(57)【要約】  Ａ群連鎖球菌（ＧＡＳ）に対して特異的に免疫応答を誘発するのに有用な免疫原性組成物を提供する。本発明により提供される免疫原性組成物は多価であり、ＧＡＳに対して免疫応答を誘発する複数の免疫原性ペプチド、或いは免疫原性ペプチドを含む融合ポリペプチドを含む。本発明により提供される免疫原性組成物は、免疫原性組成物に含まれる（Ｍタンパク質又はSpaタンパク質に由来する）免疫原性ペプチドにより表されるＧＡＳ血清型に対して免疫応答を誘発すると共に、免疫原性組成物に含まれる何れの免疫原性ペプチドにも表されない血清型に対しても免疫応答を誘発する。斯かる組成物を用いて、ＧＡＳに対する免疫応答を誘発し、或いはＧＡＳ感染を治療し、又はその発生確率を低減する方法も提供される。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３１の免疫原性ペプチドを含む免疫原性組成物であって、各免疫原性ペプチドは相違すると共に、異なるＭタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含み、異なるＭタンパク質は各々独立に、Ａ群連鎖球菌（Ａ群連鎖球菌（group A Streptococcus）：ＧＡＳ）血清型１、２、３、４、５、６、１１、１２、１４、１８、１９、２２、２４、２８、２９、４４、４９、５８、７３、７５、７７、７８、８１、８２、８３、８７、８９、９２、１１４、及び１１８のＭタンパク質から選択され、Spaタンパク質はＧＡＳ血清型１８から選択され、且つ、当該免疫原性組成物はＧＡＳに対する免疫応答を誘導する、免疫原性組成物。
【請求項２】
前記異なる免疫原性ペプチドのうち少なくとも４つが、タンデムに連結されて融合ポリペプチドを形成する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記免疫原性組成物が第１の融合ポリペプチド、第２の融合ポリペプチド、第３の融合ポリペプチド、及び第４の融合ポリペプチドを含み、これらの融合ポリペプチドは各々、タンデムに連結された少なくとも６つの前記異なる免疫原性ペプチドを含む、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記第１の融合ポリペプチドは、タンデムに連結された８つの前記異なる免疫原性ペプチドを含み、前記８つの免疫原性ペプチドが各々、異なるＭタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含み、異なるＭタンパク質は各々独立に、ＧＡＳ血清型１、２、３、６、１２、１８、及び２８のＭタンパク質から選択され、Spaタンパク質はＧＡＳ血清型１８から選択される、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記第１の融合ポリペプチドのカルボキシ末端に位置する免疫原性ペプチドが、前記第１の融合ポリペプチドのアミノ末端に位置する免疫原性ペプチドの複製である、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記複製される免疫原性ペプチドが、ＧＡＳ血清型１のＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記第２の融合ポリペプチドが、タンデムに連結された前記異なる免疫原性ペプチドを８つ含み、ここで前記８つの免疫原性ペプチドの各々が、ＧＡＳ血清型４、５、１１、１４、１９、２４、２９、及び７５のＭタンパク質から独立に選択される異なるＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記第２の融合ポリペプチドのカルボキシ末端に位置する免疫原性ペプチドが、前記第２の融合ポリペプチドのアミノ末端に位置する免疫原性ペプチドの複製である、請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記複製される免疫原性ペプチドが、ＧＡＳ血清型４のＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む、請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記第３の融合ポリペプチドが、タンデムに連結された前記異なる免疫原性ペプチドを８つ含み、ここで前記８つの免疫原性ペプチドの各々が、ＧＡＳ血清型２２、４４、５８、７３、７７、７８、８９、及び１１８のＭタンパク質から独立に選択される異なるＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記第３の融合ポリペプチドのカルボキシ末端に位置する免疫原性ペプチドが、前記第３の融合ポリペプチドのアミノ末端に位置する免疫原性ペプチドの複製である、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記複製される免疫原性ペプチドが、ＧＡＳ血清型７７のＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記第４の融合ポリペプチドが、タンデムに連結された前記異なる免疫原性ペプチドを７つ含み、ここで前記７つの免疫原性ペプチドの各々が、ＧＡＳ血清型４９、８１、８２、８３、８７、９２、及び１１４のＭタンパク質から独立に選択される異なるＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記第４の融合ポリペプチドのカルボキシ末端に位置する免疫原性ペプチドが、前記第４の融合ポリペプチドのアミノ末端に位置する免疫原性ペプチドの複製である、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記複製される免疫原性ペプチドが、ＧＡＳ血清型８３のＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む、請求項１４に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記免疫原性ペプチドの各々が、（ａ）前記異なるＭタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を二重に；（ｂ）前記異なるＭタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも４０のアミノ酸；（ｂ）前記異なるＭタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも４５のアミノ酸；又は、（ｄ）前記異なるＭタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも５０のアミノ酸を含む、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
（a）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド；
（b）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド；
（c）配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む第３の融合ポリペプチド；及び
（d）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む第４の融合ポリペプチド
を含む免疫原性組成物であって、Ａ群連鎖球菌（group A Streptococcus）に対する免疫応答を誘発する免疫原性組成物。
【請求項１８】
（ａ）前記第１の融合ポリペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み；（ｂ）前記第２の融合ポリペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み；（ｃ）前記第３の融合ポリペプチドが、配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み；（ｄ）前記第４の融合ポリペプチドが、配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
（ａ）前記第１の融合ポリペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み；（ｂ）前記第２の融合ポリペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み；（ｃ）前記第３の融合ポリペプチドが、配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み；（ｄ）前記第４の融合ポリペプチドが、配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
（ａ）前記第１の融合ポリペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列を含み；（ｂ）前記第２の融合ポリペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列を含み；（ｃ）前記第３の融合ポリペプチドが、配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列を含み；（ｄ）前記第４の融合ポリペプチドが、配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
（ａ）前記第１の融合ポリペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み；（ｂ）前記第２の融合ポリペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み；（ｃ）前記第３の融合ポリペプチドが、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含み；（ｄ）前記第４の融合ポリペプチドが、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
医薬的に許容可能な賦形剤を更に含む、請求項１、２、及び１７の何れか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
医薬的に許容可能なアジュバントを更に含む、請求項１、２、及び１７の何れか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
Ａ群連鎖球菌（group A Streptococcus）に対する免疫応答が、ＧＡＳ１、２、３、４、５、６、１１、１２、１４、１８、１９、２２、２４、２８、２９、４４、４９、５８、７３、７５、７７、７８、８１、８２、８３、８７、８９、９２、１１４、及び１１８血清型のうち少なくとも何れかに対する免疫応答を含む、請求項１、２、及び１７の何れか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
対象においてＡ群連鎖球菌（group A Streptococcus）に対する免疫応答を誘発する方法であって、請求項１、２、及び１７の何れか一項に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項２６】
対象においてＡ群連鎖球菌（group A Streptococcus）感染が生じる可能性を低減する方法であって、請求項１、２、及び１７の何れか一項に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項２７】
対象においてＡ群連鎖球菌（group A Streptococcus）感染を予防又は治療する方法であって、請求項１、２、及び１７の何れか一項に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項２８】
Ａ群連鎖球菌（group A Streptococcus）感染を予防又は治療するために使用される、請求項１、２、及び１７の何れか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９】
Ａ群連鎖球菌（group A Streptococcus）感染を予防又は治療するためのワクチンの製造のための、請求項１、２、及び１７の何れか一項に記載の免疫原性組成物の使用。
【請求項３０】
Ａ群連鎖球菌（group A Streptococcus）感染を予防又は治療するための、請求項１、２、及び１７の何れか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３１】
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列；又は
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列
を含む融合ポリペプチドであって、
Ａ群連鎖球菌（group A Streptococcus）に対する免疫応答を誘発する融合ポリペプチド。
【請求項３２】
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列；又は
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列
を含む、請求項３１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３３】
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列；又は
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列
を含む、請求項３１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３４】
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列；又は
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列
を含む、請求項３１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３５】
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列；又は
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列
を含む、請求項３１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３６】
請求項３１〜３５の何れか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項３７】
請求項３６の単離ポリヌクレオチドと作動式に連結された少なくとも１つの発現調節領域を含む組換発現ベクター。
【請求項３８】
請求項３７の組換発現ベクターでトランスフェクト、形質導入（transduced）又は形質転換（transformed）された単離宿主細胞。
【請求項３９】
融合ポリペプチドを製造する方法であって：
（ａ）請求項３８の単離宿主細胞を培養し；
（ｂ）宿主細胞の培養物から融合ポリペプチドを単離する
ことを含む方法。
【請求項４０】
請求項３１〜３５の何れか一項に記載の融合ポリペプチドに特異的に結合する抗体を、当該抗体を含む可能性がある生物学的試料において検出する方法であって：
（ａ）生物学的試料を、
（ｉ）Ｍタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチドであって、ここでＭタンパク質は、Ａ群連鎖球菌（group A Streptococcus）：ＧＡＳ）血清型１、２、３、４、５、６、１１、１２、１４、１８、１９、２２、２４、２８、２９、４４、４９、５８、７３、７５、７７、７８、８１、８２、８３、８７、８９、９２、１１４、及び１１８のＭタンパク質から選択され、Spaタンパク質はＧＡＳ血清型１８から選択される、免疫原性ペプチド；
（ii）二量体ペプチドであって、前記二量体ペプチドの各ペプチドは相違すると共に、異なるＭタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含み、前記異なるＭタンパク質は各々独立に、Ａ群連鎖球菌（Ａ群連鎖球菌（group A Streptococcus）：ＧＡＳ）血清型１、２、３、４、５、６、１１、１２、１４、１８、１９、２２、２４、２８、２９、４４、４９、５８、７３、７５、７７、７８、８１、８２、８３、８７、８９、９２、１１４、及び１１８のＭタンパク質から選択され、前記Spaタンパク質はＧＡＳ血清型１８から選択される、二量体ペプチド；又は
（iii）請求項３１〜３５の何れか一項に記載の融合ポリペプチド
の何れかと接触させ；
（ｂ）当該免疫原性ペプチド、二量体ペプチド、又は融合ポリペプチドと、生物学的試料との特異的結合を検出し、これにより生物学的試料が抗体を含むことが示される、
ことを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は35U.S.C.§119(e)の下、米国仮特許出願第61／498,397号（2011年6月17日出願）及び米国仮特許出願第61／641,448号（2012年5月2日）に基づく優先権を主張する。これらの出願はその全体が援用により本願明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府利益の宣言
本発明は国立衛生研究所の許可番号AI−010085、AI−060592及び5T35DK007405の下、政府支援により為されたものである。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
配列表に関する宣言
本願に関する配列表は紙コピーではなくテキスト形態で提供され、援用により本願明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイル名は920098_414PC_SEQUENCE_LISTING.txtである。本テキストファイルは93KBであり、2012年6月14日に作成され、EFS-Webを介して電子的に提出される。
【０００４】
技術分野
Ａ群連鎖球菌（group A streptococcal：ＧＡＳ）感染を予防するための安全且つ効果的なワクチンが求められている。本明細書において、多価ワクチンとは、複数のＧＡＳ血清型に対して免疫応答を誘発し、それを必要とする対象を免疫化するのに有用なワクチンを言う。
【背景技術】
【０００５】
Ａ群連鎖球菌（group A streptococcus：ＧＡＳ）感染を予防するための安全且つ効果的なワクチンを開発する努力が、何十年にも亘って進められている。これまで多数のＧＡＳ抗原が潜在的なワクチン成分として特定されてきたが（例えばSteer et al, Curr. Opin. Infect. Dis. 22:544-52(2009) 等参照）、リード候補は表面Ｍタンパク質のアミノ末端領域を提示するタイプ特異的ペプチドである（例えばKotloff et al, JAMA 292:709-15 (2004); McNeil et al, Clin. Infect. Dis. 41:1114-22 (2005) 等参照）。
【０００６】
北米や欧州等の経済発展国や地域において疾患の大きな負担となっているのは、単純性咽頭炎及び重症侵襲的感染症である（例えばCarapetis et al, The Lancet Infectious Diseases 5:685-94 (2005)等参照）。ＧＡＳ感染の世界的負担が最も顕著なのは、急性リウマチ熱（acute rheumatic fever：ＡＲＦ）やリウマチ性心疾患（rheumatic heart disease：ＲＨＤ）が蔓延する貧困国である（例えば上記Carapetis et al.等参照）。Ｍタンパク質系ワクチンを用いたＡＲＦ誘発性感染のワクチン予防は、困難な課題だと考えられてきた。これは、発展途上国に存在するＧＡＳ ｅｍｍタイプが、世界の経済発展地域と比べて異なっているからである（例えばSteer et al., The Lancet Infectious Diseases 9:611-16 (2009)等参照）。26価Ｍタンパク質系ワクチンの免疫原性が、前臨床（例えば上記Hu et al等参照）及び臨床研究（例えば上記McNeil et al等参照）により報告されてきた。しかし、26価ワクチンでは、感染に対する保護を提供するための異なるＧＡＳ血清型の数が、発展途上国及び先進国の双方において、最適な効果を以って使用するのに十分であるとは言えない。従って、ＧＡＳ感染を治療及び予防するための、安価に製造可能な改良された治療薬及びワクチンの開発が求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
概説すると、本発明により提供されるのは、複数のＧＡＳ種に対して免疫応答を誘発することが可能な免疫原性ペプチド、融合ポリペプチド、並びに、これらの免疫原性ペプチド及び融合ポリペプチドを含む免疫原性組成物である。本明細書に記載の免疫原性組成物は、ＧＡＳ感染を予防又は治療するための従前報告されてきた免疫原性組成物に対して、著しく改善されたものである。斯かる免疫原性組成物の使用方法も提供される。斯かる免疫原性ペプチド、融合ポリペプチド、免疫原性組成物及び方法の種々の態様を以下に要約する。
【０００８】
態様１：少なくとも３１の免疫原性ペプチドを含む免疫原性組成物であって、各免疫原性ペプチドは相違すると共に、異なるＭタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含み、異なるＭタンパク質は各々独立に、Ａ群連鎖球菌（Ａ群連鎖球菌（group A Streptococcus）：ＧＡＳ）血清型１、２、３、４、５、６、１１、１２、１４、１８、１９、２２、２４、２８、２９、４４、４９、５８、７３、７５、７７、７８、８１、８２、８３、８７、８９、９２、１１４、及び１１８のＭタンパク質から選択され、Spaタンパク質はＧＡＳ血清型１８から選択され、且つ、当該免疫原性組成物はＧＡＳに対する免疫応答を誘導する、免疫原性組成物。
【０００９】
態様２：前記異なる免疫原性ペプチドのうち少なくとも４つが、タンデムに連結されて融合ポリペプチドを形成する、態様１に記載の免疫原性組成物。
【００１０】
態様３：前記免疫原性組成物が第１の融合ポリペプチド、第２の融合ポリペプチド、第３の融合ポリペプチド、及び第４の融合ポリペプチドを含み、これらの融合ポリペプチドは各々、タンデムに連結された少なくとも６つの前記異なる免疫原性ペプチドを含む、態様１又は２に記載の免疫原性組成物。
【００１１】
態様４：前記第１の融合ポリペプチドは、タンデムに連結された８つの前記異なる免疫原性ペプチドを含み、前記８つの免疫原性ペプチドが各々、異なるＭタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含み、異なるＭタンパク質は各々独立に、ＧＡＳ血清型１、２、３、６、１２、１８、及び２８のＭタンパク質から選択され、Spaタンパク質はＧＡＳ血清型１８から選択される、態様３に記載の免疫原性組成物。
【００１２】
態様５：前記第１の融合ポリペプチドのカルボキシ末端に位置する免疫原性ペプチドが、前記第１の融合ポリペプチドのアミノ末端に位置する免疫原性ペプチドの複製である、態様４に記載の免疫原性組成物。
【００１３】
態様６：前記複製される免疫原性ペプチドが、ＧＡＳ血清型１のＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む、態様５に記載の免疫原性組成物。
【００１４】
態様７：前記第２の融合ポリペプチドが、タンデムに連結された前記異なる免疫原性ペプチドを８つ含み、ここで前記８つの免疫原性ペプチドの各々が、ＧＡＳ血清型４、５、１１、１４、１９、２４、２９、及び７５のＭタンパク質から独立に選択される異なるＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む、態様３に記載の免疫原性組成物。
【００１５】
態様８：前記第２の融合ポリペプチドのカルボキシ末端に位置する免疫原性ペプチドが、前記第２の融合ポリペプチドのアミノ末端に位置する免疫原性ペプチドの複製である、態様７に記載の免疫原性組成物。
【００１６】
態様９：前記複製される免疫原性ペプチドが、ＧＡＳ血清型４のＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む、態様８に記載の免疫原性組成物。
【００１７】
態様１０：前記第３の融合ポリペプチドが、タンデムに連結された前記異なる免疫原性ペプチドを８つ含み、ここで前記８つの免疫原性ペプチドの各々が、ＧＡＳ血清型２２、４４、５８、７３、７７、７８、８９、及び１１８のＭタンパク質から独立に選択される異なるＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む、態様３に記載の免疫原性組成物。
【００１８】
態様１１：前記第３の融合ポリペプチドのカルボキシ末端に位置する免疫原性ペプチドが、前記第３の融合ポリペプチドのアミノ末端に位置する免疫原性ペプチドの複製である、態様１０に記載の免疫原性組成物。
【００１９】
態様１２：前記複製される免疫原性ペプチドが、ＧＡＳ血清型７７のＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む、態様１１に記載の免疫原性組成物。
【００２０】
態様１３：前記第４の融合ポリペプチドが、タンデムに連結された前記異なる免疫原性ペプチドを７つ含み、ここで前記７つの免疫原性ペプチドの各々が、ＧＡＳ血清型４９、８１、８２、８３、８７、９２、及び１１４のＭタンパク質から独立に選択される異なるＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む、態様３に記載の免疫原性組成物。
【００２１】
態様１４：前記第４の融合ポリペプチドのカルボキシ末端に位置する免疫原性ペプチドが、前記第４の融合ポリペプチドのアミノ末端に位置する免疫原性ペプチドの複製である、態様１３に記載の免疫原性組成物。
【００２２】
態様１５：前記複製される免疫原性ペプチドが、ＧＡＳ血清型８３のＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む、態様１４に記載の免疫原性組成物。
【００２３】
