(57)【要約】  細胞は、３Ｄ培養物中で成長し、顕微鏡写真法によって得られる位相幾何学的特徴は、細胞生存率および細胞−細胞間相互作用と相関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）３Ｄ細胞培養物を培養することと、
ｂ）前記３Ｄ細胞培養物の顕微鏡写真を１回以上撮影することと、
ｃ）前記顕微鏡写真を分析して、ｉ）フラクタル次元、ｉｉ）細胞集団の数、ｉｉｉ）細胞集団の大きさ、ｉｖ）細胞集団の総面積、またはｖ）創傷閉鎖の速度のうちの１つ以上を測定することと、
を含み、
ｄ）フラクタル次元、創傷閉鎖の速度、および細胞集団の大きさが、細胞生存率または細胞−細胞間相互作用に正比例し、細胞集団の数および細胞集団の総面積が、細胞生存率または細胞−細胞間相互作用に反比例する、
細胞生存率または細胞−細胞間相互作用アッセイ。
【請求項２】
対照培養物として使用するために複数の３Ｄ培養物を培養することと、試験剤が添加される試験培養物として使用するために複数の３Ｄ培養物を培養することと、前記細胞生存率または細胞−細胞間相互作用に対する前記試験剤の効果を評価することと、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
様々な量の前記試験剤を前記複数の試験培養物に添加することを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記３Ｄ細胞培養物の複数の顕微鏡写真を複数回撮影することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記試験剤を洗い流すことと、前記３Ｄ細胞培養物の更に複数枚の顕微鏡写真を更に複数回撮影することと、を更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
細胞が、ａ）負に帯電したナノ粒子と、ｂ）正に帯電したナノ粒子と、ｃ）支持分子と、を含む組成物で浮遊させられ、前記負に帯電したナノ粒子または前記正に帯電したナノ粒子のうちの１つが磁気応答性要素を含有し、前記支持分子が前記負に帯電したナノ粒子および前記正に帯電したナノ粒子を密接な混合物中に保持する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記支持分子が、ペプチド、多糖類、核酸、ポリマー、ポリリジン、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ＢＳＡ、ヒアルロナン、グリコサミノグリカン、アニオン性非硫酸化グリコサミノグリカン、ゼラチン、核酸、細胞外基質タンパク質混合物、抗体、またはこれらの混合物もしくは誘導体を含み、ｂ）前記負に帯電したナノ粒子が金ナノ粒子であり、ｃ）前記正に帯電したナノ粒子が酸化鉄ナノ粒子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物がＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記試験剤による細胞生存率の減少が、試験剤が阻害的であることを示し、細胞生存率の増加が、前記試験剤が刺激的であることを示す、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
顕微鏡写真は、前記３Ｄ細胞培養物が浮遊している間に撮影される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
Ｄｆ＝［ｌｏｇ（Ｎ）−ｌｏｇ（ｋｇ）］／ｌｏｇ（Ｌ／ａ）であり、Ｄｆがフラクタル次元であり、ｋｇが構造プリファクタおよび定数であり、Ｎが細胞の数であり、ａが細胞の直径であり、Ｌがボックスの長さである、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
【数８】
2014504882.tif 000011
であり、
Ｄｆ試料が前記試験培養物のフラクタル次元であり、Ｄｆ対照が前記対照のフラクタル次元である、請求項１1に記載の方法。
【請求項１３】
前記アッセイが試験剤に応答した創傷閉鎖を測定し、前記３Ｄ培養物が穿孔されるか、または磁気パターン化されて創傷を形成し、試験剤が前記創傷した３Ｄ培養物に添加され、
【数９】
2014504882.tif 000012
であり、
式中、創傷ｔの面積が、試験剤の添加後の所定の時間での創傷の面積であり、創傷ｔ０の面積が、前記試験剤が添加される前の創傷の面積である、
請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）複数の試料のうちの１つ以上が試験剤を有さず、複数の試料のうちの１つ以上が１つ以上の前記試験剤濃度を有する、浮遊した細胞の複数の試料を培養して、細胞集団を形成することと、
ｂ）浮遊した細胞の前記複数の試料の顕微鏡写真を１回以上撮影することと、
ｃ）前記顕微鏡写真を分析して、ｉ）フラクタル次元、ｉｉ）細胞集団の数、ｉｉｉ）細胞集団の大きさ、ｉｖ）細胞集団の総面積、またはｖ）創傷閉鎖の速度のうちの１つ以上を測定することと、
を含み、
ｄ）フラクタル次元、創傷閉鎖の速度、および細胞集団の大きさが、細胞生存率または細胞−細胞間相互作用に正比例し、細胞集団の数および細胞集団の総面積が、細胞生存率または細胞−細胞間相互作用に反比例する、
細胞アッセイ。
【請求項１５】
前記細胞アッセイが、毒性、創傷治癒、有糸分裂活性、増殖刺激、細胞−細胞間相互作用、細胞基質間相互作用、生存率、細胞構造に対する前記試験剤の効果を評価するために、または培養培地を最適化するために使用される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ａ）前記複数の試料のうちの１つ以上が試験剤を有さず、前記複数の試料のうちの１つ以上が１つ以上の前記試験剤濃度を有する、３Ｄ細胞培養物の複数の試料を培養することと、
ｂ）３Ｄ細胞培養物の前記複数の試料の顕微鏡写真を１回以上撮影することと、
ｃ）前記顕微鏡写真を分析して、ｉ）フラクタル次元、ｉｉ）細胞集団の数、ｉｉｉ）細胞集団の大きさ、ｉｖ）細胞集団の総面積、またはｖ）創傷閉鎖の速度のうちの１つ以上を測定することと、
を含み、
ｄ）フラクタル次元、創傷閉鎖の速度、および細胞集団の大きさが、細胞−細胞間相互作用および細胞生存率に正比例し、細胞集団の数および細胞集団の総面積が、細胞−細胞間相互作用および細胞生存率に反比例し、細胞−細胞間相互作用の減少が、前記試験剤が阻害的であることを示し、細胞−細胞間相互作用の増加が、前記試験剤が刺激的であることを示し、
ｅ）前記３Ｄ細胞培養物が、ａ）負に帯電したナノ粒子と、ｂ）正に帯電したナノ粒子と、ｃ）支持分子と、を含む組成物で浮遊させられることにより調製され、前記負に帯電したナノ粒子または前記正に帯電したナノ粒子のうちの１つが磁気応答性鉄または酸化鉄を含有し、前記支持分子が前記負に帯電したナノ粒子および前記正に帯電したナノ粒子を密接な混合物中に保持する、
細胞−細胞間相互作用または生存率のアッセイ。
【請求項１７】
前記支持分子が、ペプチド、多糖類、核酸、ポリマー、ポリリジン、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ＢＳＡ、ヒアルロナン、グリコサミノグリカン、アニオン性非硫酸化グリコサミノグリカン、ゼラチン、核酸、細胞外基質タンパク質混合物、抗体、またはこれらの混合物もしくは誘導体を含み、ｂ）前記負に帯電したナノ粒子が金ナノ粒子であり、ｃ）前記正に帯電したナノ粒子が酸化鉄ナノ粒子である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物がＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記試験剤が、薬剤、第２の細胞型、細胞成分、毒素、または環境要因である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記試験剤が、パターン化された細胞の上もしくは下の細胞外基質、ゲル、またはヒドロゲル層もしくは被膜である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年２月１日出願の第６１／４３８、３１０号の優先権を主張し、その全体が参照として組み込まれる。本発明は、診断学、毒性学、薬剤発見、ならびに画像分析、ナノテクノロジー、材料、医薬、細胞生物学、および組織工学のための細胞アッセイの分野に関する。より詳細には、本開示の組成物および方法は、磁場を使用する細胞磁化、３Ｄ細胞培養物、細胞浮遊、細胞操作、および細胞パターン化の方法、ならびに毒性試験、薬剤試験、ハイスループットスクリーニング、ハイコンテントスクリーニング、細胞生存率、細胞−細胞間相互作用、創傷治癒、および細胞培養物最適化のアッセイの用途における画像分析方法および無標識リアルタイム検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんどの薬剤回収および規制認可の遅延は、薬剤誘発性の有害事象によってもたらされ、薬剤引き上げの最も頻繁な理由は、腎毒性および肝毒性である。例えば、２つの広く処方されている非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）のイブプロフェンおよびアセトアミノフェンは、それぞれ既知の腎毒性１および肝毒性の化合物である。しかし、細胞死を生じるＮＳＡＩＤの毒性および事象の機構は、不十分にしか理解されておらず、患者に使用する前にこれらの副作用を評価する方法は、限定された有用性しかない。
【０００３】
現行のインビトロでの２Ｄ細胞に基づいたアッセイは、実施するのが容易および安価であるばかりでなく、自動化および規模拡大が行いやすい。残念なことに、２Ｄ系は多くの場合に薬剤誘発性肝毒性の不十分な予測装置であり、２Ｄ培養細胞は細胞毒性剤に対して感受性が高くなる傾向があるので、偽陽性を生じうる。
