(57)【要約】  本発明は、生物試料中のアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の量および／または存在を検出かつ／または決定する組成物および方法を提供する。本方法は、ＡＭＰをアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）に変換することのできる第１の酵素、好適にはポリリン酸：ＡＭＰホスホトランスフェラーゼ（ＰＡＰ）を使用して、溶液中の実質的に全てのＡＭＰをＡＤＰに変換する工程と、ＡＤＰをアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に変換することのできる第２の酵素、好適にはアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）を使用して、溶液中のＡＤＰをＡＴＰに変換する工程と、ルシフェラーゼ酵素およびルシフェラーゼ酵素の基質を利用する生物発光反応を使用して、産生されたＡＴＰの量を決定する工程と、産生されたＡＴＰの量を使用して、元の溶液中に存在するＡＭＰの量を決定する工程とを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中のアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）量を決定する方法であって、
ｉ）ＡＭＰをアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）に変換することのできる第１の酵素を使用して、前記溶液中の実質的に全てのＡＭＰをＡＤＰに変換する工程と、
ｉｉ）ＡＤＰをアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に変換することのできる第２の酵素を使用して、前記溶液中の実質的に全てのＡＤＰをＡＴＰに変換する工程と、
ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の後に、ルシフェラーゼ酵素および前記ルシフェラーゼ酵素の基質を利用する生物発光反応を使用して、前記工程（ｉｉ）において産生したＡＴＰの量を決定する工程と、
ｉｖ）前記産生したＡＴＰの量を使用して、工程（ｉ）の前の前記溶液中に存在したＡＭＰの量を決定する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記第１の酵素が、ポリリン酸：ＡＭＰホスホトランスフェラーゼ（ＰＡＰ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶液が、工程（ｉ）においてポリリン酸をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の酵素が、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｉｉ）が、工程（ｉ）と同時である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｉｉ）が、工程（ｉ）の後である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｉ）の前に、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）で、前記溶液中の実質的に全てのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）をサイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）およびピロリン酸に変換する工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉ）の前に、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）で、前記溶液中のｃＡＭＰをＡＭＰに変換する工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｉ）と同時に、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）を使用して、前記溶液中のｃＡＭＰをＡＭＰに変換する工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＤＥが、ＰＤＥ１、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ７、ＰＤＥ１０Ａ、およびＰＤＥ１１からなる群から選択される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｉ）の前に、ユビキチン化酵素およびユビキチンで、前記溶液中のＡＴＰをＡＭＰに変換する工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ユビキチン化酵素が、Ｕｂｅ１（Ｅ１）、ＵｂｃＨ５ｃ（Ｅ２）およびＣＡＲＰ２（Ｅ３）からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｉ）の前に、ＤＮＡリガーゼで、前記溶液中のＡＴＰをＡＭＰに変換する工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡリガーゼが、真核生物またはウイルスのＤＮＡリガーゼである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｉ）の前に、ＤＮＡリガーゼで、前記溶液中のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）をＡＭＰに変換する工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｉ）と同時に、ＤＮＡリガーゼで、前記溶液中のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）をＡＭＰに変換する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡリガーゼが、大腸菌のＮＡＤ＋依存型ＤＮＡリガーゼである、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
ａ）メチルトランスフェラーゼを使用して、前記溶液中のＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）をＳ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）に変換する工程と、
ｂ）ＳＡＨヒドロラーゼを使用して、前記ＳＡＨをアデノシンに変換する工程と、
ｃ）アデノシンキナーゼを使用して、前記アデノシンをＡＭＰに変換する工程と
をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
工程ｉ）の前に、工程ａ）、ｂ）、およびｃ）を実行する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
工程ｉ）およびｉｉ）と同時に、工程ａ）、ｂ）、およびｃ）を実行する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記メチルトランスフェラーゼが、ヒストン−リジン  Ｎ−メチルトランスフェラーゼ、（ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ、タンパク質イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼおよびタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｉ）の前に、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを使用して、前記溶液中のＡＴＰをＡＭＰに変換する工程を実行する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が、工程（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）の前に、産生される実質的に全てのピロリン酸を除去する工程をさらに含む、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の前に、阻害剤を含む組成物で、アデニル酸シクラーゼを阻害する工程をさらに含む、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記アデニル酸シクラーゼが、完全長の細菌アデニル酸シクラーゼの活性断片である、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記アデニル酸シクラーゼが、細菌のアデニル酸シクラーゼの活性組み換え断片である、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記アデニル酸シクラーゼが、細菌のアデニル酸シクラーゼである、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記細菌のアデニル酸シクラーゼが、百日咳菌（Ｂｏｒｔｅｄｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）または炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）由来である、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ルシフェラーゼ酵素の基質が、ルシフェリンである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
溶液中のＡＭＰの量を測定するキットであって、
ｉ）ポリリン酸：ＡＭＰホスホトランスフェラーゼ（ＰＡＰ）と、
ｉｉ）ポリリン酸と、
ｉｉｉ）アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）と、
ｉｖ）ルシフェラーゼ酵素と、
ｖ）前記ルシフェラーゼ酵素の基質と
を含む、キット。
【請求項３１】
アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）をさらに含む、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
ピロホスファターゼ（ＰＰａｓｅ）をさらに含む、請求項３０または３１に記載のキット。
【請求項３３】
塩化マグネシウムをさらに含む、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３４】
カルモジュリンをさらに含む、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３５】
