(57)【要約】本発明は、近視を含む眼軸長関連障害を診断する方法を提供する。本発明はまた、近視を含む眼軸長関連障害を治療および制限する方法も提供する。さらに、本発明は、近視およびボルンホルム眼病を含む眼軸長関連障害に関連する特定のハプロタイプを提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の近視になる可能性を決定する方法であって、
ａ）患者から得られた生体サンプルを調べて前記患者のＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプを決定するステップ；および
ｂ）前記ハプロタイプを予測等価球面屈折度と相関させるステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記Ｌ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプが表１に示されるハプロタイプ１〜１３のうちの１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ．前記患者の眼のＬ：Ｍ錐体比を決定するステップ；および
ｂ．前記Ｌ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプおよび前記Ｌ：Ｍ錐体比を予測等価球面屈折度と相関させるステップ
をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
患者の眼軸長関連障害への罹りやすさを診断する方法であって、患者から得られた生体サンプルを、患者のＬオプシン遺伝子またはＭオプシン遺伝子のアミノ酸の特定の組合せに関して調べることを含み、表１に示されるアミノ酸の組合せのうち１つが存在する場合、前記患者は眼軸長関連障害に罹りやすいとする方法。
【請求項５】
患者の眼軸長関連障害への罹りやすさを診断する方法であって、
ａ．患者から得られた生体サンプルを調べて前記患者のＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプを決定するステップ；および
ｂ．前記ハプロタイプを予測等価球面屈折度と相関させるステップ
を含み、前記予測等価球面屈折度が負のジオプターである場合、前記患者は眼軸長関連障害に罹りやすいとする方法。
【請求項６】
前記Ｌ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプが表１に示されるハプロタイプ１〜１３のうちの１つである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ａ．前記患者の眼のＬ：Ｍ錐体比を決定するステップ；および
ｂ．前記Ｌ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプおよび前記Ｌ：Ｍ錐体比を予測等価球面屈折度と相関させるステップ
をさらに含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記眼軸長関連障害が近視である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
眼軸長関連障害を治療する方法であって、
ａ．患者から得られた生体サンプルを調べて前記患者のＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプを決定するステップ；
ｂ．前記患者の眼のＬ：Ｍ錐体比を決定するステップ；
ｃ．前記ハプロタイプおよび前記Ｌ：Ｍ錐体比を予測等価球面屈折度と相関させるステップ；
ｄ．前記患者の予測等価球面屈折度が負のジオプターであれば、前記患者に波長依存性フィルタを含む治療装置を提供するステップ
を含む、方法。
【請求項１０】
前記Ｌ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプが表１に示されるハプロタイプ１〜１３のうちの１つである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記波長依存性フィルタが赤色光を遮断する、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記波長依存性フィルタが緑色光を遮断する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記波長依存性フィルタにより透過される波長が前記患者のＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプおよびＬ：Ｍ錐体比に基づいて選択される、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記治療装置が輪郭ぼけ誘発レンズを備える眼鏡である、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記輪郭ぼけ誘発レンズが、前記レンズの片面または両面の小さな凸部または凹部；前記レンズ内へのレンズ材料とは異なる材料の包含；前記レンズへの高レベル収差の組み込み；前記レンズの片面または両面への回折散乱または拡散により輪郭ぼけを生じさせるコーティングまたはフィルムの適用のうち１つ以上によって輪郭ぼけを誘発する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療装置が輪郭ぼけ誘発コンタクトレンズを含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記輪郭ぼけ誘発コンタクトレンズが、前記レンズへのレンズ材料とは異なる材料の包含；前記レンズへの高レベル収差の組み込み；前記レンズの片面または両面への回折散乱または拡散により輪郭ぼけを生じさせるコーティングまたはフィルムの適用のうち１つ以上によって輪郭ぼけを誘発する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
表１に示されるハプロタイプ１〜１３のうちの少なくとも１つを同定することができる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドセットを含むマイクロアレイ。
【請求項１９】
ａ．表１に示されるハプロタイプ１〜１３のうちの少なくとも１つを同定することができる少なくとも１対のオリゴヌクレオチドと、
ｂ．使用説明書
とを含む、キット。
【請求項２０】
表１に示されるハプロタイプ１〜１３のうちの少なくとも１つを検出するためのアッセイを含むキット。
【請求項２１】
近視に関連する変異型赤色感光色素タンパク質を含む、眼軸長関連障害のマウスモデル。
【請求項２２】
緑色感光色素タンパク質をさらに含む、請求項２１に記載のマウスモデル。
【請求項２３】
前記緑色感光色素タンパク質が近視に関連する変異型Ｌオプシン感光色素タンパク質である、請求項２２に記載のマウスモデル。
【請求項２４】
ディスプレイスクリーンに曝されることによって起こる被験者の眼における屈折異常の導入を制限する方法であって、前記被験者が、ディスプレイスクリーンから発せられる赤色光を前記被験者の眼に入る前に優先的に遮断することができる波長依存性フィルタを含む治療用光学装置を装着し、それにより、前記被験者の眼における屈折異常の導入を制限することを含む、方法。
【請求項２５】
被験者における眼軸長関連障害の発症を制限する方法であって、前記被験者が、ディスプレイスクリーンから発せられる赤色光を前記被験者の眼に入る前に優先的に遮断することができる波長依存性フィルタを含む治療用光学装置を装着し、それにより、前記被験者における眼軸長関連障害の発症を制限することを含む、方法。
【請求項２６】
前記眼軸長関連障害が近視である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記治療用光学装置が輪郭ぼけ誘発レンズをさらに含む、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記輪郭ぼけ誘発レンズがレンズ表面に適用されるホログラフィックディフューザを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記治療用光学装置が眼鏡を含む、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記治療用光学装置がコンタクトレンズを含む、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ディスプレイスクリーンがコンピュータモニタ、タブレットモニタ、テレビスクリーン、携帯用デバイススクリーン、テレビゲームスクリーン、ヘッドマウントディスプレイスクリーン、および映画館のスクリーンからなる群から選択される、請求項２４〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記被験者が１８歳以下である、請求項２４〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記被験者が眼軸長関連障害に罹りやすい被験者である、請求項２４〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記被験者が表１に示されるＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプを持っている場合、前記被験者は眼軸長関連障害に罹りやすいとされる請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記患者のＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプが質量分析を用いて決定される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