【０００４】
更に、２Ｄ環境は、天然の細胞環境を反映しておらず、酸化および浸透ストレスのような細胞外ストレスのモデルを作ることができない。例として、インビボにおいて２Ｄで培養した腎細胞は、細胞培養モデルのものと比較して、高浸透圧のために腎毒素に対して高い感受性がある可能性があるが、このことは２Ｄ細胞培養物でモデルを作ることが（不可能ではないとしても）困難である。したがって、３Ｄ組織モデルであり、これは細胞−細胞間および細胞基質相互作用を捕捉することができ、よりインビボ様の環境を提供することができ、毒性試験のためにより良好なプラットフォームをもたらすことができる。
【０００５】
三次元（３Ｄ）細胞培養条件を支持することができる材料が開発されている。３Ｄ細胞培養物における現在までの大部分の操作は、フラスコの回転、細胞が接着しうる外側足場の使用、細胞を懸濁する磁場の使用、またはこれらの手法の幾つかの組み合わせを伴う。
【０００６】
例えば、Ｆｅｌｄｅｒの米国特許出願第２００５／０５４１０１号、国際公開第２００５／０１０１６２号は、細胞が増殖することができ、３Ｄ環境で支持されうる外側足場を形成するヒドロゲル基質を記載する。これは、細胞−細胞間相互作用を急速に促進するよりはむしろ細胞が相互作用する人工基質を導入するのであり、２Ｄ培養よりも改善されているが、足場は細胞を乱す可能性があり、最終生成物に残ったままになる。更に、細胞をマイクロキャリアの上または中で増殖させることができるが、細胞を、包括的な細胞−細胞間接触および相互作用が可能である方法で浮遊させることができない。
【０００７】
Ｆｅｌｄｅｒのマイクロキャリアの組み立てには、労力を要する化学反応および複雑な器具の必要性を含む有意なレベル複雑さも存在する。更に、マイクロキャリアを作製する主な試薬の１つであるａｌｇｉｍａｔｒｉｘは、内毒素の供給源でありうる。浮力の制御も浮遊を促進するために関連があると思われ、マイクロキャリアへの気泡の注入により制御され、ここでも複雑さおよび困難さに寄与している。最後に、特殊な機器が撹拌のために必要であり、これはガス交換を達成するため、およびマイクロキャリアの凝集を防止するために必要であり、多くの場合にインペラーが細胞を撹拌するために使用される。しかし、撹拌によりもたらされる剪断応力は、細胞に損傷を引き起こすことが知られている。更に、撹拌は３Ｄ培養物の任意の磁気形状制御を損なう。
【０００８】
Ｂｅｃｋｅｒの米国特許出願第２００９／１３７０１８号、国際公開第２００５／００３３３２号は、生体誘引性磁化コア粒子の被覆を使用し、これによって磁化コア粒子への生体細胞の接着を開始し、磁場における懸濁を可能にする。被覆は、培養の間中細胞に留まり、したがって培養物に不自然な要素を導入し、おそらく細胞を乱す。本発明者たちは、最終的に排除されうる生分解性被覆の使用を考慮するが、開示されているものはなく、この手法が成功するかは分からない。更に、細胞がマイクロキャリアのコアに増殖するので、細胞−細胞間相互作用を促進する目的で磁気浮遊により一緒に集められうる個別の細胞の浮遊は、発生する見込みがない。したがって、細胞−細胞間接触に起因する３Ｄ多細胞構造の急速（時間）な集合は、マイクロキャリアを使用した場合に実証できることが明白ではない。また、マイクロキャリアで細胞を増殖させることによって、異なる細胞型の、とりわけ個別の細胞を浮遊させることによる同時培養、次にそれらを磁気的に集めることが実証されていない。最後に、この系は扱いにくく、規模拡大およびハイスループット用途には適していない。
【０００９】
より良好な手法は、細胞を一時的に磁化して、３Ｄ培養物を可能にすることでありうる。例えば、Ａｋｉｒａの米国特許出願第２００６／０６３２５２号、国際公開第２００４／０８３４１２号、国際公開第２００４／０８３４１６号は、リポソームの取り込みにより細胞を磁化するため、磁気カチオン性リポソーム（ＭＣＬ）を使用する。次に磁化細部は、磁気誘引を使用してプレートの底部のシートで増殖され、次に使用時に放出される。しかし、細胞のシートを生成することができるが、細胞は依然としてプレートの底部で増殖され、したがって磁気浮遊による真の３Ｄ培養物ではない。更に、機能性アッセイが実証されていなかった。
【００１０】
ＳｈｉｍｉｚｕおよびＡｋｉｒａらは、近年、脱細胞化血管への種細胞の磁気誘導を使用した。彼らの研究は、有望な結果を示すが、脱細胞化される組織の供給源として磁化細胞を使用していない。磁化細胞は、脱細胞化血管の再細胞化だけに使用されている。
【００１１】
Ｓｏｕｚａによる特許出願の国際公開第２０１０／０３６９５７号では、細胞を、磁場に応答するナノ粒子を有するバクテリオファージを含む「ヒドロゲル」と接触させることにより、細胞が磁場において浮遊する。特に、ｆｄ、ｆｌまたはＭ１３バクテリオファージのような繊維状ファージが使用される。この方法がどのように作動するか完全には明らかではないが、細胞を被覆し、細胞が磁気的に応答性のナノ粒子を取り込むまたは吸着するのをどうにかして助けるゲル様構造またはアセンブリーをファージが提供すると理論付けられる。したがって、ヒドロゲルが洗い流されても、細胞は磁気的に応答性のままであり、適切な磁場において浮遊されうる。しかし、ヒドロゲルがほとんど洗い流されるが、ファージ感染力または遺伝物質の移動の可能性は残り、したがって、ファージを使用することなく細胞取り込みまたは吸着を可能にする材料を提供することが望ましい。
【００１２】
またＳｏｕｚａによる国際公開第２０１１／０３８３７０号は、第二世代のヒドロゲルを記載し、これは細胞の磁化を可能にするバクテリオファージの使用を完全に回避している。更に、主張されているゲルの変形が、商標名ＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）によりＮ３Ｄ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（商標）で現在市販されている。新たなヒドロゲルは、任意の毒性または感染性作用物質を使用することなく細胞を磁化する優れた方法を提供し、細胞は、ゲルが洗い流されたときも磁化されたままである。
【００１３】
これらの手法の幾つかは有望であるが、天然の環境のより正確なモデルを作り、頑強で、再現性が高く、規模拡大のし易い、薬剤毒性を評価する改善された３Ｄ方法の余地が依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許出願第２００５／０５４１０１号明細書
【特許文献２】国際公開第２００５／０１０１６２号明細書
【特許文献３】米国特許出願第２００９／１３７０１８号明細書
【特許文献４】国際公開第２００５／００３３３２号明細書
【特許文献５】米国特許出願第２００６／０６３２５２号明細書
【特許文献６】国際公開第２００４／０８３４１２号明細書
【特許文献７】国際公開第２００４／０８３４１６号明細書
【特許文献８】国際公開第２０１０／０３６９５７号明細書
【特許文献９】国際公開第２０１１／０３８３７０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、改善された無標識リアルタイム細胞生存率アッセイを提供する。方法は、磁気浮遊による３Ｄ細胞培養を使用し、３Ｄ培養技術を画像分析と結合して、細胞生存率および細胞−細胞間相互作用を評価する。
【課題を解決しようとする手段】
【００１６】
以下本明細書で使用する略語の定義をまとめた。
【００１７】
【表１】
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本明細書において「培養する」とは、単一の細胞型を培養すること、または２つ以上の細胞型を同時培養することを含む。
【００１８】
一般的に言えば、細胞生存率検出法は、死亡細胞が溶解し、ゆえに任意の磁気応答性粒子を失い、したがってもはや浮遊しないこと、または死亡細胞が３Ｄ細胞集団を崩壊させることのいずれかの原則に基づいている。したがって、生きている細胞のみがこの方法で画像化される。細胞死の増加は、より多くではあるが、より小さく、より拡散した、または多孔性の細胞集団をもたらす。更に、フラクタル次元が細胞Ｎの構造および数の両方の関数であるので、生存細胞の増幅はＮを増加し、したがって多細胞構造のフラクタル次元を増加する。
【００１９】
本発明は、また、培養に導入された任意の試験剤（試薬としての細胞および細胞外基質タンパク質を含む）または環境変化に応答する細胞生存率（細胞の健康）または細胞−細胞間相互作用をモニターおよび測定することを可能にする。技術は、細胞生存率または細胞−細胞間相互作用を定量化するために、磁気浮遊による３Ｄ細胞培養物の急速な形成を位相幾何学的パラメーターの画像分析と組み合わせる点において新規である。方法を以下の通り簡潔に記載することができる。
【００２０】
１．最初に、細胞を浮遊させて３Ｄ培養物増殖を可能にする。
【００２１】
２．低倍率（４×）顕微鏡写真を３Ｄ細胞で撮影する。
【００２２】
３．これらの顕微鏡写真は、例えばフラクタル次元、細胞集団の数、細胞集団の大きさ、組織開口、および／または細胞集団の総面積、ならびに本明細書全体に記載されている他の細胞パラメーターを測定するために、例えばｉｍａｇｅＪソフトウエア（フリーウエア）を使用して分析される。このステップは、実験の間または後の任意の時点で実施することができる。
【００２３】
４．次に、薬剤候補または作用物質（薬剤、環境毒素、増殖因子、インヒビター、ナノ粒子、細胞の均質もしくは異質混合物、ならびに／または細胞外基質タンパク質および／もしくはペプチドの均質もしくは異質混合物が含まれるが、これらに限定されない）が、通常は用量および／または時間依存的形態（例えば、異なる試料が薬剤の異なる用量を有する）で細胞に添加される。
【００２４】
５．ステップ２および３を繰り返す。
【００２５】
