(57)【要約】  実施形態において、培養培地、培養培地に添加するための組成物、および生物学的サンプルを培養するための方法が開示される。実施形態において、その方法は、細菌を検出するための方法であり、実施形態において、その細菌にはサルモネラ属菌が含まれ、実施形態において、大腸菌属菌が含まれる。実施形態において、その培地および組成物は、アルカノールアミンおよびコバラミン化合物を含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的に有効な濃度の：
コバラミン化合物および
アルカノールアミン
を含む、培養培地。
【請求項２】
コバラミン化合物が、コバラミン、メチルコバラミン、アデノスリコバラミン、ヒドロキソコバラミンおよびシアノコバラミンからなる群より選択される、請求項１に記載の培地。
【請求項３】
アルカノールアミンが、エタノールアミンである、請求項１に記載の培地。
【請求項４】
請求項１に記載の細菌の培養培地。
【請求項５】
細菌が、サルモネラ属菌または大腸菌属菌である、請求項４に記載の培地。
【請求項６】
細菌が、サルモネラ・チフィリウム、大腸菌１５７、志賀毒素産生大腸菌または腸管出血性大腸菌である、請求項５に記載の培地。
【請求項７】
前記アルカノールアミンが、約０．００２Ｍより高い濃度で存在し、前記コバラミン化合物が、約０．００１ｍｇ／リットルより高い濃度で存在する、請求項２に記載の培地。
【請求項８】
生物学的サンプルを培養するための方法であって、該方法は、生物学的に有効な濃度の：
コバラミン化合物および
アルカノールアミン
の存在下において該サンプルをインキュベートする工程を包含する、方法。
【請求項９】
コバラミン化合物が、コバラミン、メチルコバラミン、アデノスリコバラミン、ヒドロキソコバラミンおよびシアノコバラミンからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
アルカノールアミンが、エタノールアミンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
細菌を培養するための、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
細菌が、サルモネラ属菌または大腸菌属菌である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
細菌が、サルモネラ・チフィリウム、大腸菌１５７、志賀毒素産生大腸菌または腸管出血性大腸菌である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アルカノールアミンが、約０．００２Ｍより高い濃度で存在し、前記コバラミン化合物が、約０．００１ｍｇ／リットルより高い濃度で存在する、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
サンプル中のサルモネラ属菌または大腸菌属菌を検出するための請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
アルカノールアミンがエタノールアミンである、サンプル中のサルモネラ属菌または大腸菌属菌を検出するための、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＣＲ、レクチン結合、単純拡散、側方拡散、抗体結合、ラテラルフローまたはフロースルーの工程をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
サルモネラ属菌および大腸菌属菌を培地中で優先的に培養するための方法であって、該方法は、コバラミン化合物とアルカノールアミンとの生物学的に有効な組み合わせを該培地に添加する工程を包含する、方法。
【請求項１９】
コバラミン化合物および
アルカノールアミン
を含む、培養培地に添加するための組成物。
【請求項２０】
コバラミン化合物が、コバラミン、メチルコバラミン、アデノスリコバラミン、ヒドロキソコバラミンおよびシアノコバラミンからなる群より選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
アルカノールアミンが、エタノールアミンである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
細菌を増殖させるための、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２３】
細菌が、サルモネラ属菌または大腸菌属菌である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
生物学的サンプル中のサルモネラ・チフィリウム、大腸菌１５７、志賀毒素産生大腸菌および腸管出血性大腸菌を検出するための方法であって、該方法は、生物学的に有効濃度のエタノールアミン；ならびに
メチルコバラミン、アデノスリコバラミン、ヒドロキソコバラミンおよびシアノコバラミンからなる群より選択されるコバラミン化合物
の存在下において該サンプルを培養する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
１．分野
開示される主題は、概して、微生物を培養する培地および方法ならびに微生物を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．関連刊行物
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【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
要旨
第１の実施形態において、生物学的に有効な濃度の：コバラミン化合物およびアルカノールアミンを含む培養培地が開示される。
【０００４】
実施形態において、上記コバラミン化合物は、コバラミン、メチルコバラミン、アデノスリコバラミン（ａｄｅｎｏｓｌｙｃｏｂａｌａｍｉｎ）、ヒドロキソコバラミンおよびシアノコバラミンからなる群より選択される。
【０００５】
実施形態において、上記アルカノールアミンは、エタノールアミンである。
実施形態において、細菌の培養培地が開示される。
【０００６】
実施形態において、細菌は、サルモネラ属菌（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）または大腸菌属菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｐｐ．）である。
【０００７】
実施形態において、細菌は、サルモネラ・チフィリウム（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１５７、志賀毒素産生（Ｓｈｉｇａｔｏｘｉｎ）大腸菌または腸管出血性大腸菌である。
【０００８】
実施形態において、コバラミン化合物は、約０．００２Ｍより高い濃度で存在し、前記アルカノールアミンは、約０．００１ｍｇ／リットルより高い濃度で存在する。
【０００９】
さらなる一連の実施形態において、生物学的サンプルを培養するための方法が開示され、その方法は、生物学的に有効な濃度の：コバラミン化合物およびアルカノールアミンの存在下においてそのサンプルをインキュベートする工程を包含する。
【００１０】
実施形態において、上記コバラミン化合物は、コバラミン、メチルコバラミン、アデノスリコバラミン、ヒドロキソコバラミンおよびシアノコバラミンからなる群より選択される。
【００１１】
実施形態において、上記アルカノールアミンは、エタノールアミンである。
実施形態において、上記方法は、細菌を培養するための方法である。
【００１２】
実施形態において、上記細菌は、サルモネラ属菌または大腸菌属菌である。
実施形態において、上記細菌は、サルモネラ・チフィリウム、大腸菌１５７、志賀毒素産生大腸菌または腸管出血性大腸菌である。
【００１３】
実施形態において、アルカノールアミンは、約０．００２Ｍより高い濃度で存在し、前記コバラミン化合物は、約０．００１ｍｇ／リットルより高い濃度で存在する。
【００１４】
上記方法は、サンプル中のサルモネラ属菌または大腸菌属菌を検出するための方法である。
【００１５】
実施形態において、上記方法は、サンプル中のサルモネラ属菌または大腸菌属菌を検出するための方法であり、上記アルカノールアミンは、エタノールアミンである。
【００１６】
実施形態において、上記方法は、ＰＣＲ、レクチン結合、単純拡散、側方拡散、抗体結合、ラテラルフローまたはフロースルーの工程をさらに包含する。
【００１７】
さらなる一連の実施形態において、サルモネラ属菌および大腸菌属菌を培地中で優先的に培養する方法が開示され、その方法は、コバラミン化合物とアルカノールアミンとの生物学的に有効な組み合わせをその培地に添加する工程を包含する。
【００１８】
さらなる一連の実施形態において、培養培地に添加するための組成物が開示され、その組成物は：コバラミン化合物およびアルカノールアミンを含む。
【００１９】
実施形態において、上記コバラミン化合物は、コバラミン、メチルコバラミン、アデノスリコバラミン、ヒドロキソコバラミンおよびシアノコバラミンからなる群より選択される。
【００２０】
実施形態において、上記アルカノールアミンは、エタノールアミンである。
実施形態において、上記組成物は、細菌の増殖のための組成物である。
【００２１】
実施形態において、上記細菌は、サルモネラ属菌または大腸菌属菌である。
さらなる一連の実施形態において、生物学的サンプル中のサルモネラ・チフィリウム、大腸菌１５７、志賀毒素産生大腸菌および腸管出血性大腸菌を検出するための方法が開示され、その方法は、生物学的に有効な濃度の：エタノールアミン；ならびにメチルコバラミン、アデノスリコバラミン、ヒドロキソコバラミンおよびシアノコバラミンからなる群より選択されるコバラミン化合物の存在下においてそのサンプルを培養する工程を包含する。
【００２２】
本明細書の主題の特徴および利点は、添付の図面に図示されているような、以下の選択された実施形態の詳細な説明に照らすとより明らかになるだろう。理解されるように、開示されるおよび特許請求される主題は、すべてが請求項の範囲から逸脱することなく様々な点において改変が可能である。したがって、図面および説明は、限定的ではなく、本質的に例証としてみなされるべきであり、主題の完全な範囲は、請求項に示される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【発明を実施するための形態】
【００２４】
選択された実施形態の詳細な説明
用語
本開示において、単語「含む」は、その単語の前にある項目が含まれるが具体的に述べられていない項目は除外されないことを意味するために、非限定的な意味において使用される。ある実施形態が、ある特徴または特性を含むと示される場合、その実施形態の別の変化形において、その実施形態が、当該特徴からなり得るか、または当該特徴から本質的になり得ることも企図されることが理解されるだろう。不定冠詞「ａ」によるあるエレメントに対する言及は、文脈が、１つおよびただ１つのそのエレメントが存在することを明らかに要求していない限り、そのエレメントの２つ以上が存在する可能性を排除しない。
【００２５】
本開示において、終点による数値の範囲の列挙は、その範囲内に包含されるすべての数値（すべての自然数、すべての整数およびすべての分数の中間値を含む）を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４および５などを含む）。
【００２６】
本開示において、単数形「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容が明らかに他のことを指示していない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」を含む組成物に対する言及は、２つ以上の化合物の混合物を包含する。
【００２７】
本開示において、用語「または」は、その内容が明らかに他のことを指示していない限り、通常、「および／または」を含む意味で使用される。
【００２８】
本開示において、別段示されない限り、本明細書および請求項において使用される量または成分を表しているすべての数値、特性の測定値などは、すべての場合において用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、文脈に照らして反対のことまたは必然のことが示されていない限り、本開示に示される数値のパラメータは、本開示の教示を利用して当業者が得ようとする所望の特性に応じて、ならびに測定および定量の不正確さに照らして、変動し得る近似値である。請求項の範囲に対する均等論の適用を制限せずに、各数値パラメータは、報告されている有効数字の数値に照らして、および通常の丸めの手法を適用することによって、少なくとも解釈されるべきである。本開示の広範囲に示されている数値の範囲およびパラメータは、近似値であるにもかかわらず、特定の例に示されるそれらの数値の値は、これが、本開示の妥当性の限りならびに開示されるおよび特許請求される主題と従来技術との相違と一致する限りにおいてのみ広く理解される。