ＡＴＰおよびＡＭＰをさらに含む、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３６】
ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）をさらに含む、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３７】
前記ＰＤＥが、ＰＤＥ１、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ７、ＰＤＥ１０Ａ、およびＰＤＥ１１からなる群から選択される、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）をさらに含む、請求項３６または３７に記載のキット。
【請求項３９】
ユビキチン化酵素およびユビキチンをさらに含む、請求項３０〜３８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４０】
前記ユビキチン化酵素が、Ｕｂｅ１（Ｅ１）、ＵｂｃＨ５ｃ（Ｅ２）およびＣＡＲＰ２（Ｅ３）からなる群から選択される、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
ＤＮＡリガーゼをさらに含む、請求項３０〜４０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４２】
前記ＤＮＡリガーゼが、大腸菌のＤＮＡリガーゼである、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）をさらに含む、請求項４１または４２に記載のキット。
【請求項４４】
前記ＤＮＡリガーゼが、大腸菌のＮＡＤ＋依存型ＤＮＡリガーゼである、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
メチルトランスフェラーゼ、ＳＡＨヒドロラーゼ、およびアデノシンキナーゼをさらに含む、請求項３０〜４４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４６】
前記メチルトランスフェラーゼが、ヒストン−リジン  Ｎ−メチルトランスフェラーゼ、（ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ、タンパク質イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼおよびタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをさらに含む、請求項３０〜４６のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に細胞用ツールに関し、より詳細には、生物試料中のアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）は、細胞内のエネルギー電荷比を制御するなどといった様々な細胞機能に関与する重要なメディエーターであり、細胞内の同化および異化の過程を調節する重要な指標である。また、ユビキチン化反応、タンパク質の合成および翻訳、核酸連結、ホスホジエステラーゼ活性などの産物でもある。ユビキチン化を介したユビキチン、ＳＵＭＯ化を介した低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、ＮＥＤＤ化を介したユビキチン様タンパク質Ｎｅｄｄ８などによるタンパク質の翻訳後修飾は、細胞周期、転写、核輸送、エンドサイトーシス、およびタンパク質の品質管理の制御機構などの様々な細胞過程の間に機能する重要な調節機構である。ユビキチン−プロテアソーム系（ＵＰＳ）は、多くの主要な細胞シグナリング分子の分解に関与している。ユビキチン鎖の結合の種類によって、修飾されたタンパク質がプロテアソームにより分解されるか、それとも他のタンパク質を誘引してシグナルカスケードを開始または内部移行されるかが決定される。このユビキチン化の過程は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ユビキチンもしくはその類似体を使用するユビキチン活性化酵素（ＵＡＥ、Ｅ１としても知られている）、ユビキチン結合酵素（Ｕｂｅ２、Ｅ２としても知られている）、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）、およびユビキチン化される基質により開始される酵素カスケードにより媒介される。このユビキチン化カスケードの産物は、ＡＭＰ、ピロリン酸（ＰＰｉ）、およびユビキチン化された（またはポリユビキチン化された）基質である。多発性骨髄腫・再発性マントル細胞リンパ腫患者の治療用としてプロテアソーム阻害剤ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）がＦＤＡの承認を取得したことから証明されているように、このユビキチン化（またはポリユビキチン化）および脱ユビキチン化の過程は非常に魅力的な研究領域である。したがって、ＵＰＳ経路における他の成分を標的とすることで、新規抗癌剤の開発の可能性が得られると考えられる。パーキンソン病の神経変性疾患研究においても同様の関心から、αシヌクレインをユビキチン化してそれをエンドソームのリソソーム経路に差し向けることでαシヌクレインを低減させ、それによりパーキンソン病および他のαシヌクレイン病の発病を予防するＥ３リガーゼとしてＮｅｄｄ４が同定されている。
【０００３】
タンパク質の翻訳は、基質アミノ酸を同族のｔＲＮＡに高いフィデリティーで連結させることを必要とする。この過程は、１つのＡＴＰ分子の消費を介したアミノアシルアデニル酸へのアミノ酸の活性化およびｔＲＮＡの受容体末端への活性化アミノ酸の送達という２つの工程で進行する。この過程のフィデリティーは、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＲＳ）によるアミノ酸およびそれらと同族のｔＲＮＡの認識ならびに誤ったｔＲＮＡに対する誤ったアミノ酸の連結を防止するプルーフリーディングの各正確性に依存する。プルーフリーディングは、ｔＲＮＡへのアミノアシル−ＡＭＰの送達の前に起こり、結果としてＡＭＰを放出する。したがって、タンパク質の翻訳は、ＡＴＰを消費する過程および産物としてＡＭＰを放出することを必要とする。ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、基質としてサイクリックアデノシン３，５−一リン酸（ｃＡＭＰ）を使用し、反応産物としてＡＭＰを放出する酵素の別の一例である。これらの酵素は、喘息、心血管機能、神経変性疾患などの多様な病的障害に関与する。
【０００４】
ＤＮＡリガーゼは、切断された一本鎖の連結を触媒し、ＤＮＡの複製を完全なものとし、かつ、ＡＴＰを介して破綻したＤＮＡを修復し、ＤＮＡ中の新規ホスホジエステル結合の形成をもたらす。真核生物のＤＮＡリガーゼは、アデニリル基の供与体としてＡＴＰを使用し、細菌のＤＮＡリガーゼは、ＡＴＰまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を使用する。ＤＮＡリガーゼは、アデニル化５’−リン酸への３’−ヒドロキシルの求核攻撃を触媒して、新規のホスホジエステル結合を形成させ、ＡＭＰを放出させる。真核生物のリガーゼや他のＤＮＡ結合酵素に影響を与えない細菌のＤＮＡリガーゼの阻害は、新規抗菌剤の開発のための新たな戦略として採用され、成功を収めている。
【０００５】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＭＴ）やタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）が関与する他の反応は、エピジェネティクスの分野で有望とされており、現在盛んに研究されている。これらの酵素は、基質としてＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を使用し、生じる産物のＳ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）は、ＳＡＨヒドロラーゼにより、アデノシンへと加水分解することができる。産物のアデノシンは、アデノシンキナーゼを使用してＡＭＰへと変換することができる。したがって、ＡＭＰの形成のモニタリングを、ＤＭＴおよびＰＭＴの活性の読み取りとして使用することができる。
【０００６】
低酸素状態の腫瘍で野生型と比較して有意にＡＭＰの濃度が増加し、それによりＡＴＰに対するＡＭＰの比率が増加してホスホフルクトキナーゼ−１（ＰＦＫ−１）のアロステリック活性が惹起されることも報告されている。したがって、腫瘍は、阻害作用を有するＡＴＰの濃度をより低くし、かつ活性化作用を有するＡＭＰの濃度を大幅に高くすることにより、通常の解糖速度を維持することができる。同様に、腫瘍細胞のＡＭＰ濃度を高くし、ＡＴＰ濃度を低くすることにより、ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼの活性化を誘導し、細胞増殖と炭素源利用能との均衡を図ることができる。上述の例は、生化学的試料および細胞または組織の試料におけるＡＭＰ濃度をモニタリングすることの重要性を強調するものである。標的の妥当性の検証、ならびにこの生化学的過程を変化させ得る分子、すなわち細胞生理異常の発現に関与する分子を開発することや特定の病態を誘導することは、確実で迅速な技術が利用できるかどうかに依存する。したがって、技術的研究の品質、費用、およびスピードが必要とされる創薬プログラムの要求を満たすアッセイが必要とされる。このようなニーズは現在使用されているアッセイでは満たされておらず、したがって、本発明のＡＭＰ検出方法は、これらの満たされていない需要を満たすものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願は、様々な生化学的用途および細胞学的用途においてＡＭＰをモニタリングするための方法およびキットを提供する。本技術およびキットは、細胞抽出物中に存在する遊離ＡＭＰを、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）、ユビキチン化（リガーゼ）に関与する酵素、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＲＳ）、ＤＮＡリガーゼ（細菌ＤＮＡリガーゼおよび真核生物のＤＮＡリガーゼ）など、生化学反応において産生する他のヌクレオチドおよびＡＭＰの存在下で検出する。
【０００８】
本キットはまた、生化学的反応から間接的に産生されるＡＭＰを、その反応産物をＡＭＰに変換することにより検出することが可能であり、この新規に形成されたＡＭＰは従来のアッセイ形式により検出することも可能である。これらは、ＤＮＡおよびタンパク質メチルトランスフェラーゼ、タンパク質イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）などを含む。
