(57)【要約】分析物を選択的に検出するための化合物の態様が、該化合物によって分析物を検出するための方法およびキットと共に開示される。前記化合物は、一般構造の少なくとも1つのフルオロフォアを含む架橋ビオローゲンコンジュゲートである。R1/R2、R2/R3、R3/R4、R5/R6、R6/R7、および/またはR7/R8の少なくとも1つは一緒になって置換もしくは非置換のシクロアルキルまたはアリールを形成する。2014525905.tif 000090
2014525905.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋ビオローゲン骨格ならびに置換基RAおよびRBを含む、以下の式I、式IIまたは式IIIの化合物:
2014525905.tif 000080
式中、X-は任意の対アニオンであり、RAおよびRBは独立して置換もしくは非置換の脂肪族、あるいは、1個もしくは複数の置換もしくは非置換の芳香環および/または芳香族複素環を含む置換もしくは非置換のアリールまたはヘテロアリールであり、かつRAおよびRBの少なくとも一方は、以下の一般式(i)の構造を有するフルオロフォアであり:
2014525905.tif 000081
式中、「
2014525905.tif 000082
」として示される各結合は、原子価要件を満たすために必要な単結合または二重結合であり;
X1はO、S、Se、Si(CH3)2、Ge(CH3)2、Sn(CH3)2、CH2、C(CH3)2またはNHであり;
R1、R2、R4は独立して水素、ヒドロキシル、酸素、チオール、低級アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、置換アミノ、アルコキシ、ハロゲンまたは-NHRcであり、ここでRcは
2014525905.tif 000083
であり;
R5、R7およびR8は独立して水素、ヒドロキシル、チオール、低級アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、置換アミノ、アルコキシまたはハロゲンであり;
R3およびR6は独立して水素、ヒドロキシル、ハロゲン、酸素、硫黄、チオール、アミノ、アルキルアミノ、イミノ、イミニウム、アルキルイミノ、アルキルイミニウム、シクロアルキルイミノまたは-NHRcであり;
R1およびR2、R2およびR3、R3およびR4、R5およびR6、R6およびR7、ならびに/またはR7およびR8の少なくとも1つは一緒になって置換もしくは非置換のシクロアルキルまたはアリールを形成し;
R9〜R12は独立して水素、アルキル、アシル、カルボキシル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノまたは-SO3Hであり;
R13は水素、ヒドロキシル、低級アルキル、低級アルコキシ、-SO3H、またはR14が水素もしくは低級アルキルである-COOR14であり、かつB環中の「
2014525905.tif 000084
」として示される結合は二重結合であり、あるいは、R13は、B環およびD環と環系を形成する1個もしくは複数の原子であり、かつB環中の「
2014525905.tif 000085
」として示される結合は単結合であり;
R1〜R13の少なくとも1つは、フルオロフォアを架橋ビオローゲン骨格に共有結合させるリンカーであり、ここでR3およびR4が一緒になって置換もしくは非置換のシクロアルキルまたはアリールを形成する場合、R1およびR8の少なくとも一方は水素以外であり、あるいは、R13は-COOR14ではなく、あるいは、少なくとも1つのさらなる置換もしくは非置換のシクロアルキルまたはアリールがR1およびR2、R2およびR3、R5およびR6、R6およびR7、ならびに/またはR7およびR8によって形成される。
【請求項２】
RAおよびRBの少なくとも一方が、以下の一般式(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)、(ix)、(x)または(xi)の構造を有するフルオロフォアである、請求項1記載の化合物:
2014525905.tif 000086
2014525905.tif 000087
式中、R15〜R22は独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシル、酸素、チオール、アミノ、アルキルアミノ、アルコキシ、硫黄、イミノ、イミニウム、アルキルイミノ、アルキルイミニウムまたは-NHRcであり、ここでRcは
2014525905.tif 000088
であり;かつ
R1〜R22の少なくとも1つは、フルオロフォアをビオローゲン骨格に共有結合させるリンカーであり、ここでフルオロフォアが一般式(iii)の構造を有する場合、R1およびR8の少なくとも一方は水素以外であり、あるいは、R13は-COOR14ではない。
【請求項３】
R13がリンカーであり、かつ式-COO-を有する、請求項1記載の化合物。
【請求項４】
RAおよびRBがいずれもフルオロフォアであり、各フルオロフォアが独立して一般式(i)の選択される構造を有する、請求項1記載の化合物。
【請求項５】
RAおよびRBが同一の構造を有する、請求項4記載の化合物。
【請求項６】
RAおよびRBの一方が一般式(i)のフルオロフォアであり、かつRAおよびRBの他方が低級アルキルニトリル基、低級アルキル置換フェニル基、アルケニル基、アルキニル基、置換クマリン基、アセタール基またはカルボキシレート基である、請求項1記載の化合物。
【請求項７】
RAおよびRBの他方が下記式である、請求項6記載の化合物:
2014525905.tif 000089
。
【請求項８】
X1が酸素である、請求項1記載の化合物。
【請求項９】
R13が-COO-であり、かつラクトン環を形成し、かつR1〜R12の少なくとも1つがリンカーである、請求項1記載の化合物。
【請求項１０】
R13が-COO-であり、かつラクトン環を形成し、かつR1〜R12またはR15〜R22の少なくとも1つがリンカーである、請求項2記載の化合物。
【請求項１１】
イオン化可能部分に隣接して位置する少なくとも1個のハロゲン原子を含む、請求項1記載の化合物。
【請求項１２】
一般式(i)のフルオロフォアが700nm以上の波長での発光スペクトル極大を有する、請求項1記載の化合物。
【請求項１３】
発光スペクトル極大が750nm以上の波長で生じる、請求項12記載の化合物。
【請求項１４】
一般式(i)のフルオロフォアが80nm以上のストークスシフトを有する、請求項1記載の化合物。
【請求項１５】
ストークスシフトが100nm以上である、請求項14記載の化合物。
【請求項１６】
フルオロフォアが一般式(iii)、(iv)、(ix)または(x)の構造を有し、ここでX1が酸素であり、かつR18がハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、アルキルアミノまたはアルコキシである、請求項2記載の化合物。
【請求項１７】
フルオロフォアが一般式(iv)の構造を有し、ここでX1が酸素であり、かつR19がヒドロキシル、チオール、酸素、イミノ、イミニウム、アルキルイミノ、アルキルイミニウム、アミノまたはアルキルアミノである、請求項2記載の化合物。
【請求項１８】
R18がハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、アルキルアミノまたはアルコキシである、請求項17記載の化合物。
【請求項１９】
フルオロフォアが一般式(vi)の構造を有し、ここでR17がハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、アルキルアミノまたは-NHRcであり、かつR20が酸素、硫黄、イミノ、イミニウム、アルキルイミニウムまたは-NHRcである、請求項2記載の化合物。
【請求項２０】
フルオロフォアが、X1が酸素であり、かつR6およびR16が-NHRcである一般式(iii)、またはX1が酸素であり、かつR16およびR21が-NHRcである一般式(iv)の構造を有する、請求項2記載の化合物。
【請求項２１】
以下の段階を含む、分析物を検出するための方法:
分析物を含む試料と請求項1〜20のいずれか一項記載の化合物とを合わせることによって溶液を形成する段階;
分析物が存在することを示す、溶液の吸光度スペクトル、発光スペクトルまたはその両方の検出可能な変化を生成するために有効な期間、溶液中の分析物と化合物との間の反応を進行させる段階; および
変化を検出する段階。
【請求項２２】
変化を検出する段階が、
溶液を光源に曝露する段階; および
化合物からの蛍光を検出することによって分析物を検出する段階
を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
光源が190nm〜850nmの範囲の波長を有する、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
化合物からの蛍光を検出することが、反応が前記有効な期間進行した後の化合物の発光スペクトル極大に対応する波長での蛍光を検出することを含む、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
化合物が700nm以上の波長での発光スペクトル極大を有する、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
化合物が750nm以上の波長での発光スペクトル極大を有する、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
化合物の発光スペクトル極大に対応する波長での化合物からの蛍光量を測定することによって分析物を定量化する段階をさらに含む、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
試料が生体液を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２９】
生体液が血液または尿を含む、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
分析物がシステイン、ホモシステイン、グルタチオンまたはその組み合わせを含む、請求項21記載の方法。
【請求項３１】
分析物がシステイン、ホモシステイン、グルタチオン、スクシニル-5-アミノ-4-イミダゾールカルボキサミドリボシド、スクシニルアデノシン、またはスクシニル-5-アミノ-4-イミダゾールカルボキサミドリボシドとスクシニルアデノシンとの組み合わせを含む、請求項21記載の方法。
【請求項３２】
化合物が一般式(vi)の少なくとも1つのフルオロフォアを含み、ここで
R1、R4、R5およびR8が独立して水素、ヒドロキシル、チオール、低級アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、置換アミノ、アルコキシまたはハロゲンであり;
R15〜R18が独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、アルキルアミノ、アルコキシまたは-NHRcであり;
R19〜R22が独立して水素、ヒドロキシル、チオール、ハロゲン、酸素、イミノ、イミニウム、アルキルイミノ、アルキルイミニウム、アミノ、アルキルアミノまたは-NHRcであり;かつ
R1、R4、R5、R8〜R13、R15、R16、R18、R19、R21またはR22の少なくとも1つが、フルオロフォアをビオローゲン骨格に共有結合させるリンカーである、
請求項31記載の方法。
【請求項３３】
R13がリンカーであり、かつ式-COO-を有する、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
分析物がグルタチオンであり、R17がヒドロキシル、アミノまたはアルキルアミノであり、かつR20が酸素、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、イミノまたはアルキルイミニウムである、請求項32記載の方法。
【請求項３５】
分析物がスクシニル-5-アミノ-4-イミダゾールカルボキサミドリボシド、スクシニルアデノシンまたはその組み合わせであり、R17およびR20の少なくとも一方が-NHRcであり、R13が-COOR14であり、ここでR14が水素または低級アルキルであり、かつR9、R10、R11またはR12の1つがリンカーである、請求項32記載の方法。
【請求項３６】
分析物がスクシニル-5-アミノ-4-イミダゾールカルボキサミドリボシド、スクシニルアデノシンまたはその組み合わせであり、かつ化合物が、X1が酸素であり、かつR6およびR16が-NHRcである一般式(iii)、またはX1が酸素であり、かつR16およびR21が-NHRcである一般式(iv)の、少なくとも1つのフルオロフォアを含む、請求項31記載の方法。
【請求項３７】
変化を検出する段階が、反応が前記有効な期間進行した後の1つもしくは複数の波長での溶液の吸光度の変化を検出する段階を含む、請求項21記載の方法。
【請求項３８】
変化を検出する段階が、試料と化合物とを合わせた後の第1の時点での溶液の吸光度スペクトルを、反応が前記有効な期間進行した後の溶液の吸光度スペクトルと比較する段階を含む、請求項21記載の方法。
【請求項３９】
変化を検出する段階が、試料と化合物とを合わせた後の第1の時点での溶液の発光スペクトルを、反応が前記有効な期間進行した後の溶液の発光スペクトルと比較する段階を含む、請求項21記載の方法。
【請求項４０】
変化を検出する段階が、化合物との反応前の溶液の色を化合物との前記有効な期間反応後の溶液の色と比較する段階を含む、請求項21記載の方法。
【請求項４１】
請求項1〜20のいずれか一項記載の少なくとも1つの化合物を含む、分析物を検出するためのキットであって、化合物が、分析物を含む試料と合わせた際に、分析物を含まない試料中の化合物に比べての吸光度スペクトルおよび/または発光スペクトルの変化を経る、キット。
【請求項４２】
試料が生体液である、請求項41記載のキット。
【請求項４３】
少なくとも1つの緩衝液をさらに含み、化合物が、分析物を含む試料と合わせた際に、緩衝液、および分析物を含まない試料と合わせた化合物に比べての吸光度スペクトルおよび/または発光スペクトルの変化を経る、請求項41記載のキット。
【請求項４４】
分析物がグルタチオン、システイン、ホモシステイン、スクシニル-5-アミノ-4-イミダゾールカルボキサミドリボシド、スクシニルアデノシン、またはスクシニル-5-アミノ-4-イミダゾールカルボキサミドリボシドとスクシニルアデノシンとの組み合わせを含む、請求項41記載のキット。
【請求項４５】
化合物が一般式(vi)の少なくとも1つのフルオロフォアを含み、ここで
R1、R4、R5およびR8が独立して水素、ヒドロキシル、チオール、低級アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、置換アミノ、アルコキシまたはハロゲンであり;
R15〜R18が独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、アルキルアミノ、アルコキシまたは-NHRcであり;
R19〜R22が独立して水素、ヒドロキシル、チオール、ハロゲン、酸素、イミノ、イミニウム、アルキルイミノ、アルキルイミニウム、アミノ、アルキルアミノまたは-NHRcであり;かつ
R1、R4、R5、R8〜R13、R15、R16、R18、R19、R21またはR22の少なくとも1つが、フルオロフォアをビオローゲン骨格に共有結合させるリンカーである、
請求項44記載のキット。
【請求項４６】
化合物が、X1が酸素であり、かつR6およびR16が-NHRcである一般式(iii)、またはX1が酸素であり、かつR16およびR21が-NHRcである一般式(iv)の、少なくとも1つのフルオロフォアを含む、請求項44記載のキット。
【請求項４７】
化合物と分析物との間の反応によって生成される色変化を評価するための色比較チャートをさらに含む、請求項41記載のキット。
【請求項４８】
化合物と分析物との間の反応を行うことができる複数の使い捨て容器をさらに含む、請求項41記載のキット。
【請求項４９】
分析物と反応する際に吸光度スペクトル、発光スペクトルまたはその両方に検出可能な変化を経るために有効な量の化合物が予め秤量されて複数の使い捨て容器に入れられる、請求項48記載のキット。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は2011年7月6日出願の米国仮出願第61/505,029号および2011年6月29日出願の米国仮出願第61/502,795号の恩典を主張し、それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
分野
分析物の検出のための、近赤外フルオロフォアを含む化合物、方法、およびキットの態様が開示される。
【０００３】
政府支援の承認
本発明は、米国国立衛生研究所が授与したR01 EB002044の下での政府支援により行った。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
背景
診断検査の簡略化に対する障壁は、現行の臨床化学技術が複雑な生体試料の分析用に相当量の試料の調製および取り扱いを必要とするということである。試料の調製は診断法における主要なボトルネックである。試料の取り扱いまたは分離の段階なしに分析物の媒質(例えば血液、尿)中で直接機能することが可能な特異的バイオマーカー用の指示薬フルオロフォアによれば、必要とする操作数が少なくなることで、より速やかな結果が生成され、試料の取り扱いによる潜在的な健康被害が減少するであろう。しかし、驚くべきことに、そのようなフルオロフォアの開発はほとんど進捗がない。これは少なくとも部分的には、長波長プローブの相対的な欠如が理由である。
【０００５】
日常的に使用される近赤外(NIR)活性色素またはフルオロフォアのクラスは相対的に少なく、1つのNIR色素のみが臨床用に現在承認されている。NIR色素の利点としては、生体試料による干渉性の吸収および蛍光の最小化、レーザーダイオード励起の安価さ、ならびに散乱の減少および組織侵入深さの増大が挙げられる。しかし、容易に入手可能なそのような色素のクラスは相対的にごくわずかである。これらの色素としてはフタロシアニン、シアニン色素およびスクアライン色素が挙げられる。色素の各クラスは固有の強みおよび限界を有する。例えば、長波長フルオロフォアのほぼすべての既存の群は非常に小さなストークスシフト(すなわち発光-励起波長差)、例えば10nmを有する(Miller, Springer Ser. Fluoresc., 2008, 5, 147-162 (非特許文献1))。LEDなどの相対的に広帯域の光源との組み合わせで使用する場合、相当な散乱光バックグラウンド信号が生じて、低い信号対ノイズ比が生成されることがある。
【０００６】
以前の研究では、生体診断法および画像診断用途向けの赤色移動キサンテン色素を調査した。長波長キサンテン系色素を細胞画像診断用途に使用した。しかし、それらのスペクトル特性は、血中での分析物検出を促進する、700〜800nmという有用なNIR「血液窓」の範囲内にはない。ローダミンは「赤色」または長波長キサンテン色素である。1つの注目すべき長波長キサンテン色素はローダミン800であり、これは赤色とNIRとの界面、すなわち溶媒に応じて700nmの数ナノメートル前後において発光する。しかし、ローダミン800は限定された水溶性および二量体形成ならびに16nmという小さなストロークシフトという問題があり(Sauer et al., J. Fluoresc., 1995, 5, 247-261 (非特許文献2))、これにより血中での分析が複雑になる。別の技術革新としては、窒素含有環に対する二重結合の付加を通じてスペクトルをより長波長に移動させる「JA」色素が挙げられる(Sauerら; 米国特許第5,750,409号(特許文献1))。Arden-Jacobおよび共同研究者は、赤色領域での生体診断法用の改良された一連のフルオロフォアを開発した。しかし、これらの色素はむしろ小さなストークスシフトを示し、NIRにおいて吸収も発光もしない(米国特許第5,750,409号(特許文献1))。
【０００７】
環化は、より長波長のフルオロフォアを生成するために使用される別のアプローチである。[c]型環化キサンテンとしては、Hauglandが開発したセミナフトフルオレセイン(SNAFL)およびセミナフトローダフルオル(SNARF)化合物が挙げられ(Whitaker et al., Anal. Biochem., 1991, 194, 330-344 (非特許文献3))、これらはレシオメトリックpHセンサ、金属イオンセンサおよび画像診断プローブとして使用されている(Chang et al., PNAS, 2004, 101, 1129-1134 (非特許文献4); Nolan et al. J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 5910-5918 (非特許文献5))。
【０００８】
生物学的に重要なチオールの検出は多くの研究の焦点であった。同様の構造を有しうる異なった天然のチオールは、まったく異なった生理学的性質を有しうる。これらのチオールについて観察された生理学的作用および相関は、公衆衛生上の懸念事項である。多少なりとも同様の構造を有するが不同性の生理学的性質を有する低分子チオールの例としてはシステイン(Cys)、ホモシステイン(Hcy)、グルタチオン(GSH)、N-アセチルシステインおよびペニシラミンが挙げられる。
【０００９】
グルタチオンは医療専門家にとって特に関心の対象となる。グルタチオンレベルは酸化ストレスを示す。さらに、低グルタチオンレベルは、例えばミトコンドリア病、自閉症および水銀中毒に関連しうる。
【００１０】
チオールは容易に酸化され、典型的には無色であり、可視波長で非蛍光である。大部分の報告されたチオール検出用の方法は、非特異的レドックス化学反応、イムノアッセイ、または発色団もしくはフルオロフォアによる誘導体化に基づいている。チオールを検出するための一般的方法は、構造上同様の種を容易には区別しない。生体チオールを検出および定量化するための改善された方法が大きく求められている。
【００１１】
メチルビオローゲン(MV2+)は4,4'-ジピリジルジカチオンである。
2014525905.tif 000003
MV2+は、Hcy、CysおよびGSHに由来する還元性ジスルフィドとα-アミノ炭素を中心とするラジカルとの両方の平衡動力学の調査における酸化体として使用されている。生体チオールの存在下で形成されるメチルビオローゲンラジカルカチオンを含有する溶液の紫外可視スペクトルの変化を通じて、還元性ラジカルの形成をモニタリングした。R. Zhao et al., "Kinetics of one-electron oxidation of thiols and hydrogen abstraction by thiyl radicals from α-amino C-H bonds," J. Am. Chem. Soc., vol. 116, pp. 12010-12015 (1994) (非特許文献6); およびR. Zhao et al., "Significance of the intramolecular transformation of glutathione thiyl radicals to α-aminoalkyl radicals. Thermochemical and biological implications," J. Chem. Soc., Perkins Trans., vol. 2, pp. 569-574 (1997) (非特許文献7)を参照。Hcyより誘導される還元性α-アミノアルキルラジカルの形成が、5原子環遷移状態を包含する分子内水素引き抜き機構が理由で特に好ましいはずであると推測された(図1A参照)。対照的に、CysまたはGSHの場合、H原子引き抜きによって還元性炭素を中心とするラジカルにすることは、比較的好ましくない4員環(図1B)または9員環(図示せず)遷移状態の幾何学的配置を通じてそれぞれ進行する。それぞれHcyおよびCysのチイルラジカルからのα-アミノアルキルラジカルの形成を導く推定プロトン引き抜きを示す図1Aおよび図1Bを参照。これらの参考文献はホモシステイン、システインおよびグルタチオンの間での認識可能な比色選択性を開示していない。
【００１２】