態様１６：前記免疫原性ペプチドの各々が、（ａ）前記異なるＭタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を二重に；（ｂ）前記異なるＭタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも４０のアミノ酸；（ｂ）前記異なるＭタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも４５のアミノ酸；又は、（ｄ）前記異なるＭタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも５０のアミノ酸を含む、態様１又は２に記載の免疫原性組成物。
【００２４】
態様１７：（a）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド；
（b）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド；
（c）配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む第３の融合ポリペプチド；及び
（d）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む第４の融合ポリペプチド
を含む免疫原性組成物であって、Ａ群連鎖球菌（group A Streptococcus）に対する免疫応答を誘発する免疫原性組成物。
【００２５】
態様１８：（ａ）前記第１の融合ポリペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み；（ｂ）前記第２の融合ポリペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み；（ｃ）前記第３の融合ポリペプチドが、配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み；（ｄ）前記第４の融合ポリペプチドが、配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、態様１７に記載の免疫原性組成物。
【００２６】
態様１９：（ａ）前記第１の融合ポリペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み；（ｂ）前記第２の融合ポリペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み；（ｃ）前記第３の融合ポリペプチドが、配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み；（ｄ）前記第４の融合ポリペプチドが、配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、態様１７に記載の免疫原性組成物。
【００２７】
態様２０：（ａ）前記第１の融合ポリペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列を含み；（ｂ）前記第２の融合ポリペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列を含み；（ｃ）前記第３の融合ポリペプチドが、配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列を含み；（ｄ）前記第４の融合ポリペプチドが、配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列を含む、態様１７に記載の免疫原性組成物。
【００２８】
態様２１：（ａ）前記第１の融合ポリペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み；（ｂ）前記第２の融合ポリペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み；（ｃ）前記第３の融合ポリペプチドが、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含み；（ｄ）前記第４の融合ポリペプチドが、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、態様１７に記載の免疫原性組成物。
【００２９】
態様２２：医薬的に許容可能な賦形剤を更に含む、態様１、２、及び１７の何れか一項に記載の免疫原性組成物。
【００３０】
態様２３：医薬的に許容可能なアジュバントを更に含む、態様１、２、及び１７の何れか一項に記載の免疫原性組成物。
【００３１】
態様２４：Ａ群連鎖球菌（group A Streptococcus）に対する免疫応答が、ＧＡＳ１、２、３、４、５、６、１１、１２、１４、１８、１９、２２、２４、２８、２９、４４、４９、５８、７３、７５、７７、７８、８１、８２、８３、８７、８９、９２、１１４、及び１１８血清型のうち少なくとも何れかに対する免疫応答を含む、態様１、２、及び１７の何れか一項に記載の免疫原性組成物。
【００３２】
態様２５：対象においてＡ群連鎖球菌（group A Streptococcus）に対する免疫応答を誘発する方法であって、態様１、２、及び１７の何れか一項に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む方法。
【００３３】
態様２６：対象においてＡ群連鎖球菌（group A Streptococcus）感染が生じる可能性を低減する方法であって、態様１、２、及び１７の何れか一項に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む方法。
【００３４】
態様２７：対象においてＡ群連鎖球菌（group A Streptococcus）感染を予防又は治療する方法であって、態様１、２、及び１７の何れか一項に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む方法。
【００３５】
態様２８：Ａ群連鎖球菌（group A Streptococcus）感染を予防又は治療するために使用される、態様１、２、及び１７の何れか一項に記載の免疫原性組成物。
【００３６】
態様２９：Ａ群連鎖球菌（group A Streptococcus）感染を予防又は治療するためのワクチンの製造のための、態様１、２、及び１７の何れか一項に記載の免疫原性組成物の使用。
【００３７】
態様３０：Ａ群連鎖球菌（group A Streptococcus）感染を予防又は治療するための、態様１、２、及び１７の何れか一項に記載の免疫原性組成物。
【００３８】
態様３１：（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列；又は
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列
を含む融合ポリペプチドであって、
Ａ群連鎖球菌（group A Streptococcus）に対する免疫応答を誘発する融合ポリペプチド。
【００３９】
態様３２：（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列；又は
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列
を含む、態様３１に記載の融合ポリペプチド。
【００４０】
態様３３：（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列；又は
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列
を含む、態様３１に記載の融合ポリペプチド。
【００４１】
態様３４：（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列；又は
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列
を含む、態様３１に記載の融合ポリペプチド。
【００４２】
態様３５：（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列；又は
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列
を含む、態様３１に記載の融合ポリペプチド。
【００４３】
態様３６：態様３１〜３５の何れか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【００４４】
態様３７：態様３６の単離ポリヌクレオチドと作動式に連結された少なくとも１つの発現調節領域を含む組換発現ベクター。
【００４５】
態様３８：態様３７の組換発現ベクターでトランスフェクト、形質導入（transduced）又は形質転換（transformed）された単離宿主細胞。
【００４６】
態様３９：融合ポリペプチドを製造する方法であって：
（ａ）態様３８の単離宿主細胞を培養し；
（ｂ）宿主細胞の培養物から融合ポリペプチドを単離する
ことを含む方法。
【００４７】
態様４０：態様３１〜３５の何れか一項に記載の融合ポリペプチドに特異的に結合する抗体を、当該抗体を含む可能性がある生物学的試料において検出する方法であって：
（ａ）生物学的試料を、
（ｉ）Ｍタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチドであって、ここでＭタンパク質は、Ａ群連鎖球菌（group A Streptococcus）：ＧＡＳ）血清型１、２、３、４、５、６、１１、１２、１４、１８、１９、２２、２４、２８、２９、４４、４９、５８、７３、７５、７７、７８、８１、８２、８３、８７、８９、９２、１１４、及び１１８のＭタンパク質から選択され、Spaタンパク質はＧＡＳ血清型１８から選択される、免疫原性ペプチド；
（ii）二量体ペプチドであって、前記二量体ペプチドの各ペプチドは相違すると共に、異なるＭタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含み、前記異なるＭタンパク質は各々独立に、Ａ群連鎖球菌（Ａ群連鎖球菌（group A Streptococcus）：ＧＡＳ）血清型１、２、３、４、５、６、１１、１２、１４、１８、１９、２２、２４、２８、２９、４４、４９、５８、７３、７５、７７、７８、８１、８２、８３、８７、８９、９２、１１４、及び１１８のＭタンパク質から選択され、前記Spaタンパク質はＧＡＳ血清型１８から選択される、二量体ペプチド；又は
（iii）態様３１〜３５の何れか一項に記載の融合ポリペプチド
の何れかと接触させ；
（ｂ）当該免疫原性ペプチド、二量体ペプチド、又は融合ポリペプチドと、生物学的試料との特異的結合を検出し、これにより生物学的試料が抗体を含むことが示される、
ことを含む方法。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、３０価のＭタンパク質に基づくＧＡＳ免疫原性組成物を含む４つのタンパク質の略図を示す。
【００４９】
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｈは、４つの合成ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（図２Ａ（配列番号１７）；２Ｃ（配列番号１８）；２Ｅ（配列番号１９）；及び２Ｇ（配列番号２０））と、コードされる成分組換えポリペプチドの各々のアミノ酸配列（図２Ｂ（配列番号９）；２Ｄ（配列番号１０）；２Ｆ（配列番号１１）；及び２Ｈ（配列番号１２））を示す。各ポリヌクレオチドは、上流のＴ７プロモーター、リボゾーム結合部位、開始コドン（太字のＡＴＧ、図２Ａ、２Ｃ、２Ｅ、２Ｇの各々の１０８位で開始される）、３’ポリヒスチジンモチーフ、及び終止コドンを含むように合成された。
【図２Ｂ】同上。
【図２Ｃ】同上。
【図２Ｄ】同上。
【図２Ｅ】同上。
【図２Ｆ】同上。
【図２Ｇ】同上。
【図２Ｈ】同上。
【００５０】
【図３】図３は、本明細書に記載の３０価の免疫原性組成物で免疫したウサギにおける、抗体力価レベルの用量応答を示す。
【００５１】
【図４】図４Ａ〜Ｂは、８００μｇの３０価のＧＡＳ免疫原性組成物の３回の投与で免疫した後の、３羽のウサギで誘発した幾何平均抗体レベル（Ｌｏｇ2）を示す。固相結合抗原は、組換え二量体ペプチド又は合成ペプチド（Ｍ４４、Ｍ７８、Ｍ１１８、Ｍ８３、Ｍ８１、Ｍ８７、Ｍ４９）を使用し、これらは、３０価のＧＡＳ免疫原性組成物で使用した各ペプチドと同じアミノ酸配列を有した。図４Ｂは、３０価のＭタンパク質に基づくＧＡＳ免疫原性組成物により誘発された細菌の抗体レベルのグラフを示す。８００μｇ用量の免疫原性組成物で免疫したウサギの１羽からの免疫血清が、免疫原性組成物中のＧＡＳのすべての血清型に対して、殺菌活性アッセイで使用された。死滅パーセントは、実施例に記載のように計算された。
【００５２】
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｂは、３０価の免疫原性組成物中のＧＡＳペプチドでは示されないＧＡＳの血清型に対する、３０価の免疫原性組成物により誘発された殺菌性抗体のレベルを示す。
【図５Ｂ】同上。
【００５３】
【図６】図６は、３０価の免疫原性組成物に誘発された交差オプソニン性殺菌性抗体と、２６価ワクチン（例えば、Hu et al., 前出；米国特許第７，２７０，８２７号を参照）により誘発された交差オプソニン性殺菌性抗体との比較を示す。融合ポリペプチド構築体にいずれによっても示されなかった１０の血清型に対して、３０価の免疫原性組成物により促進される殺菌性のレベルは、２６価ワクチンで観察された殺菌性より有意に大きかった（平均６４．９％対２３．６％、ｐ＝０．０００８、スチューデントｔ検定、対応のある両側検定）。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本明細書と添付の特許請求の範囲において、単数形の「１つ（a）」、「１つ（an）」、及び「それ（the）」は、特に別に明示的に示さない場合は、複数形を含む。すなわち、例えば「１つの（a）ポリペプチド」は、１つ又はそれ以上のポリペプチド、すなわち複数のそのようなポリペプチドをいい、「１つの（a）細胞」又は「その（the）細胞」は、１つ又はそれ以上の細胞、及び当業者に公知のその同等物（例えば、複数の細胞）への言及などを含む。同様に、「１つの（a）組成物」への言及は、特に別に明示的に示さない場合は、複数のそのような組成物を含み、１つ又はそれ以上の組成物をいう。ある方法の工程が記載又は特許請求される時、及びそれらの工程が特定の順序で起きると記載されている時、第１の工程が第２の工程「以前に」（すなわち、前に）起きる（又は、行われる）という記載は、第２の工程が第１の工程の「次に」起きる（又は、行われる）と書き換えても、同じ意味を有する。ある数値又は数値範囲について言及する時の用語「約」は、言及されるその数値又は数値範囲が、実験的変動の範囲内（又は、統計的な実験的誤差内）の近似値であり、従ってその数値又は数値範囲が、記載の数値又は数値範囲がの１％〜１５％の間で変動し得ることを意味する。用語「含む（comprising）」（及び、関連する用語である、「含む（comprise）」又は「含む（comprises）」又は「有する」又は「含む（including」）は、他のいくつかの態様を排除することを意図するものではなく、例えば、本明細書に記載のある組成物、方法、又はプロセスなどの態様は、記載された特徴「からなる」か又は「から基本的になる」。
【００５５】
本明細書において用語「単離された」は、ある物質が、その元々の環境（すなわち、天然に存在する場合は、天然の環境）から分離されることを意味する。例えば、生きた動物中に存在する天然に存在する核酸又はポリペプチドは単離されていないが、天然の系で同時に存在する物質の一部又はすべてから分離されている同じ核酸又はポリペプチドは、単離されている。そのような核酸は、ベクターの一部でもよく、及び／又はそのような核酸もしくはポリペプチドは組成物の一部でもよいが、ベクター又は組成物は、核酸もしくはポリペプチドの天然の環境の一部ではないという点で、単離されている。用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡの一部を意味し、これは、コード領域の前及び後にある領域「リーダーとトレーラー」を、ならびに個々のコード部分（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を含む。アミノ酸は本明細書において１文字コードと３文字コードで示されるが、これらは当該分野の一般的な教科書の情報に従って理解されるものであり、従って当業者は周知している。本明細書において用語「融合ポリペプチド」は、「融合タンパク質」と同義に使用され、特に別に明示的に示さない場合は、これらの２つの用語が、区別可能な性質又は特性を有する分子を意味するものではない。
【００５６】
多くの株のＡ群連鎖球菌（group A Streptococcus：ＧＡＳ）に対する免疫応答を誘発（すなわち、誘導）することができ、かつ当該分野で既に記載されている免疫原性組成物に対して顕著な改良である免疫原性組成物が、本明細書に提供される。本明細書において、多価の免疫原性組成物中の、ＧＡＳ菌株から得られた免疫原性ペプチドの組合せは、この免疫原性ペプチドが誘導されたＧＡＳ菌株のみならず、この組成物中の免疫原性ペプチドでは示されないＧＡＳの複数の追加の菌株に対しても、免疫応答を誘発する。
【００５７】
Ａ群連鎖球菌（化膿性ブドウ球菌（Staphylococcus pyogenes））は、２つの主要な表面露出した抗食作用因子（カプセルとＭタンパク質）を有し、これらは、これらの細菌が宿主中にコロニー形成し生存することを可能にする。Ａ群連鎖球菌（ＧＡＳ）の細胞表面Ｍタンパク質は、この病原体の主要な毒性因子の１つである。emm遺伝子によりコードされるＭタンパク質は、細胞表面からαらせんコイルドコイル二量体として伸長し、ＧＡＳ細菌の表面上のフィブリルとして現れる。Ｍタンパク質は抗原性の多様な群を形成し、ＧＡＳ菌株は、Ｍタンパク質血清型に従って血清型分類されている。１２０を超えるＭタンパク質血清型が同定されており、一部の血清型では、サブタイプも同定されている。例えば、ＧＡＳ血清型３のＭタンパク質は、３．０、３．１、３．２などと呼ばれる関連する血清型を含む。Ｍタンパク質に対する抗体は、血液中に存在する食細胞によるオプソニン食作用を促進することができる。
【００５８】
本明細書に記載のように及び例として、北アメリカ、ヨーロッパ、及び開発途上国によく見られるＧＡＳ血清型のＭタンパク質から誘導される免疫原性ペプチドを含む３０価の免疫原性組成物（これはまた、本明細書と当該分野においてワクチンとも呼ばれる）が構築された。この組成物中に示される血清型の選択は、北アメリカとヨーロッパ（例えば、Shulman et al, Clin. Infect. Dis. 39:325-32 (2004)); Shulman et al, Clin. Infect. Dis. 4P:78-84 (2009); O'Loughlin et al, Clin. Infect. Dis. 45:853-62 (2007); Luca-Harari et al, J. Clin. Microbiol. 47: 1155-65 (2009)を参照）、及び一部の開発途上国（例えば、Steer et al.、前出）におけるＧＡＳ感染症の入手できる疫学と血清型の普及を基礎にした。これらの免疫原性組成物はまた、当該分野においてSpaと呼ばれるタンパク質からの免疫原性ペプチドを含有し、これは、２種以上のＧＡＳ血清型と交差反応する抗体を誘発する。例えば３０の異なるＭタンパク質ペプチド免疫原とSpaペプチド免疫原とを含む組成物のような、本明細書に記載の免疫原性組成物は、咽頭炎及び浸潤性ＧＡＳ感染症の疫学を充分に示している。
【００５９】
さらに、本明細書に記載の免疫原性組成物は、ＧＡＳ血清型４のＭタンパク質から誘導される免疫原性ペプチドを含む。ＧＡＳ血清型４は、北アメリカのＧＡＳ疾患の大部分と合併症のない咽頭炎の約９％、及びヨーロッパの侵襲性ＧＡＳ感染症の５％を引き起こす（例えば、Shulman et al, Clin. Infect. Dis. 2009, 前出; Luca-Harari et al、前出、を参照）。ＧＡＳ血清型４の細菌の細胞表面上に存在するＡｒｐ４と呼ぶＭタンパク質ファミリーのメンバー（例えば、Johnsson et al., J. Immunol. 153:3557-64 (1994)を参照）は、Ｍタンパク質ファミリーの他のメンバー（例えば、Husmann et al., Infect. Immun. 63:345-48 (1995)を参照）とは異なり、最初は、毒性又は食作用に対する耐性には必要無いと考えられた。さらなる実験により、免疫された宿主においてオプソニン性抗体を誘発するＡｒｐ４（Ｍ４）タンパク質のアミノ末端からの免疫原性ペプチドが同定された（例えば、Courtney et al、前出、を参照）。ＧＡＳ免疫原性組成物にＭ４免疫原性ペプチドを添加すると、そのような多価の免疫原性組成物が免疫応答を誘導するＧＡＳ菌株の数を、約７８％から９０％に上昇させることにより、合併症の無い及び合併症のある感染症に関して、多価ワクチンの有効性を改善させる。
【００６０】
Ｍタンパク質とは異なり、Spa（連鎖球菌防御性抗原）と呼ぶポリペプチドは、オプソニン性防御性抗体の産生を誘導するエピトープを含有する。Spaポリペプチドは、血清型特異性（例えば、ＧＡＳ血清型３６から単離されたSpaポリペプチド）の場合があり、一方、他のSpaポリペプチド（例えば、ＧＡＳ血清型１８から単離されたSpaポリペプチド）は、複数のＧＡＳ血清型に結合する抗体を誘発する。ＧＡＳ血清型１８のSpaポリペプチドは、血清型３と２８ならびに血清型１８に結合し、これらに対して防御性である抗体を誘導する（例えば、米国特許第７，０６３，８５０号；Ahmed et al, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 29:51-57 (2010) Epub 2009 Oct 29; McLellan et al, Infect. Immun. 69:2943-49 (2001); Dale et al, J. Clin. Invest. 103:1261-68 (1999)を参照）。
【００６１】
ある態様において、各々が、タンデムに連結された７又は８つのＧＡＳ Ｍタンパク質又はＧＡＳ Spaタンパク質免疫原性断片を含む４つの異なる融合タンパク質を含む免疫原性組成物が提供される。ある組成物の例はウサギにおいて免疫原性であり、この組成物中に含まれる免疫原性ペプチドで示されるすべての血清型のＧＡＳに対する殺菌性抗体を誘発した。さらに、予想外にかつ当該分野ですでに記載されている２６価の免疫原性組成物とは異なり、本明細書に記載の３０価の組成物例で免疫した動物から得られた抗血清は、そこからの免疫原性ペプチド断片が組成物中に含まれなかったＧＡＳ血清型（すなわち、非ワクチンＧＡＳ血清型、又は示されていないＧＡＳ血清型）に対して、高レベルの殺菌性抗体を含有した。従って、本明細書に記載の免疫原性組成物（例えば、３０価の免疫原性組成物）の効力の可能性は、サブユニットであるＭペプチドやSpaペプチドで示される血清型をはるかに超えるかも知れない。
【００６２】
免疫原性組成物
ある態様において、複数のＧＡＳ免疫原性ペプチドを含む免疫原性組成物が提供される。具体的態様において、免疫原性組成物は少なくとも３１の異なる免疫原性ペプチドを含む。各免疫原性ペプチドは、それぞれ、３１の異なるＧＡＳポリペプチドのアミノ（本明細書において及び当該分野において、ＮＨ2とも呼ばれる）末端に位置するアミノ酸配列を含む。具体的態様において、少なくとも３０の異なる免疫原性ペプチドの各々は、それぞれ、３０の異なるＧＡＳ血清型からの少なくとも３０のＭタンパク質のアミノ酸配列から誘導される。Ｍタンパク質の各々の免疫原性ペプチドは、Ｍタンパク質のアミノ末端部からの少なくとも２５の連続するアミノ酸を含む。本明細書に記載の組成物はまた、Spaポリペプチドのアミノ末端部からの少なくとも２５の連続するアミノ酸を含む免疫原性ペプチドも含み、これは、具体的態様において、ＧＡＳ血清型Ｍ１８菌株の細胞表面で発現され存在するSpaポリペプチドである。別の具体的態様において、複数の免疫原性ペプチド（例えば、ＧＡＳ Spaタンパク質のＧＡＳ Ｍタンパク質から誘導される少なくとも３１の異なる免疫原性ペプチド）を含む少なくとも４つの融合ポリペプチドを含む免疫原性組成物が提供される。
【００６３】
Ｍタンパク質のアミノ末端領域は、最大の殺菌（防御）活性を有する抗体を誘発し、ヒトの組織と交差反応する可能性が最も低いことが証明されている（例えば、Dale, Adv. Exp. Med. Biol. 609:53-63 (2008)を参照）。１つのアプローチは、Ａ群連鎖球菌の疫学的に重要な血清型に対するオプソニン性抗体を誘発するように設計された多価ワクチンと一緒にしたＭタンパク質ペプチドを含有する組換えハイブリッドタンパク質を構築することである（例えば、Dale, Inf. Dis. Clin. N. Amer. 13:227-43 (1999); Hu et al, Infect. Immun. 70:2171-77 (2002)を参照）。
【００６４】
本明細書に記載の抗ＧＡＳ免疫原性組成物は、既に記載されているワクチン組成物と比較して、大きな改良を提供する。ある態様において、Ｍタンパク質免疫原性ペプチドで示される各々のＧＡＳ血清型に対してのみではなく、重要なことに、多くの非ワクチン血清型（すなわち、Ｍタンパク質免疫原性ペプチドやSpa免疫原性ペプチドによる免疫原性組成物中で示されないＧＡＳ血清型）に対する免疫応答を誘発したＭタンパク質とSpaタンパク質の免疫原性ペプチドを含む３０価の免疫原性組成物が提供される。さらに、重要なことに、本明細書に記載の免疫原性組成物は、ＧＡＳ血清型４のＭタンパク質からの免疫原性ペプチドを含む（例えば、Courtney et al, Molec. Microbiol. 59:936-47 (2006)を参照）。ＧＡＳ血清型４は、北アメリカにおいて合併症の無い咽頭炎の約９％、及びヨーロッパの侵襲性ＧＡＳ感染症の５％を引き起こす（例えば、Shulman et al, Clin. Infect. Dis. 2009, 前出; Luca-Harari et al, J. Clin. Microbiol. 47: 1155-65 (2009)、前出、を参照）。従って、Ｍ４免疫原性ペプチドの導入は、多価ＧＡＳワクチンの効力を大幅に改善する。
【００６５】
