す細胞、第２及び第３段階を示す細胞、又は３つの段階全てを示す細胞を含む。
【００７２】
インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）のシグナル伝達
ＩＦＮ−γ（ＩＩ型インターフェロン）のシグナル伝達は、多くの遺伝子、例えば、ＩＦＮ−γ受容体、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ１ホモ二量体、ＳＴＡＴ１／ＳＴＡＴ２ヘテロ二量体、ＩＲＦ−１、ＧＡＳ、及びＩＲＦ−Ｅの発現に依存する。研究により、ＩＦＮ−γのシグナル伝達は、ＩＦＮ−γ受容体（ＩＦＮＧＲ１鎖、ＩＦＮＧＲ２鎖）に依存していることが示されている。細胞表面におけるＩＦＮＧＲの低発現は、ＩＦＮ−γのシグナル伝達のいくつかの側面を阻害することができる（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｂｏｉｌ．  ７５：１６３−１８９）。１つの態様において、本開示は、ＩＦＮＧＲの表面発現が低い癌細胞の使用を除外する。別の態様において、本開示は、ＳＴＡＴ１ホモ二量体を発現する癌細胞をスクリーニングし、これらの細胞を使用し、ＳＴＡＴ１ホモ二量体を発現しない細胞を実質的に除外する。さらに別の態様において、本開示は、ＳＴＡＴ１のリン酸化（セリン−７２７）が見られる細胞のスクリーニングを検討する。また、ＳＴＡＴ１遺伝子に機能喪失突然変異を有する患者からの癌細胞の除外を検討する（例えば、Ｄｕｐｕｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：３００−３０３、Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃ．  Ｂｉｏｌ．  ７５：１６３−１８９を参照）。以下は、ＩＲＦ遺伝子ファミリーに関する。ＩＲＦ−１、ＩＲＦ−２、及びＩＲＦ−９は、全てＩＦＮ−γのシグナル伝達に関与する。本開示は、ＩＲＦ遺伝子ファミリーのこれらの遺伝子の１つ又は複数を発現する癌細胞の使用、又はこれらの遺伝子の１つ又は複数を発現しない癌細胞の除外を含む。
【００７３】
ＩＦＮ−γ応答遺伝子
いくつかの例示的な実施形態において、本開示は、ＩＦＮ−γに応答するメラノーマ細胞又は前腫瘍性メラノーマ細胞の使用を要する生体物質、組成物、試薬、及び方法を含む。メラノーマ細胞は、１つ又は複数のＩＦＮ−γ応答遺伝子の発現のためのアッセイにより、特定、区別、及び選択することができる。多くのＩＦＮ−γ応答遺伝子が、特定されている（例えば、Ｈａｌｏｎｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．  １７５：１９−３０、ＭａｃＭｉｃｋｉｎｇ  （２００４）  １１：６０１−６０９、  Ｂｏｅｈｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  １５：７４９−７９５を参照）。前記アッセイには、患者からの１つ又は複数のメラノーマ細胞の除去、ＩＦＮ−γの添加がある場合と添加がない場合での細胞培養、及びＩＦＮ−γへの応答の判定を含むことができる。アッセイにおいて、ＩＦＮ−γ誘導性遺伝子の発現は、ＩＦＮ−γ誘導性遺伝子のプロモーターへの転写因子の結合、ＩＦＮ−γ誘導性遺伝子からのｍＲＮＡの発現、発現したポリペプチド等を感知するアッセイにより検出することができる。ＩＦＮ−γ応答遺伝子としては、例えば、免疫応答に使用され、転写因子、輸送タンパク質をコードする遺伝子、アポトーシス遺伝子、細胞増殖又は細胞維持に使用される遺伝子、脂質代謝に使用される遺伝子、エンドサイトーシス又はエキソサイトーシスを媒介する遺伝子、細胞内シグナル伝達遺伝子、グルコース代謝遺伝子、細胞接着遺伝子、及び確立された機能がない遺伝子を挙げることができる。
【００７４】
１つの態様において、本開示は、ＩＦＮ−γ処理によりＭＨＣクラスＩＩの発現低下を示すメラノーマ細胞、ＭＨＣクラスＩＩ発現において検出可能な変化を示さないメラノーマ細胞、１０％以下のＭＨＣクラスＩＩの発現増加を示すメラノーマ細胞、１５％以下のＭＨＣクラスＩＩの発現増加を示すメラノーマ細胞、２０％以下、２５％以下、３０％以下、４０％以下、及び５０％以下等のＭＨＣクラスＩＩの発現増加を示すメラノーマ細胞を除外する。１つの態様において、パーセント値は、所定の被験体又は患者からの生検又は生検の一部に存在するメラノーマ細胞集団の平均発現値を意味する。
【００７５】
ＩＦＮ−γ応答癌細胞のスクリーニングに使用するＩＦＮ−γ誘導性遺伝子の限定されない一覧
ａｂ０００６７７、ＪＡＢ／ＳＯＣＳ１；ｍ６３９６１、ＩＦＮ−γ誘導タンパク質（ｍａｇ−１）；ｍ３５５９０、マクロファージ炎症性タンパク質１−β；ｍ１９６８１、ＭＣＰ−１（ＪＥ）；ｙ０７７１１、ザイキシン；Ｍ３４８１５、ＩＦＮ−γ誘導モノカイン（ＭＩＧ）；ｍ３３２６６、インターフェロン誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）；Ｕ４４７３１、プリン・ヌクレオチド結合タンパク質；Ｕ８８３２８、サイトカインシグナル伝達抑制分子−３（ＳＯＣＳ−３）；Ｍ２１０６５、インターフェロン制御因子１；Ｍ６３６３０、ＧＴＰ結合タンパク質（ＩＲＧ−４７）；Ｕ１９１１９、Ｇタンパク質様ＬＲＧ−４７；Ｌ２７９９０、Ｒｏタンパク質；Ｍ３１４１９、２０４インターフェロン活性化タンパク質；ａｆ０２２３７１、インターフェロン誘導タンパク質２０３；Ｕ２８４０４、ＭＩＰ−１α受容体；Ｕ４３０８５、グルココルチコイド弱毒化応答３９；ｘ５６１２３、タリン；ｍ３１４１９、２０４インターフェロン活性化タンパク質；Ｕ５３２１９、ＧＴＰアーゼＩＧＴＰ；Ｉ３８４４４、Ｔ細胞特異的タンパク質；Ｍ３１４１８、２０２インターフェロン活性化タンパク質；ｄ３８４１７、芳香族炭化水素受容体；ｍ２６０７１、組織因子（ｍｔｆ）；Ｄ１３７５９、Ｃｏｔ癌原遺伝子；Ｍ１８１９４、フィブロネクチン；ｕ５９４６３、ＩＣＨ−３；Ｍ１３９４５、ｐｉｍ−１癌原遺伝子；Ｌ２０４５０，ＤＮＡ結合タンパク質（Ｇｉｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ９８：６６８０−６６８５を参照）。本開示は、ＩＦＮ−γ誘導性遺伝子ＣＩＩＴＡの使用を包含する（例えば、Ｃｈａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．  ８８：３０３−３１１、Ｋｗｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４４：２８４１−２８４９を参照）。