【００２９】
本開示において、用語「培地（ｍｅｄｉａ）」、「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」、「ブロス」、「培養培地（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）」、「培養培地（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）」、「培養ブロス」などのすべては、細菌もしくは微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）もしくは微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）または病原体の菌株もしくは種であり得る所望の微生物を培養するのに適した栄養分の混合物のことを指す。実施形態において、培地は、本明細書中に定義されるような任意のコア培地であり得るかまたはそれを含み得、粉末または濃縮物の形態で調製され得る。
【００３０】
実施形態において、培地は、ｐＨ緩衝剤を含む。１つの一連の実施形態において、ｐＨ緩衝剤は、リン酸二水素カリウムとリン酸水素二カリウムとの混合物であるが、別の生物学的に適合性の緩衝剤（例えば、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、３−モルホリノプロパン−１−スルホン酸；３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸；３−Ｎ−モルホリノプロパンスルホン酸；および４−モルホリンプロパンスルホン酸としても知られる）および好適な炭酸カルシウム緩衝剤）も好適であり得、それらは、その培地にとって所望のｐＨを達成するように当業者によって容易に選択され、実行される。
【００３１】
実施形態において、培地は、複数の成分を含み、所望の濃度の特定の成分を含む液体培地を提供するための所定の体積の水との混和に適した、通常、「粉末」、「濃縮物」、「粉末培地」、「培地粉末」、「培地濃縮物」、「濃縮培地」などとも呼ばれる粉末または濃縮物の形態で提供され得る。そのような粉末培地または濃縮培地は、完全であり得、これは、それが使用前に好適な水、通常、滅菌水への溶解だけが必要であることを意味する。あるいは、実施形態において、粉末培地または濃縮培地は、不完全であり得、これは、使用に適した完全培地を提供するために追加の成分を加える必要があることを意味する。実施形態において、粉末培地または濃縮培地は、細菌を培養する際に実際に使用するための培地を生成するための希釈に適した濃縮された形態において少なくとも部分的に水和した培地も包含する。本明細書中で使用される用語「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」または「培地（ｍｅｄｉａ）」は、文脈が他のことを要求しない限り、細菌および微生物を培養するのに適した濃度で成分を有する最終的な培地と、希釈に適した粉末培地または濃縮培地の両方を包含することが理解されるだろう。用語「ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣ」増菌培地または「ＡＥＭ」培地および類似の用語は、実施形態に係る培地のことを広く指すために使用される。
【００３２】
本開示において、用語「ビタミンＢ１２」および「コバラミン」は、それらの通常の意味を有し、その両方が、図１Ａに示される構造式を有するビタミンのことを指し、式中、Ｒは、実質的に正常なビタミンＢ１２活性または本明細書中で特許請求される主題の実施形態における使用に適した活性と適合する任意の基を表す。特定の実施形態において、前述の限定ではないが、中央のＣｏ２＋イオンに配位結合するリガンドＲは、Ｍｅ、ＯＨ、ＣＮ、５’−デオキシアデノシルであり得る。さらなる念のためであって限定するわけではないが、ビタミンＢ１２およびその生物学的に活性な誘導体に対する別名としては：Ｂ−１２、Ｂ１２、ビタミンＢ複合体（Ｂ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｖｉｔａｍｉｎ）、ベズミル（Ｂｅｄｕｍｉｌ）、コバラミン（Ｃｏｂａｌａｍｉｎ）、コバラミン（Ｃｏｂａｌａｍｉｎｅ）、コバミン（Ｃｏｂａｍｉｎ）、コバミン（Ｃｏｂａｍｉｎｅ）、ビタミンＢ複合体（Ｃｏｍｐｌｅｘｅ  Ｖｉｔａｍｉｎｉｑｕｅ  Ｂ）、シアノコバラミン（Ｃｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎ）、シアノコバラミン（Ｃｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎｅ）、シアノコバラミニウム（Ｃｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎｕｍ）、シコベミン（Ｃｙｃｏｂｅｍｉｎ）、ヒドロキソコバラミン（Ｈｙｄｒｏｘｏｃｏｂａｌａｍｉｎ）、ヒドロキソコバラミン（Ｈｙｄｒｏｘｏｃｏｂａｌａｍｉｎｅ）、ヒドロキソコバラミニウム（Ｈｙｄｒｏｘｏｃｏｂａｌａｍｉｎｕｍ）、ヒドロキソコベミン（Ｈｙｄｒｏｘｏｃｏｂｅｍｉｎｅ）、ヒドロキソコベミン（Ｈｙｄｒｏｘｏｃｏｂｅｍｉｎｅ）、ヒドロキソコバラミン（Ｉｄｒｏｓｓｏｃｏｂａｌａｍｉｎａ）、メチルコバラミン（Ｍｅｔｈｙｌｃｏｂａｌａｍｉｎ）、メチルコバラミン（Ｍｅｔｈｙｌｃｏｂａｌａｍｉｎｅ）、ビタズリン（Ｖｉｔａｄｕｒｉｎ）、ビタズリン（Ｖｉｔａｄｕｒｉｎｅ）、ビタミン（Ｖｉｔａｍｉｎａ）Ｂ１２、ビタミン（Ｖｉｔａｍｉｎｅ）Ｂ１２、リボフラビン、ビタミンＢ２；フラビン（Ｆｌａｖｉｎ）；フラビン（Ｆｌａｖｉｎｅ）；ラクトフラビン；リボフラビン；ビタミンＢ−２；およびビタミンＧが挙げられる。
【００３３】
同様に、用語「コバラミン化合物」は、ビタミンＢ１２またはコバラミンと実質的に生物学的に等価な化合物のすべてを包含すると理解される。例えば、限定するわけではないが、当業者は、実施形態において、ビタミンＢ１２またはコバラミン化合物に対する言及が、シアノコバラミン、メチルコバラミン、アデノシルコバラミン、ヒドロキシルコバラミンおよび他の機能的に等価な化学物質（それらのすべてが当業者によって容易に特定される）を包含すると理解されるべきであることを容易に理解するだろう。
【００３４】
実施形態において、コバラミンの種々の改変されたまたは結合体化された形態が、生物学的に有効であり得、そのすべてが、当業者によって容易に認識され、用語「コバラミン化合物」の中に含まれると理解されることがさらに理解されるだろう。広範な態様において、コバラミン化合物は、図１Ｂに図示される一般構造の任意の化合物を包含し得、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５は、互いに同じであっても異なってもよく、独立してＨであり得るか、または直鎖もしくは分枝鎖のアルキル、環式シクロアルキルであり得、種々の方法（そのすべてが当業者に容易に明らかである）で分枝され得るかもしくは置換され得、独立して、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８個またはそれ以上の炭素原子を含み得るかもしくは含む。特定の実施形態において前述の限定ではないが、中央のＣｏ２＋イオンに配位結合するリガンドＲ１５は、Ｍｅ、ＯＨ、ＣＮ、５’−デオキシアデノシルであり得る。
【００３５】
本開示において、用語「アルカノールアミン」（あるいは「アミノアルコール」とも呼ばれる）は、アルカン骨格上にアルコール基およびアミノ基を含む有機化合物のことを意味する。アルカノールアミンの非限定的な例としては、メタノールアミン、エタノールアミン、ジメチルエタンメタノールアミン、Ｎ−メチルエタノールアミン、ヘプタミノール、イソエタリン、ノルエピネフリン、プロパノールアミン、ペンタノールアミン、スフィンゴシン、式Ｎ（Ｈ）Ｒ１，Ｒ２を有するジ−アルカノールアミンおよび式ＮＲ１，Ｒ２，Ｒ３を有するトリ−アルキルアノールアミンが挙げられる。特定の実施形態において、アルカノールアミンは、エタノールアミンであり得るか、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個もしくはそれ以上の炭素原子を有する骨格を含み得、かつ２つ以上のアミン基もしくは２つ以上のヒドロキシル基もしくは２つ以上のアミン基および２つ以上のヒドロキシル基を含み得る。実施形態において、アルカノールアミンは、置換アルカノールアミンであり得る。特定の実施形態において、アルカノールアミンは、エタノールアミンであり得る。念のため、エタノールアミンに対する別名には、モノエタノールアミン、２−アミノエタノール、コラミン、アミノエタノール、２−ヒドロキシエチルアミン、グリシノール、オラミン（Ｏｌａｍｉｎｅ）、エチルオラミン（Ｅｔｈｙｌｏｌａｍｉｎｅ）、２−アミノ−１−エタノールが含まれる。特定の実施形態において、アルカノールアミンは、プロピレングリコール、モノイソプロパノール、エチレングリコール、２−１アミノアセトアルデヒド、アミノプロピオニトリル、エチレンジアミン、２−アミノプロパノール、１，２，ジアミノプロパン、Ｎ−メトリアミノエタノール（ｍｅｔｈｌｙａｍｉｎｏｅｔｈａｎｏｌ）、２−ヒドロキシエチルヒドラジン、３−アミノ−１−プロパノール、２−フルオロエタノール、グリコールアミド、２−アミノエタノール、（Ｒ）−（−）１，２，プロパンジオールからなる群より選択される。
【００３６】
本開示において、文脈が他のことを要求しない限り、アルカノールアミンもしくはコバラミン化合物を含む培地もしくは溶液、または「１つの」アルカノールアミンもしくはコバラミン化合物などに対する言及は、２つ、３つまたは複数のアルカノールアミンもしくはコバラミン化合物、またはアルカノールアミンとコバラミン化合物の両方を包含し得ることが理解されるだろう。したがって、限定ではなく例として、培地が１リットルあたり１グラムのアルカノールアミンを含むという詳述は、その１グラムが、種々のアルカノールアミンの混合物（その重量がまとめて合計１グラムの重量である）を含み得ることを企図している。同様におよびまた、限定ではなく例として、混合物が１グラムのコバラミン化合物を含むという規定は、その１グラムが、１つ以上のコバラミン化合物、例えば、メチルコバラミン、シアノコバラミンおよび／または他のコバラミン化合物の一部（そのまとめた量が合計１グラムである）を含むことを企図していると理解されるべきである。
【００３７】
本開示において、動詞「緩衝する」は、培養培地であり得る溶液のｐＨを、当業者に容易に明らかになる方法で所定の範囲内に安定化することを意味する。名詞「緩衝剤」は、溶液のｐＨを安定化するのに適した化学物質のことを意味する。
【００３８】
本開示において、用語「基本」または「コア」培地またはブロスとは、当業者が容易に認識するある特定の必要とされる基本成分を含む不完全なブロスのことを指し、その不完全なブロスの詳細な組成は、培養される微生物の増殖を可能にしつつも変動し得る。したがって、実施形態において、限定するわけではないが、コア培地は、塩、緩衝剤およびタンパク質エキスを含み得、実施形態において、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムおよびリン酸水素二ナトリウム、硫酸マグネシウムならびに塩化カルシウムを含み得る。実施形態において、１リットルのコア培地は、表１に示される一般的な処方を有し得るが、別の実施形態において、コア培地は、水、寒天、タンパク質、アミノ酸、カエゼイン（ｃａｅｓｅｉｎ）加水分解物、塩、脂質、炭水化物、塩、ミネラルおよびｐＨ緩衝剤のうちの１つ以上を含むかまたは含み得、エキス（例えば、肉エキス、酵母エキス、トリプトン、フィトン、ペプトンおよび麦芽エキス）を含み得、実施形態において、培地は、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）培地；低塩ＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母エキスおよび０．５％ＮａＣｌ）、ＳＯＢ培地（２％ペプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４）、ＳＯＣ培地（２％ペプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２０ｍＭグルコース）、Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ（３．２％ペプトン、２％酵母エキスおよび０．５％ＮａＣｌ）、２×ＴＹ培地（１．６％ペプトン、１％酵母エキスおよび０．５％ＮａＣｌ）、ＴｅｒｒｉｆｉｃＢｒｏｔｈ（ＴＢ）（１．２％ペプトン、２．４％酵母エキス、７２ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４および０．４％グリセロール）、ＬＢ  ＭｉｌｌｅｒブロスまたはＬＢ  Ｌｅｎｎｏｘブロス（１％ペプトン、０．５％酵母エキスおよび１％ＮａＣｌ）であり得るか、またはそれらを含み得る。特定の実施形態において、１つ以上の成分がコア培地から省かれることがあることが理解されるだろう。実施形態において、培地は、簡易培地、複合培地または限定培地であり得、強化培地であり得、多種多様の方法（そのすべてが当業者に容易に理解される）で添加され得る。広範な態様において、当業者は、培地が、１種類以上の微生物の増殖の補助に広く適した任意の組成を企図することを理解するだろう。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