本明細書に記載のＧＡＳ免疫原性ペプチドを含む免疫原性組成物は、ＧＡＳに対する免疫応答を、さらに詳しくは、ワクチン中に示されそこから免疫原性ペプチドが誘導されるＧＡＳ血清型の各々に対する免疫応答を誘発する。さらに、本明細書に記載の免疫原性組成物は、そこから免疫原性ペプチドが得られなかった、従って免疫原性組成物中に含まれていなかったＧＡＳ血清型（本明細書において、非ウイルスＧＡＳ血清型、又は示されていないＧＡＳ血清型とも呼ばれる）に対する免疫応答を誘発する。ここで使用される「３０価」又は「２６価」のような用語は、そこから免疫原性ペプチドが得られたか又は誘導されたＧＡＳ血清型の数をいう。免疫原性組成物中に含まれる免疫原性ペプチドの数は、記載の価より大きくても良い。例えば、本明細書に記載の３１の免疫原性ペプチドを含む免疫原性組成物は、この組成物に含まれるSpa免疫原性ペプチド（本明細書に及び当該分野で記載されている）はＧＡＳ血清型Ｍ１８から得ることができ、血清型Ｍ１８のＭタンパク質からの免疫原性ペプチドもまた、ワクチン組成物中に含まれるため、３０価の組成物と呼んでもよい。
【００６６】
地理的位置とは無関係に、臨床的に関連するＧＡＳ血清型の最大数に対する免疫応答を誘発する組成物を提供するように、免疫原性組成物が設計され構築された。従って、臨床的使用と効力を最大にするために、１つ又はそれ以上の地域で普及しているＧＡＳ血清型（これは、当該分野で入手できる疫学データから決定される）は、Ｍタンパク質免疫原性断片又は他のＧＡＳポリペプチド免疫原性断片（例えば、Spa免疫原性断片）の供給源として役立つことがある。本明細書に記載の免疫原性組成物中の免疫原性断片で示されるＧＡＳ血清型は、非侵襲的な感染症（例えば、咽頭炎、膿痂疹、丹毒、及び蜂巣炎）を引き起こすＧＡＳ血清型、及び侵襲性感染（例えば、血液（菌血症）、筋肉、及び肺（肺炎）のＧＡＳ血清型、壊死性筋膜炎、及び連鎖球菌毒素ショック症候群）、及び、急性リウマチ熱、反応性関節炎、糸球体腎炎などの非化膿後遺症を引き起こすＧＡＳ血清型を含む（例えば、Cunningham, Clin. Microbiol. Rev. 13:470 (2000)を参照）。
【００６７】
疫学データは、公的な及び／又は私的な地方の、国の、及び国際的組織や研究者から得ることができる。例えば、免疫原性組成物で使用するために、そこからＭタンパク質の免疫原性ペプチドが選択されるＧＡＳの血清型は、非侵襲性の感染症、例えば、北アメリカの小児対象における咽頭炎（例えば、Shulman et al, Clin. Infect. Dis. 2009、前出、を参照）、（２）侵襲性ＧＡＳ感染症（例えば、Centers for Disease Control and Prevention後援のActive Bacterial Core Surveillance of the Emerging Infections Program Networkを参照）（例えば、O'Loughlin et al、前出、を参照）、（３）ヨーロッパにおける侵襲性感染症（例えば、StrepEuro協会により報告されている、例えばLuca-Harari et al、前出、を参照）、及び／又は（４）開発途上国で普及しているＧＡＳ血清型（例えば、Steer et al, The Lancet Infectious Diseases 9:611-16 (2006)を参照）、の疫学に基づく。また本明細書に記載の免疫原性組成物（例えば、３０価のワクチン組成物）には、現在又は歴史的に「リウマチ発症性」であると考えられているＧＡＳの血清型からのＭペプチドが含まれる（例えば、Shulman et al, Clin. Infect. Dis. 42:441-47 (2006)を参照）。さらに、Ａ群連鎖球菌の少なくとも数個の血清型（特に限定されないが、ＧＡＳ血清型１８、ＧＡＳ血清型３、及びＧＡＳ血清型２８）により発現される防御性抗原であるSpa18のアミノ末端ペプチド断片は、本明細書に記載の多価免疫原性組成物に含まれてよい（例えば、Dale et al, J. Clin. Invest. 103: 1261-68 (1999)、米国特許第７，０６３，８５０号、国際特許出願公報ＷＯ００／３７６４８を参照）。
【００６８】
Ｍタンパク質のアミノ酸配列とＭタンパク質のサブタイプは、タンパク質データベース、例えばGenBank、GenEMBL、及びSwiss Prot データベースから入手できる。Ｍタンパク質配列はまた、cdc.gov/ncidod/biotech/strep/emmtypesでインターネットにアクセスして見つかるCenter for Disease Control (CDC) emm typing centerのウェブサイトでも入手できる。Spaポリペプチドのアミノ酸配列もまた、公のデータベースから入手でき、Dale et al., J. Clin. Invest. 103: 1261-68 (1999)、米国特許第７，０６３，８５０号、及び国際特許出願公報ＷＯ００／３７６４８に記載されている。当該分野で現在使用されているＧＡＳ Ｍ血清型のサブタイプ判定基準は、Facklam et al, Emerg. Infect. Dis. 5:247-53 (1999)により記載されている。
【００６９】
また当該分野において昔から知られているが、Ｍタンパク質の領域は、宿主の組織、例えばヒトの心臓（例えば、Dale et al, J. Exp. Med. 156: 1165-76 (1982); Dale et al, J. Exp. Med. 161 : 113-22 (1985)を参照）、脳（例えば、Bronze et al, J. Immunol. 151 :2820-28 (1993)）、筋肉、腎臓、及び軟骨、と交差反応する抗体を含むアミノ酸配列を含む。従って、本明細書に記載の多価免疫原性組成物の設計は、１つ又はそれ以上のヒトタンパク質とともに各Ｍタンパク質が５つ以上の連続するアミノ酸を有するかどうか、従って、どれがヒト組織と結合する可能性のある抗体を誘導し得るかを決定するための、Ｍタンパク質のアミノ酸配列の解析を含む。本明細書に記載の免疫原性組成物に含まれるＭタンパク質の免疫原性ペプチドと、免疫原性ペプチドを含む融合ポリペプチドは、既知のヒトタンパク質の５つ以上の連続するアミノ酸と同一である５つ以上の連続するアミノ酸が欠如している。
【００７０】
Ｍタンパク質とヒトタンパク質のアミノ酸配列の比較は、当業者が利用できるいくつかの整列プログラムの１つ又はそれ以上を使用して行われる。そのような整列手段（これはまた、Ｍタンパク質をコードするようなヌクレオチド配列を比較するのにも有用である）は、特に限定されないが、BlastP、BLAST、tBLAST、及びMegAlignなどのソフトウェアプログラムを含む。他のソフトウェアプログラムは、Lasergene バイオインフォーマティクスコンピューティングスイート （DNASTAR（登録商標） Madison, Wisconsin）、CLUSTALWプログラム（例えば、Thompson et al, Nucleic Acids Res. 22:4673-80 (1991)を参照）、及び"GeneDoc" (Nicholas et al, EMBNEWNews 4: 14 (1991))で提供されている。ALIGNやBLASTなどのアルゴリズムの参照文献は、例えばAltschul, J. Mol. Biol. 219:555-565, 1991; 及び Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992で見つかる。Align及びBLASTアルゴリズムを含むアルゴリズムは、NCBIウェブサイト（例えば、［オンライン］インターネット、ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST）で利用できる。デフォールトパラメータを使用してもよい。ヌクレオチド及びアミノ酸配列を比較し、最適な整列を決定するための当該分野で利用できる追加の方法は、例えばPeruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997); Wu et al. (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins," Methods in Gene Biotechnology中, pages 123-151 (CRC Press, Inc. 1997); and Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Ed. (Academic Press, Inc. 1998)に記載された方法がある。
【００７１】
本明細書に記載の多価ワクチン組成物（例えば、多価免疫原性組成物）で使用されるＧＡＳ免疫原性ペプチドは、完全長ＧＡＳポリペプチドの免疫原性部分を含み、成熟ポリペプチド（すなわち、シグナルペプチド配列が除去されているポリペプチド）のアミノ末端部の少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０以上の連続するアミノ酸（又は、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、４０〜５５、もしくは５５〜６０の間の任意の数のアミノ酸、又は６０以上の連続するアミノ酸）を含んでよい。ある具体的態様において、免疫原性ペプチドは、Ｍタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から、少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０以上の連続するアミノ酸（又は、Ｍタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、４０〜５５、もしくは５５〜６０の間の任意の数のアミノ酸、又は６０以上の連続するアミノ酸）を含んでよい。成熟又は完全長ＧＡＳポリペプチドの免疫原性部分は、免疫応答を誘導する１つまたはそれ以上のエピトープを含み、この免疫応答は、免疫原性ペプチドに、成熟及び完全長ポリペプチド内の免疫原性部分に、及びこのポリペプチドを発現するＧＡＳ細菌に特異的に結合する抗体の産生を含む。多くの具体的態様において、免疫原性ペプチドは、Ｍタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端からの、少なくとも２５又は少なくとも５０の連続するアミノ酸を含む。ある具体的態様において、１つまたはそれ以上の免疫原性ペプチドは、Ｍタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端からの、少なくとも２５の連続するアミノ酸を含み、この免疫原性ペプチドは二重で存在し、複製物は直接タンデムに連結されている。すなわち、例として、選択される免疫原性領域が、Ｍタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端のアミノ酸残基１〜２５を含む場合、二重の免疫原性ペプチドは、アミノ酸１〜２５の第２の繰り返し配列にタンデムに連結されたアミノ酸残基１〜２５を含む（すなわち、第１の複製のアミノ酸残基２５は、第２の複製のアミノ酸残基１に直接結合する）。
【００７２】
ある態様において、多価免疫原性組成物は、代表的な（又は、から得られる、から誘導される）少なくとも３０の異なるＧＡＳ血清型である免疫原性ペプチドを含む。より具体的な例において、本明細書に記載の免疫原性組成物で示されるＧＡＳ血清型の１つはＭ４であり、免疫原性ペプチドは、Ｍ４タンパク質のアミノ末端部からの少なくとも２５の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。他の態様において、免疫原性組成物は、少なくとも３０の異なるＧＡＳ血清型の代表的な少なくとも３１の免疫原性ペプチドを含む。より具体な例において、３１の免疫原性ペプチドの各々のアミノ酸配列は異なり、各々は、ＧＡＳ血清型M18などのＧＡＳ血清型からのSpaタンパク質のアミノ末端部からの、ＧＡＳ血清型（１）Ｍｌ；（２）Ｍ２；（３）Ｍ３；（４）Ｍ４；（５）Ｍ５；（６）Ｍ６；（７）Ｍ１ｌ；（８）Ｍ１２；（９）Ｍ１４；（１０）Ｍ１８；（１１）Ｍ１９；（１２）Ｍ２２；（１３）Ｍ２４；（１４）Ｍ２８；（１５）Ｍ２９；（１６）Ｍ４４；（１７）Ｍ４９；（１８）Ｍ５８；（１９）Ｍ７３；（２０）Ｍ７５；（２１）Ｍ７７；（２２）Ｍ７８；（２３）Ｍ８１；（２４）Ｍ８２；（２５）Ｍ８３；（２６）Ｍ８７；（２７）Ｍ８９；（２８）Ｍ９２；（２９）Ｍ１１４；（３０）Ｍ１１８，及び（３１）の１つからの、Ｍタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０以上のアミノ酸（又は、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、４０〜５５、もしくは５５〜６０の間の任意の数のアミノ酸、又は６０以上の連続するアミノ酸）を含む。別のさらに具体的な例において、１つまたはそれ以上の免疫原性ペプチドは、少なくとも２５の連続するアミノ酸を二重で含む。別の具体的態様において、１つまたはそれ以上の免疫原性ペプチドは、少なくとも４０の連続するアミノ酸、又は少なくとも４５の連続するアミノ酸を含む。さらに別の具体的態様において、１つまたはそれ以上の免疫原性ペプチドは少なくとも５０の連続するアミノ酸を含む。本明細書において、血清型に従ってＧＡＳ細菌に言及する時、この細菌は、例えばＧＡＳ血清型３、ＧＡＳ Ｍ血清型３、又はＧＡＳ血清型Ｍ３と呼ばれる。特定の血清型のＭタンパク質に言及する時、そこからＭタンパク質が誘導されるＧＡＳ血清型（例えばＭ３）の名称は、典型的には、文脈に応じてタンパク質又は免疫原性ペプチドという単語が続く（すなわち、Ｍ３タンパク質、又はＭ３免疫原性ペプチド）。
【００７３】
従って、言い換えると、上記した免疫原性組成物の態様は、少なくとも以下の免疫原性ペプチドを含む：ＧＡＳ血清型１からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型２からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型３からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型４からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型５からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型６からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型１１からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型１２からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型１４からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型１８からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型１９からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型２２からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型２４からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型２８からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型２９からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型４４からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型４９からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型５８からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型７３からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型７５からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型７７からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型７８からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型８１からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型８２からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型８３からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型８７からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型８９からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型９２からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型１１４からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型１１８からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド；ＧＡＳ血清型、例えばＧＡＳ血清型１８、からのSpaタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチド。本明細書に記載のある具体的態様において、上記の各免疫原性ペプチドは、Ｍタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から、少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０以上の連続するアミノ酸（又は、Ｍタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、４０〜５５、もしくは５５〜６０の間の任意の数のアミノ酸、又は６０以上の連続するアミノ酸）を含んでよい。別の具体的態様において、１つまたはそれ以上の免疫原性ペプチドは、少なくとも２５の連続するアミノ酸を二重で含む。別の具体的態様において、１つまたはそれ以上の免疫原性ペプチドは、少なくとも４０の連続するアミノ酸、又は少なくとも４５の連続するアミノ酸を含む。さらに別の具体的態様において、１つまたはそれ以上の免疫原性ペプチドは少なくとも５０の連続するアミノ酸を含む。
【００７４】
他のいくつかの態様において、免疫原性組成物は、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、又はそれ以上の異なる免疫原性ペプチドを含んでよい。この異なる免疫原性ペプチドは、ＧＡＳ血清型１、２、３、４、５、６、１１、１２、１４、１８、１９、２２、２４、２８、２９、４４、４９、５８、７３、７５、７７、７８、８１、８２、８３、８７、８９、９２、１１４、１１８からのＭタンパク質の、及びＧＡＳ血清型１８（上記したように）からのSpaタンパク質の、アミノ末端部からの、３１の免疫原性ペプチドを含んでよく、さらに、少なくとも１つの追加の異なるＧＡＳ血清型もしくはサブタイプからのＭタンパク質のアミノ末端部からの免疫原性ペプチド、及びSpaタンパク質のアミノ末端部からの１つまたはそれ以上の追加の異なる免疫原性ペプチドを含んでよい。追加の免疫原性ペプチドの選択は、疫学データ、ＧＡＳタンパク質の５つ又はそれ以上の連続するアミノ酸とヒトタンパク質との共有された同一性の欠如、細菌及び／又は防御データ（免疫原性組成物による免疫に応答して産生される抗体により認識される示されていないＧＡＳ血清型の数を増加させる１つまたはそれ以上の追加の免疫原性ペプチドの能力を含む）により、知ることができる。
【００７５】
本明細書に記載のように及び当業者に公知のように、Ｍタンパク質とSpaタンパク質のアミノ末端部は１つまたはそれ以上の免疫原性エピトープを有するＭタンパク質とSpaタンパク質の領域を含む。本明細書において、Ｍタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部は、成熟タンパク質をいい、これはシグナルペプチド配列が欠如した発現されたタンパク質である。当該分野において充分に理解されているように、分泌されるか又は膜結合タンパク質であるポリペプチドは、発生期のポリペプチドのアミノ末端でシグナルペプチドと相互作用する転位装置により、それぞれ膜を介するか又は膜に転位される。細菌では、シグナルペプチドの配列は、典型的には、生じたばかりの翻訳されたポリペプチドが細菌プロテアーゼによりインビボで切断されて、成熟ポリペプチドを形成する。従って、特に明記しない場合は、Ｍタンパク質（例えば）の残基１〜５０のアミノ酸配列を含む免疫原性ペプチドとしての免疫原性ペプチドの本明細書での説明において、残基１は、シグナルペプチド配列の非存在下のＭタンパク質のアミノ末端にある。免疫原性ペプチドのアミノ酸配列の例は、配列番号２９〜５９に提供される（配列リストと表１を参照）。
【００７６】
Ｍタンパク質又はSpaタンパク質の用語「アミノ末端部」は、ポリペプチドの半分のアミノ末端部に位置するポリペプチドの一部又は領域として、当業者には容易に理解される。Ｍタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部からのアミノ酸を含む本明細書に記載の免疫原性ペプチドは、特に限定されないが、各Ｍタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端から連続する少なくとも２５のアミノ酸（すなわち、成熟ポリペプチドのアミノ酸１〜２５）を含む。他の例では、免疫原性ペプチドは、成熟タンパク質のアミノ末端に位置する１つまたはそれ以上のアミノ酸が欠如したＭタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含んでよい（例えば、成熟ポリペプチドのアミノ酸２〜２６、３〜２７、４〜２８など）。他の態様において及び例として、少なくとも２５の連続するアミノ酸は、アミノ酸位置５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５で始まるＭタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から誘導されてよい。本明細書に記載の、各免疫原性ペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも一部は、少なくとも１つの免疫原性エピトープの存在、及び既知のヒトタンパク質中に存在する少なくとも５つの連続するアミノ酸と同一の少なくとも５つの連続するアミノ酸の欠如に基づいて選択される。
【００７７】
ある態様において、少なくとも３１の異なる免疫原性ペプチドを含む免疫原性組成物は、個々の免疫原性ペプチドの各々を別々のペプチドとして含有する。ある態様において免疫原性組成物は、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５，又はそれ以上の異なる免疫原性ペプチドを含んでもよく、個々の免疫原性ペプチドを別々のペプチドとして含有する。これらの免疫原性ペプチドの各々は、それぞれ化学合成されるか、又は本明細書で詳述され当該分野の技術と方法に従って組換え産生されてよい。個々のペプチドは一緒にされ、免疫原性組成物として調製される。また本明細書に詳述されるように、免疫原性組成物は、１つまたはそれ以上の医薬的に適切な賦形剤を含んでよく、さらに１つまたはそれ以上の医薬的に適切なアジュバントを含んでよい。さらに別の態様において、免疫原性組成物は、少なくとも３１の異なる免疫原性ペプチドを、個々の免疫原性ペプチド、二量体ペプチド、及び／又は三量体ペプチドの組合せとして含む。
【００７８】
さらに別の態様において、少なくとも４つの異なる免疫原性ペプチドが一緒にタンデムに連結されて、免疫原性組成物に含めるための融合ポリペプチドを形成する。ある態様において、少なくとも３１の異なる免疫原性ペプチド（例えば、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、又はそれ以上の異なる免疫原性ペプチド）を含む免疫原性組成物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、又はそれ以上の融合ポリペプチドを含んでよく、ここで、各融合ポリペプチドは、一緒にタンデムに連結された少なくとも４つの異なる免疫原性ペプチドを含む。さらなる具体的態様において、免疫原性組成物に含まれる１つまたはそれ以上の融合ポリペプチドは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５、又はそれ以上の個々の、タンデムに連結された免疫原性ペプチドを含んでよい。さらなる具体的態様において、タンデムに連結された異なる免疫原性ペプチドを含み、本明細書に記載の免疫原性組成物で使用される各融合ポリペプチドは、少なくとも、６、７、８、９、又は１０の異なる免疫原性ペプチドを含む。さらに本明細書に記載の具体的態様において、免疫原性組成物は、各々がＧＡＳ Ｍタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部由来の、少なくとも３１の異なる免疫原性ペプチドを含み、少なくとも６、７、８、又は９つの異なる免疫原性ペプチドは、４つの融合ポリペプチドを提供するような方法で一緒に連結される。さらに別の具体的態様において、免疫原性組成物は、各々がＧＡＳ Ｍタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部由来の、少なくとも３１の異なる免疫原性ペプチドを含み、７又は８つの異なる免疫原性ペプチドは、４つの融合ポリペプチドを提供するような方法で、融合ポリペプチド１つにつきタンデムに連結される。言い換えると、少なくとも３１の異なる免疫原性ペプチドの各々は、これら４つの融合ポリペプチドの１つに含まれる。
【００７９】
