(57)【要約】プロテアソーム阻害剤での治療への感受性に関連したマーカーが本明細書に開示される。感受性は、腫瘍細胞中のＲＡＳ遺伝子が野生型であるときに観察される。マーカー遺伝子のマーカーを判定するための組成物および方法が提供され、固形腫瘍を有する患者のプロテアソーム阻害治療の成果を予測する。本開示は、本明細書に提供されるマーカーの少なくとも１つの特徴の測定による固形腫瘍の治療の予後および計画に関する。ヒト癌細胞の異種移植片由来の固形腫瘍試料中のマーカーは、それらの特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量を、プロテアソーム阻害治療での宿主動物のその後の治療の成果と関連させることによって特定された。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺腫瘍および結腸腫瘍からなる群から選択される固形腫瘍を有する患者をプロテアソーム阻害剤で治療するかを決定するための方法であって、
ａ）腫瘍細胞を含む患者試料中の少なくとも１つのマーカー遺伝子に関連した少なくとも１つのマーカーの少なくとも１つの特徴を測定するステップであって、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子がｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２  Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）である、前記測定するステップと、
ｂ）ステップａ）で測定された前記少なくとも１つの特徴が前記プロテアソーム阻害剤での治療の成果に情報的に有益であるかを特定するステップと、
ｃ）前記腫瘍細胞が野生型ＫＲＡＳを含むことを前記情報的に有益な特徴が示す場合に、前記患者を前記プロテアソーム阻害剤で治療することを決定するステップと、を含む、前記方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つのマーカーが、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子に対応する核酸およびタンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの特徴が、大きさ、配列、組成、活性、および量からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記固形腫瘍が、非小細胞肺腫瘍および結腸腫瘍からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの特徴が配列である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのマーカーが核酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸が、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｃＤＮＡからなる群から選択されるか、または前記ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｃＤＮＡのうちのいずれかの一部であり、前記一部が、少なくとも１つのマーカー遺伝子の少なくとも１つの変異部位を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸が、コドン１２、コドン１３、およびコドン６１からなる群から選択される配列番号２のコドン、またはその変異形、またはその相補体を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのマーカーが少なくとも２つのマーカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのマーカー遺伝子が少なくとも２つのマーカー遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも２つのマーカー遺伝子が、少なくともＫＲＡＳおよびＧＬＵＴ４を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＧＬＵＴ４の前記少なくとも１つの特徴が量である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＧＬＵＴ４の前記量が標準以下である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料が腫瘍浸出液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
腫瘍細胞の前記試料を富化することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料が、非小細胞肺癌細胞および結腸癌細胞からなる群から選択される腫瘍細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記プロテアソーム阻害剤が、ペプチジルボロン酸およびペプチジルエポキシケトンからなる群から選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチジルボロン酸が、ボルテゾミブ、クエン酸イクサゾミブ、および［（１Ｒ）−１−［［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［（６−フェニル−ピリジン−２−カルボニル）アミノ］−１−オキソ−ブチル］アミノ］−３−メチルブチル］ボロン酸からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
患者における固形腫瘍のプロテアソーム阻害剤治療を継続するかを決定するための方法であって、
ａ）固形腫瘍を有する患者をプロテアソーム阻害剤で治療することと、
ｂ）固形腫瘍細胞を含む試料を前記患者から得ることと、
ｃ）前記試料中の少なくとも１つのマーカー遺伝子に関連した少なくとも１つのマーカーの少なくとも１つの特徴を測定することであって、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子がＫＲＡＳである、前記測定することと、
ｄ）ｃ）における前記測定の結果を参照と比較することと、
ｅ）前記試料中の前記固形腫瘍細胞が野生型ＫＲＡＳを含むことを前記比較が示す場合に、前記プロテアソーム阻害剤での治療を継続することを決定することと、を含み、
前記患者が、肺腫瘍および結腸腫瘍からなる群から選択される固形腫瘍を有する、前記方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのマーカーが、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子に対応する核酸およびタンパク質からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの特徴が、大きさ、配列、組成、活性、および量からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記患者試料が、非小細胞肺癌細胞および結腸癌細胞からなる群から選択される腫瘍細胞を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの特徴が配列である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのマーカーが核酸である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸が、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｃＤＮＡからなる群から選択されるか、または前記ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｃＤＮＡのうちのいずれかの一部であり、前記一部が、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子の少なくとも１つの変異部位を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸が、コドン１２、コドン１３、およびコドン６１からなる群から選択される配列番号２のコドン、またはその変異形、またはその相補体を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１つのマーカーが少なくとも２つのマーカーである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのマーカー遺伝子が少なくとも２つのマーカー遺伝子である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも２つのマーカー遺伝子が、少なくともＫＲＡＳおよびＧＬＵＴ４を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＧＬＵＴ４の前記少なくとも１つの特徴が量である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＧＬＵＴ４の前記量が標準以下である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記試料が腫瘍浸出液を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
腫瘍細胞の前記試料を富化するステップをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記プロテアソーム阻害剤が、ペプチジルボロン酸およびペプチジルエポキシケトンからなる群から選択される、請求項１６〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ペプチジルボロン酸が、ボルテゾミブ、クエン酸イクサゾミブ、および［（１Ｒ）−１−［［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［（６−フェニル−ピリジン−２−カルボニル）アミノ］−１−オキソ−ブチル］アミノ］−３−メチルブチル］ボロン酸からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
腫瘍細胞を含む試料に添加する安定剤と、試料中の少なくとも１つのマーカーの少なくとも１つの特徴を測定する試薬と、を含む、キットであって、前記測定の結果が、少なくとも１つのマーカー遺伝子に変異が存在するかを示し、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子がＫＲＡＳである、前記キット。
【請求項３７】
前記少なくとも１つのマーカーが核酸である、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記試薬がプライマーである、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記プライマーが、配列番号１、２、４、５からなる群から選択される核酸配列、１１５２４７０８５と１１５２５９５１５の塩基対の染色体１ｐの配列、２５３５８１８０と２５４０３８５４の塩基対の染色体１２ｐの配列、および前記配列のうちのいずれかの相補体にハイブリダイズする、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
第２のプライマーをさらに含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４１】
プローブをさらに含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４２】
前記安定剤がＲＮＡ安定剤である、請求項３６〜４１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４３】
前記少なくとも１つのマーカーがタンパク質であり、前記試薬が抗体である、請求項３６に記載のキット。
【請求項４４】
前記抗体がＧＬＵＴ４に結合する、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
試料中の少なくとも２つのマーカーの少なくとも１つの特徴を測定する少なくとも２つの試薬を含むキットであって、前記測定の結果が、少なくとも１つのマーカー遺伝子に変異が存在するかを示し、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子がＫＲＡＳであり、前記試料が、肺腫瘍細胞および結腸腫瘍細胞からなる群から選択される固形腫瘍細胞を含む、前記キット。
【請求項４６】
少なくとも１つのマーカー遺伝子が少なくとも２つのマーカー遺伝子である、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
前記少なくとも２つのマーカー遺伝子がＫＲＡＳおよびＧＬＵＴ４を含む、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
少なくとも１つの試薬が少なくとも２つの試薬である、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
少なくとも２つの試薬が抗体を含む、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記抗体がＧＬＵＴ４に結合する、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
前記試料に添加する安定剤をさらに含む、請求項４５〜５０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５２】
固形腫瘍細胞のプロテアソーム阻害剤への感受性を予測するための方法であって、
ａ）前記細胞が変異ＫＲＡＳを発現するかを判定することと、
ｂ）前記細胞のプロテアソーム阻害剤への感受性を予測することと、を含み、
変異ＫＲＡＳの発現が前記プロテアソーム阻害剤への感受性不足を予測し、前記固形腫瘍細胞が、肺腫瘍細胞および結腸腫瘍細胞からなる群から選択される、前記方法。
【請求項５３】
ＧＬＵＴ４が過剰発現されるかを判定することをさらに含み、ＧＬＵＴ４の過剰発現が前記プロテアソーム阻害剤への感受性不足を予測する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
野生型ＫＲＡＳ状態を含む固形腫瘍を有する患者を治療するための方法であって、前記患者に治療的に有効な量のプロテアソーム阻害剤を投与するステップを含み、前記固形腫瘍が、肺腫瘍および結腸腫瘍からなる群から選択される、前記方法。
【請求項５５】
前記プロテアソーム阻害剤が、ペプチジルボロン酸およびペプチジルエポキシケトンからなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ペプチジルボロン酸が、ボルテゾミブ、クエン酸イクサゾミブ、および［（１Ｒ）−１−［［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［（６−フェニル−ピリジン−２−カルボニル）アミノ］−１−オキソ−ブチル］アミノ］−３−メチルブチル］ボロン酸からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
プロテアソーム阻害剤を非血液学的癌を有する患者の治療における使用に好適であると特定するための方法であって、
ａ）少なくとも１つのマーカー遺伝子に少なくとも１つの変異を含む異種移植片中の腫瘍細胞を試験プロテアソーム阻害剤と接触させることであって、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子がＫＲＡＳである、前記接触させることと、
ｂ）前記試験プロテアソーム阻害剤の前記細胞の生存率への影響を判定することと、
ｃ）前記試験プロテアソーム阻害剤が前記細胞の前記生存率を低下させる場合に、非血液学的癌を有する患者の治療における使用に好適であると決定することと、を含む、前記方法。
【請求項５８】
ＫＲＡＳにおける前記変異が、コドン１２、コドン１３、およびコドン６１からなる群から選択される配列番号２のコドンに存在する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記試験プロテアソーム阻害剤がＧＬＵＴ４の前記発現を減少させる場合に、非血液学的癌を有する患者の治療における使用に好適であると決定するステップをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
プロテアソーム阻害剤での癌の治療代を支払うための方法であって、
ａ）肺癌または結腸癌を有する患者由来の固形腫瘍細胞を含む試料中のＫＲＡＳが変異したかを記録することと、
ｂ）ＫＲＡＳが野生型である場合に、前記プロテアソーム阻害剤での治療の支払いを許可することと、を含む、前記方法。
【請求項６１】
前記プロテアソーム阻害剤が、ペプチジルボロン酸およびペプチジルエポキシケトンからなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ペプチジルボロン酸が、ボルテゾミブ、クエン酸イクサゾミブ、および［（１Ｒ）−１−［［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［（６−フェニル−ピリジン−２−カルボニル）アミノ］−１−オキソ−ブチル］アミノ］−３−メチルブチル］ボロン酸からなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
プロテアソーム阻害剤での治療に応答しないであろう非血液学的癌患者を特定する方法であって、肺癌および結腸癌からなる群から選択される非血液学的癌を有する前記患者由来の腫瘍細胞を含む試料における少なくとも１つのＫＲＡＳ変異の存在または不在を決定することを含み、それによって少なくとも１つのＫＲＡＳ変異の存在が、前記患者が前記プロテアソーム阻害剤に応答しないであろうことを示す、前記方法。
【請求項６４】
前記少なくとも１つのＫＲＡＳ変異が活性化変異である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
少なくとも１つのＫＲＡＳ変異の存在または不在が、前記変異を含む疑いのあるマーカーまたはマーカーの一部を配列決定することによって決定される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記マーカーまたは一部が、コドン１２、コドン１３、またはコドン６１を含む配列番号２またはその一部を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記プロテアソーム阻害剤が、ペプチジルボロン酸およびペプチジルエポキシケトンからなる群から選択される、請求項６３〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記ペプチジルボロン酸が、ボルテゾミブ、クエン酸イクサゾミブ、および［（１Ｒ）−１−［［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［（６−フェニル−ピリジン−２−カルボニル）アミノ］−１−オキソ−ブチル］アミノ］−３−メチルブチル］ボロン酸からなる群から選択される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
プロテアソーム阻害剤での治療に対して好ましい成果を有するであろう非血液学的癌患者を特定する方法であって、肺癌および結腸癌からなる群から選択される非血液学的癌を有する前記患者由来の腫瘍細胞を含む試料における少なくとも１つのＫＲＡＳ変異の存在または不在を決定することを含み、それによって野生型ＫＲＡＳまたはコドン１４６における変異の存在が、前記患者が前記プロテアソーム阻害剤に応答するであろうことを示す、前記方法。
【請求項７０】
少なくとも１つのＫＲＡＳ変異の存在または不在が、前記変異を含む疑いのあるマーカーまたはマーカーの一部を配列決定することによって決定される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記マーカーまたは一部が、コドン１２、コドン１３、コドン６１、またはコドン１４６を含む配列番号２またはその一部を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記プロテアソーム阻害剤が、ペプチジルボロン酸およびペプチジルエポキシケトンからなる群から選択される、請求項６９〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記ペプチジルボロン酸が、ボルテゾミブ、クエン酸イクサゾミブ、および［（１Ｒ）−１−［［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［（６−フェニル−ピリジン−２−カルボニル）アミノ］−１−オキソ−ブチル］アミノ］−３−メチルブチル］ボロン酸からなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１１年１１月１１日出願の米国特許仮出願第６１／５５８，４７４号および２０１２年１１月２日出願の米国特許仮出願第６１／７２１，８１８号に対する優先権を主張するものである。前述の出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、電子的に読み取り可能な形式で本明細書とともに提出される配列表を包含する。電子配列表ファイルは２０１２年１１月８日に作成されたものであり、「ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」というファイル名前であり、２６．４ｋｂ（２７，０９９バイト）である。電子ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔファイル中の配列表の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
細胞は、正常組織環境の制限に支配されない増殖が制御されないようにそれらの細胞の遺伝子型または表現型が変化するときに癌性になる。１つ以上の遺伝子が、変異するか、増幅されるか、欠失するか、過剰発現されるか、または過小発現される。染色体部分は、失われるか、１つの位置から別の位置に移動し得る。いくつかの癌は特徴パターンを有し、それによって遺伝子型または表現型が変化する。
【０００４】
多くの遺伝子は、癌に関連した変異を有する。いくつかの遺伝子は、変異が生じ得る複数の部位を有する。多くの癌は、２つ以上の遺伝子における変異および／または２つ以上の遺伝子の誤発現を有する。遺伝子変異は、腫瘍進行、腫瘍成長速度、または腫瘍の転移を促進し得る。いくつかの変異は、腫瘍細胞が治療に応答するかに影響を及ぼし得る。
【０００５】
様々な作用薬が癌を治療する。血液癌および骨髄癌は、多くの場合、ステロイド／グルココルチコイド、ＩＭｉＤ、プロテアソーム阻害剤、およびアルキル化剤で治療される。他の組織の癌は、多くの場合、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、微小管阻害剤、血管新生阻害剤、または他の作用薬で治療される。一部の患者は、ある治療よりも他の治療に良好に応答し、患者が効果的な治療への複数の治療経路に従う可能性を示す。患者に無効であると最終的に証明される治療を続行することによって、その患者の治療プログラム初期の貴重な時間が無駄に費やされ得る。多くの患者は、治療レジメンを試行錯誤して選択する時間的余裕がない。好都合かつ正確な治療法の決定は、疾患の効果的な管理につながる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、本明細書に提供されるマーカーの少なくとも１つの特徴の測定による固形腫瘍の治療の予後および計画に関する。ヒト癌細胞の異種移植片由来の固形腫瘍試料中のマーカーは、それらの特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量を、プロテアソーム阻害治療での宿主動物のその後の治療の成果と関連させることによって特定された。これらのマーカーは、ペプチジルボロン酸またはペプチジルエポキシケトン等のプロテアソーム阻害剤で患者を治療した後に好ましい成果（例えば、良好な応答、長期の無増悪期間、および／または長期生存）が存在するかを予測する。遺伝子マーカーの存在、量、または変化を決定するための腫瘍細胞を含む試験試料は、例えば、プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸での治療によって好ましい成果を有すると予想される特定の患者（これらの患者の疾患は、標準的な治療またはそれほど積極的ではない治療によって管理され得る）、ならびにその治療で好ましくない成果を有すると予想され、かつ好ましい成果および／または疾患の管理の成功を確実にもたらすために、プロテアソーム阻害剤の代替治療、プロテアソーム阻害剤との治療の組み合わせ、および／またはプロテアソーム阻害剤でのより積極的な治療を必要とし得る患者を特定する。
【０００７】
一態様において、本発明は、マーカーの特徴、例えば、量、存在、または変化の決定に有用なキットを提供する。別の態様では、本発明は、予後および治療または疾患管理戦略を決定するための方法を提供する。これらの態様において、腫瘍細胞を含む試料中のマーカーの特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量が測定される。一実施形態において、腫瘍は、固形腫瘍、例えば、非血液学的腫瘍、例えば、非小細胞肺癌、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、頭頸部癌、前立腺癌、または腎細胞癌である。
【０００８】
様々な実施形態において、本明細書に記載の１つ以上の変異、例えば、体細胞変異を有するマーカー遺伝子に対応するマーカーＤＮＡの特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、もしくは量、マーカーＲＮＡの大きさ、配列、組成、もしくは量、および／またはマーカータンパク質の大きさ、配列、組成、活性、もしくは量が測定される。マーカー遺伝子についての情報、例えば、その遺伝子が変異するか否か、その変異の正体、および／または１つの変異遺伝子もしくは複数の変異遺伝子のＲＮＡもしくはタンパク質量が過剰発現もしくは過小発現を示すかをアッセイが明らかにするときに、予後または治療または疾患管理戦略につながる有用な情報が得られる。一実施形態において、プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸、例えば、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））、またはクエン酸イクサゾミブ（ＭＬＮ９７０８）治療のための戦略が決定される。
【０００９】
例えばプロテアソーム阻害剤を用いた非血液学的腫瘍、すなわち、固形腫瘍の予後または治療または疾患管理戦略の決定の試験に有用なマーカー遺伝子は、ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２  Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）である。このマーカー遺伝子は、マーカーＤＮＡ中のその存在、あるいは例えばマーカーＲＮＡおよび／またはタンパク質の特徴、例えば、量、大きさ、配列、活性、もしくは組成へのその影響が、予後または治療または疾患管理の決定のための情報を提供し得る変異または変化を含む。いくつかの実施形態において、マーカー遺伝子として有用な遺伝子もしくは変異体またはそれらの修飾された形態は、例えば腫瘍細胞を含む試料中の１つ以上のマーカー、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質の特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、もしくは量に関連しており、通常のＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質とは異なる。「マーカー遺伝子」と称されるこの遺伝子の修飾の例が本明細書に記載され、その変異は、そのような情報を提供し得る。
【００１０】
いくつかの実施形態において、非血液学的腫瘍、すなわち、固形腫瘍の決定のための、例えばプロテアソーム阻害剤を用いた予後または治療または疾患管理戦略の試験に有用なマーカー遺伝子は、グルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）である。
【００１１】
本発明のマーカー遺伝子の変異は、例えば、プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸またはペプチジルエポキシケトンでの治療後の成果についての情報を提供し得る。腫瘍における特定されたマーカーのうちの１つ以上の特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量を試験することによって、どの治療薬、治療薬の組み合わせ、投薬および／または投与レジメンが、治療時に好ましい成果を提供すると予想されるかを決定することが可能である。癌における特定されたマーカーまたはマーカーセットのうちの１つ以上の特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量を試験することによって、どの治療薬、治療薬の組み合わせ、投薬および／または投与レジメンが、治療時に好ましい成果を提供する可能性が低いかを決定することも可能である。特定されたマーカーのうちの１つ以上の特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、もしくは量を試験することによって、効果がないか、または不適切な治療薬もしくはレジメンを排除することが可能である。重要なことに、これらの決定は、患者別に行われ得る。したがって、特定の患者または患者の種類に恩恵をもたらす可能性が高いか否か、および／または特定のレジメンが開始もしくは回避されるか、継続されるか、中止されるか、または変更されるべきかを決定することができる。
【００１２】
本発明は、治療レジメン、例えば、ペプチジルボロン酸またはペプチジルエポキシケトン治療等のプロテアソーム阻害剤を含む治療レジメンの投与時に好ましい成果を示すと予想される癌患者を特定および／または選択する方法を対象とする。そのような治療レジメンの投与時に好ましくない成果を有すると予想される患者を特定する方法がさらに提供される。これらの方法は、典型的には、患者の腫瘍（例えば、患者の癌細胞、例えば、非血液学的癌細胞、例えば、固形腫瘍細胞）における１つ以上のマーカーの特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、もしくは量、またはマーカー遺伝子の変異についての情報を測定すること、決定すること、受信すること、記憶すること、または送信すること、任意に、それを参照マーカーの特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、もしくは量と比較することを含み、さらなる実施形態において、試料の結果が、ペプチジルボロン酸またはペプチジルエポキシケトンでの治療レジメン等の例えばプロテアソーム阻害剤での治療レジメンの好ましい成果に相当するかを特定または通知することを含む。
【００１３】
さらに提供される方法には、患者が、治療薬、例えば、プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸またはペプチジルエポキシケトンでの治療レジメンによって好ましい成果を示すと予想されることをマーカー遺伝子の変異の存在、または患者の１つのマーカーまたは複数のマーカーの特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、もしくは量が示す場合に、適宜に治療を開始するステップ、継続するステップ、または始めるステップをさらに含む治療方法が含まれる。加えて、この方法は、患者が、例えば、同一の治療レジメンを受けることによって好ましい成果を有すると特定された患者と比較して、例えば、ペプチジルボロン酸またはペプチジルエポキシケトン等のプロテアソーム阻害剤での治療レジメンによって好ましくない成果を示すと予想されることをマーカー遺伝子における変異の存在、または患者のマーカーの特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、もしくは量が示す場合に、適宜に治療を停止するステップ、中止するステップ、変更するステップ、または中断するステップをさらに含む治療方法を含む。別の態様では、治療薬、例えば、プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸またはペプチジルエポキシケトンで治療されていない患者を分析するための方法、ならびにマーカー遺伝子における変異の存在、または本明細書に記載の患者のマーカーのうちの１つ以上の特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、もしくは量に基づいて治療成果を特定および予測するための方法が提供される。そのような方法は、治療薬、例えば、プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸もしくはペプチジルエポキシケトン治療薬で治療されないこと、治療薬、例えば、プロテアソーム阻害剤で治療されること、もう１つのさらなる治療薬と組み合わせてペプチジルボロン酸もしくはペプチジルエポキシケトン治療薬で治療されること、ペプチジルボロン酸もしくはペプチジルエポキシケトン治療薬等のプロテアソーム阻害剤の代替の治療薬で治療されること、または例えば、標準のプロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸もしくはペプチジルエポキシケトン治療薬に対して好ましい成果を有すると特定された患者の投薬および／もしくは投与レジメンと比較して、治療薬、例えば、プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸もしくはペプチジルエポキシケトン阻害剤のより積極的な投薬および／もしくは投与レジメンで治療されることを含み得る。したがって、本発明の提供される方法は、治療薬、例えば、プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸またはペプチジルエポキシケトン治療レジメンの効果のない使用または不適切な使用を排除し得る。
【００１４】
さらなる方法は、作用薬の活性、作用薬の有効性を決定する方法、または新たな治療薬もしくは組み合わせを特定する方法を含む。そのような方法は、マーカー遺伝子における変異の存在、または本発明の１つのマーカーもしくは複数のマーカーの特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、もしくは量に影響を与える能力に基づいて、癌、例えば、非血液学的癌、すなわち、固形腫瘍癌（例えば、非小細胞肺癌、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、頭頸部癌、前立腺癌、または腎細胞癌）の治療に、例えば、プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸もしくはペプチジルエポキシケトンと同程度に有用な作用薬を特定する方法を含む。いくつかの実施形態において、癌を有する患者の好ましい成果が癌の候補作用薬であることを示すように、マーカー遺伝子における変異の存在、または１つのマーカーもしくは複数のマーカーの特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、もしくは量を減少または増加させる阻害剤が提供される（すなわち、細胞集団において、阻害剤は、それぞれ、変異特徴を含む細胞を不利に選択するか、または変異もしくは特徴を含む細胞を有利に選択する）。別の実施形態では、好ましくない成果を示すマーカーを含む腫瘍細胞の生存率を増加させることができる作用薬が癌の候補作用薬である。
【００１５】
本発明は、癌患者を、治療レジメン、例えば、プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸またはペプチジルエポキシケトン治療レジメンで（例えば、単独で、または化学療法剤等のさらなる作用薬、例えば、グルココルチコイド作用薬、微小管阻害剤、アルキル化剤、キナーゼ阻害剤、もしくはトポイソメラーゼ阻害剤と組み合わせて）治療する方法も対象とし、この方法は、患者の治療法を選択するステップ（その患者のマーカー特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量が、患者が治療レジメンによって好ましい成果を有すると予想されることを示す）と、患者を治療薬、例えば、プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸治療薬で治療するステップとを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、患者を選択するステップ（この患者のマーカー特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または１つの量もしくは複数の量が、患者が好ましい成果を有すると予想されることを示す）と、プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸治療薬と同様の予想される無増悪生存期間を示すプロテアソーム阻害剤治療薬以外の治療薬を投与するステップとを含み得る。
【００１６】
癌患者を治療するさらなる方法は、癌療法（例えば、プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸またはペプチジルエポキシケトン治療薬）での治療時に好ましい成果を経験する可能性が低い患者を選択することを含む。そのような方法は、標準の治療によって好ましい成果を有すると特定された患者の用量または投薬スケジュールと比較して、より高い用量または増加した投薬スケジュールの治療薬、例えば、プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸またはペプチジルエポキシケトンを投与すること；プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸またはペプチジルエポキシケトン治療薬以外の癌治療薬を投与すること；化学療法剤、例えば、グルココルチコイド剤、微小管阻害剤、アルキル化剤、キナーゼ阻害剤、またはトポイソメラーゼ阻害剤等のさらなる作用薬と組み合わせて、プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸またはペプチジルエポキシケトン剤を投与することのうちの１つ以上をさらに含み得る。より短い無増悪期間または短期間生存を示すと予想される侵攻性疾患を有する患者を選択するための方法がさらに提供される。
【００１７】
さらなる方法は、癌治療薬、例えば、プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸またはペプチジルエポキシケトン治療レジメンに対する成果を示す患者の１つまたは複数のマーカーの量を審査することによって、癌、例えば、非血液学的癌、すなわち、固形腫瘍癌（例えば、非小細胞肺癌、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、頭頸部癌、前立腺癌、または腎細胞癌）を治療するか、またはその治療代を支払うかを評価する方法、および支払いが行われるべきかの決断を下すか、または勧める方法を含む。
【００１８】
本明細書で言及されるすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献の全内容は、参照により組み込まれる。
【００１９】
本発明の他の特徴および利点は、以下の発明を実施するための形態、図面、および特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＫＲＡＳの変異状態と腫瘍異種移植片のＭＬＮ２２３８への感受性との相関関係。
【図２Ａ】ビヒクル対照と比較した代表的な異種移植片におけるＭＬＮ２２３８の抗腫瘍活性。Ａ．ＰＨＴＸ１３２Ｌｕ一次ＮＳＣＬＣ異種移植片（野生型ＫＲＡＳ）、Ｂ．ＨＣＴ−１１６異種移植片（変異体ＫＲＡＳ）。
【図２Ｂ】同上。
【図３Ａ】同質遺伝子ＳＷ４８細胞株の異種移植片におけるＭＬＮ２２３８の抗腫瘍活性。Ａ．ＳＷ４８異種移植片（野生型ＫＲＡＳ）、Ｂ．ＳＷ４８−ＫｒａｓＧ１３Ｄ異種移植片（組換え変異ＫＲＡＳ−Ｇ１３Ｄ）、Ｃ．ＳＷ４８−ＫｒａｓＧ１２Ｖ異種移植片（組換え変異ＫＲＡＳ−Ｇ１２Ｖ）。
【図３Ｂ】同上。
【図３Ｃ】同上。
【図４Ａ】ＫＲＡＳ野生型細胞および変異体細胞由来のＧＬＵＴ４タンパク質のウエスタンブロット。図４Ａ：生体外で増殖した細胞におけるＧＬＵＴ４レベル、図４Ｂ：腫瘍異種移植片におけるＧＬＵＴ４レベル。
【図４Ｂ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
癌患者の治療に関する依然として存在する問題のうちの１つは、治療薬への応答の個体差である。功を奏する癌療法の開発における進展が進歩する一方で、一部の患者のみが任意の特定の療法に応答する。多くの利用可能な癌療法の低い治療指数および毒性のため、そのような応答差は、患者が、不要で効果がなく、さらには有害である可能性のある治療レジメンを経験する一員となる可能性がある。設計された療法が個々の患者を治療するように最適化され得る場合、そのような状況は低減するか、またはさらには排除され得る。さらに、標的とされる設計された療法は、全体的により集中的かつ功を奏する療法を患者に提供し得る。したがって、特定の癌療法を投与したときに好ましい成果を有すると予想される特定の癌患者、ならびにより積極的および／または代替の癌療法、例えば、患者に投与された以前の癌療法の代替療法を用いることによって好ましい成果を有し得る特定の癌患者を特定する必要性が存在する。したがって、特定の癌阻害療法から恩恵を受け、かつより積極的なおよび／または代替の癌阻害療法、例えば、患者が受けた１つもしくは複数の癌療法の代替療法から恩恵を受ける患者、例えば、非血液学的癌患者、例えば、固形腫瘍（例えば、非小細胞肺癌、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、頭頸部癌、前立腺癌、または腎細胞癌）を有する患者を含む癌患者を診断、進行度診断、予後診断、および監視することは有益であり、したがって、適切な予防措置につながる。
