(57)【要約】  本出願は、内因性糸状菌宿主細胞のＤＮアーゼ活性を用いて、糸状菌宿主細胞由来のタンパク質製剤又はブロスのＤＮＡ含有量を減少させる方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌宿主細胞が培養されたブロスのＤＮＡ含有量を減少させる方法であって、
培養に使用するｐＨ及び／又は温度を増加させるために、前記菌宿主細胞が少なくとも２４時間培養されたブロスのｐＨ及び／又は温度を調整する工程と、
その製剤中の菌宿主ＤＮＡを検出可能に減少させるために、その増加したｐＨ及び／又は温度にて、十分な時間をかけて前記ブロスをインキュベーションする工程と、を含み、
前記ＤＮＡの減少が、前記ブロス中の外因性ＤＮアーゼの存在を主因とするものではないことを条件とする、方法。
【請求項２】
前記調整工程の前に、前記糸状菌宿主細胞由来のブロスを分離するために、固液分離工程を実行する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記調整工程の前に限外濾過を実行することによって前記ブロス中の巨大分子が濃縮される限外濾過工程を更に含む、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記限外濾過工程の後に前記ブロスが室温である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記調整工程の前の前記ブロスの温度が２５℃〜３４℃である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記調整工程の前の前記ブロスのｐＨが４〜５の間である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記調整工程の前に、前記ブロス中に分泌された目的のタンパク質の所望の濃度が達成されるまで、前記ブロス中で前記糸状菌宿主細胞を培養する工程を更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記調整工程中に前記ｐＨがｐＨ  ６〜８に増加される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記調整工程中に前記温度が３５℃〜４７℃に増加される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ブロスのＤＮＡ含有量を評価する工程を更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記インキュベーション工程の前及び後に前記ＤＮＡ含有量を評価する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ含有量が、ＰＣＲ及び／又は臭化エチジウム染色によるゲル電気泳動による評価で検出不能なレベルまで減少される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記インキュベーション工程の後に前記ブロスを室温まで冷ますことを更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ブロスからの１つ以上のタンパク質を精製する工程を更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ブロスの１つ以上のタンパク質が前記糸状菌宿主細胞によって組み換えにより発現される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記糸状菌宿主細胞に外因性ＤＮアーゼが欠失している、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ブロスにＤＮアーゼが添加されない、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記糸状菌宿主細胞がセルラーゼ酵素を組み換えにより発現する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記糸状菌宿主細胞がフィターゼを組み換えにより発現する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記糸状菌宿主細胞がリパーゼを組み換えにより発現する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
糸状菌宿主細胞由来のタンパク質製剤のＤＮＡ含有量を減少させる方法であって、
前記菌宿主細胞由来のタンパク質製剤中の糸状菌宿主細胞ＤＮＡのレベルを評価する工程と、
前記タンパク質製剤のｐＨ及び／又は温度を、調整されたｐＨ及び／又は温度に調整する工程と、
前記タンパク質製剤中の糸状菌宿主細胞ＤＮＡのレベルを検出可能に減少させるために、前記調整されたｐＨ及び／又は温度にて、十分な時間をかけて前記タンパク質製剤をインキュベーションする工程と、
前記タンパク質製剤中の糸状菌宿主細胞ＤＮＡの量の減少を決定する工程と、を含み、
前記減少が前記タンパク質製剤中に存在する外因性ＤＮアーゼを主因とするものではないことを条件とする、方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡの量が検出不能なレベルまで減少されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
糸状菌宿主細胞が培養されたブロスのＤＮＡ含有量を減少させる方法であって、
前記糸状菌宿主細胞が少なくとも２４時間培養されたブロスであり、糸状菌宿主細胞から前記ブロスを分離するために固液分離工程が実行されたブロスの、ｐＨ及び／又は温度を増加させる工程と、
前記ブロス中の糸状菌宿主ＤＮＡを検出可能に減少させるために、前記増加されたｐＨ及び／又は温度にて、十分な時間をかけて前記ブロスをインキュベーションする工程と、を含み、
前記減少が前記ブロス中に存在する外因性ＤＮアーゼを主因とするものではないことを条件とする、方法。
【請求項２４】
前記糸状菌宿主細胞由来のタンパク質製剤中の糸状菌宿主細胞ＤＮＡを減少させるための、内因性の糸状菌宿主細胞のＤＮアーゼ活性の使用。
【請求項２５】
糸状菌宿主細胞が培養された培養ブロス中のその糸状菌宿主細胞ＤＮＡを減少させるための、内因性糸状菌宿主細胞ＤＮアーゼ活性の使用。
【請求項２６】
前記糸状菌宿主細胞が、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）、アスペルギルスニガー（A. niger）、アスペルギルスツビンゲンシス（A. tubingensis）、アスペルギルスオリザエ（A. oryzae）、ゲオスミチアエメルソニイ（G. emersonii）、ミセリオフソーラサーモフィラ（M. thermophila）、ペニシリウムフニクロサム（P. funiculosum）、フサリウムベネナタム（F. venenatum）、又はフミコーラインソレンス（H. insolens）の細胞である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記糸状菌宿主細胞が、トリコデルマリーゼイ（T. reesei）、アスペルギルスニガー（A. niger）、アスペルギルスツビンゲンシス（A. tubingensis）、アスペルギルスオリザエ（A. oryzae）、ゲオスミチアエメルソニイ（G. emersonii）、ミセリオフソーラサーモフィラ（M. thermophila）、ペニシリウムフニクロサム（P. funiculosum）、フサリウムベネナタム（F. venenatum）、又はフミコーラインソレンス（H. insolens）の細胞である、請求項２４又は２５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１１年９月２２日付出願の米国仮特許出願第６１／５３７，８３７号の利益を主張し、その全容を参考として本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
糸状菌（例えば、トリコデルマ属（Trichoderma）、アスペルギルス属（Aspergillus）、ゲオスミチア属（Geosmithia）、マイセリオフトラ属（Myceliophthora）、ペニシリウム属（Penicillium）、フザリウム属（Fusarium）、フミコーラ属（Humicola）、及びその他）は、近年、タンパク質の産生に広く用いられる宿主株となってきた。トリコデルマリーゼイ（T. reesei）、アスペルギルスニガー（A. niger）、アスペルギルスツビンゲンシス（A. tubingensis）、アスペルギルスオリザエ（A. oryzae）、ゲオスミチアエメルソニイ（G. emersonii）、ミセリオフソーラサーモフィラ（M. thermophila）、ペニシリウムフニクロサム（P. funiculosum）、フサリウムベネナタム（F. venenatum）、フミコーラインソレンス（H. insolens）のような真菌種によって生産された酵素製剤が市販品として開発されている。例えばトリコデルマ属、アスペルギルス属、マイセリオフトラ属、ペニシリウム属、フザリウム属、及びその他の糸状菌もまた、例えば、酵素及び治療用タンパク質などの異種タンパク質を発現するために、典型的には誘導性プロモーターの制御下で遺伝子操作を受けてきた（例として、ＥｎｇｌａｎｄらのＰＣＴ特許公報第ＷＯ２００４／０３５０７０号を参照されたい）。そのようにして調製された（例えば、トリコデルマリーゼイ、アスペルギルスニガー、アスペルギルスツビンゲンシス、アスペルギルスオリザエ、ゲオスミチアエメルソニイ、ミセリオフソーラサーモフィラ、ペニシリウムフニクロサム、フサリウムベネナタム、フミコーラインソレンスなどの）真菌タンパク質の多くは、食料又は飼料添加物として（例えば、Ｄｕｎｎ−ＣｏｌｅｍａｎらのＰＣＴ公開特許第ＷＯ２００３／０３８０３５号を参照されたい）、及び他の工業用に、有用である。通常、真菌中のタンパク質の生産は大規模に行われるので、生産及び加工効率の改善は偉大な経済的意義を有する場合がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、糸状菌宿主細胞が培養されたブロスのＤＮＡ含有量を減少させる方法を提供する。かかる方法は、ブロスのｐＨ及び／又は温度を調整する工程において、糸状菌宿主細胞が、培養に用いられるｐＨ及び／又は温度を超えて少なくとも２４時間培養される、工程と、その製剤中の糸状菌宿主ＤＮＡを、検出可能なほどに減少させるために、その高いｐＨ及び／又は温度で、十分な時間をかけてそのブロスをインキュベートする工程と、を含む。かかる方法におけるＤＮＡの減少は、ブロス中の外因性ＤＮアーゼの存在を主因とするものではない。いくつかの方法は、調整工程の前に糸状菌宿主細胞から培養ブロスを分離するために固液分離工程を行うことを更に含む。いくつかの方法は、調整工程の前にブロス中の巨大分子を濃縮する限外濾過工程を更に含む。いくつかの方法では、限外濾過工程後、ブロスは室温に置かれる。いくつかの方法では、調整工程の前のブロスの温度は２５℃〜３４℃である。いくつかの方法では、調整工程の前のブロスのｐＨは４〜５である。いくつかの方法は、調整工程の前に、ブロス中に分泌された所望のタンパク質の所望の濃度が得られるまで、ブロス中の糸状菌宿主細胞を培養する工程を更に含む。好ましくは、ｐＨ及び／又は温度調整工程は、宿主細胞によって産生された酵素が、目的の基質を処置する又はそれに作用するために適用される前に、行われる。