さらなる具体的態様において、免疫原性組成物は、少なくとも３１の異なる免疫原性ペプチド（ＧＡＳ Ｍ血清型１、２、３、４、５、６、１１、１２、１４、１８、１９、２２、２４、２８、２９、４４、４９、５８、７３、７５、７７、７８、８１、８２、８３、８７、８９、９２、１１４、１１８からのＭタンパク質の、及びＧＡＳ血清型１８からのSpaタンパク質のアミノ末端部からの免疫原性ペプチド）を含み、ここで、少なくとも６、７、８、又は９つの異なる免疫原性ペプチドは、一緒にタンデムに連結されて、少なくとも４つの融合ポリペプチドを形成する。ある具体的態様において、４つの融合ポリペプチドの各々は、少なくとも７つ又は少なくとも８つの異なる免疫原性ペプチドを含む。ある態様において、この免疫原性組成物は、４つの融合ポリペプチド（これは、便宜上、第１の融合ポリペプチド、第２の融合ポリペプチド、第３の融合ポリペプチド、及び第４の融合ポリペプチドと呼ばれる）を含み、各融合ポリペプチドは、少なくとも３１の異なる免疫原性ペプチドから独立に選択された７又は８つの異なる免疫原性ペプチドを含む。第１、第２、第３、及び第４の融合ポリペプチドの各々に含まれる免疫原性ペプチドと、及びこの免疫原性ペプチドが連結される順序とは、本明細書に記載されかつ当該分野でルーチンに行われている方法と技術を使用して当業者が容易にに決定することができ、各ポリペプチドの免疫原性の最適化のために不当に経験的な試行錯誤的分析を必要としない。２つの異なる免疫原性ペプチドがタンデムに連結されているジャンクションに位置するアミノ酸が、ヒトタンパク質と同一性を共有する連続的５−アミノ酸配列を導入しないことを決定するために、各融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書に記載され当業者に公知のデータベースで入手できるヒトタンパク質の配列と比較される。
【００８０】
ＧＡＳ血清型からのＭタンパク質及びSpaタンパク質のアミノ末端部からの３つ又はそれ以上の異なる免疫原性ペプチドを含む融合ポリペプチドは、アミノ末端に位置する免疫原性ペプチドが、融合ポリペプチドのカルボキシ末端で繰り返される（すなわち、複製される）ように、構築される。融合ポリペプチドのカルボキシ末端に複製された免疫原性ペプチドが存在しない場合、最後から２番目の及びカルボキシ末端のペプチドの免疫原性は低下しているか悪化していることがある。理論に拘束されるつもりはないが、カルボキシ末端でのアミノ末端ペプチドの繰り返しは、融合タンパク質に含まれるすべてのペプチドの免疫原性を保存し、目的の抗原に対する免疫応答を増強するために当該分野で使用される破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、又は他のタンパク質もしくはタンパク質断片などの非ＧＡＳ担体タンパク質を含める必要性を低下させるか又は不要にする。米国特許第６，７１６，４３３号及び７，４０２，３１６号を参照。
【００８１】
本明細書に記載のように、Ｍタンパク質とSpaタンパク質のアミノ酸配列は、当該分野において容易に入手できる。ＣＤＣ emm typing centerのウェブサイトで提供されるようなデータベースにアクセスして、ＧＡＳ血清型からのＭタンパク質内の（本明細書において及び当該分野において、ＧＡＳサブタイプと呼ばれる）又はＧＡＳ血清型からのSpaタンパク質内のアミノ酸配列変動を調べることができる。Ｍタンパク質（又はSpaタンパク質）のアミノ末端部の比較のための整列手段を使用して、変動可能なアミノ末端部内のアミノ酸残基を同定することができる。本明細書に記載の免疫原性ペプチドと融合ポリペプチドのアミノ酸配列は例であり、ＧＡＳに対する免疫応答を誘導するのに有用な免疫原性ペプチドと融合ポリペプチドは、免疫原性ペプチドは融合ポリペプチドの免疫原性に悪影響（統計的に有意な方法で、又は生物学的もしくは臨床的に有意な方法で、減少させるか又は低下させる）を与えない１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入、及び欠失を含んでよい。統計的に、生物学的に、又は臨床的に有意な方法で、それぞれ本明細書に記載された免疫原性ペプチド又は融合ポリペプチドの免疫原性と実質的に類似している変種ペプチド又は変種融合ポリペプチドの免疫原性が、好ましい。ＧＡＳ Ｍ血清型１、２、３、４、５、６、１１、１２、１４、１８、１９、２２、２４、２８、２９、４４、４９、５８、７３、７５、７７、７８、８１、８２、８３、８７、８９、９２、１１４、１１８からのＭタンパク質の、及びＧＡＳ血清型１８からのSpaタンパク質のアミノ末端部からの免疫原性ペプチドのアミノ酸配列の例は、表１に記載される。
【００８２】
また、さらなる具体的態様には、特定の地域で使用される免疫原性組成物が提供される。例えばある態様には、少なくとも２３の異なる免疫原性ペプチド（ＧＡＳ Ｍ血清型１、２、３、４、５、６、１１、１２、１４、１８、１９、２２、２４、２８、２９、４４、５８、７３、７５、７７、７８、８９、１１８からのＭタンパク質、及びＧＡＳ血清型１８からのSpaタンパク質のアミノ末端部からの免疫原性ペプチド）を含む免疫原性組成物が提供され、ここで、少なくとも６、７、８、又は９つの異なる免疫原性ペプチドは一緒にタンデムに連結されて、少なくとも３つ又は少なくとも４つの融合ポリペプチドを形成する。ある具体的態様において、免疫原性組成物は、各々が少なくとも７つ又は少なくとも８つの異なる免疫原性ペプチドを含む各３つの融合ポリペプチドを含む。ある態様において免疫原性組成物は、３つの融合ポリペプチド（これは、便宜上、第１の融合ポリペプチド、第２の融合ポリペプチド、及び第３の融合ポリペプチドと呼ばれる）を含み、各融合ポリペプチドは７つ又は８つの異なる免疫原性ペプチドを含む。この免疫原性組成物の例は、ヨーロッパなどの他の地域より北アメリカのＧＡＳ感染症でより普及しているＧＡＳ血清型を含む。ＧＡＳ Ｍ血清型（例えば、４９、８１、８２、８３、８７、９２、及び１１４）は、ＧＡＳ感染症の原因として、北アメリカよりヨーロッパでより頻繁に同定されている。
【００８３】
ある態様において、本明細書に記載の免疫原性ペプチド又は融合ポリペプチドは、それぞれ、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、挿入、又は欠失を含む、免疫原性ペプチド又は融合ポリペプチド種（ここでは、変種とも呼ばれる）を含む。本明細書に記載の免疫原性ペプチド又はこの免疫原性ペプチドを含む融合ポリペプチド種は、それぞれ、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、挿入、又は欠失を含む、免疫原性ペプチド又は融合ポリペプチド種（ここでは、変種とも呼ばれる）を含む。免疫原性ペプチド変種は、免疫原性ペプチドについて本明細書に記載のアミノ酸配列の例とは異なるアミノ酸配列を含み、同じ各ＧＡＳ血清型の異なるサブタイプのアミノ酸配列（Spaタンパク質又はＭタンパク質のアミノ末端部の少なくとも２５の連続連続するアミノ酸）を含むものである。融合ポリペプチド変種は、少なくとも１つの免疫原性ペプチド変種を含む種を含む。Ｍタンパク質サブタイプのアミノ酸配列は、ＣＤＣ emm typing centerウェブサイト（前出）を含む公のデータベースから入手できる。
【００８４】
免疫原性ペプチド変種と融合ポリペプチド変種はまた、化学合成又は組換え産生（特定の免疫原性ペプチド又は融合ポリペプチドを産生するのに、いずれの方法も使用される）される、アミノ酸置換、欠失、又は挿入を有するものを含む。ＧＡＳに対する免疫応答を誘導するのに有用な免疫原性ペプチド変種及び融合ポリペプチド変種は、本明細書に記載され、統計的に、生物学的に、又は臨床的に有意な方法で、免疫原性ペプチドは融合ポリペプチドの免疫原性に悪い影響又は改変（減少又は低下）を与えない１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入、及び欠失を含んでよい。言い換えると、本明細書に記載の免疫原性ペプチドの変種又は融合ポリペプチドの変種は、それぞれ免疫原性部分又は融合ポリペプチドが示す免疫原性を保持する。本明細書に記載のように、免疫原性の保持は、ＧＡＳに対する免疫応答を誘発する能力、例えば同族の免疫原性ペプチド及び／又は融合ポリペプチド、同族の完全長もしくは成熟Ｍタンパク質又はSpaタンパク質（単離されているか、又はＧＡＳ細菌の細胞表面上に存在する）に特異的に結合する抗体を産生する能力を含み、この抗体は、殺菌活性及び食作用活性を含む。
【００８５】
一般に、免疫原性ペプチド又は融合ポリペプチドに含まれてよいアミノ酸置換は、保存的置換である。アミノ酸の保存的置換は公知であり、Ｍタンパク質又はSpaポリペプチドで自然に存在するか、又はペプチドもしくは融合ポリペプチドが組換え産生される時、導入されてもよい。当業者により理解されている様々な基準は、免疫原性ペプチド又は融合ポリペプチド中の特定の位置で置換されるアミノ酸が保存である（又は類似）であるかどうかを示す。例えば、類似のアミノ酸又は保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似のアミノ酸は、以下の分類に含まれる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）；非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、ヒスチジン）；非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；β −分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン） ；及び、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）。分類することがより困難であると考えられるプロリンは、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（例えば、ロイシン、バリン、イソロイシン、及びアラニン）と性質を共有する。ある状況において、グルタミンをグルタミン酸で又はアスパラギンをアスパラギン酸で置換することは、グルタミンとアスパラギンが、それぞれグルタミン酸とアスパラギン酸のアミン誘導体であるという点で、類似置換であると考えることができる。当該分野において理解されているように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、Align又はBLASTアルゴリズム、又は本明細書に記載され当該分野で実施されている他のアルゴリズムを使用して、ペプチド又はポリペプチドのアミノ酸配列及び保存的アミノ酸置換物を、それぞれ第２のペプチド又はポリペプチドの配列と比較することにより決定される。
【００８６】
アミノ酸置換、欠失、及び付加は、免疫原性ペプチド又は融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの化学合成中に、その免疫原性ペプチド又は融合ポリペプチド中に導入してもよい。あるいはアミノ酸置換、欠失、及び付加は、公知の及びルーチンに行われている突然変異誘発法（例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 2001を参照）を使用して、組換え的に免疫原性ペプチド又は融合ポリペプチド中に導入してもよい。オリゴヌクレオチド指令部位特異的（又はセグメント特異的）突然変異誘発法を行って、所望の置換、欠失、又は挿入に従って改変された特定のコドンを有する改変ポリヌクレオチドを提供してもよい。あるいは、ランダム突然変異誘発法（例えば、アラニンスキャン突然変異誘発、エラーが起きやすいポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発、オリゴヌクレオチド指令突然変異誘発）を使用して、免疫原性ペプチド及び融合ポリペプチド変種を調製してもよい（例えば、Sambrook et al、前出、を参照）。免疫原性ペプチド変種又は融合ポリペプチド変種は、配列リスト中のもの（例えば、配列番号１〜１２で示される融合ポリペプチド、及び配列番号２９〜５９で示される免疫原性ペプチド）を含む、本明細書に記載の免疫原性ペプチド及び融合ポリペプチドのアミノ酸配列のいずれかと、少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する、それぞれ免疫原性ペプチド又は融合ポリペプチドを含む。あるアミノ酸配列と１つまたはそれ以上の追加の配列との同一性パーセントは、本明細書に記載の及び当該分野で使用される整列手段のいずれかを使用して決定してもよい。
【００８７】
免疫原性を示し、ヒトの細胞上に発現されるタンパク質と交差反応する抗体を誘導する不要なエピトープが欠如した、Ｍタンパク質とSpaタンパク質の領域についての当該分野と本明細書の記載から、当業者は、Ｍタンパク質とSpaタンパク質のアミノ末端部中のどのアミノ酸が改変（すなわち１つまたはそれ以上のアミノ酸の、置換、欠失、又は付加）をより受けやすいか、及びどのアミノ酸が変化を受けにくいかを、容易に決定することができる。また、ペプチド又はポリペプチドに変異を導入し、これらのペプチドやポリペプチド及びこれらの変種を単離し、これらを分析するために、本明細書に記載され、多くの分子生物学、タンパク質発現、及びタンパク質分離技術及び方法に提供されているため、所望の免疫原性は、容易に、かつ過度に実験をすることなく、作成することができる。免疫原性の保持は、例えば、同族の免疫原性ペプチド及び／又は融合ポリペプチド、同族の成熟Ｍタンパク質又はSpaタンパク質（単離されているか、又はＧＡＳ細菌の細胞表面上に存在する）、又は同族の完全長Ｍタンパク質又はSpaタンパク質に特異的に結合する抗体の産生、及び殺菌活性及び食作用活性を有するものを含む抗体の産生などの、ＧＡＳに対する免疫応答を誘発する能力を含む。
【００８８】
Ｍタンパク質又はSpaタンパク質の免疫原性ペプチドの変種、又は免疫原性ペプチドを含む融合ポリペプチドが、折り畳まれて、非変種ペプチド又は融合ポリペプチドに匹敵するコンフォメーションを取るかどうかの評価するためのアッセイは、例えば、未変性のもしくは折り畳まれていないエピトープに特異的なモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体と反応するペプチドもしくは融合ポリペプチドの能力、リガンド結合機能の保持、及びプロテアーゼによる消化に対する変異ペプチドもしくは融合ポリペプチドの感受性もしくは耐性（例えば、Sambrook et al、前出、を参照）を含む。本明細書に記載の免疫原性ペプチド変種及び融合ポリペプチド変種は、当業者によりルーチンに実施されている、本明細書に記載のこれらの方法及び当該分野で公知の他の方法に従って、同定、性状解析、及び／又は作成することができる。
【００８９】
個々の免疫原性ペプチドの及び免疫原性ペプチドを含む融合ポリペプチドの変種は、生じる分子の生物活性を変化させることなく（すなわち、統計的に、生物学的に、又は臨床的に有意な、又は生物学的に有意な方法で、１つまたはそれ以上の免疫原性を変化させることなく）調製することができる。例えば本明細書でより詳細に記載されるように、そのような置換は一般的に、あるアミノ酸を同じ群（例えば、極性残基、荷電残基、疎水性残基、及び／又は小さい残基などの群）内の別のアミノ酸と交換することにより作成される。アミノ酸置換の効果は、生じた改変ペプチドもしくは融合ポリペプチドを、生物学的アッセイで機能する能力、又は同族のリガンドもしくは標的分子（例えば、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体）に結合する能力を単に試験することにより、経験的に決定することができる。
【００９０】
４つの融合ポリペプチドを含む抗ＧＡＳ免疫原性組成物
ある具体的態様において、ＧＡＳに対する免疫応答を誘導するのに有用な免疫原性組成物は、３１の異なる免疫原性ペプチドを含み、各免疫原性ペプチドは、４つの融合ポリペプチドのうちの１つに取り込まれる。各免疫原性ペプチドは、ＧＡＳ Ｍ血清型１、２、３、４、５、６、１１、１２、１４、１８、１９、２２、２４、２８、２９、４４、４９、５８、７３、７５、７７、７８、８１、８２、８３、８７、８９、９２、１１４、１１８の１つからのＭタンパク質のアミノ末端部由来、又はＧＡＳ血清型１８のSpaタンパク質のアミノ末端部由来である。３つの融合ポリペプチド（便宜上、それぞれ第１、第２、及び第３の融合ポリペプチドと呼ばれる）は、それぞれタンデムに連結された８つの異なる免疫原性ペプチドを含み、及び４つの融合ポリペプチドは、タンデムに連結された少なくとも７つの異なる免疫原性ペプチドを含む。具体的態様において、第１の融合ポリペプチドは、８つの免疫原性ペプチドを含み、これらは相違し、各免疫原性ペプチドは、ＧＡＳ Ｍ血清型１、２、３、６、１２、１８、２８の１つからのＭタンパク質のアミノ末端部から、及びＧＡＳ血清型１８のSpaタンパク質のアミノ末端部から、連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む。言い換えると、第１の融合ポリペプチドは、タンデムに連結された少なくとも８つの異なる免疫原性ペプチドを含み、各免疫原性ペプチドは、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、Ｍ３タンパク質、Ｍ６タンパク質、Ｍ１２タンパク質、Ｍ１８タンパク質、Ｍ２８タンパク質、及びSpa１８タンパク質の１つのアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む（すなわち、従って融合ポリペプチドは、Ｍ１タンパク質のアミノ末端部からの免疫原性ペプチド、Ｍ２タンパク質のアミノ末端部からの免疫原性ペプチド、Ｍ３タンパク質のアミノ末端部からの免疫原性ペプチドを含む、など）。免疫原性ペプチドの１つは、融合ポリペプチドのアミノ末端とカルボキシ末端の各々で繰り返される。さらなる具体的態様において、第１の融合ポリペプチドは、ＧＡＳ血清型１からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチドの複製（繰り返し）を含み、１つの複製は、融合ポリペプチドのアミノ末端に位置し、第２の複製は、融合ポリペプチドのカルボキシ末端に位置する。
【００９１】
第２の融合ポリペプチドは、８つの免疫原性ペプチドを含み、これらは相違すると共に、各免疫原性ペプチドは、ＧＡＳ Ｍ血清型４、５、１１、１４、１９、２４、２９、及び７５の１つからのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む。言い換えると、及び第１の融合ポリペプチドの説明と同様に、第２の融合ポリペプチドは、タンデムに連結された少なくとも８つの異なる免疫原性ペプチドを含み、各免疫原性ペプチドは、Ｍ４ンパク質、Ｍ４タンパク質、Ｍ１１タンパク質、Ｍ１４タンパク質、Ｍ１９タンパク質、Ｍ２４タンパク質、Ｍ２９タンパク質、及びＭ２５タンパク質の１つのアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む。免疫原性ペプチドの１つは、第２の融合ポリペプチドのアミノ末端とカルボキシ末端の各々で繰り返される。さらなる具体的態様において、第２の融合ポリペプチドは、ＧＡＳ血清型４からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチドの複製（繰り返し）を含み、１つの複製は、融合ポリペプチドのアミノ末端に位置し、第２の複製は、融合ポリペプチドのカルボキシ末端に位置する。
【００９２】
ある態様において、第３の融合ポリペプチドは、８つの免疫原性ペプチドを含み、これらは相違すると共に、各免疫原性ペプチドは、ＧＡＳ Ｍ血清型２２、４４、５８、７３、７７、７８、８９、及び１１８の１つからのＭタンパク質のアミノ末端部から、連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む。言い換えると、及び第３の融合ポリペプチドは、タンデムに連結された少なくとも８つの異なる免疫原性ペプチドを含み、各免疫原性ペプチドは、Ｍ２２ンパク質、Ｍ４４タンパク質、Ｍ５８タンパク質、Ｍ７３タンパク質、Ｍ７７タンパク質、Ｍ７８タンパク質、Ｍ８９タンパク質、及びＭ１１８タンパク質の１つのアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む。免疫原性ペプチドの１つは、第３の融合ポリペプチドのアミノ末端とカルボキシ末端の各々で繰り返される。さらなる具体的態様において、第３の融合ポリペプチドは、ＧＡＳ血清型７７からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチドの複製（繰り返し）を含み、１つの複製は、融合ポリペプチドのアミノ末端に位置し、第２の複製は、融合ポリペプチドのカルボキシ末端に位置する。
【００９３】
第４の融合ポリペプチドは、７つの免疫原性ペプチドを含み、これらは相違すると共に、各免疫原性ペプチドは、ＧＡＳ Ｍ血清型４９、８１、８２、８３、８７、９２、及び１１４の１つからのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む。言い換えると、及び第４の融合ポリペプチドは、タンデムに連結された少なくとも８つの異なる免疫原性ペプチドを含み、各免疫原性ペプチドは、Ｍ４９ンパク質、Ｍ８１タンパク質、Ｍ８２タンパク質、Ｍ８３タンパク質、Ｍ８７タンパク質、Ｍ９２タンパク質、及びＭ１１４タンパク質の１つのアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む。免疫原性ペプチドの１つは、第４の融合ポリペプチドのアミノ末端とカルボキシ末端の各々で繰り返される。さらなる具体的態様において、第４の融合ポリペプチドは、ＧＡＳ血清型８３からのＭタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチドの複製（繰り返し）を含み、１つの複製は、融合ポリペプチドのアミノ末端に位置し、第２の複製は、融合ポリペプチドのカルボキシ末端に位置する。
【００９４】
第１、第２、第３、及び第４の融合ポリペプチドの各々の各免疫原性ペプチドは、各Ｍタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０、又はそれ以上のアミノ酸（又は、各Ｍタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から連続する２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、４０〜５５、もしくは５５〜６０の間の任意の数のアミノ酸、又は６０以上の連続するアミノ酸）を含んでよい。別のさらなる具体的態様において、１つまたはそれ以上の免疫原性ペプチドは、少なくとも２５の連続するアミノ酸を二重で含み、各複製はタンデムである（すなわち、融合タンパク質の異なるＭタンパク質又はSpaタンパク質からの１つまたはそれ以上の免疫原性ペプチドにより分離されていない）。別の具体的態様において、１つまたはそれ以上の免疫原性ペプチドは、各Ｍタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から、連続する少なくとも４０のアミノ酸、又は少なくとも４５のアミノ酸を含む。さらに別の具体的態様において、１つまたはそれ以上の免疫原性ペプチドは、各Ｍタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも５０のアミノ酸を含む。
【００９５】
上記したように、ある具体的態様において、免疫原性ペプチドは各Ｍタンパク質のサブタイプから誘導されてよい。例えば、ある具体的態様において、ＧＡＳ血清型３のＭタンパク質からの免疫原性ペプチドはＧＡＳ血清型３．１から誘導される。他の具体的態様において、ＧＡＳ血清型６のＭタンパク質からの免疫原性ペプチドは、ＧＡＳ血清型６．ｌから誘導される。さらに別の具体的態様において、ＧＡＳ血清型５のＭタンパク質からの免疫原性ペプチドは、ＧＡＳ血清型５．０（親サブタイプ）から誘導される。ある具体的態様において、ＧＡＳ血清型１４のＭタンパク質からの免疫原性ペプチドは、ＧＡＳ血清型１４．３から誘導される。さらに別の具体的態様において、ＧＡＳ血清型２９のＭタンパク質からの免疫原性ペプチドは、ＧＡＳ血清型２９．２から誘導される。さらに別の具体的態様において、ＧＡＳ血清型４９のＭタンパク質からの免疫原性ペプチドは、ＧＡＳ血清型４９．１から誘導される。さらに別の具体的態様において、ＧＡＳ血清型８３のＭタンパク質からの免疫原性ペプチドは、ＧＡＳ血清型８３．１から誘導される。サブタイプが指定されない場合、Ｍタンパク質は、当該分野において「親」サブタイプと考えられているサブタイプ（例えば、Ｍ１２．０、Ｍ１８．０、Ｍ２８．０など）から誘導される。
【００９６】
さらなる具体的態様において、８つの免疫原性ペプチド（これらの免疫原性ペプチドは、独立に、上記した、ＧＡＳ Ｍ血清型１、２、３、６、１２、１８、２８の１つからのＭタンパク質のアミノ末端部から誘導され、ＧＡＳ血清型１８からのSpaタンパク質のアミノ末端部から誘導される）を含む第１の融合ポリペプチドは、タンデムで以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ連結される：Ｍ１、Ｍ３．１、Ｍ６．４、Ｍ２、Ｍ１８、Ｍ２８、Ｍ１２、Spa、及びＭ１。Ｍ１、Ｍ１８、Ｍ２８、Ｍ１２、及びSpa免疫原性ペプチドの各々は、各成熟Ｍタンパク質又はSpaタンパク質の各々からのアミノ酸残基１〜５０を含む。ＧＡＳ血清型３．１である免疫原性ペプチドは、成熟Ｍ３．１タンパク質の２２〜７１位にアミノ酸残基を含む。Ｍ３．１タンパク質とＭ６．４タンパク質の免疫原性ペプチドの各々は、残基１〜２５の複製（すなわち、繰り返し）と直接タンデムに連結された各成熟Ｍタンパク質のアミノ酸残基１〜２５を含む。Ｍ２タンパク質の免疫原性ペプチドは、残基２〜２６の複製（すなわち、繰り返し）と直接タンデムに連結された各成熟Ｍタンパク質のアミノ酸残基２〜２６を含む。８つの免疫原性ペプチド（これらの免疫原性ペプチドは、独立に、ＧＡＳ Ｍ血清型４、５、１１、１４、１９、２４、２９、及び７５の１つからのＭタンパク質のアミノ末端部から誘導される）を含む第２の融合ポリペプチドは、タンデムで以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ連結される：Ｍ４、Ｍ５．０、Ｍ１ｌ、Ｍ７５、Ｍ１９、Ｍ２９．２、Ｍ１４．３、Ｍ２４、及びＭ４。Ｍ４、Ｍ１１、Ｍ７５、Ｍ２９．２、Ｍ１４．３、及びＭ２４免疫原性ペプチドの各々は、各成熟Ｍタンパク質のアミノ末端部からのアミノ酸残基１〜５０を含む。Ｍ５．０タンパク質とＭ１９タンパク質の免疫原性ペプチドの各々は、残基１〜２５の複製（すなわち、繰り返し）と直接タンデムに連結された各成熟Ｍタンパク質のアミノ酸残基１〜２５を含む。８つの免疫原性ペプチド（これらの免疫原性ペプチドは、独立に、ＧＡＳＭ血清型２２、４４、５８、７３、７７、７８、８９、及び１１８の１つからのＭタンパク質のアミノ末端部から誘導される）を含む第３の融合ポリペプチドは、タンデムで以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ連結される：Ｍ７７、Ｍ２２、Ｍ７３、Ｍ８９、Ｍ５８、Ｍ４４、Ｍ７８、Ｍ１１８、及びＭ７７。これらのＭタンパク質免疫原性ペプチドの各々は、各成熟Ｍタンパク質のアミノ末端部でアミノ酸残基１〜５０を含む。７つの免疫原性ペプチド（これらの免疫原性ペプチドは、独立に、ＧＡＳＭ血清型４９、８１、８２、８３、８７、９２、及び１１４の１つからのＭタンパク質のアミノ末端部から誘導される）を含む第４の融合ポリペプチドは、タンデムで以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ連結される：Ｍ８３．１、Ｍ８２、Ｍ８１、Ｍ８７、Ｍ４９．１、Ｍ９２、Ｍｌ１４、及びＭ８３．１。これらのＭタンパク質免疫原性ペプチドの各々は、各成熟Ｍタンパク質のアミノ末端部でアミノ酸残基１〜５０を含む。図１も参照されたい。