米国政府支援の記載
本研究は、米国国立衛生研究所の助成Ｒ０１ＥＹ０９６２０、Ｐ３０ＥＹ０１９３１およびＰ３０ＥＹ０１７３０によって支援されたものである。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、近視を含む眼軸長関連障害を検出および治療する方法に関する。さらに、本発明は、眼軸長関連障害に関連する特定のハプロタイプに関する。
【背景技術】
【０００３】
正視化と呼ばれる過程で、眼軸長の成長は、視覚経験によって、眼の光学系を適合させ、角膜／レンズの曲率と視力における遺伝的バリエーションを補償するように調節される。高い明所視力、従って、正視化を導く信号は、長波長（Ｌ）および中波長（Ｍ）感受性錐体光受容体に見られる感光色素における光の吸収によって誘発される。ぼやけた画像と鮮明に焦点が合った画像を特徴付ける網膜画像における明暗パターンの変化が生体プロセスによって監視され、協調した平面（中立的）光学系に適当な長さに達した際に眼の成長を停止する。しかしながら、近視者では、発育中に眼全体の大きさに対する相対的な眼の軸長が、遠くの物にほぼ最適に焦点が合う長さを超えて延び続け、ますます顕著な近視となる。
【０００４】
近視の罹患率は世界の多くの地域で警戒の必要な率に増えつつある。遺伝的因子が疑われたが、最近まで、小児期の読書のしすぎが近視の発生に関連する唯一の特定可能な環境因子または行動因子であると考えられていた。読書の制限（および屋外活動の奨励）がこれまでのところ、子供の過度の眼の伸長を防ぐための唯一の実際的技術であり、眼鏡およびコンタクトレンズを含む矯正レンズが、近視を含む眼軸長関連障害を改善するための主要な手段である。これらの処置は眼軸長関連障害に関連する屈折異常を視力的に矯正するが、根底にある原因、すなわち、眼軸長の過度な成長に対処するものではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
よって、眼軸長関連障害への罹りやすさを検出する方法、およびこのような個体に対する過度な眼軸伸長を防ぐ治療の必要が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、患者の近視になる可能性を決定する方法であって、患者から得られた生体サンプルを調べて患者のＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプを決定すること；および前記ハプロタイプを予測等価球面屈折度と相関させることを含む方法を提供する。別の態様では、本方法は、患者の眼のＬ：Ｍ錐体比を決定するステップ；および前記Ｌ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプおよび前記Ｌ：Ｍ錐体比を予測等価球面屈折度と相関させるステップをさらに含む。
【０００７】
本発明はまた、患者の眼軸長関連障害への罹りやすさを診断する方法も提供し、前記方法は、患者から得られた生体サンプルを調べて患者のＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプを決定すること；および前記ハプロタイプを予測等価球面屈折度と相関させることを含み；前記予測等価球面屈折の異常（ジオプターとして測定）が負の指数（negative power）を持つ場合、前記患者は眼軸長関連障害に罹りやすいとする。一態様では、本方法は、患者の眼のＬ：Ｍ錐体比を決定するステップ；および前記Ｌ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプおよび前記Ｌ：Ｍ錐体比を予測等価球面屈折度と相関させるステップをさらに含む。
【０００８】
本発明はさらに、患者の眼軸長関連障害への罹りやすさを診断する方法も提供し、前記方法は、患者から得られた生体サンプルを、患者のＬオプシン遺伝子またはＭオプシン遺伝子によりコードされるアミノ酸の特定の組合せに関して調べることを含み、表１に示されるアミノ酸の組合せのうち１つが存在する場合、前記患者は眼軸長関連障害に罹りやすいとする。
【０００９】
さらに、本発明は、眼軸長関連障害を治療する方法であって、患者から得られた生体サンプルを調べて患者のＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプを決定すること；患者の眼のＬ：Ｍ錐体比を決定すること；前記ハプロタイプおよび前記Ｌ：Ｍ錐体比を予測等価球面屈折度と相関させること；前記患者の予測等価球面屈折度異常が負の符号(negative power)を持てば、前記患者に波長依存性フィルタを含む治療装置を提供することを含む方法を提供する。
【００１０】
一態様では、前記波長依存性フィルタにより透過される波長は、患者のＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプおよびＬ：Ｍ錐体比に基づいて選択される。
別の態様では、本発明の方法で使用される治療装置は、輪郭ぼけ誘発（blur-inducing）レンズを備える眼鏡である。特定の態様では、輪郭ぼけ誘発レンズは、レンズの片面または両面の小さな凸部または凹部；レンズへのレンズ材料とは異なる材料の包含；レンズへの高レベル収差の組み込み；一方または両方のレンズによる、隣接する錐体光受容体の活動間の相互関係の増強；およびレンズの片面または両面への拡散性または回折性輪郭ぼけを生じさせるコーティングまたはフィルムの適用のうち１つ以上によって輪郭ぼけを誘発する。
【００１１】
さらに別の態様では、本発明の方法で使用される治療装置は、輪郭ぼけ誘発コンタクトレンズを含む。特定の態様では、輪郭ぼけ誘発コンタクトレンズは、レンズへのレンズ材料とは異なる材料の包含；レンズへの高レベル収差の組み込み；およびレンズの片面または両面への、拡散、回折または光散乱により輪郭ぼけを生じさせるコーティングまたはフィルムの適用のうちの１つ以上によって輪郭ぼけを誘導する。
【００１２】
特定の態様では、本発明の方法において同定されるＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプは、表１に示されるハプロタイプ１〜１３のうちの１つである。
本発明はまた、表１に示されるハプロタイプ１〜１３のうちの少なくとも１つを同定することができる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドセットを含む、患者の眼軸長関連障害への罹りやすさを決定するためのマイクロアレイも提供する。
【００１３】
本発明はさらに、患者が眼軸長関連障害に罹りやすいかどうかを決定するためのキットも提供する。一態様では、本発明のキットは、表１に示されるハプロタイプ１〜１３のうち少なくとも１つを同定することができる少なくとも１対のオリゴヌクレオチドと使用説明書とを含む。別の態様では、本発明のキットは、表１に示されるハプロタイプ１〜１３のうちの少なくとも１つを検出するためのアッセイを含む。
【００１４】
別の態様では、本発明は、ディスプレイスクリーンに曝されることによって起こる被験者の眼における屈折異常の導入を制限する方法であって、被験者が、ディスプレイスクリーンから発せられる赤色光を被験者の眼に入る前に優先的に遮断することができる波長依存性フィルタを含む治療用光学装置を装着し、それにより、被験者の眼における屈折異常の導入を制限することを含む方法を提供する。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、被験者における眼軸長関連障害の発症を制限する方法であって、被験者が、ディスプレイスクリーンから発せられる赤色光を被験者の眼に入る前に優先的に遮断することができる波長依存性フィルタを含む治療用光学装置を装着し、それにより、被験者における眼軸長関連障害の発症を制限することを含む方法を提供する。一実施形態では、前記眼軸長関連障害は近視を含む。
【００１６】
本発明の特定の好ましい実施形態は、以下の特定の好ましい実施形態のより詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】正常対照（Ａ）と比較したＬＩＡＶＡ変異体を有する被験者（Ｂ、Ｃ、Ｄ）の錐体モザイクの平均的補償光学網膜画像。Ｂ、ＣおよびＤで示される被験者では、ＬＩＡＶＡ変異体を発現する錐体は、正常錐体に比べて低い反射率を持ち、モザイク中の暗い領域として見られる。ＬＩＡＶＡ変異体を発現する錐体の割合には大きな変動がある。Ｂ、ＣおよびＤは、近視誘発変異体を発現する錐体の割合が低、中および高程度であり、これは眼軸長（Ｅ）と、また、屈折異常とも相関している。
【図２】異なる人種の眼軸長と錐体比の関係。人種間でＬ：Ｍ錐体比と眼軸長（および近視罹患率）の間には強い正の相関が見られた。
【図３】（Ａ）男性１５９名の１３の異なるＬ／Ｍ感光色素ハプロタイプの近視になる可能性（近視になる可能性が低い方から順に配置）。各ハプロタイプを有する個体数を右に示す。ハプロタイプの表記は、一文字アミノ酸コードを使用している：Ｍ＝メチオニン、Ｉ＝イソロイシン、Ｓ＝セリン、Ｖ＝バリン、Ａ＝アラニン、およびＬ＝ロイシン。平均ＳＥＲは、ハプロタイプごとに、最も近視度の高い半数の被験者に関して計算した平均等価球面屈折度±１ＳＥＭである。（Ｂ）（Ａ）に記載されたものに相当するハプロタイプを有する１１名の被験者の測定等価球面屈折度（ＳＥＲ： spherical equivalent refraction）に対する予測等価球面屈折度。被験者ごとにＬ：Ｍ錐体比を評価し、Ｌ錐体＋Ｍ錐体に対するＬ錐体のパーセンテージとして表す。
