(57)【要約】  BRCA1及びBRCA2遺伝子中のゲノム再編成を、分子コーミングを用いて高解像度で検出する方法、及び卵巣癌又は乳癌に対する素因を含む、これらの再編成と関連する疾患又は障害に対する素因を決定する方法。この方法のためのプローブを作製するのに有用なプライマー及び該方法を実施するためのキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
各々のポリヌクレオチドがBRCA1及び/又はBRCA2遺伝子を含むゲノムの一部に結合する少なくとも2つのポリヌクレオチドを含む組成物であって、該少なくとも2つのポリヌクレオチドの各々が、少なくとも200個の連続するヌクレオチドを含み、かつAlu反復ヌクレオチド配列の10％未満を含む、前記組成物。
【請求項２】
前記少なくとも2つのポリヌクレオチドがBRCA1を含むゲノムの一部に結合する、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
前記少なくとも2つのポリヌクレオチドがBRCA2を含むゲノムの一部に結合する、請求項1又は請求項2記載の組成物。
【請求項４】
前記少なくとも2つのポリヌクレオチドの各々が、少なくとも500〜最大6000個の連続するヌクレオチドを含み、かつAlu反復ヌクレオチド配列の10％未満を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも2つのポリヌクレオチドが、検出可能な標識又はマーカーで各々タグ化されている、請求項1〜4のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６】
異なる検出可能な標識又はマーカーで各々タグ化されている少なくとも2つのポリヌクレオチドを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
異なる検出可能な標識又はマーカーで各々タグ化されている少なくとも3つのポリヌクレオチドを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
異なる検出可能な標識又はマーカーで各々タグ化されている少なくとも4つのポリヌクレオチドを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
同じ又は異なる視覚的に検出可能なマーカーで各々独立にタグ化されている3〜10のポリヌクレオチドを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
同じ又は異なる視覚的に検出可能なマーカーで各々独立にタグ化されている11〜20のポリヌクレオチドを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
少なくとも2つの異なる検出可能な標識又はマーカーのうちの1つで各々タグ化された少なくとも2つのポリヌクレオチドを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２】
BRCA1又はBRCA2遺伝子座、BRCA1又はBRCA遺伝子、BRCA1又はBRCAフランキング配列又はイントロン中の重複、欠失、逆位、挿入、転座、又は大きな再編成を検出する方法であって:
(i)DNAサンプルを単離すること、
(ii)該サンプルを分子コーミングすること、
(iii)分子コーミングされたDNAを、プローブとしての請求項5記載の組成物と、ハイブリダイゼーションが起こるのに十分な時間及び条件下で接触させること、
(iv)請求項5記載の組成物又は請求項6〜11のいずれか一項記載の組成物の該DNAサンプルに対するハイブリダイゼーションを可視化すること、並びに
(v)該可視化を、再編成も突然変異も含まない正常な又は標準的なBRCA1又はBRCA2遺伝子座、BRCA1又はBRCA遺伝子、BRCA1又はBRCAフランキング配列又はイントロンの対照サンプルから得られる可視化と比較すること
を含む、前記方法。
【請求項１３】
前記プローブが、1.5kbを超える再編成又は突然変異を検出するように選択される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
卵巣癌又は乳癌に対する素因を、コード又は非コードBRCA1又はBRCA2遺伝子座配列中で検出される遺伝子再編成又は突然変異の種類に基づいて予測又は評価することをさらに含む、請求項10又は13記載の方法。
【請求項１５】
対象の治療的処置に対する感受性を、コード又は非コードBRCA1又はBRCA2遺伝子座配列中で検出される遺伝子再編成又は突然変異の種類に基づいて決定することをさらに含む、請求項10又は13記載の方法。
【請求項１６】
BRCA1又はBRCA2遺伝子座、BRCA1又はBRCA2遺伝子、BRCA1又はBRCA2フランキング配列又はイントロン中の重複、欠失、逆位、挿入、転座、又は大きな再編成を検出するキットであって、
a)各々のポリヌクレオチドがBRCA1もしくはBRCA2遺伝子を含むゲノムの一部に結合する少なくとも2つのポリヌクレオチドであって、該少なくとも2つのポリヌクレオチドの各々が、少なくとも200個の連続するヌクレオチドを含み、かつ反復ヌクレオチド配列を含まず、ここで、該少なくとも2つのポリヌクレオチドが、視覚的に検出可能なマーカーでタグ化されており、かつBRCA1もしくはBRCA2遺伝子座、BRCA1もしくはBRCA2遺伝子、BRCA1もしくはBRCA2フランキング配列もしくはイントロンの特定のセグメント中の重複、欠失、逆位、挿入、転座、もしくは大きな再編成を同定するように選択されている、少なくとも2つのポリヌクレオチド、並びに任意に
b)BRCA1もしくはBRCA2遺伝子座、BRCA1もしくはBRCA遺伝子、BRCA1もしくはBRCAフランキング配列もしくはイントロン中の重複も、欠失も、逆位も、挿入も、転座も、大きな再編成も有さない対象についてのハイブリダイゼーションプロファイルを記述する標準;
c)分子コーミングを実施するのに必要な1以上のエレメント、
d)使用説明書、及び/又は
e)包装材料
を含む、前記キット。
【請求項１７】
前記少なくとも2つのポリヌクレオチドが、卵巣癌又は乳癌と関連するBRCA1又はBRCA2遺伝子座、BRCA1又はBRCA2遺伝子、BRCA1又はBRCA2フランキング配列又はイントロンの特定のセグメント中の重複、欠失、逆位、挿入、転座、又は大きな再編成を同定するように選択される、請求項16記載のキット。
【請求項１８】
前記少なくとも2つのポリヌクレオチドが、特定の治療剤、薬物、又は処置に感受性のある卵巣癌又は乳癌の種類と関連するBRCA1又はBRCA2遺伝子座、BRCA1又はBRCA2遺伝子、BRCA1又はBRCA2フランキング配列又はイントロンの特定のセグメント中の重複、欠失、逆位、挿入、転座、又は大きな再編成を同定するように選択される、請求項16記載のキット。
【請求項１９】
ゲノムDNAを含むサンプル中で、BRCA1遺伝子の5'末端にまたがるゲノム配列からなる多数のタンデムコピーのリピート単位のリピート配列をインビトロで検出する方法であって、該リピート配列が、少なくとも3コピーの該リピート単位からなり、かつ該方法が:
-該プライマーから始まるPCRによる重合を可能にするために、第一のプライマーと標的ゲノム配列の5'末端とのハイブリダイゼーション及び第二のプライマーと該標的配列の3'末端とのハイブリダイゼーションを可能にする条件を提供すること;
-該プライマーとハイブリダイズした配列を増幅させること;
-それにより得られたアンプリコンを、特にプローブで検出し、かつそのサイズ又はその内容、特に、そのヌクレオチド配列を決定すること
を含む、前記方法。
【請求項２０】
前記リピート単位が、BRCA1遺伝子のエキソン1a、1b、及び2を包含し、かつ任意にNBR2遺伝子の5'末端の配列を包含する、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
下流プライマー及び上流プライマーが:
下流プライマーについて:
-好ましくは、エキソン2の3’末端から2〜4kb離れた、より好ましくは、エキソン2の3’末端から2.5〜3kb離れた、BRCA1のエキソン2と3の間の領域中のポリヌクレオチド配列、又は
-エキソン2の3’末端から2kb以内、好ましくは、エキソン2の3’末端から1.5kb以内、及びより好ましくは1kb以内にある、BRCA1のエキソン2と3の間の領域中のポリヌクレオチド配列
上流プライマーについて:
-BRCA1のエキソン1aから2kb以内、好ましくは、BRCA1のエキソン1aの1.5kb以内、及びより好ましくは1kb以内にある、BRCA1遺伝子とNBR2遺伝子の間の領域中のポリヌクレオチド配列、又は
-BRCA1のエキソン1a内、もしくはエキソン1b内、もしくはエキソン1aと1bの間の領域中のポリヌクレオチド配列、又は
-エキソン1bと2の間の領域中、もしくはエキソン2中、もしくはエキソン2と3の間の領域中のポリヌクレオチド配列
の群からそれぞれ選択される、請求項19又は20記載の方法。
【請求項２２】
前記プライマーが:BRCA1-A3A-F(配列番号25)、BRCA1-A3A-R(配列番号26)、BRCA1-Synt1-F(配列番号125)、及びBRCA1-Synt1-R(配列番号126)、又はそれらの逆相補配列の群から選択される、請求項19〜21のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の背景)
(発明の分野)
本発明は、BRCA1及びBRCA2遺伝子及び遺伝子座のゲノム再編成を、分子コーミングを用いて高解像度で検出する方法に関するものであり、また、卵巣癌又は乳癌に対する素因を含む、これらの再編成と関連する疾患又は障害に対する素因を決定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
(関連技術の説明)
乳癌は、女性の最も一般的な悪性腫瘍であり、女性人口の約10％に影響を及ぼしている。発生率は毎年増加しつつあり、約140万人の女性が毎年世界中で乳癌であると診断され、約460,000人がこの疾患が原因で死亡すると推定される。遺伝性乳癌及び卵巣癌感受性遺伝子BRCA1(MIM#113705)及びBRCA2(MIM# 600185)の生殖系列突然変異は浸透率が高い(Kingらの文献、2003)、(Nathansonらの文献、2001)。スクリーニングは、家族歴陽性の個体の遺伝子カウンセリング及び突然変異保有者における早期診断又は予防に重要である。BRCA1又はBRCA2突然変異が同定された場合、予測的検査が18歳を超える家族全員に提案される。女性が検査で陰性反応を示した場合、その人のリスクは再び、一般集団のリスクになる。女性が検査で陽性反応を示した場合、個別の監視プロトコルが提案され:これには、若年齢からの乳房撮影スクリーニング、及び場合により、予防的手術が含まれる。抗エストロゲン剤による乳癌の化学的予防も、現在、臨床試験で検討されており、今後、処方される可能性がある。
【０００３】
大半の有害な突然変異は、未成熟な終止コドンを生じる小さなフレームシフト(挿入もしくは欠失)又は点突然変異か、保存されたドメイン中のミスセンス突然変異か、或いは異常な転写物プロセッシングをもたらすスプライス部位突然変異かのいずれかからなる(Szaboらの文献、2000)。しかしながら、突然変異には、DNAシークエンシングと組み合わせた従来のPCRベースの突然変異スクリーニングによる検出から漏れる大きなゲノム領域の欠失及び重複を含む、より複雑な再編成も含まれる(Mazoyerの文献、2005)。
【０００４】
これらの複雑な再編成を検出することができる技術としては、ロングレンジPCR又はタンパク質トランケーションテスト(PTT)と組み合わせたサザンブロット解析、短い蛍光断片の定量的マルチプレックスPCR(QMPSF)(Hofmannらの文献、2002)、リアルタイムPCR、蛍光DNAマイクロアレイアッセイ、マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅(MLPA)(Casilliらの文献、2002)、(Hofmannらの文献、2002)、及び高解像度オリゴヌクレオチドアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション(aCGH)(Rouleauらの文献、2007)、(Staafらの文献、2008)が挙げられる。qPCR-HRM及びEMMAなどの、事前スクリーニングと定量的情報の両方を提供する新しい手法が最近になって開発され、大量並列シークエンシングと組み合わせたゲノム捕捉が、乳癌及び卵巣癌に関与する21の遺伝子に影響を及ぼす小さな突然変異と大きな再編成の同時検出のために提案されている(Walshらの文献、2010)。
【０００５】
分子コーミングは、特殊処理したガラス表面に均一かつ不可逆的に付着している単一DNA分子の直接可視化のためのFISHベースの強力な技術である(Herrick及びBensimonの文献、2009);(Schurra及びBensimonの文献、2009)。この技術は、ゲノムにわたるDNAの構造及び機能解析をかなり改善し、ゲノム全体を、1回の解析で、高解像度で(kb範囲で)可視化することができる。分子コーミングは、モザイク現象、ヘテロ接合性の消失(LOH)、コピー数多型(copy number variations)(CNV)、並びに複雑な再編成、例えば、転座及び逆位などの、ゲノム不均衡の検出に特に適しており(Caburetらの文献、2005)、したがって、乳癌遺伝子中で潜在的に検出可能な突然変異の範囲を拡大する。分子コーミングは、第一世代の「カラーバーコーディング」スクリーニング法を用いて、BRCA1((Gadらの文献、2001)、(Gadらの文献、2002a)、(Gadらの文献、2003)、及びBRCA2(Gadらの文献、2002b)中の大きな再編成の検出にうまく利用されている。しかしながら、これらの技術は解像度を欠いており、BRCA1及びBRCA2中の並びにそれらの周辺の大きな再編成を正確に検出することができない。
【０００６】
本明細書に開示されているような従来技術と対照的に、本発明者らは、ゲノムDNAサンプルの高解像度の目視検査、突然変異したエキソンの正確なマッピング、ロバスト統計による突然変異サイズの正確な測定、BRCA1及びBRCA2遺伝子構造又は再編成の同時検出、遺伝子の逆位又は転座の検出、並びにBRCA1及びBRCA2遺伝子座のAlu配列などの反復DNA配列と関連する問題の実質的な排除を提供する新規の遺伝子モールスコード分子コーミング法を提供する。
【発明の概要】
【０００７】
(発明の概要)
