(57)【要約】【課題】  画像診断／治療の効率を高める。【解決手段】  癌特異性または癌選択性プロモーター（進行増強遺伝子‐３（ＰＥＧ‐３）プロモーターなど）に機能し得るように連結されたリポーター遺伝子を含む遺伝子構築物を提供し、癌画像診断、癌治療、および画像診断と治療とを組み合わせたプロトコールでそれを使用するための方法も提供する。リポーター遺伝子を癌特異性または癌選択性プロモーターに連結させ、癌を発症しやすくなるようにさらに遺伝子操作し、繁殖させ、選択できるようにしたトランスジェニック動物も提供する。【選択図】図１Ａ／１Ｂ【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体内の腫瘍または癌細胞もしくは癌組織を画像診断する方法であって、
癌特異性または癌選択性プロモーターに機能し得るように連結された画像診断リポーター遺伝子を含む核酸構築物を前記被験体に投与する過程と、
前記画像診断リポーター遺伝子に相補的な画像診断薬を前記被験体に投与する過程と、
前記画像診断薬から検出できるシグナルを検出することによって前記被験体内の腫瘍または癌組織もしくは癌細胞を画像診断する過程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記画像診断リポーター遺伝子を、ルシフェラーゼおよび単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１‐ｔｋ）から成る群から選択した請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記画像診断リポーター遺伝子がＨＳＶ１‐ｔｋであり、前記被験体が癌患者である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記画像診断薬が放射標識ヌクレオシド類似体である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記放射標識ヌクレオシド類似体が２'‐フルオロ‐２'デオキシ‐β‐Ｄ‐５‐［１２５Ｉ］ヨードウラシル‐アラビノフラノシドである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
画像診断の前記過程をシングルフォトン放出コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）またはポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）により行う請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記画像診断リポーター遺伝子がルシフェラーゼであり、前記被験体が実験動物である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記画像診断薬がルシフェラーゼ基質である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸構築物がカチオン性ポリマーを含むポリプレックス中に存在する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記カチオン性ポリマーがポリエチレメイニンである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
核酸構築物を投与する前記過程を静脈内注射により行う請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍、癌組織または癌細胞を、乳癌、メラノーマ、原発不明癌（ＣＵＰ）、神経芽細胞腫、悪性神経膠腫、子宮頸癌、結腸癌、肝臓癌、卵巣癌、肺癌、膵臓癌および前立腺癌から成る群から選んだタイプの癌細胞を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸構築物がプラスミド内に存在する請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸構築物がウイルスベクター内に存在する請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ウイルスベクターが、条件付きで複製可能なアデノウイルスである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記癌特異性または癌選択性プロモーターが進行増強遺伝子‐３（ＰＥＧ‐３）プロモーターである請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記投与過程の内の少なくとも１過程が全身に行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
被験体内の腫瘍または癌組織もしくは癌細胞に対して画像診断および治療の両方を行う方法であって、
癌特異性または癌選択性プロモーターに機能し得るように連結された画像診断リポーター遺伝子および抗腫瘍薬をコードする遺伝子を含む１種以上の核酸構築物を前記被験体に投与する過程と、
前記画像診断リポーター遺伝子に相補的な画像診断薬を前記被験体に投与する過程と、
前記画像診断薬から検出できるシグナルを検出することによって前記被験体内の腫瘍または癌組織もしくは癌細胞を画像診断する過程とを含み、前記抗腫瘍薬をコードする前記遺伝子が前記腫瘍内の細胞または癌組織もしくは癌細胞によって発現し、前記細胞に作用する方法。
【請求項１９】
抗腫瘍薬をコードする前記遺伝子がタンデム遺伝子発現要素に機能し得るように連結された請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンデム遺伝子発現要素が内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
抗腫瘍薬をコードする前記遺伝子が癌特異性または癌選択性プロモーターに機能し得るように連結された請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗腫瘍薬がｍｄａ‐７／ＩＬ‐２４である請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記投与過程の内の少なくとも１過程が全身に行われる請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
癌特異性または癌選択性プロモーターに機能し得るように連結された画像診断リポーター遺伝子を含む核酸構築物から成る、全身投与に好適な癌選択性または癌特異性画像診断系。
【請求項２５】
前記癌特異性または癌選択性プロモーターがＰＥＧ‐ＰＲＯＭである請求項２４の癌選択性または癌特異性画像診断系。
【請求項２６】
癌特異性または癌選択性プロモーターに連結されたリポーター遺伝子を含有し、発現するように遺伝子操作されたトランスジェニック動物。
【請求項２７】
前記トランスジェニック動物はまた癌を発症しやすくしてある請求項２６記載のトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概括的には遺伝子構築物、ならびに癌画像診断、癌治療および画像診断と治療とを組み合わせたプロトコールで前記構築物を使用するための方法に関する。より詳しくいうと、前記構築物における遺伝子転写は癌特異性プロモーターによって作動される。
【背景技術】
【０００２】
癌の標的画像診断は依然として重要であるが、捉えどころのない目標である。このような画像診断は初期診断、転移の検出、治療処置計画および有益な治療モニタリングをもたらす可能性もある。腫瘍の特定の分子特性およびその微環境の拡張したリストを活用することで、分子画像診断が腫瘍特異性試薬を生成する可能性もある。しかし、想定される標的試薬の局在化が非特異的であり、許容を超えるほど高濃度のバックグラウンドノイズが生じるため、腫瘍特異的画像診断では多くの取り組みが問題を抱えている。
【０００３】
研究者らは腫瘍特異的画像診断薬を提供するために多くの戦略  ―  バックグラウンドに対する標的の比率を高く維持することに多大に尽力していること  ―  を試みており、それらは２つの概括的なカテゴリーに、すなわち直接的および間接的な方法に分類される１。直接的方法は、通常、標的タンパク質に直接結合することで、受容体、トランスポーターまたは酵素濃度などの特定のパラメータについて直接にリポートする試薬を使用している。間接的方法は、インビトロでの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の使用法と同様にリポーター導入遺伝子戦略を使用し、外部画像診断装置を使用してインビボで生じる細胞プロセスを読み取るものである。分子遺伝学的画像診断には、疾患過程に関与する多様な遺伝子プロモーター、転写因子および鍵酵素の活性の視覚化および定量化を可能にしている間接的技術、ならびにＧｌｉ２、Ｅ２Ｆ１３、テロメラーゼ４，５およびヒト遺伝子療法試験６、７に有用であると判明しているものも含む数種のキナーゼなどのインビボでの療法が採用されている。残念ながら現在まで、これら技術は画像診断薬の特異的局在化を十分に提供しておらず、許容を超えるほど高濃度のバックグラウンドノイズが依然として頻繁に存在する。
【０００４】
この数十年、癌療法もかなり進歩してきている。しかしながら、抗腫瘍薬の正常細胞への送達が非特異的であるためその進歩も未だ停滞しており、患者に対して重大な副作用を招いている。患者が最も必要とする集中的な方法で活性剤を送達させる、すなわち癌細胞のみに送達させる能力が不足していることから、特異性のこのような欠如も治療効率を低下させている原因となっている。
【０００５】
本明細書に、参照によって内容が完全に組み入れる米国特許第６，７３７，５２３号（Ｆｉｓｈｅｒら）は、癌細胞内で遺伝子発現させることに特異的な進行増強遺伝子‐３（ＰＥＧ‐３）プロモーターを記載している。この特許には、特異的な方法で癌細胞内の関心遺伝子を発現するプロモーターを使用することが記載されている。しかし、画像診断、および画像診断と治療とを併用することは述べられていない。
【０００６】
米国特許出願第２００９／０３１１６６４号には、癌細胞内でのみリポーター遺伝子を発現させることに条件付きで適しているウイルスベクターを使用する癌細胞検出および画像診断が記載されている。しかし、該技術はインビボでは使用せず、画像診断と治療とを組み合わせた方法は記載されておらず、ヘルペスとワクチニアウイルスのみ詳細に記述されている。
【０００７】
【非特許文献１】Nat. Clin.Pract. Oncol, Vol.6,pp.53-58 (2009年)
【特許文献１】米国特許第６，７３７，５２３号
【特許文献２】米国特許出願第２００９／０３１１６６４号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
癌細胞に対する特異性の高い癌画像診断および治療を向上させた方法の開発が依然として必要であり、それは患者や医師にとって、癌画像診断の手段と単独方法で癌を治療処置する手段とを組み合わせる方法を利用可能にする利点をもたらすものと思われる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は概括的には、ｉ）癌画像診断、ｉｉ）癌治療；およびｉｉｉ）治療と画像診断との併用における、遺伝子構築物およびそれを使用するための方法に関する。治療と画像診断との組み合わせは本明細書では、癌への「セラノスティック」アプローチと称してもよい。これらの方法で使用される遺伝子構築物は癌細胞内で特異的あるいは選択的に活性であるプロモーターを含む。これらのプロモーターは本明細書では、「癌プロモーター」または「癌特異性／選択性プロモーター」または単に「特異性／選択性プロモーター」と称してもよい。これらのプロモーターによって得られた特異性によって、癌画像化または癌治療またはその両方を必要とする被験体の全身に本発明の構築物を含む組成物を有利に投与することが可能となる。
【００１０】
本発明の治療の側面では、本方法に関連する抗腫瘍薬は癌細胞内でのみ発現することから、全身に送達させる場合でさえ高レベルの抗腫瘍薬を癌細胞へ正確に送達させることが可能となる。これによって好都合にも、本方法で治療する患者では副作用がほとんど無いか、あるいはまったく無いという結果がもたらされる。
【００１１】
同様に、本発明の画像診断の側面では、バックグラウンドシグナルがほとんど無いか、あるいはまったく無い状態で癌細胞および腫瘍を高レベルで正確に画像診断することが可能となる。本発明の画像技術によって、転移癌、さらに例えば、新規で増殖した腫瘍の寸法が小さすぎるか、あるいは腫瘍を実際に形成しない癌細胞のパターンが拡散しているために他の方法で検出できない転移癌でさえ、滞りなく検出可能になることは重要である。当技術分野で公知のとおり、腫瘍を初期に検出することは腫瘍治療の結果を大幅に改善できるものである。同様に、腫瘍が形成される前に癌組織を検出することは非常に有益である。
【００１２】
画像診断と治療法との併用は多岐にわたって先行技術より有利である。画像診断および治療へのアプローチは併用するとさらに効率的になり、手順も少なくなり、したがって患者および癌専門家の立場において労力も抑えられる。活性が癌細胞に限定されることから、副作用が低減される。また、画像診断と治療法を併用すると、治療と同時に、過去の治療効果を正確にモニタリングすることが可能となり、このことは治療の進歩への貴重かつ正しい糸口を癌治療専門家に付与し、治療パラメータが治療と密接に連携して微調整されるようになる。
【００１３】
また、本発明は、癌特異性または癌選択性プロモーターに機能し得るように連結されたリポーター遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むように遺伝子操作されたトランスジェニック動物、および療法を臨床的に評価するためのそれらの使用も提供している。いくつかの実施態様では、トランスジェニック動物は癌を増殖しやすくしてある。
【００１４】
被験体において腫瘍または癌細胞もしくは癌組織を画像診断する方法を提供することは本発明の目的の１つである。該方法には、１）癌特異性または癌選択性プロモーターに機能し得るように連結された画像診断リポーター遺伝子を含む核酸構築物を前記被験体に投与する工程；２）前記画像診断リポーター遺伝子に相補的な画像診断薬を前記被験体に投与する工程；および３）前記画像診断薬から検出可能なシグナルを検出することによって前記被験体の腫瘍あるいは癌組織または細胞を画像診断する工程が含まれる。いくつかの実施態様では、画像診断リポーター遺伝子はルシフェラーゼおよび単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１‐ｔｋ）から成る群より選択され；被験体は癌患者である場合もある。画像診断薬は放射標識ヌクレオシド類似体、２’‐フルオロ‐２’デオキシ‐β‐Ｄ‐５‐［１２５Ｉ］ヨードウラシル‐アラビノフラノシドである。画像診断の工程はシングルフォトン放出コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）またはポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）により行ってもよい。画像診断リポーター遺伝子はルシフェラーゼとすることも可能であり、前記被験体は実験動物であり、この場合画像診断薬はルシフェラーゼ基質である。いくつかの実施態様では、核酸構築物はポリエチレメイニンなどのカチオン性ポリマーを含むポリプレックスに存在する。投与の前記工程のうち１つあるいは２つを全身投与で行ってもよい。核酸構築物を投与する工程は静脈注射により行ってもよい。いくつかの実施態様では、腫瘍、癌組織または細胞は、乳癌、メラノーマ、原発不明癌（ＣＵＰ）、神経芽細胞腫、悪性神経膠腫、子宮頸癌、結腸癌、肝臓癌、卵巣癌、肺癌、膵臓癌および前立腺癌から成る群より選択されるタイプの癌細胞を含む。いくつかの実施態様では、核酸構築物はプラスミド内に存在する。他の実施態様では、核酸構築物は条件付きで複製可能なアデノウイルスなどのウイルスベクター内に存在する。いくつかの実施態様では、癌特異性または癌選択性プロモーターは進行増強遺伝子‐３（ＰＥＧ‐３）プロモーターである。
【００１５】
本発明は被験体内の腫瘍あるいは癌組織または細胞の画像診断および治療の両方を行う方法をも提供する。前記方法には、１）癌特異性または癌選択性プロモーターに機能し得るように連結されたリポーター遺伝子および抗腫瘍剤をコードする遺伝子の画像化を含む１種以上の核酸構築物を前記被験体に投与する工程；２）前記画像診断リポーター遺伝子に相補的な画像診断薬を前記被験体に投与する工程；および３）前記画像診断薬から検出可能なシグナルを検出することによって前記被験体の腫瘍あるいは癌組織または細胞を画像診断する工程が含まれ、ここでは、前記抗腫瘍薬をコードする前記遺伝子は、前記腫瘍内の細胞あるいは癌組織または細胞によって発現し、前記細胞に作用する。いくつかの実施態様では、投与の前記工程のうち少なくとも１工程、できれば２工程を全身に行ってもよい。いくつかの実施態様では、抗腫瘍薬をコードする遺伝子がタンデム遺伝子発現要素、例えば内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）に機能し得るように連結される。他の実施態様では、抗腫瘍薬をコードする遺伝子が癌特異性または癌選択性プロモーターに機能し得るように連結される。抗腫瘍薬はｍｄａ‐７／ＩＬ‐２４にしてもよい。
【００１６】
本発明はまた、癌特異性または癌選択性プロモーターに機能し得るように連結された画像診断リポーター遺伝子から成る核酸構築物を含む癌特異性または癌選択性遺伝子発現画像診断系も提供する。いくつかの実施態様では、癌特異性または癌選択性プロモーターはＰＥＧ‐ＰＲＯＭである。いくつかの実施態様では、系は全身投与に適したものである。
【００１７】
本発明はさらに、癌特異性または癌選択性プロモーターに連結されたリポーター遺伝子を含み、発現するように遺伝子操作されたトランスジェニック動物を提供する。いくつかの実施態様では、トランスジェニック動物も癌を増殖しやすくしてある。
【発明の効果】
【００１８】
癌特異性または癌選択性プロモータに機能し得るよう連結されたリポーター遺伝子を含む遺伝子構築物を提供し、癌画像診断、癌治療および画像診断と治療とを組み合わせたプロトコルでそれを使用するための方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の実施態様は、核酸構築物、ならびにそれを癌画像診断および癌治療に使用して癌画像診断と治療を併用する方法を提供するものである。治療用に設計した構築物は通常、癌特異性プロモーター、およびその癌特異性プロモーターに機能し得るように連結された治療薬（例えばその発現が癌細胞を害するタンパク質またはポリペプチド）をコードする組み換え遺伝子から成る。したがって、構築物が全身に投与されるときでさえ、癌細胞が標的となり、死滅する。画像診断用に設計された構築物は癌特異性プロモーター、およびその癌特異性プロモーターに機能し得るように連結されたリポーター分子をコードする組み換え遺伝子から成る。そのリポーター分子はそれ自体で検出可能であるため癌細胞内で発現すると癌細胞を検出可能に変える；あるいはリポーターは、検出可能であるかまたは相互作用によって検出可能になる「補体」に会合するか、それと相互作用することができる。リポーターは癌細胞のみに発現することから、リポーターをコードする構築物およびリポーターの補体は安全に全身投与できる；たとえその両方が被験体の全身に広く分散していても、補体は癌細胞内でのみリポーターに接触し、それと相互作用する。いくつかの用途では、腫瘍への直接注射も採用し得る。いくつかの実施態様では、リポーター‐補体の会合によって癌細胞の有無と致死率を画像診断することが可能になる。これらの構築物および方法、ならびにこれらの多様な組み合わせおよび入れ替えは下記で詳細に説明する。
【００２０】
プロモーター