【図４】（Ａ）１日２時間赤色光を当てることによってもたらされた近視化。試験手順の開始前に各被験者の眼軸長を測定した。その後、各被験者は１日２時間、右のレンズは無色で、左のレンズは、Ｍ錐体よりもはるかにＬ錐体が活性化されるように色を付けたゴーグルを装着しながら白黒テレビゲームを行った。（Ｂ）試験レンズを装着した２０個の眼についての、また（Ｃ）各試験眼の対照となるもう片方の２０個の眼についての、時間の関数としての正規化眼軸長測定値。誤差バー付きの黒い線は、全ての眼の平均を表す（誤差バー±２ＳＥＭ）。試験レンズは、近視の子供の眼の成長速度を有意に低下させた。（Ｄ）試験レンズを装着した眼の成長速度を左に、対照レンズを装着した眼の成長速度を右に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書に記載される特定のものは、例として、また、本発明の好ましい実施形態を単に例示的に述べることを目的とするものであり、本発明の種々の実施形態の原理および概念的態様の最も有用かつ容易に理解される記載であると考えられるものを示すために提示される。これに関しては、本発明の基本的理解に必要なもの以上の本発明の構造的詳細を示そうとするものではなく、この記載を図面および／または例とともに理解すれば、本発明のいくつかの形態が実際にどのように具体化することができるかが当業者に明らかとなる。
【００１９】
以下の定義および説明は、以下の例において明らかに疑いなく改変されていない限り、またはその意味の適用がいずれかの構成を無意味または本質的に無意味にする場合でない限り、今後のいずれの構成にも効力を及ぼすことを意味し、意図される。この用語の構成がそれを無意味または本質的に無意味にする場合には、その定義は、Webster’s Dictionary第３版、または当業者に公知の辞書、例えば、Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (Anthony Smith編, Oxford University Press, Oxford, 2004)から採用すべきである。
【００２０】
本明細書において、特に断りのない限り、「a」および「an」という用語は、「１つ」、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味するものとする。文脈上、そうではない必要がない限り、本明細書で用いられる単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００２１】
特定の実施形態では、本発明は、眼軸長関連障害の予防的処置の利益を判定するため、また、眼軸長関連障害に罹りやすいと同定される患者のための予防的光学装置の特徴について適当な処方を決定するために使用できる方法を提供する。本明細書に述べられているように、このような予防的光学装置には、管理せずに放置すれば眼軸長関連障害に至る眼軸長の成長を抑制することができるスペクトル特徴および／または分散特性が含まれる。
【００２２】
一実施形態では、本発明は、患者の眼軸長関連障害への罹りやすさを診断する方法を提供し、前記方法は、患者から得られた生体サンプルを調べて患者のＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプを決定すること；および前記ハプロタイプを予測等価球面屈折度と相関させることを含み、前記予測等価球面屈折度が負のジオプターである場合、前記患者は眼軸長関連障害に罹りやすいとする。
【００２３】
本明細書において「相関させる」とは、本明細書において示され、述べられているように、患者の眼軸長関連障害への罹りやすさを決定するために、患者の錐体比とオプシンハプロタイプに関する情報との組合せを用いるステップを意味する。
【００２４】
本明細書において「眼軸長関連障害」とは近視を含むがこれに限定されない。
一実施形態では、Ｌ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプは、患者のＤＮＡのヌクレオチド配列を同定して患者のＸｑ２８オプシン遺伝子座ハプロタイプを決定することにより決定される。ハプロタイプは、ＯＰＮ１ＬＷおよびＯＰＮ１ＭＷ遺伝子のエキソン２、３および４のヌクレオチド配列を同定することにより決定することができる。本明細書に述べられているように、ハプロタイプは、ＯＰＮ１ＬＷおよびＯＰＮ１ＭＷ遺伝子のコドン６５、１１１、１１６、１５３、１７１、１７８、１８０、２３０、２３３および２３６によりコードされているアミノ酸によって生じる。特定の実施形態では、ハプロタイプは、エキソン３のコドン１５３、１７１、１７８および１８０、ならびにエキソン４のコドン２３６によりコードされるアミノ酸によって決定される。好ましい実施形態では、Ｌ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプは、本明細書において近視に関連するとして最初に示した表１に示される１３のハプロタイプのうちの１つである（実施例および図３Ａ参照）。従って、患者が表１に示された１３のハプロタイプのうちの１つを持つ場合、その患者は眼軸長関連障害に罹りやすいと診断される。特に、表１に示されるハプロタイプのうちの１つを有する患者は、近視になりやすいと診断される。一実施形態では、患者において、表１に示される、Ｌ−オプシン遺伝子に関連する変異型アミノ酸の組合せのうちの１つが同定された場合、その患者は近視なりやすいと診断される。別の実施形態では、患者において、表１に示される、Ｍ−オプシン遺伝子に関連する変異型アミノ酸の組合せのうちの１つが同定された場合、その患者は近視になりやすいと診断される。
【００２５】
【表１】
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別の実施形態では、本発明は、患者の眼軸長関連障害への罹りやすさを診断する方法を提供し、前記方法は、患者から得られた生体サンプルを調べて患者のＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプを決定すること、患者の眼のＬ：Ｍ錐体比を決定すること、および前記Ｌ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプおよび前記Ｌ：Ｍ錐体比を予測等価球面屈折度と相関させることを含み、前記予測等価球面屈折の異常（ジオプターとして）が負の指数（negative power）を持つ場合、前記患者は眼軸長関連障害に罹りやすいとする。
【００２６】
Ｌ：Ｍ錐体比は、当業者に公知の方法を用いて決定することができる。例えば、本明細書に記載のように補償光学網膜撮像法を使用することができ、または網膜電図（ＥＲＧ： electroretinogram）（フリッカ測光ＥＲＧなど）および個別化錐体スペクトルを使用することもできる。Ｌ：Ｍ錐体比の測定は、例えば、Neitz and Neitz, J. Vis. 2:531-42, 2002に記載されているような遺伝学も含み得る。Ｌ：Ｍ錐体比を測定するもう１つの限定されない例としては、Kuchenbeckerら, Vis. Neurosci. 25(3):301-6, 2008に記載されているような広角カラー多局所ＥＲＧが含まれる。Ｌ：Ｍ錐体比を測定する別の限定されない例としては、Gunther and Dobkins Vision Research 42: 1367-1378, 2002に記載されているような心理物理学的異色フリッカ測光を用いて、ちらつきが最小であると知覚された赤色光／緑色光の比率を測定することを含む。
【００２７】
一実施形態では、本発明は、患者の近視になる可能性を決定する方法であって、患者から得られた生体サンプルを調べて患者のＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプを決定することを含む方法を提供する。
【００２８】
本明細書において「近視になる可能性」という用語は、Ｌ：Ｍオプシンハプロタイプに関連する予測等価球面屈折度を参照し、この予測等価球面屈折度は、患者が有する、または有する可能性のある予測近視度に相関する。特に、近視になる可能性は、例えば図３Ａに示されているように、患者の特定のＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプに基づいて予測されるある特定の等価球面屈折度を参照する。
【００２９】
特定の実施形態では、近視になる可能性は、より具体的には、患者のＬ：Ｍ錐体比を測定すること、およびその比を特定のＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプに関して予測される等価球面屈折度と相関させることにより決定することができる。例えば、以下の実施例に述べられているように、Ｌ：Ｍ錐体比は、表１に示されるハプロタイプのような特定のＬ：Ｍオプシンハプロタイプを有する患者に関して決定することができる。Ｌ：Ｍ錐体比を決定し、より具体的な予測される近視になる可能性を得るための計算を行う。例えば、被験者がハプロタイプ８（図３Ａ）を持っていた場合、その近視になる可能性は−４．５ジオプターである。被験者が１：１の錐体比を持っていた場合、最大−４．５ジオプターの屈折異常を有すると予測される。しかしながら、被験者が１００パーセントに近いＬ錐体を持っていた場合、ほぼ正視であると予測される。７５％Ｌ錐体は、１：１錐体比（５０％Ｌ）と１００％Ｌの間にあるので、ハプロタイプ８と７５％Ｌ錐体を有する被験者は、５０％のＳＥＲ（すなわち、−４．５／２＝−２．２５ジオプター）を有すると予測される。
【００３０】
本明細書において「眼軸長関連障害への罹りやすさ」は、特定のＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプが存在する場合に、近視などの眼軸長関連障害を発症する可能性の高さを参照する。一実施形態では、患者は、表１に示されるハプロタイプ（近視になる可能性が低い方から順に挙げられている）のうちの１つが存在する場合、眼軸長関連障害に罹りやすいとみなされる。
【００３１】
