(57)【要約】  一態様において、本開示は、タンパク質を安定化する製剤であって、緩衝剤を含む製剤を提供する。いくつかの実施形態において、緩衝剤は、リン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウムを含むか、又は緩衝剤は、リン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質はアンチトロンビンである。
2014520820.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用タンパク質及び緩衝剤を含む製剤であって、
前記緩衝剤がリン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウムを含むか、又は
前記緩衝剤がリン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムを含むことを特徴とする製剤。
【請求項２】
前記緩衝剤が１０ｍＭから１００ｍＭの濃度を有することを特徴とする、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記緩衝剤が５０ｍＭの濃度を有することを特徴とする、請求項２に記載の製剤。
【請求項４】
塩化カリウムをさらに含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５】
前記塩化カリウムが１００から１５０ｍＭの濃度を有することを特徴とする、請求項４に記載の製剤。
【請求項６】
前記塩化カリウムが１２０ｍＭの濃度を有することを特徴とする、請求項４に記載の製剤。
【請求項７】
前記製剤のｐＨが７．５から８．５であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項８】
前記製剤のｐＨが８であることを特徴とする、請求項７に記載の製剤。
【請求項９】
前記治療用タンパク質がアンチトロンビンであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１０】
前記製剤が清澄化された乳製品を含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１１】
前記製剤が追加のタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１２】
前記アンチトロンビンが、保存の前のヘパリン結合機能性と比べて、２〜８℃で３か月保存した後に、少なくとも９０％のヘパリン結合機能性を維持することを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１３】
２〜８℃で３か月保存した後の凝集した形態のアンチトロンビンの量の増加（重量による）が、保存前の凝集した形態のアンチトロンビンの量（重量による）と比べて３倍未満であることを特徴とする、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１４】
２〜８℃で３か月保存した後のアンチトロンビンの酸化の量の増加が、保存前のアンチトロンビンの酸化の量と比べて２倍未満であることを特徴とする、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１５】
治療用タンパク質を安定化する製剤を生成する方法であって、
リン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウムを含む緩衝剤又はリン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムを含む緩衝剤を含む溶液を与える工程、及び
治療用タンパク質を前記溶液に加えて、治療用タンパク質を安定化する製剤を生み出す工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
治療用タンパク質を安定化する製剤を生成する方法であって、
治療用タンパク質を含む溶液を与える工程、及び
緩衝剤を前記溶液に加えて治療用タンパク質を安定化する製剤を生み出す工程を含み、
前記緩衝剤がリン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウムを含むか、又は
前記緩衝剤がリン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
前記緩衝剤の生じた濃度が５０ｍＭであることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記製剤が塩化カリウムをさらに含むことを特徴とする、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記溶液の生じたｐＨが８のｐＨであることを特徴とする、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療用タンパク質がアンチトロンビンであることを特徴とする、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
アンチトロンビンを安定化する製剤を生成する方法であって、
アンチトロンビンを含む乳組成物からアンチトロンビンを分離して、アンチトロンビンを含む溶液を生み出す工程、
アンチトロンビンを含む前記溶液を低温殺菌する工程、
アンチトロンビンを含む前記溶液を緩衝剤と交換する工程を含み、
前記緩衝剤がリン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウムを含むか、又は
前記緩衝剤がリン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムを含み、
それによりアンチトロンビンを安定化する製剤を生み出すことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、アンチトロンビンなどの治療用タンパク質を含むタンパク質を安定化する製剤を提供する。
【背景技術】
【０００２】
治療用タンパク質の安定性が限られていることは、製造段階の間と投与すべき最終治療用タンパク質製剤の保存の間の両方で製薬産業における全般的な問題である。例えば、治療用タンパク質の（合成、遺伝子組み換え、又は遺伝子導入による）製造の間に、タンパク質は、種々の精製工程と処理工程の間で長期間保存されることが多く、製剤の成分は、治療用タンパク質の安定性に対して影響を有し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
一態様において、本開示は、治療用タンパク質などのタンパク質を安定化する製剤を提供する。いくつかの実施形態において、製剤は、リン酸一水素塩及びリン酸二水素塩を含む緩衝剤であって、リン酸一水素塩及びリン酸二水素塩が同じ対イオンを有する緩衝剤を含む。いくつかの実施形態において、対イオンはナトリウム又はカリウムである。いくつかの実施形態において、製剤は、リン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウムを含む緩衝剤を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、リン酸一水素塩ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムを含む緩衝剤を含む。
【０００４】
いくつかの実施形態において、製剤は、リン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウムから基本的になる緩衝剤を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、リン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムから基本的になる緩衝剤を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、リン酸一水素ナトリウムとリン酸二水素カリウムの両方は含まない。いくつかの実施形態において、製剤は、リン酸一水素カリウムとリン酸二水素ナトリウムの両方は含まない。
【０００５】
いくつかの実施形態において、製剤は治療用タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質はアンチトロンビンである。
【０００６】
一態様において、本開示は、治療用タンパク質及び緩衝剤を含む製剤であって、緩衝剤がリン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウムを含むか、又は緩衝剤がリン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムを含む製剤を提供する。本明細書に開示される製剤のいずれかのいくつかの実施形態において、緩衝剤は、１０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度を有する。本明細書に開示される製剤のいずれかのいくつかの実施形態において、緩衝剤は５０ｍＭの濃度を有する。本明細書に開示される製剤のいずれかのいくつかの実施形態において、製剤は、塩化カリウムをさらに含む。本明細書に開示される製剤のいずれかのいくつかの実施形態において、塩化カリウムは、１００〜１５０ｍＭの濃度を有する。本明細書に開示される製剤のいずれかのいくつかの実施形態において、塩化カリウムは１２０ｍＭの濃度を有する。本明細書に開示される製剤のいずれかのいくつかの実施形態において、製剤のｐＨは７．５〜８．５である。本明細書に開示される製剤のいずれかのいくつかの実施形態において、製剤のｐＨは８である。本明細書に開示される製剤のいずれかのいくつかの実施形態において、治療用タンパク質はアンチトロンビンである。本明細書に開示される製剤のいずれかのいくつかの実施形態において、製剤は、清澄化された（ｃｌａｒｉｆｉｅｄ）乳製品を含む。本明細書に開示される製剤のいずれかのいくつかの実施形態において、製剤は追加のタンパク質を含む。
【０００７】
一態様において、本開示は、アンチトロンビンを含む製剤を提供する。本明細書に開示されるアンチトロンビンを含む製剤のいずれかのいくつかの実施形態において、アンチトロンビンは、保存前のヘパリン結合機能性と比べて、２〜８℃で３か月保存した後に少なくとも９０％のヘパリン結合機能性を維持する。本明細書に開示されるアンチトロンビンを含む製剤のいずれかのいくつかの実施形態において、２〜８℃で３か月保存した後の凝集した形態のアンチトロンビンの量の増加（重量による）は、保存前の凝集した形態のアンチトロンビンの量（重量による）と比べて３倍未満である。本明細書に開示されるアンチトロンビンを含む製剤のいずれかのいくつかの実施形態において、２〜８℃で３か月保存した後のアンチトロンビンの酸化の量の増加は、保存前のアンチトロンビンの酸化の量と比べて２倍未満である。
【０００８】
一態様において、本開示は、治療用タンパク質を安定化する製剤を生成する方法であって、リン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウムを含む緩衝剤又はリン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムを含む緩衝剤を含む溶液を与える工程、及び治療用タンパク質を溶液に加えて治療用タンパク質を安定化する製剤を生み出す工程を含む方法を提供する。
