(57)【要約】本発明は、免疫応答を調節するための材料および方法を提供する。ある態様において、本発明は、最初の人工のリンパ節ホーミング環境を提供し、同時にまたはその後に、人工の脾臓環境を提供して、活性化された免疫応答の収束を導く。ある特定の態様において、本発明は、病原性感染症、癌、アレルギー反応、および／または望ましくない免疫応答もしくは自己免疫応答を予防および／または治療するために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的抗原、自己抗原またはアレルゲンに対する防御免疫応答を誘導するための方法であって、そのような免疫応答を必要とする対象に、炎症誘発性アジュバントおよび抗炎症性アジュバントを投与する段階を含み、該標的抗原、自己抗原またはアレルゲンを投与する段階をさらに含む、前記方法。
【請求項２】
炎症誘発性アジュバントが以下の1つまたは複数を含む、請求項1記載の方法：
水酸化アルミニウム（Alum）、リポ多糖（LPS）、シトシン-グアノシン（CpG）オリゴヌクレオチド（CpG-ODN）配列、ポリイノシン：ポリシチジン酸（poly IC）、炎症誘発性サイトカイン、CpGリッチオリゴヌクレオチド、ロイコトリエン、アラキドン酸、プロスタグランジン、アラキドン酸経路アクチベーター、シクロオキシゲナーゼ経路アクチベーター、不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、およびムラミルジペプチド（MDP）を含むフロイントアジュバント。
【請求項３】
抗炎症性アジュバントが以下の1つまたは複数を含む、請求項1記載の方法：
ヘモグロビン：ハプトグロビン、ヘミン、ヘム：ヘモペキシン、非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）、トリテルペノイド、ピルビン酸エチル（EP）、ヘムオキシゲナーゼ（HO-1）経路アクチベーター、アラキドン酸経路阻害剤、およびCOX経路阻害剤。
【請求項４】
炎症誘発性アジュバントの後に抗炎症性アジュバントが投与される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
炎症誘発性アジュバントと抗炎症性アジュバントが同時に投与される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
免疫細胞の遊走を誘導する免疫調節分子を投与する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
GM-CSF、G-CSF、またはその双方から免疫調節分子が選択される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
病原性感染症、癌、アレルギー、免疫疾患、および／または自己免疫疾患を予防または治療するために使用される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
1型糖尿病を予防または治療するために使用される、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
以下を含む、対象における免疫応答を調節するためのデバイス：
炎症誘発性作用物質、抗炎症性作用物質、および抗原、自己抗原またはアレルゲンを包含する、生体適合性材料から作られた足場マトリックス。
【請求項１１】
前記足場マトリックスがハイドロゲルを含む、請求項10記載のデバイス。
【請求項１２】
前記足場マトリックスが免疫細胞の遊走を誘導する免疫調節分子をさらに包含する、請求項10記載のデバイス。
【請求項１３】
前記免疫調節分子がGM-CSF、G-CSF、またはその双方から選択される、請求項12記載のデバイス。
【請求項１４】
前記足場マトリックスが微粒子をさらに含み、該微粒子が少なくとも抗原、自己抗原またはアレルゲンをその中に封入し、該微粒子の外側表面が、標的免疫細胞に結合する1つまたは複数の表面リガンドを含む、請求項12記載のデバイス。
【請求項１５】
前記微粒子がPLGAを含む材料から作られる、請求項14記載のデバイス。
【請求項１６】
以下を含む、対象における免疫応答を調節するためのデバイスであって、微粒子の外側表面が、標的免疫細胞に結合する1つまたは複数の表面リガンドを含む、デバイス：
（1）以下を包含する足場マトリックスを含む、炎症誘発性組成物：
（a）免疫細胞の遊走を誘導する免疫調節分子、
（b）炎症誘発性作用物質、および
（c）少なくとも抗原、自己抗原、またはアレルゲンをその中に封入する微粒子；
ならびに
（2）抗炎症性作用物質を包含する足場マトリックスを含む、抗炎症性組成物。
【請求項１７】
炎症誘発性組成物が放出された後に抗炎症性組成物が放出される、請求項16記載のデバイス。
【請求項１８】
前記足場マトリックスがハイドロゲルを含む材料から作られる、請求項16記載のデバイス。
【請求項１９】
前記免疫調節分子がGM-CSF、G-CSF、またはその双方から選択される、請求項16記載のデバイス。
【請求項２０】
前記免疫細胞が樹状細胞である、請求項16記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
牛痘への曝露が天然痘に対する防御になったというジェンナー（Edward Jenner）の知見以来、ワクチン接種領域においては幾つかの目覚ましい成功や進歩が認められているものの、数多くの感染因子や病態に対する防御免疫を達成するためにはなおも大きな課題が残されている。
【０００２】
一般に、ワクチンとは特定の疾患に対する免疫力を向上させる生物学的調製物である。ワクチンは典型的に、疾患を引き起こす物質群に似た作用物質を含む。該作用物質によって身体の免疫系が刺激されて、その作用物質を異物と認識し、破壊し、「記憶する」ようになることによって、免疫系が後に遭遇するそのような病原体をより容易に認識し破壊することができるようになる。
【０００３】
ワクチンは、予防的なもの（例えば、天然または「野生型」の病原体によって将来起こり得る感染による影響を予防または改善するためのもの）、または治療的なもの（例えば、癌に対するワクチンも研究されている；癌ワクチンを参照のこと）であることが可能である。
【０００４】
癌および病原性感染症に対する免疫法について、従来的なワクチン設計では主に、「炎症誘発性の」反応の誘導に焦点が当てられている。
【０００５】