参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2008/0261315号(特許文献2)は、メチルビオローゲンによってホモシステインを選択的に決定するための方法を開示している。Hcyを含有する試料をメチルビオローゲンの無色溶液と共に約25℃〜110℃の温度および約3.9〜約9.5のpHで5分間以上加熱することで、目に見える色変化が生成される。398nmおよび605nmでの吸収ピークの出現を通じて色形成をモニタリングすることができる。対照的に、CysまたはGSHを含有する試料は、同様の条件下でメチルビオローゲン溶液と共に加熱する際に無色のままである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第5,750,409号
【特許文献２】米国特許出願公開第2008/0261315号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Miller, Springer Ser. Fluoresc., 2008, 5, 147-162
【非特許文献２】Sauer et al., J. Fluoresc., 1995, 5, 247-261
【非特許文献３】Whitaker et al., Anal. Biochem., 1991, 194, 330-344
【非特許文献４】Chang et al., PNAS, 2004, 101, 1129-1134
【非特許文献５】Nolan et al. J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 5910-5918
【非特許文献６】R. Zhao et al., "Kinetics of one-electron oxidation of thiols and hydrogen abstraction by thiyl radicals from α-amino C-H bonds," J. Am. Chem. Soc., vol. 116, pp. 12010-12015 (1994)
【非特許文献７】R. Zhao et al., "Significance of the intramolecular transformation of glutathione thiyl radicals to α-aminoalkyl radicals. Thermochemical and biological implications," J. Chem. Soc., Perkins Trans., vol. 2, pp. 569-574 (1997)
【発明の概要】
【００１５】
概要
分析物を選択的に検出するための化合物の態様が開示される。検出を行うための方法およびキットの態様も開示される。溶液中で1つもしくは複数の分析物と反応する場合の開示される化合物の態様は、溶液の吸光度スペクトルおよび/または発光スペクトルの検出可能な変化を生成する。溶液は生体液(例えば血液または尿)を含みうる。
【００１６】
開示される化合物の態様は、式I、IIまたはIIIの構造を有する架橋ビオローゲンコンジュゲートである:
2014525905.tif 000004
式中、X-は任意の対アニオンであり、RAおよびRBは独立して置換もしくは非置換の脂肪族、あるいは、1個もしくは複数の置換もしくは非置換の芳香環および/または芳香族複素環を含む置換もしくは非置換のアリールまたはヘテロアリールであり、RAおよびRBの少なくとも一方は、一般式(i)の構造を有するフルオロフォアであり:
2014525905.tif 000005
式中、「
2014525905.tif 000006
」として示される各結合は、原子価要件を満たすために必要な単結合または二重結合であり; X1はO、S、Se、Si(CH3)2、Ge(CH3)2、Sn(CH3)2、CH2、C(CH3)2またはNHであり;R1、R2およびR4は独立して水素、ヒドロキシル、酸素、チオール、低級アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、置換アミノ、アルコキシ、ハロゲンまたは-NHRcであり、ここでRcは
2014525905.tif 000007
であり;
R5、R7およびR8は独立して水素、ヒドロキシル、チオール、低級アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、置換アミノ、アルコキシまたはハロゲンであり;R3およびR6は独立して水素、ヒドロキシル、ハロゲン、酸素、硫黄、チオール、アミノ、アルキルアミノ、イミノ、イミニウム、アルキルイミノ、アルキルイミニウム、シクロアルキルイミノ、またはRcが上記定義の通りである-NHRcであり; R1およびR2、R2およびR3、R3およびR4、R5およびR6、R6およびR7、ならびに/またはR7およびR8の少なくとも1つは一緒になって置換もしくは非置換のシクロアルキルまたはアリールを形成し;R9〜R12は独立して水素、アルキル、アシル、カルボキシル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノまたは-SO3Hであり;R13は水素、ヒドロキシル、低級アルキル、低級アルコキシ、-SO3H、またはR14が水素もしくは低級アルキルである-COOR14であり、B環中の「
2014525905.tif 000008
」として示される結合は二重結合であり、あるいは、R13は、B環およびD環と環系を形成する1個もしくは複数の原子であり、B環中の「
2014525905.tif 000009
」として示される結合は単結合であり; R1〜R13の少なくとも1つは、フルオロフォアを架橋ビオローゲン骨格に共有結合させるリンカーである。
【００１７】
いくつかの態様では、RAおよびRBの少なくとも一方は、一般式(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)、(ix)、(x)または(xi)の構造を有するフルオロフォアである:
2014525905.tif 000010
2014525905.tif 000011
式中、「
2014525905.tif 000012
」として示される各結合は、原子価要件を満たすために必要な単結合または二重結合であり; X1およびR1〜R14は上記定義の通りであり; R15〜R22は独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシル、酸素、チオール、アミノ、アルキルアミノ、アルコキシ、硫黄、イミノ、イミニウム、アルキルイミノ、アルキルイミニウム、またはRcが上記定義の通りである-NHRcであり; R1〜R22の少なくとも1つは、フルオロフォアをビオローゲン骨格に共有結合させるリンカーである。特定の態様では、R13はリンカーであり、式-COO-を有する。いくつかの態様では、X1は酸素である。特定の態様では、R13は-COO-であり、ラクトン環を形成し、R1〜R12またはR15〜R22の少なくとも1つはリンカーである。
【００１８】
いくつかの態様では、フルオロフォアは一般式(iii)、(iv)、(ix)または(x)の構造を有し、ここでX1は酸素であり、R16およびR18は独立してハロゲン、水素、ヒドロキシル、酸素、チオール、アミノ、アルキルアミノ、アルコキシ、Rcが上記定義の通りである-NHRc、またはリンカー部分であり、R16およびR18の少なくとも一方は水素以外である。特定の態様では、フルオロフォアは一般式(iv)の構造を有し、ここでX1は酸素であり、R19およびR21は独立してヒドロキシル、チオール、酸素、イミノ、イミニウム、アルキルイミノ、アルキルイミニウム、アミノ、アルキルアミノ、Rcが上記定義の通りである-NHRc、またはリンカー部分であり、R19およびR21の少なくとも一方は水素以外であり、特定の態様では、一般式(iv)の前述のフルオロフォアはR16またはR18においてハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、アルキルアミノ、アルコキシ、またはRcが上記定義の通りである-NHRcをさらに含む。いくつかの態様では、フルオロフォアは、X1が酸素であり、R6およびR16が-NHRcである一般式(iii)の構造、またはX1が酸素であり、R16およびR21が-NHRcである一般式(iv)の構造を有する。特定の態様では、フルオロフォアは一般式(vi)の構造を有し、ここでR17はハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、アルキルアミノ、またはRcが上記定義の通りである-NHRcであり、R20は酸素、硫黄、イミノ、イミニウム、アルキルイミニウム、またはRcが上記定義の通りである-NHRcである。
【００１９】
開示されるNIRフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートのいくつかの態様は、700nm以上、例えば750nm以上の波長での発光スペクトル極大を有する、一般式(i)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)、(ix)、(x)または(xi)の少なくとも1つのフルオロフォアを含む。特定の態様では、フルオロフォアは80nm以上、例えば100nm以上のストークスシフトを有する。
【００２０】
いくつかの態様では、RAおよびRBはいずれもフルオロフォアであり、各フルオロフォアは独立して一般式(i)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)、(ix)、(x)または(xi)より選択される構造を有する。特定の態様では、RAおよびRBは同一の構造を有する。いくつかの態様では、RAおよびRBの一方は一般式(i)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)、(ix)、(x)または(xi)のフルオロフォアであり、RAおよびRBの他方は低級アルキルニトリル基、低級アルキル置換フェニル基、アルケニル基、アルキニル基、置換クマリン基、アセタール基またはカルボキシレート基である。特定の態様では、RAおよびRBの他方は下記式である。
2014525905.tif 000013
【００２１】
本化合物の態様を使用することで分析物を検出することができる。いくつかの態様では、分析物を検出するための方法は、分析物を含む試料と開示される化合物の一態様とを合わせることによって溶液を形成する段階、分析物が存在することを示す、溶液の色、吸光度スペクトル、発光スペクトルまたはその組み合わせの検出可能な変化を生成するために有効な期間、溶液中の分析物と化合物との間の反応を進行させる段階、および変化を検出する段階を含む。いくつかの態様では、変化は、溶液を光源に曝露する段階、および化合物からの蛍光を検出することによって分析物を検出する段階によって検出される。例えば、蛍光は、反応が前記有効な期間進行した後の化合物の発光スペクトル極大に対応する波長で検出することができる。特定の態様では、本方法は、化合物の発光スペクトル極大に対応する波長での化合物からの蛍光量を測定することによって分析物を定量化する段階をさらに含む。
【００２２】
いくつかの態様では、変化は、反応が前記有効な期間進行した後の1つもしくは複数の波長での溶液の吸光度の変化を検出することによって検出される。特定の態様では、試料および化合物を合わせた後の第1の時点での溶液の吸光度スペクトルを、反応が前記有効な期間進行した後の溶液の吸光度スペクトルと比較する。他の態様では、試料および化合物を合わせた後の第1の時点での溶液の発光スペクトルを、反応が前記有効な期間進行した後の溶液の発光スペクトルと比較する。
【００２３】
いくつかの態様では、試料は血液または尿などの生体液を含む。特定の態様では、分析物はシステイン、ホモシステイン、グルタチオン、スクシニル-5-アミノ-4-イミダゾールカルボキサミドリボシド、スクシニルアデノシンまたはその組み合わせである。
【００２４】
分析物がグルタチオン、システインおよび/またはホモシステインを含む場合、化合物は一般式(vi)の少なくとも1つのフルオロフォアを含むことができ、ここでX1はO、S、Se、Si(CH3)2、Ge(CH3)2、Sn(CH3)2、CH2またはNHであり; R1、R4、R5およびR8は独立して水素、ヒドロキシル、チオール、低級アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、置換アミノ、アルコキシまたはハロゲンであり; R9〜R12は独立して水素、アルキル、アシル、カルボキシル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノまたは-SO3Hであり;R13は水素、ヒドロキシル、低級アルキル、低級アルコキシ、-SO3H、またはR14が水素もしくは低級アルキルである-COOR14であり、かつB環中の「
2014525905.tif 000014
」として示される結合は二重結合であり、あるいは、R13は、B環およびD環と環系を形成する1個もしくは複数の原子であり、かつB環中の「
2014525905.tif 000015
」として示される結合は単結合であり; R15〜R18は独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、アルキルアミノまたはアルコキシであり; R19〜R22は独立して水素、ヒドロキシル、チオール、ハロゲン、酸素、イミノ、イミニウム、アルキルイミノ、アルキルイミニウム、アミノまたはアルキルアミノであり; R1、R4、R5、R8〜R13、R15、R16、R18、R19、R21またはR22の少なくとも1つは、フルオロフォアをビオローゲン骨格に共有結合させるリンカーである。特定の態様では、R13はリンカーであり、式-COO-を有する。
【００２５】
いくつかの態様では、分析物がグルタチオンである場合、R17はヒドロキシル、アミノまたはアルキルアミノであり、R20は酸素、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、イミノまたはアルキルイミニウムである。特定の態様では、分析物がスクシニル-5-アミノ-4-イミダゾールカルボキサミドリボシド、スクシニルアデノシンまたはその組み合わせである場合、R17およびR20の少なくとも一方は-NHRcである。そのような態様では、R13は通常-COOR14であり、ここでR14は水素または低級アルキルであり、リンカーはR9、R10、R11またはR12にある。
【００２６】
分析物を検出するためのキットの態様は、分析物を含む試料(例えば生体液)と合わせた際に、分析物を含まない試料中の化合物に比べての吸光度スペクトルおよび/または発光スペクトルの変化を経る、開示される化合物の少なくとも1つの態様を含む。いくつかの態様では、キットは少なくとも1つの緩衝液をさらに含み、化合物は、分析物を含む試料と合わせた際に、緩衝液、および分析物を含まない試料と合わせた化合物に比べての吸光度スペクトルおよび/または発光スペクトルの変化を経る。キットの特定の態様は、化合物と分析物との間の反応によって生成される色変化を評価するための色比較チャートも含みうる。いくつかの態様では、キットは、化合物と分析物との間の反応を行うことができる複数の使い捨て容器をさらに含む。特定の態様では、分析物と反応する際に色、吸光度スペクトル、発光スペクトルまたはその組み合わせの検出可能な変化を経るために有効な量の化合物が予め秤量されて複数の使い捨て容器に入れられる。
【００２７】
分析物がシステイン、ホモシステイン、グルタチオン、スクシニル-5-アミノ-4-イミダゾールカルボキサミドリボシド、スクシニルアデノシンまたはその組み合わせであるいくつかの態様では、キットは、一般式(vi)の少なくとも1つのフルオロフォアを有する化合物を含み、ここでR17はヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、またはRcが上記定義の通りである-NHRcであり、R20は酸素、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、イミノ、アルキルイミニウム、またはRcが上記定義の通りである-NHRcである。
【００２８】
本発明の前述のおよび他の目的、特徴および利点は、少なくともその一部が完全色で提示される添付図面を参照して進行する以下の詳細な説明よりさらに明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図1Aおよび図1Bはそれぞれホモシステインおよびシステインのチイルラジカルからのα-アミノアルキルラジカルの形成を導く推定プロトン引き抜きを示す。
【図２】環化環の炭素-1または炭素-3において置換基を有する[c]型環化キサンテンの一般的化学構造を含み、ここでRは-OHまたは-N(CH3)2であり、R'は酸素または-N(CH3)2+であり、R''は水素または低級アルキルである。
【図３】一重架橋オルト、メタおよびパラ-ビスクマリンビオローゲン類似体のエネルギー最小化構造およびπ-πスタッキングを示す。
【図４】グルタチオンおよびパラ-ビスクマリンビオローゲンの超分子集合体のエネルギー最小化構造である。
【図５】一般式(iv)の化学構造を有する開示される色素のいくつかの態様の合成を示す反応スキームである。
【図６】一般式(iii)のセミ-ナフトフルオレセイン化学構造を有する開示される色素のいくつかの態様の合成を示す反応スキームである。
【図７】一般式(iii)のロドールまたはローダミン化学構造を有する開示される色素のいくつかの態様の合成を示す反応スキームである。
【図８】一般式(iv)の化学構造を有する開示される色素の一態様の合成を示す反応スキームである。
【図９】一般式(vi)および(viii)〜(xi)の化学構造を有する開示される色素のいくつかの態様の合成を示す反応スキームである。
【図１０】一般式(v)および(vii)の化学構造を有する開示される色素のいくつかの態様の合成を示す反応スキームである。
【図１１】X1がSi(CH3)2、Ge(CH3)2またはSn(CH3)2である一般式(i)の化学構造を有する開示される色素のいくつかの態様の合成を示す反応スキームである。
【図１２】X1がSまたはSeである一般式(i)の化学構造を有する開示される色素のいくつかの態様の合成を示す反応スキームである。
【図１３】一般式(iii)のビス-ボロン酸化学構造を有する開示される色素のいくつかの態様の合成を示す反応スキームである。
【図１４】一般式(iv)のビス-ボロン酸化学構造を有する開示される色素のいくつかの態様の合成を示す反応スキームである。
【図１５】開示されるNIR色素-ビオローゲンコンジュゲートの一態様の合成を示す反応スキームである。
【図１６】開示されるNIR色素-ビオローゲンコンジュゲートの別の態様の合成を示す反応スキームである。
【図１７】一重架橋オルト-ビスロドールビオローゲン類似体のエネルギー最小化構造を示す。
【図１８】一重架橋メタ-ビスロドールビオローゲン類似体のエネルギー最小化構造を示す。
【図１９】一重架橋パラ-ビスロドールビオローゲン類似体のエネルギー最小化構造を示す。
【図２０】開示される色素の一態様とグルタチオンとの分子相互作用を示す。
【図２１】開示される色素の2つの態様とS-Ado(左側)およびSAICAr(右側)との分子相互作用を示す。
【図２２】開示される色素の一態様のX線構造である。
【図２３】ジアニオン状態およびモノアニオン状態の開示される色素の2つの態様の一連の吸光度スペクトルである。
【図２４】中性形およびアニオン形の開示される色素の2つの態様の一連の吸光度スペクトルである。
【図２５】中性形およびアニオン形の開示される色素の2つの態様の一連の吸光度スペクトルである。
【図２６】フェノール形およびフェノキシド形の開示される色素の一態様の一連の吸光度スペクトルである。
【図２７】フェノール形およびフェノキシド形の開示される色素の一態様の一連の吸光度スペクトルである。
【図２８】カチオン形の開示される色素の2つの態様の一連の吸光度スペクトルである。
【図２９】開示される色素の一態様の一連のpH滴定曲線である。
【図３０】緩衝液中のおよび緩衝液中5%全血中の開示される色素の一態様の一連のスペクトルである。
【図３１】A) 10%全血中の開示される色素の一態様の吸収スペクトルである。B) 10%および90%全血中の開示される色素の一態様の一連の発光スペクトルである。
【図３２】開示される色素のいくつかの態様の吸収極大に対するイオン化の効果を示す一連の吸収スペクトルである。
【図３３】開示される色素の一態様の分子内水素結合ネットワークを示す。
【図３４】脱プロトン化時に減少する開示される色素の一態様の縮合環系の共平面性を水素結合が増大させることを示す、分子シミュレーションである。
【図３５】a〜fはローダミンビス-ボロン酸の2つの態様およびそれらの各前駆体の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルである。スペクトルはDMSO:緩衝液1:9(図35a〜c)およびDMSO:緩衝液1:1(図35d〜f)中で得た。
【図３６】ローダミンビス-ボロン酸の2つの態様およびそれらの各前駆体の一連のDMSO滴定曲線である。最終pH 7.4リン酸緩衝液濃度は12.5mMとした。
【図３７】a〜dは各種糖類に応答してのローダミンビス-ボロン酸の一態様の吸光度スペクトルおよび蛍光スペクトルである。図37aは、DMSO:緩衝液1:9中の10mM糖に応答しての化合物(3.75μM)の吸収スペクトルおよび発光スペクトルであり、図37bは、DMSO:緩衝液1:9中の糖濃度の関数としての蛍光発光(励起580nm/発光660nm)であり、図37cは、DMSO:緩衝液1:1中の10mM糖に応答しての化合物(3.75μM)の吸収スペクトルおよび発光スペクトルであり、図37dは、DMSO:緩衝液1:1中の糖濃度の関数としての蛍光発光(励起580nm/発光640nm)である。最終pH 7.4リン酸緩衝液濃度は12.5mMとした。
【図３８】a〜dは各種糖類に応答してのローダミンビス-ボロン酸の一態様の吸光度スペクトルおよび蛍光スペクトルである。図38aは、DMSO:緩衝液1:9中の糖濃度の関数としての化合物(7.5μM)の吸収(630nm)スペクトルであり、図38bは、DMSO:緩衝液1:9中の糖濃度の関数としての化合物(7.5μM)の蛍光(励起630/発光690nm)スペクトルであり、図38cは、DMSO:緩衝液1:1中の糖濃度の関数としての化合物(7.5μM)の吸収(640nm)スペクトルであり、図38dは、DMSO:緩衝液1:1中の糖濃度の関数としての化合物(7.5μM)の蛍光(励起640/発光700nm)スペクトルであり、最終pH 7.4リン酸緩衝液濃度は12.5mMとした。
【図３９】リボースとローダミンビス-ボロン酸化合物の一態様との間で形成される複合体の一態様のエネルギー最小化構造を示す。
【図４０】フルクトースの2個の分子とローダミンビス-ボロン酸化合物の一態様との間で形成される複合体の一態様のエネルギー最小化構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
詳細な説明
分析物を選択的に検出するための化合物の態様が開示される。本化合物は架橋ビオローゲン骨格を含むものであり、少なくとも1つのフルオロフォアを含みうる。検出を行うための方法およびキットの態様も開示される。溶液中で1つもしくは複数の分析物と反応する場合の開示される化合物の態様は、溶液の吸光度スペクトルおよび/または発光スペクトルの検出可能な変化を生成する。いくつかの態様では、本化合物は、近赤外領域内の波長での極大を有する発光スペクトルを生成可能なフルオロフォア、すなわち近赤外(NIR)色素を含む。近赤外フルオロフォア部分を含む化合物の特定の態様は、(i) 相対的に低い分子量、(ii) 水溶性、ならびに/または(iii) 蛍光性の中性形およびアニオン形からの二重の励起および発光を含む望ましい特性の組み合わせを示す。重要なことに、芳香環化およびイオン化可能部分の位置化学の系統的な変化によって(iv) 調節可能な濃赤色〜NIR発光、および(v) 増大したストークスシフトが得られる。有利なことに、開示される化合物の特定の態様は、血液または尿などの体液からの干渉の範囲外の波長での発光スペクトル極大を生成し、これにより該化合物は生体液中の分析物の直接検出に好適になる。
【００３１】
I. 用語および定義
