(57)【要約】  本発明は、中枢神経系における虚血性損傷に関連するアポトーシスを阻害するための組成物及び方法に関する。加えて、本発明は、虚血性損傷に関連する治療域の拡張に有用な組成物及び方法に関する。【選択図】図１−１
2014502953.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中枢神経系における虚血性損傷を治療する方法であって、有効量のアポトーシス標的阻害剤を、それを必要とする対象に鼻腔内投与するステップを含み、前記虚血性損傷がそれにより治療される方法。
【請求項２】
アポトーシス標的阻害剤が細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされている、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
細胞透過性ペプチドが、ペネトラチン1、トランスポータン、pISl、Tat(48-60)、pVEC、MAP及びMTSからなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
細胞透過性ペプチドがペネトラチン1である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
アポトーシス標的阻害剤がカスパーゼ阻害剤である、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
アポトーシス標的阻害剤がカスパーゼ-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12及び14の阻害剤からなる群から選択されるカスパーゼ阻害剤である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
アポトーシス標的阻害剤が、カスパーゼ-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12及び14からなる群から選択される1種のカスパーゼを特異的に阻害するカスパーゼ阻害剤である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
アポトーシス標的阻害剤が、カスパーゼ-6を特異的に阻害する、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
アポトーシス標的阻害剤が、カスパーゼ-9を特異的に阻害する、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
アポトーシス標的阻害剤が、アポトーシス標的が発現されているか、又は活性であるかのいずれかである時間域の間に投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
アポトーシス標的阻害剤がカスパーゼ-9阻害剤であり、投与が虚血性損傷の発症と再灌流の24時間後の間に行われる、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
アポトーシス標的阻害剤がカスパーゼ-6阻害剤であり、投与が再灌流の12時間後と24時間後の間に行われる、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
アポトーシス標的阻害剤が、細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされたXBIR3である、請求項7に記載の方法。
【請求項１４】
細胞透過性ペプチドが、ペネトラチン1、トランスポータン、pISl、Tat(48-60)、pVEC、MAP及びMTSからなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
アポトーシス標的阻害剤が、Pen1-XBIR3である、請求項13に記載の方法。
【請求項１６】
アポトーシス標的阻害剤が、細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされたカスパーゼのドミナントネガティブ型である、請求項7に記載の方法。
【請求項１７】
細胞透過性ペプチドが、ペネトラチン1、トランスポータン、pISl、Tat(48-60)、pVEC、MAP及びMTSからなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
アポトーシス標的阻害剤がPen1-C6DNである、請求項16に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
助成金情報
本発明は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)から授与された助成金番号NS43089及びNS37878の下で政府支援を受けて成された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
優先権
本出願は、2010年8月16日出願の米国仮出願第61/374,113号の出願日の利益を主張し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
1. 序論
本発明は、中枢神経系(「CNS」)における虚血性損傷に関連するアポトーシスを阻害するための組成物及び方法に関する。加えて、本発明は、CNS虚血性損傷に関連する治療域の拡張に有用な組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
2. 発明の背景
脳卒中は、工業化社会における死の第3の主因であり、運動障害の主因である。すべての脳卒中症例の85%を占める虚血性脳卒中において、血栓症又は塞栓症は、脳に酸素を供給する主幹動脈の閉塞につながり、酸素の枯渇が組織の損傷をもたらす。閉塞から下流の損傷区域は、虚血コア及びその周辺のペナンブラから構成される。虚血コアは、灌流が生存能力に関する閾値より低く低下し、細胞が電気的に無反応であり不可逆的に損傷もしている区域である。コアに対する損傷は、まず壊死を介して起こるが、アポトーシスがコアにおいても起こり得ることを示す最近の証拠がある。(Yuan、Apoptosis 14 (4)、469〜477頁(2009年))。対照的に、ペナンブラとして定義されるエリアは容量は低下するものの血液及び栄養を受け続け、これらの細胞は依然として生存能力のある可能性がある。細胞死がペナンブラにおいて起こる場合、細胞死はアポトーシスのためであると思われる。(Ribeら、Biochem J 415 (2)、165〜182頁(2008年))。自発的又は治療的のいずれかの時宜を得た灌流により、この区域は救うことができる。しかし、血流の回復は「再灌流損傷」を誘導することもあり、これは、炎症、興奮毒性及びアポトーシス性細胞損傷を悪化させる。(Ribeら、Biochem J 415 (2)、165〜182頁(2008年))。ヒトにおいて、切断カスパーゼを含むアポトーシスマーカーは、梗塞周囲領域において脳卒中後24時間から26日に観察することができ、拡散テンソル画像化により、脳卒中ペナンブラにおける軸索路の広範囲に及ぶ喪失が明らかにされる。(Broughtonら、Stroke 40 (5)、e331〜339頁(2009年); Mitsiosら、Cell Biochem Biophys 47 (1)、73-86頁(2007年); Lieら、Stroke 35 (1)、86〜92頁(2004年); Thomallaら、Neuroimage 22 (4)、1767〜1774頁(2004年))。
【０００５】
脳卒中ペナンブラにおいて同定されるような軸索変性は、一般に軸索腫脹、軸索輸送の不良又は中止及び断片化により特徴付けられる。この変性は、単にニューロン死のマーカーというだけではなく、神経細胞の死の誘発/促進においても積極的な役割を果たす。(Ferriら、Curr Biol 13 (8)、669〜673頁(2003年); Fischerら、Exp Neurol 185 (2)、232〜240頁(2004年); Stokinら、Science 307 (5713)、1282〜1288頁(2005年); Liら、J Neurosci 21 (21)、8473〜8481頁(2001年); Coleman, Nat Rev Neurosci 6 (11)、889〜898頁(2005年))。例えば、病理学的役割が、ハンチントン舞踏病及びALSなどの運動ニューロン疾患における軸索変性に関して報告されており、さらに脳卒中及び外傷性脳損傷を含む急性神経学的疾患の顕著な特徴でもある。(Ferriら、Curr Biol 13 (8)、669〜673頁(2003年); Fischerら、Exp Neurol 185 (2), 232〜240頁(2004年); Stokinら、Science 307 (5713)、1282〜1288頁(2005年); Liら、J Neurosci 21 (21)、8473〜8481頁(2001年))。酸素欠乏状態下の視神経培養は、軸索細胞骨格の断片化及び高速軸索内輸送の欠損を示す。(Waxmanら、Brain Res 574 (1-2)、105〜119頁(1992年))。げっ歯類における一時的中大脳動脈閉塞(tMCAo)の後、微小管、神経フィラメント及びタウを含む軸索の結合タンパク質の選択的ダメージが存在する。(Dewarら、Brain Res 684 (1)、70〜78頁(1995年); Dewarら、Acta Neuropathol 93 (1)、71〜77頁(1997年))。さらに、脊椎及び軸索末端の数は、スナネズミtMCAo後の再灌流のおよそ12〜24時間後(hpr；再灌流後の時間)に減少する。(Itoら、Stroke 37 (8)、2134〜2139頁(2006年))。さらに、WldS(遅発性ウォーラー変性)突然変異マウスは、軸索変性に対する著しい抵抗性を表し、これらのマウスは脳虚血から保護される。(Gillingwaterら、J Cereb Blood Flow Metab 24 (1)、62〜66頁(2004年))。したがって、初期軸索崩壊を防止することにより、脳卒中後の続く機能的神経学的欠損を限定できる。
【０００６】
上記のように、タンパク質のカスパーゼファミリーのメンバー(カスパーゼ-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、10、-11、-12及び14を含む)は、虚血性損傷後に活性化されるアポトーシス分子として同定されている。例えば、虚血性損傷後のアポトーシスの誘導におけるカスパーゼ-9の役割に関係した多数の推定機序が存在する。一つの機序において、活性酸素種が低酸素症によりまず産生され、これらがDNAのダメージ及びp53の活性化をもたらす。(Niizumaら、J Neurochem 109 Suppl 1, 133〜138頁(2009年))。アポトーシスの際、活性化されたp53は、p53がBcl-2結合Xタンパク質(Bax)及び他のアポトーシス促進性タンパク質を動員するミトコンドリアの外膜に移行する。この動員は、ミトコンドリア外膜の透過化につながり、チトクロームcをサイトゾル内に放出し、これがカスパーゼ-9の活性化につながる。あるいは、カスパーゼ-9の活性化及び虚血における得られたアポトーシスの活性化が受容体を媒介し得る。p75-ニューロトロフィン受容体(p75NTR)及び死受容体6(DR6)の両方の刺激が、カスパーゼ-6の活性化をもたらし、DR6が軸索変性をもたらす。(Troyら、J Biol Chem 277 (37)、34295〜34302頁(2002年); Nikolaevら、Nature 457 (7232)、981〜989頁(2009年))。p75NTRの多数の下流標的の一つがp53である。DR6の相互作用パートナーの一つが腫瘍壊死因子1型受容体-関連デスドメイン(TRADD)であり、これがシグナルトランスデューサーTRAF2に結合し、NF-カッパBを活性化する。細胞死機能に関して、NF-カッパBはアポトーシス促進機能及び抗アポトーシス機能の両方を有するが、脳卒中におけるNF-カッパBの持続的活性化は、アポトーシス促進性運命の駆動に関連すると考えられている。(Ridderら、Neuroscience 158 (3)、995-1006頁(2009年))。NF-カッパBは、Bcl-2ファミリーのメンバー(Bim、Bid、Bax、Bak)を制御し、ミトコンドリアの膜安定性、チトクロームcの放出をもたらし、続くカスパーゼ-9の活性化がアポトーシスにつながる。(Ridderら、Neuroscience 158 (3)、995〜1006頁(2009年))。
【０００７】
同様に、カスパーゼ-6は、複数の神経変性疾患におけるニューロン死に関与している。カスパーゼ-6のタンパク質分解基質の初期インビトロ分析で、標的としてラミン及びポリADPリボースポリメラーゼ(PARP)が同定された。(Orthら、A. J Biol Chem 271 (28)、16443〜16446頁(1996年); Takahashiら、Proc Natl Acad Sci U S A 93 (16)、8395〜8400頁(1996年))。これらの標的はまた、カスパーゼ-3に対しても共通であるので、これらの観察は、カスパーゼ-6及びカスパーゼ-3がニューロンのアポトーシスの際に核分解の媒介において重複した役割を果たすという共通の仮定につながった。しかし、最近の証拠は、カスパーゼ-6が非核標的の切断を特異的に媒介できることを示す。(Klaimanら、Mol Cell Proteomics 7 (8)、1541〜1555頁(2008年); Grahamら、Cell 125 (6)、1179〜1191頁(2006年); Guoら、Am J Pathol 165 (2)、523-531頁(2004年))。例えば、ハンチントン舞踏病において、カスパーゼ-3ではなく、カスパーゼ-6による突然変異ハンチンチンの切断が神経変性に必要である。(Grahamら、Cell 125 (6)、1179-119頁(2006年))。アルツハイマー病(AD)において、神経網糸（neuropil threads）は、カスパーゼ-6により切断されたタウ及びチューブリンを含有し、ADにおける軸索変性でのカスパーゼ-6に関する機能を示唆する。(Klaimanら、Mol Cell Proteomics 7 (8)、1541〜1555頁(2008年); Guoら、Am J Pathol 165 (2)、523〜531頁(2004年))。さらに、カスパーゼ-6は、カスパーゼ-3に非依存的な様式での神経成長因子(NGF)欠乏後、感覚ニューロン中の軸索変性を媒介する。(Nikolaevら、Nature 457 (7232)、981〜989頁(2009年))。
【０００８】
上記のカスパーゼを含むアポトーシスに関与する特定のタンパク質は、虚血性損傷における治療的介入の潜在的標的であるが、最新の薬理学的療法は、代わりに血栓溶解薬に集中している。血栓溶解治療薬は、血塊の形成に関係するフィブリン線維を破壊することによって、虚血性損傷部位に血流を回復するように機能し、その血塊は、それ自体が虚血性損傷の原因である。虚血性損傷の治療に使用するために現在市販されている血栓溶解薬の例は、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)及びウロキナーゼを含む。残念ながら、それらの限定された治療域のためだけでなく、それらの使用に関連する重篤な副作用を考慮して、血栓溶解薬の使用は著しく制限されている。
【０００９】
血栓溶解薬を投与できる適切な治療域を決定するために、臨床試験が、国立神経疾患脳卒中研究所(National Institute of Neurologic Disorder and Stroke)のNINDS組換えtPA脳卒中試験により実施された。(Marlerら、N Engl J Med 333 (24)、1581〜1588頁(1995年))。この試験は、症状の発症後3時間以内の静脈内組換えtPA治療の効果に集中した。患者の生存能力に対するこの治療で観察された陽性効果のために、虚血性損傷の発症後3時間の限られた時間枠内における組換えtPA治療が推奨された。しかし、この狭い域内でさえ、著者らは、やはり脳内出血(「ICH」)に関する高い危険性を見出した。追加の研究を試み、治療域が拡大できるかどうかを決定したが、拡大域における投与はICHの危険性を増加させたので、脳卒中の発症後6時間以内の組換えtPAの一般的使用は、最終的には推奨されなかった。(Lewandowski及びBarsan、Annals of Emergency Medicine 37 (2) S. 202 ff. (2001年))。