他方、自己免疫疾患の治療では、自己抗原ワクチン接種法の一般概念は、免疫寛容を誘導することである。しかし、1型糖尿病の治療のための樹状細胞ワクチンの現行の使用には幾つか制限がある。例えば、樹状細胞ワクチンでは、患者の細胞をエクスビボにおいて改変してからその改変細胞を患者に導入する必要がある。残念ながら、本アプローチでは患者の安全性に有害な影響を与えるのみならず、高いコストも伴う。さらに、現行の樹状細胞ワクチン組成物のエクスビボにおける安定性は至適とはいえない。
【０００６】
したがって、感染、癌、および自己免疫疾患の予防および／または治療のための、より改善されたワクチン技術およびワクチン組成物の開発が必要とされている。また、患者の体内で免疫細胞を直接プログラムおよび改変するための、より改善された材料および方法が必要とされている。以下の開示から明らかとなるように、本発明によってこれらおよびその他の利点が提供される。
【発明の概要】
【０００７】
簡単な概要
本発明は、免疫応答を調節するための材料および方法を提供する。ある態様において、本発明は人工のリンパ節環境を提供し、同時にまたはその後に、人工の脾臓環境を提供する。好都合にも、これらの環境を提供することにより、免疫応答の有効な収束が導かれる。
【０００８】
ある特定の態様において、本発明の材料および方法は、病原性感染症、癌、アレルギー反応、および／または免疫疾患もしくは自己免疫疾患を予防および／または治療するために使用することができる。
【０００９】
ある態様において、本発明は、少なくとも炎症誘発性作用物質、抗炎症性作用物質、および任意で抗原、自己抗原またはアレルゲンをその中に封入する、生体適合性材料から作られた足場マトリックスを含む、免疫応答を調節するためのデバイスを提供する。ある特定の態様において、本発明の免疫調節デバイスはワクチンとして処方される。
【００１０】
ある態様において、足場マトリックスは微粒子をその中に封入し、該微粒子の外側表面は標的免疫細胞に結合する1つまたは複数の表面リガンドを含み、かつ該微粒子は少なくとも抗原、自己抗原またはアレルゲンをその中に封入する。
【００１１】
ある特定の態様において、足場マトリックスは化学誘因物質をさらに含む。化学誘因物質は例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、またはその双方から選択することができる。ある特定の態様において、足場材料はハイドロゲルである。ある態様において、微粒子はポリ（乳酸-グリコール酸共重合体）（PLGA）から作られる。
【００１２】
本発明のその他の局面は、免疫応答を調節するための方法を提供する。ある態様において、本方法は、炎症誘発性アジュバントおよび抗炎症性アジュバントを、そのような調節を必要とする対象に投与する段階を含み、抗原、自己抗原またはアレルゲン、および任意で、免疫細胞の遊走を誘導する免疫調節分子を投与する段階をさらに含む。
【００１３】
ある態様において、免疫調節はインサイチューにおいて免疫細胞（例えば抗原提示細胞）をプログラムすることにより達成される。限定しないが、樹状細胞、マクロファージおよびB細胞を含む抗原提示細胞を本発明のデバイスに動員し、その表面上に抗原、自己抗原またはアレルゲンをT細胞に対して提示するように活性化することができる（初回抗原刺激）；プログラムされた免疫細胞はその後、デバイスから出てリンパ節に向かって遊走する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】炎症誘発性アジュバントおよび抗炎症性アジュバントの双方を皮下注射した後の糖尿病罹患率のKaplan-Meierプロットを示す。注射によって糖尿病の予防がもたらされたことが認められる（n =10/群、p= 0.0437）。
【図２】マウス脾細胞からのIL-10産生に対するアジュバント刺激の効果を示す。生体マウス由来の脾細胞は、CpG単独またはCpGとHb:Hpの組み合わせのいずれかによって細胞が刺激された場合に、著しくより高いレベルのIL-10を産生した [28週齢、n= 5、ANOVA、****P< 0.0001]。
【００１５】
配列の簡単な説明
SEQ ID NO:1は、本発明に照らして有用なヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）ポリペプチドのアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:2は、本発明に照らして有用なヒト顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）ポリペプチドのアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
詳細な開示
本発明は、免疫応答を調節するための材料および方法を提供する。ある態様において、本発明は、最初に免疫活性化シグナルを、同時にまたはその後に、活性化された免疫応答を鈍化させるためのシグナルを対象に送達し、それにより免疫応答の有効な調節および収束を導く。
【００１７】
具体的には、ある態様において、本発明は、人工のリンパ節環境、および、同時にまたはその後に人工の脾臓環境を提供し、免疫応答の有効かつ効率のよい収束を導く。ある特定の態様において、本発明は、病原性感染症および／または癌に対する防御免疫応答を提供する。その他の態様において、本発明は、アレルギー反応および／または望ましくない自己免疫応答を低減するために使用することができる。
【００１８】
本発明は様々な態様において、独自の免疫系調節指針に従ったプライム-ブースト設計にて抗原（感染性疾患または癌に関連）、自己抗原（自己免疫疾患に関連）、またはアレルゲン（アレルギーに関連）を提供する。ある特定の態様においては、「プライム」相は炎症誘発性アジュバントの投与によって成される一方、「ブースト」相は抗炎症性アジュバントの投与によって成される。
【００１９】
ある態様において、炎症誘発性アジュバントは、アラキドン酸／シクロオキシゲナーゼ（COX）経路のような、炎症誘発経路を活性化するリンパ節型の環境を提供する。本発明に照らして有用な例示的な炎症誘発性アジュバントは、限定しないが、水酸化アルミニウム（Alum）、リポ多糖（LPS）、シトシン-グアノシン（CpG）オリゴヌクレオチド（CpG-ODN）配列、およびポリイノシン：ポリシチジン酸（polyIC）を含む。
【００２０】
