(57)【要約】本発明は、混合性核酸試料から標的核酸を隔離するための方法、組成物およびキットを提供する。これらの方法、組成物およびキットは、標的核酸に結合する（例えば、メチル化特異性を有する）非加工性エンドヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）または抗体を含む。混合性核酸試料は、原核生物核酸および真核生物核酸、ならびに／または原核生物もしくは真核生物の２つ以上に由来する核酸を含むことができる。一局面において、標的核酸および非標的核酸を含有する混合性試料から前記標的核酸を隔離するための方法が提供され、この方法は、（ｉ）前記混合性試料を非加工性エンドヌクレアーゼと接触させるステップと、（ｉｉ）前記複合体を含有する前記試料の第１の画分を、前記非標的核酸を含有する前記試料の第２の画分から隔離するステップとを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸および非標的核酸を含有する混合性試料から前記標的核酸を隔離するための方法であって、
（ｉ）前記混合性試料を非加工性エンドヌクレアーゼと接触させるステップであって、
前記非加工性エンドヌクレアーゼが、前記標的核酸に結合するが、前記標的核酸を切断せず、
前記非加工性エンドヌクレアーゼと前記標的核酸との複合体が形成される、ステップと、
（ｉｉ）前記複合体を含有する前記試料の第１の画分を、前記非標的核酸を含有する前記試料の第２の画分から隔離するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記第１の画分および前記第２の画分が保持される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記混合性試料が、前記第１の画分または前記第２の画分のいずれかに隔離する阻害物質を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記阻害物質がフミン酸である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記阻害物質がディーゼルすすである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記阻害物質が、表６から選択される阻害物質である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記阻害物質が、環境または臨床からの混入物である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記混合性試料が、少なくとも２つの異なる原核生物に由来する核酸を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記混合性試料が、ヒトおよび細菌性生物に由来する核酸を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記混合性試料が、真核生物および原核生物に由来する核酸を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記混合性試料が、少なくとも２つの異なる真核生物に由来する核酸を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記混合性試料が、未知の生物に由来する核酸を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記接触させるステップが、前記非加工性エンドヌクレアーゼが前記標的核酸に結合するが、前記標的核酸を切断しないのに適した条件を有する緩衝液中で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記緩衝液が、前記非加工性エンドヌクレアーゼが前記標的核酸に結合するが、前記標的核酸を切断しないのに適したＭｇ２＋の濃度を含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｍｇ２＋の濃度が１０ｍＭ未満である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記緩衝液がＭｇ２＋を含有しない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記緩衝液が二価のカチオンを含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記緩衝液が、Ｃａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋、Ｃｏ２＋またはＭｎ２＋を含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記緩衝液が、少なくとも５０ｍＭのＣａ２＋の濃度を含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記緩衝液が、前記緩衝液のＭｇ２＋の濃度よりも少なくとも５００倍高いＣａ２＋の濃度を含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記緩衝液が、５〜７のｐＨを含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記非加工性エンドヌクレアーゼが、前記エンドヌクレアーゼのカチオン結合性モチーフ中に変異を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記変異が、表３から選択される変異である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記非加工性エンドヌクレアーゼが、ＰＤモチーフ、Ｄ／ＥＸＫモチーフ、Ｈ−Ｎ−ＨモチーフまたはＧＩＹ−ＹＩＧモチーフから選択されるモチーフを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記非加工性エンドヌクレアーゼが、メチル化された核酸を有する認識部位に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記非加工性エンドヌクレアーゼが、メチル化された核酸を有する認識部位に結合しない、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記非加工性エンドヌクレアーゼが、メチル化特異性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記非加工性エンドヌクレアーゼが、Ｎ４−メチルシトシンまたはＮ６−メチルアデニンに対する特異性を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記非加工性エンドヌクレアーゼが、検出可能な標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記検出可能な標識が、ビオチン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン（ＨＩＳ）またはジゴキシゲニンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記非加工性エンドヌクレアーゼが触媒活性を有さない、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記非加工性エンドヌクレアーゼが、０．１％未満の触媒活性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記非加工性エンドヌクレアーゼが、１％未満の触媒活性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記非加工性エンドヌクレアーゼが、１０％未満の触媒活性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記非加工性エンドヌクレアーゼが、非加工性の制限酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記非加工性エンドヌクレアーゼがＤｐｎＩである、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記非加工性エンドヌクレアーゼが、リコンビナーゼ、レソルバーゼ、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、修復酵素ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｉｏｎ）化タンパク質、例として、ＤｐｔＢＣＤＥもしくはＤｐｔＦＧＨ、またはその他のＤＮＡ結合性タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記非加工性エンドヌクレアーゼが、固体基材に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記固体基材が、磁気ビーズ、マイクロタイタープレートウエル、カラム表面である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
隔離された前記核酸が、標的ゲノムの少なくとも９０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
完了するのに８０分未満を必要とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
完了するのに２０分未満を必要とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記混合性試料中の前記非標的核酸の１０％未満が、前記第１の画分に隔離される、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
前記混合性試料中の前記非標的核酸の１％未満が、前記第１の画分に隔離される、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
前記混合性試料中の前記標的核酸の少なくとも９０％が、前記第１の画分に隔離される、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
前記混合性試料が、５またはそれより多い対数の非標的核酸を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
前記混合性試料が、１０ｐｇ未満の標的核酸を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の前記第１の画分を、非加工性エンドヌクレアーゼと接触させるステップであって、
前記非加工性エンドヌクレアーゼが、前記標的核酸に結合するが、前記標的核酸を切断せず、
前記非加工性エンドヌクレアーゼと前記標的核酸との複合体が形成される、ステップと、
（ｖｉ）前記非標的核酸を含有する前記試料の画分から、（ｉｉｉ）の前記複合体を含有する画分を隔離するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
標的核酸および非標的核酸を含有する混合性試料中の前記標的核酸を濃縮するための方法であって、
（ｉ）前記混合性試料を、前記非標的核酸ではなく、前記標的核酸を切断するメチル化感受性またはメチル化依存性のエンドヌクレアーゼを用いて消化するステップと、
（ｉｉ）前記試料を、エンドヌクレアーゼを用いて消化するステップであって、前記エンドヌクレアーゼが、前記標的核酸ではなく、前記非標的核酸を切断し、結果として、切断された前記標的核酸とは不適合である非標的核酸の末端が生じる、ステップと、
（ｉｉｉ）リンカーを切断された前記標的核酸にライゲーションするか、または切断された前記標的核酸を環状化するステップと、
（ｉｖ）前記非標的核酸を枯渇させるステップと
を含む、方法。
【請求項５０】
（ｉｉｉ）の環状化された前記標的核酸が、ＤＮアーゼまたはエキソヌクレアーゼを用いる消化に対して抵抗性である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
（ｉｉｉ）の環状化された前記標的核酸が、Ｐｌａｓｍｉｄ  ＳａｆｅＤＮアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＶ（ＲｅｃＢＣＤ）またはエキソヌクレアーゼＩＩＩを用いる消化に対して抵抗性である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記リンカーが、（ｉｖ）の前記枯渇に対して抵抗性である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記リンカーが、逆方向ｄＴ、ホスホロチオエート化、ステムループ、メチル化、ヒドロキシメチル化、アデニル化、グルコシル化、および４ヌクレオチド長またはそれより長い３’ＯＨ末端オーバーハングから選択される改変を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
（ｉｉ）の前記エンドヌクレアーゼが、前記非標的核酸上に平滑末端を形成する制限エンドヌクレアーゼである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記非標的核酸の制限エンドヌクレアーゼ認識配列が、前記標的核酸の制限エンドヌクレアーゼ認識配列内に位置する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記標的核酸を、前記リンカーについてのプライマーを使用して増幅するステップをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
前記増幅するステップが、ローリングサークル増幅により実施される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記増幅するステップが、ポリメラーゼ連鎖反応により実施される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記増幅するステップが、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用して実施される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
（ｉ）および（ｉｉ）が、同時に実施される、請求項４９に記載の方法。
【請求項６１】
（ｉｖ）が、（ｉｉ）の前に実施される、請求項４９に記載の方法。
【請求項６２】
前記枯渇させるステップが、ゲルによる単離、サイズ排除またはエキソヌクレアーゼ消化によって実施される、請求項４９に記載の方法。
【請求項６３】
混合性試料から標的核酸を隔離するための組成物であって、
（ｉ）標的核酸および非標的核酸を含有する混合性試料、
（ｉｉ）前記標的核酸に結合するが、前記標的核酸を切断しない非加工性エンドヌクレアーゼ
を含む、組成物。
【請求項６４】
前記混合性試料が、ヒトおよび細菌性生物に由来する核酸を含有する、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
前記混合性試料が、真核生物および原核生物に由来する核酸を含有する、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６６】
前記非加工性エンドヌクレアーゼが、前記エンドヌクレアーゼのカチオン結合性モチーフ中に変異を含有する、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６７】
