(57)【要約】本発明は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の、血液におけるコレステロール逆転送を支持する能力を、ＨＤＬに特異的なスピンラベルしたリポタンパク質プローブの交換の測定および電子常磁性分光法によって評価するための組成物および方法を提供する。本発明は、心臓血管疾患のリスクがある個体を同定する方法、心臓血管疾患の治療をモニターする方法、および心臓血管疾患を治療する療法の開発における方法も提供する。本発明は、アルツハイマー病のリスクがある個体を同定する方法、アルツハイマー病の治療をモニターする方法、およびアルツハイマー病を治療するための療法の開発における方法も提供する。
2014513795.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のコレステロール逆転送を支持する能力を測定するための方法であって、
ａ）ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加するステップと、
ｂ）前記試料の電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップと
を含む方法。
【請求項２】
ｃ）ステップｂ）の前記スペクトルと陽性対照および／または陰性対照を比較することによって、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合を比較するステップ
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記陰性対照が、無脂質環境または低脂質環境中にある前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記陽性対照が、ジミリストイルホスファチジルコリンと結合した前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記コレステロール逆転送がコレステロール流出潜在力である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＥＰＲスペクトルの中心ピークの振幅を測定する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
低脂質のスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルと比較した、前記血液試料中の前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの前記ＥＰＲスペクトルの前記中心ピークの前記振幅の差異が、前記リポタンパク質と前記ＨＤＬとの結合の差異を示す、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記中心ピークの前記振幅の増加が、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブと前記ＨＤＬとの結合の増加を示す、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記中心ピークの前記振幅の増加が、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブと前記ＨＤＬとの結合の減少を示す、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記中心ピークの前記振幅の減少が、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブと前記ＨＤＬとの結合の増加を示す、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記中心ピークの前記振幅の減少が、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブと前記ＨＤＬとの結合の減少を示す、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記中心ピークの振幅の変化を、前記血液試料中の前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬが結合しても変化しない近ピークおよび／または遠ピークの振幅との関連で測定する、請求項８から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＥＰＲスペクトルのプロファイルの変化が、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの結合の変化を示す、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記中心ピークのシフトが、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの結合の変化を示す、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料が全血試料である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料が血漿試料である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料が血清試料である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料が、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブを添加する前に１回または２回凍結解凍されている、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料が非ヒト哺乳動物血液試料である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料がヒト血液試料である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記スピンラベルが前記リポタンパク質の単一の部位に位置する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、第１のスピンラベルおよび第２のスピンラベルを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
第１のスピンラベルが前記リポタンパク質の第１の単一の部位に位置し、前記第２のスピンラベルが、前記リポタンパク質の第２の単一の部位に位置する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記スピンラベルが前記リポタンパク質に共有結合によって付着している、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記スピンラベルが前記リポタンパク質に非共有結合によって付着している、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＡ−Ｉまたはその断片を含み、前記ａｐｏＡ−Ｉまたはその断片が、ＨＤＬに対して高い特異性を有する、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＡ−ＩのＨＤＬ結合領域を含むａｐｏＡ−Ｉの断片を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質またはその断片の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の残基１８８〜残基２４３のうちの１つのアミノ酸残基に共有結合によって付着している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、９８位、１０１位、１１１位、１６７位、２１７位、または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
２６位、４４位、６４位、９８位、１０１位、１１１位、１６７位、２１７位、または２２６位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着している、請求項２８から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、前記スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＥＰＲスペクトルの中心ピークの振幅の増加が、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料における前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の増加を示す、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１１１位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、前記スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＥＰＲスペクトルの中心ピークの振幅の増加が、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料における前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の増加を示す、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片を含み、前記ａｐｏＡ−ＩＩまたはその断片が、ＨＤＬに対して高い特異性を有する、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質の前記単一の部位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＥリポタンパク質またはその断片を含み、前記ａｐｏＥまたはその断片が、ＨＤＬに対して高い特異性を有する、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ａｐｏＥリポタンパク質がａｐｏＥ３リポタンパク質である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＥリポタンパク質の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項４０または４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ａｐｏＥタンパク質の前記単一の部位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＡ−Ｉ模倣物を含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ａｐｏＡ−Ｉ模倣物が１８Ａ、１８Ａ−Ｐｒｏ−１８Ａ、４Ｆ、および４ｆ−Ｐｒｏ−４Ｆからなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉ模倣物の単一の部位に共有結合によって付着している、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記スピンラベルが自由電子を担持する原子を含む、請求項１から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
自由電子を担持する前記原子が窒素である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ；１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ，ｄ１５；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（−）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（＋）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；３−（２−ヨードアセトアミド）−ＰＲＯＸＹＬ；３−ヨードメチル−（１−オキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリン）；１−オキシル−３−（マレイミドメチル）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジン；（１−オキシル−２，２，３，５，５−ペンタメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；Ｎ−（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジニル）マレイミド；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドエチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドヘキシルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドプロピルメタンメタンチオスルホネート；３−（２−ブロモアセトアミド）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ、フリーラジカル；４−ブロモ−３−ヒドロキシメチル−１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−δ３−ピロリン；３−ブロモメチル−２，５−ジヒドロ−２，２，５，５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−１−イルオキシ；４−ブロモ−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；３−［２−（２−マレイミドエトキシ）エチルカルバモイル］−ＰＲＯＸＹＬ；３−マレイミド−ＰＲＯＸＬ、３−（２−マレイミドエチル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（３−（２−ヨード−アセトアミド）−プロピル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（２−ブロモ−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；または３−（２−ヨード−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカルである、請求項２９に記載の方法。
【請求項５０】
前記スピンラベルが過重水素化スピンラベルである、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記スピンラベルが、前記リポタンパク質のアミノ酸にチオスルホネート部分を通じて付着している、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記スピンラベルが、前記スピンラベルと前記リポタンパク質との間のスペーサー部分をさらに含む、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記スペーサー部分がメタン、エタン、プロパンまたはブタンである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＨＤＬがＨＤＬ３である、請求項１から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブを、最終濃度約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．１ｍｇ／ｍｌで前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加する、請求項１から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブを、最終濃度約０．３ｍｇ／ｍｌで前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブを、最終濃度約０．８ｍｇ／ｍｌ超で前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＥＰＲスペクトルを、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブを前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加した後の１つまたは複数の時点で収集する、請求項１から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＥＰＲスペクトルを、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブを前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加した後１．５分、４分、６分、８分、１０分、３０分、６０分の時点のうちの１つまたは複数でモニターする、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブと前記ＨＤＬとの結合が平衡に達するまでの時間が１０分以上であることが、ＨＤＬのコレステロール逆転送に関する能力の低下を示す、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブと前記ＨＤＬとの結合が平衡に達するまでの時間が正常なコレステロール逆転送能力を伴うｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料の平衡に達するまでの時間より少なくとも２倍長いことが、コレステロール逆転送の能力の低下を示す、請求項５７または５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
ステップｃ）の評価が、スピンラベルしたリポタンパク質プローブと前記ＨＤＬとの結合の程度の決定である、請求項１から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブと前記ＨＤＬとの結合の平衡の程度が、正常なコレステロール逆転送能力を伴うｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料における前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの結合と比較して８０％以下であることが、コレステロール逆転送の能力の低下を示す、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ステップｃ）の評価が、前記ＨＤＬの転移温度の決定であり、前記ＨＤＬの転移温度が２５℃以上であることが、コレステロール逆転送能力の低下を示す、請求項１から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＥＰＲスペクトルを０℃〜３７℃にわたる温度で収集する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＥＰＲスペクトルを、３７℃で収集し、次いで、２０℃および／または０℃で収集する、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＥＰＲスペクトルを、０℃で収集し、次いで、２０℃および／または３７℃で収集する、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＥＰＲスペクトルを、４℃で収集し、次いで、３７℃で収集する、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料が抗凝固薬をさらに含む、請求項１から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記抗凝固薬がヘパリン、クマジン、ワルファリン、ＥＤＴＡ、シトレートまたはオキザレートである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
第１の個体において心臓血管疾患が発生するリスクを決定するための方法であって、
ａ）請求項１から７０のいずれか一項に従って前記第１の個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料のコレステロール逆転送能力を決定するステップ
を含む方法。
【請求項７２】
ｂ）ステップａ）のコレステロール逆転送能力を、心臓血管疾患の明白なリスクがない１または複数の第２の個体由来の血液試料の逆転送能力と比較するステップであって、前記第１の個体由来の前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料のコレステロール逆転送能力が前記１または複数の第２の個体と比較して低下していることが、心臓血管疾患のリスクの増加を示すステップ
をさらに含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記第１の個体および第２の個体がヒトである、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記心臓血管疾患が冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢血管疾患、および脳卒中から選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記第１の個体が糖尿病かつ／または肥満である、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項７６】
心臓血管疾患に対する治療を受けている個体において心臓血管疾患に対する療法の経過をモニターするための方法であって、
ａ）請求項１から７１のいずれか一項に従って前記個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料のコレステロール逆転送能力を決定するステップ
を含む方法。
【請求項７７】
ｂ）前記個体に前記療法を施している間、および／またはその後に、１回または複数回、前記個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料のコレステロール逆転送能力を決定するステップであって、前記個体由来の血液試料の前記逆転送能力の増加が治療有効性を示すステップ
をさらに含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記個体がヒトである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記心臓血管疾患が冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢血管疾患、および脳卒中から選択される、請求項７６または７８に記載の方法。
【請求項８０】
心臓血管疾患に対する公知の療法または潜在的な療法の有効性を決定するための方法であって、
ａ）請求項１から７１のいずれか一項に従って試験個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料のコレステロール逆転送能力を決定するステップであって、試験動物が前記療法に供されているステップ
を含む方法。
【請求項８１】
前記試験動物が、前記試験動物に前記療法を施すことによって前記療法に供されている、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
ｂ）前記療法を前記試験動物に施している間、および／またはその後に、１回または複数回、前記試験動物由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料のコレステロール逆転送能力を決定するステップであって、前記試験動物由来の前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料の前記逆転送能力の増加が治療有効性を示すステップ
をさらに含む、請求項８０または８１に記載の方法。
【請求項８３】
心臓血管疾患に対する公知の療法または潜在的な療法の有効性を決定する方法であって、
ａ）請求項１から７１のいずれか一項に従って試験動物由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料のコレステロール逆転送能力を決定するステップと、
ｂ）前記試験動物に前記療法を施すステップと、
ｃ）前記療法を前記試験動物に施している間、および／またはその後に、１回または複数回、前記試験動物由来の前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料の前記コレステロール逆転送能力を決定するステップであって、前記試験動物由来の前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料の前記逆転送能力の増加が治療有効性を示すステップと
を含む方法。
【請求項８４】
前記試験動物がマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、イヌ、ネコ、およびブタから選択される、請求項８０から８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定するためのキットであって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキット。
【請求項８６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定するためのキットであって、スピンラベルと、ＨＤＬに対して高い特異性を有するリポタンパク質とを含むキット。
【請求項８７】
前記コレステロール逆転送がコレステロール流出潜在力である、請求項８５または８６に記載のキット。
【請求項８８】
個体において心臓血管疾患が発生するリスクを決定するためのキットであって、前記個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加し、ＥＰＲによって分析するために製剤化されたスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキット。
【請求項８９】
個体における心臓血管疾患に対する療法の経過を決定するためのキットであって、前記個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加し、ＥＰＲによって分析するために製剤化されたスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキット。
【請求項９０】
前記個体がヒトである、請求項８８または８９に記載のキット。
【請求項９１】
前記個体が非ヒト哺乳動物である、請求項８８または８９に記載のキット。
【請求項９２】
前記心臓血管疾患が冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢血管疾患、および脳卒中から選択される、請求項９０に記載のキット。
【請求項９３】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、全血試料とともに使用するために製剤化されている、請求項８５から９２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９４】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、血漿試料とともに使用するために製剤化されている、請求項８５から９２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９５】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、血清試料とともに使用するために製剤化されている、請求項８５から９２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９６】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブを添加する前に１回または２回凍結解凍されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料とともに使用するために製剤化されている、請求項８５から９５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９７】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、哺乳動物血液試料とともに使用するために製剤化されている、請求項８５から９５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９８】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ヒト血液試料とともに使用するために製剤化されている、請求項８５から９５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９９】
使用説明書をさらに含む、請求項８５から９８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１００】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＡ−Ｉまたはその断片を含み、前記ａｐｏＡ−Ｉまたはその断片が、ＨＤＬに対して高い特異性を有する、請求項８５から９９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０１】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＡ−ＩのＨＤＬ結合領域を含むａｐｏＡ−Ｉの断片を含む、請求項１００に記載のキット。
【請求項１０２】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項１００または１０１に記載のキット。
【請求項１０３】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の残基１８８〜残基２４３のうちの単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項１００または１０１に記載のキット。
【請求項１０４】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、９８位、１０１位、１１１位、１６７位、２１７位、または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項１００または１０１に記載のキット。
【請求項１０５】
２６位、４４位、６４位、９８位、１０１位、１１１位、１６７位、２１７位、または２２６位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている、請求項１０４に記載のキット。
【請求項１０６】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着している、請求項１０５に記載のキット。
【請求項１０７】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、前記スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである、請求項１０６に記載の方法キット。
【請求項１０８】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１１１位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、前記スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである、請求項１０４に記載のキット。
【請求項１０９】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片を含み、前記ａｐｏＡ−ＩＩまたはその断片が、ＨＤＬに対して高い特異性を有する、請求項８５から９７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１０】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項１０９に記載のキット。
【請求項１１１】
前記ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質の前記単一の部位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている、請求項１１０に記載のキット。
【請求項１１２】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＥリポタンパク質またはその断片を含み、前記ａｐｏＥまたはその断片が、ＨＤＬに対して高い特異性を有する、請求項８５から９７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１３】
前記ａｐｏＥリポタンパク質またはその断片がａｐｏＥ３リポタンパク質またはその断片である、請求項１１２に記載のキット。
【請求項１１４】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＥリポタンパク質の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項１１２または１１３に記載のキット。
【請求項１１５】
前記ａｐｏＥタンパク質の前記単一の部位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている、請求項１１４に記載のキット。
【請求項１１６】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＡ−Ｉ模倣物を含む、請求項８５から９７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１７】
前記ａｐｏＡ−Ｉ模倣物が１８Ａ、１８Ａ−Ｐｒｏ−１８Ａ、４Ｆ、および４ｆ−Ｐｒｏ−４Ｆからなる群から選択される、請求項１１６に記載のキット。
【請求項１１８】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉ模倣物の単一の部位に共有結合によって付着している、請求項１１６または１１７に記載のキット。
【請求項１１９】
前記スピンラベルが自由電子を担持する原子を含む、請求項８５から１１８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２０】
自由電子を担持する前記原子が窒素である、請求項１１９に記載のキット。
【請求項１２１】
前記スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ；１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ，ｄ１５；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（−）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（＋）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；３−（２−ヨードアセトアミド）−ＰＲＯＸＹＬ；３−ヨードメチル−（１−オキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリン）；１−オキシル−３−（マレイミドメチル）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジン；（１−オキシル−２，２，３，５，５−ペンタメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；Ｎ−（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジニル）マレイミド；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドエチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドヘキシルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドプロピルメタンメタンチオスルホネート；３−（２−ブロモアセトアミド）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ、フリーラジカル；４−ブロモ−３−ヒドロキシメチル−１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−δ３−ピロリン；３−ブロモメチル−２，５−ジヒドロ−２，２，５，５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−１−イルオキシ；４−ブロモ−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；３−［２−（２−マレイミドエトキシ）エチルカルバモイル］−ＰＲＯＸＹＬ；３−マレイミド−ＰＲＯＸＬ、３−（２−マレイミドエチル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（３−（２−ヨード−アセトアミド）−プロピル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（２−ブロモ−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；または３−（２−ヨード−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカルである、請求項１１９または１２０に記載のキット。
【請求項１２２】
前記スピンラベルが過重水素化スピンラベルである、請求項１２０または１２１に記載のキット。
【請求項１２３】
前記スピンラベルが、前記リポタンパク質のアミノ酸にチオスルホネートを通じて付着している、請求項１２０から１２２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２４】
前記スピンラベルが、前記スピンラベルと前記リポタンパク質との間のスペーサーをさらに含む、請求項１２０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２５】
前記スペーサーがメタン、エタン、プロパンまたはブタンである、請求項１２４に記載のキット。
【請求項１２６】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの６０％超がＨＤＬと結合する、請求項８５から１２５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２７】
前記ＨＤＬがＨＤＬ３である、請求項１２６に記載のキット。
【請求項１２８】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に最終濃度約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．１ｍｇ／ｍｌで添加されるように製剤化されている、請求項８５から１２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２９】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に最終濃度約０．３ｍｇ／ｍｌで添加されるように製剤化されている、請求項１２８に記載のキット。
【請求項１３０】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に最終濃度約０．８ｍｇ／ｍｌ超で添加されるように製剤化されている、請求項１２８に記載のキット。
【請求項１３１】
抗凝固薬をさらに含む、請求項８５から１３０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３２】
前記抗凝固薬がヘパリン、クマジン、ワルファリン、ＥＤＴＡ、シトレートまたはオキザレートである、請求項１３１に記載のキット。
【請求項１３３】
シリンジをさらに含む、請求項８５から１３２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３４】
ａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片を含む組成物であって、前記ａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質がスピンラベルを含み、前記ａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片がＨＤＬに対して高い特異性を有する組成物。
【請求項１３５】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項１３４に記載の組成物。
【請求項１３６】
前記ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質の前記単一の部位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている、請求項１３５に記載の組成物。
【請求項１３７】
ＨＤＬに対して高い特異性を有し、スピンラベルを含むａｐｏＡ−Ｉ模倣物を含む組成物。
【請求項１３８】
前記ａｐｏＡ−Ｉ模倣物が、１８Ａ、１８Ａ−Ｐｒｏ−１８Ａ、４Ｆ、および４ｆ−Ｐｒｏ−４Ｆからなる群から選択される、請求項１３７に記載の組成物。
【請求項１３９】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉ模倣物の単一の部位に共有結合によって付着している、請求項１３７または１３８に記載の組成物。
【請求項１４０】
ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質またはその断片を含む組成物であって、前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質またはその断片がスピンラベルを含み、前記スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（−）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；または（＋）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートを含む組成物。
【請求項１４１】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の残基１８８〜残基２４３のうちの単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項１４０に記載の組成物。
【請求項１４２】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、９８位、１０１位、１１１位、１６７位、２１７位、または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項１４０または１４１に記載の組成物。
【請求項１４３】
２６位、４４位、６４位、９８位、１０１位、１１１位、１６７位、２１７位、または２２６位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている、請求項１４２に記載の組成物。
【請求項１４４】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着している、請求項１４３に記載の組成物。
【請求項１４５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料と、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとを含む組成物。
【請求項１４６】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料が全血試料である、請求項１４５に記載の組成物。
【請求項１４７】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料が血漿試料である、請求項１４５に記載の組成物。
【請求項１４８】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料が血清試料である、請求項１４５に記載の組成物。
【請求項１４９】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料が１回または２回凍結解凍されている、請求項１４５から１４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５０】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料が非ヒト哺乳動物血液試料である、請求項１４５から１４９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５１】
前記哺乳動物血液試料がヒト血液試料である、請求項１４５から１４９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５２】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＡ−Ｉまたはその断片を含み、前記ａｐｏＡ−Ｉまたはその断片がＨＤＬに対して高い特異性を有する、請求項１４５から１５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５３】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＡ−ＩのＨＤＬ結合領域を含むａｐｏＡ−Ｉの断片を含む、請求項１５２に記載の組成物。
【請求項１５４】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項１５２または１５３に記載の組成物。
【請求項１５５】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の残基１８８〜残基２４３のうちの単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項１５２から１５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５６】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、９８位、１０１位、１１１位、１６７位、２１７位、または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項１５２または１５３に記載の組成物。
【請求項１５７】
２６位、４４位、６４位、９８位、１０１位、１１１位、１６７位、２１７位、または２２６位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている、請求項１５６に記載の組成物。
【請求項１５８】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着している、請求項１５７に記載の組成物。
【請求項１５９】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、前記スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである、請求項１５８に記載の組成物。
【請求項１６０】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１１１位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、前記スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである、請求項１５７に記載の組成物。
【請求項１６１】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片を含み、前記ａｐｏＡ−ＩＩまたはその断片が、ＨＤＬに対して高い特異性を有する、請求項１４５から１５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６２】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項１６１に記載の組成物。
【請求項１６３】
前記ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質の前記単一の部位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている、請求項１６１または１６２に記載の組成物。
【請求項１６４】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＥリポタンパク質またはその断片を含み、前記ａｐｏＥまたはその断片が、ＨＤＬに対して高い特異性を有する、請求項１４５から１５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６５】
前記ａｐｏＥリポタンパク質またはその断片がａｐｏＥ３リポタンパク質またはその断片である、請求項１６４に記載の組成物。
【請求項１６６】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＥリポタンパク質の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項１６３または１６４に記載の組成物。
【請求項１６７】
前記ａｐｏＥタンパク質の前記単一の部位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている、請求項１６６に記載の組成物。
【請求項１６８】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物を含み、前記ａｐｏＡ−Ｉ模倣物が、ＨＤＬに対して高い特異性を有し、前記ａｐｏＡ−Ｉ模倣物が、１８Ａ、１８Ａ−Ｐｒｏ−１８Ａ、４Ｆ、および４ｆ−Ｐｒｏ−４Ｆからなる群から選択される、請求項１４５から１５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６９】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉ模倣物の単一の部位に共有結合によって付着している、請求項１６７または１６８に記載の組成物。
【請求項１７０】
前記スピンラベルが自由電子を担持する原子を含む、請求項１４５から１６９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７１】
自由電子を担持する前記原子が窒素である、請求項１７０に記載の組成物。
【請求項１７２】
前記スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ；１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ，ｄ１５；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（−）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（＋）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；３−（２−ヨードアセトアミド）−ＰＲＯＸＹＬ；３−ヨードメチル−（１−オキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリン）；１−オキシル−３−（マレイミドメチル）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジン；（１−オキシル−２，２，３，５，５−ペンタメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；Ｎ−（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジニル）マレイミド；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドエチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドヘキシルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドプロピルメタンメタンチオスルホネート；３−（２−ブロモアセトアミド）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ、フリーラジカル；４−ブロモ−３−ヒドロキシメチル−１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−δ３−ピロリン；３−ブロモメチル−２，５−ジヒドロ−２，２，５，５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−１−イルオキシ；４−ブロモ−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；３−［２−（２−マレイミドエトキシ）エチルカルバモイル］−ＰＲＯＸＹＬ；３−マレイミド−ＰＲＯＸＬ、３−（２−マレイミドエチル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（３−（２−ヨード−アセトアミド）−プロピル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（２−ブロモ−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；または３−（２−ヨード−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカルである、請求項１７０または１７１に記載の組成物。
【請求項１７３】
前記スピンラベルが過重水素化スピンラベルである、請求項１７１または１７２に記載の組成物。
【請求項１７４】
前記スピンラベルが、前記リポタンパク質のアミノ酸にチオスルホネートを通じて付着している、請求項１７１から１７３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７５】
前記スピンラベルが、前記スピンラベルと前記リポタンパク質との間のスペーサーをさらに含む、請求項１７４に記載の組成物。
【請求項１７６】
前記スペーサーがメタン、エタン、プロパンまたはブタンである、請求項１７５に記載の組成物。
【請求項１７７】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブがＨＤＬ３と結合する、請求項１４５から１７６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７８】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの６０％超がＨＤＬ３と結合する、請求項１７７に記載の組成物。
【請求項１７９】
抗凝固薬をさらに含む、請求項１４５から１７８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８０】
前記抗凝固薬がヘパリン、クマジン、ワルファリン、ＥＤＴＡ、シトレートまたはオキザレートである、請求項１７９に記載の組成物。
【請求項１８１】
前記１または複数の第２の個体のスペクトルがヒストリカルスペクトルである、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項１８２】
前記個体に前記療法を施す前に前記個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料のコレステロール逆転送能力を決定するステップをさらに含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項１８３】
前記試験個体が試験動物である、請求項８０に記載の方法。
【請求項１８４】
前記試験動物に前記療法を施す前に前記個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料のコレステロール逆転送能力を決定するステップをさらに含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項１８５】
ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を測定するための組成物であって、前記組成物は、試験片を含み、前記試験片は、スピンラベルしたリポタンパク質プローブおよび固体支持体を含み、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、スピンラベルおよびタンパク質を含み、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ＨＤＬに対して高い特異性を有する組成物。
【請求項１８６】
前記コレステロール逆転送が流体のコレステロール流出潜在力である、請求項１８５に記載の組成物。
【請求項１８７】
血液試料または脳脊髄液試料から選択される試料とともに使用するために製剤化されている、請求項１８５に記載の組成物。
【請求項１８８】
前記血液試料が全血試料、血漿試料、および血清試料から選択される、請求項１８７に記載の組成物。
【請求項１８９】
前記試料が哺乳動物血液試料である、請求項１８７に記載の組成物。
【請求項１９０】
前記哺乳動物試料がヒト血液試料である、請求項１８８に記載の組成物。
【請求項１９１】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＡ−Ｉポリペプチドまたはその断片を含む、請求項１８５に記載の組成物。
【請求項１９２】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＡ−ＩのＨＤＬ結合領域を含むａｐｏＡ−Ｉ断片を含む、請求項１９１に記載の組成物。
【請求項１９３】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質またはその断片の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項１９１または１９２に記載の組成物。
【請求項１９４】
前記スピンラベルが、残基１８８〜残基２４３に位置する前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質のアミノ酸残基に共有結合によって付着している、請求項１９３に記載の組成物。
【請求項１９５】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、９８位、１０１位、１１１位、１６７位、２１７位、または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項１９３に記載の組成物。
【請求項１９６】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の９８位、１１１位または２１７位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項１９５に記載の組成物。
【請求項１９７】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項１９５に記載の組成物。
【請求項１９８】
９８位、１１１位、または２１７位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている、請求項１９５に記載の組成物。
【請求項１９９】
２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位、または２２６位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている、請求項１９５に記載の組成物。
【請求項２００】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着している、請求項１９８に記載の組成物。
【請求項２０１】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、前記スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである、請求項２００に記載の組成物。
【請求項２０２】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１１１位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、前記スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである、請求項１９８に記載の組成物。
【請求項２０３】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片を含み、前記ａｐｏＡ−ＩＩまたはその断片が、ＨＤＬに対して高い特異性を有する、請求項１８５から１９０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０４】
前記ａｐｏＡ−ＩＩまたはその断片、ここで、全リポタンパク質分子の６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上がＨＤＬと会合する、請求項２０３に記載の組成物。
【請求項２０５】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項２０３に記載の組成物。
【請求項２０６】
前記ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質の前記単一の部位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている、請求項２０５に記載の組成物。
【請求項２０７】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＥリポタンパク質またはその断片を含み、前記ａｐｏＥまたはその断片が、ＨＤＬに対して高い特異性を有する、請求項１８５から１９０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０８】
前記ａｐｏＥリポタンパク質またはその断片がａｐｏＥ３リポタンパク質またはその断片である、請求項２０７に記載の組成物。
【請求項２０９】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＥリポタンパク質の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項２０７または２０８に記載の組成物。
【請求項２１０】
前記ａｐｏＥタンパク質の前記単一の部位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている、請求項２０９に記載の組成物。
【請求項２１１】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＡ−Ｉ模倣物を含む、請求項１８５から１９０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１２】
前記ａｐｏＡ−Ｉ模倣物が１８Ａ、１８Ａ−Ｐｒｏ−１８Ａ、４Ｆ、および４ｆ−Ｐｒｏ−４Ｆからなる群から選択される、請求項２１１に記載の組成物。
【請求項２１３】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉ模倣物の単一の部位に共有結合によって付着している、請求項２１１または２１２に記載の組成物。
【請求項２１４】
前記スピンラベルが自由電子を担持する原子を含む、請求項１８５から２１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１５】
自由電子を担持する前記原子が窒素である、請求項２１４に記載の組成物。
【請求項２１６】
前記スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ；１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ，ｄ１５；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（−）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（＋）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；３−（２−ヨードアセトアミド）−ＰＲＯＸＹＬ；３−ヨードメチル−（１−オキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリン）；１−オキシル−３−（マレイミドメチル）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジン；（１−オキシル−２，２，３，５，５−ペンタメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；Ｎ−（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジニル）マレイミド；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドエチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドヘキシルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドプロピルメタンメタンチオスルホネート；３−（２−ブロモアセトアミド）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ、フリーラジカル；４−ブロモ−３−ヒドロキシメチル−１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−δ３−ピロリン；３−ブロモメチル−２，５−ジヒドロ−２，２，５，５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−１−イルオキシ；４−ブロモ−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；３−［２−（２−マレイミドエトキシ）エチルカルバモイル］−ＰＲＯＸＹＬ；３−マレイミド−ＰＲＯＸＬ、３−（２−マレイミドエチル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（３−（２−ヨード−アセトアミド）−プロピル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（２−ブロモ−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；または３−（２−ヨード−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカルである、請求項２１４または２１５に記載の組成物。
【請求項２１７】
前記スピンラベルが過重水素化スピンラベルである、請求項２１５または２１６に記載の組成物。
【請求項２１８】
前記スピンラベルが、前記リポタンパク質のアミノ酸にチオスルホネートを通じて付着している、請求項２１４から２１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１９】
前記スピンラベルしたリポタンパク質が、前記スピンラベルと前記リポタンパク質との間のスペーサーをさらに含む、請求項２１４から２１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２０】
前記スペーサーがメタン、エタン、プロパンまたはブタンである、請求項２１９に記載の組成物。
【請求項２２１】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの６０％超がＨＤＬと結合する、請求項１８５から２２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２２】
前記ＨＤＬがＨＤＬ３である、請求項２２１に記載の組成物。
【請求項２２３】
前記固体支持体が、常磁性が低いポリマー材料またはセルロース系材料から選択される、請求項１８５から２２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２４】
前記固体支持体が吸着性材料である、請求項１８５から２２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２５】
前記吸着性材料がポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ナイロンまたはニトロセルロースである、請求項２２４に記載の組成物。
【請求項２２６】
前記固体支持体が吸着性材料をさらに含む、請求項１８５から２２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２７】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが前記固体支持体に共有結合によって付着している、請求項１８５から２２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２８】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが前記吸着性材料に共有結合によって付着している、請求項２２６に記載の組成物。
【請求項２２９】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが前記試験片に静電気によって付着している、請求項１８５から２２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３０】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが前記吸着性材料に静電気によって付着している、請求項２２６に記載の組成物。
【請求項２３１】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが前記試験片に疎水性相互作用によって付着している、請求項１８５から２２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３２】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが前記吸着性材料に疎水性相互作用によって付着している、請求項２２６に記載の組成物。
【請求項２３３】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが前記試験片に疎水性相互作用および静電気によって付着している、請求項１８５から２２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３４】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが前記吸着性材料に疎水性相互作用および静電気によって付着している、請求項２２６に記載の組成物。
【請求項２３５】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが前記吸着性材料内に捕捉されている、請求項２２６に記載の組成物。
【請求項２３６】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが前記固体支持体または吸着性材料上で乾燥されている、請求項２２６に記載の組成物。
【請求項２３７】
前記試験片がスピンラベルした参照プローブをさらに含む、請求項１８５から２３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３８】
前記スピンラベルした参照プローブがＨＤＬの存在の影響を受けないスピンプローブである、請求項２３７に記載の組成物。
【請求項２３９】
前記スピンラベルした参照プローブが、テトラメチルピペリジン（ＴＥＭＰＯ；２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル）、ＴＥＭＰＯＬ（４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル）、ＴＡＭＩＮＥ（４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル）、ＢＺＯＮＯ（４−（ベンゾイルオキシ）−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル）、ＳＬＰＥＯ（ポリ（エチレンオキシド）−２，２，６，６−テトラメチル−ピペリジン−１−オキシル）、およびテトラシアノキノジメタン（ＴＣＮＱ；２，５−シクロヘキサジエン−１，４−ジイリデン）ジマロノニトリル、７，７，８，８−テトラシアノキノジメタン）から選択される、請求項２３７に記載の組成物。
【請求項２４０】
前記試験片が２種以上のスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む、請求項１８５から２３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４１】