【０００９】
一態様において、本開示は、治療用タンパク質を安定化する製剤を生成する方法であって、治療用タンパク質を含む溶液を与える工程、及び緩衝剤を溶液に加えて治療用タンパク質を安定化する製剤を生み出す工程であって、緩衝剤がリン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウムを含むか、又は緩衝剤がリン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムを含む工程を含む方法を提供する。
【００１０】
本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、緩衝剤の得られる濃度は５０ｍＭである。本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、製剤はさらに塩化カリウムを含む。本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、溶液の生じるｐＨは、８のｐＨである。本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、治療用タンパク質はアンチトロンビンである。
【００１１】
一態様において、本開示は、アンチトロンビンを安定化する製剤を生成する方法であって、アンチトロンビンを含む乳組成物からアンチトロンビンを分離して、アンチトロンビンを含む溶液を生み出す工程、アンチトロンビンを含む溶液を低温殺菌する工程、アンチトロンビンを含む溶液を緩衝剤と交換する工程であって、緩衝剤がリン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウムを含むか、又は緩衝剤がリン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムを含み、それによりアンチトロンビンを安定化する製剤を生成する工程を含む方法を提供する。
【００１２】
本発明の制限のそれぞれは、本発明の種々の実施形態を包含し得る。したがって、任意の要素又は要素の組み合わせを含む本発明の制限のそれぞれが、本発明の各態様に含まれ得ることが予期される。本発明は、以下の説明に述べられるか又は図に表されている要素の構造の詳細及び配置にその用途が限定されない。本発明は他の実施形態が可能であり、種々の方法で実行されるか又は実施されることが可能である。また、本明細書での語法及び用語は説明のためであり、限定的であるとみなされないものとする。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、種々の緩衝剤中での凍結／解凍の後のアンチトロンビンの酸化状態を示す。
【図２】図２は、種々の緩衝剤中での凍結／解凍の後のアンチトロンビンのヘパリン親和性を示す。
【図３】図３は、種々の緩衝剤中での凍結／解凍の後のアンチトロンビンの凝集を示す。
【図４】図４は、種々の緩衝剤中で２〜８℃で保存した後のアンチトロンビンの酸化状態を示す。
【図５】図５は、種々の緩衝剤中で２〜８℃で保存した後のアンチトロンビンのヘパリン親和性を示す。
【図６】図６は、種々の緩衝剤中で２〜８℃で保存した後のアンチトロンビンの凝集を示す。
【図７】図７は、リン酸塩系中での凍結／解凍の後のアンチトロンビンの安定性パラメーターの概要を与える。
【図８】図８は、リン酸塩系中で２〜８℃で１か月保存した後のアンチトロンビンの安定性パラメーターの概要を与える。
【図９】図９は、リン酸塩系中で２〜８℃で３か月保存した後のアンチトロンビンの安定性パラメーターの概要を与える。
【図１０】図１０は、種々の緩衝剤中で２〜８℃で１か月保存した後のアンチトロンビンの安定性パラメーターの概要を与える。
【図１１】図１１は、塩化カリウムを含む種々の緩衝剤中での凍結／解凍の後のアンチトロンビンの酸化状態を示す。
【図１２】図１２は、塩化カリウムを含む種々の緩衝剤中での凍結／解凍の後のアンチトロンビンのヘパリン親和性を示す。
【図１３】図１３は、塩化カリウムを含む種々の緩衝剤中での凍結／解凍の後のアンチトロンビンの凝集を示す。
【図１４】図１４は、塩化カリウムを含む種々の緩衝剤中での凍結／解凍の後のアンチトロンビンの安定性パラメーターの概要を与える。
【図１５】図１５は、塩化カリウムを含む種々の緩衝剤中で２〜８℃で保存した後のアンチトロンビンの酸化状態を示す。
【図１６】図１６は、塩化カリウムを含む種々の緩衝剤中で２〜８℃で保存した後のアンチトロンビンのヘパリン親和性を示す。
【図１７】図１７は、塩化カリウムを含む種々の緩衝剤中で２〜８℃で保存した後のアンチトロンビンの凝集を示す。
【図１８】図１８は、塩化カリウムを含む種々の緩衝剤中で２〜８℃で保存した後のアンチトロンビンの安定性パラメーターの概要を与える。
【図１９】図１９は、２４か月の期間にわたるアンチトロンビンの酸化を示す。
【図２０】図２０は、２４か月の期間にわたるアンチトロンビンの凝集を示す。
【図２１】図２１は、２４か月の期間にわたるアンチトロンビンのヘパリン親和性を示す。
【図２２】図２２は、従来の方法を使用するヘパリン溶出液のスループットデータを示す。
【図２３】図２３は、清澄化された乳を使用するヘパリン溶出液のスループットデータを示す。
【図２４】図２４は、ヘパリン溶出液のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。
【図２５】図２５は、アンチトロンビン製剤ロット番号３００−２１−ＤＳの安定性を示す。
【図２６】図２６は、アンチトロンビン製剤ロット番号３００−２２−ＤＳの安定性を示す。
【図２７】図２７は、アンチトロンビン製剤ロット番号３００−２３−ＤＳの安定性を示す。
【図２８】図２８は、アンチトロンビン製剤の酸化を示す。
【図２９】図２９は、アンチトロンビン製剤のヘパリン親和性を示す。
【図３０】図３０は、アンチトロンビン製剤の凝集を示す。
【図３１】図３１は、アンチトロンビン製剤のタンパク質濃度を示す。
【図３２】図３２は、アンチトロンビン製剤のトロンビン阻害活性を示す。
【図３３】図３３は、アンチトロンビン製剤の比活性を示す。
【００１４】
図は説明のみをするものであり、本開示の実施可能性のために必要ではない。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
一態様において、本開示は、治療用タンパク質などのタンパク質を安定化する製剤を提供する。
【００１６】
治療用タンパク質とは、本明細書では、疾病又は疾患の治療のために対象に投与できるタンパク質である。治療用タンパク質には、細菌、植物、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞系、及び遺伝子導入哺乳動物などの生体系により産生されるタンパク質及び合成により製造されるタンパク質がある。治療用タンパク質の例には、抗体（例えば、モノクローナル抗体）、血液タンパク質（例えば、第ＶＩＩＩ因子）、酵素（例えば、αガラクトシダーゼ）、及びインスリンなどのホルモンがある。タンパク質（及び治療用タンパク質）は、本明細書では、（例えば、グルコシル化により、又は標識付けにより）修飾されたタンパク質（及び治療用タンパク質）も含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、製剤は、リン酸一水素塩及びリン酸二水素塩を含む緩衝剤であって、リン酸一水素塩とリン酸二水素塩が同じ対イオンを有する緩衝剤を含む。いくつかの実施形態において、対イオンはナトリウム又はカリウムである。いくつかの実施形態において、製剤は、リン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウムを含む緩衝剤を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、リン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムを含む緩衝剤を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、製剤は、リン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウムから基本的になる緩衝剤を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、リン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムから基本的になる緩衝剤を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、リン酸一水素ナトリウムとリン酸二水素カリウムの両方は含まない。いくつかの実施形態において、製剤は、リン酸一水素カリウムとリン酸二水素ナトリウムの両方は含まない。
【００１９】
いくつかの実施形態において、製剤はタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、製剤は治療用タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質はアンチトロンビンである。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本開示は、タンパク質の安定性を損なわずに、これらのタンパク質の長期の保存を可能にする製剤を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される製剤は、製造及び精製プロセスの様々な段階で、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）の長期保存を可能にする。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される製剤は、タンパク質の安定性を維持しながら、高温（すなわち、−２０℃、４℃、又は室温）でのタンパク質（例えば、治療用タンパク質）の長期保存を可能にする。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される製剤は、タンパク質の安定性を維持しながら、低温（すなわち−４０℃又は−６０℃）でのタンパク質（例えば、治療用タンパク質）の長期保存を可能にする。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される製剤は、保存条件が理想的でなくても、例えば、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）を含む製剤が凍結−解凍サイクルを経験しても、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）の安定性を維持する。
【００２１】
緩衝剤を含み、緩衝剤がリン酸一水素塩及びリン酸二水素塩を含み、両リン酸イオンが同じ対イオンを有する製剤がタンパク質の安定性を維持することが、驚くべきことに本明細書に見出された。このため、一態様において、本開示は、緩衝剤を含む製剤であって、緩衝剤がリン酸一水素塩及びリン酸二水素塩を含み、両リン酸イオンが同じ対イオンを有する製剤を提供する。緩衝剤を含み、緩衝剤がリン酸一水素塩及びリン酸二水素塩を含み、両リン酸イオンが同じ対イオンを有さない製剤は、タンパク質の安定性を維持しないことも驚くべきことに本明細書に見出された。