前記非加工性エンドヌクレアーゼが、メチル化特異性を有する、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６８】
前記非加工性エンドヌクレアーゼが、Ｎ４−メチルシトシンまたはＮ６−メチルアデニンに対する特異性を有する、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６９】
前記非加工性エンドヌクレアーゼが、検出可能な標識を含む、請求項６３に記載の組成物。
【請求項７０】
前記非加工性エンドヌクレアーゼが、１０％未満の触媒活性を有する、請求項６３に記載の組成物。
【請求項７１】
前記非加工性エンドヌクレアーゼが、非加工性の制限酵素である、請求項６３に記載の組成物。
【請求項７２】
前記非加工性エンドヌクレアーゼがＤｐｎＩである、請求項６３に記載の組成物。
【請求項７３】
標的核酸および非標的核酸を含有する混合性試料から標的核酸を増幅するためのキットであって、
（ｉ）前記標的核酸に結合するが、前記標的核酸を切断しないビオチン化非加工性エンドヌクレアーゼ、および
（ｉｉ）前記非加工性エンドヌクレアーゼが前記標的核酸に結合するが、前記標的核酸を切断しないのに適した条件を有する緩衝液
を含む、キット。
【請求項７４】
前記緩衝液が、前記非加工性エンドヌクレアーゼが前記標的核酸に結合するが、前記標的核酸を切断しないのに適したＭｇ２＋の濃度を含有する、請求項７３に記載のキット。
【請求項７５】
前記Ｍｇ２＋の濃度が、１０ｍＭ未満である、請求項７４に記載のキット。
【請求項７６】
前記緩衝液が、少なくとも５０ｍＭのＣａ２＋の濃度を含有する、請求項７３に記載のキット。
【請求項７７】
前記緩衝液が、５〜７のｐＨを含有する、請求項７３に記載のキット。
【請求項７８】
標的核酸および非標的核酸を含有する混合性試料から標的核酸を増幅するためのキットであって、
（ｉ）前記標的核酸に結合するが、前記標的核酸を切断しないビオチン化非加工性エンドヌクレアーゼ、
（ｉｉ）固体の支持材料、および
（ｉｉｉ）ビオチン化に特異的な結合剤
を含む、キット。
【請求項７９】
（ｉｖ）メチル化された核酸の陽性対照
をさらに含む、請求項７８に記載のキット。
【請求項８０】
前記非加工性酵素が、前記標的ＤＮＡと等しいまたは前記標的ＤＮＡを上回るモル比で存在する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府によって資金供与を受けた研究または開発に関する声明
この発明は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｏｍｅｌａｎｄ  Ｓｅｃｕｒｉｔｙによって付与された契約番号ＨＳＨＱＤＣ‐１０‐Ｃ‐０００１９の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
電子的に提出した配列表についての言及
名称：３１７９＿００１０００１＿ＳＥＱＩＤＬｉｓｔｉｎｇＰＣＴａｓｃｉｉ．ｔｘｔ、サイズ：２，２２６バイト、および創出の日：２０１２年６月２６日の、電子的に提出した配列表の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０００３】
本発明は一般に、混合性核酸試料から標的核酸を隔離するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
生物学的脅威の迅速な検出および詳細な解析が、標的集団に対する影響を緩和するのに重要である。検出および解析への一般的なアプローチは、環境試料（空気、水、食品、ヒト組織）を集め、試料が生物学的脅威（細菌、ウイルス等）に由来する何らかの核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含有するかどうかを決定することである。このアプローチにおいて主として遭遇する問題は、環境試料が、純粋でなく、しばしば、標的の生物学的脅威の核酸よりも顕著に多いバックグラウンドの真核生物核酸を含有し、標的核酸を単離または増幅するのが困難であることである。実際に、原核生物核酸と真核生物核酸との複合混合物が、自然界における典型である。空気、水および土壌中には、生物の混在性の共同体が存在し、細菌が植物またはヒトと共生的に関連することが、生命体の現実である。試料中のこれらの生物学的脅威の検出とは別に、より大きな真核生物ゲノム（２．３メガベース〜１６ギガベース）から、生物学的脅威、例として、細菌（４〜６メガベース）の比較的小さなゲノムを隔離し、単離することについては、研究上および商業上の理由もある。換言すると、このゲノムサイズの差は、単一のヒト細胞が、単一のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のおよそ１０００倍の遺伝物質を混合物にもたらすのと同等であるとみなされる。この結果として、ほとんどの混合性試料から、圧倒的な量の真核生物ＤＮＡが生じて、混合性試料中の細菌の検出および同定が妨害される。
【０００５】
敗血症が、生物学的脅威の検出が非常に困難である状況の１つの例である。敗血症が、全世界で非心臓系の集中治療室における死亡の主要な原因であり、敗血症の病原体の複合範囲には、グラム陽性およびグラム陰性の細菌が含まれる。血液中の細菌のレベルは、１ｍＬの血液当たり１０００コロニー形成単位（ＣＦＵ）を上回り、その他の場合には、１ｍＬの血液当たり１ＣＦＵよりも少ないと報告されている。最も濃度の高いレベル、すなわち、１ｍＬの血液当たりおよそ１０００個の細菌であっても、細菌ＤＮＡより、同じ体積中の１０９個の血液細胞（１０７個がＤＮＡを含有する）の方がはるかに多いであろう。この場合、ヒトＤＮＡは、細菌ＤＮＡよりも１０００万倍多いのと同等であるとみなされる。
【０００６】
真核生物ＤＮＡを含有する混合性試料から細菌ＤＮＡを分離し、単離するための包括的な解決策は、現在手に入らない。しばしば、混合性試料を培養して、試料中の一部の細菌を示差的に増幅する。実際に、敗血症の場合、参考検査室における病原体の同定の標準は依然として、培養を介する検出である。典型的には、培養は、病原体が十分に増殖しきって確認を行うのに１〜５日を必要とする。また、培養方法は、食品の試験および環境試料の場合の標準的な方法でもある。細菌感染の同定は、炭疽感染においては、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ特異的ファージが作るプラークについてモニターすることによってより迅速化しており、９０％を上回る感度および特異性をもたらす。しかし、ＦＤＡの承認を得ているファージ溶解アッセイは、実験室に基づくアッセイであり、熟練技術者が完了するのに８〜２４時間を必要とし、ファージを精製し、取り出して、解析を行うのではなく、細菌を計数するに過ぎない。
【０００７】
培養に基づく検出方法の代替として、混合性の原核生物／真核生物の環境試料から単離した核酸を極めて感度の高いポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイに付して、生物学的脅威の標的配列を検出することができる。例えば、ＦＤＡは、特定の脅威、例として、鼻のスワブからのＳ．ａｕｒｅｕｓおよび連鎖球菌属の細菌を同定するための迅速リアルタイムＰＣＲ技術に承認を与えている。Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＧｅｎｅＯｈｍキット（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国）には、鼻のスワブの懸濁液を得、迅速に溶解させ、それに続いて、およそ２時間増幅することが必要になり、９８．９％の感度および９６．７％の特異性が公開されている。しかし、鼻のスワブ試料の真核生物核酸のバックグラウンドは、血液試料と比較して低い。さらに、この方法は、特定の細菌の純粋な検出に限定され、したがって、この方法により、解析のための、細菌標的ゲノムの単離および精製は可能にならず、この方法は、未知の原核生物の脅威を検出するのには有効ではなかろう。
【０００８】
血液中の細菌の検出が、機械的／化学的な溶解を介して生成した未精製の溶解液から達成されている。このアプローチでは、原核生物ＤＮＡの検出には、高価な、リアルタイムＰＣＲアッセイ、例として、Ｒｏｃｈｅ  ＳｅｐｔｉＦａｓｔ（商標）システム、またはそれに代わって、質量分析アッセイ、例として、Ａｂｂｏｔ  Ｐｌｅｘ−ＩＤシステムが必要となる。これらのシステムは、ＦＤＡの承認を得ておらず、１．５ｍｌの血液しか取り扱うことができず、感度が制限される。さらにまた、これらのアッセイは、追加の解析のために、原核生物の脅威から遺伝物質を単離し、精製することもできない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、混合性試料中の原核生物核酸の選択的な単離を可能にし、それにより、標的の原核生物ゲノムのさらなる解析および特徴付けを可能にする方法が必要である。さらに、これまでに知られていない細菌の脅威の同定および特徴付けが可能になるように、非特異的な原核生物の形質に基づく分離および単離を可能にする方法も必要である。最後に、高価な定量的ＰＣＲアッセイを必要としない方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
現在の単離プロトコールに伴う問題に照らして、本発明は、核酸の混合性試料から核酸を（例えば、真核生物核酸から原核生物または細菌の核酸を）効率的に隔離するための方法、組成物およびキットを提供する。いくつかの実施形態では、このプロセスは、原核生物界に特有である、ＤＮＡのエピジェネティックな改変を活用し、それにより、混合性の環境試料または臨床試料から、原核生物核酸を迅速かつ効率的に単離し、同定する。したがって、本発明により、迅速な診断が可能となり、生物学的脅威のゲノムのさらなる特徴付けおよび解析も可能となる。
【００１１】
一実施形態では、この方法は、（１）エピジェネティック結合剤が、エピジェネティックな改変を担持する核酸と複合体を形成するのを可能にするのに十分な条件下で、エピジェネティック結合剤を試料に適用するステップと、（２）エピジェネティック結合剤／核酸の複合体を単離するステップと、（３）単離した複合体中に存在する核酸を精製するステップと、（４）精製した核酸を解析するステップとを含む。一態様では、エピジェネティック結合剤は、原核生物のエピジェネティックな改変、例として、Ｎ４−メチルシトシン（Ｎ４ｍＣ）、Ｎ６−メチルアデニン（Ｎ６ｍＡ）、および任意のその他の、原核生物に特異的なエピジェネティックな改変からなる群から選択される改変に特異的に結合する分子または分子複合体である。エピジェネティック結合剤は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、コンジュゲートポリクローナル抗体またはコンジュゲートモノクローナル抗体、制限酵素、コンジュゲート制限酵素、結合性変異制限酵素（ｂｉｎｄｉｎｇ−ｍｕｔａｎｔ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ）、および上記のエピジェネティックな改変に対する特異的な親和性を有するその他の分子または分子複合体からなる群から選択される。
【００１２】
別の実施形態では、エピジェネティック特異的消化法を提供する。この方法は、エピジェネティックな改変が標的核酸中に存在する場合、エピジェネティック特異的消化因子が核酸を、特定のエピジェネティックな改変を欠くサブ配列において選択的に切断するのを可能にするのに十分な条件下で、エピジェネティック特異的消化因子を試料に適用するステップを含む。エピジェネティック特異的切断に続いて、非標的核酸を枯渇させ、標的核酸を解析する。追加のステップを、この方法に追加することができ、それについては、下記の詳細な説明でさらに論じる。
【００１３】
別の実施形態では、エピジェネティック結合剤組成物を提供する。好ましい実施形態では、エピジェネティック結合剤は、標的核酸に特異的なエピジェネティックな改変、例として、Ｎ４ｍＣまたはＮ６ｍＡに対して作られたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である。関連の実施形態では、エピジェネティック結合剤は、標的核酸に、標的核酸に特異的なエピジェネティックな改変を担持するサブ配列において選択的に結合するが、標的核酸を切断しない変異させた制限酵素である。いずれの実施形態でも、エピジェネティック結合剤を、場合により、ビオチン化させて、または第２の分子とコンジュゲートさせて、試料から結合剤／核酸の複合体を単離するのを援助する。
【００１４】
本発明は、上記に記載した実施形態に限定されず、その他の実施形態および適用例が、下記の詳細な説明に提供する論述および実施例から明らかになるであろう。
【００１５】
以下の詳細な説明および図面から、本発明の種々の実施形態をより十分に理解することができ、詳細な説明および図面は、本出願の一部をなす。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａは、ＭＡＤＡの実証のために使用する合成アダプターの配列（配列番号１）を示す図である。アダプターは、ＧＡＴＣ部位に適合するポリヌクレオチドのオーバーハングを有する。プライマーにより、アダプターを含有する断片の増幅が可能になる（例えば、示すように、プライマー＃１およびプライマー＃２）（配列番号８および９）。ＮｏｔＩ制限部位が、必要な場合の断片の直鎖化のために存在する。図１Ｂは、ＭＡＤＡの実証のために使用することができる代替の合成アダプターの配列を示す（配列番号２〜７：配列番号２と３がアニールし、配列番号４と５がアニールし、配列番号６と７がアニールする）。
【図２】図２は、メチル化選択的消化により、原核生物（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡと真核生物（小麦）ＤＮＡとの隔離が可能になることを示す図である。ＤｐｎＩは、ＧＡＴＣ部位のアデニンにおいてメチル化されているＤＮＡのみを切る。ＤｐｎＩＩは、ＧＡＴＣがメチル化されていない場合にのみ切る。細菌ＤＮＡと真核生物ＤＮＡとの混合物が示差的に制限されて、制限末端のサイズまたは適合性による隔離が可能になる。
【図３】図３は、マッピング可能な配列の読取りの超高スループットスクリーニング（ＵＨＴＳ）による同定によって、細菌の濃縮を示す図である。配列のＭｅｇａＢｌａｓｔによるカテゴリー化をプロットすると、細菌の配列のほとんど３０×の濃縮が示される（図３Ａおよび３Ｂ）。また、消化した生物混合物中のＧＡＴＣ部位を含有する配列の読取りの、精製前および精製後の解析も示す（図３Ｃおよび３Ｄ）。
【図４−１】図４は、Ｎ６ｍＡの濃縮が、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ＭＧ１６５５の高い、一様なカバー範囲をもたらすことを示す図である。ＩＣｘ  Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  ＳＰＥＥＤパイプラインを使用して、染色体の線形表現に対して、各読取りの最初の３２ｂｐのマッピングを行った。（図４Ａおよび４Ｃ）。カバー範囲の深さが、濃縮前の０．２４から、濃縮後の６．０×に急増した。結果として得られたカバー範囲のレベルは９９％と記載されている。（図４Ｂおよび４Ｄ）。位置によるカバー範囲は、染色体にわたり均等な分布を示す。
