(57)【要約】本発明は、インビボでのRNA干渉（RNAi）ポリヌクレオチドの細胞への標的指向送達のための、膜活性ポリ(ビニルエステル)ポリマーおよび組成物を目的とする。RNAiポリヌクレオチドをポリ(ビニルエステル)ポリマーに結合し、ポリマーを可逆的に修飾して、インビボでの標的指向送達を可能にする。ポリ(ビニルエステル)の膜活性は、RNAiポリヌクレオチドの細胞外部から細胞内部への移動を提供する。可逆的修飾は、生理的反応性を提供する。2014531476.tif 000071
2014531476.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造を有するポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマー：
2014531476.tif 000069
式中：
Nは-NH2または-N-CO-O-C-(CH3)3であり、
N'は-NR5H、-NR5R6、-NR5R6R7、窒素複素環、アルジミン、ヒドラジド、ヒドラゾン、またはイミダゾールであり、ここでR5、R6、およびR7は独立に-CH3および-CH2-CH3から選択され、
YおよびY'は独立に-(CH2)a-または-(CH2-CH2-O)b-(CH2)c-であり、ここでa、b、およびcは独立に1、2、3、4、5、または6であり、
Rは1〜7個の炭素原子を有する疎水性基、またはアルコキシルエチル基であり、
R'は12〜20個の炭素原子を有する疎水性基であり、
R1、R2、R3、およびR4は独立に水素（-H）およびメチル（-CH3）から選択され、
mおよびpは独立にゼロ（0）よりも大きい整数であり、
nおよびqは独立にゼロ（0）以上の整数であり、かつ
比(m+n)/(p+q)は1〜9である。
【請求項２】
比(m+n)/(p+q)が1.5〜4である、請求項1記載のポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマー。
【請求項３】
ポリマーの多分散性が1.5未満である、請求項1記載のポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマー。
【請求項４】
Yが-(CH2)a-であり、ここでaは2、3、または4である、請求項1記載のポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマー。
【請求項５】
Yが-CH2-CH2-O-CH2-CH2-である、請求項1記載のポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマー。
【請求項６】
Rが-(CH2)k-CH3であり、ここでkは1、2、3、4、または6である、請求項1記載のポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマー。
【請求項７】
nがゼロである、請求項1記載のポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマー。
【請求項８】
qがゼロである、請求項7記載のポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマー。
【請求項９】
R1、R2、R3およびR4がそれぞれ水素である、請求項1記載のポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマー。
【請求項１０】
Yが-(CH2)4-であり、
Rが-(CH2)2-CH3であり、
R1およびR3がそれぞれ水素であり、かつ
nおよびpがそれぞれゼロである、
請求項1記載のポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマー。
【請求項１１】
比m/pが1.3〜2.3である、請求項10記載のポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマー。
【請求項１２】
Yが-(CH2)2-であり、
Rが-(CH2)2-CH3であり、
R1およびR3がそれぞれ水素であり、かつ
nおよびpがそれぞれゼロである、
請求項1記載のポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマー。
【請求項１３】
Yが-(CH2)2-であり、
Rが-(CH2)3-CH3であり、
R1およびR3がそれぞれ水素であり、かつ
nおよびpがそれぞれゼロである、
請求項1記載のポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマー。
【請求項１４】
RNA干渉ポリヌクレオチドに結合している、請求項1記載のポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマー。
【請求項１５】
50％よりも多くのNが、二置換無水マレイン酸マスキング剤、ジペプチド-アミドベンジル-カルボナートマスキング剤、または二置換無水マレイン酸マスキング剤およびジペプチド-アミドベンジル-カルボナートマスキング剤の組み合わせとの反応によって可逆的に修飾されている、請求項1記載のポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマー。
【請求項１６】
インビボで遺伝子発現を阻害するための組成物であって、薬学的に許容される担体中の請求項16記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマーおよびRNA干渉ポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項１７】
RNA干渉ポリヌクレオチドがポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマーに共有結合している、請求項16記載の組成物。
【請求項１８】
RNA干渉ポリヌクレオチドが、少なくとも20個の炭素原子を含む疎水性基に結合している、請求項16記載の組成物。
【請求項１９】
以下の構造を有するポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマー：
2014531476.tif 000070
式中：
Nは-NH2の形を有する一級アミンであり、
Yは-(CH2)a-または-(CH2-CH2-O)b-(CH2)c-であり、ここでa、b、およびcは独立に1、2、3、4、5、または6であり、
Rは1〜7個の炭素原子を有する疎水性基であり、
R1およびR2は独立に水素（-H）およびメチル（-CH3）から選択され、
mはゼロ（0）よりも大きい整数であり、
pはゼロ（0）よりも大きい整数であり、かつ
比m/pは1〜9である。
【請求項２０】
比m/pが1.5〜4である、請求項19記載のポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマー。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
ポリヌクレオチドおよび他の実質的に細胞膜不透過性化合物の生細胞への送達は、細胞の複雑な膜系によって高度に制限されている。アンチセンス、RNAi、および遺伝子療法において用いられる薬物は比較的大きい親水性ポリマーであり、高度に負に荷電していることが多い。これらの物理的特徴はいずれも、細胞膜を通過してのそれらの直接拡散を妨げる。このため、ポリヌクレオチド送達の主な障壁は細胞膜を通過しての細胞の細胞質または核へのポリヌクレオチドの送達である。
【０００２】
インビボで小さい核酸を送達するために用いられてきた1つの手段は、核酸を小さい標的指向分子または脂質もしくはステロールのいずれかに結合することであった。これらの結合体でいくらかの送達および活性が観察されたが、これらの方法により必要とされる核酸用量は実際に適用するためには極端に大きい。
【０００３】
インビトロでポリヌクレオチドの細胞への適度に効率的な送達を達成する多くの形質移入試薬が開発されている。しかし、これらの同じ形質移入試薬を用いてのポリヌクレオチドのインビボ送達は、インビボ毒性、血清相互作用、および不良な標的指向により複雑で無効となっている。インビトロで良好にはたらく形質移入試薬、カチオン性ポリマーおよび脂質は、典型的には大きい静電粒子を形成し、細胞膜を不安定化する。インビトロ形質移入試薬の正電荷は電荷-電荷（静電）相互作用を介して核酸との結合を促進し、したがって核酸/形質移入試薬複合体を形成する。正電荷は媒体の細胞への非特異的結合、および膜融合、不安定化、または破壊のためにも有益である。膜の不安定化は実質的に細胞膜不透過性ポリヌクレオチドの細胞膜を通過しての送達を促進する。これらの特性はインビトロでの核酸移動を促進するが、これらはインビボで毒性および無効な標的指向を引き起こす。カチオン電荷は血清成分との相互作用をもたらし、これはポリヌクレオチド-形質移入試薬相互作用の不安定化ならびに不良なバイオアベイラビリティおよび標的指向を引き起こす。インビトロでは有効でありうる、形質移入試薬の膜活性は、インビボでは毒性につながることが多い。
【０００４】
インビボ送達のために、媒体（核酸および関連する送達物質）は小さい、直径100nm未満、好ましくは50nm未満であるべきである。さらにより小さい複合体、20nm未満または10nm未満がより有用であろう。100nmよりも大きい送達媒体はインビボで血管細胞以外の細胞にほとんど接近できない。静電相互作用により形成された複合体は、生理的塩濃度または血清成分に曝露されると凝集または分解する傾向にある。さらに、インビボ送達媒体上のカチオン電荷は有害な血清相互作用と、したがって不良なバイオアベイラビリティにつながる。面白いことに、高い負の電荷も、標的指向に必須の相互作用を妨害することにより、インビボ送達を阻害しうる。したがって、インビボでの分布および標的指向のために、中性に近い媒体が望ましい。注意深く調節しなければ、膜破壊または不安定化活性はインビボで用いると毒性である。媒体毒性と核酸送達との釣り合いを取ることは、インビボよりもインビトロでより容易に達成される。
【０００５】
Rozemaらは、米国特許出願公開第20040162260号（特許文献1）で、一級アミンの一対のカルボキシル基（2-プロピオン酸-3-メチル無水マレイン酸のβカルボキシルおよびγカルボキシル）への可逆的変換により、膜活性ポリアミンの膜破壊活性を可逆的に調節する手段を示した。Rozemaら（Bioconjugate Chem. 2003, 14, 51-57）（非特許文献1）は、βカルボキシルは完全な見かけの負電荷を示さず、それ自体では膜活性を阻害することができないと報告した。有効な膜活性阻害のためにはγカルボキシル基の追加が必須であると報告された。しかし、媒体は高度に負に荷電しているため、高い負電荷密度を有する核酸および修飾ポリマーのいずれでも、この系はインビボ送達のために効率的ではなかった。
【０００６】
2-プロピオン酸-3-メチル無水マレイン酸のγカルボキシルの代わりに中性親水性標的指向（ガラクトース）および立体安定化（PEG）基を用いることにより、Rozemaらは全般的水溶性および膜活性の可逆的阻害を保持する一方で、有効なインビボ肝細胞標的指向を組み込むことができた（米国特許出願公開第20080152661号（特許文献2））。
【０００７】
本発明者らはここで、インビボで核酸の細胞への送達において用いるための、新しい膜活性ポリマーおよび記載するポリマーで作成した組成物を記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第20040162260号
【特許文献２】米国特許出願公開第20080152661号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Rozemaら（Bioconjugate Chem. 2003, 14, 51-57）
【発明の概要】
【００１０】
好ましい態様において、本発明は、インビボでポリヌクレオチドを細胞に送達するのに特に適した、両親媒性カチオン性ポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマーを特徴とする。本発明の両親媒性カチオン性ポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマーは、複数のアミン含有ビニルエステルモノマーおよび複数の第一の疎水性ビニルエステルモノマーを含む。アミン含有モノマーは、側鎖一級アミン基を含む。疎水性モノマーは、炭化水素基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシアルキル基、芳香族基、およびアリール基からなる群より選択される、2〜20個の炭素原子を有する側鎖疎水性基を含む。ポリマーは、複数の第二のアミン含有ビニルエステルモノマーまたは複数の第二の疎水性ビニルエステルモノマーをさらに含んでいてもよい。第二のアミン含有ビニルエステルモノマーは、一級アミン、二級アミン、三級アミン、四級アミン、保護アミン、窒素複素環、アルジミン、ヒドラジド、ヒドラゾン、およびイミダゾールからなる群より選択される、側鎖アミン基を含む。両親媒性であることに加えて、本発明のポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマーは、膜活性である。好ましいポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマーは、一級アミン含有およびブチリルビニルエステルモノマーを含む。
【００１１】
本発明のポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマーは、2、3、または4つの異なるモノマーから合成してもよい。モノマーは、保護アミンビニルエステル、イミダゾールビニルエステル、アルキルビニルエステル、アルケニルビニルエステル、アルキニルビニルエステル、芳香族ビニルエステル、およびアリールビニルエステルを含むリストから選択してもよい。保護アミンビニルエステルモノマーには、tert-ブトキシカボニル（Boc）保護アミン含有ビニルエステルが含まれるが、それらに限定されるわけではない。保護一級アミンモノマーを、アルキルビニルエステルモノマーと共重合させる。次いで、アミン保護基を重合後に除去して、水溶性、両親媒性ランダムコポリマーを生成する。脂肪族疎水性基は直鎖、分枝、または環式であってもよく、1つまたは複数のヘテロ原子の置換を含んでいてもよい。
【００１２】
好ましい態様において、ポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマーを、可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）重合により合成する。1つの態様において、RAFT重合を、マロナートN,N-ジフェニルジチオカルバマート（MDP-DTC）を用いて実施する。RAFT重合、および任意に細分化を用いて、1.5未満、またはより好ましくは1.4もしくは1.3未満の多分散性を有するポリマーが可能である。
【００１３】
インビボでのポリヌクレオチドの細胞への送達のために、前述の両親媒性ポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマーを可逆的に修飾する。可逆的修飾は、本明細書において規定する複数のマスキング剤をポリマー一級アミンに、複数の生理的に不安定な可逆的共有結合を通じて結合することを含む。生理的に不安定な可逆的共有結合は、pHに不安定な結合および酵素切断可能結合を含む群から選択してもよい。本明細書において用いられる可逆的修飾とは、マスキング剤をポリマーに連結している生理的に不安定な共有結合の切断後にポリマー一級アミンが復元されることを意味する。好ましい態様において、ポリマー一級アミンの50％よりも多く、60％よりも多く、70％よりも多く、80％よりも多く、または90％よりも多くをマスキング剤の可逆的結合によって修飾する。マスキング剤は、立体安定化部分および標的指向基を含む群から選択してもよい。マスキング剤は、インビボでポリマーまたはポリマー-ポリヌクレオチド結合体の生体分布または標的指向を改善する。マスキング剤は、ポリマーの血清成分または非標的細胞との非特異的相互作用を阻害しうる。マスキング剤は、ポリマーまたはポリマー-ポリヌクレオチド結合体の凝集を低減しうる。標的指向基を含むマスキング剤は、結合体系を細胞表面受容体へと標的指向させることにより、細胞特異的標的指向または細胞内部移行を増強する。マスキング剤は、ポリマーのポリヌクレオチドへの結合の前または後にポリマーに結合することができる。
【００１４】
もう1つの好ましい態様において、ポリヌクレオチドを本発明のポリマーに、第二の生理的に不安定な共有結合を通じて連結する。1つまたは複数のポリヌクレオチドをポリマーに、第二の生理的に不安定な共有結合を介して連結してもよい。マスキング剤をポリマーに連結している不安定結合、すなわち第一の不安定結合、およびポリヌクレオチドをポリマーに連結している不安定結合、すなわち第二の不安定結合は、同じもしくは類似の条件下で切断されてもよく、またはそれらは別の条件下で切断されてもよく、すなわち、それらは直交の不安定結合であってもよい。ポリヌクレオチドは、DNA、RNA、ブロッキングポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、RNA干渉ポリヌクレオチド、siRNA、マイクロRNA、mRNA、およびshRNAを含む群から選択してもよい。第二の生理的に不安定な共有結合は、pHに不安定な結合、酵素切断可能結合、ジスルフィド結合、および核酸エステル結合を含む群から選択してもよい。
【００１５】
