(57)【要約】  本発明は、細胞においてヒトSMN2をコードしている核酸を標的化し、十分に機能しない切断型転写産物SMN2Δ7ではなく全長SMN2 mRNAに有利に働く、SMN2 mRNAスプライシングの調節をもたらすオリゴマー化合物（オリゴマー）に関する。SMNΔ7mRNA発現の減少及び/又は全長SMN2 mRNA発現の増加は、SMN2の異常形態、特にSMN2Δ7の過剰発現若しくは望ましくない高レベルに関連する疾患又は障害、例えば脊髄性筋萎縮症（SMA）の治療に有益である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つのLNA単位を含む長さ10〜30ヌクレオチドのオリゴマーであって、該オリゴマーの核酸塩基配列が、Genbankアクセッション番号NG_008728（配列番号167）又はその天然に存在するバリアントのヌクレオチド26231〜26300、31881〜31945又は32111〜32170の対応する領域と少なくとも80％相補的である、上記オリゴマー。
【請求項２】
前記核酸塩基配列が、Genbankアクセッション番号NG_008728（配列番号167）のヌクレオチド26231〜26246、26274〜26300、31890〜31905、31918〜31945又は32115〜32162に対応する領域と少なくとも80％相補的である、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項３】
Genbankアクセッション番号NG_008728（配列番号167）のヌクレオチド26231〜26300と少なくとも80％相補的である、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項４】
前記オリゴマーの核酸塩基配列が、配列番号1、2、3〜16、19〜20、22、24〜34、35〜38、40、41、45〜49、60〜80又は83の配列と少なくとも80％同一である、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項５】
前記オリゴマーの核酸塩基配列が、配列番号1、5、9、11、12、26、27、28、29、30、34、40、53〜59、62、63、65、66、69〜77又は79の配列を有する、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項６】
SMN2 mRNAのスプライシングを調節して、全長SMN2 mRNA転写産物のレベルの増加をもたらす、請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項７】
核酸標的のRNアーゼH活性を誘発しない、請求項１〜６のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項８】
LNA及びDNAヌクレオチドのみを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項９】
4個未満の連続するDNA単位、例えば3個未満の連続するDNA単位、例えば2個未満の連続するDNA単位を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項１０】
前記オリゴマーがLNA及びDNAヌクレオチドを含み、3個以下の連続的なLNA単位、例えば2個以下の連続的なLNA単位があり、5'ヌクレオチドがLNA単位であり、3'ヌクレオチド、例えば2個の3'ヌクレオチドがLNA単位である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項１１】
長さ12〜16ヌクレオチドである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項１２】
ホスホロチオエートオリゴマーである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマーと、該オリゴマーに共有結合された少なくとも1つの非ヌクレオチド部分又は非ポリヌクレオチド部分とを含むコンジュゲート。
【請求項１４】
脊髄性筋萎縮症、例えばI型、II型又はIII型脊髄性筋萎縮症の治療用医薬などの、医薬として使用するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマー又は請求項１３に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマー又は請求項１３に記載のコンジュゲート、及び薬学的に許容される希釈剤、担体、塩又はアジュバントを含む医薬組成物。
【請求項１６】
SMN2 mRNAを発現しているヒト細胞においてSMN2 mRNAのスプライシングを調節するin vitro方法であって、該ヒト細胞に、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマー、又は請求項１３に記載のコンジュゲート、又は請求項１５に記載の医薬組成物を投与するステップを含み、該ヒト細胞においてSMN2 RNAのスプライシングが調節され、切断型SMN2 mRNAに対する全長SMN2 mRNAの比が増加する、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生存運動ニューロン2（SMN2）RNAに標的化し、SMN2 mRNAスプライシングの調節をもたらすオリゴマー化合物（オリゴマー）に関する。SMN2スプライシングの調節は、脊髄性筋萎縮症（SMA）の治療に有益であると考えられる。
【背景技術】
【０００２】
脊髄性筋萎縮症（SMA）は、脊髄内の運動ニューロンの変性を特徴とする常染色体劣性遺伝の神経筋疾患であり、四肢及び胴体の進行性脱力、それに続いて筋萎縮及び呼吸不全による死をもたらす。SMAは、幼児期において最も一般的な遺伝的死因である。SMA患者は、発症年齢及び臨床経過に基づいてI〜III型に一般に分類される。しかし、SMAの型は3つすべて、生存運動ニューロン遺伝子（SMN1）の変異によって引き起こされ、SMA患者の96％はこの遺伝子に変異を示す。Wirth, B、(2000) Human Mutation、15:228〜237頁。同じ染色体座、5q13に、この遺伝子のほとんど同一の2つのコピー、SMN1及びSMN2がある。SMN1のホモ接合性の機能消失変異又は欠失はSMAに関与する、一方で、SMN2のホモ接合性欠損は臨床表現型が全くなく、健康な対照の約5％に見られる。SMN1とSMN2の間の単一ヌクレオチドの違いにより、SMN2エクソン7のスキッピング及びSMNΔ7と呼ばれるほとんど機能しないタンパク質の産生が起こるので、SMN2の存在がSMN1欠損の効果を緩和するとは限らない。SMAの疾患重症度は、存在するSMN2遺伝子のゲノムコピー数に反比例する。
【０００３】
SMA研究の主要な目的は、SMN2由来機能的SMNタンパク質の発現を改善することである。SMAにおいて全長SMNタンパク質のレベルを上昇させる手段として、スプライシングの調節によるSMN2エクソン7封入の増大について熱心に研究されてきた。
【０００４】
エクソン中に位置するシグナルは、スプライシングの間のエクソンの認識に対して正又は負の効果をもち得る。エクソンスプライシングエンハンサ（ESE）は、スプライシングを刺激し、効率的なイントロン除去にしばしば必要とされるが、エクソンスプライシングサイレンサ（ESS）は、スプライシングを阻害する。SMN2とSMN1の間の単一のヌクレオチドの違いは、SMN2エクソン7スキッピングの主要な原因として広く受け入れられており、おそらくエクソンスプライシングエンハンサ（ESE）が破壊され及び/又はその代わりにhnRNP A1を結合するエクソンスプライシングサイレンサ（ESS）に変わることによる[Kashimaら、(2003) Nature Gen 34:460〜463頁;Cartegniら、(2006) Am J Hum Genet. 1月;78(1):63〜77頁;Huaら、(2007) PLoS 5(4):e73頁]。
【０００５】
加えて、いくつかのシス作用性スプライシング調節エレメントが、エクソン7及びそれを囲むイントロン配列中にマッピングされた（図1に要約される）。イントロン6には、ISS-E1と命名されたサイレンサ配列[Miyajimaら、(2002) J. Biol. Chem 277:23271〜23277頁]、及びイントロン6の3'ss近傍の命名されていないサイレンサ[Huaら、(2008) Am J Hum Genet 82:834〜848頁]の2つが公開されている。
【０００６】
エクソン7中の別のエンハンサ（Tra2β結合部位）も、エクソン7封入に重要である。エクソン7中の末端ステムループ構造（TSL-2）は、イントロン7の5'ssへのU1snRNPの動員と競合し[Singhら、(2006) Nucl. Acids Res. 35:371〜389頁;Huaら、2007]、それによってエクソン7スキッピングが増強される。イントロン7中にある、スプライシングサイレンサISS-N1は、エクソン7スキッピングを増強し、直列のhnRNPA1/A2モチーフとして特徴づけられた（Singh 2006;Hua 2008）。第2のモチーフ、ISE-E2は、最初、エクソン7スプライシングのエンハンサとして記載されたが[Miyajimaら、(2003) J .Biol. Chem 278:15825〜15831頁]、後にhnRNP A1結合部位がすぐ近くにマッピングされた。その結合部位は、SMN1とSMN2の間のA→G転移（トランジション）によって生成され、このエレメントの二機能特性を示す[Kashimaら、(2007) Proc .Natl. Acad. Sci.104:3426〜3431頁]。
【０００７】
SMNタンパク質自体は、プレmRNAスプライシング経路において機能するので、このタンパク質は、自身のプレmRNAのスプライシングに影響を与える可能性があると提唱された。Jodelkaらは、SMNタンパク質の存在量が、部分的に、SMN2の選択的スプライシングの結果を決定することを示した。それらの結果から、SMN発現におけるフィードバックループによって、低いSMNタンパク質レベルがSMN2エクソン7スキッピングを増幅させ、SMNタンパク質のさらなる減少をもたらすことが同定された。これらの結果は、SMNタンパク質存在量の適度な増加により、SMN発現の不相応に大きい増加及びそれにより有意に見込みのある治療効果がもたらされ得るということを著者に示唆した。Jodelka, F.M.ら、Hum Mol Genet. 2010 12月15日;19(24):4906〜4917頁。
【０００８】
インビトロ実験及びインビボマウスモデルにおいてオリゴヌクレオチドを使用して、SMN2スプライシングを調節させるためのいくつかの取り組みが行われた。エクソン7並びにエクソンの上流及び下流60ヌクレオチドにある配列に対して特異的に修飾された2'-メトキシエトキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの大規模標的化について記載している特許出願がある。これには、公開されている領域、ISS（イントロン6）、エクソン7中のESE/ISS及びTSL2並びにイントロン7中のISS-N1がある（ISIS & Krainerら、特許WO/2007/002390 A2;Huaら、2008）。得られた導入オリゴヌクレオチドである、ホスホロチオエート骨格を含む18マーの均一な2'-MOEオリゴマーは、ISS-N1を標的しており、さらに調査され、単回の心室内注射により脊髄のすべての領域へ推定治療レベルのオリゴヌクレオチドが送達されることが示されているマウスモデル（WO/2010/120820 A1、WO/2010/148249 A1）及びカニクイザルに与えられた。Passiniら(2011) 3:72ra18。Singhらは、ISS-N1領域を標的にする集中的な手法を使用した［米国特許出願公開第2007/0292408号;Singhら、(2009) RNA Biol. 6:341〜350頁］。特に、ISS-N1を標的にし、エクソン7封入を効果的に増加させる短い8マーの2'-O-メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドについて記載されている。
【０００９】
さらに、ISS-E1（イントロン6）を標的にしている単一の2'-O-メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチド及びISE/ISS-E2（イントロン7）を標的にしている単一の2'-O-メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを使用するインビトロデータがある。本明細書における観察とは対照的に、1つ目（「オリゴエレメント1」、Miyajima 2002）は、エクソン7封入を増加させることが見いだされ、イントロン7中の「エレメント2」に標的化されている2つ目は、エクソン7封入を低下させることが示された[Miyasoら、(2003) J. BIol. Chem 278:15825〜15831頁]。Baughanらは、二官能性2'-Oメチルオリゴヌクレオチドを使用して、イントロン6中のISS-E1エレメントにスプライス支援SRタンパク質を動員させた[Baughanら、(2009) Hum Mol Ther. 18:1600〜1611頁]。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
多くの取り組みにもかかわらず、SMA治療としてのアンチセンス化合物は全く現れていなかった。本発明のLNAオリゴマーは、スプライススイッチング（splice switching）に特によく適していると考えられ、したがってSMN2スプライシングを調節し、それによりこの遺伝子疾患の症状を軽減する治療上の用途があると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書において、少なくとも1つのロックド核酸（LNA）単位を含む長さ10〜30ヌクレオチドのオリゴマーであって、長さ10〜30核酸塩基の核酸塩基配列をさらに含むものであり、前記核酸塩基配列は、Genbankアクセッション番号NG_008728（配列番号167）又はその天然に存在するバリアントのヌクレオチド26231〜26300、31881〜31945又は32111〜32170に対応する領域と少なくとも80％相補的であるオリゴマーが提供される。
【００１２】
オリゴマーは、SMN2 mRNAのスプライシングを調節し、全長mRNA転写産物のレベルの増加が生じる。オリゴマーは、RNアーゼH切断を誘発しないオリゴマーでもよい。
【００１３】
いくつかの実施形態において、オリゴマー配列は、Genbankアクセッション番号NG_008728（配列番号167）のヌクレオチド26231〜26246、26274〜26300、31890〜31905、31918〜31945又は32115〜32162に対応する領域と少なくとも80％相補的である。他の実施形態において、オリゴマー配列は、Genbankアクセッション番号NG_008728（配列番号167）のヌクレオチド26231〜26300と少なくとも80％相補的である。オリゴマーは、配列番号1、2、3〜16、19〜20、22、24〜34、35〜38、40、41、45〜49、60〜80又は83の配列と少なくとも80％同一の核酸塩基配列を有してもよく、配列番号1、5、9、11、12、26、27、28、29、30、34、40、53〜59、62、63、65、66、69〜77又は79を有してもよい。
【００１４】
いくつかの実施形態において、オリゴマーは、スプライシングを調節して、対照の110％より多く、対照の120％より多く、対照の130％より多く、対照の140％より多く、対照の150％より多く、対照の160％より多く、対照の170％より多く、対照の180％より多く、対照の190％より多く又は対照の200％より多く全長SMN2転写産物の量を増加させる。オリゴマーは、長さ12〜16ヌクレオチドでもよく、ミックスマー（mixmer）でもよい。
【００１５】
上述のオリゴマーとそのオリゴマーに共有結合された少なくとも1つの非ヌクレオチド又は非ポリヌクレオチド部分とを含むコンジュゲートも提供される。オリゴマー又はコンジュゲートは、医薬として、例えば、I、II及びIII型脊髄性筋萎縮症を含めた脊髄性筋萎縮症の治療用医薬として使用できる。
【００１６】
上述のオリゴマー又はコンジュゲート、及び薬学的に許容される希釈剤、担体、塩又はアジュバントを含む医薬組成物がさらに提供される。脊髄性筋萎縮症を治療する方法であって、脊髄性筋萎縮症を患っている若しくは患っている可能性があると考えられる患者に、上述のオリゴマー、コンジュゲート又は医薬組成物の有効量を投与するステップを含む前記方法も提供される。
【００１７】
本明細書に提供されるオリゴマー、コンジュゲート又は医薬組成物を使用して、SMN2 mRNAを発現しているヒト細胞においてSMN2 mRNAのスプライシングを調節する方法も提供される。例えば、本方法は、インビボでもインビトロでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ヒトSMN2遺伝子（灰色の四角）のエクソン6、7及び8、イントロン6及び7（それぞれ、エクソン6と7の間及びエクソン7と8の間に位置する）、5'及び3'スプライス部位（ss）並びに標的配列上にある一連のスプライシング調節配列（ISS、ESE/ESS、ISE/ISS、など）を示す模式的線図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
オリゴマー