６．最後に、画像分析の出力（例えば、フラクタル次元、細胞集団の数、集団面積の大きさ、集団の総量域が含まれるが、これらに限定されない）を、時間および／または薬剤濃度の関数としてプロットし、データを使用して、細胞に対する試験剤の効果を決定する。
【００２６】
試験剤は、薬剤、他の細胞型、細胞成分、推定毒素または任意の環境的もしくは産業的作用物質もしくは化学薬品を含む、その毒性がアッセイされることが望ましい任意のものでありうる。
【００２７】
上記に直線的で段階的な様式で記載されているが、これは理解の容易さのためのみであり、通常全ての試料（ゼロ薬剤制御＋薬剤増加用量の複数の試料）は、並行して処理されうる。代替的には、試料を１〜７、好ましくは２〜３日間増殖させて、十分な大きさを得ることができ、後の時点で薬剤を添加することができる。
【００２８】
更に、簡単な環状磁石を本明細書において使用したが、磁場を変えることによりどのように３Ｄ培養物の形状または構造に影響を与えるかについては知られている。最後に、本明細書に記載されている磁気浮遊を使用することが好ましいが、ここに記載されるように、任意の３Ｄ培養方法を本方法に使用することができる。
【００２９】
好ましくは、写真は細胞が依然として浮遊している間に撮影され、それはこのことが培養物の破損を最小限にすることが予測されるからである。しかし、これは必須ではなく、３Ｄ培養物を浮遊していないときも撮影することができる。このことは、多細胞構図における裂け目または孔の閉鎖速度を測定する創傷治癒アッセイなどの幾つかのアッセイにおいて、特に適切でありうる。
【００３０】
好ましくは、対照試料画像（薬剤または作用物質なし）を生存率１００％の基準値に指定し、総細胞死を生じる最低投与量を生存率０％の基準値に指定する。したがって、その間の任意の値は、薬剤または作用物質の毒性を反映するはずである。これらの計算は、ＭＴＴのような様々な比色剤で使用されるものと類似しており、差は、他の方法が色を使用し、本発明の方法は、フラクタル次元のような位相幾何学的変数を使用すること、したがって任意のシグナル報告化学薬品または標識剤の添加を回避することである。
【００３１】
系の試験として、２Ｄ培養物のＭＴＴデータを本発明の３Ｄ方法と比較し（図３）、３Ｄ構造が培養物の内部の細胞に保護効果をもたらすが、結果は同等であることが見出され、細胞生存率における有意な増加を反映した。
【００３２】
より詳細には、本発明は、浮遊細胞を培養して、３Ｄ細胞構造を形成すること、前記細胞の顕微鏡写真を１回以上撮影すること（撮影の間細胞が浮遊している必要はないが、培養物の破損を最小限にするためには好ましい）、前記顕微鏡写真を分析して、ｉ）フラクタル次元、ｉｉ）細胞集団の数、ｉｉｉ）細胞集団の大きさ、ｉｖ）細胞培養組織、ｖ）細胞集団の総面積、および／またはｖｉ）創傷閉鎖もしくは組織開口（本明細書において、創傷閉鎖と呼ばれる）の速度のうちの１つ以上を測定することを含む、細胞生存率アッセイである。最後に、フラクタル次元、創傷閉鎖の速度、および細胞集団の大きさは、細胞生存率または細胞−細胞間相互作用に正比例し、細胞集団の数および細胞集団の総面積は、それらに反比例している。
【００３３】
浮遊細胞の複数の試料も存在することができ、前記試料は、様々な試験剤の１つ以上の濃度を有するおよび有さないものであるか、または試験剤が１回以上添加されているものである。一般に、前記試験剤による細胞生存率の減少は、試験剤が阻害的であることを示し、細胞生存率の増加は、前記試験剤が刺激的であることを示す。同じ方法は、作用物質の毒性、増殖刺激、有糸分裂刺激、創傷治癒、細胞−細胞間相互作用、細胞の大きさ、細胞発芽、細胞構造変化などを含む多数の変数を評価することができる。
【００３４】
更に、本明細書において生存率および細胞−細胞間相互作用に焦点を当てているが、方法は、細胞状態の重要な変化と相関する細胞形状および構造についての重要な情報を提供することもできる。例えば、幾つかの細胞は、血管形成プロセスなどの際に癌性細胞、上皮細胞発芽／伸長への形質転換で丸くなる。
【００３５】
更に、方法を他の方法、例えば細胞および核染色と組み合わせることができ、細胞の大きさ、核／細胞質の比、細胞円形度などに対する効果も、細胞状態についての重要な情報を提供することができる。これらのアッセイは、細胞生存率および／もしくは細胞分化（幹細胞の場合）に対する試験剤の効果が顕微鏡写真法により確定された後に実施することができる、または別個の試料を同様に調製することができる。
【００３６】
幾つかの実施態様において、本発明は、１つ以上の細胞型の３Ｄ細胞培養物を培養すること、前記３Ｄ細胞培養物の顕微鏡写真を１回以上撮影すること、前記顕微鏡写真を分析して、ｉ）フラクタル次元、ｉｉ）細胞集団の数、ｉｉｉ）細胞集団の大きさ、ｉｖ）細胞集団の組織、またはｖ）細胞集団の総面積のうちの１つ以上を測定することを含み、フラクタル次元および細胞集団の大きさが、細胞生存率、細胞−細胞間相互作用、細胞移動、細胞外基質形成、細胞−細胞外基質相互作用または培養物に存在する細胞の型および／もしくは数に正比例し、細胞集団の数および細胞集団の総面積が、細胞生存率、細胞−細胞間相互作用または培養物に存在する細胞型に反比例する、細胞生存率または細胞−細胞間相互作用のアッセイである。創傷閉鎖の速度も、細胞−細胞間相互作用、細胞移動、細胞外基質形成、細胞−細胞外基質相互作用および生存率と直接的に相関する。
【００３７】
方法は、対照培養物として使用するために複数の３Ｄ培養物を培養することと、試験剤が添加される試験培養物として使用するために複数の３Ｄ培養物を培養することと、前記細胞生存率、細胞−細胞間相互作用、細胞−細胞外基質相互作用または培養に存在する細胞型（細胞を同時培養する場合）に対する前記試験剤の効果を評価することと、を含むことができる。
【００３８】
方法は、様々な量の前記試験剤を前記複数の試験培養物に添加すること、前記３Ｄ細胞培養物の複数の顕微鏡写真を複数回撮影すること、ならびに／または前記試験剤を洗い流し、前記３Ｄ細胞培養物の更なる複数の顕微鏡写真を更に複数回撮影することを含むこともできる。
【００３９】
好ましい実施形態において、細胞は、ａ）負に帯電したナノ粒子、ｂ）正に帯電したナノ粒子、およびｃ）支持分子を含む組成物により浮遊させられ、前記負に帯電したナノ粒子または正に帯電したナノ粒子のうちの１つは、鉄または酸化鉄のような磁気応答性材料を含有し、前記支持分子は、前記負に帯電したナノ粒子および前記正に帯電したナノ粒子を密接な混合物で保持する。
【００４０】
好ましくは、支持分子は、ペプチド、多糖類、核酸、ポリマー、ポリリジン、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ＢＳＡ、ヒアルロナン、グリコサミノグリカン、アニオン性非硫酸化グリコサミノグリカン、ゼラチン、核酸、細胞外基質タンパク質混合物、抗体、またはこれらの混合物もしくは誘導体を含み、ｂ）前記負に帯電したナノ粒子は金ナノ粒子であり、ｃ）前記正に帯電したナノ粒子は酸化鉄ナノ粒子である。最も好ましくは、組成物はＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）である。
【００４１】
幾つかの実施態様において、Ｄｆ＝［ｌｏｇ（Ｎ）−ｌｏｇ（ｋｇ）］／ｌｏｇ（Ｌ／ａ）であり、Ｄｆはフラクタル次元であり、ｋｇは構造プリファクタおよび定数であり、Ｎは細胞の数であり、ａは細胞の直径であり、Ｌはボックスの長さである。更に、
【００４２】
【数１】
2014504882.tif 000004
であり、Ｄｆ試料は、試験培養物のフラクタル次元であり、Ｄｆ対照は、対照のフラクタル次元である。しかし、他の方法を使用してこれらを計算することができる。
【００４３】
創傷閉鎖アッセイにおいて、創傷を生じる２つの手法があり、一方は、３Ｄ培養物に孔をあけて創傷を形成することであり、他方は、３Ｄ培養物を機械的に細断し、次に磁気的に環構造にパターン化することである。両方の場合において、試験剤を前記創傷３Ｄ培養物に添加することができ、
【００４４】
【数２】
2014504882.tif 000005
であり、ここで、創傷ｔの面積は、試験剤の添加後の所定の時間での創傷の領域であり、創傷ｔ０の面積は、前記試験剤が添加される前の創傷の面積である。
【００４５】
細胞アッセイを、少なくとも毒性、創傷治癒、有機分裂活性、増殖刺激、細胞−細胞間相互作用、生存率または細胞構造などに対する試験剤の効果を評価することを含む様々な用途に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ペトリ皿内の分散細胞（１）および環状磁石（５）を使用して集められた磁気的に濃縮された浮遊細胞（３）の概略図である。
【図２】未処理条件下および０、０．２５、１、２、４、１０ｍＭのイブプロフェンで０、４、２４、４８、７２、９６、および１６８時間処理した後での４×倍率での３Ｄ  ＨＥＫ２９３形態の位相差顕微鏡写真である（尺度目盛りは５００μｍである）。
【図３】ＨＥＫ２９３における２４時間の投与時間のイブプロフェン濃度の対数に対する生存率である。３Ｄ無標識アッセイでは、データを平均化し、エラーバーが報告されている。ＬＤ５０は、生存率５０％での薬剤濃度を推定して決定することができる。
【図４】方程式を使用した模擬フラクタル理論計算である。  Ｄｆ＝［ｌｏｇ（Ｎ）−ｌｏｇ（ｋｇ）］／ｌｏｇ（Ｌ／ａ）ここで、１単位（ａ）は細胞の直径であり、ボックスの長さ（Ｌ）は９．８単位である。Ｋｇは、構造プリファクタと呼ばれる定数であり、本明細書では０．８と随意選択される。細胞の数（Ｎ）は変動する。計算されたフラクタル次元（Ｄｆ）値は、４つの構造で（ａ）１．４７、（ｂ）１．５９、（ｃ）１．８６、および（ｄ）１．９４である。したがって、Ｄｆは細胞生存率と比例する。