BRCA1及びBRCA2遺伝子は、乳癌及び卵巣癌感受性に高い浸透率で関与している。BRCA1及びBRCA2点突然変異について陰性である家族歴陽性の乳癌患者の約2％〜4％は、これら2つの遺伝子のうちの1つ、特に、BRCA1に大きな遺伝子変化(欠失又は重複)を保有すると予想することができる。しかしながら、大きな再編成は、直接シークエンシングで見落とされる。分子コーミングは、ゲノム全体を、1回の解析で、高解像度で調べることができる、単一DNA分子の直接可視化のためのFISHベースの強力な技術である。分子コーミングに基づく新規の予測的遺伝子検査が本明細書に開示されている。その目的のために、コード領域及び非コード領域をカバーし、かつ両方の遺伝子に隣接する大きなゲノム部分を含む、特異的なBRCA1及びBRCA2「ゲノムモールスコード」(GMC)を設計した。GMCは、ゲノムDNAの特定の部分に沿って分布した一連のカラーシグナルであり、このシグナルは、本発明のプローブとのプローブハイブリダイゼーションによって生じる。GMCの背後にある概念は、WIPO特許出願WO/2008/028931号(これは引用により組み込まれている)において以前に定義されており、検査すべき巨大分子上の関心対象の少なくとも1つのドメインの存在の検出方法に関連している。
【０００８】
測定戦略がGMCシグナルについて開示され、6人の家族歴陽性の乳癌患者と10人の対照患者とを検査することにより検証されている。1つ又はいくつかのエキソンの欠失及び重複に対応し、かつ3kb〜40kbの範囲のサイズを有する、大きな再編成を両方の遺伝子(BRCA1及びBRCA2)上で検出した。重要なことに、開発されたGMCにより、両方の遺伝子上のいくつかのタンデムリピート重複の場所を明確に突き止めること、及びBRCA1のAluに富んだ問題のある5'領域中の大きな再編成を正確にマッピングすることが可能になった。この開発された新しい分子コーミング遺伝子検査は、BRCA1及びBRCA2中の大きな再編成のスクリーニングのための有益なツールであり、臨床の場で、点突然変異の検出を可能にするアッセイと任意に組み合わせることができる。
【０００９】
第二世代の高解像度BRCA1及びBRCA2ゲノムモールスコード(GMC)の設計に基づく、従来のカラーバーコーディング法と比べた実質的な技術的改善が本明細書に開示されている。重要なことに、反復配列をDNAプローブから除去し、それにより、バックグラウンドノイズを低下させ、GMC内のカラーシグナル長のロバストな測定を可能にした。両方のGMCを、10人の健常対照由来のサンプルで統計的に検証し、その後、乳癌家族歴陽性の6人の乳癌患者で検査した。CGHで得られる解像度(1〜3kb)と同様の解像度で、大きな再編成を検出した。突然変異の検出は、反復エレメントが豊富なゲノム領域中に局在するタンデムリピート重複又は突然変異などの、問題のある突然変異さえも検出する、この技術のロバスト性を証明するものである。開発された分子コーミングプラットフォームは、BRCA1及びBRCA2中の大きな再編成の同時検出を可能にし、乳癌及び卵巣癌のための新規の遺伝子検査及び検査キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
(図面の簡単な説明)
特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも1つの図面を含む。
【図１】図1A及び1B:ヒトBRCA1及びBRCA2ゲノム領域のドットプロットアラインメント。GRCh37ゲノムアセンブリ(hg19とも呼ばれる、2009年4月公開)に基づく、及びJDotterソフトウェア(URL:http://_athena.bioc.uvic.ca/tools/JDotter)を用いた、BRCA1をコードするBAC RP11-831F13(ch17:41172482-41379594)から得られた207-kbのゲノム領域(1A)及びBRCA2をコードするBAC RP11-486017(ch13: 32858070-33030569)から得られた172-kbのゲノム領域(1B)の自己アラインメントを示すドットプロットマトリックス。主対角線は、配列とそれ自体とのアラインメントを表し、一方、主対角線から外れる線は、配列内の類似又は反復パターンを表す。濃い領域が多数の反復配列を含むのに対し、薄い領域は全く含まない。遺伝子は、5'→3'方向の矢印として表されている。反復配列をコードし、DNAプローブには含まれない、ゲノム領域のサイズ及びBAC座標は、表中、左に示されている。下のパネルは、バイオインフォマティクス解析から得られた、妨害する可能性のある反復配列を含まないDNAプローブの名前及びサイズ(kbで表す)(BRCA1について35個及びBRCA2について27個)を示す。
【図２】図2A、2B、2C、及び2D:BRCA1及びBRCA2ゲノム領域の高解像度物理マッピング用に設計されたコンピュータ生成ゲノムモールスコード。プローブの色は、ここでは、グレースケールのバリエーションとして表されており:青のプローブは、黒の四角形として示され、緑のプローブは、白の四角形として示され、赤のプローブは、グレーの四角形として示されている。(2A)完全なBRCA1 GMCは、200kbのゲノム領域をカバーし、異なる色(緑、赤、又は青)の18のシグナル(S1B1〜S18B)から構成される。各シグナルは、1つ(例えば、S2B1)〜3つの小さい水平バー(例えば、S15B1)から構成され、各バーは、単一のDNAプローブに対応する。BRCA1遺伝子(81.2kb)をコードする領域は、7つの「モチーフ」(g1b1〜g7b1)から構成される。各モチーフは、1つ〜3つの小さい水平バー及び黒の「ギャップ」(シグナルなし)から構成される。(2B)BRCA1遺伝子特異的シグナル及びエキソンの相対位置の拡大表示。(2C)完全なBRCA2 GMCは、172kbのゲノム領域をカバーし、異なる色(緑、赤、又は青)の14のシグナル(S1B2〜S14B2)から構成される。各シグナルは、1つ(例えば、S14B2)〜5つの小さい水平バー(例えば、S1B2)から構成される。BRCA2遺伝子(84.2kb)をコードする領域は、5つのモチーフ24(g1b2〜g5b2)から構成される。各モチーフは、2つ〜4つの小さい水平バー及び黒のギャップから構成される。(2D)BRCA2遺伝子特異的シグナル及びエキソンの相対位置の拡大表示。欠失又は挿入は、存在する場合、これらのモチーフによってカバーされる領域中に現われる。
【図３】図3A及び3B:対照患者におけるBRCA1及びBRCA2ゲノムモールスコードシグナルの検証。もとの顕微鏡画像は、3チャンネルの画像からなり、ここで、各チャンネルは、所与のフルオロフォアからのシグナルであり-これらは、顕微鏡検査の手順において個別に獲得される。これらのチャンネルは、ここでは、異なる色合いとしてグレースケールで表されており:青のプローブは黒で示され、緑のプローブは白で示され、赤のプローブはグレーで示されており、一方、バックグラウンド(シグナルの欠如)は、薄いグレーである。略図において、図2と同じ慣例が使用されている。縦横比は維持されておらず、シグナルは、プローブの視認性を改善するために、「拡大」されている(すなわち、DNA繊維の方向に対して垂直に引き伸ばされている)。1人の対照患者(大きな再編成の欠如)における典型的なBRCA1(3A)及びBRCA2(3B)ゲノムモールスコードシグナル並びに測定されたモチーフ長(kb)が報告されている。顕微鏡による可視化の後に得られたBRCA1及びBRCA2シグナルは、表の上部に示されており、これには、関心対象の遺伝子に関連するモチーフの位置が含まれる。通常、20〜40枚の画像(画像の数)を選択し、モチーフをGVLabソフトウェアで測定した。各モチーフについて、以下の値を決定した:理論的に計算される長さ(計算値(kb))、平均測定長(μ(kb))、標準偏差(SD(kb))、変動係数(CV(％))、μと計算値の差(デルタ)、及び伸張係数(SF＝(計算値/μ)×2)。突然変異がない場合、SF値は、1.8〜2.2の間に含まれ、デルタ値は、−1.9kb〜1.9kbの間に含まれる(詳細については、実施例1の材料及び方法を参照されたい)。
【図４】図4A、4B、及び4C:乳癌患者で検出される既知のBRCA1の大きな再編成。  図2及び3と同様に、略図及び顕微鏡画像は、以下の対応を伴ってグレーの色合いとして表されている:(薄いグレーのバックグラウンド上で)青は黒として示され、緑は白として示され、赤は濃いグレーとして示されており、顕微鏡画像の縦横比は、明瞭にするために修正されている場合がある。乳癌患者から回収されたEBV不死化Bリンパ球から単離されたDNAを、分子コーミングにより解析して、以前にaCGHにより特徴付けられた既知の大きな再編成を確認した(表3参照)。7つのうち3つの大きな再編成が図に示されている:(4A)青のシグナルS7B1のタンデムリピート重複として見える、Dup ex 13(症例1)。g4B1モチーフ(16.5kb)を、野生型及び突然変異アレルを含む40枚の画像の混合群でまず測定し、以下の値を得た:μ(BRCA1wt＋BRCA1mtシグナル)＝19kb±3.5kb、デルタ＝2.5kb(デルタ≧2kbであるので、重複が確認される)。その後、画像を2つのグループに分けた:21枚の画像をBRCA1wtに分類し、19枚の画像をBRCA1mtに分類した。その後、サイズを、2つのアレルのモチーフ平均サイズの差として計算した:μ(BRCA1wt)＝16.1±1.6kb、μ(BRCA1mt)＝22.2±2.0kb、突然変異サイズ＝μ(BRCA1mt)−μ(BRCA1wt)＝6.1±1.6kb。下のパネルは、MLPA断片の表示(左)及び正規化されたMLPAの結果(右)を示し、矢印は、重複していると解釈されるエキソンを示す。(4B)シグナルS7B1とS8B1の間の大きなゲノム部分を含む、青のシグナルS7B1の欠失として見える、Del ex 8〜13(症例6)。g4B1(16.5kb)及びg5b1(19.7kb)モチーフを23枚の画像の混合群でまず測定し、以下の値を得た。g4b1について:μ(BRCA1wt＋BRCA1mt)＝17.5±4.0kb、デルタ＝−2.2kb(デルタ≦−2kb);その後、13枚の画像をBRCA1wtに分類し、10枚の画像をBRCA1mtに分類した:μ(BRCA1wt)＝20.8±1.6kb、μ(BRCA1mt)＝13.3±1.1kb、μ(BRCA1mt)−μ(BRCA1wt)＝−7.5±1.6kb。g5b1について:μ(BRCA1wt＋BRCA1mt)＝12.8±5.5kb、デルタ＝−3.7kb(デルタ≦−2kb);その後、13枚の画像をBRCA1wtに分類し、10枚の画像をBRCA1mtに分類した:μ(BRCA1wt)＝18.3±1.3kb、μ(BRCA1mt)＝5.8±0.5kb、μ(BRCA1mt)−μ(BRCA1wt)＝−12.5±1.0kb。全体の突然変異サイズ＝突然変異サイズg4B1＋突然変異サイズg5b1＝−20±2.8kb。(4C)緑のシグナルS10B1並びにS11B1及びS12B1を含むBRCA1の上流の5'領域の大きなゲノム部分の欠失として見える、Del ex 2(症例2)。BRCA1遺伝子中の欠失の存在を確認するために、g7B1(17.7kb)モチーフを20枚の画像の混合群でまず測定し、以下の値を得た:μ(BRCA1wt＋BRCA1mt)＝12.3±2.9kb、デルタ＝−5.4kb(デルタ≦−2kbであるので、欠失が確認される)。BRCA1遺伝子内の突然変異サイズを測定するために、その後、11枚の画像をBRCA1wtに分類し、9枚の画像をBRCA1mtに分類して、以下の値を得た:μ(BRCA1wt)＝18.1±0.7kb、μ(BRCA1mt)＝8.1±1.6kb、突然変異サイズ＝μ(BRCA1mt)−μ(BRCA1wt)＝−10±1.5kb。BRCA1の上流の欠失したゲノム領域を含めて、全体の突然変異サイズを決定するために、本発明者らは、シグナルS8B1とS14B1の間のゲノム領域(89.9kb)を測定しなければならなかった。S8B1〜S14B1領域を19枚の画像でまず測定し、以下の値を得た:μ(BRCA1wt＋BRCA1mt)＝62.3±18.4kb、デルタ＝−27.6kb。その後、11枚の画像をBRCA1wtに分類し、8枚の画像をBRCA1mtに分類し、以下の値を得た:μ(BRCA1wt)＝92.2±3.2kb、μ(BRCA1mt)＝51.4±2.2kb、突然変異サイズ＝μ(BRCA1mt)−μ(BRCA1wt)＝−40.8±3.5kb。顕微鏡による可視化の後に得られた、野生型(＝BRCA1wt)と突然変異アレル(＝BRCA1mt)の両方に由来するBRCA1シグナルが、上のパネルに示されている。欠失した大きな再編成の位置、性質(欠失又は重複)、及びサイズ(kbで表す)は、オレンジで示されている。BRCA1遺伝子特異的シグナル及び突然変異したエキソンの相対位置の拡大表示は、下のパネルに示されている。mt、突然変異アレル;wt、野生型アレル。
【図５】図5。BRCA1に使用したGMC。BRCA1遺伝子領域を解析するための高解像度ゲノムモールスコードの別の例がここに示されている。図2と同様に、略図は、以下の対応を伴って表されている:青のプローブは黒として示され、緑のプローブは白として示され、赤のプローブは濃いグレーとして示されている。
【図６】図6:BRCA1のエキソン18〜20中の重複  図2に記載されているGMCを、略図に示すように修飾されたプローブ標識とともに、このサンプル上でハイブリダイズさせた。図2及び3と同様に、略図及び顕微鏡画像は、以下の対応を伴ってグレーの色合いで表されている:(薄いグレーのバックグラウンド上で)青は黒として示され、緑は白として示され、赤は濃いグレーとして示されており、顕微鏡画像の縦横比は、明瞭にするために修正されている場合がある。目視検査により、赤のシグナルS5B1のタンデム重複があるように見える。測定後、突然変異は、エキソン18〜20をコードするゲノムの部分に限定される、6.7±1.2kbのサイズを有すると推定された。推定された突然変異サイズは、文献(Staafの文献、2008)に報告されている8.7kbと完全に一致している。測定及び統計解析に関する詳細は、実施例1に見出すことができる。
【図７】図7 9:BRCA1(A)及びBRCA2(B)GMCから除外されたAlu配列の例。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
(発明の詳細な説明)
(定義)
物理マッピングは:分子生物学的手法を用いた、ゲノムDNA上の特定のエレメント、突然変異、又はマーカーの位置を規定する遺伝子地図の作成である。物理マッピングは、解析されるゲノムDNAの事前シークエンシングを必要としない。
【００１２】
FISH:蛍光インサイチュハイブリダイゼーション。
分子コーミング:特殊処理したガラス表面に均一かつ不可逆的に付着している単一DNA分子の直接可視化のためのFISHベースの技術。
【００１３】