【００１０】
血栓溶解薬の投与に関する限定された治療域に加えて、このような治療薬の使用は、著しい有害な副作用に関連する。例えば、ストレプトキナーゼは細菌性プロテアーゼであり、したがって、体内でアレルギー反応を引き起こし得るので、ストレプトキナーゼを用いる療法は深刻な不利益を有する。加えて、患者が連鎖球菌感染症を以前に経験していた場合、患者は、ストレプトキナーゼ抵抗性を示し、それは療法をさらにより解決の難しいものにすることがある。さらに、欧州における臨床試験(欧州多施設急性脳卒中試験(Multicenter Acute Stroke Trial of Europe)(MAST-E)、イタリア多施設急性脳卒中試験(Multicenter Acute Stroke Trial of Italy)(MAST-I)及びオーストラリアストレプトキナーゼ試験(Australian Streptokinase Trial)(AST))は、ストレプトキナーゼによる治療後の死亡危険性の増加及びICHの高い危険性を示し、場合によってはこれらの試験は早期に終了しなければならなかった。(Jaillardら、Stroke 30、1326〜1332頁(1999年); Mottoら、Stroke 30 (4)、761〜4(1999年); Yasakaら、Neurology 50 (3)、626〜32頁(1998年))。さらに、組換えtPAは、虚血性損傷に関連した使用がFDAにより最終的には承認されたが、この承認は、その公知の神経毒性副作用及び死亡率についてのその悪影響にもかかわらず許可された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
前述を踏まえて、切断カスパーゼなどの特定のアポトーシス標的の活性の特定の持続期間を同定すれば、虚血性損傷に関連するアポトーシス活性を阻害するための治療標的としてのそれらの有用性をさらに規定するのに有利となるだけではなく、脳卒中に関する現在の治療域を拡張することも可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
3. 発明の要旨
特定の実施形態において、本発明は、中枢神経系における虚血性損傷を治療する方法であって、鼻腔内に、有効量のアポトーシス標的阻害剤を、それを必要とする対象に投与するステップを含み、ここで虚血性損傷がこのような投与により治療される方法を対象とする。
【００１３】
特定の実施形態において、本発明は、中枢神経系における虚血性損傷を治療する方法であって、鼻腔内に、有効量のアポトーシス標的阻害剤を、それを必要とする対象に投与するステップを含み、ここでアポトーシス標的阻害剤が細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされている方法を対象とする。
【００１４】
特定の実施形態において、本発明は、中枢神経系における虚血性損傷を治療する方法であって、鼻腔内に、有効量のアポトーシス標的阻害剤を、それを必要とする対象に投与するステップを含み、ここで細胞透過性ペプチドが、ペネトラチン1、トランスポータン、pISl、Tat(48-60)、pVEC、MAP及びMTSからなる群から選択される方法を対象とする。
【００１５】
本発明の特定の実施形態において、アポトーシス標的阻害剤はカスパーゼ阻害剤、例えば、限定するものではないが、カスパーゼ-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12及び14からなる群から選択されるカスパーゼの阻害剤である。
【００１６】
ある特定の、限定されない実施形態において、本発明は、中枢神経系における虚血性損傷を治療する方法であって、鼻腔内に、有効量のアポトーシス標的阻害剤を、このような治療を必要とする対象に投与するステップを含み、ここでアポトーシス標的阻害剤がカスパーゼ-9阻害剤であり、その投与が虚血性損傷の発症と再灌流の24時間後の間に行われる方法を対象とする。再灌流の開始につながる閉塞のクリアランスは、医療介入(tPA)又は天然破壊により臨床的虚血において一般的である。再灌流損傷は、脳においてアポトーシスを誘発することにより疾病負荷に寄与する閉塞除去の直接的かつ頻繁に起こる結果である。このことを踏まえて、本明細書に記載の一時的閉塞モデルは、再灌流により引き起こされるダメージを考慮しており、したがって本研究は、それらの再灌流時点で標識される。しかし、タイミングは、例えば、限定するものではないが、虚血性損傷の発症から測定する他の手段により、同等に決定できる。
【００１７】
特定の実施形態において、本発明は、中枢神経系における虚血性損傷を治療する方法であって、鼻腔内に、有効量のアポトーシス標的阻害剤を、このような治療を必要とする対象に投与するステップを含み、ここでアポトーシス標的阻害剤がカスパーゼ-6阻害剤であり、投与が再灌流の12時間後と24時間後の間に行われる方法を対象とする。
【００１８】
特定の実施形態において、本発明は、中枢神経系におけるアポトーシスを阻害する方法であって、鼻腔内に、有効量のアポトーシス標的阻害剤を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法を対象とする。例えば、このような阻害は、中枢神経系におけるアポトーシスに関連する神経変性状態、例えば、アルツハイマー病、軽度認識傷害、パーキンソン病、筋委縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病、クロイツフェルト-ヤコブ病などを治療する様式である。さまざまな関連する限定されない実施形態において、アポトーシス標的阻害剤は細胞透過性ペプチド、例えば、限定するものではないが、ペネトラチン1、トランスポータン、pISl、Tat(48-60)、pVEC、MAP若しくはMTSにコンジュゲートされており、及び/又はアポトーシス標的阻害剤は、カスパーゼ阻害剤、例えば、限定するものではないが、カスパーゼ-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12及び14からなる群から選択されるカスパーゼの阻害剤(好ましくは、限定するものではないが、カスパーゼ6若しくは9の阻害剤)である。
【００１９】
特定の実施形態において、本発明は、細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされたアポトーシス標的阻害剤を含む組成物を対象とする。
【００２０】
特定の実施形態において、本発明は、細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされたアポトーシス標的阻害剤を含む組成物であって、ここで細胞透過性ペプチドが、ペネトラチン1、トランスポータン、pISl、Tat(48-60)、pVEC、MAP及びMTSからなる群から選択される組成物を対象とする。
【００２１】
特定の実施形態において、本発明は、細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされたアポトーシス標的阻害剤を含む組成物であって、アポトーシス標的阻害剤がカスパーゼ阻害剤である組成物を対象とする。
【００２２】
特定の実施形態において、本発明は、細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされたアポトーシス標的阻害剤を含む組成物であって、ここでアポトーシス標的阻害剤がカスパーゼ-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12及び14の阻害剤からなる群から選択される組成物を対象とする。特定の実施形態において、本発明は、細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされたアポトーシス標的阻害剤を含む組成物であって、アポトーシス標的阻害剤が、カスパーゼ-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12及び14からなる群から選択される1種のカスパーゼを特異的に阻害するカスパーゼ阻害剤である組成物を対象とする。
【００２３】
特定の実施形態において、本発明は、細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされたアポトーシス標的阻害剤を含む組成物であって、アポトーシス標的阻害剤が、低分子阻害剤、ポリペプチド阻害剤及び核酸阻害剤からなる群から選択される組成物を対象とする。
【００２４】
4. 図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１−１】tMCAoは、ニューロンの突起及び細胞体においてカスパーゼ-6の活性化を誘導する。1a。前頭皮質線条体系領域中のニューロン密度に基づくコア及びペナンブラ領域の概略図。この図及び残りの図中の対象となる染色領域は、帯状皮質、一次運動皮質、一次+二次体性感覚皮質の第III〜IV皮層及びペナンブラ中の顆粒性島皮質である。同側半球は、一時的に閉塞されたそのMCAを有し、一方、対側部位は操作されていない。
【図１−２】tMCAoは、ニューロンの突起及び細胞体においてカスパーゼ-6の活性化を誘導する。1b。ラットのtMCAoは、脳卒中ペナンブラの細胞体及び突起において切断カスパーゼ-6を誘導する。ラットは、2時間の一時的中大脳動脈閉塞(tMCAo)、次いで示されている持続期間の再灌流に供された。動物を灌流/固定し、脳を切片にし、切断カスパーゼ-6を免疫染色し(cl-C6、緑色)、核をHoechst(青色)で染色した。cl-C6は、再灌流12時間後(12hpr)において細胞体及び突起に出現している。細胞体及び突起の染色は、再灌流後3日(3dpr)を通して観察された。7dprまでに、アポトーシス小体に似た核及び細胞構造はcl-C6に関して陽性である。スケールバー: 50μm。1c。マウスtMCAoは、脳卒中ペナンブラ中の細胞体及び突起において切断カスパーゼ-6を誘導する。マウスを、1時間のtMCAo及び3dprに供した。動物を灌流させ、脳を切片にし、切断カスパーゼ-6を免疫染色し(cl-C6、緑色)、核をHoechst(青色)で染色した。cl-C6は突起に出現している。落射蛍光顕微鏡;スケールバー: 50μm。
【図１−３】tMCAoは、ニューロンの突起及び細胞体においてカスパーゼ-6の活性化を誘導する。1d。切断カスパーゼ-6はニューロン特異的である。tMCAo(24hpr)に供した脳卒中ラット対象由来の皮質ペナンブラ組織(第III〜IV層)切片を、cl-C6(緑色)、NeuN(赤色)、ニューロンマーカー及びHoechst(青色)を用いて免疫染色した。左パネルは、cl-C6を示し、中央のパネルはNeuNを示し、右パネルはcl-c6、NeuN及びHoechstの統合を示す。cl-C6は、星状膠細胞のマーカーGFAPを共局在化しない。共焦点顕微鏡;スケールバー:50μm。
【図１−４】tMCAoは、ニューロンの突起及び細胞体においてカスパーゼ-6の活性化を誘導する。1e。切断カスパーゼ-6は、軸索及び樹状突起に存在する。上方パネル:脳卒中ラット(12hpr)由来の皮質ペナンブラ切片を、cl-C6(赤色)及び軸索マーカーであるTuj1(緑色)を用いて免疫染色し、共焦点顕微鏡を使用して画像化した。左パネルは、cl-C6を示し、中央のパネルはTuj1を示し、右パネルは両方の統合を示す。cl-C6を含有する単一の突起が出現している。非断片化Tuj1染色を有する軸索の領域は、cl-C6染色されない。対照的に、cl-C6を含む領域は断片化Tuj1染色を示した。中央パネル:脳切片をcl-C6(赤色)及び別の軸索マーカーの神経フィラメント-軽鎖(NF-L、緑色)に対して免疫染色した。左パネルはcl-C6を示し、中央パネルはNF-Lを示し右パネルは両方の統合を示す。染色パターンは、cl-C6及びTuj1と同様である:非断片化NF-L染色を含む軸索領域は、cl-C6染色を有さない。対照的に、cl-C6を含む領域は断片化NF-L染色を示す。下方パネル:脳切片を、cl-C6(赤色)及び樹状マーカーであるMAP-2(緑色)を用いて免疫染色し、共焦点顕微鏡を使用して画像化した。左パネルはcl-C6を示し、中央パネルはMAP-2を示し、右パネルは両方の統合を示す。そのパターンは、軸索マーカーにより観察されたパターンと同様である。非断片化MAP-2染色された軸索領域はcl-C6染色を示さない。対照的に、cl-C6を含む領域は、断片化MAP-2染色を示す。共焦点顕微鏡;スケールバー:25μm。
【図２−１】カスパーゼ-6ノックアウトマウスは、突起及びニューロンの保持並びにtMCAo後の神経機能の改善を実証する。2a。カスパーゼ-6-/-マウスの特徴付け。野生型及びカスパーゼ-6-/-マウスの脾臓におけるカスパーゼ-6発現のウエスタンブロット分析。Erk発現を、ローディング対照として利用する。2b。マウスの神経機能試験の判定基準。2c。カスパーゼ-6のノックアウトは神経機能を改善させる。1時間のtMCAo後及び24hpr後の野生型マウス及びカスパーゼ-6-/-マウスの神経機能分析スコア。カスパーゼ-6-/-マウスは、24hprにおいて表1に要約した運動課題/協調課題について野生型マウスより有意に優れている。野生型: 19.21±1.931、n=14;カスパーゼ-6-/-: 12.64±1.525、n=14、p値=0.0129。
【図２−２】カスパーゼ-6ノックアウトマウスは、突起及びニューロンの保持並びにtMCAo後の神経機能の改善を実証する。2d。カスパーゼ-6のノックアウトにより、ニューロンが保存される。野生型マウス及びカスパーゼ-6-/-マウスを1時間のtMCAoに供し、24hprにおいて屠殺した。脳切片のNeuN染色により、脳卒中野生型マウス(148.0±20.22, n=3)におけるニューロンの数が、非梗塞野生型マウス(282.7±32.97, n=3; p=0.0253)と比較して有意に減少していることが明らかになる。tMCAoに供されたカスパーゼ-6-/-マウスは、脳卒中野生型マウスより多くのニューロンを保持する(225.0±8.114、n=4対148.0±20.22、n=3;p=0.0108)。非脳卒中野生型及び非脳卒中カスパーゼ-6-/-マウスは、ニューロンの数において統計的有意差は有さない(282.7±32.97、n=3対296.3±9.207、n=3)。落射蛍光顕微鏡;スケールバー:50μm。皮質ペナンブラ組織染色。Nissl染色も同様の結果をもたらした。
【図２−３】カスパーゼ-6ノックアウトマウスは、突起及びニューロンの保持並びにtMCAo後の神経機能の改善を実証する。2e。カスパーゼ-6のノックアウトによりニューロン突起が保存される。1時間のtMCAo及び24hprに供された野生型マウス及びカスパーゼ-6-/-マウス由来の脳切片を、NF-L(上方パネル)及びMAP-2(下方パネル)に関して免疫染色した。脳卒中野生型マウスは、脳卒中カスパーゼ-6-/-マウスと比較してより少ないNFL及びMAP-2陽性突起を有する(47.67±7.219、n=3対70.00±4.916、n=4; p=0.0447)。NF-L陽性突起はさらに、カスパーゼ-6-/-と比較して、野生型マウスにおいてより短く、より断片化されていた。MAP-2陽性神経突起(樹状突起)における減少が、脳卒中野生型マウスで観察されている。野生型: 24.00±2.887、n=3、カスパーゼ-6-/-: 40.33±4.807、n=3。落射蛍光顕微鏡;スケールバー:50μm。皮質ペナンブラ組織染色。
【図２−４】カスパーゼ-6ノックアウトマウスは、突起及びニューロンの保持並びにtMCAo後の神経機能の改善を実証する。2f。カスパーゼ-6のノックアウトがタウにおける減少を防止する。1時間のtMCAo及び24hprに供した野生型マウス及びカスパーゼ-6-/-マウス由来の脳溶解液を単離し、ウエスタンブロットにより分析した。タウの発現を抗Tau(V-20)を用いて分析し、抗Tau(V-20)は、カスパーゼ-6切断部位の推定上の位置であるタウのC末端を認識する。(Guoら、Am J Pathol 165 (2)、523-531頁(2004年); Horowitzら、J Neurosci 24 (36)、7895-7902頁(2004年))。脳卒中カスパーゼ-6-/-マウスは、脳卒中野生型マウスより多くのタウを含有する。Erkをローディング対照として使用し、正規化した(n=2)。濃度分析を、Image Jのゲル分析を用いて実施した。エラーバーは標準偏差である。