【図４−２】図４は、Ｎ６ｍＡの濃縮が、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ＭＧ１６５５の高い、一様なカバー範囲をもたらすことを示す図である。ＩＣｘ  Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  ＳＰＥＥＤパイプラインを使用して、染色体の線形表現に対して、各読取りの最初の３２ｂｐのマッピングを行った。（図４Ａおよび４Ｃ）。カバー範囲の深さが、濃縮前の０．２４から、濃縮後の６．０×に急増した。結果として得られたカバー範囲のレベルは９９％と記載されている。（図４Ｂおよび４Ｄ）。位置によるカバー範囲は、染色体にわたり均等な分布を示す。
【図５】図５は、ＢａｍＨＩ粘着末端にライゲーションさせたアダプターにより、分子が、環状化され、消化から保護され、ＰＣＲ増幅が可能になることを示す図である。
【図６】図６は、標的分子の選択的増幅を可能にする、直鎖ＤＮＡ分子対環状ＤＮＡ分子の選択的消化を示す図である。ＤｐｎＩＩによって制限されたヒトゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は、ｐｌａｓｍｉｄ  ｓａｆｅＤＮアーゼに対して感受性を示し（レーン２とレーン３とを比較されたい）、一方、アダプターのライゲーションにより生成した環状の分子は感受性を示さない（レーン５、ｐＵＣ１９対照）。
【図７】図７は、アダプターのライゲーションを伴うエピジェネティック特異的消化法が、混合性試料中の標的ＤＮＡを単離し、増幅するのに有効であることを示す図である。
【図８】図８は、アダプターのライゲーションを伴うエピジェネティック特異的消化法が、単一混合物において、細菌のゲノムＤＮＡを有効に増幅し、かつヒトゲノムＤＮＡを選択的に分解することを示す図である。
【図９】図９は、エピジェネティック特異的濃縮の後に、細菌のゲノムの濃縮およびヒトゲノムの分解のレベルを、ＱＰＣＲを使用して定量化することを示す図である。ヒト男性ＤＮＡのＤＹＺ遺伝子座およびＥ．ｃｏｌｉ細菌ＤＮＡの１６Ｓ遺伝子座に対するプライマーおよびプローブを使用して、増幅の前および後に、混合物中の各生物に由来するゲノムＤＮＡのレベルを測定した。
【図１０】図１０は、制限酵素が、改変した条件下で、切ることなく、Ｎ６ｍＡに選択的に結合することができることを示す図である。
【図１１】図１１は、ビオチン化ＤｐｎＩ（ｂＤｐｎＩ）が、重複する、メチル化されていない６５１ｂｐのＤＮＡ断片よりも先に、メチル化された４７７ｂｐのＤＮＡ断片に特異的に結合し、メチル化された４７７ｂｐのＤＮＡ断片のゲルの遊走を遅らせることを示す図である。
【図１２】図１２は、最初に、メチル化された４７７ｂｐのＤＮＡ断片と共に、次いで、アビジンビーズと共に、インキュベートしたｂＤｐｎＩが、アビジンビーズをｂＤｐｎＩであらかじめコートする場合よりも低い特異性を示すことを示す図である。
【図１３】図１３は、ゲル解析により評価した、センチネルＤＮＡ断片がある状態での標的ＤＮＡの結合の特異性を示す図である。１００ｎｇの非標的ＤＮＡ断片（６５１ｂｐ）および１００ｎｇの標的ＤＮＡ断片（４７７ｂｐ）を混合し、ｂＤｐｎＩをコートしたアビジンビーズ８０ｕｌ〜１８０ｕｌと結合させた。３０分後、洗浄画分または溶出画分から得られた試料を、アガロースゲル上に充填した。センチネル断片を対照として使用して、反応の効率を評価することができる。
【図１４】図１４は、１ｕｇのヒトＤＮＡを含有する混合性試料からの、標的の細菌ＤＮＡの回収効率を示すグラフである。Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡの量を減少させて（１０ｎｇ〜１ｐｇ）、１ｕｇのヒトＤＮＡ中に加えた。回収を、細菌の１６ＳおよびヒトのＤＹＺに関して、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を用いて評価し、それぞれを、それらのそれぞれのマーカーの頻度に対して正規化した。
【図１５】図１５は、本発明の実施形態の迅速な結合および高い特異性を示す、細菌ＤＮＡおよびヒトＤＮＡの結合の時間的経過を示すグラフである。ｂＤｐｎＩをコートしたビーズを、５００ｐｇのＥ．ｃｏｌｉ（正方形を伴う破線）と１ｕｇのヒト男性のＤＮＡ（円を伴う破線）との混合物に添加した。表示する時間において、ビーズを、磁石を用いて収集し、洗浄した。Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ遺伝子またはヒトのＤＹＺについてのｑＰＣＲを使用して、結合量を定量化した。
【図１６】図１６は、例示的なゲノム混合物、およびＳＣＯＤＡの影響、およびＤｐｎＩによる濃縮プロセスを示す表である。
【図１７−１】図１７は、ＤｐｎＩによる濃縮が、４．６ＭＢのゲノムにわたり、顕著な偏りを導入することなく、ゲノムのカバー範囲をおよそ１５倍増加させたことを示す図である。図１７Ａは、濃縮前のカバー範囲を示し、挿入部は、濃縮前のゲノムのカバー範囲パターンを強調するために、同じデータを２０×増加させたスケール上で示す。図１７Ｂは、濃縮後のカバー範囲が劇的に増加することを示す。主要な特徴、例として、ゲノムのカバー範囲の低い点および高い点（それぞれ、末端および複製開始点（ＯｒｉＣ））、ならびにカバー範囲の人工的な急上昇（バクテリオファージのＤＬＰ、ＲｅｃおよびＱｉｎ）が提示されている。
【図１７−２】図１７は、ＤｐｎＩによる濃縮が、４．６ＭＢのゲノムにわたり、顕著な偏りを導入することなく、ゲノムのカバー範囲をおよそ１５倍増加させたことを示す図である。図１７Ａは、濃縮前のカバー範囲を示し、挿入部は、濃縮前のゲノムのカバー範囲パターンを強調するために、同じデータを２０×増加させたスケール上で示す。図１７Ｂは、濃縮後のカバー範囲が劇的に増加することを示す。主要な特徴、例として、ゲノムのカバー範囲の低い点および高い点（それぞれ、末端および複製開始点（ＯｒｉＣ））、ならびにカバー範囲の人工的な急上昇（バクテリオファージのＤＬＰ、ＲｅｃおよびＱｉｎ）が提示されている。
【図１８】図１８は、抗血清の、Ｎ６−メチル−２−デオキシアデノシン（Ｎ６ｍＡ）に対する特異性を示すグラフである。三つ組の血清試料を、競合ＥＬＩＳＡフォーマット中で、種々のレベルのアデニン（正方形）またはＮ６ｍＡ（菱形）を用いて誘発することによって試験した。エラーバーは、試料間の標準偏差を示す。１００ｎｇのＮ６ｍＡからのみ、Ｎ６ｍＡコートＥＬＩＳＡ用プレートに対する血清の結合の５０％の阻害が生じる。一方、１０ｕｇのアデニン（試薬の１００倍の増加）からは、約３０％の阻害が生じた。
【図１９】図１９は、メチル化オリゴヌクレオチドおよび非メチル化オリゴヌクレオチドに対して試験したポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体からのＥＬＩＳＡのシグナルを示すグラフである。図１９Ａは、アデニン（Ａ）またはＮ６ｍ−アデニン（６ｍＡもしくはＮ６ｍＡ）を含有するオリゴヌクレオチドを、マイクロタイターウエル中に固定化し、種々の抗体に対する、それらの結合について試験したグラフを示す。３つの、仕切って分けたクローンにより例示される、Ｎ６ｍＡオリゴに由来する高いシグナルおよび非メチル化オリゴに由来する、相応に低いシグナルから、特異性が示される。これらを、マウス１、４、８、９から得られた最終血液のポリクローナル血清（４つの、仕切って分けたクローン）と比較することができる。また、抗体なしの対照も示す（ｎｏ  ａｂｓ）。図１９Ｂは、６ｍＡ対Ａのシグナルの比を示す。
【図２０】図２０は、図１９の抗体の、ヒトゲノムＤＮＡおよびＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡに対する特異性を示すグラフである。記載のゲノムＤＮＡを、各ウエル中で増減させて使用して、ＥＬＩＳＡを行った。４５０ｍｍ（ＯＤ４５０）における光学密度は、抗体の各ゲノムに対する反応性を示す。
【図２１】図２１は、実施例７の方法についてのプロセスを示すフローチャートである。
【図２２】図２２は、土壌の試料中に加えたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ単独と比較して増幅することができず、ＰＣＲの阻害物質が、土壌の試料中に存在することが疑われたことを示す図である。フミン酸が多い、市販されている表土の試料を、フィロデンドロン植物またはプルメリア植物の下から収集した。実施例８に詳述するように、画分を、「非標的」または「標的」として示した。
【図２３】図２３は、川床シルトまたは川の表面水、赤鉄鉱被覆砂または火山泥から単離したＤＮＡの１６Ｓ  ＰＣＲによるプロファイリングを示す図である。１６Ｓプライマーを用いた場合、鋳型なしの対照（ＮＴＣ）およびヒトＤＮＡは増幅せず、一方、１００ｎｇのＥ．ｃｏｌｉからは、細菌性生物に特徴的なバンドが生成した。さらに、川床シルト、サンゴ砂の砂丘および火山泥水から単離したＤＮＡの画分および未結合の画分も増幅しなかった。全ての試料からの結合画分および溶出画分は増幅した。
【図２４】図２４は、ＤｐｎＩによる濃縮を行った場合および行わなかった場合の、ライ麦花粉の、Ｅ．ｃｏｌｉ  １６ＳによるｑＰＣＲアッセイに対する作用を示すグラフである。１６ＳによるｑＰＣＲアッセイが検出したＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡの分量は、花粉のインプットの関数としてグラフに描かれ（実線）、一方、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡのレベルは一定状態を維持した（破線）。次いで、阻害性を示すレベルの花粉（１０，０００および１００，０００ｕｇ／ｍｌ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ試料中に加え、これを、ＤｐｎＩを使用して隔離した。結合画分（「％ＤｐｎＩ結合」）および未結合画分（「％ＤｐｎＩ未結合」）中で検出されたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡの量を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡの総量のパーセントとしてグラフに描く。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、特定の供給源に由来する核酸に特異的な、エピジェネティックな改変を活用することを対象とする。１つの適用例では、現在の発明の実施形態を使用して、過剰量の真核生物ＤＮＡを含有する試料中に存在する原核生物ＤＮＡを分離し、単離することができる。より詳細には、現在の発明の実施形態は、混合性試料中に見出される原核生物ＤＮＡを選択的に単離し、解析するために、原核生物ＤＮＡに特有であるエピジェネティックな改変を活用することを対象とする。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本発明は、標的核酸および非標的核酸を含有する混合性試料から標的核酸を隔離するための方法に関する。いくつかの実施形態では、この方法は、混合性試料を、標的核酸に結合する（例えば、エピジェネティックな改変または標的核酸のメチル化に結合する）非加工性エンドヌクレアーゼまたは抗体もしくはその抗原結合性断片と接触させるステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、（ｉ）混合性試料を、標的核酸に結合する非加工性エンドヌクレアーゼまたは抗体もしくはその抗原結合性断片と接触させるステップと、（ｉｉ）第１の画分の、複合体を含有する試料を、第２の画分の、非標的核酸を含有する試料から隔離するステップとを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、（ｉ）混合性試料を、標的核酸に結合する非加工性エンドヌクレアーゼまたは抗体もしくはその抗原結合性断片と接触させるステップであって、非加工性エンドヌクレアーゼまたは抗体もしくはその抗原結合性断片と標的核酸との複合体が形成されるステップと、（ｉｉ）第１の画分の、複合体を含有する試料を、第２の画分の、非標的核酸を含有する試料から隔離するステップとを含む。いくつかの実施形態では、第１の画分および第２の画分が保持される。いくつかの実施形態では、非加工性エンドヌクレアーゼは、標的核酸に結合するが、標的核酸を切断しない。いくつかの実施形態では、この方法は、（ｉｉｉ）（ｉｉ）の第１の画分を、標的核酸に結合する非加工性エンドヌクレアーゼまたは抗体もしくはその抗原結合性断片と接触させるステップであって、非加工性エンドヌクレアーゼは、標的核酸に結合するが、標的核酸を切断せず、非加工性エンドヌクレアーゼまたは抗体もしくはその抗原結合性断片と標的核酸との複合体が形成されるステップと、（ｖｉ）非標的核酸を含有する試料の画分から、（ｉｉｉ）の複合体を含有する画分を隔離するステップとをさらに含む。
【００１９】
本発明のその他の実施形態は、標的核酸および非標的核酸を含有する混合性試料中の標的核酸を濃縮するための方法に関連する。いくつかの実施形態では、この方法は、混合性試料を、非標的核酸ではなく、標的核酸を切断するメチル化感受性またはメチル化依存性のエンドヌクレアーゼを用いて消化し、または混合性試料を、エピジェネティックな改変に結合する抗体またはその抗原結合性断片と共にインキュベートするステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、試料を、エンドヌクレアーゼを用いて消化するステップであって、エンドヌクレアーゼが、標的核酸ではなく、非標的核酸を切断し、結果として、切断された標的核酸とは不適合である非標的核酸の末端が生じるステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、リンカーを、切断された標的核酸にライゲーションし、または切断された標的核酸を環状化するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、非標的核酸を枯渇させるステップをさらに含む。
【００２０】
また、本発明は、混合性試料から標的核酸を隔離する組成物およびキットにも関する。いくつかの実施形態では、この組成物は、（ｉ）標的核酸および非標的核酸を含有する混合性試料、ならびに（ｉｉ）標的核酸に結合するが、標的核酸を切断しない非加工性エンドヌクレアーゼ、または標的核酸に結合する抗体もしくはその抗原結合性断片を含む。いくつかの実施形態では、このキットは、（ｉ）標的核酸に結合するが、標的核酸を切断しない、ビオチン化非加工性エンドヌクレアーゼ、および（ｉｉ）非加工性エンドヌクレアーゼが標的核酸に結合するが、標的核酸を切断しないのに適した条件を有する緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、このキットは、メチル化された核酸を認識する、ビオチン化非加工性エンドヌクレアーゼを含む。その他の実施形態では、このキットは、（ｉ）標的核酸に結合するが、標的核酸を切断しない、ビオチン化非加工性エンドヌクレアーゼ、または標的核酸に結合するビオチン化された抗体もしくはその抗原結合性断片、（ｉｉ）固体の支持材料、および（ｉｉｉ）ビオチン化に特異的な結合剤を含む。いくつかの実施形態では、キットは、メチル化された核酸の陽性対照をさらに含む。
【００２１】
