(57)【要約】フザリウム種、スクレロチニア種、リゾクトニア種、ピシウム種などにより例示される植物病原性真菌によって引き起こされる病徴を制御するための組成物を提供する。組成物は、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、またはSEQ ID NO: 7と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と共に提供される。組成物は、種子処理剤、植物処理剤、または土壌処理剤のうちの1つであってもよい。SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、またはSEQ ID NO: 7と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子を発現する、形質転換された植物細胞であって、植物病原性真菌による感染に対して抵抗性である植物細胞を提供する。SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、またはSEQ ID NO: 7と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子を発現する、形質転換された微生物細胞を提供する。2014513919.tif 000010
2014513919.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1種類または複数種類の植物病原性真菌によって引き起こされる病徴を制御するための組成物であって、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、およびSEQ ID NO: 7から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子、ならびに担体を含む、組成物。
【請求項２】
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 4と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
ポリペプチド分子がSEQ ID NO: 4を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 5と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
ポリペプチド分子がSEQ ID N0: 5を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項６】
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 6と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項７】
ポリペプチド分子がSEQ ID N0: 6を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項８】
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 7と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項９】
ポリペプチド分子がSEQ ID N0: 7を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１０】
種子処理組成物である、請求項1〜9のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
植物処理組成物である、請求項1〜9のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２】
土壌処理組成物である、請求項1〜9のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１３】
植物病原性真菌が、フザリウム（Fusarium）種、スクレロチニア（Sclerotinia）種、リゾクトニア（Rhizoctonia）種、またはピシウム（Pithium）種のうちの1つである、請求項1〜12のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４】
フザリウム種、スクレロチニア種、リゾクトニア種、またはピシウム種のうちの1つによって引き起こされる植物における病徴を制御するための、請求項1〜13のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項１５】
種子を処理する段階、植物を処理する段階、および植物成長基質を処理する段階のうちの1つまたは複数を含む、請求項14記載の使用。
【請求項１６】
1種類または複数種類の植物病原性真菌によって引き起こされる病徴を制御するための、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、およびSEQ ID NO: 7から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子を発現する微生物細胞の使用。
【請求項１７】
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 4と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項16記載の使用。
【請求項１８】
ポリペプチド分子がSEQ ID N0: 4を含む、請求項16記載の使用。
【請求項１９】
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 5と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項16記載の使用。
【請求項２０】
ポリペプチド分子がSEQ ID N0: 5を含む、請求項16記載の使用。
【請求項２１】
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 6と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項16記載の使用。
【請求項２２】
ポリペプチド分子がSEQ ID N0: 6を含む、請求項16記載の使用。
【請求項２３】
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 7と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項16記載の使用。
【請求項２４】
ポリペプチド分子がSEQ ID N0: 7を含む、請求項16記載の使用。
【請求項２５】
微生物細胞が、真菌細胞、酵母細胞、または細菌細胞である、請求項16〜24のいずれか一項記載の使用。
【請求項２６】
真菌細胞が、スフェロデス・ミコパラシチカ（Sphaerodes mycoparasitica）の細胞、またはペニシリウム（Penicillium）種の細胞である、請求項25記載の使用。
【請求項２７】
酵母細胞が、ジゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）種の細胞、サッカロミセス（Saccharomyces）種の細胞、ピキア（Pichia）種の細胞、またはクルベロミセス（Kluveromyces）種の細胞である、請求項25記載の使用。
【請求項２８】
細菌細胞が、大腸菌（Escherichia coli）の細胞、シュードモナス（Pseudomonas）種の細胞、またはバチルス（Bacillus）種の細胞である、請求項25記載の使用。
【請求項２９】
SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、およびSEQ ID NO: 7から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子を発現する、形質転換された植物細胞であって、フザリウム種による感染に対して抵抗性である、植物細胞。
【請求項３０】
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 4と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項29記載の形質転換された植物細胞。
【請求項３１】
ポリペプチド分子がSEQ ID NO: 4を含む、請求項29記載の形質転換された植物細胞。
【請求項３２】
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 5と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項29記載の形質転換された植物細胞。
【請求項３３】
ポリペプチド分子がSEQ ID NO: 5を含む、請求項29記載の形質転換された植物細胞。
【請求項３４】
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 6と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項29記載の形質転換された植物細胞。
【請求項３５】
ポリペプチド分子がSEQ ID NO: 6を含む、請求項29記載の形質転換された植物細胞。
【請求項３６】
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 7と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項29記載の形質転換された植物細胞。
【請求項３７】
ポリペプチド分子がSEQ ID NO: 7を含む、請求項29記載の形質転換された植物細胞。
【請求項３８】
油糧種子植物細胞、または穀類植物細胞、または豆類植物細胞である、請求項29〜37のいずれか一項記載の形質転換された植物細胞。
【請求項３９】
1種類または複数種類の植物病原性真菌によって引き起こされる病徴を制御するための単離されたタンパク質であって、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、およびSEQ ID NO: 7から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子を含む、単離されたタンパク質。
【請求項４０】
ポリペプチド配列が、SEQ ID NO: 4と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項39記載の単離されたタンパク質。
【請求項４１】
SEQ ID NO: 4を含む、請求項39記載の単離されたタンパク質。
【請求項４２】
SEQ ID NO: 5と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項39記載の単離されたタンパク質。
【請求項４３】
SEQ ID NO: 5を含む、請求項39記載の単離されたタンパク質。
【請求項４４】
SEQ ID NO: 6と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項39記載の単離されたタンパク質。
【請求項４５】
SEQ ID NO: 6を含む、請求項39記載の単離されたタンパク質。
【請求項４６】
SEQ ID NO: 7と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項39記載の単離されたタンパク質。
【請求項４７】
SEQ ID NO: 7を含む、請求項39記載の単離されたタンパク質。
【請求項４８】
請求項39〜47のいずれか一項記載のタンパク質をコードする、単離された核酸分子。
【請求項４９】
請求項48記載の核酸分子で形質転換された微生物細胞。
【請求項５０】
前記核酸分子がプロモーターに機能的に連結されている、請求項49記載の微生物細胞。
【請求項５１】
真菌細胞、酵母細胞、または細菌細胞である、請求項49または50記載の微生物細胞。
【請求項５２】
真菌細胞が、スフェロデス・ミコパラシチカの細胞、またはペニシリウム種の細胞である、請求項51記載の微生物細胞。
