(57)【要約】  本発明は、ＶＥＧＦＲ−１遺伝子の遺伝子型を決定することにより、患者がベバシズマブなどの血管新生阻害剤を用いた治療法によってより適切に治療されるかどうかを決定する方法に関する。本発明は、ＶＥＧＦＲ−１遺伝子の遺伝子型に基づいて癌に罹患している患者を治療するための、ベバシズマブなどの血管新生阻害剤を含む薬学的組成物に更に関する。本発明は、ＶＥＧＦＲ−１遺伝子の遺伝子型に基づいて、ベバシズマブなどの血管新生阻害剤を加えることによって、癌に罹患している患者の化学療法の治療効果を改善するための方法に更に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌又は生理学上若しくは病理学上の血管新生異常に罹患している患者が、ベバシズマブ又はベバシズマブと本質的に同じＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を用いた治療法によって適切に治療されるか否かを決定するインビトロ方法であって、
（ａ）癌又は生理学上若しくは病理学上の血管新生異常に罹患している患者から得られたサンプルにおいて、位置１２１３のチロシンについてＴＡＴコドン及びＴＡＣコドンにそれぞれ対応するＶＥＧＦＲ−１のエクソン２８に位置する同義置換Ｔ／Ｃ  ＳＮＰでの遺伝子型を決定すること、及び
（ｂ）前記遺伝子型に基づいて、ベバシズマブ又はベバシズマブとＶＥＧＦ上の本質的に同じエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を用いた治療法により、前記患者がより適切に治療されるか又はあまり適切に治療されないかを同定することを含み、ここで前記ＳＮＰでの各Ｔ対立遺伝子の存在は前記患者がより適切に治療される可能性の増大を示し、又は前記ＳＮＰでの各Ｃ対立遺伝子の存在は前記患者があまり適切に治療されない可能性の増大を示す、方法。
【請求項２】
患者が血管新生阻害剤を用いた治療法によって適切に治療されるかどうかが無増悪生存期間又は全生存期間が改善されるかどうかの観点から決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血管新生阻害剤を用いた前記治療法により患者を治療することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
血管新生阻害剤が化学療法剤又は化学療法レジメンとの併用療法として投与される、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
血管新生阻害剤が、タキサン、インターフェロンアルファ、５−フルオロウラシル、カペシタビン、ロイコボリン、ゲムシタビン、エルロチニブ及び白金系化学療法剤からなる群から選択される一以上の薬剤と共に投与される、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
癌が、膵臓癌、腎細胞癌、大腸癌、乳癌又は肺癌である、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
ベバシズマブ又はベバシズマブと本質的に同じＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を含む、癌又は生理学上若しくは病理学上の血管新生異常に罹患している患者を治療するための薬学的組成物であって、ここで患者は、請求項１から６の何れか一項に記載の方法にしたがって前記血管新生阻害剤によってより適切に治療されることが同定されている、薬学的組成物。
【請求項８】
位置１２１３のチロシンについてＴＡＴコドン及びＴＡＣコドンにそれぞれ対応するＶＥＧＦＲ−１のエクソン２８に位置する同義置換Ｔ／Ｃ  ＳＮＰでの遺伝子型を決定することができるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１から６の何れか一項に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項９】
ベバシズマブ又はベバシズマブと本質的に同じＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を加えることによって、癌又は生理学上若しくは病理学上の血管新生異常に罹患している患者の化学療法剤又は化学療法レジメンの治療効果を改善するための方法であって、
（ａ）癌又は生理学上若しくは病理学上の血管新生異常に罹患している患者から得られたサンプルにおいて、位置１２１３のチロシンについてＴＡＴコドン及びＴＡＣコドンにそれぞれ対応するＶＥＧＦＲ−１のエクソン２８に位置する同義置換Ｔ／Ｃ  ＳＮＰでの遺伝子型を決定すること、
（ｂ）前記遺伝子型に基づいて、前記患者を、ベバシズマブ又はベバシズマブと本質的に同じＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤の添加によってより適切に治療されると同定し、ここで前記ＳＮＰでの各Ｔ対立遺伝子の存在は、前記患者がより適切に治療される可能性の増大を示すこと、及び
（ｃ）（ｂ）に従ってより適切に治療されると同定された患者に、前記血管新生阻害剤を化学療法剤又は化学療法レジメンと組み合わせて投与すること
を含む方法。
【請求項１０】
患者が血管新生阻害剤を用いた治療法によって適切に治療されるかどうかが、無増悪生存期間又は全生存期間が改善されるかどうかの観点から決定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
血管新生阻害剤が、タキサン、インターフェロンアルファ、５−フルオロウラシル、カペシタビン、ロイコボリン、ゲムシタビン、エルロチニブ及び白金系化学療法剤からなる群から選択される一以上の薬剤と共に投与される、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
癌が、膵臓癌、腎細胞癌、大腸癌、乳癌又は肺癌である、請求項９から１１の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、どの患者が最も抗癌剤による治療の利益を受けるかを同定し、抗癌剤による治療に対する感受性及び応答性について患者をモニターするための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、癌の発生など良性及び悪性疾患に寄与し、特に癌において、原発性腫瘍増殖、浸潤及び転移のために必要である。増殖するために、腫瘍に血管新生スイッチが入らなければならない。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、この血管新生スイッチを誘導するために必要とされる。ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ経路中の遺伝子は、癌の進行の重要なメディエーターと考えられている。ＶＥＧＦ遺伝子ファミリーは、ＶＥＧＦＡとも称するＶＥＧＦ遺伝子、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＤを含むＶＥＧＦホモログ、ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２（それぞれＦＬＴ１及びＦＬＫ１／ＫＤＲとも称する）を含むＶＥＧＦ受容体、低酸素誘導因子ＨＩＦ１α、ＨＩＦ２α、及び酸素センサーＰＨＤ１、ＰＨＤ２及びＰＨＤ３を含むＶＥＧＦ誘導因子を含む。
【０００３】
癌細胞増殖及び転移におけるこの経路の重要性が、癌治療における使用のための抗血管新生剤の開発をもたらした。これらの治療法には、とりわけ、ベバシズマブ、ペガプタニブ、スニチニブ、ソラフェニブとバタラニブが含まれている。ベバシズマブなどの血管新生阻害剤を用いて得られた著しく延長された生存期間にもかかわらず、患者はなお癌で死亡する。更に、全ての患者が血管新生阻害剤治療に応答するわけではない。非応答性の根底にある機序は不明のままである。更に、血管新生阻害剤治療は、胃腸穿孔、血栓症、出血、高血圧及びタンパク尿などの副作用と関連する。 
【０００４】
従って、どの患者が血管新生阻害剤治療に特によく応答するかを決定する方法が必要である。 
【０００５】
ＶＥＧＦＲ−１遺伝子の１つ以上の変異対立遺伝子が抗血管新生治療の成績の改善に関連していることが、国際公開第２０１１／０１５３４８号に記載されている。国際公開第２０１１／０１５３４８号で開示されているＳＮＰの中に、ｒｓ９５５４３１６、ｒｓ９５８２０３６、ｒｓ９５１３０７０、及びｒｓ９５５４３２０がある。一方、他のＳＮＰが連鎖不平衡により同定され、それゆえこれら４つのＳＮＰにリンクしている。
【発明の概要】
【０００６】
連鎖不平衡により同定され、また国際公開第２０１１／０１５３４８号で開示されたＳＮＰの一つが、ベバシズマブなどの血管新生阻害剤の治療成績のための予測バイオマーカーとして特に役立つことが見い出された。
【０００７】
本発明は、それゆえ、位置１２１３のチロシンについてＴＡＴコドン及びＴＡＣコドンにそれぞれ対応するＶＥＧＦＲ−１のエクソン２８に位置する同義置換Ｔ／Ｃ  ＳＮＰで遺伝子型を決定することにより、患者がベバシズマブなどの血管新生阻害剤を用いた治療によってより適切に治療されるか又はあまり適切に治療されないかを決定する方法に関する。本発明はまた、癌に罹患している患者であって、位置１２１３のチロシンについてＴＡＴコドン及びＴＡＣコドンにそれぞれ対応するＶＥＧＦＲ−１のエクソン２８に位置する同義置換Ｔ／Ｃ  ＳＮＰで改善された治療効果に関連する遺伝子型を持つ患者の治療のためのベバシズマブなどの血管新生阻害剤を含む薬学的組成物に関する。本発明は更に、位置１２１３のチロシンについてＴＡＴコドン及びＴＡＣコドンにそれぞれ対応するＶＥＧＦＲ−１のエクソン２８に位置する同義置換Ｔ／Ｃ  ＳＮＰでの遺伝子型に基づいて、ベバシズマブなどの血管新生阻害剤を加えることにより癌に罹患する患者の化学療法の治療効果を改善するための方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
１．定義
「投与する」という用語は、患者への血管新生阻害剤などの薬学的組成物の投与を意味する。例えば、体重の２．５ｍｇ／ｋｇから体重の１５ｍｇ／ｋｇのベバシズマブ（アバスチン（登録商標））を、治療される癌のタイプに応じて、毎週、２週間ごと、又は３週間ごとに投与することができる。特定の投与量は、５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、及び１５ｍｇ／ｋｇを含む。より特定の投与量は、５ｍｇ／ｋｇを２週間毎に、１０ｍｇ／ｋｇを２週間毎に、及び１５ｍｇ／ｋｇを３週間ごとにである。
【０００９】
本発明との関連において、用語「血管新生阻害剤」は、血管新生（例えば、血管を形成するプロセス）を変化させる全ての薬剤を指し、限定されないが、腫瘍血管新生を含む血管新生を阻害する薬剤を含む。これに関連して、阻害とは、血管の形成を阻止し、血管の成長を停止又は遅くすることを指すことができる。血管新生阻害剤の例としては、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標）としても知られている）、ペガプタニブ、スニチニブ、ソラフェニブ及びバタラニブが含まれる。ベバシズマブは、インビトロ及びインビボでのアッセイ系においてヒトＶＥＧＦＡに結合し、その生物学的活性を阻害する組換えヒト化モノクローナルＩｇＧ１抗体である。用語「ベバシズマブ」は、米国、ヨーロッパ、及び日本からなる国々のグループから選択された国又は地域において、同一又はバイオシミラー製品として販売承認を得るために必要な要件を満たした対応する全ての抗ＶＥＧＦ抗体を包含する。本発明との関連において、血管新生阻害剤は、ベバシズマブと本質的に同じＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体、より具体的には、ベバシズマブと同じＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体を含む。抗体は、該抗体と参照抗体の２つの抗体が同一又は立体的に重複するエピトープを認識するとき、参照抗体と「本質的に同じエピトープ」に結合する。２つのエピトープが同一又は立体的に重複するエピトープに結合するかどうかを決定するための最も広く使用される迅速な方法は、標識抗原又は標識抗体の何れかを使用して、全ての数の異なる形態で構成することができる競合アッセイである。通常、抗原は９６ウェルプレート上に固定化され、標識抗体の結合を遮断する非標識抗体の能力は、放射性又は酵素標識を用いて測定される。
【００１０】
用語「癌」は、未制御の細胞増殖によって典型的に特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指す。癌の例としては、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病が含まれる。このような癌のより具体的な例には、扁平上皮癌、肺癌(小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌を含む)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｏｒ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）(消化器癌を含む)、膵臓癌(転移性膵臓癌を含む)、神経膠芽細胞腫、子宮頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌（局所的進行型、再発性又は転移性ＨＥＲ−２陰性乳癌を含む）、結腸癌、大腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓又は腎癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、及び様々なタイプの頭頸部癌、並びにＢ細胞リンパ腫(低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)；小リンパ球(ＳＬ)ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非分割細胞ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；及びワルデンストローム型マクログロブリン血症を含む)；慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)；急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性疾患(ＰＴＬＤ)、並びに、母斑症と関係する異常な血管性増殖、浮腫(脳腫瘍と関係するものなど)、メイグス症候群が含まれる。