前記試験片が治療薬または治療薬候補をさらに含む、請求項１８５から２４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４２】
前記治療薬または治療薬候補がＣＥＴＰ阻害剤である、請求項２４１に記載の組成物。
【請求項２４３】
前記治療薬または治療薬候補がトルセトラピブ、アナセトラピブ、ダルセトラピブまたはエバセトラピブである、請求項２４２に記載の組成物。
【請求項２４４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料の、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定するためのキットであって、固体支持体およびスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む試験片を含み、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、スピンラベルおよびタンパク質を含み、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ＨＤＬに対して高い特異性を有するキット。
【請求項２４５】
コレステロール流出潜在力を調節するための治療薬の有効性を試験するためのキットであって、固体支持体およびスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む試験片を含み、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ＨＤＬに対して高い特異性を有するキット。
【請求項２４６】
個体における高コレステロール血症を治療するための治療薬の有益性を決定するためのキットであって、固体支持体、スピンラベルしたリポタンパク質プローブ、ならびに治療薬を含む試験片を含み、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ＨＤＬに対して高い特異性を有するキット。
【請求項２４７】
個体におけるアルツハイマー病を治療するための治療薬の有益性を決定するためのキットであって、固体支持体、スピンラベルしたリポタンパク質プローブ、ならびに治療薬を含む試験片を含み、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ＨＤＬに対して高い特異性を有するキット。
【請求項２４８】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが前記固体支持体上に存在する、請求項２４４から２４７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２４９】
１つまたは複数の追加的な試験片をさらに含む、請求項２４８に記載のキット。
【請求項２５０】
前記１つまたは複数の追加的な試験片が、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブを異なる量で含む、請求項２４９に記載のキット。
【請求項２５１】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが前記試験片とは別の容器に入っている、請求項２４４から２４７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５２】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが乾燥粉末として提供される、請求項２５１に記載のキット。
【請求項２５３】
スピンラベル参照プローブをさらに含む、請求項２４４から２５２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５４】
前記スピンラベル参照プローブが前記固体支持体上に存在する、請求項２５３に記載のキット。
【請求項２５５】
前記スピンラベル参照プローブが前記試験片とは別の容器に入っている、請求項２５３に記載のキット。
【請求項２５６】
前記スピンラベル参照プローブが乾燥粉末として提供される、請求項２５５に記載のキット。
【請求項２５７】
前記コレステロール逆転送が流体のコレステロール流出潜在力である、請求項２４４から２５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５８】
前記試験片が、血液試料または脳脊髄液試料から選択される試料とともに使用するために製剤化されている、請求項２４４から２５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５９】
前記血液試料が全血試料、血漿試料、および血清試料から選択される、請求項２５８に記載のキット。
【請求項２６０】
前記試料が哺乳動物血液試料である、請求項２５８に記載のキット。
【請求項２６１】
前記哺乳動物試料がヒト血液試料である、請求項２６０に記載のキット。
【請求項２６２】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＡ−Ｉポリペプチドまたはその断片を含む、請求項２４４から２５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２６３】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＡ−ＩのＨＤＬ結合領域を含むａｐｏＡ−Ｉ断片を含む、請求項２６２に記載のキット。
【請求項２６４】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質またはその断片の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項２６２または２６３に記載のキット。
【請求項２６５】
前記スピンラベルが、残基１８８〜残基２４３に位置する前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質のアミノ酸残基に共有結合によって付着している、請求項２６４に記載のキット。
【請求項２６６】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、９８位、１０１位、１１１位、１６７位、２１７位、または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項２６５に記載のキット。
【請求項２６７】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の９８位、１１１位または２１７位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項２６６に記載のキット。
【請求項２６８】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項２６６に記載のキット。
【請求項２６９】
９８位、１１１位、または２１７位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている、請求項２６６に記載のキット。
【請求項２７０】
２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位、または２２６位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている、請求項２６６に記載のキット。
【請求項２７１】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着している、請求項２６９に記載のキット。
【請求項２７２】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、前記スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである、請求項２７１に記載のキット。
【請求項２７３】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１１１位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、前記スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである、請求項２６９に記載のキット。
【請求項２７４】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片を含み、前記ａｐｏＡ−ＩＩまたはその断片が、ＨＤＬに対して高い特異性を有する、請求項２４４から２６１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２７５】
前記ａｐｏＡ−ＩＩまたはその断片、ここで、全リポタンパク質分子の６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上がＨＤＬと会合する、請求項２７４に記載のキット。
【請求項２７６】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項２７４に記載のキット。
【請求項２７７】
前記ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質の前記単一の部位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている、請求項２７６に記載のキット。
【請求項２７８】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＥリポタンパク質またはその断片を含み、前記ａｐｏＥリポタンパク質またはその断片が、ＨＤＬに対して高い特異性を有する、請求項２４４から２６１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２７９】
前記ａｐｏＥリポタンパク質またはその断片がａｐｏＥ３リポタンパク質またはその断片である、請求項２７８に記載のキット。
【請求項２８０】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＥリポタンパク質の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項２７８または２７９に記載のキット。
【請求項２８１】
前記ａｐｏＥタンパク質の前記単一の部位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている、請求項２８０に記載のキット。
【請求項２８２】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＡ−Ｉ模倣物を含む、請求項２４４から２６１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２８３】
前記ａｐｏＡ−Ｉ模倣物が１８Ａ、１８Ａ−Ｐｒｏ−１８Ａ、４Ｆ、および４ｆ−Ｐｒｏ−４Ｆからなる群から選択される、請求項２８２に記載のキット。
【請求項２８４】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉ模倣物の単一の部位に共有結合によって付着している、請求項２８２または２８３に記載のキット。
【請求項２８５】
前記スピンラベルが自由電子を担持する原子を含む、請求項２４４から２８４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２８６】
自由電子を担持する前記原子が窒素である、請求項２８５に記載のキット。
【請求項２８７】
前記スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ；１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ，ｄ１５；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（−）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（＋）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；３−（２−ヨードアセトアミド）−ＰＲＯＸＹＬ；３−ヨードメチル−（１−オキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリン）；１−オキシル−３−（マレイミドメチル）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジン；（１−オキシル−２，２，３，５，５−ペンタメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；Ｎ−（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジニル）マレイミド；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドエチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドヘキシルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドプロピルメタンメタンチオスルホネート；３−（２−ブロモアセトアミド）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ、フリーラジカル；４−ブロモ−３−ヒドロキシメチル−１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−δ３−ピロリン；３−ブロモメチル−２，５−ジヒドロ−２，２，５，５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−１−イルオキシ；４−ブロモ−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；３−［２−（２−マレイミドエトキシ）エチルカルバモイル］−ＰＲＯＸＹＬ；３−マレイミド−ＰＲＯＸＬ、３−（２−マレイミドエチル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（３−（２−ヨード−アセトアミド）−プロピル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（２−ブロモ−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；または３−（２−ヨード−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカルである、請求項２８５または２８６に記載のキット。
【請求項２８８】
前記スピンラベルが過重水素化スピンラベルである、請求項２８６または２８７に記載のキット。
【請求項２８９】
前記スピンラベルが、前記リポタンパク質のアミノ酸にチオスルホネートを通じて付着している、請求項２８６から２８８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９０】
前記スピンラベルしたリポタンパク質が、前記スピンラベルと前記リポタンパク質との間のスペーサーをさらに含む、請求項２８５から２８９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９１】
前記スペーサーがメタン、エタン、プロパンまたはブタンである、請求項２９０に記載のキット。
【請求項２９２】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの６０％超がＨＤＬと結合する、請求項２４４から２９１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９３】
前記ＨＤＬがＨＤＬ３である、請求項２９２に記載のキット。
【請求項２９４】
前記固体支持体が、常磁性が低いポリマー材料またはセルロース系材料から選択される、請求項２４４から２９３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９５】
前記固体支持体が吸着性材料である、請求項２４４から２９３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９６】
前記吸着性材料がポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ナイロンまたはニトロセルロースである、請求項２９５に記載のキット。
【請求項２９７】
前記固体支持体が吸着性材料をさらに含む、請求項２４４から２９４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９８】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが前記固体支持体に共有結合によって付着している、請求項２４４から２８６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９９】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが前記吸着性材料に共有結合によって付着している、請求項２９７に記載のキット。
【請求項３００】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが前記試験片に静電気によって付着している、請求項２４４から２９６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０１】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが前記吸着性材料に静電気によって付着している、請求項２９７に記載のキット。
【請求項３０２】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが前記試験片に疎水性相互作用によって付着している、請求項２４４から２９６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０３】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが前記吸着性材料に疎水性相互作用によって付着している、請求項２９７に記載のキット。
【請求項３０４】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが前記試験片に疎水性相互作用および静電気によって付着している、請求項２４４から２９６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０５】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが前記吸着性材料に疎水性相互作用および静電気によって付着している、請求項２９７に記載のキット。
【請求項３０６】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが前記吸着性材料内に捕捉されている、請求項２９７に記載のキット。
【請求項３０７】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが前記固体支持体または吸着性材料上で乾燥されている、請求項２９７に記載のキット。
【請求項３０８】
前記試験片がスピンラベルした参照プローブをさらに含む、請求項２４４から３０７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０９】
前記スピンラベルした参照プローブがＨＤＬの存在の影響を受けないスピンプローブである、請求項３０８に記載のキット。
【請求項３１０】
前記スピンラベルした参照プローブが、テトラメチルピペリジン（ＴＥＭＰＯ；２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル）、ＴＥＭＰＯＬ（４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル）、ＴＡＭＩＮＥ（４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル）、ＢＺＯＮＯ（４−（ベンゾイルオキシ）−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル）、ＳＬＰＥＯ（ポリ（エチレンオキシド）−２，２，６，６−テトラメチル−ピペリジン−１−オキシル）、およびテトラシアノキノジメタン（ＴＣＮＱ；２，５−シクロヘキサジエン−１，４−ジイリデン）ジマロノニトリル、７，７，８，８−テトラシアノキノジメタン）から選択される、請求項３０９に記載のキット。
【請求項３１１】
２種以上のスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む、請求項２４４から３１０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１２】
前記試験片が治療薬または治療薬候補をさらに含む、請求項２４４から３１１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１３】
前記治療薬または治療薬候補がＨＤＬ修飾治療薬またはＨＤＬ修飾治療薬候補である、請求項３１２に記載のキット。
【請求項３１４】
前記治療薬または治療薬候補がＣＥＴＰ阻害剤である、請求項３１２に記載のキット。
【請求項３１５】
前記治療薬または治療薬候補がトルセトラピブ（Ｔｏｒｃｅｔｒａｐｉｂ）、アナセトラピブ（Ａｎａｃｅｔｒａｐｉｂ）、ダルセトラピブ（Ｄａｌｃｅｔｒａｐｉｂ）またはエバセトラピブ（Ｅｖａｃｅｔｒａｐｉｂ）である、請求項３１４に記載のキット。
【請求項３１６】
凝固薬をさらに含む、請求項２４４から３１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１７】
前記凝固薬が、ヘパリン、クマジン、ワルファリン、ＥＤＴＡ、シトレートまたはオキザレートである、請求項３１６に記載のキット。
【請求項３１８】
使用説明書をさらに含む、請求項２４４から３１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１９】
試料中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のコレステロール逆転送を支持する能力を測定するための方法であって、
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、固体支持体およびスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む試験片と接触させるステップであって、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブがスピンラベルおよびリポタンパク質を含み、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブがＨＤＬに対して高い特異性を有するステップと、
ｂ）前記試験片上の前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップと
を含む方法。
【請求項３２０】
試料中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のコレステロール逆転送を支持する能力を測定するための方法であって、
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、スピンラベルしたリポタンパク質プローブと接触させるステップであって、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ＨＤＬに対して高い特異性を有すると、
ｂ）前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、固体支持体を含む試験片と接触させるステップであって、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの一部または全部が前記試験片に接着するステップと、
ｃ）前記試験片上の前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップと
を含む方法。
【請求項３２１】
ステップａ）およびｂ）が逐次的または同時になされる、請求項３２０に記載の方法。
【請求項３２２】
治療薬の、個体における高コレステロール血症またはアルツハイマー病を治療するための有益性を決定するための方法であって、
ａ）前記個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、固体支持体およびスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む試験片と接触させるステップであって、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ＨＤＬに対して高い特異性を有する、ステップと、
ｂ）前記試験片上の前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップと
を含み、
前記個体の前記試料のコレステロール流出潜在力が正常な個体からのコレステロール流出潜在力と比較して減少することが、前記個体にとって、前記高コレステロール血症またはアルツハイマー病を治療することに前記治療薬が有益である可能性があることを示す方法。
【請求項３２３】
個体におけるアルツハイマー病を診断するための方法であって、
ａ）前記個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、固体支持体およびスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む試験片と接触させるステップであって、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ＨＤＬに対して高い特異性を有する、ステップと、
ｂ）前記試験片上の前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップと、
を含み、
前記個体の前記試料のコレステロール流出潜在力が正常な個体からのコレステロール流出潜在力と比較して減少することが、前記個体がアルツハイマー病を有する可能性があることを示す方法。
【請求項３２４】
治療薬の、個体における高コレステロール血症またはアルツハイマー病を治療するための有益性を決定するための方法であって、
ａ）前記個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、スピンラベルしたリポタンパク質プローブと接触させるステップであって、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ＨＤＬに対して高い特異性を有する、ステップと、
ｂ）前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、固体支持体を含む試験片と接触させるステップであって、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの一部または全部が前記試験片に接着するステップと、
ｃ）前記試験片上の前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップと
を含み、
前記個体の前記試料のコレステロール流出潜在力が正常な個体からのコレステロール流出潜在力と比較して減少することが、前記個体にとって、前記高コレステロール血症またはアルツハイマー病を治療することに前記治療薬が有益である可能性があることを示す方法。
【請求項３２５】
ステップａ）およびｂ）が逐次的または同時になされる、請求項３２４に記載の方法。
【請求項３２６】
高コレステロール血症を治療するための療法を受けている個体において高コレステロール血症を治療するために治療薬の治療有効性を最適化するための方法であって、
ａ）前記個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、固体支持体およびスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む試験片と接触させるステップであって、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ＨＤＬに対して高い特異性を有する、ステップと、
ｂ）前記試験片上の前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップと
を含み、
前記個体の前記試料のコレステロール流出潜在力が療法を受ける前の前記個体由来の試料のコレステロール流出潜在力と比較して増加することが、前記個体にとって、高コレステロール血症を治療することに前記治療薬が有益である可能性があることを示す方法。
【請求項３２７】
高コレステロール血症を治療するための療法を受けている個体において高コレステロール血症を治療するために治療薬の治療有効性を最適化するための方法であって、
ａ）前記個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、スピンラベルしたリポタンパク質プローブと接触させるステップであって、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ＨＤＬに対して高い特異性を有すると、
ｂ）前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、固体支持体を含む試験片と接触させるステップであって、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの一部または全部が前記試験片に接着するステップと、
ｃ）前記試験片上の前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップと
を含み、
前記個体の前記試料のコレステロール流出潜在力が療法を受ける前の前記個体由来の試料のコレステロール流出潜在力と比較して増加することが、前記個体にとって、高コレステロール血症を治療することに前記治療薬が有益である可能性があることを示す方法。
【請求項３２８】
ステップａ）およびｂ）が逐次的または同時になされる、請求項３２７に記載の方法。
【請求項３２９】
療法に応答してコレステロール流出潜在力が増加することが実証されれば療法が継続される、請求項３２５または３２６に記載の方法。
【請求項３３０】
前記療法に応答したコレステロール流出潜在力の変化を受けて療法が調節される、請求項３２６から３２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３１】
個体の血液のコレステロール流出能を調節するための候補治療薬をスクリーニングするための方法であって、
ａ）コレステロール流出能が低いｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、固体支持体およびスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む試験片と接触させるステップであって、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ＨＤＬに対して高い特異性を有する試験片と、
ｂ）前記試料を前記候補組成物と接触させるステップと、
ｂ）前記試験片上の前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップと
を含み、
前記試料のコレステロール流出潜在力の増加が、前記組成物がコレステロール流出能を調節するために有用である可能性があることを示す方法。
【請求項３３２】
個体のコレステロール流出能を調節するための候補治療薬をスクリーニングするための方法であって、
ａ）コレステロール流出能が低いｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、スピンラベルしたリポタンパク質プローブと接触させるステップであって、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ＨＤＬに対して高い特異性を有する、ステップと、
ｂ）前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を前記候補治療薬と接触させるステップと、
ｃ）前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、固体支持体を含む試験片と接触させるステップであって、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの一部または全部が前記試験片に接着するステップと、
ｄ）前記試験片上の前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップと
を含み、
前記試料のコレステロール流出潜在力の増加が、前記組成物がコレステロール流出能を調節するために有用である可能性があることを示す方法。
【請求項３３３】
ステップａ）、ｂ）およびｃ）が逐次的または同時になされる、請求項３３２に記載の方法。
【請求項３３４】
コレステロール流出潜在力の行動性調節因子を決定するための方法であって、
ａ）行動調節を受けている個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、固体支持体およびスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む試験片と接触させるステップであって、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ＨＤＬに対して高い特異性を有する、ステップと、
ｂ）前記試験片上の前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップと
を含み、
前記個体の前記試料のコレステロール流出潜在力が行動調節を受ける前の前記個体由来の試料のコレステロール流出潜在力と比較して増加することが、前記行動調節によりコレステロール流出能に利益がもたらされることを示す方法。
【請求項３３５】
コレステロール流出潜在力の行動性調節因子を決定するための方法であって、
ａ）行動調節を受けている個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、スピンラベルしたリポタンパク質プローブと接触させるステップであって、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ＨＤＬに対して高い特異性を有する、ステップと、
ｂ）前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、固体支持体を含む試験片と接触させるステップであって、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの一部または全部が前記試験片に接着するステップと、
ｃ）前記試験片上の前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップと
を含み、
前記個体の前記試料のコレステロール流出潜在力が行動調節を受ける前の前記個体由来の試料のコレステロール流出潜在力と比較して増加することが、前記行動調節によりコレステロール流出能に利益がもたらされることを示す方法。
【請求項３３６】
ステップａ）およびｂ）が逐次的または同時になされる、請求項３３５に記載の方法。
【請求項３３７】
前記行動が食事、運動または喫煙である、請求項３３４から３３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３８】
前記試料が血液試料または脳脊髄液試料である、請求項３１８から３３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３９】
前記試料が血液試料である、請求項３３８に記載の方法。
【請求項３４０】
前記血液試料が全血試料、血漿試料、および血清試料から選択される、請求項３３９に記載の方法。
【請求項３４１】
前記試料が哺乳動物血液試料である、請求項３４０に記載の組成物。
【請求項３４２】
前記哺乳動物試料がヒト血液試料である、請求項３４１に記載の組成物。
【請求項３４３】
前記ＥＰＲスペクトルを、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブを前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料に添加した後の１つまたは複数の時点で収集する、請求項３１８から３４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４４】
前記ＥＰＲスペクトルを、前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブを前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料に添加した後１．５分、４分、６分、８分、１０分、３０分、６０分の時点のうちの１つまたは複数でモニターする、請求項３４３に記載の方法。
【請求項３４５】
前記ＥＰＲスペクトルを０℃〜３７℃にわたる温度で収集する、請求項３１８から３４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４６】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＡ−Ｉポリペプチドまたはその断片を含む、請求項３１８から３４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４７】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＡ−ＩのＨＤＬ結合領域を含むａｐｏＡ−Ｉ断片を含む、請求項３４６に記載の方法。
【請求項３４８】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質またはその断片の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項３４６または３４７に記載の方法。
【請求項３４９】
前記スピンラベルが、残基１８８〜残基２４３に位置する前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質のアミノ酸残基に共有結合によって付着している、請求項３４８に記載の方法。
【請求項３５０】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、９８位、１０１位、１１１位、１６７位、２１７位、または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項３４８に記載の方法。
【請求項３５１】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の９８位、１１１位または２１７位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項３５０に記載の方法。
【請求項３５２】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項３５０に記載の方法。
【請求項３５３】
９８位、１１１位、または２１７位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている、請求項３５０に記載の方法。
【請求項３５４】
２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位、または２２６位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている、請求項３５０に記載の方法。
【請求項３５５】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着している、請求項３５３に記載の方法。
【請求項３５６】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、前記スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである、請求項３５５に記載の方法。
【請求項３５７】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１１１位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、前記スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである、請求項３５３に記載の方法。
【請求項３５８】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片を含み、前記ａｐｏＡ−ＩＩまたはその断片が、ＨＤＬに対して高い特異性を有する、請求項３１８から３４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５９】
前記ａｐｏＡ−ＩＩまたはその断片、ここで、全リポタンパク質分子の６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上がＨＤＬと会合する、請求項３５８に記載の方法。
【請求項３６０】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項３５８または３５９に記載の方法。
【請求項３６１】
前記ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質の前記単一の部位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている、請求項３６０に記載の方法。
【請求項３６２】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ａｐｏＥリポタンパク質またはその断片を含み、前記ａｐｏＥまたはその断片が、ＨＤＬに対して高い特異性を有する、請求項３１８から３４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６３】
前記ａｐｏＥリポタンパク質またはその断片がａｐｏＥ３リポタンパク質またはその断片である、請求項３６２に記載の方法。
【請求項３６４】
前記スピンラベルが前記ａｐｏＥリポタンパク質の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している、請求項３６２または３６３に記載の方法。
【請求項３６５】
前記ａｐｏＥタンパク質の前記単一の部位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている、請求項３６４に記載の方法。
【請求項３６６】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＡ−Ｉ模倣物を含む、請求項３１８から３４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６７】
前記ａｐｏＡ−Ｉ模倣物が１８Ａ、１８Ａ−Ｐｒｏ−１８Ａ、４Ｆ、および４ｆ−Ｐｒｏ−４Ｆからなる群から選択される、請求項３６６に記載の方法。
【請求項３６８】
前記スピンラベルが、前記ａｐｏＡ−Ｉ模倣物の単一の部位に共有結合によって付着している、請求項３６６または３６７に記載の方法。
【請求項３６９】
前記スピンラベルが自由電子を担持する原子を含む、請求項３１８から３６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７０】
自由電子を担持する前記原子が窒素である、請求項３６９に記載の方法。
【請求項３７１】
前記スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ；１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ，ｄ１５；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（−）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（＋）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；３−（２−ヨードアセトアミド）−ＰＲＯＸＹＬ；３−ヨードメチル−（１−オキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリン）；１−オキシル−３−（マレイミドメチル）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジン；（１−オキシル−２，２，３，５，５−ペンタメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；Ｎ−（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジニル）マレイミド；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドエチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドヘキシルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドプロピルメタンメタンチオスルホネート；３−（２−ブロモアセトアミド）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ、フリーラジカル；４−ブロモ−３−ヒドロキシメチル−１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−δ３−ピロリン；３−ブロモメチル−２，５−ジヒドロ−２，２，５，５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−１−イルオキシ；４−ブロモ−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；３−［２−（２−マレイミドエトキシ）エチルカルバモイル］−ＰＲＯＸＹＬ；３−マレイミド−ＰＲＯＸＬ、３−（２−マレイミドエチル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（３−（２−ヨード−アセトアミド）−プロピル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（２−ブロモ−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；または３−（２−ヨード−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカルである、請求項３６９または３７０に記載の方法。
【請求項３７２】
前記スピンラベルが過重水素化スピンラベルである、請求項３７１または３７３に記載の方法。
【請求項３７３】
前記スピンラベルが、前記リポタンパク質のアミノ酸にチオスルホネートを通じて付着している、請求項３７０から３７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７４】
前記スピンラベルしたリポタンパク質が、前記スピンラベルと前記リポタンパク質との間のスペーサーをさらに含む、請求項３７０から３７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７５】
前記スペーサーがメタン、エタン、プロパンまたはブタンである、請求項３７４に記載の方法。
【請求項３７６】
前記スピンラベルしたリポタンパク質プローブの６０％超がＨＤＬと結合する、請求項３１８から３７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７７】
前記ＨＤＬがＨＤＬ３である、請求項３７６に記載の方法。
【請求項３７８】
前記固体支持体が、常磁性が低いポリマー材料またはセルロース系材料から選択される、請求項３１８から３７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７９】
前記固体支持体が吸着性材料である、請求項３１８から３７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８０】
前記吸着性材料がポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ナイロンまたはニトロセルロースである、請求項３７９に記載の方法。
【請求項３８１】
前記固体支持体が吸着性材料をさらに含む、請求項３１８から３７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８２】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料が抗凝固薬をさらに含む、請求項３１８から３８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８３】
前記抗凝固薬がヘパリン、クマジン、ワルファリン、ＥＤＴＡ、シトレートまたはオキザレートである、請求項３８２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１１年１２月２日に提出した米国仮特許出願第６１／５６６，５８１号および２０１１年４月２９日に提出した米国仮特許出願第６１／４８１，１４８号の優先権の利益を主張する。これらの出願はいずれも、その全体が本明細書に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を測定するために電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光法を用いる分野に関する。ＥＰＲ分光法を用いて、個体における冠動脈疾患のリスクを決定することができる。
【０００３】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、一部、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）からの助成金番号２  ＲＯ１  ＨＬ０７７２６８−０５によって支援された研究の間に行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ヒトにおける試験［１〜５］および遺伝子改変マウスモデル系における試験［６〜９］のどちらによっても、血漿高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）と、米国における死亡数の主な原因である冠動脈疾患（ＣＡＤ）との間に強力な関連性が実証された。集団研究では、ＣＡＤに対しては、ＨＤＬ−Ｃレベルが低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）のレベルよりも強力な独立した危険因子であることが一貫して実証されている［１］。長期的な集団研究では、血漿ＨＤＬ−ＣのレベルはＣＡＤと明白に関連するが、ＨＤＬ−Ｃのレベルは、個体ベースではＣＡＤに対する患者の素因の優良な予測因子ではない。さらに、フラミンガム子孫研究（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ  Ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ  Ｓｔｕｄｙ）およびＭＥＳＡ研究のどちらによっても、ＣＡＤ患者のほぼ４０％のＨＤＬ−Ｃレベルが正常であるかまたは上昇していることが見いだされた［１０、１１］。同様に、ＩＤＥＡＬ試験では、ＨＤＬ−Ｃレベルが７０ｍｇ／ｄＬを超える患者において最も高いリスク推定値が見られた［１２、１３］。これらの試験により、異常に高いＨＤＬ−Ｃおよび／またはＣＡＤを導く恐れがある高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の機能不全プールが存在する可能性があることが示唆されている。ＨＤＬ−Ｃ測定値を決定するための現行の方法は、健康ＨＤＬ粒子および機能不全ＨＤＬ粒子を含むという理解により、ＣＡＤに対する診断薬および予後マーカーとしてのＨＤＬ−Ｃの有効性が疑問視される。したがって、現在決定されている通り、ＨＤＬ−Ｃレベル単独では、個体レベルでのＣＡＤリスクについての正確な予後またはＣＡＤに対する治療を生じるために必要な情報の全てはもたらされない。
【０００５】
健康ＨＤＬによりＣＡＤが予防されると考えられる主要な手段は、コレステロール逆転送（ＲＣＴ）によるものである（図１）。１９７０年代に、ＲｏｓｓおよびＧｌｏｍｓｅｔにより、ＲＣＴによるコレステロールの動員が、アテローム性動脈硬化症の発症を予防するために重大であることが仮定された［１４］。その後すぐに、ＨＤＬが、ＲＣＴの主要なメディエーターとして同定され、マクロファージがＬＤＬ誘導性アポトーシスから保護され、内皮機能が保存されることによってアテローム硬化性保護が付与される［１６〜１９］抗アテローム硬化性脂質複合体として提唱された［１５］。ＨＤＬは、ＲＣＴを通じて、ＣＡＤの根底にある主要な病理学的状態である動脈硬化巣を含有する壊死性コアの形成を開始し進行させる泡沫細胞の生成および蓄積を予防する。
【０００６】
年齢、糖尿病状態、高血圧症、および肥満などの因子によって複雑になるが、慢性炎症の指標（Ｃ反応性タンパク質、フィブリノーゲン、白血球数、および血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ）が、ＣＡＤのリスクの増加と有意に関連する［２０〜２３］。慢性炎症は、マクロファージの活性化を伴い、これにより、動脈内膜において酸化酵素ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）が産生されることに主に起因して酸化的環境が生じる可能性がある［２４〜２６］。内膜において酸化的環境が生じることにより、ＨＤＬの酸化的修飾が導かれ［２７］、ＨＤＬの主要なタンパク質成分であるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ａｐｏＡ−Ｉ）がＭＰＯによるＨＤＬの酸化の主要な標的となる［２８、２９］。ＭＰＯにより引き出されるａｐｏＡ−Ｉの酸化的修飾により、ＡＢＣＡ１を介したコレステロールの動員が損なわれ［２８、３０〜３２］、これにより、ＣＡＤにおける慢性炎症の１つの結果が、コレステロール流出能（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ  ｃａｐａｃｉｔｙ）が損なわれた機能不全ＨＤＬの生成であるという結論が裏付けられる。
【０００７】
興味深いことに、Ｒａｄｅｒ博士およびＲｏｔｈｂｌａｔ博士の研究室により、最近、ヒト血漿ＨＤＬの、培養されたマクロファージからのステロール流出を促進する能力は、ＨＤＬ−ＣおよびａｐｏＡ−Ｉのレベルが同様であるにもかかわらず個々の対象間で有意に変動することが実証された［３３］。さらに、彼らは、血漿ＨＤＬのステロール流出能（ｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ  ｃａｐａｃｉｔｙ）が、ＨＤＬ−Ｃとは無関係に、ＣＡＤ状態と強力に関連することを決定した［３４］。このＨＤＬ機能の計量は、ＨＤＬ−Ｃ（０．８５；９５％ＣＩ）よりも大きな逆相関オッズ比（０．７５；９５％ＣＩ）を示し、ＨＤＬ−Ｃよりも正確なＣＡＤの予測因子であると思われ、それぞれｐ＜０．００２対ｐ＜０．０９である。ヒト血漿のＨＤＬのステロール流出能の測定は、有望ではあるが、培養細胞を用いて実施される、労力を要し費用が掛かるプロセスである。この手法は情報価値がある可能性があるが、必ずしも、大きな試料数または効率的な処理量に容易に規模を拡大できるものではない。
【０００８】
ＨＤＬがＲＣＴを通過する間に、ＨＤＬは、その脂質およびタンパク質の含有量の変化（例えば、ａｐｏＡ結合／置き換え）によって生じる一連のリモデリング事象を受ける。各ＨＤＬサブクラスは独特の安定性、コレステロール流出能、ならびに酵素および受容体親和性を有する［３５〜３７］。これらのサブクラス転移により、ａｐｏＡ−Ｉはかなりのコンフォメーションの適応を受け、この柔軟性はＡＢＣＡ１媒介性コレステロール流出に必須である。試験により、ａｐｏＡ−ＩのＭＰＯ媒介性酸化により、このプロセスが損なわれ、同時にＨＤＬの、ＡＢＣＡ１を介してコレステロールの動員を媒介する能力が影響を受けることが示された［２８、３０］。最近、ＨＤＬのａｐｏＡ−Ｉ結合／置き換え速度に対するＭＰＯ酸化の影響を測定する蛍光に基づくアッセイが開発された［３８］。この手法は、ＨＤＬのコレステロールを流出させる能力に対する酸化的事象の影響を評価することにおいて情報価値のあるものであることが証明されたが、生体試料におけるＨＤＬの流出能力を評価することにおいては使用が限定されている。残念ながら、血漿を含めた複雑な生体液には固有の蛍光があるので、この蛍光による手法は、例えば、全血、血清または血漿を含めたヒトｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料などの臨床的に関連する試料に直接適用することができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Gordon, T., W.P. Castelli, M.C.Hjortland, W.B. Kannel, and T.R. Dawber, High density lipoprotein as aprotective factor against coronary heart disease. The Framingham Study. Am JMed, 1977. 62(5): p. 707-14.
【非特許文献２】Assmann, G., H. Schulte, A. vonEckardstein, and Y. Huang, High-density lipoprotein cholesterol as a predictorof coronary heart disease risk. The PROCAM experience and pathophysiological implicationsfor reverse cholesterol transport. Atherosclerosis, 1996. 124 Suppl: p. S11-20.
【非特許文献３】Sharrett, A.R., C.M. Ballantyne,S.A. Coady, G. Heiss, P.D. Sorlie, D. Catellier, and W. Patsch, Coronary heartdisease prediction from lipoprotein cholesterol levels, triglycerides,lipoprotein(a), apolipoproteins A-I and B, and HDL density subfractions: TheAtherosclerosis Risk in Communities (ARIC) Study. Circulation, 2001. 104(10):p. 1108-13.
【非特許文献４】Gordon, D.J., J.L. Probstfield,R.J. Garrison, J.D. Neaton, W.P. Castelli, J.D. Knoke, D.R. Jacobs, Jr., S.Bangdiwala, and H.A. Tyroler, High-density lipoprotein cholesterol andcardiovascular disease. Four prospective American studies. Circulation, 1989.79(1): p. 8-15.
【非特許文献５】Downs, J.R., M. Clearfield, S.Weis, E. Whitney, D.R. Shapiro, P.A. Beere, A. Langendorfer, E.A. Stein, W.Kruyer, and A.M. Gotto, Jr., Primary prevention of acute coronary events withlovastatin in men and women with average cholesterol levels: results ofAFCAPS/TexCAPS. Air Force/Texas Coronary Atherosclerosis Prevention Study.JAMA, 1998. 279(20): p. 1615-22.
【非特許文献６】Rubin, E.M., R.M. Krauss, E.A.Spangler, J.G. Verstuyft, and S.M. Clift, Inhibition of early atherogenesis intransgenic mice by human apolipoprotein AI. Nature, 1991. 353(6341): p. 265-7.
【非特許文献７】Liu, A.C., R.M. Lawn, J.G.Verstuyft, and E.M. Rubin, Human apolipoprotein A-I prevents atherosclerosisassociated with apolipoprotein[a] in transgenic mice. J Lipid Res, 1994. 35(12):p. 2263-7.
【非特許文献８】Hughes, S.D., J. Verstuyft, andE.M. Rubin, HDL deficiency in genetically engineered mice requires elevated LDLto accelerate atherogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1997. 17(9): p.1725-9.
【非特許文献９】Voyiaziakis, E., I.J. Goldberg,A.S. Plump, E.M. Rubin, J.L. Breslow, and L.S. Huang, ApoA-I deficiency causesboth hypertriglyceridemia and increased atherosclerosis in human apoBtransgenic mice. J Lipid Res, 1998. 39(2): p. 313-21.
【非特許文献１０】Asztalos, B.F., L.A. Cupples, S.Demissie, K.V. Horvath, C.E. Cox, M.C. Batista, and E.J. Schaefer, High-densitylipoprotein subpopulation profile and coronary heart disease prevalence in maleparticipants of the Framingham Offspring Study. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004. 24(11): p. 2181-7.
【非特許文献１１】Tsai, M.Y., C. Johnson, W.H. Kao,A.R. Sharrett, V.L. Arends, R. Kronmal, N.S. Jenny, D.R. Jacobs, Jr., D.Arnett, D. O'Leary, and W. Post, Cholesteryl ester transfer protein geneticpolymorphisms, HDL cholesterol, and subclinical cardiovascular disease in theMulti-Ethnic Study of Atherosclerosis. Atherosclerosis, 2008. 200(2): p.359-67.
【非特許文献１２】Pedersen, T.R., O. Faergeman,J.J. Kastelein, A.G. Olsson, M.J. Tikkanen, I. Holme, M.L. Larsen, F.S.Bendiksen, C. Lindahl, M. Szarek, and J. Tsai, High-dose atorvastatin vsusual-dose simvastatin for secondary prevention after myocardial infarction:the IDEAL study: a randomized controlled trial. JAMA, 2005. 294(19): p.2437-45.
【非特許文献１３】van der Steeg, W.A., I. Holme,S.M. Boekholdt, M.L. Larsen, C. Lindahl, E.S. Stroes, M.J. Tikkanen, N.J.Wareham, O. Faergeman, A.G. Olsson, T.R. Pedersen, K.T. Khaw, and J.J.Kastelein, High-density lipoprotein cholesterol, high-density lipoproteinparticle size, and apolipoprotein A-I: significance for cardiovascular risk:the IDEAL and EPIC-Norfolk studies. J Am Coll Cardiol, 2008. 51(6): p. 634-42.
【非特許文献１４】Ross, R. and J.A. Glomset,Atherosclerosis and the arterial smooth muscle cell: Proliferation of smoothmuscle is a key event in the genesis of the lesions of atherosclerosis.Science, 1973. 180(93): p. 1332-9.
【非特許文献１５】Miller, N.E. and G.J. Miller,Letter: High-density lipoprotein and atherosclerosis. Lancet, 1975. 1(7914): p.1033.
【非特許文献１６】Terasaka, N., N. Wang, L.Yvan-Charvet, and A.R. Tall, High-density lipoprotein protects macrophages fromoxidized low-density lipoprotein-induced apoptosis by promoting efflux of7-ketocholesterol via ABCG1. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(38): p. 15093-8.
【非特許文献１７】Cui, D., E. Thorp, Y. Li, N.Wang, L. Yvan-Charvet, A.R. Tall, and I. Tabas, Pivotal advance: macrophagesbecome resistant to cholesterol-induced death after phagocytosis of apoptoticcells. J Leukoc Biol, 2007. 82(5): p. 1040-50.
【非特許文献１８】Terasaka, N., S. Yu, L.Yvan-Charvet, N. Wang, N. Mzhavia, R. Langlois, T. Pagler, R. Li, C.L. Welch,I.J. Goldberg, and A.R. Tall, ABCG1 and HDL protect against endothelialdysfunction in mice fed a high-cholesterol diet. J Clin Invest, 2008. 118(11):p. 3701-13.
【非特許文献１９】Spieker, L.E., I. Sudano, D.Hurlimann, P.G. Lerch, M.G. Lang, C. Binggeli, R. Corti, F. Ruschitzka, T.F.Luscher, and G. Noll, High-density lipoprotein restores endothelial function inhypercholesterolemic men. Circulation, 2002. 105(12): p. 1399-402.
【非特許文献２０】Packard, C.J., D.S. O'Reilly,M.J. Caslake, A.D. McMahon, I. Ford, J. Cooney, C.H. Macphee, K.E. Suckling, M.Krishna, F.E. Wilkinson, A. Rumley, and G.D. Lowe, Lipoprotein-associatedphospholipase A2 as an independent predictor of coronary heart disease. West ofScotland Coronary Prevention Study Group. N Engl J Med, 2000. 343(16): p.1148-55.
【非特許文献２１】Ridker, P.M., M. Cushman, M.J.Stampfer, R.P. Tracy, and C.H. Hennekens, Inflammation, aspirin, and the riskof cardiovascular disease in apparently healthy men. N Engl J Med, 1997.336(14): p. 973-9.
【非特許文献２２】Kuller, L.H., R.P. Tracy, J.Shaten, and E.N. Meilahn, Relation of C-reactive protein and coronary heartdisease in the MRFIT nested case-control study. Multiple Risk FactorIntervention Trial. Am J Epidemiol, 1996. 144(6): p. 537-47.
【非特許文献２３】Koenig, W., M. Sund, M. Frohlich,H.G. Fischer, H. Lowel, A. Doring, W.L. Hutchinson, and M.B. Pepys, C-Reactiveprotein, a sensitive marker of inflammation, predicts future risk of coronaryheart disease in initially healthy middle-aged men: results from the MONICA(Monitoring Trends and Determinants in Cardiovascular Disease) Augsburg CohortStudy, 1984 to 1992. Circulation, 1999. 99(2): p. 237-42.
【非特許文献２４】Daugherty, A., J.L. Dunn, D.L.Rateri, and J.W. Heinecke, Myeloperoxidase, a catalyst for lipoproteinoxidation, is expressed in human atherosclerotic lesions. J Clin Invest, 1994.94(1): p. 437-44.
【非特許文献２５】Hazen, S.L., J.P. Gaut, J.R.Crowley, F.F. Hsu, and J.W. Heinecke, Elevated levels of protein-boundp-hydroxyphenylacetaldehyde, an amino-acid-derived aldehyde generated bymyeloperoxidase, are present in human fatty streaks, intermediate lesions andadvanced atherosclerotic lesions. Biochem J, 2000. 352 Pt 3: p. 693-9.
【非特許文献２６】Zheng, L., M. Settle, G.Brubaker, D. Schmitt, S.L. Hazen, J.D. Smith, and M. Kinter, Localization ofnitration and chlorination sites on apolipoprotein A-I catalyzed bymyeloperoxidase in human atheroma and associated oxidative impairment inABCA1-dependent cholesterol efflux from macrophages. J Biol Chem, 2005. 280(1):p. 38-47.
【非特許文献２７】Bergt, C., S. Pennathur, X. Fu,J. Byun, K. O'Brien, T.O. McDonald, P. Singh, G.M. Anantharamaiah, A. Chait, J.Brunzell, R.L. Geary, J.F. Oram, and J.W. Heinecke, The myeloperoxidase producthypochlorous acid oxidizes HDL in the human artery wall and impairsABCA1-dependent cholesterol transport. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(35):p. 13032-7.