用語および略語の以下の説明は、本開示をより良く記述するために、また本開示の実施において当業者を指導するために示される。本明細書において使用する「含む(comprising)」は「含む(including)」を含み、単数形「a」もしくは「an」または「the」は、文脈上別途明らかな指示がない限り、複数に対する言及を含む。「または」という用語は、文脈上別途明らかな指示がない限り、述べられる代替要素のうちの単一の要素、または2つ以上の要素の組み合わせを意味する。
【００３２】
別途説明しない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者が通常理解するものと同一の意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本開示の実施または試験において使用できるが、好適な方法および材料を以下に記載する。材料、方法および実施例は例示的なものでしかなく、限定的であるようには意図されていない。本開示の他の特徴は以下の詳細な説明および特許請求の範囲より明らかである。
【００３３】
別途指示しない限り、本明細書または特許請求の範囲において使用される、成分の量、分子量、割合、温度、時間などを表すすべての数値は、「約」という用語によって修正されるものと理解すべきである。したがって暗示的または明示的に別途指示しない限り、記載される数値パラメータは、求められる所望の性質、および/または標準的試験条件/方法下での検出限界に依存しうる近似値である。態様と論じられる先行技術とを直接かつ明示的に区別する場合、「約」という用語が述べられない限り、態様の数値は近似値ではない。
【００３４】
一般的な化学用語の定義はRichard J. Lewis, Sr. (ed.), Hawley's Condensed Chemical Dictionary, published by John Wiley & Sons, Inc., 1997 (ISBN 0-471-29205-2)に見出すことができる。
【００３５】
本開示の各種態様の考察を容易にするために、具体的用語の以下の説明を示す。
【００３６】
吸光度: 化合物もしくは物質による、化合物もしくは物質に入射する特定波長の放射線の保持率; 光が化合物もしくは物質または化合物もしくは物質の溶液を通過する際に吸収される特定波長での光の量の程度。
【００３７】
脂肪族という用語は、分岐または非分岐炭素鎖を有することを意味する。この鎖は飽和(全面的に単結合を有する)でも不飽和(1個もしくは複数の二重結合または三重結合を有する)でもよい。
【００３８】
アルキルとは、飽和炭素鎖を有する炭化水素基を意味する。この鎖は分岐でも非分岐でもよい。低級アルキルという用語は、この鎖が1〜10個の炭素原子を含むことを意味する。
【００３９】
類似体または誘導体とは、同様の化合物より誘導される化合物、または、例えば1個の原子を別の原子もしくは原子団で置き換える際に別の化合物より生じると想像されうる化合物のことである。類似体は、他の原子、基または部分構造で置き換えられる1個もしくは複数の原子、官能基または部分構造が互いに異なりうる。
【００４０】
環化(annelation/annulation)とは、1個の環式構造または環構造を別のそれに付加することで多環式化合物または環化化合物を形成する化学反応のことである。環化は、新たに付加された環の位置に応じて[a]型、[b]型または[c]型と分類することができる。以下に示すように、[a]型とは「下方環化」を意味し、「b」型とは「横断環化」を意味し、「c」型とは「上方環化」を意味する。
2014525905.tif 000016
【００４１】
本明細書において使用される「環化」という用語は、環もしくは環状セグメントを有すること、またはそれからなることを意味する。「芳香環化」という用語は、ベンゼン環に縮合した環状化合物(通常は芳香族)の誘導体を意味する。芳香環化化合物の例としては特にベンゾピレン、キノリン、ナフトキノン、ナフトフルオレセイン、ローダミンおよびキサンテンが挙げられる。
【００４２】
芳香族またはアリール化合物とは、典型的には、単結合および二重結合を交互に有する不飽和環状炭化水素のことである。3個の二重結合を含有する6炭素環であるベンゼンが典型的な芳香族化合物である。
【００４３】
深色移動とは、分子の吸収スペクトル、反射率スペクトル、透過率スペクトルまたは発光スペクトルにおける、より長波長または低周波数へのスペクトル帯の位置の変化のことである。深色移動は一般的に「赤色移動」と呼ばれる。深色移動は、異なる置換および/または置換パターンを伴う一連の構造的に関連性のある分子のスペクトルにおいて生じうる。環境、例えば溶媒極性の変化も深色移動を生じさせることがある。
【００４４】
コンジュゲート: 第2の単位に結合した第1の単位。本明細書において使用される「コンジュゲート」という用語は、別の分子に共有結合した1つの分子を意味する。
【００４５】
クマリン: 下記一般構造を有するベンゾピロン。
2014525905.tif 000017
本明細書において使用される「置換クマリン」とは、1個もしくは複数の置換基を含むクマリンを意味する。好適な置換基としては置換もしくは非置換の低級アルキル基、置換もしくは非置換の低級アルコキシ基、低級アルキルカルボニル基、置換もしくは非置換のアミノ基、ハロ基、およびヒドロキシル基を挙げることができる。いくつかの態様では、クマリンは3位および/または7位において例えば低級アルキル基、低級アルキルカルボニル基、低級アルコキシ基、アミノ基または置換アミノ基で置換されている。
【００４６】
検出する: 例えば試料中に作用物質(標的分子などの)が存在するかまたは存在しないかを決定すること。「検出する」とは、何かが存在するかまたは存在しないかを決定する、例えば標的分子が生体試料中に存在するか否かを決定する任意の方法を意味する。例えば、「検出する」は、試料が特定の特性を示すか否かを決定するために視覚的または機械的装置を使用することを含みうる。
【００４７】
発光または発光信号とは、発生源から発生する特定波長の光を意味する。特定の例では、フルオロフォアが励起波長で光を吸収した後に、発光信号がフルオロフォアより放出される。
【００４８】
励起または励起信号とは、電子遷移をより高いエネルギーレベルに励起させるために必要かつ/または十分な特定波長の光を意味する。特定の例では、励起信号とは、フルオロフォアが励起信号による光の波長とは異なる(例えばより長い)波長の光を発光するという状態にフルオロフォアを励起させるために必要かつ/または十分な特定波長の光のことである。
【００４９】
蛍光とは、高電子状態から低電子状態までを通過する原子または分子による可視光線の発光のことであり、ここでエネルギーの吸収と放出との間の時間間隔は10-8〜10-3秒である。本明細書において使用される蛍光は、原子または分子が励起光源(例えば190〜850nmの波長範囲内で光を生成するランプ)よりエネルギーを吸収した後、エネルギーを可視光線および/または近赤外線として放出する際に生じる。
【００５０】
フルオロフォアまたは発蛍光団とは、蛍光が可能な化合物、例えば蛍光色素のことである。「フルオロフォア」という用語は、励起光源に露出される際に分子が蛍光を発するようにする分子の部分も意味する。
【００５１】
官能基とは、分子の特徴的な化学反応の原因である分子内の特定の原子団のことである。例示的な官能基としてはアルカン、アルケン、アルキン、アレーン、ハロ(フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード)、エポキシド、ヒドロキシル、カルボニル(ケトン)、アルデヒド、炭酸エステル、カルボキシレート、エーテル、エステル、ペルオキシ、ヒドロペルオキシ、カルボキサミド、アミン(第一級、第二級、第三級)、アンモニウム、イミド、アジド、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、ニトレート、ニトライト、ニトリル、ニトロアルカン、ニトロソ、ピリジル、ホスフェート、スルホニル、スルフィド、チオール(スルフヒドリル)、ジスルフィドが挙げられるがそれに限定されない。
【００５２】
ヘテロアリール化合物とは、少なくとも1個のヘテロ原子を有する芳香族化合物のことであり、すなわち、環中の1個もしくは複数の炭素原子は、少なくとも1つの孤立電子対を有する原子、典型的には窒素、酸素または硫黄で置き換えられている。
【００５３】
イミノとは、式=NHを有する官能基を意味する。
【００５４】
イミニウムとはプロトン化イミンまたは置換イミン、例えば=NH2+または(=NRARB)+を意味し、ここでRAおよびRBはアルキル基または置換アルキル基を表す。本明細書において使用される(=NRARB)+はアルキルイミニウム基と呼ばれる。
【００５５】
MIP: 分子刷り込みポリマー。
【００５６】
近赤外(NIR)とは、可視領域と赤外領域との間の電磁スペクトル領域のことである。近赤外領域の境界に関する決まった定義はないが、定義としては波長範囲650〜2500nm、750〜2500nm、780〜2500nm、800〜2500nm、700〜1400nm、または780〜3000nmが挙げられる。本明細書において使用されるNIRは通常、波長領域700〜1400nmを意味する。
【００５７】
ロドールとは、フルオレセインおよびローダミンの構造混成体のことである。ローダミンとは、関連性のあるフルオロン色素のファミリーのことである。フルオレセイン、ローダミンおよび2つのロドール類似体の構造を以下に示す。
2014525905.tif 000018
【００５８】
SNAFL: セミナフトフルオレセイン。
【００５９】
SNAFR: セミナフトフルオロン。
【００６０】
SNARF: セミナフトローダフルオル。
【００６１】
ストークスシフトとは、同一電子遷移の吸光度スペクトル極大と発光スペクトル極大との間の差(波長または周波数単位)を意味する。典型的には、蛍光発光極大波長は励起放射波長、すなわち吸光度極大波長よりも長い。
【００６２】
置換基とは、反応の結果として分子中の別の原子を置き換える原子または原子団のことである。典型的には、「置換基」という用語は、親炭化水素鎖または環上の水素原子を置き換える原子または原子団を意味する。
【００６３】
置換された: アリール化合物もしくは脂肪族化合物などの基本化合物、または、典型的には水素原子の代わりに第2の置換基がそこに結合したそのラジカル。例えば、置換アリール化合物または置換基では、例えばトルエンを有するアリール基質の閉環体に脂肪族基が結合しうる。長鎖炭化水素では、置換基、例えば1個もしくは複数のハロゲン、アリール基、環式基、ヘテロアリール基または複素環基がそこに結合しうるが、これらはやはり単に例示的なものであり、限定するものではない。
【００６４】
キサンテンとは、式C13H10Oを有する有機複素環式化合物のことである。
2014525905.tif 000019
キサンテン誘導体はキサンテンと呼ばれ、フルオレセイン、ローダミン、およびその誘導体を含む。
【００６５】
II.代表的態様の概観
緩衝液および/または生体媒質中の分析物を選択的に検出するフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートの態様が開示される。検出を行うための方法およびキットの態様も開示される。溶液中で1つもしくは複数の分析物と反応する場合の開示される化合物の態様は、溶液の吸光度スペクトルおよび/または発光スペクトルの検出可能な変化を生成する。
【００６６】
開示される化合物の態様は、本明細書に記載の式I、式IIまたは式IIIの構造を有する。いくつかの態様では、RAおよびRBの少なくとも一方は、本明細書に記載の一般式(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)、(ix)、(x)または(xi)の構造を有するフルオロフォアであり、ここでR1〜R22の少なくとも1つは、フルオロフォアをビオローゲン骨格に共有結合させるリンカーであり、ここでフルオロフォアが一般式(iii)の構造を有する場合、R1およびR8の少なくとも一方は水素以外であり、あるいは、R13は-COOR14ではない。上記態様のいずれかまたはすべてにおいては、R13はリンカーでありうるし、式-COO-を有しうる。
【００６７】
上記態様のいずれかまたはすべてにおいては、RAおよびRBはいずれも、一般式(i)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)、(ix)、(x)または(xi)の選択される構造を独立して有するフルオロフォアでありうる。いくつかの態様では、RAおよびRBは同一の構造を有する。
【００６８】
上記態様のいずれかまたはすべてにおいては、RAおよびRBの一方は一般式(i)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)、(ix)、(x)または(xi)のフルオロフォアでありうるし、RAおよびRBの他方は低級アルキルニトリル基、低級アルキル置換フェニル基、アルケニル基、アルキニル基、置換クマリン基、アセタール基またはカルボキシレート基でありうる。いくつかの態様では、RAおよびRBの他方は
2014525905.tif 000020
である。
【００６９】
上記態様のいずれかまたはすべてにおいては、X1は酸素でありうる。上記態様のいずれかまたはすべてにおいては、RAおよびRBの少なくとも一方は、一般式(i)の構造を有するフルオロフォアでありうるし、ここでR13は-COO-であり、ラクトン環を形成し、R1〜R12の少なくとも1つはリンカーである。上記態様のいずれかまたはすべてにおいては、RAおよびRBの少なくとも一方は、一般式(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)、(ix)、(x)または(xi)の構造を有するフルオロフォアでありうるし、ここでR13は-COO-であり、ラクトン環を形成し、R1〜R12またはR15〜R22の少なくとも1つはリンカーである。上記態様のいずれかまたはすべてにおいては、本化合物は、イオン化可能部分に隣接して位置する少なくとも1個のハロゲン原子を含みうる。
【００７０】
上記態様のいずれかまたはすべてにおいては、一般式(i)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)、(ix)、(x)または(xi)のフルオロフォアは、700nm以上の波長での発光スペクトル極大、例えば750nm以上での発光スペクトル極大を有しうる。上記態様のいずれかまたはすべてにおいては、一般式(i)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)、(ix)、(x)または(xi)のフルオロフォアは、80nm以上、例えば100nm以上のストークスシフトを有しうる。
【００７１】
上記態様のいずれかまたはすべてにおいては、フルオロフォアは一般式(iii)、(iv)、(ix)または(x)の構造を有しうるものであり、ここでX1は酸素であり、R18はハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、アルキルアミノまたはアルコキシである。上記態様のいずれかまたはすべてにおいては、フルオロフォアは一般式(vi)の構造を有しうるものであり、ここでR17はハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、アルキルアミノまたは-NHRcであり、R20は酸素、硫黄、イミノ、イミニウム、アルキルイミニウムまたは-NHRcである。
【００７２】
上記態様のいずれかまたはすべてにおいては、フルオロフォアは一般式(iv)の構造を有しうるものであり、ここでX1は酸素であり、R19はヒドロキシル、チオール、酸素、イミノ、イミニウム、アルキルイミノ、アルキルイミニウム、アミノまたはアルキルアミノである。いくつかの態様では、R18はハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、アルキルアミノまたはアルコキシである。上記態様のいずれかまたはすべてにおいては、フルオロフォアは、X1が酸素であり、R6およびR16が-NHRcである一般式(iii)の構造、またはX1が酸素であり、R16およびR21が-NHRcである一般式(iv)の構造を有しうる。
【００７３】
分析物を検出するための方法は、分析物を含む試料と上記態様のいずれかまたはすべての化合物とを合わせることによって溶液を形成する段階、分析物が存在することを示す、溶液の吸光度スペクトル、発光スペクトルまたはその両方の検出可能な変化を生成するために有効な期間、溶液中の分析物と化合物との間の反応を進行させる段階、および変化を検出する段階を含む。
【００７４】
前記態様のいずれかまたはすべてにおいては、変化を検出する段階は、反応が前記有効な期間進行した後の1つもしくは複数の波長での溶液の吸光度の変化を検出する段階を含みうる。前記態様のいずれかまたはすべてにおいては、変化を検出する段階は、試料および化合物を合わせた後の第1の時点での溶液の吸光度スペクトルを、反応が前記有効な期間進行した後の溶液の吸光度スペクトルと比較する段階を含みうる。前記態様のいずれかまたはすべてにおいては、変化を検出する段階は、試料および化合物を合わせた後の第1の時点での溶液の発光スペクトルを、反応が前記有効な期間進行した後の溶液の発光スペクトルと比較する段階を含みうる。前記態様のいずれかまたはすべてにおいては、変化を検出する段階は、化合物との反応前の溶液の色を化合物との前記有効な期間反応後の溶液の色と比較する段階を含みうる。
【００７５】
前記態様のいずれかまたはすべてにおいては、変化を検出する段階は、溶液を光源に曝露する段階、および化合物からの蛍光を検出することによって分析物を検出する段階を含みうる。いくつかの態様では、光源は190nm〜850nmの範囲の波長を有する。いくつかの態様では、化合物からの蛍光を検出することは、反応が前記有効な期間進行した後の化合物の発光スペクトル極大に対応する波長での蛍光を検出することを含む。本化合物は、700nm以上、例えば750nm以上の波長での発光スペクトル極大を有しうる。いくつかの態様では、本方法は、化合物の発光スペクトル極大に対応する波長での化合物からの蛍光量を測定することによって分析物を定量化する段階をさらに含む。
【００７６】
上記態様のいずれかまたはすべてにおいては、試料は生体液でありうる。いくつかの態様では、生体液は血液または尿を含む。上記態様のいずれかまたはすべてにおいては、分析物はシステイン、ホモシステイン、グルタチオンまたはその組み合わせでありうる。
【００７７】
上記態様のいずれかまたはすべてにおいては、分析物はシステイン、ホモシステイン、グルタチオン、スクシニル-5-アミノ-4-イミダゾールカルボキサミドリボシド、スクシニルアデノシン、またはスクシニル-5-アミノ-4-イミダゾールカルボキサミドリボシドとスクシニルアデノシンとの組み合わせでありうる。そのような態様では、本化合物は一般式(vi)の少なくとも1つのフルオロフォアを含みうるものであり、ここでX1はO、S、Se、Si(CH3)2、Ge(CH3)2、Sn(CH3)2、CH2またはNHであり; R1、R4、R5およびR8は独立して水素、ヒドロキシル、チオール、低級アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、置換アミノ、アルコキシまたはハロゲンであり; R9〜R12は独立して水素、アルキル、アシル、カルボキシル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノまたは-SO3Hであり;R13は水素、ヒドロキシル、低級アルキル、低級アルコキシ、-SO3H、またはR14が水素もしくは低級アルキルである-COOR14であり、B環中の「
2014525905.tif 000021
」として示される結合は二重結合であり、あるいは、R13は、B環およびD環と環系を形成する1個もしくは複数の原子であり、B環中の「
2014525905.tif 000022
」として示される結合は単結合であり; R15〜R18は独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、アルキルアミノ、アルコキシまたは-NHRcであり; R19〜R22は独立して水素、ヒドロキシル、チオール、ハロゲン、酸素、イミノ、イミニウム、アルキルイミノ、アルキルイミニウム、アミノ、アルキルアミノまたは-NHRcであり; R1、R4、R5、R8〜R13、R15、R16、R18、R19、R21またはR22の少なくとも1つは、フルオロフォアをビオローゲン骨格に共有結合させるリンカーである。いくつかの態様では、R13はリンカーであり、式-COO-を有する。いくつかの態様では、分析物はグルタチオンであり、R17はヒドロキシル、アミノまたはアルキルアミノであり、R20は酸素、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、イミノまたはアルキルイミニウムである。いくつかの態様では、分析物はスクシニル-5-アミノ-4-イミダゾールカルボキサミドリボシド、スクシニルアデノシンまたはその組み合わせであり、R17およびR20の少なくとも一方は-NHRcであり、R13は-COOR14であり、ここでR14は水素または低級アルキルであり、R9、R10、R11またはR12の1つはリンカーである。特定の態様では、分析物はスクシニル-5-アミノ-4-イミダゾールカルボキサミドリボシド、スクシニルアデノシンまたはその組み合わせであり、化合物は、X1が酸素であり、R6およびR16が-NHRcである一般式(iii)、またはX1が酸素であり、R16およびR21が-NHRcである一般式(iv)の、少なくとも1つのフルオロフォアを含む。
【００７８】
分析物を検出するためのキットの態様は、上記態様のいずれかまたはすべての少なくとも1つの化合物を含み、化合物は、分析物を含む試料と合わせた際に、分析物を含まない試料中の化合物に比べての吸光度スペクトルおよび/または発光スペクトルの変化を経る。いくつかの態様では、試料は生体液である。上記態様のいずれかまたはすべてにおいては、キットは、少なくとも1つの緩衝液をさらに含みうるものであり、化合物は、分析物を含む試料と合わせた際に、緩衝液、および分析物を含まない試料と合わせた化合物に比べての吸光度スペクトルおよび/または発光スペクトルの変化を経る。
【００７９】
上記態様のいずれかまたはすべてにおいては、分析物はグルタチオン、システイン、ホモシステイン、スクシニル-5-アミノ-4-イミダゾールカルボキサミドリボシド、スクシニルアデノシン、またはスクシニル-5-アミノ-4-イミダゾールカルボキサミドリボシドとスクシニルアデノシンとの組み合わせでありうる。いくつかの態様では、キット中の化合物は本明細書に記載の一般式(vi)の少なくとも1つのフルオロフォアを含む。いくつかの態様では、キット中の化合物は、X1が酸素であり、R6およびR16が-NHRcである本明細書に記載の一般式(iii)、またはX1が酸素であり、R16およびR21が-NHRcである本明細書に記載の一般式(iv)の、少なくとも1つのフルオロフォアを含む。
【００８０】
上記態様のいずれかまたはすべてにおいては、キットは、化合物と分析物との間の反応によって生成される色変化を評価するための色比較チャートを含みうる。上記態様のいずれかまたはすべてにおいては、キットは、化合物と分析物との間の反応を行うことができる複数の使い捨て容器を含みうる。いくつかの態様では、分析物と反応する際に吸光度スペクトル、発光スペクトルまたはその両方の検出可能な変化を経るために有効な量の化合物が予め秤量されて複数の使い捨て容器に入れられる。
【００８１】
III. フルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲート
緩衝液および/または生体媒質中の分析物を選択的に検出するフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートの態様が本明細書に開示される。例示的な分析物としてはチオール(例えばシステイン(Cys)、ホモシステイン(Hcy)および/もしくはグルタチオン(GSH))、スクシニル-5-アミノ-4-イミダゾールカルボキサミドリボシド、スクシニルアデノシンまたはその組み合わせが挙げられる。開示されるフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートの態様としては、架橋ビオローゲンにコンジュゲートした少なくとも1個のフルオロフォア部分が挙げられる。いくつかの態様では、フルオロフォアは、近赤外領域内の波長での発光極大を有する発光スペクトルを生成可能である。本明細書において使用される「架橋ビオローゲン」という用語は、ジメチルベンゼン環などの共通の構造要素または橋に結合した2個のビオローゲン部分を含む中心部分を有する化合物を意味する。各種の置換基をビオローゲン部分の遊離端に結合させることで、種々の性質を有する架橋ビオローゲン化合物を形成することができる。いくつかの態様では、コンジュゲートは緩衝液および/または生体液中で分析物と反応することで、着色生成物を形成し、かつ/または吸光度スペクトルおよび/もしくは発光スペクトルの変化を経る。生成物の形成および/またはスペクトルの差を視覚的に、または分光学的方法、例えば紫外可視もしくは蛍光分光法によってモニタリングすることができる。特定の態様では、フルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートはCys、HcyおよびGSHの1つまたは複数に対して選択的である。他の態様では、フルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートはスクシニル-5-アミノ-4-イミダゾールカルボキサミドリボシド、スクシニルアデノシンまたはその組み合わせに対して選択的である。選択性は、着色がより強い生成物および/または着色が異なった生成物の形成によって示すことができる。選択性は、架橋ビオローゲンおよび分析物を含有する溶液の吸光度スペクトルおよび/もしくは発光スペクトルの検出可能な変化、またはフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートおよび分析物を含有する溶液の1つもしくは複数の波長での吸光度および/もしくは蛍光発光の検出可能な変化によって示すこともできる。特定の態様では、温度および/または緩衝液の組成が特定のフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートの選択性に影響する。決定は定性的(例えば視覚的色変化をモニタリングするか、または反応の前後の吸光度スペクトルおよび/もしくは発光スペクトルの変化をモニタリングする)あるいは定量的(例えば特定の1つもしくは複数の波長での吸光度もしくは発光の変化を測定する)でありうる。
【００８２】
フルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートは一般式I、IIまたはIIIを有する:
2014525905.tif 000023
式中、Xは任意の対アニオンであり、RAおよびRBは置換基であり、RAおよびRBの少なくとも一方は環化キサンテン構造に基づくフルオロフォアである。いくつかの態様では、各X-は独立してハロゲン化物イオンまたはPF6-である。特に関心の対象となるのは、近赤外領域内の波長での発光スペクトル極大を有するフルオロフォア、すなわち近赤外(NIR)フルオロフォアである。本明細書に開示されるいくつかの態様では、RAおよびRBは同一である。しかし、他の態様では、RAおよびRBを独立して選択することができる。他の好適なRAおよびRB置換基としては、置換および非置換のアルカン、アルケンまたはアルキンなどの置換および非置換の脂肪族基、1個もしくは複数の置換もしくは非置換の芳香環および/または芳香族複素環を含むアリール基またはヘテロアリール基、特に、低級脂肪族、アリールまたはヘテロアリール置換基が挙げられ、ここで置換低級脂肪族、アリールまたはヘテロアリール置換基としては、ヒドロキシル、スルフヒドリル、ニトリル、アミド、ヒドロキシルや、ケトン、アルデヒドおよびカルボキシルなどのカルボニルを有する基を含む1個もしくは複数の官能基が挙げられる。特定の態様では、RAおよびRBの一方はNIRフルオロフォアであり、RAおよびRBの他方は低級アルキルニトリル基、低級アルキル置換フェニル基、アルケニル基、アルキニル基、置換クマリン基(例えば3位において低級アルキル基もしくは低級アルキルカルボニル基で置換されかつ/または7位において低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基もしくは置換アミノ基で置換されたクマリン)、アセタール基、あるいはカルボキシレート基である。特定の態様では、RAおよびRBの他方は下記式である。
2014525905.tif 000024
【００８３】
開示されるフルオロフォアの態様は、環化キサンテン構造に基づくNIR色素である。開示されるNIRフルオロフォアのいくつかの態様は、構造的に関連性のある類似体に比べて相当な深色移動および増大したストロークシフトを示す。いくつかの態様では、NIRフルオロフォアは、一重環化または二重環化を伴う芳香環化キサンテンである。環化は[a]型 - 下方、[b]型 - 横断または[c]型 - 上方でありうる。一重環化および二重環化NIRフルオロフォアの少なくともいくつかの態様は、市販のNIRフルオロフォア、すなわちNIR色素に比べて実質的に赤色移動した吸光度スペクトルおよび発光スペクトルを有する。いくつかの態様では、スペクトルは少なくとも100nm赤色移動している。特に、開示されるNIRフルオロフォアのいくつかの態様は700nmを超える発光極大を有する。特定の態様では、発光極大は十分に近赤外領域の範囲内であり、例えば700nmを超え、750nmを超え、さらには780nmを超える。これに比べ、いくつかの公知の環化キサンテンは560nm(完全芳香環化ジベンゾフルオレセイン)、630nm(SNAFL)、650nm(SNARF)、670nm(ナフトフルオレセイン)または650〜675nm(ジベンゾローダミン)近傍の発光極大を有する。いくつかの態様では、吸収極大は600nmを超え、650nmを超え、675nmを超え、さらには800nmを超える。
【００８４】
また、NIRフルオロフォアのいくつかの態様は、公知の長波長キサンテンに比べて増大したストロークシフトを示す。特定の態様では、ストークスシフト(同一電子遷移の吸光度スペクトル極大と発光スペクトル極大との間の差)は50nmを超え、80nmを超え、100nmを超え、または150nmを超え、例えば50〜200nm、50〜150nm、80〜150nm、90〜170nm、100〜150nmまたは100〜200nmである。大きなストロークシフトは、測定される発光波長での光源からの散乱光干渉を最小限にして発光ダイオードなどの相対的に広帯域の光源を使用することを促進することから有利である。
【００８５】
A. フルオロフォア構造
いくつかの態様では、フルオロフォアは、一般式(i)の構造を有するNIRフルオロフォアである。
2014525905.tif 000025
一般式(i)中、「
2014525905.tif 000026
」として示される各結合は、原子価要件を満たすために必要な単結合または二重結合であり; X1はO、S、Se、Si(CH3)2、Ge(CH3)2、Sn(CH3)2、CH2、C(CH3)2またはNHである。R1、R2およびR4は独立して水素、ヒドロキシル、酸素、チオール、低級アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、置換アミノ、アルコキシ、ハロゲンまたは-NHRcであり、ここでRcは
2014525905.tif 000027
であり;
R5、R7およびR8は独立して水素、ヒドロキシル、チオール、低級アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、置換アミノ、アルコキシまたはハロゲンであり;R3およびR6は独立して水素、ヒドロキシル、ハロゲン、酸素、硫黄、チオール、アミノ、アルキルアミノ、イミノ、イミニウム、アルキルイミノ、アルキルイミニウム、シクロアルキルイミノ、またはRcが上記定義の通りである-NHRcであり; R1およびR2、R2およびR3、R3およびR4、R5およびR6、R6およびR7、ならびに/またはR7およびR8の少なくとも1つは一緒になって置換もしくは非置換のシクロアルキルまたはアリールを形成する。R9〜R12は独立して水素、アルキル、アシル、カルボキシル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノまたは-SO3Hである。R13は水素、ヒドロキシル、低級アルキル、低級アルコキシ、-SO3H、またはR14が水素もしくは低級アルキルである-COOR14であり、B環中の「
2014525905.tif 000028
」として示される結合は二重結合であり、あるいは、R13は、B環およびD環と環系を形成する1個もしくは複数の原子であり、B環中の「
2014525905.tif 000029
」として示される結合は単結合である。
【００８６】
R1〜R13の少なくとも1つは、フルオロフォアを架橋ビオローゲン骨格に共有結合させるリンカー部分である。好適なリンカーとしては低級アルキル基、アルコキシ基、カルボキシレート基、アルキルカルボキシレート基、アミノ基および置換アミノ基、ならびにポリアミノ鎖およびポリ(アルキレンオキシド)鎖が挙げられる。特定の態様では、R13はリンカーであり、式-COO-を有する。いくつかの態様では、R4またはR5はリンカーであり、低級アルキル基(-CH2-)nであり、ここでnは1〜10の整数である。他の態様では、リンカーは、R1およびR2、R2およびR3、R3およびR4、R5およびR6、R6およびR7、またはR7およびR8によって形成される置換シクロアルキル基または置換アリール基上の、低級アルキル基、アルコキシ基、カルボキシレート基、アルキルカルボキシレート基、アミノ基、置換アミノ基、ポリアミノ基またはポリ(アルキレンオキシド)基である。
【００８７】
いくつかの態様では、R13は-COO-であり、一般式(ii)に示すラクトン環を形成する。
2014525905.tif 000030
【００８８】
いくつかの態様では、R3およびR4ならびに/またはR5およびR6は一緒になって、一般式(iii)および(iv)に示すアリール環または置換アリール環を形成する。
2014525905.tif 000031
式中、「
2014525905.tif 000032
」として示される各結合は、原子価要件を満たすために必要な単結合または二重結合である。R1〜R14およびX1は一般式(i)および(ii)について定義の通りである。R15〜R22は独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシル、酸素、チオール、アミノ、アルキルアミノ、低級アルコキシなどのアルコキシ、硫黄、イミノ、イミニウム、アルキルイミノ、アルキルイミニウム、またはRcが上記定義の通りである-NHRcである。R1、R2、R5(存在すれば)、R6(存在すれば)、R7、R8、R9〜R13、R15〜R18またはR19〜R22(存在すれば)の1つは、NIRフルオロフォアを架橋ビオローゲン骨格に共有結合させるリンカー部分である。特定の態様では、X1は酸素であり、R1、R2、R5、R7およびR8は独立して水素、ハロゲンまたはリンカー部分であり; R6は酸素、イミノ、イミニウム、低級アルキルイミニウム、またはRcが上記定義の通りである-NHRcであり; R9〜R12は独立して水素、アミノ、低級アルキル、カルボキシル、-SO3Hまたはリンカー部分であり; R15、R17、R20およびR22は独立して水素またはリンカー部分であり; R13は水素、低級アルキル、低級アルコキシ、-SO3H、リンカー部分、またはR14が水素もしくは低級アルキルである-COOR14であり、B環中の「
2014525905.tif 000033
」として示される結合は二重結合であり、あるいは、R13は、B環およびD環と環系を形成する1個もしくは複数の原子であり、B環中の「
2014525905.tif 000034
」として示される結合は単結合であり; R16およびR18は独立して水素、ヒドロキシル、酸素、低級アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、Rcが上記定義の通りである-NHRc、またはリンカー部分であり、R16およびR18の少なくとも一方は水素以外であり; R19およびR21は独立して酸素、イミノ、イミニウム、低級アルキルイミニウム、Rcが上記定義の通りである-NHRc、またはリンカー部分であり、R19およびR21の少なくとも一方は水素以外である。いくつかの態様では、X1は酸素であり、R1、R2、R5、R8、R9、R12、R15、R17、R20およびR22は独立して水素またはリンカー部分であり; R6は酸素、イミノ、イミニウム、低級アルキルイミニウム、またはRcが上記定義の通りである-NHRcであり; R7は水素、ハロゲンまたはリンカー部分であり; R10およびR11は独立して水素、アミノ、低級アルキル、カルボキシル、-SO3Hまたはリンカー部分であり; R13は水素、低級アルキル、低級アルコキシ、-SO3H、リンカー部分、またはR14が水素もしくは低級アルキルである-COOR14であり、B環中の「
2014525905.tif 000035
」として示される結合は二重結合であり、あるいは、R13は、B環およびD環と環系を形成する1個もしくは複数の原子であり、B環中の「
2014525905.tif 000036
」として示される結合は単結合であり; R16およびR18は独立して水素、ヒドロキシル、酸素、低級アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、Rcが上記定義の通りである-NHRc、またはリンカー部分であり、R16およびR18の少なくとも一方は水素以外であり; R19は水素、ヒドロキシル、酸素、イミノ、イミニウム、低級アルキルイミニウム、Rcが上記定義の通りである-NHRc、またはリンカー部分であり; R21は水素、酸素、Rcが上記定義の通りである-NHRc、またはリンカー部分であり、R19およびR21の少なくとも一方は水素以外である。特定の態様では、R5またはR13は、フルオロフォアを架橋ビオローゲン骨格に共有結合させるリンカー部分である。一般式(iii)および(iv)の代表的化合物を表1に示す。
【００８９】
【表１】
2014525905.tif 000037
2014525905.tif 000038
2014525905.tif 000039
* 表1に含まれない1個のR置換基は、NIRフルオロフォアをビオローゲン骨格に共有結合させるリンカーであり、表1に含まれないすべての他のR置換基は水素であり、X1は酸素である。
†R11はラクトン環を形成する。
【００９０】
いくつかの態様では、R2およびR3ならびに/またはR6およびR7は一緒になって、一般式(v)および(vi)に示すアリール環または置換アリール環を形成する。
2014525905.tif 000040
式中、「
2014525905.tif 000041
」として示される各結合は、原子価要件を満たすために必要な単結合または二重結合であり、R1〜R22およびX1は上記定義の通りである。R1、R4、R5、R6(存在すれば)、R7(存在すれば)、R8〜R13、R15〜R18またはR19〜R22(存在すれば)の1つは、NIRフルオロフォアを架橋ビオローゲン骨格に共有結合させるリンカー部分である。特定の態様では、X1は酸素であり、R1、R4、R5、R7およびR8は独立して水素、ハロゲンまたはリンカー部分であり; R6は酸素、イミノ、イミニウム、低級アルキルイミニウム、またはRcが上記定義の通りである-NHRcであり; R9〜R12は独立して水素、アミノ、低級アルキル、カルボキシル、-SO3Hまたはリンカー部分であり; R15、R17、R19およびR22は水素またはリンカー部分であり; R13は水素、低級アルキル、低級アルコキシ、-SO3H、リンカー部分、またはR14が水素もしくは低級アルキルである-COOR14であり、B環中の「
2014525905.tif 000042
」として示される結合は二重結合であり、あるいは、R13は、B環およびD環と環系を形成する1個もしくは複数の原子であり、B環中の「
2014525905.tif 000043
」として示される結合は単結合であり; R16、R17およびR18の少なくとも1つはヒドロキシル、酸素、アミノ、アルキルアミノ、Rcが上記定義の通りである-NHRc、またはリンカー部分であり; R19、R20およびR21の少なくとも1つは酸素、イミノ、イミニウム、低級アルキルイミニウム、Rcが上記定義の通りである-NHRc、またはリンカー部分である。いくつかの態様では、X1は酸素であり、R1、R4、R5、R8、R9、R12、R15、R16、R18、R19、R21およびR22は水素またはリンカー部分であり; R6は酸素、イミノ、イミニウム、低級アルキルイミニウム、またはRcが上記定義の通りである-NHRcであり; R7は水素、ハロゲンまたはリンカー部分であり; R10およびR11は独立して水素、アミノ、低級アルキル、カルボキシル、-SO3Hまたはリンカー部分であり; R13は水素、低級アルキル、低級アルコキシ、-SO3H、またはR14が水素もしくは低級アルキルである-COOR14であり、あるいは、R13はリンカー部分であり; R17はヒドロキシル、酸素、アミノ、アルキルアミノ、Rcが上記定義の通りである-NHRc、またはリンカー部分であり; R20は酸素、イミノ、イミニウム、低級アルキルイミニウム、Rcが上記定義の通りである-NHRc、またはリンカー部分である。特定の態様では、R13は、フルオロフォアを架橋ビオローゲン骨格に共有結合させるリンカー部分である。一般式(v)および(vi)の代表的化合物を表2に示す。
【００９１】
【表２】
2014525905.tif 000044
* 表2に含まれない1個のR置換基は、NIRフルオロフォアをビオローゲン骨格に共有結合させるリンカーであり、表2に含まれないすべての他のR置換基は水素であり、X1は酸素である。
†R11は環を形成する。
【００９２】
いくつかの態様では、R1およびR2ならびに/またはR7およびR8は一緒になって、一般式(vii)および(viii)に示すアリール環または置換アリール環を形成する。
2014525905.tif 000045
式中、「
2014525905.tif 000046
」として示される各結合は、原子価要件を満たすために必要な単結合または二重結合である。一般式(vii)中のR3〜R18およびX1は上記定義の通りである。一般式(viii)中のR3〜R5、R9〜R22およびX1は上記定義の通りであり、R6は水素、ヒドロキシル、酸素、ハロゲン、チオール、アミノ、アルキルアミノ、またはRcが上記定義の通りである-NHRcである。R3〜R6、R7(存在すれば)、R8(存在すれば)、R9〜R13、R15〜R18またはR19〜R22(存在すれば)の1つは、NIRフルオロフォアを架橋ビオローゲン骨格に共有結合させるリンカー部分である。特定の態様では、X1は酸素であり、R3、R4、R5は独立して水素、ハロゲンまたはリンカー部分であり; R7およびR8は、存在すれば独立して水素、ハロゲンまたはリンカー部分であり; R9〜R12は独立して水素、アミノ、低級アルキル、カルボキシル、-SO3Hまたはリンカー部分であり; R15、R17、R19およびR22は独立して水素またはリンカー部分であり; R13は水素、低級アルキル、低級アルコキシ、-SO3H、リンカー部分、またはR14が水素もしくは低級アルキルである-COOR14であり、B環中の「
2014525905.tif 000047
」として示される結合は二重結合であり、あるいは、R13は、B環およびD環と環系を形成する1個もしくは複数の原子であり、B環中の「
2014525905.tif 000048
」として示される結合は単結合であり; R16、R17およびR18の少なくとも1つはヒドロキシル、酸素、アミノ、アルキルアミノ、Rcが上記定義の通りである-NHRc、またはリンカー部分であり; R19、R20およびR21の少なくとも1つは酸素、イミノ、イミニウム、低級アルキルイミニウム、Rcが上記定義の通りである-NHRc、またはリンカー部分であり; 一般式(vii)中、R6は酸素、イミノ、イミニウム、低級アルキルイミニウム、またはRcが上記定義の通りである-NHRcであり、一般式(viii)中、R6は水素、またはRcが上記定義の通りである-NHRcである。特定の態様では、X1は酸素であり、R3、R4、R5、R8(存在すれば)、R9、R12、R15、R17、R18、R19、R20およびR22は独立して水素またはリンカー部分であり; R7(存在すれば)は水素、ハロゲンまたはリンカー部分であり; R10およびR11は独立して水素、アミノ、低級アルキル、カルボキシル、-SO3Hまたはリンカー部分であり; R13は水素、低級アルキル、低級アルコキシ、-SO3H、R14が水素もしくは低級アルキルである-COOR14、またはリンカー部分であり; R16はヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノまたはリンカー部分であり; R21は酸素、イミノ、イミニウム、低級アルキルイミニウムまたはリンカー部分であり; 一般式(vii)中、R6は酸素、イミノ、イミニウム、低級アルキルイミニウム、またはRcが上記定義の通りである-NHRcであり、あるいは、一般式(viii)中、R6は水素、またはRcが上記定義の通りである-NHRcである。特定の態様では、R13は、フルオロフォアを架橋ビオローゲン骨格に共有結合させるリンカー部分である。一般式(vii)および(viii)の代表的化合物を表3に示す。
【００９３】
【表３】
2014525905.tif 000049
* 表3に含まれない1個のR置換基は、NIRフルオロフォアをビオローゲン骨格に共有結合させるリンカーであり、表3に含まれないすべての他のR置換基は水素であり、X1は酸素である。
【００９４】
いくつかの態様では、NIRフルオロフォアは混合環化、例えば[a]型および[c]型、[a]型および[b]型、または[b]型および[c]型を有する。例えば、いくつかの態様では、一般式(ix)に示すように、R3およびR4は一緒になってアリール環または置換アリール環を形成し、R7およびR8は一緒になってアリール環または置換アリール環を形成する。他の態様では、一般式(x)に示すように、R3およびR4は一緒になってアリール環または置換アリール環を形成し、R6およびR7は一緒になってアリール環または置換アリール環を形成する。さらに他の態様では、一般式(xi)に示すように、R1およびR2は一緒になってアリール環または置換アリール環を形成し、R6およびR7は一緒になってアリール環または置換アリール環を形成する。
2014525905.tif 000050
式中、「
2014525905.tif 000051
」として示される各結合は、原子価要件を満たすために必要な単結合または二重結合である。一般式(ix)〜(xi)中のR1〜R5、R7〜R22およびX1は上記定義の通りであり、R6は水素、ヒドロキシル、酸素、ハロゲン、チオール、アミノ、アルキルアミノ、またはRcが上記定義の通りである-NHRcである。R1〜R4(存在すれば)、R5、R6、R8(存在すれば)、R9〜R13またはR15〜R22の1つは、NIRフルオロフォアを架橋ビオローゲン骨格に共有結合させるリンカー部分である。特定の態様では、X1は酸素であり; R1〜R6(存在すれば)、R8(存在すれば)、R9、R10、R12、R15、R17およびR22は独立して水素またはリンカー部分であり; R11は水素、アミノ、低級アルキル、カルボキシル、-SO3Hまたはリンカー部分であり; R13は水素、低級アルキル、低級アルコキシ、-SO3H、R14が水素もしくは低級アルキルである-COOR14、またはリンカー部分であり、B環中の「
2014525905.tif 000052
」として示される結合は二重結合であり、あるいは、R13は、B環およびD環と環系を形成する1個もしくは複数の原子であり、B環中の「
2014525905.tif 000053