【図３−１】カスパーゼ-9は脳卒中早期において活性であり、cl-C6と共局在する。3a。活性カスパーゼ-9は、tMCAoにより1hpr以内に脳卒中コアにおいて誘導される。bVAD-fmkを、ICCによりtMCAo前にラットの予測脳卒中エリアに注入した。動物を1hprに採取し、bVAD-カスパーゼ複合体を単離し、ウエスタンブロッティングにより分析した。I-同側、C-対側。3b。活性カスパーゼ-9は、脳卒中において活性化され続ける。VAD-fmkをICCとともに注入し、動物を4hprに採取し、bVAD-カスパーゼ複合体を単離しウエスタンブロッティングにより分析した。
【図３−２】カスパーゼ-9は脳卒中早期において活性であり、cl-C6と共局在する。3c。カスパーゼ-9及び切断カスパーゼ-6が、tMCAo後に同じ細胞において誘導される。ラットを2時間のtMCAo、次いで24hprに供した。カスパーゼ-9の共焦点分析及びcl-C6免疫染色により、24hprにカスパーゼ-9及びcl-C6を用いて共標識された細胞が明らかにされる。カスパーゼ-9は、突起においてcl-C6とともに可視的である。tMCAoに供されないげっ歯類由来の正常な組織は、カスパーゼ-9又はcl-C6染色を表さない(図3C)。共焦点顕微鏡;スケールバー:25μm。皮質ペナンブラ組織染色。3d。Pen1-XBIR3は、ニューロン細胞体及びニューロン突起においてtMCAoによる切断カスパーゼ-6の誘導を遮断する。ラットを、tMCAo前にPen1-XBIR3又はビヒクルを用いて処置し、24hprにcl-C6(緑色)、カスパーゼ-9(赤色)及びHoechst(青色)に関する免疫組織化学のために採取した。上方パネルは非脳卒中動物を示す。中央パネルはビヒクル処置動物を示し、下方パネルはPen1-XBIR3処置動物を示す。カスパーゼ-9特異的阻害剤のPen1-XBIR3は、24hprに観察されたカスパーゼ-9における増加及びcl-C6の誘導を遮断する。落射蛍光顕微鏡。スケールバー:50μm。
【図４−１】Pen1-XBIR3の鼻腔内送達は、神経突起におけるカスパーゼ-6の活性化を改善し、突起の喪失を抑止する。4a。鼻腔内適用は、Pen1-XBIR3をラットCNSの全体にわたって送達する。注射されたラットを、Pen1-XBIR3(60μl)の鼻腔内送達後1時間で屠殺した。脳を6片の2mmの冠状切片に、前方(嗅球)から後方(後頭極)にかけて薄切した。切片を可溶化し、SDS-PAGE及び抗HISを用いたウエスタンブロッティングによりタンパク質分析し、XBIR3を可視化した。概略図に示すように、レーン1〜6の冠状切片は前方(1)から後方(6)である。
【図４−２】Pen1-XBIR3の鼻腔内送達は、神経突起におけるカスパーゼ-6の活性化を改善し、突起の喪失を抑止する。4b。鼻腔内Pen1-XBIR3はニューロンを保護し、24hprにおいて突起中の切断カスパーゼ-6を減少させる。ビヒクル又はPen1-XBIR3を、tMCAo前に鼻腔内送達し、ラットを12hpr(左パネル)及び24hpr(右パネル)において採取した。切片を、NeuN(緑色)及びcl-C6(赤色)に関して免疫染色し、NeuN陽性細胞及びcl-C6陽性突起を定量した。NeuN:非脳卒中:494.7±18.52、n=3;ビヒクル-12hpr:463.7±57.53、n=3;Pen1-XBIR3-12hpr:477.3±28.95、n=3;ビヒクル-24hpr:338.0±22.91、n=3;Pen1-XBIR3-24hpr:453.7±25.44、n=3;ビヒクル対Pen1-XBIR3-24hpr p値:0.0278。cl-C6突起:ビヒクル-12hpr:144.0±28.50、n=3対Pen1-XBIR3-12hpr: 102.7±23.15、n=3;p=0.3233。ビヒクル-24hpr:109.7±12.73、n=3対Pen1-XBIR3-24hpr:57.33±10.04、n=3;p=0.032。落射蛍光顕微鏡。スケールバー:50μm。Nissl染色も、NeuNと同様の結果をもたらした。
【図４−３】Pen1-XBIR3の鼻腔内送達は、神経突起におけるカスパーゼ-6の活性化を改善し、突起の喪失を抑止する。4c。鼻腔内Pen1-XBIR3は、ラットにおいてtMCAoにより誘導されたNF-L陽性突起の減少を遮断する。ラットを、Bのように処置し、切片をNF-L(緑色)に関して免疫染色し、NF-L陽性軸索を12及び24hprにおいて定量した。ビヒクル-12hpr:118.7±14.88、n=3;Pen1-XBIR3-12hpr:179.7±14.89、n=3;ビヒクル-24hpr:138.0±9.074、n=3;Pen1-XBIR3-24hpr:213.7±11.84、n=3。落射蛍光顕微鏡。スケールバー:50μm。
【図４−４】Pen1-XBIR3の鼻腔内送達は、神経突起におけるカスパーゼ-6の活性化を改善し、突起の喪失を抑止する。4d。鼻腔内Pen1-XBIR3は、ラットにおいてtMCAoに関連するMAP-2陽性突起(樹状突起)の数に影響を与えない。ラットを、Bのように処置し、切片をMAP-2(緑色)に関して免疫染色し、MAP-2陽性軸索12及び24hprにおいて定量した。ビヒクル-12hpr:130.3±18.26、n=3;Pen1-XBIR3-12hpr:162.0±19.22、n=3;ビヒクル-24hpr:116.7±19.33、n=3;Pen1-XBIR3-24hpr:138.3±6.766、n=3。落射蛍光顕微鏡。スケールバー:50μm。
【図４−５】Pen1-XBIR3の鼻腔内送達は、神経突起におけるカスパーゼ-6の活性化を改善し、突起の喪失を抑止する。4e。鼻腔内Pen1-XBIR3は、虚血性梗塞体積を減少させる。ビヒクル又はPen1-XBIR3を鼻腔内に送達し、ラットを24hprにおいて採取した。切片を、H&Eを用いて染色した。4f。直接的(梗塞領域/同側半球エリア)及び間接的(梗塞領域/対側半球)な脳卒中体積を定量した、n=3(ANOVA、p<0.05)。
【図５】ヒト虚血における活性カスパーゼ-6を示す。年齢の一致する対照由来の脳組織と比較した、梗塞を患った患者由来の死後の脳組織である。5a。切断カスパーゼ-6に関する免疫組織学的分析(DAB処理)。cl-C6に関するDAB処理は、細胞体及び突起の染色を示した。一次抗体を用いずに染色された切片は、細胞体も突起も染色されなかった。切断カスパーゼ-6突起染色は、神経フィラメント-L突起染色と似ている。年齢の一致する対照の脳由来の切片は、切断カスパーゼ-6染色を示さない。スケールバー:100μm。5b。切断カスパーゼ-6及びTuj1に関する免疫蛍光染色。梗塞領域は、突起内の切断カスパーゼ-6の存在を示し、Tuj1は同じ突起に出現する。対照脳は、切断カスパーゼ-6の証拠を有していない。落射蛍光顕微鏡;スケールバー:50μm。
【図６】鼻腔内Pen1-XBIR3は、脳卒中からの長期保護をもたらす。2時間のtMCAoを、予防的(脳卒中前)鼻腔内ビヒクル(黒い四角)又は予防的(脳卒中前)(青い三角)/治療的(脳卒中後)(赤い丸)Pen1-XBIR3のいずれかを与えられたラットにおいて実施した。ラットを、21日間モニターした。神経機能スコアの平均(SEMを含む)。*p<0.05。
【図７】鼻腔内Pen1-C6DNが、脳卒中の際のカスパーゼ-6基質の切断を防止した。脳卒中梗塞(24hpr)のコア及びペナンブラ領域由来のタンパク質溶解液を単離した。同側の(脳卒中)半球は、ビヒクルのみで処置した場合、カスパーゼにより切断されたタウを豊富に含有した。Pen1-C6DNはカスパーゼにより切断されたタウの切断を低下させた。
【図８】tMCAoの機序及び機能の時系列の概略図。8a。tMCAoの分子効果及び機能効果。8b。3時間におけるPen1-XBIR3による予防的介入が、活性カスパーゼ-9を阻害し、カスパーゼ-6の活性化を遮断し、突起及びニューロンの喪失を防止する。4hprにおけるPen1-XBIR3による治療的介入は最大21日までの機能回復をもたらす。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
5. 発明の詳細な説明
本発明は、中枢神経系(「CNS」)における虚血性損傷に関連するアポトーシスを阻害するための組成物及び方法に関する。例えば、本発明は、特定の実施形態において、CNS虚血性損傷の発生後の特定の時点に発現又は活性化される特定のアポトーシス標的を阻害することによるCNS虚血性損傷に関連する治療域の拡張に有用な組成物及び方法に関する。
【００２７】
5.1  アポトーシス標的阻害剤組成物
5.1.1  カスパーゼ阻害剤
特定の実施形態において、本発明は、限定するものではないが、特定のアポトーシス誘導標的のアポトーシス活性を阻害する組成物などのアポトーシスの阻害剤に関する。このようなアポトーシス標的は、限定するものではないが、タンパク質のカスパーゼファミリーのメンバーを含む。カスパーゼは、イニシエーター群(カスパーゼ-8、10、9又は2)を誘発する、外因性(細胞外シグナルに起因する)又は内因性アポトーシスシグナルから出発する活性化の階層的順序に従って出現し、イニシエーター群は順番にエクセキューショナーカスパーゼ(カスパーゼ-7、3及び6)を処理する。カスパーゼのイニシエーター若しくはエクセキューショナー又は両方のクラスは、本発明に従って阻害され得る。例えば、決して限定するものではないが、本発明の阻害剤は、カスパーゼ-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、10、-11、-12及び14の一種以上を標的とする。特定の実施形態において、この阻害剤は、カスパーゼ-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、10、-11、-12及び14の一種以上の非特異的阻害剤である。代替の実施形態において、この阻害剤は、単一のカスパーゼの特異的阻害剤又はカスパーゼ-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、10、-11、-12及び-14からなる群から選択されるカスパーゼの特定のサブセットの特異的阻害剤である。特定の実施形態において特異的阻害剤は、カスパーゼ-9の阻害剤又はカスパーゼ-6の阻害剤である。
【００２８】
特定の実施形態において、限定するものではないが、カスパーゼ阻害剤を含む本発明のアポトーシス標的阻害剤は、低分子阻害剤、ペプチド/タンパク質阻害剤及び核酸阻害剤からなる群から選択される。このような阻害剤は、アポトーシス標的の発現又は活性のいずれかを阻害することによって、それらの機能を発揮できる。
【００２９】
特定の実施形態において、本発明のアポトーシス標的阻害剤は、カスパーゼの低分子阻害剤を含む。特定の実施形態において、カスパーゼの低分子阻害剤は、限定するものではないが、イサチンスルホンアミド(Leeら、J Biol Chem 275:16007〜16014頁(2000年); Nuttallら、Drug Discov Today 6:85〜91頁(2001年))、アニリノキナゾリン(Scottら、JPET 304 (1) 433〜440頁(2003年)および米国特許第6,878,743号に開示の一種以上の低分子カスパーゼ阻害剤を包含する。
【００３０】
特定の実施形態において、本発明アポトーシス標的阻害剤は、カスパーゼのペプチド阻害剤である。特定の実施形態において、カスパーゼのペプチド阻害剤は、限定するものではないが、EG Z-VEID-FMK(WO 2006056487); Z-VAD-FMK、CrmA及びZ-VAD-(2, 6-ジクロロベンゾイルオキソペンタン酸)(Garcia-Calvoら、J. Biol. Chem.、273、32608〜32613頁(1998年))を包含する。
【００３１】
代替の好ましい実施形態において、アポトーシス標的阻害剤は、限定するものではないが、アポトーシスの阻害剤(「IAP」)として同定されるタンパク質阻害剤のクラスを含む。IAPは、概して、それぞれがおよそ70アミノ酸残基からなる、一つから三つのBIR(バキュロウイルスIAPリピート)ドメインを含有する。加えて、特定のIAPはまた、二つの亜鉛原子を配位させることができる7つのシステイン及び一つのヒスチジン(例えばC3HC4)により規定されるRINGフィンガードメインを有する。限定するものではないが、c-IAP1(アクセッション番号Q13490.2)、cIAP2(アクセッション番号Q13489.2)及びXIAP(アクセッション番号P98170.2)などの例示的哺乳動物IAPは、それぞれが、分子のN末端部分に三つのBIR及びC末端にRINGフィンガーを有する。対照的に、別の例示的哺乳動物IAPであるNAIP(アクセッション番号Q13075.3)は、三つのBIRを含有するがRINGを含有せず、また二つの追加の例示的IAPであるサバイビン(アクセッション番号O15392.2)及びBRUCE(アクセッション番号Q9H8B7)は、それぞれ一つだけのBIRを有する。
【００３２】
特定の実施形態において、アポトーシス標的阻害剤は、カスパーゼポリペプチドのドミナントネガティブ型である。例えば、決して限定するものではないが、カスパーゼポリペプチドのドミナントネガティブ型は、カスパーゼ-6のドミナントネガティブ型であってもよい。特定の実施形態において、カスパーゼ-6のドミナントネガティブ型は、Denault, J.B.及びG.S.Salvesen、Expression, purification, and characterization of caspases. Curr Protoc Protein Sci、2003年.21章: p. Unit 21 13において「C6DN」と呼ばれているポリペプチドである。代替の実施形態において、カスパーゼポリペプチドのドミナントネガティブ型は、カスパーゼ-1、-2、-3、-4、-5、-7、-8、-9、10、-11、-12及び14からなる群から選択されるカスパーゼのドミナントネガティブ型である。
【００３３】
ポリペプチドアポトーシス標的阻害剤は、同定されたアポトーシス標的阻害剤ポリペプチドの特定の構造的及び機能的特徴を保持するが、その同定された阻害剤のアミノ酸配列と一つ又は複数の位置において異なるアミノ酸配列を、包含する。このようなポリペプチド変異体は、当分野において公知の方法により、元の配列からアミノ酸残基を置換、欠失又は付加することによって調製できる。
【００３４】
特定の実施形態において、このような実質的に類似の配列は、保存的アミノ酸置換を組み込んだ配列を含む。本明細書において使用する場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられる置換を含むことを意図する。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野において定義されており、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン);酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸);非荷電性極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン);非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン);β-分枝型側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン);及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。他の一般に好ましい置換は、アミノ酸残基と、アラニン又はグリシンなどの小型の側鎖を有する別の残基との置き換えを伴う。アミノ酸置換されたペプチドは、自動化化学合成などの標準技術により調製され得る。
【００３５】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、例えばIAPなどの元のアポトーシス標的阻害剤のアミノ酸配列と、少なくとも、約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%相同であり、かつアポトーシス標的を阻害できる。本明細書において使用する場合、二つのアミノ酸配列の間の相同性パーセントは、BLAST又はFASTAなどの標準ソフトウェアを使用して決定できる。合成されたポリペプチドのアポトーシス標的を阻害する能力についてのアミノ酸置換の効果は、下記の実施例の項に開示された方法を使用して試験できる。
【００３６】