好ましい態様において、本発明者らは：a）生理的に不安定な可逆的共有結合を介して1つもしくは複数の標的指向基および/または立体安定化部分に；ならびにb）直交の第二の生理的に不安定な共有結合を介して1つまたは複数のポリヌクレオチドに、共有結合された両親媒性ポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマーを含む組成物を記載する。ポリヌクレオチド-ポリマー結合体を哺乳動物に、薬学的に許容される担体または希釈剤中で投与する。
【００１６】
好ましい態様において、本発明者らは、膜不透過性分子を細胞に送達し、分子を細胞中で放出するためのポリマー結合体系を記載する。ポリマー結合体系は、本発明の可逆的に修飾されたポリ(ビニルエステル)に可逆的に連結された膜不透過性分子を含む。好ましい膜不透過性分子は、ポリヌクレオチドを含む。好ましいポリヌクレオチドは、RNA干渉ポリヌクレオチドを含む。好ましいRNA干渉ポリヌクレオチドは、siRNAまたはmiRNAを含む。ポリマーまたはポリヌクレオチド-ポリマー結合体を哺乳動物に、薬学的に許容される担体または希釈剤中で投与する。
【００１７】
もう1つの好ましい態様において、本発明は、インビボでRNA干渉ポリヌクレオチドを肝細胞に送達するための組成物であって、生理的に不安定な可逆的共有結合を介して1つもしくは複数の標的指向基および/または立体安定化部分に共有結合された両親媒性ポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマー、ならびにポリヌクレオチド標的指向基に結合されたRNA干渉ポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド結合体）を含む組成物を特徴とする。好ましいポリヌクレオチド標的指向基は、少なくとも20個の炭素原子を含む疎水性基である。もう1つの好ましいポリヌクレオチド標的指向は、三価ガラクトサミンである。ポリ(ビニルエステル)およびポリヌクレオチド結合体は別々に合成し、別々の容器または1つの容器で供給してもよい。本組成物において、ポリヌクレオチドはポリマーに結合していない。修飾ポリマーおよびポリヌクレオチド結合体を哺乳動物に、薬学的に許容される担体または希釈剤中で投与する。1つの態様において、送達ポリマーおよびRNAiポリヌクレオチド結合体は、哺乳動物への投与前に溶液中で混合してもよい。もう1つの態様において、送達ポリマーおよびRNAiポリヌクレオチド結合体は、別々の溶液で哺乳動物に同時投与してもよい。さらにもう1つの態様において、送達ポリマーおよびRNAiポリヌクレオチド結合体は、哺乳動物に逐次投与してもよい。逐次投与のために、送達ポリマーをRNAiポリヌクレオチド結合体の投与の前に投与してもよい。または、逐次投与のために、RNAiポリヌクレオチド結合体を送達ポリマーの投与の前に投与してもよい。
【００１８】
もう1つの態様において、記載した両親媒性ポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマーは、インビトロでポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に送達するのに適している。インビトロ細胞送達のために、両親媒性ポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマーを、記載のとおりに可逆的に修飾してもよく、または可逆的修飾なしで用いてもよい。これらは脂質または他のポリマーと組み合わせてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図1は、様々な両親媒性ポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマーの構造を示す図であり、式中：Nは-NH2の形を有する一級アミンであり、N'は-NR5H、-NR5R6、もしくは-NR5R6R7（ここでR5、R6、およびR7は独立に-CH3および-CH2-CH3から選択される）の形を有する二級、三級、もしくは四級アミンであるか、またはN'は窒素複素環、アルジミン、ヒドラジド、ヒドラゾン、もしくはイミダゾールであり得、YおよびY'はリンカー基であり、RおよびR'は独立に2〜20個の炭素原子を有する疎水性基であり、R1、R2、R3、およびR4は独立に水素（-H）およびメチル（-CH3）から選択され、mおよびpはゼロ（0）よりも大きい整数であり、nおよびqはゼロ（0）以上の整数であり、かつ比(m+n)/(p+q)は1〜9である。
【図２】図2は、様々なジペプチドマスキング剤の構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、核酸、ペプチド、およびタンパク質などの、生物活性物質の送達のために有用な、両親媒性ポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマーおよびその結合体系に関する。核酸および他の実質的に細胞膜不透過性化合物の生細胞への送達は、細胞の複雑な膜系によって高度に制限されている。インビボ送達のために、両親媒性ポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマーを、生理的に不安定な連結を介してのマスキング剤の共有結合により可逆的に修飾する。
【００２１】
1つの態様において、本発明は、式（I）の膜活性ポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマーを目的とする：
2014531476.tif 000003
式中：
Nは-NH2の形を有する一級アミンであり、
N'は-NR5H、-NR5R6、もしくは-NR5R6R7の形を有する二級、三級、もしくは四級アミンであり、ここでR5、R6、およびR7は独立に-CH3および-CH2-CH3から選択されるか、またはN'は窒素複素環、アルジミン、ヒドラジド、ヒドラゾン、もしくはイミダゾールであり得、
YおよびY'はリンカー基であり、
RおよびR'は、独立に2〜20個の炭素原子を有する、本明細書において規定する疎水性基、またはアルコキシルエチル基、-(CH2)l-O-CH2-CH3であり、ここでlは2、3、または4であり（好ましいアルコキシエチル基は2-エトキシエチル基、-(CH2)2-O-CH2-CH3であり、
R1、R2、R3、およびR4は独立に水素（-H）およびメチル（-CH3）から選択され、
mおよびpはゼロ（0）よりも大きい整数であり、
nおよびqはゼロ（0）以上の整数であり、かつ
比(m+n)/(p+q)は1〜9（50〜90％アミン）、より好ましくは1.5〜4（60〜80％アミン）である。
【００２２】
好ましいR基は、2〜6個の炭素原子を有する疎水性基である。
【００２３】
リンカー基YおよびY'は非荷電で、窒素をビニルエステルに1〜24個の炭素原子を介して連結し、その1つまたは複数はヘテロ原子で置換されていてもよい。好ましい態様において、YおよびY'は独立に1〜12個の炭素原子を有し、その1つまたは複数はヘテロ原子で置換されていてもよい。1つの態様において、YおよびY'は独立に-(CH2)x-および-(CH2-CH2-O)z-(CH2)x-から選択され、ここでxおよびzは独立に1、2、3、4、5、または6である。
【００２４】
1つの態様において、本発明は、式（Ia）のビニルエステルランダムコポリマーを目的とする：
2014531476.tif 000004
式中：
Nは-NH2の形を有する一級アミンであり、
Yは前述のリンカー基であり、
Rは、2〜6個の炭素原子を有する、本明細書において規定する疎水性基、またはアルコキシルエチル基、-(CH2)l-O-CH2-CH3であり、ここでlは2、3、または4（好ましくは2-エトキシエチル）であり、
R1およびR3は独立に水素（-H）およびメチル（-CH3）から選択され、
mはゼロ（0）よりも大きい整数であり、
pはゼロ（0）よりも大きい整数であり、
比m/pは1〜9（50〜90％アミン）、より好ましくは1.5〜4（60〜80％アミン）である。
【００２５】
本発明のポリマーは一般には、本明細書に記載のとおり、および有機化学または薬品化学の当業者には公知の方法を用いて、得ることができる。ポリマーを疎水性基含有ビニルエステルモノマーおよび保護アミン含有ビニルエステルモノマーから重合する。本発明のポリマーを生成するための重合は、好ましくは可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）重合を用いて実施する。1つの態様において、RAFT重合を、マロナートN,N-ジフェニルジチオカルバマート（MDP-DTC）を用いて実施する。ポリマー合成を、保護アミンモノマーを用いて実施する。アミンの脱保護により、Nが-NH2である、式（I）または（Ia）のアミン含有ポリマーを得る。一例として、Yが-(CH2)3-であり、R1が水素であり、R3が水素であり、かつRが-(CH2)3-CH3である、式（Ia）の化合物を、出発原料として化合物3および8を用いて得ることができる。
2014531476.tif 000005
2014531476.tif 000006
ビニルエステルモノマー3および8の合成を以下に記載する。
【００２６】
可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）重合は、制御されたラジカル重合の1つの形態である。より具体的には、RAFTは、可逆的連鎖移動試薬存在下での通常のラジカル重合を含む、リビング重合の1つの型である。RAFT重合により、多くのモノマーについて、制御された分子量および1.05から1.6の間の低い多分散性（PDI）を有する広範なポリマーの合成が可能となる。本発明のポリ(ビニルエステル)は、好ましくは1.5未満、より好ましくは1.4または1.3未満の多分散性を有する。細分化を用いて、多分散性をさらに低下させてもよい。RAFT重合は、国際公開公報第9504026号、国際公開公報第9801478号、国際公開公報第9905099号、国際公開公報第9931144号、国際公開公報第10083569号、米国特許第6,291,620号、米国特許第6,376,626号、米国特許第6,642,318号、および米国特許第6,747,111号に記載されている。分子量が20,000よりも大きく、多分散性が低いポリマーも、RAFT重合により可能で、インビボ送達のために好ましい。高分子が血流中を有効に循環し、腎臓によって排出されないために、30,000〜50,000よりも大きい分子量が好ましいことが多い。
【００２７】
本発明の非修飾両親媒性ポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマーが膜活性である；すなわち、形質膜またはリソソーム/エンドサイトーシス膜を破壊しうることは、それらの必須の特徴である。しかし、ポリマーをインビボで投与すると、膜活性は毒性を引き起こしうる。ポリアミンはインビボで多くのアニオン成分とも容易に相互作用し、望ましくない生体分布を引き起こす。したがって、ポリアミンの膜活性の可逆的阻害をインビボ使用のために用いる。この阻害は、可逆的にマスクした膜活性ポリ(ビニルエステル）、すなわち、本明細書において送達ポリマーとも呼ぶものを生成するための、マスキング剤のポリマーアミンへの生理的に不安定な可逆的結合を通じて達成される。膜活性を阻害することに加えて、マスキング剤はポリマーを非特異的相互作用から遮蔽し、血清相互作用を低減し、循環時間を増大させ、または細胞特異的相互作用、すなわち標的指向を提供する。可逆的修飾のプロセスは、中性に近い荷電ポリマーを生成するために、正電荷も低減する。本明細書において用いられる、不安定とは、マスキング剤のポリマーへの連結が、生理的条件下で典型的に存在する条件下で容易に切断されることを意味する。本明細書において用いられる、可逆的とは、マスキング剤をポリマーに連結している結合の切断が、ポリマーアミンの修飾前状態、すなわち一級アミンへの復元をもたらすことを意味する。
【００２８】
好ましい生理的に不安定な可逆的連結には、生理的に不安定な共有結合または哺乳動物の細胞内条件下で切断可能な共有結合が含まれる。好ましい不安定な共有結合には、pHに不安定な結合が含まれる。好ましいpHに不安定な生理的に不安定な連結には、マレアマートが含まれる。もう1つの好ましい生理的に不安定な連結には、酵素切断可能連結が含まれる。好ましい酵素切断可能連結は、ペプチド（アミド）結合である。好ましいペプチド連結には、米国特許出願第13/326,433号に記載のジペプチド-アミドベンジル-カルボナートが含まれ、前記出願は参照により本明細書に組み入れられる。
【００２９】
全般的に、マスキング剤がポリマーの膜活性を阻害し、ポリマーを非特異的相互作用から遮蔽し（血清相互作用を低減し、循環時間を増大させ）、かつインビボでの細胞標的指向を提供することは、マスキング剤の必須の特徴である。本発明の膜活性ポリ(ビニルエステル)は非修飾（マスクしていない）状態で膜活性であり、修飾（マスクした）状態で膜活性ではない（不活化されている）。所望のレベルの不活化を達成するのに十分な数のマスキング剤をポリマーに連結する。マスキング剤の結合によるポリ(ビニルエステル)の所望のレベルの修飾は、適切な膜活性検定を用いて容易に判定される。例えば、ポリ(ビニルエステル)が所定の検定において膜活性を有するならば、その検定において膜活性の所望のレベルの阻害を達成するのに十分なレベルのマスキング剤をポリマーに連結する。マスキングは、いかなるマスキング剤も非存在下で、ポリマー上のアミンの量により判定して、ポリマー上のアミン基の≧50％、≧60％、≧70％、または≧80％の修飾を必要とする。マスキング剤のポリマーへの結合がポリマーの正味の電荷を低減し、したがってより中性の送達ポリマーを生成することも、マスキング剤の好ましい特徴である。マスクしたポリマーが水溶性を保持していることが望ましい。
【００３０】
本明細書において用いられる、本発明の膜活性ポリ(ビニルエステル)は、修飾ポリマーが膜活性を示さず、インビボで細胞特異的（例えば、肝細胞）標的指向を示す場合、マスクされている。本発明の膜活性ポリ(ビニルエステル)は、マスキング剤をポリマーに結合している連結の切断がポリ(ビニルエステル)上のアミンを復元し、それにより膜活性を復元する場合、可逆的にマスクされている。
【００３１】
マスキング剤が膜活性ポリ(ビニルエステル)に生理的に不安定な可逆的共有結合を通じて連結されていることも、もう一つの必須の特徴である。生理的に不安定な可逆的連結または結合を用いることにより、マスキング剤をインビボでポリマーから切断し、それによりポリマーのマスクを除去し、マスクしていないポリマーの活性を復元することができる。適切な可逆的連結を選択することにより、所望の細胞型または細胞部位に送達または標的指向させられた後に膜活性ポリマーの活性を復元する結合体を生成することが可能である。連結の可逆性は、膜活性ポリマーの選択的活性化を提供する。適切な可逆的共有結合は、生理的に不安定な結合、細胞生理的に不安定な結合、プロテアーゼに感受性の連結、pHに不安定な結合、pHに非常に不安定な結合、およびpHに極度に不安定な結合からなる群より選択されうる不安値な可逆的結合を含む。
【００３２】
本明細書において用いられるマスキング剤は、細胞標的指向基または立体安定化部分およびアミン反応性基を有する化合物を含み、ここでアミン反応性基のポリ(ビニルエステル)上のアミンとの反応は標的指向基または立体安定化部分の生理的に不安定な可逆的共有結合を介してのポリマーへの連結を生じる。好ましくは、マスキング剤は電荷中性である。好ましい標的指向基は、アシアロ糖タンパク質受容体（ASGPr）標的指向基である。ASGPr標的指向基は、アシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を有する基、典型的には糖類である。好ましい立体安定化部分はポリエチレングリコール（PEG）である。本発明の好ましいマスキング剤は、水溶液中で本発明のポリ(ビニルエステル)を修飾（ポリマーと可逆的結合を形成）することができる。
【００３３】
好ましいアミン反応性基は二置換無水マレイン酸を含む。好ましいマスキング剤は以下の構造で表される：
2014531476.tif 000007
式中、R1はメチル基（-CH3）、エチル基（-CH2CH3）、またはプロピル基（-CH2CH2CH3）などのアルキル基であり、かつR2は中性標的指向基または中性立体安定化部分を含む。より好ましくは、標的指向剤および立体安定化部分は非荷電である。R1またはR2が水素である、一置換無水マレイン酸は、記載する発明に適していない連結を生じる。無水マレイン酸のアミドとの反応はβカルボキシル基を生じるが、このβカルボキシルは完全な見かけの負電荷を示さない（Rozema et al. Bioconjugate Chem. 2003, 14, 51-57）。したがって、R1およびR2が電荷中性である無水マレイン酸系マスキング剤を用いて、高い負電荷を与えることなく、ポリアミンを中和することができる。
【００３４】
1つの態様において、本発明のポリ(ビニルエステル)ポリアミンを、複数の二置換無水マレイン酸との反応により可逆的に修飾する。したがって、本発明は、以下の式のランダムコポリマーを提供する：
2014531476.tif 000008
式中、N'、Y、Y'、R、R'、R1、R2、R3、R4、m、n、p、qは前記式（I）および（Ia）に与えた意味を有し、
m1はゼロ以上かつ式（I）または（Ia）のm以下の整数であり、
m3はゼロ以上かつ式（I）または（Ia）のm以下の整数であり、
m1＋m2＋m3＝式（I）または（Ia）のmであり、
m1＋m3は≧m2［すなわち、式（I）または（Ia）のm×0.5以上かつ式（I）または（Ia）のm以下］の整数であり、
R7はアルキル基であり、かつR8は中性標的指向基を含むか、またはR8はアルキル基であり、かつR7は中性標的指向基を含み、かつ