【００２２】
リン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウムを含む緩衝剤を含む製剤並びにリン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムを含む緩衝剤を含む製剤が、治療用タンパク質を安定化することが見出された。対照的に、リン酸一水素カリウム及びリン酸二水素ナトリウムを含む緩衝剤を含む製剤も、リン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素カリウムを含む緩衝剤を含む製剤も、治療用タンパク質を安定化しなかった。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される製剤はタンパク質を安定化する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される製剤は治療用タンパク質を安定化する。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質はアンチトロンビンである。
【００２４】
本明細書に開示される製剤を使用して、タンパク質の製造方法にかかわらず（例えば、遺伝子導入、遺伝子組み換え、又は合成による）、タンパク質を安定化できる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される製剤は、乳から製造されたタンパク質を安定化する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される製剤は、遺伝子組み換えにより製造されたタンパク質を安定化する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される製剤は、乳から製造された治療用タンパク質を安定化する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される製剤は、遺伝子組み換えにより製造された治療用タンパク質を安定化する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される製剤は、乳から製造されたアンチトロンビンを安定化する。いくつかの実施形態において、開示される製剤は、遺伝子組み換えにより製造されたアンチトロンビンを安定化する。
【００２５】
本明細書に開示される製剤を使用して、タンパク質の製造プロセスの任意の段階の間にタンパク質を安定化できる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される製剤は、採取段階の直後（例えば、遺伝子導入動物の乳からタンパク質を採取した直後、溶解した細胞からタンパク質を採取した直後、又はタンパク質を合成した直後）にタンパク質を安定化するのに使用される。いくつかの実施形態において、製剤は乳を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、溶解した細胞由来の成分又はタンパク質合成由来の成分を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される製剤は、部分的にしか精製されていないタンパク質を安定化するのに使用される。例えば、タンパク質は採取され、本明細書に開示される緩衝剤のいずれかとタンパク質が組み合わされる前に、１又は２つの精製工程を受けて、本明細書に開示される製剤のいずれかを生成することができる。いくつかの実施形態において、製剤は、清澄化された乳製品を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、部分的に精製された細胞溶解物由来の成分又は部分的に精製されたタンパク質合成反応由来の成分を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、安定化すべきタンパク質（例えば、治療用タンパク質）に加えて、１種以上のタンパク質又はポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、製剤は非タンパク質成分を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、タンパク質を含む組成物又は溶液は、本明細書に開示される緩衝剤のいずれかとタンパク質が組み合わされる前に、多数の精製工程を受けて、本明細書に開示される製剤のいずれかを生成することができる。いくつかの実施形態において、タンパク質を含む組成物又は溶液は、本明細書に開示される緩衝剤（例えば、リン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウム又はリン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウム）のいずれかとタンパク質が組み合わされる前に、低温殺菌される。タンパク質が、本明細書に開示される緩衝剤のいずれかとタンパク質が組み合わされる前に、低温殺菌と精製工程の組み合わせを受け得ることを認識されたい。そのため、例えば、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）は、本明細書に開示される緩衝剤のいずれかとタンパク質が組み合わされる前に、第一の精製工程、低温殺菌工程、及び第二の精製工程を受けることがある。
【００２８】
いくつかの実施形態において、タンパク質は遺伝子導入動物の乳内に産生され、タンパク質は遺伝子導入動物の乳から採取される。いくつかの実施形態において、乳の溶液は清澄化されて、不溶成分が除かれる。いくつかの実施形態において、乳は濾過により清澄化される。いくつかの実施形態において、さらなる精製工程は実施されず、これらの部分的精製工程の後に成分が加えられて、本明細書に開示される治療用タンパク質を含む製剤が生成する。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質を含む製剤は、投与前にさらに精製される。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質を含む製剤は、投与のためのさらなる精製前に出荷される。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質を含む製剤は、出荷及び／又は投与の前に、例えば、ウイルス及びウイルス粒子を除くために、ナノ濾過に付される。
【００２９】
いくつかの実施形態において、タンパク質製剤は精製されて、製剤のタンパク質の安定性の分析を可能にする。いくつかの実施形態において、タンパク質はアンチトロンビンであり、製剤は、製剤をヘパリンカラムに接触させることにより精製されて、不純物が除去される。いくつかの実施形態において、製剤は、製剤をカチオン交換カラムに接触させることにより精製される。いくつかの実施形態において、タンパク質の安定性は、製剤の精製後に、「安定性指標」、例えば、凝集、酸化を決定して分析される。いくつかの実施形態において、タンパク質はアンチトロンビンであり、製剤は、製剤をヘパリンカラム及びカチオン交換カラムにより精製した後に、「安定性指標」、例えば、凝集、酸化を決定して分析される。
【００３０】
本開示は、本明細書に開示されるタンパク質を含む製剤を確立するどのような方法も包含する。いくつかの実施形態において、タンパク質は、本明細書に記載される緩衝剤のいずれかに加えられ（例えば、固体として、又はコンセントレートとして）、本開示の製剤が生成する。いくつかの実施形態において、製剤は、１種以上の緩衝剤成分（例えば、ある濃度のリン酸カリウム）を、タンパク質を含む組成物又は溶液に加えることにより確立される。いくつかの実施形態において、製剤は、安定化すべきタンパク質を含む組成物又は溶液の緩衝剤を、本開示の緩衝剤（例えば、リン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウム又はリン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウム）に交換して確立される。緩衝剤の交換は、例えば、安定化すべきタンパク質を含む組成物又は溶液をカラムに加えてタンパク質の固定化を起こし、本明細書に開示される緩衝剤の１つ（例えば、リン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウム又はリン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウム）により溶離させることにより実施できる。本明細書に記載される製剤を確立する上述の方法の組み合わせも、同様に包含される。
安定性
一態様において、本開示は、タンパク質を安定化する製剤を提供する。いくつかの実施形態において、タンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質はアンチトロンビンである。
【００３１】
「タンパク質を安定化する製剤」とは、本明細書では、ある期間（例えば、１か月又は２か月）にわたり、好ましくは高温で（例えば、−２０℃又は４℃）、又は１回以上の凍結／解凍サイクルを受けた後に、タンパク質の安定性を維持する製剤である。
【００３２】
本明細書に開示される製剤は、ある期間にわたりタンパク質を安定化する。いくつかの実施形態において、製剤は、タンパク質を、１日より長く、２日より長く、５日より長く、１週間より長く、１か月より長く、２か月より長く、１年より長く、１０年までの期間にわたり安定化する。いくつかの実施形態において、製剤は、１年より長くタンパク質を安定化する。いくつかの実施形態において、製剤は２年間タンパク質を安定化する。
【００３３】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される製剤は、タンパク質を高温で安定化する。いくつかの実施形態において、高温は、−６０℃より高く、−５０℃より高く、−４０℃より高く、−３０℃より高く、−２０℃より高く、−１０℃より高く、０℃より高く、又は２０℃より高い。いくつかの実施形態において、高温は−２０℃である。さらに他の実施形態において、高温は、０℃〜−６０℃、０℃〜−５０℃、０℃〜−４０℃、０℃〜−３０℃、０℃〜−２０℃、０℃〜２０℃、又は２℃〜８℃の範囲である。いくつかの実施形態において、高温は２℃〜８℃の範囲である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される製剤は、製剤が１回以上の凍結／解凍サイクルを受ける場合でも、タンパク質を安定化する。いくつかの実施形態において、製剤は、−２０℃で２年間タンパク質を安定化する。
【００３４】
「タンパク質の安定性」は、本明細書では、ある期間にわたるタンパク質の構造的完全性（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）及び機能性の持続を意味する。そのため、タンパク質がその構造的完全性及び機能性（例えば、生物学的機能性）を特定の期間にわたり維持する場合、タンパク質は安定である。同様に、上述の通り、タンパク質を安定化する製剤は、ある期間にわたりタンパク質の安定性を維持する製剤である。
【００３５】