【００２２】
本発明は、マーカー遺伝子の変異が変異遺伝子を含む細胞のプロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸への感受性に関連し得るという認識に一部基づく。いくつかの実施形態において、マーカー遺伝子は、ラット肉腫（ＲＡＳ）シグナル伝達経路、例えば、その変異が経路の活性化を可能にする遺伝子に関与する。ＲＡＳは、発癌性ＧＴＰａｓｅであり、その活性ＧＴＰ結合状態が腫瘍形成に関与する経路（例えば、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼカスケード）を活性化する。腫瘍抑制因子を含むタンパク質は、ＲＡＳ結合ＧＴＰのＧＤＰへの加水分解を促進してＲＡＳを不活性化し、したがって、ＲＡＳ癌遺伝子からのシグナル伝達を制限する。ＲＡＳ癌遺伝子上流（例えば、ｐ２１０ＢＣＲ−ＡＢＬもしくはｅｒｂＢ）、ＲＡＳ癌遺伝子（例えば、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、もしくはＮＲＡＳ）、ＲＡＳ関連腫瘍抑制因子（神経線維腫症１型（ＮＦ１））、および／またはＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（例えば、ＲＡＳＧＡＰ）のいずれかにおけるこのチェックポイントに関与する遺伝子における変異は、ＲＡＳシグナル伝達経路の活性化を可能にし得る。プロテアソーム阻害剤への感受性のためにマーカー遺伝子によってコードされるタンパク質は、ＲＡＳタンパク質であり得る。ＫＲＡＳは、マーカー遺伝子の一例である。ＲＡＳ、例えば、ＮＲＡＳ、ＨＲＡＳ、およびＫＲＡＳタンパク質のＧＴＰ結合状態でＲＡＳシグナル伝達が生じ、ＧＤＰ結合状態でシグナル伝達が抑制される。変異ＲＡＳタンパク質は、そのＧＴＰ結合状態での期間を延長し得、結果として生じるシグナル伝達経路活性化は、変異遺伝子を持つ細胞の増殖をもたらし得る。マーカー遺伝子は、１つ以上の変異、例えば、体細胞変異を呈し得、その存在は、コードされた遺伝子産物の発現または活性に影響を与え得る。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞または腫瘍中のマーカー遺伝子において２つ以上の変異が存在し得る。さらなる実施形態において、１つ以上のさらなる遺伝子で変異（腫瘍形成をもたらし得る変異を含む）を有する細胞においてマーカー遺伝子変異が存在し得るが、さらなる変異遺伝子（複数を含む）は、本明細書でマーカー遺伝子と見なされるマーカー遺伝子ではない場合がある。いくつかの実施形態において、変異は、活性化変異である。他の実施形態では、変異は、マーカー遺伝子の発現に影響を与える。他の実施形態では、変異は、コードされた遺伝子産物と細胞結合パートナーとの相互作用の変化をもたらし得る。
【００２３】
一態様において、本発明は、肺腫瘍および結腸腫瘍からなる群から選択される固形腫瘍を有する患者をプロテアソーム阻害剤で治療するかを決定するための方法を提供し、この方法は、ａ）腫瘍細胞を含む患者試料中の少なくとも１つのマーカー遺伝子に関連した少なくとも１つのマーカーの少なくとも１つの特徴を測定するステップ（１つのマーカー遺伝子がｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２  Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）である）、ｂ）ステップａ）で測定された少なくとも１つの特徴がプロテアソーム阻害剤での治療成果に情報的に有益であるかを特定するステップ、およびｃ）腫瘍細胞が野生型ＫＲＡＳを含むことを情報的に有益な特徴が示す場合に、患者をプロテアソーム阻害剤で治療することを決定するステップを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、腫瘍細胞がコドン１４６での変異を有する野生型ＫＲＡＳまたはＫＲＡＳを含むことを情報的に有益な特徴が示す場合に、患者をプロテアソーム阻害剤で治療することを決定することを含む。いくつかの実施形態において、プロテアソーム阻害剤で治療するかを決定する方法は、生体外で行われる。
【００２４】
別の態様では、本発明は、患者における固形腫瘍のプロテアソーム阻害剤での治療を継続するかを決定するための方法を提供し、ａ）固形腫瘍を有する患者をプロテアソーム阻害剤で治療すること、ｂ）患者から腫瘍細胞を含む試料を得ること、ｃ）試料中の少なくとも１つのマーカー遺伝子に関連した少なくとも１つのマーカーの少なくとも１つの特徴を測定すること（少なくとも１つのマーカー遺伝子がＫＲＡＳである）、ｄ）ｃ）での測定結果を参照と比較すること、およびｅ）試料中の固形腫瘍細胞が野生型ＫＲＡＳを含むことを比較が示す場合に、プロテアソーム阻害剤での治療を継続することを決定することを含み、患者は、肺腫瘍および結腸腫瘍からなる群から選択される固形腫瘍を有する。いくつかの実施形態において、この方法は、固形腫瘍細胞がコドン１４６での変異を有する野生型ＫＲＡＳまたはＫＲＡＳを含むことを比較が示す場合に、患者のプロテアソーム阻害剤での治療を継続することを決定することを含む。いくつかの実施形態において、プロテアソーム阻害剤での治療を継続するかを決定する方法は、生体外で行われる。
【００２５】
別の態様では、本発明は、腫瘍細胞を含む試料に添加する安定剤と試料中の少なくとも１つのマーカーの少なくとも１つの特徴を測定する試薬とを含むキットを提供し、測定結果は、少なくとも１つのマーカー遺伝子に変異が存在するかを示し、少なくとも１つのマーカー遺伝子は、ＫＲＡＳである。
【００２６】
別の態様では、本発明は、試料中の少なくとも２つのマーカーの少なくとも１つの特徴を測定する少なくとも２つの試薬を含むキットを提供し、測定結果は、少なくとも１つのマーカー遺伝子に変異が存在するかを示し、少なくとも１つのマーカー遺伝子は、ＫＲＡＳであり、試料は、固形腫瘍細胞を含み、この固形腫瘍細胞は、肺腫瘍細胞および結腸腫瘍細胞からなる群から選択される。
【００２７】
別の態様では、本発明は、固形腫瘍細胞のプロテアソーム阻害剤への感受性を予測するための方法を提供し、ａ）細胞が変異ＫＲＡＳを発現するかを判定すること、およびｂ）細胞のプロテアソーム阻害剤への感受性を予測することを含み、変異ＫＲＡＳの発現は、プロテアソーム阻害剤への感受性不足を予測し、固形腫瘍細胞は、肺腫瘍細胞および結腸腫瘍細胞からなる群から選択される。一実施形態において、変異ＫＲＡＳは、変異コドン１４６を有しない。
【００２８】
別の態様では、本発明は、野生型ＫＲＡＳ状態を含む固形腫瘍を有する患者を治療するための方法を提供し、患者に治療的に有効な量のプロテアソーム阻害剤を投与するステップを含み、固形腫瘍は、肺腫瘍および結腸腫瘍からなる群から選択される。一実施形態において、固形腫瘍は、コドン１４６での変異を有する野生型ＫＲＡＳまたはＫＲＡＳを含む。
【００２９】
別の態様では、本発明は、肺腫瘍および結腸腫瘍からなる群から選択される固形腫瘍を治療するための薬剤の製造におけるプロテアソーム阻害剤の使用を提供し、固形腫瘍は、野生型ＫＲＡＳを有する。一実施形態において、固形腫瘍は、コドン１４６での変異を有する野生型ＫＲＡＳまたはＫＲＡＳを有する。
【００３０】
別の態様では、本発明は、患者における肺腫瘍または結腸腫瘍を治療するためのプロテアソーム阻害剤の使用を提供し、その患者の肺腫瘍または結腸腫瘍は、野生型ＫＲＡＳを有する。一実施形態において、腫瘍は、コドン１４６での変異を有する野生型ＫＲＡＳまたはＫＲＡＳを有する。
【００３１】
別の態様では、本発明は、プロテアソーム阻害剤を非血液学的癌を有する患者の治療での使用に好適であると特定するための方法を提供し、ａ）少なくとも１つのマーカー遺伝子に少なくとも１つの変異を含む異種移植片中の腫瘍細胞を試験プロテアソーム阻害剤と接触させること（少なくとも１つのマーカー遺伝子がＫＲＡＳである）、ｂ）試験プロテアソーム阻害剤の細胞の生存率への影響を判定すること、およびｃ）試験プロテアソーム阻害剤が細胞の生存率を低下させる場合に、非血液学的癌を有する患者の治療での使用に好適であると決定することを含む。一実施形態において、変異は、ＫＲＡＳのコドン１４６で生じない。
【００３２】
別の態様では、本発明は、プロテアソーム阻害剤での癌治療の代金を支払うための方法を提供し、ａ）肺癌または結腸癌を有する患者由来の固形腫瘍細胞を含む試料中のＫＲＡＳが変異したかを記録すること、およびｂ）ＫＲＡＳが野生型である場合に、プロテアソーム阻害剤での治療の支払いを許可することを含む。一実施形態において、この方法は、ＫＲＡＳが野生型であるか、またはコドン１４６で変異した場合に、支払いを許可することを含む。
【００３３】
プロテアソーム阻害剤での治療に応答しないであろう非血液学的癌患者を特定する方法であって、肺癌および結腸癌からなる群から選択される非血液学的癌を有する患者由来の腫瘍細胞を含む試料における少なくとも１つのＫＲＡＳ変異の存在または不在を決定することを含み、それによって少なくとも１つのＫＲＡＳ変異の存在が、患者がプロテアソーム阻害剤に応答しないであろうことを示す。一実施形態において、変異は、コドン１４６で生じない。
【００３４】
別の態様では、本発明は、プロテアソーム阻害剤での治療に好ましい成果を有する非血液学的癌患者を特定する方法を提供し、肺癌および結腸癌からなる群から選択される非血液学的癌を有する患者由来の腫瘍細胞を含む試料における少なくとも１つのＫＲＡＳ変異の存在または不在を決定することを含み、それによって野生型ＫＲＡＳの存在またはコドン１４６での変異が、患者がプロテアソーム阻害剤に応答することを示す。
【００３５】
いくつかの実施形態において、この変異は、腫瘍細胞またはそれから調製された抽出物においてＫＲＡＳマーカー遺伝子に関連したマーカーの特徴を測定することによって特定される。いくつかの実施形態において、この方法は、腫瘍細胞ＫＲＡＳ配列を決定することを含む。
【００３６】
本発明のさらなる実施形態は、腫瘍細胞または腫瘍における特定に基づき、そのプロテアソーム阻害剤への感受性または耐性は、ＲＡＳマーカー遺伝子、さらなるマーカー遺伝子、グルコース輸送体、例えば、ＧＬＵＴ４の変異状態に相関する。一実施形態において、特徴、例えば、組成、活性、もしくは量、例えば、グルコース輸送体、例えば、ＧＬＵＴ４の腫瘍細胞または腫瘍における発現は、ＫＲＡＳマーカー遺伝子の変異状態、または特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、もしくは量に相関し得る。いくつかの実施形態において、プロテアソーム阻害剤への感受性と相関したグルコース輸送体マーカー特徴は、量である。いくつかの実施形態において、グルコース輸送体マーカー、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質は、情報的に有益で特徴的な量の腫瘍細胞において低発現または標準の発現を有し、そのＲＡＳマーカー遺伝子は、プロテアソーム阻害剤で腫瘍を治療したときに好ましい成果を示す変異状態を有する。いくつかの実施形態において、グルコース輸送体マーカー、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質は、情報的に有益な特徴である野生型ＫＲＡＳの発現を有する腫瘍細胞における情報的に有益な特徴である低発現または標準の発現を有する。一実施形態において、本発明の方法は、ＫＲＡＳ変異状態を特定するステップとＧＬＵＴ４の発現を測定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、腫瘍、例えば、固形腫瘍が、野生型ＫＲＡＳおよび低ＧＬＵＴ４発現または標準のＧＬＵＴ４発現を含む患者は、プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸またはペプチジルエポキシケトンでの治療において好ましい成果を有することが予測される。別の実施形態では、腫瘍、例えば、固形腫瘍が、変異体ＫＲＡＳ、および高い、標準より高い、または参照レベルより高いＧＬＵＴ４発現を含む患者は、プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸またはペプチジルエポキシケトンでの治療において好ましくない成果を有することが予測される。
【００３７】
マーカー遺伝子における変異の特定および／もしくは測定、またはマーカーの特徴を用いて、例えばプロテアソーム阻害剤、例えばペプチジルボロン酸またはペプチジルエポキシケトン治療薬で腫瘍を治療することによって好ましい成果が予想され得るか、あるいは例えばプロテアソーム阻害剤、例えばペプチジルボロン酸もしくはペプチジルエポキシケトン阻害剤の代替治療、および／またはそれを用いたより積極的な治療が応答を増強し得るかを決定することができる。例えば、本明細書に提供される組成物および方法を用いて、患者が、プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸またはペプチジルエポキシケトン治療薬投薬または投与レジメンに好ましい成果を有すると予想されるかを決定することができる。これらの特定に基づいて、本発明は、制限なく、１）プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸またはペプチジルエポキシケトン治療レジメンが好ましい成果の達成および／または癌の管理に効果的であるかを決定するための方法および組成物、２）プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸またはペプチジルエポキシケトン治療薬（単独で、または作用薬と組み合わせて）ならびに腫瘍の治療に使用される投薬および投与レジメンの有効性を監視するための方法および組成物、３）例えばプロテアソーム阻害剤、例えばペプチジルボロン酸またはペプチジルエポキシケトン阻害治療レジメンを含む腫瘍を治療するための方法および組成物、４）特定の治療薬および治療薬の組み合わせ、ならびに特定の患者における腫瘍の治療に有効な投薬および投与レジメンを特定するための方法および組成物、ならびに５）疾患管理戦略を特定するための方法および組成物を提供する。
【００３８】
プロテアソーム阻害は、癌療法における重要な戦略を表す。プロテアソームは、細胞周期の調整に関与するタンパク質を分解する役割を果たすすべての細胞に存在する多酵素複合体である。例えば、Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１６５２−１６５９（１９９６））は、ユビキチン−プロテアソーム経路が、細胞周期、腫瘍成長、および転移の調整に重要な役割を果たすことを示した。ｐ５３、サイクリン、ならびにサイクリン依存性キナーゼｐ２１およびｐ２７ＫＩＰ１を含むいくつかの主要な調節タンパク質は、ユビキチン−プロテアソーム経路によって細胞周期中に一時的に分解される。これらのタンパク質の要求される分解は、細胞が細胞周期を通じて成長し、かつ有糸分裂を経るのに必要とされる。さらに、ユビキチン−プロテアソーム経路は、転写調節に必要とされる。Ｐａｌｏｍｂｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．（国際特許出願公開第ＷＯ９５／２５５３３号）は、転写因子ＮＦ−κＢの活性化が阻害剤タンパク質ＩκＢのプロテアソーム媒介性分解によって調節されることを教示する。次いで、ＮＦ−κＢは、免疫および炎症応答に関与する遺伝子の調節において中心的役割を果たす。例えば、Ｒｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２：４９３−５０６（１９９５））は、ユビキチン−プロテアソーム経路が、Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、およびＶＣＡＭ−１等の細胞接着分子の発現に必要とされることを示した。Ｚｅｔｔｅｒ（Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：２１９−２２９（１９９３））は、腫瘍細胞の脈管構造への接着および脈管構造からの血管外遊出を体内の遠位組織部位に指向することによって、細胞接着分子が生体内での腫瘍転移および血管新生に関与することを見出したため、さらなる所見は、癌療法におけるプロテアソーム阻害の役割をさらに支持する。さらに、Ｂｅｇ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：７８２（１９９６））は、ＮＦ−κＢが抗アポトーシス因子であり、ＮＦ−κＢ活性化の阻害が細胞の環境ストレスおよび細胞毒性剤に対する感受性をさらに高めることを見出した。ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））は、ファーストインクラスのペプチジルボロン酸プロテアソーム阻害剤である。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、「プロテアソーム」という用語は、細胞がもはや必要としないタンパク質または欠陥タンパク質を分解することによってタンパク質の恒常性に関与し、かつユビキチンまたはユビキチン様タンパク質で標識されることによって分解の標的とされる細胞内複合体を指す。プロテアソームは、タンパク質分解を媒介するプロテアーゼを有するコア複合体を含む。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、「プロテアソーム阻害剤」という用語は、生体外または生体内で２０Ｓまたは２６Ｓプロテアソームの酵素活性を直接阻害する任意の物質を指す。プロテアソーム阻害剤、それらの薬理学的特性、ならびに腫瘍学的疾患および炎症性疾患を含む疾患の治療における使用は、Ｒｕｇｇｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７：９１−１３５に概説されている。いくつかの実施形態において、プロテアソーム阻害剤は、ペプチジルボロン酸である。本発明の方法における使用に好適なペプチジルボロン酸プロテアソーム阻害剤の例は、Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，７８０，４５４号（１９９８）、同第６，０６６，７３０号（２０００）、同第６，０８３，９０３号（２０００）、同第６，２９７，２１７号（２００１）、同第６，４６５，４３３号（２００２）、同第６，５４８，６６８号（２００３）、同第６，６１７，３１７号（２００３）、および同第６，７４７，１５０号（２００４）に開示されており、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、それに開示されるすべての化合物および式を含む。いくつかの実施形態において、ペプチジルボロン酸プロテアソーム阻害剤は、Ｎ（４モルホリン）カルボニル−β−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸、Ｎ（８キノリン）スルホニル−β−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニン−Ｌ−アラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸、Ｎ（ピラジン）カルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸、およびＮ（４モルホリン）−カルボニル−［Ｏ−（２−ピリジルメチル）］−Ｌ−チロシン−Ｌ−ロイシンボロン酸からなる群から選択される。一実施形態において、プロテアソーム阻害剤は、Ｎ（ピラジン）カルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸（ボルテゾミブ、以前はＭＬＮ３４１と呼ばれたＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、またはＰＳ−３４１）である。別の実施形態では、プロテアソーム阻害剤は、米国特許第７，４４２，８３０号に開示されており、例えば、［（１Ｒ）−１（｛［（２，４−ジクロロベンゾイル）アミノ］アセチル｛−アミノ）−３−メチルブチル］ボロン酸（ＭＬＮ２２３８）またはそのボロン酸エステル、例えば、そのクエン酸エステル、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００９１５４７３７号に開示されるもの（クエン酸イクサゾミブ、ＭＬＮ９７０８）である。経口投与され得るクエン酸イクサゾミブ、例えば、ＭＬＮ９７０８は、様々な血液学的および固形腫瘍異種移植片モデルにおいて抗腫瘍活性を有する（Ｋｕｐｐｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７０：１９７０−１９８０）。ＭＬＮ９７０８は、水溶液または血漿に曝露すると迅速に加水分解して活性形態のＭＬＮ２２３８になるクエン酸エステルである。別の実施形態では、ペプチドボロン酸は、米国特許第７，９１５，２３６号に開示されており、例えば、［（１Ｒ）−１−［［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［（６−フェニル−ピリジン−２−カルボニル）アミノ］−１−オキソ−ブチル］アミノ］−３−メチルブチル］ボロン酸（デランゾミブ）である。前述の特許公開のそれぞれの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４１】
ペプチジルボロン酸プロテアソーム阻害剤のさらなる例は、Ｆｌｅｍｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌｉ、国際特許公開第ＷＯ２０１０／０３６３５７号および同第ＷＯ２０１１／１２３５０２号に開示されており、これらいずれも参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、それらに開示されるすべての化合物および式を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態において、プロテアソーム阻害剤は、式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2014533112.tif 000003
または薬学的に許容される塩もしくは薬学的組成物もしくはそれらのボロン酸無水物を特徴とし、式中、
Ｚ１およびＺ２はそれぞれ、独立して、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、もしくはアラルコキシであるか、またはＺ１およびＺ２は、ボロン酸錯化剤に由来する部分を一緒に形成する。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、「ボロン酸」という用語は、−Ｂ（ＯＨ）２部分を含有する化学化合物を指す。いくつかの実施形態において、ボロン酸化合物は、ボロン酸部分の脱水によってオリゴマー無水物を形成し得る。例えば、Ｓｎｙｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８０：３６１１（１９５８）は、オリゴマーアリールボロン酸を報告している。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、「ボロン酸無水物」という用語は、１つ以上の水分子を喪失した、ボロン酸化合物の２つ以上の分子の組み合わせによって形成される化学化合物を指す。水と混合されると、ボロン酸無水物化合物は水和して遊離ボロン酸化合物を放出する。様々な実施形態において、ボロン酸無水物は、２つ、３つ、または４つ以上のボロン酸ユニットを含み得、環状または線状構造を有し得る。本発明のペプチドボロン酸化合物のオリゴマーボロン酸無水物の非限定的な例が、以下に示される：
【化２】
2014533112.tif 000004
【化３】
2014533112.tif 000005
【００４５】
真上の式（１）および（２）において、可変ｎは、０〜約１０、好ましくは、０、１、２、３、または４の整数である。いくつかの実施形態において、ボロン酸無水物化合物は、式（２）の環状三量体（「ボロキシン」）を含み、式中、ｎは、１である。可変Ｗは、以下の式（３）を有する：
【化４】
2014533112.tif 000006
【００４６】
いくつかの実施形態において、ボロン酸無水物化合物に存在するボロン酸の少なくとも８０％は、単一のオリゴマー無水物形態で存在する。いくつかの実施形態において、ボロン酸無水物化合物に存在するボロン酸の少なくとも８５％、９０％、９５％、または９９％は、単一のオリゴマー無水物形態で存在する。ある好ましい実施形態において、ボロン酸無水物化合物は、式（３）を有するボロキシンからなるか、またはそれから本質的になる。
【００４７】
ボロン酸無水物化合物は、好ましくは、再結晶化、凍結乾燥、熱への曝露、および／または乾燥剤への曝露を含むが、これらに限定されない脱水条件に曝露することによって対応するボロン酸から調製され得る。好適な再結晶化溶媒の非限定的な例として、酢酸エチル、ジクロロメタン、ヘキサン、エーテル、アセトニトリル、エタノール、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００４８】
いくつかの実施形態において、Ｚ１およびＺ２は、Ｏｌｈａｖａ  ａｎｄ  Ｄａｎｃａの米国特許第７，４４２，８３０号、同第７，８６７，６６２号、および同第８，００３，８１９号に開示されるボロン酸錯化剤に由来する部分を一緒に形成し、これらはすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本発明の目的のために、「ボロン酸錯化剤」という用語は、それぞれがホウ素と共有結合を形成し得る少なくとも２つの官能基を有する任意の化合物を指す。好適な官能基の非限定的な例として、アミノ、ヒドロキシル、およびカルボキシルが挙げられる。いくつかの実施形態において、官能基のうちの少なくとも１つは、ヒドロキシル基である。「ボロン酸錯化剤に由来する部分」という用語は、ボロン酸錯化剤の２つの官能基から水素原子を取り除くことによって形成される部分を指す。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、「ボロン酸エステル」および「ボロン酸エステル」という用語は、同義に使用され、−Ｂ（Ｚ１）（Ｚ２）部分を含有する化学化合物を指し、式中、Ｚ１またはＺ２のうちの少なくとも１つは、アルコキシ、アラルコキシ、もしくはアリールオキシであるか、またはＺ１およびＺ２は、少なくとも１つのヒドロキシル基を有するボロン酸錯化剤に由来する部分を一緒に形成する。
【００５０】
いくつかの実施形態において、Ｚ１およびＺ２はそれぞれ、ヒドロキシであり、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ）：
【化５】
2014533112.tif 000007
または薬学的に許容される塩もしくは薬学的組成物もしくはそれらのボロン酸無水物を特徴とする。
【００５１】
式（ＩＩ）の化合物、［（１Ｒ）−１（｛［（２，４−ジクロロベンゾイル）アミノ］アセチル｛−アミノ）−３−メチルブチル］ボロン酸（ＭＬＮ２２３８）は、Ｏｌｈａｖａ  ａｎｄ  Ｄａｎｃａの米国特許第７，４４２，８３０号に開示されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５２】
いくつかの他の実施形態において、Ｚ１およびＺ２は、鎖または環中の少なくとも２つの連結原子によって分離される少なくとも２つのヒドロキシル基を有する化合物に由来する部分を一緒に形成し、この鎖または環は、炭素原子、および任意に、Ｎ、Ｓ、またはＯであり得る１つまたは複数のヘテロ原子を含み、いずれの場合もホウ素に結合される原子は、酸素原子である。
【００５３】
本明細書で用いられるとき、「少なくとも２つのヒドロキシル基を有する化合物」という用語は、２つ以上のヒドロキシル基を有する任意の化合物を指す。本発明の目的のために、２つのヒドロキシル基は、好ましくは、少なくとも２つの連結原子、好ましくは、約２〜約５つの連結原子、より好ましくは、２つまたは３つの連結原子によって分離される。便宜上、「ジヒドロキシ化合物」という用語は、上で定義される少なくとも２つのヒドロキシル基を有する化合物を指すために使用され得る。したがって、本明細書で用いられるとき、「ジヒドロキシ化合物」という用語は、ヒドロキシル基を２つのみ有する化合物に限定されるようには意図されていない。少なくとも２つのヒドロキシル基を有する化合物に由来する部分は、そのヒドロキシル基のうちの任意の２つの酸素原子によってホウ素に結合され得る。好ましくは、ホウ素原子、ホウ素に結合される酸素原子、および２つの酸素原子を連結する原子は、５または６員環を一緒に形成する。
【００５４】
本発明の目的のために、ボロン酸錯化剤は、好ましくは、薬学的に許容されるもの、すなわち、ヒトへの投与に好適なものである。いくつかの好ましい実施形態において、ボロン酸錯化剤は、例えば、Ｐｌａｍｏｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．の国際公開第ＷＯ０２／０５９１３１号およびＧｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．の国際公開第ＷＯ０２／０５９１３０号に記載の糖である。「糖」という用語は、単糖類、二糖類、多糖類、糖アルコール、およびアミノ糖を含む任意のポリヒドロキシ炭水化物部分を含む。いくつかの実施形態において、糖は、単糖類、二糖類、糖アルコール、またはアミノ糖である。好適な糖の非限定的な例として、グルコース、スクロース、フルクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、グルコサミン、およびＮ−メチルグルコサミンが挙げられる。ある実施形態において、糖は、マンニトールまたはソルビトールである。したがって、糖がマンニトールまたはソルビトールである実施形態において、Ｚ１およびＺ２は、式Ｃ６Ｈ１２Ｏ６の部分を一緒に形成し、２つの脱プロトン化したヒドロキシル基の酸素原子は、ホウ素との共有結合を形成して、ボロン酸エステル化合物を形成する。ある実施形態において、Ｚ１およびＺ２は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，４４２，８３０号に開示のＤ−マンニトールに由来する部分を一緒に形成する。
【００５５】
いくつかの実施形態において、ボロン酸錯化剤は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＥｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．の国際公開第ＷＯ０９／１５４７３７号に記載のα−ヒドロキシカルボン酸またはβ−ヒドロキシカルボン酸である。いくつかの実施形態において、ボロン酸錯化剤は、グリコール酸、リンゴ酸、ヘキサヒドロマンデル酸、クエン酸、２−ヒドロキシイソ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、マンデル酸、乳酸、２−ヒドロキシ−３，３−ジメチル酪酸、２−ヒドロキシ−３−メチル酪酸、２−ヒドロキシイソカプロン酸、β−ヒドロキシイソ吉草酸、サリチル酸、酒石酸、ベンジル酸、グルコヘプトン酸、マロン酸、ラクトビオン酸、ガラクタル酸、エンボン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、および３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸からなる群から選択される。ある実施形態において、ボロン酸錯化剤は、クエン酸である。
【００５６】
α−ヒドロキシカルボン酸またはβ−ヒドロキシカルボン酸がクエン酸であるある実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩＩ−Ａ）もしくは（ＩＩＩ−Ｂ）：
【化６】
2014533112.tif 000008
【化７】
2014533112.tif 000009
またはそれらの混合物もしくはそれらの薬学的組成物を特徴とする。
【００５７】
α−ヒドロキシカルボン酸またはβ−ヒドロキシカルボン酸がクエン酸であるある実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩＩ−Ａ）：
【化８】
2014533112.tif 000010
またはその薬学的組成物を特徴とする。
【００５８】
式（ＩＩＩ−Ａ）、２，２’−｛２−［（１Ｒ）−１−（｛［（２，５ジクロロベンゾイル）アミノ］アセチル｝アミノ）−３−メチルブチル］−５−オキソ−１，３，２−ジオキサボロラン−４，４−ジイル｝ジ酢酸（ＭＬＮ９７０８、クエン酸イクサゾミブ）の化合物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＥｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．の国際公開第ＷＯ０９／１５４７３７号に開示される。
【００５９】
さらに、プロテアソーム阻害剤は、ペプチドアルデヒドプロテアソーム阻害剤（それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，６９３，６１７号（１９９７）、Ｓｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．の国際特許公開第ＷＯ９１／１３９０４号、Ｉｑｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．のＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：２２７６−２２７７（１９９５）、およびＩｉｎｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．の国際特許公開第ＷＯ０５／１０５８２６号）、ペプチジルエポキシケトンプロテアソーム阻害剤（Ｃｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６，８３１，０９９号、Ｓｍｙｔｈ  ｅｔ  ａｌ．の国際特許公開第ＷＯ０５／１１１００８号、Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．の国際特許公開第ＷＯ０６／０４５０６６号、または米国特許出願公開第ＵＳ２００５０２４５４３５号、例えば、（Ｓ）−４−メチル−Ｎ−（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−４−メチル−１−（（Ｒ）−２−メチルオキシラン−２−イル）−１−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）−２−（（Ｓ）−２−（２−モルホリノアセトアミド）−４−フェニルブタンアミド）ペンタンアミド（カーフィルゾミブ）、Ｓｐａｌｔｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．のＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：１３４３（１９９６）、ＭｅｎｇのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：１０４０３（１９９９）、およびＭｅｎｇのＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：２７９８（１９９９））、α−ケトアミドプロテアソーム阻害剤（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  ａｎｄ  Ｍａｌｌａｍｏの米国特許第６，３１０，０５７号（２００１）および同第６，０９６，７７８号（２０００）、ならびにＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６，０７５，１５０号（２０００）および同第６，７８１，０００号（２００４））、ペプチジルビニルエステルプロテアソーム阻害剤（Ｍａｒａｓｔｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．のＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４８：５０３８（２００５）、およびペプチジルビニルスルホンおよび２−ケト−１，３，４−オキサジアゾールプロテアソーム阻害剤（Ｒｙｄｚｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．のＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４９：２９５３（２００６）、およびＢｏｇｙｏ  ｅｔ  ａｌ．のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：６６２９（１９９７）に開示のもの）、アザペプトイド（Ｂｏｕｇｅｔ  ｅｔ  ａｌ．のＢｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１１：４８８１（２００３）、Ｂａｕｄｙ−Ｆｌｏｃ’ｈ  ｅｔ  ａｌ．の国際特許公開第ＷＯ０５／０３０７０７号、およびＢｏｎｎｅｍａｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．の国際特許公開第ＷＯ０３／０１８５５７号）、エフラペプチンオリゴペプチド（Ｐａｐａｔｈａｎａｓｓｉｕの国際特許公開第ＷＯ０５／１１５４３１号）、ラクタシスチンおよびサリノスポラミドおよびそれらの類似体（Ｆｅｎｔｅａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，７５６，７６４号（１９９８）、同第６，１４７，２２３号（２０００）、同第６，３３５，３５８号（２００２）、および同第６，６４５，９９９号（２００３）、Ｆｅｎｔｅａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９４）９１：３３５８、Ｆｅｎｉｃａｌ  ｅｔ  ａｌ．の国際特許公開��ＷＯ０５／００３１３７号、Ｐａｌｌａｄｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．の国際特許公開第ＷＯ０５／００２５７２号、Ｓｔａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の国際特許公開第ＷＯ０４／０７１３８２号、Ｘｉａｏ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｌの米国特許公開２００５／０２３１６２号、およびＣｏｒｅｙの国際特許公開第ＷＯ０５／０９９６８７号）を含む。
【００６０】
ＮＲＡＳおよびＫＲＡＳ等の遺伝子は、多くの癌型において変異する。癌に関連した変異の公開目録作成への関心が集まっている。癌に関連した変異についての情報を含む公開データベースの例には、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）が管理する遺伝子型および表現型のデータベース（ｄｂＧａＰ）、ならびにＷｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）が管理する癌における体細胞変異目録（ＣＯＳＭＩＣ）データベースがある。
【００６１】
腫瘍および細胞株異種移植片由来の腫瘍試料中の４１個のはっきりと異なる癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子における５１４個の既知の変異を評価した際に、プロテアソーム阻害剤による阻害に耐性を示した試料がいくつか存在した。プロテアソーム阻害剤による阻害への耐性は、ＫＲＡＳ遺伝子の変異状態と相関した。驚いたことに、耐性異種移植片由来の試料のすべてがＫＲＡＳにおける変異を有し、感受性または応答性試料のほぼすべてが野生型ＫＲＡＳを有した。したがって、固形腫瘍を有する患者（この患者の腫瘍細胞は野生型ＫＲＡＳを含む）は、プロテアソーム阻害剤での治療の候補であり得る。いくつかの実施形態において、固形腫瘍は、非小細胞肺癌、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、頭頸部癌、前立腺癌、または腎細胞癌である。他の実施形態では、固形腫瘍は、非小細胞肺癌、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、または黒色腫である。いくつかの実施形態において、固形腫瘍は、非小細胞肺癌、結腸癌、前立腺癌、または膵臓癌である。いくつかの実施形態において、固形腫瘍は、前立腺癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、または結腸癌である。いくつかの実施形態において、固形腫瘍は、前立腺癌、非小細胞肺癌、または結腸癌である。いくつかの実施形態において、固形腫瘍は、肺癌および結腸癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、肺癌は、非小細胞肺癌または結腸癌の転移形態である。他の実施形態では、固形腫瘍は、非小細胞肺癌または結腸癌である。いくつかの実施形態において、固形腫瘍は、肺癌である。いくつかの実施形態において、固形腫瘍は、非小細胞肺癌である。いくつかの実施形態において、固形腫瘍は、結腸癌である。
【００６２】
プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸またはペプチジルエポキシケトンでの治療時の成果、例えば、治療、無増悪期間、または生存への応答を予測するために、変異状態を決定する、例えば、固形腫瘍、例えば、非血液学的腫瘍、例えば、非小細胞肺癌、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、頭頸部癌、前立腺癌、または腎細胞癌中のマーカー遺伝子における変異を特定するための組成物および方法が提供される。いくつかの実施形態において、プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸での治療成果を予測するために、非小細胞肺癌、結腸癌、および前立腺癌からなる群から選択される固形腫瘍の変異状態を決定するための組成物および方法が提供される。