【非特許文献２８】Shao, B., C. Bergt, X. Fu, P.Green, J.C. Voss, M.N. Oda, J.F. Oram, and J.W. Heinecke, Tyrosine 192 inapolipoprotein A-I is the major site of nitration and chlorination bymyeloperoxidase, but only chlorination markedly impairs ABCA1-dependentcholesterol transport. J Biol Chem, 2005. 280(7): p. 5983-93.
【非特許文献２９】Zheng, L., B. Nukuna, M.L.Brennan, M. Sun, M. Goormastic, M. Settle, D. Schmitt, X. Fu, L. Thomson, P.L.Fox, H. Ischiropoulos, J.D. Smith, M. Kinter, and S.L. Hazen, ApolipoproteinA-I is a selective target for myeloperoxidase-catalyzed oxidation andfunctional impairment in subjects with cardiovascular disease. J Clin Invest,2004. 114(4): p. 529-41.
【非特許文献３０】30.  Shao, B., S. Pennathur, I. Pagani,M.N. Oda, J.L. Witztum, J.F. Oram, and J.W. Heinecke, Modifying apolipoproteinA-I by malondialdehyde, but not by an array of other reactive carbonyls, blockscholesterol efflux by the ABCA1 pathway. J Biol Chem, 2010. 285(24): p.18473-84.
【非特許文献３１】Shao, B., M.N. Oda, C. Bergt, X.Fu, P.S. Green, N. Brot, J.F. Oram, and J.W. Heinecke, Myeloperoxidase impairsABCA1-dependent cholesterol efflux through methionine oxidation andsite-specific tyrosine chlorination of apolipoprotein A-I. J Biol Chem, 2006.281(14): p. 9001-4.
【非特許文献３２】Shao, B., G. Cavigiolio, N. Brot,M.N. Oda, and J.W. Heinecke, Methionine oxidation impairs reverse cholesteroltransport by apolipoprotein A-I. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008. 105(34): p.12224-9.
【非特許文献３３】de la Llera-Moya, M., D.Drazul-Schrader, B.F. Asztalos, M. Cuchel, D.J. Rader, and G.H. Rothblat, Theability to promote efflux via ABCA1 determines the capacity of serum specimenswith similar high-density lipoprotein cholesterol to remove cholesterol frommacrophages. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2010. 30(4): p. 796-801.
【非特許文献３４】Khera, A.V., M. Cuchel, M. de laLlera-Moya, A. Rodrigues, M.F. Burke, K. Jafri, B.C. French, J.A. Phillips,M.L. Mucksavage, R.L. Wilensky, E.R. Mohler, G.H. Rothblat, and D.J. Rader,Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis.N Engl J Med, 2011. 364(2): p. 127-35.
【非特許文献３５】Mora, S., J.D. Otvos, N. Rifai,R.S. Rosenson, J.E. Buring, and P.M. Ridker, Lipoprotein particle profiles bynuclear magnetic resonance compared with standard lipids and apolipoproteins inpredicting incident cardiovascular disease in women. Circulation, 2009. 119(7):p. 931-9.
【非特許文献３６】Lund-Katz, S. and M.C. Phillips,High density lipoprotein structure-function and role in reverse cholesteroltransport. Subcell Biochem, 2010. 51: p. 183-227.
【非特許文献３７】Fidge, N.H., High densitylipoprotein receptors, binding proteins, and ligands. J Lipid Res, 1999. 40(2):p. 187-201.
【非特許文献３８】Cavigiolio, G., E.G. Geier, B.Shao, J.W. Heinecke, and M.N. Oda, Exchange of apolipoprotein A-I between lipid-associatedand lipid-free states: a potential target for oxidative generation ofdysfunctional high density lipoproteins. J Biol Chem, 2010. 285(24): p.18847-57.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を測定するための感度のよいアッセイが必要である。そのようなアッセイは、ＣＡＤ、アテローム性動脈硬化症、末梢血管疾患および脳卒中を含めた心臓血管疾患のリスクを決定すること；ＣＡＤ、アテローム性動脈硬化症、末梢血管疾患および脳卒中を含めた心臓血管疾患に対する治療の進行をモニターすること；ならびにＣＡＤ、アテローム性動脈硬化症、末梢血管疾患および脳卒中を含めた心臓血管疾患に対する治療の開発において有用である可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
特許出願および刊行物を含めた本明細書において引用された全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００１２】
（発明の簡単な概要）
本発明は、試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）における高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のコレステロール逆転送を支持する能力を測定するための方法であって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを試料に添加するステップと、試料の電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップとを含む方法を提供する。本発明は、血液における高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のコレステロール逆転送を支持する能力を測定するための方法であって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加するステップと、試料の電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、該方法は、スペクトルを陽性対照および／または陰性対照と比較することによって、スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合を比較するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、陰性対照は、無脂質環境または低脂質環境中にあるスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルである。いくつかの実施形態では、陽性対照は、ジミリストイルホスファチジルコリンと結合したスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルである。いくつかの実施形態では、コレステロール逆転送がコレステロール流出潜在力（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）である。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態では、ＥＰＲスペクトルの中心ピークの振幅を測定する。いくつかの実施形態では、低脂質のスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルと比較した、血液試料中のスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルの中心ピークの振幅の差異が、リポタンパク質とＨＤＬとの結合の差異を示す。他の実施形態では、中心ピークの振幅の増加が、スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の増加を示す。他の実施形態では、中心ピークの振幅の増加が、スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の減少を示す。他の実施形態では、中心ピークの振幅の減少が、スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の増加を示す。他の実施形態では、中心ピークの振幅の減少が、スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の減少を示す。いくつかの実施形態では、中心ピークの振幅の変化を、血液試料中のスピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬが結合しても変化しない近ピークおよび／または遠ピークの振幅との関連で測定する。本発明のいくつかの実施形態では、ＥＰＲスペクトルのプロファイルの変化が、スピンラベルしたリポタンパク質プローブの結合の変化を示す。いくつかの実施形態では、中心ピークのシフトが、スピンラベルしたリポタンパク質プローブの結合の変化を示す。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態では、試料は体液；例えば、血液または脳液（ＣＳＦ）である。本発明のいくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は全血試料である。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は血漿試料である。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は血清試料である。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は、スピンラベルしたリポタンパク質プローブを添加する前に１回または２回凍結解凍されている。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は非ヒト哺乳動物血液試料である。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料はヒト血液試料である。いくつかの実施形態では、試料はＣＳＦ試料である。いくつかの実施形態では、ＣＳＦは非ヒト哺乳動物ＣＳＦ試料である。いくつかの実施形態では、ＣＳＦはヒト哺乳動物ＣＳＦ試料である。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルはリポタンパク質の単一の部位に位置する。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、第１のスピンラベルおよび第２のスピンラベルを含む。いくつかの実施形態では、第１のスピンラベルはリポタンパク質の第１の単一の部位に位置し、第２のスピンラベルは、リポタンパク質の第２の単一の部位に位置する。いくつかの実施形態では、スピンラベルはリポタンパク質に共有結合によって付着している。他の実施形態では、スピンラベルはリポタンパク質に非共有結合によって付着している。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＡ−Ｉまたはその断片を含む。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ａｐｏＡ−ＩのＨＤＬ結合領域を含むａｐｏＡ−Ｉの断片を含む。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質またはその断片の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の残基１８８〜残基２４３のうちの１つのアミノ酸残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の９８位、１１１位、または２１７位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、９８位、１０１位、１１１位、１６７位、２１７位、または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位、または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、９８位、１１１位、または２１７位のネイティブなアミノ酸残基はシステイン残基によって置き換えられている。いくつかの実施形態では、２６位、４４位、６４位、９８位、１０１位、１１１位、１６７位、２１７位、または２２６位のネイティブなアミノ酸残基はシステイン残基によって置き換えられている。いくつかの実施形態では、２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位、または２２６位のネイティブなアミノ酸残基はシステイン残基によって置き換えられている。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートであり、ＥＰＲスペクトルの中心ピークの振幅の増加が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるスピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の増加を示す。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１１１位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１１１位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートであり、ＥＰＲスペクト��の中心ピークの振幅の増加が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるスピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の増加を示す。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の９８位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の９８位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２６位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２６位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の４４位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の４４位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の６４位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の６４位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１０１位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１０１位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１６７位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１６７位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２２６位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２２６位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。
【００１７】
いくつかの実施形態では、慣習的なアミノ酸合成によってスピンラベルをタンパク質に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたアミノ酸残基を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系またはｉｎ  ｖｉｖｏ発現系を使用することによってポリペプチドに組み込む。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質の単一の部位のネイティブなアミノ酸残基はシステイン残基によって置き換えられている。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＥリポタンパク質またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥリポタンパク質はａｐｏＥ３リポタンパク質である。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＥリポタンパク質の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質の単一の部位のネイティブなアミノ酸残基はシステイン残基によって置き換えられている。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＡ−Ｉ模倣物を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は１８Ａ、１８Ａ−Ｐｒｏ−１８Ａ、４Ｆ、および４ｆ−Ｐｒｏ−４Ｆからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物の単一の部位に共有結合によって付着している。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本発明は、試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）における高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のコレステロール逆転送を支持する能力を測定するための方法であって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加するステップと、試料の電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、血液における高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のコレステロール逆転送を支持する能力を測定するための方法であって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加するステップと、試料の電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、スピンラベルは自由電子を担持する原子を含む。いくつかの実施形態では、自由電子を担持する原子は窒素である。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ；１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ，ｄ１５；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（−）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（＋）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；３−（２−ヨードアセトアミド）−ＰＲＯＸＹＬ；３−ヨードメチル−（１−オキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリン）；１−オキシル−３−（マレイミドメチル）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジン；（１−オキシル−２，２，３，５，５−ペンタメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；Ｎ−（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジニル）マレイミド；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドエチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドヘキシルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドプロピルメタンメタンチオスルホネート；３−（２−ブロモアセトアミド）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ、フリーラジカル；４−ブロモ−３−ヒドロキシメチル−１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−δ３−ピロリン；３−ブロモメチル−２，５−ジヒドロ−２，２，５，５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−１−イルオキシ；４−ブロモ−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；３−［２−（２−��レイミドエトキシ）エチルカルバモイル］−ＰＲＯＸＹＬ；３−マレイミド−ＰＲＯＸＬ、３−（２−マレイミドエチル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（３−（２−ヨード−アセトアミド）−プロピル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（２−ブロモ−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；または３−（２−ヨード−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカルである。いくつかの実施形態では、スピンラベルは過重水素化（ｐｅｒｄｅｕｔｅｒａｔｅ）スピンラベルである。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質のアミノ酸にチオスルホネート部分を通じて付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、スピンラベルとリポタンパク質との間のスペーサー部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、スペーサー部分はメタン、エタン、プロパンまたはブタンである。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態では、ＨＤＬはＨＤＬ３である。
【００２３】
本発明は、試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）における高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のコレステロール逆転送を支持する能力を測定するための方法であって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加するステップと、試料の電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップとを含む方法を提供する。本発明は、血液における高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のコレステロール逆転送を支持する能力を測定するための方法であって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加するステップと、試料の電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブを、最終濃度約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．１ｍｇ／ｍｌでｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加する。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブを、最終濃度約０．３ｍｇ／ｍｌでｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加する。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブを、最終濃度約０．８ｍｇ／ｍｌ超でｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加する。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態では、ＥＰＲスペクトルを、スピンラベルしたリポタンパク質プローブを試料に添加した後の１つまたは複数の時点で収集する。本発明のいくつかの実施形態では、ＥＰＲスペクトルを、スピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加した後の１つまたは複数の時点で収集する。いくつかの実施形態では、ＥＰＲスペクトルを、スピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加した後１．５分、４分、６分、８分、１０分、３０分または６０分の時点のうちの１つまたは複数でモニターする。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合が平衡に達するまでの時間が１０分以上であることが、ＨＤＬのコレステロール逆転送に関する能力の低下を示す。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合が平衡に達するまでの時間が正常なコレステロール逆転送能力を伴うｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料の平衡に達するまでの時間より少なくとも２倍長いことが、コレステロール逆転送の能力の低下を示す。いくつかの実施形態では、評価が、スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬの結合の程度の決定である。いくつかの実施形態では、結合の初速度の傾きにより、スピンラベルしたリポタンパク質プローブのＨＤＬに対する親和性が決定される。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の平衡の程度は、正常なコレステロール逆転送能力を伴うｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるスピンラベルしたリポタンパク質プローブの結合と比較して８０％以下であることが、コレステロール逆転送の能力の低下を示す。いくつかの実施形態では、平衡状態におけるスピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の程度が、正常なコレステロール逆転送能力を伴うｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるスピンラベルしたリポタンパク質プローブの結合と比較して８０％以下であることが、コレステロール逆転送の能力の低下を示す。
【００２５】
本発明は、試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）における高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のコレステロール逆転送を支持する能力を測定するための方法であって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加するステップと、試料の電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップとを含む方法を提供する。本発明は、血液における高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のコレステロール逆転送を支持する能力を測定するための方法であって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加するステップと、試料の電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、血液における高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のコレステロール逆転送を支持する能力を、ＨＤＬの転移温度を決定することによって評価し、ＨＤＬの転移温度が２５℃以上であることが、コレステロール逆転送能力が低下したことを示す。いくつかの実施形態では、ＥＰＲスペクトルを０℃〜３７℃にわたる温度で収集する。いくつかの実施形態では、ＥＰＲスペクトルを、３７℃で収集し、次いで、２０℃および／または０℃で収集する。いくつかの実施形態では、ＥＰＲスペクトルを、０℃で収集し、次いで、２０℃および／または３７℃で収集する。いくつかの実施形態では、ＥＰＲスペクトルを、４℃で収集し、次いで、３７℃で収集する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は抗凝固薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗凝固薬はヘパリン、クマジン、ワルファリン、ＥＤＴＡ、シトレートまたはオキザレートである。
【００２７】
いくつかの態様では、本発明は、第１の個体において心臓血管疾患が発生するリスクを決定するための方法であって、ａ）上記の実施形態のいずれかに従って第１の個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料のコレステロール逆転送能力を決定するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、ステップａ）のコレステロール逆転送能力を、心臓血管疾患の明白なリスクがない１または複数の第２の個体由来の血液試料の逆転送能力と比較するステップであって、第１の個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料のコレステロール逆転送能力が１または複数の第２の個体と比較して低下していることが、心臓血管疾患のリスクの増加を示すステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の個体および第２の個体はヒトである。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患は冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢血管疾患、および脳卒中から選択される。いくつかの実施形態では、第１の個体は糖尿病かつ／または肥満である。いくつかの実施形態では、１または複数の第２の個体のスペクトルはヒストリカルスペクトルである。
【００２８】
いくつかの態様では、本発明は、心臓血管疾患に対する治療を受けている個体において心臓血管疾患に対する療法の経過をモニターするための方法であって、ａ）上記の実施形態のいずれか１つに従って個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料のコレステロール逆転送能力を決定するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、ｂ）個体に療法を施している間、および／またはその後に、１回または複数回、個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料のコレステロール逆転送能力を決定するステップであって、個体由来の血液試料の逆転送能力の増加が治療有効性を示すステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患は冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢血管疾患、および脳卒中から選択される。いくつかの実施形態では、該方法は、療法を個体に施す前に個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料のコレステロール逆転送能力を決定するステップをさらに含む。
【００２９】
いくつかの態様では、本発明は、心臓血管疾患に対する公知の療法または潜在的な療法の有効性を決定するための方法であって、ａ）上記の実施形態のいずれかに従って試験個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料のコレステロール逆転送能力を決定するステップであって、試験動物が療法に供されているステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、試験動物は、試験動物に療法を施すことによって療法に供されている。いくつかの実施形態では、方法は、ｂ）療法を試験動物に施している間、および／またはその後に、１回または複数回、試験動物由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料のコレステロール逆転送能力を決定するステップであって、試験動物由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料の逆転送能力の増加が、治療有効性を示すステップをさらに含む。
【００３０】
いくつかの態様では、本発明は、心臓血管疾患に対する公知の療法または潜在的な療法の有効性を決定するための方法であって、ａ）上記の実施形態のいずれかに従って試験個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料のコレステロール逆転送能力を決定するステップであって、個体から血液試料を取り出した後、分析する前に治療薬が添加されているステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、試験治療薬を多数の血液試料に異なる濃度で添加する。いくつかの実施形態では、血液を試験治療薬と一緒に、種々の時間、例えば、これらに限定されないが１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、または１０分超にわたってインキュベートする。上記の実施形態の別の実施形態では、試験動物由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料の逆転送能力の増加が、治療有効性を示す。
【００３１】
いくつかの態様では、本発明は、心臓血管疾患に対する公知の療法または潜在的な療法の有効性を決定する方法であって、ａ）上記の実施形態に従って試験動物由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料のコレステロール逆転送能力を決定するステップと、ｂ）試験動物に療法を施すステップと、ｃ）療法を試験動物に施している間、および／またはその後に、１回または複数回、試験動物由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料のコレステロール逆転送能力を決定するステップであって、試験動物由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料の逆転送能力の増加が、治療有効性を示すステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、試験動物はマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、イヌ、ネコ、およびブタから選択される。
【００３２】
いくつかの態様では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定するためのキットであって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定するためのキットであって、スピンラベルと、ＨＤＬに対して高い特異性を有するリポタンパク質とを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、コレステロール逆転送はコレステロール流出潜在力である。
【００３３】
いくつかの態様では、本発明は、個体において心臓血管疾患が発生するリスクを決定するためのキットであって、個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加し、ＥＰＲによって分析するために製剤化されたスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。いくつかの実施形態では、個体は非ヒト哺乳動物である。
【００３４】
いくつかの態様では、本発明は、個体における心臓血管疾患に対する療法の経過を決定するためのキットであって、個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加し、ＥＰＲによって分析するために製剤化されたスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。いくつかの実施形態では、個体は非ヒト哺乳動物である。
【００３５】
上記の態様のいくつかの実施形態では、心臓血管疾患は冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢血管疾患、および脳卒中から選択される。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、全血試料とともに使用するために製剤化されている。
【００３６】
いくつかの態様では、本発明は、個体におけるアルツハイマー病に対する療法の経過を決定するためのキットであって、個体由来の脳脊髄液に添加し、ＥＰＲによって分析するために製剤化されたスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。いくつかの実施形態では、個体は非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、脳脊髄液とともに使用するために製剤化されている。
【００３７】
上記の態様のいくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、生体試料とともに使用するために製剤化されている。上記の態様のいくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、血漿試料とともに使用するために製剤化されている。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、血清試料とともに使用するために製剤化されている。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、スピンラベルしたリポタンパク質プローブを添加する前に少なくとも１回または２回凍結解凍されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料とともに使用するために製剤化されている。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、哺乳動物血液試料とともに使用するために製剤化されている。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ヒト血液試料とともに使用するために製剤化されている。上記の態様のいくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ＣＳＦ試料とともに使用するために製剤化されている。上記の態様のいくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、合成試料とともに使用するために製剤化されている。いくつかの態様では、容器中のキット中でスピンラベルしたリポタンパク質プローブが提供される。いくつかの実施形態では、容器は、管、フラットセル管または毛細管である。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブはキット中で乾燥粉末として提供される。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態では、上記の態様のキットは、使用説明書をさらに含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、上記の態様のキットは、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＡ−Ｉまたはその断片を含むスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ａｐｏＡ−ＩのＨＤＬ結合領域を含むａｐｏＡ−Ｉの断片を含む。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の残基１８８〜残基２４３のうちの単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の９８位、１１１位、または２１７位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、９８位、１１１位、または２１７位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の９８位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の９８位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１１１位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、９８位、１０１位、１１１位、１６７位、２１７位、または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、２６位、４４位、６４位、９８位、１０１位、１１１位、１６７位、２１７位、または２２６位のネイティブなアミノ酸残基はシステイン残基によって置き換えられている。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位、または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位、または２２６位のネイティブなアミノ酸残基はシステイン残基によって置き換えられている。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２６位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の４４位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の６４位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１０１位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１６７位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２２６位のシステイン残基に共有結合によって付着している。
【００４０】
いくつかの実施形態では、上記の態様のキットは、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片を含むスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質の単一の部位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている。
【００４１】
いくつかの実施形態では、上記の態様のキットは、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＥリポタンパク質またはその断片を含むスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥリポタンパク質またはその断片は、ａｐｏＥ３リポタンパク質またはその断片である。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＥリポタンパク質の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質の単一の部位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている。
【００４２】
いくつかの実施形態では、上記の態様のキットは、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＡ−Ｉ模倣物を含むスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は１８Ａ、１８Ａ−Ｐｒｏ−１８Ａ、４Ｆ、および４ｆ−Ｐｒｏ−４Ｆからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物の単一の部位に共有結合によって付着している。
【００４３】
いくつかの実施形態では、上記の態様のキットは、自由電子を担持する原子を含むスピンラベルしたリポタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、自由電子を担持する原子は窒素である。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ；１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ，ｄ１５；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（−）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（＋）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；３−（２−ヨードアセトアミド）−ＰＲＯＸＹＬ；３−ヨードメチル−（１−オキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリン）；１−オキシル−３−（マレイミドメチル）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジン；（１−オキシル−２，２，３，５，５−ペンタメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；Ｎ−（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジニル）マレイミド；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドエチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドヘキシルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドプロピルメタンメタンチオスルホネート；３−（２−ブロモアセトアミド）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ、フリーラジカル；４−ブロモ−３−ヒドロキシメチル−１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−δ３−ピロリン；３−ブロモメチル−２，５−ジヒドロ−２，２，５，５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−１−イルオキシ；４−ブロモ−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；３−［２−（２−マレイミドエトキシ）エチルカルバモイル］−ＰＲＯＸＹＬ；３−マレイミド−ＰＲＯＸＬ、３−（２−マレイミドエチル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（３−（２−ヨード−アセトアミド）−プロピル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（２−ブロモ−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；または３−（２−ヨード−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカルである。いくつかの実施形態では、スピンラベルは過重水素化スピンラベルである。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質のアミノ酸にチオスルホネートを通じて付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、スピンラベルとリポタンパク質との間のスペーサーをさらに含む。いくつかの実施形態では、スペーサーはメタン、エタン、プロパンまたはブタンである。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブの６０％超はＨＤＬと結合する。いくつかの実施形態では、ＨＤＬはＨＤＬ３である。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に最終濃度約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．１ｍｇ／ｍｌで添加されるように製剤化されている。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に最終濃度約０．３ｍｇ／ｍｌで添加されるように製剤化されている。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に最終濃度約０．８ｍｇ／ｍｌ超で添加されるように製剤化されている。
【００４５】
いくつかの実施形態では、上記態様のキットは、抗凝固薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗凝固薬はヘパリン、クマジン、ワルファリン、ＥＤＴＡ、シトレートまたはオキザレートである。いくつかの実施形態では、キットは、シリンジをさらに含む。
【００４６】
いくつかの態様では、本発明は、ａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片を含む組成物であって、ａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質がスピンラベルを含み、ａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片がＨＤＬに対して高い特異性を有する組成物を提供する。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質の単一の部位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている。
【００４７】
いくつかの態様では、本発明は、ＨＤＬに対して高い特異性を有し、スピンラベルを含むａｐｏＡ−Ｉ模倣物を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は、１８Ａ、１８Ａ−Ｐｒｏ−１８Ａ、４Ｆ、および４ｆ−Ｐｒｏ−４Ｆからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物の単一の部位に共有結合によって付着している。
【００４８】
いくつかの態様では、本発明は、スピンラベルを含むａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質またはその断片を含む組成物であって、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（−）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；または（＋）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の残基１８８〜残基２４３のうちの単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の９８位、１１１位、または２１７位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、９８位、１１１位、または２１７位のネイティブなアミノ酸残基はシステイン残基によって置き換えられている。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の９８位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の９８位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、９８位、１０１位、１１１位、１６７位、２１７位、または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、２６位、４４位、６４位、９８位、１０１位、１１１位、１６７位、２１７位、または２２６位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位、または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位、または２２６位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている。
【００４９】
いくつかの態様では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料と、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は全血試料である。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は血漿試料である。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は血清試料である。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は１回または２回凍結解凍されている。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は非ヒト哺乳動物血液試料である。いくつかの実施形態では、哺乳動物血液試料はヒト血液試料である。
【００５０】
いくつかの態様では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ脳脊髄液試料およびＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は１回または２回凍結解凍されている。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ脳脊髄液試料は非ヒト哺乳動物脳脊髄液試料である（例えば、ラット、マウス、非ヒト霊長類）。いくつかの実施形態では、哺乳動物脳脊髄液試料はヒト脳脊髄液試料である。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＡ−Ｉまたはその断片を含む。いくつかの態様では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ａｐｏＡ−ＩのＨＤＬ結合領域を含むａｐｏＡ−Ｉの断片を含む。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の残基１８８〜残基２４３のうちの単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の９８位、１１１位、または２１７位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、９８位、１１１位、または２１７位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の９８位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の９８位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１１１位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、９８位、１０１位、１１１位、１６７位、２１７位、または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、２６位、４４位、６４位、９８位、１０１位、１１１位、１６７位、２１７位、または２２６位のネイティブなアミノ酸残基はシステイン残基によって置き換えられている。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位、または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位、または２２６位のネイティブなアミノ酸残基はシステイン残基によって置き換えられている。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質の単一の部位のネイティブなアミノ酸残基はシステイン残基によって置き換えられている。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＥリポタンパク質またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥリポタンパク質またはその断片はａｐｏＥ３リポタンパク質またはその断片である。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＥリポタンパク質の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質の単一の部位のネイティブなアミノ酸残基はシステイン残基によって置き換えられている。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＡ−Ｉ模倣物を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は１８Ａ、１８Ａ−Ｐｒｏ−１８Ａ、４Ｆ、および４ｆ−Ｐｒｏ−４Ｆからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物の単一の部位に共有結合によって付着している。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルは自由電子を担持する原子を含む。いくつかの実施形態では、自由電子を担持する原子は窒素である。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ；１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ，ｄ１５；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（−）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（＋）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；３−（２−ヨードアセトアミド）−ＰＲＯＸＹＬ；３−ヨードメチル−（１−オキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリン）；１−オキシル−３−（マレイミドメチル）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジン；（１−オキシル−２，２，３，５，５−ペンタメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；Ｎ−（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジニル）マレイミド；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドエチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドヘキシルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドプロピルメタンメタンチオスルホネート；３−（２−ブロモアセトアミド）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ、フリーラジカル；４−ブロモ−３−ヒドロキシメチル−１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−δ３−ピロリン；３−ブロモメチル−２，５−ジヒドロ−２，２，５，５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−１−イルオキシ；４−ブロモ−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；３−［２−（２−マレイミドエトキシ）エチルカルバモイル］−ＰＲＯＸＹＬ；３−マレイミド−ＰＲＯＸＬ、３−（２−マレイミドエチル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（３−（２−ヨード−アセトアミド）−プロピル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（２−ブロモ−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；または３−（２−ヨード−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカルである。いくつかの実施形態では、スピンラベルは過重水素化スピンラベルである。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質のアミノ酸にチオスルホネートを通じて付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、スピンラベルとリポタンパク質との間のスペーサーをさらに含む。いくつかの実施形態では、スペーサーはメタン、エタン、プロパンまたはブタンである。