【図５】１つ（ａ〜ｇ）または２つ（ｊ〜ｍ）の細胞型の経時的な模擬３Ｄ細胞培養物増殖である。ａ〜ｇの部分は、経時的に増殖した健康な培養物を表し、増量した薬剤が培養物ｄ〜ｇに添加される。ｈ〜ｉの部分は、増量した薬剤投与量濃度または時間に曝露された培養物ｄ〜ｇのプロットを表す。計算されたＤｆ値は、（ａ）１．７２６５、（ｂ）１．７６７８、（ｃ）１．８１４４、（ｄ）１．８９３５、（ｅ）１．７１９５、（ｆ）１．６７３４、および（ｇ）１．５４０５である。健康な培養物増殖に対する経時的なＤｆおよび生存率（ｈ）、ならびに薬剤／毒素濃度（ｉ）。ｊ〜ｍの部分は、健康な２つ細胞型の同時培養物を表し、ここでは１つの細胞型（小さな楕円形）の数が増加している。ｎの部分は、一方の細胞型（小さな楕円形）の細胞の数が増加し、他方の細胞型（大きな楕円形）が一定を保つ培養物ｊ〜ｍのプロットを表す。計算されたＤｆ値は、（ｊ）１．４１８、（ｋ）１．８１２、（ｌ）１．８４４、および（ｍ）１．９１２である。同時培養模擬系（ｎ）の一方の細胞型の細胞数に対するＤｆである。
【図６】模擬データに基づいた様々なプロットであり、（ａ）濃度に対するＤｆ、（ｂ）濃度に対する細胞数、（ｃ）濃度に対する平均の大きさ、（ｄ）濃度の対する総面積、（ｅ）時間に対するＤｆ、（ｆ）時間に対する細胞の数、（ｇ）時間に対する平均の大きさ、および（ｈ）時間に対する総面積である。
【図７】図２に示されている物理的データに基づいた様々なプロットである。様々な濃度のイブプロフェンに１、２４および１６８時間曝露されたＨＥＫ２９３細胞の（ａ）フラクタル次元（Ｄｆ）、（ｂ）集団の平均的な大きさ（ｐｘ２）、および（ｃ）総面積（ｐｘ２）である。（ｄ）フラクタル次元（Ｄｆ）、（ｅ）集団の平均的な大きさ）、および（ｆ）総面積に基づいた細胞生存率である（ここでｐｘ２は、面積の随意単位であり、平方ピクセルを意味する）。０ｍＭ濃度は、ＤＭＳＯを含有するが、薬剤を含有しない。
【図８】位相差顕微鏡写真は、未処理条件下（対照）、ならびに４および８ｍＭのアセトアミノフェン（「ＡＰＡＰ」）で０、２４、４８、７２、１４４時間処理し、続いて初期薬剤投与の１６８、１９２、および２１６時間後にＡＰＡＰなしで回収した後の、４倍倍率での３Ｄ肝細胞の形態を示す。
【図９】キシレンへの曝露時間に対する気管支上皮（「ＢｒＥｐｉｃ」）細胞生存率である。３Ｄの細胞は、キシレンへの最初の曝露の後に死滅（右上のパネル、右側の矢印は生存率０％のプロットを示す）または健康な上皮に特徴的な扁平もしくはタイル状の構造を完全に失っている（左上パネル、最初の矢印は生存率１００％のプロットを示す（３Ｄ）（中間の矢印は最後の曝露時点を示す）。これは、空気中の因子の毒性を試験するために重要であり、組織を気相液相界面に浮遊させて、細胞をガスに曝露させることができる。気相液相界面の細胞だけが影響を受けることを示すため、キシレン曝露ペトリ皿の底部に２Ｄで同時培養した細胞も示す（右および左下のパネル）。
【図１０】非接着性および接着性細胞培養皿で増殖させたＨＥＫ２９３組織シートの写真である。
【図１１】（Ａ）０または１０％のＦＢＳを補充した培地における時間（０、２、４、２４、および２１６時間）の関数としての引っ掻き傷閉鎖を示す２Ｄにおいて増殖させたＨＥＫ２９３細胞の顕微鏡写真である（４×倍率、尺度目盛りは５００μｍである）。（Ｂ）０、１、５および１０％のＦＢＳを補充した培地における時間の関数としての引っ掻き傷閉鎖の率である。閉鎖速度は、破線の間にデータを当てはめることにより見出される。（Ｃ）（Ｃ）に示されるデータを使用した血清％に対する閉鎖速度である。
【図１２】（Ａ）０または１０％のＦＢＳを補充した培地における時間（０、２、４、および２４時間）の関数としての孔閉鎖を示す３Ｄにおいて増殖させたＨＥＫ２９３細胞の顕微鏡写真である（４×倍率、尺度目盛りは５００μｍである）。（Ｂ）０、１、５、および１０％のＦＢＳを補充した培地における時間の関数としての孔閉鎖の率である。閉鎖速度は、破線の間にデータを当てはめることにより見出される。（Ｃ）（Ｂ）に示されるデータを使用した血清％に対する閉鎖速度である。
【図１３】平滑筋（ａ〜ｃ、左）または線維芽細胞（ｄ〜ｆ、右）培地（ＳＣＩＥＮＣＥＬＬ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ（商標）Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；線維芽細胞培地、カタログ番号２３０１；及び平滑筋細胞培地、カタログ番号１１０１培地；２．５×倍率、尺度目盛りは３００μｍである）で培養したとき、時間（３、１２、２０、および３４時間）の関数として孔閉鎖を示す、３Ｄで増殖させたヒト初代線維芽細胞（ａおよびｄ；ＨＰＦ；５００、０００細胞）および平滑筋細胞（ｃおよびｆ、ＳＭＣ；５００、０００細胞）の培養物、ならびにヒト初代線維芽細胞（２５０、０００細胞）と平滑筋（２５０、０００細胞）細胞（ｂおよびｅ）の同時培養物（１：１；ＨＰＦ−ＳＭＣ）の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明は、磁気浮遊および／または磁気誘導による３Ｄ細胞培養を、フラクタル次元分析を含む位相幾何学的特徴の画像分析と組み合わせることにより、細胞生存率または細胞−細胞間相互作用を評価および定量化する無標識検出方法である。３Ｄ細胞培養物の構造の凝集性は、毒物または他の作用物質の存在に、これらの作用様式が細胞の生存率、増殖または細胞−細胞間相互作用を損なうかにかかわらず感受性がある。したがって、本発明者たちは、フラクタル次元分析および他の位相幾何学的ツールを適用して、例えばフラクタル次元、３Ｄ培養物の大きさ、創傷の大きさ、および細胞集団の数などに関する３Ｄ多細胞構造変化における変化からもたらされる細胞生存率を、毒物濃度および／または時間の関数として定量化する。
【００４８】
本発明の明確な利点には、１．生存率の無標識評価、２．試料を妨害または破壊することなく、時間の関数として生存率をモニターする能力、３．標準的な倒立顕微鏡（透過光線、カメラを備える）および細胞培養器具のみを必要とすること、４．３Ｄ培養物の使用は、２Ｄ単層の使用よりも大きな改善であること、５．技術がハイスループットに適合可能であること、ならびに６．集められる情報の量を、共焦点もしくはデコンボリューション顕微鏡法、リアルタイム画像化、スペクトル分解画像化（例えばハイパースペクトル画像化）および／または蛍光顕微鏡法を使用して、異なる平面で画像を収集すること（したがって、より多くの３Ｄデータを提供すること）により増加できることが含まれる。
【００４９】
この技術の別の利点は、フラクタル次元分析に選択された範囲が充填されている限り、多細胞構造の大きさに対して感受性がないことである。フラクタル次元は、細胞を一緒に集める細胞−細胞間相互作用と、細胞の生存率および増殖の両方に感受性があり、下記に示されている。
【００５０】
フラクタル幾何学において、フラクタル次元Ｄは、フラクタルがどのように完全に空間を占めるように見えるかを示す統計的量であり、縮小するほど微細の尺度になる。フラクタル次元について多くの特定の定義がある。最も重要な理論的なフラクタル次元は、Ｒｅｎｙｉ次元、Ｈａｕｓｄｏｒｆｆ次元、およびパッキング次元である。ボックスカウント次元および相関次元は、部分的には実施の容易さに起因して広く使用されている。本明細書では、本発明者たちは、ボックスカウント方法論を用いているが、方法が一貫して用いられるのであれば、他の方法を使用することが可能である。
【００５１】
この分析技術は、現行の蛍光および比色アッセイで必要とされるそれぞれの時点での余分の試料の必要性のない、薬剤投与時間の関数としてデータを得ることを可能にする。フラクタル次元分析と結合した磁気浮遊方法または「ＭＬＭ」は、腎細胞、肝細胞、および肺細胞、ならびに多くの他の細胞型、更には組織様構造を形成する細胞型の混合物におけるインビトロ毒性研究の貴重なツールであると思われる、
更に、薬剤を洗い流し、回収物を評価することができる。したがって、それぞれの３Ｄ細胞培養物は、それ自体の対照として機能することができ、このことは結果の信頼性を更に改善する。
【００５２】
追加的な改善は、この技術を、透過光線強度の測定、細胞自己蛍光検出、蛍光検出、３Ｄデコンボリューションもしくは共焦点顕微鏡法、暗視野（もしくは散乱光線）顕微鏡法、および／または多光子顕微鏡法と結合することにより行うことができる。
【００５３】
化学発光をこの系に結合することもできるが、化学発光基質の添加は、生存率を損なうことがあり、無標識技術の価値を損なうことがある。蛍光にも同じことが当てはまり、それは、修飾された細胞（例えば、ＧＦＰ発現細胞）または蛍光分子を培養に導入する必要があり、したがって系の生存率を損ない、もはや無標識ではなくなるおそれがあるからである。しかし、ＮＩＲ検出／画像化を使用することもでき、利点が、人工標識を系に添加する欠点を超える場合もありうる。
【００５４】
更に、時間の関数としてのＤｆ値およびＤｆ変化は、同じ培養内のそれぞれの細胞型、細胞株、および細胞組成にとって特徴的であることが予測される。したがって、本発明を、異なる細胞型または細胞の混合物を同定よび分化するこの方法に使用する目的で、細胞の多様な細胞型および同時培養物のＤｆの表への集計に使用することができる。
【００５５】
本発明を使用して、細胞−細胞間相互作用によりもたらされるタンパク質相互作用を評価することもできる。３Ｄ細胞培養物形成が、多くの場合に細胞−細胞間接触の際の細胞膜タンパク質間の相互作用により仲介されるので、細胞膜におけるこれらのタンパク質の数および分布、ならびにこれらのタンパク質の解離定数も、Ｄｆに影響を及ぼすはずである。例えば、細胞の周りに均一に分布された大量のこれらの表面タンパク質を有する細胞の３Ｄ培養は、低いタンパク質細胞被覆および／または細胞の特定の位置に局在化（もしくは集中）しているタンパク質を有する系よりも高いＤｆ（より緊密な集団）を示すはずである。またこのことは、細胞の極性化もＤｆに影響を及ぼしうることを示唆している。そのような分析を、細胞表面タンパク質の阻害を研究する場合、またはそのようなタンパク質の産生に遺伝子のサイレンシングが原因である場合（例えば、ｓＲＮＡを使用する場合であるが、これに限定されない）に使用することもできる。例えば抗体またはペプチドを使用して細胞表面のタンパク質を遮断することも、Ｄｆの変化に影響を及ぼすことができる。したがって、タンパク質発現のレベルおよびタンパク質の利用可能性における変化は、Ｄｆの変化に影響を及ぼすはずである。したがって、方法は、様々な細胞−細胞間相互作用の測定、およびそれを乱す作用物質の試験を可能にする。
