(57)【要約】  本発明は、腫瘍の血管新生の阻害に関する。特に、本発明は、抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）治療に対して難治性の腫瘍において、例えば、抗ＩＬ−１７抗体及び他のアンタゴニストなどのＩＬ−１７アンタゴニストを用いた、腫瘍の血管新生の阻止又は治療及び腫瘍増殖の抑制に関する。
2014525412.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以前に血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストで治療された腫瘍を有するヒト被験体にＩＬ−１７アンタゴニストの有効量を投与することを含む、腫瘍血管新生を阻害する方法であって、腫瘍が該ＶＥＧＦアンタゴニストによる治療に対して難治性である方法。
【請求項２】
以前にＶＥＧＦアンタゴニストで治療された腫瘍を有するヒト被験体にＩＬ−１７アンタゴニストの有効量を投与することを含む、腫瘍増殖を抑制する方法であって、腫瘍が該ＶＥＧＦアンタゴニストによる治療に対して難治性である方法。
【請求項３】
以前にＶＥＧＦアンタゴニストで治療された腫瘍を有するヒト被験体にＩＬ−１７アンタゴニストの有効量を投与することを含む、腫瘍治療の方法であって、腫瘍が該ＶＥＧＦアンタゴニストによる治療に対して難治性である方法。
【請求項４】
ＶＥＧＦアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＶＥＧＦアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ＶＥＧＦアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
抗ＶＥＧＦ抗体が配列番号１の可変重鎖配列及び配列番号２の可変軽鎖配列を含むベバシズマブ又はその断片若しくは変異体である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
抗ＶＥＧＦ抗体が配列番号１の可変重鎖配列及び配列番号２の可変軽鎖配列を含むベバシズマブ又はその断片若しくは変異体である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
抗ＶＥＧＦ抗体が配列番号１の可変重鎖配列及び配列番号２の可変軽鎖配列を含むベバシズマブ又はその断片若しくは変異体である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ＩＬ−１７アンタゴニストが、抗ＩＬ−１７抗体若しくはその断片又は抗ＩＬ−１７受容体抗体若しくはその断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＩＬ−１７アンタゴニストが、抗ＩＬ−１７抗体若しくはその断片又は抗ＩＬ−１７受容体抗体若しくはその断片である、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
ＩＬ−１７アンタゴニストが、抗ＩＬ−１７抗体若しくはその断片又は抗ＩＬ−１７受容体抗体若しくはその断片である、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗ＩＬ−１７抗体又はその断片がＩＬ−１７Ａ又はＩＬ−１７Ｆ又はＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆに特異的に結合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗ＩＬ−１７抗体又はその断片がＩＬ−１７Ａ又はＩＬ−１７Ｆ又はＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆに特異的に結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗ＩＬ−１７抗体又はその断片がＩＬ−１７Ａ又はＩＬ−１７Ｆ又はＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆに特異的に結合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体又はその断片がモノクローナル抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体又はその断片がモノクローナル抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体又はその断片がモノクローナル抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体又はその断片がヒト、ヒト化又はキメラ抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体又はその断片がヒト、ヒト化又はキメラ抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体又はその断片がヒト、ヒト化又はキメラ抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
ＩＬ−１７アンタゴニスト又はＩＬ−１７抗体又はその断片は、ＩＬ−１７アンタゴニスト又はＩＬ−１７抗体若しくはその断片の有効量を投与されなかったヒト被験体における腫瘍と比較して前記腫瘍の平均血管密度を減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ＩＬ−１７アンタゴニスト又はＩＬ−１７抗体又はその断片は、ＩＬ−１７アンタゴニスト又はＩＬ−１７抗体若しくはその断片の有効量を投与されなかったヒト被験体における腫瘍と比較して前記腫瘍の平均血管密度を減少させる、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
ＩＬ−１７アンタゴニスト又はＩＬ−１７抗体又はその断片は、ＩＬ−１７アンタゴニスト又はＩＬ−１７抗体若しくはその断片の有効量を投与されなかったヒト被験体における腫瘍と比較して前記腫瘍の平均血管密度を減少させる、請求項３に記載の方法。
【請求項２５】
腫瘍の血管新生の前記阻害が、ＩＬ−１７アンタゴニスト又はＩＬ−１７抗体又はその断片の有効量を投与されなかったヒト被験体における腫瘍と比較して、前記ヒト被験体において前記腫瘍の平均血管密度を少なくとも５％、又は少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも２５％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％又は少なくとも９９％減少させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記腫瘍増殖の抑制が、ＩＬ−１７アンタゴニスト又はＩＬ−１７抗体又はその断片の有効量を投与されなかったヒト被験体における腫瘍と比較して、前記ヒト被験体において前記腫瘍の平均血管密度を少なくとも５％、又は少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも２５％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％又は少なくとも９９％減少させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記腫瘍治療が、ＩＬ−１７アンタゴニスト又はＩＬ−１７抗体又はその断片の有効量を投与されなかったヒト被験体における腫瘍と比較して、前記ヒト被験体において前記腫瘍の平均血管密度を少なくとも５％、又は少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも２５％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％又は少なくとも９９％減少させる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記平均血管密度が、前記腫瘍の全細胞面積に対する前記腫瘍のＣＤ３１陽性細胞の面積の平均を採用して測定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記平均血管密度が、前記腫瘍の全細胞面積に対する前記腫瘍のＣＤ３１陽性細胞の面積の平均を採用して測定される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記平均血管密度が、前記腫瘍の全細胞面積に対する前記腫瘍のＣＤ３１陽性細胞の面積の平均を採用して測定される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記腫瘍増殖の抑制が、ＩＬ−１７アンタゴニスト又はＩＬ−１７抗体又はその断片の有効量を投与されなかったヒト被験体における腫瘍と比較して、前記ヒト被験体において腫瘍体積を少なくとも５％、又は少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも２５％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％又は少なくとも９９％減少させる、請求項２に記載の方法。
【請求項３２】
前記腫瘍治療が、ＩＬ−１７アンタゴニスト又はＩＬ−１７抗体又はその断片の有効量を投与されなかったヒト被験体における腫瘍と比較して、前記ヒト被験体において腫瘍体積を少なくとも５％、又は少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも２５％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％又は少なくとも９９％減少させる、請求項３に記載の方法。
【請求項３３】
腫瘍体積の前記減少が、コンピュータ断層撮影（ＣＡＴスキャン）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）又は単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）によって測定される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
腫瘍体積の前記減少が、コンピュータ断層撮影（ＣＡＴスキャン）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）又は単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）によって測定される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記ヒト被験体に抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片を投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記ヒト被験体に抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片を投与することを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３７】
前記ヒト被験体に抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片を投与することを更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項３８】
抗ＶＥＧＦ抗体が配列番号１の可変重鎖配列及び配列番号２の可変軽鎖配列を含むベバシズマブ又はその断片である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
抗ＶＥＧＦ抗体が配列番号１の可変重鎖配列及び配列番号２の可変軽鎖配列を含むベバシズマブ又はその断片である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
抗ＶＥＧＦ抗体が配列番号１の可変重鎖配列及び配列番号２の可変軽鎖配列を含むベバシズマブ又はその断片である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記ヒト被験体に化学療法または放射線療法を受けさせることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記ヒト被験体に化学療法または放射線療法を受けさせることを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４３】
前記ヒト被験体に化学療法または放射線療法を受けさせることを更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項４４】
腫瘍が、結腸、直腸、肝臓、肺、前立腺、乳房又は卵巣である、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
腫瘍が、結腸、直腸、肝臓、肺、前立腺、乳房又は卵巣である、請求項２に記載の方法。
【請求項４６】
腫瘍が、結腸、直腸、肝臓、肺、前立腺、乳房又は卵巣である、請求項３に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＩＬ−１７アンタゴニストの投与前に前記ヒト被験体から得られた腫瘍試料又は末梢血試料の数または頻度に対して前記ヒト被験体から得られた腫瘍試料中又は末梢血試料中のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数又は頻度を決定することにより、腫瘍血管新生の前記阻害の有効性をモニタリングすることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＩＬ−１７アンタゴニストの投与前に前記ヒト被験体から得られた腫瘍試料又は末梢血試料の数または頻度に対して前記ヒト被験体から得られた腫瘍試料中又は末梢血試料中のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数又は頻度を決定することにより、前記腫瘍増殖の抑制の有効性をモニタリングすることを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＩＬ−１７アンタゴニストの投与前に前記ヒト被験体から得られた腫瘍試料又は末梢血試料の数または頻度に対して前記ヒト被験体から得られた腫瘍試料中又は末梢血試料中のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数又は頻度を決定することにより、前記腫瘍治療の方法の有効性をモニタリングすることを更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５０】
Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストの有効量を投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストの有効量を投与することを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５２】
Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストの有効量を投与することを更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５３】
前記Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗Ｇ−ＣＳＦ抗体又はその断片がモノクローナル抗体である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗Ｇ−ＣＳＦ抗体又はその断片がモノクローナル抗体である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗Ｇ−ＣＳＦ抗体又はその断片がモノクローナル抗体である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗Ｇ−ＣＳＦ抗体又はその断片がヒト、ヒト化又はキメラ抗体である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗Ｇ−ＣＳＦ抗体又はその断片がヒト、ヒト化又はキメラ抗体である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記抗Ｇ−ＣＳＦ抗体又はその断片がヒト、ヒト化又はキメラ抗体である、請求項５８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１１年８月１７日出願の米国仮出願番号６１／５２４，６７０の３５ ＵＳＣ １１９（ｅ）の下での利益を主張し、内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、腫瘍の血管新生の阻害に関する。特に、本発明は、抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）治療に対して難治性の腫瘍において、例えば、抗ＩＬ−１７抗体及び他のアンタゴニストなどのＩＬ−１７アンタゴニストを用いた、腫瘍の血管新生の阻止又は治療及び腫瘍増殖の抑制に関する。
【０００３】
発明の背景
現在では、既存の内皮からの新たな血管の形成を含む血管形成は様々な障害の病因に関与していることが十分に確立されている。これらには、固形腫瘍および転移、アテローム性動脈硬化症、水晶体後線維増殖症、血管腫、慢性炎症、増殖性網膜症、例えば糖尿病性網膜症などの眼内新生血管症候群、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、血管新生緑内障、移植された角膜組織及び他の組織の免疫拒絶、関節リウマチ、及び乾癬が含まれる。Folkman et al., J. Biol. Chem., 267: 10931-10934 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol., 53: 217-239 (1991);及びGarner A., "Vascular diseases", In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710。
【０００４】
腫瘍増殖の場合、血管新生は、過形成から新形成への移行のため及び腫瘍の増殖および転移のため栄養を提供するために重要であると思われる。Folkman et al., Nature, 339: 58 (1989)。新血管新生は、正常細胞と比較して腫瘍細胞が増殖優位性と増殖自主性を獲得することを可能とする。腫瘍は通常、利用可能な毛細血管床からの距離に起因して数立方ミリメートルのサイズにのみ増殖することができる単一異常細胞として始まり、そして長期間更に増殖及び転移することなく「休止状態」で留まることができる。一部の腫瘍細胞は、次いで、内皮細胞を活性化するために血管新生の表現型へと転換し、増殖して新たな毛細血管に成熟する。これらの新しく形成された血管は原発性腫瘍の継続的増殖を可能にするだけでなく、転移性腫瘍細胞の転移及び再コロニー化を可能とする。従って、腫瘍切片における毛細血管の密度と、乳癌並びに他の幾つかの腫瘍における患者の生存率との間に相関が観察されている。Weidner et al., N. Engl. J. Med, 324: 1-6 (1991); Horak et al., Lancet, 340: 1120-1124 (1992); Macchiarini et al., Lancet, 340: 145-146 (1992)。血管形成スイッチを制御する正確なメカニズムはよく理解されていないが、腫瘍塊の新血管新生は多数の血管新生刺激因子及び阻害剤ネットバランスに起因すると考えられている(Folkman, 1995, Nat Med 1(1):27-31)。
【０００５】
血管発達の過程は厳密に調節されている。今日まで、かなりの数の分子、大半は周囲の細胞によって産生される分泌因子が、ＥＣ分化、増殖、遊走及び索状構造への合体を調節することが示されている。例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管新生を刺激し血管透過性を誘導することに関与する重要な因子として同定されている。Ferrara et al., Endocr. Rev., 18: 4-25 (1997)。単一のＶＥＧＦ対立遺伝子の欠失でさえも胚性致死を生じるという知見は、血管系の発達および分化においてこの因子が果たす置き換えられない役割を指し示している。更に、ＶＥＧＦは、腫瘍及び眼内障害に関連する新血管新生の重要なメディエーターであることが示されている。Ferrara et al., Endocr. Rev., 上記。ＶＥＧＦのｍＲＮＡは、検討された大部分のヒト腫瘍により過剰発現している。 Berkman et al., J. Clin. Invest., 91: 153-159 (1993); Brown et al., Human Pathol., 26: 86-91 (1995); Brown et al., Cancer Res., 53: 4727-4735 (1993); Mattern et al., Brit. J. Cancer, 73: 931-934 (1996); Dvorak et al., Am. J. Pathol., 146: 1029-1039 (1995)。
【０００６】
抗ＶＥＧＦ中和抗体による処置は幾つかの腫瘍細胞株の増殖を有意に阻害し、ＶＥＧＦ単独のの遮断は血管新生の阻害を介して実質的に腫瘍増殖を抑制し得ることを示唆している(Kim et al., Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumour growth in vivo, Nature 362 (1993)を参照。ＶＥＧＦ−Ａを阻害することに加えて、ＶＥＧＦ受容体を遮断することを目的とした戦略はまた、腫瘍増殖の阻害をもたらす ([Ellis and Hicklin, 2008], [Ferrara, 2004] and [Kerbel, 2008])。ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（アフリベルセプト、リジェネロン社）は、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２からの構造要素を含むキメラ可溶性受容体であり（Ｈｏｌａｓｈら、２００２）、異種移植モデルにおける腫瘍増殖を阻害し、幾つかの腫瘍の治療用に現在臨床試験中である。
【０００７】
ＶＥＧＦシグナル伝達経路を標的とする様々な小分子阻害剤が開発されている。これらは受容体チロシンキナーゼ、例えばＢａｙ ４３−９００６（ソラフェニブ；Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））(Kupsch et al., 2005)及びＳＵ１１２４８（スニチニブ；Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））(O'Farrell et al., 2003)を含む。ソラフェニブはＶＥＧＦＲ−２及び−３、ＰＤＧＦＲ−β、Ｆｌｔ−３及びｃ−ｋｉｔをも阻害するＲａｆキナーゼ阻害剤である(Fabian et al., 2005)。ソラフェニブは、進行性腎細胞癌（ＲＣＣ）(Kane et al., 2006)及び手術不能な肝細胞癌 (Lang, 2008)のためにＦＤＡによって承認されている。同様に、スニチニブはＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｋｉｔ及びＦｌｔ−３を含むいくつかの経路を阻害し、進行したＲＣＣ(van der Veldt et al., 2008)において及びイマチニブ抵抗性消化管間質性腫瘍 (Smith et al., 2004)において有効性を示している。
【０００８】
ＶＥＧＦ阻害剤は、進行した癌患者において臨床的有効性と生存優位性を実証したが、ほとんどの患者は結局は再発する。一般には抗血管新生剤、特にＶＥＧＦ遮断薬に対する応答の減少の基礎となる細胞及び分子のメカニズムを解明するために集中的な研究が進められている(F. Shojaei and N. Ferrara, Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells, Cancer Res. 68 (2008), pp. 5501-5504)。
【０００９】
抗ＶＥＧＦに対する応答の減少は、腫瘍及び／又は非腫瘍（間質）の区画から生じ得る。腫瘍細胞とは対照的に、間質細胞は、遺伝的に安定であり、染色体異常を示さない(Hughes, 2008)。間質には、線維芽細胞、周皮細胞、間葉系幹細胞及び造血細胞を含む細胞の異種集団を含む。間質細胞は、腫瘍血管系への直接的な寄与(Santarelli et al., Incorporation of bone marrow-derived Flk-1-expressing CD34+ cells in the endothelium of tumor vessels in the mouse brain, Neurosurgery 59 (2006), pp. 374-382、ＶＥＧＦ(Liangら、2006) 及びＭＭＰ９(Coussensら、2000)及びＳｅｍａ４Ｄ(Sierraら、２００８）の放出などの幾つかの可能なメカニズムを介して、又は腫瘍細胞から免疫監視を外すことによって腫瘍増殖を支える。
【００１０】
多くの疾患及び障害における血管新生の役割を考慮すると、これらのプロセスを引き起こす生物学的作用の一以上を減少又は阻害する手段を有することが望まれる。本明細書に引用される全ての参考文献は、特許出願および刊行物を含み、その全体が参考により援用される。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、ＩＬ−１７アンタゴニストの有効量を投与することにより以前にＶＥＧＦアンタゴニストで治療された腫瘍を有するヒト被験体において、腫瘍の血管新生を阻害し、腫瘍増殖を抑制し、及び腫瘍を治療する方法を提供する。
【００１２】
一実施態様において、以前に血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストで治療された腫瘍を有するヒト被験体にＩＬ−１７アンタゴニストの有効量を投与することを含む腫瘍血管新生を阻害する方法が意図される。別の実施態様において、上記に考慮される方法において、ＩＬ−１７アンタゴニストは、抗ＩＬ−１７抗体又はその断片、又は抗ＩＬ−１７受容体抗体又はその断片である。更に別の実施態様において、抗ＩＬ−１７抗体又はその断片はＩＬ−１７Ａ又はＩＬ−１７Ｆ又はＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆに特異的に結合する。更なる実施態様において、上記に考慮される方法において、腫瘍は前記ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に難治性である。更に他の実施態様では、ＶＥＧＦアンタゴニストは抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片である。更に別の実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は配列番号１の可変重鎖配列及び配列番号２の可変軽鎖配列を含むベバシズマブ又はその断片若しくは変異体である。一実施態様において、ＩＬ−１７抗体又はその断片はモノクローナル抗体である。別の実施態様において、ＩＬ−１７抗体又はその断片はヒト、ヒト化又はキメラ抗体である。
【００１３】
一実施態様において、上記に考慮される方法において、ＩＬ−１７アンタゴニスト又はＩＬ−１７抗体又はその断片は、ＩＬ−１７アンタゴニスト又はＩＬ−１７抗体又はその断片の有効量を投与されなかったヒト被験体における腫瘍と比較して前記腫瘍の平均血管密度を減少させる。上記に考慮される方法の更なる実施態様において、腫瘍の血管新生の前記阻害は、ＩＬ−１７アンタゴニスト又はＩＬ−１７抗体又はその断片の有効量を投与されなかったヒト被験体における腫瘍と比較して、前記ヒト被験体において前記腫瘍の平均血管密度を少なくとも５％、又は少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも２５％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％又は少なくとも９９％減少させる。更に別の実施態様において、上記に考慮される方法において、前記平均血管密度は、前記腫瘍の全細胞面積に対する前記腫瘍のＣＤ３１陽性細胞の面積の平均を採用して測定される。
【００１４】
更に別の実施態様において、本方法は、前記ヒト被験体に抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片を投与することを含む。上記に考慮される方法の更なる実施態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は配列番号１の可変重鎖配列及び配列番号２の可変軽鎖配列を含むベバシズマブ又はその断片である。更に別の実施態様において、本方法は、前記ヒト被験体に化学療法または放射線療法を受けさせることを更に含む。更に別の実施態様において、本方法は、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストの有効量を投与することを更に含む。別の実施態様において、前記Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストは抗Ｇ−ＣＳＦ抗体又はその断片である。更に別の実施態様において、前記Ｇ−ＣＳＦ抗体又はその断片はモノクローナル抗体である。更に別の実施態様において、前記Ｇ−ＣＳＦ抗体又はその断片はヒト、ヒト化又はキメラ抗体である。
【００１５】
一実施態様において、上記に考慮される方法において、腫瘍は、結腸、直腸、肝臓、肺、前立腺、乳房又は卵巣である。
【００１６】
別の実施態様において、上記に考慮される方法は、前記ＩＬ−１７アンタゴニストの投与前に前記ヒト被験体から得られた腫瘍試料又は末梢血試料の数または頻度に対して前記ヒト被験体から得られた腫瘍試料中又は末梢血試料中のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数又は頻度を決定することにより、腫瘍血管新生の前記阻害の有効性をモニタリングすることを更に含む。
【００１７】
一実施態様において、以前に血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストで治療された腫瘍を有するヒト被験体にＩＬ−１７アンタゴニストの有効量を投与することを含む腫瘍増殖を抑制する方法が意図される。別の実施態様において、上記に考慮される方法において、ＩＬ−１７アンタゴニストは、抗ＩＬ−１７抗体又はその断片、又は抗ＩＬ−１７受容体抗体又はその断片である。更に別の実施態様において、抗ＩＬ−１７抗体又はその断片はＩＬ−１７Ａ又はＩＬ−１７Ｆ又はＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆに特異的に結合する。更なる実施態様において、上記に考慮される方法において、腫瘍は前記ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に難治性である。更に他の実施態様では、ＶＥＧＦアンタゴニストは抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片である。更に別の実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は配列番号１の可変重鎖配列及び配列番号２の可変軽鎖配列を含むベバシズマブ又はその断片若しくは変異体である。一実施態様において、ＩＬ−１７抗体又はその断片はモノクローナル抗体である。別の実施態様において、ＩＬ−１７抗体又はその断片はヒト、ヒト化又はキメラ抗体である。
【００１８】
一実施態様において、上記に考慮される方法において、ＩＬ−１７アンタゴニスト又はＩＬ−１７抗体又はその断片は、ＩＬ−１７アンタゴニスト又はＩＬ−１７抗体又はその断片の有効量を投与されなかったヒト被験体における腫瘍と比較して前記腫瘍の平均血管密度を減少させる。上記に考慮される方法の更なる実施態様において、腫瘍増殖の前記抑制は、ＩＬ−１７アンタゴニスト又はＩＬ−１７抗体又はその断片の有効量を投与されなかったヒト被験体における腫瘍と比較して、前記ヒト被験体において腫瘍体積を少なくとも５％、又は少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも２５％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％又は少なくとも９９％減少させる。別の実施態様において、腫瘍体積の前記減少は、コンピュータ断層撮影（ＣＡＴスキャン）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）又は単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）によって測定される。
【００１９】
