(57)【要約】本発明は、対象においてＦｅＬＶ感染を検出するための方法を提供し、対象から得られた試料は、ｐ１５（Ｅ）抗体結合段階において、組換え膜貫通ｐ１５Ｅタンパク質とインビトロで接触する。【選択図】図１
2014521058.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における過去または現在のＦｅＬＶ感染検出方法であって、
前記対象から得られた試料を、ＳＥＱ  ＩＤ  ００１のアミノ酸配列またはＳＥＱ  ＩＤ  ００１と９０％以上同一である配列を含むタンパク質と接触させる工程と、
抗体の前記タンパク質への結合を検出する工程と
を備えたことを特徴とするＦｅＬＶ感染検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載のＦｅＬＶ感染検出方法であって、前記タンパク質は単離された組換えタンパク質であることを特徴とする、ＦｅＬＶ感染検出方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＦｅＬＶ感染検出方法であって、前記試料中においてＦｅＬＶｐ２７タンパク質の存在を検出する工程をさらに備えたことを特徴とする、ＦｅＬＶ感染検出方法。
【請求項４】
請求項３に記載のＦｅＬＶ感染検出方法であって、
ａ．前記抗体の前記膜貫通ｐ１５Ｅタンパク質への結合、および前記試料中における前記ｐ２７タンパク質の存在は、ＦｅＬＶウイルス血症を示し、
ｂ．前記抗体の前記膜貫通ｐ１５Ｅタンパク質への結合、および前記試料中における前記ｐ２７タンパク質の非存在は、ＦｅＬＶに対する免疫を示す
ことを特徴とする、ＦｅＬＶ感染検出方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載のＦｅＬＶ感染検出方法であって、
前記試料中においてＦｅＬＶｐ４５タンパク質に対する前記抗体の存在を検出する工程をさらに備えたことを特徴とする、ＦｅＬＶ感染検出方法。
【請求項６】
対象におけるＦｅＬＶ感染を検出または診断する場合の、ＳＥＱ  ＩＤ  ００１のアミノ酸配列またはＳＥＱ  ＩＤ  ００１と９０％以上同一である配列を含む組換えタンパク質の使用方法。
【請求項７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ００１のアミノ酸配列またはＳＥＱ  ＩＤ  ００１と９０％以上同一である配列を含む単離された組換えタンパク質を備えたことを特徴とする表面。
【請求項８】
請求項７に記載の表面であって、ニトロセルロース膜、ガラス繊維膜、マイクロタイタープレートの空洞、プラズモン共鳴チップ、または水晶微量天秤の表面であることを特徴とする、表面。
【請求項９】
ＦｅＬＶの血清学的検出用キットであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ００１のアミノ酸配列またはＳＥＱ  ＩＤ  ００１と９０％以上同一である配列を含む単離された組換えｐ１５Ｅタンパク質を含むことを特徴とするＦｅＬＶの血清学的検出用キット。
【請求項１０】
請求項９に記載のＦｅＬＶの血清学的検出用キットであって、標識を含む抗ネコ免疫グロブリン抗体をさらに含むことを特徴とする、ＦｅＬＶの血清学的検出用キット。
【請求項１１】
請求項１０に記載のＦｅＬＶの血清学的検出用キットであって、前記標識は発色酵素、発光タンパク質、または蛍光のタンパク質もしくは色素であることを特徴とする、ＦｅＬＶの血清学的検出用キット。
【請求項１２】
請求項９乃至１１のいずれか一項に記載のＦｅＬＶの血清学的検出用キットであって、ＦｅＬＶｐ２７タンパク質に対するリガンドをさらに含むことを特徴とする、ＦｅＬＶの血清学的検出用キット。
【請求項１３】
請求項９または１０に記載のＦｅＬＶの血清学的検出用キットであって、単離されたＦｅＬＶｐ４５タンパク質をさらに含むことを特徴とする、ＦｅＬＶの血清学的検出用キット。
【請求項１４】
請求項９乃至１３のいずれか一項に記載のＦｅＬＶの血清学的検出用キットであって、前記単離された組換えｐ１５Ｅタンパク質、前記ＦｅＬＶｐ２７に対するリガンド、および／または前記単離されたＦｅＬＶｐ４５タンパク質は表面に結合されていることを特徴とする、ＦｅＬＶの血清学的検出用キット。
【請求項１５】
請求項１４に記載のＦｅＬＶの血清学的検出用キットであって、前記リガンドはガンマ免疫グロブリンであることを特徴とする、ＦｅＬＶの血清学的検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
ＦｅＬＶ感染症は、貧血、腫瘍、および免疫不全などの多面的な臨床兆候を誘導し得る獣医学的に重要な疾患である。有効なワクチンがあるにもかかわらず、ＦｅＬＶ感染症は依然として存在しているが、大部分の研究対象集団において著しく異なっている（Ｌｅｖｙら，２００６，Ｊ  Ａｍ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ．２２８（３）：３７１−６）。
【背景技術】
【０００２】
感染後、ＦｅＬＶは最初に局所リンパ節または扁桃腺において複製する。感染したリンパ球はウイルスを骨髄に運び、ウイルスは高速で複製し、最終的には血流を経由して全身に広がる。ＦｅＬＶが骨髄および血液の細胞へ組み込まれることで、ネコはプロウイルス陽性となる。ウイルスが血液中で検出できる場合、ネコはウイルス血症になる。膀胱の粘膜および／または腸および唾液腺の上皮の感染により、ＦｅＬＶは新たな感染サイクルを開始することがある。
【０００３】
ＦｅＬＶの診断は、主に血漿、血清、または全血中におけるウイルスまたはウイルス抗原の検出に依存している。最も一般的な血清学的検査では、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によりＦｅＬＶｐ２７抗原の存在を検出するか（Ｌｕｔｚら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５６，２０９−２２０（１９８３）、Ｌｕｔｚら，Ａｍ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｒｅｓ．４４（１１）：２０５４−９）、または、免疫蛍光抗体試験（ＩＦＡ）により感染した白血球および血小板の細胞質中でＦｅＬＶ構造抗原を検出する（Ｈａｒｄｙら，１９９１，Ｊ  Ａｍ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ．１９９（１０）：１３２７−３５；ｉｂｉｄ．１３６５−７３）。さらに、ウェスタンブロット分析によってＦｅＬＶ抗体の存在が検出される。
