(57)【要約】  サイトカインもしくは成長因子および／またはそれらの受容体に特異的に結合するアルファボディーならびにかかるアルファボディーを含有するか、または当該アルファボディーから本質的になるポリペプチド。かかるアルファボディーをコードするさらなる核酸；かかるアルファボディーおよびポリペプチドを調製するための方法；かかるアルファボディーおよびポリペプチドを発現するか、または発現することができる宿主細胞；かかるアルファボディー、ポリペプチド、核酸および／または宿主細胞を含有している組成物および特に医薬組成物ならびに；かかるアルファボディーもしくはポリペプチド、核酸、宿主細胞および／または組成物の特に予防、治療もしくは診断目的での使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカイン−サイトカイン受容体の複合体または成長因子−成長因子受容体の複合体のメンバーに特異的に結合するアルファボディーを含有してなるアルファボディーポリペプチド。
【請求項２】
前記結合部位が、
−アルファボディーのヘリックス表面上、
−アルファボディーヘリックスの少なくとも１個のｅ残基またはｇ残基を含むアルファボディーの溝中、
−アルファボディーのループ領域またはリンカー領域中
のいずれかに主に位置していることを特徴とする、請求項１に記載のアルファボディーポリペプチド。
【請求項３】
前記結合部位が、
（ｉ）アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位および第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｇ位、ならびに任意に、アルファボディーの前記第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位および／またはアルファボディーの前記第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｃ位、または
（ｉｉ）アルファボディーの１個のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位、ｃ位およびｆ位、または
（ｉｉｉ）アルファボディーの連続する２個のα−ヘリックスを連結するリンカー断片における位置、
のいずれかにより主に形成される、請求項１に記載のアルファボディーポリペプチド。
【請求項４】
サイトカインまたは成長因子に特異的に結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアルファボディーポリペプチド。
【請求項５】
前記サイトカインにおける受容体結合部位または成長因子における受容体結合部位に特異的に結合する、請求項４に記載のアルファボディーポリペプチド。
【請求項６】
サイトカイン受容体または成長因子受容体に特異的に結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアルファボディーポリペプチド。
【請求項７】
前記アルファボディーポリペプチドが、前記サイトカイン受容体または成長因子受容体のサイトカインまたは成長因子の結合部位に特異的に結合する、請求項６に記載のアルファボディーポリペプチド。
【請求項８】
前記アルファボディーポリペプチドが、前記サイトカインまたは成長因子と前記サイトカイン受容体または成長因子受容体との間の相互作用を阻害する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアルファボディーポリペプチド。
【請求項９】
前記アルファボディーポリペプチドが、前記サイトカインもしくは成長因子および／または前記サイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に、少なくとも１マイクロモルの解離定数（ＫＤ）で特異的に結合する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアルファボディーポリペプチド。
【請求項１０】
前記サイトカインまたは成長因子が、カルジオトロフィン１、カルジオトロフィン様サイトカイン因子１、カルジオトロフィン様サイトカイン因子１、毛様体神経栄養因子、インターロイキン１１、インターロイキン６（インターフェロン、ベータ２）、白血病抑制因子（コリン作動性分化因子）、オンコスタチンＭ、インターロイキン４、アイソフォーム１、インターロイキン１３、インターロイキン１２Ａ、インターロイキン２３、アルファサブユニットｐ１９、コロニー刺激因子２、インターロイキン３、インターロイキン５、インターロイキン２、インターロイキン４アイソフォーム１、インターロイキン７、インターロイキン９、インターロイキン１５、プレプロタンパク質、インターロイキン２１、コロニー刺激因子３アイソフォームａ、エリスロポイエチン、成長ホルモン１アイソフォーム１、成長ホルモン２アイソフォーム１、レプチン、プロラクチン、胸腺間質性リンパ球新生因子アイソフォーム１、甲状腺ペルオキシダーゼアイソフォームａ、インターロイキン１アルファプロタンパク質およびインターロイキン１ベータプロタンパク質、インターロイキン１０、インターロイキン１９アイソフォーム２、インターロイキン２０、インターロイキン２２、インターロイキン２４アイソフォーム１、インターロイキン２８Ａ、インターロイキン２８Ｂおよびインターロイキン２９、インターロイキン１７、インターロイキン１７Ｂおよびインターロイキン１７Ｅアイソフォーム１、インターフェロンアルファ１、インターフェロンベータ１、インターフェロンカッパ、インターフェロンイプシロン１、インターフェロンオメガ１、インターフェロンガンマ、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー７、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１４アイソフォーム１前駆体、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１３アイソフォームアルファプロタンパク質、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリー、メンバー１１アイソフォーム１、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー９、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー８、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー４、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１８、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１３ｂ、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１２アイソフォーム１前駆体、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１０、リンホトキシン−ベータアイソフォームａ、リンホトキシンアルファ、ｆａｓリガンド、エクトジスプラシンＡアイソフォームＥＤＡ−Ａ２、神経成長因子、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、コロニー刺激因子１アイソフォームａ、上皮成長因子（ベータ−ウロガストロン）、ｆｍｓ−関連チロシンキナーゼ３リガンド、肝細胞成長因子アイソフォーム１プレプロタンパク質、ＫＩＴリガンドアイソフォームｂ、ＰＨドメイン含有タンパク質、血小板由来成長因子ベータアイソフォーム１プレプロタンパク質、血小板由来成長因子Ｃ、血管内皮成長因子Ｂ、血管内皮成長因子Ｃプレプロタンパク質、血管内皮成長因子アイソフォームａ、トランスフォーミング成長因子ベータ３、トランスフォーミング成長因子ベータ２、トランスフォーミング成長因子ベータ１、インヒビンベータＣ鎖プレプロタンパク質、インヒビンベータＢサブユニット、インヒビンベータＡ、成長分化因子５プレプロタンパク質、骨形成タンパク質７、骨形成タンパク質２、抗ミュラー管ホルモン、アクチビンベータＥ、ケモカイン（Ｃモチーフ）リガンド１、ケモカイン（Ｃモチーフ）リガンド２、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１４アイソフォーム１、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１５、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２０、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２６、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド３、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド４、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド７、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１１、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１３、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１６、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１７、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１９、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２１、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２２、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２３アイソフォームＣＫベータ８−１、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２４、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２５アイソフォーム１、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２７、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２８、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド５、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド８、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（ストロマ細胞由来因子１）アイソフォームベータ、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１３（Ｂ細胞化学誘引物質）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１６、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド５、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）、インターロイキン８、プロ血小板塩基性タンパク質、血小板因子（ＰＦ）４、ｇｒｏａ、ＭＩＧ、ＥＮＡ−７８、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）Ｉａ、ＭＩＰ１単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−１、１−３  ０９、ＨＣ１４、Ｃ１０、ＲＡＮＴＥＳ（Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−  ｃｅｌｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，Ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１０、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド９およびケモカイン（Ｃ−Ｘ３−Ｃモチーフ）リガンド１からなる群より選択される、請求項１、２、３、４、５、８または９のいずれか１項に記載のアルファボディーポリペプチド。
【請求項１１】
前記サイトカイン受容体または成長因子受容体が、１型インターロイキン受容体、エリスロポイエチン受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、成長ホルモン受容体、プロラクチン受容体、オンコスタチンＭ受容体、白血病抑制因子受容体、ＩＩ型インターロイキン受容体、インターフェロン−アルファ／ベータ受容体、インターフェロン−ガンマ受容体、インターロイキン−１受容体、ＣＳＦ１、Ｃ−ｋｉｔ受容体、インターロイキン−１８受容体、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ１２０、ＣＤ４０、リンホトキシンベータ受容体、インターロイキン−８受容体、ＣＣＲ１、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＭＣＡＦ受容体、ＮＡＰ−２受容体、ＣＣケモカイン受容体、ＣＸＣケモカイン受容体、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体、ＸＣケモカイン受容体（ＸＣＲ１）、ＴＧＦベータ受容体１およびＴＧＦベータ受容体２からなる群より選択される、請求項６〜９に記載のアルファボディーポリペプチド。
【請求項１２】
前記サイトカインまたは成長因子が、ヘテロ二量体のサイトカインもしくは成長因子である、および／または前記サイトカイン受容体もしくは成長因子受容体が、ヘテロ二量体のサイトカインに対する受容体もしくは成長因子に対する受容体である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアルファボディーポリペプチド。
【請求項１３】
前記ヘテロ二量体サイトカインが、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７およびＩＬ−３５からなる群より選択される、および／または前記ヘテロ二量体サイトカインに対する受容体がＩＬ−１２受容体、ＩＬ−２３受容体、ＩＬ−２７受容体およびＩＬ−３５受容体からなる群より選択される、請求項１２に記載のアルファボディーポリペプチド。
【請求項１４】
前記ヘテロ二量体サイトカインがＩＬ−２３である、請求項１２または１３のいずれか１項に記載のアルファボディーポリペプチド。
【請求項１５】
前記アルファボディーポリペプチドが、ＩＬ−２３のｐ１９サブユニットに結合する、請求項１４に記載のアルファボディーポリペプチド。
【請求項１６】
前記アルファボディーポリペプチドが、ＩＬ−２３のｐ１９サブユニットには結合するが、ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットには結合しない、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のアルファボディーポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号：１〜配列番号：１２７ならびに配列番号：１３４および配列番号：１３５のいずれか１つに対応するアミノ酸配列の少なくとも１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のアルファボディーポリペプチド。
【請求項１８】
前記アルファボディーポリペプチドが、Ｆｌｔ３リガンドまたはＦｌｔ３受容体と結合する、請求項１０または１１に記載のアルファボディーポリペプチド。
【請求項１９】
前記アルファボディーに加えて、任意に、１個以上のリンカーを介して連結された１個以上のさらなる基を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のアルファボディーポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のアルファボディーポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の少なくとも１個のアルファボディーポリペプチドまたは請求項２０に記載の核酸配列および任意に、少なくとも１個の薬学的に許容され得る担体を含有してなる医薬組成物。
【請求項２２】
サイトカインもしくは成長因子および／または前記サイトカインもしくは成長因子の受容体に対する、検出可能な結合親和性を有する、少なくとも１個のアルファボディーポリペプチドの製造方法であって、
ａ）少なくとも１００個の異なる配列の単鎖アルファボディーポリペプチドを含み、前記アルファボディーポリペプチドが５〜２０個の多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットの少なくとも１つにおいて互いに異なり、前記多様化されるアミノ酸残基位置の少なくとも７０％が、
（ｉ）アルファボディーポリペプチドの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位および第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｇ位、ならびに任意に、アルファボディーポリペプチドの前記第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位および／またはアルファボディーポリペプチドの前記第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｃ位、
または
（ｉｉ）アルファボディーポリペプチドの１個のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位、ｃ位およびｆ位、または
（ｉｉｉ）アルファボディーポリペプチドの連続する２個のアルファへリックスを連結するリンカー断片における位置
のいずれかに位置する単鎖アルファボディーライブラリーを作製するステップ、ならびに
ｂ）前記単鎖アルファボディーライブラリーから、前記サイトカインもしくは成長因子および／または前記サイトカインもしくは成長因子の受容体に対する検出可能な結合親和性を有する少なくとも１個の単鎖アルファボディーポリペプチドを選択するステップ、
を少なくとも含む方法。
【請求項２３】
炎症性疾患および／または自己免疫疾患、移植拒絶反応、嚢胞性線維症、ぜんそく、慢性閉塞性肺疾患、がん、ウイルス感染症または分類不能型免疫不全症の予防および／または治療における使用のための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に特異的に結合するアルファボディーポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、サイトカインもしくは成長因子および／またはそれらの受容体に対する結合剤の分野ならびに予防、治療もしくは診断目的ならびにスクリーニングおよび検出のためのこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
成長因子は、細胞成長、増殖および細胞分化を刺激できる天然の物質である。サイトカインは、細胞シグナル伝達タンパク質分子として機能する、成長因子のサブクラスであると考えられている。多数の成長因子に関して、「サイトカイン」または「ホルモン」としての特徴付けは、当該技術分野の生化学者らにより討論されている。
【０００３】
サイトカインは、細胞のシグナル伝達および通信を媒介する低分子タンパク質の多様な群を包含する。初期応答に関与する主要な炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１−アルファ、ＩＬ−１−ベータ、ＩＬ−６およびＴＮＦ−アルファである。他の炎症促進性メディエーターは、ＬＩＦ、ＩＦＮ−ガンマ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＴＧＦ−ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−８および炎症細胞を化学誘引する様々な走化性サイトカイン（ケモカイン）を含む。これらのサイトカインは、内因性発熱物質（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−アルファ）のいずれかとして作用し、二次メディエーターおよび炎症促進性サイトカインの合成を、マクロファージおよび間葉細胞（線維芽細胞、上皮細胞および内皮細胞を含む）の両方により上方制御し、急性期タンパク質の産生を刺激するか、または炎症細胞を誘因する。抗炎症性サイトカインは、炎症促進性サイトカインの応答を調節する。主要な抗炎症性サイトカインは、インターロイキン（ＩＬ）−１受容体アンタゴニスト、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１およびＩＬ−１３を含む。ＩＬ−１、腫瘍壊死因子−αおよびＩＬ−１８に対する特異的サイトカイン受容体もまた、炎症促進性サイトカイン阻害剤として機能する。炎症応答の正味の効果は、炎症促進性サイトカインと抗炎症性サイトカインとの間のバランスにより決定される。
【０００４】
従来のサイトカインは、免疫／ヘマトポイエチン、インターフェロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−関連分子およびケモカインを含むいくつかのグループにさらに細かく分けることができる。それらは、標的細胞の表面において発現される特異的受容体を介して、それらの機能を発揮する。これらの受容体は、構造およびアミノ酸配列の類似性の両方に従ってファミリーに分類することができる。サイトカイン受容体のスーパーファミリーは、インターフェロン、ＴＮＦおよび造血成長因子を含む多数の成長因子ファミリーに対する受容体から構成される。このファミリー中のもっとも大きなサブクラスは、Ｉ型サイトカイン受容体のサブクラス、２個のフィブロネクチンＩＩＩ型折り畳みを含有する、およそ２００アミノ酸の保存された細胞外領域の存在により特徴付けられるグループである。ヘマトポイエチン受容体モジュールとして公知のこの領域は、受容体／リガンドの結合および受容体／受容体の二量化において重要な役割を果たすことが示されている。それは、第１ドメイン中の４個の保存システイン残基および第２ドメイン中のＷ−Ｓ−ｘ−Ｗ−Ｓモチーフにより特徴付けられる。この標準的なＷ−Ｓ−ｘ−Ｗ−Ｓモチーフは、クラスＩＩサイトカイン受容体において欠損されている。
【０００５】
多数の他の成長因子は、サイトカインとそれらとの機能的および構造的重複のため、多くの場合、当該技術分野においてサイトカインと称される。例えば、チロシンキナーゼ受容体リガンド、例えば、Ｆｌｔ３リガンドは、多くの場合、短鎖サイトカインとして分類される。Ｆｌｔ３リガンドは、Ｍ−ＣＳＦおよびＣＳＦの二量体に類似した二量体を形成する。Ｆｌｔ３リガンドは、造血幹細胞／造血前駆細胞の生存および増殖において重要な役割を果たす。Ｆｌｔ３リガンドは、膜結合受容体において作用するので、細胞のシグナル伝達に関与すると考えることができる。
【０００６】
Ｉ型サイトカイン受容体の受容体鎖は、リガンド結合およびシグナル伝達サブユニットの両方を含む多成分複合体の一部を形成し、その中で、後者は通常いくつかの受容体複合体のメンバーである。これらの特徴が、サイトカインの中の多機能性および機能重複の大部分を占める。
【０００７】
サイトカインまたは成長因子は、単量体（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１アルファ、Ｉｌ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６）、ホモ二量体（例えば、ｌＬ−５、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１０、Ｆｌｔ３リガンド）またはヘテロ二量体（例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３）であってよい。
【０００８】
サイトカインの十分に特徴付けられたファミリーは、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、ＣＬＣ−ｓＣＮＴＦＲ、ＣＬＣ−ＣＬＦ−１および新たに同定されたＩＬ−３５を含むヘテロ二量体サイトカインのスーパーファミリーであり、これらはすべてヘテロ二量体受容体と結合する。ヘテロ二量体サイトカインは、２個の異なるサブユニットからなる。これらのサブユニットの１つは、４へリックスバンドルドメインを含む。例えば、ＩＬ−２３は、サイトカインＩＬ−１２と共有されているｐ４０サブユニットと、ｐ１９または４へリックスバンドル構造を有するＩＬ−２３アルファサブユニットとからなる。さらに、ＩＬ−１７に関しては、ヘテロ二量体サイトカインアセンブリが実証されていて、例えば、ＩＬ−１７Ｆ／ＩＬ−１７Ａはヘテロ二量体サイトカインである〔ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００８，１８１：２７９９−２８０５〕。
【０００９】
また、ヘテロ二量体サイトカインの受容体は、２個以上の異なるサブユニットからなる。例えば、ＩＬ−１２受容体はＩＬ−１２Ｒベータ１およびＩＬ−１２Ｒベータ２のヘテロ二量体であり、ＩＬ−２３受容体は、ＩＬ−１２Ｒベータ１およびＩＬ−２３のヘテロ二量体である。ＩＬ−１２Ｒベータ１は、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３の両方により、シグナル伝達に使用される。この受容体の標的化は、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３の両方のシグナル伝達の封鎖につながると思われる。ＩＬ２３は、ＩＬ−１２と同じシグナル伝達分子：ＪＡＫ２、ＴＹＫ２、およびＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４およびＳＴＡＴ５を活性化する。ＳＴＡＴ４の活性化は、実質的に弱く、さまざまなＤＮＡ結合ＳＴＡＴ複合体は、ＩＬ１２と比較してＩＬ−２３に応答して形成される。ＩＬ−２３Ｒは、ＪＡＫ２と構成的に会合し、リガンド依存性様式でＳＴＡＴ３と会合する。
【００１０】
ヘテロ二量体のサイトカインまたは成長因子は多くの場合、異なるサイトカインと共通のサブユニットを有する（例えば、ｐ４０は、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３に共通である）。このことは、これらのサイトカインに対して上げられた結合剤の特異性を、特に、結合剤が異なるサイトカインに共通のサブユニットを認識する場合、制限する恐れがある。さらに特に重要なことは、時としてヘテロ二量体サイトカインの単離されたサブユニットは、体液中に見出されることである。例えば、リウマチ滑膜において、インターロイキン（ＩＬ）２３  ｐ１９サブユニットの豊富な発現が観察されている〔ブレンターノ（Ｂｒｅｎｔａｎｏ）ら、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ２００８；６８：１４３−１５０〕。したがって、結合剤が、ヘテロ二量体状態においてのみ、かかるサブユニットを認識することを望む場合、この結合剤に、ヘテロ二量体サイトカインに対する特異性が確実な結合特性を与えることが有利であり得る。このことは、所与のヘテロ二量体サイトカインの両方のサブユニットを同時に認識するが、個別のサブユニットに対する親和性をほとんど示さない結合剤によって達成され得る。反対に、結合剤は、（例えば、豊富に発現された単離サイトカインサブユニットを「取り除く（ｍｏｐ−ｕｐ）」ことが望ましい場合）ヘテロ二量体状況以外の所与のサブユニットだけを認識することが望ましいと思われる。このことは、例えば、所与の個別のサブユニット（例えば、ＩＬ−２３（ｐ１９））に対する親和性を示すが、ヘテロ二量体状況において前記個別のサブユニットとの結合が、他のサブユニット（例えば、ＩＬ−２３（ｐ４０））により立体的に妨害されている結合剤により達成され得る。
【００１１】
ＩＬ−２３は、感染症に対する炎症応答において重要な役割を果たす。ＩＬ−２３は、マトリックスメタロプロテアーゼＭＭＰ９の上方制御を促進し、血管新生を増加させ、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の浸潤を減少させる。近年、ＩＬ−２３はがん性腫瘍の発生に関係づけられた。ＩＬ−６およびＴＧＦ−β１と併せて、ＩＬ−２３は、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞を刺激し、Ｔｈ１７細胞と呼ばれる、細胞の新規なサブセットに分化させ、これらは古典的なＴｈ１およびＴｈ２細胞とは異なる。Ｔｈ１７細胞はＩＬ−１７を産生し、ＩＬ−１７は、Ｔ細胞のプライミングを増強し、炎症促進性分子、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−アルファ、ＮＯＳ−２および炎症をもたらすケモカインの産生を刺激する炎症促進性サイトカインである。
【００１２】
ＩＬ−２３が、臓器特異的自己免疫疾患の重要なメディエーターであることが示されている〔エン（Ｙｅｎ）ら、２００６〕。ｐ４０もしくはｐ１９のいずれか、またはＩＬ−２３受容体のサブユニット（ＩＬ−２３ＲおよびＩＬ１２Ｒ−β１）のいずれかを欠損したノックアウトマウスは、多発性硬化症および炎症性腸疾患のそれほど重症ではない症状を発症する。加えて、抗ＩＬ−２３（ｐ１９）特異的抗体がＥＡＥ、ヒトＭＳの前臨床モデルを阻害できることが実証されている〔チェン（Ｃｈｅｎ）ら、２００６〕。
【００１３】
活性化された樹状細胞および食細胞によるＩＬ−１２の分泌は、インターフェロン−ガンマの産生によるＴｈ１応答とともに細胞毒性、抗腫瘍性および抗菌性応答の増強につながる。その結果として、抗ＩＬ１２抗体は、感染症の感受性につながるＴｈ１経路に干渉することができる。
【００１４】
治療抗体のウステキヌマブ（Ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）（ＣＮＴＯ１２７５の実験用名称でも以前から知られ、現在尋常性乾癬の治療用に承認されている）およびブリアキヌマブ（Ｂｒｉａｋｉｎｕｍａｂ）（尋常性乾癬の治療のために第ＩＩＩ相臨床試験およびＭＳのために第ＩＩ相臨床試験中）は、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３の両方を中和するヒトモノクローナル抗体である。ＩＬ２３／ＩＬ−１２交差反応性によりもたらされる有害事象、より具体的には感染症の危険性が懸念される。リマ（Ｌｉｍａ）ら、（２００９）は、ウステキヌマブを使用した臨床研究において結核または他の日和見感染症の症例の報告はまったくないことを示しており、ＳＴＥＬＡＲＡ（商標）に関する医薬ガイドは、「ＳＴＥＬＡＲＡ（商標）を服用したにもかかわらず、結核（ＴＢ）および細菌、真菌またはウイルスにより引き起こされる感染症を含む、重症の感染症を発症する人もいる。それらの感染症の治療のために入院させなければならない人もいる」ことを述べている。加えて、ドラッグ・ドット・コム（Ｄｒｕｇ．ｃｏｍ）ウェブサイト（ドラッグ・インフォメーション・オンライン（Ｄｒｕｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｏｎｌｉｎｅ））においてウステキヌマブに関して報告された副作用は、最大５％の上気道感染症を示す。
【００１５】
上記に基づき、成長因子、より具体的にはサイトカインおよびそれらの受容体が、それらの関与する疾患または障害の予防または治療のための医薬の開発にとって、魅力的な標的を構成することは明らかである。より具体的には、ヘテロ二量体のサイトカインまたは成長因子に関しては、サイトカインの一方のサブユニットを特異的にブロックする化合物は、共通のサブユニットを共有するサイトカインの間を識別しない化合物より有利であると思われる。
【００１６】
さらに、サイトカイン媒介性もしくは成長因子媒介性または受容体媒介性の疾患および／または障害の予防または治療に使用できる、代替の、および／または改良された、活性化合物または活性薬剤、したがって、かかる活性化合物によるサイトカインまたは成長因子の有効な結合の必要性は依然として存在したままである。
【００１７】
国際公開第２０１０／０６６７４０号は、単鎖の三本鎖アルファへリカルコイルドコイル足場である、アルファボディー足場について記載している。しかしながら、これらのアルファボディー足場を操作して、これらの標的が関与している生物学的機序を調節するために十分な親和性で、標的に特異的に結合するアルファボディーを得ることができる方法は開示されていなかった。
【発明の概要】
【００１８】
発明の概要
本発明者らは、目的の標的に特異的に結合するアルファボディーポリペプチドの作製を可能にする方法を見出した。アルファボディー足場を使用して、目的の標的に高い親和性および特異性で、先行技術の結合剤の１つ以上の不利益を克服する結合剤が作製できるように結合する結合剤を作製できることを見出した。さらに、かかる結合剤が、当該技術分野において公知の従来の（免疫グロブリンおよび非免疫グロブリン）結合剤を上回るいくつかの有利性を有することを見出した。かかる有利性は、限定されるものではないが、それらはサイズが小型で小さく（１０および１４ｋＤａの間であり、これは抗体の１０分の１である）、それらは極めて安定であり（１００℃を超える融解温度を有する）、それらはさまざまなプロテアーゼに対して抵抗性にすることができ、それらは（多重置換が、それらの正確および安定なフォールディングを通常破壊しないであろうという意味で）高度に操作可能であり、タンパク質工学技術を介して再設計された天然のモチーフに基づく構造を有するという事実を含む。
【００１９】
本発明は、サイトカインまたは成長因子および／またはそれらの受容体と特異的に結合するアルファボディー（本明細書において定義する場合、本発明のアルファボディーとも称される）を含有しているアルファボディーポリペプチドならびに１個以上のかかるアルファボディーを含有するか、またはこれらから本質的になるポリペプチドおよび予防、治療又は診断目的のためのかかるアルファボディーまたはポリペプチドの使用を提供する。
【００２０】
一態様において、本発明は、サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に特異的に結合するアルファボディーポリペプチドを提供する。
【００２１】
特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドは、サイトカインもしくは成長因子、より具体的にはそのサイトカインもしくは成長因子の受容体結合部位に特異的に結合する。特定の実施形態において、サイトカインまたは成長因子に結合する本発明のアルファボディーポリペプチドは、サイトカインまたは成長因子と、そのサイトカイン受容体または成長因子の（１もしくは複数の）受容体との間の相互作用を阻害する。
【００２２】
特定の実施形態において、該サイトカインまたは成長因子は、ヘテロ二量体のサイトカインまたは成長因子である。さらに特定の実施形態において、該サイトカインまたは成長因子は、ヘテロ二量体のサイトカインまたは成長因子であり、該アルファボディーは、該サイトカインのサイトカイン特異的サブユニットまたは該成長因子の成長因子特異的サブユニットを対象とする。さらに特定の実施形態において、該サイトカインは、ＩＬ−１２サイトカインのファミリーである。より具体的には、該サイトカインはＩＬ−２３である。
【００２３】
本発明の特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドが特異的に結合するサイトカインは、ヘテロ二量体サイトカイン、例えば、限定されるものではないが、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７またはＩＬ−３５である。ある特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドはＩＬ−２３、より具体的には、ＩＬ−２３のｐ１９−サブユニット、ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットまたはＩＬ−２３のｐ１９およびｐ４０サブユニットの両方に特異的に結合する。ある特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドは、ＩＬ−２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合するが、ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットには結合しない。サイトカインに特異的に結合する本発明のアルファボディーポリペプチドは、特定の実施形態において、配列番号：１から配列番号：１２７のいずれか１つに対応するアミノ酸配列の少なくとも１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。
【００２４】
本発明のさらなる特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドが特異的に結合するサイトカインまたは成長因子は、クラスＩＩＩ受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）リガンドおよび／またはその受容体、例えば、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）またはＦｌｔ３受容体（Ｆｌｔ３Ｒ）である。ある特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドは、Ｆｌｔ３Ｌ二量体、例えば、ヒトｆｌｔ３Ｌ（ｈｆｌｔ３Ｌ）二量体の単一の単量体と実質的に相互作用する。サイトカインまたは成長因子と特異的に結合する本発明のアルファボディーポリペプチドは、特定の実施形態において、本明細書の表５に示された、特異的ｈＦｌｔ３Ｌ結合残基を有するアミノ酸配列および／または配列番号：１３４または配列番号：１３５に対応するアミノ酸配列の少なくとも１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。
【００２５】
他の特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドは、サイトカイン受容体または成長因子受容体、より具体的には、サイトカイン受容体または成長因子受容体のサイトカインまたは成長因子の結合部位に特異的に結合する。特定の実施形態において、サイトカイン受容体または成長因子受容体に特異的に結合する、本発明のアルファボディーポリペプチドは、サイトカイン受容体または成長因子受容体と、そのサイトカインまたは成長因子のリガンドとの間の相互作用を阻害する。
【００２６】
本発明のアルファボディーポリペプチドが特異的に結合することができるサイトカイン受容体または成長因子受容体の例は、限定されるものではないが、１型インターロイキン受容体、エリスロポイエチン受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、成長ホルモン受容体、プロラクチン受容体、オンコスタチンＭ受容体、白血病抑制因子受容体、ＩＩ型インターロイキン受容体、インターフェロン−アルファ／ベータ受容体、インターフェロン−ガンマ受容体、インターロイキン−１受容体、ＣＳＦ１、Ｃ−ｋｉｔ受容体、インターロイキン−１８受容体、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ１２０、ＣＤ４０、リンホトキシンベータ受容体、インターロイキン−８受容体、ＣＣＲ１、ＣＸＣＲ４、ＭＣＡＦ受容体、ＮＡＰ−２受容体、ＣＣケモカイン受容体、ＣＸＣケモカイン受容体、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体、ＸＣケモカイン受容体（ＸＣＲ１）、ＴＧＦベータ受容体１およびＴＧＦベータ受容体２からなる群より選択できる。
【００２７】
本発明の特定の実施形態において、本発明のアルファボディーに特異的に結合するサイトカイン受容体または成長因子受容体は、ヘテロ二量体のサイトカインまたは成長因子のための受容体、例えば、限定されるものではないが、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−２３受容体、ＩＬ−２７受容体またはＩＬ−３５受容体である。
【００２８】
ある特定の実施形態によれば、本発明のアルファボディーポリペプチドは、サイトカインまたは成長因子と、サイトカイン受容体または成長因子受容体との両方に結合し、かかる実施形態におけるアルファボディーポリペプチドは「二重特異性」であると言われている。
【００２９】
したがって、特定の態様に従って、本発明は、サイトカインもしくは成長因子またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に特異的に結合する、唯一の単一のアルファボディーを含有するか、または単一のアルファボディーのみからなるアルファボディーポリペプチドを提供する。代替的には、本発明のポリペプチドは、１個のポリペプチド鎖において相互連結された複数のアルファボディーを含有する。
【００３０】