【００６３】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味を有する。概して、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチド化学反応およびハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法、ならびにそれらの技法は、当技術分野で既知のものである。ＧｅｎＢａｎｋまたはＧｅｎＰｅｐｔ受託番号ならびに有用な核酸およびペプチド配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）が管理するウェブサイトで見つけることができる。本出願（表を含む）を通して引用されるすべてのデータベース受託記録内容（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ１３３注釈ファイル、Ｅｎｔｒｅｚ、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑ、ＣＯＳＭＩＣからのもの）は、参照により本明細書に組み込まれる。標準の技法は、ＤＮＡ組換え、オリゴヌクレオチド合成、タンパク質精製、組織培養、ならびに形質転換およびトランスフェクション（例えば、電気穿孔、リポフェクション等）のために使用される。ＲＡＳ活性のためのＧＴＰａｓｅアッセイ、またはＲＡＳ活性化シグナル伝達活性のためのアッセイ、例えば、レポーターアッセイ等の酵素反応は、製造業者の仕様書に従って、または当技術分野で一般に達成されるか、または本明細書に記載されるように行われる。ＲＡＳ局在化およびシグナル伝達を決定するためのいくつかの方法は、Ｐｒｉｏｒ  ａｎｄ  Ｈａｎｃｏｃｋ（２０１１）Ｓｅｍｉｎ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｅｐ  ８  ｅｐｕｂで概説されるか、またはＣｕｉｆｆｏ  ａｎｄ  Ｒｅｎ（２０１０）Ｂｌｏｏｄ  １１４：３５９８−３６０５で見つけられるか、またはＬｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：１７１−１８５で概説される。前述の技法および手順は、概して、当技術分野で既知の方法、例えば、本明細書を通して引用され、かつ論じられる様々な一般的かつより具体的な参考文献に記載の方法に従って行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ））またはＨａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ））を参照されたい。本明細書に記載の分析化学、有機合成化学、ならびに医薬品および薬化学に関連して利用される命名法、ならびにそれらの実験室手順および技法は、当技術分野で既知である。標準の技法は、化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤化、および送達、ならびに患者の治療ために使用される。さらに、別途文脈によって必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。矛盾が生じた場合、定義を含む本明細書が支配する��のとする。
【００６４】
「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「少なくとも１つ（ｏｎｅ）」という冠詞は、本明細書において、１つのその冠詞の文法上の目的語、またはその冠詞の文法上の目的語のうちの２つ以上を指すために使用される。一例として、「１つの要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは、１つまたは２つ以上の要素、少なくとも１つの要素を意味する。矛盾が生じた場合、定義を含む本明細書が支配するものとする。
【００６５】
本明細書で使用されるとき、「マーカー遺伝子」または「遺伝子型マーカー遺伝子」は、そのＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質が、治療時に予後または成果についての情報を提供する（すなわち、「情報的に有益」である）特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量（複数を含む）を有するように変異、例えば、遺伝子型を有し得る遺伝子を指す。プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸（例えば、ボルテゾミブまたはクエン酸イクサゾミブ）での治療後の成果に関係していると本明細書に記載されるマーカー遺伝子、例えば、遺伝子型マーカー遺伝子は、本明細書に記載の染色体遺伝子座マーカー内の遺伝子の例であり、表１に提供される。マーカー遺伝子に対応するｍＲＮＡ、オープンリーディングフレーム、およびタンパク質の配列も表１に列記される。表１に列記されるマーカー遺伝子、例えば、遺伝子型マーカー遺伝子は、遍在性であるか、または制限発現を有するかのいずれかであるアイソフォームを有し得る。表１のＤＮＡ配列番号は、主要なアイソフォームまたは最長のアイソフォームをコードするｍＲＮＡのみを指し、タンパク質配列番号は、そのようなアイソフォームの少なくとも１つの前駆体を表し、必ずしも成熟タンパク質を表すわけではない。これらの配列は、マーカー遺伝子の正体をそのアイソフォームまたは前駆体に限定するようには意図されていない。さらなるアイソフォームおよび成熟タンパク質は、当業者であれば、表１に列記されるＩＤ番号によって識別されるＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）が管理するデータベース）に提供される情報を概観することによって容易に読み取り、理解することができる。
【００６６】
【表１】
2014533112.tif 000011
【００６７】
本明細書で使用されるとき、「表現型マーカー遺伝子」は、体細胞ＤＮＡ変異が存在しないマーカー遺伝子、すなわち、遺伝子型変化を有しないが、その他のマーカー、例えば、転写物、例えば、ＲＮＡ、および／またはタンパク質が、治療時に予後または成果についての情報を提供する（すなわち、「情報的に有益」である）特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量を有するマーカー遺伝子を指す。この指定は、遺伝子型マーカー遺伝子に関連したマーカーのために測定されるが、表現型の特徴として当技術分野で知られている組成、量、および活性等の特徴と混同されるべきではない。プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸（例えば、ボルテゾミブまたはクエン酸イクサゾミブ）での治療後の成果に関係していると本明細書に記載される表現型マーカー遺伝子は、ＧＬＵＴ４、配列番号７、８、９を含む。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、「ＫＲＡＳ」は、ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２  Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログを指し、この遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４９８５、配列番号１（オープンリーディングフレームは、配列番号２、配列番号１のヌクレオチド１８２〜７４８である）に関連しており、ＧｅｎＰｅｐｔ受託番号ＮＰ＿００４９７６、配列番号３、染色体１２上のＫＲＡＳ遺伝子の優性転写物変異形をコードする。ＫＲＡＳの他の名称には、ＫＲＡＳ２およびヌーナン症候群３（ＮＳ３）が含まれる。ＫＲＡＳは、ＧＴＰａｓｅ活性を有する癌遺伝子として機能し、染色体１２ｐ上に見られ得る。ＫＲＡＳは、細胞膜およびＡｋｔおよびＣｄｃ４２等の様々なエフェクタータンパク質と相互作用し、それらは、細胞骨格を介してそのシグナル伝達機能を実行し、かつ細胞運動に影響を与える（Ｆｏｔｉａｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．２７：６７４２−６７５５）。
【００６９】
本明細書で使用されるとき、「ＮＲＡＳ」は、神経芽細胞腫ＲＡＳウイルス（ｖ−ｒａｓ）癌遺伝子ホモログを指し、この遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２５２４、配列番号４（オープンリーディングフレームは、配列番号５、配列番号４のヌクレオチド２５５〜８２４である）に関連しており、ＧｅｎＰｅｐｔ受託番号ＮＰ＿００２５１５、配列番号６をコードする。ＮＲＡＳの他の名称には、ＩＶ型自己免疫リンパ球増殖性症候群（ＡＬＰＳ４）、ＮＲＡＳ１、およびヌーナン症候群６（ＮＳ６）が含まれる。ＮＲＡＳは、ＧＴＰａｓｅ活性を有する癌遺伝子として機能し、染色体１ｐ上に見られ得る。ＮＲＡＳは、細胞膜およびＲａｆおよびＲｈｏＡ等の様々なエフェクタータンパク質と相互作用し、これらは、細胞骨格を介してそのシグナル伝達機能を実行し、細胞接着に影響を与える（Ｆｏｔｉａｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．２７：６７４２−６７５５）。
【００７０】
本明細書で使用されるとき、「ＧＬＵＴ４」は、グルコース輸送体４を指し、この遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０４２、配列番号７（オープンリーディングフレームは、配列番号８、配列番号７のヌクレオチド２０１〜１７３０である）に関連しており、ＧｅｎＰｅｐｔ受託番号ＮＰ＿００１０３３、配列番号８をコードする。ＧＬＵＴ４の別の名称は、溶質担体ファミリー２（促進性グルコース輸送体）のメンバー４（ＳＬＣ２Ａ４）である。ＧＬＵＴ４は、グルコース輸送体として機能し、染色体１７ｐ上に見られ得る。ＧＬＵＴ４の細胞位置は、インスリンの存在に依存し得、これは、筋肉および脂肪組織等の細胞を刺激してＧＬＵＴ４を細胞内貯蔵所から細胞表面に移動させて、グルコース輸送体としてのその機能を開始する。ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ４、およびＧＬＵＴ９を含むグルコース輸送体は、腫瘍細胞において正常な活性よりも高い活性を有し、正常な細胞よりも高いグルコース代謝レベルを可能にし得る（Ａｄｅｋｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）２４：６５０−６５４に概説されている）。ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ３、およびＧＬＵＴ４は、肺癌において発現され得る（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１４：８９５−９０４）。ＫＲＡＳ変異体結腸直腸癌細胞は、栄養素ストレス下で野生型細胞よりも高いグルコース取り込みおよび解糖、ならびに良好な増殖および生存を示した（Ｙｕｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５：１５５５）。これらの研究は、以前の研究とは対照的に、ＧＬＵＴ１（グルコース輸送体１）の上方制御と結腸直腸癌細胞における変異体ＫＲＡＳとの間の相関関係を突き止めた（Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．１５４：１３７−１４２）。
【００７１】
「マーカー」は、本明細書で使用されるとき、患者の腫瘍細胞における変異を有し、さらにその変異が患者の特徴である（その患者の成果が、例えばプロテアソーム阻害剤、例えばペプチジルボロン酸またはペプチジルエポキシケトンでの治療に好ましいか、または好ましくない）と特定されたマーカー遺伝子に関連した物質を含む。マーカーの例として、物質、例えば、染色体遺伝子座、遺伝子のＤＮＡ、遺伝子のＲＮＡ、または遺伝子のタンパク質が挙げられる。例えば、マーカーは、マーカー遺伝子物質、例えば、染色体遺伝子座、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を含み、その変異、または特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、もしくは量は、治療にあまり応答しない患者を示し、あるいは、マーカーは、マーカー遺伝子物質、例えば、染色体遺伝子座、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を含み、その変異、または特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、もしくは量は、良好に応答する患者を示す。別の例において、マーカーは、マーカー遺伝子物質、例えば、染色体遺伝子座、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を含み、その変異、または特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、もしくは量は、治療時に短期の無増悪期間（ＴＴＰ）を有する患者を示し、あるいは、マーカーは、マーカー遺伝子物質、例えば、染色体遺伝子座、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を含み、その変異、または特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、もしくは量は、疾患が長期のＴＴＰを有する患者を示す。なおさらなる例において、マーカーは、マーカー遺伝子物質、例えば、染色体遺伝子座、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を含み、その変異、または特徴、例えば、大きさ、配列、組成、もしくは量は、治療時に疾患が短期の生存期間を有する患者を示し、あるいは、マーカーは、マーカー遺伝子物質、例えば、染色体遺伝子座、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を含み、その変異、または特徴、例えば、大きさ、配列、組成、もしくは量は、疾患が長期の生存期間を有する患者を示す。マーカーは、患者の腫瘍細胞における変異を有すると特定されていないが、その患者の特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量が、患者における固形腫瘍のプロテアソーム阻害治療への応答を示すマーカー遺伝子に関連した物質を含み得る。したがって、本明細書で使用されるとき、マーカーは、これらの可能性の１つ１つを含むよう意図されており、さらに、それぞれの単一マーカーを個別に、またはマーカーとして独立して含み得るか、またはあるいは、「マーカー」または「マーカーセット」について言及されるとき、特徴のうちの１つ以上もしくはすべてを集合的に含み得る。
【００７２】
いくつかの実施形態において、マーカーは、核酸およびタンパク質からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、マーカーは、核酸である。いくつかの実施形態において、核酸マーカーは、染色体またはゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態において、核酸は、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、核酸は、ｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡである。いくつかの実施形態において、マーカーは、タンパク質である。
【００７３】
いくつかの実施形態において、特徴は、大きさ、配列、組成、活性、および量からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、特徴は、配列である。いくつかの実施形態において、特徴は、量である。いくつかの実施形態において、特徴は、組成である。いくつかの実施形態において、特徴は、大きさである。いくつかの実施形態において、特徴は、活性である。
【００７４】
いくつかの実施形態において、マーカーは、染色体ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡであり、特徴は、配列である。いくつかの実施形態において、マーカーは、ｍＲＮＡであり、特徴は、配列である。いくつかの実施形態において、マーカーは、ｃＤＮＡであり、特徴は、配列である。いくつかの実施形態において、マーカーは、ｍＲＮＡであり、特徴は、量である。いくつかの実施形態において、マーカーは、ｍＲＮＡであり、特徴は、大きさである。
【００７５】
いくつかの実施形態において、マーカーは、タンパク質であり、特徴は、量である。いくつかの実施形態において、マーカーは、タンパク質であり、特徴は、活性である。いくつかの実施形態において、マーカーは、タンパク質であり、特徴は、配列である。
【００７６】
予後または治療または疾患管理戦略を決定するための測定に有用な染色体遺伝子座マーカーは、例えば１１５２４７０８５と１１５２５９５１５との塩基対の染色体１ｐ１３．２（ＮＲＡＳ）および例えば２５３５８１８０と２５４０３８５４との塩基対の染色体１２ｐ１２．１（ＫＲＡＳ）からなる群から選択される。染色体遺伝子座および塩基対番号は、ＮＣＢＩ遺伝子データベースにおける参照ヒトゲノムＢｕｉｌｄ３７．３（２０１１年１０月５日現在）に基づいている。マーカーＤＮＡ、マーカーＲＮＡ、またはマーカータンパク質は、染色体遺伝子座マーカーの塩基対に相当し得る。例えば、マーカーＤＮＡは、染色体遺伝子座マーカー由来のゲノムＤＮＡを含み得、マーカーＲＮＡは、遺伝子座マーカーから転写されたポリヌクレオチドを含み得、マーカータンパク質は、例えば腫瘍細胞を含む試料中の染色体遺伝子座マーカーにおける発現に由来するポリペプチドを含み得る。
【００７７】
「マーカー核酸」は、本発明のマーカー遺伝子によってコードされるか、本発明のマーカー遺伝子に関連するか、または本発明のマーカー遺伝子に対応する核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ）である。そのようなマーカー核酸は、全配列もしくは部分配列、例えば、ゲノムＤＮＡのエクソンのうちの１つ以上（マーカー遺伝子のうちのいずれかのオープンリーディングフレームまで）、またはそのような配列の相補体を含む、ＤＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡ（例えば、その中で生じる任意のイントロンを含む）のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。マーカー核酸は、任意のマーカーの全配列もしくは部分配列またはそのような配列の相補体を含むＲＮＡも含み、すべてのチミジン残基は、ウリジン残基で置換され、ＲＮＡは、ゲノムＤＮＡ転写によって生成され（すなわち、スプライシングの前）、ＲＮＡは、ゲノムＤＮＡから転写されたＲＮＡのスプライシングによって生成され、タンパク質（すなわち、膜貫通シグナル配列等の正常に切断された領域の切断前および切断後の両方のタンパク質を含む）は、スプライシングされたＲＮＡの翻訳によって生成される。本明細書で使用されるとき、「マーカー核酸」は、ゲノムＤＮＡの転写によって生成されたＲＮＡ（スプライシングされたＲＮＡを含む）の逆転写によって作製されたｃＤＮＡも含み得る。マーカー核酸は、遺伝コードの縮重のため、本発明のマーカーに対応するタンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列とは異なる配列、したがって、同一のタンパク質または極めて類似性の高いタンパク質、例えば、野生型タンパク質または野生型機能を有しないが、多型を有するタンパク質をコードする配列も含む。本明細書で使用されるとき、「対立遺伝子変異形」という語句は、所与の遺伝子座に生じるヌクレオチド配列、またはヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを指す。そのような天然に存在する対立遺伝子変異は、典型的には、所与の遺伝子のヌクレオチド配列に１〜５％の不一致をもたらし得る。代替の対立遺伝子は、例えば、癌を有しない個体の細胞、例えば、生殖系列細胞中のいくつかの異なる個体の目的とする遺伝子を配列決定することによって特定され得る。これは、様々な個体の同一の遺伝子座を特定するために、ハイブリダイゼーションプローブを用いて容易に実行され得る。天然に存在する対立遺伝子変異の結果であり、かつ野生型マーカー遺伝子の機能活性を変化させないありとあらゆるそのようなヌクレオチド変異および結果として生じるアミノ酸多型または変異の検出は、本明細書に記載のマーカーの野生型バージョンの範囲内に収まるよう意図される。「マーカータンパク質」は、本発明のマーカー、例えば、核酸によってコードされるか、またはそれに対応するタンパク質である。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、同義に使用される。マーカーのタンパク質は、具体的には、その名称またはアミノ酸配列で言及され得るが、当業者であれば、ナンセンス、ミスセンス、挿入、または欠失等の変異が、様々な形でタンパク質構造、外観、細胞位置、および／または挙動に影響を与え得ることを理解する。別途示されない限り、そのような違いは本明細書で区別されず、本明細書に記載の変異体マーカーは、そのような違いのうちのいずれかまたはすべてを含むよう意図される。
【００７８】
変異ＲＡＳ遺伝子を有する典型的な腫瘍は、１つ以下のいずれかのＲＡＳ遺伝子に変異を有する。ＫＲＡＳの場合、ｍＲＮＡ等の野生型核酸の一例は、配列番号１である。野生型ＫＲＡＳ核酸の別の例は、配列番号２である。野生型ＫＲＡＳタンパク質の一例は、配列番号３である。いくつかの実施形態において、変異は、ＫＲＡＳマーカーの少なくとも１つの変異部位に見られ得る。本研究において、変異は、ＫＲＡＳ（配列番号２）のコドン１２、１３、６１、および１４６に見られた。一般的な実施形態において、野生型ＲＡＳ遺伝子、例えば、ＫＲＡＳが、固形腫瘍、例えば、非血液学的腫瘍、例えば、非小細胞肺癌または結腸癌に対して好ましい成果、例えば、応答性、長期の無増悪期間、および／または長期の生存期間を予測する一方で、変異ＫＲＡＳ遺伝子は、好ましくない成果を予測する。いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳ（配列番号２）のコドン１４６の変異を含む変異部位は、プロテアソーム阻害剤での治療の好ましくない成果を予測しない。本明細書で使用されるとき、「コドン１４６の変異」または「変異コドン１４６」は、ＫＲＡＳ（配列番号２）のオープンリーディングフレームにおける稀な変異を指す。特徴が変異コドン１４６に情報的に有益であるマーカーは、アミノ酸残基１４６が配列番号３とは異なるアミノ酸配列を有するＫＲＡＳタンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、特徴がこの方法における好ましい成果に情報的に有益であるタンパク質マーカーは、ＫＲＡＳの１４６番目の残基にアラニンの代わりにトレオニンを有する。配列番号１の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドの断片（この断片は塩基６１７〜６１９を含む）またはその相補体を含む核酸マーカーは、塩基６１７、６１８、および６１９からなる群から選択される少なくとも１つの塩基が変異する場合、コドン１４６の変異に情報的に有益な特徴を有し得る。
【００７９】
固形腫瘍癌患者における発現が非応答または好ましくない成果を示す変異体ＫＲＡＳの例として、配列番号２のコドン１２（塩基３４〜３６）、コドン１３（塩基３７〜３９）、もしくはコドン６１（塩基１８１〜１８３）の少なくとも１つの塩基、または配列番号１の類似コドン（それぞれ、配列番号１の塩基２１５〜２１７、塩基２１８〜２２０、もしくは塩基３６２〜３６４）等の少なくとも１つの変異部位の少なくとも１つの変化を有し、かつ配列番号３の少なくとも１つのアミノ酸残基１２、１３、または６１の変化をもたらすマーカー核酸が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳの対立遺伝子変異形は、配列番号２のコドン１２、コドン１３、もしくはコドン６１、または配列番号１の類似コドンではないコドンの変化を有し、結果として生じるコードされた対立遺伝子変異形タンパク質は、野生型ＲＡＳ活性、例えば、ＧＴＰａｓｅ活性を有し、したがって、好ましくない成果に関連しない。あるいは、ＫＲＡＳの対立遺伝子変異形は、コドン１２、コドン１３、またはコドン６１の塩基の変化を有し、この変化は、例えば、遺伝コードの縮重によるものであり、翻訳された残基の変化をもたらさない。そのような実施形態において、対立遺伝子変異形核酸は、配列番号３の１２位のグリシン、配列番号３の１３位のグリシン、および配列番号３の６１位のグルタミン等の野生型アミノ酸残基をコードし、コードされたポリペプチドは、野生型ＲＡＳ活性、例えば、ＧＴＰａｓｅ活性を有し、したがって、好ましくない成果に関連しない。
【００８０】
配列番号１の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドの断片（この断片は塩基２１５〜２１７を含む）またはその相補体を含む核酸マーカーは、塩基２１５、２１６、および２１７からなる群から選択される少なくとも１つの塩基が、配列番号３のアミノ酸残基１２の変化をもたらし得る様式で変異する場合に、コドン１２の変異に情報的に有益な特徴を有し得る。いくつかの実施形態において、核酸マーカーは、配列番号２の塩基３４〜３６を含む。いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳ核酸における変異は、配列番号３の１２番目のグリシン残基の代わりに、アラニン、システイン、アスパラギン酸塩、フェニルアラニン、アルギニン、セリン、およびバリンからなる群から選択されるアミノ酸残基を有するＫＲＡＳタンパク質をもたらし得る。配列番号１の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドの断片（この断片は塩基２１８〜２２０を含む）またはその相補体を含む核酸マーカーは、塩基２１８、２１９、および２２０からなる群から選択される少なくとも１つの塩基が、配列番号３のアミノ酸残基１３の変化をもたらし得る様式で変異する場合に、コドン１３の変異に情報的に有益な特徴を有し得る。いくつかの実施形態において、核酸マーカーは、配列番号２の塩基３７〜３９を含む。いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳ核酸における変異は、配列番号３の１３番目のグリシン残基の代わりに、アスパラギン酸塩、バリン、システイン、セリン、アラニン、およびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸残基を有するＫＲＡＳタンパク質をもたらし得る。配列番号１の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドの断片（この断片は塩基３６２〜３６４からなる群から選択される塩基を含む）またはその相補体を含む核酸マーカーは、塩基３６２、３６３、および３６４からなる群から選択される少なくとも１つの塩基が、配列番号３のアミノ酸残基６１の変化をもたらし得る様式で変異する場合に、コドン６１の変異に情報的に有益な特徴を有し得る。いくつかの実施形態において、核酸マーカーは、配列番号２の塩基１８１〜１８３を含む。いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳ核酸における変異は、配列番号３の６１番目のグルタミン残基の代わりに、グルタミン酸塩、ヒスチジン、リジン、ロイシン、プロリン、およびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸残基を有するＫＲＡＳタンパク質をもたらし得る。
【００８１】
本明細書で使用されるとき、マーカーの「情報的に有益な」特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量は、その値または違いが予後または成果に相関する特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量を指す。マーカーの情報的に有益な特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量は、マーカー遺伝子、例えば、遺伝子型マーカー遺伝子もしくは表現型マーカー遺伝子に対応する核酸、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはタンパク質のいずれかを分析することによって得られ得る。マーカー、例えば、染色体遺伝子座マーカーまたは患者由来の試料中のマーカーの特徴、例えば、大きさ（例えば、長さもしくは分子量）、配列（例えば、核酸配列もしくはタンパク質配列）、組成（例えば、塩基もしくはアミノ酸組成またはペプチド消化もしくは遺伝子断片パターン）、活性（酵素活性もしくはシグナル伝達活性）、または量（例えば、コピー数および／もしくは発現レベル）は、それが分析される物質の野生型または対立遺伝子変異形とは異なる場合、「情報的に有益」である。いくつかの実施形態において、マーカーの特徴は、それがマーカー遺伝子が野生型であることを示す場合、情報的に有益である。マーカーの量が測定されるいくつかの実施形態において、量は、それが発現を判定するために用いられるアッセイの標準誤差よりも大きく参照量を超えるか、または参照量を下回る場合、「情報的に有益」である。マーカーの情報的に有益な発現レベルは、測定された発現レベルと成果、例えば、良好な応答、応答不良、長期の無増悪期間、短期の無増悪期間、短期の生存期間、または長期の生存期間の統計的な相関関係に基づいて決定され得る。統計分析の結果は、本明細書に記載の方法で用いるマーカーを選択するための閾値を確立し得る。あるいは、異なる特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量を有するマーカー、例えば、染色体遺伝子座マーカー、またはマーカー遺伝子は、成果を予測する典型的な範囲の量を有する。情報的に有益な特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量は、成果に対して決定される特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量の範囲内に収まる特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量である。なおさらに、マーカーセットはともに、それらの特徴、例えば、大きさ、配列、組成物、活性、もしくは量の組み合わせが、本明細書に提供される方法によって決定されるマーカー、例えば、染色体遺伝子座マーカー、またはマーカー遺伝子セットの所定のスコアと一致するか、またはそれを超える／下回るかのいずれかの場合、「情報的に有益」であり得る。遺伝子転座、転写スプライス変異、欠失、および切断は、マーカー配列または組成を変化させ得る点変異に加えて、マーカーの大きさ、配列、または組成を変化させ得る事象の例である。マーカー、例えば、マーカー遺伝子（すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質）の１つのみの特徴の測定は、予後を提供し得る、すなわち、成果を示し得る。マーカー、例えば、マーカー遺伝子（すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質）の１つのみの特徴の測定は、予後を提供し得る、すなわち、成果を予測し得るか、または成果を示し得る。マーカー、例えば、マーカー遺伝子の２つ以上の特徴の測定は、２つの特徴の情報的に有益な結果が互いに一致するとき、すなわち、生物学的結果が矛盾しないとき、予後を提供し得る。マーカー遺伝子の複数の特徴の測定からの一貫した結果の例は、ＤＮＡもしくはＲＮＡにおけるナンセンス変異、点変異、挿入、もしくは欠失、およびコードされたタンパク質の低量もしくは分子量変化、またはタンパク質の結合ポケットもしくは活性部位をコードする領域における変異、およびコードされたタンパク質の活性変化の特定であり得る。タンパク質がその活性レベルに基づいてその合成を制御するフィードバックループを有する経路内に存在するとき、異なる例が生じ得る。この例において、低量または低活性のタンパク質は、マーカー遺伝子変異のため、組織としての豊富な量のその変異ｍＲＮＡに関連し得、したがって、タンパク質活性に飢えており、タンパク質産生を繰り返しシグナル伝達する。
【００８２】
非限定的な説明として、この場合において、例えば、ＫＲＡＳマーカー、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはタンパク質の配列の特徴を測定したときの情報的に有益な結果の一例は、ＫＲＡＳ配列、例えば、配列番号１、２、または３の変異状態を特定した結果である。この場合において、腫瘍細胞を含む試料におけるＫＲＡＳ配列の変異の特定が、好ましくない成果に情報的に有益である一方で、野生型配列の特定は、プロテアソーム阻害剤での腫瘍の治療の好ましい成果に情報的に有益である。一実施形態において、ＫＲＡＳにおけるＡ１４６Ｔ変異の特定は、好ましい成果に情報的に有益である。別の例において、特徴、例えば、ＫＲＡＳマーカー、例えば、タンパク質の活性の測定は、高いＧＴＰａｓｅ活性または低いシグナル伝達活性が存在する場合、好ましい成果の情報的に有益な結果を提供する。
【００８３】
マーカーの「標準的な」特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量は、「参照試料」の特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量を指し得る。参照試料は、例えば体細胞変異を有する腫瘍がその患者に由来する同一の患者由来の標準的な対応試料、例えば、生殖系列試料であり得る。参照試料は、マーカー関連疾患または一部の健常な対象における野生型マーカーの参照特徴、例えば、平均的な特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、もしくは量を有しない健常な対象由来の試料であり得る。参照試料の特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量は、参照データベースからの１つ以上のマーカーの特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量からなり得る。あるいは、マーカーの「標準的な」特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または発現レベルは、腫瘍がその患者に由来する同一の患者由来の同様の環境または応答状態下の非腫瘍細胞のマーカー、例えば、マーカー遺伝子の特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量である。標準的な量のＤＮＡコピー数は、２または２倍体であるが、ＤＮＡコピー数が１である男性（雄）のＸ連鎖遺伝子を除く。
【００８４】
マーカー遺伝子の「過剰発現」および「過小発現」とは、例えば、発現を判定するために用いるアッセイの標準誤差を超える試験試料におけるｍＲＮＡまたはタンパク質によって測定されるとき、それぞれ、マーカー遺伝子の発現の標準的なレベルよりも高いレベルまたは低いレベル（例えば、２分の３倍超、少なくとも２倍、少なくとも３倍高いまたは低いレベル等）での患者のマーカー遺伝子の発現を指す。「有意な」発現レベルは、本明細書に提供される方法によって決定されるマーカー遺伝子セットの所定のスコアと一致するか、またはそれを超える／下回るかのいずれかのレベルを指し得る。
【００８５】
本明細書で使用されるとき、「遺伝子欠失」は、２に満たないＤＮＡのコピー数の量を指し、「増幅」は、２を超えるＤＮＡのコピー数の量を指す。「２倍体」量は、２に等しいコピー数を指す。「２倍体または増幅」という用語は、遺伝子コピーが「欠失していない」と解釈され得る。代替の情報的に有益な量が遺伝子欠失であるマーカーにおいて、増幅は通常見られない。逆に、「２倍体または欠失」という用語は、コピー数が「増幅していない」と解釈され得る。代替の情報的に有益な量が増幅であるマーカーにおいて、遺伝子欠失は通常見られない。明確にするために、配列欠失は、マーカー遺伝子変異の結果として遺伝子内で生じ得、転写されたタンパク質の不在またはｍＲＮＡまたはタンパク質の短縮をもたらし得る。そのような欠失は、コピー数に影響を与え得ない。
【００８６】
本明細書で使用されるとき、「好ましい」成果または予後は、長期の無増悪期間（ＴＴＰ、または無増悪生存期間）、長期の生存期間、および／または良好な応答を指す。逆に、「好ましくない」成果または予後は、短期の生存期間、短期の無増悪期間（ＴＴＰ、または無増悪生存期間）、および／または応答不良を指す。
【００８７】
「長期の生存期間」および「短期の生存期間」という用語は、癌患者が生存することが予測される治療の初回投与を受けた後の期間を指す。「長期生存者」とは、短期生存者と特定された患者よりも遅い進行速度を有するか、または腫瘍による死が遅いことが予想される患者を指す。「生存期間の改善」または「より遅い死亡速度」は、例えば、集団の７０％、８０％、９０％以上が治療の初回投与を受けた後に十分な期間生存するような参照基準と比較した、本明細書に記載のマーカーのうちの１つ以上の特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量に基づいて決定された推定寿命である。「より速い死亡速度」または「より短い生存期間」とは、例えば、集団の５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％以下が治療の初回投与を受けた後に十分な期間生存しないような参照基準と比較した、本明細書に記載のマーカーのうちの１つ以上の特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量に基づいて決定された推定寿命を指す。いくつかの実施形態において、十分な時間とは、癌療法を受けた初日から測定して少なくとも６、１２、１８、２４、または３０ヶ月である。
【００８８】
治療薬との接触なしでの癌の成長と比較して、癌の成長速度が治療薬との接触の結果として抑制される場合、癌は治療薬に「応答」するか、または治療への「良好な応答」が存在する。癌の成長は、様々な方法で測定され得、例えば、特徴、例えば、腫瘍の大きさまたはその腫瘍型に適切な腫瘍マーカーの発現が測定され得る。国際ワーキンググループは、様々な種類の癌の応答基準を設定、更新、および公開するために定期的に招集されている。そのような公開された報告に従って、対象の腫瘍のマーカーの特定およびそれらのプロテアソーム阻害剤への応答を支援することができる。例えば、固形腫瘍の場合、固形腫瘍（ＲＥＣＩＳＴ）ガイドラインにおける応答評価基準（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｅ．Ｊ．Ｃａｎｃ．４５：２２８−２４７）を用いて、固形腫瘍に関連したマーカーの特定および固形腫瘍のプロテアソーム阻害剤への応答を支援することができる。骨髄腫に関連したマーカーの特定およびそのプロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸治療薬への応答を支援するために使用される応答定義である、Ｂｌａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０２：１１１５−２３に記載のＳｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ群（ＳＷＯＧ）基準が用いられ得る。これらの基準は、骨髄腫において測定される応答の種類を定義し、疾患増悪までの期間も特徴付け、これは、腫瘍の治療薬への感受性のもう１つの重要な尺度である。他の例として、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、Ｃｈｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２１：４６４２−４６４９）、リンパ腫、例えば、非ホジキンおよびホジキンリンパ腫（Ｃｈｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５：５７９−５９６）の基準がある。基準は、細胞組成（例えば、血液塗抹標本もしくは骨髄生検中の芽球数、有糸分裂像の存在および数）または組織構造（例えば、不規則な組織構造もしくは基底膜の細胞浸潤）を特定するための組織学的方法等の従来の方法に加えて、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）（例えば、測定可能な代謝活性変化を有する部位（例えば、腫瘍部位）を特定するか、または生体内で腫瘍中の特異的マーカーを追跡するもの）、免疫組織化学分析（例えば、特異的腫瘍マーカーへの抗体の結合を検出することによって腫瘍細胞を特定するもの）、およびフローサイトメトリー（例えば、差次的マーカーおよび蛍光染色によって細胞型を特徴付けるもの）等の分析方法を考慮に入れる。プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸治療薬に応答する性質は、変わりやすい性質であり得、異なる癌は、異なる条件下で、所与の治療薬に対して異なるレベルの「応答性」を呈する。なおさらに、応答性の尺度は、患者の生活の質、転移の程度等を含む腫瘍成長の大きさを超えたさらなる基準を用いて判定され得る。加えて、臨床予後マーカーおよびその変形は、適用可能な条件下で判定され得る（例えば、骨髄腫中のＭタンパク質、前立腺癌におけるＰＳＡレベル）。
【００８９】
治療薬との接触なしでの癌の成長と比較して、癌の成長速度が治療薬との接触の結果として抑制されない場合、または非常に低い程度にしか抑制されない場合、癌は治療薬に「応答しない」か、または「応答不良」であるか、あるいは治療への応答不良が存在する。上述のように、癌の成長は、様々な方法で測定され得、例えば、腫瘍の大きさまたはその腫瘍型に適切な腫瘍マーカーの発現が測定され得る。例えば、応答の定義を用いて、腫瘍の治療薬への非応答に関連したマーカーの特定を支援し、上述のガイドライン等のガイドラインが用いられ得る。治療薬に応答しない性質は、非常に変わりやすい性質であり得、異なる癌は、異なる条件下で、所与の治療薬に対して異なるレベルの「非応答性」を呈する。なおさらに、非応答性の尺度は、患者の生活の質、転移の程度等を含む腫瘍成長の大きさを超えるさらなる基準を用いて判定され得る。加えて、臨床予後マーカーおよびその変形は、適用可能な条件下で判定され得る（例えば、骨髄腫中のＭタンパク質、前立腺癌のけるＰＳＡレベル）。