【請求項５３】
酵母細胞が、ジゴサッカロミセス種の細胞、サッカロミセス種の細胞、ピキア種の細胞、またはクルベロミセス種の細胞である、請求項51記載の微生物細胞。
【請求項５４】
細菌細胞が、大腸菌の細胞、シュードモナス種の細胞、またはバチルス種の細胞である、請求項51記載の微生物細胞。
【請求項５５】
請求項48記載の核酸分子で形質転換された植物細胞。
【請求項５６】
前記核酸分子がプロモーターに機能的に連結されている、請求項55記載の植物細胞。
【請求項５７】
油糧種子植物細胞、穀類植物細胞、または豆類植物細胞である、請求項55または56記載の植物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、真菌性植物病原体を制御するために有効な新規な生物的防除剤、関連組成物、およびその使用に関する。特に、本発明は、植物病原性真菌に対して静真菌（mycostatic）効果および／または殺真菌（mycocidal）効果を有する新規タンパク質に関する。本発明はさらに、前記タンパク質を含む生物的防除剤、および、それを含む使用、方法、組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
フザリウム（Fusarium）は、植物上および土壌中に広く分布している糸状菌である。あるフザリウム種は、植物病原体である。例えば、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）は、100を超える植物種においてフザリウム萎凋病を引き起こす。フザリウム・オキシスポラムは、閉塞および衰弱をもたらし得る植物木部でのコロニー形成により、該病害を引き起こす。これが起こると、葉の萎れおよび黄化などの症状が植物に現れ、最終的に植物の死滅がもたらされる。この状態が、世界中の市場からグロスミッチェル（Gros Michel）バナナ品種が減少して消えた主な原因であった。最近、新たな株が優勢なキャベンディッシュ（Cavendish）品種の植物を攻撃し始めており、解決策が無ければ、この品種も世界市場から消えるであろうという懸念をもたらしている。
【０００３】
フザリウム根腐れ病（root rot）は、森林の種苗場における実生の枯死の主な原因であり、かつ、移植後の最初の成長期における生存率の低下も引き起こす。病害は、いくつかのフザリウム種によって引き起こされ、世界の多くの地域において一般的である。病害は、西部カナダおよび米国において、ならびに中北部および南部の州においても、特別な問題である。さらに、真菌であるフザリウム・シルシナタム（Fusarium circinatum）によって引き起こされるマツ漏脂病（Pine pitch canker）は、マツの木の重大な病害であり、特に米国およびニュージーランドにおける林業に対して脅威である。ラジアータマツまたはモンテレーマツは、この病害に対する感受性が高く、カリフォルニアのいくつかの地域では成木における枯死率が80％に達する。
【０００４】
「イヤーブライト（ear blight）」または「黒星病」としても公知であるフザリウム赤カビ病（FHB）は、フザリウムによって引き起こされるコムギ、オオムギ、オートムギ、およびその他の小粒穀物の病害である。トウモロコシおよびメイズは、「黒穂病」として公知である同様の状態によって影響を受け得る。上述の状態は、作物の収穫量および等級を低下させることがあり、かつ穀類をマイコトキシンで汚染する可能性がある。FHBのために穀物産業は年間ほぼ50億ドルを要すると、概算されている。近年、FHBは、西部カナダにおける商業的に重要なコムギ作物およびオオムギ作物について高まりつつある重大な問題となっている。過去に、いくつかの影響を受けた圃場における収穫量が30％以上低下したカナダにおいて、FHBと主に関連する2つの種として、フザリウム・オキシスポラムおよびフザリウム・アベナセウム（Fusarium avenaceum）が同定されている。FHBおよび黒穂病の収穫された穀類は、飼料の拒絶、一般の消化障害、下痢、および出血と関連するデオキシニバレノール（DON）トリコテセンなどのマイコトキシンで、しばしば汚染されている。北アメリカにおける毒素産生性3-アセチルデオキシニバレノール（3-ADON）フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）集団の出現は、かなり最近の現象である。これは、15-ADON化学型に取って代わりつつある。さらに、実験室および圃場の両方の条件下でF. グラミネアラムと類似しているF. カルモラム（F. culmorum）のマイコトキシンプロフィールは、世界中のトウモロコシ、メイズ、およびコムギの生産に対してさらなる脅威を呈する。現在、FHBおよび関連するマイコトキシンのための有効な制御手段は存在しない。さらに、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、オートムギ、またはその他の小粒穀物の抵抗性品種も存在しない。殺真菌剤は有効であり得るが、一時的に病害を抑制するだけである。
【０００５】
フザリウム種は、一般的な植物病原体であることに加えて、動物に日和見感染することがあり、ヒトにおける表在性感染および／または全身感染の原因となる作用物質であり得る。フザリウムは、最も薬物抵抗性である真菌のうちの1つであり、フザリウム感染を処置することを困難にする。侵襲性の感染は、致命的にもなり得る。
【０００６】
スクレロチニア（Sclerotinia）茎腐病（stem rot）は、病原体であるスクレロチニア・スクレロチオルム（Sclerotinia sclerotiorum）によって引き起こされる。S. スクレロチオルムは、広範な宿主を有し、多数の植物種（キャノーラ、ヒマワリ、ダイズ、アマなど）に感染することが公知である。病害の大発生は、輪作をしない条件下、または輪作がいくつかの感受性植物種を含む場合に、特に重篤になり得る。感染が開花時期の初期に起きた場合には、収穫量の損失は20％に達し得る。広く一般的な別の真菌性植物病原体は、作物植物において「立枯れ病」または「ワイヤーステム（wire-stem）」病徴を引き起こすリゾクトニア（Rhizoctonia）である。感染は、成長期中の任意の時に起こり得るが、実生期が最も感受性である。すべての成長期における病害の発生率および重篤度は、天候、土壌条件、および接種レベルにより影響される。涼しい天候は、実生の感染に有利に働く。同様に、ワイヤーステム病害の発生率は、土壌が湿っていて冷たい春および秋に最も重篤である。根腐れ病は、一般に、温かく湿った天候の時期中に起こり、任意の発育の段階にある植物に影響を及ぼし得る。立枯れ病により影響を受けた実生は、出てくることができないか、または出てきた場合は、急速に衰退し、倒れ、死滅する。より成長した実生においては、下葉が紫色化し、茎の下部が土壌表面近くで収縮しかつ暗褐色になる。他の症状は、種子の腐敗、腐食した根、および下方の葉柄上の癌腫病を含み得る。ピシウム・ウルティマム（Pythium ultimum）は、世界中に広く分布している遍在性の土壌伝播性病原体であり、植物に立枯れ病および根腐れ病を引き起こす。P. ウルティマムは、多くの重要な農作物および芝草を含む広範な宿主を有する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、真菌性病原体を制御する、および／または、フザリウム種、スクレロチニア種、リゾクトニア種、ピシウム（Pithium）種などにより例示される植物病原性真菌によって引き起こされる病徴を制御する新規タンパク質に関する。さらに、これらの新規タンパク質はまた、フザリウム種、スクレロチニア種、リゾクトニア種、ピシウム種などにより例示される植物病原性真菌によって産生される毒素に対して抗マイコトキシン効果を有する。
【０００８】
本発明のいくつかの例示的態様は、植物病原性真菌の胞子の発芽を制御および／もしくは予防するため、ならびに／または植物病原性真菌の菌糸体の繁殖を制御するため、ならびに／または植物病原性真菌が植物細胞に感染するのを予防するため、または任意のこれらの組み合わせのために有用である、スフェロデス・ミコパラシチカ（Sphaerodes mycoparasitica）により産生される新規細胞内タンパク質に関する。
【０００９】
本発明のいくつかの例示的態様は、植物病原性真菌の胞子の発芽を制御および／もしくは予防するため、ならびに／または植物病原性真菌の菌糸体の繁殖を制御するため、ならびに／または植物病原性真菌が植物細胞に感染するのを予防するため、または任意のこれらの組み合わせのために有用である、S. ミコパラシチカにより産生される新規細胞外タンパク質に関する。
【００１０】
本発明の1つの局面は、SEQ ID NO: 4を含みかつ約79 kDaの分子量を有する、S. ミコパラシチカにより産生される新規細胞外タンパク質に関係する。
【００１１】
本発明の1つの局面は、SEQ ID NO: 5を含みかつ約50 kDaの分子量を有する、S. ミコパラシチカにより産生される新規細胞外タンパク質に関係する。
【００１２】
本発明の1つの局面は、SEQ ID NO: 6を含みかつ約36 kDaの分子量を有する、S. ミコパラシチカにより産生される新規細胞外タンパク質に関係する。
【００１３】
本発明の1つの局面は、SEQ ID NO: 7を含みかつ約13 kDaの分子量を有する、S. ミコパラシチカにより産生される新規細胞外タンパク質に関係する。
【００１４】
本発明のいくつかの例示的態様は、1種または複数種の新規細胞外タンパク質を含む組成物に関係する。組成物は、種子処理組成物であってもよく、または植物処理組成物であってもよく、または土壌処理組成物であってもよい。
【００１５】
本発明のいくつかの例示的態様は、1種または複数種の新規細胞内タンパク質および新規細胞外タンパク質を産生するように形質転換された微生物細胞に関係する。形質転換された微生物細胞は、フザリウム種、スクレロチニア種、リゾクトニア種、ピシウム種などにより例示される植物病原性真菌によって引き起こされる病徴を制御するために使用することができる。形質転換された微生物細胞は、種子処理剤、および／または植物処理剤、および／または土壌処理剤、または任意のこれらの組み合わせとして使用することができる。あるいは、形質転換された微生物細胞は、前記の新規タンパク質を作製するために使用することができる。本発明の組成物を調製するために、前記タンパク質を採取して使用することができる。
【００１６】
本発明のいくつかの例示的態様は、1種または複数種の新規タンパク質を過剰発現する、形質転換された植物細胞に関係する。そのような形質転換された植物細胞は、培養して植物全体へとなり得る、種子、体細胞胚、器官形成組織などにより例示される植物繁殖体中に含まれ得る。形質転換された植物細胞を含む植物全体は、フザリウム種、スクレロチニア種、リゾクトニア種、ピシウム種などにより例示される植物病原性真菌によって引き起こされる病徴に対して抵抗性であるか、または少なくとも耐性である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明の例示的態様を、以下の図面についての言及と共に説明する。
【００１８】
【図１】図1(a)Aおよび図1(a)Bは、フザリウム・オキシスポラム（図1(a)A）およびF. グラミネアラム（図1(a)B）の菌糸体の増殖に対する本発明の例示的タンパク質の阻害効果を示すディスク拡散アッセイの顕微鏡写真であり、図1(b)は、3日間および4日間の増殖後の、例示的タンパク質によるF. オキシスポラム（A）およびF. グラミネアラム（B）の菌糸体増殖の阻害％を示す図である。
【図２】スフェロデス・ミコパラシチカにより産生された細胞内タンパク質の、2本のバンドへの10％非変性PAGE分離の顕微鏡写真である。
【図３】図2に示される10％非変性PAGEゲル上に示された上方バンドおよび下方バンドから溶出されたS. ミコパラシチカ細胞内タンパク質の12％ SDS-PAGE分離の顕微鏡写真である。
【図４】S. ミコパラシチカにより産生された細胞外タンパク質の、4本のバンドへの10％非変性PAGE分離の顕微鏡写真である。
【図５】図4に示される10％非変性PAGEゲルの4本のバンドから溶出されたS. ミコパラシチカ細胞外タンパク質の12％ SDS-PAGE分離の顕微鏡写真である。