【０００４】
いくつかの方法では、調整工程中にｐＨがｐＨ  ６〜８に上昇される。いくつかの方法では、調整工程中に温度が３５℃〜４７℃に上昇される。いくつかの方法は、ブロスのＤＮＡ含有量を評価する工程を更に含む。いくつかの方法では、インキュベーション工程の前及び後にＤＮＡ含有量を評価することができる。いくつかの方法では、ＰＣＲ及び／又は臭化エチジウム染色ゲルでの電気泳動によって評価したＤＮＡ含有量は、検出不可能なレベルまで減少される。いくつかの方法は、インキュベーション工程の後にブロスを室温まで冷ます工程を更に含む。いくつかの方法は、ブロスからの１つ以上のタンパク質を精製することを更に含む。いくつかの方法は、ブロス中の１つ以上のタンパク質が組み換えにより糸状菌宿主細胞によって発現される。いくつかの方法では、糸状菌宿主細胞には外因性ＤＮアーゼが欠失している。いくつかの方法では、ブロスにＤＮアーゼが添加されない。いくつかの方法では、糸状菌宿主細胞は組み換えによりセルラーゼ酵素を発現する。いくつかの方法では、糸状菌宿主細胞は組み換えによりフィターゼを発現する。いくつかの方法では、糸状菌宿主細胞は組み換えによりリパーゼを発現する。
【０００５】
本発明は更に、糸状菌宿主細胞から作られた（例えば培養ブロスを含む）タンパク質製剤のＤＮＡ含有量を減少させる方法を提供する。これらの方法は、糸状菌宿主細胞由来のタンパク質製剤中の真菌宿主細胞のＤＮＡレベルを測定する工程と、そのタンパク質製剤のｐＨ及び／又は温度を調整して、調整されたｐＨ及び／又は温度にする工程と、そのタンパク質製剤中の糸状菌宿主細胞のＤＮＡレベルを検出可能に減少させるために、調整されたｐＨ及び／又は温度でそのタンパク質製剤を十分な時間をかけてインキュベーションする工程と、そのタンパク質製剤中の糸状菌宿主細胞のＤＮＡの量の減少を決定する工程と、を含む。そのような方法においての減少は、タンパク質製剤中に存在する外因性ＤＮアーゼを主因とするものではない。いくつかの方法では、ＤＮＡの量は検出不能なレベルまで減少された。
【０００６】
本発明は、糸状菌宿主細胞が培養されたブロスのＤＮＡ含有量を減少させる方法を更に提供する。これらの方法は、糸状菌宿主細胞を少なくとも２４時間培養したブロスでありかつ、そのブロスを糸状菌宿主細胞から分離するために固液分離工程が行われたブロスの、ｐＨ及び／又は温度を上昇する工程と、そのブロス中の糸状菌宿主細胞を検出可能に減少させるために、その上昇したｐＨ及び／又は温度で十分な時間をかけてそのブロスをインキュベーションする工程と、を含む。そのような方法においての減少は、ブロス中に存在する外因性ＤＮアーゼを主因とするものではない。
【０００７】
本発明は、糸状菌宿主細胞から作られたタンパク質製剤中のその糸状菌宿主細胞ＤＮＡを減少させるための、内因性糸状菌宿主細胞のＤＮアーゼ活性の使用もまた提供する。
【０００８】
本発明は更に、糸状菌宿主細胞が培養された培養ブロス中のその糸状菌宿主細胞ＤＮＡを減少させるための、内因性糸状菌宿主細胞ＤＮアーゼ活性の使用を提供する。
【０００９】
上記の方法又は使用のいずれにおいても、真菌宿主細胞は、トリコデルマリーゼイ、アスペルギルスニガー、アスペルギルスツビンゲンシス、アスペルギルスオリザエ、ゲオスミチアエメルソニイ、ミセリオフソーラサーモフィラ、ペニシリウムフニクロサム、フサリウムベネナタム、又はフミコーラインソレンスであってよい。
【００１０】
用語の定義
「ＤＮアーゼ」は、通常はホスホジエステル結合の切断により、ＤＮＡを分解することができる酵素である。ＤＮアーゼには、内部サイトを切断するエンドヌクレアーゼ、及びＤＮＡ分子の末端からモノヌクレオチドを切断するエキソヌクレアーゼが含まれる。ＤＮアーゼは通常はタンパク質であるが、非タンパク質ＤＮアーゼである場合もある。ＤＮアーゼは、ＲＮアーゼ活性及びＤＮアーゼ活性を有することもあり、有さないこともある。
【００１１】
「外因性」タンパク質（例えば、外因性ＤＮアーゼ）は、組み換え発現によって宿主株に導入されたタンパク質、又はタンパク質の外部供給源から宿主株の抽出物に追加されたタンパク質を指す。外因性タンパク質は、宿主株に異種性（すなわち、異なる宿主株によって産生されるもの）であることもあり、相同（すなわち、宿主株によって自然に産生されるもの）であることもある。
【００１２】
用語「組み換え体」は、宿主細胞で自然発生しないポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。組み換え分子は、自然発生しないやり方で共に連結されている２つ以上の自然発生する配列を含むことができる。
【００１３】
用語「異種」は、通常は相互に関連付けられていないエレメントを指す。例えば、宿主細胞が異種タンパク質を産生する場合、そのタンパク質は、通常は、その宿主細胞中で産生されない。同様に、異種コード配列に操作可能に連結されたプロモーターは、通常は野生型宿主細胞内で操作可能に連結されていないコード配列に、操作可能に連結されたプロモーターである。ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）又はタンパク質に関しての用語「相同」は、宿主細胞中に自然発生する核酸（例えば、ＤＮＡ）又はタンパク質を指す。
【００１４】
「遺伝子」は、ポリペプチドの産生に関与するＤＮＡセグメントを指し、コード領域の前及び後に続く領域（エキソン）、及びいくつかの遺伝子においては、個々のコード領域の間に介在する領域（イントロン）を包含する。
【００１５】
核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらの一本鎖又は二本鎖の、化学的に修飾されたバージョンを包含する。
【００１６】
「ベクター」は、核酸を１つ以上の細胞型に導入するように設計されたポリヌクレオチド配列である。ベクターとしては、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット、及び同様のものなどが挙げられる。
【００１７】
「フィターゼ」は、フィチン酸の加水分解を触媒して、（１）ｍｙｏ−イノシトール及び／又は（２）そのモノー、ジ−、トリ−、テトラ−、及び／又はペンターリン酸、及び（３）無機リン酸にする酵素である。例えば、フィターゼとしては、ＥＣ第３．１．３．８号、又はＥＣ第３．１．３．２６号で定義された酵素が挙げられる。
【００１８】
「セルラーゼ酵素」又は「セルラーゼ」としては、直接的にセルロースに作用する酵素、及びセルロース上の他の酵素の直接的な作用を促進するアクセサリー酵素に作用する酵素が含まれる。セルラーゼとしては、細菌又は真菌のエキソグルカナーゼ若しくはエキソセロビオヒドロラーゼ、及び／又はエンドグルカナーゼ、及び／又はβ−グルコシダーゼが含まれる。これらの三つの異なるタイプのセルラーゼ酵素は、層状的に作用して、セルロース及びその誘導体をグルコースに転化する。セルラーゼ酵素としては、アクセサリー酵素もまた含まれ、ＥＧ４、スウォレニン、ルーセニン、ＣＩＰ１などのようなＧＨ６１メンバーが含まれる。
【００１９】
「リパーゼ」は、脂質の加水分解又は形成を触媒する酵素である。例えば、リパーゼは、トリアシルグリセロールの加水分解を触媒してジアシルグリセロール及びカルボキシレートを生成する。リパーゼとしては、ＥＣ第３．１．１．３．号の定義のものが挙げられる。
【００２０】
「単離する」は、対象種が自然に関連付けられている少なくとも１つの構成要素からその対象種を取り出すことを意味する。
【００２１】
「精製」は、対象種の少なくとも５０％、場合によっては少なくとも７５％、９０％、９５％又は９９％（ｗ／ｗ）に、その産生若しくは精製に使用された巨大分子汚染物質がないことを意味するが、対象種の使用を促進するために添加された賦形剤の存在を除外しない。
【００２２】
タンパク質製剤としては、任意の純度の状態にある糸状菌宿主（例えば、トリコデルマリーゼイ、アスペルギルスニガー、アスペルギルスツビンゲンシス、アスペルギルスオリザエ、ゲオスミチアエメルソニイ、ミセリオフソーラサーモフィラ、ペニシリウムフニクロサム、フサリウムベネナタム、フミコーラインソレンスなど）により分泌される１つ又はそれ以上の所望のタンパク質が挙げられるが、所望のタンパク質又は添加された賦形剤の産生又は精製による汚染物もまた含まれる場合がある。したがって、タンパク質製剤はブロスであることもあり、ブロスから精製されたタンパク質であることもある。
【００２３】
ブロス又は「発酵ブロス」は、発酵後の細胞及び細胞片の取り出しを伴う又は伴わない、及び限外濾過又は同様の技法によるブロス中のタンパク質及び他の巨大分子の濃縮を伴う又は伴わない、糸状菌宿主細胞（例えば、トリコデルマリーゼイ、アスペルギルスニガー、アスペルギルスツビンゲンシス、アスペルギルスオリザエ、ゲオスミチアエメルソニイ、ミセリオフソーラサーモフィラ、ペニシリウムフニクロサム、フサリウムベネナタム、フミコーラインソレンス）の培養に用いられた培養培地を意味するが、新鮮な培地でのカラムクロマトグラフィー及び溶出によるタンパク質沈殿及び再懸濁のような技術によってブロスから所望のタンパク質が分離される精製タンパク質の調製は含まない。