R9はアルキル基であり、かつR10は中性立体安定化部分を含むか、またはR10はアルキル基であり、かつR9は中性立体安定化部分を含む。
【００３５】
もう1つの好ましいマスキング剤は、以下の構造で表されるプロテアーゼ感受性ジペプチド-アミドベンジル-カルボナートを含む：
2014531476.tif 000009
式中、R4は中性、好ましくは非荷電の標的指向リガンドまたは立体安定化部分を含み、R3はアミン反応性カルボナート基を含み、かつR1およびR2はアミノ酸側鎖である。好ましいジペプチドにおいて、R1は疎水性アミノ酸側鎖であり、R2は非荷電親水性アミノ酸側鎖である。好ましい疎水性アミノ酸はフェニルアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アラニン、またはトリプトファンである。好ましい非荷電親水性アミノ酸はアスパラギン、グルタミン、またはシトルリンである。より好ましい疎水性アミノ酸はフェニルアラニンまたはバリンである。より好ましい非荷電親水性アミノ酸はシトルリンである。好ましい活性化カルボナートはパラニトロフェノールである。しかし、当技術分野において公知の他のアミン反応性カルボナートも容易にパラニトロフェノールの代わりに用いられる。活性化カルボナートのアミンとの反応により、標的指向リガンドまたは立体安定化部分が膜活性ポリアミンに、ペプチダーゼで切断可能なジペプチド-アミドベンジル-カルバマート連結を介して接続される。アミノ酸とアミドベンジル基との間のジペプチドの酵素切断により、ポリマーからR4が除去されて脱離反応が誘発され、これによりポリマーアミンが再生される。
【００３６】
ジペプチド-アミドベンジル-カルボナートマスキング剤の、ポリ(ビニルエステル)のアミンとの反応により、ポリ(ビニルエステル)が可逆的に修飾されることになる。したがって、本明細書において提供するのは、ジペプチド-アミドベンジル-カルボナートマスキング剤での修飾によりマスクした、本明細書に記載の両親媒性膜活性ポリ(ビニルエステル)を含む結合体である。そのようにマスクしたポリマーは以下の式を有する：
2014531476.tif 000010
式中：
Xは-NH-、-O-、または-CH2-であり
Yは-NH-または-O-であり
R1は好ましくは
-(CH2)k-フェニル（kは1、2、3、4、5、6であり；k＝1 フェニルアラニン）、
-CH-(CH3)2（バリン）、
-CH2-CH-(CH3)2（ロイシン）、
-CH(CH3)-CH2-CH3（イソロイシン）、
-CH3（アラニン）、
-(CH2)2-COOH（グルタミン酸）、
または
2014531476.tif 000011
R2は好ましくは
水素（グリシン）
-(CH2)3-NH-C(O)-NH2（シトルリン）、
-(CH2)4-N-(CH3)2（リジン(CH3)2）、
-(CH2)k-C(O)-NH2；（kは1、2、3、4、5、6であり）、
-CH2-C(O)-NH2（アスパラギン）、
-(CH2)2-C(O)-NH2（グルタミン）、
-CH2-C(O)-NR1R2（アスパラギン酸アミド）、
-(CH2)2-C(O)-NR1R2（グルタミン酸アミド）、
-CH2-C(O)-OR1（アスパラギン酸エステル）、または
-(CH2)2-C(O)-OR1（グルタミン酸エステル）であり、
R1およびR2はアルキル基であり
R4は中性ポリエチレングリコールまたは標的指向リガンドを含み；かつ
ポリアミンは両親媒性膜活性ポリ(ビニルエステル)である。
【００３７】
前記構造は、ポリマーに連結された1つのジペプチドマスキング剤を示すが、本発明の実施において、ポリマーアミンの50％から90％以上がジペプチドマスキング剤で修飾されている。
【００３８】
本発明の膜活性ポリ(ビニルエステル)は、過剰のマスキング剤存在下でマスキング剤に結合することができる。過剰のマスキング剤は送達ポリマーの投与前に結合送達ポリマーから除去してもよい。
【００３９】
一つの態様において、膜活性ポリ(ビニルエステル)ポリアミンを、標的指向基マスキング剤または立体安定化部分マスキング剤のポリアミン上のアミンの≧50％、≧60％、≧70％、または≧80％への結合により可逆的にマスクする。もう一つの態様において、膜活性ポリアミンを、標的指向基マスキング剤および立体安定化部分マスキング剤のポリアミン上のアミンの≧50％、≧60％、≧70％、または≧80％への結合により可逆的にマスクする。もう一つの態様において、標的指向基マスキング剤は、PEGリンカーを介してアミン反応性基に連結された標的指向基を含む。標的指向基マスキング剤および立体安定化部分マスキング剤の両方による膜活性ポリアミンマスキングのために、立体安定化部分の標的指向部分に対する比は約0〜4：1、より好ましくは約0.5〜2：1である。もう一つの態様において、約1の標的指向基剤に対して約1.3〜2の立体安定化部分マスキング剤がある。
【００４０】
本発明のさらなる態様において、生物活性化合物、好ましくはRNA干渉ポリヌクレオチドに共有結合された式（I）または（Ia）のポリマーの結合体が提供される。好ましくは、ポリマーはポリヌクレオチドに生理的に不安定な連結によって共有結合されている。好ましい生理的に不安定な連結は、マスキング剤の生理的に不安定な連結に直交である。適切な生理的に不安定な連結は、生理的に不安定な結合、細胞生理的に不安定な結合、pHに不安定な結合、pHに非常に不安定な結合、pHに極度に不安定な結合、酵素切断可能結合（適切なエステル、アミド、およびホスホジエステル結合を含む）、およびジスルフィド結合を含む群から選択してもよい。
【００４１】
本発明者らは、ポリヌクレオチドをポリマーに、ポリヌクレオチドが細胞に送達された後に切断される可逆的リンカーを介して結合することにより、インビボで機能的に活性なポリヌクレオチドを細胞に送達可能であることを見いだした。不安定な連結は、特定の生理的条件（例えば、細胞質中の還元環境）にある場合、化学的変換（例えば、切断）を起こすように選択する。ポリヌクレオチドの本発明のポリ(ビニルエステル)への結合は、インビボでポリヌクレオチドの細胞への送達を増強する。不安定な連結の切断による、ポリマーからのポリヌクレオチドの放出は、ポリヌクレオチドの活性のために適切な細胞成分との相互作用を促進する。
【００４２】
RNAiポリヌクレオチド-ポリマー結合体を、RNAiポリヌクレオチドをポリマーに、生理的に不安定な共有結合を介して連結することにより生成する。ポリヌクレオチドを、それが反応性基Aを含むように合成または修飾する。ポリマーも、それが反応性基Bを含むように合成または修飾する。反応性基AおよびBは、それらが当技術分野において公知の方法を用いて生理的に不安定な共有結合を介して連結されうるように選択する。ポリマーは、RNAiポリヌクレオチドの3'または5'末端に連結してもよい。siRNAポリヌクレオチドに対し、標的指向部分はセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれに連結してもよいが、センス鎖が好ましい。
【００４３】
RNAiポリヌクレオチドの、ポリマー（I）または（Ia）の側鎖一級アミンへの結合により、式（IV）または（IVa）のポリマーを得る。
2014531476.tif 000012
2014531476.tif 000013
式中、N'、Y、Y'、R、R'、R1、R2、R3、R4、m、n、p、qは前記式（I）および（Ia）に与えた意味を有し、
m1は1、2、3、または4であり、
m1＋m2＝式（I）または（Ia）のmであり；かつ
リンカーは生理的に不安定なリンカーを含む。
【００４４】
もう1つの態様において、式（V）および（Va）に例示するとおり、RNAiポリヌクレオチドをポリマー主鎖末端に結合する。ポリヌクレオチドは他方の末端に結合してもよい。
2014531476.tif 000014
式中、N、N'、Y、Y'、R、R'、R1、R2、R3、R4、m、n、p、qは前記式（I）および（Ia）に与えた意味を有し、かつリンカーは生理的に不安定なリンカーを含む。
【００４５】
本発明のさらなる態様において、非修飾ポリマーについて上に示すとおり、生物活性化合物、好ましくはRNA干渉ポリヌクレオチドに共有結合された式（II）、（IIa）、および（III）のポリマーの結合体が提供される。好ましくは、ポリマーはポリヌクレオチドに生理的に不安定な連結によって共有結合されている。
【００４６】
ポリヌクレオチドは、過剰のポリマー存在下でポリマーに結合することができる。過剰のポリマーはポリヌクレオチド-ポリマー結合体の生成を助け得る。過剰のポリマーは、結合体の生成中に結合体の凝集を低減しうる。ポリヌクレオチド-ポリマー結合体は、結合体を細胞または生物に投与する前に過剰のポリマーから分離してもよい。または、ポリヌクレオチド-ポリマー結合体を細胞または生物に、過剰のポリマーと同時投与してもよい。過剰のポリマーはポリマーと同じでもよく、または異なるヘルパーもしくはブーストポリマーであってもよい。
【００４７】
もう1つの態様において、本発明は、インビボでRNA干渉ポリヌクレオチドを肝細胞に送達するための組成物であって、式（II）、（IIa）、または（III）のポリマー、およびポリヌクレオチド標的指向基に結合されたRNA干渉ポリヌクレオチドを含む組成物を特徴とする。ポリヌクレオチド標的指向基は、少なくとも20個の炭素原子を含む疎水性基または米国特許出願公開第20110207799号に記載の三価ASPGr標的指向基のいずれかでありうる。可逆的に修飾したポリ(ビニルエステル)およびsiRNA結合体は別々に合成し、別々の容器または1つの容器で供給してもよい。RNA干渉ポリヌクレオチドはポリマーに結合していない。
【００４８】
本発明者らは、RNAiポリヌクレオチドの疎水性基またはガラクトースクラスターいずれかであるポリヌクレオチド標的指向基への結合、およびRNAiポリヌクレオチド結合体の前述の修飾ポリ(ビニルエステル)ポリマーとの同時投与は、インビボでのRNAiポリヌクレオチドの肝細胞、特に肝実質細胞への効率的、機能的送達を提供することを見いだした。機能的送達とは、RNAiポリヌクレオチドが細胞に送達され、予期される生物活性である遺伝子発現の配列特異的阻害を有することを意味する。哺乳動物の脈管構造に投与された、ポリヌクレオチドを含む多くの分子は、通常は肝臓によって体から排出される。ポリヌクレオチドが体からの除去のために分解またはそれ以外に処理され、ポリヌクレオチドが遺伝子発現の配列特異的阻害を引き起こさない、肝臓によるポリヌクレオチドのクリアランスは、機能的送達とは考えない。
【００４９】
RNAiポリヌクレオチド-ポリヌクレオチド標的指向基結合体を、可逆的に修飾したポリ(ビニルエステル)と同時投与する。同時投与とは、RNAiポリヌクレオチドおよび送達ポリマーを哺乳動物に、両方が哺乳動物中に同時に存在するように投与することを意味する。RNAiポリヌクレオチド-標的指向基結合体および送達ポリマーを一斉に投与してもよく、またはこれらを逐次投与してもよい。一斉投与のために、これらを投与前に混合してもよい。逐次投与のために、RNAiポリヌクレオチド-標的指向基結合体または送達ポリマーのいずれかをまず投与してもよい。
【００５０】
RNAiポリヌクレオチド-疎水性標的指向基結合体について、RNAi結合体を送達ポリマーの投与の30分前までに投与してもよい。同様にRNAiポリヌクレオチド-疎水性標的指向基結合体について、送達ポリマーをRNAi結合体の投与の2時間前までに投与してもよい。
【００５１】
RNAiポリヌクレオチド-ガラクトースクラスター標的指向基結合体について、RNAi結合体を送達ポリマーの投与の15分前までに投与してもよい。同様にRNAiポリヌクレオチド-ガラクトースクラスター標的指向基結合体について、送達ポリマーをRNAi結合体の投与の15分前までに投与してもよい。
【００５２】
両親媒性
本発明のポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマーは両親媒性である。両親媒性（amphipathic）、または両親媒性（amphiphilic）ポリマーは、親水性（極性、水溶性）および疎水性（非極性、親油性、水不溶性）基または部分の両方を有する。
【００５３】
両親媒性ポリマーに関して、本明細書において用いられる部分とは、一つの共有結合が切断され、水素で置換されたときに誘導される分子と定義される。例えば、ブチルアミンにおいて、炭素と窒素との間の結合の切断、および水素による置換は、アンモニア（親水性）およびブタン（疎水性）を生じる。1,4-ジアミノブタンが窒素-炭素結合で切断され、水素で置換されると、得られる分子はここでもアンモニア（2×）およびブタンである。しかし、1,4-ジアミノブタンは、疎水性部分の生成が2つの結合の切断を必要とするため、両親媒性とは考えられない。
【００５４】
膜活性
本明細書において用いられる膜活性ポリマーは、生体膜に対して以下の効果の1つまたは複数を誘導することができる、表面活性、両親媒性ポリマーである：膜不透過性分子が細胞に侵入する、もしくは膜を通過することを可能にする、膜の変化もしくは破壊、膜における孔形成、膜の分裂、または膜の破壊もしくは溶解。本明細書において用いられる膜、または細胞膜は、脂質二重層を含む。膜の変化または破壊は、以下の検定の少なくとも1つにおいてポリマーの活性により機能的に規定することができる：赤血球溶解（溶血）、リポソーム漏出、リポソーム融合、細胞融合、細胞溶解、およびエンドソーム放出。細胞膜の溶解を引き起こしうる膜活性ポリマーは、膜溶解性ポリマーとも呼ぶ。形質膜よりもエンドソームまたはリソソームの破壊を優先的に引き起こすポリマーはエンドソーム溶解性と考えられる。膜活性ポリマーの細胞膜に対する効果は一時的でありうる。膜活性ポリマーは、膜に対する親和性を有し、二重層構造の変性または変形を引き起こす。膜活性ポリマーは合成または非天然両親媒性ポリマーであってもよい。
【００５５】
ポリヌクレオチドの細胞への送達は、膜に孔を形成する、またはエンドソームもしくはリソソーム小胞を破壊し、それにより小胞の内容物を細胞質中に放出させることを含む、形質膜または内部の小胞膜（エンドソームまたはリソソームなど）を破壊または不安定化する、膜活性ポリマーによって仲介される。
【００５６】
エンドソーム溶解性
エンドソーム溶解性ポリマーは、pHの変化に反応して、エンドソームの破壊もしくは溶解を引き起こす、またはポリヌクレオチドもしくはタンパク質などの通常は細胞膜不透過性の化合物の、エンドソームもしくはリソソームなどの細胞内部の膜封入小胞からの放出を提供することができるポリマーである。エンドソーム溶解性ポリマーは、生理的に適切なpH範囲（通常はpH5.5〜8）にわたって、それらの物理化学的性質のシフトを起こす。このシフトは、電荷、疎水性、または親水性におけるシフトの結果としての、ポリマーの溶解性または他の化合物もしくは膜と相互作用する能力における変化でありうる。例示的エンドソーム溶解性ポリマーは、pHに不安定な基または結合を有する。したがって、マスキング剤がpHに不安定な結合を介してポリマーに結合している、可逆的にマスクした膜活性ポリ(ビニルエステル)は、エンドソーム溶解性ポリマーであると考えることができる。
【００５７】
親水性基
親水性基は、質的な用語で、化学基が水を好むことを示す。典型的には、そのような化学基は水溶性であり、水との水素結合供与体または受容体である。親水性基は荷電または非荷電でありうる。荷電基は正に荷電（アニオン）もしくは負に荷電（カチオン）または両方（両性イオン）でありうる。親水性基の例には、以下の化学部分が含まれる：炭水化物、ポリオキシエチレン、特定のペプチド、オリゴヌクレオチド、アミン、アミド、アルコキシアミド、カルボン酸、硫黄、およびヒドロキシル。
【００５８】
疎水性基
疎水性基は、質的な用語で、化学基が水を避けることを示す。典型的には、そのような化学基は水溶性ではなく、水素結合を形成しない傾向にある。疎水性基は脂肪、油、脂質、および非極性溶媒に溶解し、水素結合を形成する能力はほとんど、またはまったくない。2個またはそれ以上の炭素原子を含む炭化水素、特定の置換炭化水素、コレステロール、およびコレステロール誘導体は、疎水性基および化合物の例である。
【００５９】
疎水性基は好ましくは、炭素および水素原子だけを含む炭化水素である。しかし、疎水性を維持し、例えば、フッ素を含む非極性置換または非極性ヘテロ原子が認められることもある。この用語は、脂肪族基、芳香族基、アシル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、およびアラルキニル基を含み、これらはそれぞれ直鎖、分枝、または環式であってもよい。疎水性基なる用語は、ステロール、ステロイド、コレステロール、ならびにステロイドおよびコレステロール誘導体も含む。本明細書において用いられる低級疎水性モノマーまたは基は、2から6個の炭素原子を有する疎水性基を含む。本明細書において用いられる中級疎水性モノマーまたは基は、7から11個の炭素原子を有する疎水性基を含む。本明細書において用いられる高級疎水性モノマーまたは基は、12から36個またはそれ以上の炭素原子を有する疎水性基を含む。
【００６０】
標的指向基
標的指向基または部分は、それらが結合している結合体の薬物動態または生体分布特性を増強して、結合体の細胞特異的分布および細胞特異的取り込みを改善する。標的指向基は分子の標的細胞との結合を増強する。したがって、標的指向基は、それらが結合している結合体の薬物動態または生体分布特性を増強して、結合体の細胞分布および細胞取り込みを改善しうる。リガンドなどの標的指向基の細胞または細胞受容体への結合は、エンドサイトーシスを開始しうる。標的指向基は一価、二価、三価、四価であってもよく、またはより高い原子価を有していてもよい。標的指向基は、細胞表面分子に親和性を有する化合物、細胞受容体リガンド、ならびに細胞表面分子に親和性を有する抗体、抗体断片、および抗体様物質を含む群から選択してもよい。好ましい標的指向基は細胞受容体リガンドを含む。様々なリガンドが、薬物および遺伝子を細胞および特定の細胞受容体へと標的指向させるために用いられてきた。細胞受容体リガンドは、炭水化物、グリカン、糖類（ガラクトース、ガラクトース誘導体、マンノース、およびマンノース誘導体を含むが、それらに限定されるわけではない）、ビタミン、葉酸塩、ビオチン、アプタマー、およびペプチド（RGD含有ペプチド、インスリン、EGF、およびトランスフェリンを含むが、それらに限定されるわけではない）を含む群から選択してもよい。