【００７６】
本開示は、薬剤投与に関して患者を認定又は選択するためのスクリーニング法として、以下のＩＦＮ−γ誘導性遺伝子のうちの１つ又は複数の発現測定を含む。遺伝子として、（遺伝子１）ＦＣＧＲ１Ａ、（遺伝子２）ＩＬ６Ｒ、（遺伝子３）ＣＸＣＬ９、（遺伝子４）ＣＬＣＳＦ１４、（遺伝子５）ＵＢＤ、（遺伝子６）Ｃ／ＥＢＰα、及び（遺伝子７）ＭＨＣ２ＴＡ（ＣＩＩＴＡ）が挙げられる（Ｗａｄｄｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５：ｅ９７５３を参照）。同様に、認定法においてこれらの遺伝子の特定群、例えば、遺伝子１及び２、２及び３、３及び４、４及び５、５及び６、６及び７、１及び３、１及び４、１及び５、１及び６、１及び７、２及び４、２及び５、２及び６、２及び７、３及び５、３及び６、３及び７、４及び６、４及び７、５及び７、並びに３つの遺伝子の組み合わせ、例えば、１、２、３；又は３、４、５；又は４、５、６；又は５、６、７；又は１、３、４；又は１、３、５；又は１、３、６；又は１、３、７；又は１、２、４；又は１、２、５；又は１、２、６；又は１、２、７等を含む。（これらの遺伝子番号は、任意である。）
【００７７】
ＩＦＮ−γ処理
ＩＦＮ−γ処理に曝されたメラノーマ細胞を包含する試薬及び関連方法について、以下に示す。ＩＦＮ−γ応答遺伝子の誘導が、少なくとも２０％（対照値の１．２倍）、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％（対照値の２倍）、少なくとも２．５倍、少なくとも３．０倍、少なくとも４．０倍等である細胞を包含する。
【００７８】
ＩＦＮ−γ処理後、９０％未満が自食性であるメラノーマ細胞集団、８０％未満が自食性であるメラノーマ細胞集団、７０％未満が自食性であるメラノーマ細胞集団、６０％未満が自食性であるメラノーマ細胞集団、５０％未満が自食性であるメラノーマ細胞集団、４０％未満が自食性であるメラノーマ細胞集団等は、除外する。
【００７９】
ＩＦＮ−γ処理後、９０％未満が非アポトーシス性であるメラノーマ細胞集団、８０％未満が非アポトーシス性であるメラノーマ細胞集団、７０％未満が非アポトーシス性であるメラノーマ細胞集団、６０％未満が非アポトーシス性であるメラノーマ細胞集団、５０％未満が非アポトーシス性であるメラノーマ細胞集団、４０％未満が非アポトーシス性であるメラノーマ細胞集団等は、除外する。
【００８０】
ＩＦＮ−γ処理後、９０％未満が非接着性であるメラノーマ細胞集団、８０％未満が非接着性であるメラノーマ細胞集団、７０％未満が非接着性であるメラノーマ細胞集団、６０％未満が非接着性であるメラノーマ細胞集団、５０％未満が非接着性であるメラノーマ細胞集団、４０％未満が非接着性であるメラノーマ細胞集団等は、除外する。
【００８１】
ＭＨＣクラスＩＩの発現測定
ＭＨＣクラスＩＩの発現は、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子産物に特異的な抗体又は核酸プローブを用いて測定することができる。このＭＨＣクラスＩＩ遺伝子産物としては、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、並びにＨＬＡ−ＤＭ及びＨＬＡ−ＤＯが挙げられる（例えば、Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ４：４００−４０９を参照）。
【００８２】
例えば、本開示は、メラノーマ細胞が、ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ２を発現すること、活性化ＳＴＡＴ１シグナル伝達経路を有すること、活性化ＳＴＡＴ２シグナル伝達経路を有すること、又は活性化ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ２シグナル伝達経路を有することを要求する試薬、処理方法、及び診断方法を包含する。
【００８３】
本開示は、ハザード比（ＨＲ）１．０未満、ＨＲ０．９未満、ＨＲ０．８未満、ＨＲ０．７未満、ＨＲ０．６未満、ＨＲ０．５未満、ＨＲ０．４未満、ＨＲ０．３未満等を用いた生存データをもたらす医薬組成物又は薬学的試薬、関連する投与方法、及び処理方法を提供する。本開示の結果、全生存率データ、無増悪生存率データ、無増悪期間データ等が得られる。また、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％等の６ヶ月ＰＦＳを提供する。更に、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％等の６ヶ月全生存率を提供する。加えて、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％等の１年（又は２年）ＰＦＳを提供する。更に、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％等の１年（又は２年）全生存率を提供する（例えば、米国保健福祉省  食品医薬品局  産業界のためのガイダンス  抗癌剤及び生物製剤の承認のための臨床試験エンドポイント（２００５年４月）を参照）。
【００８４】
ＩＦＮ−γの使用と自食作用の誘導