したがって、本発明は、サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体と特異的に結合する１個以上の本発明のアルファボディーを含有するか、または当該アルファボディーから本質的になるアルファボディーポリペプチド（本明細書において、本発明のポリペプチドとも称される）を提供する。さらなる実施形態において、アルファボディーポリペプチドは、１個以上の本発明のアルファボディーおよび任意に、１個以上の連結配列を介して、任意に、連結された１個以上のさらなる基を含有する。
【００３１】
さらなる態様において、本発明は、アルファボディーポリペプチド（アルファボディーなど）または本発明のポリペプチドをコードする核酸配列（本明細書において本発明の核酸配列とも称される）を提供する。
【００３２】
別のさらなる態様において、本発明は、１個以上の本発明の核酸配列を含有するベクターを提供する。
【００３３】
さらなる態様において、本発明は、１個以上の本発明のアルファボディーポリペプチドを発現する、または発現できる、宿主または宿主細胞を提供する。
【００３４】
さらなる態様において、本発明は、１個以上の本発明のアルファボディーポリペプチドおよび／または核酸配列および任意に、少なくとも１個の薬学的に許容され得る担体を含有している医薬組成物（本明細書において、本発明の医薬組成物とも称される）を提供する。ある特定の実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、任意に、少なくとも１個の他の医薬的活性化合物を含有することもできる。
【００３５】
別の態様において、本発明は、サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に特異的に結合する、本発明のアルファボディーポリペプチドまたは医薬組成物の製造方法を提供し、この方法は、
（ｉ）適切な宿主細胞または発現系において、１個以上の本発明のアルファボディーポリペプチドを発現させるステップ、ならびに
（ｉｉ）本発明のアルファボディーポリペプチドを単離および／または精製するステップ、
を少なくとも含む。
【００３６】
特定の実施形態によれば、サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に特異的に結合する本発明のアルファボディーポリペプチドまたは医薬組成物の製造方法は、
ａ）少なくとも１００個の異なる配列の単鎖アルファボディーポリペプチドを含有し、当該アルファボディーポリペプチドが５〜２０個の多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットの少なくとも１つにおいて互いに異なり、多様化されるアミノ酸残基位置の少なくとも７０％が、
（ｉ）アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位および前記第１のアルファへリックスに平行な第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｇ位、ならびに任意に、アルファボディーの前記第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位および／またはアルファボディーの前記第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｃ位、
または
（ｉｉ）アルファボディーの１個のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位、ｃ位およびｆ位、または
（ｉｉｉ）アルファボディーの２個の連続するアルファへリックスを連結するリンカー断片における位置
のいずれかに位置する単鎖アルファボディーライブラリーをコードする核酸またはベクターのライブラリーを作製するステップ、
ｂ）核酸またはベクターのライブラリーを宿主細胞に導入し、宿主細胞を、培地中で単鎖アルファボディーライブラリーの産生に適した条件下で培養するステップ、
ｃ）任意に、ステップｂ）において産生された単鎖アルファボディーライブラリーを、宿主細胞および／または培地から単離するステップ、
ｄ）サイトカインもしくは成長因子またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体と、ステップｂ）において産生またはステップｃ）において単離された単鎖アルファボディーライブラリーとを接触させるステップ、ならびに
ｅ）ステップｄ）において、目的のサイトカインもしくは成長因子またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体と接触させた単鎖アルファボディーライブラリーから、サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に対する検出可能な結合親和性、またはこれらの活性に対する検出可能なイン・ビトロ効果を有する１個以上の単鎖アルファボディーを単離するステップ、
を少なくとも含むことができる。
【００３７】
特定の実施形態において、ステップｄ）およびｅ）を繰り返し行ない、任意に、単離ステップｄ）の後に増幅ステップを補なうことにより、サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に対する検出可能な結合親和性またはこれらの活性に対する検出可能なイン・ビトロ効果を有する単鎖アルファボディーについて、アルファボディーライブラリーをさらに濃縮する。さらに特定の実施形態において、この方法は、ステップｅ）において得られた１個以上の単鎖アルファボディーのアミノ酸配列を決定するステップを含む。特定の実施形態において、この方法は、ステップｅ）において得られた１個以上の単鎖アルファボディーを合成するステップを含む。
【００３８】
さらなる態様によれば、本発明は、サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に特異的に結合する本発明のアルファボディーまたはポリペプチドの、前記サイトカインもしくは成長因子および／または前記サイトカイン受容体もしくは成長因子受容体が関与する少なくとも１つのサイトカイン媒介性または成長因子媒介性の疾患および／または障害の予防および／または治療用医薬の調製のための使用を提供する。従って、本発明は、前記サイトカインもしくは成長因子および／または前記サイトカイン受容体もしくは成長因子受容体が関与する少なくとも１つのサイトカイン／成長因子媒介性の疾患および／または障害の予防および／または治療における使用のための、サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に特異的に結合する、アルファボディー、ポリペプチドおよび医薬組成物を提供する。また、特定の実施形態において、本発明は、これらを必要とする対象に、医薬的に活性な量の１個以上の本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび／または医薬組成物を投与するステップを含む、少なくとも１つのサイトカイン／成長因子媒介性の疾患および／または障害の予防および／または治療の方法も提供する。
【００３９】
サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体が関与するサイトカイン媒介性または成長因子媒介性の疾患および／または障害は、限定されるものではないが、炎症性および／または自己免疫性の疾患および障害からなる群より選択できる。より具体的には、この疾患および／または障害は、限定されるものではないが、腸疾患（大腸炎、クローン病、ＩＢＤ）などの炎症および炎症性障害、感染性疾患、乾癬および他の自己免疫疾患（関節リウマチ、多発性硬化症、脊椎関節炎、サルコイドーシス、狼瘡、ベーチェット病など）、移植拒絶反応、嚢胞性線維症、ぜんそく、慢性閉塞性肺疾患、がん、ウイルス感染症、分類不能型免疫不全症から選択される。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
発明の詳細な説明
［定義］
［全般的定義］
本明細書において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特に明記しない限り、単数形および複数形の両方の指示対象を含む。
【００４１】
本明細書において、「含有している（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「から構成されている（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」という用語は、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含有している（含んでいる）（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（含む）（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同じ意味であり、包括的または被限定的であり、追加の、記載されていないメンバー、要素または方法のステップを排除するものではない。
【００４２】
端点による数値範囲の記載は、各範囲内に包含されたすべての数および有理数、ならびに記載されている端点を含む。
【００４３】
本明細書において、「約」という用語は、測定可能な値、例えば、パラメータ、量、時間の持続時間などについて言及する場合、特定の値の、および特定の値から＋／−１０％以下、好ましくは＋／−５％以下、より好ましくは＋／−１％以下、さらにより好ましくは＋／−０．１％以下の変動を、かかる変動が開示の発明を実施するうえで適切である限り、包含することを意味する。修飾語句「約」が言及する値は、それ自体も明確に好ましく開示されていることが理解されるべきである。
【００４４】
本明細書において、「（本発明の）アルファボディー（Ａｌｐｈａｂｏｄｙ）」または「（本発明の）アルファボディー（Ａｌｐｈａｂｏｄｉｅｓ）」は、自己フォールディングしており、単鎖の三本鎖の、α−ヘリックスコイルドコイルを主に有するアミノ酸配列、ポリペプチドまたはタンパク質として、全般に定義することができる。より具体的には、本発明との関係において使用する場合、アルファボディーは、一般式
ＨＲＳ１−Ｌ１−ＨＲＳ２−Ｌ２−ＨＲＳ３
（式中、
・ＨＲＳ１、ＨＲＳ２およびＨＲＳ３は、それぞれ独立して、２〜７個の連続するヘプタッド反復単位からなるヘプタッド反復配列（ＨＲＳ）であり、すべてのヘプタッドのａ位およびｄ位の少なくとも５０％は、イソロイシン残基によって占められており、各ＨＲＳは、ヘプタッドのａ位またはｄ位のいずれかに位置する脂肪族アミノ酸残基または芳香族アミノ酸残基で開始および終了しており、ＨＲＳ１、ＨＲＳ２およびＨＲＳ３は、ともに三本鎖のα−ヘリックスコイルドコイル構造を形成しており；かつ
・Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、ＨＲＳ１とＨＲＳ２とを共有結合的に連結し、ＨＲＳ２とＨＲＳ３とを共有結合的に連結する、以下でさらに定義されるリンカー断片である、
アミノ酸配列、ポリペプチドまたはタンパク質として定義することができる。
【００４５】
本明細書において、「平行アルファボディー」は、三本鎖のα−ヘリックスコイルドコイル構造のα−ヘリックスが、平行コイルドコイル構造、すなわち、３個のα−ヘリックスのすべてが平行であるコイルドコイルをともに形成する（本発明の）アルファボディーの意味を有するものとする。
【００４６】
本明細書において、「逆平行アルファボディー」は、三本鎖のα−ヘリックスコイルドコイル構造のα−ヘリックスが、逆平行コイルドコイル構造、すなわち、２個のα−ヘリックスが平行であり、かつ第３のα−ヘリックスがこれらの２個のヘリックスに対して逆平行であるコイルドコイルをともに形成する（本発明の）アルファボディーの意味を有するものとする。
【００４７】
本明細書におけるさらなる説明から明らかになるように、本発明は、一般式ＨＲＳ１−Ｌ１−ＨＲＳ２−Ｌ２−ＨＲＳ３を有する配列を含有する複数のポリペプチドも想定するが、ある特定の実施形態において、これらポリペプチドは、さらなる基、部分および／または残基を含有し、これらは式ＨＲＳ１−Ｌ１−ＨＲＳ２−Ｌ２−ＨＲＳ３を有する基本アルファボディー構造に共有結合的に連結され、より具体的には、Ｎ末端および／またはＣ末端が共有結合的に連結される。したがって、本明細書において、本発明のアルファボディーを含有するか、または当該アルファボディーからなる「アルファボディーポリペプチド」について全般に言及する。本明細書において、アルファボディーに関して記載される結合特性は、前記アルファボディーを含有しているアルファボディーポリペプチドに全般に適用することもできる。しかしながら、本発明のアルファボディーポリペプチドはコイルドコイルを形成するような、少なくとも１個の（３本のヘリックスからなる）三本鎖へリックス構造の存在により特徴付けられる。
【００４８】
「ヘプタッド」、「ヘプタッド単位」または「ヘプタッド反復単位」という用語は、本明細書において互換的に使用され、本明細書においては、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物の各ヘプタッド反復配列内で２回以上反復される７残基の（ポリ）ペプチド断片の意味を有するものとし、「ａｂｃｄｅｆｇ」または「ｄｅｆｇａｂｃ」（式中、「ａ」から「ｇ」の記号は、通常のヘプタッドの位置を表わす）として表わされる。通常のヘプタッド位置は、例えば、ルパス（Ｌｕｐａｓ）ら〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９１、２５２：１１６２−１１６４；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｕｓｓｅｌｌ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｉｌｓ−ｓｖｒ．ｐｌ〕のＣＯＩＬＳ法などの専門のソフトウェアを使用することによって、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物中に存在するヘプタッド、ヘプタッド単位またはヘプタッド反復単位内の特異的アミノ酸残基に割り当てられている。しかしながら、本発明のアルファボディー（またはこれらのアルファボディーを含有する本発明のポリペプチドおよび組成物）中に存在するヘプタッドまたはヘプタッド単位が、本明細書のさらなる説明により明らかになるように、厳密には、上記表記（すなわち、「ａｂｃｄｅｆｇ」または「ｄｅｆｇａｂｃ」）に限定されるものではなく、それらのもっとも広い意味において、少なくとも割り当て可能なヘプタッドのａ位およびｄ位を含有する７残基（ポリ）ペプチド断片それ自体を構築することに留意すべきである。
【００４９】
「ヘプタッドのａ位」、「ヘプタッドのｂ位」、「ヘプタッドのｃ位」、「ヘプタッドのｄ位」、「ヘプタッドのｅ位」、「ヘプタッドのｆ位」および「ヘプタッドのｇ位」という用語は、それぞれ、本発明のアルファボディーポリペプチドまたは組成物のヘプタッド、ヘプタッド反復またはヘプタッド反復単位における通常の「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」、「ｅ」、「ｆ」および「ｇ」のアミノ酸位置を指す。
【００５０】
本明細書において、「ヘプタッドモチーフ」は、７残基の（ポリ）ペプチドパターンの意味を有するものとする。「ａｂｃｄｅｆｇ」型の「ヘプタッドモチーフ」は、通常、「ＨＰＰＨＰＰＰ」と表わされ得るが、「ｄｅｆｇａｂｃ」型の「ヘプタッドモチーフ」は、通常、「ＨＰＰＰＨＰＰ」で表わされ得、式中、記号「Ｈ」は、非極性アミノ酸残基または疎水性アミノ酸残基を意味し、記号「Ｐ」は、極性アミノ酸残基または親水性アミノ酸残基を意味する。しかしながら、本明細書のさらなる説明から明らかになるように、本発明のアルファボディー（またはこれらのアルファボディーを含有する本発明のポリペプチドおよび組成物）中に存在するヘプタッドモチーフは、厳密には、上記表記（すなわち、「ａｂｃｄｅｆｇ」、「ＨＰＰＨＰＰＰ」、「ｄｅｆｇａｂｃ」および「ＨＰＰＰＨＰＰ」）に限定されるものではないことに留意すべきである。
【００５１】
本明細書において、「ヘプタッド反復配列」（「ＨＲＳ」）は、ｎ個の連続するヘプタッドからなるアミノ酸配列または配列断片の意味を有するものであり、ｎは２以上の数である。
【００５２】
（本明細書において定義された）アルファボディーの単鎖構造との関連において、「リンカー」、「リンカー断片」または「リンカー配列」という用語は、本明細書において互換的に使用され、単鎖アルファボディーの隣接アミノ酸配列の一部であり、そのアルファボディーのＨＲＳ配列を相互に共有結合的に連結するアミノ酸配列断片を指す。
【００５３】
本発明との関連において、「コイルドコイル」または「コイルドコイル構造」は、本明細書において互換的に使用され、当業者には、共通の一般知識ならびに本明細書に引用した説明およびさらなる参考文献に基づき明らかであると思われる。これに関する具体的な参考文献は、コイルドコイル構造に関する総説、例えば、コヘン（Ｃｏｈｅｎ）およびパリー（Ｐａｒｒｙ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １９９０，７：１−１５；コーン（Ｋｏｈｎ）およびホッジ（Ｈｏｄｇｅｓ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９８，１６：３７９−３８９；シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら、Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ  １９９８，３：Ｒ２９−Ｒ４０；ハーブリー（Ｈａｒｂｕｒｙ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８，２８２：１４６２−１４６７；メーソン（Ｍａｓｏｎ）およびアーント（Ａｒｎｄｔ）、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２００４，５：１７０−１７６；ルパス（Ｌｕｐａｓ）およびグリューバー（Ｇｒｕｂｅｒ）、Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００５，７０：３７−７８；ウールフソン（Ｗｏｏｌｆｓｏｎ）、Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００５，７０：７９−１１２；パリー（Ｐａｒｒｙ）、Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ２００８，１６３：２５８−２６９；マクファーレン（ＭｃＦａｒｌａｎｅ）ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００９：６２５：１０１−１０７などを特に参照されたい。
【００５４】
「アルファボディーのα−ヘリックス部分」は、本明細書において、α−ヘリックス二次構造を有するアルファボディーの一部という意味を有するものである。さらに、α−ヘリックス二次構造を有するアルファボディー全体の任意の部分も、アルファボディーのα−ヘリックス部分と考えられる。より具体的には、結合部位との関連において、アルファボディーのα−ヘリックス部分に位置する１個以上のアミノ酸が結合部位に寄与している場合、当該結合部位は、アルファボディーのα−ヘリックス部分により形成されると考えられる。
【００５５】
アルファボディーのα−ヘリックスの「溶媒配向（ｓｏｌｖｅｎｔ−ｏｒｉｅｎｔｅｄ）」または「溶媒曝露」領域は、本明細書において、それが存在する溶媒、環境、周囲または周辺（ｍｉｌｉｅｕ）に直接曝露されるか、または直接接触するアルファボディーの部分の意味を有するものである。さらに、溶媒に直接曝露されるか、または直接接触するアルファボディー全体のうちの任意の部分も、アルファボディーの溶媒配向領域または溶媒曝露領域とみなされる。より具体的には、結合部位との関連において、アルファボディーの溶媒配向部分に位置する１個以上のアミノ酸が結合部位に寄与している場合、結合部位は、アルファボディーの溶媒配向部分によって形成されているとみなされる。
【００５６】
「アルファボディーの溝」という用語は、本明細書において、アルファボディー内の空間的に隣接したα−ヘリックスの任意の対によって形成される、くぼんだ溝様の局所的形状に対応するアルファボディーの部分の意味を有するものとする。
【００５７】
本明細書において、アミノ酸残基は、それらの正式名称によって示されるか、または標準的な３文字もしくは１文字のアミノ酸コードにしたがって示されるであろう。
【００５８】
本明細書において、「相同性」という用語は、同じ分類群または異なる分類群に由来する２個の高分子間、具体的には、２個のポリペプチド間または２個のポリヌクレオチド間の少なくとも二次構造の類似性を表わし、前記類似性は、共通の祖先に起因する。したがって、「ホモログ」という用語は、前記二次構造の類似性、および任意に、三次構造の類似性を有する非常に関連性のある高分子を表わす。２個以上のヌクレオチド配列を比較するために、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間の「配列同一性（のパーセンテージ）」は、当業者に公知の方法を使用することによって、例えば、第１のヌクレオチド中のヌクレオチドであって、第２のヌクレオチド配列における対応する位置のヌクレオチドと同一のヌクレオチドの数を、第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの総数で割り、１００％を乗じることによって、またはシーケンスアライメントのための公知のコンピュータアルゴリズム、例えば、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔなどを使用することによって計算され得る。２個のアルファボディー間の配列同一性の程度を決定する際、当業者であれば、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮することができ、保存的アミノ酸置換は、一般に、あるアミノ酸残基が類似の化学構造の別のアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換であって、ポリペプチドの機能、活性またはその他の生物学的特性に対してほとんど影響を及ぼさないか、あるいは本質的にまったく影響を及ぼさないアミノ酸置換として説明され得る。可能な保存的アミノ酸置換は、当業者には明らかであると思われる。アルファボディーおよび核酸配列は、これらが、それらの全長にわたって１００％の配列同一性を有する場合、「まったく同じもの」であると言われる。
【００５９】
本発明のアルファボディーが、その標的（またはこれらの少なくとも一部もしくは断片）に対する親和性、特異性を有する、および／またはその標的を特異的に対象とする場合、本発明のアルファボディーは、特定の標的「に特異的に結合する」と言われる。
【００６０】
本明細書において、本発明のアルファボディーの「特異性」は、親和性および／またはアビディティに基づいて決定さえ得る。本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物の親和性は、アルファボディー、ポリペプチドまたは組成物と、結合する目的の標的タンパク質との解離に関する平衡定数により表わされる。ＫＤ値が低いほど、アルファボディー、ポリペプチドまたは組成物と、それが結合する目的の標的タンパク質との間の結合力がより強くなる。代替的には、親和性は、１／ＫＤに対応する親和定数（ＫＡ）としても表わされ得る。本発明のアルファボディーの結合親和性は、具体的な目的の標的タンパク質に応じて、当業者に公知の方法で決定され得る。ＫＤが、ｋＯｆｆ（秒−１またはｓ−１で表わされる）で示される複合体の解離速度定数の、ｋＯｎ（モル−１秒−１またはＭ−１ｓ−１で表わされる）で示されるその結合速度定数に対する比として表わされ得ることが、当該技術分野において一般的に公知である。約１ミリモルより大きいＫＤ値は、一般に、非結合または非特異的結合を示すとみなされる。
【００６１】
本発明のアルファボディーの「アビディティ」は、本発明のアルファボディーと目的の関連標的タンパク質との間の結合力の大きさの尺度である。アビディティは、目的の標的タンパク質の結合部位と、本発明のアルファボディーの結合部位との間の親和性、および本発明のアルファボディーに存在する関連結合部位の数の両方に関係するものである。
【００６２】
本発明のアルファボディーは、本発明のアルファボディーが目的の第２の標的タンパク質に結合する親和性に対し、少なくとも５倍、例えば、少なくとも１０倍、例えば、少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍高い親和性で目的の第１のタンパク質に結合する場合、「目的の第２の標的タンパク質にではなく目的の第１の標的タンパク質に対して特異的」であると言われる。したがって、ある実施形態において、アルファボディーが目的の第２の標的タンパク質にではなく目的の第１の標的タンパク質に対して特異的であると言われる場合、アルファボディーは、目的の第１の標的タンパク質に（本明細書において定義したように）特異的に結合するが、目的の第２の標的タンパク質とは結合しないであろう。
【００６３】
本発明のアルファボディーの「半減期」は、一般に、アルファボディーのイン・ビボの血清濃度または血漿濃度が５０％減少するまでに必要な時間として定義することができる。本発明のアルファボディーのイン・ビボ半減期は、当業者に公知の任意の方法、例えば、薬物動態分析によって決定され得る。当業者に明らかであるように、半減期は、ｔ１／２−α、ｔ１／２−βおよび曲線下面積（ＡＵＣ）などのパラメータを使用して表わされ得る。イン・ビボの半減期の増加は、一般に、ｔ１／２−アルファ、ｔ１／２−ベータおよび曲線下面積（ＡＵＣ）の１個以上のパラメータの増加、好ましくは３つすべてのパラメータの増加によって特徴付けられる。
【００６４】
本明細書において、「阻害」、「減少」および／または「抑制」という用語は、目的の標的タンパク質に特異的に結合し、当該目的のその標的タンパク質とその天然の結合パートナーとの間の相互作用を阻害、減少および／または抑制する、本発明のアルファボディー（の使用）を指し得る。また、「阻害」、「減少」および／または「抑制」という用語は、目的の標的タンパク質に特異的に結合し、適切なイン・ビトロアッセイ、細胞アッセイまたはイン・ビボアッセイを使用して測定した場合、当該目的の標的タンパク質の生物学的活性を阻害、減少および／または抑制する、本発明のアルファボディー（の使用）も指し得る。したがって、「阻害」、「減少」および／または「抑制」は、目的の標的タンパク質に特異的に結合し、目的の標的タンパク質が関与する１つ以上の生物学的または生理学的な機序、効果、応答、機能経路または活性を阻害、減少および／または抑制する、本発明のアルファボディー（の使用）も指し得る。本発明のアルファボディーの、アンタゴニストとしてのかかる作用は、目的の標的タンパク質に応じて、任意の適切な様式で、および／または任意の適切な（イン・ビトロおよび普通は細胞性またはイン・ビボの）、当該技術分野において公知のアッセイを使用して決定することができる。
【００６５】
本明細書において使用する場合、「増強」、「増加」および／または「活性化」という用語は、目的の標的タンパク質に特異的に結合し、目的の標的タンパク質とその天然の結合パートナーとの間の相互作用を増強、増加および／または活性化する、本発明のアルファボディー（の使用）を指すことができる。また、「増強」、「増加」および／または「活性化」という用語は、目的の標的タンパク質に特異的に結合し、適切なイン・ビトロ、細胞性またはイン・ビボのアッセイを使用して測定した場合、目的の標的タンパク質の生物学的活性を増強、増加および／または活性化する、本発明のアルファボディー（の使用）を指すことができる。したがって、「増強」、「増加」および／または「活性化」は、目的の標的タンパク質に特異的に結合し、目的の標的タンパク質が関与する１つ以上の生物学的または生理学的な機序、効果、応答、機能経路または活性を増強、増加および／または活性化する本発明のアルファボディー（の使用）を指すこともできる。アゴニストとしての本発明のアルファボディーのかかる作用は、目的の標的タンパク質に応じて、任意の適切な方法で、および／または当該技術分野において公知の任意の適切な（イン・ビトロおよび通常は細胞またはイン・ビボ）アッセイを使用して決定され得る。
【００６６】
本発明のアルファボディーの阻害活性もしくはアンタゴニスト活性または増強活性もしくはアゴニスト活性は、可逆的でもよく、不可逆的であってもよいが、医薬的用途および薬理学的用途においては、通常、可逆的に起こるであろう。
【００６７】
本発明のアルファボディー、ポリペプチド、組成物または核酸配列は、それが産生される宿主細胞および／または培地から抽出または精製されている場合、本明細書においては、アルファボディーに対応する「本質的に単離された（形態）」であるとみなされる。
【００６８】
アルファボディーについては、アルファボディーに存在する「結合領域」、「結合部位」または「相互作用部位」という用語は、本明細書において、アルファボディーに存在するアミノ酸残基の特定の部位、部分、ドメインまたはストレッチであって、標的分子との結合に関与する特定の部位、部分、ドメインまたはストレッチの意味を有するものである。かかる結合領域は、標的分子と接触するアルファボディーの特異的アミノ酸残基から本質的に構成される。
【００６９】
本発明のアルファボディーは、目的のこれらの異なる標的タンパク質の両方に（本明細書において定義したように）特異的である場合、目的の２個の異なる標的タンパク質に対して「交差反応性」を示すと言われる。
【００７０】
本発明のアルファボディーは、アルファボディーが、目的の標的のアミノ酸残基の部位、決定基、部分、ドメインまたはストレッチに対する１個の結合部位またはそれらに特異的に結合する１個の結合部位を含有する場合、「一価」であると言われる。アルファボディーの２個以上の結合部位が、目的の標的のアミノ酸残基の同じ部位、決定基、部分、ドメインまたはストレッチに対するものであるか、またはそれらに特異的に結合する場合、アルファボディーは、「二価」（アルファボディーに２個の結合部位がある場合）または多価（アルファボディーに３個以上の結合部位がある場合）、例えば、三価などであると言われる。
【００７１】
アルファボディーについて言及する場合、「二重特異性」という用語は、ａ）アルファボディーの２個以上の結合部位が、同じ目的の標的に対するものであるか、または当該標的に特異的に結合するが、その標的のアミノ酸残基の同じ部位、決定基、部分、ドメインまたはストレッチに対するものではなく（すなわち、異なる部位、決定基、部分、ドメインもしくはストレッチに対するもの）、またはそれらに特異的に結合しないこと、アルファボディーは、「二重特異性」（アルファボディーに２個の結合部位がある場合）もしくは多重特異性（アルファボディーに３個以上の結合部位がある場合）と言われるか、またはｂ）アルファボディーの２個以上の結合部位が目的の異なる標的分子に対する者であるか、またはそれらに特異的に結合することのいずれかを意味する。「多重特異性」という用語は、３個以上の結合部位がアルファボディーに存在する場合に使用される。
【００７２】
したがって、本明細書において、「二重特異性アルファボディー」または「多重特異性アルファボディー」は、それぞれ、２個または少なくとも２個の結合部位を含有する式（Ｎ−）ＨＲＳ１−Ｌ１−ＨＲＳ２−Ｌ２−ＨＲＳ３（−Ｃ）の単鎖アルファボディーであって、これらの２個以上の結合部位が異なる結合特異性を有する単鎖アルファボディーの意味を有するものとする。したがって、本明細書において、それぞれ２個または３個以上の異なる結合領域が同じ単一ドメインアルファボディー中に存在する場合、アルファボディーは、「二重特異性」または「多重特異性」と考えられる。
【００７３】
本明細書において、「予防および／または治療」という用語は、特定の疾患および／または障害を予防および／または治療すること、特定の疾患および／または障害の発症を予防すること、特定の疾患および／または障害の進行を遅延または回復させること、特定の疾患および／または障害に伴う１つ以上の症状の発症を予防または遅延させること、特定の疾患および／または障害に伴う１つ以上の症状を軽減および／または緩和すること、特定の疾患および／または障害の重症度および／または持続期間を軽減すること、ならびに一般には、治療されているる被験体または患者にとって有益な本発明のアルファボディーの任意の予防効果または治療効果を含む。
【００７４】
本明細書に引用されたすべての文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。特に定義されない限り、専門用語および科学用語などの本発明を開示するのに使用されるすべての用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されている意味を有する。さらなるガイダンスによって、用語の定義は、本発明の教示をより理解するためにを包含される。
【００７５】
［説明の主要部］
本発明者らは、標的結合アルファボディーポリペプチドの作製または製造方法、より具体的には、サイトカイン結合性もしくは成長因子結合性またはサイトカイン受容体結合性もしくは成長因子受容体結合性のアルファボディーポリペプチドを提供する方法を特定している。加えて、標的結合アルファボディーポリペプチドが、従来の結合剤に少なくとも匹敵する親和性で標的に結合することができることを見出した。さらに、標的結合アルファボディーポリペプチドは、アルファボディー足場に関して同定された有利性を維持したままである。アルファボディーは固有の構造を有するだけでなく、当該技術分野において公知の従来の足場（免疫グロブリンおよび非免疫グロブリン）を上回るいくつかの有利性もまた有する。それらの有利性は、限定されるものではないが、それらはサイズが小型で小さく（１０および１４ｋＤａの間であり、これは抗体の１０分の１である）、それらは極めて熱安定性であり（これらは全般に１００℃を超える融解温度を有する）、それらはさまざまなプロテアーゼに対して抵抗性にすることができ、これらは（多重置換が、それらの正確および安定なフォールディングを通常破壊しないであろうという意味で）高度に操作可能であり、タンパク質工学技術を介して再設計されている天然のモチーフに基づく構造を有するという事実を含む。
【００７６】
［発明に関連する記載］
本発明は、サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に結合することができるアルファボディーポリペプチドを提供する。より具体的には、本発明は、アルファボディーへリックスの表面上、またはアルファボディーのリンカー領域により形成されるいずれかのアルファボディーの溝内に主に位置する結合部位により、サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に結合することができるアルファボディーポリペプチドを提供する。
【００７７】
より具体的には、サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体を対象とするアルファボディーポリペプチドが提供され、アルファボディーポリペプチドの結合部位は、
（ｉ）主にアルファボディーポリペプチドの第１のアルファへリックスにおける１個以上のヘプタッドのｅ位と第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｇ位、任意に、アルファボディーポリペプチドの前記第１のアルファへリックスにおける１個以上のヘプタッドのｂ位および／またはアルファボディーポリペプチドの前記第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｃ位、または
（ｉｉ）主にアルファボディーポリペプチドの１個のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ、ｃおよびｆ位、または
（ｉｉｉ）主にアルファボディーポリペプチドの２個の連続するα−ヘリックスを連結するリンカー断片における位置、
のいずれかにより形成される。これを本明細書において以下に詳細に述べる。
より具体的には、アルファボディーポリペプチドに含まれ得るアルファボディーの結合部位は、
（ｉ）主に、アルファボディーの第１のアルファへリックスにおける１個以上のヘプタッドのｅ位および前記第１のアルファへリックスに平行な第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｇ位、任意に、アルファボディーの前記第１のアルファへリックスにおける１個以上のヘプタッドのｂ位および／またはアルファボディーの前記第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｃ位、または
（ｉｉ）主に、アルファボディーの１個のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位、ｃ位およびｆ位、または
（ｉｉｉ）主に、アルファボディーポリペプチドの２個の連続するα−ヘリックスを連結するリンカー断片における位置、
のいずれかに形成される。これを本明細書において以下に詳細に述べる。
【００７８】
［サイトカインのクラスおよび受容体のクラスおよび具体例］
「成長因子」という用語は、通常、当該技術分野において、細胞成長、増殖および細胞分化を刺激できる天然物質を指すために使用される。成長因子はさまざまな細胞過程の制御にとって重要である。「サイトカイン」という用語は、細胞シグナル伝達タンパク質分子として機能する、成長因子のサブクラスクラスを通常指す。サイトカインは時として、構造、機能、分泌細胞タイプまたは標的細胞に基づきインターロイキン、リンホカイン、ケモカイン、トランスフォーミング成長因子およびインターフェロンに分類されるが、この識別は、これらのクラス間の重複を考慮すると時代遅れである。同様に、多くの成長因子に関して、「サイトカイン」または「ホルモン」としての特徴付けが、当該技術分野において生化学者により議論されている。
【００７９】
本発明は、成長因子または成長因子受容体に結合することができるアルファボディーに関する。より具体的には、成長因子は、サイトカインなどの免疫調節性成長因子、または免疫調節に関与する成長因子である。特定の実施形態において、本発明との関連において、目的の成長因子は、Ｉ型の細胞性免疫応答またはＩＩ型の抗体免疫応答を増強する成長因子である。したがって、本発明は、「古典的」サイトカインなどの免疫調節に関与する成長因子に対するアルファボディーを特に対象とするが、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド、インヒビンおよびアクチビンなどの免疫調節性成長因子を含む成長因子に対するアルファボディーもまた対象とする。特定の実施形態において、本発明のアルファボディーまたはアルファボディーポリペプチドは、サイトカイン／成長因子の下記クラスの１つ以上に属するサイトカインまたは成長因子に結合することができる：免疫／ヘマトポイエチンファミリー、ＩＬ−１ファミリー、ＩＬ−１０ファミリー、ＩＬ−１２−ファミリー、ＩＬ−１７−ファミリー、インターフェロンファミリー、（ＩＦＮ）、ＴＮＦファミリー（ＴＮＦ）、血小板由来成長因子ファミリー（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−ベータファミリー（ＴＧＦ−β）および／またはケモカインファミリー。
【００８０】
特定の実施形態において、本発明は、４ヘリックスバンドルフォールドを特徴とするサイトカインおよび成長因子および／またはそれらの受容体を対象とするアルファボディーに関する。実際、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（Ｆｌｔ３）などの成長因子は、サイトカインの４アルファへリックスバンドルファミリー中にも見出される、４へリックスバンドルフォールドの存在により特徴付けられる。
【００８１】
特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドが免疫／ヘマトポイエチンファミリーのサイトカインまたは成長因子に結合する場合、本発明のアルファボディーポリペプチドは、ヘマトポイエチンの下記サブクラスの１つ以上に属する１個以上のサイトカインまたは成長因子に結合することができる：ｇｐ１３０（ＩＬ６ＳＴ）共有ヘマトポイエチン、ＩＬ１３ＲＡ１共有ヘマトポイエチン、ＩＬ１２ＲＢ１共有ヘマトポイエチン、ＩＬ３ＲＢ（ＣＳＦ２ＲＢ）共有ヘマトポイエチン、ＩＬＲＧ共有ヘマトポイエチン。
【００８２】
より具体的には、これらの実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドが免疫／ヘマトポイエチンファミリーのサイトカインまたは成長因子に結合する場合、それらは、カルジオトロフィン１、カルジオトロフィン様サイトカイン因子１、カルジオトロフィン様サイトカイン因子１、毛様体神経栄養因子、インターロイキン１１、インターロイキン６（インターフェロン、ベータ２）、白血病抑制因子（コリン作動性分化因子）、オンコスタチンＭ、インターロイキン４、アイソフォーム１、インターロイキン１３、インターロイキン１２Ａ、インターロイキン２３、アルファサブユニットｐ１９、コロニー刺激因子２、インターロイキン３、インターロイキン５、インターロイキン２、インターロイキン４アイソフォーム１、インターロイキン７、インターロイキン９、インターロイキン１５、プレプロタンパク質、インターロイキン２１、コロニー刺激因子３アイソフォームａ、エリスロポイエチン、成長ホルモン１アイソフォーム１、成長ホルモン２アイソフォーム１、レプチン、プロラクチン、胸腺間質性リンパ球新生因子アイソフォーム１および甲状腺ペルオキシダーゼアイソフォームａからなる群より選択される１個以上のサイトカインと結合することができる。
【００８３】
特定の実施形態において、本発明のアルファボディーまたはアルファボディーポリペプチドがＩＬ−１ファミリーのサイトカインと結合する場合、それらは、インターロイキン１アルファプロタンパク質およびインターロイキン１ベータプロタンパク質からなる群より選択される１個以上のサイトカインと結合することができる。
【００８４】
