(57)【要約】本発明は、ＲＮＡ成分とポリペプチド成分とを含む免疫原性組成物に一般的に関する。２つの異なる形態にある抗原エピトープ（病原体に由来する第１のエピトープであって、ＲＮＡによりコードされる形態にあるエピトープ；および同じ病原体に由来する第２のエピトープであって、ポリペプチド形態にあるエピトープ）を送達する免疫原性組成物は、病原体に対する免疫応答を誘発するのに有効である。本発明はまた、ＲＮＡベースの初回刺激組成物と、ポリペプチドベースの追加刺激組成物とを含むキットにも関する。キットは、初回刺激組成物および追加刺激組成物の逐次投与のために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子と；
（ｉｉ）第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原と
を含む、免疫原性組成物であって、
前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとが同じ病原体に由来するエピトープである、
免疫原性組成物。
【請求項２】
前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとが同じエピトープである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとが異なるエピトープである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記第１のポリペプチド抗原と前記第２のポリペプチド抗原とが実質的に同じである、請求項１または２に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記第１のポリペプチド抗原が可溶性ポリペプチドまたは膜アンカー型ポリペプチドであり、前記第２のポリペプチド抗原が可溶性ポリペプチドである、請求項１から４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記第１のポリペプチド抗原が、異なる病原体に由来する第３のエピトープをさらに含む融合ポリペプチドである、請求項１から５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記第２のポリペプチド抗原が、異なる病原体に由来する第３のエピトープをさらに含む融合ポリペプチドである、請求項１から６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとが、前記病原体の同じ亜種に由来するエピトープである、請求項１から７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記自己複製ＲＮＡが、アルファウイルスに由来するＲＮＡレプリコンである、請求項１から８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記自己複製ＲＮＡ分子が、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
カチオン性脂質、リポソーム、コクリエート、ウィロソーム、免疫刺激複合体、微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、単層小胞、多重膜小胞、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、エマルソーム、ポリカチオン性ペプチド、またはカチオン性ナノエマルジョンをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記ＲＮＡ分子を、カチオン性脂質、リポソーム、コクリエート、ウィロソーム、免疫刺激複合体、微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、単層小胞、多重膜小胞、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、エマルソーム、およびポリカチオン性ペプチド、カチオン性ナノエマルジョン、またはこれらの組合せの中に被包する、これらへと結合させる、またはこれらに吸着させる、請求項１から１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記病原体がウイルスであり、前記第１のポリペプチド抗原および前記第２のポリペプチド抗原がウイルス抗原である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記ウイルス抗原が、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）に由来する、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記ウイルス抗原が、ＲＳＶ−Ｆ抗原である、請求項１４に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記ＲＳＶ−Ｆ抗原が、配列番号２５〜４０から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記ウイルス抗原が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記ＣＭＶ抗原が、ｇＢ抗原、ｇＨ抗原、ｇＬ抗原、ｇＭ抗原、ｇＮ抗原、ｇＯ抗原、ＵＬ１２８抗原、ＵＬ１２９抗原、およびＵＬ１３０抗原からなる群より独立に選択される、請求項１７に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
アジュバントをさらに含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
請求項１から１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物と、薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容されるビヒクルとを含む医薬組成物。
【請求項２１】
感染性疾患を処置または予防するための方法であって、感染性疾患の処置または予防を必要とする被験体に、治療有効量の、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項２２】
被験体において免疫応答を誘発するための方法であって、免疫応答の誘発を必要とする被験体に、治療有効量の、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項２３】
被験体にワクチン接種する方法であって、ワクチン接種を必要とする被験体に、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項２４】
（ｉ）病原体に由来する第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む初回刺激組成物と；
（ｉｉ）前記病原体に由来する第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む追加刺激組成物と
を含む、キットであって、
前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとが同じエピトープである、
キット。
【請求項２５】
前記第１のポリペプチド抗原と前記第２のポリペプチド抗原とが実質的に同じである、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記第１のポリペプチド抗原が可溶性ポリペプチドまたは膜アンカー型ポリペプチドであり、前記第２のポリペプチド抗原が可溶性ポリペプチドである、請求項２４または２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記第１のポリペプチド抗原が、融合ポリペプチドである、請求項２４から２６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２８】
前記第２のポリペプチド抗原が、融合ポリペプチドである、請求項２４から２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９】
前記自己複製ＲＮＡが、アルファウイルスに由来するＲＮＡレプリコンである、請求項２４から２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
前記自己複製ＲＮＡ分子が、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項２４から２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１】
前記初回刺激組成物が、カチオン性脂質、リポソーム、コクリエート、ウィロソーム、免疫刺激複合体、微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、単層小胞、多重膜小胞、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、エマルソーム、ポリカチオン性ペプチド、またはカチオン性ナノエマルジョンをさらに含む、請求項２４から３０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３２】
前記ＲＮＡ分子を、カチオン性脂質、リポソーム、コクリエート、ウィロソーム、免疫刺激複合体、微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、単層小胞、多重膜小胞、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、エマルソーム、ポリカチオン性ペプチド、カチオン性ナノエマルジョン、またはこれらの組合せの中に被包する、これらへと結合させる、またはこれらに吸着させる、請求項２４から３１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３３】
前記病原体がウイルスであり、前記第１のポリペプチド抗原および前記第２のポリペプチド抗原がウイルス抗原である、請求項２４から３２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３４】
前記ウイルス抗原が、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）に由来する、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記ウイルス抗原が、ＲＳＶ−Ｆ抗原である、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記ＲＳＶ−Ｆ抗原が、配列番号２５〜４０から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記ウイルス抗原が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する、請求項３０に記載のキット。
【請求項３８】
前記ＣＭＶ抗原が、ｇＢ抗原、ｇＨ抗原、ｇＬ抗原、ｇＭ抗原、ｇＮ抗原、ｇＯ抗原、ＵＬ１２８抗原、ＵＬ１２９抗原、およびＵＬ１３０抗原からなる群より独立に選択される、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記初回刺激組成物、前記追加刺激組成物、またはこれらの両方が、アジュバントを含む、請求項２４から３８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４０】
前記アジュバントが、ＭＦ５９である、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
前記初回刺激組成物、前記追加刺激組成物、またはこれらの両方が、薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容されるビヒクルを含む、請求項２４から４０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４２】
感染性疾患を処置または予防するための方法であって、
（ｉ）感染性疾患の処置または予防を必要とする被験体に、病原体に由来する第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む治療有効量の初回刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップと；
（ｉｉ）その後、前記被験体に、前記病原体に由来する第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む治療有効量の追加刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップと
を包含し、
前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとが同じエピトープである、
方法。
【請求項４３】
被験体において免疫応答を誘発するための方法であって、
（ｉ）免疫応答の誘発を必要とする被験体に、病原体に由来する第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む治療有効量の初回刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップと；
（ｉｉ）その後、前記被験体に、前記病原体に由来する第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む治療有効量の追加刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップと
を包含し、
前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとが同じエピトープである、
方法。
【請求項４４】
被験体にワクチン接種する方法であって、
（ｉ）ワクチン接種を必要とする被験体に、病原体に由来する第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む治療有効量の初回刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップと；
（ｉｉ）その後、前記被験体に、前記病原体に由来する第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む治療有効量の追加刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップと
を包含し、
前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとが同じエピトープである、
方法。
【請求項４５】
前記第１のポリペプチド抗原と前記第２のポリペプチド抗原とが実質的に同じである、請求項４２から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１のポリペプチド抗原が可溶性ポリペプチドまたは膜アンカー型ポリペプチドであり、前記第２のポリペプチド抗原が可溶性ポリペプチドである、請求項４２から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１のポリペプチド抗原が、融合ポリペプチドである、請求項４２から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記第２のポリペプチド抗原が、融合ポリペプチドである、請求項４２から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記自己複製ＲＮＡが、アルファウイルスに由来するＲＮＡレプリコンである、請求項４２から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記自己複製ＲＮＡ分子が、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項４２から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記初回刺激組成物が、カチオン性脂質、リポソーム、コクリエート、ウィロソーム、免疫刺激複合体、微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、単層小胞、多重膜小胞、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、エマルソーム、ポリカチオン性ペプチド、またはカチオン性ナノエマルジョンをさらに含む、請求項４２から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＲＮＡ分子を、カチオン性脂質、リポソーム、コクリエート、ウィロソーム、免疫刺激複合体、微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、単層小胞、多重膜小胞、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、エマルソーム、ポリカチオン性ペプチド、カチオン性ナノエマルジョン、またはこれらの組合せの中に被包する、これらへと結合させる、またはこれらに吸着させる、請求項４２から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記病原体がウイルスであり、前記第１のポリペプチド抗原および前記第２のポリペプチド抗原がウイルス抗原である、請求項４２から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ウイルス抗原が、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）に由来する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ウイルス抗原が、ＲＳＶ−Ｆ抗原である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＲＳＶ−Ｆ抗原が、配列番号２５〜４０から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ウイルス抗原が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＣＭＶ抗原が、ｇＢ抗原、ｇＨ抗原、ｇＬ抗原、ｇＭ抗原、ｇＮ抗原、ｇＯ抗原、ＵＬ１２８抗原、ＵＬ１２９抗原、およびＵＬ１３０抗原からなる群より独立に選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記初回刺激組成物、前記追加刺激組成物、またはこれらの両方が、アジュバントを含む、請求項４２から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記アジュバントが、ＭＦ５９である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記初回刺激組成物、前記追加刺激組成物、またはこれらの両方が、薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容されるビヒクルを含む、請求項４２から６０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１１年７月６日に出願された米国仮出願第６１／５０５，１０５号の利益を主張する。上記出願の全体の内容は、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１２年７月５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＰＡＴ５４５１４．ｔｘｔと名付けられ、９２，６３１バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
核酸ベースのワクチンは、ワクチン接種にとって魅力的な手法である。たとえば抗原をコードするプラスミドＤＮＡによる筋内（ＩＭ）免疫化は、細胞性免疫応答および体液性免疫応答を誘発し、攻撃に対して防御することが可能である。ＤＮＡワクチンは、タンパク質抗原または弱毒化された病原体を使用する従来のワクチンを凌ぐ一定の利点をもたらす。たとえばタンパク質ワクチンと比較して、ＤＮＡワクチンは、その天然のコンフォメーションにおいて適正にフォールドした抗原を作製し、細胞性免疫応答を発生させるのにより有効でありうる。ＤＮＡワクチンはまた、殺滅または弱毒化された病原体と関連する安全性の問題のうちのいくつかを有さない。たとえば殺滅されたウイルス性調製物は、残留生存ウイルスを含有する可能性があり、弱毒化されたウイルスは、病原性表現型へと変異および復帰変異する可能性がある。ＤＮＡワクチンは、一般的に細胞介在性免疫（インターフェロンγを分泌する抗原特異的Ｔ細胞および抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞など）を発生させるのには有効であるが、コードされて発現する抗原に対する抗体を生成させるのにはそれほど有効ではない。
【０００４】
特許文献１は、核酸によりコードされるタンパク質を同時的に投与することにより、核酸ワクチンに対する免疫応答を増強する方法について開示している。２つの成分を、同じ組成物により投与する必要はない。いずれの成分も、免疫応答の誘発相において投与する必要があるが、タンパク質は、核酸により免疫系が刺激されるまでマスキングまたは隠蔽されることが好ましい。いくつかの例では、ワクチンが、裸のＤＮＡと裸のタンパク質抗原とを物理的混合物中に含んだ。他の例では、タンパク質抗原が、裸のＤＮＡと混合された生分解性ポリマー−ミョウバン処方物中で遅延放出用に処方された。
【０００５】
特許文献２は、核酸およびタンパク質抗原を抗原提示細胞へと送達するワクチンについて開示している。核酸は、タンパク質抗原と同じタンパク質をコードしうる。核酸およびタンパク質は、たとえば共有結合的コンジュゲーションにより「複合体化させる」。複合体は、合成のウイルス様粒子として処方することができる。また、リポソーム系を使用しうることも示唆される。
【０００６】
特許文献３は、核酸とそのコードタンパク質との同じ細胞へのリポソーム系を使用する共送達について開示している。ＤＮＡ分子とそのコードタンパク質とは、この２つの実体が、抗原提示細胞に一緒に到達するように、同じリポソームビヒクル内に捕捉され、結果として抗原のタンパク質形態のプロセシングおよび提示が、同じ細胞における抗原のＤＮＡコード形態の発現と共になされる。
【０００７】
特許文献４は、免疫応答を被験体においてもたらすための初回刺激／追加刺激法について開示している。方法は、（ｉ）少なくとも１用量の初回刺激免疫原性組成物を被験体に投与し、病原体に対する一次免疫応答を誘発するステップと；（ｉｉ）追加刺激免疫原性組成物を被験体へと投与して、その投与の２１日以内に病原体に対する既往の防御性免疫応答を誘発するステップとを含む。
【０００８】
特許文献５は、（ｉ）担体粒子へとコーティングされた少なくとも１つのインフルエンザウイルス抗原をコードする核酸配列と、（ｉｉ）逐次投与または共時投与のための補助剤タンパク質とを含むワクチンについて開示している。補助剤タンパク質と核酸分子によりコードされる抗原とは、少なくとも１つの共通のエピトープを共有する。
【０００９】
特許文献６は、ヘルペスウイルスベクターを使用する初回刺激−追加刺激ワクチン接種法、特に、それらの一方がヘルペスウイルスベクターである、２つの異なる非複製型ウイルスベクターを使用する異質的な初回刺激−追加刺激レジメンについて開示している。２つのベクターは、標的抗原または標的疾患と関連する共通のエピトープを共有する。
【００１０】
特許文献７は、免疫応答を初回刺激および追加刺激するための初回刺激組成物および追加刺激組成物の使用について開示している。初回刺激組成物は、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）またはそのエピトープ保有ドメインをコードする核酸分子を含むＤＮＡプラスミドを含む。追加刺激組成物は、インフルエンザワクチンを含む。
【００１１】
非コード型プラスミドＤＮＡは、リポソーム小胞内にペプチドと共に共捕捉されると免疫アジュバント作用を示し（Ｇｕｒｓｅｌ，  Ｍ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９９年）、１７巻：１３７６〜１３８３頁）、ＣｐＧモチーフを有するＤＮＡは、裸のＤＮＡおよびペプチドワクチンに対してアジュバント効果を及ぼす（Ｋｌｉｎｍａｎ，  Ｄ．  Ｍ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９９年）、１７巻：１９〜２５頁）ことが公知である。
【００１２】
ＤＮＡベースのワクチンの安全性に関しては、憂慮がなされている。導入されたＤＮＡ分子は、宿主ゲノムへと組み込まれる可能性がある、またはそれらの多様な組織への分布に起因して、望ましくない持続的な抗原の発現をもたらしうるであろう。加えて、ＤＮＡウイルスのあるものはまた、ＤＮＡ分子を送達するのにも使用されている。それらの感染性特性のために、このようなウイルスは、きわめて高いトランスフェクション率を達成する。使用されるウイルスは、トランスフェクトされた細胞における機能的感染性粒子の形成を防止するために、遺伝子的に修飾される。しかし、これらの注意にもかかわらず、たとえば組換えイベントの可能性に起因して、導入された遺伝子およびウイルス性遺伝子の制御不能な増殖の危険性を排除することは可能でない。これはまた、ＤＮＡがたとえば組換えにより宿主細胞ゲノムの無傷の遺伝子へと挿入される危険性も伴い、その帰結として、宿主遺伝子が、変異し、したがって、完全にもしくは部分的に不活化される場合もあり、または誤情報がもたらされる場合もある。言い換えれば、細胞にとってきわめて重要な宿主遺伝子産物の合成が完全に抑制される場合もあり、または代替的に、改変された遺伝子産物もしくは不適正な遺伝子産物が発現する場合もある。
【００１３】
抗原またはその派生物をコードするＲＮＡ分子もまた、ワクチンとして使用することができる。ＲＮＡワクチンは、ＤＮＡワクチンと比較してある利点をもたらす。しかし、ＲＮＡベースのワクチンに注がれてきた関心は、ＤＮＡベースのワクチンの場合と比較して比較的小さかった。ＲＮＡは、治療剤またはワクチンとして投与されると、ヌクレアーゼによる分解に対する感受性が高い。加えて、ＲＮＡは、細胞へと能動的に輸送されない。たとえばＶａｊｄｙ，  Ｍ．ら、「Ｍｕｃｏｓａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−，  ＤＮＡ−  ａｎｄ  ＲＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００４年、８２巻（６号）：６１７〜２７頁を参照されたい。
【００１４】
ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）とは、細菌、真菌、原虫、およびウイルスに由来する病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰＳ）に結合し、侵入する病原体に対する防御の最前線として作用するパターン認識受容体の群である。ヒト、マウス、および他の哺乳動物種では、多くのＴＬＲが同定されている。ＤＮＡ分子（細菌性ＤＮＡまたはウイルス性ＤＮＡなど）がＴＬＲ９により認識されるのに対し、ＲＮＡ分子（一本鎖ウイルス性ＲＮＡなど）は、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８により認識される。
【００１５】
特許文献８は、抗原およびアルファウイルスベースのアジュバントを投与することにより免疫応答をもたらす方法について開示している。方法は、（＋）ｓｓＲＮＡウイルスであるアルファウイルスが、抗原を提示しないまたはウイルスにより発現させなくとも、抗原に対する免疫応答を増強するためのアジュバントとして作用しうることの発見に基づいている。アルファウイルス粒子は、リポソーム系により送達することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際公開第９９／３０７３３号
【特許文献２】国際公開第９７／２８８１８号
【特許文献３】米国特許第７，６０４，８０３号明細書
【特許文献４】国際公開第２００９／１５６８５２号
【特許文献５】国際公開第２００９／０７４８６１号
【特許文献６】国際公開第２００６／０６１６４３号
【特許文献７】国際公開第２０１０／０３６９４８号
【特許文献８】米国特許第７，８６２，８２９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
タンパク質サブユニットワクチンおよびＲＮＡワクチンなどの核酸ワクチンの有効性を改善する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本明細書において本発明について記載するのに使用される特定の用語については、本明細書の第６節で定義および説明する。
【００１９】
本発明は、ＲＮＡ成分とポリペプチド成分とを含む免疫原性組成物に一般的に関する。２つの異なる形態にある抗原エピトープ（病原体に由来する第１のエピトープであって、ＲＮＡによりコードされる形態にあるエピトープ；および同じ病原体に由来する第２のエピトープであって、ポリペプチド形態にあるエピトープ）を送達する免疫原性組成物は、病原体に対する免疫応答を、ＲＮＡ単独またはポリペプチド単独による免疫化と比較して増強しうる。第１のエピトープと第２のエピトープとは、同じエピトープであることが好ましい。
【００２０】
本発明はまた、逐次投与のためのＲＮＡベースの初回刺激組成物およびポリペプチドベースの追加刺激組成物を含むキットにも関する。キットは、たとえば病原体に対する免疫応答を発生させるための「ＲＮＡによる初回刺激、タンパク質による追加刺激」の免疫化レジメンに適する。
【００２１】
本発明はまた、ＲＮＡ分子とポリペプチド分子とを共送達（共投与）することにより、感染性疾患を処置もしくは予防するための方法、免疫応答を誘発するための方法、または被験体にワクチン接種する方法にも関する。
【００２２】
本発明はまた、ＲＮＡ分子とポリペプチド分子とを逐次投与（初回刺激−追加刺激）することにより、感染性疾患を処置もしくは予防するための方法、免疫応答を誘発するための方法、または被験体にワクチン接種する方法にも関する。
【００２３】
一態様では、本発明は、（ｉ）第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子と；（ｉｉ）第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原とを含み；第１のエピトープと第２のエピトープとが同じ病原体に由来するエピトープである、免疫原性組成物を提供する。第１のエピトープと第２のエピトープとは、同じエピトープでありうる。第１のエピトープと第２のエピトープとは、異なるエピトープでありうる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド抗原と第２のポリペプチド抗原とが実質的に同じである。
【００２５】
第１のポリペプチド抗原は、可溶性ポリペプチドまたは膜アンカー型ポリペプチドであることが可能であり、第２のポリペプチド抗原は、可溶性ポリペプチドでありうる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド抗原が、異なる病原体に由来する第３のエピトープをさらに含む融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド抗原が、異なる病原体に由来する第３のエピトープをさらに含む融合ポリペプチドである。第１のエピトープと第２のエピトープとは、病原体の同じ亜種に由来するエピトープでありうる。
【００２７】
自己複製ＲＮＡは、アルファウイルスに由来するＲＮＡレプリコンでありうる。自己複製ＲＮＡ分子には、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが含まれうる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、免疫原性組成物が、カチオン性脂質、リポソーム、コクリエート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）、ウィロソーム、免疫刺激複合体、微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、単層小胞、多重膜小胞、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、エマルソーム（ｅｍｕｌｓｏｍｅ）、ポリカチオン性ペプチド、またはカチオン性ナノエマルジョンをさらに含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子を、カチオン性脂質、リポソーム、コクリエート、ウィロソーム、免疫刺激複合体、微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、単層小胞、多重膜小胞、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、エマルソーム、ポリカチオン性ペプチド、カチオン性ナノエマルジョン、またはこれらの組合せの中に被包する、これらへと結合させる、またはこれらに吸着させる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、病原体がウイルスであり、第１のポリペプチド抗原と第２のポリペプチド抗原とがウイルス抗原である。ウイルス抗原は、ＲＳＶ−Ｆ抗原でありうる。ＲＳＶ−Ｆ抗原は、配列番号２５〜４０から選択されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００３１】
ウイルス抗原は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来しうる。いくつかの実施形態では、ＣＭＶ抗原が、ｇＢ抗原、ｇＨ抗原、ｇＬ抗原、ｇＭ抗原、ｇＮ抗原、ｇＯ抗原、ＵＬ１２８抗原、ＵＬ１２９抗原、およびＵＬ１３０抗原からなる群より独立に選択される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、免疫原性組成物が、アジュバントをさらに含む。アジュバントは、ＭＦ５９でありうる。
【００３３】
本発明はまた、本明細書で記載される免疫原性組成物と、薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容されるビヒクルとを含む医薬組成物にも関する。
【００３４】
本発明はまた、感染性疾患を処置または予防するための方法であって、それを必要とする被験体に、治療有効量の本明細書で記載される組成物を投与するステップを含む方法にも関する。
【００３５】
本発明はまた、被験体において免疫応答を誘発するための方法であって、それを必要とする被験体に、治療有効量の本明細書で記載される組成物を投与するステップを含む方法にも関する。
【００３６】
本発明はまた、被験体にワクチン接種するための方法であって、それを必要とする被験体に、本明細書で記載される組成物を投与するステップを含む方法にも関する。
【００３７】
本発明はまた、（ｉ）病原体に由来する第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む初回刺激組成物と；（ｉｉ）病原体に由来する第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む追加刺激組成物とを含むキットにも関する。第１のポリペプチド抗原と第２のポリペプチド抗原とは、実質的に同じでありうる。第１のポリペプチド抗原は、可溶性ポリペプチドまたは膜アンカー型ポリペプチドであることが可能であり、第２のポリペプチド抗原は、可溶性ポリペプチドでありうる。第１のポリペプチド抗原は、融合ポリペプチドでありうる。第２のポリペプチド抗原は、融合ポリペプチドでありうる。自己複製ＲＮＡは、アルファウイルスに由来するＲＮＡレプリコンでありうる。自己複製ＲＮＡ分子には、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが含まれうる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、キットの初回刺激組成物が、カチオン性脂質、リポソーム、コクリエート、ウィロソーム、免疫刺激複合体、微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、単層小胞、多重膜小胞、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、エマルソーム、ポリカチオン性ペプチド、またはカチオン性ナノエマルジョンをさらに含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、キットのＲＮＡ分子を、カチオン性脂質、リポソーム、コクリエート、ウィロソーム、免疫刺激複合体、微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、単層小胞、多重膜小胞、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、エマルソーム、ポリカチオン性ペプチド、カチオン性ナノエマルジョン、またはこれらの組合せの中に被包する、これらへと結合させる、またはこれらに吸着させる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、キットの病原体がウイルスであり、第１のポリペプチド抗原と第２のポリペプチド抗原とがウイルス抗原である。ウイルス抗原は、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）に由来しうる。ウイルス抗原は、ＲＳＶ−Ｆ抗原でありうる。好ましくは、ＲＳＶ−Ｆ抗原は、配列番号２５〜４０から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＭＶ抗原が、ｇＢ抗原、ｇＨ抗原、ｇＬ抗原、ｇＭ抗原、ｇＮ抗原、ｇＯ抗原、ＵＬ１２８抗原、ＵＬ１２９抗原、およびＵＬ１３０抗原からなる群より独立に選択される。
【００４２】
いくつかの実施形態では、キットの初回刺激組成物、キットの追加刺激組成物、またはこれらの両方が、アジュバントを含む。アジュバントは、ＭＦ５９でありうる。初回刺激組成物、追加刺激組成物、またはこれらの両方には、薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容されるビヒクルが含まれうる。
【００４３】
本発明はまた、感染性疾患を処置または予防するための方法であって、（ｉ）それを必要とする被験体に、病原体に由来する第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む治療有効量の初回刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップと；その後被験体に、前記病原体に由来する第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む治療有効量の追加刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップとを含み、前記第１のエピトープと第２のエピトープとが同じエピトープである方法にも関する。
【００４４】
本発明はまた、被験体において免疫応答を誘発するための方法であって、（ｉ）それを必要とする被験体に、病原体に由来する第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む治療有効量の初回刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップと；その後被験体に、前記病原体に由来する第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む治療有効量の追加刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップとを含み、前記第１のエピトープと第２のエピトープとが同じエピトープである方法にも関する。
【００４５】
本発明はまた、被験体にワクチン接種する方法であって、それを必要とする被験体に、病原体に由来する第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む治療有効量の初回刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップと；その後被験体に、前記病原体に由来する第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む治療有効量の追加刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップとを含み、前記第１のエピトープと第２のエピトープとが同じエピトープである方法にも関する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド抗原と第２のポリペプチド抗原とが実質的に同じである。
【００４７】
第１のポリペプチド抗原は、可溶性ポリペプチドまたは膜アンカー型ポリペプチドであることが可能であり、第２のポリペプチド抗原は、可溶性ポリペプチドでありうる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド抗原が、異なる病原体に由来する第３のエピトープをさらに含む融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド抗原が、異なる病原体に由来する第３のエピトープをさらに含む融合ポリペプチドである。第１のエピトープと第２のエピトープとは、病原体の同じ亜種に由来するエピトープでありうる。
【００４９】
自己複製ＲＮＡは、アルファウイルスに由来するＲＮＡレプリコンでありうる。自己複製ＲＮＡ分子には、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが含まれうる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、免疫原性組成物が、カチオン性脂質、リポソーム、コクリエート、ウィロソーム、免疫刺激複合体、微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、単層小胞、多重膜小胞、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、エマルソーム、ポリカチオン性ペプチド、またはカチオン性ナノエマルジョンをさらに含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子を、カチオン性脂質、リポソーム、コクリエート、ウィロソーム、免疫刺激複合体、微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、単層小胞、多重膜小胞、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、エマルソーム、ポリカチオン性ペプチド、カチオン性ナノエマルジョン、またはこれらの組合せの中に被包する、これらへと結合させる、またはこれらに吸着させる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、病原体がウイルスであり、第１のポリペプチド抗原と第２のポリペプチド抗原とがウイルス抗原である。ウイルス抗原は、ＲＳＶ−Ｆ抗原でありうる。好ましくは、ＲＳＶ−Ｆ抗原は、配列番号２５〜４０から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５３】
ウイルス抗原は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来しうる。いくつかの実施形態では、ＣＭＶ抗原が、ｇＢ抗原、ｇＨ抗原、ｇＬ抗原、ｇＭ抗原、ｇＮ抗原、ｇＯ抗原、ＵＬ１２８抗原、ＵＬ１２９抗原、およびＵＬ１３０抗原からなる群より独立に選択される。
【００５４】
いくつかの実施形態では、免疫原性組成物が、アジュバントをさらに含む。アジュバントは、ＭＦ５９でありうる。
【００５５】
本発明はまた、本明細書で記載される免疫原性組成物と、薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容されるビヒクルとを含む医薬組成物にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、３用量の免疫化レジメンであって、ｇＨ／ｇＬを発現させるＶＲＰ、緑色蛍光タンパク質を発現させるＶＲＰ（ＶＲＰ−Ｇ）、および精製ｇＨ／ｇＬを、多様な順序で投与した、または混合および共投与した免疫化レジメンを介して誘発される中和抗体力価を示すグラフである（実施例ＶＩ、表ＶＩ−１を参照されたい）。注解：ＶＲＰ＝ｇＨ／ｇＬを発現させるＶＲＰ、ＶＲＰ−Ｇ＝緑色蛍光タンパク質を発現させるＶＲＰ、ＰＢＳ＝ＰＢＳ中のｇＨｓｏｌ／ｇＬサブユニット、ＭＦ５９＝ＭＦ５９中のｇＨｓｏｌ／ｇＬ、Ｍｉｘ＝ｇＨ／ｇＬ  ＶＲＰ＋ｇＨｓｏｌ／ｇＬ（アジュバントなし）、Ｍｉｘ−Ｇ＝ＶＲＰ−Ｇ＋ｇＨｓｏｌ／ｇＬ（アジュバントなし）。
【図２】図２は、図１および実施例ＶＩ、表ＶＩ−１において記載される用量／免疫化レジメンを使用する免疫化後４ｗｐ３（６９日目）における、サイトカイン陽性の抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の百分率を示すグラフである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ｇＨｓｏｌ／ｇＬタンパク質により、脾臓細胞を再刺激した。
【図３】図３は、図１および実施例ＶＩ、表ＶＩ−１において記載される用量／免疫化レジメンを使用する免疫化後４ｗｐ３（６９日目）における、サイトカイン陽性の抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の百分率を示すグラフである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ｇＨペプチドプール２により、脾臓細胞を再刺激した。
【図４】図４は、自己増幅ＲＮＡおよびサブユニットが、単独でまたは組合せで、高度な中和抗体力価を誘発することを示すグラフである。自己増幅ＲＮＡは、ＬＮＰ内に被包した。自己増幅ＲＮＡおよびサブユニットの用量は、１μｇであり、混合用量は、１＋１μｇであった。中和アッセイ：補体の存在下におけるＡＲＰＥ−１９細胞のＶＲ１８１４感染。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、（Ａ）３ｗｐ３（６４日目）および（Ｂ）４ｗｐ３（７１日目）における、精製ｇＨ／ｇＬおよび五量体サブユニットを使用するワクチン接種に対するＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を示すグラフである。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、（Ａ）３ｗｐ３（６４日目）および（Ｂ）４ｗｐ３（７１日目）における、精製五量体複合体を使用するワクチン接種に対するＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を示すグラフである。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、（Ａ）３ｗｐ３（６４日目）および（Ｂ）４ｗｐ３（７１日目）における、精製五量体複合体を使用するワクチン接種に対するＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示すグラフである。図７Ａおよび７Ｂは、（Ａ）３ｗｐ３（６４日目）および（Ｂ）４ｗｐ３（７１日目）における、精製五量体複合体を使用するワクチン接種に対するＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示すグラフである。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、（Ａ）３ｗｐ３（６４日目）および（Ｂ）４ｗｐ３（７１日目）における、ｇＨペプチドプール２を使用するワクチン接種に対するＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示すグラフである。