」として示される結合は単結合であり; R16、R17およびR18は独立して水素、ヒドロキシル、酸素、低級アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、Rcが上記定義の通りである-NHRc、またはリンカー部分であり、R16およびR18の少なくとも一方は水素以外であり; R19〜R21は独立して水素、ヒドロキシル、チオール、酸素、イミノ、イミニウム、アルキルイミノ、アルキルイミニウム、アミノ、アルキルアミノ、Rcが上記定義の通りである-NHRc、またはリンカー部分であり、R19〜R21の少なくとも1つは水素以外である。特定の態様では、X1は酸素であり; R1〜R6(存在すれば)、R8(存在すれば)、R9、R10、R12、R15、R17およびR22は独立して水素またはリンカー部分であり; R11は水素、カルボキシルまたはリンカー部分であり; R13は低級アルキル、カルボキシルまたはリンカー部分であり; R16およびR18は独立して水素、ヒドロキシル、酸素、Rcが上記定義の通りである-NHRc、またはリンカー部分であり、R16およびR18の少なくとも一方は水素以外であり; R19〜R21は独立して水素、酸素、アルキルイミニウム、Rcが上記定義の通りである-NHRc、またはリンカー部分であり、R19〜R21の少なくとも1つは水素以外である。特定の態様では、R5またはR13は、フルオロフォアを架橋ビオローゲン骨格に共有結合させるリンカー部分である。一般式(ix)〜(xi)の代表的化合物を表4に示す。
【００９５】
【表４】
2014525905.tif 000054
* 表4に含まれない1個のR置換基は、NIRフルオロフォアをビオローゲン骨格に共有結合させるリンカーであり、表4に含まれないすべての他のR置換基は水素であり、X1は酸素である。
【００９６】
B. スペクトルおよびストロークシフトに構造が与える効果
構造に基づく体系的な評価は、驚くべきことに、一重環化キサンテンの環化環上の置換基の位置を移動させることで発光極大および吸収極大が実質的に赤色移動したことを示した。例えば、図2に示すいくつかの態様では、一般式(iii)の[c]型環化キサンテンは環化環の3位(R16)または1位(R18)において置換基を含みうる。実施態様では、一般式(iii)および(iv)中で3位(R16)の代わりに1位(R18)に置換基を位置づけることで吸光度スペクトルを10nm超、典型的には30nm超または50nm超、例えば10〜200nm、10〜60nm、30〜75nm、50〜75nm、30〜100nmまたは75〜200nm赤色移動させることがわかった。いくつかの態様では、3-1転位(transposition)によって発光スペクトルが少なくとも100nm、例えば100〜200nm、120〜160nmまたは130〜150nm赤色移動した。特定の態様では、置換基が1位にあった場合(一般式(iii)および(iv)中のR18)、発光極大は725nm超、750nm超または770nm超において生じた。いくつかの場合、発光極大は測定不能であったが、850nm超(機器の範囲外)において生じると考えられる。ストークスシフトが同時に増大したことも注目された。いくつかの態様では、3-1転位によってストークスシフトの大きさが50nm超、例えば50〜100nm、70〜90nmまたは70〜100nm増加した。
【００９７】
したがって、3-1転位はいくつかの利点を提供する。吸光度極大および発光極大の両方が赤色移動する。発光スペクトルが通常は吸光度スペクトルよりも大きな赤色移動を示すことから、ストークスシフトが増大する。この挙動は対称構造(例えば一般式(iv))および非対称構造(例えば一般式(iii))の至る所で生じ、各種イオン化可能基(例えばヒドロキシル官能基およびアミン官能基)の至る所で観察された。また、いくつかの態様では、3-1転位とイオン化可能官能基の転位とを組み合わせることで、予期しないpH応答が得られる。いくつかのロドールは高pHにおいて長波長を吸収および発光する。しかし、3-1転位とイオン化可能部分の転位とを組み合わせた、開示されるフルオロフォアのいくつかの態様では、長波長挙動が酸性pH値において観察された。
【００９８】
いくつかの態様では、3-1転位を有するフルオロフォアのアニオン形は、フルオロフォアの対応する中性形よりも大きな赤色移動を生成する。例えば、化合物15aの吸光度極大は化合物20aに比べて15nm赤色移動している。しかし、化合物15aのアニオン形である化合物15hの吸光度極大は、化合物20aのアニオン形である化合物20cに比べて50nmの赤色移動を示す。図32は、開示されるフルオロフォアのいくつかの態様の吸収スペクトルに対するイオン化の効果を示す一連の紫外可視スペクトルである。化合物20cに比べての化合物15hの発光波長の深色移動は130nmであった。これらの移動の間の差は、760nmにおけるNIR発光を160nmという著しく増大したストークスシフトと共に生じさせる。
【００９９】
一般式(iii)、(ix)および(x)の化合物中のR18と内部架橋酸素との間には空間を通じた極性相互作用が存在する。電界効果は、対称化合物、例えばR19が酸素である一般式(iv)の化合物の場合にさらに増大する。そのような化合物、例えば化合物8には独自の分子内水素結合ネットワークも存在する(図33)。このネットワークは、イオン化可能な酸素原子上で増大した負電荷密度を生成することで、相対的に大きな深色移動を促進する。分子シミュレーションは、水素結合ネットワークが、ヒドロキシル基が脱プロトン化される際に減少する縮合環形の共平面性も増大させることを示す(図34)。水素結合は化合物8などの化合物において1H NMR分光法によって確認することができる。水素原子の周りの電子密度の再分布は、化合物8のヒドロキシルプロトンとカルボニルと中心酸素との間の水素結合形成時に生じる。化合物8では、シミュレーションは、R19におけるカルボニルとR18におけるヒドロキシルとの間の水素結合総距離O---H-Oが2.52Åであり、典型的な水素結合距離(2.8Å以上)よりも短く、低障壁水素結合について観察される距離(2.55Å)に近いということを示す。水素結合の証拠は化合物15aにも見られたが、その程度はより小さかった。化合物15aでは、R18位のヒドロキシルとキサンテン中心酸素との間の水素結合総距離O---H-Oは2.95Åであり、一般的な水素結合の範囲内にある。化合物8aを生成するための化合物8中の共有プロトンの除去は、化合物22を化合物22aに脱プロトン化した際に観察された吸収極大の大きな深色移動を生じさせなかった。したがって、8などの化合物の特性に対する水素結合ネットワークの効果がさらに証明される。驚くべきことに、化合物10を脱プロトン化した際に、移動は浅色性であった。
【０１００】
いくつかの態様、例えば化合物8では、最大pH 9で水素結合を示す化合物においてNIR蛍光が観察され、一方、共有プロトンの除去が蛍光を消光させることが観察された。特に、化合物7は、生理的pH 7.4未満の1:9 DMSO:緩衝液中の対応する無色ラクトンとして存在することから、独特なpHプローブを具現化する。
【０１０１】
一般式(iii)または(iv)の化学構造を有するフルオロフォアのいくつかの態様は、ローダミンよりも長い吸収波長および発光波長を有する。R16およびR6(式(iii))またはR21(式(iv))において-NHRc(ボロン酸)置換基を有する類似体は、R16およびR6/R21において-NH2を有する対応するフルオロフォアよりもさらに赤色移動している。糖の非存在下では、ボロン酸はPET(光誘起電子移動)機構を通じて消光しうる。特定の態様では、糖結合時の非対称(式(iii))および対称(式(iv))の両方のビス-ボロン酸類似体について深色移動、および量子収率の増加が観察された。
【０１０２】
いくつかの態様では、一般式(i)のフルオロフォアはその下側ベンゼン環を経由して架橋ビオローゲン骨格にコンジュゲートしている。そのようなコンジュゲーションは、ラクトン環を含むフルオロフォア(すなわちR13 = -COO-)をビオローゲン骨格にコンジュゲートさせることでラクトン環が開環してビオローゲン骨格とエステル結合を形成することによって実現することができる。
2014525905.tif 000055
この幾何配置では、下側ベンゼン環はスペーサーとして作用することができ、キサンテンの共役系とビピリジン部分との間の分子内π-π相互作用を促進することができる。フルオロフォアがビオローゲンにコンジュゲートしている場合、これらのπ-π相互作用はフルオロフォアの蛍光を消光させる。いくつかの態様では、分析物の存在はこれらのπ-π相互作用を分断し、フルオロフォアの蛍光を回復させる。
【０１０３】
他の態様では、一般式(i)のフルオロフォアはその上側キサンテン環の1つを経由してビオローゲン骨格にコンジュゲートしている。以下の例では、R5は上記定義のリンカーであり、フルオロフォアはR5位においてビオローゲン骨格にコンジュゲートしている。
2014525905.tif 000056
【０１０４】
超分子集合体型機構が、溶液中での分析物(例えばグルタチオン)と架橋ビオローゲンの特定の態様との間の反応において観察される吸光度スペクトルおよび/または発光(蛍光)スペクトルの変化に関与しうると仮定される。いくつかの態様では、架橋ビオローゲン骨格にコンジュゲートしたフルオロフォアはその蛍光能力を失う。ビオローゲンはフルオロフォアより電子を受容することによって蛍光を消光させることができると考えられる。例えば、図3は、オルト、メタおよびパラ-ビスクマリン類似体のエネルギー最小化構造を示す。各構造は、2つのクマリン部分間のπ-πスタッキングを示す。しかし、パラ構造のみが、グルタチオン分子が嵌まりうる空洞を形成する。図4は、GSHおよびp-ビスクマリン類似体によって形成される潜在的な超分子集合体を示す。空洞へのGSHの挿入がπ-πスタッキングを分断すると予測される。さらに、架橋ビオローゲン類似体がGSH分子の周りに折りたたまれると、GSH分子内の負電荷領域はフルオロフォア部分内の正電荷中心に整列することにより、電荷移動機構を通じてクマリン部分の蛍光能力を回復させることができる。同様の挙動が、一般式(i)〜(xi)の構造を有する開示されるフルオロフォアの特定の態様について予想される。いくつかの態様では、RAおよびRBはいずれもフルオロフォアであり、2つのフルオロフォアは同一の化学構造または異なる化学構造を有しうる。他の態様では、RAおよびRBの一方はフルオロフォアであり、RAおよびRBの他方は、置換および非置換のアルカン、アルケンまたはアルキンなどの置換および非置換の脂肪族基、1個もしくは複数の置換もしくは非置換の芳香環および/または芳香族複素環を含むアリール基またはヘテロアリール基、特に、低級脂肪族、アリールまたはヘテロアリール置換基であり、ここで置換低級脂肪族、アリールまたはヘテロアリール置換基としては、ヒドロキシル、スルフヒドリル、ニトリル、アミド、ヒドロキシルや、ケトン、アルデヒドおよびカルボキシルなどのカルボニルを有する基を含む1個もしくは複数の官能基が挙げられる。
【０１０５】
IV. 合成
一般式(iv)の化学構造を有するナフトフルオレセイン類似体のいくつかの態様は、スキーム1(図5)に示すように合成される。いくつかの態様では、メタンスルホン酸中での1,8-ジヒドロキシナフタレンとフタル酸との酸縮合によってラクトン含有化合物(化合物7)を生成することで類似体を合成する。メタノール中で化合物7と塩化アセチルとを反応させることでラクトン環を開環させ、それにより該化合物をエステル化し、メチルカルボキシレート8を生成する。共役系中の電子密度再分布を通じて1個のヒドロキシル基を酸素に変換する。ジメチルホルムアミド中での化合物8と炭酸カリウムおよびヨウ化メチルとのさらなる反応によって残りのヒドロキシル基をメトキシ基に変換する(化合物9)。他の態様では、リン酸中での1,8-ジヒドロキシナフタレンと所望のアルデヒドとの酸縮合によって代表的化合物10および11の構造を有する類似体を生成することで、一般式(iv)の類似体を合成する。いくつかの態様では、化合物10および11を炭酸カリウムおよびヨウ化メチルとさらに反応させることでメチル類似体を生成する。
【０１０６】
一般式(iii)の化学構造を有する類似体は、スキーム2(図6)に示す酸縮合によって合成される。ヒドロキシベンゾフェノン誘導体(化合物12)および1,8-ナフタレン誘導体(化合物13)をメタンスルホン酸およびトリフルオロ酢酸の1:1混合物中での反応によって縮合することでラクトン含有化合物(化合物14)を生成する。硫酸中での化合物14とメタノールとのさらなる反応によってラクトン環を開環させ、それにより該化合物をエステル化し、メチルエステル(化合物15)を生成する。共役系中の電子再分布を経由して化合物14を化合物15に変換する。あるいは、化合物14と炭酸カリウムおよびヨウ化メチルとを反応させることで環を開環させ、化合物16を生成する。
【０１０７】
一般式(iii)の化学構造を有する特定の非対称セミナフトフルオレセインおよびローダミン類似体は、スキーム3(図7)に示すように合成される。ヒドロキシベンゾフェノン誘導体(化合物17)およびナフトール誘導体(化合物18)をメタンスルホン酸/トリフルオロ酢酸中での酸縮合を経由して反応させることでラクトン含有化合物である化合物19を生成する。硫酸中での化合物19とメタノールとのさらなる反応によって化合物20を生成する。
【０１０８】
スキーム4(図8)に示すフィッシャーエステル化を経由して市販のラクトン含有ナフトフルオレセイン類似体をそのメチルエステルに変換した。ナフトフルオレセイン類似体(化合物21)をメタノールに溶解させる。硫酸を加え、混合物を24時間還流させることで化合物22を生成する。
【０１０９】
一般式(vi)の化学構造を有するいくつかの類似体、および一般式(viii)〜(xi)の化学構造を有するいくつかの非対称拡張共役類似体は、スキーム5(図9)に示すように合成される。スキーム5に示す方法は、グリニャール反応を経由する第三級カルビノールロイコ塩基の形成と、それに続く脱保護およびBBr3との縮合とによって対応するキサンテン色素を生成することを包含する。ケトン前駆体は、ポリリン酸の存在下での対応するメトキシ-ナフタレンと塩化ベンゾイルまたは無水フタル酸との反応によって合成することができる(Gorelick et al., Zhurnal Org. Kihimii, 1983, 19, 199-206)。
【０１１０】
一般式(v)および(vii)の化学構造を有するいくつかの類似体は、スキーム6(図10)に示すように合成される。ヒドロキシベンゾフェノン誘導体を合成し、メタンスルホン酸およびトリフルオロ酢酸の1:1混合物中で1,8-ナフタレン誘導体と縮合することでラクトン含有化合物の混合物を生成する。所望であれば、該化合物とメタノールとを硫酸中で反応させることまたは該化合物と炭酸カリウムおよびヨウ化メチルとを反応させることでラクトン環を開環させることによって、メチルエステル誘導体を生成することができる。
【０１１１】
X1がSi(CH3)2、Ge(CH3)2またはSn(CH3)2である一般式(i)の化学構造を有するいくつかの類似体は、スキーム7(図11)に従って合成可能である。スキーム7に関して、R1、R2、R4、R5、R7およびR8は既に定義の通りであるが、但しR1、R2、R4、R5、R7またはR8はいずれも-NH2ではない。工程(a)では、ジリチウム中間体をビス(2-ブロモフェニル)メタン誘導体からハロゲン-金属交換反応によって発生させ、ケイ素、ゲルマニウムまたはスズの適切なジアルキルジクロリドによって反応停止させ、酸化することでキサンテンを形成することができる。工程(b)では、フェニルリチウム誘導体を挿入することでロドール型構造またはローダミン型構造を生成することができる。例えばKoide et al., ACS Chem. Biol. 2011, 6(6), 600-608を参照。
【０１１２】
X1がSまたはSeである一般式(i)の化学構造を有するいくつかの類似体は、スキーム8(図12)に従って合成可能である。スキーム8に関して、R1、R2、R4、R5、R7およびR8は既に定義の通りであるが、但しR1、R2、R4、R5、R7またはR8はいずれも-NH2またはハロではない。m-アニシジンから3-ヨードアニソールをそのジアゾニウムクロリド経由で調製し、ナトリウムエトキシドと対応するチオフェノールとの反応によって3-メトキシチオフェノールナトリウム塩を別に調製することで、硫黄類似体を合成することができる。3-ヨードアニソールおよび3-メトキシチオフェノールナトリウム塩を粉末銅と共に加熱することで1,1'-チオビス(3-メトキシベンゼン)を生成し、これを酢酸中ヨウ化水素によるエーテル開裂によってm,m'-チオジフェノールに変換する。次に、m,m'-チオジフェノールを無水フタル酸と共に塩化亜鉛の存在下で融解させること(経路a)、または2-スルホ安息香酸環状無水物およびトルエン-4-スルホン酸と共に融解させること(経路b)によってロドール類似体を調製することで、図12に示すスルホ安息香酸類似体を生成することができる。例えばPfoertner, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1991, 523-526を参照。
【０１１３】
R6およびR16がアミノ酸またはボロン酸である一般式(iii)の化学構造を有するいくつかの類似体は、スキーム9(図13)に従って合成される。ローダミンを塩基性条件下で加水分解した後、アミノヒドロキシナフタレンとの酸縮合によってセミナフトローダミンを生成する。還元的アミノ化によって対応するビス-ボロン酸を生成する。
【０１１４】
R16およびR21がアミノ酸またはボロン酸である一般式(iv)の化学構造を有するいくつかの類似体は、スキーム10(図14)に従って合成される。無水フタル酸およびアミノヒドロキシナフタレンの酸促進性縮合によってナフトローダミンを調製する。還元的アミノ化によって対応するビス-ボロン酸を生成する。
【０１１５】
いくつかの態様では、スキーム11(図15)に示すようにフルオロフォアをパラ架橋ビオローゲンにコンジュゲートさせる。ビピリジンおよびp-ビス-(ブロモメチル)ベンゼンをアセトニトリル中で合わせ、還流させてパラ架橋ビオローゲンを形成する。次にビオローゲンをヘキサフルオロリン酸アンモニウムと反応させることでビオローゲンヘキサフルオロリン酸塩を生成する。ヘキサフルオロリン酸塩を、架橋ビオローゲンの末端に結合しかつフルオロフォアのリンカーとして機能する1,3-ジブロモプロパンと反応させる。一般式(ii)の(すなわちラクトン環を含有する)フルオロフォアをリンカー含有架橋ビオローゲンと合わせ、加熱する。反応によってラクトン環を開環させ、フルオロフォア分子をその下側環を経由して各リンカーにコンジュゲートさせることで、2個のフルオロフォア部分を有する架橋ビオローゲンを形成する。オルトおよびメタ架橋ビオローゲンは、p-ビス-(ブロモメチル)ベンゼンの代わりにそれぞれo-またはm-ビス-(ブロモメチル)ベンゼンを使用することで同様に合成可能である。
【０１１６】
特定の態様では、スキーム12(図16)に示すように、アルキル化化学反応を使用してフルオロフォアをその1つの環上のR基を経由して架橋ビオローゲンにコンジュゲートさせることができる。
【０１１７】
特定の態様では、架橋ビオローゲン骨格のいずれかの末端上のR基であるRAおよびRBは互いに異なっていてもよい。例えば、フルオロフォアの組み合わせをビオローゲン骨格にコンジュゲートさせてもよい。あるいは、フルオロフォア、およびフルオロフォア以外の第2の部分をビオローゲン骨格にコンジュゲートさせてもよい。他の好適な部分としては例えば、置換および非置換のアルカン、アルケンまたはアルキンなどの置換および非置換の脂肪族基、1個もしくは複数の置換もしくは非置換の芳香環および/または芳香族複素環を含むアリール基またはヘテロアリール基、特に、低級脂肪族、アリールまたはヘテロアリール置換基が挙げられ、ここで置換低級脂肪族、アリールまたはヘテロアリール置換基としては、ヒドロキシル、スルフヒドリル、ニトリル、アミド、ヒドロキシル、ならびにケトン、アルデヒドおよびカルボキシルなどのカルボニルを有する基を含む1個もしくは複数の官能基が挙げられる。以下に示す代表的態様では、一般式(iii)のフルオロフォア(例えば化合物3i(もしくは15d)または化合物15b)が架橋ビオローゲン骨格の一方の端部にコンジュゲートしており、アセトニトリル部分が架橋ビオローゲン骨格の他方の端部にコンジュゲートしている。
2014525905.tif 000057
【０１１８】
いくつかの態様では、フルオロフォアのpKaを減少させかつ/またはフルオロフォアの水溶性を増加させることが有利でありうる。特定の態様では、フルオロフォア分子の大部分が中性水溶液中でイオン形になるように、フルオロフォアをハロゲン化すること、例えば1個もしくは複数のフッ素原子を1個もしくは複数のイオン化可能部分に対してオルト位に位置づけることで、pKaを減少させることができる。本発明者らは、開示されるフルオロフォアのイオン化種が一般に中性フルオロフォア分子よりも大きなストークスシフトを有することを発見した。合成の間、すなわち縮合反応の間にフッ素化ナフトールを使用してフルオロフォアの態様をフッ素化することができる。フッ素化ナフトールは、文献(Yang et al., Heteroatom Chem., 1998, 9, 229-239; Bluck et al., J. Fluor. Chem., 2004, 125, 1873-1877)記載のようにシアン化メチル中でヒドロキシナフタレンとフッ素ドナー(例えばSelectfluor(登録商標)(1-クロロメチル-4-フルオロ-1,4-ジアゾニアビシクロ[2.2.2]オクタンビス(テトラフルオロボレート))とを還流温度で反応させることで合成可能である。
【０１１９】
また、いくつかの態様では、生体媒質中での非特異的結合を減少させることが有利でありうる。非特異的結合を減少させるために、フルオロフォアをオリゴエチレングリコールにコンジュゲートさせることで、開示されるフルオロフォアのオリゴペグ化誘導体を調製することができる。二官能性ペグ化試薬を使用すると、フルオロフォアは関心対象の他の生体分子にさらにコンジュゲートしうる。6〜8個のエチレングリコール単位を含む好適な二官能性ペグ化試薬は、市販されているか、または文献プロトコール(Svedhem et al., J. Org. Chem., 2001, 66, 4494-4503; Wosnick et al., J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 3400-3405)を使用して調製することができる。カルボキシル基を含む開示されるフルオロフォアの態様にアミド結合形成を経由してペグ化試薬をコンジュゲートさせることができる。また、ペグ化は疎水性を有するフルオロフォアの溶解性を増加させることができる。
【０１２０】
V. 用途
開示されるNIRフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートのいくつかの態様は、血液、血漿および尿などの生体媒質に取り組む上での使用に好適である。血液は強いバックグラウンド吸収、相当な自己蛍光、および可視領域中での散乱を示す。開示されるコンジュゲートの特定の態様は、血液ヘモグロビンからの干渉を克服するために十分な長さの波長における発光スペクトル極大、例えば640nm超または680nm超における発光スペクトル極大を有する。特定の態様では、開示されるコンジュゲートは640nm超、例えば680nm超の吸光度スペクトル極大も有する。そのような態様では、640nmを超える波長を有する光源を利用することで血液による光吸収を最小化することができる。血液の最適範囲を超えて機能するNIRフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートは、希釈および試料の調製/取り扱いを限定することで分析物およびバイオマーカーの試験を単純化し、それにより誤差源を減少させ、結果を得るための時間を減少させ、かつ/または試料の取り扱いおよび操作による健康被害を減少させる。現行の方法および検出剤は、クロマトグラフィー、脆弱な材料(例えば水溶液中で不安定であり、-20℃未満での保存を必要とし、かつ/もしくは暗中保存を必要とする材料)、および/または高度の試料処理を利用している。例えば、現行の方法では、試料を1000倍超に希釈することで血液からの光学干渉を克服することがあり、あるいは、全血の代わりに血漿中で試験を行うことがある。対照的に、開示されるNIRフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートのいくつかの態様は、周囲温度にて、溶液中であっても数週間安定である。また、開示されるコンジュゲートの特定の態様は、細胞培地中でフルオレセインよりも光安定性が高い。したがって、開示されるNIRフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートの態様は、体液中の分析物を検出するために有用でありうると予測される。
【０１２１】