【００６１】
ASGPr標的指向基
ガラクトースおよびガラクトース誘導体は、肝細胞表面上で発現されるアシアロ糖タンパク質受容体（ASGPr）へのそれらの結合を通じて、インビボで分子を肝細胞へと標的指向させるために用いられてきた。本明細書において用いられるASGPr標的指向基は、ガラクトースおよびガラクトースと等しいか、またはそれよりも大きいASGPrへの親和性を有するガラクトース誘導体（構造類縁体）を含む。ガラクトース標的指向部分のASGPrへの結合は、送達ポリマーの肝細胞への細胞特異的標的指向および送達ポリマーの肝細胞へのエンドサイトーシスを促進する。
【００６２】
ASGPr標的指向部分は、ラクトース、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）、ガラクトサミン、N-ホルミルガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-プロピオニルガラクトサミン、N-n-ブタノイルガラクトサミン、N-イソブタノイルガラクトサミン、オリゴ糖、糖クラスター（Tyr-Glu-Glu-(アミノヘキシルGalNAc)3、リジン系ガラクトースクラスター、およびコラン系ガラクトースクラスターなど）を含む群から選択してもよい（Iobst, S.T. and Drickamer, K. J.B.C. 1996, 271, 6686）。ASGPr標的指向部分はモノマー（例えば、1つのガラクトサミンを有する）またはマルチマー（例えば、複数のガラクトサミンを有する）の部分でありうる。さらなる適切な結合体には、アシアロ糖タンパク質受容体（ASGP-R）上で見いだされる炭水化物認識ドメイン（CRD）に結合しうるオリゴ糖が含まれうる。オリゴ糖および/または炭水化物複合体を含む例示的結合体部分は、米国特許第6,525,031号に提供されている。
【００６３】
いくつかの態様において、ASGPr標的指向基を、以下の構造で例示するPEGリンカーを通じて、無水マレイン酸などのアミン反応性基に連結する：
2014531476.tif 000015
式中、nは1から19（両端を含む）の間の整数である。
【００６４】
一つの態様において、ASGPr標的指向基はガラクトースクラスター（ガラクトースクラスター標的指向基）を含む。本明細書において用いられるガラクトースクラスターは、2から4つの末端ガラクトース誘導体を有する分子を含む。末端ガラクトース誘導体を分子に、そのC-1炭素を通じて結合する。好ましいガラクトースクラスターは、それぞれアシアロ糖タンパク質受容体に親和性を有する3つの末端ガラクトサミンまたはガラクトサミン誘導体を有する。より好ましいガラクトースクラスターは、3つの末端N-アセチルガラクトサミンを有する。当技術分野において一般的な他の用語には、三分岐ガラクトース、三価ガラクトースおよびガラクトーストリマーが含まれる。三分岐ガラクトース誘導体クラスターはASGPrに、二分岐または単鎖ガラクトース誘導体構造よりも大きい親和性で結合することが公知である（Baenziger and Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620；Connolly et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945）。
2014531476.tif 000016
【００６５】
ガラクトースクラスターはそれぞれ中心の分枝点に連結している3つのガラクトース誘導体を含む。ガラクトース誘導体は中心分枝点に糖のC-1炭素を通じて結合される。ガラクトース誘導体を好ましくは分枝点にリンカーまたはスペーサーを介して連結される。好ましいスペーサーは柔軟な親水性スペーサーである（米国特許第5885968号；Biessen et al. J. Med. Chem. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546）。好ましい柔軟な親水性スペーサーはPEGスペーサーである。好ましいPEGスペーサーはPEG3スペーサーである。分枝点は、3つのガラクトース誘導体の結合を可能にし、分枝点のRNAiポリヌクレオチドへの結合をさらに可能にする、任意の低分子でありうる。例示的分枝点基はジリジンである。ジリジン分子は、それを通じて3つのガラクトース誘導体が結合しうる3つのアミン基、およびそれを通じてジリジンがRNAiポリヌクレオチドに結合しうるカルボキシル反応性基を含む。
2014531476.tif 000017
【００６６】
立体安定化部分
本明細書において用いられる立体安定化部分は、立体安定化部分を含まないポリマーに比べて、それが結合しているポリマーの分子内または分子間相互作用を防止または阻害する、非イオン性親水性ポリマー（天然、合成、または非天然のいずれか）である。立体安定化部分は、それが結合しているポリマーが静電相互作用を起こすことを妨害する。静電相互作用は、正電荷と負電荷との間の引力による、2つまたはそれ以上の物質の非共有結合である。立体安定化部分は血液成分との相互作用を阻害し、したがって細網内皮系によるオプソニン作用、食作用、および取り込みを阻害することができる。したがって、立体安定化部分は、それらが結合している分子の循環時間を延長することができる。立体安定化部分はポリマーの凝集も阻害しうる。好ましい立体安定化部分はポリエチレングリコール（PEG）またはPEG誘導体である。本明細書において用いられる好ましいPEGは、約1〜500のエチレングリコールモノマー、2〜20のエチレングリコールモノマー、5〜15のエチレングリコールモノマー、または約10のエチレングリコールモノマーを有しうる。本明細書において用いられる好ましいPEGは、約85〜20,000ダルトン（Da）、約200〜1000Da、約200〜750Da、または約550Daの分子量平均も有しうる。本明細書において用いられる立体安定化部分は水溶液中で、立体安定化部分を含まないポリマーに比べて、それが結合しているポリマーの分子内または分子間相互作用を防止または阻害する。
【００６７】
構造類縁体は、もう1つの化合物と類似の構造を有するが、特定の成分に関して異なる化合物である。構造類縁体は、1つまたは複数の原子、官能基、または部分構造が異なり得、これらは他の原子、基、または部分構造で置き換えられている。典型的には、構造類縁体は、単一の元素の置換、すなわち、1つの原子または官能基の別の異なる元素の原子または官能基による置換で異なる。構造類縁体は、少なくとも理論的には、他方の化合物から生成されると推測することができる。したがって、構造類縁体は、他方の化合物と高い化学的類似性を有する。当技術分野において典型的に用いられるとおり、構造類似性にもかかわらず、構造類縁体は、非常に異なる物理的、化学的、または生化学的性質を有しうる。しかし、それらの規定された性質に関して本明細書において用いられるとおり、構造類縁体は、類似の物理的、化学的、または生化学的性質を有する。
【００６８】
表面電荷
ゼータ電位は、懸濁液中の粒子が示す物理的性質であり、表面電荷に密接に関連している。水性媒質中で、試料のpHはゼータ電位に影響をおよぼす最も重要な因子の1つである。電荷が塩基/酸のプロトン化/脱プロトン化に基づいている場合、電荷はpHに依存する。したがって、ゼータ電位の値が意味を持つためには、溶液の状態、特にpHを含まなければならない。典型的な粒子について、ゼータ電位の大きさはコロイド系の潜在的安定性の指標となる。懸濁液中のすべての粒子が大きい負または正のゼータ電位を有する場合、これらは互いに反発する傾向があり、粒子が一緒になる傾向はないであろう。しかし、粒子が低いゼータ電位値を有する場合、粒子が一緒になって凝集するのを防ぐ力はないであろう。典型的な粒子の安定懸濁液と不安定懸濁液との間の一般的境界線は、一般には+30または-30mVのいずれかとされる。+30mVよりも正または-30mVよりも負のゼータ電位を有する粒子は通常は安定と考えられる。記載の発明の送達ポリマーは、生理的塩およびpHで20mVから-20mVのゼータ電位を示すが、水溶液中でコロイドとして安定であり、凝集しない。
【００６９】
膜活性ポリアミンの正電荷、またはゼータ電位は、マスキング剤での修飾により低下する。ポリマー電荷、特に正電荷は、血清成分または非標的細胞と望まれない相互作用を引き起こしうる。正の表面電荷は、ポリマーの負に荷電した細胞膜との相互作用を増強することにより、膜活性においても役割を果たす。したがって、ほぼ中性の正味の電荷またはゼータ電位を有するインビボsiRNA送達媒体が好ましい。本発明の送達ポリマー、ASGPr標的指向基マスキング剤および立体安定化部分マスキング剤の可逆的結合により修飾した膜活性ポリアミンは、ほぼ中性の見かけの表面電荷を有し、血清中で安定である。より具体的には、本発明の送達ポリマーは、pH8で測定して+30から-30mVの間、+20から-20mVの間、+10から-10mVの間、または+5から-5mVの間のゼータ電位を有する。pH7では、結合体の正味の電荷はpH8での電荷よりも正であると予想される。正味の電荷、または表面電荷は、インビボ適用のための重要な因子である。
【００７０】
不安定な連結
連結またはリンカーは、関心対象の1つの化学基または区分を関心対象のもう1つの化学基または区分に、1つまたは複数の共有結合を介して連結する、2つの原子間の接続である。例えば、連結は修飾またはマスキング剤をポリマーに接続することができる。連結の形成は2つの別々の分子を1つの分子に接続することもあり、または同じ分子内の2つの原子を接続することもある。連結は中性電荷でもよく、または正もしくは負の電荷を有していてもよい。可逆的または不安定な連結は可逆的または不安定な結合を含む。連結は任意に2つのつなぎ合わせた原子間の距離を延ばすスペーサーを含んでいてもよい。スペーサーは連結に柔軟性および/または長さをさらに加えうる。スペーサーには、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、アラルキニル基が含まれるが、それらに限定されるわけではなく；これらはそれぞれ1つまたは複数のヘテロ原子、複素環、アミノ酸、ヌクレオチド、および糖類を含みうる。スペーサー基は当技術分野において周知で、前述のリストは本発明の範囲を制限する意図はない。
【００７１】
可逆的または不安定な結合は、同じ分子内の他の共有結合を分解または切断しない条件下で選択的に分解または切断されうる、水素原子への共有結合以外の共有結合である。より具体的には、可逆的または不安定な結合は、適切な条件下で同じ分子内の他の不安定でない共有結合よりも安定性が低い（熱力学的に）、またはより速やかに分解される（動力学的に）共有結合である。分子内の不安定な結合の切断は、2つの分子の生成を引き起こしうる。当業者にとって、結合の切断または不安定性は一般には結合切断の半減期（t1/2）（結合の半分が切断するのに要する時間）によって議論される。したがって、可逆的または不安定な結合は、分子内の他の結合よりも速やかに選択的に切断されうる結合を含む。
【００７２】
適切な条件は不安定な結合の型によって決まり、有機化学において周知である。不安定な結合はpH、酸化もしくは還元条件もしくは物質、温度、塩濃度、酵素の存在（ヌクレアーゼ、およびプロテアーゼを含むエステラーゼなど）、または添加した作用物質の存在に対して感受性でありうる。例えば、pH上昇または低下はpHに不安定な結合に対する適切な条件である。
【００７３】
不安定な基が変換を起こす速度は、不安定な基を含む分子の化学成分を変えることによって制御することができる。例えば、不安定な基の近くに特定の化学部分（例えば、電子受容体または供与体）を付加することで、化学変換が起こる特定の条件（例えば、pH）に影響をおよぼしうる。
【００７４】
本明細書において用いられる生理的に不安定な結合は、哺乳動物の体内で通常遭遇する条件、または遭遇するものに類似の条件下で切断可能な不安定な結合である。生理的に不安定な連結基は、特定の生理的条件にある場合に化学変換（例えば、切断）を起こすように選択される。
【００７５】
本明細書において用いられる細胞生理的に不安定な結合は、哺乳動物の細胞内条件下で切断可能な不安定な結合である。哺乳動物の細胞内条件には、哺乳動物の細胞において見られる、または遭遇するものに類似の、pH、温度、酸化または還元条件または物質、および塩濃度などの化学的条件が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解または加水分解酵素などの、哺乳動物の細胞において通常存在する酵素活性の存在も含まれる。半減期が45分未満で適切な条件下で切断される生理的に不安定な結合は、非常に不安定であると考えられる。半減期が15分未満で適切な条件下で切断される生理的に不安定な結合は、極度に不安定であると考えられる。
【００７６】
化学変換（不安定な結合の切断）は、不安定な結合を含む分子が適切な細胞内および/または細胞外環境に到達した場合に起こる。例えば、pHに不安定な結合は、分子が酸性化されたエンドソームに入ると切断されうる。したがって、pHに不安定な結合はエンドソームで切断可能な結合であると考えてもよい。酵素切断可能結合は、エンドソームもしくはリソソームまたは細胞質に存在するものなどの酵素に曝露された場合に切断されうる。ジスルフィド結合は、分子が細胞質のより還元性の環境に入った場合に切断されうる。したがって、ジスルフィドは細胞質で切断可能な結合であると考えてもよい。
【００７７】
本明細書において用いられるpHに不安定な結合は、酸性条件（pH＜7）下で選択的に分解される不安定な結合である。細胞エンドソームおよびリソソームは7未満のpHを有するため、そのような結合はエンドソームで不安定な結合と呼んでもよい。pHに不安定ななる用語は、pHに不安定、pHに非常に不安定、およびpHに極度に不安定な結合を含む。
【００７８】
アミド酸を生成するアミンの環状無水物との反応
2014531476.tif 000018
【００７９】
アミンおよび無水物を生成するアミド酸の切断はpH依存的で、酸性pHで大幅に加速される。このpH依存的反応性を利用して可逆的なpHに不安定な結合およびリンカーを生成することができる。
【００８０】
pHに非常に不安定な結合：pHに非常に不安定な結合は45分未満のpH5での切断の半減期を有する。pHに非常に不安定な結合の構築は化学の技術分野において周知である。
【００８１】
pHに極度に不安定な結合：pHに極度に不安定な結合は15分未満のpH5での切断の半減期を有する。pHに極度に不安定な結合の構築は化学の技術分野において周知である。
【００８２】
二置換環状無水物は、マスキング剤の本発明の膜活性ポリ(ビニルエステル)ポリマーへの修飾または結合のために特に有用である。これらは生理的にpHに不安定な連結を提供し、容易にアミンを修飾し、かつ細胞エンドソームおよびリソソームで見られる低いpHでの切断によってこれらのアミンを復元する。第二に、アミンとの反応によって作成されるαまたはβカルボン酸基は、ポリマーに対して予想される負電荷の約1/20しか寄与しないようである（Rozema et al. Bioconjugate Chemistry 2003）。したがって、ポリアミンの二置換無水マレイン酸による修飾は、高い負電荷を有するポリマーを作成するよりもむしろ、ポリアミンの正電荷を効果的に中和する。インビボ送達のためにはほぼ中性のポリマーが好ましい。
【００８３】
RNAiポリヌクレオチド-ポリヌクレオチド標的指向基結合体
RNAiポリヌクレオチド-ポリヌクレオチド標的指向基結合体を、RNAiポリヌクレオチドをポリヌクレオチド標的指向基に共有結合することにより生成する。ポリヌクレオチドを、それが反応性基Aを含むように合成または修飾する。標的指向基も、それが反応性基Bを含むように合成または修飾する。反応性基AおよびBは、それらが当技術分野において公知の方法を用いて共有結合を介して連結されうるように選択する。
【００８４】
ポリヌクレオチド標的指向基は、RNAiポリヌクレオチドの3'または5'末端に連結してもよい。siRNAポリヌクレオチドに対し、標的指向基はセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれに連結してもよいが、センス鎖が好ましい。
【００８５】
一つの態様において、ポリヌクレオチド標的指向基は疎水性基からなる。より具体的には、ポリヌクレオチド標的指向基は、少なくとも20個の炭素原子を有する疎水性基からなる。ポリヌクレオチド標的指向部分として用いる疎水性基は、本明細書において疎水性標的指向部分と呼ぶ。適切な例示的疎水性基は、コレステロール、ジコレステロール、トコフェロール、ジトコフェロール、ジデシル、ジドデシル、ジオクタデシル、ジドデシル、ジオクタデシル、イソプレノイド、およびコレアミドを含む群より選択してもよい。
【００８６】
疎水性標的指向基は、当技術分野において公知の方法を用いてRNAiポリヌクレオチドの3'または5'末端に結合してもよい。siRNAなどの2つの鎖を有するRNAiポリヌクレオチドに対し、疎水性基はいずれの鎖に結合してもよい。
【００８７】
ガラクトースクラスターは、当技術分野において公知の方法を用いてRNAiポリヌクレオチドの3'または5'末端に結合してもよい。siRNAなどの2つの鎖を有するRNAiポリヌクレオチドに対し、ガラクトースクラスターはいずれの鎖に結合してもよい。
【００８８】
ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチド、または核酸もしくはポリ核酸なる用語は、少なくとも2つのヌクレオチドを含むポリマーを意味する当技術分野の用語である。ヌクレオチドはポリヌクレオチドポリマーのモノマー単位である。120未満のモノマー単位を有するポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドと呼ぶことが多い。天然核酸はデオキシリボース-またはリボース-リン酸骨格を有する。非天然または合成ポリヌクレオチドは、インビトロまたは無細胞系で重合されるポリヌクレオチドで、天然リボースまたはデオキシリボース-リン酸骨格と同じまたは類似の塩基を含むが、天然のもの以外の型の骨格を含みうる。ポリヌクレオチドは任意の当技術分野において公知の技術を用いて合成することができる。当技術分野において公知のポリヌクレオチド骨格には、PNA（ペプチド核酸）、ホスホロチオアート、ホスホロジアミダート、モルホリノ、および天然核酸のリン酸骨格の他の変種が含まれる。塩基にはプリンおよびピリミジンが含まれ、これらにはさらに天然化合物アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然類縁体が含まれる。プリンおよびピリミジンの合成誘導体には、アミン、アルコール、チオール、カルボキシラート、およびハロゲン化アルキルなどであるが、それらに限定されるわけではない、ヌクレオチド上に新しい反応性基を配置する修飾が含まれるが、それらに限定されるわけではない。塩基なる用語は、DNAおよびRNAの任意の公知の塩基類縁体を含む。ポリヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、または任意の適切な組み合わせを含んでいてもよい。ポリヌクレオチドはインビトロで重合してもよく、組換えでもよく、キメラ配列、またはこれらの基の誘導体を含む。ポリヌクレオチドは5'末端、3'末端、または5'および3'両末端に末端キャップ基を含んでいてもよい。キャップ基は、逆方向デオキシ脱塩基基、逆方向デオキシチミジン基、チミジン基、または3'グリセリル修飾でありうるが、それらに限定されるわけではない。
【００８９】
RNA干渉（RNAi）ポリヌクレオチドは、配列特異的様式で導入遺伝子のメッセンジャーRNA（mRNA）転写物を分解またはその翻訳を阻害するための、哺乳動物細胞のRNA干渉経路機構との相互作用を通じてRNA干渉を誘導することができる分子である。2つの主なRNAiポリヌクレオチドは低分子（または短鎖）干渉RNA（siRNA）およびマイクロRNA（miRNA）である。RNAiポリヌクレオチドは、siRNA、miRNA、二本鎖RNA（dsRNA）、短鎖ヘアピンRNA（shRNA）、およびRNA干渉を誘導しうるRNAをコードする発現カセットを含む群より選択してもよい。siRNAは、典型的には15〜50塩基対、好ましくは21〜25塩基対を含み、細胞内で発現された標的遺伝子またはRNAにおけるコード配列と同じ（完全に相補的）またはほぼ同じ（部分的に相補的）ヌクレオチド配列を有する、二本鎖構造を含む。siRNAはジヌクレオチド3'オーバーハングを有していてもよい。siRNAは2つのアニールしたポリヌクレオチドまたはヘアピン構造を形成する1つのポリヌクレオチドからなっていてもよい。本発明のsiRNA分子はセンス領域およびアンチセンス領域を含む。一つの態様において、結合体のsiRNAは2つのオリゴヌクレオチド断片から構築され、ここで1つの断片はsiRNA分子のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含み、第二の断片はsiRNA分子のセンス領域のヌクレオチド配列を含む。もう一つの態様において、センス鎖はアンチセンス鎖に、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーなどのリンカー分子を介して接続される。マイクロRNA(miRNA）は、それらのmRNA標的の破壊または翻訳抑制を誘導する、約22ヌクレオチドの長さの小さい非コードRNA遺伝子産物である。miRNAと標的mRNAとの間の相補性が部分的である場合、標的mRNAの翻訳が抑制される。相補性が高度である場合、標的mRNAは切断される。miRNAについて、複合体は、典型的にはmiRNAと部分的相同性しか共有しないmRNAの3'UTRに通常は位置する標的部位に結合する。「シード領域」-その標的と完全な塩基対を形成する、miRNAの5'末端における約7つの連続するヌクレオチドのひと続きの配列-は、miRNA特異性において重要な役割を果たす。RISC/miRNA複合体のmRNAへの結合は、タンパク質翻訳の抑制またはmRNAの切断および分解のいずれかを引き起こしうる。最近のデータは、シード領域でのみ完全な塩基対形成を示す代わりに、miRNAおよびその標的の全長にわたり完全な相同性がある場合に、mRNA切断が優先的に起こることを示している（Pillai et al. 2007）。
【００９０】
RNAiポリヌクレオチド発現カセットは細胞内で転写されて、siRNA、別々のセンスおよびアンチセンス鎖直鎖siRNA、またはmiRNAとして機能しうる小さいヘアピンRNAを産生することができる。RNAポリメラーゼIII転写DNAは、U6プロモーター、H1プロモーター、およびtRNAプロモーターを含むリストから選択されるプロモーターを含む。RNAポリメラーゼIIプロモーターには、U1、U2、U4、およびU5プロモーター、snRNAプロモーター、マイクロRNAプロモーター、ならびにmRNAプロモーターが含まれる。
【００９１】
公知のmiRNA配列のリストは、特にWellcome Trust Sanger Institute、Penn Center for Bioinformatics、Memorial Sloan Kettering Cancer Center、およびEuropean Molecule Biology Laboratoryなどの研究組織によって維持されるデータベース中に見いだすことができる。公知の有効なsiRNA配列および同族の結合部位も関連する文献中に詳細に示されている。RNAi分子は当技術分野において公知の技術によって容易に設計され、産生される。加えて、有効かつ特異的配列モチーフを見いだす機会を高めるコンピューターツールがある（Pei et al. 2006, Reynolds et al. 2004, Khvorova et al. 2003, Schwarz et al. 2003, Ui-Tei et al. 2004, Heale et al. 2005, Chalk et al. 2004, Amarzguioui et al. 2004）。
【００９２】
本発明のポリヌクレオチドは化学的に修飾することができる。そのような化学的修飾の非限定例には、ホスホロチオアートヌクレオチド間連結、2'-O-メチルリボヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロリボヌクレオチド、2'-デオキシリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、5-C-メチルヌクレオチド、および逆方向デオキシ脱塩基残基組み込みが含まれる。これらの化学的修飾は、様々なポリヌクレオチド構築物において用いる場合、細胞内でポリヌクレオチド活性を保存するが、同時にこれらの化合物の血清安定性を高めることが示されている。化学的に修飾したsiRNAは、ヒトにおけるインターフェロン活性を活性化する可能性を最小限にすることもできる。
【００９３】
一つの態様において、本発明の化学的に修飾したRNAiポリヌクレオチドは、2つの鎖を有する二重鎖を含み、その一方または両方は化学的に修飾されていてもよく、ここで各鎖は約19から約29ヌクレオチドである。一つの態様において、本発明のRNAiポリヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むが、細胞または再構成したインビトロ系内部でRNAiを仲介する能力を維持している。RNAiポリヌクレオチドを修飾することができ、ここで化学修飾は1つまたは複数（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上）のヌクレオチドを含む。本発明のRNAiポリヌクレオチドは、RNAiポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドの総数のパーセンテージとして修飾ヌクレオチドを含みうる。したがって、本発明のRNAiポリヌクレオチドは一般にはヌクレオチドの位置の約5から約100％（例えば、ヌクレオチドの位置の5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％または100％）の修飾ヌクレオチドを含みうる。所与のRNAiポリヌクレオチド中に存在する修飾ヌクレオチドの実際のパーセンテージは、RNAiポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドの総数に依存する。RNAiポリヌクレオチドが一本鎖である場合、修飾パーセントは一本鎖RNAiポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドの総数に基づきうる。同様に、RNAiポリヌクレオチドが二本鎖である場合、修飾パーセントはセンス鎖、アンチセンス鎖、またはセンスおよびアンチセンス両方の鎖中に存在するヌクレオチドの総数に基づきうる。加えて、所与のRNAiポリヌクレオチド中に存在する修飾ヌクレオチドの実際のパーセンテージは、RNAiポリヌクレオチド中に存在するプリンおよびピリミジンヌクレオチドの総数にも依存しうる。例えば、ここでRNAiポリヌクレオチド中に存在するすべてのピリミジンヌクレオチドおよび/またはすべてのプリンヌクレオチドが修飾される。
【００９４】
RNAiポリペプチドは遺伝子によってコードされるRNAの発現を調節する。複数の遺伝子が互いにある程度の配列相同性を共有しうるため、RNAiポリヌクレオチドは十分な配列相同性を有する遺伝子のクラスを標的とするよう設計することができる。したがって、RNAiポリヌクレオチドは、異なる遺伝子標的の間で共有される、または特定の遺伝子標的に特有である、配列に対する相補性を有する配列を含むことができる。したがって、RNAiポリヌクレオチドは、いくつかの遺伝子間の相同性を有するRNA配列の保存領域を標的とし、それにより遺伝子ファミリー内のいくつかの遺伝子（例えば、異なる遺伝子アイソフォーム、スプライスバリアント、突然変異体遺伝子など）を標的とするよう設計することができる。もう一つの態様において、RNAiポリヌクレオチドは、1つの遺伝子の特定のRNA配列に特有な配列を標的とするよう設計することができる。
【００９５】
相補性なる用語は、ポリヌクレオチドが伝統的なワトソン-クリックまたは他の非伝統的な型のいずれかによりもう一つのポリヌクレオチド配列と水素結合を形成する能力を意味する。本発明のポリヌクレオチド分子に関して、ポリヌクレオチド分子のその標的（エフェクター結合部位）または相補的配列との結合自由エネルギーは、ポリヌクレオチドの関連する機能、例えば、酵素的mRNA切断または翻訳阻害を進行させるのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの判定は当技術分野において周知である（Frier et al. 1986, Turner et al. 1987）。相補性パーセントは、第二のポリヌクレオチド配列と水素結合（例えば、ワトソン-クリック塩基対形成）を形成しうる、第一のポリヌクレオチド分子の、近接鎖における塩基のパーセンテージ（例えば、10のうちの5、6、7、8、9、10は50％、60％、70％、80％、90％、および100％の相補性である）を示す。完全に相補性とは、ポリヌクレオチド配列の近接鎖中の塩基すべてが第二のポリヌクレオチド配列における同じ数の近接塩基と水素結合することを意味する。
【００９６】
遺伝子発現を阻害する、ダウンレギュレートする、またはノックダウンするとは、遺伝子から転写されたRNAのレベル、またはRNAから翻訳されたポリペプチド、タンパク質もしくはタンパク質サブユニットのレベルにより評価しての遺伝子の発現が、本発明の阻止ポリヌクレオチド結合体非存在下で観察されるものよりも低減されることを意味する。本発明の組成物により送達されるポリヌクレオチドによる、遺伝子発現の阻害、ダウンレギュレーション、またはノックダウンは、好ましくは対照不活性核酸、スクランブル配列もしくは不活化ミスマッチを含む核酸存在下、またはマスクしたポリマーへのポリヌクレオチドの結合非存在下で観察されるレベルよりも低い。
【００９７】
インビボ投与
薬理学および毒性学において、投与経路とは薬物、液体、毒、または他の物質を体に接触させる路である。一般に、哺乳動物を処置するための薬物および核酸の投与法は当技術分野において周知で、本発明の組成物の投与に適用することができる。本発明の化合物は、任意の適切な経路を介して、最も好ましくは非経口により、その経路に適切に合わせて作られた製剤で投与することができる。したがって、本発明の化合物は、注射により、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、または腹腔内投与することができる。したがって、本発明は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物も提供する。
【００９８】
投与の非経口経路には、シリンジおよび針またはカテーテルを用いる、血管内（静脈内、動脈内）、筋肉内、実質内、皮内、真皮下、皮下、腫瘍内、腹腔内、クモ膜下、硬膜下、硬膜外、およびリンパ内注射が含まれる。本明細書における血管内とは、体内の組織または臓器に接続される、血管と呼ばれる管状構造内を意味する。管状構造の腔内で、体液は体の部分に流動し、または体の部分から流動する。体液の例には、血液、脳脊髄液（CSF）、リンパ液、または胆汁が含まれる。血管の例には、動脈、細動脈、毛細血管、細静脈、洞様血管、静脈、リンパ管、胆管、および唾液腺または他の外分泌腺の管が含まれる。血管内経路には、動脈または静脈などの血管を通じての送達が含まれる。血液循環系は薬剤の全身拡散を提供する。
【００９９】
記載した組成物を、薬学的に許容される担体溶液中で注射する。薬学的に許容されるとは、薬理学的/毒性学的観点から哺乳動物に対して許容される性質および/または物質を意味する。薬学的に許容されるなる語句は、生理的に耐容でき、典型的には哺乳動物に投与した場合にアレルギー性または他の有害もしくは毒性反応を生じない、分子実体、組成物、および性質を意味する。好ましくは、本明細書において用いられる薬学的に許容されるなる用語は、動物、特にヒトにおいて用いるために、連邦もしくは州政府の規制機関により承認されている、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に収載されていることを意味する。
【０１００】
治療効果
RNAiポリヌクレオチドを研究目的のため、または細胞において治療的である変化を生じるために送達してもよい。RNAiポリヌクレオチドのインビボ送達は、研究試薬のため、ならびに様々な治療、診断、標的確認、ゲノム発見、遺伝子工学、および薬理ゲノミクス適用のために有用である。本発明者らは、肝細胞における内因性遺伝子発現の阻害をもたらすRNAiポリヌクレオチド送達を開示してきた。ポリヌクレオチドの送達後に測定したレポーター（マーカー）遺伝子発現のレベルは、他のポリヌクレオチド送達後の遺伝子発現が同様のレベルであるとの合理的な予想を示している。当業者により有益と考えられる処置のレベルは疾患ごとに異なる。例えば、血友病AおよびBはそれぞれX連鎖第VIIIおよび第IX凝固因子の欠失によって引き起こされる。これらの臨床経過は第VIIIまたは第IX因子の通常の血清レベルのパーセンテージによって大きく影響される：＜2％、重度；2〜5％、中等度；および5〜30％軽度。したがって、重度患者における循環因子の通常レベルの1％から2％への上昇は有益であると考えることができる。6％よりも高いレベルは自然出血を防止するが、手術または傷害に続発するものは防止しない。同様に、遺伝子の阻害は治療的利益を提供するために100％である必要はない。遺伝子療法の当業者であれば、マーカー遺伝子の結果の十分なレベルに基づき、疾患に特異的な遺伝子発現の有益なレベルを合理的に予想するであろう。血友病の例において、マーカー遺伝子が発現されて第VIII因子の通常レベルの2体積％に匹敵するレベルでタンパク質を生じる場合、第VIII因子をコードする遺伝子も同様のレベルで発現されるであろうと合理的に予期することができる。したがって、レポーターまたはマーカー遺伝子は一般に細胞内タンパク質の発現の有用な代表例として役立つ。
【０１０１】
肝臓は、その代謝（例えば、様々な高コレステロール血症におけるリポタンパク質代謝）および循環タンパク質の分泌（例えば、血友病における凝固因子）における中心的役割を考慮すると、RNAi療法の重要な標的組織である。加えて、慢性肝炎および肝硬変などの後天的障害は一般的で、RNAi療法によって処置できる可能性もある。肝臓に影響をおよぼす、または肝臓によって影響を受けるいくつかの疾患または状態は、肝臓における遺伝子発現のノックダウン（阻害）を通じて処置できる可能性がある。そのような肝疾患および状態は、肝臓癌（肝細胞癌、HCCを含む）、ウイルス感染症（肝炎を含む）、代謝障害（高脂血症および糖尿病を含む）、線維症、および急性肝傷害を含むリストから選択されうる。
【０１０２】