予測的遺伝子検査:出生後、多くの場合、中年期以降に現われる障害と関連する遺伝子突然変異を検出するために使用される、ヒト生体サンプル(例えば:血液)から単離されたDNA分子の直接解析を含むスクリーニング法。これらの検査は、遺伝子障害を有する家族の一員がいるが、検査の時点で自分自身に障害の特徴がない人々にとって役立ち得る。予測的検査は、人が、遺伝的基礎がある障害、例えば、特定のタイプの癌を発症する可能性を増大させる突然変異を同定することができる。
【００１４】
ポリヌクレオチド:この用語は、天然のDNA及びRNAポリヌクレオチド分子(配列とも表記される)、並びに例えば、その安定性を増大させる修飾された構造を有するDNA又はRNA類似体を包含する。分子コーミングに使用されるゲノムDNAは、通常、生体サンプルから単離されるような、修飾されていない形態にある。プライマーとして使用される、ポリヌクレオチド、通常、DNAは、修飾されていなくても、修飾されていてもよいが、DNAを増幅させる際に使用するのに好適な形態にある。同様に、プローブとして使用されるポリヌクレオチドは、相補的標的配列に結合することができる未修飾又は修飾ポリヌクレオチドであることができる。この用語は、他のポリヌクレオチドの断片、例えば、5、10、15、20、30、40、50、75、100、200、又はそれよりも多くの連続ヌクレオチドを有する断片であるポリヌクレオチドを包含する。
【００１５】
BRCA1遺伝子座:この遺伝子座は、81kbのサイズ(リファレンスゲノムビルドGRCh37/hg19)を有する、塩基対41,196,311〜塩基対41,277,499の、17番染色体の長(q)腕のバンド21に位置するヒトBRCA1遺伝子(遺伝子ID:672、参照配列NM_007294)のコード部分、並びにそのイントロン及びフランキング配列を包含する。フランキング配列に続いて、BRCA1 GMCには:BRCA1遺伝子の上流の102kb(41,277,500〜41,379,500)及びBRCA1遺伝子の下流の24kb(41,196,310〜41,172,310)が含まれている。したがって、BRCA1 GMCは、207kbのゲノム領域をカバーしている。
【００１６】
BRCA2遺伝子座:この遺伝子座は、84kbのサイズ(リファレンスゲノムビルドGRCh37/hg19)を有する、塩基対32,889,617〜塩基対32,973,809の、13番染色体の長(q)腕の位置12.3(13q12.3)に位置するヒトBRCA2遺伝子(遺伝子ID:675、参照配列NM_000059.3)のコード部分、並びにそのイントロン及びフランキング配列を包含する。フランキング配列に続いて、BRCA2 GMCには:BRCA2遺伝子(32,857,616〜32,889,616)の上流の32kb及びBRCA2遺伝子(32,973,810〜33,029,810)の下流の56kbが含まれている。したがって、BRCA2 GMCは、172kbのゲノム領域をカバーしている。
【００１７】
生殖系列再編成:体細胞で起こる体細胞再編成と区別されるべき、有性生殖する生物体の配偶子を生じる任意の生体細胞で起こる遺伝子再編成を伴う遺伝子突然変異。
【００１８】
点突然変異:遺伝物質であるDNA又はRNAの1塩基ヌクレオチドと別のヌクレオチドとの置換を生じさせる遺伝子突然変異。多くの場合、点突然変異という用語は、1塩基対の挿入又は欠失も含む。
【００１９】
フレームシフト突然変異:3で均等に割り切れないいくつかのヌクレオチドの、DNA配列からのインデル(挿入又は欠失)によって生じる遺伝子突然変異。コドンによる遺伝子発現のトリプレット性が原因で、挿入又は欠失によってリーディングフレーム(コドン集団)が変化し、オリジナルとは完全に異なる翻訳が生じることがある。
【００２０】
タンデムリピート重複:2以上の隣接するコピーを生じさせて、タンデムリピートを生じさせるように重複しているDNAのストレッチを特徴とする突然変異。
【００２１】
タンデムリピート配列:遺伝子増幅をもたらす配列の2以上の隣接するコピーからなるDNAのストレッチ。リピート配列中のこの配列の単一のコピーをリピート単位と呼ぶ。自然に生じる遺伝子増幅は、通常、完全に保存的であるわけではない、すなわち、特に、リピート単位の両端は、再編成され、突然変異し、及び/又は切断され得る。本発明において、90％を上回る相同性を有する2以上の隣接配列は、等価なリピート単位からなるリピート配列とみなされる。別途指定されない限り、タンデムリピート配列内のリピート単位の向きは想定されない。
【００２２】
複雑な再編成:単純な欠失又は重複と区別することができる任意の遺伝子再編成。例としては、転座又は逆位がある。
【００２３】
プローブ:この用語は、相補的なポリヌクレオチド配列(標的)にハイブリダイズし、したがって、相補的な配列を同定するのに役立つ本発明のポリヌクレオチドに対して、その通常の意味で使用される。通常、プローブは、ひとたびその相補体に結合すれば、それが検出されるのを可能にするマーカー、例えば、化学的又は放射性マーカーでタグ化される。本明細書に記載のプローブは、通常、目で見えるマーカー、例えば、特定の色を有する蛍光色素、例えば、青、緑、又は赤の色素でタグ化される。本発明によるプローブは、BRCA1又はBRCA2、そのエキソン又はフランキング配列の特定の部分又はセグメントを認識するように選択される。BRCA1について、プローブは、通常、長さが200bp〜5,000bpの範囲である。BRCA2について、プローブは、通常、長さが200bp〜6,000bpの範囲である。本発明のプローブの名前及びサイズは、図2に記載されている。本発明による代表的なプローブ、例えば、BRCA1-1A(3,458bp)又はBRCA2-1(2,450bp)は、表1及び2に記載されている。本発明の特定の実施態様において、プローブは、「反復ヌクレオチド配列を含まない」と言われる。そのようなプローブは、本明細書で定義されているような反復配列を欠いている関心対象のゲノム領域中に位置し得る。
【００２４】
検出可能な標識又はマーカー:ポリヌクレオチドに付着させることができる任意の分子であって、その位置が、例えば、蛍光顕微鏡法、酵素検出、放射能などの手段によって決定されることができるか、又は2010年2月18日に公開されたUS出願番号US2010/0041036A1号に記載されている分子。
【００２５】
プライマー:この用語は、ポリヌクレオチド合成の出発点としての役割を果たす核酸分子(配列とも表記される)としてのその従来の意味を有する。特に、プライマーは、20〜40ヌクレオチド長を有することができ、また、標的と塩基対形成せず、その3'末端に十分なヌクレオチド、特に、少なくとも20個のヌクレオチドを提供し、該標的とハイブリダイズするヌクレオチドを含むことができる。本明細書に記載されている本発明のプライマーを用いて、BRCA1又はBRCA2のプローブを生成させ、例えば、1対のプライマーを用いて、鋳型DNAとしての細菌人工染色体からPCRアンプリコンを生成させる。本明細書で使用されるプライマーの配列は、表8の配列番号1〜配列番号130として参照されている。場合により(詳細は表1)、プライマーは、クローニングを容易にするために、これらに対する追加の配列をその5'末端に含んでいた。これらの追加の配列は、フォワードプライマーについては、配列番号134(ポリAとAscIのための制限部位とを含む)、及びリバースプライマーについては、配列番号135(ポリAとPacIのための制限部位とを含む)である。
【００２６】
表1及び2及び8には、代表的なプライマー配列及び対応するプローブ座標が記載されている。
【００２７】
ゲノムモールスコード:GMCは、特定のゲノム領域を物理的にマッピングするために設計された、一連の「ドット」(特定のサイズ及び色を有するDNAプローブ)及び「ダッシュ」(DNAプローブ間に位置する特定のサイズを有する無色のスペース)である。特定の遺伝子又は遺伝子座のGMCは、他の遺伝子又は遺伝子座のGMCによって得られるシグナルと区別することができる独特のカラー「シグナチャー」によって特徴付けられる。高解像度GMC用のDNAプローブの設計は、特殊なバイオインフォマティクス解析及び関心対象のゲノム領域のプラスミドベクターへの物理的クローニングを必要とする。低解像度CBCは、バイオインフォマティクス解析もクローニング手順もなしで確立されている。
【００２８】
反復ヌクレオチド配列:BRCA1及びBRCA2遺伝子座は、異なる種類の反復配列:SINE、LINE、LTR、及びAluを含む。ゲノム配列中に大量に存在するが、プローブ中には存在しない、すなわち、本発明のBRCA1及びBRCA2 GMCから除去された反復配列は、主に、約300bpの長さを有するAlu配列である(さらなる詳細については、図S1、S1、S2、及びS3を参照されたい)。これは、主に、参照ゲノム中に存在するパーセンテージと比べたDNAプローブ内の残存Alu配列のパーセンテージが、10％未満、好ましくは2％未満であることを意味する。したがって、ポリヌクレオチドは、上で引用した反復配列の種類から選択される少なくとも1種類の反復配列(例えば、Alu、SINE、LINE、又はLTR)が検討されるプローブ中に含まれないとき、「反復ヌクレオチド配列を含まない」と言われ、これは、該プローブが、参照ゲノム中に存在するパーセンテージと比べて10％未満、好ましくは2％未満を含むことを意味する。BRCA1及び2遺伝子中に見られるAluリピートの例は、図7A及び7Bに示されており、一方、表3及び4には、BRCA1のゲノム領域をカバーするBACクローンRP11-831F13(図7A)又はBRCA2のゲノム領域をカバーするBACクローンRP11-486017(図7B)に含まれる、RepeatMaskerによって同定されたリピートが記載されている。どちらの場合も、Aluリピートは、本発明者らのプローブがハイブリダイズする領域及びこのプローブ設計から除外された領域で別々にカウントされる。
【００２９】
本明細書で使用される「遺伝子内の大きな再編成」という用語は、遺伝子配列中に観察することができる欠失及び重複事象を指し、該配列は、限定された見方では、イントロン及びエキソンを;並びに広い見方では、イントロン、エキソン、該遺伝子の5'領域、及び該遺伝子の3'領域を含む。遺伝子内の大きな再編成は、ゲノム物質の任意の獲得又は損失にも及び、結果として、関心対象の遺伝子の発現を伴うこともある。
【００３０】
本明細書で使用される「遺伝子座」という用語は、遺伝子又は他の関心対象の配列の染色体上での特定の位置を指す。BRCA1及びBRCA2について、この用語は、BRCA1及びBRCA2遺伝子を指し、イントロン及びフランキング配列は、BRCA1/BRCA2＋イントロン及びフランキング配列を指す。
【００３１】
本明細書で使用される「核酸」という用語は、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、又は2つの天然の核酸の場合と同様に配列特異的な様式で天然の核酸とハイブリダイズすることができる、例えば、ワトソンクリック型塩基対形成相互作用に関与することができる、PNAなどの、合成で生成された化合物から構成されるポリマー又は分子を意味する。核酸は、一本鎖であっても、二本鎖であっても、部分二重鎖であってもよい。
【００３２】
本明細書で使用される「リボ核酸」及び「RNA」という用語は、リボヌクレオチドから構成されるポリマー又は分子を意味する。
【００３３】
本明細書で使用される「デオキシリボ核酸」及び「DNA」という用語は、デオキシリボヌクレオチドから構成されるポリマー又は分子を意味する。
【００３４】
本明細書で使用される「サンプル」という用語は、1以上の関心対象の成分を含む、通常、流体の形態にあるが、必ずしもそうである必要はない、材料又は材料の混合物を指す。分子コーミングのために、サンプルは、診断用途向けの生体源由来の、通常、患者由来のゲノムDNAを含む。本発明は、サンプルに対するインビトロでの実施に好適な手段、特に、ポリヌクレオチド、及び方法に関する。
【００３５】
「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」という用語は、既知のプリン及びピリミジン塩基だけでなく、修飾されている他の複素環塩基も含む部分を含むことが意図される。そのような修飾としては、メチル化されたプリン又はピリミジン、アシル化されたプリン又はピリミジン、アルキル化されたリボース又は他の複素環が挙げられる。さらに、「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」という用語は、従来のリボース及びデオキシリボース糖だけでなく、他の糖も含む部分を含む。修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドは、例えば、水酸基の1つ又は複数が、ハロゲン原子もしくは脂肪族基と置換されているか、又はエーテル、アミンなどとして官能基化されている、糖部分上の修飾も含む。
【００３６】
本明細書で使用される「ストリンジェントな条件」という用語は、所望のレベルの特異性をアッセイで提供するための相補性が十分な核酸、例えば、表面結合した及び溶液相の核酸の結合対の生成に適合している一方、所望の特異性を提供するための相補性が不十分な結合メンバー間での結合対の形成にはあまり適合していない条件を指す。ストリンジェントなアッセイ条件は、ハイブリダイゼーション条件と洗浄条件の両方の合計又は組合せ(全体)である。
【００３７】
核酸ハイブリダイゼーションに関する(例えば、分子コーミングに、又はGMCに有用なプローブの同定に必要とされる)「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存的であり、異なる実験パラメータの下では異なる。本発明の範囲内の核酸を同定するために使用することができるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、例えば、50％ホルムアミド、5×SSC、及び1％SDSを含むバッファー中、42℃でのハイブリダイゼーション、又は5×SSC及び1％SDSを含むバッファー中、65℃でのハイブリダイゼーション(どちらも0.2×SSC及び0.1％SDSによる65℃での洗浄を含む)を挙げることができる。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、40％ホルムアミド、1M NaCl、及び1％SDSのバッファー中、37℃でのハイブリダイゼーション、及び1×SSC中、45℃での洗浄を挙げることもできる。或いは、フィルターに結合したDNAとの、0.5M NaHP04、7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1mM EDTA中、65℃でのハイブリダイゼーション、及び0.1×SSC/0.1％SDS中、68℃での洗浄を利用することができる。またさらなるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、60℃以上及び3×SSC(450mM塩化ナトリウム/45mMクエン酸ナトリウム)でのハイブリダイゼーション、又は30％ホルムアミド、1M NaCl、0.5％サルコシンナトリウム、50mM MES、pH 6.5を含む溶液中、42℃でのインキュベーションが挙げられる。当業者は、代替的ではあるが、同等のハイブリダイゼーション及び洗浄条件を利用して、同様のストリンジェンシーの条件を提供することができることを容易に認識するであろう。
