(57)【要約】本発明は、乳癌の予後に関連するバイオマーカーに関する。これらのバイオマーカーとしては、コード転写物およびそれらの発現産物、ならびに非コード転写物が挙げられ、乳癌患者における乳癌の再発の可能性を予測するために有用である。本発明は、臨床転帰と相関する遺伝子間配列を同定する新規の方法にも関する。一態様では、本発明は、乳癌患者における乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性を予測する方法を提供する。この方法は、患者から得た乳癌腫瘍試料における１種または複数種のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルを決定することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌患者における乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性を予測する方法であって、
前記患者から得た乳癌腫瘍試料における１つまたは複数の乳癌予後判定バイオマーカーのレベルを決定するステップであって、前記１つまたは複数の乳癌予後判定バイオマーカーが、
（ａ）表１および／または表１５から選択される１種または複数種のＲＮＡ転写物またはその発現産物、
（ｂ）表２から選択される１種または複数種のＲＮＡ転写物またはその発現産物、
（ｃ）表３から選択される１種または複数種のイントロンＲＮＡ、
（ｄ）表４から選択される１つまたは複数の長い遺伝子間非コード領域（ｌｉｎｃＲＮＡ）、
（ｅ）表５から選択される１種または複数種の遺伝子間配列、
（ｆ）表５の遺伝子間領域１〜６９から選択される１種または複数種の遺伝子間領域、
（ｇ）表６〜１１から選択される１種または複数種のＲＮＡ転写物またはその発現産物、および
（ｈ）表１３から選択される１種または複数種のＲＮＡ転写物またはその発現産物から選択されるステップと、
前記１つまたは複数の乳癌予後判定バイオマーカーのレベルを正規化して、前記１つまたは複数の乳癌予後判定バイオマーカーの正規化されたレベルを得るステップと、
前記患者の乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性を予測するステップであって、表１、２、３、４、５、または１５において前記乳癌予後判定バイオマーカーの関連性の方向が１と記されている場合には、前記１つまたは複数の乳癌予後判定バイオマーカーの正規化されたレベルの上昇が、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加と負に相関し、表１、２、３、４、５、または１５において前記１つまたは複数の乳癌予後判定バイオマーカーの関連性の方向が−１と記されている場合には、前記１つまたは複数の乳癌予後判定バイオマーカーの正規化されたレベルの上昇が、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加と正に相関するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記１つまたは複数の乳癌予後判定バイオマーカーのレベルが（ｂ）および／または（ｈ）から選択され、前記乳癌患者が、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳癌患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｆ）の１種または複数種の遺伝子間領域のレベルを、前記１種または複数種の遺伝子間領域を構成する１種または複数種の遺伝子間配列のレベルを決定することによって決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ｇ）の１種または複数種のＲＮＡ転写物またはその発現産物を、細胞周期ネットワーク、ＥＳＲ１ネットワーク、Ｃｈｒ９ｑ２２ネットワーク、Ｃｈｒ１７ｑ２３−２４ネットワーク、Ｃｈｒ８ｑ２１−２４ネットワーク、および嗅覚受容体ネットワークから選択される１種または複数種の遺伝子ネットワークに割り当てるステップと、
前記正規化されたレベルを用いて前記１種または複数種の遺伝子ネットワークについての可能性スコアを決定するステップと、
乳癌患者における前記乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性を前記可能性スコアに基づいて予測するステップであって、前記可能性スコアの増加が、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加と負に相関するステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ｈ）の１種または複数種のＲＮＡ転写物またはその発現産物を嗅覚受容体ネットワークに割り当てるステップと、
前記正規化されたレベルを用いて前記嗅覚受容体ネットワークについての可能性スコアを決定するステップと、
乳癌患者における前記乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性を前記可能性スコアに基づいて予測するステップであって、前記可能性スコアの増加が、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加と負に相関し、前記乳癌患者がエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳癌患者であるステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
乳癌患者における乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性を予測する方法であって、
前記患者から得た乳癌腫瘍試料における少なくとも３種のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルを決定するステップであって、前記少なくとも３種のＲＮＡ転写物またはその発現産物がＥＮ０１、ＩＤＨ２、ＴＭＳＢ１０、ＰＧＫ１、およびＧ６ＰＤから選択されるステップと、
前記少なくとも３種のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルを正規化して、前記少なくとも３種のＲＮＡ転写物またはその発現産物の正規化された発現レベルを得るステップと、
前記正規化された発現レベルを用いて前記患者の乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性を予測するステップであって、正規化された発現レベルの上昇が、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加と負に相関するステップとを含む方法。
【請求項７】
少なくともＩＤＨ２、ＰＧＫ１、およびＧ６ＰＤのレベルを決定する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＥＮＯ１、ＩＤＨ２、ＴＭＳＢ１０、ＰＧＫ１、およびＧ６ＰＤのレベルを決定する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
乳癌患者における乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性を予測する方法であって、
前記患者から得た乳癌腫瘍試料における少なくとも５種のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルを決定するステップであって、前記少なくとも５種のＲＮＡ転写物またはその発現産物が、ＰＧＤ、ＴＫＴ、ＴＡＬＤＯ１、Ｇ６ＰＤ、ＧＰ１、ＳＬＣ１Ａ５、ＳＬＣ７Ａ５、ＯＧＤＨ、ＳＵＣＬＧ１、ＥＮＯ１、ＰＧＫ１、ＩＤＨ２、ＡＣＯ２、およびＦＢＰ１から選択されるステップと、
前記少なくとも５種のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルを正規化して、前記少なくとも５種のＲＮＡ転写物またはその発現産物の正規化された発現レベルを得るステップと、
前記正規化された発現レベルを用いて、前記患者の、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性を予測するステップであって、ＰＧＤ、ＴＫＴ、ＴＡＬＤＯ１、Ｇ６ＰＤ、ＧＰ１、ＳＬＣ１Ａ５、ＳＬＣ７Ａ５、ＯＧＤＨ、ＳＵＣＬＧ１、ＥＮＯ１、ＰＧＫ１、ＩＤＨ２、およびＡＣＯ２の正規化された発現レベルの上昇が、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加と負に相関し、ＦＢＰ１の正規化された発現レベルの上昇が乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加と正に相関するステップとを含む方法。
【請求項１０】
ＰＧＤ、ＴＫＴ、ＴＡＬＤＯ１、Ｇ６ＰＤ、ＧＰ１、ＳＬＣ１Ａ５、ＳＬＣ７Ａ５、ＯＧＤＨ、ＳＵＣＬＧ１、ＥＮＯ１、ＰＧＫ１、ＩＤＨ２、ＡＣＯ２、およびＦＢＰ１のレベルを決定する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記レベルを全トランスクリプトーム配列決定によって決定する、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記レベルを逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって決定する、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記レベルをアレイによって決定する、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記乳癌腫瘍試料が、固定し蝋に包埋した組織試料である、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記乳癌腫瘍試料が細針生検試料である、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記１種または複数種のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルに基づいて報告書を作成することをさらに含む、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１１年１１月８日に出願された米国仮特許出願第６１／５５７，２３８号および２０１２年２月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／５９７，４２６号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、乳癌の予後に関連するバイオマーカーに関する。これらのバイオマーカーとしては、コード転写物およびそれらの発現産物、ならびに非コード転写物が挙げられ、乳癌患者における乳癌の再発の可能性を予測するために有用である。
【背景技術】
【０００３】
緒言
１０年超にわたって、ＤＮＡマイクロアレイおよび逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）などの技術により、特定のＲＮＡ転写物のレベル（「遺伝子発現プロファイル」）が、特に、さまざまな癌において、患者の層別化および疾患の転帰に関連することが実証された。いくつかの検証されており現在広く用いられている臨床検査では、遺伝子発現プロファイリング、例えば、保存用ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織における２１種のバイオマーカーＲＮＡのレベルを測定するＯｎｃｏｔｙｐｅ  ＤＸ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲ検査などを用いる。Ｏｎｃｏｔｙｐｅ  ＤＸ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲ検査により初期のエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳癌の再発のリスク、ならびに化学療法に対する応答の可能性が予測され、現在この検査は、米国においてＥＲ＋乳癌患者の約半分に対する治療の決定を手引きするために用いられている。
【０００４】
しかし、ＲＴ−ＰＣＲは、特に、多くの腫瘍検体から入手可能な患者のＦＦＰＥ  ＲＮＡの量が限られることを考慮すると、調べることができる転写物の数および配列の複雑さにより制約される。ＤＮＡシークエンシングにおける最近の主要な進歩（「次世代シークエンシング」）により、ＲＴ−ＰＣＲなどの他の技術を用いて可能な核酸情報量を凌ぐ大規模並列処理量およびデータ量がもたらされる。次世代シークエンシングにより、配列の差異、多型、突然変異、コピー数の変動、後成的変動および転写物の存在量（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）の分析を含めた、個体の群の前例のない広範囲にわたるゲノム分析が実行可能になる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要旨
多重化全ゲノムシークエンシング方法体系が開発されて、低量のＦＦＰＥ組織を使用した全トランスクリプトームワイドな乳癌バイオマーカーの発見が可能になった。本発明は、乳癌における特定の臨床転帰と正または負に関連するバイオマーカーを提供する。これらのバイオマーカーは表１〜５および表１５に列挙されている。例えば、臨床転帰は癌が再発しないこと、または癌が再発することであり得る。臨床転帰は、例えば、無病または無再発生存、無転移生存、全生存などの臨床エンドポイントによって定義することができる。
【０００６】
本発明は、保存用パラフィン包埋生検材料の使用をセット内の全てのマーカーのアッセイに適応させ、したがって、最も広く利用可能な種類の生検材料と適合する。本発明は、例えば、コア生検または細針吸引によって腫瘍組織を採取する他の異なる方法とも適合する。
【０００７】
一態様では、本発明は、乳癌患者における乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性を予測する方法を提供する。この方法は、患者から得た乳癌腫瘍試料における１種または複数種のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルを決定することを含む。ＲＮＡ転写物またはその発現産物は、表１および表１５から選択することができる。次いで、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性を、ＲＮＡ転写物またはその発現産物と、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加との負または正の相関に基づいて予測する。ＲＮＡ転写物は、表１および表１５においてその関連性の方向が１と記されている場合には、乳癌の再発を伴わない長期生存の増加と負に相関し、表１および表１５においてその関連性の方向が−１と記されている場合には、乳癌の再発を伴わない長期生存の増加と正に相関する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳癌患者における、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性を予測する方法を提供する。この方法は、患者から得た乳癌腫瘍試料における１種または複数種のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルを決定することを含む。ＲＮＡ転写物またはその発現産物は、表２から選択することができる。次いで、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性を、ＲＮＡ転写物またはその発現産物と、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加との負または正の相関に基づいて予測する。ＲＮＡ転写物は、表２においてその関連性の方向が１と記されている場合には、乳癌の再発を伴わない長期生存の増加と負に相関し、表２においてその関連性の方向が−１と記されている場合には、乳癌の再発を伴わない長期生存の増加と正に相関する。
【０００９】
ＲＮＡ転写物または発現産物は、現在理解されているそれらの細胞機能に基づいて遺伝子ネットワークに群分けすることができる。例えば、遺伝子ネットワークとしては、細胞周期ネットワーク、ＥＳＲ１ネットワーク、Ｃｈｒ９ｑ２２ネットワーク、Ｃｈｒ１７ｑ２３−２４ネットワーク、Ｃｈｒ８ｑ２１−２４ネットワーク、嗅覚受容体ネットワーク、および代謝様ネットワークが挙げられる。したがって、本発明は、乳癌患者における乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性を、１種または複数種の遺伝子ネットワークについての定量値、例えば可能性スコアなどを、患者から得た乳癌腫瘍試料における遺伝子ネットワーク内の少なくとも１種のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルに基づいて決定することによって予測する方法も提供する。遺伝子ネットワークについての定量値は、１種または複数種のＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物の、再発のリスクなどの臨床転帰に対する寄与に重み付けすることによって決定することができる。
【００１０】
さらに別の態様では、本発明は、乳癌患者における乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性を、患者から得た乳癌組織試料における１つまたは複数の非コード配列のレベルを決定することによって予測する方法を提供する。一実施形態では、非コード配列は、表３から選択される１種または複数種のイントロンＲＮＡである。別の実施形態では、非コード配列は、表４から選択される１つまたは複数の長い遺伝子間非コード領域（ｌｉｎｃＲＮＡ）である。別の実施形態では、非コード配列は、表５から選択される１種または複数種の遺伝子間配列である。さらに別の実施形態では、非コード配列は、表５から選択される１種または複数種の遺伝子間領域１〜６９である。遺伝子間領域は、表５による１種または複数種の遺伝子間配列で構成されていてよい。乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性を、非コード配列と乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加との負または正の相関に基づいて予測する。非コード配列は、表３〜５においてその関連性の方向が１と記されている場合には、乳癌の再発を伴わない長期生存の増加と負に相関し、表３〜５においてその関連性の方向が−１と記されている場合には、乳癌の再発を伴わない長期生存の増加と正に相関する。
【００１１】
別の態様では、本発明は、乳癌患者における乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性を、患者から得た乳癌腫瘍試料における代謝様ネットワーク由来のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルを決定することによって予測する方法を提供する。代謝様ネットワークとしては、ＥＮＯ１、ＩＤＨ２、ＴＭＳＢ１０、ＰＧＫ１、およびＧ６ＰＤを含む５種の遺伝子のセット、ならびにＰＧＤ、ＴＫＴ、ＴＡＬＤＯ１、Ｇ６ＰＤ、ＧＰ１、ＳＬＣ１Ａ５、ＳＬＣ７Ａ５、ＯＧＤＨ、ＳＵＣＬＧ１、ＥＮＯ１、ＰＧＫ１、ＩＤＨ２、ＡＣＯ２、およびＦＢＰ１を含む１４種の遺伝子のセットが挙げられる。一態様では、ＥＮＯ１、ＩＤＨ２、ＴＭＳＢ１０、ＰＧＫ１、およびＧ６ＰＤから選択される少なくとも３種のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルを決定する。特定の実施形態では、少なくともＩＤＨ２、ＰＧＫ１、およびＧ６ＰＤのレベルを決定する。さらに別の実施形態では、ＥＮＯ１、ＩＤＨ２、ＴＭＳＢ１０、ＰＧＫ１、およびＧ６ＰＤのレベルを決定する。別の態様では、ＰＧＤ、ＴＫＴ、ＴＡＬＤＯ１、Ｇ６ＰＤ、ＧＰ１、ＳＬＣ１Ａ５、ＳＬＣ７Ａ５、ＯＧＤＨ、ＳＵＣＬＧ１、ＥＮＯ１、ＰＧＫ１、ＩＤＨ２、ＡＣＯ２、およびＦＢＰ１から選択される少なくとも５種のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルを決定する。特定の実施形態では、ＰＧＤ、ＴＫＴ、ＴＡＬＤＯ１、Ｇ６ＰＤ、ＧＰ１、ＳＬＣ１Ａ５、ＳＬＣ７Ａ５、ＯＧＤＨ、ＳＵＣＬＧ１、ＥＮＯ１、ＰＧＫ１、ＩＤＨ２、ＡＣＯ２、およびＦＢＰ１のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルを決定する。乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性を、ＲＮＡ転写物またはその発現産物と、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加との負または正の相関に基づいて予測する。ＥＮＯ１、ＩＤＨ２、ＴＭＳＢ１０、ＰＧＫ１、Ｇ６ＰＤ、ＰＧＤ、ＴＫＴ、ＴＡＬＤＯ１、ＧＰ１、ＳＬＣ１Ａ５、ＳＬＣ７Ａ５、ＯＧＤＨ、ＳＵＣＬＧ１、およびＡＣＯ２のレベルは全て、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加と負に相関するが、ＦＢＰ１のレベルは、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加と正に相関する。
【００１２】
上記の方法のいずれにおいても、乳癌の予後を予測するためにコードＲＮＡ転写物と非コードＲＮＡ転写物の組み合わせを利用することができる。さらに、上記の方法はいずれも、全トランスクリプトームシークエンシング、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、またはアレイによって実施することができる。当技術分野で公知の他の方法を用いることができる。本発明のある実施形態では、乳癌腫瘍試料は固定し蝋に包埋した組織試料または細針生検試料である。別の実施形態では、ＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベル、または非コード配列のレベルを正規化することができる。
【００１３】
本発明のある実施形態では、可能性スコア（例えば、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性を予測するスコア）を、コードＲＮＡ転写物またはその発現産物、および／または非コードＲＮＡ転写物のレベルまたは正規化されたレベルに基づいて算出することができる。スコアは、コードＲＮＡ転写物（もしくはその発現産物）および／または非コードＲＮＡ転写物のレベルまたは正規化されたレベル、ならびに乳癌の再発を伴わない長期生存などの臨床転帰に対するその寄与に基づいて重み付けした値を使用して算出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１は、乳癌患者１３６人におけるＲＮＡ発現の増加と乳癌の再発のリスクの関係を示すグラフである。各点は、別個のＲＮＡ配列を示す。効果量の大きさがコックス比例ハザード分析からのハザード比およびＰ値による統計的有意性によって示されている。図１Ａは、ＲＴ−ＰＣＲによって測定された１９２種の遺伝子の分析を示す。試験したＯｎｃｏｔｙｐｅ  Ｄｘ（登録商標）遺伝子が示されている。図１Ｂは、全トランスクリプトームシークエンシングによって測定した、構築されたＲｅｆＳｅｑ転写物の分析を示す。