表１において、ＸおよびＹは、グラムとして表される数値である。ＸおよびＹの各々は、独立して、０．０、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、１５．０、１６．０、１７．０、１８．０、１９．０もしくは１９．０超、または任意のその間の数であり得、特定の実施形態において、Ｘ〜Ｙの範囲は、ＸおよびＹのいずれかの値によって範囲が定められ得る。特定の実施形態において、酵母エキスは、種々の形態で使用され得、Ｂａｃｔｏ（商標）Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔに対する一連の代替物は、当業者によって容易に選択されることが理解されるだろう。例としては、特定の実施形態において、トリプトン、肉エキスおよび植物エキスが好適な代替物であり得、別の緩衝剤が使用され得、いくつかの実施形態では、マグネシウム、カルシウムおよびナトリウムの別の塩が使用され得、特定の実施形態では、マグネシウム、カルシウムおよびナトリウムに対する代替物が選択され得る。当業者は、基本培地に対する処方を特定の目的に適するように容易に適切に調整する。本明細書中に開示される増菌の有効性に適合する基本培地に対する任意およびすべての変化形が、特許請求される主題の範囲内に含まれるように意図されることが理解されるだろう。
【００４１】
表２は、コア培地の１つの可能性のある実施形態に対する処方を示している。
【００４２】
【表２】
2014520537.tif 000005
【００４３】
当業者は、所望の微生物の増殖が、当該微生物に適した選択された温度において最もよく促進されることを容易に理解するだろう。特定の実施形態において、培養工程は、約３９℃において行われ得、使用されるブロスは、試験のためのサンプルの接種の前にこの温度に予熱され得る。本明細書中に開示される実施形態において、培養工程は、３３℃〜４３℃の任意の温度において行われ得、約３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、もしくは３９℃、もしくは４０℃、もしくは４１℃、もしくは４２℃もしくは４３℃、または３３℃〜３４℃、３４℃〜３５℃、３５℃〜３６℃、３６℃〜３７℃、３７℃〜３８℃、３８℃〜３９℃、３９℃〜４０℃、４０℃〜４１℃、４１℃〜４２℃もしくは４２℃〜４３℃、または３４℃〜４３℃、もしくは３５℃〜４２℃、もしくは３６℃〜４２℃、３８℃〜４２℃、もしくは３９℃〜４１℃、もしくは３９℃〜４０℃、もしくは３８℃〜３９℃、もしくは３９℃〜４０℃、もしくは４０℃〜４１℃、もしくは４１℃〜４２℃もしくは４２℃〜４３℃の温度において行われ得る。
【００４４】
本開示において、培地の「強化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」または「添加（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）」とは、１つ以上の所望の微生物の増殖、繁殖または他の特徴を促進するための選択された成分（「サプリメント（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）」または集合的に「サプリメント（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）」とも呼ばれる）の付加のことを指し、「強化された」または「添加された」培地は、そのように強化された培地である。「強化液」または「添加液」または「サプリメント」または「付加溶液」とは、これらの追加の成分を含む溶液のことを指す。実施形態において、強化液に含まれる成分は、アルカノールアミンとコバラミン化合物との生物学的に有効な組み合わせを含み得、実施形態において、そのアルカノールアミンは、エタノールアミンであり得、コバラミン化合物は、コバラミン、メチルコバラミン、アデノスリコバラミン、ヒドロキソコバラミンおよびシアノコバラミンからなる群より選択され得る。特定の実施形態において、サプリメントは、サルモネラ属菌または大腸菌属菌の増殖を促進し得るか、または選択し得る。添加液または強化液は、そのような成分の最終的な所望の濃度より実質的に高い濃度の活性成分を含み得、レシピエント培地（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  ｍｅｄｉｕｍ）のコア成分の体積または濃度に対して望ましくないまたは過剰な変更なしに、そのレシピエント培地へのサプリメントの付加が行われ得ることが理解されるだろう。実施形態において、強化液は、約１ｍｇ／ｍｌのコバラミン化合物もしくは約０．１２５ｍｇ／ｍｌのコバラミン化合物または約１６．６Ｍアルカノールアミンを含み得るか、あるいは培地へのコバラミン化合物およびアルカノールアミンの付加が大腸菌属菌およびサルモネラ属菌の増殖を促進するのに生物学的に有効であるような相対濃度および絶対濃度でコバラミン化合物とアルカノールアミンの両方を含み得る。実施形態において、そのアルカノールアミンは、エタノールアミンであり得、コバラミン化合物は、コバラミンであり得る。
【００４５】
実施形態において、培地の強化は、約１リットルの培地に、約４ｍｌの０．１２５ｍｇ／ｍｌのコバラミン化合物溶液および約２ｍｌの１６．６Ｍアルカノールアミン溶液を加えることを含み得、実施形態において、アルカノールアミンは、エタノールアミンであり得、コバラミン化合物は、コバラミンであり得る。しかしながら、これらの量が特定の要件に適するように変動し得ることが当業者によって容易に理解されるだろうし、別の実施形態では、最終的な強化培地は、約１×１０−６、２×１０−６、３×１０−６、４×１０−６、５×１０−６、６×１０−６、７×１０−６、８×１０−６、９×１０−６、１×１０−５、２×１０−５、３×１０−５、４×１０−５、５×１０−５、６×１０−５、７×１０−５、８×１０−５、９×１０−５、１×１０−４、２×１０−４、３×１０−４、４×１０−４、５×１０−４、６×１０−４、７×１０−４、８×１０−４、９×１０−４、１×１０−３、２×１０−３、３×１０−３、４×１０−３、５×１０−３、６×１０−３、７×１０−３、８×１０−３、９×１０−３、１×１０−２、２×１０−２、３×１０−２、４×１０−２、５×１０−２、６×１０−２、７×１０−２、８×１０−２、９×１０−２、１×１０−１、２×１０−１、３×１０−１、４×１０−１、５×１０−１、６×１０−１、７×１０−１、８×１０−１、９×１０−１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１×１０２、２×１０２、３×１０２、４×１０２、５×１０２、６×１０２、７×１０２、８×１０２、９×１０２、１×１０３、２×１０３、３×１０３、４×１０３、５×１０３、６×１０３、７×１０３、８×１０３、９×１０３ｇ／リットルまたは９×１０３ｇ／リットル超のコバラミン化合物を含み得、特定の実施形態では、コバラミン化合物は、上限および下限が前述の任意の値によって定義される範囲内であり得、約１×１０−３ｇ／リットルであり得、特定の実施形態では、１×１０−４〜１×１０−１ｇ／リットルもしくは１×１０−４〜１ｇ／リットルであり得るか、または１×１０−４ｇ／リットル、１×１０−３ｇ／リットル、１×１０−２ｇ／リットルもしくは１×１０−１ｇ／リットル超であり得る。同様に、強化培地中のアルカノールアミンの濃度は、０．０２Ｍアルカノールアミンの近似値であり得るかまたはそれを超えることがあるが、特定の実施形態では、強化培地は、少なくとも約１×１０−６、２×１０−６、３×１０−６、４×１０−６、５×１０−６、６×１０−６、７×１０−６、８×１０−６、９×１０−６、１×１０−５、２×１０−５、３×１０−５、４×１０−５、５×１０−５、６×１０−５、７×１０−５、８×１０−５、９×１０−５、１×１０−４、２×１０−４、３×１０−４、４×１０−４、５×１０−４、６×１０−４、７×１０−４、８×１０−４、９×１０−４、１×１０−３、２×１０−３、３×１０−３、４×１０−３、５×１０−３、６×１０−３、７×１０−３、８×１０−３、９×１０−３、１×１０−２、２×１０−２、３×１０−２、４×１０−２、５×１０−２、６×１０−２、７×１０−２、８×１０−２、９×１０−２、１×１０−１、２×１０−１、３×１０−１、４×１０−１、５×１０−１、６×１０−１、７×１０−１、８×１０−１、９×１０−１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１×１０２、２×１０２、３×１０２、４×１０２、５×１０２、６×１０２、７×１０２、８×１０２、９×１０２、１×１０３、２×１０３、３×１０３、４×１０３、５×１０３、６×１０３、７×１０３、８×１０３、９×１０３またはそれらより多いエタノールアミンまたはその生物学的に有効な前駆体もしくは改変された形態を含み得、特定の実施形態では、２×１０−３〜２×１０−１Ｍアルカノールアミンを含み得、実施形態において、２×１０−３〜２Ｍアルカノールアミンを含み得、実施形態において、アルカノールアミンは、エタノールアミンであり得るかまたはエタノールアミンを含み得ることが当業者によって容易に理解されるだろう。実施形態に係る強化されたブロスの特定の実施形態において、アルカノールアミンは、約０．００１Ｍ、０．００２Ｍ、０．０１Ｍ、０．０２Ｍ、０．１Ｍまたは０．２Ｍを超える濃度であり得、コバラミン化合物は、約０．００１ｍｇ／ｍｌ、０．０１ｍｇ／ｍｌまたは０．１ｍｇ／ｍｌを超える濃度であり得る。
【００４６】
本開示において、「培養条件」は、微生物を培養するためのパラメータのことを意味し、それには、培養培地の化学組成および物理的特性、ならびに培養の温度、撹拌、封じ込めおよび持続時間ならびに微生物の増殖に影響し得る他の任意のパラメータが含まれる。したがって、特定の実施形態において、培養物は、３３℃〜４３℃の任意の温度において維持され得、約３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃もしくは４３℃、または３３℃〜３４℃、３４℃〜３５℃、３５℃〜３６℃、３６℃〜３７℃、３７℃〜３８℃、３８℃〜３９℃、３９℃〜４０℃、４０℃〜４１℃、４１℃〜４２℃もしくは４２℃〜４３℃、または３４℃〜４３℃もしくは３５℃〜４２℃もしくは３６℃〜４２℃、３８℃〜４２℃、もしくは３９℃〜４１℃、もしくは３９℃〜４０℃、もしくは３８℃〜３９℃、もしくは３９℃〜４０℃、もしくは４０℃〜４１℃もしくは４１℃〜４２℃、もしくは４２℃〜４３℃の温度または目的の細菌の増殖に適合する他の任意の温度範囲において行われ得る。特定の実施形態において、培養温度は、約３９℃であり得る。本明細書中に開示される培地を使用して微生物を培養するために４３℃超および３３℃未満の温度も使用され得ることが理解されるが、しかしながら、大腸菌属菌またはサルモネラ属菌の培養を望む場合、４３℃〜３３℃の範囲を外れる温度は、他の所望でない微生物の相対的により速い増殖をもたらし得るか、または目的の微生物の増殖の促進においてより有効でない場合があることが見出されている。培養培地のｐＨは、通常、７〜８に設定され、例えば、特定の実施形態において、約７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９もしくは９．０であるか、または前述の値のいずれか２つによって範囲が定められる範囲内であり得る。したがって、特定の実施形態において、培養培地のｐＨは、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８または７．９の下限および７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９または９．０の上限を有する範囲内である。１つの実施形態において、培地は、７．８〜８．４のｐＨを有し、別の実施形態において、培地は、７．９〜８．３のｐＨを有し、なおもさらなる実施形態において、培地は、８．０〜８．２のｐＨを有する。
【００４７】
ｐＨ７〜９の範囲を外れるｐＨも、実施形態において使用可能であり得るが、その培養の効率および選択性に悪影響があり得ることが理解されるだろう。培養物は、サンプルへの接種後の任意の所望の期間にわたって生育され得るが、実施形態において、通常の方法による試験を可能にするのにサルモネラ属菌または大腸菌属菌の含有量を十分に増菌するのに７時間の培養時間で十分であることが見出されている。しかしながら、別の実施形態では、特定の目的のために、培養時間は、それよりも長いかまたは短く、最長１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４時間もしくはそれ以上であるか、またはそれら未満である。当業者は、特定の要件を満たすのに適した培養期間を容易に選択する。