【０００９】
一実施形態において、本発明は、元の溶液中のアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の量を、ＡＭＰをアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）に変換することのできる第１の酵素を使用して、溶液中の実質的に全てのＡＭＰをＡＤＰに変換させることにより決定する方法を提供する。好適には、元の溶液中の少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％のＡＭＰが、第１の酵素により変換される。この第１の酵素は、好適には、ポリリン酸：ＡＭＰホスホトランスフェラーゼ（ＡＴＰ）であるが、他の任意の適切な酵素であってもよい。ポリリン酸を、任意にＰＡＰと共に添加してもよい。その後、溶液中のＡＤＰが、ＡＤＰをアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に変換することのできる第２の酵素を使用して、ＡＴＰに変換される。この第２の酵素は、好適には、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）であるが、他の任意の適切な酵素であってもよい。ＡＤＰをＡＴＰへ変換することは、第１の酵素によるＡＭＰのＡＤＰへの変換と同時であってもその後であってもよい。産生されたＡＴＰの量を、ルシフェラーゼ酵素およびルシフェラーゼ酵素の基質を利用することにより決定する。好適には、このルシフェラーゼ酵素の基質はルシフェリンであるが、他の任意の適切な基質であってもよい。その後、産生されたＡＴＰの量を使用して、元の溶液中に存在したＡＭＰの量を決定することができる。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、まず元の溶液中の実質的に全てのＡＴＰを、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）を使用してサイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）およびピロリン酸に変換し、その後、この溶液中の実質的に全てのＡＭＰを、ＡＭＰをＡＤＰに変換することのできる第１の酵素を使用して、ＡＤＰに変換することにより、元の溶液中のＡＭＰの量を決定する方法を提供する。ＡＣは、細菌のアデニル酸シクラーゼの完全長の活性断片であっても細菌のアデニル酸シクラーゼの活性組み換え断片であってもよい。好適には、ＡＣは、百日咳菌（Ｂｏｒｔｅｄｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）または炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）といった細菌のアデニル酸シクラーゼとすることができる。ある特定の実施形態において、好適には、元の溶液中の少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％のＡＴＰが、ＡＣにより変換される。ＡＭＰをＡＤＰに変換するために使用される第１の酵素は、好適にはＰＡＰであるが、他の任意の適切な酵素であってもよい。任意にポリリン酸を、ＰＡＰと共に添加してもよい。その後、この溶液中のＡＤＰは、ＡＤＰをＡＴＰに変換することのできる第２の酵素を使用してＡＴＰに変換される。任意に、ＡＤＰがＡＴＰに変換される前に、溶液中のＡＣを阻害する工程が、溶液にカルミダゾリウムなどのＡＣを阻害する化合物を供給することにより行われてもよい。ＡＤＰをＡＴＰに変換する第２の酵素は、好適にはＡＫであるが、他の任意の適切な酵素であってもよい。ＡＤＰのＡＴＰへの変換は、第１の酵素によるＡＭＰのＡＤＰへの変換と同時であってもその後であってもよい。産生されたＡＴＰの量が、ルシフェラーゼ酵素およびルシフェラーゼ酵素の基質を利用することにより決定される。好適には、このルシフェラーゼ酵素の基質はルシフェリンであるが、他の任意の適切な基質とすることができる。次に、産生されるＡＴＰ量を、元の溶液に存在したＡＭＰ量を決定するために使用することができる。任意に、この溶液中の実質的に全ての任意のピロリン酸を除去する工程を、ＡＤＰをＡＴＰに変換する前、かつ／または生物発光反応を実行する前に、ピロホスファターゼを入れることにより行い、溶液中のＡＴＰ量を決定することができる。ある特定の実施形態において、好適には、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％のピロリン酸が、ピロホスファターゼ（Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐａｈａｔａｓｅ）により除去される。
【００１１】
別の実施形態において、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）を使用して、元の溶液中のｃＡＭＰの一部または実質的に全てをＡＭＰに変換し、かつ、ＡＭＰをＡＤＰに変換することのできる第１の酵素を使用して、溶液中の実質的に全てのＡＭＰをＡＤＰに変換することにより、元の溶液中のＡＭＰ量を決定する方法を提供する。このｃＡＭＰのＡＭＰへの変換は、ＡＭＰのＡＤＰへの変換の前に行われるか、または同時に行われる。ある特定の実施形態において、好適には、元の溶液中の少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％のｃＡＭＰが、ＰＤＥにより変換される。好適には、このＰＤＥは、ＰＤＥ１、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ７、ＰＤＥ１０Ａ、ＰＤＥ１１、または他のいずれかの適切なＰＤＥとすることができる。ＡＭＰをＡＤＰに変換する第１の酵素は好適にはＰＡＰであるが、他のいずれかの酵素とすることができる。ポリリン酸を、任意にＰＡＰと共に添加してもよい。次に、この溶液中のＡＤＰを、ＡＤＰをＡＴＰに変換することのできる第２の酵素を使用してＡＴＰに変換させる。この第２の酵素は好適にはＡＫであるが、他のいずれかの適切な酵素とすることができる。ＡＤＰのＡＴＰへの変換は、第１の酵素によるＡＭＰのＡＤＰへの変換と同時に、またはその後に行われることができる。産生されるＡＴＰ量は、ルシフェラーゼ酵素およびルシフェラーゼ酵素の基質を利用することにより決定される。好適には、このルシフェラーゼ酵素の基質はルシフェリンであるが、他のいずれかの基質とすることができる。次に、産生されるＡＴＰ量を使用して、元の溶液中に存在したＡＭＰ量を決定することができる。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、ユビキチン化酵素系（Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３リガーゼ）およびユビキチンを使用して、元の溶液中に存在するＡＴＰの一部または実質的に全てをＡＭＰに変換し、その後、ＡＭＰをＡＤＰに変換することのできる第１の酵素を使用して、溶液中の実質的に全てのＡＭＰをＡＤＰに変換することにより、元の溶液中のＡＭＰを決定する方法を提供する。ある特定の実施形態において、好適には、この元の溶液中の少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％のＡＴＰが、ユビキチンン化酵素により変換される。このユビキチン化酵素は、好適には、Ｕｂｅ１（Ｅ１）、ＵｂｃＨ５ｃ（Ｅ２）、ＣＡＲＰ２（Ｅ３）、または他のいずれかの適切なユビキチン化酵素である。ＡＭＰをＡＤＰに変換するための第１の酵素は、好適にはＰＡＰであるが、他のいずれかの適切な酵素とすることができる。ポリリン酸を、任意にＰＡＰと共に添加してもよい。ＡＭＰをＡＤＰに変換すると同時に、またはその前に、元の溶液中の実質的に全てのＡＴＰを、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）を使用して、ｃＡＭＰおよびピロリン酸に変換することができる。次に、この溶液中の第１の酵素により形成されるＡＤＰを、ＡＤＰをＡＴＰに変換することのできる第２の酵素を使用して、ＡＴＰに変換させる。この第２の酵素は、好適にはＡＫであるが、他のいずれかの適切な酵素とすることができる。ＡＤＰのＡＴＰへの変換は、第１の酵素によるＡＭＰのＡＤＰへの変換と同時またはその後とすることができる。産生されるＡＴＰ量は、ルシフェラーゼ酵素およびルシフェラーゼ酵素の基質を利用することにより決定される。好適には、このルシフェラーゼ酵素の基質はルシフェリンであるが、他のいずれかの適切な基質とすることができる。次に、産生されるＡＴＰ量を使用して、元の溶液中に存在したＡＭＰ量を決定することができる。任意に、溶液中の実質的に全てのいずれかのピロリン酸を除去する工程を、ＡＤＰをＡＴＰに変換する前および／または溶液中のＡＴＰ量を決定するための生物蛍光反応を実行する前に、ピロホスファターゼを入れることにより行うことができる。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、ＤＮＡリガーゼを使用して、元の溶液中にＡＴＰが存在すればその一部または実質的に全てをＡＭＰに変換し、その後、ＡＭＰをＡＤＰに変換することのできる第１の酵素を使用して、この溶液中の実質的に全てのＡＭＰをＡＤＰに変換することにより、元の溶液中のＡＭＰ量を決定する方法を提供する。ある特定の実施形態において、好適には、この元の溶液中の少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％のＡＴＰが、ＤＮＡリガーゼを使用して変換される。任意に、この溶液は、ＤＮＡリガーゼによりＡＭＰに変換されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を含んでいても、そのＮＡＤ＋が添加されていてもよい。このＮＡＤ＋の変換は、ＡＭＰのＡＤＰへの変換の前であってもそれと同時であってもよい。好適には、このＤＮＡリガーゼは、真核生物またはウイルスのＤＮＡリガーゼである。ＮＡＤ＋が存在する場合、好適なＤＮＡリガーゼとしては、大腸菌ＮＡＤ＋依存型ＤＮＡリガーゼまたは他の適切なリガーゼが考えられる。ＡＭＰのＡＤＰへの変換のための第１の酵素は、好適にはＰＡＰであるが、他の任意の適切な酵素であってもよい。ポリリン酸を、任意にＰＡＰと共に添加してもよい。ＡＭＰのＡＤＰへの変換と同時に、またはその前に、元の溶液中の実質的に全てのＡＴＰを、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）を使用して、ｃＡＭＰおよびピロリン酸に変換することができる。その後、この溶液中の第１の酵素により形成されるＡＤＰが、ＡＤＰをＡＴＰに変換することのできる第２の酵素を使用して、ＡＴＰに変換される。この溶液中のＡＤＰは、ＡＤＰをＡＴＰに変換することのできる第２の酵素を使用してＡＴＰに変換される。この第２の酵素は、好適にはＡＫであるが、他の任意の適切な酵素であってもよい。