【００９７】
第１、第２、第３、及び第４の融合ポリペプチドの具体例の各々のアミノ酸配列の例は、それぞれ配列番号１、２、３、及び４に示される。発現、可溶化、安定化、単離、及び／又は検出を促進するために、免疫原性ペプチド、二量体ペプチド、及び融合ポリペプチド（本明細書に記載の融合ポリペプチドの例を含む）は、アミノ末端又はカルボキシ末端のいずれか又は両方で、異種ペプチドもしくはポリペプチドをさらに含んでよい。例えば、免疫原性ペプチド、二量体ペプチド、又は融合ポリペプチドが組換え法に従って産生される時、アミノ末端の開始メチオニン残基が典型的に含まれる（例えば、第１、第２、第３、及び第４の融合ポリペプチドに対応する、それぞれ配列番号５、６、７、及び８を参照）。ペプチド又は融合ポリペプチドの単離、可溶化、安定化、及び／又は検出を促進するために、アミノ末端又はカルボキシ末端のいずれかに付加されるアミノ酸配列（ポリペプチドタグとも呼ばれる）の例は、ポリヒスチジンタグ（例えば、６−Ｈｉｓタグ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、FLAG（登録商標）エピトープタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号６０）、ベータガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、XPRESS（登録商標）エピトープタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ、配列番号６１、Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（可溶化タグ）、及びポリ（ＮＡＮＰ）（可溶化タグ）を含む（例えば、米国特許第５，０１１，９１２号；Hopp et al, (Bio/Technology 6:1204 (1988)を参照）。ペプチド、二量体ペプチド、又は融合ポリペプチドが組換え法で産生される場合、ベクターにより親和性配列（例えば、ヘキサヒスチジンタグ）が、核酸コード配列を組換え法で生成するのに使用されるプライマー中に合成法で又は工学的（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して）に、付加される。ポリペプチドタグを使用するための追加の方法及び技術は、当該分野においてルーチンに実施されており、目的のペプチド又はポリペプチドにタグを付加するためのシステムやキットを製造している販売業者から入手できる。例えば、第１、第２、第３、及び第４の融合ポリペプチドは、精製を促進するためのポリヒスチジンを取り込んでもよい（例えば、それぞれ配列番号９〜１２を参照）。
【００９８】
融合ポリペプチド変種は、配列リスト（例えば、配列番号１〜１２）のものを含む本明細書に記載の融合ポリペプチドアミノ酸配列の例のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する融合ポリペプチドを含む。ＧＡＳに対する免疫応答を誘導するのに有用な融合ポリペプチドは、上記のアミノ酸配列のいずれかであり、融合ポリペプチドの免疫原性を、統計的、生物学的、又は臨床的に有意な方法で悪い影響を与えるか又は改変（減少又は低下）しない１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入、及び欠失を含んでよい。言い換えると、本明細書に記載の融合ポリペプチドの変種は、親ポリペプチド又は非変種融合ポリペプチドにより示される免疫原性を保持する。本明細書に記載のように、免疫原性の保持は、例えば、同族の免疫原性ペプチド及び／又は融合ポリペプチド、同族の成熟もしくは完全長Ｍタンパク質もしくはSpaタンパク質（単離されているか、又はＧＡＳ細菌の細胞表面上に存在する）に特異的に結合する抗体の産生、及び殺菌活性と食作用活性を有するものを含む抗体の産生などの、ＧＡＳに対する免疫応答を誘発する能力を含む。
【００９９】
実施例に記載されるように、上記の第１、第２、第３、及び第４の融合ポリペプチドの例の各々を含む免疫原性組成物を用いて動物を免疫すると、Ｍタンパク質免疫原性ペプチドとSpa免疫原性ペプチドで示される各ＧＡＳ血清型（すなわち、ＧＡＳ血清型１、２、３、４、５、６、１１、１２、１４、１８、１９、２２、２４、２８、２９、４４、４９、５８、７３、７５、７７、７８、８１、８２、８３、８７、８９、９２、１１４、１１８）に特異的に結合する細菌抗体の産生を誘発した。さらに、免疫された動物からの抗血清は、いずれの融合ポリペプチドにおいてもＭタンパク質又はSpaタンパク質からの免疫原性ペプチドが表れなかったＧＡＳ血清型の半分以上に対して、殺菌性であった。この改良された効力は、他の多価組成物を用いて既に記載された結果に基づいて、当業者が予測したものより大きい。すでに記載された２６価ワクチン（例えば、米国特許第７，３７０，８２７号；Hu et al、前出、を参照）と比較すると、本明細書に記載の免疫原性ペプチドの特定の組合せは、より多くの非ワクチンＧＡＳ血清型を認識した（実施例４を参照）。２６価ワクチンには含まれなかった本明細書に記載の３０価の免疫原性組成物に示された血清型は、ＧＡＳ Ｍ血清型４、２９、５８、４４、４９、７３、７８、８１、８２、８３、８７、１１８を含む。本明細書に記載の組成物中の免疫原性ペプチドで示されなかった２６価組成物中の血清型は、ＧＡＳ Ｍ血清型１．２、１３、３３、４３、５９、７６、及び１０１を含む。
【０１００】
２つの異なる免疫原性ペプチドは、直接タンデムに連結されて二量体ペプチド（ジペプチドとも呼ばれる）を形成し、これは、ある態様において、免疫原性ペプチドに特異的な抗体を検出するのに有用である。二量体ペプチドは、本明細書及び当該分野で記載のように、当該分野でルーチンに使用されている方法と技術（例えば、Hu et al、前出、を参照）に従って、組換え法で産生される。あるいは、二量体ペプチドは、本明細書と当該分野で記載されている方法に従って化学合成される。二量体ペプチドは、本明細書に記載の任意の２つの異なる免疫原性ペプチドからなってよい。例えば、二量体ペプチド（これは、免疫原性二量体ペプチドを含む）は、２つの２免疫原性ペプチドからなり、二量体ペプチドの各ペプチドは相違すると共に、異なるＭタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸からなり、ＧＡＳ血清型１、２、３、４、５、６、１１、１２、１４、１８、１９、２２、２４、２８、２９、４４、４９、５８、７３、７５、７７、７８、８１、８２、８３、８７、８９、９２、１１４、及び１１８のＭタンパク質から独立に選択され、Spaタンパク質はＧＡＳ血清型１８から選択される。
【０１０１】
免疫原性ペプチドと融合ポリペプチドの産生
これらの免疫原性ペプチドを含むＡ群連鎖球菌の異なる血清型からのＭタンパク質又はSpaタンパク質と、融合ポリペプチドとのアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を含む免疫原性ペプチドが、本明細書に提供される。免疫原性ペプチド、免疫原性二量体ペプチド（すなわち、２つの異なる免疫原性ペプチドを含むポリペプチド）、及び融合ポリペプチドの各々は、組換え法で産生されるか、又は化学合成してもよい。あるいは、個々の免疫原性ペプチド、免疫原性二量体ペプチド、及び融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、組換え法で構築されるか、又は化学合成され、構築又は合成されたポリヌクレオチドは、発現ベクターが導入されている宿主細胞中で、ペプチド、二量体ペプチド、又は融合ポリペプチドの産生のための発現ベクター中に取り込まれてもよい。
【０１０２】
ペプチド及びポリペプチドは、用手法又は自動化法により化学合成してもよい。自動化ペプチド合成装置は、Perkin-Elmer, Inc.やApplied BioSystems Division (Foster City, CA)のような業者により販売されており、製造業者の説明書に従って操作することができる。例えば、固相ペプチド合成は、１９６０年代初頭から行われている（例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)を参照）。合成法には無数の改良法が開発されており、多くの方法は自動化されており、末端及び他の反応性基を保護するための化学が開発されている（例えば、Geysen et al, J. Immun. Meth. 102:259-274 (1987); Miranda et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1181-86 (1999); Frank et al, Tetrahedron 44:6031-6040 (1988); Hyrup et al, Bioorg. Med. Chem. 4:5-23 (1996); Perry-O'Keefe et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-675 (1996); Schnolzer, et al. Int. J. Pept. Protein Res. 40, 180-193 (1992); Hackeng et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:7845-50 (1997); Creighton, T. E. Protein: Structures and Molecular Properties, pp. 55-60, W. H. Freeman and Co., New York, NY (1984)）。自動合成を実施するための装置は、多くの製造業者から入手できる。合成されたペプチド、二量体ペプチド、及び融合ポリペプチドは、多くの異なるカスタムペプチド合成業者のいずれからでも得ることができる。必要であれば、合成されたペプチド又はポリペプチドは、分取逆相クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル電気泳動、又はイオン交換クロマトグラフィー、又は当該分野で使用される他の方法を使用して、精製してもよい。
【０１０３】
ポリヌクレオチドもまた、化学合成されるか、又は当業者に公知の組換え法により構築してもよい。ポリヌクレオチドはまた、自動合成機を使用して合成することもできる。ヌクレオチド配列は、所望の特定のアミノ酸配列用の適切なコドンを用いて設計することができる。一般に好適なコドンは、そこでヌクレオチド配列が発現される目的の宿主について選択される。ポリヌクレオチドを調製するための１つの組換え法は、完全なコード配列を与えるために、標準的方法により調製される重複するオリゴヌクレオチドからの集成体を含む（例えば、Au et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 248:200-203 (1998); Stemmer et al, Gene 164:49-53 (1995); Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, (Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., 1993)); Sambrook et al, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., (Cold Spring Harbor Laboratory 2001などを参照）。化学合成後又は組換え合成後にポリヌクレオチドを精製する方法は、当業者に公知である（例えば、Ausubel et al, 前出; Sambrook et al、前出、を参照）。
【０１０４】
プライマーやプローブ用のオリゴヌクレオチドの化学合成は、当該分野において昔から行われている（例えば、Letsinger et al, J. Am. Chem. Soc. 98:3655-61 (1976); Matteucci et al, J. Am. Chem. Soc. 103:3185-9 (1981)を参照）。より迅速な結果と高い収率と長いポリヌクレオチドを提供するオリゴヌクレオチドとポリヌクレオチドを合成するための改良法が、開発され自動化されている（例えば、Gao et al, Biopolymers 73:579-96 (2004); Mueller et al, Chem. Biol. 16:337- 47 (2009); Lee et al, Nucleic Acids Res. 38:2514-21 (2010)を参照）。本明細書に記載の免疫原性ペプチド、二量体ペプチド、及び融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、商業的に合成してもよい（例えば、GENSCRIPT, Piscataway, NJを参照）。
【０１０５】
本明細書に記載の免疫原性ペプチド、二量体ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、種々の異なる宿主細胞中で組換え法で発現してもよい。組換え発現構築体を含有する宿主細胞は、ベクター及び／又は発現構築体（例えば、クローニングベクター、シャトルベクター、又は発現構築体）を用いて、遺伝子工学的に作成される（形質導入、形質転換、又はトランスフェクションされる）。ベクター又は構築体は、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形でもよい。工学作成された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択、又は特定の遺伝子もしくはコーディングヌクレオチド配列の増幅に適するように修飾された従来の栄養培地で培養することができる。特定の宿主細胞の培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）の選択と維持は、当業者には明らかであろう。一般に、所望の宿主細胞は、充分量のペプチド、二量体ペプチド、又は融合ポリペプチドを発現することができる安定な細胞株を与えるように、培養物中での持続的増殖ができるように改変できるものである。ある態様において、細胞株は不死細胞株であり、これは、対数増殖期後の培養物中で繰り返し継代できる（生存能力を保持しながら、少なくとも１０回）細胞株をいう。他の形態において、細胞株を作成するために使用される宿主細胞は、無制限な増殖が可能な細胞株、例えば癌細胞、形質転換された細胞、又は悪性腫瘍細胞である。
【０１０６】
有用な細菌発現構築体は、機能性プロモーターを有する機能性読み枠中に、適切な翻訳開始及び転写開始シグナルとともに、所望のペプチド又はポリペプチドをコードする構造ＤＮＡ配列を、発現ベクター中に挿入することにより調製される。この構築体は、１つまたはそれ以上の表現型選択マーカーと、ベクター構築の維持を確実にし、所望であれば宿主内での増幅を提供する複製開始点とを含んでよい。形質転換のための適切な原核生物宿主は、大腸菌（E. coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、及びシュードモナス（Pseudomonas）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、及びブドウ球菌（Staphylococcus）属内の種々の種を含むが、他の種も選択事項として使用される。他のプラスミド又はベクターも、宿主中で複製可能であり生存能力を有する限り、使用することができる。すなわち、例えば、ここで提供されるポリヌクレオチドは、種々の発現ベクター構築体のいずれにも、ペプチド、二量体ペプチド、又は融合ポリペプチドを発現するための組換え発現構築体として、含まれてもよい。そのようなベクター及び構築体は、染色体性、非染色体性、及び合成のＤＮＡ配列、例えば細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドやファージＤＮＡの組合せから誘導されるベクター；ウイルスＤＮＡ、例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、及び仮性狂犬病ウイルスを含む。
【０１０７】
適切なＤＮＡ配列は、当業者に公知の種々の方法により、ベクター中に挿入することができる。ある例では、ＤＮＡ配列は、当該分野で公知の方法により、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。特に、本明細書に記載の融合ポリペプチドは、融合ポリペプチドを含む免疫原性ペプチドのいずれにおいても、制限酵素部位が欠如している。制限部位と制限部位にコードされるアミノ酸配列の脱落は、所望の免疫原性エピトープが改悪されるか又はエピトープが不注意に付加されて好ましくない免疫原性を有する可能性（例えば、通常のヒトタンパク質を認識する抗体の産生を含む）を排除することを意図する。クローニング、ＤＮＡ単離、増幅、及び精製のための、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む酵素反応のための標準的方法、及び種々の分離法は、当業者に公知で一般的に使用されているものである（例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., 1993)、及びSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., (Cold Spring Harbor Laboratory 2001)）。
【０１０８】
発現ベクター中のペプチド又はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、少なくとも１つの適切な発現制御配列（例えば、プロモーター又は制御されたプロモーター）に機能できる形で結合して、ｍＲＮＡ合成を指令する。そのような発現制御配列の代表例は、ＬＴＲ又はＳＶ４０プロモーター、大腸菌（E. coli）ｌａｃ又はｔｒｐ、ファージラムダＰＬプロモーター、及び原核生物もしくは真核生物又はこれらのウイルス中の遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターがある。プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクター又は選択マーカーを有する他のベクターを使用して、所望の遺伝子から選択することができる。具体的なプロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ５、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ＰＬ、及びｔｒｐを含む。適切なベクターやプロモーターの選択、及び本明細書に記載のポリヌクレオチドに機能できる形で結合している少なくとも１つのプロモーター又は制御されたプロモーターを含むいくつかの組換え発現構築体の調製は、当該分野における通常の技術レベル内である。
【０１０９】
誘導性に制御されたプロモーター及び／又は厳密に制御されたプロモーターの設計と選択は、当該分野で公知であり、具体的な宿主細胞と発現系とに依存するであろう。ｐＢＡＤ発現系（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）は、大腸菌（E. coli）アラビノースオペロン（ＰＢＡＤ又はＰＡＲＡ）（例えば、Guzman et al, J. Bacteriology 177:4121-30 (1995); Smith et al, J. Biol. Chem. 253:6931-33 (1978); Hirsh et al, Cell 11 :545-50 (1977)を参照）を使用する厳密に制御された発現系の例であり、これは、アラビノース代謝経路を制御する。この系を使用するベクターベクターが市販されている。厳密に制御されたプロモーターに駆動される発現系の他の例は、Stratagene (La Jolla, CA)から入手できるＰＥＴ発現系（米国特許第４，９５２，４９５号を参照）、又はｔｅｔ制御された発現系（Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-51 (1992); Gossen et al, Science 268: 1766-69 (1995)）を含む。ｐＬＰ−ＴＲＥ２アクセプターベクター（BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA）は、CLONTECHのCreator（登録商標）キットとともに使用するように設計されており、部位特異的Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え系（例えば、Sauer, Methods 14:381-92 (1998); Furth, J. Mamm. Gland Biol. Neoplas. 2:373 (1997)を参照）を使用して、目的の遺伝子の厳密に制御された誘導性発現のための、テトラサイクリン制御発現構築体を迅速に作成し、これはまた宿主細胞の不死化にも使用される（例えば、Cascio, Artif. Organs 25:529 (2001)を参照）。
【０１１０】
融合ポリペプチドの例（配列番号１〜４）をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１３、１７、２１、及び２５（配列番号１を含む融合ポリペプチドをコードする）、配列番号１４、１８、２２、及び２６（配列番号２を含む融合ポリペプチドをコードする）、配列番号１５、１９、２３、及び２７（配列番号３を含む融合ポリペプチドをコードする）、及び配列番号１６、２０、２４、及び２８（配列番号４を含む融合ポリペプチドをコードする）に与えられる。配列番号２５、２６、２７、及び２８の各々は、制御配列、開始メチオニン残基をコードするコドン、及びポリヒスチジンタグをコードするコドンが欠如している。配列番号２１、２２、２３、及び２４の各々は、各融合ポリペプチドの開示メチオニン残基をコードするヌクレオチド配列を含むが、発現制御配列とポリヒスチジンタグをコードする配列とが欠如している。配列番号１７、１８、１９、及び２０の各々は、発現制御配列、開示メチオニン残基をコードするコドン、及びポリヒスチジンタグをコードするコドンを含む（また、図２Ａ、２Ｃ、２Ｅ、及び２Ｆを参照）。配列番号１３、１４、１５、及び１６の各々は、発現制御配列と開示メチオニン残基をコードするコドンを含むが、ポリヒスチジンタグをコードするコドンが欠如している。
【０１１１】
Ｍタンパク質とSpaタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例は、本明細書に記載のように公のデータベースから容易に得ることができる（例えば、GenBank; GenEBML; CDC emm typing center ウェブサイト、インターネットで cdc.gov/ncidod/biotech/strep/emmtypesでアクセスできる）。Ｍタンパク質変種又はSpaタンパク質変種のヌクレオチド配列（又は、Ｍタンパク質変種又はSpaタンパク質変種のアミノ末端部）は、変種をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、特定のＭタンパク質又はSpaタンパク質をコードする本明細書に記載の又は当該分野で公知のポリヌクレオチドと、本明細書に記載の及び当該分野で使用されている整列アルゴリズムの１つを使用して比較することにより、決定及び／又は同定することができる。こうして２つのポリヌクレオチド間の同一性パーセントを容易に決定することができる。一致が最大になるように整列した時に２つの配列のヌクレオチド残基が同じである場合、ポリヌクレオチドは１００％のヌクレオチド配列同一性を有する。具体的態様において、Ｍタンパク質免疫原性ペプチド変種をコードするポリヌクレオチド又はSpaタンパク質免疫原性ペプチド変種をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列、又はそこから免疫原性ペプチドが誘導されるＭタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部をコードするＭタンパク質又はSpaタンパク質のポリヌクレオチドの領域のヌクレオチド配列は、各Ｍタンパク質とSpaタンパク質の免疫原性ペプチド（本明細書に記載される）をコードするポリヌクレオチド配列の１つまたはそれ以上と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９８％同一である。ポリヌクレオチド変種はまた、遺伝コードの縮重のためにヌクレオチド配列同一性が異なり、かつ本明細書に記載の又は当業者に公知のアミノ酸配列を有するＭタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部をコードするヌクレオチド配列とは異なるポリヌクレオチドを含む。コーディングポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド配列は、当業者が容易に決定することができる。免疫原性ペプチド又はその変種をコードするいくつかのポリヌクレオチドはまた、プローブ、プライマー、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＡ）、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドとしても使用できる。ポリヌクレオチドは、１本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ（コーディング又はアンチセンス）又は２本鎖ＲＮＡ（例えば、ゲノム又は合成）、又はＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ又は合成）でもよい。
【０１１２】