ある態様において、抗炎症性アジュバントは、例えばヘムオキシゲナーゼ-1（HO-1）経路のような、抗炎症経路を活性化する脾臓型の環境を提供する。本発明に照らして有用な、例示的な炎症誘発性アジュバントは、限定しないが、ヘモグロビン：ハプトグロビン、ヘミン、ヘム：ヘモペキシン、非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）、およびトリテルペノイドを含む。
【００２１】
ある態様において、炎症誘発性アジュバントの投与により、例えばアラキドン酸／シクロオキシゲナーゼ（COX）経路のような、炎症誘発経路を活性化する人工の高脂肪／低ヘモグロビン環境が提供される。COX経路のこの活性化により、プロスタグランジンおよびロイコトリエンが産生され得、したがって免疫応答の急性期の反応が亢進される。
【００２２】
抗炎症性アジュバントの投与により、ヘムオキシゲナーゼ-1（HO-1）経路のような抗炎症経路を活性化する低脂肪／高ヘモグロビンの脾臓型の環境が提供される。ヘムオキシゲナーゼ-1の活性化により、IL-10、一酸化炭素、およびビリベルジンのような抗炎症性分子の産生がもたらされる。ビリベルジンはさらにビリルビンに分解され得る。好都合にも、炎症誘発性アジュバントおよび抗原、自己抗原、またはアレルゲンによって活性化された炎症反応の収束の際に、免疫細胞はその抗原、自己抗原、またはアレルゲンについての免疫記憶を獲得する。
【００２３】
本発明は、対象における免疫応答を調節するためのデバイスも提供する。ある態様において、本デバイスは生体適合性材料から作られた足場マトリックスを含む。好ましい態様において、足場マトリックスは炎症誘発性作用物質、抗炎症性作用物質、および抗原、自己抗原またはアレルゲンを捕捉する。ある態様において、本発明は、人工のリンパ節および脾臓の「二重環境」を構築する「オールインワンの」デバイスを提供することにより、ワクチン接種の効率および有効性を高める。
【００２４】
ある特定の態様において、本デバイスは、樹状細胞およびT細胞を注入部位に指向させる化学誘因物質、動員された免疫細胞に細胞外にて作用する炎症誘発性アジュバントおよび／または抗炎症性アジュバント、ならびに、少なくとも抗原、自己抗原、またはアレルゲン、および任意で、付加的なアジュバントおよび治療用物質をその中に封入する微粒子をさらに包含する、注入可能なハイドロゲルを含む。ある態様においては、微粒子が免疫細胞（樹状細胞など）による食作用を受け；その結果、微粒子に封入された作用物質（抗原、自己抗原またはアレルゲン、および付加的なアジュバントなど）が免疫細胞の細胞内に輸送されることが可能となる。
【００２５】
したがって、ある態様において、本発明は、（a）化学誘因物質；（b)アジュバント；および（c)少なくとも抗原、自己抗原、またはアレルゲンを封入する微粒子（例えばPLGAから作られる）を包含するハイドロゲルベースの足場マトリックスを含む、免疫調節デバイスを提供する。
【００２６】
免疫調節デバイスは、アジュバント、化学誘因物質、抗原、自己抗原、またはアレルゲン、および好ましくは、付加的な治療用物質の時限放出を提供することが可能である。ある態様において、微粒子のサイズは、免疫細胞が微粒子を貪食することを可能にし、かつ微粒子の外側の表面は、特定の免疫細胞を標的とする1つまたは複数の表面リガンドまたは表面抗体をさらに含み得る。
【００２７】
免疫応答を調節するためのデバイス
本発明は、対象における免疫応答を調節するためのデバイスを提供する。ある態様において、本デバイスは、炎症誘発性作用物質、抗炎症性作用物質、および任意で抗原、自己抗原、またはアレルゲンをその中に封入する、生体適合性材料から作られた足場マトリックスを含む。抗炎症性作用物質は、炎症誘発性作用物質が放出された後に放出されることが可能である、または、抗炎症性作用物質と炎症誘発性作用物質が同時に放出されることが可能である。
【００２８】
本発明に照らして有用な生体適合性足場材料は、限定しないが、ハイドロゲル、コラーゲン、アルギン酸塩、ポリ（グリコリド）（PGA）、ポリ（L-ラクチド）（PLA）、ポリ（ラクチド-グリコリド共重合体）（PLGA）、およびポリエチレングリコール（PEG）を含む。
【００２９】
ある態様において、足場マトリックスは、ハイドロゲルを含む材料から作られる。本発明のハイドロゲルは、例えばビニルスルホン、アクリル多糖誘導体、チオール多糖誘導体、アクリルポリエチレングリコール誘導体、チオールポリエチレングリコール誘導体、およびその任意の組み合わせから選択される、1つまたは複数のハイドロゲル形成ポリマーから作られることが可能である。
【００３０】
ある態様においては、抗原提示細胞およびエフェクター細胞（限定しないが樹状細胞、マクロファージ、B細胞、およびT細胞を含む）がデバイスに動員され、活性化されてその表面上に抗原、自己抗原、またはアレルゲンを提示する（初回抗原刺激）；その後、プログラムされた免疫細胞がデバイスから出てリンパ節まで遊走し得る。
【００３１】
好ましくは、足場マトリックスは多孔構造を有しており、骨髄細胞、脾細胞、ならびに限定しないが樹状細胞、マクロファージ、B細胞、およびT細胞を含む免疫細胞のような細胞の出入りが可能である。足場マトリックスは、炎症誘発性もしくは抗炎症性の作用物質もしくはアジュバント、抗原、自己抗原、またはアレルゲン、および治療用物質の細胞外輸送を可能にする。
【００３２】
足場マトリックスは例えば、骨髄細胞、脾細胞、例えば樹状細胞、マクロファージ、B細胞、およびT細胞などの免疫細胞のような細胞より大きなサイズを有することが可能である。特定の態様において足場マトリックスは1μm〜200μm、またはその間の任意の値の直径を有する。特定の態様において足場マトリックスの孔は0.5μm〜20μm、またはその間の任意の値の直径を有する。
【００３３】
ある態様において、本発明の炎症誘発性作用物質は抗原、自己抗原、またはアレルゲンの免疫原性を増強する。炎症誘発性作用物質は、炎症誘発性アジュバントの形態にあることが可能である。本発明に照らして有用な炎症誘発性の作用物質またはアジュバントは、限定しないが、以下を含む：水酸化アルミニウム（Alum）、リポ多糖（LPS）、シトシン-グアノシン（CpG）オリゴヌクレオチド（CpG-ODN）配列、ポリイノシン：ポリシチジン酸（poly IC）、炎症誘発性ケモカイン／IL-2、IL-4、IL-18のようなサイトカイン、CpGリッチオリゴヌクレオチド、ロイコトリエンA4（LTA4）、ロイコトリエンB4（LTB4）、ロイコトリエンC4（LTC4）、ロイコトリエンD4（LTD4）、ロイコトリエンE4（LTE4）のようなロイコトリエン、アラキドン酸、プロスタグランジン、アラキドン酸経路アクチベーター、シクロオキシゲナーゼ（COX-1および／またはCOX-2を含むCOX）経路アクチベーター、不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、およびムラミルジペプチド（MDP）を含むフロイントアジュバント。