【００５６】
いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブはＨＤＬ３と結合する。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブの６０％超はＨＤＬ３と結合する。
【００５７】
いくつかの実施形態では、組成物は抗凝固薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗凝固薬は、ヘパリン、クマジン、ワルファリン、ＥＤＴＡ、シトレートまたはオキザレートである。
【００５８】
いくつかの態様では、本発明は、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を測定するための、スピンラベルしたリポタンパク質プローブおよび固体支持体を含む試験片を含む組成物であって、スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、スピンラベルおよびタンパク質を含み、ＨＤＬに対して高い特異性を有する組成物を提供する。いくつかの実施形態では、コレステロール逆転送は流体のコレステロール流出潜在力である。いくつかの実施形態では、組成物は、血液試料または脳脊髄液試料から選択される試料とともに使用するために製剤化されている。いくつかの実施形態では、血液試料が全血試料、血漿試料、および血清試料から選択される。いくつかの実施形態では、試料は哺乳動物血液試料である。別の実施形態では、哺乳動物試料はヒト血液試料である。
【００５９】
いくつかの実施形態では、試験片は、ａｐｏＡ−Ｉポリペプチドまたはその断片を含むスピンラベルしたリポタンパク質を含む。別の実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−ＩのＨＤＬ結合領域を含む。さらに別の実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質またはその断片の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している。別の実施形態では、スピンラベルは、残基１８８〜残基２４３に位置するａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質のアミノ酸残基に共有結合によって付着している。さらに別の実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、９８位、１０１位、１１１位、１６７位、２１７位、または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している。さらに別の実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の９８位、１１１位または２１７位のアミノ酸に共有結合によって付着している。さらに別の実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している。さらに別の実施形態では、９８位、１１１位、または２１７位のネイティブなアミノ酸残基はシステイン残基によって置き換えられている。さらに別の実施形態では、２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位、または２２６位のネイティブなアミノ酸残基はシステイン残基によって置き換えられている。別の実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着している。別の実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。別の実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１１１位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片を含むスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む試験片を提供する。いくつかの実施形態では、全リポタンパク質分子の６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上がＨＤＬと会合するところのａｐｏＡ−ＩＩまたはその断片。別の実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している。別の実施形態では、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質の単一の部位のネイティブなアミノ酸残基はシステイン残基によって置き換えられている。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＥリポタンパク質またはその断片を含むスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む試験片を提供する。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥリポタンパク質またはその断片はａｐｏＥ３リポタンパク質またはその断片である。別の実施形態では、スピンラベルはａｐｏＥリポタンパク質の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している。さらに別の実施形態では、ａｐｏＥタンパク質の単一の部位のネイティブなアミノ酸残基はシステイン残基によって置き換えられている。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＡ−Ｉ模倣物を含むスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む試験片を提供する。別の実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は１８Ａ、１８Ａ−Ｐｒｏ−１８Ａ、４Ｆ、および４ｆ−Ｐｒｏ−４Ｆからなる群から選択される。別の実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物の単一の部位に共有結合によって付着している。
【００６３】
上記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、本発明は、自由電子を担持する原子を含むスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む試験片を提供する。別の実施形態では、自由電子を担持する原子は窒素である。さらに別の実施形態では、スピンラベルは、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ；１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ，ｄ１５；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（−）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（＋）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；３−（２−ヨードアセトアミド）−ＰＲＯＸＹＬ；３−ヨードメチル−（１−オキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリン）；１−オキシル−３−（マレイミドメチル）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジン；（１−オキシル−２，２，３，５，５−ペンタメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；Ｎ−（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジニル）マレイミド；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドエチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドヘキシルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドプロピルメタンメタンチオスルホネート；３−（２−ブロモアセトアミド）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ、フリーラジカル；４−ブロモ−３−ヒドロキシメチル−１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−δ３−ピロリン；３−ブロモメチル−２，５−ジヒドロ−２，２，５，５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−１−イルオキシ；４−ブロモ−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；３−［２−（２−マレイミドエトキシ）エチルカルバモイル］−ＰＲＯＸＹＬ；３−マレイミド−ＰＲＯＸＬ、３−（２−マレイミドエチル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（３−（２−ヨード−アセトアミド）−プロピル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（２−ブロモ−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；または３−（２−ヨード−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカルである。別の実施形態では、スピンラベルは、過重水素化スピンラベルである。さらに別の実施形態では、スピンラベルはリポタンパク質のアミノ酸にチオスルホネートを通じて付着している。別の実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質は、スピンラベルとリポタンパク質との間のスペーサーをさらに含む。別の実施形態では、スペーサーは、メタン、エタン、プロパンまたはブタンである。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本発明は、６０％超がＨＤＬと結合するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む試験片を提供する。いくつかの実施形態では、ＨＤＬはＨＤＬ３である。
【００６５】
いくつかの態様では、本発明は、スピンラベルしたリポタンパク質プローブ、および常磁性が低いポリマー材料またはセルロース系材料から選択される固体支持体を含む試験片を提供する。いくつかの実施形態では、固体支持体は吸着性材料である。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、共有結合によって、イオンによって、疎水性相互作用によって、または静電気的な相互作用によって吸着性材料に結合している。いくつかの実施形態では、吸着性材料はポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ナイロンまたはニトロセルロースである。いくつかの実施形態では、固体支持体は吸着性材料をさらに含む。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは固体支持体に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは吸着性材料に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは試験片に静電気によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは吸着性材料に静電気によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは試験片に疎水性相互作用によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは吸着性材料に疎水性相互作用によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは試験片に疎水性相互作用および静電気によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは吸着性材料に疎水性相互作用および静電気によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは吸着性材料内に捕捉されている。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは固体支持体または吸着性材料上で乾燥されている。
【００６６】
いくつかの態様では、本発明は、スピンラベルしたリポタンパク質プローブを含み、スピンラベルした参照プローブをさらに含む試験片を提供する。いくつかの実施形態では、スピンラベルした参照プローブはＨＤＬの存在の影響を受けないスピンプローブである。いくつかの実施形態では、スピンラベルした参照プローブは、テトラメチルピペリジン（ＴＥＭＰＯ；２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル）、ＴＥＭＰＯＬ（４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル）、ＴＡＭＩＮＥ（４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル）、ＢＺＯＮＯ（４−（ベンゾイルオキシ）−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル）、ＳＬＰＥＯ（ポリ（エチレンオキシド）−２，２，６，６−テトラメチル−ピペリジン−１−オキシル）、およびテトラシアノキノジメタン（ＴＣＮＱ；２，５−シクロヘキサジエン−１，４−ジイリデン）ジマロノニトリル、７，７，８，８−テトラシアノキノジメタン）から選択される。
【００６７】
上記の実施形態のいくつかの実施形態では、試験片は２種以上のスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む。上記の実施形態のいくつかの実施形態では、試験片は治療薬または治療薬候補をさらに含む。別の実施形態では、治療薬または治療薬候補はＣＥＴＰ阻害剤である。いくつかの実施形態では、治療薬または治療薬候補はトルセトラピブ（Ｔｏｒｃｅｔｒａｐｉｂ）、アナセトラピブ（Ａｎａｃｅｔｒａｐｉｂ）、ダルセトラピブ（Ｄａｌｃｅｔｒａｐｉｂ）またはエバセトラピブ（Ｅｖａｃｅｔｒａｐｉｂ）である。
【００６８】
いくつかの態様では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料の、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定するためのキットであって、固体支持体およびスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む試験片を含み、スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、スピンラベルおよびタンパク質を含み、ＨＤＬに対して高い特異性を有するキットを提供する。
【００６９】
いくつかの態様では、本発明は、コレステロール流出潜在力を調節するための治療薬の有効性を試験するためのキットであって、固体支持体およびスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む試験片を含み、スピンラベルしたタンパク質プローブが、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、ＨＤＬに対して高い特異性を有するキットを提供する。
【００７０】
いくつかの態様では、本発明は、個体における高コレステロール血症を治療するための治療薬の有益性を決定するためのキットであって、固体支持体、スピンラベルしたリポタンパク質プローブ、ならびに治療薬を含む試験片を含み、スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、ＨＤＬに対して高い特異性を有するキットを提供する。
【００７１】
いくつかの態様では、本発明は、個体におけるアルツハイマー病を治療するための治療薬の有益性を決定するためのキットであって、固体支持体、スピンラベルしたリポタンパク質プローブ、ならびに治療薬を含む試験片を含み、スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、ＨＤＬに対して高い特異性を有するキットを提供する。
【００７２】
上記の態様のいくつかの実施形態では、キットのスピンラベルしたリポタンパク質プローブは、固体支持体上に存在する。いくつかの実施形態では、キットは１つまたは複数の追加的な試験片をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の追加的な試験片は、スピンラベルしたリポタンパク質プローブを異なる量で含む。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは試験片とは別の容器に入っている。いくつかの実施形態では、容器は、管、フラットセル管または毛細管である。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは乾燥粉末として提供される。
【００７３】
上記の態様のいくつかの実施形態では、キットはスピンラベル参照プローブをさらに含む。いくつかの実施形態では、スピンラベル参照プローブは固体支持体上に存在する。いくつかの実施形態では、スピンラベル参照プローブは試験片とは別の容器に入っている。いくつかの実施形態では、スピンラベル参照プローブは乾燥粉末として提供される。
【００７４】
上記の態様のいくつかの実施形態では、コレステロール逆転送は流体のコレステロール流出潜在力である。いくつかの実施形態では、キットの試験片は血液試料または脳脊髄液試料から選択される試料とともに使用するために製剤化されている。いくつかの実施形態では、血液試料は全血試料、血漿試料、および血清試料から選択される。いくつかの実施形態では、試料は哺乳動物血液試料である。いくつかの実施形態では、哺乳動物試料はヒト血液試料である。
【００７５】
上記の態様のいくつかの実施形態では、キットのスピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ａｐｏＡ−Ｉポリペプチドまたはその断片を含む。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ａｐｏＡ−ＩのＨＤＬ結合領域を含むａｐｏＡ−Ｉ断片を含む。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質またはその断片の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、残基１８８〜残基２４３に位置するａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質のアミノ酸残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、９８位、１０１位、１１１位、１６７位、２１７位、または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の９８位、１１１位または２１７位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している。別の実施形態では、９８位、１１１位、または２１７位のネイティブなアミノ酸残基はシステイン残基によって置き換えられている。別の実施形態では、２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位、または２２６位のネイティブなアミノ酸残基はシステイン残基によって置き換えられている。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１１１位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２６位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２６位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の４４位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の４４位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の６４位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、ス���ンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の６４位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１０１位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１０１位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１６７位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１６７位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２２６位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２２６位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。
【００７６】
上記の態様のいくつかの実施形態では、キットのスピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、全リポタンパク質分子の６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上がＨＤＬと会合するところのａｐｏＡ−ＩＩまたはその断片。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している。別の実施形態では、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質の単一の部位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている。
【００７７】
上記の態様のいくつかの実施形態では、キットのスピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＥリポタンパク質またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥリポタンパク質またはその断片は、ａｐｏＥ３リポタンパク質またはその断片である。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＥリポタンパク質の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している。別の実施形態では、ａｐｏＥタンパク質の単一の部位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている。
【００７８】
上記の態様のいくつかの実施形態では、キットのスピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＡ−Ｉ模倣物を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は、１８Ａ、１８Ａ−Ｐｒｏ−１８Ａ、４Ｆ、および４ｆ−Ｐｒｏ−４Ｆからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物の単一の部位に共有結合によって付着している。
【００７９】
上記の態様のいくつかの実施形態では、スピンラベルは、自由電子を担持する原子を含む。いくつかの実施形態では、自由電子を担持する原子は窒素である。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ；１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ，ｄ１５；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（−）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（＋）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；３−（２−ヨードアセトアミド）−ＰＲＯＸＹＬ；３−ヨードメチル−（１−オキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリン）；１−オキシル−３−（マレイミドメチル）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジン；（１−オキシル−２，２，３，５，５−ペンタメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；Ｎ−（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジニル）マレイミド；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドエチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドヘキシルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドプロピルメタンメタンチオスルホネート；３−（２−ブロモアセトアミド）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ、フリーラジカル；４−ブロモ−３−ヒドロキシメチル−１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−δ３−ピロリン；３−ブロモメチル−２，５−ジヒドロ−２，２，５，５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−１−イルオキシ；４−ブロモ−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；３−［２−（２−マレイミドエトキシ）エチルカルバモイル］−ＰＲＯＸＹＬ；３−マレイミド−ＰＲＯＸＬ、３−（２−マレイミドエチル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（３−（２−ヨード−アセトアミド）−プロピル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（２−ブロモ−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；または３−（２−ヨード−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカルである。いくつかの実施形態では、スピンラベルは過重水素化スピンラベルである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはリポタンパク質のアミノ酸にチオスルホネートを通じて付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質は、スピンラベルとリポタンパク質との間のスペーサーをさらに含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、メタン、エタン、プロパンまたはブタンである。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブの６０％超がＨＤＬと結合する。いくつかの実施形態では、ＨＤＬはＨＤＬ３である。
【００８０】
上記の態様のいくつかの実施形態では、固体支持体は、常磁性が低いポリマー材料またはセルロース系材料から選択される。いくつかの実施形態では、固体支持体は吸着性材料である。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、共有結合によって、イオンによって、疎水性相互作用によって、静電気的な（電荷）相互作用によって、またはそれらの組合せによって固体支持体に結合している。いくつかの実施形態では、吸着性材料は、ポリフッ化ビニリデン（polyvinylidine fluoride）（ＰＶＤＦ）、ナイロンまたはニトロセルロースである。いくつかの実施形態では、固体支持体は、吸着性材料をさらに含む。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、固体支持体に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、吸着性材料に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、試験片に静電気によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、吸着性材料に静電気によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは試験片に疎水性相互作用によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは吸着性材料に疎水性相互作用によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは試験片に疎水性相互作用および静電気によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは吸着性材料に疎水性相互作用および静電気によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、吸着性材料内に捕捉されている。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、固体支持体または吸着性材料上で乾燥されている。
【００８１】
上記の態様のいくつかの実施形態では、キットの試験片は、スピンラベルした参照プローブをさらに含む。いくつかの態様では、スピンラベルした参照プローブはＨＤＬの存在の影響を受けないスピンプローブである。いくつかの態様では、スピンラベルした参照プローブは、テトラメチルピペリジン（ＴＥＭＰＯ；２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル）、ＴＥＭＰＯＬ（４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル）、ＴＡＭＩＮＥ（４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル）、ＢＺＯＮＯ（４−（ベンゾイルオキシ）−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル）、ＳＬＰＥＯ（ポリ（エチレンオキシド）−２，２，６，６−テトラメチル−ピペリジン−１−オキシル）、およびテトラシアノキノジメタン（ＴＣＮＱ；２，５−シクロヘキサジエン−１，４−ジイリデン）ジマロノニトリル、７，７，８，８−テトラシアノキノジメタン）から選択される。
【００８２】
いくつかの実施形態では、キットは２種以上のスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む。いくつかの実施形態では、試験片は治療薬または治療薬候補をさらに含む。いくつかの実施形態では、治療薬または治療薬候補はＣＥＴＰ阻害剤である。いくつかの実施形態では、治療薬または治療薬候補はトルセトラピブ、アナセトラピブ、ダルセトラピブまたはエバセトラピブである。
【００８３】
上記の態様のいくつかの実施形態では、キットは凝固薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、凝固薬は、ヘパリン、クマジン（counadin）、ワルファリン、ＥＤＴＡ、シトレートまたはオキザレート（oxalae）である。いくつかの実施形態では、キットは使用説明書をさらに含む。
【００８４】
いくつかの態様では、本発明は、試料中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のコレステロール逆転送を支持する能力を測定するための方法であって、ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、固体支持体およびスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む試験片であって、スピンラベルしたリポタンパク質プローブがスピンラベルおよびリポタンパク質を含み、ＨＤＬに対して高い特異性を有する試験片と接触させるステップと、ｂ）試験片上のスピンラベルしたリポタンパク質プローブの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップとを含む方法を提供する。
【００８５】
いくつかの態様では、本発明は、試料中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のコレステロール逆転送を支持する能力を測定するための方法であって、ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブと接触させるステップと、ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、固体支持体を含む試験片と接触させるステップであって、スピンラベルしたリポタンパク質プローブの一部または全部が試験片に接着するステップと、ｃ）試験片上のスピンラベルしたリポタンパク質プローブの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ステップａ）およびｂ）は逐次的または同時になされる。
【００８６】
いくつかの態様では、本発明は、個体における高コレステロール血症またはアルツハイマー病を治療するための治療薬の有益性を決定するための方法であって、ａ）個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、固体支持体およびスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む試験片であって、スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、ＨＤＬに対して高い特異性を有する試験片と接触させるステップと、ｂ）試験片上のスピンラベルしたリポタンパク質プローブの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップとを含み、個体の試料のコレステロール流出潜在力が正常な個体由来のコレステロール流出潜在力と比較して減少することが、個体にとって、高コレステロール血症またはアルツハイマー病を治療するための治療薬が有益である可能性があることを示す方法を提供する。
【００８７】
いくつかの態様では、本発明は、個体における高コレステロール血症またはアルツハイマー病を治療するための治療薬の有益性を決定するための方法であって、ａ）個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブと接触させるステップと、ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、固体支持体を含む試験片と接触させるステップであって、スピンラベルしたリポタンパク質プローブの一部または全部が試験片に接着するステップと、ｃ）試験片上のスピンラベルしたリポタンパク質プローブの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップとを含み、個体の試料のコレステロール流出潜在力が正常な個体由来のコレステロール流出潜在力と比較して減少することが、個体にとって、高コレステロール血症またはアルツハイマー病を治療するための治療薬が有益である可能性があることを示す方法を提供する。いくつかの実施形態では、ステップａ）およびｂ）は逐次的または同時になされる。
【００８８】
いくつかの態様では、本発明は、高コレステロール血症を治療するための療法を受けている個体における高コレステロール血症を治療するための治療薬の治療有効性を最適化するための方法であって、ａ）個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、固体支持体およびスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む試験片であって、スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、ＨＤＬに対して高い特異性を有する試験片と接触させるステップと、ｂ）試験片上のスピンラベルしたリポタンパク質プローブの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップとを含み、個体の試料のコレステロール流出潜在力が療法を受ける前の個体由来の試料のコレステロール流出潜在力と比較して増加することが、個体にとって、高コレステロール血症を治療するための治療薬が有益である可能性があることを示す方法を提供する。いくつかの実施形態では、療法に応答してコレステロール流出潜在力が増加することが実証されれば療法は継続される。いくつかの実施形態では、療法に応答したコレステロール流出潜在力の変化を受けて療法は調節される。
【００８９】
いくつかの態様では、本発明は、高コレステロール血症を治療するための療法を受けている個体における高コレステロール血症を治療するための治療薬の治療有効性を最適化するための方法であって、ａ）個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブと接触させるステップと、ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、固体支持体を含む試験片と接触させるステップであって、スピンラベルしたリポタンパク質プローブの一部または全部が試験片に接着するステップと、ｃ）試験片上のスピンラベルしたリポタンパク質プローブの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップとを含み、個体の試料のコレステロール流出潜在力が療法を受ける前の個体由来の試料のコレステロール流出潜在力と比較して増加することが、個体にとって、高コレステロール血症を治療するための治療薬が有益である可能性があることを示す方法を提供する。いくつかの実施形態では、ステップａ）およびｂ）は逐次的または同時になされる。いくつかの実施形態では、療法に応答してコレステロール流出潜在力が増加することが実証されれば療法は継続される。いくつかの実施形態では、療法に応答したコレステロール流出潜在力の変化を受けて療法は調節される。
【００９０】
いくつかの態様では、本発明は、個体におけるアルツハイマー病を診断するための方法であって、ａ）個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、固体支持体およびスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む試験片であって、スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、ＨＤＬに対して高い特異性を有する試験片と接触させるステップと、ｂ）試験片上のスピンラベルしたリポタンパク質プローブの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップとを含み、個体の試料のコレステロール流出潜在力が正常な個体由来のコレステロール流出潜在力と比較して減少することが、個体がアルツハイマー病を有する可能性があることを示す方法を提供する。いくつかの実施形態では、試料はＣＳＦ試料である。
【００９１】
いくつかの態様では、本発明は、個体におけるアルツハイマー病を診断するための方法であって、ａ）個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブと接触させるステップと、ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、固体支持体を含む試験片と接触させるステップであって、スピンラベルしたリポタンパク質プローブの一部または全部が試験片に接着するステップと、ｃ）試験片上のスピンラベルしたリポタンパク質プローブの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップとを含み、個体の試料のコレステロール流出潜在力が正常な個体由来のコレステロール流出潜在力と比較して減少することが、個体がアルツハイマー病を有する可能性があることを示す方法を提供する。いくつかの実施形態では、ステップａ）およびｂ）は逐次的または同時になされる。いくつかの実施形態では、試料はＣＳＦ試料である。
【００９２】
いくつかの態様では、本発明は、個体の血液のコレステロール流出能を調節するための候補治療薬をスクリーニングするための方法であって、ａ）コレステロール流出能が低いｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、固体支持体およびスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む試験片であって、スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、ＨＤＬに対して高い特異性を有する試験片と接触させるステップと、ｂ）試料を候補治療薬と接触させるステップと、ｂ）試験片上のスピンラベルしたリポタンパク質プローブの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップとを含み、試料のコレステロール流出潜在力の増加が、治療薬がコレステロール流出能を調節するために有用である可能性があることを示す方法を提供する。
【００９３】
いくつかの態様では、本発明は、個体のコレステロール流出能を調節するための候補治療薬をスクリーニングするための方法であって、ａ）コレステロール流出能が低いｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブと接触させるステップと、ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を候補治療薬と接触させるステップと、ｃ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、固体支持体を含む試験片と接触させるステップであって、スピンラベルしたリポタンパク質プローブの一部または全部が試験片に接着するステップと、ｄ）試験片上のスピンラベルしたリポタンパク質プローブの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップとを含み、試料のコレステロール流出潜在力の増加が、治療薬がコレステロール流出能を調節するために有用である可能性があることを示す方法を提供する。いくつかの実施形態では、ステップａ）、ｂ）およびｃ）は逐次的または同時になされる。
【００９４】
いくつかの態様では、本発明は、コレステロール流出潜在力の行動性調節因子（ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）を決定するための方法であって、ａ）行動調節を受けている個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、固体支持体およびスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む試験片であって、スピンラベルしたリポタンパク質プローブが、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、ＨＤＬに対して高い特異性を有する試験片と接触させるステップと、ｂ）試験片上のスピンラベルしたリポタンパク質プローブの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップとを含み、個体の試料のコレステロール流出潜在力が行動調節を受ける前の個体由来の試料のコレステロール流出潜在力と比較して増加することが、行動調節によりコレステロール流出能に利益がもたらされることを示す方法を提供する。いくつかの実施形態では、ステップａ）およびｂ）は逐次的または同時になされる。いくつかの実施形態では、行動は食事、運動または喫煙である。
【００９５】
いくつかの態様では、本発明は、コレステロール流出潜在力の行動性調節因子を決定するための方法であって、ａ）行動調節を受けている個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、スピンラベルおよびリポタンパク質を含み、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブと接触させるステップと、ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を、固体支持体を含む試験片と接触させるステップであって、スピンラベルしたリポタンパク質プローブの一部または全部が試験片に接着するステップと、ｃ）試験片上のスピンラベルしたリポタンパク質プローブの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップとを含み、個体の試料のコレステロール流出潜在力が行動調節を受ける前の個体由来の試料のコレステロール流出潜在力と比較して増加することが、行動調節によりコレステロール流出能に利益がもたらされることを示す方法を提供する。いくつかの実施形態では、ステップａ）およびｂ）は逐次的または同時になされる。いくつかの実施形態では、行動は食事、運動または喫煙である。
【００９６】
上記の態様のいくつかの実施形態では、試料は血液試料または脳脊髄液試料である。いくつかの実施形態では、試料は血液試料である。いくつかの実施形態では、血液試料は全血試料、血漿試料、および血清試料から選択される。いくつかの実施形態では、試料は哺乳動物血液試料である。いくつかの実施形態では、哺乳動物試料はヒト血液試料である。
【００９７】
上記の態様のいくつかの実施形態では、ＥＰＲスペクトルを、スピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料に添加した後の１つまたは複数の時点で収集する。いくつかの実施形態では、ＥＰＲスペクトルを、スピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料に添加した後１．５分、４分、６分、８分、１０分、３０分、６０分の時点のうちの１つまたは複数でモニターする。
【００９８】
上記の態様のいくつかの実施形態では、ＥＰＲスペクトルを０℃〜３７℃にわたる温度で収集する。
【００９９】
上記の態様のいくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ａｐｏＡ−Ｉポリペプチドまたはその断片を含む。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ａｐｏＡ−ＩのＨＤＬ結合領域を含むａｐｏＡ−Ｉ断片を含む。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質またはその断片の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、残基１８８〜残基２４３に位置するａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質のアミノ酸残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、９８位、１０１位、１１１位、１６７位、２１７位、または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の９８位、１１１位または２１７位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している。別の実施形態では、９８位、１１１位、または２１７位のネイティブなアミノ酸残基はシステイン残基によって置き換えられている。別の実施形態では、２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位、または２２６位のネイティブなアミノ酸残基はシステイン残基によって置き換えられている。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１１１位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２６位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２６位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の４４位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の４４位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の６４位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベ���はａｐｏＡ−Ｉタンパク質の６４位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の９８位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の９８位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１０１位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１０１位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１６７位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１６７位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２２６位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２２６位のシステイン残基に共有結合によって付着しており、スピンラベルは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートである。
【０１００】
上記の態様のいくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、全リポタンパク質分子の６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上がＨＤＬと会合するところのａｐｏＡ−ＩＩまたはその断片。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−ＩＩリポタンパク質またはその断片の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している。別の実施形態では、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質の単一の部位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている。
【０１０１】
上記の態様のいくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＥリポタンパク質またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥリポタンパク質またはその断片は、ａｐｏＥ３リポタンパク質またはその断片である。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＥリポタンパク質の単一の部位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質の単一の部位のネイティブなアミノ酸残基はシステイン残基によって置き換えられている。
【０１０２】
上記の態様のいくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ＨＤＬに対して高い特異性を有するａｐｏＡ−Ｉ模倣物を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は、１８Ａ、１８Ａ−Ｐｒｏ−１８Ａ、４Ｆ、および４ｆ−Ｐｒｏ−４Ｆからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物の単一の部位に共有結合によって付着している。
【０１０３】
上記の態様のいくつかの実施形態では、スピンラベルは、自由電子を担持する原子を含む。いくつかの実施形態では、自由電子を担持する原子は窒素である。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ；１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ，ｄ１５；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（−）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（＋）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；３−（２−ヨードアセトアミド）−ＰＲＯＸＹＬ；３−ヨードメチル−（１−オキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリン）；１−オキシル−３−（マレイミドメチル）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジン；（１−オキシル−２，２，３，５，５−ペンタメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；Ｎ−（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジニル）マレイミド；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドエチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドヘキシルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドプロピルメタンメタンチオスルホネート；３−（２−ブロモアセトアミド）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ、フリーラジカル；４−ブロモ−３−ヒドロキシメチル−１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−δ３−ピロリン；３−ブロモメチル−２，５−ジヒドロ−２，２，５，５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−１−イルオキシ；４−ブロモ−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；３−［２−（２−マレイミドエトキシ）エチルカルバモイル］−ＰＲＯＸＹＬ；３−マレイミド−ＰＲＯＸＬ、３−（２−マレイミドエチル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（３−（２−ヨード−アセトアミド）−プロピル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（２−ブロモ−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；または３−（２−ヨード−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカルである。いくつかの実施形態では、スピンラベルは過重水素化スピンラベルである。いくつかの実施形態では、スピンラベルはリポタンパク質のアミノ酸にチオスルホネートを通じて付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質は、スピンラベルとリポタンパク質との間のスペーサーをさらに含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、メタン、エタン、プロパンまたはブタンである。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブの６０％超はＨＤＬと結合する。いくつかの実施形態では、ＨＤＬはＨＤＬ３である。
【０１０４】
上記の態様のいくつかの実施形態では、固体支持体は、常磁性が低いポリマー材料またはセルロース系材料から選択される。いくつかの実施形態では、固体支持体は吸着性材料である。いくつかの実施形態では、吸着性材料は、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ナイロンまたはニトロセルロースである。いくつかの実施形態では、固体支持体は、吸着性材料をさらに含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は、吸着性材料をさらに含む。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、固体支持体に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、吸着性材料に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、試験片に静電気によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、吸着性材料に静電気によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは試験片に疎水性相互作用によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは吸着性材料に疎水性相互作用によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは試験片に疎水性相互作用および静電気によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは吸着性材料に疎水性相互作用および静電気によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、吸着性材料内に捕捉されている。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、固体支持体または吸着性材料上で乾燥されている。
【０１０５】
上記の態様のいくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料は抗凝固薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗凝固薬はヘパリン、クマジン、ワルファリン、ＥＤＴＡ、シトレートまたはオキザレートである。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図１は、コレステロール逆転送経路を示す図である。
【図２】図２は、内膜におけるコレステロール逆転送を示す図である。コレステロール負荷マクロファージからのコレステロール流出を容易にするために、低脂質／無脂質ａｐｏＡ−Ｉは、ＡＢＣＡ１に結合する。ＡＢＣＡ１との会合の間に、ａｐｏＡ−Ｉは遊離のコレステロール（ＦＣ）およびリン脂質（ＰＬ）を得て、円板状プレβＨＤＬを形成する。これらの粒子はＬＣＡＴの作用を受け、コレステロールエステルコアを含有するアルファＨＤＬに変換される。ａｐｏＡ−Ｉは、リン脂質転移タンパク質（ＰＬＴＰ）、コレステロールエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）および肝性リパーゼ（ＨＬ）の作用（複数可）によってアルファＨＤＬから遊離する。出典Curtissら、２００６年。
【図３】図３は、ＥＰＲスペクトルに反映される、ＥＰＲスピンカップリングに対する距離の影響を示す図である。
【図４】図４は、ポリペプチドの構造的特徴を同定するための走査ＥＰＲを示す図である。スピンラベルをタンパク質のいくつもの単一の部位に位置させた。ＥＰＲスペクトルの差異にタンパク質の構造的特徴が反映されている。出典Lagerstedt, JO（２００７年）J. Biol Chem ２８２巻：９１４３〜９１４９頁、参照により本明細書に組み込まれる。
【図５】図５は、ＥＰＲスペクトルおよびそれらが示すそれぞれの構造要素（挿入図）のサンプリングを示す図である。各構造要素の線形が、メタンチオスルホネート（ＭＴＳ）スピンラベルの移動性を示す。ＭＴＳスピンラベルがより規則的な構造につながると、スピンラベルの移動性は特徴的な様式で制限される。この結果、ピーク間の対称性が示差的に失われ、それに伴って近距離場ピークおよび遠距離場ピークが広がり、平坦になる。
【図６Ａ】図６Ａは、どのようにしてスピンラベルの溶媒露出度により二次構造が同定されるかを示す概略図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、スピンラベルの溶媒露出度を用いて、アルファヘリックスおよびベータシートを同定することができることを示す概略図である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、スピンラベルの溶媒露出度を用いて、タンパク質の構造的特徴を示すことができることを実証するグラフである。スピンラベルａｐｏＡ−Ｉ分子のライブラリーを、タンパク質の配列全体にわたって単一のアミノ酸位に位置させることによって作製した。
【図７】図７は、スピンラベルが部位特異的に配置され、脂質と結合しているか、または無脂質環境にあるａｐｏＡ−Ｉタンパク質のＥＰＲスペクトルを示す図である。
【図８】図８は、血漿中のＨＤＬのＥＰＲ分析を示す図である。スピンラベルしたａｐｏＡ−Ｉを患者４人の血漿に、最終濃度０．３ｍｇ／ｍｌで添加した。ＥＰＲスペクトルを１．５分、４分、６分、８分、および１０分の時点で収集した（パネルＡ）。無脂質ａｐｏＡ−Ｉのスペクトルが青色で示されている。脂質と結合したａｐｏＡ−Ｉ参照試料の中心磁場の振幅は、緑色の棒として示されている。参照の枠の通り、緑色の棒は全てのパネルにおいて同じ長さである。データがグラフ形式で示されており（パネルＢ）、ここでは、試料の中心磁場ピークの振幅と、脂質と結合した参照の中心磁場の振幅（緑色の棒、パネルＡ）の比率を時間に対してプロットした。
【図９】図９は、ａｐｏＡ−Ｉ交換のＥＰＲに基づく分析を示す図である。交換についての２つのシナリオを考察する。Ａ）置き換え、またはａｐｏＡ−ＩとｒＨＤＬ粒子を離す手段、ｒＨＤＬがスピンラベルした（点）ａｐｏＡ−Ｉを担持する（Ｋ１３３位において）。Ｂ）ｒＨＤＬへのａｐｏＡ−Ｉの付加、無脂質ａｐｏＡ−Ｉがスピンラベルされている（Ｇ２１７位において）。これらの２つのシナリオを考察することにより、置き換えおよび挿入の相対的な速度を決定する。