【図９】図９は、ＲＳＶ−Ｆ−ＲＮＡワクチンによる初回刺激に続き、ＲＳＶ−Ｆサブユニットワクチンによる追加刺激を投与されたＢａｌｂ／ｃマウスにおける高度な中和抗体力価を示すグラフである。マウスには、０、２１、および４４日目に筋内にワクチンを投与し、３５および５７日目に採血した。
【図１０】図１０は、ＲＳＶ−Ｆ−ＲＮＡワクチンを投与されたＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＦ特異的ＩｇＧ２ａ：Ｆ特異的ＩｇＧ１比を示すグラフである。Ｆ−ＲＮＡワクチンは、Ｔｈ１免疫応答の開始時に強力であり、これは、Ｆサブユニットワクチンによる追加刺激後にも維持される。マウスには、０、２１、および４４日目に筋内ワクチン接種を行い、３５および５７日目に採血した。マウスの脾臓は、５７日目に摘出した。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃは、アジュバントの、サブユニットによる追加刺激に対する効果を示すグラフである。極低用量のＲＮＡ（３００ｐｇ）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける測定可能なＲＳＶ特異的抗体応答は誘発しない（Ａ）が、サブユニットワクチンによる追加刺激後において、Ｔｈ１に偏った表現型（ＩｇＧ２ａに偏っているが、それほどＩＬ−５に偏っているわけではない）を開始させるには十分である（ＢおよびＣ）。サブユニットワクチンのアジュバント（なし、ミョウバン、またはＭＦ５９）は、ＲＮＡワクチンによる初回刺激、サブユニットワクチンによる追加刺激を介して誘発される中和抗体力価の大きさにはほとんど影響を及ぼさない。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
１．概観
ＲＮＡワクチンに特有の１つの利点は、ＲＮＡ分子が自己アジュバント作用性であることである。たとえば本発明者らは、ＲＮＡ分子（リポソーム中で処方された）が、マウスモデルへの筋内注射後２４時間以内に、ＩＦＮ−α、ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ−１０）、ＩＬ−６、ＫＣ（ＣＸＣＬ１）、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＭＣＰ−１、およびＭＩＰ−αを含めた複数の血清サイトカインを誘発することを観察した。これらのサイトカインは、ＲＮＡ分子によりコードされたタンパク質抗原に対する、宿主による免疫応答を増強しうる。
【００５８】
ＲＮＡ分子とポリペプチド分子とを組み合わせるワクチン接種戦略（たとえばＲＮＡ成分とタンパク質成分とを有する免疫原性組成物の投与；または「ＲＮＡによる初回刺激、タンパク質による追加刺激」などの逐次投与レジメン）は、複数の利益をもたらす。たとえばポリペプチド分子が宿主における全抗体力価を増強しうるのに対し、ＲＮＡ分子は、その天然構造における抗原を認識する抗体の産生を増強しうる。したがって、これらの組合せは、全抗体に対する機能的抗体（たとえば中和抗体）の比を増強した抗体応答を誘発しうる。さらに、ＲＮＡ分子が、１型ヘルパーＴ細胞応答（Ｔｈ１、ＩＦＮ−γｈｉ、ＩＬ−４ｌｏ）を促進するのに対し、タンパク質分子は、２型ヘルパーＴ細胞応答を促進する。したがって、ＲＮＡ分子とポリペプチド分子とを組み合わせることにより、Ｔ細胞介在性免疫ならびに体液性免疫の両方を促進することができる。加えて、ＲＮＡ分子は、リポソームまたは水中油エマルジョンなどの送達系を使用して細胞へと送達することができる。リポソームおよび水中油エマルジョンはまた、アジュバント活性を有することも公知である。したがって、送達系のアジュバント活性と併せたＲＮＡのアジュバント活性が相乗作用的に作用して、抗原に対する免疫応答を増強しうる。最後に、ポリペプチド抗原を、同じ病原体に由来する異なる抗原をコードするＲＮＡと組み合わせることにより、多価性も達成することができる。
【００５９】
（Ａ）ＲＮＡ分子とポリペプチド分子との共投与
一態様では、本発明は、ＲＮＡ成分とポリペプチド成分とを含む免疫原性組成物に関する。抗原エピトープを２つの異なる形態（病原体に由来する第１のエピトープであって、ＲＮＡによりコードされる形態にあるエピトープ；および同じ病原体に由来する第２のエピトープであって、ポリペプチド形態にあるエピトープ）で送達する免疫原性組成物は、病原体に対する免疫応答を増強しうる。
【００６０】
好ましくは、第１のエピトープと第２のエピトープとが同じエピトープである（すなわちＲＮＡによりコードされる形態にある第１の抗原と、ポリペプチド形態にある第２の抗原とが、少なくとも１つの共通のエピトープを共有する）。たとえば免疫原性組成物のＲＮＡ成分は、免疫原性組成物のポリペプチド成分と実質的に同じタンパク質をコードしうる（たとえばＲＮＡ分子によりコードされるアミノ酸配列と免疫原性組成物のポリペプチド成分とは、短い方の抗原の長さにわたり少なくとも約９０％の配列同一性を共有する）。代替的に２つの抗原は、（１つまたは複数の）同じ免疫優性エピトープなど、同じエピトープを有する。
【００６１】
本明細書で記載される通り、本発明者らは、（ｉ）ウイルス抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子と、（ｉｉ）ポリペプチド形態にあるウイルス抗原とを含む免疫原性組成物の有効性を評価した。これらの研究において使用されたウイルス抗原には、ＨＩＶ  ｇｐ１４０抗原およびＲＳＶ−Ｆ抗原が含まれる。結果は、ウイルス抗原をコードするＲＮＡ分子を、ポリペプチド形態にあるウイルス抗原と共に共投与することにより、抗原に対する免疫応答が強化され、ＲＮＡ分子単独の投与と比較した抗体力価の上昇がもたらされることを裏付けた。加えて、ＲＮＡによりコードされる形態にあるウイルス抗原とポリペプチド形態にあるウイルス抗原とを共投与することにより、ＩｇＧ１からＩｇＧ２ａへのアイソタイプの切換えが増強されることから、ポリペプチド抗原単独の投与と比較してよりバランスのとれたＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ亜型プロファイルがもたらされた。最後に、本明細書で開示される研究はまた、ＲＮＡによりコードされる形態にある抗原およびポリペプチド形態にある抗原を投与することにより、ＣＤ４＋  Ｔ細胞介在性免疫およびＣＤ８＋  Ｔ細胞介在性免疫が増強されうることも示す。
【００６２】
本明細書で記載される免疫原性組成物は、宿主による病原体に対する免疫応答を誘発または増強するためのワクチンとして処方することができる。本明細書ではまた、本発明の免疫原性組成物を使用して、それを必要とする被験体における免疫応答を誘発または増強する方法も提供される。
【００６３】
（Ｂ）初回刺激−追加刺激
別の態様では、本発明は、（ｉ）第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む初回刺激組成物と、（ｉｉ）第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む追加刺激組成物とを含み；前記第１のエピトープと第２のエピトープとが同じエピトープである（すなわちＲＮＡによりコードされる形態にある第１の抗原と、ポリペプチド形態にある第２の抗原とが、少なくとも１つの共通のエピトープを共有する）キットに関する。キットは、初回刺激組成物および追加刺激組成物の逐次投与のために使用することができる。
【００６４】
別の態様では、本発明は、感染性疾患を処置もしくは予防するための方法、被験体において免疫応答を誘発するための方法、または被験体にワクチン接種する方法であって、（ｉ）それを必要とする被験体に、第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む治療有効量の初回刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップと、（ｉｉ）その後被験体に、第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む治療有効量の追加刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップとを含み；前記第１のエピトープと第２のエピトープとが同じエピトープである（すなわちＲＮＡによりコードされる形態にある第１の抗原と、ポリペプチド形態にある第２の抗原とが、少なくとも１つの共通のエピトープを共有する）方法に関する。
【００６５】
本明細書で記載される通り、本発明者らは、「ＲＮＡによる初回刺激、タンパク質による追加刺激」のワクチン接種戦略を評価した。これらの研究は、「タンパク質による初回刺激、タンパク質による追加刺激」の戦略と比較して、たとえば抗体力価の増大、よりバランスのとれたＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ亜型プロファイル、ウイルス粒子による免疫応答の誘発と類似したＴＨ１型のＣＤ４＋  Ｔ細胞介在性免疫応答の誘発、および非中和抗体の産生の低減を含め、「ＲＮＡによる初回刺激、タンパク質による追加刺激」の戦略の複数の利益を裏付けている。
【００６６】
好ましくは、初回刺激組成物中のＲＮＡ分子が、追加刺激組成物中のポリペプチド分子と実質的に同じタンパク質をコードする（たとえば初回刺激組成物中のＲＮＡ分子によりコードされるアミノ酸配列と、追加刺激組成物中のポリペプチドとは、短い方の抗原の長さにわたり少なくとも約９０％の配列同一性を共有する）。代替的に２つの抗原は、（１つまたは複数の）同じ免疫優性エピトープなど、同じエピトープを有する。
【００６７】
本明細書で記載される初回刺激組成物と追加刺激組成物とは、病原体に対する免疫応答を誘発または増強するためのワクチンとして処方することができる。本明細書ではまた、本発明の初回刺激組成物および追加刺激組成物を使用して、それを必要とする被験体における免疫応答を誘発または増強する方法も提供される。
【００６８】
本発明はまた、治療における使用のための、本明細書で記載される免疫原性組成物、医薬組成物、またはキット、および免疫応答を増強するまたは生成させるための医薬の製造のための、本明細書で記載される免疫原性組成物、医薬組成物、またはキットの使用にも関する。
【００６９】
２．免疫原性組成物
一態様では、本発明は、ＲＮＡ成分とポリペプチド成分とを含む免疫原性組成物を提供する。免疫原性組成物は、（ｉ）第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子（ＲＮＡ成分）と；（ｉｉ）第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原（ポリペプチド成分）とを含み；ここで、前記第１のエピトープと第２のエピトープとは、同じ病原体に由来するエピトープである。
【００７０】
第１のエピトープと第２のエピトープとは、同じエピトープであってもよく、または所望の場合、異なるエピトープであってもよい。第１のエピトープと第２のエピトープとは、病原体の同じポリペプチドに由来してもよく、または病原体の異なるポリペプチドに由来してもよい。第１のエピトープと第２のエピトープとはまた、変異性変動が限定されているエピトープまたは変異性変動が見られないエピトープなど、病原体の異なる株または亜種の間で高度に保存されたエピトープでもありうる。たとえば第１のエピトープと第２のエピトープとは、同じ病原体に由来する異なるエピトープでありうる（たとえば第１のエピトープはＲＳＶ  Ｆに由来し、第２のエピトープはＲＳＶ  Ｇに由来する）。
【００７１】
ある実施形態では、第１のポリペプチド抗原と第２のポリペプチド抗原とは、病原体に由来する同じタンパク質に由来する。たとえばＲＮＡ分子は、病原体に由来する全長タンパク質（たとえばウイルスタンパク質）またはその抗原性部分であって、ＲＮＡによりコードされるウイルスタンパク質の発現、産生、精製、もしくは検出を容易としうる異種配列と任意選択により融合させた全長タンパク質またはその抗原性部分を含む第１のポリペプチド抗原をコードしうる。第２のポリペプチド抗原は、全長タンパク質またはその抗原性部分であって、第２のポリペプチド抗原の発現、産生、精製、もしくは検出を容易としうる異種配列（たとえばＨｉｓタグ）と任意選択により融合させた全長タンパク質またはその抗原性部分を含む組換えタンパク質でありうる。代替的に第１のポリペプチド抗原、第２のポリペプチド抗原、またはこれらの両方は、病原体に由来するタンパク質の変異改変体（たとえば（１つまたは複数の）アミノ酸置換、（１つまたは複数の）アミノ酸付加、または（１つまたは複数の）アミノ酸欠失を有するウイルスタンパク質）を含みうる。
【００７２】
好ましくは、第１のポリペプチド抗原と第２のポリペプチド抗原との間のアミノ酸配列の同一性は、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％である。ある実施形態では、第１のポリペプチド抗原と第２のポリペプチド抗原とが同じ抗原である。
【００７３】
ある実施形態では、第１のポリペプチド抗原と第２のポリペプチド抗原とが、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの共通のＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを共有する。ある実施形態では、第１のポリペプチド抗原と第２のポリペプチド抗原とが、少なくとも１つの共通の免疫優性エピトープを有する。ある実施形態では、第１のポリペプチド抗原と第２のポリペプチド抗原とが、（１つまたは複数の）同じ免疫優性エピトープ、または同じ主要免疫優性エピトープを有する。
【００７４】
ある実施形態では、第１のポリペプチド抗原が、可溶性ポリペプチドまたは膜アンカー型ポリペプチドであり、第２のポリペプチド抗原が、可溶性ポリペプチドである。たとえば野生型ウイルスタンパク質が膜貫通型表面タンパク質である場合、ＲＮＡ分子が、第１の（膜アンカー型）抗原を産生する全長コード配列を含みうるのに対し、ウイルスタンパク質の膜貫通領域を欠失させて、第２のポリペプチド抗原（これは可溶性である）を産生させることができる。
【００７５】
ある実施形態では、第１の抗原または第２の抗原が、第３のエピトープをさらに含む融合ポリペプチドである。第３のエピトープは、異なる病原体に由来してもよく、または同じ病原体の異なる抗原に由来してもよい。
【００７６】
Ａ．抗原
本明細書で記載される免疫原性組成物中に包含させるのに適した抗原（ＲＮＡによりコードされる形態にあるまたはポリペプチド形態にある）は、あらゆる病原体（たとえば細菌性病原体、ウイルス性病原体、真菌性病原体、原虫病原体、または多細胞寄生虫性病原体）、アレルゲン、または腫瘍に由来しうる。
【００７７】
ある実施形態では、第１の抗原および第２の抗原が、ウイルス性病原体に由来する。例示的なウイルス性病原体には、たとえばＲＳウイルス（ＲＳＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デングウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ；たとえばＨＳＶ−Ｉ、ＨＳＶ−ＩＩ）、伝染性軟属腫ウイルス、ワクシニアウイルス、天然痘ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ライノウイルス、エンテロウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス（たとえばＳＡＲＳ）、インフルエンザウイルス（ｆｌｕ）、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、フラビウイルス、レトロウイルス、アレナウイルス（たとえばリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、フニンウイルス、マクポウイルス、グアナリトウイルス、またはラッサ熱ウイルス）、ノロウイルス、黄熱病ウイルス、狂犬病ウイルス、フィロウイルス（たとえばエボラウイルスまたはマールブルク（ｍａｒｂｕｇ）ウイルス）、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、モルビリウイルス（たとえば麻疹ウイルス）、ルブラウイルス（たとえばムンプスウイルス）、ルビウイルス（たとえば風疹ウイルス）、ウシウイルス性下痢ウイルスが含まれる。たとえば抗原は、ＣＭＶ糖タンパク質であるｇＨ、もしくはｇＬ；パルボウイルス；ＨＩＶ糖タンパク質であるｇｐ１２０もしくはｇｐ１４０、ＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇ、ｐｏｌ；またはＲＳＶ−Ｆ抗原などでありうる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、第１の抗原および第２の抗原が、伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）、サケ膵臓病ウイルス（ＳＰＤＶ）、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、アメリカナマズウイルス（ＣＣＶ）、魚類リンホシスチス病ウイルス（ｆｉｓｈ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）（ＦＬＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、コイヘルペスウイルス、サケピコルナ様ウイルス（また、大西洋サケのピコルナ様ウイルスとしても公知である）、陸封ザケウイルス（ｌａｎｄｌｏｃｋｅｄ  ｓａｌｍｏｎ  ｖｉｒｕｓ）（ＬＳＶ）、大西洋サケロタウイルス（ＡＳＲ）、マスイチゴ病ウイルス（ｔｒｏｕｔ  ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＳＤ）、ギンザケ腫瘍ウイルス（ＣＳＴＶ）、またはウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）など、魚類に感染するウイルスに由来する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、第１の抗原および第２の抗原が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、またはＰ．ｏｖａｌｅなどのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ属からの寄生虫に由来する。したがって、本発明は、マラリアに対する免疫化のために使用することができる。いくつかの実施形態では、第１の抗原および第２の抗原が、Ｃａｌｉｇｉｄａｅ科からの寄生虫、特にＬｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ属およびＣａｌｉｇｕｓ属からの寄生虫、たとえばＬｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓまたはＣａｌｉｇｕｓ  ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉなどのウオジラミ（ｓｅａ  ｌｉｃｅ）に由来する。
【００８０】
ある実施形態では、第１の抗原および第２の抗原が、細菌性病原体に由来する。例示的な細菌性病原体には、たとえばＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａおよびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓを含めたＮｅｉｓｓｅｒｉａ種；Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓを含めたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種；Ｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、種別不明のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉを含めたＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種；また、Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとしても公知のＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓを含めたＭｏｒａｘｅｌｌａ種；Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、およびＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａを含めたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ種；Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを含めたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種；Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａを含めたＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ種；腸管毒性Ｅ．ｃｏｌｉ、腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ、腸管病原性Ｅ．ｃｏｌｉを含めたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種；Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａを含めたＶｉｂｒｉｏ種；Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉｉを含めたＳｈｉｇｅｌｌａ種；Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ、Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含めたＹｅｒｓｉｎｉａ種；Ｃ．ｊｅｊｕｎｉおよびＣ．ｃｏｌｉを含めたＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種；Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓを含めたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含めたＬｉｓｔｅｒｉａ種；Ｈ．ｐｙｌｏｒｉを含めたＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ種；Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含めたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種；Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを含めたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種；Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍを含めたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種；Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを含めたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種；Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓを含めたＢａｃｉｌｌｕｓ種；Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅを含めたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種；Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ、Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ、Ｂ．ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ、Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉを含めたＢｏｒｒｅｌｉａ種；Ｅ．ｅｑｕｉおよびヒト顆粒球エーリキア症の病原菌を含めたＥｈｒｌｉｃｈｉａ種；Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉを含めたＲｉｃｋｅｔｔｓｉａ種；Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃ．ｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉを含めたＣｈｌａｍｙｄｉａ種；Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓを含めたＬｅｐｔｓｉｒａ種；Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅを含めたＴｒｅｐｏｎｅｍａ種が含まれる。
【００８１】
ある実施形態では、第１の抗原および第２の抗原が、真菌性病原体（たとえば酵母またはかびの病原体）に由来する。例示的な真菌性病原体には、たとえばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａ．ｆｌａｖｕｓ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｐｏｓａｄａｓｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、およびＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉが含まれる。
【００８２】
ある実施形態では、第１の抗原および第２の抗原が、原虫病原体に由来する。例示的な原虫病原体には、たとえばＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉおよびＳｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓが含まれる。
【００８３】
ある実施形態では、第１の抗原および第２の抗原が、多細胞寄生虫性病原体に由来する。例示的な多細胞寄生虫性病原体には、たとえば吸虫類（吸虫）、条虫（サナダムシ）、線虫（回虫）、および節足動物が含まれる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、第１の抗原および第２の抗原が、花粉アレルゲン（樹木花粉アレルゲン、薬草花粉アレルゲン、雑草花粉アレルゲン、および草花粉アレルゲン）；昆虫アレルゲンまたはクモ類アレルゲン（吸入性アレルゲン、唾液アレルゲン、および毒液アレルゲン、たとえばダニアレルゲン、ゴキブリアレルゲン、およびコバエアレルゲン、ｈｙｍｅｎｏｐｔｈｅｒａ毒液アレルゲン）；動物体毛アレルゲンおよび動物ふけアレルゲン（たとえばイヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウスなどからの）；および食物アレルゲン（たとえばグリアジン）などのアレルゲンに由来する。樹木、草および薬草からの重要な花粉アレルゲンは、分類学上のブナ目、モクセイ科（Ｏｌｅａｌｅｓ）、マツ目、およびスズカケノキ科、以下を含むがこれらに限定されない、カバノキ（Ｂｅｔｕｌａ）、ハンノキ（Ａｌｎｕｓ）、ハシバミ（Ｃｏｒｙｌｕｓ）、シデ（Ｃａｒｐｉｎｕｓ）およびオリーブ（Ｏｌｅａ）、ヒマラヤスギ（ＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａおよびＪｕｎｉｐｅｒｕｓ）、スズカケノキ（Ｐｌａｔａｎｕｓ）、Ｌｏｌｉｕｍ属、Ｐｈｌｅｕｍ属、Ｐｏａ属、Ｃｙｎｏｄｏｎ属、Ｄａｃｔｙｌｉｓ属、Ｈｏｌｃｕｓ属、Ｐｈａｌａｒｉｓ属、Ｓｅｃａｌｅ属、およびＳｏｒｇｈｕｍ属の草を含めたＰｏａｌｅｓ目、Ａｍｂｒｏｓｉａ属、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ属、およびＰａｒｉｅｔａｒｉａ属の薬草を含めたＡｓｔｅｒａｌｅｓ目、およびＵｒｔｉｃａｌｅｓ目に由来するアレルゲンである。他の重要な吸入性アレルゲンは、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ属およびＥｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ属のチリダニからの吸入性アレルゲン、コナダニ（ｓｔｏｒａｇｅ  ｍｉｔｅ）、たとえばＬｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ属、Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ属、およびＴｙｒｏｐｈａｇｕｓ属、ゴキブリ、コバエ、およびノミ、たとえばＢｌａｔｅｌｌａ属、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ属、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ属、およびＣｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｐｈａｌｉｄｅｓ）属からの吸入性アレルゲン、ならびにネコ、イヌ、およびウマなどの哺乳動物からの吸入性アレルゲン、ミツバチ（Ａｐｉｄａｅ科）、スズメバチ（Ｖｅｓｐｉｄｅａ科）、およびアリ（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ科）を含めた、分類学上のＨｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ目からの刺咬昆虫などの刺咬昆虫に由来する毒液アレルゲンを含めた毒液アレルゲンである。
【００８５】
いくつかの実施形態では、第１の抗原および第２の抗原が、（ａ）ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１の他、ＲＡＧＥファミリー、ＢＡＧＥファミリー、ＧＡＧＥファミリー、およびＭＡＧＥファミリーのポリペプチド、たとえばＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、およびＭＡＧＥ−１２（たとえば黒色腫、肺腫瘍、頭頸部腫瘍、ＮＳＣＬＣ腫瘍、乳房腫瘍、消化器腫瘍、および膀胱腫瘍に対処するのに使用しうる）などのがん−精巣抗原；（ｂ）変異抗原、たとえばｐ５３（多様な充実性腫瘍、たとえば結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がんと関連する）、ｐ２１／Ｒａｓ（たとえば黒色腫、膵臓がん、および結腸直腸がんと関連する）、ＣＤＫ４（たとえば黒色腫と関連する）、ＭＵＭ１（たとえば黒色腫と関連する）、カスパーゼ８（たとえば頭頸部がんと関連する）、ＣＩＡ  ０２０５（たとえば膀胱がんと関連する）、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１、ベータカテニン（たとえば黒色腫と関連する）、ＴＣＲ（たとえばＴ細胞性非ホジキンリンパ腫と関連する）、ＢＣＲ−ａｂｌ（たとえば慢性骨髄性白血病と関連する）、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＫＩＡ  ０２０５、ＣＤＣ−２７、およびＬＤＬＲ−ＦＵＴ；（ｃ）過剰発現抗原、たとえばガレクチン４（たとえば結腸直腸がんと関連する）、ガレクチン９（たとえばホジキン病と関連する）、プロテイナーゼ３（たとえば慢性骨髄性白血病と関連する）、ＷＴ  １（たとえば多様な白血病と関連する）、炭酸脱水酵素（たとえば腎臓がんと関連する）、アルドラーゼＡ（たとえば肺がんと関連する）、ＰＲＡＭＥ（たとえば黒色腫と関連する）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（たとえば乳がん、結腸がん、肺がん、および卵巣がんと関連する）、マンマグロビン、アルファ−フェトプロテイン（たとえば肝がんと関連する）、ＫＳＡ（たとえば結腸直腸がんと関連する）、ガストリン（たとえば膵臓がんおよび胃がんと関連する）、テロメラーゼ触媒タンパク質、ＭＵＣ−１（たとえば乳がんおよび卵巣がんと関連する）、Ｇ−２５０（たとえば腎細胞癌と関連する）、ｐ５３（たとえば乳がん、結腸がんと関連する）、およびがん胎児性抗原（たとえば乳がん、肺がん、および結腸直腸がんなどの消化管がんと関連する）；（ｄ）共有抗原、たとえばＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ  Ａ、ｇｐ１００、ＭＣ１Ｒ、メラニン細胞刺激ホルモン受容体、チロシナーゼ、チロシナーゼ類縁タンパク質１／ＴＲＰ１およびチロシナーゼ類縁タンパク質２／ＴＲＰ２（たとえば黒色腫と関連する）などの黒色腫−メラニン細胞分化抗原；（ｅ）たとえば前立腺がんと関連するＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ２などの前立腺関連抗原；（ｆ）免疫グロブリンイディオタイプ（たとえば骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫と関連する）から選択される腫瘍抗原に由来する。ある実施形態では、腫瘍免疫原に、ｐ１５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、Ｈ−Ｒａｓ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタインバーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、Ｅ６およびＥ７を含めたヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウ���ルス抗原、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス抗原、ＴＳＰ−１８０、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｍｎ−２３Ｈ１、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１  Ｔｇｐ７２、ベータ−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３（ＣＡ  ２７．２９｜ＢＣＡＡ）、ＣＡ  １９５、ＣＡ  ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８｜ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質／シクロフィリンＣ会合タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳなどが含まれるがこれらに限定されない。
【００８６】
１．ＲＳＶ
いくつかの態様では、病原体がＲＳＶである。ＲＳＶとは、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ属のエンベロープ非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスである。宿主細胞に感染するために、ＲＳＶなどのパラミクソウイルスは、インフルエンザウイルスおよびＨＩＶなど、他のエンベロープウイルスと同様に、ウイルス膜の宿主細胞の膜との融合を必要とする。ＲＳＶでは、保存された融合タンパク質（ＲＳＶ−Ｆ糖タンパク質）が、不可逆的なタンパク質リフォールディングを、膜の並置とカップリングさせることにより、ウイルス膜および細胞膜に融合する。パラミクソウイルス研究に基づく最新のモデルでは、ＲＳＶ−Ｆタンパク質が、まず準安定性の「融合前」コンフォメーションへとフォールドする。細胞への侵入時に、融合前コンフォメーションは、リフォールディングおよびコンフォメーション変化を経て、その安定性の「融合後」コンフォメーションへと至る。融合前ＲＳＶ−Ｆ構造および融合後ＲＳＶ−Ｆ構造に関してはまた、Ｓｗａｎｓｏｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１０８巻（２３号）：９６１９〜９６２４頁（２０１１年）も参照されたい。
【００８７】
ある実施形態では、第１の抗原および第２の抗原が、ＲＳＶに由来する。たとえば第１の抗原と第２の抗原とは、ＲＳＶ表面糖タンパク質融合体（Ｆ）、糖タンパク質（Ｇ）、低分子疎水性タンパク質（ＳＨ）、マトリックスタンパク質ＭおよびＭ２、ヌクレオカプシドタンパク質Ｎ、Ｐ、およびＬ、ならびに非構造タンパク質ＮＳ１およびＮＳ２に独立に由来しうる。ある好ましい実施形態では、第１の抗原および第２の抗原の各々が、ＲＳＶ−Ｆ抗原である。
【００８８】
ＲＳＶのＦ糖タンパク質とは、４つの一般的ドメイン：Ｎ末端ＥＲ輸送シグナル配列（ＳＳ）、細胞外ドメイン（ＥＤ）、膜貫通型ドメイン（ＴＭ）、および細胞質テール（ＣＴ）を有するＩ型１回貫通型内在性膜タンパク質である。ＣＴは、単一のパルミトイル化されたシステイン残基を含有する。Ｆタンパク質の配列は、ＲＳＶ分離株間で高度に保存されているが、常に進化しつつある（Ｋｉｍら（２００７年）、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ、７９巻：８２０〜８２８頁）。大半のパラミクソウイルスと異なり、ＲＳＶ中のＦタンパク質は、他のウイルスタンパク質には非依存で、侵入および合胞体の形成を媒介しうる（他のパラミクソウイルスでは通例、Ｆに加えてＨＮが必要である）。
【００８９】
ＲＳＶ−Ｆ糖タンパク質は、ｍＲＮＡから、Ｆ０と称する約５７４アミノ酸のタンパク質へと翻訳される。Ｆ０の翻訳後プロセシングは、小胞体内のシグナルペプチダーゼによるＮ末端シグナルペプチドの除去を包含する。Ｆ０はまた、トランスゴルジ内の細胞性プロテアーゼ（特にフリン）により、２つの部位（おおよそ１０９／１１０およびおおよそ１３６／１３７）においても切断される。この切断は、短い介在型配列の除去を結果としてもたらし、互いと会合させたままにするＦ１（約５０ｋＤａ；Ｃ末端；おおよそ残基１３７〜５７４）およびＦ２（約２０ｋＤａ；Ｎ末端；おおよそ残基１〜１０９）と称する２つのサブユニットを発生させる。Ｆ１は、そのＮ末端において疎水性の融合ペプチドを含有し、また、２つの両親媒性の７アミノ酸反復領域（ＨＲＡおよびＨＲＢ）も含有する。ＨＲＡは、融合ペプチドの近傍にあり、ＨＲＢは、膜貫通ドメインの近傍にある。３つのＦ１−Ｆ２ヘテロ二量体は、ビリオンにおいてＦ１−Ｆ２のホモ三量体としてアセンブルされる。
【００９０】
本明細書で記載される免疫原性組成物中に包含させるのに適したＲＳＶ−Ｆ抗原であって、ＲＮＡによりコードされる形態におけるＲＳＶ−Ｆ抗原またはポリペプチドとしてのＲＳＶ−Ｆ抗原には、ＲＳＶ−Ｆ糖タンパク質およびＲＳＶ−Ｆ糖タンパク質改変体が含まれる。適したＲＳＶ−Ｆ糖タンパク質改変体には、たとえば、全長Ｆタンパク質、および可溶性細胞外ドメインなどの切断型改変体（各々がフリン切断の変異、トリプシン切断の変異、融合ペプチドの変異（たとえば全体または部分における欠失）、ＨＲＢ三量体を安定化させる変異、およびＨＲＡ三量体を不安定化させる変異など、１つまたは複数の変異を任意選択により含有する）が含まれる。
【００９１】
当技術分野では、１つまたは複数のこのような変異を多様な組合せで有する全長ＲＳＶ−Ｆ糖タンパク質および切断型ＲＳＶ−Ｆ糖タンパク質を含め、全長ＲＳＶ−Ｆ糖タンパク質および切断型ＲＳＶ−Ｆ糖タンパク質が周知であり、たとえばその開示が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１１／００８９７４において開示されている。
【００９２】
当業者には、免疫原性組成物中においてＲＮＡ形態で使用してもよく、またはポリペプチドとして使用してもよい、例示的なＲＳＶ−Ｆ抗原について開示しているＷＯ２０１１／００８９７４の以下の節への参照を指示する：（ｉ）ＲＳＶ−Ｆ、そのアミノ酸配列およびドメイン構造について記載する１５頁の２０行目〜１６頁の２７行目；（ｉｉ）ＲＳＶ−Ｆの可溶性細胞外ドメインについて記載する１６頁の２８行目〜１８頁の１１行目；（ｉｉｉ）フリン切断の変異、トリプシン切断の変異、融合ペプチドの変異について記載する１８頁の１４行目〜２０頁の１５行目；（ｉｖ）任意選択のオリゴマー化配列について記載する２０頁の１６行目〜２１頁の８行目および２６頁の２９行目〜３０頁の１４行目；（ｖ）プロテアーゼ切断部位の導入について記載する２０頁の９〜２４行目；（ｖｉ）ならびにＨＲＢ三量体を安定化させ、ＨＲＡ三量体を不安定化させる変異、および包含されうる他の変異について記載する３０頁の１８行目〜３２頁の１８行目。
【００９３】
具体的な実施形態では、ＷＯ２０１１／００８９７４において開示されている配列番号１または配列番号２など、ＲＳＶ−Ｆ糖タンパク質のアミノ酸残基１００〜１５０の配列、またはその可溶性細胞外ドメインが、以下の通りである。
【００９４】
【化１】
2014520807.tif 000002
【００９５】
前出の配列における記号「−」は、その位置におけるアミノ酸が欠失していることを示す。
【００９６】
具体的な実施形態では、ＲＳＶ−Ｆ抗原の配列が、以下を含む。
【００９７】
【化２】
2014520807.tif 000003
【００９８】
上記で提示した配列は、シグナルペプチドおよびＨＩＳタグを含有する。本発明で使用されるＲＳＶ−Ｆタンパク質は、シグナルペプチドおよび／またはＨＩＳタグを有するまたは有さない上記で示したアミノ酸配列のうちのいずれかを含有しうる。
【００９９】
本発明において使用しうる追加のＲＳＶ  Ｆ抗原の例には、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００９／０７９７９６の５８〜６０頁において開示されている、配列番号６、８、および１０が含まれる。
【０１００】
本明細書で記載される免疫原性組成物中に包含させるのに適したＲＳＶ−Ｆポリペプチドは、形態およびコンフォメーションのあらゆる所望の混合物を含めた、あらゆる所望の形態およびコンフォメーションでありうる。たとえばＲＳＶ−Ｆポリペプチドは、単量体でもよく、または３つの単量体ポリペプチドを含む三量体でもよい。三量体は、単分散していてもよく、たとえば個別の三量体の融合ペプチドの間の相互作用に起因してロゼットの形態であってもよい。免疫原性組成物は、単量体、三量体、単量体と三量体との組合せ（たとえば動的平衡にある）、三量体のロゼット、および前出のあらゆる組合せであるＲＳＶ−Ｆポリペプチドを含みうる。当技術分野では、単量体、三量体、単量体と三量体との組合せ（たとえば動的平衡にある）、三量体のロゼット、切断型形態および非切断型形態、ならびに融合前形態および融合後形態を含めたＲＳＶ−Ｆの形態およびコンフォメーションが周知であり、たとえばその開示が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１１／００８９７４において開示されている。当業者には、多様な形態およびコンフォメーションにおけるＲＳＶ−Ｆタンパク質およびそれらを作製するための方法について記載している、ＷＯ２０１１／００８９７４、特に２４頁の１０行目〜２６頁の２７行目および実施例２〜７の参照を指示する。
【０１０１】
２．ＣＭＶ
いくつかの態様では、病原体がＣＭＶであり、第１の抗原と第２の抗原とが、ＣＭＶに独立に由来する。ある実施形態では、第１の抗原および第２の抗原が、カプシドタンパク質、エンベロープ糖タンパク質（ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＭ、ｇＮなど）、またはテグメントタンパク質に由来する。ある実施形態では、第１の抗原および第２の抗原が、以下のタンパク質：ｐｐ６５、ＩＥ１、ｇＢ、ｇＤ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＭ、ｇＮ、ｇＯ、ＵＬ１２８、ＵＬ１２９、ｇＵＬ１３０、ＵＬ１５０、ＵＬ１３１、ＵＬ３３、ＵＬ７８、ＵＳ２７、ＵＳ２８、ＲＬ５Ａ、ＲＬ６、ＲＬ１０、ＲＬ１１、ＲＬ１２、ＲＬ１３、ＵＬ１、ＵＬ２、ＵＬ４、ＵＬ５、ＵＬ６、ＵＬ７、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１４、ＵＬ１５Ａ、ＵＬ１６、ＵＬ１７、ＵＬ１８、ＵＬ２２Ａ、ＵＬ３８、ＵＬ４０、ＵＬ４１Ａ、ＵＬ４２、ＵＬ１１６、ＵＬ１１９、ＵＬ１２０、ＵＬ１２１、ＵＬ１２４、ＵＬ１３２、ＵＬ１４７Ａ、ＵＬ１４８、ＵＬ１４２、ＵＬ１４４、ＵＬ１４１、ＵＬ１４０、ＵＬ１３５、ＵＬ１３６、ＵＬ１３８、ＵＬ１３９、ＵＬ１３３、ＵＬ１３５、ＵＬ１４８Ａ、ＵＬ１４８Ｂ、ＵＬ１４８Ｃ、ＵＬ１４８Ｄ、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ６、ＵＳ７、ＵＳ８、ＵＳ９、ＵＳ１０、ＵＳ１１、ＵＳ１２、ＵＳ１３、ＵＳ１４、ＵＳ１５、ＵＳ１６、ＵＳ１７、ＵＳ１８、ＵＳ１９、ＵＳ２０、ＵＳ２１、ＵＳ２９、ＵＳ３０、またはＵＳ３４Ａのうちの１または複数に由来する。
【０１０２】
ＣＭＶ抗原はまた、ｐｐ６５／ＩＥ１（Ｒｅａｐら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００７年）、２５巻：７４４１〜７４４９頁）、ｇＨ／ｇＬ（Ｃｈｏｗｄａｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７巻、８８２〜８８８頁（２０１０年））など、１つまたは複数のＣＭＶタンパク質の融合ポリペプチドでもありうる。
【０１０３】
適したＣＭＶ抗原には、ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯが含まれ、これらはあらゆるＣＭＶ株に由来しうる。たとえばＣＭＶタンパク質は、ＣＭＶのＭｅｒｌｉｎ株、ＡＤ１６９株、ＶＲ１８１４株、Ｔｏｗｎｅ株、Ｔｏｌｅｄｏ株、ＴＲ株、ＰＨ株、ＴＢ４０株、またはＦｉｘ株に由来しうる。本発明のために使用しうるＣＭＶタンパク質の例示的な配列を、表１に示す。
【０１０４】
【表１】
2014520807.tif 000004
【０１０５】
ｇＢ抗原
