(57)【要約】  本発明は、アポトーシス阻害剤、好ましくはカスパーゼ阻害剤、高張剤および／または特許請求の範囲に記載の式（１）の化合物を使用して、細胞含有生体試料中の細胞外核酸集団を安定化するための方法、組成物およびデバイスを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞含有試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化する安定化組成物を含み、前記安定化組成物はカスパーゼ阻害剤を含む、細胞含有試料、好ましくは血液、血漿または血清試料を収集する容器。
【請求項２】
前記安定化組成物が、
ａ）少なくとも１種のカスパーゼ阻害剤；
ｂ）任意選択により、前記試料に含まれている細胞を安定化する少なくとも１種の高張剤；および
ｃ）任意選択により、少なくとも１種の式１の化合物
【化１】
2014528719.tif 000030
［式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１〜Ｃ５アルキル残基、より好ましくはメチル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、直鎖または分岐状に配列した炭素原子１〜２０個の鎖長を有する、同じまたは異なる炭化水素残基であり、Ｒ４は、酸素、硫黄またはセレン残基である］、
を含む、請求項１に記載の容器。
【請求項３】
さらに前記安定化組成物が抗凝固剤を含む、請求項１または２に記載の容器。
【請求項４】
前記容器が脱気される、請求項１から３の１項または複数項に記載の容器。
【請求項５】
前記安定化組成物が、安定化に起因して、前記試料に含有されている細胞からのゲノムＤＮＡの、前記試料の無細胞部分への放出が低減され、かつ／または前記試料中に存在する核酸の分解が低減されることをもたらす、請求項１から４の１項または複数項に記載の容器。
【請求項６】
ａ）前記カスパーゼ阻害剤が、以下の特徴：
ｉ）汎カスパーゼ阻害剤（Pancaspase）であること；および／もしくは
ｉｉ）Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈおよびＺ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＦＭＫからなる群から選択されること、
の１つもしくは複数を有し、
ならびに／または
ｂ）前記高張剤が、以下の特徴：
ｉ）非荷電であること；
ｉｉ）細胞収縮を誘発することによって、前記試料に含まれている前記細胞を安定化すること；
ｉｉｉ）細胞不透過性であること；
ｉｖ）水溶性であること；
ｖ）ヒドロキシル化有機化合物であること；
ｖｉ）ポリオールであること；
ｖｉｉ）ヒドロキシカルボニル化合物であること；
ｖｉｉｉ）炭水化物もしくは糖アルコールであること；および／もしくは
ｉｘ）ジヒドロキシアセトンであること、
の１つもしくは複数、好ましくは２つ以上を有し、
ならびに／または
ｃ）前記式１の化合物が、以下の特徴：
ｉ）Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が、１〜５個の炭素原子を含むこと；
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が、１個または２個の炭素原子を含むこと；
ｉｉｉ）Ｒ４が、酸素であること；
ｉｖ）Ν，Ν−ジアルキル−カルボン酸アミドであること；
ｖ）Ν，Ν−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド、Ν，Ν−ジメチルホルムアミドおよびΝ，Ν−ジエチルホルムアミドからなる群から選択されること；および／もしくは
ｖｉ）Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドであること、
の１つもしくは複数を有する、
請求項１から５の１項または複数項に記載の容器。
【請求項７】
前記安定化組成物が、さらに少なくとも１種の抗凝固剤、好ましくはＥＤＴＡなどのキレート剤を含む、請求項１から６の１項または複数項に記載の容器。
【請求項８】
前記安定化組成物は、前記試料が前記安定化組成物に加えられるときに、得られる混合物が、以下の特徴：
ａ）前記カスパーゼ阻害剤を、少なくとも０．０１μＭ、少なくとも０．０５μＭ、少なくとも０．１μＭ、少なくとも０．５μＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも２．５μＭもしくは少なくとも３．５μＭから選択される濃度で含むこと；
ｂ）前記カスパーゼ阻害剤を、０．０１μＭ〜１００μＭ、０．０５μＭ〜１００μＭ、０．１μＭ〜５０μＭ、１μＭ〜４０μＭ、１μＭ〜３０μＭもしくは２．５μＭ〜２５μＭから選択される濃度範囲で含むこと；
ｃ）前記高張剤を、少なくとも０．０５Ｍ、少なくとも０．１Ｍ、好ましくは少なくとも０．２５Ｍ、より好ましくは少なくとも０．５Ｍの濃度で含むこと；
ｄ）前記高張剤を、０．０５Ｍ〜２Ｍ、０．１〜１．５Ｍ、０．１５Ｍ〜０．８Ｍ、０．２Ｍ〜０．７Ｍもしくは０．１Ｍ〜０．６Ｍから選択される濃度範囲で含むこと；
ｅ）式１の前記化合物を、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも０．７５％、少なくとも１％、少なくとも１．２５％もしくは少なくとも１．５％の濃度で含むこと；
ｆ）式１の前記化合物を、０．１％〜５０％、０．５％〜２５％、０．７５％〜２０％、１％〜１５％、もしくは１％〜１０％から選択される濃度範囲で含むこと；および／または
ｇ）前記抗凝固剤、好ましくはキレート剤を、０．０５ｍＭ〜１００ｍＭ、０．０５ｍＭ〜５０ｍＭ、０．１ｍＭ〜３０ｍＭ、１ｍＭ〜２０ｍＭもしくは２ｍＭ〜１５ｍＭから選択される濃度範囲で含むこと、
の１つまたは複数を有する濃度において、前記カスパーゼ阻害剤、前記高張剤、式１の前記化合物および／または前記抗凝固剤を含む、請求項１から７の１項または複数項に記載の容器。
【請求項９】
前記安定化組成物が、
ａ）カスパーゼ阻害剤としての少なくとも１種の汎カスパーゼ（pancaspase）阻害剤、
ｂ）少なくとも１種の高張剤、好ましくはヒドロキシル化有機化合物、および
ｃ）任意選択により、少なくとも１種の式１の化合物、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキル−カルボン酸アミド、および
ｄ）任意選択により、抗凝固剤として、キレート剤、好ましくはＥＤＴＡ、
を含む、
請求項１から８の１項または複数項に記載の容器。
【請求項１０】
前記細胞外核酸集団の安定化が、冷蔵されずに、好ましくは室温で、
ａ）少なくとも２日；
ｂ）少なくとも３日；
ｃ）少なくとも１日〜３日；
ｄ）少なくとも１日〜６日；および／または
ｅ）少なくとも１日〜７日、
から選択される期間にわたって達成可能である、請求項１から９の１項または複数項に記載の容器。
【請求項１１】
前記容器は、開口上部、底部、およびその間に広がってチャンバを画定する側壁を有し、前記安定化組成物は前記チャンバに含まれる、請求項１から１０の１項または複数項に記載の容器。
【請求項１２】
前記容器は管であり、前記底部は閉じた底部であり、前記容器はさらに、前記開口上部に蓋を含み、チャンバは減圧状態にされる、請求項１１に記載の容器。
【請求項１３】
前記蓋は、針またはカニューレで穿通することができ、減圧度は、特定体積の液体試料をチャンバに引き入れるように選択される、請求項１１または請求項１２に記載の容器。
【請求項１４】
前記チャンバは、特定体積の液体試料をチャンバに引き入れるように選択された減圧状態にされ、前記安定化組成物は液体であり、安定化組成物と特定体積の細胞含有試料の体積比が、１０：１〜１：２０、５：１〜１：１５、１：１〜１：１０および１：２〜１：５から選択されるようにチャンバ内に分注される、請求項１３に記載の容器。
【請求項１５】
血液試料を収集するための容器であって、前記血液試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するための安定化組成物は、安定化に起因して、前記試料に含有されている細胞からのゲノムＤＮＡの前記試料の無細胞部分への放出が低減され、かつ前記試料中に存在する核酸の分解が低減されることをもたらし、前記安定化組成物はカスパーゼ阻害剤および抗凝固剤を含む、請求項１から１４の１項または複数項に記載の容器。
【請求項１６】
生体試料、好ましくは血液試料中の細胞外核酸集団を安定化する組成物が、
ａ）少なくとも１種のカスパーゼ阻害剤、および
ｂ）前記試料に潜在的に含まれている細胞を安定化する少なくとも１種の高張剤、好ましくは少なくとも１種のヒドロキシル化有機化合物および／または
ｃ）少なくとも１種の式１の化合物
【化２】
2014528719.tif 000031
［式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１〜Ｃ５アルキル残基、より好ましくはメチル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、直鎖または分岐状に配列した炭素原子１〜２０個の鎖長を有する、同じまたは異なる炭化水素残基であり、Ｒ４は、酸素、硫黄またはセレン残基である］；および
ｄ）任意選択により、少なくとも１種の抗凝固剤、好ましくはキレート剤、
を含む、請求項１から１５の１項または複数項に記載の容器。
【請求項１７】
前記安定化組成物が、以下の特徴：
ａ）前記試料に含有されている細胞からのゲノムＤＮＡの、前記試料の無細胞部分への放出を低減できること；
ｂ）前記試料中に存在する核酸、特にゲノムＤＮＡの分解を低減できること；
ｃ）固体形態で提供されること；
ｄ）液体形態で提供されること；ならびに／または
ｅ）前記試料に含有されている前記細胞外核酸集団を、室温で少なくとも３日間、好ましくは少なくとも６日間にわたって安定化できること、
の１つまたは複数を有する、請求項１から１６の１項または複数項に記載の容器。
【請求項１８】
前記容器が前記無細胞試料をさらに含み、前記無細胞試料が、以下の特徴：
ａ）細胞外核酸を含むこと；
ｂ）全血、血漿、血清、リンパ液、尿、髄液、脳脊髄液、腹水、乳、糞便、気管支洗浄液、唾液、羊水、精液／精漿、スワブ／スメア、体液、身体分泌物、鼻分泌物、膣分泌物、創傷分泌物および排泄物、ならびに細胞培養上清からなる群から選択されること；
ｃ）細胞が欠乏しているもしくは細胞を含有する体液であること；
ｄ）全血、血漿および／もしくは血清から選択されること；ならびに／または
ｅ）全血であること、
の１つまたは複数を有する、請求項１から１７の１項または複数項に記載の容器。
【請求項１９】
患者から試料を収集して、請求項１から１８の１項または複数項に記載の容器のチャンバに入れるステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に開示の技術は、細胞含有試料、特に血液試料中の細胞外核酸集団を安定化するのに適した方法および組成物、ならびにそれぞれに安定化された生体試料から細胞外核酸を単離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明を成すに至った研究は、助成契約第２２２９１６号の下で欧州共同体の第７次フレームワークプログラム（ＦＰ７／２００７〜２０１３年）から資金援助を受けている。
【０００３】
細胞外核酸は、血液、血漿、血清および他の体液において同定されている。それぞれの試料に見出される細胞外核酸は、ヌクレアーゼから保護されていることに起因して（例えば、プロテオリピド複合体の形態で分泌され、タンパク質に結合し、または小胞に含有されているので）、分解に対してある程度の耐性がある。多くの病状、悪性腫瘍および感染過程において高レベルで存在するＤＮＡおよび／またはＲＮＡなどの細胞外核酸は、中でも、スクリーニング、診断、予後、疾患進行の監視、潜在的治療標的の同定、および治療応答のモニタリングの対象となる。さらに、母体血における胎児ＤＮＡ／ＲＮＡの上昇は、例えば性別識別を決定し、染色体異常を評価し、妊娠関連合併症をモニタするために使用されている。したがって、細胞外核酸は、特に非侵襲的な診断および予後において有用であり、非侵襲的な出生前遺伝的試験、腫瘍学、移植医療または多くの他の疾患などの多くの適用分野において、例えば診断マーカーとして使用することができ、したがって診断に関連するものである（例えば、胎児または腫瘍由来の核酸）。しかし細胞外核酸は、健康なヒトにも見出される。細胞外核酸の一般的な適用および分析方法は、例えば特許文献１、特許文献２、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５に記載されている。
【０００４】
従来、血液などの細胞含有生体試料から細胞外核酸を単離する第１のステップは、前記試料の本質的に無細胞の画分、例えば血液の場合には血清または血漿のいずれかを得ることである。次に、前記無細胞画分、血液試料を処理する場合には一般に血漿から、細胞外核酸を単離する。しかし、試料の本質的に無細胞の画分を得るには、問題を伴う場合があり、細胞の破壊中に放出される細胞核酸により細胞外核酸を汚染するおそれがある遠心分離中には、細胞が破壊されないように注意深く制御された条件を使用することが重要であるため、分離は、しばしば長ったらしく時間のかかる多段階過程となる。さらに、すべての細胞を除去することは、しばしば困難である。したがって、血漿または血清などの「無細胞」としばしば一般に分類される、処理済みの多くの試料は、実際には分離過程中に除去されなかった残存量の細胞を依然として含有している。考慮すべき別の重要な事項は、典型的には採血を行ってから相対的に短時間内に、エクスビボ（ex vivo）でのインキュベーション中に細胞が破壊されることに起因して、試料に含有されている細胞から細胞核酸が放出されてしまうということである。細胞溶解が始まると、溶解細胞がさらなる核酸を放出し、それらが細胞外核酸と混合され、試験のために細胞外核酸を回収することがますます困難になる。これらの問題は、従来技術で論じられている（例えば、非特許文献６、非特許文献５および特許文献３参照）。さらに分解に起因して、利用可能な細胞外核酸の量および回収可能性が、ある期間にわたって実質的に低下するおそれがある。
【０００５】
例えば腫瘍細胞または胎児に由来する哺乳動物の細胞外核酸に加えて、細胞含有試料は、細胞には含まれていないが対象となる他の核酸を含む場合もある。重要な非限定的な例が、ウイルス核酸などの病原体核酸である。輸送および取扱い中に、特に血液被験物などの細胞含有試料中のウイルス核酸の完全性を保存することは、その後の分析およびウイルス負荷モニタリングにとっても極めて重要である。
【０００６】
先に論じた問題は、特に、例えば全血試料を用いる場合のように、試料が多量の細胞を含む場合に課題となる。したがって、前述の問題を回避し、それぞれに低減するために、基本的には試料を得た直後に、試料に含有されている細胞から、試料の本質的に無細胞の画分を分離するのが一般的である。例えば、細胞外核酸の完全性を保存し、含有細胞から放出される細胞内核酸によって細胞外核酸集団が汚染されるのを回避するために、基本的には採血直後に全血から血漿を得、かつ／または全血および／もしくは得られた血漿もしくは血清を冷却することが推奨される。しかし、例えば血液から血漿を直接分離する必要がある場合、採血を行う多くの施設（例えば診療所）が、血漿を効率的に分離できる遠心分離機を備えていないので、大きな不利益となる。さらに、通常条件で得られた血漿は、しばしば残存量の細胞を含んでおり、したがってそれらの細胞が損傷を受ける場合もあり、または試料の取扱い中に死滅する場合もあり、それによって前述の通り、細胞内核酸、特にゲノムＤＮＡが放出される。これらの残存細胞は、取扱い中に損傷を受ける危険性もあり、その結果、それらの核酸内容物、特にゲノム（核）ＤＮＡおよび細胞質性ＲＮＡが、細胞外の循環核酸画分に混ざり込み、それによってその画分を汚染し、それぞれに希釈するおそれがある。これらの残存する汚染性細胞を除去し、前述の問題を回避／低減するために、第２の遠心分離ステップをより高速で実施することが知られている。しかしやはり、このような強力な遠心分離機は、血液を得る施設では利用可能でないことが多い。さらに、血漿が採血直後に得られるとしても、核酸を直接単離できない場合には、血漿に含有されている核酸を保存するために−８０℃で凍結させることが推奨される。このことも、例えば血漿試料を凍結させて輸送しなければならないため、試料の処理時に実用的な制約を課す。これにより費用が増大し、さらに、低温流通体系が中断される場合には、試料が損なわれる危険性がある。
【０００７】
現在、血液試料は、通常はスプレー乾燥させたまたは液体のＥＤＴＡを含有する採血管（例えば、ＢＤバキュテイナＫ2ＥＤＴＡ）に収集されている。ＥＤＴＡは、マグネシウム、カルシウムおよび他の二価の金属イオンをキレートし、それによって、例えば凝血またはＤＮａｓｅによるＤＮＡ分解などの酵素反応を阻害する。しかしＥＤＴＡは、効率的な抗凝固剤であっても、放出された細胞内核酸によって細胞外核酸集団が希釈され、それぞれに汚染されるのを効率的に防止するものではない。したがって、試料の無細胞部分に見出される細胞外核酸集団は、貯蔵中に変化してしまう。したがってＥＤＴＡでは、特に採血後に、試料の運搬および貯蔵中の細胞分解および細胞不安定性によって生じる、例えばゲノムＤＮＡ断片による細胞外核酸集団の汚染を回避できないため、細胞外核酸集団を十分に安定化することができない。
【０００８】
従来技術では、特に、全血に含有されている循環核酸を安定化することを目的とした方法が知られている。ある方法では、ホルムアルデヒドを用いて細胞膜を安定化し、それによって細胞溶解を低減する。さらに、ホルムアルデヒドはヌクレアーゼを阻害する。それぞれの方法は、例えば特許文献４および特許文献５に記載されている。しかし、ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド放出物質の使用には、核酸分子同士、またはタンパク質と核酸との間に架橋を誘発することによって、細胞外核酸の単離効率を損なうおそれがあるという欠点がある。血液試料を安定化する代替方法は、例えば特許文献６および特許文献７に記載されている。かなり最近になって開発されたこれらの方法は、細胞含有生体試料を安定化して、例えばこのような試料に含有されている細胞外核酸を効率的に回収することができる手段を提供する必要性が高いことを実証している。
【０００９】
しかし、かなり最近のこうした開発にもかかわらず、生体試料、特に細胞を含有すると疑われる試料を含む細胞含有試料、特に全血、血漿または血清に含まれている細胞外核酸集団を安定化し、それによってこのような試料の取扱い、それぞれに処理をより容易にし（例えば、全血から血漿を直接分離する、または単離された血漿を冷却もしくはさらには凍結する必要を回避することによって）、それによってこのような試料に含有されている細胞外核酸の単離および試験を、より信頼性が高いものにし、それによって結果的に、細胞外核酸の診断および予後能力を改善する試料処理技術の開発が、依然として継続的に必要とされている。特に、例えば出生前試験および／または新生物、特に前悪性疾患もしくは悪性疾患のスクリーニングのために、全血試料中の細胞外核酸を保存するための解決策が、継続的に必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第９７／０３５５８９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９７／３４０１５号パンフレット
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１０／０１８４０６９号明細書
【特許文献４】米国特許第７，３３２，２７７号明細書
【特許文献５】米国特許第７，４４２，５０６号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１０／０１８４０６９号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１０／０２０９９３０号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】スワラップ(Swarup)ら, エフイービーエス  レターズ（FEBS Letters） 581 (2007)795-799
【非特許文献２】フライシュハッカー(Fleischhacker) アンナルズ  オブ  ザ  ニューヨーク  アカデミー  オブ  サイエンス（Ann. N.Y. Acad. Sci.） 1075: 40-49 (2006)
【非特許文献３】フライシュハッカーおよびシュミット(Fleischhacker and Schmidt), ビオキミカ  エト  ビオフィジカ  アクタ（Biochmica et Biophysica Acta） 1775 (2007)191-232
【非特許文献４】ロマドニコワ(Hromadnikova)ら(2006)ＤＮＡと細胞生物学(DNA and Cell biology), Volume 25, Number 11 pp 635-640
【非特許文献５】ファン(Fan)ら(2010), 臨床化学(Clinical Chemistry) 56:8
【非特許文献６】チュウ(Chiu)ら(2001), 臨床化学(Clinical Chemistry) 47:9 1607-1613
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、従来技術の試料安定化方法の欠点の少なくとも１つを克服することである。したがって本発明の一目的は、中でも細胞含有試料、特に全血を安定化することができる方法を提供することである。特に、本発明の一目的は、生体試料に含有されている細胞外核酸集団を安定化し、特に、ゲノムＤＮＡ、特に断片化ゲノムＤＮＡによる細胞外核酸集団の汚染を回避することである。さらに、特に本発明の一目的は、生体試料、好ましくは全血試料を、室温でも、好ましくは少なくとも２日間、好ましくは少なくとも３日間にわたって安定化するのに適した方法を提供することである。さらに、本発明の一目的は、生体試料、特に試料に含まれている細胞外核酸集団を有効に安定化することができる試料収集容器、特に採血管を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、驚くべきことには、いくつかの添加剤が、細胞外核酸を含む細胞含有生体試料、特に全血試料または例えば血漿などの全血に由来する試料を安定化するのに有効であると見出したことに基づく。これらの添加剤は、細胞外核酸集団を安定化するのに効率が高く、特にゲノムＤＮＡ、特に断片化ゲノムＤＮＡによる汚染を回避し、または少なくとも著しく低減できることが見出された。