ＤＮＡの改変は、全ての界において見出される。現在の発明を追求するに際して、ＤＮＡのメチル化の種々の形態を調べ、Ｎ４−メチルシトシン（Ｎ４ｍＣ）およびＮ６−メチルアデニン（Ｎ６ｍＡ）が、もっぱらまたは圧倒的に細菌において見出されることに注目した。Ｎ６ｍＡは、ＤＮＡアデニンメチラーゼ（ＤＡＭ）のタンパク質改変の結果として、細菌中に広範に見出されることから、特に興味深いが、その他のアデニンメチラーゼも原核生物中に存在する。ＤＡＭは、これらに限定されないが、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅおよびＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｏｌｏｓｉｓを含めた、細菌中に見出される必須のアデニンメチラーゼである。表１に、ｄａｍメチル化を示す細菌の非包括的なリストを提供する。多くの細菌が、ＧＡＴＣ配列内のアデニンのＮ６位においてメチル化され、ＧＡＴＣ配列は、染色体中に、およそ２５６塩基毎に存在して、偏在性の標的を生み出す。鞭毛、線毛（ｆｉｍｂｒａｅ）、接着タンパク質の生成、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ型の分泌、毒素の合成および排出を含めて、細菌の毒性は、Ｎ６ｍＡを介して制御される。細菌は、細菌のゲノムを複製する場合、メチル化が存在しないことにより、新生の娘鎖と親鎖とを識別することができる。したがって、本発明の実施形態は、細菌が細菌自体の親ＤＮＡを認識する、この機構を活用し、この機能は、細菌の生存および病原性に極めて重要であり、この機能について研究が続いている。これまでに、Ｎ６ｍＡ以外の改変ヌクレオチドの検出も、抗体を用いて達成されている。
【００２２】
【表１】
2014520530.tif 000002
これらの観察結果に基づいて、現在の発明のいくつかの実施形態は、細菌中のＮ６ｍＡの存在を活用することができる分子を利用する。一実施形態では、Ｎ６ｍＡに対して作られた抗体またはその抗原結合性断片を含む、エピジェネティック結合剤組成物を提供する。試験する細菌中の平均頻度が、１ＫＢ当たり＞１つのＮ６ｍＡであることを考えると、Ｎ６ｍＡを含有するＤＮＡの免疫単離は、細菌ＤＮＡについて極めて包括的であると思われる。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＡＴＣＣ寄託指定番号＿，＿，＿，＿，＿または＿の下に寄託したハイブリドーマ細胞株により生成された単離した抗体またはその抗原結合性断片である。この単離した抗体またはその抗原結合性断片は、細菌ＤＮＡ中の非配列特異的標的を提供する。抗体またはその抗原結合性断片を、場合により、ビオチン化またはコンジュゲートして、選択的な単離を可能にすることもできる。抗体またはその抗原結合性断片の、エピジェネティック結合剤としての使用により、より普遍的な代替物が得られ、これは、抗体またはその抗原結合性断片が、（制限性酵素の実施形態の場合のように）特定の配列モチーフに依存することがなく、したがって、特定のエピジェネティックな改変を通常担持する、広い範囲の細菌に対して使用することができるからである。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本発明は、実施例に記載し、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、２０１１０−２２０９に寄託したハイブリドーマ細胞株により生成された抗体またはその抗原結合性断片を提供し、それらは、＿にＡＴＣＣに寄託したＡＴＣＣ寄託指定＿、＿にＡＴＣＣに寄託したＡＴＣＣ寄託指定＿、＿にＡＴＣＣに寄託したＡＴＣＣ寄託指定＿、＿にＡＴＣＣに寄託したＡＴＣＣ寄託指定＿、＿にＡＴＣＣに寄託したＡＴＣＣ寄託指定＿、および＿にＡＴＣＣに寄託したＡＴＣＣ寄託指定＿である。いくつかの実施形態では、本発明は、＿にＡＴＣＣに寄託したＡＴＣＣ寄託指定＿、＿にＡＴＣＣに寄託したＡＴＣＣ寄託指定＿、＿にＡＴＣＣに寄託したＡＴＣＣ寄託指定＿、＿にＡＴＣＣに寄託したＡＴＣＣ寄託指定＿、＿にＡＴＣＣに寄託したＡＴＣＣ寄託指定＿、および＿にＡＴＣＣに寄託したＡＴＣＣ寄託指定＿の下にＡＴＣＣに寄託したハイブリドーマ細胞株を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＡＴＣＣ寄託指定番号＿，＿，＿，＿，＿または＿の下に寄託したハイブリドーマ細胞株により生成された単離した抗体またはその抗原結合性断片を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＡＴＣＣ寄託指定番号＿，＿，＿，＿，＿または＿の下に寄託したハイブリドーマ細胞株を提供する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＡＴＣＣ寄託指定番号＿，＿，＿，＿，＿または＿の下に寄託したハイブリドーマ細胞株により生成された抗体またはその抗原結合性断片が結合する抗原と実質的に同じ抗原に結合する単離した抗体またはその抗原結合性断片を提供する。ＡＴＣＣ寄託指定番号＿，＿，＿，＿，＿または＿の下に寄託したハイブリドーマ細胞株により生成された抗体またはその抗原結合性断片が結合する抗原と実質的に同じ抗原に結合する単離した抗体またはその抗原結合性断片は、当技術分野で公知の方法により同定することができる。例えば、対での結合実験により、２つの抗体または抗原結合性断片の、同じ抗原に同時に結合する能力を試験する。別個のエピトープに対して作られた抗体またはそれらの抗原結合性断片は、独立に結合し、一方、同一のまたは密接に関連のあるエピトープに対して作られた抗体は、相互の結合を妨げる。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）を用いる、これらの結合実験は、実行するのが単純明快である。例えば、捕捉分子を使用して、第１の抗体または抗原結合性断片に結合させ、続いて、抗原および第２の抗体または抗原結合性断片を順次に添加することができる。センサーグラムは、（１）抗原のうちのどれだけが、第１の抗体または抗原結合性断片に結合するか、（２）どんな程度で第２の抗体または抗原結合性断片が、表面付着抗原に結合するか、（３）第２の抗体または抗原結合性断片が結合しない場合、対での試験の順番を逆転させると、結果が変化するかどうかを示す。また、競合ＥＬＩＳＡ実験、例えば、実施例６に記載する実験も、２つの抗体または抗原結合性断片の、同じ抗原に同時に結合する能力を試験する。Ｉｔｏｈ，  Ｋ．、Ｍ．  ＭｉｚｕｇａｋｉおよびＮ．  Ｉｓｈｉｄａ、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  １−ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  １−ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ、Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１９８８年、７９巻（１０号）：１１３０〜８頁。
【００２５】
いくつかの実施形態では、そのような抗体またはそれらの抗原結合性断片を、本発明の方法、組成物およびキット中で使用して、混合性試料から標的核酸を隔離する。
【００２６】
本発明のその他の実施形態では、非加工性エンドヌクレアーゼを、本発明の方法、組成物およびキット中で使用して、混合性試料から標的核酸を隔離する。本明細書で使用する場合、「非加工性エンドヌクレアーゼ」は、エンドヌクレアーゼ活性を低下させたまたは排除した、改変エンドヌクレアーゼである。そのような改変の例として、例えば、エンドヌクレアーゼの変異、またはエンドヌクレアーゼの活性を低下させるもしくは排除する緩衝液条件が挙げられる。非加工性にすることができるエンドヌクレアーゼの例として、例えば、制限酵素（例えば、ＤｐｎＩ）、リコンビナーゼ、レソルバーゼ、トランスポザーゼ、インテグラーゼまたは修復酵素が挙げられる。さらに、本発明の非加工性エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡに結合する場合、エピジェネティックな改変に対して感受性も示す（例えば、メチル化感受性を有する）。
【００２７】
いくつかの実施形態では、非加工性エンドヌクレアーゼは、例えば、未改変のエンドヌクレアーゼよりも１０％低い、９％低い、８％低い、７％低い、６％低い、５％低い、４％低い、３％低い、２％低い、１％低い、０．９％低い、０．８％低い、０．７％低い、０．６％低い、０．５％低い、０．４％低い、０．３％低い、０．２％低いもしくは０．１％低いかまたはそれらの値の任意の範囲の触媒活性を有する。いくつかの実施形態では、非加工性エンドヌクレアーゼは、例えば、未改変のエンドヌクレアーゼよりも１０％〜０．０１％、９％〜０．０１％、８％〜０．０１％、７％〜０．０１％、６％〜０．０１％、５％〜０．０１％、４％〜０．０１％、３％〜０．０１％、２％〜０．０１％、１％〜０．０１％、１０％〜１％、９％〜１％、８％〜１％、７％〜１％、６％〜１％、５％〜１％、４％〜１％、３％〜１％または２％〜１％低い触媒活性を有する。非加工性エンドヌクレアーゼの触媒活性を決定するための方法が、当技術分野で公知であり、それらの方法を、本明細書に記載する。
【００２８】
別の実施形態では、本発明の制限酵素は、特定のエピジェネティックな改変を担持するサブ配列において選択的に結合するが、切断しないように構成される。制限酵素活性を、例えば、金属イオン補助因子の除去により、またはそれに代わって、タンパク質自体のアミノ酸点変異を通して改変する。この制限酵素活性の改変により、対象の画分の精製および解析を行うために、エピジェネティックな改変を有さないＤＮＡ（例えば、Ｎ６ｍＡを有さない真核生物ＤＮＡ）または所望のエピジェネティックな改変を有するＤＮＡ（Ｎ６ｍＡを有する細菌ＤＮＡ）のいずれかとの選択的な結合が可能になる。表２に、メチル化特異性を有する制限酵素およびＤＮＡタンパク質結合剤のリストを提供する（Ｒｏｂｅｒｔｓ，  Ｒ．Ｊ．ら、ＲＥＢＡＳＥ−−ａ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  ｅｎｚｙｍｅｓ，  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３８巻（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２３４〜６頁）。
【００２９】
【表２】
2014520530.tif 000003
いくつかの実施形態では、非加工性エンドヌクレアーゼは、１つまたは複数の変異を含有し、こうした変異により、エンドヌクレアーゼの、メチル化された核酸の認識部位または切断部位への結合が生じるが、切断は生じない。いくつかの実施形態では、変異は、エンドヌクレアーゼのカチオン結合性モチーフ中にある。いくつかの実施形態では、非加工性エンドヌクレアーゼは、以下の表３から選択される変異を有する制限酵素である。
【００３０】
【表３−１】
2014520530.tif 000004
【００３１】
【表３−２】
2014520530.tif 000005
【００３２】
【表３−３】
2014520530.tif 000006
【００３３】
【表３−４】
2014520530.tif 000007
いくつかの実施形態では、非加工性エンドヌクレアーゼは、ＰＤモチーフ、Ｄ／ＥＸＫモチーフ、Ｈ−Ｎ−ＨモチーフまたはＧＩＹ−ＹＩＧモチーフから選択されるモチーフを含有する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、非加工性エンドヌクレアーゼは、メチル化された核酸を有する認識部位に結合する（例えば、メチル化特異性を有する）。いくつかの実施形態では、非加工性エンドヌクレアーゼは、メチル化された核酸を有する認識部位に結合しない（例えば、メチル化特異性を有さない）。いくつかの実施形態では、非加工性エンドヌクレアーゼは、Ｎ４−メチルシトシンまたはＮ６−メチルアデニンに対する特異性を有する。
【００３５】
また、現在の発明は、混合性試料から標的核酸集団を分離し、単離するために、メチル化特異性を有するエピジェネティック結合剤組成物、非加工性エンドヌクレアーゼまたは抗体を利用するための方法も提供する。一実施形態では、この方法は、複合体を標的ＤＮＡと形成するのに十分な条件下で、エピジェネティック結合剤を混合性試料に適用するステップを含む。次いで、複合体を、混合性試料から、エピジェネティック結合剤にもたらされた、多様な標識または物理学的特性に基づいて単離することができる。これらとして、磁気ビーズ、光学的特性により選別するビーズ、電気泳動ゲルの場合のような、タンパク質の結合性に基づく、核酸の示差的隔離が挙げられる。隔離のより精巧な機構としては、質量分析、ＦＡＣＳ、音響泳動（ａｃｏｕｓｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）が挙げられよう。複合混合物を、多数の標識を利用することによって、生物体のＤＮＡの複数の寄与に隔離することができることが理解されるであろう。
【００３６】
別の実施形態では、エピジェネティック特異的消化法を提供する。この方法は、エピジェネティックな改変が標的核酸中に存在する場合、エピジェネティック特異的消化因子が核酸を、特定のエピジェネティックな改変を欠くサブ配列において選択的に切断するのを可能にするのに十分な条件下で、エピジェネティック特異的消化因子を試料に適用するステップを含む。エピジェネティック特異的切断に続いて、非標的核酸を枯渇させ、標的核酸を解析する。この実施形態では、潜在的には、あらゆる界に属する生物を含有する混合性核酸試料に対して、非標的ＤＮＡ（真核生物または望まない細菌）を枯渇させ、選択された細菌のゲノムの包括的な増幅を行うことができる。好ましい実施形態では、エピジェネティック特異的消化因子は、非メチル化認識配列を選択的に切り、それにより、非標的ＤＮＡを枯渇させる制限酵素である。
【００３７】
この実施形態は、４つの一般的なステップを含む。第１に、混合性試料中の全てのＤＮＡを、全てのゲノム中に存在するＲＥを用いて切って、中程度の数の大きな断片を生成する。第２に、普遍的なプライミング部位を含有するアダプターを、断片に付加し、断片をライゲーションさせて、環を形成する。第３に、帰属する制限エンドヌクレアーゼ（すなわち、ＫｐｎＢＩまたはＤｐｎＩＩ）を用いて切り、直鎖特異的ＤＮアーゼを用いて処理することによって、非標的ＤＮＡを選択して除く（結果として、非標的ＤＮＡの枯渇が生じる）。したがって、この段階では、アダプターを有する核酸のみが、環状の分子をなす。第４に、標的ＤＮＡを、全ゲノム増幅、またはアダプターに普遍的なプライマーを用いて増幅する。
【００３８】
表４に、エピジェネティック特異的消化法を実行する際に利用することができる物質および追加の改変の例のリストを提供する。非標的ＤＮＡのエピジェネティック特異的消化に続いて、標的ＤＮＡを分離し、単離し、増幅するための、本明細書に記載しない、複数の代替のアプローチがあることを理解すべきである。
【００３９】
【表４−１】
2014520530.tif 000008
【００４０】
【表４−２】
2014520530.tif 000009
表４の上記のステップ１に示したように、非標的ＤＮＡを選択的に枯渇させるために、非メチル化サブ配列およびメチル化サブ配列において選択的に切り、さらに、アダプターの標的ＤＮＡ中への選択的な挿入も可能にする、制限酵素の組合せを利用することができる。一実施形態では、標的特異的制限酵素が認識するサブ配列中に入れ子状態になっているサブ配列において切る、非標的特異的制限酵素を選ぶことによって、この選択を実施する。現在考案の方法のこの実施形態で使用するのに適している制限性酵素の組合せの例を、表５に提供する。
【００４１】
【表５】
2014520530.tif 000010