【図１Ｂ】図１は、乳癌患者１３６人におけるＲＮＡ発現の増加と乳癌の再発のリスクの関係を示すグラフである。各点は、別個のＲＮＡ配列を示す。効果量の大きさがコックス比例ハザード分析からのハザード比およびＰ値による統計的有意性によって示されている。図１Ａは、ＲＴ−ＰＣＲによって測定された１９２種の遺伝子の分析を示す。試験したＯｎｃｏｔｙｐｅ  Ｄｘ（登録商標）遺伝子が示されている。図１Ｂは、全トランスクリプトームシークエンシングによって測定した、構築されたＲｅｆＳｅｑ転写物の分析を示す。
【００１５】
【図２−１】図２は、再発の状態によって層別化した乳癌患者におけるＲＮＡの正規化された発現値の箱型図である。各点は、患者の腫瘍を示す。箱の下部および上部は群内の点の２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイルであり、箱の中のバンドは群内の点の５０パーセンタイル（中央値）である。ひげの末端は、さらに低四分位数の１．５四分位範囲（ＩＱＲ）内に入る最低データ、およびさらに上四分位数の１．５ＩＱＲ内に入る最高データを示す。ＲＮＡ−Ｓｅｑからの値（左側のパネル）およびＲＴ−ＰＣＲからの値（右側のパネル）が示されている。図２Ａ：ＢＣＬ２；図２Ｂ：ＧＳＴＭ１；図２Ｃ：ＡＵＲＫＡ；図２Ｄ：ＭＫＩ６７。
【図２−２】図２は、再発の状態によって層別化した乳癌患者におけるＲＮＡの正規化された発現値の箱型図である。各点は、患者の腫瘍を示す。箱の下部および上部は群内の点の２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイルであり、箱の中のバンドは群内の点の５０パーセンタイル（中央値）である。ひげの末端は、さらに低四分位数の１．５四分位範囲（ＩＱＲ）内に入る最低データ、およびさらに上四分位数の１．５ＩＱＲ内に入る最高データを示す。ＲＮＡ−Ｓｅｑからの値（左側のパネル）およびＲＴ−ＰＣＲからの値（右側のパネル）が示されている。図２Ａ：ＢＣＬ２；図２Ｂ：ＧＳＴＭ１；図２Ｃ：ＡＵＲＫＡ；図２Ｄ：ＭＫＩ６７。
【００１６】
【図３】図３は、ＲＴ−ＰＣＲの結果（ｘ軸）とＲＮＡ−Ｓｅｑ（構築されたＲｅｆＳｅｑ）の結果（ｙ軸）を比較した、１９２種のＲＮＡ配列の乳癌の再発リスクハザード比の散布図である。各点は、別個のＲＮＡを示す。
【００１７】
【図４】図４は、公的に入手可能なマイクロアレイデータおよび本発明のＮＧＳ（「次世代シークエンシング」）データを使用して同定した遺伝子の比較を示す図である。図４Ａは、２つのプラットフォーム間で、予後判定的であると同定された遺伝子が実質的に一致することを示す（共通に１１，６５９種の遺伝子、オッズ比＝２．９９）。図４Ｂは、ＲＮＡ−Ｓｅｑ発現の下端では（平均カウント＜１０．２５種のＲＮＡ）、２つのプラットフォーム間での一致のレベルは統計的に有意ではないことを示す（共通に１６２０種の遺伝子、オッズ比＝０．８９）。
【００１８】
【図５】図５は、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ２．８を使用して生成した、１３０７種の同定された予後判定的ＲｅｆＳｅｑの間の遺伝子同時発現のネットワークを２Ｄ可視化した図である（ピアソン相関係数カットオフ≧０．６）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
本発明および本発明の特定の例示的な実施形態を記載する前に、本発明は記載されている特定の実施形態に限定されず、したがって当然変動し得ることが理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書において使用される用語法は特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定的なものではないことも理解される。
【００２０】
値の範囲が提供される場合、範囲の上限と下限の間の、文脈により明確に別段の規定がなされない限り下限の単位の１０分の１までの、間に入る値のそれぞれ、およびその明示された範囲内の任意の他の明示されたまたは間に入る値が本発明の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限と下限はそれぞれ独立に、同様に本発明に包含されるより小さな範囲に含まれてよく、明示された範囲の具体的に排除される限界に従う。明示された範囲が限界の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除く範囲も本発明に包含される。
【００２１】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、および「ｔｈｅ（その）」は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「ａｎ（１つの）ＲＮＡ転写物」への言及は、複数のそのようなＲＮＡ転写物を包含する。
【００２２】
別段の定義のない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第２版、Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ  １９９４年）により、本出願において使用される用語の多くについての一般的な手引きが当業者に提供される。
【００２３】
さらに、本発明の実施では、別段の指定のない限り、当技術分野の技術の範囲内に入る分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、および生化学の従来の技法を用いる。そのような技法は、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．  Ｇａｉｔ編、１９８４年）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７年）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、第４版（Ｄ．Ｍ．  Ｗｅｉｒ  ＆  Ｃ．Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、１９８７年）；「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．  Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．Ｐ．  Ｃａｌｏｓ、編、１９８７年）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年）；および「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」、（Ｍｕｌｌｉｓら、編、１９９４年）などの文献において十分に説明されている。
【００２４】
「癌」および「癌性」という用語は、一般に調節されていない細胞の成長を特徴とする、哺乳動物における生理的状態を指すまたは説明する。癌の例は乳癌である。
【００２５】
「同時発現」という用語は、本明細書で使用される場合、１つの配列の発現レベルと別の配列の発現レベルの間の統計学的な相関を指す。ペアワイズ同時発現は、当技術分野で公知のさまざまな方法によって、例えば、ピアソン相関係数またはスピアマン相関係数を算出することによって算出することができる。グラフ理論を用いて同時発現遺伝子派閥または遺伝子ネットワークを同定することもできる。同時発現の分析は、正規化されたデータを使用して算出することができる。
【００２６】
「相関する（ｃｏｒｒｅｌａｔｅ）」または「相関している（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｎｇ）」という用語は、２つの事象の例の間の統計学的関連を指し、事象は数字、データセットなどを含んでよい。例えば、事象が数字を伴う場合、正の相関（本明細書では「直接相関」とも称される）とは、一方が増加するにつれて他方も増加することを意味する。負の相関（本明細書では「逆相関」とも称される）とは、一方が増加するにつれて他方が減少することを意味する。本発明は、コードＲＮＡ転写物および非コードＲＮＡ転写物またはその発現産物を提供し、そのレベルは、特定の転帰の尺度と相関する。例えば、ＲＮＡ転写物のレベルと乳癌の再発を伴わない長期の生存の可能性など。例えば、ＲＮＡ転写物のレベルの上昇は、患者についての良好な臨床転帰の可能性、例えば、再発を伴わない長期生存の可能性および／または化学療法に対する陽性反応の増加などと正に相関し得る。そのような正の相関は、種々のやり方で、例えば、ハザード比が低いことによって統計学的に実証することができる。別の例では、ＲＮＡ転写物のレベルの上昇は、患者についての良好な臨床転帰の可能性と負に相関し得る。この場合、例えば、患者の癌の再発を伴わない長期生存の可能性および／または化学療法に対する陽性反応などは減少する。そのような負の相関により、患者が予後不良を有するまたは化学療法に対する応答が不十分になる可能性が示され、また、これは、種々のやり方で、例えばハザード比が高いことによって統計学的に実証することができる。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「エクソン」という用語は、成熟ＲＮＡ産物において表される任意の分断された遺伝子のセグメントを指す（Ｂ．  Ｌｅｗｉｎ．  Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｍａｓｓ、１９９０年）。本明細書で使用される場合、「イントロン」および「イントロン配列」という用語は、遺伝子内に見いだされる任意の非コード領域を指す。
【００２８】
「発現産物」という用語は、本明細書で使用される場合、コードＲＮＡ転写物の発現産物を指す。したがって、この用語は、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「遺伝子間領域」とは、少数の遺伝子を含有するまたは遺伝子を含有しない遺伝子のクラスター間に位置するＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列のひと続きを指す。遺伝子間領域は、遺伝子内のエクソンの間に見いだされる非コード領域である遺伝子内領域（または「イントロン」）とは異なる。遺伝子間領域は、１つまたは複数の「遺伝子間配列」で構成されていてよい。下の実施例において示されているように、６９種の遺伝子間領域が、乳癌の再発を伴わない長期生存と相関することが見いだされ、各遺伝子間領域は、１種または複数種の遺伝子間配列を含む。遺伝子間配列は公的に入手可能な情報から容易に入手可能である。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙにおいて利用可能なＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒにより、表４および表５に示されている染色体番号および染色体上の開始／停止位置などの座標を入力して、その配列を含む出力を生じさせることが可能になる。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「長い遺伝子間非コードＲＮＡ」および「ｌｉｎｃＲＮＡ」という用語は、互換的に使用され、一般には２００ヌクレオチドよりも長い非コード転写物を指す。下の実施例において示されているように、２２のｌｉｎｃＲＮＡが乳癌の再発を伴わない長期生存と相関することが見いだされた。これらのｌｉｎｃＲＮＡの座標は公的に入手可能であり、表４にも列挙されている。ｌｉｎｃＲＮＡの配列は、上記のＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒなどの、公的に入手可能な情報から得ることもできる。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「レベル」という用語は、本明細書で使用される場合、コードＲＮＡ転写物もしくは非コードＲＮＡ転写物またはポリペプチド／タンパク質のコピーの数の定性的または定量的な決定を指す。ＲＮＡ転写物またはポリペプチド／タンパク質は、ＲＮＡ転写物またはポリペプチド／タンパク質のレベルが、第１の試料、例えば、臨床的に関連性のある患者の亜集団（例えば、癌の再発を経験した患者）などにおいて、第２の試料、例えば、関連する亜集団（例えば、癌の再発を経験しなかった患者）などにおけるものよりも高い場合、「レベルの上昇」を示す。個々の患者から得た腫瘍試料におけるＲＮＡ転写物またはポリペプチド／タンパク質のレベルの分析に関しては、ＲＮＡ転写物またはポリペプチド／タンパク質は、対象におけるＲＮＡ転写物またはポリペプチド／タンパク質のレベルが、臨床的に関連性のある患者の亜集団のレベル特性に傾くまたはより密接に近づく場合、「レベルの上昇」を示す。
【００３２】
したがって、例えば、分析したＲＮＡ転写物が、癌の再発を伴わない長期生存を経験した対象において癌の再発を伴わない長期生存を経験しなかった対象と比較してレベルが上昇するＲＮＡ転写物である場合には、所与のＲＮＡ転写物のレベルの「上昇」は癌の再発を伴わない長期生存の可能性と正に相関すると説明することができる。評価されている個々の患者におけるＲＮＡ転写物のレベルが癌の再発を伴わない長期生存を経験した対象のレベル特性に傾いている場合、ＲＮＡ転写物のレベルにより、個々の患者が癌の再発を伴わない長期生存を経験する可能性がより高いという決定が裏付けられる。個々の患者におけるＲＮＡ転写物のレベルが癌の再発を経験した対象のレベル特性に傾いている場合には、ＲＮＡ転写物のレベルにより、個々の患者が癌の再発を経験する可能性がより高いという決定が裏付けられる。
【００３３】
「可能性スコア」という用語は、より複雑な定量的情報、例えば、開示されているＲＮＡ転写物、それらの発現産物、または遺伝子ネットワークの特定のレベルと乳癌患者におけるある特定の臨床転帰の可能性、例えば、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性などとの相関などの分析を単純化または開示または通知することを補助するための、算術的または数学的に算出した数値である。可能性スコアは、特定のアルゴリズムを適用することによって決定することができる。可能性スコアを算出するために使用するアルゴリズムにより、ＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物を遺伝子ネットワークに群分けすることができる。可能性スコアは、遺伝子ネットワークについて、１種または複数種のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルを決定し、再発などのある特定の臨床転帰に対するそれらの寄与に重み付けすることによって決定することができる。可能性スコアは、患者について決定することもできる。ある実施形態では、可能性スコアは再発スコアであり、再発スコアの増加は乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加と負に相関する。言い換えれば、再発スコアの増加は予後が悪いことと相関する。可能性スコアまたは再発スコアを決定するための方法の例は、米国特許第７，５２６，３８７号に開示されている。
【００３４】
「長期」生存という用語は、本明細書で使用される場合、少なくとも３年にわたって生存することを指す。他の実施形態では、この用語は、外科手術または他の治療の後、少なくとも５年、または少なくとも１０年にわたって生存することを指す場合がある。
【００３５】
本明細書で使用される場合、コードＲＮＡ転写物もしくは非コードＲＮＡ転写物またはコードＲＮＡ転写物の発現産物に関する「正規化された」という用語は、ＲＮＡ転写物またはその発現産物の、参照ＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物のセットの転写物／産物の平均レベルと相対的なレベルを指す。参照ＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物は、患者、組織、または治療にわたるそれらの変動が最小であることに基づく。あるいは、コードＲＮＡ転写物もしくは非コードＲＮＡ転写物またはその発現産物は、試験したＲＮＡ転写物またはそのような試験したＲＮＡ転写物のサブセットの全体に対して正規化することができる。
【００３６】
本明細書で使用される場合、癌の「病理」という用語は、患者のウェルビーイングを含む全ての現象を包含する。この用語は、これだけに限定することなく、異常なまたは制御できない細胞の成長、転移、隣接する細胞の正常な機能への干渉、サイトカインまたは他の分泌性産物の異常なレベルでの放出、炎症性応答または免疫学的応答の抑制または増悪、新形成、前悪性、悪性腫瘍、周囲または遠位の組織または器官、例えば、リンパ節などへの浸潤を包含する。
【００３７】
「患者の応答」は、これだけに限定することなく、（１）腫瘍の成長に対する、減速および完全な成長停止を含めた、いくらかの程度の阻害、（２）腫瘍細胞の数の減少、（３）腫瘍サイズの低下、（４）近接する末梢器官および／または組織への腫瘍細胞の浸潤の阻害（すなわち、低下、減速または完全な停止）、（５）転移の阻害（すなわち、低下、減速または完全な停止）、（６）抗腫瘍免疫応答の増強、但し腫瘍の退縮または拒絶はもたらされなくてもよい（７）癌に付随する１つまたは複数の症状の、いくらかの程度までの軽減、（８）治療後の生存の長さの増加、および／または（９）治療後の所与の時点における死亡率の低下を含めた、患者への利益を示す任意のエンドポイントを使用して評価することができる。
【００３８】
「予後判定」という用語は、本明細書で使用される場合、乳癌などの新生物疾患の再発、転移性の拡散、および薬物抵抗性を含めた、癌に起因し得る死亡または進行の可能性を予測することを指す。「予測」という用語は、本明細書では、患者が薬物または薬物のセットに対して好都合にまたは不都合に応答する可能性、同様にその応答の程度、または患者が、原発腫瘍の外科的除去および／または化学療法後に特定の期間にわたって癌の再発を伴わずに生存する可能性を指すために使用される。本発明の方法は、任意の特定の患者に対する最も適切な治療モダリティを選択することによって治療の決定を行うために臨床的に用いることができる。本発明の方法は、患者が、治療レジメン、例えば、外科的介入、所与の薬物もしくは薬物の組み合わせを用いた化学療法、および／または放射線療法などに対して好都合に応答する可能性があるかどうか、または、患者が外科手術および／または化学療法または他の治療モダリティの終了後に癌の再発を伴わずに長期生存する可能性があるかどうかを予測するツールである。
【００３９】
「乳癌の予後判定バイオマーカー」という用語は、本明細書に開示されている、乳癌の再発を伴わない長期の生存に関連することが見いだされたＲＮＡ転写物もしくはその発現産物、イントロンＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、遺伝子間配列、および／または遺伝子間領域を指す。
【００４０】
「参照」ＲＮＡ転写物またはその発現産物という用語は、本明細書で使用される場合、そのレベルを試験試料中のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルと比較するために用いることができるＲＮＡ転写物またはその発現産物を指す。本発明のある実施形態では、参照ＲＮＡ転写物としては、ベータ−グロビン、アルコールデヒドロゲナーゼなどのハウスキーピング遺伝子、または、任意の他のＲＮＡ転写物が挙げられ、そのレベルもしくは発現は、ＲＮＡ転写物もしくはその発現産物を含有する細胞の疾患の状態に応じて変動しない。別の実施形態では、アッセイされるＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物、またはそのサブセットは全て、参照ＲＮＡ転写物または参照ＲＮＡ発現産物としての機能を果たし得る。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「ＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡ」という用語は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）によって築かれた公的に入手可能なヌクレオチド配列およびそれらのタンパク質産物の集合であるＲｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＲｅｆＳｅｑ）データベースにおいて見いだすことができるＲＮＡを指す。ＲｅｆＳｅｑデータベースにより、データベースに含まれる天然の生体分子（すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質）のそれぞれについてアノテートされた非冗長性の記録が提供される。したがって、ＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡの配列は周知であり、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＲｅｆＳｅｑ／のＲｅｆＳｅｑデータベースにおいて見いだすことができる。Ｐｒｕｉｔｔら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３３巻（補遺１）：Ｄ５０１〜Ｄ５０４頁（２００５年）も参照されたい。各ＲｅｆＳｅｑについての、任意の代替のスプライス型についての受託番号を含む受託番号は表１および表２ならびに表Ｂにおいて提供される。ＲｅｆＳｅｑのイントロン配列も公的に入手可能である。それでもなお、表３に列挙されている各イントロン配列についての座標が表Ａにおいて提供される。したがって、表１〜３および表１５にある各ＲＮＡ配列の配列は公的に利用可能な供給源から容易に入手可能である。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ転写物」という用語は、ＤＮＡのＲＮＡ転写産物を指し、コードＲＮＡ転写物および非コードＲＮＡ転写物を包含する。ＲＮＡ転写物としては、例えば、ｍＲＮＡ、スプライシングされていないＲＮＡ、スプライス変異体ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、断片化ＲＮＡ、長い遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、遺伝子間ＲＮＡ配列または領域、およびイントロンＲＮＡが挙げられる。
【００４３】
「対象」、「個体」、および「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、治療について評価されており、かつ／または治療されている哺乳動物を指す。ある実施形態では、哺乳動物はヒトである。したがって、「対象」、「個体」、および「患者」という用語は、癌性組織を除去するための切除（外科手術）を受けた、またはその候補である個体を含めた、癌（例えば、乳癌）を有する個体を包含する。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「外科手術」という用語は、乳房切除術、乳腺腫瘤摘出術、リンパ節除去、センチネルリンパ節郭清、予防的乳房切除術、予防的卵巣除去、寒冷療法、および腫瘍生検を含めた、癌性組織を除去するために行われる外科的方法に当てはまる。本発明の方法のために使用する腫瘍試料は、これらの方法のいずれから得たものであってもよい。
【００４５】
「腫瘍」という用語は、本明細書で使用される場合、悪性であろうと良性であろうと腫瘍性の細胞の成長および増殖の全て、ならびに前癌性の細胞および組織および癌性の細胞および組織を指す。
【００４６】