【００５６】
最後に、この型の画像分析を、磁気的に浮遊していない３Ｄ培養物と共に使用することもでき、これらの培養物は、表面、基質中、および／またはウエルの底部もしくは別の表面に３Ｄの集団になって増殖する。しかし、本発明の磁気浮遊方法の使用に対して他の培養方法では欠点がある。磁気浮遊方法の明確な利点は、細胞を急速に一緒に集め、Ｄｆおよび他の位相幾何学的変数をモニタリングしている間に一緒に保持する能力である。他の細胞培養系を使用する場合、細胞は大きな面積にわたって分散し、試料採取および画像分析を困難にしうる。他に、他の培養系に関連する全ての欠点は生存率の評価にも当てはまり、３Ｄ培養物は、より密接に天然の組織に近似する。
【実施例】
【００５７】
実施例１：材料および方法
細胞株および細胞培養物：ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ（商標）、カタログ番号ＣＲＬ−１５７３）から購入した。ＨＥＫ２９３は、ウシ胎児血清（ＺＥＮ−ＢＩＯ（商標）、ＳＥＲ−５００）、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（商標）、Ｐ４３３３）、ＨＥＰＥＳ（９９％、生化学用、ＡＣＲＯＳ  ＯＲＧＡＮＩＣＳ、１７２５−７１０００）および重炭酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（商標）、Ｓ−８８７５）を補充したダルベッコー修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＭＥＤＩＡＴＥＣＨ（商標）ＩＮＣ．、１０−０１７−ＣＶ）の塩基性培地を使用して繁殖させた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（商標）、Ｐ４４１７−１００ＴＡＢ）およびトリプシン／ＥＤＴＡ  １×（ＭＥＤＩＡＴＥＣＨ（商標）ＩＮＣ．、２５−０５３−Ｃ１）を使用して、細胞を継代培養した。全ての培養物を５％ＣＯ２雰囲気下において３７℃でインキュベートした。細胞を約１３８０ＲＣＦで１．５分間遠心分離した。
【００５８】
化合物：（＋／−）−イブプロフェン（ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ（商標）、Ｉ１１０）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（ＦＩＳＨＥＲ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（商標）、ＢＰ２３１１）に溶解した。陽性対照は、培地に１％の濃度で添加された任意の毒素のない化合物を送達するのに使用される同じ貯蔵液で細胞を処理することからなる。陰性対照は、貯蔵液で処理されない細胞からなる。
【００５９】
創傷面積の画像化は、ＬＥＩＴＺ（商標）Ｌａｂｏｖｅｒｔ  ＦＳ倒立顕微鏡を使用して実施した。明視野顕微鏡画像による画像分析は、ＩＭＡＧＥＪ  １．４３ｕソフトウエアにより実施した。ＩｍａｇｅＪプログラムにより、画像ファイルを開き、尺度をｍｍの単位長さに設定した。画像を最大化して、引っ掻き傷または孔の面積をペイントブラシツールの使用によりトレースし、ブラックラインを線状の引っ掻き傷または孔の縁の周りに引いた。引っ掻き傷または孔の面積は、最初にワンドツールを選択し、次に彩色ブラックラインを選択し、最後にメジャーを選択することによって決定した。次に、得られた面積を記録した。
【００６０】
２Ｄ引っ掻き傷アッセイ：ＨＥＫ２９３細胞を、接着性培養皿において＞９０％のコンフルエンスで培養し、引っ掻き傷を、２００μＬのピペットの先端（およそ０．９０ｍｍの直径）で細胞単層に沿って手動により掻き取って作り出した。２Ｄ培養物に使用される６ウエル細胞培養プレートは、細胞培養物の懸濁用の滅菌された、未処理のマルチディッシュ（ＮＵＮＣ（商標）、１５０２３９）であった。標示は、経時的に同じ面積をモニターできるように、画像取得の基準点として培養皿の外側に行った。
【００６１】
３Ｄ創傷アッセイ：浮遊３Ｄ細胞培養物は、ＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）溶液、６ウエルプレート磁気駆動および６ウエル組織培養プレートからなる６ウエルＢｉｏ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ（商標）キット（ＮＡＮＯ３Ｄ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（商標）ＩＮＣ．）を使用して生成した。ＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）溶液は、ナノ粒子の細胞取り込みを促進する、ポリ−Ｌ−リジンの水溶液中に集められた酸化鉄ナノ粒子（Ｆｅ２Ｏ３）およびＡｕナノ粒子のナノ粒子アセンブリー溶液である。
【００６２】
磁気駆動は、ＡＰＰＬＩＥＤ  ＭＡＧＮＥＴＳ（商標）（Ｐｌａｎｏ、ＴＸ、モデル番号Ｃｕｐ−３２）の６個のカップ磁石またはＫ＆Ｊ  ＭＡＧＮＥＴＳ（商標）（Ｊａｍｉｓｏｎ、ＰＡ、モデル番号Ｄ４８−Ｎ５２）の２４個の円柱磁石を有するアクリル製マウントである。磁石の底面のおよそ１８ｍｍ（６ウエル系）および４ｍｍ（２４ウエル系）下の、細胞が浮遊したときに留まるメニスカスの中心の場の値は３００Ｇである。場は、Ｆｉｎｉｔｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ１２のプログラムを使用して計算し、ガウスメータープローブにより確認した。３Ｄ培養物に使用される６ウエルおよび２４ウエルプレートは、平底超低取付複数ウエルプレート（ＣＯＳＴＡＲ（登録商標）３４７１または３４７３）であった。
【００６３】
細胞を、最初に２Ｄにより約８０％のコンフルエンスで培養し、次にＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）（ＮＡＮＯ３Ｄ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（商標）、Ｈｏｕｓｔｏｎ  ＴＸ）で処理し、標準的なＣＯ２細胞培養インキュベーターに１２時間のインキュベーション時間で置いた。次に、細胞をトリプシン処理して、容器および互いから分離させた。トリプシンを不活性化し、細胞をカウントし、遠心分離し、次に特定の細胞型のために推奨されている培地を使用する６ウエルプレートの個別のウエルに接種した。それぞれのウエルの培地容量は１．０ｍｌであった。磁気駆動は、培養物の真上に配置され、磁力が細胞を穏やかに一緒に浮遊および誘導して、細胞−細胞間相互作用を素早く誘発し、３Ｄアセンブリーを形成した。次に、浮遊された培養物をインキュベートした。
【００６４】
本明細書に提示されている実験では、ＨＥＫ２９３を１２時間浮遊させ、次に孔を以下の手順に従ってアセンブリーに開けた。磁気駆動を培養プレートの上から取り外し、下に配置して、アセンブリーを底部に穏やかに引っ張り、細胞をその場所で保持した。滅菌毛細管を使用して、細胞球状体に孔を開けた。毛細管（ＤＲＵＭＭＯＮＤ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（商標）、  Ｂｒｏｏｍａｌｌ  Ｐａ．、カタログ番号１−０００−８００）は、長さ７５ｍｍ、内径０．４ｍｍおよび外径０．８ｍｍを有した。毛細管を取り外した後、円形欠陥はそのままであった。毛細管は、一定の円形孔を作り出すことが見出されたが、更に複雑な創傷を模倣するため、他の形状の孔開け装置を開発して、使用することができる。
【００６５】
創傷を作り出した後、培地容量を１．５ｍＬにし、磁石を培養物の上に戻して、細胞を再び浮遊させた。細胞培養プレートを顕微鏡試料台に置いて、磁石の中央開口部を介した画像化により顕微鏡写真を得た。次に細胞培養プレートを細胞培養インキュベーターに入れるが、創傷閉鎖の際には細胞を顕微鏡法によりモニタリングするために一定間隔で取り出した。細胞は、２〜３日毎に培地を補充することにより維持した。
【００６６】
別の実験では、ヒト初代線維芽細胞（ＨＰＦ）、初代平滑筋細胞（ＳＭＣ）、およびこれらの２つの細胞の同時培養物（５０％のＨＰＦ＆５０％のＳＭＣ、またはＨＰＦ−ＳＭＣ）を、凝集性３Ｄ培養物を生成するために、２４ウエル磁気浮遊系により４〜２４時間浮遊させ、次に孔を以下の手順に従って生成した。
【００６７】
磁気駆動を培養プレートの上から取り外し、次に培養物を、Ｐ１０００ピペット（１、０００マイクロリットル）でピペット動作を４回繰り返して細断した。渦および／または切断のような他の機械的剪断または切断法を、３Ｄ培養物の断片化のために使用することができる。
【００６８】