【００９０】
本明細書で使用されるとき、「長期の無増悪期間」、「長期のＴＴＰ」、および「短期の無増悪期間」、「短期のＴＴＰ」とは、治療によってもたらされた安定した疾患が活動性疾患または進行性疾患に変わるまでの期間を指す。時々、治療は、良好な応答でも応答不良でもない安定した疾患（ＳＤ）をもたらすか、または、疾患が単に悪化しない、例えば、ある期間進行性疾患にならないといった最小応答（ＭＲ）をもたらす。この期間は、少なくとも４〜８週間、少なくとも３〜６ヶ月、または６ヶ月以上であり得る。
【００９１】
「治療」とは、腫瘍のさらなる成長を予防または阻害し、かつ腫瘍の縮小を引き起こし、より長期の生存期間を提供するための治療法の使用を意味するものとする。治療は、腫瘍の転移の予防も含むよう意図される。癌または腫瘍の少なくとも１つの症状（応答性／非応答性、無増悪期間によって決定されるもの、または当技術分野で既知であり、かつ本明細書に記載される指標）が、緩和されるか、なくなるか、遅延するか、最小限に抑えられるか、または予防される場合、腫瘍は「阻害される」か、または「治療される」。本明細書にさらに記載される治療レジメン（例えば、プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸レジメン）を用いた治療に従う腫瘍の任意の症状（物理的な症状またはその他の症状）の任意の改善は、本発明の範囲内である。
【００９２】
本明細書で使用されるとき、「作用薬」という用語は、腫瘍細胞を含む癌細胞が治療プロトコルにおいて曝露され得る任意のものとして広く定義される。本発明の文脈において、そのような作用薬には、プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸剤、ならびに当技術分野で既知であり、かつ本明細書でさらに詳細に説明される化学療法剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００９３】
「プローブ」という用語は、特異的に目的とされた標的分子、例えば、本発明のマーカーに選択的に結合することができる任意の分子、例えば、単離された分子を指す。プローブは、当業者によって合成されるか、または適切な生物学的調製物から得られるかのいずれかであり得る。標的分子の検出の目的のために、プローブは、本明細書に記載されるように標識されるように特異的に設計され得る。プローブとして利用され得る分子の例として、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、および有機単量体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
「相補性」とは、２つの核酸鎖の領域間または同一の核酸鎖の２つの領域間の配列相補性の広範な概念を指す。第１の核酸領域のアデニン残基が、その残基がチミンまたはウラシルである場合、第１の領域に逆平行の第２の核酸領域の残基と特異的水素結合を形成（「塩基対合」）することができることが知られている。同様に、第１の核酸鎖のシトシン残基が、その残基がグアニンである場合、第１の鎖に逆平行の第２の核酸鎖の残基と塩基対合することができることが知られている。２つの領域が逆平行様式で配置されるときに、第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が第２の領域の残基と塩基対合することができる場合、核酸の第１の領域は、同一または異なる核酸の第２の領域と相補的である。いくつかの実施形態において、第１の領域が第１の部分を含み、第２の領域が第２の部分を含み、それにより、第１および第２の部分が逆平行様式で配置されるとき、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、またはすべてが、第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。
【００９５】
「相同」とは、本明細書で使用されるとき、同一の核酸鎖の２つの領域間または２つの異なる核酸鎖の領域間のヌクレオチド配列類似性を指す。両方の領域内のヌクレオチド残基位置が同一のヌクレオチド残基によって占有されるとき、領域は、その位置で相同である。第１の領域は、それぞれの領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基位置が同一の残基によって占有される場合、第２の領域と相同である。２つの領域間の相同性は、同一のヌクレオチド残基によって占有される２つの領域のヌクレオチド残基位置の割合で（すなわち、パーセント同一性によって）表される。一例として、ヌクレオチド配列５’−ＡＴＴＧＣＣ−３’を有する領域およびヌクレオチド配列５’−ＴＡＴＧＧＣ−３’を有する領域は、５０％の同一性で相同性を持つ。一実施形態において、第１の領域は第１の部分を含み、第２の領域は第２の部分を含み、それにより、これらの部分のそれぞれのヌクレオチド残基位置の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が、同一のヌクレオチド残基によって占有される。１００％同一性のいくつかの実施形態において、これらの部分のそれぞれのすべてのヌクレオチド残基位置は、同一のヌクレオチド残基によって占有される。
【００９６】
本明細書で別途特定されない限り、「１つの抗体」および「複数の抗体」という用語は、抗体の天然に存在する形態、例えば、ポリクローナル抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ）、ならびにモノクローナルおよび組換え抗体、例えば、一本鎖抗体、二重鎖および多重鎖タンパク質、キメラ、ＣＤＲ移植、ヒトおよびヒト化抗体、ならびに多特異的抗体、ならびに前述のすべての断片および誘導体（それらの断片（例えば、ｄＡｂｓ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆａｂ’）および誘導体は、少なくとも１つの抗原結合部位を有する）を広く包含する。抗体誘導体は、タンパク質または抗体に接合される化学的部分を含み得る。「抗体」という用語は、合成変異形および遺伝子操作された変異形も含む。
【００９７】
「キット」は、本発明のマーカーまたはマーカーセットを特異的に検出するために少なくとも１つの試薬、例えば、プローブを含む任意の製品（例えば、パッケージまたは容器）である。この製品は、例えば患者から得られた試料において本発明の方法を例えば生体外で実行するために、販売促進されるか、分配されるか、販売されるか、または一つの単位として売り出され得る。そのようなキットに含まれる試薬は、少なくとも１つの核酸プローブと、任意に、本明細書に記載の１つ以上のマーカーの分析、例えば、マーカーの特徴、例えば、大きさ、配列、組成、もしくは量、例えば、発現の検出に用いるための１つ以上のプライマーおよび／または抗体を含み得る。加えて、本発明のキットは、好適な検出アッセイを説明する取扱説明書を包含し得る。そのようなキットは、例えば、臨床試験設定または医薬品試験受託設定において、記録、記憶、送信、または受信される、例えば、１つ以上のマーカーの発現レベル、特徴、例えば、大きさ、配列、活性、または組成に関する情報を生成するために好都合に使用され、例えば、非血液学的癌、例えば、非小細胞肺癌、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、頭頸部癌、前立腺癌、または腎細胞癌を含むプロテアソーム阻害治療薬で治療することができる癌が存在する可能性を呈する特定の患者において、癌の症状を呈する患者の診断、評価、または治療を可能にすることができる。
【００９８】
本方法および組成物は、癌に罹患する患者の診断および治療で用いるように設計される。癌または腫瘍は、本方法に従って治療または診断される。「癌」または「腫瘍」は、患者における初期の腫瘍および任意の転移を含む任意の腫瘍成長を含むよう意図される。癌は、血液学的癌または固形腫瘍型であり得る。血液学的腫瘍は、例えば、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、白血病（例えば、ワルデンシュトレーム症候群、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、他の白血病）、リンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫）、および骨髄異形成症候群を含む血液学由来の腫瘍を含む。固形腫瘍は、臓器で発生し得、皮膚癌、肺癌、脳癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸癌、腎臓癌、膵臓癌、肝臓癌、食道癌、胃癌、腸癌、膀胱癌、子宮癌、頸癌、精巣癌、副腎癌等の癌を含む。癌は、そのマーカー遺伝子が変異を有する細胞を含み得る。本明細書で使用されるとき、腫瘍細胞を含む癌細胞は、異常な（増加した）速度で分裂する細胞、またはその増殖もしくは生存期間の制御が、癌細胞が発生または生存する同一の組織中の細胞とは異なる細胞を指す。癌細胞には、癌腫、例えば、扁平上皮癌、基底細胞癌、汗腺癌、脂腺癌、腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、未分化癌、気管支癌、黒色腫、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌（ｂｉｌｅ  ｄｕｃｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胆管癌（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳頭癌、移行上皮癌、絨毛腫、セミノーマ、胎生期癌、乳癌、消化管癌、結腸癌、膀胱癌、前立腺癌、および頸頭部領域の扁平上皮癌；肉腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索肉腫（ｃｈｏｒｄｏｓａｒｃｏｍａ）、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、および中皮肉腫；血液癌、例えば、骨髄腫、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、顆粒球性白血病、単球性白血病、リンパ球性白血病）、およびリンパ腫（例えば、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、悪性リンパ腫、形質細胞腫、細網肉腫、またはホジキン病）、ならびに神経膠腫、髄膜腫、髄芽腫、神経鞘腫、または上衣腫を含む神経系腫瘍中の細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００９９】
本明細書で使用されるとき、「非侵襲性」という用語は、対象に最小の危害を加える手順を指す。臨床応用の場合、非侵襲性サンプリング手順は、典型的には麻酔なしで、かつ／または外科的手段もしくは縫合を用いることなく、例えばウォークイン設定で迅速に行われ得る。非侵襲性試料の例は、血液、血清、唾液、尿、口腔スワブ、咽喉培養物、糞便サンプル、および頸管スミアを含む。非侵襲的診断分析は、ｘ線、磁気共鳴映像法、陽電子放出断層撮影等を含む。
【０１００】
薬理ゲノムマーカーの量、例えば、遺伝子型マーカー遺伝子、例えば、ＲＡＳの変異状態の測定による腫瘍の治療の成果の判定が本明細書に記載される。本発明の方法は、患者由来の細胞または核酸の試料中の野生型または変異体ＫＲＡＳ遺伝子の存在または不在の検出を含むことを特徴とし得る。変異は、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの同一性の違い、または（ｉｉ）ヌクレオチドの数の違いであり得、この違いは、単一のヌクレオチドまたはいくつかのヌクレオチドであり得る。本発明は、染色体再配置、例えば、染色体転置等のＫＲＡＳ遺伝子の違いを検出するための方法も提供する。例えば血液試料からの非侵襲的手段、便利な手段、または低コストの手段による成果の判定についても記載される。固形腫瘍、例えば、非血液学的腫瘍、例えば、非小細胞肺癌、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、頭頸部癌、前立腺癌、または腎細胞癌等の癌の程度または成果を決定するための典型的な方法は、遺伝子型または表現型分析、例えば、組織学的分析のために組織を収集する生検を用い得る。本発明は、患者における腫瘍の治療または疾患の管理に適切な治療レジメンを決定するか、判定するか、勧めるか、または提供するための方法を提供する。本明細書に開示のキットおよび方法を用いた治療の監視は、好ましくない成果の可能性を特定してそれらの予防を可能にし得、したがって、治療レジメンの調整、治療の中止、または代替の治療の使用による罹患率の低下、死亡率の低下、および治療費の節約を可能にし得る。
【０１０１】
「試料」という用語は、試料、例えば、対象から単離される組織、細胞、生体液、およびそれらの単離物、ならびに対象に存在する組織、細胞、および体液を含むよう意図され、患者または健常な対象から得られ得る。骨髄、例えば、骨髄腫腫瘍の血液学的腫瘍において、腫瘍の一次分析は、骨髄試料、例えば、骨髄腫腫瘍細胞を含む試料で行われ得る。しかしながら、いくつかの腫瘍細胞（例えば、クロノタイプ腫瘍細胞、循環内皮細胞）は、全血中の細胞集団の割合である。これらの細胞は、血液学的腫瘍、例えば、白血病、リンパ腫、および骨髄腫の標準的な治療法である骨髄移植に備えて、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）での患者の治療中に血液中にも動員され得る。多発性骨髄腫中の循環腫瘍細胞の例は、例えば、Ｐｉｌａｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｌｏｏｄ  ９５：１０５６−６５およびＲｉｇｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ  １０７：２５３１−５によって研究されている。したがって、例えばマーカーを生体外で測定して治療の成果を決定するための非侵襲的試料は、末梢血試料を含み得る。したがって、末梢血中の細胞は、マーカー量について試験され得る。血液学的腫瘍を有する患者の場合、標準の特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量の対照参照試料は、患者の皮膚または口腔スワブから得られ得る。固形腫瘍の場合、腫瘍細胞を含む典型的な試料は、一次腫瘍または隣接リンパ節の生検である。低侵襲的な手段で得られた固形腫瘍試料、例えば、腫瘍部位から流れるか、または掻爬された固形腫瘍試料は、頸管スミア（例えば、子宮頸癌患者のもの）、腫瘍浸出液、例えば、リンパ液、嚢胞液、乳頭吸引液（例えば、乳癌患者のもの）、腹水、胸膜液、唾液（例えば、肺癌患者のもの）、婦人科液（例えば、卵巣癌患者のもの）、尿、糞便（例えば、結腸癌のもの）を含む。固形腫瘍の場合、標準の特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量の対照参照試料は、患者の血液から得られ得る。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、腫瘍細胞は、肺癌細胞および結腸癌細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、固形腫瘍細胞を含む試料は、肺癌細胞を含む。いくつかの実施形態において、固形腫瘍細胞を含む試料は、非小細胞肺癌細胞を含む。いくつかの実施形態において、固形腫瘍細胞を含む試料は、結腸癌細胞を含む。
【０１０３】
血液収集容器は、抗凝血剤、例えば、ヘパリンまたはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、血液の完全性を維持するためにデキストロースまたはアルブミンまたは緩衝液、例えば、リン酸塩等の添加物を有するクエン酸ナトリウムもしくはクエン酸塩溶液を含み得る。マーカーの量が試料中のそのＤＮＡレベルを測定することによって測定される場合、ＤＮＡ安定剤、例えば、ＤＮＡｓｅを阻害する作用薬が試料に添加され得る。マーカーの量が試料中のそのＲＮＡレベルを測定することによって測定される場合、ＲＮＡ安定剤、例えば、ＲＮＡｓｅを阻害する作用薬が試料に添加され得る。マーカーの量が試料中のそのタンパク質レベルを測定することによって測定される場合、タンパク質安定剤、例えば、プロテアーゼを阻害する作用薬が試料に添加され得る。血液収集容器の一例には、血液収集時のＲＮＡ安定化に有用なＰＡＸＧＥＮＥ（登録商標）チューブ（ＰＲＥＡＮＡＬＹＴＩＸ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）がある。末梢血試料または腫瘍浸出液は、修飾、例えば、分画、分類、または濃縮され得る（例えば、腫瘍で富化された試料または腫瘍を枯渇した試料（例えば、参照試料用に）をもたらすため）。修飾された試料の例として、例えば、負の選択、例えば、赤血球から白血球の分離（例えば、濃厚糖溶液または高分子溶液（例えば、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））またはＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ（登録商標）−１０７７溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＬＰおよびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））の分画遠心分離）、ならびに／または選択剤（例えば、直接単離（例えば、Ｂ細胞マーカーに結合する磁気ビーズ（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）のもの）を含む細胞の溶液への磁場の印加）または蛍光活性化細胞分類のためにＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、もしくはＣＤ１３３等の腫瘍細胞もしくは骨髄前駆体マーカーに結合する試薬）へのＢ細胞の結合による正の選択によって収集され得るクロノタイプ骨髄腫細胞が挙げられる。非骨髄腫試料、例えば、固形腫瘍由来の腫瘍浸出液は、例えば、当技術分野で既知の腫瘍細胞選択マーカーを用いた、腫瘍細胞を富化するための骨髄腫試料と同様の方法によって処理され得る。
【０１０４】
あるいは、腫瘍細胞株、例えば、ＨＣＴ−１１６、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、ＮＣＩ−Ｈ１６５０、ＨＣＣ−８２７、ＳＷ４８、Ｃａｌｕ−１、ＯＣＩ−Ｌｙ３、ＯＣＩ−Ｌｙ１０細胞（Ａｌｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：５０３−５１１）、ＲＰＭＩ６６６６細胞、ＳＵＰ−Ｂ１５細胞、ＫＧ−１細胞、ＣＣＲＦ−ＳＢ細胞、８ＥＳ細胞、Ｋａｓｕｍｉ−１細胞、Ｋａｓｕｍｉ−３細胞、ＢＤＣＭ細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｍｏ−Ｂ細胞、ＪＭ１細胞、ＧＡ−１０細胞、もしくはＢ細胞リンパ腫（例えば、ＢＣ−３）もしくは細胞株、または腫瘍細胞株の収集（例えば、ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＰＮＡＳ  １０４：１９９３６−１９９４１またはＯＮＣＯＰＡＮＥＬ（商標）抗癌腫瘍細胞プロファイリングスクリーニング（Ｒｉｃｅｒｃａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ））を参照のこと）がアッセイされ得る。当業者であれば、本方法で使用される適切な細胞を（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から）容易に選択し、得ることができる。患者における治療の成果を予測するか、または治療プロトコルの有効性を監視するための組成物または方法が用いられる場合、治療される患者から得られた組織または血液試料は、アッセイに有用な細胞源またはマーカー遺伝子源または遺伝子産物源である。
【０１０５】
試料、例えば、腫瘍試料、例えば、生検もしくは骨髄試料、血液もしくは修飾された血液試料、（例えば、腫瘍細胞を含む）、腫瘍浸出液試料、および／または参照試料、例えば、対応対照（例えば、生殖系列）試料は、試料中のマーカーの量を判定する前に様々な周知の収集後調製および保存技法（例えば、核酸および／またはタンパク質抽出、固定、保存、凍結、限外濾過、濃縮、蒸発、遠心分離等）に供され得る。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、マーカーにおける変異は、マーカー遺伝子、例えば、遺伝子型マーカー遺伝子、例えば、ＫＲＡＳと相関した核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはタンパク質を配列決定することによって特定され得る。核酸を配列決定するための当技術分野で既知のいくつかの配列決定方法が存在する。核酸プライマーは、潜在的な変異部位を含む領域に結合するように設計され得るか、または野生型配列ではなく変異した配列を補完するように設計され得る。プライマー対は、マーカー遺伝子における潜在的な変異を含む領域を括弧で囲む（ｂｒａｃｋｅｔ）ように設計され得る。プライマーまたはプライマー対を用いて、マーカー遺伝子に対応するＤＮＡの一方の鎖または両方の鎖を配列決定することができる。配列量を増大させるために配列決定して、マーカー遺伝子における変異の検出する前に、プライマーをプローブ、例えば、核酸プローブ、例えば、ハイブリダイゼーションプローブとともに用いて、目的とする領域を増幅することができる。配列決定され得る領域の例として、全遺伝子、全遺伝子の転写物、および全遺伝子または転写物の断片、例えば、エクソンまたは非翻訳領域のうちの１つ以上、または変異部位を含むマーカーの一部が挙げられる。プライマー選択および配列決定または組成分析を目的とした変異の例は、ＣＯＳＭＩＣおよびｄｂＧａＰ等の変異情報を収集する公開データベースで見つけられ得る。ＫＲＡＳ等のマーカー遺伝子のいくつかの変異は、プロテアソーム阻害、例えば、ペプチジルボロン酸、例えば、ボルテゾミブまたはクエン酸イクサゾミブによる阻害への耐性に関連し得る変異の例として、実施例１および実施例の表５に列記される。
【０１０７】
配列決定法は当業者に既知である。配列決定法の例として、サンガー法、ＳＥＱＵＥＮＯＭ（商標）法、および次世代シーケンシング（ＮＧＳ）法が挙げられる。電気泳動、例えば、プライマー伸長標識ＤＮＡ断片を分離するためのキャピラリー電気泳動の使用を含むサンガー法は、ハイスループット適用のために自動化され得る。プライマー伸長配列決定は、目的とする領域のＰＣＲ増幅後に行われ得る。ソフトウェアは、塩基配列決定コーリング（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅ  ｃａｌｌｉｎｇ）および変異特定を支援し得る。ＳＥＱＵＥＮＯＭ（商標）ＭＡＳＳＡＲＲＡＹ（登録商標）配列決定分析（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、変異を特定するために目的とする特定の断片の実際の質量を予想される質量と比較する質量分析法である。ＮＧＳ技術（「超並列配列決定」および「第２世代配列決定」とも称される）は、概して、以前の方法よりもはるかに高いスループットを提供し、様々な手法を用いる（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３８：９５−１０９およびＳｈｅｎｄｕｒｅ  ａｎｄ  Ｈａｎｌｅｅ（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６：１１３５−１１４５で概説される）。ＮＧＳ法は、試料中のマーカーにおける低頻度の変異を特定し得る。いくつかのＮＧＳ法（例えば、ＧＳ−ＦＬＸゲノムシーケンサー（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ））、ゲノムアナライザー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））、ＳＯＬＩＤ（商標）アナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、Ｐｏｌｏｎａｔｏｒ  Ｇ．００７（Ｄｏｖｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｌｅｍ，ＮＨ））、ＨＥＬＩＳＣＯＰＥ（商標）（Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ））を参照のこと）は、フローセルにおいて空間的に分離されたＰＣＲ産物をクローン増幅するか、またはクローン増幅しない環状アレイシークエンシング、およびシークエンシング酵素（例えば、ポリメラーゼまたはリガーゼ）によって組み込まれる標識修飾ヌクレオチドを検出する様々なスキームを用いる。１つのＮＧＳ法において、プライマー対をＰＣＲ反応で用いて、目的とする領域を増幅することができる。増幅された領域は連結されて、連鎖状の産物になり得る。クローンライブラリは、ＰＣＲ産物または連結された産物からフローセル内に生成され、ポリメラーゼが標識塩基の同一性に応じて４つのチャネルのうちの１つに画像化される可逆的に終結された標識塩基を添加するときにシングルエンドシークエンシングのためにさらに増幅され（「ブリッジ」または「クラスター」ＰＣＲ）、その後、次のサイクルのために除去される。ソフトウェアは、変異を特定するためのゲノム配列の比較に役立ち得る。別のＮＧＳ法は、ゲノム中のすべての遺伝子のエクソン配列決定に焦点を当てたエクソームシーケンシングである。他のＮＧＳ法と同様に、エクソンは、捕捉法または増幅法によって富化され得る。
【０１０８】
タンパク質および核酸の組成は、当技術分野で既知の多くの方法によって、例えば、それらを切断、分解、または消化するようにそれらを処理し、その後、それらの構成成分を分析することによって決定され得る。質量分析、電気泳動、およびクロマトグラフィーは、比較のために構成成分を分離および定義し得る。欠失または挿入を引き起こす変異は、これらの方法における大きさまたは変化の違いによって特定され得る。タンパク質消化または制限酵素での核酸消化は、いくつかの変異後に異なる断片パターンを明らかにし得る。それらの構造の文脈において特定の変異体アミノ酸を認識する抗体は、試料におけるこれらの変異を特定および検出し得る（以下を参照のこと）。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ、例えば、野生型または変異マーカーに対応するゲノムＤＮＡは、当技術分野で既知の方法を用いて、生体試料においてｉｎ  ｓｉｔｕ形式および生体外形式の両方によって分析され得る。ＤＮＡは、試料から直接単離され得るか、または別の細胞成分、例えば、ＲＮＡもしくはタンパク質の単離後に単離され得る。キット、例えば、ＱＩＡＡＭＰ（登録商標）ＤＮＡマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））は、ＤＮＡ単離に使用可能である。そのようなキットを用いてＤＮＡを増幅することもできる。
【０１１０】
別の実施形態では、マーカーに対応するｍＲＮＡは、当技術分野で既知の方法を用いて、生体試料においてｉｎ  ｓｉｔｕ形式および生体外形式の両方によって分析され得る。発現レベルを測定するための方法の一例が実施例に含まれる。多くの発現検出方法が単離ＲＮＡを用いる。生体外での方法の場合、ｍＲＮＡの単離を選択しない任意のＲＮＡ単離技法を利用して、腫瘍細胞からＲＮＡを精製することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８７−１９９９を参照のこと）。さらに、多数の組織試料を、例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉの一段階ＲＮＡ単離プロセス（米国特許第４，８４３，１５５号（１９８９年））等の当業者に周知の技法を用いて容易に処理することができる。ＲＮＡを、標準の手順（例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９を参照のこと）、溶液（例えば、トリゾール、ＴＲＩ  ＲＥＡＧＥＮＴ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）米国特許第５，３４６，９９４号を参照のこと）、またはキット（例えば、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）Ｇｒｏｕｐ  ＲＮＥＡＳＹ（登録商標）単離キット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）またはＬＥＵＫＯＬＯＣＫ（商標）全ＲＮＡ単離システム（Ａｍｂｉｏｎ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）））を用いて単離することができる。
【０１１１】
さらなるステップを用いて、ＤＮＡをＲＮＡ試料から除去することができる。細胞溶解を、非イオン洗剤を用いて達成し、その後、マイクロ遠心分離して核、ゆえに、細胞ＤＮＡの大部分を除去することができる。ＤＮＡは、その後、ＤＮＡ分析のために核から単離され得る。一実施形態において、ＲＮＡは、チオシアン酸グアニジン溶解、その後、ＲＮＡをＤＮＡから分離するＣｓＣｌ遠心分離を用いて、目的とする様々な種類の細胞から抽出される（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：５２９４−９９）。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、オリゴ−ｄＴセルロースの選択によって選択される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．））。あるいは、ＤＮＡからのＲＮＡの分離は、例えば、熱フェノールまたはフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールでの有機抽出によって達成され得る。所望される場合、ＲＮＡｓｅ阻害剤は、溶解緩衝液に添加され得る。同様に、ある細胞型において、タンパク質変性／消化ステップをプロトコルに追加することが望ましくあり得る。多くの適用において、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）等の他の細胞ＲＮＡに対してｍＲＮＡを富化することが望ましい。ほとんどのｍＲＮＡは、３’末端にポリ（Ａ）尾部を含有する。これは、それらが、例えば、セルロースまたはＳＥＰＨＡＤＥＸ．Ｒ（商標）媒体等の固体支持体に結合されたオリゴ（ｄＴ）またはポリ（Ｕ）を用いて、親和性クロマトグラフィーによって富化されることを可能にする（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。いったん結合されると、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡは、２ｍＭのＥＤＴＡ／０．１％ＳＤＳを用いて親和性カラムから溶出される。
【０１１２】
例えば、試料（例えば、骨髄試料、腫瘍生検、または参照試料）を試験対象から得た後の試料中の本発明のマーカーの特徴は、例えば核酸（例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、もしくはｃＤＮＡ）および／または翻訳されたタンパク質の例えば１つのマーカーまたは複数のマーカーの特徴を検出または測定するための様々な周知の方法のうちのいずれかによって判定され得る。そのような方法の非限定的な例として、分泌タンパク質、細胞表面タンパク質、細胞質タンパク質、または核タンパク質を検出するための免疫学的方法；タンパク質精製方法；タンパク質機能もしくは活性アッセイ；ミスマッチ領域、すなわち、変異体または変異形領域を消化して、結果として生じた消化された断片から変異体または変異形を分離および特定する、任意に「ミスマッチ切断」ステップを含む核酸ハイブリダイゼーション方法（Ｍｙｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２）；核酸逆転写法；ならびに核酸増幅法および増幅された産物の分析が挙げられる。これらの方法は、遺伝子アレイ／チップ技術、ＲＴ−ＰＣＲ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））（例えば、ＧＬＰによって認可された実験室条件下）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、免疫組織化学方法、免疫ブロット法、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）、ＦＡＣＳ分析、ノーザンブロット、サザンブロット、ＩＮＦＩＮＩＵＭ（登録商標）ＤＮＡ分析ビーズチップ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））、定量ＰＣＲ、細菌人工染色体アレイ、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ））、または細胞遺伝学的分析を含む。
【０１１３】
２つの核酸間の少なくとも１つのヌクレオチドの違いを検出するための技法の例として、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、オリゴヌクレオチドプローブが調製され得、そこで、既知の多型ヌクレオチドが中心に置かれ（対立遺伝子または変異体特異的プローブ）、その後、完全一致が見られる場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズされ得る（Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３、Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：６２３０、およびＷａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．６：３５４３）。そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション技法を用いて、ＫＲＡＳの異なる多型または変異領域におけるいくつかのヌクレオチド変化を同時に検出することができる。例えば、特異的対立遺伝子変異形または変異体のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドは、固体支持体、例えば、ハイブリダイゼーション膜およびこの支持体、例えば、膜に結合され、その後、標識試料核酸とハイブリダイズされる。したがって、ハイブリダイゼーションシグナルの分析は、試料核酸のヌクレオチドの同一性を明らかにし得る。
【０１１４】
したがって、本発明の検出方法を用いて、例えば、生体試料中のＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡを生体外でも生体内でも検出することができる。さらに、本発明のマーカーに対応するポリペプチドまたは核酸の生体内での検出技法は、対象に標識プローブを導入して、バイオマーカー、例えば、バイオマーカーの転写物と相補的な核酸または標識抗体、ポリペプチドに対して指向されるＦｃ受容体または抗原、例えば、野生型または変異体マーカーを検出することを含む。例えば、抗体は、対象におけるその存在および位置が標準の画像化技法によって検出され得る放射性同位体で標識され得る。これらのアッセイを様々な方法で実施することができる。当業者であれば、マーカー（複数を含む）、組織試料、および問題の変異の性質に基づいて、これらまたは他の適切かつ利用可能な方法から選択することができる。いくつかの方法は、以下の項でより詳細に説明される。様々な方法もしくは方法の組み合わせは、様々な事例、または例えば、様々な種類の腫瘍もしくは患者集団において適切であり得る。
【０１１５】
本発明のマーカーに対応するポリペプチドの生体外での検出技法は、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、タンパク質アレイ、免疫沈降、免疫組織化学的方法、および免疫蛍光法を含む。そのような例において、マーカーの発現は、マーカータンパク質もしくはその断片、例えば、変異部位等の変異され得る領域もしくは変異配列を含む部分を含むタンパク質もしくは断片、またはその構造の文脈における変異残基（その正常な翻訳後修飾のすべてまたは一部を経たマーカータンパク質を含む）に特異的に結合する抗体（例えば、非標識抗体、放射性標識抗体、発色団標識抗体、フルオロフォア標識抗体、または酵素標識抗体）、抗体誘導体（例えば、基質またはタンパク質リガンド対（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン）のタンパク質もしくはリガンドと接合された抗体）、または抗体断片（例えば、一本鎖抗体、単離された抗体、超可変ドメイン等）を用いて判定される。抗体は、配列番号３、６、および９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を検出し得る。あるいは、抗体は、配列番号３および６からなる群から選択される変異体の変異形アミノ酸配列を有する変異タンパク質を検出し得る。ｄｂＧａＰのＣＯＳＭＩＣ等の公開データベースにおいて変異したと見なされる残基は、変異体残基を特異的に認識し、かつそれに結合する抗体を生成するための免疫原性組成物中で調製され得る。別の方法は、抗体対を用いることができ、その対の一方は、マーカータンパク質、すなわち、予想される変異、例えば、ナンセンス変異、点変異、挿入、または欠失の領域のＮ末端に結合し、対の他方は、タンパク質の下流に結合する。野生型タンパク質は、その対の両方の抗体に結合するが、ナンセンス変異、点変異、挿入、または欠失変異を有するタンパク質は、その対のＮ末端抗体にのみ結合する。サンドイッチＥＬＩＳＡ法等のアッセイは、例えば参照試料と比較して、腫瘍試料中の野生型タンパク質の数量損失を検出し得るか、または標準のＥＬＩＳＡは、抗体の結合レベルを比較して、変異が腫瘍試料に存在することを推測する。
【０１１６】
タンパク質マーカーの量または機能性を決定するための間接的な方法は、タンパク質の活性の測定も含む。例えば、試料、あるいは試料から単離されるか、または試料から単離、クローニング、または増幅された核酸から発現されたタンパク質は、マーカータンパク質活性について判定され得る。ＲＡＳ癌遺伝子の場合、活性化変異は、ＧＴＰａｓｅ活性の低下またはＲａｓＧＡＰもしくは細胞膜への結合の変化として測定され得る。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、方法は、ＧＬＵＴ４の量の測定を含む。いくつかの実施形態において、ＧＬＵＴ４発現を測定するためのアッセイは、配列番号９に結合する抗体を用いる。いくつかの実施形態において、ＧＬＵＴ４発現の定量化は、腫瘍細胞を含む試料中の配列番号９に結合する抗体への結合量を測定する。いくつかの実施形態において、ＧＬＵＴ４の量は、腫瘍生検の免疫組織化学によって定量化される。いくつかの実施形態において、ＧＬＵＴ４の量は、腫瘍浸出液の免疫組織化学によって定量化される。いくつかの実施形態において、ＧＬＵＴ４の量は、抗体結合または染色度のスコアによって決定される。いくつかの実施形態において、ＧＬＵＴ４の量は、腫瘍細胞中の抗体結合または染色を腫瘍細胞を含む試料中の非腫瘍細胞と比較することによって決定される。
【０１１８】
一実施形態において、マーカーの発現は、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ（すなわち、転写ポリヌクレオチド）を患者試料中の細胞から調製し、かつｍＲＮＡ／ｃＤＮＡをマーカー核酸の相補体またはその断片である参照ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることによって判定される。ｃＤＮＡは、任意に、参照ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの前に様々なポリメラーゼ連鎖反応法のうちのいずれかを用いて増幅され得る。１つ以上のマーカーの発現は、同様に、定量ＰＣＲを用いて検出されて、マーカー（複数を含む）の発現レベルを判定することができる。ｍＲＮＡレベルの測定の使用例は、マーカー遺伝子における不活性化変異が、細胞におけるｍＲＮＡのレベルの変化をもたらし得ることである。レベルは、タンパク質の機能不全もしくは不在を考慮してフィードバックシグナル伝達タンパク質が産生されるため上方制御され得るか、または変化したｍＲＮＡ配列が不安定であるため下方制御され得る。あるいは、本発明のマーカーの変異または変異形（例えば、上述の単一ヌクレオチド多型、欠失等）を検出する多くの既知の方法のうちのいずれかを用いて、患者におけるマーカー遺伝子の変異の発生を検出することができる。
【０１１９】
直接測定の一例として、転写物の定量化がある。本明細書で使用されるとき、発現のレベルまたは量は、マーカーによってコードされるｍＲＮＡの発現の絶対量またはマーカーによってコードされるタンパク質の発現の絶対量を指す。選択されたマーカーの絶対発現量に基づく決定の代替案として、決定は、規格化発現量に基づき得る。発現量は、例えば、構成的に発現されるハウスキーピングの役割において、その発現とマーカーではない対照マーカーの発現との比較時にマーカーの絶対発現レベルを補正することによって規格化され得る。規格化に好適なマーカーは、アクチン遺伝子またはβ−２ミクログロブリン等のハウスキーピング遺伝子も含む。データ規格化のための参照マーカーには、遍在的に発現されるマーカーおよび／またはその発現が癌遺伝子によって制御されないマーカーが含まれる。構成的に発現された遺伝子は当技術分野で既知であり、関連組織および／または患者の状態、ならびに分析方法に従って特定および選択され得る。そのような規格化は、ある試料の発現レベルを別の試料と比較すること、例えば、異なる時間または異なる対象由来の試料間の発現レベルを比較することを可能にする。さらに、発現レベルは、関連発現レベルとして提供され得る。ゲノムＤＮＡ試料のベースライン、例えば、２倍体コピー数は、腫瘍を有しない対象由来の細胞または患者由来の非腫瘍細胞の量を測定することによって決定され得る。マーカーまたはマーカーセットの相対量を決定するために、マーカーまたはマーカーセットの量は、問題の試料の発現の決定前にベースラインを確立するために、少なくとも１個、または２、３、４、５個以上の試料、例えば、７、１０、１５、２０、または５０個以上の試料から決定される。ベースライン測定を確立するために、大量の試料においてアッセイされたマーカーまたはマーカーセットの平均量またはそれぞれのレベルが決定され、これは、問題のバイオマーカーまたはバイオマーカーセットのベースライン発現レベルとして使用される。その後、試験試料のために決定されたマーカーまたはマーカーセットの量（例えば、絶対発現レベル）は、そのマーカーまたはマーカーセットのために得られたベースライン値で割られる。これは、相対量を提供し、異常なレベルのマーカータンパク質活性の特定に役立つ。