【００１４】
第１の態様によれば、試料を、
ａ）少なくとも１種のアポトーシス阻害剤、
ｂ）試料に含まれている細胞を安定化する少なくとも１種の高張剤、および／または
ｃ）少なくとも１種の式１の化合物
【００１５】
【化１】
2014528719.tif 000002
［式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１〜Ｃ５アルキル残基、より好ましくはメチル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、直鎖または分岐状に配列した炭素原子１〜２０個の鎖長を有する、同じまたは異なる炭化水素残基であり、Ｒ４は、酸素、硫黄またはセレン残基である］
と接触させる、細胞含有試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するのに適した方法が提供される。
【００１６】
第１の従属態様によれば、試料を少なくとも１種のアポトーシス阻害剤と接触させる、細胞含有試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するのに適した方法が提供される。好ましくは、細胞含有試料は、全血、血漿または血清から選択される。驚くべきことに、アポトーシス阻害剤は、試料に含有されている細胞から生じる、例えば損傷細胞または死滅細胞から生じる細胞内核酸、特に断片化ゲノムＤＮＡによる細胞外核酸集団の汚染を低減することが見出された。さらに本発明者らは、アポトーシス阻害剤が、試料中に存在する核酸の分解を低減することを見出した。したがって、アポトーシス阻害剤を使用する本発明による安定化には、生体試料を得、それぞれに収集した時点で、その試料に含有されている細胞外核酸集団が示す状態で、それらが実質的に保存されるという効果がある。
【００１７】
第２の従属態様によれば、試料を、試料に含まれている細胞を安定化することができる少なくとも１種の高張剤と接触させる、細胞含有試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するのに適した方法が提供される。驚くべきことには、穏やかな高張効果（浸透）によって誘発される細胞収縮は、細胞の安定性をかなり増大することが見出された。高張剤は、細胞の安定性を増大することによって、特に細胞内核酸、特にゲノムＤＮＡが、それを含有する細胞から試料の細胞外の部分または区画に放出されるのを低減する。したがって、高張剤を使用する本発明による安定化には、生体試料を得、それぞれに収集した時点で、その試料に含有されている細胞外核酸集団が示す状態で、それらが実質的に保存されるという効果がある。
【００１８】
本発明の第３の従属態様によれば、試料を、少なくとも１種の式１の化合物
【化２】
2014528719.tif 000003
［式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１〜Ｃ５アルキル残基、より好ましくはメチル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、直鎖または分岐状に配列した炭素原子１〜２０個の鎖長を有する、同じまたは異なる炭化水素残基であり、Ｒ４は、酸素、硫黄またはセレン残基である］
と接触させる、細胞含有試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するのに適した方法が提供される。それぞれの化合物を添加することは、細胞外核酸集団に対して有利な安定化効果があることが見出された。
【００１９】
第４の従属態様によれば、試料を、
ａ）少なくとも１種のアポトーシス阻害剤、および
ｂ）試料に含まれている細胞を安定化する少なくとも１種の高張剤
と接触させる、細胞含有試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するのに適した方法が提供される。
【００２０】
これらの安定化剤（および任意選択によりさらなる添加剤）の組合せは、細胞内核酸、特にゲノムＤＮＡが、それを含有する細胞から試料の細胞外部分に放出されるのを阻害するのに著しく有効であることが見出された。さらに、試料中に存在する核酸の分解が、高効率で防止されることが示された。特に、それぞれに安定化された試料では、見出される断片化ゲノムＤＮＡが少ない。したがって、この安定化添加剤の組合せを使用する本発明による安定化には、生体試料を得、それぞれに収集した（例えば、血液の場合には採血した）時点で、その試料に含有されている細胞外核酸集団が示す状態で、それらが実質的に有効に保存され、特に、断片化ゲノムＤＮＡによる細胞外核酸集団の汚染が低減されるという効果がある。
【００２１】
また本発明の一目的は、細胞外核酸の安定化効果を強化するために、細胞含有試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するための安定化剤のさらなる組合せを提供することである。それぞれの組合せは、少なくとも１種のアポトーシス阻害剤、少なくとも１種の高張剤および／または先に定義の少なくとも１種の式１の化合物、例えば（１）少なくとも１種のアポトーシス阻害剤および先に定義の少なくとも１種の式１の化合物の組合せ、（２）少なくとも１種の高張剤および少なくとも１種の式１の化合物の組合せ、または（３）３種すべての安定化剤、すなわち少なくとも１種のアポトーシス阻害剤、少なくとも１種の高張剤および少なくとも１種の式１の化合物の組合せを含むことができる。それぞれの組合せは、例えばキレート剤などの安定化効果を強化する追加の添加剤を含むこともできる。試料が血液または血液由来の試料である場合、通常は抗凝固剤も添加される。この目的では、例えばＥＤＴＡなどのキレート剤が適している。それぞれの安定化剤の組合せは、本発明の第１の態様に従って細胞含有試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するのに適した方法で有利に使用される、第５の従属態様に従うことができる。
【００２２】
第２の態様によれば、生体試料から細胞外核酸を単離する方法が提供され、前記方法は、
ａ）本発明の第１の態様に定義の方法に従って、試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するステップと、
ｂ）細胞外核酸を前記試料から単離するステップと
を含む。
【００２３】
ステップａ）における安定化は、例えば、前述の本発明の第１の態様の５つの従属態様の１つに従って達成することができる。先に論じた通り、本発明の安定化には、生体試料を得、それぞれに収集した時点で、その試料に含有されている細胞外核酸集団が示す状態で、それらが実質的に保存されるという効果がある。したがって、それぞれに安定化された試料から得られた細胞外核酸は、安定化されていない試料から得られる細胞外核酸と比較して、例えば試料に含まれている崩壊細胞から生じる細胞内核酸、特に断片化ゲノムＤＮＡによる汚染が少ない。細胞外核酸集団の実質的な保存は、この安定化／保存が任意のその後の試験の精度を強化するので、重要な利点である。細胞外核酸集団の実質的な保存により、細胞外核酸集団の単離およびその後の分析が標準化され、それによって細胞外核酸画分に基づく診断または予後の適用が、より信頼性が高いものになり、使用される貯蔵／取扱い条件との独立性がより高まる。それによって、それぞれに単離された細胞外核酸の診断および予後の適用性が改善される。特に、本開示の教示は、特定の細胞外核酸分子の比が、試料を収集した時点の比と比較して、実質的に一定に保持され得るという利点を有する。安定化は、細胞内核酸が細胞内に実質的に保持され、細胞外核酸が実質的に安定化されると達成される。
【００２４】
第３の態様によれば、細胞含有生体試料を安定化するのに適した組成物が提供され、その組成物は、
ａ）少なくとも１種のアポトーシス阻害剤、好ましくはカスパーゼ阻害剤、および／または
ｂ）試料に含まれている細胞を安定化するのに適した少なくとも１種の高張剤；好ましくはヒドロキシル化有機化合物；および／または
ｃ）先に定義の少なくとも１種の式１の化合物；および／または
ｄ）任意選択により少なくとも１種の抗凝固剤、好ましくはキレート剤
を含む。
【００２５】
それぞれの安定化組成物は、細胞含有生体試料、特に全血、血漿および／または血清に含まれている細胞および細胞外核酸集団を安定化することによって、前記試料を安定化するのに特に有効である。好ましくは、ａ）〜ｃ）に定義の安定化剤の少なくとも２種、より好ましくはａ）〜ｃ）に定義の安定化剤のすべてが、安定化組成物中に存在する。それぞれの安定化組成物により、試料の質、それぞれにその試料に含有されている細胞外核酸集団の質を実質的に損なわずに、試料、例えば全血を、室温で少なくとも２日間または好ましくは３日間にわたって貯蔵し、かつ／または取り扱い、例えば輸送することができる。したがって、本発明による安定化組成物を使用すると、試料収集、例えば採血と、核酸抽出との間の時間は、試料に含有されている細胞外核酸集団に対して実質的な効果を及ぼさずに変わり得る。このことは、様々な取扱い手順に起因し得る細胞外核酸集団の変動性を低減するので、重要な利点である。
【００２６】
第４の態様によれば、細胞含有生体試料、好ましくは血液試料を収集するための、本発明の第３の態様による組成物を含む容器が提供される。安定化組成物を含むそれぞれの容器、例えば試料収集管を提供することには、試料がそれぞれの容器に収集されるとすぐに安定化されるという利点がある。さらに、それぞれの試料収集容器、特に採血管は、血液細胞および細胞外核酸、ならびに任意選択により血液試料または血液由来の試料に含有されているウイルス、それぞれにウイルス核酸を安定化することができる。それによって、さらなる問題が克服された。
【００２７】
第５の態様によれば、患者から生体試料、好ましくは血液を、本発明の第４の態様による容器のチャンバに直接収集し、好ましくは採血するステップを含む方法が提供される。
【００２８】
第６の態様によれば、組成物の構成成分が混合され、好ましくは溶液内で混合される、本発明の第３の態様による組成物を生成する方法が提供される。用語「溶液」は、本明細書で使用される場合、特に液体組成物、好ましくは水性組成物を指す。溶液は、一相だけからなる均質な混合物であってもよいが、本発明の範囲には、例えば沈殿物などの固体構成成分を含むことも含まれる。
【００２９】
本願の他の目的、特徴、利点および態様は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から当業者には明らかとなる。しかし、以下の説明、添付の特許請求の範囲および具体例は、本願の好ましい実施形態を示すものであり、単に例示的であることを理解されたい。開示の本発明の精神および範囲に含まれる様々な変更および改変は、以下を読むことによって当業者には容易に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１ａ】カスパーゼ阻害剤で処理した試料から単離したＤＮＡに、チップ電気泳動法を施した後のゲルの写真である（実施例１）。
【図１ｂ】血漿中のリボソーム１８Ｓ  ＤＮＡの増加に対する、カスパーゼ阻害剤の効果を示す図である（実施例１）。
【図２ａ】異なる濃度のカスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨで処理した試料から単離したＤＮＡに、チップ電気泳動法を施した後のゲルの写真である（実施例２）。
【図２ｂ】異なる濃度のカスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨとグルコースとの組合せの、血漿中のリボソーム１８Ｓ  ＤＮＡの増加に対する効果を示す図である（実施例２）。
【図３】様々な緩衝液に溶解したジヒドロキシアセトンで処理した血液細胞について、フローサイトメトリーによって測定した血液細胞の完全性を示す図である（実施例３）。
【図４ａ】様々な緩衝液に溶解したジヒドロキシアセトンで処理した試料から単離したＤＮＡに、チップ電気泳動法を施した後のゲルの写真である（実施例３）。
【図４ｂ】リボソーム１８Ｓ  ＤＮＡの増加に対する、ジヒドロキシアセトンの効果を示す図である（実施例３）。
【図５】異なる濃度のジヒドロキシアセトンで処理した血液細胞について、フローサイトメトリーによって測定した血液細胞の完全性を示す図である（実施例４）。
【図６ａ】様々な濃度のジヒドロキシアセトンで処理した試料から単離したＤＮＡに、チップ電気泳動法を施した後のゲルの写真である（実施例４）。
【図６ｂ】リボソーム１８Ｓ  ＤＮＡの増加に対する、様々なジヒドロキシアセトン濃度の効果を示す図である（実施例４）。
【図７ａ】高濃度のＫ2ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨおよびＤＨＡの組合せで処理した血液細胞について、フローサイトメトリーによって測定した血液細胞の完全性を示す図である（実施例５）。
【図７ｂ】１８Ｓ  ＤＮＡの増加に対する、ＥＤＴＡ、ＤＨＡおよびＱ−ＶＤ−ＯＰＨの組合せの効果を示す図である（実施例５）。
【図８】血漿中の遊離循環ｍＲＮＡの転写レベルに対する、ＥＤＴＡ、ＤＨＡおよびＱ−ＶＤ−ＯＰＨの組合せの効果を示す図である（実施例６）。
【図９】血漿中のリボソーム１８Ｓ  ＤＮＡの増加に対する、異なる濃度のＤＭＡＡの効果を示す図である。
【図１０】１８Ｓ  ｒＤＮＡの増加に対する様々な糖アルコールの影響を示す図である（実施例８）。
【図１１】１８Ｓ  ｒＤＮＡの増加に対する物質の影響を示す図である（実施例９）。
【図１２】１８Ｓ  ｒＤＮＡの増加に対する物質の影響を示す図である（実施例１０）。
【図１３】１８Ｓ  ｒＤＮＡの増加に対する物質の影響を示す図である（実施例１１）。
【図１４】１８Ｓ  ｒＤＮＡの増加に対する物質の影響を示す図である（実施例１１）。
【図１５】１８Ｓ  ｒＤＮＡの増加に対する物質の影響を示す図である。
【図１６】３７℃で最長６日間インキュベートした全血の血漿画分中のｃｃｆＤＮＡの増加を示す図である（実施例１３）。
【図１７】３７℃で最長６日間インキュベートした全血の血漿画分中のｃｃｆＤＮＡの増加を示す図である（実施例１３）
【図１８】スパイクインしたＤＮＡ断片のヒット率（％）を示す図である（実施例１４）。
【図１９】平均コピー数を示す図である（実施例１４）。
【図２０】ＢＤバキュテイナＫ２Ｅと比較した１８Ｓの百分率を示す図である（実施例１４）。
【図２１】全血において３７℃でインキュベートし、血漿から精製したＨＩＶの減少を示す図である（実施例１５）。
【図２２】全血において３７℃でインキュベートし、血漿から精製したＨＣＶの減少を示す図である（実施例１５）。
【図２３】１８Ｓ  ｒＤＮＡ増加ドナー１に対するプロピオンアミドの影響を示す図である（実施例１６）。
【図２４】１８Ｓ  ｒＤＮＡ増加ドナー２に対するプロピオンアミドの影響を示す図である（実施例１６）。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するのに適した方法、組成物およびデバイスを対象とし、したがってそれに適した技術を対象とする。本明細書に開示の安定化技術により、細胞外核酸集団が、例えば試料に含有されている損傷細胞および／または死滅細胞に由来する、例えばそれから放出される細胞内核酸、特に断片化ゲノムＤＮＡによって汚染される危険性が低減する。したがって、本発明は、試料を安定化することを達成し、したがって試料に含まれている細胞外核酸集団を、含有細胞の溶解なしに安定化することを達成する。さらに正確には、試料に含有されている細胞が安定化され、それによって細胞内核酸の放出が実質的に防止または低減される。本発明の方法および組成物によって達成される注目すべき安定化により、試料の質、それぞれにその試料に含有されている細胞外核酸の質を危険にさらすことなく、安定化された試料を室温で長期間貯蔵し、かつ／または取り扱うことができる。細胞外核酸集団の組成物は、本発明の教示を使用することによって試料を得た時点で安定化され、したがって実質的に保存されるので、試料収集と核酸抽出との間の時間は、細胞外核酸集団の組成に対して著しく大きい作用を及ぼさずに変わり得る。このことにより、試料の取扱い／貯蔵における変動が、細胞外核酸集団の質、それぞれに組成に対して影響が少ないので、例えば診断または予後の細胞外核酸分析を標準化することができ、それによって従来技術の方法を上回る重要な利点を提供する。したがって試料も、それぞれに安定化された試料から得られる細胞外核酸もそれぞれに、より同等になる。さらに、本発明の教示では、普通なら崩壊細胞から放出される細胞内核酸、特に断片化ゲノムＤＮＡによって細胞外核酸が汚染されるのを回避し、それぞれに低減するために、試料に含有されている細胞を、試料の無細胞部分から直接分離するという必要がなくなる。この利点により、試料の取扱い、特に全血試料の取扱いが大幅に簡素化される。例えば、診療所で得られ、本発明の教示に従って安定化された全血試料は、室温で輸送することができ、好都合には、細胞外核酸を含有する血漿は、それを受け取る臨床研究室で分離することができる。しかし、本発明の教示は、細胞が欠乏している生体試料、または一般に「無細胞」と呼ばれる試料、例えば血漿または血清などを処理する場合にも有利である。細胞欠乏または「無細胞」のそれぞれの生体試料は、ゲノムＤＮＡを含む残存細胞、特に白血球細胞を依然として含む場合があり（使用される分離過程にもよる）、したがってそれにより（潜在的に）残存している細胞が輸送または貯蔵過程中に損傷または死滅する場合には、細胞外核酸集団が細胞内核酸、特に断片化ゲノムＤＮＡで徐々に汚染される危険性がある。この危険性は、本発明によって教示される安定化方法を使用すると、大幅に低減される。本発明の技術により、試料を収集し、安定化剤と接触させた時点で、試料の細胞外核酸集団を効率的に保存することができるので、前記試料は、それを受け取る施設で細胞外核酸を前記試料から単離するために適切に後処理され得ると同時に、細胞外核酸集団が細胞内核酸によって汚染されるのを実質的に回避し、それぞれに低減することができる。試料を受け取る施設、例えば研究室などは、通常、細胞欠乏試料に存在し得る残存細胞を含む、例えば血漿などの試料に含まれている細胞を効率的に除去するのに必要な装置、例えば高速遠心分離機（または他の手段、下記も参照）なども備えている。このような装置は、試料が得られる施設には備えられていないことが多い。したがって、本発明は、多量の細胞を含む生体試料、例えば全血試料などを安定化する場合に多くの利点を有するだけでなく、ごく少量の細胞を含むか、または細胞を含有していると単に疑われ得る生体試料、例えば血漿、血清、尿、唾液、滑液、羊水、涙液、膿漿、リンパ液、髄液、脳脊髄液などを安定化する場合にも重要な利点を有する。
【００３２】
第１の態様によれば、試料を、
ａ）少なくとも１種のアポトーシス阻害剤、および／または
ｂ）試料に含まれている細胞を安定化する少なくとも１種の高張剤、および／または
ｃ）少なくとも１種の式１の化合物
【００３３】
【化３】
2014528719.tif 000004
［式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１〜Ｃ５アルキル残基、より好ましくはメチル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、直鎖または分岐状に配列した炭素原子１〜２０個の鎖長を有する、同じまたは異なる炭化水素残基であり、Ｒ４は、酸素、硫黄またはセレン残基である］
と接触させる、細胞含有試料、好ましくは血液試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するのに適した方法が提供される。
【００３４】
それによって、含有細胞から生じる、例えば損傷細胞もしくは死滅細胞から生じる細胞内核酸、特に断片化ゲノムＤＮＡによって細胞外核酸集団が汚染される危険性が低減し、および／または試料中に存在する核酸の分解が低減され、それぞれに阻害される。このことは、前記試料に含まれている細胞外核酸集団の組成が、実質的に保存され、それぞれに安定化されるという効果を有する。
【００３５】
用語「複数の細胞外核酸」または「１個の細胞外核酸」は、本明細書で使用される場合、特に、細胞には含有されていない核酸を指す。それぞれの細胞外核酸は、無細胞核酸と呼ばれることも多い。これらの用語は、本明細書では同義語として使用される。したがって、細胞外核酸は、通常は試料中の１つまたは複数の細胞の外部に存在する。用語「細胞外核酸」は、例えば細胞外ＲＮＡならびに細胞外ＤＮＡを指す。生体試料、例えば血漿などの体液の無細胞画分（それぞれに部分）に見出される典型的な細胞外核酸の例には、それに限定されるものではないが、哺乳動物の細胞外核酸、例えば腫瘍関連または腫瘍由来の細胞外ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、他の疾患に関係する細胞外ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、後成的に修飾されたＤＮＡ、胎児のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡなど、ならびに非哺乳動物の細胞外核酸、例えば原核生物（例えば細菌）、ウイルス、真核生物の寄生虫または真菌などから細胞外核酸集団に放出されたウイルス核酸、病原体核酸などが含まれる。一実施形態によれば、細胞外核酸は、細胞含有生体試料としての体液、例えば血液、血漿、血清、唾液、尿、髄液、脳脊髄液、喀痰、涙液、汗、羊水またはリンパ液などから得られ、それぞれにそれらに含まれる。本明細書では、循環体液から得られる細胞外核酸は、循環細胞外核酸または循環無細胞核酸と呼ばれる。一実施形態によれば、細胞外核酸という用語は、特に、哺乳動物の細胞外核酸、好ましくは疾患関連もしくは疾患由来の細胞外核酸、例えば腫瘍関連もしくは腫瘍由来の細胞外核酸、炎症もしくは傷害、特に外傷に起因して放出された細胞外核酸、他の疾患に関係し、かつ／もしくはそれに起因して放出された細胞外核酸、または胎児に由来する細胞外核酸を指す。用語「複数の細胞外核酸」または「１個の細胞外核酸」は、本明細書に記載の通り、他の試料、特に体液以外の生体試料から得られた細胞外核酸も指す。通常、２個以上の細胞外核酸が試料に含まれる。通常、試料は、２つ以上の種類またはタイプの細胞外核酸を含む。用語「細胞外核酸集団」は、本明細書で使用される場合、特に、細胞含有試料に含まれている様々な細胞外核酸の集合体を指す。細胞含有試料は、通常、特徴的であり、したがってユニークな細胞外核酸集団を含む。したがって、特定の試料の細胞外核酸集団に含まれている１つまたは複数の細胞外核酸のタイプ、種類および／または量は、試料の重要な特徴である。したがって先に論じた通り、前記細胞外核酸集団を安定化し、したがってそれを組成物として実質的に保存することが重要であり、かつ／または試料の細胞外核酸集団に含まれている１個もしくは複数の細胞外核酸の量は、医療、予後または診断分野において有益な情報を提供することができる。特に、試料を収集した後に細胞内核酸によって、特にゲノムＤＮＡによって細胞外核酸集団が汚染され、したがって希釈されるのを低減することが重要である。本発明の安定化技術によって細胞外核酸集団の実質的な保存が達成され得ることにより、試料中の細胞外核酸集団を、試料を安定化した時点の細胞外核酸集団と比較して、安定化期間にわたって実質的に未変化のままにすることができる。少なくとも、含まれている細胞外核酸の量、質および／または組成に関する細胞外核酸集団の変化、特に、放出されたゲノムＤＮＡの増加に起因し得る変化は、安定化されていない試料と比較して、または例えば血液試料もしくは血液由来の試料の場合にはＥＤＴＡによって安定化されている対応試料と比較して、安定化期間にわたって大幅に（好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％）低減される。