【００３４】
本発明に従って使用される抗炎症性作用物質は、炎症反応を抑制する。ある態様において、抗炎症性作用物質は抗炎症性アジュバントである。本発明に照らして有用な抗炎症性の作用物質またはアジュバントは、限定しないが、以下を含む：ヘモグロビン：ハプトグロビン、ヘミン、ヘム：ヘモペキシン、アスピリン、イブプロフェン、およびナプロキセンのような非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）、ベツリン酸、バルドキソロンメチル、およびトリテルペノイドサポニンのようなトリテルペノイド、ピルビン酸エチル（EP）、ヘムオキシゲナーゼ（HO-1）経路アクチベーター、アラキドン酸経路阻害剤、ならびにCOX経路阻害剤。
【００３５】
ある態様において、本発明に照らして有用な免疫調節分子は、限定しないが、骨髄細胞、脾細胞、例えば樹状細胞、マクロファージ、B細胞のような抗原提示細胞、およびT細胞を含む免疫細胞を含む細胞の遊走を誘導する。ある態様において、免疫調節分子は、例えば、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、およびCCL28などのCCケモカイン、CXCケモカイン、Cケモカイン、ならびにCX3Cケモカインのような、ケモカインまたは化学誘因物質である。
【００３６】
ある態様において、免疫細胞の遊走を誘導する免疫調節分子は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）ポリペプチドまたは顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）ポリペプチドから選択される。本発明に照らして有用なGM-CSFポリペプチドおよびG-CSFポリペプチドは、内在源から単離することができ、組換え技術によって作製することができ、または、化学的に合成することができる。ある態様において、GM-CSFポリペプチドおよび／またはG-CSFポリペプチドは、哺乳類のGM-CSFポリペプチドのヒト化誘導体である。GM-CSFポリペプチドおよびG-CSFポリペプチドを誘導できる例示的な哺乳類種は、限定しないが、マウス、ラット、ハムスター、および霊長類を含む。
【００３７】
ある態様において、本発明に照らして有用なGM-CSFポリペプチドは、SEQ ID NO:1（GenBankアクセッション番号AAA52578）のアミノ酸配列を有するヒトGM-CSFである。ある態様において、本発明に照らして有用なGM-CSFポリペプチドは、少なくとも80％、85％、90％、95％、または99％の、SEQ ID NO:１との同一性を有する。ある態様において、本発明に照らして有用なG-CSFポリペプチドは、SEQ ID NO:2（GenBankアクセッション番号ADI49832）のアミノ酸配列を有するヒトG-CSFである。ある態様においては、本発明に照らして有用なG-CSFポリペプチドは、少なくとも80％、85％、90％、95％、または99％の、SEQ ID NO:2との同一性を有する。
【００３８】
ある態様において、本発明に照らして有用な抗原は、対抗する防御免疫応答が誘導される感染性病原体の、生きているまたは生きていない抗原性／免疫原性成分に由来し得る。本発明に照らして有用な抗原は、例えば百日咳、ポリオ、肝炎、麻疹、ムンプス、風疹、インフルエンザ、天然痘、帯状疱疹、炭疽、破傷風、ロタウイルス、狂犬病、水痘、髄膜炎菌、ジフテリア、アンパピローマウイルス、脳炎ウイルス、肺炎球菌、肺炎、発疹チフス、腸チフス、レンサ球菌、ブドウ球菌、ナイセリア、ライム病、コレラ、大腸菌、赤痢菌、リーシュマニア、らい病、サイトメガロウイルス（CMV）、RSウイルス、エプスタイン‐バーウイルス、ヘルペス、パラインフルエンザ、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、水痘、黄熱、フラビウイルス、デング熱、トキソプラズマ症、コクシジオイデス症、住血吸虫症、マラリア、クラミジア・トラコマティス（Chlamydia trachomatis）、肺炎クラミジア（Chlamydia pneumonaie）、結核菌、およびヘリコバクターピロリ菌（H.pylori）のような細菌、ウイルス、真菌、または他の病原体に由来し得る。
【００３９】
ある態様において、本発明に照らして有用な抗原は、腫瘍抗原または癌抗原である。腫瘍抗原または癌抗原は、対抗する防御免疫が誘導される非悪性、悪性、または転移性の腫瘍細胞／癌細胞に由来し得る。例えば、腫瘍抗原または癌抗原は、腫瘍細胞および／または癌細胞の表面上に発現する抗原性／免疫原性エピトープに由来し得る。本発明の腫瘍抗原または癌抗原の例示的な態様は、乳房、肺、結腸、胃、口腔、食道、骨髄、胃、CNS、および肝臓の癌腫細胞に由来し得る。
【００４０】
本発明に照らして有用な自己抗原は、望ましくない自己免疫反応を誘発し得る内在性の抗原性ペプチドまたはペプチドフラグメントに由来し得る。
【００４１】
糖尿病の場合、本発明に照らして有用な自己抗原は、例えば、インスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）、およびインスリノーマ関連タンパク2（IA-2）であり得る。
【００４２】
ある態様において、本発明に照らして有用なアレルゲンは、アレルギー反応を誘発するタンパク質、ペプチド、核酸、または他の物質であり得る。例えば、アレルゲンは、ピーナッツ、ゴマ、牛乳、小麦、および花粉の、タンパク質、ペプチド、核酸、または他の無毒の物質に由来し得る。
【００４３】
さらなる態様において、免疫調節デバイスは、本発明に照らして有用な、抗原、自己抗原、もしくはアレルゲンをコードする核酸、または抗原、自己抗原、もしくはアレルゲンに特異的に結合する抗体もしくは自己抗体をさらに含む。特定の態様において、足場マトリックスは、本発明に照らして有用な核酸、抗体、および／または自己抗体をさらに含む。ある特定の態様において、微粒子は、本発明に照らして有用な核酸、抗体、および／または自己抗体をその中にさらに封入する。