【０１２０】
本発明の核酸分子の配列に基づくプローブを用いて、本発明の１つ以上のマーカーに対応する転写物またはゲノム配列を検出することができる。このプローブは、それに結合される標識基、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補助因子を含み得る。そのようなプローブは、例えば、対象由来の細胞の試料中のタンパク質をコードする核酸分子のレベルを測定することによって、例えば、ｍＲＮＡレベルを検出するか、またはタンパク質をコードする遺伝子が変異もしくは欠失されたかを決定することによって、タンパク質を発現する細胞または組織を特定するための診断試験キットの一部として使用され得る。
【０１２１】
本明細書に記載のデータベース記録に記載されるヌクレオチド配列に加えて、当業者であれば、アミノ酸配列の変化をもたらすＤＮＡ配列多型が集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることを理解する。そのような遺伝的多型は、天然に発生する対立遺伝子変異のため、集団内の個体の間に存在し得る。対立遺伝子は、所与の遺伝子座で選択的に生じる遺伝子群のうちの１つである。加えて、ＲＮＡ発現レベルに影響を与えるＤＮＡ多型も存在し得、その遺伝子の全体の発現レベルに影響を与え得ることが理解される（例えば、制御または分解に影響を与えることによって）。
【０１２２】
プライマーまたは核酸プローブは、特異的マーカーまたはその変異領域と相補的なヌクレオチド配列を含み、マーカー遺伝子またはマーカー遺伝子に関連した核酸と選択的にハイブリダイズするのに十分な長さであり、例えば、それらは、核酸に塩基配列特異的に結合し得、例えば、洗浄後、結合されたままであり得る。プライマーおよびプローブを用いて、マーカー核酸の単離および配列決定を支援することができる。一実施形態において、プライマーまたは核酸プローブ、例えば、実質的に精製されたオリゴヌクレオチド、単離された核酸は、例えば、ストリンジェントな条件下で、マーカー遺伝子の約６、８、１０、１２、もしくは１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、２００、３５０、５００個以上の連続したヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する領域、またはマーカー遺伝子もしくはそれ由来の転写物もしくはその相補体における変異を含む領域を含む。別の実施形態では、プライマーまたは核酸プローブは、配列番号１、２、４、５、７、８のうちのいずれかに記載の任意の配列のヌクレオチド配列、または例えば１１５２４７０８５と１１５２５９５１５の塩基対の染色体１ｐの配列、および例えば２５３５８１８０と２５４０３８５４の塩基対の染色体１２ｐの配列、または前述の配列のうちのいずれかの相補体を含むマーカー核酸にハイブリダイズすることができる。例えば、少なくとも約１５個の連続したヌクレオチド、少なくとも約２０個の連続したヌクレオチド、少なくとも約２５個の連続したヌクレオチド、少なくとも約３５個の連続したヌクレオチド、少なくとも約５０個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、または配列番号１、２、４、５、７、８のうちのいずれかに記載の約１５〜約２０個の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、または１１５２４７０８５と１１５２５９５１５の塩基対の染色体１ｐの配列もしくは２５３５８１８０と２５４０３８５４の塩基対の染色体１２ｐ、または前述の配列のうちのいずれかの相補体を含むプライマーまたは核酸プローブが、本発明によって提供される。約２５個以上、４０個以上、または５０個以上のヌクレオチドの配列を有するプライマーまたは核酸プローブも本発明の範囲内である。別の実施形態では、プライマーまたは核酸プローブは、配列番号１、２、４、５、７、８のうちのいずれかに記載の任意の配列のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、８０％、もしくは８５％、または少なくとも９０％、９５％、もしくは９７％同一の配列、あるいは１１５２４７０８５と１１５２５９５１５の塩基対の染色体１ｐの配列、２５３５８１８０と２５４０３８５４の塩基対の染色体１２ｐの配列、または前述の配列のうちのいずれかの相補体を有し得る。核酸類似体は、ハイブリダイゼーションのための結合部位として用いられ得る。好適な核酸類似体の一例には、ペプチド核酸がある（例えば、Ｅｇｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：５６６  ５６８（１９９３）、米国特許第５，５３９，０８３号を参照のこと）。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、核酸プローブは、野生型配列に結合するように設計され得、したがって、その領域における変異の存在が、そのプローブによる結合またはハイブリダイゼーションの減少、例えば、測定可能な減少を引き起こし得る。別の実施形態では、核酸プローブは、変異体配列に結合するように設計され得、したがって、その領域における変異の存在は、そのプローブによる結合またはハイブリダイゼーションの増加を引き起こし得る。他の実施形態では、プローブおよびプライマーセットまたはプライマー対は、変異を有し得るマーカー内の領域を括弧で囲むように設計され得、したがって、そのセットまたは対に基づく増幅は、変異を特定するために配列決定され得る核酸をもたらし得る。
【０１２４】
プライマーまたは核酸プローブは、結合エネルギー、塩基組成、配列複雑性、交差ハイブリダイゼーション結合エネルギー、および二次構造を考慮したアルゴリズムを用いて選択され得る（２００１年１月２５日に公開されたＦｒｉｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．の国際特許公開第ＷＯ０１／０５９３５号、Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：３４２−７（２００１）を参照のこと）。本発明の有用なプライマーまたは核酸プローブは、それぞれの転写物、例えば、変異標的領域に特有の配列に結合し、その特定の核酸、例えば、転写物または変異転写物のみを増幅、検出、および配列決定するためにＰＣＲで用いられ得る。マーカー遺伝子、例えば、ＫＲＡＳのいくつかの変異の例は、実施例１および実施例の表５に記載される。他の変異は、本明細書で引用される参考文献および本明細書に記載の公開データベースに記載される。当業者であれば、当技術分野の技術を用いて、例えば、プライマーまたは核酸プローブの縮重またはＧＣ含有量を操作して、プライマーまたは核酸プローブが標準の配列、変異体、または対立遺伝子変異形に結合する可能性を調整することによって、本明細書に開示のマーカー、あるいは同様の特徴を有する関連マーカー、例えば、染色体遺伝子座上のマーカー、または本明細書に記載の同一のマーカー遺伝子の異なる領域における変異を有する関連マーカーのプライマーおよび核酸プローブを設計することができる。Ｏｌｉｇｏバージョン５．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＭＮ））等の当技術分野で周知のコンピュータプログラムは、必要とされる特異性および最適増幅特性を有するプライマーの設計において有用である。完全に相補的な核酸プローブおよびプライマーが本明細書に記載のマーカー、およびその変異体、多型、または対立遺伝子を検出するために使用され得る一方で、完全な相補性からの逸脱が分子の標的領域への特異的なハイブリダイゼーションを阻止しない場合、そのような逸脱が企図される。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端に非相補的な断片を有し得、そのプライマーの残りの部分は、標的領域に相補的であり得る。あるいは、非相補的なヌクレオチドは、結果として生じるプローブまたはプライマーが引き続き標的領域に特異的にハイブリダイズすることができる限り、核酸プローブまたはプライマーに散在し得る。
【０１２５】
治療成果の指標は、１個のマーカー、２個のマーカー、３個のマーカー、または４個以上のマーカー、例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５個のマーカー、変異部位を含む部分もしくはその変異部分、例えば、ＲＡＳ経路に関与するか、またはそれと相互作用するマーカー遺伝子、例えば、細胞周期を制御する遺伝子、例えば、癌における体細胞変異によって不活性化され得る遺伝子、またはグルコース輸送に関与する遺伝子を研究することによって判定され得る。マーカーは、治療成果の別の評価基準、例えば、生化学的マーカー（例えば、骨髄腫におけるＭタンパク質、タンパク尿等の腎臓健康マーカー、Ｃ反応性タンパク質の血清レベル、またはＮＳＣＬＣのサイトケラチン１９、サイトケラチン断片２１−１（ＣＹＦＲＡ２１−１）、または炭水化物抗原１９−９（ＣＡ１９−９）の血清レベルもしくは膵臓癌の代謝プロファイリング））、あるいは組織学的マーカー（例えば、芽球数、単位面積当たりの有糸分裂像数、黒色腫腫瘍もしくは頭頸部腫瘍、例えば、食道腫瘍の浸潤の深度測定）と組み合わせて研究され得る。
【０１２６】
統計的方法は、マーカーの量の測定時、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質の測定時の治療成果の決定を支援し得る。１つのマーカーの量は、複数の時点、例えば、作用薬、例えば、プロテアソーム阻害剤での治療前、治療中、治療後に測定され得る。例えば時間的なベースラインからのマーカーの発現の変化の進行を決定するために、発現結果は、反復測定線形回帰モデルによって分析され得る（Ｌｉｔｔｅｌｌ，Ｍｉｌｉｋｅｎ，Ｓｔｒｏｕｐ，Ｗｏｌｆｉｎｇｅｒ，Ｓｃｈａｂｅｎｂｅｒｇｅｒ（２００６）ＳＡＳ  ｆｏｒ  Ｍｉｘｅｄ  Ｍｏｄｅｌｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｙ，ＮＣ））：
等式１
【数１】
2014533112.tif 000012
式中、Ｙｉｊｋは、ｉ回目の治療における第ｊの動物のｋ日目のｌｏｇ２変換した発現（ハウスキーピング遺伝子に対して規格化された発現）であり、Ｙｉｊ０は、ｉ回目の治療における第ｊの動物の定義されたベースラインｌｏｇ２変換した発現（ハウスキーピング遺伝子に対して規格化された発現）であり、ｋ日目は、カテゴリ変数として扱われ、εｉｊｋは、残差項である。共分散行列（例えば、一次自己回帰、化合物対称性、空間べき乗則（ｓｐａｔｉａｌ  ｐｏｗｅｒ  ｌａｗ））を特定して、それぞれの動物における反復測定を経時的にモデル化することができる。さらに、それぞれの治療時点は、治療値がビヒクルと大きく異なったかを試験するために、ビヒクル群の同一の時点に戻って比較され得る。
【０１２７】
いくつかの他の方法を用いて、データを分析することができる。例えば、サイクル数の代わりに相対発現値が分析され得る。これらの値は、倍率変化またはベースラインとの絶対差のいずれかとして試験され得る。さらに、不一致の反復測定分析（ＡＮＯＶＡ）は、不一致がすべての群および時点にわたって等しい場合に使用され得る。最後の（または他の）時点にベースラインからの観察された変化は、対応のあるｔ−検定、小さい試料サイズのデータの有意性を試験するためのフィッシャーの正確検定（ｐ値＝Σ  Ｐ（Ｘ＝ｘ）（ｘ＝１からプロテアソーム阻害に対する感受性、例えば、好ましい成果、またはプロテアソーム阻害に対する非応答性を示す試験された状態、例えば、野生型または変異の数））、または腫瘍患者が健常な対象と大きく異なるかを比較するためのウィルコクソンの符号順位検定（データが正規分布されない場合）を用いて分析され得る。
【０１２８】
１つの時点の量と次の時点の量の差または腫瘍試料の量と正常試料の量の差は、治療成果の予後を示し得る。ベースラインレベルは、治療前に、例えば、ゼロ時点で、治療の１日前、３日前、１週間前、および／または２週間以上前に１、２、３、４回以上発現を測定することによって決定され得る。あるいは、ベースラインレベルは、数名の対象、例えば、健常な対象、あるいは上述の治療を受けないか、またはまだ治療を受けていない同一の健康状態もしくは障害を有する患者から決定され得る。あるいは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ））の遺伝子発現オムニバス（ＧＥＯ）プログラムで蓄積された発現値を用いることができる。例えば、プロテアソーム阻害治療前にサンプリングされた骨髄腫ｍＲＮＡ発現量のデータセットには、ＧＥＯ受託番号ＧＳＥ９７８２（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ  １０９：３１７７−８８においても分析されたもの）およびＧＳＥ６４７７（Ｃｈｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６７：２９２−９によっても分析されたもの）が含まれる。治療が腫瘍に与える影響を試験するために、マーカーの発現は、いくつかの治療後の任意または複数の時点で、例えば、治療の１日後、２日後、３日後、５日後、１週間後、２週間後、３週間後、３週間治療サイクル後に１回、４週間後、４週間治療サイクル後に１回、１ヶ月後、５週間治療サイクル後に１回、２ヶ月後、３ヶ月後、５ヶ月治療サイクル後に１回、および／または６ヶ月以上後に測定され得る。例えば、マーカーの量は、数回の治療後に１回、または治療中複数の間隔で、例えば、１週間、２週間、４週間、３週間に１回、４週間、または５週間サイクルおきに、２回のサイクル、２ヶ月、３ヶ月、または５回以上のサイクルおきに測定され得る。ボルテゾミブでの治療サイクルは、作用薬での治療についての出版物、または製品の添付文書において見つけられ得る。クエン酸イクサゾミブ（ＭＬＮ９７０８）での治療サイクルは、米国国立衛生研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）が管理する臨床試験ウェブサイトで見つけられ得る。逆に、治療レジメンの投与を中止した後の進行性の疾患の発現を決定するために、マーカーの量は、任意または複数の時点で、例えば、最後の治療から１日後、２日後、３日後、５日後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、１ヶ月後、２ヶ月後、３ヶ月後、および／または６ヶ月後以上後に決定され得る。治療後のマーカーの測定結果は、治療の最後に同一のマーカー測定結果と比較され得る。当業者は、マーカーの量を判定するために、様々な要素、例えば、治療の薬物動態、治療期間、治療の薬物動力、患者の年齢、障害の性質、または治療の作用機序に応じて１つまたは複数の時点を決定する。プロテアソーム阻害治療に感受性のあるマーカーの発現のベースラインまたは所定の基準と比較して負の方向に向かう傾向または量の減少は、治療に対する腫瘍の応答性の減少、例えば、耐性の増加を示す。治療成果を有するマーカーの発現のベースラインまたは所定の基準と比較して好ましい成果に向かう傾向は、治療レジメンの有用性または治療の継続的な利益を示す。
【０１２９】
任意のマーカー、例えば、マーカー遺伝子またはマーカーの組み合わせ、例えば、本発明のマーカー遺伝子、またはその変異、ならびにこのマーカー、例えば、本発明のマーカー遺伝子と組み合わせた任意の既知のマーカーは、本発明の組成物、キット、および方法において使用され得る。概して、腫瘍細胞を含む試料中のマーカーの特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量と、対照細胞中の同一のマーカーの特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量との間の可能な限り大きい差のマーカーが選択される。この差は、マーカーの量を判定するための方法の検出限界と同程度に小さい場合もあるが、別の実施形態では、差は、少なくとも判定法の標準誤差よりも大きくあり得る。ＲＮＡまたはタンパク質量の場合、差は、少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、１００、５００、１０００倍以上であり得る。「低い」ＲＮＡまたはタンパク質量は、全体平均に対する発現が腫瘍（例えば、固形腫瘍）試料にわたって低いという意味であり得る。ＤＮＡの量、例えば、コピー数の場合、量は、０、１、２、３、４、５、６個以上のコピーである。欠失は、コピー数を０または１にさせ、増幅は、コピー数を２より多くする。差は、信頼レベル、例えば、０．０５未満のｐ値、０．０２未満のｐ値、０．０１未満のｐ値、またはそれよりも低いｐ値によって限定され得る。
【０１３０】
２つ以上のマーカー、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、または２５セット以上のマーカー、例えば、ＫＲＡＳマーカーを含むマーカーのセットの測定は、治療成果を示す発現プロファイルまたは傾向を提供し得る。いくつかの実施形態において、マーカーセットは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、または２５個以下のマーカーを含む。いくつかの実施形態において、マーカーセットは、複数の染色体遺伝子座、複数のマーカー遺伝子、または１つ以上のマーカー遺伝子（例えば、核酸およびタンパク質、ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡ、または本明細書に記載のマーカーの様々な組み合わせ）の複数のマーカーを含む。マーカーセット中のマーカーの量の判定による治療成果の分析は、統計的方法、例えば、そのマーカーセット中のマーカーの量の治療成果の等級または傾向、例えば、それぞれのマーカーの測定結果の信号対雑音比またはハイブリダイゼーションの効率に寄与し得る変数を計上する加重投票法によって達成され得る。マーカーセット、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、または２５セット以上のマーカーは、少なくとも１つの本明細書に記載のマーカーＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば、１１５２４７０８５と１１５２５９５１５の塩基対の染色体１ｐ上のマーカー、塩基対２５３５８１８０と２５４０３８５４の塩基対の染色体１２ｐ上のマーカー、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＧＬＵＴ４、または前述のうちのいずれかの相補体を分析するために、１つのプライマー、プローブ、または複数のプライマーを含み得る。マーカーセット、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、または２５個以上のマーカーセットは、少なくとも１つもしくは少なくとも２つ以上のマーカー、あるいは例えば、ＮＲＡＳおよび／またはＫＲＡＳおよび／またはＧＬＵＴ４のマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、もしくは２５個以上の変異を検出するために、１つのプライマー、プローブ、または複数のプライマーを含み得る。別の実施形態では、マーカーセットは、野生型バージョンの変異領域を含む野生型ＫＲＡＳ核酸もしくはプローブもしくはプライマー、またはその相補体を含み得るか、あるいはＫＲＡＳの変異領域、例えば、配列番号２のコドン１２、コドン１３、またはコドン６１の配列の特定を支援することができる。いくつかの実施形態において、マーカーセットは、ＫＲＡＳの変異コドン１４６の配列の特定を支援することができるプローブまたはプライマーを含み得る。選択されたマーカーセットは、本明細書に提供されるマーカーから構築され得るか、または本明細書に提供される方法および当技術分野で既知の類似の方法を用いてマーカーの中から選択され得る。本発明のアッセイで用いる新たなマーカーを限定するための１つの方法は、腫瘍細胞を含む試料中のＤＮＡのコピー数をマーカー、例えば、マーカー遺伝子の発現（例えば、ベースラインからの倍率変化）の差と相関させる方法である。関係を判断するための有用な方法は、標準の統計的方法を用いて、決定係数ｒ２を計算し、ｒの値を求めた後、ピアソンの積率相関係数を計算し、かつ／または最小二乗プロットを作成する方法である。相関関係は、マーカー、例えば、マーカー遺伝子の発現レベルに対するＤＮＡのコピー数を分析し得る。遺伝子産物は、相関関係の結果（ｒ２、例えば、この分析におけるデータの線形勾配）が、少なくとも０．１〜０．２、少なくとも０．３〜０．５、または少なくとも０．６〜０．８以上である場合、マーカーとして選択され得る。マーカーは、応答、ＴＴＰ、または生存期間との正の相関関係によって変化し得る（すなわち、コピー数と同一の様式で発現レベルを変化させ得る、例えば、コピー数が減少するときに減少し得る）。コピー数との負の相関関係によって変化する（すなわち、コピー数レベルと反対の様式で発現レベルを変化させる、例えば、コピー数が減少するときに増加する）マーカーは、一貫性のない結果決定を提供する。
【０１３１】
このアッセイで用いる新たなマーカーを限定するための別の方法は、試験薬での治療前および治療後に数名の対象における多数のマーカーをアッセイする方法である。発現結果は、前処理された試料と比較して、治療後に一定方向に大規模な変化を示すマーカーの特定を可能にする。反復測定線形回帰モデルを構築して、統計的に有意な変化または差を示す遺伝子を特定することができる。その後、これらの有意な遺伝子をランク付けするために、例えば、ベースライン対時間曲線からの変化下面積を計算することができる。これは、最大の統計的に有意な変化を示す遺伝子リストをもたらし得る。その後、いくつかのマーカーは、主成分分析、クラスタリング方法（例えば、Ｋ平均法、階層分析）、多変量分散分析（ＭＡＮＯＶＡ）、または線形回帰技法等の方法を用いてともに１組に組み合わせられ得る。そのような遺伝子（または遺伝子群）をマーカーとして使用するために、ベースラインと２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、７、１０倍以上の発現の差を示す遺伝子がマーカーセットに包含される。発現プロファイル、例えば、集計マーカーセットのベースラインまたは参照との発現レベルの差の複合は、例えば、マーカーの過半数、例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上のマーカーが、特定の結果、例えば、ベースラインまたは参照との有意差を示す場合、またはより多くのマーカー、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％より多くのマーカーが、他方の方向ではなく一方の方向に有意な結果を示す場合、傾向を示す。
【０１３２】
本発明の組成物、キット、および方法が患者における治療成果を特徴付けるために使用される実施形態において、本発明のマーカーまたはマーカーセットは、有意な結果が試験薬で治療された少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、６０％、もしくは８０％、または実質的にすべての患者において得られるように選択される。本発明のマーカーまたはマーカーセットは、約１０％を超える陽性的中率（ＰＰＶ）が一般集団のために得られるように選択され得、マーカーのさらなる信頼は、ＰＰＶが８０％を超えるアッセイの特異性と関連するときに推測され得る。
【０１３３】
治療薬
本発明のマーカーおよびマーカーセットは、本発明の１つもしくは複数のマーカーの少なくとも１つの特徴、例えば、組成、もしくは量の値または変化に基づいて、患者、例えば、癌患者、例えば、固形腫瘍癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）等の肺癌、または肺腺癌、結腸癌、膵臓癌、もしくは前立腺癌）を有する患者における好ましい成果（例えば、治療薬への感受性）の可能性を判定するために使用され得る。この予測を用いて、癌治療を評価して、好ましい成果または好ましくない成果のいずれかを有することが予測される患者に最も好適な治療レジメンを設計することができる。
【０１３４】
具体的には、この方法を用いて、先の項で説明されたプロテアソーム阻害剤への患者の感受性を予測することができる。本方法において試験される作用薬は、単一の作用薬または作用薬の組み合わせであり得る。本発明の方法は、プロテアソーム阻害治療薬と他の作用薬またはさらなる作用薬、「組み合わせ作用薬」、例えば、化学療法剤からなる群から選択されるものとの組み合わせを含む。例えば、本方法を用いて、単一の化学療法剤、例えば、プロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸（例えば、ＭＬＮ９７０８）もしくはペプチジルエポキシケトンが癌を治療するために使用され得るか、または１つ以上の作用薬がプロテアソーム阻害剤（例えば、ＭＬＮ９７０８）と組み合わせて使用されるべきであるかを決定することができる。有用な組み合わせ作用薬は、異なる作用機序を有する作用薬、例えば、プロテアソーム阻害剤と組み合わせた抗有糸分裂薬またはアルキル化剤の使用を含み得る。プロテアソーム阻害剤については、先の項で説明されている。
【０１３５】
本発明の方法は、プロテアソーム阻害治療とグルココルチコイド阻害治療の組み合わせを含む。本発明のある用途において、プロテアソーム阻害剤（例えば、ＭＬＮ９７０８）と組み合わせて使用される組み合わせ作用薬は、グルココルチコイド剤（例えば、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレジソロン、プレドニゾン、またはトリアムシノロン）である。プロテアソーム阻害治療と組み合わせて使用される他の治療薬には、化学療法剤が含まれる。「化学療法剤」は、増殖性細胞または組織の増殖を阻害する化学試薬を含むよう意図されており、この場合、そのような細胞または組織の増殖は望ましくない。化学療法剤、例えば、代謝拮抗剤、例えば、Ａｒａ  ＡＣ、５−ＦＵ、およびメトトレキサート；抗有糸分裂剤、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル等のタキサン、ビンブラスチン、ならびにビンクリスチン；アルキル化剤、例えば、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、およびナイトロジェンマスタード；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、ＶＷ−２６、トポテカン、およびブレオマイシン；鎖切断剤、例えば、ドキソルビシンおよびミトキサントロン（ＤＨＡＤ）；トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えば、トポテカンおよびイリノテカン；チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ソラフェニブまたはエルロチニブ；血管新生阻害剤／免疫調節薬、例えば、サリドマイド、レナリドミドおよびポマリドマイド；架橋剤、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン（ＣＢＤＣＡ）；放射光および紫外線光は、当技術分野で周知であり（例えば、Ｇｉｌｍａｎ  Ａ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｓｅｃ  １２：１２０２−１２６３（１９９０）を参照のこと）、典型的には、腫瘍性疾患を治療するために使用される。一般に化学療法治療で用いられる化学療法剤の例は、以下の表２に列記される。
【０１３６】
【表２−１】
2014533112.tif 000013
【表２−２】
2014533112.tif 000014
【０１３７】
本方法において試験される作用薬は、単一の作用薬または作用薬の組み合わせであり得る。例えば、本方法を用いて、プロテアソーム阻害剤等の単一の化学療法剤が癌を治療するために使用され得るか、または２つ以上の作用薬の組み合わせがプロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブまたはクエン酸イクサゾミブ）と組み合わせて使用され得るかを決定することができる。有用な組み合わせ作用薬は、異なる作用機序を有する作用薬、例えば、アルキル化剤およびプロテアソーム阻害剤と組み合わせた抗有糸分裂剤の使用を含み得る。一例において、プロテアソーム阻害剤は、アドリアマイシンと組み合わせて投与される。別の実施形態では、プロテアソーム阻害剤は、タキソテールと投与される。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、プロテアソーム阻害剤は、少なくとも１つの組み合わせ作用薬と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、組み合わせ作用薬は、イリノテカン、ＣＰＴ−１１、シスプラチン、カルボプラチン、ドセタキセル、ゲムシタビン、エトポシド、ペメトレキセド、およびビノレルビンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、組み合わせ作用薬は、５−フルオロウラシルまたはその変異形、イリノテカン、オキサリプラチン、およびロイコボリンからなる群から選択される。
【０１３９】
本明細書に開示の作用薬は、皮内、皮下、経口、動脈内、または静脈内を含む任意の経路で投与され得る。一実施形態において、投与は、静脈内経路による。非経口投与は、ボーラスまたは輸注で提供され得る。
【０１４０】
薬学的に許容される混合物中の本開示の化合物の濃度は、投与される化合物の用量、用いられる化合物（複数を含む）の薬物動態特性、および投与経路を含むいくつかの要素によって異なる。作用薬は、単回投与または繰り返し投与で投与され得る。治療薬は、患者の全般的な健康状態、ならびに選択された化合物（複数を含む）の製剤および投与経路を含むいくつかの要素に応じて、１日１回またはより高い頻度で投与され得る。
検出方法
【０１４１】
予後アッセイの一般的原理は、マーカーおよびプローブを含有し得る試料または反応混合物を、適切な条件下でマーカーおよびプローブを相互作用および結合させるのに十分な時間調製し、故に、除去され、かつ／または反応混合物中で検出され得る複合体を形成することを含む。これらのアッセイを様々な方法で実施することができる。
【０１４２】
例えば、そのようなアッセイを実施するための１つの方法は、マーカーまたはプローブを基質とも称される固相支持体上に係留することと、反応の最後に固相上に係留された標的マーカー／プローブ複合体を検出することとを含む。そのような方法の一実施形態において、マーカーの存在および／または濃度についてアッセイされる対象由来の試料は、担体または固相支持体上に係留され得る。別の実施形態では、プローブが固相に係留され得、かつ対象由来の試料がアッセイの非係留成分として反応することを許され得るといった逆の状況も可能である。そのようないくつかの実施形態の一例として、試料の発現分析のために係留された予測マーカーまたはマーカーセットを含有するアレイまたはチップの使用が挙げられる。
【０１４３】
アッセイ成分を固相に係留するための多くの確立された方法が存在する。これらには、制限なく、ビオチンおよびストレプトアビジンの共役によって固定化されるマーカーまたはプローブ分子が含まれる。そのようなビオチン化アッセイ成分は、当技術分野で既知の技法（例えば、ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製され、ストレプトアビジンをコーティングした９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定化され得る。ある実施形態において、固定化アッセイ成分を有する表面は、事前に調製され、保存され得る。
【０１４４】
そのようなアッセイに好適な他の担体または固相支持体には、マーカーまたはプローブが属する分子のクラスに結合することができる任意の物質が含まれる。周知の支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン、ナイロン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエチレン、デキストラン、アミラーゼ、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、およびマグネタイトが含まれるが、これらに限定されない。当業者であれば、抗体または抗原への結合に好適な多くの他の担体を理解しており、そのような支持体を本発明での使用に適応させることができる。例えば、細胞から単離されたタンパク質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動上で泳動し、ニトロセルロース等の固相支持体上で固定化され得る。その後、この支持体は、好適な緩衝液で洗浄され、続いて、検出可能に標識された抗体で処理され得る。その後、固相支持体は、２回目の緩衝液での洗浄が行われ、非結合抗体を除去し得る。その後、固体支持体上の非結合標識の量が従来の方法で検出され得る。
【０１４５】
上述の手法でアッセイを実施するために、非固定化成分は、第２の成分が係留された固相に添加される。反応が完了した後、非複合成分は、任意の複合体が固相上に固定化されたまま留まるような条件下で除去され得る（例えば、洗浄によって）。固相に係留されたマーカー／プローブ複合体の検出は、本明細書に概説されるいくつかの方法で達成され得る。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、プローブが非係留アッセイ成分であるとき、このプローブは、本明細書で論じられ、かつ当業者に周知の検出可能な標識を用いて、直接的または間接的のいずれかで、アッセイの検出および読み出しのために標識され得る。プローブ（例えば、核酸または抗体）に関して、「標識」という用語は、検出可能な物質をプローブに結合（すなわち、物理的に連結）させることによるプローブの直接標識、ならびに直接標識される別の試薬と反応させることによるプローブの間接標識を包含するよう意図される。間接標識の一例として、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出が挙げられる。例えば、蛍光エネルギー移動の技法（ＦＥＴ、例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，６３１，１６９号、Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ，ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，８６８，１０３号を参照のこと）を利用して、いずれの成分（マーカーまたはプローブ）もさらに操作または標識することなくマーカー／プローブ複合体形成を直接検出することも可能である。第１の「ドナー」分子上のフルオロフォア標識は、適切な波長の入射光での励起時にその放射された蛍光エネルギーが第２の「受容体」分子上の蛍光標識によって吸収され、次いで、吸収したエネルギーのため蛍光を発することができるように選択される。あるいは、「ドナー」タンパク質分子は、単にトリプトファン残基の天然蛍光エネルギーを利用し得る。「受容体」分子標識が「ドナー」分子標識と異なり得るように異なる波長の光を放射する標識が選択される。標識間のエネルギー移動の効率が分子を分離する距離に関連しているため、分子間の空間的関係が判定され得る。結合が分子間で生じるといった状況下において、アッセイにおける「受容体」分子標識の蛍光放射は最大であるべきである。ＦＥＴ結合事象は、当技術分野で周知の標準の蛍光検出手段によって（例えば、蛍光光度計を用いて）好都合に測定され得る。
【０１４７】
別の実施形態では、マーカーを認識するプローブの能力の決定は、リアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．ａｎｄ  Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５、およびＳｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５）等の技術を利用して、いずれのアッセイ成分（プローブまたはマーカー）も標識することなく達成され得る。本明細書で使用されるとき、「ＢＩＡ」または「表面プラズモン共鳴」は、相互作用物（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））のうちのいずれも標識することなく生体特異的相互作用をリアルタイムで試験する技術である。結合表面における質量の変化（結合事象を示す）は、表面付近の光の屈折率の変化（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）をもたらし、生体分子間のリアルタイム反応の指標として使用され得る検出可能なシグナルをもたらす。
【０１４８】
あるいは、別の実施形態では、類似の診断および予後アッセイは、液相中の溶質としてマーカーおよびプローブを用いて実施され得る。そのようなアッセイにおいて、複合マーカーおよびプローブは、分画遠心分離、クロマトグラフィー、電気泳動、および免疫沈降を含むが、これらに限定されないいくつかの標準の技法のうちのいずれかによって非複合成分から分離される。分画遠心分離において、マーカー／プローブ複合体は、それらの異なる大きさおよび密度に基づいて複合体の沈降平衡が異なるため、一連の遠心分離ステップによって非複合アッセイ成分から分離され得る（例えば、Ｒｉｖａｓ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｐ．（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．１８：２８４−７を参照のこと）。標準のクロマトグラフ技法も複合分子を非複合分子から分離するために利用され得る。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーは、大きさに基づいて、かつカラム形式の適切なゲル濾過樹脂を利用して分子を分離し、例えば、比較的大きい複合体は、比較的小さい非複合成分から分離され得る。同様に、非複合成分と比較したマーカー／プローブ複合体の比較的異なる電荷特性は、例えば、イオン交換クロマトグラフィー樹脂を利用して複合体と非複合成分を区別するために利用され得る。そのような樹脂およびクロマトグラフ技法は、当業者に周知である（例えば、Ｈｅｅｇａａｒｄ，Ｎ．Ｈ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１１：１４１−８、Ｈａｇｅ，Ｄ．Ｓ．ａｎｄ  Ｔｗｅｅｄ，Ｓ．Ａ．（１９９７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．６９９：４９９−５２５を参照のこと）。ゲル電気泳動は、複合アッセイ成分を非結合成分から分離するためにも用いられ得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７−１９９９を参照のこと）。この技法において、タンパク質または核酸複合体は、例えば大きさまたは電荷に基づいて分離される。いくつかの実施形態において、還元剤の不在下における非変性ゲルマトリックス物質および条件は、電気泳動プロセス中に結合相互作用を維持するために使用される。特定のアッセイおよびその成分に適切な条件は、当業者に周知である。
【０１４９】
単離ｍＲＮＡは、サザンまたはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応およびＴＡＱＭＡＮ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））、ならびにプローブアレイが含まれるが、これらに限定されないハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイで使用され得る。ｍＲＮＡレベルを検出するための１つの診断方法は、単離ｍＲＮＡを検出される遺伝子によってコードされるｍＲＮＡにハイブリダイズし得る核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。マーカー遺伝子の変異を含む核酸は、プローブまたはプライマーとして使用され得る。本発明の核酸プローブまたはプライマーは、一本鎖ＤＮＡ（例えば、オリゴヌクレオチド）、二本鎖ＤＮＡ（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド）、またはＲＮＡであり得る。本発明のプライマーは、目的とする領域に隣接した核酸配列にハイブリダイズし、かつ伸長するか、または目的とする領域を被覆する核酸を指す。核酸プローブは、例えば、全長ｃＤＮＡ、またはその部分、例えば、マーカーの少なくとも７、１５、２０、２５、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、または５００個以上の連続したヌクレオチドを有し、かつストリンジェントな条件下で本発明のマーカーをコードするｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドであり得る。核酸プローブの正確な長さは、当業者が日常的に考慮および実施する多くの要素に依存する。本発明の核酸プローブは、当技術分野で既知の任意の好適な方法論を用いて化学合成によって調製され得るか、組換え技術によって産生され得るか、または例えば制限消化によって生体試料から得られ得る。本発明の診断アッセイにおける使用に好適な他のプローブが本明細書に記載される。プローブは、それに結合される標識基、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、酵素補助因子、ハプテン、配列タグ、タンパク質、または抗体を含み得る。核酸は、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾され得る。核酸標識の一例は、ＳＵＰＥＲ（商標）修飾塩基技術（Ｎａｎｏｇｅｎ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）、米国特許第７，０４５，６１０号を参照のこと）を用いて組み込まれる。発現レベルは、例えば増幅ＤＮＡレベルを測定した後の一般的な核酸レベルとして（例えば、ＤＮＡ挿入染色、例えば、ＳＹＢＲグリーン染色（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を用いて）、または特異的核酸として（例えば、プローブが標識された状態のプローブに基づく設計を用いて）測定され得る。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイ形式は、プローブに基づく設計を用いて、特異性および信号対雑音比を増加させ得る。