【００３６】
第１の態様の第１の従属態様によれば、試料を安定化するために、少なくとも１種のアポトーシス阻害剤が使用される。提供した実施例によって示される通り、アポトーシス阻害剤だけでも、細胞含有試料を安定化し、特に断片化ゲノムＤＮＡによる汚染から生じるその組成の変化から、細胞外核酸集団を実質的に保存するのに有効である。試料は、例えばアポトーシス阻害剤を試料に添加するか、またはその逆によって、アポトーシス阻害剤と接触させることができる。得られた混合物中に存在する少なくとも１種のアポトーシス阻害剤は、試料に含有されている細胞の安定化を支持し、試料に含まれている核酸の分解を阻害し、それによって細胞外核酸集団を実質的に保存する。
【００３７】
用語「アポトーシス阻害剤」は、本明細書で使用される場合、特に、細胞含有生体試料中に存在することにより、細胞のアポトーシス過程を低減、予防かつ／もしくは阻害し、かつ／またはアポトーシス性の刺激に対する細胞の耐性を増大する化合物を指す。アポトーシス阻害剤には、それに限定されるものではないが、タンパク質、ペプチド、またはタンパク質様もしくはペプチド様の分子、有機および無機分子が含まれる。アポトーシス阻害剤には、代謝阻害剤、核酸分解、それぞれに核酸経路の阻害剤、酵素阻害剤、特にカスパーゼ阻害剤、カルパイン阻害剤、およびアポトーシス過程に関与する他の酵素の阻害剤として作用する化合物が含まれる。それぞれのアポトーシス阻害剤を、表１の一覧にする。好ましくは、細胞含有生体試料を安定化するために使用される少なくとも１種のアポトーシス阻害剤は、代謝阻害剤、カスパーゼ阻害剤およびカルパイン阻害剤からなる群から選択される。各クラスに適した例を、それぞれの分類により表１の一覧にする。好ましくは、アポトーシス阻害剤は、細胞透過性である。
【００３８】
本発明の範囲には、同じまたは異なるクラスのアポトーシス阻害剤のいずれかの、様々なアポトーシス阻害剤の組合せを使用すること、それぞれに同じまたは異なる作用機序のいずれかによってアポトーシスを阻害する様々なアポトーシス阻害剤の組合せを使用することも含まれる。
【００３９】
本発明の有利な一実施形態では、アポトーシス阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である。カスパーゼ遺伝子ファミリーのメンバーは、アポトーシスにおいて著しく大きい役割を果たす。個々のカスパーゼの基質に対する優先性または特異性が、うまく競合してカスパーゼと結合するペプチドの開発に利用されてきた。カスパーゼに特異的なペプチドを、例えばアルデヒド、ニトリルまたはケトン化合物にカップリングさせることによって、カスパーゼ活性化の可逆的または不可逆的な阻害剤を創出することが可能である。例えば、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫなどのフルオロメチルケトン（ＦＭＫ）誘導体化ペプチドは、細胞傷害作用を加えることなく有効な不可逆的阻害剤として作用する。Ｎ末端およびＯメチル側鎖がベンジルオキシカルボニル基（ＢＯＣ）で合成された阻害剤は、細胞透過性が強化される。さらに適切なカスパーゼ阻害剤は、Ｃ末端がフェノキシ基で合成されたものである。一例がＱ−ＶＤ−ＯＰｈであり、これは、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫよりもアポトーシスを防止するのにさらにより有効な、細胞透過性の不可逆的な広範なカスパーゼ阻害剤である。
【００４０】
一実施形態によれば、カスパーゼ阻害剤は、汎カスパーゼ阻害剤であり、したがって広範なカスパーゼ阻害剤である。一実施形態によれば、カスパーゼ阻害剤は、カスパーゼに特異的な修飾ペプチドを含む。好ましくは、前記カスパーゼに特異的なペプチドは、アルデヒド、ニトリルまたはケトン化合物によって修飾されている。好ましい一実施形態では、カスパーゼに特異的なペプチドは、好ましくは、カルボキシル末端がＯ−フェノキシまたはフルオロメチルケトン（ＦＭＫ）基で修飾されている。一実施形態によれば、カスパーゼ阻害剤は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈおよびＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫからなる群から選択される。一実施形態では、汎カスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫが使用され、これは不可逆的な競合的ペプチド阻害剤であり、カスパーゼ−１ファミリーおよびカスパーゼ−３ファミリー酵素を阻止する。好ましい一実施形態では、カスパーゼの広範な阻害剤であるＱ−ＶＤ−ＯＰｈが使用される。Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈは細胞透過性であり、アポトーシスによる細胞死を阻害する。Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈは、極度に高い濃度でも細胞に毒性がなく、アミノ酸のバリンおよびアスパラギン酸にコンジュゲートしたカルボキシ末端フェノキシ基からなる。Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈは、カスパーゼ−９およびカスパーゼ−３と、カスパーゼ−８およびカスパーゼ−１０と、カスパーゼ−１２とによって媒介される、３つの主なアポトーシス経路によるアポトーシスを防止するのに等しく有効である（カゼルタ（Caserta）ら、2003）。さらなるカスパーゼ阻害剤を、表１の一覧にする。一実施形態によれば、細胞含有試料を安定化するためにアポトーシス阻害剤として使用されるカスパーゼ阻害剤は、細胞の細胞内細胞死経路の下流に位置する、カスパーゼ−３などの１つまたは複数のカスパーゼに対して作用する阻害剤である。本発明の一実施形態では、カスパーゼ阻害剤は、カスパーゼ−３、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０およびカスパーゼ−１２からなる群から選択される１つまたは複数のカスパーゼのための阻害剤である。本発明の範囲には、カスパーゼ阻害剤の組合せを使用することも含まれる。
【００４１】
生体試料を少なくとも１種のアポトーシス阻害剤と接触させた後に得られる混合物は、アポトーシス阻害剤（またはアポトーシス阻害剤の組合せ）を、少なくとも０．０１μＭ、少なくとも０．０５μＭ、少なくとも０．１μＭ、少なくとも０．５μＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも２．５μＭ、または少なくとも３．５μＭの群から選択される濃度で含むことができる。当然のことながら、より高い濃度を使用することもできる。アポトーシス阻害剤（複数可）の適切な濃度範囲には、細胞含有生体試料と混合される場合、それに限定されるものではないが、０．０１μＭ〜１００μＭ、０．０５μＭ〜１００μＭ、０．１μＭ〜５０μＭ、０．５μＭ〜５０μＭ、１μＭ〜４０μＭ、より好ましくは１μＭ〜３０μＭ、または２．５μＭ〜２５μＭが含まれる。濃度が高いほどより有効であることが見出されたが、低濃度でも良好に安定化されるという結果が得られた。したがって、効率的な安定化は、特にアポトーシス阻害剤が高張剤と併用される場合、例えば０．１μＭ〜１０μＭ、０．５μＭ〜７．５μＭ、または１μＭ〜５μＭから選択される範囲の低濃度でも達成される（以下参照）。前述の濃度は、単一のアポトーシス阻害剤の使用にも、カスパーゼ阻害剤の組合せの使用にも適用される。カスパーゼ阻害剤の組合せが使用される場合、アポトーシス阻害剤の組合せの全体的濃度が前述の特徴を満たすならば、アポトーシス阻害剤の前記混合物において使用される個々のアポトーシス阻害剤の濃度は、前述の濃度未満であってもよい。細胞をなおも効率的に安定化し、かつ／または試料中に存在する核酸の分解を低減する低濃度を使用することには、安定化のための費用を抑えることができるという利点がある。低濃度は、例えばアポトーシス阻害剤が本明細書に記載の１種または複数種の安定剤と併用される場合に、使用することができる。前述の濃度は、カスパーゼ阻害剤、特にＱ−ＶＤ−ＯＰｈおよび／またはＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫなどのカスパーゼに特異的な修飾ペプチドをアポトーシス阻害剤として使用する場合に、特に適している。前述の濃度は、例えば全血、特に血液１０ｍｌを安定化するのに非常に適している。他のアポトーシス阻害剤および／または他の細胞含有生体試料に適した濃度範囲は、当業者が日常的な実験を使用して、例えば実施例に記載した試験アッセイにおいて、アポトーシス阻害剤、それぞれにその異なる濃度を試験することによって決定することができる。
【００４２】
一実施形態によれば、有効量のアポトーシス阻害剤は、細胞含有生体試料におけるアポトーシスを、それぞれのアポトーシス阻害剤を含有していない対照試料と比較して、少なくとも２５パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも４０パーセント、少なくとも５０パーセント、好ましくは少なくとも７５パーセント、より好ましくは少なくとも８５パーセント低下または低減する。
【００４３】
本発明の第１の態様の第２の従属態様によれば、試料を安定化するために、少なくとも１種の高張剤が使用され、ここで使用される高張剤は、試料中に含まれる細胞を安定化する。提供した実施例によって示される通り、高張剤だけでも、細胞含有試料を安定化し、試料に含まれている細胞外核酸集団の組成を実質的に保存するのに有効である。高張剤は、穏やかな高張効果（浸透）によって細胞収縮を誘発し、それによって細胞の安定性を増大する。したがって細胞は、例えば機械的に誘発される細胞損傷を受けにくくなる。試料は、例えば高張剤を試料に添加するか、またはその逆によって、高張剤と接触させることができる。得られた混合物中に存在する高張剤は、特に、試料に含有されている細胞を安定化し、それによって損傷細胞から放出される細胞内核酸、特にゲノムＤＮＡの量を低減するのに適している。それによって、細胞外核酸集団は、実質的に保存され、細胞外核酸が、細胞内核酸、特にゲノムＤＮＡによって汚染され、それぞれに希釈される危険性が低減する。
【００４４】
一実施形態によれば、高張剤は、細胞収縮を誘発するのに十分に浸透活性が高いが（細胞が水を放出する）、細胞に傷害を与えず、すなわち細胞溶解、それぞれに細胞破裂を誘発または促進しない。したがって、高張剤は、好ましくは穏やかな浸透圧効果を有する。さらに、高張剤と試料との間の相互作用は、基本的には望ましくない副作用を回避するために、主に細胞安定化効果に限定されることが望ましい。したがって、一実施形態によれば、非荷電高張剤が使用される。非荷電高張剤を使用することには、細胞が高張剤の浸透圧効果によってそれぞれに安定化されるとしても、高張剤と試料に含まれる他の化合物との間の相互作用が、荷電高張剤を使用する場合と比較して制限されるという利点がある。
【００４５】
有利な一実施形態によれば、高張剤は、ヒドロキシル化有機化合物であり、したがって少なくとも１個のヒドロキシル基を担持する。一実施形態によれば、ヒドロキシル化有機化合物は、少なくとも２個のヒドロキシル基を含む。一実施形態によれば、ヒドロキシル化有機化合物は、ポリオールである。一実施形態によれば、ポリオールは、２〜１０個のヒドロキシル基、好ましくは３〜８個のヒドロキシル基を含む。ヒドロキシル化有機化合物は、２〜１２個、好ましくは３〜８個の炭素原子を含むことができ、環式または直鎖、分枝状または非分枝状の分子であってよく、飽和または不飽和、芳香族または非芳香族であってよい。一実施形態によれば、ヒドロキシル化有機化合物は、ヒドロキシカルボニル化合物である。ヒドロキシカルボニル化合物は、１つまたは複数のヒドロキシ（ＯＨ）基および１つまたは複数のカルボニル基を有する化合物である。ヒドロキシル化有機化合物には、それに限定されるものではないが、ヒドロキシル化ケトン化合物および炭水化物、またはそれに由来する化合物が含まれ得る。一実施形態によれば、ヒドロキシル化有機化合物は、多価アルコール、特に糖アルコールである。したがって、ヒドロキシル化有機化合物には、それに限定されるものではないが、炭水化物、例えばグルコース、ラフィノース、スクロース（succrose）、フルクトース、アルファ−ｄ−ラクトース一水和物、イノシトール、マルチトール、マンニトール、ジヒドロキシアセトン、アルコール、例えばグリセロール、エリスリトール、マンニトール、ソルビトール、ボレミトールまたは糖アルコールが含まれる。適切な例を、やはり以下の表の一覧にする。本発明の範囲には、それぞれのヒドロキシル化有機化合物の組合せを使用することも含まれる。
【００４６】
【表１】
2014528719.tif 000005
【００４７】
一実施形態によれば、先の一覧のポリオールおよび糖アルコールは、ヒドロキシル基が少ないアルコール（例えば、ヘキサン−１，２，３，４，５−ペントール、ペンタン−１，２，３，４−テトラオール）によって置き換えることができる。一実施形態によれば、ヒドロキシル化有機化合物は、１〜５個の炭素原子を有し、ヒドロキシル基を１個だけ担持するアルコールではない。一実施形態によれば、ヒドロキシル基を１個だけ有するアルコールは、ヒドロキシル化有機化合物から除外される。本発明の安定剤として使用できるヒドロキシル化有機化合物は、好ましくは水溶性であり、安定化される生体試料に含まれる細胞に対して非毒性である。好ましくは、ヒドロキシル化有機化合物は、生体試料に含有されている細胞の溶解を誘発または支持せず、したがって、好ましくは洗浄剤または細胞膜溶解剤としては機能しない。本発明の適切なヒドロキシル化有機化合物は、例えば実施例部分で記載したアッセイによって試験され得る通り、細胞外核酸集団の組成の保存を改善することによって、細胞含有試料を安定化する効果を達成する。
【００４８】
ヒドロキシル化有機化合物を、例えば全血などの細胞含有生体試料に添加すると、無細胞部分、それぞれに画分（例えば血漿）中の前記ヒドロキシル化有機化合物の濃度が増大し、したがって浸透圧（高張）効果の結果として、血液細胞が水を血漿中に放出する。一実施形態によれば、細胞の代謝産物に密接に関係するが、好ましくは細胞が利用できないヒドロキシル化有機化合物が使用される。
【００４９】
好ましい一実施形態では、生体試料に含有されている細胞は、安定化するのに使用される高張剤にとって本質的に不透過性である。したがって、好ましくは先に詳説したヒドロキシル化有機化合物である高張剤は、本質的に細胞不透過性である。これに関して、本質的に細胞不透過性とは、特に、好ましくはヒドロキシル化有機化合物である高張剤の濃度が、本発明の教示に従って安定化される生体試料に含有されている細胞内よりも、試料の細胞外部分において実質的に高いことを意味する。好ましい一実施形態では、好ましくはヒドロキシル化有機化合物である高張剤は、非毒性であり、したがって細胞生存率は損なわれない。このことは、細胞代謝を妨害する影響を回避するのに好ましい。
【００５０】
一実施形態によれば、高張剤は、ジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）である。ＤＨＡは炭水化物であり、通常、セルフタンニングローションにおける日焼け物質として働く。実施例によって実証される通り、ＤＨＡは、驚くべきことには、細胞含有生体試料、特に全血試料および血漿または血清などの全血に由来する試料に対して注目すべき安定化効果を有する。ＤＨＡのリン酸エステル、ジヒドロキシアセトンリン酸、解糖の中間産物以外のＤＨＡは、哺乳動物細胞において自然には生じない。したがってＤＨＡは、血液細胞中に活性に運搬または拡散されないと予想される。一実施形態によれば、高張剤は、ジヒドロキシアセトンリン酸ではない。
【００５１】
細胞含有生体試料を少なくとも１種の高張剤と接触させて得られる混合物は、高張剤または高張剤混合物を、少なくとも０．０５Ｍ、好ましくは０．１Ｍ、好ましくは少なくとも０．２Ｍ、より好ましくは少なくとも０．２５Ｍの濃度で含むことができる。当然のことながら、より高い濃度を使用することもできる。高張剤に適した濃度範囲は、０．０５Ｍ〜２Ｍ、０．１Ｍ〜１．５Ｍ、０．１５Ｍ〜０．８Ｍ、０．２Ｍ〜０．７Ｍ、または０．１Ｍ〜０．６Ｍから選択される。それぞれの濃度は、ヒドロキシル化有機化合物、例えばジヒドロキシアセトンなどの炭水化物を高張剤として使用する場合に、特に適している。前述の濃度は、例えば全血、特に血液１０ｍｌを安定化するのに非常に適している。他の高張剤および／または他の細胞含有生体試料に適した濃度範囲は、当業者が日常的な実験を使用して、例えば実施例に記載した試験アッセイにおいて、高張剤、それぞれにその異なる濃度を試験することによって決定することもできる。
【００５２】
本発明の第１の態様の第３の従属態様によれば、細胞含有試料中の細胞外核酸集団を安定化するために、少なくとも１種の式１の化合物が使用される
【００５３】
【化４】
2014528719.tif 000006
［式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１〜Ｃ５アルキル残基、より好ましくはメチル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、直鎖または分岐状に配列した炭素原子１〜２０個の鎖長を有する、同じまたは異なる炭化水素残基であり、Ｒ４は、酸素、硫黄またはセレン残基である］。
【００５４】
提供した実施例によって示される通り、前述の式１の化合物は、注目すべき安定化効果を達成し、安定化した試料中の細胞外核酸集団の組成を実質的に保存するのに有効である。式１の１つまたは複数の化合物の混合物も、安定化のために使用することができる。
【００５５】
炭化水素残基Ｒ２および／またはＲ３は、短鎖アルキルおよび長鎖アルキルを含むアルキル、アルケニル、アルコキシ、長鎖アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ハロアルキル、アルキルシリル、アルキルシリルオキシ、アルキレン、アルケンジイル、アリーレン、カルボキシレート、ならびにカルボニルを含む群から互いに独立に選択することができる。一般的な基、例えばアルキル、アルコキシ、アリール等は、本説明および特許請求の範囲に特許請求され、記載されている。好ましくは、本発明の範囲に含まれる、一般に記載される基に含まれる以下の基が使用される。
（１）アルキル、好ましくは短鎖アルキル、特に直鎖および分岐Ｃ１〜Ｃ５アルキルまたは長鎖アルキル、直鎖および分岐Ｃ５〜Ｃ２０アルキル、
（２）アルケニル、好ましくはＣ２〜Ｃ６アルケニル、
（３）シクロアルキル、好ましくはＣ３〜Ｃ８シクロアルキル、
（４）アルコキシ、好ましくはＣ１〜Ｃ６アルコキシ、
（５）長鎖アルコキシ、好ましくは直鎖および分岐Ｃ５〜Ｃ２０アルコキシ、
（６）アルキレン、好ましくは２〜１８個の炭素原子を有し、任意選択によりヘテロ原子を含有する、二価の直鎖または分岐脂肪族、脂環式または芳香族炭化水素残基、例えばメチレン、１，１−エチレン、１，１−プロピリデン、１，２−プロピレン、１，３−プロピレン、２，２−プロピリデン、ブタン−２−オール−１，４−ジイル、プロパン−２−オール−１，３−ジイル、１，４−ブチレン、１，４−ペンチレン、１，６−へキシレン、１，７−ヘプチレン、１，８−オクチレン、１，９−ノニレン、１，１０−デシレン、１，１１−ウンデシレン、１，１２−ドデシレン（docedylene）、シクロヘキサン−１，１−ジイル、シクロヘキサン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，３−ジイル、シクロヘキサン−１，４−ジイル、シクロペンタン−１，１−ジイル、シクロペンタン−１，２−ジイル、およびシクロペンタン−１，３−ジイルを含む群から選択されるもの、
（７）アルケンジイル、好ましくは１，２−プロペンジイル、１，２−ブテンジイル、２，３−ブテンジイル、１，２−ペンテンジイル、２，３−ペンテンジイル、１，２−ヘキセンジイル、２，３−ヘキセンジイル、および３，４−ヘキセンジイルを含む群から選択されるもの、
（８）
【００５６】
【化５】
2014528719.tif 000007
に等しいアルキンジイル、
（９）アリール、好ましくは３００Ｄａ未満の分子量を有する芳香族から選択されるもの、