「腫瘍試料」という用語は、本明細書で使用される場合、癌患者から得た腫瘍材料を含む試料を指す。この用語は、腫瘍組織試料、例えば、外科的切除によって得られた組織、および例えばコア生検または細針生検などの生検によって得られた組織を包含する。特定の実施形態では、腫瘍試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料などの固定し蝋に包埋した組織試料である。さらに、「腫瘍試料」という用語は、原発腫瘍以外の部位から得た腫瘍細胞、例えば、循環性腫瘍細胞を含む試料を包含する。この用語は、患者の腫瘍細胞の後代である細胞、例えば、原発腫瘍細胞または循環性腫瘍細胞に由来する細胞培養試料も包含する。この用語は、さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞から脱落したタンパク質または核酸材料、例えば、骨髄、血液、血漿、血清などを含み得る試料を包含する。この用語は、調達後に腫瘍細胞を富化させた、または他の操作をした試料、ならびに患者の腫瘍材料から得たポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを含む試料も包含する。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「全トランスクリプトームシークエンシング」とは、試料のＲＮＡ含有量に関する情報を得るために、ハイスループットなシークエンシング技術を用いてトランスクリプトーム全体をシークエンシングすることを指す。全トランスクリプトームシークエンシングは、種々のプラットフォーム、例えば、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）およびＳＯＬｉＤ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｈｅｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて行うことができる。しかし、全トランスクリプトームシークエンシングのために有用な任意のプラットフォームを使用することができる。
【００４８】
「ＲＮＡ−Ｓｅｑ」または「トランスクリプトームシークエンシング」という用語は、ＤＮＡの代わりにＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）に対して実施されるシークエンシングを指し、一般には、主要な目標は、発現レベルを測定すること、融合転写物、代替のスプライシング、およびＲＮＡからより良く評価することができる他のゲノムの変更を検出することである。ＲＮＡ−Ｓｅｑは、全トランスクリプトームシークエンシングならびに標的特異的シークエンシングを含む。
【００４９】
「コンピュータに基づく系」という用語は、本明細書で使用される場合、情報を分析するために使用するハードウェア手段、ソフトウェア手段、およびデータ記憶手段を指す。患者のコンピュータに基づく系の最小のハードウェアは、中央処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段、およびデータ記憶手段を含む。当業者は、現在利用可能なコンピュータに基づく系の多くは本発明において使用するために適しており、本発明の特定の測定機能および／または算出機能を実施するためにプログラムすることができることを容易に理解することができる。
【００５０】
コンピュータ可読媒体上のデータ、プログラミング情報または他の情報を「記録」するとは、当技術分野で公知の任意のそのような方法を用いて情報を記憶させるプロセスを指す。任意の都合のよいデータ記憶構造は、記憶された情報にアクセスするために使用される手段に基づいて選択することができる。記憶には、種々のデータプロセッサプログラムおよびフォーマット、例えば、ワードプロセッシングテキストファイル、データベースフォーマットなどを使用することができる。
【００５１】
「プロセッサ」または「演算手段」とは、必要な機能を実施する任意のハードウェアおよび／またはソフトウェアの組み合わせを参照する。例えば、本明細書における任意のプロセッサは、電子制御器、メインフレーム、サーバーまたはパーソナルコンピュータ（デスクトップまたは携帯型）の形態で利用可能なものなどのプログラム可能なデジタルのマイクロプロセッサであってよい。プロセッサがプログラム可能である場合、適切なプログラミングは、離れた場所からプロセッサに通信することもでき、コンピュータプログラム製品（例えば、磁気デバイス、光学的デバイスまたは固体デバイスのいずれに基づくものであっても、携帯型または固定型コンピュータ可読記憶媒体）に予め保存されていてもよい。例えば、磁気媒体または光ディスクにプログラミングが保持されていてよく、その対応する端末において各プロセッサと通信する適切なリーダーによって読み取ることができる。
【００５２】
本発明は、乳癌に対して予後判定的であるＲＮＡ転写物を提供する。これらのＲＮＡ転写物は表１〜５および表１５に列挙されており、コードＲＮＡ転写物および非コードＲＮＡ転写物を含む。表１のＲＮＡ転写物のサブセットは、それらの公知の機能に応じて遺伝子ネットワークにさらに群分けすることができる。例えば、遺伝子ネットワークとしては、細胞周期ネットワーク、ＥＳＲ１ネットワーク、Ｃｈｒ９ｑ２２ネットワーク、Ｃｈｒ１７ｑ２３−２４ネットワーク、Ｃｈｒ８ｑ２１−２４ネットワーク、嗅覚受容体ネットワーク、および代謝様ネットワークを挙げることができる。細胞周期ネットワークは、表６に列挙されている遺伝子を含む。ＥＳＲ１ネットワークは、表７に示されているように、ＢＣＬ２、ＳＣＵＢＥ２、ＣＰＥＢ２、ＩＬ６ＳＴ、ＤＮＡＬＩ１、ＰＧＲ、ＳＬＣ７Ａ８、Ｃ６ｏｒｆ９７、ＲＳＰＨ１、ＥＶＬ、ＢＣＬ２、ＮＸＮＬ２、ＧＡＴＡ３、ＧＦＲＡ１、ＧＦＲＡ１、ＺＮＦ７４０、ＭＫＬ２、ＡＦＦ３、ＥＲＢＢ４、ＲＡＢＥＰ１、ＫＤＭ４Ｂ、ＥＳＲ１、Ｃ４ｏｒｆ３２、およびＣＰＬＸ１を含む。Ｃｈｒ９ｑ２２ネットワークは、表８に示されているように、ＡＳＰＮ、ＣＥＮＰＰ、ＥＣＭ２、ＯＧＮ、およびＯＭＤを含む。Ｃｈｒ１７ｑ２３−２４ネットワークは、表９に示されているように、ＣＣＤＣ４５、ＰＯＬＧ２、ＳＭＵＲＦ２、ＣＣＤＣ４７、ＣＬＴＣ、ＤＣＡＦ７、ＤＤＸ４２、ＦＴＳＪ３、ＰＳＭＣ５、ＲＰＳ６ＫＢ１、ＳＭＡＲＣＤ２、およびＴＥＸ２を含む。Ｃｈｒ８ｑ２１−２４ネットワークは、表１０に示されているように、ＣＹＣ１、ＤＧＡＴ１、ＧＰＡＡ１、ＧＲＩＮＡ、ＰＵＦ６０、ＰＹＣＲＬ、ＲＰＬ８、ＳＱＬＥ、ＴＳＴＡ３、ＥＳＲＰ１、ＧＲＨＬ２、ＩＮＴＳ８、ＭＴＤＨ、およびＵＱＣＲＢを含む。嗅覚受容体ネットワークは、表１１に列挙されている１３４種の遺伝子を含む。ＯＲ１０Ｈ３、ＯＲ１４Ｊ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ２Ｗ５、ＯＲ５Ｔ２、ＯＲ７Ｅ２４、ＯＲ７Ｇ３、ＯＲ８Ｓ１、およびＯＲ９Ｋ２は嗅覚受容体をコードし、ＭＩＲ１２０８、ＭＩＲ１２６６、ＭＩＲ１２９７、ＭＩＲ１３３Ａ１、ＭＩＲ１９５、ＭＩＲ１９６Ａ１、ＭＩＲ３１７０、ＭＩＲ３１８３、ＭＩＲ４２６７、ＭＩＲ４２７５、ＭＩＲ４３１８、ＭＩＲ５０１、ＭＩＲ５０１、ＭＩＲ５３９、およびＭＩＲ５４２はマイクロＲＮＡ前駆体である。代謝様ネットワークは、ＥＮＯ１、ＩＤＨ２、ＴＭＳＢ１０、ＰＧＫ１、およびＧ６ＰＤの５種の遺伝子のセットを含む、またはＰＧＤ、ＴＫＴ、ＴＡＬＤＯ１、Ｇ６ＰＤ、ＧＰ１、ＳＬＣ１Ａ５、ＳＬＣ７Ａ５、ＯＧＤＨ、ＳＵＣＬＧ１、ＥＮＯ１、ＰＧＫ１、ＩＤＨ２、ＡＣＯ２、およびＦＢＰ１の１４種の遺伝子のセットを含む。ＲＮＡ転写物またはその発現産物は、表１〜５および表１５においてＲＮＡ転写物の関連性の方向が１と記されている場合には、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加と負に相関し、表１〜５および表１５においてＲＮＡ転写物の関連性の方向が−１と記されている場合には、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加と正に相関する。遺伝子ネットワーク内で同時発現するＲＮＡ転写物は同じ遺伝子ネットワーク内の他のＲＮＡ転写物で置換することができる。
【００５３】
本発明は、ＲＮＡ転写物および関連する情報を利用する方法を提供する。例えば、本発明は、乳癌患者が乳癌の再発を伴わない長期生存を示す可能性を予測する方法を提供する。本発明の方法は、腫瘍試料における少なくとも１種のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルを決定するステップと、ＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルと、乳癌の再発を伴わない長期生存との相関に基づいて乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性を決定するステップとを含む。
【００５４】
本発明の全ての態様について、この方法は、少なくとも２種のＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物のレベルを決定するステップをさらに含んでよい。さらに、本発明の方法は、少なくとも３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、または少なくとも１５種のＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物のレベルを決定するステップをさらに含んでよいことが意図されている。例えば、ＥＮＯ１、ＩＤＨ２、ＴＭＳＢ１０、ＰＧＫ１、およびＧ６ＰＤから選択される少なくとも３種のＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物のレベルを決定することができる。別の態様では、ＥＮＯ１、ＩＤＨ２、ＴＭＳＢ１０、ＰＧＫ１、およびＧ６ＰＤの５種全てのＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物のレベルを決定することができる。別の例では、ＰＧＤ、ＴＫＴ、ＴＡＬＤＯ１、Ｇ６ＰＤ、ＧＰ１、ＳＬＣ１Ａ５、ＳＬＣ７Ａ５、ＯＧＤＨ、ＳＵＣＬＧ１、ＥＮＯ１、ＰＧＫ１、ＩＤＨ２、ＡＣＯ２、およびＦＢＰ１から選択される少なくとも５種のＲＮＡ転写物またはその発現産物を決定することができる。さらに別の例では、ＰＧＤ、ＴＫＴ、ＴＡＬＤＯ１、Ｇ６ＰＤ、ＧＰ１、ＳＬＣ１Ａ５、ＳＬＣ７Ａ５、ＯＧＤＨ、ＳＵＣＬＧ１、ＥＮＯ１、ＰＧＫ１、ＩＤＨ２、ＡＣＯ２、およびＦＢＰ１の１４種全てのレベルを決定することができる。本明細書に記載の方法のいずれにおいても、コードＲＮＡ転写物および非コードＲＮＡ転写物を組み合わせることができる。
【００５５】
本発明によって提供されるＲＮＡ転写物および関連する情報は、癌を治療するための療法の開発および臨床試験に含める患者のスクリーニングにおいても有用である。ＲＮＡ転写物および関連する情報は、さらに、ＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルまたは活性を調整する試薬を設計または作製するためにも使用することができる。そのような試薬としては、これだけに限定されないが、薬物、アンチセンスＲＮＡ、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ）、リボザイム、小分子、モノクローナル抗体、およびポリクローナル抗体を挙げることができる。
【００５６】
本発明の方法の種々の実施形態では、これだけに限定することなく、以下により詳細に記載されている全トランスクリプトームシークエンシング、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、および遺伝子発現の逐次分析法（Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＳＡＧＥ）を含めた、ＲＮＡ転写物のレベルを決定するための種々の科学技術的手法が利用可能である。
ＲＮＡ転写物または発現産物と臨床転帰との相関レベル
【００５７】
当業者は、対象の転帰（例えば、生存の可能性）と本明細書に記載のＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物のレベルとの間に相関があるかどうかを決定するために用いることができる多くの統計学的な方法が存在することを理解されよう。この関係を連続的な再発スコア（ＲＳ）として示すことができる、または患者をリスク群（例えば、低、中、高）に層別化することができる。例えば、コックス比例ハザード回帰モデルを特定の臨床エンドポイント（例えば、ＲＦＩ、ＤＦＳ、ＯＳ）に当てはめることができる。コックス比例ハザード回帰モデルの１つの仮定は、比例ハザード仮定、すなわち、効果パラメータにより、基礎をなすハザードが増すという仮定である。これだけに限定されないが、マルチンゲール残差（ｍａｒｔｉｎｇａｌｅ  ｒｅｓｉｄｕａｌ）の累積和の考察を含めた、モデルの妥当性の評価を実施することができる。当業者は、ハザードスケールおよびワイブル分布を使用し、対数累積ハザード関数の自然スプライン平滑化を伴い、治療（化学療法または観察）に対する効果およびＲＳを時間依存的にさせて、柔軟なパラメトリックモデルに当てはめるために用いることができる多数の統計学的な方法が存在することを理解されよう（例えば、ＲｏｙｓｔｏｎおよびＰａｒｍｅｒ（２００２年）、平滑化スプラインなど）（例えば、Ｐ．  Ｒｏｙｓｔｏｎ、Ｍ．  Ｐａｒｍｅｒ、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１巻（１５号：２１７５〜２１９７頁（２００２年）を参照されたい）。
【００５８】
例示的な実施形態では、Ｆ．  ＨｓｉｅｈおよびＰ．  Ｌａｖｏｒｉ、Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｔｒｉａｌｓ  ２１巻：５５２〜５６０頁（２０００年）によって提唱された方法をＰＡＳＳ２００８において実行された通り用いて、単一の非バイナリ共変量を用いたコックス比例ハザードモデルについて検出力計算を行う。
【００５９】
記載されている方法のいずれかにより、ＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物のレベルを群分けすることができる。ＲＮＡ転写物または発現産物の群分けは、本明細書に記載の遺伝子ネットワークにおけるものなどの生理機能または構成細胞特性に従ったＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物の寄与に関する知見に少なくとも部分的に基づいて実施することができる。さらに、群の形成により、種々の発現レベルの再発／可能性スコアに対する寄与の数学的重み付けを容易にすることができる。生理的プロセスまたは構成細胞特性を示す遺伝子ネットワークに重み付けすることにより、そのプロセスまたは特性の癌の病理および臨床転帰に対する寄与を反映することができる。したがって、本発明は、本明細書に開示されている方法において使用するための、本明細書において同定されるＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物の遺伝子ネットワークを提供する。
【００６０】
本発明のコードＲＮＡ転写物および非コードＲＮＡ転写物、ならびに任意のその発現産物は表１〜５および表１５に列挙されている。本発明のある実施形態では、表１および表１５に列挙されている１種または複数種のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルは、表１および表１５においてＲＮＡ転写物の関連性の方向が１と記されている場合には、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加と負に相関し、表１および表１５においてＲＮＡ転写物の関連性の方向が−１と記されている場合には、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加と正に相関する。
【００６１】
本発明の別の実施形態では、表２に列挙されている１種または複数種のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルは、表２においてＲＮＡ転写物の関連性の方向が１と記されている場合には、ＥＲ陽性乳癌患者における、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加と負に相関し、表２においてＲＮＡ転写物の関連性の方向が−１と記されている場合には、ＥＲ陽性乳癌患者における、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加と正に相関する。
【００６２】
本発明の別の実施形態では、表３から選択されるイントロンＲＮＡのレベルは、表３においてイントロンＲＮＡの関連性の方向が１と記されている場合には、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加と負に相関し、表３においてイントロンＲＮＡの関連性の方向が−１と記されている場合には、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加と正に相関する。
【００６３】
特定の実施形態では、表４から選択される１つまたは複数の長い遺伝子間非コード領域（ｌｉｎｃＲＮＡ）のレベルは、表４においてｌｉｎｃＲＮＡの関連性の方向が１と記されている場合には、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加と負に相関し、表４においてｌｉｎｃＲＮＡの関連性の方向が−１と記されている場合には、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加と正に相関する。
【００６４】
別の実施形態では、表５に列挙されている遺伝子間領域１〜６９から選択される１種または複数種の遺伝子間配列または遺伝子間領域のレベルは、表５において遺伝子間配列または遺伝子間領域の関連性の方向が１と記されている場合には、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加と負に相関し、表５において遺伝子間配列または遺伝子間領域の関連性の方向が−１と記されている場合には、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性の増加と正に相関する。
【００６５】
さらに別の実施形態では、乳癌患者におけるある特定の臨床転帰の可能性、例えば、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性などを評価するための可能性スコアを決定する。可能性スコアは、表１〜５および表１５から選択される１種または複数種のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルを決定し、臨床転帰に対するその寄与を数学的に重み付けすることによって算出することができる。特定の実施形態では、細胞周期ネットワーク、ＥＳＲ１ネットワーク、Ｃｈｒ９ｑ２２ネットワーク、Ｃｈｒ１７ｑ２３−２４ネットワーク、Ｃｈｒ８ｑ２１−２４ネットワーク、嗅覚受容体ネットワーク、および代謝様ネットワークから選択される遺伝子ネットワークについての可能性スコアを、遺伝子ネットワーク内の１種または複数種のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルを決定することによって決定する。１種または複数種のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルを、再発などのある特定の臨床転帰に対する寄与によって重み付けすることができる。可能性スコアは、遺伝子ネットワークについて、遺伝子ネットワーク内の１種または複数種のＲＮＡ転写物またはその発現産物の可能性スコアに基づいて決定することもできる。別の実施形態では、可能性スコアを、患者について、１種または複数種のＲＮＡ転写物またはその発現産物の可能性スコア、および／または１種または複数種の遺伝子ネットワークの可能性スコアに基づいて決定することができる。
乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性を予測するための方法
【００６６】
上記の通り、乳癌の予後と相関するいくつものコードＲＮＡ転写物および非コードＲＮＡ転写物が同定された。これらのＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物のレベルを、乳癌を有し、治療が検討されている個々の患者から得た腫瘍試料において決定することができる。評価の転帰に応じて、化学療法を用いた治療が示される可能性もあり、代替の治療レジメンが示される可能性もある。
【００６７】
本発明の方法の実行では、腫瘍試料をＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルについてアッセイまたは測定する。腫瘍試料は、固形腫瘍から、例えば、生検によって、または腫瘍を除去するために行われる外科手技から、または癌細胞を含有する組織または体液から得ることができる。本発明のある実施形態では、腫瘍試料は、ＥＲ陽性乳癌などの乳癌の患者から得られる。別の実施形態では、ＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルを、１つまたは複数の参照ＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルに対して正規化する。
【００６８】
本発明のある実施形態では、個々の患者における、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性を、個々の患者由来の腫瘍試料におけるＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルまたは正規化されたレベルと、臨床的に関連性のある患者の亜集団におけるＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルまたは正規化されたレベルとを直接または間接的に比較することによって予測する。したがって、上記の通り、分析されるＲＮＡ転写物またはその発現産物が、乳癌の再発を伴わない長期生存を経験した対象において、乳癌の再発を経験した対象と比較してレベルが上昇するＲＮＡ転写物または発現産物であり、評価されている個々の患者におけるＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルが乳癌の再発を伴わずに長期生存している対象のレベル特性に傾いている場合、ＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルにより、個々の患者が乳癌の再発を伴わない長期生存を経験する可能性がより高いという決定が裏付けられる。同様に、分析されるＲＮＡ転写物またはその発現産物が、乳癌の再発を経験した対象において、乳癌の再発を伴わない長期生存を経験した対象と比較して増加するＲＮＡ転写物または発現産物であり、評価されている個々の患者のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルが、乳癌が再発した対象のレベル特性に傾いている場合、ＲＮＡ転写物または発現産物のレベルにより、個々の患者が乳癌の再発を経験する可能性が高いという決定が裏付けられる。したがって、所与のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルは乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性と正に相関する、または乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性と負に相関すると説明することができる。