特定の実施形態において、本発明のアルファボディーまたはアルファボディーポリペプチドがＩＬ−１０ファミリーのサイトカインと結合する場合、それらは、インターロイキン１０、インターロイキン１９アイソフォーム２、インターロイキン２０、インターロイキン２２、インターロイキン２４アイソフォーム１、インターロイキン２８Ａ、インターロイキン２８Ｂおよびインターロイキン２９からなる群より選択される１個以上のサイトカインと結合することができる。
【００８５】
特定の実施形態において、本発明のアルファボディーがＩＬ−１２ファミリーのサイトカインと結合する場合、それらは、インターロイキン１２およびインターロイキン２３からなる群より選択される１個以上のサイトカインと結合することができる。
【００８６】
特定の実施形態において、本発明のアルファボディーまたはアルファボディーポリペプチドがＩＬ−１７ファミリーのサイトカインと結合する場合、それらは、インターロイキン１７、インターロイキン１７Ｂおよびインターロイキン１７Ｅアイソフォーム１からなる群より選択される１個以上のサイトカインと結合することができる。
【００８７】
特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドがインターフェロンファミリーのサイトカインと結合する場合、それらは、インターフェロンアルファ１、インターフェロンベータ１、インターフェロンカッパ、インターフェロンイプシロン１、インターフェロンオメガ１およびインターフェロンガンマからなる群より選択される１個以上のサイトカインと結合することができる。
【００８８】
特定の実施形態において、本発明のアルファボディーまたはアルファボディーポリペプチドが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのサイトカインと結合する場合、それらは、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー７、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１４アイソフォーム１前駆体、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１３アイソフォームアルファプロタンパク質、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１１アイソフォーム１、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー９、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー８、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー４、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１８、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１３ｂ、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１２アイソフォーム１前駆体、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１０、リンホトキシン−ベータアイソフォームａ、リンホトキシンアルファ、ｆａｓリガンド、エクトジスプラシンＡアイソフォームＥＤＡ−Ａ２、神経成長因子、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンドおよびＣＤ４０リガンドからなる群より選択される１個以上のサイトカインと結合することができる。
【００８９】
特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドが血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ファミリーの成長因子と結合する場合、それらは、コロニー刺激因子１アイソフォームａ、上皮成長因子（ベータ−ウロガストロン）、ｆｍｓ−関連チロシンキナーゼ３リガンド、肝細胞成長因子アイソフォーム１プレプロタンパク質、ＫＩＴリガンドアイソフォームｂ、ＰＨドメイン含有タンパク質、血小板由来成長因子ベータアイソフォーム１プレプロタンパク質、血小板由来成長因子Ｃ、血管内皮成長因子Ｂ、血管内皮成長因子Ｃプレプロタンパク質および血管内皮成長因子アイソフォームａからなる群より選択される１個以上の成長因子と結合することができる。
【００９０】
特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドは、Ｆｌｔ３Ｌまたはその受容体Ｆｌｔ３Ｒと結合する。「Ｆｌｔ３」は「Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３」として当該技術分野において公知である。文献中のＦｌｔ３の他の名称は、「Ｆｌｋ−２」（「胎児肝キナーゼ（ｆｅｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｋｉｎａｓｅ）２」）および「ＳＴＫ−１」（「幹細胞チロシンキナーゼ１」）である。「Ｆｌｔ３Ｒ」は、当該技術分野において「Ｆｌｔ３受容体」として公知である。マウスＦｌｔ３／Ｆｌｋ−２受容体は、１９９０年代初期に同定された。〔マシューズ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ）ら、Ｃｅｌｌ，１９９１，６５：１１４３−１１５２；ロズネット（Ｒｏｓｎｅｔ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９１，６：１６４１−１６５０〕。それ以降、マウスＦｌｔ３／Ｆｌｋ−２配列に基づくＤＮＡプローブを使用して、ヒトＦｌｔ３  ｃＤＮＡが単離され、クローン化された〔ロズネット（Ｒｏｓｎｅｔ）ら、Ｂｌｏｏｄ，１９９３，８２：１１１０−１１１９；スモール（Ｓｍａｌｌ）ら、ＰＮＡＳ，１９９４，９１：４５９−４６３〕。Ｆｌｔ３Ｒは、チロシンキナーゼＩＩＩファミリーのメンバーであり、また、チロシンキナーゼＩＩＩファミリーは、ＣＳＦ１−Ｒ（コロニー刺激因子１受容体）、ｃ−ｋｉｔおよびＰＤＧＦ−Ｒα／β（血小板由来成長因子受容体αおよびβ）を含む。これらの受容体は、二量体として活性なバイトピック（ｂｉｔｏｐｉｃ）Ｉ型膜タンパク質である。それらは、５免疫グロブリン様サブドメイン、膜貫通ドメインならびにＡＴＰ−結合部位およびキナーゼドメインを含有する細胞質部分で構成される外部ドメインからなる。二量体リガンドは、これらの受容体の二量体化および活性化に必要である。Ｆｌｔ３Ｒは、造血細胞の増殖、分化およびアポトーシスに関与する。骨髄およびリンパの早期前駆細胞により主に発現される。「Ｆｌｔ３Ｌ」は、当該技術分野において「Ｆｌｔ３リガンド」として公知である。マウスＦｌｔ３Ｌは、Ｆｌｔ３−Ｆｃ融合構築物に結合するその能力によりマウスＦｌｔ３受容体に対する同族タンパク質リガンドとして同定された〔ライマン（Ｌｙｍａｎ）ら、Ｃｅｌｌ，１９９３，７５：１１５７−１１６７；ハナム（Ｈａｎｎｕｍ）、Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３６８：６４３−６４８〕。その結果として、ヒトＦｌｔ３Ｌ  ｃＤＮＡをクローン化した〔ライマン（Ｌｙｍａｎ）ら、Ｂｌｏｏｄ，１９９４，８３：２７９５−２８０１；ハナム（Ｈａｎｎｕｍ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３６８：６４３−６４８〕。今日までに、Ｆｌｔ３Ｌは、Ｆｌｔ３Ｒに対する唯一の公知のリガンドである。Ｆｌｔ３Ｌは、脳組織を除くすべての細胞型において発現される。他の因子（例えば、ＩＬ３、ｃ−ｋｉｔリガンド、ＣＳＦ、ＩＬ７、ＩＬ１１）との相乗作用において、Ｆｌｔ３Ｌは、特定の早期造血前駆細胞の増殖および分化を刺激できる。Ｆｌｔ３系は、樹状細胞の発生においても重要な役割を果たす。
【００９１】
特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドがトランスフォーミング成長因子−ベータファミリー（ＴＧＦ−β）の成長因子と結合する場合、それらはトランスフォーミング成長因子ベータ３、トランスフォーミング成長因子ベータ２、トランスフォーミング成長因子ベータ１、インヒビンベータＣ鎖プレプロタンパク質、インヒビンベータＢサブユニット、インヒビンベータＡ、成長分化因子５プレプロタンパク質、骨形成タンパク質７、骨形成タンパク質２、抗ミュラー管ホルモンおよびアクチビンベータＥからなる群より選択される１個以上の成長因子と結合することができる。
【００９２】
特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドがケモカインファミリーのサイトカインと結合する場合、それらは、ケモカインの以下の１つ以上のサブクラスに属する１個以上のサイトカイン：Ｃサブファミリー、ＣＣサブファミリー、ＣＸＣサブファミリーおよびＣＸ３Ｃサブファミリーに結合することができる。
【００９３】
より具体的には、本発明のアルファボディーポリペプチドがケモカインファミリーのサイトカインと結合する場合、それらは、：ケモカイン（Ｃモチーフ）リガンド１、ケモカイン（Ｃモチーフ）リガンド２、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１４アイソフォーム１、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１５、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２０、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２６、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド３、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド４、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド７、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１１、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１３、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１６、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１７、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１９、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２１、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２２、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２３アイソフォームＣＫベータ８−１、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２４、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２５アイソフォーム１、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２７、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２８、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド５、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド８、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（ストロマ細胞由来因子１）アイソフォームベータ、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１３（Ｂ細胞化学誘引物質）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１６、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド５、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）、インターロイキン８、プロ血小板塩基性タンパク質、血小板因子（ＰＦ）４、ｇｒｏａ、ＭＩＧ、ＥＮＡ−７８、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）Ｉａ、ＭＩＰ  Ｉ単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−１、１−３０９、ＨＣ１４、Ｃ１０、Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−  ｃｅｌｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，Ｓｅｃｒｅｔｅｄ（ＲＡＮＴＥＳ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１０、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド９およびケモカイン（Ｃ−Ｘ３−Ｃモチーフ）リガンド１からなる群より選択される１個以上のサイトカインと結合することができる。
【００９４】
特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドは、１つ以上の下記クラスのサイトカイン受容体または成長因子受容体に属する１個以上のサイトカイン受容体または成長因子受容体：Ｉ型サイトカイン受容体、ＩＩ型サイトカイン受容体、免疫グロブリンスーパーファミリー、腫瘍壊死因子受容体ファミリー、ケモカイン受容体およびＴＧＦベータ受容体に結合することができる。
【００９５】
さらに特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドがＩ型サイトカイン受容体ファミリーのサイトカイン受容体または成長因子受容体に結合する場合、それらは１個以上の下記サイトカイン受容体：Ｉ型インターロイキン受容体、エリスロポイエチン受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体，成長ホルモン受容体、プロラクチン受容体、オンコスタチンＭ受容体および白血病抑制因子受容体に結合することができる。
【００９６】
ある特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドがＩＩ型サイトカイン受容体ファミリーのサイトカイン受容体に結合する場合、それらは１個以上の下記サイトカイン受容体：ＩＩ型インターロイキン受容体、インターフェロン−アルファ／ベータ受容体およびインターフェロン−ガンマ受容体に結合することができる。
【００９７】
ある特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドが免疫グロブリンスーパーファミリーのサイトカイン受容体に結合する場合、それらは１個以上の下記サイトカイン受容体：インターロイキン−１受容体、ＣＳＦ１、Ｃ−ｋｉｔ受容体およびインターロイキン−１８受容体に結合することができる。
【００９８】
ある特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドが腫瘍壊死因子受容体ファミリーのサイトカイン受容体に結合する場合、それらは１個以上の下記サイトカイン受容体：ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ１２０、ＣＤ４０およびリンホトキシンベータ受容体に結合することができる。
【００９９】
ある特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドがケモカイン受容体ファミリーのサイトカイン受容体に結合する場合、それらは１個以上の下記サイトカイン受容体：インターロイキン−８受容体、ＣＣＲ１、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＭＣＡＦ受容体、ＮＡＰ−２受容体、ＣＣケモカイン受容体、ＣＸＣケモカイン受容体、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体およびＸＣケモカイン受容体（ＸＣＲ１）に結合することができる
【０１００】
ある特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドがＴＧＦベータ受容体ファミリーの成長因子受容体に結合する場合、それらは１個以上の下記サイトカイン受容体：ＴＧＦベータ受容体１およびＴＧＦベータ受容体２に結合することができる。
【０１０１】
［ヘテロ二量体サイトカインおよび／またはヘテロ二量体サイトカイン受容体に対するアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物］
本発明の具体的な実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドは、ヘテロ二量体のサイトカインもしくは成長因子（本明細書において定義される）および／またはヘテロ二量体のサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に特異的に結合する。
【０１０２】
広範囲な解釈において、本明細書において使用する場合、「ヘテロ二量体の（１もしくは複数の）サイトカイン〔ｃｙｔｏｋｉｎｅ（ｓ）〕またはヘテロ二量体の（１もしくは複数の）成長因子〔ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｓ）〕」という用語は、少なくとも２個、特定の場合において２個のみのサブユニットを含有する任意のサイトカインまたは成長因子を含む。より具体的には、本明細書において使用する場合、「ヘテロ二量体サイトカインまたはヘテロ二量体成長因子」という用語は、細胞媒介性（ＴＨＩ）免疫に関与するヘテロ二量体のサイトカインまたは成長因子ならびに液性（ＴＨ２）免疫に関与するヘテロ二量体のサイトカインまたは成長因子の両方を包含する。
【０１０３】
さらに特定の実施形態において、アルファボディーポリペプチドは、ヘテロ二量体のサイトカインまたは成長因子に対して与えられ、それによって、サイトカインまたは成長因子のサブユニットに特異的であり、アルファボディーはサイトカインまたは成長因子に特異的である。代替的には、目的のサブユニットは、２個以上のサイトカインまたは成長因子に共通しているサブユニットである。したがって、本発明の特定の実施形態において、特異的サブユニットを対象とするアルファボディーを提供する。
【０１０４】
特定の限定されない実施形態によれば、本発明のアルファボディーポリペプチドは、ｐ１９サブユニットまたはｐ１９様サブユニット、例えば、ＩＬ−２３中に存在するｐ１９サブユニット、ＩＬ−１２およびＩＬ−３５中に存在するｐ３５サブユニットまたはＩＬ−２７中に存在するｐ２８サブユニットもしくはこれらのホモログなどから選択されるサブユニットに特異的に結合する。より具体的には、アルファボディーポリペプチドは、１個以上のこれらのサブユニットを含むサイトカインに結合することができる。さらにより特定の、限定されない実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドは、ヘテロ二量体サイトカインのｐ１９サブユニットまたはｐ１９様サブユニットに特異的に結合する。ｐ３５サブユニットおよびｐ４０サブユニットと比較して、ｐ１９サブユニットまたはｐ１９様サブユニット、例えば、ＩＬ−２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合する本発明のこれらのアルファボディーポリペプチドは、ｐ３５（様）サブユニットまたはｐ４０（様）サブユニットに特異的に結合する本発明のアルファボディーと比較して、予防、治療および／または診断目的に関する有利性を有すると思われる。
【０１０５】
特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドは、ＩＬ−２３のｐ１９サブユニットまたはこれらのホモログに特異的に結合する。
【０１０６】
別の特定の実施形態によれば、本発明のアルファボディーポリペプチドは、ｐ４０サブユニットもしくはｐ４０様サブユニット、例えば、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３中に存在するｐ４０サブユニットまたはＩＬ−２７およびＩＬ−３５中に存在するエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）誘導分子３（ＥＢＩ３）を含むヘテロ二量体サイトカインに特異的に結合する。
【０１０７】
具体的な実施形態によれば、本発明のアルファボディーポリペプチドは、ヘテロ二量体サイトカインのｐ１９サブユニットもしくはｐ１９様サブユニットまたはヘテロ二量体サイトカインのｐ４０サブユニットもしくはｐ４０様サブユニットまたは同じヘテロ二量体サイトカインのｐ１９サブユニットもしくはｐ１９様サブユニットおよびｐ４０サブユニットもしくはｐ４０様サブユニットの両方に特異的に結合する。さらにより特定の実施形態において、本発明のアルファボディーは、ヘテロ二量体サイトカインのｐ１９サブユニットもしくはｐ１９様サブユニットに排他的に結合するが、ヘテロ二量体サイトカインのｐ４０様サブユニットには結合しない。
【０１０８】
ある実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドは、少なくとも１個のｐ１９サブユニットまたはｐ１９様サブユニットおよび少なくとも１個のｐ４０サブユニットまたはｐ４０様サブユニットを含むヘテロ二量体サイトカインに特異的に結合することができる。
【０１０９】
したがって、本発明の具体的な実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドは、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７およびＩＬ−３５からなる群より選択された（本明細書において定義される）ヘテロ二量体サイトカインに特異的に結合する。
【０１１０】
特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドは、ＩＬ−２３に結合する。したがって、一つの具体的な実施形態によれば、本発明のアルファボディーポリペプチドは、ＩＬ−２３のｐ１９サブユニットもしくはＩＬ−２３のｐ４０サブユニットのいずれか、またはＩＬ−２３のｐ４０およびｐ１９サブユニットの両方に特異的に結合する。
【０１１１】
さらに特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドは、ＩＬ−２３のｐ１９サブユニットに特異的および排他的に結合するが、ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットには結合しない。より具体的には、アルファボディーポリペプチドは、ＩＬ−２３に特異的に結合する。かかるＩＬ−２３特異的アルファボディーポリペプチドは、ＩＬ−２３が関与する疾患および／または障害の予防および／または治療にとって興味深い。
【０１１２】
さらに特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドは、配列番号：１〜配列番号：１２７のいずれか１つに対応するアミノ酸配列の少なくとも１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する。
【０１１３】
別の具体的な実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドは、ＩＬ−１２またはこれらのサブユニットに特異的に結合する。より具体的には、本発明のアルファボディーポリペプチドは、ＩＬ−１２のｐ３５サブユニットに結合する。ＩＬ−１２に特異的に結合するかかる本発明のアルファボディーポリペプチドは、ＩＬ−１２が関与する疾患および／または障害の予防および／または治療にとって興味深い可能性がある。
【０１１４】
さらに別の具体的な実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドは、ＩＬ−２７、より具体的には、ＩＬ−２７のｐ２８サブユニットに特異的に結合する。ＩＬ−２７に特異的に結合するかかる本発明のアルファボディーポリペプチドは、ＩＬ−２７が関与する疾患および／または障害の予防および／または治療に使用できる。
【０１１５】
別の具体的な実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドは、ＩＬ−３５に特異的に結合する。特定の実施形態において、それらは、ＩＬ−３５のｐ３５サブユニットに結合する。ＩＬ−３５に特異的に結合する本発明のアルファボディーポリペプチドは、ＩＬ−３５が関与する疾患および／または障害の予防および／または治療に有用である。
【０１１６】
特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドは、１個以上のヘテロ二量体サイトカイン受容体、例えば、限定されるものではないが、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−２３受容体、ＩＬ−２７受容体またはＩＬ−３５受容体などに結合する。
【０１１７】
例えば、特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドは、ＩＬ−２３受容体のＩＬ−２３Ｒサブユニットに結合する。さらなる実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドは、ＩＬ−１２受容体のＩＬ１２Ｒ−β１および／またはＩＬ１２Ｒ−β２サブユニットに結合する。さらなる特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドは、ＩＬ−２７受容体のＩＬ−２７Ｒおよび／またはｇｐ１３０サブユニットに結合する。
【０１１８】
特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドは、ヘテロ二量体サイトカインの少なくとも２個の異なるサブユニットに特異的に結合する。より具体的には、かかる本発明のアルファボディーポリペプチドは、同じヘテロ二量体サイトカインにおいて生じる２個の異なるサブユニットのインターフェイス、例えば、ＩＬ−２３におけるｐ１９／ｐ４０インターフェイスまたはＩＬ−１２におけるｐ３５／ｐ４０インターフェイス、またはＩＬ−２７におけるｐ２８／ＥＢＩ３インターフェイスまたはＩＬ−３５におけるｐ３５／ＥＢＩ３インターフェイスに特異的に結合する。
【０１１９】
さらに、本発明のアルファボディーポリペプチドがヘテロ二量体サイトカイン受容体の少なくとも２個の異なるサブユニットに特異的に結合する場合、本発明のかかるアルファボディーポリペプチドが、同じヘテロ二量体サイトカイン受容体において生じる２個の異なるサブユニットのインターフェイス、例えば、ＩＬ−２３受容体のＩＬ−２３Ｒ／ＩＬ１２−β２インターフェイスまたはＩＬ−１２受容体のＩＬ１２Ｒ−β１／ＩＬ１２Ｒ−β２インターフェイスまたはＩＬ−２７受容体のＬ−２７Ｒ／ｇｐ１３０インターフェイスに特異的に結合することができることは明らかである。
【０１２０】
１個以上のヘテロ二量体サイトカインおよび／または１個以上のヘテロ二量体サイトカイン受容体に結合する本発明のアルファボディーポリペプチドは、任意に、１個以上の他の（非ヘテロ二量体）サイトカインおよび／または１個以上の他の（非ヘテロ二量体）サイトカイン受容体ともさらに結合することができることに留意すべきである。
【０１２１】
本発明者らは、サイトカインまたは成長因子に特異的に結合するアルファボディーポリペプチドの製造方法を同定した。したがって、サイトカイン結合アルファボディーポリペプチドまたは成長因子結合アルファボディーポリペプチドを提供する。アルファボディーポリペプチドが特異的に対象とすることがができるサイトカインまたは成長因子の例は、限定されるものではないが、カルジオトロフィン１、カルジオトロフィン様サイトカイン因子１、カルジオトロフィン様サイトカイン因子１、毛様体神経栄養因子、インターロイキン１１、インターロイキン６（インターフェロン、ベータ２）、白血病抑制因子（コリン作動性分化因子）、オンコスタチンＭ、インターロイキン４、アイソフォーム１、インターロイキン１３、インターロイキン１２Ａ、インターロイキン２３、アルファサブユニットｐ１９、コロニー刺激因子２、インターロイキン３、インターロイキン５、インターロイキン２、インターロイキン４アイソフォーム１、インターロイキン７、インターロイキン９、インターロイキン１５、プレプロタンパク質、インターロイキン２１、コロニー刺激因子３アイソフォームａ、エリスロポイエチン、成長ホルモン１アイソフォーム１、成長ホルモン２アイソフォーム１、レプチン、プロラクチン、胸腺間質性リンパ球新生因子アイソフォーム１、甲状腺ペルオキシダーゼアイソフォームａ、インターロイキン１アルファプロタンパク質およびインターロイキン１ベータプロタンパク質、インターロイキン１０、インターロイキン１９アイソフォーム２、インターロイキン２０、インターロイキン２２、インターロイキン２４アイソフォーム１、インターロイキン２８Ａ、インターロイキン２８Ｂおよびインターロイキン２９、インターロイキン１７、インターロイキン１７Ｂおよびインターロイキン１７Ｅアイソフォーム１、インターフェロンアルファ１、インターフェロンベータ１、インターフェロンカッパ、インターフェロンイプシロン１、インターフェロンオメガ１、インターフェロンガンマ、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー７、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１４アイソフォーム１前駆体、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１３アイソフォームアルファプロタンパク質、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリー、メンバー１１アイソフォーム１、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー９、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー８、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー４、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１８、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１３ｂ、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１２アイソフォーム１前駆体、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１０、リンホトキシン−ベータアイソフォームａ、リンホトキシンアルファ、ｆａｓリガンド、エクトジスプラシンＡアイソフォームＥＤＡ−Ａ２、神経成長因子、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、コロニー刺激因子１アイソフォームａ、上皮成長因子（ベータ−ウロガストロン）、ｆｍｓ−関連チロシンキナーゼ３リガンド、肝細胞成長因子アイソフォーム１プレプロタンパク質、ＫＩＴリガンドアイソフォームｂ、ＰＨドメイン含有タンパク質、血小板由来成長因子ベータアイソフォーム１プレプロタンパク質、血小板由来成長因子Ｃ、血管内皮成長因子Ｂ、血管内皮成長因子Ｃプレプロタンパク質、血管内皮成長因子アイソフォームａ、トランスフォーミング成長因子ベータ３、トランスフォーミング成長因子ベータ２、トランスフォーミング成長因子ベータ１、インヒビンベータＣ鎖プレプロタンパク質、インヒビンベータＢサブユニット、インヒビンベータＡ、成長分化因子５プレプロタンパク質、骨形成タンパク質７、骨形成タンパク質２、抗ミュラー管ホルモン、アクチビンベータＥ、ケモカイン（Ｃモチーフ）リガンド１、ケモカイン（Ｃモチーフ）リガンド２、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１４アイソフォーム１、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１５、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２０、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２６、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド３、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド４、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド７、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１１、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１３、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１６、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１７、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１９、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２１、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２２、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２３アイソフォームＣＫベータ８−１、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２４、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２５アイソフォーム１、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２７、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２８、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド５、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド８、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（ストロマ細胞由来因子１）アイソフォームベータ、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１３（Ｂ細胞化学誘引物質）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１６、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド２、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド５、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）、インターロイキン８、プロ血小板塩基性タンパク質、血小板因子（ＰＦ）４、ｇｒｏａ、ＭＩＧ、ＥＮＡ−７８、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）Ｉａ、ＭＩＰ１単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−１、１−３  ０９、ＨＣ１４、Ｃ１０、Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−  ｃｅｌｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，Ｓｅｃｒｅｔｅｄ（ＲＡＮＴＥＳ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１０、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１１、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド９およびケモカイン（Ｃ−Ｘ３−Ｃモチーフ）リガンド１からなる群より選択されるサイトカインまたは成長因子を含む。
【０１２２】
通常、本発明のアルファボディーポリペプチドは、目的の標的タンパク質と、約１マイクロモル（１μＭ）未満、好ましくは約１ナノモル（１ｎＭ）未満の解離定数（ＫＤ）［すなわち、約１，０００，０００／モル（１０６Ｍ−１、１Ｅ６／Ｍ）以上、好ましくは約１，０００，０００，０００／モル（１０９Ｍ−１、１Ｅ９／Ｍ）以上の結合定数（ＫＡ）で］で結合するものである。約１ミリモルより大きいＫＤ値は、非結合または非特異的結合を示すと一般に考えられている。ＫＤが、ｋＯｆｆ（秒−１またはｓ−１で表わされる）で表わされる複合体の解離速度定数対ｋＯｎ（モル−１秒−１またはＭ−１ｓ−１で表わされる）で表わされるその結合速度定数の割合として表わすことができることは、当該技術分野において一般的に公知である。特に、本発明のアルファボディーポリペプチドは、目的の標的タンパク質と、０．１および０．０００１ｓ−１の間に及ぶｋＯｆｆおよび／または１，０００および１，０００，０００Ｍ−１ｓ−１の間に及ぶの間に及ぶｋＯｎで結合するものである。結合親和性、ｋＯｆｆおよびｋＯｎの速度割合は、当業者に公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ法、等温滴定熱量計、表面プラズモン共鳴、蛍光標識細胞分取分析などを用いて決定することができる。
【０１２３】
本発明の標的結合アルファボディーポリペプチドは、一般式ＨＲＳ１−Ｌ１−ＨＲＳ２−Ｌ２−ＨＲＳ３を含有し、任意に、式Ｎ−ＨＲＳ１−Ｌ１−ＨＲＳ２−Ｌ２−ＨＲＳ３−Ｃをもたらす追加のＮ末端およびＣ末端連結基、残基または部分を含有するアミノ酸配列である。任意選択のＮおよびＣの伸長は、例えば、検出もしくは精製用のタグ（例えば、Ｈｉｓタグ）または別のタンパク質もしくはタンパク質ドメインであってよく、この場合、完全構築物は、融合タンパク質を表わす。明確さの為に、本明細書における任意選択の伸長ＮまたはＣは、単鎖アルファボディー構造の一部を形成するものではないと考えられ、単鎖アルファボディー構造は、一般式「ＨＲＳ１−Ｌ１−ＨＲＳ２−Ｌ２−ＨＲＳ３」で定義される。
【０１２４】
上記のようにアルファボディーのヘプタッド反復配列は、「ａｂｃｄｅｆｇ」または「ｄｅｆｇａｂｃ」として一般に表わされ、「ａ」〜「ｇ」の記号は、従来のヘプタッドの位置を表わす。本発明のアルファボディーの各ヘプタッド単位における「ａ位」および「ｄ位」は、溶媒遮蔽された（すなわち、埋もれた）コア残基が位置している、コイルドコイル構造のアミノ酸残基の位置である。本発明のアルファボディーの各ヘプタッド単位における「ｅ位」および「ｇ位」は、部分的に溶媒曝露されたアミノ酸残基が位置している、コイルドコイル構造のアミノ酸残基の位置である。三本鎖コイルドコイルにおいて、これらの「ｅ位」および「ｇ位」は、空間的に隣接する２個のα−ヘリックス間に形成される溝中に位置し、対応するアミノ酸残基は、一般に「溝残基」と表わされる。本発明のアルファボディーの各ヘプタッド単位における「ｂ位」、「ｃ位」および「ｆ位」は、コイルドコイル構造においてもっとも溶媒曝露された位置である。
【０１２５】
ヘプタッド断片は、通常、真のコイルドコイルアミノ酸配列において何度も反復されるので、先行技術において、ヘプタッドは、「ヘプタッド反復」と称されることもあることに留意すべきである。
【０１２６】
「ａｂｃｄｅｆｇ」型の（本明細書において定義される）ヘプタッドモチーフは、通常、「ＨＰＰＨＰＰＰ」として表わされ、一方、「ｄｅｆｇａｂｃ」型の「ヘプタッドモチーフ」は、通常、「ＨＰＰＰＨＰＰ」で表わされ得、式中、記号「Ｈ」は、非極性アミノ酸残基または疎水性アミノ酸残基を表わし、記号「Ｐ」は、極性アミノ酸残基または親水性アミノ酸残基を表わす。通常、ａ位またはｄ位に位置する疎水性残基は脂肪族アミノ酸残基（例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン）または芳香族アミノ酸残基（例えば、フェニルアラニン）を含む。コイルドコイル配列内のヘプタッドは、極性残基が時として「Ｈ」位に位置し、疎水性残基が「Ｐ位」に位置することもあるので、必ずしも疎水性残基および極性残基の理想的ンパターンに従うものではない。したがって、パターン「ＨＰＰＨＰＰＰ」および「ＨＰＰＰＨＰＰ」は、理想的なパターンおよび特徴的な参照モチーフとして考えるべきである。時として、特徴的ヘプタッドモチーフは、「ＨＰＰＨＣＰＣ」または「ＨｘｘＨＣｘＣ」として表わされ、式中「Ｈ」および「Ｐ」は上記と同じ意味を有し、「Ｃ」は荷電残基（リジン、アルギニン、グルタミン酸またはアスパラギン酸）を表わし、「ｘ」は任意の（非特定）天然アミノ酸残基を表わす。ヘプタッドは、同様に良好にｄ位から出発してもよく、後者のモチーフもまた、「ＨＣＰＣＨＰＰ」または「ＨＣｘＣＨｘｘ」として書くことができる。単鎖アルファボディーは、ヘプタッドのｅ位およびｇ位の荷電（「Ｃ」）残基の間のイオン相互作用の助けを必要としないほど、本来安定であることに留意すべきである。