例えば、決して限定するものではないが、核酸である本発明のアポトーシス標的阻害剤は、限定するものではないが、標的の発現を阻害することによって機能する阻害剤、例えばリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤及びsiRNA阻害剤を含む。「リボザイム」は、特定の核酸配列を切断できる核酸を指す。いくつかの実施形態において、リボザイムは、特異的認識のためのアンチセンス配列及びRNA切断酵素活性を含有するRNA分子を指すと理解するべきであり、例えば、米国特許第6,770,633号を参照されたい。対照的に、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、概して、その遺伝子の発現に影響を及ぼす遺伝子部分に相補的な低分子オリゴヌクレオチドである。遺伝子発現は、オリゴヌクレオチドと特異的遺伝子又はそれらのメッセンジャーRNA(mRNA)とのハイブリダイゼーションにより阻害できる。ある場合には、治療戦略を、炎症を開始する、又は加速すると考えられている1種又は複数の遺伝子の発現を弱めるために適用でき、例えば、米国特許第6,822,087号及びWO 2006/062716を参照されたい。「低分子干渉RNA」若しくは「短鎖干渉RNA」若しくは「siRNA」又は「短鎖ヘアピンRNA」若しくは「shRNA」は、RNA干渉(RNAi)の形態である。干渉RNAは、標的核酸配列、例えば、カスパーゼ6又はカスパーゼ9に相補的な二本鎖RNA又は部分的二本鎖RNA分子であってよい。マイクロ干渉RNA(miRNA)もまた、このカテゴリーに納まる。二本鎖RNA分子は、分子内の第1のRNA部分と第2のRNA部分との間の相補的ペアリングによって形成される。各部分の長さは、概して、30ヌクレオチド未満(例えば、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11又は10ヌクレオチド)長である。いくつかの実施形態において、各部分の長さは19〜25ヌクレオチド長である。いくつかのsiRNA分子において、RNA分子の相補的な第1及び第2の部分は、ヘアピン構造の「ステム」である。二つの部分は連結配列により接合されてよく、これはヘアピン構造の「ループ」を形成できる。連結配列は長さが変動してよい。いくつかの実施形態において、連結配列は、5、6、7、8、9、10、11、12又は13ヌクレオチド長であってよい。連結配列は、第1及び第2の部分を接合するために使用でき、当分野において公知である。ヘアピン構造は3'又は5'オーバーハングヌクレオチド(例えば、1、2、3、4又は5ヌクレオチドのオーバーハング)を含有できるので、第1及び第2の部分は相補的であるが、完全に対称でなくてもよい。本発明のRNA分子は、ベクターから発現させてもよく、又は化学的若しくは合成的に作製してもよい。
【００３７】
5.1.2  アポトーシス阻害剤-細胞透過性ペプチドのコンジュゲート
本発明の特定の実施形態において、アポトーシス標的阻害剤は、細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされ、アポトーシス阻害剤-細胞透過性ペプチド(「AICPP」)コンジュゲートを形成する。AICPPコンジュゲートは、アポトーシスを防止することが望ましい細胞内への阻害剤の送達を容易にする。
【００３８】
本明細書において使用する場合、「細胞透過性ペプチド」とは、細胞の細胞膜及び/又は核膜を横断する膜透過性複合体輸送に関連するエネルギー非依存性(すなわち、非エンドサイトーシス性の)移行特性をもたらす、短鎖の(約12〜30残基)のアミノ酸配列又は機能的モチーフを含むペプチドである。特定の実施形態において、本発明の膜透過性複合体に使用される細胞透過性ペプチドは、好ましくは、少なくとも一つの非機能的システイン残基を含み、その非機能的システイン残基は遊離又はアポトーシス標的阻害剤とジスルフィド結合を形成するように誘導体化されており、これはこのような結合のために改変されている。このような特性をもたらす代表的アミノ酸モチーフは、米国特許第6,348,185号に記載されており、この内容は明確に参照により本明細書に組み込まれる。本発明の細胞透過性ペプチドは、好ましくは、限定するものではないが、ペネトラチン1、トランスポータン、pIsl、TAT(48-60)、pVEC、MTS及びMAPを包含する。
【００３９】
本発明の細胞透過性ペプチドは、同定された細胞透過性ペプチドの特定の構造的特徴及び機能的特徴を保持するが、同定されたペプチドのアミノ酸配列と一つ又は複数の位置において異なる配列を包含する。このようなポリペプチド変異体は、当分野において公知の方法により、元の配列からアミノ酸残基を置換、欠失又は付加することによって調製できる。
【００４０】
特定の実施形態において、このような実質的に同様の配列は、ポリペプチドアポトーシス標的阻害剤に関連して上述されるように、保存的アミノ酸置換を組み込んだ配列を含む。特定の実施形態において、本発明の細胞透過性ペプチドは、同定されたペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも、約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%相同であり、かつ細胞浸透を媒介できる。合成されたペプチドの細胞浸透媒介能力に対するアミノ酸置換の効果は、下記の実施例の項に開示の方法を使用して試験できる。
【００４１】
本発明の特定の実施形態において、膜透過性複合体の細胞透過性ペプチドは、ペプチド配列RQIKIWFQNRRMKWKK又はそれらの保存的変異体を含む、ペネトラチン1である。本明細書において使用する場合、「保存的変異体」は、一以上のアミノ酸置換を有するペプチドであって、その置換が、細胞透過性ペプチドの形状、すなわち、生物学的活性(すなわち輸送活性)又は膜毒性、に悪影響を与えないものである。
【００４２】
ペネトラチン1は、ショウジョウバエのアンテナペディア(antennapedia)のホメオドメインの第3のαへリックス由来の16アミノ酸のポリペプチドである。その構造及び機能は十分研究され、特徴付けられている: Derossiら、Trends Cell Biol.、8(2):84〜87頁、1998年; Dunicanら、Biopolymers、60(1):45〜60頁、2001年; Hallbrinkら、Biochim. Biophys. Acta、1515(2):101〜09頁、2001年; Boltonら、Eur. J. Neurosci.、12(8):2847〜55頁、2000年; Kilkら、Bioconjug. Chem.、12(6):911〜16頁、2001年; Bellet-Amalricら、Biochim. Biophys. Acta、1467(1):131〜43頁、2000年; Fischerら、J. Pept. Res.、55(2): 163〜72頁、2000年; Thorenら、FEBS Lett.、482(3):265〜68頁、2000年。
【００４３】
ペネトラチン1が63-kDaのタンパク質であるアビジンを、ヒトBowesメラノーマ細胞に有効に運搬することが示されている(Kilkら、Bioconjug. Chem.、12(6):911〜16頁、2001年)。さらに、ペネトラチン1及びそのカーゴの輸送は非エンドサイトーシス及びエネルギー非依存性であり、受容体分子又は輸送分子に依存しないことが示されている。さらに、ペネトラチン1が、純粋な脂質二分子層を横切ることができることは公知である(Thorenら、FEBS Lett.、482(3):265〜68頁、2000年)。この特徴は、ペネトラチン1がそのカーゴを輸送可能にし、細胞表面受容体/細胞表面輸送体の利用可能性の制限から解放する。送達ベクターは、すべての細胞型に侵入すること(Derossiら、Trends Cell Biol.、8(2):84〜87頁、1998年)及びペプチドに有効に送達すること(Troyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93:5635〜40頁、1996年)又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに有効に送達すること(Troyら、J. Neurosci.、16:253〜61頁、1996年; Troyら、J. Neurosci.、17:1911〜18頁、1997年)がすでに示されている。
【００４４】
本発明の他の限定されない実施形態は、下記の例示的細胞透過性分子: RL16(H-RRLRRLLRRLLRRLRR-OH)、物理学的特性がわずかに異なる、ペネトラチン1由来の配列(Biochim Biophys Acta. 2008年Jul-Aug;1780(7-8):948〜59頁);及びニューロンを標的とする狂犬病ウイルス配列であるRVGRRRRRRRRRの使用を伴う。P. Kumar, H. Wu, J.L.McBride, K. E. Jung, M. H. Kim, B. L. Davidson, S. K. Lee, P. Shankar及びN. Manjunath, Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system, Nature 448 (2007年)、39〜43頁を参照されたい。
【００４５】
本発明の特定の代替的な限定されない実施形態において、膜透過性複合体の細胞透過性ペプチドは、トランスポータン、pISl、Tat(48-60)、pVEC、MAP、及びMTSからなる群から選択される細胞透過性ペプチドである。トランスポータンは、神経ペプチドであるガラニンのアミノ末端から12個の機能性アミノ酸、及びマストパランのカルボキシ末端の14残基配列がリジンにより連結されたものを含む27アミノ酸長のペプチドである(Poogaら、FASEB J.、12(1):67〜77頁、1998年)。トランスポータンは、アミノ酸配列GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL又はそれらの保存的変異体を含む。
【００４６】
pIslは、ラットインスリン1遺伝子エンハンサータンパク質のホメオドメインの第3へリックスに由来する(Magzoubら、.、Biochim. Biophys. Acta, 1512(1):77〜89頁、2001年; Kilkら、, Bioconjug. Chem.、12(6):911〜16頁、2001年)。pIslは、アミノ酸配列PVIRVW FQNKRCKDKK又はそれらの保存的変異体を含む。
【００４７】
Tatは、HIV感染細胞の細胞膜を横切る移行を可能にし、ウイルスゲノムを転写活性化する86〜102アミノ酸の転写活性化因子である(Hallbrinkら、Biochem. Biophys. Acta.、1515(2):101〜09頁、2001年; Suzukiら、J. Biol. Chem.、277(4):2437〜43頁、2002年; Futakiら、J. Biol. Chem.、276(8):5836〜40頁、2001年)。残基48〜60に及ぶ小型のTat断片は、核内輸入に関与することが決定されており(Vivesら、J. Biol. Chem.、272(25):16010〜017頁、1997年)、アミノ酸配列GRKKRRQRRRPPQ又はそれらの保存的変異体を含む。
【００４８】
pVECは、アミノ酸615〜632に及ぶ、細胞接着分子である血管内皮のカドヘリンのネズミ配列に由来する18アミノ酸長のペプチドである(Elmquistら、Exp. Cell Res.、269(2):237〜44頁、2001年)。pVECは、アミノ酸配列LLIILRRRIRKQAHAH又はそれらの保存的変異体を含む。
【００４９】
MTS又は膜移行配列は、さらなるプロセシングのための、新生翻訳産物の適切な細胞器官への指示に関与するアクセプタータンパク質により認識される特定のペプチドの一部である(Lindgrenら、Trends in Pharmacological Sciences、21(3):99〜103頁、2000年; Brodsky, J. L., Int. Rev. Cyt.、178:277〜328頁、1998年; Zhaoら、J. Immunol. Methods、254(1-2):137〜45頁、2001年)。特に関連のあるMTSは、ウイルスgp41タンパク質の疎水性末端ドメインとシミアンウイルス40ラージ抗原由来の核局在化シグナルとのキメラであるMPSペプチドであり、これは、核局在化シグナルと、温度に無関係に内部移行し、オリゴヌクレオチドの担体として機能する膜転移配列との一つの組み合わせを表す(Lindgrenら、Trends in Pharmacological Sciences、21(3):99-103頁、2000年; Morrisら、Nucleic Acids Res.、25:2730〜36頁、1997年)。MPSは、アミノ酸配列GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV又はそれらの保存的変異体を含む。
【００５０】
モデル両親媒性ペプチドすなわちMAPは、それらの本質的特徴として、へリックス両親媒性及び少なくとも四つの完全なヘリカルターン(helical turns)の長さを有する一群のペプチドを形成する(Schellerら、J. Peptide Science、5(4):185〜94頁、1999年; Hallbrinkら、Biochim. Biophys. Acta.、1515(2):101〜09頁、2001年)。例示的MAPは、アミノ酸配列KLALKLALKALKAALKLA-アミド又はそれらの保存的変異体を含む。
【００５１】
特定の実施形態において、細胞透過性ペプチド及び上記のアポトーシス標的阻害剤は共有結合し、AICPPコンジュゲートを形成する。特定の実施形態において、細胞透過性ペプチドは、ペプチドアポトーシス標的阻害剤と、組換えDNA技術により動作可能に連結される。例えば、アポトーシス標的阻害剤がペプチド又はポリペプチド配列である実施形態において、そのアポトーシス標的阻害剤をコードする核酸配列は、対象となるアポトーシス標的阻害剤をコードする核酸配列の上流(細胞透過性ペプチドのアミノ末端に連結)若しくは下流(細胞透過性ペプチドのカルボキシ末端に連結)のいずれか、又は両方に導入することができる。アポトーシス標的阻害剤コード核酸配列と細胞透過性ペプチドコード核酸配列との両方を含むこのような融合配列は、当分野において周知の技術を使用して発現させることができる。
【００５２】
特定の実施形態において、アポトーシス標的阻害剤は、非共有結合を介して細胞透過性ペプチドに動作可能に連結され得る。特定の実施形態において、このような非共有結合は、イオン相互作用、疎水性相互作用、水素結合又はファンデルワールス力により媒介される。
【００５３】
特定の実施形態において、アポトーシス標的阻害剤は、化学的リンカーを介して細胞透過性ペプチドに動作可能に連結される。このような連結の例は、通常、C、N、O、S及びPからなる群から選択される1〜30個の非水素原子を含む。例示的リンカーは、限定するものではないが、置換されたアルキル又は置換されたシクロアルキルを含む。代替的には、(リンカーが一重結合である場合)異種部分を、細胞透過性ペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端に直接結合することができる。リンカーが一重共有結合でない場合、リンカーは、場合により一重、二重、三重又は芳香族炭素-炭素結合並びに炭素-窒素結合、窒素-窒素結合、炭素-酸素結合、イオウ-イオウ結合、炭素-イオウ結合、リン-酸素結合、リン-窒素結合及び窒素-プラチナ結合を含む、安定した化学結合の任意の組み合わせであり得る。特定の実施形態において、リンカーは20個未満の非水素原子を有し、エーテル、チオエーテル、尿素、チオ尿素、アミン、エステル、カルボキサミド、スルホンアミド、ヒドラジド結合及び芳香族結合又はヘテロ芳香族結合の任意の組み合わせから構成される。特定の実施形態において、リンカーは、一重炭素-炭素結合及びカルボキサミド、スルホンアミド又はチオエーテル結合の組み合わせである。
【００５４】
コンジュゲーションの一般戦略は、細胞透過性ペプチド及びアポトーシス標的阻害剤成分を別々に調製し、それぞれを適切な反応基を用いて改変又は誘導体化し、二つの間を連結させるステップを伴う。改変されたアポトーシス標的阻害剤を、その後、連結用に調製された細胞透過性ペプチドと一緒に、細胞透過性ペプチドとアポトーシス標的阻害剤分子との間に共有結合が生じるように、十分な時間(及び温度、pH、モル比などの適切な条件下で)インキュベートする。