更に別の実施態様において、本方法は、前記ヒト被験体に抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片を投与することを更に含む。上記に考慮される方法の別の実施態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は、ベバシズマブ又はその断片である。更に別の実施態様において、本方法は、前記ヒト被験体に化学療法または放射線療法を受けさせることを更に含む。更に別の実施態様において、本方法は、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストの有効量を投与することを更に含む。別の実施態様において、前記Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストは抗Ｇ−ＣＳＦ抗体又はその断片である。更に別の実施態様において、前記Ｇ−ＣＳＦ抗体又はその断片はモノクローナル抗体である。更に別の実施態様において、前記Ｇ−ＣＳＦ抗体又はその断片はヒト、ヒト化又はキメラ抗体である。
【００２０】
一実施態様において、上記に考慮される方法において、腫瘍は、結腸、直腸、肝臓、肺、前立腺、乳房又は卵巣である。
【００２１】
別の実施態様において、上記に考慮される方法は、前記ＩＬ−１７アンタゴニストの投与前に前記ヒト被験体から得られた腫瘍試料又は末梢血試料の数または頻度に対して前記ヒト被験体から得られた腫瘍試料中又は末梢血試料中のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数又は頻度を決定することにより、腫瘍増殖の前記抑制の有効性をモニタリングすることを更に含む。
【００２２】
一実施態様において、以前に血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストで治療された腫瘍を有するヒト被験体にＩＬ−１７アンタゴニストの有効量を投与することを含む腫瘍治療の方法が意図される。別の実施態様において、上記に考慮される方法において、ＩＬ−１７アンタゴニストは、抗ＩＬ−１７抗体又はその断片、又は抗ＩＬ−１７受容体抗体又はその断片である。更に別の実施態様において、抗ＩＬ−１７抗体又はその断片はＩＬ−１７Ａ又はＩＬ−１７Ｆ又はＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆに特異的に結合する。更なる実施態様において、上記に考慮される方法において、腫瘍は前記ＶＥＧＦアンタゴニストでの治療に難治性である。更に他の実施態様では、ＶＥＧＦアンタゴニストは抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片である。更に別の実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は配列番号１の可変重鎖配列及び配列番号２の可変軽鎖配列を含むベバシズマブ又はその断片若しくは変異体である。一実施態様において、ＩＬ−１７抗体又はその断片はモノクローナル抗体である。別の実施態様において、ＩＬ−１７抗体又はその断片はヒト、ヒト化又はキメラ抗体である。
【００２３】
一実施態様において、上記に考慮される方法において、ＩＬ−１７アンタゴニスト又はＩＬ−１７抗体又はその断片は、ＩＬ−１７アンタゴニスト又はＩＬ−１７抗体又はその断片の有効量を投与されなかったヒト被験体における腫瘍と比較して前記腫瘍の平均血管密度を減少させる。上記に考慮される方法の更なる実施態様において、前記腫瘍治療は、ＩＬ−１７アンタゴニスト又はＩＬ−１７抗体又はその断片の有効量を投与されなかったヒト被験体における腫瘍と比較して、前記ヒト被験体において腫瘍体積を少なくとも５％、又は少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも２５％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％又は少なくとも９９％減少させる。別の実施態様において、腫瘍体積の前記減少は、コンピュータ断層撮影（ＣＡＴスキャン）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）又は単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）によって測定される。
【００２４】
更に別の実施態様において、本方法は、前記ヒト被験体に抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片を投与することを更に含む。上記に考慮される方法の更なる実施態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は配列番号１の可変重鎖配列及び配列番号２の可変軽鎖配列を含むベバシズマブ又はその断片である。更に別の実施態様において、本方法は、前記ヒト被験体に化学療法または放射線療法を受けさせることを更に含む。更に別の実施態様において、本方法は、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストの有効量を投与することを更に含む。別の実施態様において、前記Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストは抗Ｇ−ＣＳＦ抗体又はその断片である。更に別の実施態様において、前記Ｇ−ＣＳＦ抗体又はその断片はモノクローナル抗体である。更に別の実施態様において、前記Ｇ−ＣＳＦ抗体又はその断片はヒト、ヒト化又はキメラ抗体である。
【００２５】
一実施態様において、上記に考慮される方法において、腫瘍は、結腸、直腸、肝臓、肺、前立腺、乳房又は卵巣である。
【００２６】
別の実施態様において、上記に考慮される方法は、前記ＩＬ−１７アンタゴニストの投与前に前記ヒト被験体から得られた腫瘍試料又は末梢血試料の数または頻度に対して前記ヒト被験体から得られた腫瘍試料中又は末梢血試料中のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数又は頻度を決定することにより、前記腫瘍治療の有効性をモニタリングすることを更に含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、培養物中の抗ＶＥＧＦ感受性腫瘍細胞（Ｔｉｂ６）に対する抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍細胞（ＥＬ４）の分泌タンパク質のプロファイルを示す。図１Ａは、Ｉｌ−１７は、インビトロで抗ＶＥＧＦ感受性（Ｔｉｂ６）腫瘍細胞に対して抗ＶＥＧＦ耐性（ＥＬ４）腫瘍細胞で見いだされた最も豊富な分泌因子であることを示している。図１Ｂは、抗ＶＥＧＦ難治性ＥＬ４細胞および正常皮膚繊維芽細胞（ＮＳＦ）の共培養物中でＩＬ−６およびＧ−ＣＳＦレベルが上昇していることを示している。
【図２】図２は、ＧＦＰ標識化ＥＬ４腫瘍細胞が７２時間正常な皮膚繊維芽細胞（ＮＳＦ）と共培養され、続いて線維芽細胞から腫瘍細胞がＦＡＣＳ単離され、ｑＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現の解析がなされたことを示す。図２ＡはＧ−ＣＳＦ（Ｃｓｆ３）誘導性発現を示し、図２ＢはＩＬ−６を誘導性発現示し及び図２Ｃは、ＩＬ−１７誘導性発現を示している（単一培養細胞に対して抗ＶＥＧＦ耐性ＥＬ４細胞株と共培養したとき正常線維芽細胞において観察された）。プリソート分析を、ＦＡＣＳソーティングにより導入された潜在的アーティファクトの調製のために実施した。
【図３】図３は、ＩＬ−１７中和は、共培養のＥＬ４腫瘍細胞によって誘導される、線維芽細胞におけるＥＬ４誘導されたＧ−ＣＳＦ発現を阻害することを示している。
【図４】図４Ａ及びＢは、対照抗体（抗ブタクサ、１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内（ＩＰ）、週二回）又は抗ＶＥＧＦ（１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、週二回）で処置されたＣ５７／ＢＬ６ ＷＴ及びＩｌ−１７ｒｃ−／−マウスにおけるＥＬ４腫瘍の増殖を示す。データは平均値±ＳＥＭとして示される。＊は、抗ＶＥＧＦ抗体で処置されたＷＴ及びＩｌ−１７ｒｃ−／−動物におけるＥＬ４腫瘍間の有意な相違（Ｐ＜０．０００１）を示している。
【図５】図５は、対照抗ブタクサ抗体（Ｒａｇ，１０ｍｇ／ｋｇ）又は抗ＶＥＧＦ抗体（Ｂ２０，１０ｍｇ／ｋｇ）のどちらかで処置されたＥＬ４担持ＷＴ及びＩｌ−１７ｒｃ−／−マウスにおける図５Ａ：ｍＧ−ＣＳＦ、図５Ｂ：Ｂｖ８、及び図５Ｃ：ＩＬ−１７Ａの血清レベルを示す。データは平均値±ＳＤとして示される。
【図６】図６は、担腫瘍マウスから単離され、Ｇｒ１＋／ＣＤ１１ｂ＋抗体で染色され、ＦＡＣＳでソートされた全血細胞を示す。免疫抑制未熟骨髄細胞がＧｒ１＋／ＣＤ１１ｂ＋二重陽性細胞として定義される。
【図７】図７は、図６におけるのと同じデータを示し、ここでＧｒ１＋／ＣＤ１１ｂ＋二重陽性細胞の数は図７Ａ：血液、図７Ｂ：脾臓及び図７Ｃ：腫瘍において定量化される。＊＊ｐ＜０．０００５、＊ｐ＜０．５。
【図８】図８は、ＬＰＳの存在下または非存在下で一晩培養し、続いてＢＶ８（図８Ａ）などの血管新生促進遺伝子、及びＳ１００Ａ８（図８Ｂ）；ＭＭＰ９（図８Ｃ）；及びＳ１００Ａ９（図８Ｄ）などの腫瘍促進遺伝子の発現のためのｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行った担腫瘍マウスの脾臓から単離したＧｒ１＋細胞を示している。
【図９】図９は、対照抗体（抗ブタクサ）又は抗ＶＥＧＦ抗体（クローンＢ２０）で処置され、緑色で示される抗ＣＤ３１（内皮細胞）、青色で示される抗デスミン（壁細胞）、及び赤色で示される抗平滑筋アクチン（ＳＭＡ）で免疫染色されたＷＴ及びＩＬ−１７ｒｃのＫＯ動物由来のＥＬ４腫瘍を示し、ここで陽性染色はこの腫瘍型における細動脈に対応する。
【図１０】図１０は、細胞の全面積に対するＣＤ３１陽性細胞の平均面積として表される免疫染色の定量化として、図９と同じデータを示す。少なくとも５つの異なるマウス／群からの全腫瘍切断面が定量化のために用いられた。＊ｐ＜０．０５．エラーバーは±ＳＥＭとして表される。
【図１１】図１１は、パラクリンＩＬ−１７の機能がＶＥＧＦ処置に感受性であるＴｉｂ６細胞株を用いた抗ＶＥＧＦ治療に対する不応性に必要とされる。抗ＶＥＧＦで処置されたＴｉｂ６−新生腫瘍細胞株（ｎ＝２）（実線）及び安定してｍＩＬ−１７Ａを発現するＴｉｂ−６腫瘍株（Ｔｉｂ６−ＩＬ−１７；ｎ＝４）（破線）の腫瘍体積（相対体積（％）をｙ軸）の変化を示す。データは平均値±ＳＥＭとして示される。
【図１２】図１２はＣ５７ＢＬ／６ ＷＴマウス（ｎ＝８）及びＧ−ＣＳＦＲ−／−マウス（ｎ＝８）におけるＥＬ４腫瘍の増殖曲線を示す。パネルＡは、腫瘍接種の２４時間後に開始した抗ＶＥＧＦまたは対照抗ブタクサ抗体による処置を示す。Ｇ−ＣＳＦＲ−／−宿主に対して担腫瘍ＷＴにおいて、循環に入り、腫瘍を浸潤するＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞のレベルの定量をフローサイトメトリー分析（パネルＢ）によって測定した。データは平均値±ＳＥＭとして表され、＊はスチューデントのｔ検定によりｐ＜０．０５を示す。
【図１３】図１３は、ＴＨ１７細胞は腫瘍微小環境内におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の補充及び活性化を介して抗ＶＥＧＦ処置に対する耐性を媒介することを示す。パネルＡは、ＷＴ及びＩｌ−１７ｒｃ−／−マウスにおいて対照（α−ＲＷ）および抗ＶＥＧＦ抗体の投与後に時間に対する同系皮下ルイス肺癌（ＬＬＣ）の腫瘍体積を示す。パネルＢは、対照、ＩＬ−１７Ａ（α−ＩＬ１７Ａ）に対する中和抗体、抗ＶＥＧＦ、又はα−ＩＬ１７Ａ及び併用した抗ＶＥＧＦの投与後の同系ＣＴ２６腫瘍体積を示す。全データは平均値±ＳＥＭとして表され、＊は両側スチューデントのｔ検定によりｐ＜０．０５を示す。
【図１４】図１４は、染色後フローサイトメトリーによる定量後にＷＴ及びＩｌ−１７ｒｃ−／−（ＫＯ）で増殖するＬＬＣ腫瘍からのＣＤ４＋（パネルＡ）及びＣＤ４＋ＩＬ−１７Ａ＋ＩＬ−２２＋産生腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）（パネルＢ）の割合を示す。
【図１５】図１５のパネルＡは実施例８に記載したようにＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＴＩＬの定量化を示す。ＣＤ３＋集団のうちＣＤ４＋ＩＬ−１７＋ＩＬ−２２＋の割合はフローサイトメトリーにより定量された（パネルＢ）。α−ＲＷ及びα−ＶＥＧＦの投与後のＷＴ及びＫＯ宿主中のＩｌ−１７Ａの腫瘍レベルはＥＬＩＳＡにより測定された（パネルＣ）。全データは平均値±ＳＥＭとして表され、＊は両側スチューデントのｔ検定によりｐ＜０．０５を示す。
【図１６】図１６は、処置後のＬＬＣ腫瘍内のＧ−ＣＳＦのレベルはＥＬＩＳＡにより（パネルＡ）、続いて腫瘍浸潤性ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数により（パネルＢ）測定され、Ｂｖ８のレベルはＥＬＩＳＡにより測定された（パネルＣ）ことを示す。全データは平均値±ＳＥＭとして表され、＊は両側スチューデントのｔ検定によりｐ＜０．０５を示す。
【図１７】図１７は、フローサイトメトリーにより定量した腫瘍関連内皮細胞の数を示す。群あたりｎ＝５−８。全データは平均値±ＳＥＭとして表され、＊＊は両側スチューデントのｔ検定によりｐ＜０．００５を示す。
【００２８】
本発明の詳細な記述
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、特定の組成物または生物系に限定されるものではなく、当然に変わりうると理解されるべきである。更に当然のことながら、本明細書で使用される用語は、特定の実施態様のみを説明する目的のためであり、限定することを意図するものではない。この明細書及び添付される特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、本内容が明確に指示しない限り、複数の参照対象を含む。従って、例えば、「分子」への言及は、必要に応じて２つ以上のそのような分子の組み合わせなどを含む。
【００２９】
Ａ．定義
通常、ポリペプチド「変異体」（すなわち本明細書において開示される任意のポリペプチドの変異体）は、対応する天然配列のポリペプチドと少なくともおよそ８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを意味する。このような変異体は、例えば、ポリペプチドのＮ−および／またはＣ末端で、一又は複数のアミノ酸（天然に生じるアミノ酸および／または天然に生じないアミノ酸）残基が付加又は欠失しているポリペプチドを含む。通常、変異体は、天然配列のポリペプチドと少なくともおよそ８０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくともおよそ９０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくともおよそ９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する。また、変異体は、一般的に生物学上活性な天然配列のポリペプチド断片（例えば部分配列、切断配列など）を含む。
【００３０】
本明細書での「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとして、選択した配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＩＮ−２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較プログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって以下に記載のように得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、米国著作権事務所，ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録され、ジェネンテク社、サウスサンフランシスコ，カリフォルニアから公に入手可能である。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄなど、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【００３１】
ここでの目的のために、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて完全に一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００３２】
本明細書中で用いられる「アンタゴニスト」なる用語は、リガンドの場合には一又は複数のレセプターへの結合、又はレセプターの場合には一又は複数のリガンドへの結合を含む、本発明のタンパク質の活性を中和、遮断（ブロック）、阻害、抑止、低減又は干渉することができる分子を指す。アンタゴニストには、抗体及びその抗原結合断片、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、生物有機分子、ペプチド模倣薬、薬理学的薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳制御配列などが含まれる。また、アンタゴニストには、本発明のタンパク質の小分子インヒビター、及び融合タンパク質、タンパク質に特異的に結合することによってその標的への結合を隔離するレセプター分子及び誘導体、タンパク質のアンタゴニスト変異体、本発明のタンパク質に対するアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、及び本発明のタンパク質に対するリボザイムが含まれる。
【００３３】
「遮断（ブロック）」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、結合する抗原の生物学的活性を阻害するか又は低減させるものである。特定の阻止抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を、実質的に又は完全に阻害する。
【００３４】
本明細書で使用される「腫瘍血管新生を阻害する」なる用語は、新規血管形成を誘導する腫瘍の能力の阻害、又は既存の血管系を補充する腫瘍の能力を阻害することを指す。
【００３５】
本明細書で用いられる「腫瘍増殖を抑制する」なる用語は、治療後に更に増殖せず及び／又は転移しない腫瘍を指す。本明細書に記載されるように、腫瘍血管新生が阻害されるときに腫瘍増殖を抑制することができる。本明細書で使用される場合、腫瘍増殖の前記抑制は、ＩＬ−１７アンタゴニスト又はＩＬ−１７抗体又はその断片の有効量を投与されなかったヒト被験体における腫瘍と比較して、前記ヒト被験体において腫瘍体積を少なくとも５％、又は少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも２５％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％又は少なくとも９９％減少させる。更に、本明細書で使用される場合、腫瘍体積の前記減少は、全て当該技術分野でよく知られた技術である、コンピュータ断層撮影（ＣＡＴスキャン）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）又は単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）によって測定される。
【００３６】
「腫瘍の平均血管密度が減少する」なる用語は、腫瘍の増殖をサポートする腫瘍脈管構造の量や濃度を特定の測定可能な量だけ阻害又は抑制することを意味し、血管密度の低下がアンタゴニストによってもたらされる場合、ＩＬ−１７アンタゴニスト又はＩｌ−１７抗体又はその断片の有効量を投与されなかったヒト被験体における腫瘍と比較して、少なくとも５％、又は少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも２５％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％又は少なくとも９９％だけ減少する。本明細書で使用される場合、「平均血管密度」は、前記腫瘍の全細胞面積に対する前記腫瘍のＣＤ３１陽性細胞の面積の平均を採用して測定される。
【００３７】
本明細書中で用いられる「ＶＥＧＦ」なる用語は天然配列の血管内皮性増殖因子及びその変異体を指す。
【００３８】
本明細書中で用いる「ＶＥＧＦ」又は「ＶＥＧＦ−Ａ」なる用語は、Leung等 Science, 246:1306 (1989)、Houck等 Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)、及びRobinson & Stringer, Journal of Cell Science, 144(5): 853-865 (2001)によって記載されているように、天然配列の１６５アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子と、関連した１２１−、１４５−、１８３−、１８９−、及び２０６−アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子、並びにそれらの天然に生じる対立遺伝子型及びプロセシング型、並びにその変異体を意味する。ＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−Ｆ及びＰｌＧＦを含む遺伝子ファミリの一部である。ＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）及びＶＥＧＦＲ−２（Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ）の２つの高親和性レセプターチロシンキナーゼに主に結合する。この後者はＶＥＧＦ−Ａの血管内皮細胞分裂促進シグナルの主な伝達物質である。また、「ＶＥＧＦ」又は「ＶＥＧＦ−Ａ」なる用語は、マウス、ラット又は霊長類などの非ヒト動物腫由来のＶＥＧＦも意味する。時には特定の種由来のＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦはｈＶＥＧＦ、マウスＶＥＧＦはｍＶＥＧＦなどの用語で表される。また、「ＶＥＧＦ」なる用語は、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸８〜１０９、又は１〜１０９を含むポリペプチドの切断型ないしはその断片を意味する。そのようなＶＥＧＦ型を指すときは、本明細書では、例えば、「ＶＥＧＦ（８−１０９）」、「ＶＥＧＦ（１−１０９）」又は「ＶＥＧＦ１６５」と表す。「切断した（切断型の）」天然のＶＥＧＦのアミノ酸位置は、天然のＶＥＧＦ配列に示される数で示す。例えば、切断型の天然ＶＥＧＦのアミノ酸位置１７（メチオニン）は、天然のＶＥＧＦ中の位置１７（メチオニン）でもある。切断型の天然ＶＥＧＦは天然配列のＶＥＧＦに匹敵するＫＤＲ及びＦｌｔ−１レセプター結合親和性を有する。
【００３９】
「ＶＥＧＦアンタゴニスト」は、一又は複数のＶＥＧＦレセプターへの結合を含む、天然配列ＶＥＧＦの活性を中和、遮断、阻害、抑止、低減又は干渉することができる分子（ペプチジル又は非ペプチジル）を指す。ＶＥＧＦアンタゴニストには、抗ＶＥＧＦ抗体及びその抗原結合性断片、ＶＥＧＦに特異的に結合することによって一又は複数のレセプターへの結合を隔離するレセプター分子及び誘導体（例えば、可溶性ＶＥＧＦレセプタータンパク質、又はそのＶＥＧＦ結合断片、又はキメラＶＥＧＦレセプタータンパク質）、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの小分子インヒビターなどの抗ＶＥＧＦレセプター抗体及びＶＥＧＦレセプターアンタゴニスト、及び融合タンパク質、例として、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、ＶＥＧＦ１２１−ゲロニン（Ｐｅｒｅｇｉｎｅ）が含まれる。また、ＶＥＧＦアンタゴニストには、ＶＥＧＦのアンタゴニスト、ＶＥＧＦに対するアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、及びＶＥＧＦないしはＶＥＧＦレセプターに対するリボザイムが含まれる。さらに、本発明の方法に有用なＶＥＧＦアンタゴニストには、ＶＥＧＦを特異的に結合するペプチジルないしは非ペプチジル化合物、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体ないしその抗原結合性断片、ポリペプチド、又はＶＥＧＦに特異的に結合する抗体変異体又はその断片；ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも断片に相補性があるアンチセンス核酸塩基のオリゴマー；ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも断片に相補性がある小ＲＮＡ；ＶＥＧＦを標的とするリボザイム；ＶＥＧＦに対するペプチボディ；及びＶＥＧＦアプタマーが含まれる。一実施態様では、ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦの発現レベル又は生物学的活性を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上低減するか、又は阻害する。他の実施態様では、ＶＥＧＦアンタゴニストによって阻害されるＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ（８−１０９）、ＶＥＧＦ（１−１０９）又はＶＥＧＦ１６５である。
【００４０】
「抗ＶＥＧＦ抗体」又は「ＶＥＧＦに結合する抗体」なる用語は、抗体がＶＥＧＦを標的とした診断上の薬剤及び／又は治療上の薬剤として有用であるために十分な親和性と特異性を有してＶＥＧＦに結合することができる抗体を指す。例えば、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が関与する疾患及び症状を標的とし、干渉する際の治療上の薬剤として有用でありうる。例として米国特許第６５８２９５９号、同第６７０３０２０号；国際公開第９８／４５３３２号；国際公開第９６／３００４６号；国際公開第９４／１０２０２号、国際公開第２００５／０４４８５３号；；欧州特許第０６６６８６８号Ｂ１；米国特許公開第２００３０２０６８９９号、同第２００３０１９０３１７号、同第２００３０２０３４０９号、同第２００５０１１２１２６号、同第２００５０１８６２０８号及び同第２００５０１１２１２６号；Popkov等, Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)；及び国際公開第２００５０１２３５９号を参照のこと。選択した抗体は通常、ＶＥＧＦに対して十分に強い結合親和性を有し、例えば、抗体は１００ｎＭ−１ｐＭの間のＫｄ値でｈＶＥＧＦを結合しうる。抗体親和性は、例えば、表面プラスモン共鳴をベースとしたアッセイ（ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００５／０１２３５９に記載のあるＢＩＡｃｏｒｅアッセイなど）；酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；及び、競合アッセイ（例えばＲＩＡのもの）によって決定されうる。例えば治療としての有効性を評価するために、抗体を他の生物学的な活性アッセイに用いてもよい。このようなアッセイは当分野で公知であり、標的抗原と抗体の使用目的に依存する。例として、ＨＵＶＥＣ阻害アッセイ；腫瘍細胞増殖阻害アッセイ（例えば国際公開第８９／０６６９２号に記載のもの）；抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体媒介性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイ（米国特許第５５００３６２号）；及び、アゴニスト活性又は造血アッセイ（国際公開第９５／２７０６２号を参照）などがある。抗ＶＥＧＦ抗体は通常、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ又はＶＥＧＦ−Ｅなどの他のＶＥＧＦホモログにも、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦ又はｂＦＧＦなどの他の増殖因子にも結合しないだろう。一実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体には、ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ １０７０９によって産生されるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体；Presta等 (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599に従って産生される組み換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体であり、限定するものではないが「ベバシズマブ（ＢＶ）」とも「ｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦ」又は「ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）」としても知られる抗体が含まれる。ベバシズマブは、ヒトＶＥＧＦのそのレセプターへの結合をブロックするマウスの抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ．４．６．１からの変異したヒトのＩｇＧ１フレームワーク領域と抗原結合性相補性決定領域を含む。フレームワーク領域のほとんどを含め、ベバシズマブのアミノ酸配列のおよそ９３％は、ヒトのＩｇＧ１に由来し、配列のおよそ７％はマウスの抗体Ａ４．６．１に由来する。ベバシズマブは、およそ１４９０００のダルトンの分子量を有し、グリコシル化されている。ベバ���ズマブ及び他のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体は、２００５年２月２６日に発行の米国特許第６８８４８７９号にさらに記載されている。
【００４１】
本明細書で提供される方法、用途及び組成物の何れかにおいて、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト、例えば本明細書に記載されるＶＥＧＦ受容体分子またはキメラＶＥＧＦ受容体分子で置換されていてもよい。本明細書で提供される方法、用途及び組成物のある実施態様において、抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブである。抗ＶＥＧＦ抗体、又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、完全ヒト抗体、又はヒト化抗体であり得る。本発明の方法において有用な抗体の例は、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、Ｇ６抗体、Ｂ２０抗体及びその断片が含まれる。ある実施態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴ ＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬＥＷＶＧＷ
ＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹ ＡＡＤＦＫＲＲＦＴＦ ＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹ ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＫＹＰ
ＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦ ＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴ ＶＳＳ （配列番号１）
及び以下のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳ ＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰ ＧＫＡＰＫＶＬＩＹＦ
ＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳ ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱ ＹＳＴＶＰＷＴＦＧＱ
ＧＴＫＶＥＩＫＲ （配列番号２）。
【００４２】
幾つかの実施態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下のアミノ酸配列：ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号３）を含むＣＤＲＨ１、以下のアミノ酸配列：ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ（配列番号４）を含むＣＤＲＨ２、以下のアミノ酸配列：ＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号５）を含むＣＤＲＨ３、以下のアミノ酸配列：ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号６）を含むＣＤＲＬ１，以下のアミノ酸配列：ＦＴＳＳＬＨＳ（配列番号７）を含むＣＤＲＬ２、及び以下のアミノ酸配列：ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号８）を含むＣＤＲＬ３を含む。