本発明は、ヒトSMN2をコードしている核酸分子、例えばGenbankアクセッション番号NG_008728のSMN2核酸及びヒトSMN2をコードしているそのような核酸分子の天然に存在するバリアントの機能の調節に使用するためのオリゴマー化合物（本明細書においてオリゴマーと称される）を利用する。Genbankアクセッション番号NG_00828は、ヒトSMN2転写産物バリアントdをコードするゲノム核酸配列であり、すべてのエクソンを含む。
【００２０】
本発明の文脈において用語「オリゴマー」は、2個以上のヌクレオチドの共有結合によって形成される分子（即ちオリゴヌクレオチド）を指す。本明細書において、単一のヌクレオチド（単位）は、モノマー又は単位と呼ぶこともできる。いくつかの実施形態において、用語「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」、「単位」及び「モノマー」は、互換的に使用される。ヌクレオチド又はモノマーの配列を呼ぶ場合、塩基、例えばA、T、G、C又はUの配列と呼ばれることは認識されよう。
【００２１】
オリゴマーは、長さ10〜50ヌクレオチド、例えば長さ10〜30ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列からなる又はこれを含む。
【００２２】
様々な実施形態では、本発明の化合物は、RNA（単位）を含まない。本発明に係る化合物は、線状分子であるか、又は線状分子として合成されることが好ましい。オリゴマーは、一本鎖分子であり、好ましくは、例えば、同じオリゴマー内の等価な領域に相補的である（即ち二重鎖を形成することができる）、少なくとも3、4、又は5の連続ヌクレオチドの短い領域を含まない。いくつかの実施形態では、オリゴマーは本質的に二本鎖ではない、即ちsiRNAではない。様々な実施形態では、本発明のオリゴマーは、連続ヌクレオチド領域から完全になっていてもよい。したがって、オリゴマーは、実質的に、自己相補的ではない。
【００２３】
標的
好適には、本発明のオリゴマーは、ヒトSMN2 mRNAのスプライシングを調節することができる。これに関連して、通常ヒト細胞において、本発明のオリゴマーは、SMN2の異常スプライシングに影響を及ぼすことができる。当然のことながら、「異常型」は、過剰、不要又は不適当であることを意味する。
【００２４】
本発明のオリゴマーは、SMN2核酸に結合し、全長SMN2 mRNAのレベルを対照（例えば、未処理又は模擬処理対照）と比較して増加させ（即ち、対照レベルの100％より高くにまで）、より好ましくは、全長SMN2 RNAのレベルを正常な発現レベル（例えばオリゴマー（複数可）又はコンジュゲート（複数可）の非存在下における発現レベル）と比較して少なくとも130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％又は200％以上に増加させる。好ましくは、全長SMN2 mRNAのレベルは、対照の少なくとも150％、より好ましくは200％にまで増加し、即ち、イントロン7封入が増加する。いくつかの実施形態において、全長SMN2 mRNAのレベルが増加するにつれて、SMN2Δ7mRNAのレベルは低下する（エクソン7排除（exon 7 exclusion）が低下する）。他の実施形態において、全長SMN2とSMN2Δ7mRNAの両方が増加する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴマーは、哺乳動物、好ましくはSMN2 mRNAスプライシングの調節を必要とするヒトに投与される。オリゴマー投与量は、例えば約0.1〜約100mg/kg体重、例えば1日当たり0.1〜1mg/kg体重、又は1日当たり1.0〜約10mg/kg体重でよい。したがって、70kgのヒトに投与する場合、いくつかの実施形態において、投与量範囲は、1日当たり約7mg〜0.7gである。いくつかの実施形態において、オリゴマーの各用量は、例えば、約0.1mg/kg又は1mg/kg〜約10mg/kg又は20mg/kg（即ち、例えば0.1〜20mg/kg、例えば1mg/kg〜12mg/kgの範囲）である。個々の用量は、したがって、例えば約0.2mg/kg、例えば約0.3mg/kg、例えば約0.4mg/kg、例えば約0.5mg/kg、例えば約0.6mg/kg、例えば約0.7mg/kg、例えば約0.8mg/kg、例えば約0.9mg/kg、例えば約1mg/kg、例えば約2mg/kg、例えば約3mg/kg、例えば約4mg/kg、例えば約5mg/kg、例えば約6mg/kg、例えば約7mg/kg、例えば約8mg/kg、例えば約9mg/kg、例えば約10mg/kgである。いくつかの実施形態において、オリゴマーの用量は、7mg/kg以下、例えば5mg/kg以下又は3mg/kg以下である。いくつかの実施形態において、オリゴマーの用量は、0.5mg/kg超、例えば1mg/kg超である。いくつかの実施形態において、オリゴマーの各投与の間隔は、例えば、1日、2日、3日、4日、5日、6日間隔及び毎週からなる群より選択されてよい。いくつかの実施形態において、投与の間隔は、少なくとも隔日、例えば少なくとも3日毎に、例えば少なくとも4日毎に、例えば少なくとも5日毎に、例えば少なくとも6日毎に、例えば毎週、例えば少なくとも2週間毎（隔週）又は、少なくとも3若しくは4週間毎、又は少なくとも毎月である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、0.04〜25nM、例えば0.8〜20nMの本発明の化合物、例えば、0.5、1、5、20又は25nMを使用する場合、そのような調節が見られる。他の実施形態において、5〜25μM、例えば8〜20μMの本発明の化合物、例えば1、5、20μM又は25μMを使用する場合、そのような調節が見られる。全長SMN2のスプライシングの調節は、SMNタンパク質レベルを測定することよって、例えば、SDS-PAGEの後に標的タンパク質の適切な領域に対して生起された適当な抗体を使用するウェスタンブロッティングなどの方法によって決定することができる。別法として、スプライシングの調節は、mRNAのレベルを測定することよって、例えば適切なプローブ、全長及び/若しくはΔ7mRNA用のプローブなどを使用するノーザンブロッティング又は定量RT-PCRによって決定することができる。
【００２７】
本明細書に例示されるように、細胞型は、いくつかの実施形態において、SMAであるヒト患者に由来する細胞、例えばGM03813（Corriell Institute for Medical Research, Camden NJ）などのSMA線維芽細胞細胞系であってよい。使用されるオリゴマー濃度は、いくつかの実施形態において、5nMとすることができる。使用されるオリゴマー濃度は、いくつかの実施形態において、25nMでよい。使用されるオリゴマー濃度は、いくつかの実施形態において、0.5nM又は1nMでよい。実施例に例示したように、この濃度のオリゴマーが、トランスフェクション（リポフェクション）を使用するインビトロ細胞アッセイに通常使用される。トランスフェクション試薬がない場合、標的のダウンレギュレーションを得るのに必要なオリゴ濃度は、通常1〜25μM、例えば5μMである。
【００２８】
したがって本発明は、SMN2 mRNAを発現している細胞においてSMN2 mRNAのスプライシングを調節する方法であって、前記細胞に本発明に係るオリゴマー又はコンジュゲートを投与して、前記細胞においてSMN2 mRNAのスプライシングを調節するステップを含む方法を提供する。好適には、細胞は、ヒト細胞、例えばSMA患者由来細胞である。投与は、いくつかの実施形態において、インビトロで行われてよい。投与は、いくつかの実施形態において、インビボで行われてもよい。
【００２９】
本明細書において用いられる用語「標的核酸」は、ヒトSMNポリペプチド、例えばGenbankアクセッション番号NG_008728又は天然に存在するそのバリアントをコードしているDNA又はRNA、並びにそれに由来するRNA核酸、好ましくはプレmRNA及び成熟mRNAを含めたRNAのことを指す。いくつかの実施形態において、例えば研究又は診断に使用される場合、「標的核酸」は、上記のDNAから得られるcDNA若しくは合成オリゴヌクレオチド又はRNA核酸標的でもよい。本発明に係るオリゴマーは、標的核酸にハイブリダイズすることができる。Genbankアクセッション番号NG_008728はゲノムDNA配列であり、したがって、プレmRNA標的配列に対応しているが、cDNA配列においてはウラシルがチミジンと置きかえられることは認識されよう。プレmRNAの標的化は、スプライシングの調節に好ましい。スプライシングの調節の文脈において、「mRNAを標的化する」及び「RNAを標的化する」は、「プレmRNAを標的化する」を意味することを目的とすることは理解されよう。「SMN2スプライシング」は、イントロンがSMN2プレmRNAからスプライスされて、成熟SMN2 mRNAを産生する成熟プロセスを意味することは理解されよう。
【００３０】
用語「その天然のバリアント」は、規定される分類群、即ちヒト内に天然に存在する、核酸配列のSMNポリペプチドのバリアントを指す。典型的に、ポリヌクレオチドの「天然のバリアント」を指す場合、この用語はまた、染色体転座又は重複から生じるSMNコードゲノムDNAの任意の対立遺伝子バリアント及びそれに由来するmRNAなどのRNAを包含してもよい。「天然のバリアント」はまた、SMN2 RNAの選択的スプライシングに由来するバリアントを含んでいてもよい。特定のポリペプチド配列が参照される場合、例えば、この用語はまた、そのため、例えば、シグナルペプチド切断、タンパク分解性の切断、グリコシル化などの同時翻訳修飾又は翻訳後修飾によってプロセシングされてもよい、タンパク質の天然の形態を含む。
【００３１】
配列
オリゴマーは、NG_008728中に存在するヌクレオチド配列の逆相補体に対応する連続ヌクレオチド配列を含む又はそれからなる。したがって、例えば、オリゴマーは、配列番号1〜83からなる群より選択される配列を含み又はそれからなることができ、前記オリゴマー（又はその連続ヌクレオチド部分）は、所望により、前記選択される配列に対して1、2、又は3つのミスマッチを有していてもよい。
【００３２】
オリゴマーはヒトSMNをコードする核酸（例えば、Genbankアクセッション番号NG_008728）の等価な領域に完全に相補的な（100％相補的な）連続ヌクレオチド配列を含んでいてもよい又はそれからなってもよい。したがって、オリゴマーは、アンチセンスヌクレオチド配列を含む又はそれからなることができる。しかしながら、いくつかの実施形態では、オリゴマーは、標的配列とハイブリダイズし、なお標的に十分に結合して、所望の効果、即ち、標的のスプライシングの調節を示す場合、1、2、3、若しくは4つの（又はそれ以上の）ミスマッチを許容しうる。ミスマッチは、例えば、ヌクレオチド配列内に存在する、オリゴマーヌクレオチド配列の増加した長さ及び/又はLNAなどのヌクレオチド類似体の増加した数によって補うこともできる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ヒトSMNをコードする核酸の対応する領域になどの、標的配列とハイブリダイズする場合、3つ以下、例えば2つ以下のミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ヒトSMNをコードする核酸の対応する領域などの、標的配列とハイブリダイズする場合、単一のミスマッチしか含まない。
【００３４】
本発明のオリゴマーのヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号1〜83からなる群より選択される対応する配列と少なくとも80％相同、例えば少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％相同、少なくとも97％相同、少なくとも98％相同、又は少なくとも99％相同、例えば100％相同（同一）である。
【００３５】
本発明のオリゴマーのヌクレオチド配列は、好ましくは、NG_008728に存在する対応する配列の逆相補体と少なくとも80％相同、例えば少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％相同、少なくとも97％相同、少なくとも98％相同、又は少なくとも99％相同、例えば100％相同（同一）である。
【００３６】
本発明のオリゴマーのヌクレオチド配列は、好ましくは、NG_008728に存在する部分配列（sub-sequence）と少なくとも80％相補的、例えば少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％相補的、少なくとも97％相補的、少なくとも98％相補的、又は少なくとも99％相補的、例えば100％相補的（完全に相補的）である。
【００３７】
いくつかの実施形態において、オリゴマー（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号1〜83、若しくは少なくとも10個の連続したヌクレオチドであるその部分配列からなる群より選択され、又はそれらから選択される配列の1つを含み、その配列と比較したとき、前記オリゴマーは、任意で1個、2個又は3個のミスマッチを含んでもよい。
【００３８】
いくつかの実施形態において、オリゴマー又は部分配列は、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28若しくは29個の連続したヌクレオチド、例えば12〜22、例えば12〜18ヌクレオチドからなるものである。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、長さ16ヌクレオチドであり、配列番号1〜20、22、24、26、28、又は30〜83のうちの1つの配列を有する。なお、他の実施形態において、オリゴマーは、長さ12ヌクレオチドであり、配列番号21、23、25、27又は29の配列を有する。
【００３９】
好適には、いくつかの実施形態では、部分配列は、本発明のオリゴマーの連続ヌクレオチド配列と同じ長さである。しかしながら、いくつかの実施形態では、オリゴマーのヌクレオチド配列は、標的配列に非相補的である、さらなる5'又は3'ヌクレオチド、例えば、独立して、5'及び/又は3'に1、2、3、4又は5つのさらなるヌクレオチドを含みうることが認識される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号1のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号2のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００４２】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号3のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号4のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号5のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号6のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号7のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号8のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号9のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号10のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号12のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号13のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号14のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号15のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号16のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号17のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号18のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号19のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号20のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号21のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号22のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号23のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号24のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号25のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号26のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号27のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号28のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号29のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号30のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号31のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号32のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号33のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号34のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号35のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号36のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号37のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号38のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号39のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号40のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号41のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号42のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号43のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号44のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号45のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号46のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号47のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号48のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号49のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号50のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号51のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号52のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号53のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号54のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号55のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号56のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号57のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号58のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号59のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号60のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号61のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号62のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号63のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号64のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号65のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号66のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号67のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号68のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号69のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号70のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号71のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号72のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号73のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号74のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号75のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号76のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号77のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号78のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号79のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号80のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号81のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号82のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、配列番号83のヌクレオチド配列又はその部分配列を含む又はそれからなる。
【０１２２】
本発明のオリゴマー（又はその領域）とヒトSMNをコードする核酸の標的領域、例えば本明細書に開示されている領域との「相補性」の程度を決定する際には、「相補性」の程度は、オリゴマー（又はその領域）の配列とそれと最良に整列する標的領域の逆相補体の配列との同一性％（相同性％）として表される。パーセンテージ（％）は、2配列間で同一である整列された塩基の数を数え、オリゴマー中の連続するモノマーの総数によって割り、100を掛けることよって算出される。そのような比較において、ギャップが存在する場合、そのようなギャップは、ギャップ内のモノマーの数が本発明のオリゴマーと標的領域との間で異なる場所ではなく、単なるミスマッチであることが好ましい。
【０１２３】
同様に、「相同性」又は「同一性」の程度は、オリゴマー（又はその領域）の配列とそれと最良に整列する標的領域の配列との同一性％（相同性％）として表される。本明細書では、用語「相同な」及び「相同性」は、用語「同一の」及び「同一性」と相互に交換可能である。
【０１２４】
用語「に対応する（corresponding to）」及び「に対応する（corresponds to）」は、オリゴマーのヌクレオチド配列（即ち、核酸塩基若しくは塩基配列）又は連続ヌクレオチド配列と、i)Genbankアクセッション番号NG_008728などの、SMNタンパク質をコードする核酸などの、核酸標的の逆相補体の部分配列、並びに/又はii)配列番号1〜83からなる群などの、本明細書で提供されるヌクレオチド配列若しくはその部分配列のいずれかから選択されるさらなる配列の等価な連続ヌクレオチド配列との比較を指す。ヌクレオチド類似体は、その等価又は対応するヌクレオチドと直接比較される。i)又はii)のさらなる配列に対応する第1の配列は、典型的に、第1の配列（連続ヌクレオチド配列など）の全長にわたってその配列と同一であるか、又は本明細書に記載の通りであり、いくつかの実施形態では、対応する配列と少なくとも80％相同、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％相同、例えば100％相同（同一）である。
【０１２５】
用語「対応するヌクレオチド類似体」及び「対応するヌクレオチド」は、ヌクレオチド類似体中の核酸塩基及び天然のヌクレオチドが同一であることを示すことを意図する。例えば、ヌクレオチドの2-デオキシリボース単位がアデニンに連結される場合、「対応するヌクレオチド類似体」は、アデニンに連結されたペントース単位（2-デオキシリボースと異なる）を含有する。
【０１２６】
用語「逆相補体」、「逆相補的」及び「逆相補性」は、本明細書では用語「相補体」、「相補的」、「相補性」と相互に交換可能である。
【０１２７】
長さ
オリゴマーは、長さが、連続する合計10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含み得る又はそれからなり得る。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、オリゴマーは、長さが、連続する合計10〜22ヌクレオチド、例えば12〜18、13〜17又は12〜16ヌクレオチド、例えば13、14、15又は16ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む又はそれからなる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、オリゴマーは、長さが合計10、11、12、13又は14の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む又はそれからなる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、22以下のヌクレオチド、例えば20以下のヌクレオチド、例えば18以下のヌクレオチド、例えば15、16又は17のヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、20未満のヌクレオチドを含む。オリゴマー又は連続ヌクレオチド配列の長さに範囲がある場合、それは、範囲で規定された下限と上限の長さ、例えば10〜30（又はその間）を含み、10と30の両方を含むことは理解されよう。
【０１３１】
ヌクレオシド（複数）及びヌクレオシド（単数）類似体
いくつかの実施形態において、用語「ヌクレオシド類似体」及び「ヌクレオチド類似体」は互換的に使用される。
【０１３２】
本明細書で使用される用語「ヌクレオチド」は、糖部分、塩基部分、及びリン酸又はホスホロチオエートヌクレオチド間連結基などの共有結合基（連結基）を含むグリコシドを指し、DNA又はRNAなどの天然のヌクレオチド、並びに本明細書で「ヌクレオチド類似体」とも呼ばれる、修飾された糖及び/又は塩基部分を含む非天然のヌクレオチドの両方を包含する。本明細書で、単一のヌクレオチド（単位）はまた、モノマー又は核酸単位と呼ぶこともできる。
【０１３３】
生化学の分野では、用語「ヌクレオシド」は、糖部分及び塩基部分を含むグリコシドを指すために一般に使用され、そのため、オリゴマーのヌクレオチドの間のヌクレオチド間連結によって共有結合されるヌクレオチド単位を指す場合に、使用されうる。バイオテクノロジーの分野において、用語「ヌクレオチド」は、核酸モノマー又は単位のことを指すためにしばしば使用され、したがって、オリゴヌクレオチドの文脈においては、塩基、例えば「ヌクレオチド配列」のことを指してもよく、通常は、核酸塩基配列（即ち、糖骨格及びヌクレオシド間連結の存在を黙示する）のことを指してもよい。同様に、特に、1個以上のヌクレオシド間連結基が修飾されているオリゴヌクレオチドの場合、用語「ヌクレオチド」は、「ヌクレオシド」のことを指してもよく、例えば用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオシド間の連結の存在又は性質を特定する場合にも使用されてよい。
【０１３４】
当業者が認識するように、オリゴヌクレオチドの5'末端ヌクレオチドは、5'末端基を含んでいても含んでいなくてもよいが、5'ヌクレオチド間連結基を含まない。
【０１３５】
非天然のヌクレオチドは、二環式ヌクレオチド又は2'置換ヌクレオチドなどの2'修飾ヌクレオチドなどの修飾された糖部分を有するヌクレオチドを含む。
【０１３６】
「ヌクレオチド類似体」は、糖及び/又は塩基部分中の修飾によって、DNA又はRNAのヌクレオチドなどの天然のヌクレオチドのバリアントとなる。類似体は、基本的に、オリゴヌクレオチドとの関連で天然のヌクレオチドに対して単に「無変化」又は「等価」とすることができ、即ち、オリゴヌクレオチドが標的遺伝子発現を阻害するように作用する方法に対する機能効果を有していない。しかしながら、そのような「等価な」類似体は、例えば、それらが、製造するのにより容易である若しくはより安価である、又は貯蔵若しくは製造条件に対してより安定している、又はタグ若しくは標識を表す場合、有用であり得る。しかしながら、好ましくは、類似体は、例えば、標的に対する結合親和性の増大及び/又は細胞内ヌクレアーゼに対する抵抗性の増大及び/又は細胞の中への輸送の容易性の増大をもたらすことによって、オリゴマーが発現を阻害するように作用する方法に対する機能効果を有するであろう。ヌクレオシド類似体の具体例は、例えばFreier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及びUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213並びにスキーム1中に記載されている。
【化１】
2014533944.tif 000002
【０１３７】
スキーム１
オリゴマーは、したがって、天然ヌクレオチド、好ましくは2'-デオキシヌクレオチド（本明細書において一般に「DNA」と呼ばれる）、さらにおそらくリボヌクレオチド（本明細書において一般に「RNA」と呼ばれる）の単純な配列、又はそのような天然のヌクレオチド及び1つ以上の非天然のヌクレオチド、即ちヌクレオチド類似体の組み合わせを含んでいてもよい又はそれからなってもよい。そのようなヌクレオチド類似体は、好適には、標的配列に対するオリゴマーの親和性を増強するものである。
【０１３８】
適した好ましいヌクレオチド類似体の例は、WO2007/031091によって提供され、又はそこで参照される。
【０１３９】
LNA又は2'-置換糖などの、オリゴマー中の親和性増強ヌクレオチド類似体の組み込みは、特異的に結合するオリゴマーのサイズを低下させることを可能にするものであり、また、非特異的又は異常な結合が起こる前に、オリゴマーのサイズに対する上限を低下させ得る。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、オリゴマーは、少なくとも1個のヌクレオシド類似体を含む。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、少なくとも2個のヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、3〜8つのヌクレオチド類似体、例えば6又は7つのヌクレオチド類似体を含む。さらに最も好ましい実施形態では、前記ヌクレオチド類似体の少なくとも1つは、ロックド核酸（LNA）である、例えば、少なくとも3又は少なくとも4又は少なくとも5又は少なくとも6又は少なくとも7又は8つのヌクレオチド類似体は、LNAでありうる。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド類似体のすべてがLNAであってよく、他の実施形態において、ヌクレオチド類似体のおよそ半分がLNAであってもよい。
【０１４１】
ヌクレオチドのみからなる、好ましいヌクレオチド配列モチーフ又はヌクレオチド配列を指す場合、その配列によって規定される本発明のオリゴマーは、前記配列中に存在する1つ以上のヌクレオチドの代わりに、オリゴマー/標的二重鎖の二重鎖安定性/Tmを上昇させるLNA単位又は他のヌクレオチド類似体（即ち、親和性増強ヌクレオチド類似体）などの、対応するヌクレオチド類似体（即ち、同一の核酸塩基を有する）を含んでいてもよいことが認識されるであろう。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、オリゴマーのヌクレオチド配列と標的配列の間のあらゆるミスマッチは、好ましくは、親和性増強ヌクレオチド類似体の以外の領域中に及び/又はオリゴヌクレオチド中のDNAヌクレオチドなどの非修飾の部位に及び/又は連続ヌクレオチド配列の5'若しくは3'側にある領域中に存在している。
【０１４３】
ヌクレオチドのそのような修飾の例は、2'置換基を提供するための、又は結合親和性を増強する架橋（ロックド核酸）構造を生成し、また増加したヌクレアーゼ抵抗性を提供するための糖部分の修飾を含む。