【００２４】
用語「糸状菌」は、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａの細分亜門の全ての糸状形態を指す（例えば、Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．（１９６２），ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＯＲＹ  ＭＹＣＯＬＯＧＹ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、及びＡＩＮＳＷＯＲＴＨ  ＡＮＤ  ＢＩＳＢＹ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＦＵＮＧＩ，９．ｓｕｐ．ｔｈ  Ｅｄ．（２００１）Ｋｉｒｋら編、ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＵＫを参照されたい）。これらの真菌は、キチン、セルロース、及びその他の複合多糖からなる細胞壁を有する栄養菌糸を示すことを特徴とする。本発明の糸状菌は、形態学的に、生理学的に、及び遺伝学的に、酵母とは区別される。糸状菌による栄養増殖は菌糸の伸長によるものであり、炭素の異化は絶対好気性である。
【００２５】
用語「トリコデルマ」又は「トリコデルマｓｐ．」は、「トリコデルマ属」としてこれまでに分類された又は現在分類されている任意の真菌属、及びそれらの株、並びにそれらが遺伝学的に変性された形態（例えば、変異又は遺伝子導入、若しくは遺伝子ノックアウトにより変性されたもの）を指す。
【００２６】
「飼料」は、ヒト以外の動物が食べる、摂取する、若しくは消化することを目的とした又はそれに適した任意の天然若しくは人工の食事療法、食事など、又はそのような食事の成分を意味する。
【００２７】
「食料」は、ヒトが食べる、摂取する、若しくは消化することを目的とした又はそれに適した任意の天然若しくは人工の食事療法、食事など、又はそのような食事の成分を意味する。
【００２８】
「食料又は飼料添加物」は、食料又は飼料への添加を目的とした若しくはそれに適した１つの精製化合物又は多成分組成物である。それは、ビタミン、ミネラル、酵素、及び好適な担体及び／又は賦形剤のような１つ以上の化合物を含む場合がある。
【００２９】
「評価する」、「測定する」、又は「決定する」という用語は、分析物、特に内因性ＤＮＡの、定性的若しくは定量的検出を包含する。従って、そのような評価又は決定は、分析物の存在若しくは欠如、又はその量を示す場合がある。
【００３０】
本明細書で使用するとき、用語「備える／含有する／含む（comprising）」及びその関連語は、それらが包括するという感覚で使用され、すなわち用語「含む／包含する（including）」及びその対応する同類語と等価である。
【００３１】
文脈から明らかでない限り、特定の数値の参照はその記述されている値及びその測定値（すなわち＋／−ＳＥＭ）に固有のその変化形を包含する。
【００３２】
文脈から明らかでない限り、「約」は＋／−１０％の許容誤差を示す。
【００３３】
数値の範囲は、範囲を定義する数値を包含する。いくつかの好ましい下位範囲も記載されているが、いずれにしても、範囲の参照には、範囲内に含まれる整数により定義される全ての下位範囲が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】バチアグセラｓｐ．からのフィターゼを発現するトリコデルマリーゼイの発酵ブロスの限外濾過濃縮物に認められた、高いｐＨ又は温度がＤＮＡ分解に与える影響。
【図２】バチアグセラｓｐ．からのフィターゼを発現するトリコデルマリーゼイの発酵ブロスの上記と同じ限外濾過濃縮物に認められた、インキュベーション時間がＤＮＡ分解に与える影響。
【図３】バチアグセラｓｐ．からのフィターゼを発現するトリコデルマリーゼイの発酵ブロスの上記と同じ限外濾過濃縮物に認められた、高温及びインキュベーション時間がＤＮＡ分解に与える影響。
【図４Ａ】アスペルギルスツビンゲンシスからのリパーゼを発現するトリコデルマリーゼイの発酵ブロスの限外濾過濃縮物にｐＨレベル５．２、６．３、及び７．６で認められた、高いｐＨがＤＮＡ分解に与える影響。
【図４Ｂ】アスペルギルスツビンゲンシスからのリパーゼを発現するトリコデルマリーゼイの発酵ブロスの限外濾過濃縮物にｐＨレベル５．２、６．３、及び７．６で認められた、高いｐＨがＤＮＡ分解に与える影響。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
Ｉ．一般的技術
本出願は、外因性ＤＮアーゼの使用を必要とせずに、糸状菌由来のタンパク質製剤のＤＮＡ含有量を減少させる方法を提供する。本出願は、商業的に価値のあるタンパク質を有する培養ブロス中の内因性糸状菌ＤＮアーゼ活性の観察に部分的に基づいている。例えば、ＤＮアーゼ活性は、トリコデルマリーゼイ、アスペルギルスニガー、アスペルギルスツビンゲンシス、アスペルギルスオリザエ、ゲオスミチアエメルソニイ、ミセリオフソーラサーモフィラ、ペニシリウムフニクロサム、フサリウムベネナタム、フミコーラインソレンス、又は対象の特定の産業用酵素を発現及び／又は産生する別の株の培養ブロス中に見出される。機構の理解は本発明の実施に必要ではないが、内因性ＤＮアーゼ活性は、糸状菌（例えば、トリコデルマリーゼイ、アスペルギルスニガー、アスペルギルスツビンゲンシス、アスペルギルスオリザエ、ゲオスミチアエメルソニイ、ミセリオフソーラサーモフィラ、ペニシリウムフニクロサム、フサリウムベネナタム、フミコーラインソレンスなど）に内因性の１つ以上の分泌されたＤＮアーゼか、又は細胞溶解により放出されるそのような糸状菌の細胞内ＤＮアーゼの結果であり得ると考えられている。
【００３６】
そのような内因性ＤＮアーゼを使用して、例えば、トリコデルマリーゼイ、アスペルギルスニガー、アスペルギルスツビンゲンシス、アスペルギルスオリザエ、ゲオスミチアエメルソニイ、ミセリオフソーラサーモフィラ、ペニシリウムフニクロサム、フサリウムベネナタム、又はフミコーラインソレンスの培養ブロスのような糸状菌培養ブロスから、ＤＮＡ分子を減少若しくは除去することができる。そのようなＤＮＡ分子の除去は、例えば、食料又は飼料添加物又はサプリメントとしての酵素製剤の提供など、多くの用途において有用である。規制当局により、一部の商業用酵素製剤、特に食料又は飼料の調製に使用される酵素製剤は、検出可能な宿主ＤＮＡを含まないこと、又は少なくとも、定義された制限未満の宿主ＤＮＡを有することが要求されている。培養ブロス中の真菌ＤＮＡ（例えば、トリコデルマリーゼイ、アスペルギルスニガー、アスペルギルスツビンゲンシス、アスペルギルスオリザエ、ゲオスミチアエメルソニイ、ミセリオフソーラサーモフィラ、ペニシリウムフニクロサム、フサリウムベネナタム、フミコーラインソレンスなどからのＤＮＡ）は、外因性ＤＮアーゼを用いて除去することができるが、そのようなＤＮアーゼを組み換えにより発現すること又はそれを培養ブロスに供給することには、追加の工程、より多くのコスト、及び効率低下の可能性が関わる。本方法は、宿主細胞の遺伝学的操作及び製剤へのＤＮアーゼの追加のいずれも必要とせずにタンパク質製剤中の宿主の遺伝物質を除去する簡易な手順を提供する。
【００３７】
ＩＩ．糸状菌宿主株
異種又は内因性のいずれかの種類のタンパク質を発現することができる任意の好適な真菌宿主株を使用して、本発明を実行することができる。例えば、真菌宿主株は例えば、子嚢菌門及びＰｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ亜門からのものなど糸状菌種の宿主株であり得る。そのような生物としては、商業的に重要な産業及び製薬タンパク質の産生に使用される糸状菌が挙げられ、限定するものではないが、トリコデルマｓｐｐ．、アスペルギルスｓｐｐ．、フザリウムｓｐｐ．、ペニシリウムｓｐｐ．、クリソスポリウムｓｐｐ．、タラロマイセスｓｐｐ．、ゲオスミチアｓｐｐ．、マイセリオフトラｓｐｐ．、及びニューロスポーラｓｐｐ．が挙げられる。好適な宿主株を得ることができる具体的な生物としては、限定するものではないが、トリコデルマリーゼイ（かつてはトリコデルマロンギブラキアタム及びハイポクレアジェコリナとして分類されていた）、アスペルギルスニゲル、アスペルギルスフミガーツス、アスペルギルスイタコニクス、アスペルギルスオリザエ、アスペルギルスニデュランス、アスペルギルステルレウス、アスペルギルスソジャエ、アスペルギルスジャポニクス、アスペルギルスツビンゲンシス、フミコーラインソレンス、フミコーラグリセア、サーモマイセスラヌギノサス、ニューロスポラクラッサ、ペニシリウムフニクロスム、ペニシリウムクリソゲナム、タラロマイセス（ゲオスミチア）エメルソニイ、フサリウムベネナタム、フサリウムグラミネアルム、ミセリオフィソーラサーモフィラ、及びクリソスポリウムラクノウェンスが挙げられる。真菌宿主株はまた、担子菌門やＭｕｃｏｒｍｙｃｏｔｉｎａ亜門からのもののような糸状菌種の宿主株であってもよい。そのような生物としては、商業的に重要な産業及び医薬タンパク質の生産のために使用される糸状菌細胞が挙げられ、限定するものではないが、アガリクスｓｐｐ．、ファネロカエテｓｐｐ．、シゾフィリウムｓｐｐ．、リゾムコールｓｐｐ．、及びムコールｓｐｐ．が含まれる。好適な宿主株を得ることができる具体的な生物としては、限定するものではないが、アガリクスビスポラス、ファネロカエテクリソスポリウム、シゾフィリウムコムネ、リゾムコールミエヘイ、及びムコールシルシネロイデスが挙げられる。
【００３８】
上記の及び他の糸状菌種から得られる発酵生成物（例えば、培養ブロスのようなタンパク質製剤など）に、ある程度の内因性ＤＮアーゼ活性が存在するであろうと期待することができる。ＤＮアーゼ活性レベル及びＤＮアーゼのｐＨ又は温度最適条件は、種によって異なる場合がある。しかし、本明細書に記載のｐＨ、温度、及びインキュベーション時間に対して行われた調整を本開示に従って試験して、ＤＮＡ除去のための要件を決定することができる。