投与することになる送達ポリマーおよびRNAiポリヌクレオチド結合体の量（用量）は日常的実験を通じて決定することができる。本発明者らは、0.05〜20mg/kg動物体重のsiRNA結合体および1.5〜60mg/kg動物体重の送達ポリマーを用いて、遺伝子発現の有効なノックダウンを示している。マウスにおける好ましい量は0.25〜2.5mg/kgのsiRNA結合体および1〜40mg/kgの送達ポリマーである。より好ましくは、約2〜20mg/kgの送達ポリマーを投与する。
【０１０３】
本明細書において用いられるインビボとは、生物の内部で起こるもの、より具体的には、部分的または死んだものに対して、哺乳動物などの全体の生きている多細胞生物（動物）の生きている組織内または組織上で行われるプロセスを意味する。
【０１０４】
形質移入試薬
本明細書に記載のポリ(ビニルエステル)をインビトロ形質移入試薬として用いてもよい。インビトロでポリヌクレオチドを細胞に送達するプロセスは一般に形質移入または形質移入プロセスと呼ばれている。本明細書において用いられる形質移入なる用語は、ポリヌクレオチドが生物活性を有するような、細胞の外側から細胞の内側へのポリヌクレオチドの導入を意味する。ポリヌクレオチドを研究目的のため、または細胞において治療的でありうる変化を生じるために用いてもよい。ポリヌクレオチドの送達は標的細胞中に存在する遺伝物質の修飾につながりうる。
【０１０５】
インビトロ形質移入試薬は、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドに結合するか、またはそれらと複合体形成し、インビトロで細胞、典型的には哺乳動物細胞へのそれらの侵入を仲介する、化合物または化合物の組成物である。インビトロ形質移入試薬の例には、タンパク質およびポリマー複合体（ポリプレックス）、脂質およびリポソーム（リポプレックス）、ポリマーおよび脂質の組み合わせ（リポポリプレックス）、リン酸カルシウム沈澱、ならびにデンドリマーが含まれるが、それらに限定されるわけではない。典型的には、インビトロ形質移入試薬は、静電相互作用を介してオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの負電荷と結合または複合体形成する、正味の正電荷を有する成分を有する。カチオン性インビトロ形質移入試薬は、大きい核酸も凝縮しうる。インビボ送達のためのそれらの有用性に加えて、本明細書に記載のポリ(アクリラート)をインビトロ形質移入試薬として用いることもできる。インビトロ形質移入試薬としての使用のために、ポリ(アクリラート)はマスクしても、マスクしなくてもよい。
【実施例】
【０１０６】
実施例1. ポリマーモノマーの合成
A. 材料
酢酸ビニル（VAc）、酪酸ビニル（VBu）、酢酸Pd(II)、γ-(Boc-アミノ)酪酸（Boc-GABA）、5-(Boc-アミノ)吉草酸（Boc-5-Ava-OH）、吉草酸、二硫化炭素、水素化ナトリウム、テトラヒドロフラン（THF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ジフェニルアミン、クロロマロン酸ジエチル、および硫酸マグネシウム（MgSO4）はSigma-Aldrichから購入し、それ以上精製せずに用いた。モノマー3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオン酸ビニルエステル（BAPVE）はSigma-Aldrichから購入した後、酢酸エチルに溶解し、アルミナプラグを通過させて、阻害剤を除去した。
【０１０７】
B. 4-tert-ブトキシカルボニルアミノ-酪酸ビニルエステル（BABVE）3保護アミンビニルエステルモノマー
γ-(Boc-アミノ)酪酸2（Boc-GABA、10g、49.20mmol、CAS 57294-38-9）を酢酸ビニル1（450mL、4920mmol、CAS 108-05-4）に室温（RT）で溶解した。いったん溶解すれば、酢酸Pd(II)（2.21g、9.84mmol、CAS 3375-31-3）およびKOH（276mg、4.92mmol、CAS 1310-58-3）を加え、反応混合物を室温で終夜撹拌した。次いで、反応混合物を大過剰のジエチルエーテル中に移して、黒色Pd副産物を沈澱させた。次いで、溶液および沈澱をセライトを通してろ過し、黒色沈澱を除去した。次いで、得られた溶液を濃縮乾固し、生成物3をシリカカラムでヘキサン中15％酢酸エチル溶離剤を用いて精製した。典型的収率は70〜90％であった。分子量：229.28。
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【０１０８】
C. 5-tert-ブトキシカルボニルアミノ-吉草酸ビニルエステル（BAVVE）6保護アミンモノマー
5-(Boc-アミノ)吉草酸5（Boc-5-Ava-OH、10g、46.03mmol、CAS 27219-07-4）を酢酸ビニル1（424mL、4603mmol）に室温で溶解した。いったん溶解すれば、酢酸Pd(II)（2.07g、9.21mmol）およびKOH（258mg、4.60mmol）を加え、反応混合物を室温で終夜撹拌した。次いで、反応混合物を大過剰のジエチルエーテル中に移して、黒色Pd副産物を完全に沈澱させた。次いで、溶液および沈澱をセライトを通してろ過し、黒色沈澱を除去した。次いで、得られた溶液を濃縮乾固し、生成物6をシリカカラムで酢酸エチル/ヘキサン溶離剤を用いて精製した。典型的収率は70〜90％であった。分子量：243.31。
2014531476.tif 000020
【０１０９】
D. 吉草酸ビニル（VV）8疎水性モノマー（CAS 5873-43-8）
吉草酸7（5g、48.96mmol、CAS 109-52-4）を酢酸ビニル1（450mL、4896mmol）に室温で溶解した。いったん溶解すれば、酢酸Pd(II)（2.20g、9.79mmol）およびKOH（275mg、4.89mmol）を加え、反応混合物を室温で終夜撹拌した。次いで、反応混合物を大過剰のジエチルエーテル中に移して、黒色Pd化合物を完全に沈澱させた。次いで、溶液および沈澱をセライトを通してろ過し、黒色沈澱を除去した。次いで、得られた溶液を濃縮乾固し、生成物をシリカカラムで酢酸エチル/ヘキサン溶離剤を用いて精製した。典型的収率は約30％であった。分子量：128.17。
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【０１１０】
E. 3-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-エトキシ)-プロピオン酸ビニルエステル（BEPVE）の合成
1）3-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-エトキシ)-プロピオン酸tert-ブチルエステルの合成
火炎乾燥し、アルゴンでパージした丸底フラスコ中、Boc-エタノールアミン（10mL、64.64mmol）およびアクリル酸tert-ブチル（18.82mL、129.28mmol）をジオキサン（25mL）に溶解し、25℃まで加熱した。60％KOH溶液（1.5mL）を加え、反応混合物を25℃で終夜撹拌した。反応をTLCでモニターし、出発Boc-エタノールアミンの大部分が消費されるまでKOH溶液を追加した。次いで、反応混合物をDCMと混合し、脱イオン水で3回と食塩水で1回洗浄した。有機層を回収し、Na2SO4で乾燥し、溶媒をロータリーエバポレーションにより除去した。得られた油状物をシリカカラムで酢酸エチル/ヘキサン溶離剤を用いて精製した。収率＝70％。
【０１１１】
2）3-(2-アミノ-エトキシ)-プロピオン酸
3-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-エトキシ)-プロピオン酸tert-ブチルエステル（10g）をトリフルオロ酢酸（TFA）/DCM＝1：1混合物（100mL）に溶解し、室温で1時間撹拌した。次いで、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、得られた油状物をDCMに再溶解し、濃縮乾固した。この工程を残留TFA臭が最小限になるまで繰り返した後、油状物を高減圧下で数時間乾燥した。
【０１１２】
3）3-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-エトキシ)-プロピオン酸
3-(2-アミノ-エトキシ)-プロピオン酸を最少量の脱イオン水に溶解した後、1M NaOHを注意深く加えてpHを8.5まで高めた。pH調節後、Boc2O（THF中1M、2当量）を溶液に滴加し、これを室温で終夜撹拌した。THFをロータリーエバポレーションにより除去し、反応混合物を酢酸エチル/メタノール＝1：1に溶解し、10％クエン酸溶液で洗浄した。水層を酢酸エチルで3回と、DCMで2回抽出した。有機層を合わせ、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮乾固した。得られた粗製油状物をシリカゲルクロマトグラフィで酢酸エチル/ヘキサン溶離剤により精製した。収率＝30％。
【０１１３】
4）3-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-エトキシ)-プロピオン酸ビニルエステル
3-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-エトキシ)-プロピオン酸（3.72g、15.95mmol）を酢酸ビニル（147mL、1595mmol）に溶解した。酢酸Pd(II)（716mg、3.19mmol）およびKOH（89mg、1.59mmol）を反応混合物に加え、終夜撹拌した。反応混合物を大過剰のジエチルエーテル中に移して、黒色Pd副産物を完全に沈澱させた。次いで、溶液および沈澱をセライトを通してろ過し、黒色沈澱を除去した。次いで、得られた溶液を濃縮乾固し、生成物をシリカカラムで酢酸エチル/ヘキサン溶離剤を用いて精製した。収率＝60％。
2014531476.tif 000022
【０１１４】
F. マロナートN,N-ジフェニルジチオカルバマート（MDPD）の合成
MDPDをShippらによって記載された手順に従って合成した。簡単に言うと、NaH（1.24g、0.0520mol）をTHF（10mL）に懸濁し、氷浴を用いて0℃まで冷却した。DMSO（18mL）およびTHF（9mL）中のジフェニルアミン（3.38g、0.0200mol）の溶液を加え、0℃で1時間撹拌した。二硫化炭素（2.84mL、0.0472mol）を加え、溶液を0℃でさらに30分間撹拌した。次いで、溶液をエチレングリコール/CO2浴を用いて冷却した後、クロロマロン酸ジエチル（3.23mL、0.0200mol）を加え、室温でさらに2時間撹拌した。任意の残存NaHをメタノールで加水分解し、生成物をジエチルエーテルで抽出した。次いで、揮発性物質を除去し、生成物をシリカカラム（酢酸エチル：ヘキサン混合物＝10：90でジフェニルアミン不純物を除去し、続いて30：70で生成物を溶出）を用いて精製した。生成物を減圧下で乾燥して、黄色固体を得た（収率72％）。
【０１１５】
実施例2. ビニルエステルモノマーのRAFT共重合による両親媒性カチオン性ポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマーの生成
A. 可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）重合をShipp et al. 2009に従い、マロナートN,N-ジフェニルジチオカルバマート9（MDP-DTC）を用いて実施した。
2014531476.tif 000023
Vidyasagar Malepu et al. ''RAFT Polymerization of Vinyl Acetate, Styrene and Acrylates Using N,N-Dithiocarbamates'' in Controlled/Living Radical Polymerization: Progress in RAFT, DT, NMP & OMRP, Matyjaszewski K, editor; ACS Symposium Series, Vol. 1024, chapter 3, pp 37-47; American Chemical Society, Washington D.C., 2009。
【０１１６】
B. ポリマー計算：ポリマーの理論分子量（Mn, th）、モノマーのモル数、連鎖移動剤のモル数、イニシエーターのモル数
モノマーAおよびBからのポリマーP合成のための一般的反応
2014531476.tif 000024
A＝親水性モノマー
B＝疎水性モノマー
P＝ポリマー
C＝連鎖移動剤（CTA）
I＝イニシエーター
ポリマーPのためのモノマー平均分子量の計算
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％A＝ポリマーPにおける親水性モノマーAのパーセント
％B＝ポリマーPにおける疎水性モノマーBのパーセント
MWA＝親水性モノマーAの分子量
MWB＝疎水性モノマーBの分子量
2014531476.tif 000026
＝ポリマーモノマーの平均分子量
所望の（理論）分子量Mn, th（以下の式中のMn）を有するポリマーPにおけるモノマーの数の計算：
2014531476.tif 000027
nAB＝理論分子量Mn, thを有するポリマーPにおけるモノマーの数
理論分子量Mn, thを有するポリマーPのxグラム中のモノマーAおよびBのモル数の計算：
2014531476.tif 000028
モルA＝親水性モノマーAのモル数
モルB＝疎水性モノマーBのモル数
理論分子量Mn, thを有するポリマーPをxグラム合成するための連鎖移動剤のモル数の計算：
2014531476.tif 000029
モルC＝連鎖移動剤のモル数
理論分子量Mn, thを有するポリマーPをxグラム合成するためのイニシエーターのモル数の計算：
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モルI＝イニシエーターのモル数
【０１１７】
C. 保護アミンビニルエステルランダムコポリマーのRAFT重合のための一般的手順
CTAおよびイニシエーターを、高減圧下で乾燥した反応容器内で混合する。親水性モノマーを加え、混合物をN2通気により1時間脱気する。過剰の疎水性モノマーの別のバイアルを同様に脱気する。測定した量の脱気疎水性モノマーを反応容器に加え、混合物を95℃で終夜撹拌する。約16時間後、反応容器を熱から取り除き、溶液を室温まで冷却する。得られたゲルをジクロロメタン（DCM）に溶解し、ポリマーをヘキサン（約8倍容量）の添加により沈澱させる。遠心分離後、溶液をデカンテーションし、ポリマーをヘキサンで洗浄する。洗浄したポリマーをDCMに再溶解し、ヘキサン（約8倍容量）で再度沈澱させる。遠心分離後、溶液をデカンテーションし、ポリマーを高減圧下で乾燥する。
2014531476.tif 000031
【０１１８】
D. NMR分析
ポリマーの試料をCDCl3中7.5mg/mlで調製する。1H-NMRスペクトルをVarian 400Hz MR装置により、2秒の緩和遅延で、32〜64回走査して得る。スペクトルを、手動で移相合わせした後、積分および基準線補正して解析する。
【０１１９】
E. MALS（多角度光散乱）分子量解析
ポリマーの試料を、0.02μmワットマンanodiscでろ過したDCN、20％THF、5％ACNの緩衝液中、10mg/mlに合わせる。次いで、溶液を0.1μmワットマンanotopフィルターを通してろ過する。試料を前記緩衝液中0.75ml/分でJordi Gel DVB混合床分析カラムを通す。次いで、試料をHELEOS光散乱検出器およびoptilab REX RI検出器を通過させる。データを収集し、ASTRA Vソフトウェアを用い、以前に求めた0.63ml/gmのdn/dcを用いて解析する。ASTRA V解析によりMwおよびMnを得る。
【０１２０】
実施例3. ポリ(5-tert-ブトキシカルボニルアミノ吉草酸ビニルエステル-コ-酪酸ビニル)、P(BAVVE-co-VBu)の合成
A. アミン保護DAN-41947-106ポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマー合成
マロナートN,N-ジフェニルジチオカルバマート（MDPC、2.56mg、0.0066mmol）および過酸化ベンゾイル（BPO、0.795mg、0.00328mmol）を反応容器中で乾燥し、5-tert-ブトキシカルボニルアミノ-吉草酸ビニルエステル3（1.00g、4.11mmol）を加えた。混合物をN2通気により1時間脱気した。酪酸ビニル（VBu）の別のバイアルを同様に脱気した。VBu（345μL、2.74mmol、CAS 123-20-6）を反応容器に加え、混合物を95℃で終夜撹拌した。約16時間後、反応容器を熱から取り除き、溶液を室温（RT）まで冷却した。得られたゲルを5mLのDCMに溶解し、ポリマーを40mLのヘキサンの添加により沈澱させた。遠心分離後、溶液をデカンテーションし、ポリマーを5mLのヘキサンで洗浄した。洗浄したポリマーを5mLのDCMに再溶解し、40mLのヘキサンで再度沈澱させた。遠心分離後、溶液をデカンテーションし、ポリマーを高減圧下で乾燥した。
2014531476.tif 000032
2014531476.tif 000033
【０１２１】
B. ポリマーの沈澱
乾燥後、ポリマーをDCMに100mg/mLの濃度で溶解し、ヘキサンの添加により完全または分別沈澱させた。
【０１２２】
(コ)ポリマーの完全沈澱および分別沈澱
重合後、反応溶液を室温まで冷却し、50mL遠沈管に移した。DCM（2mL）を用いて反応容器を洗浄し、反応溶液の移動を助けた後、ヘキサン（35mL）を溶液に加えた。溶液を4,400rpmで2分間遠心分離した。上清層を注意深くデカンテーションし、下（粘性の液体または固体）層をヘキサンで洗浄した。下層をDCM（7mL）に再溶解し、ヘキサン（35mL）中で沈澱させ、もう1回遠心分離した。上清をデカンテーションし、下層をヘキサンで洗浄した後、ポリマーを減圧下で数時間乾燥した。