アクリルプレートに貼り付けられ、２４ウエルプレートのウエルの中央の下に収まるように分布された２４個の環状磁石のアレイ（Ｋ＆Ｊ  Ｍａｇｎｅｔｓ、Ｊａｍｉｓｏｎ、ＰＡ、モデル番号Ｒ４１１の外径１／４”×内径１／１６”×厚さ１／１６”）を、培養物を有する２４ウエルプレート（Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｉｎｃ．）の下に配置した。これらの磁石からの磁場は、細断された培養物を環状構造に再形状化（またはパターン化）する。これらの環の内径はおよそ１／１６″であるが、この大きさを、ウエル中の細胞の数を増加するまたは減少することによりそれぞれ減少または増加することができる。超低取付プレートが通常使用されるが、他の表面改質を有する他のプレートを、細断された培養物を磁気的にパターン化する表面として使用することができ、例えば、細胞接着性表面（多くの場合、ポリ−Ｌ−リジンで改質されている）、細胞外基質被覆／改質（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ＢＤ、Ｉｎｃ．を含む）、コラーゲン被覆、ヒドロゲル改質およびゼラチン被覆組織培養プレートなどである。
【００６９】
磁石が２４ウエル培養プレートの下に配置され、環形状が形成されると、磁石アレイは、組織培養インキュベーターの中で１〜２４時間にわたって培養物の下に静止したまま保持される。このインキュベーション時間の後、２４ウエルプレートを直接的な垂直運動により磁石アレイから持ち上げる。ここでは、環状構造を変形させないために、水平運動（横方向）は望ましくない
一つの実施形態において、環状培養物をパターン化した後および磁石アレイを取り外す前に、培養条件および／または組成を、例えば、ｉ）細胞を系に添加すること（これらの細胞は同じもしくは異なる細胞型であることができ、磁性ＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）を有する若しくは有さない可能性がある）、ｉｉ）パターン化細胞に細胞外基質、ゲルもしくはヒドロゲル様材料を添加するもしくは重ねるもしくは被覆すること、および／またはｉｉｉ）これらの培養物の孔閉鎖プロセスに影響を与える（刺激もしくは抑制する）ことができる分子もしくはナノ粒子を加えることによって操作することができる。
【００７０】
創傷または環開口部を作り出した後、培地容量を一定に保ち、これらの構造を非接着性組織培養プレートの底部に留まらせた。したがって、培養物は再浮遊されなかった。細胞培養プレートを顕微鏡試料台に置いて、磁石の中央開口部を介した画像化により顕微鏡写真を得た。次に細胞培養プレートを細胞培養インキュベーターに入れるが、創傷閉鎖の際には細胞を顕微鏡法によりモニタリングするために一定間隔で取り出した。細胞は、２〜３日毎にまたは必要に応じて培地を補充することにより維持した。
【００７１】
ＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）を有さない単一細胞および／または細胞型の組み合わせ（同時培養物）を磁化細胞に重ねる／注ぐことにより、これらのアッセイに組み込む（孔を開け、磁気パターン化する）ことができる。磁化細胞（ＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）を有する細胞）と一旦接触した、ＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）を有さない細胞は、磁化細胞型と適合する場合、相互作用し、パターン化組織の一部として組み込まれる。したがって、１つの細胞型だけが、ＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）で処理または改質される必要があるが、望ましい場合は２つ以上の細胞型を処理することができる。
【００７２】
実施例２：細胞生存率アッセイ
図１は、分散された細胞（１）およびＭＬＭ単一ウエル装置を使用して増殖された磁気的に濃縮された浮遊細胞（３）の概略図を示す。ここで本発明者たちは、６個の磁石を６つのウエルにわたって所定の場所に保持する特別に設計された覆い蓋または二次カバー（６−ＷＥＬＬ  ＢＩＯ−ＡＳＳＥＭＢＬＥＲ（商標）ＭＡＧＮＥＴＩＣ  ＤＲＩＶＥ、Ｎ３Ｄ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（商標））と一緒にした、標準的な６ウエル培養プレートおよび蓋（示されず）を含む、市販のハイスループット装置にこの技術を拡大した。他のアレイの大きさも当然のことながら可能である。装置の使用は標準的な２Ｄ技術と同じくらい簡単であり、市場のあらゆる３Ｄ細胞培養製品よりも素早いことが証明されている。
【００７３】
３Ｄ細胞アセンブリーの位置および形状は、磁場の位置および／または形状を調整することにより磁気的に制御することができる。しかし、アセンブリーの形態および特定の段階に達するのに必要な時間の量は、細胞特異的である。上皮のような幾つかの細胞型は、層状シートを形成し、扁平形態を示し、一方、ヒト臍帯静脈内皮細胞のような他のものは、分岐状構造を示す。浮遊構造を分離して複数の試料を作り出すことができ、生存細胞を更なる実験のために３Ｄ培養物から取り出すことができる。
【００７４】
特別な追加の器具は必要なく、ＭＬＭ装置は、同時培養、標準的な画像化および診断技術と適合する。細胞を数か月維持することができ、毒素を培養物に導入して、任意の有害な作用を検査することができる。ＭＬＭ技術により増殖された培養物は、天然のヒト組織のモデルを提供し、これを様々な薬剤に曝露し、生存率および／または細胞−細胞間相互作用についてモニターすることができる。
【００７５】
図２は、６ウエルプレートにおいて３Ｄで培養されたＨＥＫ２９３細胞の例示的な顕微鏡車線を示す。Ｎｕｎｃ未処理６ウエル細胞培養プレートを使用し（６−ＷＥＬＬ  ＢＩＯ−ＡＳＳＥＭＢＬＥＲ（商標）ＭＡＧＮＥＴＩＣ  ＤＲＩＶＥ、Ｎ３Ｄ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（商標））、試料を様々な濃度のイブプロフェン（０〜１０ｍＭ）と共に投与した。細胞を薬剤を投与する前に１時間プレ浮遊させ、画像を様々なインキュベーション時間（０〜１６８時間）で得た。画像は、３Ｄ構造の中央において４×倍率で撮影した。
【００７６】
イブプロフェン投与濃度またはインキュベーション時間が増加すると（図２）、３Ｄ作成物は凝集性が少なくなり始めると思われる。高い濃度およびインキュベーション時間（２ｍＭ、２４時間）では、３Ｄ構造体は複数のコロニーに完全に分解した。このことは、イブプロフェンが、３Ｄ球状形成を促進する細胞−細胞間相互作用および細胞−基質間相互作用および／または細胞生存率を破損することを示す。
【００７７】
図２の顕微鏡写真をフラクタル次元分析を使用して検査したとき（フラクタル次元の計算方法の記載について下記を参照すること）、全体的な傾向を観察することができる。フラクタル次元（Ｄｆ）は、尺度にわたって自己相似構造として定義することができ２、その分析は、凝集体および集団形成の研究に使用されてきた２−３。薬剤濃度および薬剤インキュベーション時間の増加による個別細胞コロニーの数および３Ｄ構造体の多孔性の増加は、両方とも、フラクタル次元の減少を生じる。フラクタル次元におけるこの変化を、細胞生存率または細胞−細胞間相互作用に転換することができる。試料のフラクタル次元が減少すると、細胞の生存率または細胞−細胞間相互作用も減少する。
【００７８】
図３は、２Ｄで培養され、ＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）の存在なし（菱形）、ＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）の存在あり（四角形）のＭＴＴアッセイで評価されたイブプロフェン投与ＨＥＫ２９３細胞における、およびＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）と共に３Ｄで培養され、無標識フラクタル分析アッセイで評価された細胞（三角形）における生存率を示す。２４時間のＬＤ５０値（２４時間後に細胞の半分が死滅する濃度）を、２Ｄで培養され、ＭＴＴアッセイで評価された細胞においておよそ１ｍＭ、およびＭＬＭと共に培養され、上記に記載された無標識アッセイを使用して評価された細胞において２．２ｍＭと推定することができる。
【００７９】
本明細書において提示されている２Ｄ細胞毒性の結果は、文献のものと十分に匹敵し、ＭＴＴアッセイを使用する２４時間ＬＤ５０値は、ＨＥＫ２９３細胞おけるイブプロフェンでは１０００μＭと報告された。本発明者たちは、３ＤアセンブリーのＬＤ５０の増加が、３Ｄ作成物の中心への薬剤拡散の限界、ＥＣＭの存在、および細胞−細胞間相互作用を含む幾つかの要因に起因し、これらが構造体の内側の細胞を外側と同じほどの薬剤へ曝露から保護し、それによって全ての細胞が薬剤に曝露されないと仮定する。これらは、インビボ組織の脈略内に存在する全ての側面であるが、２Ｄ単層培養物では容易に複製することができない。
【００８０】
実施例３：画像分析
２Ｄ画像のフラクタル次元分析を使用して、フラクタル様物体塊の構造を評価することができる。２、４−８フラクタル次元理論は、フラクタル凝集体における一次物体（Ｎ）の数とその回転半径（Ｒｇ）の関係が以下の方程式に従うと仮定する３−１０。
【００８１】
【数３】
2014504882.tif 000006
ここで、ａは一次物体の直径を意味し、Ｄｆはフラクタル次元であり、ｋｇは構造プリファクタと呼ばれる定数である。この実証において、本発明者たちは、細胞を互いに連結している球体として描いた。フラクタル様構造体は複雑なので、Ｒｇの決定は、多くの場合に些細なことではない。１１したがって、本発明者たちは、Ｒｇを多細胞塊により占められた空間の最大長（Ｌ）と代えることにより上記の方程式を変更した９、１２。
【００８２】
【数４】
2014504882.tif 000007
これを下記のように書き換えることができる。
【００８３】
【数５】
2014504882.tif 000008