あるいは、非血清学的診断としては、ウイルスの単離（Ｊａｒｒｅｔｔ  ＯおよびＧａｎｉｅｒｅ  ＪＰ．Ｖｅｔ  Ｒｅｃ．１３８（１）：７−１１）、またはプロウイルス（ＦｅＬＶ  ＤＮＡ）およびウイルス量（ＦｅＬＶ  ＲＮＡ）を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｈｏｆｍａｎｎ−Ｌｅｈｍａｎｎ  Ｒら，２００１．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．８２（Ｐｔ  ７）：１５８９−９６，Ｈｅｒｒｉｎｇ  ＩＰら，２００１．Ｖｅｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．４（２）：１１９−２６，Ｊａｃｋｓｏｎら，１９９６．Ｊ  Ｖｅｔ  Ｄｉａｇｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．８（１）：２５−３０）を含む。これらの方法の大部分は時間がかかり、および／または費用がかかる特徴により、それらは実用的かつ臨床的な使用には適していない。ＦｅＬＶ感染症を予測するために抗体検出はどの程度信頼できるのか、およびどの抗体が適しているのかに関する証拠が提供されていないため、診断のためにＦｅＬＶ抗体を検出する血清学的検査は今まで利用することができなかった。
【０００４】
感染したネコにおけるＦｅＬＶ疾患の結果はかなり予測することが不可能である。それらは、不稔性（プロウイルス陰性）、進行性（持続的にｐ２７陽性、プロウイルス陽性、ＦｅＬＶ  ＲＮＡ陽性、ウイルス単離陽性）、および退行性（ｐ２７陰性、一過性抗原血症後に、または一過性抗原血症なしでプロウイルス陽性）と称される。
しかしながら、血液中でプロウイルス陰性のままであろうネコが血清転換し、ＦｅＬＶ感染症が発生したことが明らかになったと報告されている（Ｇｏｍｅｓ−Ｋｅｌｌｅｒ  ＭＡら，２００９．Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３４（３−４）：２０８−１７；Ｍａｊｏｒ  Ａら，２０１０．Ｖｅｔ  Ｒｅｓ．４１（２）：１７．）。これらのネコにおける疾患検出は、面倒で費用のかかる血清学的手順（ネコのオンコルナウイルス結合細胞膜抗原に対する免疫蛍光検査法‘ＦＯＣＭＡ‐試験’）によってのみ可能である。
【０００５】
今までは、ＦｅＬＶに対する抗体の検出は、ネコ集団における内因性ＦｅＬＶ（ｅｎＦｅＬＶ）の広範囲に及ぶ存在のために、獣医学診療における診断の手段として限られた意義しかなかった。ｅｎＦｅＬＶは免疫系によって許容されないため抗体が誘発され（Ｌａｎｇｈａｍｍｅｒら，２００６．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１１７（２）：２２９−３７）、それは外因性ＦｅＬＶに対する抗体と区別できない。ＰＣＲのみが、内因性ＦｅＬＶと外因性ＦｅＬＶの間を区別することができる。したがって、ＦｅＬＶ抗体はこれまで診断パラメータとして有用であると考えられていなかった。さらにいくつかの研究では、ＦｅＬＶの様々なエピトープに対する十分な抗体反応を検出することができなかった。
Ｆｏｎｔｅｎｏｔおよび共同研究者（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９２）３０（７）：１８８５−９０）は、予測ＦｅＬＶ膜貫通免疫優性ドメイン（Ｉｍｄ‐ＴＭペプチド、２６個のアミノ酸長）の反応性を分析し、血清学における診断薬としてのその可能性を調査した。引用研究では、ペプチドはＦｅＬＶに感染したネコからの血清を用いて、無視できるだけのレベルの反応性を示し、それは著者をＩｍｄ‐ＴＭペプチドはＦｅＬＶ診断には有用ではないという結論に導いた。
Ｌａｎｇｈａｍｍｅｒら，（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００６；１１７（２）：２２９−３７）は、細胞外ドメイン（ＡＡ４７６‐５８３）を含むＦｅＬＶｐ１５Ｅポリペプチドを組換え生成し、ＦｅＬＶに感染したネコはｐ１５Ｅに対する抗体を作ったが、ＥＬＩＳＡにおける反応は低かったことを示した。エピトープマッピングにより、ｐ１５Ｅ免疫ネコからの血清により検出されたエピトープを含めて、ＦｅＬＶ感染動物からの血清により認識される様々なエピトープが示されたが、感染した動物における反応はワクチン接種を受けた動物よりも弱かった。該研究から、自然ＦｅＬＶ感染はｐ１５Ｅに特異的な抗体の弱い誘導、および中和抗体の少ない誘導をもたらすことが結論付けられた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ａｍ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ．２２８（３）：３７１−６
【非特許文献２】Ｌｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５６，２０９−２２０（１９８３）
【非特許文献３】Ｌｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｒｅｓ．４４（１１）：２０５４−９
【非特許文献４】ＩＦＡ；Ｈａｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ  Ａｍ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ．１９９（１０）：１３２７−３５；ｉｂｉｄ．１３６５−７３
【非特許文献５】Ｊａｒｒｅｔｔ  Ｏ  ａｎｄ  Ｇａｎｉｅｒｅ  ＪＰ．Ｖｅｔ  Ｒｅｃ．１３８（１）：７−１１
【非特許文献６】Ｈｏｆｍａｎｎ−Ｌｅｈｍａｎｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．８２（Ｐｔ  ７）：１５８９−９６
【非特許文献７】Ｈｅｒｒｉｎｇ  ＩＰ  ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｖｅｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．４（２）：１  １９−２６
【非特許文献８】Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６．Ｊ  Ｖｅｔ  Ｄｉａｇｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．８（１）：２５−３０