【００４３】
更なる好ましい抗体は、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００５／０１２３５９に記載されているように、Ｇ６又はＢ２０シリーズの抗体（たとえば、Ｇ６−２３、Ｇ６−３１、Ｂ２０−４．１）が含まれる。更に好ましい抗体については、米国特許第７，０６０，２６９号、第６，５８２，９５９号、第６，７０３，０２０号；第６，０５４，２９７号；国際公開第９８／４５３３２号；国際公開第９６／３００４６号；国際公開第９４／１０２０２号；欧州特許出願公開第０６６６８６８Ｂ１号；米国特許出願公開第２００６００９３６０号、第２００５０１８６２０８号、第２００３０２０６８９９号、第２００３０１９０３１７号、第２００３０２０３４０９号、及び第２００５０１１２１２６号；及びPopkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)を参照。
【００４４】
本発明に係る「Ｇ６シリーズ抗体」は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００５／０１２３５９の、図７、図２４〜２６、及び３４〜３５の何れか一項に記載のＧ６抗体又はＧ６由来抗体の配列に由来する抗ＶＥＧＦ抗体であり、その全開示は、参照により本明細書に援用される。また、開示全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ公開番号ＷＯ２００５／０４４８５３も参照のこと。一実施態様において、Ｇ６シリーズ抗体は、残基Ｆ１７、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｄ６３、Ｉ８３およびＱ８９を含むヒトＶＥＧＦ上の機能的なエピトープに結合する。
【００４５】
本発明に係る「Ｂ２０シリーズ抗体」は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００５／０１２３５９の、図２７〜２９の何れか一項に記載のＢ２０抗体又はＢ２０由来抗体の配列に由来する抗ＶＥＧＦ抗体であり、その全開示は、参照により本明細書に援用される。また、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００５／０４４８５３および米国特許出願第６０／９９１、３０２を参照いただき、これらの特許出願の内容は参照により本明細書に組み込まれる。一実施態様において、Ｂ２０シリーズ抗体は、残基Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｙ２５、Ｑ８９、Ｉ９１、Ｋ１０１、Ｅ１０３、及びＣ１０４を含むヒトＶＥＧＦ上の機能的なエピトープに結合する。
【００４６】
「造血幹／前駆細胞」又は「未分化造血細胞」は、より関係しているか、又は成熟した血液細胞種を形成するように分化することができるものである。「リンパ系の血液細胞系統」は、リンパ球（Ｂ細胞又はＴ細胞）を形成するように分化することができるそれらの造血前駆細胞である。同様に「リンパ球新生」はリンパ球の形成である。「赤血球血液細胞系統」は、赤血球(erythrocytes、red blood cells)を形成するように分化することができるそれらの造血前駆細胞であり、「赤血球新生」は赤血球の形成である。
【００４７】
本明細書中の目的のために、「骨髄血液細胞系統」なる表現は、上記のリンパ系及び赤血球血液細胞系統以外の、すべての造血始原細胞を包含し、「骨髄造血」は血液細胞（リンパ球及び赤血球以外の）の形成を伴う。
【００４８】
骨髄細胞群は、Ｇｒ１＋／ＣＤ１１ｂ＋（又はＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋）又はＧｒ１＋／Ｍａｃ−１＋である骨髄免疫細胞が豊富でありうる。これらの細胞は、マクロファージ系統の骨髄性細胞用のマーカーであるＣＤ１１ｂと、顆粒球用のマーカーであるＧｒ１を発現する。Ｇｒ１＋／ＣＤ１１ｂ＋は、例えばＧｒ１＋に対する抗体による免疫吸着パニングによって選択されてもよい。
【００４９】
「骨髄系細胞減少薬剤」又は「骨髄性細胞減少剤」は、骨髄性細胞群を減少させるか又は除去する薬剤を指す。一般的に、骨髄性細胞減少剤は、骨髄性細胞、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋、単球、マクロファージなどを減少させるか又は除去する。骨髄性細胞減少薬剤の例には、限定するものではないが、Ｇｒ１＋アンタゴニスト、ＣＤ１１ｂアンタゴニスト、ＣＤ１８アンタゴニスト、エラスターゼインヒビター、ＭＣＰ−１アンタゴニスト、ＭＩＰ−１αアンタゴニストなどが含まれる。
【００５０】
本明細書中で用いられる「Ｇｒ１アンタゴニスト」なる用語は、Ｇｒ１に結合して、Ｇｒ１の生物学的な活性を阻害するか又は実質的に減少させる分子を指す。Ｇｒ１アンタゴニストの非限定的な例には、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、バイオ有機分子、ペプチド模倣薬、製薬的薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳制御配列などが含まれる。本発明の一実施態様では、Ｇｒ１アンタゴニストは、抗体、特にヒトのＧｒ１を結合する抗Ｇｒ１抗体である。
【００５１】
本明細書中で用いられる「ＣＤ１１ｂアンタゴニスト」なる用語は、ＣＤ１１ｂに結合して、ＣＤ１１ｂの生物学的活性を阻害するか又は実質的に減少させる分子を指す。通常、アンタゴニストは、細胞表面にＣＤ１１ｂサブユニットを発現する細胞（例えば未成熟骨髄系細胞）が持つ内皮へ結合する能力を（部分的にないしは完全に）ブロックするであろう。ＣＤ１１ｂアンタゴニストの非限定的な例には、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、生物有機分子、ペプチド模倣薬、製薬的薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳制御配列などが含まれる。本発明の一実施態様では、ＣＤ１１ｂアンタゴニストは、抗体、特にヒトのＣＤ１１ｂを結合する抗ＣＤ１１ｂ抗体である。典型的なＣＤ１１ｂ抗体には、ＭＹ９０４（米国特許第４８４０７９３号）；１Ｂ６ｃ（Zhang等, Brain Research 698:79-85 (1995)を参照）；ＣＢＲＮ１／５及びＣＢＲＭ１／１９（国際公開第９４／０８６２０号）が含まれる。
【００５２】
「ＵＲＣＧＰ」は、抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ＋１細胞において上方制御されるタンパク質を指す。ＵＲＣＧＰには、限定するものではないが、好中球エラスターゼ、ＣＤ１４、ｅｘｐｉ、Ｉｌ−１３Ｒ、ＬＤＬＲ、ＴＬＲ−１、ＲＬＦ、Ｅｎｄｏ−Ｌｉｐ、ＳＯＣＳ１３、ＦＧＦ１３、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−１１Ｒ、ＩＬ−１ＲＩＩ、ＩＦＮ ＴＭ１、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＷＮＴ５Ａ、分泌キャリア膜１、ＨＳＰ８６、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＲＢ２、ＧＰＣＲ２５、ＨＧＦ、アンギオポエチン様−６、Ｅｐｈ−ＲＡ７、セマフォリンＶｌｂ、ニューロトロフィン５、クローディン−１８、ＭＤＣ１５、ＥＣＭ及びＡＤＡＭＴＳ７Ｂが含まれる。ある実施態様では、ＵＲＣＧＰは、ＩＬ−１３Ｒ、ＴＬＲ−１、Ｅｎｄｏ−Ｌｉｐ、ＦＧＦ１３及び／又はＩＬ−４Ｒを指す。
【００５３】
「ＤＲＣＧＰ」は、抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞において下方制御されるタンパク質を指す。ＤＲＣＧＰには、限定するものではないが、ＴＨＢＳ１、Ｃｒｅａ７、アクアポリン−１、溶質キャリアファミリタンパク質（ＳＣＦ３８）、アポリポタンパクＥ（ＡＰＯＥ）、脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）、ＮＣＡＭ−１４０、フィブロネクチンＩＩＩ型、ＷＩＰ、ＣＤ７４、ＩＣＡＭ−２、Ｊａｇｇｅｄ１、ｌｔｇａ４、ＩＴＧＢ７、ＴＧＦ−ＢＩＩ−Ｒ、ＴＧＦｂ ＩＥＰ、Ｓｍａｄ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＣＤ８３、Ｄｅｃｔｉｎ−１、ＣＤ４８、Ｅ−セレクチン、ＩＬ−１５、サイトカインシグナル伝達４のサプレッサー、Ｃｙｔｏｒ４及びＣＸ３ＣＲ１が含まれる。ある実施態様では、ＤＲＣＧＰはＴＨＢＳ１及び／又はＣｒｅａ７を指す。
【００５４】
「ＵＲＲＴＰ」は、抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍において上方制御されるタンパク質を指す。ＵＲＲＴＰには、限定するものではないが、Ｎｏｔｃｈ２、ＤＭＤ８、ＭＣＰ−１、ＩＴＧＢ７、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−８Ｒ、ＭＩＰ２、ＭＳＣＡ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１Ｒ、Ｍｅｇ−ＳＦ、ＨＳＰ１Ａ、ＩＬ−１Ｒ、Ｇ−ＣＳＦＲ、ＩＧＦ２、ＨＳＰ９Ａ、ＦＧＦ１８、ＥＬＭ１、Ｌｅｄｇｆａ、スカベンジャーレセプタータイプＡ、マクロファージＣ−タイプレクチン、Ｐｉｇｒ３、マクロファージＳＲＴ−１、Ｇプロテイン−結合レセプター、ＳｃｙＡ７、ＩＬ−１Ｒ２、ＩＬ−１誘導型タンパク質、ＩＬ−１β、及びＩＬＩＸ前駆物質が含まれる。ある実施態様では、ＵＲＲＴＰはＭＳＣＡ、ＭＩＰ２、ＩＬ−８Ｒ及び／又はＧ−ＣＳＦを指す。
【００５５】
「ＤＲＲＴＰ」は、抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍において下方制御されるタンパク質を指す。ＵＲＲＴＰには、限定するものではないが、ＩＬ１０−Ｒ２、Ｅｒｂ−２．１、カベオリン３、Ｓｅｍｃａｐ３、ＩＮＴＧ４、ＴＨＢＳＰ−４、ＥｒｂＢ３、ＪＡＭ、Ｅｎｇ、ＪＡＭ、Ｅｎｇ、ＪＡＭ−２、Ｐｅｃａｍ１、Ｔｌｒ３、ＴＧＦ−Ｂ、ＦＩＺＺ１、Ｗｆｓ１、ＴＰ１４Ａ、ＥＭＡＰ、ＳＵＬＦ−２、細胞外基質２、ＣＴＦＧ、ＴＦＰＩ、ＸＣＰ２、Ｒａｍｐ２、ＲＯＲ−α、エフリンＢ１、ＳＰＡＲＣ−様１及びセマフォリンＡが含まれる。ある実施態様では、ＤＲＲＴＰはＩＬ１０−Ｒ２、ＴＨＢＳＰ−４及び／又はＪＡＭ−２を指す。
【００５６】
「生物学的試料」なる用語は、任意の動物からの身体試料を指すが、好ましくは哺乳動物からのもの、より好ましくはヒトからのものである。このような試料は、血液、血清、血漿、骨髄、硝子体体液、リンパ体液、関節液、濾胞液、精液、羊水、乳汁、全血液、尿、脳脊髄液、唾液、痰、涙、汗、粘液および組織培養液のような体液、並びにホモジナイズした組織のような組織抽出物、及び細胞抽出物を含む。本明細書において好適な生体試料は、血清、血漿、尿又は骨髄試料である。
【００５７】
「抗体」という用語は最も広義に使用され、モノクローナル抗体（完全長又は無傷のモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多価抗体、少なくとも２つのインタクト抗体から形成される多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片（以下を参照）を具体的に包含する。
【００５８】
他に示されない限り、「多価抗体」なる表現は、３つ以上の抗原結合部位を含む抗体を指すために本明細書を通して使用される。多価抗体は、３つ以上の抗原結合部位を有するように典型的に操作されており、一般的に天然配列のＩｇＭ又はＩｇＡ抗体ではない。
【００５９】
「抗体断片」は、一般にはインタクトな抗体の抗原結合部位を含み、よって抗原に結合する能力を保持しているインタクトな抗体の一部のみを含む。本定本定義に包含される抗体断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦａｂ断片；（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に一又は複数のシステイン残基を持つＦａｂ断片であるＦａｂ’断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦｄ断片；（ｉｖ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に一又は複数のシステイン残基とＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦｄ’断片；（ｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを持つＦｖ断片；（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward等, Nature 341, 544-546 (1989))；（ｖｉｉ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉｉｉ）ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって結合された２つのＦａｂ’断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｘ）単鎖抗体分子（例えば単鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ）（Bird等, Science 242:423-426 (1988)；及びHuston等, PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988))；（ｘ）同一のポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を持つ「ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」（例えば、欧州特許公報第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）；（ｘｉ）相補的軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む「線形抗体」（Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995)；及び米国特許第５６４１８７０号）が含まれる。
【００６０】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を一般的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作ることができ、それらの技術には例えばハイブリドーマ法（例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)；Hongo等, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow等, Antibodies: A loboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第２版 1988）；Hammerling等： Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981))、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）、ファージディスプレイ法（例えば、Clarkson等， Nature, 352:624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)；Lee等, J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee等, J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)参照）、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生する技術（例えば、国際公開第１９９８／２４８９３号；国際公開第１９９６／３４０９６号；国際公開第１９９６／３３７３５号；国際公開第１９９１／１０７４１号；Jackobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；及び同第５，６６１，０１６号；Marks等, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)；Longerg等, Nature, 368:856-859 (1994)；Morrison, Nature, 368:812-813 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996)；及びLongerg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995))が含まれる。
【００６１】
本発明のモノクローナル抗体は、具体的には、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の種に由来する又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同であるが、その（それらの）鎖の残部は別の種に由来する又は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体、並びにそのような抗体の断片（但し、それらが所望の生物学的活性を示すことを条件とする）であり得る（米国特許第４８１６５６７号；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
【００６２】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性、及び性能を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などのヒト以外の種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例においては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非−ヒト残基によって置き換えられている。更に、ヒト化抗体はレシピエント抗体又はドナー抗体において見いだされない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改良するために作成される。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、超可変ループの全て又は実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、任意で、免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれをも含むであろう。更なる詳細については、Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Reichmann et al.,Nature,332:323-329(1988)；およびPresta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)を参照。また、Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)； Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)； Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)；及び米国特許第６，９８２，３２１号及び同第７，０８７，４０９号も参照。van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)も参照。抗原刺激に応答して抗体を産生するように修飾されているが、その内在性遺伝子座が無能になっているトランスジェニック動物、例えば免疫化ゼノマウスに抗原を投与することによってヒト抗体を調製することができる（例として、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術に関する米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号を参照）。また、例えば、ヒトのＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成したヒト抗体に関するLi等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)も参照のこと。
【００６３】
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。
【００６４】
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つ又はインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載している、米国特許第６，０７５，１８１号及び６，１５０，５８４号；ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術を記載している米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７，０４１，８７０号及び、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）も参照のこと。このような動物で生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変される可能性がある。
【００６５】
ヒト抗体は、ハイブリドーマベース法によって作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ細胞株が記載されている。（例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)； Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及びBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体はまた、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載される。
【００６６】
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。
【００６７】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域はＦＲによって極く近傍に一緒に保持され、他の鎖からの高頻度可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性への抗体の関与を示す。
【００６８】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性であり、及び／又は抗原認識に関与している。典型的な超可変ループはアミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる。(Chothia and Lesk, J. Mol.Biol.196:901-917 (1987))。典型的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２で生じる。(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」をも含む。ＳＤＲは、略称（abbreviated-）ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれる、ＣＤＲの領域内に含まれている。典型的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２で生じる。（Almagro and Fransson, Front.Biosci.13:1619-1633 (2008)を参照）。特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従い、本明細書において番号が付けられる。多数のＨＶＲの描写が使用され、ここに含まれる。カバット相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列変化に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, ５版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置に言及している(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ ＨＶＲは、カバットＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａ構造的ループの間の妥協を表し、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用できる複合体結晶構造の解析に基づく。これらのＨＶＲの各々からの残基は以下の表１に記される。
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【００６９】
ＨＶＲは、次のような「拡大ＨＶＲ」を含むことができる：ＶＬの２４−３６又は２４−３４（Ｌ１）、４６−５６又は５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７又は８９−９６（Ｌ３）と、ＶＨの２６−３５（Ｈ１）、５０−６５又は４９−６５（Ｈ２）及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基には、これら各々を定義するために、Kabat等，上掲に従って番号を付した。
【００７０】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメインで構成される：ＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３，及びＦＲ４。従っ従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００７１】
「カバット（Ｋａｂａｔ）による可変ドメイン残基番号付け」又は「カバットに記載のアミノ酸位番号付け」なる用語及びその異なる言い回しは、上掲のカバット等の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲ内の短縮又は挿入に相当する２、３のアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えばカバットによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど）と、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸の挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）を含んでもよい。残基のＫａｂａｔ番号は、「標準の」カバット番号付け配列によって抗体の配列の相同領域でアライメントすることによって与えられる抗体について決定してもよい。
【００７２】
本明細書及び特許請求の範囲すべてにわたって、一般的に、可変ドメインの残基を指す場合にはカバット番号付けシステムを用いる（およそ、軽鎖の残基１−１０７と重鎖の残基１−１１３）（例として、Kabat 等, Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。一般的に、免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基を指す場合には、「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」を用いる（ＥＵインデックスはKabat 等， Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)において報告されており、出典明記によって本明細書中に特別に組み込まれる）。本明細書中で特に述べない限り、抗体の可変ドメイン内の残基の数の参照は、カバット番号付けシステムによって番号付けした残基を意味する。本明細書中で特に述べない限り、抗体の定常ドメイン内の残基の数の参照は、ＥＵ番号付けシステムによって番号付けした残基を意味する（例として、米国特許仮出願第６０／６４０３２３号、ＥＵ番号付けについての図を参照）。
【００７３】
免疫グロブリンの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体（イムノグロブリン）は異なるクラスが割り当てられる。イム免疫グロブリンには５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、更にそれらは、ＩｇＧ１（非Ａ及びＡアロタイプを含む）、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２等のサブクラス（アイソタイプ）に分かれる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られており、一般に、例えばAbbas等 Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000)に記載されている。抗体は、抗体と一又は複数の他のタンパク質ないしペプチドとの共有的ないしは非共有的結合によって形成される大きな融合分子の一部であってもよい。
【００７４】
任意の脊椎動物種からの抗体（イムノグロブリン）の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
【００７５】
「Ｆｃ領域」なる用語は、インタクト抗体のパパイン消化によって生成されうる免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は天然配列Ｆｃ領域又は変異形Ｆｃ領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はおよそＣｙｓ２２６の位置又はおよそＰｒｏ２３０からの位置のアミノ酸残基からＦｃ領域のカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７）は、例えば、抗体の産生又は精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え遺伝子操作することによって取り除かれてもよい。したがって、インタクト抗体の組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体群、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体群、及びＫ４４７残基を有する抗体と有さない抗体の混合を含む抗体群を含みうる。免疫グロブリンのＦｃ領域は一般に、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの２つの定常ドメインを含み、場合によってＣＨ４ドメインを含む。
【００７６】
特に明記しない限り、本明細書中の免疫グロブリン重鎖の残基の番号付けは、出典明記によって本明細書中に特別に援用される上掲のＫａｂａｔ等のＥＵインデックスのものである。「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号を指す。
【００７７】
本明細書中の「Ｆｃ領域鎖」は、Ｆｃ領域の２つのポリペプチド鎖の１つを意味する。
【００７８】
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｃｇ２」ドメインとも呼ばれる）は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基まで延びている。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと親密な対にならないという点で独特である。代わりに、２つのＮ結合分岐炭水化物鎖が、無傷の天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に挿入される。炭水化物はドメイン−ドメイン対の代替物を提供し、ＣＨ２ドメインの安定化を助けることができると推測される。Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)。ここで、ＣＨ２ドメインは天然配列のＣＨ２ドメイン又は変異体ＣＨ２ドメインとすることができる。
【００７９】
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域におけるＣ末端からＣＨ２ドメインまでの範囲（つまり、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸から約４４７位のアミノ酸）を含む。ここでは、ＣＨ３領域は、天然配列のＣＨ３ドメインか、又は変異体ＣＨ３ドメイン（例えば、その一鎖に「突出部(protroberance)」が導入され、それに対応して他の鎖に「空洞」が導入されたＣＨ３ドメイン：出典明記によって特別に本明細書中に援用される米国特許第５８２１３３３号参照）とすることができる。このような変異体ＣＨ３ドメインを使用して本明細書に開示する多重特異性（例えば二重特異性）抗体をつくることができる。