眼軸長関連障害に罹りやすく、かつ／または本明細書に記載されるように負のジオプターに関連する近視になる可能性のある患者を同定した後、眼科衛生士は治療プロトコールを処方し、かつ／または患者の近視になる可能性への対処もしくは低減を意図した特定の行動を提案することができる。例えば、患者は治療装置（例えば、本明細書に記載の通り）を用いて治療されてもよいし、あるいは薬理学的介入を行ってもよい。このような処置に加えて、またはこのような処置の代わりに、患者に、赤色光または緑色光への曝露を制限すること（患者の特定のＬ：Ｍ変異体に応じて）、幼齢時の読書を制限すること、および屋外活動をする時間を長くすることを伝えることができる。
【００３２】
本明細書において「生体サンプル」には、限定されるものではないが、血液、唾液、頬スワブで得た細胞、皮膚生検、羊水、種々の他の組織などが含まれる。生体サンプルから診断アッセイに用いる核酸を精製または部分精製する方法は当技術分野で周知である。核酸は例えば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。ゲノムＤＮＡは、例えば、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、カナダ）を用いて末梢血白血球から単離することができる。
【００３３】
別の実施形態では、本発明は、患者においてボルンホルム眼病（ＢＥＤ：Bornholm Eye Disease）を診断する方法を提供し、前記方法は、患者から生体サンプルを得ること、および患者のＬおよびＭオプシン遺伝子のヌクレオチド配列を同定することを含み、患者が正常なオプシン遺伝子と変異型オプシン遺伝子とを持つ場合、その患者はＢＥＤを有すると診断される。好ましい実施形態では、変異型オプシン遺伝子は、ＬまたはＭオプシン遺伝子のいずれかにおいて、アミノ酸１５３位にロイシン（Ｌ１５３）、１７１位にバリン（Ｖ１７１）、１７４位にアラニン（Ａ１７４）、１７８位にバリン（Ｖ１７８）、および１８０位にアラニン（Ａ１８０）を（「ＬＶＡＶＡ」）、またはアミノ酸１５３位にロイシン（Ｌ１５３）、１７１位にイソロイシン（Ｉ１７１）、１７４位にアラニン（Ａ１７４）、１７８位にバリン（Ｖ１７８）、および１８０位にアラニン（Ａ１８０）（「ＬＩＡＶＡ」）を含む。別の実施形態では、他方の遺伝子は、１５３位、１７１位、１７４位、１７８位、および１８０位のアミノ酸にメチオニン、バリン、バリン、バリン、およびアラニンの組合せ（「ＭＶＶＶＡ」）を有する。
【００３４】
本発明の診断方法は、患者のＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプを決定するための標準的な分子生物学的方法の使用を含み、１つの非限定的実施形態においてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction）を含む。現在、ＬおよびＭオプシン遺伝子のＤＮＡ配列の調査を可能とする、利用可能な様々な分子生物学的方法がある。例えば、遺伝子断片を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅してもよい。遺伝子は、従前に記載されているように(Neitzら, Vision Research 35: 2395-2407, 1995)個別かつ選択的に増幅することができる。
【００３５】
増幅された遺伝子断片に対してＤＮＡ配列に関する情報を得る以下の手順のうちの１つ以上を行うことが好ましい。
１）従前に記載されているような(J. Neitz, M. Neitz and Grishok, 前掲, 1995)ＰＣＲ産物の直接的ＤＮＡ配列決定。
【００３６】
２）制限消化分析（従前にJ. Neitz, M. Neitz and Grishok, 前掲, 1995に記載）。
３）一本鎖コンフォメーション多形または他の類似の手順。増幅されたＤＮＡ断片を蛍光または放射性物質で末端標識し、変性させて一本鎖とし、これらの鎖を電気泳動で分離する。電場でのこれらの鎖の移動度に基づき、ＤＮＡ配列に関する情報を推定することができる。
【００３７】
別の実施形態では、本発明は、眼軸長関連障害を治療する方法であって、患者から得られた生体サンプルを調べて患者のＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプを決定すること；患者の眼のＬ：Ｍ錐体比を決定すること；前記ハプロタイプおよび前記Ｌ：Ｍ錐体比を予測等価球面屈折度と相関させること；前記患者の予測等価球面屈折度が負のジオプターであれば、前記患者に波長依存性フィルタを含む治療装置を提供することを含む方法を提供する。一実施形態では、Ｌ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプは、表１に示されるハプロタイプ１〜１３のうちの１つである。
【００３８】
国際公開第２０１０／０７５３１９号（参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）に述べられているように、オプシン遺伝子の遺伝子変異は、オプシン光受容体タンパク質の吸光度特性に影響を及ぼす。従って、本発明の方法で使用される波長依存性フィルタは、変異型オプシン光受容体タンパク質の有効吸光度スペクトルを調整するために、光を眼に入る前にフィルタにかけることを意図する。変異型Ｍ−オプシン遺伝子により生じる、正常型Ｍ光受容体タンパク質よりも光の吸収が少ない欠陥型Ｍ光受容体タンパク質を有する患者では、この波長依存性フィルタが赤色光を優先的に遮断し得る。他方、変異型Ｍ−オプシン遺伝子により生じる、正常型Ｌ光受容体タンパク質よりも光の吸収が少ない欠陥型Ｌ光受容体タンパク質を有する患者では、この波長依存性フィルタは緑色光を優先的に遮断し得る。
【００３９】
特定の実施形態では、本発明の方法で使用される特定の波長依存性フィルタは、患者のＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプ（特定の光受容体変異体を特定する）および／または患者のＬ：Ｍ錐体比（患者の眼に存在するＭ光受容体に対するＬ光受容体の数を特定する）に基づいて選択することができる。特定のＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプおよび／またはＬ：Ｍ比に基づき、フィルタは極めて特定的な波長を遮断および／または伝達して欠陥型光受容体タンパク質の相対的な吸収特性を回復させるように設計することができる。よって、本発明はさらに、特定の患者のＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプおよび／またはＬ：Ｍ錐体比に基づき、前記患者の治療装置をカスタマイズする方法を提供する。例えば、患者がより活性な赤色（Ｍ）錐体に関連するオプシン変異体を持っていた場合、フィルタは赤色光を遮断するように設計することができ、患者がより活性な緑色（Ｌ）錐体に関連するオプシン変異体を持っていた場合には、フィルタは緑色光を遮断するように設計することができる。
【００４０】
特定の実施形態では、治療装置は、例えば、国際公開第２０１０／０７５３１９号に記載されているような輪郭ぼけ誘発レンズを含む。一実施形態では、この装置は、輪郭ぼけ誘発レンズを備える眼鏡であり、この場合、輪郭ぼけは網膜の隣接する錐体光受容体間の相対的活性（本明細書において、眼を刺激して異常な長さに成長させるシグナルを生じることが示されている）を低減するように設計される。輪郭ぼけ誘発レンズは、例えば、レンズの片面または両面の小さな凸部または凹部；レンズ内へのレンズ材料とは異なる材料の包含；レンズへの高レベル収差の組み込み；光散乱、回折または拡散により輪郭ぼけを生じさせるコーティングまたはフィルムの、レンズの片面または両面への適用のうち１つ以上によって輪郭ぼけを誘発するように作製することができる。
【００４１】
さらに別の実施形態では、治療装置は、輪郭ぼけ誘発コンタクトレンズを含む。輪郭ぼけ誘発コンタクトレンズは、例えば、レンズへのレンズ材料とは異なる材料の包含；レンズへの高レベル収差の組み込み；一方または両方のレンズに、レンズの中心からレンズの下部に向かい段階的な負の集光を設けること；および光散乱、拡散または回折により輪郭ぼけを生じさせるコーティングまたはフィルムの、レンズの片面または両面への適用のうち１つ以上によって輪郭ぼけを誘発するように作製することができる。
【００４２】
１つのさらなる態様では、本発明は、ディスプレイスクリーンに曝されることによって起こる被験者の眼における屈折異常の導入を制限する方法であって、被験者が、ディスプレイスクリーンから発せられる赤色光を被験者の眼に入る前に優先的に遮断することができる波長依存性フィルタを含む治療用光学装置を装着し、それにより、被験者の眼における屈折異常の導入を制限することを含む方法を提供する。
【００４３】
なおさらなる態様では、本発明は、被験者における眼軸長関連障害の発症を制限する方法であって、被験者が、ディスプレイスクリーンから発せられる赤色光を被験者の眼に入る前に優先的に遮断することができる波長依存性フィルタを含む治療用光学装置を装着し、それにより、被験者における眼軸長関連障害の発症を制限することを含む方法を提供する。一実施形態では、眼軸長関連障害は近視を含む。
【００４４】
これらの方法は、スクリーンディスプレイからの赤色光に過度に曝されることによって起こる眼の損傷を制限するために使用することができる。種々の非限定的実施形態では、スクリーンディスプレイは、コンピュータモニタ、タブレットモニタ、テレビスクリーン、携帯用デバイススクリーン、テレビゲームスクリーン、ヘッドマウントディスプレイスクリーン、および映画館のスクリーンであり得る。
【００４５】
本明細書において「制限する」とは、（ａ）被験者の眼における屈折異常導入の発生率を低減すること、および／もしくは治療された被験者において発症する眼軸長関連障害の発生率を低減すること；（ｂ）その後被験者の眼に発症した屈折異常の重篤度を軽減すること、および／もしくはその後被験者に発症した眼軸長関連障害の重篤度を軽減すること；ならびに／または（ｃ）被験者の眼の屈折異常および／または眼軸長関連障害に特徴的な症状の発症を制限もしくは予防することのうち１つ以上を意味する。