【非特許文献９】Ｇｏｍｅｓ−Ｋｅｌｌｅｒ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３４（３−４）：２０８−１７
【非特許文献１０】Ｍａｊｏｒ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｖｅｔ  Ｒｅｓ．４１（２）：１７
【非特許文献１１】Ｌａｎｇｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１  １７（２）：２２９−３７
【非特許文献１２】Ｆｏｎｔｅｎｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９２）３０（７）：１８８５−９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、いくつかの実施形態において、ネコにおけるＦｅＬＶ感染を検出するため、特にｐ２７陽性ウイルス血症の非存在下で潜伏伝染性のＦｅＬＶ感染を診断するための、安全かつ経済的な方法および手段を提供することである。この目的は、独立請求項の主題によって達成される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書において使用される「ＦｅＬＶ感染」は、生殖細胞系における内因性ＦｅＬＶ配列の存在の対語として、外因性ＦｅＬＶの存在および複製を指す。
【０００９】
本発明のある実施形態の基礎は、感染を例えばＥＬＩＳＡによるｐ２７の検出などの従来の方法によって検出することができない場合であっても、Ｎ末端アミノ酸配列を含む組換え膜貫通タンパク質ｐ１５Ｅへの抗体の結合は、過去及び現在のＦｅＬＶ感染を検出するための重要な診断能力の手段であるという、驚くべき知見にある。
本発明は、ＦｅＬＶ診断における別のアプローチとして、血清学における４つのＦｅＬＶ抗原：組換えｅｎｖ遺伝子産物（ｐ４５）、全ウイルス、ＦｅＬＶ  ＴＭ  Ｃ領域からの短いペプチド、および全細胞質配列を含む組換えｐ１５Ｅ、の有用性に関する研究の成果である。実験的に感染し、かつ免疫されたネコからだけでなく、現地調査のネコからの血清をＥＬＩＳＡで調べた。各試料から、プロウイルス、ｐ２７、および免疫の状態を知った。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】平均Ｏ．Ｄ．（ｙ軸）に対して血清型（ｘ軸）をプロットした図である。ＥＬＩＳＡにより組換えｐ１５Ｅ調製物において免疫原性汚染物質が存在しないことが示されている。
【図２】ＳＰＦネコおよびプロウイルス陽性（ｐ２７陽性およびｐ２７陰性のネコ）を含む実験的に感染したネコに対するプロウイルスの経験的受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す図である。様々なカットオフで、真陽性率（感度、ｙ軸）を偽陽性率（１‐特異度、ｘ軸）に対してプロットされている。
【図３】カットオフ（ｘ軸）に対してプロットした感度×特異度（ｙ軸）により、実験的に感染したネコに対する最適なカットオフ値の決定を示す図である。暗線は、特異度≧８０％を表し、矢印は、カットオフポイントを示している。
【図４】現地調査ネコに対するプロウイルスの経験的受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す図である。様々なカットオフで、真陽性率（感度、ｙ軸）が偽陽性率（１‐特異度、ｘ軸）に対してプロットされている。
【図５】カットオフ（ｘ軸）に対してプロットした感度×特異度（ｙ軸）により、実験的に感染したネコに対する最適なカットオフ値の決定を示す図である。
【図６】決定のための種々の方法の間の一致度の程度を示している（コーエンのｋ（＝カッパ）値）図である。
【図７】相対的ＯＤ値を表すｙ軸および研究で使用されるさまざまなワクチンのｘ軸により、実験的にワクチン接種したネコにおけるｐ１５Ｅ反応性を示す図である。灰色バー：ワクチン接種前の８週齢のＳＰＦネコ、白色バー：チャレンジ実験前に２回ワクチン接種した後の同じ子ネコ。
【図８】相対的ＯＤ値を表すｙ軸および抗原のｘ軸により、ワクチン接種した現地調査のネコにおける４つの異なる抗原調製物に対する反応性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の第１の態様によれば、対象においてＦｅＬＶ感染を検出する方法が提供され、前記対象から得られた試料は、組換え膜貫通タンパク質ｐ１５Ｅ、またはｐ１５ＥのＮ末端アミノ酸配列を含むその断片とインビトロで接触し、組換えｐ１５Ｅタンパク質に結合することができる試料中に含まれる抗体の存在が検出される。
【００１２】
本発明の他の態様では、対象においてＦｅＬＶ感染を検出する方法が提供され、前記対象から得られた試料は、（ａ）完全な膜貫通ｐ１５Ｅタンパク質、および（ｂ）ｅｎｖポリタンパク質前駆体からのｐ１５Ｅタンパク質切断後の前記ｐ１５Ｅタンパク質のＮ末端を含む膜貫通ｐ１５Ｅタンパク質の断片、から選択されるタンパク質と接触する。
【００１３】
本発明の他の態様では、対象においてＦｅＬＶ感染を検出する方法が提供され、前記対象から得られた試料は、ＳＥＱ  ＩＤ  ００１のアミノ酸配列を含むｐ１５Ｅタンパク質、またはＳＥＱ  ＩＤ  ００１と９０％以上同一である配列とインビトロで接触し、ｐ１５Ｅタンパク質に結合することができる試料中に含まれる抗体の存在が検出される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、前記タンパク質は組換えタンパク質である。
【００１５】
本発明の文脈において、用語「組換え」は、タンパク質が、例えば（ａ）ｐ１５Ｅの細胞質領域のＮ末端アミノ酸配列を含むｐ１５Ｅ膜貫通タンパク質の配列をコードする遺伝子の宿主細胞中で発現することによって、または（ｂ）無細胞系において、例えば個々のアミノ酸の固相合成によって、合成的に生成されることを意味する。
【００１６】
対象は、ＦｅＬＶに感染しやすい宿主、例えば飼い猫（Ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ）、スペインオオヤマネコ（Ｌｙｎｘ  ｐａｒｄｉｎｕｓ）、またはヨーロッパヤマネコ（Ｆｅｌｉｓ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ）である。試料は、抗体を含み得る任意の対象の試料である。最も好ましい試料は、全血試料または血清試料である。
【００１７】