ＩＦＮ−γ処理後の自食作用の誘導は、主要組織適合遺伝子クラスＩＩ複合体の発現増加により測定されるため、ＩＦＮ−γ全身処理に対する応答を判断する方法となる。生検メラノーマ腫瘍細胞の測定可能な集団が、培養液中でＩＦＮ−γに曝された際に、自食作用を行うがアポトーシスは行わない場合、このことは、これらの患者が、ＩＦＮ−γ全身処理に対して好ましく応答するであろうことを示す。また、生検からの細胞株の確立に成功すれば、患者も、自食性非アポトーシス性接着性細胞集団由来のＩＦＮ−γ処理精製腫瘍細胞株から調製した細胞治療薬の恩恵を受けるであろう。
【００８５】
本開示は、インターフェロン−γで処理した腫瘍細胞株から収集した自食性非アポトーシス性細胞から分離した主要組織適合遺伝子複合体の単離及び特性評価を含む。主要組織適合遺伝子複合体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に特異的な抗原を含有し、抗体媒介免疫応答に関連している。この複合体は、幅広い抗原レパートリーを示し、自食性細胞中で誘導されるリソーム媒介抗原プロセッシングの作用のため、非自食性細胞中には存在しないであろう。
【００８６】
ＩＦＮ−γ処理細胞株から生成された非アポトーシス性自食性腫瘍細胞は、樹状細胞と融合して、自食性腫瘍細胞の表面上に高レベルに存在する主要組織適合遺伝子複合体により抗原提示を増強させることができる。この過程により、２種の細胞の融合から生成される新規の細胞生産物が生じるであろう。
【００８７】
ＩＦＮ−γに応答した自食作用の誘導過程は、アポトーシスをもたらさない形で誘導されてもよい。カスパーゼ阻害剤とインターフェロンγとを組み合わせて腫瘍細胞を処理することにより、細胞死（及び最終的には寛容誘導アポトーシス細胞の形成）の過程を、自食作用の誘導、又は主要組織適合遺伝子クラスＩＩ複合体の増加を阻害することなく抑制することができる。
【００８８】
アポトーシス性細胞を死滅させ、自食性生細胞を維持する手順
メラノーマの研究により、アポトーシス性細胞の存在と臨床試験における低生存率との相関関係が実証された（Ｃｏｒｎｆｏｒｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ６０：１２３−１３１；  Ｄｉｌｌｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ．  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ２６：４０７−４１５）。以下の研究では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでメラノーマ腫瘍細胞をＩＦＮ−γ処理した後の自食作用、アポトーシス、及びＭＨＣクラスＩＩ分子の誘導について調べた。
【００８９】
選別
以下に「選別」の手順を提供する。本開示は、非アポトーシス性である細胞においてメラノーマ細胞集団を富化する方法及びこれらの方法により生成される細胞を提供する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩＦＮ−γ処理前に、任意のメラノーマ細胞集団において、第１の割合の細胞はアポトーシス性にバイアスが掛かる可能性があるが、第２の割合の細胞は非アポトーシス性にバイアスを掛けることができる。このような状況において、バイアスを掛けるとは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩＦＮ−γ処理により第１の割合の細胞（又は第１の細胞亜集団）のアポトーシスは刺激するが、第２の割合の細胞（又は第２の細胞亜集団）のアポトーシスは刺激しないことを意味する。実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩＦＮ−γ処理は、アポトーシス性にバイアスが掛かっているメラノーマ細胞にアポトーシスを経験させることにより、樹状細胞ワクチンに使用する免疫刺激性メラノーマ細胞集団を富化するために使用することができる。アポトーシス性にバイアスが掛かっているメラノーマ細胞亜集団が一旦アポトーシスを経験してしまえば、これらの細胞は、除去及び廃棄することができる。
【００９０】
研究手法は、以下の通りとした。自己メラノーマ腫瘍細胞株モデルは、自食作用、アポトーシス、及びＭＨＣクラスＩＩの発現の分析前に、１０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−γと共に７２時間インキュベートした。自食作用は、ＬＣ３ＩＩに対する抗体を用いた免疫ブロット、及びエンゾ社製ＣｙｔｏＩＤ（登録商標）オートファジー検出キットを用いたフローサイトメトリーにより検出した。アポトーシス及びＭＨＣクラスＩＩの誘導は、それぞれ７−ＡＡＤ及びアネキシン−Ｖ染色、並びにＭＨＣクラスＩＩに対する抗体を用いたフローサイトメトリーにより分析した。
【００９１】
研究の結果、メラノーマ細胞株において、ＩＦＮ−γにより自食性細胞集団及びアポトーシス性細胞集団の両方が誘導されることが実証された。アポトーシス性集団は、主に非接着性集団で見られたが、自食性細胞は、フラスコに接着したままであった。阻害剤３−メチルアデニン（３−ＭＡ）を用いて自食作用を阻害すると、ＩＦＮ−γへの応答によるＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞の誘導が阻害される（３９．４％ＩＦＮ−γ対１０．０％ＩＦＮ−γ＋３−ＭＡ）。汎カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤを用いたカスパーゼ活性の阻害により、ＩＦＮ−γ処理細胞において、アポトーシスは妨害されるが、自食作用は摂動されない（２．７５±０．１５ＩＦＮ−γ対３．０４±０．２７ＩＦＮ−γ＋Ｚ−ＶＡＤ、倍率変化）。結論として、アポトーシスの誘導は、自食作用及びＭＨＣクラスＩＩ誘導のレベル低下に関連している。本開示は、ＩＦＮ−γ処理後、アポトーシス性細胞は死滅させるが、自食性生細胞は維持する方法又は手順を提供し、この種の細胞系免疫療法の有効性を高めることができる。
【００９２】
第１の研究の材料及び方法
自己樹状細胞の生成