【００６９】
個々の患者由来のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルまたは正規化されたレベルを、臨床的に関連性のある患者の亜集団におけるＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルまたは正規化されたレベルと直接または間接的に比較することができることが理解される。例えば、間接的に比較する場合、個々の患者由来のＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルまたは正規化されたレベルを用いて、乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性、例えば上記の可能性／再発スコア（ＲＳ）などを算出し、臨床的に関連性のある患者の亜集団における算出スコアと比較することができる。
ＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物のレベルをアッセイする方法
【００７０】
発現プロファイリングの方法としては、ポリヌクレオチドのシークエンシングに基づく方法、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づく方法、およびプロテオミクスに基づく方法が挙げられる。シークエンシングに基づく分析についての代表的な方法としては、大規模並列シークエンシング（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（例えば、Ｔｕｃｋｅｒら、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊ．  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５巻：１４２〜１５４頁、２００９年を参照されたい）および遺伝子発現の逐次分析法（Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＳＡＧＥ）が挙げられる。試料中のｍＲＮＡの発現を数量化するための当技術分野で公知の典型的な方法としては、ノーザンブロット法およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｐａｒｋｅｒ  ＆  Ｂａｒｎｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０６巻：２４７〜２８３頁（１９９９年））；ＲＮＡ分解酵素保護アッセイ（Ｈｏｄ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３巻：８５２〜８５４頁（１９９２年））；ならびに逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）などのＰＣＲに基づく方法（Ｗｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８巻：２６３〜２６４頁（１９９２年））が挙げられる。ＤＮＡ２重鎖、ＲＮＡ２重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド２重鎖またはＤＮＡ−タンパク質２重鎖を含めた配列特異的な２重鎖を認識することができる抗体を用いることができる。
核酸シークエンシングに基づく方法
【００７１】
核酸シークエンシング技術は発現分析のために適した方法である。これらの方法の基礎をなす原理は、試料においてｃＤＮＡ配列が検出される回数はその配列に対応する相対的なＲＮＡレベルに直接関連するというものである。これらの方法は、時には、生じたデータの別個の数値的性質を反映させるためにデジタル遺伝子発現（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＤＧＥ）という用語で称される。この原理が適用された初期の方法は、遺伝子発現の逐次分析法（Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＳＡＧＥ）および大規模並列サインシークエンシング（ＭＰＳＳ）であった。例えば、Ｓ．  Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８巻（６号）：６３０〜６３４頁（２０００年）を参照されたい。
【００７２】
つい最近、「次世代」シークエンシング技術の出現により、ＤＧＥがより単純、より高処理量、かつより手頃なものになった。結果として、より多くの研究室でＤＧＥを利用して、以前可能であったものよりも多くの個々の患者試料において多くの核酸の発現をスクリーニングすることが可能になった。例えば、Ｊ．  Ｍａｒｉｏｎｉ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８巻（９号）：１５０９〜１５１７頁（２００８年）；Ｒ．  Ｍｏｒｉｎ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８巻（４号）：６１０〜６２１頁（２００８年）；Ａ．  Ｍｏｒｔａｚａｖｉ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５巻（７号）：６２１〜６２８頁（２００８年）；Ｎ．  Ｃｌｏｏｎａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５巻（７号）：６１３〜６１９頁（２００８年）を参照されたい。大規模並列シークエンシング法により、全ゲノムシークエンシングまたは全トランスクリプトームシークエンシングも可能になり、これにより、コード配列だけでなく非コード配列も分析することが可能になった。Ｔｕｃｋｅｒら、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊ．  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５巻：１４２〜１５４頁（２００９年）に概説されている通り、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＩＩｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＯＬｉＤ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｒｏｃｈｅ  ＧＳ−ＦＬＸ４５４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびＨｅｌｉｃｏｓ（登録商標）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）などの大規模並列シークエンシングプラットフォームがいくつか市販されている。他の開発技術を使用することができる。
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
【００７３】
出発材料は、一般には、ヒト腫瘍から、通常は原発腫瘍から単離した全ＲＮＡである。場合によって、同じ患者由来の正常組織を内部対照として使用することができる。ＲＮＡは、組織試料から、例えば、新鮮試料、凍結（例えば、新鮮凍結）試料、またはパラフィン包埋固定（例えば、ホルマリン固定）試料から抽出することができる。
【００７４】
ＲＮＡ抽出のための一般的な方法は当技術分野で周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７年）を含めた分子生物学の標準の教本に開示されている。パラフィン包埋組織からＲＮＡを抽出するための方法は、例えば、ＲｕｐｐおよびＬｏｃｋｅｒ、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ５６巻：Ａ６７頁（１９８７年）、およびＤｅ  Ａｎｄｒｅｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８巻：４２０４４頁（１９９５年）において開示されている。具体的には、ＲＮＡ単離は、Ｑｉａｇｅｎなどの商業的製造者からの精製キット、緩衝液セットおよびプロテアーゼを製造者の説明書に従って使用して実施することができる。例えば、培養物中の細胞由来の全ＲＮＡはＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニカラムを使用して単離することができる。他の市販のＲＮＡ単離キットとしては、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、およびＰａｒａｆｆｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。組織試料由来の全ＲＮＡは、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を使用して単離することができる。腫瘍試料から調製したＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって単離することができる。次いで、米国特許出願公開第２０１１／０１１１４０９号に記載の通り、単離されたＲＮＡからリボソームＲＮＡを枯渇させることができる。
【００７５】
次いで、ＲＮＡを含有する試料を逆転写に供して、ＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを作製し、その後、ＰＣＲ反応で指数関数的に増幅させる。最も一般的に使用される２つの逆転写酵素はトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写ステップは、一般には、状況および発現プロファイリングの目的に応じて、特異的なプライマー、ランダムな六量体、またはオリゴ−ｄＴプライマーを使用してプライミングする。例えば、抽出されたＲＮＡを、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）を製造者の説明書に従って使用して逆転写することができる。次いで、導かれたｃＤＮＡをその後のＰＣＲ反応において鋳型として使用することができる。
【００７６】
ＰＣＲに基づく方法では、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用する。例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲでは、標的アンプリコンに結合したハイブリダイゼーションプローブを加水分解するために一般にはＴａｑポリメラーゼまたはＴｔｈポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性を利用するが、同等の５’ヌクレアーゼ活性を有する任意の酵素を使用することができる。２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲ反応産物に特有のアンプリコンを生成する。２つのＰＣＲプライマーのハイブリダイゼーション部位の間に位置するアンプリコンのヌクレオチド配列の検出を容易にするために、第３のオリゴヌクレオチドまたはプローブを設計することができる。プローブは、例えば、レポーター色素を用いて検出可能に標識することができ、さらに、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブ配置と同様に蛍光色素とクエンチャー蛍光色素の両方をもたらすことができる。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブを使用する場合、増幅反応の間にＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素によりプローブが鋳型依存的に切断される。得られたプローブ断片は溶液中で解離し、放出されたレポーター色素からのシグナルは第２のフルオロフォアのクエンチ効果を受けない。合成された新しい分子のそれぞれに対してレポーター色素の分子１つが遊離し、クエンチされていないレポーター色素を検出することにより、データの定量的解釈の基礎がもたらされる。
【００７７】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲは、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）などの市販の設備を使用して実施することができる。好ましい実施形態では、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）などのリアルタイム定量的ＰＣＲデバイスで５’ヌクレアーゼ手順を実行する。このシステムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラおよびコンピュータからなる。このシステムでは試料をサーモサイクラーにおいて３８４ウェル形式で増幅する。ＲＴ−ＰＣＲは、反応体積１０μＬ当たりＲＮＡ投入２ｎｇ相当を用いて３連のウェルで実施することができる。増幅の間、全てのウェルについてレーザー誘起蛍光シグナルを光ファイバーケーブルによってリアルタイムで収集し、ＣＣＤで検出する。このシステムは、計器を実行しデータを分析するためのソフトウェアを含む。
【００７８】
５’−ヌクレアーゼアッセイデータは、一般に、最初に閾値サイクル数（「Ｃｔ」）として表される。蛍光値を全てのサイクルの間に記録し、これは増幅反応のその点までに増幅した産物の量を示す。閾値サイクル数（Ｃｔ）は、一般に蛍光シグナルが統計的に有意であるとして最初に記録される点として説明される。
【００７９】
誤差および試料間の変動の影響を最小限にするために、ＲＴ−ＰＣＲは、通常、内部標準を使用して実施される。理想的な内部標準遺伝子（参照遺伝子とも称される）は、同起源の癌性組織および非癌性組織の間で一定のレベル（すなわち、正常な組織と癌性組織の間で有意に異ならないレベル）で発現され、実験処理の影響を有意に受けない（すなわち、化学療法に曝露させた結果、関連性のある組織における発現レベルに有意差が示されない）。遺伝子発現のパターンを正規化するために最も頻繁に使用されるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびβ−アクチンのｍＲＮＡである。遺伝子発現測定値は、１種または複数種（例えば、２種、３種、４種、５種、またはそれ以上）の参照遺伝子の平均と比較して正規化することができる。参照で正規化された発現測定値は０〜１５にわたってよく、１単位の増加は一般にＲＮＡ量の２倍の増加を反映する。
【００８０】
リアルタイムＰＣＲは、正規化するために各標的配列に対して内部競合物質を使用する定量的競合的ＰＣＲと、試料中に含有される正規化遺伝子またはＲＴ−ＰＣＲ用のハウスキーピング遺伝子を使用する定量的比較的ＰＣＲのどちらにも適合する。さらなる詳細に関しては、例えば、Ｈｅｌｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６巻：９８６〜９９４頁（１９９６年）を参照されたい。
ＰＣＲプライマーおよびプローブの設計
【００８１】
ＰＣＲプライマーおよびプローブは、対象のＲＮＡ転写物内に存在するエクソン、イントロン、または遺伝子間配列に基づいて設計することができる。プライマー／プローブの設計は、Ｋｅｎｔ，  Ｗ．Ｊ．、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １２巻（４号）：６５６〜６４頁（２００２年）によって開発されたＤＮＡ  ＢＬＡＴソフトウェアなどの公的に入手可能なソフトウェアを使用して、または、変形を含めたＢＬＡＳＴソフトウェアによって実施することができる。
【００８２】
必要または所望である場合、標的配列の反復配列を遮蔽して非特異的シグナルを減少させることができる。これを実現するための例示的なツールとしては、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅを通じてオンラインで利用可能なＲｅｐｅａｔ  Ｍａｓｋｅｒプログラムが挙げられ、これは、反復エレメントのライブラリーに対してＤＮＡ配列をスクリーニングし、反復エレメントが遮蔽されているクエリ配列を返すものである。次いで、遮蔽された配列を使用し、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；ＭＧＢ  ａｓｓａｙ−ｂｙ−ｄｅｓｉｇｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；Ｐｒｉｍｅｒ３（Ｓｔｅｖｅ  ＲｏｚｅｎおよびＨｅｌｅｎ  Ｊ．  Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ（２０００年）Ｐｒｉｍｅｒ  ３  ｏｎ  ｔｈｅ  ＷＷＷ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｕｓｅｒｓ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ．、Ｒｒａｗｅｔｚ  Ｓ、Ｍｉｓｅｎｅｒ  Ｓ（編）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、３６５〜３８６頁）などの任意の商業的にまたは他のやり方で公的に入手可能なプライマー／プローブの設計パッケージを使用してプライマーおよびプローブの配列を設計することができる。
【００８３】
ＰＣＲプライマー設計に影響を及ぼし得る他の因子としては、プライマーの長さ、融解温度（Ｔｍ）、およびＧ／Ｃ含量、特異性、相補的なプライマー配列、および３’末端配列が挙げられる。一般に、最適なＰＣＲプライマーは、一般に、１７〜３０塩基長であり、約２０〜８０％、例えば、約５０〜６０％などのＧ＋Ｃ塩基を含有し、５０〜８０℃、例えば、約５０〜７０℃のＴｍを示す。
【００８４】
ＰＣＲプライマーおよびプローブの設計に関する他のガイドラインについては、例えば、その開示全体が明白に参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，  ＣＷ．ら、「Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｆｏｒ  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ」、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ；  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９５年、１３３〜１５５頁；ＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ、「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲｓ」、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９９４年、５〜１１頁；およびＰｌａｓｔｅｒｅｒ，  Ｔ．Ｎ．  Ｐｒｉｍｅｒｓｅｌｅｃｔ：  Ｐｒｉｍｅｒ  ａｎｄ  ｐｒｏｂｅ  ｄｅｓｉｇｎ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  ７０巻：５２０〜５２７頁（１９９７年）を参照されたい。
ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ
【００８５】
Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって開発された典型的な方法などのＭａｓｓＡＲＲＡＹに基づく方法では、ＲＮＡを単離し、逆転写した後、得られたｃＤＮＡを、一塩基以外の全ての位置において標的ｃＤＮＡ領域と一致し、内部標準としての機能を果たす合成ＤＮＡ分子（競合物質）を用いてスパイクする。ｃＤＮＡ／競合物質混合物をＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ後エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）酵素処理に供し、それにより、残りのヌクレオチドが脱リン酸化する。アルカリホスファターゼを不活化した後、競合物質およびｃＤＮＡからのＰＣＲ産物をプライマー伸長に供し、それにより、競合物質由来のＰＣＲ産物およびｃＤＮＡ由来のＰＣＲ産物について別個の質量シグナルを生成する。精製後、これらの産物を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）分析を用いた分析に必要な成分を予めローディングしたチップアレイ上に分配する。次いで、反応産物中に存在するｃＤＮＡを、生成した質量スペクトルにおけるピーク面積の比率を分析することによって数量化する。さらなる詳細に関しては、例えば、ＤｉｎｇおよびＣａｎｔｏｒ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １００巻：３０５９〜３０６４頁（２００３年）を参照されたい。
他のＰＣＲに基づく方法
【００８６】
本明細書に開示されている方法において用いることができる別のＰＣＲに基づく技法としては、例えば、ＢｅａｄＡｒｒａｙ（登録商標）技術（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｏｌｉｐｈａｎｔら、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  （Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、２００２年６月；Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７２巻：５６１８頁（２０００年））；遺伝子発現ための急速アッセイ（Ｙａｎｇら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １１巻：１８８８〜１８９８頁（２００１年））において市販のＬｕｍｉｎｅｘｌＯＯ  ＬａｂＭＡＰ（登録商標）ｓｙｓｔｅｍおよび多色コードマイクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を使用したＢｅａｄｓＡｒｒａｙ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（登録商標）（ＢＡＤＧＥ）；ならびに高適用範囲の発現プロファイリング（ＨｉＣＥＰ）分析（Ｆｕｋｕｍｕｒａら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  ３１巻（１６号）ｅ９４頁（２００３年）が挙げられる。
マイクロアレイ
【００８７】
この方法では、対象のポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）を基質上にアレイする。次いで、アレイされた配列を、特異的なハイブリダイゼーションに適した条件下で、検出可能に標識した、試料のＲＮＡから生成したｃＤＮＡと接触させる。ＲＮＡの供給源は、一般には、腫瘍試料、および場合によって内部対照として同じ患者の正常な組織から、または細胞株から単離した全ＲＮＡである。ＲＮＡは、例えば、凍結組織試料または保存用パラフィン包埋固定（例えば、ホルマリン固定）組織試料から抽出することができる。
【００８８】