本発明の好ましい態様によれば、組換えタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ００１（ＦｅＬＶ‐Ａのアミノ酸４４６‐６４２；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ９３０９３．１）のアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ００１と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上同一である配列から基本的に成る、または構成される。
【００１８】
本発明の文脈における同一性は、位置ごとの配列比較の結果を表す単一の定量的パラメータである。配列比較の方法は当技術分野で周知であり、公的に利用可能であるＢＬＡＳＴアルゴリズムが例としてある。
【００１９】
試料と組換え膜貫通タンパク質とが接触した後、組換え膜貫通タンパク質への抗体の結合が検出される。抗体結合のこのような検出は、例えば結合パートナーの一方、好ましくは組換えタンパク質が結合している表面の物理的性質を測定することによって、直接行うことができる。このような方法の例としては、水晶微量天秤または表面プラズモン（ＢＩＡＣＯＲＥ社）実験がある。
【００２０】
あるいは、ｐ１５Ｅに対する抗体の存在は、例えばウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ型の方法によって間接的に検出することができ、それには対象種のガンマ免疫グロブリンの一定部分に特異的な検出抗体またはリガンドが用いられ、検出抗体の結合は、例えば検出抗体を標識することによって検出される。
好ましい標識は発色酵素であり、それは基質を生成物に変換し、生成物形成の速度または量は分析法によって検出することができる。例としては西洋ワサビペルオキシダーゼがある。好ましい標識の他の種類としては、発光タンパク質（例えばルシフェラーゼ）、または蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ）、または蛍光色素もしくは燐光色素がある。
【００２１】
一実施形態によれば、ＦｅＬＶ感染の検出方法は、組換えｐ１５のＮ末端配列を含む組換えｐ１５に結合する抗体の存在を検出することに加えて、試料中のＦｅＬＶｐ２７タンパク質の存在を検出する工程を含む。
【００２２】
ｐ２７の検出は、均一または不均一アッセイとして、試料をｐ２７に対する抗体に接触させることによって達成することができる。ｐ２７に対して反応する抗体は表面に結合させることができ、ｐ２７の結合は、上記に記載したように表面プラズモン共鳴または同等の技術によって直接測定することができる。同様に、ｐ２７に対する抗体は、表面にｐ２７を結合させるために使用され得、結合したｐ２７は、二次抗体に結合した検出可能な標識を有する二次抗体によって測定することができる。
【００２３】
一実施形態において、本発明の方法はｐ２７の検出を含み、前記試料中におけるｐ２７タンパク質の存在と合わせて膜貫通ｐ１５Ｅタンパク質への抗体の結合は、ＦｅＬＶウイルス血症を示し、試料中における前記ｐ２７タンパク質非存在下での膜貫通ｐ１５Ｅタンパク質への抗体の結合は、ＦｅＬＶに対する免疫を示す。
【００２４】
試料を組換えｐ１５Ｅタンパク質に接触させる前の段階として、ｐ２７の検出を行ってもよい。ｐ２７タンパク質の検出は、対象における急性のＦｅＬＶウイルス血症の指標であるため、ｐ１５Ｅと接触させることによるさらなる分別分析の必要性を取り除く。しかしながら、試料がｐ２７に対して陰性を示した場合、試料をｐ１５Ｅと接触させて、対象が過去にＦｅＬＶにさらされていたか、および潜伏感染の可能性があるかを確立する。
あるいは、ｐ２７およびｐ１５Ｅの検出を組み合わせることで、いずれかの因子の個別の検出よりも複雑でないワークフローを与える。検出反応条件によって、ｐ１５Ｅの後にｐ２７を検出することが好ましい場合がある。
【００２５】
ＦｅＬＶｐ２７の検出は、ｐ２７に特異的な抗体またはリガンドによって達成することができ、それは上記に記載したように標識することができる。ｐ２７の検出およびｐ１５Ｅの検出が同時に行われる実施例では、２つの抗原に対する抗体の標識は異なっていなければならない。
【００２６】
同様に、他の好ましい実施形態によれば、ｐ４５に対する抗体の存在は、ｐ１５Ｅ膜貫通タンパク質に対する抗体に加えて、場合によってはｐ２７の存在に加えて検出することができる。ｐ４５に対する抗体の存在は、ｐ１５Ｅに対する抗体の存在を検出するために用いられる手段と同様の手段によって達成可能である。
【００２７】
ｐ４５に対する抗体を検出することの利点は、ｐ４５は全ての商業ワクチンに共通する抗原であるため、以前にＦｅＬＶに対するワクチン接種を受けたことがある対象が検出されることである。
【００２８】
本発明の第１の態様による方法は、結合パートナーの一方が表面に結合して他のパートナーの結合を検出する二相系として必ずしも実施される必要はない。このような表面‐液体系は、現在のところ操作が容易であり、ＥＬＩＳＡ読み取り機の遍在性、および試薬の安定供給のために商業市場を支配しているが、均一相検出システムは、同様にリガンドへの抗体の結合を確実に示すことができると当技術分野で知られている。均一相近接検出システムの一例は、Ａｌｐｈａ  Ｓｃｒｅｅｎ技術（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）であり、それにより光誘起一重項酸素種は近くのパートナーにおいて化学発光を起こす。
【００２９】
本発明の他の態様によれば、特に、対象におけるＦｅＬＶウイルスの検出またはＦｅＬＶ感染症の診断に使用するために、ＳＥＱ  ＩＤ  ００１のアミノ酸配列、または様々な実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ００１と９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上同一である配列を有する、単離された組換えタンパク質が提供される。
【００３０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ００１
ｅｐｉｓｌ  ｔｖａｌｍｌｇｇｌｔ  ｖｇｇｉａａｇｖｇｔ  ｇｔｋａｌｌｅｔａｑ  ｆｒｑｌｑｍａｍｈｔ  ｄｉｑａｌｅｅｓｉｓ  ａｌｅｋｓｌｔｓｌｓ  ｅｖｖｌｑｎｒｒｇｌ  ｄｉｌｆｌｑｅｇｇｌ  ｃａａｌｋｅｅｃｃｆ  ｙａｄｈｔｇｌｖｒｄ  ｎｍａｋｌｒｅｒｌｋ  ｑｒｑｑｌｆｄｓｑｑ  ｇｗｆｅｇｗｆｎｒｓ  ｐｗｆｔｔｌｉｓｓｉ  ｍｇｐｌｌｉｌｌｌｉ  ｌｌｆｇｐｃｉｌｎｒ  ｌｖｑｆｖｋｄｒｉｓ  ｖｖｑａｌｉｌｔｑｑ  ｙｑｑｉｋｑｙｄｐｄ  ｒｐ
【００３１】