【００４６】
これらのさらなる態様のそれぞれにおいて、治療用光学装置は、限定されるものではないが、国際公開第２０１０／０７５３１９号に開示されているもの、および上記に開示されるものなどを含む、輪郭ぼけ誘発レンズをさらに含んでよい。一実施形態では、輪郭ぼけ誘発レンズは、例えば、下記実施例に記載されているような、レンズ表面に適用されるホログラフィックディフューザを含む。ホログラフィックディフューザは、例えば、ディスプレイからの入射光線を所望の角度で拡散させて、わずかな輪郭ぼけを作り出し、これより、隣接する錐体間の活性の差異を低減するために使用することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、治療用光学装置は、限定されるものではないが、眼鏡およびコンタクトレンズを含め、好適ないずれのタイプのものでもよい。
【００４７】
２１歳以下、好ましくは、３〜２１歳、３〜２０歳、３〜１９歳、または３〜１８歳の間の子供を含め、いずれの適した被験者をこれらの態様で処置してもよい。上記実施形態のいずれとも組合せ可能な別の実施形態では、被験者は例えば近視などの眼軸長関連障害に罹りやすい。この実施形態は、前述の開示のいずれかで述べたようなリスクのあるいずれかの被験者を治療することを含み得る。１つの特定の実施形態では、被験者が表１に示されるＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプを持つ場合、その被験者は眼軸長関連障害に罹りやすい。
【００４８】
一実施形態では、本発明は、例えば、眼軸長関連障害の診断に使用可能なキットを提供する。特定の実施形態では、本発明のキットは、表１に示されるものなどのＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプの有無を識別するためのハプロタイプ特異的オリゴヌクレオチドセットを含む。例えば、キットは、本明細書に記載のハプロタイプ、例えば、表１に挙げられているハプロタイプのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、または１３に関連するエキソン３および４の部分を増幅するためのプライマー対のセット；本明細書に記載のハプロタイプに関連するエキソン３および４の部分にハイブリダイズし得るプローブのセット；および／またはＳＮＰチップなどのマイクロアレイを含む。プライマーおよびプローブは、当業者ならば本明細書に記載のハプロタイプに関連するエキソン３および４の部分に関連する配列を参照することによって、すぐにかつ容易に設計することができる。マイクロアレイもまた、本明細書に記載のハプロタイプに関連するエキソン３および４の部分に相当する本発明のオリゴヌクレオチドを用いて容易にかつすぐに設計することができる。あるいは、分析は、特殊設計されたＰＣＲプライマーを用いた既知の多形部位の遺伝子型分析と、それに続く質量分析を可能とする質量分析装置（例えば、ＭａｓｓＡｒｒａｙ（登録商標）装置）を用いて行うこともできる。この技術は、その遺伝的基礎がよく理解されている、本明細書に記載の眼軸長障害などの症状の診断に適している。ＭａｓｓＡｒｒａｙ（登録商標）プライマー伸長プロセスは、一ヌクレオチドのレベルで配列の違いを検出する。初回のＰＣＲでゲノムＤＮＡからＳＮＰの前後の短いＤＮＡを増幅する。この後、そのＳＮＰのすぐ隣にアニーリングするプライマーの一塩基伸長が起こる。このプライマーは鋳型配列に従って伸長し、伸長産物間で対立遺伝子特異的な質量の違いを生じる。この質量の違いが、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析を用いたＳＮＰ対立遺伝子間の識別を可能とする。
【００４９】
別の実施形態では、本発明は、本明細書の実施例に記載されるような、近視に関連する変異型緑色（Ｌ）感光色素タンパク質を含む眼軸長関連障害のマウスモデルを提供する。本発明はさらに、変異型赤色（Ｍ）感光色素タンパク質と正常型または変異型緑色（Ｌ）感光色素タンパク質（この場合、変異型タンパク質は近視に関連するアミノ酸配列を有する）とを発現するマウスモデルを提供する。このようなマウスは、例えば、本明細書に提供されている方法に記載されている通りに作出することができる。このようなマウスは本明細書に記載の方法を用いて作出されたものであり、本方法の異型接合マウスは、赤色感光色素タンパク質と緑色感光色素タンパク質とを含む。特定の実施形態では、本発明のマウスモデルは、薬理学的介入または遺伝学的介入などの眼軸長関連障害への介入を試験するために使用することができる。
【００５０】
特定の実施形態では、本発明は、診断装置に患者のＬ：Ｍ錐体比またはＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプを評価させるための指示セットを含む機械読み取り可能な記録媒体を提供する。他の実施形態では、本発明は、患者のＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプおよびＬ：Ｍ錐体比を相関させて、眼軸長関連障害に罹りやすいと同定された患者のための予防的光学装置の特徴の適当な処方を決定することを目的とする自動化法の各工程をプロセッサに実行させるための指示を含む、機械読み取り可能な記録媒体を提供する。本明細書において「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」には、磁気ディスク、光ディスク、有機メモリ、およびＣＰＵにより読み取り可能な他の任意の揮発性（例えば、ランダムアクセスメモリ（「ＲＡＭ」：Random Access Memory））または不揮発性（例えば、リードオンリーメモリ（「ＲＯＭ」：Read-Only Memory））の大容量記録装置が含まれる。コンピュータ読み取り可能な媒体には、処理システム上にだけ存在するか、またはその処理システムに対してローカルであってもリモートであってもよい複数の相互接続処理システム間に分配される協調型または相互接続型コンピュータ読み取り可能な媒体が含まれる。本明細書において「診断装置」とは、限定されるものではないが、マイクロアレイリーダーまたは質量分析計を含め、本発明の方法を実施するためにＬ：Ｍ錐体比の測定またはＬ：Ｍオプシン遺伝子ハプロタイプの決定を行うことができる装置を意味する。
【００５１】
本明細書に引用される参照文献は、本明細書に示される事項の捕捉となる例示的手順または他の詳細を示す限りにおいて、参照により特に本明細書に組み入れられる。
当業者は本開示に鑑みて、本明細書に開示されている実施形態の明らかな改変が本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく行えることが分かるであろう。本明細書に開示される実施形態は全て、本開示に鑑みて過度の実験を行わずに作製および実施することができる。本発明の全範囲は本開示およびその等価な実施形態に示される。本明細書は、本発明が権利を与えられた保護の全範囲を不当に狭くするように解釈されるべきではない。
【００５２】
実施例
以下の実施例は、実施された実験および得られた結果を含め、単に例示を目的として示されるものであり、本発明を限定するものと考えるべきでない。
【００５３】
（実施例１）
ボルンホルム眼病における突然変異ＯＰＮ１ＬＷおよびＯＰＮ１ＭＷ遺伝子
最初に同定された高度近視遺伝子座は染色体Ｘｑ２８に存在し、ＭＹＰ１と呼ばれる(M. Schwartz, M. Haim, D. Skarsholm, Clinical Genetics 38, 281 (1990年10月))。この表現型はボルンホルム眼病（ＢＥＤ）としても知られ、近視、乱視および視神経変化を伴うＸ連鎖錐体機能不全症候群である(T. L. Youngら, Archives of Ophthalmology 122, 897 (2004年6月); U. Radhakrishnaら, Investigative Ophthalmology & Visual Science supplement (abstract #3814) (2005); M. Michaelidesら, Ophthalmology 112, 1448 (2005))。Ｘ連鎖錐体機能不全症候群を伴うＢＥＤの表現型の一部が、異常な錐体網膜電図（ＥＲＧ）である。ＯＰＮ１ＬＷおよびＯＰＮ１ＭＷ遺伝子はＸｑ２８に存在し、錐体ＥＲＧを生成する初期事象を担う錐体感光色素をコードする。
【００５４】
ＬおよびＭ錐体オプシン遺伝子が、ＢＥＤ表現型の候補として評価された。Youngら(T. L. Youngら, Archives of Ophthalmology 122, 897 (2004年6月)）により記載された２つの無関連のＸ連鎖近視／錐体機能不全家系は、原型のＢＥＤ(M. Schwartz, M. Haim, D. Skarsholm, Clinical Genetics 38, 281 (1990年10月)) 家系では、錐体オプシン遺伝子アレイの最初の２つの位置のいずれかにＯＰＮ１ＭＷ遺伝子が存在しないこと、そして、ミネソタ（ＭＮ）家系の場合には、完全なＯＰＮ１ＬＷ遺伝子が存在しないことによって起こる色覚異常を有する。インド在住の第３の家系では、罹患男性(U. Radhakrishnaら, Investigative Ophthalmology & Visual Science supplement (abstract #3814) (2005))は正常色覚を有する。Ｘ染色体オプシンアレイの最初の遺伝子を選択的に増幅し、ＭＮ、ＢＥＤ１、およびインドの家系における罹患および非罹患の男性からの個々のエキソンを直接配列決定した。最初の遺伝子の下流にあるオプシン遺伝子も選択的に増幅し、それらのエキソンを直接配列決定した。ＭＮ家系の、全ての罹患男性では、アレイの最初の位置（最も５’側）のオプシン遺伝子は、エキソン３における二型性コドンを特徴とする異常なアミノ酸の組合せを有するＭオプシンをコードしていた。この組合せは、アミノ酸位１５３のロイシン（Ｌ１５３）、１７１位のバリン（Ｖ１７１）、１７４位のアラニン（Ａ１７４）、１７８位のバリン（Ｖ１７８）、および１８０位のアラニン（Ａ１８０）であった（以下、「ＬＶＡＶＡ」と略す）。アレイの２番目の遺伝子は、これらの位置に視力異常のない個体のＭオプシンに一般に見られるアミノ酸の組合せ（「ＭＶＶＶＡ」）をコードしていた。