本発明の構築物は、癌細胞内で特異的または選択的に転写を作動するプロモーターに機能し得るように接続または連結された少なくとも１つの転写可能な要素（例えば核酸配列から成る遺伝子）を含む。その転写可能な要素の発現は誘導可能または構造的である。使用できる好適な癌選択性／特異性プロモーター（および／またはプロモーター／エンハンサー配列）には；ＰＥＧ‐ＰＲＯＭ、星状膠細胞増加遺伝子１（ＡＥＧ‐１）プロモーター、サバイビン‐Ｐｒｏｍ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）‐Ｐｒｏｍ、ハイポキシア誘導性プロモーター（ＨＩＦ‐１‐α）、ＤＮＡ損傷誘導性プロモーター（例えば、ＧＡＤＤプロモーター）、転移関連プロモーター（メタロプロテイナーゼ、コラゲナーゼ等）、セルロプラスミンプロモーター（Ｌｅｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００４年３月１日、６４；１７８８）、ＤＦ３／ＭＵＣ１などのムチン‐１プロモーター（米国特許第７，２４７，２９７号参照）、米国特許出願第２００１／００１１１１２８に記載のＨｅｘＩＩプロモーター；前立腺特異性抗原エンハンサー／プロモーター（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．，５７：２５５９〜２５６３，１９９７年）；α‐フェトプロテイン遺伝子プロモーター（Ｈａｌｌｅｎｂｅｃｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１０：１７２１〜１７３３、１９９９年）；界面活性タンパク質Ｂ遺伝子プロモーター（Ｄｏｒｏｎｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７５：３３１４〜３３２４、２００１年）；ＭＵＣ１プロモーター（Ｋｕｒｉｈａｒａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．、１０６：７６３〜７７１、２０００年）；米国特許第８，０３４，９１４号にあるＨ１９プロモーター；交付済の米国特許第７，８１６，１３１号、第６，８９７，０２４号、第７，３２１，０３０号、第７，３６４，７２７号等に記載のプロモーター；等、ならびにそれらの誘導体が挙げられるが限定されるものではない。癌細胞内のみの遺伝子発現の作動に特異的であるか、あるいは癌細胞または少なくとも（例えば前立腺癌、大腸癌、乳癌等の原発性および転移性癌を治療および画像診断をするための）癌の特定のタイプの細胞における遺伝子発現の作動に選択的であれば、いかなるプロモーターでも本発明の実行に使用し得る。「癌細胞における遺伝子発現の作動に特異的」とは、正常細胞、非癌性細胞内には無くて癌細胞、悪性細胞内のみに遺伝子が存在する場合にプロモーターが遺伝子に機能し得るように連結されて遺伝子の転写を促進するように機能することを意味する。「癌細胞内における遺伝子発現の作動に選択的」とは、非癌細胞内より癌細胞内に多く遺伝子が存在する場合にプロモーターが遺伝子に機能し得るように連結されて遺伝子の転写を促進するように機能することを意味する。例えば、非癌細胞内より癌細胞内に遺伝子が存在する場合、当業者に公知の標準的な遺伝子発現測定技術を利用して測定すると、プロモーターは少なくとも約２倍、約３、４、５、６、７、８、９または１０倍、それどころか約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００倍以上（例えば５００または１０００倍）の遺伝子の遺伝子発現を作動することが分かる。
【００２１】
１つの実施態様では、プロモーターはＰＥＧ‐ＰＲＯＭプロモーター（図１０Ａ、配列番号：１参照）またはその機能的誘導体である。このプロモーターは例えば本明細書に参照によって内容が完全に組み込まれている発行済の米国特許第６，７３７，５２３号に詳細に記述されている。好ましい実施態様では、「最小限」のＰＥＧ‐ＰＲＯＭプロモーターを使用し、すなわちＰＥＡ３タンパク質結合ヌクレオチド配列（図１０Ｃ、配列番号：１の１５０７〜１９７０のヌクレオチド）を含む最小限のプロモーター、ＴＡＴＡ配列（例えば図１０Ｄ、配列番号：１の１６７２〜１６７７のヌクレオチド）、およびＡＰ１タンパク質結合ヌクレオチド配列（図１０Ｅ、配列番号：１の１７４８〜１７５３のヌクレオチド）、例えば第６，７３７，５２３号に記載の図１０Ｂ（配列番号：２）に記述されている配列が挙げられる。使用にはＰＥＧ‐ＰＲＯＭプロモーターおよび最小限ＰＥＧ‐ＰＲＯＭプロモーター配列に相同性を示すヌクレオチド配列も包含されており、例えば、当技術分野で公知の標準的ヌクレオチド配列比較プログラムで測定すると少なくとも約５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の相同性を示す配列である。
【００２２】
ベクター
本明細書に記載された構築物を含むベクターも本発明の実施態様に包含され、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターの両方を含むものである。採用し得る非ウイルスベクターの例としては、例えば、コスミドまたはプラスミド；特に、大型核酸分子のクローニングには、細菌人工染色体ベクター（ＢＡＣ）および酵母人工染色体ベクター（ＹＡＣ）；ならびにリポソーム（標的リポソームを含む）；カチオン性ポリマー；リガンド共役リポプレックス；ポリマー‐ＤＮＡ複合体；ポリ‐Ｌ‐リジン‐モロシン（ｍｏｌｏｓｓｉｎ）‐ＤＮＡ複合体；キトサン‐ＤＮＡナノ粒子；ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、例えば分岐ＰＥＩ）‐ＤＮＡ複合体；多機能性ナノ粒子、金属ナノ粒子またはシェル（例えば正電荷の、負電荷の、または中性の金粒子、カドミウムセレン化物等）などの多様なナノ粒子および／またはナノシェル；超音波を介したマイクロバブル送達系；多様なデンドリマー（例えばポリフェニレンおよびポリ（アミドアミン）ベースのデンドリマー）；などが挙げられるが、限定されるものではない。
【００２３】
また、ウイルスベクターを使用してもよい。ウイルスベクターの例としては、バクテリオファージ、多様なバキュロウイルス、レトロウイルス等が挙げられるが、限定されるものではない。当業者は「遺伝子治療」用途で使用するウイルスベクターに精通しており、これには単純ヘルペスウイルスベクター（Ｇｅｌｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：１６６７〜１６６９（１９８８年））；ワクチニアウイルスベクター（Ｐｉｃｃｉｎｉ
ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５３：５４５〜５６３ （１９８７年））；サイトメガロウイルスベクター（Ｍｏｃａｒｓｋｉ ら、ｉｎ Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｙ．ＧｌｕｚｍａｎおよびＳ．Ｈ．Ｈｕｇｈｅｓ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．，
１９８８年、７８〜８４ページ）；モロニーマウス白血病ウイルスベクター（Ｄａｎｏｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ.．ＵＳＡ，８５：６４６０〜６４６４ (１９８８年）)；Ｂｌａｅｓｅ ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０：４７５〜４７９（１９９５年）；Ｏｎｏｄｅｒａ
ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２：１７６９〜１７７４（１９９８年））；アデノウイルスベクター（Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：６１６〜６２６（１９８８年）；Ｃｏｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：６０９４〜６０９８
（１９９２年）；Ｇｒａｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１０９〜１２７（１９９１年）；Ｌｉら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、４：４０３〜４０９（１９９３年）；Ｚａｂｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、６：７５〜８３（１９９４年））；アデノ随伴ウイルスベクター（Ｇｏｌｄｍａｎら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１０：２２６１〜２２６８（１９９７年）；Ｇｒｅｅｌｉｓｈら、Ｎａｔｕｒｅ
Ｍｅｄ．，５：４３９〜４４３（１９９９年）；Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６：３９０６〜３９１０（１９９９年）；Ｓｎｙｄｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，５：６４〜７０（１９９９年）；Ｈｅｒｚｏｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，５：５６〜６３（１９９９年））；レトロウイルスベクター（Ｄｏｎａｈｕｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，４：１８１〜１８６（１９９８年）；Ｓｈａｃｋｌｅｆｏｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：９６５５〜９６５９（１９８８年）；米国特許第４，４０５，７１２号、第４，６５０，７６４号および第５，２５２，４７９号、ならびにＷＩＰＯ公報ＷＯ９２／０７５７３，ＷＯ９０／０６９９７、ＷＯ８９／０５３４５、ＷＯ９２／０５２６６およびＷＯ９２／１４８２９）；およびレンチウイルスベクター（Ｋａｆｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１７：３１４〜３１７（１９９７年））、ならびに米国特許出願第２００９／０３１１６６４号に記載された腫瘍退縮ヘルペスウイルスＮＶ１０６６およびワクシニアウイルスＧＬＶ‐１ｈ６８などの癌細胞に条件付きで複製可能なウイルスが挙げられるが、限定されるものではない。特に、アデノウイルスベクターが使用され、例えば、公開されている米国特許出願第２００８／０２１３２２０号に記載のベクターなどの標的ウイルスベクターが挙げられる。
【００２４】
特定のベクターの選択はその正確な使用量に依存していることを当業者は認識している。通常、挿入突然変異のリスクがあることから、宿主細胞ゲノムと一体化するベクターを使用する者はおらず、ベクターの核酸配列内またはベクター間に組み換えが起こることを回避または最小限にするようにベクターを設計すべきである。
【００２５】
本発明の構築物およびベクターを含む宿主細胞も包含されており、例えば、保存に使用する培養細胞、あるいは細菌または昆虫細胞などのインビトロの細胞はベクター等を生成または操作する。組み換え技術または合成手段によって構築物およびベクターを生成してもよい。
【００２６】
画像診断
画像診断構築物およびベクター
いくつかの実施態様では、本発明は癌細胞および腫瘍の画像診断に使用するための遺伝子構築物を提供する。構築物には、画像診断技術を使用して直接検出できるか、あるいは画像診断技術を使用して検出できるシグナルを作成する方式で１種以上の付加的な分子と共に機能する少なくとも１種の転写可能要素が含まれる。前記転写可能要素は上述した癌選択性／特異性プロモーターに機能し得るように連結され、一般的に「リポーター」分子と呼ばれている。リポーター分子は、いくつかの方法のうち任意の方法で検出可能なシグナルを生成することができる：それ自体で検出可能な特性を有するタンパク質またはポリペプチドをコードすることもできる；第２物質と相互に作用し、その第２物質を検出可能にするタンパク質またはポリペプチドをコードすることもできる；検出可能物質を隔絶することによってその局所濃度を十分に増加させて周囲環境（例えば癌細胞）を検出可能に変えるタンパク質またはポリペプチドをコードすることもできる。リポーター遺伝子の遺伝子産物と、検出可能シグナルを生成する他の物質とが相互作用する場合、本明細書では前記他の物質をリポーター分子の「補体」と称する。
【００２７】
それ自体で検出可能な（直接に検出可能な）リポータータンパク質またはポリペプチドの例としては、例えばエネルギーの特定の波長または波長範囲に暴露したとき  検出可能な特性を表すものが挙げられる。検出可能なタンパク質のこのカテゴリーの例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ならびに青、シアンおよび黄色蛍光タンパク質などの突然変異体も含むその変異体；スペクトルの近赤外線領域で放出するように操作されたタンパク質；スペクトルの短波長、中波長、長波長および遠赤外線領域で放出するように操作されたタンパク質；等が挙げられるが限定されるものではない。このような検出可能タンパク質がヒトへの使用に適しているか否かは含まれる試薬の毒性または免疫原性に依存していることを当業者は認識している。しかし、この実施態様は例えば、動物、細胞培養液、組織培養液、多様なエクスビボ手技等を含む実験または調査の取り組みにおける用途を包含している。
【００２８】
リポータータンパク質の他のクラスには、補体分子と機能するものがある。この実施態様では、リポーター分子をコードする遺伝子を含む構築物を、画像診断を必要とする被験体に全身投与し、前記構築物投与の前に、またはその後に、または投与と共に、被験体にリポーターの補体である分子も全身投与する。構築物投与の前、またはその後に投与する場合、癌細胞内の各々の濃度を十分にする方法で、各構成要素が標的癌細胞を含む細胞内に分散できるようにその２種の投与を同時に行い、例えば典型的に約１時間以下で検出可能なシグナルを生成することも可能である。２種を「同時に」投与する場合、別々の組成物は同時にまたはほぼ同時（例えば約３０、２０、１５、１０または５分以下以内）に投与しても、あるいは、構築物および補体の両方を含む単一の組成物を投与してもよい。いかなる場合でも、癌細胞外ではリポーターと補体間とは相互作用することはない。何故なら、その転写が癌特異性／選択性プロモーターに制御されていることからリポーターは生成されず、よって他のいかなる場所にも存在しないからである。
【００２９】
この実施態様の一例としては酸化酵素ルシフェラーゼ、およびその補体がルシフェリンである多様な修飾形態が挙げられる。すなわち、ルシフェラーゼによるその補体ルシフェリンの酸化での触媒は検出可能な光量を容易に生成する。被験体に補体、ルシフェリンを投与しなければならないことから、この系は一般的にヒトに使用しないことが当業者に認識されている。しかし、この実施態様は、動物、ならびに細胞培養液、組織培養液および多様なエクスビボ手技を含む調査の取り組みにおける使用に適している。
【００３０】
このタイプのタンパク質の別の例としては、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、例えば単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）または他の起源由来のＴＫが挙げられる。ＴＫはＡＴＰから得たリン酸基のチミジンへの付加を触媒するホスホトランスフェラーゼ酵素（キナーゼ）であり、それによってチミジンが核酸、例えばＤＮＡに組み込まれるように活性化するものである。チミジンの多様な類似体もＴＫの基質として利用されており、チミジンまたはチミジン類似体の放射標識形態はリポータータンパク質ＴＫに相補的な分子として使用し得る。理論的な制約にとらわれなければ、いったんＴＫにリン酸化されると放射標識ヌクレオチドは、負電荷のリン酸基によって細胞内に保持されるか；あるいは例えば癌細胞内のＤＮＡに組み込まれ、癌細胞内に蓄積することが予想される。どちらにしても、検出が容易でバックグラウンドの放射活性と区別できるシグナルがもたらされる。また、画像診断時にＴＫに結合する基質は癌細胞内のシグナルを増やす。実際、基質に対してＫｍが非常に低い突然変異ＴＫは基質の捕捉効果を増加させる可能性がある。ヌクレオチドによって放出された放射活性は、本明細書に記載のとおり、様々な技術を使用して検出できるようになる。ＴＫを使用するこの態様は、この酵素の標識能を利用するものである；ＴＫの毒性能は下記で述べる。
【００３１】
様々なＴＫ酵素、あるいはその修飾形態または突然変異形態は本発明の実行に使用可能であり、ＨＳＶ１‐ＴＫ、ＨＳＶ１‐ｓｒ３９ＴＫ、様々な基質への親和性が増減する突然変異体、温度感受性ＴＫ突然変異体、コドン最適化ＴＫ、参照によって本明細書に組み込まれた米国特許第６，４５１，５７１号および米国特許出願第２０１１／０１３６２２１号に記載の突然変異体；多様かつ好適なヒトＴＫおよび突然変異ヒトＴＫ等が挙げられるが、限定されるものではない。
【００３２】
使用できる検出可能なＴＫ基質は：「ＦＩＡＵ」としても公知の「フィアルリジン」すなわち［１‐（２‐デオキシ‐２‐フルオロ‐１‐Ｄ‐アラビノフラノシル）‐５‐ヨードウラシル］およびその多様な形態、例えば２'‐フルオロ‐２'‐デオキシ‐β‐Ｄ‐５‐［１２５Ｉ］ヨードウラシル‐アラビノフラノシド（［１２５Ｉ］ＦＩＡＵ）、［１２４Ｉ］ＦＩＡＵなどのチミジン類似体；以下に記載のように細胞毒性を媒介する点で２重機能も有し得るＡｌ  Ｍａｈｏｕｄら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４年９月１日  ６４；６２８０）に記載の３位にｏ‐カルボラニルアルキル（ｃａｒｂｏｒａｎｙｌａｌｋｙｌ）基を含むチミジン類似体；９‐（４‐１８Ｆ‐フルオロ‐３‐［ヒドロキシメチル］ブチル）グアニン（１８Ｆ‐ＦＨＢＧ）などの（［ヒドロキシメチル］ブチル）グアニン（ＨＢＧ）誘導体；２'‐デオキシ‐２'‐［１８Ｆ］‐フルオロ‐１‐ベータ‐Ｄ‐アラビノフラノシル‐５‐ヨードウラシル（１８Ｆ‐ＦＥＡＵ）、２'‐デオキシ‐２'‐［１８Ｆ］フルオロ‐５‐メチル‐１‐β‐Ｌ‐アラビノフラノシルウラシルウラシル（１８Ｆ‐ＦＭＡＵ）、１‐（２'‐デオキシ‐２'‐フルオロ‐ベータ‐Ｄ‐アラビノフラノシル）‐５‐［１８Ｆ］ヨードウラシル（１８Ｆ‐ＦＩＡＵ）、２'‐デオキシ‐２'‐［１８Ｆ］‐フルオロ‐１‐ベータ‐Ｄ‐アラビノフラノシル‐５‐ヨードウラシル（１８Ｆ‐ＦＩＡＣ、例えばＣｈａｎら、Ｎｕｃｌｅａｒ  ＭｅｄｉｃｉｎｅおよびＢｉｏｌｏｇｙ  ３８（２０１１年）９８７〜９９５；およびＣａｉら、Ｎｕｃｌｅａｒ  ＭｅｄｉｃｉｎｅおよびＢｉｏｌｏｇｙ３８（２０１１年）６５９〜６６６参照）；Ｍｕｌｌｅｒら（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１１年、最新刊）によって述べられたＣ‐６アルキル化ピリミジン誘導体などの様々なアルキル化ピリミジン誘導体；等が挙げられるが、限定されるものではない。
【００３３】
他の例示的なリポーター分子は、多様なメカニズムの中の任意のメカニズムによって、検出可能に標識した補体を保持するか、あるいはそれの保持を誘発させることができる。例えば、リポーター分子は非常に強く補体と結合するため、癌細胞内で補体の局所濃度を増加させる；あるいは細胞内で補体が検出可能な純量で蓄積し難いか、または少なくともそれを十分に遅延させる細胞から補体を放出させるようにリポーター分子は補体を改変する；あるいは、補体または上述したＴＫの例の場合の検出可能なラベルを細胞内に含むその修飾形態を「捕捉」または固定する１つ以上の反応に寄与するに適したものとなるよう、リポーターは補体を変え得る。
【００３４】