樹状細胞は、前述の通り、プラスチック接着法により生成した（Ｃｈｏｉ，  （１９９８）  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４：２７０９−２７１６；  Ｌｕｆｔ，  （１９９８）  Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．２６：４８９−５００）。簡単には、自己アフェレーシス産物を、フィコール・ハイパック（ＧＥヘルスケア社、バッキンガムシャー、英国）密度勾配分離にかけた。得られた末梢血単核細胞は、細胞培養フラスコ（コーニング・コースター社、カミング、ニューヨーク州）において、１５×１０６細胞／ｍＬの割合で、ＩＬ−４（セルジェニックス社、フレイスバーグ、ドイツ）及びＧＭ−ＣＳＦ（バーレックス社、シアトル、ワシントン州）（ＤＣ培地）をそれぞれ１，０００ＩＵ／ｍＬずつ加えた抗生物質無添加のＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン社、グランドアイランド、ニューヨーク州）に撒いた。１時間インキュベートした後、非接着性集団を廃棄し、新たなＤＣ培地をフラスコに加えた。翌朝、非接着性細胞を廃棄し、フラスコを常温のＰＢＳで１回洗浄し、新たなＤＣ培地を加えた。次に、フラスコを６日間培養し、その時に手法で生成したＤＣ（ロード前ＤＣ）の割合及び表現型を判定するためにフローサイトメトリー評価を行った。
【００９３】
自己腫瘍細胞株の生成
前述の通り生成し、特徴付けられた純粋腫瘍細胞を、２億個まで増やした後、１５％ＦＢＳ／ＥＣＳのＲＰＭＩ（完全培地）中で１０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−γ（インターミューン社、ブリスベン、カリフォルニア州）と共に７２時間インキュベートし、セシウム源から１００Ｇｙ照射し、前述のように凍結保存した（Ｃｈｏｉ，  （１９９８）  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４：２７０９−２７１６；  Ｌｕｆｔ，  （１９９８）  Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．２６：４８９−５００；  Ｄｉｌｌｍａｎ  （１９９３）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４：６５−６９）。ＩＦＮ−γ処理照射腫瘍細胞は、凍結保存から起こし、ＰＢＳで３回洗浄した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養したＤＣに加え、〜２４時間インキュベートした。抗原ロードＤＣは、ラバー・ポリスマンで穏やかに剥がして採取し、同量ずつ９−１１等分にして凍結保存した。ロード後ＤＣ細胞を表すフローサイトメトリー評価のため、１等分量の細胞を得た。
【００９４】
フローサイトメトリー
樹状細胞集団の表現型の特徴付けは、ＢＤファーミンゲン社（サンディエゴ、カリフォルニア州）から購入した表面マーカーに対するモノクローナル抗体：ＰｅｒＣｐと結合する抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体、ＡＰＣと結合する抗ＣＤ１１ｃ抗体、ＰＥと結合する抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８３抗体、抗ＣＤ８６抗体、を用いて行った。対照アイソタイプを用いて陽性細胞の割合を判定した。腫瘍細胞のフローサイトメトリーは、ＢＤファーミンゲン社から購入した、ＦＩＴＣと結合するＭＨＣクラスＩ及びＩＩに対する抗体、アネキシン−Ｖ−ＰＥ、及び７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＤＤ）を用いて行った。ＣａｌｉＢＲＩＴＥフローサイトメトリー校正（ＢＤファーミンゲン社）を各稼動の前に使用し、フローサイトメトリーデータの収集の間中、同じ機器設定を使用した。
【００９５】
免疫ブロットアッセイ
細胞質の細胞溶解物は、哺乳類タンパク質抽出試薬（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（サーモサイエンティフィック社、ロックフォード、イリノイ州）とプロテアーゼ阻害剤混合物（ロシュ社、インディアナポリス、インディアナ州）を用いて、１０，０００細胞／ｕＬの割合で、氷上で調製した。約２５ｕＬｓ／レーンの細胞溶解物を１２．５％トリス−グリシンゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、以下に対する抗体でプローブした：カルレティキュリン（ＭＢＬ社、ウバーン、マサチューセッツ州）、Ｈｓｐ−６０、Ｈｓｐ−７０、Ｈｓｐ−９０（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州）、ＨＭＢＧ−１（セルシグナリング社、ダンバース、マサチューセッツ州）、ＩＣＡＭ−１（サンタクルーズバイオテック社、サンタクルーズ、カリフォルニア州）、Ｍｅｌ−４、Ｍａｒｔ−１（シグネット社、エメリービル、カリフォルニア州）、チロシナーゼ（アップステート社、レイクプラシッド、ニューヨーク州）、及びＧＡＤＰＨ（カルバイオケム社、ダルムシュタット、ドイツ）。
【００９６】
免疫組織化学