これらの方程式を使用して、図４に示されているように、モデル化された系のＤｆを評価することができる。この簡素化した手順において、Ｌ、ａ、およびｋｇは、一定に保たれ、このことはＤｆをＮの関数にし、対数（Ｎ）と比例する。この分析の結果は、細胞の数の増加がＤｆ値を上昇させることを示した（図４、ａ＜ｂ＜ｃ＜ｄ）。これらの結果は、本発明のＤｆ分析および３Ｄ多細胞アセンブリーの解釈と定性的に一致し、４本発明者たちは、細胞の生存率（Ｎの増加によりもたらされる細胞複製）および生存細胞によりもたらされる細胞−細胞間相互作用が、薬剤濃度が減少すると、Ｄｆの増加を誘導すると仮定する。
【００８４】
本発明者たちは、ボックスカウント法３、１１（ＩｍａｇｅＪソフトウエア）を使用して、時間の関数としての構造体における模擬変化のため、図５の構造体のＤｆも計算した。一般に、ボックスカウントは、１ピクセル幅の２進法（白地に黒）境界を覆うのに必要な所定の大きさのボックスの数をカウントする手順からなり、この手順は様々な大きさのボックスで繰り返される。ボックスカウントの対数がボックスの大きさの対数の関数としてプロットされる、曲線がプロットされる。この関係の直線性は、通常、自己相似性の指数であり、フラクタル物体の主な特徴である。Ｄｆは、それぞれのボックス内の細胞の数の対数に対するボックスの大きさの対数をプロットすることにより生成される曲線の勾配を測定して評価される。この方法は、多細胞構造体（図５（ｄ〜ｇ））のＤｆ値１．８９、１．７２、１．６７、および１．５４をそれぞれ生じる。
【００８５】
これらの値は、本発明の実験結果と類似の傾向をたどるが（細胞密度の関数としてのＤｆの増加、例えば図２および図８）、Ｎの変化に対するこの方法の感受性は、上記の計算よりも劣っている。細胞の様々な層の顕微鏡写真を得ることができれば、方法論のダイナミックレンジおよび感受性を増加することができ、それによって組織の三次元（３Ｄ）を考慮することができる。本明細書で使用される２Ｄ画像は、細胞の層を分解することができず、したがって、多細胞構造体の投影だけがＤｆ計算において考慮される（図４、５）。まとめると、提示された分析は、Ｄｆの関連する測定が、フラクタル次元の関数として多細胞構造体の細胞の相対数の推論を可能にすることを示す。
【００８６】
フラクタル次元と同様に、細胞生存率を、球状構造体における形態変化に基づいて評価することもできる。細胞生存率は以下の方程式を使用して計算される。
ｉ．細胞生存率＝、Ｄ−ｆ試料．−、Ｄ−ｆ１００％細胞死−、Ｄ−ｆ対照．−  Ｄ−
【００８７】
【数６】
2014504882.tif 000009
ここで、Ｄｆ試料は、特定の薬剤投与時間の長さｔでの試料のフラクタル次元であり、Ｄｆ対照は、特定の薬剤投与時間の長さｔでの陰性対照のフラクタル次元であり、Ｄｆ１００％細胞死は、細胞死が１００％の試料のフラクタル次元である。この値は、最高濃度の薬剤および最長の薬剤投与の時点で試料から得た。計算されたフラクタル次元および生存率（図５（ｈ、ｉ））は、損なわれていない培養時間の関数として増加し、毒性濃度の関数として減少する。
【００８８】
次にこの方法を、外来性作用物質が既知または未知の型細胞により代えられるアッセイに使用することができる（細胞には、血液および／または間質細胞画分のような、細胞型の異質混合物を含めることができる）。本明細書において、磁化細胞を使用して、未知試料からの細胞を捕捉することができる。この未知試料の細胞は、ＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）を有する、または有さない可能性がある。
【００８９】
図５のｊ〜ｍの部分は、健康な２つ細胞型の同時培養物を表し、ここでは１つの細胞型（小さな楕円形）の数が増加している。本明細書において、培養物の異質組成物および構造体がＤｆ分析で検出される。ｎの部分は、一方の細胞型（小さな楕円形）の細胞の数が増加し、他方の細胞型（大きな楕円形）が一定を保つ培養物ｊ〜ｍのプロットを表す。計算されたＤｆ値は、（ｊ）１．４１８、（ｋ）１．８１２、（ｌ）１．８４４、および（ｍ）１．９１２である。同時培養模擬系（ｎ）の一方の細胞型の細胞数に対するＤｆである。
【００９０】
更に、試験細胞が浮遊に必要なＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）を有さない場合、これらは、ＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）を有する既知の細胞（これらの細胞は、浮遊および３Ｄ培養を可能にする）と共に非接着性プレートの底部で少なくとも３０分間インキュベートされる必要がある。あるいは、細胞の混合物を遠心分離して、一緒に集めることができる。複数の細胞型が接触し、細胞−細胞間相互作用が発生すると、細胞は一緒に浮遊する。
【００９１】
まとめると、このアッセイを使用して、単離幹細胞、血液および／または間質細胞混合物のような均質または異質細胞混合物を捕捉、検出、および特徴決定することができる。
【００９２】
上記に示された模擬データに基づいて、様々なプロットを構築することができる。図６は、図６で模擬されたデータについて、（ａ）濃度に対するＤｆ、（ｂ）濃度に対する細胞の数、（ｃ）濃度に対する平均の大きさ、（ｄ）濃度の対する総面積、（ｅ）時間に対するＤｆ、（ｆ）時間に対する細胞の数、（ｇ）時間に対する平均の大きさ、および（ｈ）時間に対する総面積を示す。
【００９３】
前記に紹介された３つの異なるモダリティー（Ｄｆ、大きさ、および大きさの分布）に基づいて、幾つかの分析方法を提示することができる。図７は、図２に提示された物理的データに基づいて様々なプロットを示す。（ａ）フラクタル次元（Ｄｆ）、（ｂ）集団の平均的な大きさ（ｐｘ２）、および（ｃ）総面積（ｐｘ２）が、様々な濃度のイブプロフェンに１、２４、および１６８時間曝露されたＨＥＫ２９３細胞で決定される。（ｄ）フラクタル次元、（ｅ）集団の平均の大きさ、および（ｆ）総面積に基づいた細胞生存率も示される。
【００９４】
薬剤投与量が減少すると（例えば、洗い流されると）、経時的に、細胞が回復し始め、３Ｄ培養物が再び集まることを観察することができる。図８は、様々な濃度のアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）（０〜１６ｍｍ）が投与された、ＭＬＭ  ６−ＷＥＬＬ  ＭＡＧＮＥＴＩＣ  ＤＲＩＶＥにより３Ｄで培養された肝細胞の顕微鏡写真を示す。薬剤を有さない新たな培地に変えた後、構造体は、また凝集球状体に集まり始める。
【００９５】
実施例４：空気中の毒素
磁気浮遊培養物への空気中の毒素の効果を探求するため、気管支上皮細胞（ＢｒＥｐｉｃｓ）を３Ｄで増殖させ、無希釈キシレン蒸気に曝露した。ＢｒＥｐｉｃｓを、最初に、ＳＩＮＧＬＥ  ＷＥＬＬ  ＢＩＯＡＳＳＥＭＢＬＥＲ  ＫＩＴ（商標）（ＮＡＮＯ３Ｄ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（商標））に含まれる３５ｍｍ×１０ｍｍ培養皿において３Ｄで２日間培養した。キシレン蒸気の供給源として、滅菌細胞培養フードにおいて、およそ１５ｍＬのキシレン（組織学的等級、ＦＩＳＨＥＲ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ（商標））を１００ｍｍ×２０ｍｍＰｙｒｅｘ（登録商標）ペトリ皿に入れ、密閉プラスチックバックの中に大気圧で放置した。浮遊細胞を、プラスチックバックの中に蓄積したキシレンガスに３０分間隔で曝露した。キシレンに繰り返し（４回）曝露した後、細胞死は観察されなかった。次に、３５ｍｍの皿を大型の９５ｍｍ×１５ｍｍのペトリ皿ホルダから取り外し、バッグの中に個別に３０分きざみで個別に入れ、続いて１５分きざみでＣＯ２インキュベーターの中に入れた。これを、細胞死が観察される前に１時間（２回）繰り返した。本発明者たちは、大型のペトリ皿ホルダはキシレン蒸気が細胞に達することをいくらか妨害したと仮定する。
【００９６】
図９は、ＢｒＥｐｉｃ細胞の浮遊（３Ｄ）および非浮遊（下側、２Ｄ）画像、ならびに上記に記載された無標識フラクタル次元アッセイを使用したキシレン曝露時間の関数としてのＢｒＥｐｉｃの細胞生存率を示す。矢印は、細胞死が最初に観察された時を示す。浮遊しているプレキシレン処理細胞は、健康であると思われ、シートを形成し、特徴的な扁平形態を示した。細胞死は、１５０分のキシレン曝露時点まで観察されなかった。この時点の直前、大型のペトリ皿ホルダを取り外し、それによってキシレン蒸気がより効率的に浮遊細胞に達することができた。キシレン曝露の増加は、シート状形成を破損し、非相互作用死亡細胞が残った（図９、１８０分）。
【００９７】
細胞生存率を研究する本明細書に提示されている無標識フラクタル分析アッセイは、３Ｄ組織をモニターする非侵襲的な方法である。データ処理における現在の進歩によって、この技術は、インビトロ毒性アッセイにとってますます重要になりうる。細胞の浮遊および増殖は（望ましい場合）、気相液相界面で生じさせることができ、このことは、空気中の環境毒素の容易な導入、続くモニタリングを可能にする。この特定の特徴は、肺および環境汚染物への曝露を研究するために有用である。
【００９８】
実施例４：創傷閉鎖
図１は、磁気的に誘導された組織シート形成の概略図である。非浮遊分散細胞（１）は、非接着性単一ウエル培養皿において磁気的に（５）濃縮（３）されている。平坦シートを、その位置でアッセイすること、または磁場を逆転して浮遊させ、使用することができる。追加の細胞型を加えることもでき、このようにして複雑な３Ｄ組織構造体を作り上げることができる。
【００９９】
この簡単な物理的検査が図１０に示されており、これは、非接着性および接着性の両方の細胞培養皿で２日間培養した後のＨＥＫ２９３細胞の拡大写真および顕微鏡写真を示す。非接着性皿は、ＨＥＫ２９３細胞で形成された２Ｄ組織シートの明確な証拠を示すが、接着性皿は、プラスチックに付着した単離細胞を示す。非接着性皿で形成されたもののような細胞の平坦シートを、創傷治癒アッセイのような様々な用途に使用することができる。