このような系の一例は酵素‐基質複合体であり、ここではリポーターは通常、酵素であり、補体は通常、基質である。ただし；リポーターは「補体」として機能する酵素の基質であるポリペプチドまたはペプチドをコードする；という条件が常に必要である訳ではない。いくつかの実施態様では、基質は検出可能なラベル（例えば放射線、蛍光、リン光、比色、発光、または他のラベル）で標識され、癌細胞内で蓄積する。何故なら、例えば酵素との結合反応は不可逆的である（すなわち自殺基質である）ため、あるいは、癌細胞内で蓄積を検出可能にするに十分緩徐な速度で酵素からラベルが放出されるため、あるいは細胞から容易に離れないようにするか、または非常に緩徐に細胞から離れるように基質の特性を（例えば寸法の増加、電荷、疎水性または親水性等の変化により）酵素反応が変えるため；あるいは、酵素との相互作用または会合の結果として、基質が修飾され、その後それが細胞内で（検出可能なタグまたはラベルと共に）保持されるようにその後の反応に関与するため、等の理由が挙げられる。
【００３５】
本発明の実施におけるリポーター分子として機能し得る他のタンパク質は、細胞表面に存在するか、または膜貫通タンパク質であるトランスポーター分子であり、例えば細胞膜を通過し、細胞内に入るように多様なイオンを輸送するイオンポンプである。例示としてのイオンポンプは溶質担体ファミリー５のメンバー５（ＳＬＣ５Ａ５）としても公知であるナトリウム‐ヨウ化物共輸送体（ＮＩＳ）である。本来、このイオンポンプは、例えば側底膜を通過し、甲状腺上皮細胞に入るようにヨウ化物（Ｔ）を活性的に輸送する。本明細書に記載された構築物の配列にコードされるトランスポーターの組み換え形態は癌細胞に選択的に転写され、放射標識したヨウ化物が癌細胞に入るように輸送する。本発明の実行に使用し得るトランスポーターのこのファミリーの他の例では、ノルエピネフリントランスポーター（ＮＥＴ）；ドーパミン受容体；多様なエストロゲン受容体系）、膜固定エフリン‐Ａ（ＥＦＮＡ）および膜貫通タンパク質エフリン‐Ｂ（ＥＦＮＢ）などのエフリンタンパク質；上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；インスリン様増殖因子受容体（例えばＩＧＦ‐１、ＩＧＦ‐２）等）；ＴＧＦαなどの形質転換増殖因子（ＴＧＦ）受容体；等が挙げられるが、限定されるものではない。これらの場合、タンパク質、またはその機能的修飾形態は本発明のベクターで発現され、リガンド分子が患者に投与される。通常、リガンドは本明細書に記載されているように検出可能なラベルで標識するか、あるいはトランスポーターとの会合または相互作用で検出可能にする。いくつかの実施態様では、検出には第三の構成要素とリガンド、例えば金属イオンとの会合が必要になる場合がある。リガンドはタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドでもよい。
【００３６】
また抗体も本発明の実施に利用し得る。例えば、抗原であるか、あるいは特定の抗体が生成されているか、生成される可能性がある抗原エピトープから成るタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを発現するように本発明のベクターは設計されている。抗原の例としては、突然変異に起因する異常構造を有する腫瘍特異性タンパク質（癌原遺伝子、腫瘍抑制因子、ｒａｓおよびｐ５３遺伝子の異常生成物等）；非常に低量で正常に生成されるが腫瘍細胞では生成が劇的に増加するタンパク質などの多様な腫瘍関連抗原（例えばメラノーマ細胞で増加する酵素チロシナーゼ）；多様な腫瘍胎児抗原（例えばアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）および癌胎児性抗原（ＣＥＡ））；オンコウイルス、例えばＥＢＶおよびＨＰＶに感染した細胞によって生成された異常タンパク質；腫瘍細胞で異常構造を有する多様な細胞表面糖脂質および糖タンパク質；等が挙げられるが、限定されるものではない。モノクローナルまたはポリクローナルとなり得る抗体を検出可能なラベルで標識し、ベクターの後に、あるいはベクターと一緒に患者に投与する。抗体は癌細胞でのみ（少なくとも大部分）生成される発現した抗原またはエピトープと接触し、それと反応し、それによって癌細胞を標識する。逆に、抗体は本発明のベクターでも生成可能であり、標識した抗原を患者に投与してもよい。この実施態様では、抗体またはそのフラグメント、例えばＦａｂ（フラグメント、抗原結合性）セグメント、あるいは当業者に公知である他のものを使用している。この実施態様では、抗原または抗原含有物質、あるいは当該抗体が特異性を示すエピトープを標識し、画像診断する被験体に投与する。
【００３７】
このような系の他の例としては、画像診断可能なリガンドに結合するリポータータンパク質／ポリペプチドなどの多様なリガンド結合系が挙げられ、それらの例としては、検出可能なシグナルを有する金属と結合またはキレートするタンパク質（例えば金属酵素）；ＯｒｄａｎｏｖａおよびＡｈｒｎｅｓ（ＮｅｕｒｏＩｍａｇｅ、２０１１年、最新刊）に記載されているようなフェリチンをベースとした鉄貯蔵タンパク質；等が挙げられるが、限定されるものではない。リポーターまたは補体が癌プロモーターの制御下で転写可能であり、そして他方の結合パートナーが検出可能であるか、検出可能に標識され、被験体に投与可能であり、癌細胞に拡散可能であれば、リポーターおよび補体のこのような系は本発明の実行に使用可能である。このような系には、例えばヒト被験体への使用に適したものもあるが、例えば毒性があるために適していないものもあることを当業者は認識している。しかし、後者のカテゴリーの系は実験室での使用に好適である場合もある。
【００３８】
さらに他の実施態様では、本発明のベクター内の癌特異性または癌選択性プロモーターは、循環内に通常見られない分泌タンパク質の発現を作動する。この実施態様では、タンパク質の存在は、血清や尿中の高い感受性を利用した標準的（市販物も含む）方法によって検出し得る。すなわち、検出される癌細胞は体液中で検出される。
【００３９】
さらに他の実施態様では、本発明のベクター内の癌特異性または癌選択性プロモーターは細胞表面上に発現するタンパク質または抗原の転写を作動し、その後これを適当な検出可能抗体または他の親和性試薬でタグをつけることが可能となる。選択および細胞表面発現の候補タンパク質には、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβ‐サブユニット（βｈＣＧ）；ヒトα‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）、およびストレプトアビジン（ＳＡ）が挙げられるが、限定されるものではない。
【００４０】
βｈＣＧは妊婦で発現し、妊娠初期に黄体の維持を向上させるものである。妊娠していない健常な女性および男性のβｈＣＧレベルは０〜５ｍＩＵ／ｍＬである。ｈＣＧは血清および尿中に分泌されるもので、ｈＣＧのα‐サブユニットは他のホルモンにも含まれることからβｈＣＧは妊娠試験に用いられてきた。尿βｈＣＧは家庭、診療所、研究室でクロマトグラフ免疫アッセイ（すなわち妊娠試験紙、検出閾値は２０〜１００ｍＩＵ／ｍＬである）によって容易に検出可能である。より定量的な検出を行うために、２〜４ｍＬの静脈血を使用して化学発光または蛍光免疫アッセイによって血清レベルを測定することが可能である。βｈＣＧはサルの細胞で発現すると培地中に分泌されることが分かっている。ヒトＡＦＰは、胎児成長期、および特定のタイプの癌の成人でのみ発現する腫瘍胎児抗原である。成人におけるＡＦＰは肝細胞癌、精巣腫瘍および転移肝臓癌で見られる。ＡＦＰは、定量的測定ではクロマトグラフ免疫アッセイおよび酵素免疫アッセイよって血清、血漿または全血で検出できる。
【００４１】
本発明の実施において、細胞表面標的としてストレパヴァジン（ｓｔｒｅｐａｖａｄｉｎ）（ＳＡ）も使用することが可能である。ＳＡとビオチンとの親和性が非常に高くなると、画像診断および治療用として高効率かつ強力な標的がもたらされる。癌細胞の細胞膜にＳＡを送るために、ＳＡは、ヒトＣＤ１４のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定シグナルと融合させることができる。ＧＰＩアンカータンパク質は回収エンドソームに形質膜陥入させることが可能であるため、ＳＡのＧＰＩ固定は治療用途に好適である。細胞表面に発現するとＳＡはその後、毒性または放射能毒性の弾頭を含むアビジン複合体で固定することができる。リシン、アブリン、緑膿菌外毒素（ＰＥ３７、ＰＥ３８およびＰＥ４０などのＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、サポリン、レストリクトシン、コレラ毒素、ゲロニン、赤痢菌毒素およびヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質などの毒性タンパク質および毒液；百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）アデニル酸シクラーゼ毒素またはその修飾毒素；あるいは細胞増殖を直接または間接的に阻害するか、細胞を死滅させる他の毒性薬剤は以下のものと連結し得る：アビジン；ドキソルビシンまたは
タキソールなどの毒性にもなり得る低分子量種、あるいは１２５Ｉ、
１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、２２５Ａｃ、２１３Ｂｉ および９０Ｙなどの放射性核種；サリドマイド、アンジオスタチン、アンチセンス分子、
ＣＯＸ‐２阻害剤、インテグリンアンタゴニスト、エンドスタチン、トロンボスポンジン‐１およびインターフェロンαなどの血管新生阻害剤、ビタキシン、セレコキシブ、ロフェコキシブ；ならびにピリミジン類似体（５‐フルオロウラシル、フロキシウリジン、カペシタビン、ゲムシタビンおよびシタラビン）およびプリン類似体、葉酸アンタゴニストおよび関連する阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチンおよび２‐クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））などの化学療法剤；ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビン）などの天然物、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポシロンおよびナベルビンなどの微小管撹乱物質、エピジポドフィロトキシン（エトポシド、テニポシド）、ＤＮＡ損傷剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトセシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メルクロレフタミン（ｍｅｒｃｈｌｏｒｅｈｔａｍｉｎｅ）、マイトマイシン、マイトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびエトポシド（ＶＰ１６））といった抗増殖／抗有糸分裂剤；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、マイトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびマイトマイシンなどの抗生物質；酵素（Ｌ‐アスパラギンを全身で代謝し、自身のアスパラギンを合成する能力を持たない細胞を喪失させるＬ‐アスパラギナーゼ）；抗血小板剤；窒素マスタード
（メクロールエサミン、シクロフォスファミドおよび類似体、メルファラン、クロラムブシル）、
エチレンイミンおよび
メチルメラミン（ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）などの抗増殖／抗有糸分裂アルキル化剤、スルホン酸アルキル‐ブスルファン、ニトロソウレア（カルムスチン（ＢＣＮＵ）および類似体、ストレプトゾシン）、トラゼン‐ダカルバジニン（ＤＴＩＣ）；葉酸類似体（メトトレキサート)などの抗増殖／抗有糸分裂代謝拮抗薬；白金配位複合体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモン類似体（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）およびアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝固剤（ヘパリン、合成ヘパリン塩および他のトロンビンの阻害剤）；線維素溶解薬（組織プラスミノゲン活性化因子、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼなど）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走剤；抗分泌剤（ブレベルジン（ｂｒｅｖｅｌｄｉｎ））；免疫抑制薬（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ‐５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；抗血管新生化合物（ＴＮＰ‐４７０、ゲニステイン）および成長因子阻害剤（血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）阻害剤）；アンジオテンシン受容体遮断薬；一酸化窒素供与体；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ、リツキシマブ）； 細胞周期阻害剤および分化誘導因子 （トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド（ｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イリノテカン（ＣＰＴ‐１１）およびミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルペドニゾロン（ｍｅｔｈｙｌｐｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、プレドニゾンおよびプレニゾロン（ｐｒｅｎｉｓｏｌｏｎｅ））；成長因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能障害誘導因子；カスパーゼ活性化因子；ならびに特にナノ粒子と共役し得るクロマチン撹乱物質。
【００４２】
画像化シグナルの検出
本発明の画像診断の実施態様で使用する系の検出可能な成分（通常、補体または基質）は、例示として上述している多様な検出可能ラベルの中の任意のラベルで標識することができる。また、特に有用な検出可能ラベルは高感度で、非侵襲的に検出できるラベルであり、同位体１２４Ｉ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、１８Ｆ、８６Ｙ、１１Ｃ、１２５Ｉ、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、２０１Ｔｌ、７６Ｂｒ、７５Ｂｒ、１１１Ｉｎ、８２Ｒｂ、１３Ｎ等が挙げられる。
【００４３】
本発明の実行には使用し得る多くの多様な検出技術が存在すること、ならびに１つの特定の技術の取捨選択は通常、生成されるシグナルのタイプ、および例えば人体、実験動物、細胞または組織内培養液、エクスビボ等でシグナルを検出する媒体に依存していることは当業者に認識されている。例えば、生物発光画像法（ＢＬＩ）；蛍光画像法
；磁気共鳴画像法［ＭＲＩ、例えば、Ｇｉｌａｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５、２（２００７年）に記載の高リジンタンパク質（ＬＲｐ）；またはクレアチンキナーゼ、チロシナーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、トランスフェリンやフェリチンなどの鉄ベースのリポーター遺伝子、およびＭａｇＡ；低濃度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ；ポリ‐Ｌ‐リジン、ポリ‐Ｌ‐アルギニンおよびポリ‐Ｌ‐トレオニンなどのポリペプチド；および例えば
Ｇｉｌａｄら、Ｊ. Ｎｕｃｌ. Ｍｅｄ．２００８年；４９（１２）：１９０５〜１９０８に記載の他のポリペプチド）を使用］；コンピューター断層撮影法（ＣＴ）；ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）；シングルフォトン放出コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）；ホウ素中性子捕捉法；金属類には：金属を画像化するためのシンクロトロンＸ線蛍光（ＳＸＲＦ）顕微鏡法、二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ）、およびレーザーアブレーション誘導結合プラズマ質量分析法（ＬＡ‐ＩＣＰ‐ＭＳ）；光熱イメージング（例えば磁気プラズモニクスナノ粒子）等。
【００４４】
療法
標的癌療法は、本明細書に記載の構築物、ベクター等を、それを必要とする患者に投与して行う。この実施態様では、治療分子、例えば癌細胞を害するタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は本明細書の「治療構築物」または「治療ベクター」で記載した癌特異性プロモーターに機能し得るように連結される。治療用タンパク質は癌細胞を死滅させ（例えばアポトーシスを開始または誘起する）、あるいはその成長速度を遅延させ（例えば増殖速度を遅延させる）、あるいは、その増殖および成長を停止させるか、そうでなければいくつかの様式で癌細胞を損傷し、あるいはさらに他の抗癌剤に対して癌細胞の感受性をより高くすること等ができる。
【００４５】
本発明で使用し得る治療用分子をコードする遺伝子は、多様な酵素をコードする遺伝子を含む自殺遺伝子；癌遺伝子；腫瘍抑制遺伝子；毒素；サイトカイン；オンコスタチン；ＴＲＡＩＬ等を含むが、限定されるものではない。例示として酵素には例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）およびその多様な誘導体；ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、キサンチン‐グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）；シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）；ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）；等が挙げられる。例示として腫瘍抑制遺伝子には、ｎｅｕ、ＥＧＦ、ｒａｓ（Ｈ、ＫおよびＮ  ｒａｓを含む）、ｐ５３、網膜芽細胞腫抑制因子遺伝子（Ｒｂ）、ウィルムス腫瘍遺伝子産物、リン酸化チロシンホスファターゼ（ＰＴＰアーゼ）、ＡｄＥ１Ａおよびｎｍ２３が挙げられる。好適な毒素には、緑膿菌外毒素ＡおよびＳ；ジフテリア毒素（ＤＴ）；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ毒素、志賀毒素、志賀様毒素（ＳＬＴ‐１、２）、リシン、アブリン、スポリン（ｓｕｐｐｏｒｉｎ）、ゲロニン等が挙げられる。好適なサイトカインには、インターロイキン１（ＩＬ‐１）、ＩＬ‐２、ＩＬ‐３、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、ＩＬ‐８、ＩＬ‐９、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐１１、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１３、ＩＬ‐１４、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐１８、β‐インターフェロン、α‐インターフェロン、γ‐インターフェロン、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、ＧＭ‐ＣＳＦ、Ｇ‐ＣＳＦ、ＭＥＴＨ１、ＭＥＴＨ２、腫瘍壊死因子、ＴＧＦβ、ＬＴおよびこれらの組み合わせなどのインターフェロンおよびインターロイキンが挙げられる。他の抗腫瘍薬には：ＧＭ‐ＣＳＦインターロイキン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；インターフェロン‐ベータおよびウイルス誘導ヒトＭｘタンパク質；ＴＮＦアルファおよびＴＮＦベータ；インターロイキン‐２４（ＩＬ‐２４）としても公知のヒトメラノーマ分化関連遺伝子‐７（ｍｄａ‐７）、Ｍ４などのｍｄａ‐７／ＩＬ‐２４の多様な切断型；重要な増殖調節を標的にするｓｉＲＮＡおよび