【００５５】
コンジュゲーションの多数の方法及び戦略は、当業者には容易に明らかであり、有効なコンジュゲーションに必要とされる条件も当業者には容易に明らかであろう。単に例示の目的で、このようなコンジュゲーションのための戦略の一つを以下に記載するが、融合タンパク質の作製又は化学リンカーの使用などの他の技術もまた本発明の範囲内である。
【００５６】
特定の実施形態において、アポトーシス標的阻害剤分子と本発明の細胞透過性ペプチドとの間にジスルフィド結合を作製する場合、アポトーシス標的阻害剤分子は、チオール基を含有するように改変でき、ニトロピリジル脱離基を、細胞透過性ペプチドのシステイン残基上に作製できる。任意の適切な結合(例えば、チオエステル結合、チオエーテル結合、カーバメート結合など)は、当分野において一般的かつ周知の方法に従って作り出すことができる。誘導体化又は改変された細胞透過性ペプチド及びチオール含有アポトーシス標的阻害剤の両方を、RNase/DNase滅菌水中で再構成し、その後コンジュゲーションに適切な量(例えば等モル量)で相互に加える。コンジュゲーション混合物を、その後15分間、65℃においてインキュベートし、次いで60分、37℃においてインキュベートし、その後4℃において保存する。連結は、ベクター連結アポトーシス標的阻害剤分子を、DTTにより還元させたアリコートを15%非変性PAGEにおいて泳動させることによって確認できる。アポトーシス標的阻害剤分子を、その後適切な染色により可視化できる。
【００５７】
特定の実施形態において、AICPPは、細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされた二本鎖核酸を含む。このような実施形態の特定の実施において、少なくとも二本鎖リボ核酸分子の一方の鎖(センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか)は、細胞透過性ペプチドと(例えばチオール基と)の連結のために改変し、改変された鎖と細胞透過性ペプチドとを共有結合が連結するようにしてもよい。細胞透過性ペプチドがカップリングのために遊離のチオール基(すなわち、ピリジルジスルフィド又は遊離のシステイン残基)を有する場合と同様に、鎖がチオール基で改変される場合、細胞透過性ペプチドとリボ核酸分子の改変された鎖を連結する共有結合は、ジスルフィド結合であってよい。しかし、広範囲の共有結合(例えば、エステル結合、カルバメート結合、スルホネート結合など)が適用可能になるように、広範囲の官能基がリボ核酸の改変に使用できることは当業者には明らかであろう。さらに、本発明の膜透過性複合体は、標的細胞特異性を複合体にもたらす部分をさらに含むことができる。特定の実施形態において、本発明は、ペネトラチン1- XBIR3コンジュゲートを対象とする。特定のこのような実施形態において、ペネトラチン1-XBIR3配列の配列は、PEN1-XBIR3:RQIKIWFQNRRMKWKK-s-s-NTLPRNPSMADYEARIFTFGTWIYSVNKEQLARAGFYALGEGDKVKCFHCGGGLTDWRPSEDPWEQHARWYPGCRYLLEQRGQEYINNIHLTHSである。特定の実施形態において、本発明は、ペネトラチン1とカスパーゼポリペプチドのドミナントネガティブ型とのコンジュゲートを対象とする。特定のこのような実施形態において、カスパーゼ-6のドミナントネガティブ型は、Denault, J.B. and G.S. Salvesen, Expression, purification, and characterization of caspases. Curr Protoc Protein Sci、2003年. 21章: p. Unit 21 13において「C6DN」と呼ばれているポリペプチドであり、ペネトラチン1-C6DNの配列は、RQIKIWFQNRRMKWKK-s-s-MASSASGLRRGHPAGGEENMTETDAFYKREMFDPAEKYKMDHRRRGIALIFNHERFFWHLTLPERRGTCADRDNLTRRFSDLGFEVKCFNDLKAEELLLKIHEVSTVSHADADCFVCVFLSHGEGNHIYAYDAKIEIQTLTGLFKGDKCHSLVGKPKIFIIQAARGNQHDVPVIPLDVVDNQTEKLDTNITEVDAASVYTLPAGADFLMCYSVAEGYYSHRETVNGSWYIQDLCEMLGKYGSSLEFTELLTLVNRKVSQRRVDFCKDPSAIGKKQVPCFASMLTKKLHFFPKSNLEHHHHである。
【００５８】
5.1.3  医薬組成物
特定の実施形態において、本発明のアポトーシス標的阻害剤又は膜透過性複合体は、経鼻投与のために製剤化される。経鼻投与のために、本発明のアポトーシス標的阻害剤又は膜透過性複合体を含む溶液又は懸濁液は、従来の手段、例えば、点滴器、ピペット又はスプレーにより鼻腔に直接適用するために製剤化することができる。経鼻スプレー組成物を送達するための他の手段、例えば定量噴霧式吸入器(MDI)を介した吸入もまた、本発明に従って使用できる。MDIのいくつかの型が、吸入による投与のために定期的に使用される。これらの型の装置は、呼吸作動式MDI、ドライパウダー吸入器(DPI)、スペーサー/ホールディングチャンバーとMDIとの組み合わせ及び噴霧器を含むことができる。本明細書において使用する場合、「MDI」という用語は、例えば、任意選択で1種以上の賦形剤とともに高圧ガスに溶解又は懸濁された活性薬剤を含有するキャニスター、定量噴霧式バルブ、アクチュエーター及びマウスピースを含む吸入送達系を指す。キャニスターは、通常経鼻スプレー組成物などの活性薬剤の溶液又は懸濁液及び一種以上のハイドロフルオロアルカンなどの高圧ガスを充填されている。アクチュエーターを押し下げると、溶液の定量噴霧が吸入用にエアゾール化される。活性薬剤を含む粒子がマウスピースに向かって推進され、その後活性薬剤が対象により吸入される。製剤は、単回投与又は複数回投与形態で提供される。例えば、点滴器又はピペットの場合、これは、患者が適切な所定の体積の溶液又は懸濁液を投与することにより達成され得る。スプレーの場合、これは、例えば、定量式噴霧スプレーポンプを用いて達成され得る。経鼻送達及び保持を好転させるために、本発明に従った成分は、シクロデキストリンを用いたカプセル化、又は経鼻粘膜における送達及び保持を強化することが期待される薬剤とともに製剤化することができる。
【００５９】
本発明の組成物の経鼻投与に使用される、又は適用できる市販の投与装置としては、AERONEB(商標)(Aerogen、San Francisco、Calif.)、AERONEB GO(商標)(Aerogen); PARI LC PLUS(商標)、PARI BOY(商標) N、PARI(商標) eflow(米国特許第6,962,151号に開示の噴霧器)、PARI LC SINUS(商標)、PARI SINUSTAR(商標)、PARI SINUNEB(商標)、VibrENT(商標)及びPARI DURANEB(商標)(PARI Respiratory Equipment, Inc.、Monterey、Calif.又はMunich、Germany); MICROAIR(商標)(Omron Healthcare, Inc、Vernon Hills、Ill.)、HALOLITE(商標)(Profile Therapeutics Inc、Boston、Mass.)、RESPIMAT(商標)(Boehringer Ingelheim、Germany)、AERODOSE(商標)(Aerogen, Inc、Mountain View、Calif.)、OMRON ELITE(商標)(Omron Healthcare, Inc、Vernon Hills、Ill.)、OMRON MICROAIR(商標)(Omron Healthcare, Inc、Vernon Hills、Ill.)、MABISMIST(商標)II(Mabis Healthcare, Inc、Lake Forest、Ill.)、LUMISCOPE(商標) 6610、(The Lumiscope Company, Inc、East Brunswick、N.J.)、AIRSEP MYSTIQUE(商標)、(AirSep Corporation、Buffalo、N.Y.)、ACORN-1(商標)及びACORN-II(商標)(Vital Signs, Inc、Totowa、N.J.)、AQUATOWER(商標)(Medical Industries America、Adel、Iowa)、AVA-NEB(商標)(Hudson Respiratory Care Incorporated、Temecula、Calif.)、AEROCELL(商標)使い捨てカートリッジを利用するAEROCURRENT(商標)(AerovectRx Corporation、Atlanta、Ga.)、CIRRUS(商標)(Intersurgical Incorporated、Liverpool、N.Y.)、DART(商標)(Professional Medical Products、Greenwood、S.C.)、DEVILBISS(商標) PULMO AIDE(DeVilbiss Corp; Somerset、Pa.)、DOWNDRAFT(商標)(Marquest、Englewood、Colo.)、FAN JET(商標)(Marquest、Englewood、Colo.)、MB-5(商標)(Mefar、Bovezzo、Italy)、MISTY NEB(商標)(Baxter、Valencia、Calif.)、SALTER 8900(商標)(Salter Labs、Arvin、Calif.)、SIDESTREAM(商標)(Medic-Aid、Sussex、UK)、UPDRAFT-II(商標)(Hudson Respiratory Care; Temecula、Calif.)、WHISPER JET(商標)(Marquest Medical Products、Englewood、Colo.)、AIOLOS(商標)(Aiolos Medicnnsk Teknik、Karlstad、Sweden)、INSPIRON(商標)(Intertech Resources,Inc.、Bannockburn、Ill.)、OPTIMIST(商標)(Unomedical Inc.、McAllen、Tex.)、PRODOMO(商標)、SPIRA(商標)(Respiratory Care Center、Hameenlinna、Finland)、AERx(商標) Essence(商標)及びUltra(商標)、(Aradigm Corporation、Hayward、Calif.)、SONIK(商標) LDI Nebulizer(Evit Labs、Sacramento、Calif.)、ACCUSPRAY(商標)(BD Medical、Franklin Lake、N.J.)、ViaNase ID(商標)(electronic atomizer; Kurve、Bothell、Wash.)、OptiMist(商標)装置又はOPTINOSE(商標)(Oslo、Norway)、MAD Nasal(商標)(Wolfe Tory Medical, Inc.、Salt Lake City、Utah)、Freepod(商標)(Valois、Marly le Roi、France)、Dolphin(商標)(Valois)、Monopowder(商標)(Valois)、Equadel(商標)(Valois)、VP3(商標)及び  VP7(商標)(Valois)、VP6 Pump(商標)(Valois)、Standard Systems Pumps(商標)(Ing. Erich Pfeiffer、Radolfzell、Germany)、AmPump(商標)(Ing.Erich Pfeiffer)、Counting Pump(商標)(Ing.Erich Pfeiffer)、Advanced Preservative Free System(商標)(Ing. Erich Pfeiffer)、Unit Dose System(商標)(Ing. Erich Pfeiffer)、Bidose System(商標)(Ing. Erich Pfeiffer)、Bidose Powder System(商標)(Ing. Erich Pfeiffer)、Sinus Science(商標)(Aerosol Science Laboratories, Inc.、Camarillo、Calif.)、ChiSys(商標)(Archimedes、Reading、UK)、Fit-Lizer(商標)(Bioactis, Ltd、a SNBL subsidiary(Tokyo、J P)、Swordfish V(商標)(Mystic Pharmaceuticals、Austin、Tex.)、DirectHaler(商標) Nasal(DirectHaler、Copenhagen、Denmark)及びSWIRLER(商標) Radioaerosol System(AMICI, Inc.、Spring City、Pa.)を含む。
【００６０】
細胞、組織又は対象への送達を容易にするために、本発明のアポトーシス標的阻害剤又は膜透過性複合体は、さまざまな組成物中に、医薬として許容される担体、賦形剤又は希釈剤とともに製剤化され得る。本明細書において使用する場合、「医薬として許容される」という用語は、選択される担体、賦形剤又は希釈剤が、アポトーシス標的阻害剤若しくは膜透過性複合体の生物学的活性又は組成物のレシピエントの生物学的活性に悪影響を与えないことを意味する。本発明に使用する適切な医薬担体、賦形剤及び/又は希釈剤は、限定するものではないが、ラクトース、スクロース、デンプン粉末、タルク粉末、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、結晶セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、アカシアゴム、リン酸及び硫酸のナトリウム塩及びカルシウム塩、ポリビニルピロリドン及び/又はポリビニルアルコール、生理食塩水並びに水を含む。治療的治療のための化合物の特定の製剤は、Hoover, J. E., Remington's Pharmaceutical Sciences (Easton, Pa.: Mack Publishing Co.、1975年)並びにLiberman及びLachman編、Pharmaceutical Dosage Forms (New York, N.Y.: Marcel Decker Publishers、1980年)で論じられている。
【００６１】
本発明の方法によれば、細胞、組織又は対象に投与されるアポトーシス標的阻害剤又は膜透過性複合体の量は、組織又は対象内でアポトーシス標的を阻害するために有効な量でなければならない。この量は、当業者により容易に決定される。本発明の任意の実施形態に関連して用いられる具体的投薬量は、使用される阻害剤の型、阻害されるアポトーシス標的及び標的を発現する細胞型を含む多数の因子に依存するものである。量は、対象の体重及び標的とされる特定の疾患又は状態によって調整される。
【００６２】
5.2  治療方法
特定の実施形態において、本発明は、CNS虚血性損傷の影響を改善し、又は神経変性疾患の危険性若しくは兆候を減少させる方法を対象とする。例えば、特定の実施形態において、本発明は、虚血性損傷に関連するアポトーシスを阻害しそれによって虚血性損傷の影響を改善するために有効量のAICPPコンジュゲートを投与する方法を対象とする。
【００６３】
特定の実施形態において、本発明の方法は、中枢神経系における虚血性損傷に関連するアポトーシスを阻害するための、アポトーシス標的阻害剤の鼻腔内投与を対象とする。本発明の特定の限定されない実施形態において、AICPPコンジュゲートを、虚血の発症において開始され次の48時間に及ぶ治療域の間に投与し、治療は、好ましくは虚血性事象の約24時間以内又は約12時間以内に投与される。したがって、特定の実施形態において、本発明は、従来の治療域(例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)を用いた治療は、一般に、虚血性損傷の発症の3時間以内に投与されなければならない)を越えて実施できる、虚血性損傷の影響を改善する方法を提供する。追加の限定されない実施形態において、本発明の方法は、脳梗塞又は一時的虚血性発作の診断に一致する神経学的欠損の突然の発症を経験をした患者の治療に使用することができ;例えば、その神経学的欠損は言語機能、感覚機能又は運動機能の障害であり得る。