ＡＤＰのＡＴＰへの変換は、第１の酵素によるＡＭＰのＡＤＰへの変換と同時であってもその後であってもよい。産生されたＡＴＰの量が、ルシフェラーゼ酵素およびルシフェラーゼ酵素の基質を利用することにより決定される。好適には、このルシフェラーゼの酵素の基質はルシフェリンであるが、他の任意の適切な基質であってもよい。産生されたＡＴＰの量を使用して、元の溶液中に存在したＡＭＰの量を決定することができる。任意に、この溶液中にピロリン酸があれば実質的にその全てを除去する工程を、ＡＤＰのＡＴＰへの変換の前および／または溶液中のＡＴＰの量を決定するための生物発光反応を実行する前に、ピロホスファターゼを入れることにより行うことができる。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、メチルトランスフェラーゼを使用して、溶液中に存在するＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）をＳ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）に変換し、ＳＡＨヒドロラーゼを使用してＳＡＨをアデノシンに変換し、アデノシンキナーゼを使用してアデノシンをＡＭＰに変換し、ＡＭＰをＡＤＰに変換することのできる第１の酵素を使用してこの溶液中の実質的に全てのＡＭＰをＡＤＰに変換することにより、元の溶液中のＡＭＰ量を決定する方法を提供する。ＳＡＭのＳＡＨへの変換、ＳＡＨのアデノシンへの変換、およびアデノシンのＡＭＰへの変換は、ＡＭＰのＡＤＰへの変換の前であってもよく、それと同時であってもよい。メチルトランスフェラーゼは、好適には、ヒストン−リジン  Ｎ−メチルトランスフェラーゼ、（ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ、タンパク質イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ、およびタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ、または他の任意の適切なメチルトランスフェラーゼとすることができる。ＡＭＰのＡＤＰへの変換のための第１の酵素は、好適にはＰＡＰであるが、他の任意の適切な酵素であってもよい。任意にポリリン酸を、ＰＡＰと共に添加してもよい。次に、この溶液中のＡＤＰが、ＡＤＰをＡＴＰに変換することのできる第２の酵素を使用して、ＡＴＰに変換される。この第２の酵素は、好適にはＡＫであるが、他の任意の適切な酵素であってもよい。ＡＤＰのＡＴＰへの変換は、第１の酵素によるＡＭＰのＡＤＰへの変換と同時であってもその後であってもよい。産生されたＡＴＰの量が、ルシフェラーゼ酵素およびルシフェラーゼ酵素の基質を利用することにより決定される。好適には、このルシフェラーゼ酵素の基質はルシフェリンであるが、他の任意の適切な基質であってもよい。その後、産生されたＡＴＰの量を使用して、元の溶液中に存在したＡＭＰの量を決定することができる。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを使用して、溶液中にＡＴＰがあればその一部または実質的に全てをＡＭＰに変換し、その後、ＡＭＰをＡＤＰに変換することのできる第１の酵素を使用して、この溶液中の実質的に全てのＡＭＰをＡＤＰに変換することにより、元の溶液中のＡＭＰ量を決定する方法を提供する。ある特定の実施形態において、元の溶液中の少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％のＡＴＰが、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを使用して変換される。ＡＭＰのＡＤＰへの変換のための第１の酵素は、好適にはＰＡＰであるが、他の任意の適切な酵素であってもよい。ポリリン酸を、任意にＰＡＰと共に添加してもよい。次に、本溶液中のＡＤＰを、ＡＤＰをＡＴＰに変換することのできる第２の酵素を使用してＡＴＰに変換する。この第２の酵素は、好適にはＡＫであるが、他の任意の適切な酵素であってもよい。ＡＤＰのＡＴＰへの変換は、第１の酵素によるＡＭＰのＡＤＰへの変換と同時であってもその後であってもよい。産生されたＡＴＰの量が、ルシフェラーゼ酵素およびルシフェラーゼ酵素の基質を利用することにより決定される。好適には、ルシフェラーゼ酵素の基質はルシフェリンであるが、他の任意の適切な基質であってもよい。次に、産生されたＡＴＰの量を使用して、元の溶液中に存在したＡＭＰの量を決定することができる。任意に、この溶液中にピロリン酸があれば実質的にその全てを除去する工程を、ＡＤＰのＡＴＰへの変換の前および／または溶液中のＡＴＰ量を決定するための生物蛍光反応を実行する前に、ピロホスファターゼを入れることにより行うことができる。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、ポリリン酸：ＡＭＰホスホトランスフェラーゼ（ＰＡＰ）、ポリリン酸、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）、ルシフェラーゼ酵素、およびルシフェラーゼ酵素の基質を含む、溶液中のＡＭＰ量を測定するキットを提供する。任意に、本キットは、以下の成分のいずれかまたは全てを含むことができる：アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）、ピロホスファターゼ（ＰＰａｓｅ）、塩化マグネシウム、カルモジュリン、ＡＴＰ、ＡＭＰ、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、またはアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ。本キットはまた、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）を含んでもよい。一実施形態において、ＰＤＥとしては、ＰＤＥ１、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ７、ＰＤＥ１０ＡまたはＰＤＥ１１が考えられる。本キットはまた、ユビキチン化酵素およびユビキチンを含んでもよい。一実施形態において、ユビキチン化酵素としては、Ｕｂｅ１（Ｅ１）、ＵｂｃＨ５ｃ（Ｅ２）またはＣＡＲＰ２（Ｅ３）が考えられる。本キットはまた、ＤＮＡリガーゼを含んでもよい。一実施形態において、ＤＮＡリガーゼは大腸菌ＤＮＡリガーゼである。本キットはまた、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を含んでもよく、任意に大腸菌ＮＡＤ＋依存型ＤＮＡリガーゼを含んでもよい。本キットはまた、ＳＡＨヒドロラーゼ（ｄｙｄｒｏｌａｓｅ）、アデノシンキナーゼ、およびメチルトランスフェラーゼを含んでもよい。一実施形態において、メチルトランスフェラーゼとしては、ヒストン−リジン  Ｎ−メチルトランスフェラーゼ、（ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ、タンパク質イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼまたはタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼが考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明において記載されるＡＭＰ検出アッセイのスキームを示す。
【図２】実施例１において記載されるように本発明の方法および組成物を使用して行う、ＡＴＰの存在下または非存在下におけるＡＭＰ検出の直線性を示す。
【図３】１５０ｎＭのＥ１および６００ｎＭのＥ２の存在下における１００μＭのＡＴＰおよび４０μＭのユビキチンを使用したＥ３リガーゼＣＡＲＰ２の滴定を示す。Ｅ３リガーゼの活性は実施例２において記載されるように本発明の方法および組成物を使用して決定した。
【図４】多様なｃＡＭＰホスホジエステラーゼの滴定を示す。実施例３において記載されるように１工程または２工程のアッセイで本発明の方法および組成を使用して、ｃＡＭＰ、ＰＤＥ活性の検出を実行した。
【図５】実施例３において記載されるように本発明の方法および組成物を使用して行った、ＰＤＥ  ３Ｂに対する多様な阻害剤の滴定を示す。
【図６】実施例４において記載されるように本発明の方法および組成物を使用して検出したＴ４  ＤＮＡリガーゼ滴定を示す。
【図７】実施例４において記載されるように本発明の方法および組成物を使用して実証した、多様なニコチンアミドの基質に対する大腸菌ＤＮＡリガーゼの特異性を示す。
【図８】本発明において記載されるＡＭＰ検出アッセイを、異なるメチルトランスフェラーゼ活性の定量のためのＳＡＨ検出に対して適用した場合のスキームを示す。
【図９】実施例６において記載されるように本発明の方法および組成物を使用して行った、多様なメチルトランスフェラーゼ酵素活性の定量を示す。本発明は、Ａ）リジンメチルトランスフェラーゼ（ＥＨＭＴ２−Ｇ９ａ）、Ｂ）アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＰＲＭＴ５）、およびＣ）ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ１）の活性を検出するために使用された。
【図１０】実施例６において記載されるように各種基質ならびに本発明の方法および組成物を使用して行った、リジンメチルトランスフェラーゼ、ＥＨＭＴ２−Ｇ９ａの滴定を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、生物試料中のアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の量および／または存在を検出かつ／または決定する組成物および方法を提供する。本発明はまた、生物試料中のＡＭＰ量を検出かつ／または決定することにより、たとえば、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）、ユビキチンおよびユビキチン様活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチンおよびユビキチン様結合酵素（Ｅ２）、ユビキチンおよびユビキチン様リガーゼ（Ｅ３）、ＤＮＡリガーゼ、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＲＳ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＭＴ）およびタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、タンパク質イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼなどの様々な酵素の活性を検出または決定する組成物および方法を提供する。本発明はまた、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）といった他のヌクレオチドを含む混合物中のＡＭＰを検出するために使用されてもよい。本発明の方法を、純粋な生化学的酵素反応中または細胞もしくは組織の抽出物の試料中のＡＭＰ量を検出または決定するために使用することができる。