いくつかの態様では、近赤外フルオロフォアは5員ラクトン環(すなわち一般式(ii))を含み、これは該5員環中の酸素原子を経由して架橋ビオローゲンに結合可能である(スキーム11(図15)、実施例2、および図17〜図19も参照)。
2014525905.tif 000058
【０１２２】
5員環を開環させてカルボキシレート基(-COO-)を形成することができ、これを架橋ビオローゲンに結合させることができる。
2014525905.tif 000059
【０１２３】
通常、フルオロフォアの吸光度スペクトルおよび蛍光スペクトルはpH依存性である。例えば、0.1M NaOH中での1つのエステル誘導体(化合物15d)の吸光度極大は620nmであり、同溶媒中での発光極大は770nmである。この溶媒中でのストークスシフトは150nm(3142cm-1)である。
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【０１２４】
開示されるNIRフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートの特定の態様は、特異的分子バイオマーカーの検出を促進可能な官能基を含む。NIRフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートの態様を官能化させることで、(a) フルオロフォアと所望のバイオマーカーとの間の共有結合性相互作用および/もしくは超分子相互作用の組み合わせを示す所望の幾何配置を生成すること、ならびに/または(b) 所望のバイオマーカーの存在下で酸化還元特性および/もしくはエネルギー移動特性を改変することができる。例えば、分子モデリングは、一般式(vi)の化学構造、ならびにR17位およびR20位におけるアミノ基、酸素基および/またはヒドロキシル基などの極性末端基を有するNIRフルオロフォアのいくつかの態様が、グルタチオンの極性末端との好ましい静電相互作用を示しうることを示す(図20)。また、分子モデリングは、R17およびR20の少なくとも一方が-NHRcであり、Rcが
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である、一般式(vi)の化学構造を有するNIRフルオロフォアのいくつかの態様が、特異的ヌクレオシドと優先的に相互作用しうることを示す(図21)。特定の態様では、特異性は、R13がカルボキシレート部分を含む場合に増大しうる。
【０１２５】
関心対象のバイオマーカーとしては、ミトコンドリア障害(例えば糖尿病、アテローム性動脈硬化症、神経変性疾患、低酸素性虚血性脳症、自閉症、未熟児網膜症、慢性進行性外眼筋麻痺、およびがん(Akturi et al., PNAS U.S.A., 2009, 106, 3941-3945))ならびに有機酸血症(例えばメチルマロン酸血症)において全血、白血球および血漿中で減少するグルタチオン(GSH)が挙げられる。GSHを検出するためのいくつかの商業的に利用可能な方法は、他のチオール(例えばシステイン、ジチオスレイトール)に比べてGSHに対して選択的でなく、かつ/または血漿中での試験を必要とする、検出剤を利用している。しかし、全血中のGSHレベルはミリモル範囲であるか、または血漿中よりも100〜1000倍高い。
【０１２６】
開示されるNIRフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートのいくつかの態様は、血中でのGSHの選択的検出に好適でありうる。例えば、分子モデリングは、化合物5a(表2)がGSHとの非常に好ましい構造的相互作用を示すことを示す。さらに、化合物5aは、5%血液溶液中で検出可能であることがわかった(実施例3参照)。多点相互作用、グルタチオン選択的共有結合性相互作用、超分子相互作用および/または酸化還元相互作用を促進するように官能化されたNIRフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートの態様は、酸化ストレスおよびミトコンドリア障害の指示薬として役立ちうる。
【０１２７】
ローダミンBラクトールは、アルデヒド互変異性体との反応により生じると考えられるGSH選択性を有することで、観察される発光および吸光度の増加を与える。
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【０１２８】
フルオロフォアの極性基(イオン化状態および光学特性を実際に調節する)とGSHトリペプチドの極性基との間の好ましい静電相互作用を少なくとも部分的に理由として、GSHの場合には平衡がチオヘミアセタールに傾くと考えられる。潜在的な塩架橋形成およびイオン対形成を理解するために、フルオロフォアの反応において形成される共有結合複合体、例えば化合物24を模擬した。これにより、相対的に拡大したGSH部分がフルオロフォアの極性末端と同時に相互作用しうることが示される(図20)。
【０１２９】
関心対象の他のバイオマーカーとしては、アデニロコハク酸リアーゼ(ADSL)欠損症の指示薬であるスクシニル-5-アミノ-4-イミダゾールカルボキサミドリボシド(SAICA-リボシド)およびスクシニルアデノシン(S-Ado)が挙げられる。
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ADSL欠損症は、精神遅滞および発作を生じさせうる稀な(200,000人中約1人)先天プリン代謝異常である(Jaeken, Lancet, 1984, 2, 1058-1061)。プリンおよびピリミジン(PP)代謝の診断未確定の遺伝的欠陥は早期の死および/または施設収容を生じさせることがある。ADSL欠損症は、SAICA-リボチド(SAICAr)およびアデニロコハク酸に対応するヌクレオシドであるSAICA-リボシドおよびS-Adoの大量の尿中排泄(ミリモルレベル)を特徴とする。
【０１３０】
特異的ヌクレオシドを標的とする共有結合部位および超分子結合部位で官能化された、開示されるフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートの態様は、ADLS欠損症の指示薬として役立ちうる。いくつかの態様では、フルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートは少なくとも1個のボロン酸官能基を含み、すなわち、少なくとも1個のR基は、Rcが下記式である-NHRcである。
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【０１３１】
フェニルボロン酸で修飾されたローダミンは、フルクトースに比べてのリボースおよび同類物に対する前例のない親和性を示しうる(Jiang et al., J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 12221-12228)。
2014525905.tif 000065
コンピュータ支援分子シミュレーションは、リボースのフラノース形の2,3-cisジオールと反応する上でのボロン酸の優先性、および強い静電相互作用B--O---H-N+以外にも、非共有結合性二次相互作用が発色団のイオン化状態を修正する上で重要な役割を果たすことを示す。図21は、ヌクレオシドと一般式(vi)の化学構造を有するフルオロフォアの2つの態様(化合物43および44、表2)のカルボキシレート部分との間で生じうる荷電H結合を示す。図21のエネルギー最小化モデルは、Sybyl(商標)X 1.1(ミズーリ州セントルイス、Tripos)による模擬アニーリング(加熱/冷却の連続サイクル)およびMOPAC2009(コロラド州コロラドスプリングス、Stewart Computational Chemistry)による幾何配置の最適化を使用して作成した。ローダミンビス-ボロン酸中でのカルボキシレート部分のエステル化によってその選択性がフルクトースに戻ることから、カルボキシレート部分との相互作用は、S-AdoおよびSAICArとの相互作用において重要な役割を果たすようである。
【０１３２】
いくつかの場合では、生体媒質中での評価が不満足な場合、特定の分析物に特異的な分子刷り込みポリマー(MIP)を合成し、固相抽出段階において利用した後で、開示されるNIRフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートの態様による評価を行ってもよい。MIPは分析物の捕捉および濃縮を可能にする。フルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートおよび/またはMIPによる選択性の任意の欠陥は互いに補われうるので、優れた相乗作用が実現されうる。
【０１３３】
VI. キット
キットも本開示の特徴である。キットの態様は、試料(例えば血液または尿などの生体液)中の分析物を選択的に検出するために好適な、一般式I〜IIIのいずれか1つに係る少なくとも1つの化合物を含む。いくつかの態様では、キットは少なくとも1つの緩衝液も含み、化合物は、分析物を含むかまたは含むことが疑われる試料と合わせた際に、分析物を含まない試料と合わせた緩衝液中の化合物に比べての吸光度スペクトルおよび/または発光スペクトルの変化を経る。キットは、化合物と分析物との間の反応によって生成される色変化を評価するための色比較チャートを含みうる。キットは、検出を行うことができる1つまたは複数の容器、例えば使い捨て試験管またはキュベットも含みうる。キットは、検出を行うための説明書をさらに含みうる。いくつかの態様では、キットは分析物の対照試料、例えばグルタチオン、システイン、ホモシステイン、スクシニル-5-アミノ-4-イミダゾールカルボキサミドリボシドおよび/またはスクシニルアデノシンを含む。典型的には、対照試料は固体形態で与えられる。
【０１３４】
キットのいくつかの態様では、化合物は固体として与えられ、緩衝液は液体形態で与えられる。緩衝液をCys、Hcy、GSH、スクシニル-5-アミノ-4-イミダゾールカルボキサミドリボシド、スクシニルアデノシンまたはその混合物を検出するために好適な濃度で与えることができる。あるいは、緩衝液を濃縮溶液として与えることもでき、これは続いて使用前に希釈される。特定の態様では、化合物が秤量されて1つもしくは複数の容器(例えば試験管またはキュベット)に入れられることがあり、続いて容器に緩衝液および試験試料を加えることによって検出が行われる。
【実施例】
【０１３５】
VII. 実施例
試薬および一般的手順
化学的性質
別途指示しない限り、すべての市販の出発原料をさらに精製せずに直接使用した。ナフトフルオレセインはSigma-Aldrichより得た。シリカゲル(Sorbent Technologies) 32〜63μmをフラッシュカラムクロマトグラフィーに使用した。1H-NMRはARX-400 Advance Bruker分光計上で得た。別途指示しない限り、化学シフト(δ)はd6-DMSO(2.50ppm、1H、39.52 13C)に対するppmで与えられる。MS(HRMS、ESI)スペクトルはPortland State University Bioanalytical Mass Spectrometry Facilityにおいて、専用Accela HPLCシステムを備えたThermoElectron LTQ-Orbitrap高分解能質量分析計上で得た。
【０１３６】
メタンスルホン酸を使用する一般的な酸縮合
ジヒドロキシナフタレン(3.12mmol)および無水フタル酸(1.56mmol)をメタンスルホン酸3mLに溶解させる。混合物を90℃で24時間攪拌する。混合物を室温に冷却した後、蒸留水(50mL)に注ぐ。析出物を濾過し、水(3x50mL)で洗浄する。析出物が形成されない場合、固体NaHCO3を数回に分けて加えることで混合物をpH 5〜7に中和する。析出物を減圧乾燥させる。シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって標的化合物を単離する。
【０１３７】
CH3SO3H:TFA 1:1混合物を使用する一般的縮合法
ヒドロキシベンゾフェノン(918μmol)および1,8-ナフタレン誘導体(1380μmol)をメタンスルホン酸1.5mLに溶解させた後、トリフルオロ酢酸(TFA)1.5mLを加える。混合物を加熱し、80℃で16〜24時間攪拌する。反応混合物を室温に昇温させた後、脱イオン(DI)水50mLに注ぐ。固体NaHCO3を数回に分けて加えることで混合物をpH 6〜7に中和する。得られた析出物を濾過し、DI水で洗浄し、風乾させる。シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって標的化合物を単離する。
【０１３８】
一般的エステル化法A
カルボキシレート(0.243μmol)をメタノール(MeOH)2mLに溶解させる。この溶液に濃H2SO4(100μL)を滴下した後、混合物を24時間還流させる。混合物を室温に冷却した後、氷水50mLに注ぎ、NaHCO3 200mgを1回で加える。析出物が形成される場合、固体を濾過し、2% NaHCO3(2x10mL)、次に水(2x10mL)で洗浄する。析出物が得られない場合、中和した水相をCHCl3(3x50mL)で抽出する。有機相をNa2SO4で乾燥させ、溶媒を減圧蒸発させる。次にフラッシュカラムクロマトグラフィーによって標的化合物を単離する。
【０１３９】
一般的エステル化法B
アルゴン雰囲気下で化合物(0.131mmol)を無水メタノール25mLに溶解させる。溶液を氷浴中で0℃に冷却する。塩化アセチル(750μL)を滴下する。混合物を攪拌し、50℃で48時間保持する。塩化アセチル(300μL)を滴下し、混合物を50℃でさらに24時間保持する。混合物を室温に冷却し、溶媒を減圧蒸発させる。
【０１４０】
実施例1
近赤外フルオロフォアの合成および特性決定
スキーム1(図5)に示すように、メタンスルホン酸中での1,8-ジヒドロキシナフタレンと無水フタル酸との酸縮合を経由して、または85% H3PO4中、125℃/24時間の1,8-ジヒドロキシナフタレンと対応するアルデヒドとの縮合によって、一般式IVの構造を有する類似体を合成した。典型的なフィッシャーエステル化プロトコールを経由して21からナフトフルオレセインメチルエステル22を得た(スキーム4)。CH3SO3H:TFA 1:1混合物中、80℃で16〜24時間のヒドロキシベンゾフェノンと対応するナフトールとの酸縮合によって、一般式IIIの非対称のセミナフトフルオレセイン類似体、ロドール類似体およびローダミン類似体(スキーム2および3)を合成した。必要なヒドロキシベンゾフェノンおよび1,8-ナフタレン誘導体は、記載のまたは修正された文献プロトコールに従って合成した。H2SO4またはHClにより触媒されるMeOH中でのエステル化によってメチルエステル誘導体を得た。ジメチルホルムアミド中K2CO3の存在下でカルボキシレートまたはメチルエステル中間体をヨウ化メチルで処理することで、さらなるメチルアルキル化を行った。一般に、主要な単離生成物がフルオレセインに対応する、ジヒドロキシ-ベンゾフェノンと8-アミノナフトール誘導体との間の縮合生成物を例外として、この系列に含まれる化合物の大部分について良好な全体的収率が得られた。すべての化合物はフラッシュカラムクロマトグラフィー(順相または逆相)で単離し、NMRおよびMSで特性決定した。化合物14aの構造(図22)はX線単結晶構造によって確認した。
【０１４１】
化合物21および7(公知の位置化学を伴う[c]型完全環化ナフトフルオレセイン対3-1転位を伴う完全環化[c]型ナフトフルオレセイン)
化合物21および7を紫外可視分光法によって特性決定した(図23)。90%水、10% DMSOである溶液中の各化合物の15μM溶液を使用して吸光度を測定した。600nm(細破線)および675nm(細実線)におけるピークは、NaOH(pH 12)中のそれぞれ化合物21および7のジアニオンを表す。590nm(太破線)および650nm(太実線)におけるピークは、pH 7.4の化合物21のモノアニオンとジアニオンとの混合物、およびpH 9の化合物7の主にモノアニオンをそれぞれ表す。したがって、3-1転位は、イオン化状態に応じて約60〜75nmの赤色移動した吸収スペクトルを生じさせた。
【０１４２】
また、化合物21および7を蛍光発光スペクトルによって特性決定した。90%水、10% DMSOである溶液中の各化合物の15μM溶液を使用して蛍光を測定した。化合物21では、ジアニオンから観察される最長波長発光がpH 9において680nm近傍で生じた。化合物7(転位)では、モノアニオンから観察される最長波長発光がpH 9において800nm近傍で生じた。水酸化ナトリウム中の転位ジアニオンからの発光は、弱すぎて検出できないか、またはより高確率には、機器の測定範囲を超えていた(850nm超)。3-1転位は、イオン化状態に応じて約120nm、場合によってはそれ以上の赤色移動した発光を生じさせた。
【０１４３】
各化合物のストークスシフトを測定し、化合物21ジアニオンについて約80nm、化合物7(転位)モノアニオンについて約150nmと決定された。したがって、3-1転位はストークスシフトも増大させた。
【０１４４】
化合物22および8(公知の位置化学を伴う[c]型完全環化ナフトフルオレセインメチルエステル対3-1転位を伴う完全環化[c]型ナフトフルオレセインメチルエステル)
化合物22をスキーム4に従って合成した。ナフトフルオレセイン(化合物21、0.05g、0.115mmol)をメタノール2mLに溶解させた。溶液を氷浴中で0℃に冷却した。濃硫酸(100μL)を溶液に加え、混合物を24時間還流させた。混合物を室温に冷却した後、氷水250mLに注ぎ、NaHCO3 200mgを加えた。析出物を濾過し、2% NaHCO3で2回、次に水で2回洗浄した。CH2Cl2:MeOH 9:1を溶離に使用するシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって化合物22を単離した。収量は26mg、50%であった。
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【０１４５】
1,8-ジヒドロキシ-ナフタレン(0.5g、3.12mmol)および無水フタル酸(0.231g、1.56mmol)をメタンスルホン酸2mLに溶解させた後、トリフルオロ酢酸2mLを加えることで、化合物8を合成した。混合物を80℃で24時間加熱攪拌した。混合物を室温に冷却した後、脱イオン水100mLに注いだ。析出物(化合物7)を濾過し、脱イオン水で洗浄した後、CH2Cl2:MeOH 9:1を溶離に使用するシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって単離した。収量0.122g、18%。次に化合物22について記載のようにエステル化を行った。CH2Cl2:MeOH 9:1を溶離に使用するシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって化合物8を単離した。収量0.023g、86%。
2014525905.tif 000067
【０１４６】
化合物22および8を紫外可視分光法によって特性決定した(図24)。90%水、10% DMSOである溶液中の各化合物の15μM溶液を使用して吸光度を測定した。610nm(細破線)および685nm(細実線)におけるピークは、NaOH(pH 12)中のそれぞれ化合物22および8のアニオンを表す。605nm(太破線)および805nm(太実線)におけるピークは、pH 7.4の化合物22および8の中性形をそれぞれ表す。したがって、3-1転位は、イオン化状態に応じて約75〜200nmの赤色移動した吸収スペクトルを生じさせた。
【０１４７】
興味深いことに、転位化合物について、ヒドロキシルのイオン化がより短波長での吸収を導くことが注目される。これは、公知の位置化学について観察されることとは反対である。また、これら最初の2つの例からは、スペクトル特性に対する3-1転位の効果(赤色移動したスペクトル)が、カルボキシレートがメチルエステルで置き換えられる場合にいっそう顕著であることが明らかである。
【０１４８】
3-1転位によって与えられるヒドロキシル基の独特な場所は、キサンテン酸素との相互作用の増大を導く。これは、観察される赤色移動および予期せぬ挙動の1つのありうる説明となる。分子モデリングは、中性形において、転位構造のヒドロキシルプロトンが2個の水素結合によって緊密に保持されていること、およびアニオン形において、キサンテン酸素の陽電性が公知の位置化学よりも転位構造の方で高い(Mulliken電荷-0.289対-0.386)ことを示した。この相互作用をさらに特性決定し、かつ陽電性がより高い元素(すなわちS、Se、C、Siなど)でキサンテン酸素を置き換えることを含みうる複雑な合成戦略を必要とせずにキサンテン系構造のスペクトル特性をさらに調節するためにこの戦略を使用するための研究が、現在進行中である。最近の研究において、Naganoおよび共同研究者は、ローダミンおよびピロニンの吸収波長および発光波長をそれぞれ約80nm広げるために同様の戦略を使用した(DOI: 10.1021/cb1002416)。このアプローチが、親構造に存在する相対的に小さなストークスシフト(15〜20nm)を保持することに留意すべきである。しかし、本明細書に開示される転位アプローチはストークスシフトを増加させた。さらに、Naganoおよび共同研究者が報告した化合物の発光は、本明細書に記載の3-1転位アプローチにより得られる化合物よりも約100nm以上青色側である。
【０１４９】
また、化合物22および8を蛍光発光スペクトルによって特性決定した。90%水、10% DMSOである溶液中の各化合物の15μM溶液を使用して蛍光を測定した。化合物22では、アニオンから観察される最長波長発光がpH 9において690nm近傍で生じた。化合物8(転位)では、発光は観察されなかった。このクラスの化合物において観察される800nmを超える吸光度ピークおよび典型的には大きなストークスシフトを前提とすれば、発光が機器の測定範囲を超えていた(850nm超)可能性が高い。転位化合物の発光が850nmを超えると仮定すれば、3-1転位は160nmを超える赤色移動発光を生じさせた。
【０１５０】
各化合物のストークスシフトを測定し、化合物22アニオンについて約80nm、化合物8(転位)中性形について測定不能であると決定された。3-1転位はストークスシフトも増大させた可能性が高い。
【０１５１】
また、化合物22および8の吸光度および蛍光をメタノール中で測定した。化合物22は598nmにおける吸収極大を示した。化合物8は701nmにおける吸収極大を示した。化合物22は688nmにおける発光極大を示した。化合物8は816nmにおける発光極大を示した。したがって、化合物8中でキサンテン内部酸素に対して近位にヒドロキシル基を配置することで、吸収スペクトルの深色移動103nmが生じた。転位によって、励起スペクトルの対応する移動、および蛍光発光の大きな深色移動128nmも生じた。重要なことに、化合物8は近赤外において吸収および発光し、吸収極大および発光極大はそれぞれ701nmおよび816nmである。類似の傾向が他の溶媒系、例えばDMSO、DMSO:水1:1(pH 9)、DMSO:水1:9(pH 9)、DMSO:水1:1(pH 12.1、NaOH)およびDMSO:水1:9(pH 12.1、NaOH)において観察された。
【０１５２】
化合物20aおよび15a(公知の位置化学を伴う[c]型環化セミナフトフルオレセインメチルエステル対3-1転位を伴う環化[c]型セミナフトフルオレセインメチルエステル)
炭素3上のイオン化可能基という位置化学を伴ういくつかの[c]型セミナフトフルオレセインが市販されている。しかし、上記の転位幾何配置を伴う化合物上でカルボキシレートをメチルエステルで置き換えた際に観察される大きな効果を前提として、以前に未報告のセミナフトフルオレセインメチルエステル類似体を新規転位化合物との直接比較用に調製した。
【０１５３】
酸性条件下で化合物17a(0.25g、0.968mmol)と化合物18a(0.232g、1.45mmol)とを縮合することで化合物20aを合成した(スキーム3)。EtOAc:MeOH 9:1を溶離に使用するシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって化合物19aを単離した。収量303mg、82%。化合物22について既に記載のように化合物19a(50mg、131μmol)をエステル化した。EtOAc:MeOH 9:1を溶離に使用するシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって化合物20aを単離した。収量27mg、52%。