タンパク質の構造的完全性は、タンパク質のポリペプチド鎖のコンフォメーションの完全性及びポリペプチド鎖中のアミノ酸及びアミノ酸側鎖の化学的性質の完全性を意味する。構造的完全性を維持したタンパク質は、ポリペプチド鎖のコンフォメーション及びポリペプチド鎖中のアミノ酸及びアミノ酸側鎖の化学的性質を維持したタンパク質である。例えば、タンパク質が、ある期間の前と比べて、その期間の後に同じコンフォメーションを有し、ポリペプチド鎖中のアミノ酸及びアミノ酸側鎖の化学的性質がその期間の間に変化しなかった場合、タンパク質は構造的完全性をその期間にわたり維持した。同じオリゴマー化状態の維持も、タンパク質の構造的完全性の尺度であることを認識されたい。そのため、タンパク質は、同じオリゴマー化状態を維持した（例えば、モノマーのままであった）場合、おそらく構造的完全性を維持した。当業者は、タンパク質の構造的完全性（コンフォメーション、アミノ酸の化学的性質、及びオリゴマー化状態）を決定する方法を知っているだろう。タンパク質のコンフォメーションは、通常の実験室技術、例えば、Ｘ線結晶学、円二色性分光法及び蛍光分光法、及び核磁気共鳴などの分光法を利用して決定できる。側鎖の化学的性質を含む、アミノ酸の化学的性質は、特定の化学基の存在を調べる化学反応によっても（例えば、側鎖の酸化状態の決定）、タンパク質の構造を決定できる上述の実験室技術によっても決定できる。タンパク質のオリゴマー化状態は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定できる。
【００３６】
タンパク質の機能性は、タンパク質が発揮する機能（例えば、生物学的機能）を意味する。機能性を維持したタンパク質は、特定の（生物学的）機能を発揮するその能力を維持したタンパク質である。例えば、タンパク質が、ある期間の前の能力と比べて特定の機能を発揮する同じ能力を有する場合、タンパク質はその期間にわたり機能性を維持した。機能性の維持には、酵素反応を実施する能力（例えば、ペプチド結合の切断）、標的に結合する能力（例えば、受容体の遮断）、又は細胞反応を惹起する能力（例えば、受容体の活性化により）がある。各タンパク質の機能性を決定する具体的方法は、タンパク質の性質に依存するだろう。当業者は当分野に公知である方法を利用して、特定のタンパク質の機能活性を決定するのにどの機能アッセイが必要とされるか見出すだろう。タンパク質の機能性の多くは、タンパク質の標的への結合を要する。そのため、タンパク質の機能性は、タンパク質が特定の標的に結合できるかどうかを調査することにより決定できることが多い。この結合は、構造アッセイ（結合があるか）によっても、機能アッセイ（タンパク質はその生物学的機能を発揮できるか、例えば、それは細胞のシグナル伝達カスケードを開始できるか、それは酵素機能を発揮できるか、それはタンパク質−タンパク質相互作用を遮断できるか）によっても決定できる。機能アッセイの例は、結合アッセイ、酵素アッセイ、及び細胞アッセイである。
【００３７】
いくつかの実施形態において、タンパク質の安定性は、ある期間の初めのタンパク質の構造的完全性及び／又は機能性を、ある期間（例えば、３か月の期間）の終わりのタンパク質の構造的完全性及び／又は機能性と比べることにより決定される。例えば、タンパク質の凝集のパーセンテージが特定の期間の前に決定され、その期間の後のタンパク質の凝集のパーセンテージと比べられる。
【００３８】
いくつかの実施形態において、タンパク質の安定性は、異なる保存条件でのタンパク質の構造的完全性及び／又は機能性を比較することにより決定される。例えば、タンパク質の凝集のパーセンテージは、特定の期間にわたり２〜８℃で保存された第一のアリコートで決定され、同じ期間にわたり−２０℃で保存された第二のアリコートと比較される。
【００３９】
いくつかの実施形態において、タンパク質の安定性は、異なる条件、時点と比較することなく、タンパク質の構造的完全性及び／又は機能性の絶対値を決定することにより決定される。例えば、タンパク質の凝集のパーセンテージが特定の期間の後に決定され、所定の標準と比較される。例えば、いくつかの実施形態において、特定の試料中のタンパク質の５％未満が凝集している場合、タンパク質は安定であると考えられる。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤は、製剤中のタンパク質の凝集のパーセンテージが、製剤のナノ濾過を可能にするほど低い場合に、安定であると考えられる。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤が出荷及び／又は投与に許容できるかどうかを決定するための試験としてナノ濾過が利用される。製剤がナノフィルターを通過できる場合、製剤は出荷に許容できる。
【００４０】
いくつかの実施形態において、タンパク質の安定性は、ある期間（例えば、１か月、２か月、又は３か月）の前後でタンパク質の構造的完全性及び／又は機能性を比較することにより決定される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ある期間の前の構造的完全性及び／又は機能性と比べて、その期間の後に、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９１％超など、９９％超までの構造的完全性及び／又は機能性が維持されている場合、安定化されている。例えば、いくつかの実施形態において、タンパク質は、タンパク質が３か月保存された時、保存前の機能性と比較して、タンパク質の機能性の９５％超が維持されている場合、安定化されている。
【００４１】
いくつかの実施形態において、タンパク質の安定性は、タンパク質が異なる温度である期間（例えば、１か月、２か月、又は３か月）保存される時、構造的完全性及び／又は機能性を比較することにより決定される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、タンパク質が高温で保存される時、低温での保存と比較して、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９１％超など、９９％超までの構造的完全性及び／又は機能性が維持される場合、安定化されている。例えば、いくつかの実施形態において、タンパク質は、タンパク質が高温で（例えば、２℃〜８℃）で保存される場合、低温（例えば、−２０℃）での保存と比較して、９５％超のタンパク質の機能性が維持される場合、安定化されている。
【００４２】
いくつかの実施形態において、安定性を決定すべきタンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質はアンチトロンビンである。いくつかの実施形態において、アンチトロンビンの安定性は、ヘパリンに結合できるアンチトロンビンのパーセンテージ又は量を決定することにより決定される。いくつかの実施形態において、アンチトロンビンの安定性は、凝集するアンチトロンビンのパーセンテージ又は量（重量による）を決定することにより決定される。いくつかの実施形態において、アンチトロンビンの安定性は、酸化されたアンチトロンビンのパーセンテージを決定することにより決定される。
【００４３】
いくつかの実施形態において、アンチトロンビンの安定性は、ある期間にわたる保存の前後でのヘパリンに結合する能力を比較することにより決定される。いくつかの実施形態において、アンチトロンビンの安定性は、高温で保存される第一のアリコートにおいてヘパリンに結合する能力を、低温で同じ期間保存されるアリコートと比較して決定される。いくつかの実施形態において、アンチトロンビンは、ある期間の保存の前と比べて、保存後に、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９１％超など、９９％超までのアンチトロンビンがヘパリンに結合する場合、安定化されている。いくつかの実施形態において、アンチトロンビンは、高温で保存された後、低温で同じ期間保存されるアリコートと比べて、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９１％超など、９９％超までのアンチトロンビンがヘパリンに結合できる場合、安定化されている。いくつかの実施形態において、アンチトロンビンは、高温で（例えば、２℃〜８℃）アンチトロンビンが保存される時、低温（例えば、−２０℃）である期間（例えば、３か月）と比べて、９５％超のアンチトロンビンがヘパリンに結合できる場合、安定化されている。
【００４４】
いくつかの実施形態において、アンチトロンビンの安定性は、ある期間の保存の前後で、アンチトロンビンの凝集（重量による）を比較することにより決定される。いくつかの実施形態において、アンチトロンビンの安定性は、高温で保存される第一のアリコートにおけるアンチトロンビンの凝集（重量による）を、低温で同じ期間保存されるアリコートと比較することにより決定される。いくつかの実施形態において、アンチトロンビンは、保存前の凝集の量と比べて、１０倍未満、９倍未満、８倍未満、７倍未満、６倍未満、５倍未満、４倍未満、３倍未満、２倍未満、１．５倍未満、及び同じ量までのアンチトロンビンが保存後に凝集した形態である場合、安定化されている。いくつかの実施形態において、アンチトロンビンは、アンチトロンビンが高温で保存される時、低温と比較して、１０倍未満、９倍未満、８倍未満、７倍未満、６倍未満、５倍未満、４倍未満、３倍未満、２倍未満、１．５倍未満、及び同じ量までのアンチトロンビンが凝集した形態である場合、安定化されている。いくつかの実施形態において、アンチトロンビンは、低温（例えば、−２０℃）である期間（例えば、３か月）と比べて、タンパク質が、高温で（例えば、２℃〜８℃）保存される時、３倍未満の量のアンチトロンビンが凝集した形態である場合（重量による）、安定化されている。
【００４５】
いくつかの実施形態において、アンチトロンビンの安定性は、ある期間の保存の前後でアンチトロンビンの酸化を比較することにより決定される。いくつかの実施形態において、アンチトロンビンの安定性は、高温で保存される第一のアリコートにおけるアンチトロンビンの酸化を、低温で同じ期間保存されるアリコートと比較して決定される。いくつかの実施形態において、アンチトロンビンは、保存前の凝集の量と比較して、保存後に、１０倍未満、９倍未満、８倍未満、７倍未満、６倍未満、５倍未満、４倍未満、３倍未満、２倍未満、１．５倍未満、及び同じ量までのアンチトロンビンが酸化されている場合、安定化されている。いくつかの実施形態において、アンチトロンビンは、アンチトロンビンが高温で保存される時、低温と比べて、１０倍未満、９倍未満、８倍未満、７倍未満、６倍未満、５倍未満、４倍未満、３倍未満、２倍未満、１．５倍未満、及び同じ量までのアンチトロンビンが酸化されている場合、安定化されている。いくつかの実施形態において、アンチトロンビンは、タンパク質が高温で（例えば、２℃〜８℃）保存される時、低温（例えば、−２０℃）である期間（例えば、３か月）と比べて、２倍未満の量のアンチトロンビンが酸化されている場合、安定化されている。
【００４６】
いくつかの実施形態において、アンチトロンビンは、３か月の保存後に、保存前と比べて、少なくとも９０％のアンチトロンビンがヘパリンに結合する場合、又は２％未満のアンチトロンビンが酸化される場合、又は５％未満のアンチトロンビンが凝集する場合、又は少なくとも９０％のアンチトロンビンがヘパリンに結合する場合、安定化されている。
【００４７】
いくつかの実施形態において、アンチトロンビンは、３か月の保存後に、保存前と比べて、少なくとも９０％のアンチトロンビンがヘパリンに結合する場合、かつ２％未満のアンチトロンビンが酸化される場合、かつ５％未満のアンチトロンビンが凝集する場合、かつ少なくとも９０％のアンチトロンビンがヘパリンに結合する場合、安定化されている。