【図６】S. ミコパラシチカにより産生された細胞外タンパク質の4本のバンドのFLPC分離を示す、クロマトグラムである。
【図７】図7(a)は、対照処理におけるF. オキシスポラムの菌糸体増殖の顕微鏡写真であり；図7(b)は、対照処理＋緩衝液におけるF. オキシスポラムの菌糸体増殖の顕微鏡写真であり；図7(c)は、F. オキシスポラムの菌糸体増殖に対する50 kDa細胞内タンパク質の阻害効果の顕微鏡写真であり；および図7(d)は、F. オキシスポラムの菌糸体増殖に対する79 kDa細胞内タンパク質の阻害効果の顕微鏡写真である。
【図８】図8(a)は、対照処理におけるF. グラミネアラムの菌糸体増殖の顕微鏡写真であり；図8(b)は、対照処理＋緩衝液におけるF. グラミネアラムの菌糸体増殖の顕微鏡写真であり；図8(c)は、F. グラミネアラムの菌糸体増殖に対する50 kDa細胞内タンパク質の阻害効果の顕微鏡写真であり；および図8(d)は、F. グラミネアラムの菌糸体増殖に対する79 kDa細胞内タンパク質の阻害効果の顕微鏡写真である。
【図９】図9(a)は、対照処理（c）と比較した、79 kDa細胞外タンパク質（EC1）によるF. オキシスポラムの菌糸体生長の阻害を示す顕微鏡写真であり、ならびに図9(b)は、50 kDa細胞外タンパク質（EC2）および36 kDa細胞外タンパク質（EC3）によるF. オキシスポラムの菌糸体生長の阻害を示す顕微鏡写真である。
【図１０】図10(a)は、対照処理（c）と比較した、79 kDa細胞外タンパク質（EC1）によるF. グラミネアラムの菌糸体生長の阻害を示す顕微鏡写真であり、ならびに図10(b)は、50 kDa細胞外タンパク質（EC2）および36 kDa細胞外タンパク質（EC3）によるF. グラミネアラムの菌糸体生長の阻害を示す顕微鏡写真である。
【図１１】図11(a)は、対照処理（c）と比較した、13 kDa細胞外タンパク質（EC4）によるF. グラミネアラムの菌糸体生長の阻害を示す顕微鏡写真であり、および図11(b)は、対照処理（c）と比較した、13 kDa細胞外タンパク質（EC4）によるF. オキシスポラムの菌糸体生長の阻害を示す顕微鏡写真である。
【図１２】図12(a)および図12(b)は、F. オキシスポラム胞子（図12(a)）およびF. グラミネアラム胞子（図12(b)）の発芽に対する、S. ミコパラシチカ細胞外タンパク質画分EC1、EC2、EC3、およびEC4の効果を示す図である。
【図１３】F. オキシスポラムおよびF. グラミネアラムのコロニー増殖および成長の阻害に対する、S. ミコパラシチカ細胞外タンパク質画分EC1、EC2、EC3、およびEC4の効果を示す図である。
【図１４】図14A(c)、図14A(a)、図14A(b)は、対照のF. オキシスポラム胞子の発芽（c）、F. オキシスポラム胞子の発芽に対する50 kDaタンパク質の阻害効果（a）、および13 kDaタンパク質の阻害効果を示す顕微鏡写真であり、ならびに図14B(c)、図14B(a)、図14B(b)は、対照のF. グラミネアラム胞子の発芽（c）、F. グラミネアラム胞子の発芽に対する50 kDaタンパク質の阻害効果（a）、および13 kDaタンパク質の阻害効果を示す顕微鏡写真である。
【図１５】図15(a)および図15(b)は、対照（図15(a)）と比較して、結晶形成細胞外タンパク質EC1およびEC3の、F. アベナセウムの菌糸体増殖に対する効果（図15(b)）を示す顕微鏡写真である。
【図１６】図16(a)および図16(c)は、対照（図16(a)）と比較して、結晶形成細胞外タンパク質EC1およびEC3の、F. グラミネアラムの発芽コムギ種子へのコロニー形成および菌糸体増殖に対する効果（図16(b)）を示す顕微鏡写真であり、他方、図16(c)は、該細胞外タンパク質で処理されたコムギ実生の表面からの、多数の溶解したF. グラミネアラム菌糸要素（矢印参照）を示す共焦点レーザー走査顕微鏡写真である。「K+」は、培地がEC1およびEC3細胞外タンパク質を含有していたことを示す。「K-」は、EC1およびEC3細胞外タンパク質が培地に存在しなかったことを示す。「K-結晶」は、細胞外タンパク質分子の位置を特定する。
【図１７】図17(a)および図17(b)は、対照（図17(a)）と比較して、結晶形成細胞外タンパク質EC1およびEC3の、F. グラミネアラムの菌糸体増殖に対する効果（図17(b)）を示す顕微鏡写真である。
【図１８】図18(a)は、図17(b)由来の結晶タンパク質で処理されたF. グラミネアラムからの、タンパク質結晶および溶解した真菌菌糸の存在を示す走査電子顕微鏡写真であり、図18(b)は、図17(b)由来の結晶タンパク質で処理されたF. グラミネアラムの菌糸中のタンパク質結晶の存在を示す共焦点レーザー走査顕微鏡写真であり、ならびに図18(c)は、図17(b)由来の結晶タンパク質で処理されたF. グラミネアラムからの、タンパク質結晶および多数の壊れた菌糸要素およびアポトーシス溶解した細胞（矢印）の存在を示す化学力顕微鏡写真である。「K結晶：細胞外タンパク質分子の位置を特定する。」
【図１９】79 kDA EC1タンパク質を構成するアミノ酸のMALDI-TOF-MS分離を示す図である。
【図２０】50 kDa EC2タンパク質を構成するアミノ酸のMALDI-TOF-MS分離を示す図である。
【図２１】36 kDa EC3タンパク質を構成するアミノ酸のMALDI-TOF-MS分離を示す図である。
【図２２】13 kDa EC3タンパク質を構成するアミノ酸のMALDI-TOF-MS分離を示す図である。
【図２３】図23(a)〜図23(f)は、以下の顕微鏡写真である：（図23(a)）PDA上の、対照となる未処理のスクレロチニア・スクレロチオルム培養物、（図23(b)）細胞外タンパク質EC1＋EC3で修正されたPDA上で増殖させたS. スクレロチオルム培養物、（図23(c)）対照となる未処理のリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）培養物、（図23(d)）細胞外タンパク質EC1＋EC3で修正されたPDA上で増殖させたR. ソラニ培養物、（図23(e)）対照となる未処理のピシウム・ウルティマム培養物、および（図23(f)）細胞外タンパク質EC1＋EC3で修正されたPDA上で増殖させたP. ウルティマム培養物。
【図２４】結晶形成細胞外タンパク質EC1およびEC3の、スクレロチニア・スクレロチオルム、リゾクトニア・ソラニ、およびピシウム・ウルティマムの菌糸体増殖に対する阻害効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
スフェロデス・ミコパラシチカ（子嚢菌門（Ascomycetes）メラノスポラ目（Melanosporales））は、コムギまたはアスパラガスの圃場に起因するフザリウム・アベナセウム、フザリウム・グラミネアラム、およびフザリウム・オキシスポラムの単離物から単離された菌寄生菌である。この種は、子嚢胞子のサイズ、形状（紡錘形および三角形）、ならびに壁装飾（網状および平滑）の独特な組み合わせを特徴とする。また、子嚢果子殻壁の表面上、菌糸周囲の子嚢果上、および菌糸から発生する不規則に分岐した分生子柄上の単純フィアライドから、分生子が産生される。S. ミコパラシチカは、フィアロ型アナモルフを有し、かつ、子嚢果子殻壁の表面上に、または菌糸周囲の子嚢果上に不規則に散在して、および分生子柄上に単純フィアライドを産生する。S. ミコパラシチカは、フザリウムの生きている菌糸に寄生するフック様構造を形成する。
【００２０】
スフェロデス・ミコパラシチカの試料培養物は、アクセッション番号IDAC301008-01で、International Depositary Authority of Canada Collection （1015 Arlington Street, Winnipeg, Canada, R3E 3R2）に寄託されている。フザリウム・アベナセウム（テレオモルフ：ジベレラ・アベナセア（Giberella avenacea））に生体栄養的に（biotrophically）寄生するスフェロデス・ミコパラシチカの試料培養物は、アクセッション番号IDAC301008-02で、International Depositary Authority of Canada Collectionに寄託されており、本明細書において「SM-Bst」と呼ばれる。フザリウム・グラミネアラム（テレオモルフ：ジベレラ・ゼアエ（Giberella zeae））に生体栄養的に寄生するスフェロデス・ミコパラシチカの試料培養物は、アクセッション番号IDAC301008-03で、International Depositary Authority of Canada Collectionに寄託されており、本明細書において「SM-Gst」と呼ばれる。
【００２１】
S. ミコパラシチカの大サブユニットリボソームRNA遺伝子（LSU）からの1266bp DNA配列を、SEQ ID N0: 1に示す。
2014513919.tif 000003
【００２２】
S. ミコパラシチカの小サブユニットリボソームRNA遺伝子（SSU）からの1233bp DNA配列を、SEQ ID NO: 2に示す。
2014513919.tif 000004
【００２３】
本明細書において開示されるスフェロデス・ミコパラシチカにより産生される新規タンパク質は、抗真菌剤として有用である。これらの新規タンパク質は、フザリウム菌の感染を処理するか、寛解させるか、またはさもなければ制御するために使用され得る。S. ミコパラシチカにより産生されるこれらの新規タンパク質は、フザリウム・アベナセウム、フザリウム・グラミネアラム、および／またはフザリウム・オキシスポラムの感染を、処理するか、寛解させるか、またはさもなければ制御するため、ならびに植物の健康または成長を改善するために特に有用である。
【００２４】
本明細書において開示される新規S. ミコパラシチカタンパク質は、真菌感染、特にフザリウムの感染が発生する確率を減少させるための予防剤として使用され得る。
【００２５】
本明細書において開示される新規S. ミコパラシチカタンパク質は、フザリウム萎凋病またはフザリウム赤カビ病により影響を受けた植物を処理するために使用され得る。これらのタンパク質は、そのような状態が蔓延することを妨げるために、あるいはそのような状態が発生するリスクを減少させるための予防手段として、使用され得る。
【００２６】
本明細書において開示される新規S. ミコパラシチカタンパク質は、フザリウム菌の感染を処理するか、寛解させるか、またはさもなければ制御するために使用され得る。前記タンパク質は、処理を必要とする生物に対して、任意の適当な様式で適用され得る。例えば、前記タンパク質は、直接使用されてもよいし、あるいは、土壌システムもしくは無土壌成長システムへの適用のための接種材料（例えば、顆粒組成物、泥炭ベースの組成物）、種子への適用のための接種材料（例えば、粉末組成物、顆粒組成物、泥炭ベースの組成物、液体組成物）、または成長する植物への適用のための接種材料（例えば、粉末組成物、液体ベースの組成物）へとさらに加工されてもよい。
【００２７】
本明細書において開示される製剤は、（i）1種または複数種の新規タンパク質を含む、1種または複数種の活性成分、（ii）1種または複数種の担体（しばしば、高密度の活性成分を支持し、標的へと送達するために使用される不活性材料）、ならびに任意で（iii）1種または複数種のアジュバント（UV線からの防御により活性成分の機能を促進および維持する化合物、標的における雨耐性を確実にする化合物、湿気を保持するかもしくは乾燥に対して防御する化合物、および／または、Hynes and Boyetchko（2006, Research initiatives in the art and science of biopesticide formulations. Soil Biol. & Biochem. 38: 845-49）により開示されるものなどの、標準的な農業設備を用いた生物農薬の散布および分散を促進する化合物）を含む。
【００２８】
S. ミコパラシチカ由来の内部転写スペーサー（Internal Transcribed Spacer）リボソームDNAを、配列決定した。ITS領域からの560bp DNA配列を、SEQ ID NO: 3に示す。
2014513919.tif 000005
【００２９】