【００６４】
虚血の効果の治療/改善、又は神経変性疾患の治療のいずれかに使用する場合、治療は、単回投与又は複数回投与として投与することができ、複数回投与を投与する場合、それらは、6回/24時間又は4回/24時間又は3回/24時間又は2回/24時間の間隔で投与することができる。初期投与量は、その後の投与量より多くてもよく、又はすべての投与量が同じであってもよい。
【００６５】
本発明のある特定の限定されない例において、限定するものではないが、Pen1-XBIR3又はカスパーゼのドミナントネガティブ型などのポリペプチドアポトーシス標的阻害剤は、虚血の治療に用いられる。特定のこのような例において、Pen1-XBIR3又はカスパーゼAICPPコンジュゲートのドミナントネガティブ型は、虚血性損傷を患う患者に単回投与又は複数回投与のいずれかとして投与される。複数回投与を投与する場合、それらは、6回/24時間又は4回/24時間又は3回/24時間又は2回/24時間の間隔で投与することができる。初期投与量は、その後の投与量より多くてもよく、又はすべての投与量が同じであってもよい。投与されるPen1-XBIR3又はカスパーゼAICPP組成物のドミナントネガティブ型の濃度は、特定の実施形態において、0.01μM〜1000μM; 1μM〜500μM又は10μM〜100μM)である。Pen1-XBIR3又はカスパーゼAICPP組成物のドミナントネガティブ型は、特定の実施形態において、0.1μl〜1000μl、1.0μl〜500μl又は10μl〜100μlの液滴を、30秒〜5分ごと、1分〜4分ごと又は2分ごとに10〜60分、15〜30分ごと又は20分ごとに交互の鼻孔に投与することによって経鼻的に送達される。特定の実施形態において、具体的なヒト等価投薬量が、Reagan-Shawら、FASEB J.、22; 659〜661頁(2007年)に概説された、体表面積比較を介した動物研究から計算できる。
【００６６】
本発明のある特定の限定されない例において、Pen1-XBIR3又はカスパーゼのドミナントネガティブ型は、神経変性疾患を治療するために用いられる。特定のこのような例において、Pen1-XBIR3又はカスパーゼAICPPコンジュゲートのドミナントネガティブ型は、神経変性疾患を患う患者に単回投与又は複数回投与のいずれかとして投与される。複数回投与を投与する場合、それらは、6回/24時間又は4回/24時間又は3回/24時間又は2回/24時間の間隔で投与することができる。初期投与量は、その後の投与量より多くてもよく、又はすべての投与量が同じであってもよい。投与されるPen1-XBIR3又はカスパーゼAICPP組成物のドミナントネガティブ型の濃度は、特定の実施形態において、0.01μM〜1000μM; 1μM〜500μM又は10μM〜100μM)である。Pen1-XBIR3又はカスパーゼAICPP組成物のドミナントネガティブ型は、特定の実施形態において、0.1μl〜1000μl、1.0μl〜500μl又は10μl〜100μlの液滴を、30秒〜5分ごと、1分〜4分ごと又は2分ごとに10〜60分、15〜30分ごと又は20分ごとに交互の鼻孔に投与することによって経鼻的に送達される。特定の実施形態において、具体的なヒト等価投薬量が、Reagan-Shawら、FASEB J.、22; 659〜661頁(2007年)に概説された、体表面積比較を介した動物研究から計算できる。
【００６７】
本発明の特定の実施形態において、アポトーシス標的阻害剤は、単独で又は膜透過性複合体との関連で、一種以上の追加の治療薬と併用投与される。特定のこのような実施形態において、追加の治療薬は、限定するものではないが、tPA又はヘパリンなどの抗血液凝固剤、フリーラジカルスカベンジャー、抗グルタミン薬などを含む(例えば、Zaleskaら、2009年、Neuropharmacol. 56(2):329〜341頁を参照されたい)。特定の実施形態において、本方法は、一種以上の追加のアポトーシス標的阻害剤を、単独で又は膜透過性複合体との関連で、投与することを伴う。
【実施例】
【００６８】
6. 実施例
6.1  軸索喪失及び神経変性におけるカスパーゼ-6
本実施例は、カスパーゼ-6が、脳虚血後の軸索変性及びニューロン喪失のメディエーターであり、カスパーゼ-6の活性の阻害がインビボで神経保護することを立証する。下記の6.2項に概説するように、活性カスパーゼ-6は、ラット及びマウスの両方において、虚血後、細胞体及びニューロン突起において一時的に誘導される。カスパーゼ-6の遺伝的ノックアウトが、脳卒中に対して神経保護的であり、脳卒中に関連する神経機能の欠損を改善することを、6.3項に示す。さらに、カスパーゼ-6の活性化の時間経過は、ヒト脳卒中及び他のげっ歯類モデルにおいて観察された軸索変性の時間経過と一致し、12〜24hprの軸索及び樹状突起におけるカスパーゼ-6のこの活性化が、神経保護のための魅力的な分子標的となる。下記の6.4項に概説するように、インビボで使用するための活性カスパーゼを捕捉するインビトロ技術(Tu,S.ら、Nat Cell Biol 8 (1)、72〜77頁(2006年))が用いられており、カスパーゼ-9が1hpr及び4hprにおいて活性であることが見出されている。(Akpanら、J. Neuroscience 31 (24)、8894-8904頁(2011年))。カスパーゼ-9の活性化がカスパーゼ-6の切断につながるかどうかを決定するために、カスパーゼ-9の活性を、タンパク質のアポトーシスファミリーの阻害剤のメンバーである、XIAPのBIR3ドメイン(XBIR3)で阻害した(6.5項を参照されたい)。カスパーゼ-9の高度に特異的な阻害剤であるこのタンパク質ドメインを、細胞膜を横切って送達するために、細胞導入ペプチドであるペネトラチン1(Pen1)に連結した(Eckelmanら、EMBO Rep 7 (10)、988〜994頁(2006年))。実質内対流増加送達戦略及びPen1-XBIR3の鼻腔内送達はカスパーゼ-6の活性化をニューロン突起において阻害することから、神経保護的である。さらに、6.6項に概説するように、Pen1-XBIR3の鼻腔内送達は、機能的神経保護をインビボで提供する。要約すると、これらの例は、カスパーゼ-6及びカスパーゼ-9が、脳卒中における軸索変性及びニューロン死において活性であり、それらの阻害により、虚血性損傷の影響を改善させ得ることを立証する。
【００６９】
6.2  カスパーゼ-6は、脳卒中後、ニューロン突起及び細胞体において活性である
多くのカスパーゼが、脳卒中における神経変性の進行に関与するが、個々のカスパーゼの具体的な役割に関する明確な証拠は、依然として見つけるのが難しいままである。(Ribeら、Biochem J 415 (2)、165〜182頁(2008年))。本実施例は、カスパーゼ-6が、インビボの虚血後にニューロン突起において活性化されたかどうかを試験する。ラットを、2時間の一時的中大脳動脈閉塞(tMCAo)に供し、脳を、切断カスパーゼ-6(cl-C6)に関して、再灌流後経時的に画像化した。大型及び小型のサブユニットの間のカスパーゼ-6の切断は、このプロテアーゼを完全に活性化するので、切断により生み出されたネオエピトープに対する抗血清反応性は、活性化の真の読み出しである。(Stennickeら、Methods Enzym. 17 (4)、313-319頁(1999年))。前脳のペナンブラ領域、特に顆粒性島の皮層第I〜IV層、体性感覚皮質、脊椎運動皮質(図1a)は、cl-C6に関する染色の一時的増加が明らかになった(図1b)。cl-C6は、対照の非虚血性動物において検出されなかった。4hprまで、ペナンブラでは最小染色であったが、12hprまでに、帯状皮質、一次運動皮質、一次及び二次体性感覚皮質並びに顆粒性島皮質中の突起及び細胞体において大量のcl-C6染色が認められれた(図1a、b)。24hprまでに、核においてC6の活性化の進行が認められ、それは再灌流後3日(dpr)にわたり続いた。7dprに、cl-C6は核においてのみ見られた。tMCAoに供された野生型マウスにおいて、染色パターンは、24hpr及び3dprにおいて検出された細胞体及び突起の染色と同様であった(図1c)。神経学的にこの時間経過は、最初の3日にわたる梗塞の拡大及び軸索変性を伴う梗塞の進行の両方と一致する。NeuNとの共染色は、cl-C6がニューロンに位置することを示し(図1d)、一方、星状膠細胞のマーカーであるGFAPとの共局在化はなかった。cl-C6が、軸索又は樹状突起に存在したかどうかを同定するために、切片を、cl-C6及びTuj1若しくはNF-L(軸索マーカー)又はMAP-2(樹状突起マーカー)に関して共染色した。24hprに、Tuj1及びcl-C6は、単一のニューロン突起に見出された(図1e)。これらの突起は、連続しておらず、突起中のギャップはcl-C6に関して陽性であった。興味深いことに、ADにおける先の作業は、カスパーゼ-6がチューブリン及びタウを切断することを示唆しており、このことが微小管及び軸索の安定性を破壊すると思われる。(Klaimanら、Mol Cell Proteomics 7 (8)、1541〜1555頁(2008年); Guoら、Am J Pathol 165 (2)、523〜531頁(2004年))。cl-C6はまた、NF-L又はMAP-2を含有する単一の突起に見出され(図1e)、突起染色においてcl-C6の詰まった同様のギャップが認められた。このような機能は、カスパーゼ-6が、これらのタンパク質又はそれらのポリマー化を安定化させる結合タンパク質を直接切断している結果であり得る。
【００７０】
6.3  カスパーゼ-6の遺伝的ノックアウトは神経保護的である
カスパーゼヌルマウス(「カスパーゼ-6-/-」)は、脳虚血におけるこれらのプロテアーゼの役割を研究する上で強力な道具である。野生型及びカスパーゼ-6-/-マウスをtMCAoに供し、カスパーゼ-6-/-マウス(図2a)は、28-ポイント試験に基づき野生型マウスと比較して、24hprにおいて有意に優れた神経学的機能を示した(図2b及び2c)。(Clarkら、Neurol Res 19 (6)、641〜648頁(1997年))。同様の神経保護は、tMCAoに供されたカスパーゼ-3ヌルマウスにおいても以前に観察された。(Leら、Proc Natl Acad Sci USA 99 (23)、15188〜15193頁(2002年))。梗塞体積の一般的な測定である、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロライド(TTC)染色は、神経機能における有意差にもかかわらず、24hprにおいて有意差を示さなかった。このことをさらに研究するために、ニューロン数及び突起数を定量した。1時間のtMCAoに供された野生型マウスはその後24hprに、非脳卒中野生型マウスと比較してニューロン数が47%の減少を示し、この減少は、カスパーゼ-6-/-マウスにおいて部分的に回復した(図2d)。蛍光nissl(NeuroTrace)染色も同様の結果をもたらした。このことは、細胞の計数及び神経機能試験が、この時点においてTTCよりさらに高感度な測定を提供したことを示した。さらに、tMCAoに供された野生型マウスは、カスパーゼ-6-/-マウスと比較して、より少ないNF-L-陽性突起を有した(図2e)。野生型マウス由来の突起はより短く、より多くの断片化NF-L染色を示し、これは軸索の断片化及び変性を示唆する。脳卒中野生型マウスにおいてMAP-2を含む突起もまた、カスパーゼ-6-/-と比較してより少なかった(図2e)。タウは、カスパーゼ-6の推定上の軸索基質であり、タウのN末端及びC末端領域に潜在的な切断部位を有する。(Guoら、Am J Pathol 165 (2)、523〜531頁(2004年); Horowitzら、J Neurosci 24 (36)、7895〜7902頁(2004年))。タウのC末端領域に特異的な抗体を用いた分析は、24hprにおいてカスパーゼ-6-/-脳が、野生型脳より多くの無傷のタウを保持していたことを明らかにした(図2F)。このことは、カスパーゼ-6が、脳卒中の際にタウレベルを減少させることを示唆する。タウのこの喪失は、微小管の不安定性、及び突起の完全性の喪失につながり得る。
【００７１】
6.4  カスパーゼのイニシエーターであるカスパーゼ9は、脳卒中の早期に活性である
カスパーゼ-6は、エフェクターカスパーゼであり、先行する研究は、イニシエーターカスパーゼのカスパーゼ-9が、カスパーゼ-6の活性化につながることを示した。(Pop & Salvesen、J Biol Chem 284 (33)、21777〜21781頁(2009年))。12hprまでの検出可能な切断カスパーゼ-6の誘導は、イニシエーターカスパーゼの活性化がこの時点の前に起こっているはずであることを示唆した。エフェクターカスパーゼの活性化は切断を必要とし、それにより切断部位特異的抗体を使用して活性化状態を判定することが可能になる一方、イニシエーターカスパーゼは活性化のために切断を必要としないが、二量化により活性化され得る。(Ribeら、Biochem J 415 (2)、165-182頁(2008年))。現在のところ、カスパーゼ活性に基づくプローブであるビオチン-VAD-fmk(bVAD)が、イニシエーターカスパーゼが、死刺激後に活性であるかどうかを決定するための最善の方法である。bVADは、さまざまな死刺激後のカスパーゼ活性化を同定するためにインビトロで使用されている、不可逆的汎用カスパーゼ阻害剤である。(Tuら、Nat Cell Biol 8 (1)、72〜77頁(2006年); Denault & Salvesen、J Biol Chem 278 (36)、34042〜34050頁(2003年); Tizonら、J Alzheimers Dis 19 (3)、885〜94頁(2009年))。bVADは、任意の活性カスパーゼに不可逆的に結合し、下流事象を阻害するものである。最終的には、イニシエーターカスパーゼは切断されるが、このことはそれらの活性化の下流結果である。(Malladiら、EMBO J 28 (13)、1916〜1925頁(2009年); Denault & Salvesen、Methods Mol Biol 414, 191〜220頁(2008年); Srinivasulaら、Nature 410 (6824)、112〜116頁(2001年))。この方法は、培養初代ニューロンにおける使用のために適合化されており、現在、CNSにおけるインビボでの使用のためにさらに適合化されている。(Tizonら、J Alzheimers Dis 19 (3)、885〜94頁(2009年))。イニシエーターカスパーゼが、脳卒中において初期に活性化されたかどうかを決定するために、ラットに、200ナノモルのbVADをtMCAoの1時間前に線条体に対流増加送達により注射し、1hprに屠殺した。注射領域を切り取り、bVAD-カスパーゼ複合体を、ストレプトアビジン-アガロースビーズ上に単離し、ウエスタンブロッティングにより分析した。bVADにより捕捉されたカスパーゼ-9(図3a)及びカスパーゼ-8は、これらのイニシエーターカスパーゼの活性化が脳卒中の早期事象であることを示す。カスパーゼ-1及び2は、bVADにより単離されなかった。カスパーゼ-9が活性であり続けているかどうかを決定するために、動物を、3aのように処置し、4hprに屠殺した。bVADにより捕捉されたカスパーゼ-9(図3b)は、カスパーゼ-9が、脳卒中の進行とともに活性化され続けていることを示した。さらに、24hprにおいて、cl-C6に関して陽性の細胞は、カスパーゼ-9に関しても陽性であったことが観察された(図3c)。カスパーゼ-9は、突起においてcl-C6とともに観察された。これらのデータに基づいて、カスパーゼ-9はカスパーゼ-6の活性を制御できると考えられることから、したがってこの関係をさらに探求した。
【００７２】
6.5  カスパーゼ-9は、ニューロンの突起及び細胞体においてカスパーゼ-6を活性化する