【００３９】
本方法のいずれか１つの特定の実施形態において、宿主細胞は、周知の糸状菌であるトリコデルマリーゼイの細胞である。トリコデルマリーゼイ株の例としては、ＡＴＣＣ第１３６３１号、ＡＴＣＣ第２６９２１号、ＡＴＣＣ第５６７６４号、ＡＴＣＣ第５６７６５号、ＡＴＣＣ第５６７６７号、及びＮＲＲＬ第１５７０９号が挙げられる。宿主細胞の一例は、ＲＬ−Ｐ３７トリコデルマリーゼイ株に由来するものである（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓら（１９８４）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：４６〜５３に記載されている）。別の宿主細胞はＭｏｒｐｈ  １．１（ｐｙｒ＋）トリコデルマリーゼイ菌株であり、これは、クワド欠失ＲＬ−Ｐ３７トリコデルマリーゼイ菌株の自発的ｐｙｒ４復帰変異体である（ＰＣＴ特許公報第ＷＯ  ０５／００１０３６号に記載されている）。ＲＬ−Ｐ３７に類似の他の宿主株としては、トリコデルマリーゼイ（ロンギブラキアタム）菌株であるＲＵＴ−Ｃ３０（ＡＴＣＣ第５６７６５号）及びＱＭ９４１４株（ＡＴＣＣ第２６９２１号）が挙げられる。
【００４０】
特定の実施形態において、宿主株は、遺伝子工学、古典的な突然変異誘発、又は既存の株のハイブリッドの形成により遺伝子操作されている場合がある。遺伝子工学を用いて、外因性遺伝子を導入すること、又は内因性遺伝子のノックアウト若しくはノックダウンを行うことができる。突然変異誘発を用いて、内因性遺伝子を阻害又はノックアウトすることができ、あるいは、宿主細胞によっては、内因性遺伝子の機能を変更若しくは向上することができる。例としては、例えば、ＢｏｗｅｒらのＰＣＴ特許公報第ＷＯ  ２００８／１５３９０３号に記載されているように突然変異体を過剰産生することが挙げられる。また、真菌宿主細胞の多様な天然遺伝子が不活性化されている宿主株もまた含まれる。遺伝子の不活性化は、完全な又は部分的な欠失により、挿入による不活性化により、又は（遺伝子の機能性タンパク質の発現が阻害されるように）意図される目的のために遺伝子を非機能的にする任意の他の手段により、実行できる。遺伝子の不活性化の方法の例は、米国特許第５，２４６，８５３号、同第５，４７５，１０１号、及びＰＣＴ特許公報第ＷＯ  ９２／０６２０９号に見出すことができる。いくつかの宿主では、セルロース分解などのエンドグルカナーゼ（ＥＧ）及びエキソセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）（例えばは、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、又はｅｇｌ２）のような、セルロース分解酵素をコードする１つ以上の遺伝子を不活性化することができる。例えば、米国特許第５，６５０，３２２号は、ｃｂｈ１及びｃｂｈ２遺伝子の両方が欠失したＲＬ−Ｐ３７の誘導株を開示している。具体的な例としては、米国特許第５，８４７，２７６号及びＰＣＴ特許公報第ＷＯ  ０５／００１０３６号に、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、及びｅｇｌ２の「クワド」欠失（“quad” deletion）が記載されている。更に別の例として、特定の宿主細胞は、プロテアーゼ欠損株又はプロテアーゼマイナス株となるように操作することができ、そのようにして、そのような株によって発現される対象タンパク質の分解のリスクを減少させること又は失くすことができる。
【００４１】
上述したように、本方法は、第ＥＰ６５８６２１号又はＰＣＴ特許公報第ＷＯ２００８０６５２００号に記載されている手順のように外因性ＤＮアーゼを用いて宿主細胞培養を補う必要がない。しかしながら、方法に採用されるＤＮアーゼ活性が主に外因性ＤＮアーゼの活性によるものでないことを条件として、１つ以上の外因性ＤＮアーゼが組み換えにより発現される宿主細胞を使用してもよい（ただし使用する必要はない）。そのような宿主細胞では、外因性ＤＮアーゼは活性形態で発現されない（例えば、インクルージョン体において発現される）か、又は発現が非常に乏しい。そのような宿主細胞のいくつかでは、外因性ＤＮアーゼは細胞外で分泌されない（例えば、シグナルペプチドが欠けている）。任意の外因性ＤＮアーゼが培養ブロス又は他のタンパク質製剤に存在する場合、宿主ＤＮＡの分解に対するそのような外因性ＤＮアーゼの寄与は、総ＤＮアーゼ活性の４９％以下（例えば、４９％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、又は５％以下）である。このことは、そのアッセイの温度及びｐＨ条件下（例えば、温度４０℃、ｐＨ  ７．０）で、検出不可能なレベルまで内因性ＤＮＡを減少させるために要する時間の増加が、４９％以下（例えば、４９％以下、４５％以下で、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、又は５％以下）であること、及び好ましくは、外因性ＤＮアーゼの存在下ではなくその欠如下で、２５％又は１０％未満増加させることを示すことによって、実証することができる。換言すれば、培養ブロス又は他のタンパク質製剤中の宿主細胞（例えば、トリコデルマリーゼイ、アスペルギルスニガー、アスペルギルスツビンゲンシス、アスペルギルスオリザエ、ゲオスミチアエメルソニイ、ミセリオフソーラサーモフィラ、ペニシリウムフニクロサム、フサリウムベネナタム、フミコーラインソレンスなど）のＤＮＡの分解は、主に内因性のＤＮアーゼ活性によるものである。
【００４２】
宿主株は、１つ以上の内因性又は外因性酵素又は内因性酵素と外因性酵素とのブレンドの発現及び好ましくは分泌のために、使用することができる。内因的に又は外因的に発現させることができる酵素の種類のいくつかの例としては、デンプン分解酵素、タンパク質分解酵素、セルラーゼ酵素、オキシドレダクターゼ酵素、及び植物壁分解酵素が挙げられる。更に特定すると、そのような酵素としては、アミラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、フィターゼ、ペクチナーゼ、グルコシダーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、ガラクトシダーゼ、及びキチナーゼが挙げられる。
【００４３】
代替的又は追加的に、宿主株は、ホルモン、酵素、増殖因子、サイトカイン、抗体などを発現し、好ましくは分泌するように、遺伝子操作することができる。発現させることができるホルモンのいくつかの例としては、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ソマトスタチン、ゴナドトロピンホルモン、バソプレシン、オキシトシン、エリスロポエチン、インスリンなどが挙げられる。
【００４４】
増殖因子は、細胞表面上の受容体に結合するタンパク質であり、その主要な結果として細胞増殖及び／又は分化を活性化する。発現させる増殖因子のいくつかの例としては、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、神経増殖因子、線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、トランスフォーミング増殖因子などが挙げられる。
【００４５】
サイトカインは、特有の増殖因子の一群である。主として白血球から分泌されるものであるサイトカインは、体液性及び細胞性免疫応答、並びに食細胞の活性化の両方を刺激する。発現させるサイトカインのいくつかの例としては、コロニー刺激因子、インターロイキン（ＩＬ−１α及びβ）、ＩＬ−１３を介するＩＬ−２、及びインターフェロン（α、β、及びγ）が挙げられる。
【００４６】
宿主細胞はまた、抗体を発現するように遺伝子操作することができる。ヒト、ヒト化、キメラ又はベニヤ抗体が好ましい。抗体は、任意のクラス及びアイソタイプからのもの、すなわち、Ｇ１、２、３及び４、並びにＡ、Ｍ、Ｅ、又はＤであり得る。
【００４７】
特定の実施形態において、外因性タンパク質をコードする核酸セグメントは、発現ベクターにクローニングされる。外因性タンパク質をコードする核酸セグメントは、分泌を付与するシグナルペプチドと操作可能に連結して配置することができ、又はそれは、適切な発現のために、プロモーター及び時には他の調節配列と操作可能に連結して配置することができる。ポリペプチドをコードする発現ベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）の「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載されている標準的手法を用いて宿主細胞にトランスフェクト（形質移入）又は形質転換することができる。核酸は、レトロウィルスベクター（例えば、Ｆｅｒｒｙら（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：８３７７〜８３８１、及びＫａｙら（１９９２）、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：６４１〜６４７を参照）、アデノウィルスベクター（例えば、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９２）、Ｃｅｌｌ  ６８：１４３〜１５５、及びＨｅｒｚ及びＧｅｒａｒｄ（１９９３）、ＰｒｏｃＮａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９０：２８１２〜２８１６を参照）、受容体媒介ＤＮＡ取り込み（例えば、Ｗｕ及びＷｕ（１９８８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１；Ｗｉｌｓｏｎら（１９９２）、Ｊ．ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２６７：９６３〜９６７；及び米国特許第５，１６６，３２０号を参照）、ＤＮＡの直接注入（例えば、Ａｃｓａｄｉら（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：８１５〜８１８、及びＷｏｌｆｆら（１９９０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５〜１４６８を参照）、又は粒子ボンバードメント（バイオリスティック）（例えば、Ｃｈｅｎｇら（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ，９０：４４５５〜４４５９；Ｚｅｌｅｎｉｎら（１９９３）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ  ３１５：２９〜３２を参照）を介して細胞を形質転換することもできる。