一実施形態によれば、ＳＥＱ  ＩＤ  ００１のアミノ酸配列、または他の実施形態においてＳＥＱ  ＩＤ  ００１と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上同一である配列を有する組換えタンパク質は、表面に結合される。
より好ましい実施形態では、この表面は、マイクロタイタープレートの空洞の表面、例えばＥＬＩＳＡキットの一部として、ラボオンチップ装置の表面、水晶微量天秤の表面、またはプラズモン共鳴チップの表面である。同様に、この表面はニトロセルロース膜またはガラス繊維膜であってもよい。
【００３２】
本発明の他の態様によれば、上記で定義した表面の一つ以上はＦｅＬＶの血清学的検出のためのキットに含まれている。好ましい実施形態において、このキットはさらに、標識された抗ネコ免疫グロブリン抗体を含む。より好ましい実施形態では、標識は発色酵素、発光または蛍光のタンパク質もしくは色素を含む群からの１つ以上の標識を含む。最も好ましい実施態様では、キットはさらに、ｐ２７タンパク質の血清学的検出のためのリガンドを含む。
【００３３】
本発明の第１の態様による適したリガンドはまた、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、またはＳＥＬＥＸなどの発展的方法によって作成することが可能であり、ポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドが標的物質に対するそれらの結合親和性に応じて選択される。
【００３４】
さらに、より高い親和性阻害剤は、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列における発展および選択の反復ラウンドによって特定することができる。
【００３５】
本発明の基礎となる研究の目的は、非感染のネコと感染したネコとを区別するため、およびワクチン接種を受けたネコの抗体レベルを評価するために、血清学における診断薬としての種々のＦｅＬＶ成分の可能性を分析することであった。原理の証明として、実験的に感染したネコを試験した。診断の可能性に関して、最善の試験抗原はＯＤ＝０．０４９５でのカットオフで、９５．７％の診断感度および１００％の特異度を有する組換えＦｅＬＶ膜貫通（ＴＭ）タンパク質ｐ１５Ｅであるが、ＥＰＫ２１１、ＦＬ‐７４およびｐ４５は適していないことを実証することができた。現地調査のネコにおけるｐ１５Ｅに対するカットオフ値は、７７．１％の診断感度および８５．６％の特異度で、ＯＤ＝０．１６２５に決定された。
ｐ１５Ｅで試験したほぼ全てのＳＰＦ血清はｅｎＦｅＬＶに対する抗体を持っていなかったが、ある種類がｅｎＦｅＬＶに対する抗体の増加したレベルを有し得る可能性を我々は排除してはならない。ほぼ全てのネコはＦｅＬＶと接触した後に血清転換し、我々は、ネコがＦｅＬＶに感染した確率はｐ２７陰性のネコでは高いがｐ１５Ｅ陽性のネコでは低いことを明言することができる。
しかしながら、ｐ１５Ｅはウイルス血症のネコと免疫性のネコとの間を区別することができず、そのためｐ２７はウイルス血症を検出するために診断においてより一層必要とされていることが示される。
【００３６】
ネコにワクチン接種を割り当てるために、ＦｅＬＶ抗原に対してだけでなく、ＦｅＬＶ抗体も試験することが有用であろう。そうすることで動物の潜在的な免疫力に関する情報を取得することができ、それはワクチン接種を不必要なものにするかもしれない。
ネコ白血病ウイルスまたは狂犬病のワクチン含む特定のワクチン、およびワクチン接種の手続きは、ネコ注射部位関連肉腫（ＦＩＳＡＳ）と関係することが示唆されており、それは浸潤性の挙動を有する局所侵襲性肉腫の形成、および全症例の２５‐７０％における転移の確率を特徴とする悪性疾患である。ＦＩＳＡＳは、１０，０００匹のネコ当たり、わずか１‐１０匹において発生することが報告されている。
【００３７】
抗体検査では、免疫動物だけでなく、ＦｅＬＶに接触したことがないネコも検出しなければならず、診療する獣医にとって臨床的に有用なものとするために、内因性のＦｅＬＶに対する抗体を検出してはならない。ＦｅＬＶ未感作動物は、ＦｅＬＶによる後の感染を避けるために、ワクチン接種のための候補である。
獣医師は、ＦＩＳＡＳの危険性を伴うさらなるワクチン接種を避けるために免疫ネコの検出により多くの重点を置くか、または後のワクチン接種のために感染していないネコの検出により多くの重点を置くかどうかを選択する必要がある。
【００３８】
カットオフを超えるｐ１５ＥＯＤ値を有するネコは免疫があると考えられ（ｐ２７ＥＬＩＳＡが陰性の場合）、カットオフ未満にＯＤ値を有するネコは未感作でＦｅＬＶの影響を受けやすいと考えられ、ワクチン接種をする必要がある。
カットオフを超えるワクチン接種を受けたネコは、感染によって免疫があると考えられ、ワクチン接種を受けない。これらのネコはＦｅＬＶに感染する危険性はない。カットオフ未満のワクチン接種を受けたネコは、ＦｅＬＶの影響を受けやすいと考えられるため、再びワクチン接種を受ける。
ほとんど全てのネコがＬｅｕｃｏｇｅｎで免疫された場所では（例えば本明細書に関連する現地調査において：９８％）、獣医師はネコがワクチン接種を受けていることを確認するために、ｐ４５  ＥＬＩＳＡを用いてｐ１５Ｅ陰性のネコを試験して、ワクチン接種によるＦＩＳＡＳの（小さな）危険性を排除することができる。
【００３９】
ｐ１５Ｅは、非感染動物から感染動物を区別するために使用することができるが、ワクチン接種を受けたネコの大部分はｐ１５Ｅ  ＥＬＩＳＡに対して計算されるカットオフよりも低い抗体値を有するので、この抗原はワクチン接種を明確に検出するのには有用ではない。したがって、ｐ１５Ｅはこれまでの知見（Ｌｕｔｚ  Ｈら，１９８０．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４０（１０）：３６４２−５１）と一致して、ワクチン接種よりもむしろ感染を読み出すようである。
【００４０】
４つの抗原の間、および実験的に感染したネコと現地調査のネコとの間の著しい差異を、本発明の基礎となる調査において観察した。最も顕著な差異は、第１に、ｐ１５Ｅは他の全ての抗原に比べて群を抜いて最も強力な診断薬であり、これは実験的に感染したネコにおいてだけでなく、現地調査のネコでも同様である。
第２に、実験的に感染したネコにおけるｐ１５Ｅの検査の特異度は現地調査のネコよりも良く、それはおそらく現地調査のネコとは対照的に、実験的に感染したネコからの試料は特定かつ規定された時点で採取していたためであろう。