【００４４】
「特異的な結合」または「特異性」は、標的とする抗原、抗体、または他の物質に専ら結合し、一方、標的でないものに対しては比較的弱い非特異的な親和性を有する、抗原、抗体または他の物質の能力を指す。特異性は、例えばBiacore機器を用いた結合アッセイまたは競合結合アッセイによって決定することができる。特異性は、例えば特異的な標的との結合に対する無関係の分子との非特異的な結合における、約10：1、約20：1、約50：1、約100：1、10.000：1またはそれ以上の親和性／結合力の比率により、数学的に計算することができる。
【００４５】
ある特定の態様において、本発明の免疫調節デバイスは、標的免疫細胞の遊走を誘導する免疫調節分子、アジュバント、微粒子、および1つまたは複数の付加的な治療用物質を包含する足場マトリックスを含み；該微粒子の外側表面は、標的免疫細胞に結合する1つまたは複数の表面リガンドを含み、かつ該微粒子は、少なくとも抗原、自己抗原、またはアレルゲンをその中に封入する。
【００４６】
ある態様において、本発明の免疫調節デバイスは以下を含む：
（1）以下を包含する生体適合性足場マトリックスを含む、炎症誘発性組成物：
（a）免疫細胞の遊走を誘導する免疫調節分子、
（b）炎症誘発性の作用物質および／またはアジュバント、
（c）少なくとも以下をその中に封入する微粒子
（i）抗原、自己抗原、またはアレルゲン、
（ii）任意で、炎症誘発性の作用物質またはアジュバント、および、
（iii）任意で、1つまたは複数の付加的な治療用物質、ならびに
（d）任意で、1つまたは複数の治療用物質；ならびに
（2）以下を包含する足場マトリックスを含む、抗炎症性組成物：
（a）抗炎症性の作用物質またはアジュバント、
（b）任意で、免疫細胞の遊走を誘導する免疫調節分子、
（c）任意で、抗原、自己抗原、またはアレルゲン、
（d）任意で、1つまたは複数の付加的な治療用物質、ならびに
（e）任意で、少なくとも以下をその中に封入する微粒子
（i）抗原、自己抗原、またはアレルゲン、
（ii）任意で、抗炎症性の作用物質またはアジュバント、および
（iii）任意で、1つまたは複数の付加的な治療用物質。
【００４７】
ある態様において、足場マトリックスは細胞の出入りを可能にし、貪食されることはない。その結果、足場マトリックスに包含された物質が細胞外にて放出されることが可能である。ある態様においては、微粒子が免疫細胞によって貪食され得る。その結果、微粒子に封入された物質が免疫細胞内に放出されることが可能である。
【００４８】
本発明に照らして有用な付加的な治療用物質は、例えば、免疫調節剤、トランスフォーミング増殖因子β1、ラパマイシン、ビタミンD、およびレチノイン酸を含む。治療用物質は親水性または疎水性の物質であることが可能である。
【００４９】
好ましい態様において、足場マトリックスおよび微粒子は、実質的に、生物学的に不活性または生物学的に適合性の材料から作られる。本明細書において使用される「不活性の」、「生物学的に不活性の」または「生物学的に適合性の」という用語は、生きている組織に投与された場合に、正常な回復期の後に実質的に有害な生化学反応、アレルギー反応、または望ましくない免疫応答を誘発しないような物質または材料を指す。好ましくは、足場マトリックスおよび微粒子は生分解性である。
【００５０】
ある態様において、微粒子の外側表面は、特定の免疫細胞を標的とする1つまたは複数の表面リガンドまたは表面抗体を含む。好ましくは、表面リガンドまたは抗体は、免疫細胞におけるアポトーシスおよび／または免疫寛容誘導経路の誘導も行う。樹状細胞に対する例示的な表面リガンドは、限定しないが、ホスファチジルセリン（PS）｛PS受容体｝、4N1K｛CD 36/CD 47｝、PD2｛CD11c｝、P2｛CD11b｝、RGD｛αvβ3｝、およびCS1｛α4β7｝を含む。その他の態様において、表面抗体は、樹状細胞を認識する抗DEC-205抗体である。好ましい態様において、微粒子は、樹状細胞を標的化するためにPD2によって表面を修飾される。
【００５１】
ある態様において、微粒子は免疫細胞（樹状細胞など）より小さい。ある態様において、微粒子は免疫細胞（樹状細胞など）による貪食が可能であり、それにより、関心対象の治療用物質の細胞内輸送を可能にする。貪食によって、PLGAのようなポリマーマトリックスからの、封入されていた抗原、自己抗原、および／またはアレルゲンのエンドソーム放出が可能となる。ある態様において、クロスプレゼンテーションを通して、MHC-II誘導の免疫応答およびMHC-I誘導の免疫応答の双方が微粒子によって生み出される。
【００５２】
微粒子は0.5μm〜10.0μm、0.5μm〜8.0μm、0.5μm〜5.0μm、0.5μm〜3.0μm、0.5μm〜2.0μm、0.5μm〜1.0μmの直径を有し得る。ある態様において、微粒子は約1.0μmの直径を有する。
【００５３】
ある態様において、免疫調節デバイスは注射用ワクチン調合物として処方される。
【００５４】
免疫応答を調節する方法
本発明の付加的な局面は、最初に人工のリンパ節環境を提供し、そして同時に、またはその後に、人工の脾臓環境を提供することにより、活性化された免疫応答の収束を導くことによって、対象における免疫応答を調節する方法を提供する。好都合にも、本発明は感染、癌、アレルギーおよび／または自己免疫疾患に対する、均衡のとれた防御免疫を提供する。ある特定の態様において、本発明は、1型糖尿病の予防および／または治療のために有用な、改善されたワクチン接種法を提供する。
【００５５】
ある態様において、本方法は、炎症誘発性アジュバントおよび抗炎症性アジュバントをそのような治療を必要とする対象に投与する段階を含み、抗原、自己抗原またはアレルゲン、および免疫細胞の遊走を誘導する免疫調節分子を投与する段階をさらに含む。  
【００５６】
ある特定の態様においては、炎症誘発性アジュバントと抗炎症性アジュバントが同時に投与される。その他の特定の態様においては、抗炎症性アジュバントは炎症誘発性アジュバントの投与後に投与される。
【００５７】
さらなる態様において、本方法は、本発明に照らして有用な、抗原、自己抗原、もしくはアレルゲンをコードする核酸、または抗原、自己抗原、もしくはアレルゲンに特異的に結合する抗体もしくは自己抗体を投与する段階をさらに含む。