【００４８】
エピソーム発現ベクター及び組み込み発現ベクター（integrating expression vector）の両方を使用することができる。組み込みベクターから成分（integrant）を同定するために、選択マーカー（例えば、薬物耐性）を含む遺伝子を目的の核酸とともに宿主細胞に導入する。選択マーカーの例としては、Ｇ４１８及びハイグロマイシンなどの特定の薬物に対する耐性を付与するものが挙げられる。選択マーカーは、目的の核酸からの別個のベクター又は同じベクター上に導入することができる。トランスフェクトされた宿主細胞は、次いで、選択マーカーを用いて細胞を選択することによって同定することができる。例えば、その選択マーカーが、ネオマイシン耐性を付与する遺伝子をコードするのであれば、核酸を取り込んだ宿主細胞は、Ｇ４１８の存在下でのそれらの増殖によって同定することができる。選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する。
【００４９】
いったん発現したポリペプチドは、アフィニティー精製、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、又はゲル電気泳動を含む従来の手順に従って精製することができる（一般には、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ（１９８２）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．を参照）。あるいは、ポリペプチドは、それを発現する宿主細胞の培養ブロスに実質的に類似している組成物において使用されるように、最小限の発現後操作に供してもよく、又は、全く発現後操作をしなくてもよい。
【００５０】
ＩＩＩ．糸状菌宿主細胞の培養
例えばセルラーゼ酵素、飼料酵素、又は他の酵素などの所望のタンパク質は、回分培養及び流加培養などを含む固体培養又は液内培養によって、糸状菌宿主（例えば、トリコデルマリーゼイ、アスペルギルスニガー、アスペルギルスツビンゲンシス、アスペルギルスオリザエ、ゲオスミチアエメルソニイ、ミセリオフソーラサーモフィラ、ペニシリウムフニクロサム、フサリウムベネナタム、フミコーラインソレンスなどの）の細胞中で生産することができる。流加培養は、その制御の容易さ、製品の均一な量の生産、及び全設備の最も経済的な使用のために、広く使用されている。
【００５１】
培養（時には発酵とも呼ばれる）は、液体（例えば、水性）媒体又は固体媒体中で行うことができ、本方法は、どちらにも適用可能であり得る。特定の典型的な実施形態では、培養は、水性無機塩培地、有機増殖因子、炭素又はエネルギー源材料、同化可能な窒素、酸素分子、及び使用される真菌宿主種の出発接種材料を含む培養ブロス中で実行される。無機培地は、好適には、可溶性の同化可能なイオンとしての組み合わされた形態でのリン、マグネシウム、カルシウム、カリウム、硫黄、及び／又はナトリウムの一定量を含み、かつ好ましくは、やはり好適な可溶性の同化可能な形態での銅、マンガン、モリブデン、亜鉛、鉄、ホウ素、及び／又はヨウ素などの特定の微量元素もまた含む。無機栄養素は、適切な微生物の増殖に寄与し、微生物変換プロセスにおける細胞による炭素及びエネルギー源の同化を最大化し、最大の細胞収量を達成することができる。
【００５２】
同化可能な窒素源は、任意の窒素含有化合物又は、微生物による代謝の利用に適した形態で窒素を放出することができる化合物であり得る。タンパク質加水分解物のような様々な種類の有機窒素源化合物を使用することができるが、通常は、アンモニア、水酸化アンモニウム、尿素、又は例えばリン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、ピロリン酸アンモニウム、塩化アンモニウムなど様々なアンモニウム塩などの安価な窒素含有化合物、又は様々な他のアンモニウム化合物を利用することができる。アンモニアガス自体は、大規模操作に便利であり、かつ適切な量で水性発酵（発酵培地）によってバブリングすることができる。アンモニアはまた、ｐＨ制御を助けることができる。
【００５３】
培養は、典型的には、微生物種が旺盛に増殖するのを補助するために有効な適切な酸素分圧で発酵容器の内容物を維持するために提供される、空気、酸素富化空気、又は更には実質的に純粋な分子酸素のような分子状酸素含有ガスによって供給される分子状酸素が関わる好気性プロセスである。実際には、酸素化炭化水素基質を用いることによって、微生物の増殖のための酸素要求が減少される。それにもかかわらず、基質の同化及びそれに対応した微生物の増殖は、部分的には、燃焼プロセスであるので、増殖のために分子状酸素が供給される。
【００５４】
エアレーション速度はかなりの範囲にわたって変化することができるが、エアレーションは、一般には、発酵槽内の液体体積あたりの酸素含有ガスの体積が（使用されている圧力において、２５℃にて）約０．５〜１０、好ましくは約０．５〜７の範囲の速度で行われる。この量は、リアクターに供給されている正常な酸素含有量の空気に基づくものであり、純粋な酸素という観点からは、それらの範囲はそれぞれ、発酵槽内の液体体積あたりの酸素含有ガスの体積が（使用されている圧力において、２５℃にて）約０．１〜１．７、又は好ましくは約０．１〜１．３となるであろう。
【００５５】
発酵のための圧力の範囲もまた広範であり得る。圧力は、一般には、約０〜３４５ｋＰａ（約０〜５０ｐｓｉｇ）、好ましくは約０〜２０７ｋＰａ（約０〜３０ｐｓｉｇ）の範囲内であり、より好ましくは、設備及び稼動費対酸素溶解度のバランスが達成され得るように、大気圧を少なくともわずかに超えたレベルである。大気圧を超えた圧力は、溶解した酸素の濃度を増すために有利であり、細胞の増殖速度の増加を助けることができる。しかし、より高い圧力は、設備費及び稼動費を増す。
【００５６】
発酵温度は、いくらか変化してもよい。例えば、トリコデルマリーゼイについては、温度は一般には約２０℃〜約４０℃の範囲であり、一般により好ましくは約２５℃〜約３４℃の範囲である。トリコデルマリーゼイに関しての好ましい発酵温度は、約２７℃〜約３０℃の範囲内である。
【００５７】
水生微生物発酵（発酵混合物）におけるｐＨの範囲は、例えば、約２．０〜約８．０の範囲である。糸状菌では、ｐＨは、通常、約２．５〜約８．０の範囲内であり、例えば、トリコデルマリーゼイでは、ｐＨは、通常、約３．０〜約７．０の範囲内である。トリコデルマリーゼイに関しての好ましいｐＨの範囲は、約３．５〜約５．０の範囲内である。
【００５８】
発酵槽中の発酵混合物の平均滞留時間は大幅に変化し得るが、用いる発酵温度及び培養に部分的に依存して、一般には約２４時間〜約５００時間の範囲であり、好ましくは２４時間〜４００時間の範囲である。特定の実施形態において、真菌宿主細胞は、少なくとも２４時間、例えば、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、又は少なくとも９６時間、培養した。例えば、トリコデルマリーゼイは、少なくとも２４時間、例えば、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、又は少なくとも９６時間、培養した。発酵は、好ましくは、１つ以上の目的の分泌タンパク質の細胞密度及び／又は濃度が予め決定された所望のレベルに近づくまで継続される。そのような所望のレベルに達したかどうかは、発酵槽からの定期的なサンプリングを用いて決定することができる。１つ以上の目的の分泌タンパク質の細胞密度及び／又は濃度の特定の所望のレベルは変化する場合があり、多数の要因を考慮して設定することができる。特定の実施形態では、特定の所望のレベルは、宿主細胞の生産性が低下し始める点に設定することができる。特定の他の実施形態では、特定の所望のレベルは、発酵槽がいっぱいになり過ぎて有効な発酵を続行することができなくなる時点として設定することができる。更に別の実施形態では、特定の所望のレベルは、単に、発酵槽で別の発酵作業を行う必要がある時点として、柔軟に設定することができる。細胞密度の特定の所望のレベルは、上記の要因の１つ、２つ、又はそれ以上により設定することができる。
【００５９】
ＤＮアーゼ分解のいくつかの方法において、発酵後のｐＨ及び／又は温度の任意の上昇は、発酵中のｐＨ及び温度に対して評価する。ｐＨ又は温度が有意に（すなわち、２℃を超えて、又は０．５ｐＨ単位を超えて）変化する場合、その発酵期間にかけてのｐＨの平均値を比較のベースラインとして使用する。あるいは、ｐＨ又は温度が有意に変化しない場合は特に、例えば発酵期間の始まり又は終わりでの単一の測定値を使用することができる。
【００６０】
好ましくは、炭素含有基質が限定的因子として制御されるようなやり方で発酵を行うことにより、炭素含有基質の細胞への良好な転換を提供し、未転換の基質の実質的な量での細胞の汚染を避ける。そのような基質が水溶性であれば、そのような基質の微少残留は全て容易に洗浄除去されるので、未転換の基質は問題にはならない。しかし、非水溶性の基質については、適した洗浄工程のような追加の製品処理工程が必要となる場合がある。
【００６１】
炭素及びエネルギー源材料の一部又は全て、及び／又は、例えばアンモニアのような同化できる窒素源の一部は、培地が発酵器に供給される前に、水性の無機培地に添加することができる。
【００６２】