【００４８】
本開示において、「微生物」は、病原性のある細菌であり得る細菌のことを意味し、実施形態において、サルモネラ属菌または大腸菌属菌である。特定の実施形態において、サルモネラは、サルモネラ・チフィリウムであり、大腸菌は、大腸菌１５７、志賀毒素産生大腸菌（ＳＴＥＣ）または腸管出血性（Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒａｇｉｃ）大腸菌（ＥＨＥＣ）である。本開示において、微生物を「検出する」は、微生物または微生物の変化が実際に検出されるか否かに関係なく、生物学的サンプル中の微生物の有無または微生物の存在の変化を観察する任意のプロセスのことを意味する。換言すれば、微生物または微生物のレベルの変化についてサンプルを検査する行為は、その微生物が存在しないまたは感度レベル未満であると判定されるとしても「検出」である。検出は、定量的、半定量的または非定量的な観察であり得、１つ以上のコントロールサンプルとの比較に基づき得る。検出は、微生物の有無が評価される任意のサンプルに適用され得、特定の実施形態では、前述の一般性を限定しないが、サンプルは、任意の形態の生物学的材料であるかまたはそれを含み、すりつぶされたまたはすりつぶされていない、食肉、鳥肉、魚肉、海産物、野菜、果実、乳製品、乳、卵、パック詰め食品（ｐａｃｋａｇｅｄ  ｆｏｏｄ）、缶詰食品、瓶詰食品もしくは包装食品（ｗｒａｐｐｅｄ  ｆｏｏｄ）または拭き取りパッド（ｓｗｉｐｅ  ｐａｄｓ）もしくは拭い取り繊維（ｗｉｐｅｓ）を含み得る。種々の検出方法が可能であり、これらは、当業者によって容易に選択され、実行されることが理解されるだろう。特定の実施形態において、検出は、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、レクチン、単純拡散、側方拡散、免疫学的検出、ラテラルフローまたはフロースルーの方法を使用して行われ、そのような方法は、ＥＩＡおよびＥＬＩＳＡに基づくアッセイを含み、蛍光検出または比色検出の組み込みを含み得、免疫クロマトグラフィー技術を含み得、分子手法（例えば、ＤＮＡハイブリダイゼーションおよびＰＣＲベースのアッセイ）を組み込み得る。実施形態において、検出は、ＦｏｏｄＣｈｅｋ（商標）のＭＩＣＴ（商標）検査法および装置を使用して行われ、ここで、標的検体を殺滅するために、増菌された培養物のアリコートを加熱する。加熱されたサンプルを、病原体の抗原に結合する抗体に結合体化されたナノサイズの磁気粒子を含むサンプル／結合体パッドから構成されるラテラルフローカセットに充填する。その検査は、捕捉ゾーンと呼ばれる細いストリップに第２の抗体も含む。毛細管流動によって、充填された液体はサンプルパッドを通過して結合体パッドに達し、そこで標的細菌は、その抗体でコーティングされた粒子に結合する。この免疫複合体は、捕捉ゾーンに向かってテストストリップ中を流動する。結果は、捕捉ゾーンにおける磁気粒子の蓄積である。標的病原体が存在しない場合、免疫複合体は形成されず、粒子は捕捉ラインに蓄積せず、その検査結果は陰性である。さらに下流では、同様の形式であるが異なる試薬でストリップ状にされた（ｓｔｒｉｐｐｅｄ）コントロールラインによって、その検査が正しく行われたことおよびそれらの試薬がなおも活性であることが確かめられる。そのカセットは、低濃度の磁気粒子を検出することができる機器において読まれる。その検出器は、テストストリップが検出コイル群の下を通過するとき、そのテストストリップに沿って磁場の小さな変化を検知する。そのコイルは、特徴的なシグナルプロファイルが、テストラインまたはコントロールラインに結合した磁気粒子の存在によって生成されるように交互方向に巻かれる。その機器は、検出シグナルを、各個別のカセット上に貼付されたバーコードにコードされている正の閾値の値と比較し、次いで、陽性または陰性の結果を報告する。結果は、その機器の液晶ディスプレイスクリーン上に表示され、印刷されるか、または関連するコンピュータに移される。そのバーコードは、すべての解析パラメータに加えて、検査名、ロット番号および使用期限もコードし、それらは、検査結果とともに印刷される。サルモネラ属菌、大腸菌属菌および他の微生物に対する種々の認識されている検査手順は、当業者に広く知られており、そのような当業者は、そのような好適な検出方法を本明細書中に開示される培養物および培養方法と容易に組み合わせることが理解されるだろう。限定目的ではなく例証目的で、特定の実施形態において、可能性のある検出方法は、米国特許第６４８３３０３号；米国特許第６５９７１７６号；米国特許第６６０７９２２号；米国特許第６９２７５７０号；米国特許第７３２３１３９号（これらの開示は、その全体が参照により本明細書に援用され、場合により本明細書の実施形態においてまたは本明細書の実施形態とともに使用され得るＦｏｏｄＣｈｅｋ（商標）ＭＩＣＴ（商標）検査法をさらに説明する）のいずれかに開示されている主題を含むかまたは使用する。
【００４９】
本開示において、用語「生物学的に有効」は、所望の生物学的効果を有する化合物、化学物質または化合物もしくは化学物質の混合物もしくは組み合わせのことを意味する。したがって、アルカノールアミンとコバラミン化合物との生物学的に有効な混合物または組み合わせに対する言及は、その混合物が、所望の微生物の増殖を優先的に促進する所望の効果を有することを意味し、実施形態において、その微生物は、大腸菌属菌またはサルモネラ属菌のうちの１つ以上であり得る。
【００５０】
本開示において、用語「濃縮された」は、１つ以上の化学物質または成分に関して使用される場合、化学物質もしくは成分または化学物質もしくは成分の混合物をそれらの望ましい作用濃度より有意に高い濃度で含む調製物のことを意味する。したがって、例えば、０．０２Ｍの濃度で化学物質を使用することが望まれる場合、その化学物質の好適な濃縮溶液は、２０Ｍ溶液であり得、その濃縮液を例えば培養培地に加えることによって、その培養培地の他の成分の濃度を別途実質的に変更することなく、所望の作用濃度を得ることができる。
【００５１】
本開示において、特定の微生物「の増殖を優先的に促進する」および特定の微生物を「優先的に培養する」という用語および類似の用語は、他の微生物の増殖に優先して特定の微生物の増殖を促進または補助する培養条件に関して使用される。したがって、実施形態において、他の微生物に優先してサルモネラ属菌および大腸菌属菌の増殖および分裂を増加させる方法および培地が開示される。したがって、それらの用語は、特定の微生物の増殖が、サンプル中の他の微生物と比べて増強される（その他の微生物の増殖は阻害され得る）条件または増大し得る条件のことを示し、いずれの場合も、所望の促進される微生物の割合は、その培養物中の他の微生物と比べて上昇する。実施形態において、培養物の増殖は、もっぱらまたは実質的にもっぱら、目的の微生物の増殖であり得る。
【００５２】
本開示において、用語「サンプル」および「生物学的サンプル」は、その文脈と一致する、最も広い可能性のある同じ意味を有し、限定するわけではないが、通常、目的の１つ以上の微生物の存在について試験されることが望まれるもののことを指し、それが実際に任意の微生物または目的の任意の微生物を含むか否かおよびそれがサルモネラ属菌または大腸菌属菌を含むか否かに関係なく、そのような主題のすべてを包含する。実施形態において、サンプルは、ある片もしくは部分を採取することによって、または拭き取り、拭い取り、濾過、塗抹もしくは他の任意の好適な方法（それらのすべてが、当業者によって容易に理解され、実行され、選択される）を使用することによって、得られ得る。特定の実施形態において、サンプルは、食品の原料であるかもしくはそれを含むか、または植物もしくは動物材料であるかもしくはそれを含むか、あるいは食肉、海産物、魚肉、野菜、果実、サラダ、予め作られた食事、卵、乳製品、混合されたおよび混合されていない食品の原料、缶詰品、または他の任意の形態の新鮮な、生の、調理された、調理されていない、冷凍された、冷蔵された、すりつぶされた、切り刻まれた、缶詰された、パック詰めされた、加熱処理された、乾燥された、貯蔵された、精製されたもしくは保存された食材の何でもであるかもしくはそれらを含む。さらなる実施形態において、サンプルは、目的の微生物が存在するかを判定することが望まれる環境、表面、容器または場所から採取され得、例えば、限定するわけではないが、調理場表面、料理表面、食品貯蔵容器、食器、冷蔵庫、冷凍庫、陳列容器、包装材料、生きている植物および動物、ならびに使用者にとって興味深い可能性がある他の任意の環境、場所、表面または材料の何でもである。当業者は、実施形態において使用するための任意のサンプルを選択する、得るおよび取り扱うのに適した方法を理解し、実行する。選択された実施形態において、サンプルは、食肉、魚肉、海産物、野菜、卵または乳製品のサンプルである。
【００５３】
ある実施形態の培養培地：
ある実施形態において、生物学的に有効な濃度の：コバラミン化合物およびアルカノールアミンを含む培養培地が開示される。その実施形態の変化形において、その実施形態の他の変化形を限定しないが、コバラミン化合物は、コバラミン、メチルコバラミン、アデノスリコバラミン、ヒドロキソコバラミンおよびシアノコバラミンからなる群より選択される。その実施形態の特定の変化形において、アルカノールアミンは、エタノールアミンである。実施形態において、培養培地は、細菌の培養培地であり、実施形態において、細菌は、サルモネラ属菌および大腸菌属菌または前述のもののいずれかであるかまたはそれらを含む。その実施形態の変化形において、細菌は、サルモネラ・チフィリウム、大腸菌１５７、志賀毒素産生大腸菌もしくは腸管出血性大腸菌であるか、またはそれらを含み得る。
【００５４】
その実施形態の変化形において、コバラミン化合物は、０．００２Ｍより高い濃度で存在し、アルカノールアミンは、０．００１ｍｇ／リットルより高い濃度で存在する。一連の変化形において、大腸菌は、大腸菌１５７であり、サルモネラは、サルモネラ・チフィリウムであり、ある実施形態では、生物学的サンプルは、食品サンプル（それは食肉サンプルであり得、すりつぶされた食肉サンプルであり得る）である。
【００５５】
実施形態の例：
組成物の非限定的な例の組成および用途ならびに実施形態に係る培地の例の使用法は、以下のとおりである。
【００５６】
培地を調製するために、１４，２ｇの粉末のコア培地成分を１リットルの蒸留水に懸濁する。この例に係るコア培地の組成を表３に示す。最終的な容器に分注し、１２１℃で１５分間オートクレーブすることによって滅菌する。室温に冷却する。使用前に、１リットルあたり２ｍＬのエタノールアミン溶液（サプリメント１）および１リットルあたり０，５ｍＬのビタミンＢ１２（サプリメント２）を加える。十分混合する。これらのサプリメントは、表４にさらに例証されている。その培地のｐＨは、７．９〜８．５であり、目標値は約８．２である。
【００５７】
それらの成分に対する製造者の情報が提供されるが、これは、単に例としてであって、限定の意図はないことが理解されるだろう。当業者は、同じもしくは等価な材料または好適なグレードが一連の別の供給源から入手され得ることを容易に理解し、当業者は、表３に列挙されている成分に対する好適な代替物を容易に決定する。
【００５８】
【表３】
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【００５９】
【表４】
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【００６０】
品質管理の場合
性能：Ｓ．チフィリウム（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）  ＡＴＣＣ１４０２８および大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７  ＡＴＣＣ４３８９５を接種することによって調製された培地１リットルあたり１０ｍＬを試験する。両方が、好適なインキュベーション期間の後にその培地中で生育されるべきである。ネガティブコントロールは、いかなる接種材料もなしに、同じ培地を同じまたはそれより長い時間にわたってインキュベートすることである。そこには、細菌または微生物の明らかな増殖はないはずである。
【００６１】
前述の混合物（「基本」または「コア」ブロスまたは「培地」とも呼ばれる）が冷却されると、コアブロスを強化するためまたは添加するための組成物が加えられる（その組成物は、エタノールアミンおよびビタミンＢ１２を含む）。実際には、エタノールアミンおよびビタミンＢ１２は、使用の直前に培地に加えられ得る。そのビタミン溶液およびエタノールアミンは使用前に滅菌されるべきであることが当業者によって理解されるだろう。ある実施形態において、ビタミンＢ１２溶液は、水１ｍｌあたり１ｍｇのビタミンＢ１２（１ｍｇ／ｍＬ）を混合することによって調製され、濃縮されたエタノールアミンおよびビタミンＢ１２溶液は、使用前に濾過滅菌される。