（１０）アリーレン、好ましくは１，２−フェニレン、１，３−フェニレン、１，４−フェニレン、１，２−ナフタレニレン（1,2-naphtthalenylene）、１，３−ナフタレニレン（1,3-naphtthalenylene）、１，４−ナフタレニレン（1,4-naphtthalenylene）、２，３−ナフタレニレン（2,3-naphtthalenylene）、１−ヒドロキシ−２，３−フェニレン、１−ヒドロキシ−２，４−フェニレン、１−ヒドロキシ−２，５−フェニレン、１−ヒドロキシ−２，６−フェニレンを含む群から選択されるもの、
（１１）カルボキシレート、好ましくは−Ｃ（Ｏ）ＯＲ基［式中、Ｒは、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｃ６Ｈ５、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｃｓ、Ｍｇ、Ｃａから選択される］、
（１２）カルボニル、好ましくは−Ｃ（Ｏ）Ｒ基［式中、Ｒは、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｃ６Ｈ５、および−ＮＲ’２基から選択されるアミン（アミドをもたらす）から選択され、各Ｒ’は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｃ６Ｈ５およびフェニルから独立に選択され、Ｒの両方（Rs）がＣ１〜Ｃ６アルキルを表す場合、それらは、ＮＣ３〜ＮＣ５複素環を形成することができ、その環のアルキル置換基は、他のアルキル鎖を形成する］、
（１３）アルキルシリル、好ましくは−ＳｉＲ１Ｒ２Ｒ３基［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、アルキル、長鎖アルキル、フェニル、シクロアルキル、ハロアルキル、アルコキシ、長鎖アルコキシから互いに独立に選択される］、
（１４）アルキルシリルオキシ、好ましくは−Ｏ−ＳｉＲ１Ｒ２Ｒ３基［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、アルキル、長鎖アルキル、フェニル、シクロアルキル、ハロアルキル、アルコキシ、長鎖アルコキシから互いに独立に選択される］。
【００５７】
Ｒ２および／またはＲ３の鎖長ｎは、特に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０の値を有することができる。好ましくはＲ２およびＲ３は、１〜１０の炭素鎖長を有する。この場合、鎖長ｎは、特に１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０の値を有することができる。好ましくは、Ｒ２およびＲ３は、１〜５の炭素鎖長を有し、この場合、鎖長は、特に１、２、３、４および５の値を有することができる。Ｒ２およびＲ３について特に好ましいのは、１または２の鎖長である。
【００５８】
Ｒ１の鎖長ｎは、好ましくは１、２、３、４または５の値を有する。Ｒ１について特に好ましいのは、１または２の鎖長である。
【００５９】
Ｒ４は、好ましくは酸素である。
【００６０】
好ましい一実施形態では、式１の化合物は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−カルボン酸アミドである。好ましいＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４基は、既に記載されている。一実施形態によれば、化合物は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよびＮ，Ｎ−ジエチルホルムアミドからなる群から選択される。実施例に示す通り、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドなどのＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドも適している。好ましくは、式１の物質は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（N,N-dimethlylacetamide）（ＤＭＡＡ）である。好ましい化合物の構造式は、以下の通りである。
【００６１】
【化６】
2014528719.tif 000008
【００６２】
Ｒ４として酸素の代わりに硫黄を含むそれぞれのチオ類似体も適している。
【００６３】
細胞含有生体試料を、式１の化合物またはそれぞれの化合物の混合物と接触させて得られる混合物は、前記化合物または化合物混合物を、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも０．７５％、少なくとも１％、少なくとも１．２５％、または少なくとも１．５％の最終濃度で含むことができる。適切な濃度範囲には、それに限定されるものではないが、０．１％〜５０％が含まれる。好ましい濃度範囲は、０．１％〜３０％、０．１％〜２０％、０．１％〜１５％、０．１％〜１０％、０．１％〜７．５％、０．１％〜５％、１％〜３０％、１％〜２０％、１％〜１５％、１％〜１０％、１％〜７．５％、１％〜５％、１．２５％〜３０％、１．２５％〜２０％、１．２５％〜１５％、１．２５％〜１０％、１．２５％〜７．５％、１．２５％〜５％、１．５％〜３０％、１．５％〜２０％、１．５％〜１５％、１．５％〜１０％、１．５％〜７．５％、および１．５％〜５％からなる群から選択することができる。それぞれの濃度は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−カルボン酸アミド、例えばＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルホルムアミドまたはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（N,N-diemethylformamide）またはＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドを安定剤として使用する場合に、特に適している。前述の濃度は、例えば、全血または血漿などの血液製剤を安定化するのに非常に適している。他の式１の化合物および／または他の細胞含有生体試料に適した濃度範囲は、当業者が日常的な実験を使用して、例えば実施例に記載した試験アッセイにおいて、化合物、それぞれにその異なる濃度を試験することによって決定することもできる。
【００６４】
好ましくは、式１の化合物は、細胞含有試料を安定化するためのキレート剤と併用される。特にキレート剤は、血液試料、または例えば血漿もしくは血清などの血液由来の試料を安定化する場合に、抗凝固剤として使用することができる。適切なキレート剤および濃度範囲を、以下に提示する。
【００６５】
好ましい第４の従属態様によれば、試料を、
ａ）少なくとも１種のアポトーシス阻害剤、および
ｂ）試料に含まれている細胞を安定化する少なくとも１種の高張剤
と接触させる、細胞含有試料、好ましくは血液試料を安定化するのに適した方法が提供される。
【００６６】
したがって、この好ましい実施形態によれば、細胞含有試料を安定化するのに共に単独で既に有効であったアポトーシス阻害剤および高張剤（先および実施例を参照）が併用される。それによって、安定化効果を増大することができ、かつ／または個々の構成成分（アポトーシス阻害剤および／または高張剤）の濃度を低減しながらも、試料中の細胞外核酸集団を効率的に保存し、特に試料に含有されている損傷細胞もしくは崩壊細胞から放出される細胞内核酸、特に断片化ゲノムＤＮＡによる汚染を回避し、それぞれに低減することができる。実施例に示す通り、それぞれの組合せを使用することは、細胞含有試料、さらには全血試料などの非常に複雑な試料を安定化するのに特に有効である。本発明の範囲には、様々なアポトーシス阻害剤を、様々な高張剤と組み合せた混合物を使用することも含まれる。アポトーシス阻害剤および高張剤の適切な好ましい実施形態、ならびに試料の効率的な安定化を達成するのに適したそれぞれの薬剤の好ましい濃度は、細胞含有生体試料を安定化するのにアポトーシス阻害剤または高張剤のいずれかを使用する実施形態と共に先に詳説されている。先の開示が参照され、その開示も、アポトーシス阻害剤を高張剤と併用する実施形態に適用される。好ましくは、少なくとも１種のカスパーゼ阻害剤、好ましくはカスパーゼに特異的な修飾されたペプチド、好ましくはＱ−ＶＤ−ＯＰｈなどのＣ末端がＯ−フェノキシ基で修飾されたペプチドが、高張剤としての少なくとも１種のヒドロキシル化有機化合物、例えばジヒドロキシアセトンまたはポリオールなどの炭水化物と併用される。実施例によって実証される通り、それぞれの組合せは、細胞含有生体試料、特に全血試料を、室温で３日間を超えて、さらには６日間にわたって安定化するのに著しく有効である。
【００６７】
一実施形態によれば、少なくとも１種のアポトーシス阻害剤、少なくとも１種の高張剤および／または先に定義の少なくとも１種の式１の化合物を含む安定化剤の組合せが使用される。それぞれの組合せの例には、（１）少なくとも１種のアポトーシス阻害剤および先に定義の少なくとも１種の式１の化合物の組合せ、（２）少なくとも１種の高張剤および先に定義の少なくとも１種の式１の化合物の組合せ、または（３）３種すべての安定化剤、すなわち少なくとも１種のアポトーシス阻害剤、少なくとも１種の高張剤および先に定義の少なくとも１種の式１の化合物の組合せが含まれる。それぞれの組合せは、例えば抗凝固剤およびキレート剤などの安定化効果を強化する追加の添加剤を含むこともできる。一実施形態によれば、安定化剤の組合せは、カスパーゼ阻害剤および抗凝固剤、好ましくはＥＤＴＡなどのキレート剤を含む。それぞれの組合せは、本発明の第１の態様に従って細胞含有試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するのに適した方法で有利に使用される、第５の従属態様に従うことができる。安定化剤の組合せを用いることによって観測される安定化効果は、個々の安定化剤のいずれかを単独で使用する場合に観測される効果よりも強力であり、および／またはその安定化効果によって個々の安定化剤を低濃度で使用することができ、それによって安定化剤の併用は魅力的な選択肢となる。アポトーシス阻害剤、高張剤および先に定義の式１の化合物の適切な好ましい実施形態、ならびに試料の効率的な安定化を達成するのに適したそれぞれの薬剤の適切な好ましい濃度は、細胞含有生体試料を安定化するのにアポトーシス阻害剤、高張剤または式１の化合物のいずれかを使用する実施形態と共に先に詳説されている。
【００６８】
本発明の背景技術で論じた通り、細胞外核酸は、通常、試料中に「裸」では存在しないが、例えば放出されないように複合体によって保護され、または小胞等に含有されることによって、ある程度安定化されている。これには、細胞外核酸が、その性質によって既にある程度安定化されており、したがって通常は、全血、血漿または血清などの細胞含有試料中のヌクレアーゼによって急速には分解されないという効果がある。したがって、生体試料に含まれている細胞外核酸の安定化が企図される場合、その主な問題の１つは、試料に含有されている損傷細胞または死滅細胞から生じる細胞内核酸、特に断片化ゲノムＤＮＡによって細胞外核酸集団が希釈され、それぞれに汚染されることである。これについては、血漿または血清などの細胞欠乏試料（微量の細胞を含み得る場合でも、「無細胞」と説明される時がある）を処理する場合にも問題がある。本発明の安定化技術は、これに関して、試料中に存在する細胞外核酸を実質的に保存し、例えば試料に含まれている細胞外核酸の分解を阻害するだけでなく（安定化されていない試料またはＥＤＴＡで安定化された試料と比較して、安定化期間にわたって好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％阻害する）、さらには試料に含有されている細胞からゲノムＤＮＡが放出されるのを効率的に低減し、かつ／またはそれぞれのゲノムＤＮＡの断片化を効率的に低減するので、特に利点がある。一実施形態によれば、本発明の教示に従って、細胞含有試料を安定化するためにアポトーシス阻害剤、高張剤および／または式１の化合物を使用することは、試料に含有されている細胞からＤＮＡが放出されることによるＤＮＡの増加が、安定化されていない試料と比較して少ないという効果を有する。一実施形態によれば、前記ゲノムＤＮＡの放出は、安定化されていない試料またはＥＤＴＡで安定化された対応する試料（特に血液試料、または血漿もしくは血清などの血液由来の試料の場合）と比較して、安定化期間にわたって少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍、少なくとも１５倍、少なくとも１７倍、または少なくとも２０倍低減される。一実施形態によれば、前記ゲノムＤＮＡの放出は、安定化されていない試料またはＥＤＴＡで安定化された対応する試料（特に血液試料、または血漿もしくは血清などの血液由来の試料の場合）と比較して、安定化期間にわたって少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減される。ＤＮＡの放出は、本明細書において実施例部分で記載した通り、例えばリボソーム１８Ｓ  ＤＮＡを定量化することによって測定することができる。例えば、標準のＥＤＴＡで安定化された血液試料は、それぞれのアッセイにおいて、例えば室温で貯蔵して６日目に測定すると、ＤＮＡが４０倍増大している（図２ｂ参照）。本発明の教示によって安定化が達成され得ることにより、このＤＮＡ放出は著しく低減され、例えば最大４倍にま���も低減される。したがって、試料に含有されている細胞外核酸集団は、標準のＥＤＴＡ管内で安定化された試料と比較して大幅に安定化される。したがって、一実施形態によれば、本発明が教示する通り、アポトーシス阻害剤、高張剤および／または式１の化合物によって達成される安定化効果によって、試料に含有されている細胞からのＤＮＡの放出が、例えば実施例に記載の１８Ｓ  ＤＮＡアッセイで決定され得る通り、最大１０倍、好ましくは７倍、より好ましくは５倍、最も好ましくは少なくとも最大４倍まで低減される。実施例によって示される通り、細胞外核酸集団の有効な安定化は、少なくとも最長６日間にわたって達成され得る。試料の貯蔵期間が、例えば最長３日間と短い期間であれば、ＤＮＡ放出は、例えば実施例に記載の１８Ｓ  ＤＮＡアッセイで決定され得る通り、少なくとも最大２倍まで低減され得る。したがって、ＤＮＡ放出は、本説明の安定化方法を使用すると、最長３日間の保存期間では２倍以下まで低減され得る。このことは、従来技術の方法と比較して、細胞外核酸集団の安定化の注目すべき改善点である。これによって、任意のその後の試験の精度が著しく強化される。特定の場合には、例えば試料材料を、例えば室温で長距離運搬しなければならず、または長期間貯蔵しなければならない場合（例えば、いくつかの国の場合にあり得る）、本発明の方法によって、このような期間が経過した後でも、これらの試験を初めて実施することが可能となる。しかし当然のことながら、必要に応じてそれより早期に試料を処理することもできる。達成され得る安定化期間を必ずしもすべて利用する必要はない。本発明を用いて達成される安定化によって、収集した後の試料の、様々な取扱い／処理（例えば、貯蔵条件および貯蔵期間）によって生じ得る細胞外核酸集団の変動が低減される。これにより、取扱いおよび分子分析の標準化が大幅に改善される。
【００６９】
細胞含有試料をさらに安定化するために、アポトーシス阻害剤、高張剤および／または先に定義の式１の化合物に加えて、さらなる添加剤を使用することができる。安定化効果にも寄与し得る適切な添加剤の選択は、安定化される細胞含有試料のタイプに応じても変わり得る。例えば、細胞含有生体試料として全血を処理する場合、例えばヘパリン、エチレンジアミン四酢酸、クエン酸塩、シュウ酸塩、およびその任意の組合せからなる群から選択される抗凝固剤を含むことが有利であり、一般的でもある。有利な一実施形態では、抗凝固剤はキレート剤である。キレート剤は、有機化合物の２個以上の原子を介して金属と配位結合を形成することができる有機化合物である。本発明のキレート剤には、それに限定されるものではないが、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジニトリロ四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）およびＮ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン（ＮＴＡ）が含まれる。好ましい一実施形態では、ＥＤＴＡが使用される。本明細書で使用される場合、用語「ＥＤＴＡ」は、中でもＥＤＴＡ化合物の、例えばＫ2ＥＤＴＡ、Ｋ3ＥＤＴＡまたはＮａ2ＥＤＴＡなどのＥＤＴＡ部分を指す。ＥＤＴＡなどのキレート剤の使用には、ＤＮａｓｅなどのヌクレアーゼが阻害され、それによって例えばＤＮａｓｅによる細胞外ＤＮＡの分解が防止されるという有利な効果もある。さらに本発明者らは、ＥＤＴＡをより高濃度で使用／添加すると、細胞から細胞内核酸、特にゲノムＤＮＡが放出されるのを低減することができ、それによってアポトーシス阻害剤、高張剤および／または少なくとも１種の式１の化合物によって達成される安定化効果が支持されることを見出した。しかし、ＥＤＴＡだけでは、例えば試料に含有されている細胞から放出されるゲノムＤＮＡの断片化を効率的に阻害することができない。したがって、ＥＤＴＡでは、十分な安定化効果を達成できない。しかしＥＤＴＡは、本発明の教示と組み合せて、特にアポトーシス阻害剤、特にカスパーゼ阻害剤と組み合せて使用すると、先に論じた理由から、安定化をさらに改善することができる。さらには、ＲＮＡの化学的安定性も増大すると思われる。一実施形態によれば、前述の安定化化合物の１種または複数種と混合される生体試料中のキレート剤、好ましくはＥＤＴＡの濃度は、接触ステップの後、０．０５ｍＭ〜１００ｍＭ、０．０５ｍＭ〜５０ｍＭ、０．１ｍＭ〜３０ｍＭ、１ｍＭ〜２０ｍＭ、および２ｍＭ〜１５ｍＭからなる群から選択される範囲である。それぞれの濃度は、血液、血漿および／または血清試料、特に血液試料１０ｍｌを安定化する場合に、特に有効である。
【００７０】
また、細胞含有試料の安定化をさらに支持し、それぞれに細胞外核酸集団の保存を支持するために、追加の添加剤を使用することができる。それぞれの添加剤の例には、それに限定されるものではないが、ヌクレアーゼ阻害剤、特にリボヌクレアーゼ（RNase）およびデオキシリボヌクレアーゼ（DNase）阻害化合物が含まれる。リボヌクレアーゼ（RNase）阻害剤の例には、それに限定されるものではないが、抗ヌクレアーゼ抗体またはリボヌクレオシド−バナジル複合体が含まれる。それぞれのさらなる添加剤を選択する場合、アポトーシス阻害剤、高張剤および／または式１の化合物の安定化効果を損なわず、かつ／または相殺しないように注意すべきである。したがって、添加剤は、生体試料に含有されている細胞の溶解および／もしくは分解をもたらす、もしくは支持する、かつ／または生体試料の無細胞画分に含有されている核酸の分解を支持する濃度で使用されるべきではない。
【００７１】
本発明の有利な一実施形態では、好ましくは血液試料、または血漿もしくは血清などの血液由来の試料である細胞含有生体試料を、
ａ）好ましくは濃度範囲１μＭ〜３０μＭの、アポトーシス阻害剤としての少なくとも１種のカスパーゼ阻害剤、好ましくはＱ−ＶＤ−ＯＰｈ、
ｂ）任意選択により、濃度範囲０．１Ｍ〜０．６Ｍの、高張剤としてのジヒドロキシアセトンなどの少なくとも１種のヒドロキシル化有機化合物、および
ｃ）任意選択により、先に定義の少なくとも１種の式１の化合物（好ましい実施形態および濃度は、先に記載されている）および／または
ｄ）好ましくは濃度範囲４ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは４ｍＭ〜２０ｍＭのさらなる添加剤、好ましくはキレート剤、最も好ましくはＥＤＴＡ
を接触させる。
【００７２】
安定化組成物の構成成分は、緩衝液、例えばＭＯＰＳ、ＴＲＩＳ、ＰＢＳなどの生理的緩衝液等に含まれ、それぞれに溶解することができる。
【００７３】
アポトーシス阻害剤、高張剤および／または先に定義の式１の化合物、ならびに任意選択により存在するさらなる添加剤は、例えば、試料を収集するためのデバイス、好ましくは容器内に存在することができ、または生体試料を収集する直前に、それぞれの収集デバイスに添加することができ、または試料をデバイス内に収集した直後に収集デバイスに添加することができる。本発明の範囲には、安定剤（複数可）、および任意選択によりさらなる添加剤（複数可）を、細胞含有生体試料に別個に添加することも含まれる。しかし、取扱いを容易にするために、１つまたは複数の安定化剤、および任意選択によりさらなる添加剤が、１つの組成物で提供されるのが好ましい。さらに有利な一実施形態では、アポトーシス阻害剤、高張剤および／または前述の式１の化合物、ならびに任意選択によりさらなる添加剤（複数可）は、試料を添加する前に、収集デバイス内に存在する。これにより、細胞含有生体試料を安定剤（複数可）と接触させるとすぐに、確実に安定化することができる。安定化剤（複数可）は、容器に収集され、それぞれにその容器に含まれる量の細胞含有試料を安定化するのに有効な量で、前記容器内に存在する。前述の通り、試料はその収集後および／またはその最中に安定化剤（複数可）と直接混合され、それによって安定化された試料になる。
【００７４】
好ましくは、試料は、試料の収集後および／またはその最中に、安定化剤（複数可）と直接混合される。したがって好ましくは、前述の安定化剤（複数可）および添加剤は、安定化組成物の形態で提供される。好ましくは、前記安定化組成物は、液体形態で提供される。前記安定化組成物は、試料の収集中に試料がすぐに安定化されるように、例えば試料収集デバイスに予め充填することができる。一実施形態によれば、安定化組成物を、細胞含有試料と１０：１〜１：２０、５：１〜１：１５、１：１〜１：１０および１：２〜１：５から選択される体積比で接触させる。多量の試料を少量の安定化組成物によって安定化できることが、本発明の教示の特別な利点である。したがって好ましくは、安定化組成物と試料の比は、１：２〜１：７、より好ましくは１：３〜１：５の範囲に含まれる。
【００７５】