ある実施形態では、第１の抗原、第２の抗原、またはこれらの両方が、ｇＢ抗原でありうる。ｇＢ抗原は、全長ｇＢタンパク質の場合もあり、またはｇＢタンパク質の１つまたは複数の領域が取り除かれる場合もある。代替的に、ｇＢタンパク質断片を使用することもできる。ｇＢアミノ酸は、配列番号２に示される全長ｇＢアミノ酸配列（ＣＭＶ  ｇＢ  ＦＬ）であって、９０７アミノ酸の長さである全長ｇＢアミノ酸配列に従い番号付けされる。全長タンパク質から取り除かれる場合もあり、または断片として包含される場合もある、適したｇＢタンパク質の領域は、シグナル配列（アミノ酸１〜２４）、ｇＢ−ＤＬＤディスインテグリン様ドメイン（アミノ酸５７〜１４６）、フリン切断部位（アミノ酸４５９〜４６０）、７アミノ酸繰り返し領域（６７９〜６９３）、膜貫通ドメイン（アミノ酸７５１〜７７１）、およびアミノ酸７７１〜９０６に由来する細胞質ドメインを包含する。いくつかの実施形態では、ｇＢ抗原が、アミノ酸６７〜８６（中和エピトープであるＡＤ２）および／またはアミノ酸５３２〜６３５（免疫優性エピトープであるＡＤ１）を包含する。ｇＢ抗原の具体例には、ｇＢの最初の６９２アミノ酸を包含する「ｇＢ  ｓｏｌ  ６９２」、およびｇＢの最初の７５０アミノ酸を包含する「ｇＢ  ｓｏｌ  ７５０」が含まれる。所望に応じて、シグナル配列であるアミノ酸１〜２４をｇＢ  ｓｏｌ  ６９２内およびｇＢ  ｓｏｌ  ７５０内に存在させてもよく、または存在させなくてもよい。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ｇＢ抗原が、１０アミノ酸以上のｇＢ断片である。たとえば断片内のアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、または８７５アミノ酸を含みうる。
【０１０７】
本発明はまた、配列番号２と少なくとも７５％同一な（たとえば配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一な）アミノ酸配列を含むｇＢ抗原も使用しうる。
【０１０８】
ｇＨ抗原
ある実施形態では、第１の抗原、第２の抗原、またはこれらの両方が、ｇＨ抗原でありうる。ｇＨ抗原は、全長ｇＨタンパク質（たとえば７４３アミノ酸のタンパク質である配列番号８のＣＭＶ  ｇＨ  ＦＬ）でありうる。ｇＨは、７１６位〜７４３位に始まる膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有する。７１７〜７４３のアミノ酸を除去することにより、可溶性ｇＨ（たとえばＣＭＶ  ｇＨ  ｓｏｌ、配列番号１０）がもたらされる。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、ｇＨ抗原が、１０アミノ酸以上のｇＨ断片である。たとえば断片内のアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、または７２５アミノ酸を含みうる。
【０１１０】
本発明はまた、配列番号８または１０と少なくとも７５％同一な（たとえば配列番号８または１０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一な）アミノ酸配列を含むｇＨ抗原も使用しうる。
【０１１１】
ｇＬ抗原
ある実施形態では、第１の抗原、第２の抗原、またはこれらの両方が、ｇＬ抗原でありうる。ｇＬ抗原は、全長ｇＬタンパク質（たとえば２７８アミノ酸のタンパク質である、配列番号１２のＣＭＶ  ｇＬ  ＦＬ）でありうる。代替的にｇＬ断片も使用することができる。たとえば断片内のアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、または２５０アミノ酸を含みうる。
【０１１２】
本発明はまた、配列番号１２と少なくとも７５％同一な（たとえば配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一な）アミノ酸配列を含むｇＬ抗原も使用しうる。
【０１１３】
ｇＯ抗原
ある実施形態では、第１の抗原、第２の抗原、またはこれらの両方が、ｇＯ抗原でありうる。ｇＯ抗原は、全長ｇＯタンパク質（たとえば４７２アミノ酸のタンパク質である、配列番号１８のＣＭＶ  ｇＯ  ＦＬ）でありうる。代替的にｇＯ抗原は、１０アミノ酸以上のｇＯ断片でもありうる。たとえば断片内のアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、または４５０アミノ酸を含みうる。
【０１１４】
本発明はまた、配列番号１８と少なくとも７５％同一な（たとえば配列番号１８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一な）アミノ酸配列を含むｇＯ抗原も使用しうる。
【０１１５】
ｇＭ抗原
ある実施形態では、第１の抗原、第２の抗原、またはこれらの両方が、ｇＭ抗原でありうる。ｇＭ抗原は、全長ｇＭタンパク質（たとえば３７１アミノ酸のタンパク質である、配列番号１４のＣＭＶ  ｇＭ  ＦＬ）でありうる。代替的にｇＭ抗原は、１０アミノ酸以上のｇＭ断片でもありうる。たとえば断片内のアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、または３５０アミノ酸を含みうる。
【０１１６】
本発明はまた、配列番号１４と少なくとも７５％同一な（たとえば配列番号１４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一な）アミノ酸配列を含むｇＭ抗原も使用しうる。
【０１１７】
ｇＮ抗原
ある実施形態では、第１の抗原、第２の抗原、またはこれらの両方が、ｇＮ抗原でありうる。ｇＮ抗原は、全長ｇＮタンパク質（たとえば１３５アミノ酸のタンパク質である、配列番号１６のＣＭＶ  ｇＮ  ＦＬ）でありうる。代替的にｇＮ抗原は、１０アミノ酸以上のｇＮ断片でもありうる。たとえば断片内のアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１２５アミノ酸を含みうる。
【０１１８】
本発明はまた、配列番号１６と少なくとも７５％同一な（たとえば配列番号１６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一な）アミノ酸配列を含むｇＮ抗原も使用しうる。
【０１１９】
ＵＬ１２８抗原
ある実施形態では、第１の抗原、第２の抗原、またはこれらの両方が、ＵＬ１２８抗原でありうる。ＵＬ１２８抗原は、全長ＵＬ１２８タンパク質（たとえば１７１アミノ酸のタンパク質である、配列番号２０のＣＭＶ  ＵＬ１２８  ＦＬ）でありうる。代替的にＵＬ１２８抗原は、１０アミノ酸以上のＵＬ１２８断片でもありうる。たとえば断片内のアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、または１５０アミノ酸を含みうる。
【０１２０】
本発明はまた、配列番号２０と少なくとも７５％同一な（たとえば配列番号２０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一な）アミノ酸配列を含むＵＬ１２８抗原も使用しうる。
【０１２１】
ＵＬ１３０抗原
ある実施形態では、第１の抗原、第２の抗原、またはこれらの両方が、ＵＬ１３０抗原でありうる。ＵＬ１３０抗原は、全長ＵＬ１３０タンパク質（たとえば２１４アミノ酸のタンパク質である、配列番号２２のＣＭＶ  ＵＬ１３０  ＦＬ）でありうる。代替的にＵＬ１３０抗原は、１０アミノ酸以上のＵＬ１３０断片でもありうる。たとえば断片内のアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、または２００アミノ酸を含みうる。
【０１２２】
本発明はまた、配列番号２２と少なくとも７５％同一な（たとえば配列番号２２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一な）アミノ酸配列を含むＵＬ１３０抗原も使用しうる。
【０１２３】
ＵＬ１３１抗原
ある実施形態では、第１の抗原、第２の抗原、またはこれらの両方が、ＵＬ１３１抗原でありうる。ＵＬ１３１抗原は、全長ＵＬ１３１タンパク質（たとえば１２９アミノ酸のタンパク質である、配列番号２４のＣＭＶ  ＵＬ１３１）でありうる。代替的にＵＬ１３１抗原は、１０アミノ酸以上のＵＬ１３１断片でもありうる。たとえば断片内のアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、または２００アミノ酸を含みうる。
【０１２４】
本発明はまた、配列番号２４と少なくとも７５％同一な（たとえば配列番号２４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一な）アミノ酸配列を含むＵＬ１３１抗原も使用しうる。
【０１２５】
ＣＭＶ抗原は、融合ポリペプチドでありうる。たとえば抗原は、第１のドメインと第２のドメインとを含むことができ、ここで、（ｉ）第１のドメインは、第１のＣＭＶ抗原を含み、（ｉｉ）第２のドメインは、第２のＣＭＶ抗原を含む。第１のＣＭＶ抗原と第２のＣＭＶ抗原とは、上記のｇＢ抗原、ｇＨ抗原、ｇＬ抗原、ｇＯ抗原、ｇＭ抗原、ｇＮ抗原、ＵＬ１２８抗原、ＵＬ１３０抗原、またはＵＬ１３１抗原から独立に選択される。
【０１２６】
また、２つ以上のＣＭＶ抗原を、複合体の形態で共送達してもよく、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて複合体を形成しうる形態で共送達してもよい（たとえばｇＨ／ｇＬ複合体、ｇＭ／ｇＮ複合体、ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合体）。たとえば免疫原性組成物は、２つ以上の別個のタンパク質、たとえば、ｇＨおよびｇＬをコードするＲＮＡ分子を含みうる。免疫原性組成物はまた、２つ以上のポリペプチド抗原、たとえばｇＨおよびｇＬも含みうる。
【０１２７】
Ｂ．ＲＮＡ分子
本明細書で記載される免疫原性組成物は、ＲＮＡ成分とポリペプチド成分とを含む。ＲＮＡは、自己複製ＲＮＡであることが好ましい。
【０１２８】
組成物は、抗原をコードする１つより多いＲＮＡ分子、たとえば２つ、３つ、５つ、１０以上のＲＮＡ分子を含有しうる。代替的にまたは加えて、１つのＲＮＡ分子はまた、１つより多い抗原もコードすることが可能であり、たとえば異なる抗原または同一な抗原をコードするバイシストロニックＲＮＡ分子またはトリシストロニックＲＮＡ分子でもありうる。
【０１２９】
ＲＮＡ分子の配列は、ヒト細胞など所望の宿主における発現についてコドン最適化されていてもよく、または脱最適化されていてもよい。
【０１３０】
ＲＮＡ分子の配列は、所望の場合、たとえばＲＮＡの発現または複製の有効性を増大させるように修飾してもよく、またはさらなる安定性または分解に対する耐性をもたらすように修飾してもよい。たとえばＲＮＡ配列は、そのコドン使用に関して修飾して、たとえばＲＮＡの翻訳有効性を増大させ、半減期を延長することができる。ポリＡテール（たとえば約３０以上のアデノシン残基の）を、ＲＮＡの３’末端へと付着させて、その半減期を延長することができる。ＲＮＡの５’末端は、構造ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（キャップ０構造）またはその誘導体であって、ＲＮＡ合成の間に組み込むこともでき、ＲＮＡの転写後において酵素的に操作することもできる（たとえばｍＲＮＡトリホスファターゼ、グアニリルトランスフェラーゼ、およびグアニン−７−メチルトランスフェラーゼからなるワクシニアウイルスキャッピング酵素（ＶＣＥ）であって、Ｎ７−モノメチル化されたキャップ０構造の構築を触媒するＶＣＥを使用することにより）、キャップ０構造またはその誘導体を有する修飾リボヌクレオチドでキャップすることができる。キャップ０構造は、ＲＮＡ分子の安定性および翻訳有効性の維持において重要な役割を果たす。ＲＮＡ分子の５’側キャップは、キャップ１構造（ｍ７Ｇｐｐｐ［ｍ２’−Ｏ］Ｎ）の生成を結果としてもたらす２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼによりさらに修飾することができ、これにより、翻訳有効性をさらに増大させることができる。
【０１３１】
所望の場合、ＲＮＡ分子は、あらゆる５’側キャップ構造に加えて、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドも含みうる。哺乳動物のＲＮＡでは、９６を超える天然に存在するヌクレオシド修飾が見出されている。たとえばＬｉｍｂａｃｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２巻（１２号）：２１８３〜２１９６頁（１９９４年）を参照されたい。当技術分野では、ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドならびに修飾ヌクレオシドの調製が、たとえばそれらのすべてが参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第４３７３０７１号、同第４４５８０６６号、同第４５００７０７号、同第４６６８７７７号、同第４９７３６７９号、同第５０４７５２４号、同第５１３２４１８号、同第５１５３３１９号、同第５２６２５３０号、同第５７００６４２号から周知であり、多くの修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドが市販されている。
【０１３２】
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドへと組み込むことが可能であり、ＲＮＡ分子内に存在させうる修飾核酸塩基には、ｍ５Ｃ（５−メチルシチジン）、ｍ５Ｕ（５−メチルウリジン）、ｍ６Ａ（Ｎ６−メチルアデノシン）、ｓ２Ｕ（２−チオウリジン）、Ｕｍ（２’−Ｏ−メチルウリジン）、ｍ１Ａ（１−メチルアデノシン）；ｍ２Ａ（２−メチルアデノシン）；Ａｍ（２−１−Ｏ−メチルアデノシン）；ｍｓ２ｍ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン）；ｉ６Ａ（Ｎ６−イソペンテニルアデノシン）；ｍｓ２ｉ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデノシン）；ｉｏ６Ａ（Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｇ６Ａ（Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン）；ｔ６Ａ（Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｔ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｈｎ６Ａ（Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；Ａｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルアデノシン（ホスフェート））；Ｉ（イノシン）；ｍ１Ｉ（１−メチルイノシン）；ｍ’Ｉｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン）；ｍ３Ｃ（３−メチルシチジン）；Ｃｍ（２Ｔ−Ｏ−メチルシチジン）；ｓ２Ｃ（２−チオシチジン）；ａｃ４Ｃ（Ｎ４−アセチルシチジン）；ｆ５Ｃ（５−ホンニルシチジン）；ｍ５Ｃｍ（５，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４アセチル２ＴＯメチルシチジン）；ｋ２Ｃ（リシジン）；ｍ１Ｇ（１−メチルグアノシン）；ｍ２Ｇ（Ｎ２−メチルグアノシン）；ｍ７Ｇ（７−メチルグアノシン）；Ｇｍ（２’−Ｏ−メチルグアノシン）；ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン）；ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン）；Ｇｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルグアノシン（ホスフェート））；ｙＷ（ウィブトシン）；ｏ２ｙＷ（ペルオキシウィブトシン）；ＯＨｙＷ（ヒドロキシウィブトシン）；ＯＨｙＷ＊（修飾不十分なヒドロキシウィブトシン）；ｉｍＧ（ウィオシン）；ｍｉｍＧ（メチルグアノシン）；Ｑ（クォイオシン）；ｏＱ（エポキシクォイオシン）；ｇａｌＱ（ガルタクトシル−クォイオシン）；ｍａｎＱ（マンノシル−クォイオシン）；ｐｒｅＱｏ（７−シアノ−７−デアザグアノシン）；ｐｒｅＱｉ（７−アミノメチル−７−デアザグアノシン）；Ｇ＊（アルカエオシン）；Ｄ（ジヒドロウリジン）；ｍ５Ｕｍ（５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｓ４Ｕ（４−チオウリジン）；ｍ５ｓ２Ｕ（５−メチル−２−チオウリジン）；ｓ２Ｕｍ（２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ａｃｐ３Ｕ（３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン）；ｈｏ５Ｕ（５−ヒドロキシウリジン）；ｍｏ５Ｕ（５−メトキシウリジン）；ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸）；ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル）；ｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））；ｍｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）；ｍｃｍ５Ｕ（５−メトキシカルボニルメチルウリジン）；ｍｃｍ５Ｕｍ（Ｓ−メトキシカルボニルメチル−２−Ｏ−メチルウリジン）；ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン）；ｎｍ５ｓ２Ｕ（５−アミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５Ｕ（５−メチルアミノメチルウリジン）；ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン）；ｎｃｍ５Ｕ（５−カルバモイルメチルウリジン）；ｎｃｍ５Ｕｍ（５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン）；ｃｎｍｍ５Ｕｍ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−Ｌ−オメチルウリジン）；ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン）；Ｔｍ（２’−Ｏ−メチルイノシン）；ｍ４Ｃ（Ｎ４−メチルシチジン）；ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ｈｍ５Ｃ（５−ヒドロキシメチルシチジン）；ｍ３Ｕ（３−メチルウリジン）；ｃｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルウリジン）；ｍ６Ａｍ（Ｎ６，Ｔ−Ｏ−ジメチルアデノシン）；ｒｎ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，Ｏ−２−トリメチルアデノシン）；ｍ２’７Ｇ（Ｎ２，７−ジメチルグアノシン）；ｍ２’２’７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン）；ｍ３Ｕｍ（３，２Ｔ−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロウリジン）；ｆ５Ｃｍ（５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン）；ｍ１Ｇｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ’Ａｍ（１，２−Ｏ−ジメチルアデノシン）イリノメチルウリジン）；ｔｍ５ｓ２Ｕ（Ｓ−タウリノメチル−２−チオウリジン））；ｉｍＧ−１４（４−デメチルグアノシン）；ｉｍＧ２（イソグアノシン）；ａｃ６Ａ（Ｎ６−アセチルアデノシン）、ヒポキサンチン、イノシン、８−オキソ−アデニン、その７置換誘導体、ジヒドロウラシル、プソイドウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルウラシル、５−メチルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルシトシン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ２−ジメチルグアニン、７−デアザグアニン、８−アザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン、７−デアザ−７−（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニルグアニン、７−デアザ−８−置換グアニン、８−ヒドロキシグアニン、６−チオグアニン、８−オキソグアニン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，４−ジアミノプリン、２，６−ジアミノプリン、８−アザプリン、置換７−デアザプリン、７−デアザ−７−置換プリン、７−デアザ−８−置換プリン、水素（非塩基性残渣）、ｍ５Ｃ、ｍ５Ｕ、ｍ６Ａ、ｓ２Ｕ、Ｗ、または２’−Ｏ−メチル−Ｕが含まれる。これらの修飾核酸塩基およびそれらの対応するリボヌクレオシドの多くは、商業的販売元から入手可能である。たとえば参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１１／００５７９９を参照されたい。
【０１３３】
所望の場合、ＲＮＡ分子は、ホスホルアミデート連結、ホスホロチオエート連結、および／またはメチルホスホネート連結を含有しうる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が、修飾ヌクレオチドを包含しない、たとえば修飾核酸塩基を包含せず、ＲＮＡ分子内のすべてのヌクレオチドが、たとえば７−メチルグアノシンが含まれうる任意選択の５’側キャップを除き、通常の標準的なリボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｇ、およびＣである。他の実施形態では、ＲＮＡが、７’−メチルグアノシンを含む５’側キャップを包含することが可能であり、最初の１つ、２つ、または３つの５’側リボヌクレオチドを、リボースの２’位でメチル化することができる。
【０１３５】
自己複製ＲＮＡ
いくつかの態様では、カチオン性水中油エマルジョンが、自己複製ＲＮＡ分子を含有する。ある実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子が、ＲＮＡウイルスまたはレトロウイルスに由来するまたはこれに基づく。ある実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子が、アルファウイルスに由来するまたはこれに基づく。
【０１３６】
当技術分野では、自己複製ＲＮＡ分子が周知であり、たとえばアルファウイルスに由来する複製エレメントを使用し、ウイルス構造タンパク質を、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列で置換することにより作製することができる。自己複製ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞は、アポトーシスによる死滅を経る前の短時間にわたり、抗原を産生する。この死滅は、樹状細胞を超活性化することもまた示されている、必須の二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ中間体の結果である可能性が高い。したがって、自己複製ＲＮＡの免疫原性の増強は、宿主細胞のＲＮＡウイルス感染を模倣する炎症促進性ｄｓＲＮＡの産生の結果でありうる。
【０１３７】
自己複製ＲＮＡ分子により、細胞機構が、細胞内に蓄積されうるまたは細胞から分泌されうるタンパク質または抗原など、コードされる遺伝子産物の指数関数的増大を発生させるように使用されると有利である。自己複製ＲＮＡ分子によるタンパク質または抗原の過剰発現は、トランスフェクトされた細胞のアポトーシスを誘発する、ＲＮＡの複製産物および増幅産物ならびに翻訳産物による、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）３経路、ＴＬＲ７経路、およびＴＬＲ８経路、ならびに非ＴＬＲ（たとえば、ＲＩＧ−１、ＭＤ−５）経路の刺激を含めた免疫刺激性アジュバント効果を利用する。
【０１３８】
自己複製ＲＮＡは、一般的に、ウイルスレプリカーゼ、ウイルスプロテアーゼ、ウイルスヘリカーゼ、および他の非構造ウイルスタンパク質からなる群より選択される少なくとも１つまたは複数の遺伝子を含有し、また、５’末端および３’末端のシス活性複製配列ならびに所望の場合、所望のアミノ酸配列（たとえば目的の抗原）をコードする異種配列を含む。異種配列の発現を誘導するサブゲノムプロモーターは、自己複製ＲＮＡ中に包含することができる。所望の場合、異種配列（たとえば目的の抗原）は、自己複製ＲＮＡにおける他のコード領域に対してインフレームで融合させてもよく、かつ／または内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）の制御下に置いてもよい。
【０１３９】
ある実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子をウイルス様粒子内に被包しない。本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、自己複製ＲＮＡ分子が感染性ウイルス粒子の産生を誘発することができないように、設計することができる。これは、たとえば、自己複製ＲＮＡにおけるウイルス粒子の産生に必要な構造タンパク質をコードする１つまたは複数のウイルス遺伝子を取り除くことによって達成することができる。たとえば、自己複製ＲＮＡ分子が、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｅｂｉｓウイルス）（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）などのアルファウイルスに基づくものである場合は、カプシドおよび／またはエンベロープ糖タンパク質などのウイルス構造タンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子を取り除くことができる。
【０１４０】
所望の場合、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、弱毒化されたもしくは毒性のある感染性ウイルス粒子の産生を誘発するようにまたは１回の続く感染が可能なウイルス粒子を産生するように設計することができる。
【０１４１】
自己複製ＲＮＡ分子は、脊椎動物細胞に送達された場合、それ自体からの（またはそれ自体のアンチセンスコピーからの）転写によって複数の娘ＲＮＡの産生を導くことができる。自己複製ＲＮＡは、細胞に送達した後に、直接翻訳することができ、この翻訳は、送達されたＲＮＡから転写物をその後産生するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを提供する。したがって、送達されたＲＮＡは、複数の娘ＲＮＡの産生を導く。これらの転写物は、送達されたＲＮＡに関してアンチセンスであり、遺伝子産物のｉｎ  ｓｉｔｕ発現をもたらすためにそれら自体翻訳されてもよい、または遺伝子産物のｉｎ  ｓｉｔｕ発現を提供するために翻訳される、送達されたＲＮＡと同じセンスを有するさらなる転写物を提供するために転写されてもよい。
【０１４２】
自己複製を達成するのに適した１つの系は、アルファウイルスベースのＲＮＡレプリコンを使用することである。アルファウイルスは、遺伝子的、構造的、および血清学的に類縁の、一連のＴｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科の節足動物媒介性ウイルスを含む。２６の公知のウイルスおよびウイルス亜型が、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスを含めた、アルファウイルス属内に分類されている。本発明の自己複製ＲＮＡはそれ自体、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、またはアルファウイルス科に属する他のウイルスに由来するＲＮＡレプリカーゼを組み込みうる。
【０１４３】
本発明では、アルファウイルスベースの「レプリコン」による発現ベクターを使用することができる。レプリコンベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および組換えレプリコン粒子を含めた複数のフォーマットで用いることができる。このようなレプリコンベクターは、たとえばシンドビスウイルス（Ｘｉｏｎｇら（１９８９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３巻：１１８８〜１１９１頁；Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（１９９６年）、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７０巻：５０８〜５１９頁；Ｈａｒｉｈａｒａｎら（１９９８年）、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：９５０〜９５８頁；Ｐｏｌｏら（１９９９年）、ＰＮＡＳ、９６巻：４５９８〜４６０３頁）、セムリキ森林ウイルス（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ（１９９１年）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻：１３５６〜１３６１頁；Ｂｅｒｇｌｕｎｄら（１９９８年）、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６巻：５６２〜５６５頁）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｐｕｓｈｋｏら（１９９７年）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２３９巻：３８９〜４０１頁）が含まれるアルファウイルスに由来している。アルファウイルスに由来するレプリコンは、全体的な特徴（たとえば構造、複製）において一般的にきわめて類似しているが、個別のアルファウイルスは、固有ないくつかの特定の特性（たとえば受容体結合、インターフェロン感受性、および疾患プロファイル）を呈示しうる。したがって、様々なウイルス科から作製されるキメラアルファウイルスレプリコンもまた有用でありうる。
【０１４４】
アルファウイルスに基づくレプリコンは、レプリカーゼ（またはレプリカーゼ−トランスクリプターゼ）を産生するために細胞に送達した後に翻訳され得る（＋）鎖レプリコンである。レプリカーゼは、＋鎖送達ＲＮＡのゲノム（−）鎖コピーを生成する複製複合体を提供するために自己切断するポリプロテインとして翻訳される。これらの（−）鎖転写物は、（＋）鎖の親ＲＮＡのさらなるコピーを提供するために、また、所望の遺伝子産物をコードするサブゲノム転写物をも提供するために、それら自体を転写することができる。サブゲノム転写物の翻訳は、したがって、感染細胞による所望の遺伝子産物のｉｎ  ｓｉｔｕ発現を導く。適したアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを使用することができる。
【０１４５】
好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、したがって、（ｉ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写することができるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび（ｉｉ）ポリペプチド抗原をコードする。ポリメラーゼは、たとえばアルファウイルスタンパク質ｎｓＰ４を含むアルファウイルスレプリカーゼでありうる。
【０１４６】
天然アルファウイルスゲノムは、非構造レプリカーゼに加えて構造ビリオンタンパク質をコードするのに対して、本発明のアルファウイルスベースの自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス構造タンパク質をコードしないことが好ましい。したがって、自己複製ＲＮＡは、ＲＮＡ含有アルファウイルスビリオンの産生ではなく、細胞におけるそれ自体のゲノムＲＮＡコピーの産生を導くことができる。これらのビリオンを産生することができないということは、野生型アルファウイルスと異なり、自己複製ＲＮＡ分子が感染性形態でそれ自体を永続させることができないことを意味する。野生型ウイルスにおいて永続化に必要なアルファウイルス構造タンパク質は、本発明の自己複製ＲＮＡに存在せず、それらの場所は、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子（複数可）によって使用され、サブゲノム転写物は、構造アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく所望の遺伝子産物をコードする。
【０１４７】
したがって、本発明による有用な自己複製ＲＮＡ分子は、２つのオープンリーディングフレームを有しうる。第１の（５’）オープンリーディングフレームは、レプリカーゼをコードし、第２の（３’）オープンリーディングフレームは、ポリペプチド抗原をコードする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、たとえば別の所望の遺伝子産物をコードする、追加の（下流）オープンリーディングフレームを有していてもよい。自己複製ＲＮＡ分子は、コードされるレプリカーゼと適合性の５’配列を有することができる。
【０１４８】
他の態様では、自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス以外のウイルス、好ましくはプラス鎖ＲＮＡウイルスおよびより好ましくはピコルナウイルス、フラビウイルス、ルビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、カリシウイルス、またはコロナウイルスに由来するまたはそれに基づく。適した野生型アルファウイルス配列は、周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．などの配列保管機関から入手可能である。適したアルファウイルスの代表的な例は、アウラ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６８）、ベバルウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６００、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４０）、カバス（Ｃａｂａｓｓｏｕ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２２）、チクングニヤウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６４、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４１）、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６５、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４２）、フォートモーガン（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２４）、ゲタウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４３）、キジラガチ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２７）、マヤロ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６６）、マヤロウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２７７）、ミッデルブルグ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７０）、ムカンボウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４４）、ヌドゥム（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７１）、ピクスナウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４５）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、セムリキ森林（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、シンドビスウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６８、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４８）、トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２５）、トリニティ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−４６９）、ユナ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７４）、ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）、西部ウマ脳脊髄炎（ＡＴＣＣ  ＶＲ−７０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６２２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５２）、ワタロア（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２６）、およびＹ−６２−３３（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７５）を含む。
【０１４９】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、他の種類のＲＮＡ（たとえばｍＲＮＡ）より大型である。典型的に、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、少なくとも約４ｋｂを含有する。たとえば自己複製ＲＮＡは、少なくとも約５ｋｂ、少なくとも約６ｋｂ、少なくとも約７ｋｂ、少なくとも約８ｋｂ、少なくとも約９ｋｂ、少なくとも約１０ｋｂ、少なくとも約１１ｋｂ、少なくとも約１２ｋｂ、または１２ｋｂ超を含有しうる。ある例では、自己複製ＲＮＡが、約４ｋｂ〜約１２ｋｂ、約５ｋｂ〜約１２ｋｂ、約６ｋｂ〜約１２ｋｂ、約７ｋｂ〜約１２ｋｂ、約８ｋｂ〜約１２ｋｂ、約９ｋｂ〜約１２ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１２ｋｂ、約１１ｋｂ〜約１２ｋｂ、約５ｋｂ〜約１１ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約５ｋｂ〜約９ｋｂ、約５ｋｂ〜約８ｋｂ、約５ｋｂ〜約７ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約１２ｋｂ、約６ｋｂ〜約１１ｋｂ、約６ｋｂ〜約１０ｋｂ、約６ｋｂ〜約９ｋｂ、約６ｋｂ〜約８ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約７ｋｂ〜約１１ｋｂ、約７ｋｂ〜約１０ｋｂ、約７ｋｂ〜約９ｋｂ、約７ｋｂ〜約８ｋｂ、約８ｋｂ〜約１１ｋｂ、約８ｋｂ〜約１０ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂ、約９ｋｂ〜約１１ｋｂ、約９ｋｂ〜約１０ｋｂ、または約１０ｋｂ〜約１１ｋｂである。
【０１５０】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチド（たとえばプソイドウリジン、Ｎ６−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン）を含みうる。
【０１５１】
自己複製ＲＮＡ分子は、単一のポリペプチド抗原をコードすることもでき、任意選択により、配列の各々がアミノ酸配列として発現したときにその同一性を保持する方式で併せて連結された（たとえば直列で連結された）ポリペプチド抗原の２つ以上をコードすることもできる。したがって、自己複製ＲＮＡから生成したポリペプチドは、融合ポリペプチドとして作製することもでき、別個のポリペプチドまたはペプチド配列を結果としてもたらすような様式で操作することもできる。
【０１５２】
本発明の自己複製ＲＮＡは、ある範囲のエピトープを含有する１つまたは複数のポリペプチド抗原をコードしうる。エピトープは、ヘルパーＴ細胞応答もしくは細胞傷害性Ｔ細胞応答またはこれらの両方を誘発することが好ましくは可能である。
【０１５３】
本明細書で記載される自己複製ＲＮＡ分子を操作して、複数のヌクレオチド配列を、２つ以上のオープンリーディングフレームから発現させ、これにより、２つ以上の抗原など、タンパク質の、免疫応答の発生を増強しうるサイトカインまたは他の免疫調節物質との共発現を可能とすることができる。このような自己複製ＲＮＡ分子であれば、たとえば多様な遺伝子産物（たとえばタンパク質）を、たとえば二価ワクチンまたは多価ワクチンと同時に産生させるのに特に有用であろう。
【０１５４】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、あらゆる適した方法を使用して調製することができる。当技術分野では、修飾ヌクレオチドを含有するＲＮＡ分子を作製するための複数の適した方法が公知である。たとえば修飾ヌクレオチドを含有する自己複製ＲＮＡ分子は、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ファージＲＮＡポリメラーゼなど、または修飾ヌクレオチドのＲＮＡ分子への効率的な組込みを可能とするこれらのポリメラーゼの変異体など、適したＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、自己複製ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを転写させること（たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける転写）により調製することができる。転写反応物は、ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチド、ならびに適した緩衝液および適した塩など、選択されるポリメラーゼの活性を支援する他の成分を含有するであろう。ヌクレオチドアナログの自己複製ＲＮＡへの組込みは、たとえばこのようなＲＮＡ分子の安定性を改変する、ＲＮアーゼに対する耐性を増大させる、適切な宿主細胞への導入後における複製を確立する（ＲＮＡの「感染性」）、および／または生得免疫応答および獲得免疫応答を誘発もしくは低減するように操作することができる。
【０１５５】
適した合成の方法を、単独でまたは１つもしくは複数の他の方法（たとえば組換えＤＮＡ法または組換えＲＮＡ法）と組み合わせて使用して、本発明の自己複製ＲＮＡ分子を産生することができる。当技術分野では、新規の合成に適した方法が周知であり、特定の適用に適応させることができる。例示的な方法には、たとえばＣＥＭ（Ｍａｓｕｄａら（２００７年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ、５１巻：３〜４頁）などの適した保護基を使用する化学合成；β−シアノエチルホスホルアミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ  Ｓ  Ｌら（１９８１年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ、２２巻：１８５９頁）；ヌクレオシドＨ−ホスホネート法（Ｇａｒｅｇｇ  Ｐら（１９８６年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ、２７巻：４０５１〜４頁；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  Ｂ  Ｃら（１９８６年）、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ、１４巻：５３９９〜４０７頁；Ｇａｒｅｇｇ  Ｐら（１９８６年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ、２７巻：４０５５〜８頁；Ｇａｆｆｎｅｙ  Ｂ  Ｌら（１９８８年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ、２９巻：２６１９〜２２頁）が含まれる。市販されている自動式核酸合成器と使用するために、これらの化学反応を実行するまたは適応させることができる。さらなる適した合成法は、Ｕｈｌｍａｎｎら（１９９０年）、Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ、９０巻：５４４〜８４頁；およびＧｏｏｄｃｈｉｌｄ  Ｊ（１９９０年）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ、１巻：１６５頁において開示されている。核酸合成はまた、ポリヌクレオチドおよびこのようなポリヌクレオチドによりコードされる遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を含め、当技術分野において周知であり通常である、適した組換え法を使用しても実行することができる。遺伝子断片および合成ポリヌクレオチドのランダムな断片化およびＰＣＲによる再構成を介するＤＮＡシャフリングは、ポリヌクレオチド配列を設計および操作するのに使用しうる公知の技法の例である。部位指向変異誘発を使用して、たとえば新たな制限部位を挿入する、グリコシル化パターンを改変する、コドンの優先性を変化させる、スプライス改変体を作製する、変異を導入するなどのように、核酸およびコードされるタンパク質を改変することができる。当技術分野では、核酸配列の転写、翻訳、および発現に適した方法が公知であり、通常である（一般的に、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、２巻、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ａｓｓｏｃ．  ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１３章、１９８８年；Ｇｌｏｖｅｒ、「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、ＩＩ巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈ．，  Ｄ．Ｃ．、３章、１９８６年；Ｂｉｔｔｅｒら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、１５３巻：５１６〜５４４頁（１９８７年）；「Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ」、Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＩおよびＩＩ巻、１９８２年；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃ��ｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年を参照されたい）。