現地調査のネコは、多くの場合、未知の経緯、不明確な年齢、および試料採取の不明確な時点を有する。さらに、特に、現地調査のネコが捨て猫の場合、現地調査のネコがＦｅＬＶによって、種々のＦｅＬＶサブタイプによって、または他のウイルスによって何回感染したかは分からず、それは異なる検査の特異度の説明に役立つ。これらの要因は、実験的に感染したネコのデータと比較して、現地調査のネコのデータのカットオフ値およびカッパ値が上昇するという猫の免疫状態があまり明確でない結果をもたらし得る。
【００４１】
本発明の基礎となる研究では、ＳＰＦネコ、実験的に感染したネコ、および４つのＦｅＬＶ抗原、すなわち組換えｅｎｖ遺伝子産物、全ウイルス、ＦｅＬＶ膜貫通タンパク質からの１５個のアミノ酸長ペプチド、および組換えｐ１５Ｅに免疫があるネコからの血清の反応性を体系的に評価した。
間接ＥＬＩＳＡを用いて、ＦｅＬＶ感染症の診断のための代替的アプローチとして、ネコがＦｅＬＶと接触したことがあるかまたはないかどうかの証拠を求めた。本明細書に提示するｐ１５Ｅの結果に基づいて、血清学的結果は、少なくとも部分的にＰＣＲに取って代わる、ネコの感染状態を評価するのに有益な支持を示すという結論に達した。
【実施例】
【００４２】
材料および方法
間接酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）は、ＦｅＬＶの診断に役立つその能力を評価するために開発した。そして、ＦｅＬＶ膜貫通タンパク質からの短いペプチド、組換えｅｎｖ遺伝子産物（ｐ４５）、全ＦｅＬＶ抗原、および組換えｐ１５Ｅを抗原として用いた。実験的に感染し、かつワクチン接種したネコからの血清、および現地調査のネコの血清を、抗原に対するそれらの反応性について調査した。
【００４３】
ＥＬＩＳＡのための抗原
ｐ４５：ＦｅＬＶ‐Ａエンベロープ糖タンパク質のｇｐ７０表面ユニット（ワクチン抗原）の非グリコシル化組換え変異体（Ｊａｒｒｅｔｔ  ＯおよびＧａｎｉｅｒｅ  ＪＰ．１９９６．Ｖｅｔ  Ｒｅｃ．１３８（１）：７−１１．）。抗原懸濁液（Ｌｅｕｃｏｇｅｎ（登録商標）、Ｖｉｒｂａｃ  Ｓｃｈｗｅｉｚ  ＡＧ社、グラットブルック、スイス）を、０．１ｍｌの３％水酸化アルミニウムゲルおよび１０μｇのキラヤの精製抽出物をアジュバントとして添加した。
【００４４】
全ウイルス：全ウイルスは、ＦＬ‐７４細胞に由来する。このリンパ芽球ＦＯＣＭＡ（オンコウイルス関連細胞膜抗原）細胞株をＦｅＬＶABCに慢性的に感染させた（Ｊａｒｒｅｔｔら，１９７３．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．２０（２）：１６９−７５．）。ウイルスをショ糖密度勾配で精製した。
【００４５】
ＥＰＫ２１１：この合成１５アミノ酸ペプチド（Ａｃ−ＧＷＦＥＧＷＦＮＲＳＰＷＦＴＴ−ＮＨ2）は、ｐ１５ＥのＦｅＬＶカルボキシ末端領域の一部を模倣している。これは、固相ペプチド合成により合成し、分析用高圧液体クロマトグラフィーで精製した（純度＞８５％）。
【００４６】
ｐ１５Ｅ：ＦｅＬＶエンベロープ糖タンパク質の組換え膜貫通部分（ＴＭ）を生成するために、ＦｅＬＶ‐Ａのアミノ酸４４６‐６４２をコードするＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ９３０９３．１）をｐＣＲＩＩ  Ｔｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ルツェルン、スイス）でクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞において発現させた。
ｐ１５Ｅを含む融合タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーで精製した。ＥＬＩＳＡに使用するタンパク質を７．５ｍＭトリス‐Ｃｌ緩衝液ｐＨ８．０に対して透析した。生成物をウェスタンブロット分析によって確認した。ｐ１５Ｅ中の大腸菌残渣の存在を、大腸菌成分に対して免疫した３匹のウサギからの３つの異なる抗大腸菌血清（血清１、２および３）（図１を参照のこと）を用いてＥＬＩＳＡにより決定した。精製したｐ１５（Ｅ）の調製物中に微量の大腸菌成分のみが存在していたことが結果から示された。
【００４７】
血清および血漿の試料
４つの抗原に対する抗体について試験するために、種々のワクチン研究の血清および血漿を用いた。第１研究からの試料（ｎ／群＝９）は：１群‐ワクチン接種を受けていない対照動物。２群‐Ｅｕｒｉｆｅｌ（登録商標）（新名称：Ｐｕｒｅｖａｘ（登録商標）；Ｍｅｒｉａｌ社、リヨン、フランス）でワクチン接種。ＥｕｒｉｆｅｌはＦｅＬＶ‐Ａ  ｅｎｖ、ｇａｇ、およびｐｏｌの一部を含む、非アジュバントカナリア痘ベクター化生ワクチン（ＡＬＶＡＣ）である。３群‐全ウイルスＦｅＬＶを死滅させた多価ワクチンである、Ｆｅｌ‐Ｏ‐Ｖａｘ（登録商標）ＬＶ−ＫＩＶ（Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ社、アイオワ州、米国）でワクチン接種。ワクチンは二回皮下注射した。２回目のワクチン接種から四週間後に、各ネコにＦｅＬＶ‐Ａ／Ｇｌａｓｇｏｗ‐１（Ｊａｒｒｅｔｔら，１９９６．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．２０（２）：１６９−７５．）をチャレンジした。
【００４８】
１９９７年に行われた第２の研究からの試料（ｎ／群＝１４）は：１群‐ワクチン接種を受けていない対照群。２群‐不活性化（または死滅）抗原から成る、Ｆｅｖａｘｙｎ（登録商標）ＦｅＬＶ（Ｓｏｌｖａｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ社、メンドータ  ハイツ、ミネソタ州、米国）でワクチン接種。３群‐Ｆｅｌ‐Ｏ‐Ｖａｘ（登録商標）ＬＶ‐ＫＩＶでワクチン接種し、４群はＬｅｕｃｏｇｅｎ（登録商標）を接種した。ワクチンは二回皮下注射した。２回目のワクチン接種から四週間後に、各ネコにＦｅＬＶ‐Ａ／Ｇｌａｓｇｏｗ‐１をチャレンジした。
両研究において、チャレンジ暴露の前日およびその日に血液を採取した。その後、試料を１５週目まで毎週採取した。さらに、我々は、チャレンジから８週または１０週後のワクチン未接種の対照群からの血漿を使用した（ｎ＝４７）。抗体に対する長期的な影響について、我々はワクチン未接種であるがチャレンジした対象群からの血清を使用した。我々はまた、若いＳＰＦネコ（ｎ＝９０）、成体の血液ドナー（ＳＰＦ）ネコ（ｎ＝２０）からの血漿も使用し、かつ長期的な影響のために、我々は２２週間チャレンジしていない状態のネコから成る研究からの陰性対照群（ｎ＝４）を試験した。ワクチン接種したネコの反応性を試験するために、我々はワクチン研究からの全ての群を使用し、ワクチン接種前、およびワクチン接種後／ＦｅＬＶ‐Ａでのチャレンジ前にネコを試験した。