本明細書で使用する場合、本発明に関連する混合性試料は、標的核酸および非標的核酸を含有する。いくつかの実施形態では、本発明に関連する混合性試料は、少なくとも１つの標的核酸および少なくとも１つの非標的核酸を含有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、原核生物核酸（例えば、細菌）または真核生物核酸（例えば、ヒト）である。いくつかの実施形態では、混合性試料は、少なくとも２つの異なる原核生物に由来する核酸を含有する。いくつかの実施形態では、混合性試料は、ヒトおよび細菌性生物に由来する核酸を含有する。いくつかの実施形態では、混合性試料は、真核生物および原核生物に由来する核酸を含有する。いくつかの実施形態では、混合性試料は、少なくとも２つの異なる真核生物に由来する核酸を含有する。いくつかの実施形態では、混合性試料は、未知の生物に由来する核酸を含有する。
【００４２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、阻害物質をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、阻害物質は、第１の画分または第２の画分のいずれかに隔離することができる。本明細書で使用する場合、「阻害物質」は、混合性試料から得られた核酸の増幅を阻害する、環境もしく臨床からの混入物、フミン酸、ディーゼルすすを含めた、任意の化合物、または以下の表６から選択される阻害物質を含む（Ｒａｄｓｔｒｏｍ，  Ｐ．ら、（２００４年）、Ｐｒｅ−ＰＣＲ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ：  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ＰＣＲ−ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ｓａｍｐｌｅｓ、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２６巻、１３３〜４６頁）。
【００４３】
【表６】
2014520530.tif 000011
いくつかの実施形態では、本発明の非加工性エンドヌクレアーゼは、方法または組成物のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける緩衝液条件に起因して、標的核酸に結合するが、標的核酸を切断しない。いくつかの実施形態では、緩衝液は、非加工性エンドヌクレアーゼが標的核酸に結合するが、標的核酸を切断しないのに適したＭｇ２＋の濃度を含有する。いくつかの実施形態では、Ｍｇ２＋の濃度は、例えば、１０ｍＭ未満、９ｍＭ未満、８ｍＭ未満、７ｍＭ未満、６ｍＭ未満、５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、３ｍＭ未満、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、またはそれらの値の任意の範囲である。いくつかの実施形態では、Ｍｇ２＋の濃度は、例えば、１０ｍＭ〜１ｍＭ、９ｍＭ〜１ｍＭ、８ｍＭ〜１ｍＭ、７ｍＭ〜１ｍＭ、６ｍＭ〜１ｍＭ、５ｍＭ〜１ｍＭ、４ｍＭ〜１ｍＭ、３ｍＭ〜１ｍＭ、または２ｍＭ〜１ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝液は、Ｍｇ２＋を含有しない。いくつかの実施形態では、緩衝液は、二価のカチオンを含有する。いくつかの実施形態では、緩衝液は、Ｃａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋、Ｃｏ２＋またはＭｎ２＋を含有する。いくつかの実施形態では、Ｃａ２＋の濃度は、例えば、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも６０ｍＭ、少なくとも７０ｍＭ、少なくとも８０ｍＭ、少なくとも９０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、またはそれらの値の任意の範囲である。いくつかの実施形態では、Ｃａ２＋の濃度は、例えば、５０ｍＭ〜１００ｍＭ、６０ｍＭ〜１００ｍＭ、７０ｍＭ〜１００ｍＭ、８０ｍＭ〜１００ｍＭ、または９０ｍＭ〜１００ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝液は、例えば、緩衝液のＭｇ２＋の濃度よりも少なくとも５００倍高い、少なくとも６００倍高い、少なくとも７００倍高い、少なくとも８００倍高い、少なくとも９００倍高い、少なくとも１，０００倍高いかまたはそれらの値の任意の範囲であるＣａ２＋の濃度を含有する。いくつかの実施形態では、緩衝液は、緩衝液のＭｇ２＋の濃度よりも５００〜１，０００、６００〜１，０００、７００〜１，０００、８００〜１，０００または９００〜１，０００倍高いＣａ２＋の濃度を含有する。いくつかの実施形態では、緩衝液は、エンドヌクレアーゼ活性を阻害するｐＨを含有する。５よりも高いｐＨは、非特異的な配列と比べて、特異的なＤｐｎＩ配列に対する結合を最大化することが示された。類似の結果が、他者によっても観察されている（Ｅｎｇｌｅｒら、（１９９７年）、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ＥｃｏＲＶ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｔｏ  ｉｔｓ  ＤＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ＧＡＴＡＴＣ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２６９巻（１号）：８２〜１０１頁）。一方、ＤＮＡ触媒作用の速度が、ｐＨ７未満では急速に減少する（Ｓｔａｎｆｏｒｄら、（１９９９年）、ＤＮＡ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＥｃｏＲＶ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ：  ｐＨ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒｓ  ｉｎ  ｃａｔａｌｙｓｉｓ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２８８巻（１号）：１０５〜１６頁。したがって、５〜７のｐＨ値は、特異的な結合を促進し、かつ触媒活性を低下させる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本発明の非加工性エンドヌクレアーゼまたは抗体もしくはその抗原結合性断片は、検出可能な標識を含む。検出可能な標識の例として、例えば、ビオチン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン（ＨＩＳ）およびジゴキシゲニン（ｄｉｇｉｏｘｉｇｅｎｉｎ）が挙げられる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物またはキットは、固体基材に結合している非加工性エンドヌクレアーゼまたは抗体もしくはその抗原結合性断片を含む。固体基材の例として、例えば、磁気ビーズ、マイクロタイタープレートウエルおよびカラム表面が挙げられる。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物またはキットにより、例えば、標的ゲノムの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％またはそれらの値の任意の範囲をなす、隔離された核酸が得られる。いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物またはキットにより、例えば、標的ゲノムの５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％、８０％〜１００％、９０％〜１００％または９５％〜１００％をなす隔離された核酸が得られる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物またはキットは、例えば、完了するのに８０分未満、７０分未満、６０分未満、５０分未満、４０分未満、３０分未満、２０分未満、１０分未満もしくは５分未満またはそれらの値の任意の範囲を要する。いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物またはキットは、例えば、完了するのに８０分〜５分、７０分〜５分、６０分〜５分、５０分〜５分、４０分〜５分、３０分〜５分、２０分〜５分または１０分〜５分を要する。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物またはキットにより、混合性試料中の非標的核酸の、例えば、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満もしくは１％未満またはそれらの値の任意の範囲が第１の画分に隔離される。いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物またはキットにより、混合性試料中の非標的核酸の、例えば、１０％〜１％、９％〜１％、８％〜１％、７％〜１％、６％〜１％、５％〜１％、４％〜１％、３％〜１％または２％〜１％が第１の画分に隔離される。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物またはキットにより、混合性試料中の標的核酸の、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％またはそれらの値の任意の範囲が第１の画分に隔離される。いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物またはキットにより、混合性試料中の標的核酸の、例えば、５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％、８０％〜１００％、９０％〜１００％または９５％〜１００％が第１の画分に隔離される。
【００５０】
いくつかの実施形態では、混合性試料は、例えば、５、６、７、８、９、１０もしくは２０以上の対数またはそれらの値の任意の範囲の非標的核酸を含有する。いくつかの実施形態では、混合性試料は、例えば、５〜２０対数、６〜２０対数、７〜２０対数、８〜２０対数、９〜２０対数または１０〜２０対数の非標的核酸を含有する。その他の実施形態では、混合性試料は、例えば、１０ｐｇ未満、９ｐｇ未満、８ｐｇ未満、７ｐｇ未満、６ｐｇ未満、５ｐｇ未満、４ｐｇ未満、３ｐｇ未満、２ｐｇ未満もしくは１ｐｇ未満またはそれらの値の任意の範囲の標的核酸を含有する。いくつかの実施形態では、混合性試料は、例えば、１０ｐｇ〜１ｐｇ、９ｐｇ〜１ｐｇ、８ｐｇ〜１ｐｇ、７ｐｇ〜１ｐｇ、６ｐｇ〜１ｐｇ、５ｐｇ〜１ｐｇ、４ｐｇ〜１ｐｇ、３ｐｇ〜１ｐｇまたは２ｐｇ〜１ｐｇの非標的核酸を含有する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本発明は、標的生物および非標的生物に由来する核酸を含有する試料中の標的生物由来の核酸を単離し、検出するための方法を対象とし、この方法は、エピジェネティック結合剤が標的生物の核酸中に存在するエピジェネティックな改変に結合するのを可能にするのに十分な条件下で、エピジェネティック結合剤を試料に適用し、それにより、エピジェネティック結合剤−核酸の複合体が形成されるステップと、試料からエピジェネティック結合剤−核酸の複合体を単離するステップと、単離した複合体中に存在する核酸を精製するステップとを含む。いくつかの実施形態では、エピジェネティックな改変は、原核生物に特異的な、エピジェネティックな改変である。いくつかの実施形態では、エピジェネティックな改変は、Ｎ４−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニンおよび硫黄の改変からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、エピジェネティック結合剤は、Ｎ６−メチルアデニンの改変を担持する核酸に対する親和性を有するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である。いくつかの実施形態では、エピジェネティック結合剤は、Ｎ４−メチルシトシンの改変を担持する核酸に対する親和性を有するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である。いくつかの実施形態では、エピジェネティック結合剤は、ビオチン化された制限酵素である。いくつかの実施形態では、エピジェネティック結合剤は、ホスホロチオエート化の改変を担持する核酸に対する親和性を有するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である。いくつかの実施形態では、エピジェネティック結合剤は、制限酵素である。いくつかの実施形態では、エピジェネティック結合剤−核酸の複合体の形成を可能にするのに十分な条件は、反応緩衝液から制限酵素補助因子を除外する。いくつかの実施形態では、エピジェネティック結合剤は、制限酵素の非切断性変異体である。いくつかの実施形態では、標的生物は、原核生物である。いくつかの実施形態では、標的生物は、細菌である。いくつかの実施形態では、エピジェネティック結合剤−核酸の複合体を単離するステップは、免疫沈降の使用を含む。いくつかの実施形態では、エピジェネティック結合剤−核酸の複合体を単離するステップは、ゲル遅延方法の使用を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本発明は、標的生物および非標的生物に由来する核酸を含有する試料中の標的生物由来の核酸を単離し、検出するための方法を対象とし、この方法は、エピジェネティック特異的消化因子が核酸を、特定のエピジェネティックな改変を欠くサブ配列において選択的に切断するのを可能にするのに十分な条件下で、エピジェネティック特異的消化因子を試料に適用するステップであって、標的生物の核酸が、特定のエピジェネティックな改変をサブ配列において含有し、非標的生物の核酸が、特定のエピジェネティックな改変をサブ配列において欠くステップと、標的生物の未切断の核酸を単離するステップとを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、実質的に全ての非標的生物の核酸を枯渇させるのに十分な条件下で、枯渇因子を試料に適用するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、特定のエピジェネティックな改変は、Ｎ４−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニンおよびホスホロチオエート化からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、標的生物は原核生物であり、非標的生物は真核生物である。
【００５３】