【０１５６】
自己複製ＲＮＡ分子における１つまたは複数の修飾ヌクレオチドの存在および／または量は、任意の適した方法を使用して決定することができる。たとえば自己複製ＲＮＡを、モノホスフェートへと消化し（たとえばヌクレアーゼＰ１を使用して）、脱リン酸化し（たとえばＣＩＡＰなどの適したホスファターゼを使用して）、結果として生じるヌクレオシドを、逆相ＨＰＬＣ（たとえばＹＭＣ  Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱカラム（５ミクロン、４．６×２５０ｍｍ）を使用し、３０％Ｂ（０〜５分）〜１００％Ｂ（５〜１３分）、１００％Ｂ（１３〜４０分）の勾配、流量（０．７ｍｌ／分）、ＵＶ検出（波長：２６０ｎｍ）、カラム温度（３０℃）を使用して溶離する。緩衝液Ａ（ｐＨ３．５の２０ｍＭ酢酸−酢酸アンモニウム）、緩衝液Ｂ（ｐＨ３．５の２０ｍＭ酢酸−酢酸アンモニウム／メタノール［９０／１０］））により分析することができる。
【０１５７】
任意選択により、本発明の自己複製ＲＮＡ分子に、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを包含させ、宿主細胞（たとえばヒト細胞）への導入または移入時における自己複製ＲＮＡ分子の免疫調節活性を、修飾ヌクレオチドを含有しない、対応する自己複製ＲＮＡ分子と比較して低下させてもよい。
【０１５８】
所望の場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける当業者に公知の多様な試験法を使用して、自己複製ＲＮＡ分子をスクリーニングまたは分析し、それらの治療的特性および予防的特性を確認することができる。たとえば自己複製ＲＮＡ分子を含むワクチンを、目的の特定のリンパ球型、たとえばＢ細胞、Ｔ細胞、Ｔ細胞株、およびＴ細胞クローンの増殖またはエフェクター機能の誘発に対するそれらの効果について調べることができる。たとえば免疫化されたマウスに由来する脾臓細胞を単離し、細胞傷害性Ｔリンパ球が、ポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含有する自己標的細胞を溶解させる潜在能力について調べることができる。加えて、ＥＬＩＳＡを介して、ＴＨ１（ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）サイトカインおよび／もしくはＴＨ２（ＩＬ−４およびＩＬ−５）サイトカインの増殖または産生を測定することにより、ヘルパーＴ細胞の分化を分析することもでき、または細胞質サイトカインの染色およびフローサイトメトリーを介して、ＣＤ４＋  Ｔ細胞内で直接的にヘルパーＴ細胞の分化を分析することもできる。
【０１５９】
ポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子はまた、たとえばＢ細胞による目的の抗原に特異的な抗体の産生の誘発により証拠立てられる、体液性免疫応答を誘発する能力についても調べることができる。これらのアッセイは、たとえば免疫化された個体に由来する末梢Ｂリンパ球を使用して行うことができる。このようなアッセイ法は、当業者に公知である。本発明の自己複製ＲＮＡ分子を特徴付けるのに使用しうる他のアッセイは、標的細胞によりコードされる抗原の発現を検出することを伴いうる。たとえばＦＡＣＳを使用して、細胞表面においてまたは細胞内で抗原の発現を検出することができる。ＦＡＣＳによる選択の別の利点は、異なるレベルの発現について分取しうる（場合によって低度の発現が所望でありうる）ことである。特定の抗原を発現させる細胞を同定するために適する他の方法は、プレート上でモノクローナル抗体を使用するパニングまたはモノクローナル抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用する捕捉を伴う。
【０１６０】
本発明の自己複製ＲＮＡは、裸のＲＮＡ送達または細胞への移入を容易とする脂質、ポリマー、もしくは他の化合物と組み合わせた送達など、多様な方法で送達することができる。本発明のＲＮＡ分子は、たとえば直接的な注射、マイクロインジェクション、電気穿孔、リポフェクション、微粒子銃（ｂｉｏｌｙｓｔｉｃｓ）などによるあらゆる適した技法を使用して標的細胞または被験体へと導入することができる。
【０１６１】
Ｃ．ポリペプチド分子
本明細書で記載される免疫原性組成物は、ポリペプチド成分とＲＮＡ成分とを含む。ポリペプチド成分は、ポリペプチド複合体（たとえば２つ以上のタンパク質により形成される複合体）、またはＶＬＰなどの大型のポリペプチド構造など、多重鎖ポリペプチド構造を包含する。
【０１６２】
免疫原性組成物のポリペプチド成分として使用しうる適した抗原（「第２のポリペプチド抗原」）には、細菌性病原体、ウイルス性病原体、真菌性病原体、原虫病原体、または多細胞寄生虫性病原体など、あらゆる病原体に由来するタンパク質およびペプチドが含まれる。例示的な抗原には、ＲＳＶ、ＨＩＶ、またはＣＭＶに由来する抗原など、上記の抗原のうちのいずれか１つが含まれる。組成物は、１つより多いポリペプチド抗原を含有しうる。代替的にまたは加えて、ポリペプチドはまた、同じ病原体の２つの異なるタンパク質に由来する２つ以上のエピトープまたは２つの異なる病原体に由来する２つ以上のエピトープを含む融合ポリペプチドでもありうる。
【０１６３】
ポリペプチド抗原は、発現、産生、精製、または検出を容易とする配列（たとえばポリＨｉｓ配列）など、付加的な配列を包含しうる。
【０１６４】
ポリペプチド抗原は通例、単離または精製されるであろう。したがって、ポリペプチド抗原は、妥当な場合にそれらが通常天然で共に見出される分子と会合していないであろう。
【０１６５】
ポリペプチドは通例、組換え宿主系における発現により調製されるであろう。一般的に、ポリペプチドは、適した組換え宿主細胞において細胞外ドメインをコードする組換え構築物の発現により作製されるが、あらゆる適した方法を使用することができる。適した組換え宿主細胞には、たとえば昆虫細胞（たとえばＡｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、哺乳動物細胞（たとえばヒト、非ヒト霊長動物、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、およびげっ歯動物（たとえばハムスター）、鳥類細胞（たとえばニワトリ、アヒル、およびガチョウ）、細菌（たとえばＥ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種）、酵母細胞（たとえばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕａｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、およびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、テトラヒメナの細胞（たとえばＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、またはこれらの組合せが含まれる。当技術分野では、多くの適した昆虫細胞および哺乳動物細胞が周知である。適した昆虫細胞には、たとえばＳｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｔｎ５細胞、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｓ２細胞、および高度な５細胞（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉのＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４親細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するクローン分離株）が含まれる。適した哺乳動物細胞には、たとえばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞（剪断されたアデノウイルス５型ＤＮＡによって典型的に形質転換されたＨＥＫ２９３細胞）、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、２９３−Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＥＲＣ．６細胞（ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０）、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７１）、ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７５）、胎児アカゲザル肺細胞（ＡＴＣＣ  ＣＬ−１６０）、メイディン−ダービーウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞、メイディン−ダービーイヌ腎臓（「ＭＤＣＫ」）細胞（たとえばＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４；またはＭＤＣＫ  ３３０１６、ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）、ＢＨＫ２１−Ｆなどのベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＨＫＣＣ細胞などが含まれる。適した鳥類細胞には、たとえばニワトリ胚性幹細胞（たとえばＥＢｘ（登録商標）細胞）、ニワトリ胚性線維芽細胞、ニワトリ胚性生殖細胞、アヒル細胞（たとえばＶａｃｃｉｎｅ、２７巻：４９７５〜４９８２頁（２００９年）およびＷＯ２００５／０４２７２８において記載されている、たとえばＡＧＥ１．ＣＲおよびＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ細胞株（ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ））、ＥＢ６６細胞などが含まれ���。
【０１６６】
当業者には、バキュロウイルス系などの適した昆虫細胞発現系が公知であり、たとえばＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、１５５５号（１９８７年）において記載されている。バキュロウイルス／挿入細胞発現系のための材料および方法は、キット形態で、とりわけＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡから市販されている。当業者にはまた、鳥類細胞発現系も公知であり、たとえば米国特許第５，３４０，７４０号；同第５，６５６，４７９号；同第５，８３０，５１０号；同第６，１１４，１６８号；および同第６，５００，６６８号；欧州特許第ＥＰ０７８７１８０Ｂ号；欧州特許出願第ＥＰ０３２９１８１３．８号；ＷＯ０３／０４３４１５；ならびにＷＯ０３／０７６６０１において記載されている。同様に当技術分野ではまた、細菌発現系および哺乳動物細胞発現系も公知であり、たとえば「Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」（Ｂａｒｒら編、１９８９年）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｌｏｎｄｏｎにおいて記載されている。
【０１６７】
ポリペプチドをコードする組換え構築物は、通常の方法を使用して適したベクター内で調製することができる。当技術分野では、昆虫細胞または哺乳動物細胞における組換えタンパク質の発現に適した多数のベクターが周知であり通常のものである。適したベクターは、以下：複製起点；選択マーカー遺伝子；転写制御エレメント（たとえばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター）、および／または１もしくは複数の翻訳シグナルなど、１もしくは複数の発現制御エレメント；ならびに選択された宿主細胞内の分泌経路を標的とするためのシグナル配列もしくはリーダー配列（たとえば哺乳動物を起源とする、または異種哺乳動物もしくは哺乳動物以外の種に由来する）のうちの１または複数が含まれるがこれらに限定されない多数の成分を含有しうる。たとえば昆虫細胞における発現のためには、ｐＦａｓｔＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの適したバキュロウイルス発現ベクターを、組換えバキュロウイルス粒子を作製するために使用する。バキュロウイルス粒子を増幅し、昆虫細胞に感染させて、組換えタンパク質を発現させるために使用する。哺乳動物細胞における発現のためには、所望の哺乳動物の宿主細胞（たとえばチャイニーズハムスター卵巣細胞）における構築物の発現を駆動するベクターを使用する。
【０１６８】
ポリペプチドは、あらゆる適した方法を使用して精製することができる。当技術分野では、たとえばイムノアフィニティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製するための方法が公知である（Ｒｕｉｚ−Ａｒｇｕｅｌｌｏら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．、８５巻：３６７７〜３６８７頁（２００４年））。当技術分野では、沈殿ならびに疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、キレート化クロマトグラフィー、およびサイズ除外クロマトグラフィーなどの多様な種類のクロマトグラフィーを含め、所望のタンパク質を精製するのに適した方法が周知である。これらの適した方法または他の適した方法のうちの２つ以上を使用して適した精製スキームを創出することができる。所望の場合、ポリペプチドは、エピトープタグまたはＨＩＳタグなど、精製を容易にする「タグ」を包含しうる。このようなタグ付けされたポリペプチドは、たとえば馴化培地から、キレート化クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーにより簡便に精製することができる。
【０１６９】
Ｄ．任意選択のＲＮＡ送達系
タンパク質成分およびＲＮＡ成分に加えて、脂質、ポリマー、または他の化合物などの付加的成分を、本明細書で記載される免疫原性組成物中に、任意選択により包含させて、ＲＮＡの標的細胞への移入を容易とすることができる。
【０１７０】
ＲＮＡは、裸のＲＮＡとして（たとえばただＲＮＡの水溶液として）送達して、細胞への移入を増強し、また後の細胞内効果も増強しうるが、ＲＮＡ分子は、粒子状送達系またはエマルジョン送達系などの送達系と組み合わせて投与することが好ましい。大多数の送達系は、当業者に周知である。
【０１７１】
例えば、ＲＮＡ分子は、受容体媒介性エンドサイトーシスによって細胞の中に導入されてもよい。たとえば米国特許第６，０９０，６１９号；ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６３巻：１４６２１頁（１９８８年）；およびＣｕｒｉｅｌら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８巻：８８５０頁（１９９１年）を参照されたい。たとえば、米国特許第６，０８３，７４１号は、それ自体インテグリン受容体結合部分（たとえば配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを有する環状ペプチド）にカップリングされているポリカチオン部分（たとえば３〜１００リシン残基を有するポリＬ−リシン）に核酸を結合することによって、哺乳動物細胞の中に外因性の核酸を導入することを開示する。
【０１７２】
本発明のＲＮＡ分子は、両親媒性物質によって細胞の中に送達することができる。たとえば米国特許第６，０７１，８９０号を参照されたい。典型的に、核酸分子は、カチオン性両親媒性物質と共に複合体を形成してもよい。複合体と接触させた哺乳動物細胞は、容易にそれを取り込むことができる。
【０１７３】
３つの特に有用な送達系は、（ｉ）リポソーム、（ｉｉ）無毒性で生分解性のポリマー微粒子、および（ｉｉｉ）カチオン性サブミクロン水中油型エマルジョンである。
【０１７４】
１．リポソーム
様々な両親媒性脂質は、リポソームとしてＲＮＡ含有水性コアを被包するために、水性環境において二重層を形成することができる。これらの脂質は、アニオン性、カチオン性、または両性イオン性の親水性頭部基（ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐ）を有することができる。アニオン性リン脂質からのリポソームの形成は、１９６０年代にさかのぼり、カチオン性リポソーム形成脂質は、１９９０年代から研究されてきた。いくつかのリン脂質は、アニオン性であるのに対して、他のものは、両性イオン性である。適したクラスのリン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルグリセロールを含むが、これらに限定されず、いくつかの有用なリン脂質は、表２に列挙される。有用なカチオン性脂質は、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ  ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）を含むが、これらに限定されない。両性イオン性脂質は、アシル両性イオン性脂質およびエーテル両性イオン性脂質を含むが、これらに限定されない。有用な両性イオン性脂質の例は、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＣ、およびドデシルホスホコリンである。脂質は、飽和または不飽和であってもよい。
【０１７５】
【表２−１】
2014520807.tif 000005
【０１７６】
【表２−２】
2014520807.tif 000006
【０１７７】
リポソームは、単一の脂質または脂質の混合物から形成することができる。混合物は、（ｉ）アニオン性脂質の混合物（ｉｉ）カチオン性脂質の混合物（ｉｉｉ）両性イオン性脂質の混合物（ｉｖ）アニオン性脂質およびカチオン性脂質の混合物（ｖ）アニオン性脂質および両性イオン性脂質の混合物（ｖｉ）両性イオン性脂質およびカチオン性脂質の混合物、または（ｖｉｉ）アニオン性脂質、カチオン性脂質、および両性イオン性脂質の混合物を含んでいてもよい。同様に、混合物は、飽和および不飽和脂質の両方を含んでいてもよい。たとえば、混合物は、ＤＳＰＣ（両性イオン性、飽和）、ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性、不飽和）、および／またはＤＭＰＧ（アニオン性、飽和）を含んでいてもよい。脂質の混合物が使用される場合、混合物における成分脂質のすべてが、両親媒性である必要があるとは限らない、たとえば、１つまたは複数の両親媒性脂質は、コレステロールと混合することができる。
【０１７８】
脂質の親水性部分は、ペグ化することができる（すなわち、ポリエチレングリコールの共有結合によって修飾することができる）。この修飾は、リポソームの安定性を増大させ、非特異的吸着を予防することができる。たとえば、脂質は、Ｈｅｙｅｓら（２００５年）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７巻：２７６〜８７頁において開示されるものなどの技術を使用してＰＥＧにコンジュゲートすることができる。
【０１７９】
ＤＳＰＣ、ＤｌｉｎＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＰＧ、およびコレステロールの混合物は、本実施例で使用される。本発明の別の態様は、ＤＳＰＣ、ＤｌｉｎＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、およびコレステロールを含むリポソームである。このリポソームは、好ましくは、たとえば免疫原をコードする自己複製ＲＮＡなどのＲＮＡを被包する。
【０１８０】
リポソームは、３つの群に通常分けられる：多重膜小胞（ＭＬＶ）；小型単層小胞（ＳＵＶ）；また大型単層小胞（ＬＵＶ）。ＭＬＶは、いくつかの別々の水性コンパートメントを形成する、それぞれの小胞において複数の二重層を有する。ＳＵＶおよびＬＵＶは、水性コアを被包する単一の二重層を有する；ＳＵＶは、典型的に、直径≦５０ｎｍを有し、ＬＵＶは、直径＞５０ｎｍを有する。本発明で有用なリポソームは、理想的には、５０〜２２０ｎｍの範囲の直径を有するＬＵＶである。異なる直径を有するＬＵＶの集団を含む組成物については：（ｉ）数の上で少なくとも８０％が、２０〜２２０ｎｍの範囲の直径を有するべきであり、（ｉｉ）集団の平均直径（Ｚａｖ、強度による）は、理想的には、４０〜２００ｎｍの範囲にあり、および／または（ｉｉｉ）直径は、多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）＜０．２を有するべきである。
【０１８１】
適したリポソームを調製するための技術は、当技術分野において周知であり、たとえばＬｉｐｏｓｏｍｅｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第１巻：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．（Ｗｅｉｓｓｉｇ編）．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００９年．ＩＳＢＮ  １６０３２７３５９Ｘ；Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ巻、ＩＩ巻、およびＩＩＩ巻．（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編）．Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２００６年；ならびにＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  第４巻（Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ＆  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）．（Ａｒｓｈａｄｙ  ＆  Ｇｕｙｏｔ編）．Ｃｉｔｕｓ  Ｂｏｏｋｓ、２００２年を参照されたい。１つの有用な方法は、（ｉ）脂質のエタノール性の溶液、（ｉｉ）核酸の水溶液、および（ｉｉｉ）緩衝剤を混合し、その後に、混合、平衡化、希釈、および精製を続けることを含む（Ｈｅｙｅｓら（２００５年）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７巻：２７６〜８７頁）。
【０１８２】
ＲＮＡは、好ましくは、リポソーム内に被包され、したがって、リポソームは、水性ＲＮＡ含有コアのまわりに外層を形成する。この被包は、ＲＮアーゼ消化からＲＮＡを保護することが分かっている。リポソームは、いくつかの外部ＲＮＡを含むことができる（たとえばリポソームの表面上に）が、少なくともＲＮＡの半分（理想的には、そのすべて）は、被包される。
【０１８３】
２．ポリマー微粒子
様々なポリマーは、ＲＮＡを被包するまたは吸着するために微粒子を形成することができる。実質的に無毒性のポリマーの使用は、レシピエントが安全に粒子を受けることができることを意味し、生分解性ポリマーの使用は、粒子が、長期的な存続を回避するように送達後に代謝され得ることを意味する。有用なポリマーはまた、医薬グレードの処方物を調製するのを支援するために滅菌することもできる。
【０１８４】
適した無毒性で生分解性のポリマーは、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリラクトン（ポリカプロラクトンを含む）、ポリジオキサノン、ポリバレロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリシアノアクリレート、チロシン由来ポリカーボネート、ポリビニルピロリジノン、またはポリエステルアミドおよびその組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、微粒子は、ポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）などのポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）などのラクチドおよびグリコリドのコポリマー、ならびにＤ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマーから形成される。有用なＰＬＧポリマーは、たとえば２０：８０〜８０：２０、たとえば２５：７５、４０：６０、４５：５５、５５：４５、６０：４０、７５：２５の範囲のラクチド／グリコリドモル比を有するものを含む。有用なＰＬＧポリマーは、たとえば５，０００〜２００，０００Ｄａ、たとえば１０，０００〜１００，０００、２０，０００〜７０，０００、４０，０００〜５０，０００Ｄａの分子量を有するものを含む。
【０１８６】
微粒子は、理想的には、０．０２μｍ〜８μｍの範囲の直径を有する。異なる直径を有する微粒子の集団を含む組成物については、数の上で少なくとも８０％が、０．０３〜７μｍの範囲の直径を有するべきである。
【０１８７】
適した微粒子を調製するための技術は、当技術分野において周知であり、たとえばＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  第４巻（Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，  ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ＆  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）．（Ａｒｓｈａｄｙ  ＆  Ｇｕｙｏｔ編）．Ｃｉｔｕｓ  Ｂｏｏｋｓ、２００２年；Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．（Ｕｃｈｅｇｂｕ  ＆  Ｓｃｈａｔｚｌｅｉｎ編）．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、２００６年．（特に第７章）、およびＭｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．（Ｃｏｈｅｎ  ＆  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ編）．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年を参照されたい。ＲＮＡの吸着を容易にするために、微粒子は、たとえばＯ’Ｈａｇａｎら（２００１年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７５巻：９０３７〜９０４３頁；およびＳｉｎｇｈら（２００３年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０巻：２４７〜２５１頁において開示されるように、カチオン性界面活性剤および／または脂質を含んでいてもよい。ポリマー微粒子を作製するための代替方法は、たとえば国際公開第２００９／１３２２０６号において開示されるように成形し、硬化することによるものである。
【０１８８】
本発明の微粒子は、４０〜１００ｍＶのゼータ電位を有することができる。
【０１８９】
ＲＮＡは、微粒子に吸着することができ、吸着作用は、微粒子中にカチオン性材料（たとえばカチオン性脂質）を含めることによって容易になる。
【０１９０】
３．水中油型カチオン性エマルジョン
水中油型エマルジョンは、インフルエンザワクチンのアジュバント処理（ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ）、たとえばＦＬＵＡＤ（商標）製品におけるＭＦ５９（商標）アジュバント、およびＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸ（商標）製品におけるＡＳ０３アジュバントについて公知である。エマルジョンが１つまたは複数のカチオン性分子を含むという条件で、本発明にしたがうＲＮＡ送達は、水中油型エマルジョンを利用し得る。たとえば、カチオン性脂質は、負に荷電したＲＮＡが付着することができる正に荷電した液滴表面を提供するためにエマルジョン中に含むことができる。
【０１９１】
エマルジョンは、１つまたは複数の油を含む。適した油（複数可）は、たとえば、動物（魚類など）供給源または植物供給源に由来するものを含む。油は、理想的には、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。植物油についての供給源は、堅果、種子、および穀類を含む。最も一般的に入手可能なラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油およびオリーブ油は、堅果油を例示する。たとえばホホバ豆から得られるホホバ油を使用することができる。種子油は、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ油、およびその他同種のものを含む。穀類の群において、コーン油は、最も容易に入手可能であるが、コムギ、カラスムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギ、およびその他同種のものなどの他の穀物粒（ｃｅｒｅａｌ  ｇｒａｉｎ）の油もまた、使用されてもよい。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅果および種子油から出発して、適切な材料の加水分解、分離、およびエステル化によって調製されてもよい。哺乳動物の乳由来の脂肪および油は、代謝可能であり、したがって、使用されてもよい。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、けん化、および他の手段についての手順は、当技術分野において周知である。
【０１９２】
ほとんどの魚は、容易に回収され得る代謝可能な油を含有する。たとえば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨ろうなどの鯨油は、本明細書において使用されてもよいいくつかの魚油を例示する。多くの分枝鎖油は、５−炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、一般的にテルペノイドと呼ばれる。スクアレンは、酵母または他の適切な微生物からも取得することができる。一部の実施形態において、スクアレンは、好ましくは非動物供給源、例えば、オリーブ、オリーブ油または酵母から取得される。スクアラン（スクアレンに対する飽和アナログ）もまた、使用することができる。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、市販の供給源から容易に入手可能であるまたは当技術分野において公知の方法によって得られてもよい。
【０１９３】
他の有用な油は、特にスクアレンと組み合わせたトコフェロールである。エマルジョンの油相がトコフェロールを含む場合、α、β、γ、δ、ε、またはζトコフェロールのいずれかを使用することができるが、α−トコフェロールが好ましい。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールは両方とも使用することができる。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールである。スクアレンおよびトコフェロール（たとえばＤＬ−α−トコフェロール）を含む油の組み合わせを使用することができる。
【０１９４】
好ましいエマルジョンは、スクアレン、分岐不飽和テルペノイドであるサメ肝油を含む（Ｃ３０Ｈ５０；［（ＣＨ３）２Ｃ［＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）］２＝ＣＨＣＨ２−］２；２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン；ＣＡＳ  ＲＮ  ７６８３−６４−９）。
【０１９５】
エマルジョン中の油は、油、たとえばスクアレンおよび少なくとも１つのさらなる油の組み合わせを含んでいてもよい。
【０１９６】
エマルジョンの水性成分は、淡水（ｐｌａｉｎ  ｗａｔｅｒ）（たとえばｗ．ｆ．ｉ．）であり得るか、または成分、たとえば溶質をさらに含むことができる。たとえば、それは、緩衝液を形成するための塩（たとえば、ナトリウム塩などのクエン酸塩またはリン酸塩）を含んでいてもよい。典型的な緩衝剤は、リン酸緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤；ホウ酸緩衝剤；コハク酸緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤；またはクエン酸緩衝剤を含む。緩衝化された水相が好ましく、緩衝剤は、典型的に、５〜２０ｍＭの範囲で含まれるであろう。
【０１９７】
エマルジョンはまた、カチオン性脂質をも含む。好ましくは、この脂質は、それがエマルジョンの形成および安定化を容易にすることができるように、界面活性剤である。有用なカチオン性脂質は、一般的に、たとえば第三級または第四級アミンとして生理学的条件下で正に荷電した窒素原子を含有する。この窒素は、両親媒性界面活性剤の親水性頭部基中にあり得る。有用なカチオン性脂質は、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３’−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ、たとえばブロミド）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含むが、これらに限定されない。他の有用なカチオン性脂質は、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）、塩化ベンゼトニウム、セトラミド（ｃｅｔｒａｍｉｄｅ）（テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドならびにおそらく少量のドデシルトリメチルアンモニウム（ｄｅｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）ブロミドおよびヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含有する）、セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、一級アミン、二級アミン、三級アミン（Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ポリオキシエチレン（１０）−Ｎ−獣脂（ｔａｌｌｏｗ）−１，３−ジアミノプロパンを含むが、これに限定されない）、以下を含むがこれらに限定されない四級アミン塩：ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、混合アルキルトリメチルアンモニウムブロミド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロリド、ベンジルトリメチルアンモニウムメトキシド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、メチルベンゼトニウムクロリド、デカメトニウムクロリド、メチル混合トリアルキルアンモニウムクロリド、メチルトリオクチルアンモニウムクロリド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［２（２−メチル−４−（１，１，３，３テトラメチルブチル）−フェノキシ］−エトキシ）エチル］−ベンゼンメタンアミニウムクロリド（ＤＥＢＤＡ）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、［１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ，トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ジアシル−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジアシル−３（ジメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロール、１，２−ジオレオイル３−スクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル、コレステリル（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノエート、Ｎ−アルキルピリジニウム塩（たとえばセチルピリジニウムブロミドおよびセチルピリジニウムクロリド）、Ｎ−アルキルピペリジニウム塩、ジカチオン性ボラホルム（ｂｏｌａｆｏｒｍ）電解質（Ｃ１２Ｍｅ６；Ｃ１２Ｂｕ６）、ジアルキルグリセチルホスホリルコリン、リソレシチン、Ｌ−αジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、コレステロールヘミスクシネートコリンエステル、リポポリアミン（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン（ＤＰＰＥＳ）、リポポリＬ（またはＤ）−リシン（ＬＰＬＬ、ＬＰＤＬ）、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミンにコンジュゲートされたポリＬ（またはＤ）−リシン、ペンダントアミノ基を有するジドデシルグルタミン酸エステル（Ｃ１２ＧｌｕＰｈＣｎＮ＋）、ペンダントアミノ基を有するジテトラデシルグルタミン酸エステル（Ｃ１４ＧｌｕＣｎＮ＋）を含むが、これらに限定されない）、コレステロールのカチオン性誘導体（コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレンジメチルアミン、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレンジメチルアミンを含むが、これらに限定されない）である。他の有用なカチオン性脂質は、参照によって本明細書において組み込まれるＵＳ  ２００８／００８５８７０およびＵＳ  ２００８／００５７０８０において記載される。
【０１９８】
カチオン性脂質は、好ましくは、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。
【０１９９】
油およびカチオン性脂質に加えて、エマルジョンは、非イオン性界面活性剤および／または両性イオン性界面活性剤を含むことができる。そのような界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、とりわけポリソルベート２０およびポリソルベート８０；線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなどの、ＤＯＷＦＡＸ（商標）商標下で販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；繰り返しのエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変動し得るオクトキシノール、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）などの、ラウリル、セチル、ステアリル、およびオレイルアルコールから誘導されるポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）；ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル；ならびにソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウレートなどのソルビタンエステル（Ｓｐａｎとして一般的に公知）を含むが、これらに限定されない。エマルジョン中に含むための好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【０２００】
これらの界面活性剤の混合物、たとえばＴｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ  ８５混合物またはＴｗｅｅｎ８０／Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００混合物は、エマルジョン中に含むことができる。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）などのポリオキシエチレンソルビタンエステルおよびｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）などのオクトキシノールの組み合わせもまた、適している。他の有用な組み合わせは、ラウレス９ならびにポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。有用な混合物は、１０〜２０の範囲のＨＬＢ値を有する界面活性剤（たとえば、１５．０のＨＬＢを有するポリソルベート８０）および１〜１０の範囲のＨＬＢ値を有する界面活性剤（たとえば、１．８のＨＬＢを有するソルビタントリオレエート）を含むことができる。
【０２０１】
最終エマルジョン中の油の好ましい量（容積による％）は、２〜２０％、たとえば５〜１５％、６〜１４％、７〜１３％、８〜１２％である。約４〜６％または約９〜１１％のスクアレン含有量は、特に有用である。
【０２０２】
最終エマルジョン中の界面活性剤の好ましい量（重量による％）は、０．００１％〜８％である。たとえば、０．２〜４％、特に０．４〜０．６％、０．４５〜０．５５％、約０．５％、または１．５〜２％、１．８〜２．２％、１．９〜２．１％、約２％、または０．８５〜０．９５％、または約１％のポリオキシエチレンソルビタンエステル（ポリソルベート８０など）；０．０２〜２％、特に約０．５％または約１％のソルビタンエステル（ソルビタントリオレエートなど）；０．００１〜０．１％、特に０．００５〜０．０２％のオクチルまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００など）；０．１〜８％、好ましくは０．１〜１０％、特に０．１〜１％、または約０．５％のポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）。
【０２０３】
油および界面活性剤の絶対量ならびにそれらの比は、なおエマルジョンを形成しながらも、広い範囲内で変動され得る。当業者は、所望のエマルジョンを得るために成分の相対的な割合を容易に変動し得るが、油および界面活性剤についての４：１〜５：１の重量比は、典型的である（過剰な油）。
【０２０４】
エマルジョンの免疫賦活性活性を確実にするための重要なパラメーターは、特に大型の動物において、油滴サイズ（直径）である。最も有効なエマルジョンは、サブミクロン（ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ）範囲の液滴サイズを有する。適切には、液滴サイズは、範囲５０〜７５０ｎｍにあるであろう。最も有用には、平均液滴サイズは、２５０ｎｍ未満、たとえば２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満である。平均液滴サイズは、有用には、８０〜１８０ｎｍの範囲にある。理想的には、エマルジョンの油滴の少なくとも８０％（数で）は、直径２５０ｎｍ未満であり、好ましくは少なくとも９０％がそうである。エマルジョン中の平均液滴サイズおよびサイズ分布を決定するための装置は、市販で入手可能である。これらは、典型的に、動的光散乱および／または単一粒子光学検知法（ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｅｎｓｉｎｇ）の技術、たとえば、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＵＳＡ）から入手可能な機器のＡｃｃｕｓｉｚｅｒ（商標）およびＮｉｃｏｍｐ（商標）シリーズ、またはＭａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ＵＫ）からのＺｅｔａｓｉｚｅｒ（商標）機器、またはＨｏｒｉｂａ（Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）からのＰａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ機器を使用する。
【０２０５】
理想的には、液滴サイズの分布（数による）は、１つの最大値だけを有する、すなわち、２つの最大値を有するのではなく、平均値（モード）のあたりで分布する液滴の単一の集団がある。好ましいエマルジョンは、＜０．４、たとえば０．３、０．２、またはそれ以下の多分散性を有する。
【０２０６】
サブミクロン液滴および狭いサイズ分布を有する適したエマルジョンは、微少流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の使用によって得ることができる。この技術は、高圧および高速度で、幾何学的に固定されたチャネルを通して入力成分のストリームを推進させることによって、平均油滴サイズを低下させる。これらのストリームは、チャネル壁、チャンバー壁、および互いに接触する。その結果としての剪断力、衝撃力、およびキャビテーション力は、液滴サイズの低下を引き起こす。微少流動化の繰り返しのステップは、所望の液滴サイズ平均値および分布を有するエマルジョンが達成されるまで、実行することができる。
【０２０７】
微少流動化の代替物として、熱的方法は、転相を引き起こすために使用することができる。これらの方法もまた、厳密な粒度分布を有するサブミクロンエマルジョンを提供することができる。
【０２０８】
好ましいエマルジョンは、濾過滅菌することができる、すなわち、それらの液滴は、２２０ｎｍのフィルターを通過することができる。滅菌の提供と同様に、この手順はまた、エマルジョン中のあらゆる大きな液滴をも除去する。
【０２０９】
ある実施形態では、エマルジョン中のカチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含んでいてもよい。たとえば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．９ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１．８ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌなどのＤＯＴＡＰを含んでいてもよい。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、たとえば０．８ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、または１．６ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む。
【０２１０】