製剤
いくつかの実施形態において、製剤は緩衝剤を含む。緩衝剤は、本明細書では、弱酸及びその共役塩基を含む組成物又は弱塩基とその共役酸の組み合わせである。緩衝剤を含む組成物又は溶液は、緩衝剤のない組成物又は溶液よりも、一般的により安定なｐＨを有する。
【００４８】
いくつかの実施形態において、製剤は、リン酸一水素塩及びリン酸二水素塩を含む緩衝剤であって、リン酸一水素塩及びリン酸二水素塩が同じ対イオンを有する緩衝剤を含む。いくつかの実施形態において、対イオンはナトリウム又はカリウムである。いくつかの実施形態において、製剤は、リン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウムを含む緩衝剤を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、リン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムを含む緩衝剤を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態において、製剤は、リン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウムから基本的になる緩衝剤を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、リン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムから基本的になる緩衝剤を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、リン酸一水素ナトリウムとリン酸二水素カリウムの両方は含まない。いくつかの実施形態において、製剤は、リン酸一水素カリウムとリン酸二水素ナトリウムの両方は含まない。
【００５０】
リン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウム「から基本的になる」緩衝剤は、リン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウムに加えて、緩衝剤として作用できる類似の量の追加のイオン又は他の成分を有さない緩衝剤である。類似の量は、本明細書では、同じ量、０．９倍の量、０．８倍の量、０．７倍の量、０．６倍の量、０．５倍の量、０．４倍の量、０．３倍の量、０．２倍までの量を意味する。そのため、例えば、リン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウムから基本的になり、５０ｍＭのリン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウムを含む緩衝剤は、５０ｍＭのリン酸一水素ナトリウムも５０ｍＭのリン酸二水素ナトリウムも含まない。
【００５１】
同様に、リン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウム「から基本的になる」緩衝剤は、リン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムに加えて、緩衝剤として作用できる類似の量の追加のイオン又は他の成分を有さない緩衝剤である。
【００５２】
そのため、リン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウム「から基本的になる」緩衝剤は、類似の量の非カリウム（例えば、ナトリウム）リン酸一水素塩及び非カリウム（例えば、ナトリウム）リン酸二水素塩も含まない。同様に、リン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウム「から基本的になる」緩衝剤は、類似の量の非ナトリウム（例えば、カリウム）リン酸一水素塩及び非ナトリウム（例えば、カリウム）リン酸二水素塩も含まない。
【００５３】
いくつかの実施形態において、緩衝剤濃度は、１０ｍＭ〜２５０ｍＭ、又は２５ｍＭ〜１００ｍＭである。いくつかの実施形態において、緩衝剤濃度は５０ｍＭである。
【００５４】
いくつかの実施形態において、製剤は１種以上の塩をさらに含む。いくつかの実施形態において、塩は塩化カリウムである。いくつかの実施形態において、塩化カリウム濃度は、１ｍＭ〜２５０ｍＭ、２ｍＭ〜２００ｍＭ、又は１０〜１５０ｍＭである。いくつかの実施形態において、塩化カリウム濃度は１２０ｍＭである。
【００５５】
いくつかの実施形態において、製剤は、塩化カリウムに加えて１種以上の塩を含む。製剤に使用できる塩の非限定的な例には、アンモニウム塩及びカルシウム塩がある。いくつかの実施形態において、これらの１種以上の追加の塩の濃度は、１０ｍＭ〜２５０ｍＭ、２５ｍＭ〜１００ｍＭである。いくつかの実施形態において、塩濃度は５０ｍＭである。いくつかの実施形態において、塩濃度は１０ｍＭ未満である。いくつかの実施形態において、塩濃度は２５０ｍＭ超である。いくつかの実施形態において、塩濃度は５０ｍＭである。
【００５６】
いくつかの実施形態において、製剤は治療用タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質は、アルブミン、α−マクログロブリン、アンチキモトリプシン、アンチトロンビン、アンチトリプシン、Ａｐｏ  Ａ、Ａｐｏ  Ｂ、Ａｐｏ  Ｃ、Ａｐｏ  Ｄ、Ａｐｏ  Ｅ、Ａｐｏ  Ｆ、Ａｐｏ  Ｇ、βＸＩＩａ、Ｃ１−阻害剤、Ｃ−反応性タンパク質、Ｃ７タンパク質、Ｃ１ｒタンパク質、Ｃ１ｓタンパク質、Ｃ２タンパク質、Ｃ３タンパク質、Ｃ４タンパク質、Ｃ４ｂＰタンパク質、Ｃ５タンパク質、Ｃ６タンパク質、Ｃ１ｑタンパク質、Ｃ８タンパク質、Ｃ９タンパク質、カルボキシペプチダーゼＮ、セルロプラスム（ｃｅｒｕｌｏｐｌａｓｍ）、Ｂ因子、Ｄ因子、Ｈ因子、Ｉ因子、ＩＸ因子、Ｖ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩａ因子、ＶＩＩＩ因子、Ｘ因子、ＸＩ因子、ＸＩＩ因子、ＸＩＩＩ因子、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ヘパリン補因子ＩＩ、ヒスチジンリッチＧＰ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩＴＩ、ＩｇＭ、キニナーゼＩＩ、キニノーゲン、リゾチーム、ＰＡＩ  ２、ＰＡＩ  １、ＰＣＩ、プラスミン、プラスミン阻害剤、プラスミノゲン、プレアルブミン、プロカリクレイン、プロパージン、プロテアーゼネキシン、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、タンパク質Ｚ、プロトロンビン、ＴＦＰＩ、チオール−プロテイナーゼ、トロンボモジュリン、組織因子（ＴＦ）、ＴＰＡ、トランスコラバミン（ｔｒａｎｓｃｏｌａｂａｍｉｎ）ＩＩ、トランスコルチン、トランスフェリン、ビトロネクチン、又はフォンヴィレブランド因子である。
【００５７】
いくつかの実施形態において、製剤は、１〜５０ｍｇ／ｍｌの治療用タンパク質、２〜２５ｍｇ／ｍｌの治療用タンパク質、３〜１０ｍｇ／ｍｌの治療用タンパク質、４〜８ｍｇ／ｍｌの治療用タンパク質、又は５〜６ｍｇ／ｍｌの治療用タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、１ｍｇ／ｍｌ未満の治療用タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、５０ｍｇ／ｍｌ超の治療用タンパク質を含む。
【００５８】
いくつかの実施形態において、治療用タンパク質はアンチトロンビンである。いくつかの実施形態において、製剤は、１〜５０ｍｇ／ｍｌのアンチトロンビン、２〜２５ｍｇ／ｍｌのアンチトロンビン、３〜１０ｍｇ／ｍｌのアンチトロンビン、４〜８ｍｇ／ｍｌのアンチトロンビン、又は５〜６ｍｇ／ｍｌのアンチトロンビンを含む。いくつかの実施形態において、製剤は、５〜６ｍｇ／ｍｌのアンチトロンビンを含む。いくつかの実施形態において、製剤は１ｍｇ／ｍｌ未満のアンチトロンビンを含む。いくつかの実施形態において、製剤は、５０ｍｇ／ｍｌ超のアンチトロンビンを含む。いくつかの実施形態において、製剤は、１００ｍｇ／ｍｌまでのアンチトロンビンを含む。いくつかの実施形態において、製剤は、１００ｍｇ／ｍｌ超のアンチトロンビンを含む。
【００５９】
製剤が、追加のタンパク質を含む追加の成分も含み得ることを認識されたい。例えば、治療用タンパク質の新しく採取された溶液（例えば、まだ精製されていない、又は部分的にのみ精製された）は、治療用タンパク質（例えば、乳タンパク質又は細胞溶解液に存在するタンパク質）に加えて他のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態において、製剤は、種々の追加の非タンパク質成分（例えば、乳又は細胞溶解物に存在する非タンパク質成分）を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態において、製剤のｐＨは、ｐＨ６〜ｐＨ９、又はｐＨ７．５〜ｐＨ８．５である。いくつかの実施形態において、製剤のｐＨは、ｐＨ８である。必要であれば、酸（ＨＣｌなど）又は塩基（ＮａＯＨなど）を製剤に加えて、所望のｐＨを得ることができる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、治療用タンパク質はアンチトロンビンであり、製剤のｐＨは、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．５である。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質はアンチトロンビンであり、製剤のｐＨは、ｐＨ８である。製剤のｐＨが治療用タンパク質の性質に依存し得ることを認識されたい。
【００６２】
いくつかの実施形態において、製剤は、安定化賦形剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）を含まない。
【００６３】