【００１１】
「生理学上又は病理学上の血管新生異常」の例には、限定されないが、加齢黄斑変性(AMD)等の眼疾患、高悪性度神経膠腫、神経膠芽細胞腫、オスラー・ランデュ病、フォンヒッペル・リンドウ病、血管腫、乾癬、カポジ肉腫、眼内血管新生、関節リウマチ、子宮内膜症、アテローム性動脈硬化、心筋虚血症、末梢性虚血、脳虚血及び創傷治癒が含まれる。
【００１２】
用語「化学療法剤」又は「化学療法レジメン」は、抗癌治療効果を提供することができる任意の活性薬剤を含み、特に癌細胞又は腫瘍細胞に介入することができる化学薬剤又は生物学的薬剤であってもよい。特定の活性薬剤は、悪性細胞の発生、成熟又は増殖を阻害又は防止する抗新生物（化学毒性（ｃｈｅｍｏｔｏｘｉｃ）又は化学安定性（ｃｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ））剤として作用するものである。化学療法剤の例は、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン及びクロラムブシル）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、及びセムスチン（メチル−ＣＣＮＵ））、エチレンイミン／メチルメラミン（例えば、トリエチレンメラミン（ｔｈｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｍｅｌａｍｉｎｅ）（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホルアミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン））、スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン）、及びトリアジン（例えば、ダカルバジン（ＤＴＩＣ））等のアルキル化剤；葉酸アナログ（例えば、メトトレキサート、トリメトレキサート）、ピリミジンアナログ（例えば、５−フルオロウラシル、カペシタビン、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、２，２′−ジフルオロデオキシシチジン）、及びプリンアナログ（例えば、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２′−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、及び２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ））等の代謝拮抗剤；天然物に由来する有糸分裂阻害剤（例えば、パクリタキセル、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、及びビノレルビン）、ドセタキセル、エストラムスチン、及びリン酸エストラムスチン）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシド、テニポシド）、抗生物質（例えばアクチノマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ、アクチノマイシン）、酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）、及び生体応答修飾物質（例えば、インターフェロン−α、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）；白金配位錯体（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン）、アントラセンジオン（例えば、ミトキサントロン）、置換尿素（すなわちヒドロキシウレア）、メチルヒドラジン誘導体（例えば、Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）、プロカルバジン）、副腎皮質抑制剤（例えば、ミトタン（ｏ，ｐ′−ＤＤＤ）、アミノグルテチミド）を含む種々の薬剤；副腎皮質ステロイドアンタゴニスト（例えば、プレドニゾン及び等価物、デキサメタゾン、アミノグルテチミド）、プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール）、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオー���及びその等価物）を含むホルモン及びアンタゴニスト；抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン）、アンドロゲン（例えば、プロピオン酸テストステロン、フルオキシメステロン及びその等価物）、抗アンドロゲン剤（例えば、フルタミド、性腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログ、リュープロリド）、非ステロイド性抗アンドロゲン剤（例えば、フルタミド）、上皮成長因子阻害剤（例えば、エルロチニブ、ラパチニブ、ゲフィチニブ）抗体（例えば、トラスツズマブ）、イリノテカン、及びロイコボリンなどの他の薬剤を含む。転移性膵臓癌の治療のために、ベバシズマブとともに投与するための化学療法剤は、ゲムシタビン及びエルロチニブ及びそれらの組合せを含む（本明細書で提供される実施例も参照）。腎細胞癌の治療のために、ベバシズマブとともに投与するための化学療法剤は、インターフェロンアルファを含む（本明細書で提供される実施例も参照）。
【００１３】
用語「対立遺伝子」は、目的の遺伝子のヌクレオチド配列変異体を指す。
【００１４】
用語「遺伝子型」は、個体又はサンプル中に含まれる遺伝子の対立遺伝子の記述を指す。本発明との関連において、個体の遺伝子型と該個体由来のサンプルの遺伝子型との間に区別はなされていない。典型的には、遺伝子型は二倍体細胞のサンプルから決定されるが、遺伝子型は、精子細胞など半数体細胞のサンプルから決定することができる。
【００１５】
用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、交換可能に使用され、２つ以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、好ましくは３つ以上からなる分子を指す。その正確な大きさは、該オリゴヌクレオチドの最終的な機能又は用途に依存して、多くの要因に依存するであろう。オリゴヌクレオチドは、合成又はクローニングによって誘導することができる。デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドのキメラ体も本発明の範囲内にあり得る。
【００１６】
用語「多型性」は、集団中の遺伝子の２つ又はそれ以上の遺伝的に決定される代替配列の発生を言う。典型的には、最初に同定された対立遺伝子型が参照型として任意に指定され、他の対立遺伝子型は、代替又は変異体対立遺伝子として指定される。選択された集団において最も頻繁に生じる対立遺伝子型は、時には野生型と呼ばれる。
【００１７】
用語「一塩基多型」又は「ＳＮＰ」は、対立遺伝子間で変化する一つのヌクレオチドの部位である。一塩基多型は、遺伝子の任意の領域で生じ得る。幾つかの例において多型性は、タンパク質配列の変化をもたらすことができる。タンパク質配列の変化は、タンパク質機能に影響し得るかもしれないし、影響しない場合もある。
【００１８】
「患者」という用語は任意の単一動物、より具体的には治療が所望される哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、動物園の動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、及び非ヒト霊長類のような非ヒト動物を含む）を意味する。更により具体的には、本明細書の患者はヒトである。本発明との関連において、患者は、白人であり得る。
【００１９】
用語「被験者」は、本明細書において、血管新生障害の一以上の徴候、症状、又は他の指標を経験している又は経験した、治療対象の患者を含む任意の単一のヒト被験者である。被験者として含まれることが意図されるのは、疾患の臨床的兆候を示していない、臨床研究試験に関与する任意の被験者、又は疫学的研究に関与する被験者、又は一度対照として用いられた被験者である。被験者は、以前に抗癌剤で治療されていてもよいし、又はそのように治療されていなくてもよい。被験者は、本明細書における治療が開始されるときに使用されている追加の薬剤に対してナイーブであってもよく、すなわち、被験者は、「ベースライン」で （すなわち、治療が開始される前に被験者をスクリーニングする日など、本明細書における治療法における抗癌の最初の用量の投与前の時点における設定点において）、例えば、抗腫瘍剤、化学療法剤、成長阻害剤、細胞毒性剤で以前に治療されていない可能性がある。そのような「ナイーブ」被験者は、一般に、そのような追加の薬剤を用いた治療の候補者であると考えられる。
【００２０】
用語「罹患している患者」とは、例えば癌、生理学的及び病理学的血管新生に関わる疾患及び／又は腫瘍性疾患などの特定の悪性疾患に関する臨床徴候を示す患者を指す。
【００２１】
本明細書で用いられるように、「治療法」又は「治療」は、治療されている個体又は細胞の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために又は臨床病理の過程においてのいずれかで実施できる。治療の望ましい効果は、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的結果の縮減、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。
【００２２】
用語「治療効果」は、用語「全生存期間」と「無増悪生存期間」を包含する。
【００２３】
用語「全生存期間」は、患者が生存する治療中及び治療後の期間の長さを指す。当業者は理解するように、患者が、他の患者サブグループと比較して、統計学的に有意なより長い平均生存期間を有する患者サブグループに属する場合、患者の全生存期間が改善又は向上される。
【００２４】
用語「無増悪生存期間」は、治療担当医師又は治験責任医師の評価によると、患者の疾患は悪化しない、すなわち進行しない、治療中及び治療後の期間の長さを指す。当業者は理解するように、患者が、同様の状況の患者の対照群の平均無増悪生存期間と比較して、疾患が進行しない期間がより長い患者サブグループに属する場合、患者の無増悪生存期間が改善又は向上される。
【００２５】
用語「薬学的組成物」は、該医薬の生物学的活性を有効にするような形態であって、該製剤が投与される被験者への許容できない毒性のある追加成分を含まない無菌製剤を指す。
【００２６】
２．詳細な実施態様
本発明において、ＶＥＧＦＲ−１遺伝子におけるｒｓ７９９３４１８ＳＮＰが、血管新生阻害剤を用いた治療に対する全生存期間（ＯＳ）及び／又は無増悪生存期間（ＰＦＳ）のためのマーカー又は予測バイオマーカーとして同定された。用語「マーカー」と「予測バイオマーカー」は、交換可能に使用することができ、遺伝子の特定の対立遺伝子変異体を指す。変異又はマーカーはまた、一塩基多型（ＳＮＰ）と呼ばれる場合もある。ＶＥＧＦＲ−１のアミノ酸及び核酸と同様、ＳＮＰ上の配列情報も、それぞれの参照／アクセッション番号、例えば、ｒｓ７９９３４１８、ＮＰ＿００２０１０及びＮＭ＿００２０１９を用いてＮＣＢＩウェブサイト上で入手可能である。ｒｓ７９９３４１８の配列情報は、更に表１に示されている。本発明との関連において、用語「ＶＥＧＦＲ−１」は、それの変異体及び／又はアイソフォームをも包含する。
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【００２７】
本発明の方法にしたがって、ＶＥＧＦＲ−１のＳＮＰが、ベバシズマブを用いた２つの第３相試験、すなわち、ＡＶＩＴＡ（膵臓癌、Van Cutsem, J. Clin. Oncol. 2009 27:2231-2237参照）及びＡＶＯＲＥＮ（腎臓癌、Escudier 他, Lancet 2007 370:2103参照）から得られたサンプルを用いて分析された。
【００２８】
例に示されているように、ＶＥＧＦＲ−１におけるｒｓ７９９３４１８のＳＮＰが、４つのタグＳＮＰ、すなわち、ｒｓ９５５４３１６、ｒｓ９５８２０３６、ｒｓ９５１３０７０及びｒｓ９５５４３２０  によって表されるＶＥＧＦＲ−１遺伝子座とベバシズマブで治療されたＡＶＩＴＡからの患者におけるＰＦＳとＯＳとの間の関連性の基礎にある機能的変異体として同定された。更に、ｒｓ７９９３４１８は、ＡＶＯＲＥＮにおけるベバシズマブで治療された患者のＰＦＳと相関があった（対立遺伝子あたり、ＨＲ＝１．８，Ｐ＝０．０３３）。プラセボ被験者においては全く効果が見られず（対立遺伝子あたり、ＨＲ＝０．８，Ｐ＝０．４９）、これは、ｒｓ７９９３４１８がベバシズマブ治療による良好な治療成績のための予測マーカーとして役立ちうることを示唆している。