ある実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＣコレステロールである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ  ＤＣコレステロールのＤＣコレステロールを含んでいてもよい。たとえば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．６２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２．４６ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．４６ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約０．６２ｍｇ／ｍｌ、約０．１５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６２ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約２．４６ｍｇ／ｍｌ、約４．９２ｍｇ／ｍｌなどのＤＣコレステロールを含んでいてもよい。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．６２ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌ、たとえば２．４６ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロールを含む。
【０２１１】
ある実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＤＡである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含んでいてもよい。たとえば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．４５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．４５ｍｇ／ｍｌなどのＤＤＡを含んでいてもよい。その代わりに、カチオン性水中油型エマルジョンは、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１ｍｇ／ｍｌ、約２１．５ｍｇ／ｍｌ、約２１．６ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含んでいてもよい。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌ、たとえば１．４５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含む。
【０２１２】
また、本発明のＲＮＡ分子を、個別の患者から外植される細胞（たとえばリンパ球、骨髄吸引物、組織生検材料）またはユニバーサルドナーの造血幹細胞など、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける細胞へと送達した後、これらの細胞を、通例ＲＮＡ分子でトランスフェクトされた細胞についての選択の後で、患者へと再移植することもできる。患者に送達するのに適切な細胞の量は、当業者により決定されうる患者の状態および所望の効果と共に変化するであろう。たとえば米国特許第６，０５４，２８８号；同第６，０４８，５２４号；および同第６，０４８，７２９号を参照されたい。好ましくは、使用される細胞は自己由来、すなわち処置される患者から得られる細胞である。
【０２１３】
Ｅ．アジュバント
ある実施形態では、本明細書で提示される免疫原性組成物が、アジュバントなど、１つもしくは複数の免疫調節剤を包含する、または任意選択により包含する。例示的なアジュバントには、以下でさらに論じられるＴＨ１アジュバントおよび／またはＴＨ２アジュバントが含まれるがこれらに限定されない。ある実施形態では、本明細書で提示される免疫原性組成物中で使用されるアジュバントに、
１．ミネラル含有組成物；
２．油エマルジョン；
３．サポニン処方物；
４．ウィロソームおよびウイルス様粒子；
５．細菌性誘導体または微生物性誘導体；
６．生体付着物質および粘膜付着物質；
７．リポソーム；
８．ポリオキシエチレンエーテル処方物およびポリオキシエチレンエステル処方物；
９．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）；
１０．ムラミルペプチド；
１１．イミダゾキノロン化合物；
１２．チオセミカルバゾン化合物；
１３．トリプタントリン化合物；
１４．ヒト免疫調節物質；
１５．リポペプチド；
１６．ベンゾナフチリジン；
１７．微粒子
１８．免疫刺激性ポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ；たとえばＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチドなど）
が含まれるがこれらに限定されない。
【０２１４】
１．ミネラル含有組成物
アジュバントとしての使用に適したミネラル含有組成物には、アルミニウム塩およびカルシウム塩などのミネラル塩が含まれる。免疫原性組成物には、水酸化物（たとえばオキシ水酸化物）、リン酸塩（たとえばヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩などのミネラル塩（たとえば「ＶＡＣＣＩＮＥ  ＤＥＳＩＧＮ：  ＴＨＥ  ＳＵＢＵＮＩＴ  ＡＮＤ  ＡＤＪＵＶＡＮＴ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ」（Ｐｏｗｅｌｌ，  Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，  ＭＪ．編）（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９５年、８および９章を参照されたい）、または異なるミネラル化合物（たとえば任意選択により過剰なリン酸塩を含む、リン酸アジュバントと水酸化物アジュバントとの混合物）の混合物が含まれ得、これらの化合物は任意の適した形態（たとえばゲル、結晶質、アモルファスなど）をとり、（１つまたは複数の）塩への吸着が好ましい。ミネラル含有組成物はまた、金属塩の粒子としても処方することができる（ＷＯ００／２３１０５）。
【０２１５】
アルミニウム塩は、Ａｌ３＋の用量が１用量当たり０．２〜１．０ｍｇの間であるように、本発明のワクチン中に包含させることができる。
【０２１６】
ある実施形態では、アルミニウムベースのアジュバントが、ミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム（ＡｌＫ（ＳＯ４）２）またはミョウバン誘導体であって、リン酸緩衝液中の抗原をミョウバンと混合するのに続き、水酸化アンモニウムまたは水酸化ナトリウムなどの塩基で滴定および沈殿を行うことにより、ｉｎ  ｓｉｔｕで形成されるミョウバン誘導体などのミョウバン誘導体である。
【０２１７】
ワクチン処方物における使用に適した別のアルミニウムベースのアジュバントは、水酸化アルミニウムアジュバント（Ａｌ（ＯＨ）３）、または約５００ｍ２／ｇの表面積を有する優れた吸着剤である結晶質アルミニウムオキシ水酸化物（ＡｌＯＯＨ）である。代替的にアルミニウムベースのアジュバントは、水酸化アルミニウムアジュバントのヒドロキシル基の一部または全部の代わりにリン酸基を含有する、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡｌＰＯ４）またはヒドロキシリン酸アルミニウムでもありうる。本明細書で提示される好ましいリン酸アルミニウムアジュバントは、酸性、塩基性、および中性の媒体中でアモルファスおよび可溶性である。
【０２１８】
ある実施形態では、アジュバントが、リン酸アルミニウムと水酸化アルミニウムとの両方を含む。より具体的な実施形態では、アジュバントのリン酸アルミニウムの量が、リン酸アルミニウム対水酸化アルミニウムの重量で２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または９：１を超える比など、水酸化アルミニウムの量より多い。別の実施形態では、ワクチン中のアルミニウム塩を、ワクチン１用量当たり０．４〜１．０ｍｇ、またはワクチン１用量当たり０．４〜０．８ｍｇ、またはワクチン１用量当たり０．５〜０．７ｍｇ、またはワクチン１用量当たり約０．６ｍｇで存在させる。
【０２１９】
一般的に、（１つまたは複数の）好ましいアルミニウムベースのアジュバント、またはリン酸アルミニウム対水酸化アルミニウムの比など、複数のアルミニウムベースのアジュバントの比は、抗原が、所望のｐＨでアジュバントと反対の電荷を帯びるように、分子間の静電引力を最適化することにより選択する。たとえばリン酸アルミニウムアジュバント（ｉｅｐ＝４）は、ｐＨ７．４でリゾチームには吸着するが、アルブミンには吸着しない。アルブミンを標的とするならば、水酸化アルミニウムアジュバントが選択されるであろう（ｉｅｐ＝４）。代替的に水酸化アルミニウムのリン酸塩による前処理は、その等電点を低下させ、それをより塩基性の抗原に好ましいアジュバントとする。
【０２２０】
２．油エマルジョン
アジュバントとしての使用に適した油エマルジョン組成物および油エマルジョン処方物（ムラミルペプチドまたは細菌性細胞壁成分など、他の特異的免疫刺激剤を有するまたは有さない）には、ＭＦ５９（マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロンの粒子へと処方される５％のスクアレン、０．５％のＴｗｅｅｎ  ８０、および０．５％のＳｐａｎ  ８５）などのスクアレン−水エマルジョンが含まれる。ＷＯ９０／１４８３７を参照されたい。また、Ｐｏｄｄａ（２００１年）、ＶＡＣＣＩＮＥ、１９巻：２６７３〜２６８０頁；Ｆｒｅｙら（２００３年）、Ｖａｃｃｉｎｅ、２１巻：４２３４〜４２３７頁も参照されたい。ＭＦ５９は、ＦＬＵＡＤ（商標）インフルエンザウイルス三価サブユニットワクチン中でアジュバントとして使用されている。
【０２２１】
本組成物における使用に特に好ましい油エマルジョンアジュバントは、サブミクロンの水中油エマルジョンである。本発明における使用に好ましいサブミクロンの水中油エマルジョンは、４〜５％  ｗ／ｖのスクアレン、０．２５〜１．０％  ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ  ８０（商標）（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、および／または０．２５〜１．０％のＳｐａｎ  ８５（商標）（ソルビタントリオレエート）、ならびに、任意選択により、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ＳＭ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｙｌ−Ｄ−ｉｓｏｇｌｕａｔｍｉｎｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ−２−（ｌ’−２’−  ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ＳＭ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３  −ｈｕｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）−ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）（ＭＴＰ−ＰＥ）を含有するサブミクロンの水中油エマルジョンなど、任意選択により量を変化させるＭＴＰ−ＰＥを含有するスクアレン／水エマルジョン、たとえば「ＭＦ５９」として公知のサブミクロンの水中油エマルジョン（ＷＯ９０／１４８３７；米国特許第６，２９９，８８４号；米国特許第６，４５１，３２５号；およびＯｔｔら、「ＭＦ５９  −  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓａｆｅ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，  Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，  ＭＪ．編）（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）１９９５年、２７７〜２９６頁）である。ＭＦ５９は、４〜５％  ｗ／ｖのスクアレン（たとえば４．３％）、０．２５〜０．５％  ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ  ８０（商標）、および０．５％  ｗ／ｖのＳｐａｎ  ８５（商標）を含有し、任意選択により、Ｍｏｄｅｌ  １１ＯＹマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）などのマイクロフルイダイザーを使用してサブミクロンの粒子へと処方された多様な量のＭＴＰ−ＰＥを含有する。たとえばＭＴＰ−ＰＥは、１用量当たり約０〜５００μｇ、より好ましくは１用量当たり０〜２５０μｇ、および最も好ましくは、１用量当たり０〜１００μｇの量で存在させることができる。本明細書で使用される用語「ＭＦ５９−０」が、ＭＴＰ−ＰＥを欠く上記のサブミクロンの水中油エマルジョンを指すのに対し、用語ＭＦ５９−ＭＴＰは、ＭＴＰ−ＰＥを含有する処方物を指し示す。たとえば「ＭＦ５９−１００」は、１用量当たり１００μｇのＭＴＰ−ＰＥを含有するなどである。本発明における使用のための別のサブミクロンの水中油エマルジョンであるＭＦ６９は、４．３％  ｗ／ｖのスクアレン、０．２５％  ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ  ８０（商標）、および０．７５％  ｗ／ｖのＳｐａｎ  ８５（商標）を含有し、任意選択によりＭＴＰ−ＰＥを含有する。さらに別のサブミクロンの水中油エマルジョンは、ＳＡＦとしてもまた公知であり、１０％のスクアレン、０．４％のＴｗｅｅｎ  ８０（商標）、５％のプ���ロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有し、これもまたサブミクロンのエマルジョンへと微少流動化されるＭＦ７５である。ＭＦ７５−ＭＴＰとは、１用量当たり１００〜４００μｇのＭＴＰ−ＰＥなど、ＭＴＰを包含するＭＦ７５処方物を指し示す。
【０２２２】
本組成物における使用のためのサブミクロンの水中油エマルジョン、これを作製する方法、およびムラミルペプチドなどの免疫刺激剤については、ＷＯ９０／１４８３７；米国特許第６，２９９，８８４号；および米国特許第６，４５１，３２５号において詳細に記載されている。
【０２２３】
本発明ではまた、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）もアジュバントとして使用することができる。
【０２２４】
３．他の免疫アジュバント
サポニンとは、広範囲にわたる植物種の樹皮、葉、茎、根、およびまた花において見出されるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群である。Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ（Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）の木の樹皮から単離されたサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。サポニンはまた、Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルベール（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ））、およびＳａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ）（カスミソウ（ｓｏａｐ  ｒｏｏｔ））から商業的に得ることもできる。サポニンアジュバント処方物には、ＱＳ２１などの精製処方物の他、ＩＳＣＯＭなどの脂質処方物も含まれる。サポニンアジュバント処方物には、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（登録商標）アジュバント（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）が含まれる。
【０２２５】
サポニン組成物は、高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰ−ＴＬＣ）および逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用して精製されている。これらの技法を使用して、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、およびＱＨ−Ｃを含めた特定の精製画分が同定されている。サポニンはＱＳ２１であることが好ましい。米国特許第５，０５７，５４０号では、ＱＳ２１を作製する方法が開示されている。サポニン処方物はまた、コレステロールなどのステロールも含みうる（ＷＯ９６／３３７３９を参照されたい）。
【０２２６】
サポニン処方物は、ステロール、コレステロール、および脂質処方物を包含しうる。サポニンとコレステロールとの組合せを使用して、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる固有の粒子を形成することができる。ＩＳＣＯＭはまた典型的に、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどのリン脂質も包含する。あらゆる公知のサポニンは、ＩＳＣＯＭ中で使用することができる。ＩＳＣＯＭは、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＱＨＡ、およびＱＨＣのうちの１または複数を包含することが好ましい。ＥＰ０１０９９４２、ＷＯ９６／１１７１１、およびＷＯ９６／３３７３９では、ＩＳＣＯＭがさらに記載されている。任意選択により、ＩＳＣＯＭは、追加の（１つまたは複数の）洗浄剤を欠くこともできる。ＷＯ００／０７６２１を参照されたい。
【０２２７】
Ｂａｒｒら（１９９８年）、ＡＤＶ．  ＤＲＵＧ  ＤＥＬ．  ＲＥＶ．、３２巻：２４７〜２７１頁では、サポニンに基づくアジュバントの開発についての総説を見出すことができる。また、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒら（１９９８年）、ＡＤＶ．  ＤＲＵＧ  ＤＥＬ．  ＲＥＶ．、３２巻：３２１〜３３８頁も参照されたい。
【０２２８】
ウィロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）は一般的に、ウイルスに由来する１または複数のタンパク質であって、任意選択により、リン脂質と組み合わせたまたは処方されたタンパク質を含有する。それらは一般的に、非病原性、非複製性であり、一般的に天然のウイルスゲノムのうちのいずれも含有しない。ウイルスタンパク質は、組換えにより作製されうるまたは全ウイルスから単離されうる。ウィロソームまたはＶＬＰにおいて使用するのに適したこれらのウイルスタンパク質には、インフルエンザウイルス（ＨＡまたはＮＡなど）、Ｂ型肝炎ウイルス（コアタンパク質またはカプシドタンパク質など）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡファージ、Ｑβファージ（コートタンパク質など）、ＧＡファージ、ｆｒファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１など）に由来するタンパク質が含まれる。ＶＬＰは、ＷＯ０３／０２４４８０；ＷＯ０３／０２４４８１；Ｎｉｉｋｕｒａら（２００２年）、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、２９３巻：２７３〜２８０頁；Ｌｅｎｚら（２００１年）、Ｊ．  ＩＭＭＵＮＯＬ．、１６６巻（９号）：５３４６〜５３５５頁；Ｐｉｎｔｏら（２００３年）、Ｊ．  ＩＮＦＥＣＴ．  Ｄｉｓ．、１８８巻：３２７〜３３８頁；およびＧｅｒｂｅｒら（２００Ｉ）Ｊ．  ＶＩＲＯＬ．、７５巻（１０号）：４７５２〜４７６０頁においてさらに論じられている。ウィロソームは、たとえばＧｌｕｃｋら（２００２年）、ＶＡＣＣＩＮＥ、２０巻：Ｂ１０〜Ｂ１６頁においてさらに論じられている。鼻腔内用の三価ＩＮＦＬＥＸＡＬ（商標）製品（ＭｉｓｃｈｌｅｒおよびＭｅｔｃａｌｆｅ（２００２年）、ＶＡＣＣＩＮＥ、２０巻、増刊５号：Ｂ１７〜Ｂ２３頁）およびＩＮＦＬＵＶＡＣ  ＰＬＵＳ（商標）製品では、免疫増強再構成型インフルエンザウィロソーム（ＩＲＩＶ）がサブユニット抗原送達系として使用されている。
【０２２９】
アジュバントとしての使用に適した細菌性誘導体または微生物性誘導体には、以下が含まれるがこれらに限定されない。
【０２３０】
（１）腸内細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体：このような誘導体は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）を包含する。３ｄＭＰＬとは、４つ、５つ、または６つのアシル化鎖を有する３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。ＥＰ０６８９４５４では、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小粒子」形態が開示されている。３ｄＭＰＬのこのような「小粒子」は、０．２２ミクロンの膜を介して滅菌濾過するのに十分な程度に小型である（ＥＰ０６８９４５４を参照されたい）。他の非毒性ＬＰＳ誘導体には、アミノアルキルグルコサミニドリン酸塩誘導体、たとえばＲＣ−５２９など、モノホスホリルリピドＡ模倣体が含まれる。Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９９年）、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．、９巻：２２７３〜２２７８頁を参照されたい。
【０２３１】
（２）リピドＡ誘導体：リピドＡ誘導体には、ＯＭ−１７４など、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに由来するリピドＡの誘導体が含まれる。ＯＭ−１７４については、たとえばＭｅｒａｌｄｉら（２００３年）、Ｖａｃｃｉｎｅ、２１巻：２４８５〜２４９１頁；およびＰａｊａｋら（２００３年）、Ｖａｃｃｉｎｅ、２１巻：８３６〜８４２頁において記載されている。別の例示的なアジュバントは、合成のリン脂質二量体のＥ６０２０（日本、東京、エーザイ株式会社）であり、これは、グラム陰性菌に由来する天然のリピドＡのうちの多くの物理化学的特性および生物学的特性を模倣する。
【０２３２】
（３）免疫刺激性オリゴヌクレオチド：本発明におけるアジュバントとしての使用に適した免疫刺激性オリゴヌクレオチドまたはポリマー分子は、ＣｐＧモチーフ（非メチル化シトシンに続きグアノシンを含有し、ホスフェート結合により連結された配列）を含有するヌクレオチド配列を包含する。また、細菌性二本鎖ＲＮＡまたは回文配列もしくはポリ（ｄＧ）配列を含有する細菌性オリゴヌクレオチドも、免疫刺激性であることが示されている。ＣｐＧは、ホスホロチオエート修飾などのヌクレオチド修飾／アナログを包含することができ、二本鎖であってもよく、または一本鎖であってもよい。任意選択により、グアノシンを、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンなどのアナログと交換することもできる。可能なアナログ置換の例については、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら（２００３年）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３１巻（９号）：２３９３〜２４００頁；ＷＯ０２／２６７５７；およびＷＯ９９／６２９２３を参照されたい。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、Ｋｒｉｅｇ（２００３年）、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．、９巻（７号）：８３１〜８３５頁；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅら（２００２年）、ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３２巻：１７９〜１８５頁；ＷＯ９８／４０１００；米国特許第６，２０７，６４６号；米国特許第６，２３９，１１６号；および米国特許第６，４２９，１９９号においてさらに論じられている。
【０２３３】
ＣｐＧ配列は、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴなど、ＴＬＲ９へと方向付けられうる。Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら（２００３年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．、３１巻（３号）：６５４〜６５８頁を参照されたい。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮなど、ＴｈＩ免疫応答を誘発するのに特異的であってもよく、またはＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮなど、Ｂ細胞応答を誘発するのにより特異的であってもよい。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌら（２００３年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７０巻（８号）：４０６１〜４０６８頁；Ｋｒｉｅｇ（２００２年）、ＴＲＥＮＤＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３巻（２号）：６４〜６５頁；およびＷＯ０１／９５９３５において論じられている。ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮであることが好ましい。
【０２３４】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識のために接近可能であるように構築することが好ましい。任意選択により、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列をそれらの３’末端において接合して「イムノマー」を形成してもよい。たとえばＫａｎｄｉｍａｌｌａら（２００３年）、ＢＢＲＣ、３０６巻：９４８〜９５３頁；Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら（２００３年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．、３１巻（３号）：６５４〜６５８頁；Ｂｈａｇａｔら（２００３年）、ＢＢＲＣ、３００巻：８５３〜８６１頁；およびＷＯ０３／０３５８３６を参照されたい。
【０２３５】
また、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリマー分子には、ポリビニル骨格（Ｐｉｔｈａら（１９７０年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ、２０４巻（１号）：３９〜４８頁；Ｐｉｔｈａら（１９７０年）、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、９巻（８号）：９６５〜９７７頁）、およびモルホリノ骨格（米国特許第５，１４２，０４７号；米国特許第５，１８５，４４４号）などであるがこれらに限定されない、代替的なポリマー骨格構造も含まれる。当技術分野では、多様な他の荷電ポリヌクレオチドアナログおよび非荷電ポリヌクレオチドアナログが公知である。当技術分野では、非荷電連結（たとえばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、およびカルバメート）および荷電連結（たとえばホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート）が含まれるがこれらに限定されない、多数の骨格修飾が公知である。
【０２３６】
アジュバントのＩＣ３１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ  ＡＧ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）は、抗菌ペプチドであるＫＬＫおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチドであるＯＤＮＩａを含有する合成の処方物である。２つの成分溶液は、抗原（たとえば抗原と会合した、本発明に従う粒子）と簡単に混合することができ、コンジュゲーションは必要とされない。
【０２３７】
ＡＤＰリボシル化毒素およびそれらの解毒誘導体：細菌性ＡＤＰリボシル化毒素およびそれらの解毒誘導体は、本発明におけるアジュバントとして使用することができる。好ましくは、タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（すなわちＥ．ｃｏｌｉの易熱性腸内毒素「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）に由来する。解毒ＡＤＰリボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用は、ＷＯ９５／１７２１１において記載されており、非経口アジュバントとしての使用は、ＷＯ９８／４２３７５において記載されている。好ましくは、アジュバントが、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴＲ１９２Ｇなどの解毒ＬＴ変異体である。ＡＤＰリボシル化毒素およびそれらの解毒誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２のアジュバントとしての使用は、以下の参考文献：Ｂｅｉｇｎｏｎら（２００２年）、Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．、７０巻（６号）：３０１２〜３０１９頁；Ｐｉｚｚａら（２００１年）、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９巻：２５３４〜２５４１頁；Ｐｉｚｚａら（２０００年）、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２９０巻（４〜５号）：４５５〜４６１頁；Ｓｃｈａｒｔｏｎ−Ｋｅｒｓｔｅｎら（２０００年）、Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．、６８巻（９号）：５３０６〜５３１３頁；Ｒｙａｎら（１９９９年）、Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．、６７巻（１２号）：６２７０〜６２８０頁；Ｐａｒｔｉｄｏｓら（１９９９年）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．、６７巻（３号）：２０９〜２１６頁；Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉら（２００３年）、Ｖａｃｃｉｎｅｓ、２巻（２号）：２８５〜２９３頁；およびＰｉｎｅら（２００２年）、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ、８５巻（１〜３号）：２６３〜２７０頁において見出すことができる。アミノ酸置換の番号について言及は、Ｄｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉら（１９９５年）、Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１５巻（６号）：１１６５〜１１６７頁において示されている、ＡＤＰリボシル化毒素のＡサブユニットおよびＢサブユニットのアラインメントに基づくことが好ましい。
【０２３８】
また、生体付着物質および粘膜付着物質もアジュバントとして使用することができる。適した生体付着物質には、エステル化されたヒアルロン酸マイクロスフェア（Ｓｉｎｇｈら（２００１年）、Ｊ．  Ｃｏｎｔ．  Ｒｅｌｅａｓｅ、７０巻：２６７〜２７６頁）またはポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖、およびカルボキシメチルセルロースの架橋された誘導体などの粘膜付着物質が含まれる。また、キトサンおよびその誘導体も、本発明におけるアジュバントとして使用することができる（ＷＯ９９／２７９６０を参照されたい）。
【０２３９】
アジュバントとしての使用に適したリポソーム処方物の例は、米国特許第６，０９０，４０６号；米国特許第５，９１６，５８８号；およびＥＰ特許公開第ＥＰ０６２６１６９号において記載されている。
【０２４０】
本発明における使用に適したアジュバントは、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルを包含する（たとえばＷＯ９９／５２５４９を参照されたい）。このような処方物には、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１２０７）の他、オクトキシノールなど、少なくとも１つの追加の非イオン性界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤またはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１１５２）がさらに含まれる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ−８−ｓｔｅｏｒｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０２４１】
アジュバントとしての使用に適したＰＣＰＰ処方物については、たとえばＡｎｄｒｉａｎｏｖら（１９９８年）、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９巻（１〜３号）：１０９〜１１５頁；およびＰａｙｎｅら（１９９８年）、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．  Ｒｅｖ．、３１巻（３号）：１８５〜１９６頁において記載されている。
【０２４２】
アジュバントとしての使用に適したムラミルペプチドの例には、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−ｌ−アラニル−ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−ｌ−アラニル−ｄ−イソグルタミニル−ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）が含まれる。
【０２４３】
アジュバントとしての使用に適したイミダゾキノリン化合物の例には、Ｓｔａｎｌｅｙ（２００２年）、Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、２７巻（７号）：５７１〜５７７頁；Ｊｏｎｅｓ（２００３年）、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．  Ｄｒｕｇｓ、４巻（２号）：２１４〜２１８頁；ならびに米国特許第４，６８９，３３８号；同第５，３８９，６４０号；同第５，２６８，３７６号；同第４，９２９，６２４号；同第５，２６６，５７５号；同第５，３５２，７８４号；同第５，４９４，９１６号；同第５，４８２，９３６号；同第５，３４６，９０５号；同第５，３９５，９３７号；同第５，２３８，９４４号；および同第５，５２５，６１２号においてさらに記載されている、イミキモドおよびそのアナログが含まれる。
【０２４４】
アジュバントとしての使用に適したチオセミカルバゾン化合物、ならびにこのような化合物を処方する方法、製造する方法、およびこれらについてスクリーニングする方法の例には、ＷＯ０４／６０３０８において記載される例が含まれる。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αなどのサイトカインを産生するためにヒト末梢血単核細胞を刺激するのに特に有効である。
【０２４５】
アジュバントとしての使用に適したトリプタントリン化合物、ならびにこのような化合物を処方する方法、製造する方法、およびこれらについてスクリーニングする方法の例には、ＷＯ０４／６４７５９において記載される例が含まれる。トリプタントリン化合物は、ＴＮＦ−αなどのサイトカインを産生するためにヒト末梢血単核細胞を刺激するのに特に有効である。
【０２４６】
アジュバントとしての使用に適したベンゾナフチリジン化合物、ならびに処方する方法および製造する方法の例には、ＷＯ２００９／１１１３３７において記載される例が含まれる。
【０２４７】
アジュバントとしての使用に適したリポペプチドについては、上記に記載されている。他の例示的なリポペプチドには、たとえばＴＬＲ２のアゴニストであるＬＰ４０が含まれる。たとえばＡｋｄｉｓら、ＥＵＲ．  Ｊ．  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、３３巻：２７１７〜２６頁（２００３年）を参照されたい。ムレインリポペプチドとは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するリポペプチドである。Ｈａｎｔｋｅら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３４巻：２８４〜２９６頁（１９７３年）を参照されたい。ムレインリポペプチドは、Ｎ−アセチルムラミン酸へと連結されたペプチドを含み、したがって、Ｂａｓｃｈａｎｇら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４５巻（２０号）：６３３１〜６３６０頁（１９８９年）において記載されているムラミルペプチドと類縁である。
【０２４８】
アジュバントとしての使用に適したヒト免疫調節物質には、例だけを目的として述べると、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２）、インターフェロン（例だけを目的として述べると、インターフェロンγなど）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子などのサイトカインが含まれるがこれらに限定されない。
【０２４９】
アジュバントとしての使用に適した微粒子には、生分解性および非毒性の物質（たとえばポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成される微粒子が含まれるがこれらに限定されない。ある実施形態では、このような微粒子を、負に荷電した表面を有するように（たとえばＳＤＳにより）処理する、または正に荷電した表面を有するように（たとえばＣＴＡＢなどのカチオン性洗浄剤により）処理する。アジュバントとしての使用に適した微粒子の粒子直径は、約１００ｎｍ〜約１５０μｍである。ある実施形態では、粒子直径が、約２００ｎｍ〜約３０μｍであり、他の実施形態では、粒子直径が、約５００ｎｍ〜１０μｍである。
【０２５０】
３．キット
（Ａ）ＲＮＡ分子とポリペプチド分子とを共投与するためのキット
本発明はまた、第１のポリペプチド抗原をコードするＲＮＡ分子（ＲＮＡ成分）と、第２のポリペプチド抗原（ポリペプチド成分）とが別個の容器に入ったキットも提供する。たとえばキットは、第１のポリペプチド抗原をコードするＲＮＡ分子を含む組成物を含む第１の容器と、第２のポリペプチド抗原を含む組成物を含む第２の容器とを含有しうる。ポリペプチドまたはＲＮＡ分子は、液体形態であってもよく、または固体形態（たとえば凍結乾燥させた）であってもよい。
【０２５１】
記載されるキットは、本明細書で記載される免疫原性組成物のＲＮＡ成分とポリペプチド成分との共送達のために使用することができる（たとえばＲＮＡ成分とポリペプチド成分とを、同時的送達のために、投与前に混合する、たとえば投与前約７２時間、約４８時間、約２４時間、約１２時間、約１０時間、約９時間、約８時間、約７時間、約６時間、約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間、約４５分間、約３０分間、約１５分間、約１０分間、または約５分間以内に混合する）。
【０２５２】
（Ｂ）初回刺激−追加刺激のためのキット
別の態様では、本発明は、（ｉ）第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む初回刺激組成物と；（ｉｉ）第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む追加刺激組成物とを含み；前記第１のエピトープと第２のエピトープとが同じエピトープであるキットを提供する。キットは、病原体に対する免疫応答を発生させるための「ＲＮＡによる初回刺激、タンパク質による追加刺激」の免疫化レジメンなど、ＲＮＡおよびポリペプチドの逐次投与に適する。
【０２５３】
ＲＮＡによりコードされる抗原（第１のポリペプチド抗原）として使用しうる抗原であって、初回刺激組成物に適した抗原、または追加刺激組成物のためのポリペプチド抗原（第２のポリペプチド抗原）には、細菌性病原体、ウイルス性病原体、真菌性病原体、原虫病原体、または多細胞寄生虫性病原体など、あらゆる病原体に由来するタンパク質およびペプチドが含まれる。例示的な抗原には、ＲＳＶ、ＨＩＶ、またはＣＭＶに由来する抗原など、上記の抗原のうちのいずれか１つが含まれる。
【０２５４】
初回刺激組成物のＲＮＡ分子は、裸のＲＮＡとして（たとえば、単にＲＮＡの水溶液として）送達しうる。代替的に、細胞への移入を増強するために、かつまた後の細胞内効果も増強するために、ＲＮＡ分子が送達系と組み合わせて投与されるように、初回刺激組成物は、送達系（粒子状送達系またはエマルジョン送達系など）を任意選択により含みうる。例示的な送達系は上記に記載されている。送達系は、ＲＮＡ分子（たとえばあらかじめ処方された）と同じ容器内に入れてもよく、またはＲＮＡと異なる容器内に入れてもよい（たとえばＲＮＡと送達系とを別個にパッケージングし、たとえば投与前約７２時間、約４８時間、約２４時間、約１２時間、約１０時間、約９時間、約８時間、約７時間、約６時間、約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間、約４５分間、約３０分間、約１５分間、約１０分間、または約５分間以内に混合することができる）。
【０２５５】
初回刺激組成物、追加刺激組成物、またはこれらの両方は、本明細書で記載されるアジュバントなど、１つまたは複数の免疫調節剤を任意選択により包含しうる。免疫調節剤は、初回刺激組成物もしくは追加刺激組成物と同じ容器内に入れてもよく、または投与前に初回刺激組成物もしくは追加刺激組成物と混合しうる別個の容器内に入れてもよい。
【０２５６】
ＲＮＡ分子を含む初回刺激組成物またはポリペプチドを含む追加刺激組成物は、液体形態であってもよく、または固体形態（たとえば凍結乾燥させた）であってもよい。
【０２５７】
（Ｃ）キットの他の成分
適した容器には、たとえばボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックを含めた多様な材料から形成されうる。容器は、滅菌のアクセスポートを有しうる（たとえば容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針により穿刺可能なストッパーを有するバイアルでありうる）。
【０２５８】
キットは、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、またはデキストロース溶液など、薬学的に許容される緩衝液を含む第３の容器をさらに含みうる。キットはまた、緩衝剤、希釈剤など、薬学的に許容される他の処方溶液、フィルター、注射針、およびシリンジ、または他の送達デバイスを含め、エンドユーザーに有用な他の材料も含有しうる。キットは、アジュバント（アルミニウム含有アジュバントまたはＭＦ５９など）を含む第４の容器もさらに包含しうる。
【０２５９】
キットはまた、免疫を誘発する方法または感染を処置する方法についての書面による指示を含有するパッケージの添付文書も含みうる。パッケージの添付文書は、未承認のパッケージの添付文書の草稿であってもよく、または米国食品医薬品局（ＦＤＡ）または他の規制機関により承認されたパッケージの添付文書であってもよい。
【０２６０】
本発明はまた、上記の免疫原性組成物、初回刺激組成物、または追加刺激組成物であらかじめ充填された送達デバイスも提供する。
【０２６１】
４．医薬組成物
一態様では、本発明は、ＲＮＡ成分とポリペプチド成分とを含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、（ｉ）第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子（ＲＮＡ成分）と；（ｉｉ）第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原（ポリペプチド成分）（前記第１のエピトープと第２のエピトープとは同じ病原体に由来するエピトープである）と；（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容されるビヒクルとを含む。
【０２６２】
別の態様では、本発明は、（ｉ）第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む初回刺激組成物と；（ｉｉ）第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む追加刺激組成物とを含み；前記第１のエピトープと第２のエピトープとが同じエピトープであり；初回刺激組成物、追加刺激組成物、またはこれらの両方が、薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容されるビヒクルを含むキットに関する。
【０２６３】
医薬組成物は典型的に、本明細書で記載される、薬学的に許容される担体および／または適した送達系（リポソーム、ナノエマルジョン、ＰＬＧによる微粒子およびナノ粒子、リポプレックス、キトサンによる微粒子およびナノ粒子、ならびにＲＮＡ送達のための他のポリプレックスなど）を包含する。所望の場合、他の薬学的に許容される成分は、賦形剤およびアジュバントなどを包含しうる。これらの医薬組成物は、ワクチンとして使用することができる。
【０２６４】
薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物により部分的に決定される他、組成物を投与するのに使用される特定の方法によっても決定される。したがって、本発明の医薬組成物に適した多種多様な処方物が存在する。多様な水性担体を使用することができる。医薬組成物において使用するのに適した、薬学的に許容される担体には、真水（たとえばｗ．ｆ．ｉ）または緩衝液、たとえばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、またはクエン酸緩衝液が含まれる。緩衝液の塩は典型的に、５〜２０ｍＭの範囲で包含することができる。
【０２６５】
医薬組成物は滅菌であることが好ましく、通常の滅菌技法で滅菌することができる。
【０２６６】
組成物は、ｐＨ調整剤およびｐＨ緩衝剤、ならびに張度調整剤など、たとえば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど、生理学的状態を近似するのに必要とされる、薬学的に許容される補助物質を含有しうる。
【０２６７】