【００８０】
「ヒンジ領域」は、通常、ヒトＩｇＧ１の約Ｇｌｕ２１６又は約Ｃｙｓ２２６から約Ｐｒｏ２３０まで延びていると定義される(Burton, Molec. Immunol.22:161-206, 1985)。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、同じ位置に内部重鎖Ｓ−Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を配置することによりＩｇＧ１と整列させることができる。本明細書のヒンジ領域は、天然配列のヒンジ領域か、又は変異体ヒンジ領域とすることができる。変異体ヒンジ領域の２つのポリペプチド鎖は、通常、１つのポリペプチド鎖につき少なくとも１つのシステイン残基を保持しており、よって２つの変異体ヒンジ領域のポリペプチド鎖は２つの鎖の間にジスルフィド結合を形成することができる。本発明の好ましいヒンジ領域は、天然配列のヒトヒンジ領域、例えば天然配列のヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
【００８１】
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つの「作動体機能」を有する。例示的「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）、Ｆｃレセプター結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面レセプター（例えばＢ細胞レセプター；ＢＣＲ）の下方制御などが含まれる。そのようなエフェクター機能は、通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わさることを必要とし、そのような抗体のエフェクター機能を評価するための当技術分野で既知の様々なアッセイを使用して評価される。
【００８２】
「天然配列のＦｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を包含する。天然配列のヒトＦｃ領域は、天然配列のヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域（非Ａ−及びＡ−アロタイプ）；天然配列のヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域；天然配列のヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域；及び天然配列のヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域；並びに、これらの自然に生じる変異体が含まれる。
【００８３】
「インタクトな」抗体は、抗原−結合可変領域、並びに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそれらのアミノ酸配列変異体であってよい。好ましくは、インタクトな抗体は、一又は複数のエフェクター機能を有する。
【００８４】
「親抗体」又は「野生型」抗体は、本明細書中で開示する抗体変異体と比較して一又は複数のアミノ酸配列の変更が無いアミノ酸配列を含む抗体である。ゆえに、一般に親抗体は、本明細書中で開示する抗体変異体の対応する高頻度可変領域のアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる少なくとも一の高頻度可変領域を有する。親抗体は、天然の配列（すなわち、天然に生じる）抗体（天然に生じる対立変異体を含む）、又は天然に生じる配列の既存のアミノ酸配列修飾（例えば挿入、欠失及び／又は他の変更）を有してもよい。開示内容全体を通して、「野生型」、「ＷＴ」、「ｗｔ」、及び「親」ないしは「親の」抗体は交換可能に用いられる。
【００８５】
ここで用いる「抗体変異体」又は「変異抗体」は、親抗体のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する抗体を指す。好ましくは、抗体変異体は、天然に見られないアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインを含む。このような変異体は、必然的に親抗体と１００％未満の配列同一性又は類似性がある。好適な実施態様では、抗体変異体は、親抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメインの何れかのアミノ酸配列と、およそ７５％から１００％未満、より好ましくはおよそ８０％から１００％未満、より好ましくはおよそ８５％から１００％未満、より好ましくはおよそ９０％から１００％未満、最も好ましくはおよそ９５％から１００％未満のアミノ酸配列同一性又は類似性があるアミノ酸配列を有するであろう。抗体変異体は一般に、一又は複数の高頻度可変領域内又は該領域に隣接して一又は複数のアミノ酸改変を有するものである。
【００８６】
「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾により、天然配列のＦｃ領域とは異なるアミノ酸配列を包含するものである。ある実施態様において、変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域に比べて少なくとも一のアミノ酸置換、例えば、天然配列のＦｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域において、約１から約１０のアミノ酸置換、好ましくは約１から約５のアミノ酸置換、例えば、天然配列のＦｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域において、約１から約１０のアミノ酸置換、好ましくは約１から約５のアミノ酸置換を有する。本明細書中の変異体Ｆｃ領域は、典型的には、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と、例えば少なくともおよそ８０％の同一性を有するか、又は少なくともおよそ９０％の配列同一性を、又は少なくともおよそ９５％の配列又はそれ以上の同一性を有するものであろう。
【００８７】
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）；貪食作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【００８８】
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞障害細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）上に存在するＦｃレセプター（ＦｃＲｓ）と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞障害エフェクター細胞が抗原−担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞障害性の形態を意味する。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する初代細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の464ページの表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性をアッセイするために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代わ代わりとして、又は更に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等, (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。
【００８９】
「ヒトエフェクター細胞」は、一又は複数のＦｃＲを発現する白血球であり、エフェクター機能を果たす。ある実施態様では、その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が一般的に好まれる。エフェクター細胞はその天然源、例えば本明細書中に記載の血液又はＰＢＭＣから単離してもよい。
【００９０】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。いくつかの実施態様では、ＦｃＲは天然ヒトＦｃＲである。いくつかの実施態様では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマレセプター）と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性型レセプター」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害型レセプター」）が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインに免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含んでいる。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに、免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。（例えば、Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)を参照）。FcRは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)に総説される。他のＦｃＲは、将来同定されるべきものを含み、本明細書にて用語「ＦｃＲ」により網羅される。
【００９１】
また、「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」なる用語には、母性ＩｇＧの胎児への移送（Guyer等， J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim等， J. Immunol.24:249 (1994))及び免疫グロブリンのホメオスタシスの調節を担う新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。ＦｃＲｎへの結合を測定する方法は既知である（例えば、Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997)；Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)；国際公開第２００４／９２２１９号（Hinton et al.）を参照）。
【００９２】
インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合とヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又は変異形Ｆｃ領域を有するポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。国際公開公報２０００／４２０７２（Presta）にＦｃＲへの結合を向上又は減弱させた抗体変異型が述べられている。例としてShields等，J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
【００９３】
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系（Ｃｌｑ）の第１補体が、同族抗原と結合した（適切なサブクラスの）抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等，J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。Ｆｃ領域アミノ酸配列を変更してＣ１ｑ結合能力が増大又は減少したポリペプチド変異体（変異形Ｆｃ領域を有するポリペプチド）は、米特許第６１９４５５１号Ｂ１及び国際公開第１９９９／５１６４２号に記述される。また例としてIdusogie等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)も参照のこと。
【００９４】
「親和性成熟」抗体は、その１つ以上のＣＤＲに１つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。一実施態様では、親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier他、Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson他， J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；及びHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
【００９５】
ここでの「可動（フレキシブル）リンカー」とはペプチド結合によって結合した２又はそれ以上のアミノ酸残基を含むペプチドを意味し、それによって結合された（例えば２つのＦｄ領域のような）２つのポリペプチドに対してより大なる回転自由度を提供する。そのような回転自由度により、可動リンカーによって結合された２又はそれ以上の抗原結合部位がそれぞれより効率的に標的抗原（一又は複数）に接近できるようになる。適切な可動リンカーペプチド配列の例には、ｇｌｙ−ｓｅｒ、ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒ（配列番号：３４）、ａｌａ−ｓｅｒ、及びｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ（配列番号：３５）が含まれる。
【００９６】
「二量体化ドメイン」は少なくとも２つのアミノ酸残基（一般にはシステイン残基）又は少なくとも２つのペプチド又はポリペプチド（これは同じか異なったアミノ酸配列を持ちうる）の結合(association)によって形成される。ペプチド又はポリペプチドは共有的及び／又は非共有的結合（一又は複数）によって互いに相互作用しうる。ここでの二量体化ドメインの例には、Ｆｃ領域；ヒンジ領域；ＣＨ３ドメイン；ＣＨ４ドメイン；ＣＨ１−ＣＬ対；出典明示によりここに取り込まれる米国特許第５８２１３３３号に記載されたような、遺伝子操作された「ノブ(knob)」及び／又は「隆起(protruberance)」を持つ「インターフェース」；ロイシンジッパー（例えば、ｊｕｎ／ｆｏｓロイシンジッパー、Kostelney等， J. Immunol., 148:1547-1553 (1992)を参照；又は酵母ＧＣＮ４ロイシンジッパー）；イソロイシンジッパー；レセプター二量体対（例えばインターロイキン−８レセプター（ＩＬ−８Ｒ）；及びインテグリンヘテロ二量体、例えばＬＦＡ−１及びＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａ）、又はその二量体化領域（一又は複数）；二量体リガンドポリペプチド（例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＤＧＦメンバー、及び脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；Arakawa等， J. Biol. Chem. 269(45): 27833-27839 (1994)及びRadziejewski等 Biochem. 32(48): 1350 (1993)を参照）、又はその二量体化領域（一又は複数）；ジスルフィド結合を形成可能なシステイン残基対；ペプチド又はポリペプチドの間にジスルフィド結合が形成可能なようにそれぞれが少なくとも一つのシステイン残基（例えば約１、２又は３から約１０のシステイン残基）を有するペプチド又はポリペプチドの対（以下、「合成ヒンジ」）；及び抗体可変ドメインが含まれる。ここでの最も好適な二量体化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域である。
【００９７】
抗体の「機能的抗原結合部位」は標的抗原に結合することができるものである。抗原結合部位の抗原結合親和性は、必ずしも抗原結合部位が由来する親抗体ほど強くないが、しかし、抗原に結合する能力は、抗原への抗体結合を評価するための公知の種々の方法の何れかを用いて測定可能でなければならない。更に本明細書において多価抗体の抗原結合部位の各々の抗原結合親和性は、定量的に同じである必要はない。ここの多量体抗体に対して、機能的抗原結合部位の数は超遠心分離分析法を使用して評価することができる。分析のこの方法によれば、多量体抗体に対する標的抗原の異なった比率を組み合わせて、複合体の平均分子量は機能的結合部位の異なった数を仮定して計算される。これらの理論値を、機能的結合部位の数を評価するために得られた実際の実験値と比較する。
【００９８】
指定された抗体の「生物学的特徴」を有する抗体は、同じ抗原に結合する他の抗体とは区別したその抗体の生物学的特徴の一以上を有するものである。
【００９９】
対象の抗体が結合する抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載のものなどの常套的な交差遮断(cross-blocking)アッセイを行ってもよい。
【０１００】
「エピトープ」という用語は、タンパク質抗原上の（モノクローナル又はポリクローナル）抗体との結合部位を指すために使用される。
【０１０１】
本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する(treat)」又は「治療している(treating)」など文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の過程においてのいずれかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。具体的には、治療は、細胞変性又は損傷の病理状態、例えば骨髄系細胞の動員及び／又は腫瘍血管形成と関連する疾患又は症状の病理状態を直接的に防止し、遅延させ又は減少等させうる。
【０１０２】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。
【０１０３】
本明細書で用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての新生細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性の細胞及び組織を意味する。「癌」、「癌性」、「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」という用語はここで意味するように相互排他的ではない。
【０１０４】
用語「癌」及び「癌性」は、無秩序な細胞成長／細胞増殖を典型的に特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を記述する。癌の例には、限定されないが、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、及び白血病を含む。そのような癌のより具体的な例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化器癌、膵臓癌、神経膠腫を含む、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜、子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、白血病、及びその他のリンパ増殖性疾患、及び様々な型の頭頸部癌を包含する。
【０１０５】
「耐性腫瘍」なる用語は、少なくともＶＥＧＦアンタゴニストを含む癌治療に対して癌治療の間を通して十分に反応しない、又は反応がない、ないしは反応が低減している癌、癌細胞又は腫瘍を指す。また、耐性腫瘍は、本明細書中において耐性があると診断された腫瘍（また、本明細書中では「抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍」と称される）を指す。ある実施態様では、少なくともＶＥＧＦアンタゴニストを含む療法に感受性がある腫瘍と比較して、耐性腫瘍ではＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の増加がある。
【０１０６】
「抗新生物性組成物」なる用語は、少なくとも一の活性な治療剤、例えば「抗癌剤」を含む癌の治療に有用な組成物を指す。治療剤（抗癌剤）の例には、限定するものではないが、例えば化学療法剤、増殖阻害剤、細胞障害性剤、放射線療法において使用する薬剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、毒素、及び癌を治療するための他の薬剤、例えば抗ＶＥＧＦ中和抗体、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト、インターフェロン、ＩＬ−１７を含むサイトカイン、又はＩＬ−１７レセプター、又はＶＥＧＦレセプターアンタゴニスト（例えば、中和抗体）、及び他のバイオ活性がある有機化学的薬剤などが含まれる。それらの組合せも本発明に包含される。
【０１０７】
用語「細胞分裂阻害剤」とは、インビトロ又はインビボの何れかにおいて、細胞の増殖を停止する化合物又は組成物を指す。従って、細胞分裂阻害剤は、Ｓ期の細胞の割合を有意に減少させるものであってもよい。細胞分裂阻害剤の更なる例は、Ｇ０／Ｇ１停止又はＭ期停止を誘導することによって、細胞周期の進行を遮断する薬剤を含む。ヒト化抗Ｈｅｒ２抗体のトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））はＧ０／Ｇ１停止を誘導する細胞分裂阻害剤の例である。古典的なＭ期ブロッカーには、ビンカ（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン、及び例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンなどのトポイソメラーゼＩＩ阻害剤が含まれる。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、及びアラ−Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編、第１章、表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」， Murakami等，(WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類（パクリタキセル及びドセタキセル）は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、ローン・プーラン ローラー）は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ブリストル−マイヤー スクウィブ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。この用語は、放射性同位体（例えば、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ及びＬｕの放射性同位体）、化学治療薬、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素を含むように意図されている。
【０１０８】
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞の増殖をインビトロ及び／又はインビボで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、Ｓ期でＨｉｐ発現細胞の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール（登録商標）、及びトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、及びアラ−Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編，第１章，表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」， Murakami等， (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
【０１０９】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物を指す。化学療法剤の例には、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン(piposulfan)；アジリジン類、例えばベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)；アルトレトアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標）；βラパチョーネ；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン（合成アナログトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）を含む）、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン(scopolectin)及び９−アミノカンプトテシン；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロランブシル、クロロナファジン（chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１（例えばNicolaou et al., Agnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186(1994)参照）；ＣＤＰ３２３、経口α−４インテグリン阻害剤；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射剤（ＤＯＸＩＬ（登録商標）、リポソームドキソルビシンＴＬＣＤ−９��（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標））、ペグ化リポソームドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標）、及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸（mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン(gemcitabine)（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフル(tegafur)（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン(capecitabine)（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン(epothilone)、及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６−アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポチロン；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン(lonidainine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン類(ansamitocins)のようなメイタンシノイド類(maytansinoids)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダンモール(mopidanmol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン(losoxantron)；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)（特に、Ｔ−２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリジンＡ(roridin A)及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ａｒａ��Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ）、及びドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロランブシル；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナ剤、例えばシスプラチン、オキサリプラチン（例えばＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））及びカルボプラチン；ビンカ類でチューブリン重合の微小管形成を阻害するもの、例えばビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標）、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））、及びビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボビン(leucovovin)；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド、例えば、ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））；ビスホスホネート、例えばクロドロネート（例えばＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）又はＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロン酸（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロン酸（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロン酸（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、又はリセドロン酸（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））；トロキサシタビン(troxacitabine)（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ−α、Ｒａｆ、及びＨ−Ｒａｓ、及び上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害薬（例えばＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えばＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ＢＡＹ４３９００６（ソラフェニブ；Ｂａｙｅｒ）；ＳＵ−１１２４８（スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリフォシン(perifosine)、ＣＯＸ−２阻害剤（例えばセレコキシブ又はエトリコキシブ）、プロテオゾーム阻害剤（例えばＰＳ３４１）；ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））；ＣＣＩ−７７９；チピファルニブ(tipifarnib)（Ｒ１１５７７）；オラフィニブ(orafenib)、ＡＢＴ５１０；ＢＣＬ−２阻害剤、例えばオブリメルセンナトリウム(oblimersen sodium)（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））；ピクサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤（以下の定義を参照）；チロシンキナーゼ阻害剤；セリン−スレオニンキナーゼ阻害剤、例えばラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標））；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばロナファーニブ（ＳＣＨ６６３６，ＳＡＲＡ���ＡＲＴＭ）；及び上述したものの何れかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体：並びに上記のうち２以上の組合せ、例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソロンの併用療法の略称であるＣＨＯＰ；及び５−ＦＵ及びロイコボリンとオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ）を組合せた治療法の略称であるＦＯＬＦＯＸが含まれる。
【０１１０】