カスパーゼ-9及びcl-C6の共局所化は、カスパーゼ-9がカスパーゼ-6を活性化する機序を支持する。カスパーゼ-9がカスパーゼ-6を活性化していたかどうかを決定するために、カスパーゼ-9の阻害が、カスパーゼ-6の活性化を遮断するものかどうかを調べる試験に取り組んだ。現在利用可能な低分子阻害剤は、個々のカスパーゼの寄与を分析するために十分に特異的ではなく、それ故、カスパーゼ-9を明確に阻害するための代替的な試みを開発した。(McStayら、Cell Death Differ 15 (2)、322〜331頁(2008年))。哺乳動物は、IAPとして知られる細胞死阻害タンパク質のファミリーを発現する。このファミリーの一員であるX連鎖IAP(すなわちXIAP)は、活性カスパーゼ-9、-3、-7の強力な特異的阻害剤である。IAPは、バキュロウイルスIAPリピート(BIR)ドメインを含有し、XIAPに関して、カスパーゼ阻害特異性は、特異的BIRドメインに依存し、BIR3ドメインは活性カスパーゼ-9を特異的に標的とする。(Eckelmanら、EMBO Rep 7 (10)、988〜994頁(2006年))。
【００７３】
XIAP-BIR3の細胞内への取り込みを促進するために、そのペプチドを、細胞導入ペプチドであるペネトラチン1にジスルフィド結合させた。(Davidsonら、J Neurosci 24 (45)、10040-10046頁(2004年))。細胞への進入において、ジスルフィド結合は細胞質の還元環境により破壊され、ペプチドカーゴ（積荷）を放出し、それをその標的に作用させる。この構築物の機能的有効性を、カスパーゼ-9依存的死である4-ヒドロキシノネナール(HNE)媒介性死を被った海馬のニューロン培養物を使用して確認した。(Rabacchiら、Neurobiol Aging 25(8)、1057〜1066頁(2004年))。Pen1-XBIR3及びHNEを用いた培養物の処理は死を取り消した。Pen1-ペプチドを脳に送達できることを確保するために、Pen1を、FITC標識対照ペプチドに連結し、対流増加送達(CED)を使用して線条体に送達した。送達の24時間後に脳を採取し、切片にし、画像化した。FITC-ペプチドは同側半球全体に分布し、より高性能の画像により細胞の取り込みが明らかにされた。Pen1-XBIR3は、ICCを使用したtMCAoの1時間前に線条体に送達された。動物を24hprにて採取し、カスパーゼ-9及びcl-C6に関して免疫染色した。Pen1-XBIR3は、細胞体及び突起においてcl-C6及びカスパーゼ-9の出現を阻害した(図3c)。したがって、カスパーゼ-9の活性は、ラットにおける一時的虚血性事象後のニューロンの細胞体及び突起においてカスパーゼ-6の活性化に必要である。
【００７４】
前述の知見は、Pen1-XBIR3の実質内送達がカスパーゼ-6の活性化を防止することを実証している。下記の実験を実施して、別の送達技術によりPen1-XBIR3が血液脳関門を迂回することもできるかどうかを確認した。ニューロトロフィン及び他の化合物の鼻腔内送達は、CNSへの接近を提供し、脳卒中を含む多数のモデルにおいて神経変性を防止することが実証されている。(Dhuriaら、J Pharm Sci 99 (4)、1654〜1673頁(2010年); Liuら、J Stroke Cerebrovasc Dis 13 (1)、16〜23頁(2004年); Liuら、J Neurol Sci 187(1-2)、91〜97頁(2001年))。この送達方法は、血液脳関門を迂回するのに嗅覚路を利用するが、現在のところ、この方法により送達されたタンパク質及び化合物は、げっ歯類モデルにおいて、細胞表面受容体などの細胞外標的を標的としている。細胞内タンパク質であるカスパーゼをこの実験において標的としているため、カーゴは、細胞内に送達される必要がある。上記のように、ペネトラチン1は、必要な、連結ペプチドの細胞内取り込みを提供する。Pen1-XBIR3は、ラットに鼻腔内送達され、その後、脳を冠状に薄切し、CNSにおけるXBIR3の存在を、ウエスタンブロッティングにより決定した(図4a)。Pen1-XBIR3は、脳のすべての薄片に送達され、IGF41の送達パターンと同様であった。
【００７５】
Pen1-XBIR3の鼻腔内送達もまた、カスパーゼ-6の活性、軸索/樹状突起の喪失を減少させ、脳卒中からの神経保護を提供するかどうかを決定するために、動物を、tMCAoの1時間前にPen1-XBIR3を用いて処置し、示されている再灌流時間に採取した。脳を、12hpr及び24hprにおいて、活性化カスパーゼ-6、NF-L、MAP-2及びNeuNの発現に関して分析した。Pen1-XBIR3は、突起において、12hprまでにカスパーゼ-6の活性化を有意に減少させなかったが、この時点において低下に向かう傾向があった(図4b)。24hprまでに、生理食塩水を用いて処置したラットと比較して、突起において24hprまでにcl-C6の有意な減少があった(図4b)。したがって、この送達技術を使用するカスパーゼ-9阻害は、カスパーゼ-6の活性を減少させた。さらに、24hprにおいて、Pen1-XBIR3は、ニューロン喪失に対して有意な保護を提供し、12hprにおいていずれの群においても明らかなニューロンの喪失はなかった(図4b)。ニューロン密度とは対照的に、NF-L陽性神経突起の数は12hprにおいて有意に低下し、これは、軸索の喪失がニューロンの細胞体の喪失の前に起こっていることを示唆している(図4c)。これは、脳卒中において軸索変性がニューロン死に先行することを示唆しており、それは他の神経変性疾患に関してもすでに提示されている。(Coleman, M.、Nat Rev Neurosci 6 (11)、889〜898頁(2005年))。鼻腔内Pen1-XBIR3による軸索保護は、24hprまで続いた(図4c)。軸索密度とは異なり、樹状突起レベルは、12及び24hprにおいて影響を受けず(図4d)、これは、樹状変性の時間経過がより緩慢であるか又は変性の機序が異なることを示している可能性がある。
【００７６】
カスパーゼ-6が、ヒト脳卒中において活性であるかどうかを決定するために、虚血性脳卒中後に死亡した患者の脳由来の死後組織を、cl-C6に関して免疫染色した。DABの発色(図5a)は、梗塞組織における細胞体及び突起の染色を示し、隣接する切片のNF-L染色は、突起密度の減少を示した。cl-C6が、突起に対するマーカーと共局在するかどうかを決定するために、切片を、cl-C6及びTuj1に対して共染色した(図5b)。cl-C6は、虚血性組織中の突起に見出され、Tuj1との共局在化のパターンは、虚血のげっ歯類モデルにおいて観察されたパターンと非常に類似していた。
【００７７】
6.6  鼻腔内Pen1-XBIR3は、インビボで機能的神経保護を提供する
Pen1-XBIR3の、脳卒中により引き起こされる感覚-運動障害を防止する効果を、ラットに、予防的(閉塞前)又は治療的(再灌流の4時間後)な、ビヒクル又はPen1-XBIR3の鼻腔内ボーラス注入を施すことにより試験した(下記の6.8項に記載のように調製及び投与した)。げっ歯類を、24ポイントの神経機能的スケールにより、虚血の1日後に開始して虚血性事象後1日おきに3週間試験することにより、アッセイした。予防的又は再灌流の4時間後にPen1-XBIR3を用いて処置された動物は、それらのビヒクル処置対応動物よりも脳卒中関連障害が少ないことを示した(図6)。図3bに示すように、Pen1-XBIR3による治療的保護は、カスパーゼ-9の活性化が脳卒中の際、再灌流後少なくとも4時間まで持続すること及びこの経路が、脳卒中により引き起こされた急性神経変性にとって重要であることを示す。
【００７８】
6.7  鼻腔内Pen1-C6DNはカスパーゼ-6基質の切断を防止する
カスパーゼ-6の直接阻止が、虚血後の保護を提供するかどうかを決定するために、Pen1連結カスパーゼ-6のドミナントネガティブ(Pen1-C6DN)構築物を利用した。Pen1-C6DNを、tMCAoの1時間前にマウスに鼻腔内ボーラスにより送達し、マウスを、その後1時間のMCAo、次いで再灌流に供した。動物を、24hprに屠殺し、脳のコア及びペナンブラ領域を、ウエスタンブロッティング用に調製した。図7に表したように、脳卒中梗塞(24hpr)のコア及びペナンブラ領域由来のタンパク質溶解液を単離した。ビヒクルのみで処置した場合、(脳卒中の)同側半球は、カスパーゼにより切断されたタウを豊富に含有した。Pen1-C6DNは、カスパーゼにより切断されたタウの切断を減少させ、鼻腔内Pen1-C6DNが、脳卒中の際のカスパーゼ-6基質の切断を防止し得ることを示している。
【００７９】
6.8  データ分析
これらのデータは、カスパーゼ-6及び9が、脳虚血における軸索変性及びニューロンの喪失の制御因子であることを示す。図8は、虚血におけるカスパーゼ-9及び6の活性化並びにこの活性化への介入の効果を示す概略図を提供する。カスパーゼ-6は、ラット及びマウスモデルの両方並びにヒト梗塞組織周囲において、ニューロンの突起及び細胞体中のペナンブラ領域において活性化される。カスパーゼ-6の遺伝的切除は、構造レベル及び機能レベルで神経保護を提供する。ニューロンにおけるカスパーゼ-6に関する機能は、ハンチントン舞踏病における神経変性に関連するハンチンチンのプロセシングを含む。(Grahamら、Cell 125 (6)、1179〜1191頁(2006年))。カスパーゼ-6はタウを切断し、微小管を安定化させるその能力に影響を及ぼす可能性があり、タウのカスパーゼ-6媒介性切断は、ADの病因に関与し得る。(Horowitzら、J Neurosci 24 (36)、7895〜7902頁(2004年); Klaimanら、Mol Cell Proteomics 7 (8)、1541〜1555頁(2008年); Guoら、Am J Pathol 165 (2)、523〜531頁(2004年))。脳虚血の上記のモデルにおいて、6.1〜6.5項を参照すると、活性カスパーゼ-6は、軸索マーカー及び樹状マーカーと共局在化し、このカスパーゼがニューロン突起の変性に関与している。同じ突起に存在するが、活性カスパーゼ-6を含むいくつかのエリアは突起マーカーを欠如しており、そのことはカスパーゼ-6がこのマーカーを切断することを示唆している。脳卒中におけるカスパーゼ6のこの機能を支持するように、カスパーゼ-6-/-マウスと比較した、tMCAoに供された野生型マウスにおけるタウの減少が観察された。カスパーゼ-6阻害剤であるPen1-C6DNの鼻腔内送達は、カスパーゼにより切断されたタウの出現を減少させ、脳卒中におけるカスパーゼ-6の標的化が機能的神経保護を提供するものであることを示している。さらに、カスパーゼ-6-/-及び野生型マウス由来の梗塞組織の組織溶解液のプロテオーム解析を使用して、脳卒中の際にカスパーゼ-6により切断された広範なタンパク質を明らかにでき、その多くは軸索安定性を制御する可能性がある。
【００８０】
さらに、カスパーゼ-6は、栄養因子の欠乏を被った解離DRGニューロンにおける突起変性に関与し(Nikolaevら、Nature 457 (7232)、981〜989頁(2009年))、その研究は、カスパーゼ-6が突起変性に関与するだけでなく、ニューロン死にも関与することを提示した。本研究は、カスパーゼ-6が、虚血の際の突起変性及びニューロン死の両方を媒介していることを見出している。脳卒中のペナンブラにおけるカスパーゼ-6の一時的活性化は、軸索変性の進行と対応する。神経変性の他の形態に関して、軸索変性は、細胞死への主要な寄与因子であり、標的由来の栄養因子の除去による死を引き起こし得る。(Ferriら、Curr Biol 13 (8)、669〜673頁(2003年); Fischerら、Exp Neurol 185 (2)、232〜240頁(2004年); Stokinら、Science 307 (5713)、1282〜1288頁(2005年))。この事例において、軸索変性が細胞死に先行した。脳虚血の臨床的症例において、軸索変性は、虚血後2日という早期に観察されるが(Thomallaら、Neuroimage 22 (4)、1767〜1774頁(2004年))、軸索変性を誘発する分子事象は、より早期に始まっていると思われる。ペナンブラ領域において、軸索の喪失がニューロンの喪失に先行することが見出され、これが、軸索変性が虚血性事象後のニューロン喪失に先行することを間接的に示唆している。
【００８１】
カスパーゼ-6は、カスパーゼ-9により活性化されるエフェクターカスパーゼである。(Pop & Salvesen、J Biol Chem 284 (33)、21777〜21781頁(2009年))。カスパーゼ活性をアッセイするために短鎖ペプチドのカスパーゼ基質を使用することは一般的なやり方であるが、これらのペプチドは非常に雑多であり、したがって紛らわしいデータを生じることがあり得る。(McStayら、Cell Death Differ 15 (2)、322〜331頁(2008年))。不可逆的汎用カスパーゼ阻害剤であるビオチン-VAD-fmkは、活性カスパーゼ複合体の生化学的プルダウンを介してカスパーゼ活性の信頼できる測定を提供する。元は細胞系においてカスパーゼ活性をアッセイするために使用され、最近では、初代ニューロン培養物で使用されており、この手順は、CNSにおけるインビボ使用に適合化されている。(Tuら、Nat Cell Biol 8 (1)、72〜77頁(2006年); Tizonら、J Alzheimers Dis 19 (3)、885〜94頁(2009年))。本研究において、カスパーゼ-9が、梗塞進行の早期(1及び4hpr)に、コア領域において活性であることが、ビオチン-VADfmkにより活性カスパーゼ-9複合体を単離することによって実証されている。
【００８２】
どのようにカスパーゼ-9が脳卒中において活性化され、カスパーゼ-6の切断につながるかに関する、2〜3の推定上の機序が存在する。第1に、低酸素症により生じた活性酸素種が、DNAの損傷及びp53の活性化をもたらし得る。(Niizumaら、J Neurochem 109 Suppl 1、133〜138頁(2009年))。アポトーシスの際、活性化されたp53はミトコンドリア外膜に移行し、そこで、p53はBcl-2結合Xタンパク質(Bax)及び他のプロアポトーシスタンパク質を動員する。この動員がミトコンドリア外膜の透過化につながり、チトクロームcをサイトゾルに放出させ、それがカスパーゼ-9の活性化につながる。あるいは、虚血におけるカスパーゼ-9の活性化及び得られたカスパーゼ-6の活性化が、受容体により媒介され得る。p75-ニューロトロフィン受容体(p75NTR)及び死受容体6(DR6)刺激の両方が、カスパーゼ-6の活性化をもたらし、DR6が軸索変性をもたらす。(Troyら、J Biol Chem 277 (37)、34295〜34302頁(2002年); Nikolaevら、Nature 457 (7232)、981〜989頁(2009年))。p75NTRの多数の下流標的の一つはp53であり、これがカスパーゼ-6の活性化につながり得る。DR6の一つの相互作用パートナーは腫瘍壊死因子1型受容体関連デスドメイン(TRADD)であり、これがシグナルトランスデューサーTRAF2に結合し、NF-カッパBを活性化する。細胞死機能に関して、NF-カッパBは、アポトーシス促進性及び抗アポトーシス機能の両方を有するが、脳卒中におけるNF-カッパBの持続的活性化は、アポトーシス促進性運命の駆動に関連すると考えられている。(Ridder & Schwaninger、Neuroscience 158 (3)、995〜1006頁(2009年)。NF-カッパBは、Bcl-2ファミリーメンバー(Bim、Bid、Bax、Bak)を制御し、ミトコンドリア膜の安定性、チトクロームcの放出及び続くカスパーゼ-9活性化をもたらす。(Ridder & Schwaninger、Neuroscience 158 (3)、995〜1006頁(2009年))。
【００８３】