【００６２】
当業者は、便宜上、基本ブロスまたは完全ブロスが濃縮物として調製され得、使用が望まれるときに滅菌水で希釈され得ることも容易に理解するだろう。
【００６３】
実施形態において、次いで、生物学的サンプルが、所望の体積の強化培地に加えられ、所望の温度で所望の期間にわたって維持される。検出される微生物が、サルモネラ属菌である場合、その実施形態のある例では、培養培地の温度は、約３８℃〜４０℃であり、さらなる変化形では、約３９℃である。実施形態において、その培養物は、任意の所望のまたは必要な撹拌とともに、任意の所望の時間にわたって、所望の温度で維持される。培養の目的が、目的の微生物の検出である場合、約７（７）時間またはそれ以上の培養時間が、ほとんどの試験手順にとって適切であり得るが、特定の変化形の実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０時間またはそれ以上の時間が、選択されるだろう。しかしながら、当業者は、特定の目的にとって必要であり得るかまたは望まれ得るように、培養条件の時間、撹拌および温度を容易に調整し得る。
【００６４】
ある実施形態に係る培養方法：
さらなる実施形態において、生物学的サンプルを培養するための方法が開示され、その方法は、そのサンプルを生物学的に有効な濃度の：コバラミン化合物およびアルカノールアミンの存在下においてインキュベートする工程を包含する。その実施形態の変化形において、その培地は、培養培地の実施形態に係る培地である。特定の実施形態において、コバラミン化合物は、コバラミン、メチルコバラミン、アデノスリコバラミン、ヒドロキソコバラミンおよびシアノコバラミンからなる群より選択され；実施形態において、アルカノールアミンは、エタノールアミンである。その実施形態に係る方法は、細菌を培養するための方法であり得る。その実施形態の変化形において、細菌は、サルモネラ属菌もしくは大腸菌属菌であるか、またはサルモネラ属菌と大腸菌属菌の両方を包含する。その実施形態の変化形において、細菌は、サルモネラ・チフィリウム、大腸菌１５７、志賀毒素産生大腸菌または腸管出血性大腸菌を包含する。その実施形態の変化形において、アルカノールアミンは、０．００２Ｍ、０．０２Ｍまたは０．２Ｍより高い濃度で存在し得、コバラミン化合物は、０．００１ｇ／リットル、０．０１ｇ／リットルまたは０．１ｇ／リットルより高い濃度で存在し得る。実施形態において、上記方法は、生物学的サンプル中のサルモネラ属菌もしくは大腸菌属菌またはその両方を検出するための方法である。
【００６５】
実施形態において、上記方法は、ＰＣＲ、レクチン結合、単純拡散、側方拡散、抗体結合、ラテラルフローまたはフロースルーの工程を包含する。
【００６６】
さらなる実施形態において、上記方法は、培地中でサルモネラ属菌および大腸菌属菌を優先的に培養するための方法であり、その方法は、培地に生物学的に有効な濃度のコバラミン化合物およびアルカノールアミンを添加する工程を包含する。
【００６７】
ある実施形態に係る培地サプリメント：
さらなる一連の実施形態において、培養培地に添加するための組成物が開示される。実施形態において、そのような組成物は、コバラミン化合物およびアルカノールアミンを含む。その実施形態の変化形において、限定するわけではないが、コバラミン化合物は、コバラミン、メチルコバラミン、アデノスリコバラミン、ヒドロキソコバラミンおよびシアノコバラミンからなる群より選択される。実施形態において、アルカノールアミンは、エタノールアミンである。実施形態において、その組成物は、細菌の増殖用である。実施形態において、その細菌は、サルモネラ属菌または大腸菌属菌であるかまたはそれらを含み、実施形態において、サルモネラ・チフィリウム、大腸菌１５７、志賀毒素産生大腸菌および腸管出血性大腸菌である。
【００６８】
ある実施形態に係る細菌を検出するための方法：
さらなる実施形態において、生物学的サンプル中の細菌を検出するための方法が開示される。実施形態において、他の実施形態を限定するわけではないが、その細菌は、大腸菌属菌およびサルモネラ属菌のいずれかまたはその両方であるかまたはそれらを含む。その実施形態の特定の変化形において、その方法は、エタノールアミンとコバラミン化合物との生物学的に有効な組み合わせの存在下においてサンプルを培養する工程を包含する。実施形態において、コバラミン化合物は、メチルコバラミン、アデノスリコバラミン、ヒドロキソコバラミンおよびシアノコバラミンからなる群より選択される。
【００６９】
その実施形態の変化形において、サンプル中のサルモネラ属菌または大腸菌属菌であり得る微生物を検出するための方法が開示される。その実施形態の変化形において、その方法は、順を追って：生物学的に有効な量のエタノールアミンおよびコバラミン化合物を含むある体積の培地中でサンプルを培養する工程；ならびにその培養物中の大腸菌属菌またはサルモネラ属菌を検出する工程を包含する。その実施形態において、エタノールアミンおよびビタミンＢ１２の濃度は、他の実施形態と一致して選択される。実施形態において、培養物は、微生物を検出する前に、目的の微生物の増殖を可能にするのに好適な温度および他の条件において好適な時間にわたってインキュベートされる。特定の実施形態において、検出工程は、ＰＣＲ、レクチン、単純拡散、側方拡散、免疫学的検出、ラテラルフローもしくはフロースルーの方法を使用することによって細菌を検出する工程を包含するか、または他の任意の好適な検出方法を使用し得る。
【００７０】
ある実施形態に係る培地中で微生物を好適な培養条件下で好適な時間にわたって培養した後、目的の微生物の存在が、当業者に容易に明らかな一連の方法のいずれか１つによって検出される。そのような方法としては、ＰＣＲ検出、リアルタイムＰＣＲ検出、レクチン結合、単純拡散、側方拡散、免疫学的検出、ラテラルフローまたはフロースルーの方法が挙げられるがこれらに限定されない。限定するわけではないが、免疫学的方法としては、免疫沈降、ブロッティング、イムノラジオアッセイもしくは磁気リガンドに関連する免疫沈降が挙げられるか、または他の任意の好適な免疫学的方法を含み得る。特定の実施形態において、培養物のアリコートは、検査前に微生物を殺滅するために加熱されるかまたは別途処理される。加熱されたサンプルは、目的の微生物に特徴的な抗原（ａｎｔｉｇｅｎｔｓ）または核酸配列の存在を識別する所望の方法によって処理される。
【００７１】
１つの実施形態において、培地は、ＦｏｏｄＣｈｅｋの専売の検査法とともに使用される。そのような方法は、本明細書中でＭＩＣＴと呼ばれる。広範には、ＭＩＣＴプロセスの１つの実施形態において、増菌された培養物のアリコートは、標的検体を殺滅するために加熱され得る。加熱されたサンプルは、病原体の抗原に結合する抗体に結合体化されたナノサイズの磁気粒子を含むサンプル／結合体パッドから構成されるラテラルフローカセットに充填される。その検査は、捕捉ゾーンと呼ばれる細いストリップに第２の抗体も含む。毛細管流動によって、充填された液体はサンプルパッドを通過して結合体パッドに達し、そこで標的細菌は、その抗体でコーティングされた粒子に結合する。この免疫複合体は、捕捉ゾーンに向かってテストストリップ中を流動する。結果は、捕捉ゾーンにおける磁気粒子の蓄積である。標的病原体が存在しない場合、免疫複合体は形成されず、粒子は捕捉ラインに蓄積せず、その検査結果は陰性である。さらに下流では、同様の形式であるが異なる試薬でストリップ状にされたコントロールラインによって、その検査が正しく行われたことおよびそれらの試薬がなおも活性であることが確かめられる。そのカセットは、低濃度の磁気粒子を検出することができる機器において読まれる。その検出器は、テストストリップが検出コイル群の下を通過するとき、そのテストストリップに沿って磁場の小さな変化を検知する。そのコイルは、特徴的なシグナルプロファイルが、テストラインまたはコントロールラインに結合した磁気粒子の存在によって生成されるように交互方向に巻かれる。その機器は、検出シグナルを、各個別のカセット上に貼付されたバーコードにコードされている正の閾値の値と比較し、次いで、陽性または陰性の結果を報告する。結果は、その機器の液晶ディスプレイスクリーン上に表示され、印刷されるか、または関連するコンピュータに移される。そのバーコードは、すべての解析パラメータに加えて、検査名、ロット番号および使用期限もコードし、それらは、検査結果とともに印刷される。ＭＩＣＴの方法および装置の実施形態は、米国特許第７３２３１３９号、米国特許第６９２７５７０号、米国特許第６６０７９２２号、米国特許第６５９７１７６号、米国特許第６５１８７４７号、米国特許第６４８３３０３号、米国特許第６０４６５８５号、米国特許第６２７５０３１号、米国特許第６４３７５６３号（これらの開示全体が参照により本明細書に援用される）の１つ以上に示されている。当業者は、多種多様の別の検査方法が使用され得ることを容易に理解するだろう。
【００７２】
実施形態に係る培地は、サルモネラの単離および同定のための標準的なプロトコルにおける少なくとも第１の増菌工程を置き換え得る。
【００７３】
実施形態において、約１ｃｆｕしか含まない可能性がある最初の接種材料からおよそ７時間のインキュベーションにおいて、いくつかの現行の検出法に必要な標的微生物レベル（すなわち約１０３〜１０４ｃｆｕ／ｍｌ）に達することが可能である。他の実施形態では、そのようなレベルに達することが可能であり得る。実施形態において、検出工程は、ＭＩＣＴプロセスを使用し得る。実施形態において、最初のサンプルは、食肉であり得、そのサンプルは、約３７５ｇの食肉であり得るが、しかしながら、当業者は、任意の好適なサイズおよび性質のサンプルが特定の目的のために選択され得ることを認識するだろう。
【実施例】
【００７４】
以下の実施例は、上記の実施形態の例証として提示されるものであって、特許請求される様々な実施形態の主題の範囲を限定しない。
【００７５】
表５は、サルモネラ細菌を培養するための培地（ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣ増菌培地とも呼ばれる）に対する処方を示している。
【００７６】
その実施形態に係る培地の組成および使用法は、以下のとおりである。１４，２ｇの粉末培地成分を１リットルの蒸留水に懸濁する。最終的な容器に分注し、１２１℃で１５分間オートクレーブすることによって滅菌する。室温に冷却する。使用前に、１リットルあたり２ｍＬのエタノールアミン溶液（サプリメント１）および１リットルあたり０，５ｍＬのビタミンＢ１２（サプリメント２）を加える。十分混合する。その培地のｐＨは、７．９〜８．５であり、目標値は約８．２である。
【００７７】
【表５】
2014520537.tif 000008
【００７８】
品質管理の場合
性能：Ｓ．チフィリウム  ＡＴＣＣ１４０２８および大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７  ＡＴＣＣ４３８９５を接種することによって調製された培地１リットルあたり１０ｍＬを試験する。両方が、好適なインキュベーション期間の後にその培地中で生育されるべきである。ネガティブコントロールは、いかなる接種材料もなしに、同じ培地を同じまたはそれより長い時間にわたってインキュベートすることである。そこには、細菌または微生物の明らかな増殖はないはずである。
【００７９】
上記混合物（「基本」または「コア」培地またはブロスとも呼ばれる）が冷却されたら、エタノールアミンおよびビタミンＢ１２が加えられる。一般に、そのエタノールアミンおよびビタミンＢ１２は、使用の直前に培地に加えられる。そのビタミン溶液およびエタノールアミンは使用前に滅菌されるべきであることが当業者によって理解されるだろう。実際には、そのビタミンＢ１２溶液は、水１ｍｌあたり１ｍｇ（１ｍｇ／ｍＬ）または１ｍｌあたり１ｍｇ（１ｍｇ／ｍｌ）を混合することによって調製され、そのエタノールアミンおよびビタミンＢ１２溶液は、濾過滅菌される。
【００８０】
当業者は、便宜上、基本ブロスまたは完全ブロスが濃縮物として調製され得、使用が望まれるときに滅菌水で希釈され得ることも容易に理解するだろう。
【００８１】
試験方法
３２５ｇのすりつぶされた複合牛肉サンプルに対するサンプルを調製する。
１．培地を恒温器内で一晩（１０〜２０時間）またはウォーターバス内で数時間保持することによって、基本培地を３９℃に予熱する。
２．増菌の直前に、２ｍＬのエタノールアミンおよび５００μＬの１ｍｇ／ｍＬのＢ１２ビタミン溶液を１Ｌの予熱された基本培地に加える。回転させ、反転させることによって、十分に混合する。
３．フィルター付きのストマッカーバッグにおいて、２部の予熱された培地（エタノールアミンとＢ１２ビタミンの両方を含む）を１部のサンプルに（例えば、６５０ｍＬの添加された培地を３２５ｇのすりつぶされた牛肉に）加える。
４．Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ（登録商標）３５００において１５０ｒｐｍで３０秒間、サンプルをストマッキング処理する。