スフェロデス・ミコパラシチカ由来の全細胞内タンパク質抽出物および全細胞外タンパク質抽出物は、フザリウム種、スクレロチニア種、リゾクトニア種、およびピシウム種の真菌胞子の発芽の有意な阻害を実証する。殺真菌効果を有する4種の新規タンパク質を、全タンパク質抽出物から単離し、1種は約79 kDaの分子量を有してSEQ ID NO:4を含み、別の1種は約50 kDaの分子量を有してSEQ ID NO:5を含み、別の1種は約36 kDaの分子量を有してSEQ ID NO:6を含み、および4種目は約13 kDaの分子量を有してSEQ ID NO:7を含んだ。本発明は、これらのタンパク質の1種または複数種を含む抗真菌剤を提供する。
【００３０】
従来の分子生物学的技術が、4種の新規タンパク質の各々を単離し、特徴決定し、および作製するために使用されてもよい。例えば、本タンパク質についての遺伝子を同定するために、S. ミコパラシチカをF. オキシスポラム濾液で曝露し、上方制御されたmRNAを標準的なノーザンブロットにより単離することができる。cDNAは、逆転写酵素PCR（RT-PCR）によりmRNAから作製することができる。cDNAは、増幅し、精製し、および適切なベクター中に挿入することができる。このベクターを、適切な宿主細胞中に挿入してもよい。
【００３１】
クローニングおよび発現は、同定されたタンパク質のためのプライマーを設計することによる、これらの新規な抗微生物タンパク質をコードする遺伝子の単離に焦点を合わせてもよい。当該タンパク質の大規模作製のための産業用株を生成するために、単離された遺伝子を、適当な／効率的なプロモーターを有する適当な発現ベクター（酵母または細菌）中にクローニングしてもよい。これらのベクターは、Promega、Invitrogen、Clontech、または他の会社から購入することができる。クローニングされた遺伝子を、そのタンパク質発現について試験してもよく、発現されたタンパク質は、（Hisタグカラムまたは他のカラムを用いて）精製されると考えられる。精製されたタンパク質を、ディスクプレートアッセイ法および／またはDrummond et al.（2000, The development of microbiological methods for phytochemical screening. Rec. Res. Dev. Phytochem. 4:143-152）によって開示されるマイクロタイタープレートアッセイ法により例示される方法を用いて、植物病原性真菌に対する抗真菌活性について試験してもよい。次に、遺伝子変異、またはエンハンサー、イントロン、もしくはタンパク質特異的プロモーター（GA誘導性）の付加、または付加欠失を含むrDNA技術を、タンパク質の作製を増強するために使用してもよい。
【００３２】
Sanghyun et.al.（2008, Transgenic wheat expressing a barley class II chitinase gene has enhanced resistance against Fusarium graminearum. J. Expt. Botany, 59, 2371-2378）およびTobias et. al. （2007, Co-bombardment, integration and expression of rice chitinase and thaumatin-like protein genes in barley (Hordeum vulgare cv. Conlon). Plant Cell Reports 26: 631-639）により例示されるような当業者に公知である技術を用いて、病原性真菌に対して抗真菌活性を有するトランスジェニック系統を作製するために、新規タンパク質、すなわち、13 kDaタンパク質、36 kDaタンパク質、50 kDaタンパク質、および79 kDaタンパク質のうちの1種または複数種またはすべてをコードする選択された遺伝子を、選択された植物ゲノム中に形質転換してもよい。これらの新規タンパク質での形質転換に適する作物植物は、特に、油糧種子作物、穀類作物、豆類作物、針葉樹種、および落葉樹種により例示される。例示的な油糧種子作物は、特に、キャノーラ、カラシナ、ナタネ、ダイズ、アマ、ヒマワリ、ベニバナ、トウゴマ、およびカメリナを含む。例示的な穀類作物は、特に、コムギ、オオムギ、オートムギ、ライコムギ、ライムギ、イネ、メイズ、モロコシ、およびキノアを含む。例示的な豆類作物は、特に、インゲン、エンドウ、ヒヨコマメ、レンズマメ、およびルピナスを含む。例示的な針葉樹種は、特に、マツ、トウヒ、モミ、およびツガを含む。例示的な落葉樹種は、特に、ポプラ、アスペン、カエデ、オーク、堅果を実らせる木、果樹、アカシア、およびユーカリを含む。
【００３３】
本発明は、S. ミコパラシチカにより産生される、（SEQ ID NO:4を含む）79 kDaタンパク質、（SEQ ID NO:5を含む）50 kDaタンパク質、（SEQ ID NO:6を含む）36 kDaタンパク質、および（SEQ ID NO:7を含む）13 kDaタンパク質のうちの1種または複数種またはすべてを含む抗真菌組成物を提供する。あるいは、13 kDaタンパク質、36 kDaタンパク質、50 kDaタンパク質、および79 kDaタンパク質のうちの1種または複数種またはすべては、13 kDaタンパク質、36 kDaタンパク質、50 kDaタンパク質、および79 kDaタンパク質のうちの1種または複数種またはすべてをコードする1種または複数種の核酸分子が提供された、形質転換された微生物により産生されてもよい。本発明はまた、植物の真菌病害を制御する方法、およびマイコトキシン解毒のための方法であって、以下で総称して「抗真菌剤」と呼ばれる13 kDaタンパク質、36 kDaタンパク質、50 kDaタンパク質、および79 kDaタンパク質のうちの1種または複数種またはすべてを、植物の部位に適用する段階を含む方法を、提供する。
【００３４】
本発明の組成物は、例えば、植物の種子、および／または植物を成長させるために使用される成長培地（例えば、土壌もしくは水）、および／または植物の根、および／または植物の葉、またはこれらの任意の組み合わせへ適用されてもよい。本組成物で処理することができる例示的な作物植物は、種子作物、穀類作物、豆類作物、園芸作物、森林作物、および芝草などの農作物を含む。
【００３５】
本発明は、抗真菌剤と、最終生成物の安定性および／または性能を確実にすると考えられる農学的に許容される担体および／または希釈剤の1種または複数種とを含む組成物を提供する。適当な担体は、特に、カオリナイト、ベントナイト、およびモンモリロナイトにより例示される粘土粉体、泥炭顆粒、泥炭粉末、炭素粉体、セルロース顆粒、およびおがくずにより例示される粉体、バーミキュライト、パーライト、軽石、メチルセルロース、タルクによって例示される。適当な希釈剤は、水によって、および、アルギナート、カラギーナン、寒天、カルボキシメチルセルロースなどにより例示される非粘性ゲルによって例示される。担体または希釈剤は、活性成分と適合性であるべきであり、農学的に許容されるべきであり、容易な粒子の分散および付着を可能にする優れた吸収力および適当な容積密度を有するべきである。
【００３６】
本明細書における組成物は、当技術分野において確立された慣行に従って、水性スプレー、顆粒、および粉剤として適用されてもよい。水性スプレーは、通常、本発明の化合物の水和剤または乳剤製剤を、相対的に大量の水と混合して、分散液を形成させることにより調製される。
【００３７】
水和剤は、抗真菌剤と固体担体と界面活性剤の微粉化された混合物を含んでもよい。固体担体は、通常、アタパルガイト粘土、カオリン粘土、モンモリロナイト粘土、珪藻土、微粉化されたシリカ、精製されたケイ酸塩、またはこれらの組み合わせの中から選択される。本明細書において有用であり得る界面活性剤は、湿潤能力、浸透能力、および／または分散能力を有する。それらは、典型的には、約0.5重量％〜約10重量％の量で存在する。本明細書における界面活性剤は、例えば、アルキルベンゼンスルホナート、アルキルスルファート、ナフタレンスルホナートおよび縮合ナフタレンスルホナート、スルホン化リグニン、ならびに非イオン性界面活性剤から選択され得る。
【００３８】
乳剤は、水に不混和性の溶媒と界面活性剤との混合物である液体担体中に、本発明の抗真菌剤を含んでもよい。本明細書において有用であり得る溶媒は、キシレン、アルキルナフタレン、石油蒸留物、テルペン溶媒、エーテル-アルコール、有機エステル溶媒、またはこれらの適当な組み合わせのような芳香族炭化水素溶媒を含む。
【００３９】
本発明の組成物が、汚染源および接種材料の分散を制御するために植物の破片もしくは落葉落枝に適用される場合、または発芽前保護のためとして土壌に適用される場合、顆粒製剤または粉体が、時にはスプレーよりも便利である。
【００４０】
1つの態様において、本明細書において開示される抗真菌剤は、アルギナートペレット中に封入される。ペレットは、任意の適当な様式で調製されてもよい。例えば、1つの有用な方法は、Harveson et. al.（2002, Novel Use of a Pyrenomycetous Mycoparasite for Management of Fusarium Wilt of Watermelon. Plant Disease 86(9): 1025-1030）に記載されている。
【００４１】
組成物は、抗真菌剤において有用である他の活性物質を含んでもよい。例えば、本明細書における組成物は、トリコデルマ（Trichoderma）、硫黄、ニーム油、ローズマリー油、ホホバ油、枯草菌（Bacillus subtilis）、アリルアミン（例えば、テルビナフィン）、代謝拮抗物質（例えば、フルシトシン）、アゾール（例えば、ケトコナゾール、イトラコナゾール）、エキノカンジン（例えば、カスポファンギン）、ポリエン（例えば、アンホテリシンB）、全身性剤（例えば、グリセオフルビン）、またはこれらの組み合わせのような、他の抗真菌剤を含んでもよい。
【００４２】
本明細書における組成物は、約0.1重量％〜約95重量％の抗真菌剤、ならびに約0.1重量％〜約95重量％の担体および／または界面活性剤を含有してもよい。播種前の植物種子に対する直接適用は、いくつかの場合において、非常に薄く、かつ種子の重量に基づいてほんの1または2重量％以下を占める実質的に均一なコーティングを得るように、本発明の粉末化された固体化合物または粉剤のいずれかを種子と混合することによって達成されてもよい。しかしながら、いくつかの場合において、メタノールなどの植物毒性でない溶媒が、種子の表面上の本発明の化合物の均一な分布を容易にするための担体として、便利に使用される。
【００４３】
本明細書における組成物は、植物における真菌感染の処理において有用であり得る。従って、本明細書における組成物は、本明細書において開示される（SEQ ID NO:4を含む）79 kDaタンパク質、（SEQ ID NO:5を含む）50 kDaタンパク質、（SEQ ID NO:6を含む）36 kDaタンパク質、および（SEQ ID NO:7を含む）13 kDaタンパク質のうちの1種または複数種またはすべてと、そのための許容される担体とを含んでもよい。
【００４４】
本発明は、S. ミコパラシチカの13 kDaタンパク質、36 kDaタンパク質、50 kDaタンパク質、および79 kDaタンパク質のうちの1種または複数種またはすべてを含む抗真菌組成物を作製するための例示的方法に関する。方法は、以下の段階を含む：
（a）S. ミコパラシチカ胞子の胞子形成を誘導する段階；
（b）S. ミコパラシチカを培養する段階；
（c）S. ミコパラシチカ培養物からタンパク質を回収する段階、
（d）13 kDaタンパク質、36 kDaタンパク質、50 kDaタンパク質、および79 kDaタンパク質のうちの1種または複数種またはすべてを、前記の回収されたS. ミコパラシチカタンパク質から分離および回収する段階；ならびに
（e）S. ミコパラシチカタンパク質から回収された、13 kDaタンパク質、36 kDaタンパク質、50 kDaタンパク質、および79 kDaタンパク質のうちの1種または複数種またはすべてを含む組成物を調製する段階。
【００４５】