ｓｈＲＮＡあるいは癌細胞に必要であるか、または癌細胞内で過剰発現する癌遺伝子；癌細胞攻撃に特異的であるか、または選択的である抗体などの抗体；等が挙げられる。
【００４６】
治療薬がＴＫ（例えばウイルスＴＫ）である場合、アシクロビル；ガンシクロビル；多様なチミジン類似体（例えば３位にｏ‐カルボラニルアルキル基を含むもの［Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４年９月１日  ６４；６２８０］）などのＴＫ基質を被験体に投与する。これらの薬剤はプロドラッグとして作用し、これは自身では毒性はないが、ウイルスＴＫによるリン酸化を介して毒性薬剤に変化する。宿主癌細胞に毒性をもつようにＴＫ遺伝子と基質との両方を同時に使用しなければならない。
【００４７】
画像診断プラス治療
いくつかの実施態様では、本発明は癌治療プロトコールを提供するもので、ここでは癌細胞および腫瘍の画像診断は疾患の治療、すなわち癌細胞の死滅、破壊、その増殖の遅延、細胞分裂（複製）能力の減弱化、またはその他の方法による損傷と併用する。本明細書ではこれらのプロトコールを「セラノスティックス」または「併用療法」または「併用プロトコール」、あるいは類似の用語および語句で表わしてもよい。
【００４８】
いくつかの実施態様では、併用治療には、リポーター遺伝子（画像診断用）と少なくとも１つの関心対象の治療遺伝子（疾患治療用）との両方を単一の構築物に含む遺伝子構築物（例えばプラスミド）を癌患者に投与する工程が含まれる。この実施態様では、リポーター遺伝子または治療遺伝子のいずれか、あるいは好ましくはそれら両方の発現は本明細書に記載の癌細胞特異性または選択性プロモーターに媒介される。好ましくは、構築物内の乗り換えおよび組み換えのきっかけを防止または低減するために、この実施態様では２種の異なるプロモーターを使用する。あるいは、タンデム翻訳機序を採用することも可能であり、例えば１種以上の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の前記構築物への挿入が挙げられ、これは単一のｍＲＮＡから複数のｍＲＮＡ転写産物を翻訳することを可能にする。この様式では、リポータータンパク質／ポリペプチドと、癌細胞に致死的または有毒であるタンパク質／ポリペプチドとの両方を、標的癌細胞内で選択的または特異的に生成する。
【００４９】
あるいは、本発明の構築物（例えばプラスミド）にコードされたポリペプチドは、関心対象の２種以上のポリペプチド（例えばリポーターや毒性薬剤）から成る近接した配列と共に、癌細胞内で切断可能な介在配列、例えば細胞内プロテアーゼに酵素切断されるか、または非酵素的な加水分解切断機序に感受性のある配列とを含むように遺伝子操作することもできる。この場合、介在配列を切断すると、機能的ポリペプチド、すなわち意図する機能を実行し得るポリペプチドが生成され、例えばそのポリペプチドは、当業者に公知の標準的技術を使用して測定した時に、ポリペプチドが作られるか、またはポリペプチドが誘導されるタンパク質配列と比較して、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または１００％活性的（できればそれ以上）であるポリペプチドである。
【００５０】
画像診断と療法を組み合わせた他の実施態様では、２種の異なるベクターを投与することも可能であり、その１種は本明細書に記載の「画像診断ベクターまたは構築物」であり、他方は本明細書に記載の「治療ベクターまたは構築物」である。
【００５１】
画像診断と療法を組み合わせた他の実施態様では、ウイルスに固有の特性から、複数のｍＲＮＡおよび／またはそれらがコードするポリペプチドもしくはタンパク質を転写および／または翻訳することができるウイルスベクターのゲノムに、関心対象の遺伝子をコードさせる。この実施態様ではこのようなウイルスベクターは、１種以上の癌特異性プロモーターの基本的な制御下で関心対象の遺伝子（例えばリポーター遺伝子および治療遺伝子）を含んで発現するように遺伝子操作する。
【００５２】
組成物
本発明は、本明細書に記載の１種以上のベクターまたは構築物および薬理学的に好適な担体を含む組成物を提供する。前記組成物は通常、全身に投与する。このような組成物の製剤は当業者に公知である。通常、投与に先だって組成物は溶液または懸濁液として、あるいは溶液や懸濁液への溶解に適した固形として調製する。前記製剤は乳化させてもよい。薬理的に許容可能であり、活性成分と適合する賦形剤と活性成分とを混合してもよい。好適な賦形剤としては、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、あるいはこれらの組み合わせが挙げられる。また、前記組成物は湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤等の補助物質を少量含むこともある。組成物を経口で投与する必要がある場合、様々な増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤、結合剤等を添加してもよい。投与に適した形態で組成物を提供するために、本発明の組成物は当技術分野で公知の１種以上の任意の成分を含んでもよい。前記製剤中のベクターの最終量は多様に変えてもよい。しかし一般的に、製剤の量は約１〜９９％である。
【００５３】
投与
本発明のベクター組成物（製剤）は通常、全身に投与するが、常に全身投与のケースである必要はなく、局所投与（例えば腫瘍内、または膣、鼻咽頭領域、口などの外口内；あるいは胸腔、頭蓋腔、腹腔、脊椎腔等の内部空洞内）も例外ではない。ベクターを全身に分布させるために、好ましい投与経路には、静脈内、注射、経皮、吸入または経鼻、あるいはカチオン性ポリマーベースの賦形剤（例えばｖｉｖｏ‐ｊｅｔＰＥＩ（商標））の注射または静脈内投与が挙げられるが、限定されるものではない。リポソーム送達は標的部分と組み合わせると送達が促進される。画像診断薬剤およびセラノスティック薬剤（Ｄａｓｈら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１１年５月２４日；１０８（２１）：８７８５〜９０．Ｅｐｕｂ  ２０１１年５月９日）；ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ‐ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ（Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１１年５月；３２（１５）：３７９４〜８０６）；および他（Ｄａｓｈ
ら、Ｄｉｓｃｏｖ  Ｍｅｄ．２０１１年１月；１１（５６）：４６〜５６．概説）；等を送達するために、微小気泡超音波破壊砕（ＵＴＭＤ）技術を利用することもできる。当業者に公知であり、使用する構築物のタイプに適していればいかなる方法でも利用できる。また、様々なＰｔ薬などの化学療法剤、免疫系を増強する物質、抗生剤等の当技術分野で公知の他の治療法；あるいは他の検出法および画像診断法（例えばマンモグラム、Ｘ線、Ｐａｐスメア、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）試験等と併用して改善または綿密にした画像診断を確認または提供する）と併用して組成物を投与してもよい。
【００５４】
投与する構築物またはベクターの量は患者間で異なり、また同じ患者でも投与形態間で異なり、これは限定するものではないが体重、年齢、性別、健康状態全般、治療する特定の疾患ならびに他の要素などの多様な要素に依存しており、投与の量および回数は医師などの医療専門家に設定してもらうことが最善であることは当業者に認識されている。通常、最適あるいは効果的な腫瘍阻害量または腫瘍死滅量は、例えば動物実験期間中および標準臨床試験期間中に確立される。Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｒｅｐ  １９６６年；５０（４）：２１９〜２４４）に記載されているように、通常、例えば体表面積でなされるマウスからヒトへの用量の変更について当業者は熟知している；ウェブサイトｄｔｐ，ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖから抜粋した下記の表１および２を参照されたい。
【００５５】
【表１】
2014504149.tif 000002
例えば、マウスに５０ｍｇ／ｋｇの用量を与えると、サルへの適切な用量は５０ｍｇ／ｋｇ×１／４＝１３ｍｇ／ｋｇとなり；または約１．２ｍｇ／ｋｇの用量のときは、ヒトでは約０．１ｍｇ／ｋｇとなる。
【００５６】
【表２】
2014504149.tif 000003
用量を等価のｍｇ／ｓｑ．ｍ．用量として表すために、用量と適切な係数とを乗じる。
ヒト成人で１００ｍｇ／ｋｇでは、１００ｍｇ／ｋｇ×３７ｋｇ／ｓｑ．ｍ．＝３７００ｍｇ／ｓｑ．ｍ．に等しい。
【００５７】
一般的に、治療方法では、プラスミドなどのベクターの量は約０．０１〜約５ｍｇ／ｋｇまたは約０．０５〜約１ｍｇ／ｋｇ（例えば約０．１ｍｇ／ｋｇ）であり、ウイルス系ベクターでは約１０５〜約１０２０感染単位（ＩＵ）または約１０８〜約１０１３ＩＵの範囲である。一般的に、画像診断方法では、例えばプラスミドのベクターの量は約０．０１〜約５ｍｇ／ｋｇまたは約０．０５〜約１ｍｇ／ｋｇ（例えば約０．１ｍｇ／ｋｇ）であり、ウイルス系ベクターでは約１０５〜約１０２０感染単位（ＩＵ）または約１０８〜約１０１３ＩＵの範囲である。画像診断と治療の併用では、ベクターの量は上述の範囲にある。適切な検出に必要な画像診断用シグナルのレベルを計算または決定することに当業者は精通している。例えば［１２４］ＦＩＡＵなどの放射性医薬品では、約１ｍＣｉ〜約１０ｍＣｉ、通常約５ｍＣｉ（すなわち約１ｍｇの材料）位の注入で一般的に十分である。
【００５８】
さらに、例えば、治療ベクタープラス画像診断ベクター、または２種（以上）の異なる治療ベクター（例えば、各々は治療成績を最適化または向上させるため、異なる作用機序を有する）、または２種以上の異なる画像診断ベクター等、１種のベクターまたは複数種のベクターを単回で投与することも可能である。
【００５９】
通常、癌治療には組成物の投与を繰り返すことが必要である。例えば、投与は毎日、または数日おきに（例えば２、３、４、５または６日毎）、または１週間、２週間または３、４週間毎に、または１カ月毎に、またはこれらを組み合わせて、またはこれらのパターンを改変して行うことも可能である。患者の適切な治療に適合するように、例えば治療の１「ラウンド」（例えば、週１回の投与を１カ月間）の後、非投与期間を１カ月間、その後、第２ラウンドとして週１回の投与を１カ月間行うなど、任意の好適な期間周期で行ってよい。
【００６０】
例えば特定の遺伝子突然変異の存在、家族歴、発癌物質への暴露、癌の既往歴、高齢等に起因する癌の成長リスクが被験体にあることが分かっているか、またはその疑いがあるとき特に、画像診断法を定期的に行ってもよい。例えば、１年に１回、半年に１回、２年に１回、または他の周期で検査することは、このような個人にとって賢明なことであると思われる。あるいは、危険因子が無い個人は疾患を防止するため、習慣的な健康管理の一環として単に検査されることを望んでいる。
【００６１】
治療と画像診断との両方を包含する本発明の実施態様では、投与プロトコールは患者の利益に最も係る事柄である。例えば最初に、被験体が実際に癌を有するか否かを判定するために、あるいは既に癌であると診断された患者における癌細胞の位置を特定するために、画像診断ベクターを単独で投与する場合もある。注目すべきは、本発明は非常に特異性があるため癌細胞の質量が非常に小さくても本方法で可視化可能になることである。癌が実際に示されると、疾患の治療に必要な治療ベクターを含む組成物がその後投与される。通常、上述のように複数回の投与が必要であり、これらのうち少なくとも１回、通常はそれ以上、場合によっては全ての回において、少なくとも１種の画像診断ベクターと少なくとも１種の治療ベクターとを共に投与、あるいは場合により両方の能力を有する単独ベクターを投与する。治療と画像診断とを交互に行えること、または両方を同時に行えることは癌治療分野にとって明らかに朗報である。この方法によって、医療従事者は厳重な管理状態で治療の進行をモニタリングし、患者の利益に必要な治療を調整および／または改変することが可能になる。例えば、治療ベクターと画像診断ベクターの投与を交互に行ってもよい；あるいは、治療の初期段階で、初めに画像診断ベクターを投与し、その後、腫瘍が視認されなくなるまで治療ベクターおよび画像診断ベクターを共に投与し、その後、再発性または潜在的疾病を予防または検出するに必要と思われる期間、画像診断ベクターを単独で投与する。
【００６２】
本発明の組成物を投与する被験体または患者は通常、哺乳動物であり、ほとんどがヒトであるが、常にこのようなケースである必要はない。獣医学における用途も期待される。
【００６３】
治療し得る癌の種類
本発明の構築物および方法はどのような種類の癌にも特異的であるという訳ではない。「癌」については、本発明では制御不能に細胞分裂して増殖し、悪性腫瘍を形成し、隣接する人体の一部に侵入する悪性新生物を意味している。癌はまた、リンパ系または血流を経て、身体の遠位部に拡大または転移する可能性もある。本発明の構築物および方法は、限定するものではないが、骨肉腫、卵巣癌、乳癌、メラノーマ、肝臓癌、肺癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、造血細胞、前立腺癌、子宮頸癌、網膜芽細胞腫、食道癌、膀胱癌、神経芽細胞腫、腎臓癌、胃癌、膵臓癌等のうちの任意の種類の癌、腫瘍、新生物または腫瘍細胞を画像診断、診断、治療、モニタリング等するために使用し得るものである。
【００６４】
また、本発明は近接する組織に侵入しないこと、または転移しないことが一般的に認識されている良性の腫瘍、例えば母斑、子宮筋腫等の画像診断および治療にも適用することが可能である。
【００６５】
トランスジェニック動物
本発明はまた、ＰＥＧ‐ＰＲＯＭプロモーターに機能し得るように連結されたリポーター遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含有するように遺伝子操作されたトランスジェニック非ヒト動物、および治療を臨床評価するためのその使用を包含している。トランスジェニック動物では、前記ヌクレオチド配列は安定的に動物のゲノムと一体化する。健常動物では、前記プロモーターは非活性的であり、前記リポーター遺伝子は発現しない。しかしこのような動物が癌を発症すれば、前記プロモーターが誘導または活性化され、前記リポーター遺伝子が発現する。前記動物にリポーターの補体を投与すると、癌細胞の増殖、位置および運命が詳細にモニタリングできる。このような動物は実験目的、例えば物質の発癌性試験、化学的予防戦略の評価および治療のモニタリングに使用することもできる。動物を強力な発癌物質に暴露させ、補体を投与し、その後モニタリングして潜在的発癌物質の影響を観察する。同様に、候補の抗癌剤の効果を動物において、癌誘導を試みる前に、または癌が確立された後に候補薬を投与することで、試験またはスクリーニングし、薬剤の有効性を追跡および測定することも可能である。当業者は、例えば腫瘍の位置、段階、寸法、体積、外観、頻度、期間等をモニタリングする工程を含む候補薬の有効性評価法に精通している。
【００６６】
他の実施態様では、本発明におけるＰＥＧ‐ＰＲＯＭ動物が癌増殖傾向を持つようにさらに遺伝子改変する。これは例えば、当該動物と、すでに癌増殖傾向にある動物（例えば多様な癌のモデル系として使えるように選択または遺伝子操作された多数のマウスからの任意の１匹）とを異種交配させて行われる。あるいは、これはＰＥＧ‐ＰＲＯＭ動物において所望の遺伝子突然変異（癌発症に関連する突然変異）を誘導するか、または癌を発症する傾向を持つように動物をさらに遺伝子操作することで達成され得る。
【００６７】
高発癌動物の例示的な種類としては、乳癌（例えばマウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）‐ｎｅｕトランスジェニックマウスなどのマウス）；前立腺癌（例えばＨｉ‐Ｍｙｃ、ＴＲＡＭＰ等のマウス）などの癌に感受性を有する（またはそれらの癌を必ず発症する）動物；前立腺癌および乳癌のＣ３（１）／ＳＶ４０Ｔ抗原トランスジェニックマウスモデル；ならびにメラノーマ、脳腫瘍、結腸直腸癌および大腸癌等のモデルである動物であればいかなるものも含まれる。このようなマウスは例えばＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ社（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、メイン州）から購入可能である。
【００６８】
このような様式で遺伝子改変された動物には、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ブタ、ニワトリ、ヤギ、マーモセットなどの霊長類等が挙げられるが、限定されるものではない。当業者は研究用動物を遺伝子操作および／または異種交配および選択する方法に精通している。
【実施例１】
【００６９】
実施例１．進行増強遺伝子‐３プロモーター作動型遺伝子発現による腫瘍特異的画像診断
要約
分子遺伝学的画像診断は患者の管理を支援する価値ある前臨床ツールから発達してきた。その戦略には、遺伝子発現、タンパク質相互作用の測定、あるいはインビボでの遺伝子タグ付き細胞の追跡に使用可能な系内で画像診断リポーター遺伝子と相補的画像診断薬とを合わせる工程も含まれる。組織特異性プロモーターを使用して、特に適当な増殖機構と連結した場合の特定の組織内での遺伝子発現を詳細に説明することができる。ここでは、悪性表現型を媒介する齧歯類遺伝子由来の進行増強遺伝子‐３プロモーター（ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ）を使用して、生物発光および放射性核種をベースとした分子画像診断技術によってヒトメラノーマおよび乳癌のネズミ科モデルにおける微小転移疾患の検出を選択的に可能にするように画像診断リポーターを作動させ得ることを示す。強力なプロモーター、腫瘍特異性および臨床応用能力を有することから、ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ作動型遺伝子発現は癌画像診断ならびに治療と併用する画像診断を容易にする実用的かつ新規な系である。
【００７０】
緒言
サブトラクションハイブリダイゼーション（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を利用して、悪性転換および腫瘍進行との関連性について進行増強遺伝子‐３（ＰＥＧ‐３）、齧歯類遺伝子の最小限のプロモーター領域を事前に同定した８。ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍは腫瘍特異的な様式で下流の遺伝子発現を作動するものであり、脳、前立腺、胸部および膵臓などの多様な組織の癌細胞株９〜１１、ならびに転移性メラノーマ１２で試験してきた。転写因子ＡＰ‐１およびＥ１ＡＦ／ＰＥＡ３（ＥＴＳ‐１）はＰＥＧ‐Ｐｒｏｍの癌特異的活性を媒介することが知られている８、９、１３。先行の研究は腫瘍内送達を経て癌遺伝子療法に対するＰＥＧ‐Ｐｒｏｍの有用性を説明している９〜１２、１４。ここでは、ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍの全身送達によって多様な転移癌を画像診断するための新規な方法を述べる。実験に基づいて、異なる組織起源またはサブタイプの腫瘍に広く応用できる様式において、原発腫瘍内のみならず関連の転移部位でも、ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ作動型画像診断構築物の全身送達はリポーター遺伝子の腫瘍特異的発現を可能にすることが分かる。