ポリヌクレオチド変種は、本明細書に記載の及び当該分野の整列法により、及びハイブリダイゼーション法により同定することができる。２つのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、適切な中程度の厳密条件、例えば、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液で前洗浄し、５０℃〜７０℃、５×ＳＳＣで１〜１６時間ハイブリダイズし、次に０．０５〜０．１％ ＳＤＳを含有する２×、０．５×、及び０．２×ＳＳＣの１つまたはそれ以上を用いて、２２〜６５℃で２０〜４０分、１回又は２回洗浄する方法を使用して行うことができる。さらなる厳密性のためには、条件は、０．１×ＳＳＣと０．１％ ＳＤＳ中で５０〜６０℃で１５分の洗浄を含む。当業者には理解されるように、ハイブリダイゼーション条件の厳密性の変化は、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、及び洗浄工程で使用される時間、温度、及び／又は溶液の濃度を変化させることにより行われる。適切な条件はまた、一部は使用されるプローブの具体的なヌクレオチド配列（すなわち、例えばグアニン＋シトシン（Ｇ／Ｃ）対アデニン＋チミジン（Ａ／Ｔ）含量）に依存することもある。従って、プローブの所望の選択性が特定されるなら、過度の実験をすることなく、適切な厳密性条件を容易に選択できることを、当業者は理解するであろう。
【０１１３】
所望であれば、免疫原性ペプチド変種と融合ポリペプチド変種は、遺伝子工学と組換え分子生物学の方法及び技術により、容易に調製できる。免疫原性ペプチド又は融合ポリペプチドの１次及び２次アミノ酸配列を解析しそれをコンピューターモデル化し、ポリペプチドの３次構造を解析することは、構造を変化させることなく置換、付加、又は欠失できるアミノ酸残基を同定することを助け、従ってペプチド又はポリペプチドの免疫原性の同定することを助けるであろう。免疫原性ペプチド又は融合ポリペプチド変種をコードするポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）の修飾は、ＤＮＡの部位特異的又は部位指令突然変異誘発を含む種々の方法（これらの方法は、重複伸長によるＰＣＲスプライシングのような、ＤＮＡ鋳型に変化を導入し増幅するためのプライマーを使用するＤＮＡ増幅を含む）により行われる。変異は、非変種配列の断片への連結を可能にする制限部位が両側に位置する変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の位置に導入してもよい。連結後、生じる再構成された配列は、所望のアミノ酸挿入、置換、又は欠失を有する変種をコードする。本明細書に記載のように、突然変異誘発操作中に制限部位が導入される時、不要なエピトープを導入する可能性を下げるために、コードされるペプチド又は融合ポリペプチド中の制限部位のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸の含有は避けられる。
【０１１４】
免疫原性ペプチド又は融合ポリペプチドの変種をコードするようなポリヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発は、本明細書に記載の及び当該分野で実施されている多数の方法のうちのいずれかに従って行われる（Kramer et al, Nucleic Acids Res. 12:9441 (1984); Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92 (1985); Kunkel et al, Methods Enzymol. 154:367-82 (1987)）。変異（例えば、置換又は欠失）された時、リガンド（例えば、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体）への免疫原性ペプチド又は融合ポリペプチドの結合を変化させる残基を同定するためのランダム突然変異誘発法もまた、当業者によりルーチンに実施されている方法に従って行われる［例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発；エラーの起きやすいポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発；及びオリゴヌクレオチド指令突然変異誘発（例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (2001)を参照）］。免疫原性ペプチド又は融合ポリペプチドの変種が、ＧＡＳに対する免疫応答を誘導するための免疫原性組成物の使用と目的とする時、変種は好ましくは、実質的に同様の方法（すなわち、統計的、生物学的、又は臨床的に有意な方法）で、非変種の免疫原性ペプチド又は融合ポリペプチドとして特異抗体に結合し、ＧＡＳ細菌に結合しかつ細菌性である抗体の産生を誘発する。
【０１１５】
免疫原性ペプチド及び融合ポリペプチドの性状解析
本明細書で詳述されるように、免疫原性ペプチド及び免疫原性ペプチドを含む融合ポリペプチドは、ヒトのＧＡＳ感染症を引き起こす大部分のＧＡＳ血清型に対する免疫応答（特に防御性免疫応答）を誘導するための免疫原として使用することが意図される。免疫原性ペプチド及び融合ポリペプチドの免疫原性を決定し性状解析するために、当業者によりルーチンに実施されている方法に従って、イムノアッセイ、食作用、及び殺菌活性アッセイ、及び動物試験のいくつでも使用することができる。対象に投与される免疫原性組成物の安全性を評価するための追加の前臨床的試験が、典型的に行われる。最終的には、本明細書に記載の免疫原性ペプチド又は融合ポリペプチドを含む免疫原性組成物の安全性と効力は、規制機関によりモニターされる臨床試験により決定されるであろう。
【０１１６】
免疫原性ペプチド又は融合ポリペプチド（又はこれを含む免疫原性組成物）の免疫原性は、本明細書に記載の及び当該分野の免疫プロトコールに従って、宿主（又は対象、患者）に本明細書に記載の免疫原性組成物を投与することにより決定してもよい。典型的には、初期用量の免疫原性組成物を宿主に投与（１次免疫とも呼ばれる）後、免疫原性組成物の１回、２回、又はそれ以上の用量（追加用量又はブースター用量とも呼ばれる）が投与される。
【０１１７】
一般に、動物での前臨床的試験中に、免疫された宿主の免疫応答をモニターするために、最初の投与前（すなわち、免疫前血清）かつ最後の追加投与後に、動物から血清が得られる。血清はまた、初期投与と最終的追加投与の間の１回以上の追加投与後に得てもよい。臨床試験又は市販後調査中に、免疫された宿主の免疫応答をモニターするために、最初の免疫前に、及び免疫原性組成物の１回またはそれ以上の投与後に、血清を得てもよい。
【０１１８】
免疫原性ペプチド（及び、融合ポリペプチド、二量体ペプチド、完全長もしくは成熟タンパク質、又はこのタンパク質を発現するＧＡＳ細菌）に特異的に結合する抗体は、いずれかの免疫グロブリンクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＡ）に属してもよい。本明細書に記載の免疫原性ペプチド及び融合ポリペプチドの性状解析のために、ポリクローナル抗体及び／又はモノクローナル抗体の使用が好ましい。抗体は、動物、例えば家禽（例えば、ニワトリ）、及び哺乳動物（これは、特に限定されないが、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又は他のげっ歯動物、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ヒト、又は他の霊長類）から得られるか又は誘導されてよい。本明細書に記載のように、１つの免疫原性ペプチド、複数の免疫原性ペプチド、又は融合ポリペプチドもしくは複数の融合ポリペプチドを含む免疫原性組成物を用いて動物を免疫することにより、動物から、ポリクローナル抗血清が得られる。
【０１１９】
免疫された宿主（ヒト宿主を含む）中の免疫原性ペプチド特異的抗体の産生は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、及び／又はＩｇＥを含む任意のクラスの免疫グロブリン、及びこれらのクラス内のイソタイプの産生を含んでよい。特異的ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、及びＩｇＡ（特に粘膜分泌物中）の存在は、免疫された宿主から得られる生物学的試料（例えば、血清、鼻洗浄液、肺洗浄液、又は他の組織）で検出してもよい。イムノアッセイにおける免疫原性ペプチド特異的及びＧＡＳ特異的抗体の検出のために、生物学的試料は、精製され、単離され、部分的に単離された抗原と、又はその断片と相互作用もしくは接触されるか、又は固定（エタノール又はホルムアルデヒドで）されているか又は固定されていないか又は変性されていない微生物と、相互作用もしくは接触されてもよい。粘膜分泌物は、呼吸器（鼻咽頭及び肺を含む）から採取されるものを含む。免疫原特異的抗体が、ＧＡＳの食作用もしくはオプソニン作用を促進するか、又はＧＡＳの増殖を阻害するか、又は細菌を死滅させるか、又は宿主細胞へのＧＡＳの侵入を防ぐ能力のような、機能的アッセイを実施することもできる。そのような方法は、本明細書に記載されており、当業者によりルーチンに実施されている。
【０１２０】
免疫血清（すなわち、免疫原性組成物の１回またはそれ以上の投与により免疫後の宿主から得られる血清）又は他の生物学的試料は、免疫原性組成物（融合ポリペプチド中に取り込まれるものを含む）に含まれる任意の１つまたはそれ以上の免疫原性ペプチドに特異的に結合する抗体（免疫グロブリン）の存在について評価することができる。本明細書に記載のイムノアッセイのような、生物学的試料中の特異抗体の存在を検出するためのアッセイもまた、成熟もしくは完全長Ｍタンパク質又はSpaタンパク質、及び／又はＧＡＳ細菌全体を使用してもよい。免疫原性組成物中の免疫原性ペプチドで示されるＧＡＳ血清型に免疫血清中の抗体が結合するレベル、及び組成物中の免疫原性ペプチドで示されないＧＡＳ血清型（非ワクチンＧＡＳ血清型とも呼ばれる）に抗体が結合するレベルを、測定してもよい。免疫原性ペプチド、融合ポリペプチド、Ｍタンパク質、Spaタンパク質、又はＧＡＳ細菌に抗体が結合するレベル（典型的には、力価と呼ばれる）は、当業者によりルーチンに実施されている任意の１つまたはそれ以上のイムノアッセイを使用して、容易に測定することができる。非限定例として、イムノアッセイは、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学、蛍光活性化細胞ソーター解析（ＦＡＣＳ）、オクタロニーなどを含む。イムノアッセイは、免疫原性組成物に含まれ、アッセイで使用される１つまたはそれ以上の免疫原性ペプチド（例えば個々の免疫原性ペプチド、二量体ペプチド、又は融合ポリペプチド）を使用して行ってもよい。
【０１２１】
ある態様において、抗体を検出するための方法が提供され、この抗体は、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体でもよく、いずれのクラスもしくはイソタイプでもよく、本明細書に記載の生物学的試料中に存在するかもしくは存在が疑われるものでもよく、この抗体は、任意の免疫原性ペプチド（例えば、配列番号２９〜５９の何れか１つのアミノ酸配列を含む免疫原性ペプチドを含む）、二量体ペプチド、融合ポリペプチド（配列番号１、２、３、４、及び配列番号５〜１２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドなどの、本明細書に記載の融合ポリペプチド例の任意の１つを含む）に結合する。この方法は、生物学的試料に、本明細書に記載の免疫原性ペプチド、二量体ペプチド、又は融合ポリペプチドを、試料中の抗体が、ペプチド、二量体ペプチド、又は融合ポリペプチドと相互作用するのに充分な条件下かつ時間、接触させること（すなわち、混合、組合せ、又は生物学的試料と免疫原性ペプチド、融合ポリペプチド、もしくは二量体ペプチドが相互作用することを可能にする何らかの方法）を含む。ペプチド、二量体ペプチド、又は融合ポリペプチドに特異的に結合する生物学的試料中に存在する抗体は、抗体−抗原結合を検出するための本明細書に記載の及び当該分野の検出法の例のいずれか１つを使用して、検出することができる。非限定例として、ペプチド、二量体ペプチド、又は融合ポリペプチドに結合した抗体は、抗体のＦｃ部分などの抗体の保存領域に特異的な試薬を使用して検出することができ、この試薬は典型的には抗体の起源に依存して（すなわち、抗体が、マウス、ラット、ヤギ、又はヒツジなどの動物由来であるか、又は抗体がヒト由来であるかにより）選択される。このような試薬は典型的には、検出可能な標識物、例えば酵素、蛍光標識物、発光標識物、又は放射性標識物を含む。試薬の追加の例は、抗体の特異的イソタイプ又はクラスを検出するものである。このような試薬の多くは、市販品から得られる。
【０１２２】
免疫前血清及び免疫血清内の抗体の完全性、及びアッセイに使用される抗原（これは、免疫原性ペプチド、二量体ペプチド、又は融合ポリペプチド、Ｍタンパク質、Spaタンパク質、又は細菌でもよい）の完全性を維持する、温度、緩衝液（塩、カチオン、培地を含む）を含む具体的なアッセイの条件は、当業者に公知であり、及び／又は容易に決定することができる。血清などの生物学的試料は、抗原と試料中の抗体との相互作用を可能にするのに充分な条件かつ時間、抗原と接触（混合、組合せ、又は相互作用を可能にする何らかの方法）させられる。免疫血清試料（又は他の生物学的試料）中に存在する抗体への抗原の相互作用、又は結合レベルを測定し、免疫前の試料（又は他の適切な陰性対照）中に存在する抗体に各抗原が結合するレベルと比較してもよい。免疫前の血清試料と比較して、免疫血清試料への抗原の結合レベルが上昇していることは、免疫原性組成物が特異抗体の産生を誘発したことを示す。本明細書に記載のように、免疫された宿主からの試料中の抗体への免疫原の結合レベルは、当該分野において典型的には力価と呼ばれる。
【０１２３】
特異的抗原への抗体の相互作用又は結合は、一般的には静電的相互作用、水素結合、ファンデアワールス相互作用、及び疎水性相互作用を含む。抗体とその抗原との結合では、これらのいずれか又はその組合せが関与している。本明細書において、抗体が反応性免疫原と検出可能なレベルで、好ましくは親和性定数Ｋａが、約１０4 Ｍ-1か又はそれ以上、約１０5 Ｍ-1か又はそれ以上、約１０6 Ｍ-1か又はそれ以上、約１０7 Ｍ-1か又はそれ以上、又は約１０8 Ｍ-1か又はそれ以上で、反応する時、抗体は、免疫原性ペプチド、免疫原性ペプチドを含む融合ポリペプチド、Ｍタンパク質、Spaタンパク質、又はＧＡＳ細菌に、「特異的」であるか又は「特異的に結合」すると言われる。同族のリガンド（この場合、免疫原性ペプチド、融合ポリペプチド、Ｍタンパク質、Spaタンパク質、又は細菌）に結合する抗体の能力はまた、解離定数ＫDとして表わしてもよく、ＫＤが、１０-4 Ｍか又はそれ以下、約１０-5 Ｍか又はそれ以下、約１０-6 Ｍか又はそれ以下、約１０-7 Ｍか又はそれ以下、又は約１０-8 Ｍか又はそれ以下で結合するなら、抗体はその同族のリガンドに特異的に結合と言われる。
【０１２４】
免疫原性ペプチド又は免疫原性ペプチドを含むポリペプチド（例えば、本明細書に記載の融合ポリペプチド）に対する抗体の親和性は、例えばScatchard et al. (Ann. N. Y. Acad. Sci. USA 51 :660 (1949)) により記載された方法、及び表面プラズモン共鳴(SPR; BIAcore(TM), Biosensor, Piscataway, NJ)を使用して、容易に測定することができる。表面プラズモン共鳴については、標的分子は固相に固定化され、フローセルに沿って流れる移動相中でリガンドに暴露される。固定化された標的へのリガンドの結合が起きると、局所的な屈折率が変化して、ＳＰＲ角度の変化が起き、これは、反射光の強度の変化を検出することによりリアルタイムでモニターすることができる。ＳＰＲシグナルの変化速度を分析して、結合反応の結合期と解離期の見かけの速度定数を得ることができる。これらの値の比は、見かけの平衡定数（親和性）を与える（例えば、Wolff et al, Cancer Res. 53:2560-65 (1993)を参照）。
【０１２５】
本明細書に記載の及び当該分野でルーチンに実施されているいくつかのインビトロアッセイは、本明細書に記載の免疫原性及び融合ポリペプチドにより誘発される特異抗体の活性を測定するために使用することができる。アッセイ例は、オプソニン食作用アッセイであり、これは、抗血清中に存在するオプソニン抗体の存在により促進される食作用を検出する。簡単に説明すると、このアッセイは、免疫血清の存在下で細菌をプレインキュベートした後、好中球による細菌の食作用レベルを測定する。免疫前又は他の適切な陰性対照もまた、このアッセイ中に含まれる。プレインキュベートした細菌は次に、オプソニン防御が求められる宿主（例えば、ヒト）などの適切な宿主からの全血と混合されて、細菌細胞と結合する好中球のパーセント（これは、オプソニン抗体により促進された食作用活性の尺度である）が決定される。免疫血清とプレインキュベートした細菌に結合した好中球のパーセントは、免疫前血清（又は、抗ＧＡＳ抗体を含有しないと考えられるか又はこれがわかっている他の適切な血清）とプレインキュベートされる細菌と結合した好中球のパーセントと比較することができる。免疫前血清とプレインキュベートした細菌と結合した好中球のパーセントと比較して、免疫血清とプレインキュベートした細菌と結合した好中球のパーセントが大きいこと（すなわち、統計的、生物学的、又は臨床的に有意に上昇したパーセント）は、試験免疫血清がオプソニン抗体を含有することを示す。
【０１２６】
試料中に存在する抗体の殺菌活性を決定するインビトロアッセイの別の例は、殺菌活性アッセイである（例えば、Hu et al、前出；本明細書の実施例を参照）。ＧＡＳ細菌は免疫血清、又は適切な対照血清（例えば、免疫前血清）とともにインキュベートされ、次にＧＡＳの増殖を可能にする培地（例えば、ヒツジ血液寒天）上に置かれる。典型的には、一晩インキュベート後、生存能力のある細菌の数を定量し、結果は死滅パーセントとして表される。死滅パーセントを表すための間接的な殺菌活性アッセイで一般的に使用される式は、［（免疫前血清でプレインキュベートした細菌試料のＣＦＵ（コロニー形成単位）−（免疫血清でプレインキュベートした細菌試料のＣＦＵ）÷免疫前血清でプレインキュベートした細菌試料のＣＦＵ］×１００である。
【０１２７】
オプソニン化、食作用、及び殺菌活性アッセイは、抗ＧＡＳ予防的及び治療的処置の可能性の性状解析のための、当該分野に認められているインビトロ動物モデルである。予防的又は治療的使用のためのワクチンの有用性を当業者に示唆する１つまたはそれ以上のこれらのアッセイで得られる結果は、臨床試験の知見により支持される（例えば、米国特許第７，２７０，８２７号；Kotloff et al, 前出; McNeil et al, 前出）。免疫原性ペプチド、融合ポリペプチド、及びこれらを含む免疫原性組成物の免疫原性を性状解析するために使用できる動物モデルは、異なる免疫療法モデル（すなわち、動物は可能性のある免疫原性組成物候補で免疫され、次にＧＡＳで抗原刺激される）と考えられているもの、及び間接又は受動免疫療法モデル（すなわち、ＧＡＳ抗原に特異的な免疫原性組成物候補又はモノクローナル抗体で免疫した動物から得られた抗血清、又は抗血清から精製され単離された抗体は、ＧＡＳ抗原刺激細菌の前に、又はこれと同時に投与される）と考えられているものを含む。
【０１２８】
非侵襲性ＧＡＳ疾患（例えば咽頭炎）を模倣する動物モデルは、げっ歯動物モデルで樹立することは困難であった。ＧＡＳ膿痂疹を研究するためのマウスモデルが、Scaramuzzino et al. (Infect. Immun. 68:2880-87 (2000))により記載されている。咽頭炎を研究するために開発が成功している非ヒト霊長類モデルは、ヒトの疾患を模倣する急性咽頭炎のマカクザル（cynomolgus macaque）を含む（例えば、Ashbaugh et al, Cellular Microbiol. 2:283-92 (2000); Sumby et al, in Meth. Molec. Biol. 431 :255-67 (DeLeo et al. (ed.) Humana Press, Totowa NJ (2008))を参照）。当該分野で入手できる他の動物モデルは、侵襲性軟組織感染（例えば、Ashbaugh et al, J. Clin. Investig. 102:550-60 (1998); Boyle et al, J. Infect. Dis. 177:991-97 (1998)を参照）、敗血症（例えば、Goldmann et al, J. Inf. Dis. 187:854-61 (2003); Kapur et al, Microbiol. Pathogenesis 16:443-50 (1994); Medina et al, J. Infect. Dis. 184:846-52 (2001)）、及び壊死性筋膜炎（Patel et al, J. Inf. Dis. 181 :230-34 (2000)を参照）などの侵襲性疾患の治療薬及び予防薬を評価するために開発されている。
【０１２９】
免疫原性ペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体（及び、かかるポリクローナル抗体を含む免疫血清）は、本明細書に記載され当業者によりルーチンに実施されている方法を使用して調製することができる（例えば、Green et al., "Production of Polyclonal Antisera," in Immunochemical Protocols (Manson, ed.), pages 1-5 (Humana Press 1992); Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Williams et al, "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 15 (Oxford University Press 1995)）。また、例えば米国特許第７，２７０，８２７号、６，７１６，４３３号、７，４０２，３１６号、７，０６３，８５０号を参照。ポリクローナル抗体は典型的には、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウシ、又はヒツジなどの動物で作成されるが、抗体はまた、ヒトに近い霊長類由来でもよい。ヒヒを免疫するための一般的方法は、例えば、国際特許出願公報ＷＯ９１／１１４６５（１９９１）、及びLosman et al, Int. J. Cancer 46: 10, 1990に見いだされる。
【０１３０】
免疫原性ペプチド、二量体ペプチド、融合ポリペプチド、又はこれらを含む免疫原性組成物の任意の１つので免疫される非ヒト動物は、非限定例として、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、フェレット、イヌ、ネコ、ラクダ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ニワトリ、及び非ヒト霊長類（例えば、マカクザル（cynomolgus macaque）、チンパンジー、アカゲザル（rhesus monkey）、オランウータン、及びヒヒ）を含む。本明細書に記載のの免疫原性組成物の任意の１つのは、非経口（例えば、静脈内）、腹腔内、筋肉内、皮内、眼内、又は皮下経路により、動物を免疫するために投与されてもよい。免疫原性組成物はさらに、免疫原に対する免疫応答を増強するための適切なアジュバントを含んでよい。例えば、Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)を参照。非ヒト動物の免疫のために典型的に使用されるアジュバントは、特に限定されないが、フロインド完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、モンタニドＩＳＡ、Ribiアジュバント系（ＲＡＳ）（GlaxoSmithKline, Hamilton, MT）、ニトロセルロース吸着抗原を含む。一般に、最初の注射後、動物は、好適なスケジュール（これは、特に免疫原、アジュバント（もしあれば）、及び／又は具体的な動物種）に従って、１回またはそれ以上の追加免疫を受ける。免疫応答は、動物を定期的に出血させ、採取した血液から血清を分離し、血清をイムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ又はオクタロニー拡散アッセイなど）で分析して、特異抗体の力価を決定してもよい。充分な抗体力価が確立されたら、動物を定期的に出血させて、ポリクローナル抗血清を蓄積する。
【０１３１】
次に、免疫原に特異的に結合するポリクローナル抗体は、適切な固相支持体上に固定化されたプロテインＡ又はプロテインＧが固定化を使用して、親和性クロマトグラフィーにより免疫抗血清から精製してもよい（例えば、Coligan, 前出, p. 2.7.1-2.7.12; 2.9.1-2.9.3; Baines et al, Purification of Immunoglobulin G (IgG), in Methods in Molecular Biology, 10:9-104 (The Humana Press, Inc. (1992)を参照）。あるいは、特定の免疫動物種のＩｇ定常領域に特異的な抗体が適切な固相支持体上に固定化されている、親和性クロマトグラフィーが行われる。親和性クロマトグラフィーはまた、１つまたはそれ以上の免疫原性ペプチド、二量体ペプチド、又は融合ポリペプチド（これらは、特定の免疫原性ペプチドへの結合活性により、ポリクローナル抗体を分離するのに有用となり得る）の使用を含んでよい。
【０１３２】
免疫原性ペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体、及び所望の結合特異性を有するモノクローナル抗体を産生する不死化真核細胞細胞株（例えば、ハイブリドーマ）もまた、Kohler and Milsteinの方法（Nature, 25(5:495-97 (1976), Eur. J. Immunol. 6:511-19 (1975)）、及びこれらの改良法（例えば、Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1 :2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991); 米国特許第４，９０２，６１４号、４，５４３，４３９号、及び４，４１１，９９３号; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett et al. (eds.) (1980); and Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); see also, e.g., Brand et al, Planta Med. 70:986-92 (2004); Pasqualini et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 :257-59 (2004)を参照）を使用して、調製してもよい。モノクローナル抗体は、免疫原性ペプチド、融合ポリペプチド、及び複数の免疫原性ペプチド又は融合ポリペプチドを含む免疫原性組成物の免疫原性を測定しモニターするために使用することができる。