本発明の医薬組成物のｐＨは、５．０〜９．５の間、たとえば６．０〜８．０の間であることが好ましい。
【０２６８】
本発明の医薬組成物は、張度をもたらすためのナトリウム塩（たとえば塩化ナトリウム）を包含しうる。１０±２ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌ濃度が典型的である（たとえば約９ｍｇ／ｍｌ）。
【０２６９】
本発明の医薬組成物の浸透圧モル濃度は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、たとえば２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、または２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの間でありうる。
【０２７０】
本発明の医薬組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなど、１つまたは複数の防腐剤を包含しうる。水銀非含有組成物が好ましく、防腐剤非含有ワクチンも調製することができる。
【０２７１】
本発明の医薬組成物は、非発熱性であることが好ましく、たとえば１用量当たり＜１ＥＵ（標準的な尺度である内毒素単位）を含有し、１用量当たり＜０．１ＥＵを含有することが好ましい。本発明の医薬組成物は、グルテン非含有であることが好ましい。
【０２７２】
医薬組成物中のポリペプチド分子および／またはＲＮＡ分子の濃度は、変化する可能性があり、選択される特定の投与方式および意図されるレシピエントの必要に従い、流体の容量、粘性、体重、および他の検討事項に基づき選択されるであろう。しかし、医薬組成物は、処置または防止に有効な量（単回用量において、またはシリーズの一部として）など、有効量のＲＮＡ＋ポリペプチド（ＲＮＡによる初回刺激、タンパク質による追加刺激など、同時投与または逐次投与される）を提供するように処方される。この量は、処置される個体の健康および体調、年齢、処置される個体の分類群（たとえば非ヒト霊長動物、霊長動物など）、抗原によりコードされるタンパク質またはペプチドに対して個体の免疫系が反応する能力、処置される状態、および他の関与性の因子に応じて変化する。量は、日常的な試験を介して決定されうる比較的広い範囲内に収まることが予測される。組成物のＲＮＡ含量は一般的に、１用量当たりのＲＮＡの量で表現される。好ましい用量は、≦２００μｇ、≦１００μｇ、≦５０μｇ、または≦１０μｇのＲＮＡであり、発現は、たとえば１用量当たり≦１μｇ、１用量当たり≦１００ｎｇ、１用量当たり≦１０ｎｇ、１用量当たり≦１ｎｇなどはるかに低レベルで見られうる。各用量におけるポリペプチドの量は一般的に、約０．１〜約１００μｇのポリペプチドを含み、約５〜約５０μｇが好ましく、１用量当たり約５〜約２５μｇが代替的に好ましい。
【０２７３】
存在する場合のアジュバントの量は、著明な有害な副作用を有さない免疫調節性応答を誘発する量であろう。特定のワクチンのための任意選択の量は、ワクチンの抗体力価およびそれらのウイルスの中和能についての観察を伴う標準的な研究により確認することができる。アジュバントの量は、１用量当たり約１〜約１００μｇであり、１用量当たり約５〜約５０μｇが好ましく、１用量当たり約２０〜約５０μｇが代替的に好ましい。
【０２７４】
たとえば関節内（ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒ）（関節内（ｉｎ  ｔｈｅ  ｊｏｉｎｔｓ））注射、静脈内注射、または腹腔内注射により、好ましくは筋内注射、皮内注射、または皮下注射によるなど、非経口投与に適する処方物には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および処方物を意図されるレシピエントの血液と等張性とする溶質を含有しうる水性および非水性で等張性の滅菌注射溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および防腐剤を包含しうる水性および非水性の滅菌懸濁液が含まれる。処方物は、アンプルおよびバイアルなど、単位用量または複数用量の密封容器内に存在させることができる。注射溶液および懸濁液は、滅菌の粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。また、ＲＮＡ分子により形質導入される細胞も、静脈内投与または非経口投与することができる。
【０２７５】
経口投与に適する処方物は、（ａ）水、食塩水、またはＰＥＧ  ４００などの希釈剤中に懸濁させた、有効量のパッケージングされた核酸などの液体溶液；（ｂ）各々が液体、固体、顆粒、またはゼラチンとしての所定量の有効成分を含有する、カプセル、小袋（ｓａｃｈｅｔ）、または錠剤；（ｃ）適切な液体中の懸濁液；および（ｄ）適したエマルジョンからなりうる。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、トラガント、微晶質セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状の二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、保湿剤、防腐剤、芳香剤、色素、崩壊剤、および医薬として適合性の担体のうちの１または複数を包含しうる。ロゼンジ形態が、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガントである矯味矯臭剤中に有効成分を含みうる他、香錠は、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースなど、不活性の基剤中に有効成分を含み、アカシアエマルジョン、アカシアゲルなどは、有効成分に加えて、当技術分野で公知の担体を含有する。
【０２７６】
ポリペプチドおよびＲＮＡ分子は、経口投与される場合、消化から保護されなければならないことが認識される。ポリペプチドおよびＲＮＡ分子の保護は、典型的にＲＮＡ分子またはポリペプチド分子を組成物と複合体化させて、ＲＮＡ／ポリペプチドを酸および酵素による加水分解に対して耐性とすることにより、またはＲＮＡ分子またはポリペプチド分子を、リポソームなど、適切に耐性である担体中にパッケージングすることにより達成することができる。当技術分野では、核酸（ＲＮＡ分子など）およびポリペプチドを消化から保護する手段が周知である。
【０２７７】
医薬組成物は、たとえばリポソーム中または有効成分の徐放をもたらす処方物中に被包することができる。たとえばＲＮＡ分子は、リポソームとして処方し、次いで、初回刺激組成物として投与することができる。代替的にリポソームと処方されたＲＮＡは、本発明のＲＮＡ＋ポリペプチド免疫原性組成物を産生するためのポリペプチド分子と混合することができる。代替的にＲＮＡ分子とポリペプチド分子とは、リポソーム内に共被包することができる。
【０２７８】
本明細書で記載される組成物（初回刺激組成物、追加刺激組成物、またはＲＮＡおよびポリペプチドを含む免疫原性組成物）は、単独でまたは他の適した成分と組み合わせて、吸入を介して投与するためのエアゾール処方物へと作製することができる（たとえば「噴霧化」させることができる）。エアゾール処方物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容可能な噴霧体中に入れることができる。
【０２７９】
適した坐剤処方物は、ＲＮＡ、ポリペプチド、または本明細書で記載されるポリペプチドとＲＮＡとの組合せ、および坐剤基剤を含有しうる。適した坐剤基剤には、天然または合成のトリグリセリドまたはパラフィン炭化水素が含まれる。また、本明細書で記載されるポリペプチドおよびＲＮＡ分子ならびに適した基剤、たとえば液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、およびパラフィン炭化水素で充填したゼラチンによる直腸用カプセルを使用することも可能である。
【０２８０】
５．免疫応答を生成させる方法またはこれを増強する方法
（Ａ）ＲＮＡ分子とポリペプチド分子との共投与
別の態様では、本発明は、免疫応答を、それを必要とする脊椎動物、好ましくは哺乳動物などの被験体において誘発する、生成させる、または増強するための方法であって、有効量のＲＮＡ成分とポリペプチド成分とを含む免疫原性組成物を投与するステップを含む方法を提供する。組成物は、（ｉ）第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子（ＲＮＡ成分）と；（ｉｉ）第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原（ポリペプチド成分）とを含み；ここで、前記第１のエピトープと第２のエピトープとは同じ病原体に由来するエピトープである。免疫応答は防御性であることが好ましく、抗体および／または細胞介在性免疫を伴うことが好ましい。方法を使用して、一次免疫応答を誘発することもでき、かつ／または免疫応答を追加刺激することもできる。
【０２８１】
別の態様では、本明細書で開示される免疫原性組成物を、それを必要とする脊椎動物、好ましくは哺乳動物などの被験体において免疫応答を誘発する、生成させる、または増強するための医薬の製造において使用することができる。
【０２８２】
別の態様では、本発明は、それを必要とする被験体（脊椎動物、好ましくは哺乳動物などの）において感染性疾患を処置または予防するための方法であって、有効量のＲＮＡ成分とポリペプチド成分とを含む免疫原性組成物を投与するステップを含む方法を提供する。組成物は、（ｉ）第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子（ＲＮＡ成分）と；（ｉｉ）第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原（ポリペプチド成分）とを含み；ここで、前記第１のエピトープと第２のエピトープとは同じ病原体に由来するエピトープである。
【０２８３】
別の態様では、本明細書で開示される組成物を、それを必要とする脊椎動物、好ましくは哺乳動物などの被験体において感染性疾患を処置または予防するための医薬の製造において使用することができる。
【０２８４】
別の態様では、本発明は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物などの被験体にワクチン接種する、または被験体を病原体（たとえば細菌性病原体、ウイルス性病原体、真菌性病原体、原虫病原体、または多細胞寄生虫性病原体）に対して免疫化するための方法であって、有効量のＲＮＡ成分とポリペプチド成分とを含む免疫原性組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む方法を提供する。組成物は、（ｉ）第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子（ＲＮＡ成分）と；（ｉｉ）第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原（ポリペプチド成分）とを含み；ここで、前記第１のエピトープと第２のエピトープとは同じ病原体に由来するエピトープである。
【０２８５】
別の態様では、本明細書で開示される組成物を、それを必要とする、脊椎動物、好ましくは哺乳動物などの被験体にワクチン接種するための医薬の製造において使用することができる。
【０２８６】
ＲＮＡ分子とポリペプチド分子とを共投与する場合も、ポリペプチド分子とＲＮＡ分子とを別個にパッケージングすることが依然として望ましくあり得る。２つの成分は、たとえば投与前約７２時間、約４８時間、約２４時間、約１２時間、約１０時間、約９時間、約８時間、約７時間、約６時間、約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間、約４５分間、約３０分間、約１５分間、約１０分間、または約５分間以内に混合することができる。たとえばポリペプチド分子とＲＮＡ分子とは、患者のベッドサイドで混合することができる。
【０２８７】
（Ｂ）初回刺激−追加刺激
本発明の一態様は、「初回刺激および追加刺激」による免疫化レジームであって、初回刺激組成物により誘発された免疫応答を、追加刺激組成物により追加刺激する免疫化レジームに関する。たとえば抗原（たとえばポリペプチド抗原、ＲＮＡによりコードされる抗原、弱毒化された病原体、またはこれらの組合せ）による初回刺激（少なくとも１回）の後に、実質的に同じ抗原を同じ形態で含む追加刺激組成物（たとえばタンパク質による初回刺激、タンパク質による追加刺激；ＲＮＡによる初回刺激、ＲＮＡによる追加刺激など）、実質的に同じ抗原を異なる形態で含む追加刺激組成物（たとえばＲＮＡによる初回刺激、タンパク質による追加刺激；この場合、ＲＮＡとタンパク質とが同じ標的抗原を指向する）、または異なる抗原を同じもしくは異なる形態で含む追加刺激組成物（たとえば抗原１を標的とするＲＮＡによる初回刺激、抗原２を標的とするタンパク質による追加刺激、ここで、抗原１と抗原２とは異なるが、共通のエピトープを共有する）を投与して、初回刺激された宿主における免疫応答を追加刺激することができる。
【０２８８】
別の態様では、本発明は、免疫応答を、それを必要とする、脊椎動物、好ましくは哺乳動物などの被験体において誘発する、生成させる、または増強するための方法であって、（ｉ）それを必要とする被験体に、第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む治療有効量の初回刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップと；（ｉｉ）その後この被験体に、第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む治療有効量の追加刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップとを含み；前記第１のエピトープと第２のエピトープとが同じエピトープである方法を提供する。免疫応答は防御性であることが好ましく、抗体および／または細胞介在性免疫を伴うことが好ましい。
【０２８９】
別の態様では、本明細書で開示される初回刺激組成物および追加刺激組成物を、それを必要とする脊椎動物、好ましくは哺乳動物などの被験体において免疫応答を誘発する、生成させる、または増強するための医薬の製造において使用することができる。
【０２９０】
別の態様では、本発明は、それを必要とする被験体（脊椎動物、好ましくは哺乳動物などの）において感染性疾患を処置または予防するための方法であって、（ｉ）それを必要とする被験体に、第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む治療有効量の初回刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップと；（ｉｉ）その後この被験体に、第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む治療有効量の追加刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップとを含み；前記第１のエピトープと第２のエピトープとが同じエピトープである方法を提供する。
【０２９１】
別の態様では、本明細書で開示される初回刺激組成物および追加刺激組成物を、それを必要とする脊椎動物、好ましくは哺乳動物などの被験体において感染性疾患を処置または予防するための医薬の製造において使用することができる。
【０２９２】
別の態様では、本発明は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物などの被験体にワクチン接種する、または被験体を病原体（たとえば細菌性病原体、ウイルス性病原体、真菌性病原体、原虫病原体、または多細胞寄生虫性病原体）に対して免疫化するための方法であって、（ｉ）それを必要とする被験体に、第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む治療有効量の初回刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップと；（ｉｉ）その後この被験体に、第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む治療有効量の追加刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップとを含み；前記第１のエピトープと第２のエピトープとが同じエピトープである方法を提供する。
【０２９３】
別の態様では、本明細書で開示される初回刺激組成物および追加刺激組成物を、それを必要とする、脊椎動物、好ましくは哺乳動物などの被験体にワクチン接種するための医薬の製造において使用することができる。
【０２９４】
初回刺激組成物と追加刺激組成物とは、実質的に同じ（たとえばＲＮＡ＋タンパク質の初回刺激、ＲＮＡ＋タンパク質の追加刺激）であってもよく、または異なって（たとえばＲＮＡ＋タンパク質の初回刺激、タンパク質の追加刺激）いてもよい。
【０２９５】
初回刺激組成物中に包含される抗原と追加刺激組成物中に包含される抗原（ポリペプチド形態にある、またはＲＮＡによりコードされる形態にある）とは、同一である必要はないが、少なくとも１つの共通のエピトープ（たとえば第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードするＲＮＡ分子を含む初回刺激組成物；第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む追加刺激組成物であって；前記第１のエピトープと第２のエピトープとが同じエピトープである）を共有するものとする。
【０２９６】
本発明の一実施形態では、「ＲＮＡによる初回刺激、タンパク質による追加刺激」の免疫化戦略を使用する。ＲＮＡ分子による初回刺激（少なくとも１回）に続き、その後ポリペプチド分子を投与して、初回刺激された宿主における免疫応答を追加刺激する。
【０２９７】
本発明の別の実施形態では、「ＲＮＡ＋タンパク質による初回刺激、タンパク質による追加刺激」の戦略を使用する。ＲＮＡ分子とポリペプチド分子とを含む免疫原性組成物による初回刺激（少なくとも１回）に続き、その後ポリペプチド分子を投与して、初回刺激された宿主における免疫応答を追加刺激する。
【０２９８】
被験体を、１回より多く初回刺激および／または追加刺激することができる。たとえば免疫化戦略は、初回刺激、初回刺激、追加刺激であってもよく；初回刺激、追加刺激、追加刺激であってもよい。ある実施形態では、初回刺激組成物を少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、または少なくとも５回にわたり投与する。ある実施形態では、追加刺激組成物を少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、または少なくとも５回にわたり投与する。
【０２９９】
追加刺激組成物の投与は、初回刺激組成物を投与した約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約８週間、約１２週間、約１６週間、約２０週間、約２４週間、約２８週間、約３２週間、約３６週間、約４０週間、約４４週間、約４８週間、約５２週間、約１カ月間、約２カ月間、約３カ月間、約４カ月間、約５カ月間、約６カ月間、約７カ月間、約８カ月間、約９カ月間、約１０カ月間、約１１カ月間、約１２カ月間、約１８カ月間、約２年間、約３年間、約４年間、約５年間、約６年間、約７年間、約８年間、約９年間、または約１０年間の後など、一般的に初回刺激組成物を投与した数週間後または数カ月後である。
【０３００】
（Ｃ）投与のための付加的な検討事項
本明細書で開示される組成物を投与するのに適した動物被験体には、たとえば魚類、鳥類、ウシ、ブタ、ウマ、シカ、ヒツジ、ヤギ、バイソン、ウサギ、ネコ、イヌ、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウなどが含まれる。哺乳動物は、好ましくはヒトである。ワクチンが予防的使用のためである場合、ヒトは小児（たとえばよちよち歩きの小児または幼児）、ティーンエイジャー、または成人であることが好ましいが；ワクチンが治療的使用のためである場合、ヒトは青少年または成人であることが好ましい。また、小児用に意図されるワクチンを成人へと投与して、たとえば安全性、投与量、免疫原性などを評価することもできる。
【０３０１】
治療的処置の有効性を点検する１つの方法は、本明細書で開示される組成物またはワクチンを投与した後における病原体感染のモニタリングを伴う。予防的処置の有効性を点検する１つの方法は、抗原に対する全身における免疫応答のモニタリング（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの産生レベルのモニタリングなど）および／または粘膜における免疫応答のモニタリング（ＩｇＡの産生レベルのモニタリングなど）を伴う。典型的に、抗原特異的血清抗体応答が、免疫化後であるが攻撃前に決定されるのに対し、抗原特異的粘膜性抗体応答は、免疫化後であり攻撃後に決定される。
【０３０２】
核酸分子（たとえばＲＮＡ）がタンパク質抗原をコードする場合に本明細書で開示される組成物またはワクチンの免疫原性を評価する別の方法は、タンパク質抗原を組換えにより発現させて、患者の血清または粘膜性分泌物を免疫ブロットおよび／またはマイクロアレイによりスクリーニングすることである。タンパク質と患者試料との陽性反応は、患者が問題のタンパク質に対する免疫応答を惹起したことを示す。この方法はまた、タンパク質抗原内の免疫優性抗原および／または免疫優性エピトープを同定するのにも使用することができる。
【０３０３】
組成物の有効性はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて目的の感染病原体の適切な動物モデルを攻撃することによっても決定することができる。
【０３０４】
投与は、単回用量スケジュールによってもよく、または複数回用量スケジュールによってもよい。複数回投与は、一次免疫化スケジュールおよび／または追加投与免疫化スケジュールにおいて使用することができる。複数回用量スケジュールでは、多様な用量を、たとえば非経口の初回刺激および粘膜の追加刺激、粘膜の初回刺激および非経口の追加刺激など、同じ経路により施してもよく、または異なる経路により施してもよい。複数回用量は典型的に、少なくとも１週間（たとえば約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）隔てて投与される。
【０３０５】
本明細書で開示される組成物であって、１つもしくは複数の抗原を包含する、または１つもしくは複数の抗原と共に使用される組成物を使用して、小児および成人の両方を処置することができる。したがって、ヒト被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳でありうる。組成物を受けるのに好ましい被験体は、老齢者（たとえば＞５０歳、＞６０歳であり、好ましくは＞６５歳である）、若齢者（たとえば＜５歳）、入院患者、医療ケア従事者、軍隊および軍の職員、妊婦、慢性疾病患者、または免疫不全患者である。組成物は、これらの群だけに適するわけではなく、集団内でより一般的に使用することができる。
【０３０６】
好ましい投与経路は、筋内注射、腹腔内注射、皮内注射、皮下注射、静脈内注射、動脈内注射、および眼内注射が含まれるがこれらに限定されない。経口投与および経皮投与の他また、吸入または坐剤による投与も想定される。特に好ましい投与経路には、筋内注射、皮内注射、および皮下注射が含まれる。本発明のいくつかの実施形態に従い、組成物は、周知であり広く利用可能な注射針のない注射デバイスを使用して宿主動物へと投与される。
【０３０７】
場合によって、特定の標的細胞型（たとえば抗原提示細胞または抗原プロセシング細胞）を標的とするワクチンを用いることも有利である。
【０３０８】
カテーテルまたは同様のデバイスを使用して、本発明の組成物を、ポリペプチド＋裸のＲＮＡ、送達系と処方されたポリペプチド＋ＲＮＡ（たとえばリポソーム内に被包されるＲＮＡ）、ＲＮＡだけ、またはポリペプチドだけとして、標的器官または組織の中に送達してもよい。適したカテーテルは、たとえば、すべてが参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第４，１８６，７４５号；同第５，３９７，３０７号；同第５，５４７，４７２号；同第５，６７４，１９２号；および同第６，１２９，７０５号において開示されている。本発明のＲＮＡ分子はまた、筋肉などの組織へと直接的に導入することもできる。たとえば米国特許第５，５８０，８５９号を参照されたい。「微粒子銃」または粒子介在性形質転換（たとえばＳａｎｆｏｒｄら、米国特許第４，９４５，０５０号；米国特許第５，０３６，００６号を参照されたい）など、他の方法もまた、ＲＮＡを哺乳動物の細胞へと導入するのに適する。これらの方法は、ＲＮＡの哺乳動物へのｉｎ  ｖｉｖｏにおける導入に有用であるだけでなく、また、哺乳動物へと再導入される細胞のｅｘ  ｖｉｖｏにおける修飾にも有用である。
【０３０９】
本発明は、ＲＮＡ、またはＲＮＡ＋ポリペプチドを送達して、免疫応答を誘発するための、ＲＮＡまたはＲＮＡ＋ポリペプチドを被包したまたは吸着させたリポソーム、ポリマー微粒子、またはサブミクロンのエマルジョン微粒子など、適した送達系の使用を包含する。本発明は、ＲＮＡまたはＲＮＡ＋ポリペプチドを吸着させたかつ／または被包した、リポソーム、微粒子、サブミクロンのエマルジョン、またはこれらの組合せを包含する。
【０３１０】
本明細書で開示される組成物であって、１つもしくは複数の抗原を包含するまたは１つもしくは複数の抗原と共に使用される組成物は、他のワクチン、たとえば麻疹ワクチン、ムンプスワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、ｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅコンジュゲートワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌性コンジュゲートワクチン（四価のＡ  Ｃ  Ｗ１３５  Ｙワクチンなど）、ＲＳウイルスワクチンなどと実質的に同時に（たとえば医療ケア従事者またはワクチン接種施設への同じ医療診察または医療来院の間に）患者へと投与することができる。
【０３１１】
６．定義
本明細書で使用される用語「約」とは、値の±１０％を意味する。
【０３１２】
「抗原」とは、免疫学的な応答を誘発する１つまたは複数のエピトープ（直鎖状エピトープ、コンフォメーショナルエピトープ、またはこれらの両方）を含有する分子を指す。
【０３１３】
「エピトープ」とは、免疫系により（たとえば抗体、免疫グロブリン受容体、Ｂ細胞受容体、またはＴ細胞受容体により）認識される抗原の部分である。エピトープは、直鎖状エピトープであってもよく、またはコンフォメーショナルエピトープであってもよい。一般的に、エピトープとは、天然に存在する抗原内のポリペプチドまたは多糖である。人工抗原では、エピトープが、アルサニル酸誘導体などの低分子量物質でありうる。
【０３１４】
Ｔ細胞とＢ細胞とは、抗原を異なる方式で認識する。Ｔ細胞が、クラスＩＩ  ＭＨＣ分子またはクラスＩ  ＭＨＣ分子に埋め込まれたタンパク質のペプチド断片を細胞の表面において認識するのに対し、Ｂ細胞は、免疫グロブリン様細胞表面受容体を介してプロセシングされていない抗原の表面特徴を認識する。Ｔ細胞の抗原認識機構とＢ細胞の抗原認識機構との差違は、それらのエピトープの異なる性格に反映されている。したがって、Ｂ細胞が、抗原または病原体の表面特徴を認識するのに対し、Ｔ細胞エピトープ（約８〜１２アミノ酸の長さのペプチドを含む）は、抗原の三次元構造の文脈で見ると、「内部」エピトープの他、「表面」エピトープでもありうる。したがって、Ｂ細胞エピトープが、抗原または病原体の表面において露出されることが好ましく、直鎖状エピトープであってもよく、またはコンフォメーショナルエピトープであってもよいのに対し、Ｔ細胞エピトープは典型的に、直鎖状エピトープであるが、利用可能であるまたは抗原の表面にあることが必要とされない。通常、Ｂ細胞エピトープは、少なくとも約５アミノ酸を包含するが、３〜４アミノ酸ほどの小型であってもよい。ＣＴＬエピトープなどのＴ細胞エピトープは典型的に、少なくとも約７〜９アミノ酸を包含し、ヘルパーＴ細胞エピトープは典型的に、少なくとも約１２〜２０アミノ酸を包含する。
【０３１５】
個体を、複数のエピトープを有するポリペプチド抗原で免疫化する多くの場合、応答するＴリンパ球の大部分は、その抗原に由来する１つまたは少数の直鎖状エピトープに特異的であり、かつ／または応答するＢリンパ球の大部分は、その抗原に由来する１つまたは少数の直鎖状エピトープまたはコンフォメーショナルエピトープに特異的であろう。このようなエピトープを典型的に「免疫優性エピトープ」と称する。複数の免疫優性エピトープを有する抗原では、単一のエピトープが、最も優性となる可能性があり、典型的に「主要」免疫優性エピトープと称する。残りの免疫優性エピトープを、典型的に（１つまたは複数の）「二次的」免疫優性エピトープと称する。
【０３１６】
用語「融合ポリペプチド」とは、アミノ酸配列が、少なくとも２つの異なる天然に存在するタンパク質またはポリペプチド鎖に由来する単一のポリペプチドを指す。
【０３１７】
本明細書で使用される用語「裸の」とは、脂質、ポリマー、およびタンパク質など、他の高分子を実質的に含まない核酸を指す。自己複製ＲＮＡなど、「裸の」核酸は、細胞への取込みを改善するために他の高分子と一緒に処方しない。したがって、裸の核酸は、リポソーム、微粒子またはナノ粒子、カチオン性エマルジョンなどの中に被包しない、これらに吸着させない、またはこれらへと結合させない。
【０３１８】
本明細書で使用される「ヌクレオチドアナログ」または「修飾ヌクレオチド」とは、１つまたは複数の化学修飾（たとえば置換）を、ヌクレオシド（たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）（またはウラシル（Ｕ））、アデニン（Ａ）、またはグアニン（Ｇ））の窒素性塩基の内部または表面上において含有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチドアナログは、ヌクレオシドの糖部分（たとえばリボース、デオキシリボース、修飾リボース、修飾デオキシリボース、六員環糖アナログ、または非環式糖アナログ）またはホスフェートの内部または表面上においてさらなる化学修飾を含有しうる。
【０３１９】
用語「病原体」とは、増殖が可能であり、脊椎動物（たとえば哺乳動物）などの宿主生物において疾患または疾病を引き起こすウイルス、真核生物、原核生物、または古細菌を指す。病原体は、ウイルス種、細菌種、原虫種、または真菌種の他、多細胞寄生虫種でありうる。本明細書で使用される２つのエピトープは、２つのエピトープが同じ病原体の種に由来するが、必ずしも同じ株、血清型、クレードなどに由来しない場合も、同じ病原体に由来する。したがって、２つのエピトープは、同じ病原体の２つの異なる亜種、株、または血清型に由来しうる（たとえば１つのエピトープがＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスに由来し、他のエピトープがＨ３Ｎ２インフルエンザウイルスに由来する；１つのエピトープがＨＩＶ−１のクレードＢに由来し、他のエピトープがＨＩＶ−１のクレードＣに由来するなど）。
【０３２０】
本明細書で使用される「ポリペプチド抗原」とは、免疫学的な応答を誘発する１つまたは複数のエピトープ（直鎖状エピトープ、コンフォメーショナルエピトープ、またはこれらの両方）を含むポリペプチドを指す。ポリペプチド抗原には、たとえば天然に存在するタンパク質、天然に存在するタンパク質の変異改変体（たとえば（１つまたは複数の）アミノ酸置換、（１つまたは複数の）アミノ酸付加、または（１つまたは複数の）アミノ酸欠失を有するタンパク質）、天然に存在するタンパク質の切断型形態（たとえば膜アンカー型タンパク質の細胞内ドメインまたは細胞外ドメイン）の他、融合タンパク質（少なくとも２つの異なる天然に存在するタンパク質またはポリペプチド鎖に由来するタンパク質）が含まれる。加えて、ポリペプチド抗原はまた、１つまたは複数のアミノ酸の立体異性体、誘導体、またはアナログを含むポリペプチドも包含する。たとえばアミノ酸誘導体は、たとえばアルキル化、アシル化、カルバミル化、ヨード化など、アミノ酸の化学修飾を包含する。アミノ酸アナログには、たとえばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなど、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を有する化合物が含まれる。ポリペプチド抗原はまた、翻訳後修飾されたポリペプチド（アセチル化、リン酸化、またはグリコシル化されたポリペプチドなど）も包含する。したがって、ポリペプチド抗原のエピトープは、ペプチドに限定されない。たとえばグリコシル化されたポリペプチドのエピトープは、ポリペプチド鎖へと接合された糖基でありうる。
【０３２１】
２つのタンパク質抗原は、２つの抗原の間のアミノ酸配列の同一性が、短い方の抗原の長さにわたり少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％であれば、「実質的に同じ」である。
【０３２２】
本明細書で使用される用語「〜を処置する」、「〜を処置すること」、または「処置」は、疾患もしくは状態の症状の緩和、軽減、もしくは改善、さらなる症状の防止、症状の根底にある代謝性原因の改善もしくは防止、疾患もしくは状態の阻害、たとえば疾患もしくは状態の発症の抑止、疾患もしくは状態の除去、疾患もしくは状態の退縮の惹起、疾患もしくは状態により引き起こされる状態の除去、または疾患もしくは状態の症状の停止を包含する。用語「〜を処置する」、「〜を処置すること」、または「処置」には、予防的処置および／または治療的処置が含まれるがこれらに限定されない。
【０３２３】
用語「ウイルス性レプリコン粒子」または「ＶＲＰ」とは、（１つまたは複数の）構造遺伝子が欠失するために、感染性後代を発生させることが不可能な組換え感染性ビリオンを指す。
【０３２４】
用語「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」とは、ウイルス性コートタンパク質（たとえばカプシド）により形成され、任意選択によりエンベロープにより形成されるが、遺伝物質を有さない構造を指す。ＶＬＰは、ウイルス粒子に類似する。
【実施例】
【０３２５】
ここまで一般的に記載されつつある本発明は、本発明のある態様および実施形態の例示だけを目的として包含されるものであり、本発明を限定することを意図するものではない、以下の例を参照することによりより容易に理解されるであろう。
【０３２６】
方法：
ＲＮＡの合成
アルファウイルスレプリコン（ｖＡ３１７、ｖＡ１７、ｖＡ３３６、ｖＡ１６０、ｖＡ３２２、ｖＡ３１１、ｖＡ３０６、ｖＡ１４２、ｖＡ５２６、ｖＡ５２７、ｖＡ３１８、ｖＡ１４０、ｖＡ３１８、ｖＡ３７２、ｖＡ３６８、ｖＡ３６９の配列を参照されたい）をコードするプラスミドＤＮＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＲＮＡを合成するための鋳型として用いた。レプリコンは、ＲＮＡを複製するために必要とされる遺伝子エレメントを含有するが、粒子のアセンブリーに必要な遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントは欠き、アルファウイルスゲノムの構造遺伝子が、異種タンパク質をコードする配列で交換される。レプリコンが真核細胞へと送達されると、プラス鎖ＲＮＡが翻訳されて、ゲノムＲＮＡを複製するのと併せて、異種遺伝子産物をコードする豊富なサブゲノムｍＲＮＡも転写する、４つの非構造タンパク質が産生される。アルファウイルス構造タンパク質の発現の欠如に起因して、レプリコンは、感染性粒子の生成を誘発することが不可能である。アルファウイルスｃＤＮＡの上流のバクテリオファージ（Ｔ７またはＳＰ６）プロモーターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるレプリコンＲＮＡの合成を容易とし、ポリ（Ａ）テールのすぐ下流の肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）のリボザイムは、その自己切断活性を介して適正な３’末端を生成させる。
【０３２７】
適した制限エンドヌクレアーゼによりＨＤＶリボザイムの下流のプラスミドＤＮＡを直鎖化するのに続き、Ｔ７バクテリオファージまたはＳＰ６バクテリオファージに由来するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてランオフ転写物を合成した。転写は、製造元（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）により提供されている指示書に従い、ヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰ）の各々７．５ｍＭ（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）または５ｍＭ（ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）の存在下、３７℃で２時間にわたり実行した。転写の後、鋳型ＤＮＡを、ＴＵＲＢＯ  ＤＮアーゼ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）で消化させた。レプリコンＲＮＡをＬｉＣｌで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中で再構成した。キャップされていないＲＮＡは、使用者用マニュアルにおいて概括されている通りにＳｃｒｉｐｔＣａｐ  ｍ７Ｇ  Ｃａｐｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、ワクシニアキャッピング酵素（ＶＣＥ）で転写後キャップを施した。転写後キャップを施されたＲＮＡは、ＬｉＣｌで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中で再構成した。ＲＮＡ試料の濃度は、２６０ｎｍにおける光学密度を測定することにより決定した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける転写物の完全性は、変性アガロースゲル電気泳動により確認した。
【０３２８】
ＬＮＰ処方物
１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤｌｉｎＤＭＡ）は、既に公表された手順［Ｈｅｙｅｓ，  Ｊ．、Ｐａｌｍｅｒ，  Ｌ．、Ｂｒｅｍｎｅｒ，  Ｋ．、ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，  Ｉ．、「Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、１０７巻：２７６〜２８７頁（２００５年）］を使用して合成した。１，２−ジステアロイル（Ｄｉａｓｔｅａｒｏｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）は、Ｇｅｎｚｙｍｅから購入した。コレステロールは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｉｓ、ＭＯ）から得た。１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＰＥＧ  ＤＭＧ  ２０００）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＰＥＧ  ＤＭＧ  １０００）、および１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＰＥＧ  ＤＭＧ  ３０００）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）から得た。１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（塩化物塩）（ＤＯＴＡＰ）および３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールヒドロクロリド（ＤＣ−ｃｈｏｌ）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから得た。特許権のある脂質であるＲＶ０３、ＲＶ０４、ＲＶ０５、ＲＶ０６、ＲＶ０７、ＲＶ０８、ＲＶ０９、ＲＶ１０、ＲＶ１１、ＲＶ１２、ＲＶ１５は、既に脂質およびそれらを作製するための方法について開示しているＷＯ２０１１／０７６８０７において記載されている通りに作製した。脂質ＲＶ０２は、ＷＯ２０１１／０５７０２０において開示されている方法を含めた公知の方法に従い、たとえばノルアルゲニンのアルファ−アミノおよびカルボニルを、それぞれ、長鎖アルケノイルおよび長鎖アルキルアミノで置換することにより調製することができる。ＲＶ０２は、構造
【０３２９】
【化３】
2014520807.tif 000007
【０３３０】
を有する。
【０３３１】
ＬＮＰは、以下の３つの方法を使用して処方した：
方法Ａ（４０μｇのバッチ、Ｍｕｓｔａｎｇなし、２回目の混合なし、ＴＦＦなし、透析あり）
エタノール中で新鮮な脂質原液を調製した。３７ｍｇのＤｌｉｎＤＭＡ、１１．８ｍｇのＤＳＰＣ、２７．８ｍｇのコレステロール、および８．０７ｍｇのＰＥＧ  ＤＭＧ  ２０００を秤量し、７．５５ｍＬのエタノール中で溶解させた。調製したばかりの脂質原液を、３７℃で約１５分間にわたり静かに振盪して、均一な混合物を形成した。次いで、１２０．９μＬの原液を、１．８７９ｍＬのエタノールへと添加して、２ｍＬの作業用脂質原液を作製した。この量の脂質を使用して、４０μｇのＲＮＡを８：１のＮ：Ｐ（窒素対ホスフェート）比で有するＬＮＰを形成した。ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性脂質）におけるプロトン化可能な窒素とＲＮＡ上のホスフェートとを、この計算に使用する。１μｇの自己複製ＲＮＡ分子は、３ナノモルずつのアニオン性ホスフェートを含有すると仮定し、１μｇのＤｌｉｎＤＭＡは、１．６ナノモルずつのカチオン性窒素を含有すると仮定した。また、２ｍＬのＲＮＡ作業用溶液も、１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）（Ｔｅｋｎｏｖａ）中に約１μｇ／μＬの原液から調製した。３つの２０ｍＬガラスバイアル（攪拌バーを有する）を、使用前にＲＮａｓｅ  Ａｗａｙ溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）ですすぎ、潤沢なＭｉｌｌｉＱ水で洗浄して、バイアル内のＲＮアーゼを除染した。バイアルのうちの１つをＲＮＡ作業用溶液に使用し、他のバイアルを、脂質およびＲＮＡミックスを回収するのに使用した（後出で記載される通り）。作業用脂質およびＲＮＡ溶液を３７℃で１０分間にわたり加熱してから、３ｃｃのルアロックシリンジ（ＢＤ  Ｍｅｄｉｃａｌ）へと投入した。２ｍＬのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）を、別の３ｃｃシリンジに投入した。ＲＮＡおよび脂質を含有するシリンジは、２ｍｍのＩＤ×３ｍｍのＯＤのＦＥＰ管（［フッ化エチレン−プロピレン］、Ｉｄｅｘ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｏａｋ  Ｈａｒｂｏｒ、ＷＡ）を使用して、Ｔミキサー（ＰＥＥＫ（商標）  ５００μｍ  ＩＤ接合部）へと接続した。Ｔミキサーからの出口もまた、ＦＥＰ管（２ｍｍのＩＤ×３ｍｍ）とした。クエン酸緩衝液を含有する第３のシリンジは、別個の管部分（２ｍｍのＩＤ×３ｍｍのＯＤ）へと接続した。次いで、すべてのシリンジを、シリンジポンプ（ｋｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製；モデル番号：ＫＤＳ−２２０）を使用して、７ｍＬ／分の流量で駆動した。管の出口は、混合物を２０ｍＬガラスバイアル内に回収する（攪拌しながら）ように配置した。次に、ＬＮＰを、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、特別な強度、０．５〜３ｍＬの容量）へと投入し、オートクレーブ処理されたプラスチック容器内の４００〜５００ｍＬの１倍濃度ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ製の１０倍濃度のＡｃｃｕＧＥＮＥ  ＰＢＳから希釈した）に対して４℃で一晩にわたり透析してから、最終生成物を回収した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける実験のために、処方物を、必要とされるＲＮＡ濃度まで、１倍濃度ＰＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ製）で希釈した。
【０３３２】
ｐＫａ
別段であることが明示的に示されない限り、本明細書で言及されるすべてのｐＫａは、標準的な温度および圧力の水中で測定される。また、別段に示されない限り、ｐＫａに対するすべての言及は、以下の技法を使用して測定したｐＫａに対する言及である。エタノール中に２ｍＭの脂質溶液は、脂質を秤量し、次いで、エタノール中で溶解させることにより調製する。９：１のエタノール：メタノール中に０．３ｍＭの蛍光プローブＴＮＳ溶液は、まず、メタノール中に３ｍＭのＴＮＳ溶液を作製し、次いで、エタノールで０．３ｍＭまで希釈することにより調製する。
【０３３３】
リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、および塩化ナトリウムを、それぞれ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、および１５０ｍＭの濃度で含有する水性緩衝液を調製する。緩衝液を８部に分け、１２ＮのＨＣｌまたは６ＮのＮａＯＨにより、ｐＨを、４．４４〜４．５２、５．２７、６．１５〜６．２１、６．５７、７．１０〜７．２０、７．７２〜７．８０、８．２７〜８．３３、および１０．４７〜１１．１２へと調整した。２ｍＭの脂質溶液４００ｕＬと、０．３ｍＭのＴＮＳ溶液８００ｕＬとを混合する。
【０３３４】
Ｔｅｃａｎ  Ｇｅｎｅｓｉｓ  ＲＳＰ  １５０ハイスループット液体処理機およびＧｅｍｉｎｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、７．５ｕＬのプローブ／脂質ミックスを、１ｍＬの９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ  ２６０２５２モデル；Ｎａｌｇａｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）内の２４２．５ｕＬの緩衝液へと添加した。これは、８つの緩衝液すべてについて行う。
【０３３５】
１ｍＬの９６ウェルプレート内で混合した後、１００ｕＬの各プローブ／脂質／緩衝液混合物を、２５０ｕＬの黒色で底部が透明な９６ウェルプレート（ＣＯＳＴＡＲ  ３９０４モデル；Ｃｏｒｎｉｎｇ）へと移す。蛍光の測定は、ＳｏｆｔＭａｘ  ｐｒｏ  ５．２ソフトウェアおよび以下のパラメータを使用するＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５分光光度計上で実行する：
読取りモード：蛍光、トップリード
波長：励起波長：３２２ｎｍ、発光波長：４３１ｎｍ、自動カットオフ波長：４２０ｎｍ
感度：読取り：６、ＰＭＴ：自動
自動ミックス：前：オフ
自動較正：オン
アッセイプレート型：９６ウェル標準透明底部
読み取るウェル：プレートの全体を読み取る
修正時間：オフ
カラム波長の優先：カラム優先
キャリッジ速度：通常