用語「細胞含有試料」は、本明細書で使用される場合、特に、少なくとも１個の細胞を含む試料を指す。細胞含有試料は、少なくとも２個、少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２５０個、少なくとも５００個、少なくとも１０００個、少なくとも１５００個、少なくとも２０００個、または少なくとも５０００個の細胞を含むことができる。さらに、大幅に多量の細胞を含む細胞含有試料も、前記用語に包含され、本発明の教示に従って安定化することができる。しかし、それぞれの試料は、残存細胞をしばしば含むので、用語「細胞含有試料」は、例えば血漿などの「無細胞」と一般に呼ばれる細胞欠乏試料を含む細胞欠乏試料も指し、したがって細胞欠乏試料も包含する。少なくとも、血漿などのいわゆる「無細胞」試料であっても、その試料が残存量の細胞を含み、したがってそれにより前記残存細胞から放出される細胞内核酸によって細胞外核酸集団が汚染される危険性があることを、完全には除外できないことが多い。したがって、一実施形態によれば、それぞれの細胞欠乏試料および「無細胞」試料も、用語「細胞含有試料」に包含される。したがって「細胞含有試料」は、例えば全血を用いる場合のように、多量の細胞を含み得るが、単に微量の細胞しか含まない場合もある。したがって、用語「細胞含有試料」は、細胞を含有すると単に疑われ得るか、またはその危険性を有する場合がある試料も包含する。先に論じた通り、例えば血漿などの単に微量の、それぞれに残存量の細胞しか含まない生体試料に関しても（血漿は、調製方法に応じて、通常は、一般に無細胞と呼ばれる場合でも残存する少量の細胞を含有する）、これらの残存細胞が、やはり試料に含まれる細胞外核酸の望ましくない汚染をもたらし得るので、本発明の方法にはかなり大きな利点がある。本発明の安定化技術を使用すると、残存量の細胞しか含まないか、または残存量の細胞を含むと単に疑われるか、もしくはその危険性を有するそれぞれの試料も、やはり先に詳説した通り確実に効率的に安定化される。本発明の安定化方法の使用には、試料の組成および試料に含有されている細胞の数とは無関係に、試料に含有されている細胞外核酸集団が、実質的に保存され、それぞれに安定化され、それによって試料に含有されている細胞外核酸のその後の単離および／または分析を標準化できるという利点がある。
【００７６】
一実施形態によれば、細胞含有生体試料は、全血、血液由来の試料、血漿、血清、喀痰、涙液、リンパ液、尿、汗、髄液（liquor）、脳脊髄液（cerebrospinal fluid）、腹水、乳、糞便、気管支洗浄液、唾液、羊水、経鼻分泌物、膣内分泌物、精液（semen）／精漿（seminal fluid）、創傷分泌物、ならびに細胞培養上清、および他のスワブ試料から得られた上清からなる群から選択される。一実施形態によれば、細胞含有生体試料は、体液、身体分泌物または身体排泄物、好ましくは体液、最も好ましくは全血、血漿または血清である。細胞含有生体試料は、細胞外核酸を含む。別の実施形態によれば、細胞含有生体試料は、例えば糞便、組織または生検試料などの、ヒトまたは動物に由来する非流体試料である。本発明の方法を用いて安定化できる細胞含有生体試料の他の例には、それに限定されるものではないが、細胞外核酸を含む生体試料である細胞懸濁液、細胞培養物、細胞培養上清等が含まれる。
【００７７】
前述の通り、また実施例によって実証される通り、本発明の方法を使用すると、細胞含有試料を長期間冷蔵または凍結させずに安定化することができる。したがって試料は、室温で、または例えば最大３０℃もしくは最大４０℃の高温でも保持することができる。一実施形態によれば、安定化効果は、室温で少なくとも２日間、好ましくは少なくとも３日間、より好ましくは少なくとも１日間〜６日間、最も好ましくは少なくとも１日間〜少なくとも７日間達成される。実施例に示す通り、本発明の方法に従って安定化された試料は、室温で３日間貯蔵しても実質的に損なわれなかった。室温でより長い期間、最長６日間、またはさらには７日間貯蔵しても、細胞外核酸集団は、安定化されていない試料と比較して、または例えばＥＤＴＡ処理などの標準方法を使用して安定化された試料と比較して、実質的により安定化された。安定化効果は、経時的に低下し得るとしても、細胞外核酸集団の組成を保存して、分析および／またはさらなる処理を可能にするのに十分である。したがって、本発明の方法に従って安定化された試料は、室温で長期間貯蔵した後でも、試料に含有されている細胞外核酸を単離し、任意選択により分析するのに適していた。したがって、特に安定化剤の好ましい組合せを使用すると試料は損なわれなかったため、さらに長期間の貯蔵／輸送も考えられる。しかし通常は、通常の貯蔵時間、例えば核酸の単離および任意選択により分析が実施される実験室までの輸送時間は、通常は６日または７日を超えず、通常は２日または３日でも完了するので、それより長い期間は必要ない。実施例に示される通り、安定化効率は、この期間にわたって特に良好である。しかし、本説明の方法を用いて達成され得る、特別に長い安定化期間および特別に高い安定化効率によって、重要な安定係数が提供される。
【００７８】
本発明の教示に従って使用される添加剤は活性が高いので、本発明の方法および後述する組成物により、少量の物質を添加して、多量の生体試料を安定化することもできる。このことは、特に試料に含有されている細胞外核酸を単離するために自動化過程の使用が企図される場合には、試料のサイズ／体積がその後の単離手順に対して相当大きい制約を課すので、重要な利点である。さらに、細胞外核酸は、それを含有する試料中に、しばしばごく少量で含まれることを考慮しなければならない。したがって、例えば血液試料などの多量の細胞含有試料の処理には、より多量の循環核酸を試料から単離することができ、したがってその後の分析に利用できるという利点がある。
【００７９】
生体試料の安定化の後、核酸分析技術を直接行うことができ、または核酸を試料から精製することができる。したがって、本発明の方法に従って安定化された試料は、核酸の分析方法および／もしくは検出方法で分析することができ、かつまたはさらに処理することができる。例えば、細胞外核酸を、安定化された試料から単離することができ、次に核酸の分析方法および／もしくは検出方法で分析することができ、またはさらに処理することができる。
【００８０】
さらに、第２の態様によれば、細胞含有生体試料から細胞外核酸を単離する方法が提供され、その方法は、
ａ）本発明の第１の態様に定義の方法に従って、細胞含有試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するステップと、
ｂ）細胞外核酸を単離するステップと、
を含む。
【００８１】
先に論じた通り、本発明の安定化には、生体試料を得、それぞれに収集した時点で、その試料に含有されている細胞外核酸集団が示す状態で、それらが実質的に保存されるという効果がある。特に、損傷細胞または死滅細胞から放出される細胞内核酸、特にゲノムＤＮＡ、より具体的には断片化ゲノムＤＮＡから生じる、通常観測される核酸の多量の増加は、実施例で実証される通り効率的に低減される。したがって、それぞれに安定化された試料から得られる細胞外核酸は、安定化されていない試料と比較して、試料に含まれている分解細胞または死滅細胞から生じる細胞内核酸による汚染が少なく、特に含まれる断片化ゲノムＤＮＡの量が少ない。さらに、ユニークな安定化ステップによって、回収可能な細胞外核酸の量を増大することができる。本発明の安定化方法は、試料の架橋なしに実施することができる。このことは、ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド放出薬などの架橋剤が架橋するせいで、回収可能な細胞外核酸の量を減少するおそれがあるため、これらの試薬を使用するよりも重要な利点を有する。したがって、本発明の方法によって、細胞外核酸の診断および予後能力が改善される。さらに、前記安定化は、試料に含有されている細胞を分離する前および／またはステップｂ）で試料に含まれている細胞外核酸を単離する前に、室温でも長期間試料を貯蔵し、かつ／または取り扱い、例えば運搬することができる。安定化の詳細については、先の開示が参照され、その開示はここでも適用される。
【００８２】
一実施形態によれば、例えば全血試料などの、細胞含有生体試料は、先に詳説した通り、ステップａ）で、少なくとも１種のアポトーシス阻害剤、少なくとも１種の高張剤および／または前述の少なくとも１種の式１の化合物を使用して、好ましくは少なくとも２種のこれらの安定化剤および任意選択によりさらなる添加剤を使用して安定化される。適切な好ましい実施形態は、既に記載した。全血試料を安定化するのに特に好ましいのは、カスパーゼ阻害剤を、前述の抗凝固剤、好ましくはキレート剤と併用することである。
【００８３】
例えば全血を用いる場合のように、試料が多量の細胞を含む場合には、細胞外核酸を含む試料の無細胞画分、それぞれに細胞が少ない画分または細胞欠乏画分を得るために、細胞を残りの試料から分離する。したがって、一実施形態によれば、ステップａ）とステップｂ）との間で、細胞含有試料から細胞を除去する。この中間ステップは、単に任意選択であり、例えば単に微量の、例えば血漿または血清などの残存細胞を含む試料を処理する場合には使用できない。しかし結果を改善するためには、それぞれの残存細胞（または潜在的な残存細胞）も、単離中に細胞外核酸集団を汚染するおそれがあるため、除去することが好ましい。残存細胞を含む細胞は、試料のタイプに応じて、例えば遠心分離、好ましくは高速遠心分離によって、または遠心分離ステップを回避すべき場合には、例えば濾過、沈降もしくは（任意選択により磁気）粒子表面との結合などの、遠心分離以外の手段を使用することによって分離し、除去することができる。それぞれの細胞除去ステップは、自動化された試料調製プロトコルにも容易に含まれ得る。それぞれに除去された細胞を、さらに処理することもできる。細胞は、例えば貯蔵することができ、および／または例えば核酸もしくはタンパク質などの生体分子を、除去された細胞から単離することができる。
【００８４】
さらに、本発明の範囲には試料を後処理するためのさらなる中間ステップも含まれる。
【００８５】
次に、細胞外核酸は、ステップｂ）で、例えば無細胞画分、それぞれに細胞欠乏画分、例えば上清、血漿および／または血清から単離される。細胞外核酸を単離するために、それぞれの試料から、それぞれに細胞欠乏試料から核酸を単離するのに適した、任意の公知の核酸単離方法を使用することができる。それぞれの精製方法の例には、それに限定されるものではないが、抽出、固相抽出、シリカに基づく精製、磁気粒子に基づく精製、フェノール−クロロホルム抽出、クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（アニオン交換表面を使用する）、電気泳動法、濾過、沈殿、クロマチン免疫沈降、およびその組合せが含まれる。本発明の範囲には、例えば配列特異的な結合を可能にし、固体支持体に結合する適切なプローブを使用することによって、特異的標的である細胞外核酸を特異的に単離することも含まれる。当業者に公知の任意の他の核酸単離技術を使用することもできる。一実施形態によれば、核酸は、カオトロピック剤および／またはアルコールを使用して単離される。好ましくは、核酸は、固相、好ましくはシリカまたはアニオン交換官能基を含む固相に結合させることによって単離される。適切な方法およびキットは、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）循環核酸キット（Circulating Nucleic Acid Kit）（キアゲン（QIAGEN））、ケマジック循環ＮＡキット（Chemagic Circulating NA Kit）（ケマゲン（Chemagen））、ヌクレオスピン  プラズマ  ＸＳキット（NucleoSpin Plasma XS Kit）（マケリー−ナゲル（Macherey-Nagel））、血漿／血清循環ＤＮＡ精製キット（Plasma/Serum Circulating DNA Purification Kit）（ノルゲン  ビオテック（Norgen Biotek））、血漿／血清循環ＲＮＡ精製キット（Plasma/Serum Circulating RNA Purification Kit）（ノルゲン  ビオテック（Norgen Biotek））、ハイピュア  ウイルス核酸  高容量キット（High Pure Viral Nucleic Acid Large Volume Kit）（ロシュ（Roche））、および循環核酸を抽出し、精製するのに適した他の市販キットなどで市販されている。
【００８６】
一実施形態によれば、ステップａ）の後、または任意選択により中間ステップで細胞が除去された後に得られる試料に含まれるすべての核酸は、単離され、例えば無細胞画分、それぞれに細胞欠乏画分から単離される。例えば、核酸全体を血漿または血清から単離することができ、細胞外核酸は、抽出したこれらの核酸に一部として含まれる。細胞が効率的に除去されると、単離された核酸全体は、主に細胞外核酸を含み、またはさらには細胞外核酸からなる。本発明の範囲には、少なくとも主に特異的標的核酸を単離することも含まれる。標的核酸は、例えば特定のタイプの核酸、例えばｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、他の非コード核酸、後成的修飾核酸、および他の核酸を含むＲＮＡまたはＤＮＡであってよい。本発明の範囲には、例えば単離後にヌクレアーゼを使用して非標的核酸を消化することも含まれる。標的核酸という用語は、特定の種類の核酸、例えば特定の疾患マーカーであることが知られている特異的細胞外核酸も指す。先に論じた通り、細胞外核酸の単離は、例えば適切な捕獲プローブを使用することによって、それぞれの標的核酸を特異的に単離することを含む場合もある。標的核酸という用語は、一定の長さを有する核酸、例えば２０００ｎｔ以下、１０００ｎｔ以下または５００ｎｔ以下の長さを有する核酸も指す。細胞外核酸は、通常、２０００ｎｔ未満、通常１０００ｎｔ未満、しばしば５００ｎｔ未満という小さいサイズを有することが知られているので、より小さいそれぞれの標的核酸を単離することが有利な場合がある。本明細書に示したサイズ、それぞれにサイズ範囲は、鎖長を指す。すなわちＤＮＡの場合、鎖長はｂｐを指す。それぞれの小核酸の単離、それぞれに精製に焦点を合わせると、単離された核酸において得られる細胞外核酸部分を増大することができる。本発明の安定化方法によって、特に細胞内ゲノムＤＮＡの断片化が阻害されることに起因して、例えば核酸抽出手順の最中に、断片化細胞外核酸集団からこのような高分子量ゲノムＤＮＡをより効率的に分離することができる。ゲノム核酸と循環核酸との間の実質的なサイズの差異は、本発明の安定化技術を使用して本質的に保存されるので、ゲノムＤＮＡは、例えば、ＤＮＡのサイズ選択的な回収によって、それぞれ安定化されていない場合よりも効率的に除去することができる。例えば高分子量ゲノムＤＮＡを欠乏させることによって、細胞外核酸集団のそれぞれの選択的単離を達成するのに適した方法は、従来技術では周知であり、したがってここでこれ以上説明する必要はない。例えば、１，０００〜１０，０００のヌクレオチドまたは塩基対の任意の核酸の試料を欠乏させるサイズ選択的な方法を使用すれば十分であると思われる。本発明に従って安定化された試料中の、ゲノム核酸（通常１０，０００ｂｐを超える）と細胞外核酸（通常１０００ｂｐ未満）とのサイズの差異は、効率的な安定化に起因して通常は相対的に大きいので（その差異は、例えば１０００〜１０，０００ｂｐの範囲に含まれ得る）、細胞外核酸を生体試料から選択的に単離するための公知の方法を適用することができる。このことにより、単離された細胞外核酸集団中の細胞内核酸の量を低減するためのさらなる好機も提供される。例えば、核酸抽出プロトコル中のゲノムＤＮＡの除去は、残存細胞を除去するために核酸抽出を開始する前の、血漿試料の別個の高重力遠心分離を補完し、またはさらには置き換えることもできる。前記残存細胞から放出されるゲノムＤＮＡは、本発明の安定化に起因して、大量には分解されず、したがって、サイズ選択的な単離プロトコルによって除去することができる。この選択肢は、多くの臨床研究室が、このような高重力遠心分離を実施することができる遠心分離機または特に微量の残存細胞を除去するための他の手段を備えていないので、特に利点がある。
【００８７】
次に、単離された核酸を、ステップｃ）で適切なアッセイおよび／または分析方法を使用して、分析および／またはさらに処理することができる。例えば、単離された核酸を、同定し、修飾し、少なくとも１種の酵素と接触させ、増幅し、逆転写し、クローン化し、配列決定し、プローブと接触させ、検出し（それらの有無）、かつ／または定量化することができる。それぞれの方法は、従来技術で周知であり、細胞外核酸を分析するために、一般に医療、診断および／または予後分野において適用される（発明を実施するための形態も参照）。したがって、細胞外核酸を、任意選択により核酸全体、ＲＮＡ全体および／またはＲＮＡ全体として単離した（先を参照）後に分析して、それに限定されるものではないが、多数の新生物疾患、特に様々な形態の癌などの前悪性腫瘍および悪性腫瘍を含む病状の有無または重症度を同定することができる。例えば、単離された細胞外核酸は、それに限定されるものではないが、非侵襲性の出生前遺伝的試験、それぞれにスクリーニング、疾患スクリーニング、病原体スクリーニング、腫瘍学、癌スクリーニング、初期段階の癌スクリーニング、癌療法モニタリング、遺伝的試験（遺伝子型解析）、感染症試験、傷害診断、外傷診断、移植医療、または多くの他の疾患を含む多くの適用分野で、診断および／または予後マーカー（例えば、胎児由来のまたは腫瘍由来の細胞外核酸）を検出するために分析することができ、したがって診断および／または予後に関連する。一実施形態によれば、単離された細胞外核酸を分析して、疾患または胎児の特徴を同定し、かつ／または特徴を決定する。したがって先に論じた通り、本明細書に記載の単離方法は、ステップｃ）核酸の分析および／または処理をさらに含むことができる。したがって、一実施形態によれば、単離された細胞外核酸をステップｃ）で分析して、疾患および／または胎児の少なくとも１つの特徴を同定し、検出し、スクリーニングし、モニタし、または除外する。核酸の分析／さらには処理は、それに限定されるものではないが、増幅技術、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温増幅、逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、質量分析、蛍光検出、紫外線分光法、ハイブリダイゼーションアッセイ、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列決定、制限分析、逆転写、ＮＡＳＢＡ、対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応、ポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ）、非対称ポリメラーゼ連鎖反応、指数関数後線形（linear after the exponential）ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＡＴＥ−ＰＣＲ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ホットスタートポリメラーゼ連鎖反応、配列間（intersequence）特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＩＳＳＲ）、逆ポリメラーゼ連鎖反応、ライゲーション媒介ポリメラーゼ連鎖反応、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳＰ）、多重ポリメラーゼ連鎖反応、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、固相ポリメラーゼ連鎖反応、またはその任意の組合せを含む任意の核酸分析／処理方法を使用して実施することができる。それぞれの技術は当業者に周知であり、したがってここでこれ以上���明する必要はない。
【００８８】
一実施形態によれば、単離または分析ステップｂ）およびｃ）のいずれかまたは両方は、試料を収集し、それぞれに本発明の教示に従って安定化してから少なくとも１日から７日までに行われる。本発明の方法を使用して、試料、特に血液試料、それぞれに試料に含有されている細胞外核酸集団を安定化し得るのに適した期間も先に記載されており、ここでも適用される。一実施形態によれば、単離ステップは、試料を収集し、本発明の方法に従って安定化してから少なくとも１日後、少なくとも２日後、少なくとも３日後、少なくとも４日後、少なくとも５日後、または少なくとも６日後に実施される。一実施形態によれば、単離または分析ステップのいずれかまたは両方は、細胞含有生体試料を保存するために試料を凍結させずに、かつ／またはホルムアルデヒドを使用せずに行われる。生体試料は、好ましくはＥＤＴＡのような抗凝固剤などのさらなる添加剤と組み合せて、アポトーシス阻害剤、高張剤および／または先に定義の式１の化合物と接触させた後に安定化される。抗凝固剤は、好ましくは、血液または血液由来の試料を安定化する場合に使用される。それぞれに安定化された試料は、室温で取り扱い、例えば貯蔵かつ／または輸送することができる。
【００８９】
さらに、本発明の第３の態様によれば、生体試料中の細胞外核酸集団を安定化するのに適した組成物が提供され、その組成物は、
ａ）少なくとも１種のアポトーシス阻害剤、好ましくはカスパーゼ阻害剤、および／または
ｂ）試料に含まれている細胞を安定化する少なくとも１種の高張剤、好ましくはジヒドロキシアセトン；および／または
ｃ）先に定義の少なくとも１種の式１の化合物；および
ｄ）任意選択により少なくとも１種の抗凝固剤、好ましくはキレート剤
を含む。
【００９０】
先に論じた通り、それぞれの安定化組成物は、試料に含まれている細胞および試料に含まれている細胞外核酸を安定化し、それによって細胞外核酸集団を実質的に保存し、それぞれに安定化することによって、細胞含有生体試料、特に全血、血漿および／または血清を安定化するのに特に有効である。それぞれの安定化組成物によって、好ましくは全血である試料を、試料の質、それぞれにその試料に含有されている細胞外核酸集団の質を実質的に損なうことなく、室温で少なくとも２日間、好ましくは少なくとも３日間にわたって貯蔵し、かつ／または取り扱い、例えば輸送することができる。当然のことながら、安定化に可能な期間をすべて利用することは必須ではなく、必要に応じてそれより早期に試料を処理することもできる。生体試料を安定化組成物と接触させることによって、室温で試料を貯蔵し、かつまたは取り扱い、例えば輸送した後に、試料に含有されている循環核酸を単離し、任意選択により分析かつ／または処理することができる。したがって、試料の収集または安定化と、核酸抽出との間の時間は、集団、それぞれに試料に含有されている細胞外核酸集団の組成に実質的に影響を及ぼさずに変わり得る。特に、細胞内核酸、特に断片化ゲノムＤＮＡによる希釈、それぞれに汚染は低減される。好ましくは、試料を収集した直後またはその最中に、安定化組成物を試料と接触させる。好ましくは、血液試料を安定化する場合、組成物は、前述の通り、少なくとも１種のカスパーゼ阻害剤および少なくとも１種の抗凝固剤、好ましくはキレート剤を含む。組成物はまた、本明細書に記載のさらなる安定化剤を含むことができる。