【００４９】
個人所有のネコ（ｎ＝２９４）からの血清も使用し、Ｍ．Ａ．Ｇｏｍｅｓ−Ｋｅｌｌｅｒ（２００６  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４（３）：９１６−２２．）によって２００４年４月から２００５年１月まで採取した。ネコのワクチン接種状態に関する情報は、血液試料を採取していた獣医師から得た。
【００５０】
試験した全ての血清、プロウイルス、およびｐ２７について、結果が入手できた。現地調査のネコの血清を表１にまとめる。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
酵素結合免疫吸着検定法
ＥＬＩＳＡは公開されている方法に基づいた（Ｅｎｇｖａｌｌ  ＥおよびＰｅｒｌｍａｎｎ  Ｐ．１９７２．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９（１）：１２９−３５，Ｖｏｌｌｅｒら，１９７６，Ｂｕｌｌ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ．５３（１）：５５−６５．）。
抗ＦｅＬＶｐ４５および抗ＦｅＬＶ全ウイルス（‘ＦＬ‐７４’）の抗体を前に記載したようにＥＬＩＳＡより測定した（Ｌｕｔｚ  Ｈら，１９８０．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４０（１０）：３６４２−５１，Ｌｅｈｍａｎｎ  Ｒら，１９９１．Ｊ  Ａｍ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ．１９９（１０）：１４４６−５２．）。ｐ４５および全ウイルスを１００ｎｇ／ウェルの最終濃度で使用した。ＥＰＫ２１１およびｐ１５Ｅは０．００５％のＳＤＳと合わせて２５ｎｇ／ウェルの最終濃度で使用した。血漿および血清を１：２００に希釈した。ａｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ネコＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｍｉｌａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａ  ＡＧ社、ラインフェルデン、スイス）を１：３０００に希釈して使用した。ＥＬＩＳＡプレートを、４１５ｎｍの吸光度で光学密度（ＯＤ）値を測定するために、分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ｐｌｕｓ  ３８４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、カリフォルニア州、米国）を用いて評価した。陽性および陰性の対照血清を、実行の間の比較性を確保するために内部標準として使用した。
【００５３】
ｐ１５Ｅの純度は、大腸菌の特異的エピトープに対する抗体を含む３つの異なるウサギ血清を用いて試験した。ＥＬＩＳＡは、ａｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｍｉｌａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａ社）を用いて上記のように行った。
【００５４】
データ分析および統計
ＥＬＩＳＡ  ＯＤ値を標準化した：（ＯＤ値（試料）−ＯＤ値（陰性対照））／（ＯＤ値（陽性対照）−ＯＤ値（陰性対照））。
【００５５】
ソフトウェアパッケージＮＣＳＳ（登録商標）バージョン０７．１．２０（ＬＬＣ  Ｋａｙｓｖｉｌｌｅ社、ユタ州、米国）、およびＰＡＳＷ（登録商標）統計ソフトウェアバージョン１８．０．２（Ｐｏｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ社、ニキスキー、米国）を受信者動作特性（ＲＯＣ）分析に使用し、かつＷｉｎ  Ｅｐｉｓｃｏｐｅ  ２．０（登録商標）ソフトウェア（Ｂｏｒｌａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）をカッパ値の計算に使用した。成体のＳＰＦネコと若いＳＰＦネコとの間の平均値の差を比較するために、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）およびＷｅｌｃｈ／Ｂｒｏｗｎ−Ｆｏｒｓｙｔｈｅ試験を使用した。
【００５６】
結果：
要約すると、ｐ４５、全ウイルス、およびペプチドは、抗原薬として不適当であることが見出された。ｐ１５Ｅでは、実験的に感染したネコからの血清を用いて、９５．７％の診断感度および１００％の特異度が示された。現地調査のネコの血清および異なるカットオフを用いて、ｐ１５Ｅ対プロウイルスＰＣＲからは、７７．１％の診断感度および８５．６％の特異度が示された。
【００５７】
ワクチン接種したネコはｐ１５Ｅに対する低い抗体レベルのみを示し、それは抗ｐ１５Ｅ抗体がワクチン接種よりも感染の証拠であることを示している。
【００５８】
組換えｐ１５Ｅの純度。
大腸菌細胞中で産生したｐ１５Ｅの純度を、大腸菌抗原で免疫したウサギからの３つの異なる血清を用いて、組換えｐ１５Ｅでコーティングしたウェル上でＥＬＩＳＡによって試験した。我々は残渣の大腸菌成分に対する抗体レベルを測定した（図１）。ＯＤは最大０．１１７であり（血清２）、それは陰性対照（ＯＤ＝０．１０６）に相当するものである。他の２つの大腸菌血清はさらに低いＯＤ値を示した。
全てのカットオフ率は、上記に記載の実験に由来する生データに対応する。当業者は、類似の方法により導出されたデータにカットオフ率を割り当てることができ、それは異なるＯＤの生データをもたらす。
【００５９】
実験的に感染したネコにおける抗体レベル。
偽陽性率（１−特異度）に対して真陽性率（感度）をプロットした受信者動作曲線（ＲＯＣ）に、実験的に感染したネコおよび現地調査のネコを表示してそれらを比較することで、異なるＦｅＬＶ抗原の診断的有用性を評価および比較した。
【００６０】
ＲＯＣ分析では、感染し、プロウイルス陽性（血清転換）のネコから、非感染、プロウイルス陰性で、特定病原体未感染（ＳＰＦ）のネコを区別するカットオフポイントを選択することで、最適な検査の特異度および感度がもたらされる。実験的に感染したネコの評価により原理の証明が表された。