【０１２７】
（本明細書において定義される）ヘプタッド反復配列（ＨＲＳ）は、ＨＲＳにおけるすべてのアミノ酸残基が、疎水性残基および極性残基の理想的なパターンに厳密に従うとは限らないという前提で、従来のヘプタッドの位置を指す表記法において（ａｂｃｄｅｆｇ）ｎもしくは（ｄｅｆｇａｂｃ）ｎまたはヘプタッドモチーフを指す表記法において（ＨＰＰＨＰＰＰ）ｎもしくは（ＨＰＰＰＨＰＰ）ｎにより表わされる。ヘプタッド反復配列および／またはそれらのインターフェイス、コンセンサスモチーフから逸脱したアミノ酸またはアミノ酸配列を含むこれらのヘプタッド反復配列を同定するために、アミノ酸配列の情報のみが手元にある場合、その時は、ルパス（Ｌｕｐａｓ）ら〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９１，２５２：１１６２−１１６４〕のＣＯＩＬＳ法が、ヘプタッド反復配列およびそれらのインターフェイス、ならびにヘプタッドの位置の割り当ての決定または予測のための適切な方法である。さらに、ヘプタッド反復配列は、一次構造（すなわち、アミノ酸配列）より高レベルで知見に基づき解明され得る。実際、ヘプタッド反復配列は、二次構造情報（すなわち、α−ヘリックス性）または三次構造（すなわち、タンパク質のフォールディング）情報に基づき同定および描写することができる。推定ＨＲＳの通常の特徴は、α−ヘリックス構造である。別の（強力な）基準は、コイルドコイル構造中の配列または断片の意味合いである。規則的なコイルドコイル構造、すなわち、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １９９６，２６：１３４−１４５に記載されたようなスタッター（ｓｔｕｔｔｅｒｓ）またはスタマー（ｓｔａｍｍｅｒｓ）を含まないコイルドコイル構造を形成することが公知である任意の配列または断片が、本明細書においてＨＲＳと考えられる。さらに、より具体的には、ＨＲＳ断片の同定は、高解像度の３−Ｄ構造情報（Ｘ線またはＮＭＲ構造）に基づくことができる。最終的に、限定されるものではないが、相反する明確な証拠が存在しない限り、または特に明記しない限り、任意のＨＲＳ断片のインターフェイスは、（バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンの群より選択される）標準の疎水性アミノ酸残基が位置する第１の（それぞれ最後の）ａ位またはｄ位として定義することができる。
【０１２８】
（本明細書において定義される）アルファボディーの単鎖構造内のリンカーは、ＨＲＳ配列、より具体的には、アルファボディーにおける第１と第２のＨＲＳおよび第２と第３のＨＲＳを相互連結させている。アルファボディーにおける各配列リンカーは、先行するＨＲＳの最後のヘプタッドに続いて開始し、次のＨＲＳの最初のヘプタッドに先行する残基で終了する。ＨＲＳ断片間のジスルフィド架橋もしくは化学的架橋を介した、または一般の、（鎖内結合に対する）鎖間結合の任意の手段を介した連結は、単鎖アルファボディーの定義と矛盾するので、リンカー断片の定義から（少なくともアルファボディーに関連して）明白に除外される。アルファボディーにおけるリンカー断片は、好ましくは立体構造において柔軟であり、α−ヘリックスコイルドコイル構造としての３個のヘプタッド反復配列の緩んだ（妨害されない）会合を確実にする。さらに、アルファボディーとの関連において、「Ｌ１」は、リンカー断片１、すなわちＨＲＳ１およびＨＲＳ２間のリンカーを表わし、一方、「Ｌ２」は、リンカー断片２、すなわちＨＲＳ２およびＨＲＳ３間のリンカーを表わすものとする。本発明のアルファボディーにおける使用に適切なリンカーは、当業者には明らかであり、アルファボディーの特徴的な三次元コイルドコイル構造に影響を与えないという意味で、リンカーが構造的に柔軟であれば、一般にアミノ酸配列を連結する当該技術分野において使用される任意のリンカーであってよい。本発明の特定のアルファボディーにおける２個のリンカーＬ１およびＬ２は、同じであってもよく、異なっていてもよい。本明細書のさらなる開示に基づいて、当業者は、任意に、限られた数の日常的実験の実施後に、本発明の特定のアルファボディーに最適なリンカーを決定することができるであろう。特定の実施形態において、リンカーＬ１およびＬ２は、少なくとも４個のアミノ酸残基、とりわけ少なくとも８個のアミノ酸残基、さらに具体的には少なくとも１２アミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、利便性の理由から選択された重要性の低い上限は、約３０アミノ酸残基である。特定の限定されない実施形態において、好ましくは、リンカー配列のアミノ酸残基の少なくとも５０％は、プロリン、グリシンおよびセリンの群より選択される。さらなる限定されない実施形態において、好ましくは、リンカー配列のアミノ酸残基の少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、例えば、８０％など、より具体的には、９０％は、プロリン、グリシンおよびセリンの群より選択される。他の特定の実施形態において、リンカー配列は、基本的に極性アミノ酸残基から成り、かかる特定の実施形態において、好ましくはリンカー配列のアミノ酸残基の少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、例えば、７０％または８０％など、より具体的には９０％または最大１００％はグリシン、セリン、トレオニン、アラニン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、リジンおよびアルギニンからなる群より選択される。
【０１２９】
本発明の特定の実施形態において、個々のＬ１およびＬ２は、それぞれ独立して、ＨＲＳ１とＨＲＳ２とを、およびＨＲＳ２とＨＲＳ３とを共有結合的に連結するリンカー断片であり、少なくとも４アミノ酸残基からなり、好ましくはその少なくとも５０％がプロリン、グリシン、セリンの群より選択される。
【０１３０】
アルファボディーの「コイルドコイル」構造は、α−ヘリックスヘプタッド反復配列のアセンブリであると考えることができ、ヘリカルヘプタッド反復配列は上記の定義のとおりであり、
−前記α−ヘリックスヘプタッド反復配列は、左巻きの超ねじれ（ｓｕｐｅｒｔｗｉｓｔ）（超らせん）（互いの周りに巻き付いている）で巻き上がっている；
−ａ位およびｄ位のコア残基は、アセンブリのコアを形成し、それらは、ソケットアルゴリズム（Ｓｏｃｋｅｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）〔ウォルシャー（Ｗａｌｓｈａｗ）およびウールフソン（Ｗｏｏｌｆｓｏｎ）、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００１，３０７：１４２７−１４５０〕において定義され、ルパス（Ｌｕｐａｓ）およびグリューバー（Ｇｒｕｂｅｒ）、Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００５，７０：３７−７８において繰り返されたｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ様式で、互いにパックする；
−コア残基は、普通のコアパッキング層にパックされ、この層は、シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら、Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ  １９９８，３：Ｒ２９−Ｒ４０において定義されている。
【０１３１】
本発明のアルファボディーのコイルドコイル構造は、普通の３ヘリックスバンドルと混同されるべきではない。真のコイルドコイルと非コイルドコイルのヘリカルバンドルとの識別の基準は、デスメット（Ｄｅｓｍｅｔ）ら、国際公開第２０１０／０６６７４０Ａ１号およびシュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら、Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ  １９９８，３：Ｒ２９−Ｒ４０に提供され、かかる基準は、本質的に、それぞれ、コイルドコイルおよびヘリカルバンドルのコア残基のパッキングにおける構造対称性の有無に関する。さらに、コイルドコイルおよびヘリカルバンドルに関する左巻きの超らせんの有無は、それぞれ両方のタイプのフォールディングを識別する有用な基準を提供する。
【０１３２】
原則として、前述の基準は、２本鎖、３本鎖、４本鎖およびさらにそれ以上の鎖のコイルドコイルに適用されるが、本発明のアルファボディーは、３本鎖コイルドコイルに限定される。アルファボディーにおけるコイルドコイル領域は、すべてのα−ヘリックスを平行配向〔出願人コンプリックス・エンベー（Ｃｏｍｐｌｉｘ  ＮＶ）による欧州特許出願公開第２１６１２７８号明細書に記載の「平行アルファボディー」に対応する〕または３本のα−ヘリックスのうちの１本を他の２本に対して逆平行（出願人コンプリックス・エンベーによる国際公開第２０１０／０６６７４０号に記載の「逆平行アルファボディー」に対応する）に組織化することができる。
【０１３３】
通常、（本明細書において定義される）アルファボディーのα−ヘリックス部分は、ヘプタッド反復配列と大いに一致するがインターフェイスの近くで違いが存在し得る。例えば、明瞭なヘプタッドモチーフを有する配列断片は、１個以上のヘリックスをゆがめる残基（ｈｅｌｉｘ−ｄｉｓｔｏｒｔｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ）（例えば、グリシンまたはプロリン）の存在により非ヘリカルであり得る。逆に、リンカー断片の部分は、ヘプタッド反復領域の外側に位置しているという事実にもかかわらず、α−ヘリックスであり得る。さらに、１個以上のα−ヘリックスヘプタッド反復配列の任意の部分が、単鎖アルファボディーのα−ヘリックス部分と考えられる。
【０１３４】
（本明細書において定義される）アルファボディー（のα−ヘリックス）の溶媒配向領域は、重要なアルファボディー領域である。アルファボディーにおけるα−ヘリックスの立体配置を考慮して、ヘプタッドのａ位およびｄ位における残基がコアを形成し、溶媒配向領域が、ｂ残基、ｃ残基およびｆ残基により主として形成される。単鎖アルファボディー当たり３つ、すなわち、各アルファへリックス中１個のかかる領域が存在する。かかる溶媒配向領域の任意の部分が、溶媒配向領域であるとも考えられる。また、例えば、アルファボディーのアルファへリックスにおける３個の連続するヘプタッド由来の、ｂ残基、ｃ残基およびｆ残基により構成されるサブ領域も、溶媒配向表面領域を形成するものである。
【０１３５】
アルファボディーにおける隣接する２個のα−ヘリックスの間の溝（の表面）の形成に関係する残基は、一般に、ヘプタッドのｅ位およびｇ位に位置するが、より曝露されたｂ位およびｃ位のいくつか、ならびに大部分が埋もれたコアのａ位およびｄ位のいくつかもまた、溝表面に寄与することができ、このことは、これらの位置に置かれたアミノ酸側鎖のサイズに基本的に依存するものである。前記空間的に隣接するα−ヘリックスが平行に延びている場合、その時は、溝の一方の半分は、第１のヘリックス由来のｂ残基およびｅ残基により形成され、後半は第２のヘリックスのｃ残基およびｇ残基により形成される。前記空間的に隣接するα−ヘリックスが逆平行である場合、その時は２つの可能性が存在する。第１の可能性において、溝の両方の半分がｂ残基およびｅ残基により形成される。第２の可能性において溝の両方の半分がｃ残基およびｇ残基により形成される。３タイプの溝候補が、本明細書においてそれらの主要な溝形成（ｅおよびｇの）残基により表わされ、ヘリックスが平行である場合、その時は、溝はｅ／ｇ溝と称され、ヘリックスが逆平行である場合、その時溝は、ｅ／ｅ溝またはｇ／ｇ溝のいずれかと称される。平行アルファボディーは、３個のｅ／ｇ溝を有し、一方、逆平行アルファボディーは、１個のｅ／ｇ溝、１個のｅ／ｅ溝および１個のｇ／ｇ溝を有する。また、アルファボディー溝の任意の部分も溝領域と考えられる。
【０１３６】
本発明者らは、標的特異的、より具体的には、サイトカインもしくは成長因子またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体特異的アルファボディーおよびかかるアルファボディーを含むアルファボディーポリペプチドを得る方法を同定した。これらの方法は、ランダム・ライブラリー・スクリーニングの概念に基づく。
【０１３７】
［ライブラリーの製造方法］
本発明の標的特異的アルファボディーまたはアルファボディーポリペプチドは、アルファボディーポリペプチドのランダムライブラリーを生成するステップ、およびこのライブラリーを、目的の標的、特に目的のサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に特異的に結合することができるアルファボディーポリペプチドに関してスクリーニングするステップを含む方法により得ることができる。
【０１３８】
本発明の方法の第１ステップは、アルファボディーポリペプチド配列のライブラリー（すなわち、コレクションまたはセット）の作製を含み、アルファボディーポリペプチド配列は、５〜２０個の多様化されるアミノ酸残基位置の、少なくとも１つの所定のセットにおいて互いに異なる。したがって、アルファボディーポリペプチドのライブラリー内の配列は、選択されたセットまたは所定のセットに含まれる特定のアミノ酸位置において互いに異なる。したがって「異なる配列」という用語は、本発明のライブラリーの２個以上のアルファボディーポリペプチド間での、アミノ酸残基位置の所定のセットにおける配列のバリエーションまたは配列相違の発生を指す。
【０１３９】
アルファボディーポリペプチド配列のライブラリーまたはコレクションは、任意の適切な数の異なるアルファボディー（ポリペプチド）配列、例えば、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも１０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１０５個、少なくとも１０６個、少なくとも１０７個、少なくとも１０８個、少なくとも１０９個またはそれ以上の異なる配列の（単鎖）アルファボディーまたはアルファボディーポリペプチドを含むことができる。
【０１４０】
より具体的には、本発明の異なるアルファボディー（ポリペプチド）配列のライブラリーまたはコレクションは、少なくとも１００個の異なる配列のアルファボディーポリペプチド、例えば、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、例えば、少なくとも１０００個、少なくとも１００００個、少なくとも１０５、少なくとも１０６個、少なくとも１０７個、少なくとも１０８個、少なくとも１０９個またはそれ以上の配列を含む。
【０１４１】
特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチド配列のセット、コレクションまたはライブラリー（本明細書において互換的に使用される）は、少なくとも１００個の異なる配列のアルファボディーポリペプチドを含む。
【０１４２】
加えて、本発明の単鎖アルファボディーライブラリーは、これらのライブラリーに含まれる異なる配列の単鎖アルファボディーポリペプチドが所定のセットの少なくとも１個の多様化されるアミノ酸残基位置において、互いに異なることを特徴とする。
【０１４３】
したがって、本明細書において異なる配列の（単鎖）アルファボディーとも称される異なるアルファボディー配列は、所定の、アミノ酸残基位置のすなわち決まったまたはあらかじめ決められたセットにおいて互いに異なるにすぎない本発明のライブラリーに含まれる。
【０１４４】
かかる多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットは、多数の特定のアミノ酸残基位置からなり、作製されたライブラリー内の異なる配列の（単鎖）アルファボディーを互いに比較した場合、これらは、アミノ酸残基の型のバラエティまたは多様性により特徴付けられる。
【０１４５】
異なる配列のアルファボディーのライブラリーに関して「多様化されるアミノ酸残基位置」という表記法は、アルファボディーの前記ライブラリーに由来する異なる配列のアルファボディーの少なくとも２つのアミノ酸配列を互いに比較する場合、少なくとも２個の異なる型のアミノ酸残基（所定の型のアミノ酸残基、例えば、天然型のアミノ酸残基）が位置するアミノ酸残基位置を指す（これらの位置は、ライブラリーの任意の２個の異なる配列のアルファボディーに関しては異ならないが、ライブラリーは、このアミノ酸残基の位置において異なる少なくとも２個の異なる配列のアルファボディーを含有することに留意されたい）。異なる配列のアルファボディーのライブラリーに関して「多様化されるアミノ酸残基位置のセット」は、アルファボディーの前記ライブラリーに由来する異なる配列のアルファボディーの少なくとも２つのアミノ酸配列を互いに比較する場合、少なくとも２個の異なる型のアミノ酸残基が位置するアミノ酸残基の位置のセットを指す（これらの位置は、ライブラリーの任意の２個の異なる配列のアルファボディーに関しては異ならないことに留意されたい）。異なる配列のアルファボディーのライブラリーに関して「多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセット」は、異なる配列のアルファボディーの前記ライブラリーに由来するすべてのアミノ酸配列を同時に互いに比較する場合、少なくとも２個の異なる型のアミノ酸残基が位置するアミノ酸残基位置の特定のセットを指す。したがって、異なる配列のアルファボディーの前記ライブラリーに由来するすべてのアミノ酸配列の同時比較およびかかる同時比較において少なくとも２個の異なる型のアミノ酸残基が位置するアミノ酸残基位置の同定は、アルファボディーライブラリーにおける前記所定のセットの多様化されるアミノ酸残基位置の同定を可能にする。当業者は、配列ライブラリー、例えば、単鎖アルファボディーライブラリー中の配列の決定方法を熟知していると思われることを、本明細書において提起する。アルファボディー配列が、アミノ酸配列レベルまたはこれらのアミノ酸配列を提示（コード）するヌクレオチド配列のレベルの両方で比較することができることをさらに理解されたい。
【０１４６】
２個以上の異なる配列のアルファボディーを比較する好ましい方法は、自動配列アライメントのための公知のコンピュータアルゴリズム、例えば、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔにより生成されるペアワイズまたは多重配列アライメントに基づく。代替的には、２個以上の異なる配列のアルファボディーは、熟練ユーザーにより生成されたペアワイズまたは多重配列アライメントに基づいて比較することもでき、アライメントのかかる方法も、マニュアルの配列アライメントとして公知である。異なる配列のアルファボディーに適用される自動およびマニュアルの配列アライメントの技術の両方は、包括的な配列同一性または包括的な配列類似性（または相同性もしくは一致）の最大化または異なる配列のアルファボディーのコアアミノ酸位置（すなわち、本明細書において定義されるヘプタッドのａ位およびｄ位）の配列同一性もしくは類似性の最大化に基づくことができる。
【０１４７】
したがって、所定のセットの多様化されるアミノ酸残基位置は、アルファボディーライブラリーにおけるすべての異なる配列のアルファボディーのすべて、または少なくとも代表的なサブセットのアミノ酸またはヌクレオチドの配列比較から推定できる。アルファボディーライブラリーの作製において、いわゆる意図的でない変異、挿入または欠失が起こり得ることもまた認められている。かかる意図的でない変異、挿入または欠失は、前記アルファボディーライブラリーを設計または作製する時点では多様化が意図されなかった位置において起こる、ヌクレオチドまたはアミノ酸の変異、挿入または欠失である。当業者によって認識されるように、前記アルファボディーライブラリーが最先端の技術を用いて作製されるという条件において、かかる意図的でない変異、挿入または欠失は、ライブラリー配列内において散発的に、散在している様式で（すなわち、異なる位置において）でのみ起こるであろう。好ましくは、かかる意図的でない変異、挿入または欠失は、所与の位置において、１０％未満、より好ましくは５％未満、より好ましくは２％未満、１％またはさらに１％未満の頻度で起こると思われる。したがって、アルファボディーライブラリー内の意図的でない変異、挿入または欠失は、意図的な配列のバリエーションを示す位置において観察される変動性と比較すると、それらの低頻度に基づき同定することができる。したがって、本発明のアルファボディーライブラリー内の多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットを決定する好ましい方法は、前記ライブラリーの設計または作製についての知識を持たずに、このライブラリー内に含有される配列の少なくとも代表的なサブセットのヌクレオチドまたはアミノ酸の配列を決定するステップ、次いで（好ましくは多重）アライメントにおいてすべての決定された配列を比較するステップ、次いで配列のバリエーションが観察された位置を同定するステップ、次いで、各可変位置において観察されるヌクレオチドまたはアミノ酸残基タイプの頻度を同定するステップ、次いで所与のカットオフパーセンテージより高い変異、挿入または欠失の頻度を有する位置を同定し、（すべての観察された変動が多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットに含まれる場合）このカットオフパーセンテージが１０％、５％、２％、１％またはさらに１％未満、例えば、０．５％、０．１％または０％に設定されるステップによる。代替的には、単鎖アルファボディーライブラリーのもともとの設計または作製についての知識が利用可能であれば、その時は、このライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置のセットは、ライブラリーそれ自体の分析に代わり、前記知識に基づくことが好ましい。多様化位置の選択を含む、単鎖アルファボディーライブラリーの設計方法を以下に説明する。
【０１４８】
本発明の方法に従って、かかる所定のセットにおける多様化されるアミノ酸残基位置の数は、５〜２０個のアミノ酸残基位置に及ぶことができる。したがって、本発明のライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットは、５〜２０個、例えば、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個の所定の多様化されるアミノ酸残基位置を含有することができる。
【０１４９】
本発明の方法において、本発明のライブラリーに含まれる異なる配列のアルファボディーポリペプチドは、かかる５〜２０個の位置の所定のセットの少なくとも１個のアミノ酸残基位置において互いに異なり得る。したがって、例えば、ライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットが１３個の多様化されるアミノ酸残基位置のセットを含む場合、本発明のライブラリーにおける異なる配列のアルファボディーポリペプチドは、これらのアミノ酸残基位置の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個または１３個すべてにおいて互いに異なり得る。したがって、本発明のライブラリーに含まれる異なる配列のアルファボディーポリペプチド配列が、追加の、好ましくは散発的な、意図的でない変異、挿入または欠失が多様化位置の所定のセット以外の位置において起こり得るという条件で、５〜２０個の多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセット中に存在する配列の（１もしくは複数の）相違により互いに識別できることは明らかである。
【０１５０】
コイルドコイルを形成する一般的アルファボディー構造ＨＲＳ１−Ｌ１−ＨＲＳ２−Ｌ２−ＨＲＳ３内で、ヘプタッド反復（ＨＲ）配列１、２および３はそれぞれアルファへリックスを形成する。それぞれヘプタッド反復（ＨＲ）配列１、２および３により形成される、これらの（アルファボディー中に存在する）３個のヘリックスは、それぞれヘリックスクスＡ、ＢおよびＣと称される。ヘプタッド反復配列は、少なくとも２個のヘプタッド配列を含有し、各ヘプタッド配列は、一般的に、（本明細書においてさらに説明するように）「ａｂｃｄｅｆｇ」または「ｄｅｆｇａｂｃ」により表わされる。
【０１５１】
アルファボディー足場を使用して、アルファボディー構造内のアミノ酸多様化のセットの配置に応じて、異なるタイプのアルファボディーライブラリーを作製することができる。多様化されるアミノ酸のセットの配置は、ライブラリー内のアルファボディー上に作製された結合部位のタイプおよび配置を決定する。この関係において、「溝ライブラリー」（結合部位が、アルファボディーの３個のヘリックスのうちの２個のヘリックス間の溝に位置するアミノ酸残基により主に形成される場合）、「表面ライブラリー」（結合部位が、アルファボディーの３個のヘリックスのうちの１個のヘリックスの表面に位置するアミノ酸残基により主に形成される場合）または「ループライブラリー」（結合部位が、アルファボディーの１個以上のループまたはリンカー配列に位置するアミノ酸残基により主に形成される場合）を参照することもできる。
【０１５２】
多様化されるアミノ酸残基位置が、アルファボディーの溝、表面またはループのいずれかに排他的に（すなわち１００％）位置するライブラリーは、本明細書において「純粋溝」、「純粋表面」または「純粋リンカー」ライブラリーと称される。しかしながら、以下に詳細に説明されるように、本方法は、必ずしも「純粋な」溝、表面またはリンカーライブラリーではないアルファボディーライブラリーの使用を想定している。
【０１５３】
本発明の方法の一実施形態において、多様化されるアミノ酸残基位置が、アルファボディーの３個のヘリックスのうちの２個のヘリックスの間の溝に主に位置するアルファボディーライブラリーを使用する。結果として、これらの実施形態において本発明の方法により得られたアルファボディーにおいて、タンパク質との結合部位は、アルファボディーの３個のヘリックスのうちの２個のヘリックス間の溝に位置するアミノ酸残基により主に形成される。
【０１５４】
アルファボディーにおける隣接する２個のα−ヘリックスの間の溝（の表面）の形成に関係する残基は、一般に、ヘプタッドのｅ位およびｇ位に位置するが、より曝露されたｂ位およびｃ位のいくつか、ならびに大部分が埋もれたコアのａ位およびｄ位のいくつかも、溝表面に寄与することができ、このことは、これらの位置に置かれたアミノ酸側鎖のサイズに本質的に依存するものである。
【０１５５】
作製されたアルファボディーの特性（すなわち、平行または逆平行）に応じて、結合部位が溝に位置する標的結合アルファボディーを作製するライブラリーを得るために、アルファボディー配列内の多様化される必要がある位置は、変動するであろう。
【０１５６】
間に結合のための溝が形成されるアルファボディーの空間的に隣接する２個のα−ヘリックスが平行に延びている場合、平行アルファボディーにおけるヘリックスＡおよびＢ、ＡおよびＣまたはＢおよびＣならびに逆平行アルファボディーにおけるヘリックスＡおよびＣの場合のように、その時は、溝に位置する結合部位は、少なくとも第１のヘリックス由来のｅ残基および平行な第２のヘリックス由来のｇ残基により形成され得る。第１のヘリックス由来のｅ残基および平行な第２のヘリックス由来のｇ残基に加えて、結合部位は、任意に、第１のヘリックスにおけるｂ位の残基および／または平行な第２のヘリックスにおけるｃ位の残基によりさらに形成されてもよい。
【０１５７】
したがって、これらの実施形態において、結合部位が溝に位置する、目的のタンパク質を対象とするアルファボディーを得るために、標的特異的アルファボディーの作製に使用されるアルファボディーライブラリーの多様化されるアミノ酸残基位置は、アルファボディーポリペプチドの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位および第１のアルファへリックスに平行な第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｇ位に位置し、任意に、第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位および／またはアルファボディーの平行な第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドｃ位にも位置する。
【０１５８】
本発明の特定の実施形態において、多様化されるアミノ酸残基位置が、アルファボディーポリペプチドの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位および第１のアルファへリックスに平行な第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｇ位ならびに任意に、アルファボディーポリペプチド第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位および／またはアルファボディーポリペプチドの平行な第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドｃ位に主に（すなわち、少なくとも７０％）位置するアルファボディーライブラリーが使用されることが想定される。
【０１５９】
代替的には、または追加として、逆平行に位置づけられる空間的に隣接する２個のα−ヘリックスを含むアルファボディー足場も（これらのヘリックスの間の溝に位置する結合部位が想定される場合）使用できる。これは通常、逆平行アルファボディーにおけるヘリックスＡおよびＢまたはＢおよびＣの場合である。これらの実施形態において、結合部位が溝により形成されることが確実な、多様化されることが必要な多様化されるアミノ酸残基位置のタイプには２つの可能性がある。
【０１６０】
第１の可能性において、２個の逆平行ヘリックスの間の溝は、少なくとも第１のヘリックス由来のｅ残基および逆平行な第２のヘリックス由来のｅ残基により形成される。したがって、溝内に形成される結合部位を得るために、少なくともこれらのアミノ酸残基位置のいくつかは多様化される。第１のヘリックス由来のｅ残基および逆平行な第２のヘリックス由来のｅ残基に加えて、かかる結合部位は、任意に、第１のヘリックスにおけるｂ位の残基および／または逆平行な第２のヘリックスにおけるｂ位の残基によりさらに形成されてもよい。
【０１６１】
したがって、これらの実施形態において、結合部位が溝に位置する本発明のアルファボディーを得るために、多様化されるアミノ酸残基位置が、アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位および第１のアルファへリックスに逆平行な第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位に位置し、任意に、アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位および／またはアルファボディーポリペプチドの第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位に位置するアルファボディーライブラリーが使用される。
【０１６２】
本発明の特定の実施形態において、多様化されるアミノ酸残基位置が、アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位および第１のアルファへリックスに逆平行な第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位ならびに任意に、アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位および／またはアルファボディーの第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位に主に（すなわち、少なくとも７０％）位置するアルファボディーライブラリーが使用されることが想定される。
【０１６３】
逆平行アルファボディー足場において、別の溝が、少なくとも第１のヘリックス由来のｇ残基および逆平行な第２のヘリックス由来のｇ残基により形成される。第１のヘリックス由来のｇ残基および逆平行な第２のヘリックス由来のｇ残基に加えて、かかる結合部位は、任意に、第１のヘリックスにおけるｃ位の残基および／または逆平行な第２のヘリックスにおけるｃ位の残基によりさらに形成されてもよい。
【０１６４】
したがって、これらの実施形態において、結合部位が溝に位置する本発明のアルファボディーを得るために、多様化されるアミノ酸残基位置が、アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｇ位および第１のアルファへリックスに逆平行な第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｇ位に位置し、任意に、アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｃ位および／またはアルファボディーの第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｃ位に位置するアルファボディーライブラリーが使用される。
【０１６５】
本発明の特定の実施形態において、多様化されるアミノ酸残基位置が、アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｇ位および第１のアルファへリックスに逆平行な第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｇ位ならびに任意に、アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｃ位および／またはアルファボディーの第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｃ位に主に（すなわち、少なくとも７０％）位置するアルファボディーライブラリーが使用されることが想定される。
【０１６６】
本発明の方法に使用されるライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置により形成される溝結合部位候補の３タイプは、本明細書において、それらの主要な溝形成残基位置（すなわちｅおよびｇ）により表わされる。
【０１６７】
したがって、結合する溝を形成する隣接する２個のヘリックスが互いに平行に配向している場合、ひいては、この溝はｅ／ｇ溝と称され、それらの２個のヘリックスが互いに逆平行に配向している場合、ひいては、この溝は、ｅ／ｅ溝またはｇ／ｇ溝のいずれかと称される。
【０１６８】
したがって、互いに平行に配向する３個のα−ヘリックスを有する平行アルファボディーが、３個のｅ／ｇ溝を含むことは明らかであろう。他方、互いに平行な２個のα−ヘリックスおよび逆平行に延びる１個のアルファへリックスを含有する逆平行アルファボディーは、１個のｅ／ｇ溝、１個のｅ／ｅ溝または１個のｇ／ｇ溝を含有む。アルファボディーの溝の任意の部分も溝領域とみなされる。
【０１６９】
原則として、「純粋」溝ライブラリーは、かかるライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置が、アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位またはｇ位および第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位またはｇ位、ならびに任意に、アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位もしくはｃ位および／またはアルファボディーの第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位もしくはｃ位にすべて位置することを特徴とするアルファボディーライブラリーである。
【０１７０】
かかるライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置が、排他的ではないが、アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位またはｇ位および第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位またはｇ位、ならびに任意に、アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位もしくはｃ位および／またはアルファボディーの第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位もしくはｃ位にのみ主に位置することを特徴とするアルファボディーライブラリーが、より多くの優れた標的特異的アルファボディーポリペプチドを生じることが、本発明者らにより見出された。したがって、本発明の方法は、かかるライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置が、排他的ではないが、アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位またはｇ位および第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位またはｇ位、ならびに任意に、アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位もしくはｃ位および／またはアルファボディーの第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位もしくはｃ位に主に（すなわち、少なくとも７０％）位置するアルファボディーライブラリーの使用を特に想定する。特定の実施形態において、使用されるアルファボディーライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置は、示された溝形成位置に少なくとも７０％が位置する。さらに特定の実施形態において、ライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置の少なくとも１つは、アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位またはｇ位および第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位またはｇ位、ならびにアルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位またはｃ位およびアルファボディーの第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位またはｃ位に対応する位置以外に位置する。本出願を通して、ヘリックスの位置を参照すると、任意に、アルファボディーポリペプチド中に存在する、アルファボディーの対応するヘリックスを指すことが意図されることは、当業者には明らかであると思われる。
【０１７１】
追加および代替的には、本発明の方法が、結合部位が、アルファボディーの３個のヘリックスのうちの１個のヘリックスの表面により主に形成される、アルファボディーライブラリーの使用を含むことが想定される。したがって、これらの実施形態において、多様化されるアミノ酸残基位置が、アルファボディーの３個のヘリックスのうちの１個以上のヘリックスの表面に主に位置するアルファボディーライブラリーが使用される。かかるアルファボディーライブラリーは、本明細書において、「表面ライブラリー」と称される。
【０１７２】
アルファボディーの表面にあると考えられるアミノ酸残基位置は、ヘリックスＡ、ＢまたはＣのいずれに位置してもよい。もっとも突出し、かつ溶媒配向性の残基は、アルファボディーのそれぞれのα−ヘリックスのｂ、ｃおよびｆ位に位置する。したがって、特定の実施形態において、本発明のアルファボディーライブラリーは、アルファボディーの１個のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位、ｃ位およびｆ位に位置する多様化されるアミノ酸残基位置を含有する。
【０１７３】
原則として、「純粋」表面ライブラリーは、かかるライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置が、アルファボディーの１個のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位、ｃ位およびｆ位にすべて位置することを特徴とするアルファボディーライブラリーである。
【０１７４】
多様化されるアミノ酸残基位置が、排他的ではないが、アルファボディーのアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位、ｃ位およびｆ位にのみ主に位置することを特徴とするアルファボディーライブラリーが、より多くの優れた標的特異的アルファボディーを作製することが、本発明者らにより見出された。したがって、本発明の方法は、かかるライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置が、排他的ではないが、アルファボディーのアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位、ｃ位およびｆ位に主に（すなわち、少なくとも７０％）位置するアルファボディーライブラリーの使用を特に想定する。特定の実施形態において、使用されるアルファボディーライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置は、示された溶媒曝露位置に少なくとも７０％が位置する。さらなる特定の実施形態において、ライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置の少なくとも１つは、アルファボディーのアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位、ｃ位およびｆ位に対応する位置以外に位置する。