【００１９】
本発明はまた、細胞もしくは組織の抽出物、尿もしくは血液などの液体試料、またはＰＤＥ、ＡＲＳ、ユビキチン、もしくはＤＮＡリガーゼなどの精製酵素が関与する生化学酵素反応など、ＡＭＰを含み得る任意の試料中のＡＭＰを検出するために使用される組成物およびキットを提供する。本発明の組成物およびキットは、試料中に存在する実質的にすべてのＡＴＰを除去もしくは枯渇させるかまたは酵素反応が完了した後残存する酵素を含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物およびキットは、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）、ポリリン酸：ＡＭＰホスホトランスフェラーゼ（ＰＡＰ）、ピロホスファターゼ（ＰＰａｓｅ）、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）、ポリリン酸、ルシフェリン、およびルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）を含む。他の実施形態において、本発明の組成物およびキットは、ＡＭＰをＡＤＰに変換する酵素およびこの酵素の基質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、本発明の組成物およびキットは、ＡＤＰをＡＴＰに変換する酵素、および、ＡＴＰをルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を介して発光シグナル、すなわち発光に変換する酵素をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、本発明の組成物およびキットは、酵素の存在の活性に必要であり得るポリリン酸、マグネシウム、およびカルモジュリンなどの緩衝成分および基質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、本発明の組成物およびキットは、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）などの酵素から産生されるピロリン酸を切断するピロホスファターゼをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＡＤＰをＡＴＰに変換する成分およびＡＴＰの検出（たとえばルシフェリン−ルシフェラーゼ反応）のための成分を、別々または同時に添加することができる。いくつかの実施形態において、ＡＴＰを除去または枯渇させる成分およびＡＭＰをＡＤＰに変換するための成分を、別々または同時に添加することができる。
【００２０】
ＤＮＡ、タンパク質、および小分子メチルトランスフェラーゼなどのメチルトランスフェラーゼの活性が検出または決定され、共通の基質がＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）であり共通の産物がＳ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）である、いくつかの実施形態において、この産物ＳＡＨは、Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（ＳＡＨＨ）およびアデノシンキナーゼ（ＡｄＫ）などの酵素によりＡＭＰに変換され、この基質は、ＧＴＰまたはｄＧＴＰである。いくつかの実施形態において、メチルトランスフェラーゼの活性を検出または決定する成分およびキットは、ＳＡＨＨ、ＡｄＫ、およびＧＴＰまたはｄＧＴＰをさらに含む。いくつかの実施形態において、本キットは、基質Ｓ−アデノシルメチオニンなど、メチルトランスフェラーゼの標準物質、および／または産物の形成をモニタリングするための標準物質としてのＳＡＨをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＡＭＰのＡＤＰへの変換、ＡＤＰのＡＴＰへの変換のための成分、およびＡＴＰの検出（たとえばルシフェリン−ルシフェラーゼ反応）のための成分を、別々および同時に添加することができる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、２工程の方法を提供し、第１の工程において、ＡＴＰを、アデニス酸シクラーゼ（ＡＣ）を使用して除去し（ＡＴＰは完全またはほとんどが除去され）、同時に、ポリリン酸：ＡＭＰリン酸トランスフェラーゼ（ＰＡＰ）およびポリリン酸を使用して、試料中のＡＭＰをＡＤＰに変換する。第２の工程において、産生されたＡＤＰを、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）を使用してＡＴＰに変換し、同時に、形成されたＡＴＰをルシフェリンおよびルシフェラーゼを含むＡＴＰ検出試薬で検出し、発光シグナル、すなわち発光を生成させる。生成される発光の量は、第１の反応において産生されるＡＭＰの量に比例する。いくつかの実施形態において、ＡＭＰの検出量は、試料中のＰＤＥ、ＡＲＳ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡもしくはタンパク質メチルトランスフェラーゼ、タンパク質イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ、またはユビキチンリガーゼなどの酵素の酵素活性に相関する。
【００２２】
他の実施形態において、本発明の方法を、ＡＴＰおよび他のヌクレオチド三リン酸を含む試料中に存在するＡＭＰをモニタリングするために使用することもできる。注目すべきことに、ＡＴＰを基質として使用するＡＣ反応において、産生されるｃＡＭＰがＡＫおよびルシフェラーゼを使用する後続の反応に及ぼす影響はほとんどないかまたは皆無である。ＧＴＰおよびＣＴＰは細胞もしくは組織の抽出物および生物試料中の主要なヌクレオチド三リン酸であり、それらのいずれもがホタルルシフェラーゼの基質としては弱いため、これらが試料中に存在する場合に起こる発光への干渉はごくわずかである。基質のホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼ、基質のホスホクレアチンとクレアチンキナーゼ、およびポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）など、ＡＤＰをＡＴＰに変換する他の酵素を使用した場合も、同様の結果を得ることができる。いくつかの実施形態において、ピルビン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）などの酵素を使用してＡＭＰをＡＴＰに１つの工程で直接変換することができる。ただしこの反応は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、リン酸塩、界面活性剤、消泡剤などを含むルシフェラーゼ反応試薬にとって耐容し得るものではないことが示されている。
【００２３】
本発明の方法の長所は、簡単であり、高感度であり、堅牢であり、抗体の必要がなく、そして使用しやすいという点にある。本発明の別の利点として、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応試薬の組成は、ルシフェリンの類似体の影響が最小限となるよう高濃度のルシフェリンを含有しているため、蛍光化合物および／または他の化学物質からの干渉への懸念が最小限に抑えられることが挙げられる。さらに、本発明は、ＰＡＰおよびＡＫのリン酸の供与体として、ＡＴＰではなくポリリン酸を利用する。このことにより、リン酸の供与体としてＡＴＰを使用した場合に、ＡＴＰがルシフェラーゼの基質であるため、ＡＴＰがルシフェリンールシフェラーゼ反応に干渉することに起因する問題が回避される。したがって、唯一の発光源が、ＰＡＰ／ＡＫの組み合わせを介してＡＴＰへ変換される試料中のＡＭＰから生成される。いくつかの実施形態において、ＡＤＰのＡＴＰへの変換およびルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に必要な成分を、組み合わせる代わりに別々に添加することができる。
【００２４】
いくつかの実施形態において、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応において使用されるルシフェラーゼ酵素は、たとえばＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、Ｐｈｏｔｕｒｉｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａなどのホタルルシフェラーゼなどのビートルルシフェラーゼ、ビートルルシフェラーゼの組み換え体、たとえば耐熱性および／もしくは耐薬品性としたビートルルシフェラーゼの変異体、またはＡＴＰ、ルシフェリン、分子状酸素、マグネシウムもしくは他の任意の２価陽イオンを使用して発光を生成する任意のルシフェラーゼを本発明の方法において使用することができる。
【００２５】
いくつかの実施形態において、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）は、百日咳菌（Ｂｏｒｔｅｄｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）由来の百日咳毒素の組み換え活性断片とすることができる。他の実施形態において、例えば炭素毒素（ｃｙａ，Ｂ．  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）といったコレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）、哺乳類のアデニル酸シクラーゼ、および他の供給源等の由来の他のＡＣ供給源を、本発明の方法において使用することができる。他の実施形態において、カルモジュリンおよび２価の陽イオンなどのＡＣ活性化剤が本発明の組成物および方法にさらに含まれてもよい。
【００２６】
本発明の組成物