例えば、アッセイされる遺伝子のｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅した挿入断片を高密度のアレイ中の基質に適用する。通常、少なくとも１０，０００ヌクレオチド配列を基質に適用する。例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするためには、マイクロチップ上に各エレメント１０，０００個で固定化した、マイクロアレイ遺伝子が適している。対象の組織から抽出したＲＮＡを逆転写することによって蛍光ヌクレオチドを組み込ませることにより、蛍光標識されたｃＤＮＡプローブを生成することができる。チップに適用した標識されたｃＤＮＡプローブはアレイ上のＤＮＡの各スポットに特異的にハイブリダイズする。ストリンジェントな条件下で洗浄して非特異的に結合したプローブを除去した後、チップを共焦点レーザー顕微鏡によって、またはＣＣＤカメラなどの別の検出方法によってスキャンする。アレイされたエレメントのそれぞれのハイブリダイゼーションを定量化することにより、対応するｍＲＮＡの存在量を評価することが可能になる。
【００８９】
二色蛍光を用いて、２つのＲＮＡの供給源から生成した別々に標識されたｃＤＮＡプローブをアレイに対でハイブリダイズさせる。したがって、指定の遺伝子のそれぞれに対応する２つの供給源からの転写物の相対的な存在量を同時に決定する。微小規模のハイブリダイゼーションにより、多数の遺伝子についての発現パターンの好都合かつ急速な評価がもたらされる。そのような方法は、細胞当たり少数のコピーで発現されるまれな転写物を検出するため、および少なくともおよそ２倍の発現レベルの差異を再現性よく検出するために必要な感度を有することが示されている（Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３巻（２号）：１０６〜１４９頁（１９９６年））。マイクロアレイ分析は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎＣｈｉｐ（登録商標）技術、またはＩｎｃｙｔｅのマイクロアレイ技術を用いることによってなど、市販の設備で製造者のプロトコールに従って実施することができる。
体液からのＲＮＡの単離
【００９０】
発現を分析するためにＲＮＡを血液、血漿および血清から単離する方法（例えば、Ｔｓｕｉ  ＮＢら（２００２年）Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ４８巻、１６４７〜５３頁、およびそこに引用されている参考文献を参照されたい）、および尿から単離する方法（例えば、Ｂｏｏｍ  Ｒら（１９９０年）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２８巻、４９５〜５０３頁およびそこに引用されている参考文献を参照されたい）が記載されている。
免疫組織学
【００９１】
免疫組織学的方法も、遺伝子の発現レベルを検出するために適しており、本明細書に開示されている方法に適用される。そのような方法では、対象の遺伝子の遺伝子産物に特異的に結合する抗体（例えば、モノクローナル抗体）を使用することができる。抗体は、抗体自体を、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチンなどのハプテン標識、または西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの酵素を用いて直接標識することによって検出することができる。あるいは、標識されていない一次抗体と、一次抗体に特異的な標識された二次抗体を併せて使用することができる。免疫組織学的プロトコールおよびキットは当技術分野で周知であり、市販されている。
プロテオミクス
【００９２】
「プロテオーム」という用語は、特定の時点で試料（例えば組織、生物体、または細胞培養物）中に存在するタンパク質の全体と定義される。プロテオミクスは、とりわけ、試料中のタンパク質の発現の全体的な変化を試験することを含む（「発現プロテオミクス」とも称される）。プロテオミクスは、一般には、（１）試料中の個々のタンパク質を２Ｄゲル電気泳動（２Ｄ  ＰＡＧＥ）によって分離するステップと、（２）ゲルから回収された個々のタンパク質を、例えば、質量分析またはＮ末端シークエンシングによって同定するステップと、（３）バイオインフォマティクスを用いてデータを分析するステップとを含む。
全トランスクリプトームシークエンシングのための固定しパラフィン包埋した試料からのＲＮＡ単離および調製の一般的な説明
【００９３】
固定しパラフィン包埋した組織をＲＮＡ供給源として使用して遺伝子発現レベルをプロファイリングするための代表的なプロトコールのステップは種々の公開された学術論文において提供される。（例えば、Ｔ．Ｅ．  Ｇｏｄｆｒｅｙら  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ２巻：８４〜９１頁（２０００年）；Ｋ．  Ｓｐｅｃｈｔら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ、１５８巻：４１９〜２９頁（２００１年）、Ｍ．  Ｃｒｏｎｉｎら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６４巻：３５〜４２頁（２００４年）を参照されたい。）改変された方法を、実施例の節に記載の全トランスクリプトームシークエンシングのために用いることができる。簡単に述べると、代表的なプロセスは、組織試料切片（例えば、パラフィン包埋腫瘍組織試料の厚さ約１０μｍの切片）を切り取ることから開始される。次いで、ＲＮＡを抽出し、米国特許出願公開第２０１１／０１１１４０９号に記載の通りリボソームＲＮＡを欠失させることができる。指向的かつシングルエンドまたはペアエンドであるｃＤＮＡシークエンシングライブラリーを、ＳｃｒｉｐｔＳｅｑ（商標）ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）などの市販のキットを使用して調製することができる。ライブラリーは、マルチプレックスシークエンシングのために、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）からのＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｂａｒｃｏｄｅ  Ｐｒｉｍｅｒなどの市販のバーコードプライマーを使用してバーコード化することもできる。次いで、バーコードを組み入れ、ライブラリーを増幅するために、ＰＣＲを行って第２のｃＤＮＡの鎖を生成する。ライブラリーを数量化した後、シークエンシングライブラリーを本明細書に記載の通りシークエンシングすることができる。
同時発現分析
【００９４】
特定の生物学的プロセスを実施するために、遺伝子は、多くの場合、一緒になって協調的に働く、すなわち、同時発現される。癌のような疾患過程に関して同定された同時発現遺伝子ネットワークは、予後判定バイオマーカーとしての機能も果たし得る。同時発現するバイオマーカーをアッセイする代わりに、またはそれに加えて、そのような同時発現遺伝子をアッセイすることができる。
【００９５】
当業者は現在公知であるまたは後に開発される多くの同時発現分析方法が本発明の範囲および主旨の範囲内に入ることを理解されよう。これらの方法には、例えば、相関係数、同時発現ネットワーク分析、派閥分析などが組み入れられていてよく、また、これらの方法はＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、シークエンシング、および他の同様の技術からの発現データに基づいてよい。例えば、ピアソンまたはスピアマン相関係数に基づいた相関のペアワイズ分析を用いて遺伝子発現クラスターを同定することができる（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｋ．およびＬｅｅ  Ａ．、Ｂｉｏｍｅｔｒｉｋａ  ２巻：３５７頁（１９０２年）；Ｃ．  Ｓｐｅａｒｍａｎ、Ａｍｅｒ．  Ｊ．  Ｐｓｙｃｈｏｌ．  １５巻：７２〜１０１頁（１９０４年）；Ｊ．  Ｍｙｅｒｓ、Ａ．  Ｗｅｌｌ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、５０８頁（第２版、２００３年）を参照されたい）。一般に、少なくとも２０のサンプルサイズにおいて０．３以上の相関係数が統計的に有意であるとみなされる（例えば、Ｇ．  Ｎｏｒｍａｎ、Ｄ．  Ｓｔｒｅｉｎｅｒ、Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ：Ｔｈｅ  Ｂａｒｅ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ、１３７〜１３８頁（第３版、２００７年）を参照されたい）。
参照正規化
【００９６】
試料における非生物学的変動、例えば、測定される産物の量および品質に起因する発現測定値の変動を最小限にするために、ＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルを、１つまたは複数の参照ＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物について得られる平均レベルに対して正規化することができる。参照ＲＮＡ転写物または発現産物の例としては、ＧＡＰＤＨなどのハウスキーピング遺伝子が挙げられる。あるいは、アッセイされるＲＮＡ転写物もしくは発現産物、またはそのサブセットの全ても、参照としての機能を果たし得る。転写物（またはタンパク質）ごとに、測定され正規化された患者の腫瘍ＲＮＡまたはタンパク質の量を癌組織参照セットに見いだされる量と比較することができる。例えば、Ｃｒｏｎｉｎ，  Ｍ．ら、Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １６４巻：３５〜４２頁（２００４年）を参照されたい。正規化は、ＲＮＡ転写物または発現産物の正規化されたレベルの１単位の増加が一般に試料中に存在する数量の２倍の増加を反映するように行うことができる。
本発明のキット
【００９７】
本発明の方法において使用するための材料は、周知の手順に従って作製されるキットの調製に適している。したがって、本発明は、予後の転帰を予測するための、開示されているＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物のレベルを全トランスクリプトームシークエンシングまたはＲＴ−ＰＣＲなどの方法によって定量化するためのプライマーおよび／またはプローブを含んでよい作用剤を含むキットを提供する。そのようなキットは、場合によって、ＲＮＡを腫瘍試料、具体的には、固定しパラフィン包埋した組織試料から抽出するための試薬、および／または全トランスクリプトームシークエンシング用の試薬を含有してよい。さらに、キットは、場合によって、試薬（複数可）を本発明の方法におけるそれらの使用に関する識別説明またはラベルまたは説明書と一緒に含んでよい。キットは、それぞれが、例えば、予め製作されたマイクロアレイ、緩衝液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ；またはｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰおよびＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびに１つまたは複数の本発明のプローブおよびプライマー（例えば、適切な長さのポリ（Ｔ）またはＲＮＡポリメラーゼに反応するプロモーターに連結したランダムプライマー）を含めた、方法に利用する種々の試薬（一般には、濃縮された形態で）の１つまたは複数を伴う容器（方法の自動的実行に使用するために適したマイクロリットルプレートを含む）を含んでよい。予後の情報を推定または数量化するために使用される数学的アルゴリズムもキットの潜在的な構成成分である。
報告書
【００９８】
本発明の方法は、本発明の方法によって得られる予測を要約した報告書を作成するために適している。本明細書に記載されている「報告書」とは、可能性の評価およびその結果に関する対象の情報を提供する要素を含む電子文書または有形文書である。対象の報告書は、少なくとも可能性の評価、例えば、癌患者が乳癌の再発を伴わない長期生存を示す可能性に関する指標を含む。対象の報告書は、完全にまたは部分的に電子的に作成されたもの、例えば、電子ディスプレイ（例えば、コンピュータモニタ）上に表示されたものであってよい。報告書は、１）試験設備に関する情報、２）サービス提供者の情報、３）患者データ、４）試料データ、５）ａ）適応症、ｂ）１つまたは複数の対象のＲＮＡ転写物の正規化されたレベルを含んでよい試験データを含めた種々の情報を含んでよい説明的報告書、および６）他の特徴の１つまたは複数をさらに含んでよい。
【００９９】
したがって、本発明は、報告書を作成する方法およびそれにより得られる報告書を提供する。報告書は、患者の腫瘍試料から得た細胞におけるＲＮＡ転写物またはそのようなＲＮＡ転写物の発現産物のレベルの概要を含んでよい。報告書は、患者の乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性が増加するという予測を含み得る、または、報告書は、対象の乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性が減少するという予測を含み得る。報告書は、外科手術単独または外科手術と化学療法の組み合わせなどの治療モダリティに対する推奨を含んでよい。報告書は電子形式でまたは紙上に存在してよい。
【０１００】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、患者の乳癌の再発を伴わない長期生存の可能性に関する情報を含む報告書を作成することをさらに含む。例えば、本発明の方法は、患者の応答の可能性の評価の結果を提供する報告書を作成または出力するステップをさらに含んでよく、報告書は電子媒体の形態（例えば、コンピュータモニタ上への電子的表示）で、または有形媒体（例えば、紙または他の有形媒体に印刷された報告書）の形態で提供されてよい。
【０１０１】
患者が乳癌の再発を伴わない長期生存を示す可能性に関する情報を含む報告書は使用者に提供される。癌患者が乳癌の再発を伴わない長期生存を示す可能性に関する評価は、「可能性の評価」と称される。報告書を作成する人または実体（「報告書作成者」）は可能性の評価も実施してよい。報告書作成者は、試料の収集、試料の加工、およびデータ生成のうちの１つまたは複数も実施してよく、例えば、報告書作成者は、ａ）試料の収集、ｂ）試料の加工、ｃ）ＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルの測定、ｄ）参照ＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベルの測定、およびｅ）ＲＮＡ転写物またはその発現産物の正規化されたレベルの決定のうちの１つまたは複数も実施してよい。あるいは、報告書作成者以外の実体が試料の収集、試料の加工、およびデータ生成のうちの１つまたは複数を実施してよい。
【０１０２】
「使用者」または「依頼人」という用語は、報告書が伝達される人または実体を指し、ａ）試料の採取；ｂ）試料の加工；ｃ）試料または加工された試料の用意、およびｄ）可能性の評価において使用するためのデータ生成のうちの１つまたは複数を行う人または実体と同じ人または実体であってよい。いくつかの場合には、試料の採取および／または試料の加工および／またはデータ生成を提供する人もしくは実体、ならびに結果および／または報告書を受け取る人は違う人であってよいが、どちらも「使用者」または「依頼人」と称される。ある特定の実施形態、例えば、方法を単一のコンピュータで完全に実行する場合では、使用者または依頼人がデータの入力およびデータ出力についての精査を提供する。「使用者」は、医療従事者（例えば、臨床医、検査技師、医師（例えば、腫瘍専門医、外科医、病理医）など）であってよい。
【０１０３】
使用者が方法の一部のみを実行する複数の実施形態では、本発明の方法に従ってコンピュータによるデータ加工をした後に、データ出力（例えば、完全な報告書を提供するための公開前の結果）を精査する、または「不完全な」報告書を精査し、手作業による介入をし、説明的報告書を完成させる個体は、本明細書では「精査者」と称される。精査者は、使用者とは離れた場所（例えば、使用者が位置してよい健康管理設備とは離れて提供されるサービス）に位置してよい。
【０１０４】
政府の規制または他の制限が適用される場合（例えば、健康保険、医療過誤保険、または責任保険の要件）、完全に電子的に収集されたものであろうと部分的に電子的に収集されたものであろうと、全ての結果を常套的な品質管理に供した後に使用者に公開する。
コンピュータに基づくシステムおよび方法
【０１０５】
本明細書に記載の方法およびシステムは、多数のやり方で実行することができる。本発明の一実施形態では、方法は、通信基盤、例えば、インターネットの使用を伴う。本発明のいくつかの実施形態を以下に考察する。本発明は、ハードウェア、ソフトウェア、ファームウェア、プロセッサ、またはそれらの組み合わせのさまざまな形態で実行することもできる。本明細書に記載の方法およびシステムは、ハードウェアとソフトウェアの組み合わせとして実行することができる。ソフトウェアは、プログラム記憶デバイスまたは使用者のコンピュータ環境において実行されるソフトウェアの異なる部分（例えば、アプレットとして）、および精査者が離れた場所（例えば、サービス提供者の設備）に位置し得る場合には精査者のコンピュータ環境において明確に具体化された適用プログラムとして実行することができる。
【０１０６】
本発明のある実施形態では、使用者によるデータ入力の間またはその後に、データ加工の一部を、使用者側のコンピュータ環境において実施することができる。例えば、使用者側のコンピュータ環境を、可能性「スコア」を示すための定義済みの試験コードがもたらされるようにプログラム化することができ、スコアは、加工されたまたは部分的に加工された応答として、その後に１つまたは複数のアルゴリズムを実行して精査者のコンピュータ環境において結果をもたらし、かつ／または報告書を作成するための試験コードの形態で精査者のコンピュータ環境に伝達される。スコアは数値スコア（数値を表す）であっても、数値または数値の範囲を表す非数値スコアであってもよい（例えば、「Ａ」は陽性反応の可能性が９０〜９５％であることを表し、「高（Ｈｉｇｈ）」は陽性反応（またはいくつかの他の選択された可能性の閾値）の見込みが５０％超であることを表し、「低（Ｌｏｗ）」は、陽性反応（またはいくつかの他の選択された可能性の閾値）の見込みが５０％未満であることを表すなど）。
【０１０７】
コンピュータシステムとして、システムは一般にプロセッサユニットを含む。プロセッサユニットは、試験データ（例えば、ＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベル；参照ＲＮＡ転写物またはその発現産物のレベル；ＲＮＡ転写物またはその発現産物の正規化されたレベル）を含んでよく、患者データなどの他のデータなども含んでよい情報を受け取るように作動する。この受け取られた情報はデータベース内に少なくとも一時的に保管することができ、データを分析して上記の通り報告書を作成する。
【０１０８】
入力データおよび出力データの一部または全部を電子的に送信することもできる。特定の出力データ（例えば、報告書）は、電子的にまたは電話によって（例えば、ファクシミリによって、ファックスバックなどのデバイスを使用して）送信することができる。例示的な出力受信デバイスとしては、ディスプレイエレメント、プリンター、ファクシミリデバイスなどを挙げることができる。電子形態の伝達および／または表示としては、電子メール、インタラクティブテレビなどを挙げることができる。本発明のある実施形態では、入力データおよび／または出力データの全部または一部（例えば、通常は少なくとも最終的な報告書）は、利用、好ましくは機密的に利用するために典型的なブラウザを用いてウェブサーバー上で維持される。データは、所望の通り医療従事者が利用すること、または医療従事者に送信することができる。最終的な報告書の全部または一部を含む入力データおよび出力データを用いて、健康管理設備として機密データベース内に存在してよい患者の医療記録を投入することができる。
【０１０９】
本発明は、コンピュータ環境において実行されると、本明細書に記載の可能性の評価の結果の全部または一部を行うためのアルゴリズムを実行するプログラムが記憶されたコンピュータ可読記憶媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、メモリーキー、フラッシュメモリカード、ディスケットなど）も意図している。コンピュータ可読媒体が本明細書に記載の方法を実行するための完全なプログラムを含有する場合、プログラムは、出力を採取、分析および生成するためのプログラムの説明書を含み、また、一般に、本明細書に記載の使用者と情報交換し、そのデータを分析情報と併せて加工し、その使用者のために独特の印刷された媒体または電子媒体を生成するためのコンピュータ可読コードデバイスを含む。
【０１１０】
記憶媒体が本明細書に記載の方法（例えば、方法の使用者側の態様（例えば、データ入力、報告書受け取り能力など））の一部を実行するプログラムを含む場合、そのプログラムにより、使用者によるデータ入力が離れた場所にあるコンピュータ環境に伝達される（例えば、インターネットを介して、イントラネットを介してなど）。データの加工または加工の完了を離れた場所において行って報告書を作成する。報告書の精査、および任意の必要な手作業による介入を完了して完全な報告書が提供された後に、完全な報告書が電子文書または印刷された文書（例えば、ファックスまたはメール送信された紙の報告書）として使用者に再度伝達される。本発明によるプログラムを含有する記憶媒体は、適切な基材に記録された説明書（例えば、プログラムのインストール、使用などのための）またはそのような説明書を得ることができるウェブアドレスと一緒にパッケージングされていてよい。コンピュータ可読記憶媒体は、可能性の評価を実行するための１つまたは複数の試薬（例えば、プライマー、プローブ、アレイ、またはそのような他のキット構成成分）との組み合わせで提供されてもよい。
【０１１１】
本発明を説明してきて、本発明は、図表を介して提供され、本発明をいかなる形でも限定するものではない以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されよう。本開示にわたる全ての引用は、本明細書に明白に参照により組み込まれる。
【実施例】
【０１１２】
（実施例１）
材料および方法
【０１１３】
患者
【０１１４】
Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ  Ｓｔ．  Ｊｏｓｅｐｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｂｕｒｂａｎｋ、ＣＡ）から、治験審査委員会の認可を伴い、臨床転帰を伴う１３６の原発乳癌ＦＦＰＥ腫瘍検体の提供を受けた。乳癌の最初の再発または乳癌による死亡（原因不明の死亡を含む）までの時間をこれらの記録から決定した。乳癌の再発を伴わずになお生存していた患者または既知の他の原因で死亡した患者は最後の経過観察または死亡時に打ち切りとみなした。これらの腫瘍検体をＯｎｃｏｔｙｐｅ  ＤＸ（登録商標）アッセイの展開におけるバイオマーカーの発見のために使用した。例えば、米国特許第７，０８１，３４０号；Ｓ．  Ｐａｉｋら、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５１巻、２８１７頁（２００４年）を参照されたい。本試験に関して、１３６検体に適切なＲＮＡが残っていた。患者１３６人の中で、２６人が乳癌を再発したか乳癌によって死亡した。
【０１１５】
ＲＮＡ−Ｓｅｑ試料の調製およびシークエンシング
【０１１６】