（SEQ ID NO:4を含む）79 kDaタンパク質、（SEQ ID NO:5を含む）50 kDaタンパク質、（SEQ ID NO:6を含む）36 kDaタンパク質、および（SEQ ID NO:7を含む）13 kDaタンパク質を、回収されたS. ミコパラシチカタンパク質から一緒に分離および回収してもよい。あるいは、13 kDaタンパク質および／または36 kDaタンパク質および／または50 kDaタンパク質および／または79 kDaタンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを、回収されたS. ミコパラシチカタンパク質から個々に回収してもよい。
【００４６】
本発明は、S. ミコパラシチカの（SEQ ID NO:4を含む）79 kDaタンパク質、（SEQ ID NO:5を含む）50 kDaタンパク質、（SEQ ID NO:6を含む）36 kDaタンパク質、および（SEQ ID NO:7を含む）13 kDaタンパク質のうちの1種または複数種またはすべてを含む抗真菌組成物を作製するための別の例示的方法に関する。方法は、以下の段階を含む：
（f）選択された微生物培養物を、S. ミコパラシチカにより産生される13 kDaタンパク質、36 kDaタンパク質、50 kDaタンパク質、および79 kDaタンパク質のうちの1種または複数種またはすべてをコードする1種または複数種の遺伝子で形質転換する段階；
（g）形質転換された微生物培養物を培養する段階；
（h）形質転換された培養物からタンパク質を回収する段階、
（i）13 kDaタンパク質および／または36 kDaタンパク質および／または50 kDaタンパク質および／または79 kDaタンパク質を、前記の回収されたタンパク質から分離および回収する段階；ならびに
（j）13 kDaタンパク質、36 kDaタンパク質、50 kDaタンパク質、および79 kDaタンパク質のうちの1種または複数種またはすべてを含む組成物を調製する段階。
【００４７】
13 kDaタンパク質および／または36 kDaタンパク質および／または50 kDaタンパク質および／または79 kDaタンパク質を、回収されたタンパク質から一緒に分離および回収してもよい。あるいは、13 kDaタンパク質および／または36 kDaタンパク質および／または50 kDaタンパク質および／または79 kDaタンパク質を、回収されたタンパク質から個々に回収してもよい。S. ミコパラシチカにより産生される13 kDaタンパク質、36 kDaタンパク質、50 kDaタンパク質、および79 kDaタンパク質のうちの1種または複数種またはすべてをコードする1種または複数種の遺伝子で形質転換され得る適当な微生物培養物は、大腸菌（Escherichia coli）、シュードモナス（Pseudomonas）種、バチルス（Bacillus）種などのような細菌培養物、ジゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）種、サッカロミセス（Saccharomyces）種、ピキア（Pichia）種、クルベロミセス（Kluveromyces）種などのような酵母培養物、およびペニシリウム（Penicillium）種などにより例示される。
【実施例】
【００４８】
実施例1：スフェロデス・ミコパラシチカ由来の細胞内および細胞外タンパク質の産生および抽出
スフェロデス・ミコパラシチカ株IDAC 301008-02および／またはIDAC 301008-03を、本明細書において開示されるすべての研究の中で使用し、全体を通してそれぞれ「SM-Bst」および「SMGst」と呼ぶ。SM-BstおよびSM-Gstのストック培養物を調製し、ポテトデキストロースブロス（PDB）培養培地中に21℃で維持した。各種類のストック培養物から細胞内および細胞外タンパク質を調製するために、PDB培養物から約3 mlを、50 ml PDB増殖培地を含有する250-mlエルレンマイヤーフラスコへ移した。フラスコを7日間、回転式振盪機（150 rpm）上で、室温でインキュベーションした。若い菌糸体を、Whatman（登録商標）No.1濾紙（Whatmanは、Whatman International Ltd., Kent, UKの登録商標である）で濾過した。Whatman（登録商標）No. 1濾紙上に収集された菌糸体を、細胞内タンパク質の抽出のために使用し、一方、濾過された培養培地を、菌糸体由来の細胞外タンパク質の回収のために使用した。
【００４９】
実施例2：スフェロデス・ミコパラシチカ由来の細胞内タンパク質および細胞外タンパク質の分画、分離、および精製
細胞内タンパク質抽出：
細胞内タンパク質を、Chen et al.（2004, Heat shock proteins of thermophilic and thermotolerant fungi from Taiwan. Bot. Bull. Acad. Sin. 45: 247-257）により開示される方法に従って抽出した。各試料由来の総量200 mgの真菌菌糸体を、液体窒素中で、滅菌した磁器の乳鉢中で乳棒を用いて粉末化し、1.5 mlの冷却した抽出緩衝液と混合した。菌糸体（〜200 mg）を、50 mMトリス-HCl（pH 8.5）；2％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）；2％β-メルカプトエタノール；1 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（95％アルコール中のPMSF）からなる1 mLの緩衝液を含有する粉砕チューブ中で、音波処理により粉砕した。ホモジェネートを、12,000 rpm、28℃で10分間、遠心分離し、上清を収集した。4倍容量の冷アセトン（-20℃）を添加し、該試料を一晩、-20℃で冷凍した。沈殿物（タンパク質）をアセトン中で保存し、12000 rpm、28℃で5分間、遠心分離し、最終的に、50〜100μlの試料緩衝液（62.5 mM トリス-HCl（pH 6.8）；3％ SDS；10％グリセロール；5％β-メルカプトエタノール）中に溶解した。該タンパク質試料を新しい1.5 mlエッペンドルフチューブに移し、さらなる研究に使用するまで-80℃で保存した。
【００５０】
細胞外タンパク質抽出：
濾過された培養培地を、細胞外タンパク質の供給源として使用し、3000ダルトンカットオフ膜を有するAmicon（登録商標）限外濾過遠心分離チューブ（Amiconは、Millipore Corp., Billerica, MA, USAの登録商標である）により、4000 rpm、4℃での遠心分離によって濃縮した。ディスク拡散アッセイを用いて、全細胞外タンパク質を、真菌性病原体であるフザリウム・オキシスポラムおよびフザリウム・グラミネアラムに対する抗真菌活性について試験した。全細胞外タンパク質の抗真菌活性は、いくつかの改変を伴う、Roberts and Selitrennikoff（1986, Isolation and partial characterization of two antifungal proteins from barley. Biochim. Biophys. Acta, 880: 161-170）により記載されているような放射状ディスクプレート拡散アッセイによって、滅菌条件下で試験した。F. オキシスポラムおよびF. グラミネアラムに対する抗真菌活性についての全細胞外タンパク質の試験は、ポテトデキストロース寒天を含有するペトリ皿中で行った。活発に増殖中の真菌プレートからの菌糸体プラグをペトリ皿の中央に置き、滅菌濾紙ディスク（直径5 mmのWhatman（登録商標）濾紙no. 1）を、寒天表面上の菌糸体コロニーの縁から0.5 cm離れた距離に置いた。2.5μgの細胞外タンパク質を含有するアリコート（60μL）を、ディスクに添加した（試験スポットは、図1(a)Aおよび図1(a)Bにおいて「T」として特定される）。滅菌蒸留水および緩衝液を対照として用いた（対照スポットは、図1(a)Aおよび図1(a)Bにおいて「C」として特定される）。次に前記プレートを、室温で4日間インキュベーションし、菌糸体生長の阻害について調査した。菌糸体コロニーの面積を測定し、対照に対する菌糸体コロニーの生長面積の減少％を算出することにより、真菌増殖の阻害を決定した。SMCD培養物から回収された全細胞外タンパク質は、F. オキシスポラムおよびF. グラミネアラムの両方において菌糸体生長を阻害した（図1(a)Aおよび図1(a)B）。発芽開始の3日後に、F. オキシスポラムの菌糸伸長において約22％の阻害、およびF. グラミネアラムの菌糸伸長において30％の阻害が観察された（図1(b)）。1日後、F. オキシスポラムの菌糸伸長の阻害は約30％に増大し、他方、F. グラミネアラムにおける菌糸伸長の阻害は約35％に増大した（図1b）。
【００５１】
非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（非変性PAGE）：
Laemmli（1970, Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685）により教示される方法を用いて、タンパク質（細胞内および細胞外）を、不連続緩衝液システムにおいて10％非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（非変性PAGE）により分離した。濃縮用ゲル（3.75％アクリルアミド／ビスアクリルアミド 30:0.8 v/v）は、緩衝液として125 mMトリス-HCL、pH 6.8を有し、分離用ゲル（7.5％アクリルアミド／ビスアクリルアミド 30:0.8 v/v）は、緩衝液として375 mMトリス-HCl、pH 8.8を有した。ゲルを、120 Vで一晩、4℃で、25 mMトリスおよび192 mMグリシン、pH 8.3を含有するトリス-グリシン電極緩衝液で泳動した。電気泳動後、銀染色法（Bio-Rad（登録商標）キットの方法）に従ってゲルを染色した。
【００５２】
ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）：
非変性PAGEから溶出したタンパク質および全タンパク質のSDS-PAGEを、Laemmli（1970）により教示される方法に従って、12％ポリアクリルアミドゲル上で行った。タンパク質を、トリス-グリシン緩衝液（pH 8.3）中の5％濃縮用ゲル（pH 6.8）および12％分離用アクリルアミドゲル（pH 8.8）ならびに適切なマーカーを用いることにより分析した。SDS-電気泳動の前に、前記タンパク質を、5％β-メルカプトエタノールを含有する等容量の試料緩衝液（60 mMトリス-HCl緩衝液、4％ SDS、pH 6.8）と混合した。Bio-Rad（登録商標） Laboratories Canada Ltd.（Montreal, PQ, Canada；Bio-Radは、Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USAの登録商標である）から取得した標準マーカータンパク質の混合物を使用した。すべての試料を5分間95℃で加熱して、室温まで冷却した。タンパク質を、銀染色法（Bio-Rad（登録商標）キットの方法）により可視化した。タンパク質の分子量は、標準分子量マーカーの移動度との比較により概算した。
【００５３】
細胞外タンパク質の高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）：
タンパク質を、製造業者の指示書に従って、FPLC AKTA（登録商標）精製システム（AKTAは、GE Healthcare Bio-Sciences AB Ltd., Uppsala, Swedenの登録商標である）を用いて、Superdex（登録商標） 75 GL 10/30カラム（Superdexは、GE Healthcare Bio-Sciences AB Ltd., Uppsala, Swedenの登録商標である）を通して分画した。カラムを、滅菌水、および0.15 M NaClを含有する50 mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0であらかじめ平衡化し、その後、タンパク質注入（約500μL）および1.0 ml/分の流速での同緩衝液によるタンパク質の溶出を行った。タンパク質を、0.15 M NaClを含有する50 mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0を用いたゲル濾過を通して精製した。Superdex 75でのゲル濾過により、タンパク質は別個のピークに分解された。0.8 mlの画分を収集し、それらの純度をSDS-PAGEにより確認した。