メラノーマ株によるパネル抗原の発現は、免疫細胞化学的な手順を用いて測定した。細胞は、８穴チャンバースライド（サーモフィッシャー社、ロチェスター、ニューヨーク州）中で、１０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−γの存在下、又は非存在下で培養した。７２時間後、細胞は、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、冷アセトン中に固定した。内因性ペルオキシダーゼを阻害した後、細胞は、列挙した抗原に対する適切な一次抗体と共にインキュベートした。免疫組織化学は、ビオチン化アンチマウス又はラビット免疫グロブリン、超高感度ストレプトアビジン標識酵素、ホースラディッシュペルオキシダーゼ色素原、及び基質キット（バイオジェネックス社、サンラモン、カリフォルニア州）を用いて行った。以下の抗ヒトポリクローナル又はモノクローナル抗体の反応性は、アイソタイプ適合対照抗体：Ｓ−１００及びＨＭＢ−４５（バイオジェネックス社、サンラモン、カリフォルニア州）、Ｍｅｌ−２、Ｍｅｌ−５、Ｍａｒｔ−１（シグネット社、デッダム、マサチューセッツ州）、チロシナーゼ及びＭａｇｅ−１（サーモサイエンティフィック社、フリーモント、カリフォルニア州）、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩ（ダコ社、デンマーク）を用いて調べた。
【００９７】
統計分析
等分散の２標本を対象とする両側スチューデントｔ検定。有意差は、ｐ値≦０．０５で判定した。
【００９８】
第１の研究の結果
細胞死は、自己メラノーマ腫瘍細胞株において、完全培地中でのＩＦＮ−γを用いた７２時間のインキュベーションに応答して特異的に誘導された。トリパンブルー染色除外分析をＩＦＮ−γ処理又は未処理細胞に対して行ったところ、ＩＦＮ−γ処理細胞の生存率の方が低くなるという有意な傾向が明らかになった（８９．１±６．８％対８４．９±９．３％、ｐ＝０．０１４、Ｎ＝４７）。アポトーシス誘導に関するフローサイトメトリーによる４つの自己メラノーマ細胞株の標本分析（図１Ａ）から、メラノーマ細胞が、ＩＦＮ−γ誘導アポトーシスの影響に対して特異的に感受性があり、いくつかの細胞はより後期のアポトーシスを示すか又は「死亡」した集団（７−ＡＡＤ＋／アネキシン−Ｖ＋）であり、その他は初期アポトーシスの兆候示すか又は「瀕死」の集団（７−ＡＡＤ-／アネキシン−Ｖ＋）であることが明らかになった。結果としてＩＦＮ−γ処理後にアポトーシス細胞が存在することは、無増悪生存率又は全生存率における有意な減少と関連した（Ｃｏｒｎｆｏｒｔｈ  （２０１０）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ  ｏｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ（患者特異的樹状細胞免疫療法で使用したメラノーマ細胞に対するインターフェロン−γによるアポトーシス促進効果への耐性は、全生存率の改善に関連する））。ログ・ランク検定により、メラノーマ腫瘍細胞のＩＦＮ−γ処理による低い生存率と研究対象の患者の全生存率とが有意に関連することが明らかになった。
【００９９】
ＩＦＮ−γの存在下又は非存在下でインキュベートした細胞の溶解物に対し、免疫の重要な仲介物質である可能性がある様々な分子についての免疫ブロットを行った（図１Ｂ）。ＩＦＮ−γで処理したメラノーマ細胞のセットにおいて、熱ショックタンパク質が特異的に制御されているように見えるが、特にｈｓｐ−７０の場合、大部分が細胞調製物中に依然として存在している。小胞体タンパク質、カルレティキュリン、及び高移動度群ボックス１タンパク質（ＨＭＧＢ−１）は、ＩＦＮ−γで処理すると、上方制御される場合があるように見える（図１Ｂ）。一方、通常のメラノーマ抗原（ｍｅｌ−４、Ｍａｒｔ−１、及びチロシナーゼ）は、一般的にＩＦＮ−γにより下方制御されるように見えるが、リンパ球媒介細胞毒性への感受性と関連したリンパ球接着分子であるＩＣＡＭ−１（Ｈａｍａｉ  （２００８）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６８：９８５４−９８６４）は、有意に上方制御されている（図１Ｃ）。実際に、ＩＦＮ−γ処理メラノーマ腫瘍細胞は、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性に対してより感受性が高いことが分かった。また、メラノーマ関連抗原の一群の対象の免疫組織化学により、多くの検討した抗原において、ＩＦＮ−γにより抗原発現が下方制御されることが明らかになった（表１）。
【０１００】
ＩＦＮ−γの使用により、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ及びＩＩは上方制御される（Ｂｏｈｎ  (１９９８)  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：８９７−９０８）。図１Ｄに見られるように、ＩＦＮ−γを用いた自己メラノーマ細胞の処理により、ＭＨＣクラスＩは、倍数誘導の中央値が２．９１±１．１３（９５％Ｃ．Ｉ．）で、ほぼ遍在し、有意に上方制御された（ｐ＝２．８×１０−８）。また、ＭＨＣクラスＩＩの平均蛍光強度は有意に高かったが、誘導の中央値は４．２３±２．６６（９５％Ｃ．Ｉ．）とそれ程高くなかった（ｐ＝０．０３９）。自己メラノーマ細胞の表面におけるＭＨＣクラスＩＩ分子の量は、ＭＨＣクラスＩ分子の量よりも一般に低いが、症例の７０％において、ＭＨＣクラスＩＩ発現の初期量が低いことにより、ＩＦＮ−γ処理に応答したＭＨＣクラスＩＩ分子の誘導は、２倍よりも高いものとなった。抗原を樹状細胞にロードしている間、これらの分子が腫瘍細胞上に存在することにより、ＭＨＣ複合体が抗原提示細胞に「クロスドレッシング（ｃｒｏｓｓ  ｄｒｅｓｓｉｎｇ）」される機会が提供される可能性がある（Ｄｏｌａｎ  (２００６)  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２７７：６０１８−６０２４、Ｄｏｌａｎ  (２００６)  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７６：１４４７−１４５５）。
【０１０１】