【００５５】
Youngら(T. L. Youngら, Archives of Ophthalmology 122, 897 (2004年6月))により報告されている第２の無関連のＢＥＤ家系（ＢＥＤ１）およびインドの家系(U. Radhakrishnaら, Investigative Ophthalmology & Visual Science supplement (abstract #3814) (2005))の罹患者もまたＬＶＡＶＡの組合せを持っていることが判明したが、Ｌオプシンにおいてであった。これら後者の両家系では、罹患男性の下流遺伝子は、正視を有する個体に典型的な変異体をコードしていた。ＢＥＤ家系の非罹患男性はＬＶＡＶＡ変異体を持っていなかった。対照実験として、重篤な視力異常のない複数の男性からの２６１個のＯＰＮ１ＭＷ遺伝子と３２０個のＯＰＮ１ＬＷの配列決定を行った。これらの遺伝子にＬＶＡＶＡ組合せを指定するものはなかった。
【００５６】
さらに５家系の罹患男性(M. Michaelidesら, Ophthalmology 112, 1448 (2005); M. McClements, M. Neitz, A. Moore, D. M. Hunt, Invest Ophthalmol Vis Sci, ARVO E (2010))とＢＥＤ表現型を有する他の無関連の１人はＬＶＡＶＡ組合せか、１７１位にバリンの代わりにイソロイシンが存在する（Ｉ１７１）類似の組合せのいずれかを有することが判明した。この組合せは「ＬＩＡＶＡ」と表記され、成人において光受容体を非機能的とすることがこれまでに示されている(J. Carroll, M. Neitz, H. Hofer, J. Neitz, D. R. Williams, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 8461 (2004); M. Neitzら, Visual Neuroscience 21, 205 (2004); M. A. Crognaleら, Visual Neuroscience 21, 197 (2004))。Ｘ連鎖錐体機能不全症候群を有することが報告されている第７の家系の罹患者は、ＬオプシンとＭオプシンの双方に、２０３位に通常見られるシステインがアルギニンに置き換わる突然変異（Ｃ２０３Ｒ）(M. Michaelidesら, Ophthalmology 112, 1448 (2005))、すなわち、オプシンを非機能的とすることが知られている突然変異(M. Michaelidesら, Ophthalmology 112, 1448 (2005); J. Winderickxら, Nature Genetics 1, 251 (1992); J. Nathansら, Science 245, 831 (1989))を有することが判明した。
【００５７】
標的遺伝子置換を有するマウスにおけるＢＥＤオプシン突然変異の錐体表現型
いくつかの家系に見られる突然変異ＬＩＡＶＡおよびＣ２０３Ｒは錐体光受容体の機能不全を引き起こすことが従前に記載されているが、多くのＢＥＤ家系に見られるＬＶＡＶＡのアミノ酸組合せとその錐体の機能および生存力への影響は特定されていない。ＬＶＡＶＡが、発現されるＸ連鎖錐体色素遺伝子だけにコードされている個体は、錐体ジストロフィを有するが、このことは、このハプロタイプを発現する錐体が異常な機能を示し、やがて変質することを示唆する。ＬＶＡＶＡに関連するこの異常な錐体機能を証明するために、マウスＭオプシン遺伝子のエキソン２〜６が、ＬＶＡＶＡ組合せを特徴とするヒトＬオプシン遺伝子のエキソン２〜６を含有するｃＤＮＡで置換されたマウス系統を作出した。また、正視の個体に一般に見られる、ＬＩＡＩＳの組合せを特徴とすること以外はＸ染色体オプシン遺伝子置換の構造が同じ対照マウス系統も作出した。これらのマウスを、Ｌ錐体単独刺激を用いるＯＮ−ＯＦＦ  ＥＲＧを用いて試験した。ＥＲＧの大きさは、対照マウスに比べてＬＶＡＶＡ突然変異を有するマウスでは小さくなり、これはＢＥＤ患者における異常なＥＲＧの検出と一致している(T. L. Youngら, Archives of Ophthalmology 122, 897 (2004年6月))。光受容体機能に最も関連のある成分であるＥＲＧ−ａ波は、対照マウスに比べてＬＶＡＶＡマウスでは半分の大きさになった。
【００５８】
錐体比とＢＥＤ表現型の重篤度
ＬＩＡＶＡ突然変異またはＣ２０３Ｒ突然変異を有する個体の場合（双方とも、それらを発現する錐体を非機能性とする）、中〜長波長を吸収する単一の錐体タイプが残り、このことがそれらの色覚欠陥を説明する。ＬＶＡＶＡ突然変異と色覚欠陥を有する個体の場合、ＬＶＡＶＡオプシンを含む錐体は機能するが、アレイの最初の２つの遺伝子は同じオプシンタイプ、すなわち、ＢＥＤ１家系ではＬ、ＭＮ家系ではＭをコードしている。これに対して、インドの家系では、Ｌ錐体は異常な機能を示すＬＶＡＶＡ感光色素を発現するが、別の錐体亜集団では、正常なＭオプシンが発現され、この家系のＢＥＤ近視者は正常色覚を有する。
【００５９】
通常、Ｘ染色体オプシン遺伝子アレイの最初の２つの遺伝子だけが発現される。しかしながら、ＢＥＤ／Ｘ連鎖高度近視患者は、錐体光受容体を機能不全にする突然変異を有する１つのＸ連鎖オプシン遺伝子ともう１つの正常遺伝子を持っている。このアレイからの最初の２つのオプシン遺伝子のそれぞれは、２種類がランダムに散在する、その固有のサブモザイク状(submosaic)の錐体で発現される。ＢＥＤ／Ｘ連鎖高度近視に関連することが判明しているこれらの突然変異のそれぞれは、より消耗度の高い視覚障害（ＬＶＡＶＡの場合の錐体ジストロフィ）、またはそれが患者の網膜で発現される唯一のＬ／Ｍオプシンである場合には、成人においてＬ錐体およびＭ錐体機能が全く存在しない障害（ＬＩＡＶＡおよびＣ２０３Ｒの場合の青錐体一色型色覚）をもたらす。より消耗度の高い網膜表現型から高度近視患者を救うと思われるのは、サブモザイク状の錐体で発現される正常なＸ染色体色素遺伝子が存在することである。しかしながら、散在した正常錐体と突然変異錐体を有するということは、高度近視の原因である思われる。
【００６０】
正常集団では、Ｌ：Ｍ錐体比に広範囲の変動が見られる。ＬＩＡＶＡ  ＢＥＤ患者でも錐体比に同様の変動が見られた（図１）。この補償光学（ＡＯ： adaptive optics）画像から、ＢＥＤに関連する突然変異は錐体モザイクを乱し、隣接する錐体間の活性比較から焦点の鮮明な、きめの細かい画像の存在に関する確実な情報を抽出する眼の能力を損なう可能性が高く、従って正視化を妨げることが明らかである。３人の画像は、眼軸長および近視の重篤度と相関した錐体モザイクの乱れの程度を劇的に示している（図１Ｅ）。
【００６１】
ＬＶＡＶＡ  ＢＥＤ患者では、突然変異錐体は機能的であるが、正常錐体と突然変異錐体の間の応答の違いが２つの正常錐体（１つは画像の焦点の鮮明な暗−明エッジの明所側にあり、１つは暗所側にある）によってもたらされるものよりも大きい。成人では、ＬＩＡＶＡの組合せを持つオプシンを含む錐体には全く機能がないが(J. Carroll, M. Neitz, H. Hofer, J. Neitz, D. R. Williams, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 8461 (2004); M. Neitzら, Visual Neuroscience 21, 205 (2004; M. A. Crognaleら, Visual Neuroscience 21, 197 (2004))、子供ではそれらがある程度機能するという証拠がある(L. Mizrahi-Meissonnier, S. Merin, E. Banin, D. Sharon, Investigative Ophthalmology and Visual Science (March 20, 2010, 2010))。
【００６２】
ここで、初めて、近視の一形態（すなわち、ボルンホルム眼病）の完全な病因論が決定された。
（実施例２）
近視に関連するオプシン突然変異とハプロタイプ
正常色覚を有するヒトでは、不等相同組換えによって生じたＬオプシンとＭオプシンのアミノ酸配列の多大なバリエーションが見られる(J. Nathans, T. P. Piantanida, R. L. Eddy, T. B. Shows; D. S. Hogness, Science 232, 203 (1986); M. Drummond-Borg, S. S. Deeb, A. G. Motulsky, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86, 983 (1989); B. C. Verrelli, S. A. Tishkoff, American Journal of Human Genetics 75, 363 (2004))。例えば、上記の対照サンプルでは、３２０名の被験者に３４の異なるＬオプシン配列が存在し、２６１名の被験者に１７の異なるＭオプシン配列が存在していた。また、Ｌ：Ｍ錐体比もヒトの間で大きく異なっていた。例えば、正常色覚を有するコーカサス人男性では、Ｌ：Ｍ錐体比は１．１：１〜１９：１の範囲であり、平均は２．７：１である(J. Carroll, M. Neitz, J. Neitz, Journal of Vision 2, 531 (2002); H. Hofer, J. Carroll, J. Neitz, M. Neitz, D. R. Williams, Journal of Neuroscience 25, 9669 (2005年10月))。