2014525905.tif 000068
【０１５４】
酸性条件下で化合物12a(0.250mg、0918mmol)と化合物13a(0.232g、1.45mmol)とを縮合することで化合物15aを合成した(スキーム2)。CH2Cl2:MeOH 9:1を溶離に使用するシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって化合物14aを単離した。収量300mg、81%。化合物22について既に記載のように化合物14aをエステル化した。CH2Cl2:MeOH 9:1を溶離に使用するシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって化合物15aを単離した。収量40mg、77%。
2014525905.tif 000069
【０１５５】
化合物20aおよび15aを紫外可視分光法によって特性決定した(図25)。90%水、10% DMSOである溶液中の各化合物の15μM溶液を使用して吸光度を測定した。545nm(細破線)および595nm(細実線)におけるピークは、NaOH(pH 12)中の各アニオン、すなわち化合物20cおよび15hを表す。515nm(太破線)および525nm(太実線)におけるピークは、pH 6のそれぞれ化合物20aおよび15aの主に中性の形態を表す。したがって、3-1転位は、イオン化状態に応じて約10〜55nmの赤色移動した吸収スペクトルを生じさせた。
【０１５６】
また、化合物20aおよび15aを蛍光発光スペクトルによって特性決定した。90%水、10% DMSOである溶液中の各化合物の15μM溶液を使用して蛍光を測定した。化合物20aでは、その対応するアニオンである化合物20cから観察される最長波長発光がNaOH(pH 12)中にて640nm近傍で生じた。化合物15a(3-1転位を伴う)では、対応するアニオンである化合物15hから観察される最長波長発光がNaOH中にて760nm近傍で生じた。3-1転位は、最長波長発光種について約120nm赤色移動した発光を生じさせた。
【０１５７】
各化合物のストークスシフトを測定し、化合物20cアニオンについて約95nm、化合物15h(転位)アニオンについて約165nmと決定された。したがって、3-1転位はストークスシフトを約70nm増大させた。
【０１５８】
また、化合物20aおよび15aの吸光度および蛍光をメタノール中で測定した。化合物20aは487nmおよび521nmにおける吸収極大を示した。化合物15aは501nmおよび536nmにおける吸収極大を示した。化合物20aは550nmにおける発光極大を示した。化合物15aは582nmにおける発光極大を示した。したがって、化合物15a中でキサンテン内部酸素に対して近位にヒドロキシル基を配置することで、吸光度スペクトルの深色移動15nmが生じた。転位によって、励起スペクトルの対応する移動、および蛍光発光の大きな深色移動32nmも生じた。
【０１５９】
メタノール中の化合物15aの赤色移動は中程度であったが、DMSO:塩基水溶液1:9中のその対応するアニオン(化合物15h)は同一条件下のアニオン20cに比べて50nm〜599nmと相当に移動した。その蛍光発光は130nmとさらに大きく移動し、760nmで発光した。アニオン15hの比較的大きな移動は、化合物中のHOMO-LUMOギャップを調節する上で重要な役割を果たす極性効果を裏付ける。非対称15hのオキソアニオンは、対応するオキソアニオン20cに比べて著しい、近位エーテル酸素の極性に対する電界効果を示すと予想される。多くの他のNIR発光化合物と同様に、化合物15hは水溶液中で相対的に低い量子収率(1%未満)を示す。化合物15hの輝度は他のNIRプローブと同等である。
【０１６０】
化合物15bおよび15d(3-1転位位置化学を伴う[c]型環化セミナフトローダフルオルメチルエステル(それぞれ遊離アミノおよびジメチル))
公知のセミナフトフルオレセインのメチルエステル類似体は、既報の化合物と同様に挙動する。カルボキシレート含有化合物に比べて約10nmのわずかな赤色移動(Whitaker et al. Analytical Biochemistry, 1991, 194, 330-344)のみ観察された。したがって、公知のセミナフトローダフルオル(セミナフトロドールとしても知られる)のメチルエステル類似体は直接比較用に調製しなかった。公知の位置化学を伴う同様の化合物の文献値を化合物15bおよび15dとの比較に使用した。
【０１６１】
化合物15b(遊離アミノ)を紫外可視分光法によって特性決定し(図26)、C.SNARF-5(文献、SNARF = セミナフトローダフルオル)と比較した。90%水、10% DMSOである溶液中の化合物15bの15μM溶液を使用して吸光度を測定した。535nmにおけるピーク(太線)は、pH 6の15bの主にフェノールの形態を表す。615nmにおけるピーク(細線)は、NaOH(pH 12)中の化合物15bのフェノキシドを表す。これに比べ、C.SNARF-5は550nmにおけるピーク(アニオン形)および485nmにおけるピーク(中性形)を生成する(Whitaker et al., Anal. Biochem. 1991, 194, 330-344)。したがって、3-1転位は、イオン化状態に応じて約50〜65nmの赤色移動した吸収スペクトルを生じさせた。
【０１６２】
また、化合物15bをその蛍光発光スペクトルによって特性決定し、C.SNARF-5と比較した。90%水、10% DMSOである溶液中の化合物15bの15μM溶液を使用して蛍光を測定した。C.SNARF-5では、アニオンから観察される最長波長発光は632nm近傍で生じた(Whitaker et al., Anal. Biochem. 1991, 194, 330-344)。化合物15b(転位)では、フェノキシドから観察される最長波長発光が770nm近傍で生じた。3-1転位は、最長波長発光種について約138nm赤色移動した発光を生じさせた。
【０１６３】
各化合物のストークスシフトを測定し、C.SNARF-5アニオンについて約82nm、化合物15b(転位)フェノキシドについて約155nmと決定された。したがって、3-1転位はストークスシフトを約73nm増大させた。
【０１６４】
化合物15d(ジメチル)を紫外可視分光法によって特性決定し(図27)、SNARF-1(文献)と比較した。90%水、10% DMSOである溶液中の化合物15dの15μM溶液を使用して吸光度を測定した。570nmにおけるピーク(太線)は、pH 6の15dの主に中性の形態を表す。630nmにおけるピーク(細線)は、NaOH(pH 12)中の化合物15dのフェノキシドを表す。これに比べ、SNARF-1は573nmにおけるピーク(アニオン形)および515nmにおけるピーク(中性形)を生成する(Whitaker et al., Anal. Biochem. 1991, 194, 330-344)。したがって、3-1転位は、イオン化状態に応じて約55〜57nmの赤色移動した吸収スペクトルを生じさせた。
【０１６５】
また、化合物15dをその蛍光発光スペクトルによって特性決定し、SNARF-1と比較した。90%水、10% DMSOである溶液中の化合物15dの15μM溶液を使用して蛍光を測定した。SNARF-1では、アニオンから観察される最長波長発光は631nm近傍で生じた(Whitaker et al., Anal. Biochem. 1991, 194, 330-344)。化合物15d(転位)では、フェノキシドから観察される最長波長発光が780nm近傍(NaOH、pH 12)で生じた。3-1転位は、最長波長発光種について約149nm赤色移動した発光を生じさせた。
【０１６６】
各化合物のストークスシフトを測定し、SNARF-1アニオンについて約58nm、化合物15d(転位)フェノキシドについて約150nmと決定された。したがって、3-1転位はストークスシフトを約92nm増大させた。
【０１６７】
化合物20bおよび15g(公知の位置化学および3-1転位位置化学をそれぞれ伴う[c]型環化セミナフトローダミンメチルエステル(遊離アミノ))
本発明者らの知る限り、[c]型環化および公知の位置化学を伴う完全セミナフトローダミン類似体は報告されていない。本発明者らはこの化合物(20b)を、3-1転位を伴う新規セミナフトローダミン(15g)との直接比較用に調製した。
【０１６８】
化合物20bおよび15gを紫外可視分光法によって特性決定した(図28)。90%水、10% DMSOである溶液中の各化合物の15μM溶液を使用して吸光度を測定した。540nm(破線)および570nm(実線)におけるピークは、pH 7.4のそれぞれ化合物20bおよび15gのカチオンを表す。したがって、3-1転位は約30nmの赤色移動した吸収スペクトルを生じさせた。
【０１６９】
また、化合物20bおよび15gを蛍光発光スペクトルによって特性決定した。90%水、10% DMSOである溶液中の各化合物の15μM溶液を使用して蛍光を測定した。化合物20bでは、カチオンから観察される最長波長発光がpH 7.4において640nm近傍で生じた。化合物15g(転位)では、カチオンから観察される最長波長発光がpH 7.4において770nm近傍で生じた。3-1転位は約130nm赤色移動した発光を生じさせた。
【０１７０】
各化合物のストークスシフトを測定し、化合物20bカチオンについて約100nm、化合物15g(転位)カチオンについて約200nmと決定された。したがって、3-1転位はストークスシフトを約100nm増大させた。
【０１７１】
化合物15eおよび15f(3-1転位位置化学および転位したイオン化可能部分を伴う[c]型環化セミナフトローダフルオルメチルエステル(遊離アミノおよびジメチル))
前述の例に加えて、イオン化可能ヒドロキシルおよびアミン(遊離アミノおよびジメチル)官能基がやはり転位した、3-1転位を伴う第2の系列のセミナフトローダフルオル(15e〜15f)を調製した。比較用の最も近い化合物である、公知の位置化学を伴う[c]型環化セミナフトローダフルオルは、「より長波長の蛍光を示し、525nmで励起される際にMeOH中にて600nmで発光する」と報告された(Clark et al., Tetrahedron Lett., 2004, 45, 7129-7131)。
【０１７２】
イオン化可能ヒドロキシルおよびアミン官能基の転位と本明細書に開示される3-1転位位置化学との組み合わせに基づくこの新規系列の化合物は、予期しない酸塩基特性を示す。公知のセミナフトローダフルオルは高pHにおける長波長吸収を示すが、この系列の遊離アミノ化合物は、長波長吸収の増加によって低pHに応答する。図29は、化合物15eの一連のpH滴定曲線を示し、低pHにおける長波長吸収の増加および短波長吸収の減少を示す。
【０１７３】
また、予備データは、この系列(遊離アミノおよびジメチル)が、本明細書に開示される3-1転位を伴う他の化合物と同等の赤色移動したスペクトルを示すことを示す。最長波長発光種の発光極大は約740〜780nmの範囲である。転位の組み合わせに基づく赤色移動した化合物が既報の化合物に比べて相当に赤色移動していることは明らかである。
【０１７４】
化合物10
7-(2,5-ジメチルフェニル)-13-ヒドロキシ-1H-ジベンゾ[c,h]キサンテン-1-オン
2014525905.tif 000070
1,8-ジヒドロキシナフタレン(0.298mg、1.86mmol)および2,5-ジメチル-ベンズアルデヒドを85% H3PO4 2mLに懸濁させ、混合物を激しく攪拌し、125℃で24時間加熱した。混合物を室温に冷却した後、水50mLに注いだ。形成された析出物を濾過し、水(2x50mL)で洗浄した。CH2Cl2:MeOH 9:1を溶離に使用するシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって標的化合物を単離した。収量67mg、17%。
2014525905.tif 000071
【０１７５】
化合物16a
2-(1-メトキシ-10-オキソ-10H-ベンゾ[c]キサンテン-7-イル)安息香酸メチル
2014525905.tif 000072
アルゴン雰囲気下で化合物14a(0.050g、0.131mmol)およびK2CO3(0.072g、0.523mmol)を無水DMF 600μLに懸濁させた。CH3I(0.111g、0.785mmol)を1回で加え、混合物を60℃で24時間加熱した。混合物を室温に冷却した後、飽和NH4Cl水溶液5mLを加えた。CH2Cl2:MeOH 9:1を溶離に使用するシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって化合物16aを単離した。収量9.8mg、18%。
2014525905.tif 000073
【０１７６】
メチルエーテル16aを生成するためのR18におけるメチル化によって量子収率が劇的に向上した。黄橙色発光する16aの量子収率は0.4649であり、対応する中性化合物15aの40倍であった。黄緑色発光する中性化合物20aよりもわずかに高く、橙赤色発光するアニオン20cの2倍超であった。化合物(7.5μM)を10:90 DMSO:水溶液中で分析した。溶液を下から3ワットmegaMAX 505nm ALSシステムによって励起する際に、蛍光発光が暗室中で容易に目に見えた。3-1転位とメチル化との組み合わせを通じて得られた発光増大特性はセミナフトフルオレセイン化合物の既報のメチルエーテルとは対照的である。
【０１７７】
開示される化合物のいくつかの態様のさらなるNMR、ESIおよび吸収スペクトル、ならびにHOMO-LUMO表面について関心のある読者はhttp://pubs.acs.org/doi/suppl/10.1021/ja302445w/suppl_file/ja302445w_si_001.pdfを参照されたい。
【０１７８】
実施例2
パラ、オルトおよびメタ架橋ビス-ビオローゲンの合成
パラ架橋ビオローゲンをスキーム13に従って合成した。
2014525905.tif 000074
ビピリジン(16.66g、106.65mmol)をアセトニトリル125mLに溶解させ、溶液を還流させた。次にp-ビス-(ブロモ-メチル)ベンゼン(5g、18.94mmol)をアセトニトリル300mLに溶解させた。この溶液をビピリジン還流溶液に1時間中に加えた。p-ビス-(ブロモ-メチル)ベンゼン溶液の添加完了後に、混合物をさらに24時間還流させた。形成された析出物を濾過し、アセトニトリル(2x50mL)で洗浄し、風乾させた。一重架橋ビオローゲン103を淡黄色固体として得た。収量10.5g、96%。1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ (ppm) 9.4-9.41 (4H, d), 8.85-8.86 (4H, d), 8.65-8.67 (4H, d), 8.00-8.01 (4H, d), 7.74 (4H, s), 5.94 (4H, s)
【０１７９】
化合物103(3g、5.3mmol)を水30mLに懸濁させ、析出物の溶解完了まで混合物を加熱した。1M NH4PF6 20mLをゆっくりと加えた。混合物を室温に冷却し、濾過し、淡黄色析出物を水(3x50mL)で洗浄し、減圧乾燥させた。収量3.426g、93%。1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ (ppm) 9.32-9.34 (4H, d), 8.86-8.87 (4H, d), 8.63-8.64 (4H, d), 7.99-8.00 (4H, d) 7.66 (4H, s), 5.88 (4H, s)
【０１８０】
スキーム9と同じ一般的手順を使用し、化合物101の代わりにメタ-ビス-(クロロ-メチル)ベンゼンを使用することで、スキーム14に従ってメタ架橋ビオローゲンを合成した。
2014525905.tif 000075
【０１８１】
スキーム10と同じ一般的手順を使用し、化合物101の代わりにオルト-ビス-(ブロモ-メチル)ベンゼンを使用することで、スキーム15に従ってオルト架橋ビオローゲンを合成した。
2014525905.tif 000076
【０１８２】
実施例2
架橋パラ-ビスロドールビオローゲンコンジュゲートの合成
モノ(1',1''-(1,4-フェニレンビス(メチレン))ビス(1-(3-(2-(10-(ジメチルイミノ)-1-ヒドロキシ-10H-ベンゾ[c]キサンテン-7-イル)ベンゾイルオキシ)プロピル)-4,4'-ビピリジン-1,1'-ジイウム))テトラブロミド54
GSH検出用の対称および非対称の両方の一重架橋ビオローゲンコンジュゲートを生成するための近赤外フルオロフォアの使用は現在進行中である。一重架橋パラ-ビオローゲンビス-ロードール類似体である化合物54は、スキーム11(図15)に示すように合成することができる。
【０１８３】
公刊されたプロトコール(Strongin et al., "Developing Fluorogenic Reagents for Detecting and Enhancing Bloody Fingerprints," NCJ 227841, Grant Report, 2009)に従ってロドール14dを合成した(スキーム16)。
2014525905.tif 000077
【０１８４】
各ビス-ロドールビオローゲン異性体のエネルギー最小化構造を図17〜図19に示す。
【０１８５】
同じ一般的手順を使用し、パラ-ビス-(ブロモ-メチル)ベンゼンの代わりにメタ-ビス-(クロロ-メチル)ベンゼンまたはオルト-ビス-(ブロモ-メチル)ベンゼンをそれぞれ使用することで、スキーム11(図15)に従ってメタおよびオルト架橋ビオローゲンコンジュゲートを合成することができる。
【０１８６】
フルオロフォアの上側環を経由してビオローゲン骨格に結合したフルオロフォアを含む架橋パラ-ビスビオローゲンの態様をスキーム12(図16)に示すように合成する。
【０１８７】
実施例3
血中発光
化合物15d(表1)を50% DMSO:50% 25mM pH 9リン酸緩衝液中で40μMに希釈した。図30に示すように、希釈化合物はλmax ex = 約690nmおよびλmax em = 約790nm(ストークスシフト = 約100nm、1834cm-1)で蛍光を発した。この溶媒の水性部分に全血(Na-EDTA中ブタ血、Lampire Biological Laboratories)を包含させて最終血中濃度5容量%を生じさせることで、ヘモグロビン吸収に起因する蛍光の損失、および血液成分からの散乱がごく最小限なものとなった。発光は少なくとも1時間安定なままであった。吸収プロファイルはレーザーポインターの出力(635〜670nm; 最大出力5mW未満)と一致している。NIR発光(80μM)は、デジタルカメラ(Kodak EasyShare Z740)を用いて、Hoya R72カメラフィルター(690nm未満で%T 1%未満、750nm超で%T 90%超)を通じて集められる8秒間の露光で撮影されたNIR写真中で明らかに目に見えた。同様の結果は5%全血でも観察されたが、増加した散乱励起光が可視画像およびNIR画像の両方において明らかに目に見えた。この問題は第2のフィルターによって容易に克服された。
【０１８８】
しかし、化合物15dの吸収と一般的なレーザーポインターの出力との間の緊密な一致によって、単純で安価な光源によるその励起が可能になった。さらに、通常の室内光中の商業用デジタルカメラと安価なHoya R72赤外フィルターとの組み合わせによってそのNIR発光が検出された(図30挿入図)。
【０１８９】
化合物4aの吸収(表1)は明らかに目に見え、血液溶液中で長期間安定なままであった。化合物5a(表2)も5%血液中で機能することがわかった。その吸光度スペクトルおよび蛍光スペクトルは経時的に減弱したが、約1時間後には目に見えるままであった(但しその当初の発光強度のわずか10〜20%)。分子モデリングは化合物5fおよび24とグルタチオンとの好ましい構造上の相互作用を示した(例えば図20 - 化合物24を参照)。
【０１９０】
化合物15g(3-1転位を伴う[c]型環化セミナフトローダミンメチルエステル(遊離アミン))のスペクトル挙動を調査することで、全血中での感知用途におけるその潜在力を決定した。10容量%または90容量%全血(Na-EDTA中ブタ血、Lampire Biological Laboratories)中の化合物15gの溶液を3x3mmセル中で調査した。最初にフルオロフォアを完全な溶解が確実になるように50mM pH 7.4リン酸緩衝液に溶解させ、90%全血の場合、このストック溶液を全血と1:9比で混合した。10%全血の場合、全血1部を化合物15gストックの適切に希釈した(脱イオン水によって)溶液9部に加えた。いずれの場合でも、化合物15gの最終濃度は150μMとし、最終リン酸緩衝液濃度は5mMとした。図31Aは、10%全血中の化合物15gの吸光度スペクトルの、該化合物なしの10%全血との比較を示す。スペクトルの大部分を通じて、色素は血液単独よりも大きな吸光度を生成する。2つのスペクトルの間の吸光度の変化は色素の有効吸光度を示す。図31Aに示すように、約650nm〜850nmに延びる相対的に高透過性の血液「窓」が存在する。この色素の広範な吸収および大きなストークスシフトによって、血中の主要ヘモグロビンピークの波長を超える波長における50%超の効率での著しい励起が可能になる。図31Bは、670nmでの励起時の10%および90%全血試料中の化合物15gの発光スペクトルを示す。図31Bに示すように、色素発光は両血液試料中にて発光スペクトル極大約750nmで明らかに見える。図31B中の写真挿入図は、10および90%全血試料(それぞれ左側および右側)が裸眼ではほぼ識別不能であることを示す。
【０１９１】
化合物8(3-1転位を伴う[c]型完全環化ナフトフルオレセインメチルエステル)は、血中のヘモグロビン吸収の波長を大きく超える800nm超において吸収極大を示す。結果として、化合物8も血中で十分に機能しうる。
【０１９２】
実施例4
ローダミンビス-ボロン酸の合成および特性決定
化合物51
セミナフトローダミンビス-ボロン酸
スキーム9(図13)に関して、ローダミン110を160℃で3時間かけて塩基性加水分解することで出発原料2-(4-アミノ-2-ヒドロキシベンゾイル)安息香酸を収率92%で得た。CH2Cl2:MeOH 9:1でのフラッシュカラムクロマトグラフィーによる単離後、CH3SO3H:TFAの1:1混合物を使用する1,6-アミノヒドロキシナフタレンとの酸縮合によって、対応するセミナフトローダミン50を収率63%で得た。対応するビス-ボロン酸51を生成するための還元的アミノ化をジクロロエタン(DCE)中にて2段階で行った。MeCNおよびTHFを含む他の溶媒も使用したが、所望の標的は低収率(1%未満)で得られた。第1段階は、130℃で40分間のマイクロ波照射下の50と2-ホルミルボロン酸およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムとの反応を包含した。マイクロ波バイアルを開け、酢酸を1回で加え、混合物を130℃でさらに40分間加熱した。飽和NaHCO3で混合物を中和し、CH2Cl2:MeOH 9:1を使用する分取TLCによって標的化合物を単離した。標的化合物を1H NMR、HR ESI MSによって特性決定し、その純度(96%)を逆相HPLCによって決定した。
【０１９３】
化合物53
ナフトローダミンビス-ボロン酸
スキーム10(図14)に関して、アルゴン下、トリフルオロメタンスルホン酸の存在下での100℃で2時間、次に140℃でさらに2時間の加熱を経由する無水フタル酸および1,6-アミノヒドロキシ-ナフタレンの酸促進性縮合によってナフトローダミン52を収率74%で合成した。上記のように、対応するビス-ボロン酸53を生成するための還元的アミノ化をDCE中にて2段階で行った。逆相HPLCによる反応をモニタリングすることで最適な反応条件を得た。CH2Cl2:MeOH 95:5を溶離に使用する分取TLCによって標的化合物を収率38%で単離した。ナフトローダミン52および標的化合物を1H NMR、HR ESI MSによって特性決定し、それらの純度(それぞれ99%および95%)を、C18逆相カラム、およびH2O:MeCN中1% TFAで構成される溶離用の勾配溶媒系上での逆相HPLCによって決定した。
【０１９４】
特性決定