本発明のいくつかの実施形態において、たとえば、ＰＡＰおよびポリリン酸といった、ＡＭＰをＡＤＰに変換する成分を含む組成物が提供される。他の実施形態において、ＡＭＰをＡＤＰに変換する組成物は、たとえば、ＡＣおよびピロホスファターゼといった、試料中に存在するＡＴＰを除去または枯渇させる成分をさらに含んでもよい。本発明のいくつかの実施形態において、たとえば、ＡＫおよびポリリン酸といった、ＡＤＰをＡＴＰに変換する成分を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、ＡＤＰをＡＴＰに変換する組成物は、たとえば、ルシフェリンおよびルシフェラーゼといった、産生されるＡＴＰを検出するための成分をさらに含んでもよい。他の実施形態において、本発明の組成物は、１）ルシフェラーゼ、および２）ＡＤＰをＡＴＰに変換する１つ以上の酵素を含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、任意に、アデニル酸シクラーゼ阻害剤、ＡＤＰ変換酵素の基質、ルシフェラーゼの基質、ＡＭＰをＡＤＰに変換する酵素、ＡＭＰをＡＤＰに変換する酵素の阻害剤、および／またはＡＭＰをＡＤＰに変換する酵素の基質を含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、１）アデニル酸シクラーゼ、２）ピロホスファターゼ、３）アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＲＳ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、タンパク質メチルトランスフェラーゼ、小分子メチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）、ユビキチンリガーゼ、ユビキチン活性化酵素およびユビキチン結合酵素などの酵素が関与する酵素反応の１つ以上の阻害剤を含む。いくつかの実施形態において、本組成物は、Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ、アデノシンキナーゼ、ＰＡＰ、ＡＫ、ルシフェラーゼなどの酵素を含む。いくつかの実施形態において、本組成物は、任意にアデニル酸シクラーゼの活性化剤を含む。いくつかの実施形態において、たとえば、ルシフェラーゼおよびルシフェリンを含む試薬といった、ＡＴＰ検出試薬が提供される。いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼおよびルシフェリンは凍結乾燥される。いくつかの実施形態において、ＡＴＰ検出試薬は、凍結乾燥のための賦形剤、ルシフェラーゼといったタンパク質、安定剤、マグネシウムまたは代替的な陽イオン、およびマグネシウムキレート剤または代替的な陽イオンキレート剤をさらに含んでもよい。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）／ルシフェリン−ルシフェラーゼ試薬といった、ＡＤＰをＡＴＰに変換する試薬およびＡＴＰ検出試薬の添加の前に添加され得るＰＡＰまたはＡＣを阻害する化合物を含んでもよい。いくつかの実施形態において、本組成物は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ中のルシフェラーゼ活性に影響を与え得るピロリン酸を分解するピロホスファターゼをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、たとえば、ホモジニアスアッセイといった、単一の溶液、組成物、または試薬中に全ての成分を含む。いくつかの実施形態において、本組成物を、ＡＭＰが存在しているか、またはＡＭＰ生成反応が生じているかについて、ＡＭＰの存在しない対照を使用して検定することができる。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、緩衝物質、２価陽イオン金属キレート剤、マグネシウムまたは代替的な陽イオン、消泡剤、およびＴＨＥＳＩＴといった酵素安定剤をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、本発明の組成物の成分を、使用する直前に混合される別々の成分として供給してもよい。他の実施形態において、これら別々の成分は、成分のサブセットを含んでもよく、本発明の使用を支援するかまたは本発明の組成物の保存期間を延長させる任意の方法で組み合わせてもよい。
【００２９】
キット成分
いくつかの実施形態において、本発明のキットは、１）ＰＡＰおよびポリリン酸を含む、ＡＭＰをＡＤＰへ変換する組成物、ならびに２）ＡＫおよびポリリン酸を含む、ＡＤＰをＡＴＰへ変換する組成物を含む。いくつかの実施形態において、ＡＭＰをＡＤＰに変換する試薬は、たとえば、ＡＴＰおよびＡＣ産生型ピロリン酸を除去または枯渇させるためのＡＣおよびピロホスファターゼといった成分をさらに含む。いくつかの実施形態において、本キットは、たとえば、ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含む試薬といったＡＴＰ検出試薬をさらに含む。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、生存率、細胞毒性、または細胞増殖を決定するといった、さらなるアッセイ試験の実行を支援する、個別の容器に入った試薬をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＡＴＰおよび／またはＡＭＰが、検量線を決定できるようまたは内部標準として利用できるよう、本キット内に含まれてもよい。いくつかの実施形態において、ＡＭＰを産生する反応の阻害剤または活性化剤であると知られている物質を、さらなる対照として含むことができる。他の実施形態において、本キットは、マルチウェルプレートならびに／またはＰＤＥ、リガーゼ、ＡＲＳ、メチルトランスフェラーゼ、タンパク質イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ、アデニル酸シクラーゼといったＡＭＰ産生酵素、および／またはＡＭＰをＡＤＰに変換する酵素、およびＡＤＰをＡＴＰに変換する酵素を含んでもよい。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、リガーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ＰＤＥ、ＡＲＳなどの基質、緩衝物質、ならびに／またはアデニル酸シクラーゼの阻害剤および／または活性化剤を任意に含んでもよい。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本発明のキットは、１）ＳＡＭ（Ｓ−アデノシル−メチオニン）と、２）ＳＡＨ（Ｓ−アデノシル−ホモシステイン）と、３）ＰＡＰ、ＳＡＨ−ヒドロラーゼおよびアデノシンキナーゼを含む、（ＡＭＰを介して）ＳＡＨをＡＤＰへと変換する組成物と、４）アデニル酸キナーゼ（ミオキナーゼ）を含む、ＡＤＰをＡＴＰへと変換する組成物と、５）たとえば、ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含むＡＴＰ検出試薬とを含む。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）／ルシフェリン−ルシフェラーゼ試薬といった、ＡＤＰをＡＴＰに変換する試薬およびＡＴＰ検出試薬の添加前に添加し得る、アデノシンキナーゼ、ＰＡＰ、またはＡＣを阻害するための化合物を含んでもよい。いくつかの実施形態において、本キットは、ルシフェリン−ルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性に影響を与え得るピロリン酸を分解するピロホスファターゼをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、ホモジニアスアッセイキットといった、単一の溶液、組成物、または試薬中にすべての成分、組成物、または試薬を含む。いくつかの実施形態において、本キットの組成物を、ＡＭＰが存在しているか、またはＡＭＰ生成反応が生じているかについて、ＡＭＰの存在しない対照を使用して検定することができる。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本発明のキットに含まれる試薬は、個々の成分を保存できかつそれ自体の材料によって成分を吸着したり変質させたりしないような任意の容器に入っていてもよい。
【実施例】
【００３２】
多くの生化学反応の共通産物としてのＡＭＰの濃度を決定し、かつ／またはＡＭＰ形成をモニタリングするための堅牢なアッセイを作製するため、産生されるＡＭＰを、ＰＡＰを使用してＡＤＰに変換すると同時に、ＡＭＰに産生するために利用する基質がＡＴＰである場合はそれを枯渇させる。ＡＴＰの枯渇は、アデニル酸シクラーゼおよびピロホスファターゼを組み合わせて使用することにより実行される。ＰＡＰの添加により産生されるＡＤＰを、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）を使用してＡＴＰに変換すると同時に、産生されるＡＴＰを、ＡＴＰ検出試薬、たとえばルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を使用して発光シグナル、すなわち、発光に変換する。この生物発光反応は、大量のプレートを用いた場合でも十分な感度を有し、安定したシグナルを発する。
【００３３】
材料
ウサギの骨格筋由来のミオキナーゼ（ＡＫ）（シグマ社カタログ番号  Ｍ３００３）
ウサギの骨格筋由来のピルビン酸キナーゼ（シグマ社カタログ番号  Ｐ９１３６）
ホスホエノールピルビン酸（シグマ社  Ｃａｔ＃７１２７）
ウシ心臓由来のクレアチンホスホキナーゼ（シグマ社カタログ番号  Ｃ７８８６）
ウサギの筋肉由来のクレアチンホスホキナーゼ（シグマ社カタログ番号  Ｃ３７５５）
アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）は、活性ＡＣ部分を含むＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの毒素の組み換え断片であり、基質としてＡＴＰを使用した場合に活性を示した。ＡＣはプロメガ社から入手した。
ＡＭＰ  １０ｍＭ（シグマ社  ｃａｔ＃  Ａ１７５２）
ヘキサメタリン酸ナトリウム。以下、ポリリン酸と称する。（シグマ社  Ｃａｔ＃  Ｐ８５１０）
ＡＭＰ  Ｇｌｏ試薬Ｉ（ＡＴＰ枯渇用／ＡＭＰからのＡＤＰへの変換用試薬）：８０ｍＭ  トリス  ｐＨ７．５、１０Ｕ／ｍｌ  カルモジュリン、２Ｕ／ｍｌ  ピロホスファターゼ、０．１ｍｇ／ｍｌ  Ｐｒｉｏｎｅｘ、６０Ｕ／ｍｌ  ＨＱタグＡＣ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、８μｇ／ｍｌ  ＨＱタグ−ＰＡＰおよび４０μＭ  ポリリン酸
ＡＭＰ  Ｇｌｏ試薬ＩＩ（ＡＤＰからＡＴＰへの変換用試薬）：２ＫＵ／ｍｌのＡＫ、４ｍＭのポリリン酸、３．２ｍＭの硫酸アンモニウム  ｐＨ６．０、および１ｍＭのＥＤＴＡ
ＡＭＰ検出試薬：１０μｌのＡＭＰ  Ｇｌｏ試薬ＩＩを含む１ｍｌのＫｉｎａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬
Ｋｉｎａｓｅ−Ｇｌｏ試薬（プロメガ社）：Ｋｉｎａｓｅ−Ｇｌｏ基質およびＫｉｎａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）緩衝液、ＤＮＡまたはタンパク質メチルトランスフェラーゼの基質（Ｓ−アデノシルメチオニン）（プロメガ社）の混合物
Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（プロメガ社）
酵素反応産物であるＳ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）をアデノシンに変換し、アデノシンをＡＭＰに変換するアデノシンキナーゼ（プロメガ社）
【００３４】
方法
ポリリン酸−ＡＭＰホスホトランスフェラーゼ（ＰＡＰ）のクローニングおよび発現
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ２１０ＡのゲノムＤＮＡを、細菌培養物から単離し、精製し、滅菌蒸留水中に溶解させた。プライマー５’−ＡＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＴＡＡＣＧＣＣＣＧＣＴＴＴＧＧＴＴＴＡ−３’（配列番号１）および５’−ＡＡＧＣＧＡＴＣＧＣＡＣＧＧＡＡＣＴＣＧＣＴＡＴＣＡＣＡＡＡ−３’（配列番号２）、核酸混合物、ならびにＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む反応において、単離したゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを実行した。ＰＣＲ断片を精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ（登録商標）ベクター（プロメガ社）内にクローン化し、この組み換えプラスミドを、ＪＭ１０９細胞に形質転換し、適切な抗生剤を含むＬＢプレート上で増殖させた。良好に増殖した細菌コロニーを選択して、プラスミドの単離および精製のために培養物中で増殖させた。プラスミドＤＮＡの検証は、制限酵素での消化により行った。正しいＰＡＰ配列がクローン化されたことを確認するため、アイオワ大学の設備を利用してＤＮＡの配列を決定した。その後、ＰＡＰのＤＮＡをｐＦＮ６Ｋ（ＨＱ）Ｆｌｅｘｉ（登録商標）発現ベクター（プロメガ社）内にサブクローニングし、カナマイシンを含むＬＢ培地中で増殖中のＪＭ１０９に形質転換した。プラスミドを単離し、制限酵素を使用して消化して、ＤＮＡの正確なサイズを検証した。ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、発現ベクターを使用して形質転換させ、ＯＤ６００が０．４となるまでカナマイシンを含むＬＢ培養液中で増殖させた。その後、この細菌培養物を、ＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）で誘導し、さらに２時間培養した後、Ｆａｓｔ  Ｂｒｅａｋ溶解緩衝液（プロメガ社）を使用して溶解し、サイズ（５５ｋＤａ）を検証した。大規模の細菌培養物を作製し、小規模の培養物について上に述べた方法で細菌を誘導し、溶解させた。ＰＡＰ酵素を、ＨｉｓＬｉｎｋ樹脂（プロメガ社）を使用して細胞溶解液から精製し、３５０ｍＭのイミダゾールで洗浄した後に、５００ｍＭのイミダゾールを使用して溶出し、外来性タンパク質を除去した。精製した酵素のサイズを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して検証した。ＡＭＰのＡＤＰへの変換により活性を確認し、ＨＰＬＣを使用してＡＤＰの産生およびＡＭＰの基質の消費を検証した。
【００３５】
ＰＡＰの活性アッセイ
ｐＨ８．０のトリス−ＨＣｌ、４０ｍＭの（ＮＨ４）２（ＳＯ４）、４ｍＭのＭｇＣｌ２、１０μＭのＡＭＰおよび鎖の平均長が約７５０のリン酸残基である３０μＭのポリリン酸を含む標準反応混合物を作製した。この反応を、ＰＡＰの添加により開始し、３７℃で実行した。形成されたＡＤＰを、ＨＰＬＣならびに既知のＡＭＰ、ＡＤＰ、およびＡＴＰの標準物質を使用して定量化した。産物のＡＤＰおよび残存するＡＭＰのみが、クロマトグラム上で特定された。１分間に１マイクロモルのＡＤＰを産生する酵素量を１単位のＰＡＰと定義する。
【００３６】
アデニル酸シクラーゼアッセイ
様々なアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）の活性を、ｐＨ７．５、６０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１２５ｎＭのカルモジュリンおよび様々な濃度のＡＴＰの存在下で、３０℃で３０分間測定した。ＡＣ滴定に関連する実験を除いて、１００ｎｇのＡＣを使用した。カルモジュリンのアンタゴニストを使用する場合は製造者の推奨事項にしたがって調製し、直接阻害の評価時にはＡＣ反応に直接添加、ＡＴＰ形成の間のＡＣ阻害の評価時にはＡＤＰをＡＴＰに変換する反応に添加した。
【００３７】
ＡＭＰ検出アッセイ
ＡＭＰを含む試料の試験によるＡＭＰ濃度の決定は、この試料がＡＴＰを含むか否かによって左右される。この試料がＡＴＰを含む場合、反応系の規模およびＡＴＰの濃度にもよるが、この試料を、たとえば、ＡＭＰをＡＤＰに変換する試薬（ＡＭＰ  Ｇｌｏ試薬Ｉ）といった、アデニル酸シクラーゼ、ピロホスファターゼ、マグネシウム、カルモジュリン、ｐＨ７．５のトリスまたはＨＥＰＥＳ緩衝液、十分な量のＰＡＰ酵素（２５ｎｇ／反応系２５μＬ）、およびポリリン酸（４０μＭ）を含む十分な量および濃度の試薬で処理する必要がある。室温、または２５、３０、３７、４０℃といった他の任意の適温で、ＡＴＰのｃＡＭＰへの変換、それと同時にＡＭＰのＡＤＰへの変換を確実に完了させるのに十分な時間、この反応を実行する。好適には、この元の溶液中の少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％のＡＴＰが、ＡＣにより変換される。さらに、好適には、元の溶液中の少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％のＡＭＰが、ＰＡＰにより変換される。ＡＤＰをＡＴＰに変換すると同時にＡＴＰを発光に変換する場合、ミオキナーゼ（ＡＫ、１Ｕ／検出試薬５０μｌ）、ポリリン酸（４０μＭ）、塩化マグネシウム（１０ｍＭ）または他の２価陽イオン、ルシフェリンおよびルシフェラーゼ、ならびに他の成分を含むＡＭＰ検出試薬を添加することができる。生じる発光の量は、試料中に存在するＡＭＰの量に比例する。あるいは、たとえば、ＡＤＰをＡＴＰに変換する試薬（ＡＭＰ  Ｇｌｏ試薬ＩＩ）といったミオキナーゼ（ＡＫ、１Ｕ／検出試薬５０μｌ）、ポリリン酸（４０μＭ）、塩化マグネシウム（１０ｍＭ）または他の２価の陽イオンを含む試薬を別途使用して、ＡＤＰのＡＴＰへの変換を実行することができる。その後、たとえば、ルシフェリン−ルシフェラーゼアッセイ試薬、たとえば、キナーゼ−Ｇｌｏアッセイ試薬（プロメガ社）といったＡＴＰ検出試薬を添加することによりＡＴＰを測定することができる。ＰＤＥアッセイなどの場合のようにＡＴＰが第１の反応中に存在しない場合、ＡＴＰの除去は重要ではなく、したがって、ＡＭＰのＡＤＰへの変換は、ＰＡＰ、ポリリン酸、ＭｇＣｌ２といったマグネシウム、およびｐＨ７．５のトリスまたはＨＥＰＥＳなどの緩衝液を含む試薬を使用して直接実行する。７．０、８．０、および９．０といった他のｐＨまたはこれらの値の間の任意のｐＨも、本発明の組成物において使用することができる。最後の工程において形成されるＡＤＰを、上述のようにＡＴＰに変換し、上述のようにルシフェリン−ルシフェラーゼ試薬、たとえばキナーゼ−Ｇｌｏアッセイ試薬（プロメガ社）を使用してＡＴＰを発光に変換する。
【００３８】
実施例１：ＡＭＰ検出アッセイ
ＡＭＰ検出アッセイを、概して以下のように２つの工程で実行する。この実施例において、１００μＭのＡＴＰの存在下、または非存在下において、ＡＭＰ滴定を反応緩衝液Ａ（４０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０ｍＭのＭｇＣｌ２および０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）を含む２５μｌ中で実行した。２５μｌのＡＭＰ−Ｇｌｏ試薬Ｉを、ＡＭＰ試料に添加し、この混合物を、室温（２３℃）で６０分間インキュベートした。ＡＭＰを検出するために、５０μＬのＡＭＰ検出試薬（１０μｌのＡＭＰ−Ｇｌｏ試薬ＩＩを含む１ｍｌのＫｉｎａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｏｎｅ溶液）を添加し、発光をルミノメーターで読み取る前に、この混合物を室温（２３℃）で６０分間インキュベートした。図２に記載されるＡＭＰ滴定を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）、ｃａｔ＃３９１２）において実行した。
【００３９】
実施例２：ユビキチン酵素系
ユビキチン化酵素またはユビキチン化酵素系に関与する酵素との反応は、基質としてのＡＴＰの使用を含むものである。本発明の方法を、限定するものではないが、Ｕｂｅ１（Ｅ１）、ＵｂｃＨ５ｃ（Ｅ２）、ＣＡＲＰ２（Ｅ３）を含む代表的なユビキチン化酵素をアッセイするために使用し、基質としてユビキチンを使用した。酵素は、一揃いのキット（Ｅ３ＬＩＴＥ  ｃｕｓｔｏｍｉｚａｂｌｅ  Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｋｉｔ）として購入した。各酵素を、個別におよび同時に滴定し、Ｅ３ユビキチン反応緩衝液（反応緩衝液Ａに０．２ＭのＤＴＴを添加したもの）中で、この反応を実行した。ＡＭＰを、ＡＭＰ  Ｇｌｏ試薬Ｉを使用して変換し、その後ＡＤＰをＡＴＰに変換し、ＡＭＰ検出溶液を使用してＡＴＰを検出した。簡潔に述べれば、Ｅ３−リガーゼの段階希釈液（ＣＡＲＰ２、２０倍）５uｌを含むＥ３ユビキチン反応緩衝液を、３８４ウェルプレートのウェルに添加した。このＣＡＲＰ２反応を、Ｅ３ユビキチン反応緩衝液、１００μＭのＡＴＰ、０．１５μＭのユビキチンＥ１活性化酵素、０．６μＭのユビキチンＥ２結合酵素、および４０μＭの組み換え型ヒトユビキチンを含む５μｌの混合物を添加することにより開始した。２３℃で、１２０分インキュベートした後、ＡＭＰをＡＤＰに変換する試薬１０μｌを添加し、軌道振盪機上で２分間混合し、その後、室温で６０分間インキュベートした。試料に対して、２０μｌのＡＭＰ検出試薬を添加し、この試料を室温で６０分間インキュベートした。その後、ルミノメーター上で発光を検出した（図３）。この反応におけるＡＭＰの産生量がユビキチン化、複合体化および／またはリガーゼ酵素活性に比例していたことが見いだされた。ユビキチンが存在しない場合、活性は認められなかった。したがって、本発明の方法を使用して、ユビキチン化に関与するすべての酵素、またはユビキチンン化酵素系に関与する任意の酵素の活性を変える化合物をスクリーニングすることができる。
【００４０】
実施例３：ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）