【００７１】
方法
実験手順および結果に関するその他の詳細は、「図面の簡単な説明」にしたがって上記から分かる。
【００７２】
プラスミド
ｐＰＥＧ‐Ｌｕｃを先行文献で記載のとおり構築した９。ｐＰＥＧ‐Ｌｕｃ内のＬｕｃコード遺伝子をｐＯＲＦ‐ＨＳＶ１ｔｋプラスミド（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）から得たＨＳＶ１‐ｔｋコード配列と置き換え、ｐＰＥＧ‐ＨＳＶ１ｔｋを生成した。ｐＤＮＡをＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）で調製し、ＤＮＡペレットを、エンドトキシンを含まない水（Ｌｏｎｚａ社）に溶解した。ＴｏｘｉｎＳｅｎｓｏｒ  Ｇｅｌ  Ｃｌｏｔ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）を使用してエンドトキシンの濃度をエンドトキシン単位（ＥＵ）／ｍｇ  ｐＤＮＡとして確実に＜２．５にした。
【００７３】
全身ＤＮＡ送達
低分子量の１‐ＰＥＩベースのカチオン性ポリマーであるｉｎ  ｖｉｖｏ‐ｊｅｔＰＥＩ（商標）（ｐｏｌｙｐｌｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ社）によって遺伝子送達賦形剤がもたらされた。メーカー説明書にしたがってＤＮＡポリプレックスを形成した。３０μｇのｐＤＮＡと３．６μｌの１５０ｍＭ  ｉｎ  ｖｉｖｏ‐ｊｅｔＰＥＩ（商標）とを別々に、エンドトキシンを含まない５％グルコースに希釈し、その後それらを混合し、Ｎ：Ｐ比を６：１、総量では４００μｌにした。該ＤＮＡ‐ポリマー混合物を室温で１５分間インキュベートし、４００μｌを２回の２００μｌ注射に分けて５分以内の間隔をあけ、動物の側尾に静脈注射した。
【００７４】
実験的転移モデルの生成
動物試験は「ジョンズ・ホプキンス動物管理および使用委員会（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ
Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｅｅ）」の規則および基準にしたがって行った。ＢＬＩ試験ではヒトメラノーマ（Ｍｅｌ）および乳癌（ＢＣａ）の実験転移モデルを使用した。５〜６週齢の雌ＮＣＲｎｕ／ｎｕマウス（ＮＣＩ‐Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ社）に全身照射し（５Ｇｙ）、ヌードマウス内に残存した免疫系を確実に抑制した。照射後２４時間以内に、動物らを無作為に３群に分けた。１群に５×１０６個のヒト悪性メラノーマ細胞株ＭｅＷｏ（ＡＴＣＣ）を静脈内（ＩＶ）注射し、Ｍｅｌを生成した。別のマウス群に２×１０６個のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１をＩＶ注射し、ＢＣａにした。残りの群はコントロールとして無処置にした。細胞注入から４〜７週後、両モデルで肺に転移性結節の形成がＣＴによって確認された。ＳＰＥＣＴ‐ＣＴ試験では、全身照射を省略した以外は、上記と同様にＭｅｌモデルを生成した。対照群として、同年齢の雌ＮＣＲｎｕ／ｎｕマウスを使用した。１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＭＥＭおよびＲＰＭＩ‐１６４０培地でそれぞれ、ＭｅＷｏおよびＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１細胞株を維持した。
【００７５】
インビボ生物発光画像診断
遺伝子送達から２４および４８時間後に、ＩＶＩＳスペクトル（Ｘｅｎｏｇｅｎ／Ｃａｌｉｐｅｒ社）で動物を画像診断した。各撮像セッションでは、１．５〜２．５％イソフルラン／酸素混合液による麻酔下でマウスにＤ‐ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。Ｄ‐ルシフェリン注射後５分から３５分まで連続的に画像を取得した。２Ｄ画像の限界を補うため、４つの異なる位置：腹部、左右側部、背部でほとんどの動物を撮像した。グループ内で転移部位の位置に多様性があることを説明するために、胸腔全体にわたって同じ寸法および形態のＲＯＩを画像に写した。ＲＯＩ内の全光流量（ｐ／ｓ）を測定した。試薬を全く投与されていない１匹のＮＣＲｎｕ／ｎｕ雌マウスを、ビニングおよび暴露時間を含む同様の設定で画像診断した。同一のＲＯＩを画像に写し、定量した全光流量をバックグラウンドシグナルとし、これを実験動物で測定した数値から差し引いた。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用し、画像取得およびＢＬＩデータ分析を行った。
【００７６】
ＳＰＥＣＴ‐ＣＴ画像診断およびデータ分析
ｐＰＥＧ‐ＨＳＶ１ｔｋ／ＰＥＩポリプレックス注射から４６時間後、動物に５１．８ｍＢｑ（１．４ｍＣｉ）の［１２５Ｉ］ＦＩＡＵを静脈内注射した。放射性トレーサー注射の２４および４８時間後に、低エネルギー単一ピンホールコリメーター（１．０ｍｍ口径）を使用したＸ‐ＳＰＥＣＴ  ｓｍａｌｌ‐ａｎｉｍａｌ  ＳＰＥＣＴ‐ＣＴ系（Ｇａｍｍａ  Ｍｅｄｉｃａ‐Ｉｄｅａｓ，Ｉｎｃ．社）で画像データを取得した。肺に焦点を当てた画像は回転半径（ＲＯＲ）を３．３５ｃｍにして取得し、全身の画像はＲＯＲを６．７５ｃｍにして取得した。注射から２４時間後に、５．６２５度拡張し、１回の投影当たり３０秒かけて６４回投影して動物を撮像し、注射から４８時間後では、１回の投影当たり６０秒かけて撮像した。ＳＰＥＣＴ画像を、５１２枚のＣＴ画像と重ねて表示した。２Ｄサブセット化期待値最大（ＯＳ‐ＥＭ）アルゴリズムで、２回反復し、４回のサブセットとし、断層画像のデータセットを再構成し、分析にはＡＭＩＤＥ３８およびＡｍｉｒａ（Ｖｉｓａｇｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ社）ソフトウェアを使用した。
【００７７】
ＰＥＴ‐ＣＴ画像診断およびデータ分析
９．２５ｍＢｑ（０．２５ｍＣｉ）のＦＤＧのＩＶ投与から１時間後に、２５０〜７００ｋｅＶのエネルギーウィンドウによって、ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｖｉｓｔａ  ｓｍａｌｌ  ａｎｉｍａｌ  ＰＥＴスキャナー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して全身画像を取得した。非腫瘍組織における放射性トレーサーの蓄積を最小限にするため、ＦＤＧ投与の６〜１２時間前に動物を断食させ、加熱パッド上で保温した。ＰＥＴ画像を、５１２枚のＣＴ画像と重ねて表示した。３Ｄサブセット化期待値最大（ＯＳ‐ＥＭ）アルゴリズムで、３回反復し、１２回のサブセットとし、断層画像のデータセットを再構成し、ＡＭＩＤＥ３８ソフトウェアで分析した。
免疫組織化学。ｐＰＥＧ‐Ｌｕｃ／ＰＥＩポリプレックス送達から４８時間後にＢＬＩデータを取得し、その後、Ｌｕｃ発現を示す各器官を回収し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。パラフィン包埋した５μｍ厚および２５μｍ厚のスライス凍結切片を室温で１時間、ウサギ抗ルシフェラーゼポリクローナル抗体（５０μｇ／ｍｌ原液の１：２５希釈、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）で染色した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役ポリクローナルヤギ抗ウサギ抗体を二次抗体として使用した。ＨＲＰ活性を３，３’‐ジアミノベンジジン基質‐色原体（ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）＋Ｋｉｔ、Ｄａｋｏ社）で検出した。
統計的分析。図面データのエラーバーは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表している。両側Ｓｔｕｄｅｎｔ‐ｔ検定を行い、Ｐ＜０．０５であり、統計学的に有意であると思われた。
【００７８】
結果
インビボ生物発光画像診断から見るＰＥＧ‐Ｐｒｏｍの癌特異的活性
インビボで腫瘍画像診断のためのＰＥＧ‐Ｐｒｏｍの特異性を試験するため、２種の異なるリポーター、ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）および単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１‐ｔｋ）を使用した。前臨床モデルにおいて特異的遺伝子発現または遺伝子タグを付けた細胞を画像診断するための原理証明を確立するためにＬｕｃは生物発光画像診断（ＢＬＩ）で使用することが多く、一方、臨床前に使用することが多いＨＳＶ１‐ｔｋは臨床試験に応用してきた。したがって、本発明者らは２種のプラスミド構築物、ｐＰＥＧ‐ＬｕｃおよびｐＰＥＧ‐ＨＳＶ１ｔｋを作製した（図１）。２種の異なる組織：ヒトメラノーマおよび乳癌の実験的転移モデルを画像診断することを選択した。遺伝子送達賦形剤としてインビボｊｅｔＰＥＩ（商標）を使用した。これは遺伝子送達用に最も広く用いられているカチオン性ポリマーの１種である線状ポリエチレンイミン（ｌ‐ＰＥＩ）をベースとしている。静脈内（ＩＶ）投与下で肝臓に局所集中する傾向にあるウイルスベクターで分かるように１５、１６、全身送達が偏ることを避けるためにウイルス送達系ではなく不活性（非ウイルス）賦形剤を選択した。
【００７９】
ヒト悪性メラノーマ細胞株ＭｅＷｏまたはヒト転移性乳癌細胞株ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１のＩＶ投与から４〜６週後にコンピューター断層撮像（ＣＴ）によって肺の転移性結節の存在が確認された後、動物にｐＰＥＧ‐Ｌｕｃ／ＰＥＩポリプレックスをＩＶ投与した（図１Ａ）。プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）送達から２４時間および４８時間後にＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ作動型遺伝子発現をＢＬＩによって評価した。同様のｐＤＮＡ送達および画像診断プロトコールをネガティブコントロールとして健常動物群に投与した。ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍによって作動したＬｕｃ発現が、コントロール動物には見られずメラノーマ転移モデル（Ｍｅｌ）にのみ見られた（図示せず）。コントロール動物では、２４時間経過時点でＢＬＩ出力はほぼバックグラウンドのレベルであり、４８時間の画像診断セッションでそれは消失したことが分かった（図示せず）。Ｌｕｃが主に肺で発現することを示す胸腔からのＢＬＩシグナル強度の定量化では、ｐＰＥＧ‐Ｌｕｃ投与後の時点（図２Ａ）およびさらに４８時間経過時点の両方で、Ｍｅｌ群のＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ活性はコントロールと比較して有意に高いことが分かる。乳癌転移（ＢＣａ）のモデルに同様の結果が見られた（図３ＡおよびＢ）。ＢＣａモデルに対して対照群の疑似カラー画像が同様になるように再調整し、コントロールとＢＣａ群が同じ閾値になるように調整した。Ｍｅｌモデルのように、胸腔から定量した生物発光強度は対照と比較してＢＣａ群で高いＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ活性を示し、ｐＰＥＧ‐Ｌｕｃ送達から４８時間にはさらに顕著になった（図３Ａ）。下記に述べるように、ＢＣａモデルにおいて遺伝子送達の効率が低い傾向にあることから、ＢＣａ群がＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１転移を示すにはＭｅｌ群がＭｅＷｏ転移を示すより長くかかり、ＢＬＩシグナルはバックグラウンドより有意に増加する。各群、ＭｅｌおよびＢＣａならびにコントロールの動物全てのＢＬＩ画像を、同じ疑似カラー閾値で得た。
【００８０】
４８時間時点でＢＣａ群と比較して、平均して約３倍高いレベルのＬｕｃ発現がＭｅｌ群から見られた。ＣＴスキャンおよび肉眼的な解剖学的所見から、これら２つのモデルの肺で転移結節形成には非常に多様なパターンがあることが明らかになった。ＭｅＷｏ細胞が肺全体にわたって一様に分散した小結節を形成するの（図２Ｃ、黒い矢印）に対して、ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１細胞は単独の大型結節を形成する傾向にあった（図３Ｂ、黒矢印）。ヘマトキシリンを使用した組織学的分析、およびホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺切片のエオシン（Ｈ＆Ｅ社）染色から、ＭｅｌモデルのＭｅＷｏ細胞由来転移癌がうまく血管新生され（図示せず）、一方、ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１細胞由来の転移癌を有するＢＣａ動物の肺に形成された結節に壊死中心（ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｃｅｎｔｅｒ）がある（図示せず）ことが明らかになった。遺伝子送達の効率低下に加えて、不十分な血管新生およびそれに伴うＢＣａ腫瘍の中心性壊死によって、Ｄ‐ルシフェリンおよび酸素が腫瘍に接触することが制限され、これに必然的に高い生産性のＢＬＩシグナルが伴う。
【００８１】
ＢＬＩによるＬｕｃの腫瘍特異的発現が正常組織と悪性マウス肺組織間の形質移入効率の差異に起因する可能性を排除するため、各動物において肺に送達されたｐＤＮＡ量を定量した。ｐＰＥＧ‐ＬｕｃプラスミドでＬｕｃをコードする遺伝子の領域を増幅するように設計されたプライマーセットを使用した定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ‐ＰＣＲ）を行った。肺組織から抽出したＤＮＡ全体をテンプレートとして使用した。対照群とＭｅｌ群との間の形質移入効率の差異は有意ではなかった（図４ＡおよびＢ）。他方、ＢＣａ群はコントロールと比較して形質移入効率は有意に低かった。この結果から、これらモデルに見られるＬｕｃの腫瘍特異的発現は、正常肺と悪性肺間の形質移入効率の差異というよりもむしろＰＥＧ‐Ｐｒｏｍの腫瘍選択的活性に起因していることが確認できた。ＢＣａモデルの肺に見られる形質移入効率の低下は、不十分な血管新生および大型結節の隔離が最も大きな原因である。上述の腫瘍画像診断の特異的かつＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ媒介的である性質のさらなる調査として、健常コントロールとＭｅｌ群との肺における構造的サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター活性も比較した（図５ＡおよびＢ）。ｐＣＭＶ‐Ｔｒｉ／ＰＥＩポリプレックスの全身送達から４５時間後までのどの時点でも、ＢＬＩはＣＭＶプロモーター作動型Ｌｕｃ発現レベルについて対照群とＭｅｌ群との間で有意差を見せなかった。この結果からそれは、正常肺組織より腫瘍でプラスミド発現を高めるような血管増生または透過性促進といった腫瘍微環境に特有の性質ではないことが分かった。
【００８２】
全身投与されたｐＰＥＧ‐ＬｕｃによるＢＬＩはまた、肺実質の外側にある小さい転移性沈着物、すなわち微小転移癌の画像診断をＭｅｌおよびＢＣａモデルの両方で可能にした。このことは、バックグラウンドを超えているＢＬＩシグナルを生成する領域の回収、および組織学的相関解析を経て行われた。具体的には、肺、副腎、胸骨に隣接する胸腔、および膀胱に隣接する深鼠径脂肪組織で形成される転移部位にＬｕｃ発現が関連している事は代表的なＭｅｌモデルであるＭｅｌ‐２由来の組織切片の組織学的分析から確認された。同様に、転移部位とＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ活性間の相関性は、代表的なＢＣａモデルである肺内ＢＣａ‐３、膵周囲領域、胸骨に隣接する胸壁、膀胱周囲の脂肪結合組織に位置するリンパ節、および微小転移性沈着物がかすかに列になっている胸郭において観察された。
【００８３】
インビボでの放射性核種画像診断によるＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ媒介癌検出
悪性肺病変および気管外微小転移癌は共にＢＬＩで検出できたが、この技術は前臨床試験に限定される。これには、ルシフェラーゼ基質投与が必要であること、ＢＬＩ光放出の浸透深さが不十分であること、および定量的な断層撮像ＢＬＩベース画像の作成が困難であることなどのいくつかの要因がある。そこで本発明者らは、より臨床的に関連のＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ作動型遺伝子発現画像診断系、ｐＰＥＧ‐ＨＳＶ１ｔｋ（図１Ｂ）を作製した。これは良好に放射標識したヌクレオチド類似体を投与して、放射性核種ベースの技術、すなわちシングルフォトン放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）またはポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）を使用して検出可能になる。ＳＰＥＣＴ−ＣＴによる腫瘍標的画像診断を明らかにするために、Ｍｅｌ実験転移モデルを使用した。上述のようにＭｅＷｏ細胞を投与した約７週後、Ｍｅｌ群および対応するコントロールにｐＰＥＧ‐ＨＳＶ１ｔｋ／ＰＥＩポリプレックスをＩＶ注射した。ｐＤＮＡ送達から４６時間後、動物に２’‐フルオロ‐２’デオキシ‐β‐Ｄ‐５‐［１２５Ｉ］ヨードウラシル‐アラビノフラノシド（［１２５Ｉ］ＦＩＡＵ）を注射し、放射性トレーサー投与から２４および４８時間後に画像診断した（図６ＡおよびＣ）。放射活性の定量化によって、コントロールと比較してＭｅｌモデルの肺では［１２５Ｉ］ＦＩＡＵの蓄積は３１倍であることが明らかになり、ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍの制御下でのＨＳＶ１‐ｔｋの腫瘍特異的発現が示された（図６Ｂ）。さらに、４８時間の画像診断セッションの後、肉眼組織学的分析を経て、推定した胸腔外転移部位に腫瘍があることを確認した。全身で検出したが、ＳＰＥＣＴ‐ＣＴ画像（図７Ａ）は、無処置の組織学的標本に対応するＭｅｌ‐２の背部頸での複数の転移病変である。左脊髄への転移、横隔膜の真上への別の転移、および左鼠径リンパ節への他の転移といった転移部位は同様にＭｅｌ‐３に関連している（図７Ｂ〜Ｄ）。ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ媒介画像診断の検出精度および応用可能性を評価するため、病変を検出するＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ系の能力と、臨床標準である［１８Ｆ］フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）の能力とを比較した。各方法によって同じ動物を画像診断した。ほとんどの例で、検出された転移結節は２つの放射性核種ベースの技術を相互に関連付けていた。しかし、ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍベースの系は心臓、褐色脂肪組織、ＦＤＧを隔絶することが既知である領域に隣接する結節を良好に検出できた１７、１８。この所見は、ＳＰＥＣＴは本質的にＰＥＴより少なくとも１桁感受性が低いという事実を考慮すると、特に有意である。