【００９１】
アポトーシス阻害剤、高張剤および／または式１の化合物の適切な好ましい実施形態、ならびにそれぞれの化合物の適切な好ましい濃度は、安定化方法と共に先に詳説されている。先の開示が参照され、その開示も安定化組成物に対して適用される。好ましくは、少なくとも１種のカスパーゼ阻害剤、好ましくはカスパーゼに特異的な修飾ペプチド、好ましくはＱ−ＶＤ−ＯＰｈなどのＣ末端がＯ−フェノキシ基で修飾されたペプチドが、少なくとも１種の高張剤、好ましくはジヒドロキシアセトンなどのヒドロキシル化有機化合物と併用される。他の適切なヒドロキシル化有機化合物も先に記載されており、それぞれの開示が参照される。実施例によって実証される通り、それぞれの組合せは、細胞含有生体試料、特に血液試料を安定化するのに著しく有効である。
【００９２】
好ましくは、少なくとも１種の式１の化合物は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−カルボン酸アミドである。好ましいＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４基は、先に記載されている。一実施形態によれば、化合物は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルホルムアミド、およびＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドからなる群から選択される。前記化合物はまた、アポトーシス阻害剤、好ましくはカスパーゼ阻害剤（好ましい実施形態は、先に記載されており、先の開示が参照される）および／または高張剤、好ましくはヒドロキシカーボン（hydrxycarbon）化合物（好ましい実施形態は、先に記載されており、先の開示が参照される）と併用することができる。
【００９３】
さらに、安定化組成物が、特に全血、血漿または血清を安定化するのに使用される場合、その組成物は、さらなる添加剤、例えばキレート剤などの抗凝固剤を含むことが好ましい。
【００９４】
一実施形態によれば、安定化組成物は、言及した安定剤および任意選択の添加剤、および任意選択により緩衝剤から本質的になる。安定化組成物は、試料を安定化するものであり、したがって試料に含有されている細胞の溶解および／または破壊を促進するものではない。安定化組成物は、例えば実施例部分に記載のアッセイ方法によって決定され得る通り、試料に含まれている細胞の損傷を低減することができる。
【００９５】
組成物は、固体形態で提供することができる。このことは、例えば、安定化される生体試料が、固体を溶解するための液体（例えば、細胞を含有する体液、培地中の細胞、尿など）を含有している場合、または液体、例えば水を試料に添加して固体を溶解する場合に、適切な選択肢となる。固体の安定化組成物を使用する利点は、固体が通常は化学的により安定であるということである。しかし、液体組成物を使用することもできる。液体組成物には、しばしば、安定化される試料と急速に混合することができ、それによって、基本的には試料が液体の安定化組成物と接触してすぐに即時的な安定化効果を提供できるという利点がある。好ましくは、液体の安定化組成物中に存在する安定化剤（複数可）は、溶液中で安定なままであり、例えば限られた可溶性の沈殿物を溶解するなどの使用者による前処理は、安定化効率を変動させる危険性があるため、この種の前処理は必要ない。
【００９６】
生体試料と混合した本発明の安定化組成物を含む混合物も、提供される。生体試料の適切な好ましい例、ならびに生体試料と混合される場合の安定剤（複数可）の適切な濃度は、安定化方法と共に先に記載されている。先の開示が参照され、その開示はここでも適用される。好ましくは、安定化組成物は、試料が、収集中にすぐに安定化されるように、試料収集デバイスに予め充填されている。一実施形態によれば、安定化組成物を、生体試料と１０：１〜１：２０、５：１〜１：１５、１：１〜１：１０および１：２〜１：５から選択される体積比で接触させる。多量の試料を少量の安定化組成物によって安定化できることが、本発明の安定化組成物の特別な利点である。したがって好ましくは、安定化組成物と試料の比は、１：２〜１：７、より好ましくは１：３〜１：５の範囲に含まれる。
【００９７】
本発明の第３の態様による安定化組成物を使用して、細胞含有試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化することができる。さらに、本発明の第３の態様による安定化組成物は、試料に含有されている細胞を安定化するのに使用することもできる。前述の通り、安定化組成物は、中でも崩壊細胞から生じるゲノムＤＮＡが細胞から放出されるのを低減する。したがって、それぞれの使用も有利であり、本発明の教示によって提供される。
【００９８】
また、本発明の第３の態様による組成物を製造する方法が提供され、ここで組成物の構成成分は、好ましくは水溶液中で混合される。
【００９９】
本発明の組成物はまた、試料収集デバイス、特に採血アセンブリに組み込むことができ、それによってこのようなデバイスの新しい有用な型を提供する。このようなデバイスには、典型的に開口端および閉端を有する容器が含まれる。容器は、好ましくは採血管である。容器のタイプは、収集される試料によっても変わり、他の適切な型式を、以下に記載する。
【０１００】
さらに本発明は、細胞含有生体試料、好ましくは血液試料を収集するための、本発明の安定化組成物を含む容器を提供する。本発明の安定化組成物を含むそれぞれの容器、例えば試料収集管を提供することには、試料がそれぞれの容器に収集されるときに急速に安定化されるという利点がある。安定化組成物に関する詳細は既に記載されており、先の開示が参照され、その開示はここでも適用される。
【０１０１】
一実施形態によれば、生体試料を受け入れ、収集するための収集容器が提供され、その容器は、
ａ）試料が収集されるときに、得られる混合物中のアポトーシス阻害剤もしくは２種以上のアポトーシス阻害剤の組合せの濃度が、少なくとも０．０１μＭ、少なくとも０．０５μＭ、少なくとも０．１μＭ、少なくとも０．５μＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも２．５μＭもしくは少なくとも３．５μＭから選択され、好ましくは０．０１μＭ〜１００μＭ、０．０５μＭ〜１００μＭ、０．１μＭ〜５０μＭ、１μＭ〜４０μＭ、１．０μＭ〜３０μＭもしくは２．５μＭ〜２５μＭから選択される濃度範囲で存在するような、少なくとも１種のアポトーシス阻害剤、および／または
ｂ）試料が収集されるときに、得られる混合物中の高張剤もしくは２種以上のアポトーシス阻害剤の組合せの濃度が、少なくとも０．０５Ｍ、少なくとも０．１Ｍ、好ましくは少なくとも０．２５Ｍであり、好ましくは０．０５Ｍ〜２Ｍ、０．１Ｍ〜１．５Ｍ、０．１５Ｍ〜０．８Ｍ、０．２Ｍ〜０．７Ｍもしくは０．１Ｍ〜０．６Ｍの濃度範囲で存在するような、少なくとも１種の高張剤；および／または
ｃ）試料が収集されるときに、式１の化合物が、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも０．７５％、少なくとも１％、少なくとも１．２５％もしくは少なくとも１．５％の濃度で含まれ、もしくは０．１％〜５０％、０．１〜３０％、１％〜２０％、１％〜１０％、１％〜７．５％および１％〜５％から選択される濃度範囲で含まれるような、先に定義の少なくとも１種の式１の化合物；および／または
ｄ）容器が血液もしくは血液製剤を収集するためのものである場合には、任意選択により少なくとも１種のさらなる添加剤、好ましくはキレート剤、好ましくはＥＤＴＡなどの抗凝固剤、
を含む。適切な濃度は、先に記載されており、好ましくは４ｍＭ〜５０ｍＭ、より好ましくは４ｍＭ〜２０ｍＭの範囲に含まれる。
【０１０２】
予め充填される構成成分ａ）、ｂ）、ｃ）および／またはｄ）は、液体または乾燥形態で提供することができる。全血を安定化するには、少なくとも構成成分ａ）およびｄ）を使用することが好ましい。好ましくは、安定化構成成分は、安定化組成物として提供される。乾燥形態は、例えば、安定化される生体試料が、固体を溶解するための液体（例えば、細胞を含有する体液、培地中の細胞、尿など）を含有している場合、または液体、例えば水を試料に添加して固体を溶解する場合に、適切な選択肢となる。固体の安定化組成物を使用する利点は、固体が通常は液体よりも化学的に安定であるということである。一実施形態によれば、容器の内壁は、本発明の安定化組成物で処理／被覆される。前記組成物は、例えばスプレー乾燥法を使用して内壁に適用することができる。実質的に固体状態の保護性組成物を得るために、安定化組成物に液体除去技術を施すことができる。液体除去条件は、分注した液体の安定化組成物の元の量の少なくとも約５０重量％、少なくとも約７５重量％、または少なくとも約８５重量％を除去するような条件であってよい。液体除去条件は、得られる組成物が、フィルム、ゲル、または他の実質的に固体の層もしくは非常に粘性の層の形態になるように十分な液体が除去されるような条件であってよい。例えば、その条件によって、実質的に不動のコーティング（好ましくは血液製剤試料である細胞含有試料と接触させると、好ましくは再溶解するか、またはそれ以外では分散し得るコーティング）を得ることができる。実質的に固体形態（例えば、１つまたは複数のペレットの形態）の保護剤を実現するのに、凍結乾燥または他の技術を用い得ることも可能である。したがって液体除去条件は、考慮される試料（例えば全血試料）との接触時に保護剤が試料中に分散し、試料中の構成成分（例えば細胞外核酸）を実質的に保存する材料をもたらすような条件であってよい。液体除去条件は、残りの組成物が、結晶化度を実質的にもたなくなり、周囲温度で実質的に不動になるのに十分に高い粘度を有するようになり、またはその両方になるような条件であってよい。
【０１０３】
しかし、液体組成物を使用することもできる。液体組成物には、しばしば、安定化される試料と急速に混合することができ、それによって、基本的には試料が液体の安定化組成物と接触してすぐに即時的な安定化効果を提供できるという利点がある。好ましくは、液体の安定化組成物中に存在する安定化剤（複数可）は、溶液中で安定なままであり、例えば限られた可溶性の沈殿物を溶解するなどの使用者による前処理は、安定化効率を変動させる危険性があるため、この種の前処理は必要ない。
【０１０４】
安定化組成物は、容器に収集される試料の量を安定化するのに有効な量で、前記容器に含まれる。一実施形態によれば、液体の安定化組成物を、生体試料と１０：１〜１：２０、５：１〜１：１５、１：１〜１：１０および１：２〜１：５から選択される体積比で接触させる。多量の試料を少量の安定化組成物によって安定化できることが、本発明の安定化組成物の特別な利点である。したがって好ましくは、安定化組成物と試料の比は、１：２〜１：７、より好ましくは１：３〜１：５の範囲に含まれる。
【０１０５】
一実施形態によれば、容器は脱気される。脱気は、好ましくは、特定の体積の流体試料を内部に引き入れるのに有効である。それによって、正確な量の試料を、容器に含まれる予め充填された量の安定化組成物と確実に接触させられるので、効率的な安定化が確実に得られる。一実施形態によれば、容器は、開口を有し、かつセプタムで封止される管を含む。例えば容器は、固体または液体形態いずれかの規定量の安定化組成物で予め充填されており、規定の真空が提供され、セプタムで封止される。セプタムは、標準のサンプリング付属品（例えばカニューレ等）と適合するように構築される。例えばカニューレとつなぐと、真空によって所定量の試料が容器に収集される。それぞれの実施形態は、採血するのに特に有利である。適切な容器は、例えば米国特許第６，７７６，９５９号明細書に開示されている。
【０１０６】
本発明の容器は、ガラス、プラスチックまたは他の適切な材料から製造することができる。プラスチック材料は、酸素不透過材料であってよく、または酸素不透過層を含有することができる。あるいは、容器は、水透過性および空気透過性のプラスチック材料から製造することができる。本発明の容器は、好ましくは透明材料から製造される。適切な透明な熱可塑性材料の例には、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリエチレンテレフタラートが含まれる。容器は、収集される必要がある生体試料の体積に従って選択される適切な寸法を有することができる。前述の通り、好ましくは容器は、大気圧未満の内圧まで脱気される。このような一実施形態は、全血などの体液を収集するのに特に適している。圧力は、好ましくは所定体積の生体試料を容器に引き入れるように選択される。このような真空管に加えて、非真空管、機械的分離管、またはゲルバリア管も、特に血液試料を収集するための試料容器として使用することができる。適切な容器およびキャッピングデバイスの例は、米国特許第５，８６０，３９７号明細書および米国特許出願公開第２００４／００４３５０５号明細書に開示されている。細胞含有試料を収集するための容器として、さらなる収集デバイス、例えばシリンジ、蓄尿デバイスまたは他の収集デバイスを使用することもできる。容器のタイプは、収集される試料のタイプによって変わる場合もあり、適切な容器が、やはり当業者によって利用され得る。
【０１０７】
有利な一実施形態では、容器、それぞれにデバイスは、少なくとも１種のアポトーシス阻害剤、好ましくはカスパーゼ阻害剤、少なくとも１種の高張剤、好ましくは先に詳説した少なくとも１種のヒドロキシル化有機化合物、例えばジヒドロキシアセトン、および任意選択により抗凝固剤、好ましくはキレート剤、より好ましくはＥＤＴＡなどのさらなる添加剤で充填され、または予め充填されている。好ましくはヒドロキシル化有機化合物、例えばジヒドロキシアセトンなどの炭水化物である少なくとも１種の高張剤、および少なくとも１種のカスパーゼ阻害剤、好ましくはＱ−ＶＤ−ＯＰＨの混合物は、予想外に全血、血漿または血清中の細胞外核酸を安定化し、特にこのような試料に含有されている白血球細胞から細胞核酸が放出されるのを防止する。したがって、細胞外核酸集団は、採血時に示した状態で保存される。容器、それぞれにデバイスが、安定剤として先に定義した少なくとも１種の式１の化合物で充填され、または予め充填されている場合にも、有益な結果が得られる。好ましくは、式１の化合物に加えて抗凝固剤も包含される。抗凝固剤は、好ましくはＥＤＴＡなどのキレート剤である。さらに、容器に含まれている安定化組成物は、アポトーシス阻害剤、好ましくはカスパーゼ阻害剤および／または少なくとも１種の高張剤、好ましくは先に詳説した少なくとも１種のヒドロキシル化有機化合物、例えばジヒドロキシアセトン、および任意選択によりさらなる添加剤を含むこともできる。一実施形態によれば、容器に含まれている安定化組成物は、カスパーゼ阻害剤および抗凝固剤を含む。
【０１０８】
一実施形態によれば、容器は、開口上部、底部、およびその間に広がってチャンバを画定する側壁を有し、ここで本発明の安定化組成物は、そのチャンバに含まれる。本発明の安定化組成物は、液体または固体形態で容器に含まれ得る。一実施形態によれば、容器は管であり、底部は閉じた底部であり、容器はさらに、開口上部に蓋を含み、チャンバは減圧状態にされる。チャンバ内を減圧する利点は、既に記載した。好ましくは、蓋は、針またはカニューレで穿通することができ、減圧度は、特定体積の液体試料をチャンバに引き入れるように選択される。一実施形態によれば、チャンバは、特定体積の液体試料をチャンバに引き入れるように選択された減圧状態にされ、安定化組成物は液体であり、安定化組成物と特定体積の細胞含有試料の体積比が、１０：１〜１：２０、５：１〜１：１５、１：１〜１：１０および１：２〜１：５から選択されるようにチャンバ内に分注される。関連する利点は、既に記載した。
【０１０９】
好ましくは、容器は、患者から採血するためのものである。
【０１１０】
第５の態様によれば、患者から試料を収集して、本発明の第４の態様による容器のチャンバに直接入れるステップを含む方法が提供される。容器および試料に関する詳細は、既に記載した。それぞれの開示が参照される。一実施形態によれば、血液試料が収集され、好ましくは患者から採血される。
【０１１１】
本明細書に開示の方法および組成物は、細胞外核酸を効率的に保存および単離すると同時に、生体試料に含まれている細胞から生じ、損傷細胞、それぞれに細胞溶解に起因して生体試料に入り込むおそれがある核酸、特に断片化ゲノムＤＮＡと混合される可能性を低減することができる。本発明の方法、ならびに組成物および開示のデバイス（例えば収集容器）は、細胞外核酸の分解を低減し、細胞溶解および／またはゲノム核酸、特に断片化ゲノムＤＮＡの放出を低減し、したがって、試料に含有されている細胞外核酸は細胞内核酸で汚染されず、それぞれの汚染が本発明の教示によってそれぞれに低減される。先に論じた通り、細胞外核酸と細胞核酸、特に断片化ゲノムＤＮＡとが混ざり合うことにより、生体試料中の細胞外核酸の量の任意測定の精度が低下するおそれがある。先に論じた通り、本発明の重要な利点は、試料に含有されている細胞（特に、全血、血漿または血清の場合は白血球細胞）および細胞外核酸の両方を本質的に同時に安定化する可能性があるということである。このことは、細胞外核酸の構造的完全性を維持しながら、ゲノムＤＮＡなどの細胞核酸が、試料の無細胞部分に放出されるのを防止し、さらには試料に含まれている対象となる細胞外核酸（および関連するバイオマーカー）が希釈されるのを防止する一助になる。本明細書で論じる通り、全血または血漿などの細胞含有生体試料を、安定化剤（複数可）と接触させることによって、細胞外核酸を単離するまで長期間試料を貯蔵することができる。より好ましくは、細胞含有生体試料、例えば血液または血漿を、ある場所（例えば医療施設）で採血し、安定化剤（複数可）と接触させ、後に核酸の単離および試験過程のために、様々な遠隔地（例えば実験室）まで運搬することができる。
【０１１２】
さらに、本発明による試料の安定化は、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド放出薬などの架橋試薬等を使用しないので、本明細書に開示の安定化試薬は、このような架橋試薬を使用する公知の最先端の安定化試薬を上回る利点を提供する。架橋試薬は、核酸分子同士、または核酸とタンパク質との間に分子間または分子内共有結合を引き起こす。この作用により、安定化され部分的に架橋されたこのような核酸が、複雑な生体試料から精製または抽出された後の回収量が減少する場合がある。例えば、全血試料中の循環核酸の濃度は、相対的に既に低いので、このような核酸の収率をさらに低下する任意の手段は、開示されるべきである。このことは、悪性腫瘍に由来する、または妊娠初期の三半期に発育中の胎児に由来する非常に希少な核酸分子を検出し分析する場合に、特に重要になり得る。したがって、一実施形態によれば、安定化組成物にホルムアルデヒド放出薬は含まれず、さらには、安定化するのにもそれぞれに使用されることはない。一実施形態によれば、本発明の方法および／または組成物で使用されるアポトーシス阻害剤は、アウリントリカルボン酸、フェニルメチルスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ）、ロイペプチンおよびＮα−トシル−Ｌｙｓクロロメチルケトン塩酸塩（ＴＬＣＫ）からなる群からは選択されない。一実施形態によれば、アポトーシス阻害剤は、特に追加の安定剤としての高張剤と併用されなくても、前記群からは選択されない。
【０１１３】
本発明は、本明細書に開示の例示的な方法および材料によって制限されず、本明細書に記載の方法および材料に類似のまたは等価な任意の方法および材料も、本発明の実施形態を実施または試験するのに使用することができる。数値範囲は、その範囲を規定する数の両端を含む。本明細書に提示の見出しは、本明細書を全体として参照することによって読み取ることができる本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではない。
【０１１４】
用語「溶液」は、本明細書で使用される場合、特に液体組成物、好ましくは水性組成物を指す。溶液は、一相だけからなる均質な混合物であってもよいが、本発明の範囲には、例えば沈殿物などの固体添加剤を含むことも含まれる。
【０１１５】
本明細書でヌクレオチドｎｔに言及して示したサイズ、それぞれにサイズ範囲は、鎖長を指し、したがって一本鎖および二本鎖分子の長さを説明するために使用される。二本鎖分子では、前記ヌクレオチドは対を成している。
【０１１６】
一実施形態によれば、本方法の場合にいくつかのステップを含むもの、または本組成物、溶液および／もしくは緩衝液の場合にいくつかの成分を含むものとして本明細書に記載されている主題は、それぞれのステップまたは成分からなる主題を指す。本明細書に記載の好ましい実施形態を選択し、組み合わせることが好ましく、好ましい実施形態のそれぞれの組合せから生じる特定の主題も、本開示に属する。
【０１１７】
【表２】
2014528719.tif 000009
2014528719.tif 000010
2014528719.tif 000011
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【実施例】
【０１１８】
以下の実施例では、本発明の材料および方法を提示する。これらの実施例は、単に例示目的であり、いかようにも本発明を制限するものと解釈されるべきでないことを理解されたい。
【０１１９】
Ｉ．材料および方法
細胞含有生体試料、ここでは全血試料を、室温（ＲＴ）で最長６日間または７日間インキュベートする試験系を設計した。その試験系では、本発明の添加剤の試料安定化特性を、０日目、３日目、および６／７日目に試料で試験した。試料を、適用できる場合には以下のプロトコルに従って処理した（詳細については、結果部分の具体例も参照されたい）。