自動読取り：オフ  。
【０３３６】
測定後、９６ウェルプレート上の空のウェルのバックグラウンドの蛍光値を、各プローブ／脂質／緩衝液混合物の蛍光値から減じる。次いで、蛍光強度値を、ｐＨが最低のときの値に対して正規化する。次いで、正規化された蛍光強度対ｐＨチャートをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌソフトウェアによりプロットする。８つの点を滑らかな直線でつなぐ。
【０３３７】
正規化された蛍光強度が０．５と等しくなる直線上の点が見出される。０．５と等しい正規化された蛍光強度に対応するｐＨが見出され、これが脂質のｐＫａであると考えられる。
【０３３８】
方法Ｂ（７５μｇのバッチ、ＰＥＳ中空糸、Ｍｕｓｔａｎｇなし）：
エタノール中で新鮮な脂質原液を調製した。３７ｍｇのＤｌｉｎＤＭＡ、１１．８ｍｇのＤＳＰＣ、２７．８ｍｇのコレステロール、および８．０７ｍｇのＰＥＧ  ＤＭＧ  ２０００を秤量し、７．５５ｍＬのエタノール中で溶解させた。調製したばかりの脂質原液を３７℃で約１５分間にわたり静かに振盪し、均一な混合物を形成した。次いで、２２６．７μＬの原液を、１．７７３ｍＬのエタノールへと添加して、２ｍＬの作業用脂質原液を作製した。この量の脂質を使用して、７５μｇのＲＮＡを８：１のＮ：Ｐ（窒素対ホスフェート）比で有するＬＮＰを形成した。ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性脂質）におけるプロトン化可能な窒素とＲＮＡ上のホスフェートとを、この計算に使用する。１μｇの自己複製ＲＮＡ分子は、３ナノモルずつのアニオン性ホスフェートを含有すると仮定し、１μｇのＤｌｉｎＤＭＡは、１．６ナノモルずつのカチオン性窒素を含有すると仮定した。また、２ｍＬのＲＮＡ作業用溶液も、１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）（Ｔｅｋｎｏｖａ）中に約１μｇ／μＬの原液から調製した。３つの２０ｍＬガラスバイアル（攪拌バーを有する）を、使用前にＲＮａｓｅ  Ａｗａｙ溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）ですすぎ、潤沢なＭｉｌｌｉＱ水で洗浄して、バイアル内のＲＮアーゼを除染した。バイアルのうちの１つをＲＮＡ作業用溶液に使用し、他のバイアルを、脂質およびＲＮＡミックスを回収するのに使用した（後出で記載される通り）。作業用脂質およびＲＮＡ溶液を３７℃で１０分間にわたり加熱してから、３ｃｃのルアロックシリンジ（ＢＤ  Ｍｅｄｉｃａｌ）へと投入した。２ｍＬのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）を、別の３ｃｃシリンジに投入した。ＲＮＡおよび脂質を含有するシリンジは、２ｍｍのＩＤ×３ｍｍのＯＤのＦＥＰ管（［フッ化エチレン−プロピレン］、Ｉｄｅｘ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｏａｋ  Ｈａｒｂｏｒ、ＷＡ）を使用して、Ｔミキサー（ＰＥＥＫ（商標）  ５００μｍ  ＩＤ接合部）へと接続した。Ｔミキサーからの出口もまた、ＦＥＰ管（２ｍｍのＩＤ×３ｍｍ）とした。クエン酸緩衝液を含有する第３のシリンジは、別個の管部分（２ｍｍのＩＤ×３ｍｍのＯＤ）へと接続した。次いで、すべてのシリンジを、シリンジポンプ（ｋｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製；モデル番号：ＫＤＳ−２２０）を使用して、７ｍＬ／分の流量で駆動した。管の出口は、混合物を２０ｍＬガラスバイアル内に回収する（攪拌しながら）ように配置した。攪拌バーを取り出し、エタノール／水溶液を、１時間にわたり室温へと平衡化させた。次いで、混合物を５ｃｃのシリンジに投入し（ＢＤ  Ｍｅｄｉｃａｌ）、これをＦＥＰ管（２ｍｍのＩＤ×３ｍｍのＯＤ）の部分へと適合させ、等しい長さのＦＥＰ管を有する別の５ｃｃシリンジには、等容量の１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）を投入した。２つのシリンジを、シリンジポンプを使用して、７ｍＬ／分の流量で駆動し、最終混合物を２０ｍＬのガラスバイアル内に回収した（攪拌しながら）。次に、ＬＮＰを２ｍＬまで濃縮し、タンジェンシャルフロー・フィルトレーション（ＴＦＦ）系を使用して、１０〜１５容量の１倍濃度ＰＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ製）に対して透析してから、最終生成物を回���した。ＴＦＦ系および中空糸濾過膜は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓから購入し、製造元のガイドラインに従い使用した。１００ｋＤの孔径カットオフおよび２０ｃｍ２の表面積を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）中空糸濾過膜（部品番号：Ｐ−Ｃ１−１００Ｅ−１００−０１Ｎ）を使用した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける実験のために、処方物を、必要とされるＲＮＡ濃度まで、１倍濃度ＰＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ製）で希釈した。
【０３３９】
方法Ｃ（７５μｇのバッチ、ＭｕｓｔａｎｇおよびＰＥＳ中空糸あり）：
エタノール中で新鮮な脂質原液を調製した。３７ｍｇのＤｌｉｎＤＭＡ、１１．８ｍｇのＤＳＰＣ、２７．８ｍｇのコレステロール、および８．０７ｍｇのＰＥＧ  ＤＭＧ  ２０００を秤量し、７．５５ｍＬのエタノール中で溶解させた。調製したばかりの脂質原液を３７℃で約１５分間にわたり静かに振盪し、均一な混合物を形成した。次いで、２２６．７μＬの原液を、１．７７３ｍＬのエタノールへと添加して、２ｍＬの作業用脂質原液を作製した。この量の脂質を使用して、７５μｇのＲＮＡを８：１のＮ：Ｐ（窒素対ホスフェート）比で有するＬＮＰを形成した。ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性脂質）におけるプロトン化可能な窒素とＲＮＡ上のホスフェートとを、この計算に使用する。１μｇの自己複製ＲＮＡ分子は、３ナノモルずつのアニオン性ホスフェートを含有すると仮定し、１μｇのＤｌｉｎＤＭＡは、１．６ナノモルずつのカチオン性窒素を含有すると仮定した。また、２ｍＬのＲＮＡ作業用溶液も、１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）（Ｔｅｋｎｏｖａ）中に約１μｇ／μＬの原液から調製した。３つの２０ｍＬガラスバイアル（攪拌バーを有する）を、使用前にＲＮａｓｅ  Ａｗａｙ溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）ですすぎ、潤沢なＭｉｌｌｉＱ水で洗浄して、バイアル内のＲＮアーゼを除染した。バイアルのうちの１つをＲＮＡ作業用溶液に使用し、他のバイアルを、脂質およびＲＮＡミックスを回収するのに使用した（後出で記載される通り）。作業用脂質およびＲＮＡ溶液を３７℃で１０分間にわたり加熱してから、３ｃｃのルアロックシリンジ（ＢＤ  Ｍｅｄｉｃａｌ）へと投入した。２ｍＬのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）を、別の３ｃｃシリンジに投入した。ＲＮＡおよび脂質を含有するシリンジは、２ｍｍのＩＤ×３ｍｍのＯＤのＦＥＰ管（［フッ化エチレン−プロピレン］、Ｉｄｅｘ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｏａｋ  Ｈａｒｂｏｒ、ＷＡ）を使用して、Ｔミキサー（ＰＥＥＫ（商標）  ５００μｍ  ＩＤ接合部）へと接続した。Ｔミキサーからの出口もまた、ＦＥＰ管（２ｍｍのＩＤ×３ｍｍ）とした。クエン酸緩衝液を含有する第３のシリンジは、別個の管部分（２ｍｍのＩＤ×３ｍｍのＯＤ）へと接続した。次いで、すべてのシリンジを、シリンジポンプ（ｋｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製；モデル番号：ＫＤＳ−２２０）を使用して、７ｍＬ／分の流量で駆動した。管の出口は、混合物を２０ｍＬガラスバイアル内に回収する（攪拌しながら）ように配置した。攪拌バーを取り出し、エタノール／水溶液を、１時間にわたり室温へと平衡化させた。次いで、混合物を５ｃｃのシリンジに投入し（ＢＤ  Ｍｅｄｉｃａｌ）、これをＦＥＰ管（２ｍｍのＩＤ×３ｍｍのＯＤ）の部分へと適合させ、等しい長さのＦＥＰ管を有する別の５ｃｃシリンジには、等容量の１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）を投入した。２つのシリンジを、シリンジポンプを使用して、７ｍＬ／分の流量で駆動し、最終混合物を２０ｍＬのガラスバイアル内に回収した（攪拌しながら）。次に、２回目の混合ステップから回収された混合物（ＬＮＰ）に、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ膜（アニオン性分子に結合し、これらを除去するアニオン交換支持体であって、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＡｎｎＡｒｂｏｒ、ＭＩ、ＵＳＡから得たアニオン交換支持体）中を通過させた。ＬＮＰを通過させる前に、４ｍＬの１Ｍ  ＮａＯＨ、４ｍＬの１Ｍ  ＮａＣｌ、および１０ｍＬの１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）をＭｕｓｔａｎｇ膜に順次通過させた。ＬＮＰを３７℃で１０分間にわたり温めてから、Ｍｕｓｔａｎｇフィルター中を通過させた。次に、ＬＮＰを２ｍＬまで濃縮し、タンジェンシャルフロー・フィルトレーション（ＴＦＦ）系を使用して、１０〜１５容量の１倍濃度ＰＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ製）に対して透析してから、最終生成物を回収した。ＴＦＦ系および中空糸濾過膜は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓから購入し、製造元のガイドラインに従い使用した。１００ｋＤの孔径カットオフおよび２０ｃｍ２の表面積を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）中空糸濾過膜（部品番号：Ｐ−Ｃ１−１００Ｅ−１００−０１Ｎ）を使用した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける実験のために、処方物を、必要とされるＲＮＡ濃度まで、１倍濃度ＰＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ製）で希釈した。
【０３４０】
ＣＮＥ処方物
既に記載されている通り（Ｏｔｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、７９巻、１〜５頁、２００２年）、ＣＭＦ３４に対する１つの大きな修飾を有して、荷電ＭＦ５９と同様に調製した。ＤＯＴＡＰをスクアレン中で直接溶解させ、有機溶媒は使用しなかった。溶媒を、１．６ｍｇ／ｍｌを超えるＤＯＴＡＰを含有するエマルジョン中に包含させると、エマルジョンを作製するのに微少流動化することが不可能な泡沫状の原料が作製されることが発見された。スクアレンを３７℃まで加熱したところ、ＤＯＴＡＰを直接的にスクアレン中で溶解させることが可能となり、次いで、油性相を水性相中にうまく分散させ（たとえばホモジナイゼーションにより）、エマルジョンを作製することができた。
【０３４１】
【表３】
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【０３４２】
ＲＮＡの複合体化
溶液中の窒素の数は、カチオン性脂質濃度から計算したが、たとえばＤＯＴＡＰは、分子１個当たりでプロトン化されうる窒素が１個である。ＲＮＡ濃度を、ＲＮＡ１マイクログラム当たり３ナノモルのホスフェートの推定量を使用して溶液中のホスフェートの量を計算するのに使用した。ＲＮＡ：脂質の量を変化させることにより、Ｎ／Ｐ比を改変することができる。ＲＮＡを、ある窒素／ホスフェート比（Ｎ／Ｐ）の範囲内でＣＮＥへと複合体化させた。Ｎ／Ｐ比の計算は、エマルジョン中で１ミリリットル当たりのプロトン化可能な窒素のモル数を計算することにより行った。ホスフェートの数を計算するために、ＲＮＡ１マイクログラム当たり３ナノモルのホスフェートの定数を使用した。
【０３４３】
値を決定した後、適切な比のエマルジョンをＲＮＡへと添加した。これらの値を使用して、ＲＮＡを適切な濃度へと希釈し、等容量のエマルジョンへと直接的に添加する一方で、軽くボルテックスした。溶液を室温で約２時間にわたり静置した。複合体化させたら、結果として得られる溶液を適切な濃度まで希釈し、１時間以内に使用した。
【０３４４】
粒径
製造元の指示書に従いＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を使用して、粒径を測定した。粒径は、多分散指数（ｐｄｉ）によるＺ平均として報告される。リポソームを１倍濃度ＰＢＳ中で希釈してから測定した。
【０３４５】
被包効率およびＲＮＡ濃度
ＲＮＡの被包百分率およびＲＮＡ濃度は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ  ＲＮＡ試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により決定した。アッセイでは、製造元の指示書に従った。キットにより提供されるリボソームＲＮＡの標準を使用して、検量線を作成した。ＬＮＰを１倍濃度のＴＥ緩衝液（キットによる）中で１０倍または１００倍に希釈してから、色素を添加した。別個に、ＬＮＰを、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する１倍濃度のＴＥ緩衝液中で１０または１００倍に希釈してから、色素を添加した。その後、等量の色素を、各溶液へと添加し、次いで、色素添加後における約１８０μＬの各溶液を２連で９６ウェル組織培養プレート（ＶＷＲから得た；型番：３５３０７２）へと投入した。蛍光（励起波長：４８５ｎｍ、発光波長：５２８ｎｍ）は、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ製）上で読み取った。
【０３４６】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘを使用してＬＮＰを破裂させて、全ＲＮＡ量に対応する蛍光の読取りをもたらし、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘを有さない試料により、被包されていないＲＮＡに対応する蛍光をもたらした。ＲＮＡの被包％は、以下の通りに決定した：ＬＮＰ  ＲＮＡの被包（％）＝［（Ｆｔ−Ｆｉ）／Ｆｔ］×１００［式中、Ｆｔは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘを添加したＬＮＰの蛍光強度であり、Ｆｉは、洗浄剤を添加されていないＬＮＰ溶液の蛍光強度である］。これらの値（ＦｔおよびＦｉ）は、ブランク（１倍濃度のＴＥ緩衝液）の蛍光強度を減じた後で得た。被包されたＲＮＡの濃度は、Ｆｔ−Ｆｉを、作成された検量線と比較することにより得た。すべてのＬＮＰ処方物は、被包された用量に基づき、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて投与した。
【０３４７】
ゲル電気泳動
変性ゲル電気泳動を実行して、処方工程後におけるＲＮＡの完全性について評価し、被包されたＲＮＡのＲＮアーゼからの保護についても評価した。ゲルは、以下の通りに注型した：０．４ｇのアガロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を、３６ｍｌのＤＥＰＣ処理水へと添加し、溶解するまで電子レンジで加熱し、次いで、温熱状態まで冷却した。次いで、４ｍｌの１０倍濃度の変性ゲル緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を、アガロース溶液へと添加した。ゲルを注ぎ込み、室温で少なくとも３０分間にわたり硬化させた。次いで、ゲルを、ゲルタンク内に入れ、１倍濃度のＮｏｒｔｈｅｒｎｍａｘ泳動バッファー（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を添加して、ゲルを数ミリメートル被覆した。
【０３４８】
ＲＮアーゼ保護アッセイ
ＲＮアーゼによる消化は、ＲＮＡ１マイクログラム当たり３．８ｍＡＵのＲＮアーゼＡ（Ａｍｂｉｏｎ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）との室温で３０分間にわたるインキュベーションにより達成した。ＲＮアーゼは、試料を、Ｐｒｏｔｅｎａｓｅ  Ｋ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に、５５℃で１０分間にわたりインキュベートすることにより不活化した。ＲＮアーゼを不活化させた後、試料  対  ２５：２４：１  ｖ／ｖ／ｖのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの１：１  ｖ／ｖの混合物を添加して、ＲＮＡを脂質から抽出し水性相にいれた。数秒間にわたりボルテックスすることにより試料を混合し、次いで、１２ｋ  ＲＰＭで１５分間にわたる遠心分離にかけた。水性相（ＲＮＡを含有する）を取り出し、ＲＮＡを分析するのに使用した。投入する（ウェル１つ当たり４００ｎｇのＲＮＡ）前に、すべての試料を、ホルムアルデヒドローディングダイと共にインキュベートし、６５℃で１０分間にわたり変性させ、室温まで冷却した。Ａｍｂｉｏｎ  Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍマーカーを使用して、ＲＮＡ構築物の分子量を近似した。ゲルは、９０Ｖで泳動させた。ゲルは、製造元（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のガイドラインに従い、０．１％のＳＹＢＲ  ｇｏｌｄを使用して、水中、室温で１時間にわたり振盪することにより染色した。ゲル画像は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｈｅｍｉｄｏｃ  ＸＲＳ画像化システム（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）により撮影した。
【０３４９】
分泌性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）アッセイ
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗原産生の動態および量を評価するために、ＳＥＡＰをコードするＲＮＡレプリコンＳＥＡＰをコードするＲＮＡレプリコンを、筋内注射を介してマウスへ、処方物と一緒にまたは処方物を含めずに投与した。８〜１０週齢で体重約２０ｇの雌ＢＡＬＢ／ｃマウス５匹ずつの群を、ＳＥＡＰをコードするＲＮＡを被包するリポソームで免疫化した。裸のＲＮＡは、ＲＮアーゼ非含有１倍濃度ＰＢＳにより投与した。場合によってまた、陽性対照として、５×１０５感染単位（ＩＵ）の用量のウイルス性レプリコン粒子（ＶＲＰ）も投与する。１００μｌの用量を各マウスの大腿四頭筋へと投与した（部位１カ所当たり５０μｌずつ）。血液試料は、注射の１、３、および６日後に採取した。血清は、回収直後の血液から分離し、使用まで−３０℃で保存した。
【０３５０】
化学発光ＳＥＡＰアッセイ用のＰｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して、血清を分析した。マウス血清を、１倍濃度のＰｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ希釈緩衝液中１：４に希釈した。試料を、アルミニウム製の密封用フォイルで密封した水浴中に入れ、６５℃で３０分間にわたり熱不活化した。氷上で３分間にわたり冷却し、室温へと平衡化した後、５０μＬのＰｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔアッセイ緩衝液を、ウェルへと添加して、試料を室温で５分間にわたり放置した。次いで、ＣＳＰＤ（登録商標）基質（化学発光性のアルカリ性ホスフェート基質）を１：２０で含有する５０μＬの反応緩衝液を添加し、室温で２０分間のインキュベーション後に発光を測定した。発光は、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｃｅｎｔｒｏ  ＬＢ  ９６０ルミノメーター（Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ、ＴＮ）により、ウェル１つ当たり１秒間の積算（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）で測定した。各試料中のＳＥＡＰの活性は、２連で測定し、これらの２回の測定値の平均を取った。
【０３５１】
ウイルス性レプリコン粒子（ＶＲＰ）
ＲＮＡワクチンを、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるレポーター遺伝子または抗原の発現を達成するための従来のＲＮＡベクター法と比較するために、本発明者らは、Ｐｅｒｒｉら（２００３年）、「Ａｎ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｃｈｉｍｅｒａ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｇｅｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７７巻：１０３９４〜１０４０３頁により記載されている方法によりＢＨＫ細胞内で産生されるウイルス性レプリコン粒子（ＶＲＰ）を利用した。この系では、抗原（またはレポーター遺伝子）のレプリコンが、アルファウイルスキメラレプリコン（ＶＣＲ）であって、シンドビスウイルスの３’末端配列（３’ＵＴＲ）およびシンドビスウイルスパッケージングシグナル（ＰＳ）を含有するように操作されたベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）のゲノムに由来するＶＣＲからなった（Ｐｅｒｒｉらの図２を参照されたい）。これらのレプリコンを、それらをベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞へと共電気穿孔することにより、シンドビスウイルスのカプシド遺伝子および糖タンパク質遺伝子をコードする欠損性ヘルパーＲＮＡと共にＶＲＰへとパッケージングした（Ｐｅｒｒｉら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７７巻：１０３９４〜１０４０３頁（２００３年）の図２を参照されたい）。次いで、ＶＲＰを採取し、標準的な方法により力価測定（ｔｉｔｒａｔｅ）し、培養物流体または他の等張性緩衝液中で動物へと接種した。
【０３５２】
ＲＳＶ−Ｆ三量体サブユニットワクチン
ＲＳＶ  Ｆ三量体とは、融合ペプチド領域を欠失させて、他の三量体との会合を防止する、ＲＳＶ  Ｆの細胞外ドメインを含む組換えタンパク質である。結果として得られる構築物は、サイズ除外クロマトグラフィーにより観察される均一な三量体を形成し、予測される表現型であって、電子顕微鏡法により観察される融合後のＦコンフォメーションと符合する表現型を有する。このタンパク質を、昆虫細胞内で発現させ、ＨＩＳタグ付けされた構築物のＣ末端との融合体を介して精製した後、通常の技法を使用するサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。結果として得られるタンパク質試料は、９５％を超える純度を呈示する。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＦサブユニットワクチンについての評価のために、１００μｇ／ｍＬの三量体タンパク質を、１０ｍＭヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．３を使用して、２ｍｇ／ｍＬミョウバンに吸着させ、塩化ナトリウムにより１５０ｍＭへと等張性を調整した。Ｆサブユニットタンパク質は、２〜８℃で静かに攪拌しながら、一晩にわたり、ミョウバンに吸着させた。
【０３５３】
マウス免疫原性研究
８〜１０週齢および体重約２０ｇの雌ＢＡＬＢ／ｃマウス１０匹の群を、０日目および２１日目に免疫化し、１４、３５、および４９日目に採血した。すべての動物の大腿四頭筋に注射し、２本の後肢の各々に同等容量を施した（部位１カ所当たり５０μｌずつ）。Ｔ細胞応答の測定が必要とされる場合は、脾臓を３５または４９日目に摘出した。
【０３５４】
ワクチン接種およびコットンラットへの攻撃
雌コットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ  ｈｉｓｐｉｄｉｓ）は、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。すべての実験は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに従い承認および実行された。動物群は、０日目および２１日目において、表示されたワクチンで筋内免疫化した（ｉ．ｍ．、１００μＬ）。各免疫化の２週間後に血清試料を回収した。免疫化された動物またはワクチン接種されなかった対照動物を、最後の免疫化の４週間後に、１×１０５ＰＦＵのＲＳＶで鼻腔内（ｉ．ｎ．）攻撃した。血液の回収およびＲＳＶによる攻撃は、高精度噴霧器を使用する、３％のイソフルランによる麻酔下で実行した。
【０３５５】
ＲＳＶ  Ｆ特異的ＥＬＩＳＡ
個別の血清試料を、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、ＲＳＶ  Ｆ特異的ＩｇＧの存在についてアッセイした。ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ウェル、Ｎｕｎｃ）を、４℃、ＰＢＳ中に１μｇ／ｍｌの精製ＲＳＶ  Ｆで、一晩にわたりコーティングした。洗浄（０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）後、プレートを、３７℃で少なくとも１．５時間にわたり、ＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロッキングした。次いで、プレートを洗浄し、被験コットンラットおよび対照コットンラットに由来するアッセイ用希釈剤（０．１％のＴｗｅｅｎ−２０および５％のヤギ血清を有するＰＢＳ）中の血清の系列希釈物を添加し、プレートを、３７℃で２時間にわたりインキュベートした。洗浄後、プレートを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートニワトリ抗コットンラットＩｇＧ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｉｎｃ；アッセイ用希釈剤中で１：５，０００に希釈）と共に、３７℃で１時間にわたりインキュベートした。最後に、プレートを洗浄し、１００μＬのＴＭＢペルオキシダーゼ基質溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）を各ウェルへと添加した。反応は、１ＭのＨ３ＰＯ４  １００μＬを添加することにより停止させ、吸光度は、プレートリーダーを使用して４５０ｎｍで読み取った。各血清試料について、血清希釈率の逆数の対数に対する光学密度（ＯＤ）のプロットを、非線形回帰（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）により作成した。力価は、ＯＤが約０．５であるときの血清希釈率の逆数として定義した（全てのプレートに含めた、１：２５００の規定されたの力価でＲＳＶを感染させたコットンラットに由来するプールされた標準的な血清に対して正規化した）。
【０３５６】
ＲＳＶマイクロ中和アッセイ
プラーク低減中和試験（ＰＲＮＴ）により、血清試料を中和抗体の存在について調べた。ＨＩ血清（５％のＨＩ−ＦＢＳを有するＰＢＳ中）の２倍の系列希釈物を、２５μＬ当たり約１１５ＰＦＵをもたらすようにあらかじめ滴定された等容量のＲＳＶ  Ｌｏｎｇへと添加した。血清／ウイルス混合物を、５％のＣＯ２中、３７℃で２時間にわたりインキュベートして、ウイルスの中和を生じさせ、次いで、２５μＬのこの混合物（約１１５ＰＦＵを含有する）を、９６ウェルプレート内のＨＥｐ−２細胞の２連のウェルに接種した。５％のＣＯ２中、３７℃で２時間後、細胞に０．７５％のメチルセルロース／ＥＭＥＭおよび５％のＨＩ−ＦＢＳを重層させ、４２時間にわたりインキュベートした。感染性ウイルス粒子の数は、免疫染色後の自動式計数を介して合胞体の形成を検出することにより決定した。中和力価は、ウェル１つ当たりの合胞体（ｓｙｎｃｔｉａ）の数の、対照（無血清）と比べた少なくとも６０％の低減をもたらす血清希釈率の逆数として定義される。
【０３５７】
ＣＭＶマイクロ中和アッセイ
感染低減中和試験により、血清試料を中和抗体の存在について調べた。ＨＩ血清（１０％のＨＩ  ＦＢＳを有するＤＭＥＭ中）の２倍の系列希釈物を、５０μＬ当たり約２００ＩＵをもたらすようにあらかじめ滴定された等容量のＣＭＶ（ＴＢ４０株または臨床分離株である８８１９）へと添加した。血清／ウイルス混合物を、５％のＣＯ２中、３７℃で２時間にわたりインキュベートして、ウイルスの中和を生じさせ、次いで、５０μＬのこの混合物（約２００ＩＵを含有する）を、９６ハーフウェルプレート内のＡＲＰＥ−１９細胞の２連のウェルに接種した。プレートは、４０〜４４時間にわたりインキュベートした。陽性の感染増殖巣（ｆｏｃｉ）の数は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲートＩＥ１  ＣＭＶモノクローナル抗体による免疫染色後の自動式計数により決定した。中和力価は、ウェル１つ当たりの陽性のウイルス増殖巣の数の、対照（無血清）と比べた５０％の低減をもたらす血清希釈率の逆数として定義される。
【０３５８】
ウシ免疫原性研究
２０頭の初乳無摂取ホルスタイン／ホルスタイン交配仔牛を研究に使用した。すべての仔牛は、雄とした。動物は、地元の供給業者であるＪ＆Ｒから得、施設の手順に従い、同定のために耳に二重にタグ付けした。まず、去勢および角を除去する意図はなかったが、研究が３回目および４回目のワクチン接種を包含するように拡大されると、これらの手順を実行して、動物および取扱者の安全性を確保する一助とした。手順は、ＲＡＣ  ＳＯＰに従い実行した。手順は、研究結果に及ぶ影響が最小であると考えられる時点において行った。すべての仔牛を研究の開始前に、血清中和アッセイを介してプレスクリーニングしたところ、ＢＲＳＶについてセロネガティブであった。セロネガティブの仔牛を、力価が５０〜５００の５０％組織培養感染量（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  Ｄｏｓｅ）（ＴＣＩＤ５０）のＢＲＳＶを使用する定常的ウイルス減殺血清中和（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｖｉｒｕｓ，  ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ  ｓｅｒｕｍ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）（ＳＮ）アッセイにおいてＢＲＳＶに対する力価に対して≦１：４の力価を有する仔牛として定義した。仔牛はまた、獲得の前にも、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）による持続性感染についてスクリーニングした。耳切り試料についての免疫組織化学（ＩＨＣ）試験を、すべての陰性結果に対して実行した。
【０３５９】
０、２１、８６、および１４６日目において、仔牛（１群当たり５頭ずつ）に筋内ワクチン接種を施した。ＲＮＡワクチンおよびＰＢＳワクチンは、頸部の各々の側において、１．０ｍＬずつの分割用量として投与した（２ｍＬの全用量）。Ｔｒｉａｎｇｌｅ  ４製品は、標識されるように投与した（頸部の一方の側において２．０ｍＬの用量）。ＭＦ５９でアジュバント処理されたＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質ワクチン（１５μｇ）を、頸部の各々の側において、１．０ｍＬずつの分割用量として投与した（２ｍＬの全用量）。０、１４、２１、３５、４２、５６、６３、８６、１００、１０７、１１４、１２１、１２８、１３５、１４６、１６０、１６７、１７４、１８１、１８８、１９５、および２０２日目において、抗体分析のために血清を回収した。
【０３６０】
実施例Ｉ−ＲＮＡとタンパク質とのマウスへの共投与
この例では、ＲＳＶ−ＦをコードするＲＮＡ分子またはＧＦＰタンパク質をコードするＲＮＡ分子を、ポリペプチド形態にあるＲＳＶ−Ｆ抗原と共に共投与した。ＲＮＡのその「同族」抗原および「非同族」抗原に対する効果を評価した。ＲＳＶ−Ｆ抗原は、ＲＮＡ分子によりコードされるポリペプチド（ＧＦＰ）に対する配列相同性を共有せず、これと免疫学的に交差反応しないため、ＧＦＰをコードするＲＮＡの「非同族」抗原である。
【０３６１】
本研究のために、３つのＲＮＡ：ＲＳＶの表面融合糖タンパク質（ＲＳＶ−Ｆ）を発現させるｖＡ３１７レプリコン；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現させるｖＡ１７レプリコン；および複製欠損性であり、ＧＦＰをコードするｖＡ３３６レプリコンを使用した。０日目および２１日目において、１群当たり５匹ずつのＢＡＬＢ／ｃマウスに、両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施した。４９日目に、Ｔ細胞分析のために、脾臓を摘出した。合計７０匹の動物を、１４群（１群当たり５匹ずつの動物）に分けた。
【０３６２】
群１には、０、２１日目において、ＲＳＶの全長野生型表面融合糖タンパク質を発現させるＶＲＰ（１×１０６ＩＵ）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施した。
【０３６３】
群２には、０、２１日目において、ＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質（５μｇ）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施した。
【０３６４】
群３には、０、２１日目において、ミョウバンおよび低分子ＴＬＲ７アゴニスト（ＴＬＲ７Ａ；２５μｇ）でアジュバント処理されたＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質ワクチン（５μｇ）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施した。
【０３６５】
群４には、０、２１日目において、ＣＮＥ１７と一緒に処方された（１０：１のＮ：Ｐ比で、タンパク質を添加する前）自己複製ＲＮＡ（ｖＡ３１７、１μｇ、ＲＳＶ−Ｆ）と混合された、ＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質（５μｇ）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施した。
【０３６６】
群５には、０、２１日目において、ＬＮＰ（ＲＶ０１（３６））と一緒に処方された自己複製ＲＮＡ（ｖＡ３１７、１μｇ、ＲＳＶ−Ｆ）と混合された、ＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質（５μｇ）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施した。ＬＮＰは、以下の組成：４０％のＤｌｉｎＤＭＡ、１０％のＤＳＰＣ、４８％のＣｈｏｌ、２％のＰＥＧ  ＤＭＧ  ２０００を有し、Ｎ：Ｐ比が８：１であった。これらは、１５０μｇのＲＮＡバッチサイズを使用したことを除き、方法Ａを使用して作製した。
【０３６７】
群６には、０、２１日目において、空のＬＮＰ（群５に従い作製されたＲＶ０１（３６））と混合された、ＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質（５μｇ）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施した。脂質用量は、０．０１μｇのＲＮＡを含有する、群９および１２におけるＬＮＰ処方物の用量と同等であった。
【０３６８】
群７には、０、２１日目において、空のＬＮＰ（群５に従い作製されたＲＶ０１（３６））と混合された、ＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質（５μｇ）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施した。脂質用量は、０．１μｇのＲＮＡを含有する、群１０および１３におけるＬＮＰ処方物の用量と同等であった。
【０３６９】
群８には、０、２１日目において、空のＬＮＰ（群５に従い作製されたＲＶ０１（３６））と混合された、ＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質（５μｇ）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施した。脂質用量は、１．０μｇのＲＮＡを含有する、群１１および１４におけるＬＮＰ処方物の用量と同等であった。
【０３７０】
群９には、０、２１日目において、ＬＮＰ（群５に従い作製されたＲＶ０１（３６））と処方された自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１７、１μｇ、ＧＦＰ）と混合された、ＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質（５μｇ）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施した。脂質用量は、群６および１２におけるＬＮＰ処方物の用量と同等であった。
【０３７１】
群１０には、０、２１日目において、ＬＮＰ（群５に従い作製されたＲＶ０１（３６））と処方された自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１７、１μｇ、ＧＦＰ）と混合された、ＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質（５μｇ）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施した。脂質用量は、群７および１３におけるＬＮＰ処方物の用量と同等であった。
【０３７２】
群１１には、０、２１日目において、ＬＮＰ（群５に従い作製されたＲＶ０１（３６））と処方された自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１７、１μｇ、ＧＦＰ）と混合された、ＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質（５μｇ）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施した。脂質用量は、群８および１４におけるＬＮＰ処方物の用量と同等であった。
【０３７３】
群１２には、０、２１日目において、ＬＮＰ（群５に従い作製されたＲＶ０１（３６））と処方された非複製ＲＮＡ（ｖＡ３３６、１μｇ、ＧＦＰ）と混合された、ＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質（５μｇ）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施した。脂質用量は、群６および９におけるＬＮＰ処方物の用量と同等であった。
【０３７４】
群１３には、０、２１日目において、ＬＮＰ（群５に従い作製されたＲＶ０１（３６））と処方された非複製ＲＮＡ（ｖＡ３１７、１μｇ、ＧＦＰ）と混合された、ＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質（５μｇ）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施した。脂質用量は、群７および１０におけるＬＮＰ処方物の用量と同等であった。
【０３７５】
群１４には、０、２１日目において、ＬＮＰ（群５に従い作製されたＲＶ０１（３６））と処方された非複製ＲＮＡ（ｖＡ３１７、１μｇ、ＧＦＰ）と混合された、ＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質（５μｇ）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施した。脂質用量は、群８および１１におけるＬＮＰ処方物の用量と同等であった。
【０３７６】
結果および結論
Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価を、表Ｉ−１および２（１４日目）ならびにＩ−３および４（３５日目）に示す。Ｆ特異的血清ＩｇＧ１力価を、表Ｉ−５および６（３５日目）に示し、Ｆ特異的血清ＩｇＧ２ａ力価を、表Ｉ−７〜Ｉ−９（３５日目）に示す。ＲＳＶ血清中和抗体力価を、表Ｉ−１０（３５日目および４９日目）に示す。正味のＦ特異的サイトカイン陽性Ｔ細胞頻度の平均（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）を、表Ｉ−１１およびＩ−１２に示す。
【０３７７】
本研究は、ＬＮＰと処方されたＲＮＡが、組換えタンパク質（ＲＳＶ  Ｆ）のための新規で強力なアジュバントであることを示した。Ｆタンパク質のためのアジュバントとしてのＲＮＡ（ＧＦＰをコードする）を有さないＬＮＰおよびＲＮＡ（ＧＦＰをコードする）を有するＬＮＰについて調べた。Ｆ抗原に特異的な血清抗体および脾臓Ｔ細胞について測定した。ＬＮＰ  ＲＶ０１（ＲＮＡを有さない）を、Ｆタンパク質のためのアジュバントとした。ＧＦＰ  ＲＮＡと処方されたＲＶ０１がなおより有効であったことから、ＬＮＰ成分およびＲＮＡ成分の両方が、アジュバント活性に寄与することが示される。ＲＮＡは、ＩｇＧ２ａを誘発するのに必要とされたが、ＩｇＧ１を誘発するのには必要とされなかったことから、ＬＮＰは「Ｔｈ１」型アジュバントではなかったことが示される。
【０３７８】
タンパク質（ＲＳＶ  Ｆ）とＬＮＰ／ＲＮＡとの組合せについて、Ｆ  ＲＮＡをＧＦＰ  ＲＮＡおよびＲＮＡなし（ＬＮＰはすべてにおいて存在させる）と比較した。抗体応答については、Ｆ  ＲＮＡと、ＧＦＰ  ＲＮＡと、ＲＮＡなしとの間で、上記で言及したＩｇＧ２ａを除き、比較的わずかな差違しか見られなかった。しかし、Ｆ  ＲＮＡは、ＧＦＰ  ＲＮＡまたはＲＮＡなしと比較して卓越したＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘発した。
【０３７９】
【表４−１】
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【０３８０】
【表４−２】
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【０３８１】
【表４−３】
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【０３８２】
【表４−４】
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【０３８３】
【表４−５】
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【０３８４】
【表４−６】
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【０３８５】
【表４−７】
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【０３８６】
【表４−８】
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【０３８７】
【表４−９】
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【０３８８】
【表４−１０】
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【０３８９】
【表４−１１】
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【０３９０】
【表４−１２】
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【０３９１】
実施例ＩＩ−ＲＮＡとタンパク質とのマウスへの共投与およびＲＮＡとタンパク質とのマウスへの逐次投与
本研究のためにｖＡ１４２レプリコンを使用した。この構築物は、融合ペプチドを欠失させたＲＳＶの全長野生型表面融合糖タンパク質を発現させ、レプリコンの３’末端は、リボザイム介在性切断により形成される。合計１１６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、１１群（１群当たり４〜２２匹ずつの動物）に分けた。
【０３９２】
群１（８匹の動物）に、０、２１日目において、アジュバント処理されていないＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質ワクチン（３μｇ）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施し、すべての動物を４２日目に屠殺した。
【０３９３】
群２（２２匹の動物）に、０、２１日目において、ミョウバンでアジュバント処理されたＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質ワクチン（３μｇ）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施した。４匹の動物を４２日目に屠殺した。６匹のマウスに、４２日目において、ミョウバンでアジュバント処理されたＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質ワクチン（３μｇ）による３回目のワクチン接種を施し、動物を６３日目に屠殺した。６匹のマウスに、４２日目において、ＣＮＥ１７と一緒に処方された（１０：１のＮ：Ｐ比）ＲＮＡ（ｖＡ１４２、１μｇ）による３回目のワクチン接種を施し、動物を６３日目に屠殺した。６匹のマウスに、４２日目において、ＬＮＰ（ＲＶ０１（３９））（組成：ＤｌｉｎＤＭＡが４０％、ＤＳＰＣが１０％、Ｃｈｏｌが４８％、ＰＥＧ  ＤＭＧ  ５０００が２％であり、８：１のＮ：Ｐ比であり、方法Ａ、１７５μｇのＲＮＡバッチサイズを使用して作製した）中で処方されたＲＮＡ（ｖＡ１４２、１μｇ）による３回目のワクチン接種を施し、動物を６３日目に屠殺した。
【０３９４】
群３（８匹の動物）に、０、２１日目において、ミョウバンおよび低分子ＴＬＲ７アゴニスト（ＴＬＲ７Ａ）でアジュバント処理されたＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質ワクチン（３μｇ）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施し、すべての動物を４２日目に屠殺した。
【０３９５】