５．バッグを緩く閉じ、増菌のためにサンプルをウォーターバスにおいて３９℃で７時間インキュベートする。多数のサンプルが解析される場合、サンプルバッグの間の水の温度が、インキュベーション時間を記録し始める前に３９℃に達していることを確かめる。有益かつ正確な結果を得るためには、増菌時間を正確に管理することが重要である。
６．７時間後、サンプルをウォーターバスから取りだし、内容物を再懸濁する。
【００８２】
サンプルが調製されたら、上に記載されたようなＦｏｏｄＣｈｅｋの解析プロセスを使用して、または任意の従来の試験方法を使用して、サルモネラ属菌または大腸菌属菌が検出され得る。１つの例において、サルモネラ属菌は、好適な選択的抗体を使用して検出され得る。適切な感度の検出方法を使用する実施形態において、感度は、１ｃｆｕ／３２５ｇのすりつぶされた牛肉であり得る。そのような適切な感度の検出方法は、選択的抗体の使用を含み得る。
【００８３】
さらなる実施例
補給物および試薬：蒸留／脱イオン滅菌水。任意の供給源；テトラチオネートブロス（ＴＴ）−Ｑｕｅｌａｂ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ；Ｒａｐｐａｐｏｒｔ−Ｖａｓｓｉｌｉａｄｉｓ大豆ペプトンブロス（ＲＶＳ）−Ｏｘｏｉｄ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｒａｐｐａｐｏｒｔ−Ｖａｓｓｉｌｉａｄｉｓブロス（ＲＶ）；キシロースリジンＴｅｒｇｉｔｏｌ−４寒天（ＸＬＴ４）−Ｄｉｆｃｏ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ；ＢＧスルファ寒天（ＢＧＳ）−Ｄｉｆｃｏ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ；キシロースリジンデオキシコレート寒天（ＸＬＤ）−Ｑｕｅｌａｂ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ；Ｈｅｋｔｏｅｎ  Ｅｎｔｅｒｉｃ寒天（ＨＥ）−Ｑｕｅｌａｂ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ；トリプルシュガーアイアン（ＴＳＩ）−Ｄｉｆｃｏ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ；リジン鉄寒天（ＬＩＡ）−ＢＢＬ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ抗血清−Ｄｉｆｃｏ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ；腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃａｅ）の識別用のＡＰＩ２０Ｅキット−Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ，Ｍａｒｃｙ−Ｌ’ｅｔｏｉｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ；プラスチック接種針および１０μＬ白金耳（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  ｌｏｏｐｓ）。任意の供給源；滅菌ピペット，１０ｍＬ−任意の供給源。
【００８４】
装置：３９℃±０．５を提供することができる据置型恒温器Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（商標）（ＶＷＲ，ＵＳＡ）または等価物；３５℃±２．０を提供することができる据置型恒温器，モデル１５５５（ＶＷＲ，ＵＳＡ）または等価物；３９℃±０．５を提供することができるウォーターバス（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ）または等価物；４２℃±０．２を提供することができるサーモスタット制御式の循環式ウォーターバス（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ／Ｂｌｕｅ，ＵＳＡ）または等価物；４３℃±０．２を提供することができるサーモスタット制御式の循環式ウォーターバス（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ／Ｂｌｕｅ，ＵＳＡ）または等価物；５００μＬを正確に分注することができるマイクロピペット−任意の供給源；２５、１００および３２５ｇのサンプルを計量するための上皿天秤−任意の供給源；強化ブロス中で食品サンプルを十分混合するためのストマッカー−Ｓｅｗａｒｄモデル３５００（Ｓｅｗａｒｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）または等価物；強化ブロス中で食品サンプルを十分混合するためのストマッカー−Ｓｅｗａｒｄ  Ｍｏｄｅｌ  ４００（Ｓｅｗａｒｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）または等価物；ボルテックスミキサー（ＶＷＲ，ＵＳＡ）。
【００８５】
培地の一般的な調製法：ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣを調製するために、１４．２ｇの粉末培地を１リットルの蒸留水に懸濁し、十分混合する。最終的な容器に分注し、１２１℃で１５分間オートクレーブすることによって滅菌する。室温に冷却する。場合よっては、調製の直後に培地を使用する場合、その培地をオートクレーブする必要はないことが見出されているが、この場合、その培地を調製するために滅菌水を使用することが好ましい。使用前に、２ｍＬのサプリメント１（１６．６Ｍエタノールアミン）および０，５ｍＬのサプリメント２（１ｍｇ／ｍｌビタミンＢ１２）を１リットルのコア培地に無菌状態において加える。
【００８６】
製造者の指示書に従って他の培地を調製する。
さらなる材料および試薬：５％のヒツジ血液を含むＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ大豆寒天プレート（血液寒天）−ＢＢＬ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ；ＴＴブロス（ＴＴ  Ｈａｊｎａ）−Ｑｕｅｌａｂ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ；トリプトン大豆寒天（ＴＳＡ）−Ｑｕｅｌａｂ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ；トリプトン大豆ブロス（ＴＳＢ）−Ｏｘｏｉｄ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ；プレートカウント寒天（ＰＣＡ）；リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）−Ｏｘｏｉｄ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ；改変レインボー寒天（ｍＲＢＡ）−Ｂｉｏｌｏｇ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ；亜硫酸ビスマス寒天（ＢＳ）−Ｄｉｆｃｏ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ；ラクトースブロス−Ｑｕｅｌａｂ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ；緩衝ペプトン水（ＢＰＷ）−Ｆｌｕｋａ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ；５５℃±０．２を提供することができる等温ウォーターバス（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）または等価物。公定法（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ）を行うために必要な材料、方法および試薬は、ＵＳＤＡ／ＦＳＩＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒｅｖ．＃４，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｓｉｓ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ＰＤＦ／ＭＬＧ＿４＿０５．ｐｄｆにおけるＩｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｆｒｏｍ，ｍｅａｔ，ｐｏｕｌｔｒｙ  ａｎｄ  ｅｇｇｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｓという標題のＣｈａｐｔｅｒ４；ＵＳＤＡ／ＦＳＩＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒｅｖ．＃１，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｓｉｓ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ＰＤＦ／Ｍｌｑ＿５Ｂ＿０１．ｐｄｆ  におけるＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−Ｏ１５７  Ｓｈｉｇａ−ｔｏｘｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）ｆｒｏｍ  Ｍｅａｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓという標題のＣｈａｐｔｅｒ５Ｂ；ＦＤＡ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１１  Ｖｅｒｓｉｏｎ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／Ｆｏｏｄ／ＳｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈ／ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｔｈｏｄｓ／ＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｎａｌｙｔｉｃａｌＭａｎｕａｌＢＡＭ／ｕｃｍ０７０１４９．ｈｔｍにおけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａという標題のＣｈａｐｔｅｒ５にさらに詳述されている。
【００８７】
サンプル調製：サンプル調製は、そのサンプルのタイプおよびサイズに依存する。したがって、サンプルを調製するプロトコルは、それらの状態を反映するように選択される。選択されたサンプルタイプに対する調製方法を下記でさらに説明する。
【００８８】
解析：サンプルの解析は、そのサンプルのタイプに依存する。したがって、そのサンプルを調製するプロトコルは、サンプルタイプを反映するように選択されるべきである。
【００８９】
解釈および試験結果報告：結果は、ＵＳ  ＦＤＡ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｈａｐｔｅｒ５ならびにＵＳＤＡ  ＦＳＩＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ  Ｃｈａｐｔｅｒ４．０５および５Ｂ．０１に従って確かめられる。これらの両方が、当業者によって十分に理解され、法律が許す限り、それらの全体が参照により本明細書中に援用される。
【００９０】
内部妥当性確認研究：
以下の妥当性確認研究を行った：
１．ロバストネス研究：
２つのパラメータ：温度およびインキュベーション時間を改変する（ｍｏｄｆｙｉｎｇ）効果を評価するロバストネス研究を行った。そのロバストネスの変数およびそれらのそれぞれの範囲を表６に示す。
【００９１】
方法：選択寒天プレート上での３つの純粋培養物の増殖の解析によって、各試験範囲条件を評価した。サルモネラ属菌の代表としてＳ．チフィリウム  ＡＴＣＣ１４０２８を選択し、ＸＬＴ４およびＢＧＳ寒天プレートにおける結果を解析した。ＳＴＥＣとして大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７  ＡＴＣＣ４３８９５を選択し、改変レインボー寒天上で解析し、非標的菌株としてＥ．フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）  ＡＴＣＣ１９４３３を選択し、ＸＬＴ４、ＢＧＳおよび改変レインボー寒天上で解析した。
【００９２】