【００８４】
考察
本発明者らの目標は、癌の分子遺伝学的画像診断を可能にする全身送達可能な構築物を開発することである。このような構築物を提供するために必要な要素には、癌特異性、臨床応用への可能性、および遺伝子治療につながる性能を有する十分強力なプロモーターが挙げられる。腫瘍特異性リポーター発現を提供するため分子遺伝学的画像診断では、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）４由来のプロモーター、サバイビン１９および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）２０プロモーター、およびエンハンサー要素が使用されてきた。しかし、これらの研究はアデノウイルスベクターを使用したため、送達は局所投与に限られ、全身投与を行うと肝臓内にのみ発現した。対照的に、本発明者らは本明細書において、非ウイルスベクターを使用した全身送達後のＰＥＧ‐Ｐｒｏｍによる転移を詳細に説明することができた。画像処理または治療目的で下流遺伝子を作動するために、プロモーター活性を増幅させなければならないことが多い。このようにするための戦略の１つは、ＧＡＬ４‐ＶＰ１６融合タンパク質を使用した２工程転写増幅（ＴＳＴＡ）系２１、２２、やＧＡＬ４応答エレメント１９、２０、２３〜２５を含む。しかし、ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍでは、高感度画像診断の達成に増幅を必要としない。ｐＰＥＧ‐ＨＳＶ１ｔｋの投与から４週間後、ＳＰＥＣＴ‐ＣＴ画像診断から、正常肺シグナルに対する転移シグナルの比は３１になっていることが分かった（図６Ｂ）。ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ活性は、構造的に活性なＳＶ４０プロモーターに匹敵する（データなし）。先行文献で報告されているインビトロの結果９を踏まえ、両画像診断方式を使用し、試験した両腫瘍モデルにおいてＰＥＧ‐Ｐｒｏｍはインビボで腫瘍特異的であると判明し、他の方式および腫瘍にさらに一般化できる可能性があることを本発明者らは本明細書で明らかにしている。臨床応用の可能性があることから、ｐＰＥＧ‐ＨＳＶ１ｔｋをさらに選択した。臨床分子遺伝学的画像診断および遺伝子治療は、それぞれＨＳＶ１ｔｋ、および放射標識したヌクレオシド類似体７、２６、ならびにガンシクロビル６、２７〜２９を使用して確立してきた。１‐ＰＥＩポリプレックス送達賦形剤を使用することによって、免疫反応３０および発癌性など、遺伝子送達のウイルスベクターに付随する問題を回避する。ｐＤＮＡベクターを使用すると、インビボでの染色体外遺伝子の宿主ゲノムへの組み込み率は非常に低いものであった３１〜３４。全身投与を経て到達させることはナノ粒子送達系では困難であると考えられている骨および脳転移検出において、ｐＰＥＧ‐ＨＳＶ１ｔｋ送達賦形剤としてのインビボｊｅｔＰＥＩＴＭの可能性を評価した。肺内よりは少量であるが、相当量のｐＤＮＡが各組織に送達されたことがｑＲＴ‐ＰＣＲから分かった（図８）。また、血管新生が不十分な腫瘍内の壊死領域にも到達させることは難しい。概して、分子遺伝学的画像診断技術は腫瘍生存可能な部位へｐＤＮＡをより高効率に送達させると予想され、主に壊死性病巣とは逆に、良好に血管化した部位がより正確に検出されることが示唆された。
【００８５】
ここで本発明者らはインンビボでのメラノーマおよび乳癌転移のための画像診断薬としてＰＥＧ‐Ｐｒｏｍがどのように使用できるかを示し、このプロモーターがこの目的のため普遍的に使用されるものとなる可能性があることを提案する。このような薬剤を使用し、正常組織の非特異的発現を危惧することなく起源の組織またはサブタイプが特定される前に腫瘍を検出することができた。他の画像診断薬のように、ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍは腫瘍検出のみならず術前計画、術中管理および治療モニタリングにも使用可能である。ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ画像診断系は、内部リボソーム進入部位または他のタンデム遺伝子発現を可能にする戦略を経てセラノスティック薬に適合させることも可能である。分子遺伝学的画像診断を介して原発性腫瘍およびリンパ節転移癌を描出するために、前立腺癌用のＰＳＡ（前立腺特異性抗原）プロモーター２３、２４、乳癌用ムチン‐１プロモーター２５、３５および卵巣癌用のメソテリンプロモーター３６などのプロモーターを使用している。同様に、ｈＴＥＲＴ、サバイビンおよびＣＥＡプロモーターは組織特異性が低く、癌特異性が高い性質であると報告されていたが、これらの活性はマーカー遺伝子の転写レベルに依存している。むしろ、ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍは腫瘍細胞に特有の転写因子に直接応答性がある。ＰＥＧ‐３遺伝子はラット増殖停止およびＤＮＡ損傷誘導遺伝子ＧＡＤＤ３４の切断された突然変異形態であり、これはネズミ科腫瘍形成中のみ発生し、悪性表現型を促進するＧＡＤＤ３４のドミナントネガティブとして機能し得る３７。ヒトＧＡＤＤホモログのプロモーター／エンハンサー領域を含むヒトゲノム中にＰＥＧ‐Ｐｒｏｍのホモログは見られず、このことによって最小限のバックグラウンドシグナルしか生成しない傾向にあるヒト被験体でＰＥＧ‐Ｐｒｏｍが活用できる９、３７。
【００８６】
これらの研究では、ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍが多様な癌の画像診断の実践的戦略および画像支援治療の可能性を提供するために必要な要素全てを包含していることを明らかにしている。    
【００８７】
実施例１の引用文献
１．Ｂｌａｓｂｅｒｇ，Ｒ．Ｇ．＆Ｔｊｕｖａｊｅｖ，Ｊ．Ｇ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ‐ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１１,  １６２０〜１６２９（２００３年）
２．Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．  ＡＢＣＧ２／ＢＣＲＰ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  Ｄ‐Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ  ｂａｓｅｄ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７，９３８９〜９３９７（２００７年）
３．Ｕｈｒｂｏｍ，Ｌ．，  Ｎｅｒｉｏ，Ｅ．＆ Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｅ．Ｃ．  Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｇｌｉｏｍａ  ｍｏｄｅｌ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １０，１２５７〜１２６０（２００４年）
４．Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｗｉｔｈ
ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ‐ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２，１２１３〜１２１９（２００６年）
５．Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ，Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ｈＴＥＲＴ）  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｔｒｉｍｏｄａｌｉｔｙ  ｆｕｓｉｏｎ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ．  Ｊ
Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４７，  ２７０〜２７７（２００６年）
６．Ｆｒｅｙｔａｇ，Ｓ．Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ‐ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ‐ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ＩＭＲＴ  ｆｏｒ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １５，  １０１６〜１０２３（２００７年）
７．Ｙａｇｈｏｕｂｉ，  Ｓ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ｔ
ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  １８Ｆ‐ＦＨＢＧ  ＰＥＴ  ｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｇｌｉｏｍａ．  Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｏｎｃｏｌ  ６，  ５３〜５８（２００９年）
８．Ｓｕ，Ｚ．Ｚ．，  Ｓｈｉ，Ｙ．＆Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐ．Ｂ．  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ＰＥＧ‐３  ｗｉｔｈ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ａ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ‐ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４，  ９１２５〜９１３０
（１９９７年）
９．Ｓｕ，Ｚ．Ｚ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ‐ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｇｅｎｅ‐３  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２，  １０５９〜１０６４（２００５年）
１０．  Ｓａｒｋａｒ，Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｙ‐ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｔｕｍｏｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖｉｒｕｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７，  ５４３４〜５４４２（２００７年）
１１．Ｓａｒｋａｒ，Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｅｒａｄｉｃａｔｅｓ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５，  ９０５６〜９０６３（２００５年）
１２．Ｓａｒｋａｒ，Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖｉｒｕｓ  ｅｒａｄｉｃａｔｅｓ  ｂｏｔｈ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １５，  ２９３〜３０２（２００８年）
１３．Ｓｕ，Ｚ．，Ｓｈｉ，Ｙ．＆ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐ．Ｂ．  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ  ＡＰ１  ａｎｄ  ＰＥＡ３  ｓｉｔｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｇｅｎｅ‐３（ＰＥＧ‐３）ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｂａｓａｌ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＰＥＧ‐３  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｒａｔ  ｅｍｂｒｙｏ  ｃｅｌｌｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９，３４１１〜３４２１（２０００年）
１４．Ｓａｒｋａｒ，Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｕａｌ  ｃａｎｃｅｒ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｃｕｒｅｓ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｉｎ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２，  １４０３４〜１４０３９（２００５年）
１５．Ｗｏｏｄ，Ｍ．，  ｅｔ．  Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ  ｏｒ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａ  ｍｏｕｓｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ６，  ３６７〜３７２（１９９９年）
１６．Ｐｅｎｇ，Ｋ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｒｇａｎ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｄ  ｕｎｔａｒｇｅｔｅｄ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ８，  １４５６〜１４６３（２００１年）
１７．Ｅｖａｎｓ，Ｋ．Ｄ．，  Ｔｕｌｌｏｓｓ，Ｔ．Ａ．＆ Ｈａｌｌ，Ｎ．  １８ＦＤＧ ｕｐｔａｋｅ ｉｎ ｂｒｏｗｎ ｆａｔ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ
ｆｏｒ ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ．  Ｒａｄｉｏｌ Ｔｅｃｈｎｏｌ ７８，３６１〜３６６ （２００７年）
１８．Ｓｈｒｅｖｅ，Ｐ．Ｄ．，  Ａｎｚａｉ，Ｙ．＆Ｗａｈｌ，Ｒ．Ｌ．  Ｐｉｔｆａｌｌｓ  ｉｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｉｃ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ＦＤＧ  ＰＥＴ  ｉｍａｇｉｎｇ：ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  ａｎｄ  ｂｅｎｉｇｎ  ｖａｒｉａｎｔｓ．  Ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃｓ  １９，６１〜７７；ｑｕｉｚ  １５０〜１５１（１９９９年）
１９．Ｒａｙ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｙ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １６，  １８４８〜１８５６（２００８年）
２０．Ｑｉａｏ，Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｕｍｏｒ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｓｕｉｃｉｄｅ
ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９，  １６８〜１７５（２００２年）
２１．Ｉｙｅｒ，Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｗｏ‐ｓｔｅｐ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｗｅａｋ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８，  １４５９５〜１４６００（２００１年）
２２．Ｓａｄｏｗｓｋｉ，Ｉ．，  Ｍａ，Ｊ．，  Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．＆Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｍ．  ＧＡＬ４‐ＶＰ１６ ｉｓ  ａｎ  ｕｎｕｓｕａｌｌｙ  ｐｏｔｅｎｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３３５，  ５６３〜５６４（１９８８年）
２３．Ｂｕｒｔｏｎ，Ｊ．Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ‐ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｔｏ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ
ｄｅｔｅｃｔ  ｓｅｎｔｉｎｅｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １４，  ８８２〜８８８（２００８年）
２４．Ｉｙｅｒ，Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｔｗｏ‐ｓｔｅｐ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ‐ｂａｓｅｄ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １０，  ５４５〜５５２（２００４年）
２５．Ｈｕｙｎ，  Ｓ．Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ ｐｏｔｅｎｔ，  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｒｉｖｅｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｃａｎｃｅｒ‐ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｕｃｉｎ‐１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｔｈａｔ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５，  ３１２６〜３１３４（２００９年）