【０１７５】
追加または代替的には、本発明の方法が、結合部位が、アルファボディーのα−ヘリックスと相互連結する１個以上のループまたはリンカー配列中に位置するアミノ酸残基位置により主に形成されるアルファボディーライブラリーの使用を含むことが想定される。
【０１７６】
ループ中に位置するアミノ酸残基位置は、ヘプタッド反復配列の間の柔軟なリンカーの１個以上に存在するアミノ酸位置に対応する。逆平行配向におけるアルファボディーの２個のループ（すなわち、ループＡＢおよびループＢＣ）は、アルファボディーコイルドコイルの対向する側に位置づけられる、または位置する。これらのループのいずれかは、ある多様化位置に配列のバリエーションを導入するために使用できる。特定の実施形態において、ループのすべてのアミノ酸残基位置が多様化されたライブラリーが使用される。さらなる特定の実施形態において、このループの中心または中間に位置する残基位置の選択は多様化される。さらなる特定の実施形態において、このループ配列の完全長にわたって、１つおきの残基位置が多様化される。
【０１７７】
「純粋」リンカーライブラリーまたはループライブラリーは、かかるライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置が、アルファボディーのリンカー内にすべて位置することを特徴とするアルファボディーライブラリーである。
【０１７８】
上記のように、多様化されるアミノ酸残基位置が、排他的ではないが、アルファボディー内のリンカー位置にのみ主に位置することを特徴とするアルファボディーライブラリーが、より多くの優れた標的特異的アルファボディーを生成することが、本発明者らにより見出された。したがって、本発明の方法は、かかるライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置が、排他的ではないが、アルファボディーのリンカーの１つに主に（すなわち、少なくとも７０％）位置するアルファボディーライブラリーの使用を特に想定する。特定の実施形態において、使用されるアルファボディーライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置は、示されたリンカー位置に少なくとも７０％が位置する。さらなる特定の実施形態において、ライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置の少なくとも１つは、アルファボディーのアルファへリックスのリンカーまたはループにおけるアミノ酸残基位置以外に位置する。
【０１７９】
したがって、本発明の方法の特定の実施形態において、多様化されるアミノ酸のセットが、それぞれアルファボディーの溝、表面またはループ以外に、結合部位が、排他的ではないが、それぞれその溝、表面またはループにより主に形成されるように位置する、少なくとも１つ、より具体的には、２個以上のアミノ酸残基位置を含有することを特徴とするアルファボディーライブラリーが使用される。これらの実施形態において、それぞれその溝、表面またはループにより主に形成される結合部位を有する、アルファボディーの溝、表面またはループ（すなわちリンカー）内の多様化されるアミノ酸位置のパーセンテージは、１００％未満である。しかしながら、溝、表面またはループ（すなわちリンカー）内に位置するアミノ酸多様化位置のパーセンテージは、通常少なくとも７０％である。
【０１８０】
より具体的には、本発明のいくつかの実施形態において、使用されるライブラリーは純粋な溝、表面またはループライブラリーではない。より具体的には、少なくとも７０％であるがすべてではないアミノ酸多様化位置、例えば、９５％未満、例えば、９０％未満または８５％未満の多様化されるアミノ酸位置が、アルファボディーの溝、表面またはループのいずれかに位置する。
【０１８１】
多様化されたアミノ酸残基位置の数に応じて、上記のパーセンテージは、実際のアミノ酸残基位置の異なる数に対応すると思われる。したがって、上記から明らかであると思われるように、本発明の方法の特定の実施形態において、例えば、少なくとも５％（すなわち、５〜２０個の位置のうちの少なくとも１個の位置）またはこれらの５〜２０個の位置のうちの特別には少なくとも１０％（すなわち、少なくとも１個または少なくとも２個の位置）もしくは特別には少なくとも１５％（すなわち、少なくとも１〜３個の位置）、もしくは特別には少なくとも２０％（すなわち、少なくとも１〜４個の位置）、もしくは特別には少なくとも２５％（すなわち、少なくとも１〜５個の位置）、もしくは特別には３０％（すなわち、２〜６個の位置）が、
ｉ）アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位もしくはｇ位および第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位もしくはｇ位、ならびに任意に、アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位もしくはｃ位および／またはアルファボディーの第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドｂ位もしくはｃ位、例えば、
（ｉ１）アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位および第１のアルファへリックスに平行な第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｇ位、ならびに任意に、アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位および／またはアルファボディー第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｃ位、
または
（ｉ２）アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位および第１のアルファへリックスに逆平行な第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位、ならびに任意に、アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位および／またはアルファボディーの第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位、
または
（ｉ３）アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｇ位および第１のアルファへリックスに逆平行な第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｇ位、ならびに任意に、アルファボディーの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｃ位および／またはアルファボディーの第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｃ位
または
（ｉｉ）アルファボディーの１個のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ、ｃおよびｆ位、または
（ｉｉｉ）アルファボディーの連続する２個のアルファへリックスを連結するリンカー断片における位置、
以外の位置に位置するアルファボディーライブラリーが使用される。
【０１８２】
したがって、ライブラリーにおける異なる配列の（単鎖）アルファボディーは、５〜２０個のアミノ酸残基位置の所定のセットにおいて異なり、各ライブラリーに関して、これらの５〜２０個の位置の少なくとも７０％（すなわち、少なくとも４〜１４個の位置）、例えば、少なくとも７５％（すなわち、少なくとも４〜１５個の位置）、少なくとも８０％（すなわち、少なくとも４〜１６個の位置）、少なくとも８５％（すなわち、少なくとも４〜１７個の位置）、例えば、少なくとも９０％（すなわち、少なくとも５〜１８個の位置）、例えば、少なくとも９５％（すなわち、少なくとも５〜１９個の位置）またはそれ以上、例えば、１００％（すなわち、５〜２０個の位置すべて）が、
（ｉ）隣接する２個のα−ヘリックスにより、もしくはその間に形成される溝中、または
（ｉｉ）１個のアルファへリックスの表面上、または
（ｉｉｉ）ライブラリーにおける各アルファボディーの２個のα−ヘリックスを相互連結するループ／リンカー断片の１つもしくは両方中、
に位置し、
より具体的には、これらの位置は、上記の選択肢のそれぞれに関して列挙された位置に位置する。
【０１８３】
多様化されるアミノ酸残基位置が、溝に主に（すなわち、少なくとも７０％）位置するアルファボディーライブラリーに関して、示されたヘプタッドのｅ位、ｇ位、ｂまたはｃ位以外の場所に位置する残りの多様化された位置は、例えば、ヘプタッドのａ位、ヘプタッドのｄ位、ヘプタッドのｆ位またはα−ヘリックスを相互連結するアルファボディーのリンカーまたはループにおけるアミノ酸残基位置に位置してもよいことに留意すべきである。本発明のアルファボディーの各ヘプタッド単位における（コア残基とも称される）ａ位およびｄ位は、アルファボディーの溶媒遮蔽（すなわち、埋もれた）部分を基本的に形成するコイルドコイル構造のアミノ酸残基位置である。本発明との関係において使用されるもっとも多くの「溝」アルファボディーライブラリーにおいて、これらのコア残基のすべてまたはいくつかは、アルファボディーの安定性を維持するために保存され続けることが想定される。これらの実施形態において、残りの多様化された残基は、例えば、リンカー残基位置またはヘプタッドのｆ位に位置してもよい。
【０１８４】
同様に、多様化されるアミノ酸残基位置がアルファボディーヘリックスの表面に主に（すなわち、少なくとも７０％）位置するアルファボディーライブラリーに関する場合、ヘプタッドのｂ位、ｃ位もしくはｆ位に位置しない、残りの多様化された位置は、例えば、ヘプタッドのｅ位、ｇ位、ａ位もしくはｄ位またはα−ヘリックスを相互連結するアルファボディーのリンカーまたはループにおけるアミノ酸残基位置に位置してもよい。上で詳細に説明したように、本発明との関係において使用されるもっとも多くの「表面」アルファボディーライブラリーにおいて、コア残基（ａ位およびｄ位）のすべてまたはいくつかは、アルファボディーの安定性を維持するために保存され続けることが想定される。本発明のこれらの実施形態において、残りの多様化された残基は、例えば、ヘプタッドのｅ位もしくはｇ位またはリンカー残基位置に位置してもよい。
【０１８５】
最後に、多様化されるアミノ酸残基位置がアルファボディーのリンカーまたはループ配列に主に（すなわち、少なくとも７０％）位置するアルファボディーライブラリーに関して、リンカーまたはループに位置しない残りの多様化される位置は、例えば、ヘプタッドのｅ位、ｇ位、ｆ位、ｂ位、ｃ位、ａ位もしくはｄ位またはアルファボディーの２個のリンカーまたはループとは別のアミノ酸残基位置に位置してもよい。さらに、アルファボディーの各ヘプタッド単位におけるａ位およびｄ位は、いくつかの実施形態において、安定性を確実にするために変動されない。これらの実施形態において、多様化されるアミノ酸残基位置の残りは、ヘプタッドのｅ位、ｇ位、ｆ位、ｂ位もしくはｃ位またはアルファボディーの２個のリンカーまたはループとは別のアミノ酸残基位置に位置してもよい。
【０１８６】
アルファボディーの隣接する２個のα−ヘリックスにより、またはその間に形成される溝中に位置する多様化されるアミノ酸残基位置に関する場合、これらの多様化されるアミノ酸残基位置は、１個の同じ溝、すなわち、ライブラリーに含まれるアルファボディーの隣接する２個の同じα−ヘリックスにより形成される溝中に位置することを意味する。
【０１８７】
同様に、アルファボディーの１個のアルファへリックスに位置する多様化されるアミノ酸残基位置に関する場合、これらの多様化されるアミノ酸残基位置が、ライブラリーに含まれるアルファボディーの１個の同じアルファへリックスに位置することを意味する。
【０１８８】
さらに、連続する２個のα−ヘリックスを相互連結する１個以上のリンカーまたはループ断片に位置する多様化されるアミノ酸残基位置に関する場合、これらの多様化されるアミノ酸残基位置が、ライブラリーに含まれるアルファボディーにおける２個の同じ連続するα−ヘリックスを相互連結する１個以上の同じリンカーまたはループ断片に位置することを意味する。
【０１８９】
しかしながら、異なる溝、表面またはループライブラリーが、本発明の方法における使用と組み合わされることを想定することができる。より具体的には、ヘリックスＣの表面に主に位置する多様化されるアミノ酸を含む表面ライブラリーが、ヘリックスＡの表面に主に位置するアミノ酸多様化を含む表面ライブラリーと組み合わされることを想定することができる。
【０１９０】
したがって、本発明の方法のある特定の実施形態において、２〜６個の異なる構成のライブラリーを含有しているアルファボディーライブラリーの混合物が使用できる。
【０１９１】
本発明との関係において使用されるライブラリーは、アルファボディーポリペプチド間の配列のバリエーションを含み、この配列のバリエーションは、５〜２０個の所定のアミノ酸残基位置に排他的に存在し、これらの位置の少なくとも７０％は、隣接する２個のα−ヘリックス間に形成される溝中、または１個のアルファへリックス中、またはアルファボディーの連続する２個のα−ヘリックスを連結するループ（断片）もしくはリンカー（断片）における位置のいずれかに位置する。実際に、アルファボディー足場の固有の構造的特長を考えると、２つの概念上は異なるタイプのランダム化、すなわち、コイルドコイル領域におけるランダム化およびヘリックス間の非構造化リンカーにおけるランダム化が設計できる。
【０１９２】
本発明の特定の実施形態において、定常の単鎖アルファボディーライブラリー中に存在する単鎖アルファボディーの非多様化部分は、天然のタンパク質配列には対応せず、したがって、非多様化の部分または足場を表わす配列は、非天然起源である。実際は、通常、本発明のライブラリーにおけるアルファボディーの定常の非多様化部分は、人工の配列である。
【０１９３】
本発明の方法における使用のための、上記のように多様化を含むアルファボディーライブラリーが、通常、組換えＤＮＡ技術により作製されることは、当業者には理解されるものであろう。より具体的には、それぞれが特定のアミノ酸位置において異なるアルファボディーをコードする核酸配列のライブラリーは、鋳型配列の部位特異的またはランダムな変異誘発により得ることができる。当業者に認められるであろうように、ランダムなアミノ酸残基は、例えば、「ＮＮＫ」または「ＮＮＳ」コドンを、前記アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列における対応する位置に選択（導入）するステップにより、アミノ酸配列中の特定の位置に導入することができる。
【０１９４】
したがって、（部分的に）ランダム化された単鎖アルファボディーライブラリーの生成は、鋳型または標準または参照のアルファボディー足場配列内の特定の位置の（部分的）ランダム化を必要とする。ライブラリー作製のかかる方法は当業者に公知であり、商業サービスがかかるライブラリーの作製に利用可能である。目的の位置の関連アミノ酸残基を決定する１もしくは複数のヌクレオチド〔ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ｓ）〕は、例えば、異なるアルファボディーをコードする配列のライブラリーを得るようなさまざまな方法で変異させる。
【０１９５】
鋳型アルファボディー足場配列は、その（ほぼ）最適な物理化学的特性に基づき選択された参照アルファボディーの配列である。国際公開第２０１０／０６６７４０号中の実施例において実証されるように、単鎖アルファボディーは、高い熱（すなわち熱力学的）安定性、高溶解度、ｐＨ変動に対する高い耐性および重要なことには、アミノ酸配列のバリエーションに対する高い忍容性を、全般に有する。
【０１９６】
本発明の方法に使用されるライブラリーにおいて想定される多様化は、天然および合成のアミノ酸残基の両方を包含することが想定される。しかしながら、本発明の特定の実施形態において、多様化されるアミノ酸残基位置、すなわち、この位置において本発明のライブラリーに含まれる異なる配列のアルファボディーポリペプチドは互いに異なり、この位置は、天然型アミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニン、リジン、トレオニン、セリン、システイン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびバリンにより排他的に占められる。
【０１９７】
本発明のアルファボディーに結合するサイトカインもしくは成長因子またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体結合アルファボディーを得るために、本発明の方法は、単鎖アルファボディーライブラリーから、目的のサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に対する検出可能な結合親和性またはこれらに対する検出可能なイン・ビトロ活性を有する少なくとも１個の単鎖アルファボディーを選択するステップをさらに含む。
【０１９８】
標的タンパク質に対するアルファボディーの結合をスクリーニングする方法は、当該技術分野において公知であり、以下に詳細に説明する。アルファボディーライブラリーのスクリーニングはさまざまな方法で実施することができ、このスクリーニング方法は、アルファボディーライブラリーが提供される形態に適合されるものであることに留意すべきである。
【０１９９】
実際には、本発明の方法に使用されるアルファボディーライブラリーは異なる形態で提供されてよく、限定されるものではないが、タンパク質ライブラリー、核酸ライブラリー、ベクターライブラリーまたは宿主細胞ライブラリーであってよい。
【０２００】
特定の実施形態において、本発明との関係において使用されるライブラリーは宿主細胞のライブラリーであり、このライブラリーにおいて各宿主細胞は、本発明の単鎖アルファボディーライブラリーをコードする核酸ライブラリーもしくはベクターライブラリーの少なくとも１つのメンバーまたは本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物を含む。より具体的には、本ライブラリーは、アルファボディーが発現される宿主細胞のライブラリーである。
【０２０１】
特定の実施形態において、ライブラリーのアルファボディーは、目的のタンパク質に対する検出可能な結合親和性または検出可能なイン・ビトロ活性を有する所望のアルファボディー配列を単離するためのスクリーニングまたは選択を容易にするように、ファージ粒子、リボソーム、細菌、酵母細胞、哺乳動物細胞または任意の他の適切な（微）生物の表面にディスプレイされる。多様化されたポリペプチド配列またはかかるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（のセット、コレクションまたはライブラリー）をディスプレイおよび選択またはスクリーニングするための、アルファボディーに適用可能な方法、技術および宿主生物は、当業者には公知である。かかる方法は、例えば、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１５：２９−３４，１９９７；Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１２：３９５−３９９，２００１；Ｌｉｐｏｖｓｅｋ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２９０：５１−６７，２００４；Ｒｅｉｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３３：ｅ１０，２００５；Ｌｅｖｉｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，Ｍｏｌ  ＢｉｏＳｙｓｔ，２：４９−５７，２００６；Ｂｒａｔｋｏｖｉｃ，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６７：７４９−７６７，２０１０に記載されている。
【０２０２】
例えば、ファージライブラリーディスプレイの技術およびファージディスプレイ技術を用いた選択は、利用可能なもっとも強固で用途の広い選択技術の１つ（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：３８６−３９０，１９９０；Ｂｒａｔｋｏｖｉｃ，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６７：７４９−７６７，２０１０）なので、それは、タンパク質特異的結合剤のハイスループットな同定に関する方法として選択することができる。この技術の主要な有利性は、遺伝子型（すなわち、ディスプレイされたタンパク質をコードするカプセル化されたＤＮＡ）と、表現型（すなわち、ディスプレイされたタンパク質、例えば、本発明のアルファボディー）とのカップリングであり、これにより、１００万から１兆のポリペプチド変異体を有する大型ライブラリーから、比較的単純なイン・ビトロアッセイで親和性に基づく選択が可能になる。
【０２０３】
ある特定の実施形態において、本発明の方法は、単鎖アルファボディーライブラリーを単離するステップをさらに含むことができる。このことは、核酸ライブラリーまたはベクターライブラリーを、適切な条件下で発現させるステップ、および宿主細胞および／または培地から、産生されたアルファボディーを単離するステップにより確実にできる。
【０２０４】
ある特定の実施形態において、本発明は、目的のサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に対する検出可能な結合親和性または検出可能なイン・ビトロ活性を有する、少なくとも１個の単鎖アルファボディーポリペプチドの製造方法であって、少なくとも１００個の異なる配列の単鎖アルファボディーポリペプチドを含む単鎖アルファボディーライブラリーを作製するステップを少なくとも含み、前記アルファボディーポリペプチドが、５〜２０個の多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットの少なくとも１つにおいて互いに異なり、前記多様化されるアミノ酸残基位置の少なくとも７０％が、：
（ｉ）アルファボディーポリペプチドの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位もしくはｇ位および第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位もしくはｇ位、ならびに任意に、アルファボディーポリペプチドの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位もしくはｃ位および／またはアルファボディーポリペプチドの第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位もしくはｃ位に、例えば、より具体的には：
（ｉ１）アルファボディーポリペプチドの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位および第１のアルファへリックスに平行な第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｇ位、ならびに任意に、アルファボディーポリペプチドの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位および／またはアルファボディーポリペプチドの第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｃ位、
または
（ｉ２）アルファボディーポリペプチドの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位および第１のアルファへリックスに逆平行な第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位、ならびに任意に、アルファボディーポリペプチドの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位および／またはアルファボディーポリペプチドの第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位、
または
（ｉ３）アルファボディーポリペプチドの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｇ位および第１のアルファへリックスに逆平行な第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｇ位、ならびに任意に、アルファボディーポリペプチドの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｃ位および／またはアルファボディーポリペプチドの第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｃ位
または
（ｉｉ）アルファボディーポリペプチドの１個のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位、ｃ位およびｆ位、または
（ｉｉｉ）アルファボディーポリペプチドの連続する２個のアルファへリックスを連結するリンカー断片における位置、
のいずれかに位置する製造方法を提供する。
【０２０５】
例えば、単鎖アルファボディーライブラリーの作製は、少なくとも１００個の異なる配列のメンバーの核酸ライブラリーまたはベクターライブラリーを作製するステップを含むことができ、各メンバーは単鎖アルファボディーを含むポリペプチドをコードし、コードされた異なる配列のアルファボディーポリペプチドは、５〜２０個の多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットの少なくとも１つにおいて互いに異なる。特定の実施形態において、これらの多様化されるアミノ酸残基位置のすべてではないが、少なくとも７０％が、
（ｉ）アルファボディーポリペプチドの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位もしくはｇ位および第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｅ位もしくはｇ位、ならびに任意に、アルファボディーポリペプチドの第１のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位もしくはｃ位および／またはアルファボディーポリペプチドの第２のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位もしくはｃ位、または
（ｉｉ）アルファボディーポリペプチドの１個のアルファへリックスにおけるヘプタッドのｂ位、ｃ位およびｆ位、または
（ｉｉｉ）アルファボディーポリペプチドの連続する２個のアルファへリックスを連結するリンカー断片における位置、
のいずれかに位置する。
【０２０６】
適切な宿主細胞におけるこれらのアルファボディーの発現により、アルファボディーポリペプチドライブラリーが得られる。したがって、ランダムライブラリーの作製は、当業者に公知のさまざまな方法で達成できる。例えば、ファージミドディスプレイ〔カイ（Ｋａｙ）ら、Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、カイ（Ｂ．Ｋ．Ｋａｙ）ら、１９９６，ＩＳＢＮ  ０−１２−４０２３８０−０〕を使用して、所与のアルファボディーライブラリーは、それぞれが、マイナーコートタンパク質ｐＩＩＩと融合されたアルファボディーライブラリーのメンバーを含む融合タンパク質をコードする、ファージミドのコレクションにより提示され得る。これらのファージミドは、適切なＥ．ｃｏｌｉ細胞（例えば、ＴＧ１）内に、エレクトロポレーションまたは他の手段により導入することができる。ヘルパーファージによる感染を使用して、アルファボディー融合タンパク質をディスプレイする（さらにファージミドゲノムもパッケージングする）ファージが作製される。これらのファージを使用して、所与の標的に対する結合剤を選択でき、選択されたファージは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に感染させることより増殖させることができる。
【０２０７】
したがって、さらに、目的のサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に対する検出可能な結合親和性または検出可能なイン・ビトロ活性を有する少なくとも１個の単鎖アルファボディーの製造方法は、通常、前記核酸ライブラリーまたはベクターライブラリーを、前記単鎖アルファボディーライブラリーの作製に適切な条件下で発現させるステップを含む。
【０２０８】
これらの製造方法のある実施形態において、核酸ライブラリーまたはベクターライブラリーを発現させるステップは、核酸ライブラリーまたはベクターライブラリーを、好ましくは、それぞれの宿主細胞が、前記核酸ライブラリーまたはベクターライブラリーの多くても１つの要素または分子を含むように、宿主細胞に導入するステップおよび宿主細胞を、単鎖アルファボディーライブラリーの作製に適切な条件下で、培地において培養するステップを含む。
【０２０９】
［標的特異的アルファボディーを作製するためのスクリーニングステップ］
加えて、目的のサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に対する検出可能な結合親和性または検出可能なイン・ビトロ活性を有する少なくとも１個の単鎖アルファボディーを作製するための本発明の方法は、前記単鎖アルファボディーライブラリーから、目的の前記サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に対する検出可能な結合親和性または検出可能なイン・ビトロ活性を有する少なくとも１個の単鎖アルファボディーを選択する、さらなるステップを含む。
【０２１０】
本明細書に記載の方法の選択ステップが、選択方法として周知の方法を用いて、またはスクリーニング方法として周知の方法を用いて実施できることが理解されるであろう。望ましい要素および望ましくない要素の両方を含む元々の集合体（すなわちアルファボディーライブラリー）から、望ましい要素（すなわちアルファボディーライブラリーのメンバー）の同定およびその後の単離（すなわち選択ステップ）の両方の方法が想定される。選択方法の場合、ライブラリーメンバーは、通常、所望の特性を適用して所望の目標を得るステップにより単離されるものであり；かかる場合、所望の特性は、通常、所定の目的のサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に対する高い親和性に限定されており、所望の目標は、かかる高親和性のライブラリーメンバーを、他からの単離することに限定されている。かかる方法は、一般に、親和性選択方法として公知であり、本発明との関連において、かかる親和性選択方法は、目的のサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体またはこれらのサブドメインもしくはサブ領域に対する高い親和性を有するアルファボディーを選択する目的で、単鎖アルファボディーに適用されるものである。同様に、速度論的特性、例えば、所定の目的のサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体との結合に関する高いオン速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）または適切な選択条件（例えば、インキュベーション時間の短さもしくは洗浄サイクルの長さまたはライブラリーの選択技術の当業者に公知の他の条件）を調整することによる、前記標的に結合するライブラリーメンバーの低いオフ速度などに関して選択することが可能である。代替的には、スクリーニング方法の場合、ライブラリーメンバーは、すべてのライブラリーメンバーまたはライブラリーメンバーの少なくとも実質的コレクションが、所与の所望の特性に関して個別に試験され、かかる所望の特性を有するメンバーが保持され、一方、かかる所望の特性を有さないメンバーは廃棄されるステップにより通常単離されるものであり、かかる場合および本発明との関連において、所望の特性は、目的のサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体またはこれらのサブドメインもしくはサブ領域に対する高い親和性、または機能活性、例えば、目的のサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体の活性の阻害、減少および／または抑制を含む抗サイトカインもしくは抗成長因子の活性のいずれかに関し得る。したがって、本発明の方法の選択ステップは、（親和性）選択技術または親和性に基づく、もしくは活性に基づく機能性スクリーニング技術のいずれかにより達成することができ、両方の技術が、本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの非選択アルファボディーと比較して有利な（好ましい、望ましい、優れた）親和性または活性の特性を有する１個以上の単鎖アルファボディーの選択をもたらすことが提起される。
【０２１１】
特定の実施形態において、この選択ステップは、本発明の単鎖アルファボディーライブラリーもしくは本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物と、目的のサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体とを接触させるステップ、ならびに標的分子およびライブラリー中に存在するアルファボディーの間の結合を決定するステップを含む。
【０２１２】
したがって、特定の実施形態において、標的特異的アルファボディーの製造方法は、目的の標的分子（すなわち、サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体またはこれらの断片）と接触させた単鎖アルファボディーライブラリーもしくは単鎖アルファボディーライブラリーの混合物から、目的のサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に対する検出可能な結合親和性を有する１個以上の単鎖アルファボディーを同定するステップを含む。標的分子または目的のタンパク質に対するアルファボディーの特異的結合は、例えば、バイオパニング、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析および／または競合結合アッセイ、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイならびに当該技術分野において公知のこれらのさまざまな変形を含む、それ自体が公知の任意の適切な様式で決定することができる。
【０２１３】
バイオパニングは、周知の反復型の選択／スクリーニング方法であり、さまざまな分子（例えば、アルファボディーライブラリー）の初期集団を、選択標的に対する親和性を有する分子に濃縮する。もっとも多くの場合、分子の初期集団は、典型的なディスプレイビヒクル、例えば、バクテリオファージ上にディスプレイされるが、この技術は必ずしもこのタイプのディスプレイには限定されない。標的は、直接バイオパニングプロトコルにおいて、通常固定される。標的の固定化は、当該技術分野において公知の多数のさまざまな方法により実施することができる。固体支持体の例は、マイクロタイタープレートまたはチューブ（例えば、Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｐｌａｔｅｓ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｔｕｂｅｓ、Ｎｕｎｃ）または磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。標的は、プラスチックまたはビーズ（表面活性化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ２７０  Ｅｐｏｘｙ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に直接コーティングされても、または標的がビオチン化されている場合、ストレプトアビジンを介して（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｔ１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）コーティングされても、いずれでもよい。
【０２１４】
他のタグ、例えば、Ｈｉｓ−タグを使用して標的を捕捉してもよく、標的に対する抗体を使用して支持体上の標的を捕捉してもよい。これらの代替のタグもまた、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｈｉｓ−ｔａｇ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にカップリングされたプロテインＡもしくはプロテインＧと混合可能である。標的を磁気ビーズに固定化するために、各特異的ビーズタイプに関して、製造業者の推奨に従った。
【０２１５】
可溶性バイオパニングプロトコルにおいて、標的は、ファージライブラリーと一緒にインキュベーション後に固体支持体に捕捉される。誤解を避けるために、この捕捉は間接的であってよい。例えば、溶液中のインキュベーション期において、標的は、特定の生物学的対象ではない標的の領域に結合する、ビオチン化化合物に結合されてもよい。次いで、捕捉ステップは、このビオチン化化合物をストレプトアビジンコーティング磁気ビーズにトラップするステップ、その結果、標的に結合したファージを間接的に捕捉するステップから成ってもよい。標的−ファージ相互作用は、溶液中で実施される。非結合ファージを洗い流すことができるように、標的は、固体支持体に固定化される必要がある。可溶性バイオパニング法における標的の固定化は、直接バイオパニングプロトコルにおける固定化の実現性と同一である。
【０２１６】
古典的なバイオパニングプロトコルは、標的およびライブラリーのタイプに応じて、２回、３回から５回またはそれ以上のスクリーニングラウンドからなる。各選択ラウンドは、さまざまなステップ：（１）選択標的の支持体への固定化ステップ。バイオパニングは、標的が非固定化であるが溶液中に保持されている（可溶性標的の場合）または細胞に固定されたまま（例えば、膜に固定された受容体の場合）であるフォーマットにおいても実施可能なので、このステップは任意選択である。（２）ライブラリーを、標的と一緒にインキュベーションするステップ、（３）非特異的結合剤を除去するための洗浄ステップ、（４）任意に、結合剤を溶出するステップ、および（５）ステップ（４）または（ステップ（４）が連続スクリーニングラウンドにおいて省かれた場合）ステップ（３）から溶出された結合剤の増幅から通常なる。１から５のステップを２回、３回、４回またはそれ以上の回数繰り返し、初期ライブラリーから標的特異的結合剤を単離する。バイオパニング後、さまざまな選択ラウンドにより単離された結合剤の標的特異性を、ＥＬＩＳＡアッセイまたは類似のアッセイにおいて通常分析する。選択またはスクリーニングのためにもっとも一般的に使用されるディスプレイライブラリーのタイプは、ライブラリーメンバーが、ディスプレイされたペプチドまたはタンパク質が、ディスプレイされたペプチドまたはタンパク質のコード情報を含有するビヒクル（ファージ、細胞、ＲＮＡなど）に結合、融合または固定されたフォーマットにおいてディスプレイされるライブラリーである。
【０２１７】
したがって、特定の実施形態において、本発明との関係において使用されるアルファボディーライブラリーは、ファージライブラリーとして提供され、結合アルファボディーは、ファージと標識された標的分子とを接触させ、その後、標識され、結合された標的の検出または選択されたコレクションにより回収されることによって同定される。通常、ビオチン化標的を使用することができ、それによって、標的に結合するアルファボディーを産生するファージが、標的がストレプトアビジンによりコーティングされた支持体（例えば、磁気ビーズ）により捕捉される。
【０２１８】
本発明の特定の実施形態において、目的のタンパク質に対する（本明細書において定義される）検出可能な結合親和性を有する１個以上の単鎖アルファボディーを作製する方法の選択ステップは、目的のタンパク質と、本発明の単鎖アルファボディーライブラリーもしくは単鎖アルファボディーライブラリーの混合物とを接触させるステップおよび続いて、タンパク質と接触させた単鎖アルファボディーライブラリーもしくは単鎖アルファボディーライブラリーの混合物から、目的のタンパク質に対する検出可能な結合親和性を有する１個以上の単鎖アルファボディーを同定するステップの反復実行により、目的のタンパク質に対する検出可能な結合親和性を有する単鎖アルファボディーに関して、アルファボディーライブラリーまたはアルファボディーライブラリーの混合物を（さらに）濃縮するステップを含んでよい。
【０２１９】
目的の標的タンパク質と相互作用させることにより、検出可能なイン・ビトロ活性を有する単鎖アルファボディーを選択するステップは、通常、
ａ）本発明の単鎖アルファボディーライブラリーまたは単鎖アルファボディーライブラリーの混合物と、目的のサイトカインもしくは成長因子またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体またはこれらの断片とを接触させるステップ、および