【００３８】
所与のゲノム遺伝子座に位置するプローブ又はプライマーとは、ヒトゲノムのこの遺伝子座の配列にハイブリダイズするプローブ又はプライマーを意味する。通常、プローブは二本鎖であり、したがって、所与の遺伝子座の配列と同一である鎖及び所与の遺伝子座の配列と逆相補的であるもう1つの鎖を含む。プライマーは一本鎖であり、別途文脈により指定又は指示されない限り、その配列は、所与の遺伝子座の配列と同一である。指定される場合、配列は、所与の遺伝子座の配列と逆相補的であってもよい。ある実施態様において、核酸が、表面結合した核酸に特異的にハイブリダイズするかどうかを決定する条件を示す洗浄条件のストリンジェンシー。核酸を同定するために使用される洗浄条件としては、例えば、約0.02Mの塩濃度、pH 7、及び少なくとも約50℃もしくは約55℃〜約60℃の温度;又は約0.15M NaClの塩濃度、72℃で約15分間;又は約0.2×SSCの塩濃度、少なくとも約50℃もしくは約55℃〜約60℃の温度で約15〜約20分間;又はハイブリダイゼーション複合体を、0.1％SDSを含む約2×SSCの塩濃度の溶液で、室温で15分間、2回洗浄し、その後、0.1％SDSを含む0.1×SSCで、68℃で15分間2回洗浄すること;又は同等の条件を挙げることができる。洗浄のためのストリンジェントな条件は、例えば、0.2×SSC/0.1％SDS、42℃であることもできる。
【００３９】
ストリンジェントなアッセイ条件の具体的な例は、合計の一価陽イオン濃度が1.5Mである塩ベースのハイブリダイゼーションバッファー中、65℃での回転ハイブリダイゼーションと、それに続く、0.5×SSC及び0.1×SSCによる室温での洗浄である。
【００４０】
ストリンジェントなアッセイ条件は、少なくとも上記の代表的な条件と同じくらいストリンジェントであるハイブリダイゼーション条件であり、その場合、所与の組の条件は、所望の特異性を提供するのに十分な相補性を欠くさらなる結合複合体が、上記の特定の条件と比べて該所与の組の条件で実質的に生じない場合、少なくともストリンジェントであるとみなされ、その場合、「実質的に超えない」とは、約5倍未満、通常、3倍未満であることを意味する。その他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は当業者に公知であり、適宜、利用することができる。
【００４１】
「感度」は、サンプル中の関心対象の核酸を検出するアッセイの能力を説明するものである。例えば、サンプル中の低濃度の関心対象の核酸を検出することができる場合、アッセイは高い感度を有する。逆に、サンプル中の高濃度の関心対象の核酸しか検出しない場合、所与のアッセイは低い感度を有する。所与のアッセイの感度は、利用される試薬の特異性(例えば、標識の種類、結合分子の種類など)、利用されるアッセイ条件、利用される検出プロトコルなどを含む、いくつかのパラメータによって決まる。分子コーミング及びGMCハイブリダイゼーションとの関連において、所与のアッセイの感度は、表面に固定した核酸の性質、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件の性質、標識系の性質、検出系の性質などのうちの1つ又は複数によって決まり得る。
【００４２】
(高解像度BRCA1及びBRCA2ゲノムモールスコードの設計)
分子コーミングは、BRCA1及びBRCA2遺伝子中の大きな再編成を検出するために既に使用されているが、当初使用されたハイブリダイゼーションDNAプローブは、低解像度「カラーバーコーディング」スクリーニング法の一部であり、BRCA1及びBRCA2遺伝子座を一部しかカバーしないコスミド、PAC、及びロングレンジPCR生成物から構成されていた。重要なことに、該DNAプローブは、これら2つの遺伝子座に特に大量に存在する反復配列もコードしていた(Gadらの文献、2001)、(Gadらの文献、2002b)。結果として、該プローブの検出は、個々のカラーシグナルの重畳(例えば、緑のシグナルと赤のシグナルの重畳から生じる黄色のスポット)及び強いバックグラウンドノイズをもたらすことが多く、画質を低下させ、シグナル長を測定するためのロバストな戦略の開発を妨げた。そのような低解像度スクリーニング法では、タンデムリピート重複などの複雑な突然変異の明確な可視化が可能にならなかった(Schurra及びBensimonの文献、2009)、(Herrick及びBensimonの文献、2009)。
【００４３】
本発明者らは、より多くのBRCA1及びBRCA2ゲノム領域をカバーすることにより及び妨害反復配列をDNAプローブから除去することにより設計された高解像度ゲノムモールスコード(GMC)が、従来のカラーバーコーディング法に付随する問題を解決することを見出した。
【００４４】
反復配列を可視化するために、ゲノムリファレンスコンソーシアム(Genome Reference Consortium)のGRCh37ゲノムアセンブリ(hg19とも呼ばれる、2009年4月公開)に基づいて、DNAプローブクローニングに使用されるBACクローンのドットプロットアラインメントをまず実施した。Repeat Masker解析(www._repeatmasker.org)に基づくと、BRCA1をコードするBAC及びBRCA2をコードするBAC中のAlu反復DNAのパーセンテージは、それぞれ、35％及び17％であった(データは示さない)。これにより、BRCA1については、反復配列中で濃いドット-プロットマトリックス(ヒトゲノム中のわずか0.25 Alu/kbの平均値と比べて1kbのDNA当たり1.6個のAlu配列)、及びBRCA2については、より薄いドット-プロットマトリックス(0.64 Alu/DNAのkb)が得られた(図1A及び1B)。
【００４５】
顕著により少ない反復配列を有するBRCA1遺伝子座の35のゲノム領域及びBRCA2遺伝子座の27の領域を同定し、それらを用いて、分子コーミングと関連する可視化プロセスと適合するDNAハイブリダイゼーションプローブを設計し、クローニングした。DNAハイブリダイゼーションプローブの名前、サイズ、及び色、並びにこれらのプローブによってカバーされるエキソンを図1に示し、表1(BRCA1)及び2(BRCA2)に記載する。同じ色の隣接するDNAプローブがシグナルを形成する。したがって、ゲノムモールスコードは、ゲノムDNAの特定の部分に沿って分布した一連のカラーシグナルから構成される。色は、BRCA1とBRCA2とで異なる一連の独特の反復しないシグナルを生成させるように選択された。BRCA1/BRCA2 GMC DNAプローブから除外された、反復配列をコードするゲノム領域のサイズ及びBAC座標を表3及び4に示す。257個のAlu配列をBRCA1 GMCから除外し、85個のAlu配列をBRCA2 GMCから除外した。両方のGMCから除去されたAlu配列の例を図7に示す。
【００４６】
ゲノムモールスコードの認識及び測定を容易にするために、遺伝子上に位置するシグナルを、「モチーフ」と呼ばれる特定のパターンにグループ化した。設計されたBRCA1及びBRCA2ゲノムモールスコードの電子的再構築を図2に示す。この設計では、BRCA1ゲノムモールスコードは、上流遺伝子NBR1、NBR2、LOC100133166、及びTMEM106A、並びに偽遺伝子ψBRCA1を含む200kbの領域をカバーする。完全なBRCA1ゲノムモールスコードは、18のシグナル(S1B1〜S18B)から構成され、8つのBRCA1特異的シグナルは、7つのモチーフ(g1b1〜g7b1)にグループ化される(図2A及びB)。BRCA2ゲノムモールスコードは、14のシグナル(S1B2〜S14B2)から構成される172kbのゲノム領域をカバーし、7つのBRCA2特異的シグナルは、5つのモチーフ(g1b2〜g5b2)にグループ化される(図2C及び2D)。欠失又は挿入は、存在する場合、これらのモチーフによってカバーされるゲノム領域中で検出される。
【００４７】
(対照患者におけるBRCA1及びBRCA2ゲノムモールスコードシグナルの検証)
新たに設計されたゲノムモールスコードを、10人の無作為に選ばれた対照患者から単離されたゲノムDNAでまず検証した。1人の対照ドナーについての典型的な可視化されたシグナル及び測定されたモチーフ長を、BRCA1を上に及びBRCA2を下にして、図3に報告する。各ゲノムモールスコードについて、通常、様々なモチーフの長さを測定することにより、20〜30枚の画像を解析した(図3の画像の数を参照)。重要なことに、全てのモチーフについて、測定値は、計算値と常に類似していた(図3のμと計算値を比較されたい)。BRCA1及びBRCA2のシグナル測定のロバスト性は、10人の対照患者全員の測定されたモチーフ長の平均を計算することにより、及び平均測定値を計算値と比較することにより決定された(表S1参照)。BRCA1について、本発明者らは、−0.2kb〜＋0.8kbの範囲のデルタ値(μと計算値の差)を得たのに対し、BRCA2デルタ値は、−0.3kb〜＋0.4kbの範囲であり、これにより、開発された測定法の正確さが強調され、分子コーミングの解像度が約±1kbであることが確認された(Michaletらの文献、1997)。分子コーミングは、1μmが2kbに相当するという物理距離と輪郭長の相関関係で、DNA分子を均一に伸張させる(Michaletらの文献、1997)。結果として、大きな再編成がない場合、導出される伸張係数(SF)は、2kb/μm(±0.2)に近い値を有する。これは、解析された対照ドナー全員で確認され、SF値は、1.8〜2.2kb/μmの範囲であった(図3のSF参照)。したがって、BRCA1とBRCA2の両方に大きな再編成が存在する場合、SF値は、≧2.3kb/μm(欠失の場合)又は≦1.7kb/μm(重複の場合)であると予想され、対応するデルタ値は、≧2kb(重複の場合)又は≦−2kb(欠失の場合)であると予想される。重要なことに、大きな再編成の存在は、対応するゲノムモールスコードの目視検査によって常に検証される。
【００４８】
(乳癌患者における既知のBRCA1の大きな再編成の検出)
次に、分子コーミングを、重度の乳癌家族歴を有し、かつBRCA1又はBRCA2のどちらかに大きな再編成を有することが知られている患者由来の6つのサンプルに適用した(事前スクリーニングをMLPA又はQMPSFにより実施した)。重要なことに、分子コーミング解析は盲検であり、これは、患者の各々について、突然変異の内容が検査前には不明であったことを意味する。なぜなら、突然変異の内容は、全サンプルの検査が終了した後に初めて操作者に明らかにされたからである。6つの異なる大きな再編成が同定された(表5参照)。重要なことに、6つの既知の突然変異は全て、aCGH及び切断点シークエンシングによって最近特徴付けられたが(Rouleauの文献、2007)、これらは、分子コーミングによって正確に同定され、特徴付けられた。3つの最も重要な既知のBRCA1の大きな再編成の完全な特徴付けを図4に報告し、本明細書において、以下に記載する。
【００４９】
(エキソン13(BRCA1)の重複)
分子コーミングによる目視検査により、この突然変異は、青のシグナルS7B1の部分タンデム重複のように見える(図4A、上のパネル)。測定後、該突然変異は、エキソン13をコードするDNAプローブBRCA1-8の一部に限定される6.1kbのサイズを有すると推定された。推定された突然変異サイズは、文献(Pugetの文献、1999)に報告されている6.1kbと完全に一致し、乳癌インフォメーションコア(Breast Cancer Information Core)のデータベースによれば、この突然変異は、BRCA1の中で最も頻度の高い10個の突然変異に属している(Szaboの文献、2000)。重複は、MLPAなどの定量的な方法で検出することが難しく、偽陽性シグナルを生じることが多い(Cavalieriの文献、2007、Staafの文献、2008)。したがって、特徴付けられた患者をMLPAでも解析し、エキソン13の重複を確認した。より重要なことに、本発明者らは、エキソン1A＋1Bの重複も検出したが(図4A、下のパネル)、この突然変異は、分子コーミングでは検出することができなかった(エキソン13の重複は、存在するならば、2つの異なるS10B1シグナルを生じたであろう)。したがって、本発明者らは、MLPAで検出されるエキソン1A＋1B突然変異が偽陽性シグナルであると考えている。偽陽性シグナルのリスクは、分子コーミングではより限定されている。
【００５０】
(エキソン8〜エキソン13の欠失(BRCA1))
目視検査により、突然変異は、シグナルS7B1とS8B1の間の大きなゲノム部分を含む、青のシグナルS7B1の欠失のように見えるものとして現われた(図4B)。測定後、該突然変異は、エキソン8〜エキソン13をコードするBRCA1遺伝子の部分に26.7kbのサイズを有すると推定された。文献に報告されているサイズは23.8kbであり、これは、フランス人集団における再発性突然変異である(Mazoyerの文献、2005、Rouleauの文献、2007)。
【００５１】
(エキソン2の5'領域の欠失(BRCA1))
目視検査により、突然変異は、緑のシグナルS10B1の欠失、並びにS11B1及びS12B1を含むBRCA1の上流の5'領域の大きなゲノム部分のように見えた(図4C)。測定後、この突然変異は、エキソン2をコードするBRCA1遺伝子の部分、NBR2遺伝子全体(シグナルS11B1)、NBR2と偽遺伝子ψBRCA1の間のゲノム領域(シグナルS12B1)、及びψBRCA1の一部(シグナルS13B1)を包含する37.1kbのサイズを有すると推定された。重要なことに、この種の再編成の報告されたサイズは、当初は13.8〜36.9kbの範囲(Mazoyerの文献、2005)、ごく最近は40.4〜58.1kb(Rouleauの文献、2007)で大きなばらつきがある。6つの異なるエキソン1〜2欠失は、いくつかの異なる集団で16回報告されている(Sluiterの文献、2010)。本明細書で報告された再編成は、同一のサイズ(36 934bp)で3回記載されている。組換えのホットスポットは、ψBRCA1の存在によって説明される。分子コーミングは、この極めて相同な領域中の事象でさえも特徴付けることができることが分かった。
【００５２】