ここで定義された化学療法剤には、癌の増殖を促進しうるホルモンの作用を調節、低減、遮断、又は阻害するように働く「抗ホルモン剤」又は「内分泌治療剤」が含まれる。それらはそれ自体がホルモンであってもよく、限定するものではないが、混合アゴニスト／アンタゴニストプロファイルを持つ抗エストロゲン、例えばタモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標））、４−ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン(raloxifene)（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、及びＳＥＲＭ３などの選択的なエストロゲン受容体調節因子（ＳＥＲＭ）；アゴニスト特性を有さない純粋な抗エストロゲン類、例えばフルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））、及びＥＭ８００（このような薬剤はエストロゲン受容体（ＥＲ）二量体化をブロックし、ＤＮＡ結合を阻害し、ＥＲ代謝回転を増加させ、及び／又はＥＲレベルを抑制しうる）；アロマターゼインヒビター、例えば、ホルメスタン及びエキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））などのステロイド系アロマターゼインヒビター、及びアナストロゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））及びアミノグルテチミドなどの非ステロイド性アロマターゼインヒビター、及びボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、メゲストロールアセテート（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、ファドロゾール及び４（５）−イミダゾールを含む他のアロマターゼインヒビター；黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト、例えばロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）及びＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））、ゴセレリン、ブセレリン、及びトリプトレリン；性ステロイド、例えばプロゲスチン、例えばメゲストロールアセテート及びメドロキシプロゲステロンアセテート、エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール及びプレマリン、及びアンドロゲン／レチノイド、例えばフルオキシメステロン、全てのトランスレチオニン酸及びフェンレチニド；オナプリストン；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体下方制御因子（ＥＲＤ）；抗アンドロゲン類、例えばフルタミド、ニルタミド及びビカルタミド；及び上記の何れかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体；並びに、上記のうちの２以上の組合せを含む。
【０１１１】
「サイトカイン」なる用語は、一つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ）；肝臓成長因子；線維芽成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子−α及び−β；ミューラー阻害因子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（例えば、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ）、胎盤由来成長因子（ＰｌＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ、例えばＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＧＦＤ）；；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦｓ）；インシュリン様成長因子−Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘発因子；インターフェロン−α、−β、及び−γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばマクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；及び顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０−ＩＬ−３０；セクレトグロビン／ウテログロビン；オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）；；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ−α及びＴＮＦ−β；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。本明細書で用いられる際、用語サイトカインには、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
【０１１２】
「血管新生因子又は薬剤」は、血管の発達を刺激する、例えば、血管新生、血管内皮細胞増殖、血管及び／又は脈管形成の安定性などを促進する増殖因子である。例えば、血管新生因子には、限定するものではないが、例えば、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦファミリのメンバー、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦファミリ、線維芽細胞増殖因子ファミリ（ＦＧＦ）、ＴＩＥリガンド（アンギオポイエチン）、エフリン、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４などが含まれる。また、創傷治癒を促す因子、例として、成長ホルモン、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ＶＩＧＦ、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ＣＴＧＦ、及びそのファミリのメンバー、及びＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βが含まれる。例としてKlagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991);Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003);Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999);Tonini等， Oncogene, 22:6549-6556 (2003)（例えば、血管新生因子を列挙する表１）；及びSato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)を参照。
【０１１３】
「抗血管新生剤」又は「血管新生インヒビター」は、小分子量物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、単離されたタンパク質、組換えタンパク質、抗体、又はこれらのコンジュゲートないし融合タンパク質を指し、直接又は間接的に、血管新生、脈管形成又は望ましくない血管透過を阻害するものである。例えば、抗血管新生剤は、上記に定義するように、血管新生剤に対する抗体又は他のアンタゴニスト、例えばＶＥＧＦに対する抗体、ＶＥＧＦレセプターに対する抗体、ＶＥＧＦレセプターシグナル伝達を遮断する小分子（例えばＰＴＫ７８７／ＺＫ２２８４、ＳＵ６６６８、ＳＵＴＥＮＴ／ＳＵ１１２４８（リンゴ酸スニチニブ）、ＡＭＧ７０６）である。また抗血管新生剤には、天然の血管新生インヒビター、例えばアンジオスタチン、エンドスタチンなどが含まれる。例としてKlagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991)；Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)（例えば、悪性メラノーマの抗血管新生療法を列挙する表３）；Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999)；Tonini等， Oncogene, 22:6549-6556 (2003)（例えば、抗血管新生因子を列挙する表２）；及び、Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)(例えば、臨床試験で用いられる抗血管新生剤を挙げる表１）を参照。
【０１１４】
本明細書中で用いる「免疫抑制剤」なる用語は、本明細書において治療される哺乳動物の免疫系を抑制するか又は隠すために作用する物質を指す。これには、サイトカイン産生を抑制する物質、自己抗原発現を下方制御は又は抑制する物質、又は、ＭＨＣ抗原をマスキングする物質が含まれる。このような薬剤の例には、２−アミノ−６−アリル−５−置換ピリミジン（米国特許第４６６５０７７号を参照）；非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；ガンシクロビル、タクロリムス、糖質コルチコイド、例として、コルチゾール又はアルドステロン、抗炎症剤、例として、シクロオキシゲナーゼインヒビター、５−リポキシゲナーゼインヒビター又はロイコトリエンレセプターアンタゴニスト；プリンアンタゴニスト、例として、アザチオプリン又はミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）；アルキル化剤、例として、シクロホスファミド；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタールアルデヒド（ＭＨＣ抗原をマスキングするもの、米国特許第４１２０６４９号に記載）；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣ断片に対する抗イディオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；ステロイド、例として、副腎皮質ステロイド又は糖質副腎皮質ステロイド又は糖質コルチコイド類似体、例えばプレドニゾン、メチルプレドニゾロン及びデキサメサゾン；ジヒドロ葉酸レダクターゼインヒビター、例えばメトトレキセート（経口又は皮下）；ヒドロキシクロロキン；スルファサラジン；レフルノミド；サイトカインないしはサイトカインレセプター抗体、例えば抗インターフェロン−α、−β又は−γ抗体、抗腫瘍壊死因子−α抗体（インフリキシマブ又はアダリムマブ）、抗ＴＮＦ−αイムノアドヘシン（エタネルセプト）、抗腫瘍壊死因子−β抗体、抗インターロイキン２抗体及び抗ＩＬ−２レセプター抗体；抗ＣＤ１１ａ及び抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ−１抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種性の抗リンパ球グロブリン；パン−Ｔ抗体、好ましくは抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ−３結合ドメインを含む可溶性ペプチド（１９９０年７月２６日に発行の国際公開第１９９０／０８１８７号）；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ−β；ストレプトドルナーゼ；宿主のＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ−６１４４３；デオキシスペルグアリン；ラパマイシン；Ｔ細胞レセプター（Cohen等、米国特許第５１１４７２１号）；Ｔ細胞レセプター断片（Offner等， Science, 251: 430-432 (1991)；国際公開第１９９０／１１２９４号；Ianeway, Nature, 341: 482 (1989)；及び国際公開第１９９１／０１１３３号）；及び、Ｔ細胞レセプター抗体（欧州特許第３４０１０９号）、例えばＴ１０Ｂ９が含まれる。
【０１１５】
一又は複数の更なる治療薬「と組み合わせて（と併用して）」の投与は、同時（同時発生的）及び任意の順序での連続投与を含む。
【０１１６】
本明細書で用いられる「担体」は薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤を含み、被検体に非毒性であり、有効成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
【０１１７】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。
【０１１８】
本明細書中で用いる「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」なる表現は相互に交換可能に用いられ、かかる標記は子孫を含む。よって、「形質転換体」や「形質転換細胞」のような用語には、初代対象細胞と何世代移行したかを問わずそれから由来した培養物とを含む。全ての子孫が、意図的な突然変異あるいは意図せざる突然変異のため、正確に同一のＤＮＡ内容であるわけではないことも理解される。「子孫」なる用語は、最初に形質転換された細胞又は細胞株に続くすべての世代のいずれか及びすべての子孫を指す。最初に形質転換された細胞に対してスクリーニングされたものと同じ機能あるいは生物的活性を有する突然変異子孫も含まれる。区別しての標記を意図している場合は、文脈から明らかなはずである。
【０１１９】
組成物及び方法
本発明は、ＩＬ−１７経路は、少なくとも一のＶＥＧＦアンタゴニスト、例えば抗ＶＥＧＦ抗体の投与を含む治療に対する腫瘍の耐性につながる腫瘍微小環境における細胞及び分子事象において重要で潜在的に支配的な役割を果たしているとする認識に少なくとも部分的に基づいている。宿主間質細胞に対する腫瘍からのＩＬ−１７シグナル伝達は、炎症促進性及び／又は血管新生促進性サイトカイン、例えばＧ−ＣＳＦ及びＢｖ８などのレベルを調節することができる。
【０１２０】
最近の研究では、抗ＶＥＧＦ療法に対する不応性の媒介においてＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄系細胞を直接関与させている。(Shojaei, F., et al., Nature Biotechnol 25:911-20 (2007))。ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄系細胞の動員および活性化により抗ＶＥＧＦ治療に耐性が生じうることが示された(Shojaei et al 2009)。また、腫瘍保持マウスから単離された骨髄由来のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄系細胞は、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の移動を刺激した抗ＶＥＧＦ耐性（抗ＶＥＧＦ感受性でない腫瘍）からの条件培地において、抗ＶＥＧＦ治療に対する耐性を腫瘍に与えうることが示されている。
【０１２１】
本明細書において開示される実験データは、ＩＬ−１７が腫瘍発達中に骨髄由来のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋免疫抑制性未熟骨髄細胞の動員を制御することができ、よって局所的に腫瘍血管形成を促進することを示している。したがって、ＩＬ−１７は、ＶＥＧＦアンタゴニストによる治療に耐性がある腫瘍の治療のための有望な標的である。
【０１２２】
Ａ．抗ＩＬ−１７抗体の作成
本発明の結合および活性のアッセイによって同定される抗体は、組換えＤＮＡ技術の技術を含む公知の方法によって製造されうる。
【０１２３】
（ｉ）抗原調製
場合によって、他の分子にコンジュゲートした可溶性抗原ないしその断片は、抗原を生成するための免疫原として用いられうる。レセプターなどの膜貫通分子のために、その断片（例えばレセプターの細胞外ドメイン）が免疫原として用いられうる。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞を免疫源として用いてもよい。このような細胞は、天然の供与源（例えば癌細胞株）から得られてもよいし、膜貫通分子を発現するように組換え体技術によって形質転換されている細胞であってもよい。抗体を調製するために有用な他の抗原及びその形態は当分野の技術者に明らかであろう。
【０１２４】
（ｉｉ）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、関連する抗原とアジュバントを複数回の皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射することにより、動物に産生されることが好ましい。それは、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介する抱合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する抱合）、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ及びＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲへ、関連する抗原をコンジュゲートさせるために有用である。
【０１２５】
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ（それぞれウサギ又はマウスの場合）を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５から１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７から１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物を、同じ抗原であるが異なるタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なる架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートにより追加免疫する。コンジュゲートはまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【０１２６】
（ｉｉｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler et al.,Nature,256:495(1975年)によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作成されてもよく、あるいは組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作成されてもよい。ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスター又はマカクザルを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次いで、リンパ球をポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
【０１２７】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう（ＨＡＴ培地）。
【０１２８】
好適な骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランド、ＵＳＡより入手し得るＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984);Brodeur等， Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【０１２９】
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくはハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によって測定する。
【０１３０】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性な抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、そのクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地を包含する。また、このハイブリドーマ細胞は、動物の腹水症腫瘍として、インビボで増殖させることができる。
【０１３１】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティクロマトグラフィーのような常套的なイムノグロブリン精製法によって、培地、腹水、又は血清から上手く分離される。
【０１３２】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）即座に分離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好適な供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外ではイムノグロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体の組み換え産生を以下に詳細に記載する。
【０１３３】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCafferty等， Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから分離することができる。
【０１３４】
Clackson等， Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等， J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の生成（Marks等，Bio/Technology, 10:779-783 (1992））、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え（Waterhouse等，Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
【０１３５】
また、ＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン（ＣＨ及びＣＬ）のコード配列を、相同的マウス配列に代えて置換することによって（米国特許第４８１６５６７号；Morrison等， Proc.Nat.Acad.Sci., USA, 81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって修飾することができる。
【０１３６】
典型的には、前記の非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインと置き代わることができるか、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【０１３７】
（ｉｖ）ヒト化及びヒト抗体
ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(Winter)及び共同研究者[Jones等， Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等， Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等， Science, 239:1534-1536 (1988)]の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４８１６５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１３８】
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れる（Sims等， J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等， J. Immunol., 151:2623(1993))。
【０１３９】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好適な方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を調査すると、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【０１４０】
あるいは、現在では、免疫化することで、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合体欠失によって、結果として内因性抗体産生の完全な阻害が起こることが説明されてきた。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の、このような生殖細胞系突然変異体マウスへの転移によって、結果として抗原投与時にヒト抗体の産生がおこる。Jakobovits等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等， Nature 362:255-258 (1993)； Bruggeman等， Year in Immuno., 7:33 (1993)；及びDuchosal等 Nature 355:258 (1992)を参照されたい。また、ヒト抗体はファージディスプレイライブラリからも得られる（Hoogenboom等， J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等， J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Vaughan等 Nature Biotech 14:309 (1996))。抗体ファージディスプレイライブラリからのヒト抗体の生成は以下に更に記載する。
【０１４１】
（ｖ）抗体断片
抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された（例えば、Morimoto等， Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等， Science, 229:81(1985)を参照されたい）。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。例えば、抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Carter等， Bio/Technology 10:163-167(1992)）。以下の実施例に記載のような他の実施態様では、Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆ（ａｂ’）２分子のアセンブリを促すように、ロイシンジッパーＧＣＮ４を用いて形成される。他のアプローチ法では、Ｆ（ａｂ’）２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択する抗体は単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開９３／１６１８５号を参照のこと。
【０１４２】
（ｖｉ）多重特異性抗体
多重特異性抗体は、通常異なる抗原に由来する少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する。このような分子は通常２つの異なるエピトープを結合するだけであるが（すなわち二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）、本明細書中で用いられる場合には三重特異性抗体などの更なる特異性を有する抗体がこの表現に包含される。ＢｓＡｂの例には、ＩＬ−１７に対する一アームと、ＶＥＧＦ又はＧ−ＣＳＦに対する他のアームとを有するものが含まれる。
【０１４３】
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている（Millstein等， Nature, 305:537-539(1983)）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等， EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗原−抗体結合部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むイムノグロブリン重鎖定常ドメインである。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、構成に使用される３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が抗体の最適な収率をもたらす態様において、３つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きなフレキシビリティが与えられる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率があまり影響がないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１４４】
この手法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を提供する）とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等， Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０１４５】
国際公開第９６／２７０１１号に記載された他の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーの割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体の定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０１４６】
二重特異性抗体には、交差結合又は「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートの一抗体はアビジンにカップリングし、他方の抗体はビオチンにカップリングしていてもよい。例えば、このような抗体は、望ましくない細胞へ免疫系細胞を標的化するため（米国特許第４６７６９８０号）、そしてＨＩＶ感染の治療のため（国際公開９１／００３６０、国際公開９２／２００３７３）に提唱されている。ヘテロコンジュゲート抗体は従来のいずれかの交差結合法を用いて作製されてもよい。好適な交差結合剤は当分野で周知であり、多くの交差結合技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
【０１４７】
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等， Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ（ａｂ’）２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ’断片はついでチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’−チオールに再変換し、他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【０１４８】
Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、大腸菌から直接回収することもできるし、化学的に結合して二重特異性抗体を形成させることもできる。Shalaby等，J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ’断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。
【０１４９】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelny等， J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ’部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生成に対して使用することができる。Hollinger等， Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能とするには短すぎるリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する別の戦略もまた報告されている。Gruber等， J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
【０１５０】
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
【０１５１】
（ｖｉｉ）エフェクター機能工学