【００２９】
従って、本発明は、癌に罹患している患者が、ベバシズマブ又はベバシズマブと本質的に同じＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を用いた治療法によって適切に治療されるかどうかを決定するインビトロでの方法を提供し、該方法は、
（ａ）癌に罹患している患者から得られたサンプルにおいて、位置１２１３のチロシンについてＴＡＴコドン及びＴＡＣコドンにそれぞれ対応するＶＥＧＦＲ−１のエクソン２８に位置する同義置換Ｔ／Ｃ  ＳＮＰでの遺伝子型を決定すること、及び
（ｂ）前記遺伝子型に基づいて、前記患者が、ベバシズマブ又はベバシズマブと本質的に同じＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を用いた治療法によってより適切に治療されるか又はあまり適切に治療されないかを同定することを含み、ここで前記ＳＮＰでの各Ｔ対立遺伝子の存在は、前記患者がより適切に治療される可能性の増大を示し、又は前記ＳＮＰでの各Ｃ対立遺伝子の存在は前記患者があまり適切に治療されない可能性の増大を示す。一実施態様において、前記方法は更に血管新生阻害剤を用いた前記治療法により前記患者を治療することを含む。
【００３０】
より具体的には、本発明は、ベバシズマブ又はベバシズマブと本質的に同じＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を用いた治療法によって患者が適切に治療されるかどうかを決定するインビトロでの方法を提供し、該方法は、
（ａ）癌に罹患している患者から得られたサンプルにおいて、位置１２１３のチロシンについてＴＡＴコドン及びＴＡＣコドンにそれぞれ対応するＶＥＧＦＲ−１のエクソン２８に位置する同義置換Ｔ／Ｃ  ＳＮＰでの遺伝子型を決定すること、及び
（ｂ）前記遺伝子型に基づいて、前記患者が、ベバシズマブ又はベバシズマブと本質的に同じＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を用いた治療法によってより適切に治療されるか又はあまり適切に治療されないかを同定することを含み、ここで前記ＳＮＰでのＴＴ又はＴＣ遺伝子型の存在は、前記患者が前記ＳＮＰでＣＣ遺伝子型を有する患者よりもより適切に治療される可能性の増大を示し、又は前記ＳＮＰでのＣＣ遺伝子型の存在は、前記患者が前記ＳＮＰでＴＴ又はＴＣ遺伝子型を有する患者よりも適切に治療されない可能性の増大を示す。又は
（ｂ’）前記遺伝子型に基づいて、患者が、ベバシズマブ又はベバシズマブと本質的に同じＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を用いた治療法によってより適切に治療されるか又はあまり適切に治療されないかを同定することを含み、ここで前記ＳＮＰでのＴＴ遺伝子型の存在は、前記患者が前記ＳＮＰでＴＣ又はＣＣ遺伝子型を有する患者よりもより適切に治療される可能性の増大を示し、又は前記ＳＮＰでのＴＣ又はＣＣ遺伝子型の存在は、前記患者が前記ＳＮＰでＴＴ遺伝子型を有する患者よりも適切に治療されない可能性の増大を示す。一実施態様において、前記方法は更に血管新生阻害剤を用いた前記治療法により前記患者を治療することを含む。
【００３１】
本発明は更に、癌に罹患している患者を治療するために、ベバシズマブ又はベバシズマブと本質的に同じＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を含む薬学的組成物を提供し、ここで前記患者は、インビトロでの方法で、前記血管新生阻害剤を用いてより適切に治療されると同定されており、該方法は、
（ａ）癌に罹患している患者から得られたサンプルにおいて、位置１２１３のチロシンについてＴＡＴコドン及びＴＡＣコドンにそれぞれ対応するＶＥＧＦＲ−１のエクソン２８に位置する同義置換Ｔ／Ｃ  ＳＮＰでの遺伝子型を決定すること、及び
（ｂ）前記遺伝子型に基づいて、前記患者が、ベバシズマブ又はベバシズマブと本質的に同じＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を用いた治療法によってより適切に治療されるか又はあまり適切に治療されないかを同定することを含み、ここで前記ＳＮＰでの各Ｔ対立遺伝子の存在は、前記患者がより適切に治療される可能性の増大を示し、又は前記ＳＮＰでの各Ｃ対立遺伝子の存在は前記患者があまり適切には治療されない可能性の増大を示す。
【００３２】
より具体的には、本発明は、治療を必要とする患者を治療するために、ベバシズマブ又はベバシズマブと本質的に同じＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を含む薬学的組成物を提供し、ここで前記患者は、インビトロでの方法で、前記血管新生阻害剤によってより適切に治療されると同定されており、該方法は、
（ａ）癌に罹患している患者から得られたサンプルにおいて、位置１２１３のチロシンについてＴＡＴコドン及びＴＡＣコドンにそれぞれ対応するＶＥＧＦＲ１のエクソン２８に位置する同義置換Ｔ／Ｃ  ＳＮＰでの遺伝子型を決定すること、及び
（ｂ）前記遺伝子型に基づいて、前記患者が、ベバシズマブ又はベバシズマブと本質的に同じＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を用いた治療法によってより適切に治療されるか又はあまり適切に治療されないかを同定することを含み、ここで前記ＳＮＰでのＴＴ又はＴＣ遺伝子型の存在は、前記患者が前記ＳＮＰでＣＣ遺伝子型を有する患者よりもより適切に治療される可能性の増大を示し、又は前記ＳＮＰでのＣＣ遺伝子型の存在は、前記患者が前記ＳＮＰでＴＴ又はＴＣ遺伝子型を有する患者よりも適切に治療されない可能性の増大を示す。又は
（ｂ’）前記遺伝子型に基づいて、ベバシズマブ又はベバシズマブと本質的に同じＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を用いた治療法により、患者がより適切に治療されるか又はあまり適切に治療されないかを同定することを含み、ここで前記ＳＮＰでのＴＴ遺伝子型の存在は、前記患者が前記ＳＮＰでＴＣ又はＣＣ遺伝子型を有する患者よりもより適切に治療される可能性の増大を示し、又は前記ＳＮＰでのＴＣ又はＣＣ遺伝子型の存在は、前記患者が前記ＳＮＰでＴＴ遺伝子型を有する患者よりも適切に治療されない可能性の増大を示す。
【００３３】
本発明は更に、ベバシズマブ又はベバシズマブと本質的に同じＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を加えることによって、癌に罹患している患者の化学療法剤又は化学療法レジメンの治療効果を改善するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）癌に罹患している患者から得られたサンプルにおいて、位置１２１３のチロシンについてＴＡＴコドン及びＴＡＣコドンにそれぞれ対応するＶＥＧＦＲ１のエクソン２８に位置する同義置換Ｔ／Ｃ  ＳＮＰでの遺伝子型を決定すること、
（ｂ）前記遺伝子型に基づいて、ベバシズマブ又はベバシズマブと本質的に同じＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤の添加により、前記患者がより適切に治療されると同定すること、ここで前記ＳＮＰでの各Ｔ対立遺伝子の存在は、前記患者がより適切に治療される可能性の増大を示す、及び
（ｃ）（ｂ）に従って、より適切に治療されると同定された前記患者に、前記血管新生阻害剤を化学療法剤又は化学療法レジメンと組み合わせて投与することを含む。
【００３４】
より具体的には、本発明は、ベバシズマブ又はベバシズマブと本質的に同じＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を加えることによって、癌に罹患している患者の化学療法剤又は化学療法レジメンの治療効果を改善するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）癌に罹患している患者から得られたサンプルにおいて、位置１２１３のチロシンについてＴＡＴコドン及びＴＡＣコドンにそれぞれ対応するＶＥＧＦＲ１のエクソン２８に位置する同義置換Ｔ／Ｃ  ＳＮＰでの遺伝子型を決定すること、
（ｂ）前記遺伝子型に基づいて、前記患者が、ベバシズマブ又はベバシズマブと本質的に同じＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を用いた治療法によってより適切に治療されるか又はあまり適切に治療されないかを同定すること、ここで前記ＳＮＰでのＴＴ又はＴＣ遺伝子型の存在は、前記患者が前記ＳＮＰでＣＣ遺伝子型を有する患者よりもより適切に治療される可能性の増大を示し、又は前記ＳＮＰでのＣＣ遺伝子型の存在は、前記患者が前記ＳＮＰでＴＴ又はＴＣ遺伝子型を有する患者よりも適切に治療されない可能性の増大を示す、又は
（ｂ’）前記遺伝子型に基づいて、患者が、ベバシズマブ又はベバシズマブと本質的に同じＶＥＧＦ上のエピトープに結合する抗体を含む血管新生阻害剤を用いた治療法によってより適切に治療されるか又はあまり適切に治療されないかを同定すること、ここで前記ＳＮＰでのＴＴ遺伝子型の存在は、前記患者が前記ＳＮＰでＴＣ又はＣＣ遺伝子型を有する患者よりもより適切に治療される可能性の増大を示し、又は前記ＳＮＰでのＴＣ又はＣＣ遺伝子型の存在は前記患者が前記ＳＮＰでＴＴ遺伝子型を有する患者よりも適切に治療されないことを示す、及び
（ｃ）（ｂ）又は（ｂ’）に従って、より適切に治療されると同定された患者に、前記血管新生阻害剤を化学療法剤又は化学療法レジメンと組み合わせて投与することを含む。
【００３５】
一実施態様において、患者が血管新生阻害剤を用いた治療法によって適切に治療されるかが、ＰＦＳ又はＯＳが改善されるか、より具体的にはＰＦＳが改善されるかの観点から決定される。
【００３６】
一実施態様において、癌は、大腸癌、グリア芽腫、腎臓癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、胃癌及び肺癌、より具体的には腎臓癌及び膵臓癌からなる群から選択される。
【００３７】
一実施態様において、患者は、生理学上又は病理学上の血管新生異常と診断された患者でありうる。
【００３８】
一実施態様において、前記血管新生阻害剤は化学療法剤又は化学療法レジメンとの併用処置として投与される。更なる実施態様において、前記血管新生阻害剤は、ドセタキセル及びパクリタキセルなどのタキサン、インターフェロンアルファ、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、ゲムシタビン、エルロチニブ及びカルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチンなど白金系化学療法剤からなる群から選択される一以上の薬剤と共に投与される。より具体的には、前記血管新生阻害剤は、ゲムシタビン−エルロチニブ及びインターフェロンアルファからなる群から選択される化学療法剤又は化学療法レジメンとの併用処置として投与される。更に、前記血管新生阻害剤は、放射線療法との併用処置として投与され得る。
【００３９】
本発明との関連において、サンプルは生物学的サンプルであり、血液及び／又は組織サンプルであってもよい。一実施態様において、前記サンプルは血液サンプルであり、より具体的には、末梢血サンプルである。本発明との関連において、前記サンプルはＤＮＡサンプルである。前記ＤＮＡサンプルは、生殖細胞系ＤＮＡ又は体細胞ＤＮＡ、より具体的には生殖細胞系ＤＮＡでありうる。
【００４０】
一実施態様において、前記遺伝子型は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって決定される。以下のＳＮＰの検出の詳細な説明に加えて、以下の参考文献、例えば、Storm 他, Methods Mol. Biol. 212:241-62, 2003は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析ベースのＳＮＰ遺伝子型判定のための指針を提供する。
【００４１】
３．核酸多型の検出
ＳＮＰの存在について核酸を評価するための検出技術は、分子遺伝学の分野で公知の手順を含む。すべてではないが、前記方法の多くは、核酸の増幅を含む。増幅を行うための十分な指針が当該分野で提供される。代表的な参考文献には、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (H.A.Erlich編, Freeman Press, NY, N.Y., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis他編, Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, 1994-1999 (2004年4月までの追加改訂版を含む); Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第3版, 2001) 等のマニュアルが含まれる。一塩基多型の検出のための一般的な方法が、Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols, Pui-Yan Kwok編, 2003, Humana Press に開示されている。
【００４２】