【０１４４】
好ましいヌクレオチド類似体は、LNA、例えばオキシ-LNA（例えば、ベータ-D-オキシ-LNA及びアルファ-L-オキシ-LNA）及び/又はアミノ-LNA（例えば、ベータ-D-アミノ-LNA及びアルファ-L-アミノ-LNA）及び/又はチオ-LNA（例えば、ベータ-D-チオ-LNA及びアルファ-L-チオ-LNA）及び/又はENA（例えば、ベータ-D-ENA及びアルファ-L-ENA）である。ベータ-D-オキシ-LNAが最も好ましい。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー内に存在するヌクレオチド類似体は、独立して、例えば2'-O-アルキル-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、2'-フルオロ-DNA単位、LNA単位、アラビノ核酸（ANA）単位、2'-フルオロ-ANA単位、HNA単位、INA（インターカレート核酸；Christensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 2002 30: 4918-4925、参照によって本明細書に組み込まれる）単位、及び2'MOE単位から選択される。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー又はその連続ヌクレオチド配列中に存在する上記のタイプのたった1つのヌクレオチド類似体がある。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド類似体は、2'-O-メトキシエチル-RNA（2'MOE）、2'-フルオロ-DNAモノマー、又はLNAヌクレオチド類似体であり、そのため、本発明のオリゴヌクレオチドは、これらの3つのタイプの類似体から独立して選択されるヌクレオチド類似体を含んでいてもよく、又は3つのタイプから選択されるたった1つのタイプの類似体を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、前記ヌクレオチド類似体の少なくとも1つは、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の2'-MOE-RNAヌクレオチド単位などの、2'-MOE-RNAである。いくつかの実施形態では、前記ヌクレオチド類似体の少なくとも1つは、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の2'-フルオロ-DNAヌクレオチド単位などの、2'-フルオロ-DNAである。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、本発明に係るオリゴマーは、少なくとも1つのロックド核酸（LNA）単位、例えば、1、2、3、4、5、6、7又は8個のLNA単位、例えば3〜7若しくは4〜8個のLNA単位又は3、4、5、6若しくは7個のLNA単位を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド類似体はすべて、LNAである。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、ベータ-D-オキシ-LNAと、以下のLNA単位:ベータ-D若しくはアルファ-L立体配置のいずれかのチオ-LNA、アミノ-LNA、オキシ-LNA及び/若しくはENA又はその組み合わせのうちの1つ以上とを両方含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、LNAシトシン単位はすべて、5'メチル-シトシンである。本発明のいくつかの実施形態では、オリゴマーは、LNA単位及びDNA単位の両方を含んでいてもよい。好ましくは、LNA単位及びDNA単位を組み合わせた合計は、10〜25個、例えば10〜24個、好ましくは10〜20個、例えば10〜18個、さらに好ましくは12〜16個である。本発明のいくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列などのオリゴマーのヌクレオチド配列は、少なくとも1つのLNAからなり、残りのヌクレオチド単位は、DNA単位である。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、所望によりホスホロチオエートなどの修飾ヌクレオチド間連結と共に、LNAヌクレオチド類似体及び天然のヌクレオチド（例えばRNA又はDNA、最も好ましくはDNAヌクレオチド）のみを含む。
【０１４８】
用語「核酸塩基」は、ヌクレオチドの塩基部分を指し、天然及び非天然バリアントの両方を包含する。したがって、「核酸塩基」は、知られているプリン及びピリミジンヘテロ環だけでなく、そのヘテロ環式類似体及び互変異性体をも包含する。
【０１４９】
核酸塩基の例としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、5-メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、及び2-クロロ-6-アミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、オリゴマー中に存在する核酸塩基の少なくとも1つは、5-メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、及び2-クロロ-6-アミノプリンからなる群より選択される修飾核酸塩基である。
【０１５１】
LNA
用語「LNA」は、「ロックド核酸」として知られている二環式ヌクレオシド類似体を指す。それは、LNAモノマーを指してもよい、あるいは「LNAオリゴヌクレオチド」との関連で使用される場合、LNAは、1つ以上の、そのような二環式ヌクレオチド類似体を含有するオリゴヌクレオチドを指す。LNAヌクレオチドは、例えば、下に記載されるように、ビラジカルR4*-R2*として示されるように、リボース糖環のC2'とC4'の間のリンカー基（例えば架橋）の存在を特徴とする。
【０１５２】
本発明のオリゴヌクレオチド化合物中で使用されるLNAは、好ましくは、一般式Iの構造を有する。
【化２】
2014533944.tif 000003
【０１５３】
式中、
すべてのキラル中心について、非対称性の基は、R配向又はS配向で存在していてもよく;
Xは、-O-、-S-、-N(RN*)-、-C(R6R6*)-から選択され、例えば、いくつかの実施形態では-O-であり;
Bは、水素、場合により置換されていてもよいC1〜4-アルコキシ、場合により置換されていてもよいC1〜4-アルキル、場合により置換されていてもよいC1〜4-アシルオキシ、天然核酸塩基及び核酸塩基類似体を含む核酸塩基、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート基、リポーター基、並びにリガンドから選択され;好ましくは、Bは、核酸塩基又は核酸塩基類似体であり;
Pは、隣接するモノマーに対するヌクレオチド間連結又は5'末端基を示し、そのようなヌクレオチド間連結又は5'末端基は、置換基R5又は等しく適用可能な置換基R5*を場合により含んでもよく;
P*は、隣接するモノマーに対するヌクレオチド間連結又は3'末端基を示し;
R4*及びR2*は、-C(RaRb)-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-、及び>C=Zから選択される1〜4つの基/原子からなる二価のリンカー基をともに示し、ここでZは、-O-、-S-、及び-N(Ra)-から選択され、Ra及びRbは、それぞれ、水素、場合により置換されていてもよいC1〜12-アルキル、場合により置換されていてもよいC2〜12-アルケニル、場合により置換されていてもよいC2〜12-アルキニル、ヒドロキシ、場合により置換されていてもよいC1〜12-アルコキシ、C2〜12-アルコキシアルキル、C2〜12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1〜12-アルコキシカルボニル、C1〜12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ及びジ(C1〜6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ及びジ(C1〜6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1〜6-アルキル-アミノカルボニル、モノ及びジ(C1〜6-アルキル)アミノ-C1〜6-アルキル-アミノカルボニル、C1〜6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1〜6-アルカノイルオキシ、スルホノ（sulphono）、C1〜6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1〜6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート基、リポーター基、並びにリガンドから独立して選択され、アリール及びヘテロアリールは、場合により置換されてもよく、2つのジェミナルな置換基Ra及びRbは、ともに、場合により置換されていてもよいメチレン（=CH2）を示してもよく、すべてのキラル中心について、非対称性の基は、R配向又はS配向で存在していてもよく;
それぞれの置換基R1*、R2、R3、R5、R5*、R6、及びR6*は、存在する場合、水素、場合により置換されていてもよいC1〜12-アルキル、場合により置換されていてもよいC2〜12-アルケニル、場合により置換されていてもよいC2〜12-アルキニル、ヒドロキシ、C1〜12-アルコキシ、C2〜12-アルコキシアルキル、C2〜12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1〜12-アルコキシカルボニル、C1〜12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ及びジ(C1〜6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ及びジ(C1〜6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1〜6-アルキル-アミノカルボニル、モノ及びジ(C1〜6-アルキル)アミノ-C1〜6-アルキル-アミノカルボニル、C1〜6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1〜6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1〜6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1〜6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート基、リポーター基、並びにリガンドから独立して選択され、アリール及びヘテロアリールは、場合により置換されてもよく、2つのジェミナルな置換基は、ともに、オキソ、チオキソ、イミノ、又は場合により置換されていてもよいメチレンを示してもよく;RNは、水素及びC1〜4-アルキルから選択され、2つの隣接する（非ジェミナルな）置換基は、二重結合をもたらす、さらなる結合を示してもよく;RN*は、存在し、ビラジカルに関与しない場合、水素及びC1〜4-アルキル;並びにその塩基性塩及び酸付加塩から選択される。すべてのキラル中心について、非対称性の基は、R配向又はS配向で存在していてもよい。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、R4*及びR2*は、ともに、C(RaRb)-C(RaRb)-、C(RaRb)-O-、C(RaRb)-NRa-、C(RaRb)-S-、及びC(RaRb)-C(RaRb)-O-からなる群より選択される群からなるビラジカルを示し、Ra及びRbはそれぞれ、場合により、独立して選択されてもよい。いくつかの実施形態では、Ra及びRbは、水素及びC1〜6-アルキルからなる群より場合により独立して選択されていてもよく、例えばメチル、例えば水素である。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、R4*及びR2*は、ともに、R-又はS-配置いずれかのビラジカル-O-CH(CH2OCH3)- （2'O-メトキシエチル二環式核酸；Sethら、2010、J. Org. Chem）を示す。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、R4*及びR2*は、ともに、R-又はS-配置いずれかのビラジカル-O-CH(CH2CH3)- （2'O-エチル二環式核酸；Sethら、2010、J. Org. Chem）を示す。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、R4*及びR2*は、ともに、R-又はS-配置いずれかのビラジカル-O-CH(CH3)-をともに示す。いくつかの実施形態において、R4*及びR2*は、ともに、ビラジカル-O-CH2-O-CH2-（Sethら、2010、J. Org. Chem）を示す。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、R4*及びR2*は、ともに、ビラジカル-O-NR-CH3-（Sethら、2010、J. Org. Chem）を示す。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、LNA単位は、次の群から選択される構造を有する。
【化３】
2014533944.tif 000004
【０１６０】
いくつかの実施形態では、R1*、R2、R3、R5、R5*は、水素、ハロゲン、C1〜6アルキル、置換C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、置換C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル又は置換C2〜6アルキニル、C1〜6アルコキシル、置換C1〜6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1〜6アミノアルキル又は置換C1〜6アミノアルキルからなる群より独立して選択される。すべてのキラル中心について、非対称性の基は、R配向又はS配向で存在していてもよい。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、R1*、R2、R3、R5、R5*は、水素である。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、R1*、R2、R3は、水素、ハロゲン、C1〜6アルキル、置換C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、置換C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル又は置換C2〜6アルキニル、C1〜6アルコキシル、置換C1〜6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1〜6アミノアルキル又は置換C1〜6アミノアルキルからなる群より独立して選択される。すべてのキラル中心について、非対称性の基は、R配向又はS配向で存在していてもよい。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、R1*、R2、R3は、水素である。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、R5及びR5*は、それぞれ、H、-CH3、-CH2-CH3、-CH2-O-CH3、及び-CH=CH2からなる群より独立して選択される。好適には、いくつかの実施形態では、R5又はR5*のいずれかが、水素であり、他方の基（それぞれR5又はR5*）は、C1〜5アルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、置換C1〜6アルキル、置換C2〜6アルケニル、置換C2〜6アルキニル、又は置換アシル（-C(=O)-）からなる群より選択され;置換基は、それぞれ、ハロゲン、C1〜6アルキル、置換C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、置換C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、置換C2〜6アルキニル、OJ1、SJ1、NJ1J2、N3、COOJ1、CN、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)NJ,J2、又はN(H)C(=X)N(H)J2から独立して選択される置換基と一置換又は多置換され、Xは、O又はSであり;J1及びJ2は、それぞれ、独立して、H、C1〜6アルキル、置換C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、置換C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、置換C2〜6アルキニル、C1〜6アミノアルキル、置換C1〜6アミノアルキル、又は保護基である。いくつかの実施形態では、R5又はR5*は、置換C1〜6アルキルである。いくつかの実施形態では、R5又はR5*のいずれかは、置換メチレンであり、好ましい置換基は、F、NJ1J2、N3、CN、OJ1、SJ1、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)NJ,J2、又はN(H)C(O)N(H)J2から独立して選択される、1つ以上の基を含む。