いくつかの実施形態において、製剤は、カルボン酸又はその塩などの安定化賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、カルボン酸は、クエン酸ナトリウムである。いくつかの実施形態において、製剤は、モノカルボン酸及び／又はその塩を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、グルコン酸及び／又はグルコン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、製剤は、ジカルボン酸及び／又はその塩を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、クエン酸、コハク酸、マロン酸、マレイン酸、酒石酸、又はその塩を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、トリカルボン酸及び／又はその塩を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、ニトリロトリ酢酸及び／又はニトリロトリ酢酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、製剤は、テトラカルボン酸及び／又はその塩を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び／又はＥＤＴＡナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、製剤は、ペンタカルボン酸及び／又はその塩を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）及び／又はＤＴＰＡナトリウムを含む。好適なカルボン酸には、クエン酸ナトリウムなどのクエン酸塩化合物；酒石酸塩化合物、コハク酸塩化合物、マロン酸塩、グルコン酸塩、１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸（ＢＴＣ）、ＥＤＴＡ、若しくはＤＴＰＡ、又はその塩がある。Ｋａｕｓｈｉｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９  ８：２２２−２３３及びＢｕｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２５６，Ｎｕｍｂｅｒ  ２３  ｐａｇｅｓ  １２１４０−１２１０−１２１４７は、カルボン酸及びそれらの使用を記載している。いくつかの実施形態において、安定化賦形剤は、緩衝剤として機能しない。
【００６４】
いくつかの実施形態において、安定化賦形剤は、５０〜６００ｍＭ、２５０〜５００ｍＭ、又は２５０〜３５０ｍＭの濃度を有する。いくつかの実施形態において、安定化賦形剤は、５０〜１００ｍＭ、５０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、５０〜２５０ｍＭ、５０〜３００ｍＭ、５０〜３５０ｍＭ、５０〜４００ｍＭ、５０〜４５０ｍＭ、５０〜５００ｍＭ、又は５０〜５５０ｍＭの濃度である。いくつかの実施形態において、安定化賦形剤は、５５０〜６００ｍＭ、５００〜６００ｍＭ、４５０〜６００ｍＭ、４００〜６００ｍＭ、３５０〜６００ｍＭ、３００〜６００ｍＭ、２５０〜６００ｍＭ、２００〜６５０ｍＭ、１５０〜６００ｍＭ、又は１００〜６００ｍＭの濃度である。いくつかの実施形態において、安定化賦形剤は、１００〜５５０ｍＭ、１５０〜５００ｍＭ、２００〜４５０ｍＭ、２５０〜４００ｍＭ、又は３００〜３５０ｍＭの濃度である。いくつかの実施形態において、安定化賦形剤は、１００、１５０、２５０、５００、又は６００ｍＭの濃度である。いくつかの実施形態において、安定化賦形剤の濃度は１００ｍＭ未満である。いくつかの実施形態において、安定化賦形剤の濃度は６００ｍＭ超である。一実施形態において、安定化賦形剤は、３００ｍＭの濃度である。
【００６５】
いくつかの実施形態において、製剤は糖（例えば、二糖）を含む。一般に、糖は、追加の安定化効果を有し、タンパク質の凝集を最低限にできる。いくつかの実施形態において、糖は二糖である。製剤に加えることができる二糖には、スクロース、ラクチュロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、及びセロビオースがあるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、製剤は、二糖としてスクロース又はトレハロースを含む。
【００６６】
いくつかの実施形態において、糖は０．５〜５％（重量／体積）で存在する。いくつかの実施形態において、糖は、重量体積比で（ｏｆ  ｖｏｌｕｍｅ  ｂｙ  ｗｅｉｇｈｔ）少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも２．５％、少なくとも３％、少なくとも３．５％、少なくとも４％、少なくとも４．５％、又は５％までである。いくつかの実施形態において、糖は、１〜２％（重量／体積）で存在する。いくつかの実施形態において、糖は１％（重量／体積）で存在する。いくつかの実施形態において、糖は、１％（重量／体積）未満で存在する。いくつかの実施形態において、糖は、５％（重量／体積）超で存在する。一実施形態において、糖は、スクロース又はトレハロースであり、１％（重量／体積）で存在する。
【００６７】
いくつかの実施形態において、安定な液体製剤は界面活性剤を含まない。いくつかの実施形態において、安定な液体製剤は、１種以上の界面活性剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ２０、Ｔｗｅｅｎ２０、又はＴｗｅｅｎ８０である。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、体積体積比で０．５〜１％である。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、体積体積比で０．５又は１％である。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、過酸化水素の汚染をほとんど有さず（例えば、５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、３ｍＭ未満、２ｍＭ未満、又は１ｍＭ未満の過酸化水素）、又は過酸化水素の汚染が全くない。
【００６８】
いくつかの実施形態において、治療用タンパク質の製剤は、シリンジ、バイアル、ボトル、アンプル、又はバッグに収容されている。いくつかの実施形態において、バッグはＥＶＡバッグである。他の実施形態において、ボトルはＰＥＴＧボトルである。
【００６９】
いくつかの実施形態において、製剤は、５０ｍＭのリン酸カリウム（リン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウム）、及び１２０ｍＭ塩化カリウムを含み、ｐＨは８である。いくつかの実施形態において、製剤は、５０ｍＭリン酸カリウム（リン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウム）及び１２０ｍＭ塩化カリウムから基本的になり、ｐＨは８である。
アンチトロンビン
いくつかの実施形態において、製剤は治療用タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質はアンチトロンビンである。アンチトロンビンは、一般に、４３２のアミノ酸及び分子量５８ｋＤＡの糖タンパク質であり、トロンビン及びＸａ因子を阻害するセリンプロテアーゼ阻害剤である。アンチトロンビンは、アンチトロンビンＩＩＩのα（ａｌｆａ）（又はα（ａｌｐｈａ））形態になり得るが、本開示の製剤は、どの形態のアンチトロンビンにも使用できる。アンチトロンビンは天然には血漿に存在し、ヒトアンチトロンビンはヒト血漿から単離できる。ヒトアンチトロンビンは、遺伝子組み換え法によっても製造でき、遺伝子組み換えヒトアンチトロンビンが生じる（ｒｈＡＴ；特記されない限り、本明細書では、用語「アンチトロンビン」はｒｈＡＴを含む）。
【００７０】
遺伝子組み換えアンチトロンビンαは、遺伝子導入動物で産生することができ、アンチトロンビンαが欠乏している対象の治療に使用できる（例えば、米国特許第５，８４３，７０５号明細書、米国特許第６，４４１，１４５号明細書、及び米国特許第７，０１９，１９３号明細書を参照されたい）。ＡＴｒｙｎ（登録商標）は、遺伝性アンチトロンビン欠乏症の患者の周術期及び周産期の血栓塞栓性事象の予防にＦＤＡから認可されている、遺伝子組み換えにより製造されたヒトアンチトロンビンαである。欧州では、ＡＴｒｙｎ（登録商標）は、臨床的に危険な状態において、深静脈血栓症及び血栓塞栓症の予防のために、先天性アンチトロンビン欠乏症を持つ手術患者に使用するために認可されている。用語「アンチトロンビン」は、本明細書ではＡＴｒｙｎ（登録商標）を含む。
【００７１】
本明細書に開示されるアンチトロンビン製剤は、高温などの保存条件下で安定である。本明細書に開示されるアンチトロンビンの製剤が長い貯蔵寿命を有し、そのような保存条件下で所望のレベルの活性を維持することが見出された。
【００７２】
本明細書に開示される製剤を使用して、投与の前にさらに処理される必要のあるアンチトロンビンの製剤及びすぐに投与できる製剤を安定化できることを認識されたい。このため、いくつかの実施形態において、アンチトロンビンの製剤は、投与される前に、出荷し、さらに処理し、精製し、かつ／又はバッチに分けることができる。いくつかの実施形態において、製剤は、乳から製造されたアンチトロンビンを含む。いくつかの実施形態において、製剤は、深層濾過により精製されたアンチトロンビン（米国特許第７，５３１，６３２号明細書）及び／又はＴＦＦバッファ交換により精製されたアンチトロンビン（米国特許第６，２６８，４８７号明細書）を含む。いくつかの実施形態において、アンチトロンビン製剤は乳成分も含む。いくつかの実施形態において、アンチトロンビン製剤は低温殺菌されている。
【００７３】
一態様において、本開示は、アンチトロンビンを安定化する製剤を生成する方法であって、アンチトロンビンを含む乳組成物からアンチトロンビンを分離して、アンチトロンビンを含む溶液を生み出す工程、アンチトロンビンを含む溶液を低温殺菌する工程、アンチトロンビンを含む溶液を緩衝剤と交換する工程を含み、
緩衝剤がリン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウムを含むか、又は緩衝剤がリン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムを含み、それによりアンチトロンビンを安定化する製剤を生成する方法を提供する。
製剤に加える添加剤
いくつかの実施形態において、製剤は、１種以上の酸化防止剤を含む。酸化防止剤は、溶液からフリーラジカルを除去することにより酸化を阻害できる物質である。酸化防止剤は当業者に周知であり、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体（例えば、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウムなど）、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、没食子酸アルキル、メタ重亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、亜ジチオン酸ナトリウム、チオグリコール酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、トコフェロール及びその誘導体（ｄ−αトコフェロール、ｄ−αトコフェロールアセテート、ｄｌ−αトコフェロールアセテート、ｄ−αトコフェロールスクシネート、βトコフェロール、δトコフェロール、γトコフェロール、及びｄ−αトコフェロールポリオキシエチレングリコール１０００スクシネート）、モノチオグリセロール、及び亜硫酸ナトリウムなどの物質がある。そのような物質は、典型的には、０．０１〜２．０％（重量／体積）の範囲で加えられる。
【００７４】
いくつかの実施形態において、製剤は、１種以上の等張化剤を含む。この用語は、当分野において等浸透圧剤と互換的に使用され、血漿などのヒトの細胞外液と等張である０．９％塩化ナトリウム溶液まで浸透圧を増すために医薬用調製物に加えられる化合物として知られている。好ましい等張化剤は、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、デキストロース、及びグリセロールである。