【図１０】図１０は、無脂質環境にあるａｐｏＡ−Ｉおよび脂質と結合したａｐｏＡ−Ｉを示すモデルである。無脂質環境ではＦＲＥＴが観察されたが、ａｐｏＡ−Ｉが脂質と結合している場合にはＦＲＥＴは観察されなかった。図１２にグラフで示されている。
【図１１】図１１は、ｒＨＤＬからのａｐｏＡ−Ｉの置き換えを示す図である。Ａｌｅｘａ３５０で標識したａｐｏＡ−Ｉを用いて９．６ｎｍのＰＯＰＣ  ｒＨＤＬを生成した。ｒＨＤＬを、５：１比の無脂質の標識していないａｐｏＡ−ＩとｒＨＤＬ  ａｐｏＡ−Ｉの存在下、および不在下、３７℃でインキュベートし、ＮＤＧＧＥによって分離した。５時間後に、蛍光無脂質ａｐｏＡ−Ｉの出現によって示されるｒＨＤＬからのａｐｏＡ−Ｉの有意な置き換えが存在する。最小のリモデリング（他の異なるサイズのｒＨＤＬの出現）が２４時間後にも観察され、これにより、この反応が、１つのａｐｏＡ−Ｉが別のａｐｏＡ−Ｉと交換されるものであり、ｒＨＤＬ粒子リモデリングの産物ではないことが示唆される。外因性のａｐｏＡ−Ｉの不在下では、無脂質ａｐｏＡ−Ｉは生成せず、このことにより、これが置き換え反応であることがさらに示される。
【図１２】図１２は、励起したドナーから放出された光がアクセプター部分に移動する際に起こるＦＲＥＴ（グラフの実線）を示すグラフである。ドナーおよびアクセプターが７５Å超離れている場合にはＦＲＥＴは観察されない（グラフの明るい陰影付きの領域）。エネルギー移動の効率は、ドナーの蛍光の量によって測定する（暗い陰影付きの領域）。
【図１３】図１３は、ａｐｏＡ−Ｉ交換の酸化カイネティクスの影響を示すグラフである。ａｐｏＡ−ＩＷ１９：Ａ１３６を担持するｒＨＤＬを、モル比１：５の標識していないａｐｏＡ−Ｉ（ＴｒｐヌルａｐｏＡ−Ｉ）中、３７℃で最大６時間インキュベートした。無処理のＴｒｐヌルａｐｏＡ−Ｉ（陰影付きの丸）がｒＨＤＬ由来の蛍光標識したａｐｏＡ−Ｉとτ＝０．９４ｈで置き換わった。ＴｒｐヌルａｐｏＡ−ＩをペルオキシナイトライトおよびＭＰＯによって酸化した。ペルオキシナイトライトによる酸化（陰影のない丸）では、ａｐｏＡ−Ｉの交換速度は有意に変化せず、τ＝０．６７ｈであった。ＴｒｐヌルａｐｏＡ−ＩのＭＰＯによる酸化（黒い丸）では、τ１＝０．９２ｈ、τ２＝１８．８ｈの二相性交換カイネティクスが創出された。これは、影響を受けなかった集団（４２．７％）と交換が損なわれた集団（５７．３％）の２つのａｐｏＡ−Ｉ集団が存在することによって最も容易に説明される。ｒＨＤＬからのａｐｏＡ−Ｉの置き換えの最大レベル（平衡状態で、標識したａｐｏＡ−Ｉと標識していないａｐｏＡ−Ｉの比１：５）が示されている（破線；８３％）。データは、６回の別々の実験の平均を示す。
【図１４】図１４は、ａｐｏＡ−Ｉとヒト血漿との結合を示す図である。Ａｌｅｘａ３５０で標識したａｐｏＡ−Ｉを、ヒトヘパリン添加血漿に、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、および０．８ｍｇ／ｍｌの濃度で添加した。外因性のａｐｏＡ−Ｉを伴う血漿を３７℃で２時間インキュベートし、ＮＤＧＧＥによって分離した。ゲルに血漿タンパク質を重度にローディングしたが、ゲルのアルブミン領域、ＨＤＬ領域、ＬＤＬ領域およびＶＬＤＬ領域（ウェルの底部）は明白であった。５μｇの精製した血漿ＬＤＬおよびＨＤＬを対照として流した。ａｐｏＡ−Ｉの蛍光信号はＨＤＬ画分には出現しているが、アルブミン、ＬＤＬまたはＶＬＤＬでは出現していない。
【図１５】図１５Ａは、ａｐｏＡ−Ｉの部位特異的スピンラベリングを示す図である。ａｐｏＡ−Ｉの、安定な窒素酸化物ラジカルスピンラベルが組み入れられることが望まれる位置に、システイン置換を工学的に行う。ａｐｏＡ−Ｉシステイン置換突然変異体を、システイン残基のスルフヒドリル基（sulfhydril group）と特異的に反応する窒素酸化物と連結したＭＴＳと一緒にＲＴでインキュベートして（３０分）、スピンラベルをシステイン置換部位に組み入れる。図１５Ｂは、脂質との結合のＥＰＲスペクトルに対する影響を示す図である。ａｐｏＡ−Ｉ内の残基は、脂質の存在に異なる程度で反応する。Ａ１７６位は脂質によって有意に変更されないが、Ｇ２１７位は劇的な影響を受ける。この差（矢印）をＨＤＬ結合の尺度として機能するように活用することができる。
【図１６】図１６は、マウス血漿のＥＰＲ分光法を示す図である。上のパネルは、スピンラベルを残基２１７に位置づけた場合の、４℃および３７℃におけるスピンラベルしたａｐｏＡ−Ｉのスペクトルである。中央のパネルは、上のパネルの試料についての経時的な信号の変化を示すグラフである。下のパネルは、スピンラベルを残基１１１に位置づけた場合の、４℃および３７℃におけるスピンラベルしたａｐｏＡ−Ｉのスペクトルである。
【図１７】図１７は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス由来の血漿およびＣＨ３マウス由来の血漿における、スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬの結合のパーセント反応を示すグラフである。
【図１８】図１８は、ａｐｏＡ−ＩとＨＤＬの結合をモニターするためのＥＰＲスペクトルの位置を示す図である。
【図１９】図１９は、ヒト血漿におけるＡｐｏＡ−ＩとＨＤＬの結合を示すグラフである。
【図２０】図２０は、対照ヒト血漿試料におけるａｐｏＡ−ＩとＨＤＬの結合の追跡を示すグラフである。
【図２１】図２１は、糖尿病状態／メタボリックシンドローム状態が同定されている９個体由来の血漿におけるＨＤＬ機能アッセイの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１０７】
本発明は、血液における高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のコレステロール逆転送を支持する能力を測定するための組成物および方法を提供し、該方法は、ａ）ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加するステップと、ｂ）試料の電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集するステップとを含む。ＥＰＲスペクトルを使用して、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力と相関するリポタンパク質とＨＤＬとの結合の程度および／または速度を評価する。そのように、本発明の方法を用いて、冠動脈疾患、脳卒中および末梢血管疾患などの心臓血管疾患のリスクがある個体を同定することができる。本発明の方法を用いて、糖尿病の個体または糖尿病のリスクがある（例えば、前糖尿病状態の）個体を同定することができる。本発明の方法は、アルツハイマー病のリスクがある個体を同定するため、または早期のアルツハイマー病の診断としても用いることができる。高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の、血液または脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるコレステロール逆転送を支持する能力の決定において使用するための組成物およびキットも提供される。
【０１０８】
本発明は、ＥＰＲ分光法を使用して、ａｐｏＡ−Ｉがｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料中のＨＤＬと結合するとａｐｏＡ−Ｉの構造の変化を検出することができるという予想外の発見に一部基づく。本明細書の実施例において示されているように、ＥＰＲ分光法によりａｐｏＡ−Ｉがｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料中のＨＤＬと結合した際のａｐｏＡ−Ｉの構造的な変化が測定され、それがｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料中に存在するＨＤＬのコレステロール流出能と相関する可能性があることが首尾よく示されている。したがって、本発明の方法は、コレステロール流出能が低下した個体を同定するために用いることができ、脂質パネル（例えば、常套的な血液検査によって得られるＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬのレベル）が正常だと思われる特定の個体に対しても用いることができる。これらのＥＰＲ方法は、ＣＳＦにおけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力の決定において、およびＣＳＦのコレステロール流出能が低下した個体を同定するためにも用いることができる。
【０１０９】
いくつかの態様では、本発明は、個体において心臓血管疾患が発生するリスクを決定する方法であって、個体由来の血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルを収集することによって測定する方法を提供する。次いで、収集されたＥＰＲスペクトルを１つまたは複数の陰性対照および／または１つまたは複数の陽性対照と比較する。陰性対照は、無脂質または低脂質のスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルであってよく、ここで、スピンラベルおよびリポタンパク質はスピンラベルしたリポタンパク質プローブを形成するスピンラベルおよびリポタンパク質と同じである。陽性対照は、ジミリストイルホスファチジルコリンなどの脂質と結合した、スピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルであってもよく、心臓血管疾患のリスクがない個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるＨＤＬと結合したスピンラベルしたリポタンパク質プローブの１つまたは複数のヒストリカルスペクトルであってもよい（スピンラベルおよびリポタンパク質は、スピンラベルしたリポタンパク質プローブを形成するスピンラベルおよびリポタンパク質と同じである）。いくつかの実施形態では、陽性対照は、心臓血管疾患のリスクが低いと同定された個体または個体の一群についての集合体または単一の試料に由来し、試料のコレステロール流出潜在力が代替の手段（すなわち、細胞に基づくコレステロール流出アッセイ）によって高いと決定される試料である。個体由来の血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力が陽性対照（複数可）と比較して減少することにより、心臓血管疾患のリスクが示される可能性がある。いくつかの実施形態では、個体は、心臓血管疾患のリスクがあるヒトである。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患のリスクがあるヒトは糖尿病である。いくつかの実施形態では、本発明の方法を用いてヒトが糖尿病であるまたは糖尿病が発生するリスクがあるかどうかを決定する。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患のリスクがあるヒトは肥満である。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患のリスクがあるヒトは、脂質異常症（dyslipidema）に罹患している。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患のリスクがあるヒトは心臓血管疾患の家族歴を有する。
【０１１０】
いくつかの態様では、本発明は、個体における心臓血管疾患に対する療法の経過をモニターする方法であって、個体由来の血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加し、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルを収集することによって測定する方法を提供する。血管疾患に対する療法を受けている個体由来の血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を療法の経過中、経時的にモニターする。いくつかの実施形態では、個体由来の血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を、療法を開始する前に測定する。いくつかの実施形態では、個体由来の血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を療法の前、その間、および／またはその後に測定する。いくつかの実施形態では、個体は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。いくつかの実施形態では、個体は非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患は、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢血管疾患または脳卒中である。
【０１１１】
いくつかの態様では、本発明は、心臓血管疾患に対する公知の治療薬または潜在的な治療薬を評価するための方法であって、試験動物由来の血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを、療法に供されている試験動物由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルを収集することによって測定する方法を提供する。コレステロール逆転送能力の増加が、治療有効性を示す。いくつかの実施形態では、試験動物は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、イヌ、ネコまたはブタである。いくつかの実施形態では、試験動物は非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態では、療法は、１種または複数種の医薬品を投与することを含む。いくつかの実施形態では、療法は、食事および／または身体活動のレベルの変化を含む。いくつかの実施形態では、療法は、食事および／または身体活動のレベルの変化と組み合わせて、１種または複数種の医薬品を投与することを含んでよい。療法を受けている試験動物由来の血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を療法の経過中、経時的にモニターする。いくつかの実施形態では、試験動物由来の血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を、療法を開始する前に測定する。いくつかの実施形態では、試験動物由来の血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を療法の前、その間、および／またはその後に測定する。
【０１１２】
いくつかの態様では、本発明は、心臓血管疾患に対する公知の療法または潜在的な療法の有効性を決定するための方法であって、ａ）上記の実施形態のいずれかに従って試験個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料のコレステロール逆転送能力を決定するステップであって、個体から血液試料を取り出した後、分析する前に治療薬が添加されているステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、試験治療薬を多数の血液試料に異なる濃度で添加する。いくつかの実施形態では、血液を試験治療薬と一緒に、種々の時間、例えば、これらに限定されないが１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、または１０分超にわたってインキュベートする。上記の実施形態の別の実施形態では、試験動物由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料の逆転送能力の増加が、治療有効性を示す。いくつかの実施形態では、試験個体は非ヒト哺乳動物である（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、イヌ、ネコまたはブタ）。いくつかの実施形態では、試験動物は非ヒト霊長類である。
【０１１３】
いくつかの態様では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を測定するためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加し、ＥＰＲによって分析する。いくつかの実施形態では、キットを使用して個体において心臓血管疾患が発生するリスクを決定する。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患のリスクがある個体は、以下の危険因子のうちの１つまたは複数を有する：糖尿病、肥満、高血圧症または喫煙。いくつかの実施形態では、キットを使用して個体における糖尿病を検出する。いくつかの実施形態では、キットを使用して心臓血管疾患に対する治療の経過をモニターする。いくつかの実施形態では、キットを使用して、心臓血管疾患の動物モデルにおける心臓血管疾患に対する公知の療法または潜在的な療法の治療有効性を測定する。
【０１１４】
いくつかの態様では、本発明は、ＣＳＦ試料におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を測定するためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブをＣＳＦ試料に添加し、ＥＰＲによって分析する。いくつかの実施形態では、キットを使用して個体においてアルツハイマー病が発生するリスクを決定する。いくつかの実施形態では、キットを使用してアルツハイマー病に対する治療の経過をモニターする。いくつかの実施形態では、キットを使用して、アルツハイマー病の動物モデルにおけるアルツハイマー病に対する公知の療法または潜在的な療法の治療有効性を測定する。
【０１１５】
いくつかの態様では、本発明は、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、リポタンパク質はａｐｏＡ−Ｉ模倣物である。いくつかの実施形態では、リポタンパク質はａｐｏＡ−Ｉであり、スピンラベルは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（−）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；または（＋）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートである。いくつかの実施形態では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料中のＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む組成物を提供する。
【０１１６】
いくつかの態様では、本発明は、セルロースまたはプラスチックポリマーなどの固体基質の使用を提供する。細片に、試料（例えば、血漿、ＣＳＦなど）を添加する前にＥＰＲプローブを浸透させるか、または、ＥＰＲプローブと試料（例えば、血漿、ＣＳＦなど）の混合物を細片と接触させることができる。細片に、ＥＰＲスピンプローブに独特のスペクトルを有する既知量のＥＰＲ標準品を浸透させることができる。この標準物質を使用してＥＰＲ計器を較正する。試料（例えば、血漿、ＣＳＦなど）または試料／プローブを試験片に添加した後、それを反応させ、スペクトルを収集するためにＥＰＲ計器に挿入する。計器により、スピンラベルしたリポタンパク質プローブ（例えば、ａｐｏＡ−Ｉ  ＥＰＲスピンプローブ）のＥＰＲスペクトル特性が測定される。血漿の存在下とリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４の存在下でのスピンラベルしたリポタンパク質プローブ（例えば、ａｐｏＡ−Ｉ  ＥＰＲスピン）の示差的なスペクトル特性により、ＨＤＬ機能（例えば、コレステロール逆転送能力）が測定される。
【０１１７】
いくつかの態様では、本発明は、血液または脊髄液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を測定するためのスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む容器を提供する。いくつかの実施形態では、容器は、管、フラットセル管または毛細管である。いくつかの実施形態では、容器中のスピンラベルしたリポタンパク質プローブは、乾燥粉末の形態である。いくつかの実施形態では、容器中のスピンラベルしたリポタンパク質プローブは凍結乾燥されている。いくつかの実施形態では、容器中のスピンラベルしたリポタンパク質プローブは、血液試料、血清試料、血漿試料、脳脊髄液試料などの体液試料とともに使用するために製剤化されている。いくつかの実施形態では、体液試料を容器中のスピンラベルしたリポタンパク質プローブに添加することができる。いくつかの実施形態では、体液試料を用いた、または用いていないスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルを容器から入手することができる。いくつかの実施形態では、容器は、ＥＰＲ分光計で使用することができる形態である。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む容器は本明細書に記載のキットに入っている。
【０１１８】
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語の意味は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものである。Singletonら、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology、第３版、JohnWiley and Sons、New York（２００２年）、およびHale & Marham、The Harper CollinsDictionary of Biology、Harper Perennial、N.Y.（１９９１年）により、本発明において使用される用語の多くに関する一般的な辞書が当業者に提供される。記載されている特定の方法体系、プロトコール、および試薬は変動する可能性があるので、本発明はこれらに限定されないことが理解されるべきである。当業者には、本明細書に記載の方法および材料と類似した、またはそれと等しい任意の方法および材料も、本発明を実施または試験するために用いることができることも理解されよう。
【０１１９】
「高密度リポタンパク質」または「ＨＤＬ」とは、コレステロールおよびトリグリセリドのような脂質を水性の血流内に転送することができる、循環している両親媒性タンパク質の非共有結合性の会合体である。ＨＤＬは、質量で約５０％が、遊離のコレステロール（約４％）ならびにトリグリセリド（約３％）およびコレステロールエステル（約１２％）のコアを埋め込んだリン脂質の単層（約２５％）で構成される脂質エマルションを安定化する両親媒性タンパク質で構成される。ＨＤＬのサブクラスとしてＨＤＬ２およびＨＤＬ３が挙げられる。ＨＤＬ２粒子はより大きく、脂質含有量が多いが、ＨＤＬ３粒子はより小さく、脂質含有量が少ない。さらなるサブクラスとして、最も大きな粒子から最小の粒子まで、ＨＤＬ２ｂ、ＨＤＬ２ａ、ＨＤＬ３ａ、ＨＤＬ３ｂ、およびＨＤＬ３ｃが挙げられる。
【０１２０】
「ＨＤＬ−Ｃ」とは、ＨＤＬ粒子内のコレステロールを指す。ＨＤＬ−Ｃの濃度とは、ヒトにおいてＨＤＬに担持されるコレステロールの濃度を指す。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「機能不全ＨＤＬ」とは、コレステロール逆転送に関する能力が低下したＨＤＬを指す。いくつかの例では、機能不全ＨＤＬとは、心臓血管疾患のリスクがない健康な個体由来のＨＤＬによるコレステロール流出と比較してコレステロール流出が低下したＨＤＬを指す。
【０１２２】
「コレステロール逆転送」（ＲＣＴ）とは、それにより過剰なコレステロールが末梢組織から肝臓またはステロイド産生組織に転送されるプロセスである。コレステロール逆転送経路は、一般に、３つの主要なステップ：（ｉ）コレステロール流出、末梢細胞の種々のプールからコレステロールが最初に取り出される；（ｉｉ）レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の作用によるコレステロールエステル化、それにより、流出したコレステロールの細胞への再侵入が妨げられる；および（ｉｉｉ）ＨＤＬによるコレステリルエステルの取り込みおよびＨＤＬ−コレステリルエステル複合体の肝臓細胞への送達を有すると考えられている。
【０１２３】
「コレステロール流出潜在力」とは、ＨＤＬの、マクロファージなどの脂質負荷組織からコレステロールを受容することによってコレステロール逆転送を促進する能力である。ＣＳＦにおけるコレステロール流出潜在力が減少することにより、アルツハイマー病またはアルツハイマー病が発生するリスクが示される可能性がある。
【０１２４】
「電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光法」は、不対電子を有する化学種を検出する分光学的技法である。ＥＰＲは、「電子スピン共鳴」（ＥＳＲ）または「電子磁気共鳴」（ＥＭＲ）としても公知であり、これらの用語は互換的に使用することができる。ＥＰＲは、少なくとも１つの不対電子スピンを有する常磁性イオンまたは分子による、静磁場の存在下でのマイクロ波照射線の共鳴吸収のプロセスである。常磁性種を含有する材料に強力な磁場を印加することにより、不対電子の電子「スピン」によって生じる個々の磁気モーメントを、印加された場に対して平行または逆平行のいずれかに向き付けることができる。これにより、不対電子に対して別個のエネルギーレベルが創出され、これにより、電磁放射線（マイクロ波の形態）の正味の吸収を起こすことが可能になる。共鳴条件は、磁場およびマイクロ波の周波数が、マイクロ波のエネルギーが、スピン状態にある対のエネルギーの差異に対応する場合に起こる。
【０１２５】
「スピンラベル」とは、不対電子を保有する有機分子である。いくつかの例では、スピンラベルは、別の分子、例えばタンパク質と結合する能力を有する。スピンラベルは、ＥＰＲ分光法を用いてタンパク質または生体膜の局所的なダイナミクスを探索するためのツールとして使用することができる。部位特異的スピンラベリングにより、タンパク質内の特定の領域をモニターすることが可能になり、例えば、タンパク質の構造検査において、アミノ酸特異的スピンラベルを使用することができる。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「スピンラベルしたリポタンパク質プローブ」とは、少なくとも１種のスピンラベルを含むリポタンパク質である。スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ＨＤＬに対して高い特異性を有する。いくつかの例では、スピンラベルは、リポタンパク質の単一の部位、例えば、単一のアミノ酸残基に位置づけることができる。いくつかの例では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ＨＤＬ粒子と会合する。いくつかの例では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ＨＤＬ粒子内のリポタンパク質と自由に交換することができる。交換は、脂質と粒子の親和性に基づく。親和性が高いまたは同等であるタンパク質を、親和性が同等以下である別のタンパク質に置き換えることができる。本明細書で使用される場合、スピンラベルしたリポタンパク質のリポタンパク質部分は、１つまたは複数の脂質分子が付着したタンパク質に限定されない。一般に、スピンラベルしたリポタンパク質プローブのリポタンパク質部分は、脂質と会合する能力を有する。さらに、スピンラベルしたリポタンパク質のリポタンパク質部分は全長のタンパク質に限定されず、ポリペプチドおよびペプチドなども包含する。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「リポタンパク質」とは、１つまたは複数の脂質分子が付着している、または付着させることができるタンパク質の一群を指す。いくつかの場合には、リポタンパク質は、結合しているリン脂質分子が４つ以下である「低脂質リポタンパク質」であってよい。本明細書で使用される場合、リポタンパク質とは、脂質が付着していないが、ＨＤＬ粒子において交換することができるタンパク質（例えば、アポリポタンパク質）を包含する。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「平衡結合」とは、１つの分子と別の分子が会合する速度がその２つの分子が解離する速度と等しい状態を指す。いくつかの例では、平衡結合は、２つの分子の結合を経時的にモニターすることによって、例えば、ＥＰＲスペクトルを経時的にモニターすることによって決定することができる。平衡結合は、結合した分子の百分率がほぼ定常状態のままである場合に実現される可能性がある。本明細書で使用される場合、脂質の「転移温度」とは、脂質が固相またはゲル相から液相に転移する、または融解する温度である。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、「試料」とは、試験される大きな全体の一部を指す。試料としては、これらだけに限定されないが、血液、脳脊髄液、尿、唾液などの体液が挙げられる。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「血液試料」とは、全血試料またはそれに由来する血漿画分または血清画分を指す。いくつかの例では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料とは、全血またはそれに由来する血漿画分または血清画分などのヒト血液試料を指す。いくつかの例では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料とは、全血またはそれに由来する血漿画分または血清画分などの非ヒト哺乳動物（「動物」）血液試料を指す。血液試料は試験動物（例えば、医薬品の有効性または毒性のｉｎ  ｖｉｖｏでの実験において用いられる動物）、ペット、家畜など由来であってよい。本明細書で使用される場合、「全血」という用語は、分画されておらず、細胞成分と液体成分の両方を含有する血液試料を指す。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、「全血」とは、新たに抜き取った血液、または、場合によって抗凝固薬を含有してよい慣習的に抜き取った血液試料を指す。いくつかの例では、全血はバキュテナー中に抜き取ることができ、全血は試験動物（例えば、医薬品の有効性または毒性のｉｎ  ｖｉｖｏでの実験において用いられる動物）、ペット、家畜など由来であってよい。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「血漿」とは、全血の液体の非細胞成分を指す。使用する分離方法に応じて、血漿は細胞成分を完全に含まない可能性もあり、種々の量の血小板および／または少量の他の細胞成分を含有する可能性もある。血漿はフィブリノーゲンなどの種々の凝固因子を含むので、「血漿」という用語は、下記の「血清」とは区別される。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「血清」という用語は、哺乳動物の全血清、例えば、ヒト全血清、試験動物に由来する全血清、ペットに由来する全血清、家畜に由来する全血清などを指す。さらに、本明細書で使用される場合、「血清」とは、凝固因子（例えば、フィブリノーゲン）が取り除かれた血漿を指す。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「脳脊髄液」または「ＣＳＦ」という用語は、例えば、ヒト脳脊髄液などの哺乳動物の脳脊髄液を指す。ＣＳＦは、脳および脊髄の周囲および内側のくも膜下腔および脳室系を占める体液である。脳脊髄液は脳または脊髄液から抜き取ることができる。この用語は、非ヒト哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、非ヒト霊長類など由来のＣＳＦも包含する。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、治療薬という用語は、治療効果を有する、または有する可能性がある任意の化合物に対して使用される。治療薬の例としては、これらに限らないが、小分子、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、脂質、炭水化物が挙げられる。本明細書で使用される場合、治療効果の潜在性についての試験を受けている化合物は治療薬；例えば、実験的治療薬または実験的薬物と考えられる。
【０１３６】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状または分岐状であってよく、修飾されたアミノ酸を含んでよく、また、非アミノ酸が割り込んでいてよい。この用語は、自然にまたは介入によって修飾されたアミノ酸のポリマーも包含する；例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作または修飾、例えば、標識成分とのコンジュゲーションなど。例えば、１つまたは複数のアミノ酸の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含めた）、ならびに当技術分野で公知の他の修飾を含有するポリペプチドもこの定義に包含される。ポリペプチドおよびタンパク質という用語は、文脈によりそうでないことが明確に示されていなければ、全長のポリペプチドまたはタンパク質の断片も包含する。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、「ａｐｏＡ−Ｉ」とは、ＨＤＬの主要な成分であるリポタンパク質を指す。ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の例はヒトａｐｏＡ−Ｉタンパク質（例えば、ＮＭ＿００００３９．１）である。ヒトａｐｏＡ−Ｉタンパク質の他の例はＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏタンパク質およびａｐｏＡ−ＩＩｏｗａタンパク質である。この用語は、非ヒト哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、非ヒト霊長類など由来のａｐｏＡ−Ｉタンパク質も包含する。「ａｐｏＡ−Ｉ」という用語には、ａｐｏＡ−Ｉ相同体も包含される。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「ａｐｏＡ−ＩＩ」とは、ＨＤＬの２番目に豊富な成分であるリポタンパク質を指す。ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質の例はヒトａｐｏＡ−ＩＩタンパク質（例えば、ＮＰ＿００１６３４）タンパク質である。この用語は、非ヒト哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、非ヒト霊長類など由来のａｐｏＡ−ＩＩタンパク質も包含する。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、「ａｐｏＥ」とは、脂質代謝およびコレステロール転送に関与するリポタンパク質を指す。ａｐｏＥタンパク質の例はヒトａｐｏＥタンパク質（例えば、ＮＭ＿００００４１．２）タンパク質である。ヒトａｐｏＥタンパク質には３つのアイソフォーム、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４がある。ＡｐｏＥ３はａｐｏＥの優性型であり、ａｐｏＥ２およびａｐｏＥ４はリポタンパク質粒子（ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ）の中で別個の分布を示す。この用語は、非ヒト哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、非ヒト霊長類など由来のａｐｏＥタンパク質も包含する。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、タンパク質「模倣物」とは、タンパク質二次構造の要素を模倣するペプチドを含有する分子である。タンパク質模倣物は、天然の分子と同様の分子相互作用を可能にすることが予想される。例えば、いくつかのａｐｏＡ−Ｉ模倣物は、親ａｐｏＡ−Ｉタンパク質のＨＤＬ結合性を模倣する（Garber, DWら（１９９２年）Arterioscler Thromb Vasc Biol １２巻：８８６〜８９４頁；Wool,GDら（２００９年）J Lipid Res ５０巻：１８８９〜１９００頁）。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は、非ヒト哺乳動物ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の模倣物である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は、ヒトａｐｏＡ−Ｉタンパク質の模倣物である。
【０１４１】
本明細書での使用に関して、他に明白な指示がなければ、「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」などの用語の使用は、１つまたは複数を指す。
【０１４２】
本明細書では、「約」値またはパラメータと称することは、その値またはパラメータそれ自体を対象とする実施形態を含む（かつ説明する）。例えば、「約Ｘ」と称する記載は、「Ｘ」についての記載を包含する。数値範囲には、その範囲を規定している数が含まれる。
【０１４３】
本明細書に記載の本発明の態様および実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」、および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）態様および実施形態を包含することが理解される。
【０１４４】
ＨＤＬおよびコレステロール逆転送
ＨＤＬの抗アテローム発生性は、大部分が、過剰なコレステロールが末梢組織から肝臓またはステロイド産生組織に転送されるプロセスであるＲＣＴにおけるその役割に帰する［４０、４１］。血漿では、ａｐｏＡ−Ｉの大部分は、アポリポタンパク質、リン脂質、トリグリセリド（ＴＧ）、遊離のコレステロールおよびコレステロールエステルの複合体である球状ＨＤＬと会合する［４２］。しかし、マクロファージからのコレステロールおよびリン脂質の主要なアクセプターは無脂質または低脂質のａｐｏＡ−Ｉ（最大で４つのリン脂質分子を含有する）であり［４３］、これは、コレステロール流出の主要なメディエーターであるＡＢＣＡ１の好ましい基質である［４４〜４９］。ａｐｏＡ−Ｉは主に肝臓で合成されるので、内膜における無脂質ａｐｏＡ−Ｉの最も可能性が高い供給源はＨＤＬから置き換えられたａｐｏＡ−Ｉ分子である。増加している証拠により、内皮の健康の維持およびマクロファージにおけるコレステロール平衡にとって重大である、成熟ＨＤＬからの無脂質／低脂質ａｐｏＡ−Ｉの産生およびそのＡＢＣＡ１を介した再脂質付加は、動脈壁において進行中のプロセスである（図１および２）という概念が裏付けられる。コレステロール負荷マクロファージからのコレステロール流出を容易にするために、低脂質／無脂質ａｐｏＡ−Ｉは、ＡＢＣＡ１に結合する。ＡＢＣＡ１との会合の間に、ａｐｏＡ−Ｉは遊離のコレステロール（ＦＣ）およびリン脂質（ＰＬ）を得て、円板状プレβＨＤＬを形成する。これらの粒子はＬＣＡＴの作用を受け、コレステロールエステルコアを含有するアルファＨＤＬに変換される。ａｐｏＡ−Ｉは、リン脂質転移タンパク質（ＰＬＴＰ）、コレステロールエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）および肝性リパーゼ（ＨＬ）の作用（複数可）によってアルファＨＤＬから遊離する。
【０１４５】
電子常磁性共鳴
電子常磁性共鳴とは、磁場に置かれた常磁性体のマイクロ波放射線または高周波放射線に対する共鳴反応の試験である。常磁性物質は、通常は奇数の電子または不対電子を有するが、いくつかの場合には、偶数の電子を有するイオンまたはビラジカルに対してＥＰＲが観察される。常磁性種を含有する材料に強力な磁場を印加することにより、不対電子の電子「スピン」によって生じる個々の磁気モーメントを、印加された場に対して平行または逆平行のいずれかに向き付けることができる。これにより、不対電子に対して別個のエネルギーレベルが創出され、これにより、電磁放射線（マイクロ波の形態）の正味の吸収を起こすことが可能になる。共鳴条件と称される状況は、マイクロ波のエネルギーが、スピン状態にある対のエネルギーの差異ΔＥに対応する場合に起こる。
【０１４６】
ＥＰＲに関与する磁気双極子遷移の感受性が内因的に低いことを克服するために、試料を空洞共振器内に置く。一般には、およそ９ギガヘルツのＸ−バンドマイクロ波周波数の定常状態で、磁場をゆっくり掃引することによって共鳴全体にわたってスペクトルを収集する。自由電子は、３２５０ガウス（３２５ミリテスラ）の磁場において、周波数９．１０８１ＧＨｚのマイクロ波で共鳴するが、有機フリーラジカルは、特定の分子それぞれに特徴的なわずかに異なる磁場で共鳴する。Ｘ−バンドマイクロ波が最も一般的であるが、ＥＰＲ分光計は、他の周波数；例えば、表１に列挙されている周波数に対して利用可能である。
【表１】
2014513795.tif 000003
【０１４７】
キャビティから反射されるマイクロ波（力が吸収されていると少ない）は、ダイオード検出器を通り、ダイオードから反射される任意の力は、ロードに完全に吸収される。ダイオードは平面偏光マイクロ波のＥベクトルに沿って取り付けられており、したがって、キャビティから反射されるマイクロ波の力に比例した電流が生じる。原理上は、マイクロアンペア計で電流の減少を記録することによって試料によるマイクロ波の吸収を検出することができるが、実際には、そのような直流（ｄ．ｃ．）測定値はあまりにもノイズが多すぎて有用ではない。
【０１４８】
信号対雑音比の問題に対する解決法は、小振幅場変調を導入することである。振動している磁場を、通常キャビティ壁に組み込まれる小さなコイルによってｄ．ｃ．場に重ね合せる。場が共鳴線の近くに入ったら線の一部を通って前後に掃引し、これにより、ダイオード電流に交流（ａ．ｃ．）成分が導かれる。このａ．ｃ．成分を、周波数選択性増幅器を使用して増幅し、それにしたがって、大量の雑音が排除される。振幅変調は通常、線幅よりも小さい。このように検出されたａ．ｃ．信号は、試料吸収の変化に比例する。検出された信号対磁場としてスペクトルをプロットする。
【０１４９】
化学におけるＥＰＲの適用としては、フリーラジカルの特徴付け、有機反応の研究、および常磁性無機分子の電子特性の調査が挙げられる。得られる情報は分子構造の調査において使用される。ＥＰＲは、生物学では、金属タンパク質の研究において、窒素酸化物スピンラベリングのために、およびタンパク質と他の生体高分子の反応プロセス中に生じるラジカルの調査において広範に用いられている。ＥＰＲにより、構造的環境（局部的な柔軟性および溶媒露出度）およびスピンラベル間の相互作用距離が報告される（図３）。
【０１５０】
スピンラベルしたリポタンパク質およびそれらが示すそれぞれの構造要素（挿入図）のＥＰＲスペクトルの例が図４および５に示されている。窒素核スピンとの超微細相互作用に起因して、窒素酸化物スピンラベルのスペクトルは、左から右に３つのピーク；近距離場ピーク、中心ピークおよび遠距離場ピークを含有する。３つの共鳴のピークの線形（幅）は、実験室の磁場内の超微細要素の方向に左右される。超微細要素の運動平均化は各ＥＰＲピークの形状（線）に反映され、したがって、１０−１０〜１０−６秒の時間尺度で起こるスピンラベルの動きがスペクトルの線幅に影響を及ぼす。スピンラベルがより規則的な構造につながると、スピンラベルの移動性は特徴的な様式で制限される。その結果、ピーク間の対称性が示差的に失われ、それに伴って近距離場ピークおよび遠距離場ピークが広がり、平坦になる。
【０１５１】
本発明のいくつかの実施形態では、ＥＰＲを、ａｐｏＡ−Ｉの構造を調べる手段として用いる。ＥＰＲを用いて、無脂質または低脂質の状態にあるａｐｏＡ−Ｉおよび脂質と結合した状態にあるａｐｏＡ−Ｉの構造が調べられており、例えば、９．６ｎｍの再構成された円板状ＨＤＬにおけるａｐｏＡ−ＩのＮ末端構造に対するＥＰＲによる解［６１、６５］。詳細には、窒素酸化物スピンラベルの標的とされる領域／ドメインのコンフォメーションは、ＥＰＲによって測定可能な３つの主要なパラメータ：つながったスピンラベルの側鎖の移動性およびその局所的なペプチド骨格のダイナミクス（図５）、スピンラベルの溶媒露出度、およびその双極子カップリングにより三次構造要素および四次構造要素を同定することができる近くの（本発明で用いる連続波ＥＰＲで＜２２Å）スピンの近傍度から得ることができる。Ｈｕｂｂｅｌｌおよび共同研究者は、ＥＰＲスペクトルの線形の変調を特徴付け、これらの変化に関連づけられる特異的なタンパク質構造特性を同定した［７３、７４］。各構造要素の線形はスピンラベルの移動性を示す；例えば、スピンラベルがより規則的な構造につながると、スピンラベルの移動性は特徴的な様式で制限される。この結果、ピーク間の対称性が示差的に失われ、それに伴って近距離場ピークおよび遠距離場ピークが広がり、平らになる。同様に、近くのスピン間の双極子カップリングにより、スペクトルが示差的に広がる（これは、運動制限に起因する広がりとは独立して評価することができる、参考文献［６１］を参照されたい）。したがって、双極子カップリング（すなわち、ラベルの空間的な近傍度）の変化に対して生じるＥＰＲスペクトルの変化も、タンパク質におけるコンフォメーションの再配置を、特異的なドメインを標的とする報告されたスピンラベルとして検出するために活用することができる（図６）。したがって、上で例示した通り、この種類のＥＰＲスペクトルの分析により、タンパク質のスピンラベルした部位のＥＰＲスペクトルの形状から構造に関する結論を確実に描くことができる。したがって、スピンラベルが、無脂質／低脂質の状態と、脂質と結合した状態の、独特のコンフォメーションを有するａｐｏＡ−Ｉの一部に位置づけられている場合、ＥＰＲスペクトルを使用して、これらのａｐｏＡ−Ｉの２つの形態を、または利用した他のスピンラベルしたリポタンパク質プローブを区別することができる（図７）。
【０１５２】
本発明のいくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料中のＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルを、ピークの線幅の関数であるスペクトルの中心ピークの振幅を測定することによって定量化する。中心ピークの振幅はベースラインとベースラインを超えた最大の信号の間の距離である（例えば、図８を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＥＰＲスペクトルを、中心ピークの線幅の変化を測定することによって定量化する。いくつかの実施形態では、ＥＰＲスペクトルを、中心ピークの中心線とスペクトルがベースラインに戻る点の間の幅を測定することによって定量化する。いくつかの実施形態では、ＥＰＲスペクトルを、中心ピークの振幅と近距離場ピークおよび／または遠距離場ピークの振幅の比率を測定することによって定量化する。
【０１５３】
本発明のいくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるスピンラベルしたリポタンパク質とＨＤＬの結合の変化を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料中のＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルと陰性対照のＥＰＲスペクトルおよび陽性対照のＥＰＲスペクトルを比較することによって測定する。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるスピンラベルしたリポタンパク質とＨＤＬの結合の変化を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料中のスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルの中心ピークの振幅と、脂質と結合したスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルの中心ピークの振幅および／または低脂質のスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルの中心ピークの振幅を比較することによって測定する。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるスピンラベルしたリポタンパク質とＨＤＬの結合の変化を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料中のＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルの中心ピークの幅と、脂質と結合した、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルの中心ピークの幅および／または低脂質のスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルの中心ピークの幅を比較することによって測定する。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるスピンラベルしたリポタンパク質とＨＤＬの結合の変化を、ＥＰＲスペクトルの中心ピークの振幅と近距離場ピークおよび／または遠距離場ピークの振幅の比率と、脂質と結合したスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルの中心ピークの振幅と近距離場ピークおよび／または遠距離場ピークの振幅の比率ならびに／あるいは低脂質のスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルの中心ピークの振幅と近距離場ピークおよび／または遠距離場ピークの振幅の比率を比較することによって測定する。
【０１５４】
本発明のいくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるスピンラベルしたリポタンパク質とＨＤＬの結合の変化を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料中のＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲ共鳴スペクトルと、脂質と結合したスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルにおけるスピンラベルの共鳴および／または低脂質のスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルにおける窒素酸化物の共鳴を比較することによって測定する。スピンラベルの共鳴は、スペクトルのＸ軸（磁場）に沿った中心ピークの周波数によって決定することができる。
【０１５５】
定量的ＥＰＲについては、Eaton, GRら（Quantiative EPR、SpringerWien New York（２０１０年））に記載されている。
【０１５６】
リポタンパク質
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルを収集することによって測定する方法を提供する。該方法は、スピンラベルしたリポタンパク質プローブをＨＤＬ粒子内のリポタンパク質と交換することができることに一部基づく。本発明のいくつかの実施形態では、ＨＤＬに対して高い特異性を有するリポタンパク質とは、全リポタンパク質分子の６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上がＨＤＬと会合するようなリポタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＨＤＬに対して高い特異性を有するリポタンパク質とは、４０％未満、３０％未満、２０％未満もしくは１０％未満、または約４０％、約３０％、約２０％もしくは約１０％が低密度リポタンパク質（ＶＬＤ）または超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）と会合するようなリポタンパク質である。いくつかの実施形態では、リポタンパク質はａｐｏＥ４タンパク質ではない。
【０１５７】
スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、脂質と結合している場合の、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルが、低脂質環境にある場合の同じスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルとは異なるように設計する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルにより、スピンラベルしたリポタンパク質プローブが試料中に存在するＨＤＬと会合しているかどうかが示される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料中のＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルが、脂質と結合した、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルとより類似していることにより、スピンラベルしたリポタンパク質プローブがＨＤＬと会合していることが示される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料中のＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルが、低脂質環境にある、ＨＤＬに対して高い特異性を有する同じスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルとより類似していることにより、スピンラベルしたリポタンパク質プローブが試料中のＨＤＬと会合していないことが示される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるスピンラベルしたプローブとＨＤＬの会合はｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力と相関する。スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合のレベルが高いことにより、コレステロール逆転送に関する能力が高いことが示される。
【０１５８】
アポリポタンパク質は、一般に、クラスＡ両親媒性α−ヘリックス構造モチーフ（Segrestら（１９９４年）Adv. Protein Chem. ４５巻：３０３〜３６９頁）、および／またはβ−シートモチーフを保有する。アポリポタンパク質は、一般に、疎水性表面に結合することができるα−ヘリックス二次構造の含有量が多い。これらのタンパク質の特徴は、それらが、特定の脂質二重層小胞と相互作用し、それらを円板状の複合体に変換させることができることである（概説については、NarayanaswamiおよびRyan（２０００年）Biochimicaet Biophysica Acta １４８３巻：１５〜３６頁を参照されたい）。脂質と接触すると、タンパク質は、コンフォメーションの変化を受け、脂質相互作用に適合するようにその構造を適応させる。
【０１５９】
本発明のいくつかの実施形態では、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブは、スピンラベルしたａｐｏＡ−Ｉタンパク質またはその断片である。ａｐｏＡ−Ｉは、ＨＤＬの主要な成分である。血漿では、ａｐｏＡ−Ｉの大部分（正常なヒトでは９８％）が球状ＨＤＬと会合する。しかし、末梢組織からのコレステロールおよびリン脂質の主要なアクセプターは無脂質または低脂質のａｐｏＡ−Ｉであり、これは、原形質膜輸送体ＡＴＰ結合性カセットＡ１（ＡＢＣＡ１）の好ましい基質である。脂質の不在下で、ａｐｏＡ−Ｉは緻密な４ヘリックス束を帯びることができる（図９）（Cavigiolio, Gら（２０１０年）J. Biol. Chem. ２８５巻：１８８４７〜１８８５７頁）。脂質付加すると（脂質と会合すると）、両親媒性α−ヘリックスのタンパク質間の接触はタンパク質−脂質相互作用に置換され、これはヘリックス束が開いて発生期のＨＤＬ粒子の周囲を取り囲む広がったベルト様α−ヘリックスになることに対応する、図１０。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−ＩはヒトａｐｏＡ−Ｉである；例えば、ａｐｏＡ−Ｉは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００３９．１に記載のアミノ酸配列を有するヒトａｐｏＡ−Ｉである。
【０１６１】
ヒトａｐｏＡ−Ｉタンパク質の配列は、
【化１】
2014513795.tif 000004
である。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ａｐｏＡ−Ｉの断片を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−ＩはａｐｏＡ−Ｉペプチドである。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１８８〜２４３を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１８８〜２４３からなる。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基２２０〜２４１を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基２２０〜２４１からなる。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基６１〜６７を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基６１〜６７からなる。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基８３〜９１を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基８３〜９１からなる。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基９６〜１０３を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基９６〜１０３からなる。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１１６〜１２４を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１１６〜１２４からなる。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１３９〜１４６を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１３９〜１４６からなる。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１６２〜１６９を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１６２〜１６９からなる。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１８２〜１９０を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１８２〜１９０からなる。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基２０４〜２１２を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基２０４〜２１２からなる。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基２１６〜２２１を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基２１６〜２２１からなる。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１〜１８６を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１〜１８６からなる。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質をタンパク質切断することによって生じるａｐｏＡ−Ｉの断片を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉをキモトリプシンで消化することによって生じる。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉのキモトリプシン断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１〜２２９を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉのキモトリプシン断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１〜１９２を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉのキモトリプシン断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１９〜２４３を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉのキモトリプシン断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基５８〜２４３を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉのキモトリプシン断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１〜２２３を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉのキモトリプシン断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１〜２１２を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉのキモトリプシン断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１〜３５〜２４３を含む。
【０１６４】