リアクターに導入されたストリームのそれぞれは、好ましくは、所定の速度で制御されるか、又は、例えば発酵器のオフガス中の炭素及びエネルギー基質、ｐＨ、溶存酸素、酸素、又は二酸化炭素の濃度、又は光透過率により測定可能な細胞密度などをモニタリングすることによって決定可能な必要に応じて制御される。基質の装入に対して可能な限り高い収量で微生物細胞を得るために、炭素及びエネルギー源の効率的利用と一致した可能な限り急速な細胞増殖速度が得られるよう、種々の材料の供給速度を変化させることができる。
【００６３】
回分培養又は好ましい流加培養作業のいずれかで、全ての設備、リアクター、又は発酵手段、容器又はコンテナ、配管、付随する装置循環又は冷却装置などを、最初に、例えば約１２１℃で、例えば少なくとも１５分間のような長時間をかけて、例えば水蒸気を用いることによって滅菌することができる。次いで、その滅菌したリアクターに、酸素を含む必要な全ての栄養素及び炭素含有基質の存在下で、選択した微生物の培養物を接種する。
【００６４】
発酵ブロスは、一般には、細胞片、細胞、様々な浮遊固形物、及び、菌宿主のＤＮＡを含む他のバイオマス汚染物質、並びに所望のタンパク質、又は目的のタンパク質を含有している。好ましくは、それぞれの所望のタンパク質の合計量の少なくとも４０％、例えば少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、又は少なくとも約９０％が、発酵の終わりにブロス中に分泌されている。
【００６５】
ＩＶ．真菌タンパク質製剤のＤＮＡ含有量の減少
発酵により所望の細胞密度又はタンパク質濃度が得られたら、培養に使用したブロス又はそれから得られたタンパク質製剤を処理して、そのＤＮＡ含有量を減少させることができる。典型的な真菌宿主生物又は宿主細胞（例えば、トリコデルマリーゼイ、アスペルギルスニガー、アスペルギルスツビンゲンシス、アスペルギルスオリザエ、ゲオスミチアエメルソニイ、ミセリオフソーラサーモフィラ、ペニシリウムフニクロサム、フサリウムベネナタム、フミコーラインソレンスなど）は、分泌後又は細胞溶解の結果として細胞培養ブロス中に存在し得る、ＤＮＡ分解活性をもたらす１つ以上のＤＮアーゼを産生することができる。そのようにして作られた真菌タンパク質製剤のＤＮＡ含有量は、そのタンパク質製剤中の外因性ＤＮアーゼを用いずに又は実質量未満で用いて、そのような内因性ＤＮアーゼ活性のみによって若しくは少なくとも主にそれのみによって、減少させることができる。
【００６６】
発酵の完了後に、ブロスを更に処理せずに、ＤＮＡをブロスから除去することができる。あるいは、少なくとも１つの固液分離工程を行って、ＤＮＡの除去の前に、ブロスから細胞及び細胞片を除去する（すなわち、少なくともそれらの量を減少させる）ことができる。いくつかの方法では、細胞及び固形物の除去の後、ブロス中のタンパク質を濃縮し、場合によっては更に精製してからＤＮＡの除去を行う。しかしながら、ＤＮＡを除去するためにインキュベーションの前に行われる任意の精製工程は、好ましくは、ＤＮアーゼ活性から所望のタンパク質を分離せず、いかなる場合においても、１０％を超えるＤＮアーゼ活性を除去してはならない（例えば、２０％以下、３０％以下、４０％以下、又は５０％以下）。同様に、ＤＮＡを除去するためにインキュベーションの前に行われる任意の工程は、好ましくは、ＤＮアーゼ活性を不活性化してはならず、いかなる場合においても、１０％を超えるＤＮアーゼ活性を不活性化してはならない（例えば、２０％以下、３０％以下、４０％以下、又は５０％以下）。
【００６７】
細胞及び細胞片の除去は、例えば、遠心分離、濾過、透析、精密濾過、回転式真空濾過、又は、無細胞の濾液を生成するための他の周知のプロセスのような従来の固液分離法によって行うことができる。例えば、限外濾過、蒸発、又は沈殿のような技法を用いて、発酵ブロス又は無細胞の濾液を更に濃縮することができる。上清又は濾液のタンパク質成分は、例えば、硫酸アンモニウムなどの塩を用いて沈殿させることができ、次いで、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー又は類似の従来の手順のような様々な従来の精製手順によって精製することができる。
【００６８】
真菌タンパク質製剤（例えば、トリコデルマリーゼイ、アスペルギルスニガー、アスペルギルスツビンゲンシス、アスペルギルスオリザエ、ゲオスミチアエメルソニイ、ミセリオフソーラサーモフィラ、ペニシリウムフニクロサム、フサリウムベネナタム、又はフミコーラインソレンスのタンパク質製剤）のＤＮＡ含有量を減少させるために、そのタンパク質製剤のｐＨ及び／又は温度を調整する（通常は増加させる）ことにより、製剤中の真菌ＤＮアーゼ活性を増加させる。この調整工程前のｐＨは、通常、発酵中のそれと変わらない。調整工程前の温度は、温度が調整される前にブロスがどれだけの時間をかけて冷却されたかに依存し、通常、培養温度から室温までの範囲である。次いで、検出可能なレベルでＤＮＡ含有量を減少し、好ましくは、ＤＮＡ含有量を検出不能なレベルにまで減少させるために、タンパク質製剤を、その調整されたｐＨ及び／又は温度で十分な時間をかけてインキュベートする。いくつかの方法では、ｐＨ又は温度の調整は、発酵に用いられるｐＨ又は温度（通常、ｐＨ  ４．０〜５．０、温度２７℃〜３０℃）を超えてｐＨ及び／又は温度を増加させることである。高いｐＨ値及び温度値の組み合わせが効果的であるが、常に必要とは限らない。例えば、ＤＮＡの完全な分解は、そのタンパク質製剤の温度を低く（例えば１０℃又は４℃に）保ちながら、又は室温（例えば４℃〜２７℃の範囲内）で変化させずに維持しながら、高いｐＨのみで達成することができる。ＤＮＡの分解はまた、タンパク質製剤のｐＨを低く（例えばｐＨ  ４〜５に）保つか、又は発酵に使用したｐＨに維持しながら、高温のみで行うこともできる。真菌タンパク質製剤中の内因性ＤＮアーゼ活性は、例えば、Ｓｉｎｉｃｒｏｐｉ，Ｄ．ら（１９９４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２２：３５１〜３５８、又はＴｏｌｕｎ，Ｇ．及びＭｙｅｒｓ，Ｒ．Ｓ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：ｅ１１１．によって開示されているようなアッセイを用いて検出することができる。そのようなアッセイは、内因性ＤＮアーゼ活性の最適のｐＨ及び／又は温度を決定するために使用することができる。
【００６９】
ＤＮＡを除去するための高いｐＨは、５．０〜９．０の範囲でよく、好ましくは、６．０〜８．０の範囲であってよい。ＤＮＡ除去のためのｐＨの範囲のいくつかの例としては、５．０〜６．０、５．２〜７．８、５．５〜７．５、６．０〜７．０、６．５〜７．５、７．０〜８．０、及び８．０〜９．０が挙げられる。
【００７０】
ＤＮＡ除去のための高温は、３０℃〜７０℃の範囲でよく、好ましくは３５℃〜４７℃の範囲である。ＤＮＡ除去のための温度範囲のいくつかの例としては、３０℃〜４０℃、４０℃〜５０℃、５０℃〜６０℃、及び６０℃〜７０℃が挙げられる。組み換えにより糸状菌宿主（例えば、トリコデルマリーゼイ、アスペルギルスニガー、アスペルギルスツビンゲンシス、アスペルギルスオリザエ、ゲオスミチアエメルソニイ、ミセリオフソーラサーモフィラ、ペニシリウムフニクロサム、フサリウムベネナタム、又はフミコーラインソレンス）において発現された熱性又は耐熱性のタンパク質については、より高い温度を使用することができる。特定の真菌宿主のＤＮアーゼの熱安定性もまた、そのようなより高い温度の決定要因である。例えば、そのようなより高い温度は約６６℃以下であってよく、例えば約６０℃以下、５８℃以下、５５℃以下、又は５２℃以下であり得る。
【００７１】
タンパク質製剤は、様々な範囲の温度との組み合わせにおいて、高いｐＨでインキュベートすることができる。例えば、ｐＨを５．２〜７．８、５．５〜７．５、５．５〜６．５、６．５〜７．５、又は７．５〜８．５の範囲に上昇させ、温度を０℃〜５℃、５℃〜１５℃、１５℃〜２５℃、２５℃〜３５℃、３５℃〜４５℃、又は４５℃〜５５℃の範囲に維持することができる。同様に、タンパク質製剤は、様々な範囲のｐＨとの組み合わせにおいて高温でインキュベートすることができる。例えば、温度を２５℃〜３５℃、３５℃〜４５℃、又は４５℃〜５５℃の範囲に上昇させ、ｐＨを３．５〜４．５、４．５〜５．５、５．５〜６．５、６．５〜７．５、又は７．５〜８．５の範囲に維持することができる。
【００７２】
ＤＮアーゼによるＤＮＡ除去をタンパク質の限外濾過濃縮物で実行する場合、濃縮物は典型的には、限外濾過後に室温である。この場合、温度を室温より高く上げてもよく、及び／又は、ｐＨを、真菌宿主の発酵で使用したｐＨより高く上げてもよい。
【００７３】
調整工程中のＤＮＡ除去のインキュベーション時間は、所望のＤＮＡ含有量の減少の程度及び、ＤＮＡ除去に使用される温度及びｐＨに対するその所望のタンパク質の感度に部分的に依存して、大幅に変化する場合がある。ＤＮＡは、検出不能なレベルまで除去されるのが好ましい。また、所望のタンパク質の活性がほとんど又は全く損失しないのが好ましい。好ましくは、最適化されたインキュベーション条件の結果として、タンパク質の安定性又は活性は全く損失しないか、有意でない損失であり、例えば、所望のタンパク質の活性の損失は、１％未満、２％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、又は２０％未満である。所望により、タンパク質の安定性又は活性は、インキュベーションの前及び／又は後に評価することができる。ＤＮＡ除去のためのインキュベーションの時間はまた、ＤＮＡの除去中のｐＨ及び／又は温度に依存し、ｐＨが７未満及び温度が４０℃未満になると、より長い時間が必要になる。時間は、一般には、少なくとも１０分、２０分、３０分、６０分、１２０分、１８０分、２４０分から、最長で４時間、６時間、１２時間、２４時間、又は４８時間であり、下限及び上限の全ての順列を含む。インキュベーション時間は４８時間より長くてもよい。好ましいインキュベーション時間は２〜８時間である。好ましくは、ｐＨ及び／又は温度調整工程は、宿主細胞によって産生された酵素（群）が、目的の基質を処理する又はそれに作用するために適用される前に行われる。