２６．Ｊａｃｏｂｓ，Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｏｓｉｔｒｏｎ‐ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒ‐ｍｅｄｉａｔｅｄ
ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｇｌｉｏｍａｓ．  Ｌａｎｃｅｔ  ３５８，  ７２７〜７２９（２００１年）
２７．Ｉｍｍｏｎｅｎ，Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  ＡｄｖＨＳＶ‐ｔｋ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｔｕｄｙ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １０，  ９６７〜９７２（２００４年）
２８．Ｋｌａｔｚｍａｎｎ，Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ
ｋｉｎａｓｅ  “ｓｕｉｃｉｄｅ”  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９，  ２５９５〜２６０４（１９９８年）
２９．Ｔｒａｓｋ，Ｔ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＳＶ‐ｔｋ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １，  １９５〜２０３（２０００年）
３０．Ｂｏｎｎｅｔ，Ｍ．Ｅ．，  Ｅｒｂａｃｈｅｒ，  Ｐ．＆Ｂｏｌｃａｔｏ‐Ｂｅｌｌｅｍｉｎ，Ａ．Ｌ．  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｌｉｎｅａｒ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ（Ｌ‐ＰＥＩ）  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２５，  ２９７２〜２９８２（２００８年）
３１．Ｃｏｅｌｈｏ‐Ｃａｓｔｅｌｏ，Ａ，Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｈｓｐ６５  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｄｏｓｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．  Ｇｅｎｅｔ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｔｈｅｒ  ４，  １（２００６年）
３２．Ｋａｎｇ，Ｋ．Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓａｆｅｔｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＸ‐１２，  ａ  ｎｅｗ  ＨＩＶ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎｅ：ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ
ｏｒｇａｎｓ．  Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４６，  ２７０〜２７６（２００３年）
３３．Ｍａｎａｍ，Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ，  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｈｏｓｔ  ＤＮＡ．  Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４３，  ２７３〜２８１（２０００年）
３４．Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｄｂｉｓ
ｖｉｒｕｓ  ｍｅａｓｌｅｓ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ａｓ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｓｅ  ｏｒ  ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  ｌｉｖｅ  ａｔ  ｔｅｎｕａｔｅｄ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ａ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｉｍｅ‐ｂｏｏｓｔ  ｒｅｇｉｍｅｎ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １９，  ５２２〜５３１（２００８年）
３５．Ｄｗｙｅｒ，Ｒ．Ｍ．，  Ｂｅｒｇｅｒｔ，Ｅ．Ｒ．，  Ｏ‘Ｃｏｎｎｏｒ  Ｍ，Ｋ．，  Ｇｅｎｄｌｅｒ，Ｓ．Ｊ．＆Ｍｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ｃ．  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｒａｄｉｏｉｏｄｉｄｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ａｆｔｅｒ  ＭＵＣ１‐ｄｒｉｖｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ  ｓｙｍｐｏｒｔｅｒ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１，１４８３〜１４８９（２００５年）
３６．Ｔｓｕｒｕｔａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｆｉｂｅｒ‐ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ‐ｂａｓｅｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４，３５８２〜３５８８（２００８年）
３７．Ｓｕ，Ｚ．Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｒｏｄｅｎｔ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ：ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｖａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ‐３（ＰＥＧ‐３）．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４，  ２２４７〜２２５５（２００５年）
３８．Ｌｏｅｎｉｎｇ，Ａ．Ｍ．＆Ｇａｍｂｈｉｒ，Ｓ．Ｓ．  ＡＭＩＤＥ：ａ  ｆｒｅｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌｉｔｙ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ２，１３１〜１３７（２００３年）
【実施例２】
【００８８】
実施例２．
概要：
癌の標的画像診断は依然として重要ではあるが捉え難い目標である。このような画像診断は初期診断を可能にし、治療計画を支援し、治療のモニタリングに多大な利益をもたらす。本発明者らは、サブトラクションハイブリダイゼーション３を介して齧歯類ＰＥＧ‐３遺伝子由来進行増強遺伝子‐３（ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ）１、２の最小プロモーター領域を同定した。この発現は、齧歯類の腫瘍３、４、ならびに脳、前立腺、胸部、メラノーマおよび膵臓における腫瘍由来癌細胞株を含むヒト腫瘍５〜９における悪性形質転換および腫瘍進行と直接関連している。これらの所見に基づいて、画像診断構築物に連結してそれを調節するＰＥＧ‐Ｐｒｏｍの全身送達は、異なる組織起源またはサブタイプの腫瘍に広く適用できる様式で原発性腫瘍のみならず関連転移癌におけるレポーター遺伝子の腫瘍特異的発現を可能にすると仮定し、その後確認した１０。ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍは腫瘍細胞６〜９、ＡＰ‐１およびＰＥＡ‐３に特有の増強された転写因子に直接応答性があり、ヒトゲノムにホモログはなく、このことによって最小限のバックグラウンドシグナルしか生成しない傾向にあるヒト被験体でＰＥＧ‐Ｐｒｏｍが活用できる１、５。したがってＰＥＧ‐Ｐｒｏｍは腫瘍検出のみならず、術前計画、術中管理および治療モニタリングに使用可能である。
【００８９】
ＰＥＧ‐３‐Ｌｕｃマウスの構造：
ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍの形質転換特異性に基づいて、本発明者らはＰＥＧ‐Ｌｕｃトランスジェニックマウスを開発した。ＰＥＧ‐３／ｌｕｃ２導入遺伝子構築物を生成するため、ラットＰＥＧ‐３プロモーターの４４６‐ｂｐフラグメント（−２５２〜＋１９４）をｐＢＳ／ｐＫＣＲ３のウサギβグロビン領域の上流に挿入した。導入遺伝子発現の効率を高めるために、ｐＢＳ／ｐＫＣＲ３ベクターにはβ‐グロビンイントロン２およびその隣接のエクソンが含まれる１１。最初の構築物由来のＰＥＧ‐３／β‐グロビン複合体フラグメントはその後、ｐＧＬ４．１０［ｌｕｃ２］ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）中の合成ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ２）の上流に挿入した。ＰＥＧ‐３／ｌｕｃ２トランスジェニックマウスを作成するため、３．４ｋｂのＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩフラグメントをＰＥＧ‐３／ｌｕｃ２構築物から切り取り、導入遺伝子発現について評価した。最初の構築物由来のＰＥＧ‐３／β‐グロビン複合体フラグメントはその後、ｐＧＬ４．１０［ｌｕｃ２］ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）中の合成ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ２）の上流に挿入した。ＰＥＧ‐３／ｌｕｃ２トランスジェニックマウスを生成するため、３．４ｋｂのＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩフラグメントをＰＥＧ‐３／ｌｕｃ２構築物から切り取り、ＣＢ６Ｆ１（Ｃ５７ＢＬ／６×Ｂａｌｂ／Ｃ）雄および雌の交配から得られた受精した単細胞マウス胚の雄前核に微量注射した。注入された胚をその後、偽妊娠ＣＤ‐１雌マウスの卵管に再移植した。ウサギβグロビンイントロン２センスプライマー（５’‐ＣＣＣＴＣＴＧＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣ‐３’、配列番号：３）およびｌｕｃ２アンチセンスプライマー（５’‐ＴＣＴＴＧＣＴＣＡＣＧＡＡＴＡＣＧＡＣＧＧＴＧ‐３’、配列番号：４）を使用し、ゲノムテールＤＮＡのＰＣＲ分析によって、ＰＥＧ‐３／ｌｕｃ２導入遺伝子の有無について子孫をスクリーニングした。ＰＥＧ‐３／ｌｕｃ２導入遺伝子を有する可能性のある４匹の初代を樹立し、ＰＥＧ‐Ｌｕｃマウスのコロニーを作成した。
【００９０】
マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）‐ｎｅｕトランスジェニックマウス：
マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）‐ｎｅｕトランスジェニックマウスはヒトｈｅｒ２遺伝子のマウスホモログ、ＮＥＵタンパク質を過剰発現する１２。このモデルはＭＭＴＶプロモーター／エンハンサーの転写制御下で不活化されたｎｅｕ遺伝子を有する。このように当該モデルはｎｅｕの点突然変異ではなくむしろ過剰発現によってヒトｈｅｒ２作動型乳癌を模倣し；乳腺腫瘍を局所集中させ、治療研究の基盤を現実的なものにする。ＭＭＴＶ‐ｎｅｕトランスジェニックマウスは授乳期に限局性乳腺腫瘍を発症し、潜伏期間は７〜８カ月である。
【００９１】
インビボ画像診断のためのダブルトランスジェニックマウス（ＭＭＴＶ‐ｎｅｕ／ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ‐Ｌｕｃ；ＭｎＰｐ‐Ｌｕｃ）の作成：
ヒト乳癌細胞株におけるＰＥＧ‐ｐｒｏｍ癌特異的発現に基づいて、乳腺細胞が腫瘍および転移癌に形質転換されるとＰＥＧ‐Ｐｒｏｍの活性が増加すると本発明者らは仮説を立てた。原理の証明を確立するため、ＭＭＴＶ‐ｎｅｕの雌と、複数ＰＥＧ‐ｌｕｃ株由来のＰＥＧ‐ｌｕｃトランスジェニックの雄とを交配させてＭＭＴＶ‐ｎｅｕ／ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ‐Ｌｕｃ（ＭｎＰｐ‐Ｌｕｃ）マウスを作成し、ダブル（ＭＭＴＶ‐ｎｅｕ／ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ‐Ｌｕｃ；ＭｎＰｐ‐Ｌｕｃ）トランスジェニックマウスを開発した。予想通り、乳腺腫瘍のマウス（図９、パネル上段）は、確認された腫瘍（触診およびマウスの他の部位）の中でルシフェラーゼを発現し、他方、腫瘍陰性マウスには触診可能な腫瘍の中で有意なルシフェラーゼ発現は見られなかった（図９、パネル下段）。これら誘発の所見に基づいて、このダブルトランスジェニック動物モデルは、非侵襲的な生物発光（ＢＬＩ）アプローチを利用して、初期段階や転移進行などの異なる疾患段階で治療的および化学予防的アプローチの有効性を検定する場合に有用である。本発明者らは様々な器官を採取し、現在はＢＬＩとの組織学的相関関係を調査中である。
【００９２】
重要なのは、腫瘍の発生、転移の進行をモニタリングし、治療的介入（細胞毒性薬、アポトーシス誘導剤、毒性自己貪食誘導剤および壊死誘導剤による治療；ウイルス治療アプローチ；免疫療法等）の多様なモデルをモニタリングし、評価するためのＢＬＩを使用できるダブルトランスジェニック腫瘍動物モデルを作成する際のＰｅｇ‐Ｐｒｏｍ‐Ｌｕｃ動物モデルの関連性について本研究が強調していることである。また、特定の毒性薬への暴露に起因する皮膚発癌、器官発癌などの過程、および癌の誘発および進行の重症度を抑制または限定する際の化学的予防のルールを考察するための単一トランスジェニック動物として、ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ‐Ｌｕｃ動物を使用することができた。
【００９３】
結論として、これらの研究は癌診断マウス（「オンコビューマウス（Ｏｎｃｏ  Ｖｉｅｗ  Ｍｉｃｅ）」）を開発するための原理の証明を提供するパラダイム変化である。これらの研究はさらに、ＢＬＩを使用して癌発症および進行が画像診断可能となる「オンコビューマウス」を作成するためのＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ‐Ｌｕｃ／ダブルトランスジェニックマウスアプローチが実用的であることを証明している。さらに、このアプローチは、限定はしないが膵臓、前立腺、肺、結腸直腸、脳、卵巣、食道、胃、皮膚（メラノーマ）等の任意の癌トランスジェニック動物モデルにも原則的に適用できることから、乳癌だけに制限される訳ではない。
【００９４】
実施例２の引用文献
１．Ｓｕ  ＺＺ，  Ｓａｒｋａｒ  Ｄ，  Ｅｍｄａｄ  Ｌ，  Ｄｕｉｇｏｕ  ＧＪ，  Ｙｏｕｎｇ  ＣＳＨ，  Ｗａｒｅ  Ｊ，  Ｒａｎｄｏｌｐｈ  Ａ，  Ｖａｌｅｒｉｅ  Ｋ，ａｎｄ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＰＢ．  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ‐ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｇｅｎｅ‐３  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００５年；１０２（４）：１０５９〜１０６４
２．Ｓｕ Ｚ，  Ｓｈｉ  Ｙ，  Ｆｉｓｈｅｒ  ＰＢ．  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＡＰ１  ａｎｄ  ＰＥＡ３  ｓｉｔｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｇｅｎｅ‐３（ＰＥＧ‐３）ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｂａｓａｌ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＰＥＧ‐３  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｒａｔ  ｅｍｂｒｙｏ  ｃｅｌｌｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０００年；１９（３０）：３４１１〜２１
３．Ｓｕ  ＺＺ，  Ｓｈｉ  Ｙ，  Ｆｉｓｈｅｒ  ＰＢ．  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ＰＥＧ‐３  ｗｉｔｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ａ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ‐ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ
ｇｅｎｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９７年；９４（１７）：９１２５〜３０
４．Ｓｕ  ＺＺ，  Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ＮＩ，  Ｊｉａｎｇ  Ｈ，  Ｗａｎｇ  ＭＮ，  Ｄｕｉｇｏｕ  ＧＪ，  Ｙｏｕｎｇ  ＣＳ，  Ｆｉｓｈｅｒ  ＰＢ．  ＰＥＧ‐３，ａ  ｎｏｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｇｅｎｅ，  ｉｓ  ａ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅｎｅｓｓ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９９年；９６（２６）：１５１１５〜２０
５．Ｓｕ  ＺＺ，  Ｅｍｄａｄ  Ｌ，  Ｓａｒｋａｒ  Ｄ，  Ｒａｎｄｏｌｐｈ  Ａ，  Ｖａｌｅｒｉｅ  Ｋ,   Ｙａｃｏｕｂ  Ａ，  Ｄｅｎｔ  Ｐ，  Ｆｉｓｈｅｒ  ＰＢ．  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｒｏｄｅｎｔ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ：ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｖａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ‐３
（ＰＥＧ‐３）．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００５年；２４（１３）：２２４７〜５５.