ゴールドスタンダードとしてプロウイルスを使用して、全ての抗原のＲＯＣ曲線を図２に示す。原則として、最適なカットオフは、特異度≧８０％、および感度×特異度は最大として定義した（図３）。抗原ｐ１５Ｅは、ＲＯＣ空間の左側の境界および上部の境界に沿って優れた曲線を示した（図２）。ＯＤ＝０．０４９５のカットオフを選択し、感度（９５．７％）と特異度（１００％）との間で最善のトレードオフを表した。ＥＰＫ２１１に対する最適なカットオフ（−０．０３９）は、６５．７％の感度および８１．１％の特異度を示し、一方でｐ４５（カットオフ０．０１６）は８０％の感度および８８．９％の特異度を示した。全ウイルスは、−０．００７のカットオフで６５．７％の感度および８１．１％の特異度を示した。
【００６１】
大部分のネコが６歳を超える、異なる年齢の２０匹の成体の血液ドナーネコ（ＳＰＦ）からの血清も試験した。それらは若いＳＰＦネコの一定のデータセットを有するために、原理証明の研究には含まなかった。これら２０匹の動物も、４つ全ての抗原で試験した（データは示していない）。
簡潔には、ｐ≦０．０１の４つ全ての抗原に対する平均値の差異が観察され、それは若いＳＰＦネコの値と比較して、成体動物のＯＤ値はより分散し、かつ上昇する傾向を有し、これは年齢がこの抗体検査に重要であることを示している。
【００６２】
ＳＰＦネコおよびチャレンジした対照群のネコからの抗体に関する長期的な影響も検討した。ＳＰＦ血清は２２週間の間低いレベルのままであり、チャレンジしたネコ（免疫およびウイルス血症）からの血清は感染から４週間後に上昇し、高いレベルのままであった（データは示していない）。
【００６３】
分類された２つのデータセット間の一致度における偶然補正型測度を表すコーエンのｋ（カッパ）値は、ｐ１５Ｅとプロウイルスとの間における一致度のほぼ完璧なレベル（ｋ＝０．９６）を示した（図６）。
プロウイルスと、ｐ４５、全ウイルス‘ＦＬ‐７４’、およびＥＰＫ２１１との間の一致度は、０．４７−０．７０の間の範囲のより低いレベルを示した。抗原のペア間における一致度は満足のいく良好なレベルを示したが、ｐ１５Ｅとプロウイルスとの間の一致度よりも低い。
【００６４】
現地調査のネコにおける抗体レベル
ゴールドスタンダードとしてプロウイルスを使用したＲＯＣ分析による現地調査のネコの評価（図４）は、抗原ｐ１５Ｅに対してよい方向を示し、それは他の抗原とは著しく対照的である。
現地調査の値は全体的に増加したため、このデータセットのために新たなカットオフポイントを決定しなければならなかった。プロウイルス陽性に加えて免疫もされた８匹のネコはこの研究から除外した。（表１）最適なカットオフは、特異度≧８０％、および感度×特異度は最大として定義し（図５）、ｐ１５Ｅに対してＯＤ＝０．１６３と計算され、７７．１％の感度および８５．６％の特異度（特異度≧８０％）がもたらされた。
ＦＬ‐７４は、カットオフ０．６４７で４２．９％の感度および８０．１％の特異度を示し、ｐ４５Ｅはカットオフ０．５３１で４０％の感度および８１．１％の特異度を示し、かつＥＰＫ２１１はカットオフ２．４１１で１７．１％の感度および８４．６％の特異度を有していた。
【００６５】
コーエンのｋ値（特異度≧８０％）は、実験的に感染したネコのｋ値と比較してより低いレベルを示し、それはＲＯＣ分析で評価した２つのデータセット間の差異と一致した。最高の一致度レベルは、プロウイルスに対してプロットしたｐ１５Ｅによって達成された（ｋ＝０．５５）（図６）。
それとは著しく対照的に、他の抗原のペア、およびプロウイルスと抗原とのペアは、わずか０．０８〜０．４２のレベルにしか到達しなかったため、明らかに不十分であった。これらの結果から、ｐ１５Ｅとプロウイルスとの間の一致度は、ｐ１５Ｅと他の抗原との如何なる組み合わせよりもはるかに優れていることが示された。
【００６６】
ｐ１５（Ｅ）血清学対プロウイルスの結果における診断感度および特異度が、実験的に感染したネコに比べて現地調査のネコにおいて低かったという事実は、Ｍａｊｏｒら（２０１０）によって記載されているように、低レベルのＦｅＬＶのへの曝露により、血液中にプロウイルスＤＮＡが存在しない状態で血清転換が誘導され得るという知見によって説明することができる。
実験的感染は、常に比較的高含量のＦｅＬＶチャレンジウイルスを用いて注入することで行われ、プロウイルス陽性および血清転換がもたらされる。これとは対照的に、現地におけるＦｅＬＶによる感染は、ネコが様々な感染圧力にさらされる結果、低ウイルス量の存在下で血清転換するという点で、非常に可変的でなければならない。したがって、現地調査のネコにおけるｐ１５（Ｅ）血清学の一見低い診断特異度は、血液中のプロウイルスの非存在下でのｐ１５（Ｅ）への血清転換を正しく反映している。
【００６７】
実験的にワクチン接種したネコ
ワクチン接種した動物の反応を見るために、若い８週齢のＳＰＦネコからの血清を、ワクチン接種前のワクチン研究の開始時、および再度、２回のワクチン接種の後、チャレンジ感染の前に試験した。
【００６８】
結果をボックスプロットにまとめている（図７）。ｐ４５に対する結果から、全６５匹のネコ（プラセボなし）のうち、５６．９２％はカットオフを超えたが、予想したように、Ｌｅｕｃｏｇｅｎ（登録商標）で免疫した場合には１００％がカットオフを上回った。全ＦｅＬＶ抗原（ＦＬ‐７４）は、抗体反応の全体的な増加を示した（９０．７７％がカットオフを超えた；Ｌｅｕｃｏｇｅｎ（登録商標）をワクチン接種した場合は１００％）。
対照的に、抗体検出のための抗原としてのＥＰＫ２１１の使用では、５８．４６％がカットオフを超え、Ｌｅｕｃｏｇｅｎ（登録商標）でワクチン接種した４０％のネコがカットオフを超えた。組換えｐ１５Ｅでは、４４．６２％のネコはカットオフを超え、Ｌｅｕｃｏｇｅｎ（登録商標）でワクチン接種した動物の１３．３％がカットオフを超えた。
【００６９】
現地調査からのワクチン接種したネコ
全てのプロウイルス陰性ネコのうち、５０匹のネコにワクチン接種した（表１）。８匹のネコは、免疫されている他に、それらはプロウイルス陽性またはさらにはウイルス血症でもあるため、本研究から除外した（表１）。研究に考慮された９８％の全ての動物は、Ｌｅｕｃｏｇｅｎ（登録商標）を受け、大部分はＦｅｌｉｇｅｎ（登録商標）（Ｖｉｒｂａｃ  Ｓｃｈｗｅｉｚ  ＡＧ社、グラットブルック、スイス；ネコ汎白血球減少症およびネコ鼻気管炎／ネコインフルエンザ用）と組み合わせて適用した。
結果（図８）から、抗体反応は抗原ｐ４５（７０％）、全ウイルス（４２％）、およびＥＰＫ２１１（２４％）を用いて明確に増加したことが示された。ｐ１５ＥはＬｅｕｃｏｇｅｎワクチン接種ネコに対して低い反応性を示し、１６％のケースでカットオフポイントを超えた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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