【００７５】
いくつかの実施形態において、製剤は、１種以上の保存剤を含む。好適な保存剤には、クロロブタノール（０．３〜０．９％Ｗ／Ｖ）、パラベン（０．０１〜５．０％）、チメロサール（０．００４〜０．２％）、ベンジルアルコール（０．５〜５％）、フェノール（０．１〜１．０％）など（重量／体積）があるが、これらに限定されない。
方法
一態様において、本開示は、治療用タンパク質を安定化する製剤を生成する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、緩衝剤を溶液に加えること、それに続いてタンパク質を加えることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、タンパク質を溶液に加えること、それに続いて緩衝剤を加えることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、タンパク質を含む溶液を与えること、及び緩衝剤を溶液に加えることを含む。
【００７６】
いくつかの実施形態において、方法は、リン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウムを含む緩衝剤を加えることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、リン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムを含む緩衝剤を加えることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、緩衝剤を含む溶液を与えること、及びタンパク質を溶液に加えることを含む。いくつかの実施形態において、緩衝剤は、リン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウムを含む。いくつかの実施形態において、緩衝剤は、リン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムを含む。
【００７７】
いくつかの実施形態において、方法は、溶液から緩衝剤を除くことを含む。いくつかの実施形態において、方法は、溶液から緩衝剤を除くこと、並びにリン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウムを含む緩衝剤を加えることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、溶液から緩衝剤を除くこと、並びにリン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムを含む緩衝剤を加えることを含む。いくつかの実施形態において、溶液は治療用タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、緩衝剤の添加と緩衝剤の除去は同時に実施される。いくつかの実施形態において、緩衝剤の添加と緩衝剤の除去は連続的に実施される。緩衝剤の添加と除去は、治療用タンパク質を含む溶液に行ってもよいが、緩衝剤を交換してから、治療用タンパク質を加えてもよい。
【００７８】
いくつかの実施形態において、上記方法の全てにおいて、緩衝剤は、上述の濃度レベル（例えば、５０ｍＭ）に導かれる。これらの方法のいくつかの実施形態において、製剤は、上述のｐＨ（例えば、ｐＨ８）であるか、上述のｐＨに導かれる。
【００７９】
塩の除去及び溶液への塩の添加の方法は当分野に公知であり、透析、バッファ交換、カラム精製などがある。
投与
いくつかの実施形態において、本開示は、投与の前にさらなる処理を必要とする治療用タンパク質の製剤を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、すぐに投与できる、治療用タンパク質の製剤を提供する。すぐに投与できるには、投与の前に解凍及び／又はシリンジへの移動などの最低限の工程を要する製剤がある。いくつかの実施形態において、本開示の製剤は、静脈内、動脈内、又は非経口投与用の濃縮用量（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  ｄｏｓａｇｅ）として意図されている。したがって、いくつかの実施形態において、製剤は主に注射用の濃縮用量としても意図されている。
【００８０】
本明細書に記載される製剤は、単独又は組み合わせて使用される場合、治療上有効な量で投与できる。治療上有効な量は、以下に議論されるパラメーターにより決定されるだろう。しかし、どのような場合でも、本明細書に記載される疾患（例えば、遺伝性又は後天性アンチトロンビン欠乏症）の１つを有する、ヒトの対象などの対象を治療するのに有効な薬物（類）のレベルを確立する量である。有効量は、単独でも多数回の投与量でも、治療される病態の発症を遅延し、治療される病態を完全に阻害若しくはその進行を減らし、又は治療すべき病態の発症若しくは進行を完全に停止させるのに必要な量を意味する。対象に投与される時、有効量は、もちろん、治療すべき特定の病態；病態の重症度；年齢、肉体的状態、大きさ、及び体重を含む個々の患者パラメーター；併用療法；治療の頻度；及び投与様式に依存するだろう。これらの因子は当業者に周知であり、型通りの実験だけで対処することができる。一般的には最大の投与量、すなわち、健全な医学的判断による最高の安全な投与量が利用されることが好ましい。
【００８１】
本明細書に記載される製剤は、薬学的に許容できる担体を含んでも、薬学的に許容できる担体に希釈されていてもよい。用語「薬学的に許容できる担体」は、本明細書では、ヒト又はイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、若しくはヤギなどの他の哺乳動物への投与に好適な、１種以上の適合性のある固体、又は半固体、又は液体の充填剤、希釈剤、又はカプセル化物質を意味する。用語「担体」は、有効成分と合わさって適用を促進する、有機又は無機の、天然又は合成の成分のことである。担体は、所望の医薬効能又は安定性を実質的に損なうような相互作用が全くないように、本発明の調合物と、及び互いに混合され得る。静脈内、動脈内、又は非経口などの製剤に好適な担体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａに見出すことができる。
【００８２】
一実施形態において、治療用タンパク質の製剤は無菌である。
【００８３】
なお他の実施形態において、治療用タンパク質の製剤はキットに収容されている。一実施形態において、キットは、製剤を使用するための説明書をさらに含む。他の実施形態において、キットはさらにシリンジを含む。なお他の実施形態において、そのようなキットは、製剤を投与するための説明書をさらに含む。さらなる実施形態において、キットは、製剤を希釈するための溶液をさらに含む。なお他の実施形態において、そのようなキットは、製剤を希釈するための溶液と製剤を混合するための説明書をさらに含む。上述のキットも、本発明の他の態様に提供されている。
【００８４】
本発明は、以下の実施例によりさらに説明されるが、実施例はさらに限定的であると決して解釈されるべきではない。本明細書全体を通して引用された引用文献（参考文献、発行済み特許、公開された特許出願、及び同時係属特許出願）の全ての内容全体は、特に、上記で引用された教示のために、引用により明確に本明細書に組み込まれる。しかし、ある引用文献の引用が、引用文献が従来技術であると認めるものではないものとする。
【実施例】
【００８５】
実施例において、「Ｋ／Ｎａリン酸塩」は、リン酸一水素カリウム及びリン酸二水素ナトリウムを意味し；「Ｎａ／Ｋリン酸塩」は、リン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素カリウムを意味し；「Ｎａ／Ｎａリン酸塩」は、リン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムを意味し；「Ｋ／Ｋリン酸塩」は、リン酸一水素カリウム及びリン酸二水素カリウムを意味する。これら４種の緩衝剤を、本明細書ではまとめて「リン酸塩系」と称する。
【００８６】
実施例１
アンチトロンビン並びに種々のリン酸塩及びクエン酸塩緩衝剤を含む、ｐＨ６、ｐＨ７、若しくはｐＨ８（リン酸緩衝剤）又はｐＨ６若しくはｐＨ７（クエン酸塩緩衝剤）の溶液を、−２０℃又は−４０℃への凍結解凍サイクルに付した。凍結解凍サイクルの間、溶液を６０ｍｌバッグに保存した。使用したアンチトロンビンの濃度は５〜１０ｍｇ／ｍｌである。アンチトロンビンの酸化状態、ヘパリン親和性、及び凝集を、凍結解凍サイクルを受ける前後で決定した。アンチトロンビンの凝集（パーセンテージで表示）を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定した。アンチトロンビンの酸化をＲＰ−ＨＰＬＣを利用して決定し、アンチトロンビンを単離し、次いでペプチドマッピングを行った。図１は、種々の緩衝剤中での凍結／解凍の後のアンチトロンビンの酸化状態を示す。図２は、種々の緩衝剤中での凍結／解凍後のアンチトロンビンのヘパリン親和性を示す。図３は、種々の緩衝剤中での凍結／解凍後のアンチトロンビンの凝集を示す。図７は、凍結／解凍後のリン酸塩系中でのアンチトロンビンの安定性パラメーターの概要を与える。
【００８７】
実施例２
アンチトロンビン並びに種々のリン酸塩及びクエン酸塩緩衝剤を含む、ｐＨ６、ｐＨ７、若しくはｐＨ８（リン酸緩衝剤）又はｐＨ６若しくはｐＨ７（クエン酸塩緩衝剤）の溶液を、３か月までの期間２℃〜８℃で保存した。溶液を６０ｍｌバッグに保存した。使用したアンチトロンビン（ａｎｔｉｈｒｏｍｂｉｎ）の濃度は５〜１０ｍｇ／ｍｌである。アンチトロンビンの酸化状態、ヘパリン親和性、及び凝集（ＳＥＣによる）を、保存の前後に決定した。アンチトロンビンの酸化（パーセンテージで表示）をＲＰ−ＨＰＬＣを利用して決定し、アンチトロンビンを単離し、次いでペプチドマッピングを行った。ヘパリン結合を、製剤をヘパリン結合カラムに接触させ、それに続いてＨＰＬＣにより決定した。図４は、種々の緩衝剤中で２〜８℃で保存した後のアンチトロンビンの酸化状態を示す。図５は、種々の緩衝剤中で２〜８℃で保存した後のアンチトロンビンのヘパリン親和性を示す。図６は、種々の緩衝剤中で２〜８℃で保存した後のアンチトロンビンの凝集を示す。図８は、リン酸塩系中で１か月２〜８℃で保存した後のアンチトロンビンの安定性パラメーターの概要を与える。図９は、リン酸塩系中で３か月２〜８℃で保存した後のアンチトロンビンの安定性パラメーターの概要を与える。図１０は、種々の緩衝剤中で１か月２〜８℃で保存した後のアンチトロンビンの安定性パラメーターの概要を与える。
【００８８】
実施例３
塩化カリウム（１２０ｍＭ、ｐＨ７．５）を、アンチトロンビン並びに種々のリン酸塩及びクエン酸塩緩衝剤を含むｐＨ６、ｐＨ７、若しくはｐＨ８（リン酸緩衝剤）又はｐＨ６若しくはｐＨ７（クエン酸塩緩衝剤）の溶液に加えた。その後、溶液を、−２０℃又は−４０℃への凍結解凍サイクルに付した。凍結解凍サイクルの間、溶液を６０ｍｌバッグに保存した。使用したアンチトロンビン（ａｎｔｉｈｒｏｍｂｉｎ）の濃度は、５〜１０ｍｇ／ｍｌである。アンチトロンビンの酸化状態、ヘパリン親和性、及び凝集を、凍結解凍サイクルを受ける前後で決定した。アンチトロンビンの酸化（パーセンテージで表示）をＲＰ−ＨＰＬＣを利用して決定し、アンチトロンビンを単離し、次いでペプチドマッピングを行った。ヘパリン結合を、製剤をヘパリン結合カラムに接触させ、それに続いてＨＰＬＣにより決定した。アンチトロンビンの凝集（パーセンテージで表示）を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定した。図１１は、種々の緩衝剤中での凍結／解凍後のアンチトロンビンの酸化状態を示す。図１２は、種々の緩衝剤中での凍結／解凍後のアンチトロンビンのヘパリン親和性を示す。図１３は、種々の緩衝剤中での凍結／解凍後のアンチトロンビンの凝集を示す。図１４は、凍結／解凍後の種々の緩衝剤中でのアンチトロンビンの安定性パラメーターの概要を与える。