４つの代表的な自己メラノーマ細胞株のセットをＩＦＮ−γと共にインキュベートし、樹状細胞に当量ずつロードした。その後、樹状細胞について、フローサイトメトリーによりＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、及びＭＨＣクラスＩＩの発現を分析した。その結果、ＣＤ８３の発現が陽性である樹状細胞集団の割合に関して、ＩＦＮ−γ処理メラノーマ細胞をロードしたことで僅かであるが感知できる増加が見られたことが分かった（図２）。また、より多くの未処理腫瘍細胞が、ＣＤ８６陽性集団の割合が明らかに減少したＣＤ８６ドットプロット（左上象限）において認められ、ＩＦＮ−γ未処理腫瘍細胞が依然として存在することが示された。前述の通りアポトーシス細胞は樹状細胞に取り込まれる可能性が高いため、この効果は、ＩＦＮ−γによるアポトーシスの誘導に起因する可能性が最も高い。
【０１０２】
図３に示すように、ロード前ＤＣサンプルは、ＣＤ８０（３９．０±１６．２％）、ＣＤ８３（７．１±６．９％）、ＣＤ８６（７３．６±１９．５％）を発現し、ＭＨＣクラスＩＩ陽性で、生存率は９６．２±５．０％であることが分かった。ロード後ＤＣは、有意に高い平均蛍光強度（１７２．９±７９．０％、ｐ＝０．０００９）と共に有意に高いＣＤ８３の割合（９．４±７．１％、ｐ＝０．０１９）を有し、照射ＩＦＮ−γ処理腫瘍細胞をＤＣにロードさせることにより、成熟が誘導される樹状細胞があることが示された（図３Ｂ）。
【０１０３】
第１の研究の考察
抗腫瘍免疫と関連した抗原ロード、成熟化、及び投与のプロトコール、並びに樹状細胞（ＤＣ）系免疫療法の指導は、当業者により実行される。この種の治療は、抗原源としての精製自己腫瘍細胞の使用を包含し、腫瘍関連抗原の患者特異的レパートリーを含む（Ｓｅｌｖａｎ  （２０１０）  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ．  ２０：２８０−２９２；  Ｄｉｌｌｍａｎ  （２００７）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ．  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．  ２２：３０９−３２１）。臨床試験の中には、未精製の自己巨大腫瘍を使用しているものがある。この抗原源には、線維芽細胞及び壊死組織が混入している可能性がある（Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ  （２００７）  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ．  １７：３１６−３２２）。抗原と関連した腫瘍幹細胞が、精製細胞株中に存在している可能性がある（Ｄｉｌｌｍａｎ  （２００６）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３５５：１１７９−１１８１）。ＩＦＮ−γ処理により、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現が増加する。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、樹状細胞系療法への応答に重要である。取り込まれた物質中に存在する分子、例えば、カルレティキュリン、ＨＭＧＢ−１、及び熱ショックタンパク質等は、成熟シグナルに関与している可能性があり、この関与は、サイトカイン混合物による関与に加わる可能性がある。本開示のＤＣの調製では、成熟化の傾向が見られ、後期アポトーシス細胞の取り込みに関連する可能性がある（ｌｐ  （２００４）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７３：１８９−１９６）。アポトーシス細胞の使用は、腫瘍細胞溶解物又は壊死細胞をロードした樹状細胞と比べてリンパ球のＩＦＮ−γ分泌をより効果的に刺激した樹状細胞の生成と相関しており、アポトーシス細胞をロードした樹状細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでより効果が高い可能性がある。ＩＦＮ−γによるアポトーシス促進効果への耐性は、より良好な臨床転帰がもたらされる可能性がある（Ｃｏｒｎｆｏｒｔｈ  （２０１０）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ６０：１２３−１３１）。成熟ＤＣによるインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の分泌は、強力な細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ、Ｃｄ＋８Ｔ細胞）の活性に繋がる可能性がある。ｅｘ  ｖｉｖｏでの成熟化が腫瘍免疫の持続に繋がるか否かという課題が取り組まれてきた。また、抗原特異的ＣＴＬを抑制することができる制御性Ｔ細胞を未成熟ＤＣが誘導する危険が、サイトカイン成熟ＤＣと共に生じることが示されている。ＤＣ成熟化のプロトコールを改善するために、成熟化に繋がる一連のシグナル伝達事象の再評価が検討されている。よって、本明細書に示す証拠はＤＣが成熟過程を開始することを示しているため、この研究における照射腫瘍細胞全体の抗原源としての使用は、ｅｘ  ｖｉｖｏでのサイトカイン成熟化の必要がなく、ＤＣ免疫療法のより好ましい方法である可能性がある。注射に際し、これらの「成熟中の」ＤＣは、ライセンシング、抗原特異的ＣＤ４０Ｌ発現ＣＤ４＋Ｔ細胞を引き付けるサイトカインの分泌により成熟過程を完了してもよい。免疫補助剤ＧＭ−ＣＳＦに応答して樹状細胞で生成されるＣＣＬ１７／ＴＡＲＣのような血清ケモカインは、無増悪生存率の向上に関連している。状況によっては、樹状��胞によるリンパ球の活性化は、ＣＤ８０及びＣＤ８６のような共刺激分子の発現を要する可能性がある。成熟化のマーカーとして、ＣＤ８３は、成熟樹状細胞で発現されるが、より強い免疫応答を誘導することができる樹状細胞に対応する可能性がある（Ｐｒａｚｍａ  （２００８）  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  １１５：１−８）。これは、医薬品中の全細胞の一部を表すものである。どの医薬療法においても、成熟ＤＣの数が単独で良好な患者反応と相関する可能性もあれば、相関しない可能性もある。