【０１３３】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物などの真核細胞培養物の上清から単離してもよい。マウスモノクローナル抗体の産生のための別の方法は、ハイブリドーマ細胞を同系マウス、例えばモノクローナル抗体を含有する腹水の生成を促進するために処理された（プリスタンでプライムされた）マウスの腹腔内に注射することである。次に採取された腹水（通常１〜３週間以内）から、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー）、ゲル濾過、沈降、抽出などの従来法により、汚染物質が除去される（例えば、Coligan, 前出, p. 2.7.1-2.7.12; 2.9.1-2.9.3; Baines et al, Purification of Immunoglobulin G (IgG), in Methods in Molecular Biology, 10:9-104 (The Humana Press, Inc. (1992)）。モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体の具体的な性質（例えば、重鎖又は軽鎖イソタイプ、結合特異性など）に基づいて選択される適切なリガンドを使用する親和性クロマトグラフィーにより精製してもよい。固相支持体に固定化された適切なリガンドの例は、プロテインＡ、プロテインＧ、抗定常領域（軽鎖又は重鎖）抗体、抗イソタイプ抗体、又はＢ細胞の供給源である動物を免疫するために使用されるペプチド又はポリペプチドを含む。
【０１３４】
所望であれば、ヒトモノクローナル抗体は、当業者が周知している多くの方法により作成してもよい。このような方法は、特に限定されないが、ヒト末梢血細胞（例えば、Ｂリンパ球を含む）のエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）形質転換（例えば、米国特許第４，４６４，４５６号；Glasky et al, Hybridoma 8:377-89 (1989)を参照）、ヒトＢ細胞のインビトロ免疫、ヒト免疫グロブリン遺伝子が挿入された免疫されたトランスジェニックマウスからの脾細胞の融合、ヒト免疫グロブリンＶ領域ファージライブラリーの単離、又は当業者に公知の及び本明細書の開示に基づく他の方法を含む。例えば、トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、例えば、Green et al, Nature Genet. 7:13 (1994); Lonberg et al, Nature 368:856 (1994); Taylor et al, Int. Immun. 6:579 (1994); 米国特許第５，８７７，３９７号; Bruggemann et al, Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997); Jakobovits et al, Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:525-35 (1995)に記載されている。ある態様において、所望の抗体を産生しているＢ細胞が選択され、当該分野で公知（ＷＯ  ９２／０２５５１；  米国特許第５，６２７，０５２号; Babcook et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996)）の及び本明細書に記載の分子生物学的技術に従って、軽鎖及び重鎖可変領域がＢ細胞からクローン化される。またヒト化抗体を含むキメラ抗体を作成してもよい。キメラ抗体は、第１の哺乳動物種から誘導される少なくとも１つの定常領域ドメインと第２の異なる哺乳動物種から誘導される少なくとも１つの可変領域ドメインとを有する（例えば、Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851-55 (1984); Shin et al, Methods Enzymol. 178:459-76 (1989); Walls et al, Nucleic Acids Res. 21 :2921-29 (1993); U.S. Patent No. 5,482,856を参照）。非ヒト／ヒトキメラ抗体は、さらに遺伝子操作をして「ヒト化」抗体を作成してもよい（例えば、Jones et al, Nature 321 :522-25 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323-27 (1988)）。ヒト化抗体を設計することは、例えばコンピューターモデル化により、非ヒト可変領域のＣＤＲループコンフォメーションと構造決定基を決定し、次にＣＤＲループ及び決定基を、既知のヒトのＣＤＲループ構造及び決定基と比較することを含む（例えば、Padlan et al, FASEB 9: 133-39 (1995); Chothia et al, Nature, 342:377-83 (1989); Bajorath et al., Ther. Immunol. 2:95-103 (1995); Davies et al, Ann. Rev. Biochem. 59:439-73, (1990); EP-0578515-A3を参照）。
【０１３５】
特定の用途について、抗体の抗原結合断片が好ましい場合がある。抗体断片であるＦ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、及びＦｄは、例えば抗体のタンパク質分解加水分解、例えば従来法による全抗体のペプシン又はパパイン消化により得ることができる。抗体断片はまた、当該分野の多数の方法に従って、特定の抗原に結合して複合体を形成する点で抗体のような作用する合成又は遺伝子工学的作成されてもよい（例えば、Larrick et al, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106, (1991); Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995); 及び Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al, (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)を参照）。
【０１３６】
抗体はまた、ヒト免疫グロブリンファージライブラリーから、ウサギ免疫グロブリンファージライブラリーから、マウス免疫グロブリンファージライブラリーから、及び／又はニワトリ免疫グロブリンファージライブラリーから、同定し単離してもよい（例えば、Winter et al, Annu. Rev. Immunol. 12:433-55 (1994); Burton et al, Adv. Immunol. 57: 191-280 (1994); 米国特許第５，２２３，４０９号; Huse et al, Science 246: 1275-81 (1989); Schlebusch et al, Hybridoma 16:47-52 (1997)、及びそこに引用されている文献; Rader et al, J. Biol. Chem. 275: 13668-76 (2000); Popkov et al, J. Mol. Biol. 325:325-35 (2003); Andris-Widhopf et al, J. Immunol. Methods 242: 159-31 (2000)を参照）。非ヒト種又は非ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体は、本明細書に記載の及び当該分野で公知の方法に従って遺伝子操作されて、抗体又はその断片が「ヒト化」されてもよい。免疫グロブリン可変領域遺伝子コンビナトリアルライブラリーは、ファージベクター中で作成してもよく、これはスクリーニングされて、本明細書に記載のように免疫原性ペプチドに特異的に結合するＩｇ断片（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、又はこれらのマルチマー）を選択することができる（例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；Huse et al, Science 246:1275-81 (1989); Sastry et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-32 (1989); Alting-Mees et al, Strategies in Molecular Biology 3: 1-9 (1990); Kang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363-66 (1991); Hoogenboom et al, J. Molec. Biol. 227:381-388 (1992); Schlebusch et al, Hybridoma 16:47-52 (1997) 及びそこに引用されている文献；米国特許第６，７０３，０１５号を参照）。
【０１３７】
免疫原性組成物の調製
本明細書に記載の免疫原性組成物は、対象（ヒト又は非ヒト動物）を免疫して、ＧＡＳに対する免疫応答を誘導するために使用してもよい。免疫原性組成物は、ヒト又は非ヒト動物への投与のために、組成物が医薬的に又は生理学的許容し得るかもしくは適切な組成物、調製した、又は製剤であるように調製される。免疫原性組成物は、医薬的に許容し得る（すなわち、生理学的に適切であるか又は許容される）賦形剤と組合せてもよく、これは本明細書において詳述される。医薬組成物での使用が当業者に公知である生理学的又は医薬的に適切な賦形剤又は担体（すなわち、活性成分の活性を妨害しない非毒性物質）が、本明細書に記載の組成物に使用できる。賦形剤の例は、組成物の成分の安定性と完全性を維持する希釈剤や担体を含む。賦形剤の例は、タンパク質の安定性と完全性を維持する希釈剤や担体を含む。治療用途の賦形剤は周知されており、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro, 第21版. Mack Pub. Co., Easton, PA (2005))に記載されており、これは、本明細書に詳細に記載される。賦形剤の選択は、免疫原性ペプチド又は融合ポリペプチドの安定性；投与経路；及び投与スケジュールを含むいくつかの要因に依存する。例えば、生理学的ｐＨでの食塩水やＰＢＳが使用できる。保存剤、安定剤、色素、及びさらには香味剤（経口投与される場合）を、組成物中に加えてもよい。
【０１３８】
本明細書に記載の免疫原性組成物はまた、適切なアジュバントを含んでよい。アジュバントは、免疫原性ペプチドとこのペプチドを含む融合ポリペプチドに対する免疫応答を増強（又は改善、強化）することが目的である（すなわち、アジュバントを投与しない場合の特異的免疫応答のレベルと比較して、統計的、生物学的、又は臨床的に有意に、免疫原性ペプチドに対する特異的免疫応答のレベルを上昇させる）。
【０１３９】
ヒトでの投与のために、医薬的に許容し得るアジュバントは、関連する規制組織により、ヒトへの投与が認可されているか又は許可されるものである。例えば、本明細書に記載の及び当業者に公知のように、完全フロイントアジュバントは、ヒトへの投与に適しない。所望のアジュバントは、定性的免疫応答に悪影響を与える可能性のある免疫原のコンフォメーションの変化を引き起こすことなく、免疫原性ペプチド又は融合ポリペプチドに対する応答を強化する。適切なアジュバントは、アルミニウム塩、例えばアラム（硫酸アルミニウムカリウム）、又は他のアルミニウム含有アジュバント、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、もしくは硫酸アルミニウムを含む。他の医薬的に許容し得るアジュバントは、非毒性の脂質Ａ関連アジュバント、例えば非限定例として、非毒性モノホスホリル脂質Ａ（例えば、Persing et al, Trends Microbiol. 10:s32-s37 (2002)を参照）、例えば３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（例えば、英国特許出願第ＧＢ２２２０２１１号を参照）を含む。他の有用なアジュバントは、南アメリカに存在するキラヤサポナリアモリナ（Quillaja saponaria Molina）の樹皮から単離されるトリテルペングリコシド又はサポニンを含むQS21とQuilAを含む（例えば、Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (編者 Powell and Newman, Plenum Press, NY, 1995); 米国特許第５，０５７，５４０号を参照）。他の適切なアジュバントは、例えばモノホスホリル脂質Ａのような免疫刺激物質と任意に組合わされる水中油エマルジョンを含む（例えば、Stoute et al, N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)を参照）。他の適切なアジュバントは、ポリマー性又はモノマー性アミノ酸、例えばポリグルタミン酸又はポリリジン、リポソーム、及びＣｐＧを含む（例えば、Klinman, Int. Rev. Immunol. 25(3-4): 135-54 (2006); U.S. Patent No. 7,402,572; European Patent No. 772 619を参照）。
【０１４０】
本明細書に記載の免疫原性組成物は、複数の免疫原性ペプチド又は複数の融合ポリペプチドを、少なくとも１つの医薬的に許容し得る賦形剤と組合せることにより調製してもよい。本明細書に記載のように、免疫原性組成物はさらに、医薬的に許容し得るアジュバントを含んでよい。典型的には、宿主への投与を目的とするすべての免疫原性ペプチド又はすべての融合ポリペプチドは、単一の免疫原性組成物中に一緒にされ、これは、少なくとも１つの医薬的に許容し得る賦形剤と含み、さらに医薬的に適切なアジュバントを含んでよい。あるいは、例えば多数の免疫原性組成物が、本明細書に記載の及び当該分野で公知の任意の経路でもよく、連続もしくは同時でもよい、別の投与のために調製してもよい。
【０１４１】
本明細書に記載の免疫原性組成物は、無菌の水溶液もしくは非水溶液、懸濁物、又はエマルジョンとして調製され、これは、本明細書に記載のように、生理学的に許容し得る賦形剤（これは担体とも呼ばれる）及び／又は希釈剤をさらに含んでよい。免疫原性組成物は、固体、液体、又は気体（エアゾル）の形でもよい。あるいは、本明細書に記載の免疫原性組成物は、凍結乾燥物（すなわち、凍結乾燥された組成物）として調製してもよく、又は当業者に公知の技術を使用してリポソーム内に封入してもよい。免疫原性組成物はまた、他の成分（これは、生物学的に活性でも不活性化でもよい）を含有することもできる。このような成分は、特に限定されないが、緩衝液（例えば、中性の緩衝化食塩水又はリン酸緩衝化生理食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、ショ糖、デキストラン）、マンニトール、タンパク質（例えばアルブミン）、ポリペプチド、又はグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤、安定剤、色素、香味剤、及び懸濁剤、及び／又は保存剤を含む。
【０１４２】
一般に、本明細書に記載のように、賦形剤のタイプは、投与モードに基づいて選択される。本明細書に記載の組成物と調製物は、任意の適切な投与法（例えば、局所、頬、舌、口腔、鼻腔内、髄腔内、直腸、膣、眼内、結膜下、経皮、舌下または非経口投与（皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、海綿体内、外尿道口内、または尿道内注射または注入を含む））のために製剤化される。
【０１４３】
非経口投与（例えば、皮下注射又は筋肉内注射）には、担体又は賦形剤は、好ましくは水、食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、又は緩衝液を含み、免疫原性組成物は無菌である。経口投与には、上記賦形剤のいずれか、又は、例えばマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、及び炭酸マグネシウムなどの固体担体が使用できる。生体分解性微小球（例えば、ポリ乳糖ガラクチド）ならびにナノ粒子も、本明細書に記載の組成物用の担体として使用できる。例えば米国特許第４，８９７，２６８号及び５，０７５，１０９号に記載の適切な生体分解性微小球がある。組成物又は調製物が微小球と組合せられる具体的態様において、微小球は、約２５ミクロンより大きい。本明細書に記載の免疫原性組成物は凍結乾燥されるか、又は１つまたはそれ以上の適切な賦形剤溶液（例えば、ショ糖、生理学的食塩水）を投与の希釈剤として使用して、凍結乾燥製品として調製してもよい。ナノ粒子は、凍結乾燥製品及び適切な賦形剤を送達するのに使用してもよい。
【０１４４】
本明細書に開示される免疫原性組成物は、粘膜組織への直接投与のような局所投与が意図され、この場合、担体は適切には、溶液、エマルジョン、軟膏剤、又はゲル基剤を含んでよい。例えば基剤は、以下の１つまたはそれ以上を含んでよい：ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜蝋、鉱油、水及びアルコールなどの希釈剤、そして乳化剤及び安定剤。局所投与（例えば、口腔又は膣）ようの医薬組成物中には、増粘剤が存在してもよい。本明細書に記載の免疫原性組成物は、本明細書に記載の及び当該分野で使用されているいくつかの送達ビヒクル（特に限定されないが、スポンジ、ゲルキャップ、坐剤、ガーゼ（又は、処置すべき組織への適用に適した布）、ナノ粒子、及びトローチ剤）の任意のものを使用して局所投与してもよい。いくつかの送達ビヒクル（例えば、スポンジ、布、又はガーゼ）について、組成物又は調製物は、処理すべき組織との接触により、組成物又は調製物の放出を可能にするビヒクルへ、付着されるか、吸着されるか、吸収されるか、又は何らかの方法で適用される。
【０１４５】
本明細書に開示される免疫原性組成物は、例えば坐剤又はトローチ剤の形での、直腸、口腔、又は膣内投与が意図され、これは、それぞれ直腸、口腔、又は膣スペース中で溶融し、組成物の薬剤又は成分を放出する。経口投与される本明細書に記載の組成物又は調製物はまた、液体の形でもよい。直腸投与用の組成物又は調製物は、適当な非刺激性賦形剤として油性基剤を含有してもよい。このような塩基は、特に限定されないが、ラノリン、ココアバター、及びポリエチレングリコールを含む。
【０１４６】
本明細書に記載の免疫原性組成物は好ましくは、特に非経口投与される時、内毒素を含まない。内毒素不含組成物は、内毒素及び／又は関連する発熱性物質を実質的に含まない（すなわち、規制機関により認められている、内毒素が存在するかどうかを充分な感度で証明する方法によっても、非毒素が検出されない）。内毒素は、生存能力のある微生物中に存在する毒素を含み、微生物が細胞の完全性を無くすか又は死滅する時のみ放出される毒素を含む。発熱性物質は、細菌及び他の微生物の外膜に存在する熱誘導性の熱安定性物質（リポ多糖および糖タンパク質）を含む。これらの物質は、ヒトに投与されると、発熱、低血圧、およびショックを引き起こすことがある。内毒素不含組成物を製造することは、特殊な装置、熟練技術者を必要とし、内毒素不含ではない製剤を製造するよりはるかに高価になることがある。
【０１４７】
別の態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物の製造法が提供される。製造法は、所望の複数の免疫原性ペプチド又は所望の融合ポリペプチドを組合せるか又は混合して、本明細書に記載の免疫原性組成物を提供することを含む。この製造法はさらに、本明細書に記載した１つまたはそれ以上の生理学的に適した（又は医薬的に適した）賦形剤を組合せるか又は混合することを含んでよい。この方法はさらに、所望の免疫原性ペプチド又は所望の融合ポリペプチドを含む免疫原性組成物を、医薬的に適切なアジュバントと組合せるか又は混合することを含み、少なくとも医薬的に適切な賦形剤を、アジュバントを含む免疫原性組成物と組合せるか又は混合してもよい。さらなる態様において、製造法は、所望の免疫原性ペプチド又は所望の融合ポリペプチドの化学合成又は組換え産生を含む。免疫原性ペプチド及び融合ポリペプチドの化学合成および組換え産生は、本明細書で詳述される。各免疫原性ペプチドと融合タンパク質の製造では、規制機関が要求する適切な製造プロセス（例えば、医薬品適正製造基準（Good Manufacturing Practices；ＧＭＰ））が使用される。さらに当業者は、免疫原性組成物の製造中に、ペプチド又は融合ポリペプチドの安定性と完全性を維持するための技術や工程を周知している。
【０１４８】
免疫原性ペプチド、融合ポリペプチド、及び免疫原性組成物を使用する方法
複数のＧＡＳ免疫原性ペプチド、例えば、ＧＡＳ Ｍタンパク質又はＧＡＳ Spaタンパク質から誘導される少なくとも３１の異なる免疫原性ペプチドを含む本明細書に記載の免疫原性組成物、および複数の免疫原性ペプチド（ＧＡＳ Ｍ血清型１、２、３、４、５、６、１１、１２、１４、１８、１９、２２、２４、２８、２９、４４、４９、５８、７３、７５、７７、７８、８１、８２、８３、８７、８９、９２、１１４、１１８からのＭタンパク質の、又はＧＡＳ血清型１８のSpaタンパク質の、１つのアミノ末端部から連続する少なくとも２５のアミノ酸を、各々が独立に含む少なくとも３１の異なる免疫原性ペプチド）を含む少なくとも４つの融合ポリペプチドを含む本明細書に記載の免疫原性組成物は、ＧＡＳに対する免疫応答を誘導するのに使用し得る。従って、ある態様において、ＧＡＳ細菌に対する免疫応答（体液性応答を含む）を誘発するのに適した方法で、ヒト宿主である宿主（又は対象）を免疫することを含む方法が、本明細書に提供される。従って本明細書に記載のこれらの組成物は、ＧＡＳに対する免疫が不充分で感染症に罹りやすい処置の必要な宿主の、予防的及び／又は治療的処置に有用である。
【０１４９】
ＧＡＳに対する免疫応答を誘導するための、及びＧＡＳ感染を予防（すなわち、発症の可能性を低下させる）及び／又は治療するための、本明細書に記載の方法は、所望の抗ＧＡＳ免疫応答を誘発し維持するのに適した時間間隔で、本明細書に記載の免疫原性組成物を宿主に、１回、２回、３回、４回、又はそれ以上投与することを含む。当該分野において長い間知られているように、ＧＡＳ感染に対する宿主の防御は一般に、ＧＡＳ血清型特異的Ｍタンパク質に対するオプソニン性抗体の産生と相関する（例えば、Lancefield, J. Immunol. 89:307, 1962を参照）。さらに、宿主中の分泌性又は粘膜性抗ＧＡＳ抗体の存在は、連鎖球菌（Streptococcus）による初期のコロニー化を防止し得る（発症の可能性を低下させるか減少させる）。複数の免疫原性ペプチドを含むか、又は複数の免疫原性ペプチドを含む融合ポリペプチドを含む、本明細書に記載の免疫原性組成物は、ＧＡＳ感染の予防、改善、又は治療のために使用されるため、この免疫原性組成物はまた、当業者によりワクチンとも呼ばれる。
【０１５０】
各免疫原性組成物の用量、宿主に投与される投与回数、および組成物の２つの投与間の時間間隔を、当業者は決定することができる。宿主に投与される免疫原性組成物中の各免疫原性ペプチドの適切な量又は各融合ポリペプチドの量は、宿主もしくは患者（例えば、ヒト）の症状、すなわち疾患のステージ、全身の健康状態、ならびに年齢と体重、及び医学分野の当業者に公知の他の要因に依存し得る。本明細書に記載の免疫原性組成物で免疫される宿主又は対象は、ヒト及び非ヒト宿主及び対象を含む。ヒト宿主／対象は、幼児、小児、又は成人を含む。成人への投与に適した免疫原性組成物はさらに、その成人が若年であるか、中年であるか、又は高齢の成人であるかに依存して調製されることがある。
【０１５１】
免疫原性組成物は、医学分野の当業者により決定されるように、治療（又は予防）すべき疾患に適した方法で投与される。適切な投与量と投与の適切な期間及び頻度は、患者の症状、患者の年齢、治療又は予防すべき患者の疾患の種類と重症度、活性成分の具体的な形態、及び投与方法などの要因により決定されるであろう。一般に、適切な投与量と治療処方は、治療的及び／又は予防的利益を提供するのに充分な量の免疫原性組成物を提供する（例えば、改善される臨床的結果、全体的生存率、又は症状の重症度の低減）。予防的用途では、投与量は、統計的、生物学的、又は臨床的に有意な方法で感染の発症を予防するか又は遅延させるのに、及び／又は重症度を低下させるのに充分である。
【０１５２】
最適用量は一般に、インビトロ、インビボ、動物モデルでの実験、及び／又はヒトの臨床治験で決定してもよい。最適用量は、宿主のボディマス、体重、又は血液容量に依存することがある。一般に、投与量中に存在する本明細書に記載の免疫原性ペプチド又は融合ポリペプチドの量は、約１０μｇ〜約１０ｍｇ、約１００μｇ〜１ｍｇ、約１５０μｇ〜５００μｇ、又は約２００μｇ〜約４００μｇの範囲である。通常は、有効な治療及び／又は予防を提供するのに充分な最小用量の使用が好ましい。患者は、治療又は予防される症状に適したアッセイ（このアッセイは当業者に公知である）を使用して、治療又は予防の有効性についてモニターされる。液体型で投与される時、適切な用量サイズは、患者の大きさにより変化するが、典型的には１０〜６０ｋｇの対象について約１ｍｌ〜約５００ｍｌ（適切な用量を含む）である。
【０１５３】
追加免疫は、約２週間〜約２６週間、例えば２、４、８、１２、１６、又は２６週間の間隔範囲の所望の時間間隔で、複数回（例えば、２回又は３回又は４回又はそれ以上）投与してもよい。異なる投与間の時間間隔（例えば、初期投与と２回目の投与、又は２回目の投与と３回目の投与）は同じでなくてもよく、各２回の投与の時間間隔は、独立に決定してもよい。
【０１５４】