【０１５０】
そのようなプライマーまたはプローブは、例えば、対象由来の細胞の試料中で転写された核酸分子の量を測定することによって、例えば、転写物、ｍＲＮＡレベルを検出することによって、またはタンパク質をコードする遺伝子が変異もしくは欠失したかを決定することによって、タンパク質を発現する細胞または組織を特定するための診断試験キットの一部として使用され得る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡの核酸プローブとのハイブリダイゼーションは、問題のマーカーが発現されることを示し得る。本発明は、遺伝コードの縮重のため、マーカータンパク質（例えば、配列番号３、６、または９の配列を有するタンパク質）をコードし、したがって、同一のタンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列とは異なる核酸分子を検出することをさらに包含する。当業者であれば、アミノ酸配列の変化につながるＤＮＡ配列多型が集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることを理解する。そのような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子変異のため、集団内の個体の間に存在し得る。対立遺伝子は、所与の遺伝子座で選択的に生じる遺伝子群のうちの１つである。そのような天然の対立遺伝子変異は、典型的には、所与の遺伝子のヌクレオチド配列に１〜５％の不一致をもたらし得る。代替の対立遺伝子は、いくつかの異なる個体、例えば、個体由来の正常な試料中の目的とする遺伝子を配列決定することによって特定され得る。これは、様々な個体の同一の遺伝子座を特定するために、ハイブリダイゼーションプローブを用いて容易に実行され得る。天然の対立遺伝子変異の結果であり、かつ機能活性を変化させないありとあらゆるそのようなヌクレオチド変異および結果として生じるアミノ酸多型または変異の検出は、本発明の範囲内に収まるよう意図される。加えて、ＲＮＡ発現レベルに影響を与えるＤＮＡ多型も存在し得、その遺伝子の全体の発現レベルに影響を与え得ることが理解される（例えば、制御または分解に影響を与えることによって）。
【０１５１】
本明細書で使用されるとき、「ハイブリダイズ」という用語は、互いに大いに同一または相同であるヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズされたまま留まるといったハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を説明するよう意図される。いくつかの実施形態において、条件は、互いに少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、９０％、または９５％同一である配列がその後の増幅および／または検出のために互いにハイブリダイズされたまま留まるような条件である。ストリンジェントな条件は、関与するヌクレオチド配列の長さによって異なるが、当業者に既知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９５）の第２項、第４項、および第６項の教示に基づいて見い出されるか、または決定され得る。さらなるストリンジェントな条件およびそのような条件を決定するための式は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９），ｃｈａｐｔｅｒｓ  ７，９，ａｎｄ  １１）において見い出される。少なくとも１０塩基対長であるハイブリッドに対するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例として、約６５〜７０℃での４×  塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーション（または約４２〜５０℃での４×  ＳＳＣと５０％ホルムアミドにおけるハイブリダイゼーション）、その後、約６５〜７０℃での１×  ＳＳＣ中での１回以上の洗浄が挙げられる。そのようなハイブリッドに対する高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例として、約６５〜７０℃での１×  ＳＳＣにおけるハイブリダイゼーション（または約４２〜５０℃での１×  ＳＳＣと５０％ホルムアミドにおけるハイブリダイゼーション）、その後、約６５〜７０℃での０．３×  ＳＳＣ中での１回以上の洗浄が挙げられる。そのようなハイブリッドに対するストリンジェンシーが低下したハイブリダイゼーション条件の非限定的な例として、約５０〜６０℃での４×  ＳＳＣにおけるハイブリダイゼーション（またはあるいは、約４０〜４５℃での６×  ＳＳＣと５０％ホルムアミドにおけるハイブリダイゼーション）、その後、約５０〜６０℃での２×  ＳＳＣ中での１回以上の洗浄が挙げられる。上に列挙される値、例えば、６５〜７０℃または４２〜５０℃の中間範囲は、本発明によって包含されるようにも意図される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の例は、約４５℃での６×  塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーション、その後、５０〜６５℃での０．２×  ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション緩衝液のさらなる例は、１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．５）、０．５％サルコシン酸ナトリウム、および３０％ホルムアミドにおけるハイブリダイゼーションである。ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液中のＳＳＰＥ（１×  ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）である）は、ＳＳＣ（１×  ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）で代用されてもよく、洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後、毎回１５分間行われる。５０未満の塩基対長であると予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも５〜１０℃低くなければならず、式中、Ｔｍは、以下の等式に従って決定される。１８塩基対長未満のハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）である。１８〜４９塩基対長のハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、式中、Ｎは、ハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液（１×  ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）中のナトリウムイオンの濃度である。当業者であれば、さらなる試薬がハイブリダイゼーションおよび／または洗浄緩衝液に添加されて、核酸分子の膜、例えば、遮断薬（例えば、ＢＳＡまたはサケまたはニシン精子担体ＤＮＡ）、洗剤（例えば、ＳＤＳ）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、Ｆｉｃｏｌｌ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等を含むが、これらに限定されないニトロセルロースまたはナイロン膜への非特異的なハイブリダイゼーションを減少させ得ることも理解する。特にナイロン膜を用いるとき、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる非限定的な例は、約６５℃での０．２５〜０．５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４および７％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション、その後、６５℃での０．０２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４および１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄（またはあるいは、０．２×  ＳＳＣ、１％ＳＤＳ）であり、例えば、Ｃｈｕｒｃｈ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１９９１−１９９５を参照されたい。プライマーまたは核酸プローブは、検出方法において単独で使用され得るか、またはプライマーは、検出方法において少なくとも１つの他のプライマーまたは核酸プローブとともに使用され得る。プライマーは、核酸の少なくとも一部を増幅するためにも使用され得る。いくつかの実施形態において、変異部位を含む核酸マーカーの一部が増幅される。本発明の核酸プローブは、目的とする領域にハイブリダイズし、かつさらに伸長されない核酸を指す。例えば、核酸プローブは、バイオマーカーの変異体領域に特異的にハイブリダイズし、かつ患者のＤＮＡもしくは形成されるハイブリッドの種類にハイブリダイズすることによって、またはハイブリダイズすることなく、バイオマーカーの変異の存在もしくは正体またはマーカー活性の量を示し得る核酸である。
【０１５２】
１つの形式において、ＲＮＡは、例えば、単離ＲＮＡをアガロースゲル上で泳動させ、かつＲＮＡをゲルからニトロセルロース等の膜に移動させることによって、固体表面上に固定化され、プローブと接触する。代替の形式において、核酸プローブ（複数を含む）は、固体表面上に固定化され、ＲＮＡを、治療成果を示す少なくとも１つのマーカーを含むマーカーセットを用いて、例えば、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）遺伝子チップアレイもしくはＳＮＰチップ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）またはカスタマイズされたアレイにおいてプローブ（複数を含む）と接触させる。当業者であれば、本発明のマーカーの量の検出で用いるための既知のＲＮＡおよびＤＮＡ検出方法を容易に適応させることができる。例えば、高密度マイクロアレイまたは分岐鎖ＤＮＡアッセイは、先の項に記載されるように腫瘍細胞を単離するよう修飾された試料等の試料中のより高い濃度の腫瘍細胞から恩恵を受け得る。関連実施形態において、試料から得られる転写ポリヌクレオチドの混合物は、マーカー核酸の少なくとも一部（例えば、少なくとも７、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、５００個以上の連続したヌクレオチド残基）と相補的であるか、または相同であるそれに固定されたポリヌクレオチドを有する基質と接触する。マーカーと相補的であるか、または相同であるポリヌクレオチドは、基質上で差次的に検出可能であり（例えば、異なる発色団またはフルオロフォアを用いて検出可能であるか、または異なる選択された位置に固定され）、その後、単一の基質（例えば、選択された位置に固定されるポリヌクレオチドの「遺伝子チップ」マイクロアレイ）を同時に用いて複数のマーカーの発現レベルが判定され得る。いくつかの実施形態において、ある核酸とのハイブリダイゼーションから別の核酸とのハイブリダイゼーションを含むマーカー発現を判定する方法が用いられるとき、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で行われ得る。
【０１５３】
試料中の本発明のマーカーに対応するＲＮＡの量を決定するための代替の方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓの米国特許第４，６８３，２０２号（１９８７）に記載の実験的実施形態）、リガーゼ連鎖反応（ＢａｒａｎｙのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１８９−１９３（１９９１））、自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８（１９９０））、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７（１９８９））、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．のＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７（１９８８））、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，８５４，０３３号）、または当業者に周知の技法を用いた増幅分子の検出が続く任意の他の核酸増幅方法による核酸増幅プロセスを含む。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少ない数だけ存在する場合にそのような分子の検出に特に有用である。本明細書で使用されるとき、増幅プライマーは、遺伝子の５’または３’領域にアニーリングし（それぞれ、プラス鎖およびマイナス鎖、または逆もまた同様）、かつその間に短い領域を含有することができる一対の核酸分子として定義される。概して、増幅プライマーは、約１０〜約３０ヌクレオチド長であり、約５０〜約２００ヌクレオチド長の領域に隣接する。適切な条件下で適切な試薬を用いて、そのようなプライマーは、プライマーに隣接するヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能にする。
【０１５４】
ｉｎ  ｓｉｔｕ方法の場合、ＲＮＡは、検出前に細胞から単離される必要はない。そのような方法において、細胞または組織試料は、既知の組織学的方法を用いて調製／処理される。その後、試料は、支持体、典型的には、スライドガラス上に固定化され、次いで、マーカーをコードするＲＮＡにハイブリダイズし得るプローブと接触する。
【０１５５】
本発明の別の実施形態では、マーカーに対応するポリペプチドが検出される。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドを検出するための作用薬は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドに結合することができる抗体である。関連実施形態において、抗体は、検出可能な標識を有する。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。無傷抗体またはその断片（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が使用され得る。
【０１５６】
様々な形式を用いて、試料が所与の抗体に結合するタンパク質を含有するかを決定することができる。そのような形式の例として、免疫組織化学（ＩＨＣ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウエスタンブロット分析、および酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、腫瘍細胞が本発明のマーカーを発現するかの決定に用いるための既知のタンパク質／抗体検出方法を容易に適応させることができる。当業者であれば、腫瘍細胞中のタンパク質の量を定量化するか、または腫瘍細胞が試料中の非腫瘍細胞よりも多くのタンパク質、正常な量のタンパク質、もしくは少ないタンパク質を発現するかを決定するためのそのような方法を容易に適応させることもできる。いくつかの実施形態において、ＧＬＵＴ４発現は、免疫組織化学アッセイにおいて測定される。
【０１５７】
マーカーに対応するポリペプチドのレベルを決定するための別の方法は、質量分析である。例えば、無傷タンパク質またはペプチド、例えば、トリプシンペプチドは、１つ以上のポリペプチドマーカーを含有する試料、例えば、血液試料、リンパ試料、または他の試料から分析され得る。この方法は、この方法の感受性を増加させるために、豊富なタンパク質、例えば、血清アルブミンの量を減少させるように試料を処理することをさらに含み得る。例えば、液体クロマトグラフィーを用いて試料を分画することができ、したがって、試料の部分を質量分析によって別々に分析することができる。これらのステップは、別々のシステムまたは組み合わせた液体クロマトグラフィー／質量分析システム（ＬＣ／ＭＳ、例えば、Ｌｉａｏ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．５０：３７９２−３８０３）で行われ得る。質量分析システムは、タンデム（ＭＳ／ＭＳ）モードでもあり得る。タンパク質またはペプチド混合物の電荷状態分布は、１回または複数回の走査させて得られ、例えばＬＣ／ＭＳシステムにおいて保持時間および質量対電荷比（ｍ／ｚ）を用いた統計的方法によって分析されて、プロテアソーム阻害治療に応答するか、または応答しない患者由来の試料中の統計的に有意なレベルで差次的に発現されたタンパク質を特定することができる。使用され得る質量分析計の例には、イオントラップシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ））または四重極飛行時間型質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））がある。この方法は、例えば、飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法でのマトリックス支援レーザー脱離イオン化におけるペプチド質量フィンガープリントのステップをさらに含み得る。この方法は、トリプシンペプチドのうちの１つ以上を配列決定するステップをさらに含み得る。この方法の結果を用いて、質量分析トリプシンペプチドｍ／ｚ基準ピークに基づいて、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）またはＳｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が管理する一次配列データベースからタンパク質を特定することができる。
【０１５８】
電子装置可読アレイ
本発明の方法とともに用いるための少なくとも１つの本発明の予測マーカーを含む可読アレイを含む電子装置も企図される。本明細書で使用されるとき、「電子装置可読媒体」とは、電子装置によって読み取られ、かつ直接アクセスされ得るデータまたは情報を記憶、保持、または含有する任意の好適な媒体を指す。本明細書で使用されるとき、「電子装置」という用語は、データまたは情報を記憶するように構成または適合される任意の好適なコンピューティングもしくは処理装置または他のデバイスを含むよう意図される。本発明との使用および記録された情報の監視に好適な電子装置の例として、スタンドアロンのコンピューティング装置；ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）インターネット、インターネット、およびエクストラネットを含むネットワーク；個人用携帯情報端末（ＰＤＡ）、携帯電話、ポケベル等の電子器具；ならびにローカルおよび分散処理システムが挙げられる。本明細書で使用されるとき、「記録される」とは、電子装置可読媒体に情報を記憶またはコード化するためのプロセスを指す。当業者であれば、既知の媒体に情報を記録して、本発明のマーカーを含む製品を生産するための現在既知の方法のうちのいずれかを容易に適応させることができる。
【０１５９】
例えば、マイクロアレイシステムが周知であり、試料を判定する（例えば、遺伝子発現の判定（例えば、ＤＮＡ検出、ＲＮＡ検出、タンパク質検出）または代謝産物産生の判定）ために当技術分野で使用されている。本発明に従って用いるマイクロアレイは、本明細書に記載の治療レジメンへの応答および／または非応答を特徴とする本発明の予測マーカー（複数を含む）の１つ以上のプローブを含む。一実施形態において、マイクロアレイは、その変異状態が応答を示すマーカー、その変異状態が長期の無増悪期間を示すマーカー、およびその変異状態が患者間の長期生存者を示すマーカーからなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対応する１つ以上のプローブを含む。いくつかの異なるマイクロアレイ構成およびそれらを産生するための方法は当業者に既知であり、例えば、米国特許第５，２４２，９７４号、同第５，３８４，２６１号、同第５，４０５，７８３号、同第５，４１２，０８７号、同第５，４２４，１８６号、同第５，４２９，８０７号、同第５，４３６，３２７号、同第５，４４５，９３４号、同第５，５５６，７５２号、同第５，４０５，７８３号、同第５，４１２，０８７号、同第５，４２４，１８６号、同第５，４２９，８０７号、同第５，４３６，３２７号、同第５，４７２，６７２号、同第５，５２７，６８１号、同第５，５２９，７５６号、同第５，５４５，５３１号、同第５，５５４，５０１号、同第５，５６１，０７１号、同第５，５７１，６３９号、同第５，５９３，８３９号、同第５，６２４，７１１号、同第５，７００，６３７号、同第５，７４４，３０５号、同第５，７７０，４５６号、同第５，７７０，７２２号、同第５，８３７，８３２号、同第５，８５６，１０１号、同第５，８７４，２１９号、同第５，８８５，８３７号、同第５，９１９，５２３号、同第５９８１１８５号、同第６，０２２，９６３号、同第６，０７７，６７４号、同第６，１５６，５０１号、同第６２６１７７６号、同第６３４６４１３号、同第６４４０６７７号、同第６４５１５３６号、同第６５７６４２４号、同第６６１０４８２号、同第５，１４３，８５４号、同第５，２８８，６４４号、同第５，３２４，６３３号、同第５，４３２，０４９号、同第５，４７０，７１０号、同第５，４９２，８０６号、同第５，５０３，９８０号、同第５，５１０，２７０号、同第５，５２５，４６４号、同第５，５４７，８３９号、同第５，５８０，７３２号、同第５，６６１，０２８号、同第５，８４８，６５９号、および同第５，８７４，２１９号、Ｓｈｅｎａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｔｉｂｔｅｃｈ  １６：３０１、Ｄｕｇｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：１０、Ｂｏｗｔｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：２５、Ｌｉｐｓｈｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２１：２０−２４，１９９９、Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，１１：６８７−９０、Ｍａｓｋｏｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：４６６３−６９、Ｈｕｇｈｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｏ���．１９：３４２，２００１に開示されており、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。組織マイクロアレイは、タンパク質特定のために使用され得る（Ｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７５−２８２を参照のこと）。ファージ・エピトープマイクロアレイは、１つまたは複数のタンパク質が患者の自己抗体を誘導するかに基づいて試料中の１つ以上のタンパク質を特定するために使用され得る（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｕｒｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．２４：２３７−２４２）。
【０１６０】
したがって、マイクロアレイは、例えば、野生型マーカー遺伝子、正常な対立遺伝子変異形、およびマーカー遺伝子の変異を特定するために、本明細書で特定される１つ以上のマーカー、例えば、治療成果を示すマーカーに対応する１つ以上のプローブを含む。マイクロアレイは、治療成果を示す、例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも７５個、もしくは少なくとも１００個のバイオマーカーおよび／またはその変異に対応するプローブを含み得る。マイクロアレイは、本明細書に記載の１つ以上のバイオマーカーに対応するプローブを含み得る。なおさらに、マイクロアレイは、本明細書に記載され、かつ本明細書に記載の方法に従って選択および編集され得る完全なマーカーセットを含み得る。このマイクロアレイを用いて、アレイ中の１つ以上の予測マーカーまたは予測マーカーセットの発現をアッセイすることができる。一例において、アレイを用いて、試料中の２つ以上の予測マーカーまたはマーカーセット発現をアッセイして、アレイ中のマーカーの発現プロファイルを解明することができる。この様式において、最大約４４，０００個のマーカーを発現について同時にアッセイすることができる。これは、１つ以上の試料において特異的に発現される一連のマーカーを示す発現プロファイルが開発されることを可能にする。なおさらに、これは、治療成果を判定する発現プロファイルが開発されることを可能にする。
【０１６１】
アレイは、正常および異常な（例えば、試料、例えば、腫瘍）細胞中の１つ以上のマーカーの差次的発現パターンの解明にも有用である。これは、患者の治療成果の特定を容易にするためのツールとしての機能を果たし得る一連のマーカーを提供する。さらに、アレイは、参照発現レベルについての参照マーカーの発現の解明に有用である。別の例において、アレイを用いて、アレイ中の１つ以上のマーカーの発現の経時変化を監視することができる。
【０１６２】
そのような定性的決定に加えて、本発明は、マーカー発現の定量化を可能にする。したがって、予測マーカーは、試料中のマーカーの量によるマーカーセットまたは成果の指標に基づいてグループ分けされ得る。これは、例えば、本明細書に提供される方法に従う量のスコア化に基づいて試料の成果を解明する際に有用である。
【０１６３】
アレイは、同一の細胞または異なる細胞中の他の予測マーカーの発現へのマーカーの発現の影響の解明にも有用である。これは、例えば、患者が好ましくない成果を有することが予測される場合、治療的介入に代替分子標的の選択を提供する。
【０１６４】
試薬およびキット
本発明は、試料（例えば、骨髄試料、腫瘍生検、または参照試料）中の本発明のマーカーに対応するポリペプチドまたは核酸の存在を検出するためのキットも包含する。そのようなキットを用いて、治療成果を判定する、例えば、対象が、例えばプロテアソーム阻害剤での治療後に、好ましい成果を有し得るかを決定することができる。例えば、キットは、本発明のマーカーに対応するゲノムＤＮＡセグメント、ポリペプチド、もしくは転写ＲＮＡ、または生体試料中のマーカー遺伝子の変異を検出することができる標識化合物もしくは作用薬、および試料中のゲノムＤＮＡセグメント、ポリペプチド、またはＲＮＡの量を決定するための手段を含み得る。マーカータンパク質への結合に好適な試薬は、抗体、抗体誘導体、抗体断片等を含む。マーカー核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライシングされたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等）への結合に好適な試薬は、相補的核酸を含む。キットは、アッセイされ、試験試料と比較され得る対照もしくは参照試料または一連の対照もしくは参照試料も含有し得る。例えば、キットは、例えば腫瘍を有しない対象由来の試料または時点または参照ゲノム間のアッセイを標準化するために、例えば、マーカーの２倍体コピー数ベースラインまたは参照発現レベルを確立するために、例えば本明細書に記載の１つ以上のマーカーもしくは変異、または参照マーカー、例えば、ハウスキーピングマーカーを含む正の対照試料を有し得る。一例として、キットは、相補的核酸のアニーリング、または抗体とそれが特異的に結合するタンパク質および１つ以上の試料区画の結合に好適な流体（例えば、緩衝液）を含み得る。本発明のキットは、任意に、本発明の方法の実行に有用なさらなる成分、例えば、試料収集容器、例えば、管と、任意に、例えば、サンプリング時と分析時との間に時間的または不利な保存および取扱条件が存在し得る場合、検出されるマーカーの量を最適化するための手段とを含み得る。例えば、キットは、上述の試料中の腫瘍細胞の数を増加させるための手段、緩衝剤、防腐剤、安定剤、または細胞物質もしくはプローブを調製するためのさらなる試薬を含有し得、検出可能な標識を、単独で、または提供されるプローブ（複数を含む）と接合した状態で、または提供されるプローブ（複数を含む）内に組み込まれた状態で含有し得る。例示の一実施形態において、試料収集容器を含むキットは、例えば、抗凝血剤および／または安定剤、例えば、ＲＮＡ安定剤（上述のものまたは当業者に既知のもの）を含む管を含み得る。キットは、検出可能な標識（例えば、酵素または基質）の検出に必要な成分をさらに含み得る。マーカーセットの場合、キットは、バイオマーカーの検出で用いるマーカーセットアレイまたはチップを含み得る。キットは、キットを用いて得られた結果を解釈するための説明書も含み得る。キットは、本明細書に記載の１つ以上のバイオマーカー、例えば、２、３、４、５つ以上のバイオマーカーを検出するための試薬を含有し得る。
【０１６５】
一実施形態において、キットは、少なくとも１つのバイオマーカー、例えば、治療成果を示すマーカー（例えば、プロテアソーム阻害剤での治療時に）を検出するためのプローブを含む。例示の実施形態において、キットは、配列番号１、２、４、５、７、８、または１１５２４７０８５と１１５２５９５１５の塩基対の染色体１ｐの配列、２５３５８１８０と２５４０３８５４の塩基対の染色体１２ｐの配列、または前述のうちのいずれかもしくは配列番号３、６、および／もしくは９の相補体からなる群から選択されるマーカー遺伝子を検出するための核酸プローブを含む。いくつかの実施形態において、キットは、ＮＲＡＳおよびＫＲＡＳからなる群から選択されるマーカーを検出するためのプローブを含む。いくつかの実施形態において、キットは、ＮＲＡＳおよびＫＲＡＳからなる群からの２つ以上のマーカーを含むマーカーセットを検出するためのプローブを含む。別の実施形態では、キットは、非血液学的試料、例えば、固形腫瘍癌試料中のＫＲＡＳを検出するためのプローブを含む。関連実施形態において、キットは、配列番号１、２、４、および５からなる群から選択される核酸配列（例えば、その断片、変異体、または変異形（例えば、相同または相補的））を含むか、またはそれから得られる核酸プローブを含む。キットは、配列番号２のコドン１２、コドン１３、および／もしくはコドン６１、または配列番号１中の類似配列における変異の存在を特定するための試薬を含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、グルコース輸送体、例えば、ＧＬＵＴ４等の表現型マーカー遺伝子を検出するためのプローブを含む。いくつかの実施形態において、キットは、少なくとも２つのマーカー、例えば、ＲＡＳマーカー遺伝子、例えば、ＫＲＡＳ等の遺伝子型マーカー遺伝子に対応する少なくとも１つのマーカー、およびグルコース輸送体、例えば、ＧＬＵＴ４等の表現型マーカー遺伝子に対応する少なくとも１つのマーカーを検出するための試薬、例えば、プローブ、例えば、核酸プローブまたはタンパク質プローブを含む。一実施形態において、患者由来の腫瘍試料がプロテアソーム阻害剤での治療時の好ましい成果に関連しているかを判定するための少なくとも２つの試薬を含むキットは、野生型または変異体ＫＲＡＳを検出するための少なくとも１つの試薬、および量、例えば、ＧＬＵＴ４の正常な発現、低い発現、または高い発現の測定を可能にする少なくとも１つの試薬を含む。前述の実施形態において、少なくとも２つの試薬は、核酸試薬である。あるいは、少なくとも２つの試薬のうちの少なくとも１つ、例えば、ＫＲＡＳ変異を検出するための試薬は、核酸試薬であり、少なくとも２つの試薬のうちの少なくとも１つ、例えば、ＧＬＵＴ４の発現を測定するための試薬は、タンパク質試薬、例えば、ＧＬＵＴ４、例えば、配列番号９に結合する抗体である。核酸プローブを含むキット、例えば、オリゴヌクレオチドベースのキットの場合、キットは、例えば、任意に基質に固定される、本発明のマーカーに対応する核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（標識または非標識のもの）等の１つ以上の核酸試薬を含み得、任意に、基質、プライマー、一対のＰＣＲプライマー、例えば、本発明のマーカーに対応する核酸分子の増幅に有用なもの、分子ビーコンプローブ、本発明のマーカーに対応する少なくとも２つの核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むマーカーセット等に結合されない標識オリゴヌクレオチドをさらに含み得る。キットは、ＲＮＡ安定剤を含有し得る。
【０１６６】
あるいは、キットは、配列番号３の１２番目のグリシン残基、１３番目のグリシン残基、および／もしくは６１番目のグルタミン残基が存在するか、または異なるアミノ酸であるかを決定するための試薬を含み得る。タンパク質プローブを含むキット、例えば、抗体ベースのキットの場合、キットは、例えば、（１）本発明のマーカーに対応するポリペプチドに結合する第１の抗体（例えば、固体支持体に結合される）と、任意に、（２）ポリペプチドまたは第１の抗体のいずれかに結合し、かつ検出可能な標識に接合される第２の異なる抗体とを含み得る。キットは、タンパク質安定剤を含有し得る。キットは、試料からプローブまでの非バイオマーカー物質の非特異的結合の量を減少させるための試薬を含有し得る。試薬の例として、非イオン性洗剤、非特異的タンパク質含有溶液、例えば、アルブミンもしくはカゼインを含有する溶液、または当業者に既知の他の物質が挙げられる。
【０１６７】
本発明は、検出可能な物質に接合される本発明の抗体を含有するキットおよび使用説明書も提供する。本発明のさらに別の態様は、本発明のプローブおよび薬学的に許容される担体を含む診断用組成物である。一実施形態において、診断用組成物は、本発明の抗体、検出可能な部分、および薬学的に許容される担体を含有する。
【０１６８】
抗体
本発明の予測マーカーに対応する単離されたポリペプチド、またはその断片もしくは変異体は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の調製のための標準の技法を用いて抗体を生成するための免疫原として使用され得る。例えば、免疫原は、典型的には、ウサギ、ヤギ、マウス、もしくは他の哺乳動物、または脊椎動物等の好適な（すなわち、免疫適格）対象を免疫化することによって抗体を調製するために使用される。なおさらなる態様において、本発明は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供し、この抗体または断片は、本発明のアミノ酸配列、本発明のｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列、本発明のアミノ酸配列の少なくとも８、１０、１２、１５、２０、または２５個のアミノ酸残基の断片、本発明のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列（パーセント同一性は、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を有するＧＣＧソフトウェアパッケージのＡＬＩＧＮプログラムを用いて決定される）、および４５℃の６×  ＳＳＣのハイブリダイゼーションならびに６５℃の０．２×  ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での洗浄の条件下で本発明の核酸分子からなる核酸分子にハイブリダイズする核酸分子またはその相補体によってコードされるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する。免疫原として用いるＫＲＡＳ断片は、配列番号３のアミノ酸１２、アミノ酸１３、またはアミノ酸６１を含み得る。モノクローナル抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、および／または非ヒト抗体であり得る。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換え発現されたか、または化学合成されたポリペプチドを含有し得る。この調製物は、フロイント完全もしくは不完全アジュバント等のアジュバント、または同様の免疫刺激剤をさらに含み得る。
【０１６９】
ヒト抗体を作製するための方法は、当技術分野で既知である。ヒト抗体を作製するための１つの方法は、トランスジェニックマウス等のトランスジェニック動物の使用を用いる。これらのトランスジェニック動物は、それら自身のゲノムに挿入されるゲノムを産生するヒト抗体のかなりの部分を含有し、動物自身の内因性抗体産生は、抗体の産生を欠損させる。そのようなトランスジェニック動物を作製するための方法は、当技術分野で既知である。そのようなトランスジェニック動物は、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を用いて、または「ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）」手法を用いて作製され得る。ＸＥＮＯＭＩＣＥ（商標）を作製するための方法は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１６２，９６３号、同第６，１５０，５８４号、同第６，１１４，５９８号、および同第６，０７５，１８１号に記載されている。「ミニ遺伝子座」手法を用いてトランスジェニック動物を作製するための方法は、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、および同第５，６２５，８２５号に記載されている（国際公開第ＷＯ９３／１２２２７号も参照のこと）。
【０１７０】
抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、本発明のポリペプチド等の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子、例えば、本発明のポリペプチドのエピトープを含む。本発明の所与のポリペプチドに特異的に結合する分子は、そのポリペプチドに結合するが、試料、例えば、ポリペプチドを自然に含有する生体試料中の他の分子には実質的に結合しない分子である。例えば、抗原結合断片、ならびに上述の抗体に由来する全長単量体、二量体、または三量体ポリペプチドは、それら自体有用である。この種の有用な抗体ホモログは、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９））、（ｖｉｉ）ＶＨＨドメインからなる単一ドメイン機能的重鎖抗体（ナノボディとして知られている）（例えば、Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：２８５３−２８５７（２００４）およびそれに引用される参考文献を参照のこと）、ならびに（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば、抗原結合断片を提供するのに十分なフレームワークを有する１つ以上の単離されたＣＤＲを含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨが別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え方法を用いて、それらをＶＬおよびＶＨ領域対が一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている）を形成する単一のタンパク質鎖として作製することを可能にする合成リンカーによって結合され得る（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）、およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）を参照のこと）。そのような本鎖抗体は、抗体の「抗原結合断片」という用語内に包含されるようにも意図される。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来の技法を用いて得られ、この断片は、無傷抗体と同一の様式で有用性についてスクリーニングされる。Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦａｂ等の抗体断片は、無傷タンパク質の切断、例えば、プロテアーゼまたは化学切断によって調製され得る。本発明は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。前述のうちのいずれかの合成および遺伝子操作された変異形（米国特許第６，３３１，４１５号を参照のこと）も本発明によって企図される。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、従来のマウスモノクローナル抗体方法論、例えば、標準の体細胞ハイブリダイゼーション技法（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５））、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２を参照のこと）、ＥＢＶハイブリドー��技法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｐｐ．７７−９６  Ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５を参照のこと）、またはトリオーマ技法を含む様々な技法によって産生され得る。概して、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４を参照されたい。診断的適用の場合、抗体は、例えば、マウス、ラット、またはウサギにおいて生成されるモノクローナル抗体であり得る。さらに、生体内適用で使用する場合、本発明の抗体は、ヒトまたはヒト化抗体であり得る。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば、標準のＥＬＩＳＡアッセイを用いて、目的とするポリペプチドに結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって検出される。