ＰＤＥ酵素は、基質としてＡＴＰを使用せず、代わりにｃＡＭＰを基質として使用する。本発明の方法において、限定するものではないが、ＰＤＥ４、ＰＤＥ１、２、３、ＰＤＥ１０ＡおよびＰＤＥ１１を含むＰＤＥ酵素との反応を、最大１００μＭのｃＡＭＰの濃度で実行したところ、生じた発光の量は、飽和となるまで基質濃度に比例し、反応の線形範囲内で酵素量に比例した。この試料中のＡＭＰは、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を添加したＡＭＰ−Ｇｌｏ試薬Ｉを使用してＡＤＰに変換した。ＩＢＭＸは、ほとんどのＰＤＥを阻害し、それによりＰＤＥ反応を終了させることが知られている。ＩＢＭＸをＡＭＰ  Ｇｌｏ試薬に加えることで、ＰＤＥ反応の終了および産生されたＡＭＰのＡＤＰへの変換が生じる。その後、産生したＡＤＰを、ＡＴＰに変換し、ＡＭＰ検出試薬を使用してＡＴＰを検出した。簡潔に述べれば、ｃＡＭＰに特異的なＰＤＥでのｃＡＭＰ滴定（図に示される量）を、ｐＨ７．５、４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、および０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む反応緩衝液中で実行した。ＰＤＥ反応を、２３℃で６０分間、５μｌで実行した。インキュベーションの後、ＡＭＰをＡＤＰへと変換する試薬５uｌに５００μＭのＩＢＭＸを添加したものを加え、軌道振盪機上で２分間混合し、その後、室温で６０分間インキュベートした。この試料に対して、１０uｌのＡＭＰ検出試薬を添加し、再びこの試料を室温で６０分間インキュベートした。その後、発光をルミノメーターで検出した（図４）。このＰＤＥ反応およびＡＭＰのＡＤＰへの変換は、１０μｌの反応系にＰＤＥ、ｃＡＭＰおよびＡＭＰ−Ｇｌｏ試薬Ｉを混合し、１０μｌのＡＭＰ添加試薬を添加する前に、室温で６０分間インキュベートすることにより１工程で実行することが可能である。この反応を、３８４ウェルの低容量ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）ｃａｔ  ＃３６７４）にて実行した。
【００４１】
異なるＰＤＥ  ３Ｂ阻害剤を含む反応も上述のように実行したところ、本発明の方法で得られた阻害剤のＩＣ５０濃度は、文献に報告された濃度（１．５〜２．０μＭ）と同程度であった（図５）。このアッセイはまた、ＬＯＰＡＣライブラリーの１２８０種類の化合物に対してスクリーニングした際、誤検出が非常に少なく、高いＺ’値を示したことにより堅牢性も確認された。
【００４２】
実施例４：細菌および真核生物のＤＮＡリガーゼ
ＤＮＡリガーゼは、基質としてＮＡＤ（細菌）またはＡＴＰ（ウイルスおよび真核生物）を使用するが、両酵素は、産物の１つとしてＡＭＰを産生する。大腸菌のＤＮＡリガーゼおよび合成オリゴまたはラムダＤＮＡ  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片を使用し、ＮＡＤ（１００μＭ）の存在下においてＤＮＡの連結を実証した。大腸菌のＤＮＡリガーゼ反応を、３８４ウェルプレートを使用し、ｐＨ８．０、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡおよび異なる量のニコチンアミド（ＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰおよびＮＡＤＰＨ）を添加した０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、１０μＭのオリゴを含む緩衝液中で実行した。この大腸菌ＤＮＡリガーゼ反応は、５μｌの体積での反応につき２Ｕを使用して実行し、この反応系を、２３℃で２０分間インキュベートした後、５μｌの試薬Ｉを添加することにより、２３℃で６０分間反応させた。試薬Ｉの反応の後、１０μｌのＡＭＰ検出溶液を添加し、２３℃で６０分インキュベートした後、発光を読み取った。結果は、大腸菌のＤＮＡリガーゼが、ニコチンアミド補因子としてＮＡＤに特異的に依存することを示している（図６）。
【００４３】
上述と同様のアッセイ条件を使用し、ＥｃｏＲＩ−線形化ベクター（ｐＢＲ３２２）を使用して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（プロメガ社）活性を検出した。ｐＨ８．０、３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、１００μＭのＡＴＰを含む緩衝液中で、６０分間ＥｃｏＲ１で前処理した０．５μｇのｐＢＲ３２２ベクターの存在下で、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ滴定を実行した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ反応を、２３℃で、３０分間、１０μｌの反応系中で実行し、その後、２３℃でさらに６０分間、１０μｌの試薬Ｉを添加して反応させた。試薬Ｉの反応の後、２０μｌのＡＭＰ検出試薬を添加し、２３℃で６０分反応させた後、この発光を読み取った（図７）。
【００４４】
実施例５：細胞および組織の抽出物中のＡＭＰの決定
本発明の方法は、組織抽出物中のＡＭＰの存在および／または量を決定するためにも使用される。ＡＭＰ  Ｇｌｏ試薬Ｉを使用して、試料中に存在するＡＴＰがあればそれを除去し、また同試薬を用いて存在するＡＭＰをＡＤＰに変換した後、ＡＤＰをＡＴＰに変換し、ＡＭＰ検出溶液を使用してＡＴＰを検出した。その後、この試料を、ＡＭＰ単独（ＰＡＰおよびＡＫを含む）での変換について試験し、ＡＫのみを含む試料と比較する。この差異をＡＭＰとして表した。
【００４５】
実施例６：ＡＭＰ検出を介したメチルトランスフェラーゼの検出または定量
たとえば、ＤＮＡまたはタンパク質メチルトランスフェラーゼといったメチルトランスフェラーゼを使用し、基質としてＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を使用して、ＤＮＡまたはタンパク質のメチル化を実行する。Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）は共通の基質であり、Ｓ―アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）は、メチルトランスフェラーゼの共通の産物であるため、本発明の方法は、ＳＡＨヒドロラーゼを使用したＳＡＨのアデノシンへの変換、およびアデノシンキナーゼを使用したアデノシンのＡＭＰへの変換を伴うものとなる。産生されるＡＭＰの量を、本明細書に記載される方法および組成物を使用して検出し、かつ／または決定することとなる。
【００４６】
異なるメチルトランスフェラーゼ活性の定量
反応緩衝液（ｐＨ８．０、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴおよび０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）中で、異なる量の酵素および以下の基質／酵素の組み合わせの存在下において、メチルトランスフェラーゼ反応を実行した（図９ａｂｃ）：５０μＭのＳＡＭおよび５０μＭのＨ３ペプチド（１−２５）とＥＨＭＴ２−Ｇ９ａ、５０μＭのＳＡＭおよび５０μＭのＨ４（１−２０）ペプチドとＰＲＭＴ５複合体、ならびに、１０μＭのＳＡＭおよび０．１μＭのＤＮＡオリゴとＤＮＭＴ１。すべてのメチルトランスフェラーゼ滴定アッセイは、２５μＭのｄＧＴＰと変換酵素であるＳＡＨ−ヒドロラーゼおよびアデノシンキナーゼを含む５μｌの反応系中で、３７℃で１２０分間実行し、その後、５μｌの試薬Ｉを添加して、２３℃でさらに６０分間反応させた。試薬Ｉの反応の後、２０μｌのＡＭＰ検出試薬を添加し、２３℃で６０分間反応させた後、発光を読み取った（図９）。
【００４７】
異なる基質とのＤＯＴ１Ｌ滴定反応を、反応緩衝液（ｐＨ８．０、２０ｍＭのトリス（Ｔｒｉ）−ＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴおよび０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）中、２０μＭのＳＡＭ、および２０μＭのＨ３（２１−４４）ペプチド、ヒストンＨ３完全長タンパク質またはヌクレオソームのうちのいずれかの存在下で実行した。上記のメチルトランスフェラーゼアッセイと同様に、ＤＯＴ１Ｌアッセイは、２５μＭのｄＧＴＰと変換酵素であるＳＡＨヒドロラーゼおよびアデノシンキナーゼを含む５μｌの反応系中、３７℃で１２０分間実行し、その後、５μｌの試薬Ｉを添加し、２３℃で６０分間さらに反応させた。試薬Ｉの反応の後、２０μｌのＡＭＰ検出試薬を添加し、２３℃で６０分反応させた後、この発光を読み取った（図１０）。
【００４８】
実施例７：タンパク質中のアスパラギンの脱アミド化またはアスパラギン酸残基の再配列の検出
長期間のタンパク質の保存および操作の間、アスパラギン残基の脱アミド化およびアスパラギン酸残基の再配列は、異なるレベルで頻発し、イソアスパラギン酸塩への変換をもたらす。生物製剤の分野においては、抗体といった治療用タンパク質の非酵素的脱アミド化のレベルをモニタリングすることが非常に重要である。タンパク質上のイソアスパラギン酸塩レベルの検出を目的として、タンパク質イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）を使用して標的タンパク質中のイソアスパラギン酸残基の存在を特定的に検出することができる。ＰＩＭＴは、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）からイソアスパラギン酸にメチル基を転移し、本発明の方法および組成物により検出することのできるＳ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）を産生する。
【００４９】
実施例８：アミノアシルｔＲＮＡ−シンテターゼ（ＡＲＳ）アッセイ
本発明の方法および組成物は、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＲＳ）の活性をモニタリングするために使用することも可能である。それはＡＴＰおよび他の基質がこの酵素反応の成分であり、ＡＭＰがこの反応の産物であり、かつこの反応からのＡＭＰの産生量がＡＲＳ活性に比例するためである。
【００５０】
ここまで本発明を特定の具体的かつ例示的な実施形態により説明したが、当業者にとって、多くのさらなる変更および改変が可能であることは本開示から明白であろう。すなわち、本発明は、特に記載した以外の方法で実施してもよいことが理解される。よって、本発明の例となる実施形態は、あらゆる点において例示的なものであって限定するものではないとみなされるべきであり、本発明の範囲は、ここまでの記載ではなく、本出願により裏付けられるあらゆる特許請求の範囲、およびそれらの均等物により決定されると考えるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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