原核生物核酸および真核生物核酸の両方を含有する試料中の原核生物核酸を単離し、検出するための方法は、エピジェネティック特異的消化因子が、核酸を第１の、特定のエピジェネティックな改変を欠くサブ配列において選択的に切断するのを可能にするのに十分な条件下で、エピジェネティック特異的消化因子を試料に適用するステップであって、原核生物核酸が、エピジェネティックな改変を第１のサブ配列において含み、真核生物核酸が、特定のエピジェネティックな改変を第１のサブ配列において含まないステップと；非エピジェネティック特異的（ｎｏｎ−ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）消化因子を試料に適用するステップであって、非エピジェネティック特異的消化因子が、第２のサブ配列において切断し、第１のサブ配列が、第２のサブ配列の切断部位内で入れ子状態になっているステップと；アダプターカセットを第２のサブ配列の切断部位の間に挿入し、結果として、エピジェネティック特異的消化因子により切断されなかった核酸のみにアダプターを与えることができるステップであって、アダプターカセットが、包埋されたポリメラーゼ連鎖反応用プライマー配列を含有するステップと；枯渇因子を試料に適用して、アダプターカセットが挿入されていない核酸を分解するステップと；アダプターカセットを含有する核酸を増幅するステップとを含む。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本発明は、原核生物核酸中のエピジェネティックな改変に結合させるための組成物を対象とし、この組成物は、Ｎ６−メチルアデニンの改変を担持する核酸に対する親和性を有するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を含む。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片をビオチン化する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本発明は、原核生物核酸中のエピジェネティックな改変に結合させるための組成物を対象とし、この組成物は、Ｎ４−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニンおよびホスホロチオエート化からなる群から選択されるエピジェネティックな改変に選択的に結合する制限酵素を含み、制限酵素の切断領域のアミノ酸が改変されて、切る能力が破壊されている。いくつかの実施形態では、制限酵素をビオチン化する。
【実施例】
【００５６】
（実施例１）
この実施例は、現在の発明の、エピジェネティック結合剤の方法を実行するための一般的なプロトコールを提供する。
【００５７】
材料
−  細菌のゲノムＤＮＡについて濃縮しようとするＤＮＡ混合物
−  メチル結合剤
−  ビオチン化ＤｐｎＩ結合剤
−  ビオチン化αＮ６ｍＡ  ｍＡｂ
−  再懸濁用緩衝液（ＴＥまたは蒸留水）
−  ｍＡｂ結合用緩衝液（１０ｍＭ  ＮａＫ、ｐＨ７、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）
−  ビオチン化ＤｐｎＩ結合用緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）
−  ＳＡ−Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ  Ｉｎｃ）
−  ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）
方法
−  配列に依存しない一本鎖ＤＮＡを収集するのを望む場合には、ｍＡｂを選ぶ。二本鎖ＤＮＡを用いて作業するのを望み、標的がメチル化ＧＡＴＣ部位を有する場合には、ＤｐｎＩ結合剤を選ぶ。
−  追加の試薬には、αＮ４ｍＡ  ｍＡｂ、および下記の同じ基本プロトコールを使用することが予期される、その他のビオチン化制限酵素が含まれる。
−  ビーズの調製
−−  ＤｐｎＩ結合剤をビーズにカップリングさせる
−−  ビーズを洗浄する
−  ＤＮＡの調製
−−  ＤＮＡを、ＴＥ緩衝液または水中に再懸濁させる
−−  ＤＮＡを、氷上でおよそ５ＫＢに分画する（超音波処理）。その他の方法は、酵素制限等を含み、下流で適用する方法に依存する。より小さい断片が、免疫沈降のためには良好に作用する。重要な変数は、１つの断片当たりの結合部位の数である。メチル結合部位が６つになると、結合の飽和が予期され、結合の飽和は、およそ１．５ｋｂ中で生じる。より大きな断片が、ゲノムのより大きなカバー範囲を確実にする。
−−  ５ｕｇの分画したＤＮＡを、ＴＥまたは水中に希釈する。ＤＮＡの量は、もちろん変化してよい。典型的な適用例では、０．５〜１０ｕｇのＤＮＡを使用する。
−−  ｍＡｂとの結合に限ってのステップ：ＤＮＡを、沸騰水浴中で１０分間加熱し、氷上で５分間クエンチすることによって一本鎖にする。
−−  ＤＮＡ溶液を、０．１１体積の１０×結合用緩衝液と混合する。
−  標的ＤＮＡの結合および溶出
−−  ５ｕｇのメチル−結合剤（３：１の質量比が標準である）をＤＮＡ溶液に添加し、混合しながら室温で１時間インキュベートする。
−−  ｍＡｂの結合は、より長いインキュベーション時間を用いると改善し、４℃で良好に実施される。
−−  結合剤がコンジュゲートされたビーズを、結合用緩衝液を用いて２回洗浄する。ＤＮＡを、５０℃での３時間〜一晩のプロテイナーゼＫ処理を用いて放出させる。また、ＤｐｎＩ結合剤も、ｐＨまたはイオン強度の変化を通して急速に放出させることができる。
−−  結合しているＤＮＡを、ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使用して精製し、ＴＥ緩衝液中に溶出する。
−−  所望により、溶出したＤＮＡを解析する。本発明者らは、リアルタイム定量的ＰＣＲを使用する。
【００５８】
（実施例２）
この実施例は、本発明の方法を実行するための別の一般的なプロトコールを提供する。
【００５９】
ビーズの調製：最初に、磁気ビーズを回転またはボルテックスにより再懸濁させることによって、コートした磁気ビーズを調製する。磁気ビーズの必要な量（「作業体積」）を、試料の必要な数に基づいて、式：（試料の数×２０ｕｌ）＋１０ｕｌ＝作業体積、を使用して計算する。２０ｕｌの磁気ビーズが、１つの試料当たり必要である。複数の試料を用いる場合、ビーズをバルクで調製することができるが、ビーズの必要な作業体積を計算する場合、ピペット操作に起因する体積の損失を計上することが推奨される。
【００６０】
次に、作業体積の磁気ビーズを新しいチューブに移動させ、磁石上に１〜２分間置く。結果として得られる上清を、チューブが磁石上にある間に、ピペットを用いる吸引により除去する。次いで、チューブを磁石から取り出し、少なくとも作業体積の洗浄用緩衝液を、ビーズが収集されているチューブの内部に添加し、混合物を、回転またはピペット操作により穏やかに再懸濁させる。これらの磁化、吸引、洗浄および再懸濁のステップを２回繰り返して、計２回の洗浄を行う。第２の洗浄の後に、磁気ビーズを、同じ作業体積の洗浄用緩衝液中に再懸濁させる。次いで、１／１０の作業体積のビオチン化タンパク質溶液を添加し、穏やかにくるくると回転させながら、例えば、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  ＴＣ−７上での１６ｒｐｍで、室温（２３°〜２５℃）で３０分間インキュベートする。次いで、チューブを磁石中に２〜３分間置き、上清を、チューブが磁石上にある間に、ピペットを用いる吸引により廃棄する。上記の磁化、吸引、洗浄および再懸濁のステップに続いて、コートしたビーズを、作業体積の洗浄用緩衝液を用いて２回洗浄する。次いで、ビーズを１回洗浄し、作業体積の結合用緩衝液中に再懸濁させ、１つの反応チューブ当たり２０ｕｌを分注する。
【００６１】
ＤＮＡの調製：ＤＮＡを、Ｔｒｉｓ  ＥＤＴＡ（ＴＥ）、水または類似の緩衝液中に懸濁させ、４５ｕｌのＤＮＡ溶液を５ｕｌの結合用緩衝液に分注する。
【００６２】
ＤＮＡの固定化：調製したビーズの反応チューブを磁石中に２〜３分間置き、上清を廃棄する。次いで、チューブを、穏やかにくるくると回転させながら、例えば、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  ＴＣ−７上での１６ｒｐｍで、室温（２３°〜２５℃）で３０分間インキュベートする。チューブを回転機から取り出し、磁石上に少なくとも２分間置く。チューブが磁石上にある間に、上清をピペットにより取り出す（すなわち、非標的画分）。次いで、上記の磁化、吸引、洗浄および再懸濁のステップに続いて、ビーズを、２００ｕｌの洗浄用緩衝液を用いて２回洗浄する。
【００６３】
細菌ＤＮＡの溶出（任意選択のステップ）：試料チューブを、磁石上に２〜３分間置き、上清を、チューブが磁石上にある間に、ピペットを用いる吸引により廃棄する。次いで、２０ｕｌの溶出用緩衝液を各試料に添加し、試料を、室温で５分間ボルテックスする。次に、試料チューブを磁石上に２〜３分間置き、上清を、ピペットを用いる吸引により取り出す。上記の溶出のステップを、第２の２０ｕｌの溶出用緩衝液を用いて繰り返し、組み合わせて、標的画分を形成する。
【００６４】
脱塩（任意選択のステップ）：下流で適用する方法が、変性を起こす高塩緩衝液に対して感受性を示す場合、脱塩スピンカラムを製造元のプロトコールに従って使用する、脱塩のステップが推奨される。
【００６５】
（実施例３）
以下の実施例は、エピジェネティック特異的消化法の一実施形態が、混合性試料から細菌ＤＮＡを単離するのに有効であるデータを提供する。実施例３は、上記の表４に属するステップ１および３を利用する。
【００６６】
１．メチル化選択的消化
混合物を、真核生物の小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）から得られたＤＮＡと細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から得られたＤＮＡとから作った（表７）。ＤｐｎＩＩを使用して、混合物中のＤＮＡを消化し、消化されたＤＮＡは、アデニンのＮ６位においてメチル化されていないＧＡＴＣ部位のみを含有した（Ｅ．ｃｏｌｉではなく、小麦ＤＮＡが制限される）（表７）。
【００６７】
【表７】
2014520530.tif 000012
図２は、メチル化選択的消化により、原核生物ＤＮＡと真核生物ＤＮＡとの隔離が可能になることを示す。ＤｐｎＩは、ＧＡＴＣ部位のアデニンにおいてメチル化されているＤＮＡのみを切る。ＤｐｎＩＩは、ＧＡＴＣがメチル化されていない場合にのみ切る。細菌ＤＮＡと真核生物ＤＮＡとの混合物が示差的に制限されて、制限末端のサイズまたは適合性による隔離が可能になる。
【００６８】
２．非標的ＤＮＡの枯渇
ＤｐｎＩＩにより処理した混合物を、１％アガロースＴＢＥゲル上、５０Ｖで２時間分離した。インプットＤＮＡに対応するバンドを、アガロース切片から、Ｑｉａｇｅｎのキットを使用して単離し、抽出した。濃縮した試料および濃縮前の試料の一定分量を調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡ−ＩＩ上で配列決定した。
【００６９】
データ解析
６，３２２，９２５個のマッピング可能な配列の読取りを、濃縮前の試料から得た。ＭｅｇａＢｌａｓｔ（ＮＣＢＩ）を使用して、最初の混合物中、６，２７７，７８６個の読取りが小麦に、４５，１３９個がＥ．ｃｏｌｉに帰属するか、または０．７％のＥ．ｃｏｌｉの読取りであった（図３）。メチル選択的消化および枯渇に続いて、５，４３０，３９２個のマッピング可能な配列の読取りを得た。驚くべきことに、１，２５０，７７７個の読取りが、Ｅ．ｃｏｌｉに由来し、この値は、２３％と多く、または３２倍に濃縮されていることが明らかである。
【００７０】
真核生物ＤＮＡの示差的メチル化消化の効率を具体的に調べるために、本発明者らは、精製の前および後に、各生物中のＧＡＴＣを含有する配列の読取りを数えた。細菌の読取りのうち、ＧＡＴＣを有する画分は、１０．２％から７５．６％に急増した。一方、小麦の読取りのうち、ＧＡＴＣを有するパーセントは、８９．７６％から２４．４％に落ちた。データからは、一部の小麦の配列が切られることなく残留した理由は示されない。使用した酵素の量が、３ｕｇの小麦全てを消化するには不十分であったと説明することが可能であろう。このことから、濃縮を劇的に改善することができることが示唆される。
【００７１】
本発明者らは、明確な偏りのない、Ｅ．ｃｏｌｉの配列カバー範囲の深さの０．２４から６倍への増加を観察した（図４Ａ〜Ｄ）。結果として得られたカバー範囲は、９９％を上回り（図４Ｃ）、微量な細菌の明確な同定が可能になる。
【００７２】
（実施例４）
以下の実施例は、エピジェネティック特異的消化法の一実施形態が、混合性試料から細菌ＤＮＡを単離するのに有効であるデータを提供する。実施例４は、上記の表４に属するステップ１〜４を利用する。ステップを、細菌ＤＮＡまたはヒトＤＮＡ個々に対して示し（図５〜６）、ヒトおよびｐＵＣ１９のＤＮＡの混合物を使用して、標的ＤＮＡの濃縮を達成し（図７）、ヒトおよびＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡの混合物を使用して、標的ＤＮＡの濃縮を達成する（図８）。効率的なライゲーション末端を有する標的ＤＮＡ、および効率が悪い、平滑末端または不適合末端を有するクラッターＤＮＡを残す、制限酵素の組合せを選んだ。必要であれば、標的の切断部位の内部に、非標的の切断部位を入れ子状態にすることを使用して、標的ＤＮＡの切断部位を破壊した（例えば、ＧＡＴＣは、ＧＧＡＴＣＣ内で入れ子状態になっている）。非標的分子の平滑末端化を実施する必要がある場合がある（Ｋｌｅｎｏｗ、Ｔ４ポリメラーゼ、マングビーンヌクレアーゼ）。
【００７３】
１．メチル化選択的消化
ａ）非標的ＤＮＡのＤｐｎＩＩ消化を、表８に従って実施した。
【００７４】
【表８】
2014520530.tif 000013
３７度で１時間インキュベートする。６５度で２０分間の加熱により不活性化させる。（図２を参照されたい）。
【００７５】
ｂ）平滑末端ＤｐｎＩＩオーバーハングを、表９に従って生成する。
【００７６】
【表９】
2014520530.tif 000014
ｃ）標的ＤＮＡのＢａｍＨＩ消化を、表１０に従って実施した。
【００７７】
【表１０】
2014520530.tif 000015
３７度で１時間インキュベートする。カラムを清浄して、酵素を除去する。
【００７８】
２．アダプターのライゲーション／環状化
過剰なモル濃度のアダプター分子を添加して、アダプターのライゲーションを推進する。標的分子の粘着末端化により、環状化を推進する（図５、７）。
【００７９】
ａ）リンカーを、表１１に従ってライゲーションした。
【００８０】
【表１１】
2014520530.tif 000016
２２度で１０分間インキュベートする。
６５度で１０分間の加熱により不活性化させる。
【００８１】
図５は、ＢａｍＨＩ粘着末端にライゲーションさせたアダプター（配列番号１）により、分子が、環状化され、消化から保護され、ＰＣＲ増幅が可能になることを示す。
【００８２】
３．非標的ＤＮＡの枯渇
直鎖分子対環状分子および／またはアダプターによる保護に基づく、非標的ＤＮＡのＤＮアーゼ消化（図６、７）。
【００８３】
ａ）非環状ＤＮＡを、表１２に従って、ＤｐｎＩＩを用いて消化し、再度消化した。
【００８４】
【表１２】
2014520530.tif 000017
図６は、標的分子の選択的増幅を可能にする、直鎖ＤＮＡ分子対環状ＤＮＡ分子の選択的消化を示す。ＤｐｎＩＩによって制限されたヒトゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は、ｐｌａｓｍｉｄ  ｓａｆｅＤＮアーゼに対して感受性を示し（レーン２とレーン３とを比較されたい）、一方、アダプターのライゲーションにより生成した環状の分子は感受性を示さない（レーン５、ｐＵＣ１９対照）。
【００８５】
４．標的の増幅
合成アダプター中のプライマーを使用して、細菌ＤＮＡをＰＣＲ増幅する（図５、レーン４）（図７、レーン１２、図８、レーン６および７）。
【００８６】
ａ）標的ＤＮＡを、表１３および１４に従ってＰＣＲ増幅した。
【００８７】
【表１３】
2014520530.tif 000018
【００８８】
【表１４】
2014520530.tif 000019