【０１２３】
(コ)ポリマーの分別沈澱
重合後、反応溶液を室温まで冷却し、50mL遠沈管に移した。DCM（2mL）を用いて反応容器を洗浄し、反応溶液の移動を助けた後、ヘキサン（35mL）を溶液に加えた。溶液を4,400rpmで2分間遠心分離した。上清層を注意深くデカンテーションし、下（粘性の液体または固体）層をヘキサンで洗浄した。下層をDCM（100mg/mLポリマー）に再溶解した後、ヘキサンを加えた。この場合、全ポリマーの半分を沈澱させるのに十分なヘキサン−典型的には、溶液が曇点をちょうど超えるのに必要な量を加えた。この点に達するために加えるヘキサンの量は、コポリマー溶液の種類および分子量に依存して変動した。混濁混合物を遠心分離（4,400rpmで3分間）し、2つの液体層を形成した。より濃稠の下層をガラスピペットを用いて除去し、DCM（5mL）で希釈し、ヘキサン（30mL）を加えることにより完全に沈澱させて分画1を得た。ヘキサンを上層に加えて、全量50mLとし、分画2を完全に沈澱させた。両方の沈澱を遠心分離（4,400rpmで2分間）し、上清をデカンテーションして分画を回収し、沈澱したポリマーをヘキサンで洗浄し、最後に減圧下で数時間乾燥した。
【０１２４】
C. ポリマーの脱保護
乾燥したポリマーを5〜10mLの酢酸中2M HCl溶液に溶解し、室温で1時間撹拌した。反応混合物を40mLの脱イオン水（dH2O）で希釈し、公称MWCO約3500の透析バッグに入れ、高い塩（NaCl）中8〜16時間の透析を2回と、dH2O中8〜16時間の透析を2回行った。次いで、ポリマーを凍結乾燥した。
2014531476.tif 000034
【０１２５】
BAVVEのVAc、VPr、VBu、またはVVとの共重合のために、同様の手順を行った。いくつかの場合に、脱気前に0〜3mLの酢酸ブチルを反応混合物に加えた。MDPD、イニシエーター、およびモノマーの相対濃度を変えた。
【０１２６】
（表１）例示的なBAVVE系ポリ(ビニルエステル)コポリマー
2014531476.tif 000035
【０１２７】
実施例4. ポリ(5-tert-ブトキシカルボニルアミノプロピオン酸ビニルエステル-コ-酪酸ビニル)、P(BAPVE-co-VBu)の合成
マロナートN,N-ジフェニルジチオカルバマート（MDPD、0.00876g、0.0217mmol）、AIBN（0.89mg、0.00542mmol）、BAPVE（0.800g、0.00374mol）、および酢酸ブチル（BuAc、1mL）の溶液を20mlバイアルに加え、N2通気により1時間脱気した。酪酸ビニル（VBu）の別のバイアルを同様に脱気した後、シリンジにより加えた（0.316mL、0.00249mmol）。混合物を80℃で4時間撹拌し、次いで室温まで冷却した。得られた粘性溶液を5mLのDCMに溶解し、ポリマーを40mLのヘキサンの添加により沈澱させた。遠心分離後、上部の溶媒をデカンテーションし、ポリマーを5mLのヘキサンで洗浄した。洗浄したポリマーを5mLのDCMに再溶解し、40mLのヘキサンでもう1回沈澱させた。遠心分離後、上部の溶媒層をデカンテーションし、ポリマーを高減圧下で乾燥した。
2014531476.tif 000036
【０１２８】
（表２）例示的なBAPVE系ポリ(ビニルエステル)コポリマー
2014531476.tif 000037
a-Mn,th
【０１２９】
BAPVEのVAc、VPr、VBu、またはVVとのすべての共重合のために、同様の手順を行った。いくつかの場合に、脱気前に0〜3mLのBuAcを反応混合物に加え、一方、BPOおよびADMVなどの別のイニシエーターも用いた。MDPD、イニシエーター、およびモノマーの相対濃度を変えた。
【０１３０】
実施例5. ポリ(4-tert-ブトキシカルボニルアミノ酪酸ビニルエステル-コ-酪酸ビニル)、P(BABVE-co-VBu)の合成
マロナートN,N-ジフェニルジチオカルバマート（MDPD、2.56mg、0.00634mmol）および過酸化ベンゾイル（0.767mg、0.00317mmol）のTHF溶液を20mlバイアルに加え、減圧下で30分間乾燥した後、BABVE（0.800mg、0.00351mol）を加えた。混合物をN2通気により1時間脱気した。酪酸ビニルの別のバイアルを同様に脱気した。酪酸ビニル（296μL、0.00234mol）を反応容器に加え、混合物を95℃で終夜撹拌した。16時間後、反応容器を熱から取り除き、溶液を室温まで冷却した。得られたゲルを5mLのDCMに溶解し、ポリマーを40mLのヘキサンの添加により沈澱させた。遠心分離後、溶液をデカンテーションし、ポリマーを5mLのヘキサンで洗浄した。洗浄したポリマーを5mLのDCMに再溶解し、40mLのヘキサンでもう1回沈澱させた。遠心分離後、溶液をデカンテーションし、ポリマーを高減圧下で乾燥した。
2014531476.tif 000038
【０１３１】
BAPVEのVAc、VPr、VBu、またはVVとの共重合のために、同様の手順を行った。いくつかの場合に、脱気前に0〜3mLの酢酸ブチルを反応混合物に加えた。MDPD、イニシエーター、およびモノマーの相対濃度を変えた。
【０１３２】
（表３）例示的なBABVE系ポリ(ビニルエステル)コポリマー
2014531476.tif 000039
【０１３３】
実施例6. ポリ3-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノエトキシ)プロピオン酸ビニルエステル-コ-酪酸ビニル)、P(BEPVE-co-VBu)の合成
マロナートN,N-ジフェニルジチオカルバマート（MDPD、2.14mg、0.0134mmol）、アゾビスイソブチロニトリル（AIBN、1.09mg、0.00665mmol）、およびBEPVE（505mg、0.00214mol）の溶液を20mlバイアルに加え、N2通気により1時間脱気した。酪酸ビニルの別のバイアルを同様に脱気した。酪酸ビニル（162mg、0.00143mol）を反応容器に加え、混合物を95℃で終夜撹拌した。16時間後、反応容器を熱から取り除き、溶液を室温まで冷却した。得られた粘性溶液を5mLのDCMに溶解し、ポリマーを40mLのヘキサンの添加により沈澱させた。遠心分離後、溶液をデカンテーションし、ポリマーを5mLのヘキサンで洗浄した。洗浄したポリマーを5mLのDCMに再溶解し、40mLのヘキサンでもう1回沈澱させた。遠心分離後、溶液をデカンテーションし、ポリマーを高減圧下で乾燥した。
2014531476.tif 000040
【０１３４】
BEPVEのVAc、VPr、VBu、またはVVとの共重合のために、同様の手順を行った。いくつかの場合に、脱気前に0〜3mLの酢酸ブチルを反応混合物に加えた。MDPD、イニシエーター、およびモノマーの相対濃度を変えた。
【０１３５】
実施例7. マスキング剤
A. ガラクトース二置換無水マレイン酸マスキング剤
1）化合物10
2014531476.tif 000041
式中
Yは、下記などであるが、それらに限定されるわけではない、中性リンカーであり：
-(CH2)a-(O-CH2-CH2)b-NH-CO-(CH2)c-、ここでa、bおよびcは独立に1〜6の整数であり、かつ
Rは、下記を含むリストから選択される、アシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を有するガラクトース誘導体である：
OH（ガラクトース）、
NH2（D-ガラクトサミン）、
NH-CO-H（N-ホルミル-D-ガラクトサミン）、
NH-CO-CH3（N-アセチル-D-ガラクトサミン（GalNAc））、
NH-CO-CH2CH3（N-プロピオニル-D-ガラクトサミン）、
NH-CO-CH2CH2CH3（N-n-ブタノイル-D-ガラクトサミン）、および
NH-CO-CH(CH3)2（N-イソ-ブタノイル-D-ガラクトサミン）。
無水マレイン酸のポリマー上のアミン基との反応により、ガラクトースとポリマーアミンとの間のpHに不安定な連結が生成する。
【０１３６】
2）化合物11
2014531476.tif 000042
式中
Yは、下記などであるが、それらに限定されるわけではない、中性リンカーであり：
-NH-(CH2-CH2-O)b-(CH2)a-、ここでbおよびcは独立に1〜6の整数であり、かつ
Rは化合物10について上で規定したとおりである。
【０１３７】
3）化合物12
2014531476.tif 000043
式中、nは1〜6の整数であり、かつRは化合物10について上で規定したとおりである。
【０１３８】
4）化合物13：N-アセチル-ガラクトサミン-PEG-メチル無水マレイン酸
2014531476.tif 000044
式中、nは1〜6の整数である。
【０１３９】
5）化合物14において例示するとおり、アルキルスペーサー基を用いてもよい。
2014531476.tif 000045
式中、nは1〜10の整数であり、かつRは化合物10について上で規定したとおりである。
【０１４０】
B. ポリエチレングリコール二置換無水マレイン酸マスキング剤
1）化合物15
2014531476.tif 000046
式中、Rは中性であり、ポリエチレングリコールを含む。
無水マレイン酸のポリマー上のアミン基との反応により、PEGとポリマーアミンとの間のpHに不安定な連結が生成する。
【０１４１】
2）化合物16
2014531476.tif 000047
式中
nは1から500の整数であり、かつ
Rは-H、-CH3、および-CH2-CH3からなる群より選択される。
好ましくは、nは2から100の整数である。より好ましくは、PEGは5から20のエチレン単位を含む（nは5から20の整数である）。より好ましくは、PEGは10〜14のエチレン単位を含む（nは10から14の整数である）。PEGは変動する長さのものであってもよく、5〜20または10〜14エチレン単位の平均長を有する。または、PEGは、例えば、ちょうど11または13エチレン単位を有する、単分散、均一または離散であってもよい。
【０１４２】
C. ジペプチドマスキング剤、化合物16
2014531476.tif 000048
R1およびR2はアミノ酸のR基であり、
R4は立体安定化部分の標的指向リガンドであり、
Xは-NH-、-O-、または-CH2-であり、
Yは-NH-または-O-であり
R5は2、4、または6位にあって、-CH2-O-C(O)-O-Zであり、ここでZカルボナート、かつ
R6は、R5が占める位置を除く2、3、4、5、または6位のそれぞれで独立に水素、アルキル、またはハロゲン化物である。
【０１４３】
実施例8. siRNAのポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマーへの、ジスルフィド結合を介しての結合
ジスルフィド結合は、典型的な哺乳動物細胞中の還元環境において、変動する切断の動力学で形成されうる。
【０１４４】
A. SATA/SMPT連結
N-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセタート（SATA）-修飾ポリヌクレオチドを、5'-アミン修飾siRNAの1重量当量のSATA試薬（Pierce）および0.36重量当量のNaHCO3との水中、4℃で16時間の反応により合成した。保護チオール修飾siRNAを、9倍量のエタノールの添加によって沈澱させ、-78℃で2時間インキュベートした。沈澱を単離し、1×siRNA緩衝液（Dharmacon）に溶解し、260nmの波長で吸光度を測定することにより定量した。
【０１４５】
別に、5mM TAPS、pH9中のポリマーを、1.5重量％4-スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチル-α-[2-ピリジルジチオ]-トルエン（SMPT、Pierce）の添加によって修飾した。SMPT添加の1時間後、SMPT-ポリマーを5mM TAPS、pH9を含む等張グルコース溶液に加えた。この溶液に、SATA修飾siRNAを加えた。得られたポリヌクレオチド-ポリマーを結合するジスルフィド結合は細胞質の還元環境において可逆的である。
2014531476.tif 000049
次いで、HEPES遊離塩基と、続いてCDM-NAGおよび/またはCDM-PEGの混合物を溶液に加えることにより、siRNA-ポリマー結合体をマスクした。次いで、溶液を室温（RT）で1時間インキュベートした後、注入した。
【０１４６】
B. SATA/SPDP連結
センス鎖上に5'-アミノ基を有するsiRNAをSATAと、HEPES塩基、pH7.5存在下で反応させた。別に、ポリマーを3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（SPDP）と、HEPES、pH7.5存在下で反応させた。次いで、修飾siRNAおよび修飾ポリマーを合わせて、siRNAをポリマーに共有結合させた。
2014531476.tif 000050
【０１４７】
C. 5-メチル-2-イミノチオラン連結
鎖末端アミノ基を有するsiRNAをS-アセチル基と反応させて、siRNA-SAcを得る。ポリマーを5-メチル-2-イミノチオラン（M2IT）と、5,5'-ジチオ-ビス-(2-ニトロ安息香酸)（DTNB）存在下で反応させて、活性化ジスルフィドを有するポリマーを得る。
2014531476.tif 000051
次いで、上の修飾ポリマーをsiRNA-SAcと反応させて、siRNA-ポリマー結合体を生成する。
2014531476.tif 000052
【０１４８】
C. 無水マレイン酸連結
鎖末端アミノ基を有するsiRNAを、追加のアミン反応性基、例えば、CDM-チオエステルも含む、2-プロピオン酸-3-メチル無水マレイン酸などの二置換無水マレイン酸誘導体と、アルカリ性緩衝液（例えば、HEPES、pH7.9）存在下で反応させる。siRNA-無水マレイン酸にポリ(ビニルエステル)を加える。次いで、無水マレイン酸がポリマー上のアミンと反応する。
2014531476.tif 000053
【０１４９】
実施例9. 膜活性ポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマーの可逆的修飾（マスキング）
A. 無水マレイン酸系マスキング剤による修飾
修飾前に、5〜7×mgの二置換無水マレイン酸マスキング剤（例えば、CDM-NAG）を氷酢酸の0.1％水溶液から凍結乾燥した。乾燥した二置換無水マレイン酸マスキング剤に、0.2×mLの等張グルコースおよび10×mgのHEPES遊離塩基中×mgのポリマーの溶液を加えた。無水物が完全に溶解した後、溶液を室温で少なくとも30分間インキュベートし、その後動物に投与した。二置換無水マレイン酸マスキング剤のポリマーとの反応により下記を得た：
2014531476.tif 000054
式中、Rはポリ(ビニルエステル)ポリマーであり、かつR1は標的指向リガンドまたは立体安定化部分を含む。無水物とポリマーアミンとの間の反応中に生じた無水物カルボキシルは、予想される電荷の約1/20を示す（Rozema et al. Bioconjugate Chemistry 2003）。したがって、膜活性ポリマーは、高度に負に荷電したポリアニオンに変換されるのではなく、有効に中性化される。
【０１５０】
いくつかの適用において、ポリマーを2段階工程で修飾した。まずCDM系マスキング剤をシールディング（PEG）および標的指向基と、シールディングの標的指向基に対する重量比2：1で混合した。ポリマーを2×mgのCDMマスキング剤混合物で30分間修飾した後、siRNAを結合した。次いで、ポリマー-siRNA結合体を5×mgのCDMマスキング剤混合物でさらに修飾した。次いで、溶液を室温（RT）で少なくとも1時間インキュベートした後、動物に注射した。
【０１５１】
B. プロテアーゼ切断可能マスキング剤による修飾
p-アシルアミドベンジルアルコール誘導体の活性化（アミン反応性）カルボナートを、両親媒性膜活性ポリアミンのアミノ基と、H2O中、pH＞8で反応させて、p-アシルアミドベンジルカルバマートを得る。
2014531476.tif 000055
R1は標的指向基リガンド（保護または非保護のいずれか）またはPEGを含み、
R2は両親媒性膜活性ポリ(ビニルエステル)であり、
AAはジペプチド（保護または非保護のいずれか）であり、かつ
Zはアミン反応性カルボナートである。
【０１５２】
×mgのポリマーに等張グルコース中の10〜12×mgのHEPES遊離塩基を加えた。緩衝化ポリマー溶液に2×から16×mgのDMF中200mg/mlジペプチドマスキング剤を加えた。いくつかの適用において、ポリマーを2×mgのジペプチドマスキング剤で修飾した後、siRNAを結合した。次いで、ポリマー-siRNA結合体を6×から8×mgのジペプチドマスキング剤でさらに修飾した。次いで、溶液を室温（RT）で少なくとも1時間インキュベートした後、動物に注射した。いくつかの適用において、ポリマーを2×mgのPEGジペプチドマスキング剤で修飾した後、siRNAを結合した。次いで、ポリマー-siRNA結合体を6×から8×mgの標的指向リガンドジペプチドマスキング剤でさらに修飾した。次いで、溶液を室温（RT）で少なくとも1時間インキュベートした後、動物に注射した。
【０１５３】
いくつかの適用において、ポリマーを2×mgのジペプチドマスキング剤で修飾した後、siRNAを結合した。次いで、ポリマー-siRNA結合体を6×から8×mgのCDM系マスキング剤でさらに修飾した。次いで、溶液を室温で少なくとも1時間インキュベートした後、動物に注射した。いくつかの適用において、ポリマーを2×mgのPEGジペプチドマスキング剤で修飾した後、siRNAを結合した。次いで、ポリマー-siRNA結合体を6×から8×mgの標的指向リガンドCDM系マスキング剤でさらに修飾した。次いで、溶液を室温（RT）で少なくとも1時間インキュベートした後、動物に注射した。