前記方法は、典型的には、ＰＣＲ工程を利用するが、他の増幅プロトコールを使用することもできる。適切な増幅方法は、リガーゼ連鎖反応(例えば、Wu & Wallace, Genomics 4:560-569, 1988 を参照)；鎖置換アッセイ (例えば Walker 他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396, 1992;米国特許第５，４５５，１６６号を参照)；及び、米国特許第５，４３７，９９０号；米国特許第５，４０９，８１８号；及び米国特許第５，３９９，４９１号に記載されている方法、転写増幅方式（ＴＡＳ）(Kwoh 他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177, 1989) 及び自家持続配列複製法（３ＳＲ）(Guatelli 他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878, 1990; 国際公開第９２／０８８００号) を含むいくつかの転写ベースの増幅方式を含む。あるいは、Ｑβレプリカーゼ増幅などの検出可能なレベルにプローブを増幅する方法を使用することができる(Kramer & Lizardi, Nature 339:401-402, 1989; Lomeli 他, Clin. Chem. 35:1826-1831, 1989)。公知の増幅方法の総説は、例えば、AbramsonとMyersによりCurrent Opinion in Biotechnology 4:41-47, 1993において提供される。
【００４３】
個体の遺伝子型、ハプロタイプ、ＳＮＰ、マイクロサテライト又は他の多型性の検出は、オリゴヌクレオチドプライマー及び／又はプローブを用いて行うことができる。オリゴヌクレオチドは、任意の適切な方法、通常、化学合成によって調製することができる。オリゴヌクレオチドは、市販の試薬及び器具を用いて合成することができる。あるいは、それらは商業的供給源から購入することができる。オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当技術分野で周知である(例えば、Narang 他, Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979; Brown他, Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979; Beaucage 他, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981; 及び米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法（the solid support method）を参照)。加えて、上記合成方法の修飾が、合成されたオリゴヌクレオチドに関して酵素作用に望ましく影響を与えるために使用することができる。例えば、修飾されたホスホジエステル結合（例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホアミデート、又はボラノホスフェート）、又はリン酸誘導体以外の結合のオリゴヌクレオチドへの取り込みが、選択された部位での切断を防ぐために使用されてもよい。更に、２’−アミノ修飾糖の使用は、新しい核酸鎖の合成のための鋳型でもある核酸にハイブリダイズする場合、オリゴヌクレオチドの消化より置換を好む傾向がある。
【００４４】
個体の遺伝子型は、当技術分野において周知である多くの検出方法を用いて決定することができる。ほとんどのアッセイは、いくつかの一般的なプロトコール：対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーション、プライマー伸長、対立遺伝子特異的ライゲーション、シークエンシング、又は電気泳動分離技術、例えば、一本鎖高次構造多型法（ＳＳＣＰ）及びヘテロ二本鎖分析のいずれかを必要とする。例示的なアッセイは、５’−ヌクレアーゼアッセイ、鋳型指向ダイターミネーターの取り込み、分子ビーコン対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドアッセイ、一塩基伸長アッセイ及びリアルタイムのピロリン酸塩配列によるＳＮＰスコアリングを含む。増幅配列の解析は、マイクロチップ、蛍光偏光アッセイ、及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型）質量分析などの様々な技術を用いて行うことができる。更にまた使用することができる２つの方法は、フラップヌクレアーゼによる侵襲的切断及びパッドロックプローブを採用した方法論に基づくアッセイである。
【００４５】
特定の対立遺伝子の存在又は非存在の決定は、一般に、分析対象の個体から得られる核酸サンプルを分析することによって行われる。多くの場合、核酸サンプルはゲノムＤＮＡを含む。ゲノムＤＮＡは、典型的には、血液サンプルから得られるが、他の細胞又は組織から得ることもできる。
【００４６】
多型性対立遺伝子の存在についてＲＮＡサンプルを分析することも可能である。例えば、ｍＲＮＡは、一以上の多型性部位での個体の遺伝子型を決定するために使用することができる。この場合には、核酸サンプルは、標的核酸が発現される細胞、例えば脂肪細胞から得られる。米国特許第５３１０６５２号；米国特許第５３２２７７０号；米国特許第５５６１０５８号；米国特許第５６４１８６４号；及び米国特許第５６９３５１７号に記載されているように、このような分析は、例えば、ウイルス逆転写酵素を用いて標的ＲＮＡを最初に逆転写し、次いで得られたｃＤＮＡを増幅することによって、又は複合高温逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、行うことができる。
【００４７】
ＳＮＰを検出するための核酸サンプルの分析のための頻繁に使用される方法論を簡潔に説明する。しかしながら、当該分野で公知の任意の方法を、単一ヌクレオチド置換の存在を検出するために、本発明において使用することができる。
【００４８】
ａ．対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション
この手法は、一般的に対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＡＳＯ）とも呼ばれ (例えば、Stoneking 他, Am. J. Hum. Genet. 48:70-382, 1991; Saiki 他, Nature 324, 163-166, 1986; 欧州特許第235,726号; 及び国際公開第89/11548号)、核酸サンプルの増幅から得られた増幅産物に変異体の一つに特異的なオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせることによって一つの塩基だけ異なる２つのＤＮＡ分子間を区別することに依存している。この方法は通常、短いオリゴヌクレオチド、例えば１５−２０塩基長を用いる。プローブは、差次的に一つの変異体対別の変異体にハイブリダイズするように設計されている。そのようなプローブを設計するための原理と指針は、当該分野で、例えば本明細書に引用された参考文献において入手可能である。ハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子間のハイブリダイゼーション強度に有意差があるように十分にストリンジェントであるべきで、本質的に二値応答を生成し、それによりプローブは対立遺伝子の一方にのみハイブリダイズする。幾つかのプローブは、多型部位がプローブの中央位置と合致するように（例えば、１５塩基のオリゴヌクレオチド中では７位に；１６塩基のオリゴヌクレオチド中では８位又は９位のいずれかに）、標的ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズするように設計されているが、しかしこの設計は必要ではない。
【００４９】
対立遺伝子の量及び／又は存在は、サンプルにハイブリダイズする対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの量を測定することによって決定される。一般的に、オリゴヌクレオチドは、蛍光標識などの標識で標識されている。例えば、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、ＳＮＰ配列を表す固定化されたオリゴヌクレオチドに適用される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件の後、蛍光強度が、各ＳＮＰオリゴヌクレオチドについて測定される。
【００５０】
一実施態様において、多型部位に存在するヌクレオチドは、多型部位を含む領域内の多型性対立遺伝子の一つと完全に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーと、配列特異的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションすることによって同定される。プローブ又はプライマーのハイブリダイズ配列及び配列特異的ハイブリダイゼーション条件が、多型部位での単一のミスマッチがそれが効率的に形成されないように十分にハイブリダイゼーション二本鎖を不安定化させるように選択される。従って、配列特異的なハイブリダイゼーション条件下で、安定な二本鎖は、プローブ又はプライマーと完全に相補的な対立遺伝子配列との間にのみ形成される。従って、多型部位を含む領域における対立遺伝子配列と完全に相補的である、長さが約１０から約３５ヌクレオチド、通常は長さが約１５から約３５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが本発明の範囲内にある。
【００５１】
代替実施態様では、多型部位に存在するヌクレオチドは、多型部位を含む領域内のＳＮＰ対立遺伝子の一つと実質的に相補的で、及び多型部位での対立遺伝子と完全に相補的であるオリゴヌクレオチドと、十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションすることによって同定される。非多型部位で生じるミスマッチが両方の対立遺伝子配列とミスマッチであるため、標的対立遺伝子配列と形成される二本鎖及び対応する非標的対立遺伝子配列と形成される二本鎖におけるミスマッチの数の差は、標的対立遺伝子配列と完全に相補的なオリゴヌクレオチドを用いた場合と同じである。この実施態様では、非標的配列との安定な二本鎖の形成を排除するのに十分なストリンジェンシーを維持しつつ、ハイブリダイゼーション条件は、標的配列と安定な二本鎖の形成を可能にするのに十分に緩和される。そのような十分ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、安定な二本鎖は、プローブ又はプライマーと標的対立遺伝子との間にのみ形成されるであろう。従って、多型部位を含む領域内の対立遺伝子配列と実質的に相補的であり、多型部位での対立遺伝子配列と完全に相補的である、長さが約１０から約３５ヌクレオチド、通常は長さが約１５から約３５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが本発明の範囲内にある。
【００５２】
完全というよりもむしろ実質的に相補的なオリゴヌクレオチドの使用が、ハイブリダイゼーション条件の最適化が制限されるアッセイ形式において望まれうる。例えば、典型的な多標的固定化オリゴヌクレオチドアッセイ形式では、各標的のためのプローブ又はプライマーが、単一の固体支持体上に固定化される。ハイブリダイゼーションは、標的ＤＮＡを含む溶液と固体支持体を接触させることによって同時に行われる。全てのハイブリダイゼーションが同一の条件下で実施されるので、ハイブリダイゼーション条件は各プローブ又はプライマーのために別個に最適化することができない。プローブ又はプライマーへのミスマッチの組み込みは、アッセイ形式がハイブリダイゼーション条件の調整を妨げる場合、二本鎖の安定性を調節するために使用することができる。二本鎖の安定性に対する特定の導入されたミスマッチの影響はよく知られており、二本鎖の安定性は、上述のように、機械的に推定され経験的に決定することができる。プローブ又はプライマーの正確なサイズ及び配列に依存する適切なハイブリダイゼーション条件は、本明細書に提供され当技術分野で公知の指針を用いて経験的に選択することができる。配列中の単一塩基対の相違を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーの使用が、例えば、Conner 他, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:278-282、並びに米国特許第５，４６８，６１３号及び米国特許第５，６０４，０９９号に記載されており、各々が参照により本明細書に援用される。
【００５３】
完全に一致及び一塩基がミスマッチであるハイブリダイゼーション二本鎖間の安定性の比例的変化は、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドの長さに依存する。より短いプローブ配列で形成された二本鎖は、ミスマッチの存在によって比例的により不安定化される。長さが約１５から約３５ヌクレオチドの間のオリゴヌクレオチドは、しばしば、配列特異的検出に使用される。更に、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドの末端は、連続ランダム解離及び熱エネルギーによる再アニーリングを受けるため、いずれの末端でのミスマッチも、内部で発生するミスマッチほど、ハイブリダイゼーション二本鎖を不安定化させない。標的配列における単一塩基対の変化を識別するために、多型部位がプローブの内部領域に生じるように、標的配列にハイブリダイズするプローブ配列が選択される。
【００５４】