【０１２０】
１．蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）による血液細胞の完全性の測定
１．１．赤血球の溶解
−血液試料２ｍｌを新しい１５ｍｌのＦａｌｃｏｎ管に移す
−５倍緩衝液ＥＬ（キアゲン（QIAGEN））を添加する
−試料を反転させる（１０×）
−氷上でインキュベートする（１０分）
−４００×ｇおよび４℃で１０分間、遠心分離処理を施す
−上清を破棄する
−２倍緩衝液ＥＬ（キアゲン（QIAGEN））を白血球細胞ペレットに添加する
−わずかにボルテックスすることによって、ペレットを緩衝液ＥＬ（キアゲン（QIAGEN））に再溶解させる
−４００×ｇで１０分間、遠心分離処理を施す
−上清を破棄する
−ＦＡＣＳ  Ｆｌｏｗ（ベクトン  ディッキンソン、プリマウス、ＵＫ（Becton、Dickinson Plymouth、UK））５００μｌを白血球細胞ペレットに添加する
−わずかにボルテックスすることによって、ペレットをＦＡＣＳ  Ｆｌｏｗに再溶解させる
−ＦＡＣＳ  Ｆｌｏｗ  １ｍｌを新しいＦＡＣＳ管に移す
−再溶解させたペレット１００μｌをＦＡＣＳ管に移す
【０１２１】
赤血球の量が多いことにより、明白な細胞集団（例えばゲノムＤＮＡを放出し得る）をＦＡＣＳ分析で区別できないので、赤血球を溶解する。
【０１２２】
１．２．フローサイトメトリーによる細胞完全性の測定
測定を、製造者の指示（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ベクトン  ディッキンソン、プリマウス、ＵＫ（Becton、Dickinson Plymouth、UK））に従って実施した。
【０１２３】
２．血漿の分離
全血から血漿を分離するために、血液試料を５０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離処理し、得られた血漿試料を、１６，０００×ｇで４℃において１０分間、再び遠心分離処理した。
【０１２４】
得られた血漿を、それに含有されている核酸を単離するために使用した。
【０１２５】
３．核酸の精製
ＱＩＡａｍｐ（登録商標）循環ＮＡ（Circulating NA）キット（ハンドブックに従う）を使用して、得られた血漿試料から循環細胞外核酸を精製した。簡潔には以下の通りであった。
−試料投入量１０ｍｌ、
−溶解。プロテイナーゼＫ１ｍｌおよび緩衝液ＡＣＬ（キアゲン（QIAGEN））８ｍｌ
−結合。緩衝液ＡＣＢ（キアゲン（QIAGEN））１８ｍｌ
−洗浄ステップ。変更なし、ハンドブックに従う
−緩衝液ＡＶＥ（キアゲン（QIAGEN））６０μｌ中で溶出
【０１２６】
４．溶出液の分析
３に従って得た溶出液を、すべての試料（６／７日目の試料を含む）が精製されるまで−２０℃で貯蔵した。後に、同じ条件による溶出液をプールし、以下の通り処理した。
【０１２７】
４．１．チップゲル電気泳動法（２１００  バイオアナライザ  アジレント  テクノロジーズ  インク  ＵＳＡ（Bioanalyzer、Agilent Technologies,Inc.、USA））を使用して、製造者の指示（ハンドブック  アジレント（Agilent）ＤＮＡ７５００およびＤＮＡ１２０００キットガイドを参照されたい）に従ってＤＮＡサイズ分布を決定することにより、血液細胞の安定性／ＤＮＡ放出を測定した。ただし、１μｌの代わりに１．５μｌの試料をウェルに移した。
【０１２８】
４．２．ＤＮＡ分解に対して感度が高いリアルタイムＰＣＲアッセイによるＤＮＡの定量化（標的は５００および６６ｂｐ長のリボソーム１８Ｓ  ＤＮＡコード配列）。
【０１２９】
ＤＮＡ二本鎖アッセイを、以下を適用してＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標）多重ＰＣＲハンドブック（キアゲン（QIAGEN））に従って実施した。
−プライマー濃度を８μｍから１６μｍまで拡大した。
−アニーリング／伸長ステップを、１分から２分まで延長した。
（試料を、１：１０希釈した後に増幅した）
【０１３０】
４．３．無細胞循環ＲＮＡレベル（標的は１８Ｓ  ｒＲＮＡ、ＩＬ８、ｃ−ｆｏｓおよびｐ５３）の変動に対して感度が高いリアルタイムＰＣＲアッセイを使用してＲＮＡを検出。ＲＮＡアッセイを、表２〜４に記載の条件に従って実施した。
【０１３１】
【表３】
2014528719.tif 000022
【０１３２】
【表４】
2014528719.tif 000023
【０１３３】
【表５】
2014528719.tif 000024
【０１３４】
【表６】
2014528719.tif 000025
【０１３５】
ＩＩ．実施実験および結果
引き続き、実施試験の詳細を説明する。実施例で使用した方法の詳細は、Ｉで既に記載した。
【０１３６】
実施例１．カスパーゼ阻害剤の添加による安定化
広範なカスパーゼ阻害剤として作用する２つの異なるオリゴペプチド、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈおよびＺ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＦＭＫを試験した。
【０１３７】
【表７】
2014528719.tif 000026
【０１３８】
試験した各カスパーゼ阻害剤を、全血試料に添加した（血液１０ｍｌ中、最終濃度２０μＭ。ＢＤバキュテイナＫ２Ｅ管に採血した）。全血試料を、セクションＩに記載した通りに処理した。２（血漿の調製）および３（核酸の単離）を参照されたい。
【０１３９】
チップゲル電気泳動法の結果
溶出した無細胞循環ＤＮＡを、チップゲル電気泳動法（その方法の詳細については、先のＩ、４．１を参照されたい）を使用して、サイズによって分離した。図１ａは、得られた結果を示す。ＤＭＳＯ対照およびＫ２Ｅ血液（本発明の教示に従って処理していない）は、同じはしご状のバンドパターンを示す。このパターンは、アポトーシスが生じる試料で発生する。アポトーシス中に、エンドヌクレアーゼがヌクレオソーム間リンカー領域でゲノムＤＮＡを分解し、約１８０ｂｐまたは１８０ｂｐの倍数のＤＮＡ断片を産生する。したがって、アポトーシスは、明確なはしご状のパターンを示す試料で発生する。さらに、パターン強度（濃い）が明白である。バンドが濃くなるにつれて、多くのゲノムＤＮＡが細胞から放出された。したがって細胞外核酸集団を汚染する。
【０１４０】
図１ａ）は、ＤＭＳＯ対照およびＫ２Ｅ血液試料が、既に３日目で強いはしご状のパターンを示し、このパターンが、７日目にはさらに強力になることを示している。したがって、ゲノムＤＮＡが、試料に含有されている細胞から放出され、やはり分解された。放出され分解されたこのＤＮＡは、試料に含有されている無細胞核酸を汚染する。したがって、これらの試料では許容される安定化が達成されない。
【０１４１】
それとは対照的に、Ｚ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＦＭＫで処理した全血試料は、対照と比較すると、特に７日目にはしご状のパターンが少なくなっており、このことは、アポトーシスによって引き起こされるゲノムＤＮＡ、それぞれに断片化ゲノムＤＮＡの放出が阻害されていることを示す。この効果は、図１ｂ）に示す結果によって確認される（以下参照）。この効果は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈで処理した血液試料においてさらにより顕著であり、この試料では、既に３日目でも、また７日目でも、はしご状のパターンが著しく少なくなっている。したがって、ゲノムＤＮＡの放出および分解は、カスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈを添加することによって有効に防止され、それぞれに低減される。
【０１４２】
ＤＮＡ定量化の結果
溶出した無細胞循環ＤＮＡも、ＤＮＡ分解に対して感度が高いリアルタイムＰＣＲアッセイで定量化した（その方法の詳細については、先のＩ、４．２を参照されたい）。図１ｂ）は、ＲＴにおける７日間の貯蔵期間中の細胞外核酸集団の安定化に対する、試験したカスパーゼ阻害剤の効果、ここではＤＮＡの増加について示す（１８Ｓ  ＤＮＡ二本鎖アッセイ）。
【０１４３】
定量的リアルタイムＰＣＲによるリボソーム１８Ｓ  ＤＮＡの検出により、０日目から３日目または７日目までのＤＮＡのｘ倍増加を算出することが可能になる（３（または７）日目のコピー数を０日目のコピー数で割って算出）。驚くべきことに、図１ｂ）に示した結果は、カスパーゼ阻害剤、特にＱ−ＶＤ−ＯＰｈを全血試料に添加すると、ＤＮＡ増加が低減されたことを実証している。Ｚ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＦＭＫの安定化効果は、標準試料と比較して７日目でより顕著であった。それによって図１ａ）に示した結果が確認される。
【０１４４】
概要
リアルタイムＰＣＲおよびゲル電気泳動法の結果をまとめると、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈまたはＺ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＦＭＫの添加により、ＤＮＡ断片化が阻害され、さらには血漿へのゲノムＤＮＡの放出が低減されることが実証された。したがって、カスパーゼ阻害剤を全血に添加することは、試料、特に細胞外核酸集団を安定化するのに室温でも有効である。したがって、本発明の安定化方法を使用すると、試料の質を危険にさらすことなく、室温でも全血試料を輸送することができる。また、より長い貯蔵期間にわたってゲノムＤＮＡの放出を完全に防止するために、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈの濃度を増大することもできる。
【０１４５】
実施例２．血液の安定性に対する低濃度のカスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈの影響
この実施例では、低濃度のカスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈを、グルコースと組み合せて試験し、グルコースを組合せパートナーとして添加して、血液細胞が生き延びるのを支持した（細胞損傷を防止することによって）。２１．４ｍＭのグルコースおよび４μＭ、１μＭまたは０μＭのＱ−ＶＤ−ＯＰｈを、ＢＤバキュテイナ管に採血した血液１０ｍｌに添加し、室温で最長７日間貯蔵した。全血試料を、セクションＩに記載の通り処理した。２（血漿の調製）および３（核酸の単離）を参照されたい。
【０１４６】
チップゲル電気泳動法の結果
溶出したＤＮＡを、チップゲル電気泳動法（その方法の詳細については、先のＩ、４．１を参照されたい）を使用して、サイズによって分離した。図２ａは、カスパーゼ阻害剤を添加しなかった対照試料と比較して、１μＭのカスパーゼ阻害剤でも、７日目のゲノムＤＮＡ放出／断片化が著しく低減されたことを示している。この効果は、４μＭのカスパーゼ阻害剤を使用すると改善される。したがってカスパーゼ阻害剤は、非常に低濃度でも、特に炭水化物と組み合わせると、血液試料を安定化するのに有効である。
【０１４７】
ＤＮＡ定量化の結果
図２ｂは、２１ｍＭのグルコースと組み合わせた試験濃度のカスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈの、ＲＴにおける７日間の貯蔵期間中の血漿中ゲノムＤＮＡ増加に対する効果を示している（１８Ｓ  ＤＮＡ二本鎖アッセイ）。Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈをグルコースと組み合せて添加すると、血漿へのゲノムＤＮＡの放出が著しく低減する。図２ｂは、安定化のために１μＭのＱ−ＶＤ−ＯＰＨを全血試料に添加するだけでも、７日間の貯蔵期間中のゲノムＤＮＡはわずかしか増加しなかったことを示している。４μＭのＱ−ＶＤ−ＯＰｈを添加すると、血漿へのゲノムＤＮＡの放出は、最大４倍まで阻害される。それとは対照的に、本発明による安定化なしに全血をＫ２Ｅ管中に採血すると、血漿中ＤＮＡは約４０倍増加する。
【０１４８】
したがって、図２ｂ）によっても、カスパーゼ阻害剤が、低濃度でも全血に対して安定化効果を有することが確認される。
【０１４９】
実施例３．浸透圧効果による血液細胞の安定化
驚くべきことに、本発明者らはまた、全血中で高張媒体として作用する試薬を添加することによって、血液細胞を安定化できることを見出した。例えばヒドロキシル化有機化合物（複数可）を全血に添加することによって高張媒体を生成すると、全血に含有されている血液細胞からの水の放出が微量まで抑えられ、細胞収縮によって安定性が増大する。前記細胞収縮は、機械力に対して細胞を安定化すると想定される。
【０１５０】
ジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）は、フルクトース代謝の中間産物であり、そのジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）由来のリン酸は、解糖系の一部となる。ＤＨＡを高張剤として試験した。この試薬の添加は、血液細胞に損傷を与えずに、血液細胞を良好な感度で収縮させる。まず、ＤＨＡをＰＢＳ（シグマ−アルドリッチ（SIGMA-Aldrich）  Ｋａｔ．Ｎｏ．Ｄ８５３７から購入）または３×ＭＯＰＳ（１リットルの１０×ＭＯＰＳ、２００ｍＭのＭＯＰＳ、５０ｍＭのＮａＡｃ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ５で希釈した。酸性媒体により、ｃｃｆＲＮＡも安定化されると想定される）に溶解し、４．２Ｍの溶解ＤＨＡを得た。次に、緩衝液ＰＢＳまたは緩衝液３×ＭＯＰＳに溶解した４．２ＭのＤＨＡ２ｍｌを、血液１０ｍｌに添加して、全血中、最終濃度０．７ＭのＤＨＡを得た。ＤＨＡの２つの異なる溶媒を、ＤＮＡ安定化用の最先端の採血管であるＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）ＤＮＡ採血管（キアゲン（QIAGEN））と比較した。
【０１５１】
ＦＡＣＳ分析の結果
血液細胞の完全性を、ＦＡＣＳを使用して分析した（その方法の詳細については、先のＩ、１を参照されたい）。図３は、フローサイトメトリーによって測定した血液細胞の完全性を示す。ドットプロットは、３種の異なる細胞集団、顆粒球（１）、単球（２）およびリンパ球（３）を可視化している。プロットの左下領域の雲（４）は、主に赤血球の溶解によって生じた破片を表す。
【０１５２】
図３の結果は、ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）ＤＮＡ採血管に収集し貯蔵した血液細胞が、互いに区別がつかず、貯蔵期間の６日目には破片が生じたことを示している。ＤＨＡを添加すると、これらの細胞が細胞収縮した結果小さくなるとしても、貯蔵期間の６日目には血液細胞の亜集団を識別することができる。このことは、試料に含有されている細胞が、ＤＨＡの添加によって安定化されたことを示している。
【０１５３】
チップゲル電気泳動法の結果
また図４ａに提示した結果は、ＤＨＡで処理した試料では、ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）ＤＮＡ採血管で貯蔵した試料よりもゲノムＤＮＡの放出が著しく低減されるので、ＤＨＡの添加によって血液試料が安定化されることを示している。さらに、図４ａから明らかなように、ＤＨＡで安定化された試料は、はしご状の分解パターンを示さず、このことは、アポトーシス、それぞれにＤＮＡの分解が効率的に防止されることを示唆している。
【０１５４】
ＤＮＡ定量化の結果
図４ｂは、ＲＴでの６日間の貯蔵期間にわたる、ＤＮＡの増加に対するＤＨＡの効果を示す（１８Ｓ  ＤＮＡ二本鎖アッセイ）。リボソーム１８Ｓ  ＤＮＡのレベルは、貯蔵して３日目まで一定のままであるように見えたため、３×ＭＯＰＳに溶解したＤＨＡによって最良の結果を得た。
【０１５５】
短いアンプリコンコピー数を長いアンプリコンコピー数で割ると（６６ｂｐ／５００ｂｐ）、検出される短いまたは長いアンプリコンが、経時的に同様に変化するかどうかが示される。この比の減少は、短いＤＮＡ分子よりも、長いＤＮＡ分子の方が強力に放出されることを暗示しており、血液細胞から高分子量ゲノムＤＮＡが放出されていると解釈することができる。図４ｂに示す図は、３つのすべての条件に関するゲノムＤＮＡの放出を示している。この結果は、ＤＨＡの存在により、この過程が緩徐することを示している。したがって、この実験も、ＤＨＡをＥＤＴＡ全血に添加すると血液細胞が安定化され、したがって無細胞血漿画分中のｃｃｆＤＮＡ集団が保存され、例えば機械的破壊に起因して試料に含有されている細胞から放出されるＤＮＡによる汚染が回避されることを示している。
【０１５６】
実施例４．異なる濃度のジヒドロキシアセトンの試験
この実施例では、異なる濃度（０．７Ｍ、０．５Ｍおよび０．２Ｍ）のＤＨＡの安定化効果を試験した。
【０１５７】
ＦＡＣＳ分析の結果
図５は、フローサイトメトリーによって測定した血液細胞の完全性を示す。ドットプロットは、３種の異なる細胞集団、顆粒球（１）、単球（２）およびリンパ球（３）を可視化している。プロットの左下領域の雲は、主に赤血球の溶解によって生じた破片を表す。
【０１５８】
ＤＨＡを全血に添加すると、ＤＨＡ濃度に関わらず、貯蔵期間の６日目でも異なる細胞集団を区別することができる。フローサイトメトリー分析の結果（図５）では、異なる濃度のＤＨＡ間の細胞完全性の差異は示されていない。
【０１５９】
チップゲル電気泳動法の結果
図６ａに提示の結果も、異なる濃度のＤＨＡを添加することによってゲノムＤＮＡの放出およびＤＮＡの分解が効率的に防止されるので、血液試料が安定化されることを示している。
【０１６０】
ＤＮＡ定量化の結果
図６ｂは、ＲＴでの６日間の貯蔵期間中の、ＤＮＡの増加に対する異なるＤＨＡ濃度の効果を示している（１８Ｓ  ＤＮＡ二本鎖アッセイ）。図６ｂに示した通り、全血中０．５ＭのＤＨＡは、ゲノムＤＮＡの放出を最も効率的に防止する。さらに、短いアンプリコンコピー数と長いアンプリコンコピー数の比は、３日目まで一定のままであり、６日目までにごくわずかに低下する。これらの結果は、全血の安定化に対する高張剤ＤＨＡの効果が注目に値することを実証している。
【０１６１】
実施例５．アポトーシス阻害剤、浸透活性化合物および抗凝固剤の組合せ
採血管中のＥＤＴＡを増大すると、ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）ＤＮＡ採血管について知られている通り、マイクロクロット（microclotting）およびマクロクロット（macroclotting）が阻害される。したがって、より高濃度のＥＤＴＡは、血液細胞および血漿中の細胞外核酸の安定化を支持することができる。さらに、先に提示の実験は、カスパーゼ阻害剤、特にＱ−ＶＤ−ＯＰｈおよび浸透活性化合物ＤＨＡの、血液細胞損傷に対する阻害作用を示しており、特に、細胞外核酸集団中のゲノムＤＮＡ、特に断片化ゲノムＤＮＡの増加が効率的に低減されることを示している。驚くべきことに、試験したカスパーゼ阻害剤も、無細胞（血漿）画分へのゲノムＤＮＡの漏出を防止／阻害した。したがって、これらの試薬の組合せにより、全血中の細胞外核酸、特に細胞外ＤＮＡの安定化が改善され、その安定性が少なくとも６日間継続し、さらには血液細胞が効率的に安定化され、それによって、安定化されなければ血漿中の天然細胞外核酸レベルを希釈するはずのゲノムＤＮＡの放出が防止される。
【０１６２】
この実施例では、ＤＨＡを３×ＭＯＰＳ２ｍｌ（３×ＭＯＰＳ２ｍｌ中３ＭのＤＨＡ）に溶解し、Ｋ2ＥＤＴＡ５０ｍｇおよび５ｎＭのＱ−ＶＤ−ＯＰｈ２．４μｌを添加し、次にＫ２Ｅ管に収集した全血１０ｍｌに移し入れた。血漿試料を、１６，０００×ｇにおいて４℃で１０分間、遠心分離処理し、次にＱＩＡａｍｐ（登録商標）循環ＮＡ（Circulating NA）キット（キアゲン（QIAGEN））を使用して精製した（詳細は、先のセクションＩに記載されている）。
【０１６３】
ＦＡＣＳ分析の結果
図７ａは、フローサイトメトリーによって測定した血液細胞の完全性を示す。ドットプロットは、３種の異なる細胞集団、顆粒球（１）、単球（２）およびリンパ球（３）を可視化している。プロットの左下領域の雲は、主に残存する赤血球の溶解によって生じた破片を表す。
【０１６４】
カスパーゼ阻害剤、高張剤および錯化剤を全血に添加すると、６日間の貯蔵期間が経過した後、血液細胞集団のパターンを区別することができた。したがって、血液試料に含有されている細胞は、効率的に安定化された。
【０１６５】
ＤＮＡ定量化の結果
図７ｂは、ＥＤＴＡ、ＤＨＡおよびカスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨの組合せの、ＲＴにおける６日間の貯蔵期間中のＤＮＡの増加に対する効果を示す（１８Ｓ  ＤＮＡ二本鎖アッセイ）。この結果は、ＥＤＴＡ、ＤＨＡおよびＱ−ＶＤ−ＯＰＨの組合せによって、血漿中の細胞外ＤＮＡが著しく強力に安定化され（測定した１８Ｓ  ｒＤＮＡのレベルは、６日目まで一定のままである）、３日間の貯蔵期間が経過するまで、血液細胞からのゲノムＤＮＡの放出が強力に防止される（短いアンプリコンコピー数と長いアンプリコンコピー数の比は、一定のままである）ことを示している。血漿中ゲノムＤＮＡがごくわずかに増大したことが、３日間の貯蔵期間と６日間の貯蔵期間との間で明白である。
【０１６６】
したがって、試験した安定化剤の組合せは、全血試料を安定化するのに特に効率的である。
【０１６７】
実施例６．全血中の遊離循環ＲＮＡに対するアポトーシス阻害剤、浸透活性化合物および防止剤の効果
Ｋ2ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈおよびＤＨＡの組合せは、全血中の遊離循環ＤＮＡおよび血液細胞の完全性に対して注目すべき安定化効果を示したので、遊離循環ＲＮＡに対するこれらの薬剤の安定化能も分析した。血漿において一定レベルの遊離循環ＲＮＡを保存するために（採血時に提示のものとして）、安定化試薬（複数可）は、ＲＮＡが分解しないように保護し、ＲＮＡが崩壊血液細胞から放出されないように防止するだけでなく、その代謝経路を阻害するべきであり、それぞれに代謝経路の変化が細胞外ＤＮＡ血漿レベルに影響を及ぼさない効果を有するべきであり、それぞれの作用をそれぞれに低減すべきである。したがって、実験５を反復し、ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定した。