【００７４】
タンパク質製剤（例えば培養ブロス）のＤＮＡ含有量はまた、調整工程のインキュベーションの前及び後にも評価することができる。真菌宿主ＤＮＡの任意のセグメントを、製剤の総ＤＮＡ含有量のマーカーとして使用することができる。好ましくはゲノムセグメントが使用される。所望により複数のセグメントを検出することができる。
【００７５】
ＰＣＲ増幅は、核酸（例えば、ＤＮＡ）の含有量を分析するための適切で好ましい方法である。任意の適切なゲノムＤＮＡセグメントにプライマーが隣接するように設計することができる（例えば、トリコデルマリーゼイの全ゲノム配列は、米国エネルギー省共同ゲノム研究所から入手することができ、アスペルギルス属の全ゲノム配列は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｒｙｌａｎｄ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ及びＳｔａｎｆｏｒｄ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅが主催するアスペルギルスゲノムデータベースから、及びＢｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの真菌ゲノムイニシアティブウェブサイトから、入手することができる）。ＰＣＲの検出は定性的でも定量的でもよい。増幅を実行した後にゲルのエチジウムブロマイド染色により増幅産物（存在する場合）を検出することは、基礎となるマーカーの存在又は欠如を示すことになるが、そのようなマーカーの量の正確な測定値は提供しない。ＤＮＡの存在は、ＰＣＲ増幅なしのゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色によってもまた検出することができる。ＤＮＡは、バンドの特徴的なスメアや梯子によって示される。
【００７６】
定量的増幅において、増幅産物の量は、元の試料中のテンプレートの量に比例し、検出は実時間に発生する。適切な対照との比較は、増幅されたＤＮＡセグメントのコピー数の尺度を提供する。定量的ＰＣＲの詳細なプロトコルは、Ｉｎｎｉｓら（１９９０）の「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．）に記載されている。
【００７７】
検出に使用するためのその他の適切な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ及びＷａｌｌａｃｅ（１９８９）（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８）（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７）、及びＢａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）（Ｇｅｎｅ  ８９：１１７）を参照）、転写増幅（Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３）、自給型配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４を参照）、ドットＰＣＲ、及びリカーアダプターＰＣＲが挙げられる。
【００７８】
タンパク質製剤（例えば、培養ブロス）中のＤＮＡの存在又はレベルも、例えば、ハイブリダイゼーションに基づくアッセイによって評価することができる。例えば、サザンブロッティングのような方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  Ｅｄ．，ｖｏｌｓ  １〜３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されている。また、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）が供給するＱｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＤＮＡアッセイキットのような市販のＤＮＡアッセイキットも入手可能である。
【００７９】
本方法を使用したブロス又は他のタンパク質製剤の処理は、ＤＮＡの検出可能な減少をもたらし、好ましくは、ＤＮＡ含有量を検出不能なレベルまで減少させる。エチジウムブロマイド染色後の、半数体ゲノム中の単一コピー中に存在するゲノムＤＮＡの任意のセグメントのＰＣＲ増幅が、（本実施例のようなＰＣＲ条件を使用して）可視のバンドを与えない場合は、検出不能なレベルとみなされる。典型的な規制要件の例では、「最終製品中に検出可能なＤＮＡがない」ことは、例えば、酵素製剤１ｍＬあたりの総糸状菌ＤＮＡが１〜５ｎｇを検出限界として、ＰＣＲベースのアッセイを用いて確認することができる。別の例では、製剤及び／又は最終製品の用途に依存して、総糸状菌ＤＮＡの検出限界として２０ｐｇ／ｍＬ、又は２ｎｇ／ｍＬ、又は１０ｎｇ／ｍＬを課すことができる。特定の他の例では、本方法を使用して、高温及び／又は高いｐＨでのインキュベーション時間を延長することによって、凍結乾燥された製品１ｇあたりの総糸状菌ＤＮＡが約５００フェムトグラム（例えば、凍結乾燥された製品１ｇあたりのＤＮＡが約４５０ｆｇ未満、約４００ｆｇ／ｇ未満、約３５０ｆｇ／ｇ未満、約３００ｆｇ／ｇ未満、約２５０ｆｇ／ｇ、又は更には約２００ｆｇ／ｇ未満）という更に低い限界を達成することができる。加えて、本方法を、培養ブロス又は他のタンパク質製剤からＤＮＡを除去するための従来の方法と組み合わせて使用することもまた企図される。例えば、本明細書に記載されている方法を使用して、培養ブロス中のＤＮＡのレベルを減少し、その後に、そのようなブロスから残留ＤＮＡを更に除去するために、外因性ＤＮアーゼを少量添加することができるが、分解へのそのような外因性ＤＮアーゼの寄与は、４９％以下（例えば、４９％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、又は５％以下）でなくてはならない。
【００８０】
タンパク質製剤（例えば、培養ブロスを含む）からＤＮＡを除去した後、ＤＮＡ除去中に上昇させた温度（上昇させた場合）を例えば室温まで低く下げるか、又は、より低い温度である４℃若しくは、製剤の保管に好適な他の温度に冷ますことができる。通常、製剤のｐＨを異なる値に再調整する必要はない。しかし、下流製剤又は他の手順が特定のｐＨを要求する場合は、製剤のｐＨを所望の値に調整してよい。
【００８１】
他の組み換え糸状菌宿主細胞の発酵生成物又はブロスは、トリコデルマリーゼイの培養ブロスと同じように、ある程度の内因性ＤＮアーゼ活性を含有するものと予測されるので、本明細書の方法を同じように使用して、そのようなブロスから、又は他のタンパク質製剤から、ＤＮＡを除去することができる。内因性ＤＮアーゼのＤＮアーゼ活性及び最適なｐＨ又は温度のレベルは種によって異なる場合があることが予測され得るので、当業者は、大規模な実験なしに本明細書に記載の教示を用いてＤＮＡ分子を除去するために必要なｐＨ調整及び／又は温度調整、並びにインキュベーション時間を確かめることができる。
【００８２】
Ｖ．処方
タンパク質製剤（例えば、培養ブロスを含む）の真菌宿主ＤＮＡが分解した後、製剤は、販売用に包装してもよく、又は、それ以上の処理をするとしても最少の処理のみで、本質的にそのまま使用することができ、あるいは、タンパク質製剤を更に精製してもよく、若しくは他の何らかの方法で、下流アプリケーションのために処理及び／又は処方してもよい。タンパク質又はタンパク質製剤は、液体、スラリー、粉末、スプレー、懸濁液、凍結乾燥組成物／処方、固体、顆粒剤、ゲルタブ、ピル、インプラント、ゲルとして、又は医薬処方、食品、飼料、食品サプリメント、飼料サプリメント、食品添加物、飼料添加物、栄養サプリメント若しくはその栄養補助食品として、処方され得る。
【００８３】
ＶＩ．タンパク質の使用
本方法により生成されたタンパク質又はタンパク質製剤（例えばブロス）は、農業、工業、医療、及び栄養学的な用途を有する。例えば、セルラーゼ酵素は、穀物からグルコースを精製するために、又は飼料の消化率を増加させることによって糞便廃棄物の生成を減少させるために動物飼料サプリメントとして、使用することができる。セルラーゼ酵素はまた、リグノセルロース系バイオマスを変換して発酵性糖にすることによって（例えばビール醸造における）アルコール発酵効率を高めるためにも使用することができる。フィターゼ製剤は、穀物の湿式粉砕、動物飼料、及び洗浄製品に使用することができる。フィターゼ、フィチン酸、及び低リン酸フィチン酸誘導体は、また、パーソナルケア製品、医療品、食品、及び栄養食品、並びに様々な産業アプリケーション、特に洗浄、テキスタイル、リソグラフィ及び化学分野に、他の多くの用途も見出す。リパーゼは、様々な食品／飼料、ベーキング、洗浄、及び／又はバイオ燃料に使用することができる。ホルモン、増殖因子、サイトカイン、及び抗体のようなタンパク質は、疾患の治療及び予防に使用することができる。
【実施例】
【００８４】
（実施例１）
パートＡ：
ブチアウクセラからフィターゼを発現する組み換えトリコデルマリーゼイ株をバイオリアクターで培養した。フィターゼを産生する発現カセットは、米国特許公報第２００９／００９８２４９号に記載されているプロトコールに従って調製した。次いで、発現カセットを、トリコデルマリーゼイ株ＲＬ−Ｐ３７の「クワド欠失」バージョン（分泌された４つの主要なセルラーゼすなわちＣＢＨＩ（ｃｅｌ７ａ）、ＣＢＨＩＩ（ｃｅｌ６ａ）、ＥＧＩ（ｃｅｌ７ｂ），ＥＧＩＩ（ｃｅｌ５ａ）が欠失しているもの）由来の宿主株に挿入した（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ  ａｎｄ  Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ、１９８４、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４６〜５３）。バイオリアクターは、米国特許公報第２００４０１２１４４６号（その関係する開示内容は参考として本明細書に援用される）に記載されているように操作した。