ｂ）単鎖アルファボディーライブラリーまたは単鎖アルファボディーライブラリーの混合物から、目的のサイトカインもしくは成長因子またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に対する検出可能なイン・ビトロ活性を有する１個以上の単鎖アルファボディーを同定するステップ、
を含む。
【０２２０】
より具体的には、サイトカイン受容体または成長因子受容体は、膜固定受容体、可溶性受容体または前記サイトカイン受容体もしくは成長因子受容体の１個以上の外部ドメインを含む分子であってよい。
【０２２１】
より具体的には、本発明との関連において、サイトカインもしくは成長因子の活性またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体の活性に対する効果は、当該技術分野において公知の方法により測定することができる。より具体的には、このことは、公知のサイトカイン媒介性、または成長因子媒介性効果に対するアルファボディーの効果をイン・ビトロで決定するステップを含む。例えば、目的のケモカインを対象とするアルファボディーの効果は、走化性アッセイにおいて、走化性細胞を使用して測定することができる。さらに、例えば、目的のサイトカインまたは成長因子を対象とするアルファボディーの効果は、前記サイトカインまたは成長因子と、その活性、成長または分化が、前記サイトカインまたは成長因子に（正または負に）応じている所与の標的細胞とをインキュベートするステップ、およびアルファボディーの不在下または存在下での、標的細胞の生物学的活性（代謝、成長、分化、アポトーシスまたは他の機能特性）を決定するステップにより測定することができる。
【０２２２】
本明細書に記載の選択方法は、スクリーニング方法として実施することもできることが理解されるであろう。したがって、本記載において「選択」という用語は、選択、スクリーニングまたは選択および／またはスクリーニングの技術の任意の適切な組み合わせを含んでよい。
【０２２３】
［単離］
いくつかの場合において、本発明の方法は、単鎖アルファボディーライブラリーから、目的のサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に対する検出可能な結合親和性または検出可能なイン・ビトロ活性を有する、少なくとも１個の単鎖アルファボディーを単離するステップをさらに含むことができる。
【０２２４】
本発明の方法は、目的のサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に対する検出可能な結合親和性または検出可能なイン・ビトロ活性を有する、少なくとも１個の単鎖アルファボディーを増幅させるステップをさらに含むことができる。
【０２２５】
例えば、本発明の方法の選択ステップにより得られた、特定の単鎖アルファボディーをディスプレイするファージクローンは、宿主細菌の再感染および成長培地におけるインキュベーションにより増幅することができる。
【０２２６】
特定の実施形態において、本発明の方法は、サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体と結合することができるアルファボディーの配列を決定するステップを包含する。
【０２２７】
アルファボディーポリペプチド配列のセット、コレクションまたはライブラリーに含まれるアルファボディーポリペプチド配列が、適切な細胞またはファージまたは粒子にディスプレイされる場合、前記細胞またはファージまたは粒子から、アルファボディーポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列の単離が可能である。この方法において、選択された１もしくは複数のアルファボディーライブラリーメンバー〔Ａｌｐｈａｂｏｄｙ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｍｅｍｂｅｒ（ｓ）〕のヌクレオチド配列は、日常的なシーケンシング方法により決定することができる。
【０２２８】
さらなる特定の実施形態において本発明の方法は、前記ヌクレオチド配列を、宿主生物において適切な条件下で、実際に所望のアルファボディーポリペプチド配列〔Ａｌｐｈａｂｏｄｙ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ｓ）〕を得るように発現させるステップを含む。このステップは、当業者に公知の方法により実施することができる。
【０２２９】
加えて、目的のサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に対する検出可能な結合親和性または検出可能なイン・ビトロ活性を有する得られたアルファボディー配列は、可溶性タンパク質構築物として、任意に、それらの配列が同定された後に合成することができる。
【０２３０】
例えば、本発明の方法により得られた、得ることが可能な、または選択されたアルファボディーは、当該技術分野において公知の組み換え法または化学的合成方法を使用して、合成することができる。さらに、本発明の方法により得られた、得ることが可能なまたは選択されたアルファボディーは、遺伝子操作技術により作製することができる。したがって、本発明の方法により得られた、得ることが可能なまたは選択されたアルファボディーを合成する方法は、宿主細胞を、目的のサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に対する検出可能な結合親和性または検出可能なイン・ビトロ活性を有するアルファボディー配列をコードする核酸またはベクターにより、形質転換させるまたはこれらに感染させるステップを含むことができる。したがって、目的のサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に対する検出可能な結合親和性または検出可能なイン・ビトロ活性を有するアルファボディー配列は、組み換えＤＮＡ法により作製することができる。アルファボディーをコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して容易に合成することができる。ひとたび調製されたら、ＤＮＡを発現ベクター内に導入することができ、これらの発現ベクターを、その後組み換え宿主細胞における、および／またはこれらの組み換え宿主細胞が存在する培地におけるアルファボディーの発現を得るために、宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたは任意の適切な発現系内に形質転換またはトランスフェクトすることができる。
【０２３１】
タンパク質の発現および精製の当業者には公知であるように、発現ベクターから、適切な発現系を使用して作製されるアルファボディーは、（通常、アルファボディーのＮ末端またはＣ末端において）、例えば、ヒスチジンまたは精製が容易になるための他の配列タグを用いて、タグ付されてもよいことが理解されるはずである。
【０２３２】
宿主細胞内への核酸またはベクターの形質転換またはトランスフェクションは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染および微粒子銃を含む、当業者に公知のさまざまな手段により達成することができる。
【０２３３】
所望のアルファボディーの発現に適切な宿主細胞は、イン・ビトロに位置しても、またはイン・ビボに位置してもどちらでも、任意の真核細胞または原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞および昆虫細胞）であってもよい。例えば、宿主細胞は、トランスジェニック動物中に位置してもよい。
【０２３４】
したがって、本発明は、宿主細胞を、かかるアルファボディーをコードする核酸配列またはベクターにより、形質転換、トランスフェクトまたは感染させるステップおよび適切な条件下でアルファボディーを発現させるステップを含む、目的のサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に対する検出可能な結合親和性または検出可能なイン・ビトロ活性を有するアルファボディーの製造方法にも関する。
【０２３５】
［配列の合理化および専用ライブラリーのスクリーニング］
１個以上の標的特異的アルファボディーの製造方法は、任意に、本発明の方法により得ることが可能な標的特異的アルファボディーの結合特異性および／または有効性を改良または最適化するさらなるステップまたは方法を含んでもよい。
【０２３６】
特定の実施形態において、１個以上の標的結合アルファボディーの製造方法は、得られた、アルファボディー配列または作製されたアルファボディー配列の合理化を含むステップまたは方法がさらに後に続いてもよい。かかる配列合理化過程は、本発明の方法を使用して作製された、目的の特異的標的分子に対する異なるアルファボディーの間またはこれらの中に保存された特定のアミノ酸残基、アミノ酸残基の位置、ストレッチ、モチーフまたはパターンの同定または決定を含むことができる。したがって、この合理化過程は、目的の特定の標的分子またはタンパク質に特異的な、作製された異なるアルファボディー配列を比較するステップ、およびこれらの配列間の配列コヒーレンスを同定するステップにより実施することができる。かかる過程は、任意に、分子モデリング、相互作用リガンド結合または生物統計のデータマイニングに関する技術を使用することによって支持または実施することができる。
【０２３７】
目的の特異的標的分子に対する異なるアルファボディーの間またはこれらの中に保存されたことが同定される特定のアミノ酸残基、アミノ酸残基位置、ストレッチ、モチーフまたはパターンは、標的特異的アルファボディーの結合または活性に寄与していると考えることができる。
【０２３８】
特定の実施形態において、上記のような配列合理化の過程は、目的の標的分子に特異的であることが同定され、本発明の方法を使用して作製される、異なるアルファボディー配列のセットから出発する、アルファボディー配列の新しいライブラリーの創出を、さらに後に続けることができる。このようないわゆる「専用ライブラリー」、目的の特定の標的分子に特異的であることが同定された異なるアルファボディー配列のセットにおいて、異なるアルファボディー配列は、多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットにおいて変動する。多様化されるアミノ酸残基位置のこの所定のセットは、異なる標的結合アルファボディーの間またはこれらの中に保存されたアミノ酸残基、ストレッチ、モチーフまたはパターンが位置する位置以外の位置に対応する。このようにして得られたアルファボディーライブラリーは、アルファボディーの「専用ライブラリー」と称される。これらの専用ライブラリーは、その後再度スクリーニングされ、もっともすぐれた標的結合アルファボディーが同定される。
【０２３９】
したがって、アルファボディー配列のかかる専用ライブラリーの作製において、異なるアルファボディーの間またはこれらの中に保存されたアミノ酸残基、ストレッチ、モチーフまたはパターンは、ライブラリーの作製過程の間も一定に保たれる。かかる専門ライブラリーから、目的の標的分子に対する、改良されたまたは最適化された結合特異性および／またはイン・ビトロ活性を有するアルファボディー配列を同定し、任意に、単離することができる。
【０２４０】
特定の実施形態において、上記のような配列合理化の過程は、目的の標的分子に特異的であることが同定され、本発明の方法を使用して作製される異なるアルファボディー配列のセットから出発したアルファボディー配列の新しいライブラリーの創出をさらに後に続けることができる。このようないわゆる「スパイクの付いたライブラリー」である、目的の特定の標的分子に特異的であることが同定された異なるアルファボディー配列のセットにおいて、異なるアルファボディー配列は、限られた数のランダムに選択された位置における、ランダムなアミノ酸置換の導入により変動する。ライブラリー作製の当業者に公知であるように、エラープローンＰＣＲが、「スパイクの付いたライブラリー」の生成に便利な方法であり、これは、ＤＮＡ合成の当業者に公知であるように、スパイクの付いたオリゴヌクレオチドを使用する直接ＤＮＡ合成方法により、便利に達成することができる。
【０２４１】
したがって、１個以上の標的結合アルファボディーの製造方法は、ランダムライブラリーから２個以上の標的結合アルファボディーの同定後、
−目的の標的タンパク質に結合する作製されたアルファボディー配列を比較するステップ、
−これらの異なるアルファボディー配列の間またはこれらの中に保存されたアミノ酸残基、アミノ酸残基の位置、ストレッチ、モチーフまたはパターンを同定するステップ、および
−比較された２個以上のアルファボディー配列の少なくとも１つから出発して、ライブラリーが、限られた数のランダムに選択された位置において多様化された、異なるアルファボディー配列を含むスパイクの付いたライブラリーを作製する、またはライブラリーが、異なる標的特異的アルファボディー配列の間またはこれらの中に保存されたアミノ酸残基、アミノ酸残基の位置、ストレッチ、モチーフもしくはパターンではないアミノ酸位置のセットにおいて多様化された異なるアルファボディー配列を含む、専門ライブラリーを作製するステップ、
−ランダムライブラリーから、目的の標的分子に対する、改良されたまたは最適化された結合特異性および／またはイン・ビトロ活性を有するアルファボディー配列を選択および／または同定するステップ、ならびに任意に、
−目的の標的分子に対する、改良されたまたは最適化された結合特異性および／またはイン・ビトロ活性を有するこれらのアルファボディー配列を単離するステップ、
をさらに含むことができる。
【０２４２】
上記のように、専門ライブラリーまたはスパイクの付いたライブラリーを作製し、目的の標的分子に対する、改良されたまたは最適化された結合特異性および／またはイン・ビトロ活性を有するアルファボディー配列を選択し、同定し、単離する方法に含まれるステップは、本発明の標的結合アルファボディーの製造方法の対応するステップに記載した、類似の様式で実施することができることが理解されるであろう。
【０２４３】
本明細書においてさらに説明するように、本発明のアルファボディーにおけるアミノ酸残基の総数は、ヘプタッドの数／ヘプタッド反復配列の数およびヘプタッド反復配列を相互連結する柔軟なリンカーの長さに主に応じて、約５０〜約２１０個の範囲内であってよい。本発明のアルファボディーポリペプチドまたは組成物の部分、断片、アナログまたは誘導体は、それらの長さおよび／またはサイズに関しては、かかる部分、断片、アナログまたは誘導体が、それらが由来する本発明のアルファボディーポリペプチドまたは組成物の生物学的機能を未だ有しており、想定された（薬理学的）目的に未だ使用できる限り、特に限定されない。
【０２４４】
また、進化分子工学（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）法（ＤＮＡシャッフリング法など）も目的の標的分子に特異的であることが同定された１個以上の異なるアルファボディー配列から出発する、アルファボディーライブラリーの構築に用いることができることに注目すべきである。また、かかる「進化分子工学」ライブラリーも目的の標的分子に対する、改良されたまたは最適化された結合特異性および／またはイン・ビトロ活性を有するそれらのアルファボディー配列の選択および／または同定に供することができる。
【０２４５】
［アルファボディーを含有しているポリペプチド］
さらなる態様において、本発明は、サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体と特異的に結合する少なくとも１個の本発明のアルファボディーを含む、またはこれから本質的になる（アルファボディー）ポリペプチド（本明細書において、本発明のポリペプチドとも称される）を提供する。本発明のポリペプチドは、少なくとも１個の本発明のアルファボディー、および任意に、１個以上のリンカーを介して動作可能に連結された１個以上のさらなる基、部分、残基を含有することができる。
【０２４６】
したがって、本発明のポリペプチドは、任意に、他の標的もしくは目的の標的タンパク質との結合のための１個以上のさらなる基、部分または残基を含むことができる。このようなさらなる基、残基、部分および／または結合部位は、本発明のアルファボディーに対する（および／またはそれが存在するポリペプチドもしくは組成物に対する）さらなる機能性を提供してもよく、提供しなくてもよく、本発明のアルファボディーの特性を改変してもよく、改変しなくてもよいことが明らかなはずである。さらに、かかる基、残基、部分または結合部位は、例えば、生物学的および／または薬理学的に活性であり得る化学基であってもよい。
【０２４７】
これらの基、部分または残基は、特定の実施形態において、アルファボディーにＮ末端またはＣ末端で連結される。しかしながら、特定の実施形態において、１個以上の基、部分または残基は、アルファボディーの本体、例えば、アルファへリックスにおける遊離のシステインに連結される。
【０２４８】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、化学的に改変されたアルファボディーを含有する。例えば、かかる改変は、１個以上の官能基、残基または部分の、本発明のアルファボディー内またはこの上への導入または連結を含むことができる。これらの基、残基または部分は、１個以上の所望の特定または機能性を、本発明のアルファボディーにもたらすことができる。かかる官能基の例は、当業者には明らかであるものとする。
【０２４９】
例えば、本発明のアルファボディーへの当該官能基の導入または連結は、本発明のアルファボディーの半減期、溶解度および／または安定性の増加、または本発明のアルファボディーの毒性の減少、または本発明のアルファボディーの任意の望ましくない副作用の除外または減衰および／または他の有利な特性をもたらすことができる。
【０２５０】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、これらの生物学的および血漿中の半減期が増加するように、例えば、ＰＥＧ化を用いて、結合する基または血清タンパク質（血清アルブミンなど）である基の付加を用いて、または一般に本発明のアルファボディーの半減期を増加させる部分へのアルファボディーの連結により、化学的に改変されたアルファボディーを含む。例のように、アルファボディーは、溶媒曝露システインにおいて、マレイミドｍＰＥＧ  ４０ｋＤ  ＰＥＧ（Ｊｅｎｋｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）または他の異なる分子量のＰＥＧ部分を使用して、ＰＥＧ化することができる。
【０２５１】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、これらの生物学的および血漿中の半減期が増加するように、タンパク質ドメインまたはペプチド、例えば、結合ドメインまたは血清タンパク質（血清アルブミンまたは免疫グロブリンのＦｃ部分など）であるドメインと融合されたアルファボディーを含有する。前記タンパク質ドメインは、血清タンパク質と結合するアルファボディーであってよい。
【０２５２】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、それらの標的結合（すなわち、目的のサイトカインもしくは成長因子またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に対する結合）に加えて、血清タンパク質に（血清アルブミンまたは免疫グロブリンのＦｃ部分などに）、前記アルファボディーの生物学的または血漿中の半減期を増加するように結合するアルファボディーを含有する。
【０２５３】
通常、半減期の増加した本発明のポリペプチドは、半減期の延長に対する上記の装備を欠いた、対応する本発明のアルファボディーの半減期と比較して、（ヒトにおいて、またはＰＫ評価に関して使用される動物モデル、例えば、ラット、イヌ、サル、マウス、ウマ、ブタ、ネコなどにおいて）１週間を超える、同様に好ましくは２週間を超える半減期を有する。
【０２５４】
本発明のアルファボディーの特定の改変は、標識されたアルファボディーの意図される使用に応じて、１個以上の検出可能な標識または他のシグナル発生基もしくは部分の導入を含んでよい。
【０２５５】
さらなる特定の改変は、例えば、１個以上の金属または金属陽イオンをキレートする、キレート化基の導入を伴ってもよい。
【０２５６】
特定の改変は、特異的結合対、例えば、ビオチン−（ストレプト）アビジン結合対の一部である官能基の導入を含んでもよい。
【０２５７】
いくつかの適用に関して、特に、本発明のアルファボディーが特異的に結合する標的を発現する細胞を殺すことが意図される（例えば、がんの治療において）またはかかる細胞の成長および／または増殖を減少または遅延させることが意図される適用に関して、本発明のアルファボディーは、毒素または毒性の残基もしくは部分に連結されてもよい。
【０２５８】
他の可能性のある化学的および酵素的改変は、当業者には明らかであろう。
【０２５９】
特定の実施形態において、１個以上の基、残基、部分は、１個以上の適切なリンカーまたはスペーサーを介してアルファボディーに連結される。
【０２６０】
さらなる特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、２個以上の標的特異的アルファボディーを含有する。かかる特定の実施形態において２個以上の標的特異的アルファボディーは、直接または間接的な方法のいずれかで、互いに連結（カップリング、鎖状連接、相互連結、融合）することができる。２個以上のアルファボディーが互いに直接連結される実施形態において、それらは、スペーサーまたはリンカーの断片または部分の助けなしで連結される。代替的には、２個以上のアルファボディーが互いに間接的に連結される実施形態において、それらは、適切なスペーサーまたはリンカーの断片または部分を介して連結される。
【０２６１】
２個以上のアルファボディーが直接連結される実施形態において、それらは、単鎖融合構築物として（すなわち、２個以上のアルファボディー配列が直接、単鎖の近接するアミノ酸配列で互いに続いている単鎖タンパク質構築物として）作製していてもよい。代替的には、アルファボディーの直接連結は、２個のアルファボディー間にジスルフィド架橋を形成するシステインを介して達成されてもよい（すなわち、適切な条件下、例えば、酸化条件下で、それぞれが遊離のシステインを含む２個のアルファボディーが互いに反応して、構成単量体が、ジスルフィド架橋を介して共有結合的に連結される二量体を形成してもよい）。
【０２６２】
代替的には、２個以上のアルファボディーが間接的に連結される実施形態において、それらは、適切なスペーサーまたはリンカー断片もしくはリンカー部分を介して互いに連結されてもよい。かかる実施形態において、アルファボディーは、単鎖融合構築物として作製されてもよい（すなわち、２個以上のアルファボディー配列が、単一の近接するアミノ酸配列で互いに続いているが、アルファボディーはスペーサー断片として作用する適切に選択されたアミノ酸配列断片の存在により、隔てられたままである単鎖タンパク質構築物として）。代替的には、アルファボディーの間接的連結は、アミノ酸の側基を介して、またはアルファボディーのＮ末端もしくはＣ末端を介して達成されてもよい。例えば、適切な選択された条件下で、それぞれが遊離のシステインを含む２個のアルファボディーはホモ二官能性化合物と反応し、構成アルファボディーが前記ホモ二官能性化合物を介して共有結合的に架橋されたアルファボディー二量体を得ることができる。類似の方法で、１個以上のアルファボディーが、反応性側基または末端およびタンパク質の架橋のための適切に選択されたホモもしくはヘテロの二官能性化合物の任意の組み合わせを介して、架橋されてもよい。
【０２６３】
連結されたアルファボディーの特定の実施形態において、２個以上の連結されたアルファボディーは、同じアミノ酸配列を有していてもよく、異なるアミノ酸配列を有していてもよい。また、２個以上の連結されたアルファボディーは、同じ結合特異性を有していてもよく、異なる結合特異性を有していてもよい。また、２個以上の連結されたアルファボディーは、同じ結合親和性を有していてもよく、異なる結合親和性を有していてもよい。
【０２６４】
本発明の異なるアルファボディーのカップリングに使用するための適切なスペーサーまたはリンカーは、当業者には明らかであると思われ、ペプチドおよび／またはタンパク質の連結に当該技術分野において使用される一般的な任意のリンカーまたはスペーサーまたはであってよい。特に、かかるリンカーまたはスペーサーは、医薬的使用が意図されるタンパク質またはポリペプチドの構築に適切である。
【０２６５】
単鎖アミノ酸配列のアルファボディーのカップリングに特に適切ないくつかのリンカーまたはスペーサーは、例えば、限定されるものではないが、ポリペプチドリンカー、例えば、グリシンリンカー、セリンリンカー、混合グリシン／セリンリンカー、グリシンに富んだリンカーおよびセリンに富んだリンカーまたは主として極性ポリペプチド断片により構成されたリンカーを含む。化学的架橋によるアルファボディーのカップリングに特に適切ないくつかのリンカーまたはスペーサーは、例えば、限定されるものではないが、グルタルアルデヒドなどのホモ二官能性化学的架橋化合物、アジプイミド酸ジメチル（ＤＭＡ）、スベルイミノ酸ジメチル（ＤＭＳ）およびピメルイミド酸ジメチル（ＤＭＰ）などのイミドエステルまたはジチオビス（スクシンイミジルプロピオン酸）（ＤＳＰ）およびジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオン酸）（ＤＴＳＳＰ）などのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを含む。架橋のためのヘテロ二官能性試薬の例は、限定されるものではないが、一方のアミン反応性末端および他方の末端にスルフヒドリル反応性部分を有する架橋剤または一方の末端にＮＨＳエステルおよび他方の末端にＳＨ反応性基（例えば、マレイミドまたはピリジルジスルフィド）を有する架橋剤を含む。
【０２６６】
単鎖の鎖状連接されたアルファボディー構築物に使用するためのポリペプチドのリンカーまたはスペーサーは、１〜５０個のアミノ酸の長さ、例えば、１〜３０個、および特に１〜１０個のアミノ酸残基の長さを有する、任意の適切な（例えば、グリシンに富んだ）アミノ酸配列であってよい。（１もしくは複数の）スペーサーの長さ、柔軟性の程度および／または限定されるものではないが、目的のタンパク質に対する、または目的の１個以上の他の標的タンパク質に対する親和性、特異性またはアビディティを含む他の特性が、本発明の最終的ポリペプチドの特性にいくらかの影響を与え得ることは明らかなはずである。２個以上のスペーサーが本発明のポリペプチドに使用される場合、これらのスペーサーは、同じであってもよく、異なっていてもよいことは明らかなはずである。本発明の文脈および開示において、当業者は、本発明のアルファボディーをカップリングする目的のための最適なスペーサーを、過度の実験負担をなくして決定することができる。
【０２６７】
連結された本発明のアルファボディーポリペプチドは、１個以上の本発明のアルファボディーを、１個以上のさらなる基、残基、部分および／または他の本発明のアルファボディーと、任意に、１個以上の適切なリンカーを介して、本発明のポリペプチドが提供されるように適切に連結する少なくとも１つのステップを含む方法により、一般に調製できる。
【０２６８】
さらに、本発明のポリペプチドは、（ｉ）適切な宿主細胞または発現系において、本発明のポリペプチドを発現させるステップ、および（ｉｉ）本発明のポリペプチドを単離および／または精製するステップ、を少なくとも含む方法により作製できる。上記のステップを実施するための技術は、当業者には公知である。
【０２６９】
［部分／断片／アナログ／誘導体］
本発明は、本発明のアルファボディーおよびポリペプチドの部分、断片、アナログ、変異体、バリアントおよび／または誘導体および／またはかかる部分、断片、アナログ、変異体、バリアントおよび／もしくは誘導体の１個以上を含有するか、またはこれらから本質的になるポリペプチドも、これらの部分、断片、アナログ、変異体、バリアントおよび／または誘導体が、本明細書において想定される予防的、治療的および／または診断的目的に適切である限り、包含する。
【０２７０】
本発明のかかる部分、断片、アナログ、変異体、バリアントおよび／もしくは誘導体は、サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に特異的に、未だ結合することができる。
【０２７１】
［本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物の起源および形態］
本発明は、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物（またはこれらを発現させるために使用される本発明のヌクレオチド配列の）起源に関して限定されないことに留意すべきである。さらに、本発明は、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列が生成された、または得られた方法に関してもまた限定されるものではない。したがって、本発明のアルファボディーは、合成または半合成のアミノ酸配列、ポリペプチドまたはタンパク質であってよい。
【０２７２】
本発明により提供されるアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は本質的に（本明細書において定義される）単離形態であってよく、または代替的には、本発明のポリペプチドまたは組成物の一部を形成することができ、これらは少なくとも１個の本発明のアルファボディーを含んでもよく、またはこれから本質的になってもよく、これらは任意に、（すべてが任意に、１個以上の適切なリンカーを介して連結される）１個以上の他の基、部分もしくは残基をさらに含んでもよい。
【０２７３】
［標的種および交差反応性］
本明細書における開示に基づいて、当然のことながら、予防的、治療的および／または診断的適用に関して、本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、原則として、ヒトのサイトカインもしくは成長因子および／またはヒトのサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体を特異的に対象とする、または結合すると思われる。しかしながら、本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物が獣医学的目的を意図される場合、それらは、治療を意図される種由来のサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカインもしくは成長因子受容体を対象とする、または特異的に結合すると思われ、またはそれらは、治療される種に由来するサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体と、少なくとも交差反応性であると思われる。したがって、１個の対象種由来のサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に特異的に結合するアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、１個以上の他の対象種由来のサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体との交差反応性を示しても、または示さなくてもよい。当然のことながら、ヒトまたは動物における使用のためのアルファボディーの開発との関連において、治療される種ではない、別の種に結合するサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体と結合するアルファボディーが、調査および実験室試験における使用のために開発されてもよいことが想定される。
【０２７４】
本発明のアルファボディーおよびポリペプチドが、サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体の、多数の天然または合成のアナログ、バリアント、変異体、対立遺伝子、部分および断片に結合するものであることもまた、期待される。より具体的には、本発明のアルファボディーおよびポリペプチドが、それらのアルファボディーおよびポリペプチドが結合する（天然／野生型）サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体の結合部位、部分またはドメインを（未だ）含有するサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体の少なくともアナログ、変異体、対立遺伝子、部分および断片に結合するものであることが期待される。
【０２７５】
［核酸配列］
その上さらなる態様において、本発明は、本発明の方法により得ることが可能な、単鎖アルファボディーまたはアルファボディーポリペプチドをコードする核酸配列（本明細書において「本発明の核酸配列」とも称される）ならびにかかる核酸配列を含有しているベクターおよび宿主細胞を提供する。
【０２７６】
さらなる態様において、本発明は、本発明のアルファボディーまたはポリペプチド（またはこれらの適切な断片）をコードする核酸配列を提供する。これらの核酸配列もまた、本明細書において本発明の核酸配列と称され、ベクターまたは遺伝子構築物またはポリヌクレオチドの形態であってもよい。本発明の核酸配列は、合成または半合成の配列、ライブラリー（および特に発現ライブラリー）から単離されたヌクレオチド配列、ＰＣＲにより重複プライマーを使用して調製されたヌクレオチド配列、またはそれ自体が公知のＤＮＡ合成に関する技術を使用して調製されたヌクレオチド配列であってよい。
【０２７７】
本発明の遺伝子構築物はＤＮＡもしくはＲＮＡであってよく、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。また、本発明の遺伝子構築物は、意図された宿主細胞もしくは宿主生物の形質転換に適切な形態、意図される宿主細胞のゲノムＤＮＡ内への統合に適切な形態、または意図された宿主生物における独立した複製、維持および／または継承に適切な形態であってよい。例えば、本発明の遺伝子構築物は、例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクターまたはトランスポゾンなどのベクターの形態であってよい。特に、べクターは、発現ベクター、すなわち、（例えば、適切な宿主細胞、宿主生物および／または発現系において）イン・ビトロおよび／またはイン・ビボの発現を提供できるベクターであってよい。本発明の遺伝子構築物は、発現されたアルファボディーを意図される細胞内または細胞外のコンパートメントに向かわせる、適切なリーダー配列を含むことができる。例えば、本発明の遺伝子構築物は、適切なベクター中にｐｅｌＢリーダー配列部位において挿入し、発現されたアルファボディーを細菌の細胞膜周辺腔に向かわせることができる。さらに、ベクターは、適切なプロモーター系を備え、例えば、アルファボディーの収率を最適化することができる。
【０２７８】
さらなる態様において、本発明は、本発明の方法により得ることができる、単鎖アルファボディーをコードする核酸を含有しているベクターを提供する。
【０２７９】
その上さらなる態様において、本発明は、本発明の方法により得ることができる、単鎖アルファボディーまたはアルファボディーポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞またはこれらの核酸を含有しているベクターを提供する。したがって、本発明の特定の実施形態は、本発明の方法により得ることができるアルファボディーまたはアルファボディーポリペプチドをコードする核酸配列を含み、それらを発現できるベクターによりトランスフェクトされた、または形質転換された宿主細胞である。本発明のアルファボディーまたはポリペプチドの発現のための宿主または宿主細胞の適切な例は、当業者には明らかであるものとし、任意の真核細胞または原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞および昆虫細胞）を含み、イン・ビトロまたはイン・ビボのいずれに位置してもよい。
【０２８０】
［阻害性のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物］
特定の実施形態において、サイトカインもしくは成長因子またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に特異的に結合する本発明のアルファボディーまたはポリペプチドは、サイトカインもしくは成長因子またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体の活性を特異的に阻害、抑制または減少できる、および／またはこれらのサイトカインもしくは成長因子および／または受容体が役割を果たすシグナル伝達ならびに生物学的な機序および経路を阻害、抑制または減少できる。
【０２８１】
１個以上の特定のサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に結合することにより、本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび医薬組成物を使用して、１個以上のサイトカインもしくは成長因子と、それらの対応するサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体との間の相互作用を抑制または阻害し、その結果、それらのサイトカインもしくは成長因子および／またはそれらの受容体により媒介されるシグナル伝達経路を抑制、阻害または減少させる、および／またはそれらのサイトカインもしくは成長因子および／またはそれらの受容体が関与する生物学的な経路および／または機序を調節することができる。したがって、本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび医薬組成物を使用して、本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物の少なくとも１つが結合する、サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体が関与する対象において、免疫系および／または１つ以上の特異的免疫応答に影響を与える変化または調節を行なうことができる。
【０２８２】
したがって、特定の実施形態において、本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、サイトカインまたは成長因子に、より具体的には、サイトカインまたは成長因子の受容体結合部位に特異的に結合する。
【０２８３】
より具体的には、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物を使用する「阻害」、「減少」および／または「抑制」は目的のタンパク質と、その天然の結合パートナーとの間の相互作用の阻害、減少および／または抑制、または目的の標的タンパク質の活性の阻害、減少および／または抑制、または１つ以上の生物学的または生理学的な機序、効果、応答、機能経路もしくは目的の標的タンパク質が関与する活性の阻害、減少および／または抑制のいずれかを意味することができ、例えば、適切なイン・ビトロ、細胞性もしくはイン・ビボアッセイを使用して測定した場合、同じアッセイにおいて、同じ条件であるが本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物を使用しない条件下で、目的の標的タンパク質の活性と比較して、例えば、少なくとも１０％、しかしながら、好ましくは少なくとも２０％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくはそれ以上を阻害、減少および／または抑制する。加えて、「阻害」、「減少」および／または「抑制」は、同じ条件であるが、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物が存在しない条件と比較して、目的の標的タンパク質の、１個以上のその天然の結合パートナーに対する親和性、アビディティ、特異性および／または選択性の減少の誘導、および／または目的の標的タンパク質の、目的の標的タンパク質が存在する培地または周囲の１つ以上の条件（ｐＨ、イオン強度、補因子の存在など）に対する感受性の減少の誘導もまた意味することができる。また、本発明に関連して、「阻害」、「減少」および／または「抑制」は、目的の標的タンパク質の活性のアロステリックな阻害、減少および／または抑制を伴ってもよい。
【０２８４】
したがって、特定の実施形態において、本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、（本明細書においてさらに説明するように）サイトカインまたは成長因子を対象とする。アルファボディーと、サイトカインまたは成長因子との結合の結果は、そのサイトカインまたは成長因子への結合において、この結合が、かかる本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは医薬組成物の不在下における、サイトカインまたは成長因子と、その受容体との結合と比較して、そのサイトカインまたは成長因子と、その受容体との結合、または少なくとも１個のこれらのサブユニットとの結合を、抑制、減少または阻害するようなものであってよく、これは、当該技術分野において公知の適切なアッセイにより決定される場合、少なくとも２０％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくはそれ以上を抑制、減少または阻害する。代替的には、アルファボディーまたはアルファボディーポリペプチドと、サイトカインまたは成長因子との結合は、この結合が、サイトカインもしくは成長因子と、その受容体とが未だ結合可能であるが、かかる本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは医薬組成物の不在下における、サイトカインもしくは成長因子と、その受容体との結合におけるシグナル伝達と比較して、サイトカインもしくは成長因子と、その受容体、または少なくとも１個のこれらのサブユニットとの結合により誘発されるシグナル伝達が抑制、減少または阻害されるようなものであり、当該技術分野において公知の適切なアッセイにより決定される場合、これは、少なくとも２０％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくはそれ以上を抑制、減少または阻害する。さらなる特定の実施形態において、アルファボディーまたはアルファボディーポリペプチドと、サイトカインまたは成長因子との結合は、この結合が、受容体の活性化および／または会合、特にサイトカイン媒介性または成長因子媒介性の受容体の会合を（すなわち、かかる本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物の不在下でのサイトカイン媒介性または成長因子媒介性の受容体の会合と比較して）、抑制、減少または阻害するようなものであり、これは、当該技術分野において公知の適切なアッセイにより決定される場合、少なくとも２０％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上を抑制、減少または阻害する。