本明細書で報告された結果は、BRCA1及びBRCA2遺伝子中の大きな再編成の検出のための分子コーミングに基づく新規の遺伝子検査の開発を開示及び例示している。大きな再編成は、BRCA1遺伝子中の有害な生殖系列突然変異の10〜15％及びBRCA2遺伝子中の1〜7％に相当する(Mazoyerの文献、2005)。特異的な高解像度GMCを設計し、一連の16の生体サンプルで検査し;関連する測定戦略のロバスト性を10の対照サンプルで統計的に検証し、6つの異なる大きな再編成を、重度の乳癌家族歴を有する患者由来のサンプルで検出し、特徴付けた。新たに設計された、反復配列を欠くGMCのロバスト性は、本発明者らの分子コーミング法によって、同じサンプルに対する高解像度の拡大aCGH(11k)で得られた結果が、1〜2kbの範囲の解像度で確認された(Rouleauらの文献、2007)という事実によって支持される。
【００５３】
タンデムリピート重複は、検出が最も難しい大きな再編成である。aCGH及びMLPAなどの他の技術とは異なり、ハイブリダイズしたDNAプローブを高解像度で可視化する分子コーミングの能力によって、本明細書中、症例1(BRCA1 Dup Ex 13)に示すように、タンデムリピート重複の正確なマッピング及び特徴付けが可能になる。aCGHを用いて、重複の存在及びサイズを決定することができるが、タンデムリピート重複の正確な位置及び向きは決定することができない。MLPAなどのPCRベースの技術では、突然変異を保有するサンプル中の重複したエキソンの数と対照サンプル中のエキソンの数の比が、突然変異したサンプルにおける3コピーの特定のエキソンの存在及び野生型サンプルにおける2コピーの存在を示す、少なくとも1.5であるとき、重複が存在すると考えられる。1.5という比は、MLPAでは明確に示すことが難しい。MLPAは、症例1(BRCA1 Dup Ex 13)で観察されているように、偽陽性シグナルを生じることが多い。MLPAの限界は、いくつかの最近の研究で強調されている(Cavalieriらの文献、2008)、(Staafらの文献、2008)。MLPAは、コード配列に限定され、21のプローブという限られたカバレッジのために、偽陰性スコアを生じることもある(Cavalieriらの文献、2008)。さらに、MLPAでは、通常非常に大きなイントロン領域又は影響されるフランキング領域中の欠失又は重複切断点の位置に関する限られた情報しか提供されず、したがって、再編成の配列特徴付けのための骨の折れるマッピングを余儀なくされる。Staafらは、最近、MLPAを、CGHなどの他の突然変異特徴付け手段によって補完される必要があるスクリーニングツールとみなすべきであると提唱した(Staafらの文献、2008)。本発明者らは、分子コーミングをそのようなMLPA又はaCGHの代替技術として提案しているが、それは、分子コーミングによって、重複が明確に同定及び可視化されるからである。
【００５４】
本明細書に開示される分子コーミングの別の利点は、BRCA1遺伝子の5'領域、並びにNBR2遺伝子、ψBRCA1偽遺伝子、及びNBR1遺伝子を含むBRCA1の上流のゲノム領域を含む、非コード領域をカバーするその能力であった。最近の研究により、重複した領域及び高密度のAluリピートが存在するため、この再編成が生じやすいゲノム領域で利用できるPCR又はaCGHプローブを設計することが極めて難しいことが示されている(Rouleauらの文献、2007)、(Staafらの文献、2008)。ゲノム再編成は、通常、Aluリピートを含む短鎖散在反復配列(short interspersed nuclear elements)(SINE)、長鎖短鎖散在反復配列(long interspersed nuclear elements)(LINE)、又は単純なリピート配列間の不均等な相同組換えによって生じる。
【００５５】
本明細書中、症例3及び2(BRCA1 Del Ex 2)に示すように、分子コーミングは、この難しい領域内での正確な物理マッピングを可能にする。これらの症例において、本発明者らは、それぞれ、38.5kb及び37.1kbの突然変異サイズを測定した。症例3及び2は、同じ家族に属するので、aCGHで確認したとき、検出された突然変異は、どちらの症例でも同じであった(Rouleauらの文献、2007)。これら2つの症例間での1.4kbという測定差は、分子コーミングアッセイの1〜2kbの解像力範囲(definition range)の範囲内にあるので、許容される。該突然変異は、Pugetらにより初めて記載されたものであり、Pugetらは、第一世代の分子コーミング「カラーバーコーディング」スクリーニング法で突然変異サイズ(37kb)を決定した(Pugetらの文献、2002)。aCGHで推定されたサイズは、このゲノム領域中で利用できるオリゴヌクレオチド配列の密度が低く、また、配列相同性が原因で22someオリゴヌクレオチドの感度が低いために、40.4〜58.1kbの範囲であった(Rouleauらの文献、2007)。したがって、分子コーミングは、多数の反復エレメントを含む、シークエンシングが難しいゲノム領域の解析に使用することができる。本明細書において、本発明者らは、BRCA1中の高濃度のAlu配列が分子コーミングの障害にならないことを示している。
【００５６】
(乳癌患者におけるこれまでに特徴付けられていないBRCA1の大きな再編成の検出)
さらなるサンプルを検査し、本発明者らは、他の技術では正確に記述することができなかった再編成を分子コーミングにより特徴付けた。1つのそのような例を以下で詳述する。
【００５７】
(BRCA1のエキソン1a、1b、及び2、並びにNBR2の一部の三重重複)
本発明者らは、サンプル#7(Institut Claudius Regaud, Toulouse, Franceにより提供されたもの)を、図5に記載のプローブのセットを用いて、分子コーミングにより解析した。目視検査により、S9B1プローブの末端からS11B1プローブの反対の末端にまで及ぶモチーフg7b1の長さが異なるBRCA1遺伝子の2つのアレルを同定した。該突然変異は、プローブ色スワッピング実験で確認したとき、SYNT1プローブ(配列番号133)及びS10B1プローブの部分を含む三重重複であるように見える。5〜10kbの間に含まれるサイズを有するDNAセグメントのこの三重重複は、BRCA1遺伝子のエキソン1a、1b、及び2、並びにおそらくは、NBR2遺伝子の5'先端の部分を含む。
【００５８】
そのような三重重複は、このゲノム領域中ではまだ報告されていない。これは、突然変異を検出する関連技術がこれまでなかったことによる可能性がある。したがって、本発明者らは、この突然変異に特異的な検査を設計した。これらの検査を用いて、この三重重複についてスクリーニングし、又はこの三重重複を、この領域での再編成が疑われるサンプル中で確認することができる。PCR、定量的PCR(qPCR)、MLPA、aCGH、シークエンシング…などの、いくつかの種類の可能な検査がある。
【００５９】
所与の配列のいくつかのコピーを提供する定量技術(qPCR、MLPA、aCGH、…)の結果は、該配列のさらなるコピーのタンデム性の直接的評価を提供するものではない。本明細書で報告される三重重複は、BRCA1のエキソン1a、1b、及び/もしくは2内の配列、並びに/又はこれらのエキソン間の配列が多数の(2倍体ゲノム当たり2よりも多くの)コピーで存在する場合に疑うことができる。一般的に言って、これらの結果が、重複した配列について決定された閾値を上回る(合計3コピーの重複した配列を有する)場合、サンプルは、(2つの別々のアレル中の配列の重複ではなく)単一のアレル上の三重重複を有することが疑われるべきである。三重重複及びそのタンデム性の確認は、PCR検査によるか、又はこの節及び実施例の節に記載されている分子コーミング検査によるかのいずれかで得ることができる。
【００６０】
これはより直接的な方法であるので、本発明者らは、本明細書中、実施例の節において、いくつかのPCR設計を詳述する。当業者は、一般に知られている共通の分子生物学的方法により、例えば、記載された配列範囲内でプライマー位置を修飾することにより、及び/又は実験条件(PCRのアニーリング温度、伸長時間、…)を修飾することにより、これらの検査を適応させることができる。また、これらの検査を、他の突然変異も探索される「マルチプレックス」検査に含めることもできる。例えば、三重重複を検出するために設計された、以下に記載されている1つ又はいくつかのプライマー対を、異なるアンプリコンを標的とする1つ又はいくつかの他のプライマー対と同時に使用することができる。これらの適応の他に、記載されている分子検査について、いくつかの一般的な変種が存在する。とはいえ、これらの変種は、記載されている検査と機能的に同一のままであり、本発明者らの設計のこれらの変種への適応は、当業者によって容易に実現可能である。例えば、シークエンシングを標的化リシークエンシングに置き換えることができ、その場合、関心対象の領域におけるカバレッジを増大させるために、関心対象の領域が、他のゲノム領域について、シークエンシング工程前に単離される。別の例として、増幅後のDNAの量を一般的なアガロース電気泳動によって評価する半定量PCRがQMPSFに取って代わることができる。
【００６１】
これらの結果は、開発された分子コーミングプラットフォームが、特に、ハイリスク乳癌家系におけるタンデムリピート重複、CNV、並びに転座及び逆位などのBRCA1及びBRCA2の他の複雑な再編成の遺伝子スクリーニングのための有益なツールであることを示している。
【００６２】
開発された分子診断ツールの際立った用途は、予測的遺伝子検査としてものである。しかしながら、本明細書に開示される方法及びツールは、例えば、PARP阻害剤の開発に関連するBRCA突然変異細胞のスクリーニングのための併用診断検査として又は該併用診断検査において適用することができる。そのような遺伝子検査は、臨床血液サンプルだけでなく、循環細胞及び不均一な細胞集団、例えば、腫瘍組織にも適用することができる。
【実施例】
【００６３】
(実施例1)
(材料及び方法)
(事前患者スクリーニング)
ゲノムモールスコードをBRCA1又はBRCA2で有害な突然変異が検出されない患者(対照患者)由来の10個のサンプルで検証した。遺伝子検査を、乳癌家族歴陽性で、かつBRCA1又はBRCA2のどちらかに影響を及ぼす大きな再編成を有することが知られている患者由来の6つのサンプルで検証した。全ヒトゲノムDNAをEBV不死化リンパ芽球様細胞株から得た。大きな再編成の事前スクリーニングは、Casilliら及びTournierらによって記載されている条件(Casilliらの文献、2002)でのQMPSFアッセイ(短い蛍光断片の定量的マルチプレックスPCR)で、又はSALSA MLPAキットP002(MRC Holland, Amsterdam, The Netherlands)をBRCA1に及びP045(MRC-Holland)をBRCA2に用いるMLPA(マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅)によって実施した。16人の患者全員が、BRCA1及びBRCA2解析に関する自筆の同意書を提出した。
【００６４】
(分子コーミング)
(サンプル調製)
全ヒトゲノムDNAをEBV不死化リンパ芽球様細胞株から得た。45μLの106個の細胞のPBS懸濁液を、事前に50℃で平衡化した1×PBS中で調製した等容量の1.2％Nusieve GTGアガロース(Lonza, Basel, Switzerland)と混合した。プラグを4℃で30分間固化させておき、その後、細胞膜を可溶化し、タンパク質を、250μLの0.5M EDTA pH 8.0、1％サルコシル(Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA)、及び2mg/mLプロテイナーゼK(Eurobio, Les Ulis, France)中、50℃での終夜インキュベーションにより消化し、プラグを、10mM Tris、1mM EDTA pH 8.0中、室温で3回洗浄した。その後、プラグを、0.5M 7EDTA pH 8.0中、4℃で保存するか、又はすぐに使用した。保存したプラグは、使用前に、10mM Tris、1mM EDTA pH 8.0中で30分間、3回洗浄した。
【００６５】
(プローブ調製)
BRCA1及びBRCA2プローブは全て、PCRアンプリコンをインサートとして用いて、TOPOクローニングにより、pCR2.1-Topo又はpCR-XL-Topo(Invitrogen)プラスミドにクローニングした。アンプリコンは、細菌人工染色体(BAC)を鋳型DNAとして用いて得られた。以下のBAC: BRCA1用の207-kbのBACRP11-831F13(ch17: 41172482-41379594, InVitrogen, USA);及びBRCA2用の172-kbのBAC RP11-486O17(ch13: 32858070-33030569, InVitrogen, USA)を使用した。プライマー配列及びプローブ座標については、表1及び2を参照されたい。プライマー配列は、配列番号1〜配列番号130として参照されている。場合により(表1に詳述したように)、クローニングを容易にするために、追加の人工配列をプライマーの5'末端に付加した。これらの人工配列は、フォワードプライマー用の配列番号134(フォワードプライマープレフィックス)及びフォワードプライマー用の配列番号135(リバースプライマープレフィックス)であり、両方とも、ポリA並びにそれぞれ、AscI及びPacIのための制限部位を含む。
【００６６】
配列番号131(BRCA1-1A)、配列番号132(BRCA1-1B)、及び配列番号133(BRCA1-SYNT1)は、プローブ配列の例である。
【００６７】
プラスミド全体をランダムプライミングによるプローブ標識のための鋳型として使用した。簡潔に述べると、ビオチン(Biota)標識のために、200ngの鋳型を、終夜標識反応で、製造業者の指示に従って、DNA Bioprimeキット(Invitrogen)で標識した。Alexa-488(A488)又はジゴキシゲニン(Dig)標識のために、同じキット及びプロトコルを使用したが、関連する標識dNTP、すなわち、Dig-11-dUTP(Roche Diagnostics, Meylan, France)又はA488-7-OBEA dCTP(Invitrogen)及びその非標識同等品をどちらも100μMで、かつ他の全てのdNTPを200μMで含むようにdNTP混合物を修飾した。標識プローブを-20℃で保存した。各カバースリップについて、5μLの各標識プローブ(標識反応産物の1/10)を10μgのヒトCot-1及び10μgのニシン精子DNA(両方ともInvitrogen製)と混合し、エタノール中で沈殿させた。その後、ペレットを、22μLの50％ホルムアミド、30％Blocking Aid(Invitrogen)、1×SSC、2.5％サルコシル、0.25％SDS、及び5mM NaClに再懸濁させた。
【００６８】
(ゲノムDNAコーミング及びプローブハイブリダイゼーション)