特定の対立遺伝子にハイブリダイズするプローブ配列を選択するための上記基準は、プローブのハイブリダイズ領域、すなわち、標的配列とのハイブリダイゼーションに関与するプローブの部分に適用される。プローブは、プローブのハイブリダイゼーション特性を著しく変化させることなく、プローブを固定化するために使用されるポリＴ尾部などの付加的核酸配列に結合することができる。当業者は、本発明の方法における使用のために、標的配列に相補的でない、従って、ハイブリダイゼーションに関与しない付加的核酸配列に結合したプローブが、本質的に非結合プローブと等価であることを認識するであろう。
【００５５】
プローブ及びサンプル中の標的核酸配列との間に形成されたハイブリッドを検出するための適切なアッセイ形式は、当技術分野で知られており、固定化標的（ドットブロット）形式及び固定化プローブ（リバースドットブロット又はラインブロット）アッセイ形式が含まれる。ドットブロット及びリバースドットブロットアッセイ形式が、米国特許第５，３１０，８９３号；米国特許第５，４５１，５１２号；米国特許第５，４６８，６１３号；及び米国特許第５，６０４，０９９号に記載されており、各々が参照により本明細書に援用される。
【００５６】
ドットブロット形式では、増幅された標的ＤＮＡは、ナイロン膜などの固体支持体上に固定化される。膜−標的複合体は、適切なハイブリダイゼーション条件下で、標識されたプローブとインキュベートされ、ハイブリダイズしなかったプローブは、適切にストリンジェントな条件下で洗浄することによって除去され、膜は結合したプローブの存在について監視される。
【００５７】
リバースドットブロット（又はラインブロット）形式では、プローブは、ナイロン膜又はマイクロタイタープレートなどの固体支持体上に固定化される。標的ＤＮＡは、典型的には標識プライマーの取り込みによる増幅中に標識される。プライマーの一方又は両方を標識することができる。膜−プローブ複合体は、適切なハイブリダイゼーション条件下で、標識された増幅された標的ＤＮＡとインキュベートされ、ハイブリダイズしなかった標的ＤＮＡは、適切にストリンジェントな条件下で洗浄することによって除去され、膜は結合した標的ＤＮＡの存在について監視される。リバースラインブロット検出アッセイは実施例に記載される。
【００５８】
多型変異体の一つに特異的である対立遺伝子特異的プローブは、しばしば、他の多型変異体の対立遺伝子特異的プローブと組み合わせて使用される。幾つかの実施態様において、プローブは固体支持体上に固定化され、個体の標的配列が同時に両方のプローブを使用して分析される。核酸アレイの例は国際公開第９５／１１９９５号に記載されている。同じアレイ又は別のアレイを特徴付けられた多型性の分析に使用することができる。国際公開第９５／１１９９５号はまた、事前に特徴付けられた多型性の変異型を検出するために最適化されたサブアレイを説明している。そのようなサブアレイは、本明細書に記載の多型性の存在を検出するのに用いることができる。
【００５９】
ｂ．対立遺伝子特異的プライマー
多型性はまた、一般的に対立遺伝子特異的増幅又はプライマー伸長法を用いて検出される。これらの反応は、プライマーの３’末端のミスマッチを介して多型性を特異的に標的とするように設計されたプライマーの使用を典型的に含む。ミスマッチの存在は、ポリメラーゼが誤りを訂正する活性を欠いているときプライマーを伸長するポリメラーゼの能力に影響を与える。例えば、対立遺伝子特異的増幅又は伸長に基づく方法を用いて対立遺伝子配列を検出するために、多型性の一つの対立遺伝子に相補的なプライマーは、３’末端ヌクレオチドが多型位置でハイブリダイズするように設計される。特定の対立遺伝子の存在は、伸長を開始するプライマーの能力によって決定することができる。３’末端がミスマッチである場合、伸長が妨げられる。
【００６０】
幾つかの実施態様において、プライマーは増幅反応において第二のプライマーと組み合わせて使用される。第二のプライマーは多型位置に関係のない部位でハイブリダイズする。特定の対立遺伝子型が存在することを示す検出可能な生成物をもたらす増幅が、二つのプライマーから発生する。対立遺伝子特異的増幅又は伸長に基づく方法が、例えば、国際公開第９３／２２４５６号；米国特許第５，１３７，８０６号；米国特許第５，５９５，８９０号；米国特許第５，６３９，６１１号；及び米国特許第４，８５１，３３１号に記載されている。
【００６１】
対立遺伝子特異的増幅に基づく遺伝子型決定を用いて、対立遺伝子の同定は、増幅された標的配列の存在又は非存在の検出のみを必要とする。増幅された標的配列の検出のための方法は当該分野で周知である。例えば、記載されるゲル電気泳動及びプローブハイブリダイゼーションアッセイは、しばしば、核酸の存在を検出するために使用される。
【００６２】
別法のプローブレス方式では、増幅された核酸は、反応混合物中の二本鎖ＤＮＡの総量の増加をモニターすることにより検出され、例えば、米国特許第５，９９４，０５６号；並びに欧州特許出願公開第４８７，２１８号及び欧州特許出願公開第５１２，３３４号に記載されている。二本鎖標的ＤＮＡの検出は、様々なＤＮＡ結合色素、例えば、ＳＹＢＲグリーンが二本鎖ＤＮＡに結合したときに呈する蛍光の増大に依存する。
【００６３】
当業者によって理解されるように、対立遺伝子特異的な増幅方法は、特定の対立遺伝子を標的化するために複数の対立遺伝子特異的プライマーを用いる反応で行うことができる。このような多重アプリケーション用のプライマーは、一般的に識別可能な標識で標識されているか又は、対立遺伝子から産生される増幅産物がサイズによって識別可能であるように選択される。従って、例えば、単一サンプル中の両方の対立遺伝子は、増幅産物のゲル分析により単一増幅を用いて同定することができる。
【００６４】
対立遺伝子特異的プローブの場合と同様に、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、ハイブリダイズ領域における多型性対立遺伝子の一つに厳密に相補的であり得るか、又はオリゴヌクレオチドの３’末端以外の位置で幾つかのミスマッチを有していてもよいが、該ミスマッチは両方の対立遺伝子配列内の非多型部位で生じる。
【００６５】
ｃ．検出可能なプローブ
ｉ）５’−ヌクレアーゼアッセイプローブ
米国特許第５，２１０，０１５号；米国特許第５，４８７，９７２号；及び米国特許第５，８０４，３７５号；並びにHolland他,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276-7280 に記載されているように、遺伝子型決定はまた、“ＴａｑＭａｎ（登録商標）”又は  ５’−ヌクレアーゼアッセイを用いて行うことができる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイにおいて、増幅された領域内でハイブリダイズする標識検出プローブが増幅反応中に添加される。プローブがＤＮＡ合成のためのプライマーとして作用するのを防止するように、前記プローブが修飾される。増幅は、５’から３’−エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる。増幅の各合成ステップの間、伸長されたプライマーから下流の標的核酸にハイブリダイズする任意のプローブは、ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’−エキソヌクレアーゼ活性によって分解される。従って、新規標的鎖の合成はプローブの分解をももたらし、分解産物の蓄積は標的配列の合成の尺度を提供する。
【００６６】
ハイブリダイゼーションプローブは、ＳＮＰ対立遺伝子間を識別する対立遺伝子特異的プローブであり得る。あるいは、この方法は、対立遺伝子特異的プライマー及び増幅産物に結合する標識プローブを用いて行うことができる。
【００６７】
分解産物を検出するのに適した任意の方法は、５’−ヌクレアーゼアッセイにおいて使用することができる。しばしば、検出プローブは、一方が他の色素の蛍光を消光することが可能である２つの蛍光色素で標識される。プローブがハイブリダイズしていない状態にあるとき消光が起き、そしてＤＮＡポリメラーゼの５’から３’−エキソヌクレアーゼ活性によるプローブの切断が２つの色素間で起こるように、色素がプローブに結合され、通常、一方が５’末端に、他方が内側部位に結合される。増幅は、消光の同時消失及び最初に消光される色素からの観察可能な蛍光の増加を伴う色素間のプローブの切断を生じる。分解産物の蓄積は、反応蛍光の増加を測定することによって監視される。米国特許第５，４９１，０６３号及び米国特許第５，５７１，６７３号は、両方とも本明細書中に参照により援用され、増幅と同時に起きるプローブの分解の代替的検出方法を記載している。
【００６８】
ｉｉ）二次構造プローブ
二次構造変化の際に検出可能なプローブは、ＳＮＰを含む多型性の検出に適している。例示した二次構造又はステム−ループ構造プローブは、分子ビーコン又はＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プライマー／プローブを含む。分子ビーコンプローブは、フルオロフォアとクエンチャーが通常、オリゴヌクレオチドの両端に配置される、ヘアピン構造を形成できる一本鎖オリゴ核酸プローブである。プローブの両端で、短い相補的な配列は、フルオロフォアとクエンチャーが近接状態になることを可能にする分子内ステムの形成を可能にする。分子ビーコンのループ部分は、目的の標的核酸に対して相補的である。目的のその標的核酸に対するこのプローブの結合は、ステムを引き離すハイブリッドを形成する。これは、フルオロフォアとクエンチャーを動かして互いに離し、より強い蛍光シグナルをもたらすコンフォメーション変化を引き起こす。しかしながら、分子ビーコンプローブは、プローブ標的の小さな配列変異に非常に敏感である(Tyagi S. and Kramer F. R., Nature Biotechnology, Vol. 14, pages 303-308 (1996); Tyagi他, Nature Biotechnology, Vol. 16, pages 49-53(1998); Piatek他, Nature Biotechnology, Vol. 16, pages 359-363 (1998); Marras S.他,Genetic Analysis: Biomolecular Engineering, Vol. 14, pages 151-156 (1999); Tpp I.他, BioTechniques, Vol 28, pages 732-738 (2000))。Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プライマー/プローブは、プライマーと共有結合したステムループ構造プローブを含む。
【００６９】
ｄ．ＤＮＡ配列と一塩基伸長
ＳＮＰはまた、直接配列決定法によって検出することができる。方法としては、例えば、ジデオキシ配列決定法に基づく方法や、マクサムとギルバート配列などの他の方法が挙げられる（例えば、前掲Sambrook and Russellを参照）。
【００７０】
他の検出方法は、オリゴヌクレオチドの長さの産物のパイロシークエンシング（商標）を含む。そのような方法は、多くの場合、ＰＣＲのような増幅技術を使用する。例えば、パイロシーケンシングでは、配列決定プライマーは、一本鎖ＰＣＲ増幅ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズされ；  酵素であるＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ及びアピラーゼ及び基質であるアデノシン５’ホスホ硫酸（ＡＰＳ）及びルシフェリンと共にインキュベートされる。４つのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の第一番目を反応に加える。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鎖にデオキシヌクレオチド三リン酸の取り込みを、それが鋳型鎖中の塩基に相補的である場合に、触媒する。各取り込み事象は、取り込まれたヌクレオチドの量に対して等モル量のピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を伴う。ＡＴＰスルフリラーゼはアデノシン５’ホスホ硫酸の存在下で定量的にＰＰｉをＡＴＰに変換する。このＡＴＰは、ＡＴＰの量に比例する量で可視光を生み出すルシフェリンのオキシルシフェリンへのルシフェラーゼ媒介性変換を駆動する。ルシフェラーゼ触媒反応において生成された光は、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラによって検出され、パイログラム（商標）においてピークとして見られる。各光シグナルは、取り込まれたヌクレオチドの数に比例する。ヌクレオチド分解酵素のアピラーゼは、取り込まれていないｄＮＴＰ及び過剰のＡＴＰを継続的に分解する。分解が完了すると、別のｄＮＴＰが添加される。
【００７１】
ＳＮＰを特徴付けるための別の類似の方法は、完全ＰＣＲの使用を必要としないが、通常、検討するヌクレオチドに相補的である、単一の蛍光標識されたジデオキシリボ核酸分子（ｄｄＮＴＰ）によるプライマーの伸長だけを使用する。多型部位のヌクレオチドは、一塩基だけ伸長されており、蛍光標識されたプライマーの検出を介して同定することができる(例えば、Kobayashi 他, Mol. Cell. Probes, 9:175-182, 1995)。
【００７２】
ｅ．電気泳動
ポリメラーゼ連鎖反応を用いて生成された増幅産物は、変性勾配ゲル電気泳動を用いて分析することができる。異なる対立遺伝子は異なる配列依存性融解特性及び溶液中のＤＮＡの電気泳動移動に基づいて同定することができる (例えば、Erlich編, PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification, W. H. Freeman and Co, New York, 1992, 7章を参照)。