【０２８５】
他の特定の実施形態において、本発明のアルファボディーまたはポリペプチドは、サイトカイン受容体または成長因子受容体、より具体的には、サイトカイン受容体または成長因子受容体のサイトカインまたは成長因子の結合部位に特異的に結合する。
【０２８６】
したがって、特定の実施形態において、（本明細書においてさらに説明するように）本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、そのサイトカイン受容体または成長因子受容体との結合に関して、この結合が、かかる本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは医薬組成物の不在下でのサイトカイン受容体または成長因子受容体と、その天然のサイトカインまたは成長因子のリガンドとの結合と比較して、サイトカイン受容体または成長因子受容体と、その天然のサイトカインまたは成長因子のリガンドとの結合を抑制、減少または阻害するように、サイトカインもしくは成長因子受容体または少なくとも１個のこれらのサブユニットを対象とし、これは、当該技術分野において公知の適切なアッセイにより決定される場合、少なくとも２０％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上を抑制、減少または阻害する。
【０２８７】
代替的には、（本明細書においてさらに説明するように）アルファボディーまたはアルファボディーポリペプチドと、サイトカイン受容体もしくは成長因子受容体、または少なくとも１個のこれらのサブユニットとの結合は、サイトカイン受容体または成長因子受容体と、その天然のサイトカインまたは成長因子のリガンドとの結合が未だ可能であるが、かかる本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは医薬組成物の不在下でのサイトカイン受容体または成長因子受容体と、その天然のサイトカインまたは成長因子のリガンドとの結合におけるシグナル伝達と比較して、サイトカイン受容体もしくは成長因子受容体と、その天然のサイトカインまたは成長因子のリガンドとの結合により誘発されるシグナル伝達が抑制、減少または阻害されるようなものであり、当該技術分野において公知の適切なアッセイにより決定される場合、これは、少なくとも２０％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上を抑制、減少または阻害する。特定の実施形態によれば、（本明細書においてさらに説明するように）本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、それが受容体の活性化および／または会合、特にサイトカイン媒介性または成長因子媒介性の受容体の会合を（すなわち、本発明のかかるアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物が存在しない場合のサイトカイン媒介性または成長因子媒介性の受容体の会合と比較して）抑制、減少または阻害するようにサイトカイン受容体または成長因子受容体と特異的に結合し、これは、当該技術分野において公知の適切なアッセイにより決定される場合、少なくとも２０％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上を抑制、減少または阻害する。
【０２８８】
当業者には公知であるように、上記の本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、一般に、サイトカイン媒介性または成長因子媒介性のシグナル伝達、すなわち、サイトカインまたは成長因子と、その受容体との結合により引き起こされるシグナル伝達ならびにかかるシグナル伝達により誘導される生物学的な機序および効果のアンタゴニストとして作用するものである。
【０２８９】
［刺激性のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物］
ある限定されない実施形態において、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物は、サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に特異的に結合し、その結果、サイトカインもしくは成長因子および／またはその受容体の間の相互作用を増強、増加および／または活性化できる。本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物をこのように刺激することは、サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体と特異的に結合し、その結果、そのサイトカインもしくは成長因子および／またはそのサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体の生物学的活性および／または１つ以上の生物学的もしくは生理学的機序、効果、応答、機能もしくは経路を、適切なイン・ビトロ、細胞性もしくはイン・ビボのアッセイを使用して測定した場合、増強、増加および／または活性化できる。当業者には明らかであるように、この特定の実施形態に従った本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、一般に、サイトカイン媒介性または成長因子媒介性のシグナル伝達、すなわち、サイトカインまたは成長因子と、その受容体との結合により引き起こされるシグナル伝達ならびにかかるシグナル伝達により誘導される生物学的な機序および効果のアゴニストとして作用するものである。
【０２９０】
したがって、これらの特定の実施形態において、本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび医薬組成物を使用して、本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物の１つ以上が結合するサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体が関与する対象において、１つ以上の特異的免疫応答を増加することができる。特定のサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に結合する、作動性の本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは医薬組成物を使用して、例えば、免疫系を弱らせることを特徴とする、または免疫系が弱くなった結果として起こり得る疾患の予防および／または治療のために、対象において、１つ以上の免疫応答を刺激または増強することができる。
【０２９１】
［医薬組成物］
その上さらなる態様において、本発明は、本発明の１個以上のアルファボディー、ポリペプチドおよび／または核酸配列、ならびに任意に、少なくとも１個の薬学的に許容され得る担体を含有している医薬組成物（本明細書において、本発明の医薬組成物とも称される）を提供する。ある特定の実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、任意に、少なくとも１個の他の医薬的活性化合物をさらに含むことができる。
【０２９２】
本発明の医薬組成物は、サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体が関係する疾患および障害の診断、予防および／または治療に使用できる。
【０２９３】
特に、本発明は、温血動物、特に哺乳動物、さらに特には人間における予防的、治療的および／または診断的使用に適切な、本発明のアルファボディーおよびポリペプチドを含有している医薬組成物を提供する。
【０２９４】
本発明は、サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体が関係するおよび／またはこれらにより媒介される１つ以上の疾患、障害、または病態の予防および／または治療において、獣医学的目的のために使用できる、本発明のアルファボディーおよびポリペプチドを含有している医薬組成物もまた提供する。
【０２９５】
概して、医薬的使用に関して、本発明のポリペプチドは、少なくとも１個の本発明のアルファボディーまたはポリペプチドならびに少なくとも１個の薬学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤および／またはアジュバント、ならびに任意に、１個以上のさらなる医薬的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む、医薬調製品または医薬組成物として製剤化できる。かかる製剤は、経口、非経口、局所投与または吸入による投与に適切であってよい。したがって、本発明のアルファボディーまたはポリペプチドおよび／またはこれらを含む組成物は、この場合もやはり使用される特定の医薬製剤または医薬組成物に応じて、例えば、経口で、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内、経皮的、局所的、坐薬を用いて、吸入により投与される。臨床医は、適切な投与経路とおよびかかる投与に使用される適切な医薬製剤または医薬組成物を選択できると思われる。
【０２９６】
該医薬組成物は、適切な結合剤、崩壊剤、甘味料または香味剤をさらに含有してもよい。錠剤、丸薬またはカプセルは、例えば、ゼラチン、ワックスまたは糖などによりコーティングされてもよい。加えて、本発明のアルファボディーおよびポリペプチドは、持続放出性の調製品およびデバイスに組み込むこともできる。
【０２９７】
注射または注入に適した医薬剤形は、滅菌の水溶液もしくは分散液または、任意に、リポソーム中にカプセル化された、滅菌の注射可能なまたは注入可能な溶液または分散液の即時調製に適した活性成分を含む滅菌粉末を含むことができる。すべての場合において、最終剤形は、製造および保存の条件下で滅菌され、流動性および安定でなければならない。液体の担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリルエステルおよびこれらの適切な混合物を含む、溶媒または液体分散媒体であってよい。抗菌剤および抗真菌剤などを任意に、加えることもできる。
【０２９８】
本発明のアルファボディーおよびポリペプチドの有用な投薬量は、動物モデルにおけるそれらのイン・ビトロ活性および／またはイン・ビボ活性を決定することにより、決定できる。マウスおよび他の動物、ヒトへの有効な投薬量を推定する方法は、当該技術者には公知である。
【０２９９】
予防および／または治療における使用に必要とされる本発明のアルファボディーおよびポリペプチドの量は、選択された特定のアルファボディーまたはポリペプチドによってのみではなく、投与経路、治療される病態の性質、および患者の年齢および病態により変動することがあり、最終的には担当の医師または臨床医の裁量である。さらに、本発明のアルファボディーおよびポリペプチドの投薬量は、標的の細胞、腫瘍、組織、移植片または器官に応じて変動し得る。
【０３００】
本発明のアルファボディーまたはポリペプチドおよび／またはこれらを含む組成物は、予防または治療される疾患または障害の予防および／または治療に適切な、治療計画に従って投与される。臨床医は、一般に、適切な治療計画を決定することができると思われる。概して、治療計画は、１個以上の本発明のアルファボディーおよび／またはポリペプチドまたはこれらを含む１つ以上の組成物を１つ以上の医薬的有効量または用量で投与することを含むものである。
【０３０１】
望ましい投与は、単回用量または適切な間隔で投与される（再度副投与されてもよい）分割用量として、便宜上、提示されてもよい。投与計画は、長期（すなわち、少なくとも２週間および例えば、数か月または数年）または毎日の治療を含むことができる。
【０３０２】
本発明のアルファボディーおよびポリペプチドは、医師により、とりわけ治療される病態および患者の重症度に基づき決定される量で投与される。通常、それぞれの疾患の兆候に対して、継続的に（例えば、注入により）、毎日１回の投与として、または１日複数回の分割用量としてのいずれかの投与される量／ｋｇ体重／日を規定する、最適用量（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｏｓａｇｅ）が決定されるであろう。臨床医は、一般に、本明細書において述べた要因に応じて適切な１日用量を決定できると思われる。特定の症例において、臨床医は、例えば、上述の要因におよび彼の熟練の判断に基づき、これらの量から逸脱させることが選択できることも明らかであると思われる。
【０３０３】
特に、本発明のアルファボディーおよびポリペプチドは、本明細書に述べた疾患および障害の予防および／または治療に使用される、または使用できる他の医薬的に活性な化合物または成分と併用でき、その結果として、相乗効果が得られても得られなくてもよい。かかる化合物および成分ならびにそれらの投与の経路、方法および医薬製剤または医薬組成物の例は、臨床医には明らかであると思われる。
【０３０４】
［予防、治療および／または診断適用］
さらなる態様に従って、本発明は、サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に特異的に結合する本発明のアルファボディーまたはポリペプチドの、前記サイトカインもしくは成長因子および／または前記サイトカイン受容体もしくは成長因子受容体が関与する、少なくとも１つのサイトカイン媒介性または成長因子媒介性の疾患および／または障害の予防用および／または治療用医薬の調製のための使用を提供する。したがって、本発明は、前記サイトカインもしくは成長因子および／または前記サイトカイン受容体もしくは成長因子受容体が関与する、少なくとも１つのサイトカイン媒介性または成長因子媒介性の疾患および／または障害の予防および／または治療における使用のための、サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体に特異的に結合する本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび医薬組成物を提供する。また、特定の実施形態において、本発明は、医薬的に活性な量の１個以上の本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび／または医薬組成物を、それらを必要とする対象に投与するステップを含む、少なくとも１つのサイトカイン媒介性または成長因子媒介性の疾患および／または障害の予防および／または治療のための方法を提供する。特に、医薬的に活性な量は、サイトカインもしくは成長因子および／またはそれらの受容体の機能またはそれらの生物学的もしくは薬理学的な活性および／またはそれらが関与する生物学的経路もしくはシグナル伝達を、阻害、抑制または減少する（または本発明の作動性アルファボディーおよびポリペプチドの場合、増強、促進または増加する）ために（循環においてアルファボディーまたはポリペプチドのレベルを作り出すために）十分な量であってよい。
【０３０５】
本発明のアルファボディーまたはポリペプチドにより治療される対象または患者は、任意の温血動物であってよいが、特に、本発明のアルファボディーまたはポリペプチドが特異的に結合するサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体が関与する疾患および障害を患う、またはその危険性がある哺乳動物、より特別にはヒトである。
【０３０６】
「サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体と関連する疾患および障害」は、１個以上のサイトカインまたは成長因子の活性が有害な役割を果たす疾患および障害として定義することができる。したがって、これらは、これらを必要とする対象（すなわち、この疾患もしくは障害またはこれらの少なくとも１つの症状を有する対象および／またはこの疾患もしくは障害を引き付ける、または発症する危険性のある対象）に、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物（および特に、これらの医薬的に活性な量の本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物）のいずれかを、適切に投与するステップにより、それぞれ予防および／または治療することができる疾患または障害である。サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体と関連する疾患および障害の例は当業者には明らかであると思われ、下記疾患および障害を含む：腸疾患（大腸炎、クローン病、ＩＢＤ）などの炎症および炎症性障害、感染性疾患、乾癬および他の自己免疫疾患（関節リウマチ、多発性硬化症、脊椎関節炎、サルコイドーシス、狼瘡、ベーチェット病など）、移植拒絶反応、嚢胞性線維症、ぜんそく、慢性閉塞性肺疾患、がん、ウイルス感染症、分類不能型免疫不全症。
【０３０７】
特定の実施形態において、この疾患または障害は、炎症性障害および／または自己免疫疾患である。更なる特定の実施形態において、この疾患は、ぜんそく、多発性硬化症、炎症性腸疾患、関節リウマチまたは乾癬からなる群より選択される。
【０３０８】
さらなる特定の実施形態において、本発明は、炎症性疾患および／または自己免疫疾患の治療方法に使用するための、または移植拒絶反応、嚢胞性線維症、ぜんそく、慢性閉塞性肺疾患、がん、ウイルス感染症または分類不能型免疫不全症の治療方法に使用するための、ＩＬ−２３またはＩＬ−２３受容体に対するアルファボディーまたはアルファボディーポリペプチドを提供する。
【０３０９】
さらなる特定の実施形態において、本発明は、炎症性疾患および／または自己免疫疾患の治療方法に使用するための、または移植拒絶反応、嚢胞性線維症、ぜんそく、慢性閉塞性肺疾患、がん、ウイルス感染症または分類不能型免疫不全症の治療方法に使用するための、Ｆｌｔ３Ｌ（すなわち、Ｆｌｔ３リガンド）またはＦｌｔ３Ｒ（すなわち、Ｆｌｔ３受容体）に対するアルファボディーまたはアルファボディーポリペプチドを提供する。
【０３１０】
本発明のアルファボディーおよびポリペプチドならびにこれらを含む組成物の有効性は、関連する特定の疾患または障害に応じて、任意の適切なイン・ビトロアッセイ、細胞ベースのアッセイ、イン・ビボアッセイおよび／またはそれ自体が公知の動物モデル、またはこれらの任意の組み合わせを使用して、試験することができる。適切なアッセイおよび動物モデルは、当業者には明らかであると思われる。例えば、抗ＩＬ−２３のアルファボディーまたはアルファボディーポリペプチドの有効性は、マウスの脾細胞におけるＩＬ−１７のＩＬ−２３依存性産生を測定するイン・ビトロアッセイにおいて、容易に決定することができる。このアッセイにおいて、ｂａｌｂ／ｃマウス由来の脾細胞を単離し、ＩＬ−２３（マウスまたはヒト）を、選択されたアルファボディーまたはアルファボディーポリペプチドと一緒に（またはこれは加えずに）、さまざまな濃度で加える。その後、上清中のＩＬ−１７Ａの出現は、抗ＩＬ−２３アルファボディーの阻害能が容易に決定される得るＥＬＩＳＡを介して検出されるであろう。
【０３１１】
例えば、抗ＩＬ−２３または抗Ｆｌｔ３Ｌのアルファボディーまたはポリペプチドの有効性は、マウス乾癬モデルにおいて、例えば、ＴＮＯのウェブ上の出版物（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｎｏ．ｎｌ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／に位置した「ヒト化マウスモデル（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ＿ｍｏｕｓｅ＿ｍｏｄｅｌ＿ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）−Ｐｈａｒｍａ１９Ｂ１．ｐｄｆ」）に記載された下記ステップを含むＴＮＯの（Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）異種移植マウスモデルを使用して決定することができる：（ａ）患者を選択し、医療倫理委員会（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認を得る、（ｂ）インフォームドコンセントに基づき、患者が生検を提供する、（ｃ）生検を、免疫不全マウスに移植する、（ｄ）末梢血の単核細胞（ＰＢＭＣ）を、患者から単離する、（ｅ）自己移植の活性化ＰＢＭＣを異種移植片に注射し、乾癬を誘導する、（ｆ）治験薬を用いて治療し、表皮の阻害（表皮肥厚）を、抗ＩＬ−２３薬によりこのヒト化マウスモデルにおいて決定する。その後、結果を、０．０５％ベタメタゾンを用いた局所治療と比較する。この研究は、皮膚の移植から、イン・ビボ治療の終了まで約７週間かかる。
【０３１２】
関係のある（１もしくは複数の）サイトカインもしくは（１もしくは複数の）成長因子および／または（１もしくは複数の）受容体に応じて、当業者は、適切なイン・ビトロアッセイ、細胞性アッセイまたは動物モデルを選択し、本発明のアルファボディーおよびポリペプチドを、サイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体との結合、またはこれらのサイトカインもしくは成長因子および受容体の活性に影響を与えるそれらの能力および／またはこれらが関与する生物学的機序ならびにサイトカインもしくは成長因子および／またはサイトカイン受容体もしくは成長因子受容体と関連する１つ以上の疾患および障害に関する治療的および／または予防的効果に関して試験することができるであろう。
【０３１３】
本発明を、以下の限定されない実施例および図面を用いて、さらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０３１４】
【図１−１】図１は、単鎖アルファボディーライブラリーｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１ｂ（図１Ａ）およびｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１２（図１Ｂ）の定義の図である。また、これらのライブラリーは、それらの省略名、それぞれＡＣ１１ｂ、ＡＣ１２およびＢ１０と名付けられる。これらのライブラリーは、Ｃ末端が、ファージコートタンパク質ｐＩＩＩのＮ末端に連結される。各ライブラリーの名称は、３つのパネルのそれぞれの最上行に示される（「ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１ｂ」、「ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１２」および「ｓｃＬｉｂ＿Ｂ１０」）。それらの完全なアミノ酸配列（配列番号：１２８、１２９、１３０）は、（一文字表記法で）各表パネルの底部に、「完全」の表示の右に記入されている。記号「ｘ」は、ランダム化された位置に使用される。「ＰＩＩＩ」は、ファージｐＩＩＩコートタンパク質を表わす。同じ配列内の特異的セグメントもまた、Ｎ末端およびＣ末端の隣接セグメント（それぞれ「Ｎ」および「Ｃ」と表示）、リンカーセグメント（それぞれ「Ｌ１」および「Ｌ２」と表示）および実際のヘプタッド反復配列（「ＨＲＳ１」、「ＨＲＳ２」および「ＨＲＳ３」と表示）の同定を容易にするために上部に示される。ヘプタッドのａ位およびｄ位は、ヘプタッド反復配列内のそれらの同定を容易にするために上部の行に提供される。
【図１−２】図１（続き）は、単鎖アルファボディーライブラリーｓｃＬｉｂ＿Ｂ１０（図１Ｃ）の定義の図である。また、これらのライブラリーは、それらの省略名、それぞれＡＣ１１ｂ、ＡＣ１２およびＢ１０と名付けられる。これらのライブラリーは、Ｃ末端が、ファージコートタンパク質ｐＩＩＩのＮ末端に連結される。各ライブラリーの名称は、３つのパネルのそれぞれの最上行に示される（「ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１ｂ」、「ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１２」および「ｓｃＬｉｂ＿Ｂ１０」）。それらの完全なアミノ酸配列（配列番号：１２８、１２９、１３０）は、（一文字表記法で）各表パネルの底部に、「完全」の表示の右に記入されている。記号「ｘ」は、ランダム化された位置に使用される。「ＰＩＩＩ」は、ファージｐＩＩＩコートタンパク質を表わす。同じ配列内の特異的セグメントもまた、Ｎ末端およびＣ末端の隣接セグメント（それぞれ「Ｎ」および「Ｃ」と表示）、リンカーセグメント（それぞれ「Ｌ１」および「Ｌ２」と表示）および実際のヘプタッド反復配列（「ＨＲＳ１」、「ＨＲＳ２」および「ＨＲＳ３」と表示）の同定を容易にするために上部に示される。ヘプタッドのａ位およびｄ位は、ヘプタッド反復配列内のそれらの同定を容易にするために上部の行に提供される。
【図２】図２は、アルファボディーライブラリーのウェスタンブロットの図である。ファージを、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて泳動させ、ウェスタンブロット分析のためにＰＶＤＦ膜に転写した。ｐＩＩＩタンパク質を、抗ｐＩＩＩ抗体を用いて可視化した。パネルＡ：最初の２つのレーンは、それぞれサイズラダー（ｓｉｚｅ  ｌａｄｄｅｒ）（ＣｏｌｏｒＰｌｕｓ  Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ  ｂｒｏａｄ  ｒａｎｇｅ  １０−２３０ｋＤａ、ＮＥＢ）および空ファージである。空のファージは、野生型ｐＩＩＩタンパク質のみをディスプレイした。次の３つのレーンは、それぞれ、参照アルファボディーライブラリー、ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１２およびｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１ｂライブラリーである。パネルＢ：最初の２つのレーンは、それぞれサイズラダー（ｓｉｚｅ  ｌａｄｄｅｒ）（ＣｏｌｏｒＰｌｕｓ  Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ  ｂｒｏａｄ  ｒａｎｇｅ  １０−２３０ｋＤａ、ＮＥＢ）および空ファージである。次の２つのレーンは、アルファボディーライブラリーおよびｓｃＬｉｂ＿Ｂ１０ライブラリーである。矢印は、野生型ｐＩＩＩタンパク質より高い分子量をディスプレイするアルファボディー融合ｐＩＩＩタンパク質を示す。
【図３】図３は、ｓｃＬｉｂ＿Ｂ１０、ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１ｂ、ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１２およびこれらのライブラリーの混合物を用いた４種のバイオパニングキャンペーンに関する、選択ラウンド２、３および４においてＥＬＩＳＡで決定した、陽性クローンのパーセンテージの進化の図である。陽性クローンのパーセンテージは、ライブラリーｓｃＬｉｂ＿Ｂ１０およびライブラリーの混合物に関しては、ラウンド４において決定しなかった。
【図４−１】図４は、単鎖アルファボディーライブラリーｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１（図４Ａ）およびｓｃＬｉｂ＿ＡＣ７（図４Ｂ）の定義の図である。また、これらのライブラリーは、それらの省略名、それぞれＡＣ１１、ＡＣ７およびＣ９と名付けられる。それらの完全なアミノ酸配列（配列番号：１３１、１３２、１３３）は、（一文字表記法で）各表パネルの底部に、「完全」の表示の右に記入されている。記号「ｘ」は、ランダム化された位置に使用される。「ＰＩＩＩ」は、ファージｐＩＩＩコートタンパク質を表わす。同じ配列内の特異的セグメントもまた、Ｎ末端およびＣ末端の隣接セグメント（それぞれ「Ｎ」および「Ｃ」と表示）、リンカーセグメント（それぞれ「Ｌ１」および「Ｌ２」と表示）および実際のヘプタッド反復配列（「ＨＲＳ１」、「ＨＲＳ２」および「ＨＲＳ３」と表示）の同定を容易にするために上部に示される。ヘプタッドのａ位およびｄ位は、ヘプタッド反復配列内のそれらの同定を容易にするために上部の行に提供される。
【図４−２】図４（続き）は、単鎖アルファボディーライブラリーｓｃＬｉｂ＿Ｃ９（図４Ｃ）の定義の図である。また、これらのライブラリーは、それらの省略名、それぞれＡＣ１１、ＡＣ７およびＣ９と名付けられる。それらの完全なアミノ酸配列（配列番号：１３１、１３２、１３３）は、（一文字表記法で）各表パネルの底部に、「完全」の表示の右に記入されている。記号「ｘ」は、ランダム化された位置に使用される。「ＰＩＩＩ」は、ファージｐＩＩＩコートタンパク質を表わす。同じ配列内の特異的セグメントもまた、Ｎ末端およびＣ末端の隣接セグメント（それぞれ「Ｎ」および「Ｃ」と表示）、リンカーセグメント（それぞれ「Ｌ１」および「Ｌ２」と表示）および実際のヘプタッド反復配列（「ＨＲＳ１」、「ＨＲＳ２」および「ＨＲＳ３」と表示）の同定を容易にするために上部に示される。ヘプタッドのａ位およびｄ位は、ヘプタッド反復配列内のそれらの同定を容易にするために上部の行に提供される。
【図５】図５は、ｈＦｌｔ３Ｌ＿ｃｌ４（配列番号：１３４）およびｈＦｌｔ３Ｌ＿ｃｌ４ｍ（配列番号：１３５）の完全アミノ酸配列のアライメントの図である。
【図６】図６は、ｈＦｌｔ３Ｌ（細胞）およびｈＦｌｔ３Ｌ＿ｃｌ４（注射器）の等温滴定熱量計の図である。この実験は、３回実施した（パネルａ−ｃ）。上のパネルは、熱出力（μｃａｌ／秒）としての記録された未加工のサーモグラムを示し、各ピークは、１回の注射に対応する。下のパネルは、統合されたエンタルピー変化（ｈＦｌｔ３Ｌ＿ｃｌ４のｋｃａｌ／モル）／ピークを示す。
【図７】図７は、ｈＦｌｔ３Ｌ＿ｃｌ４ｍ：（ｈＦｌｔ３Ｌ）２複合体の結晶学的に決定された構造の図である。二量体のｈＦｌｔ３Ｌ構造は、灰色の異なる影の各単量体を有する空間充填モードで描画される。アルファボディー  ｈＦｌｔ３Ｌ＿ｃｌ４ｍはリボンのように示され、そのＮ末端は「Ｎ」と表示される。アルファボディーヘリックスＡ、ＢおよびＣならびにリンカーセグメントＬ１およびＬ２はそれに応じて表示される。リンカーセグメントＬ２は、（Ｌ１と対照的に）Ｘ線構造において十分目に見えず、分子モデリングにより仕上げた。（ｈＦｌｔ３Ｌから４Å以内に１個以上の側鎖原子を有する）アルファボディー由来のすべての接触残基が細い枝で表わされる。すべてのこのような残基は、Ｃ−ヘリックス中に位置するが、いくつかの追加の接触が、Ｌ１にも同様に観察される。
【実施例】
【０３１５】
実施例１．ＩＬ−２３のｐ１９サブユニットに特異的に結合するアルファボディーの作製
１．アルファボディーライブラリーの作製
１個のライブラリー（「ｓｃＬｉｂ＿Ｂ１０」と称され、「Ｂ１０」とも表示される）において、ランダム化された位置を、アルファボディーのＢヘリックスに導入し、２個の他のライブラリー（それぞれ、「ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１ｂ」または「ＡＣ１１ｂ」および「ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１２」または「ＡＣ１２」と称される）において、ＡおよびＣのヘリックスにおける残基をランダム化した。ＡＣ１１ｂライブラリーは、１１の多様化される残基位置をＡおよびＣのヘリックス内に有するアルファボディーを含み、これらの位置の大部分は、Ａヘリックスにおけるヘプタッドのｃ位およびｇ位およびＣヘリックスにおけるｂ位およびｅ位に位置した。ＡＣ１１ｂライブラリーのランダム化されたアミノ酸配列を、図１Ａに示す。
【０３１６】
ＡＣ１２ライブラリーは、ＡＣ１１ｂライブラリーと同様に、ＡおよびＣのヘリックスにより形成される溝中に１２個の残基可変位置を有するアルファボディーを含んだが、可変位置をより「パッチ様」にするという明確な目的により改変された。この目的のために、Ｃヘリックスにおける２個のヘプタッドのｆ位を、同様にランダム化した。このライブラリーにおいて、Ｌ１およびＬ２リンカーは、８残基のＧｌｙ／Ｓｅｒ配列を含む。ＡＣ１２ライブラリーのランダム化されたアミノ酸配列を、図１Ｂに示す。
【０３１７】
Ｂ１０ライブラリーは、主にヘリックスＢの末端に近い、ヘプタッドのｂ位、ｃ位、ｆ位およびｇ位に位置した、Ｂヘリックスにおける９個の残基可変位置を有するアルファボディーを含んだ。アルファボディーの位置Ｂ３ｇが可変残基として含まれた場合、位置Ｃ１ｇのそのＨ結合パートナーもまた変動した。アルファボディーの位置は、本明細書において３文字表記法を使用して言及し、第１の文字はヘリックスを表わし、第２の文字はヘプタッドの数を表わし、第３の文字はヘプタッドにおける位置を表わす（例えば、「Ｃ１ｇ」は、Ｃヘリックスの第１のヘプタッドのｇ位を指す）。したがって、Ｂ１０ライブラリーにおいて合計１０個の残基が多様化された。Ｂ１０ライブラリーのランダム化されたアミノ酸配列を、図１Ｃに示す。
【０３１８】
これらのライブラリーは、ＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧ（Ｇｅｒｍａｎｙ）により整えられ、形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ＥＲ２７３８株、ｓｕｐＥ株）として届けられた。
【０３１９】
２．ファージライブラリーの作製
この実施例に記載の３個のファージディスプレイアルファボディーライブラリーを個別に使用して、ＩＬ−２３についてのバイオパニングキャンペーンを実施した。加えて、さらに「ｍｉｘ」と称されるこれらのライブラリーの混合物を、別個のバイオパニングキャンペーンに使用した。ファージライブラリーは、ウイルスｐＩＩＩタンパク質との融合タンパク質として、ランダム化アルファボディー配列をディスプレイした。ディスプレイに使用した系は、一価のディスプレイをもたらすファージミド系であるが、他のディスプレイ系も同様に想定できる。アルファボディーライブラリーのサイズは、約１Ｅ９（１０億）の固有のクローン（ｕ．ｃ．）に対応する。ライブラリーのレスキューの期間、ライブラリーの複雑さ（すなわち多様性）が保存されること、およびすべてのアルファボディー変異体が、レスキューされたファージライブラリーに提示されることが重要である。
【０３２０】
各ライブラリーのサイズおよびＧｅｎｅＡｒｔにより提供された形質転換細菌の濃度に基づき、ファージレスキューのための細菌培養液の接種体積および出発体積を計算した。ライブラリーの多様性の保護を確実にするためにライブラリーの実際のサイズより約１０倍多くのファージをレスキューすることを意図した。
【０３２１】
ＳｃＬｉｂ＿ＡＣ１２（ＡＣ１２）ライブラリーは、１．４Ｅ９ｕ．ｃ．のサイズを有し、提供されたストックは、２．３Ｅ１０の形質転換細菌／ｍｌを有した。１．４Ｅ１０のファージがレスキューされ、したがって、１．４Ｅ１０／２．３Ｅ１０＝０．６０８ｍｌのストックを、接種材料として使用した。０．０５のＯＤ６００ｎｍ（１．５Ｅ７の形質転換細菌／ｍｌを含有する）を超えないために、９３３ｍｌ（９３３＝１．４Ｅ１０／１．５Ｅ７）の液体成長培地に、０．６０８ｍｌの形質転換細菌ストックを接種した。
【０３２２】
同じタイプの計算を、ｓｃＬｉｂ＿Ｂ１０ライブラリーに実施した。このライブラリーは２．２Ｅ９ｕ．ｃ．のサイズを有した（形質転換細菌のストック：１．９Ｅ１０／ｍｌ）。２．２Ｅ１０のファージをレスキューし、したがって２．２Ｅ１０／１．９Ｅ１０＝１．１５７ｍｌのストックを、接種材料として使用した。０．０５のＯＤ６００ｎｍ（１．５Ｅ７の形質転換細菌／ｍｌを含有する）を超えないために、１４６６ｍｌ（１４６６＝２．２Ｅ１０／１．５Ｅ７）の液体成長培地に、１．１５７ｍｌの形質転換細菌ストックを接種した。
【０３２３】
同じタイプの計算を、ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１ｂライブラリーに実施した。このライブラリーは１．９Ｅ９ｕ．ｃ．のサイズを有した（形質転換細菌のストック：３Ｅ１０／ｍｌ）。１．９Ｅ１０のファージをレスキューし、したがって１．９Ｅ１０／３Ｅ１０＝０．６３３ｍｌのストックを、接種材料として使用した。０．０５のＯＤ６００ｎｍ（１．５Ｅ７の形質転換細菌／ｍｌを含有する）を超えないために、１２６６ｍｌ（１２６６＝１．９Ｅ１０／１．５Ｅ７）の液体成長培地に、０．６３３ｍｌの形質転換細菌ストックを接種した。
【０３２４】
ライブラリーストックの接種材料（０．６０８ｍｌ、１．１５７ｍｌおよび０．６３３ｍｌ）を、計算された体積（それぞれ、９３３ｍｌ、１４６６ｍｌおよび１２６６ｍｌ）の、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２％のグルコースを添加した２×ＴＹ（２×ＴＹ−ＡＧ）からなる成長培地に移した。成長培地を含有するバッフルフラスコは、良好な通気を維持するために、好ましくは過充填すべきでないことに留意されたい。
【０３２５】
細菌培養液を、３７℃において振とうしながら（３００ｒｐｍ）バッフルフラスコ中で、０．５のＯＤ６００ｎｍ（対数中期）に達するまで成長させた。細菌培養液を、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）との重複感染に使用して、ファージ粒子を作製した。ヘルパーファージの添加前に、細菌培養液の試料を取り、このステージにおける生存細胞の合計数を、２×ＴＹ−ＡＧ寒天プレートにおける滴定により決定した。重複感染に適用されるヘルパーファージ／細菌の割合は、２０：１であった。加えるべきヘルパーファージの濃度を計算するために、下記式を使用した：３Ｅ８×０．５×培養液体積×２０＝培養液に加えるべきヘルパーファージの濃度。
【０３２６】
感染培養液を、３７℃において３０分間、振とうせずにインキュベートし、細菌を感染させた。インキュベーション後、感染培養液の試料を、２×ＴＹ−ＡＧ寒天プレートおよび２×ＴＹ−ＡＧＫ寒天プレート（ヘルパーファージはカナマイシン耐性なので、Ｋはカナマイシンを表わす（２５マイクログラム／ｍｌ））における滴定のために採取し、それぞれ、生存細菌および感染細菌の数を決定した。感染培養液を、次いでさらに３０分間、３７℃において、振とうしながらインキュベートした。
【０３２７】
インキュベーション後、細菌細胞のペレットを、培養液を、４０００ｒｐｍにおいて１０分間、室温において遠心分離することによって得た。細菌ペレットを、初期出発体積として、同じ体積のあらかじめ温めた２×ＴＹ−ＡＫ培地に再懸濁した。培養液を、一晩、３０℃において振とうしながら（３００ｒｍｐ）成長させた。
【０３２８】
一晩のインキュベーション後、培養液の試料を、２×ＴＹ−ＡＧＫ寒天プレートにおける滴定のために採取し、生存細胞を決定した。培養液を５分間氷上で冷却し、細菌を、７０００ｒｐｍにおいて２０分間ペレット化した。上清を収集し、１／５の体積の２０％のＰＥＧ４０００／２．５ＭのＮａＣｌの溶液を加え、氷上で１から２時間インキュベートすることによって、ファージを沈殿させた。インキュベーション後、４℃において、７０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離することによって、ファージを回収した。ファージのペレットを、３５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／９００ｍｌの細菌培養液に溶解し、細菌のデブリを、１０分間、１２０００ｒｐｍにおいて遠心分離することによって取り除いた。第２のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿を、１時間実施し、その後細菌のデブリを取り除いた。最終的に、ライブラリーをディスプレイする精製されたファージを得た（１０ｍｌ／９００ｍｌの初期細菌培養液）。１５％のグリセロールをファージに加え、−８０℃において保存した。
【０３２９】
ライブラリーをディスプレイするファージ調製品の力価を、精製されたファージの段階希釈液を細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１株）に感染させ、これらの希釈液を２×ＴＹ−ＡＧ寒天プレートにプレートアウトすることによって決定した。この滴定により、感染ファージ粒子（コロニー形成単位（ｃｆｕ）または形質導入単位（ＴＵ））の数を決定した。ライブラリーは、形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２７３８細菌として提供されたが、すべてのさらなるファージの増殖を、ファージディスプレイ技術に一般的に使用される菌株であるＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して実施した。
【０３３０】
アルファボディーの発現を、ウェスタンブロット分析において抗ｐＩＩＩ抗体を使用して評価し、野生型ｐＩＩＩタンパク質およびアルファボディー融合ｐＩＩＩタンパク質の存在を決定した。融合ｐＩＩＩタンパク質の分子量は、野生型ｐＩＩＩタンパク質の分子量より高く、したがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいてより低速で移動すると思われる。融合タンパク質が存在する場合、２本のバンドが、抗ｐＩＩＩ抗体を使用して可視化されるはずである。