ゲノムDNAを、3μM Yoyo-1(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を含む40mM Tris、2mM EDTA中、暗所、室温での1時間のインキュベーションにより染色した。その後、プラグを1mLの0.5M MES pH 5.5に移し、68℃で20分間インキュベートして、アガロースを溶解させ、その後、1.5UのβアガロースI(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)とともに、42℃で一晩インキュベートした。該溶液を、1mlの0.5M MES pH 5.5を既に含むコーミング容器に移し、DNAコーミングを、専用カバースリップ(Combicoverslip)(両方ともGenomic Vision, Paris, France製)上で、分子コーミングシステムを用いて実施した。
【００６９】
その後、DNAがコーミングされたコーミカバースリップ(Combicoverslip)を60℃で4時間焼く。該カバースリップを-20℃で保存するか、又はすぐにハイブリダイゼーションに使用した。コーミングの質(DNA分子の直線性及び密度)を、FITCフィルターセット及び40倍空気対物レンズを備えた落射蛍光顕微鏡下で推定した。新たにコーミングされたカバースリップを、1μLのYoyo-1溶液を含む1mlのProLong-gold溶液(両方ともInvitrogen製)のうちの20μLにマウントする。ハイブリダイゼーションの前に、カバースリップを、70％、90％、及び100％エタノール浴中での3分間の連続インキュベーションにより脱水し、その後、室温で10分間風乾させた。プローブミックス(20μL;プローブ調製を参照)をカバースリップ上で行き渡らせ、その後、90℃で5分間変性させておき、ハイブリダイザー(Dako)中、37℃で一晩ハイブリダイズさせておいた。カバースリップを、50％ホルムアミド、1×SSC中で、5分間3回、その後、2×SSC中で、3×3分間洗浄した。
【００７０】
ランダムプライミング反応で利用された修飾ヌクレオチド(上記参照)に応じて、連続2層又は3層のフルオロフォア又はストレプトアビジンコンジュゲート抗体で検出を実施した。ビオチン標識プローブの検出のために、使用された抗体は、1番目及び3番目の層については、ストレプトアビジン-A594(InVitrogen, Molecular Probes)、2番目の層についてはビオチン化ヤギ抗ストレプトアビジン(Vector Laboratories)であり;A488標識プローブの検出のために、使用された抗体は、1番目については、ウサギ抗A488(InVitrogen, Molecular Probes)、2番目の層については、ヤギ抗ウサギA488(InVitrogen, Molecular Probes)であり;ジゴキシゲニン標識プローブの検出のために、使用された抗体は、1番目の層については、マウス抗Dig(Jackson Immunoresearch)、2番目の層については、ラット抗マウスAMCA(Jackson Immunoresearch)、及び3番目の層については、ヤギ抗マウスA350(InVitrogen, Molecular Probes)であった。
【００７１】
20分間のインキュベーション工程を、各層について、湿潤チャンバー中、37℃で実施し、層と層の間を、2×SSC、0.1％Tween中、室温で、連続3回3分間洗浄した。PBS中でのさらに3回の3分間の洗浄、並びに70％、90％、及び100％エタノール中での連続3分間の洗浄による脱水を実施した後、カバースリップを標本化した。
【００７２】
(画像の獲得)
画像の獲得は、カスタマイズされた自動化蛍光顕微鏡(Image Xpress Micro, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)を40倍の倍率で用いて実施し、画像解析及びシグナル測定は、ソフトウェアImageJ(http://_rsbweb.nih.gov/ij)及びJMeasure(Genomic Vision, Paris, France)を用いて実施した。BRCA1及びBRCA2プローブに対応するハイブリダイゼーションシグナルは、プローブの連続によって作られる特定のパターンに基づいて操作者によって選択された。同じDNA繊維に属する全てのモチーフシグナルについて、操作者は、セグメントの末端を設定し、その内容及び長さ(kb)を1:1スケールの画像上で決定した。その後、データをスプレッドシートとして出力した。最終的な解析では、無傷のモチーフシグナルのみを検討し、繊維の切断がBRCA1又はBRCA2モチーフ内で生じなかったことを確認した。
【００７３】
(統計解析)
分子コーミングは、1μmが2kbに相当するという物理距離と輪郭長の相関関係で、DNA分子を均一に伸張させる(Michaletらの文献、1997)。結果として、大きな再編成がない場合、導出される伸張係数(SF)は、2kb/μm(±0.2)に近い値を有する。
【００７４】
7つ全てのBRCA1モチーフ(g1b1〜g7b1)及び5つ全てのBRCA2モチーフ(g1b2〜g5b2)を20個全ての生体サンプルで測定した。10人の健常対照で測定された全てのモチーフの平均値サイズは、関連する統計解析を含め、表S1に報告されている。6人の乳癌患者で測定された全てのモチーフのサイズは、関連する統計解析を含め、表S2に報告されている。各モチーフについて、以下の値を決定した:測定された画像の数(n)、理論的に計算される長さ(計算値(kb))、平均測定長(μ(kb))、標準偏差(SD(kb))、変動係数(CV(％))、μと計算値の差(デルタ)、及び伸張係数(SF＝(計算値/μ)×2)(Michaletらの文献、1997)。突然変異がない場合、デルタ値は、-1.9kb〜1.9kbの間に含まれ、SF値は、1.8〜2.2の間に含まれる。BRCA1又はBRCA2上の大きな再編成の存在を、対応するGMCの目視検査によりまず同定した。数多くのデータから、本発明者らは、BRCA1とBRCA2の両方に大きな再編成が存在する場合、デルタ≧2kb(重複の場合)又はデルタ≦−2kb(欠失の場合)であり、かつ対応するSF値は、≧2.3kb/μm(欠失の場合)又は≦1.7kb/μm(重複の場合)であることを立証した。大きな再編成の存在を確認するために、関心対象のモチーフ(複数可)を、野生型(wt)及び突然変異(mt)アレルを含む、全画像群(通常、20〜40枚)でまず測定した。その後、大きな再編成が存在する場合、突然変異サイズを測定することを目的として、画像をwt及びmtアレルに対応する2つのグループに分けた。2つのグループのn枚の画像の各々において、以下の値を計算した:μ(kb)、SD(kb)、CV(％)。その後、野生型アレルのμ値を突然変異アレルのμ値と比較した。この目的のために、本発明者らは、平均の標準誤差(SEM＝SD/√n)及び95％信頼区間(95％CI＝μ±2×SEM)を計算した。その後、突然変異サイズを2つのアレルの平均サイズの差として計算した:突然変異サイズ＝μ(BRCA1mt)−μ(BRCA1wt)。関連誤差を以下の式に従って計算した:
誤差 = ( ( (μmt + 2x SEM mt) - (μwt- 2x SEM wt ) ) - ( (μmt- 2x SEM mt) - (μwt + 2x SEM wt ) ) ) / 2.
【００７５】
(実施例2:本発明の遺伝子モールスコード及び分子コーミングと従来のカラーバーコード法との比較)
(第1部.BRCA1及びBRCA2の大きな再編成の特徴付けへの分子コーミングの以前の適用:低解像度カラーバーコード(CBC)の設計)
分子コーミングは、BRCA1及びBRCA2遺伝子中の大きな再編成を検出するために、Gadらによって既に使用されている(Gadの文献、GenChrCan 2001、Gadの文献、JMG 2002)。当初使用されたハイブリダイゼーションDNAプローブは、コスミド、PAC、及びロングレンジPCR産物から構成される低解像度「カラーバーコーディング」スクリーニング法の一部であった。いくつかのプローブは小さく、6〜10kbの範囲であり、BRCA1及びBRCA2遺伝子座のごく一部をカバーしていた。他のプローブは、非常に大きく(BRCA1用の120kbの大きさがあるPAC 103014、及びBRCA2用の180kbの大きさがあるBAC 486017)、全ての反復配列を含む、遺伝子座全体をカバーしていた。したがって、妨害する可能性のある反復配列を同定するためのバイオインフォマティクス解析は実施すらされていない。より重要なことに、これまで、どの反復配列もCBCの設計から除外されたことがない。このため、スクリーニングされた突然変異の特徴付けが不完全に終わることが多かった(第3部参照)。結果として、プローブの検出は、個々のカラーシグナルの重畳(例えば、異なるカラーシグナルの重畳から生じる黄/白スポット)及び強いバックグラウンドノイズをもたらすことが多く、画質を低下させ、シグナル長を測定するためのロバストな戦略の開発を妨げた。さらに、どのDNAプローブも、単離され、インサートベクターにクローニングされることがなかった。BRCA1カラーバーコード(CBC)が、わずか7つのDNAプローブ((Gadらの文献、Genes Chromosomes and cancer  31:75-84(2001)))から構成されていたのに対し、BRCA2 CBCは、わずか8つのDNAプローブから構成されていた(Gadらの文献、J Med Genet(2002))。このDNAプローブの数の少なさのために、高解像度物理マッピングが可能にならなかった。
【００７６】
重要なことに、そのような低解像度スクリーニング法では、タンデムリピート重複又は三重重複などの複雑な突然変異の明確な可視化が可能にならなかった。対照的に、タンデムリピート重複及び三重重複の完全な特徴付けは、高解像度GMCで可能である(実施例1参照)。さらに、全ての突然変異エキソンの正確な物理マッピングは、問題となることが多く、さらなる骨の折れるシークエンシング実験が必要となる。このため、スクリーニングされた突然変異の特徴付けが不完全に終わることが多かった(第3章参照)。
【００７７】
(第2部.BRCA1及びBRCA2の大きな再編成の特徴付けへの分子コーミングの新しい適用:高解像度ゲノムモールスコード(GMC)の設計及び遺伝子検査の開発)
本発明の新規性に関する重要な点は、BRCA1ゲノム領域とBRCA2ゲノム領域の両方についての高解像度ゲノムモールスコード(GMC)の設計及びクローニングである。BRCA1 GMCが、35のDNAプローブから構成されているのに対し(図1)、BRCA2 GMCは、27のDNAプローブから構成されている(図2)。
【００７８】
比較図1:コンピュータで生成された(上)及び顕微鏡で観察された(下)高解像度のBRCA1 GMC。
比較図2:コンピュータで生成された(上)及び顕微鏡で観察された(下)BRCA2の高解像度GMC。
【００７９】
反復配列を欠くBRCA1中の35のゲノム領域及びBRCA2中の27の領域を同定し、これらを用いて、対応するDNAハイブリダイゼーションプローブを設計し、クローニングした。利用されたDNAハイブリダイゼーションプローブの詳細(名前、サイズ、座標、色、及びカバーされるエキソンの性質)は全て上に記載されている。クローニングされたDNAプローブにより、欠失したエキソンの正確な物理マッピングが可能になり、BRCA1及びBRCA2中の大きな再編成の同時検出が可能になる。上記の解像度の改善によって、本発明者らは、その観察結果を乳癌及び卵巣癌のためのロバストな予測的遺伝子検査の開発につなげることが可能になった(実施例1参照)。
【００８０】
(第3部:高解像度GMCにより、低解像度CBCでは特徴付けることができない複雑な突然変異(例えば:タンデムリピート重複及び三重重複)の明確な検出及び可視化が可能になる)
以下は、低解像度CBCでは特徴付けることができなかった(又は一部しか特徴付けることができなかった)が、高解像度GMCで正確かつ明確に特徴付けることができた複雑な突然変異の選択された例である:
【００８１】
(3.1  BRCA1 Dup ex 18-20)
(CBC:)
Gadらによって作成された画像(Gadらの文献、Oncogene 2001の図1の症例IC171712)は低い解像度を有しており、欠失したエキソンの性質及び特に内容は、目視検査では規定することができない。結果として、突然変異のサイズは決定されておらず、作成された画像が測定に関して問題があったことを裏付けるものである。
【００８２】
(GMC:(実施例1の表S2参照))
目視検査により、この突然変異は、赤いシグナルS5B1のタンデム重複のように見える。測定後、該突然変異は、エキソン18〜20をコードするゲノムの部分に限定される、6.7±1.2kbのサイズを有すると推定された。推定された突然変異サイズは、文献(Staafの文献、2008)に報告されている8.7kbと完全に一致している。測定及び統計解析に関する詳細は、実施例1に見出すことができる。
【００８３】
比較図3:CBC(上)及びGMC(下)によるBRCA1突然変異Dup ex 18-20の特徴付け
【００８４】
(3.2  BRCA1  Del ex 8-13)
(CBC:)
Gadらによって作成された画像(Gadらの文献、Oncogene 2001の図1の症例IC657)は、低い解像度を有しており、欠失したエキソンの性質は、目視検査では明確に規定することができない。測定後の突然変異のサイズは、20.0±9.6kbであり、重大な標準偏差を有していた。
【００８５】
(GMC:(図4B、実施例1参照))
目視検査により、突然変異は、明らかに、シグナルS7B1とS8B1の間の大きなゲノム部分を含む、青のシグナルS7B1の欠失のように見えた。測定後、突然変異は、20±2.8kbのサイズを有し、より小さい誤差を有すると推定された。
【００８６】
(3.3  BRCA1  Dup ex 13(6.1kb))
(CBC:)
突然変異に関連する顕微鏡画像は、これまで提供されてこなかった。推定された突然変異サイズは、5.8±1.8kbであったが(Gadらの文献、Oncogene 2001の図3の症例IARC3653)、目視検査で裏付けられていない。
【００８７】
(GMC:(図4A、実施例1参照)
分子コーミングによる目視検査により、この突然変異は、青のシグナルS7B1の部分的タンデム重複のように見える。測定後、該突然変異は、エキソン13をコードするDNAプローブBRCA1-8の部分に限定される、6.1±1.6kbのサイズを有すると推定された。推定された突然変異サイズは、文献(Pugetの文献、1999)に報告されている6.1kbと完全に一致しており、乳癌インフォメーションコアデータベースによれば、この突然変異は、BRCA1中の最も頻度の高い10の突然変異に属している(Szaboの文献、2000)。したがって、画像と測定結果の間には完全な相関性があり、文献中に存在する値との相関性がある。