【００５４】
ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）：
FPLC画分から回収されたタンパク質のSDS-PAGE（12％）を、Laemmli（1970）により教示される方法に従って行った。すべてのピークを与えるFPLC画分をプールして、1:4容量の冷アセトン中での沈殿により回収し、-20℃で一晩保管した。12,000 gでの10分間の遠心分離の後、沈殿したタンパク質（ペレット）を、最少量（30μL）のアッセイ緩衝液中に溶解させた。タンパク質を、トリス-グリシン緩衝液（pH 8.3）中の5％濃縮用ゲル（pH 6.8）および12％分離用アクリルアミドゲル（pH 8.8）と適切なマーカーとを有するSDS-PAGEにより分析した。SDS-電気泳動の前に、前記タンパク質を、5％β-メルカプトエタノールを含有する等容量の試料緩衝液（60 mMトリス-HCl緩衝液、4％ SDS、pH 6.8）と混合した。標準マーカータンパク質の混合物（Bio-Rad（登録商標）タンパク質マーカー, Bio-Rad Laboratories Canada Inc.）を使用した。すべての試料を、ゲル上へローディングする前に、5分間95℃で加熱して、室温まで冷却した。タンパク質を、銀染色法（Bio-Rad（登録商標）銀染色キット, Bio-Rad Laboratories Canada Inc.）により可視化した。タンパク質の分子量は、標準分子量マーカーの移動度との比較により概算した。FPLCから得られた分画されたタンパク質の分子量を、SDS-PAGE（12％および16％）により決定した。非変性PAGE過程により分離された高分子量タンパク質バンドを構成する細胞外タンパク質を分離するために、5％ SDS-PAGEを行った。
【００５５】
10％非変性ポリアクリルアミドゲルを用いた、SM-BstおよびSMGstから抽出された細胞内タンパク質の非変性PAGE電気泳動により、上方バンドおよび下方バンドと表される2本のタンパク質バンドが分離された（図2）。非変性PAGEの各タンパク質バンドを、500〜750μlの試料緩衝液（62.5 mMトリス-HCl、pH6.8；1％ PMSF、1％ EDTA）中に浸し、一晩4℃で置いた。タンパク質を、12,000 gでの10分間の遠心分離により回収した。非変性PAGEから溶出した、分離されたタンパク質の分子量の決定のために、12％ゲルを用いて、細胞内タンパク質のSDS-PAGE分離を行った。細胞内試料の下方および上方バンドから溶出されたタンパク質により、およそ50および79 kDaの2本の別個のバンドの存在が示された（図3）。
【００５６】
10％非変性ポリアクリルアミドゲルを用いた、SM-BstおよびSMGstから抽出された細胞外タンパク質の非変性PAGE電気泳動により、EC1、EC2、EC3、およびEC4と表される4本のタンパク質バンドが分離された（図4）。非変性PAGEの各タンパク質バンドを、500〜750μlの試料緩衝液（62.5 mMトリス-HCl、pH6.8；1％ PMSF、1％ EDTA）中に浸し、一晩4℃で置いた。タンパク質を、12,000 gでの10分間の遠心分離により回収した。非変性PAGEから溶出した、分離されたタンパク質の分子量の決定のために、12％ゲルを用いて、細胞外タンパク質のSDS-PAGE分離を行った。4本のバンドから溶出されたタンパク質により、約：（i）79 kDa（EC1）、（ii）50 kDa（CE2）、（iii） 36 kDa（EC3）、および13 kDa（EC4）の分子量を有する分離および精製されたタンパク質の存在が示された（図5）。
【００５７】
AKTA（登録商標）精製システムを用いたFPLC高速タンパク質液体クロマトグラフィーにより決定された、Superdex 75 GL 10/30カラムでの細胞外タンパク質の4本のバンドの溶出プロフィールを、図5に示す。
【００５８】
実施例3：S. ミコパラシチカ培養物から回収された、精製された細胞内タンパク質および精製された細胞外タンパク質による、フザリウム種による菌糸体生長の阻害
いくつかの改変を伴う、Roberts et al.（1986, Isolation and partial characterization of two antifungal proteins from barley. Biochim. Biophys. Acta, 880: 161-170）により教示される方法に従った放射状ディスクプレート拡散アッセイにより、タンパク質の抗真菌活性を滅菌条件下で試験した。F. オキシスポラムおよびF. グラミネアラムに対する抗真菌活性についての単離されたタンパク質のアッセイを、ポテトデキストロース寒天を含有するペトリ皿中で行った。活発に増殖中の真菌プレートからの菌糸体プラグをペトリ皿の中央に置き、滅菌濾紙ディスク（直径5 mmのWhatman（登録商標）濾紙no.1）を、寒天表面上の、菌糸体コロニーの縁から0.5 cm離れた距離に置いた。単離されたタンパク質（60μL）を、ディスクに添加した。滅菌蒸留水と抗真菌タンパク質のみを含まない緩衝液とを、対照として用いた。次いでプレートを、室温で3〜4日間インキュベーションし、次に、もしあれば、ディスク周囲の阻害ゾーンについて調査した。この様式において、試験されるタンパク質が抗真菌剤である場合は、三日月形の真菌増殖の阻害ゾーンが、ディスクの周囲に出現すると考えられる。菌糸体コロニーの面積を測定し、対照（水および緩衝液で処理されたプレート）との菌糸体コロニーの面積の減少％を算出することにより、真菌増殖の阻害を決定した。
【００５９】
50 kDa細胞内タンパク質および79 kDa細胞内タンパク質の両方が、F. オキシスポラム（図7(a)〜図7(d)）およびF. グラミネアラム（図8(a)〜図8(d)）の菌糸伸長、すなわち菌糸体増殖を阻害した。
【００６０】
79 kDaタンパク質（EC1）、50 kDaタンパク質（EC2）、および36 kDaタンパク質（EC3）は、F. オキシスポラム（図9(a)〜図9(b)）およびF. グラミネアラム（図10(a)〜図10(b)）の菌糸体生長を阻害した。13 kDaタンパク質（EC4）は、F. グラミネアラム（図11(a)）およびF. オキシスポラム（図11(b)）の菌糸体生長を阻害した。
【００６１】
実施例4：S. ミコパラシチカ培養物から回収された、精製された細胞外タンパク質による、フザリウム種による胞子発芽の阻害
4種の細胞外S. ミコパラシチカタンパク質EC1、EC2、EC3、およびEC4による、フザリウム種の胞子発芽に対する阻害効果を、Ghosh（2006, Antifungal Properties of Haem Peroxidase from Acorus calamus. Ann. Bot. 98: 1145-1153）およびYadav et al.（2007, An antifungal protein from Escherichia coli. J. Med. Microbiol. 56: 637-644）により開示されるマイクロタイタープレートアッセイ法を用いて評価した。分画されたタンパク質の可能性のある毒性を、真菌F. オキシスポラムおよびF. グラミネアラムを用いて増殖阻害率アッセイで試験した。分画されたタンパク質のインビトロ抗真菌活性を、96ウェルマイクロタイタープレート中で決定した。マイクロプレートウェルにおいて、10μlのポテトデキストロースブロス（PDB；Difco Laboratories, Detroit）を、3μlのF. オキシスポラムおよびF. グラミネアラムの胞子懸濁液と混合した。タンパク質画分を含有する種々のピークの7μLのアリコートを、マイクロタイタープレート（12〜8ウェル）中の懸濁液に添加した。水および緩衝液を、陰性対照として使用した。次いでマイクロタイタープレートを、室温で、暗所でインキュベーションした。24時間後に、倒立蛍光顕微鏡を用いて、処理されていないウェルおよび処理されたウェルの両方における胞子発芽の阻害について、観察を行った。顕微鏡内の、発芽胞子および未発芽胞子の数、ならびに菌糸体で覆われた面積の割合を使用して、増殖阻害％を決定した。
【００６２】
4種の細胞外タンパク質はすべて、F. オキシスポラムおよびF. グラミネアラムの胞子の発芽を有意に阻害した（図12(a)および図12(b)）。さらに、4種の細胞外タンパク質はすべて、F. オキシスポラムおよびF. グラミネアラムの菌糸体増殖について、これらの生物を固体培地上に別々にプレーティングした時、大きな阻害ゾーンを確立した（図13）。図14A(c)は、対照のF. オキシスポラム胞子の発芽を示す顕微鏡写真であり、図14A(a)は、F. オキシスポラム胞子の発芽に対する50 kDaタンパク質の阻害効果を示し、および図14A(b)は、F. オキシスポラム胞子の発芽に対する13 kDaタンパク質の阻害効果を示す。図14B(c)は、対照のF. グラミネアラム胞子の発芽を示す顕微鏡写真であり、図14B(a)は、F. グラミネアラム胞子の発芽に対する50 kDaタンパク質の阻害効果を示し、および図14(b)は、F. グラミネアラム胞子の発芽に対する13 kDaタンパク質の阻害効果を示す。
【００６３】
実施例5：S. ミコパラシチカ培養物から回収された、結晶形成EC1およびEC3タンパク質の阻害効果
結晶形成細胞外タンパク質EC1（79 KDa）およびEC3（36 KDa）のマイコトキシン効果を、PDA上で活発に増殖中のF. アベナセウムおよびF. グラミネアラム培養物で評価した。F. アベナセウムを、菌糸体がプレートの表面を覆うまで、PDA寒天上で増殖させた。プレートの半分を、EC1結晶タンパク質およびEC3結晶タンパク質の混合物で処理し、その後プレートを、暗所で、23℃で5日間インキュベーションした。プレートの処理されていない対照側（図15(a)）と比較して、EC1 / EC3タンパク質混合物で処理された半分のプレート上で（図15(B)）、有意な菌糸体の損傷が観察された。
【００６４】
コムギ種子を、PDAプレートの表面の全域にまいた。種子が発芽した後、プレートにF. グラミネアラムを接種した。プレートの半分を、EC1 / EC3タンパク質混合物で処理し、その後プレートを、暗所で、23℃で5日間インキュベーションした。EC1 / EC3タンパク質混合物を受けた半分のプレート上では、真菌の増殖が無かった（図16(b)）が、プレートの処理されていない側では、真菌の菌糸体が繁殖した（図16(a)）。共焦点レーザー走査顕微鏡での、EC1 / EC3タンパク質混合物を受けた寒天の表面の調査により、多数の溶解した菌糸要素が示された（図16(c)中の矢印を参照されたい）。
【００６５】
F. グラミネアラムを、菌糸体がプレートの表面を覆うまで、PDA寒天上で増殖させた。プレートの半分を、EC1結晶タンパク質およびEC3結晶タンパク質の混合物で処理し、その後プレートを、暗所で、21℃で5日間インキュベーションした。プレートの処理されていない対照側（図17(a)）と比較して、EC1 / EC3タンパク質混合物で処理された半分のプレート上で（図17(B)）、有意な菌糸体の損傷が観察された。走査電子顕微鏡での、EC1 / EC3タンパク質混合物を受けた寒天の表面の調査により、多数の溶解した菌糸要素が示された（図18(a)中の矢印を参照されたい）。化学力顕微鏡での同表面の調査により、多数の壊れた菌糸要素およびアポトーシス溶解した細胞が示された（図18(c)中の矢印を参照されたい）。
【００６６】
実施例6：S. ミコパラシチカ培養物から回収された、精製された細胞外タンパク質の配列決定および推定的同定
EC1（79 Kda）、EC2（50 Kda）、EC3（36 Kda）、およびEC4（13 KDa）の細胞外タンパク質のバンドを、5％、12％、および16％ SDS-PAGEゲルから切り出した。切り取ったタンパク質バンドを、MALDI-TOF-MS装置を用いた配列決定およびペプチド特徴決定のために、ならびに、ペプチド配列をUniProtKB/Swiss-ProtおよびNCBIデータベースと比較することによる推定的同定のために、McGill UniversityおよびGenome Quebec Innovation Centre（Rm 704, 740 Dr. Penfield Avenue, Montreal, PQ, Canada）に送付した。