全ＲＮＡを、厚さ１０μｍのＦＦＰＥ腫瘍組織の切片３つから、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して以前に記載されている通り調製した。Ｍ．  Ｃｒｏｎｉｎら、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １６４巻、３５頁（２００４年１月）。１００ナノグラムの単離されたＲＮＡから記載の通りリボソームＲＮＡを枯渇させた。米国特許出願公開第２０１１／０１１１４０９号を参照されたい。全トランスクリプトーム分析のためのシークエンシングライブラリーを、ＳｃｒｉｐｔＳｅｑ（商標）ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して調製した。ｃＤＮＡの合成ステップの間に、逆転写ステップにおいて３７℃で９０分の追加的なインキュベーションを実行して、ライブラリー収率を上昇させた。３’末端タグを付けた後、二重にタグ付けされたｃＤＮＡを、ＭｉｎＥｌｕｔｅ（登録商標）ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して精製した。２つの６塩基指標配列を使用して、２重鎖シークエンシングについてバーコード付けされたライブラリーを調製した（ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｂａｒｃｏｄｅ  Ｐｒｉｍｅｒｓ；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。ＰＣＲを１６サイクル行って、第２のｃＤＮＡの鎖を生成し、バーコードを組み入れ、ライブラリーを増幅した。増幅したライブラリーについて、固相可逆的固定化、常磁性ビーズに基づくプロセス（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）によってサイズ選択した。ライブラリーをＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ａｓｓａｙ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって数量化し、ＤＮＡ１０００ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで可視化した。
【０１１７】
クラスター生成のために、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｃＢＯＴ（商標）ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔにおいてＴｒｕＳｅｑ（商標）ＳＲ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｋｉｔｓ  ｖ２（ＩＩｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を製造者のプロトコールに従って使用した。２つの指標ライブラリーをフローセルの各レーンにローディングした。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ（登録商標）２０００  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）で製造者のプロトコールによってシークエンシングを実施した。実行当たり合計５７サイクル（指標配列についての７サイクルを含む）を伴う多重単一読み取り実行を行った。
【０１１８】
データ品質評価
【０１１９】
各シークエンシングレーンは、２つの患者試料ライブラリーを用いて２連にし、それらを区別するために６塩基バーコードを使用した。各レーンにおける２つの試料間の平均読み取り比＋／−ＳＤは１．０５±０．３８であり、認識されていないバーコードの平均＋／−ＳＤ百分率は２．０８％±１．６３％であった。主成分分析および他の探索的データ分析方法を用いたところ、試料間でフローセルまたはバーコードに関連づけられる系統的な差異は見いだされなかった。
【０１２０】
試験の導入期において、１３６の試験セットから無作為に選択された８つの試料について２連のライブラリーを調製した。これらのライブラリーに対するＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡの適用範囲は、３．１Ｍ〜６．７Ｍの独特にマッピングされた読み取りにわたった。２連のライブラリー間の対数計数ピアソン相関は０．９４７〜０．９８５にわたった。残りの１２８の試料について単一のライブラリーを調製し、８フローセルのレーンの間に２連方式で分布させた。３つのレーンでシークエンシングが失敗した。２つのライブラリーの収率は低く、その結果、適用範囲が狭かった。３つのレーンを種々のＩｌｌｕｍｉｎａプロセスモニタリング指標によってフラグを立てた：低Ｑ３０（適用範囲＝２．８Ｍおよび４．２Ｍ）、高クラスター密度（適用範囲＝１．６Ｍおよび１．８Ｍ）、または不十分なイメージング（適用範囲＝３．３Ｍおよび３．１Ｍ）。残りのレーンについて、試料の適用範囲は２．５Ｍ〜７．３Ｍの読み取りにわたった。収率が低い試料について新しいライブラリーを調製し、シークエンシングした。失敗し、フラグを立てたレーンのライブラリー、ならびに適用範囲が狭い試料のいくつかを再シークエンシングした。シークエンシングした試料全ての間の反復相関は非常に高く、元の実行においてクラスター密度が高かった試料については０．９８５であり、他の全てについては０．９９０を超えた。分析データセットについて、導入実験からの２連のライブラリーのそれぞれのうちの１つについてのデータを保持した。新しいライブラリーを調製した試料ならびに失敗し、フラグを立てたレーンの試料については、後の実行からの読み取りを使用した。ライブラリーの適用範囲が狭い試料は再加工し、２回の実行からの読み取りをプールした。残りの試料については、単一のレーンからの読み取りを使用した。結果は、他のデータ分析手順を使用した場合、例えば、ライブラリーを再加工した場合に第２の実行のみを使用したところ、あまり異ならなかった。
【０１２１】
統計値およびバイオインフォマティクス
【０１２２】
下記の例外を伴って、配列データの一次分析は全てＩｌｌｕｍｉｎａからの標準のデータ加工パッケージであるＣＡＳＡＶＡ１．７で実施した。試料指標の多重分離をミスマッチ許容度１に設定して各レーン内の２つの試料を分離した。両末端から未加工のＦＡＳＴＱ配列をトリミングした後にヒトゲノムにマッピングして（ＵＣＳＣ  ｒｅｌｅａｓｅ、バージョン１９）、３’末端のアダプターコンタミネーションおよびランダムＲＴプライマーアーチファクト、ならびに５’末端の末端タグオリゴヌクレオチドアーチファクトにアドレスを付けた。調製されたライブラリーは鎖起源（方向性）の配列情報を含有する。アノテートされたＲＮＡカウント（ＵＣＳＣからのｒｅｆＦｌａｔ．ｔｘｔによって定義される）をＣＡＳＡＶＡ１．７により、鎖起源情報を考慮して、および考慮せずに算出した。マッピングプロセスにおいて保持されるが、ＣＡＳＡＶＡでは初期値による方向性カウントはもたらされない。これらのカウントは、マッピングした（ｅｘｐｏｒｔ．ｔｘｔ）ファイルを、一方がセンス鎖のカウントを伴い、他方がアンチセンス鎖のカウントを伴う２つの部分に分け、それらをそれぞれ独立に加工することによって得た。ＣＡＳＡＶＡと並行してＢｏｗｔｉｅ（Ｂ．  Ｌａｎｇｍｅａｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０巻、Ｒ２５頁（２００９年））を用いて未加工のＦＡＳＴＱ配列をマッピングして、リボソームＲＮＡ転写物をカウントした。
【０１２３】
データを３つのカテゴリーで分析した：第１に、約８０％がエクソン配列であり、各遺伝子について統合したＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡ；第２に、各遺伝子について統合したイントロンＲＮＡ配列；第３に、遺伝子間配列。患者１３６人の中で最大カウントが５未満であるＲＮＡは分析から排除した。ＣＡＳＡＶＡによってカウントされた２１，２８３の全ＲｅｆＳｅｑ転写物のうち、８２１の最大カウントが５未満であり、２０，４６２のＲｅｆＳｅｑ転写物を分析のために残した。Ｂｕｌｌａｒｄら、（ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｉｒｍａｔｉｃｓ  １１巻、９４頁（２０１０年））に記載されている最近公開された手順と同様に、ｌｏｇ２未加工ＲＮＡカウント（０カウントに対するｌｏｇ２を０に設定する）を、ｌｏｇ２ＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡカウントの３四分位数を引き、コホートの平均３四分位数を足すことによって正規化した（「Ｑ３正規化」）。ＲｅｆＳｅｑおよび遺伝子間ＲＮＡの正規化の分析のためにＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡデータを使用した。イントロンＲＮＡの正規化の分析のためにイントロンＲＮＡデータを使用した。
【０１２４】
各ＲＮＡに対する乳癌の再発についての標準化ハザード比、すなわち、ＲＮＡの正規化されたレベルにおける１−標準偏差の増加を伴うハザードの比例的変化を、単変量コックス比例ハザード回帰分析を用いて算出した（Ｃｏｘ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ：  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ  （Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ）  ３４巻、１８７頁（１９７２年））。ＬｉｎおよびＷｅｉ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、８４巻、１０７４頁（１９８９年））のロバスト標準誤差推定（ｒｏｂｕｓｔ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｅｒｒｏｒ  ｅｓｔｉｍａｔｅ）を用いて、遺伝子発現と対数ハザードおよび非比例ハザードとの関係の非線形性を含めた、コックス回帰の仮定からの可能性のある逸脱を適応させた。偽発見率（ＦＤＲ、ｑ−値）を、Ｓｔｏｒｅｙ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ  ６４巻、４７９頁（２００２年））の方法を「チューニングパラメータ」λ＝０．５で用いて評価した。分析を行って、ＦＤＲを１０％に制御しながら、絶対的な標準化ハザード比が指定の下界を超えるＲＮＡの関連性の真の発見の程度（ＴＤＲＤＡ）セットを同定した（Ｃｒａｇｅｒ、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２９巻、３３頁（２０１０年）。このＦＤＲで同定された個々のＲＮＡをとると、分析により、ＲＮＡがＴＤＲＤＡセットに包含される最大下界が見いだされる。平均への回帰について補正した各ＲＮＡの実際の標準化ハザード比の推定値も計算した。同上。
【０１２５】
同じ腫瘍ＲＮＡにおける１９２の転写物の発現を、上記のＲＴ−ＰＣＲ法を用いて測定した（Ｃｒｏｎｉｎら、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １６４巻、３５頁（２００４年１月）；Ｃｒｏｎｉｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５０巻、１４６４頁（２００４年８月））。各遺伝子の発現（各遺伝子の交差閾値（ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（ＣＴ）をコホートの中央値ＣＴから引くことによって正規化した）と癌の再発を関連づける標準化ハザード比を、ＲＮＡ−Ｓｅｑデータを評価するために用いたものと同じ方法を用いて計算した。
【０１２６】
遺伝子間配列の同定
【０１２７】
長さが広範に変動するゲノム領域を集団ベースで評価する新規のプログラムによって遺伝子間領域を同定した。このプログラムは、長さが広範に変動する遺伝子間領域を評価するため、および個々の対象ではなく対象の集団からのデータを使用するために開発された。患者１３６人全てからの独特にマッピングされた読み取りを分析して、遺伝子間転写物から生じ得る読み取りのクラスターを同定した。ミスマッピング（ｍｉｓ−ｍａｐｐｉｎｇ）またはゲノムＤＮＡコンタミネーションからの潜在的なノイズを排除するために、含有されるゲノム配列のマッピングされた読み取りが２つ未満であるゲノム領域はカウントしなかった。残りの読み取りを、それらのマッピングされた座標とｈｇ１９参照ヒトゲノムとの重複に基づいて個々の読み取り「島」にクラスター化し、その結果、１３６の患者試料全てにおいて１２，７５０，０７１島が生じた。互いと３０塩基対（ｂｐ）以内である島はいずれも対象の領域（ＲＯＩ）として１つの群にし、それにより合計６，６３３，２５８ＲＯＩが生じた。ＲＯＩの数を以下の基準によってさらに減らした：１）患者１３６人全てにわたって、ＲＯＩにマッピングされた読み取りの平均数が≧５であること、２）ＲＯＩの長さが少なくとも１００ｂｐであること、および３）読み取りの深さ（平均読み取り数をＲＯＩの長さで割ったもの）が≧０．０７５であること。これらの基準を適用することにより、ＲＯＩの数が２３，０２４に減少した。ＲＯＩは、それらがＵＣＳＣから得たｒｅｆＦｌａｔ．ｔｘｔファイルにおいてアノテートされた転写物（非コード転写物を含む）と重複しなかった場合に遺伝子間領域として分類し、それにより、タンパク質コード遺伝子の公知のエクソンおよびイントロンならびに十分にアノテートされた非タンパク質コード転写物との重複を排除した。このコンピュータによる手順によって合計２，１０１の遺伝子間領域が同定された。
（実施例２）
バイオマーカー発見のためのプラットフォームとしての全トランスクリプトームＲＮＡ−Ｓｅｑの評価
【０１２８】
患者の臨床的特性が表１２に示されている。患者１１０人（８１％）でリンパ節転移はなかった。化学療法とホルモン療法を混合して用いた。エストロゲン受容体（ＥＲ）の状態は患者の記録に含めなかった。したがって、このＲＮＡ−Ｓｅｑ試験において得られた正規化されたＥＳＲ１  ｍＲＮＡのレベルを使用して、１１１の腫瘍がエストロゲン受容体陽性であり、２５がエストロゲン受容体陰性であると同定された。この目的のためにＲＮＡ−ＳｅｑではなくＲＴ−ＰＣＲを用いたところ、２人多く、合計１１３人の患者がＥＲ＋と同定され、同様であるが同一ではない結果がもたらされた。ＦＦＰＥ腫瘍ブロックの保存年数は５〜１２．４年にわたった（中央値８．５年）。
【０１２９】
ＲＮＡ−Ｓｅｑの結果は患者１３６人全てについて首尾よく収集され、平均で患者当たり４３００万の読み取り中央値（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｉｓｅｑ２０００フローセルレーン当たり８６００万の読み取り中央値）であった。これらの６９パーセントがヒトゲノムに独特にマッピングされた：１９．２％がエクソン、６４．９％がイントロン、および１５．９％が遺伝子間領域であった。リボソームＲＮＡは全読み取りの０．３％未満を占めた。平均で、患者当たり１７，２４８のＲｅｆｓｅｑ転写物が検出され、６６％が１０カウントを超え、４７％が１００カウントを超えた。
【０１３０】
３四分位数正規化を用いることにより、試料の経年数に関連する全体的な適用範囲の傾きが有効に減少し、有効な正規化の指標であるゼロに集中し、０周辺に比較的密に分布した相対的な対数発現（ＲＬＥ、個々の遺伝子のｌｏｇ２カウント−患者内中央値のｌｏｇ２カウント）値を伴って安定な発現の推定値が生じた。
【０１３１】
図１Ａは、プロビデンスの患者１３６人のコホートの歴史的なＲＴ−ＰＣＲによる１９２候補遺伝子スクリーニングからの結果を示し、ｍＲＮＡの発現の増加と再発リスクハザード比および統計的有意性が関連づけられている。示されている通り、Ｏｎｃｏｔｙｐｅ  ＤＸ（登録商標）パネル内の癌に関連する遺伝子１６種のうち１４種をアッセイし、大部分が、ハザード比が１．２超または０．８未満であり、Ｐ値＜０．０５であることが同定された。
【０１３２】
ＲＴ−ＰＣＲではなく全トランスクリプトームＲＮＡ−Ｓｅｑによってスクリーニングを行ったところ、Ｏｎｃｏｔｙｐｅ  ＤＸ（登録商標）遺伝子の効果量および統計的有意性は同様であった（図１Ａと１Ｂを比較されたい）。これは、箱型図において遺伝子ごとに詳細に示されている（図２）。対数ハザード比の散布図により、１９２種の遺伝子のＲＴ−ＰＣＲの結果とＲＮＡ−Ｓｅｑ分析との間の全体的な一致が実証されている（Ｌｉｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ  ８４巻、１０７４頁（１９８９年））（Ｌｉｎ一致相関：０．８１０；ピアソン相関係数：０．８１３；図３）。ＲＮＡ−Ｓｅｑがさらに、疾患の再発を伴う多くのＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡと関連することが有意であり：ＦＤＲ＜１０％で合計１３０７種（表１）が、以降「同定されたＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡ」と称される。対照的に、１９２種の遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ試験では、ＦＤＲ＜１０％で３２種のＲＮＡが同定され、５倍超の投入ＲＮＡが消費された。まとめると、これらの結果は、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより、ＦＦＰＥ組織においてゲノムワイドにバイオマーカーを発見するための実用的な高感度かつ正確なプラットフォームを提供することができることを示している。
（実施例３）
乳癌の再発のリスクに関連づけられるＲｅｆＳｅｑ転写物および遺伝子ネットワーク
【０１３３】
疾患の再発転帰に関連づけられるＲｅｆｓｅｑがＦＤＲ＜１０％で１３０７種存在した（表１）。試料内の転写物カウントの再現性は転写物の存在量が減少するにしたがい必然的に減少するので、最初のバイオマーカーの発見に対する転写物の存在量の影響を評価した。これらの１３０７種のＲＮＡをカウント存在量ごとにまとめた。分析から意図的に排除した、最大カウントが５未満である８２１種の転写物に相当する、まれな転写物（カウント中央値が１０未満）は全ＲｅｆＳｅｑ転写物の２８％を示す。同定されたＲＮＡのパーセントは減少するが劇的には異ならない。これは、カウント中央値も１，０００超から１０〜９９に減少するためである。１０未満のカウント中央値においてさえ、同定されたＲＮＡのパーセントは、存在量がより多い配列と比較して、半分未満の減少しかなかった。
【０１３４】
１３０７種の同定されたＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡの多くが非常に高い統計的有意性を伴って再発に関連する（表１）。ＴＤＲＤＡ分析により、ＦＤＲを１０％に制御したところ、標準化ハザード比が１．１を超える１４４種が同定された。平均への回帰について補正した推定の標準化ハザード比は、１．６６と同じ高さである。未補正のハザード比はおよそ０．４〜２．５にわたる。発現が高いことが癌の再発のリスクの増加に関連づけられるＲＮＡと、リスクの減少に関連づけられるＲＮＡの比はおよそ１である。
【０１３５】
この試験において用いるライブラリー化学により、転写物についてのＤＮＡ鎖起源の情報がもたらされる。１３０７種の予後判定的ＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡを同定する分析では方向性については選別しない。これを行う際、１０２３種のこれらのＲｅｆＳｅｑ転写物は、センス鎖のカウントのみを分析する場合にＦＤＡ＜１０％でなお疾患の再発に関連づけられる。総ＲｅｆＳｅｑカウントの１０％未満がアンチセンス方向に位置する。それにもかかわらず、７９８種のアンチセンス転写物が再発リスクに関連づけられる。
独立したコホートにおけるＲｅｆＳｅｑ転写物と乳癌の予後の関連性の検証
【０１３６】
これらの同定されたＲＮＡの性能を、ＤＮＡマイクロアレイ技術によってアッセイした乳癌患者の腫瘍の独立したコホートからの公共の遺伝子発現データを使用してさらに評価した。２つの論文（Ｍ．  ｊ．  ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｉｊｖｅｒら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３４７巻、１９９９頁（２００２年）；Ｌ．  Ｊ．  Ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１５巻、５３０頁（２００２年））において公開されている患者セットを合併させることによってマイクロアレイデータセットを構築し、患者３３７人についてのデータをもたらした（「ＮＫＩデータセット」）。患者３１９人について無転移生存情報が入手可能であった。マイクロアレイの標的とした各遺伝子について、単変量のコックス比例ハザード回帰分析を用いて癌の再発についての標準化ハザード比を推定した。ＲＮＡ−Ｓｅｑデータを用いて行ったのと同様に１０％ＦＤＲ閾値を使用して遺伝子を予後判定的であると同定した。両方のプラットフォームに共通する１１，６５９種の遺伝子の間で、予後判定的である遺伝子の分類に高度に有意な一致が存在するが（図４）、一致は転写物の存在量が減少するにつれて減少する。ＮＫＩデータセットにおいて、＞１００カウントで存在するＲＮＡ−Ｓｅｑ  ＲＮＡについて、４４％が予後判定的であると同定された。
遺伝子ネットワーク
【０１３７】
１３０７種の同定されたＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡの階層クラスタリング（Ｅｉｓｅｎら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９５巻、１４８６３頁（１９９８年））（表１）により、同時発現遺伝子ネットワークが存在することが示唆される。Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ（Ｐ．  Ｓｈａｎｎｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３巻、２４９８頁（２００３年）；Ｍ．  Ｅ．  Ｓｍｏｏｔら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２７巻、４３１頁（２０１１年））を使用して、各メンバーの発現が少なくとも１つの他のＲＮＡとＲ≧０．６で相関するこれらのＲＮＡのサブセットを評価した。図５に、結果得られた５９７種の遺伝子および４０１１の相互作用の相関行列がグラフで示されている。図５に示されている１種の顕著な（５１メンバー）ＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡネットワークは、細胞周期および有糸分裂の調節と機能的に関連するＲｅａｃｔｏｍｅデータベースアノテーション（Ｇ．  Ｊｏｓｈｉ−Ｔｏｐｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３巻、Ｄ４２８頁（２００５年））を有し、予後不良に関連づけられているＲＮＡに富んでいる（「細胞周期ネットワーク」）（表６）。このネットワークとしては、５種の増殖関連Ｏｎｃｏｔｙｐｅ  ＤＸ（登録商標）遺伝子のうちの３種が挙げられる（ＢＩＲＣ５、ＭＹＢＬ２、ＭＫＩ６７）。第２のネットワークは、Ｏｎｃｏｔｙｐｅ  ＤＸ（登録商標）遺伝子、ＢＣＬ２およびＳＣＵＢＥ２が含まれる、エストロゲン受容体遺伝子（ＥＳＲ１）と同時発現し、再発リスクの低下に関連するＲＮＡに富んでいる（「ＥＳＲ１ネットワーク」）。他のＥＳＲ１ネットワーク遺伝子としては、ＣＰＥＢ２、ＩＬ６ＳＴ、ＤＮＡＬＩ１、ＰＧＲ、ＳＬＣ７Ａ８、Ｃ６ｏｒｆ９７、ＲＳＰＨ１、ＥＶＬ、ＢＣＬ２、ＮＸＮＬ２、ＧＡＴＡ３、ＧＦＲＡ１、ＧＦＲＡ１、ＺＮＦ７４０、ＭＫＬ２、ＡＦＦ３、ＥＲＢＢ４、ＲＡＢＥＰ１、ＫＤＭ４Ｂ、ＥＳＲ１、Ｃ４ｏｒｆ３２、およびＣＰＬＸ１が挙げられる（表７）。ＥＳＲ１自体は、我々のＲＮＡ−Ｓｅｑの結果でも疾患の転帰と統計学的に関連づけられず、ＲＴ−ＰＣＲ分析によってもこのコホートにおいて有意であることは以前に見いだされていない。