【０１０４】
第１の研究の表
表１：患者特異的細胞系樹状細胞療法に用いられたメラノーマ細胞株におけるインターフェロン−γに応答した一般的な腫瘍関連抗原の発現量の変化
【０１０５】
【表１】
2014533938.tif 000003
【０１０６】
Ｎ＝２７サンプル。
【０１０７】
第２の研究の材料及び方法
メラノーマ細胞株
市販のメラノーマ細胞株Ａ３７５、ＳＫ−Ｍｅｌ−５、及びＳＫ−Ｍｅｌ−２８を、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から購入した（カタログ番号：ＣＲＬ−１６１９、ＨＴＢ−７０、及びＨＴＢ−７２）。Ａ３７５、ＳＫ−Ｍｅｌ−５、及びＳＫ−Ｍｅｌ−２８は、５％ウシ胎仔血清入りＲＰＭＩ−１６４０（インビトロジェン社、カタログ番号：１１８７５−０８５）中で維持した。汎カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ及びその対照化合物ｚ−ＦＡＤ−ｆｍｋをＢＤファーミンゲン社から購入した（カタログ番号：５５０３７７及び５５０４１１）。ＧＦＰ−ＬＣ３のトランスフェクションをメーカーの使用説明書に従って行い（インビボゲン社、カタログ番号：ｐｓｅｔｚ−ｇｆｐｌｃ３及びｌｙｅｃ−１２）、ＤＰ７２デジタルカメラを用いてオリンパス社製ＢＸ−５１顕微鏡に顕微鏡写真を撮影した。腫瘍細胞株は、分析の前に、１０００Ｕ／ｍＬのＩＦＮ−γ（インターミューン社、カタログ番号）と共に７２時間インキュベートした。患者特異的細胞株は、説明されているように（Ｈａｍａｉ  （２００８）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６８：９８５４−９８６４；  Ｔｙｒｉｎｇ  （１９８４）  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．７３：１０６７−１０７３）、外科的腫瘍サンプルの酵素消化、並びに１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭグルタミン、及びＨＥＰＥＳ緩衝液を加えたウシ胎仔血清及び濃縮子牛血清（オメガ・サイエンティフィック社、サンディエゴ、カリフォルニア州）入りＲＰＭＩ−１６４０組織培養培地での培養により生成した。ニコン社製ＤＳ−Ｌ１デジタル顕微鏡カメラを用いてオリンパス社製ＣＫ−２顕微鏡に位相差顕微鏡写真を撮影した。
【０１０８】
自己樹状細胞の生成
樹状細胞は、フィコール分離産物のプラスチック接着法（Ｓｅｌｖａｎ  （２００７）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  １２２：１３７４−１３８３、Ｃｏｒｎｆｏｒｔｈ  （２０１０）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏ．  ６０：１２３−１３１）により、抗生物質無添加のＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン社、カタログ番号）中で、ＩＬ−４（セルジェニックス社、カタログ番号）及びＧＭ−ＣＳＦ（バーレックス社、シアトル、ワシントン州）（ＤＣ培地）をそれぞれ１，０００ＩＵ／ｍＬずつ加えて生成した。次に、ＩＦＮ−γ処理照射自己腫瘍細胞をロードする前に、フラスコを６日間培養した。
【０１０９】
フローサイトメトリー
ＩＦＮ−γに応答した腫瘍細胞の細胞死及び主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ発現の変化の分析は、ＭＨＣクラスＩＩ、アネキシン−Ｖ、及び７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＤＤ）に対する抗体を用いて行い、ベクトン−ディケンソン社製ＦＡＣＳカリブル（Ｃａｌｉｂｕｒ）（登録商標）フローサイトメーターに取得した。
【０１１０】
ウェスタンブロット
メラノーマ腫瘍細胞溶解物は、１０−１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースに転写し、一次抗体で一晩プローブした後、二次抗体の結合を行い、バンドを展開するためのノベックスＡＰ発色基質（インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）による展開を行った。ＬＣ３−Ｂ抗体（セルシグナリング・テクノロジーズ社、ボストン、マサチューセッツ州）及びＧＡＤＰＨ（ＥＭＤバイオサイエンシス社、ドイツ）に対する抗体を、メーカーが推奨するようにそれぞれ１：１００及び１：１０，０００に希釈して使用した。
【０１１１】
第２の研究の説明
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでメラノーマ腫瘍細胞をＩＦＮ−γ処理した後の自食作用、アポトーシス、及びMＨＣクラスＩＩ分子の誘導について調べた。自己メラノーマ腫瘍細胞株モデルは、自食作用、アポトーシス、及びＭＨＣクラスＩＩの発現の分析前に、１０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−γと共に７２時間インキュベートした。自食作用は、ＬＣ３ＩＩに対する抗体を用いた免疫ブロット、及びエンゾ社製ＣｙｔｏＩＤ（登録商標）オートファジー検出キットを用いたフローサイトメトリーにより検出した。アポトーシス及びＭＨＣクラスＩＩの誘導は、それぞれ７−ＡＡＤ及びアネキシン−Ｖ染色、並びにＭＨＣクラスＩＩに対する抗体を用いたフローサイトメトリーによりアッセイした。
【０１１２】
第２の研究の結果