【００６３】
Ｌ：Ｍ錐体比の偏向が近視からの保護となるかどうかを決定するために、３つの人種群について、平均Ｌ：Ｍ錐体比に対して平均眼軸長をプロットした。Ｌ：Ｍ錐体比は、コーカサス人（ｎ＝８６）(H. Hofer, J. Carroll, J. Neitz, M. Neitz, D. R. Williams, Journal of Neuroscience 25, 9669 (2005年10月); J. Carroll, C. McMahon, M. Neitz, J. Neitz, Journal of the Optical Society of America A 17, 499 (2000年3月))およびアフリカ人（ｎ＝２８）(C. McMahon, J. Carroll, S. Awua, J. Neitz, M. Neitz, Journal of Vision 8, 1 (2008))であると自己申告した男性について、ＥＲＧおよび遺伝学から事前に評価した。また、５名の無関連の日本人男性のサンプル（ｎ＝５）のＬ：Ｍ比も決定した。その値は４８．１３％Ｌ〜３８％Ｌ錐体の範囲であり、平均は４３．４％Ｌ錐体であり、平均比０．８Ｌ：１Ｍに相当する。この少ないサンプルであっても、結果は、コーカサス人男性と日本人男性とで平均Ｌ：Ｍ錐体比に統計学的に有意な差を示した（ｐ＜０．０００１；マン・ホイットニーＵ）（図２）。平均眼軸長データは、Twelkerら(J. D. Twelkerら, Optometry and Vision Science 86, 918 (2009))から得た、コーカサス人、アフリカ系アメリカ人、およびアジア人の人種分類の、満１２歳の少年のものであった。このＬ：Ｍ錐体比の偏向は眼軸長と強い負の関連があり（Ｒ２＝０．９９）、従って、近視に対する罹患性とも強い負の関連があった。
【００６４】
次に、ＯＰＮ１ＬＷおよびＯＰＮ１ＭＷ遺伝子のコード配列のバリエーションを、近視を引き起こすかどうかの候補として評価した。被験者は、２１歳以上の、自己申告によるコーカサス人男性３３６名であり、全員が正常色覚を持つことが確認された。眼軸長および角膜曲率は、毛様体筋麻痺のない状態でＺｅｉｓｓ（登録商標）ＩＯＬマスターを用いて測定し、等価球面屈折度（ＳＥＲ）は、下記の方法に記載されている方程式を用いて計算した。オプシン遺伝子ハプロタイプは、被験者ごとに、ＯＰＮ１ＬＷおよびＯＰＮ１ＭＷ遺伝子のエキソン２、３および４を選択的に増幅し、配列決定を行うことにより決定した。ハプロタイプは、ＯＰＮ１ＬＷおよびＯＰＮ１ＭＷ遺伝子のコドン６５、１１１、１１６、１５３、１７１、１７８、１８０、２３０、２３３、および２３６によりコードされるアミノ酸を用いて生じたものである。３０３名の被験者で完全なハプロタイプが得られた。ハプロタイプは、エキソン２、３および４によりコードされた変異位置におけるアミノ酸の組合せとして同定された。５０％を超える、すなわち、１５９名の男性は１３のハプロタイプ群に属した（各群少なくとも３名の被験者を含む）（図３Ａ参照）。１３の各ハプロタイプ群内で、どちらの遺伝子でもコドン６５、１１１、１１６、２３０、または２３３に、またはＯＰＮ１ＭＷ遺伝子ではコドン２３６に、バリエーションは見られなかった。
【００６５】
各ハプロタイプ内で、被験者は錐体比に変動があること、およびＬ：Ｍ錐体比が高く偏向した被験者はこのハプロタイプの近視誘発作用から保護されることが予想された。各ハプロタイプの平均ＳＥＲは、そのハプロタイプ内の、最も近視度の高い半数の被験者に関する平均ＳＥＲとして計算した。各群からの最も近視度の高い５０％は、これらの個体が均等により近いＬ：Ｍ錐体比を持ち、かつ、各ハプロタイプの近視発症傾向のより正確な反映となるであろうとの前提に基づいて考えられた。これらのハプロタイプは、近視発症傾向が最小のハプロタイプ１番、そして最大のハプロタイプ１３番として、近視になる可能性の順に配置され、近視になる可能性は平均ＳＥＲ−１〜−９ジオプターまで増加した（図３Ａ）。一元配置分散分析を用いてハプロタイプと等価球面屈折度（ＳＥＲ）間の関係を検定したところ、極めて有意な関係が見られた（ｐ＜０．０００１）。
【００６６】
図３Ａから１１名の被験者のＬ：Ｍ錐体比を、フリッカ測光ＥＲＧおよび個別化錐体スペクトルを用いて評価した(J. Carroll, C. McMahon, M. Neitz, J. Neitz, Journal of the Optical Society of America A 17, 499 (2000年3月))。１１名の各被験者について、予測ＳＥＲは、図３Ａからそのハプロタイプ群の平均ＳＥＲを求め、被験者ごとにＬ錐体＋Ｍ錐体対するＬ錐体のパーセンテージに従ってこれを尺度化することによって計算した。例えば、被験者がハプロタイプ８を持っていた場合（図３Ａ）、その近視になる可能性は−４．５ジオプターである。その被験者が１：１の錐体比を持っていた場合、最大−４．５ジオプターの屈折異常を有すると予測される。しかしながら、被験者が１００パーセントに近いＬ錐体を持っていた場合、ほぼ正視であると予測される。７５％Ｌ錐体は、１：１錐体比（５０％Ｌ）と１００％Ｌの間にあるので、ハプロタイプ８と７５％Ｌ錐体を有する被験者は、５０％のＳＥＲ（すなわち、−４．５／２＝−２．２５ジオプター）を有すると予測される。
【００６７】
各被験者のＳＥＲを、ハプロタイプと錐体比データを合わせたものより予測されたＳＥＲと比較した（図３Ｂ）。相関係数（Ｒ２）は０．８６であり、ＳＥＲの８６％が、このサンプルにおいて各被験者のＸｑ２８オプシン遺伝子座ハプロタイプとＬ：Ｍ錐体比を知ることにより予測可能であることが示唆された。Ｌ：Ｍ錐体比はまた、Ｘ連鎖オプシン遺伝子アレイにおける遺伝子バリエーションによってもコードされている。
【００６８】
（実施例３）
テレビゲームの赤色含量が屈折異常の増大を招く
テレビゲームの赤色含量が近視に関与する可能性を次のように評価した。７人の１８歳の被験者について、ベースライン眼軸長測定値を得、その後、２週間おきに２ヶ月間測定を行い、その間、各被験者は１日１時間、特殊なゴーグルを装着しながらテレビゲームを行った。テレビゲームは白黒であり、ゲームをしている間、被験者は、右のレンズはＬ錐体とＭ錐体がほぼ等しく活性化されるように透明であり、左のレンズはＬ錐体だけが活性化され、Ｍ錐体は活性化されないように着色されたゴーグルを通してコンピュータモニタを見た。図４Ａにプロットしたデータは、被験者の、対照となる右目と比べての、赤色テレビゲームを見た左目の有意な近視化の傾向線（ｐ＝０．００７６）を示す。白黒テレビゲームに比べて、赤色に曝された眼の軸長の増大は、１年に１／３ジオプターの屈折異常の増強に相当する。
【００６９】
（実施例４）
網膜に到達する光のスペクトル分布を制御する眼鏡が近視を予防し得る
子供が日常的に装着した場合の、改造眼鏡が眼軸長の成長に影響を及ぼす能力を評価した。試験眼鏡の両方のレンズは、被験者の検眼士によって決定され、各被験者に最適に矯正されたものであった。各眼鏡の一方のレンズは試験レンズであり、有色で、表面にホログラフィックディフューザが適用されていた。この着色は赤色光を除去し、ディフューザは、隣接する錐体間の活性の差異を低減するために、入射光線を０．５°を超える角度で拡散させてわずかな輪郭ぼけを作り出す。各眼鏡のもう一方のレンズは対照レンズであり、Ｌ錐体とＭ錐体を等しく活性化する中性フィルタで着色され、両眼が同じ光強度に曝されるように選択された。被験者ごとに効き眼を決め、最初の３ヶ月間は、全被験者が効き眼に試験レンズを装着した。被験者には３ヶ月後に再登録の機会を設け、再登録を選択した被験者は、次の３ヶ月間、効き眼ではない眼に試験レンズを装着した。
【００７０】
被験者が試験眼鏡を装着し始める前に、両眼の眼軸長を、子供において正確かつ再現性のある測定を得るために事前に確立されたＺｅｉｓｓ（登録商標）ＩＯＬマスター（子供での眼軸長の反復測定間の標準偏差は±０．０１９）(A. Carkeet, S. M. Saw, G. Gazzard, W. Tang, D. T. Tan, Optometry and Vision Science 81, 829 (2004); J. Gwiazdaら, Investigative Ophthalmology & Visual Science 44, 1492 (2003))を用いて測定した。図４にプロットした各眼軸長測定値は、各眼につき２０個の測定値の平均である。試験に登録した１３名の被験者の一般的ベースラインの特徴を表２に示す。試験開始時に両眼の等価球面屈折度（ＳＥＲ）を決定し、子供が改造眼鏡を受け取った日に各眼の軸長測定を行った。得られた値は各眼につき２０個の測定値の平均であった。最後の列はどちらの眼に試験レンズおよび対照レンズを用いたかを示す（左目ＯＳ、右目ＯＤ）。
【００７１】
【表２】
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全ての被験者が、効き眼を試験眼、他方の眼を内部対照として、本試験を完了した。７人の被験者が再登録し、効き眼でない眼に試験レンズを装着して２回目の試験を完了した。どちらのレンズ、従ってどちらの眼に試験レンズおよび対照レンズを用いたかを表２に示す。まず、本試験の適格性を調べるために、毛様体筋麻痺下自動屈折により等価球面屈折度（ＳＥＲ）を測定したところ、最小−１．００〜最大−８．５０ジオプターの範囲であった。ベースライン眼軸長は、右目（ＯＤ）が２２．９３〜２７．５３ミリメートル（ｍｍ）、左目（ＯＳ）が２３．０８〜２７．８４ｍｍの範囲であった。
【００７２】