【０１３８】
この分析により、いくつかの新規のＲＮＡネットワークも示され、そのうちの３つは別個の細胞遺伝学的バンドに位置する（図５）：１）Ｃｈｒ９ｑ２２に位置する２８９キロベース領域にマッピングされる５つの予後不良ＲＮＡのネットワーク（「Ｃｈｒ９ｑ２２ネットワーク」）、ＡＳＰＮ、ＣＥＮＰＰ、ＥＣＭ２、ＯＧＮ、およびＯＭＤ（表８）を含む；２）Ｃｈｒ１７ｑ２３−２４の６．６メガベース領域にマッピングされる１２種のＲＮＡのネットワーク（「Ｃｈｒ１７ｑ２３−２４ネットワーク」）、ＣＣＤＣ４５、ＰＯＬＧ２、ＳＭＵＲＦ２、ＣＣＤＣ４７、ＣＬＴＣ、ＤＣＡＦ７、ＤＤＸ４２、ＦＴＳＪ３、ＰＳＭＣ５、ＲＰＳ６ＫＢ１、ＳＭＡＲＣＤ２、およびＴＥＸ２（表９）を含む；ならびに３）Ｃｈｒ８ｑ２１−２４にわたる４７メガベースにマッピングされる１４種のＲＮＡネットワーク（「Ｃｈｒ８ｑ２１−２４ネットワーク」）、ＣＹＣ１、ＤＧＡＴ１、ＧＰＡＡ１、ＧＲＩＮＡ、ＰＵＦ６０、ＰＹＣＲＬ、ＲＰＬ８、ＳＱＬＥ、ＴＳＴＡ３、ＥＳＲＰ１、ＧＲＨＬ２、ＩＮＴＳ８、ＭＴＤＨ、およびＵＱＣＲＢを含む（表１０）。最後に、図５は、嗅覚のシグナル伝達、グルコース代謝、およびグルクロン酸抱合に対する強力なＧｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃａｒｔａアノテーションを有する大きな（１３４メンバー）ＲＮＡネットワーク（「嗅覚受容体ネットワーク」）（表１１）を示す。この新規のネットワーク内の転写物のうちの９種は嗅覚受容体をコードする（ＯＲ１０Ｈ３、ＯＲ１４Ｊ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ２Ｗ５、ＯＲ５Ｔ２、ＯＲ７Ｅ２４、ＯＲ７Ｇ３、ＯＲ８Ｓ１、およびＯＲ９Ｋ２）。１５種はマイクロＲＮＡ前駆体である（ＭＩＲ１２０８、ＭＩＲ１２６６、ＭＩＲ１２９７、ＭＩＲ１３３Ａ１、ＭＩＲ１９５、ＭＩＲ１９６Ａ１、ＭＩＲ３１７０、ＭＩＲ３１８３、ＭＩＲ４２６７、ＭＩＲ４２７５、ＭＩＲ４３１８、ＭＩＲ５０１、ＭＩＲ５０１、ＭＩＲ５３９、およびＭＩＲ５４２）。このネットワーク内のＲＮＡの大部分はまれである（未加工のカウント中央値が１０未満）。表１に示されているように、それらのうち２種を除いて全てが予後不良に関連づけられる。
【表６】
2014532428.tif 000002
【表７】
2014532428.tif 000003
【表８】
2014532428.tif 000004
【表９】
2014532428.tif 000005
【表１０】
2014532428.tif 000006
【表１１】
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【表１２】
2014532428.tif 000008
（実施例４）
ＥＲ＋患者における再発のリスク
【０１３９】
ＥＲの状態は、多くの場合、臨床診療において、乳房腫瘍の免疫組織学的評価を介してＥＲ＋およびＥＲ−という二者択一的な用語で記載され、乳癌を臨床転帰および遺伝子発現プロファイルに関して二分するものである。ＥＲの状態の情報はこの試験コホートについての患者の記録の一部ではなかったので、ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ＥＳＲ１カウントを使用して患者を分離した。この分析は表２に示されている。これは、ＥＲの状態を定義する新規の方法であるが、集団サイズが小さいこと（１０の再発イベント）およびＥＲ＋と定義された患者の大部分がホルモン療法を受けていないことに注意する。ホルモン療法（例えば、タモキシフェンまたはアロマターゼ阻害剤）の投与は現在の標準の臨床診療であり、どちらによっても再発リスクが有意に減少し、再発を予測するバイオマーカーの性質が影響を受ける。それにもかかわらず、この分析では、予測の細胞周期遺伝子サインが高再発リスクのマーカーとして同定される（遺伝子ＣＣＮＡ２；ＣＥＮＰＮ、ＫＩＦ２０、ＡＲＰＰ１９およびＢＵＢ３により例示される）。全体で、ＦＤＲ＜１０％で、３６３種のＲｅｆＳｅｑ転写物の発現が再発リスクに関する（表２）。この転写物のセット内で、上記の通りＣｙｔｏｓｃａｐｅを使用して見いだされた最も顕著なＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡネットワークは、患者１３６人のコホート全体の分析において同定されたまれな「嗅覚受容体ネットワーク」と同様である。ＥＳＲ１＋患者では、この嗅覚受容体ネットワークは、８６種のＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡからなり（表１３参照）、そのうちの６種は嗅覚受容体であり（ＯＲ１４Ｊ１、ＯＲ２Ｂ３、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ２Ｗ５、ＯＲ５Ｔ２、ＯＲ８Ｓ１）、８種はマイクロＲＮＡ前駆体である（ＭＩＲ１２０８、ＭＩＲ１２５１、ＭＩＲ１２６６、ＭＩＲ１９５、ＭＩＲ４２７５、ＭＩＲ４３１８、ＭＩＲ５４２、ＭＩＲ５４８Ｉ２）。表２に示されているように、このネットワーク内のＲＮＡは全て、疾患の再発のリスクの増加に関連づけられる。
【表１３−１】
2014532428.tif 000009
【表１３−２】
2014532428.tif 000010
（実施例５）
イントロン配列と乳癌の予後の関連性
【０１４０】
ゲノムのイントロン領域への読み取りマッピングは配列データの全ての約６５％を占める。イントロンは、同じ遺伝子のエクソンと同時発現される傾向があるが（Ｒ中央値＝０．６７）、これらの相関は、およそゼロから０．９超まで広範囲にわたって変動する。アンチセンス方向にマッピングされるイントロンＲＮＡのパーセントはＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡの場合でわずかに高い（中央値：それぞれ約７．５％対約５％）。多数（１６９８種）のイントロンＲＮＡが乳癌の再発と関連づけられ（ＦＤＲ＜１０％；無方向性分析；表３）、ハザード比の範囲およびｐ値は、上記の同定された１３０７種のＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡのものと同様である。
【０１４１】
同定されたイントロン転写物の３分の２（１１５４種）超は上の表１に列挙されている予後判定的ＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡの中にはない。すなわち、それらの同族の構築されたエクソンも発見されていない（１００種の最も高度に統計的に有意なイントロンＲＮＡの中でこの画分は０．４４である）。同定されたイントロンＲＮＡのこのサブセットは、特に、ＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡによって捕捉されなかった予後の情報を含有する可能性がある。これらの基礎は統計学的であり得る：全てのイントロンＲＮＡについての平均カウントは全てのエクソンについての３倍超であり、したがって、信号対雑音比はイントロンＲＮＡを発見するのにより好都合である。それにもかかわらず、発見された同族のイントロンと一緒に発見されないエクソンの集団では、平均エクソン存在量は発見されるエクソンの集団全体におけるものよりもほんの少し少ない（それぞれ、平均カウント２４４対平均カウント３１２）。この結果は、それらの対応するエクソンには保有されない予後の情報を保有するこれらのイントロンＲＮＡと一致する。
（実施例６）
遺伝子間配列と乳癌の予後の関連性
【０１４２】
２つの手法を用いて、遺伝子間ＲＮＡの集団内のバイオマーカーを検索した。第１に、２，５００種の十分に実証された長い遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）（Ａ，  Ｍ．  Ｋｈａｌｉｌら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０６巻、１１６６７頁（２００９年７月１４日））にマッピングされる読み取りを調べた。ＦＤＲ＜１０％で、これら（表４）のうちの２２種が乳癌の再発リスクに関連づけられる。第２に、遺伝子間転写物を、実施例１に記載の新規のコンピュータによるアルゴリズムを使用することによってより広範にスクリーニングして、腫瘍検体の１つまたは複数のゲノムの遺伝子間領域にマッピングされる読み取りのクラスターを同定した。これらのクラスターにマッピングされた読み取りの数を推定上の遺伝子間転写物の相対的な発現量の尺度として使用した。総じて、２１０１種の推定上の遺伝子間転写物が同定され、そのうちの７７５種は、以前の非コード転写物の試験の１つまたは複数において以前同定されたｌｉｎｃＲＮＡに含有されるまたはそれと重複し、それらの発現を、患者１３６人のコホートにおいて乳癌の再発との関連性について試験した。ＦＤＲ＜１０％で、これらの転写物のうちの１９４種（９％）の発現が乳癌の再発と相関する。この１９４種の転写物の一覧を、＜１０００ｂｐで分離される読み取りのクラスターを合併して、乳癌の再発に関連づけられる６９種の遺伝子間転写物のセットを生じさせることによってさらに凝縮した（表５）。これらの６９種のうち３２種が再発リスクの低下に関連づけられる。クラスターを合併させる基準（＜１０００ｂｐ）は、合併させたクラスターの同時発現についての相関係数中央値が異常に高いという観察によって裏付けられる（Ｒ中央値＝０．９４）。合併させていない転写物は弱い同時発現を示した（Ｒ中央値＝０．２７）。
（実施例７）
【０１４３】
第２の試験では、Ｃｏｂｌｅｉｇｈら、Ｃｌｉｎ．  ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １１巻：８６２３〜８６３１頁（２００５年）および米国特許第７，５６９，３４５号に記載の通り、７８の患者試料を、１９７９年〜１９９９年にＲｕｓｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒにおいて外科手術を受けた、浸潤性の乳癌であり、陽性リンパ節が≧１０であり、転移性疾患の証拠がない女性から得た。全ての患者について臨床転帰データが入手可能であった。乳癌の再発を伴わずになお生存していた患者または既知の他の原因で死亡した患者は最後の経過観察または死亡時に打ち切りとみなした。本試験に関して、７６検体にＲＮＡ−Ｓｅｑに適したＲＮＡが残っていた。
【０１４４】
患者７８人の臨床的特性が表１４に示されている。ＲＮＡの調製、シークエンシング、およびデータ分析を実施例１に記載の通り実施した。表１５は、ＲＮＡ−Ｓｅｑによって同定された、ＦＤＲ＜１０％で乳癌の再発に関連づけられた１２５種のＲｅｆＳｅｑ遺伝子を示す。「１」と記されたＲｅｆＳｅｑは乳癌の再発の可能性の増加に関連づけられ、「−１」と記されたＲｅｆＳｅｑは乳癌の再発の可能性の減少に関連づけられた。表１５は、１０％ＦＤＲで、同定された遺伝子について、０以上である最大下界を示す。ＳｔｄＨＲは比例ハザードモデルからの推定の標準化ハザード比であり、ＳｔｄＨＲ．ｑｖａｌｕｅは標準誤差のロバスト推定から導かれたＳｔｄＨＲ  ｐ値のセットから、Ｒ  ｑｖａｌｕｅパッケージにおいてラムダ＝０．５を用いて実行した、ストレイの手順を用いて計算されたｑ値であり、ＳｔｄＨＲ．ｐｖは、帰無仮説ｃｏｅｆｆ＝０またはＨＲ（ハザード比）＝１についての推定の標準化係数のｐ値である。１２５種のＲｅｆＳｅｑのそれぞれの受託番号が表Ｂに示されている。これらの遺伝子のうち２０種は実施例１に記載の第１の試験においても再発に関連づけられた。この重複が偶然に起こることはまずない（ｐ＜２．５×１０−５）。
【表１４】
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【表１５−１】
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【表１５−２】
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【表１５−３】
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【表１５−４】
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（実施例８）
乳癌の予後に関連する代謝様遺伝子ネットワークの同定
【０１４５】
ＩＤＨ２は、実施例１に記載の「プロビデンス」患者コホートにおける再発リスクに関連づけられる遺伝子として同定されたが（表１を参照されたい）、Ｏｎｃｏｔｙｐｅ  ＤＸ（登録商標）Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｓｓａｙの増殖遺伝子群またはエストロゲン受容体遺伝子群のいずれにも属さなかった。実際には、ＩＤＨ２は、重要な中心的代謝遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ２をコードする。表１６に示されている通り、ＩＤＨ２は、互いとも同時発現される４種の他の遺伝子（ＥＮＯ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＧＫ１、およびＧ６ＰＤ）と同時発現されることが発見された。ＴＭＳＢ１０を除く全てが代謝経路との公知の関連性を有する。
【表１６】
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ＩＤＨ２
【０１４６】
ＩＤＨ１は、ミトコンドリアに見いだされるＮＡＤＰ（＋）依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼであるイソクエン酸デヒドロゲナーゼ２をコードする。これは、中間代謝およびエネルギー産生において役割を果たす。このタンパク質は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体と密接に関連または相互作用し得る。
ＥＮＯ１
【０１４７】
ＥＮＯ１は、哺乳動物に見いだされる３つのエノラーゼアイソザイムのうちの１つであるアルファ−エノラーゼをコードする。各アイソザイムは、２つのアルファサブユニット、２つのガンマサブユニット、または２つのベータサブユニットで構成されるホモ二量体であり、解糖の酵素として機能する。この遺伝子の代替のスプライシングにより、ｃ−ｍｙｃプロモーターに結合し、腫瘍抑制因子として機能することが示されているより短いアイソフォームがもたらされる。第１染色体の長腕上のものを含めたいくつかの偽遺伝子が同定されている。アルファ−エノラーゼは橋本脳症における自己抗原としても同定されている。
ＰＧＫ１
【０１４８】
ＰＧＫ１遺伝子は、１，３−ジホスホグリセリン酸を３−ホスホグリセリン酸に変換する別の解糖の酵素であるホスホグリセリン酸キナーゼをコードする。この反応により、細胞における主要なエネルギーの供給源であるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の分子１つが生成する。
Ｇ６ＰＤ
【０１４９】
Ｇ６ＰＤは、ペントースリン酸経路においてＮＡＤＰＨを産生させることが主要な機能である細胞質ゾルの酵素であるグルコース−６−リン酸脱水素酵素をコードする。この経路により、エネルギーと核酸および芳香族アミノ酸の分子構成要素の両方が生成する。
ＴＭＳＢ１０
【０１５０】
ＴＭＳＢ１０は、細胞骨格の組織化において重要な役割を果たすチモシンベータ−１０をコードする。ＴＭＳＢ１０は、アクチン単量体（Ｇアクチン）に結合し、それを隔離し、したがって、アクチン重合を阻害する。
【０１５１】
これらの５種の遺伝子と再発率との関連性を、プロビデンス患者コホート（実施例１を参照されたい）、「ラッシュ」患者コホート（実施例７を参照されたい）およびＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（「ＮＫＩ」）患者コホート（ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｉｊｖｅｒら、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４７巻：１９９９〜２００９頁、２００２年）において探究した。表１７に示されている通り、３つの患者コホートの全てにおいて、５種の遺伝子全てが、それぞれ独立に、再発のリスクの増加と有意に関連づけられた。
【表１７−１】
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【表１７−２】
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【０１５２】
５種の遺伝子の発現の凝集を、Ｏｎｃｏｔｙｐｅ  ＤＸ（登録商標）Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｓｓａｙの増殖遺伝子群（Ｋｉ−６７、ＳＴＫ１５、ＳＵＲＶ、ＣＣＮＢ１、ＭＹＢＬ２を含む）およびエストロゲン受容体遺伝子群（ＥＲ、ＰＲ、ＢＣＬ２、ＳＣＵＲＥ２を含む）の発現の凝集と比較した。プロビデンスコホートからのピアソンＲ値の平均および範囲は以下の通りであった：５種の遺伝子：Ｒ＝０．５６（範囲０．４８〜０．６３）；増殖遺伝子群：Ｒ＝０．６７（範囲０．６２〜０．７０）；エストロゲン受容体遺伝子群：Ｒ＝０．５８（範囲０．５５〜０．６２）。さらに、５種の遺伝子は、５種の増殖遺伝子とも同時発現され、ピアソン相関はＲ＝０．４４（範囲０．３１〜０．６０）であった。しかし、５種の遺伝子のそれぞれの、５つの遺伝子クラスターとの発現の凝集は増殖遺伝子群とのものよりも高かった。この分析は、５種の遺伝子が、以前に定義された増殖同時発現遺伝子モジュールおよびエストロゲン受容体同時発現遺伝子モジュールと凝集性がほぼ同様である同時発現遺伝子モジュールに属すること、および別個の同時発現遺伝子モジュールと正当に考えることができることを示している。これは、５種の遺伝子（ＥＮＯ１、Ｇ６ＰＤ、ＩＤＨ２、ＰＧＫ１、ＴＭＳＢ１０）のうちの１つまたは複数を含めることにより、Ｏｎｃｏｔｙｐｅ  ＤＸ（登録商標）Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  Ｓｃｏｒｅ（登録商標）の結果に追加的な予後の情報がもたらされ得ることを示唆している。
【０１５３】
上記の５種の遺伝子セットには中心的な代謝に関与する少なくとも３種の遺伝子が含まれたので、表１の結果を分析して、解糖、クエン酸（ＴＣＡ）回路、およびペントースリン酸経路に属し、乳癌の再発のリスクに関連づけられる追加的な遺伝子を同定した。１４種の遺伝子がｐ＜０．００５を有することが見いだされた：ＰＧＤ；ＴＫＴ；ＴＡＬＤ０１；Ｇ６ＰＤ；ＧＰＩ；ＳＬＣ１Ａ５；ＳＬＣ７Ａ５；ＯＧＤＨ；ＳＵＣＬＧ１；ＥＮＯ１；ＰＧＫ１；ＩＤＨ２；ＡＣＯ２；およびＦＢＰ１。表１に示されているように、これらの遺伝子はＦＢＰ１以外の全てが、癌の再発の可能性の増加と関連づけられた。この後者の結果は、ＦＢＰ１遺伝子産物は同化性であるが（糖新生を触媒する）、他の遺伝子産物は異化性である（エネルギーを生成する）という事実と一致する。
【０１５４】
１４種の遺伝子のセットおよび５種の遺伝子のセットを、個々の遺伝子ではなく所定の遺伝子セットの有意性を評価する、ＥｆｒｏｎおよびＴｉｂｓｈｉｒａｎｉ（Ｔｈｅ  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  １巻：１０７〜１２９頁、２００７年）の方法による遺伝子セット分析（「ＧＳＡ」）に供した。プロビデンスコホート、ラッシュコホート、およびＮＫＩコホートにおいて１４種の遺伝子のセットおよび５種の遺伝子のセットについてのＧＳＡスコアを評価し、Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおいて開発されたより大きなＣ２（「精選された遺伝子セット」）集合からの＞８００の正準経路（「ＣＰ」）遺伝子セットのＧＳＡスコアと比較した（Ｇｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｅｂｓｉｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｒｏａｄ上のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ  （ＭｇＳｉｇＤＢ）  ｖ３．０を参照されたい）（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら  ＰＮＡＳ  １０２巻：１５５４５〜１５５５０頁、２００５年も参照されたい）。全ての遺伝子セットの間のＧＳＡスコア、ｐ値、および順位が表１８に示されている。
【表１８】
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【０１５５】
表１８から見ることができるように、５種の遺伝子のセットおよび１４種の遺伝子のセットはどちらも、＞８００の正準遺伝子セットの全てについて、ＧＳＡスコア間のそれらの順位によって示されるように、３つの患者コホート全てにおいて高いＧＳＡスコアを示した。また、遺伝子５種および遺伝子１４種の代謝に関わる遺伝子モジュールのｐ値は３つの患者コホート全てにわたって統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
【０１５６】
実施例を含めた本開示全体を通して引用されている参考文献は全て、それらの開示全体が本明細書に明白に参照により組み込まれる。
【０１５７】
本発明は特定の実施形態と考えられるものを参照して説明されているが、本発明はそのように限定されないことが理解されるべきである。それとは反対に、本発明は、添付の特許請求の範囲の主旨および範囲に含まれる種々の改変および等価物を包含するものとする。
【表１−０１】
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【表１−０２】
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【表１−０３】
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【表１−０４】
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【表１−０５】
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【表１−０６】
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【表１−０７】
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【表１−０８】
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【表１−０９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【表１−１９】
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【表１−２０】
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【表１−２１】
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【表１−２２】
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【表１−２３】
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【表１−２４】