【０３３１】
この特別な実施例のレスキューされたライブラリーの力価を表１に示す。
【０３３２】
【表１】
2014504869.tif 000002
【０３３３】
ライブラリーｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１ｂ、ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１２およびｓｃＬｉｂ＿Ｂ１０に関して、ライブラリーのサイズの、それぞれ、１７、１４および８倍の力価が得られた。ウェスタンブロット分析は、すべてのライブラリーに関して、アルファボディー融合ｐＩＩＩタンパク質が存在したことを示した（図２）。２本のバンドが可視化された。下のバンドは、野生型ｐＩＩＩに対応し、高分子量を有する上のバンドは融合ｐＩＩＩタンパク質に対応する（図２）。結論として、ライブラリーのレスキューは成功であった。初期ライブラリーサイズの１０倍を超える力価を得、ウェスタンブロットに従って、すべてのライブラリーが融合ｐＩＩＩタンパク質をディスプレイした。
【０３３４】
他の系、例えば、ドットブロットを使用して、融合タンパク質の存在を評価できるが、この特長の評価を望む場合、さらに、ディスプレイレベル（すなわち、融合タンパク質の平均数／ファージ）を決定するためにも使用できる。ファージの２倍希釈液を、ニトロセルロース膜に、通常二系列（一方は野生型ｐＩＩＩ用であり、他方は融合ｐＩＩＩの可視化のためである）にスポットする。野生型ｐＩＩＩおよび融合ｐＩＩＩタンパク質は、それぞれ、抗ｐＩＩＩ抗体および抗Ｈｉｓ抗体を使用して可視化される。他の抗タグ抗体を、外来インサートによりディスプレイされるタグ（Ｍｙｃ−タグ、ＨＡタグ…）に応じて、使用することができる。抗ｐＩＩＩ抗体および抗Ｈｉｓタグ抗体の両方を検出する、アルカリホスファターゼにコンジュゲートされた二次抗体は、比色分析による読み取りが可能である。野生型ｐＩＩＩおよび融合ｐＩＩＩの検出の両方において同じ強度のスポットが検出され、両方の検出系において同じ強度をディスプレイするスポットの２つのファージ濃度の比率は、ライブラリーのディスプレイ数を示すものである。
【０３３５】
３．ＩＬ−２３に対するアルファボディーライブラリーのバイオパニング
４種の別個のバイオパニングキャンペーンを、個別のライブラリーＡＣ１１ｂ、ＡＣ１２およびＢ１０ならびに３種の等量混合物を各々使用して実施した。ファージライブラリーと一緒にインキュベーション後、標的ＩＬ−２３の捕捉を、サイトカインＩＬ−２３のサブユニットｐ４０を認識する、ビオチン化された抗ｐ４０ＩＬ−２３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、５０８８０２；クローンＣ８．６）を使用して実施した。ライブラリーと一緒のインキュベーションの前に、サイトカインＩＬ−２３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、３４−８２３９−８５、ロットＥ０３４０４９）を、抗ｐ４０抗体と一緒にインキュベートした。この戦略は、ｐ４０サブユニットを、抗体を用いて（部分的に）ブロックすることによって、ＩＬ−２３のｐ１９サブユニットの結合剤に対する選択を駆動するために開発された。この特定の抗体を、その後さらに使用して、ＩＬ−２３を、固体支持体に洗浄目的のために固定化した。
【０３３６】
具体的には、可変濃度のＩＬ−２３を、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２）バッファー中で、２倍濃度のビオチン化抗ＩＬ−２３ｐ４０抗体で、１時間インキュベートした。ＩＬ−２３の濃度は、より標的特異性のファージを得るように選択の厳密性を調節するため、選択ラウンドに応じて変化させた。２００、１００、５０、２５および１２．５ｎＭのＩＬ−２３をそれぞれ使用して、５ラウンドを実施した。対照的に、投入ファージ、すなわち、各選択ラウンドにおいて標的に加えられるファージの濃度は一定のままであり、１Ｅ１２ファージに相当した。ＩｇＧ−Ｆｃ結合剤の選択を避けるために（抗ｐ４０抗体がＩＬ−２３を捕捉するために使用された事実を考慮して）、第２ラウンドから、２０マイクロモルの全ＩｇＧ（Ｓａｎｇｕｉｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、ＩＬ−２３／抗ｐ４０抗体／ファージ混合物に加えた。ファージを標的（抗ｐ４０＋ＩＬ−２３）と一緒に１時間室温においてインキュベートし、その後０．１ｍｌのストレプトアビジンコーティング磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３０分間捕捉した。それらの使用前に、磁気ビーズを製造業者の推奨どおりに洗浄し、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１時間、室温で回転ホイールにおいてブロックした。
【０３３７】
捕捉後、次いで磁気ビーズを、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有する１ｍｌのＰＢＳで１０回洗浄して、非特異的ファージを排除した。磁気ビーズは、バイオパニングの当業者には公知の磁石を使用して、容易に洗浄できる。
【０３３８】
標的特異的ファージを、０．２ｍｌグリシン−ＨＣｌバッファー、ｐＨ２を使用して５分間、ビーズから溶出し、その後、０．０５ｍｌのＴｒｉｓバッファー、ｐＨ８を用いて中和した。追加の分画を、対数中期の細菌を直接磁気ビーズに加えることにより回収した。
【０３３９】
溶出されたファージの試料を使用して、対数中期（ＯＤ６００ｎｍ＝０．５）まで成長させたＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細菌の感染による滴定のために、２×ＴＹ中（希釈範囲（１Ｅ−１から１Ｅ−４）で）１０倍段階希釈液を調製した。１０倍希釈液（１Ｅ−７から１Ｅ−９の範囲内）を、選択ラウンドにおいて投入として使用されたファージの少量の試料から、さらに調製した。これらの滴定により、以前に説明した式を使用して、選択ラウンドの収率を計算できる。
【０３４０】
この実施例において、０．９ｍｌの細菌を０．１ｍｌのファージ希釈液に加え、３０分間、３７℃においてインキュベートした。０．１ｍｌの感染培養液を、コロニーの計数および力価の決定のために、２×ＴＹ−ＡＧ寒天プレートに播種した。
【０３４１】
溶出されたファージを使用して、２０ｍｌの対数中期のファージをＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細菌に、３０分間、３７℃において感染させた。インキュベーション後、細菌ペレットを、４０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心分離することによって得た。このペレットを、２ｍｌの２×ＴＹに再懸濁し、２枚の大型の２×ＴＹ−ＡＧ寒天プレート（２５×２５ｃｍ）にプレートアウトした。
【０３４２】
０．２５ｍｌの対数中期の細菌を磁気ビーズに直接加え、３０分間、３７℃においてインキュベートした。試料を、以前に説明したように滴定用に採取した。感染培養液を大型の２×ＴＹ−ＡＧ寒天プレートにプレートアウトした。
【０３４３】
翌日、各プレートのコロニーを計数し、投入および産出ファージの力価を、収率計算のために決定した。大型感染培養液に対応する大型寒天プレート上の細菌を、プレートからＬＢを使用してこそげ取って、細菌数を、ＯＤ６００ｎｍを測定することによって決定し、１５％グリセロールを加えて、−８０℃において保存した。ファージを、以前に説明したようにこれらのグリセロールストックからレスキューし、連続選択ラウンドのための精製ファージを得た。１Ｅ１２ファージを、次回の選択ラウンドのために採取した。
【０３４４】
ＩＬ−２３に対する個別のライブラリーおよびプールされたライブラリーを用いた、５回の選択ラウンドに関して得られた力価を表２に示す。
【０３４５】
【表２】
2014504869.tif 000003
【０３４６】
ＡＣ１１ｂおよびＡＣ１２ライブラリーを用いたバイオパニングに関して、４回の選択ラウンド後もっとも高い収率を得た（表２）。ライブラリーＢ１０を用いたバイオパニングは、５ラウンド後にもっとも高い収率をもたらした（表２）。すべてのバイオパニングキャンペーンに関して、産出力価が４８から１００倍の間で増加したので、濃縮が観察された。
【０３４７】
さまざまな選択ラウンドから標的陽性クローンを単離するため、およびバイオパニングの有効性をさらに決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイによるスクリーニングを実施した。このアッセイにおいて、少量の細菌培養液由来の上清を試験した。これらの細菌培養液は、さまざまな選択ラウンド由来の滴定プレートからランダムに摘み取った個別のクローン（すなわち個別のファージ）に対応した。これらの細菌クローンを、９６ディープウェルプレートにおいて０．１２ｍｌの２×ＴＹ−ＡＧ中で３０℃において一晩、振とうしながら（１８０ｒｐｍ）（ＭＡＳＴＥＲＰＬＡＴＥ）成長させた。翌日、このプレートの０．００２ｍｌを使用して０．１ｍｌ／ウェルのグルコース非含有２×ＴＹ−Ａに接種し、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（２Ｅ９プラーク形成単位／０．０２マイクロリットル／ウェル）を早急に加えた。３７℃において振とうしながら（１８０ｒｐｍ）の２．５時間のインキュベーション後、０．０３０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＫ（Ａｍｐ：０．１ｍｇ／ｍｌおよびＫａｎ：０．０５ｍｇ／ｍｌ）を培養液に加え、さらに一晩、ファージの増殖のために３０℃において振とうしながら（１８０ｒｐｍ）インキュベートした。
【０３４８】
マスタープレートには、−８０℃における保存のために、０．０２０ｍｌの８０％グリセロールを加えた。マスタープレートは、それらの標的相互作用のさらなる特徴付けのための個別の陽性クローンの成長およびそれに続くファージ精製に対して機能する。
【０３４９】
この実施例において、４種のバイオパニングキャンペーンから４４個のクローン／選択ラウンドをスクリーニングした。標的特異的クローンをこのラウンドから単離する期待が低いので、第１の選択ラウンドからはクローンはまったくスクリーニングしなかった。
【０３５０】
ＥＬＩＳＡの設定は以下の通りであった。ニュートラアビジンを、ＰＢＳ（０．１００ｍｌ）中０．０１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、１時間、室温（ＲＴ）において、プレートに固定した。プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）を用いて５分間、５回洗浄した。その次に、０．１ｍｌのビオチン化抗ｐ４０抗体（１００ｎＭ）を、プレート中の０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳに加え、一晩４℃またはＲＴにおいて１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、ＰＢＳＴを用いて５回洗浄し、０．１％ＢＳＡおよび０．５％のゼラチンを含有するＰＢＳ（０．１２０ｍｌ／ウェル）を用いて、少なくとも１時間、室温において、または一晩、４℃においてブロックした。ＰＢＳＴを用いて５回洗浄後、１００ｎＭのＩＬ−２３（標的）を、０．１％ＢＳＡ含有の０．１ｍｌのＰＢＳに加えた。個別の陰性対照には、ＩＬ−２３をまったく加えなかった（バックグラウンド）。
【０３５１】
その間に、細菌プレートを、１７００ｒｐｍにおいて１０分間、遠心分離し、細菌をペレット化した。固定化されたＩＬ−２３を含むプレートを、ＰＢＳＴを用いて５回洗浄し、０．２％ＢＳＡを含有する０．０５０ｍｌのＰＢＳを、ファージを含有する０．０５０ｍｌの細菌培養液の上清と一緒にプレートに加えた。プレートを、１〜１．５時間、室温において振とうしながらインキュベートした。プレートの振とうは、ＥＬＩＳＡのシグナルを増強した。
【０３５２】
インキュベーション後、プレートを、ＰＢＳＴを用いて５回洗浄し、０．１％ＢＳＡを含有する２％ＰＢＳ（０．１ｍｌ／ウェル）で１：５０００に希釈されたＨＲＰにコンジュゲートされた抗Ｍ１３抗体と一緒に、４０分間、室温において、揺らしながらインキュベートした。プレートを５回洗浄し、ＴＭＢ（ＨＲＰの基質）溶液（０．１ｍｌ／ウェル）を加え、プレートを、暗所で５〜３０分の間インキュベートした。反応を、０．０５ｍｌの２ＮのＨ２ＳＯ４を各ウェルに加えることによって停止させ、プレートを４５０ｎｍにおいて読み取った。
【０３５３】
標的のシグナルが、バックグラウンドの少なくとも３倍を超える場合、クローンは陽性であると考えられた。
【０３５４】
この実施例において、（ＡＣ１１ｂ、ＡＣ１２および混合ライブラリーを使用した）３種のバイオパニングキャンペーンが、ＥＬＩＳＡにより決定された陽性クローンのパーセンテージおよび連続選択ラウンドの間の正の相関関係をもたらした（図３）。ライブラリーＢ１０は、あまりよく実施されず、わずか少数の陽性クローンがこのライブラリーから取り出された。明らかに、このことは、アルファボディーが、溝結合様式でＩＬ−２３標的を好んで認識する傾向があることを示している。ＡＣ１１ｂおよびＡＣ１２ライブラリーに関して、９０％以上の陽性クローンが、４回の選択ラウンドの後で得られた（図３）。
【０３５５】
このＥＬＩＳＡは、可溶性アルファボディーをファージにディスプレイされたアルファボディーの代わりに使用して実施することもできる。可溶性アルファボディーの作製は、無グルコース条件を使用することによる、ｌａｃＺプロモーターの異化代謝抑制および細菌ゲノムにおけるｌａｃｌｑリプレッサーを不活性化することによる、転写のイソプロピルチオ−ベータ−ガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）誘導に基づく。アルファボディーをコードする遺伝子が転写され、可溶性アルファボディーが産生される。より正確には、細菌コロニーを、選択ラウンドの滴定プレートからランダムに摘み取り、９６ウェルプレートにおいて、０．１２ｍｌの２×ＴＹ−ＡＧ中で３０℃において、一晩振とうしながら（１８０ｒｐｍ）成長させる。翌日、このプレートの０．００２ｍｌを使用して、０．１％のグルコースを含む０．１ｍｌ／ウェルの２×ＴＹ−Ａに接種し、３７℃において、０．９のＯＤ６００ｎｍに達するまで（およそ２から３時間）さらに成長させた。その後、０．０３ｍｌの２×ＴＹ−Ａおよび３．３ｍＭのＩＰＴＧを培養液に加え、３０℃において振とうしながら（１８０ｒｐｍ）、１６〜１８時間さらにインキュベートする。ＩＰＴＧによる発現の誘導後、０．０１４ｍｌの新鮮に調製したＢ−ｐｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）をウェルごとに加え、１５分間、室温において混合しながらインキュベートした。その後、上清をＥＬＩＳＡアッセイに使用する。
【０３５６】
アルファボディー配列を、ＡＣ１２およびＡＣ１１ｂのバイオパニングキャンペーン由来の、ＩＬ−２３に結合するすべての陽性クローンに関して決定した（クローンは、異なるバイオパニングラウンドから摘み取った）。これらの配列を、ＶＩＢ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｎｔｗｅｒｐ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）の標準的ＤＮＡシーケンシングサービスにより、ＳａｎｇｅｒのシーケンシングおよびＭ１３ＲＳシーケンシングプライマーを使用して決定した。表３は、ＩＬ−２３に対するＡＣ１２ライブラリーからもたらされる、７７個のアルファボディー配列の多重アライメントを示す。
【０３５７】
表４は、ＩＬ−２３に対するＡＣ１１ｂライブラリーからもたらされる、５０個のアルファボディー配列の多重アライメントを示す。
【０３５８】
また、これらのアルファボディーは、上記のように可溶性アルファボディー（すなわち、ファージフォーマット以外）として容易に作製でき、その後、タンパク質精製の当業者に公知の標準的Ｎｉ−ＮＴＡ／ＳＥＣ手順により精製できる。Ｎｉ−ＮＴＡ精製は、Ｈｉｓ−タグを、再クローニングステップの結果として、それらのＣ末端（アルファボディーライブラリーＡＣ１２およびＢ１０の場合と同様に）またはそれらのＮ末端のいずれかに、含有する可溶性アルファボディーの容易な第１の精製ステップであり、所与のアルファボディー遺伝子をそのファージ状況から（標準的分子生物学技術により）切り取り、適切な発現ベクター、例えば、ｐＥＴ１６に挿入し、この時、Ｈｉｓ−タグおよびプロテアーゼ切断部位はアルファボディー遺伝子の前に置かれる。ＩＬ−２３との結合に関するＫｄ（解離定数）を決定するために、可溶性アルファボディーを、（動的）Ｂｉａｃｏｒｅ分析またはＦｒｉｇｕｅｔ（間接的ＥＬＩＳＡ）分析〔フリギュエット（Ｆｒｉｇｕｅｔ）ら、１９８５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７７：３０５−３１９〕または結合力の測定の当業者にとって公知の別の適切な方法に供する。
【０３５９】
４．交差反応性の試験
マウスＩＬ−２３との交差反応性を、ヒトＩＬ−２３戦略と同様に、マウスＩＬ−２３をマウス抗ｐ４０抗体により捕捉するＥＬＩＳＡ分析アッセイを使用して研究した。ＥＬＩＳＡアッセイを、前述のように実施し、標的に対するクローンのシグナルが、バックグラウンドについてのシグナルの少なくとも２．５倍を超えた場合、クローンを陽性と考えた。ＡＣ１１ｂおよびＡＣ１２ライブラリーからもたらされたＩＬ−２３陽性クローンに関して、それぞれ、分析クローンの３４％および２６％がマウスＩＬ−２３と交差反応性であったことが観察された（標的／バックグラウンド比、Ｔ／Ｂ、＞２．５）。
【０３６０】
５．ドメイン特異性
１２７個の異なるクローンのドメイン特異性を、ヒトＩＬ−１２に対してさらに試験した。ＥＬＩＳＡを、ＩＬ−２３に関して説明したように実施した。ヒトＩＬ−１２を、抗ヒトｐ４０抗体を介してプレートに捕捉し、ＥＬＩＳＡを前述のように実施した。ＥＬＩＳＡの結果は、それぞれ、ＡＣ１１ｂ、ＡＣ１２およびＢ１０ライブラリー由来の３／５０、５／７６および０個のクローンが、ヒトＩＬ−１２と交差反応性であったことを示した。ＡＣ１２ライブラリーに関しては、５個のヒトＩＬ−１２陽性クローンのうちの４個が、マウスＩＬ−２３とも交差反応した。
【０３６１】
【表３−１】
2014504869.tif 000004
【０３６２】
【表３−２】
2014504869.tif 000005
【０３６３】
【表３−３】
2014504869.tif 000006
【０３６４】
【表４−１】
2014504869.tif 000007
【０３６５】
【表４−２】
2014504869.tif 000008
【０３６６】
【表４−３】
2014504869.tif 000009
【０３６７】
【表４−４】
2014504869.tif 000010
【０３６８】
実施例２．Ｆｌｔ３ＬおよびＦｌｔ３Ｒに特異的に結合するアルファボディーの作製
本実施例において、アルファボディープラットホーム技術を使用してＦｌｔ３Ｌサイトカインに対する結合剤およびＦｌｔ３Ｒの外部ドメインの可溶性形態における結合剤を得た。
【０３６９】
バイオパニングキャンペーンを、ヒトＦｌｔ３Ｌ（ｈＦｌｔ３Ｌ）および可溶性ヒトＦｌｔ３Ｒ外部ドメイン（ｈＦｌｔ３Ｒｅ）の両方に対して実施した。組換えｈＦｌｔ３Ｌ標的をヴァーストレート（Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｊ．，２００９，２８：５７−６５に記載のようにＥ．ｃｏｌｉから作製した。組換えｈＦｌｔ３Ｒｅ標的は、ヴァーストレート（Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ）ら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｆ，２０１１，６７：３２５−３３１に記載のように哺乳動物細胞から作製した。基本的に、実施例１と同じ選択およびスクリーニングのプロトコルに従った。しかしながら、実施例１のものとは異なる３種のファージディスプレイされたアルファボディーライブラリーを使用した。アルファボディーライブラリー配列を、図４に示す。図４Ａに示される、「ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１」または「ＡＣ１１」と称される第１のライブラリーは、図１ｂのＡＣ１１ｂライブラリーと高度に類似した配列を含んだ。厳密には、α−ヘリックスＡおよびＣにおける同じ１１個の可変位置を維持していたが、リンカー配列およびＮ末端キャッピングモチーフが異なって選択された。「ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ７」または「ＡＣ７」と称される第２のライブラリーは、各アルファへリックスにおいてヘプタッド（１組のヘプタッド）が欠失された、より小さいアルファボディー足場に基づいた。このライブラリーは、ＡヘリックスおよびＣヘリックス中に位置した７個の多様化される残基位置を含んだ（図４Ｂ）。ＡＣ１１およびＡＣ７ライブラリーの両方は、アミノ酸の多様化が、平行なヘリックスＡおよびＣにより形成される溝に基本的に限定されるので、「溝ライブラリー」タイプである。「ｓｃＬｉｂ＿Ｃ９」または「Ｃ９」と称される第３のライブラリーは、この場合もまた、「長い」アルファボディー足場に基づき、Ｃヘリックスにおける溶媒配向位置に位置する９個の可変残基を含んだ（図４Ｃ）。単一のヘリックスに限定された可変表面領域および高度に溶媒曝露された可変位置を考慮して、このライブラリーもまた「ヘリックス表面」ライブラリーと称される。
【０３７０】
バイオパニング実験を開始する前に、３個のライブラリーＡＣ１１、ＡＣ７およびＣ９由来の等量のファージを、キャンペーンを、ライブラリー混合物を使用して実行するために混合した。
【０３７１】
バイオパニングを標的ｈＦｌｔ３ＬおよびｈＦｌｔ３Ｒｅのビオチン化形態に対して実施した。これらのキャンペーンはそれぞれ、少なくとも５回の選択ラウンドから成った。各ラウンドにおいて、１Ｅ１２のファージを、１時間、Ｒ．Ｔ．において、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中５００ｎＭの標的と一緒にインキュベートし、それに続きストレプトアビジンコーティング磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓに捕捉した。捕捉および溶出のプロトコルは、実施例１のとおりであった。実施例１のパニングプロトコルとは反対に、標的濃度は、異なるラウンドにわたって一定に保った。一定の厳密性にもかかわらず、ファージの明らかな濃縮が、両方の標的に関してラウンド３（Ｒ３）において見られた。産出／投入ファージ比（Ｏ／Ｉ比）は、ｈＦｌｔ３Ｌの選択に関して、Ｒ２と比較してＲ３において９０倍、Ｒ４において６００倍に上がった。ラウンド５はさらなる有意な濃縮は示さず、したがってこのキャンペーンは、Ｒ５後に停止した。ｈＦｌｔ３Ｒｅに対するバイオパニングキャンペーンは、連続ラウンドの３から５においてＯ／Ｉ比のゆっくりとした上昇を示し、したがって、本キャンペーンをラウンド６まで続けた。この最終ラウンド、Ｒ６は、突然、濃縮の急勾配の上昇を示し、Ｏ／Ｉ比はＲ２のＯ／Ｉ比より２００００倍であった。
【０３７２】
個別のファージクローンを、両方のキャンペーンのラウンド４および５から、ランダムに摘み取り、実施例１に記載の方法に従った標準的ファージＥＬＩＳＡにおいてさらに分析した。４枚の９６ウェルプレートを、シグナル／バックグラウンドの計算目的で空のままにしておく、各プレートの８ウェルを除いて、ビオチン化ｈＦｌｔ３ＬまたはｈＦｌｔ３Ｒｅ（各２プレート）によりコーティングした。２つのキャンペーンから選択されたファージクローンを、（すなわち、それらが選択された対象である標的によりコーティングされた）陽性プレートおよび（すなわち、他の標的によりコーティングされた）陰性プレートの両方について、標的特異性の検査目的で試験した。
【０３７３】
ｈＦｌｔ３Ｌにより選択されたクローンの集団において、そのうちの５７％が陽性とみなされた（標的／バックグラウンド比、Ｔ／Ｂ＞３）。ｈＦｌｔ３Ｒｅに対して選択されたクローンに関して、４０％がＴ／Ｂ＞３を有した。重要なことには、任意の標的に対して選択されたクローンはどれも、対照プレートに対して陽性であることが見い出されず、標的の認識が有意かつ高度に特異的であったことを示唆している。
【０３７４】
次に、もっとも高いＴ／Ｂ比を有する２０個のクローンを、各陽性プレートから摘み取り、シーケンシングに提出した。驚いたことに、両方のキャンペーン由来のすべての配列が消滅し、ヘリックス表面ライブラリーＣ９から排他的に生じた。反対のことが、実施例１に記載のＩＬ−２３についてのバイオパニング実験において正確に観察されたので、溝ライブラリーのＡＣ１１ｂまたはＡＣ１２由来の配列の不在は期待していなかった。
【０３７５】
表５ａおよび５ｂはそれぞれ、ｈＦｌｔ３ＬおよびｈＦｌｔ３Ｒｅに対して選択されたアルファボディーにおける各可変位置のアミノ酸を示す。意図的でない変異は存在しなかったので、可変位置のみを示す。ｈＦｌｔ３ＬおよびｈＦｌｔ３Ｒｅにより選択されたクローンに関して、１８および１９個の配列は、それぞれ決定に成功できた。ｈＦｌｔ３Ｌセットは１０個の固有の配列を含み、そのうちの１つは、８回出現し、別のものは２回出現し、残りのものは１回だけ出現した。所与のバイオパニングラウンドにおいて見出された各配列の回数（Ｎ＿Ｒｘ）は、表５ａおよび５ｂの右に示した（例えば、Ｎ＿Ｒ４＝６は、バイオパニングのラウンドＲ４から選択されたセット内に、この配列が６回出現したことを意味する）。ｈＦｌｔ３Ｒｅのセットは、２個の固有の配列のみを含み、１８回出現する単一の配列により大半を占められていた。
【０３７６】
ｈＦｌｔ３Ｒｅのデータセットは、小さすぎてさらなる配列分析ができなかったが、ｈＦｌｔ３Ｌのセットは、明らかな位置優先性を示した。全体として、トリプトファンの完全な保存が、２ｆ位（すなわち、Ｃ９ライブラリー由来のアルファボディーのＣヘリックスにおける第２のヘプタッドのｆ位）において観察された。加えて、１ｆ位は、アルギニンまたはグリシンのいずれかに関して強力な優先性を示し、２ｂ位は、芳香族／脂肪族残基の高頻度を示し、３ｃ位は酸性残基のアスパラギン酸またはグルタミン酸の高い発生を示した。かかる高度の配列保存は、標的分子ｈＦｌｔ３Ｌの一般的結合部位の暗示であり得る。しかしながら、表５ａ中のデータセットの前半および後半もまた、特異的位置が異なる。例えば、２ｃ位におけるグルタミン酸の厳密な保存が、６−１０に番号付されたクローンにおいて観察されるが、１−５においては観察されない。クローン７−１０は、３ｂ位において塩基性残基（アルギニン、リジン）を好むように思われる。クローン１−５は、３ｆ位に排他的にグルタミンを有する。最後に、クローン１−６は、４ｂおよび４ｃ位に非極性残基を示したが、一方、他は主に極性残基を有した。この状況は、複合体中の異なるアルファボディー結合様式にもかかわらず、ｈＦｌｔ３Ｌの共通の結合領域の暗示であると思われる。最終的に、Ｆｌｔ３Ｒｅに対してラウンド４から選択されたクローンのほぼ固有の配列（表５ｂ）は、Ｆｌｔ３受容体に対する単一の優勢な結合様式を示唆し、上述の後期ラウンドの高いＯ／Ｉ比を説明している。１回のみ見出された第２の配列は、Ｆｌｔ３Ｌにより選択されたクローンとの予期しない類似性を示し、おそらくシーケンシング用クローンの調製期間中の人為的結果（汚染）の結果である。
【０３７７】
【表５ａ】
2014504869.tif 000011
【０３７８】
【表５ｂ】
2014504869.tif 000012
【０３７９】
実施例３．アルファボディーおよびｈＦｌｔ３Ｌの間の相互作用に関する構造的基盤
表５ａの４番に対応するアルファボディー配列の２個のｈｉｓタグ付けされた変異体を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて組換え的に作製した。これらの構築物に関する合成遺伝子を、Ｎ末端に１０−Ｈｉｓタグを有するｐＥＴ１６ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）内の、ＮｄｅｌおよびＢａｍＨＩ部位の間にインフレームでサブクローニングした。本明細書において「ｈＦｌｔ３Ｌ＿ｃｌ４」で表わされ、さらに配列番号：１３４としてさらに提供される第１の変異体は、ベクターの１０−Ｈｉｓタグ配列がＮ末端に付加された、実施例２のファージクローン４番に同定された天然配列からなる。本明細書において「ｈＦｌｔ３Ｌ＿ｃｌ４ｍ」で表わされ、さらに配列番号：１３５としてさらに提供される第２の変異体は、基本的に同じ配列からなるが、α−ヘリックス間に短縮されたリンカーを有し、アルファボディーのＡヘリックスおよびＢヘリックスの両方において、リジンからセリンへの２個の変異を含む。ｈＦｌｔ３Ｌ＿ｃｌ４（配列番号：１３４）およびｈＦｌｔ３Ｌ＿ｃｌ４ｍ（配列番号：１３５）の完全アミノ酸配列を、図５に整列させる。
【０３８０】
遺伝子構築物により、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを担持する宿主のＥ．ｃｏｌｉ細胞（ＢＬ２１（ＤＥ３）株）を、ｌａｃＵＶ５プロモーター（ＤＥ３  ｌｙｓｏｇｅｎｓ）の調節下で形質転換させた。この細胞を、標準ルリア（Ｌｕｒｉａ）−（Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（１０Ｉ）中で３７℃において、カルベニシリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）の存在下で成長させた。光学密度が、６００ｎｍにおいて０．６−０．７で、タンパク質発現を、１ｍＭのイソプロピルβ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導した。発現培養液を一晩インキュベートした。発現培養液を、その後、６０００ｇにおいて１０分間（４℃において）遠心分離した。細胞ペレットを、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５に再懸濁した。次に、この細胞懸濁液を、超音波処理に供した。不溶性分画を遠心分離（２００００ｇ、２０分、４℃）により単離し、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するバッファーを用いて洗浄した。この洗浄ステップをもう１度繰り返した。不溶性タンパク質を、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、４Ｍのグアニジン塩酸塩、ｐＨ８．０中で可溶化し、ロータリーシェーカーにおいて２時間、室温においてインキュベートした。細胞デブリおよび他の非可溶化材料を、遠心分離（１時間、１０００００ｇ、４℃）により取り除いた。上清を、０．２２μｍのフィルターを通してろ過し、ＡＫＴＡ系に連結された、充填済みＮｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（１０ｍＬ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に添加し、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、４Ｍのグアニジン塩酸塩ｐＨ８．０を用いて平衡化した。試料の添加後、カラムを、平衡化バッファーで洗浄した。次に、ランニングバッファーを、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０と交換した。結合タンパク質を、イミダゾール（最終濃度として５００ｍＭ）を用いた段階的グラジエントを使用して溶出した。アルファボディーに対応する溶出分画をプールし、トリプシン消化バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０）中で脱塩した。Ｎ末端Ｈｉｓ−タグを取り除くために、タンパク質溶液を、磁気ビーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に固定化されたＴＰＣＫ−トリプシンと一緒にロータリーシェーカーにおいて２時間、３７℃においてインキュベートした。次に、磁気ビーズを、低速遠心分離（５００ｇ）により取り除き、タンパク質溶液を０．２２μｍのフィルターを通してろ過し、充填済みセファロース・ファスト・フロー（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）カラムに添加した。非結合タンパク質を収集し、孔径５ｋＤａの濃縮機を使用して、超遠心分離により濃縮した。仕上げのステップとして、アルファボディーを、ＡＫＴＡ系に連結されたスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入し、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４を用いて平衡化した。アルファボディーに対応する分画を、−８０℃において保存した。
【０３８１】
アルファボディー  ｈＦｌｔ３Ｌ＿ｃｌ４と標的ｈＦｌｔ３Ｌとの結合を、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）により、その解離定数（ＫＤ）、熱力学的パラメータ（ΔＨ、ΔＳ）および結合化学量論を決定するために試験した。測定前に、アルファボディーおよび標的試料を、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４を含有する２０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファーに対して透析した。ＩＴＣ測定を、３７℃の温度において３系列で実施した。各実験において、溶液中では安定な二量体として存在するｈＦｌｔ３Ｌを、細胞に添加し（それぞれ、ｈＦｌｔ３Ｌ二量体の３．０μＭ、６．５μＭおよび７．０μＭ濃度で）、ｈＦｌｔ３Ｌ＿ｃｌ４を注射器で（それぞれ、４１．３５μＭ、８９．６２μＭおよび８９．６２μＭの濃度で）添加した。図６は、記録されたサーモグラムを示す。エンタルピー変化は、発熱結合反応の暗示であり、平均ΔＨは−１６．６±１．９ｋｃａｌ／モルであった。平均結合自由エネルギー（ΔＧ）は、各サーモグラムの近似親和定数、ＫＡから、方程式、ΔＧ＝−ＲＴ  ｌｎ（ＫＡ）を使用して導き出され、ΔＧ＝＝−９．５±０．４ｋｃａｌ／モルであることが見出された。結合の平均エントロピー変化（ΔＳ）は、自由エネルギーおよびエンタルピー変化から、方程式ΔＧ＝ΔＨ−ＴΔＳを使用して導き出され、ΔＳ＝−２２．９±６．８ｃａｌ／（モル．Ｋ）であることが見出された。３つの測定の最終親和定数および解離定数を、平均されたΔＧ値から逆算して、ＫＡ＝４．９５×１０６Ｍ−１およびＫＤ＝２０２ｎＭであることが見出された。最終的に、サーモグラムは、結合化学量論（ｎ）が０．８８±０．１０であることを示した。これは、ｈＦｌｔ３Ｌの濃度が二量体複合体（ｈＦｌｔ３Ｌ）２に関して示されたので、１個のｈＦｌｔ３Ｌ＿ｃｌ４アルファボディーが１個のｈＦｌｔ３Ｌ二量体に結合したことを暗示する。
【０３８２】
アルファボディー：ｈＦｌｔ３Ｌの結合を特徴付けるさらなる試みにおいて、複合体の結晶化およびそれらの３−Ｄ構造の、Ｘ線結晶学による決定のステップに取り組んだ。具体的には、ｈＦｌｔ３Ｌ＿ｃｌ４ｍ：ｈＦｌｔ３Ｌ複合体を、精製組換えｈＦｌｔ３Ｌ（Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｊ，２００９）をモル過剰のアルファボディーと一緒にインキュベートすることによって形成させた。この複合体を、過剰のアルファボディーから、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４を用いて平衡化されたス＾パーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５カラムを使用して、ゲルろ過によって分離した。複合体に対応する分画をプールし、ビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）濃縮機を使用して最終濃度８ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。濃縮タンパク質溶液のアリコートを取り、液体窒素内で急速冷凍し、その後−８０℃において保存した。続いて、初期結晶スクリーニングを、モスキート（Ｍｏｓｑｕｉｔｏ）結晶化ロボット（ＴＴＰ  Ｌａｂｔｅｃｈ）を用い、市販のスパース・マトリックス・スクリーンズ（ｓｐａｒｓｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｓｃｒｅｅｎｓ）を使用して実施した。結晶化ドロップを、２７７Ｋおよび２９３Ｋの両方に、９６ウェルシッティングドロップ（ｓｉｔｔｉｎｇ−ｄｒｏｐ）結晶化プレートにおいて、１００ｎｌのリザーバ―溶液（４５ｎｌ）と一緒に１００ｎｌのタンパク質溶液を８ｍｇ／ｍｌの濃度で混合することによって設定した。Ｘ線回折実験に適切なｈＦｌｔ３Ｌ＿ｃｌ４ｍ：ｈＦｌｔ３Ｌ複合体の結晶を、２７７ＫにおけるＰＥＧ  ＩＯＮ２ｓｃｒｅｅｎ（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）のいくつかの条件下で、一晩出現させた。ｈＦｌｔ３Ｌ＿ｃｌ４ｍ：ｈＦｌｔ３Ｌ複合体の結晶化を、洗浄された結晶を銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを走らせることによって確認した。その後、結晶を、ＳＰＩＮＥ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｒｙｏｃａｐｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ）に取り付けられたナイロンループ（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、母液（５μｌ）のドロップに移した。抗凍結剤（ＰＥＧ４００）の濃度を、高濃度の抗凍結剤を含有する漸増量の母液をドロップに加えることによって、抗凍結剤の所望の濃度（２０％）に達するまで徐々に調整した。その後の添加との間に３分の平衡時間を配分した。それに続いて、結晶を液体窒素中で急速凍結させ、ＳＰＩＮＥ／ＥＳＲＦの保存用パックに詰め、輸送した。回折実験を、Ｓｗｉｓｓ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ｐａｕｌ  Ｓｃｈｅｒｒｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｖｉｌｌｉｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のＸ０６ＳＡ（ＰＸＩ）ビームラインにおいて実施した。結果として、８％ｖ／ｖ  Ｔａｃｓｉｍａｔｅ  ｐＨ４．０、２０％ＰＥＧ３３５０中で成長させた単一のｈＦｌｔ３Ｌ＿ｃｌ４ｍ：ｈＦｌｔ３Ｌ結晶に関する、１．７Åの解像度の回折データを得、さらなる構造分析に使用した。このデータをＸＤＳの一揃い（Ｋａｂｓｃｈ、２０１０）を使用して統合し、調製した。この構造を、Ｐｈａｓｅｒ〔マッコイ（ＭｃＣｏｙ）ら、２００７〕において実行された分子置換を使用して、ｈＦｌｔ３Ｌの高解像度の構造（ｐｄｂエントリーコード１  Ｅ��Ｅ、Ｓａｖｖｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）を探索モデルとして使用して、解明した。得られたマップは、ｈＦｌｔ３Ｌ＿ｃｌ４ｍ  アルファボディーに関する明らかな２ＦＯ−ＦＣおよび陽性ＦＯ−ＦＣの密度差を示した。モデル（再）構成を、Ｃｏｏｔ〔エムズリー（Ｅｍｓｌｅｙ）ら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ，２０１０〕において手動で実施した。結晶学的精密化を、ＰＨＥＮＩＸ〔アダムス（Ａｄａｍｓ）、２０１０〕において実施した。図７は、ｈＦｌｔ３Ｌ＿ｃｌ４ｍ：ｈＦｌｔ３Ｌ複合体の３Ｄ構造のリボン表示を示す。ＩＴＣにより先に得られた化学量論データと一致した、１個のアルファボディー分子が１個のｈＦｌｔ３Ｌ二量体に結合することが観察された。ｈＦｌｔ３Ｌ構造から４Å以内に少なくとも１個の側鎖原子を有するアミノ酸残基として定義された、アルファボディーの結合残基または「インターフェイス」残基は、元々のアルファボディーライブラリーにおいてランダム化された位置（すなわち、図４Ｃに示されたすべてのｘ位または表５ａに示されたすべての位置、実施例２を参照されたい）に位置したすべての残基を含んだ。このことは、これらのライブラリー位置のすべてが、アルファボディーｈＦｌｔ３Ｌ相互作用にある程度寄与していることを示唆している。さらに、これらのライブラリー残基のすべては、ｈＦｌｔ３Ｌ二量体の単一の単量体（図７の単量体２）と相互作用すると思われる。複合体のインターフェイスの中心は、アルファボディーのＣヘリックスにおける２ｆ位のトリプトファンであり、これは、ｈＦｌｔ３Ｌの比較的疎水性のポケット内に埋もれている。これは、バイオパニングキャンペーンから同定された配列の中に厳密に保存された、この残基の推定の主要な役割を裏付ける（表５ａ）。ライブラリー残基に加えて、ランダム化されていない２個の他の残基、すなわち、Ｃ−ヘリックスにおける２ｅ位および３ｇ位のグルタミンが、（４Åの基準に従って）接触残基として同定される。最終的に、リンカーセグメントＬ１は、ｈＦｌｔ３Ｌとも、たとえ違う単量体でも（図７の単量体１）好ましく相互作用すると思われる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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