化合物50〜53のスペクトル特性を決定した。ローダミンビス-ボロン酸51および53ならびにそれらの各前駆体50および52の溶液の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを図35a〜c(DMSO:緩衝液1:9中)および図35d〜f(DMSO:緩衝液1:1)に示す。前駆体50(2.25μM)およびビス-ボロン酸化合物51(3.75μM)を500nmおよび675nmで励起およびモニタリングした。前駆体52(12.5μM)およびビス-ボロン酸化合物53(7.5μM)を590nmおよび700nmで励起およびモニタリングした。励起スペクトルおよび発光スペクトルを励起波長における吸光度に対して正規化した。それらは量子収率に比例している。
【０１９５】
結果を以下の表5に要約する。DMSO:緩衝液 1:9中のセミナフトローダミン50の吸収極大は535nmにおいてであった(ローダミン110よりも40nm赤色側)。628nmにおけるその発光極大は19%という相当な量子収率を示し、ローダミン110に比べて約100nm赤色移動していた。対応するビス-ボロン酸51では、吸収極大および発光極大がそれぞれ560および638nmにおいてさらに赤色移動した。相対的に低い量子収率が証明するように、ホウ素-窒素系中で発光は光誘起電子移動(PET)を通じてわずかに消光した。興味深いことに、以下で論じる当初の「RhoBo」および完全環化ビス-ボロン酸53の消光が非対称ビス-ボロン酸51よりもはるかに大きいことが注目される。
【０１９６】
ナフトローダミン52の吸収極大は578nmにさらに移動し、発光波長および量子収率(668nm、10%)は市販のナフトフルオレセインと同等であった。対応するビス-ボロン酸53では、吸収極大および発光極大がそれぞれ628および692nmにおいてさらに赤色移動した。それは相当に強い青緑色を示したが、その蛍光はほぼ完全に消光し、これにより潜在的な点灯型センサが可能になった。他の化合物と同様に、その発光はわずかに赤色が強く、その量子収率はDMSO:緩衝液 1:1中でわずかに高かった。しかし、その対応するローダミン前駆体52と同様に、それはこの溶媒中で閉環および無色のラクトン形で主に存在する。
【０１９７】
【表５】
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a最終pH 7.4リン酸緩衝液濃度は12.5mMとした。b溶媒は10mM HEPES、pH 7.5、15%(v/v)EtOHとし、値はLeytus et al., Biochem. J. 209, 299 (*1983)によった。c値はHalo et al., J. Am. Chem. Soc. 131, 438 (2008)より得た。d部分的ラクトン形成。e弱いPET消光、f強いPET消光、gほぼ完全なラクトン形成。
【０１９８】
実施例5
糖類の感知および選択性
ボロン酸プローブの応答。化合物51および53を各種溶媒中の広範囲のグルコース、リボースおよびフルクトース濃度にわたってモニタリングした。最初に、MeCN、MeOH、EtOH、DMSOおよび緩衝液を含む溶媒を糖感知用にスクリーニングした。プローブはMeCNおよび緩衝液に部分的に可溶性であり、MeOH、EtOHおよびDMSOに可溶性であった。DMSO混合物をさらなる研究用に選択した。
【０１９９】
これらの種類のプローブが示す溶媒依存性のラクトン環開環-閉環平衡(スキーム17)を理由として、糖感知のありうる条件の範囲を決定するためにDMSO滴定を行った。試料を0〜60% DMSOから滴定した。最終pH 7.4リン酸緩衝液濃度は12.5mMとした。吸光度値は以下のように測定された: セミナフトローダミン50 - 532nm、ビス-ボロン酸51 - 578nm、ナフトローダミン52 - 578nm、ビス-ボロン酸53 - 627nm。図36に示すように、比較的低いDMSO濃度において、ローダミン前駆体50および52ならびにビス-ボロン酸51および53は少なくともある程度は着色したカルボキシレート種として存在する。DMSO濃度が増加するに従って、ビス-ボロン酸51以外ではラクトン形が優勢になった(低吸光度値)。この場合、カルボキシレート形がこのDMSO濃度範囲にわたって優勢であった。DMSO濃度60〜90%では、析出はすべての場合で生じたが、90% DMSOでは、すべての化合物は可溶性であり、主に無色閉環ラクトン形であった。興味深いことに、ボロン酸誘導体がそれらの対応するローダミン前駆体よりもラクトン形成の傾向が低いことが注目される。
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【０２００】
本発明者らの以前の研究において使用したDMSO:緩衝液9:1混合物(最終pH 7.4リン酸緩衝液濃度12.5mM)中でこれらのプローブを使用するグルコース、フルクトースおよびリボースの感知用の初期スクリーニングは、吸光度または蛍光の変化が観察不能であったことを示した。室温または37℃で最大24時間のインキュベーションによって同様の結果が得られた。糖結合は、この溶媒中でのラクトン平衡を十分には改変しなかったようである。
【０２０１】
糖類の存在下での両化合物51および53のスペクトル挙動を1:1および1:9の両方のDMSO-緩衝液(最終pH 7.4リン酸緩衝液濃度12.5mM)溶液中でさらに調査した。両ビス-ボロン酸は、発光の赤色移動、および予想される蛍光強度の増加を通じて糖の結合に応答した。
【０２０２】
図37は、上記で言及した2つの溶媒条件下のフルクトース、リボースおよびグルコースに対するビス-ボロン酸51の応答を示す。図37aは、DMSO:緩衝液1:9中の10mM糖に応答しての化合物51(3.75μM)の吸収スペクトルおよび発光スペクトルであり、図37bは、DMSO:緩衝液1:9中の糖濃度の関数としての蛍光発光(励起580nm/発光660nm)であり、図37cは、DMSO:緩衝液1:1中の10mM糖に応答しての化合物51(3.75μM)の吸収スペクトルおよび発光スペクトルであり、図37dは、DMSO:緩衝液1:1中の糖濃度の関数としての蛍光発光(励起580nm/発光640nm)である。最終pH 7.4リン酸緩衝液濃度は12.5mMとした。図37b、図37dの横線は分析物の非存在下での化合物51の蛍光を表す。1:9 DMSO:緩衝液系中で、この非対称ローダミンビス-ボロン酸はフルクトースに比較的強く応答した(図37aおよび図37b)。調査した最低濃度で、フルクトースおよびリボースについて蛍光強度の増加が観察された。高い糖濃度で、3つすべての糖に対する応答が収斂した。すべての糖について、吸光度が約2倍増加することで蛍光が5倍超増加した。溶媒系は応答に対して大きな効果を示すことがわかった。ビス-ボロン酸51は1:1 DMSO:緩衝液系中でリボースに最も強く応答した(図37cおよび図37d)。調査した濃度範囲全体にわたって、吸光度および蛍光の両方の約1.5倍の増加が観察された。3つすべての糖の結合は1:9 DMSO:緩衝液系に比べて低い濃度で生じ、リボースおよびフルクトースの両方の応答は、調査した最低濃度である10mMにおいて既に安定水準に達した。1:9溶媒系とは異なり、異なる糖に対する応答の有意なスペクトル差が存在した(図37cと図37aとの比較)。
【０２０３】
非対称ビス-ボロン酸51の応答と対称ビス-ボロン酸53の応答との間に有意な差が存在した。図38a〜dは、1:9および1:1の両方のDMSO:緩衝液系中でのフルクトース、リボースおよびグルコースに対する化合物53の応答を示す。図38aは、DMSO:緩衝液1:9中の糖濃度の関数としての化合物53(7.5μM)の吸収(630nm)スペクトルであり、図38bは、DMSO:緩衝液1:9中の糖濃度の関数としての化合物53(7.5μM)の蛍光(励起630/発光690nm)スペクトルであり、図38cは、DMSO:緩衝液1:1中の糖濃度の関数としての化合物53(7.5μM)の吸収(640nm)スペクトルであり、図38dは、DMSO:緩衝液1:1中の糖濃度の関数としての化合物53(7.5μM)の蛍光(励起640/発光700nm)スペクトルであり、最終pH 7.4リン酸緩衝液濃度は12.5mMとした。横線は分析物の非存在下での化合物53の吸光度および蛍光を表す。化合物53は1:9 DMSO-緩衝液中100mM未満の濃度で、スクリーニングした3つの糖のうちほぼフルクトースにのみ応答した(図38a、図38b)。調査した最高フルクトース濃度で、630nmにおける吸光度の3倍未満の増加は、630nmにおける励起時の710nmにおける蛍光発光の140倍超の点灯応答を生じさせた。いずれかの糖に応答してのスペクトル移動は観察されなかった。吸光度の増加は、少なくとも部分的には糖結合時のラクトン開環の結果でありうる。蛍光の増大は、大部分が遊離ローダミンビス-ボロン酸のホウ素-窒素系中のPET消光のほぼ完全な途絶の結果である。結合後の化合物53の量子収率が20%以上(140倍の蛍光増加÷3倍の吸光度増加×遊離化合物53の量子収率＝0.186)に近く、前駆体52の量子収率よりも大きいと推定された。結合時の発色団の二次相互作用およびさらなる強化は、発光のこのさらなる増大が原因である可能性がある。また、溶媒系は大きな効果を示すことがわかった。溶媒系を1:1 DMSO-緩衝液に変更した時点で、リボースに対する親和性は大きく増加し、調査した最低濃度(10mM)でフルクトースについて観察された応答に近づいた。比較的低い濃度での3つすべての糖の結合(図38cおよび図38d)は増大したことがわかり、3つすべての糖の応答は、640nmにおける励起時の720nmにおける発光の約5倍の増加に収斂した。1:1 DMSO-緩衝液中の遊離ビス-ボロン酸53は無色であったが、糖の結合はラクトンの開環を促進し、緑青色を導いた。
【０２０４】
溶媒系の大部分が水性である(1:9 DMSO:緩衝液)場合、水による溶媒和は塩架橋による分子内相互作用を阻害し、これにより、化合物51中の糖ボロネート複合体は、特にローダミン系環が延長していない側において、カルボキシル基に問題なく到達する事実上すべてのありうる立体配座をとることが可能になる。相対的に水性の低い系(1:1 DMSO:緩衝液)では、結合した糖と色素との間の分子内結合相互作用の増大が理由で、選択性はわずかにリボースに傾く。図39は、化合物51のリボースビス-ボロネートのモデルを示し、1:1 DMSO:緩衝液中のN-H-O-B原子内の静電相互作用を記述する。N-H-O-B原子間の静電引力は、C-B結合の回転を制約することで、リボース複合体に対する選択性を生じさせる。ボロネートのうち1個のみがカルボキシレートに到達可能である。
【０２０５】
化合物53が有するボロン酸基はいずれも、化合物51に比べてさらに互いに離れかつカルボキシレートから離れている。1:9 DMSO:緩衝液の溶媒系中では、選択性は通常の挙動に従った(フルクトース＞リボース＞グルコース)。DMSO:緩衝液の比が1:9である場合、分子内静電相互作用は事実上存在せず、これにより、多くのありうる立体配座をとるさらなる自由が与えられる。糖類ビス-ボロネートが形成される場合、それらの間の相互作用は、平面状の発色団をわずかに曲げることでカルボキシレートとの相互作用を可能にすることができる。
【０２０６】
溶媒系を1:1 DMSO-緩衝液に変更した時点で、リボースに対する対称化合物53の親和性は大きく増加し、相対的に低い濃度でフルクトースについて観察された応答に近づいた。より有機的なこの溶媒系において、非対称ボロン酸化合物51は選択性を逆転させ、リボースに対して最も強く応答した。DMSO:緩衝液の比が1:1である系では、静電相互作用は非常に弱いが、分子が多くのありうる立体配座をとることを制約する上では十分に強い。図40は、2個のフルクトース分子を有する化合物53のビス-ボロネート複合体のモデルを示す。
【０２０７】
化合物51および53はいずれも1:9 DMSO:緩衝液系中で選択性の傾向(フルクトース＞リボース＞グルコース)を示した。化合物53は、濃度100mM未満での、対応する点灯NIR蛍光の最大140倍の増大および他の糖からの無干渉による、透明色から青緑色への変化を通じて、フルクトースにのみ応答したことから、選択的糖決定用の候補として特に魅力的である。
【０２０８】
実施例6
フルオロフォアのスクリーニング
開示されるフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートの態様は、以下を含む各フルオロフォアの特性を決定することでスクリーニングすることができる: 1) 各形態(すなわち中性およびイオン化)の吸収極大波長; 2) 各形態のモル吸光率; 3) 各形態の励起極大波長; 4) 各形態の発光極大波長(pmt(光電子増倍管)応答について補正); 5) 各形態のnmおよびエネルギーの両方の単位のストークスシフト; 6) 溶媒付加体、中性形およびイオン化形を含む波長領域(励起335〜800nm; 発光360〜850nm)を網羅する完全励起-発光マトリックスEEM(pmt応答について補正); 7) 各形態の相対量子収率; ならびに/または8) pKa(もしくは溶媒によっては見かけのpKa)。
【０２０９】
観察される発光ピークの吸収スペクトル、励起発光マトリックス(EEM)、一般的「レーザー線」励起時の発光スペクトル、および励起スペクトル、ならびに/またはpH滴定系列の系列希釈を含む、標準化手順は、フルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートおよびそれらの各種形態を特性決定するために必要なデータを与える。
【０２１０】
スクリーニングは2つの段階に分けることができる。第1の段階は、以下により構成される化合物の初期スクリーニングである:
段階1-A: 5% DMSOを有するpH 8.25緩衝液(pH 8.25は大部分のフルオロフォア(提示されるフッ素化誘導体を例外とする)のありうるpKaに近いかまたはそれよりもわずかに高く、したがってアニオン形および中性形はいずれも有意な(ほぼ等しい)量で存在する)中の約7.5μMの各化合物(吸収が約0.25を超える場合は濃度を低下させ、吸収が約0.05未満の場合は濃度を増加させる)の単一吸収スペクトルおよびEEM。DMSOは中性形に関する任意の潜在的な溶解性の問題に役立つ(フルオロフォアが十分に可溶性である場合、DMSOの量を減少させることができる)。
段階1-B: 1-Aと同じ手順、但し5%緩衝液、95% DMSOを用いる。
段階2: フルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートの複数濃度(モル吸光率および量子収率の測定用)ならびに複数のpH(pKaの測定用)を最も有望な候補について調査する。適切な量子収率の基準が利用可能である場合、絶対量子収率の推定が可能になる。
段階3: コンピュータ支援分子モデリングを使用することで、関心対象の分析物およびフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートの様々な幾何配置によって示される該分析物との潜在的相互作用を調査することができる。
【０２１１】
結果の解釈
段階1Aおよび1Bは豊富な予備データ(両溶媒中のそれぞれの種の吸収極大および発光極大、ならびに両溶媒中の長波長種の相対量子収率の推定値)を与える。この初期の第1スクリーニングはモル吸光率pKaまたは絶対量子収率に関する情報を与えない。選択された化合物を段階2および/または段階3においてさらに調査することができる。
【０２１２】
実施例7
生体液中の分析物の検出および定量化
有望なフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートを、関心対象の分析物(例えばGSH、システイン、ホモシステイン、SAICAr、S-Ado)とのそれらの結合を決定しかつ血液および/または尿からの任意の潜在的な干渉を決定するために調査することができる。血液成分に対するアルブミン色素の結合を定量化するために使用される公知の手順を利用することができる(Omoefe et al., J. of Biomed. Optics 2001, 6(3), 359-365)。
【０２１３】
主要体液成分を含有しかつ関心対象の分析物が添加された人工的血液溶液または尿溶液中で、測定を行うことができる。主要血液成分およびそれらの平均血中濃度(mg/L)は以下の通りである: HSA - 41,000、HDL - 850、LDL - 810、グロブリン - 32,000、赤血球(43.5%ヘマトクリット) 489,375(Abugo et al., J. Biomed. Opt., 2001, 6, 359-365; Abugo et al., Anal. Biochem., 2000, 279, 142-150)。ヒト尿の化学組成はNASAが徹底的に調査し、報告した(NASA Contractor Report CR-1802)。模擬尿および尿溶液の組成はNASAの発見に基づく。尿内容物を模擬するために、5つの主要成分(尿素、クレアチニン、シュウ酸塩、尿酸およびクエン酸塩)が既に使用された(Ow et al. IFMBE Proceedings, 2008, Vol. 21, Part 3, Part 11, 742-745; Osman et al., Biomed 2008 Proceedings 2008, 21, 742-745)。
【０２１４】
見かけの結合定数をモデル仮定なしに生の滴定データから直接推定することができるが、データの解析表現を使用することで複数の潜在的干渉による複合体混合物中のフルオロフォア挙動を模擬することができる。実験滴定曲線のフィットを含む現象学的アプローチを使用することで、実験データをモデリングし、生体液成分を含有する混合物中の各種フルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートの結合の概算を可能にすることができる。すべての血液(または尿)の成分を試験することが不可能なことがあるが、開示されるフルオロフォアの態様を関心対象の分析物に対する選択性についてスクリーニングするには主要成分を包含させれば十分なはずである。生体液中での標準検量線と最適緩衝液系中での標準検量線とを比較することで、マトリックス効果を評価することができる。
【０２１５】
選択性を実験結果とさらなるコンピュータ支援分子シミュレーションとの組み合わせに基づいて微調整することができる。GSHならびにSAICArおよびS-Adoの分析を真正な生体液中で(血中GSHならびに尿中SAICArおよびS-Ado)、較正(参照)用標準物質を添加した試料を使用しかつ品質管理(QC)試料を使用することで行うことができる。開発された方法論は(a) 正確さ、(b) 精度、(c) 選択性、(d) 感受性、(e) 再現性および(f) 安定性を含む方法開発用の標準的手順に従って評価することができる。分析物の回収率は標準的添加プロトコールを使用して決定することができる。使用されるすべての生体液は商業的供給源から購入することができる。
【０２１６】
溶液中の関心対象の分析物の定量化に最適な条件、およびOrfanos (Anal. Biochem., 1980, 104, 70-74)に記載のものと同様の方法論からの結果を、濾紙中に沈着した生体液中の関心対象の分析物の検出および定量化に適応させることができる。濾紙上の乾燥血液(または尿)試料を得ることができる。血斑については、円板を濾紙から穿孔し、血液内容物を少量の溶媒中に通常は溶出/抽出することができる。従来の分析では、ヘモグロビンからの吸収は依然として大きな干渉をなす。これは通常、ヘモグロビン含有量を確実に30μg/ml未満にするためにさらに希釈することで克服される。そのような希釈は、高濃度で存在する分析物の測定を複雑にするものであり、微量分析物の分析を妨げることさえある。予備結果(実施例3参照)に基づけば、開示されるNIRフルオロフォアの態様は少なくとも5%の全血の存在下で機能する。したがって、典型的な4.8mm円板の内容物を少量(0.6mL以下、本発明者らのフルオロフォアの1つを含有)中に抽出することを、希釈なしで直接使用することができる。
【０２１７】
開示されるフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートの特定の態様のフッ素化は、水溶液中の溶解性を促進することができる。特定の場合では、ジチオスレイトール(DTT)を分析用溶液に加えることでジスルフィド形成を防止および/または最小化することができる。開示されるフルオロフォアの少なくともいくつかの態様はDTTの存在下で機能する。さらに、血中GSHの約90%が還元形であって、グルタチオンジスルフィド(GSSG)レベルが患者および対照の両方において同様であるため(Atkuri et al., PNAS U.S.A., 2009, 106, 3941-3945)、全GSH-GSSGのモニタリング(溶液にDTTを加えることによる)が実行可能である。
【０２１８】
これらの研究は、関心対象の分析物に強くかつ選択的に結合するNIRフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートの同定を可能にしうる。結合時の蛍光増大を評価して、フルオロフォアまたはフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートのどの幾何配置および官能基が標的分析物または特定の干渉成分に好都合であるかを決定するために利用することができる。
【０２１９】
実施例8
グルタチオン選択性評価
機構研究を対照実験(生理的条件下のまたは必要であれば共溶媒の存在下での緩衝化媒質)において行うことで、開示されるNIRフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートの態様による関心対象の分析物について観察される選択性の起源を決定することができる。コンジュゲート、付加体または反応生成物を単離し、HPLCおよびLC-MS ESIによって特性決定することができる。単離された複合体、付加体または反応生成物の結晶構造をX線結晶構造解析によって決定することができる。関心対象の分析物とNIRフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートとの間の複合体形成に関する結合定数を、1H NMR、2D 1H NMR(ROESY、NOESY)、紫外可視または蛍光を含む分光測定法を使用して得ることができる。選択性および交差反応性を、ありうる干渉(例えばGSHに対するCys、Cys-Glyおよび/またはCys-Glu)の存在下で評価することができる。pH、イオン強度、緩衝系の種類、および分析物:NIRフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートのモル比を含む、選択性/特異性に関与する要因の影響を、分光測定の方法論を使用して評価することができる。
【０２２０】
実施例9
尿中のSAICArおよびS-Adoの選択的検出
少なくとも1個のボロン酸官能基(すなわちRcが上記定義の通りである-NHRc)で官能化された、開示されるフルオロフォア-ビオローゲンコンジュゲートの態様は、ADLS欠損症の指示薬として役立ちうる。実施例5において行ったものと同様の機構調査および特性決定研究を使用することで、SAICArおよび/またはS-Ado検出に対する選択性を決定することができる。有望な候補を尿試料および/または合成尿試料中で評価することができる。
【０２２１】
本開示に関連しうる主題または背景情報を記述するさらなる特許文献としては米国特許出願公開第2008/0261315号、米国特許出願公開第2010/0051826号、WO 2008/011508号およびPCT/US2010/062582号が挙げられ、それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２２２】
開示される本発明の原理を適用することができる多くの可能な態様を考慮して、例示される態様が、単に本発明の好ましい例でしかなく、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではないということを認識すべきである。むしろ、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲によって規定される。したがって本発明者らは、これら請求項の範囲および真意内にあるすべてを、本発明者らの発明として特許請求する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【国際調査報告】
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