いくつかの実施形態では、J1及びJ2は、それぞれ、独立して、H又はC1〜6アルキルである。いくつかの実施形態では、R5又はR5*は、メチル、エチル、又はメトキシメチルである。いくつかの実施形態では、R5又はR5*は、メチルである。さらなる実施形態では、R5又はR5*のいずれかは、エチレニルである。いくつかの実施形態では、R5又はR5*のいずれかは、置換アシルである。いくつかの実施形態では、R5又はR5*のいずれかは、C(=O)NJ1J2である。すべてのキラル中心について、非対称性の基は、R配向又はS配向で存在していてもよい。そのような5'修飾二環式ヌクレオチドは、WO2007/134181に開示され、これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、Bは、核酸塩基類似体を含む核酸塩基並びにプリン若しくはピリミジンなどの天然の核酸塩基又は本明細書で言及される核酸塩基などの置換プリン若しくは置換ピリミジンであり、例えばアデニン、シトシン、チミン、アデニン、ウラシルからなる群より選択される核酸塩基並びに/又は5-チアゾロ-ウラシル、2-チオ-ウラシル、5-プロピニル-ウラシル、2'チオ-チミン、5-メチルシトシン、5-チオゾロ-シトシン、5-プロピニル-シトシン、及び2,6-ジアミノプリンなどの修飾若しくは置換核酸塩基などである。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、R4*及びR2*は、ともに、-C(RaRb)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-O-、-C(RaRb)-O-C(RcRd)-、-C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-、-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-、-C(Ra)=C(Rb)-C(RcRd)-、-C(RaRb)-N(Rc)-、-C(RaRb)-C(RcRd)-N(Re)-、-C(RaRb)-N(Rc)-O-、及び-C(RaRb)-S-、-C(RaRb)-C(RcRd)-S-から選択されるビラジカルを示し、Ra、Rb、Rc、Rd、Re、及びRfは、それぞれ、水素、場合により置換されていてもよいC1〜12-アルキル、場合により置換されていてもよいC2〜12-アルケニル、場合により置換されていてもよいC2〜12-アルキニル、ヒドロキシ、C1〜12-アルコキシ、C2〜12-アルコキシアルキル、C2〜12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1〜12-アルコキシカルボニル、C1〜12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ及びジ(C1〜6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ及びジ(C1〜6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1〜6-アルキル-アミノカルボニル、モノ及びジ(C1〜6-アルキル)アミノ-C1〜6-アルキル-アミノカルボニル、C1〜6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1〜6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1〜6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1〜6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート基、リポーター基、並びにリガンドから独立して選択され、アリール及びヘテロアリールは、場合により、置換されてもよく、2つのジェミナルな置換基Ra及びRbは、ともに、場合により置換されていてもよいメチレン（=CH2）を示してもよい。すべてのキラル中心について、非対称性の基は、R配向又はS配向で存在していてもよい。
【０１６７】
さらなる実施形態では、R4*及びR2*は、ともに、-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-NH-、-CH2-N(CH3)-、-CH2-CH2-O-、-CH2-CH(CH3)-、-CH2-CH2-S-、-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-CH2-CH2-CH(CH3)-、-CH=CH-CH2-、-CH2-O-CH2-O-、-CH2-NH-O-、-CH2-N(CH3)-O-、-CH2-O-CH2-、-CH(CH3)-O-、及び-CH(CH2-O-CH3)-O-、並びに/又は-CH2-CH2-及び-CH=CH-から選択されるビラジカル（二価の基）を示す。すべてのキラル中心について、非対称性の基は、R配向又はS配向で存在していてもよい。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、R4*及びR2*は、ともに、ビラジカルC(RaRb)-N(Rc)-O-を示し、ここでRa及びRbは、水素、ハロゲン、C1〜6アルキル、置換C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、置換C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル又は置換C2〜6アルキニル、C1〜6アルコキシル、置換C1〜6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1〜6アミノアルキル又は置換C1〜6アミノアルキルからなる群より独立して選択され、例えば水素であり、Rcは、水素、ハロゲン、C1〜6アルキル、置換C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、置換C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル又は置換C2〜6アルキニル、C1〜6アルコキシル、置換C1〜6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1〜6アミノアルキル又は置換C1〜6アミノアルキルからなる群より選択され、例えば水素である。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、R4*及びR2*は、ともに、ビラジカルC(RaRb)-O-C(RcRd)-O-を示し、ここでRa、Rb、Rc、及びRdは、水素、ハロゲン、C1〜6アルキル、置換C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、置換C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル又は置換C2〜6アルキニル、C1〜6アルコキシル、置換C1〜6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1〜6アミノアルキル又は置換C1〜6アミノアルキルからなる群より独立して選択され、例えば水素である。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、R4*及びR2*は、ビラジカル-CH(Z)-O-を形成し、ここでZは、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、置換C1〜6アルキル、置換C2〜6アルケニル、置換C2〜6アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオール、又は置換チオからなる群より選択され;それぞれの置換基は、独立して、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(=X)J1、OC(=X)NJ1J2、NJ3C(=X)NJ1J2、及びCNから独立して選択される保護置換基の群で場合により一置換又は多置換されていてもよく、J1、J2、及びJ3は、それぞれ、独立して、H又はC1〜6アルキルであり、Xは、O、S、又はNJ1である。いくつかの実施形態では、Zは、C1〜6アルキル又は置換C1〜6アルキルである。いくつかの実施形態では、Zは、メチルである。いくつかの実施形態では、Zは、置換C1〜6アルキルである。いくつかの実施形態では、前記置換基は、C1〜6アルコキシである。いくつかの実施形態では、Zは、CH3OCH2-である。すべてのキラル中心について、非対称性の基は、R配向又はS配向で存在していてもよい。そのような二環式ヌクレオチドは、米国特許第7,399,845号に開示されており、これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、R1*、R2、R3、R5、R5*は、水素である。いくつかの実施形態では、R1*、R2、R3*は、水素であり、R5、R5*の一方又は両方は、上記に又はWO2007/134181で言及されるように、水素以外のものであってもよい。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、R4*及びR2*は、ともに、ビラジカル-CH2N(Rc)-からなる又はそれを含むなど、架橋中に置換アミノ基を含むビラジカルを示し、ここでRcは、C1〜12アルキルオキシである。いくつかの実施形態では、R4*及びR2*は、ともに、ビラジカル-Cq3q4-NOR-を示し、ここでq3及びq4は、水素、ハロゲン、C1〜6アルキル、置換C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、置換C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル又は置換C2〜6アルキニル、C1〜6アルコキシル、置換C1〜6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1〜6アミノアルキル又は置換C1〜6アミノアルキルからなる群より独立して選択され;置換基は、それぞれ、独立して、ハロゲン、OJ1、SJ1、NJ1J2、COOJ1、CN、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)NJ1J2、又はN(H)C(=X=N(H)J2から独立して選択される置換基と一置換又は多置換され、Xは、O又はSであり;J1及びJ2は、それぞれ、独立して、H、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、C1〜6アミノアルキル、又は保護基である。すべてのキラル中心について、非対称性の基は、R配向又はS配向で存在していてもよい。そのような二環式ヌクレオチドは、WO2008/150729に開示されており、これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、R1*、R2、R3、R5、R5*は、水素、ハロゲン、C1〜6アルキル、置換C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、置換C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル又は置換C2〜6アルキニル、C1〜6アルコキシル、置換C1〜6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1〜6アミノアルキル又は置換C1〜6アミノアルキルからなる群より独立して選択される。いくつかの実施形態では、R1*、R2、R3、R5、R5*は、水素である。いくつかの実施形態では、R1*、R2、R3は、水素であり、R5、R5*の一方又は両方は、上記に又はWO2007/134181で言及されるように、水素以外のものであってもよい。いくつかの実施形態では、R4*及びR2*は、ともに、ビラジカル（二価の基）C(RaRb)-O-を示し、ここでRa及びRbは、それぞれ、独立して、ハロゲン、C1〜C12アルキル、置換C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケニル、置換C2〜C12アルケニル、C2〜C12アルキニル、置換C2〜C12アルキニル、C1〜C12アルコキシ、置換C1〜C12アルコキシ、OJ1、SJ1、SOJ1、SO2J1、NJ1J2、N3、CN、C(=O)OJ1、C(=O)NJ1J2、C(=O)J1、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)NJ1J2、N(H)C(=O)NJ1J2、若しくはN(H)C(=S)NJ1J2であり;又はRa及びRbは、ともに、=C(q3)(q4)であり;q3及びq4は、それぞれ、独立して、H、ハロゲン、C1〜C12アルキル、又は置換C1〜C12アルキルであり;置換基は、それぞれ、独立して、ハロゲン、C1〜C6アルキル、置換C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、置換C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、置換C2〜C6アルキニル、OJ1、SJ1、NJ1J2、N3、CN、C(=O)OJ1、C(=O)NJ1J2、C(=O)J1、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=O)NJ1J2、又はN(H)C(=S)NJ1J2から独立して選択される置換基と一置換又は多置換され、J1及びJ2は、それぞれ、独立して、H、C1〜C6アルキル、置換C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、置換C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、置換C2〜C6アルキニル、C1〜C6アミノアルキル、置換C1〜C6アミノアルキル、又は保護基である。そのような化合物は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれるWO2009006478Aに開示されている。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、R4*及びR2*は、ビラジカル-Q-を形成し、ここでQは、C(q1)(q2)C(q3)(q4)、C(q1)=C(q3)、C[=C(q1)(q2)]-C(q3)(q4)、又はC(q1)(q2)-C[=C(q3)(q4)]であり;q1、q2、q3、q4は、それぞれ、独立して、H、ハロゲン、C1〜12アルキル、置換C1〜12アルキル、C2〜12アルケニル、置換C1〜12アルコキシ、OJ1、SJ1、SOJ1、SO2J1、NJ1J2、N3、CN、C(=O)OJ1、C(=O)-NJ1J2、C(=O)J1、-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)NJ1J2、N(H)C(=O)NJ1J2、又はN(H)C(=S)NJ1J2であり;J1及びJ2は、それぞれ、独立して、H、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、C1〜6アミノアルキル、又は保護基であり;場合により、QがC(q1)(q2)(q3)(q4)であり、q3又はq4の一方がCH3である場合、q3若しくはq4の他方又はq1及びq2の一方の少なくとも1つは、H以外のものである。いくつかの実施形態では、R1*、R2、R3、R5、R5*は、水素である。すべてのキラル中心について、非対称性の基は、R配向又はS配向で存在していてもよい。そのような二環式ヌクレオチドは、WO2008/154401に開示されており、これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、R1*、R2、R3、R5、R5*は、水素、ハロゲン、C1〜6アルキル、置換C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、置換C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル又は置換C2〜6アルキニル、C1〜6アルコキシル、置換C1〜6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1〜6アミノアルキル、又は置換C1〜6アミノアルキルからなる群より独立して選択される。いくつかの実施形態では、R1*、R2、R3、R5、R5*は、水素である。いくつかの実施形態では、R1*、R2、R3は、水素であり、R5、R5*の一方又は両方は、上記に又はWO2007/134181若しくはWO2009/067647で言及されるように、水素以外のものであってもよい（アルファL-二環式核酸アナログ）。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド化合物中で使用されるLNAは、好ましくは、一般式IIの構造を有する。
【化４】
2014533944.tif 000005
【０１７４】
式中、