【００７３】
マイクロサテライト多型性の区別は、キャピラリー電気泳動を用いて行うことができる。キャピラリー電気泳動は、好都合には、特定のマイクロサテライト対立遺伝子における反復の数の同定を可能とする。キャピラリー電気泳動のＤＮＡ多型解析への適用は、当業者に周知である(例えば, Szantai他, J Chromatogr A. (2005) 1079(1-2):41-9; Bjorheim and Ekstrom, Electrophoresis (2005) 26(13):2520-30 及び Mitchelson, Mol Biotechnol. (2003) 24(1):41-68を参照)。
【００７４】
ｆ．一本鎖高次構造多型解析
標的配列の対立遺伝子は、一本鎖ＰＣＲ産物の電気泳動移動度の差異により塩基の違いを識別する 一本鎖高次構造多型解析を用いて区別することができ、例えば、Orita 他, Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 2766-2770 (1989)に記載されている。上記のように増幅されたＰＣＲ産物を生成することができ、そして加熱して又は他の方法で変性させて、一本鎖増幅産物を形成する。一本鎖核酸は、リフォールディングし又は塩基配列に部分的に依存する二次構造を形成してもよい。一本鎖増幅産物の異なる電気泳動移動度は、標的の対立遺伝子間の塩基配列の差に関連しうる。
【００７５】
ＳＮＰ検出法は、しばしば、標識されたオリゴヌクレオチドを使用する。オリゴヌクレオチドは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的手段により検出可能な標識を組み込むことによって標識することができる。有用な標識は、蛍光色素、放射性標識、例えば３２Ｐ、高電子密度試薬、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼなどの酵素、ビオチン、又はハプテン、及び、抗血清又はモノクローナル抗体が利用可能なタンパク質を含む。標識技術は当技術分野で良く知られている (例えば、前掲Current Protocols in Molecular Biology；前掲Sambrook & Russellを参照)。
【００７６】
４．治療の方法
ＥＭＥＡによると、特定の癌の治療のためのベバシズマブ（アバスチン（登録商標））の投与量は以下の通りである。結腸又は直腸の転移性癌（ｍＣＲＣ）では、推奨投与量は２週間に１回与えられる体重の５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ、又は３週間に１回与えられる体重の７．５ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇ、転移性乳癌（ｍＢＣ）では、推奨投与量は、静脈内注入として２週間に１回与えられる体重の１０ｍｇ／ｋｇ又は３週間に１回与えられる体重の１５ｍｇ／ｋｇ、及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）では、推奨投与量は、静脈内注入として３週間に１回与えられる体重の７．５ｍｇ  ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇである。ＮＳＣＬＣ患者における臨床的利益は７．５ｍｇ／ｋｇ及び１５  ｍｇ／ｋｇの用量の両方で実証されている。詳細は、Pharmacodynamic Properties,Non-small cell lung cancer (NSCLC)のセクション５．１を参照。進行性及び／又は転移性腎細胞癌（ｍＲＣＣ）では、好ましい投与量は静脈内注入として２週間に１回与えられる体重の１０ｍｇ／ｋｇである（治療の６サイクルまで白金に基づく化学療法に加えて、続いて疾患の進行までベバシズマブ（アバスチン（登録商標））を単剤として）。グリオブラストーマでは特定の投与量は２週間毎に１０ｍｇ／ｋｇである。
【００７７】
本発明との関連において、血管新生阻害剤は、当該分野で公知の標準的な化学療法レジメンの一部として投与される一以上の化学療法剤との併用療法又は併用処置として又はそれらに加えて投与され得る。そのような標準的な化学療法レジメンに含まれる薬剤の例としては、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゲムシタビン、エルロチニブ、カペシタビン、ドセタキセル及びパクリタキセルなどのタキサン、インターフェロンアルファ、ビノレルビン、及びパクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチンなどの白金系化学療法剤が挙げられる。転移性膵臓癌の併用処置の例としては、２週間に１回与えられる体重の５ｍｇ／ｋｇ若しくは１０ｍｇ／ｋｇの用量での、又は３週間に１回与えられる体重の７．５ｍｇ／ｋｇ若しくは１５ｍｇ／ｋｇの用量でのゲムシタビンエルロチニブ＋ベバシズマブが含まれる。腎細胞癌の併用処置の例としては、２週間に１回与えられる体重の１０ｍｇ／ｋｇの用量でのインターフェロンアルファ＋ベバシズマブが含まれる。更に、患者は、ＩＦＬ、例えば、ボーラスＩＦＬとも称する、イリノテカン、５−フルオロウラシル、ロイコボリンの組み合わせで、又はＦＯＬＦＯＸ４レジメンとも称するオキサリプラチン、ロイコボリン及び５−フルオロウラシルの組合せで、又はＸＥＬＯＸとも称するカペシタビン及びオキサリプラチンの組み合わせで併用治療することができる。従って、本発明の更なる実施態様において、悪性疾患又は生理学的及び病理学的血管新生を伴う疾患に罹患している患者は、例えば、５フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゲムシタビンエルロチニブ、カペシタビン、及び／又はパクリタキセル、カルボプラチン及びオキサリプラチンなどの白金系化学療法剤のうち一以上の化学療法剤により治療されている。併用治療又は併用処置の例としては、転移性大腸癌については、ボーラスＩＦＬと共に２週間ごとの５ｍｇ／ｋｇのベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、又はＦＯＬＦＯＸ４と共に２週間ごとの１０ｍｇ／ｋｇのベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、非扁平上皮非小細胞肺癌についてはカボプラチス（ｃａｂｏｐｌａｔｉｓ）／パクリタキセルと共に３週間ごとの１５ｍｇ／ｋｇのベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、及び転移性乳癌についてはパクリタキセルと共に２週間ごとの１０ｍｇ／ｋｇのベバシズマブ（アバスチン（登録商標））が挙げられる。更に、投与されるべき血管新生阻害剤は、放射線療法との併用治療又は併用処置として投与され得る。
【００７８】
５．キット
本発明はまた、上述のオリゴヌクレオチドのいずれか及び適切な検出手段を任意で含む診断組成物又はキットに関する。
【００７９】
本発明のキットは、本発明の方法を実施するために有利に使用され得、とりわけ種々の適用、例えば診断分野において又は研究ツールとして使用され得る。本発明のキットの部品は、個別にバイアルで、又は組み合わせで容器若しくは複数容器ユニットでのパッケージであり得る。前記キットの製造は、好ましくは当業者に公知の標準的な手順に従う。前記キット又は診断組成物は、例えば本明細書に記載の増幅技術を使用して、本発明の本明細書に記載される方法により一以上の変異対立遺伝子の検出のために使用され得る。
【００８０】
したがって、本発明の更なる実施態様において、本発明は、一以上のＳＮＰの遺伝子型を決定し得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む、本明細書に記載の方法を実施するために有用なキットを提供する。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、プライマー及び／又はプローブを含むことができる。
【００８１】
本発明は更に、例１及び例２並びに図１から図１６が特に参照される国際公開第２０１１／０１５３４８号と同様に、限定されないが以下の図及び例も参照することにより記載される。
【実施例】
【００８２】
患者及び方法
研究設計
ＡＶＩＴＡ（ＢＯ１７７０６）及びＡＶＯＲＥＮ（ＢＯ１７７０５）は、多施設無作為化第３相試験であって、それぞれ６０７人の転移性膵臓腺癌患者及び６４９人の転移性腎細胞癌患者を含む。ＡＶＩＴＡでは、患者は、ゲムシタビン−エルロチニブに加えてベバシズマブ（ｎ＝３０６）又はプラセボ（ｎ＝３０１）を投与されるように無作為に選定された。ＡＶＯＲＥＮでは、患者は、インターフェロンアルファ−２ａに加えてベバシズマブ（ｎ＝３２７）又はプラセボ（ｎ＝３２２）を投与されるように無作為に選定された。これらの研究の詳細が、以下に記載されている。
【００８３】
−ＡＶＩＴＡ：Van Cutsem 他  Phase III trial of bevacizumab in combination with gemcitabine and erlotinib in patients with metastatic pancreatic cancer. J. Clinc. Oncol. 27, 2231-7 (2009) 
−ＡＶＯＲＥＮ：Escudier B, Pluzanska A, Koralewski P, Ravaud A, Bracarda S, Szczylik C, 他  Bevacizumab plus interferon alfa-2a for treatment of metastatic renal cell carcinoma: a randomised, double-blind phase III trial. Lancet. 2007;370(9605):2103-2111.
【００８４】
試験プロトコール及び遺伝子バイオマーカー研究は、各施設の施設内審査委員会によって承認され、そしてヘルシンキ宣言、現行の米国食品医薬品局の臨床試験実施基準及び地域の倫理的法的要件に従って行なわれた。前記バイオマーカー研究に含まれる全ての患者は、遺伝的バイオマーカーテストのため別の書面によるインフォームドコンセントを提供した。研究治療が始まる前に、これらの分析のための血液サンプルが収集された。
【００８５】
一塩基多型の選択
ＶＥＧＦシグナルカスケードの中の以下の遺伝子が選択された：ＶＥＧＦリガンド、ＶＥＧＦホモログ（胎盤増殖因子［ＰｌＧＦ］，ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ−Ｃ，及びＶＥＧＦ−Ｄ［別名ｃ−ｆｏｓ誘導増殖因子又はＦｌＧＦ］）、ＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ−２又はＫＤＲ）及びＶＥＧＦレセプター１（ＶＥＧＦＲ−１又はＦＬＴ１），低酸素症の制御因子（低酸素誘導因子１α［ＨＩＦ１Ａ］，ＨＩＦ−２α［ＥＰＡＳ１］，ＨＩＦ−１α阻害因子［ＦＩＨ１］，フォンヒッペル・リンダウ腫瘍抑制因子［ＶＨＬ］，ヒストンアセチルトランスフェラーゼＥＰ３００），及び酸素センサー（それぞれ、プロリルヒドロキシラーゼドメイン含有タンパク質１，２，及び３［ＥＧＬＮ−２，−１，及び−３］）。各遺伝子の翻訳開始部位の上流５ｋｂ及び３’−ポリ−Ａ−アデニル化部位の下流５ｋｂまでのゲノム配列が、ハップマップデータベース（リリース２４／フェーズＩＩ）からＳＮＰを選択するために用いられた。タグＳＮＰが、ＨＡＰＬＯＶＩＥＷソフトウェアパッケージ(Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ. Haploview : analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics 2005;21:263-5)で提供されているタガー（Ｔａｇｇｅｒ）(Pe'er I, de Bakker PI, Maller J, Yelensky R, Altshuler D, Daly MJ. Evaluating and improving power in whole-genome association studies using fixed marker sets. Nat Genet 2006;38:663-7)を用いて選択された。一般的なＳＮＰのみが、即ち小さな対立遺伝子頻度（ｆ）≧０．１及びｒ２閾値＞０．８であるＳＮＰのみが考慮された。これらの基準を用いて合計１４０個のタグＳＮＰが選択された。更に、エキソン配列に位置し、頻度ｆ≧０．１で非同義アミノ酸変化を誘導する１４個のＳＮＰ、並びに、これらの遺伝子の機能又は発現に影響することが以前報告されたＶＥＧＦにあるＳＮＰ（ｒｓ６９９９４７、ｒｓ８３３０６１、ｒｓ２０１０９６３及びｒｓ３０２５０３９）、ＶＥＧＦＲ−１にあるＳＮＰ（ｒｓ１１１４５８６９１）、及びＶＥＧＦＲ−２にあるＳＮＰ（ｒｓ２０７１５５９）が、ｄｂＳＮＰデータベースから選択された。また、将来の分析を考慮に入れて、高血圧や血栓症への罹患性を増大させることが知られている２４個のＳＮＰも前記計画に含まれた。かくして合計で１８４個のＳＮＰが遺伝子型判定のために選択された。
【００８６】
遺伝子型判定