【００６７】
MALDI-TOF-MS分析により、EC1タンパク質を構成するアミノ酸の分離ができた（図19）。EC1タンパク質を構成するアミノ酸の配列は
2014513919.tif 000006
であると決定された。
EC1の質量は、78,688 Da（79 kDa）であると決定され、その正体は、RTXタンパク質毒素および関連するCa2+結合タンパク質に類似していると予測された。
【００６８】
EC2細胞外タンパク質バンドのMALDI-TOF-MS分離により（図20）、EC2タンパク質を構成するアミノ酸配列の決定ができた：
2014513919.tif 000007
EC2の質量は、49,443 Da（50 kDa）であると決定され、その正体は、β-1,4-グルカーゼタンパク質に類似していると予測された。
【００６９】
EC3細胞外タンパク質バンドのMALDI-TOF-MS分離により（図21）、EC3タンパク質を構成するアミノ酸配列の決定ができた：
2014513919.tif 000008
EC3の質量は、35,578 Da（36 kDa）であると決定され、その正体は、キシラナーゼタンパク質に類似していると予測された。
【００７０】
EC4細胞外タンパク質バンドのMALDI-TOF-MS分離により（図22）、EC3タンパク質を構成するアミノ酸配列の決定ができた：
2014513919.tif 000009
EC4の質量は、2,563 Daであると決定され（SDS-Page分析により分子量が13 kDaであると示されているため、これは切断された断片である）、その正体は、仮想のセラトプラタニン（Cerato-platanin）毒素であると予測された。
【００７１】
実施例6：スクレロチニア・スクレロチオルム、リゾクトニア・ソラニ、およびピシウム・ウルティマムの菌糸体増殖および成長に対する、S. ミコパラシチカ培養物から回収された、精製された細胞外タンパク質の効果
S. ミコパラシチカ培養物から回収された、精製された細胞外タンパク質EC1（79 KDa）およびEC3（36 KDa）の静真菌効果およびマイコトキシン効果を、農作物に有意な損傷を引き起こす、広く一般的な3種のさらなる植物病原体で評価した。S. スクレロチオルム、R. ソラニ、およびP. ウルティマムに対するEC1＋EC3細胞外S. ミコパラシチカタンパク質の混合物（1：1）の阻害効果を、Ghosh（2006）およびYadav et al.（2007）により開示されるマイクロタイタープレートアッセイ法を用いて評価した。Strom et al.（2005, Co-cultivation of antifungal Lactobacillus plantarum MiLAB 393 and Aspergillus nidulans, evaluation of effects on fungal growth and protein expression. FEMS Microb Let, 246: 119-124）により教示される方法に従って、36時間の増殖の後に菌糸体を収集し、生物量を秤量した。図23(a)、図23(c)、および図23(e)は、PDA上で4日間、暗所で、26℃で増殖させた、それぞれS. スクレロチオルム、R. ソラニ、およびP. ウルティマムの対照の培養物の顕微鏡写真である。図23(b)、図23(d)、および図23(f)は、S. ミコパラシチカにより産生されたEC1（79 kDa）およびEC3（36 kDa）細胞外タンパク質の混合物（1：1）で修正されたPDA上で増殖させた、それぞれS. スクレロチオルム、R. ソラニ、およびP. ウルティマムの顕微鏡写真である。細胞外タンパク質混合物は、3種の植物病原体真菌培養物のすべてに、有意な菌糸体損傷を引き起こした（図23(b)、図23(d)、図23(f)）。図24中のデータは、細胞外タンパク質混合物が、（i）S. スクレロチオルムの増殖において、未処理の対照と比較して約80％の阻害を引き起こしたこと、（ii）R. ソラニの増殖において、未処理の対照と比較して約85％の阻害を引き起こしたこと、および（iii）P.ウルティマムの増殖において、未処理の対照と比較して約95％の阻害を引き起こしたことを実証している。これらのデータにより、本明細書において開示されるS. ミコパラシチカの細胞外タンパク質は、広範な土壌病原性真菌および植物病原性真菌に対して静真菌効果およびマイコトキシン効果を有することが、実証される。
【００７２】
本明細書において開示される研究により、SEQ ID NO:4を含む79 kDaタンパク質、SEQ ID NO:5を含む50 kDaタンパク質、SEQ ID NO:6を含む36 kDaタンパク質、およびSEQ ID NO:7を含む13 kDaタンパク質として同定される、S. ミコパラシチカに由来する細胞外タンパク質が、フザリウム種、スクレロチニア種、リゾクトニア種、およびピシウム種などの様々な植物病原性真菌の胞子発芽を阻害するために有用であることが、明らかに実証される。本明細書において開示される研究により、植物病原性真菌の菌糸体をこれらの細胞外タンパク質の1種または複数種と接触させることが、菌糸体増殖の休止を引き起こして、溶解をもたらすことが、さらに実証される。従って、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、またはSEQ ID NO:7と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む1種または複数種のポリペプチドをコードする1種または複数種の核酸分子で、植物細胞を形質転換することにより、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、またはSEQ ID NO: 7に開示されるアミノ酸配列と少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む1種または複数種のポリペプチド分子を、植物細胞に産生させることができると考えられる。従って、そのような形質転換された細胞を植物中で培養した際に、該細胞を含む植物は、該細胞内で細胞外タンパク質の形成をもたらすポリペプチドを発現すると考えられる。そのような植物の表面にコロニー形成する過程中、および／または植物に感染する過程中に、細胞外タンパク質と接近したかおよび／または細胞外タンパク質と接触した植物病原性真菌は、阻害されるかまたは溶解されると考えられる。
【図１】
2014513919.tif 000011
【図２】
2014513919.tif 000012
【図３】
2014513919.tif 000013
【図４】
2014513919.tif 000014
【図５】
2014513919.tif 000015
【図６】
2014513919.tif 000016
【図７】
2014513919.tif 000017
【図８】
2014513919.tif 000018
【図９】
2014513919.tif 000019
【図１０】
2014513919.tif 000020
【図１１】
2014513919.tif 000021
【図１２】
2014513919.tif 000022
【図１３】
2014513919.tif 000023
【図１４】
2014513919.tif 000024
【図１５】
2014513919.tif 000025
【図１６】
2014513919.tif 000026
【図１７】
2014513919.tif 000027
【図１８】
2014513919.tif 000028
【図１９】
2014513919.tif 000029
【図２０】
2014513919.tif 000030
【図２１】
2014513919.tif 000031
【図２２】
2014513919.tif 000032
【図２３】
2014513919.tif 000033
【図２４】
2014513919.tif 000034
【手続補正書】
【提出日】平成25年10月30日(2013.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014513919000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年1月8日(2014.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1種類または複数種類の植物病原性真菌によって引き起こされる病徴を制御するための組成物であって、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、およびSEQ ID NO: 7から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子、ならびに担体を含む、組成物。
【請求項２】
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 4またはSEQ ID NO: 6と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
ポリペプチド分子がSEQ ID NO: 4またはSEQ ID NO: 6を含む、請求項1または2記載の組成物。
【請求項４】
種子処理組成物である、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５】
植物処理組成物である、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６】
土壌処理組成物である、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
植物病原性真菌が、フザリウム（Fusarium）種、スクレロチニア（Sclerotinia）種、リゾクトニア（Rhizoctonia）種、またはピシウム（Pithium）種のうちの1つである、請求項1〜6のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
フザリウム種、スクレロチニア種、リゾクトニア種、またはピシウム種のうちの1つによって引き起こされる植物における病徴を制御するための、請求項1〜7のいずれか一項において定義される組成物の使用。
【請求項９】
種子を処理する段階、植物を処理する段階、および植物成長基質を処理する段階のうちの1つまたは複数を含む、請求項8記載の使用。
【請求項１０】
SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、およびSEQ ID NO: 7から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子を発現する、形質転換された植物細胞。
【請求項１１】
フザリウム種による感染に対して抵抗性である、請求項10記載の形質転換された植物細胞。
【請求項１２】
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 4またはSEQ ID NO: 6と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項10または11記載の形質転換された植物細胞。
【請求項１３】
ポリペプチド分子がSEQ ID NO: 4またはSEQ ID NO: 6を含む、請求項10〜12のいずれか一項記載の形質転換された植物細胞。
【請求項１４】
油糧種子植物細胞、または穀類植物細胞、または豆類植物細胞である、請求項10〜13のいずれか一項記載の形質転換された植物細胞。
【請求項１５】