Yは、-O-、-CH2O-、-S-、-NH-、N(Re)、及び/又は-CH2-からなる群より選択され;Z及びZ*は、ヌクレオチド間連結、RH、末端基、又は保護基の中で独立して選択され;Bは、天然又は非天然ヌクレオチド塩基部分（核酸塩基）を構成し、RHは、水素及びC1〜4-アルキルから選択され;Ra、Rb Rc、Rd、及びReは、場合により、水素、場合により置換されていてもよいC1〜12-アルキル、場合により置換されていてもよいC2〜12-アルケニル、場合により置換されていてもよいC2〜12-アルキニル、ヒドロキシ、C1〜12-アルコキシ、C2〜12-アルコキシアルキル、C2〜12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1〜12-アルコキシカルボニル、C1〜12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ及びジ(C1〜6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ及びジ(C1〜6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1〜6-アルキル-アミノカルボニル、モノ及びジ(C1〜6-アルキル)アミノ-C1〜6-アルキル-アミノカルボニル、C1〜6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1〜6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1〜6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1〜6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート基、リポーター基、並びにリガンドからなる群より独立して選択され、アリール及びヘテロアリールは、場合により、置換されてもよく、2つのジェミナルな置換基Ra及びRbは、ともに、場合により置換されていてもよいメチレン（=CH2）を示してもよく;RHは、水素及びC1〜4-アルキルから選択される。いくつかの実施形態では、Ra、Rb Rc、Rd、及びReは、場合により、水素及びC1〜6アルキルからなる群より独立して選択され、例えばメチルである。すべてのキラル中心について、非対称性の基は、R配向又はS配向で存在していてもよく、例えば、2つの例示的な立体化学異性体は、ベータ-D及びアルファ-Lアイソフォームを含み、これらは、以下のように示されう
る。
【化５】
2014533944.tif 000006
【０１７５】
具体的な例のLNA単位は、下記に示される。
【化６】
2014533944.tif 000007
【０１７６】
用語「チオ-LNA」は、上記の一般式中のYがS又は-CH2-S-から選択されるロックドヌクレオチドを含む。チオ-LNAは、ベータ-D及びアルファ-L-立体配置の両方の立体配置をとることができる。
【０１７７】
用語「アミノ-LNA」は、上記の一般式中のYが-N(H)-、N(R)-、CH2-N(H)-、及び-CH2-N(R)-から選択されるロックドヌクレオチドを含み、Rは、水素及びC1〜4-アルキルから選択される。アミノ-LNAは、ベータ-D及びアルファ-L-立体配置の両方の立体配置をとることができる。
【０１７８】
用語「オキシ-LNA」は、上記の一般式中のYが-O-を表すロックドヌクレオチドを含む。オキシ-LNAは、ベータ-D及びアルファ-L-立体配置の両方の立体配置をとることができる。
【０１７９】
用語「ENA」は、上記の一般式中のYが-CH2-O-であるロックドヌクレオチドを含む（-CH2-O-の酸素原子が塩基Bに関して2'位に結合される）。Reは、水素又はメチルである。
【０１８０】
いくつかの例示的な実施形態では、LNAは、ベータ-D-オキシ-LNA、アルファ-L-オキシ-LNA、ベータ-D-アミノ-LNA、及びベータ-D-チオ-LNA、特にベータ-D-オキシ-LNAから選択される。
【０１８１】
RNアーゼ動員
エンドリボヌクレアーゼ（RNアーゼ）、例えばRNアーゼHを動員することよって、又は例えば翻訳の立体障害若しくはスプライシングの調節による標的mRNAの非RNアーゼ媒介分解によって、オリゴマー化合物は機能できることが認識されている。EP 1 222 309（特に実施例91〜95）は、RNアーゼH活性を測定するためのインビトロ方法を提供しており、その方法を使用して、RNアーゼHを動員する能力を測定できる。
【０１８２】
スプライシングの調節
多くの真核生物mRNA転写産物は、「イントロン」として公知の1つ以上の領域を含有し、翻訳される前に転写産物からイントロンが切り出される（スプライスされる）。スプライシング前のRNA転写産物は、プレmRNAと呼ばれる。残りの（したがって翻訳される）領域は、「エクソン」として公知であり、一緒にスプライスされて、連続した（成熟）mRNA配列を形成する。mRNAスプライス部位、即ち、イントロン-エクソンジャンクションは、好ましい標的領域になることもあり、異常スプライシングが疾患に関係する、又は特定のmRNAスプライス産物の過剰産生が疾患に関係する状況において特に有用である。本発明に見られるようなスプライシングの調節の場合、オリゴヌクレオチドは核酸標的のRNアーゼH切断を誘発しないことが好ましく、その切断は細胞中に存在する標的mRNA量を低下させる。その代わりとして、所望のスプライス産物（この場合、全長SMN2 mRNA）のために異常スプライシングを調節しようとする目的で、非RNアーゼH法によってスプライシングに干渉するように、オリゴマーは設計されている。したがって、アンチセンス法の使用により、所望のスプライス産物（mRNA又はそのタンパク質産物）のレベルを実際に高めることができる。
【０１８３】
ミックスマー設計
いくつかの「キメラ」オリゴマー（「ミックスマー」と称される）は、(i)RNアーゼよって認識可能であり切断可能なDNAモノマー又はヌクレオシド類似体モノマーと、(ii)RNアーゼを動員しないヌクレオシド類似体モノマーとが交互にある組成物からなる。
【０１８４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくはRNアーゼHを誘発せず、好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは「ミックスマー」であり、即ち、RNアーゼHによって容易に切断されない修飾ヌクレオシドとRNアーゼHよって切断され得る非修飾DNA単位との混合物を有するが、ギャップマーと異なり、RNアーゼHと結合し切断を媒介するのに十分長いDNA「ギャップ」領域を持たない。RNアーゼH切断には4個〜5個の連続するDNA単位が必要であると現在考えられており、したがって、RNアーゼHを誘発しないことを目的とするオリゴマー中には4個未満、より好ましくは3個未満又は2個未満の連続するDNA単位があることが好ましい。表1に示すように、本発明の好ましいミックスマーは、1個おきの位置にLNAを、3'末端に2個又は3個のLNAを有し、これは、オリゴヌクレオチドを安定化し、RNアーゼH切断を最小限に抑えると考えられる。骨格連結は、ホスホロチオエート連結である。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、オリゴマーは、LNA及びDNAヌクレオチドのみを含む。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、オリゴマーは、4個未満の連続するDNA単位、例えば3個未満の連続するDNA単位、例えば2個未満の連続するDNA単位を有する。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、1個又は2個以下の連続するDNA単位を有する。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、オリゴマーの5'単位は、LNAヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴマーの3'単位、例えば2個の3'単位は、LNAヌクレオチドである。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、オリゴマーは、LNA及びDNAヌクレオチドを含み、3個以下の連続的なLNA単位、例えば2個以下の連続的なLNA単位があり、5'ヌクレオチドはLNA単位であり、3'ヌクレオチド、例えば2個の3'ヌクレオチドはLNA単位である。いくつかの実施形態において、LNAオリゴマーは、交互になる5'-LNA-DNA-3'ヌクレオチドからなる又はこれを含み、場合により末端（5'及び/又は3'）にLNA単位である2個のヌクレオチドを有してもよい。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、オリゴマー、例えば上述のミックスマーは、長さ12〜16ヌクレオチド、例えば13、14又は15ヌクレオチドである。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、オリゴマー、例えば上述のミックスマーは、ホスホロチオエートオリゴマーである。
【０１９１】
ヌクレオチド間連結
本明細書に記載のオリゴマーのモノマーは、連結基を介して結合されている。好適には、各モノマーは、連結基を介して3'隣接モノマーに連結される。
【０１９２】
本発明の文脈において、オリゴマーの末端にある5'モノマーは、5'末端基を含んでも含まなくてもよいが、5'連結基を含まないことは、当業者には理解されよう。
【０１９３】
用語「連結基」又は「ヌクレオチド間連結」は、2つのヌクレオチドをともに共有結合することができる基を意味するように意図される。具体的な好ましい例は、ホスフェート基及びホスホロチオエート基を含む。
【０１９４】
本発明のオリゴマーのヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、連結基を介してともに結合される。好適には、それぞれのヌクレオチドは、連結基を介して3'の隣接するヌクレオチドに連結される。
【０１９５】
適したヌクレオチド間連結としては、WO2007/031091内に列挙されるもの、例えば、WO2007/031091（参照によって本明細書に組み込まれる）の34ページの第1節に列挙されるヌクレオチド間連結が挙げられる。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、その通常のホスホジエステルから、ホスホロチオエート又はボラノホスフェート（これらの2つはRNアーゼHによって切断可能である）など、ヌクレアーゼ攻撃に対してより抵抗性であるものにヌクレオチド間連結を修飾すること、標的遺伝子の発現を低下させる際、アンチセンス阻害のその経路を可能にすることもまた好ましい。
【０１９７】
本明細書で提供される、適した硫黄（S）含有ヌクレオチド間連結が好ましい。ヌクレアーゼ抵抗性の改善及び製造の容易性などの他の理由のため、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結も好ましい。
【０１９８】
しかしながら、オリゴマーは、特に、LNAヌクレオチドなどのヌクレオチド類似体の使用により、エンドヌクレアーゼ分解からヌクレオチド間連結を保護する場合、ホスホジエステル連結などの、ホスホロチオエート以外のヌクレオチド間連結を含んでいてもよい。
【０１９９】
1又は2つの連結などのホスホジエステル連結の、特に、ヌクレオチド類似体単位の間の又はそれに隣接する、他の場合にはホスホロチオエートオリゴマーへの包含は、オリゴマーの生物学的利用率及び/又は体内分布を修飾することが認識される。参照によって本明細書に組み込まれるWO2008/053314を参照されたい。
【０２００】
上に言及される実施形態などのいくつかの実施形態では、適しており、特に示されない場合、残りの連結基はすべて、ホスホジエステル若しくはホスホロチオエート又はその混合物のいずれかである。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド間連結基はすべて、ホスホロチオエートである。
【０２０２】
本明細書で提供されるものなどの、特異的なギャップマーオリゴヌクレオチド配列に対して言及する場合、様々な実施形態では、連結が、ホスホロチオエート連結である場合、本明細書で開示されるものなどの別の連結が、使用されてもよい、例えば、ホスフェート（ホスホジエステル）連結が、特に、LNA単位などのヌクレオチド類似体の間の連結について使用されてもよいことが理解されるであろう。同様に、本明細書で提供されるものなどの、特異的なギャップマーオリゴヌクレオチド配列に対して言及する場合、C（シトシン）残基が、5'メチル修飾シトシンとして注釈をつけられる場合、様々な実施形態では、オリゴマー中に存在する、1つ以上のCは、非修飾C残基であってもよい。
【０２０３】
オリゴマー化合物
本発明のオリゴマーは、例えば、表1に示される配列番号1〜83からなる群より選択される配列、又は上述のうち1つのサブセットである配列を有しうる。一実施形態において、オリゴマーは16マーであり、第1、第3、第5、第7、第9、第11、第13、第15及び第16番目のモノマー単位（5'末端から始まる）はLNAであり、残りの単位はDNAであり、連結は始めから終りまでホスホロチオエートである。別の実施形態において、オリゴマーは15マーであり、第1、第3、第5、第7、第9、第11、第13、第14及び第15番目のモノマー単位（5'末端から始まる）はLNAであり、残りの単位はDNAであり、連結は始めから終りまでホスホロチオエートである。さらなる実施形態において、オリゴマーは12マーであり、第1、第3、第5、第7、第9、第11及び第12番目のモノマー単位（5'末端から始まる）はLNAであり、残りの単位はDNAであり、連結は始めから終りまでホスホロチオエートである。
【０２０４】
コンジュゲート
本開示の文脈中で、用語「コンジュゲート」は、本明細書で記載されるオリゴマーの、1つ以上の非ヌクレオチド部分又は非ポリヌクレオチド部分への共有結合（「コンジュゲーション」）によって形成される異種分子を示すように意図される。非ヌクレオチド部分又は非ポリヌクレオチド部分の例は、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー、又はその組み合わせなどの高分子作用物質を含む。典型的に、タンパク質は、標的タンパク質に対する抗体であってもよい。典型的なポリマーは、ポリエチレングリコールである。
【０２０５】
そのため、様々な実施形態では、本発明のオリゴマーは、典型的にヌクレオチドの連続配列からなるポリヌクレオチド領域及びさらなる非ヌクレオチド領域の両方を含んでいてもよい。連続ヌクレオチド配列からなる本発明のオリゴマーに対して言及する場合、化合物は、コンジュゲート成分などの非ヌクレオチド成分を含んでいてもよい。
【０２０６】
本発明の様々な実施形態では、オリゴマー化合物は、リガンド/コンジュゲートに連結され、これらは、例えば、オリゴマー化合物の細胞取り込みを増加させるために使用されてもよい。WO2007/031091は、適したリガンド及びコンジュゲートを提供し、これは、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２０７】
本発明はまた、本明細書で記載される、本発明に係る化合物とその化合物に共有結合された少なくとも1つの非ヌクレオチド部分又は非ポリヌクレオチド部分を含むコンジュゲートをも提供する。そのため、本発明の化合物が本明細書で開示される特定された核酸又はヌクレオチド配列からなる様々な実施形態では、化合物はまた、前記化合物に共有結合される、少なくとも1つの非ヌクレオチド部分又は非ポリヌクレオチド部分を含んでいてもよい（例えば、1つ以上のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含まない）。
【０２０８】
コンジュゲーション（コンジュゲート部分との）は、本発明のオリゴマーの活性、細胞分布、又は細胞取り込みを増強しうる。そのような部分としては、抗体、ポリペプチド、コレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル-s-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪鎖、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基、リン脂質、例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロール又はトリエチルアンモニウム1,2-ジ-o-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-h-ホスホネート、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミン又はヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０９】
本発明のオリゴマーはまた、活性薬物質、例えばアスピリン、イブプロフェン、サルファ薬、抗糖尿病薬、抗菌薬、又は抗生物質にコンジュゲートされてもよい。
【０２１０】
ある実施形態では、コンジュゲート部分は、コレステロールなどのステロールである。
【０２１１】
様々な実施形態では、コンジュゲート部分は、例えば、長さが1〜50個、例えば2〜20個など、例えば3〜10個など、のアミノ酸残基の正電荷ペプチドなどの正電荷ポリマー及び/又はポリエチレングリコール（polyethylglycol）（PEG）若しくはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレンオキシドを含む又はそれからなる。参照によって本明細書に組み込まれるWO2008/034123を参照されたい。好適には、ポリアルキレンオキシドなどの正電荷ポリマーは、WO2008/034123に記載される遊離可能なリンカーなどのリンカーを介して本発明のオリゴマーに結合されてもよい。
【０２１２】
例として、以下のコンジュゲート部分が、本発明のコンジュゲート中に使用することができる。
【化７】
2014533944.tif 000008
【０２１３】
活性化オリゴマー