末梢血液がＫ２ＥＤＴＡバキュテイナ（登録商標）採血管の中にサンプリングされ、生殖細胞系ＤＮＡが沈殿した白血球細胞断片から抽出された。遺伝子型判定は、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）ｉＰＬＥＸ  Ｇｏｌｄ（シーケノム社、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてヴェサリウス研究センター（ルーベン、ベルギー）で盲検法で行われた。最初の遺伝子型判定ラウンドで失敗したＳＮＰは、ポリメラーゼ連鎖反応プライマーの異なる組を使用して再設計されて再試験した。２回目の設計にも失敗した２７個のＳＮＰは失敗とみなされた。全体では、１５７個のＳＮＰ（８５．３％）が遺伝子型の同定に成功し、ＡＶＩＴＡにおいて全体的な成功率は９８．５％であった。ＡＶＯＲＥＮ及び機能確認研究からのＤＮＡサンプルが、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）を用いてｒｓ７９９３４１８，ｒｓ９５５４３２０，ｒｓ９５８２０３６，ｒｓ９５５４３１６，及びｒｓ９５１３０７０を含むＳＮＰの限定された組について遺伝子型判定された。
【００８７】
統計
１９個のＳＮＰがＡＶＩＴＡにおいてｆ≦０．１の頻度で発生し、それゆえその後の分析から除外された。ハーディ・ワインベルグ平衡が、残りの１３８のＳＮＰについて自由度１の標準的なカイ２乗を用いて評価された。大きな違反は検出されなかった。連鎖不平衡（ＬＤ）の強さが、Ｈａｐｌｏｖｉｅｗソフトウェアパッケージを用いてｒ２及びＬｅｗｏｎｔｉｎ’ｓ  Ｄ’統計量とともに評価された（Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）。ＳＮＰ遺伝子型と事象結果（ＰＦＳ  ａｎｄ  ＯＳ）までの期間との間の関連が、相加的遺伝モデルによるコックス比例ハザード法を用いて最初に評価された。ＯＳ分析がベバシズマブ群のみにおいて１３８のＳＮＰの各々に対して個々に行われた。総合的な第一種の過誤率０．０５に対する有意性閾値は、ＡＶＩＴＡにおける多重比較に対するボンフェローニの補正に基づきＰ＜０．０００３６に設定された。この段階において同定された有意なＳＮＰは、Ｐ＜０．０５の閾値を考慮し、またコックス回帰分析を用いて更に分析された：（ｉ）ベバシズマブ群のみにおいて、他のベースライン予後共変数のために調整しながら、（ｉｉ）プラセボ群のみにおいて、観察された関連性が治療と独立かどうかを評価し、そして（ｉｉｉ）両方の治療群において、治療の相互作用により遺伝子型を評価した。治療結果に影響を与えるベースライン共変数の一組を同定するために、ステップワイズモデル選択法が、遺伝子バイオマーカー分析のために利用可能なサブグループに対して適用された。調整共変数として使用された選択された変数は、好中球数、Ｃ反応性タンパク、及び腫瘍の位置であった。ｒｓ７９９３４１８の関連性が、Ｐ＜０．０５の閾値を考慮し、またＡＶＩＴＡと同様のコックス回帰分析を用いてＡＶＯＲＥＮにおいて繰り返された。
【００８８】
結果
ＡＶＩＴＡ研究の特性
ＡＶＩＴＡからの血液サンプルは、患者６０７人中１６０人（２６．４％）から得られた。６人の患者はアジア人で、１５４人は白人であった。ＳＮＰの頻度は人種群間で違うので、白人患者からのＤＮＡ標本のみが分析された。前記遺伝子バイオマーカーサブグループは、年齢及び性別分布、喫煙状況、ＯＳ、及び  ＰＦＳに関し完全な患者コホートと同等であった（表２）。前記サブグループにおけるＯＳ中央値はベバシズマブ群及びプラセボ群においてそれぞれ７．４ヶ月及び６．７ヶ月であった（ｐ＝０．１９）。また、ＰＦＳ中央値はそれぞれ５．３ヶ月及び４．１ヶ月であった（ｐ＝０．０７８）。
【００８９】
表２．ＡＶＩＴＡ患者のベースラインでの人口統計及び臨床的特性
完全なＡＶＩＴＡ試験コホートに対して及び遺伝子バイオマーカー分析のために利用可能な前記サブグループに対して、人口統計及び臨床的特性が与えられている。Ｂｅｖはベバシズマブを示す。ＣＩは信頼区間を、ＧＥはゲムシタビン−エルロチニブを、ｍｏは月を示す。
2014533956.tif 000003
【００９０】
ＶＥＧＦＲ−１におけるｒｓ９５８２０３６ＳＮＰはベバシズマブ治療結果と相関がある。  
全１３８ＳＮＰのうち、ＶＥＧＦＲ−１におけるｒｓ９５８２０３６ＳＮＰのみが、多重検定のために調整されたＰ値閾値に合格した。このＳＮＰのＯＳに対する全体的効果はベバシズマブ群において有意であり（対立遺伝子あたり  ＨＲ＝２．１，Ｐ＝０．０００１４）、相加リスク効果モデルと矛盾しなかった（国際公開第２０１１／０１５３４８号の図３）。ＯＳ中央値は、ＣＣキャリア及びＡＣキャリアにおけるそれぞれ４．８ヶ月及び６．０ヶ月から、ＡＡキャリアにおける１０．３ヶ月に上昇した。好中球数、Ｃ反応性タンパク濃度、及び腫瘍位置についての調整後に、ベバシズマブ群におけるｒｓ９５８２０３６のＯＳとの関連性がわずかに減少したが、それでもなお有意であった（ＨＲ＝１．９，Ｐ＝０．００２）。その後のプラセボ群におけるｒｓ９５８２０３６についてのコックス回帰分析は、ＯＳとＳＮＰ遺伝子型との間での統計的に有意な相関を示さなかった（国際公開第２０１１／０１５３４８号の図４）。ｒｓ９５８２０３６と治療（ベバシズマブ又はプラセボ）との間の相互作用の正式な検定は、統計的に有意であった（Ｐ＝０．０４１）。これは、ｒｓ９５８２０３６がＡＶＩＴＡにおける治療結果のための予測マーカーであることを示した。コックス回帰分析はまた、ベバシズマブ群におけるｒｓ９５８２０３６とＰＦＳとの間の相関を明らかにした（対立遺伝子あたりＨＲ＝１．８９，Ｐ＝０．０００８１；国際公開第２０１１／０１５３４８号の図５）。ＰＦＳについてのそのような効果は、プラセボ群において観察されなかった（Ｐ＝０．５８；国際公開第２０１１／０１５３４８号の図６）。
【００９１】
関連性のあるＳＮＰがＶＥＧＦＲ−１ＴＫドメインにおける遺伝子座を規定する。
ＶＥＧＦＲ−１における他の３つのＳＮＰ（ｒｓ９５５４３１６，ｒｓ９５１３０７０，及びｒｓ９５５４３２０）もまた、ベバシズマブ群においてＯＳと相関があったが、多重検定のために調整されたＰ値閾値に合格しなかった（それぞれ、Ｐ＝０．０００４２，Ｐ＝０．００８１，及び  Ｐ＝０．００９７）。これらのＳＮＰの予測効果はｒｓ９５８２０３６のそれと同様であった（国際公開第２０１１／０１５３４８号の図７から図１０）。４つすべてのＳＮＰが、互いに近接した位置にある、すなわち、ｒｓ９５５４３２０，ｒｓ９５８２０３６，ｒｓ９５５４３１６，及びｒｓ９５１３０７０についてそれぞれイントロン２５，２７，２８，及び２９にあることが確認され、ＶＥＧＦＲ−１内の連鎖不平衡の高い４つの連続した領域を表した。各ＳＮＰのＰ値をそれのＯＳとの関連性の尺度とみなし、これらの値をＶＥＧＦＲ−１内のＳＮＰの位置の関数としてプロットすると、ＴＫドメインにおけるアミノ酸残基１０２９から１２７２についてコードするエクソン２５から２９までを含む関連性シグナルがベバシズマブ群において観察された。予想されたように、プラセボ群において、そのようなシグナルは観察されなかった。
【００９２】
ＶＥＧＦＲ−１遺伝子座の微細マッピング
ＶＥＧＦＲ−１に位置する全てのＳＮＰを同定するために、我々は、１０００人ゲノムプロジェクトにおける６０個の白人ハップマップサンプルからの全ゲノムシークエンシングデータを用いた（ＣＥＵ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ，Ｒｅｌｅａｓｅ Ｊｕｌｙ ２０１０；ｗｗｗ．１０００ｇｅｎｏｍｅｓ．ｏｒｇ）。ＶＣＦ Ｔｏｏｌｓ ｖｅｒｓｉｏｎ ０．１．５を用いて、ＶＥＧＦＲ−１のコーディング領域並びに１５ｋｂ上流及び下流の配列（すなわち、ｔｈｅ Ｃｈｒ１３：２７７６３０００−２７９８２０００ Ｅｎｓｅｍｂｌ ３６．３ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）におけるＳＮＰが選択された。合計で、我々は６２８個のＳＮＰを同定し、そのうち３８１個は小さい対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）≧０．０５であった。ハプロビュー４．２ソフトウェアを用いて、我々は、ＡＶＩＴＡにおけるベバシズマブ後の治療結果と関連した４個のタグＳＮＰ（すなわち、ｒｓ９５８２０３６，ｒｓ９５５４３１６，ｒｓ９５１３０７０及びｒｓ９５５４３２０）の１個とＬＤであった４８個のＳＮＰを同定した。ＬＤの閾値は、分析されたサンプルにおける４個のタグＳＮＰの１つの間で最も低いｒ２であったｒ２≧０．１２と設定された（表３）。
2014533956.tif 000004
【００９３】
ＶＥＧＦＲ−１遺伝子座における４個のタグＳＮＰの間のペアワイズ連鎖不平衡が示されている。完全相関及び完全同義のＳＮＰは、ｒ２の値は１である。ｒ２の値が０であるＳＮＰは互いに独立して発生する。
【００９４】
これら４８個のＳＮＰのうちどれがＶＥＧＦＲ−１の機能に影響を与え、ベバシズマブ後の治療結果に原因として寄与するかを同定するために、我々はＰｕｐａＳｕｉｔｅツール (Reumers J, Conde L, Medina I, 他 Joint annotation of coding and non-coding single nucleotide polymorphisms and mutations in the SNPeffect and PupaSuite databases. Nucleic Acids Res 2008;36:D825-9) 及び AnnoVarツール(Wang K, Li M, Hakonarson H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Res;38:e164)を使用した。特に、我々は、これらＳＮＰのうちのどれがコーディング領域、転写因子結合部位、エキソン内スプライシング促進配列／抑制配列若しくはｍｉＲＮＡ結合部位、又は他の進化上の保存配列領域に位置しているかを評価した。１個のＳＮＰのみがＶＥＧＦＲ−１エクソンのうちの一つの中に位置する、すなわち、ｒｓ７９９３４１８がＶＥＧＦＲ−１のエクソン２８に位置することが確認された。２つのＳＮＰ（すなわち、ｒｓ９５１３０７１及びｒｓ７９８２２８３）が、予測されたＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）結合モチーフの中に位置することが確認されたが、それらはＣＴＣＦモチーフのコア結合ドメインを壊さなかったので、ＶＥＧＦＲ−１の機能に機能上影響しそうにない。他の５つのＳＮＰが、前記データベース中の４４の種からの少なくとも１０の哺乳類においてそれぞれのヌクレオチド部位の保存と定義された保存部位に位置することが確認された。これらのＳＮＰは、ＶＥＧＦＲ−１遺伝子の下流（ｒｓ９５５４３０９）、介在配列の中（ｒｓ９５１３０７３，ｒｓ９５５１４７１，ｒｓ７９９２９４０）、及びＶＥＧＦＲ−１のエクソン２８の中（ｒｓ７９９３４１８）に位置することが確認された。他の関連するＳＮＰは同定されなかった。特に、これら５つのＳＮＰのうち、ｒｓ７９９３４１８が、ＶＥＧＦＲ−１ＴＫ遺伝子座における４つのタグＳＮＰとの最も高いＬＤの程度を示した（ｒｓ９５１３０７０，ｒｓ９５５４３１６，ｒｓ９５８２０３６及びｒｓ９５５４３２０とのＬＤについて、それぞれｒ２の値が、０．３４，０．８３，０．６７及び０．３６であった）。全体的に見て、この微細マッピング及びインシリコの分析に基づき、ｒｓ７９９３４１８が、ＶＥＧＦＲ−１の機能に影響する最も高いポテンシャルを持つＳＮＰであると考えられた。Ｒｓ７９９３４１８は、チロシン１２１３のＴＡＴコドンをＴＡＣコドン（Ｔｙｒ１２１３Ｔｙｒ）に変化させるＶＥＧＦＲ−１のエクソン２８に位置する同義置換Ｔ／Ｃ ＳＮＰであり、ｒｓ９５５４３１６のハプロタイプブロックに位置している。
【００９５】
ｒｓ７９９３４１８変異体はＶＥＧＦＲ−１の発現に機能的に影響を及ぼす。
１．ＶＥＧＦＲ−１ ｃＤＮＡ構築物のインビトロ転写／翻訳
ｒｓ７９９３４１８がＶＥＧＦＲ−１の発現に機能的に影響を及ぼすことを証明するために、ＶＥＧＦＲ−１ ｃＤＮＡの転写及び翻訳に対するそれの効果が、ウサギ網状赤血球抽出液システムを用いてインビトロに評価された。Ｔｙｒ１２１３のためにＴＡＴ又はＴＡＣのいずれかを保有する２つのバージョンのＶＥＧＦＲ−１ ｃＤＮＡが作成された。両方のｃＤＮＡがｐｃＤＮＡ３発現ベクターにクローン化され、市販のＴｎＴ Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ−ｃｏｕｐｌｅｄウサギ網状赤血球抽出液キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ＃ Ｌ１１７０）を用いてインビトロ転写／翻訳のために用いられた。野生型ＴＡＴ又は変異型ＴＡＣコドンのいずれかを保有する完全長ＶＥＧＦＲ−１ ｃＤＮＡは、等しい量の転写されたｍＲＮＡを産生したが、異なる量の翻訳されたＶＥＧＦＲ−１タンパク質を産生した。特に、ＴＡＣ対ＴＡＴ保有ｃＤＮＡ構築物について、ＶＥＧＦＲ−１タンパク質の２７％の増加が認められた（Ｐ＜０．００１）。同様に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における一過性の過剰発現は、ＶＥＧＦＲ−１ ｍＲＮＡ発現はＴＡＣ及びＴＡＴを保有する構築物を発現する細胞の間で等しかったけれども、１５％まで多くのＶＥＧＦＲ−１タンパク質がＴＡＣを発現する細胞によって翻訳されたことを確認した（Ｐ＜０．００１）。完全長膜貫通ＶＥＧＦＲ−１（ｔｍＶＥＧＦＲ−１）のタンパク質切断によって作成された可溶性のＶＥＧＦＲ−１アイソフォーム（ｓＶＥＧＦＲ−１）の発現が、ＴＡＣ保有構築物を発現する細胞において同様に増加した（Ｐ＜０．００１）。
【００９６】
２．ヒト血漿におけるｓＶＥＧＦＲ−１発現量