６．  Ｓａｒｋａｒ  Ｄ，  Ｓｕ  ＺＺ，  Ｖｏｚｈｉｌｌａ  Ｎ，  Ｐａｒｋ  ＥＳ，  Ｇｕｐｔａ  Ｐ，  Ｆｉｓｈｅｒ  ＰＢ．  Ｄｕａｌ  ｃａｎｃｅｒ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｃｕｒｅｓ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｉｎ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００５年；１０２（３９）：１４０３４〜９
７．Ｓａｒｋａｒ  Ｄ，  Ｓｕ  ＺＺ，  Ｖｏｚｈｉｌｌａ  Ｎ，  Ｐａｒｋ  ＥＳ，  Ｒａｎｄｏｌｐｈ  Ａ，  Ｖａｌｅｒｉｅ  Ｋ，  Ｆｉｓｈｅｒ，  ＰＢ．  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｅｒａｄｉｃａｔｅｓ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５年；６５（１９）：９０５６〜６３．
８．Ｓａｒｋａｒ  Ｄ，  Ｌｅｂｅｄｅｖａ  ＩＶ，  Ｓｕ  ＺＺ，  Ｐａｒｋ  ＥＳ，  Ｃｈａｔｍａｎ  Ｌ，  Ｖｏｚｈｉｌｌａ  Ｎ，  Ｄｅｎｔ  Ｐ，  Ｃｕｒｉｅｌ，  ＤＴ，  Ｆｉｓｈｅｒ  ＰＢ．  Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｙ‐ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｔｕｍｏｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖｉｒｕｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７年；６7（１１）：５４３４〜５４４２
９．Ｓａｒｋａｒ  Ｄ，  Ｓｕ  ＺＺ，  Ｐａｒｋ  ＥＳ，  Ｖｏｚｈｉｌｌａ  Ｎ，  Ｄｅｎｔ  Ｐ，  Ｃｕｒｉｅｌ  ＤＴ，  Ｆｉｓｈｅｒ  ＰＢ．  Ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖｉｒｕｓ  ｅｒａｄｉｃａｔｅｓ  ｂｏｔｈ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００８；１５（５）：２９３〜３０２
１０．Ｂｈａｎｇ  ＨＥＣ，  Ｇａｂｒｉｅｌｓｏｎ  ＫＬ，  Ｌａｔｅｒｒａ  Ｊ，  Ｆｉｓｈｅｒ  ＰＢ，  Ｐｏｍｐｅｒ  ＭＧ．  Ｔｕｍｏｒ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｇｅｎｅ‐３  ｐｒｏｍｏｔｅｒ‐ｄｒｉｖｅｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１１；１７（１）：１２３〜９
１１．Ｈｏｗｅｓ  ＫＡ，  Ｒａｎｓｏｍ  Ｎ，  Ｐａｐｅｒｍａｓｔｅｒ  ＤＳ，  Ｌａｓｕｄｒｙ  ＪＧ，  Ａｌｂｅｒｔ  ＤＭ，  Ｗｉｎｄｌｅ  ＪＪ．  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｒ  ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ：ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｆａｔｅｓ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＨＰＶ‐１６  Ｅ７  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｒ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐ５３．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １９９４；８（１１）：１３００〜１０
１２．  Ｊｏｌｉｃｏｅｕｒ  Ｐ，  Ｂｏｕｃｈａｒｄ  Ｌ，  Ｇｕｉｍｏｎｄ  Ａ，  Ｓｔｅ‐Ｍａｒｉｅ  Ｍ，  Ｈａｎｎａ  Ｚ，  Ｄｉｅｖａｒｔ  Ａ．  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｕｒ  ｖｉｒｕｓ  （ＭＭＴＶ）／ｎｅｕ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｇｅｎｅｓ  ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃ‐ｅｒｂＢ‐２  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｎ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｕｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｓｙｍｐ．  １９９８年；６３：１５９〜６５
【００９５】
本明細書で使用した全ての用語および語句（例えば核酸、タンパク質、ポリペプチド等）は特段の指示がない限り当技術分野で通常理解されている意味を指す。
【００９６】
本明細書および付属の請求項で使用されているように、単数形「ａ」、「ａｎ」（１つの）、および「ｔｈｅ」（前記）は、文脈上他の選択を明確に示していない限り複数形の指示対象を含む。
【００９７】
上記または下記の本明細書で引用されているすべての特許、特許出願および刊行物はそれら全体を参照によって本明細書に組み込んだものとする。
【００９８】
本発明はその好ましい実施態様について述べてきたが、付属の請求項の精神および範囲内で改変を加えて本発明を実施し得ることは当業者に理解されよう。したがって、本発明は上述の実施態様に限定されるものではなく、本明細書に記載の精神および範囲内であらゆる変形例およびその同等物をさらに含むことが好ましい。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
癌の画像診断および画像治療による治療の効率を著しく改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１Ａ−Ｂ】ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ媒介リポーター発現系。Ａ）ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍの制御下で遺伝子をコードするホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）を含有するｐＰＥＧ‐Ｌｕｃの構築物地図；Ｂ）ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍの遺伝子下流をコードするＨＳＶ１‐ｔｋを含むｐＰＥＧ‐ＨＳＶ１ｔｋの構築物地図。
【図２Ａ−Ｃ】ヒトメラノーマ転移（Ｍｅｌ）の実験モデルでの生物発光画像（ＢＬＩ）に示される癌特異性ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ活性。画像はｐＰＥＧ‐Ｌｕｃ／ＰＥＩポリプレックスの静脈内（ＩＶ）送達から４８時間後に得られたものである。身体全体をカバーするため、各動物を４方向（Ｖ：腹部、Ｌ：左側、Ｒ：右側、Ｄ：背部）から撮像した。２群から得た疑似カラー画像を同じ閾値になるように調整した。メラノーマ転移モデルにおいて特異的に生物発光シグナルが観察された。Ａ、ｐＰＥＧ‐Ｌｕｃ／ＰＥＩポリプレックス注射から２４および４８時間後のコントロール群（Ｃｔｒｌ）およびＭｅｌ群におけるＢＬＩシグナル強度の定量。４箇所すべての位置で得た各画像の動物の胸腔上に関心領域（ＲＯＩ）が写し出された。定量した数値は総光流量で示してある（１秒当りの光子量、ｐ／ｓ）。＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ＢおよびＣ）コントロール群（Ｂ）およびメラノーマ転移群（Ｃ）からそれぞれ得た１匹の代表的な動物から得た肺のＣＴスキャン画像と肉眼的解剖画像。黒い矢印は肺で見られた転移結節を示す。
【図３Ａ−Ｂ】ヒト乳癌転移（ＢＣａ）の実験モデルにおけるＢＬＩで示される癌特異性ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ活性。コントロール群および実験的乳癌転移群からそれぞれ得た１匹の代表的な動物におけるＢＬＩ。画像はｐＰＥＧ‐Ｌｕｃ／ＰＥＩポリプレックスＩＶ送達から４８時間後に得られたものである。各マウスを４方向（Ｖ：腹部、Ｌ：左側、Ｒ：右側、Ｄ：背部）から撮像した。２群から得た疑似カラー画像を同じ閾値になるように調整した。Ａ、各配置から得られた動物の胸腔上に写し出されたＲＯＩで測定した生物発光シグナル強度の定量。定量した強度は総光流量（ｐ／ｓ）で表わした。＊＊Ｐ＝０．００６６。Ｂ、ヒト乳癌の代表的な転移モデルから得た肺のＣＴ画像および顕微鏡画像。黒い矢印は肺で見られた転移結節を示す。
【図４】肺への遺伝子送達効率の群間比較。４８時間のＢＬＩセッションの後、各動物の肺組織においてｐＰＥＧ‐Ｌｕｃの絶対量を定量的リアルタイムＰＣＲで定量した。Ａ、ｌｏｇ  ｎｇ  ｐＤＮＡに対するＣＴ値の標準曲線プロット（ｐＰＥＧ‐Ｌｕｃ）。Ｂ、標準曲線法を利用した肺へのｐＤＮＡ送達効率の絶対的定量。ヒトメラノーマ転移（Ｍｅｌ）のコントロールと実験モデルとの間には有意差が見られなかった反面、乳癌転移モデル（ＢＣａ）はコントロールと比較して形質移入効率が有意に低かった。エラーバーは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（Ｃｔｒｌではｎ＝３；Ｍｅｌではｎ＝３；ＢＣａではｎ＝４）を表している（ＮＳは有意差なし；＊Ｐ＝０．０３４５）。
【図５Ａ−Ｂ】健常コントロール（Ｃｔｒｌ）と実験メラノーマ転移（Ｍｅｌ）群との構造的ＣＭＶプロモーター活性の比較。Ａ、ＣｔｒｌおよびＭｅｌ群からそれぞれ得た１匹の代表的な動物における連続的ＢＬＩ。画像はｐＣＭＶ‐Ｔｒｉ／ＰＥＩポリプレックスの全身送達から８、２４および４５時間後に得たものである。動物モデルおよびｐＤＮＡ／ＰＥＩポリプレックスを「方法」に記載のとおりに作成した。２群から得た疑似カラー画像を同じ閾値になるように調整した。Ｂ、動物の胸腔上に写し出されたＲＯＩで測定した生物発光シグナル強度の定量。ＣｔｒｌとＭｅｌ群との間にはＣＭＶプロモーター活性の有意差はどの時点でも見られなかった。エラーバーは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表している（Ｃｔｒｌではｎ＝３；Ｍｅｌではｎ＝３）。
【図６Ａ−Ｃ】ヒトメラノーマ転移（Ｍｅｌ）の実験モデルでのＳＰＥＣＴ‐ＣＴ画像診断に示されるＰＥＧ‐Ｐｒｏｍが作動するＨＳＶ１‐ｔｋの癌特異的発現。ＡおよびＣ、健常コントロール群（Ａ、ｎ＝３；Ｃｔｒｌ‐１〜３）およびメラノーマ転移モデル（Ｃ、ｎ＝５；Ｍｅｌ‐１〜５）における肺のＣＴ、ＳＰＥＣＴ、および画像合わせした（ｃｏ‐ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ）［１２５Ｉ］ＦＩＡＵ  ＳＰＥＣＴ‐ＣＴ画像。画像は［１２５Ｉ］ＦＩＡＵのＩＶ注射から４８時間後に得られたものであり、ｐＰＥＧ‐ＨＳＶ１ｔｋ／ＰＥＩポリプレックスのＩＶ投与から９４時間後ということである。Ｂ、肺ＳＰＥＣＴ画像のＡおよびＣにおける定量。各動物の肺の右葉は、ＲＯＩでは寸法および形状が同じであった。定量した放射活性を平均％ＩＤ／ｇ（組織１グラム当たり注射量の平均百分率）で表わした。＊＊Ｐ＝０．００７０。
【図７Ａ−Ｄ】ＳＰＥＣＴ‐ＣＴ画像に示されるｐＰＥＧ‐ＨＳＶ１ｔｋの全身投与後のメラノーマの転移塊の検出および局在化。図６ＣのＭｅｌ‐２（Ａ）およびＭｅｌ‐３（Ｂ、ＣおよびＤ）の画像合わせしたＳＰＥＣＴ‐ＣＴ画像の横断画像、コロナル画像およびサジタル画像。全画像は［１２５Ｉ］ＦＩＡＵ注射から２４時間後に得られたものであり、ｐＰＥＧ‐ＨＳＶ１ｔｋ／ＰＥＩポリプレックスのＩＶ投与から７０時間後ということである。Ａ、Ｂ、ＣおよびＤにおけるＳＰＥＣＴ‐ＣＴ画像に基づいて位置確認された転移塊の肉眼的解剖学的詳細。Ｍｅｌ‐２のＳＰＥＣＴ‐ＣＴ画像診断によって多数の転移部位が検出された（Ａ、破線の円）。対応する領域の剖検から、上背部の褐色脂肪組織の下側にメラノーマ塊があることが分かった。（Ｂ）蓄積した放射活性は中部胸椎の近傍から左側にかけて検出され（白い矢印）、この位置で腫瘍塊と対応していた。ＳＰＥＣ‐ＣＴ画像診断で明らかになった他の転移部位をＣおよびＤに示す（白い矢印および破線の円）。メラノーマは横隔膜の真上（ｆ、白い破線の円）および左鼠径リンパ節に露見され、ＣおよびＤと相関していた。乳癌転移モデルＢＣａ‐１におけるＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ媒介画像診断とＦＤＧ‐ＰＥＴとの相互比較。［１２５Ｉ］ＦＩＡＵ  ＳＰＥＣＴによって心臓の近傍に２つの結節（Ｔｕ‐１および‐２）が検出され、剖検によって確認された。Ｔｕ‐１は両方の方法で検出され、一方、心臓に付着した小さい方の結節Ｔｕ‐２はＰＥＴ画像で明らかになった。ＳＰＥＣＴ画像は［１２５Ｉ］ＦＩＡＵ注射から４８時間後に得られたものであり、ｐＰＥＧ‐ＨＳＶ１ｔｋ／ＰＥＩ送達から９４時間後ということである。ＰＥＴ画像はＳＰＥＣＴデータと同じ日に得られた。
【図８】インビボのｊｅｔＰＥＩＴＭ媒介全身送達による骨および脳へのｐＤＮＡ形質移入効率の評価。（ａ、ｂ）標準曲線を利用した定量的リアルタイムＰＣＲによる骨および脳へ送達させたｐＤＮＡの量の絶対量測定。ｐＰＥＧ‐Ｌｕｃ／ＰＥＩポリプレックスを雌ＮＣＲｎｕ／ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社）に全身送達させてから２４時間および４８時間後に、骨髄、大腿骨、膝関節、股関節および脳をポジティブコントロールとしての肺と一緒に単独採取し、新鮮な未凍結組織からＤＮＡ全体を抽出した。総ＤＮＡ１００ｎｇの当たりのｎｇ  ｐＤＮＡ（ａ）およびｐＤＮＡコピー数（ｂ）で、各器官に送達したｐＰＥＧ‐Ｌｕｃの絶対量を定量した。エラーバーは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表している（各時点当たり、ｎ＝３）。＊大腿骨：大腿骨から骨髄を除去した後、総ＤＮＡを抽出するために大腿部皮質骨のみを使用した。
【図９】ＢＬＩを使用してルシフェラーゼ発現についてダブルトランスジェニック（ＭＭＴＶ‐ｎｅｕ／ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ‐Ｌｕｃ；ＭｎＰｐ‐Ｌｕｃ）マウスを分析した。麻酔マウスに３ｍｇ／マウスでルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｌａｍｅｄａ、カナダ）を腹腔内に注入し、画像診断した。上部パネル：ＭＭＴＶ‐ｎｅｕ／ＰＥＧ‐Ｐｒｏｍ‐Ｌｕｃ（ＭｎＰｐ‐Ｌｕｃ）マウス；ＭＭＴＶ‐ｎｅｕマウス。
【図１０Ａ−Ｅ】ＰＥＧ‐ＰＲＯＭプロモーター。Ａ、２．０ｋｂのＰＥＧ‐３プロモーター（配列番号：１）；Ｂ、例示としての最小プロモーター（配列番号：２）；Ｃ、ＰＥＡ３タンパク質結合配列；Ｄ、ＴＡＴＡ配列；Ｅ、ＡＰ１タンパク質結合配列。
【符号の説明】
【０１０１】
（各図中の用語の対応訳）
［図１Ａ］
RV primer
3             ＲＶプライマー３
Synthetic
poly (A)      合成ポリ（Ａ）
Luciferase              ルシフェラーゼ
SV 40
poly (A)          ＳＶ４０ポリ（Ａ）
RV primer
4             ＲＶプライマー４
［図１Ｂ］
RV primer
3             ＲＶプライマー３
Synthetic
poly (A)      合成ポリ（Ａ）
SV 40
poly              ＳＶ４０ポリ（Ａ）
RV primer
4             ＲＶプライマー４
［図２Ａ］
Total
Flux              総光流量
［図３Ａ］
Total
Flux              総光流量
［図４Ｂ］
（縦軸）                         （ｎｇ  ｐＤＮＡ）／（１００ｎｇ  肺由来ｇＤＮＡ）
［図５Ａ］
カラーバー
最小
最大
［図５Ｂ］
Total
Flux              総光流量
（横軸）                         ｐＣＭＶ‐Ｔｒｉ／ＰＥＩ注射後（時間）
［図６Ａ］
重ねて表示したＳＰＥＣＴ／ＣＴ
［図６Ｂ］
（縦軸）                         平均％ＩＤ／ｇ
［図６Ｃ］
重ねて表示したＳＰＥＣＴ／ＣＴ
［図７Ａ］［図７Ｂ］［図７Ｃ］［図７Ｄ］
横断面図
冠状断面図
矢状断面図
［図８Ａ］
（縦軸）                         総ＤＮＡ１００ｎｇ当たりのｎｇ  ｐＤＮＡ
（横軸）                         骨髄、脳、大腿骨、股関節、膝関節、肺
２４ｈ  ｐｉ（注射後）
［図８Ｂ］
（縦軸）                         総ＤＮＡ１００ｎｇ当たりのｐＤＮＡのコピー数
（横軸）                         骨髄、脳、大腿骨、股関節、膝関節、肺
［図９］
（縦軸）                         発光、数値、カラースケール、最小、最大
［図１０Ａ］
（末尾）                         （配列番号：１）
［図１０Ｂ］
（末尾）                         （配列番号：２）
【図１Ａ】
2014504149.tif 000004
【図１Ｂ】
2014504149.tif 000005
【図２Ａ】
2014504149.tif 000006
【図２Ｂ】
2014504149.tif 000007
【図２Ｃ】
2014504149.tif 000008
【図３Ａ】
2014504149.tif 000009
【図３Ｂ】
2014504149.tif 000010
【図４Ａ】
2014504149.tif 000011
【図４Ｂ】
2014504149.tif 000012
【図５Ａ】
2014504149.tif 000013
【図５Ｂ】
2014504149.tif 000014
【図６Ａ】
2014504149.tif 000015
【図６Ｂ】
2014504149.tif 000016
【図６Ｃ】
2014504149.tif 000017
【図７Ａ】
2014504149.tif 000018
【図７Ｂ】
2014504149.tif 000019
【図７Ｃ】
2014504149.tif 000020
【図７Ｄ】
2014504149.tif 000021
【図８Ａ】
2014504149.tif 000022
【図８Ｂ】
2014504149.tif 000023
【図９】
2014504149.tif 000024
【図１０Ａ】
2014504149.tif 000025
【図１０Ｂ】
2014504149.tif 000026
【図１０Ｃ】
2014504149.tif 000027
【図１０Ｄ】
2014504149.tif 000028
【図１０Ｅ】
2014504149.tif 000029
【配列表】
2014504149000001.app
【国際調査報告】
2014504149.tif 000030
2014504149.tif 000031
2014504149.tif 000032
2014504149.tif 000033
2014504149.tif 000034