【００８８】
(3.4  BRCA1のエキソン1a、1b、及び2、並びにNBR2の一部のタンデムリピート三重重複)
(CBC:)
タンデム三重重複は、これまでCBCを用いて報告されていない。
【００８９】
(GMC:)
分子コーミングによる目視検査により、S9B1プローブの末端からS11B1プローブの反対の末端にまで及ぶモチーフg7b1の長さが異なるBRCA1遺伝子の2つのアレルをInstitut Claudius Regaud, Toulouse, Franceにより提供されたサンプルで同定した。突然変異は、プローブ色スワッピング実験で確認したとき、SYNT1及びS10B1プローブの部分を含む三重重複であるように見えた。5〜10kb、及びおそらくは、6〜8kbの間に含まれるサイズを有するDNAセグメントこの三重重複は、BRCA1遺伝子のエキソン1a、1b、及び2、並びにおそらくは、NBR2遺伝子の5'先端の部分を含む。
【００９０】
CBCは、せいぜい、この突然変異を単一のプローブの長さの増加として検出するぐらいであったろうし、したがって、該突然変異をタンデム三重重複として特徴付けることができなかったであろう。分子コーミングとは異なり、MLPA又はaCGHなどの現在の分子診断技術はいずれも、重複又は三重重複が(BRCA1内で)タンデムになっているか、それとも(BRCA1の外に)散在しているかを評価することができない。この観察は、リスク評価の点で明確な相違を生じるが、それは、BRCA1遺伝子座の外の反復ゲノム部分に臨床的意義があるという証拠がないからである。分子コーミングは、突然変異がBRCA1遺伝子内で生じ、したがって、臨床的に有意義であることを強調するものである。
【００９１】
CBCと比べたGMCの以下の重要な利点は、上の実施例から明白である:
-高解像度の目視検査
-突然変異エキソンの正確なマッピング
-ロバスト統計による突然変異サイズの正確な測定
-BRCA1及びBRCA2の同時検出
-逆位及び転座の検出
-GMC BRCA1及びBRCA2についての妨害反復配列(Alu配列)の不在。
【００９２】
(BRCA1の5'領域中の三重重複を検出するために特異的な検査)
上記の三重重複又は緊密な三重重複を明確に検出するためのPCR検査は、2つの方法:
a-三重重複していないアレルでは現れないPCR断片の三重重複したアレルでの出現;又は
b-PCR断片のサイズの変化
のうちのどちらか1つによって、三重重複していない形態と三重重複したアレルとを区別することができる。
【００９３】
三重重複における配列の構成を用いて、PCR増幅がタンデムリピート中でのみ可能となるように、プライマー対を設計することができる。該プライマーのうちの一方が、増幅配列中に位置し、かつBRCA遺伝子と同じ向き(5'から3')にある場合、もう一方は、第一のプライマーの上流に位置する増幅配列内の配列の逆相補体であり(すなわち、第一のプライマーの位置から第二のプライマーへの方向は、BRCA遺伝子の3'末端から5'末端への方向と同じであり)、非突然変異サンプルでのPCRは、プライマーの向きがそれを許さないので、不可能である。逆に、三重重複サンプルでは、リピート単位上でハイブリダイズする第一のプライマーは、第一のプライマーのリピート単位のすぐ上流のリピート単位中でハイブリダイズする第二のプライマーに対して正しく配向している。したがって、PCRが可能である。三重重複サンプルでは、このように設計されたプライマーの対を用いて、2つのPCR断片が得られるはずである。重複のあるサンプルでは、1つの断片しか現われないであろう。より小さいPCR断片(又は重複の場合、唯一の断片)のサイズは、以下の距離の合計である:
第一の(下流)プライマーから下流(BRCA1遺伝子に対して3'方向)の切断点まで測定されるD、及び
第二の(上流)プライマーから上流(BRCA1遺伝子に対して5'方向)の切断点まで測定されるU。
【００９４】
したがって、この測定は、両方の切断点の位置範囲を提供するものであり、下流の切断点は、下流プライマーの位置から(下流方向に)s以下離れており、上流の切断点は、上流プライマーの位置から(上流方向に)s以下離れている。加えて、三重重複配列のサイズ(L)は、2つのプライマー間の距離であるU＋Dの合計であるので、Lは、PCR断片のサイズから容易に推定することができる。
【００９５】
より大きい断片のサイズは、Lとより小さい断片のサイズの合計である。したがって、より小さい断片のサイズをより大きい断片のサイズから引くことにより、三重重複配列のサイズを第二の独立の評価において容易に評価することができる。これにより、切断点の位置に関する不確実性が低下する。したがって、このように設計された検査により、三重重複の正確な特徴付けが可能になる。ここで同定される三重重複の位置を所与として、三重重複を検出するために使用されるプライマー対は、以下の下流及び上流プライマーのうちの1つ又はいくつかの組合せを含むことができる(下流プライマーとして設計されるプライマーは、BRCA1遺伝子に対して順方向にあり、一方、上流プライマーは、BRCA1遺伝子の第一鎖と逆相補的である)。プライマーの組合せを選ぶ際、下記の規定に加えて、下流プライマーが上流プライマーの下流に位置するように、プライマー位置を選ばなければならない。
【００９６】
下流プライマーは:
i)好ましくは、エキソン2の3’末端から2〜4kb離れた、より好ましくは、エキソン2の3’末端から2.5〜3kb離れた、BRCA1のエキソン2と3の間の領域中
ii)エキソン2の3’末端から2kb以内、好ましくは、1.5kb以内、及びより好ましくは、エキソン2の3’末端から1kb以内にある、BRCA1のエキソン2と3の間の領域中
に位置することができる。
【００９７】
上流プライマーは:
i)BRCA1のエキソン1aから2kb以内、好ましくは、1.5kb以内、及びより好ましくはBRCA1のエキソン1aの1kb以内にある、BRCA1遺伝子とNBR2遺伝子の間の領域中;
ii)BRCA1のエキソン1a内、又はエキソン1b内、又はエキソン1aと1bの間の領域中;
iii)エキソン1bと2の間の領域、又はエキソン2中、又はエキソン2と3の間の領域中
に位置することができる。
【００９８】
そのような組合せの例は、プライマーBRCA1-Synt1-R(配列番号126)及びBRCA1-A3A-F(配列番号25)からなるプライマー対である。
【００９９】
上の組合せは、包括的であることが意図されるものではなく、当業者は、プライマーの向き及び相対位置が記載されている通りに選ばれることを条件として、上流及び下流プライマーのための他の位置を同様に選ぶことができる。プライマーのいくつかの組合せを別々の実験で又は単一の実験で使用することができる(どちらの場合にも、全ての「上流」プライマーは、全ての「下流」プライマーの上流に位置しなければならない。4つ以上のプライマーを同時に使用する場合(マルチプレックスPCR)、得られるPCR断片の数は、切断点の正確な位置によって変動し(PCR断片は、非突然変異サンプルでは全く出現しない)、突然変異の特徴付けは難しい。したがって、少なくとも1つの断片がマルチプレックスPCRで観察される場合、別のプライマー対を用いる追加実験を実施することが望ましい。
【０１００】
重要なことに、前段落に記載されている設計の場合、三重重複配列の向きは、あまり重要ではなく:実際、三重重複において、リピート単位のうちの少なくとも2つは同じ向きを共有し、少なくとも1つのPCR断片が増幅されるはずである。これは、逆方向リピートの場合と同様に、重複についても当てはまり、PCR断片は、逆(対向)方向の2つの別々の位置でハイブリダイズするプライマーのうちの1つから得られ、一方、直接タンデムリピートは、上記のような2つのプライマーからPCR断片を生成させる。
【０１０１】
三重重複及びそのタンデム性を明らかにするための別のタイプのPCR検査は、反復配列にまたがる(両方のプライマーが増幅配列の外側に残る)、又は切断点にまたがる(一方のプライマーが増幅配列の内部にあり、もう一方が増幅配列の外側にある)、又は増幅配列に完全に含まれるプライマー対を用いた、リピート配列のごく一部又は全体の増幅を必要とする。これらの検査により、所与のサイズのPCR断片が正常サンプル中に生成する一方、1つのアレル中に三重重複を有するサンプルでは、「正常」断片のサイズのもの1つと、リピート配列のサイズのもの2つを含む、1以上の追加のPCR断片が出現する。突然変異が存在する場合、これらの検査から、いくつかの解釈ができる結果が生じることが多い。単一の実験を実施して、突然変異を明らかにする場合、(一連の)補足的な検査を本明細書に提示されている設計に従って実施し、正確な解釈を確認することができる。ここで同定される三重重複の位置を所与として、三重重複を検出するために使用されるプライマー対は、少なくとも1つの下流プライマー及び1つの上流プライマーを含む、以下のプライマーのうちの1つ又はいくつかの組合せを含むことができる。下流プライマーとして設計されるプライマーは、BRCA1遺伝子配列に対して逆相補的であり、一方、上流プライマーは、BRCA1遺伝子に対して順方向にある。プライマーの組合せを選ぶ際、下記の規定に加えて、下流プライマーが上流プライマーの下流に位置するように、プライマー位置を選ばなければならない。
【０１０２】
下流プライマーは:
i)BRCA1遺伝子のエキソン3中;又は
ii)好ましくは、エキソン2の3'末端から2kb超かつ10kb未満、より好ましくは、3kb超かつ8kb未満、及びさらにより好ましくは、エキソン2の3'末端から4kb超かつ6kb未満のBRCA1のエキソン2と3の間の領域中
に位置することができる。
【０１０３】
上流プライマーは:
i)BRCA1のエキソン1aから10kb未満かつBRCA1のエキソン1aから1kb超、好ましくは、8kb未満かつ2kb超、及びより好ましくは、BRCA1のエキソン1aの6kb未満かつ4kb超のBRCA1遺伝子とNBR2遺伝子の間の領域中;又は
ii)エキソン1a中、エキソン1b中、もしくはBRCA1のエキソン1aと1bの間の領域中;又は
iii)エキソン2中、もしくはBRCA1のエキソン1bと2の間の領域中、もしくはエキソン2と3の間の領域中
iii)
iv)
に位置することができる。
【０１０４】
そのような組合せの例は、プライマーBRCA1-A3A-F(配列番号25)及びBRCA1-A3A-R(配列番号26)からなる、並びにプライマーBRCA1-Synt1-F(配列番号125)及びBRCA1-Synt1-R(配列番号126)からなるプライマー対である。
v)i)に記載の下流プライマー及びii)に記載の上流プライマー
vi)i)に記載の下流プライマー及びiii)に記載の上流プライマー
vii)ii)に記載の下流プライマー及びi)に記載の上流プライマー
【０１０５】
本発明の具体的な実施態様は、以下のものを含む:
1.遺伝子座BRCA1又はBRCA2中の1以上の大きな又は複雑な突然変異又はゲノム再編成を同時に検出するための核酸組成物であって、200を上回るヌクレオチドを含み、かつ各々の該遺伝子の特異的な少なくとも2つのカラー標識プローブを含み、該プローブが、高解像度で視覚的に検出可能であり、かつ反復ヌクレオチド配列を含まない、前記核酸組成物。
【０１０６】
2.遺伝子座BRCA1又はBRCA2中の1以上の大きな又は複雑な突然変異又はゲノム再編成を同時に検出するための実施態様1記載の核酸組成物であって、200を上回るヌクレオチドを含み、かつ各々の該遺伝子の特異的な少なくとも3つのカラー標識プローブを含み、該プローブが、高解像度で視覚的に検出可能であり、かつ反復ヌクレオチド配列を含まない、前記核酸組成物。
【０１０７】
3.BRCA1又はBRCA2遺伝子中の1以上の大きな又は複雑な突然変異又はゲノム再編成を同時に検出するための実施態様1又は2記載の核酸組成物であって、600を上回るヌクレオチドを含み、かつ各々の該遺伝子の特異的な少なくとも3つのカラー標識プローブを含み、該プローブが、高解像度で視覚的に検出可能であり、かつ反復ヌクレオチド配列を含まない、前記核酸組成物。
【０１０８】
4.前記プローブが、一本鎖DNA繊維上、又は関心対象のポリヌクレオチド配列上、又は検査すべきゲノム上で同時に可視化される、実施態様1、2、又は3記載の組成物。
【０１０９】
5.以下の突然変異:重複、欠失、逆位、挿入、転座、又は大きな再編成の検出を可能にする、BRCA1又はBRCA2遺伝子座の特異的な少なくとも5つのカラー標識シグナルプローブを含む、実施態様1、2、3、又は4記載の組成物。
【０１１０】
6.以下の突然変異:重複、欠失、逆位、挿入、転座、又は大きな再編成の検出を可能にする、BRCA1又はBRCA2遺伝子座の特異的な少なくとも7つのカラー標識シグナルプローブを含む、実施態様1〜4記載の組成物。
【０１１１】
7.以下の突然変異:重複、三重重複、欠失、逆位、挿入、転座、又は大きな再編成の検出を可能にする、BRCA1又はBRCA2遺伝子座の特異的な少なくとも9つのカラー標識シグナルプローブを含む、実施態様1〜4記載の組成物。
【０１１２】
8.以下の突然変異:重複、三重重複、欠失、逆位、挿入、転座、又は大きな再編成の検出を可能にする、BRCA1又はBRCA2遺伝子座の特異的な少なくとも14のカラー標識シグナルプローブを含む、実施態様1〜7記載の組成物。
【０１１３】
9.以下の突然変異:重複、三重重複、欠失、逆位、挿入、転座、又は大きな再編成の検出を可能にする、BRCA1又はBRCA2遺伝子座の特異的な少なくとも18のカラー標識シグナルプローブを含む、実施態様1〜8記載の組成物。
【０１１４】
10.検出されるゲノム再編成又は突然変異が1.5キロベース(kb)を超える、実施態様1〜9記載の組成物。
【０１１５】
11.BRCA1又はBRCA2遺伝子座のコード又は非コード配列中の1以上の特定の大きな遺伝子再編成又は突然変異の検出(有無)及び任意に特徴付けを含む、対象における乳癌又は卵巣癌の感受性の予測的遺伝子検査であって、該再編成が、実施態様1〜10記載の組成物のいずれかによって可視化される、前記予測的遺伝子検査。
【０１１６】
12.治療的処置に対する対象の感受性の検出方法であって、BRCA1又はBRCA2遺伝子又は遺伝子座のコード又は非コード配列中の1以上の遺伝子再編成又は突然変異を、該遺伝子再編成を実施態様1〜10記載の組成物のいずれかを用いることによる分子コーミングによって可視化することにより同定することを含む、前記検出方法。
【０１１７】
13.流体又は循環細胞又は生体サンプルの組織中での分子コーミング技術による少なくとも1つの大きな遺伝子再編成又は突然変異の検出方法であって、
a)検査すべき遺伝物質を、工程a)のハイブリダイゼーションを高解像度で可視化する実施態様1〜10記載の少なくとも2つのカラー標識プローブと接触させる工程、及び任意に