本発明のいくつかの実施形態では、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ａｐｏＡ−Ｉの構造ドメインを含むａｐｏＡ−Ｉの断片を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏｎＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質のα−ヘリックスドメインを含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質のランダムコイルドメインを含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉ断片のβ−シートドメインを含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ断片は、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質のα−ヘリックスドメインを含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質またはその断片の単一の残基に位置づける。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉプローブは、２つのスピンラベルを含み、それぞれがａｐｏＡ−Ｉタンパク質の単一のアミノ酸残基にある。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質またはその断片に共有結合によって付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質またはその断片に非共有結合によって付着させる、またはそれと会合させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルをａｐｏＡ−Ｉタンパク質のシステイン残基に付着させる。ネイティブなａｐｏＡ−Ｉタンパク質はシステイン残基を含有しない。本発明のいくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉを工学的に操作して、ネイティブなアミノ酸残基とシステイン残基を交換することによってシステイン残基を含める。これにより、スピンラベルの一部がａｐｏＡ−Ｉタンパク質にランダムに付着したスピンラベルしたａｐｏＡ−Ｉタンパク質が生成されるリスクを減らしながら、スピンラベルをａｐｏＡ−Ｉタンパク質の単一の部位に特異的に導くための手段がもたらされる。本発明のいくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質を工学的に操作して、残基１８８〜残基２４３のいずれかの部位に単一のシステイン残基を位置づける。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、残基１８８〜残基２４３のいずれかの部位に遺伝子操作により作製した単一のシステイン残基に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、残基１８８〜残基２４３のいずれかの部位にあるａｐｏＡ−Ｉの残基に付着させる。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位９８、１１１または２１７に遺伝子操作により作製したシステインに付着させる。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位９８、１１１または２１７のａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基２１７に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位２１７に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位、または２２６位のアミノ酸に付着させる。いくつかの実施形態では、２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位、または２２６位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている。いくつか���実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基２６に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位２６に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２６位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基４４に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位４４に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の４４位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基６４に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位６４に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の６４位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１０１に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位１０１に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１０１位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１１１に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位１１１に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１１１位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１６７に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位１６７に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１６７位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基２２６に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位２２６に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２２６位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。
【０１６６】
２１７位にシステイン残基を有するように遺伝子操作したａｐｏＡ−Ｉタンパク質の配列は以下の通りである。
【化２】
2014513795.tif 000005
【０１６７】
本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質のα−ヘリックスドメインに位置づける。α−ヘリックスドメインは定位ではない。無脂質ａｐｏＡ−Ｉでは、α−ヘリックスドメインは、８〜１４位、３０〜４０位、５１〜８５位、９２〜１３７位、１４６〜１８７位、２００〜２１０位、および２２３〜２３９位を含む。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質のランダムコイルドメインに位置づける。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉ断片のβ−シートドメインに位置づける。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質のα−ヘリックス／ランダムコイルドメインの２つの状態に位置づける。
【０１６８】
本発明のいくつかの実施形態では、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブは、スピンラベルしたａｐｏＡ−ＩＩタンパク質またはその断片である。ａｐｏＡ−ＩＩはＨＤＬの２番目に豊富なリポタンパク質成分である。タンパク質は、血漿中ではアポリポタンパク質Ｄの単量体、ホモ二量体またはヘテロ二量体として見いだされる。この遺伝子の欠陥により、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩの欠乏または高コレステロール血症がもたらされる。本発明のいくつかの態様では、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質はヒトａｐｏＡ−ＩＩタンパク質である。ヒトａｐｏＡ−ＩＩのアミノ酸配列の例は以下の通りである：
【化３】
2014513795.tif 000006
【０１６９】
いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質またはその断片の単一の残基に位置づける。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質またはその断片に共有結合によって付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質またはその断片に非共有結合によって付着させる、またはそれと会合させる。本発明のいくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質またはその断片は、２つのスピンラベルを含み、それぞれがａｐｏＡ−ＩＩタンパク質の単一のアミノ酸残基にある。いくつかの実施形態では、スピンラベルをａｐｏＡ−ＩＩタンパク質またはその断片のシステイン残基に付着させる。ネイティブなａｐｏＡ−ＩＩタンパク質は、シグナルペプチドに位置づける１つのシステイン残基を含有する。成熟ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質は、システイン残基を含有しない。本発明のいくつかの実施形態では、成熟ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質を工学的に操作して、残基２４〜残基１００の任意の部位に単一のシステイン残基を位置づける。本発明のいくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−ＩＩ前駆体を工学的に操作して、シグナルペプチドのネイティブなシステイン残基を別のアミノ酸残基と置き換え、工学的に操作して、ネイティブなアミノ酸残基とシステイン残基を交換することによって別のシステイン残基を含める。いくつかの実施形態では、スピンラベルをａｐｏＡ−ＩＩタンパク質の工学的に作製したシステイン残基に付着させる。
【０１７０】
本発明のいくつかの実施形態では、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブは、スピンラベルしたａｐｏＥタンパク質またはその断片である。ａｐｏＥは、正常なトリグリセリドリッチリポタンパク質構成物の異化に必須である。本発明のいくつかの態様では、ａｐｏＥタンパク質はヒトａｐｏＥタンパク質である。ヒトａｐｏＥタンパク質には、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４の３つのアイソフォームがある。ＡｐｏＥ３はａｐｏＥの優性型であり、ａｐｏＥ２およびａｐｏＥ４はリポタンパク質粒子の間で異なる分布で会合している。いくつかの実施形態では、スピンラベルをａｐｏＥタンパク質の工学的に作製したシステイン残基に付着させる。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質はａｐｏＥ３タンパク質である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質はａｐｏＥ４タンパク質ではない。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質は、ａｐｏＥ２タンパク質である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質はａｐｏＥ２タンパク質でもａｐｏＥ４タンパク質でもない。
【０１７１】
ヒトａｐｏＥのアミノ酸配列の例は以下の通りである：
【化４】
2014513795.tif 000007
【０１７２】
いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＥタンパク質またはその断片の単一の残基に位置づける。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＥタンパク質またはその断片に共有結合によって付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＥタンパク質またはその断片に非共有結合によって付着させる、またはそれと会合させる。本発明のいくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質またはその断片は、２つのスピンラベルを含み、それぞれがａｐｏＥタンパク質の単一のアミノ酸残基にある。いくつかの実施形態では、スピンラベルをａｐｏＥタンパク質またはその断片のシステイン残基に付着させる。ネイティブなａｐｏＥタンパク質は、２つのシステイン残基を含有し、１つはシグナルペプチドに位置し、１つは成熟ａｐｏＥタンパク質に位置する。本発明のいくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質を工学的に操作して、ネイティブなシステイン残基を置き換え、工学的に操作して、ネイティブなアミノ酸残基とシステイン残基を交換することによって別のシステイン残基を含める。
【０１７３】
本発明のいくつかの実施形態では、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブは、リポタンパク質の模倣物を含む。いくつかの実施形態では、リポタンパク質の模倣物は、ａｐｏＡ−Ｉの模倣物である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は、非ヒト哺乳動物ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の模倣物である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は、ヒトａｐｏＡ−Ｉタンパク質の模倣物である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は１８Ａ、１８Ａ−Ｐｒｏ−１８Ａ、４Ｆおよび４ｆ−Ｐｒｏ−４Ｆである。ａｐｏＡ−Ｉ模倣物１８Ａは、配列ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦ（配列番号５）で構成される（Garber, DWら（１９９２年）Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology１２巻：８８６〜８９４頁）。模倣物１８Ａ−Ｐｒｏ−１８Ａは、プロリンによって接続した１８Ａのタンデムな二量体である（Wool, GDら（２００９年）J.Lipid Res. ５０巻：１８８９〜１９００頁）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、模倣物に、模倣物内の単一の部位において共有結合によって付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、模倣物の中心に位置づける。ＡｐｏＡ−Ｉ模倣物４Ｆは以下のアミノ酸配列：Ａｃ−ＤＷＦＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＦＫＥＡＦ−ＮＨ２（配列番号６）を有し、４Ｆ−Ｐｒｏ−４Ｆは、プロリン残基によって接続した４Ｆのタンデムな二量体である（Wool,GDら（２００９年）J. Lipid Res. ５０巻：１８８９〜１９００頁）。
【０１７４】
スピンラベル
スピンラベルは、それらの構造内に不対電子が存在することに起因して常磁性である化合物である。したがって、スピンラベルは、フリーラジカルのクラスであるが、通常の温度（１００℃未満）および生理的なｐＨの条件下では必ず安定であり、また、それらのフリーラジカル部分に影響を及ぼすことなく特定の化学反応または実験に適応する。いくつかの実施形態では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を測定するための、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを提供する。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、自由電子を担持する原子を含む。いくつかの実施形態では、自由電子を担持する原子は窒素原子である。いくつかの実施形態では、スピンラベルは窒素酸化物である。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ；１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ，ｄ１５；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（−）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（＋）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；３−（２−ヨードアセトアミド）−ＰＲＯＸＹＬ；３−ヨードメチル−（１−オキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリン）；１−オキシル−３−（マレイミドメチル）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジン；（１−オキシル−２，２，３，５，５−ペンタメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；Ｎ−（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジニル）マレイミド；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドエチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドヘキシルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドプロピルメタンメタンチオスルホネート；３−（２−ブロモアセトアミド）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ、フリーラジカル；４−ブロモ−３−ヒドロキシメチル−１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−δ３−ピロリン；３−ブロモメチル−２，５−ジヒドロ−２，２，５，５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−１−イルオキシ；４−ブロモ−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；３−［２−（２−マレイミドエトキシ）エチルカルバモイル］−ＰＲＯＸＹＬ；３−マレイミド−ＰＲＯＸＬ、３−（２−マレイミドエチル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−���３−（２−ヨード−アセトアミド）−プロピル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（２−ブロモ−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；および３−（２−ヨード−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカルから選択される。
【０１７５】
ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブ
いくつかの実施形態では、本発明は、血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を測定するための、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを提供する。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、リポタンパク質に共有結合によって付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、リポタンパク質に非共有結合によって付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、リポタンパク質と会合させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、リポタンパク質のアミノ酸残基に共有結合によって付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、リポタンパク質のシステイン残基に共有結合によって付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、リポタンパク質のシステイン残基に、チオスルホネート連結を通じて共有結合によって付着させる。
【０１７６】
本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルを、リポタンパク質に、スピンラベルとリポタンパク質との間のスペーサー部分を使用することによって共有結合によってつなげる。そのようなスペーサーにより、スピンラベルとリポタンパク質の間の距離を調節することができ、スピンラベルをリポタンパク質に付着させた際の制約に影響を及ぼすことができる。スペーサー部分の例としては、メタン、エタン、プロパン、ブタンなどのアルカンが挙げられる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、リポタンパク質に、メチルチオスルホネート連結、エチルチオスルホネート連結、プロピルチオスルホネート連結、またはブチルチオスルホネート連結を通じて共有結合によって付着させる。
【０１７７】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを使用したＥＰＲ分光法によって測定するための方法を提供する。スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ＨＤＬ粒子内のリポタンパク質と交換されると、コンフォメーションの変化を受ける。この変化は、ＨＤＬに対して高い特異性を有するリポタンパク質プローブ上のスピンラベルのＥＰＲスペクトルの変化によって検出することができる。例えば、スピンラベルしたａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質プローブは、脂質付加されると、緻密な４ヘリックス束から、発生期のＨＤＬ粒子の周囲を取り囲む広がったベルト様α−ヘリックスに変換される。スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ＨＤＬと結合すると、これらの構造的な変化が検出されるように設計することができる。スピンラベルしたリポタンパク質プローブ上のスピンラベルの部位は、リポタンパク質が無脂質／低脂質である場合、または脂質と結合している場合のスピンラベルのスペクトルが異なることに基づいて選択される。スピンラベルは、リポタンパク質の任意の部位に位置づけることができる。例えば、リポタンパク質は、遺伝子操作してリポタンパク質の各位置に独特のシステイン残基を位置づけて、スピンラベルしたリポタンパク質プローブの開発に関するそれらの有用性を試験するためのリポタンパク質のライブラリーを創出することができる。次いで、ライブラリー内の遺伝子操作したリポタンパク質のそれぞれの独特のシステインにスピンラベルを付着させる。次いで、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブ候補のライブラリーを、脂質と結合したまたは無脂質／低脂質のプローブ候補のＥＰＲスペクトルを収集することによって試験する。脂質と結合した状態と無脂質の状態のＥＰＲスペクトルに検出可能な差異を示すスピンラベルしたリポタンパク質プローブ候補を、本発明の方法において使用するために選択する。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質は、乾燥粉末の形態；例えば、スピンラベルしたリポタンパク質プローブの凍結乾燥調製物である。
【０１７８】
試料
本明細書では、試料におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を、スピンラベルしたリポタンパク質のＥＰＲ分光法によって測定するためのものが提供される。いくつかの実施形態では、試料は生体試料である。いくつかの実施形態では、試料は体液である。いくつかの実施形態では、試料は血液試料である。いくつかの実施形態では、試料は脳脊髄液である。さらに他の実施形態では、試料は薬物の発見または健康診断薬の開発に使用される、合成により調製した試料である。
【０１７９】
血液試料
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を、スピンラベルしたリポタンパク質のＥＰＲ分光法によって測定するための本発明の方法。本発明のいくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は全血試料である。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は血漿試料である。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は血清試料である。別の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は抗凝固薬を含む。いくつかの実施形態では、抗凝固薬はヘパリン、クマジン、ワルファリン、ＥＤＴＡ、シトレートまたはオキザレートである。いくつかの実施形態では、を個体から採取してバキュコンテナー（ｖａｃｕｃｏｎｔａｉｎｅｒ）に入れる。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料を、個体から採取した後に本発明の方法によって分析する。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料を分析前に凍結させる。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料を、分析する前に１サイクルまたは２サイクルの凍結および解凍にかける。
【０１８０】
ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を測定する方法
いくつかの態様では、本発明は、血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料に添加し、試料（例えば、生体試料（例えば、血液、ＣＳＦなど）または合成試料）の電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集することによって測定するための方法を提供する。いくつかの態様では、本発明は、血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加し、試料の電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルを収集することによって測定するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、試料のＥＰＲスペクトルを陰性対照および／または陽性対照のＥＰＲスペクトルと比較する。いくつかの実施形態では、陰性対照は、無脂質または低脂質のスピンラベルしたリポタンパク質プローブである。いくつかの実施形態では、陽性対照は、脂質、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリンと結合したスピンラベルしたリポタンパク質プローブである。いくつかの実施形態では、試料のＥＰＲスペクトルは、正常なコレステロール逆転送能力を有する個体由来、例えば、心臓血管疾患のリスクがない個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加したスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルである。いくつかの実施形態では、血液試料のＥＰＲスペクトルは、正常なコレステロール逆転送能力を有する個体由来、例えば、糖尿病ではない個体由来の血液試料に添加したスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルである。いくつかの実施形態では、ＣＳＦ試料のＥＰＲスペクトルは、正常なコレステロール逆転送能力を有する個体由来、例えば、アルツハイマー病のリスクがない個体由来のＣＳＦ試料に添加したスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルである。
【０１８１】
本発明のいくつかの実施形態では、コレステロール逆転送能力は、コレステロール流出潜在力である。
【０１８２】
スピンラベルしたリポタンパク質プローブは、ＨＤＬに対して高い特異性を有するリポタンパク質を含む。ＨＤＬに対して高い特異性を有するリポタンパク質は、試料（例えば、本明細書に記載の）に添加すると、リポタンパク質の少なくとも６０％がＨＤＬと会合するようなリポタンパク質である。ＨＤＬに対して高い特異性を有するリポタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加すると、リポタンパク質の少なくとも６０％がＨＤＬと会合するようなリポタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＨＤＬに対して高い特異性を有するリポタンパク質は、試料（例えば、本明細書に記載の）に添加すると、リポタンパク質の少なくとも７０％がＨＤＬと会合するようなリポタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＨＤＬに対して高い特異性を有するリポタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加すると、リポタンパク質の少なくとも７０％がＨＤＬと会合するようなリポタンパク質である。
【０１８３】
ＥＰＲ分光法に関する方法は当技術分野で公知である。ＥＰＲを実施するための一般的なガイドラインは、Klug, CSおよびFeix, JB（２００８年）Methods Cell Bio. ８４巻：６１７〜６５７頁）、Fanucci GEおよびCafiso,DS（２００６年）Curr. Opin. Struct. Bio. １６巻：６４４〜６５３頁、およびthe EMX User's Manualによって提供される。非限定的な典型的なＥＰＲ分光法に関する方法は、以下の通りTetali,SDら（２０１０年 J. Lipid Res. ５１巻：１２７３〜１２８３頁）に基づく。ＥＰＲ測定を、ループギャップ共振器を取り付けたＪＥＯＬ  Ｘ−バンド分光計を用いて実施する。ＴＢＳ（１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．００５％のアジ化ナトリウム）中のＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加する。試料を片側だけ密閉したガラス毛細管にローディングし、ＥＰＲによってスキャンする。ビヒクル対照を使用する。室温または３７℃で、マイクロ波電力２ｍＷおよび振幅変調１Ｇとして１００Ｇにわたる３回のスキャン（各２分）を平均することによってスペクトルを得る。
【０１８４】
本発明のいくつかの実施形態では、試料を４℃でスキャンして、予備交換信号を確立する。次いで、試料を３７℃に上昇させ、スキャンを２分、４分、６分、１０分または、１０分超にわたって継続する。
【０１８５】
本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブを試料（例えば、本明細書に記載の）に、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．１ｍｇ／ｍｌにわたる濃度で添加する。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．１ｍｇ／ｍｌにわたる濃度で添加する。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブを、試料（例えば、本明細書に記載の）に、およそ０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．１ｍｇ／ｍｌまたは１．１ｍｇ／ｍｌ超のいずれかの濃度で添加する。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におよそ０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．１ｍｇ／ｍｌまたは１．１ｍｇ／ｍｌ超のいずれかの濃度で添加する。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、本発明は、試料（例えば、本明細書に記載の（例えば、生体試料（例えば、血液、ＣＳＦなど）、合成試料）におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質のＥＰＲ分光法によって測定するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質のＥＰＲ分光法によって測定するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は生体試料である。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は全血試料である。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は血漿試料である。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は血清試料である。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料はＣＳＦ試料である。いくつかの実施形態では、試料は合成試料である。別の実施形態では、試料は抗凝固薬を含む。別の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は抗凝固薬を含む。いくつかの実施形態では、抗凝固薬は、ヘパリン、クマジン、ワルファリン、ＥＤＴＡ、シトレートまたはオキザレートである。いくつかの実施形態では、個体から生体試料を採取してバキュコンテナーに入れる。いくつかの実施形態では、生体試料を、個体から採取した後に本発明の方法によって分析する。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料を、個体から採取した後に本発明の方法によって分析する。いくつかの実施形態では、試料（例えば、本明細書に記載の）を分析前に凍結させる。いくつかの実施形態では、試料（例えば、本明細書に記載の）を、分析する前に１サイクルまたは２サイクルの凍結および解凍にかける。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料を分析前に凍結させる。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料を、分析する前に１サイクルまたは２サイクルの凍結および解凍にかける。
【０１８７】
本発明のいくつかの実施形態では、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルを、スピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加した後に経時的にモニターする。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルを、スピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加した後、１．０分、１．５分、２．０分、３．０分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、３０分、６０分、または６０分超の時点のうちの１つまたは複数でモニターする。
【０１８８】
本発明のいくつかの実施形態では、ＥＰＲスペクトルの中心ピークの振幅を測定する。中心ピークの振幅は、中心ピークについて検出されたベースラインとベースラインからの最大の信号の間の距離の測定値である。本発明のいくつかの実施形態では、試料（例えば、本明細書に記載の）におけるスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルの中心ピークの振幅を陰性対照のＥＰＲスペクトルと比較した差異により、リポタンパク質とＨＤＬとの結合の差異が示される。本発明のいくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルの中心ピークの振幅を陰性対照のＥＰＲスペクトルと比較した差異により、リポタンパク質とＨＤＬとの結合の差異が示される。スピンラベルしたリポタンパク質プローブ上のスピンラベルの位置に応じて、スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合は、中心ピークの振幅が増加することまたは中心ピークの振幅が減少することによって示される。リポタンパク質の特定の部位にあるスピンラベルのＥＰＲスペクトルに影響を及ぼす因子としては、局部的な柔軟性および溶媒露出度が挙げられる。いくつかの実施形態では、中心ピークの振幅の増加が、スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の増加を示す。他の実施形態では、中心ピークの振幅の増加が、スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の減少を示す。さらに他の実施形態では、中心ピークの振幅の減少が、スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の増加を示す。いくつかの実施形態では、中心ピークの振幅の減少が、スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の減少を示す。いくつかの実施形態では、ＨＤＬに対して高い特異性を有する、残基２１９に位置するシステイン残基に窒素酸化物スピンラベルが共有結合によって連結したａｐｏＡ−Ｉタンパク質であるスピンラベルしたリポタンパク質プローブの結合は、そのＥＰＲスペクトルの中心ピークの振幅が増加することによって示される。いくつかの実施形態では、ＨＤＬに対して高い特異性を有する、残基１１１に位置するシステイン残基に窒素酸化物スピンラベルが共有結合によって連結したａｐｏＡ−Ｉタンパク質であるスピンラベルしたリポタンパク質プローブの結合は、そのＥＰＲスペクトルの中心ピークの振幅が増加することによって示される。
【０１８９】
本発明のいくつかの実施形態では、中心ピークの振幅の変化を、スピンラベルしたリポタンパク質プローブがＨＤＬと結合しても変化しないＥＰＲスペクトルの近ピークおよび／または遠ピークの振幅との関連で測定する。そのように、近ピークまたは遠ピークの振幅は、例えば、スピンラベルがクエンチされたかどうかを示すことによって内部標準として機能することができる。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、ＥＰＲスペクトルのプロファイルの変化が、スピンラベルしたリポタンパク質プローブの結合の変化を示す。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、磁場強度に関して中心がシフトすることにより、スピンラベルしたリポタンパク質プローブの結合が変化したことが示される。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合は、磁場強度が上昇すること（スペクトルのＸ軸に沿って右側にシフトすること）によって示される。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合は、磁場強度が低下すること（スペクトルのＸ軸に沿って左側にシフトすること）によって示される。
【０１９２】
本発明は、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）に添加した後に、スピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルを測定することによって測定するための方法を提供する。本発明は、血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加した後に、スピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルを測定することによって測定するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合を結合の速度として測定する。ＥＰＲスペクトルを経時的に収集し、ＥＰＲスペクトルの変化、例えば、中心ピークの振幅の変化によって測定される変化を、時間に対してプロットする。プロットの曲線の傾きにより、スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の速度が示される。スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の速度が速いことは、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力が高いことを反映する。スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の速度が遅いことは、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力が低いことまたは機能不全ＨＤＬを反映する。試験血液試料中のＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を評価するために、血液におけるスピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の速度を、心臓血管疾患のリスクが低い個体由来の血液または心臓血管疾患のリスクが高い個体由来の血液におけるスピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の速度と比較することができる。
【０１９３】
本発明は、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）に添加した後に、スピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルを測定することによって測定するための方法を提供する。本発明は、血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加した後に、スピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルを測定することによって測定するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合を平衡結合までの時間として測定する。ＥＰＲスペクトルを経時的に収集し、ＥＰＲスペクトルの変化、例えば、中心ピークの振幅の変化によって測定される変化を、時間に対してプロットする。平衡結合までの時間を、スピンラベルしたリポタンパク質とＨＤＬの会合速度がスピンラベルしたリポタンパク質とＨＤＬの結合の解離速度と等しくなる時間として測定する。スピンラベルしたリポタンパク質とＨＤＬの平衡結合までの時間を、陽性対照と、または正常なコレステロール逆転送を伴う１または複数の個体由来の血液、例えば、心臓血管疾患のリスクがない個体由来の血液におけるスピンラベルしたリポタンパク質とＨＤＬの結合の程度と比較することができる。平衡結合までの時間が約５分であることにより、血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力が正常であることが示される。平衡結合までの時間が約１０分以上であることにより、血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力が低下していることまたは機能不全ＨＤＬが示される。
【０１９４】
本発明は、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを試料（例えば、生体試料または合成試料）に添加した後に、スピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルを測定することによって測定するための方法を提供する。本発明は、血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加した後に、スピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルを測定することによって測定するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合をＨＤＬ結合の程度として測定する。そのような測定は終点測定である。ＥＰＲスペクトルを経時的に収集し、ＥＰＲスペクトルの変化、例えば、中心ピークの振幅の変化によって測定される変化を、時間に対してプロットする。結合の程度を、スピンラベルしたリポタンパク質とＨＤＬの会合速度が、スピンラベルしたリポタンパク質とＨＤＬの結合の解離速度と等しい平衡結合として測定する。スピンラベルしたリポタンパク質とＨＤＬの結合の程度を、陽性対照と、または正常なコレステロール逆転送を伴う１または複数の個体由来の血液、例えば、心臓血管疾患のリスクがない個体由来の血液におけるスピンラベルしたリポタンパク質とＨＤＬの結合の程度と比較することができる。スピンラベルしたリポタンパク質とＨＤＬの結合の程度を、陽性対照と、または正常なコレステロール逆転送を伴う１または複数の個体由来の試料、例えば、心臓血管疾患のリスクがない個体由来の試料におけるスピンラベルしたリポタンパク質とＨＤＬの結合の程度と比較することができる。いくつかの実施形態では、試験試料由来のＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の程度が８０％以下であることにより、試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）におけるＨＤＬのコレステロール逆転送に関する能力が低下していることが示される。いくつかの実施形態では、試験試料由来のＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の程度が８０％以下であることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるＨＤＬのコレステロール逆転送に関する能力が低下していることが示される。いくつかの実施形態では、試験試料由来のＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の程度が８０％以下であることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるＨＤＬのコレステロール逆転送に関する能力が低下していることまたは機能不全ＨＤＬが示される。いくつかの実施形態では、試験試料由来のＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の程度が７０％以下であることにより、試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）におけるＨＤＬのコレステロール逆転送に関する能力が低下していることまたは機能不全ＨＤＬが示される。いくつかの実施形態では、試験試料由来のＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の程度が７０％以下であることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるＨＤＬのコレステロール逆転送に関する能力が低下していることまたは機能不全ＨＤＬが示される。いくつかの実施形態では、試験試料由来のＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の程度が６０％以下であることにより、試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）におけるＨＤＬのコレステロール逆転送に関する能力が低下していることまたは機能不全ＨＤＬが示される。いくつかの実施形態では、試験試料由来のＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の程度が６０％以下であることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるＨＤＬのコレステロール逆転送に関する能力が低下していることまたは機能不全ＨＤＬが示される。いくつかの実施形態では、試験試料由来のＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の程度が５０％以下であることにより、試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）におけるＨＤＬのコレステロール逆転送に関する能力が低下していることまたは機能不全ＨＤＬが示される。いくつかの実施形態では、試験試料由来のＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとＨＤＬとの結合の程度が５０％以下であることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるＨＤＬのコレステロール逆転送に関する能力が低下していることまたは機能不全ＨＤＬが示される。
【０１９５】
本発明は、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）に添加した後に、スピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルを測定することによって測定するための方法を提供する。本発明は、血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加した後に、スピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルを測定することによって測定するための方法を提供する。本発明のいくつかの実施形態では、ＨＤＬの転移温度を決定する。ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブの結合を、試料に異なる温度；例えば、０℃、４℃、１０℃、２０℃、２５℃、２８℃、３０℃、３７℃で添加し、ＥＰＲスペクトルを収集する。ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブの結合を血液試料に異なる温度；例えば、０℃、４℃、１０℃、２０℃、２５℃、２８℃、３０℃、３７℃で添加し、ＥＰＲスペクトルを収集する。いくつかの実施形態では、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）に添加する。いくつかの実施形態では、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加する。温度を上昇または低下させることによって、同じ試料のＥＰＡスペクトルを異なる温度で収集する。例えば、ＥＰＲスペクトルを０℃で収集し、次いで、温度を１０℃に上昇させてＥＰＲスペクトルを収集し、次いで、温度を２０℃に上昇させてＥＰＲスペクトルを収集し、次いで、温度を３７℃に上昇させてＥＰＲスペクトルを収集することができる。いくつかの実施形態では、単一の試料由来のＥＰＲスペクトルを３７℃で収集し、その後２０℃で収集し、その後１０℃で収集し、その後０℃で収集する。任意の組合せの温度でＥＰＲスペクトルを収集することが意図されている。ＨＤＬの転移温度は、ＥＰＲスペクトルの変化によって反映される、スピンラベルしたリポタンパク質プローブがＨＤＬと結合する最低温度によって示される。転移温度が約２５℃以上であることにより、コレステロール逆転送能力が低下したＨＤＬまたは機能不全ＨＤＬが示される。
【０１９６】
本発明は、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）に添加した後に、スピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルを測定することによって測定するための方法を提供する。本発明は、血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加した後に、スピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルを測定することによって測定するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、生体試料は哺乳動物由来である。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は哺乳動物由来である。いくつかの実施形態では、生体試料はヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、イヌ、ネコ、またはブタ由来である。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料はヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、イヌ、ネコ、またはブタ由来である。いくつかの実施形態では、生体試料は本明細書に記載のヒト生体試料である。いくつかの実施形態では、試料はヒトＣＳＦ試料である。いくつかの実施形態では、血液試料はヒト血液試料である。いくつかの実施形態では、生体試料は非ヒト哺乳動物由来である。いくつかの実施形態では、血液試料は非ヒト哺乳動物由来である。
【０１９７】
本発明は、血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加した後に、スピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルを測定することによって測定するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、血液試料はヒト血液試料である。いくつかの実施形態では、血液試料は非ヒト哺乳動物由来である。いくつかの実施形態では、血液試料は、心臓血管疾患のリスクがある個体由来である。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。いくつかの実施形態では、個体は非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患のリスクがある個体は糖尿病である。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。いくつかの実施形態では、個体は非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患のリスクがある個体は肥満である。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。いくつかの実施形態では、個体は非ヒト哺乳動物である。
【０１９８】
いくつかの態様では、本発明は、個体において心臓血管疾患が発生するリスクを決定する方法であって、個体由来の血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加し、スピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルを収集することによって測定する方法を提供する。次いで、収集されたＥＰＲスペクトルを１つまたは複数の陰性対照および／または１つまたは複数の陽性対照と比較する。陰性対照は、無脂質または低脂質のスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルであってよい（例えば、スピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＳＲスペクトルを血液試料中に存在するプローブを用いて収集しない、例えば、プローブが、例えば、適切な緩衝液または他の溶媒系中に存在する場合）。陽性対照は、ジミリストイルホスファチジルコリンなどの脂質と結合した、スピンラベルしたリポタンパク質プローブであってもよく（例えば、ＥＳＲスペクトルを収集する際にプローブおよび脂質が、例えば、適切な緩衝液または他の溶媒系中に存在する場合）、心臓血管疾患のリスクがない個体由来の血液試料におけるＨＤＬと結合したスピンラベルしたリポタンパク質プローブのヒストリカルスペクトルであってもよい。個体由来の血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力が陽性対照と比較して低いことにより、心臓血管疾患のリスクが示される。いくつかの実施形態では、ＨＤＬのコレステロール逆転送能力が正常の８０％であることにより、心臓血管疾患のリスクが示される。いくつかの実施形態では、ＨＤＬのコレステロール逆転送能力が正常の７０％であることにより、心臓血管疾患のリスクが示される。いくつかの実施形態では、ＨＤＬのコレステロール逆転送能力が正常の６０％であることにより、心臓血管疾患のリスクが示される。いくつかの実施形態では、ＨＤＬのコレステロール逆転送能力が正常の５０％未満であることにより、心臓血管疾患のリスクが示される。いくつかの実施形態では、個体は、心臓血管疾患のリスクがあるヒトである。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患のリスクがあるヒトは糖尿病である。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患のリスクがあるヒトは肥満である。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患は冠動脈疾患である。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患はアテローム性動脈硬化症である。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患は末梢血管疾患である。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患は脳卒中である。
【０１９９】
いくつかの態様では、本発明は、個体における心臓血管疾患に対する療法の経過をモニターする方法であって、個体由来の血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加し、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルを収集することによって測定する方法を提供する。心臓血管疾患に対する療法を受けている個体由来の血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を療法の経過中、経時的にモニターする。いくつかの実施形態では、個体由来の血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を、療法を開始する前に測定する。いくつかの実施形態では、個体由来の血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を療法の前、その間、および／またはその後に測定する。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。いくつかの実施形態では、個体は非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患は、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢血管疾患または脳卒中である。いくつかの実施形態では、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力の増加が、治療有効性を示す。いくつかの実施形態では、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力の経時的な減少が、治療有効性の低下を示す。いくつかの実施形態では、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力の経時的な減少が、疾患状態の再発を示す。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患に対する療法を受けている個体由来の血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を、本発明の方法によって療法の経過に従って経時的にモニターして、心臓血管疾患の再発または再発のリスクを評価する。
【０２００】
いくつかの態様では、本発明は、個体におけるアルツハイマー病に対する療法の経過をモニターする方法であって、個体由来の血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを個体由来のＣＳＦ試料に添加し、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルを収集することによって測定する方法を提供する。アルツハイマー病に対する療法を受けている個体由来の血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を療法の経過中、経時的にモニターする。いくつかの実施形態では、個体由来のＣＳＦにおけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を、療法を開始する前に測定する。いくつかの実施形態では、個体由来のＣＳＦにおけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を療法の前、その間、および／またはその後に測定する。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。いくつかの実施形態では、個体は非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態では、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力の増加が、治療有効性を示す。いくつかの実施形態では、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力の経時的な減少が、治療有効性の低下を示す。いくつかの実施形態では、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力の経時的な減少が、疾患状態の再発を示す。いくつかの実施形態では、アルツハイマー病に対する療法を受けている個体由来のＣＳＦにおけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を、本発明の方法によって療法の経過に従って経時的にモニターして、アルツハイマー病の再発または再発のリスクを評価する。
【０２０１】
いくつかの態様では、本発明は、心臓血管疾患に対する公知の治療薬または潜在的な治療薬を評価するための方法であって、療法に供されている個体（例えば、非ヒト試験動物）由来の血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを個体由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加し、スピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルを収集することによって測定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、個体（例えば、非ヒト試験動物）は、療法を施すことによって療法に供されている。コレステロール逆転送能力の増加が、治療有効性を示す。いくつかの実施形態では、個体（例えば、非ヒト試験動物）由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料のコレステロール逆転送能力を、療法を個体（例えば、非ヒト試験動物）に施している間、および／またはその後に、１回または複数回決定し、試験動物由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料の逆転送能力の増加が、治療有効性を示す。いくつかの実施形態では、非ヒト試験動物は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、イヌ、ネコまたはブタである。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。