【００８５】
バイオリアクター内で増殖後、トリコデルマリーゼイ細胞を除去するために濾過により培養上清を得た。上清を限外濾過により約４倍に濃縮した。安息香酸ナトリウム及びソルビン酸カリウムの両方を、いずれも０．３％の最終濃度になるように添加し、ｐＨを５．５に調整して、以下の実験で使用する限外濾過濃縮物（ＵＦＣ）を提供した。
【００８６】
Ｑｉａｇｅｎ（カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）のＰＣＲ精製キットを製造業者の指示に従って使用し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得たＤＮＡ（スパイクＤＮＡ）の１，５２６ｂｐのフラグメントを精製した。このスパイクＤＮＡを、１μｇ／ｍＬの最終濃度で、ＵＦＣ試料に添加した．ＰＣＲに用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、バイオリアクターで増殖させたトリコデルマリーゼイ株由来のゲノムＤＮＡか、又は同じテンプレートのＤＮＡ配列を含む精製プラスミドＤＮＡのいずれかをテンプレートとして使用して、同じＤＮＡフラグメントを生成するために使用することができる。スパイクＤＮＡのＤＮＡ配列は重要ではない。トリコデルマリーゼイのゲノムＤＮＡの任意の領域は、従来の手順によって設計されたテンプレート及びプライマーとして使用することができる。
【００８７】
ＵＦＣ試料中の宿主ＤＮＡの試験手順：Ｐｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ及びＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍを製造業者の指示に従って使用し、５０μＬのＵＦＣ試料からＤＮＡを精製した（これに、所望によりスパイクＤＮＡ製剤を添加した）。簡潔に述べると、５０μＬのＵＦＣ試料を４５０μＬのＰｒｏｍｅｇａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎと混合し、この混合液をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｃｏｌｕｍｎに充填した。ミニカラムを膜洗浄液で洗った後、ミニカラムの膜と結合した全てのＤＮＡをヌクレアーゼフリー水中に最終的に溶出した。溶出された試料中のＤＮＡの検出は、スパイクＤＮＡの生成に使用したのと同じプライマーを用いたＰＣＲ、及びアガロースゲル電気泳動並びにエチジウムブロマイド染色によるＤＮＡフラグメントの可視化によって行った。それらのＰＣＲ産物には、プライマーの何らかの非特異的な結合によると推測される２つのＤＮＡバンドが観察された。
【００８８】
パートＢ：
スパイクＤＮＡを添加せずにＰＣＲ分析によって検出可能なＤＮＡを含有しているＵＦＣ試料を選択した（図１、レーン１）。このＵＦＣに１μｇ／ｍＬの最終濃度までスパイクＤＮＡを添加し、得られたＰＣＲ産物の量には増加が見られた（図１、レーン２）。このＵＦＣ（スパイクＤＮＡなし）をｐＨ  ３．０、ｐＨ  ４．５、又はｐＨ  ７．０に調整し、１０℃で１時間インキュベーションした。ＤＮＡはｐＨ  ３．０及びｐＨ  ４．５でインキュベーション後もＰＣＲ分析により検出可能であったが、ｐＨ  ７．０でインキュベーション後は検出可能でなかった。ＵＦＣ（スパイクＤＮＡなし）をｐＨ  ４．５又はｐＨ  ７．０に調整し、４０℃で２４時間インキュベーションした後、ＰＣＲ分析によりＤＮＡは検出不能であった。
【００８９】
パートＣ：
ｐＨ  ５．５のＵＦＣ試料にスパイクＤＮＡを１μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加した。試料を４０℃で０時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、又は４８時間インキュベーションした。インキュベーションなしでは、スパイクＤＮＡはＰＣＲ分析により検出可能であった（図２、レーン１）。しかし、４時間のインキュベーションまでには、スパイクＤＮＡはもはや検出可能ではなかった（図２、レーン２）。２４時間までのインキュベーション中にフィターゼ活性の損失はなかった。スパイクＤＮＡを有する同じＵＦＣ試料を４℃又は室温で７日間インキュベーションした後、ＰＣＲ分析により検出可能なＤＮＡはなかった（図２、レーン７及び８）。
【００９０】
パートＤ：
ｐＨ  ５．５のＵＦＣ試料にスパイクＤＮＡを１．４５μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加した。試料を１０℃又は２２℃又は３７℃で０時間、４時間、８時間、１２時間、又は２４時間インキュベーションした後、スパイクＤＮＡを検出するためにＰＣＲ分析を行った。
【００９１】
１０℃で８時間インキュベーション後、ＰＣＲによりＤＮＡは検出可能であり（図３、レーン４）、１０℃で２４時間後でさえも、微量のＰＣＲ産物が観察された（図３、レーン５）。２２℃で８時間インキュベーション後、ＰＣＲによりＤＮＡは検出可能であり（図３、レーン９）、２２℃で２４時間後、ＰＣＲ産物は観察されなかった（図３、レーン１０）。３７℃で２〜４時間インキュベーション後、微量のＰＣＲ産物が観察されたが（図３、レーン１２及び１３）、３７℃で８時間後、ＤＮＡは検出されなかった（図３、レーン１４）。水中にスパイクＤＮＡを含有する対照実験は、３７℃で２４時間のインキュベーション後に、明らかに検出可能なＤＮＡを示し、ＤＮＡの損失がＵＦＣの成分によるものであることが確認された（図３、レーン１６）。
【００９２】
（実施例２）
アスペルギルスツビンゲンシスからリパーゼを発現する組み換えトリコデルマリーゼイをバイオリアクターで培養した。リパーゼを産生する発現カセットは、ＰＣＴ特許公報第ＷＯ  ２０１０／１２２５３１号に記載されているプロトコールに従って調製した。次いで、発現カセットを、トリコデルマリーゼイ株ＲＬ−Ｐ３７の「クワド欠失」バージョン（分泌された４つの主要なセルラーゼすなわちＣＢＨＩ（ｃｅｌ７ａ）、ＣＢＨＩＩ（ｃｅｌ６ａ）、ＥＧＩ（ｃｅｌ７ｂ），ＥＧＩＩ（ｃｅｌ５ａ）が欠失しているもの）に由来する宿主株に挿入した（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ  ａｎｄ  Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４６〜５３）。バイオリアクターは、米国特許公報第２００４０１２１４４６号（その関係する開示内容は参考として本明細書に援用される）に記載されているように操作した。
【００９３】
バイオリアクター内で増殖後、トリコデルマリーゼイ細胞を除去するために濾過により培養上清を得た。更なる実験のために使用する限外濾過濃縮物（ＵＦＣ）を生成するために、上清を限外濾過により約４倍に濃縮した。
【００９４】
ＵＦＣ試料からＤＮＡを抽出するために、Ｐｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州、Ｍａｄｉｓｏｎ）Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ及びＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍを、製造業者の説明に従って使用した。簡潔に述べると、１００μＬのＵＦＣ試料を４５０μＬのＰｒｏｍｅｇａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎと混合し、この混合液をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｃｏｌｕｍｎに充填した。膜洗浄液でミニカラムを洗った後、ミニカラムの膜と結合した全てのＤＮＡを、ヌクレアーゼフリー水中に最終的に溶出した。溶出された試料中のＤＮＡの検出は、アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウムによる染色によって行った。多くの場合、ＵＦＣの試料には低分子量のＤＮＡフラグメント（約３００ｂｐ以下）のスメアが観察され、断片化されたトリコデルマリーゼイのゲノムＤＮＡに由来するものであると推測される。
【００９５】
ＵＦＣの様々な処置を試験し、ＵＦＣから回収されたＤＮＡの存在度に及ぼすそれらの影響を観察した。ＵＦＣの出発ｐＨは約４．０であった（対照ＵＦＣ）。ＵＦＣの試料をｐＨ  ５．２又は７．６に調整した。対照ＵＦＣ及び調整されたＵＦＣは、ｐＨ調整の直後に凍結するか、又は、４℃若しくは室温で２４時間インキュベーションしてから、後の分析まで凍結した。次いで、アガロースゲル電気泳動により、全ての試料を分析した。結果を図４Ａ及び４Ｂに示す。対照ＵＦＣ又はｐＨ  ５．２に調整したＵＦＣのインキュベーションは、ＤＮＡの存在に明らかな影響を有さなかった。ｐＨ  ６．３に調整したＵＦＣのインキュベーションは、ＤＮＡのわずかな減少を引き起こした。ｐＨ  ７．６に調整したＵＦＣのインキュベーションはＤＮＡの明らかな減少は引き起こさず、室温で２４時間後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡスメアは検出不能であった。
【００９６】
本明細書で参照される全ての特許及び出版物、及びこのような特許及び出版物に包含される全てのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、参照により例示的に組み込まれる。好ましい方法及び材料を説明してきたが、本明細書に記載のものと同様の、又は本明細書に記載のものに相当する任意の方法及び材料を、本開示を実施又は試験するために使用できる。文脈から明らかでない限り、任意の実施形態、態様、工程、特徴、要素、又は制限は、任意の他のものとの組み合わせにおいて使用され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【国際調査報告】
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