【０１００】
２Ｄ引っ掻き傷培養物を実施例１に記載されたとおりに調製し、顕微鏡写真を一定間隔で撮影し、分析した。画像が分析されると、両方の系で創傷閉鎖と呼ばれる引っ掻き傷（２Ｄ）または孔（３Ｄ）の閉鎖を、以下の方程式を使用して構造における形態変化に基づいて評価することができる。
【０１０１】
【数７】
2014504882.tif 000010
ここで、創傷の領域ｔは特定の時間ｔでの試料の画像の視野内の引っ掻き傷または孔の面積であり、創傷の領域ｔ０は０時間での試料の画像の視野内の引っ掻き傷または孔の面積である。
【０１０２】
図１１Ａは、異なる量のウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下で増殖させたＨＥＫ２９３細胞の２Ｄ単層培養物に作り出された線状引っ掻き傷の顕微鏡写真を示す。０％血清の試料は、２、４、および２４時間の時点で放出され、現れた幾つかの細胞片を示すが、２１６時間の時点の前に洗い流された。また、２１６時間での０％血清では、引っ掻き傷の縁の近くの細胞集団のいくらかの「丸まり」または「球状化」が観察された。このことは驚くべきことではなく、それは、伝統的な引っ掻き傷方法への批判の１つが、創傷縁近くの細胞の収縮、ならびに物理的な破損による元の細胞形態および機能の損失であるからである。この引っ掻き後２１６時間の「丸まり」も、血清の不在による飢餓培地条件の結果でありうる。
【０１０３】
２１６時間では、１０％ＦＢＳ培養物に刻まれた線は、細胞移動および増殖によって完全に閉鎖されたが、０％ＦＢＳ培養物ではされなかった。次に得られた明視野顕微鏡画像を、ＩＭＡＧＥＪソフトウエアを使用して分析して、引っ掻き傷閉鎖を時間および血清率の関数として定量化した。
【０１０４】
ＩＭＡＧＥＪが、パブリックドメイン画像処理プログラムであること、このユーザーフレンドリーソフトウエアが、国立衛生研究所（ＮＩＨ）から無料で入手可能であることに留意することは重要である。追加の高価なソフトウエアまたは特別プログラムは、この創傷治癒アッセイを実施するために必要ではない。
【０１０５】
本発明の３Ｄ磁気浮遊系への創傷治癒アッセイの適用は、幾つかの簡単な変更のみを必要とする。細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＰＦ、ＳＭＣ、またはＨＰＦ−ＳＭＣ）を接着性ウエルに接種するのではなく、ＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）処理細胞が、超低取付プレートに接種され（ウエル１つあたり１．０ｍＬの細胞／培地懸濁液、６ウエルでは、約５００、０００細胞／ウエル、またはウエル１つあたり３２０マイクロＬの細胞／培地懸濁液、２４ウエルでは約５００、０００細胞／ウエル）、ＢＩＯ−ＡＳＳＥＭＢＬＥＲ（商標）６ウエルまたは２４ウエル磁気駆動がそれぞれのプレートの蓋に設置された。
【０１０６】
浮遊細胞を最初に、それぞれのウエルにおいて凝集して組織の連続片を形成するまで（約４〜２４時間）、１０％ＦＢＳを有する培地で維持した。次に、孔を、ガラス毛細管を使用して（６ウエル系およびＨＥ２９３）または３Ｄ構造を磁気パターン化細断して（２４ウエル系、ならびにＨＰＦ、ＳＭＣ、およびＨＰＦ−ＳＭＣ）作製した。６ウエルでは、それぞれの試料および細胞を、培地の使用により１．５ｍＬ容量で維持し、２４ウエルでは、それぞれの試料および細胞を、ＳＭＣまたはＨＰＦ培地の使用により３２０μＬの容量で維持した。
【０１０７】
創傷治癒アッセイの最初の試験として、本発明者たちは、様々な血清濃度への細胞の応答を研究した。補充血清の濃度が増加すると、細胞分化に必要な増殖因子の量および存在するサイトカインの量が増加する。したがって、補充血清の存在の増加による一般的な結果は、細胞繁殖の増加であり、したがってアッセイの概念の証明を提供することができる。
【０１０８】
図１２は、ＨＥＫ２９３細胞を使用する創傷治癒アッセイの顕微鏡写真を示す。２つの異なる血清条件を、毛細管手法により生成された創傷の閉鎖について試験し、孔を経時的にモニターした（図１２ａ）。時間の関数として、細胞移動および新たな細胞増殖は孔を閉じた。この範囲の孔の大きさでは、閉鎖面積の率を、０〜５％の血清濃度で異なる大きさの孔の時間の対数に対してプロットしたとき（図１２ｂ）、これらの３つの異なる大きさの孔の閉鎖の勾配の適合は、極めて類似していると思われる（約１）。このことは、ＨＥＫ２９３細胞の増殖速度が、孔の大きさおよび低い血清条件にほとんど影響を受けないことを示す。
【０１０９】
本発明者たちは、イブプロフェンを細胞毒性薬として使用する２Ｄおよび３Ｄ試験も実施した。画像を、時間およびイブプロフェン濃度の関数として得て、本明細書に記載されたように分析した。対照試料は、イブプロフェンまたはＤＭＳＯなしの細胞からなり、一方、０ｍＭの試料は、イブプロフェンを用いないで、ＤＭＳＯ（培地中１％）で細胞を処理することからなった。９６時間の０および０．１ｍＭのイブプロフェンでは、３Ｄ孔を閉鎖し（示されず）、一方、同じ濃度を投与した２Ｄ引っ掻き傷は、２１６時間後でも未だ治癒されなかった（示されず）。
【０１１０】
実施された２Ｄおよび３Ｄの両方のアッセイでは、治癒に必要な時間が高い血清濃度で低減されたことを示した。治癒に必要な時間が２Ｄ増殖条件と比較して３Ｄにおいて低減されたことも示された。試験化合物のイブプロフェンが導入された時（データは示されず）、インビトロ３Ｄ創傷アッセイを毒性の予測ツールとして使用できることが示された。したがって、本発明者たちは、この性質のアッセイを使用して、試験化合物が細胞増殖および移動または創傷閉鎖のインヒビターまたはアクチベーターであるかを識別できることを実証した。
【０１１１】
図１３は、ＨＰＦ、ＳＭＣ、およびＳＭＣのＨＰＦ同時培養（ＨＰＦ−ＳＭＣ）細胞を使用する創傷治癒または創傷治癒アッセイの顕微鏡写真を示す。ＨＰＦおよびＳＭＣ培地の２つの異なる培地条件を、実施例１に記載された磁気パターン化手法により生成した創傷閉鎖について試験し、孔を経時的にモニターした。時間の関数として、細胞移動、３Ｄ細胞収縮および新たな細胞増殖は孔を閉じた。
【０１１２】
創傷の大きさは、３４時間内に両方の種類の培地で減少した。ＳＭＣ培地の培養物の創傷（図１３ａ〜ｃ）は、３４時間で閉鎖しなかった。次に、ＳＭＣ培養物（図１３ｃおよびｆ）は培地の種類に対して感受性がなく、それは、両方の種類の培地におけるこれらの培養物が、３４時間で閉鎖しなかったからである。ＨＰＦ（図１３ａおよびｄ）の培養物、ならびにＨＰＦ−ＳＭＣ同時培養物（図１３ｂおよびｅ）の創傷閉鎖を比較すると、線維芽細胞培地における培養物（図１３ｄおよびｅ）の創傷は、３４時間で閉鎖しなかったＳＭＣ培地における培養物と対照的に、２０時間で閉鎖した。これらの結果は、ＨＰＦ細胞が２つの異なる種類の培地に感受性があり、創傷閉鎖は細胞がＨＰＦ培地で培養された時に加速されることを示唆している。
【０１１３】
異なる細胞型を同時培養する現在の問題は、同時培養される異なる細胞型に適合する培地条件の最適化である。したがって、本発明者たちは、このアッセイを使用して、細胞移動、細胞収縮および／または細胞繁殖に基づいて細胞を同時培養するための培地条件および／または培地スクリーニングを最適化および／または決定できることを実証した。
【０１１４】
以下の参考文献は、その全体が参照として組み込まれる。
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１０．  Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ、  Ｍ．  Ｆｒａｃｔａｌｓ、  Ｃｈａｏｓ、  Ｐｏｗｅｒ  Ｌａｗｓ：  Ｍｉｎｕｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｐａｒａｄｉｓｅ．  （Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、  １９９２）．
１１．  Ｓｍｉｔｈ、  Ｔ．  Ｇ．  Ｊ．、  Ｄ．、  Ｌ．  Ｇ．  ＆  Ｍａｒｋｓ、  Ｗ．  Ｂ．  Ｆｒａｃｔａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６９、  １１２３−１１２６  （１９９６）．
１２．  ｆｅｍｍ．ｉｎｆｏ．から入手可能なＭｅｅｋｅｒ  ＤＣ（２６Ｄｅｃ２００９  Ｂｕｉｌｄ）  Ｆｉｎｉｔｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．２．
ＵＳ２００３４３６６２１
ＵＳ２００４０３８２６４
ＷＯ２０１１０３８３７０
ＷＯ２０１００３６９５７
６１／４３８３１０
ＵＳ２００９１３７０１８
ＷＯ２００５００３３３２
ＵＳ２００５０５４１０１
ＷＯ２００５０１０１６２
ＵＳ２００６０６３２５２
ＷＯ２００４０８３４１２
ＷＯ２００４０８３４１６
【図１】
2014504882.tif 000013
【図２】
2014504882.tif 000014
【図３】
2014504882.tif 000015
【図４】
2014504882.tif 000016
【図５】
2014504882.tif 000017
【図６】
2014504882.tif 000018
【図７】
2014504882.tif 000019
【図８】
2014504882.tif 000020
【図９】
2014504882.tif 000021
【図１０】
2014504882.tif 000022
【図１１】
2014504882.tif 000023
【図１２】
2014504882.tif 000024
【図１３】
2014504882.tif 000025
【国際調査報告】
2014504882.tif 000026
2014504882.tif 000027