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、抗体の有効性を向上させることは望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成されたホモ二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存細胞性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を有する可能性がある。Caron等， J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つホモ二量体抗体は、Wolff等， Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されているヘテロ二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように操作して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等， Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
【０１５２】
（ｖｉｉｉ）抗体−サルベージレセプター結合エピトープ融合
本発明のある実施態様において、例えば腫瘍浸透性を増大させるためにインタクト抗体よりも抗体断片を使用することが望ましい。この場合、その血清半減期を増大させるために抗体断片を改変することが望ましい。これは、例えば、抗体断片にサルベージレセプター結合エピトープを組み込むことにより（例えば、抗体断片中の適当な領域の突然変異により、あるいはついで抗体断片の何れかの末端又は中央に、例えばＤＮＡ又はペプチド合成により融合されるペプチドタグ内にエピトープを組み込むことにより）、達成しうる。
【０１５３】
サルベージレセプター結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃドメインの一又は二のループ由来の一又は複数の任意のアミノ酸残基が抗体断片の類似位置に転移している領域を構成する。更により好ましくは、Ｆｃドメインの一又は二のループ由来の３以上の残基が転移する。またより好ましくは、エピトープはＦｃ領域の（例えばＩｇＧの）ＣＨ２ドメインから得られ、抗体のＣＨ１、ＣＨ３、又はＶＨ領域、又はそのような領域の一より多くに転移する。あるいは、エピトープは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから得られ、抗体断片のＣＬ領域又はＶＬ領域、又はその両方に転移する。
【０１５４】
（ｉｘ）抗体の他の共有結合性修飾
抗体の共有結合性修飾は本発明の範囲内にある。それらは、適用可能であれば、抗体の化学合成により、又は酵素的又は化学的切断によりなされうる。抗体の共有結合性修飾の他のタイプは、選択される側鎖又はＮ若しくはＣ末端の残基と反応できる有機誘導体化剤と抗体の標的とするアミノ酸領域を反応させることにより分子中に導入される。共有結合性修飾は米国特許第５５３４６１５号に記載されており、出典明記によって特別に本明細書中に援用される。抗体の共有結合性修飾の好適なタイプは、抗体を、種々の非タンパク質様ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載された方法で結合させることを含む。
【０１５５】
また、本発明は、化学療法薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞障害性剤、あるいは放射性同位体（即ち、放射性コンジュゲート）とコンジュゲートしている本明細書中に記載の抗体を含むイムノコンジュゲートに関する。種々の放射性核種が放射性コンジュゲート抗体の生成に利用できる。例には、限定するものではないが、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。
【０１５６】
このようなイムノコンジュゲートの生成に有用な化学療法剤は上記した。例えば、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン、５−フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラミシン（米国特許第５８７７２９６号）など（本明細書中の「化学療法薬」の定義も参照のこと）が本発明の抗体ないしその断片にコンジュゲートされうる。
【０１５７】
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体ないしその断片を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、限定するものではないが、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、２１２Ｐｂ、１１１Ｉｎ及びＬｕの放射性同位体などが含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）映像（磁気共鳴映像、ＭＲＩとしても公知）用のスピン標識、例えばヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
【０１５８】
放射性又は他の標識は、既知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えば、９９ｍＴｃ又は１２３Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ及び１１１Ｉｎは、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム−９０はリジン残基を介して結合可能である。ＩＯＤＯＧＥＮ法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57)は、ヨウ素−１２３の導入に使用することができる。他の方法を詳細に記載している例えば「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)も参照のこと。
【０１５９】
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ−サルシン（sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
【０１６０】
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン−２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等， Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari等， Cancer Research, 52:127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号）が使用され得る。
【０１６１】
別法として、抗ＩＬ−１７抗体及び／又は抗ＶＥＧＦ抗体及び／又は抗Ｇ−ＣＳＦ抗体及び細胞傷害性薬剤は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
【０１６２】
ある実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」（例えばストレプトアビジン）に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体−レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞障害性剤（例えばラジオヌクレオチド）にコンジュゲートする「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。ある実施態様では、イムノコンジュゲートは抗体と核酸溶解活性を有する化合物（例えば例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ））との間で形成される。
【０１６３】
本発明は、一又は複数のメイタンシノイド分子にコンジュゲートしている本発明の抗体を提供する。メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである（米国特許第３８９６１１１号）。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ−３メイタンシノールエステルを生成することが発見された（米国特許第４１５１０４２号）。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されている。
【０１６４】
本発明の抗体は、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子にコンジュゲートすることができる。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。一実施態様において、メイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
【０１６５】
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、及びChari等， Cancer Research, 52:127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
【０１６６】
抗体とメイタンシノイドのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン−２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製されうる。典型的なカップリング剤には、ジスルフィド結合を提供するためのＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）及びＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）（Carlsson等， Biochem. J. 173:723-737[1978]）が含まれる。
【０１６７】
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位で生じる。結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ−３位で形成される。
【０１６８】
関心のある別のイムノコンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した本発明の抗体を含んでなる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ−ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号（全て、American Cyanamid Company）を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１（Hinman等， Cancer Research, 53:3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58:2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許）が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【０１６９】
（ｘ）合成抗体ファージライブラリからの抗体の産生
一実施態様では、本明細書に記載の抗体は固有のファージディスプレイアプローチ法を使用して産生され選択される。該アプローチ法は、単一フレームワーク鋳型に基づく合成抗体ファージライブラリの産生、可変ドメイン内の十分な多様性の設計、多様化した可変ドメインを有するポリペプチドのディスプレイ、抗原を標的とする高親和性を持つ候補抗体の選択、及び選択された抗体の単離を含む。
【０１７０】
ファージディスプレイ法の詳細は例えば２００３年１２月１１日公開の国際公開第０３／１０２１５７号に見出すことができ、この開示内容の全体は出典明記によって特別に本明細書中に援用される。
【０１７１】
一態様では、本発明において使用される抗体ライブラリは抗体可変ドメインの少なくとも一のＣＤＲにおいて溶媒接近可能な及び／又は高度に多様性の位置を変異させることによってつくることができる。ＣＤＲの幾らか又は全てをここに提供した方法を使用して変異させることができる。幾つかの実施態様では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成するか、又はＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成するか、又はＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成することにより、多様な抗体ライブラリをつくることが好ましい。
【０１７２】
例えばＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の溶媒接近可能な及び／又は高度に多様性の位置に変異を有する抗体可変ドメインのライブラリをつくることができる。ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３に変異を有する他のライブラリをつくることができる。これらのライブラリは所望の親和性の結合体をつくるために互いに関連させて使用することもできる。例えば、標的抗原への結合についての重鎖ライブラリの一又は複数回の選択後に、軽鎖ライブラリを結合体の親和性を増加させるために更なる選択回数に対して重鎖結合体の集団中に置き換えることができる。
【０１７３】
好ましくは、ライブラリは重鎖配列の可変領域のＣＤＲＨ３領域における変異アミノ酸での元のアミノ酸の置換によりつくられる。得られたライブラリは複数の抗体配列を含み得、ここで配列多様性は主として重鎖配列のＣＤＲＨ３領域にある。
【０１７４】
一態様では、ライブラリはＤＶＫコドンセットによってコードされるアミノ酸で重鎖の少なくとも残基９５−１００ａを置換することによりつくられ、ここでＤＶＫコドンセットはこれらの位置の各一に対して変異アミノ酸セットをコードするために使用される。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの一例は配列（ＤＶＫ）７を含む。幾つかの実施態様では、ライブラリはＤＶＫとＮＮＫの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で残基９５−１００ａを置換することによりつくられる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列（ＤＶＫ）６（ＮＮＫ）を含む。別の実施態様では、ライブラリはＤＶＫとＮＮＫの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で少なくとも残基９５−１００ａを置換することによりつくられる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列（ＤＶＫ）５（ＮＮＫ）を含む。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの別の例は配列（ＤＶＫ）６を含む。好適なオリゴヌクレオチド配列の他の例はここに記載された基準に従って当業者によって決定することができる。
【０１７５】
他の実施態様では、異なったＣＤＲＨ３設計を使用して高親和性結合体を単離し様々なエピトープに対して結合体を単離する。このライブラリにおいて産生されたＣＤＲＨ３の長さの範囲は１１から１３アミノ酸であるが、これとは異なった長さも産生することができる。Ｈ３多様性はＮＮＫ、ＤＶＫ及びＮＶＫコドンセットを使用し、並びにＮ及び／又はＣ末端での多様性をより制限して、拡張することができる。
【０１７６】
多様性をＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２においてまた生じさせることができる。ＣＤＲ−Ｈ１及びＨ２多様性の設計は、過去の設計よりも天然の多様性により密に適合する多様性に焦点を当てる変更をした上で、上述の天然抗体レパートリーを模倣するターゲティング戦略に従う。
【０１７７】
ＣＤＲＨ３での多様性に対しては、複数のライブラリを、異なった長さのＨ３と別個に構築し、ついで、標的抗原に対する結合体を選択するために組み合わせる。複数のライブラリをプールし、過去に記載され以下に記載されたような固体支持体選別及び溶液選別方法を使用して選別することができる。複数の選別方策を用いることができる。例えば、一つの変異は固体に結合した標的での選別を含み、融合ポリペプチド上に存在しうるタグ（例えば抗ｇＤタグ）の選別が続く。別法として、ライブラリは固体表面に結合した標的で先ず選別することができ、溶出した結合体がついで標的抗原の濃度を減少させた溶液相結合を使用して選別される。異なった選別法を併用することにより高度に発現した配列のみの選択の最小化がもたらされ、多くの異なった高親和性クローンの選択をもたらす。
【０１７８】
標的抗原に対する高親和性結合体はライブラリから単離することができる。Ｈ１／Ｈ２領域における多様性の制限は約１０４から１０５倍縮重を減少させ、より多くのＨ３多様性を許容することによりより多くの高親和性結合体をもたらす。ＣＤＲＨ３において異なったタイプの多様性を持つライブラリを利用することにより（例えばＤＶＫ又はＮＶＴを利用して）標的抗原の異なったエピトープに結合しうる結合体の単離をもたらす。
【０１７９】
上述のプールされたライブラリから単離された結合体において、軽鎖において制限された多様性を提供することによって親和性を更に改善することができることが発見された。軽鎖多様性はこの実施態様では以下のように生成される。ＣＤＲＬ１においては：アミノ酸位置２８がＲＤＴによってコードされる；アミノ酸位置２９がＲＫＴによってコードされる；アミノ酸位置３０がＲＶＷによってコードされる；アミノ酸位置３１がＡＮＷによってコードされる；アミノ酸位置３２がＴＨＴによってコードされる；場合によっては、アミノ酸位置３３がＣＴＧによってコードされる；ＣＤＲＬ２においては：アミノ酸位置５０がＫＢＧによってコードされる；アミノ酸位置５３がＡＶＣによってコードされる；場合によっては、アミノ酸位置５５がＧＭＡによってコードされる；ＣＤＲＬ３においては：アミノ酸位置９１がＴＭＴ又はＳＲＴ又はその両方によってコードされる；アミノ酸位置９２がＤＭＣによってコードされる；アミノ酸位置９３がＲＶＴによってコードされる；アミノ酸位置９４がＮＨＴによってコードされる；アミノ酸位置９６がＴＷＴ又はＹＫＧ又は両方によってコードされる。
【０１８０】
他の実施態様では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３領域に多様性を持つライブラリ又はライブラリ群が作製される。この実施態様では、ＣＤＲＨ３における多様性は様々な長さのＨ３領域を用い、主にコドンセットＸＹＺ及びＮＮＫ又はＮＮＳを用いてつくり出される。ライブラリは個々のオリゴヌクレオチドを使用して形成しプールすることができ、又はオリゴヌクレオチドをプールしてライブラリのサブセットを形成することができる。この実施態様のライブラリは固体に結合した標的に対して選別することができる。多重選別から単離されたクローンをＥＬＩＳＡアッセイを使用して特異性及び親和性についてスクリーニングすることができる。特異性については、クローンを所望の標的抗原並びに他の非標的抗原に対してスクリーニングすることができる。標的抗原に対するこれらの結合体をついで溶液結合競合ＥＬＩＳＡアッセイ又はスポット競合アッセイでの親和性についてスクリーニングすることができる。高親和性結合体は上に記載したようにして調製されたＸＹＺコドンセットを使用してライブラリから単離することができる。これらの結合体は抗体又は抗原結合断片として細胞培養物中に高収量で容易に産生されうる。
【０１８１】
幾つかの実施態様では、ＣＤＲＨ３領域の長さに大なる多様性を持つライブラリを作成することが望まれる場合がある。例えば、約７から１９アミノ酸の範囲のＣＤＲＨ３領域を持つライブラリを作成することが望ましい場合がある。
【０１８２】
これらの実施態様のライブラリから単離された高親和性結合体は細菌及び真核生物細胞培養で高収量で直ぐに産生される。ベクターはｇＤタグ、ウイルスコートタンパク質成分配列のような配列を直ちに除去し、及び／又は定常領域配列に加えて完全長抗体又は抗原結合断片を高収量で生産するように設計することができる。
【０１８３】
ＣＤＲＨ３での変異を持つライブラリを、例えばＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２のような他のＣＤＲの変異型を含むライブラリと組み合わせることができる。よって、例えば、一実施態様では、ＣＤＲＨ３ライブラリは予め定まったコドンセットを使用して位置２８、２９、３０、３１、及び／又は３２に変異アミノ酸を持つヒト化４Ｄ５抗体配列の形態において作りだしたＣＤＲＬ３ライブラリと組み合わせられる。他の実施態様では、ＣＤＲＨ３に対する変異のライブラリは変異ＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２重鎖可変ドメインを含むライブラリと組み合わせることができる。一実施態様では、ＣＤＲＨ１ライブラリは位置２８、３０、３１、３２及び３３に変異アミノ酸を持つヒト化抗体４Ｄ５配列を用いてつくり出される。ＣＤＲＨ２ライブラリは予め定まったコドンセットを使用して位置５０、５２、５３、５４、５６及び５８に変異アミノ酸を持つヒト化抗体４Ｄ５の配列を用いてつくり出すことができる。
【０１８４】
（ｘｉ）抗体変異体
ファージライブラリから生成される新規の抗体は、さらに修飾して、親抗体よりも改善した物理学的、化学的及び／又は生物学的特性を有する抗体変異体を生成することができる。使用するアッセイが生物学的活性アッセイである場合、抗体変異体は、選択したアッセイにおいて、該アッセイにおける親抗体の生物学的活性よりも少なくともおよそ１０倍良好な、好ましくは少なくともおよそ２０倍良好な、より好ましくは少なくともおよそ５０倍良好な、時には少なくともおよそ１００倍又は２００倍良好な生物学的活性を有する。例えば、抗ＩＬ−１７抗体変異体は、親抗体の結合親和性より、少なくともおよそ１０倍強力な、好ましくは少なくともおよそ２０倍強力な、より好ましくは少なくともおよそ５０倍強力な、時には少なくともおよそ１００倍又は２００倍強力な、ＩＬ−１７に対する結合親和性を有することが好ましい。
【０１８５】
抗体変異体を産生するためには、親抗体の高頻度可変領域の一又は複数中に一又は複数のアミノ酸修飾（例えば置換）が導入される。別法として、又は加えて、フレームワーク領域残基の一又は複数の修飾（例えば置換）を親抗体に導入することができ、これらにより第二の哺乳動物種由来の抗原に対する抗体変異体の結合親和性が改善される。修飾するためのフレームワーク領域残基の例には、抗原に非共有的に結合するもの（Amit等， Science 233:747-753 (1986)）；ＣＤＲと相互作用し／そのコンホメーションに影響を及ぼすもの（Chothia等 J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；及び／又はＶＬ−ＶＨ界面に関与するもの（欧州特許第２３９４００号Ｂ１）が含まれる。ある実施態様では、そのようなフレームワーク領域残基の一又は複数の修飾により第二の哺乳動物種由来の抗原に対する抗原の結合親和性が向上する。例えば、約１から約５のフレームワーク残基を本発明のこの実施態様において修飾することができる。時には、これは、高頻度可変領域が何ら改変されていない場合でさえ、前臨床試験に使用するのに適した抗体変異体を生じるのに十分でありうる。しかしながら、通常は、抗体は更なる高頻度可変領域の改変を含む。
【０１８６】
改変される高頻度可変領域残基は、特に親抗体の出発結合親和性が、無作為に生産された抗体変異体を直ぐにスクリーニングすることができるものである場合には、無作為に変化させることができる。
【０１８７】
そのような抗体変異体を産生するための一つの有用な方法は、「アラニンスキャンニング突然変異誘発法」（Cunningham及びWells Science 244:1081-1085 (1989)）と呼ばれる。ここで、高頻度可変領域残基の一又は複数が、第二の哺乳動物種由来の抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を及ぼすためにアラニン又はポリアラニンによって置換される。ついで置換に対する機能的感受性を示す高頻度可変領域残基は、置換部位において又はそれに対して更なる又は他の置換を導入することにより洗練される。従って、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異の種類自体は予め決める必要はない。このようにして産生されるａｌａ変異体をここに記載したその生物活性についてスクリーニングされる。
【０１８８】
通常は、「好ましい置換」の項目名で以下に示されているもののような保存的置換で始める。そのような置換が生物活性（例えば結合親和性）の変化を生じるならば、次の表において「例示的置換」と命名され、又はアミノ酸クラスを参照して以下に更に記載されるより実質的な変化が導入され、産物がスクリーニングされる。
2014525412.tif 000004
【０１８９】
抗体の生物学的性質の更により実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋コンホメーション、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持して、それらの効果において有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０１９０】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
【０１９１】
他の実施態様では、修飾のために選択された部位がファージディスプレイを使用して亜親和性成熟される（上を参照）。
【０１９２】
アミノ酸配列変異体をコードしている核酸分子は当該分野で知られている様々な方法により調製される。これらの方法は、限定されるものではないが、親抗体の先に調製された変異体又は非変異体型のオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発を含む。変異体を作製するための好ましい方法は部位特異的突然変異誘発（例えばKunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1985)を参照）である。
【０１９３】
ある実施態様では、抗体変異体は単一の高頻度可変領域残基を置換させている。他の実施態様では、親抗体の高頻度可変領域残基の２又はそれ以上が置換され、例えば約２から約１０の高頻度可変領域置換である。
【０１９４】
通常、改善された生物学的性質を有する抗体変異体は親抗体の重鎖又は軽鎖の何れかの可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に対する同一性又は類似性は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入し最大の配列同一性パーセントを達成した後に親抗体残基と同一（つまり同じ残基）又は類似（つまり共通の側鎖特性に基づく同じグループのアミノ酸残基、上を参照）である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセントとしてここで定義される。可変ドメインの外側の抗体配列中へのＮ末端、Ｃ末端、又は内部の伸展、欠失、又は挿入は何れも配列同一性又は類似性に影響を及ぼすものとはみなされない。
【０１９５】
抗体変異体の産生後に、親抗体に対するその分子の生物活性が決定される。上に述べたように、これは抗体の結合親和性及び／又は他の生物活性を決定することを含みうる。本発明の好適な実施態様では、抗体変異体のパネルを調製し、抗原ないしその断片に対する結合親和性についてスクリーニングする。この最初のスクリーニングから選択される抗体変異体の一又は複数は場合によっては一又は複数の更なる生物活性アッセイにかけて、結合親和性が向上した抗体変異体が例えば前臨床研究に確かに有用であることが確認される。
【０１９６】
このように選択された抗体変異体は、しばしば抗体の意図される用途に応じて更なる修飾を受けることができる。そのような修飾は以下に詳細を記載したもののようなアミノ酸配列の更なる改変、異種ポリペプチドに対する融合及び／又は共有的修飾を含む。アミノ酸配列改変については例示的な修飾を上に詳細に説明した。例えば、抗体変異体の正しいコンホメーションを維持することに関与しない任意のシステイン残基はまた一般にはセリンで置換して、分子の酸化安定性を改善し異常な架橋を防止することができる。逆に、システイン結合を抗体に加えてその安定性を向上することができる（特に抗体がＦｖ断片のような抗体断片である場合）。他のタイプのアミノ酸変異体は改変されたグリコシル化パターンを有する。これは抗体に見出される一又は複数の糖鎖部分を欠失させ、及び／又は抗体中に存在していない一又は複数のグリコシル化部位を加えることによって達成することができる。抗体のグリコシル化は典型的にはＮ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とはアスパラギン残基の側鎖への糖鎖部分の付着を意味する。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）がアスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的付着に対する認識配列である。よって、ポリペプチドにおいてこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると潜在的なグリコシル化部位をつくる。Ｏ結合グリコシル化はヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニン（但し５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンもまた使用できる）への糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つの付着を意味する。抗体へのグリコシル化部位の付加は、それが上述のトリペプチド配列（Ｎ結合グリコシル化部位に対する）の一又は複数を含むようにアミノ酸配列を改変することにより簡便に達成される。改変はまた元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加又は置換によって行うこともできる（Ｏ結合グリコシル化部位の場合）。
【０１９７】
抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに付着する糖を変えることができる。例えば、抗体のＦｃ領域に接着するフコースを欠損する成熟炭水化物構造の抗体は、米国公開特許第２００３／０１５７１０８号（Presta, L.）に記載される。米国公開特許第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）も参照のこと。抗体のＦｃ領域に接着した炭水化物内のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を二分する抗体は、国際公報第０３／０１１８７８号、Jean-Mairet 等、及び米国特許第６６０２６８４号、Umana 等に参照されている。抗体のＦｃ領域に接着するオリゴサッカライド内の少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体は、国際公報第９７／３００８７号、Patel 等に報告される。また、抗体のＦｃ領域に接着する変更された炭水化物を有する抗体については、国際公報第９８／５８９６４号（Raju, S.）及び国際公報第９９／２２７６４号（Raju, S.）も参照のこと。また、修飾されたグリコシル化を有する抗原結合分子については、米国公開特許第２００５／０１２３５４６号（Umana 等）を参照。
【０１９８】
本明細書中の好適なグリコシル化変異体はＦｃ領域を含有し、Ｆｃ領域に接着される炭水化物構造はフコースを欠いている。このような変異形は改善されたＡＤＣＣ機能を有する。場合によって、Ｆｃ領域は、更にＡＤＣＣを改善する一つ以上のアミノ酸置換、例えばＦｃ領域の位置２９８、３３３及び／又は３３４の置換（Ｅｕ残基番号付け）を更に含む。「脱フコース化」又は「フコース欠失」抗体に関する文献の例には以下のものを含む：米国公開番号２００３／０１５７１０８；国際公報２０００／６１７３９；国際公報２００１／２９２４６；米国公開番号２００３／０１１５６１４；米国公開番号２００２／０１６４３２８；米国公開番号２００４／００９３６２１；米国公開番号２００４／０１３２１４０；米国公開番号２００４／０１１０７０４；米国公開番号２００４／０１１０２８２；米国公開番号２００４／０１０９８６５；国際公報２００３／０８５１１９；国際公報２００３／０８４５７０；国際公報２００５／０３５５８６；国際公報２００５／０３５７７８；；国際公報２００５／０５３７４２；Okazaki 等 J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；及びYamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng.87: 614 (2004)。脱フコース化抗体を産生する細胞株の例として、タンパク質フコース化欠失Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka 等 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国公開番号２００３／０１５７１０８， Presta, L；及び国際公報２００４／０５６３１２， Adams 等、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例としてα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８，−ノックアウトＣＨＯ細胞（Yamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)）などがある。