上記３つのパラメータのために、上記菌株を、５％ヒツジ血液を含むＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ大豆寒天（血液寒天とも呼ばれる）上に画線し、３５℃±１℃で一晩インキュベートした。標的菌株のいくつかのコロニーを、３５℃±１℃において６〜７時間、９ｍＬのＴＳＢに移した。各培養物を新鮮ＴＳＢにおいて１：１０希釈し、同じ温度において一晩インキュベートした。次いで、低接種レベル（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ  ｌｅｖｅｌ）（１サンプルあたり０．５ｃｆｕ）が得られるようにこれらの培養物をＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣ  ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣブロスにおいて希釈した。その培養物を、評価されるパラメータ以外は標準的なプロトコルを使用して生育した。
【００９３】
非標的菌株については、接種レベルが１０倍高いことを除いては同じ培養方法を使用した。各標的の１０反復および非標的の５反復を、各パラメータについて試験した。
【００９４】
結果：結果に対して行われたＰＯＤ（検出確率）解析によると、有意差は観察されなかった（表６）。最も端の条件のｄＰＯＤ（検出確率の差）の信頼区間は、ゼロを含むので、各パラメータ間に統計的有意差はない。ゆえに、試験される温度および時間の小さな変更は、ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣがＳ．チフィリウム  ＡＴＣＣ１４０２８および大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７  ＡＴＣＣ４３８９５を回収する能力に有意に影響しなかった。いずれの場合も、ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣサンプル中に非標的菌株Ｅ．フェカリス  ＡＴＣＣ１９４３３の存在は検出されなかった（データ示さず）。
【００９５】
【表６】
2014520537.tif 000009
【００９６】
２．包括的研究（Ｉｎｃｌｕｓｉｖｉｔｙ  Ｓｔｕｄｉｅｓ）：
上記ブロスがサルモネラ属菌およびＳＴＥＣ菌株を増菌する能力を試験するために、サルモネラのほとんどすべての種（ラクトース陽性菌株を含む）に相当する１０９（１０９）個のサルモネラ菌株（表７）およびＳＴＥＣ種（「ビッグシックス」および大腸菌Ｏ１５７ファミリーに属する菌株）に相当する５０個の志賀毒素産生大腸菌菌株（ＳＴＥＣ）（表８）を解析した。
【００９７】
方法：すべてのサルモネラ属菌およびＳＴＥＣ菌株を血液寒天上に画線し、３５℃において一晩インキュベートした。いくつかのコロニーを、３５℃において６〜７時間、１０ｍＬのＴＳＢに移した。各培養物を新鮮ＴＳＢにおいて１：１０希釈し、同じ温度において一晩インキュベートした。次いで、ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣブロスに低濃度（１．０〜２０ＣＦＵ／ｍＬ）の菌株を接種するためにその培養物を希釈した。各菌株を３つ組で培養した。その培養物を３９±０．５℃においてウォーターバス内で７時間生育した。１０μＬの各サンプルをサルモネラ選択寒天プレート（ＸＬＴ４、ＢＧＳ、ＸＬＤおよびＨＥ）上に画線することによって、サルモネラ菌株の増殖を解析した。ＳＴＥＣ菌株の場合、改変レインボー寒天プレート上に画線することによって、増殖を確かめた。
【００９８】
結果：サルモネラ属菌およびＳＴＥＣ菌株に対する包括的研究の結果をそれぞれ表７および８に要約する。ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣブロスにおいて試験された１１０個のサルモネラの菌株のうち、６つが遅い増殖を示し、３つは生育しなかった。全体で、１０９個のうち１０６個（９７．２％）のサルモネラ菌株が、ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣブロスにおいて生育し、特定の選択寒天プレート上で識別することができた。ＳＴＥＣ種に関しては、試験された５０個（１００％）の菌株が、ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣブロスにおいて生育し、選択寒天プレート上で識別することができたが、２つは、その他と比べて遅い増殖を示す。ゆえに、全体的には、標的菌株の９８．１％が、増菌用に使用された条件において識別された。
【００９９】
【表７−１】
2014520537.tif 000010
【０１００】
【表７−２】
2014520537.tif 000011
【０１０１】
【表７−３】
2014520537.tif 000012
【０１０２】
【表８−１】
2014520537.tif 000013
【０１０３】
【表８−２】
2014520537.tif 000014
【０１０４】
３．排他的研究（Ｅｘｃｌｕｓｉｖｉｔｙ  Ｓｔｕｄｉｅｓ）：
サルモネラおよび大腸菌の遺伝的近縁種として選択された３１（３１）個の非標的菌株ならびに同じ環境に見られた種をＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣ増菌培地において試験した。それらは、細菌および酵母の異なる２５個の属である。
【０１０５】
方法：各非標的菌株を血液寒天上に画線し、３５℃において一晩インキュベートした。次いで、各非標的菌株をそれらの最適条件において培養した。各細菌懸濁液を希釈して、標的菌株に対して使用される平均濃度より１０倍高い平均濃度でＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣブロスに接種した。この工程を３つ組で行った。そのＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣブロス中での増殖を３９±０．５℃において、ウォーターバス内で７時間および恒温器内で１８時間試験した。次いで、それらをサルモネラおよびＳＴＥＣに対する特定の選択寒天プレート上で解析することにより、それらが生育しているか、およびＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣブロスが何らかの理由で、結果の誤解釈を招き得る表現型を変化させたかを検証した。
【０１０６】
結果：排他性の結果を表９に要約する。ほとんどの非標的菌株は、選択寒天プレート上で生育しなかった。増殖が観察できたものはいずれも、サルモネラもしくはＳＴＥＣ菌株に類似し得る表現型を示さなかったか、または選択寒天プレート上の結果の誤解釈を招き得る表現型を示さなかった。
【０１０７】
【表９】
2014520537.tif 000015
【０１０８】
４．サンプル調製：種々の食品のすべてを、実験を行っている場所の近くの小売店から購入した。
【０１０９】
５．食品の試験：マトリックス研究（５つのタイプの食品を使用する）を行うことにより、標準的な増菌と比較して、サルモネラおよびＳＴＥＣ菌株をＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣブロスから回収する能力を評価した。試験される食品のタイプに応じて、種々の増菌条件を使用した。上記食品は、２つの理由により選択された：１）関連する形態の食中毒または汚染の発生における影響の頻繁さおよび２）標的菌株によって補助されるストレスタイプ（低温および熱ストレス）の機能。
【０１１０】
方法：
全液卵：
サンプル調製：Ｓ．エンテリティディス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）（鶏手羽肉から単離されたもの）をＴＳＢＡ上に画線し、３５℃において一晩インキュベートした。いくつかのコロニーを、３５℃において６〜７時間、９ｍＬのＴＳＢに移した。その培養物を新鮮ＴＳＢにおいて１：１０希釈し、同じ温度において一晩インキュベートした。接種前に、１．５ｍＬの培養物を、ウォーターバス内で５５℃において２分間加熱処理することにより、接種材料の５０〜８０％の損傷を行った。選択および非選択寒天プレート上での増殖を比較することによって、損傷の程度を測定した。接種材料に対して得られた損傷の程度は、６３％だった。５５００ｍＬの全液卵に、部分的陽性（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）の結果（１ＣＦＵ／１００ｇ）が得られるレベルで接種し、手で振り混ぜることによって均質化した。１５００ｍＬの全液卵を接種しないままにした。その２つの部分を４℃において４８時間貯蔵することにより、細菌をその食品中で安定化させた。安定化の期間の後の汚染レベルを推定するためにＭＰＮ（最確数）解析を準備した。接種部分を、２セットの２０個の１００ｇのサンプルに分割し、非接種部分をフィルター付きのストマッカーバッグにおいて１０個の１００ｇのサンプルに分割した。
【０１１１】
ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣ増菌：１セット（２０個の接種サンプルおよび５個の非接種サンプル）を、３００ｍＬの予熱されたＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣブロスとともに３０秒間ストマッキング処理し、ウォーターバス内で３９±０．５℃において７時間インキュベートした。次いで、そのサンプルを、ブリリアントグリーンサルファ寒天（ＢＧＳ）およびキシロースリジンＴｅｒｇｉｔｏｌ４寒天（ＸＬＴ４）上に直接画線し、すべての推定コロニーを、サルモネラに対するＵＳＤＡ／ＦＳＩＳ参照プロトコルに従って、生化学的手順および血清学的手順によって確認した。
【０１１２】
ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣ増菌の確認：増菌されたＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣサンプルから０．５ｍｌを１０ｍＬのテトラチオネート（Ｈａｊｎａ）ブロスに移し、０．１ｍｌを１０ｍＬの改変Ｒａｐｐａｐｏｒｔ−Ｖａｓｓｉｌｉａｄｉｓ大豆ブロス（ＲＶＳ）に移し、４２±０．５℃において２２〜２４時間インキュベートした。次いで、それらをＢＧＳおよびＸＬＴ４に画線し、３５℃において１８〜２４時間インキュベートした。コロニーが小さいかまたは肉眼で見えない場合、それらをさらに１８〜２４時間、再インキュベートした。プレート１枚あたり最大３つの典型的なコロニーを拾い、ＴＳＩおよびＬＩＡの斜面に移した。ＭＬＧ４．０５におけるような生化学的手順および血清学的手順を行うことにより、陽性のサンプルを確かめた。
【０１１３】
公定法による増菌：第２のセット（２０個の接種サンプルおよび５個の非接種サンプル）を、３５±２．０℃において１８〜２４時間、９００ｍＬの緩衝ペプトン水において増菌し、次いで、サルモネラに対するＵＳＤＡ／ＦＳＩＳ参照プロトコルに従って処理した。ＭＰＮサンプルを同じ方法で処理した。すべての推定陽性サンプルを、ＵＳＤＡ／ＦＳＩＳが推奨する生化学的および血清学的同定にまわした。
【０１１４】
未加工冷凍ホタテガイ：
サンプル調製：Ｓ．セントポール（Ｓ．ｓａｉｎｔｐａｕｌ）を血液寒天上に画線し、３５℃において一晩インキュベートした。いくつかのコロニーを、３５℃において６〜７時間、９ｍＬのＴＳＢに移した。その培養物を新鮮ＴＳＢにおいて１：１０希釈し、同じ温度において一晩インキュベートした。１７００グラム（１７００ｇ）の未加工冷凍ホタテガイに、部分的陽性の結果（１．２５ＣＦＵ／２５ｇ）が得られるレベルで接種し、手で振り混ぜることによって均質化した。３００グラム（３００ｇ）の未加工冷凍ホタテガイを接種しないままにした。その２つの部分をマイナス２０℃において２週間貯蔵することにより、細菌をその食品中で安定化させた。安定化の期間の後の汚染のレベルを推定するためにＭＰＮ（最確数）解析を準備した。接種部分を、２セットの２０個の２５ｇのサンプルに分割し、非接種部分を２セットの５個の２５ｇのサンプルに分割した。
【０１１５】
ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣ増菌：１セット（２０個の接種サンプルおよび５個の非接種サンプル）を、５０ｍＬの予熱されたＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣブロスとともに３０秒間ストマッキング処理し、ウォーターバス内で３９±０．５℃において７時間インキュベートした。次いで、そのサンプルを、キシロースリジンデオキシコレート寒天（ＸＬＤ）およびＨｅｋｔｏｅｎ  Ｅｎｔｅｒｉｃ寒天（ＨＥ）上に直接画線し、すべての推定コロニーを、サルモネラに対するＢＡＭ５参照プロトコルに従って、生化学的手順および血清学的手順によって確認した。
【０１１６】
ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣ増菌の確認：増菌されたＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣサンプルから１．０ｍｌを１０ｍＬのテトラチオネートブロスに移し、０．１ｍｌを１０ｍＬのＲａｐｐａｐｏｒｔ−Ｖａｓｓｉｌｉａｄｉｓブロス（ＲＶ）に移し、それぞれ３５±２℃および４２±０．５℃において２２〜２４時間インキュベートした。次いで、それらをＢａｍ５におけるように選択寒天プレート上に画線し、サルモネラに対するＢＡＭ５参照プロトコルに従って、生化学的手順および血清学的手順によって推定陽性を確かめた。