【０２０２】
いくつかの態様では、本発明は、アルツハイマー病に対する公知の治療薬または潜在的な治療薬を評価するための方法であって、療法に供されている個体（例えば、非ヒト試験動物）由来のＣＳＦにおけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを個体由来のＣＳＦ試料に添加し、スピンラベルしたリポタンパク質プローブのＥＰＲスペクトルを収集することによって測定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、個体（例えば、非ヒト試験動物）は、療法を施すことによって療法に供されている。コレステロール逆転送能力の増加が、治療有効性を示す。いくつかの実施形態では、個体由来のＣＳＦ試料（例えば、非ヒト試験動物）のコレステロール逆転送能力を、療法を個体（例えば、非ヒト試験動物）に施している間、および／またはその後に、１回または複数回決定し、試験動物由来のＣＳＦ試料の逆転送能力の増加が、治療有効性を示す。いくつかの実施形態では、非ヒト試験動物は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、イヌ、ネコまたはブタである。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、本発明は、心臓血管疾患に対する公知の療法または潜在的な療法の有効性を決定する方法であって、個体（例えば、非ヒト試験動物）由来の血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを個体（例えば、非ヒト試験動物）由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料に添加し、療法を個体（例えば、非ヒト試験動物）に施し、個体（例えば、非ヒト試験動物）由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料のコレステロール逆転送能力を、療法を個体（例えば、非ヒト試験動物）に施している間、および／またはその後に１回または複数回決定することによって測定し、個体（例えば、非ヒト試験動物）由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料の逆転送能力の増加が、治療有効性を示す方法を提供する。いくつかの実施形態では、非ヒト試験動物は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、イヌ、ネコまたはブタである。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、本発明は、アルツハイマー病に対する公知の療法または潜在的な療法の有効性を決定する方法であって、個体（例えば、非ヒト試験動物）由来のＣＳＦにおけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを個体（例えば、非ヒト試験動物）由来のＣＳＦ試料に添加し、療法を個体（例えば、非ヒト試験動物）に施し、個体（例えば、非ヒト試験動物）由来のＣＳＦ試料のコレステロール逆転送能力を、療法を個体（例えば、非ヒト試験動物）に施している間、および／またはその後に１回または複数回決定することによって測定し、個体（例えば、非ヒト試験動物）由来のＣＳＦ試料の逆転送能力の増加が、治療有効性を示す方法を提供する。いくつかの実施形態では、非ヒト試験動物は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、イヌ、ネコまたはブタである。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。
【０２０５】
キット
いくつかの態様では、本発明は、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定するためのキットであって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキットを提供する。いくつかの態様では、本発明は、血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定するためのキットであって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、コレステロール逆転送は、コレステロール流出潜在力である。本発明のいくつかの実施形態では、ＨＤＬに対して高い特異性を有するリポタンパク質は、リポタンパク質の６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上がＨＤＬと会合するようなリポタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＨＤＬに対して高い特異性を有するリポタンパク質は、４０％未満、３０％未満、２０％未満もしくは１０％未満、または約４０％、約３０％、約２０％もしくは約１０％が低密度リポタンパク質（ＶＬＤ）または超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）と会合するようなリポタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＨＤＬはＨＤＬ３である。いくつかの実施形態では、リポタンパク質は、ａｐｏＥ４でもａｐｏＥ２でもない。いくつかの実施形態では、リポタンパク質はａｐｏＥ２ではない。いくつかの実施形態では、リポタンパク質はａｐｏＥ４ではない。いくつかの実施形態では、リポタンパク質はヒトリポタンパク質である。いくつかの実施形態では、リポタンパク質は非ヒト哺乳動物リポタンパク質である。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、本発明は、血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定するためのキットであって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、個体における心臓血管疾患が発生するリスクを、血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定することによって決定するためのキットであって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、個体における療法の経過を、血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定することによって評価するためのキットであって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。いくつかの実施形態では、本発明は、心臓血管疾患に対する公知の療法または潜在的な療法を、個体（例えば、非ヒト試験動物）の血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定することによって評価するためのキットであって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、血液試料を採取するための１種または複数種の抗凝固薬および／またはバキュテナーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質はａｐｏＥ４タンパク質ではない。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＳＦにおけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定するためのキットであって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、個体におけるアルツハイマー病が発生するまたはそれを有するリスクを、血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定することによって決定するためのキットであって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、個体における療法の経過を、ＣＳＦにおけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定することによって評価するためのキットであって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。いくつかの実施形態では、本発明は、アルツハイマー病に対する公知の療法または潜在的な療法を、個体（例えば、非ヒト試験動物）の血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定することによって評価するためのキットであって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキットを提供する。
【０２０８】
いくつかの態様では、本発明は、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定するためのキットであって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含み、リポタンパク質がａｐｏＡ−Ｉまたはその断片であるキットを提供する。いくつかの態様では、本発明は、血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定するためのキットであって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含み、リポタンパク質がａｐｏＡ−Ｉまたはその断片であるキットを提供する。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質は、ヒトａｐｏＡ−Ｉタンパク質である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質は配列番号１の配列またはその断片を有する。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質またはその断片の単一の残基に位置づける。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉプローブは、２つのスピンラベルを含み、それぞれがａｐｏＡ−Ｉタンパク質の単一のアミノ酸残基にある。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質またはその断片に共有結合によって付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質またはその断片に非共有結合によって付着させる、またはそれと会合させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルをａｐｏＡ−Ｉタンパク質のシステイン残基に付着させる。ネイティブなａｐｏＡ−Ｉタンパク質はシステイン残基を含有しない。本発明のいくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉを工学的に操作して、ネイティブなアミノ酸残基とシステイン残基を交換することによってシステイン残基を含める。これにより、スピンラベルの一部がａｐｏＡ−Ｉタンパク質にランダムに付着したスピンラベルしたａｐｏＡ−Ｉタンパク質が生成されるリスクを減らしながら、スピンラベルをａｐｏＡ−Ｉタンパク質の単一の部位に特異的に導くための手段がもたらされる。本発明のいくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質を工学的に操作して、残基１８８〜残基２４３のいずれかの部位に単一のシステイン残基を位置づける。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、残基１８８〜残基２４３のいずれかの部位に遺伝子操作により作製した単一のシステイン残基に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、残基１８８〜残基２４３のいずれかの部位にあるａｐｏＡ−Ｉの残基に付着させる。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位９８、１１１または２１７に遺伝子操作により作製したシステインに付着させる。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位９８、１１１または２１７のａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位、または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位、または２２６位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基２１７に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位２１７に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基２６に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位２６に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２６位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基４４に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位４４に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の４４位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基６４に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位６４に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の６４位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１０１に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位１０１に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの���施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１０１位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１１１に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位１１１に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１１１位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基９８に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位９８に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の９８位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１６７に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位１６７に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１６７位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基２２６に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位２２６に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２２６位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質は、非ヒト哺乳動物ａｐｏＡ−Ｉタンパク質である。いくつかの実施形態では、キットは、試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）を採取するための１種または複数種の抗凝固薬および／またはバキュテナーをさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、血液試料を採取するための１種または複数種の抗凝固薬および／またはバキュテナーをさらに含む。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、キットは、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたａｐｏＡ−ＩＩタンパク質またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質はヒトａｐｏＡ−ＩＩタンパク質である。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質またはその断片に共有結合によって付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質またはその断片に非共有結合によって付着させる、またはそれと会合させる。本発明のいくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質またはその断片は、２つのスピンラベルを含み、それぞれがａｐｏＡ−ＩＩタンパク質の単一のアミノ酸残基にある。いくつかの実施形態では、スピンラベルをａｐｏＡ−ＩＩタンパク質またはその断片のシステイン残基に付着させる。ネイティブなａｐｏＡ−ＩＩタンパク質は、シグナルペプチドに位置づける１つのシステイン残基を含有する。成熟ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質は、システイン残基を含有しない。本発明のいくつかの実施形態では、成熟ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質を工学的に操作して、残基２４〜残基１００の任意の部位に単一のシステイン残基を位置づける。本発明のいくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−ＩＩ前駆体を工学的に操作して、シグナルペプチドのネイティブなシステイン残基を別のアミノ酸残基と置き換え、工学的に操作して、ネイティブなアミノ酸残基とシステイン残基を交換することによって別のシステイン残基を含める。いくつかの実施形態では、スピンラベルをａｐｏＡ−ＩＩタンパク質の工学的に作製したシステイン残基に付着させる。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質は、非ヒト哺乳動物ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質である。いくつかの実施形態では、キットは、血液試料を採取するための１種または複数種の抗凝固薬および／またはバキュテナーをさらに含む。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、キットは、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたａｐｏＥタンパク質またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質は、ヒトａｐｏＥタンパク質である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質はａｐｏＥ３タンパク質である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質はａｐｏＥ４タンパク質ではない。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質はａｐｏＥ２タンパク質ではない。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＥタンパク質またはその断片の単一の残基に位置づける。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＥタンパク質またはその断片に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＥタンパク質またはその断片に非共有結合によって付着している、またはそれと会合している。本発明のいくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質またはその断片は、２つのスピンラベルを含み、それぞれがａｐｏＥタンパク質の単一のアミノ酸残基にある。いくつかの実施形態では、スピンラベルはａｐｏＥタンパク質またはその断片のシステイン残基に付着している。ネイティブなａｐｏＥタンパク質は、２つのシステイン残基を含有し、１つはシグナルペプチドに位置し、１つは成熟ａｐｏＥタンパク質に位置する。本発明のいくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質を工学的に操作して、ネイティブなシステイン残基を置き換え、工学的に操作して、ネイティブなアミノ酸残基とシステイン残基を交換することによって別のシステイン残基が含められている。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキットであって、スピンラベルしたリポタンパク質がリポタンパク質の模倣物を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、リポタンパク質の模倣物は、ａｐｏＡ−Ｉの模倣物である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は、非ヒト哺乳動物ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の模倣物である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は、ヒトａｐｏＡ−Ｉタンパク質の模倣物である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は１８Ａ、１８Ａ−Ｐｒｏ−１８Ａ、４Ｆおよび４ｆ−Ｐｒｏ−４Ｆである。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、模倣物に、模倣物内の単一の部位において共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、模倣物の中心に位置している。ａｐｏＡ−Ｉ模倣物４Ｆは以下のアミノ酸配列：Ａｃ−ＤＷＦＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＦＫＥＡＦ−ＮＨ２（配列番号６）を有し、４Ｆ−Ｐｒｏ−４Ｆは、プロリン残基によって接続した４Ｆのタンデムな二量体である（Wool, GDら（２００９年）J. Lipid Res. ５０巻：１８８９〜１９００頁）。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質は、非ヒト哺乳動物ａｐｏＥタンパク質である。いくつかの実施形態では、キットは、血液試料を採取するための１種または複数種の抗凝固薬および／またはバキュテナーをさらに含む。
【０２１２】
いくつかの態様では、本発明は、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定するためのキットであって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキットを提供する。いくつかの態様では、本発明は、血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定するためのキットであって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、自由電子を担持する原子を含む。いくつかの実施形態では、自由電子を担持する原子は窒素原子である。いくつかの実施形態では、スピンラベルは窒素酸化物である。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ；１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ，ｄ１５；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（−）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（＋）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；３−（２−ヨードアセトアミド）−ＰＲＯＸＹＬ；３−ヨードメチル−（１−オキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリン）；１−オキシル−３−（マレイミドメチル）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジン；（１−オキシル−２，２，３，５，５−ペンタメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；Ｎ−（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジニル）マレイミド；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドエチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドヘキシルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドプロピルメタンメタンチオスルホネート；３−（２−ブロモアセトアミド）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ、フリーラジカル；４−ブロモ−３−ヒドロキシメチル−１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−δ３−ピロリン；３−ブロモメチル−２，５−ジヒドロ−２，２，５，５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−１−イルオキシ；４−ブロモ−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；３−［２−（２−マレイミドエトキシ）エチルカルバモイル］−ＰＲＯＸＹＬ；３−マレイミド−ＰＲＯＸＬ、３−（２−マレイミドエチル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（３−（２−ヨード−アセトアミド）−プロピル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（２−ブロモ−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；および３−（２−ヨード−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカルから選択される。いくつかの実施形態では、スピンラベルは過重水素化スピンラベルである。いくつかの実施形態では、スピンラベルは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートではない。
【０２１３】
いくつかの態様では、本発明は、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定するためのキットであって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキットを提供する。いくつかの態様では、本発明は、血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定するためのキットであって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、ＨＤＬのコレステロール逆転送能力を測定するための、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む。いくつかの実施形態では、キットは、血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送能力を測定するための、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質に非共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質と会合している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質のアミノ酸残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質のシステイン残基に、チオスルホネート連結を通じて共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、キットは、血液試料を採取するための１種または複数種の抗凝固薬および／またはバキュテナーをさらに含む。
【０２１４】
いくつかの態様では、本発明は、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定するためのキットであって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキットを提供する。いくつかの態様では、本発明は、血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定するためのキットであって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキットを提供する。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質に、スピンラベルとリポタンパク質との間のスペーサー部分を使用することによって共有結合によってつながっている。そのようなスペーサーにより、スピンラベルとリポタンパク質の間の距離を調節することができ、スピンラベルをリポタンパク質に付着させた際の制約に影響を及ぼすことができる。スペーサー部分の例としては、メタン、エタン、プロパン、ブタンなどのアルカンが挙げられる。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質に、メチルチオスルホネート連結、エチルチオスルホネート連結、プロピルチオスルホネート連結、またはブチルチオスルホネート連結を通じて共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、キットは、血液試料を採取するための１種または複数種の抗凝固薬および／またはバキュテナーをさらに含む。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、キットを、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブが約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．１ｍｇ／ｍｌの濃度でもたらされるように処方する。いくつかの実施形態では、キットを、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブが約０．３ｍｇ／ｍｌの濃度でもたらされるように処方する。いくつかの実施形態では、キットを、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブが約０．８ｍｇ／ｍｌ超の濃度でもたらされるように処方する。いくつかの実施形態では、キットは、試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）を採取するための１種または複数種の抗凝固薬および／またはバキュテナーをさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、血液試料を採取するための１種または複数種の抗凝固薬および／またはバキュテナーをさらに含む。
【０２１６】
いくつかの態様では、本発明は、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定するためのキットであって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキットを提供する。いくつかの態様では、本発明は、血液におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力をＥＰＲによって測定するためのキットであって、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含むキットを提供する。キットのスピンラベルしたリポタンパク質は、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を、スピンラベルしたリポタンパク質のＥＰＲ分光法によって測定するための方法において使用するために製剤化されている。いくつかの実施形態では、キットのスピンラベルしたリポタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料におけるＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を、スピンラベルしたリポタンパク質のＥＰＲ分光法によって測定するための方法において使用するために製剤化されている。本発明のいくつかの実施形態では、試料は生体試料である。本発明のいくつかの実施形態では、試料は合成試料である。本発明のいくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は全血試料である。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は血漿試料である。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は血清試料である。いくつかの実施形態では、試料はＣＳＦ試料である。いくつかの実施形態では、生体試料はヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモットまたはブタなどの哺乳動物由来である。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料はヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモットまたはブタなどの哺乳動物由来である。いくつかの実施形態では、生体試料は非ヒト哺乳動物由来である。いくつかの実施形態では、生体試料はヒト由来である。いくつかの実施形態では、キットは、抗凝固薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗凝固薬は、ヘパリン、クマジン、ワルファリン、ＥＤＴＡ、シトレートまたはオキザレートである。いくつかの実施形態では、個体から生体試料をバキュコンテナー中に採取する。いくつかの実施形態では、個体から血液試料をバキュコンテナー中に採取する。いくつかの実施形態では、キットは、試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）をＥＰＲ分析するために適した緩衝液、シリンジなどをさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、血液試料をＥＰＲ分析するために適した緩衝液、シリンジなどをさらに含む。
【０２１７】
本明細書に記載の組成物に対する適切な包装が当技術分野で公知であり、それらとしては、例えば、バイアル（例えば、密閉バイアル）、ベッセル、アンプル、ビン、広口瓶、柔軟な包装（例えば、密閉マイラーまたはプラスチック袋）などが挙げられる。組成物に対する包装は、毛細管またはフラットセル管も含んでよい。これらの製造品をさらに滅菌し、かつ／または密閉することができる。本発明のキット中に供給される説明書は、一般には、ラベルまたは添付文書（例えば、キットに含まれる紙シート）上の使用説明書であるが、機械可読の説明書（例えば、磁気保存ディスクまたは光学保存ディスクに保持された説明書）も許容される。ＨＤＬに対して高い親和性を有するスピンラベルしたリポタンパク質の使用に関する説明書は、一般に、使用に関する情報を含む。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスピンラベルしたリポタンパク質は、凍結乾燥され、毛細管またはフラットセル管（例えば、当技術分野で公知のガラス毛細管または他のもの）中に入った状態で提供されてよい。毛細管またはフラットセル管は、場合によって、本明細書に記載のＥＰＲ標準品を含んでもよい。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、管は非常磁性体で構成される。いくつかの実施形態では、管は、ガラス、プラスチック、ポリマーまたは石英を含む。管の内部は任意の寸法であってよい。いくつかの実施形態では、管の内部は円筒状である。いくつかの実施形態では、管の内部は矩形である。本発明のいくつかの実施形態では、管の内部は平らな矩形である。いくつかの実施形態では、管は単孔管である。いくつかの実施形態では、管は多孔管である。
【０２２０】
組成物
いくつかの態様では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料およびＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質を含む組成物を提供する。本発明のいくつかの実施形態では、ＨＤＬに対して高い特異性を有するリポタンパク質は、リポタンパク質の６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上がＨＤＬと会合するようなリポタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＨＤＬに対して高い特異性を有するリポタンパク質は、４０％未満、３０％未満、２０％未満もしくは１０％未満、または約４０％、約３０％、約２０％もしくは約１０％が低密度リポタンパク質（ＶＬＤ）または超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）と会合するようなリポタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＨＤＬはＨＤＬ３である。いくつかの実施形態では、リポタンパク質は、ａｐｏＥ４でもａｐｏＥ２でもない。いくつかの実施形態では、リポタンパク質はａｐｏＥ２ではない。いくつかの実施形態では、リポタンパク質はａｐｏＥ４ではない。いくつかの実施形態では、リポタンパク質はヒトリポタンパク質である。いくつかの実施形態では、リポタンパク質は非ヒト哺乳動物リポタンパク質である。
【０２２１】
いくつかの態様では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料と、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとを含む組成物であって、リポタンパク質がａｐｏＡ−Ｉまたはその断片である組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質は、ヒトａｐｏＡ−Ｉタンパク質である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉは配列番号１の配列またはその断片を有する。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質またはその断片の単一の残基に位置づける。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉプローブは、２つのスピンラベルを含み、それぞれがａｐｏＡ−Ｉタンパク質の単一のアミノ酸残基にある。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質またはその断片に共有結合によって付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質またはその断片に非共有結合によって付着させる、またはそれと会合させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルをａｐｏＡ−Ｉタンパク質のシステイン残基に付着させる。ネイティブなａｐｏＡ−Ｉタンパク質はシステイン残基を含有しない。本発明のいくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉを工学的に操作して、ネイティブなアミノ酸残基とシステイン残基を交換することによってシステイン残基を含める。これにより、スピンラベルの一部がａｐｏＡ−Ｉタンパク質にランダムに付着したスピンラベルしたａｐｏＡ−Ｉタンパク質が生成されるリスクを減らしながら、スピンラベルをａｐｏＡ−Ｉタンパク質の単一の部位に特異的に導くための手段がもたらされる。本発明のいくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質を工学的に操作して、残基１８８〜残基２４３のいずれかの部位に単一のシステイン残基を位置づける。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、残基１８８〜残基２４３のいずれかの部位に遺伝子操作により作製した単一のシステイン残基に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、残基１８８〜残基２４３のいずれかの部位にあるａｐｏＡ−Ｉの残基に付着させる。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位９８、１１１または２１７に遺伝子操作により作製したシステインに付着させる。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位９８、１１１または２１７のａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位、または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位、または２２６位のネイティブなアミノ酸残基がシステイン残基によって置き換えられている。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基２１７に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位２１７に遺伝子操作により作製したシステイン残基に���着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基２６に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位２６に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２６位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基４４に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位４４に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の４４位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基６４に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位６４に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の６４位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基９８に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位９８に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の９８位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１０１に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位１０１に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１０１位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１１１に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位１１１に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１１１位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１６７に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位１６７に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の１６７位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基２２６に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位２２６に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルが、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートまたは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートであり、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２２６位に遺伝子操作により作製したシステイン残基に共有結合によって付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉは、非ヒトａｐｏＡ−Ｉである。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、本発明は、試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）と、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたａｐｏＡ−ＩＩタンパク質またはその断片とを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料と、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたａｐｏＡ−ＩＩタンパク質またはその断片とを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質はヒトａｐｏＡ−ＩＩタンパク質である。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質またはその断片に共有結合によって付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質またはその断片に非共有結合によって付着させる、またはそれと会合させる。本発明のいくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質またはその断片は、２つのスピンラベルを含み、それぞれがａｐｏＡ−ＩＩタンパク質の単一のアミノ酸残基にある。いくつかの実施形態では、スピンラベルをａｐｏＡ−ＩＩタンパク質またはその断片のシステイン残基に付着させる。ネイティブなａｐｏＡ−ＩＩタンパク質は、シグナルペプチドに位置づける１つのシステイン残基を含有する。成熟ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質は、システイン残基を含有しない。本発明のいくつかの実施形態では、成熟ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質を工学的に操作して、残基２４〜残基１００の任意の部位に単一のシステイン残基を位置づける。本発明のいくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−ＩＩ前駆体を工学的に操作して、シグナルペプチドのネイティブなシステイン残基を別のアミノ酸残基と置き換え、工学的に操作して、ネイティブなアミノ酸残基とシステイン残基を交換することによって別のシステイン残基を含める。いくつかの実施形態では、スピンラベルをａｐｏＡ−ＩＩタンパク質の工学的に作製したシステイン残基に付着させる。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質は、非ヒトａｐｏＡ−ＩＩタンパク質である。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、本発明は、試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）と、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたａｐｏＥタンパク質またはその断片とを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料と、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたａｐｏＥタンパク質またはその断片とを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質は、ヒトａｐｏＥタンパク質である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質はａｐｏＥ３タンパク質である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質はａｐｏＥ４タンパク質ではない。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質はａｐｏＥ２タンパク質ではない。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＥタンパク質またはその断片の単一の残基に位置している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＥタンパク質またはその断片に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＥタンパク質またはその断片に非共有結合によって付着している、またはそれと会合している。本発明のいくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質またはその断片は、２つのスピンラベルを含み、それぞれがａｐｏＥタンパク質の単一のアミノ酸残基にある。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＥタンパク質またはその断片のシステイン残基に付着している。ネイティブなａｐｏＥタンパク質は、２つのシステイン残基を含有し、１つはシグナルペプチドに位置し、１つは成熟ａｐｏＥタンパク質に位置する。本発明のいくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質を工学的に操作して、ネイティブなシステイン残基を置き換え、工学的に操作して、ネイティブなアミノ酸残基とシステイン残基を交換することによって別のシステイン残基が含められている。いくつかの実施形態では、ａｐｏＥタンパク質は、非ヒトａｐｏＥタンパク質である。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、本発明は、試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）と、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとを含む組成物であって、スピンラベルしたリポタンパク質がリポタンパク質の模倣物を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料と、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとを含む組成物であって、スピンラベルしたリポタンパク質がリポタンパク質の模倣物を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、リポタンパク質の模倣物は、ａｐｏＡ−Ｉの模倣物である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は、非ヒト哺乳動物ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の模倣物である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は、ヒトａｐｏＡ−Ｉタンパク質の模倣物である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は１８Ａ、１８Ａ−Ｐｒｏ−１８Ａ、４Ｆおよび４ｆ−Ｐｒｏ−４Ｆである。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、模倣物に、模倣物内の単一の部位において共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、模倣物の中心に位置している。ａｐｏＡ−Ｉ模倣物４Ｆは以下のアミノ酸配列：Ａｃ−ＤＷＦＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＦＫＥＡＦ−ＮＨ２（配列番号６）を有し、４Ｆ−Ｐｒｏ−４Ｆは、プロリン残基によって接続した４Ｆのタンデムな二量体である（Wool, GDら（２００９年）J. Lipid Res. ５０巻：１８８９〜１９００頁）。
【０２２５】
いくつかの態様では、本発明は、試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）と、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとを含む組成物を提供する。いくつかの態様では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料と、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、自由電子を担持する原子を含む。いくつかの実施形態では、自由電子を担持する原子は窒素原子である。いくつかの実施形態では、スピンラベルは窒素酸化物である。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ；１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ，ｄ１５；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（−）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（＋）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；３−（２−ヨードアセトアミド）−ＰＲＯＸＹＬ；３−ヨードメチル−（１−オキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリン）；１−オキシル−３−（マレイミドメチル）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジン；（１−オキシル−２，２，３，５，５−ペンタメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；Ｎ−（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジニル）マレイミド；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドエチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドヘキシルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドプロピルメタンメタンチオスルホネート；３−（２−ブロモアセトアミド）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ、フリーラジカル；４−ブロモ−３−ヒドロキシメチル−１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−δ３−ピロリン；３−ブロモメチル−２，５−ジヒドロ−２，２，５，５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−１−イルオキシ；４−ブロモ−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；３−［２−（２−マレイミドエトキシ）エチルカルバモイル］−ＰＲＯＸＹＬ；３−マレイミド−ＰＲＯＸＬ、３−（２−マレイミドエチル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（３−（２−ヨード−アセトアミド）−プロピル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（２−ブロモ−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；および３���（２−ヨード−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカルから選択される。
【０２２６】
いくつかの態様では、本発明は、試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）と、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとを含む組成物を提供する。いくつかの態様では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料と、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質に非共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質と会合している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質のアミノ酸残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質のシステイン残基に、チオスルホネート連結を通じて共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、リポタンパク質はヒトリポタンパク質である。いくつかの実施形態では、リポタンパク質は、非ヒト哺乳動物タンパク質である。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、本発明は、試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）と、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料と、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質に、スピンラベルとリポタンパク質との間のスペーサー部分を使用することによって共有結合によってつながっている。スペーサー部分の例としては、メタン、エタン、プロパン、ブタンなどのアルカンが挙げられる。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質に、メチルチオスルホネート連結、エチルチオスルホネート連結、プロピルチオスルホネート連結、またはブチルチオスルホネート連結を通じて共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、リポタンパク質はヒトリポタンパク質である。いくつかの実施形態では、リポタンパク質は、非ヒト哺乳動物タンパク質である。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、本発明は、試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）と、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料と、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、試料は生体試料である。いくつかの実施形態では、試料は合成試料である。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は全血試料である。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は血漿試料である。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料は血清試料である。いくつかの実施形態では、試料はＣＳＦ試料である。いくつかの実施形態では、生体試料はヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモットまたはブタなどの哺乳動物由来である。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタなど）である。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料はヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモットまたはブタなどの哺乳動物由来である。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタなど）である。いくつかの実施形態では、組成物は、抗凝固薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗凝固薬は、ヘパリン、クマジン、ワルファリン、ＥＤＴＡ、シトレートまたはオキザレートである。
【０２２９】