【００５８】
ある態様において、免疫応答を調節する方法は以下を含む：
（1）炎症誘発性の作用物質もしくはアジュバント、抗原、自己抗原、またはアレルゲン、および免疫細胞の遊走を誘導する免疫調節分子を含む有効量の炎症誘発性組成物を包含する生体適合性足場マトリックスを投与する段階；ならびに
2）抗炎症性の作用物質またはアジュバントを含む有効量の抗炎症性組成物を包含する生体適合性足場マトリックスを投与する段階。
【００５９】
ある態様においては、免疫応答を調節する方法は以下を含む：
（1）以下を包含する足場マトリックスを含む炎症誘発性組成物を投与する段階：
（a）免疫細胞の遊走を誘導する免疫調節分子、
（b）炎症誘発性の作用物質および／またはアジュバント、
（c）少なくとも以下をその中に封入する微粒子、
（i）抗原、自己抗原、もしくはアレルゲン、
（ii）任意で、炎症誘発性の作用物質もしくはアジュバント、
および
（iii）任意で、1つもしくは複数の付加的な治療用物質、ならびに
（d）任意で、1つまたは複数の治療用物質；ならびに
（2）以下を包含する足場マトリックスを含む抗炎症性組成物を投与する段階：
（a）抗炎症性の作用物質またはアジュバント、
（b）任意で、免疫細胞の遊走を誘導する免疫調節分子、
（c）任意で、抗原、自己抗原、またはアレルゲン、
（d）任意で、1つまたは複数の付加的な治療用物質、ならびに
（e）任意で、少なくとも以下をその中に封入する微粒子、
（i）抗原、自己抗原、もしくはアレルゲン、
（ii）任意で、抗炎症性作用物質もしくは抗炎症性アジュバント、および
（iii）任意で、1つもしくは複数の付加的な治療用物質。
【００６０】
好ましい態様において、足場マトリックスは、ハイドロゲルを含む生体適合性材料から作られる。好ましい態様において、微粒子は、ポリ（乳酸-グリコール酸共重合体）（PLGA）を含む材料から作られる。ある態様において、免疫細胞の遊走を誘導する免疫調節分子は、GM-CSF、G-CSF、またはその双方から選択される。
【００６１】
ある態様において、免疫調節デバイス／組成物は注射を介して投与される。
【００６２】
疾患の予防および／または治療
本発明は、病原性感染症、癌、アレルギー、および／または自己免疫疾患の予防、治療、または改善のための方法も提供する。本方法は、本発明の免疫調節デバイスまたは組成物の有効量を、そのような治療を必要とする対象に投与する段階を含む。ある特定の態様において、本発明は、1型糖尿病を予防および／または治療するために使用することが可能である。
【００６３】
本明細書にて使用される「治療」という用語またはその任意の文法的変形（例えば、治療する、治療する段階、および治療等）は、限定しないが、ある疾患の症状または状態を改善または緩和すること、ある状態の進行、重症度、および／または範囲を軽減すること、抑制すること、阻害すること、減弱させること、またはそれらに影響することを含む。
【００６４】
本明細書にて使用される「予防」という用語、またはその任意の文法的変形（例えば、予防する、予防する段階、および予防等）は、限定しないが、症状の発症の遅延、疾患の再燃の防止、再燃エピソードの数もしくは頻度の減少、症候性エピソード間の潜時の延長、またはその組み合わせを含む。
【００６５】
本明細書にて使用される「有効量」という用語は、疾患もしくは状態を治療もしくは改善できる量、またはさもなければ意図する治療効果を生じさせ得る量を指す。
【００６６】
ある態様において、当技術分野において公知のように、アレルギー、免疫疾患または自己免疫疾患の治療効果を、リコール反応によって決定できる。リコール反応は、抗原性刺激への二次的な遭遇に応じた抗体価、T細胞増殖能、および／またはサイトカイン放出量のいずれかによって測定することが可能である。例えば、自己免疫分野では、「免疫寛容原性ワクチン接種」後の読出しとして、制御性T細胞（Treg）、アネルギー性T細胞の増殖、T細胞の除去を測定するのが一般的である。ある態様においては、本発明に従って、ある抗原、自己抗原、またはアレルゲンによって対象を治療した後に、対象はその抗原、自己抗原、またはアレルゲンに対する防御免疫を獲得する；したがって、免疫（自然感染またはワクチンのいずれかによる）の後の、その抗原、自己抗原、またはアレルゲンとの二次的な遭遇は、穏和、静止的およびほとんど無症候性である（制御性Treg仲介の応答によるものに幾分類似している）。ある態様においては、本発明に従って治療された対象において、抗原、自己抗原、またはアレルゲンとの二次的な遭遇によって、より低い抗体価、より少ないT細胞増殖、および／またはより少ないサイトカイン放出がもたらされる。
【００６７】
本明細書にて使用される「対象」という用語は、本発明に従った組成物を用いた治療が与えられ得る、霊長類のような哺乳類を含む生物を表す。開示される治療法により恩恵を受ける可能性のある哺乳類種は、限定しないが、類人猿、チンパンジー、オランウータン、ヒト、サル；およびイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、マウス、ラット、モルモットおよびハムスターのような飼育動物を含む。
【００６８】
ある態様において、本発明は、感染、炎症、アレルギー反応、病的細胞増殖、血管新生、および悪性病変と関連する疾患の予防、治療または改善において使用することができる。
【００６９】
ある態様において、本発明は、細菌、ウイルス、真菌、原虫、および他の微生物によって引き起こされる病原性感染症の予防、治療または改善において使用することができる。ある態様において、本発明は、病原性感染症に対してワクチン接種を行うために使用することができる。本発明によって予防または治療できる感染の例示的な態様は、限定しないが、百日咳、ポリオ、肝炎、麻疹、ムンプス、風疹、インフルエンザ、天然痘、帯状疱疹、炭疽、破傷風、ロタウイルス、狂犬病、水痘、髄膜炎菌、ジフテリア、アンパピローマウイルス、脳炎、肺炎球菌、肺炎、発疹チフス、腸チフス、レンサ球菌、ブドウ球菌、ナイセリア、ライム病、コレラ、大腸菌、赤痢菌、リーシュマニア、らい病、サイトメガロウイルス（CMV）、RSウイルス、エプスタイン‐バーウイルス、ヘルペス、パラインフルエンザ、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、水痘ウイルス、黄熱、フラビウイルス、デング熱、トキソプラズマ症、コクシジオイデス症、住血吸虫症、マラリア、クラミジア・トラコマティス（Chlamydia trachomatis）、肺炎クラミジア（Chlamydia pneumoniae）、結核菌、およびヘリコバクターピロリ菌（H.pylori）による感染を含む。