【０１７１】
所望の場合、抗体分子は、対象から（例えば、対象の血液または血清から）収集または単離され、タンパク質Ａクロマトグラフィー等の周知の技法によってさらに精製されて、ＩｇＧ画分を得ることができる。あるいは、本発明のタンパク質またはポリペプチドに特異的な抗体は、例えば親和性クロマトグラフィーによって選択または精製（例えば、部分的に精製）されて、実質的に精製された抗体および精製された抗体を得ることができる。実質的に精製された抗体組成物とは、この文脈において、抗体試料が本発明の所望のタンパク質またはポリペプチドのエピトープ以外のエピトープに対して指向される汚染抗体の最大で３０乾燥重量％のみを含有し、かつ試料の最大で２０％、最大で１０％、または最大で５乾燥重量％が汚染抗体であることを意味する。精製された抗体組成物とは、組成物中の抗体の少なくとも９９％が本発明の所望のタンパク質またはポリペプチドに対して指向されることを意味する。
【０１７２】
本発明のマーカーに対応するポリペプチドに対して指向される抗体（例えば、モノクローナル抗体）を用いて、マーカー（例えば、細胞試料中のマーカー）を検出して、マーカーのレベルおよび発現パターンを評価することができる。抗体を診断的に用いて、例えば、所与の治療レジメンの有効性を決定するための臨床試験手順の一環として、（例えば、血液試料中の）組織または体液中のタンパク質レベルを監視することもできる。検出は、抗体を検出可能な物質に結合させることによって促進され得る。検出可能な物質の例として、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光物質の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが挙げられ、発光物質例として、ルミノールが挙げられ、生物発光物質の例として、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、好適な放射性物質の例として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈが挙げられる。
【０１７３】
したがって、一態様において、本発明は、実質的に精製された抗体またはその断片、および非ヒト抗体またはその断片を提供し、その抗体または断片は、本明細書で特定されるマーカーによってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する。本発明の実質的に精製された抗体またはその断片は、ヒト、非ヒト、キメラ、および／またはヒト化抗体であり得る。
【０１７４】
別の態様では、本発明は、非ヒト抗体またはその断片を提供し、この抗体または断片は、本発明の予測マーカーの核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する。そのような非ヒト抗体は、ヤギ、マウス、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ウサギ、またはラット抗体であり得る。あるいは、本発明の非ヒト抗体は、キメラおよび／またはヒト化抗体であり得る。加えて、本発明の非ヒト抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。
【０１７５】
実質的に精製された抗体またはその断片は、本発明のポリペプチドのシグナルペプチド、分泌配列、細胞外ドメイン、膜貫通もしくは細胞質ドメイン、または細胞質ループに特異的に結合し得る。本発明の実質的に精製された抗体もしくはその断片、非ヒト抗体もしくはその断片、および／またはモノクローナル抗体もしくはその断片は、分泌配列または本発明のアミノ酸配列の細胞外ドメインに特異的に結合する。
【０１７６】
感受性アッセイ
癌性細胞の試料は、患者から得られる。本明細書に記載のマーカーのうちの少なくとも１つに対応するマーカーの発現レベルが試料において測定される。本明細書に特定され、記載され、かつ本明細書に記載の方法を用いてマーカーセットにまとめられるマーカーを含むマーカーセットが利用され得る。そのような分析は、患者における腫瘍の発現プロファイルを得るために使用される。その後、発現プロファイルの評価は、患者が好ましい成果を有すると予想され、かつ治療、例えば、プロテアソーム阻害治療薬（例えば、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブまたはクエン酸イクサゾミブ）単独での治療、またはさらなる作用薬と組み合わせた治療）、または生存期間への同様の影響を有すると予想される代替の作用薬から恩恵を受けるかを決定するために使用される。発現プロファイルの評価を用いて、患者が好ましくない成果を有すると予想され、かつプロテアソーム阻害治療以外の癌療法から恩恵を受けるか、またはプロテアソーム阻害治療レジメンの変更から恩恵を受けるかを決定することもできる。評価は、提供される方法または当技術分野で既知の他の同様のスコアリング法（例えば、加重投票、閾値特徴組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｆｅａｔｕｒｅｓ；ＣＴＦ）、Ｃｏｘ比例ハザード分析、主成分スコア化、線形予測スコア、ｋ近傍法等）のうちのいずれかを用いて、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ））の遺伝子発現オムニバス（ＧＥＯ）プログラムで蓄積された発現値を用いて調製される１つのマーカーセットの使用を含み得る。なおさらに、評価は、２つ以上の調製されたマーカーセットの使用を含み得る。プロテアソーム阻害治療は、評価結果が好ましい成果を示すときに、癌の治療に適切であると特定されるか、またはより積極的な治療レジメンは、予想された好ましくない成果を有する患者を特定する。
【０１７７】
一態様において、本発明は、治療成果のために、患者、例えば、癌、例えば、固形腫瘍、例えば、非血液学的癌（例えば、非小細胞肺癌、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、頭頸部癌、前立腺癌、または腎細胞癌）を有する患者を評価する方法を特色とする。この方法は、患者におけるマーカーのマーカーセット中のマーカーの発現の評価を提供すること（このマーカーセットは、複数の遺伝子を含み、それぞれ特定された成果を有する患者と非罹患対象との間で差次的に発現され、かつ対象におけるマーカーセット中のマーカーのそれぞれの差次的な量が、（例えば、非罹患参照試料のレベルと比較して）約１５％、約１０％、約５％、約２．５％、または約１％以下の誤判定で治療成果を予測するように（誤判定とは、患者が応答しない／応答するときに、その患者が応答する／応答しないと予測することを意味する）、十分な数の差次的に発現されるマーカーを含有するといった特性を有する）と、参照値を有する患者由来のマーカーセット中のマーカーのそれぞれの量の比較を提供して、それによって患者を評価することとを含む。
【０１７８】
プロテアソーム阻害治療過程において患者から採取された腫瘍試料中の特定されたマーカーまたはマーカーセットのうちの１つ以上の量を試験することによって、治療薬が作用し続けるか、または癌が治療プロトコルに応答しなくなった（無効になった）かを決定することも可能である。例えば、ボルテゾミブまたはクエン酸イクサゾミブの治療を受けた患者の腫瘍細胞は除去され、かつマーカーまたはマーカーセットの発現が監視される。本明細書で特定される１つ以上のマーカーの量のプロファイルが、作用薬、例えば、プロテアソーム阻害剤の存在下で好ましい成果をより典型的に表す場合、治療は継続される。しかしながら、本明細書で特定される１つ以上のマーカーの量のプロファイルが、作用薬の存在下で好ましくない成果をより典型的に表す場合、癌は、治療、例えば、プロテアソーム阻害治療に耐性を示ようになった可能性があり、別の治療プロトコルを開始して患者を治療しなければならない。例えば、癌は、プロテアソーム阻害への耐性に関連したマーカー遺伝子における変異を含み得る。
【０１７９】
重要なことに、これらの決定は、患者別に、または作用薬（もしくは作用薬の組み合わせ）別に行われ得る。したがって、特定のプロテアソーム阻害治療が特定の患者もしくは患者群／クラスに利益をもたらす可能性があるか否か、または特定の治療が継続されるべきかを決定することができる。
【０１８０】
情報の使用
一方法において、情報、例えば、患者の腫瘍の変異状態、例えば、患者のマーカー（複数を含む）特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、もしくは量（例えば、本明細書に記載のマーカーまたはマーカーセットの評価結果）についての情報、または患者が好ましい成果を有すると予想されるかの情報は、第三者に、例えば、病院、診療所、政府事業体、償還者、または保険会社（例えば、生命保険会社）に提供される（例えば、通信される、例えば、電子通信される）。例えば、医療処置の選択、医療処置の支払い、償還者による支払い、またはサービスもしくは保険費用は、情報の関数であり得る。例えば、第三者は、情報を受信し、少なくともある程度情報に基づいて決定し、任意に情報を通信するか、または情報に基づいて手順、支払い、支払いの段階、補償範囲等を選択する。この方法において、表１から選択されるか、またはそれから得られ、かつ／あるいは本明細書に記載されるマーカーまたはマーカーセットの情報的に有益な特徴が決定される。
【０１８１】
一実施形態において、保険料（例えば、生命保険料または医療保険料）は、１つ以上のマーカー、例えば、マーカーまたはマーカーセットの変異状態または発現レベル、例えば、治療成果（例えば、情報的に有益な量）に関連した発現レベルについての情報の関数として評価される。例えば、患者のマーカー遺伝子または患者の本明細書に記載のマーカーセットが、被保険候補（または保険補償を求める候補）と参照値（例えば、罹患していない者）または参照試料、例えば、対応対照との間で異なる特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量を有する場合、保険料が増加し得る（例えば、ある割合）。保険料を本明細書に記載のマーカーまたはマーカーセットの評価結果に応じて計ることもできる。例えば、保険料を判定して、例えば、マーカーの関数として、例えば、本明細書に記載のマーカーまたはマーカーセットの評価結果として、リスクを分散することができる。別の例において、保険料は、既知の治療成果を有する患者から得られる保険数理データの関数として判定される。
【０１８２】
マーカー特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量、例えば、本明細書に記載のマーカーもしくはマーカーセットの評価結果（例えば、情報的に有益な特徴）についての情報は、例えば、生命保険の引受プロセスにおいて使用され得る。情報は、対象のプロファイルに組み込まれ得る。プロファイル中の他の情報には、例えば、出生日、性別、結婚歴、銀行情報、信用情報、子供等が含まれ得る。保険証券は、プロファイル中の情報の１つ以上の他の項目に加えて、マーカー特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量、例えば、本明細書に記載のマーカーまたはマーカーセットの評価結果の情報の関数として推奨され得る。保険料またはリスク評価もマーカーまたはマーカーセット情報の関数として評価され得る。一実装例において、ポイントは、予想される治療成果に基づいて割り当てられる。
【０１８３】
一実施形態において、マーカー特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量、例えば、本明細書に記載のマーカーまたはマーカーセットの評価結果についての情報は、対象に提供されたサービスまたは治療の代金を支払うために資金移動を許可するか（または本明細書で言及される別の決断を下すか）を決定する関数によって分析される。例えば、本明細書に記載のマーカーまたはマーカーセットの特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量の分析結果は、対象が好ましい成果を有すると予想されることを示し得、治療過程が必要とされることを示唆し、それによって対象に提供されたサービスまたは治療の代金の支払い許可を示すか、または引き起こす結果の一因となる。一例において、表１から選択されるか、またはそれから得られ、かつ／あるいは本明細書に記載されるマーカーまたはマーカーセットの情報的に有益な特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量が決定され、情報的に有益な量が好ましい成果を特定した場合、支払いが許可される。例えば、事業体、例えば、病院、介護人、政府事業体、もしくは保険会社、あるいは医療費を支払うか、または補償する他の事業体は、本明細書に記載の方法の結果を用いて、関係者、例えば、対象患者以外の関係者が患者に提供されたサービス（例えば、特定の治療）または治療の代金を支払うかを決定することができる。例えば、第１の事業体、例えば、保険会社は、本明細書に記載の方法の結果を用いて、患者に、または患者の代わりに金銭上の支払いを提供するか、例えば、第三者、例えば、物品もしくはサービス業者、病院、医師、または他の介護人に患者に提供されたサービスまたは治療代を償還するかを決定することができる。例えば、第１の事業体、例えば、保険会社は、本明細書に記載の方法の結果を用いて、保険プランまたはプログラム、例えば、健康保険または生命保険プランまたはプログラムを継続させるか、中止するか、個人を加入させるかを決定することができる。
【０１８４】
一態様において、本開示は、データを提供する方法を特色とする。この方法は、本明細書に記載のデータ、例えば、本明細書に記載の方法によって生成されたデータを提供し、記録、例えば、本明細書に記載の記録を提供して、支払いが提供されるかを決定することを含む。いくつかの実施形態において、データは、コンピュータ、コンパクトディスク、電話、ファクシミリ、Ｅメール、または手紙によって提供される。いくつかの実施形態において、データは、第一者によって第二者に提供される。いくつかの実施形態において、第一者は、対象、ヘルスケア提供者、治療担当医師、保健維持機構（ＨＭＯ）、病院、政府事業体、または薬物を販売もしくは供給する事業体から選択される。いくつかの実施形態において、第二者は、第三者支払人、保険会社、雇用主、雇用主が提供する医療保険、ＨＭＯ、または政府事業体である。いくつかの実施形態において、第一者は、対象、ヘルスケア提供者、治療担当医師、ＨＭＯ、病院、保険会社、または薬物を販売もしくは供給する事業体から選択され、第二者は、政府事業体である。いくつかの実施形態において、第一者は、対象、ヘルスケア提供者、治療担当医師、ＨＭＯ、病院、保険会社、または薬物を販売もしくは供給する事業体から選択され、第二者は、保険会社である。
【０１８５】
別の態様では、本開示は、患者のマーカーまたはマーカーセットの特徴、例えば、大きさ、配列、組成、活性、または量のリストおよび値を含む記録（例えば、コンピュータ可読の記録）を特色とする。いくつかの実施形態において、記録は、それぞれのマーカーの２つ以上の値を含む。
【０１８６】
スクリーニングアッセイ
本発明は、例えばＫＲＡＳ変異体発現もしくはＲＡＳ経路活性に阻害作用を有するか、あるいは例えばＲＡＳ経路におけるＫＲＡＳ基質もしくはタンパク質の発現もしくは活性、またはグルコース輸送体、例えば、ＧＬＵＴ４の発現もしくは活性に刺激作用もしくは阻害作用を有するプロテアソーム阻害剤、すなわち、候補もしくは試験化合物または作用薬（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド、小分子、または他の薬物）を特定するための方法（本明細書において「スクリーニングアッセイ」とも称される）を提供する。したがって、特定された化合物を用いて、治療プロトコルにおいて標的遺伝子産物（例えば、ＫＲＡＳ変異体遺伝子）の活性を調節するか、標的遺伝子産物の生物学的機能を作り上げるか、またはＫＲＡＳ変異体相互作用を妨害する化合物を特定することができる。死、アポトーシス、あるいは細胞の老化、例えば、固形腫瘍、例えば、非血液学的腫瘍、例えば、非小細胞肺癌、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、頭頸部癌、前立腺癌、もしくは腎細胞癌由来の細胞、または細胞株、例えば、変異体ＫＲＡＳ遺伝子または活性ＲＡＳ経路および／もしくは増加したグルコース輸送を有する応答しない患者由来の腫瘍の外植片から増殖した細胞の老化を引き起こす化合物、例えば、プロテアソーム阻害剤を特定することができる。
【０１８７】
他の実施形態では、アッセイは、ＫＲＡＳ変異体の１つ以上の活性を調節する化合物、例えば、ヌクレオチド、例えば、ＧＴＰもしくはＧＤＰに結合する能力、ヌクレオチドを加水分解する能力、ＲＡＳＧＡＰに結合する能力、リン脂質二重層、例えば、細胞膜に結合する能力、細胞周期を制御する能力、細胞のタンパク質恒常性を調整する能力、および／または腫瘍細胞生存を支持する能力を特定することができる。いくつかの実施形態において、試験薬の存在下でのＫＲＡＳ変異体の活性と、ＫＲＡＳ変異体またはＫＲＡＳ変異体を含む細胞が耐性を有するプロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸、例えば、ボルテゾミブまたはクエン酸イクサゾミブの存在下での活性が比較され得る。
【０１８８】
本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリ、ペプトイドライブラリ（酵素分解に耐性を示すにもかかわらず生物活性状態のままである、ペプチドの機能性を有するが、新規の非ペプチド骨格を有する分子のライブラリ）（例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８−８５を参照のこと）、空間的にアドレス可能な並列固相または溶液相ライブラリ、逆重畳積分を必要とする合成ライブラリ法、「１ビーズ１化合物」ライブラリ法、および親和性クロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリ法を含む当技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリ法における多数の手法のうちのいずれかを用いて得られ得る。生物学的ライブラリおよびペプトイドライブラリ手法は、ペプチドライブラリに限定されるが、他の４つの手法は、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマー、または小分子ライブラリに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。さらなる化合物は、先の項で説明されたプロテアソーム阻害剤を開示する出版物に提供される手引きから合成され得る。
【０１８９】
化合物のライブラリは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、またはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌上（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド上（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）、またはファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０、Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６、Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２、Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０、Ｌａｄｎｅｒ（上記参照））に提示され得る。
【０１９０】
一実施形態において、アッセイは、ＫＲＡＳ変異体タンパク質またはその生物学的に活性な部分を発現する細胞を試験化合物と接触させて、ＫＲＡＳ変異体活性または細胞の生存率を調節する試験化合物の能力が決定される細胞ベースのアッセイである。一実施形態において、生体外の細胞ベースのアッセイは、栄養素の乏しい、例えば、低血清または低グルコース条件下で増殖した細胞上で実施される。ＫＲＡＳ変異体活性を調節する試験化合物の能力の決定は、例えば、ヌクレオチド、例えば、ＧＴＰもしくはＧＤＰに結合する能力、ヌクレオチドを加水分解する能力、ＲＡＳＧＡＰに結合する能力、リン脂質二重層、例えば、細胞膜に結合する能力、細胞周期を制御する能力、タンパク質恒常性を調整する細胞の能力、および／または腫瘍細胞生存を支持する能力を監視することによって達成され得る。試験化合物の作用は、試験化合物に曝露されていない対照細胞と比較され得る。いくつかの実施形態において、試験薬の存在下でのＫＲＡＳ変異体の活性と、ＫＲＡＳ変異体またはＫＲＡＳ変異体を含む細胞が耐性を有するプロテアソーム阻害剤、例えば、ペプチジルボロン酸、例えば、ボルテゾミブまたはクエン酸イクサゾミブの存在下での活性が比較され得る。例えば、細胞は、哺乳動物由来の細胞、例えば、ヒトの細胞であり得る。他の実施形態では、アッセイは、生体外または生体内の薬物耐性細胞株、例えば、異種移植片腫瘍モデルにおいて、ＫＲＡＳと構造的または機構的に類似した酵素の変異形を調節する試験化合物の能力を決定することができる。化合物は、細胞生存率または細胞増殖が低下するとき、薬物耐性またはプロテアソーム阻害剤調節剤と特定される。
【０１９１】
本発明は、これから以下の実施例によって説明され、これらは決して限定的であるよう意図されていない。
【実施例】
【０１９２】
実施例１
異種移植片
ＰＨＴＸで始まる名称を有する異種移植片を、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．において以下のように得た：患者由来の腫瘍をＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＮｅｔｗｏｒｋおよびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅから得た。手術の２４時間以内に、この腫瘍を４匹のＳＣＩＤ−ＮＯＤマウスに埋め込んだ。腫瘍をＳＣＩＤ−ＮＯＤマウスに２〜３回連続継代して成長を確認し、腫瘍を再び得て後に使用するために物質を液体窒素中に貯蔵した。表３に列記されるＭＬＮ２２３８を試験するために、腫瘍を大量のＮＣｒ−Ｎｕｄｅおよび／またはＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスにさらに継代した。患者由来の腫瘍をＨ＆Ｅ染色によって組織学的に特徴付け、継代した腫瘍の凍結切片由来のＤＮＡをＳｅｑｕｅｎｏｍによる変異分析のために調製した。
【０１９３】
【表３】
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【０１９４】
ＬＸＦから始まる名称を有する異種移植片は、Ｏｎｃｏｔｅｓｔ  ＧｍｂＨ（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のものである。これらの腫瘍での研究をＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から提供されたＭＬＮ２２３８を用いてＯｎｃｏｔｅｓｔ  ＧｍｂＨで行った。ＳＷ４８およびＳＷ４８−Ｋ−Ｒａｓ  Ｇ１３Ｄ細胞株をＨｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＵＫ）から得て、ＭＬＮ２２３８を用いた実験をＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．で行った。これらの研究におけるすべての他の異種移植片は、ＡＴＣＣから購入した細胞株から得た。
【０１９５】
ゲノム変化の分析
ゲノムＤＮＡをＱｉａｇｅｎが推奨するプロトコルを用いて異種移植片腫瘍および細胞株から単離した。変異状態をＳｅｑｕｅｎｏｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の質量分析遺伝子型分析システムを用いて癌遺伝子および既知の腫瘍抑制因子パネルを試験することによって決定した。
【０１９６】
評価した変異パネルは、ＯＮＣＯＣＡＲＴＡ（商標）バージョン１．０（ＬＸＦ細胞モデル）、ならびに調査した変異のリスト（バージョン２および３）を４１個の癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子における５１４個の既知の変異にまで拡大するためにＳｅｑｕｅｎｏｍおよびＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍと共同設計されたカスタムアッセイからなった。表４は、パネルに含まれる変異を有する遺伝子を列記し、丸括弧（）内の数字は、遺伝子のアッセイの標的となったおおよその変異の数を示す。本明細書に記載の細胞株をＫＲＡＳ変異について試験し、以下のアミノ酸変化をもたらした：Ｇ１２のＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｒ、Ｓ、またはＶへの変化；Ｇ１３のＤ、Ｖ、Ｃ、Ｓ、Ａ、またはＲへの変化；Ｌ１９のＦへの変化；Ｑ２２のＫへの変化；Ｔ５８のＩへの変化；Ａ５９のＴまたはＶへの変化；Ｇ６０のＤへの変化；Ｑ６１のＥ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、またはＲへの変化；およびＡ１４６のＴへの変化。
【０１９７】
【表４】
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【０１９８】
カスタムアッセイを、伸長産物の予想質量を決定する単一塩基伸長とのＴＹＰＥＰＬＥＸ（登録商標）化学反応を用いて設計し、多重化反応において見られるすべての潜在的なピーク間の分離を確実にした。１５ｎＬの増幅および伸長産物をナノディスペンサーを用いて３８４  ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰＩＩ上にスポッティングする。３点較正物をすべてのチップに添加して、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ  Ｍａｌｄｉ−ｔｏｆ小型質量分析計の正確な動作を確実にする。ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ  ＩＩをＳｅｑｕｅｎｏｍ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ小型質量分析計内に設置する。この質量分析計を、３８４ウェルｓｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ上のそれぞれのスポットごとに最大９つの取得物を発するように設定する。ＴｙｐｅＰＬＥＸ  ＧｏｌｄキットＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ  ＩＩを製造業者が推奨するプロトコルに従って使用する。
初期変異呼び出しフィルタが１０％のＳｅｑｕｅｎｏｍ分析ソフトウェア、Ｍａｓｓアレイ（登録商標）タイパーアナライザーｖ４を用いて分析を行う。正の変異体呼び出しの初期閾値は、最低１０％の変異体対立遺伝子の頻度であるが、３％まで低下したシグナルが検出される場合がある。社内での感受性評価は、８％の閾値を低い誤判定率で用いることができることを示唆する。
【０１９９】
免疫不全マウスにおける異種移植片腫瘍成長
試験中の薬物ＭＬＮ９７０８（Ｋｕｐｐｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７０：１９７０−１９８０）は、多発性骨髄腫および軽鎖アミロイドーシスの第３相試験ならびに悪性血液学的および固形腫瘍疾患の第１相および第２相試験で現在評価されている経口プロテアソーム阻害剤である。水溶液または血漿への曝露時、ＭＬＮ９７０８は、生物学的に活性な形態のＭＬＮ２２３８に即座に加水分解する。多くの研究において、ＭＬＮ２２３８は、ＭＬＮ９７０８の代わりに使用される。生体外において、ＭＬＮ２２３８は、標準の細胞生存率およびコロニー形成アッセイ（Ｋｕｐｐｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照））で評価される広範囲の固形腫瘍細胞型にわたって強力である。しかしながら、免疫不全マウスにおいて異種移植片として生体内で増殖するとき、生体外でＭＬＮ２２３８に応答する細胞株はすべてＭＬＮ２２３８に応答するわけではない。生体内におけるＭＬＮ２２３８への感受性を決定する寄与因子を理解するために、６個の結腸および１４個の非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）異種移植片腫瘍パネルを癌関連遺伝子における変異ならびに腫瘍薬物動態および薬力学的マーカーについて評価した。
【０２００】
細胞株由来の異種移植片：標準の細胞培養手順を用いて増殖させた新鮮に解離された腫瘍細胞を免疫不全マウスの背側腹部の皮下腔に無菌的に注入した。注入した細胞の数およびマウスの系統が表５に列記される。
【０２０１】
一次ヒト腫瘍由来の異種移植片：腫瘍を免疫不全マウスにおける連続継代によって成長させ、細胞培養手順を使用しなかった。異種移植片を有するマウスから新鮮に切除された腫瘍断片を套管針を用いて表５に示される系統のレシピエント免疫不全マウスの背側腹部の皮下腔に埋め込んだ。
【０２０２】
腫瘍測定：接種後、腫瘍をノギスを用いて週に２回測定した。腫瘍体積を標準の式（０．５×［長さ×幅２］）を用いて計算した。腫瘍体積が約１５０〜２５０ｍｍ３に達したとき、マウスを無作為に治療群に分けた。
【０２０３】
治療期間：薬物で治療した群は、腫瘍を有するマウスの同一の系統で実施された耐性研究において特定された最大耐容用量（表に列記される系統および用量）のＭＬＮ２２３８またはそれ未満のＭＬＮ２２３８を週に２回の静脈内投与によって３週間受けた。対照群は、同一の経路およびスケジュールでビヒクル（５％ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン）を受けた。腫瘍の大きさおよび体重を週に２回測定した。Ｔ／Ｃ値（治療群の平均体積／対照群の平均体積）を表６に列記される日に計算した。
【０２０４】
【表５−１】
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【表５−２】
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【０２０５】
表６は、ＭＬＮ２２３８での処理後の腫瘍成長の結果を要約する。表６の区分Ａは、高用量のＭＬＮ２２３８（１１〜１４ｍｇ／ｋｇ）での結果を列記し、区分Ｂは、低用量のＭＬＮ２２３８（８ｍｇ／ｋｇ）での結果を列記する。図１は、ＫＲＡＳ遺伝子（野生型または変異体）の状態によって分析日のＴ／Ｃ値（表６の区分Ａに列記される）をまとめたチャートである。ＫＲＡＳ状態とプロテアソーム阻害剤での治療に対する感受性または応答性に関連性がある。この例において、ＫＲＡＳ（野生型）変異を有しない結腸直腸および非小細胞肺異種移植片腫瘍は、ＫＲＡＳ変異を有するものよりもＭＬＮ２２３８に対して感受性がある。ＫＲＡＳ野生型異種移植片の平均腫瘍対対照比（Ｔ／Ｃ）は０．４であり、ＫＲＡＳ変異体異種移植片の平均Ｔ／Ｃは０．８２であった。
【０２０６】
【表６】
2014533112.tif 000019
【０２０７】
図２Ａおよび２Ｂは、代表的な腫瘍異種移植片におけるＭＬＮ２２３８の抗腫瘍活性を説明する。図２Ａは、野生型ＫＲＡＳを有する異種移植片におけるＭＬＮ２２３８への応答性を説明する。図２Ｂは、変異体ＫＲＡＳを有する異種移植片におけるＭＬＮ２２３８への応答性を説明する。ＫＲＡＳ変異体腫瘍のＭＬＮ２２３８に対する耐性が、（液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）に基づく方法において測定された）薬物曝露の欠如にも、（２０Ｓプロテアソームのβ５サブユニットの阻害によって測定された）腫瘍試料における腫瘍プロテアソーム阻害の欠如にも起因しないことが決定された。
【０２０８】
生体内でのＫＲａｓ変異のＭＬＮ２２３８に対する応答性への影響をＫＲａｓ−ＳＷ４８同質遺伝子結腸細胞株（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ）を用いてさらに判定し、そこでＫＲａｓ−Ｇ１３ＤおよびＫＲａｓ−Ｇ１２Ｖ変異をｒＡＡＶ遺伝子編集技術によってＳＷ４８細胞（ＫＲａｓ野生型）に導入して安定した細胞株を生成した。（処理の７２時間時点で細胞ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定された）生体外でのＭＬＮ２２３８に対する感受性は、３つの細胞株（３３ｎＭのＥＣ５０の野生型、１９．５ｎＭのＧ１３Ｄ、および２０ｎＭのＧ１２Ｖ）で類似していたが、生体内での研究は、感受性の違いを示した。図３Ａ〜３Ｃは、野生型ＫＲＡＳを有する異種移植片モデル（図３Ａ）またはＫＲＡＳがオープンリーディングフレームコドン１３または１２で変異して、それぞれの位置でグリシンを別のアミノ酸で置換する対応異種移植片モデル（それぞれ、図３Ｂおよび３Ｃ）における腫瘍成長の経時変化を説明する。この対応モデルの結果は、異種移植片研究において、野生型株がＭＬＮ２２３８に対して感受性があり、変異体株がＭＬＮ２２３８に対して耐性があることを示す。これは、活性化ＫＲＡＳがある程度の耐性をプロテアソーム阻害剤に付与し得ることを示唆する。
【０２０９】
実施例２．グルコース輸送体
概して、腫瘍細胞は、正常細胞よりも高いレベルのグルコース代謝を呈する（Ａｄｅｋｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）２４：６５０−６５４に概説される）。ＫＲＡＳ変異体結腸直腸癌細胞は、栄養素ストレス下で野生型細胞よりも高いグルコース取り込みおよび解糖、ならびに良好な増殖および生存を示した（Ｙｕｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５：１５５５）。これらの研究は、ＫＲＡＳ変異体結腸直腸癌細胞において上方制御したときにグルコース輸送体１（ＧＬＵＴ１）を特定した。
【０２１０】
腫瘍細胞株のほとんどが、高グルコースを用いた標準の培養条件下で生体外においてＭＬＮ２２３８に対して感受性があり、感受性のある細胞株と耐性のある細胞株の生体外での区別を困難にした。しかしながら、生体内条件下では、より少ないグルコースが利用可能である。グルコース輸送体発現を、ＭＬＮ２２３８で処理されていないが、異種移植片としてマウス内で成長したか、または培養液内で成長した表５に列記される腫瘍細胞株のウエスタンブロットによって分析した。タンパク質をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＶＡ）のＭＰＥＲ哺乳動物タンパク質抽出試薬中の異種移植片腫瘍試料または細胞試料から調製した。等量のタンパク質を４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル中に泳動させ、ＰＶＤＦ膜上に移し、ＬＩ−ＣＯＲ（Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）の試薬を用いて分析した。一次抗体は、哺乳動物グルコース輸送体４（Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、カタログ番号ａｂ６５４）に対するウサギポリクローナル抗体であった。多くの細胞型（培養細胞（図４Ａ）および異種移植片（図４Ｂ）（１動物につき１レーン））におけるＧＬＵＴ４レベルの分析は、ＫＲＡＳ変異体細胞および異種移植片のＧＬＵＴ４レベルがＫＲＡＳ野生型細胞および異種移植片のＧＬＵＴ４レベルよりも高いことを示す。これらの結果は、ＫＲＡＳ野生型腫瘍のＧＬＵＴ４レベルが低い場合に、それらのＭＬＮ２２３８に対する感受性に影響を与え得ることを示唆する。逆に、ＫＲＡＳ変異体腫瘍のＧＬＵＴ４レベルが高い場合に、それらがＭＬＮ２２３８によるプロテアソーム阻害のストレスに耐え抜くことを可能にし得る。
【０２１１】
実施例３．さらなるを配列決定方法および一般手順
サンガー配列決定方法論。ＰＣＲ増幅を遺伝子のエクソンごとに最適化サイクリング条件を用いて実施する。プライマー伸長配列決定をＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＢｉｇＤｙｅバージョン３．１を用いて行う。その後、反応物をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍの３７３０ｘｌ  ＤＮＡアナライザー上で泳動させる。配列決定塩基呼び出しをＫＢＴＭ  Ｂａｓｅｃａｌｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行う。体細胞変異細胞をＭｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（ＳｏｆｔＧｅｎｅｔｉｃｓ）によって決定し、Ｓｅｑｍａｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて手作業で配列決定データを対応する参照配列と整列させることによって確認した。
【０２１２】
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）方法論。Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を用いた標的ＮＧＳを用いて、マーカーにおける低頻度の変異を確認および特定する。コーディングエクソンを増幅するようにプライマー対を設計する。ＰＣＲ産物をＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイを用いて定量化し、それぞれの試料ごとに等モル比で合わせる。精製した産物を末端修復し、連結反応によって濃縮する。濃縮した産物をＨｉ−Ｓｅｑ  ２０００ライブラリ調製に使用する。濃縮したＰＣＲ産物をせん断し、１つの多重化プール当たり１２個のバーコード化した試料からなるバーコード化したＨｉ−Ｓｅｑ  ２０００ライブラリを作製するために使用する。プールされたＨｉ−Ｓｅｑ  ２０００ライブラリは、Ｈｉ−Ｓｅｑ  ２０００フローセルの８つのレーン上でのクラスター生成によるクローン増幅を経て、Ｈｉ−Ｓｅｑ  ２０００上で１×１００シングルエンドシークエンシングを用いて配列決定する。一次シークエンシング読み取りとヒトゲノムとの整合がＨｇ１８を構築し、同様に、ＳＮＰ分析をＩｌｌｕｍｉｎａのＣＡＳＡＶＡソフトウェアバージョン１．７．１を用いて行う。
【０２１３】
化合物および薬学的組成物の調製。式（ＩＩ）の化合物、［（１Ｒ）−１（｛［（２，４−ジクロロベンゾイル）アミノ］アセチル｛−アミノ）−３−メチルブチル］ボロン酸を、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＯｌｈａｖａ  ａｎｄ  Ｄａｎｃａの米国特許第７，４４２，８３０号に開示される方法を用いて調製する。式（ＩＩＩ−Ａ）の化合物、２，２’−｛２−［（１Ｒ）−１−（｛［（２，５ジクロロベンゾイル）アミノ］アセチル｝アミノ）−３−メチルブチル］−５−オキソ−１，３，２−ジオキサボロラン−４，４−ジイル｝ジ酢酸を、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＥｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．の国際公開第ＷＯ０９／１５４７３７号に開示される方法を用いて調製する。式（ＩＩＩ−Ａ）の化合物の経口カプセル製剤を、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＥｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．の国際公開第ＷＯ０９／１５４７３７号に開示される方法を用いて調製する。式（ＩＩＩ−Ａ）の化合物の静脈内製剤を、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＥｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．の国際公開第ＷＯ０９／１５４７３７号に開示される方法を用いて調製する。静脈内製剤への再構成に好適な式（ＩＩＩ−Ａ）の化合物の凍結乾燥製剤を、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＥｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．の国際公開第ＷＯ０９／１５４７３７号に開示される方法を用いて調製する。