眼軸長成長は、３ヶ月間にわたる試験レンズおよび対照レンズの効果を評価するために用いる主要な結果指標であった。眼軸長の相対的成長は、試験レンズを装着した２０個の眼および対照レンズを装着した２０個の眼について測定した。これら２０の各試験の成長曲線は、試験群と対照群の劇的な違いを示した（図４ＢおよびＣ）。試験レンズを装着した眼の成長曲線は、ベースライン周辺に集中し、眼の伸長の低下を表したのに対し、対照レンズを装着した眼の成長曲線は正方向の成長に傾き、眼の伸長の継続を表した。２０の試験のうち１６がこの成長パターンをたどり、試験レンズは成長を低下させ、対照レンズは成長を継続させた。包括的に、対照眼と試験眼の間の眼軸長の正規化した差を対応のある２標本ｔ検定によって評価した。２種の眼の間の成長の絶対的な差は、群として３０日目までに統計学的に有意に達した。個別に見ると、２種の眼の間の成長差が有意に達した日は３０日目〜７５日目の範囲であった。
【００７３】
試験レンズと対照レンズを装着した眼の軸伸長速度も評価した（図４Ｄ）。試験レンズを装着した眼の平均眼軸長成長速度は０．０６３±０．３３μｍ／日（平均±ＳＥ）であったのに対し、対照レンズを装着した眼の平均眼軸長成長速度は１．４３±０．２４μｍ／日であった。この場合にも、２０の試験のうち１６が、対照レンズを装着した眼に対して試験レンズを装着した眼の軸伸長速度の低下をもたらした。対照群に対する試験群の全体としての成長速度の低下は統計学的に有意であった（ｐ＝０．００１９、図４Ｄ）。
【００７４】
平均して、試験レンズを装着した眼は、対照レンズを装着した眼のほぼ１０分の１の成長速度であった。
方法
色覚検査：  被験者に、ナーゲル・アノマロスコープおよびＲｉｃｈｍｏｎｄ  ＨＲＲ  ２００４年版色覚検査表検査を用いて、遺伝性赤色−緑色色覚異常の存在に関するスクリーニングを行った。
【００７５】
Ｌ：Ｍ錐体比の決定：  Ｌ：Ｍ錐体比は、従前に記載されているように(H. Hofer, J. Carroll, J. Neitz, M. Neitz, D. R. Williams, Journal of Neuroscience 25, 9669 (2005年10月); J. Carroll, C. McMahon, M. Neitz, J. Neitz, Journal of the Optical Society of America A 17, 499 (2000年3月))、フリッカ測光および遺伝学を用いて推定した。
【００７６】
補償光学撮像法：  網膜画像は、従前に記載されているように(J. Carroll, M. Neitz, H. Hofer, J. Neitz, D. R. Williams, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 8461 (2004); J. Carrollら, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 20948 (2009); J. Carrollら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA submitted (2010))、補償光学を用いて得た。
【００７７】
眼軸長、角膜曲率、および等価球面屈折度（ＳＥＲ）：  両眼の軸長および角膜曲率は、被験者ごとにＺｅｉｓｓ（登録商標）ＩＯＬマスターを用いて測定し、予測等価球面屈折度（ＳＥＲ）は、４００名の男性被験者群から得られた実際のＳＥＲ、眼軸長（ＡＬ: axial length）および角膜曲率（ＣＣ： corneal curvature）のデータセットの線形回帰から導いた式を用いて計算した。この式は、ＳＥＲ＝−（ＡＬ＊２．０３＋０．９４＊ＣＣ）＋８８．５８  であり、式中、ＡＬの値は各眼につき２０個の測定値の平均であり、ＣＣは角膜曲率を測定する２つの異なる方法の平均であった。測定は両眼について行った。
【００７８】
遺伝子分析：  ＤＮＡは、全血または頬スワブからＰｕｒｅＧｅｎｅ（登録商標）キットを用いて単離した。ポリメラーゼ連鎖反応を用いてＯＰＮ１ＬＷおよびＯＰＮ１ＭＷ遺伝子を選択的に増幅し、従前に記載されているように(M. Neitzら, Visual Neuroscience 21, 205 (2004))、エキソン２、３および４の直接配列決定を行った。各被験者からのＤＮＡサンプルに対して定量的リアルタイムＰＣＲを行い、従前に記載されているアッセイ(M. Neitz, J. Neitz, Color Research & Application 26, S239 (2001))を用い、ＯＰＮ１ＬＷおよびＯＰＮ１ＭＷ遺伝子の相対数を評価した。
【００７９】
人体研究：  全ての人体研究はウィスコンシン医科大学にてＩＲＢ承認プロトコールの下で行い、ヘルシンキ宣言の教義に従った。
ノックイン／ノックアウトマウス構築物  標的化ベクターは、Ｘ染色体上の内因性マウスＯＰＮ１ＭＷ遺伝子をヒトＬオプシンｃＤＮＡで置換するように設計された。５’相同アームは１１，９１７ｂｐの長さであり、マウスＸ染色体上のＯＰＮ１ＭＷ遺伝子の上流であるヌクレオチド位置７１，３６６，２１８から、マウスＯＰＮ１ＭＷ遺伝子のエキソン２のコドン６５（ヌクレオチド位置７１，３７８，１３５  マウスゲノムアセンブリの２００７年７月版）に延びている。部位特異的突然変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｋｉｔ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、ヒトＯＰＮ１ＬＷの対応するコドンと同じアミノ酸をコードするようにマウスコドン５８、６２および６５を変更した。アミノ酸５８および６２にはヒトＯＰＮ１ＬＷ間で変動はないが、コドン６５には変動があり、本発明者らの構築物では、このコドンはトレオニン（Ｔ６５）を指定した。マウスコドン５８はＡＣＣからＧＴＣへ変化し、マウスコドン６２はＣＴＴからＴＴＴへ変化し、マウスコドン６５はＧＴＴからＡＣＴへ変化していた。コドン６６からポリアデニル化シグナルへと延びるプラスミドｈｓ７由来のヒトｃＤＮＡセグメント(M. Drummond-Borg, S. S. Deeb, A. G. Motulsky, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86, 983 (1989))（プラスミドｈｓ７のヌクレオチド１６７９およびｈｓ７由来の１４２塩基対のポリリンカー）を５’相同アームにインフレームで連結した。ｌｏｘ  Ｐ部位に挟まれたＰＧＫ−ＮＥＯカセットを前記ヒトｃＤＮＡ断片の下流に連結し、その下流にマウスＸ染色体ヌクレオチド７１，３８９，４６０から７１，３９２，２５０に延びる３’相同アームを連結した。前記３’相同アームは、マウスＯＰＮ１ＭＷ遺伝子のイントロン５内の２８２３塩基対のセグメントに相当する。ベクターは全て、完全なベクターの直接配列決定により確認した。使用する最終ベクターおよびノックイン／ノックアウトマウスの作出はＯｚｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．によって行われた。標的化構築物をエレクトポレーションにより胚性幹細胞に導入し、ネオマイシン耐性細胞を、適切に標的事象が起こるかどうかサザンハイブリダイゼーションによりスクリーニングし、配列決定により確認した。適切に標的化された遺伝子座の生殖細胞系伝達を示すマウスをＣｒｅマウスと交配して、ＰＧＫ  Ｎｅｏカセットを削除した。動物を、最終的に遺伝子座が変更されたかどうかＰＣＲによりスクリーニングし、直接配列決定により確認した。Ｏｚｇｅｎｅからファウンダーマウスを受け取った際に、各マウスのゲノムＤＮＡを配列決定して、適切に標的化された遺伝子座の存在を確認した。
【００８０】
標的化された遺伝子座における遺伝子発現は内因性マウス調節ＤＮＡ配列により制御され、コードされているオプシンのＮ末端テールはマウスエキソン１によりコードされているものに相当していた。エキソン１によりコードされているＮ末端の部分は、ヒトの場合と、アミノ酸４〜８が削除されている点で異なっており、その配列は次のように他の７箇所で異なっている：１１位においてアラニンの代わりにトレオニン、１３位においてアルギニンの代わりにグルタミン酸、１４位においてヒスチジンの代わりにグルタミン、１５位においてプロリンの代わりにトレオニン、１６位においてグルタミンの代わりにロイシン、１８位においてセリンの代わりにヒスチジン、および３７位においてアルギニンの代わりにリシン。ヒトＬオプシンは、エキソン２によりコードされているアミノ酸６５、１１１および１１６、ならびにエキソン４によりコードされている２３０、２３３および２３６で異なっている。標的化された遺伝子座はＴ６５、Ｉ１１６、Ｓ１１６、Ｉ２３０、Ａ２３３およびＭ２３６を指定した。標的化された遺伝子座の２つの形態は、エキソン３により指定されたアミノ酸配列に関して構築した。対照遺伝子座は、チンパンジーＬオプシンに見られる配列に相当するＬ１５３、Ｉ１７１、Ａ１７４、Ｉ１７８、Ｓ１８０（ＬＩＡＩＳ）を指定し、試験下の突然変異体はＬ１５３、Ｖ１７１、Ａ１７４、Ｖ１７８、Ａ１８０（ＬＶＡＶＡ）を指定した。
【００８１】
マウスＥＲＧ：  マウスをケタミン／キシラジンで麻酔し、試験中、保温テーブル上で維持した。記録電極を角膜上に置き、対照電極を瞼の下に置き、接地電極を舌に接触させた。５２５ｎｍ  ＬＥＤ刺激を用い、パルス幅を調整することで制御される５種類の光強度（０．３ｌｏｇ強度刻み）で、ＯＮ−ＯＦＦ  ＥＲＧ（３０秒オン、３０秒オフの交互）を行った。５２５ｎｍの光は、導入遺伝子によりコードされているヒトＬ錐体オプシンによって媒介される応答を生じるが、内因性マウスＵＶオプシンにより媒介される応答は生じない。記録は、桿体が飽和した明順応状態の下で行った。
【００８２】
以上の開示は本発明の特定の具体的実施形態を強調し、それらと等価な全ての改変および変更が、添付の特許請求の範囲に示される本発明の趣旨および範囲内にあると理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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