更に、ｔｍＶＥＧＦＲ−１及びｓＶＥＧＦＲ−１のタンパク質濃度は強い相関があり、またｓＶＥＧＦＲ−１はヒト血漿において容易に評価できるので、ｓＶＥＧＦＲ−１血漿中濃度が２つの独立したコホートにおいて測定され、ｒｓ７９９３４１８について層別化された。フラマン人の家系の３６９人の健常者から血漿が赤十字社（ルーベン、ベルギー）経由で採取され、これらの個人からのＤＮＡがｒｓ７９９３４１８について遺伝子型を同定された。３０人及び２８人の無作為に選択されたＴＴ及びＴＣのキャリアからのｓＶＥＧＦＲ−１血漿中濃度を、ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｓｏｌｕｂｌｅ ＶＥＧＦ Ｒ１／Ｆｌｔ−１ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，ｃａｔａｌｏｇ ＃ ＤＶＲ１００Ｂ）によって、１１人のＣＣ（変異体）のキャリアの各々と比較した。ＣＣのキャリアはＴＴ及びＴＣのキャリアに比べてＶＥＧＦＲ−１発現の中央値が１８％増加していることを、我々は見いだした（Ｐ＝０．００６）。一元配置分散分析法が、ｓＶＥＧＦＲ−１発現に対するｒｓ７９９３４１８の効果を評価するために用いられた。両側Ｐ値＜０．０５が統計学的に有意と考えられた。乳癌患者からの血漿サンプルの独立したコホートにおいて、我々はこの関連性を再現した（ｔｈｅ Ｌｅｕｖｅｎ Ｍｕｌｔｉｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ Ｂｒｅａｓｔ Ｃｅｎｔｅｒで採取された）。手短に言えば、２６３人の患者からのＤＮＡが、ｒｓ７９９３４１８について遺伝子型を同定され、２３人及び２７人の無作為に選択されたＴＴ（野生型）及びＴＣのキャリアからのｓＶＥＧＦＲ−１血漿中濃度が、９人の検出されたＣＣ（変異型）のキャリアの各々と比較された。ｓＶＥＧＦＲ−１の発現の同様な増加（１９％）が、ＴＴ及びＴＣのキャリアと対比してＣＣのキャリアにおいて認められた（Ｐ＝０．０１４）。一元配置分散分析法が、ｓＶＥＧＦＲ−１発現に対するｒｓ７９９３４１８の効果を評価するために用いられた。両側Ｐ値＜０．０５が統計学的に有意と考えられた。
【００９７】
３．ｒｓ７９９３４１８遺伝子型について層別化されたＨＵＶＥＣ中のＶＥＧＦＲ−１の発現
最後に、ｒｓ７９９３４１８ ＴＴ，ＴＣ及びＣＣ遺伝子型を保有するＨＵＶＥＣを比較することにより、ｔｍＶＥＧＦＲ−１（Ｐ＝０．５０）及びｓＶＥＧＦＲ−１（Ｐ＝０．９１）ｍＲＮＡ発現量について何も差を確認することができなかった。しかしながら、インビトロの翻訳実験と同様に、これらのＨＵＶＥＣは、ＴＴ又はＴＣのキャリアと比較してＣＣのキャリアについてわずかに増加したｔｍＶＥＧＦＲ−１タンパク質発現量を示した（２３％増加；Ｐ＝０．０４９）。ＣＣキャリアとＴＣ又はＴＴキャリアの間で同様な効果がｓＶＥＧＦＲ−１について認められた（３９％増加；Ｐ＝０．０４４）。
【００９８】
４．ＰｌＧＦシミュレーション上でのＥＲＫ１／２活性化
ｒｓ７９９３４１８はｍＲＮＡ翻訳有効性を高めることによりｔｍＶＥＧＦＲ−１及びｓＶＥＧＦＲ−１の発現を増加させることを、上記発見は示している。更に、ＶＥＧＦＲ−１発現の増加により予想されるように、Ｃ対立遺伝子についてホモ接合であるＨＵＶＥＣ培養物は、選択的なＶＥＧＦＲ−１のリガンドであるＰｌＧＦとの活性化時に下流のＶＥＧＦＲ−１シグナル伝達の増加を示した。これは、ＣＣ対ＴＴｒｓ７９９３４１８のキャリアにおけるホスホＥＲＫ１及びホスホＥＲＫ２の濃度の増加により示される（ホスホＥＲＫ１について２．０対１．６の誘導倍率、及びホスホＥＲＫ２について２．１対１．４の誘導倍率；Ｐ＝０．０４５及びＰ＝０．０４６；ｎ＝３対５）。ＥＲＫ１及びＥＲＫ２のリン酸化が、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＡＰＫアレイキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定された。Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてリン酸化タンパク質が検出され、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｉｍａｇｉｎｇ ｆｉｌｍ（Ｋｏｄａｋ）を用いてブロットが現像された。ブロットがスキャンされ、ＩｍａｇｅＪ １．４３ソフトウェアを用いて強度が定量化された。強度は、バックグラウンド補正され、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＡＰＫアレイキットの内部の正の対照に関してスケール変更された。実験が２度行われ、両方の実験の平均値が示されている。Ｈｕｍａｎ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＡＰＫアレイキットはＥＲＫ１又は２の総量に対して補正していないので、ＳｕｒｅＦｉｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてＥＲＫ１／２の全濃度を測定した。ＥＲＫ１／２の全濃度は非促進状態及び促進状態の下でＴＴ及びＣＣキャリアについて同様であった（それぞれ、Ｐ＝０．２及び０．３４）。
【００９９】
ＶＥＧＦＲ−１遺伝子座の関連性がＡＶＯＲＥＮにおいて再現する。
最後に、ベバシズマブ治療結果とのＶＥＧＦＲ−１遺伝子座の関連性を再現しようと試みて、我々は転移性腎細胞癌患者を含む２回目のフェーズＩＩＩ臨床研究を行った（ＡＶＯＲＥＮ）。ＡＶＯＲＥＮからの血液サンプルは、患者６４９人中１１０人（１６．９％）から得られ、その中の５９人がベバシズマブを受けた。
【０１００】
表４．ＡＶＯＲＥＮ患者のベースラインでの人口統計及び臨床的特性
前記完全なＡＶＯＲＥＮ試験コホートに対して及び遺伝子バイオマーカー分析のために利用可能な前記サブグループに対して、人口統計及び特性が与えられている。Ｂｅｖはベバシズマブを示す。ＣＩは信頼区間を、ＩＦＮはインターフェロンアルファ−２ａを、ｍｏは月を示す。
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【０１０１】
ＡＶＩＴＡ試験に関する同様なＳＮＰ分析が、上記のように、前記ＡＶＯＲＥＮ試験における患者からの遺伝子サンプルについて行われた。ベバシズマブを受けているＡＶＯＲＥＮ患者は疾患進行に際しヘテロな第二選択療法に切り替えたので、ＰＦＳとの相関を評価しただけである。前記遺伝子バイオマーカーサブグループは全体の患者コホートよりも長いＰＦＳによって特徴付けられたけれども、ｒｓ７９９３４１８はベバシズマブ群においてＰＦＳと相関があり（１対立遺伝子につき  ＨＲ＝１．８，Ｐ＝０．０３３，表５）、プラセボ群においてはなかった（１対立遺伝子につき  ＨＲ＝０．８，Ｐ＝０．４９）。
【０１０２】
表５．ｒｓ７９９３４１８，ｒｓ９５５４３１６及びｒｓ９５１３０７０遺伝子型による、ＡＶＯＲＥＮのベバシズマブ及びプラセボ処置群におけるＰＦＳのカプラン・マイヤー推定値
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Ｂｅｖはベバシズマブを示す。ＣＩは信頼区間を、ＩＦＮはインターフェロンアルファ-２ａを、ｍｏは月を示す。
＊Ｒｓ７９９３４１８及びｒｓ９５５４３１６は互いに同義置換であり、表５の分析はｒｓ９５５４３１６について行われた。
【０１０３】
表５において、ｒｓ７９９３４１８のＣＣ遺伝子型は１人の患者しか含まない。それゆえＣＣキャリアの生存期間中央値についていかなる結論も引き出せない。それにもかかわらず、ＡＶＯＲＥＮにおけるｒｓ７９９３４１８のＴＣ及びＣＣの両方による結合された遺伝子型効果は、統計学的に有意である（Ｐ＝０．０３３）。表５に示された結果はｒｓ７９９３４１８の上記の機能的特徴とともに、Ｃ対立遺伝子は、ＰｌＧＦリガンドにより駆動される代償性の血管新生というよく認識された現象を増幅しうるＶＥＧＦＲ−１の発現の増加により、ベバシズマブ治療を受けている患者の生存期間に悪い影響を及ぼすという本発明の発見を支持する。
【０１０４】
全体として、このことは、ＶＥＧＦＲ−１遺伝子座はまた腎細胞癌患者におけるベバシズマブ治療結果に対して予測的でありうることを示す。
【０１０５】
転移性膵臓癌患者（ＡＶＩＴＡ）におけるＰＦＳ及びＯＳと関連性のあるＶＥＧＦＲ−１ＴＫドメイン中の遺伝子座が本発明において同定され、また腎細胞癌患者（ＡＶＯＲＥＮ）におけるＰＦＳについて再現された。重要なことには、この関連性はベバシズマブを受けている患者にとって特有であり、プラセボ治療の患者においていかなる有意な効果も認められなかった。我々はまた、ｒｓ７９９３４１８がＶＥＧＦＲ−１ ｍＲＮＡの翻訳の有効性を高め、ＶＥＧＦＲ−１タンパク質の発現を増加させることを証明することにより、この遺伝子座を機能的なレベルで確認した。
【０１０６】
ＶＥＧＦＲ−１の発現の増加がいかにしてベバシズマブ治療成績の低下に寄与するかに関して、ＶＥＧＦＲ−１の活性化が、細胞内シグナルを伝達することにより直接に、又はＶＥＧＦＲ−２をトランスリン酸化し、その結果ＶＥＧＦＲ−２起因の血管新生を増加させることにより間接的に、血管新生の誘因となることがよく知られている。興味深いことに、ＶＥＧＦＲ−１の選択的リガンド、ＰｌＧＦを過剰発現させる腫瘍は、これら腫瘍の血管新生の減少の結果としてＶＥＧＦＲ−１ＴＫドメインを欠いているマウスにおいて、よりゆっくりと成長する。ＰｌＧＦ濃度はまたベバシズマブで治療されている患者において上昇するので、ＶＥＧＦＲ−１の下流シグナル伝達を増幅する遺伝子座は、血管構造をよりＰｌＧＦに依存させ、抗ＶＥＧＦ治療への耐性を引き起こしうる。同様に、ｓＶＥＧＦＲ−１濃度の上昇は、腫瘍由来のＶＥＧＦを隔離することができ、これによりＶＥＧＦＲ−２によって伝達されたそれの血管新生促進効果を減少させ、ベバシズマブを通じたＶＥＧＦ中和の利益を制限する。実際、Ｍａｚｚｏｎｅ他は、一つの理由として、ｔｍＶＥＧＦＲ−１及びｓＶＥＧＦＲ−１を高発現する内皮細胞がＶＥＧＦの分裂促進的及び遊走性の活性に対してあまり応答性がないため、これらの細胞が腫瘍血管構造の正常化に寄与するということを示した(Mazzone M, Dettori D, Leite de Oliveira R,他  Heterozygous deficiency of PHD2 restores tumor oxygenation and inhibits metastasis via endothelial normalization. Cell 2009;136:839-51)。注目すべきことには、治療前及び治療中に血漿ｓＶＥＧＦＲ−１発現が増加した直腸癌患者は、ベバシズマブからの利益が減少しており、従って、ベバシズマブ治療のバイオマーカーとしてのＶＥＧＦＲ−１の潜在価値についての本発明の見解を強調している(Duda DG,他  Plasma soluble VEGFR-1 is a potential dual biomarker of response and toxicity for bevacizumab with chemoradiation in locally advanced rectal cancer. Oncologist. 2010;15(6):577-83)。
【０１０７】
一見すると、同義置換ＳＮＰがアミノ酸配列を変化させることなくＶＥＧＦＲ−１発現に影響を及ぼすことは、意外に思われるかもしれない。しかしながら、同義変異はタンパク質発現に影響を及ぼすことが以前報告されており、すでに４０以上の疾患に関係があるとされている。同義置換ＳＮＰがタンパク質発現に影響しうる一つの潜在的な機序は、コドンバイアスを通じてである。特に、ｒｓ７９９３４１８変異体は、ＶＥＧＦＲ−１のＴＫドメイン内の位置１２１３上にあるチロシンのコドン使用頻度に影響することがある。このドメインはＴＡＣコドンへの強いバイアスを特徴とする。すなわち、１６個のＴＡＣコドン対５個のＴＡＴコドンであり、両方ともチロシンをコードする。そのようなコドンバイアスはまた、様々な種にわたって高発現する遺伝子にも存在し、そこでそれは高発現する遺伝子の効率的翻訳を促進する機序を表す。ＴＡＣコドンによって誘発されたより効率的なＶＥＧＦＲ−１翻訳は、以下を含む様々な機序を通じて達成されうる。ｉ）第三のコドン位置での比較的強いＧ−Ｃ水素結合相互作用によるＴＡＣコドンとそのｔＲＮＡアンチコドンとの比較的有利な相互作用(Grosjean H, Fiers W. Preferential codon usage in prokaryotic genes: the optimal codon-anticodon interaction energy and the selective codon usage in efficiently expressed genes.Gene 1982;18:199-209)、ｉｉ）ＴＡＣコドンについてのｔＲＮＡの入手可能性の増大（ＴＡＴ  ｔＲＮＡは単一の遺伝子のみによってコード化され、他方、１４個のｔＲＮＡ遺伝子がＴＡＣについて存在する）(Juhling F, Morl M, Hartmann RK, Sprinzl M, Stadler PF, Putz J. tRNAdb 2009: compilation of tRNA sequences and tRNA genes. Nucleic Acids Res 2009;37:D159-62)、及びｉｉｉ）翻訳の有効性を改善するための最も使用頻度の高いコドンの再使用に有利であるリボソームによる「ｔＲＮＡリサイクリング」の効果(Cannarozzi G, Schraudolph NN, Faty M,他  A role for codon order in translation dynamics.Cell;141:355-67)。これらの機序が全体で、コドンバイアスがｒｓ７９９３４１８のＶＥＧＦＲ−１発現への効果及びそれのベバシズマブの治療成績との関連性を媒介する、という考えを支持する。
【配列表】
2014533956000001.app
【国際調査報告】
2014533956.tif 000007
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