結果として、メラノーマ細胞株において、ＩＦＮ−γにより自食性細胞集団及びアポトーシス性細胞集団の両方が誘導されることが実証された。アポトーシス性集団は、主に非接着性集団で見られたが、自食性細胞は、フラスコに接着したままであった。阻害剤３−メチルアデニン（３−ＭＡ）を用いて自食作用を阻害すると、ＩＦＮ−γへの応答によるＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞の誘導が阻害される（３９．４％ＩＦＮ−γ対１０．０％ＩＦＮ−γ＋３−ＭＡ）。汎カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤを用いたカスパーゼ活性の阻害により、ＩＦＮ−γ処理細胞において、アポトーシスは妨害されるが、自食作用は摂動されない（２．７５±０．１５ＩＦＮ−γ対３．０４±０．２７ＩＦＮ−γ＋Ｚ−ＶＡＤ、倍率変化）。アポトーシスの誘導は、自食作用及びＭＨＣクラスＩＩ発現のレベル低下に関連している。インターフェロン−γ処理純粋腫瘍細胞株由来の非アポトーシス性自食性細胞である、自己腫瘍細胞ロード樹状細胞株を投与された患者は、無増悪生存率及び全生存率が改善した（それぞれｐ＝０．００３、ｐ＝０．００２）。ＩＦＮ−γ処理後、アポトーシス性細胞は死滅させるが、自食性生細胞は維持する手法により、この種の細胞系免疫療法の有効性が高まる可能性がある。
【０１１３】
研究の統合分析
自己増殖性自己複製腫瘍細胞（推定腫瘍幹細胞及び／又は初期前駆細胞）は、転移性癌の新たな持効性製剤の確立に重要であり、ワクチン用の優れた抗原源である可能性がある。これらの研究は、そのような細胞由来の抗原を用いた免疫からの生存に与える影響について検討した。
【０１１４】
方法
データは、３つの連続したフェーズII試験から集積した。これらの試験は全て、転移性メラノーマと実証された患者を試験対象とし、患者は、自己腫瘍細胞の細胞培養液由来の抗原を使用したプロトコールで治療を受けた。皮下注射を週１回３週間行った後、月１回５ヶ月間行った。７４人の患者が照射腫瘍細胞（ＴＣ）を注射され、５４人の患者が照射自己腫瘍細胞（ＮＣＩ−Ｖ０１−１６４６）と共培養した自己樹状細胞（ＤＣ）を注射された。無作為フェーズII試験では、２４人の患者がＴＣを注射され、１８人の患者がＤＣを注射された（ＮＣＴ００４３６９３０）。
【０１１５】
結果
表２は、各試験の全生存率（ＯＳ）を集約している。統合分析において、９８人がＴＣ患者、７２人がＤＣ患者であった。年齢（５１、５２）、男性（６２％、６２％）、治療時に疾患の兆候がないこと（４６％、４７％）、及び治療時にＭ１ｃ内臓疾患が存在すること（１３％、１４％）に関しての特徴は、類似していた。ＯＳは、ＤＣで治療した患者でより長かった（中央値：６３．１ヶ月対２０．２ヶ月、５年ＯＳ：５１％対２６％、ｐ＝０．０００２、マンテル・コックス・ログ・ランク検定）。また、無作為試験におけるＯＳの違いも有意であった（ｐ＝０．００７）。
【０１１６】
自己増殖性自己複製腫瘍細胞由来の抗原で調製された患者特異的ＤＣワクチンは、長期生存率の促進に関連し、転移性メラノーマと診断された患者集団において患者特異的ＴＣワクチンよりも優れている。
【０１１７】
【表２】
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【０１１８】
患者特異的ワクチンに関する３つの試験から得た生存率曲線を図１３に示す。連続したフェーズI及びフェーズII治験は、自己腫瘍細胞を用いて、自己樹状細胞（ＤＣ）と組み合わせて又は組み合わせずに行った。皮下注射を３週間行い、月１回５ヶ月間行った。７４人の患者がＩＦＮ−γでの前処理なしの照射腫瘍細胞を注射され、５４人の患者がインターフェロン−γで前処理した照射自己腫瘍細胞（ＴＣ）と共培養した自己樹状細胞を注射された。無作為フェーズII試験では、２４人の患者がＩＦＮ−γを含まない前処理なしの腫瘍細胞（ＴＣ）を注射され、１８人の患者が樹状細胞（ＤＣ）及びＩＦＮ−γを含む前処理なしの腫瘍細胞（ＴＣ）を注射された。
【０１１９】
ＩＦＮ−γ処理の特徴
ＩＦＮ−γ処理は、アポトーシス性にバイアスが掛かっているメラノーマ細胞を実際にアポトーシスに入らせ、それにより、吸収／浮遊技術で除去できるようにする。ＩＦＮ−γ処理により、吸着／浮遊技術で選択する前であっても、より多くの自食性非アポトーシス性細胞集団が生じる。ＩＦＮ−γ処理により、吸着／浮遊技術で選択した後の測定で、より多くの自食性非アポトーシス性細胞集団が生じる。ＩＦＮ−γ処理により、自食作用が増大することで抗原提示細胞のクロスプライミングが増強されて、より多くの自食性非アポトーシス性細胞集団が生じる。
【０１２０】
このように、本開示の基本的な新規な特徴について、本開示の例示的実施及び／又は態様に応用されたものとして図示し、説明し、指摘したが、本開示の例示的実施、開示内容、及び態様の形及び細部において、種々の省略、再構成、置換、及び変更が、本開示及び／又は請求項の精神から逸脱することなく当業者によりなされてもよいことが理解されよう。例えば、実質的に同じ方式で実質的に同じ機能を果たして同じ成果を達成する要素及び／又は方法の工程の組み合わせは全て、本開示の範囲内にあることを明確に意図する。また、あらゆる開示された形又は実施に関連して図示及び／又は説明された構造及び/又は要素及び/又は方法の工程が、設計上の選択の全般的な内容として、他のあらゆる開示又は説明又は示唆された形又は実施に組み込まれてもよいことは認識されなければならない。従って、本開示の範囲を制限しないことを意図する。このような変更は全て、添付の請求項の範囲内であることを意図する。
【０１２１】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許、特許出願、論文、及び配列表は、あたかもその全体が本明細書に記載されたかのように、参照により援用される。
【０１２２】
要約書は、技術的開示の本質及び要点を読み手が迅速に確認できるように記載することを求める米国特許法施行規則第１条第７２項ｂ（３７ＣＦＲ§１．７２（ｂ））に準拠して提供する。要約書は、請求項の範囲又は意味を解釈又は限定するために使用されないという理解の下に提出する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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