【０１９９】
（ｘｉｉ）抗体の組換え製造
抗体の組換え製造のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは直ぐに単離され、従来の手法を用いて（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって）配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である（例えば米国特許第５５３４６１５号に記載されており、出典明記によって特別に本明細書中に援用される）。
【０２００】
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）及び大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
【０２０１】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用できる、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ．ラクティス、Ｋ．フラギリス（ＡＴＣＣ１２４２４）、Ｋ．ブルガリカス（ＡＴＣＣ１６０４５）、Ｋ．ウィッケラミイ（ＡＴＣＣ２４１７８）、Ｋ．ワルチイ（ＡＴＣＣ５６５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（ＡＴＣＣ３６９０６）、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア（ＥＰ４０２２２６）；ピチアパストリス（ＥＰ１８３０７０）；カンジダ；トリコデルマ・リーシア（ＥＰ２４４２３４）；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
【０２０２】
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（毛虫）、アエデス・アエジプティ（蚊）、アエデス・アルボピクトゥス（蚊）、ドゥロソフィラ・メラノガスター（ショウジョウバエ）、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ−１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ−５株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。
【０２０３】
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養（組織培養）中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等， J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ， Urlaub等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４， Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サルの腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザルの腎細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather等， Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株（ＨｅｐＧ２）である。
【０２０４】
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【０２０５】
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム（Ｈａｍ）のＦ１０（シグマ）、最小必須培地（（ＭＥＭ），（シグマ）、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ）及びダルベッコの改良イーグル培地（（ＤＭＥＭ），シグマ）が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等， Meth. Enz. 58:44 (1979)、Barnes等， Anal. Biochem. 102:255 (1980)、米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子（例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子）、塩類（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、バッファー（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮＴＭ）、微量元素（最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される）及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０２０６】
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成される場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された細胞の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【０２０７】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark等， J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
【０２０８】
Ｂ．ＩＬ−１７アンタゴニストの使用
本発明のＩＬ−１７アンタゴニストは、腫瘍血管新生を阻害するために単独で又は他の治療薬（一又は複数）と組み合わせて、使われてもよい。
【０２０９】
本発明の治療方法のための一次標的は、ＶＥＧＦアンタゴニスト、特に抗ＶＥＧＦ抗体による治療に抵抗力があることを示すか又はそのことが既知である腫瘍である。
【０２１０】
本発明の方法によって治療されるための疾患及び疾病の例は、腫瘍性疾患、例えば、「癌」及び「癌性」なる用語の下に本明細書中で記載されるものを含む。本発明のアンタゴニストによる治療に敏感に反応する非腫瘍性状態は、限定するものではないが、例として、望ましくない又は異常な肥大、関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬のプラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、アテローム硬化性プラーク、心筋梗塞からの浮腫、未熟児の網膜症を含む他の増殖性及び糖尿病性の網膜症、後水晶体繊維増殖症、血管形成緑内障、加齢性黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管形成、角膜移植片血管形成、角膜移植片拒絶、網膜／脈絡叢血管形成、アングルの血管形成（ルベオーシス）、眼性血管形成疾患、血管性再狭窄、動静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺の過形成（グレーブス病を含む）、角膜及び他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、急性の肺損傷／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性の肺滲出、大脳浮腫（例えば、急性の脳卒中／非開放性頭部損傷／外傷と関係するもの）、滑液炎症、ＲＡのパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大性骨形成、骨関節炎（ＯＡ）、抵抗性腹水、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症、第３区画の体液疾患（膵炎、区画症候群、熱傷、腸疾患）、子宮類線維腫、早産、ＩＢＤ（クローン病および潰瘍性大腸炎）のような慢性炎症、腎臓同種異系移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくない又は異常な組織塊成長（非癌）、肥満、脂肪組織質量成長、血友病関節、肥大性瘢痕、体毛成長の阻害、オスラー・ウェーバー症候群、化膿肉芽腫後水晶体線維増殖症、強皮症、トラコーマ、血管性接着、関節滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心嚢貯留液（心外膜炎と関係しているものなど）および胸水を含む。
【０２１１】
本発明は、本発明のＩＬ−１７アンタゴニストが他の療法と組み合わせて投与される併用療法を提供する。組合せ治療は具体的に、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせた、本明細書中のＩＬ−１７アンタゴニストの投与を含む。あるいは、併用治療は、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体など、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニストと併用した本明細書のＩＬ−１７アンタゴニストの投与を特に含む。さらに、または、あるいは、本明細書中のＩＬ−１７アンタゴニストは、様々な腫瘍性又は非腫瘍性の状態、例えば炎症細胞依存性血管形成又は腫瘍形成を治療するために、一又は複数の更なる薬剤、例えば骨髄系細胞減少薬剤、抗癌剤又は治療薬、化学療法及び／又は放射線療法、抗血管新生剤、又は抗新血管新生治療薬と組み合わせて投与されてもよい。
【０２１２】
一実施態様では、腫瘍性又は非腫瘍性の状態は、ＶＥＧＦアンタゴニスト治療に抵抗力がある、異常であるか望ましくない血管形成と関係している病理学的疾患に特徴を有する。本発明のアンタゴニストは、同じ組成物で又は異なる組成物として、目的のために有効である他の薬剤と連続して、又は組み合わせて投与されうる。あるいは、又は、さらに、本発明の複数のアンタゴニスト、薬剤および／またはアゴニストが投与されてもよい。
【０２１３】
アンタゴニストおよび／または薬剤の投与は、例えば単一の組成物として、または、同じか異なる投与ルートを使用した２以上の異なる組成物として、同時に行われてもよい。あるいは、又は、さらに、投与はいずれの順序で連続して行われてもよい。ある実施態様では、２以上の組成物の投与の間に分から日、週、月の間隔が存在してもよい。例えば、ＩＬ−１７アンタゴニストが第一に投与され、その後、異なるアンタゴニスト又は薬剤、例えばＶＥＧＦ及び／又はＧ−ＣＳＦアンタゴニストが投与されてよい。しかしながら、本発明の異なるアンタゴニスト又は薬剤の同時投与又は投与が第一に考慮される。
【０２１４】
投与される治療薬の有効量は医師又は獣医の裁量である。治療される症状を最大限管理するために用量投与及び調整がなされる。用量は、さらに、使用される治療薬の種類及び治療される特定の患者などの因子に依存するであろう。ＩＬ−１７アンタゴニストの好適な用量は現在用いられているものであり、ＩＬ−１７アンタゴニスト及びＶＥＧＦ及び／又はＧ−ＣＳＦアンタゴニストなどの本発明の異なるアンタゴニストの組合せ作用（相乗作用）のために低くてもよい。ある実施態様では、阻害薬の組合せは単一の阻害薬の有効性を増強する。「増強」なる用語は、その一般的又は認可された用量での治療薬の有効性の改善を指す。本明細書中の「薬学的組成物」と題した項目も参照のこと。
【０２１５】
癌との関連の抗血管新生療法は、腫瘍増殖を支える栄養分の供給に必要な腫瘍血管の発達を阻害することを目的とした癌治療方略である。血管新生が原発性腫瘍増殖と転移の療法に伴うので、本発明によって提供される抗血管新生療法は、原発部位での腫瘍の新生物性増殖の阻害と二次部位での腫瘍の転移の予防が可能であり、ゆえに他の療法によって腫瘍の攻撃がなされる。本発明の一実施態様では、抗癌剤又は膠癌療法は抗血管新生剤である。他の実施態様では、抗癌剤は化学療法剤である。
【０２１６】
多くの抗血管新生剤が同定されており、当分野で公知であり、本明細書中に挙げるもの、例えば定義の項目に挙げるもの、例えばCarmeliet and Jain, Nature 407:249-257 (2000)；Ferrara等， Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391-400 (2004)；及びSato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)に挙げるものなどがある。また、米国特許公開第２００３００５５００６号を参照。一実施態様では、本発明のＩＬ−１７アンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ中和抗体（又は断片）及び／又は他のＶＥＧＦアンタゴニストないしはＶＥＧＦレセプターアンタゴニスト、例として、限定するものではないが、例えば、可溶性ＶＥＧＦレセプター（例えば、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ニューロピリン（例えば、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２））断片、ＶＥＧＦないしはＶＥＧＦＲを遮断することができるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の低分子量インヒビター、ＶＥＧＦのアンチセンス方略、ＶＥＧＦないしはＶＥＧＦレセプターに対するリボザイム、ＶＥＧＦのアンタゴニスト変異体、及びこれらのいずれかの組み合わせと組み合わせて用いられる。あるいは又はさらに、２つ以上の血管新生インヒビターは、場合によってＶＥＧＦアンタゴニストと本発明の他の薬剤に加えて患者に同時に投与されてもよい。ある実施態様では、一又は複数の更なる治療薬、例えば抗癌剤は、本発明の薬剤、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び／又は抗血管新生剤と組み合わせて投与されてもよい。
【０２１７】
本発明のある態様では、本発明のＩＬ−１７アンタゴニストによる併用腫瘍療法に有用な他の治療剤には、他の癌療法（例えば、外科的治療、放射線処置（例えば、放射活性物質の照射又は投与を伴う）、化学療法、本明細書中に挙げる抗癌剤及び当分野で公知の抗癌剤、又はこれらの組み合わせ）が含まれる。あるいは又はさらに、本明細書中に開示した同じ又は２以上の異なる抗原を結合する２以上の抗体が患者に同時に投与されてもよい。また、患者に一又は複数のサイトカイン、例えばＧ−ＣＳＦ抗体などを投与することが有益であることもある。
【０２１８】
ある態様では、本発明は、有効量のＩＬ−１７のアンタゴニストと一又は複数の化学療法剤を、癌に罹りやすい患者又は癌と診断された患者に投与することによって、耐性腫瘍増殖又は癌細胞の増殖を遮断する又は低減する方法を提供する。様々な化学療法剤が本発明の併用治療方法で用いられてもよい。考慮する化学療法剤の例示的及び非限定的リストを本明細書中の「定義」の項目に示す。
【０２１９】
当業者によって理解されるように、化学療法剤の適切な用量は、一般的に、化学療法剤が単独ないしは他の化学療法剤と組み合わせて投与される臨床治療に既に用いられる用量の程度であろう。用量の変更はおそらく治療する症状に応じて行うであろう。治療を行う医師は、個々の被検体ごとに適当な用量を決定することが可能であろう。
【０２２０】
また、本発明は、再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖を阻害するか又は予防するための方法及び組成物を提供する。再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖は、一又は複数の現在利用可能な治療法（例えば、癌治療、例として化学療法、放射線療法、外科治療、ホルモン療法及び／又は生物学的療法／免疫療法、抗ＶＥＧＦ抗体療法、特に特定の癌のための標準的な治療投薬計画）を施されている患者ないしはこれらによって治療された患者が臨床的に治療に不十分であるか、又は患者がこのような治療からもはやいかなる有用な効果を得ておらず更なる有効な治療を求める場合の症状を表すために用いられる。本明細書中で用いるように、この表現も「非応答性／難治性」患者の症状を指すものであり、例えば、副作用に苦しむ治療に応答する患者、耐性を生じる患者、治療に応答しない患者、治療に満足に応答しない患者などを表す。様々な実施態様では、癌は、癌細胞の数が有意に低減しなかった、又は増加した、又は腫瘍の大きさが有意に減少しなかった、又は大きくなった、又は癌細胞のサイズないしは数に何らかの減少が生じなかった、再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖である。癌細胞が再発性腫瘍増殖であるか再発性癌細胞増殖であるかの決定は、文脈上で「再発」又は「難治性」又は「非応答性」の当分野で容認される意味を用いて、癌細胞に対する治療の有効性をアッセイするための当分野で公知の任意の方法によってインビトロないしはインビボでなされうる。再発性腫瘍増殖のある例は抗ＶＥＧＦ治療に耐性のある腫瘍である。
【０２２１】
本発明は、一又は複数の本発明のアンタゴニストを投与して、被検体の再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖を遮断又は低減することによって、被検体の再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖を遮断又は低減する方法を提供する。ある実施態様では、ＩＬ−１７アンタゴニストは癌治療剤に続いて投与されてもよい。ある実施態様では、本発明のＩＬ−１７アンタゴニストは癌療法、例えば化学療法と同時に投与される。あるいは又はさらに、ＩＬ−１７アンタゴニスト療法は他の癌療法と交互に行い、いずれの順序でも実施可能である。また、本発明は、癌を有する傾向にある患者の癌の発症や再発を予防するために一又は複数の阻害性抗体を投与するための方法も包含する。通常、被検体は、癌療法を施されたか同時に施されている。一実施態様では、癌療法は、抗血管新生剤、例えばＶＥＧＦアンタゴニストによる治療である。抗血管新生剤は当分野で公知のものや本明細書中の定義の項目に見られるものなどがある。一実施態様では、抗血管新生剤は、抗ＶＥＧＦ中和抗体ないしは断片（例えば、ヒト化Ａ４．６．１、アバスチン（登録商標）（ジェネンテック、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）、Ｙ０３１７、Ｍ４、Ｇ６、Ｂ２０、２Ｃ３など）である。例として、米国特許第６５８２９５９号、同第６８８４８７９号、同第６７０３０２０号、国際公開第９８／４５３３２号、同第９６／３００４６号、同第９４／１０２０２号、欧州特許第０６６６８６８号Ｂ１、米国公開特許第２００３０２０６８９９号、同第２００３０１９０３１７号、同第２００３０２０３４０９号、同第２００５０１１２１２６号、Popkov等， Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)、及び国際公開第２００５０１２３５９号を参照。更なる薬剤は、再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖を遮断又は低減するために、ＩＬ−１７アンタゴニスト及び本発明のアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。例として本明細書中の「併用療法」と題する項目を参照のこと。
【０２２２】
一実施態様では、本発明のＩＬ−１７アンタゴニストは、一又は複数の骨髄系細胞減少薬剤、例えば限定するものではないが、Ｇｒ１、好中球エラスターゼ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＵＲＣＧＰ又はＵＲＲＴＰの発現を低減する治療法と組み合わせて投与されうる。本発明のＩＬ−１７アンタゴニストと組み合わせて使用する骨髄系細胞減少薬剤は、具体的に、Ｇｒ１アンタゴニスト、Ｃｄ１１Ｂアンタゴニスト、ＣＤ１８アンタゴニスト、エラスターゼインヒビター、ＭＣＰ−１アンタゴニスト、ＭＩＰ−１αアンタゴニスト、クロドロネートを単独又はいずれかの組合せで含む。
【０２２３】
さらに、本発明のＩＬ−１７アンタゴニストは、ホルモン剤、放射線剤及び化学療法剤と組み合わせて投与され、これによって癌細胞を一又は複数の薬剤に対して再感作してもよい。この一又は複数の薬剤は転移の阻害を含め、癌の治療又は管理をするために次いで投与されうる（又は投与され続ける）。
【０２２４】
ＩＬ−１７アンタゴニストによる治療に対する腫瘍感度は、ＵＲＣＧＰ、ＤＲＣＧＰ、ＵＲＲＴＰ又はＤＲＲＴＰをコードする核酸に相同な一又は複数の核酸配列を発現することが可能な細胞を含む被検体から一又は複数の試験細胞集団を提供することによって評価されてもよい。配列の発現は参照細胞集団と比較される。参照細胞集団中の細胞のＩＬ−１７アンタゴニスト感受性状態が知られている限り、いずれの参照細胞集団が使われてもよい。比較は、同時又は時間的に異なる時に測定される試験及び参照試料について行われてよい。後者の例は収集された発現情報、例えば配列データベースの使用であり、この配列データベースは感受性の状態が既知である細胞における既知の配列の発現レベルについての情報を集めたものである。本発明の特定の実施態様では、参照細胞集団は、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄系細胞について濃縮されている。本発明の特定の実施態様では、参照細胞集団は、腫瘍細胞について濃縮されている。
【０２２５】
また、ＶＥＧＦアンタゴニストによる治療に抵抗力がある腫瘍は、２００７年３月２８日に出願の同時係属出願番号１１／６９２６８２号において提供される診断用マーカー群を使用して同定されてもよい。例えば、一マーカー群は、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、２０以上、又はすべての群の分子を含んでもよい。分子は、タンパク質又は発現および／または活性の変化を有するタンパク質をコードする核酸であって、Ｎｏｔｃｈ２、ＤＭＤ８、ＭＣＰ−１、ＩＴＧＢ７、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−８Ｒ、ＭＩＰ２、ＭＳＣＡ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１Ｒ、Ｍｅｇ−ＳＦ、ＨＳＰ１Ａ、ＩＬ−１Ｒ、Ｇ−ＣＳＦＲ、ＩＬ１０−Ｒ１、Ｅｒｂ−２．１、カベオリン３、Ｓｅｍｃａｐ３、ＩＮＴＧ４、ＴＨＢＳＰ−４、ＥｒｂＢ３、ＪＡＭ、Ｅｎｇ、ＪＡＭ、Ｅｎｇ、ＪＡＭ−２、Ｐｅｃａｍ１、Ｔｌｒ３、好中球エラスターゼ、ＣＤ１４、ｅｘｐｉ、Ｉｌ−１３Ｒ、ＬＤＬＲ、ＴＬＲ−１、ＲＬＦ、Ｅｎｄｏ−Ｌｉｐ、ＳＯＣＳ１３、ＦＧＦ１３、ＩＬ−４Ｒ、ＴＨＢＳ１、Ｃｒｅａ７、アクアポリン−１、ＳＣＦ３８、ＡＰＯＥ、ＦＡＢＰ、ＩＬ−１１Ｒ、ＩＬ−１ＲＩＩ、ＩＦＮ ＴＭ１、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＷＮＴ５Ａ、分泌型キャリア膜１、ＨＳＰ８６、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＲＢ２、ＧＰＣＲ２５、ＨＧＦ、アンギオポイエチン様−６、Ｅｐｈ−ＲＡ７、セマフォリンＶｌｂ、ニューロトロフィン５、Ｃｌａｕｄｉｎ−１８、ＭＤＣ１５、ＥＣＭ、ＡＤＡＭＴＳ７Ｂ、ＮＣＡＭ−１４０、フィブロネクチンタイプＩＩＩ、ＷＩＰ、ＣＤ７４、ＩＣＡＭ−２、Ｊａｇｇｅｄ１、ｌｔｇａ４、ＩＴＧＢ７、ＴＧＦ−ＢＩＩ−Ｒ、ＴＧＦｂ ＩＥＰ、Ｓｍａｄ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＣＤ８３、Ｄｅｃｔｉｎ−１、ＣＤ４８、Ｅ−セレクチン、ＩＬ−１５、サイトカインシグナル伝達４のサプレッサー、Ｃｙｔｏｒ４、ＣＸ３ＣＲ１、ＩＧＦ２、ＨＳＰ９Ａ、ＦＧＦ１８、ＥＬＭ１、Ｌｅｄｇｆａ、スカベンジャーレセプタータイプＡ、マクロファージＣ−タイプレクチン、Ｐｉｇｒ３、マクロファージＳＲＴ−１、Ｇプロテイン−結合レセプター、ＳｃｙＡ７、ＩＬ−１Ｒ２、ＩＬ−１誘導タンパク質、ＩＬ−１β、ＩＬＩＸ Ｐｒｅｃｕｒｏｒ、ＴＧＦ−Ｂ、ＦＩＺＺ１、Ｗｆｓ１、ＴＰ １４Ａ、ＥＭＡＰ、ＳＵＬＦ−２、細胞外マトリックスｓ２、ＣＴＦＧ、ＴＦＰＩ、ＸＣＰ２、Ｒａｍｐ２、ＲＯＲ−α、エフリンＢ１、ＳＰＡＲＣ−様１及びセマフォリンＡから選択される。本発明の一実施態様では、タンパク質を検出する抗体が提供される。一実施態様では、分子は、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞から得られ、例えば、ＩＬ−１３Ｒ、ＴＬＲ−１、Ｅｎｄｏ−Ｌｉｐ、ＦＧＦ１３、ＩＬ−４Ｒ、ＴＨＢＳ１およびＣｒｅａ７を含む。他の実施態様では、分子は、耐性腫瘍から得られ、例えば、ＭＳＣＡ、ＭＩＰ２、ＩＬ−８Ｒ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ１０−Ｒ２、ＴＨＢＳＰ−４およびＪＡＭ−２を含む。
【０２２６】
Ｃ．薬学的組成物及び投与
単独又は他の治療薬と組み合わせた本発明のＩＬ−１７アンタゴニスト、例えば抗ＩＬ−１７抗体は、ヒト患者に、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入経路、及び／又は皮下投与などにより投与される。
【０２２７】
ある実施態様では、本発明の治療はＩＬ−１７アンタゴニストとＶＥＧＦアンタゴニスト及び／又は一又は複数の骨髄系細胞減少剤ないし化学療法剤との併用投与を伴う。一実施態様では、付加的な抗癌剤、例えば、一又は複数の異なる抗血管新生剤、一又は複数の化学療法剤などが存在する。また、本発明は、複数のインヒビター、例えば同じ抗原に対する複数の抗体又は本発明の異なるタンパク質に対する複数の抗体の投与を考慮する。一実施態様では、異なる化学療法剤の混合物が、本明細書中のＩＬ−１７アンタゴニストと投与される。併用投与は、別々の製剤又は単一の製薬的製剤による同時投与、及び／又はいずれかの順序での連続投与が含まれる。例えば、ＶＥＧＦ又はＧ−ＣＳＦアンタゴニストは、ＩＬ−１７アンタゴニストの投与の前、後、交互に行われるか、又はこれらと同時になされうる。一実施態様では、両方（又はすべて）の活性剤が同時にその生物学的活性を及ぼす一定時間がある。
【０２２８】
疾患の予防又は治療のために、本発明の薬剤の好適な用量は、上記に定義した治療する疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及びインヒビターへの応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。インヒビターは一時的又は一連の治療にわたって好適に患者に投与される。併用療法投与計画では、本発明の組成物は治療的有効量又は治療的相乗作用量で投与される。本明細書中で用いられるように、治療的有効量は、本発明の組成物の投与及び／又はＩＬ−１７アンタゴニスト及び一又は複数の他の治療剤の同時投与により標的とする疾患又は症状が減少又は阻害される量である。薬剤の組み合わせの投与効果は付加的であってもよい。一実施態様では、投与の結果は相乗効果である。治療的相乗作用量は、特定の疾患に関係する状態又は症状を相乗作用的に又は有意に減少ないし除去するために必要な、ＩＬ−１７アンタゴニストと一又は複数の他の治療剤、例えばＩＬ−１７アンタゴニスト及び場合によって骨髄系細胞減少剤、化学療法剤及び／又は抗癌剤の量である。
【０２２９】
疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）のＩＬ−１７アンタゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニスト、Ｇ−ＣＳＦアンタゴニスト、骨髄系細胞減少剤、化学療法剤、又は抗癌剤が、例えば一以上の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量である。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。しかしながら他の用量処方が有用であるかもしれない。典型的には、臨床医は、必要とされる生物学的な効果が生じる用量（一又は複数）が達成されるまで本発明の分子（一又は複数）を投与するであろう。本発明の治療の経過は従来の技術及びアッセイにより容易にモニターされる。
【０２３０】
例えば、血管新生インヒビター、例えばアバスチン（登録商標）（ジェネンテック）などの抗ＶＥＧＦ抗体の調製及び投与計画は製造者の指示に従って用いられても、当業者によって経験的に決定されてもよい。他の例では、このような化学療法剤の調製及び投与計画は製造者の指示に従って用いられても、当業者によって経験的に決定されてもよい。化学療法の調製及び投与計画はChemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載される。
【０２３１】
本発明の治療の有効性は、新生物ないし非新生物疾患を治療する際に共通に用いられる様々なエンドポイントによって決定することができる。例えば、癌治療は、限定するものではないが、腫瘍再発、腫瘍重量ないしサイズの収縮、進行時間、生存期間、進行がない生存、全体の応答速度、応答の継続期間、生活の質、タンパク質の発現及び／又は活性などで評価されてもよい。本明細書に記載の抗血管新生剤は腫瘍の血管をターゲットとするのであって、新生物細胞自体をターゲットとする必要はないので、抗癌剤の特定のクラスを示し、それゆえに薬剤に対する臨床応答の特定の測定と定義を必要としうる。例えば、二次元分析において５０％より大きい腫瘍の収縮は応答を示す標準のカットオフである。しかし、本発明のインヒビターは原発性腫瘍を収縮することなく転移の拡がりを阻害するか、又は単に腫瘍抑制(tumouristatic)効果を及ぼしうる。したがって、例えば血管新生の血漿又は尿路マーカーの測定及び放射線画像法による応答の測定などの、治療の有効性を決定する手法が用いられうる。
【０２３２】
本発明の他の実施態様では、上記の疾病の治療又は診断に有用な材料を具備する製造品が提供される。該製造品は容器、ラベル及びパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。一実施態様では、容器は、症状を治療するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる）。組成物中の少なくとも一つの活性剤はＶＥＧＦモジュレーターであり、少なくとも２つ目の活性剤は骨髄性細胞減少剤及び／又は化学療法剤である。容器に添付又は付属するラベルは、組成物が選択した症状の治療に使用されることを示す。さらに製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の容器を更に具備してもよい。
【０２３３】
本発明の更なる詳細は以下の非限定的な実施例によって例示される。以下の実施例において、スチューデントのｔ検定が、すべての実験において有意差を決定するために使用された。Ｐ値が＜０．０５は有意と考えられた。
【実施例】
【０２３４】
実施例１−抗ＶＥＧＦ耐性及び抗ＶＥＧＦ感受性腫瘍細胞の分泌タンパク質のプロフィール
その微小環境を確立し指示することを担う腫瘍由来の因子を同定するために、以前に樹立された抗ＶＥＧＦ耐性及び感受性腫瘍細胞株間の分泌タンパク質のプロファイルを比較した。マウス腫瘍細胞株（ＥＬ４、ＴＩＢ−６）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手した。ＥＬ４は、抗ＶＥＧＦ耐性であるＴ細胞リンパ腫細胞株であり、一方Ｔｉｂ６は抗ＶＥＧＦ−感受性であるＢ細胞リンパ腫細胞株である。これらは両方ともＬ−グルタミン、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）(Sigma, St. Louis, MO)を補充したＤＭＥＭ（インビトロジェン、カールスバッド、ＣＡ）中で培養し、５％ＣＯ２、湿度８０％のインキュベーター中で３７℃に維持された。
【０２３５】
腫瘍細胞株を７２時間還元血清ＤＭＥＭ（１％ＦＢＳ）中で１ｘ１０６／ｍｌの密度で６ウェルプレート中で増殖させた後に、ＥＬ４及びＴｉｂ−６細胞株条件培地を収集した。  細胞生存率及び総細胞数は、調整期間中の細胞数の変化を説明するためにＶｉ−Ｃｅｌｌ ＸＲ (Beckman Coulter, Fullerton, CA) を用いて測定した。全てのデータは、調整期間の終了時に、細胞数によって正規化した。
【０２３６】