【００７０】
ある態様において、本発明は、癌の予防、治療または改善において使用することができる。ある態様において、本発明は、癌に対する免疫化を行うために使用することができる。本発明によって予防または治療できる癌または癌腫の種類の例示的な態様は、限定しないが、乳房、肺、結腸、胃、口腔、食道、骨髄、胃、CNS、および肝臓の癌を含む。
【００７１】
ある態様において、本発明は、アレルギーまたはアレルギー反応の予防、治療または改善において使用することができる。
【００７２】
ある態様において、本発明は、免疫疾患および／または自己免疫疾患、特に1型糖尿病の予防、治療または改善において使用することができる。ある態様において、本発明は、限定しないが、1型糖尿病、関節リウマチ、クローン病、慢性炎症性腸疾患、移植片対宿主病や移植片拒絶、関節リウマチ、セリアック病、尋常性天疱瘡、喘息、鼻炎、慢性蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、および関連疾患を含む免疫疾患および自己免疫疾患を治療または改善するのに有用である。
【００７３】
処方および投与
本発明は、薬学的組成物を提供する。ある態様においては、この組成物は治療的に有効な量の本発明のデバイスまたは組成物を含み、任意で、薬学的に許容される担体を含む。
【００７４】
ある態様において、本発明のデバイスおよび組成物は、感染、癌、アレルギー、および／または自己免疫関連疾患を発症する一定のリスクを有する対象に投与するためのワクチン組成物に処方される。ワクチン組成物は、ある疾患に対する能動免疫を生じさせるために使用される、1つまたは複数の免疫原性抗原を含む抗原性調製物である。さらに、本発明の組成物は、感染、癌、アレルギーまたはアレルギー反応、ならびに炎症性および自己免疫関連疾患の疾病または症状が認められる対象に投与することができ、疾患の悪化を予防または最小化するために、オーダーメイドのワクチン計画およびワクチン組成物を提供する。
【００７５】
本発明の組成物は、経口、吸入、または静脈、皮下、局所、経皮、皮内、経粘膜、腹腔内、筋肉内、嚢内、眼窩内、心臓内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内への注射を含む非経口投与、注入、およびエレクトロポレーションを含む標準の経路によって、治療が行われる対象に投与することができるだけでなく、挿入される（一時的または永続的）任意の医療デバイスまたは医療用物品の成分として、対象に同時投与することもできる。
【００７６】
ある態様において、本発明のデバイスおよび組成物は、注射可能な調合物として処方される。ある特定の態様において、デバイスおよび組成物は、限定しないが、皮下注射、皮内注射、および筋肉内注射を含む経路により投与される。ある態様においては、本発明のデバイスは対象の組織に埋め込むか、または付着させることができる。
【００７７】
作用物質と共に使用するために適した非毒性の薬学的に許容される担体は、医薬製剤の技術分野における当業者には明らかである。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, seventeenth edition, ed. Alfonso R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, Pa.(1985)を参照されたい。
【００７８】
抗原、自己抗原、アレルゲンおよびアジュバントの治療用量の範囲は、本開示によって恩恵を受ける技術分野における当業者によって決定されることが可能である。当然ながら、そのような治療用量の範囲は患者の大きさ、種、および健康状態、患者の医学的状態の重症度、使用される特定の剤形、投与経路等によって異なってくる。
【００７９】
組成物は、望ましい効果を与えるために、単回、またはある期間に渡って複数回投与することができる。
【００８０】
好ましい態様において、本発明のデバイスおよび組成物は、非経口投与のために処方することができる。本発明の遺伝的構築物のような、1つまたは複数の作用物質を含む水性組成物の調製は、本開示に照らして当技術分野の当業者に知られるものとなる。典型的に、そのような組成物は、液体の溶液または懸濁液のいずれかの注射剤として調製することが可能である；注射前に液体を添加して溶液または懸濁液を調製するための使用に適した固形剤を調製することも可能である；そして調製物は乳化することも可能である。
【００８１】
注射剤の使用に適した製薬形態は、滅菌水溶液または分散液；ゴマ油、ピーナッツオイルまたは水性プロピレングリコールを含む調合物；および滅菌注射用溶液または分散液を即座に調製するための滅菌粉末を含む。全ての場合において、この形態は滅菌されていなければならず、容易な注射器使用可能性（syringability）が存在する程度に流動性がなければならない。製造および保管の条件下において安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物による汚染作用に対し保護されなければならない。
【００８２】
滅菌注射用溶液は、適当な溶媒に活性な化合物を必要量加え、その後ろ過滅菌を行うことにより調製される。一般に、分散液は、基礎分散媒および上記に挙げられるものからの必要な他の成分を含む滅菌担体に、様々な滅菌活性成分を加えることにより調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製の方法は、事前に滅菌ろ過されたその溶液から活性成分および任意の付加的な所望の成分の粉末をもたらす、真空乾燥法および凍結乾燥法である。
【００８３】
複数の投与を行う場合、作用物質の投与は同時にまたは時間をおいて順次に行うことができる。作用物質は前後に次々と、または同時に投与することができる。本方法はまた、網膜症または本明細書において説明される他の疾患を治療するために使用される他の薬剤との同時投与も含む。
【実施例】
【００８４】
以下は本発明を実施するための手順を例証する実施例である。この実施例は、限定するものと解釈されるべきではない。特記しない限り、全てのパーセントは重量パーセントであり、全ての溶媒混合比は容量比である。