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【表１−２５】
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【表１−２６】
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【表１−２７】
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【表１−２８】
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【表１−２９】
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【表１−３０】
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【表１−３１】
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【表１−３２】
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【表１−３３】
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【表１−３４】
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【表１−３５】
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【表１−３６】
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【表１−３７】
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【表１−３８】
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【表１−３９】
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【表１−４０】
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【表１−４１】
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【表１−４２】
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【表１−４３】
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【表１−４４】
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【表１−４５】
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【表２−０１】
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【表２−０２】
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【表２−０３】
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【表２−０４】
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【表２−０５】
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【表２−０６】
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【表２−０７】
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【表２−０８】
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【表２−０９】
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【表２−１０】
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【表２−１１】
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【表２−１２】
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【表２−１３】
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【表３−０１】
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【表３−０２】
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【表３−０３】
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【表３−０４】
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【表３−０５】
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【表３−０６】
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【表３−０７】
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【表３−０８】
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【表３−０９】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
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【表３−１２】
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【表３−１３】
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【表３−１４】
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【表３−１５】
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【表３−１６】
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【表３−１７】
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【表３−１８】
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【表３−１９】
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【表３−２０】
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【表３−２１】
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【表３−２２】
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【表３−２３】
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【表３−２４】
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【表３−２５】
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【表３−２６】
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【表３−２７】
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【表３−２８】
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【表３−２９】
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【表３−３０】
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【表３−３１】
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【表３−３２】
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【表３−３３】
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【表３−３４】
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【表３−３５】
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【表３−３６】
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【表３−３７】
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【表３−３８】
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【表３−３９】
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【表３−４０】
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【表３−４１】
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【表３−４２】
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【表３−４３】
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【表３−４４】
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【表３−４５】
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【表３−４６】
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【表３−４７】
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【表３−４８】
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【表３−４９】
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【表３−５０】
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【表３−５１】
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【表３−５２】
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【表３−５３】
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【表３−５４】
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【表３−５５】
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【表３−５６】
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【表３−５７】
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【表３−５８】
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【表３−５９】
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【表３−６０】
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【表３−６１】
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【表３−６２】
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【表３−６３】
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【表３−６４】
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【表３−６５】
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【表３−６６】
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【表３−６７】
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【表３−６８】
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【表３−６９】
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【表３−７０】
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【表４】
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【表５−０１】
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【表５−０２】
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【表５−０３】
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【表５−０４】
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【表５−０５】
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【表５−０６】
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【表５−０７】
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【表Ａ−００１】
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【表Ａ−００２】
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【表Ａ−００３】
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【表Ａ−００４】
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【表Ａ−００５】
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【表Ａ−００６】
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【表Ａ−００７】
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【表Ａ−００８】
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【表Ａ−００９】
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【表Ａ−０１０】
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【表Ａ−０１１】
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【表Ａ−０１２】
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【表Ａ−０１３】
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【表Ａ−０１４】
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【表Ａ−０１５】
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【表Ａ−０１６】
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【表Ａ−０１７】
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【表Ａ−０１８】
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【表Ａ−０１９】
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【表Ａ−０２０】
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【表Ａ−０２１】
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【表Ａ−０９５】
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【表Ａ−０９８】
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【表Ａ−１００】
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【表Ａ−１０１】
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【表Ａ−１０９】
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【表Ａ−１１０】
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【表Ａ−１１４】
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【表Ａ−１１５】
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【表Ａ−１１９】
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【表Ａ−１２０】
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【表Ａ−１２１】
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【表Ａ−１２２】
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【表Ａ−１２３】
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【表Ａ−１２４】
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【表Ａ−１２５】
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【表Ａ−１２６】
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【表Ａ−１２７】
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【表Ａ−１２８】
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【表Ａ−１２９】
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【表Ａ−１３０】
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【表Ａ−１３１】
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【表Ａ−１３２】
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【表Ａ−１３３】
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【表Ａ−１３４】
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【表Ａ−１３５】
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【表Ａ−１３６】
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【表Ａ−１３７】
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【表Ａ−１３８】
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【表Ａ−１３９】
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【表Ａ−１４０】
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【表Ａ−１４１】
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【表Ａ−１４２】
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【表Ａ−１４３】
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【表Ａ−１４４】
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【表Ｂ−１】
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【表Ｂ−２】
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【表Ｂ−３】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
2014532428.tif 000308
【図５】
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【国際調査報告】
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2014532428.tif 000311
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