カスパーゼ-9の活性が脳卒中の早期に刺激され、カスパーゼ-9の上昇がcl-C6を含む細胞において観察され、カスパーゼ-9は、脳卒中の際のカスパーゼ-6の活性化につながると考えられる。カーゴを細胞に効率よく送達する導入ペプチドであるペネトラチン1(Pen1)に連結された、XIAP由来のBIR3ドメイン(カスパーゼ-9の高度に特異的な阻害剤)は、カスパーゼ-9の活性を阻害するために使用された。(Davidsonら、J Neurosci 24 (45)、10040〜10046頁(2004年); Gueganら、Neurobiol Dis 22 (1)、177〜186頁(2006年); Fanら、Neurochem Int 48 (1)、50-59頁(2006年))。先行する研究は、PTDXBIR3-Ringの融合タンパク質の腹腔内送達が、tMCAo後の梗塞体積を減少させることを示した。(Tuら、Nat Cell Biol 8 (1)、72〜77頁(2006年); Gueganら、Neurobiol Dis 22 (1)、177〜186頁(2006年); Fanら、Neurochem Int 48 (1)、50〜59頁(2006年))。上記の研究においては、二つの異なる送達戦略を用い、この阻害剤を脳に送達した。対流増加送達(CED)は、梗塞領域への直接送達を提供し、脳卒中前のこの阻害剤のCEDは、ニューロンの細胞体及び突起におけるカスパーゼ-6の活性化を消失させた。したがって、カスパーゼ-9の活性は、脳卒中においてカスパーゼ-6の活性を制御する。治療的見地から、CNS障害に関して、鼻腔内送達は、脳への直接接近を提供するので、非常に魅力的な治療戦略である。細胞透過性ペプチドのペネトラチン1と組み合わせたこの送達は、CNSへの細胞内送達を提供する。Pen1とカーゴペプチドとのジスルフィド結合の使用により、いったんカーゴペプチドが細胞に輸送され、Pen1から放出されれば、確実にカーゴペプチドは機能的になりうる。本研究において、Pen1-XBIR3の鼻腔内送達は、カスパーゼ-6の活性化を阻害し、軸索変性を減少させ、神経保護的であった。XBIR3は、カスパーゼ-9を遮断することによって間接的にカスパーゼ-6の阻害を提供するが、カスパーゼ-6の結晶構造の最近の公開は、より特異的なカスパーゼ-6阻害剤の作製につながるはずである。(Baumgartnerら、Biochem J 423 (3)、429〜439頁(2009年))。さらに、Pen1-C6DNを使用して提示されたデータは、この方法が、カスパーゼ-6の直接阻害を提供することを示す。本データは、カスパーゼ-6の活性化が脳卒中における軸索変性と対応することを明らかにし、この過程がどのように虚血において起こるかに対する洞察を提供する。カスパーゼ-6の活性化は、虚血発症後比較的遅いので、脳卒中におけるカスパーゼ-6の有効な阻害は、実質的な虚血後の機能的神経保護及び脳虚血に関する価値のある治療的戦略を提供できる。
【００８４】
6.8  材料及び方法
抗体。免疫組織化学用、抗Tuj1抗体(abcam ab7751)、抗神経フィラメント-L(Cell Signaling #2835)、抗MAP-2(Sigma #M9942)、抗GFAP(Thermo Scientific PA1-10004)、抗完全長及び切断カスパーゼ-9(abcam ab28131;ウエスタンブロッティングにも使用)、抗切断カスパーゼ-6(Cell Signaling #9761)、抗切断カスパーゼ-3(Cell Signaling #9661)及び抗切断カスパーゼ-7抗体(MBL #BV-3147-3)。ウエスタンブロッティング用、THE(商標)抗His(GenScript #A00186)、抗カスパーゼ-8(abcam ab52183)、抗カスパーゼ-6(BD #556581)、タウV-20(Santa Cruz # sc-1996)、ラミンA/C(MBL International #JM-3267-100)。
【００８５】
マウス及びラット脳卒中モデル。C57/Bl6バックグラウンドのカスパーゼ-6ヌル(C6-/-)マウス(Jackson Laboratories)48,49を、野生型C57/Bl6マウスと交配し、C6+/-ヘテロ接合体を作製し、それらを交配させ、研究用のC6-/-及び野生型同腹子を作製した。2〜3月齢の雄C6-/-及び野生型の同腹子マウス(23〜30g)及び成体Wistar雄ラット250〜300g(Taconic Laboratories)を、先に公開のように一時的中大脳動脈閉塞(tMCAo)に供した。(Connollyら、Neurosurgery 38 (3)、523〜531頁; discussion 532 (1996年); Komotarら、Nat Protoc 2 (10)、2345〜2347頁(2007年))。脳を採取し、ウエスタンブロッティング又は免疫組織化学用に、下記のように処理した。マウス神経機能的分析のため、28ポイント神経学的機能性試験を、前記のように実施した。(Clarkら、Neurol Res 19 (6)、641〜648頁(1997年))。さらに、単一マウスを各時点(脳卒中前、再灌流24時間後、再灌流7日後)において新しいケージに入れ、各マウスの代表的自発活動について短いビデオ(各時点で3分)を記録し、マウス脳卒中モデルにおける運動欠損を示した。
【００８６】
ビオチン-VAD-fmk又はPen1-XBIR3の対流増加送達(CED)。成体雄Wistarラット(250〜300g)に、定位固定装置(Stoelting)用麻酔マスクにより送達されたイソフルラン(2%)を使用して麻酔をかけ、定位固定フレームに配置した。CEDを、下記の定位座標(前方1mm、側方3mm、深さ5mm)を用いて前記のように実施した。(Bruceら、Neurosurgery 46 (3)、683〜691頁(2000年))。治療薬の注入を、その後0.5μl/分の速度で始めた。注入後、カニューレを1mm/分の速度で取り外し、穿頭孔を骨ろうで密閉し、皮膚切開を皮膚接着剤で閉鎖した。術後、ラットを、37℃の手術後インキュベーターに配置し、正常体温で1時間維持した。
【００８７】
Pen1-XBIR3。XIAP由来のBIR3ドメイン(XBIR3)を前記のように精製した。(Sunら、J Biol Chem 275 (43)、33777〜33781頁(2000年))。ペネトラチン1(Pen1、Q-Biogene、Carlsbad、CA)を、等モル比で精製XBIR3と混合し、一晩、37℃においてインキュベートし、ジスルフィド結合されたPen/BIR3を作製した。連結を、20% SDS-PAGE及び抗His抗体を用いたウエスタンブロッティングにより評価した。30μlのPen1-XBIR3(36.8μM)を、虚血の誘導の直前にICCにより注入した。動物を室温において飼育し、安楽死させ、脳免疫組織化学(下記を参照されたい)又はタンパク質の単離(脳組織の切り取り、次いで液体窒素中で急速凍結)のために処理した。等体積の生理食塩水を、陰性対照として注入した。
【００８８】
インビボのカスパーゼ活性アッセイ。ビオチン-Val-Ala-Asp(OMe)-フルオロメチルケトン(bVADfmk、MP Biomedicals)を、インビボの活性化カスパーゼ分子トラップとして使用した。200nモルのbVADfmkを30μlの滅菌生理食塩水で希釈し、脳卒中の前にICCにより注入した。脳組織を、bVADfmkを用いた治療及びtMCAo後にラット又はマウスから採取し、液体窒素で瞬間凍結した。組織を、プロテアーゼ阻害剤(Roche)を含有する冷CHAPSバッファー中で乳鉢破壊することによって溶解させた。bVADfmk-カスパーゼ複合体のプルダウンのために、タンパク質溶解液を、セファロースビーズ(GE Healthcare)で1.0時間、4℃において揺らすことによって、あらかじめ清澄にした。あらかじめ清澄にした溶解液を遠心分離機にかけ、上清を、30μlのストレプトアビジン-アガロースビーズ(Sigma)に移し、穏やかに一晩、4℃において揺らした。ビーズを、CHAPSバッファーを用いて15回、洗浄/遠心分離した(300μlの洗浄、5000rpm、5分間)。最終の洗浄/ペレット化の後で、ストレプトアビジンビーズのカスパーゼ-bVADfmk複合体を、1×SDS試料バッファーw/o還元剤中に加熱脱離させた。ビーズを、14,000rpmにおいて10分間ペレット化し、上清を新しいチューブに移し、SDS-PAGEにより分離した。生理食塩水を、bVADfmkに関するビヒクル対照として使用した。
【００８９】
Pen1-XBIR3の鼻腔内送達。イソフルラン麻酔下で仰向けにねかせながら、Pen1-XBIR3(36.8μM)を、6μlの液滴を交互の鼻孔に2分ごとに20分間投与することによってラットに送達した(合計60μlの送達)。(Thorneら、Neuroscience 127 (2)、481〜496頁(2004年))。鼻腔内治療を、脳卒中の誘導前に実施した。生理食塩水を、陰性対照として使用した。脳を、免疫組織化学又はウエスタンブロッティング用に採取した。
【００９０】
免疫組織化学(IHC)、細胞突起の定量化及び統計解析。ラット及びマウスを安楽死させ、ヘパリンで灌流し、次いで4%のパラホルムアルデヒドを用いて固定した。切片を、10%の正常なヤギ血清/1%BSAを用いて1時間ブロックし、一次抗体とともに一晩、4℃においてインキュベートし、PBS-Triton-X100(0.1%)で洗浄し、その種に適したAlexa Fluor-コンジュゲート二次抗体(Invitrogen)とともに2時間、室温(RT)においてインキュベートした。スライドをさらにHoechst 33342(1μg/ml、Invitrogen)を用いて15分、RTにおいて、又は核の染色にはNeuroTrace蛍光Nissl染色(1:300、Invitrogen)を用いて30分染色した。ヒト試料をさらに、Sudan Black(70% EtOH中1%)を用いて5分間RTにおいて処置し、3回交換してPBSで洗浄した(それぞれ3分)。蛍光染色の検出のために、切片を、正立Nikon蛍光顕微鏡を用いてSPOTデジタルカメラ及びPerkin-Elmer Spinning Disc Confocal Imaging Systemを使用して画像化した。ニューロン及び軸索の定量をCell CounterプラグインImage J(NIH)を使用して達成した。ラットの脳における定量化のために、20倍拡大画像を背側運動皮質及びS1体性感覚皮質の前肢領域から取得したが、両方の領域は梗塞ペナンブラ内に含まれる(図1A)。突起又はニューロンの単一のブラインド計数(blind count)を対象となる両方の領域において実施し、その後各個別の動物に関してプールした。3匹の動物/コホートを使用した。マウスの脳に関して、20倍拡大画像を、S1体性感覚皮質の前肢領域において取得し、同様の計数を下記のように実施した。計数を、NF-L/MAP-2陽性突起及びNeuN陽性細胞体に関して実施した。グループ間の比較はスチューデントt検定、p値:0.05を使用した。
【００９１】
ヒト試料を、DAB染色によりさらに分析した。試料を、0.3%のH2O2とともに30分間インキュベートし、次いで10%の正常ヤギ血清/ PBS中1% BSAを用いてブロックし、ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体インキュベーションを一晩、4℃において実施した。PBSで洗浄後、スライドを、その種に適したビオチン-コンジュゲート二次抗体(Vector Laboratories)とともに30分、RTにおいてインキュベートした。試料を、その後ABC試薬(Vector Laboratories)とともに30分インキュベートし、DAB染色を10分間行った。試料を、ヘマトキシリンを用いて対比染色し、続いてエタノールを用いて脱水し、キシレンの2回洗浄で清澄にした。
【００９２】
ラットの海馬培養物。E-18ラット胚由来の海馬ニューロンを切り取り、規定の無血清培地に分散させ、ポリ-D-リジンをコーティングした(0.1mg/ ml)組織培養ウェルにプレーティングした。ニューロンを、グルコース(6mg/ml)、インスリン(25μg/ml)、プトレシン(60μM)、プロゲステロン(20nM)、トランスフェリン(100μg/ml)、セレン(30nM)、ペニシリン(0.5U/ml)及びストレプトマイシン(0.5μg/ml)を含有するEagle MEM及びHam F12(Gibco; Gaithersburg、MD)を用いた、無血清環境において維持した。グリア細胞が、培養物の2%未満を構成した。すべての細胞を、治療前に8〜10日間培養した。
【００９３】
ニューロン生存アッセイ。前記のように4-ヒドロキシノネナール(Cayman Chemicals) 3μMを、Pen1-XBIR3(80nM)を含む培養物及び含まない培養物三連に加えた。(Rabacchiら、Neurobiol Aging 25 (8)、1057〜1066頁(2004年))。治療の1日後、細胞数を前記のように定量した。(Rabacchiら、Neurobiol Aging 25 (8)、1057〜1066頁(2004年))。簡潔に言うと、細胞をカウンティングバッファーに溶解させ、無傷の核を、血球計を使用して計数した。健康な細胞の核は明るく現れ、明らかに画定された核膜を有するが、一方死細胞の核は崩壊し、不規則な形状で現れた。細胞計数を三連のウェルにおいて実施し、平均した。生存%は対照ウェルと比較した。
【００９４】
鼻腔内Pen1-C6DNは、カスパーゼ-6基質の切断を防止する。カスパーゼ-6触媒ドミナントネガティブ(C6DN; C285A)を、前記のように単離し、精製した。Denault, J.B.及びG.S.Salvesen、Expression, purification, and characterization of caspases.Curr Protoc Protein Sci、2003年。21章: p. Unit 21 13。Pen1(Q-Biogene)を、等モル比で精製C6DNと混合し、一晩、37℃においてインキュベートし、ジスルフィド結合されたPen1-C6DNを作製した。連結を、20% SDS-PAGE及び抗His抗体及び抗カスパーゼ-6抗体を用いたウエスタンブロッティングにより評価した。
【００９５】
雄C57BL/6マウス(2〜3月齢; >25g)に、麻酔マスクを介して送達されたイソフルラン(2%)を使用して麻酔をかけた。Pen1-C6DN(30μM)を、2μlの液滴を交互の鼻孔に、1分ごとに10分間(合計20μlの送達)投与することによって送達した。Thorne, R.G.ら、Delivery of insulin-like growth factor-I to the rat brain and spinal cord along olfactory and trigeminal pathways following intranasal administration.Neuroscience、2004年. 127(2):481〜96頁。鼻腔内治療を、1時間の一時的中大脳動脈閉塞の前に実施した。Connolly, E.S., Jr.ら、Procedural and strain-related variables significantly affect outcome in a murine model of focal cerebral ischemia。Neurosurgery, 1996年. 38(3):523〜31頁; discussion 532 and Komotar, R.J.ら、Neurologic assessment of somatosensory dysfunction following an experimental rodent model of cerebral ischemia. Nat Protoc, 2007年. 2(10):2345〜7頁。生理食塩水を陰性対照として使用した。脳を、ウエスタンブロッティング用に採取した。
【００９６】
微小管-結合タンパク質であるタウは、カスパーゼ-6の分子基質として同定されている。タウのカスパーゼ-6切断により生じるネオエピトープと結合する抗体(抗TauC3; Santa Cruz)を使用して、インビボでアポトーシスの際のPen1-C6DNによるカスパーゼ-6阻害に関してアッセイした。抗アルファ-チューブリン(Abcam)をローディング対照として使用した。
【００９７】
さまざまな出版物が本明細書で引用されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９８】
アミノ酸配列: c-IAP1(アクセッション番号Q13490.2):
2014502953.tif 000003
アミノ酸配列:c-IAP2(アクセッション番号Q13489.2):
2014502953.tif 000004
2014502953.tif 000005
アミノ酸配列:XIAP(アクセッション番号P98170.2):
2014502953.tif 000006
アミノ酸配列: NAIP(アクセッション番号Q13075.3):
2014502953.tif 000007
2014502953.tif 000008
アミノ酸配列:サバイビン(アクセッション番号O15392.2):
2014502953.tif 000009
アミノ酸配列:BRUCE(アクセッション番号Q9H8B7):
2014502953.tif 000010
2014502953.tif 000011
【図１−１】
2014502953.tif 000012
【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2014502953.tif 000032
2014502953.tif 000033