【００８５】
実施例1
本実施例は、抗原／抗原性ペプチドおよび化学誘因物質を含む、アジュバントで修飾されたハイドロゲルベースのマトリックスの注射を介した、自己抗原提示による、1型糖尿病の予防および／または治療に関係する。
【００８６】
具体的には、インスリンB鎖:9-23およびCpG ODN 1826またはヘモグロビン：ハプトグロビン（Hb:Hp）から選択されるアジュバントを含む治療用組成物を送達するために、D,L-乳酸-グリコール酸共重合体(PLGA)から作られた生分解性の、貪食可能な微粒子（MP）を用いた。MPを化学誘因物質GM-CSFを含むハイドロゲル中に配置した。
【００８７】
12週齢の雌の非肥満糖尿病（NOD）マウスに、ワクチン組成物を皮下注射した。マウスは以下の群に分けられた（マウス10匹／群）：（a）非処置マウス；（b）GM-CSF、および空のMPを含むハイドロゲルにより処置したマウス；（c）GM-CSF、およびB-9-23を装填したMPを含むハイドロゲルにより処置したマウス；（d）GM-CSF、ならびに、CpGおよびB-9-23を装填したMPを含むハイドロゲルにより処置したマウス；（e）GM-CSF、ならびにHb:HpおよびB-9-23を装填したMPを含むハイドロゲルにより処置したマウス；（f）GM-CSF、およびCpG を装填したMPを含むハイドロゲルにより処置したマウス；ならびに（g）GM-CSF、およびHb:Hp を装填したMPを含むハイドロゲルにより処置したマウス。
【００８８】
血糖値は32週終了時まで、週1回測定した。Kaplan Meier分析により、生存率に関してのp値0.0636が明らかとなった。
【００８９】
生存率が最も高かったマウスは、GM-CSFを含むハイドロゲルベースの組成物、またはGM-CSFおよびCpG ODN 1826装填MPを含むハイドロゲルベースの組成物によって処置したマウスを含む（生存率40％に対して非処置の個体では0％）。
【００９０】
GM-CSFに向かう、脾細胞および骨髄細胞の運動能を評価するために、インビトロにおける細胞遊走アッセイを行った。本アッセイにおいてはNOD群、非肥満抵抗性（NOR）群、およびC57/BL6群（n=3／群）のマウス細胞を使用した。24時間後、GM-CSFの存在下において、C57/BL6群およびNOR群のマウスの全骨髄細胞および脾細胞は、細胞遊走における100％の増加を示した。NOD群の骨髄細胞は、NOR群およびC57/BL6群の骨髄細胞と同様の様式で移動した一方、NOD群の脾細胞は、GM-CSF の有無に関わらず、移動比に全く差異を示さなかった（p < 0.05）。
【００９１】
これにより、T1Dが末梢への細胞遊走障害と関連しており、この末梢への細胞遊走障害は、免疫調節療法に先立って骨髄細胞動員機構を改善することによって治療できることが示唆される。加えて、骨髄細胞動員作用物質（G-CSFなど）を免疫抑制剤（抗胸腺細胞グロブリンまたは抗CD3抗体など）と共に投与することにより、T1Dの治療において相乗効果が生み出されることが示唆される。
【００９２】
実施例2
注射用微粒子／ハイドロゲル系によって、抗原および免疫調節因子の制御された放出がもたらされた。
【００９３】
変性ヒトインスリンのための、貪食可能な送達担体として、ポリD,L-乳酸-グリコール酸共重合体微粒子（MP）を使用した（25μg インスリン／mg MP、5 mg MP／注射）。化学誘因物質 GM-CSFおよびアジュバントCpG ODN 1826（CpG）および／またはヘモグロビン：ハプトグロビン（Hb:Hp）を含むハイドロゲルとMPを混合した。CpGは炎症経路を誘導する一方、Hb:Hpはスカベンジャー受容体であるCD163によって結合され、HO-1およびIL-10を誘導する。
【００９４】
これらの調合物を、8週齢の雌のNODマウス（n=10例／群）に皮下注射した。全てのマウスに3回の注射を2週おきに行なった。
【００９５】
実施群は、空のMPを用いたGM-CSF群、空のMPを用いたGM-CSF／CpG／Hb:Hp群、インスリンMPを用いたGM-CSF／CpG群、インスリンMPを用いたGM-CSF／Hb:Hp群、およびインスリンMPを用いたGM-CSF／CpG／Hb:Hp群からなった。
【００９６】
これらの実験の結果は図面1および図面2において示される。
【００９７】
血糖値（BG）は28週齢まで週1回測定した。連続した2日間においてBGが250 mg/dLより高い場合には糖尿病と診断した。
【００９８】
インスリンMPを用いてGM-CSF／CpG／Hb:Hpにより処置した群が、正常血糖を維持した個体の比率が最も高かった（対照群において10％であるのに対して50％；p= 0.0199、Kaplan-Meier）。
【００９９】
機構的に、非処置NODマウスに由来する、CpG処理またはCpG／Hb:Hp処理した脾細胞は、非処理またはHb:Hp処理した脾細胞より著しく高いレベルのIL-10を産生した（n= 3、***P < 0.001）。この相乗作用から、HO-1経路に関与するために細胞の活性化が必要であることが示唆される。
【０１００】
本発明者らによる、細胞の活性化後にHO-1／IL-10経路を亢進する新規な方法は、炎症の収束および免疫寛容誘導のいずれにも寄与し得るものである。
【０１０１】
本明細書において言及または引用される全ての特許、特許出願、仮出願、および刊行物は、本明細書の明示的な開示に矛盾しない限り、全ての図面および表を含めてその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０２】
本明細書において説明される実施例および態様はあくまで例示を目的としたものであり、それに照らして様々な改変または変更が当技術分野における当業者に示唆されること、ならびに本明細書の精神および範囲内に包含されることを理解されるべきである。
【図１】
2014520162.tif 000002
【図２】
2014520162.tif 000003
【配列表】
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【国際調査報告】
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2014520162.tif 000005
2014520162.tif 000006
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