３２のマウスサイトカイン及び増殖因子に特異的な抗体のパネルを用いて馴化培地内に含まれる腫瘍細胞分泌因子を調べた（実施例２に記載のＢｉｏＲａｄ社サイトカインビーズアッセイ）。腫瘍細胞が浸潤する間質細胞と接触する状態になるインビボでの条件をモデル化するための試みにおいて、我々は、腫瘍と主要な間質細胞型、線維芽細胞との間の相互作用を研究するために共存培養アッセイを用いた。これは、細胞−細胞相互作用を研究する最も単純なシステムである。マウスから単離した正常皮膚繊維芽細胞は、最も密接にインビボでの設定を模倣する共培養実験に用いた。共培養アッセイにおいて、何れの細胞型の遺伝子発現において検出される変化は容易に検出され、それは異なる細胞型が接触または近接している場合に現れる。
【０２３７】
図１Ａに示すように、Ｉｌ−１７は、インビトロで抗ＶＥＧＦ感受性（Ｔｉｂ６）腫瘍細胞に対して抗ＶＥＧＦ耐性（ＥＬ４）腫瘍細胞で見いだされた最も豊富な分泌因子であることを実証している。図１Ｂは、抗ＶＥＧＦ難治性ＥＬ４細胞および正常皮膚繊維芽細胞（ＮＳＦ）の共培養物中でＩＬ−６およびＧ−ＣＳＦレベルが上昇していることを示している。これらの知見は、抗ＶＥＧＦ耐性及び感受性細胞株は、それらの分泌タンパク質のプロファイルが異なることを示唆しており、最も顕著なのは、耐性ＥＬ４細胞株の中で最も豊富に発現するサイトカインとしてのＩＬ−１７である。更に、炎症促進性サイトカイン、ＩＬ−６およびＧ−ＣＳＦは、ＮＳＦと耐性腫瘍細胞株を共培養すると強力にアップレギュレートされ、腫瘍および間質線維芽細胞間の細胞−細胞相互作用は、炎症促進性サイトカインの発現を誘導することができることを示唆している。
【０２３８】
実施例２−腫瘍細胞はパラクリン機構を介して線維芽細胞において炎症促進性遺伝子の発現を誘導する
ＲＮＡサンプルの調製および定量的逆転写酵素−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析：
ＤＮＡを含まない総ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＲＮｅａｓｙキット（キアゲン社、ドイツ）を用いて単離した。一段階定量的逆転写−ＰＣＲは、スーパースクリプトＩＩＩプラチナワンステップ定量ＲＴ−ＰＣＲキット（インビトロジェン、カールスバッド、ＣＡ）又はＴａｑＭａｎワンステップＲＴ−ＰＣＲマスターミックス(Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて５０μＬの総容量で行った。下記のＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイプライマー及びプローブミックスを以下のマウスの遺伝子のために使用した：ＩＬ−１７（アッセイＩＤ：Ｍｍ００４３９６１９＿ｍ１），ＩＬ−６（アッセイＩＤ：Ｍｍ０１２１０７３３＿ｍ１），Ｂｖ８（アッセイＩＤ：Ｍｍ００４５００８０＿ｍ１），Ｇ−ＣＳＦ（アッセイＩＤ：Ｍｍ００４３８３３４＿ｍ１），ＭＭＰ−９（アッセイＩＤ：Ｍｍ００４４２９９１＿ｍ１），Ｓ１００ａ８（アッセイＩＤ：Ｍｍ００４９６６９６＿ｇ１），Ｓ１００ａ９（アッセイＩＤ：Ｍｍ００６５６９２５＿ｍ１），ＧＡＰＤＨ（アッセイＩＤ：Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１）．分析は、製造業者の推奨プロトコールに従って標準ＡＢＩ７５００機(インビトロジェン)で行った。
【０２３９】
サイトカインビーズアッセイ及びＥＬＩＳＡ：
ＥＬ４細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）及び正常皮膚繊維芽細胞（ＮＳＦ）（３．３ｘ１０５細胞）を単独又は１：３（ＮＳＦ／ＥＬ４）比で一緒にのどちらかで、６ウェルプレートに７２時間３通りに培養し；上清を収集し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｐｒｏ磁性サイトカイン、ケモカイン、及び増殖因子アッセイシステム（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて分析した。細胞は還元血清培地（１％ＦＢＳ）中で培養した。マウスＩＬ−１７Ａ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６のレベルをＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキットにより測定した(R&D Systems, Minneapolis, MN)。
【０２４０】
ＦＰ標識化ＥＬ４腫瘍細胞は、７２時間正常な皮膚繊維芽細胞（ＮＳＦ）と共培養され、その後線維芽細胞から腫瘍細胞がＦＡＣＳ単離され、ｑＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現の解析がなされた。図２Ａに示されるＧ−ＣＳＦ（Ｃｓｆ３）及び図２ＢのＩＬ−６の発現は、単一培養細胞に対して抗ＶＥＧＦ耐性細胞株ＥＬ４と共培養したときに誘導され、正常線維芽細胞において観察された。プリソート分析を、ＦＡＣＳソーティングにより導入された潜在的アーティファクトの調製のために実施した。Ｇ−ＣＳＦ及びＩＬ−６発現の細胞供給源を決定するために、ＧＦＰ標識腫瘍細胞は、非標識線維芽細胞との共培養及びｑＲＴ−ＰＣＲによってこれらの細胞型における遺伝子発現の変化をプロファイリングの後にＦＡＣＳ選別した。このデータは、細胞−細胞相互作用は、共培養の際に腫瘍細胞に対する線維芽細胞コンパートメント内に、ＩＬ−６及びＧ−ＣＳＦの両方の誘導を生じることを明らかにした。同様に、ＮＳＦがＥＬ４馴化培地で刺激されるときに、線維芽細胞においてＧ−ＣＳＦ及びＩＬ−６の発現の誘導も観察され（データ非表示）、細胞間相互作用は厳密に必要ではなく、そして腫瘍細胞分泌因子がＮＳＦにおけるＧ−ＣＳＦとＩＬ−６の上方制御を誘発するのに十分であることを示唆している。まとめるとこのデータは、腫瘍細胞は、隣接する線維芽細胞に、パラクリン機構を介して、Ｇ−ＣＳＦとＩＬ−６を含む炎症促進性サイトカインの発現及び分泌へと指示しているかもしれないことを示唆している。
【０２４１】
実施例３−ＩＬ−１７中和は線維芽細胞におけるＥＬ４誘導型Ｇ−ＣＳＦ発現を阻害する
ＮＳＦにおいて観察されたＧ−ＣＳＦｎｏ誘導がＩＬ−１７依存性であり得るかどうかに対処するために、実施例１に記載したようにＥＬ４条件培地を回収し、次いで、ＩＬ−１７に対する中和抗体と共にプレインキュベートし、９６ウェルのクラスターに播種したＮＳＦに添加する前に標的の可溶性因子の中和を可能とした。ＩＬ−１７及び様々な濃度のＧ−ＣＳＦ（ＴＮＦ−α及びＩＬ−１β）の他の２つの既知の誘導物質に対する中和抗体を、全量２００μｌ中、３７℃で２４時間の共培養において、ＥＬ４／線維芽細胞とインキュベートした。このインキュベーションの後、上清の５０μＬを各ウェルから採取し、ＥＬＩＳＡ希釈液５０μＬで希釈し、ＥＬＩＳＡによりＭＧ−ＣＳＦのレベルを試験した。図３に示すように、ＩＬ−１７に対する中和抗体は、ＥＬ４／線維芽細胞共培養物の条件培地中の分泌されたＧ−ＣＳＦのレベルの最も有意な減少を与え、ＩＬ−１７は、関連する正常な線維芽細胞において炎症性サイトカインの分泌を誘導することの原因となるドミナントな腫瘍由来因子であり得ることを示唆している。
【０２４２】
実施例４−腫瘍微小環境におけるＩＬ−１７の機能
メスのマウス（６〜１２週齢）が指示されるように用いられた：Ｃ５７Ｂｌ６．ＩＬ−１７ＲＣ−／−，Ｃ５７Ｂｌ６ＷＴ同腹仔はジェネンテック社で特定の病原体を含まない条件下で飼育され、維持された。メスのＷＴ Ｃ５７ＢＬ６マウスはチャールズリバー研究所(Hollister, CA)から購入した。動物が関与する手順は、ジェネンテック社の施設内動物管理使用委員会によってレビューされ、承認され、関連する規制基準に準拠する。実施例１に記載したようにＥＬ４腫瘍細胞を培養した。
【０２４３】
この実験で用いた腫瘍のマウスモデルは次のように記述される：成長因子低減マトリゲル (ＢＤバイオサイエンス) の１００μｌ中のＥＬ４腫瘍細胞（２．０×１０６）を野生型（Ｃ５７／ＢＬ６ ＷＴ）またはＩＬ−１７受容体ノックアウト型（ＩＬ−１７ｒｃ ＫＯ）の何れかの異なる遺伝子型のマウスの背部側腹部に皮下接種した。抗体は、対応する図の説明文に示された用量で１週間に２回腹腔内注射した。対照抗体、抗ブタクサ、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体Ｂ２０−４．１．１（Liangら、２００６）又は抗ＩＬ−１７Ａでの処置は、腫瘍細胞接種後２日目に開始した。全ての腫瘍増殖実験を少なくとも３回実施し、実験動物の管理と使用に関するガイドラインに従って実施した。腫瘍体積を楕円体の体積の式（０．５×Ｌ×Ｗ２、ここでＬは長さでありＷは幅である）を用いて一日おきに計算した。
【０２４４】
図４Ａは、対照抗体（抗ブタクサ、１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内（ＩＰ）、週二回）又は抗ＶＥＧＦ（１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、週二回）で処置されたＣ５７／ＢＬ６ ＷＴ及びＩｌ−１７ｒｃ−／−マウスにおけるＥＬ４腫瘍の増殖を示す。処置は腫瘍細胞接種の４８時間後に開始した。データは平均値±ＳＥＭとして示される。対照処置群では、ＷＴマウスと比較して末期ＥＬ４腫瘍体積はＩＬ−１７ｒｃ−／−マウスで〜５０％減少し、宿主間質へのＩＬ−１７シグナル伝達が腫瘍増殖において重要な役割を果たすことを示唆している。そして抗ＶＥＧＦによる単独療法は、ＷＴマウスでＥＬ４腫瘍の縮小にわずかな影響を持つのに対し、ＩＬ−１７ｒｃ−／マウスでは〜８０％の腫瘍増殖阻害をもたらした。データは平均値±ＳＥＭとして示される。＊は、抗ＶＥＧＦ抗体で処置されたＷＴ及びＩｌ−１７ｒｃ−／−動物におけるＥＬ４腫瘍間の有意な相違（Ｐ＜０．０００１）を示している。
【０２４５】
図４Ｂは、対照抗体（抗ブタクサ）、抗ＶＥＧＦ、抗ｍＩＬ−１７、及び抗ｍＩＬ−１７／抗ＶＥＧＦの組み合わせで処置されたＣ５７／ＢＬ６ ＷＴマウスにおけるＥＬ４腫瘍の増殖を示す。全ての抗体を週２回、腹腔内（ＩＰ）に、１０ｍｇ／ｋｇ投与した。処置は腫瘍細胞接種の４８時間後に開始した。データは平均値±ＳＥＭとして示される。ＶＥＧＦが単独で投与されると、末期腫瘍体積は僅かに減少したが、抗ＩＬ−１７が抗ＶＥＧＦと組み合わせて投与されると、腫瘍体積は〜５０％だけ減少し、ＩＬ−１７の阻害は抗ＶＥＧＦ処置に対する感受性を与えることを示唆している。データは平均値±ＳＥＭとして示される(Shojaei et al 2009)。（＊）は抗ＶＥＧＦで処置されたＥＬ４腫瘍と抗ＭＩＬ−１７との組み合わせで処置されたＥＬ４腫瘍の間における有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。まとめると、図４と４Ｂは、腫瘍微小環境におけるＩＬ−１７の機能は腫瘍増殖を促進することができ、抗ＶＥＧＦ治療に対する耐性に必要とされ得ることを実証している。
【０２４６】
更に、処置に感受性のある腫瘍細胞株であるＴｉｂ−６が、マウスＩＬ−１７Ａ（Ｔｉｂ６−ＩＬ１７と表記）で形質導入され、免疫不全（ｎｕ／ｎｕ）レシピエントマウスにおける抗ＶＥＧＦ処置に対するその応答について試験されると、ＶＥＧＦ阻害に対する腫瘍耐性を媒介するＩＬ−１７の役割が確認された。対照である、（Ｔｉｂ６−ｎｅｏと表記）ネオマイシン形質導入Ｔｉｂ６（Ｔｉｂ６−ｎｅｏと表記）担腫瘍マウスと比較して、循環性及び腫瘍ＩＬ−１７Ａの両方で有意に高いレベルであった。相応して、Ｇ−ＣＳＦの高いレベルはまた、Ｔｉｂ６−ＩＬ１７腫瘍においても検出され、これらの腫瘍は、Ｔｉｂ６−ｎｅｏ腫瘍よりもインビボでより多くのＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞をリクルートした。移植されたＴｉｂ６−ＩＬ−１７腫瘍はＴｉｂ６−ｎｅｏ腫瘍と比較して腫瘍増殖速度に有意な増加を示しさなかったものの、これらの腫瘍は、４つの独立した安定なＴｉｂ−６／ＩＬ−１７クローン間で、試験された２−Ｔｉｂ６／ｎｅｏの対照クローンと比較して、抗ＶＥＧＦ処置に対して有意により耐性であった（図１１）。更にｎｕ／ｎｕマウスの機能獲得型データは、ＩＬ−１７のエフェクター機能は、Ｔ細胞から付加的インプットとは無関係に発生することができることを示しており、唯一ＩＬ−１７の機能だけが、抗ＶＥＧＦ処置に対する耐性を駆動する炎症促進性ネットワークの媒介に必要かつ十分であることを示唆している。
【０２４７】
実施例５−ＥＬ４担腫瘍マウスにおけるＩＬ−１７のシグナル伝達実験
実施例２に記載したように、ナイーブ及び担腫瘍マウスの血清中の循環サイトカインレベルを測定した。前述のようにＢＶ８濃度をＥＬＩＳＡにより測定した(Shojaei et al 2009)。この実験で用いた腫瘍のマウスモデルは実施例４記述される通りである。図５Ａ−Ｃは、対照抗ブタクサ抗体（Ｒａｇ，１０ｍｇ／ｋｇ）又は抗ＶＥＧＦ抗体（Ｂ２０，１０ｍｇ／ｋｇ）のどちらかで処置されたＥＬ４担持ＷＴ及びＩｌ−１７ｒｃ−／−マウスにおけるｍＧ−ＣＳＦ，ｍＢｖ８及びｍＩＬ−１７Ａの血清レベルを示す。データは平均値±ＳＤとして示される。このデータはＩＬ−１７及びＧ−ＣＳＦのレベルはナイーブマウスに対して担癌マウスでサイトカインレベルを比較した場合、腫瘍の存在に関連していることを示している。第二に、Ｇ−ＣＳＦおよび血管新生促進因子ＢＶ８両方のレベルは、ＩＬ−１７ＲＣ−／−宿主において両方の因子がナイーブレベルに戻るため、宿主細胞へのＩＬ−１７シグナル伝達に依存するように思われる。更に、ＷＴマウスをＩＬ−１７ＲＣ−／−マウスと比較して、循環で見いだされたＩＬ−１７のレベルの低下は無く、ＩＬ−１７の発現は腫瘍固有であることを示唆している。まとめると、この実験データは、宿主間質細胞へのＩＬ−１７シグナル伝達は、担腫瘍マウスでは炎症促進性／血管新生促進サイトカインのレベルを制御することを示している。
【０２４８】
上記のようにＥＬ４腫瘍担持マウスを用いて、白血球を担腫瘍マウスから単離し、次のようにＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞をマウスの脾臓から単離した：単一細胞懸濁液をナイーブマウス及び担腫瘍マウスから単離した脾臓から調製し、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋の集団を、製造業者によって提供されるプロトコルに従って、抗Ｇｒ−１−ＰＥコンジュゲート続いて抗ＰＥマイクロビーズ(Miltenyi Biotech)により第一標識細胞別に選別した。品質管理のために、選別された細胞のアリコートを、抗ＣＤ１１ｂおよび抗Ｇｒ１で染色し、そしてＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の純度（９０％以上）を確保するためにＦＡＣＳ分析により分析した。
【０２４９】
骨髄単核細胞（ＢＭＮＣ）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）、及び腫瘍細胞のフローサイトメトリーは腫瘍を移植したマウスから採取した。対照により処置され及び抗ＶＥＧＦにより処置されたマウスからの腫瘍を単離し、かみそりの刃で腫瘍を切り刻み、機械的に破砕し、コラゲナーゼ／ディスパーゼ及びＤＮＡｓｅ(Roche, Basel, Switzerland)で消化して、３７℃で１時間、１ｍｇ／ｍｌの増殖培地中で均質化することにより単一細胞懸濁液を得た。赤血球を、ＡＣＫ (Lonza, Basel, Switzerland) 溶解緩衝液を用いて溶解し、ラット抗マウスＣＤ１１ｂ及びＧｒ−１抗体で染色した（ＢＤバイオサイエンス、サンノゼ、カリフォルニア州）。死滅細胞を除去するため、ＬＳＲＩＩＢ ＦＡＣＳ装置(ＢＤバイオサイエンス)上でのデータ取得及びＦｌｏｗＪｏソフトソフトウェア(Tree Star, Ashland, OR)を用いた解析の前に、ヨウ化プロピジウム(Sigma, St. Louis, MO)を全てのサンプルに添加した。
【０２５０】
免疫抑制未熟骨髄細胞はＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ１＋二重陽性細胞として定義され、腫瘍増殖と関連しており、(Gabrilovich & Nagaraj 2009)に総説される。Ｇ−ＣＳＦ及びＢＶ８はＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞を補充、動員し、抗ＶＥＧＦ抗体に対する腫瘍抵抗性を付与することが報告されているので(Shojaei et al 2009)、ＥＬ４担腫瘍マウスにおけるＧ−ＣＳＦ及びＢＶ８レベルの上昇が、抗ＶＥＧＦに対する耐性を媒介する際にＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の補充に同様に関与しているかどうかを調べた。免疫抑制性未熟骨髄細胞はＧｒ１＋／ＣＤ１１ｂ＋二重陽性細胞として定義され（図６）、図７Ａ−Ｃに示すように定量化され、ナイーブマウスと比較して担腫瘍マウスにおいてフローサイトメトリー分析によって決定されるように、循環へのＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の動員を実証している。更に、担癌ＩＬ−１７ＲＣ−／−マウスの循環中に見いだされたＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の有意な低下によって示されるように、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋の動員は、腫瘍微小環境へのＩＬ−１７のシグナル伝達に依存している。これまでの研究では、脾臓のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞は腫瘍の増殖に寄与すると示唆しているので(Kusmartsev & Gabrilovich 2002), (Bronte et al 2000)、担腫瘍マウスの脾臓を調べ、ＷＴ宿主に比較してＩＬ−１７ＲＣ−／−で脾臓のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の減少が観察された。図７Ａ−Ｃでのフローサイトメトリー結果の定量化は、ＷＴ宿主と比べてＩＬ−１７ＲＣ−／−では腫瘍へ補充されるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞は少ないことを実証している。まとめると、この実験データは、ＥＬ４担腫瘍マウスにおいて、宿主間質へのＩＬ−１７のシグナル伝達が、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒｌ＋免疫抑制性未熟骨髄細胞の動員及び腫瘍浸潤に必要となり得ることを実証している。
【０２５１】
実施例６−ＩＬ−１７は、腫瘍促進機能のために必要であり得る
抵抗性の腫瘍を有するマウス由来の脾臓のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞に起因した腫瘍促進表現型を更に探索し、ＩＬ−１７シグナル伝達は、宿主のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の表現型をプライミングする役割を果たしているかどうかを更に理解を得るために、Ｇｒ１＋細胞をＥＬ４担癌マウスの脾臓から単離し、実施例５に記載したように行った。脾臓のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の純度を検証した後、これらの細胞をＬＰＳの存在下または非存在下で一晩培養し、続いてＢｖ８（図８Ａ）などの血管新生促進遺伝子、及びＳ１００Ａ８（図８Ｂ），Ｓ１００Ａ９（図８Ｄ）及びＭＭＰ９（図８Ｃ）などの腫瘍促進遺伝子の発現についてｑＲＴ−ＰＣＲによりｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。ＷＴ担腫瘍マウスのＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞は、ＩＬ−１７ＲＣ−／−宿主の脾臓に見られるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋と比較して、より高レベルの腫瘍促進遺伝子のサブセットを発現し、ＩＬ−１７は、宿主のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の腫瘍促進表現型に決定に関与するプライミングシグナルとして作用している可能性があり、ＩＬ−１７のシグナル伝達は、宿主のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の抗ＶＥＧＦ耐性の表現型に寄与することを示唆している。
【０２５２】
抗ＶＥＧＦ不応性を媒介するＧ−ＣＳＦの必要性を試験するために、抗ＶＥＧＦ耐性細胞株ＥＬ４を、全ての間質宿主細胞がＧ−ＣＳＦシグナル伝達を欠損している、同系のＧ−ＣＳＦ受容体ノックアウトＣ５７ＢＬ／６レシピエント（Ｃｓｆ３ｒ−／−，以後ＧＣＳＦＲ ＫＯと言う）へ移植した。Ｇ−ＣＳＦシグナル伝達はＥＬ４腫瘍の増殖を変化させるようには見えなかったが、このシグナル伝達軸が、抗ＶＥＧＦ治療に対する腫瘍不応性を媒介において、並びに骨髄からのＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の動員及び腫瘍微小環境への補充において本当に必要であったことが観察された。まとめると、このデータは、腫瘍微小環境中へのＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋の動員と補充を介して抗ＶＥＧＦ耐性の媒介におけるＩＬ−１７−Ｇ−ＣＳＦシグナル伝達カスケードの必要性を決定的に実証している。
【０２５３】
実施例７−平均血管密度を測定する
対照抗体（抗ブタクサ）または抗ＶＥＧＦ抗体（Ｂ２０）で処置された、ＷＴ及びＩＬ−１７ｒｃ ＫＯ動物由来のＥＬ４腫瘍を以下のように免疫染色した。腫瘍サンプルは、最適な切断温度（ＯＣＴ、サクラファイン）に包埋し、ドライアイス浴中で凍結させた。腫瘍切片を、クライオスタット（ライカマイクロシステム）中で切断（１０μｍ）した。切片を１時間、２０℃で乾燥させ、次いで−２０℃で１０分間、アセトン中で固定した。空気乾燥した後、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の１０％正常ロバ血清(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)中において非特異的結合部位を２０℃で１時間インキュベートすることによってブロックし、続いて２％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の１．５％正常血清で希釈した抗体により免疫染色を行った。腫瘍切片は、以下の一次抗体：抗マウスＣＤ３１抗体（クローンＭＥＣ１３．３、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を１：１００で４℃で一晩、抗ウサギデスミン（クローンＧＴＸ１５２００、Ｇｅｎｅｔｅｘ）を１：４００で、及び抗マウス平滑筋アクチン（ＳＭＡ）−Ｃｙ３コンジュゲート型１：４００で４℃で一晩、続いて二次抗体、抗ラット−アレクサ−４８８コンジュゲートおよび抗ウサギアレクサ６４７コンジュゲート(インビトロジェン)で２０℃で２時間染色した。スライドを、ＤＡＰＩで対比染色し、洗浄し、ダコ（ＤＡＫＯ）蛍光封入剤（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）内にマウントした。免疫蛍光画像はツァイスＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ Ｚ２正立顕微鏡（ツァイス）とＴｉｓｓｕｅＧｎｏｓｔｉｃｓスライドスキャナ（TissueGnostics、ウィーン、オーストリア）で収集した。図９は免疫染色した組織を示す。
【０２５４】
免疫染色の定量化は、細胞の全面積に対するＣＤ３１陽性細胞の平均面積として表され、以下のように実施した。腫瘍の血管密度の平均（ＭＶＤ）の測定は、２０Ｘ対物レンズを用いて、ＣＤ３１染色切片のTissueGnosticsスライドスキャナで捕獲したデジタル画像から定量化した。染色された血管に対応するピクセルは、Definiensの組織スタジオソフトウェア（Definiens、ニュージャージー州）を用いて選択した。腫瘍全体の断面及び群当たり合計５つの腫瘍を分析した。血管領域の凝集ピクセルは、画像全体の面積及び分析された全体面積に対して、陽性細胞の面積／全表面積の％として報告されている。図１０は、ＭＶＤとして表される腫瘍血管新生測定の定量化を示す。ＷＴ宿主に比べてＩＬ−１７ＲＣ−／−において、抵抗性腫瘍のＭＶＤは有意に減少しており（ｐ＜０．０５）、ＩＬ−１７ＲＣ ＫＯマウスにおける腫瘍増殖の抑制を伴うＭＶＤの減少は、対照及び抗ＶＥＧＦ処置群の両方についてＭＶＤの減少を伴うことを示唆している。このデータは、宿主微小環境へのＩＬ−１７のシグナル伝達は、新しい血管の成長を促進することを示している。
【０２５５】
実施例８−抗ＶＥＧＦ応答に対するＴＨ１７細胞の媒介作用
ＩＬ−１７はＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｔｃ１７）のＴＨ１７サブセットによって産生される。ＴＨ１７細胞の浸潤は、ヒト肺癌及び結腸直腸癌における予後不良と関連しているため、同系マウスの肺及び結腸癌モデルにおける抗ＶＥＧＦ処置に応答した腫瘍浸潤性ＴＨ１７細胞の作用を試験した。
【０２５６】
マウス腫瘍細胞株ＣＴ−２６をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手し、ＲＰＭＩ（インビトロジェン、カールスバッド、ＣＡ）中で培養した。培地にＬ−グルタミン、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（シグマ、セントルイス、ＭＯ）を補充した。ＣＴ２６は、５％ＣＯ２、湿度８０％のインキュベーター中、３７℃で培養し、維持した。成長因子低減マトリゲル（ＢＤバイオサイエンス）１００μｌ中のＣＴ−２６腫瘍細胞（２．０×１０６）をＣ５７Ｂｌ６．ＷＴ又はＣ５７Ｂｌ６．ＩＬ−１７ＲＣ−／−（ＫＯ）のどちらかの背の脇腹に皮下接種した。抗体は、１週間に２回腹腔内注射した。対照抗体、抗ブタクサ、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体Ｂ２０−４．１．１（Liangら、２００６）又は抗ＩＬ−１７Ａ又は抗ＩＬ−１７Ｆによる処置は腫瘍細胞接種後２日に開始した。全ての腫瘍増殖実験を少なくとも３回実施し、実験動物の管理と使用に関するガイドラインに従って実施した。腫瘍体積を楕円体の体積の式（０．５×Ｌ×Ｗ２、ここでＬは長さでありＷは幅である）を用いて一日おきに計算した。
【０２５７】
結腸直腸癌細胞株のＣＴ−２６において、抗ＶＥＧＦ単独と比べて、抗ＩＬ１７と抗ＶＥＧＦの組み合わせで処置すると腫瘍増殖の有意な減少が観察され、並びに抗ＶＥＧＦ処置の後に、ＷＴ同腹仔と比べて、ルイス肺癌（ＬＬＣ）担持ＩＬ−１７ｒｃ−／−において腫瘍量の有意な減少が観察された（図１３ＡおよびＢ）。
【０２５８】
ＣＴ−２６腫瘍細胞を、腫瘍を移植したマウスから採取した。対照により処置され及び抗ＶＥＧＦにより処置されたマウスからの腫瘍を単離し、かみそりの刃で腫瘍を切り刻み、機械的に破砕し、コラゲナーゼ／ディスパーゼ及びＤＮＡｓｅ（ロシュ、バーゼル、スイス）で消化して、３７℃で１時間、１ｍｇ／ｍｌの増殖培地中で均質化することにより単一細胞懸濁液を得た。死滅細胞を除去するため、ＬＳＲＩＩＢ ＦＡＣＳ装置(ＢＤバイオサイエンス)上でのデータ取得及びＦｌｏｗＪｏソフトソフトウェア(Tree Star, Ashland, OR)を用いた解析の前に、ヨウ化プロピジウム(Sigma, St. Louis, MO)を全てのサンプルに添加した（図１４Ａ−Ｂ及び図１５Ｂ）。マウスＩＬ−１７Ａ及びＧ−ＣＳＦのレベルをＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキットにより測定した(R&D Systems, Minneapolis, MN)。マウスＢＶ８レベルはジェネンテック社で開発されたＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。（図１５Ｃ及び図１６ＡとＣ）。腫瘍浸潤性ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の割合はフローサイトメトリーによって決定した。（図１６Ｂ）。
【０２５９】
ＴＩＬ分析は以前に記載したように行った。ＬＬＣ腫瘍浸潤性ＣＤ３＋Ｔ細胞のレベルはＷＴ宿主とＫＯ宿主の間で相違しなかった（それぞれ肝臓腫瘍細胞の１．２４％±０．１８％及び１．２８％±０．２２％）。しかし、抗血管新生療法は、腫瘍リンパ球浸潤３０−３２を増加させることができることを示す最近の報告と一致して、抗ＶＥＧＦ治療は、腫瘍浸潤性ＣＤ４＋とＣＤ８＋の両方の数を、ＣＤ８＋Ｔ細胞よりもＣＤ４＋Ｔ細胞が１０倍高いものの、増加させることが観察された（図１５Ａ−Ｃ）。そしてこれらの成熟Ｔ細胞亜集団の両方ともＩＬ−１３を発現することが知られているが、ＩＬ−１７の発現はＬＬＣ腫瘍においてＣＤ４＋細胞により制限された（図１４Ａ−Ｂおよび図１５Ａ−Ｃ）。全てのＩＬ−１７＋ＣＤ４＋細胞はまたＩＬ−２２（図１４Ａ−Ｂ）、成熟して末期的に分化したＴｈ１７細胞の顕著なサイトカインを発現した。ＬＬＣ腫瘍におけるＩＬ１７＋ＩＬ−２２＋ＣＤ４＋集団の増加は抗ＶＥＧＦ処置の際に観察された。これらのＴＩＬの有病率は、腫瘍微小環境におけるＩＬ−１７およびＧ−ＣＳＦの両方のレベルの上昇、並びにＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄性細胞の補充及び血管新生促進因子、ＢＶ８（図１６Ｃ）の腫瘍内レベルの増加と一致していた（図１６Ｃ）。しかし、ＴＨ１７腫瘍浸潤の下流での作用は、ＷＴ担癌宿主における完全なＩＬ−１７のシグナル伝達の存在下で唯一の観察されただけであった（図１６Ａ−Ｃ）。
【０２６０】
最近の研究は、これらの研究のほとんどは組換えＩＬ−１７タンパク質又は腫瘍へのＩＬ−１７遺伝子のレトロウイルス形質導入を用いて行われたが、ＩＬ−１７は、腫瘍の血管新生を促進する役割を果たしていることを示唆している (Tartour, E. et al. Interleukin 17, 「T細胞由来サイトカインは、ヌードマウスにおけるヒト子宮頸部腫瘍の腫瘍形成を促進する」 Cancer Res 59, 3698-704 (1999); Numasaki, M. et al. 「インターロイキン-17は、血管新生および腫瘍増殖を促進する」Blood 101, 2620-7 (2003))。同系ＬＬＣ腫瘍モデルにおける腫瘍血管構造の促進に関する内因性腫瘍浸潤性Ｔｈ１７細胞の効果が問われた。この目的のために、ＩＬ−１７ＲＣのＫＯ宿主における抗ＶＥＧＦ治療による腫瘍関連内皮細胞枯渇の増強がＷＴと比較して観察され、ＴＨ１７細胞はＶＥＧＦ遮断に直面して持続的な血管新生を同様に促進することができることを示唆している（図１６Ａ−Ｃ）。まとめると、このデータは、炎症促進性サイトカインＧ−ＣＳＦの発現の媒介及び抗ＶＥＧＦ療法に対する耐性を更に媒介するために血管新生促進ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の補充における、腫瘍浸潤性ＴＨ１７細胞の必要性及びその宿主微小環境内のＩＬ−１７のシグナル伝達の必要性についての証拠を提供している。
【０２６１】
Bronte V, Apolloni E, Cabrelle A, Ronca R, Serafini P, et al.2000.Identification of a CD11b(+)/Gr-1(+)/CD31(+) myeloid progenitor capable of activating or suppressing CD8(+) T cells.Blood 96:3838-46.
Gabrilovich DI, Nagaraj S. 2009.Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system.Nat Rev Immunol 9:162-74.
Kusmartsev S, Gabrilovich DI.2002.Immature myeloid cells and cancer-associated immune suppression.Cancer Immunol Immunother 51:293-8.
Shojaei F, Wu X, Qu X, Kowanetz M, Yu L, et al.2009.G-CSF-initiated myeloid cell mobilization and angiogenesis mediate tumor refractoriness to anti-VEGF therapy in mouse models.Proc Natl Acad Sci USA 106:6742-7.
【０２６２】
本開示を通して引用される全ての参考文献は、本明細書において参照によりその全体が明確に援用される。本発明は特定の実施態様であると考えられるものを参照して説明されるが、本発明は係る実施態様に限定されるものではないことを理解すべきである。これに対し、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神及び範囲内に含まれる種々の改変と均等物を包含するように意図されている。
【０２６３】
特許請求の範囲を含む本出願を通じて、「含む(comprising)」なる用語は、包含的で、変更可能な移行句として使用され、付加的な、列挙されていない要素又は方法工程を除外しない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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