1種類または複数種類の植物病原性真菌によって引き起こされる病徴を制御するための単離されたタンパク質であって、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、およびSEQ ID NO: 7から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子を含む、単離されたタンパク質。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明のいくつかの例示的態様は、1種または複数種の新規タンパク質を過剰発現する、形質転換された植物細胞に関係する。そのような形質転換された植物細胞は、培養して植物全体へとなり得る、種子、体細胞胚、器官形成組織などにより例示される植物繁殖体中に含まれ得る。形質転換された植物細胞を含む植物全体は、フザリウム種、スクレロチニア種、リゾクトニア種、ピシウム種などにより例示される植物病原性真菌によって引き起こされる病徴に対して抵抗性であるか、または少なくとも耐性である。
[本発明1001]
1種類または複数種類の植物病原性真菌によって引き起こされる病徴を制御するための組成物であって、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、およびSEQ ID NO: 7から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子、ならびに担体を含む、組成物。
[本発明1002]
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 4と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
ポリペプチド分子がSEQ ID NO: 4を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1004]
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 5と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1005]
ポリペプチド分子がSEQ ID N0: 5を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1006]
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 6と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1007]
ポリペプチド分子がSEQ ID N0: 6を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1008]
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 7と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1009]
ポリペプチド分子がSEQ ID N0: 7を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1010]
種子処理組成物である、本発明1001〜1009のいずれかの組成物。
[本発明1011]
植物処理組成物である、本発明1001〜1009のいずれかの組成物。
[本発明1012]
土壌処理組成物である、本発明1001〜1009のいずれかの組成物。
[本発明1013]
植物病原性真菌が、フザリウム（Fusarium）種、スクレロチニア（Sclerotinia）種、リゾクトニア（Rhizoctonia）種、またはピシウム（Pithium）種のうちの1つである、本発明1001〜1012のいずれかの組成物。
[本発明1014]
フザリウム種、スクレロチニア種、リゾクトニア種、またはピシウム種のうちの1つによって引き起こされる植物における病徴を制御するための、本発明1001〜1013のいずれかの組成物の使用。
[本発明1015]
種子を処理する段階、植物を処理する段階、および植物成長基質を処理する段階のうちの1つまたは複数を含む、本発明1014の使用。
[本発明1016]
1種類または複数種類の植物病原性真菌によって引き起こされる病徴を制御するための、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、およびSEQ ID NO: 7から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子を発現する微生物細胞の使用。
[本発明1017]
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 4と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、本発明1016の使用。
[本発明1018]
ポリペプチド分子がSEQ ID N0: 4を含む、本発明1016の使用。
[本発明1019]
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 5と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、本発明1016の使用。
[本発明1020]
ポリペプチド分子がSEQ ID N0: 5を含む、本発明1016の使用。
[本発明1021]
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 6と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、本発明1016の使用。
[本発明1022]
ポリペプチド分子がSEQ ID N0: 6を含む、本発明1016の使用。
[本発明1023]
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 7と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、本発明1016の使用。
[本発明1024]
ポリペプチド分子がSEQ ID N0: 7を含む、本発明1016の使用。
[本発明1025]
微生物細胞が、真菌細胞、酵母細胞、または細菌細胞である、本発明1016〜1024のいずれかの使用。
[本発明1026]
真菌細胞が、スフェロデス・ミコパラシチカ（Sphaerodes mycoparasitica）の細胞、またはペニシリウム（Penicillium）種の細胞である、本発明1025の使用。
[本発明1027]
酵母細胞が、ジゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）種の細胞、サッカロミセス（Saccharomyces）種の細胞、ピキア（Pichia）種の細胞、またはクルベロミセス（Kluveromyces）種の細胞である、本発明1025の使用。
[本発明1028]
細菌細胞が、大腸菌（Escherichia coli）の細胞、シュードモナス（Pseudomonas）種の細胞、またはバチルス（Bacillus）種の細胞である、本発明1025の使用。
[本発明1029]
SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、およびSEQ ID NO: 7から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子を発現する、形質転換された植物細胞であって、フザリウム種による感染に対して抵抗性である、植物細胞。
[本発明1030]
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 4と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、本発明1029の形質転換された植物細胞。
[本発明1031]
ポリペプチド分子がSEQ ID NO: 4を含む、本発明1029の形質転換された植物細胞。
[本発明1032]
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 5と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、本発明1029の形質転換された植物細胞。
[本発明1033]
ポリペプチド分子がSEQ ID NO: 5を含む、本発明1029の形質転換された植物細胞。
[本発明1034]
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 6と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、本発明1029の形質転換された植物細胞。
[本発明1035]
ポリペプチド分子がSEQ ID NO: 6を含む、本発明1029の形質転換された植物細胞。
[本発明1036]
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO: 7と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、本発明1029の形質転換された植物細胞。
[本発明1037]
ポリペプチド分子がSEQ ID NO: 7を含む、本発明1029の形質転換された植物細胞。
[本発明1038]
油糧種子植物細胞、または穀類植物細胞、または豆類植物細胞である、本発明1029〜1037のいずれかの形質転換された植物細胞。
[本発明1039]
1種類または複数種類の植物病原性真菌によって引き起こされる病徴を制御するための単離されたタンパク質であって、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、およびSEQ ID NO: 7から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子を含む、単離されたタンパク質。
[本発明1040]
ポリペプチド配列が、SEQ ID NO: 4と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、本発明1039の単離されたタンパク質。
[本発明1041]
SEQ ID NO: 4を含む、本発明1039の単離されたタンパク質。
[本発明1042]
SEQ ID NO: 5と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、本発明1039の単離されたタンパク質。
[本発明1043]
SEQ ID NO: 5を含む、本発明1039の単離されたタンパク質。
[本発明1044]
SEQ ID NO: 6と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、本発明1039の単離されたタンパク質。
[本発明1045]
SEQ ID NO: 6を含む、本発明1039の単離されたタンパク質。
[本発明1046]
SEQ ID NO: 7と少なくとも80％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、本発明1039の単離されたタンパク質。
[本発明1047]
SEQ ID NO: 7を含む、本発明1039の単離されたタンパク質。
[本発明1048]
本発明1039〜1047のいずれかのタンパク質をコードする、単離された核酸分子。
[本発明1049]
本発明1048の核酸分子で形質転換された微生物細胞。
[本発明1050]
前記核酸分子がプロモーターに機能的に連結されている、本発明1049の微生物細胞。
[本発明1051]
真菌細胞、酵母細胞、または細菌細胞である、本発明1049または1050の微生物細胞。
[本発明1052]
真菌細胞が、スフェロデス・ミコパラシチカの細胞、またはペニシリウム種の細胞である、本発明1051の微生物細胞。
[本発明1053]
酵母細胞が、ジゴサッカロミセス種の細胞、サッカロミセス種の細胞、ピキア種の細胞、またはクルベロミセス種の細胞である、本発明1051の微生物細胞。
[本発明1054]
細菌細胞が、大腸菌の細胞、シュードモナス種の細胞、またはバチルス種の細胞である、本発明1051の微生物細胞。
[本発明1055]
本発明1048の核酸分子で形質転換された植物細胞。
[本発明1056]
前記核酸分子がプロモーターに機能的に連結されている、本発明1055の植物細胞。
[本発明1057]
油糧種子植物細胞、穀類植物細胞、または豆類植物細胞である、本発明1055または1056の植物細胞。
【国際調査報告】
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