図７は、アダプターのライゲーションを伴うエピジェネティック特異的消化法が、混合性試料において、標的ＤＮＡを単離し、増幅し、非標的ＤＮＡを分解するのに有効であることを示す。ゲルのレーンを、以下に示す：レーン１−直鎖ＫＢのラダー；レーン２−ヒトゲノムＤＮＡ（ｈｇＤＮＡ）；レーン３−１ｕｇのヒトゲノムＤＮＡ中に１ｎｇのｐＵＣ１９  ＤＮＡ（ｄａｍメチル化細菌ＤＮＡの代理）を含有する１０００：１の混合物；レーン４−スーパーコイルｐＵＣ１９。ＤｐｎＩＩ消化および末端のＴ４ポリメラーゼによる平滑化、それに続く、ＢａｍＨＩ消化、カラム精製、およびアダプターのライゲーションが媒介する環状化によって、メチルによる選択を達成した。そのように処理した各鋳型の試料を、ヒトＤＮＡの染みおよび細菌ＤＮＡの保存が明らかである、レーン５〜８に示す。ヒトＤＮＡの枯渇を、Ｐｌａｓｍｉｄ  ＳａｆｅＤＮアーゼおよびＤｐｎＩＩ消化により達成し（レーン８〜９）、ここに、ヒトＤＮＡが除去されたことが示されている。アダプターに特異的なプライマーを用いた増幅は、消化した混合物（レーン１２）からでさえ、インプットｐＵＣ１９の増幅が生じた（レーン１３）が、ヒトのみのＤＮＡからは増幅が生じなかった（レーン１１）ことを示す。鋳型の陰性対照である未処理のｈｇＤＮＡ（レーン１４）、未処理のｐＵＣ１９（レーン１５）、および鋳型なしからは、シグナルの増幅が生じない。
【００８９】
図８は、アダプターのライゲーションを伴うエピジェネティック特異的消化法が、混合性試料において、標的ゲノムを単離し、増幅し、非標的ゲノムを分解するのに有効であることを示す。ゲルのレーンを、以下に示す：レーン１−直鎖ＫＢのラダー；レーン２−ヒトゲノムＤＮＡ（ｈＤＮＡ）；レーン３−Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇＤＮＡ）；レーン４−ｐＵＣ１９；レーン５−エピジェネティック特異的消化および増幅の後のヒトゲノムＤＮＡ（ｈＤＮＡ）；レーン６−エピジェネティック特異的消化および増幅の後の、混合性のヒトゲノムＤＮＡおよび１０ｎｇのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ（ｈＤＮＡ＋１０ｎｇ  Ｅｃ）；レーン７−エピジェネティック特異的消化および増幅の後の、１０ｎｇのＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡ（１０ｎｇ  Ｅｃ  ｇＤＮＡ）；レーン８−エピジェネティック特異的消化および増幅の後のｐＵＣ１９。
【００９０】
図９は、複合混合物からの濃縮のレベルを定量化する。最初の混合物は、およそ１００ｐｇのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡおよび１ｕｇのヒトＤＮＡ、または１対１０，０００の比を含んだ。男性のＤＮＡ中に存在するＤＹＺ遺伝子座（縦じまのバー）およびＥ．ｃｏｌｉ中に存在する１６Ｓ遺伝子座（横じまのバー）を使用して、ｑＰＣＲ測定をＤＮＡに対して行った。エピジェネティック特異的消化および増幅の後には、ｑＰＣＲにより、１：０．３の比の細菌ＤＮＡ：ヒトを測定し、これは、３３，０００×の濃縮であった。
【００９１】
（実施例５）
以下の実施例は、エピジェネティック特異的消化法の一実施形態が、混合性試料から細菌のゲノムＤＮＡを単離するのに有効であるデータを提供する。実施例５は、上記の表４に属するステップ１〜４を利用する。効率的なライゲーション末端を有する標的ＤＮＡおよび不適合末端を有するクラッターＤＮＡを残す制限酵素の組合せを選んだ。最初に、非標的ゲノムを、（細菌のアデニンにおけるメチル化ＧＡＴＣ部位を切らない）ＢｓｔＫＩを用いて切った。次いで、細菌ＤＮＡを、Ｓａｕ３ＡＩを用いて切って、細菌のＧＡＴＣ部位に粘着末端を残した。付加したリンカーは、細菌のＳａｕ３ＡＩ末端に対してのみ特異的であり、細菌の断片を、続いて添加するエキソヌクレアーゼから保護する。増幅は、リンカー中に包埋している部位から生じる。
【００９２】
１．  リンカーをアニールする：ＧＡＴＣ−４ｎｔのセンスおよびアンチセンス
ａ．  各５ｕｌのＳおよびＡを、９０ｕｌに添加する
ｂ．  ９５度で５分間加熱する
ｃ．  加熱ブロック中で室温までゆっくり冷却する。
【００９３】
２．  ＢｓｔＫＴＩにより消化する（Ｄａｍメチル化により遮断される−Ｅ．ｃｏｌｉは切らない）
ａ．  ＤＮＡ試料を、表１５に従って調製した−ヒトのみ（１）、ヒト＋Ｅ．ｃｏｌｉ（２）、およびＥ．ｃｏｌｉのみ（３）。
【００９４】
【表１５】
2014520530.tif 000020
ｂ．  ３７度で６０分間消化する。
ｃ．  ６５度で２０分間の加熱により不活性化させる。
【００９５】
３．  Ｓａｕ３ＡＩにより消化する（ＧＡＴＣ５’オーバーハングが生成する）
ａ．  反応物を、表１６に従って調製する。
【００９６】
【表１６】
2014520530.tif 000021
ｂ．  １反応当たり５ｕｌを添加する。
ｃ．  ３７度で６０分間インキュベートする。
ｄ．  ６５度で２０分間の加熱により不活性化させる。
【００９７】
４．  リンカーをライゲーションする
ａ．  １ｎｇのＭＧ１６５５  ＤＮＡを、ＢｓｔＹ１を用いて切って、１．０４Ｅ−０３ピコモルの分子または１．０４フェムトモルのＤＮＡを残す。
ｂ．  ５０：１では、５２フェムトモルのリンカーを必要とする
ｃ．  リンカーを、表１７に従って、５ピコモル／ｕｌ〜１０フェムトモル／ｕｌに希釈する（ｔｒｉｓまたはＤＩ中の１：５０）。
【００９８】
【表１７】
2014520530.tif 000022
ｄ．  室温で５分間インキュベートする。
ｅ．  ６５度で１０分間の加熱により不活性化させる。
【００９９】
５．  ＥｘｏＩＩＩにより消化する
ａ．  表１８の以下の構成成分を組み合わせ、ＤＮＡに添加する−１０ｕｌ／チューブ
【０１００】
【表１８】
2014520530.tif 000023
ｂ．  ３７度で３０分間インキュベートする。
ｃ．  ６５度で１５分間の加熱により不活性化させる。
【０１０１】
６．  試料の増幅を、表１９に従って、ＰＣＲにより実施した。
ａ．  対照
ｂ．  ＭｅＲ（リバース）プライマーのみを必要とする
ｃ．  試料：
１．  処理したｈＤＮＡ
２．  処理した（ｈＤＮＡ＋Ｅ．ｃｏｌｉ）
３．  処理したＥ  ｃｏｌｉ
【０１０２】
【表１９】
2014520530.tif 000024
結果
図９の結果から、ｑＰＣＲを用いて試験した場合、最初の試料混合物は、およそ１ｕｇのヒトＤＮＡおよびわずか１００ｐｇ超のＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡの測定レベルを有したことが示される。エピジェネティックな選択的増幅の後に、ヒトＤＮＡのレベルの劇的な低下（１０ｐｇ未満）および細菌ＤＮＡの増幅（１ｎｇ超）が生じた。この実施例では、増幅を２５サイクルのモードに保ったが、より高いレベルの増幅が可能であることを理解されたい。１：１０，０００のＥ．ｃｏｌｉ対ヒトＤＮＡの比が、およそ３３，０００倍だけ変化して、１：０．３となった。このことは、高いレベルの濃縮を示しており、この濃縮は、ヒトＤＮＡの高いバックグラウンドの選択的分解という点において、とりわけ独創的である。
【０１０３】
（実施例６）
以下の実施例は、エピジェネティック結合剤の、混合性試料から細菌ＤＮＡを単離する実施可能性を示すデータを提供する。具体的には、ゲル遅延を使用して、エピジェネティック結合剤である制限酵素ＤｐｎＩがメチル特異的に結合しているかを決定し、結合条件が確実にＤＮＡ制限を可能としないようにした。本明細書で提供する結果から、ＤＮＡを切断しない、ＤｐｎＩのメチル特異的結合が示されている。
【０１０４】
材料
−  ６９９ｎｇ／ｕｌのビオチン化ＦＬＩＲ  ＤｐｎＩ
−  １０単位／ｕｌのＤｐｎＩ（ＮＥＢ）
−  １ＫＢのラダー（Ｂｉｏｌｉｎｅ）
−  ＴＢＥ中の３％アガロースゲル
−  結合用緩衝液
−  制限用緩衝液
−  ＮＥＢ緩衝液４
−  カチオン：１０ｍＭ  Ｍｇ＋＋または１０ｍＭ  Ｃａ＋＋
１５０ｎｇのＤｐｎＩまたは２０単位のＮＥＢ  ＤｐｎＩ
１０×結合用緩衝液
ｍＭのカチオン（記載がある場合）
脱イオン水を加えて、最終体積とする
１００ｎｇのｐＵＣ１９  ＤＮＡ  。
【０１０５】
方法
ＤｐｎＩを、異なる結合用緩衝液、およびＤＮＡ鋳型のｐＵＣ１９を含有する２０ｕｌの溶液に添加した。結合用緩衝液は、記載するように、Ｍｇ＋＋またはＣａ＋＋のいずれかの最終濃度を含んだ。Ｎ６ｍＡ  ｐＵＣ１９は、ｄａｍ＋菌株のＭＧ１６５５中で継代することによって、ＧＡＴＣ部位においてメチル化させ、一方、非メチル化ｐＵＣ１９は、ｄａｍ−菌株のＢＬ２１中で継代した。ＤｐｎＩを、ｐＵＣ１９と共に、結合のための室温または消化のための３７℃のいずれかで２時間インキュベートした。反応物を、アガロースゲル上に慎重に充填した。タンパク質−ＤＮＡの複合体を、未結合のＤＮＡから、標準的なアガロースゲル電気泳動により分離した。実験の終わりに、ゲルの画像を、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＡｌｐｈａ  Ｉｍａｇｅｒ  ＨＰを使用して撮影した。
【０１０６】
結果
図１０の結果は、制限酵素が、改変した条件下で、切ることなく、Ｎ６ｍＡに選択的に結合することができることを示す。最初に、Ｍｇ＋＋をＣａ＋＋で置換すると、ゲル遅延が示すように、Ｎ６ｍＡ  ｐＵＣ１９の用量依存性の結合が生じた。例えば、４００ｎｇのＤｐｎＩでは、ウエル中の保持により証明されるように、全てのＤＮＡがＤｐｎＩと複合体を形成する。一方、ＤｐｎＩの非存在下では、ゲル遅延はなく、ＤＮＡは相応に遊走している。対照的に、Ｍｇ＋＋を代わりに反応物中に入れると、複数のバンドにより証明されるように、ＤｐｎＩが、Ｎ６ｍＡ  ｐＵＣ１９において切る。図１０の右のパネルに示すように、非メチル化ＤＮＡ（ｐＵＣ１９）に関しては、ゲル遅延が示されなかったので、ＤｐｎＩの結合作用は、Ｎ６ｍＡに特異的である。総合すると、これらの結果から、適切な条件下で、制限酵素を使用して、切断を生じることなく、エピジェネティックな改変に特異的に結合させることができることが示されている。これは、制限酵素を、混合性試料から原核生物ＤＮＡを分離し、単離するためのエピジェネティック結合剤として使用することができることを証明している。さらに、制限酵素−ＤＮＡの複合体の単離を援助するために、改変、例として、ビオチン化またはその他のコンジュゲーションを制限酵素に対して作製することもできる。
【０１０７】
ＤｐｎＩのビオチン化
市販されている調製物はしばしば、部分的にのみ精製され、高い量の添加ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するので、精製ＤｐｎＩをビオチン化した（ｂＤｐｎＩ）。ＨＡＢＡアッセイの結果からは、１つのＤｐｎＩ分子当たり２．８個のビオチンの組込みが生じていた。プライマーセットを使用して、４７７ｂｐ長および６５１ｂｐ長の２つのＤＮＡ断片を生成し、これらは、ｐＵＣ１９に由来する、同じ６つのＧＡＴＣ部位が重複する。メチル感受性のＭｂｏＩ制限消化により検証したところ、断片は、ＰＣＲ増幅の後に、非メチル化状態であった。Ｄａｍメチルトランスフェラーゼ（ＤＭＴ）を使用して、４７７ｂｐの断片をメチル化し（Ｍ４７７）、この断片をＤｐｎＩの基質とした。
【０１０８】
ＤｐｎＩのビオチン化形態（ｂＤｐｎＩ）を、非メチル化６５１ｂｐ断片およびＭ４７７断片の両方の混合物を用いる結合反応中で使用した。ｂＤｐｎＩは、Ｍ４７７断片のゲルの遊走を選択的に低下させ、この低下は、メチルに特異的なＤＮＡへの結合を示した（図１１）。
【０１０９】
ビオチン化ＤｐｎＩの、アビジンコートビーズに対する活性
次に、ｂＤｐｎＩの性能を、溶液相中での結合について評価した。４００ｎｇのｂＤｐｎＩを、Ｍ４７７ｂｐ断片および非メチル化６５１ｂｐ断片（ｕｎＭ６５１）のそれぞれ２００ｎｇと共に１時間インキュベートした。次いで、アビジンコートビーズを添加し、さらに１時間インキュベートした。ビーズを磁気により収集し、上清を保存し、ビーズを洗浄した。次いで、画分を、３％アガロースゲル上で泳動した（図１２）。上清は、ｕｎＭ６５１ｂｐ断片をもっぱら含有し、一方、結合画分は、両方のＤＮＡ生成物を含有した。このより低い特異性は、結合条件を変化させることによって対処することができると思われる。
【０１１０】
対照的に、ｂＤｐｎＩをビーズにあらかじめ結合させた場合には、優れた特異性が生じた。量を増加させてｂＤｐｎＩ−ビーズを、混合性のｕｎＭ６５１およびｍ４７７ｂｐの断片に添加した。３０分のインキュベーションの後に、非標的画分または標的画分から得られた試料をゲル上に充填して、解析を行った。非標的画分は、ｂＤｐｎＩビーズのレベルの増加と共に、ｍ４７７ｂｐ断片を特異的に失った。標的画分は、ｍ４７７断片をもっぱら含有した（図１３）。
【０１１１】
ゲノム混合物からの細菌ＤＮＡの単離の特異性
細菌ＤＮＡの特異性の限界を決定するために、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡを、１ｕｇのヒトＤＮＡのバックグラウンドにおいて、１０ｎｇから１ｐｇまで減量させて、一連のゲノム混合物を生成し、次いで、こうした混合物を、ｂＤｐｎＩビーズと共にインキュベートした。このプロトコールでは、ビーズを１回洗浄し、標的画分および非標的画分を収集し、次いで、各画分中のヒトおよびＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡのレベルについて試験した。回収を、細菌の１６ＳおよびヒトのＤＹＺに関して、ｑＰＣＲを用いて評価し、それぞれを、それらのそれぞれのマーカーの頻度に対して正規化した。標的画分中では、およそ１０％のヒトＤＮＡを一貫して回収した。ｐｇレベルでは、３０％以上のＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡを回収し、一方、８０％超のＥ．ｃｏｌｉを、１０ｎｇのインプットに関しては回収した。
【０１１２】
ｂＤｐｎＩ−ビーズとＤＮＡとのインキュベーションの最小時間を決定するために、１ｕｇのヒトＤＮＡと５００ｐｇのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡとの混合物について、５〜６０分のインキュベーション時間で試験した。このプロトコールでは、ｂＤｐｎＩ−ビーズとＤＮＡとの複合体の３回の洗浄を使用し、次いで、画分を、ＤＹＺおよび細菌１６ＳのｒＤＮＡについて、ｑＰＣＲを用いて試験した。回収には、測定したインキュベーション時間にわたり一貫性があった（図１４および１５）。さらに、非標的ヒトＤＮＡの結合は、１％に低下した（図１４および１５）。その他の実験では、ヒトＤＮＡの結合は、インキュベーション時間の延長と共に増加することが観察された。
【０１１３】
ゲノム回収のカバー範囲
全体的なゲノム回収の効率を評価するために、細菌の混合物を調製し、ＤｐｎＩビーズによる濃縮の前および後に配列決定した。試料は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、ならびに２つのウイルス、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ（Ａｕｔｐｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ）ウイルス（ＡｃＮＶＰ）およびファージラムダを含有した。混合物は、濃縮されないこと（バチルス属）、部分的な濃縮（シュードモナス属）、および完全な濃縮（Ｅ．ｃｏｌｉ）がＤａｍ（ＧｍＡＴＣ）ＤＮＡモチーフの存在に基づいて予想される生物を含むことから、ＤｐｎＩによる濃縮の評価に適切であるとみなした。
【０１１４】