【０１１７】
公定法による増菌：第２のセットのサンプル（２０個の接種および５個の非接種）を、３５±２℃において２４±２時間インキュベートし、サルモネラに対するＢＡＭ５公定法におけるように処理した２２５ｍＬのラクトースブロスにおいて増菌した。すべての推定陽性サンプルを、ＦＤＡが推奨するような生化学的および血清学的同定にまわした。
【０１１８】
生のすりつぶされた鶏肉：
サンプル調製：自然に汚染された生のすりつぶされた鶏肉を使用した。部分的（低レベル）陽性の結果を得るために、自然に汚染されたすりつぶされた鶏肉を、汚染されていない製品と慎重に混合することにより、均一性が保証された（１３００グラム（１３００ｇ）を調製した）。高レベルの部分のために、２５０グラム（２５０ｇ）の自然に汚染されたすりつぶされた鶏肉を希釈しないままにした。ＭＰＮ解析を、すりつぶされた鶏肉におけるサルモネラのレベルを測定するように設定した。低レベル汚染部分を２セットの２０個の２５ｇのサンプルに分割し、高レベル汚染部分を１０個の２５ｇのサンプルに分割した。そのすべてのサンプルを、フィルター付きのストマッカーバッグに入れた。
【０１１９】
ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣ増菌：１セット（２０個の低レベルサンプルおよび５個の高レベルサンプル）を、５０ｍＬの予熱されたＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣブロスとともに３０秒間ストマッキング処理し、恒温器内で３９±０．５℃において２０時間インキュベートした。次いで、それらを、ＢＧＳおよびＸＬＴ４上に画線し、３５℃において１８〜２４時間インキュベートし、すべての推定陽性コロニーを、サルモネラに対するＵＳＤＡ／ＦＳＩＳ参照プロトコルに従って、生化学的手順および血清学的手順によって確認した。
【０１２０】
ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣ増菌の確認：増菌されたＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣサンプルから、０．５ｍｌを１０ｍＬのテトラチオネート（Ｈａｊｎａ）ブロスに移し、０．１ｍｌを１０ｍＬの改変Ｒａｐｐａｐｏｒｔ−Ｖａｓｓｉｌｉａｄｉｓ大豆ブロス（ＲＶＳ）に移し、４２±０．５℃において２２〜２４時間インキュベートした。次いで、それらをＢＧＳおよびＸＬＴ４に画線し、３５℃において１８〜２４時間インキュベートした。コロニーが小さいかまたは肉眼で見えない場合、それらをさらに１８〜２４時間、再インキュベートした。プレート１枚あたり最大３つの典型的なコロニーを拾い、ＴＳＩおよびＬＩＡの斜面に移した。ＭＬＧ４．０５におけるような生化学的手順および血清学的手順を行うことにより、陽性のサンプルを確かめた。
【０１２１】
公定法による増菌：第２のセットのサンプル（２０個の接種サンプルおよび５個の非接種サンプル）を、３５±２．０℃において１８〜２４時間、９００ｍＬの緩衝ペプトン水において増菌し、次いで、サルモネラに対するＵＳＤＡ／ＦＳＩＳ参照プロトコルに従って処理した。ＭＰＮサンプルを同じ方法で処理した。すべての推定陽性サンプルを、ＵＳＤＡ／ＦＳＩＳが推奨するような生化学的および血清学的同定にまわした。
【０１２２】
スプラウト：
サンプル調製：Ｓ．モンテビデオ（Ｓ．ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ）を血液寒天上に画線し、３５℃において一晩インキュベートした。いくつかのコロニーを３５℃において６〜７時間、９ｍＬのＴＳＢに移した。その培養物を新鮮ＴＳＢにおいて１：１０希釈し、同じ温度において一晩インキュベートした。１５００グラム（１５００ｇ）のスプラウトを、部分的陽性の結果（１．０ＣＦＵ／２５ｇ）が得られるレベルで接種し、手で振り混ぜることによって慎重に均質化した。４００グラム（４００ｇ）のスプラウトを接種しないままにした。その２つの部分を４℃において４８時間貯蔵することにより、細菌をその食品中で安定化させた。安定化の期間の後の汚染のレベルを推定するためにＭＰＮ解析を準備した。接種された部分を、２セットの２０個の２５ｇのサンプルに分割し、接種されなかった部分を２セットの５個の２５ｇのサンプルに分割した。
【０１２３】
ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣ増菌：１つのセット（２０個の接種サンプルおよび５個の非接種サンプル）を、１５０ｍＬの予熱されたＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣブロスとともに３０秒間ストマッキング処理し、ウォーターバス内で３９±０．５℃において７時間インキュベートした。増菌されたＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣサンプルから、１．０ｍｌを１０ｍＬのテトラチオネートブロスに移し、０．１ｍｌを１０ｍＬのＲａｐｐａｐｏｒｔ−Ｖａｓｓｉｌｉａｄｉｓブロス（ＲＶ）に移し、それぞれ４３±０．２℃および４２±０．２℃において１８時間インキュベートした（なぜなら、スプラウトは、高微生物負荷量を有すると考えられるからである）。次いで、それらをＢａｍ５におけるように選択寒天プレート上に画線し、サルモネラに対するＢＡＭ５参照プロトコルに従って、生化学的手順および血清学的手順によって推定陽性を確認した。
【０１２４】
ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣ増菌の確認：確認のために、ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣサンプルの２回増菌物（ｄｏｕｂｌｅ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）をさらに６時間、合計２４時間インキュベーションしなおした（ＦＤＡが推奨するように）。次いで、それらをＢａｍ５におけるような選択寒天プレート上に画線し、サルモネラに対するＢＡＭ５参照プロトコルに従って、生化学的手順および血清学的手順によって推定陽性を確認した。
【０１２５】
公定法による増菌：第２のセットのサンプル（２０個の接種および５個の非接種）を、３５±２℃において２４±２時間インキュベートし、サルモネラに対するＢＡＭ５公定法におけるように処理した２２５ｍＬのラクトースブロスにおいて増菌した。すべての推定陽性サンプルを、ＦＤＡが推奨する生化学的および血清学的同定にまわした。
【０１２６】
結果：比較方法研究（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｓｔｕｄｙ）のすべての結果を表１０、１１に要約する［全液卵において、３９℃のウォーターバスでの７時間の増菌のためにＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣブロスを使用したとき、２０個のサンプルのうち１０個が陽性と検出された。ＵＳＤＡ／ＦＳＩＳ参照プロトコルに従ったＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣ増菌サンプルの２回増菌物は、１００％という特異性に対する結果が確認された（表１０）。公定法によって試験された２０個のサンプルのうち、１０個が陽性と確認された。非接種サンプルのすべてが、ＦｏｏｄＣｈｅｋ  ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣ増菌法とＵＳＤＡ／ＦＳＩＳ公定法の両方によって陰性と見出された（表１１）。
【０１２７】
Ａ）未加工冷凍ホタテガイにおいても、ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣブロスを使用したＦｏｏｄＣｈｅｋ増菌法の性能は、公定法と似ていた。ウォーターバス内での７時間の増菌のためにＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣブロスを効率的に使用したとき、２０個の接種サンプルのうち５つが、１００％という特異性で部分的レベルにおいて陽性と確認された（表１０）。ＦＤＡ（ＢＡＭ５）公定法は、４つの陽性サンプルを検出した。すべての非接種サンプルが、両方の方法によって陰性と確認された。得られた結果の統計解析（対応のない研究）は、ＦｏｏｄＣｈｅｋ  ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣ増菌法とＵＳＤＡ／ＦＳＩＳ公定法との間に有意差が無いことを示している（表１１）。
【０１２８】
Ｂ）生のすりつぶされた鶏肉では、自然に汚染されたサンプルを試験した。ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣブロスを使用した３９℃の恒温器内での２０時間の増菌からなるＦｏｏｄＣｈｅｋ  ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣ法は、解析された２０個のうち７つの陽性を検出した。ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣにおいて増菌されたサンプルの２回増菌による確認によってもまた、１００％という特異性に対する同じ７つの陽性が得られる（表１０）。公定法は、試験された２０個のうち１０個の陽性サンプルを検出した。両方の方法が、５個の自然に汚染された高レベルサンプルを検出した。それが対応のない研究であるとき、得られた結果の統計解析は、ＦｏｏｄＣｈｅｋ  ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣ増菌法とＵＳＤＡ／ＦＳＩＳ公定法との間に有意差が無いことを示している（表１１）。
【０１２９】
Ｃ）スプラウトでは、ＡｃｔｅｒｏＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／ＳＴＥＣブロスにおける３９℃のウォーターバス内での７時間の第１の増菌、ならびにＴＴブロスおよびＲＶにおけるそれぞれ４３℃および４２℃のウォーターバス内での１８時間の第２の増菌からなるＦｏｏｄＣｈｅｋ増菌法は、調製された２０個のうち１１個の確定陽性サンプルを見出した（表１０）。公定法の場合、残念なことに、典型的なコロニーはほとんど単離されず、それらは生化学的検査によってすべて陰性だった。単離されなかった典型的なコロニーの再単離を最大３回試みたが、いずれも生化学的検査によってサルモネラについて陽性と見出されなかった。見出された唯一の陽性結果は、ＭＰＮ解析の５０ｇのサンプルである。ここで得られた結果の統計解析は、両方の方法の間に有意差があることが示されている（表１１）。
【０１３０】
【表１０】
2014520537.tif 000016
【０１３１】
【表１１】
2014520537.tif 000017
【０１３２】
本明細書中に提示された実施形態および実施例は、特許請求される主題の一般的性質の例証であって限定ではない。これらの実施形態が、特許請求される主題の範囲から逸脱することなく、様々な用途のために様々な方法で容易に改変および／または適合され得ることを当業者は理解するだろう。本明細書の請求項は、別の実施形態およびその主題の等価物のすべてを含むがこれらに限定されないと理解されるべきである。本明細書中で使用される句、単語および用語は、例証であって限定ではない。法律が許す限り、本明細書に引用されたすべての参考文献が、その全体が参照により本明細書に援用される。本明細書中に開示される種々の実施形態の任意の態様が、一連の可能性のある別の実施形態において組み合され得ること、および別の特徴の組み合わせ（それらのすべてが特徴の組み合わせを変更させる）が、特許請求される主題の一部を形成すると理解されるべきであることが理解されるだろう。特定の実施形態は、開示されるエレメントのいずれか１つ以上を二者択一的に含み得るか、それらからなり得るか、またはそれらを排除し得る。
【０１３３】
独占的な特性または権利が請求される本発明の実施形態は以下のとおりで定義される：
【図１Ａ】
2014520537.tif 000018
【図１Ｂ】
2014520537.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成26年3月12日(2014.3.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
【図１Ａ】ビタミンＢ１２の化学構造である。
【図１Ｂ】一般的なコバラミン化合物の化学構造である。
【国際調査報告】
2014520537.tif 000020
2014520537.tif 000021
2014520537.tif 000022
2014520537.tif 000023
2014520537.tif 000024