【００８９】
実施例４
塩化カリウム（１２０ｍＭ、ｐＨ７．５）を、アンチトロンビン並びに種々のリン酸塩及びクエン酸塩緩衝剤を含むｐＨ６、ｐＨ７、若しくはｐＨ８（リン酸緩衝剤）又はｐＨ６若しくはｐＨ７（クエン酸塩緩衝剤）の溶液に加えた。溶液を、２℃〜８℃で３か月まで保存した。溶液を６０ｍｌバッグに保存した。アンチトロンビンの酸化状態、ヘパリン親和性、及び凝集（ＳＥＣによる）を、保存の前後で決定した。アンチトロンビンの酸化（パーセンテージで表示）をＲＰ−ＨＰＬＣを利用して決定し、アンチトロンビンを単離し、次いでペプチドマッピングを行った。ヘパリン結合を、製剤をヘパリン結合カラムに接触させ、それに続いてＨＰＬＣにより決定した。図１５は、種々の緩衝剤中で２〜８℃で保存した後のアンチトロンビンの酸化状態を示す。図１６は、種々の緩衝剤中で２〜８℃で保存した後のアンチトロンビンのヘパリン親和性を示す。図１７は、種々の緩衝剤中で２〜８℃で保存した後のアンチトロンビンの凝集を示す。図１８は、種々の緩衝剤中で２〜８℃で保存した後のアンチトロンビンの安定性パラメーターの概要を与える。
【００９０】
実施例５
３つのロットの清澄化された出発物質（ＣＳＭ）をパイロットスケールで調製した。これらＣＳＭのそれぞれを１０Ｌバッグ中で−２０℃で凍結し、最長２年間保存した。種々の時点で、バッグを冷凍庫から取り出し、解凍して、精製した。アンチトロンビンα分子の安定性を、試験の過程にわたり、酸化、凝集、及びヘパリン親和性をモニタリングすることにより決定した。２年間の凍結保存にわたり、安定性を示すパラメーターのいずれにも著しい変化は全く見られなかった（図１９〜２１参照）。
【００９１】
トランスジェニックヤギの乳を清澄化し、低温殺菌し、濃縮し、次いで、精製操作において必要となるまで保存施設に送った。最初に、ＣＳＭをｐＨ７．４のＰＢＳ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）中で製剤化したが、−２０℃で凍結すると同時に、溶液は凝集し、解凍時にヘパリン親和性が失われた。
【００９２】
ｐＨ７を超えるカリウム塩とともに製造されたＰＢＳ製剤、安定化されたアンチトロンビンαを、−２０℃で完全に凍結した。新しい清澄化された製剤（５０ｍＭリン酸カリウム、１２０ｍＭ塩化カリウム、ｐＨ８．０）を使用してプロセスを大規模にし、バルク凍結が製品に影響を与えるかどうかを決定した。
【００９３】
３ロットのＣＳＭを、深層濾過、低温殺菌、及びカリウムＣＳＭ製剤緩衝剤中への濃縮／透析濾過により製造した。凍結前に、少量の試料を小規模精製のために除去し、時間ゼロの分析結果を決定した。各ロットを、およそ５Ｌの２つの部分に分け、１０Ｌバッグに濾過した。バッグを−２０℃で直ちに凍結し、適切な時点に達するまで保存した。試験スケジュールの概要を表１に記録した。
【００９４】
【表１】
2014520820.tif 000003
【００９５】
各時点で、アリコートを水浴中で解凍し、下記の通り精製した。ＣＳＭを１．１５Ｌ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨｙｐｅｒＤにロードし、２つのローディング／溶離サイクルを実施した。２つの溶離ピークを一緒に回収し、プールを濃縮し、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅローディングバッファー中に透析濾過した。生成物を４９０ｍｌ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにロードし、より多い塩緩衝剤で溶離させた。Ｑ溶離液を、１．７６Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ７．０と１：１で混合し、直接４５０ｍｌ  Ｔｏｓｏｈ  Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｃカラムにロードした。生成物は、素通り分画にあったが、それを回収しておよそ２５ｇ／ｌに濃縮し、透析濾過して原薬（ＤＳ）製剤緩衝剤とした。最終的なＤＳを、分析試験の前に無菌濾過した。
【００９６】
最終的なＤＳを、凝集及びヘパリン親和性の決定に使用し、酸化レベルはヘパリン溶出液で決定したが、それは、フェニルカラムの後で酸化が著しく増加するからである。ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅプレカラムの導入は下流の酸化をなくすため、各時点はＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムなしで同等に精製された。すべての分析結果を、各ＣＳＭロットで得られた時間ゼロ結果と比べた。
【００９７】
材料及び方法
各精製は、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅプレカラム以外、第二世代開発報告書に記載のとおり実施した。
Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨｙｐｅｒＤ（Ｃａｍｂｒｅｘにより使用２００３−２００４）
Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ  ロット３０３３６７
Ｔｏｓｏｈ  Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｃロット６５ＰＨＣ０１Ｂ
凝集、ヘパリン親和性、及び酸化はＰＡＤで実施した。
５０ｍＭリン酸塩（Ｋ／Ｎａ）１２０ｍＭ  ＫＣｌ  ｐＨ７．５
５０ｍＭリン酸塩（Ｎａ／Ｋ）１２０ｍＭ  ＫＣｌ  ｐＨ７．５
５０ｍＭリン酸塩（Ｎａ／Ｎａ）１２０ｍＭ  ＫＣｌ  ｐＨ７．５
５０ｍＭリン酸塩（Ｋ／Ｋ）１２０ｍＭ  ＫＣｌ  ｐＨ７．５
５０ｍＭクエン酸ナトリウム１２０ｍＭ  ＫＣｌ  ｐＨ７．５
【００９８】
結果
各凍結バッグを、解凍前に不十分な凍結及び／又は貯留の痕跡がないか注意深く検査した。どの時点でも、異常は全く観察されなかった。表２は、安定性試験全体の分析結果の概要を含む。
【００９９】
【表２】
2014520820.tif 000004
【０１００】
各ロットの時間ゼロ結果が異なるため、データを規格化し、それぞれの時間ゼロ結果に対する各分析結果の差を示した。安定性を示す技術のそれぞれのデータを図１９〜２１にプロットした。
【０１０１】
酸化結果は、０．３％の増加から０．２％の減少まで変動した。この変動は平均に落ち着き、正味の差は初期時点と比べて無視できた。ヘパリン親和性結果のそれぞれは、時間ゼロ結果に等しいか、又は高かった。したがって、−２０℃での凍結保存は、アンチトロンビンαに悪影響を与えない。凝集結果は、初期の未凍結試料と同様に、各時点でアッセイの定量限界を超えることは全くなかった。−２０℃での保存は、アンチトロンビンαの凝集に全く影響を与えなかった。
【０１０２】
結論
−２０℃はリン酸カリウム緩衝化塩化カリウム清澄化製剤緩衝剤の最低共融点よりも十分に低いので、リン酸カリウム緩衝化塩化カリウム清澄化製剤緩衝剤は−２０℃で完全に凍結した。以前使用したナトリウム系ＰＢＳは、塩化ナトリウムのために部分的に液体のままであり、時間経過とともに、塩化ナトリウムが非常の高レベルの凝集及び低レベルのヘパリン親和性を起こした。ナトリウムをカリウムに替えると、この問題がなくなった。
【０１０３】
−２０℃での凍結状態におけるアンチトロンビンαの安定性が、全てのカリウム緩衝剤において２年まで示された。安定性を示す最も敏感なアッセイ３種により、製品の質を評価した。各安定性時点調合物は、３種のアッセイ全てにより、新しいＣＳＭに実施した初期の小規模精製と同等であった。したがって、清澄化された出発物質は、−２０℃で凍結された５０ｍＭリン酸カリウム、１２０ｍＭ塩化カリウム、ｐＨ８．０中で２４か月まで安定であることが決定された。
【０１０４】
実施例６
アンチトロンビン製剤からウイルスを除去するために、ナノ濾過を実施した。清澄化された乳のプールを、ヘパリンカラムを使用して精製した。ヘパリン溶出液を、５ｃｍ２の２０ｎＭウイルスフィルターを使用して濾過した。ＳＤＳ  Ｐａｇｅを利用して、流れを分析した。プレフィルターを使用して、汚染種を除去した：０．１μｍ  ＰＥＳ  Ｐｒｅ−ｆｉｌｔｅｒ、０．２μＭ  Ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｅｒ、３００ＫＤ  ＵＦ、Ｑ−ａｂｓｏｒｂｅｒ及びＳ−ａｂｓｏｒｂｅｒ。スループットデータを図２２及び２３に示す。ＳＤＳ  ｐａｇｅを図２４に示す。
【０１０５】
等価物
上記の明細書は、当業者が本発明を実施可能とするのに充分であると考えられる。実施例は、本発明の特定の様態及び実施形態の説明であることが意図されるため、本発明は、与えられた実施例によりその範囲が限定されるものではない。他の機能的に等価な実施形態は、本発明の範囲内にある。本明細書に示され説明されたものに加えられた本発明の種々の変更は、上記の説明から当業者には明らかであり、添付された特許請求の範囲の範囲内にあるだろう。本発明の利点及び目的は、本発明の各実施形態により必ずしも包含されない。
【図１】
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【図２】
2014520820.tif 000006
【図３】
2014520820.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2014520820.tif 000011
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2014520820.tif 000021
【図１８】
2014520820.tif 000022
【図２２】
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【図２３】
2014520820.tif 000024
【図２８】
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【図２９】
2014520820.tif 000026
【図３０】
2014520820.tif 000027
【図３１】
2014520820.tif 000028
【図３２】
2014520820.tif 000029
【図３３】
2014520820.tif 000030
【図１９】
2014520820.tif 000031
【図２０】
2014520820.tif 000032
【図２１】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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