群４（８匹の動物）に、０、２１日目において、ＭＦ５９（ＣＮＥ１７と同等のスクアレン用量）でアジュバント処理されたＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質ワクチン（３μｇ）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施し、すべての動物を４２日目に屠殺した。
【０３９６】
群５（８匹の動物）に、０、２１日目において、ＣＮＥ１７でアジュバント処理されたＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質ワクチン（３μｇ）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施し、動物を４２日目に屠殺した。
【０３９７】
群６（１６匹の動物）に、０、２１日目において、ＣＮＥ１７と一緒に処方されたＲＮＡ（ｖＡ１４２、１μｇ）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施した。４匹の動物を４２日目に屠殺した。６匹のマウスに、４２日目において、ミョウバンでアジュバント処理されたＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質ワクチン（３μｇ）による３回目のワクチン接種を施し、動物を６３日目に屠殺した。６匹のマウスに、４２日目において、ＣＮＥ１７と一緒に処方されたＲＮＡ（ｖＡ１４２、１μｇ）による３回目のワクチン接種を施し、動物を６３日目に屠殺した。
【０３９８】
群７（１６匹の動物）に、０、２１日目において、ＬＮＰ（ＲＶ０１（３９））（組成：ＤｌｉｎＤＭＡが４０％、ＤＳＰＣが１０％、Ｃｈｏｌが４８％、ＰＥＧ  ＤＭＧ  ５０００が２％であり、８：１のＮ：Ｐ比であり、方法Ａ、１７５μｇのＲＮＡバッチサイズを使用して作製した）と処方されたＲＮＡ（ｖＡ１４２、１μｇ）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施した。４匹の動物を４２日目に屠殺した。６匹のマウスに、４２日目において、ミョウバンでアジュバント処理されたＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質ワクチン（３μｇ）による３回目のワクチン接種を施し、動物を６３日目に屠殺した。６匹のマウスに、４２日目において、ＬＮＰ（ＲＶ０１（３９））（組成：ＤｌｉｎＤＭＡが４０％、ＤＳＰＣが１０％、Ｃｈｏｌが４８％、ＰＥＧ  ＤＭＧ  ５０００が２％であり、８：１のＮ：Ｐ比であり、方法Ａ、１７５μｇのＲＮＡバッチサイズを使用して作製した）と処方されたＲＮＡ（ｖＡ１４２、１μｇ）による３回目のワクチン接種を施し、動物を６３日目に屠殺した。
【０３９９】
群８（８匹の動物）に、０、２１日目において、ＣＮＥ１７と一緒に処方されたＲＮＡ（ｖＡ１４２、１μｇ）およびＲＳＶ−Ｆタンパク質サブユニット（ミョウバンもＭＦ５９もなし）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施した。すべての動物を４２日目に屠殺した。
【０４００】
群９（８匹の動物）に、０、２１日目において、ＬＮＰ（ＲＶ０１（３９））（組成：ＤｌｉｎＤＭＡが４０％、ＤＳＰＣが１０％、Ｃｈｏｌが４８％、ＰＥＧ  ＤＭＧ  ５０００が２％であり、８：１のＮ：Ｐ比であり、方法Ａ、１７５μｇのＲＮＡバッチサイズを使用して作製した）中で処方され、ＲＳＶ−Ｆタンパク質サブユニット（ミョウバンもＭＦ５９もなし）と混合されたＲＮＡ（ｖＡ１４２、１μｇ）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施した。すべての動物を４２日目に屠殺した。
【０４０１】
群１０（１０匹の動物）に、０、２１日目において、融合ペプチドを欠失させたＲＳＶの全長野生型表面融合糖タンパク質を発現させるＶＲＰ（１×１０６ＩＵ）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施した。４匹の動物を４２日目に屠殺した。６匹のマウスに、４２日目において、ミョウバンでアジュバント処理されたＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質ワクチン（３μｇ）による３回目のワクチン接種を施し、動物を６３日目に屠殺した。
【０４０２】
群１１（４匹の動物）ナイーブ対照。０、２０、４１、および６３日目において、抗体分析のために血清を回収した。４２および６３日目において、Ｔ細胞分析のために、脾臓を摘出した。
【０４０３】
結果
Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価を、表ＩＩ−１（２０日目）、ＩＩ−２（４１日目）、およびＩＩ−７（６３日目）に示す。Ｆ特異的血清ＩｇＧ１力価を、表ＩＩ−３（４１日目）およびＩＩ−８（６３日目）に示し、Ｆ特異的血清ＩｇＧ２ａ力価を、表ＩＩ−４（４１日目）およびＩＩ−９（６３日目）に示す。ＲＳＶ血清中和抗体力価を、表ＩＩ−５（４１日目）およびＩＩ−１０（６３日目）に示す。正味のＦ特異的サイトカイン陽性Ｔ細胞頻度の平均（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）を、表ＩＩ−６（４２日目）およびＩＩ−１１（６３日目）に示す。
【０４０４】
結論
ＢＡＬＢ／ｃマウスに対する２回目のワクチン接種後に回収されたデータは、以下を示す。
【０４０５】
Ｆサブユニット＋ＣＮＥ１７でのワクチン接種により誘発されるＦ特異的ＩｇＧ力価が、アジュバント処理されていないＦサブユニットにより誘発されるＦ特異的ＩｇＧ力価より大きく、Ｆサブユニット＋ミョウバンまたはＦサブユニット＋ＭＦ５９により誘発されるＦ特異的ＩｇＧ力価と同等であったので、ＣＮＥ１７は、Ｆサブユニットのための強力なアジュバントである。これらの４つの群（Ｆサブユニット＋ＣＮＥ１７、アジュバント処理されていないＦサブユニット、Ｆサブユニット＋ミョウバン、Ｆサブユニット＋ＭＦ５９）の各々において、Ｆ特異的ＩｇＧ応答は、主にＩｇＧ１応答であった（ＩｇＧ２ａ応答はきわめてわずか／なし）。Ｆ＋ミョウバンワクチンにＴＬＲ７アゴニスト（ＴＬＲ７Ａ）を添加したところ、全Ｆ特異的ＩｇＧ応答の大きさが約２倍となり、ＩｇＧ２ａへのクラス切換えが誘発された。
【０４０６】
ｖＡ１４２＋ＣＮＥ１７ワクチンおよびｖＡ１４２＋ＲＶ０１ワクチンの各々は、Ｆ特異的ＩｇＧのＩｇＧ２ａへのクラス切換えを誘発した（２回目のワクチン接種後に測定したところ、Ｆ特異的ＩｇＧ２ａ力価は、Ｆ特異的ＩｇＧ１力価の少なくとも１０倍であった）が、ｖＡ１４２＋ＲＶ０１に対する応答の大きさは、ｖＡ１４２＋ＣＮＥ１７に対する応答の約１０倍であった。
【０４０７】
ｖＡ１４２＋ＣＮＥ１７＋Ｆサブユニット（ミョウバンもＭＦ５９も有さない）は、ｖＡ１４２＋ＣＮＥ１７（Ｆサブユニットを有さない）により誘発されるＦ特異的ＩｇＧ力価の２４倍のＦ特異的ＩｇＧ力価を誘発したが、Ｆサブユニット＋ＣＮＥ１７（ｖＡ１４２を有さない）により誘発されるＦ特異的ＩｇＧ力価とほぼ同等であった。ｖＡ１４２＋ＣＮＥ１７＋Ｆサブユニットにより誘発されるＦ特異的ＩｇＧのアイソタイプは主にＩｇＧ１であり、Ｆサブユニット＋ＣＮＥ１７に対する応答（主にＩｇＧ１）に匹敵したが、ｖＡ１４２＋ＣＮＥ１７に対する応答（主にＩｇＧ２ａ）には匹敵しなかった。
【０４０８】
ｖＡ１４２＋ＲＶ０１＋Ｆサブユニット（ミョウバンもＭＦ５９も有さない）は、ｖＡ１４２＋ＣＮＥ１７（Ｆサブユニットを有さない）により誘発されるＦ特異的ＩｇＧ力価と大きさがほぼ等しいＦ特異的ＩｇＧ力価を誘発した。ｖＡ１４２＋ＲＶ０１＋Ｆサブユニットワクチンにより誘発されるＦ特異的ＩｇＧのアイソタイプは、主にＩｇＧ２ａであり、ｖＡ１４２＋ＣＮＥ１７に対する応答に匹敵した。
【０４０９】
２回目のワクチン接種時点の２週間後におけるＲＳＶ中和力価は、全Ｆ特異的ＩｇＧ力価と良好に相関した。
【０４１０】
レプリコンを含有しないすべてのサブユニットワクチンに対する脾臓Ｔ細胞応答（ＣＤ４およびＣＤ８）は、低度であった。レプリコンワクチンは、頑健なＣＤ８応答および中程度のＣＤ４応答を誘発した。いずれのＴ細胞亜型も、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ２を含めた１型サイトカインを主に産生した。ｖＡ１４２＋ＲＶ０１に対するＣＤ８  Ｔ細胞応答の大きさは、ＶＲＰにより誘発される応答とほぼ同等であり、ｖＡ１４２＋ＣＮＥ１７により誘発される応答の約５倍であった。
【０４１１】
ｖＡ１４２＋ＣＮＥ１７＋Ｆサブユニットは、Ｆサブユニット＋ＣＮＥ１７ワクチンにより誘発される応答とｖＡ１４２＋ＣＮＥ１７ワクチンにより誘発される応答との合計より大きさが大きい、頑健なＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘発した。ｖＡ１４２＋ＲＶ０１＋Ｆサブユニットは、ｖＡ１４２＋ＲＶ０１により誘発されるＣＤ８応答と大きさが等しい、頑健なＣＤ８応答を誘発した。
【０４１２】
ＢＡＬＢ／ｃマウスに対する３回目のワクチン接種後に回収されたデータは、以下を示す。
【０４１３】
３回目のｖＡ１４２＋ＣＮＥ１７ワクチン接種は、Ｆ特異的ＩｇＧ力価およびＲＳＶ中和力価を３倍に上昇させた。３回目のｖＡ１４２＋ＲＶ０１ワクチン接種は、Ｆ特異的ＩｇＧ力価を２倍に上昇させ、ＲＳＶ中和力価を４倍に上昇させた。
【０４１４】
Ｆ特異的力価およびＲＳＶ中和力価は、あらかじめｖＡ１４２＋ＣＮＥ１７により２回にわたりワクチン接種されたマウスに対するＦサブユニット＋ミョウバンによるワクチン接種の後、大幅に増強された（ＩｇＧ力価が４６倍に増大し、ＲＳＶ中和力価が６２倍に増大した）。Ｆ特異的力価およびＲＳＶ中和力価はまた、あらかじめｖＡ１４２＋ＲＶ０１により２回にわたりワクチン接種されたマウスに対するＦサブユニット＋ミョウバンによるワクチン接種の後でも増強された（ＩｇＧ力価が５倍に増大し、ＲＳＶ中和力価が６倍に増大した）。２回にわたるレプリコンワクチン接種に続く１回のＦサブユニット＋ミョウバンワクチン接種の後におけるＲＳＶ中和力価の大きさは、３回にわたるサブユニットワクチン接種により誘発されるＲＳＶ中和力価と同等であったまたはこれを超えた。
【０４１５】
２回にわたるワクチン接種後、Ｆサブユニット＋ミョウバンにより誘発されるＦ特異的ＩｇＧのアイソタイプが主にＩｇＧ１であるのに対し、ｖＡ１４２＋ＣＮＥ１７またはｖＡ１４２＋ＲＶ０１により誘発されるアイソタイプは主にＩｇＧ２ａであった。初回刺激ワクチン接種により開始されるこのアイソタイプバランスは、同種ワクチンまたは異種ワクチンによる３回目のワクチン接種の後でも維持された。たとえばＦ特異的ＩｇＧの優性アイソタイプは、Ｆサブユニット＋ミョウバンにより３回にわたりワクチン接種されたマウス、Ｆサブユニット＋ミョウバンにより２回にわたりワクチン接種され、次いで、ｖＡ１４２＋ＣＮＥ１７により１回ワクチン接種されたマウス、またはＦサブユニット＋ミョウバンにより２回にわたりワクチン接種され、次いで、ｖＡ１４２＋ＲＶ０１により１回ワクチン接種されたマウスではＩｇＧ１であった。Ｆ特異的ＩｇＧの優性アイソタイプは、ｖＡ１４２＋ＣＮＥ１７により３回にわたりワクチン接種されたマウス、ｖＡ１４２＋ＲＶ０１により３回にわたりワクチン接種されたマウス、ｖＡ１４２＋ＣＮＥ１７により２回にわたりワクチン接種され、次いで、Ｆサブユニット＋ミョウバンにより１回ワクチン接種されたマウス、およびｖＡ１４２＋ＲＶ０１により２回にわたりワクチン接種され、次いで、Ｆサブユニット＋ミョウバンにより１回ワクチン接種されたマウスではＩｇＧ２ａであった。ＩｇＧ１は、１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）応答と関連することが多く、ＩｇＧ２ａは、２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）応答と関連することが多い。これらのデータは、レプリコンワクチンが、Ｔｈ１型応答を誘発し、これが、サブユニット＋ミョウバンによる追加刺激（それ自体ではＴｈ２様応答を誘発する）の後でも維持されたことを示す。
【０４１６】
【表５−１】
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【０４１７】
【表５−２】
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【０４１８】
【表５−３】
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【０４１９】
【表５−４】
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【０４２０】
【表５−５】
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【０４２１】
【表５−６】
2014520807.tif 000026
【０４２２】
【表５−７】
2014520807.tif 000027
【０４２３】
【表５−８】
2014520807.tif 000028
【０４２４】
【表５−９】
2014520807.tif 000029
【０４２５】
【表５−１０】
2014520807.tif 000030
【０４２６】
【表５−１１】
2014520807.tif 000031
【０４２７】
実施例ＩＩＩ−ＲＮＡとタンパク質とのラットへの逐次投与（研究１）
本研究のために、３つの異なるレプリコン：ＲＳＶの全長野生型表面融合糖タンパク質（ＲＳＶ−Ｆ）を発現させるｖＡ３１７レプリコン；ＲＳＶの切断型（膜貫通ドメインおよび細胞質テールを除去した）表面融合糖タンパク質を発現させるｖＡ３１８レプリコン；および融合ペプチドを欠失させたＲＳＶの全長野生型表面融合糖タンパク質を発現させるｖＡ１４２レプリコンを使用した。１群当たり２〜８匹ずつのコットンラットに、０日目および２１日目において、ＬＮＰ（ＲＶ０１（２９））またはＣＮＥ１７中で処方された３つの異なるＲＮＡ（ｖＡ３１７、ｖＡ３１８、ｖＡ１４２）（Ｎ：Ｐ比１０：１）により、筋内ワクチン接種を施し（四肢１本に１００μＬ）たが、２つの用量（１．０および０．１μｇ；１群当たり８匹ずつの動物）で施した。ＬＮＰは、以下の組成：４０％のＤｌｉｎＤＭＡ、１０％のＤＳＰＣ、４８％のＣｈｏｌ、２％のＰＥＧ  ＤＭＧ  ２０００を有し、８：１のＮ：Ｐ比であり、１５０μｇのＲＮＡバッチサイズを使用することを除き、方法Ｂを使用して作製した。対照群は、ミョウバン（１群当たり８匹ずつの動物）でアジュバント処理されたＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質ワクチン（５μｇ）および全長ＲＳＶ−Ｆを発現させるＶＲＰ（１×１０６ＩＵ、１群当たり８匹ずつの動物）を受けた。ＬＮＰ群、サブユニット群、およびＶＲＰ群のすべては、ミョウバンでアジュバント処理されたＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質ワクチン（５μｇ）による３回目のワクチン接種（５６日目）を受けた。加えて、ナイーブ対照（１群当たり４匹ずつの動物）も設けた。０、２１、３５、５６、７０日目において、抗体分析のために血清を回収した。加えて、２つの群に、０および５６日目において、ＬＮＰ（ＲＶ０１（２９））またはＣＮＥ１７（１群当たり８匹ずつの動物）中で処方されたＲＮＡ（ｖＡ３１７、１μｇ）による両側筋内ワクチン接種（四肢１本当たり５０μＬずつ）を施した。これらの群は、サブユニットタンパク質ワクチンによる３回目のワクチン接種を受けなかった。０、１４、２１、２８、３５、４２、５６、７０日目において、抗体分析のために血清を回収した。
【０４２８】
結果
ＲＳＶ−Ｆサブユニットワクチンによる３回目のワクチン接種を受けた群について、Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価を、表ＩＩＩ−１（２１日目）、ＩＩＩ−２（３５日目）、ＩＩＩ−３（５６日目）、ＩＩＩ−４（７０日目）に示す。２１、３５、５６、および７０日目におけるＲＳＶ血清中和抗体力価を、表ＩＩＩ−５に示す。ＲＳＶ−Ｆサブユニットワクチンによる３回目のワクチン接種を受けなかった２つの群について、１４、２１、２８、３５、４２、５６、７０日目におけるＦ特異的血清ＩｇＧ力価を、表ＩＩＩ−６に示す。これらの２つの群についての、１４、２１、２８、３５、４２、５６、７０日目におけるＲＳＶ血清中和抗体力価を、表ＩＩＩ−７に示す。
【０４２９】
結論
ＲＶ０１またはＣＮＥ１７と処方したところ、本研究で評価される３つのレプリコンすべて（ｖＡ３１７、ｖＡ３１８、ｖＡ１４２）は、コットンラットにおいて免疫原性であった。各レプリコンは、１回目のワクチン接種後に血清Ｆ特異的ＩｇＧおよびＲＳＶ中和抗体を誘発し、２回目のワクチン接種は、この応答を効果的に追加刺激した。１．０μｇのレプリコンによる２回目のワクチン接種後におけるＦ特異的ＩｇＧ力価は、処方物に関わらず、０．１μｇのレプリコンによる２回目のワクチン接種後の１．５〜４倍高かった。本研究で評価される３つのレプリコン（ｖＡ３１７、ｖＡ３１８、ｖＡ１４２）は、同等の抗体力価を誘発したことから、全長ＲＳＶ−Ｆ（融合ペプチドを有する全長ＲＳＶ−Ｆおよび融合ペプチドを有さない全長ＲＳＶ−Ｆ）と切断型ＲＳＶ−Ｆとは、コットンラットにおいて同等に免疫原性であることが示唆される。また、同じレプリコンをＲＶ０１またはＣＮＥ１７と処方した場合の抗体力価の差違もほとんど認められなかったことから、これらの２つの処方物がコットンラットにおいて同等に強力であることも示唆される。２回目のレプリコンワクチン接種後におけるＲＳＶ血清中和力価は、２回目のＲＳＶ−Ｆサブユニット＋ミョウバンまたはＶＲＰによるワクチン接種後の少なくとも１０分の１であった。
【０４３０】
０日目および２１日目においてレプリコン、ＶＲＰ、またはサブユニットでワクチン接種したコットンラットのすべてに、５６日目（２回目のワクチン接種の５週間後）において、５μｇのＲＳＶ−Ｆ三量体サブユニット＋ミョウバンでワクチン接種した。この３回目のワクチン接種は、あらかじめＦ三量体サブユニット＋ミョウバンでワクチン接種したコットンラットにおける抗体力価を上昇させなかったが、あらかじめレプリコン（ＲＶ０１処方物およびＣＮＥ１７処方物の両方）でワクチン接種したコットンラットにおける力価に対しては大きな上昇をもたらした。大半の場合には、２回にわたるレプリコンワクチン接種に続くＦサブユニット＋ミョウバンによる追加刺激の後におけるＲＳＶ血清中和力価が、２回または３回にわたる逐次的なＦサブユニット＋ミョウバンワクチン接種により誘発される力価と同等であったまたはこれを超えた。
【０４３１】
各群および各時点について、Ｆ特異的ＩｇＧ力価のＲＳＶ中和力価に対する比を計算することができるが、これは、抗体応答の質の１つの指標である。比が低ければ、ワクチンにより誘発された抗体のうちの大きな画分が、ＲＳＶを中和することが可能であり、したがって機能的であることが示唆される。本研究に由来するデータは、Ｆ特異的ＩｇＧ力価：ＲＳＶ中和抗体力価の比が、レプリコンまたはＶＲＰによるワクチン接種後において、Ｆサブユニット＋ミョウバンによるワクチン接種後より低かったことを示す。２回にわたるレプリコンワクチン接種またはＶＲＰワクチン接種により開始されるＦ特異的ＩｇＧ力価：ＲＳＶ中和抗体力価の比の低さは、Ｆサブユニット＋ミョウバンによる追加刺激後においても維持された。
【０４３２】
本研究はまた、ＲＶ０１またはＣＮＥ１７と一緒に処方された１．０μｇのｖＡ３１７に対する抗体応答の動態も評価した。単回のワクチン接種により誘発されるＦ特異的血清ＩｇＧ力価およびＲＳＶ中和力価は、ほぼ２１日目にそれらのピークに達し、少なくとも５６日目まで維持された（Ｆ特異的ＩｇＧ力価における５０〜７０％の降下、ＲＳＶ中和力価におけるわずかな変化）。５６日目において、同種の２回目のワクチン接種をこれらの動物に施したところ、抗体力価は、２１日目に２回目のワクチン接種を投与したときに達成されたレベルと少なくとも同等レベルまで上昇した。
【０４３３】
【表６−１】
2014520807.tif 000032
【０４３４】
【表６−２】
2014520807.tif 000033
【０４３５】
【表６−３】
2014520807.tif 000034
【０４３６】
【表６−４】
2014520807.tif 000035
【０４３７】
【表６−５】
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【０４３８】
【表６−６】
2014520807.tif 000037
【０４３９】
【表６−７】
2014520807.tif 000038
【０４４０】
実施例ＩＶ−ＲＮＡとタンパク質とのラットへの逐次投与（研究２）
本実験のために、融合ペプチドを欠失させたＲＳＶの全長野生型表面融合糖タンパク質を発現させるｖＡ１４２レプリコンを使用した。０日目および２１日目において、１群当たり４〜８匹ずつのコットンラットに、筋内ワクチン接種を施した（四肢１本に１００μＬ）。４９日目（２回目のワクチン接種の４週間後）において、本研究におけるすべてのコットンラット（ナイーブ群を除く）に、５μｇのＦサブユニット＋ミョウバンでワクチン接種した。
【０４４１】
群１：ＬＮＰ（ＲＶ０１（３７））中で処方された自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１４２、１μｇ、ＲＳＶ−Ｆ）。ＬＮＰは、以下の組成：４０％のＤｌｉｎＤＭＡ、１０％のＤＳＰＣ、４８％のＣｈｏｌ、２％のＰＥＧ  ＤＭＧ  ２０００を有し、８：１のＮ：Ｐ比であった。これらは、１７５μｇのＲＮＡバッチサイズを使用することを除き、方法Ｂを使用して作製した。
【０４４２】
群２：ＬＮＰ（ＲＶ０１（３７））中で処方された自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１４２、０．１μｇ、ＲＳＶ−Ｆ）。ＬＮＰは、以下の組成：４０％のＤｌｉｎＤＭＡ、１０％のＤＳＰＣ、４８％のＣｈｏｌ、２％のＰＥＧ  ＤＭＧ  ２０００を有し、８：１のＮ：Ｐ比であった。これらは、１７５μｇのＲＮＡバッチサイズを使用することを除き、方法Ｂを使用して作製した。
【０４４３】
群３：ＬＮＰ（ＲＶ１７（１０））中で処方された自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１４２、１μｇ、ＲＳＶ−Ｆ）。ＬＮＰは、以下の組成：ＮＶＰ−ＬＪＣ３０５−ＮＸ−２が４０％、ＤＳＰＣが１０％、Ｃｈｏｌが４９．５％、ＰＥＧ  ＤＭＧ  ５０００が０．５％であり、８：１のＮ：Ｐ比であった。これらは、２００μｇのＲＮＡバッチサイズを使用することを除き、方法Ａを使用して作製した。
【０４４４】
群４：ＬＮＰ（ＲＶ１７（１０））中で処方された自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１４２、０．１μｇ、ＲＳＶ−Ｆ）。ＬＮＰは、以下の組成：ＮＶＰ−ＬＪＣ３０５−ＮＸ−２が４０％、ＤＳＰＣが１０％、Ｃｈｏｌが４９．５％、ＰＥＧ  ＤＭＧ  ５０００が０．５％であり、８：１のＮ：Ｐ比であった。これらは、２００μｇのＲＮＡバッチサイズを使用することを除き、方法Ａを使用して作製した。
【０４４５】
群５：ＬＮＰ（ＲＶ０５（１１））中で処方された自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１４２、１μｇ、ＲＳＶ−Ｆ）。ＬＮＰは、以下の組成：ＮＶＰ−ＬＧＢ０４６−ＮＸ−１が４０％、１８：２  ＰＥ（ＤＬｏＰＥ）が３０％、Ｃｈｏｌが２８％、ＰＥＧ  ＤＭＧ  ２０００が２％であり、８：１のＮ：Ｐ比であった。これらは、２００μｇのＲＮＡバッチサイズを使用することを除き、方法Ａを使用して作製した。
【０４４６】
群６：ＬＮＰ（ＲＶ０５（１１））中で処方された自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１４２、０．１μｇ、ＲＳＶ−Ｆ）。ＬＮＰは、以下の組成：ＮＶＰ−ＬＧＢ０４６−ＮＸ−１が４０％、１８：２  ＰＥ（ＤＬｏＰＥ）が３０％、Ｃｈｏｌが２８％、ＰＥＧ  ＤＭＧ  ２０００が２％であり、８：１のＮ：Ｐ比であった。これらは、２００μｇのＲＮＡバッチサイズを使用することを除き、方法Ａを使用して作製した。
【０４４７】
群７：１０：１のＮ：Ｐ比でＣＮＥ１３と一緒に処方された自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１４２、１．０μｇ、ＲＳＶ−Ｆ）。
【０４４８】
群８：１０：１のＮ：Ｐ比でＣＮＥ１３と一緒に処方された自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１４２、０．１μｇ、ＲＳＶ−Ｆ）。
【０４４９】
群９：１０：１のＮ：Ｐ比でＣＮＥ１７と一緒に処方された自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１４２、１．０μｇ、ＲＳＶ−Ｆ）。
【０４５０】
群１０：１０：１のＮ：Ｐ比でＣＮＥ１７と一緒に処方された自己複製ＲＮＡ（ｖＡ１４２、０．１μｇ、ＲＳＶ−Ｆ）。
【０４５１】
群１１：ＲＳＶの全長野生型表面融合糖タンパク質を発現させるＶＲＰ（１×１０６ＩＵ）。
【０４５２】
群１２：ミョウバンでアジュバント処理されたＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質ワクチン（５μｇ）。
【０４５３】
群１３：ナイーブ対照（３匹の動物）。
【０４５４】
０、２１、３５、４９、６４日目において、抗体分析のために血清を回収した。
【０４５５】
結果
Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価を、表ＩＶ−１（２１日目）、ＩＶ−２（３５日目）、ＩＶ−３（４９日目）、ＩＶ−４（６４日目）に示す。２１、３５、４９、および６４日目におけるＲＳＶ血清中和抗体力価を、表ＩＶ−５に示す。
【０４５６】
結論
本研究では、コットンラットに、ＲＶ０１、ＲＶ１７、ＲＶ０５、ＣＮＥ１７、またはＣＮＥ１３と一緒に処方されたｖＡ１４２レプリコンでワクチン接種した。これらのワクチンの各々は、２つの用量（１．０および０．１μｇ）で施した。１回目のレプリコンワクチン接種後、Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価は、ＲＶ０１が最高であり、ＲＶ０５、ＲＶ１７、およびＣＮＥ１７がこれに続き（匹敵した用量のｖＡ１４２＋ＲＶ０１により誘発されるＦ特異的ＩｇＧ力価の４０〜６７％）、ＣＮＥ１３が最下位（匹敵した用量のｖＡ１４２＋ＲＶ０１により誘発されるＦ特異的ＩｇＧ力価の６〜１０％）であった。１回目のレプリコンワクチン接種後、ＲＳＶ中和力価は、ＲＶ０１、ＲＶ０５、ＲＶ１７、およびＣＮＥ１７についてほぼ等しかったのに対し、ＣＮＥ１３による力価は低かった（匹敵した用量のｖＡ１４２＋ＲＶ０１により誘発されるＲＳＶ中和力価の３５〜６８％）。すべての群における力価は、２１日目に施される同種の２回目のワクチン接種により上昇された。２回目のレプリコンワクチン接種後においてもまた、Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価は、ＲＶ０１が最高であり、ＲＶ０５、ＲＶ１７、およびＣＮＥ１７がこれに近接して続き、ＣＮＥ１３による場合は低かった（匹敵した用量のｖＡ１４２＋ＲＶ０１により誘発されるＦ特異的ＩｇＧ力価の２５〜３３％）。２回目のワクチン接種後におけるＲＳＶ中和力価は、群内でより大きなばらつきを呈示したが、一般的にはこの同じ傾向に従った。２回目のワクチン接種の２週間後におけるＲＳＶ血清中和力価は、レプリコン群で、Ｆサブユニット＋ミョウバンまたはＶＲＰ群の少なくとも３分の１であった。
【０４５７】
本研究におけるすべてのコットンラット（ナイーブ群を除く）に、４９日目（２回目のワクチン接種の４週間後）において、５μｇのＦサブユニット＋ミョウバンでワクチン接種した。この３回目のワクチン接種は、あらかじめサブユニットでワクチン接種されたコットンラットにおける抗体力価を上昇させなかったが、レプリコンであらかじめワクチン接種されたコットンラットにおける力価に対しては、処方物（ＲＶ０１、ＲＶ１７、ＲＶ０５、ＣＮＥ１７、ＣＮＥ１３）に関わらず大きな上昇をもたらした。大半の場合には、２回にわたるレプリコンワクチン接種に続くＦサブユニット＋ミョウバンによる追加刺激の後におけるＲＳＶ血清中和力価が、２回または３回にわたる逐次的なＦサブユニット＋ミョウバンワクチン接種により誘発される力価と同等であった。
【０４５８】
各群および各時点について、Ｆ特異的ＩｇＧ力価のＲＳＶ中和力価に対する比を計算することができるが、これは、抗体応答の質の１つの指標である。比が低ければ、ワクチンにより誘発された抗体のうちの大きな画分が、ＲＳＶを中和することが可能であり、したがって機能的であることが示唆される。本研究に由来するデータは、Ｆ特異的ＩｇＧ力価：ＲＳＶ中和抗体力価の比が、レプリコンまたはＶＲＰによるワクチン接種後において、Ｆサブユニット＋ミョウバンによるワクチン接種後より低いことを示す。２回にわたるレプリコンワクチン接種またはＶＲＰワクチン接種により開始されるＦ特異的ＩｇＧ力価：ＲＳＶ中和抗体力価の比の低さは、Ｆサブユニット＋ミョウバンによる追加刺激後においても維持された。
【０４５９】
【表７−１】
2014520807.tif 000039
【０４６０】
【表７−２】
2014520807.tif 000040
【０４６１】
【表７−３】
2014520807.tif 000041
【０４６２】
【表７−４】
2014520807.tif 000042
【０４６３】
【表７−５】
2014520807.tif 000043
【０４６４】
実施例Ｖ−ＲＮＡとタンパク質とのウシへの逐次投与
本実験のために、ＲＳＶの表面融合糖タンパク質（ＲＳＶ−Ｆ）を発現させるｖＡ３１７レプリコンを使用した。０、２１、８６、および１４６日目において、仔牛（１群当たり５頭ずつ）に筋内ワクチン接種を施した。ＲＮＡワクチンおよびＰＢＳワクチンは、頸部の各々の側において、１．０ｍＬずつの分割用量として投与した（２ｍＬの全用量）。Ｔｒｉａｎｇｌｅ  ４製品（ウシＲＳウイルスの他、他の病原体により引き起こされる疾患を防止するためのワクチン；Ｆｔ．Ｄｏｄｇｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）を、標識されるように投与した（頸部の一方の側において２．０ｍＬの用量）。ＭＦ５９でアジュバント処理されたＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質ワクチン（１５μｇ）を、頸部の各々の側において、１．０ｍＬずつの分割用量として投与した（２ｍＬの全用量）。自己複製ＲＮＡ（ｖＡ３１７、６０μｇ）は、以下の組成：４０％のＤｌｉｎＤＭＡ、１０％のＤＳＰＣ、４８％のＣｈｏｌ、２％のＰＥＧ  ＤＭＧ  ２０００を有し、Ｎ：Ｐ比が８：１であり、１．５ｍｇのＲＮＡバッチサイズを使用したことを除き、方法Ｃを使用して作製されたＬＮＰ（ＲＶ０１（０１））中で処方された。自己複製ＲＮＡ（ｖＡ３１７、６０μｇ）は、１０：１のＮ：Ｐ比でＣＮＥ１７と一緒に処方された。
【０４６５】
仔牛には、ＲＮＡ／ＣＮＥ、ＲＮＡ／ＬＮＰ、市販のＲＳＶワクチン（Ｔｒｉａｎｇｌｅ  ４）、またはＰＢＳで、３回にわたりワクチン接種した。本研究におけるＲＮＡワクチンがヒトＲＳＶ  Ｆをコードしたのに対し、Ｔｒｉａｎｇｌｅ  ４は、ウシＲＳＶ  Ｆを含有したことに注意されたい（ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＢＲＳＶとＨＲＳＶとの間で高度に保存されている）。すべての仔牛に、ＲＳＶ−Ｆサブユニット／ＭＦ５９で第４回目のワクチン接種を行った。０、１４、２１、３５、４２、５６、６３、８６、１００、１０７、１１４、１２１、１２８、１３５、１４６、１６０、１６７、１７４、１８１、１８８、１９５、および２０２日目において、抗体分析のために血清を回収した。
【０４６６】
結果
２１、３５、５６、８６、１００、１２１、１４６、１６０、１８１、および２０２日目におけるＦ特異的血清ＩｇＧ力価を、表Ｖ−１に示す。３５、５６、１００、１０７、１１４、１４６、１６０、１６７、１７４日目におけるＲＳＶ血清中和抗体力価を、表Ｖ−２に示す。
【０４６７】
結論
本研究に由来するデータは、大型動物におけるＲＮＡレプリコンによるＲＳＶワクチンについての概念実証を提示し、５頭のＲＮＡ／ＣＮＥによりワクチン接種された仔牛のうちの２頭が、補体非依存型ＨＲＳＶ中和アッセイにより測定される３回目のワクチン接種後に、良好な中和抗体力価を顕示した。補体増強型ＨＲＳＶ中和アッセイでは、ワクチン接種されたすべての仔牛が、処方物に関わらず、２回目のＲＮＡワクチン接種後において、良好な中和抗体力価を示した。さらに、ＲＮＡ／ＣＮＥおよびＲＮＡ／ＬＮＰのいずれもが、Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価を誘発し、これらは、２回目のワクチン接種後の数頭の仔牛および３回目のワクチン接種後のすべての仔牛において検出された。大型動物におけるＲＮＡレプリコンワクチンについての概念実証は、小型動物モデルから大型動物およびヒトへと移行するときにＤＮＡベースのワクチンにより既に観察された効力の喪失に照らして特に重要である。ウシにおけるＤＮＡの典型的な用量は０．５〜１．０ｍｇであり（Ｔａｙｌｏｒ、２００５年；Ｂｏｘｕｓ、２００７年）、６０μｇの用量のこれらの第１世代のＲＮＡワクチンにより免疫応答が誘発されたことは、きわめて有望である。ＲＮＡ／ＬＮＰワクチンはまた、マウスモデルの実験におけるＤＮＡを凌ぐことも示されている。
【０４６８】
これらのデータはまた、仔牛では、ＣＮＥで処方されたＲＮＡの免疫原性が、ＬＮＰで処方されたＲＮＡより大きいことも示唆する。これは、前者の処方物による２回目のワクチン接種後におけるＥＬＩＳＡ力価の上昇および３回目のワクチン接種後における中和力価の上昇において明らかであった。ＲＳＶ−Ｆサブユニット／ＭＦ５９は、あらかじめワクチン接種されたすべての仔牛におけるＩｇＧ応答を追加刺激し、ＲＮＡであらかじめワクチン接種された仔牛の補体非依存型ＨＲＳＶ中和力価を上昇させることが可能であった。
【０４６９】
【表８−１】
2014520807.tif 000044
【０４７０】
【表８−２】
2014520807.tif 000045
【０４７１】
実施例ＶＩ−アルファウイルスＶＲＰによる初回刺激、タンパク質による追加刺激、およびＲＮＡとサブユニットとの共投与
マウスを、３週間を隔てて、３回にわたり、ｇＨ／ｇＬ複合体を発現させるＶＲＰ、緑色蛍光タンパク質を発現させるＶＲＰ（ＶＲＰ−Ｇ）、ＭＦ５９を有するまたは有さない精製ｇＨ／ｇＬサブユニット、異なる配列のＶＲＰまたはＶＲＰ−Ｇに続き、ＰＢＳもしくはＭＦ５９中のサブユニット、精製ｇＨ／ｇＬサブユニットと混合された、ｇＨ／ｇＬ複合体を発現させるＶＲＰ、または精製ｇＨ／ｇＬサブユニットと混合されたＶＲＰ−Ｇで免疫化した（表ＶＩ−１を参照されたい）。対照マウス群は、ワクチンを受けず、さらなる対照群は、ＶＲＰによる初回刺激に由来するあらゆる効果が、コードされる抗原に対して特異的であるかどうかを決定するために、ＧＦＰ  ＶＲＰを包含した。
【０４７２】
【表９】
2014520807.tif 000046
【０４７３】
血清は、各免疫化の３週間後に採取し、アッセイにおいてサブユニットワクチン中の精製ｇＨ／ｇＬ抗原と同じ精製ｇＨ／ｇＬ抗原を使用して結合抗体力価を決定するためのＥＬＩＳＡに使用した。血清はまた、ＡＲＰＥ−１９上皮細胞のＴＢ４０感染を使用するＨＣＭＶマイクロ中和アッセイにも使用した。
【０４７４】
３回目の免疫化の４週間後、屠殺したマウスから脾臓を摘出した。脾臓細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、精製ｇＨ／ｇＬタンパク質またはｇＨタンパク質のＣ末端側の半分にほぼ対応する１５マーペプチドのプール（１１アミノ酸が重複する）で刺激し、ＣＤ４、ＣＤ８、およびサイトカインの発現について染色し、フローサイトメトリーを使用して分析した。
【０４７５】
ｇＨ／ｇＬ  ＶＲＰによるワクチン接種は、強力な中和抗体応答を誘発した（図１）。アジュバントを有さない精製ｇＨ／ｇＬサブユニットは、軽微な応答を誘発した。ＭＦ５９と処方されると、ｇＨ／ｇＬ  ＶＲＰにより誘発される応答と少なくとも同程度に強い、強力な中和抗体応答が誘発された。異なる「ＶＲＰによる初回刺激、サブユニット／ＭＦ５９による追加刺激」のレジメンは、サブユニットと比較して中和力価を増大させなかった。初回刺激−追加刺激レジメンにおけるｇＨ／ｇＬ  ＶＲＰを、ＧＦＰを発現させるＶＲＰで置換したところ、中和応答の大きさを減殺させる、予測された結果がもたらされた。ＶＲＰによる初回刺激に続く、アジュバント処理されていないタンパク質による追加刺激は、サブユニット／ＭＦ５９単独と比較して中和力価を増大させなかった。サブユニットによる追加刺激をＭＦ５９とともにまたは伴わないで送達したところ、所与のあらゆる初回刺激・追加刺激レジメンの力価は同等であった。
【０４７６】
アジュバントを有さないＶＲＰまたはサブユニットによるワクチン接種は、微弱なＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を誘発した（図２）。ＭＦ５９でアジュバント処理されたサブユニットは、Ｔｈ２／Ｔｈ０の表現型を有するＣＤ４細胞を誘発した。サブユニット／ＭＦ５９より著明に多くのＣＤ４細胞を誘発したＶＲＰとサブユニットとの唯一の組合せ（初回刺激−追加刺激または混合型モダリティー）は、１用量のＶＲＰに続き、２用量のサブユニット／ＭＦ５９であった。これらの細胞は、Ｔｈ１／Ｔｈ０表現型を有し；ｇＨ／ｇＬを発現させるＶＲＰを受けたすべての群は、この表現型を有する細胞を誘発した。これに対し、ＧＦＰを発現させるＶＲＰによる初回刺激または共免疫化は、サブユニット／ＭＦ５９と比較してＴ細胞の表現型を変化させなかった。
【０４７７】
ｇＨ／ｇＬを発現させるＶＲＰによるワクチン接種は、頑健なＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘発した（図３）。いかなる被験の初回刺激・追加刺激の組合せまたはサブユニットとの共投与によっても応答は改善されなかった。
【０４７８】
本研究に由来するデータは、ｇＨ／ｇＬによる初回刺激に続く、ｇＨ／ｇＬサブユニットによる追加刺激が、応答の持続性に影響を及ぼしうる、共時的なＣＤ４  Ｔ細胞応答を有する強力な中和力価を誘発することを示した。結果として、ＶＲＰによる初回刺激の後で、サブユニットによる追加刺激をＭＦ５９でアジュバント処理する必要はない。異種抗原を発現させるＶＲＰは、後のサブユニットによる追加刺激のために動物を初回刺激せず、共送達された場合のサブユニットに対する応答をアジュバント処理しなかった。
【０４７９】
実施例ＶＩＩ−ＨＣＭＶ五量体抗原を使用する、ＳＡＭ（商標）ワクチンによる初回刺激、タンパク質による追加刺激、およびＲＮＡとサブユニットとの共投与
マウスを、本明細書で記載される自己複製ＲＮＡであって、ＣＭＶの五量体複合体（ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１）をコードする自己複製ＲＮＡであるＳＡＭワクチン、ＭＦ５９でアジュバント処理された精製五量体サブユニット、異なる配列によるＳＡＭに続き、ＭＦ５９中のサブユニット、またはこれら２つの組合せで、３週間を隔てて、３回にわたり免疫化した（表ＶＩＩ−１）。ＳＡＭワクチンは、非ウイルス性送達のための合成ＬＮＰ内に被包した。対照マウス群は、ワクチンを受けなかった。
【０４８０】
【表１０】
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【０４８１】
血清は、各免疫化の３週間後に採取し、アッセイにおいてサブユニットワクチン中の精製抗原と同じ精製抗原を使用して結合抗体力価を決定するためのＥＬＩＳＡに使用した。血清はまた、ＡＲＰＥ−１９上皮細胞のＴＢ４０またはＶＲ１８１４感染を使用するＨＣＭＶマイクロ中和アッセイにも使用した。３回目の免疫化の３または４週間後、屠殺したマウスから脾臓を摘出した。脾臓細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、精製タンパク質またはｇＨタンパク質のＣ末端側の半分に対応する１５マーペプチドのプール（１１アミノ酸が重複する）で刺激し、サイトカインの発現について染色し、フローサイトメトリーを使用して分析した。
【０４８２】
ＳＡＭワクチンおよびサブユニット／ＭＦ５９は、３用量の後、単独で強力な中和抗体応答を誘発した（図４）。ＭＦ５９中の五量体サブユニットは、１回目および２回目の用量のワクチンに対して、五量体ＳＡＭワクチンほど良好に応答しなかったが、３回目の用量後においてサブユニット／ＭＦ５９により誘発される力価は、ＳＡＭワクチンにより誘発される力価を上回った。１回のＳＡＭワクチンによる初回刺激に続く、単回用量のサブユニット／ＭＦ５９は、２用量のサブユニット／ＭＦ５９より強力な中和応答を誘発したが、ＳＡＭワクチン単独と同等であった。これらの動物へと投与された、２回目のサブユニット／ＭＦ５９による追加刺激は、３用量のサブユニット／ＭＦ５９またはＳＡＭワクチンの後において見られる中和応答を超えるレベルまでの中和応答をもたらした。２用量のＳＡＭワクチンに続く、単回用量のサブユニット／ＭＦ５９は、サブユニット／ＭＦまたはＳＡＭワクチンの単独と比較して、中和応答に利益をもたらさないと考えられた。ＳＡＭワクチンを、ＭＦ５９を有さないサブユニットと混合したところ、最初の用量後にＲＮＡ単独と同様の強力な応答が誘発され、２用量および３用量の後にも強力な中和力価が誘発された。
【０４８３】
精製ｇＨ／ｇＬおよび五量体サブユニットを使用するワクチン接種に対するＣＤ４＋  Ｔ細胞応答について分析した。ＳＡＭワクチンによる初回刺激およびタンパク質による追加刺激、ならびに混合したＳＡＭワクチン＋サブユニットは、ｇＨ／ｇＬによる再刺激に対して応答するＣＤ４＋  Ｔ細胞を、ＳＡＭワクチンまたはサブユニット／ＭＦ５９単独より多く誘発した（図５）。ＲＮＡ単独に対するＣＤ４＋応答が僅少であったのに対し、サブユニット／ＭＦ５９単独に対する応答はＴｈ２／Ｔｈ０の表現型であった。ＳＡＭワクチンとサブユニットとの組合せで免疫化されたマウスに由来する応答細胞の表現型は、主にＴｈ１／Ｔｈ０であった。細胞を精製五量体複合体で再刺激したところ、同様の傾向が見られたが、応答は一般的により強力であった（図６）。
【０４８４】
また、ｇＨに対する精製五量体サブユニットまたはペプチドプールを使用するワクチン接種に対するＣＤ８＋  Ｔ細胞応答も分析した。２用量のＳＡＭワクチンに続く、１用量のサブユニット／ＭＦ５９で免疫化されたマウスでは、五量体サブユニットで再刺激したときに見られた著名なＣＤ８応答だけが見られた（図７）。これらの動物に由来する細胞もまた、ｇＨペプチドで再刺激したときに最も強力な応答を示した（図８）。ＳＡＭワクチン＋サブユニット、１用量のＳＡＭワクチンに続く２用量のサブユニット／ＭＦ５９、またはＳＡＭワクチン単独で免疫化されたマウスもまた、再刺激に対して著明な応答を示した（図８）。
【０４８５】
結論：１用量のＳＡＭワクチンに続く２用量のサブユニット／ＭＦ５９の他、ＳＡＭワクチン＋サブユニットも、サブユニット／ＭＦ５９単独より高い中和力価を誘発した。ＳＡＭワクチン＋サブユニットに対する応答は、ＭＦ５９アジュバントの添加を必要としなかった。ＳＡＭワクチンによる初回刺激およびサブユニット／ＭＦ５９による追加刺激による最大の影響は、細胞性免疫応答に対するものであった。ＳＡＭワクチンを包含するあらゆる組合せは、主にＴｈ１／Ｔｈ０のＣＤ４＋応答をもたらした。さらに、ＳＡＭワクチンによる２回にわたる免疫化に続く、サブユニット／ＭＦ５９による１回の免疫化は、最も強力なＣＤ８＋応答をもたらした。本研究は、「ＳＡＭワクチンによる初回刺激、タンパク質による追加刺激」のレジメンを最適化して、所望の免疫応答、すなわち、細胞性免疫応答または体液性免疫応答をもたらしうることを示す。
【０４８６】
実施例ＶＩＩＩ−ＲＳＶ  Ｆ  ＲＮＡによる初回刺激（用量範囲）、タンパク質による追加刺激（３μｇ、処方を変化させる）
ＲＳＶ−Ｆ  ＲＮＡによる初回刺激（用量範囲の通り）およびサブユニットによる追加刺激（３μｇ、異なる処方物）をマウスへと投与して、表ＶＩＩＩ−１に示される異なる処方を有するサブユニットが、ＲＮＡにより誘発された応答を追加刺激する能力について評価した。各マウスは、ＲＮＡ用量が可変的で、サブユニットアジュバントが異なる、で一定の３μｇのサブユニット用量を受けた。０、２１、および４２日目において、１００μｌの用量を２本の後肢に二分して、マウスの筋内にワクチン接種した。２０日目に、Ｆ特異的ＩｇＧについて血清のサンプルを採取し、３５および５６日目において、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、および中和抗体について血清のサンプルを採取した。５６日目において脾臓を摘出した。
【０４８７】
【表１１】
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【０４８８】
データは、ＲＮＡによる初回刺激、サブユニットによる追加刺激が、ＲＳＶ中和抗体の高い力価を誘発するために有効なレジメンであることを示した（図９）。追加刺激は、ミョウバン−アジュバント処理された追加刺激、ＭＦ５９−アジュバント処理された追加刺激、なおまたはアジュバント処理されていないＦサブユニットによる追加刺激と共に働く（図１１）。
【０４８９】
ＲＮＡワクチンは、Ｔｈ１に偏った応答（ＩｇＧ２ａ、Ｔｈ１サイトカイン）を開始させ、これは、追加刺激アジュバントに関わらず、アジュバントワクチンを有するまたは有さないサブユニットが自然により多くのＴｈ２に偏った応答（ＲＮＡによる初回刺激を有さない）を誘発した場合であっても、サブユニットによる追加刺激後に維持された。検出可能な免疫応答を有さないＲＮＡワクチンであっても、きわめて低用量のＲＮＡワクチンが、サブユニットによる追加刺激後に維持される、Ｔｈ１に偏った応答を開始させるのに十分であった（図１０）。
【０４９０】
本明細書は、本明細書内で引用される参考文献の教示に照らして最も完全に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明の実施形態の例示を提示するものであり、本発明の範囲を限定するものとみなすべきではない。当業者は、他の多くの実施形態が、本発明により包含されることを容易に認識する。本開示において引用されるすべての刊行物および特許は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。参照により組み込まれる材料が本明細書と相反するまたは矛盾する場合は、本明細書がこのようなあらゆる材料に優先されるであろう。本明細書におけるあらゆる参考文献の引用は、このような参考文献が本発明に先行することの容認ではない。
【０４９１】
当業者は、日常的な実験だけを使用して、本明細書で記載される本発明の特定の実施形態との多くの同等物を認識するであろう、または確認することが可能であろう。このような同等物は、以下の実施形態により包含されることを意図する。
【０４９２】
【化４】
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【０４９３】
【化５】
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【０４９４】
【化６】
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【０４９５】
【化７】
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【０４９６】
【化８】
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【０４９７】
【化９】
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【０４９８】
【化１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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