本明細書で使用される用語「活性化オリゴマー」は、1つ以上のコンジュゲート部分、即ちそれら自体、核酸又はモノマーでない部分へのオリゴマーの共有結合を可能にし、本明細書で記載されるコンジュゲートを形成する、少なくとも1つの機能部分に共有結合される（即ち官能性の）本発明のオリゴマーを指す。典型的に、機能部分は、例えば3'-ヒドロキシル基又はアデニン塩基の環外のNH2基を介してオリゴマーに共有結合することができる化学基、好ましくは親水性であるスペーサー、及びコンジュゲート部分に結合することができる末端基（例えばアミノ基、スルフヒドリル基、又はヒドロキシル基）を含むであろう。いくつかの実施形態では、この末端基は、保護されない、例えばNH2基である。他の実施形態では、末端基は、例えば、"Protective Groups in Organic Synthesis" Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999）に記載されるものなどの任意の適した保護基によって保護される。適したヒドロキシル保護基の例としては、酢酸エステルなどのエステル、ベンジル、ジフェニルメチル、又はトリフェニルメチルなどのアラルキル基、及びテトラヒドロピラニルが挙げられる。適したアミノ保護基の例としては、ベンジル、アルファ-メチルベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシカルボニル、第三級ブトキシカルボニル、及びトリクロロアセチル又はトリフルオロアセチルなどのアシル基が挙げられる。いくつかの実施形態では、機能部分は、自己切断性である。他の実施形態では、機能部分は、生分解性である。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第7,087,229号を参照されたい。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、オリゴマーの5'末端とのコンジュゲート部分の共有結合を可能にするために5'末端で官能化されている。他の実施形態では、本発明のオリゴマーは、3'末端で官能化されている。他の実施形態では、本発明のオリゴマーは、骨格に沿って又はヘテロ環式塩基部分上で官能化されることができる。他の実施形態では、本発明のオリゴマーは、5'末端、3'末端、骨格、及び塩基から独立して選択される、1つを超える位置で官能化されることができる。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、本発明の活性化オリゴマーは、機能部分に共有結合される1つ以上のモノマーを合成の間に組み込むことによって合成される。他の実施形態では、本発明の活性化オリゴマーは、官能性ではないモノマーと共に合成され、オリゴマーは、合成の完成に際して官能化される。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、アミノアルキルリンカーを含有するヒンダードエステルを用いて官能化され、アルキル部分は、式(CH2)wを有し、wは、1〜10の範囲の整数、好ましくは約6であり、アルキルアミノ基のアルキル部分は、直鎖又は分枝鎖とすることができ、官能基は、エステル基（-O-C(O)-(CH2)wNH）を介してオリゴマーに結合される。
【０２１６】
他の実施形態では、オリゴマーは、(CH2)w-スルフヒドリル（SH）リンカーを含有するヒンダードエステルを用いて官能化され、wは、1〜10の範囲の整数、好ましくは約6であり、アルキルアミノ基のアルキル部分は、直鎖又は分枝鎖とすることができ、官能基は、エステル基（-O-C(O)-(CH2)wSH）を介してオリゴマーに結合される。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、スルフヒドリル活性化オリゴヌクレオチドは、ポリエチレングリコール又はペプチドなどのポリマー部分とコンジュゲートされる（ジスルフィド結合の形成を介して）。
【０２１８】
上に記載されるヒンダードエステルを含有する活性化オリゴマーは、当技術分野で知られている任意の方法、特に、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるPCT公開WO2008/034122に開示される方法及びその中の実施例によって合成することができる。
【０２１９】
他の実施形態では、本発明のオリゴマーは、実質的に米国特許第4,962,029号及び第4,914,210号に記載される官能化試薬、即ち、保護又は非保護スルフヒドリル基、アミノ基、又はヒドロキシル基を含む反対の末端に親水性スペーサー鎖を通して連結される、一方の末端にホスホルアミダイトを有する実質的に線状の試薬を用いて、オリゴマーの中へスルフヒドリル基、アミノ基、又はヒドロキシル基を導入することによって官能化される。そのような試薬は、主として、オリゴマーのヒドロキシル基と反応する。いくつかの実施形態では、そのような活性化オリゴマーは、オリゴマーの5'-ヒドロキシル基に結合される官能化試薬を有する。他の実施形態では、活性化オリゴマーは、3'-ヒドロキシル基に結合される官能化試薬を有する。他の実施形態では、本発明の活性化オリゴマーは、オリゴマーの骨格上のヒドロキシル基に結合される官能化試薬を有する。さらなる実施形態では、本発明のオリゴマーは、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第4,962,029号及び第4,914,210号に記載される、1つを超える官能化試薬を用いて官能化される。そのような官能化試薬を合成し、モノマー又はオリゴマーの中へそれらを組み込むための方法は、米国特許第4,962,029号及び第4,914,210号に開示される。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、固相結合オリゴマーの5'末端は、ジエニルホスホルアミダイト誘導体を用いて官能化され、その後、脱保護オリゴマーと、ディールス-アルダー環化付加反応を介した、例えばアミノ酸又はペプチドとのコンジュゲートが起こる。
【０２２１】
様々な実施形態では、オリゴマーの中への、2'-カルバメート置換糖又は2'-(O-ペンチル-N-フタルイミド)-デオキシリボース糖などの2'糖修飾を含有するモノマーの組み込みは、オリゴマーの糖とコンジュゲート部分の共有結合を促進する。他の実施形態では、1つ以上のモノマーの2'位にアミノ含有リンカーを有するオリゴマーは、例えば5'-ジメトキシトリチル-2'-O-(e-フタルイミジルアミノペンチル)-2'-デオキシアデノシン-3'-N,N-ジイソプロピル-シアノエトキシホスホルアミダイトなどの試薬を使用して調製される。例えばManoharan, et al., Tetrahedron Letters, 1991, 34, 7171を参照されたい。
【０２２２】
さらなる実施形態では、本発明のオリゴマーは、N6プリンアミノ基上、グアニンの環外N2上、又はシトシンのN4若しくは5位上を含む核酸塩基上にアミン含有官能性部分を有していてもよい。様々な実施形態では、そのような官能化は、オリゴマー合成で既に官能性の市販の試薬を使用することによって達成されてもよい。
【０２２３】
いくつかの官能性部分は、市販で入手可能であり、例えば、ヘテロ二官能性及びホモ二官能性の連結部分は、Pierce Co.（Rockford, Ill.）から入手可能である。他の市販の連結基は、5'-アミノ-修飾因子C6及び3'-アミノ-修飾因子試薬であり、ともに、Glen Research Corporation（Sterling、Va.）から入手可能である。Aminolink-2及び3'-アミノ-修飾因子はまた、Clontech Laboratories Inc.（Palo Alto、Calif.）からも入手可能であるように、5'-アミノ-修飾因子C6はまた、ABI（Applied Biosystems Inc.、Foster City、Calif.）からも入手可能である。
【０２２４】
組成物
本発明のオリゴマーは、医薬製剤及び医薬組成物で使用されてもよい。好適には、そのような組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、又はアジュバントを含む。WO/2007/031091は、好適な好ましい薬学的に許容される希釈剤、担体、及びアジュバントを提供し、これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。適した投薬量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組み合わせ、プロドラッグ製剤もまた、参照によって本明細書に組み込まれるWO/2007/031091で提供される。
【０２２５】
適用（用途）
本発明のオリゴマーは、例えば診断薬、治療薬、及び予防法のための研究試薬として利用されてもよい。研究において、そのようなオリゴマーを使用して、SMN2 mRNAのスプライシングを特異的に調節させ、それにより様々なスプライス産物の役割の機能的分析を容易にすることもできる。
【０２２６】
診断薬では、オリゴマーを使用して、ノーザンブロッティング、in situハイブリダイゼーション、又は類似した技術によって、細胞及び組織中のSMN2発現を検出し、定量することができる。
【０２２７】
治療薬について、SMN又は特定のSMN2 mRNAスプライス産物の発現を調節することによって治療することができる疾患又は障害を有する疑いがある動物又はヒトは、本発明に従ってオリゴマー化合物を投与することによって治療される。さらに、治療的又は予防的に有効な量で1種以上の本発明のオリゴマー又は組成物を投与することにより、異常なSMNスプライス産物の発現を含めたSMNの異常発現に関連する疾患若しくは症状を有する疑いがある又は起こしやすいヒトを治療する方法が提供される。本発明に係るオリゴマー、コンジュゲート又は医薬組成物は、有効量で通常投与される。
【０２２８】
本発明はまた、本明細書で言及される障害を治療するための方法であって、その必要性のある患者に、本明細書で記載される本発明に係る化合物及び/又は本発明に係るコンジュゲート及び/又は本発明に係る医薬組成物を投与するステップを含む方法もまた提供する。
【０２２９】
治療用組成物の処方及びその後の投与は、当業者の範囲内であると考えられる。投薬は、数日〜数カ月間、又は治癒が果たされる若しくは病状の縮小が達成されるまで続けられる治療過程と共に、治療すべき病状の重症度及び反応性によって決まる。最適投薬スケジュールは、患者体内での薬物の蓄積の測定から算出することができる。当業者は、最適用量、投薬方法及び繰り返し率を容易に決定することができる。最適用量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的効力に応じて変化し、一般に、インビトロ及びインビボ動物モデルにおいて有効であることが分かっているEC50に基づいて推定することができる。一般に、用量は体重1kgにつき0.01μg〜10gであり、1日に1回以上、毎週、毎月若しくは毎年、さらに一生のうちに単回投与で又は必要に応じて投与されてもよい。当業者は、体液又は組織中で測定される薬物の滞留時間及び濃度に基づいて、投薬の繰り返し率を容易に推定することができる。良好な治療の後、患者は、維持療法を受けて病状の再発を予防することが望ましく、オリゴヌクレオチドは、体重1kgにつき0.01μg〜100gの範囲で1日1回以上から20年毎に1回、維持量で投与することができる。
【０２３０】
医療適応症
本発明に係るオリゴマー及び他の組成物を使用して、過剰発現、望ましくない若しくは異常なレベル（特に過剰蓄積による可能性がある高レベル）、又は変異した若しくはそれ以外の異常な形態のSMNの発現と関連する症状を治療できる。
【０２３１】
本発明は、本明細書で言及される疾患、障害、又は状態を治療するための医薬の製造における本発明の化合物の使用をさらに提供する。
【０２３２】
概説するならば、本発明の一態様は、望ましくない若しくは異常なレベルのSMNと関連する状態に罹患している、又はそれにかかりやすいヒト対象を治療するための方法であって、1つ以上のLNA単位を含む、SMN2に標的化するオリゴマーの治療有効量をヒト対象に投与するステップを含む方法に関する。本発明に係るオリゴマー、コンジュゲート又は医薬組成物は、有効量で通常投与される。
【０２３３】
本明細書で言及される疾患又は障害は、いくつかの実施形態では、SMN2遺伝子又はそのタンパク質産物がSMNと関連若しくは相互作用する遺伝子中の変異と関連していてもよい。そのため、いくつかの実施形態では、標的プレmRNAは、SMN2配列の変異形態である。
【０２３４】
疾患又は障害は、SMN2の異常スプライシングと関連している場合があり、したがっていくつかの実施形態において、オリゴマーは、SMN2 mRNAのスプライシングを調節するように設計される。
【０２３５】
本発明の方法は、好ましくは、異常な若しくは望ましくないレベルのSMNによって、又は異常なSMN mRNAスプライス産物によって引き起こされる疾患に対する治療又は予防法のために利用される。
【０２３６】
別に述べると、いくつかの実施形態において、本発明は、さらに異常な若しくは望ましくないレベルのSMN、例えば、所望のレベルより高いSMN、又は特定のSMN mRNAスプライス産物を調節する方法であって、それを必要とするヒト対象に、本発明のオリゴマー、若しくは本発明のコンジュゲート又は本発明の医薬組成物を投与するステップを含む方法に関する。
【０２３７】
本発明はまた、医薬として使用するための、本明細書に記載のオリゴマー、組成物、又はコンジュゲートにも関する。さらに、本発明は、本明細書で言及されるものなどの疾患又は状態に罹患している対象を治療する方法に関する。治療を必要としている患者は、疾患又は障害に罹患している、又はそれに罹患する可能性がある患者である。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、本明細書で使用される用語「治療」は、既存の疾患（例えば本明細書で言及される疾患若しくは障害）の治療又は疾患の予防、即ち予防法の両方を指す。そのため、本明細書で言及される治療は、いくつかの実施形態では、予防的であってもよいことが認識されるであろう。
【０２３９】
実施形態
1. 少なくとも1つのロックド核酸（LNA）単位を含み、RNアーゼH活性を誘発しない長さ10〜30ヌクレオチドのオリゴマーであって、長さ10〜30核酸塩基の核酸塩基配列をさらに含むものであり、前記核酸塩基配列が、Genbankアクセッション番号NG_008728（配列番号167）又はその天然に存在するバリアントのヌクレオチド26231〜26300、31881〜31945又は32111〜32170に対応する領域と少なくとも80％相補的であり、前記配列が、SMN2 mRNAのスプライシングを調節し、全長SMN2 mRNA転写産物レベルの増加をもたらす、上記オリゴマー。
【０２４０】
2. 前記核酸塩基配列が、Genbankアクセッション番号NG_008728（配列番号167）のヌクレオチド26231〜26246、26274〜26300、31890〜31905、31918〜31945又は32115〜32162に対応する領域と少なくとも80％相補的である、実施形態1に記載のオリゴマー。
【０２４１】
3. Genbankアクセッション番号NG_008728（配列番号167）のヌクレオチド26231〜26300と少なくとも80％相補的である、実施形態1に記載のオリゴマー。
【０２４２】
4. 前記オリゴマーの核酸塩基配列が、配列番号1、2、3〜16、19〜20、22、24〜34、35〜38、40、41、45〜49、60〜80又は83の配列と少なくとも80％同一である、実施形態1に記載のオリゴマー。
【０２４３】
5. 前記オリゴマーの核酸塩基配列が、配列番号1、5、9、11、12、26、27、28、29、30、34、40、53〜59、62、63、65、66、69〜77又は79の配列を有する、実施形態1に記載のオリゴマー。
【０２４４】
6. スプライシングの調節が、対照の110％より多く、対照の120％より多く、対照の130％より多く、対照の140％より多く、対照の150％より多く、対照の160％より多く、対照の170％より多く、対照の180％より多く、対照の190％より多く又は対照の200％より多くの全長SMN2転写産物の量の増加である、実施形態1に記載のオリゴマー。
【０２４５】
7. 前記ヌクレオチド配列が、長さ12〜16ヌクレオチドである、実施形態1に記載のオリゴマー。
【０２４６】
8. ミックスマーである、実施形態8に記載のオリゴマー。
【０２４７】
9. 実施形態1に記載のオリゴマーと、前記オリゴマーに共有結合された少なくとも1つの非ヌクレオチド部分又は非ポリヌクレオチド部分とを含むコンジュゲート。
【０２４８】
10. 脊髄性筋萎縮症の治療用医薬などの、医薬として使用するための、実施形態1に記載のオリゴマー又は実施形態9に記載のコンジュゲート。
【０２４９】
11. 前記脊髄性筋萎縮症が、I型、II型又はIII型脊髄性筋萎縮症である、実施形態10に記載のオリゴマー。
【０２５０】
12. 実施形態1に記載のオリゴマー又は実施形態9に記載のコンジュゲート、及び薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、又はアジュバントを含む医薬組成物。
【０２５１】
13. 脊髄性筋萎縮症を治療する方法であって、脊髄性筋萎縮症を患っている又は患っている可能性があると考えられる患者に、実施形態1に記載のオリゴマー、又は実施形態9に記載のコンジュゲート、又は実施形態12に記載の医薬組成物の有効量を投与するステップを含む前記方法。
【０２５２】