【０１６８】
図８は、ＥＤＴＡ、ＤＨＡおよび試験したカスパーゼ阻害剤の組合せの、６日間の貯蔵期間中の血漿の転写レベルに対する効果を示す図である。ＲＮＡレベルの変動を測定するために、ｐ５３、ＩＬ８またはｃ−ｆｏｓと内部標準（１８Ｓ  ｒＲＮＡ）との間のΔＣｔを算出して、標的ｍＲＮＡを参照標的（１８Ｓ  ｒＲＮＡ）と呼んだ。３日目または６日目の試料のΔＣｔから０日目の試料のΔＣｔを減算することによって、ｍＲＮＡ転写レベルの相対的な減少（−値）または増加（＋値）を可視化するΔΔＣｔが規定される。ＩＬ８およびｃ−ｆｏｓは、採血後に転写が誘発される遺伝子である。したがって、これらの標的の転写レベルは、細胞がそれらの内容物を放出するときに劇的に上昇し得る。本発明の好ましい実施形態による安定化溶液（高濃度のＥＤＴＡ、ジヒドロキシアセトン、カスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈの組合せ）を添加すると、３日間の貯蔵期間が経過するまで、核酸が血液細胞から放出されるのが強力に防止される。しかし先の図のデータは、驚くべきことには、６日間の貯蔵期間が経過するまで、ｃ−ｆｏｓおよびＩＬ８のｍＲＮＡが著しく増大しないことを示している。したがって明らかに、安定化によって、ＲＮＡ（ｐ５３）の分解もｍＲＮＡ（ＩＬ８／ｃ−ｆｏｓ）の放出も防止される。
【０１６９】
ｐ５３の転写は、採血後に代謝が継続している間にも抑制され、したがってｐ５３ｍＲＮＡの分解または下方制御は、（−）ΔΔｃｔの減少をもたらし得る。しかし結果は、試験したＱＧＮ安定化溶液が、最長６日間の全血の貯蔵期間中、ｐ５３ｍＲＮＡレベルの低下を防止することを示している。
【０１７０】
この実験により、高濃度のＥＤＴＡ、ジヒドロキシアセトン、カスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈの組合せを、新しく採血した全血に添加すると、採血時に存在していた循環血漿のｍＲＮＡ集団を保存するように作用し、ｍＲＮＡ濃度におけるｍＲＮＡに特異的な変化を低減することが実証された。このことは、血漿中の循環ｍＲＮＡを分析し、例えば潜在的に腫瘍特異的なｍＲＮＡ種を同定し、その特徴を決定するのに特に重要である。このような試験では、血漿中ｍＲＮＡ集団が、採血時と、核酸の抽出および分析時との間で実質的に不変のままであることが必要である。
【０１７１】
実施例７．ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＡ）の添加による安定化
２種の異なる濃度のＤＭＡＡを、Ｋ2ＥＤＴＡと共に試験し、ＥＤＴＡ単独と比較した（Ｋ２Ｅ  ＢＤ、Ｋ2ＥＤＴＡ１８ｍｇ）。
【０１７２】
ＤＭＡＡを、全血試料の複写物に添加した（血液１０ｍｌ中、最終濃度０．７５％および１．５％。血液をＢＤバキュテイナＫ２Ｅ管に収集した）。
【０１７３】
血液試料を、室温で最長６日間インキュベートした。０日目、３日目および６日目に、全血試料を１９１２×ｇにおいて室温で１５分間、遠心分離処理し、その後血漿試料を１６，０００×ｇにおいて４℃で１０分間、遠心分離処理した。ＤＮＡを単離するために、材料および方法のセクションで記載したプロトコルに従って、投入試料１ｍｌを使用した。ＤＮＡを、ＥＢ緩衝液８０μｌで溶出させ、Ｉ、４．２に記載のＲＴ  ＰＣＲアッセイを用いて定量化した。
【０１７４】
ＤＮＡ定量化の結果
図１１は、血漿中ゲノムＤＮＡの増大に対する、ＤＭＡＡの試験濃度の効果を示している。ＤＭＡＡの添加は、血漿へのゲノムＤＮＡの放出を著しく低減する。多量のＤＭＡＡを全血に添加するほど、放出されるＤＮＡが減少する。１．５％ＤＭＡＡを全血試料に添加すると、６日間の貯蔵期間中、無細胞ＤＮＡの増加はわずかしか観測されなかった。さらに、１．５％ＤＭＡＡを添加すると、０．７５％の場合よりも効率的に全血試料中の無細胞ＤＮＡレベルが安定化され、測定した短い１８Ｓ  ＤＮＡコピー数と長い１８Ｓ  ＤＮＡコピー数の比は、０日目から６日目まで減少するので、ＤＭＡＡ濃度が１．５％よりも高いと、より効率的な安定化効果を得ることができる。
【０１７５】
つまり、ＤＭＡＡの添加は、血漿へのゲノムＤＮＡの放出を低減する。したがって、ＤＭＡＡを血液試料に添加することは、室温でも試料を安定化するのに有効である。
【０１７６】
実施例８．全血中のｃｃｆＤＮＡ状態の保存に対する糖アルコールの影響
まず、２人のドナーの全血試料１０ｍｌを、ＢＤバキュテイナＫ２Ｅ−ＥＤＴＡ（４．４５ｍＭのＥＤＴＡ＝参照）に収集した。後に、以下の安定化溶液２ｍｌを添加した（示した濃度は、安定化された血液溶液中の最終濃度を表す）。
【０１７７】
【表８】
2014528719.tif 000027
【０１７８】
それぞれに安定化された試料を、室温で最長６日間インキュベートした。０日目、３日目および６日目に、複写物を以下の通り処理した。血漿を収集するために、試料を、３，０００ｒｐｍにおいて室温で１０分間、遠心分離処理した。収集した血漿を、１６，０００×ｇにおいて４℃で１０分間、遠心分離処理した。除去された血漿画分を収集し、ＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ核酸キット（投入材料１ｍｌ、溶出体積６０μｌ）を使用して細胞外核酸を単離した。結果を、０日目の試験と比較した相対的な変化として、図１０に示す（Ｘ日目のコピー数／０日目のコピー数）。１に近い値は、ｃｃｆＤＮＡの保存レベルが高いことを暗示する。この値が高いほど、達成される安定化が低下する。試験した糖アルコールでは、ＤＨＡ（０．５Ｍ）によって非常に良好な結果が達成された。ここで、血漿画分中のｃｃｆＤＮＡレベルの増大が最小であったことが観測された。他の適切な代替は、例えば０．０５Ｍの濃度のイノシトール、および０．０１Ｍ以下の濃度のマルチトールである。さらに、マンニトールでも３日間にわたって安定化効果が見られた。
【０１７９】
実施例９．ｃｃｆＤＮＡレベルに対するＤＭＡＡ、ＤＨＡおよびグリシンの影響
まず、３人のドナーの全血試料１０ｍｌを、ＢＤバキュテイナＫ２Ｅ−ＥＤＴＡ（４．４５ｍＭのＥＤＴＡ＝参照）に収集した。後に、以下の溶液２ｍｌを添加した（示した濃度は、安定化された血液溶液中の最終濃度を表す）。
【０１８０】
【表９】
2014528719.tif 000028
【０１８１】
試料を、実施例８に記載の通り処理した。その結果および試験条件を、図１１に示す。図に見られる通り、ＤＨＡだけでも、最長３日間にわたってｃｃｆＤＮＡレベルが安定化する（ドナー１参照）。ＱＧＮ混合物を使用すると、特に安定なｃｃｆＤＮＡレベルが得られた。ＤＭＡＡを、例えばＥＤＴＡ濃度を増大し、カスパーゼ阻害剤を添加することと組み合わせて試料に添加すると、ＱＧＮ混合物と同等の結果を得ることができた。
【０１８２】
実施例１０．カスパーゼ阻害剤および濃度を増大したＥＤＴＡと組み合わせた糖アルコールのｃｃｆＤＮＡレベルに対する影響
まず、２人のドナーの全血試料１０ｍｌを、ＢＤバキュテイナＫ２Ｅ−ＥＤＴＡ（４．４５ｍＭのＥＤＴＡ＝参照）に収集した。次に、以下の溶液２ｍｌを添加した（示した濃度は、安定化された血液溶液中の最終濃度を表す）。
１．０．５ＭのＤＨＡ、１μＭのＯＰＨ、１４ｍＭのＥＤＴＡ（ＱＧＮ混合物）、
２．ＱＧＮ混合物中０．５Ｍのイノシトール（ＤＨＡなし）、
３．ＱＧＮ混合物中０．０１Ｍのマルチトール（ＤＨＡなし）。
【０１８３】
次に、試料を、実施例８に記載の通り処理した。その結果を図１２に示す。最良の結果が、ＱＧＮ混合物で得られた。糖アルコールとＱＧＮ混合物の組合せも、ＥＤＴＡで安定化された試料と比較して高い安定化効果を示した。
【０１８４】
実施例１１．ｃｃｆＤＮＡレベルに対するＤＭＡＡの濃度およびＯＰＨ（カスパーゼ阻害剤）の濃度の組合せの影響
まず、全血試料１０ｍｌを、ＢＤバキュテイナＫ２Ｅ−ＥＤＴＡ（４．４５ｍＭのＥＤＴＡ＝参照）に収集した。次に、以下の溶液２ｍｌを添加した（示した濃度は、安定化された血液溶液中の最終濃度を表す）。各条件を、異なるドナーからの６つの管で試験した。
１．ＥＤＴＡ参照（ＢＤバキュテイナＫ２Ｅ）、
２．ＱＧＮ混合物、
３．ＥＤＴＡ５０ｍｇ、１μＭのＯＰＨ、
４．ＥＤＴＡ５０ｍｇ、２μＭのＯＰＨ、
５．ＥＤＴＡ５０ｍｇ、１μＭのＯＰＨ、５％ＤＭＡＡ、
６．ＥＤＴＡ５０ｍｇ、１μＭのＯＰＨ、１０％ＤＭＡＡ、
７．ＥＤＴＡ５０ｍｇ、２μＭのＯＰＨ、５％ＤＭＡＡ、
８．ＥＤＴＡ５０ｍｇ、２μＭのＯＰＨおよび１０％ＤＭＡＡ。
【０１８５】
試料のインキュベーション、血漿の単離、および除去された血漿画分からの核酸の単離を、実施例８に記載の通り実施した。しかし、３，０００ｒｐｍで第１の遠心分離ステップを行った後、同じ安定化条件による血漿試料をプールした後、血漿を除去するための第２の遠心分離ステップ（１６，０００×ｇ）を実施した。その結果を図１３に示す。図に見られる通り、様々なＤＭＡＡ濃度と様々なＯＰＨ濃度の組合せは、ＱＧＮ混合物と同等の結果を示す。図１４は、ｃｃｆＤＮＡレベルに対するＤＭＡＡの濃度およびＯＰＨの濃度の組合せの影響を示す（参照データの囲い込みに起因する様々なスケーリング）。
【０１８６】
実施例１２．ｃｃｆＤＮＡレベルに対するＱＧＮ混合物と糖アルコールの組合せの影響
まず、全血試料１０ｍｌを、ＢＤバキュテイナＫ２Ｅ−ＥＤＴＡ（４．４５ｍＭのＥＤＴＡ＝参照）に収集した。後に、以下の溶液２ｍｌを添加した（示した濃度は、安定化された血液溶液中の最終濃度を表す）。各条件を、６つの管、したがって６人の異なるドナーで試験した。
１．ＥＤＴＡ参照（ＢＤバキュテイナＫ２Ｅ）；
２．ＱＧＮ混合物（０．０１ＭのＤＨＡ、１４ｍＭのＥＤＴＡ、１μＭのＯＰＨ）；
３．０．０１ＭのＤＨＡ；
４．５％ＤＭＡＡ、１４ｍＭのＥＤＴＡ、１μＭのＯＰＨ；
５．０．０１ＭのＤＨＡ、３％ＤＭＡＡ、１μＭのＯＰＨ、１４ｍＭのＥＤＴＡ；
６．１μＭのＯＰＨ、１４ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１ＭのＤＨＡ、０．０１Ｍのマルチトール；
７．１μＭのＯＰＨ、１４ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１ＭのＤＨＡ、０．０５Ｍのイノシトール；
８．１μＭのＯＰＨ、１４ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１ＭのＤＨＡ、０．０５Ｍのイノシトール、０．０１Ｍのマルチトール。
【０１８７】
試料を、実施例１１に記載の通り処理した。ただし試料を、室温ではなく、その代わりに３７℃で貯蔵した。その結果を図１５に示す。図に見られる通り、特に、５％ＤＭＡＡを１４ｍＭのＥＤＴＡおよび１μＭのＯＰＨと組み合わせて添加すると、ｃｃｆＤＮＡの安定なレベルが達成された。したがって予想外に、高温（３７℃）でも、全血においてｃｃｆＤＮＡの非常に良好な安定化を達成することができた。
【０１８８】
実施例１３．３７℃におけるインキュベーション−単一ドナー試料の分析
６人の異なるドナーから、全血試料をＢＤバキュテイナＫ２Ｅに収集し、次に全血１０ｍｌ当たり以下の安定化溶液２ｍｌを添加した（示した濃度は、安定化された血液溶液中の最終濃度を表す）。
１．２μＭのＯＰＨ、１４ｍＭのＥＤＴＡ、５％ＤＭＡＡ、
２．１μＭのＯＰＨ、１４ｍＭのＥＤＴＡ、３％ＤＭＡＡ、
３．１μＭのＯＰＨ、１４ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１ＭのＤＨＡ、３％ＤＭＡＡ。
【０１８９】
試料を、最長６日間にわたって３７℃でインキュベートした。それ以外は、実施例８と同じ手順に従った。結果を図１６および１７に示す。図に見られる通り、６人すべてのドナーについて、異なる濃度のＤＭＡＡをＯＰＨおよびＥＤＴＡと組み合わせて血液試料に添加すると、図に示したレベルのｃｃｆＤＮＡが保存された。したがって、本発明の方法によって、効率的な安定化を達成することができる。
【０１９０】
実施例１４．検出限界（ＬｏＤ）
細胞外核酸は、試料中にしばしば非常に少量で含まれる。したがって、安定化された試料中の細胞外核酸を効率的に保存するだけでなく、さらにその後、安定化された試料から細胞外核酸を高収率で単離することもできる安定化手順を得ることが重要である。実施例１４は、安定化された試料から細胞外核酸をより高収率で単離することができるという点で、本発明の安定化方法が、従来技術の安定化方法よりも優れていることを実証している。本発明の安定化方法は、有利には検出限界を低減し、したがって細胞外核酸集団内の希少な標的核酸も確実に測定することができる。
【０１９１】
以下の安定化溶液／安定化管を比較した。
１．無細胞ＲＮＡ  ＢＣＴ（Ｓｔｒｅｃｋ社、カタログ番号２１８９７６。安定剤としてホルムアルデヒド放出薬を含む）
２．ＢＤバキュテイナＫ２Ｅ（ＢＤ、カタログ番号３６７５２５。ＥＤＴＡを含む）＝参照
３．安定化用ＱＧＮ（５％ＤＭＡＡ、１４ｍＭのＥＤＴＡ、２μＭのＯＰＨ（カスパーゼ阻害剤））
【０１９２】
全血試料を、無細胞ＲＮＡ  ＢＣＴおよびＢＤバキュテイナＫ２Ｅ管に収集した。ＢＤ管に収集した血液の半分に、ＱＧＮ安定化溶液を添加した。したがって、本発明に従って安定化された試料は、追加量のＥＤＴＡを含み、このＥＤＴＡはＢＤバキュテイナの安定化に寄与する。試料を３，０００×ｒｐｍで１０分間、遠心分離処理し、得られた血漿を等分して複写物１．５ｍｌに添加した。後に、試料１つ当たり以下の量のＤＮＡスパイクイン対照（１，０００ｂｐ）を添加した。コピー数１，０００、コピー数５０００、コピー数１００、コピー数５０およびコピー数１０。
【０１９３】
コピー数５００〜１０の８種類の複写物／試料、コピー数１，０００の４種類の複写物／試料、およびコピー数５／試料を調製した。試料を、室温で３日間インキュベートした。キアシンフォニー（QIAsymphony）  ＳＰ自動化系により、血漿試料から細胞外核酸を単離することができるキアシンフォニー  ウイルス／細菌無細胞１０００アプリケーション（QIAsymphony virus/bacteria Cell-free 1000 application）を使用して、試料の調製を行った。核酸を６０μｌで溶出させ、その後ＰＣＲを三重に実施した。
【０１９４】
その結果を図１８に示す。図に見られる通り、ＢＤ  ＥＤＴＡ管または本発明の安定化溶液のいずれかを使用すると、試料１つ当たりコピー数１，０００以上の１００％ヒットが得られた。このことは、本発明の安定化溶液を使用すると核酸の単離が損なわれないことを示している。それとは対照的に、ホルムアルデヒド放出薬（Ｓｔｒｅｃｋ）の使用に基づく安定化は、核酸の単離を強力に阻害する。図に見られる通り、コピー数５００またはさらにはコピー数１，０００をスパイクインした試料でも、それぞれの試料から単離される核酸を著しく低減することができた。さらに図１８は、本発明に従って安定化された試料によって最良の感度が得られたことを示している。試料１つ当たりわずかコピー数１０をスパイクインした実施形態についても、１３％ものＰＣＲ陽性ヒットが得られた。したがって、本発明の方法は、血液試料などの試料を効率的に安定化するだけでなく、さらにその後、非常に少量の細胞外核酸でも回収することができる。このことにより、本方法は、診断適用、および例えば腫瘍に由来する細胞外核酸または胎児の核酸などの希少な標的細胞外核酸の検出に、特に適したものになるため、重要な利点である。特に、コピー数が小さい方が、ホルムアルデヒド放出薬の使用に基づく安定化溶液は、性能が非常に低く、最も高い検出限界を示した。
【０１９５】
このことは、以下の表によっても確認される。
【０１９６】
【表１０】
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【０１９７】
前記の表に見られる通り、１，０００ｂｐの断片については、ＥＤＴＡ試料および本発明の安定化溶液で達成された結果は同等である。したがって、本発明による安定化は、その後の核酸の単離を損なうことはない。ホルムアルデヒド放出薬を使用する安定化は、最も高い検出限界を示し、したがってその後の核酸の単離が強力に損なわれたことが実証された。したがって、本発明による安定化は、最新技術の方法を使用しても達成されない希少なｃｃｆＤＮＡ標的の高感度な検出に適している。
【０１９８】
このことは、図１９および２０に示した結果によっても確認される。図に見られる通り、ＥＤＴＡで安定化された試料、および本発明の方法を使用して安定化された試料では、同等のｃｃｆＤＮＡ収量が得られる（１８Ｓ  ｒＤＮＡのｑＰＣＲによって測定）。しかし、ホルムアルデヒド放出薬（Ｓｔｒｅｃｋ管）を使用する安定化では、ｃｃｆＤＮＡ収量が低減した。ホルムアルデヒドで安定化された試料の収率は、ＥＤＴＡで安定化された試料と比較して約５０％低減した。それとは対照的に、本発明の安定化試薬には、従来の核酸単離方法を使用すると生じるｃｃｆＤＮＡ収率に対する有害作用がない。このことは、本発明の安定化方法を、既存の核酸単離手順およびワークフローに統合することができるので、重要な利点である。
【０１９９】
実施例１５．３人のドナーの全血試料への１０4ＩＵ／ｍｌのＨＩＶ、ＨＣＶのスパイクイン
全血試料をＢＤバキュテイナ２ＫＥ管に収集した。後に、以下の安定化溶液２ｍｌを添加した（示した濃度は、安定化された血液溶液中の最終濃度を表す）。次にＨＩＶおよびＨＣＶを、１０4ＩＵ／ｍｌで全血試料に添加した。
１．５％ＤＭＡＡ、ＥＤＴＡ５０ｍｇ、１μＭのＯＰＨ、０．０５Ｍイノシトール、
２．５％ＤＭＡＡ、ＥＤＴＡ５０ｍｇ、１μＭのＯＰＨ、０．０１Ｍマルチトール、
３．５％ＤＭＡＡ、ＥＤＴＡ５０ｍｇ、１μＭのＯＰＨ、０．０５Ｍイノシトール、０．０１Ｍのマルチトール、
４．２％イノシトール、４％ソルビトール。
【０２００】
再び、ＢＤバキュテイナＫ２Ｅで安定化された試料は、参照として役立つ。
【０２０１】
試料を３７℃で最長６日間にわたって室温にてインキュベートした。０日目および３日目に、複写物を以下の通り処理した。試料を、３，０００ｒｐｍにおいて室温で１５分間、遠心分離処理して、血漿を収集した。次に、得られた血漿を、１６，０００×ｇにおいて４℃で１０分間、再び遠心分離処理した。除去された血漿上清から得られた細胞外核酸を、キアシンフォニー  ウイルス／細菌無細胞１０００プロトコール（QIAsymphony virus/bacteria Cell-free 1000 protocol）を使用して精製した。投入材料として血漿１ｍｌを使用し、溶出のために体積６０μｌを使用した。その結果を図２１に示す。図に見られる通り、ＤＭＡＡ、ＥＤＴＡおよびＯＰＨを糖アルコールと組み合わせると、ウイルス核酸レベルを３７℃で最長３日間にわたって安定化することができる。したがって、本発明の方法は、診断適用に特に適しており、潜在的に冷蔵施設が利用できない環境において、試料を安定化するのにも適している。０日目と３日目との間のΔＣｔは、ＥＤＴＡ血液参照と比較して小さい（ΔＣｔ約２．５対ΔＣｔ約１）。さらに、ソルビトールをイノシトールと組み合わせると、安定化効果が見られた（ΔＣｔ約１〜１．４）。
【０２０２】
図２２は、３７℃でインキュベートした全血においてＨＣＶが低下したことを示す。再び、ＤＭＡＡ、ＥＤＴＡおよびＯＰＨを糖アルコールと組み合わせると、ウイルスＲＮＡレベルの緩慢な低下によって示される通り、ＨＣＶ核酸レベルが３７℃で３日間にわたって安定化されることが示される。０日目と３日目との間のΔＣｔ（ΔＣｔ約１）は、ＥＤＴＡ血液参照（ΔＣｔ約２〜３）と比較して小さい。さらに、ソルビトールとイノシトールの組合せにでも、良好な安定化効果が達成された。
【０２０３】
実施例１６．Ｎ，Ｎジメチルプロパンアミドおよびカスパーゼ阻害剤による安定化
２人の異なるドナーからの血液を、１０ｍｌのＫ２ＥＤＴＡ管（ＢＤ）に収集した。それぞれに収集した血液４．５ｍｌを、それぞれＫ２ＥＤＴＡ３４．２ｍｇ、キノリン−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ２−ＯＰＨ（カスパーゼ阻害剤）溶液（ＤＭＳＯ３８８μｌに１ｍｇを溶解した）１．２ｍｌおよびＮ，Ｎジメチルプロパンアミド０．１５ｇもしくは０．３ｇもしくは０．４５ｇ、またはＤＭＡＡ０．３ｍｌを含有する安定化溶液０．９ｍｌ（安定化溶液１ｍｌ当たり）と混合した。それによって、以下の通り、血液／安定化混合物中、それぞれ以下の最終濃度を得た。Ｋ２ＥＤＴＡ５．７ｍｇ、１μＭのキノリン−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ２−ＯＰＨ（カスパーゼ阻害剤）および２．５％、５％もしくは７．５％（ｗ／ｖ）のＮ，Ｎジメチルプロパンアミド、または５％（ｖ／ｖ）ＤＭＡＡ。
【０２０４】
安定化されたすべての血液試料を、一条件および一試験時点について三重に設定した。０時点（参照）において、安定化溶液と血液を混合した直後に血漿を得、ｃｃｆＤＮＡを抽出した。残りの血液試料を、室温で３日間および６日間貯蔵した。対照としてＥＤＴＡで安定化された血液試料も、３日間および６日間貯蔵した。血液含有管を４回反転することによって、安定化された血液試料および安定化されていない（ＥＤＴＡ）血液試料から血漿を得た。次に、管を３，０００ｒｐｍ／１９１２×ｇで１５分間、遠心分離処理した。血漿画分２．５ｍｌを、新しい１５ｍｌのｆａｌｃｏｎ管に移し、１６，０００×ｇで１０分間、遠心分離処理した。ＱＩＡａｍｐ循環核酸キットを使用して細胞外核酸を単離するために、それぞれに除去された血漿２ｍｌを使用した。
【０２０５】
その結果を図２３および２４に示す。０時点に対するＤＮＡの増加を、２．５％、５％および７．５％Ｎ，Ｎジメチルプロパンアミドまたは５％ＤＭＡＡにより、様々なアンプリコン長の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子を使用して示す。バーは、一条件および一試験時点当たりの三重試料の平均を示す。本発明のすべての溶液は、安定化されていないＥＤＴＡ血液と比較して、室温で３日間および６日間貯蔵した後に放出されるＤＮＡ量の著しい低下を示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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