【０２１４】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ。ｃＤＮＡ合成および定量的ＲＴ−ＰＣＲを、ＡＢＩ遺伝子発現アッセイ、試薬、およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））を用いて行い、以下のサイクル条件を用いる：ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧ活性化のために５０℃で２分間維持、その後、ＤＮＡポリメラーゼの活性化のために９５．０℃で１０分間維持、その後、９５．０℃で１５秒間および６０．０℃で１分間の４０回２部サイクル運転。対照遺伝子Ｂ２Ｍ（Ｈｓ９９９９９９０７＿ｍ１）およびＲＰＬＰＯ（Ｈｓ９９９９９９０２＿ｍ１）の平均Ｃｔを用いてｄＣｔを計算する。比較ＣＴ法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて相対ｍＲＮＡ発現定量化をもたらす。ｍＲＮＡ発現倍率変化値を正常試料および対応する腫瘍試料から生成する。
【０２１５】
等価物
本発明の実施形態が特定の用語を用いて説明されているが、そのような説明は、例証目的のためであって、本発明の精神または範囲から逸脱することなく変更および変形を加えてもよいことを理解されたい。当業者であれば、日常の実験のみを用いて、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識するか、解明することができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるよう意図される。
【図１】
2014533112.tif 000020
【図２Ａ】
2014533112.tif 000021
【図２Ｂ】
2014533112.tif 000022
【図３Ａ】
2014533112.tif 000023
【図３Ｂ】
2014533112.tif 000024
【図３Ｃ】
2014533112.tif 000025
【図４Ａ】
2014533112.tif 000026
【図４Ｂ】
2014533112.tif 000027
【配列表】
2014533112000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年7月10日(2014.7.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞を含む患者試料中の少なくとも１つのマーカー遺伝子に関連した少なくとも１つのマーカーの少なくとも１つの特徴を、肺腫瘍および結腸腫瘍からなる群から選択される固形腫瘍を有する患者をプロテアソーム阻害剤で治療することの指標とするための方法であって、
ａ）腫瘍細胞を含む患者試料中の少なくとも１つのマーカー遺伝子に関連した少なくとも１つのマーカーの少なくとも１つの特徴を測定するステップであって、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子がｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２  Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）である、前記測定するステップを含み、
ステップａ）で測定された前記少なくとも１つの特徴が前記プロテアソーム阻害剤での治療の成果に情報的に有益であるかどうかが特定され、
前記腫瘍細胞が野生型ＫＲＡＳを含むことを前記情報的に有益な特徴が示す場合に、前記患者に、前記プロテアソーム阻害剤での治療が必要であると示される、前記方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つのマーカーが、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子に対応する核酸およびタンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの特徴が、大きさ、配列、組成、活性、および量からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記固形腫瘍が、非小細胞肺腫瘍および結腸腫瘍からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの特徴が配列である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのマーカーが核酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸が、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｃＤＮＡからなる群から選択されるか、または前記ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｃＤＮＡのうちのいずれかの一部であり、前記一部が、少なくとも１つのマーカー遺伝子の少なくとも１つの変異部位を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸が、コドン１２、コドン１３、およびコドン６１からなる群から選択される配列番号２のコドン、またはその変異形、またはその相補体を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのマーカーが少なくとも２つのマーカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのマーカー遺伝子が少なくとも２つのマーカー遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも２つのマーカー遺伝子が、少なくともＫＲＡＳおよびＧＬＵＴ４を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＧＬＵＴ４の前記少なくとも１つの特徴が量である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＧＬＵＴ４の前記量が標準以下である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料が腫瘍浸出液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
腫瘍細胞の前記試料を富化することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料が、非小細胞肺癌細胞および結腸癌細胞からなる群から選択される腫瘍細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記プロテアソーム阻害剤が、ペプチジルボロン酸およびペプチジルエポキシケトンからなる群から選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチジルボロン酸が、ボルテゾミブ、クエン酸イクサゾミブ、および［（１Ｒ）−１−［［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［（６−フェニル−ピリジン−２−カルボニル）アミノ］−１−オキソ−ブチル］アミノ］−３−メチルブチル］ボロン酸からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
プロテアソーム阻害剤で治療されている固形腫瘍を有する患者から得られた固形腫瘍細胞を含む試料中の少なくとも１つのマーカー遺伝子に関連した少なくとも１つのマーカーの少なくとも１つの特徴と参照との比較を、患者における固形腫瘍のプロテアソーム阻害剤治療を継続することの指標とするための方法であって、
ａ）前記試料中の少なくとも１つのマーカー遺伝子に関連した少なくとも１つのマーカーの少なくとも１つの特徴を測定することであって、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子がＫＲＡＳである、前記測定することと、
ｂ）ａ）における前記測定の結果を参照と比較することと、
を含み、
前記試料中の前記固形腫瘍細胞が野生型ＫＲＡＳを含むことを前記比較が示す場合に、前記患者に、前記プロテアソーム阻害剤での継続的な治療が必要であると示され、
前記患者が、肺腫瘍および結腸腫瘍からなる群から選択される固形腫瘍を有する、前記方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのマーカーが、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子に対応する核酸およびタンパク質からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの特徴が、大きさ、配列、組成、活性、および量からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記患者試料が、非小細胞肺癌細胞および結腸癌細胞からなる群から選択される腫瘍細胞を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの特徴が配列である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのマーカーが核酸である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸が、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｃＤＮＡからなる群から選択されるか、または前記ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｃＤＮＡのうちのいずれかの一部であり、前記一部が、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子の少なくとも１つの変異部位を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸が、コドン１２、コドン１３、およびコドン６１からなる群から選択される配列番号２のコドン、またはその変異形、またはその相補体を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１つのマーカーが少なくとも２つのマーカーである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのマーカー遺伝子が少なくとも２つのマーカー遺伝子である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも２つのマーカー遺伝子が、少なくともＫＲＡＳおよびＧＬＵＴ４を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＧＬＵＴ４の前記少なくとも１つの特徴が量である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＧＬＵＴ４の前記量が標準以下である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記試料が腫瘍浸出液を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
腫瘍細胞の前記試料を富化するステップをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記プロテアソーム阻害剤が、ペプチジルボロン酸およびペプチジルエポキシケトンからなる群から選択される、請求項１６〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ペプチジルボロン酸が、ボルテゾミブ、クエン酸イクサゾミブ、および［（１Ｒ）−１−［［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［（６−フェニル−ピリジン−２−カルボニル）アミノ］−１−オキソ−ブチル］アミノ］−３−メチルブチル］ボロン酸からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
腫瘍細胞を含む試料に添加する安定剤と、試料中の少なくとも１つのマーカーの少なくとも１つの特徴を測定する試薬と、を含む、キットであって、前記測定の結果が、少なくとも１つのマーカー遺伝子に変異が存在するかを示し、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子がＫＲＡＳである、前記キット。
【請求項３７】
前記少なくとも１つのマーカーが核酸である、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記試薬がプライマーである、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記プライマーが、配列番号１、２、４、５からなる群から選択される核酸配列、１１５２４７０８５と１１５２５９５１５の塩基対の染色体１ｐの配列、２５３５８１８０と２５４０３８５４の塩基対の染色体１２ｐの配列、および前記配列のうちのいずれかの相補体にハイブリダイズする、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
第２のプライマーをさらに含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４１】
プローブをさらに含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４２】
前記安定剤がＲＮＡ安定剤である、請求項３６〜４１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４３】
前記少なくとも１つのマーカーがタンパク質であり、前記試薬が抗体である、請求項３６に記載のキット。
【請求項４４】
前記抗体がＧＬＵＴ４に結合する、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
試料中の少なくとも２つのマーカーの少なくとも１つの特徴を測定する少なくとも２つの試薬を含むキットであって、前記測定の結果が、少なくとも１つのマーカー遺伝子に変異が存在するかを示し、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子がＫＲＡＳであり、前記試料が、肺腫瘍細胞および結腸腫瘍細胞からなる群から選択される固形腫瘍細胞を含む、前記キット。
【請求項４６】
少なくとも１つのマーカー遺伝子が少なくとも２つのマーカー遺伝子である、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
前記少なくとも２つのマーカー遺伝子がＫＲＡＳおよびＧＬＵＴ４を含む、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
少なくとも１つの試薬が少なくとも２つの試薬である、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
少なくとも２つの試薬が抗体を含む、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記抗体がＧＬＵＴ４に結合する、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
前記試料に添加する安定剤をさらに含む、請求項４５〜５０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５２】
固形腫瘍細胞のプロテアソーム阻害剤への感受性を予測するための生体外での方法であって、
ａ）前記細胞が変異ＫＲＡＳを発現するかを判定することと、
ｂ）前記細胞のプロテアソーム阻害剤への感受性を予測することと、を含み、
変異ＫＲＡＳの発現が前記プロテアソーム阻害剤への感受性不足を予測し、前記固形腫瘍細胞が、肺腫瘍細胞および結腸腫瘍細胞からなる群から選択される、前記方法。
【請求項５３】
ＧＬＵＴ４が過剰発現されるかを判定することをさらに含み、ＧＬＵＴ４の過剰発現が前記プロテアソーム阻害剤への感受性不足を予測する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
野生型ＫＲＡＳ状態を含む固形腫瘍を有する患者を治療するための治療的に有効な量のプロテアソーム阻害剤を含む組成物であって、前記固形腫瘍が、肺腫瘍および結腸腫瘍からなる群から選択される、前記組成物。
【請求項５５】
前記プロテアソーム阻害剤が、ペプチジルボロン酸およびペプチジルエポキシケトンからなる群から選択される、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記ペプチジルボロン酸が、ボルテゾミブ、クエン酸イクサゾミブ、および［（１Ｒ）−１−［［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［（６−フェニル−ピリジン−２−カルボニル）アミノ］−１−オキソ−ブチル］アミノ］−３−メチルブチル］ボロン酸からなる群から選択される、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
プロテアソーム阻害剤を非血液学的癌を有する患者の治療における使用に好適であると特定するための方法であって、
ａ）少なくとも１つのマーカー遺伝子に少なくとも１つの変異を含む宿主動物における異種移植片中の腫瘍細胞を試験プロテアソーム阻害剤と接触させることであって、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子がＫＲＡＳである、前記接触させることと、
ｂ）前記試験プロテアソーム阻害剤の前記細胞の生存率への影響を判定することと、
ｃ）前記試験プロテアソーム阻害剤が前記細胞の前記生存率を低下させる場合に、非血液学的癌を有する患者の治療における使用に好適であると決定することと、を含む、前記方法。
【請求項５８】
ＫＲＡＳにおける前記変異が、コドン１２、コドン１３、およびコドン６１からなる群から選択される配列番号２のコドンに存在する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記試験プロテアソーム阻害剤がＧＬＵＴ４の前記発現を減少させる場合に、非血液学的癌を有する患者の治療における使用に好適であると決定するステップをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
プロテアソーム阻害剤での癌の治療代を支払うための方法であって、
ａ）肺癌または結腸癌を有する患者由来の固形腫瘍細胞を含む試料中のＫＲＡＳが変異したかを記録することと、
ｂ）ＫＲＡＳが野生型である場合に、前記プロテアソーム阻害剤での治療の支払いを許可することと、を含む、前記方法。
【請求項６１】
前記プロテアソーム阻害剤が、ペプチジルボロン酸およびペプチジルエポキシケトンからなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ペプチジルボロン酸が、ボルテゾミブ、クエン酸イクサゾミブ、および［（１Ｒ）−１−［［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［（６−フェニル−ピリジン−２−カルボニル）アミノ］−１−オキソ−ブチル］アミノ］−３−メチルブチル］ボロン酸からなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
少なくとも１つのＫＲＡＳ変異の存在を、プロテアソーム阻害剤での治療に応答しないであろう非血液学的癌患者を特定することの指標とするための方法であって、肺癌および結腸癌からなる群から選択される非血液学的癌を有する前記患者由来の腫瘍細胞を含む試料における少なくとも１つのＫＲＡＳ変異の存在または不在を決定することを含み、それによって少なくとも１つのＫＲＡＳ変異の存在が、前記患者が前記プロテアソーム阻害剤に応答しないであろうことを示す、前記方法。
【請求項６４】
前記少なくとも１つのＫＲＡＳ変異が活性化変異である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
少なくとも１つのＫＲＡＳ変異の存在または不在が、前記変異を含む疑いのあるマーカーまたはマーカーの一部を配列決定することによって決定される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記マーカーまたは一部が、コドン１２、コドン１３、またはコドン６１を含む配列番号２またはその一部を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記プロテアソーム阻害剤が、ペプチジルボロン酸およびペプチジルエポキシケトンからなる群から選択される、請求項６３〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記ペプチジルボロン酸が、ボルテゾミブ、クエン酸イクサゾミブ、および［（１Ｒ）−１−［［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［（６−フェニル−ピリジン−２−カルボニル）アミノ］−１−オキソ−ブチル］アミノ］−３−メチルブチル］ボロン酸からなる群から選択される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
野生型ＫＲＡＳまたはコドン１４６における変異の存在を、プロテアソーム阻害剤での治療に対して好ましい成果を有するであろう非血液学的癌患者を特定することの指標とするための方法であって、肺癌および結腸癌からなる群から選択される非血液学的癌を有する前記患者由来の腫瘍細胞を含む試料における少なくとも１つのＫＲＡＳ変異の存在または不在を決定することを含み、それによって野生型ＫＲＡＳまたはコドン１４６における変異の存在が、前記患者が前記プロテアソーム阻害剤に応答するであろうことを示す、前記方法。
【請求項７０】
少なくとも１つのＫＲＡＳ変異の存在または不在が、前記変異を含む疑いのあるマーカーまたはマーカーの一部を配列決定することによって決定される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記マーカーまたは一部が、コドン１２、コドン１３、コドン６１、またはコドン１４６を含む配列番号２またはその一部を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記プロテアソーム阻害剤が、ペプチジルボロン酸およびペプチジルエポキシケトンからなる群から選択される、請求項６９〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記ペプチジルボロン酸が、ボルテゾミブ、クエン酸イクサゾミブ、および［（１Ｒ）−１−［［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［（６−フェニル−ピリジン−２−カルボニル）アミノ］−１−オキソ−ブチル］アミノ］−３−メチルブチル］ボロン酸からなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明の他の特徴および利点は、以下の発明を実施するための形態、図面、および特許請求の範囲から明らかになる。
好ましい実施形態において、本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
肺腫瘍および結腸腫瘍からなる群から選択される固形腫瘍を有する患者をプロテアソーム阻害剤で治療するかを決定するための方法であって、
ａ）腫瘍細胞を含む患者試料中の少なくとも１つのマーカー遺伝子に関連した少なくとも１つのマーカーの少なくとも１つの特徴を測定するステップであって、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子がｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２  Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）である、前記測定するステップと、
ｂ）ステップａ）で測定された前記少なくとも１つの特徴が前記プロテアソーム阻害剤での治療の成果に情報的に有益であるかを特定するステップと、
ｃ）前記腫瘍細胞が野生型ＫＲＡＳを含むことを前記情報的に有益な特徴が示す場合に、前記患者を前記プロテアソーム阻害剤で治療することを決定するステップと、を含む、前記方法。
（項目２）
前記少なくとも１つのマーカーが、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子に対応する核酸およびタンパク質からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記少なくとも１つの特徴が、大きさ、配列、組成、活性、および量からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記固形腫瘍が、非小細胞肺腫瘍および結腸腫瘍からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記少なくとも１つの特徴が配列である、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記少なくとも１つのマーカーが核酸である、項目２に記載の方法。
（項目７）
前記核酸が、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｃＤＮＡからなる群から選択されるか、または前記ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｃＤＮＡのうちのいずれかの一部であり、前記一部が、少なくとも１つのマーカー遺伝子の少なくとも１つの変異部位を含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記核酸が、コドン１２、コドン１３、およびコドン６１からなる群から選択される配列番号２のコドン、またはその変異形、またはその相補体を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記少なくとも１つのマーカーが少なくとも２つのマーカーである、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記少なくとも１つのマーカー遺伝子が少なくとも２つのマーカー遺伝子である、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記少なくとも２つのマーカー遺伝子が、少なくともＫＲＡＳおよびＧＬＵＴ４を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
ＧＬＵＴ４の前記少なくとも１つの特徴が量である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
ＧＬＵＴ４の前記量が標準以下である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記試料が腫瘍浸出液を含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
腫瘍細胞の前記試料を富化することをさらに含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記試料が、非小細胞肺癌細胞および結腸癌細胞からなる群から選択される腫瘍細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記プロテアソーム阻害剤が、ペプチジルボロン酸およびペプチジルエポキシケトンからなる群から選択される、項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記ペプチジルボロン酸が、ボルテゾミブ、クエン酸イクサゾミブ、および［（１Ｒ）−１−［［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［（６−フェニル−ピリジン−２−カルボニル）アミノ］−１−オキソ−ブチル］アミノ］−３−メチルブチル］ボロン酸からなる群から選択される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
患者における固形腫瘍のプロテアソーム阻害剤治療を継続するかを決定するための方法であって、
ａ）固形腫瘍を有する患者をプロテアソーム阻害剤で治療することと、
ｂ）固形腫瘍細胞を含む試料を前記患者から得ることと、
ｃ）前記試料中の少なくとも１つのマーカー遺伝子に関連した少なくとも１つのマーカーの少なくとも１つの特徴を測定することであって、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子がＫＲＡＳである、前記測定することと、
ｄ）ｃ）における前記測定の結果を参照と比較することと、
ｅ）前記試料中の前記固形腫瘍細胞が野生型ＫＲＡＳを含むことを前記比較が示す場合に、前記プロテアソーム阻害剤での治療を継続することを決定することと、を含み、
前記患者が、肺腫瘍および結腸腫瘍からなる群から選択される固形腫瘍を有する、前記方法。
（項目２０）
前記少なくとも１つのマーカーが、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子に対応する核酸およびタンパク質からなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記少なくとも１つの特徴が、大きさ、配列、組成、活性、および量からなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記患者試料が、非小細胞肺癌細胞および結腸癌細胞からなる群から選択される腫瘍細胞を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記少なくとも１つの特徴が配列である、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記少なくとも１つのマーカーが核酸である、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
前記核酸が、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｃＤＮＡからなる群から選択されるか、または前記ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｃＤＮＡのうちのいずれかの一部であり、前記一部が、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子の少なくとも１つの変異部位を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記核酸が、コドン１２、コドン１３、およびコドン６１からなる群から選択される配列番号２のコドン、またはその変異形、またはその相補体を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記少なくとも１つのマーカーが少なくとも２つのマーカーである、項目１９に記載の方法。
（項目２８）
前記少なくとも１つのマーカー遺伝子が少なくとも２つのマーカー遺伝子である、項目１９に記載の方法。
（項目２９）
前記少なくとも２つのマーカー遺伝子が、少なくともＫＲＡＳおよびＧＬＵＴ４を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
ＧＬＵＴ４の前記少なくとも１つの特徴が量である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
ＧＬＵＴ４の前記量が標準以下である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記試料が腫瘍浸出液を含む、項目１９に記載の方法。
（項目３３）
腫瘍細胞の前記試料を富化するステップをさらに含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記プロテアソーム阻害剤が、ペプチジルボロン酸およびペプチジルエポキシケトンからなる群から選択される、項目１６〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記ペプチジルボロン酸が、ボルテゾミブ、クエン酸イクサゾミブ、および［（１Ｒ）−１−［［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［（６−フェニル−ピリジン−２−カルボニル）アミノ］−１−オキソ−ブチル］アミノ］−３−メチルブチル］ボロン酸からなる群から選択される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
腫瘍細胞を含む試料に添加する安定剤と、試料中の少なくとも１つのマーカーの少なくとも１つの特徴を測定する試薬と、を含む、キットであって、前記測定の結果が、少なくとも１つのマーカー遺伝子に変異が存在するかを示し、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子がＫＲＡＳである、前記キット。
（項目３７）
前記少なくとも１つのマーカーが核酸である、項目３６に記載のキット。
（項目３８）
前記試薬がプライマーである、項目３７に記載のキット。
（項目３９）
前記プライマーが、配列番号１、２、４、５からなる群から選択される核酸配列、１１５２４７０８５と１１５２５９５１５の塩基対の染色体１ｐの配列、２５３５８１８０と２５４０３８５４の塩基対の染色体１２ｐの配列、および前記配列のうちのいずれかの相補体にハイブリダイズする、項目３８に記載のキット。
（項目４０）
第２のプライマーをさらに含む、項目３８に記載のキット。
（項目４１）
プローブをさらに含む、項目３８に記載のキット。
（項目４２）
前記安定剤がＲＮＡ安定剤である、項目３６〜４１のいずれか１項に記載のキット。
（項目４３）
前記少なくとも１つのマーカーがタンパク質であり、前記試薬が抗体である、項目３６に記載のキット。
（項目４４）
前記抗体がＧＬＵＴ４に結合する、項目４３に記載のキット。
（項目４５）
試料中の少なくとも２つのマーカーの少なくとも１つの特徴を測定する少なくとも２つの試薬を含むキットであって、前記測定の結果が、少なくとも１つのマーカー遺伝子に変異が存在するかを示し、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子がＫＲＡＳであり、前記試料が、肺腫瘍細胞および結腸腫瘍細胞からなる群から選択される固形腫瘍細胞を含む、前記キット。
（項目４６）
少なくとも１つのマーカー遺伝子が少なくとも２つのマーカー遺伝子である、項目４５に記載のキット。
（項目４７）
前記少なくとも２つのマーカー遺伝子がＫＲＡＳおよびＧＬＵＴ４を含む、項目４６に記載のキット。
（項目４８）
少なくとも１つの試薬が少なくとも２つの試薬である、項目４７に記載のキット。
（項目４９）
少なくとも２つの試薬が抗体を含む、項目４８に記載のキット。
（項目５０）
前記抗体がＧＬＵＴ４に結合する、項目４９に記載のキット。
（項目５１）
前記試料に添加する安定剤をさらに含む、項目４５〜５０のいずれか１項に記載のキット。
（項目５２）
固形腫瘍細胞のプロテアソーム阻害剤への感受性を予測するための方法であって、
ａ）前記細胞が変異ＫＲＡＳを発現するかを判定することと、
ｂ）前記細胞のプロテアソーム阻害剤への感受性を予測することと、を含み、
変異ＫＲＡＳの発現が前記プロテアソーム阻害剤への感受性不足を予測し、前記固形腫瘍細胞が、肺腫瘍細胞および結腸腫瘍細胞からなる群から選択される、前記方法。
（項目５３）
ＧＬＵＴ４が過剰発現されるかを判定することをさらに含み、ＧＬＵＴ４の過剰発現が前記プロテアソーム阻害剤への感受性不足を予測する、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
野生型ＫＲＡＳ状態を含む固形腫瘍を有する患者を治療するための方法であって、前記患者に治療的に有効な量のプロテアソーム阻害剤を投与するステップを含み、前記固形腫瘍が、肺腫瘍および結腸腫瘍からなる群から選択される、前記方法。
（項目５５）
前記プロテアソーム阻害剤が、ペプチジルボロン酸およびペプチジルエポキシケトンからなる群から選択される、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記ペプチジルボロン酸が、ボルテゾミブ、クエン酸イクサゾミブ、および［（１Ｒ）−１−［［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［（６−フェニル−ピリジン−２−カルボニル）アミノ］−１−オキソ−ブチル］アミノ］−３−メチルブチル］ボロン酸からなる群から選択される、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
プロテアソーム阻害剤を非血液学的癌を有する患者の治療における使用に好適であると特定するための方法であって、
ａ）少なくとも１つのマーカー遺伝子に少なくとも１つの変異を含む異種移植片中の腫瘍細胞を試験プロテアソーム阻害剤と接触させることであって、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子がＫＲＡＳである、前記接触させることと、
ｂ）前記試験プロテアソーム阻害剤の前記細胞の生存率への影響を判定することと、
ｃ）前記試験プロテアソーム阻害剤が前記細胞の前記生存率を低下させる場合に、非血液学的癌を有する患者の治療における使用に好適であると決定することと、を含む、前記方法。
（項目５８）
ＫＲＡＳにおける前記変異が、コドン１２、コドン１３、およびコドン６１からなる群から選択される配列番号２のコドンに存在する、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記試験プロテアソーム阻害剤がＧＬＵＴ４の前記発現を減少させる場合に、非血液学的癌を有する患者の治療における使用に好適であると決定するステップをさらに含む、項目５７に記載の方法。
（項目６０）
プロテアソーム阻害剤での癌の治療代を支払うための方法であって、
ａ）肺癌または結腸癌を有する患者由来の固形腫瘍細胞を含む試料中のＫＲＡＳが変異したかを記録することと、
ｂ）ＫＲＡＳが野生型である場合に、前記プロテアソーム阻害剤での治療の支払いを許可することと、を含む、前記方法。
（項目６１）
前記プロテアソーム阻害剤が、ペプチジルボロン酸およびペプチジルエポキシケトンからなる群から選択される、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記ペプチジルボロン酸が、ボルテゾミブ、クエン酸イクサゾミブ、および［（１Ｒ）−１−［［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［（６−フェニル−ピリジン−２−カルボニル）アミノ］−１−オキソ−ブチル］アミノ］−３−メチルブチル］ボロン酸からなる群から選択される、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
プロテアソーム阻害剤での治療に応答しないであろう非血液学的癌患者を特定する方法であって、肺癌および結腸癌からなる群から選択される非血液学的癌を有する前記患者由来の腫瘍細胞を含む試料における少なくとも１つのＫＲＡＳ変異の存在または不在を決定することを含み、それによって少なくとも１つのＫＲＡＳ変異の存在が、前記患者が前記プロテアソーム阻害剤に応答しないであろうことを示す、前記方法。
（項目６４）
前記少なくとも１つのＫＲＡＳ変異が活性化変異である、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
少なくとも１つのＫＲＡＳ変異の存在または不在が、前記変異を含む疑いのあるマーカーまたはマーカーの一部を配列決定することによって決定される、項目６３に記載の方法。
（項目６６）
前記マーカーまたは一部が、コドン１２、コドン１３、またはコドン６１を含む配列番号２またはその一部を含む、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記プロテアソーム阻害剤が、ペプチジルボロン酸およびペプチジルエポキシケトンからなる群から選択される、項目６３〜６６のいずれか１項に記載の方法。
（項目６８）
前記ペプチジルボロン酸が、ボルテゾミブ、クエン酸イクサゾミブ、および［（１Ｒ）−１−［［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［（６−フェニル−ピリジン−２−カルボニル）アミノ］−１−オキソ−ブチル］アミノ］−３−メチルブチル］ボロン酸からなる群から選択される、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
プロテアソーム阻害剤での治療に対して好ましい成果を有するであろう非血液学的癌患者を特定する方法であって、肺癌および結腸癌からなる群から選択される非血液学的癌を有する前記患者由来の腫瘍細胞を含む試料における少なくとも１つのＫＲＡＳ変異の存在または不在を決定することを含み、それによって野生型ＫＲＡＳまたはコドン１４６における変異の存在が、前記患者が前記プロテアソーム阻害剤に応答するであろうことを示す、前記方法。
（項目７０）
少なくとも１つのＫＲＡＳ変異の存在または不在が、前記変異を含む疑いのあるマーカーまたはマーカーの一部を配列決定することによって決定される、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記マーカーまたは一部が、コドン１２、コドン１３、コドン６１、またはコドン１４６を含む配列番号２またはその一部を含む、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記プロテアソーム阻害剤が、ペプチジルボロン酸およびペプチジルエポキシケトンからなる群から選択される、項目６９〜７１のいずれか１項に記載の方法。
（項目７３）
前記ペプチジルボロン酸が、ボルテゾミブ、クエン酸イクサゾミブ、および［（１Ｒ）−１−［［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［（６−フェニル−ピリジン−２−カルボニル）アミノ］−１−オキソ−ブチル］アミノ］−３−メチルブチル］ボロン酸からなる群から選択される、項目７２に記載の方法。
【国際調査報告】
2014533112.tif 000028
2014533112.tif 000029
2014533112.tif 000030
2014533112.tif 000031
2014533112.tif 000032