b)工程b)の結果を、BRCA1又はBRCA2遺伝子又は遺伝子座中に再編成も突然変異も保有しない標準化された遺伝物質で得られる結果と比較する工程
を含む、前記方法。
【０１１８】
14.以下のものを含む組成物:
実施態様1〜10記載の2以上のオリゴヌクレオチドプローブ;
該オリゴヌクレオチドプローブに相補的なプローブ;
ストリンジェントな条件下で実施態様1〜10記載の該プローブにハイブリダイズするプローブ;
表1もしくは2記載のプライマー(配列番号1〜配列番号130)の対を用いるPCRにより増幅されたプローブ;又は
BRCA1-1A(配列番号131)、BRCA1-1B(配列番号132)、もしくはBRCA1-SYNT1(配列番号133)を含むプローブ。
【０１１９】
15.BRCA1用の配列番号1〜配列番号70及び配列番号125〜配列番号130からなるプライマーの群から選択されるプライマーの組。
【０１２０】
16.BRCA2用の配列番号71〜配列番号124からなるプライマーの群から選択されるプライマーの組。
【０１２１】
17.BRCA1又はBRCA2のコード配列、イントロン配列、又はフランキング配列を実施態様15又は16記載のプライマー対を用いて増幅することにより生成される単離又は精製されたプローブ。
【０１２２】
18.配列番号131(BRCA1-1A)、配列番号132(BRCA1-1B)、もしくは配列番号133(SYNT1)のポリヌクレオチド配列を含むか、又はストリンジェントな条件下で配列番号131もしくは配列番号132もしくは配列番号133にハイブリダイズする単離又は精製されたプローブ。
【０１２３】
19.その各々が、BRCA1及び/又はBRCA2遺伝子を含むゲノムの一部に結合する少なくとも2つのポリヌクレオチドを含む組成物であって、該少なくとも2つのポリヌクレオチドの各々が、少なくとも200個の連続するヌクレオチドを含み、かつAlu反復ヌクレオチド配列の10％未満を含む、前記組成物。
【０１２４】
20.前記少なくとも2つのポリヌクレオチドがBRCA1を含むゲノムの一部に結合する、実施態様19記載の組成物。
【０１２５】
21.前記少なくとも2つのポリヌクレオチドがBRCA2を含むゲノムの一部に結合する、実施態様19記載の組成物。
【０１２６】
22.前記少なくとも2つのポリヌクレオチドの各々が、少なくとも500〜最大6000個の連続するヌクレオチドを含み、かつAlu反復ヌクレオチド配列の10％未満を含む、実施態様19記載の組成物。
【０１２７】
23.前記少なくとも2つのポリヌクレオチドが、検出可能な標識又はマーカーで各々タグ化されている、実施態様19記載の組成物。
【０１２８】
24.異なる検出可能な標識又はマーカーで各々タグ化されている少なくとも2つのポリヌクレオチドを含む、実施態様19記載の組成物。
【０１２９】
25.異なる検出可能な標識又はマーカーで各々タグ化されている少なくとも3つのポリヌクレオチドを含む、実施態様19記載の組成物。
【０１３０】
26.異なる検出可能な標識又はマーカーで各々タグ化されている少なくとも4つのポリヌクレオチドを含む、実施態様19記載の組成物。
【０１３１】
27.同じ又は異なる視覚的に検出可能なマーカーで各々独立にタグ化されている3〜10のポリヌクレオチドを含む、実施態様19記載の組成物。
【０１３２】
28.同じ又は異なる視覚的に検出可能なマーカーで各々独立にタグ化されている11〜20のポリヌクレオチドを含む、実施態様19記載の組成物。
【０１３３】
29.少なくとも2つの異なる検出可能な標識又はマーカーのうちの1つで各々タグ化された少なくとも2つのポリヌクレオチドを含む、実施態様19記載の組成物。
【０１３４】
30.BRCA1又はBRCA2遺伝子座、BRCA1又はBRCA遺伝子、BRCA1又はBRCAフランキング配列又はイントロン中の重複、三重重複、欠失、逆位、挿入、転座、又は大きな再編成を検出する方法であって:DNAサンプルを単離すること、該サンプルを分子コーミングすること、分子コーミングされたDNAを、プローブとしての実施態様5記載の組成物と、ハイブリダイゼーションが起こるのに十分な時間及び条件下で接触させること、実施態様5記載の組成物の該DNAサンプルに対するハイブリダイゼーションを可視化すること、並びに該可視化を、再編成も突然変異も含まない正常な又は標準的なBRCA1又はBRCA2遺伝子座、BRCA1又はBRCA遺伝子、BRCA1又はBRCAフランキング配列又はイントロンの対照サンプルから得られる可視化と比較すること、を含む、前記方法。  
【０１３５】
31.該プローブが、1.5kbを超える再編成又は突然変異を検出するように選択される、実施態様30記載の方法。
【０１３６】
32.卵巣癌又は乳癌に対する素因を、コード又は非コードBRCA1又はBRCA2遺伝子座配列中で検出される遺伝子再編成又は突然変異の種類に基づいて予測又は評価することをさらに含む、実施態様30記載の方法。
【０１３７】
33.対象の治療的処置に対する感受性を、コード又は非コードBRCA1又はBRCA2遺伝子座配列中で検出される遺伝子再編成又は突然変異の種類に基づいて決定することをさらに含む、実施態様30記載の方法。
【０１３８】
34.BRCA1又はBRCA2遺伝子座、BRCA1又はBRCA2遺伝子、BRCA1又はBRCA2フランキング配列又はイントロン中の重複、欠失、三重重複、逆位、挿入、転座、又は大きな再編成を検出するキットであって、各々のポリヌクレオチドがBRCA1もしくはBRCA2遺伝子を含むゲノムの一部に結合する少なくとも2つのポリヌクレオチドであって、該少なくとも2つのポリヌクレオチドの各々が、少なくとも200個の連続するヌクレオチドを含み、かつ反復ヌクレオチド配列を含まず、ここで、該少なくとも2つのポリヌクレオチドが、視覚的に検出可能なマーカーでタグ化されており、かつBRCA1もしくはBRCA2遺伝子座、BRCA1もしくはBRCA2遺伝子、BRCA1もしくはBRCA2フランキング配列もしくはイントロンの特定のセグメント中の重複、欠失、逆位、挿入、転座、もしくは大きな再編成を同定するように選択されている、少なくとも2つのポリヌクレオチド、並びに任意にBRCA1もしくはBRCA2遺伝子座、BRCA1もしくはBRCA遺伝子、BRCA1もしくはBRCAフランキング配列もしくはイントロン中の重複も、欠失も、逆位も、挿入も、転座も、大きな再編成も有さない対象についてのハイブリダイゼーションプロファイルを記述する標準;分子コーミングを実施するのに必要な1以上のエレメント、使用説明書、及び/又は包装材料を含む、前記キット。
【０１３９】
35.前記少なくとも2つのポリヌクレオチドが、卵巣癌又は乳癌と関連するBRCA1又はBRCA2遺伝子座、BRCA1又はBRCA2遺伝子、BRCA1又はBRCA2フランキング配列又はイントロンの特定のセグメント中の重複、欠失、逆位、挿入、転座、又は大きな再編成を同定するように選択される、実施態様34記載のキット。
【０１４０】
36.前記少なくとも2つのポリヌクレオチドが、特定の治療剤、薬物、又は処置に感受性のある種類の卵巣癌又は乳癌と関連するBRCA1又はBRCA2遺伝子座、BRCA1又はBRCA2遺伝子、BRCA1又はBRCA2フランキング配列又はイントロンの特定のセグメント中の重複、欠失、逆位、挿入、転座、又は大きな再編成を同定するように選択される、実施態様34記載のキット。
【０１４１】
37.ゲノムDNAを含むサンプル中で、BRCA1遺伝子の5'末端にまたがり、かつ少なくとも3コピーの配列からなるゲノム配列の増幅を検出する方法。したがって、本発明は、特に、ゲノムDNAを含むサンプル中で、BRCA1遺伝子の5'末端にまたがるゲノム配列からなる多数のタンデムコピーのリピート単位のリピート配列をインビトロで検出する方法であって、該リピート配列が、少なくとも3コピーの該リピート単位からなり、かつ該方法が:
-該プライマーから始まるPCRによる重合を可能にするために、第一のプライマーと標的ゲノム配列の5'末端とのハイブリダイゼーション及び第二のプライマーと該標的配列の3'末端とのハイブリダイゼーションを可能にする条件を提供すること;
-該プライマーとハイブリダイズした配列を増幅させること;
-それにより得られたアンプリコンを、特にプローブで検出し、かつそのサイズ又はその内容、特に、そのヌクレオチド配列を決定すること
を含む、前記方法に関する。
【０１４２】
38.前記増幅配列が少なくとも2kb長である、実施態様37記載の方法。
【０１４３】
39.前記増幅配列が少なくとも5kb長である、実施態様37記載の方法。
【０１４４】
40.前記増幅配列が最大でも20kb長である、実施態様37記載の方法。
【０１４５】
41.前記増幅配列が最大でも10kb長である、実施態様37記載の方法。
【０１４６】
42.前記増幅配列が、少なくとも2kb長、及び最大でも20kb長である、実施態様37記載の方法。
【０１４７】
43.前記増幅配列が、少なくとも5kb長、及び最大でも10kb長である、実施態様37記載の方法。
【０１４８】
44.前記増幅配列が、BRCA1遺伝子のエキソン1a、1b、及び2のうちの少なくとも1つを含む、実施態様37〜43のいずれか一に記載の方法。
【０１４９】
45.前記増幅配列が、BRCA1遺伝子のエキソン1a、1b、及び2を含む、実施態様37〜43のいずれか一に記載の方法。
【０１５０】
46.遺伝子増幅の検出が、増幅領域中に含まれる配列のコピーを定量することによって達成される、実施態様37〜45のいずれか一に記載の方法。
【０１５１】
47.遺伝子増幅の検出が、増幅配列を包含するゲノム配列のサイズを測定することによって達成される、実施態様37〜46のいずれか一に記載の方法。
【０１５２】
48.遺伝子増幅の検出が、ポリメラーゼ連鎖反応又は他のDNA増幅技術を利用することによって達成される、実施態様37〜47のいずれか一に記載の方法。
【０１５３】
49.遺伝子増幅の検出が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって達成される、実施態様37〜48のいずれか一に記載の方法。
【０１５４】
50.遺伝子増幅の検出が、マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅(MLPA)によって達成される、実施態様37〜48のいずれか一に記載の方法。
【０１５５】
51.遺伝子増幅の検出が、アレイベースの比較ゲノムハイブリダイゼーション(aCGH)によって達成される、実施態様37〜48のいずれか一に記載の方法。
【０１５６】
52.遺伝子増幅の検出が、短い断片の迅速マルチプレックスPCR(QMPSF)によって達成される、実施態様37〜48のいずれか一に記載の方法。
【０１５７】
53.下流プライマー及び上流プライマーが:
下流プライマーについて:
-好ましくは、エキソン2の3’末端から2〜4kb離れた、より好ましくは、エキソン2の3’末端から2.5〜3kb離れた、BRCA1のエキソン2と3の間の領域中のポリヌクレオチド配列、又は
-エキソン2の3’末端から2kb以内、好ましくは、エキソン2の3’末端から1.5kb以内、及びより好ましくは、1kb以内にある、BRCA1のエキソン2と3の間の領域中のポリヌクレオチド配列
上流プライマーについて:
-BRCA1のエキソン1aから2kb以内、好ましくは、BRCA1のエキソン1aの1.5kb以内、及びより好ましくは1kb以内にある、BRCA1遺伝子とNBR2遺伝子の間の領域中のポリヌクレオチド配列、又は
-BRCA1のエキソン1a内、もしくはエキソン1b内、もしくはエキソン1aと1bの間の領域中のポリヌクレオチド配列、又は
-エキソン1bと2の間の領域中、もしくはエキソン2中、もしくはエキソン2と3の間の領域中のポリヌクレオチド配列
の群からそれぞれ選択される、実施態様37〜48のいずれか一に記載の方法。
【０１５８】
54.BRCA1-A3A-F(配列番号25)、BRCA1-A3A-R(配列番号26)、BRCA1-Synt1-F(配列番号125)、及びBRCA1-Synt1-R(配列番号126)、又はそれらの逆相補配列から選択される2以上のプライマーを用いる、実施態様37〜48のいずれか一に記載の方法。
【０１５９】
55.Synt 1プローブ(配列番号133)を用いる、実施態様37〜48のいずれか一に記載の方法。
【表１】
2014532403.tif 000002
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【０１６０】
【表２】
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【０１６１】
【表３】
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【０１６２】
【表４】
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【０１６３】
【表５】
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【０１６４】
【表６】
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【０１６５】
【表７】
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【０１６６】
【表８】
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【０１６７】
(参考文献)
【化１】
2014532403.tif 000051
2014532403.tif 000052
【０１６８】
(関連する特許及び特許出願)
【化２】
2014532403.tif 000053
【図１Ａ】
2014532403.tif 000054
【図１Ｂ】
2014532403.tif 000055
【図２Ａ−Ｂ】
2014532403.tif 000056
【図２Ｃ−Ｄ】
2014532403.tif 000057
【図３】
2014532403.tif 000058
【図４Ａ】
2014532403.tif 000059
【図４Ｂ】
2014532403.tif 000060
【図４Ｃ】
2014532403.tif 000061
【図５】
2014532403.tif 000062
【図６】
2014532403.tif 000063
【図７Ａ】
2014532403.tif 000064
【図７Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年7月11日(2014.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014532403000001.app
【国際調査報告】
2014532403.tif 000066
2014532403.tif 000067
2014532403.tif 000068