15. SMN2 mRNAを発現しているヒト細胞においてSMN2 mRNAのスプライシングを調節する方法であって、前記ヒト細胞に、実施形態1に記載のオリゴマー、又は実施形態9に記載のコンジュゲート、又は実施形態12の医薬組成物を投与するステップを含み、前記ヒト細胞においてSMN2 RNAのスプライシングが調節され、切断型SMN2 mRNAに対する全長SMN2 mRNAの比が増加する、前記方法。
【実施例】
【０２５３】
[実施例1]
オリゴヌクレオチドの設計
本発明においては、一連のオリゴヌクレオチドは、ヒトSMN2ゲノム配列（Genbankアクセッション番号NG_008728）に標的化するように設計された。表1に示すように、これらは、いくつかの位置にベータ-D-オキシLNA単位（大文字）及び他の位置にDNA単位（小文字）を有するキメラオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、示した通りゲノム配列の様々な領域に対して標的化した。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが相補的である、Genbankアクセッション番号NG_008728上の第1（最も5'側）ヌクレオチドのヌクレオチド番号を示している。表1において、ヌクレオシド間連結はすべて、ホスホロチオエート連結であり、LNA-シトシン（大文字）はすべて5-メチルシトシンである。
【表１】
2014533944.tif 000009
【０２５４】
2014533944.tif 000010
【０２５５】
2014533944.tif 000011
【０２５６】
[実施例2]
インビトロモデル:細胞培養
標的核酸発現に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果は、様々な細胞型のいずれかで試験することができ、ただし、標的核酸が測定可能なレベルで存在する。標的は、内因的に又は前記標的をコードする核酸の一過性の若しくは安定したトランスフェクションによって発現することができる。標的核酸の発現レベルは、常法に従って、例えばノーザンブロット分析、リアルタイムPCR、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して測定することができる。以下の細胞型は、例示目的で提供されるが、標的が選ばれた細胞型中で発現される限り、他の細胞型を常法に従って使用することができる。
【０２５７】
細胞は、下に記載される適切な培地中で培養し、95〜98％湿度及び5％CO2で37℃で維持した。細胞は、毎週2〜3回、常法に従って継代培養した。
【０２５８】
SMA1細胞:ヒトSMA1患者線維芽細胞細胞系（カタログ番号GM03813、Coriell Institute for Medical Research、Camden、NJ）を、10％ウシ胎仔血清（Biochrom、BCHS0115）及び0.25μg/mLゲンタマイシン（G1397、Sigma）を含むイーグル最少必須培地（#M5650、Sigma）、2mMグルタミン（AQ、#G8541、Sigma）及び非必須アミノ酸（11140-035、Invitrogen）中で培養した。この細胞系は、SMN2を発現するが、SMN1は発現せず、したがってSMA患者における状況を表している。
【０２５９】
[実施例3]
インビトロモデル:脂質トランスフェクションを使用するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理
トランスフェクション媒体としてカチオンリポソーム製剤LipofectAMINE 2000（#11668-019、Invitrogen）を使用して、実施例2に掲げたSMA1細胞系をオリゴヌクレオチドで処理した。リポフェクタミン/オリゴヌクレオチド混合物と共に6ウェル細胞培養プレート（NUNC、#）に細胞を播種した。オリゴは、最終濃度25nMで使用した。オリゴ-脂質複合体の形成は、無血清OptiMEM（#51985、Gibco）及び最終脂質濃度2.5μg/mLのLipofectAMINE 2000を使用して、基本的に製造業者の記述の通り実行された。トランスフェクションの後に、以下の実施例に記載の通り24時間後に全RNAを調製し（RNeasy Mini Kit、#74106、Qiagen）、逆転写し（M-MLV逆転写酵素及びランダムデカマー、#2044、#5722G、Ambion）、2つの注文設計のTaqMan遺伝子発現アッセイ（#Applied Biosystems、AI39QW5、AI5I03D）を使用するリアルタイムPCRを続けて、全長の転写産物又はエクソン7がスキップされた短い転写産物のいずれかを検出した。正規化にはGAPDHを使用した。
【０２６０】
結果を、以下の実施例7に示す（表2）。
【０２６１】
[実施例4]
インビトロモデル:RNA抽出及びcDNA合成
全RNA単離及び第1鎖合成
製造業者の説明書に従ってQiagen RNeasyキット（#74106、Qiagen）を使用して、上記の通りトランスフェクトした細胞から全RNAを抽出した。製造業者の説明書に従ってAmbion製のMMLV-逆転写酵素（#2044、Ambion）及びランダムデカマープライマー（#5722G、Ambion）試薬を使用して、第1鎖合成を実施した。
【０２６２】
各サンプルに対して、全RNA 0.3〜0.4μgを、RNアーゼを含まないH2Oで（10.8μL）に調整し、ランダムデカマー（50μM）2μL及びdNTP混合物（各2.5mM dNTP）4μLと混合し、70℃で3分間加熱し、その後サンプルを氷上で急冷した。氷上でサンプルを冷却した後、10x Buffer RT 2μL、MMLV逆転写酵素（100U/μL）1μL及びRNアーゼ阻害剤（10U/μL）0.25μLを各サンプルに添加し、42℃で60分間インキュベーションし、95℃で10分間酵素を熱不活性化し、次いでサンプルを4℃に冷却した。
【０２６３】
[実施例5]
インビトロモデル:リアルタイムPCRによるSMN2 RNAスプライシングのオリゴヌクレオチド調節の分析
SMN2発現のアンチセンス調節は、当技術分野において公知の様々な方法でアッセイできる。例えば、SMN2 mRNAレベルは、例えば、ノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）又はリアルタイムPCRによって定量化することができる。リアルタイム定量PCRが、現在のところ好ましい。RNA分析は、細胞の全RNA又はmRNAで実施できる。
【０２６４】
RNA単離及びRNA分析、例えばノーザンブロット解析の方法は、当業者にとって日常業務であり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sonsに教示されている。リアルタイム定量（PCR）は、Applied Biosystemsから入手可能な、市販の多色リアルタイムPCR検出系を使用して都合よく達成できる。
【０２６５】
SMN2 mRNAレベルのリアルタイム定量PCR分析
製造業者の説明書に従って注文設計のヒトSMN ABI Prism TaqMan Assays（全長#AI5I03D、エクソン7スキップ#AI39QW5、Applied Biosystems）を使用して、ヒト全長及びエクソン7スキップSMN2 mRNAのサンプル含有量を定量化した。グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）mRNA量を、サンプル調製における何らかの変動を正規化するための内在性対照として使用した。
【０２６６】
製造業者の説明書に従ってヒトGAPDH ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent（#4310884E、Applied Biosystems）を使用して、ヒトGAPDH mRNAのサンプル含有量を定量化した。
【０２６７】
リアルタイム定量PCRは、当技術分野で周知の技術であり、例えばHeidら、Real time quantitative PCR、Genome Research (1996)、6: 986〜994頁に教示されている。
【０２６８】
リアルタイムPCR:実施例5に記載の通り実施した第1鎖合成由来cDNAを5倍希釈し、Applied BiosystemsのTaqman7500 FAST又は7900 FASTを使用するリアルタイム定量PCRによって分析した。プライマー及びプローブを、2x Taqman Fast Universal PCRマスターミックス（2x）（#4352042、Applied Biosystems）と混合し、cDNA 4μLに添加して最終容量10μLにした。各サンプルを、2連で分析した。対象のRNAを発現している細胞系から精製される物質において調製されるcDNAを2倍希釈アッセイすることにより、アッセイ用の標準曲線を生成した。鋳型なしの対照には、cDNAの代わりとして滅菌H2Oを使用した。PCRプログラム:95℃20秒間、その後に40サイクルの95℃、3秒間、60℃、30秒間。Applied Biosystems Fast System SDS Software Version 1.3.1.21又はSDS Software Version 2.3を使用して計算した閾値サイクルから、標的mRNA配列の相対量を決定した。
【０２６９】
[実施例6]
インビトロ分析:SMN2のSD6（イントロン6）5'領域に標的化されたオリゴヌクレオチド化合物による、ヒトSMN2 mRNAスプライシングのアンチセンス調節
脂質トランスフェクションを使用して、25nMのオリゴ濃度でSMN2 mRNAスプライシングを調節する潜在力について、SMA1細胞系において、表1に提示されているオリゴヌクレオチドを評価した。これらのオリゴヌクレオチドは、SMN2のイントロン6中のスプライスドナー6（SD6）の5'領域、文献ではこれまで標的にされていない領域、に標的されている。結果を表2に示す。
【０２７０】
表2:ヒトSMN2スプライシングのアンチセンス調節
表2のデータは、SMA1細胞において25nMで模擬トランスフェクトした細胞と対比したダウンレギュレーション（％）として提示される。オリゴヌクレオチド配列及び修飾は、表1に示される。
【表２】
2014533944.tif 000012
【０２７１】
対照の100％より高い全長SMN2 mRNAレベルをもたらすオリゴヌクレオチドが好ましい。表2から分かるように、配列番号1、2、3〜16、19〜20、22及び24〜34のオリゴヌクレオチドは、全長SMN2転写産物のそのような増加を達成している。これらの現在のところ好適なオリゴマーは、Genbankアクセッション番号NG_008728のヌクレオチド26231〜26300に標的化されている。
【０２７２】
これらの実験において、配列番号1、5、9、11、12、26、27、28、29、30及び34のオリゴヌクレオチドは、対照（この実験では模擬トランスフェクト細胞）と比較して、SMN2Δ7mRNA発現の低下と同時に全長SMN2 mRNA発現の約150％以上の増加を示した、したがって特に好ましい。当然のことながら、これらのオリゴは、スプライススイッチングを引き起こして、SMN2エクソン7封入を増加させ、十分に機能しない切断型SMN2Δ7転写産物のレベルを低下させる。これらの特に好ましい化合物は、NG_008728のヌクレオチド位置26231〜26246及び26274〜26300に標的化されている。
【０２７３】
例示したアンチセンスオリゴ配列、例えば様々な長さ（より短い若しくはより長い）並びに/又は核酸塩基の内容（例えばその型及び/若しくは類似体単位の割合）に基づくオリゴヌクレオチドも好ましく、そのオリゴヌクレオチドは、全長転写産物のためのSMN2発現の良好な調節、好ましくは対照と比較して少なくとも150％の全長ももたらす。
【０２７４】
[実施例7]
インビトロ分析:SMN2のISS-E1（イントロン6）領域に標的化されたオリゴヌクレオチド化合物による、ヒトSMN2 mRNAスプライシングのアンチセンス調節
脂質トランスフェクションを使用して、25nMのオリゴ濃度でSMN2 mRNAスプライシングを調節する潜在力について、SMA1細胞系において、表1に提示されているオリゴヌクレオチドを評価した。結果を表3に示す。
【０２７５】
表3:SMN2のISS-E1（イントロン6）領域におけるLNA-アンチセンスオリゴヌクレオチドのファインタイリング（fine tiling）
表3のデータは、SMA1細胞において25nMで模擬トランスフェクトした細胞と対比したダウンレギュレーション（％）として提示される。オリゴヌクレオチド配列及び修飾は、表1に示される。
【表３】
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【０２７６】
対照の100％より高い全長SMN2 mRNAレベルをもたらすオリゴマー（表3に示される）が好ましい。表から分かるように、配列番号35〜38、40、41及び45〜49のオリゴマーは、全長SMN2転写産物のそのような増加を達成している。これらのオリゴマーは、Genbankアクセッション番号NG_008728のヌクレオチド位置31881〜31945に標的されている。これらの実験において、Genbankアクセッション番号NG_008728のヌクレオチド位置31890〜31905及び31918〜31945に標的化されている配列番号53〜59のオリゴマーは、対照（この実験では模擬トランスフェクト細胞）と比較して、SMN2Δ7mRNA発現の低下と同時に全長SMN2 mRNA発現の約200％以上の増加を示した、したがって特に好ましい。当然のことながら、これらのオリゴは、スプライススイッチングを引き起こして、SMN2エクソン7封入を増加させ、十分に機能しない切断型SMN2Δ7転写産物のレベルを低下させる。この実験において、配列番号40のオリゴヌクレオチドは、対照と比較して、SMNΔ7の増加と同時に全長SMN2の200％を超える増加を示したので、これも特に好ましい。これらの特に好ましいオリゴマーは、NG_008728のヌクレオチド位置31890〜31905及び31918〜31945に標的化されている。
【０２７７】
例示したアンチセンスオリゴマー配列、例えば様々な長さ（より短い若しくはより長い）並びに/又は核酸塩基の内容（例えばその型及び/若しくは類似体単位の割合）に基づくオリゴマーも好ましく、そのオリゴマーは、SMN2スプライシングに同等（対照と比較して少なくとも約200％）の調節をもたらして、SMN2エクソン7封入を増加させる（全長SMN2転写産物を増加させる）。
【０２７８】
[実施例8]
インビトロ分析:SMN2のISE/ISS-E2（イントロン7）領域に標的化されたオリゴヌクレオチド化合物による、ヒトSMN2 mRNAスプライシングのアンチセンス調節
脂質トランスフェクションを使用して、25nMのオリゴ濃度でSMN2 mRNAスプライシングを調節する潜在力について、SMA1細胞系において、表1に提示されているオリゴマーを評価した。結果を表4に示す。
【０２７９】
表4:SMN2のISE/ISS-E2（イントロン7）領域におけるLNA-アンチセンスオリゴヌクレオチドのファインタイリング
表4のデータは、SMA1細胞において25nMで模擬トランスフェクトした細胞と対比したダウンレギュレーション（％）として提示される。オリゴヌクレオチド配列及び修飾は、表1に示される。
【表４】
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【０２８０】
対照の100％より高い全長SMN2 mRNAレベルをもたらすオリゴマー（表4に示される）が好ましい。表から分かるように、配列番号60〜80及び83を有するオリゴマーは、全長SMN2転写産物のそのような増加を達成している。これらのオリゴマーは、Genbankアクセッション番号NG_008728のヌクレオチド位置31211〜32170に標的されている。これらの実験において、Genbankアクセッション番号NG_008728のヌクレオチド位置32115〜32162に標的化されている配列番号62、63、65、66及び69〜77のオリゴマーは、対照細胞（この実験では模擬トランスフェクト細胞）と比較して、SMN2Δ7mRNA発現の低下と同時に全長SMN2 mRNA発現の約200％以上の増加を示した、したがって特に好ましい。当然のことながら、これらのオリゴは、スプライススイッチングを引き起こして、SMN2エクソン7封入を増加させ、十分に機能しない切断型SMN2Δ7転写産物のレベルを低下させる。この実験において、配列番号79のオリゴヌクレオチドは、対照と比較して、全長とSMNΔ7転写物の両方において少なくとも約200％の増加を示したので、これも特に好ましい。これらの特に好ましいオリゴマーは、NG_008728のヌクレオチド位置32115〜32162に標的化されている。
【０２８１】
例示したアンチセンスオリゴマー配列、例えば様々な長さ（より短い若しくはより長い）並びに/又は核酸塩基の内容（例えばその型及び/若しくは類似体単位の割合）に基づくオリゴヌクレオチドも好ましく、そのオリゴヌクレオチドは、SMN2スプライシングに同等の調節をもたらして、SMN2エクソン7封入を増加させる（全長SMN2転写産物を増加させる）。
【０２８２】
本明細書に記載され、特許請求の範囲に記載されている組成物及び方法のすべては、本開示に照らして過度の実験なしに作製され、実行され得る。この発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態の点から記載されたが、組成物及び方法に変化を加えてもよいことは当業者には明らかであろう。当業者にとって明らかなそのような類似の置換及び修飾のすべては、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の精神の範囲内であるとみなされる。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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