【０１５４】
実施例10. 結合体形成-マスキングおよびポリヌクレオチド結合
A）ポリマーをSMPTで修飾した。1時間後、2重量当量のCDM-NAG（N-アセチルガラクトースアミン）および/またはCDM-PEG（平均11単位）をポリマーに、HEPES塩基存在下で加えた。この溶液に、SATA-siRNAを加えた。終夜インキュベートした後、CDM-NAGおよび/またはCDM-PEGが結合体に付加された。
【０１５５】
B）ポリマーをSMPTで修飾した。1時間後、2重量当量のPheCit-NAG（N-アセチルガラクトースアミン）および/またはPheCit-PEG（平均11単位）をポリマーに、HEPES塩基存在下で加えた。この溶液に、SATA-siRNAを加えた。終夜インキュベートした後、PheCit-NAGおよび/またはPheCit-PEGが結合体に付加された。
【０１５６】
実施例10. siRNA
siRNAは以下の配列を有していた：
第VII因子−齧歯類
2014531476.tif 000056
第VII因子−霊長類
2014531476.tif 000057
2014531476.tif 000058
小文字＝2'-O-CH3置換
s＝ホスホロチオアート連結
ヌクレオチドの後のf＝2'-F置換
ヌクレオチドの前のd＝2'-デオキシ
【０１５７】
RNA合成は、AKTA Oligopilot 100（GE Healthcare、Freiburg、Germany）で固体支持体として多孔性ガラス（CPG）を用い、固相上で通常のホスホラミダイト化学により実施した。
【０１５８】
実施例11. アミノ修飾RNAの合成
センス鎖の5'-末端にC-6-アミノリンカーを備えたRNAを、AEKTA Oligopilot 100（GE Healthcare、Freiburg、Germany）および固体支持体として多孔性ガラス（Prime Synthesis、Aston、PA、USA）を用い、固相上で標準のホスホラミダイト化学により1215μmolの規模で生成した。2'-O-メチルヌクレオチドを含むRNAを、対応するホスホラミダイト、2'-O-メチルホスホラミダイト、およびTFA-ヘキシルアミノリンカーアミダイト（Sigma-Aldrich、SAFC、Hamburg、Germany）を用いて生成した。切断および脱保護ならびに精製は、当技術分野において公知の方法によって達成した（Wincott F., et al, NAR 1995, 23, 14, 2677-84）。
【０１５９】
実施例12. ポリ(ビニルエステル)送達ポリマーを用いてのRNAiポリヌクレオチドのインビボ送達
RNAiポリヌクレオチド結合体およびマスクしたポリ(ビニルエステル)ポリマーを前述のとおりに合成した。6から8週齢のマウス（C57BL/6またはICR系統、それぞれ約18〜20g）をHarlan Sprague Dawley（Indianapolis、IN）から入手した。注射前にマウスを少なくとも2日間飼育した。飼料はHarlan Teklad Rodent Diet（Harlan、Madison WI）を自由に与えた。特に記載がないかぎり、マウスに送達ポリマー-siRNA結合体の溶液0.4mLを尾静脈中への点滴により注入した。組成物は生理的条件で可溶性かつ非凝集性であった。他の血管への注射、例えば、眼窩後注射も同等に有効であると推測される。
【０１６０】
Wistar Hanラット、175〜200gをCharles River（Wilmington、MA）から入手した。注射前にラットを少なくとも1週間飼育した。ラットの注射量は典型的には1mlであった。
【０１６１】
示した量のポリマー-siRNA結合体をカニクイザル（Macaca fascicularis）霊長類（雄、3.0から8.0kg）に、22から25ゲージ静脈内カテーテルを用いて伏在静脈中への注射により投与した。対照として、もう1組の霊長類に等張グルコースを注射した。血液尿素窒素（BUN）、アラニントランスアミナーゼ（ALT）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、およびクレアチニンについての血液検査を、Cobas Integra 400（Roche Diagnostics）で製造者の推奨に従って実施した。
【０１６２】
注射前にマウス、ラット、および霊長類を4時間、16時間、または終夜絶食させた。霊長類は採血または組織回収前に終夜絶食させた。血液試料を、マウスは顎下出血により、ラットは頸静脈から、および霊長類は大腿静脈から採取した。マウスおよびラットについて、特に記載がないかぎり、試料をポリマー注射の2日後に採取した。霊長類については、血液試料を第2日（注射の24時間後）および第4日（注射の72時間後）に採取する。さらに、霊長類については、採血を最長で第81日まで行った。ウェスタン検定において用いるための血清を回収し、等しい量のEDTA含有Complete Protease Inhibitor Cocktail（Roche、Indianapolis IN）に加え、-20℃で保存した。回収直後に、全RNAを肝臓からTRI-REAGENT(登録商標)を製造者のプロトコルにより用いて（Molecular Research Center、Cincinnati OH）単離した。
【０１６３】
血清ApoBレベル定量
血清ApoBタンパク質レベルを、標準のサンドイッチELISA法によって定量した。簡単に言うと、ポリクローナルヤギ抗マウスApoB抗体およびウサギ抗マウスApoB抗体（Biodesign International）をそれぞれ捕捉および検出抗体として用いた。その後HRP-結合ヤギ抗ウサギIgG抗体（Sigma）を適用して、ApoB/抗体複合体を結合した。次いで、テトラメチル-ベンジジン（TMB、Sigma）発色の吸光度を、Tecan Safire2（Austria、Europe）マイクロプレート読み取り器により450nmで測定した。
【０１６４】
血漿第VII因子（F7）活性測定
動物からの血漿試料を、標準の手順に従い、0.109mol/Lクエン酸ナトリウム抗凝固剤（1倍量）を含むマイクロ遠沈管中に採血（9倍量）（マウスは顎下出血により、またはラットは頸静脈から）することにより調製した。血漿中のF7活性を、BIOPHEN VIIキット（Hyphen BioMed/Aniara、Mason、OH）を製造者の推奨に従い用いて、色素産生法により測定する。発色の吸光度を、Tecan Safire2マイクロプレート読み取り器を用いて405nmで測定した。
【０１６５】
実施例13. P(BAVVE-co-VBu)ポリマーによる第VII因子siRNA送達後のマウス、ラット、および非ヒト霊長類における第VII因子ノックダウン
P(BAVVE-co-VBu)ポリマー（DAN-41947-106-1またはDAN-41947-129-1）を、前述のとおり、2.3重量当量のCDM-NAGおよび4.7重量当量のCDM-PEGで可逆的に修飾し、第VII因子siRNA（SEQ ID 3および4の二本鎖）に結合した。第VII因子レベルに対する効果を前述のとおりに判定した。第VII因子活性の有効なノックダウンが、約0.5mg/kgからほぼ16mg/kgのP(BAVVE-co-VBu)ポリマーを用いて、血液尿素窒素（BUN）、アラニントランスアミナーゼ（ALT）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、またはクレアチニンレベルの3倍を超える増大を引き起こすことなく観察された。
【０１６６】
（表４）第VII因子-siRNAに結合したCDM-NAG/CDM-PEGマスクP(BAVVE-co-VBu)ポリマーで処置した動物の正常な肝細胞における第VII因子活性の阻害
2014531476.tif 000059
【０１６７】
実施例14. 変動するモノマー比組成を有するポリ(ビニルエステル)送達ポリマーを用いてのsiRNA送達後のマウスにおける標的遺伝子ノックダウン
変動するアミンモノマー：疎水性モノマー組成を有するP(BAVVE-co-VBu)またはP(BAPVE-co-VBu)ポリマーを、前述のとおり、2.3重量当量のCDM-NAGおよび4.7重量当量のCDM-PEGで可逆的に修飾し、第VII因子siRNA（上のSEQ ID 3および4の二本鎖）に結合した。7.5mg/kgのポリマーおよび2mg/kgのsiRNAを各マウスに注射した。第VII因子レベルに対する効果を前述のとおりに判定した。結果は、56〜80％のアミン含有率を有するポリマーで、有効なノックダウンが観察されたことを示している。しかし、56〜60％のアミン含有率を有するポリマーが最も効率的であった。
【０１６８】
（表５）標的遺伝子ノックダウンにより判定した、マスクしたP(BAVVE-co-VBu)またはP(BAPVE-co-VBu)送達ポリマーで処置したマウスの正常な肝細胞へのsiRNA送達
2014531476.tif 000060
【０１６９】
実施例15. 異なるアミンモノマーで生成したポリ(ビニルエステル)送達ポリマーを用いてのsiRNA送達後のマウスにおける標的遺伝子ノックダウン
P(BAPVE-co-VBu)、P(BABVE-co-VBu)、およびP(BAVVE-co-VBu)ポリマーを、前述のとおり、2.3重量当量のCDM-NAGおよび4.7重量当量のCDM-PEGで可逆的に修飾し、第VII因子siRNA（上のSEQ ID 3および4の二本鎖）に結合した。7.5mg/kgのポリマーおよび2mg/kgのsiRNAを各マウスに注射した。第VII因子レベルに対する効果を前述のとおりに判定した。結果は、試験した各アミンモノマーで、有効なノックダウンが観察されたことを示している。
【０１７０】
（表６）標的遺伝子ノックダウンにより判定した、マスクしたP(BAPVE-co-VBu)、P(BABVE-co-VBu)、およびP(BAVVE-co-VBu)送達ポリマーで処置したマウスの正常な肝細胞へのsiRNA送達
2014531476.tif 000061
【０１７１】
実施例16. 異なる疎水性モノマーを有するポリ(ビニルエステル)送達ポリマーを用いてのsiRNA送達後のマウスにおける標的遺伝子ノックダウン
異なる疎水性モノマーを有するP(BAVVE-co)ポリマーを、前述のとおり、2.3重量当量のCDM-NAGおよび4.7重量当量のCDM-PEGで可逆的に修飾し、第VII因子siRNA（上のSEQ ID 3および4の二本鎖）に結合した。7.5mg/kgのポリマーおよび2mg/kgのsiRNAを各マウスに注射した。第VII因子レベルに対する効果を前述のとおりに判定した。結果は、ブチリルおよびバレリル疎水性モノマーで、有効なノックダウンが観察されたことを示している。ブチリル疎水性モノマーを有するポリマーがより効率的であった。
【０１７２】
（表７）標的遺伝子ノックダウンにより判定した、マスクしたP(BAVVE-co-疎水性ビニルエステル)送達ポリマーで処置したマウスの正常な肝細胞へのsiRNA送達
2014531476.tif 000062
【０１７３】
実施例17. 変動する分子量を有するポリ(ビニルエステル)送達ポリマーを用いてのsiRNA送達後のマウスにおける標的遺伝子ノックダウン
変動する分子量を有するP(BAVVE-co-VBu)ポリマーを、前述のとおり、2.3重量当量のCDM-NAGおよび4.7重量当量のCDM-PEGで可逆的に修飾し、第VII因子siRNA（上のSEQ ID 3および4の二本鎖）に結合した。7.5mg/kgのポリマーおよび2mg/kgのsiRNAを各マウスに注射した。第VII因子レベルに対する効果を前述のとおりに判定した。結果は、23k〜200kのMn, thを有するP(BAVVE-co-VBu)ポリマーで、有効なノックダウンが観察されたことを示している。67kDa（70kDa Mw）よりも大きいMn, thを有するポリマーがより効率的であった。100〜150kDa（67〜86kDa Mw）のポリマーが最も好ましかった。
【０１７４】
（表８）標的遺伝子ノックダウンにより判定した、変動する分子量を有するマスクしたP(BAVVE-co-VBu)送達ポリマーで処置したマウスの正常な肝細胞へのsiRNA送達
2014531476.tif 000063
【０１７５】
実施例18. 両親媒性カチオン性ポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマーは有効なインビトロ形質移入試薬である
示したコポリマー（500mg）を酢酸中2N HClの溶液（5mL）に溶解し、1時間撹拌した。溶液を水（30mL）で希釈し、NaCl水溶液と、次いで脱イオン水に対して2日間かけて透析した。次いで、溶液を凍結乾燥し、H2Oに再溶解して、20mg/mL溶液とした。示したとおり、Hep3B-SEAP（肝細胞癌）、MCF7（乳癌）、HT29（結腸癌）、HepG2-SEAP（肝細胞癌）、またはA375（黒色腫）細胞を96穴培養プレートに10,000細胞/ウェルの密度で播種した。細胞に、OPTI-MEM還元血清培地（Gibco）中で調製した1.5μg/mLまたは3μg/mLいずれかのコポリマーおよび500ng/mLのAha1 siRNAを形質移入した。形質移入の24時間後、TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit（Life Technologies）を用いての定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）のために、細胞を溶解し、処理した。Biplex qRT-PCRを、StepOne Real-Time PCR System（Life Technologies）で、ヒトAha1（製品# Hs00201602_ml）およびヒトCycA（製品# 4326316E）についてTaqMan検定を用いて実施した。解析は、相対的遺伝子発現定量のΔΔCT法を用いて実施した。
2014531476.tif 000064
【０１７６】
（表９）インビトロ形質移入のために用いたポリ(ビニルエステル)ポリマー
2014531476.tif 000065
a-kDa
【０１７７】
（表１０）ポリ(ビニルエステル)ポリマーによるAha1 siRNA後のインビトロでのAha1のノックダウン。ポリマーは表9と同じ順序で挙げている。
2014531476.tif 000066
a-μg/mL
【０１７８】
実施例19. NAG/PEG-AA-p-ニトロフェニル-カルバマートポリ(ビニルエステル)DPCを用いての皮下注射後のインビボでのsiRNA送達
100mM pH7.5 HEPES緩衝液中のポリビニルエステルDAN-41947-129-1を、Pierce社の活性化ジスルフィド試薬、スクシンイミジルオキシカルボニル-アルファ-メチル-アルファ(2-ピリジルジチオ)トルエン（SMPT）で0.5重量％修飾した。チオール反応性ポリマーを60mg/mL HEPES塩基中で5mg/mLに希釈した。この溶液に、10mg/mL PEG（12単位）-Phe-Cit-p-ニトロフェニル-カルボナートマスキング試薬を加えた。1時間後、アセタート保護チオール第VII因子siRNAをポリマー溶液に、ポリマー対siRNA比5〜10：1の範囲で加えた。終夜インキュベートした後、NAG-Ala-Cit-p-ニトロフェニル-カルボナートマスキング試薬（図2）を30mg/mLまで加えた。少なくとも60分間であるが、4時間を超えない時間インキュベートした後、DPCを20gのICRマウスの後頸部に皮下注射した。注射後の様々な時点で、血清の試料を回収し、fVIIのレベルを測定した。対照として、同様に調製したDAN-41947-129-1-siRNA結合体を血管内注射した。
【０１７９】
（表１１）PEG12-Phe-Cit/NAG-Ala-Cit-p-ニトロフェニル-カルバマートDPCで処置したマウスにおけるインビボでの第VII因子のノックダウン
2014531476.tif 000067
a動物体重1kgあたりのポリマーまたはsiRNA mg
b未処置対照に対して
【０１８０】
実施例20. コレステロール-siRNAおよびマスクした両親媒性ポリ(ビニルエステル)ランダムコポリマーの同時投与後のインビボでの内因性遺伝子発現の阻害
ポリ(ビニルエステル)ポリマー、DAN-41947-129-1を、前述の二置換無水マレイン酸マスキング剤またはジペプチドマスキング剤によりマスクした。次いで、マスクしたポリマーをコレステロール-siRNA（ApoBまたは第VII因子）と共にマウスに同時注射し、標的遺伝子発現に対する効果を判定した。
【０１８１】
（表１２）CDM-PEGおよびCDM-NAGまたはPEG(12)-PheCitおよびNAG-AlaCitでマスクしたDAN-41947-129-1（15mg/kg）をコレステロール結合siRNAと共にマウスに同時注射した。注射の48時間後、ApoBノックダウンを測定した。
2014531476.tif 000068
a等張グルコース注射対照に対して
【図１】
2014531476.tif 000072
【図２Ａ】
2014531476.tif 000073
【図２Ｂ】
2014531476.tif 000074
【図２Ｃ】
2014531476.tif 000075
【図２Ｄ】
2014531476.tif 000076
【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
2014531476.tif 000078
【図２Ｇ】
2014531476.tif 000079
【図２Ｈ】
2014531476.tif 000080
【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
2014531476.tif 000083
【配列表】
2014531476000001.app
【国際調査報告】
2014531476.tif 000084