本明細書に記載の免疫原性組成物は、経口、経腸、非経口、経皮／経粘膜、および吸入を含む経路で投与してもよい。本明細書において経腸という用語は、薬剤が胃腸管又は口腔粘膜（経口、直腸内、および舌下を含む）を介して吸収される投与経路である。本明細書において非経口という用語は、胃腸管を迂回する投与経路を説明し、典型的には動脈内、皮内、皮下、筋肉内、鼻腔内、眼内、腹腔内、静脈内、皮下、粘膜下、膣内、胸骨内、胸骨内、海綿、髄腔内、外尿道口内、及び尿道内注射を含む注射または注入によって投与される。本明細書において経皮／経粘膜という用語は、薬剤が局所投与を含む皮膚を介して又は皮膚によって投与される投与経路である。吸入という用語は、薬剤が、呼吸樹（肺内または肺を含む）中に導入される投与法を包含し、鼻腔内投与を含む。より具体的な態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、口腔、筋肉内、又は鼻腔内に投与されてもよい。ある態様において、異なる用量の免疫原性組成物は、例えば、経口、筋肉内、及び鼻腔内経路の２つ以上の経路などの、異なる経路によって送達されてもよい。
【０１５５】
本明細書に記載の免疫原性組成物は、ＧＡＳ感染の発症の可能性を低下させるために、又は以下のいずれかを引き起こすＧＡＳ感染を治療するために使用してもよい：咽頭炎、猩紅熱、壊死性筋膜炎、蜂巣炎、髄膜炎、肺炎、連鎖球菌毒素性ショック症候群、菌血症、敗血症、敗血症性関節炎、膿皮症、皮膚感染（侵襲性及び非侵襲性）、膿痂疹、丹毒、軟部組織感染症、腎炎、およびＧＡＳ発熱性反応。ＧＡＳに対する免疫応答を誘導するための、およびＧＡＳ感染の発症の可能性を低下させるための又は治療するための本明細書に記載の方法はまた、急性リウマチ熱、リウマチ性心疾患、反応性関節炎、および糸球体腎炎などの非化膿性続発症の発症の可能性又は重症度を低下させるのにも有効なことがある。
【０１５６】
免疫された対象は一般に、治療又は予防される感染又は症状に適したアッセイを使用して、治療的又は予防的有効性についてモニターされ、このアッセイは、当業者に公知であり、本明細書に記載される。上記方法に従って本明細書に記載の免疫原性組成物を投与することにより誘発される免疫応答は、体液性応答を含む適応免疫応答を含み、また免疫原性組成物で示される各免疫原性ペプチドに特異的な細胞応答（ＣＤ４免疫応答およびＣＤ８免疫応答を含む）を含んでいてもよい。体液性免疫応答（すなわち、抗体応答）は、イムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ、免疫ブロッティング）、インビトロ機能的アッセイ（例えば、オプソニン、食作用、及び死滅アッセイ、間接的な殺菌性アッセイ）などのいずれかを使用して、免疫プロトコールを通してモニターすることができる。このような方法は、免疫された宿主からの生物学的試料（例えば血清）中に存在する特異抗体の結合レベル（すなわち力価）をモニターし決定するのに有用である。これらのアッセイの１つ以上の結果に基づいて、次の投与の投与量やタイミング又はさらなる投与の必要性を決定することができる。
【０１５７】
細胞性免疫応答は、種々のタイプのＴ細胞（すなわちＴリンパ球）を含む。細胞性応答において、Ｔ細胞はいくつかの機構により抗原を排除するように作用する。例えば、特異的抗原を認識することができるヘルパーＴ細胞は、サイトカインのような可溶性メディエーターを放出して、免疫系の追加の細胞を動員して免疫応答に参加させるように応答する。また細胞障害性Ｔ細胞は、抗原を特異的に認識することができ、ＧＡＳ細菌細胞のような抗原担持細胞に結合し、これを破壊又は傷害することにより応答する。
【０１５８】
細胞性免疫応答を調べるための当該分野においてルーチンに実施されているアッセイは、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、ホルモン、増殖因子、ならびに他のメディエーターなどの可溶性メディエーターの存在およびレベルを決定することを含む。イムノアッセイはまた、免疫細胞の変化した機能的または構造的特性（細胞増殖、変化した運動性、特異的遺伝子発現もしくは細胞溶解的挙動なんどの特殊な活動の誘導；細胞成熟、およびＴｈ１応答とＴｈ２応答の間の関係の変化）を分析することによって免疫細胞の細胞の活性化状態の変化を決定することを含む、これらおよび類似のアッセイを行うための手順は、Lefkovits (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998）に見いだされる。またCurrent Protocols in Immunology; Weir, Handbook of Experimental Immunology, Blackwell Scientific, Boston, MA (1986); Mishell and Shigii (eds.) Selected Methods in Cellular Immunology, Freeman Publishing, San Francisco, CA (1979); Green and Reed, Science 281 : 1309 (1998) ，およびそこに引用される文献を参照されたい。
【０１５９】
本明細書に簡単に記載されるように、免疫原性ペプチドに対する、免疫原性ペプチドを含む融合ポリペプチドに対する、及び／又は完全長もしくは成熟ペプチド、又は本明細書に記載の免疫原性組成物を投与された対象中のＧＡＳ細菌に対する、免疫応答の存在及びレベルを測定するために、対象から得ることができる。本明細書において「生物学的試料」は、被験体または生物学的供給源からの、血液試料（そこから血清または血漿を調製される）、生検標本、体液（例えば、肺洗浄液、腹水、粘膜洗浄液、滑液）、骨髄、リンパ節、組織外植片、器官培養物、または任意の他の組織または細胞調製物でもよい。生物学的試料はまた、免疫原性組成物を投与される前の対象から得られ、この生物学的試料は、ベースライン（すなわち、免疫前）データを確立するための対照として有用である。
【０１６０】
本明細書に記載の免疫原性組成物を用いる免疫の有効性を測定は、臨床的評価を含んでよい。例えば、ＧＡＳ感染の存在は、臨床家が入手できるルーチンアッセイ（細菌細胞培養；免疫蛍光アッセイ）を行うことにより、体液中に体のある部位（例えば、喉、粘膜組織、又は皮膚）にＧＡＳが存在するかを迅速に測定することにより決定される。発熱、炎症、疼痛などの症状、およびＧＡＳ感染の種々の他のかつ多くの症状は、臨床分野の当業者がモニターすることができる。
【０１６１】
本明細書に記載の免疫原性ペプチド、二量体ペプチド、及び融合ポリペプチドは、試料中の特異抗体の存在及びレベルを検出するための試薬として使用してもよい。生物学的試料、非限定例として、免疫された宿主からの本明細書に記載の生物学的試料、又は特異的モノクローナル抗体を産生することが知られているか又は疑われる細胞株の細胞上清もしくは細胞溶解物が得られる。生物学的試料は、免疫原性ペプチド（又は各々が免疫原性ペプチドを含む、二量体ペプチド、融合ポリペプチド、成熟もしくは完全長タンパク質、又はＧＡＳ細菌）と、生物学的試料中の抗体と免疫原性ペプチド（単独で、又はより大きな分子の一部として）とが相互作用するのに充分な時間およびその条件下で、接触（すなわち、混合、組合せ、又は相互作用を可能にする何らかの方法）させられる。生物学的試料と免疫原性ペプチドとの相互作用のレベルが検出され、免疫原性ペプチドとベースライン又は陰性対照として機能する対照生物学的試料との相互作用のレベルと比較される。相互作用（すなわち、抗体と免疫原性ペプチドとの結合）のレベルは、本明細書に記載のおよび当業者に公知の多くのイムノアッセイ法の任意の１つにより決定することができる。
【０１６２】
本明細書に記載の免疫原性ペプチド、二量体ペプチド、及び融合ポリペプチドはまた、免疫原性ペプチドに特異的結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を産生するための方法で使用してもよい。この方法の例は、本明細書で詳述される。
【実施例】
【０１６３】
実施例１
ＧＡＳ血清型４からのＭタンパク質
本例は、ＧＡＳ血清型４により発現されその細胞表面に存在するＧＡＳ抗原の性状解析を記載する。
【０１６４】
後述される３０価ワクチンの潜在的な防御効力は、タンパク質２の成分であるタンパク質Ａｒｐ４のＮ−末端内のオプソニン性エピトープの発見によって増強された。Ａｒｐ４はＩｇＡと結合することがすでに示されていたが、食作用に対する病原性や抵抗のために必要とされなかった（例えば、Husmann et al, Infect. Immun. 63:345-348 (1995)を参照）。最も最近の疫学研究は、４型連鎖球菌感染症が、すべてのＧＡＳ感染症の最大９％を占めることを見いだした。Ａｒｐ４（Ｍ４）のＮ末端内のオプソニン性エピトープを検出するために、（１）タンパク質のＮ末端の３０アミノ酸である合成ペプチド、（２）Ａｒｐ４ならびに５つの他のＭペプチドの５０アミノ酸残基を含有する組換え融合タンパク質、又は（３）無傷の組換えＡｒｐ４タンパク質、に対するウサギ抗血清が作成された。すべての３つの抗血清は、インビトロ殺菌活性アッセイを使用して試験すると、有意な殺菌活性を示した（実験プロトコールの例３を参照）：抗ｓＭ４（１〜３０）抗血清は、５２％の死滅を与えた；６価融合タンパク質の成分として組換え５０ａａ Ａｒｐ４ペプチドで免疫したウサギから得られた抗血清は、８２％の死滅を与えた；無傷の組換えＡｒｐ４で免疫した動物からの抗血清は、８５％の死滅を与えた。機能的死滅アッセイの結果は、Ａｒｐ４（Ｍ４）のＮ末端ペプチドが、３０価ワクチン中に含めるための適切な候補であることを示した。
【０１６５】
実施例２
多価ＧＡＳペプチド組成物の設計と構築
本例は、そこからＭタンパク質免疫原性断片が選択されるであろうＧＡＳ血清型の選択を説明し、これらの免疫原性断片を含む融合ポリペプチドの構築を説明する。
【０１６６】
（１）北アメリカの小児対象中の咽頭炎（例えば、Shulman et al, Clin. Infect. Dis. 2009、前出、を参照）、（２）侵襲性ＧＡＳ感染症（例えば、Centers for Disease Control and Preventionにより後援されたActive Bacterial Core Surveillance of the Emerging Infections Program Networkを参照）（例えば、O'Loughlin et al, 前出、を参照）、及び（３）ヨーロッパの侵襲性感染症（例えば、StrepEuro協会により報告されている、例えばLuca-Harari et al、前出、を参照）の疫学に基づいて、ＧＡＳの血清型からＭペプチドが選択された。また３０価のワクチン組成物に、現在又は歴史的に「リウマチ発症性」であると考えられているＧＡＳの血清型からのＭペプチド（例えば、Shulman et al, Clin. Infect. Dis. 42:441-47 (2006)を参照）、及びSpa１８のアミノ末端ペプチド断片（ＧＡＳ血清型１８からのSpaタンパク質、Ａ群連鎖球菌の少なくとも数個の血清型により発現される防御性抗原（例えば、Dale et al, J. Clin. Invest. 103: 1261-68 (1999)、米国特許第７，０６３，８５０号、国際特許出願公報ＷＯ００／３７６４８を参照）が含まれた。
【０１６７】
免疫原性組成物に含めるために選択されたＭタンパク質のアミノ酸配列は、cdc.gov/ncidod/biotech/strep/emmtypesでインターネットにアクセスして見つかるCenter for Disease Control (CDC) emm typing centerのウェブサイトから得られた。サブタイプが存在する場合は、ほとんどの場合、主要なサブタイプからのＭタンパク質の配列が選択された。成熟Ｍタンパク質とSpaのアミノ末端領域が、GenBankデータベース中でBlastPにより検索されて、ヒトタンパク質と相同性の領域が同定された。ヒトタンパク質と同一の５つ又はそれ以上の連続するアミノ酸を有するアミノ末端領域は、ワクチンの設計に導入された。
【０１６８】
組換え多価融合タンパク質の構築と発現。各emm遺伝子の特異的５’配列を使用して、４つのハイブリッドＤＮＡ分子を設計した。タンデムに連結された７又は８つのemm遺伝子断片、上流のＴ７プロモーター、および終止コドンが続く３’ポリヒスチジンモチーフを含有する各遺伝子が、化学合成（GENSCRIPT（登録商標）, Piscataway, NJ）された。２６価ワクチン（Hu et al, 前出; 米国特許第７，２７０，８２７号を参照）と異なり、emm配列の間に連結コドンは挿入されなかった。大腸菌（E. coli）のコドンの最適化は、以後の部位変異ではなく合成中に行われた。ＤＮＡ鎖をアニーリングし、ｐＵＣ５７中に連結した。合成遺伝子配列の完全性は、ＡＢＩ色素終止法を使用して配列決定することにより証明した。各多価融合タンパク質の発現は、ＩＰＴＧ誘導前及び後の全細胞溶解物を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により検出された。６つのヒスチジン残基のポリペプチドタグ（すなわち、Ｈｉｓタグ）を、当該分野でルーチンに実施されている方法に従ってニッケル親和性クロマトグラフィーによる精製を容易にするために、カルボキシ（本明細書においておよび当該分野において、ＣＯＯＨとも呼ばれる）末端に付加されている。
【０１６９】
図１は、４つの融合タンパク質の各々についてコードされたＭタンパク質免疫原性ペプチドの略図を示す。そこからのＭタンパク質がワクチン組成物中に含まれる血清型は、アメリカ合衆国とカナダの咽頭炎のすべての奨励の９８％、アメリカ合衆国の侵襲性疾患の９０％、およびヨーロッパの侵襲性疾患の７８％を占めるＧＡＳ血清型を含めた。図１では、各免疫原性ペプチドの記載の下の数は、Ｍタンパク質又はSpaタンパク質のアミノ末端部中のアミノ酸の位置を示す。例示と説明のために、タンパク質１において、ＭＩ免疫原性ペプチドは、ＧＡＳ血清型１からのＭタンパク質のアミノ末端から１〜５０位のアミノ酸を含有する；Ｍ３．１免疫原性ペプチドは、ＧＡＳ血清型３．１からのＭタンパク質のアミノ末端から２２〜７１位のアミノ酸を含有する；Ｍ６．４は、ＧＡＳ血清型６．４のアミノ末端部からの１〜２５位のアミノ酸のタンデム繰り返しを含有する、など。タンパク質１のカルボキシ末端では、ＭＩ免疫原性ペプチド（アミノ酸１〜５０）が繰り返される。各融合タンパク質中のアミノ酸の総数は、各タンパク質の略図の右端に示される。アミノ末端の開始メチオニン残基は、総アミノ酸数中に含まれる。
【０１７０】
免疫原性ペプチドのアミノ酸配列は表１に提示される。完全長Ｍタンパク質の開始アミノ酸（典型的にはメチオニン）は、融合タンパク質の各ペプチドの免疫原性断片ペプチド配列中に含まれない（表１を参照）。４つの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列とコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、図２Ａ〜２Ｈに示される。図２に示されるヌクレオチド配列は、コード領域の上流の発現制御配列と、Ｈｉｓタグをコードするカルボキシ末端のヌクレオチドを含む（それぞれ、配列番号１７〜２０、融合タンパク質１〜４をコードするポリヌクレオチドを参照）。発現制御配列を含むがＨｉｓタグをコードするヌクレオチドは含まない融合タンパク質１〜４をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１３〜１６に与えられる。発現制御配列を含まず、Ｈｉｓタグをコードするヌクレオチドを含まず、かつアミノ末端メチオニンをコードするヌクレオチド（ＡＴＧ）を含む融合タンパク質１〜４をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１７〜２０に与えられる。発現制御配列を含まず、Ｈｉｓタグをコードするヌクレオチドを含まず、かつアミノ末端メチオニンをコードするヌクレオチドを含まない融合タンパク質１〜４をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号２１〜２４に与えられる。
【０１７１】
組換え多価ワクチン成分融合タンパク質の精製。各融合タンパク質は、すでに報告されている操作法（例えば、Hu et al, 前出、を参照）に従って、別々に精製された。純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥでモニターし、純粋な組換えタンパク質を含有する断片をプールし、使用するまでー２０℃で保存した。
個々の組換え二量体Ｍペプチドの構築と発現。既に記載されている（例えば、Hu et al, 前出、を参照）ように、ワクチン成分ペプチドを含む個々の組換え二量体ペプチドを発現させ、血清学試薬として使用するために精製された。さらに、これらの試験のために、７つの新しいＭペプチドが化学合成された（GENSCRIPT（登録商標）, Piscataway, NJ）。
【０１７２】
表１：Ｍタンパク質免疫原性ペプチドのアミノ酸配列
【表１Ａ】
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【表１Ｂ】
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【表１Ｃ】
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【０１７３】
実施例３
多価ＧＡＳペプチド組成物の免疫原性
本例は、多価免疫原性組成物の免疫学的性質を性状解析するために行われた試験を説明する。
【０１７４】
ワクチン製剤とウサギの免疫。４つのワクチン融合ポリペプチドを等モル量で混合し、アラム（REHYDRAGEL（登録商標）, low viscosity, Reheis, Inc., Berkeley Heights, NJ）に吸着させた。各０．５ｍｌ用量が、２００μｇ、４００μｇ、８００μｇ、又は１０００μｇのタンパク質と、質量でほぼ等量のアラムを含有するように、ワクチンを調製した。３群のニュージーランド白色ウサギを、記載のプロトコールに従って、４つのワクチン用量で、筋肉内経路で、０、４、及び８週目に免疫した（例えば、Dale, Vaccine 17: 193-200 (1999)を参照）。最初の注射の前と、最後の注射の２週間後に、血清を得た。
【０１７５】
タイプ特異的抗体の検出。免疫前血清および免疫ウサギ血清を使用して、既に記載されている方法（例えば、Dale, Vaccine 17: 193-200 (1999)を参照）により、ＥＬＩＳＡを行なった。ワクチンペプチドを含む精製された組換え二量体Ｍペプチド又は合成ペプチドを、固相抗原として使用した。
【０１７６】
組織交差反応性抗体のアッセイ。ヒトの心臓、脳、および腎臓の凍結切片を使用して間接免疫蛍光アッセイにより、既に記載されている方法（例えば、McNeil et al, 前出、を参照）により、組織交差反応性抗体の存在について、免疫血清を試験した。
【０１７７】
３０価ワクチンを含む４つの組換えワクチンタンパク質を精製し、アラムで４つの異なる濃度で調製した。０、４、及び８週目に２００μｇ、４００μｇ、８００μｇ、又は１０００μｇを３回注射された３羽のウサギのセットを使用して、用量応答試験を行なった。最後の注射の２週間後に得られた血清を、ＥＬＩＳＡにより、ワクチンサブユニットペプチドを試験抗原として使用して測定した。組換え二量体ペプチド又は合成ペプチドを、プレートに結合した抗原の供給源として使用した。アッセイで使用された合成ペプチドは、Ｍ４４、Ｍ７８、Ｍ１１８、Ｍ８３、Ｍ８１、Ｍ８７、及びＭ４９ペプチドであった。ワクチンサブユニットペプチドに対する３つの抗血清の平均幾何平均抗体力価を計算することにより、用量応答を調べた：２００μｇ用量群＝５６５１平均抗体力価、４００μｇ＝８８６８、８００μｇ＝９６１９、及び１，０００μｇ＝８０７１。これらのデータを示すグラフは図３に与えられる。関節免疫蛍光アッセイにより測定すると、どの免疫血清も、ヒトの脳、腎臓、又は心臓と交差反応する抗体を含有しなかった。用量応答曲線に基づいて、以後のすべての実験は、８００μｇ量のワクチンを投与されたウサギからの抗血清を使用して行なった。この用量は高度に免疫原性であり、図４Ａに示されるように、ワクチン中に含有される各サブユニットペプチドに対して高レベルの抗体を誘発した。
【０１７８】
間接殺菌活性試験。既に記載されている（例えば、Hu et al, 前出、を参照）ように、殺菌活性アッセイを行なった。簡単に説明すると、細菌を含有する０．０５ｍのTodd-Hewittブロスを０．１ｍｌの試験血清と０．３５ｍｌの血液に加え、混合物を３７℃で３時間回転させた。次に、この混合物の０．１ｍｌアリコートを溶融させたヒツジ血液寒天に加え、４つのプレートを調製し、３７℃で一晩インキュベーション後、生存能力のある微生物（ＣＦＵ）を計測した。試験した各血清型について、３つの異なる接種物を使用して、免疫前血清を含有する血液中の増殖が最適かつ定量可能であることを確認した。結果は死滅パーセントとして表し、これは以下の式を使用して計算される：［（免疫前血清で３時間増殖後のＣＦＵ）−（免疫血清で３時間増殖後のＣＦＵ）÷免疫前血清で３時間増殖後のＣＦＵ］×１００。免疫前血清の存在下で少なくとも７世代に、試験菌株の増殖を与えたアッセイのみが、免疫血清の存在下での死滅パーセントを表すのに使用された。
【０１７９】
ヒトの全血でインビトロのオプソニン食作用性死滅アッセイにより測定すると、８００μｇ用量のワクチンは、ＧＡＳ血清型のワクチン血清型に対して、高レベルの殺菌性抗体を誘発した。結果は図４Ｂに示される。免疫ウサギの１羽からの血清を使用して、ＧＡＳの２８／３０ワクチン血清型について、５０％を超える細菌死滅が観察された。５０％未満の死滅である２つのワクチン血清型について、細菌死滅は３５〜４０％であった（図４Ｂ、ＧＡＳ Ｍ血清型７７と４４を参照）。すべてのワクチン血清型に対して観察された平均死滅は８３％であった。
【０１８０】
実施例４
非ウイルス血清型に対する免疫血清の殺菌活性
本例は、３０価ワクチンで免疫した動物からの免疫血清が、ワクチンで示されないＧＡＳ血清型に対して殺菌活性を示したことを説明する。これらのデータは、既に記載した２６価ワクチンで免疫した動物から得られた免疫血清を使用して得られたデータとは異なる。
【０１８１】
２６価ワクチンには含有されず３０価ワクチンで示されたＧＡＳ Ｍ血清型は、Ｍ４、Ｍ２９、Ｍ７３、Ｍ５８、Ｍ４４、Ｍ７８、Ｍ１１８、Ｍ８２、Ｍ８３、Ｍ８１、Ｍ８７、及びＭ４９である。３０価ワクチンの成分ではない２６価ワクチンで示される血清型は、Ｍ１．２、Ｍ４３、Ｍ１３、Ｍ５９、Ｍ３３、Ｍ１０１、及びＭ７６である。Hu et al, 前出；米国特許第７，２７０，８２７号を参照。ＭＩ血清型のようないくつかの血清型は、現在使用されているemm型判定システムの前にサブタイプが決定された（Facklam et al, Emerg. Infect. Dis. 5:247-53 (1999)を参照）。Ｍ１．２と示される血清型は、血清型Ｍ１．０からは顕著なアミノ酸変化があり、より新しい型判定基準では、Ｍ１血清型と考えられない可能性がある（例えば、Dale et al, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 12:833-36 (2005)を参照）。
【０１８２】
非ワクチン血清型に対する抗血清の殺菌活性。実施例３に記載のように、殺菌活性アッセイを行なった。３０価ワクチンで示されなかったＧＡＳ血清型のパネルに対する間接殺菌活性アッセイで、３０価ワクチンに対する免疫血清（実施例３を参照）もまた使用された。図５Ａに示すように、最初の実験で、内部実験室コレクションからランダムに選択された１１／２１血清型に対して、５０％超の殺菌活性が観察された。５０％超の死滅を示した１１の血清型について観察された平均は８０％の死滅であり、試験したすべての２１の血清型では５０％であった。この免疫血清は、試験した２１の非ワクチン血清型のうちの４つのみに対して殺菌活性が欠如していた。
【０１８３】
第２の実験では、ワクチンで示されないより多くのＧＡＳ血清型が、殺菌活性アッセイに含まれた。図５Ｂに示されるように、実験室のコレクションから選択された３３／４７血清型に対して５０％超の殺菌活性が観察された。５０％超の死滅を示した３３の血清型について観察された平均は８０％の死滅であり、試験したすべての４７の血清型では６３％であった。この免疫血清は、試験した４７の非ワクチン血清型のうちの４つのみに対して殺菌活性が欠如していた。
【０１８４】
非ワクチン血清型に対して３０価ワクチン対２６価ワクチンにより誘発された殺菌抗体活性の比較。３０価ワクチンにより誘発された交差オプソニン性抗体が、すでに報告された２６価ワクチン（Hu et al, 前出; 米国特許第７，２７０，８２７号を参照）より、感染症に対してより広い防御を与える可能性があるかどうかを調べるために、同じ実験で両方の抗血清を用いて殺菌活性アッセイを行なった。３０価ワクチン又は２６価ワクチンのいずれにも含まれない２１のＧＡＳ血清型が、この実験に含めるためにランダムに選択された。結果は図６に示される。いずれのワクチン構築体でも示されなかった１０の血清型に対して、３０価ワクチンにより促進された殺菌死滅のレベルは、２６価抗血清で観察されたものより有意に大きかった（平均、６４．９％対２３．６％、ｐ＝０．０００８、スチューデントｔ検定、対応のある両側検定）。
【０１８５】
上記の種々の実験を組合せて、さらなる態様を提供することができる。本明細書で言及したか及び／又は出願データシートで参照したすべての米国特許、米国仮特許出願公報、米国仮特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。種々の特許、出願、刊行物の概念を使用して、さらなる態様を提供するために、必要であれば、態様の形態を変更することができる。
【０１８６】
上記の詳細な説明を考慮すると、本態様に対してこれら及び他の変更が可能である。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を、明細書と特許請求の範囲に開示された具体例に限定するものと理解してはならず、このような特許請求の範囲が認められる同等物の全範囲とともに、すべての可能な態様を含むと理解すべきである。従って、この開示によって特許請求の範囲は限定されない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2014520122.tif 000008
【図２Ｃ】
2014520122.tif 000009
【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３】
2014520122.tif 000015
【図４】
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【図５Ａ】
2014520122.tif 000017
【図５Ｂ】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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