いくつかの態様では、本発明は、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む組成物であって、リポタンパク質がａｐｏＡ−ＩＩタンパク質またはその断片である組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質はヒトａｐｏＡ−ＩＩタンパク質である。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質またはその断片に共有結合によって付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質またはその断片に非共有結合によって付着させる、またはそれと会合させる。本発明のいくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質またはその断片は、２つのスピンラベルを含み、それぞれがａｐｏＡ−ＩＩタンパク質の単一のアミノ酸残基にある。いくつかの実施形態では、スピンラベルをａｐｏＡ−ＩＩタンパク質またはその断片のシステイン残基に付着させる。ネイティブなａｐｏＡ−ＩＩタンパク質は、シグナルペプチドに位置づける１つのシステイン残基を含有する。成熟ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質は、システイン残基を含有しない。本発明のいくつかの実施形態では、成熟ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質を工学的に操作して、残基２４〜残基１００の任意の部位に単一のシステイン残基を位置づける。本発明のいくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−ＩＩ前駆体を工学的に操作して、シグナルペプチドのネイティブなシステイン残基を別のアミノ酸残基と置き換え、工学的に操作して、ネイティブなアミノ酸残基とシステイン残基を交換することによって別のシステイン残基を含める。いくつかの実施形態では、スピンラベルをａｐｏＡ−ＩＩタンパク質の工学的に作製したシステイン残基に付着させる。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質は、非ヒトａｐｏＡ−ＩＩタンパク質である。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む組成物であって、リポタンパク質がａｐｏＡ−ＩＩタンパク質である組成物を提供する。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、自由電子を担持する原子を含む。いくつかの実施形態では、自由電子を担持する原子は窒素原子である。いくつかの実施形態では、スピンラベルは窒素酸化物である。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ；１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ，ｄ１５；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（−）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（＋）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；３−（２−ヨードアセトアミド）−ＰＲＯＸＹＬ；３−ヨードメチル−（１−オキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリン）；１−オキシル−３−（マレイミドメチル）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジン；（１−オキシル−２，２，３，５，５−ペンタメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；Ｎ−（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジニル）マレイミド；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドエチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドヘキシルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドプロピルメタンメタンチオスルホネート；３−（２−ブロモアセトアミド）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ、フリーラジカル；４−ブロモ−３−ヒドロキシメチル−１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−δ３−ピロリン；３−ブロモメチル−２，５−ジヒドロ−２，２，５，５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−１−イルオキシ；４−ブロモ−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；３−［２−（２−マレイミドエトキシ）エチルカルバモイル］−ＰＲＯＸＹＬ；３−マレイミド−ＰＲＯＸＬ、３−（２−マレイミドエチル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（３−（２−ヨード−アセトアミド）−プロピル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（２−ブロモ−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；および３−（２−ヨード−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカルから選択される。いくつかの実施形態では、スピンラベルは過重水素化スピンラベルである。いくつかの実施形態では、スピンラベルは（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネートではない。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質はヒトａｐｏＡ−ＩＩタンパク質である。
【０２３１】
いくつかの態様では、本発明は、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む組成物であって、リポタンパク質がａｐｏＡ−ＩＩタンパク質である組成物を提供する。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質に非共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質と会合している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質のアミノ酸残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質のシステイン残基に、チオスルホネート連結を通じて共有結合によって付着している。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む組成物であって、リポタンパク質がａｐｏＡ−ＩＩタンパク質である組成物を提供する。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質に、スピンラベルとリポタンパク質との間のスペーサー部分を使用することによって共有結合によってつながっている。スペーサー部分の例としては、メタン、エタン、プロパン、ブタンなどのアルカンが挙げられる。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質に、メチルチオスルホネート連結、エチルチオスルホネート連結、プロピルチオスルホネート連結、またはブチルチオスルホネート連結を通じて共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質は、非ヒト哺乳動物ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−ＩＩタンパク質はヒトａｐｏＡ−ＩＩタンパク質である。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む組成物であって、リポタンパク質がａｐｏＡ−Ｉ模倣物である組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は、非ヒト哺乳動物ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の模倣物である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は、ヒトａｐｏＡ−Ｉタンパク質の模倣物である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は１８Ａ、１８Ａ−Ｐｒｏ−１８Ａ、４Ｆおよび４ｆ−Ｐｒｏ−４Ｆである。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、模倣物に、模倣物内の単一の部位において共有結合によって付着している。ＡｐｏＡ−Ｉ模倣物４Ｆは以下のアミノ酸配列：Ａｃ−ＤＷＦＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＦＫＥＡＦ−ＮＨ２（配列番号６）を有し、４Ｆ−Ｐｒｏ−４Ｆは、プロリン残基によって接続した４Ｆのタンデムな二量体である（Wool, GDら（２００９年）J. Lipid Res. ５０巻：１８８９〜１９００頁）。
【０２３４】
いくつかの態様では、本発明は、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む組成物であって、リポタンパク質がａｐｏＡ−Ｉ模倣物である組成物を提供する。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、自由電子を担持する原子を含む。いくつかの実施形態では、自由電子を担持する原子は窒素原子である。いくつかの実施形態では、スピンラベルは窒素酸化物である。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ；１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート−１５Ｎ，ｄ１５；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（−）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；（＋）−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネート；３−（２−ヨードアセトアミド）−ＰＲＯＸＹＬ；３−ヨードメチル−（１−オキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリン）；１−オキシル−３−（マレイミドメチル）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジン；（１−オキシル−２，２，３，５，５−ペンタメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；Ｎ−（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジニル）マレイミド；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドエチルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドヘキシルメタンチオスルホネート；（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−イル）カルバミドプロピルメタンメタンチオスルホネート；３−（２−ブロモアセトアミド）−２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ、フリーラジカル；４−ブロモ−３−ヒドロキシメチル−１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−δ３−ピロリン；３−ブロモメチル−２，５−ジヒドロ−２，２，５，５−テトラメチル−１Ｈ−ピロール−１−イルオキシ；４−ブロモ−（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルホネート；３−［２−（２−マレイミドエトキシ）エチルカルバモイル］−ＰＲＯＸＹＬ；３−マレイミド−ＰＲＯＸＬ、３−（２−マレイミドエチル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（３−（２−ヨード−アセトアミド）−プロピル−カルバモイル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；３−（２−ブロモ−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカル；および３−（２−ヨード−アセトアミド−メチル）−ＰＲＯＸＹＬ、フリーラジカルから選択される。いくつかの実施形態では、スピンラベルは過重水素化スピンラベルである。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は、非ヒト哺乳動物ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の模倣物である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は、ヒトａｐｏＡ−Ｉタンパク質の模倣物である。
【０２３５】
いくつかの態様では、本発明は、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む組成物であって、リポタンパク質がａｐｏＡ−Ｉ模倣物である組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は、非ヒト哺乳動物ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の模倣物である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は、ヒトａｐｏＡ−Ｉタンパク質の模倣物である。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質に非共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質と会合している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質のアミノ酸残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質のシステイン残基に、チオスルホネート連結を通じて共有結合によって付着している。
【０２３６】
いくつかの態様では、本発明は、試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）と、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとを含む組成物であって、リポタンパク質がａｐｏＡ−Ｉまたはその断片であり、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートである組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む組成物であって、リポタンパク質がａｐｏＡ−Ｉ模倣物である組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は、非ヒト哺乳動物ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の模倣物である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉ模倣物は、ヒトａｐｏＡ−Ｉタンパク質の模倣物である。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質に、スピンラベルとリポタンパク質との間のスペーサー部分を使用することによって共有結合によってつながっている。スペーサー部分の例としては、メタン、エタン、プロパン、ブタンなどのアルカンが挙げられる。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質に、メチルチオスルホネート連結、エチルチオスルホネート連結、プロピルチオスルホネート連結、またはブチルチオスルホネート連結を通じて共有結合によって付着している。
【０２３７】
いくつかの態様では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料と、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとを含む組成物であって、リポタンパク質がａｐｏＡ−Ｉまたはその断片であり、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートである組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質は、ヒトａｐｏＡ−Ｉタンパク質である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉは配列番号１の配列またはその断片を有する。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質またはその断片の単一の残基に位置づける。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉプローブは、２つのスピンラベルを含み、それぞれがａｐｏＡ−Ｉタンパク質の単一のアミノ酸残基にある。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質またはその断片に共有結合によって付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質またはその断片に非共有結合によって付着させる、またはそれと会合させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルをａｐｏＡ−Ｉタンパク質のシステイン残基に付着させる。ネイティブなａｐｏＡ−Ｉタンパク質はシステイン残基を含有しない。本発明のいくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉを工学的に操作して、ネイティブなアミノ酸残基とシステイン残基を交換することによってシステイン残基を含める。これにより、スピンラベルの一部がａｐｏＡ−Ｉタンパク質にランダムに付着したスピンラベルしたａｐｏＡ−Ｉタンパク質が生成されるリスクを減らしながら、スピンラベルをａｐｏＡ−Ｉタンパク質の単一の部位に特異的に導くための手段がもたらされる。本発明のいくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質を工学的に操作して、残基１８８〜残基２４３のいずれかの部位に単一のシステイン残基を位置づける。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、残基１８８〜残基２４３のいずれかの部位に遺伝子操作により作製した単一のシステイン残基に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、残基１８８〜残基２４３のいずれかの部位にあるａｐｏＡ−Ｉの残基に付着させる。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位９８、１１１または２１７に遺伝子操作により作製したシステインに付着させる。本発明のいくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位９８、１１１または２１７のａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の２１７位のシステイン残基に共有結合によって付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、ａｐｏＡ−Ｉリポタンパク質の２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位、または２２６位のアミノ酸に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、２６位、４４位、６４位、１０１位、１６７位、または２２６位のネイティブなアミノ酸残基はシステイン残基によって置き換えられている。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基２１７に付着させる。いく���かの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位２１７に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基２６に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位２６に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基４４に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位４４に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基６４に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位６４に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基９８に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位９８に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１０１に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位１０１に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１１１に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位１１１に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基１６７に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位１６７に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の残基２２６に付着させる。いくつかの実施形態では、スピンラベルを、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質の部位２２６に遺伝子操作により作製したシステイン残基に付着させる（配列番号２）。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質は、非ヒト哺乳動物ａｐｏＡ−Ｉタンパク質である。
【０２３８】
いくつかの態様では、本発明は、試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）と、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとを含む組成物であって、リポタンパク質がａｐｏＡ−Ｉまたはその断片であり、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートである組成物を提供する。いくつかの態様では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料と、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとを含む組成物であって、リポタンパク質がａｐｏＡ−Ｉまたはその断片であり、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートである組成物を提供する。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質に非共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質と会合している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質のアミノ酸残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質のシステイン残基に共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質のシステイン残基に、チオスルホネート連結を通じて共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質は、非ヒト哺乳動物ａｐｏＡ−Ｉタンパク質である。
【０２３９】
いくつかの態様では、本発明は、試料（例えば、本明細書に記載の生体試料または合成試料）と、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとを含む組成物であって、リポタンパク質がａｐｏＡ−Ｉまたはその断片であり、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートである組成物を提供する。いくつかの態様では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血液試料と、ＨＤＬに対して高い特異性を有するスピンラベルしたリポタンパク質プローブとを含む組成物であって、リポタンパク質がａｐｏＡ−Ｉまたはその断片であり、スピンラベルが（１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−３−イル）メチルメタンスルホネートである組成物を提供する。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質に、スピンラベルとリポタンパク質との間のスペーサー部分を使用することによって共有結合によってつながっている。スペーサー部分の例としては、メタン、エタン、プロパン、ブタンなどのアルカンが挙げられる。いくつかの実施形態では、スピンラベルは、リポタンパク質に、メチルチオスルホネート連結、エチルチオスルホネート連結、プロピルチオスルホネート連結、またはブチルチオスルホネート連結を通じて共有結合によって付着している。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質は、非ヒト哺乳動物ａｐｏＡ−Ｉタンパク質である。いくつかの実施形態では、ａｐｏＡ−Ｉタンパク質はヒトａｐｏＡ−Ｉタンパク質である。
【０２４０】
試験片
いくつかの態様では、本発明は、ＨＤＬのコレステロール逆転送を支持する能力を決定するための試験片を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、スピンラベルしたリポタンパク質プローブおよび固体支持体を含む試験片であって、スピンラベルしたリポタンパク質プローブが本明細書に記載のスピンラベルおよびリポタンパク質を含み、ＨＤＬに対して高い特異性を有する試験片を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、細片はポリマー基材またはセルロース基材のいずれかで構成される。いくつかの実施形態では、細片は、観察する磁場領域（３０００〜４０００ガウス）において固有の低ＥＰＲサインを帯びる。いくつかの実施形態では、試験片は固体支持体を含む。いくつかの例では、ポリマーは、吸着剤またはポリマーに接着させた吸着試薬パッドのいずれかであってよい。例えば、吸着試薬パッドは、セルロース細片のように単純なものであってもよく、親水性ポリマーのように複雑なものであってもよく、これにＥＰＲスピンプローブおよびＥＰＲ標準品を吸収させる、または共有結合によって付着させる。試験片に使用することができる材料の例としては、これらに限らないが、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）、ナイロンまたはニトロセルロースが挙げられる。試験片に使用するための材料としては、市販の吸着性材料、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＷｈａｔｍａｎまたはＰａｌｌから市販されている吸着性材料などが挙げられる。本発明の試験片は、ＥＰＲ分光計において使用するために設計する。本発明の試験片は、ＥＰＲ分光計で用いるために適する限りはいかなる特定の形状またはサイズにも縛られない。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、試薬細片はＥＰＲスピンプローブおよびＥＰＲ標準品を吸着し、固定化し、プローブをヒト血漿試料に効率的にもたらす。いくつかの実施形態では、ＥＰＲ標準品の定義済みの量を、ポリマーまたは吸着試薬パッドのいずれかに浸透させる。さらに、ＥＰＲスピンプローブを細片のポリマーまたは吸着試薬パッドに浸透させる、吸収させるまたは吸着させることができる。本発明の一実施形態では、ＥＰＲ標準品とＥＰＲスピンプローブの両方をポリマーまたは吸着試薬パッドに浸透させる。いくらか類似した同様の細片組成物の例はグルコース試験片またはケトン試験片である。
【０２４２】
いくつかの態様では、本発明は、窒素酸化物スピンラベルを担持するａｐｏＡ−Ｉタンパク質またはＨＤＬに特異的なペプチドもしくはポリマーを含むＥＰＲスピンプローブを提供する。窒素酸化物プローブは、無脂質の場合とＨＤＬと会合している場合で異なるＥＰＲスペクトルを有する可能性がある。差異の程度によりＨＤＬ機能が測定される。いくつかの実施形態では、材料を試験片上で乾燥させることができる。他の実施形態では、材料をその表面に共有結合による連結を通じて化学的に接着させることができる。他の実施形態では、材料をその表面に静電気による連結を通じて化学的に接着させることができる。他の実施形態では、材料は、その表面に疎水性連結を通じて化学的に接着させることができる。他の実施形態では、材料をその表面に共有結合による連結、静電気による連結、および疎水性連結の任意の組合せを通じて化学的に接着させることができる。
【０２４３】
本発明は、ＥＰＲスピンプローブ上の窒素酸化物ラベルと同様の性質を有する窒素酸化物プローブとは別個のＥＰＲスペクトルを有する常磁性の安定なラジカルであってよく、したがって、その検出の変化が窒素酸化物プローブの検出の変化に反映されるＥＰＲ標準品を提供する。いくつかの態様では、ＥＰＲ標準品の目的は、アッセイの正規化を可能にすることである。例えば、明確に定義された量のＥＰＲ標準品を細片のポリマーまたは吸着試薬パッドに浸透させる。この例では、ＥＰＲ標準品により、オペレーターがＥＰＲ計器のダイナミックレンジを既知の反応に対して較正することが可能になる。ＥＰＲスピン対照の例は、テトラメチルピペリジン（ＴＥＭＰＯ、ＴＥＭＰＯＬ、ＴＡＭＩＮＥ）、ＴＣＮＱ（テトラシアノキノジメタン）、ＢＺＯＮＯ、ＳＬＰＥＯおよび同様の変異体である。非ピロリン窒素酸化物スピンラベルをＥＰＲスピンプローブに使用する場合、ピロリンに基づくスピンラベルを標準品として使用することができる。いくつかの実施形態では、材料を、細片のポリマーまたは吸着試薬パッド上で乾燥させること、またはそれに化学的に接着させることができる。
【０２４４】
試験片を読み取るために使用する計器は、ＥＰＲ分光計のキャビティ内の特定の場所にあるＥＰＲ細片の位置に付属品を取り付けたＥＰＲ分光計である。いくつかの場合には、計器内の細片の位置は、試験片の特異的なセグメントの考察および正確な幾何的位置に対して重要であり得る。一般に、計器により、電磁気スペクトルのＸ−バンド（７．０〜１２ＧＨｚ）および３０００〜４０００ガウスの磁場強度の信号を検出する。
【０２４５】
少なくとも２つの使用方式が構想される。第１の非限定的な例では、細片をＥＰＲスピン対照試薬に単独で浸透させる。ＥＰＲプローブを、血漿（または本明細書に記載の他の試料）などの試料と合わせ、細片に特定の体積で投与する。いくつかの例では、混合物を細片上で、室温で５分間（最小）反応させ、ＥＰＲ分光計に挿入し、スペクトルを得る。本発明の第２の非限定的な態様では、特定量の血漿をＥＰＲスピンプローブおよびＥＰＲスピン対照を浸透させた試験片に添加し、細片上で、室温で５分間反応させる。どちらの場合でも、ＥＰＲスピン対照により、相対的な信号強度を確立することができ、これを使用して計器を較正する。ＥＰＲスピンプローブからの信号を使用して、血漿におけるＥＰＲスピンプローブのＨＤＬに対する相対的な反応を決定することができる。
【０２４６】
本発明のいくつかの実施形態では、試験片を定義済みの分量のＨＤＬ修飾治療薬（例えば、有効性について試験されている治療用組成物、感度について試験されている診断用組成物など）の存在下で用いることもできる。治療薬をＥＰＲスピンプローブとして細片に組み入れることができる、または、ＥＰＲ標準品を定義済みの分量でヒト血漿に添加し、その後、これを細片上でＥＰＲ分光分析によって分析する。
【０２４７】
二相性容器
いくつかの態様では、本発明は、本発明の方法において使用するための、内部が二相性の容器を提供する。いくつかの実施形態では、二相性容器は固体材料を含む。いくつかの実施形態では、容器は、本発明の方法において使用する試料中の固体材料または固体様材料を捕捉するための材料を含有する。いくつかの実施形態では、本発明は二相性容器を提供し、その容器には本発明の方法において使用する試料が添加されており、試料中の固体材料または固体様材料が試料中の１種または複数種の液体から分離されている。例えば、材料により、細胞を血漿または血清と分離することができる。いくつかの実施形態では、容器の内側の材料は、１種または複数種の固体材料または固体様材料と結合する、それをトラップする、またはそれを試料中の１種または複数種の液体から隔離する。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、容器中の材料は、フィルター、メッシュ、スポンジ、またはスポンジ様材料などの空間充填材料である。いくつかの実施形態では、容器は、固体区画と液体区画を含む。いくつかの実施形態では、材料は、綿、セルロース、またはビニルなどのポリマーである。本発明のいくつかの実施形態では、容器中の材料により、試料中の１つまたは複数の固体が試料中の１種または複数種の液体から分離される。いくつかの実施形態では、材料は容器の内部の一部を占める。いくつかの実施形態では、材料は、容器の第１の端部を占める。いくつかの実施形態では、材料は容器の第２の端部を占める。いくつかの実施形態では、材料は容器の中央を占める。いくつかの実施形態では、材料は容器の内部全体にわたって見られる。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、材料に抗凝固薬を浸透させる。いくつかの実施形態では、抗凝固薬は、ヘパリン、クマジン、ワルファリン、ＥＤＴＡ、シトレートまたはオキザレートである。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、容器は、スピンラベルしたリポタンパク質プローブを含む。いくつかの実施形態では、容器は薬物を含む。いくつかの実施形態では、容器は、スピンラベルしたリポタンパク質プローブおよび薬物を含む。上記の実施形態の別の実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブおよび／または薬物は、乾燥粉末の（例えば、凍結乾燥した）形態である。上記の実施形態の他の実施形態では、スピンラベルしたリポタンパク質プローブおよび／または薬物は液剤である。いくつかの実施形態では、試料を容器に添加する前に、スピンラベルしたリポタンパク質プローブを容器に添加する。いくつかの実施形態では、試料を容器に添加した後に、スピンラベルしたリポタンパク質プローブを容器に添加する。いくつかの実施形態では、試料を容器に添加するのと同時に、スピンラベルしたリポタンパク質プローブを容器に添加する。いくつかの実施形態では、試料を容器に添加する前に、スピンラベルしたリポタンパク質プローブを試料に添加する。いくつかの実施形態では、試料を容器に添加する前に、薬物を容器に添加する。いくつかの実施形態では、試料を容器に添加した後に、薬物を容器に添加する。いくつかの実施形態では、試料を容器に添加するのと同時に、薬物を容器に添加する。いくつかの実施形態では、試料を容器に添加する前に、薬物を試料に添加する。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、容器は、管、フラットセル管または毛細管である。いくつかの実施形態では、容器は、非常磁性体で構成される。いくつかの実施形態では、容器は、ガラス、プラスチック、ポリマーまたは石英を含む。管の内部は任意の寸法であってよい。いくつかの実施形態では、容器の内部は円筒状である。いくつかの実施形態では、容器の内部は矩形である。本発明のいくつかの実施形態では、容器の内部は平らな矩形である。いくつかの実施形態では、容器は単孔容器である。いくつかの実施形態では、容器は多孔容器である。
【０２５２】
例示的な実施形態
本明細書に開示されている特徴は全て、任意の組合せで組み合わせることができる。本明細書に開示されているそれぞれの特徴は、同じ、等価の、または同様の目的にかなう代替の特徴に置き換えることができる。したがって、別段の規定が明示されていない限り、開示されているそれぞれの特徴は、単に一般的な一連の等価物または同様の特徴の一例にすぎない。
【実施例】
【０２５３】
実施例は本発明を純粋に例示するものとし、したがって、本発明をいかなる形でも限定するものとみなされるべきではなく、同様に上記の本発明の態様および実施形態も記載し、詳説する。別段の指定のない限り、温度は摂氏度であり、圧力は大気または大気付近の圧力である。前述の例および発明の詳細な説明は、例証するために提供されており、限定する目的で提供されているのではない。本明細書において引用されている刊行物、特許出願、および特許は全て、個々の刊行物、特許出願、または特許が具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたのと同様に参照により本明細書に組み込まれる。特に、本明細書において引用されている刊行物は全て、本発明とともに用いることができる組成物および方法体系を記載し、開示するために、明白に参照により本明細書に組み込まれる。前述の発明は、明確な理解のために例証および例によっていくつかの詳細で記載されているが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の主旨または範囲から逸脱することなく特定の変化および改変を行うことができることは当業者には容易に明らかになろう。
【０２５４】
（実施例１）
ａｐｏＡ−Ｉ結合／置き換えのゲルに基づく分析
ａｐｏＡ−Ｉは、１つのリポタンパク質プールから別のリポタンパク質プールに移動させることができ、低脂質タンパク質としてリポタンパク質プールから離脱させることもできるタンパク質のクラスである、交換可能なアポリポタンパク質のファミリーのメンバーである［５０］。リポタンパク質粒子間のアポリポタンパク質の交換は、脂質代謝の中心的な要素である。ａｐｏＡ−Ｉの交換は置き換え反応であるという有意な証拠が存在するが、ＨＤＬ粒子由来のａｐｏＡ−Ｉの直接結合および置き換えは直接実証されていない。ＨＤＬ上に常在するａｐｏＡ−Ｉが外因的に付加された無脂質／低脂質ａｐｏＡ−Ｉと平衡になり得るかどうかを考察した。Ａｌｅｘａ３５０で標識したａｐｏＡ−Ｉ変異体（Ｅ１３６位において標識した）を使用して蛍光ｒＨＤＬを生成した。Ａｌｅｘａ３５０で標識したａｐｏＡ−Ｉを用いて異なるサイズのｒＨＤＬ粒子（７．８ｎｍ、８．４ｎｍおよび９．６ｎｍ）を再構成し、以前に記載されている通り精製した［５１］。精製したｒＨＤＬを、標識していない無脂質ａｐｏＡ−Ｉと一緒に、タンパク質：タンパク質のモル比１：５で、３７℃で最大７日間インキュベートした。リポタンパク質を非変性濃度傾きゲル電気泳動（ｎｏｎ−ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＮＤＧＧＥ）によって検査した。最初の５時間以内に、Ａｌｅｘａ３５０で標識したａｐｏＡ−Ｉの９０％超が無脂質タンパク質プール内に急速に放出された（図１１）。粒子は３７℃で２４時間に至るまで安定であり、これにより、ＨＤＬからのａｐｏＡ−Ｉ結合／置き換えがＨＤＬ粒子の分解または大規模なリモデリングに起因するものではないことが示されている。外因性の無脂質ａｐｏＡ−ＩをＡｌｅｘａ３５０標識した場合にも同様の結果が得られた［５１］。ａｐｏＡ−Ｉ結合／置き換えの速度には、ｒＨＤＬがＡＢＣＡ１を介してコレステロールを流出させる相対的な能力が反映された。９．６ｎｍ粒子で最も遅いａｐｏＡ−Ｉ結合／置き換えの速度が示され、７．８ｎｍ粒子で最も速いａｐｏＡ−Ｉ結合／置き換えの速度が示された。７．８ｎｍ粒子はＡＢＣＡ１媒介性コレステロール流出の好ましい基質である。このａｐｏＡ−Ｉの置き換えのプロセスは、コレステリルエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）［５３］、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）［５４、５５］、リン脂質転移タンパク質（ＰＬＴＰ）［５６、５７］および肝性リパーゼ［５８］などの血漿因子が存在することによって有意に加速される（約５分）［４１、５２］。
【０２５５】
（実施例２）
ａｐｏＡ−Ｉ交換のＦＲＥＴに基づくアッセイ。
ａｐｏＡ−Ｉ結合／置き換えのゲルに基づく評価には情報価値があるが、この手法の時間尺度および分解能では、酸化状態およびＨＤＬ粒子組成の変更によって生じる結合／置き換えのカイネティクスの複雑な差異を解明することができない。ゲルに基づく手法のこの欠点に取り組むために、無脂質の状態のａｐｏＡ−Ｉのコンフォメーション、および脂質と結合した状態のａｐｏＡ−Ｉのコンフォメーションに基づいて、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づくアッセイを展開した。ＦＲＥＴは、残基が１つのコンフォメーションでは近位にあり、別のコンフォメーションでは遠位にある場合のタンパク質のコンフォメーションの状態を推定するために有用である、タンパク質内の残基間の距離を決定することができる有力な技法である。ＦＲＥＴの有効範囲は１０〜７５Åであり、これは無脂質のａｐｏＡ−Ｉと、脂質と結合したａｐｏＡ−Ｉの規模に適する。原子間距離を、ドナーフルオロフォアからアクセプターフルオロフォアへのエネルギー交換の程度によって測定する。発光スペクトル（３３０〜３５０ｎｍ）がＮ−ヨードアセチル−Ｎ’−（５−スルホ−１−ナフチル）エチレンジアミン（ＡＥＤＡＮＳ）の吸収スペクトルと重複するトリプトファンの蛍光特性を利用した。４つの内在性トリプトファンがフェニルアラニンに置換されたａｐｏＡ−Ｉ変異体を創出した（ＴｒｐヌルａｐｏＡ−Ｉ）。ａｐｏＡ−ＩにおけるこれらのＴｒｐのＰｈｅへの置換は、ＷＴのＡＢＣＡ１媒介性コレステロール流出活性と匹敵することによって実証された通り、タンパク質の構造［５９］または機能には有意な影響を及ぼさない［６０］。４４０ｎｍにおけるＡＥＤＡＮＳ蛍光の相対的なレベルによって、エネルギー移動の程度を表すトリプトファン蛍光ドナーとＡＥＤＡＮＳ蛍光アクセプター部分の間の距離が決定された（図１２）。
【０２５６】
無脂質の状態［６１〜６３］および脂質と結合した状態［６４、６５］のａｐｏＡ−Ｉの構造に関する以前の調査により、アミノ酸位１９と１３６が、無脂質ａｐｏＡ−Ｉの構造では近位にあり、脂質と結合したａｐｏＡ−Ｉの構造では遠位にあることが示された（図１２ＡおよびＢ）。円板状ＨＤＬにおいて無脂質ａｐｏＡ−Ｉ束が開いて広がったヘリックスになる速度を測定するために、ＴｒｐヌルａｐｏＡ−Ｉ（ａｐｏＡ−ＩＷ１９）において１９位のＶａｌをＴｒｐで置換し、１３６位のＧｌｕをＣｙｓで置換した。ａｐｏＡ−Ｉ内に内在性のシステインが存在しないことを利用して、マレイミドチオール化学作用を利用して導入するシステインをＡＥＤＡＮＳで標識した。得られたａｐｏＡ−ＩＷ１９：Ａ１３６を用いてｒＨＤＬを生成した。実施例１に記載のゲルに基づくアッセイと同様に、蛍光標識したｒＨＤＬを、標識していないａｐｏＡ−Ｉ（ＴｒｐヌルａｐｏＡ−Ｉ）と一緒に、タンパク質：タンパク質のモル比１：５でインキュベートした。ｒＨＤＬからのａｐｏＡ−ＩＷ１９：Ａ１３６の置き換えを、λｍａｘ（４４０ｎｍ）におけるＡＥＤＡＮＳ蛍光の増加として観察した。これから、「交換速度」と称されるａｐｏＡ−Ｉ結合／置き換えの速度を決定した。０時間における交換反応混合物の発光スペクトルを０％交換の参照として使用し、７２時間のスペクトルを最終的な平衡状態（最大の交換；６回の実験の平均）として使用した（図１３）。単一指数関数的なデータフィッティング分析により、指数関数的な緩和時間（５０％最大交換までの時間、τ）０．９４時間がもたらされ、この測定値はＮＤＧＧＥによって観察されたａｐｏＡ−Ｉ結合／置き換えの定性的評価と一致した（図１１）。単独でインキュベートした場合の蛍光標識したｒＨＤＬの発光スペクトルには同じ期間中に変化が示されず、これにより、蛍光発光スペクトルの変化がｒＨＤＬの自発性リモデリングの結果ではないことがさらに示されている。
【０２５７】
（実施例３）
交換速度に対する酸化の影響。
ａｐｏＡ−Ｉの交換速度に対する、ペルオキシナイトライトおよびＭＰＯによる酸化の影響。無脂質ＴｒｐヌルａｐｏＡ−Ｉを、反応性窒素種の強力な供給源であるＭＰＯ−Ｈ２Ｏ２−亜硝酸系による酸化に供した［６６］。無脂質ＴｒｐヌルａｐｏＡ−Ｉを、ペルオキシナイトライトによる酸化にも供した。これらの２つの酸化方式間の違いは、ＭＰＯ媒介性酸化は、ａｐｏＡ−Ｉの、ＡＢＣＡ１によってコレステロールを流出させる能力を激しく低下させる３−クロロチロシンおよび３−ニトロチロシンの強力な供給源であるが［２８、３０］、ａｐｏＡ−Ｉのペルオキシナイトライト酸化ではａｐｏＡ−ＩのＡＢＣＡ１媒介性流出能力に有意な減退は導かれない［６７］ことである。ペルオキシナイトライトによる酸化の影響を試験した場合には、ａｐｏＡ−Ｉ交換速度に有意差は観察されなかった（図５）［３８］。対照的に、ＭＰＯによる酸化により、ａｐｏＡ−Ｉの２つの集団がもたらされ、一方は交換の程度が正常であり、第２の集団（５７％）は、ＨＤＬに常在するａｐｏＡ−Ｉを交換するその能力が激しく損なわれる［３８］。興味深いことに、同様の条件下でのａｐｏＡ−ＩのＭＰＯによる酸化では、ａｐｏＡ−Ｉの、ＡＢＣＡ１によってコレステロール流出を容易にする能力の著しい匹敵する低下（約５０％）がもたらされた［３１］。これらのデータにより、ＨＤＬのａｐｏＡ−Ｉ交換（あるいはａｐｏＡ−Ｉ  ＨＤＬ結合／置き換えと称される）の速度がそのコレステロール流出能を反映することが示唆されている。
【０２５８】
ＦＲＥＴに基づくアッセイにより、ＨＤＬ機能に対する酸化の影響に関する洞察がもたらされた。ａｐｏＡ−Ｉ交換を害する酸化反応により、ａｐｏＡ−ＩのＡＢＣＡ１を介してコレステロールを流出させる能力も阻害されるが、ａｐｏＡ−Ｉ交換に影響を及ぼさない酸化反応ではＡＢＣＡ１媒介性コレステロール流出は害されない。ａｐｏＡ−Ｉ交換速度の測定の潜在的なＣＡＤ予測値を、ａｐｏＡ−Ｉの交換速度を害する化学的修飾が、ＣＡＤの発生率の増加に関連づけられる、糖尿病［２９、６８、６９］、肥満、およびタバコ喫煙［７０〜７２］において観察される化学的修飾と同様であるという事実によってさらに検証する。
【０２５９】
（実施例４）
ＥＰＲ方法体系
ＥＰＲを用いて、無脂質の状態のａｐｏＡ−Ｉ、および脂質と結合した状態のａｐｏＡ−Ｉの構造を考察した。９．６ｎｍの再構成された円板状ＨＤＬ上のａｐｏＡ−ＩのＮ末端構造に対するＥＰＲによる解［６５］。この方法体系は、ＮＭＲと類似しており、スピンラベルの構造的な微小環境（約１０〜１５Å）に関する情報を提供する。詳細には、この領域のコンフォメーションは、ＥＰＲによって測定可能な３つの主要なパラメータ：ペプチド骨格の移動性（図５）、スピンラベルの溶媒露出度、および環境の相対的な流動性から得ることができる。後者は、膜結合タンパク質および近位の脂質の流動性を考察するために最も適当である。Ｈｕｂｂｅｌｌおよび共同研究者は、ＥＰＲスペクトルの線形の変調を特徴付け、これらの変化に関連づけられる特異的なタンパク質構造特性を同定した［７３、７４］。これにより、タンパク質のスピンラベルした部位のＥＰＲスペクトルの形状から構造に関する結論を引き出すことができる。したがって、スピンラベルが、無脂質の状態と、脂質と結合した状態の、独特のコンフォメーションを有するａｐｏＡ−Ｉの一部に位置づけられている場合、ＥＰＲスペクトルを使用してこれらのａｐｏＡ−Ｉの２つの形態を区別することができる。
【０２６０】
ａｐｏＡ−Ｉとヒト血漿ＨＤＬの結合。以前にＨＤＬからのａｐｏＡ−Ｉ結合／置き換え（図１１）を評価するために使用したＡｌｅｘａ３５０で標識したａｐｏＡ−Ｉを用い、ヒト血漿における無脂質ａｐｏＡ−Ｉの結合優先性を調査した。健康な絶食した女性ボランティアドナー由来のヘパリン添加ヒト血漿に、Ａｌｅｘａ３５０で標識したａｐｏＡ−Ｉを０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、および０．８ｍｇ／ｍｌの濃度で添加した。外因性のａｐｏＡ−Ｉを伴う血漿を３７℃で２時間インキュベートし、ＮＤＧＧＥによって分離した（図１４）。ａｐｏＡ−Ｉの主要な結合は、ＨＤＬリポタンパク質画分に限られる。ａｐｏＡ−Ｉのかなりの部分が直径およそ８．０ｎｍの粒子と会合するが、ａｐｏＡ−Ｉは、より大きなＨＤＬ粒子にも結合する。プレβＨＤＬに対応するゲルの領域内にいくつかのａｐｏＡ−Ｉが存在する。本実験でなされた重要な観察は、ヒト血漿に添加したａｐｏＡ−Ｉは、ゲルのＶＬＤＬ部分（一番上）、ＬＤＬ部分、またはアルブミン部分のいずれにおいても見いだすことができないということである。ＮＤＧＧＥにおいてａｐｏＡ−ＩはＨＤＬリポタンパク質画分と一緒に移動し、また、ａｐｏＡ−ＩはＨＤＬに対して特異性が高いことが報告されているので［３９］、ａｐｏＡ−ＩはＨＤＬと結合し、スピンラベルから集めたデータによりＨＤＬの様子が報告される可能性がある。
【０２６１】
（実施例５）
ＥＰＲによるヒト血漿ＨＤＬの考察。
ＥＰＲを、血漿中のＨＤＬを直接評価する手段として使用することの実現性を評価するために、以下について考察する：１）新しく改善されたＥＰＲ器具類のこの分析に対する感度；２）血漿ＨＤＬに対するａｐｏＡ−Ｉの特異性；および３）ＥＰＲスペクトルにより、正常者およびＣＡＤの「リスクがある」患者から採取したヒト血漿試料における差異が示されるかどうか。最初に、ＪＥＯＬ  ＴＥ−１００  ＥＰＲ分光計の感度の増強が、生理的に関連する濃度でａｐｏＡ−Ｉの構造特性を測定するために十分であるかどうかを試験した。ａｐｏＡ−Ｉ参照試料（種々のよく特徴付けられた位置にスピンラベルしたａｐｏＡ−Ｉ）を、再現性のある信号が検出されなくなるまで濃度を低下させながら評価した。この閾値は０．１ｍｇ／ｍｌであり、血漿中のａｐｏＡ−Ｉの生理的濃度を十分に下回った。これらの試験のためには、０．３ｍｇ／ｍｌのスピンラベルしたａｐｏＡ−Ｉが最適程度のＨＤＬ特異性をもたらし、ＥＰＲ分光計で頑強かつ再現性のある信号を帯びるので、それを使用した。
【０２６２】
システイン置換変異体を使用してａｐｏＡ−Ｉを標識し、ａｐｏＡ−Ｉ内に内在性のシステインが存在しないことを利用して標識を特異的な場所に位置づける（図１５Ａ）。このアッセイは、無脂質のａｐｏＡ−Ｉと、脂質と結合したａｐｏＡ−Ｉを識別することができることに依拠するので、ａｐｏＡ−ＩのＧ２１７位をスピンラベル部位として選択する。ａｐｏＡ−Ｉの２４３アミノ酸の２４０におけるａｐｏＡ−Ｉの構造を考察し、タンパク質の全体の長さを下回るａｐｏＡ−Ｉの構造に対する脂質の会合の影響を決定した。残基Ｇ２１７のＥＰＲスペクトルは、脂質結合の影響を受ける（図１５Ｂ）。この脂質結合に際したＥＰＲスペクトルのシフトが、ＨＤＬ会合に対する非常に感度のよいレポーターとしての機能を果たす。これは、ａｐｏＡ−Ｉ内のその位置におけるａｐｏＡ−Ｉコンフォメーションの指標としての機能も果たす。対照的に、Ａ１７６位は、脂質の影響を有意に受けず、したがって、大多数のａｐｏＡ−Ｉ残基と同様に、脂質結合を報告するには不十分な位置である。反応のダイナミックレンジはＧ２１７で最も大きいが、他の残基も脂質付加すると同等に変更され、同様にレポーター位置として機能することができる。Ｇ２１７位においてスピンラベルしたａｐｏＡ−Ｉ（ａｐｏＡ−ＩＳＬ２１７）は、ＷＴ  ａｐｏＡ−Ｉとほぼ同一の構造的性質を有し、ＷＴ  ａｐｏＡ−Ｉと区別できない様式でコレステロールを流出させ、ＨＤＬを形成する。結合を数量化するために、中心ＥＰＲピークの最大振幅を脂質と結合したａｐｏＡ−Ｉと比較して測定する（図１５、矢印）。これは、脂質の会合の程度の信頼できる測定値である。
【０２６３】
（実施例６）
健康者由来のヒト血漿のＥＰＲスペクトルと、リスクがある患者由来のヒト血漿のＥＰＲスペクトルの比較。
ＥＰＲ分光法が、患者のＨＤＬの質を血漿において直接評価するために実行可能な手法であるかどうかを調査するために、患者４人の血漿中のａｐｏＡ−ＩＳＬ２１７のＥＰＲスペクトルを比較した（表２）。２人の個体を、正常な脂質およびＣＡＤリスクプロファイルを有すると特徴付け、他の２人の個体をＣＡＤのリスクが高いと特徴付けた。患者は、結果の解釈を補助するために、ＨＤＬ−ＣおよびａｐｏＡ−Ｉのそれらの濃度に基づいて対応させた患者であった。
【表２】
2014513795.tif 000008
試料はＣＨＯＲＩにある現行の血漿バンクから入手した。全ての機密性およびヒト安全性問題がそれらの採取中観察された。患者を性別、相対的なＨＤＬレベル、および抜き取り／保管方法に基づいて対応させた。血漿をヘパリン添加管中に採取し、分析する前に１回だけ凍結させた。試料の品質管理を厳密に精査して、試料の採取および取扱いにおける差異の結果への寄与が最小限になることを確実にした。
【０２６４】
このアッセイでは、濃度６．３ｍｇ／ｍｌのａｐｏＡ−ＩＳＬ２１７を比率１：２０（ｖ／ｖ）で血漿に添加し、血漿中０．３ｍｇ／ｍｌのａｐｏＡ−ＩＳＬ２１７を得た。試料をすぐにＪＥＯＬ  ＴＥ−１００  ＥＰＲ分光計で検査し、１．５分、４分、６分、８分、および１０分の時点でモニターした。前のＥＰＲに基づく調査により、ａｐｏＡ−Ｉと血漿ＨＤＬの結合の速度が、血漿中にリモデリング酵素が存在することに起因して急速であることが決定された［４１、５２〜５８］。全ての試料について、最大の会合は１０分以内に起こった（４時間後のスペクトルの変化の欠如によって確認された）。非常に健康的な生活様式および脂質プロファイルを有する患者Ｎ１と、どちらも病的に肥満であり、それぞれ糖尿病およびメタボリックシンドロームである患者Ｄ１およびＭ１との間に有意差が観察された。ＡｐｏＡ−ＩＳＬ２１７は、患者Ｎ１の血漿のＨＤＬとは最初の５分以内に急速に結合し、患者Ｄ１およびＭ１では、結合ははるかに遅く、それぞれ１０分後および８分後に最大になった（図８）。最大のＨＤＬ結合の程度も、同様に影響を受け、患者Ｎ１がａｐｏＡ−Ｉ結合について最大の能力を示し、Ｄ１が最低であった。アッセイにおいてａｐｏＡ−ＩＳＬ２１７濃度を上昇させることにより、ａｐｏＡ−ＩＳＬ２１７の飽和濃度が実現されるまで同様の反応の程度がもたらされたので、これは利用可能なＨＤＬの機能ではない。ａｐｏＡ−ＩＳＬ２１７の飽和濃度が全ての個体で同等である（約１．９ｍｇ／ｍｌ）ことにより、観察された反応が異なることは、患者血漿中のＨＤＬが飽和したことに起因するものではないことが示されている。
【０２６５】
患者Ｎ２のデータは、ＣＡＤのリスクが低いが、結合速度および反応の程度は患者Ｄ１とＭ１の中間であると思われることが認められた。この個体の家族歴が利用可能であり、少なくとも１人の親および２人の祖父母でＣＡＤが発生している。この患者は、利用可能な臨床的指標に基づくと、この個体におけるこのアッセイに対して「リスクがある」反応が観察されるとは予測されなかった。しかし、家族歴により、可能性のある遺伝成分が存在する可能性があり、ＣＡＤの任意の臨床徴候が顕在化し得る前に検出可能である可能性があることが示唆されている。対照的に、患者Ｎ１は、心疾患の家族歴を有さない。必ずしも十分に規模の大きい試験が統計的に有意であるとは限らないが、この転帰により、顕性の臨床徴候の不在下でさえもＣＡＤリスクに対するバイオマーカーとなる潜在性が示されている。
【０２６６】
アッセイ結果に対する試料の取扱いおよび採取手順の影響。試料採取の３つの方式：ヘパリン、シトレートおよびＥＤＴＡの影響には、方法間で差異は観察されなかった。凍結融解の取扱いは酵素様のＨＤＬ活性および受容体相互作用に有意に影響を及ぼす可能性があるので、凍結融解サイクルを繰り返すことのアッセイに対する影響を考察した。凍結融解サイクルにより、ａｐｏＡ−Ｉ結合の速度および程度がどちらもおよそ１０％低下した。興味深いことに、３回目の凍結融解後、この影響はおよそ２０％に増大した。ＴＧ濃度が高い血漿試料ほど凍結融解による変化を受けやすく、ＥＰＲによって観察可能な結合が、それぞれ１５％および２５％低下したことが認められた。
【０２６７】
（実施例７）
Ｃ５７Ｂｌ／６マウス由来のＥＰＲスペクトルとＣＨ３マウス由来のＥＰＲスペクトルの比較。
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは遺伝的に正常であるが、心疾患を起こしやすく、一方Ｃ３Ｈマウスは遺伝的に正常であり、心疾患を起こしにくい。ａｐｏＡ−ＩＳＬ２１７の、ＨＤＬのコレステロール逆転送に関する能力の低下を同定する能力を評価するために、これらの２つの系統由来の血漿を分析した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスには通常食を与え、Ｃ３Ｈマウスには高脂肪食を与えた。マウスから血漿試料を取り出し、ａｐｏＡ−ＩＳＬ２１７を最終濃度１．４ｍｇ／ｍｌで血漿に添加し、すぐにＥＰＲスペクトルを収集した。最初に４℃で収集を開始してベースラインをもたらし、次いで温度を３７℃までシフトさせ、スペクトルを３００秒に至るまで連続的に収集した。図１６に試料スペクトルが示されている。結果は図１７にグラフで示されている。Ｃ５７Ｂｌ／６マウス由来の血漿試料では、Ｃ３Ｈマウス由来の血漿試料と比較してスピンラベルしたプローブとの結合の低下が示された。１匹のＣ３Ｈマウスについて極度の外れ値であり、分析に含めなかったことに留意する。この外れ値の理由は不明である。どちらのマウス系統についても反応時間は少なく、これはマウス血漿においてヒトａｐｏＡ−Ｉプローブを使用したことを反映する可能性が最も高いことにも留意する。
【０２６８】
１１１位にスピンラベルを有する第２のプローブを、いくつかの試料と一緒に使用し（図１６、下のパネル）、これにより、脂質と結合した際のａｐｏＡ−Ｉの構造の変化を検出するための１１１位のスピンラベルの有用性が示されている。
【０２６９】
（実施例８）
ａｐｏＡ−ＩとＨＤＬの結合をモニターするためのＥＰＲスペクトルの位置
ａｐｏＡ−ＩとＨＤＬの結合をモニターするためのＥＰＲスペクトルの位置を、等吸収点の磁気強度を同定することによって決定した。ＰＢＳ中１５μｌの量のスピンラベルしたリポタンパク質プローブ（ａｐｏＡ−ＩＳＬ２１７、３ｍｇ／ｍｌ）を、フラットセル試料保持器中のヒト血漿の試料４５μｌに添加した。試料を４℃で維持し、ＥＰＲ信号の１００ガウス掃引を得た（２分超；Ｘ−バンド）。スピンラベルしたリポタンパク質プローブの結合をモニターするための位置を決定するために、等吸収点の０．１５ｍＴｅｓｌａ高磁場側の位置を同定した。等吸収点のおよそ０．１５ｍＴｅｓｌａ（１．５ガウス）高磁場側のピークを連続的に観察し、この位置の反応を時間とともにモニターした。
【０２７０】
（実施例９）
ａｐｏＡ−ＩとＨＤＬの結合
ヒト血漿におけるａｐｏＡ−ＩとＨＤＬの結合を、等吸収点のおよそ０．１５ｍＴｅｓｌａ（１．５ガウス）高磁場側のスペクトルの位置を連続的にモニターすることによって決定した。ＰＢＳ中１５μｌの量のスピンラベルしたリポタンパク質プローブ（ａｐｏＡ−ＩＳＬ２１７、３ｍｇ／ｍｌ）を血漿の試料４５μｌに添加した。試料を４℃で維持し、３７℃までシフトさせた。温度を上昇させながら、等吸収点のおよそ０．１５ｍＴｅｓｌａ高磁場側の位置を１０分にわたって連続的にモニターした。この分析から、ａｐｏＡ−ＩとＨＤＬの結合の多数のパラメータ、すなわち、反応の振幅および結合の初速度の傾きが識別可能であった。振幅が大きく結合の初速度の傾きが大きいほど、より大きな流出能力と関連づけられた。健康な個体由来の血漿の反応が高かった。不健康な個体由来の血漿の反応は低かった。
【０２７１】
（実施例１０）
陽性試料および陰性試料の反応。
対照ヒト血漿試料におけるａｐｏＡ−ＩとＨＤＬの結合の追跡。ＰＢＳ中１５μｌの量のスピンラベルしたリポタンパク質プローブ（ａｐｏＡ−ＩＳＬ２１７、３ｍｇ／ｍｌ）を血漿の試料４５μｌに添加した。試料を４℃で維持し、３７℃までシフトさせた。温度を上昇させながら、等吸収点のおよそ０．１５ｍＴｅｓｌａ高磁場側の位置を４分にわたって連続的にモニターした。細胞に基づくマクロファージ流出測定による実験の前にヒト血漿対照ＡおよびＢのコレステロール流出能を決定した。対照Ａのコレステロール流出能は対照Ｂのコレステロール流出能の５０％であった。同様に、対照Ｂは、対照Ａのおよそ２倍のレベルのプレベータＨＤＬを含有した。
【０２７２】
（実施例１１）
正常な個体、メタボリックシンドロームの個体および糖尿病の個体由来の血漿のコレステロール逆転送能力
糖尿病／メタボリックシンドロームの状態が同定された９個体由来の血漿をＨＤＬ機能アッセイによって検査した。簡単に述べると、血漿を、絶食した、糖尿病状態がよく特徴付けられた個体（女性５個体および男性４個体）のセットから採取した。血漿４５μｌをａｐｏＡ−Ｉプローブ（３ｍｇ／ｍｌ）１５μｌに添加した。ａｐｏＡ−ＩプローブはＧ２１７Ｃ突然変異を担持するａｐｏＡ−Ｉで構成された。この突然変異により、ネイティブな配列にはシステイン残基がないａｐｏＡ−Ｉにシステインを導入した。導入したシステイン（２１７位）のスルフヒドリルをチオスルホネート連結窒素酸化物スピンラベルで誘導体化した。得られたスピンラベルしたタンパク質を３ｍｇ／ｍｌに濃縮した。プローブを血漿に添加した後、ＥＰＲサインスペクトルを８℃および３７℃の両方でモニターした。中心場ピークの振幅を参照試料と比較した％反応として報告した。この場合、参照試料は０．１％ＳＤＳに対するプローブの反応であり、これにより最大の脂質様反応がもたらされた。患者は、年齢を対応させた。内部標準（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）を読み取りに含め（示されていない）、計器の性能に対する対照として使用した。しかし、塩化マンガンなどの内部標準で十分である。
【０２７３】
引用文献
【表３−１】
2014513795.tif 000009
【表３−２】
2014513795.tif 000010
【表３−３】
2014513795.tif 000011
【表３−４】
2014513795.tif 000012
【表３−５】
2014513795.tif 000013
【表３−６】
2014513795.tif 000014
【表３−７】
2014513795.tif 000015
【表３−８】
2014513795.tif 000016
【表３−９】
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【表３−１０】
2014513795.tif 000018
【表３−１１】
2014513795.tif 000019
【表３−１２】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図１】
2014513795.tif 000029
【図２】
2014513795.tif 000030
【図３】
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【図４】
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【図５】
2014513795.tif 000033
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
2014513795.tif 000037
【図８】
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【図１０】
2014513795.tif 000039
【図１１】
2014513795.tif 000040
【図１２】
2014513795.tif 000041
【図１３】
2014513795.tif 000042
【図１４】
2014513795.tif 000043
【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年1月10日(2014.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014513795000001.app
【国際調査報告】
2014513795.tif 000045
2014513795.tif 000046