次いで、細胞／ウイルスの混合物を使用して、ＤｐｎＩによる濃縮を行い、続いて、ＤＮＡを調製して、ＨｉＳｅｑを使用して次世代配列決定を行った。これらのデータの概要を、図１６に示す。優れたカバー範囲を伴う、Ｅ．ｃｏｌｉの１４×の濃縮が観察され（図１７）、また、ゲノムのカバー範囲の主要な物理学的特徴も維持された。そのような特徴には、複製開始点（ＯｒｉＣ）と末端との間のカバー範囲の比が含まれる。１の比は、固定相の生物を示し、一方、高い比（４、８、１６および３２）は、増殖の急速な増加を示す。そのような情報は、脅威生物について、供給源および増殖方法を評価するのに重要である。低いカバー範囲の偏り、および濃縮プロセスの間の物理的なカバー範囲の特徴の維持が極めて望ましい。カバー範囲の急上昇が人工的であり、バクテリオファージ（ＤＬＰ、ＲｅｃおよびＱｉｎ）が、このミックスに属するその他の細菌中に存在するので、高いカバー範囲が生じて、誤ったインフレーションがもたらされていることに留意すべきである。
【０１１５】
（実施例６）
以下の実施例は、バイオ脅威に焦点を合わせた細菌および代表的な真核生物のパネル上で、Ｎ６−メチルアデノシン（Ｎ６ｍＡ）に対して産生された最初のポリクローナル血清の特徴付けを示す。アデニンのメチル化は、一般的な真核生物ゲノムからの細菌ＤＮＡの識別子であるが、一部の病原体には、検出可能なアデニンのメチル化が存在しない。この実施例は、免疫沈降の可能性、および一連のモノクローナル抗体の確立を示す。また、これらの方法は、生物のアデニンのメチル化状態の同定および細菌のゲノムの一般的な濃縮のために使用することもできる。
【０１１６】
材料および方法
免疫原、コンジュゲート、およびＤＮＡ試料。Ｎ６−メチルアデノシンの５’−一リン酸ナトリウム塩、Ｎ６−メチル−２−デオキシアデノシンおよび２−デオキシアデノシン５−一リン酸、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。免疫原としての、ＫＬＨの、Ｎ６−メチルアデノシンの５’−一リン酸ナトリウム塩へのコンジュゲーション（Ｎ６ｍＡ−ＫＬＨ）、およびカウンタースクリーニングのための、ＢＳＡの、Ｎ６−メチルアデノシンの５’−一リン酸ナトリウム塩へのコンジュゲーション（Ｎ６ｍＡ−ＢＳＡ）を、以前の記載に従って実施した。Ｅｒｌａｎｇｅｒ，  Ｂ．Ｆ．およびＳ．Ｍ．Ｂｅｉｓｅｒ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１９６４年、５２巻：６８〜７４頁。ヒト男性については、ゲノムＤＮＡを購入し（Ｚｙａｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｅ．ｃｏｌｉのＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ）からは、ゲノムＤＮＡを、標準的なＤＮＡ抽出プロトコール（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を使用して単離した。
【０１１７】
抗体生成およびスクリーニング。Ｎ６−メチルアデノシンの５’−一リン酸ナトリウム塩を、ＫＬＨにコンジュゲートし、抗原として使用した。Ｅｒｌａｎｇｅｒ，  Ｂ．Ｆ．およびＳ．Ｍ．  Ｂｅｉｓｅｒ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１９６４年、５２巻：６８〜７４頁。９匹のＢａｌｂ／ｃマウスの免疫化を、以前の記載に従って実施した。Ｒｅｙｎａｕｄ，  Ｃ．ら、Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｓｉｘ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ、１９９２年、６１巻（３号）：２５５〜６２頁。免疫前の血液および各免疫化の後の試験血液を収集して、間接ＥＬＩＳＡおよび競合ＥＬＩＳＡにより、Ｎ６−メチル−２−デオキシアデノシンおよび２−デオキシアデノシン５−一リン酸を使用してモニターした。確立された手順を使用して、ＳＰ２／０細胞を用いてハイブリドーマを生成し、結果として得られた融合体を、上記に従って再スクリーニングした。Ｓｈｕｌｍａｎ，  Ｍ．，  Ｃ．Ｄ．  Ｗｉｌｄｅ，  ａｎｄ  Ｇ．  Ｋｏｈｌｅｒ、Ａ  ｂｅｔｔｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｍａｋｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ、１９７８年、２７６巻（５６８５号）：２６９〜７０頁。
【０１１８】
ヌクレオチドの直接ＥＬＩＳＡを実施して、抗体の力価を求めた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４中の、１ｕｇ／ｍｌの、Ｎ６−メチルアデノシンの５’−一リン酸ナトリウム塩−ＢＳＡのコンジュゲートを１００ｕｌ用いて、ウエルをコートした。検出を、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｌｏｓ  Ｇａｔｏｓ、ＣＡ）を用いて達成した。力価を、試料のＯＤがブランクよりも２．１倍高い、最も高い希釈度から同定した。
【０１１９】
競合ＥＬＩＳＡを、以前の記載に従って実施した。Ｉｔｏｈ，  Ｋ．、Ｍ．  ＭｉｚｕｇａｋｉおよびＮ．  Ｉｓｈｉｄａ、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  １−ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  １−ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ、Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１９８８年、７９巻（１０号）：１１３０〜８頁。ウエルを、Ｎ６ｍＡ−ＢＳＡのコンジュゲートでコートして、結合活性が免疫原のＫＬＨ構成成分に対して生じないことを確実にした。抗血清をＮ６−メチル−２−デオキシアデノシン（所望の活性に対する特異的な阻害物質）または２−デオキシアデノシン５−一リン酸のいずれかと共にインキュベートし、それをコートしたウエルに添加することによって、特異性を決定した。抗血清がコートしたウエルに結合した場合には、競合は存在しなかった。
【０１２０】
オリゴヌクレオチドＥＬＩＳＡを、以下の配列：ＧＣＡＧＧＡＴＣＡＡＣＡＧＴＣＡＣＡＣＴを有する、２つのオリゴ（ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して実施し、ここで、下線を付したアデニンは、１つのセットでは非メチル化アデニンであり、または別のセットではＮ６−メチル化アデニンであった。ガラス製チューブ中で、各オリゴを、８μｇオリゴ／ｍｌの最終ＤＮＡ濃度で、等しい体積のＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ  ＤＮＡコーティング溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）と混合した。１００ｕｌのこのコーティング混合物を、９６ウエル丸底ＥＩＡプレート中のウエルに移動させ、オービタル混合機上、室温で２時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、洗浄用緩衝液（ＴＢＳおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて３回洗浄し、続いて、１ウエル当たり２００μｌのブロッキング溶液（ＴＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および１％ＢＳＡ）を用いて室温で１時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を除去した後、ウエルを、抗メチルアデニンマウスポリクローナル抗血清を（１：１０，０００の希釈度で）含有する１００μｌのブロッキング溶液を加えて１時間インキュベートし、洗浄用緩衝液を用いて３回洗浄し、次いで、ブロッキング溶液中で、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）と共に３０分間インキュベートした。未結合の抗体を、洗浄用緩衝液を用いて３回洗浄して除去し、次いで、１ウエル当たり１００μｌの１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＥＬＩＳＡを発色させた。酵素反応を、１５分後に１００μｌの２Ｍ硫酸を用いて止め、発色を４５０ｎｍの吸光度で測定した。ゲノムＤＮＡのＥＬＩＳＡを実施するために、オリゴを、各実験では、記載濃度のＤＮＡで置換した。
【０１２１】
結果
免疫反応は、試験した全てのマウスにおいて強力であり、最高１００，０００倍の希釈度が必要であった。全ての血清の特異性を、アデニンおよびＮ６−メチル−アデニンの両方に対する反応性を比較することによって試験した（図１９）。本発明者らは、１００ｎｇのＮ６ｍＡからのみ、Ｎ６ｍＡコートＥＬＩＳＡ用プレートに対する血清の結合の５０％の阻害が生じることを観察した。一方、１０ｕｇのアデニン（試薬の１００倍の増加）からは、約３０％の阻害が生じた。１、４、８および９から得られた最終の血液を選んで、融合体を生成した。
【０１２２】
およそ５００個の融合体をスクリーニングし、サブクローニングの後に、一次の、ヌクレオチドの直接ＥＬＩＳＡにおいて、Ｎ６ｍＡに対する特異性を有する１６個のハイブリドーマを同定した（それらのうち６つを、ＡＴＣＣ寄託指定番号＿，＿，＿，＿，＿または＿の下に寄託した）。次いで、最終の血液、および１６個のハイブリドーマを、オリゴＥＬＩＳＡを使用して試験した（図１９）。試験したポリクローナル血清の全てが、非メチル化オリゴに比して、Ｎ６ｍＡを１０倍超選好し、１つのハイブリドーマは、Ｎ６ｍＡに対して、ほとんど４０倍の識別を示した。
【０１２３】
ポリクローナル血清をさらに評価して、それらの反応性を、Ｅ．ｃｏｌｉから抽出したＤＮＡとヒトから抽出したＤＮＡとで比較した（図２０）。これらの試験のために、ゲノムＥＬＩＳＡを使用し、ウエルをコートするゲノムＤＮＡの量を増減させた。細菌に対する示差的な感受性が、６ｎｇ超のゲノムＤＮＡに関して観察された。
【０１２４】
（実施例７）
以下の実施例は、非加工性エンドヌクレアーゼを、ＤＮＡを単離するために使用する本発明の実施形態が、ＰＣＲ阻害物質から、細菌のゲノムを隔離して分けるデータを提供する。腐植土、ならびにＳａｎ  Ｄｉｅｇｏの暴風雨の間の、都市排水の場所の海洋水および汚染水の試料、赤鉄鉱被覆砂、セッコウを含有する火山泥、ならびにＵｔａｈの高い鉱物含有量の地域から得られた川床シルトを含めた、環境試料を収集した。ＰＣＲの阻害物質が多いことが公知である、多種多様かつ、しばしば、困難な試料のタイプから得られた細菌ＤＮＡを濃縮する能力を評価した。
【０１２５】
試料を、ＭｏＢｉｏキットを使用して処理して、全ＤＮＡを単離し、続いて、ＤｐｎＩ−ビーズを用いて、実施例２のプロトコールを使用して、γ−プロテオバクテリアのゲノムの濃縮された標的画分およびその他のゲノムの非標的画分を生成した。元々の試料および全てのその後の画分を、普遍的な１６Ｓプライマーを使用して、多様性について評価した。作業の流れを、図２１に要約する。試料のタイプおよび１６Ｓによる増幅の結果の概要を、表２０に列挙する。
【０１２６】
【表２０】
2014520530.tif 000025
水の試料および空気の試料のほとんどが、細菌の存在を示す、１６Ｓのアンプリコンを生成した。都市の塩気のある川の試料の増幅は芳しくなく、腐植土の試料、砂、泥およびシルトからはいずれも、１６Ｓによる増幅が見られなかった。ＭｏＢｉｏによりＤＮＡを単離したいずれの場合も、１６Ｓプロファイルは生成されず、未結合の画分からも、１６Ｓプロファイルは生成されなかった。しかし、結合した標的画分は、阻害されず、目に見える植物、動物または細菌増殖がないことが多い微小環境に由来する細菌の存在を示した。
【０１２７】
図２２は、２つの腐植土の試料から得られた非標的ＤＮＡ画分は増幅しないことを示す。ＰＣＲ阻害物質の存在が疑われ、この場合、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ単独と比較して、土壌の試料中に加えたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡは、増幅しなかった。しかし、標的画分は、阻害を示さず、実際に、高く、多様な１６Ｓのバンドを明らかに示した。一方、最初の多様な土壌の試料も、非標的画分も、評価することができない。したがって、これまでは入手不可能であった試料のタイプからの有用な情報が得られた。
【０１２８】
図２３は、土壌の試料（シルト、砂および火山泥）からのＭｏＢｉｏキットを用いて直接単離したＤＮＡは、１６Ｓプライマーを用いる増幅は可能でなかったことを示す。これらの試料は、塩、赤鉄鉱およびセッコウがそれぞれ多いことが公知である。ＤｐｎＩによる隔離の後には、全ての試料が増幅可能であった。
【０１２９】
（実施例８）
以下の実施例は、非加工性エンドヌクレアーゼを、ＤＮＡを単離するために使用する本発明の実施形態が、特定のＰＣＲ阻害物質から、細菌のゲノムを隔離して分けるデータを提供する。表２１は、一般的な干渉物質；ＤｐｎＩによる隔離における、試験したレベル；ならびにＤｐｎＩによる隔離がある場合およびない場合の、結果として得られた検出のリストを提供する。
【０１３０】
【表２１】
2014520530.tif 000026
図２４は、１５０ｐｇのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡを、１６Ｓ  Ｅ．ｃｏｌｉ特異的ｑＰＣＲアッセイ中に入れた場合、Ｅ．ｃｏｌｉは、１００％検出されることを示す。ライ麦花粉のレベルをおよそ１０，０００ｕｇ／ｍｌまで増加させると、検出は、０％まで減少する。次いで、１５０ｎｇのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡの抽出を、１０，０００ｕｇ／ｍｌまたは１００，０００ｕｇ／ｍｌのライ麦花粉の存在下において試験した。いずれの場合も、ＰＣＲ阻害が軽減され、Ｅ．ｃｏｌｉの検出の何らかのレベルが修復された。
【０１３１】
緩衝液による洗浄の回数またはタイプ、添加剤（ＥＤＴＡ、阻害物質の不活性化剤）の添加、または（競合的阻害を軽減するための）ＤｐｎＩレベルの増加を含めて、当業者が実施例２からプロトコールを変化させることによって、ここに提示した方法に対する改善が得られることが理解され得る。
【０１３２】
本明細書に記載する実施例および説明は、現在の発明の実施形態の例示に過ぎず、本明細書に記載する方法および組成物を限定するものではないことを理解すべきである。本明細書に記載する種々の態様、実施形態および選択肢は全て、あらゆる変更形態に組み合わせることができる。本明細書で言及する刊行物、特許および特許出願は全て、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれていることが具体的かつ個々に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１３３】
本明細書で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」もしくは「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、またはそれらの任意のその他の変化形は、非排他的であるかまたは無制限であることを意図する。また、本発明の要素または構成成分に先行する不定の冠詞「ある（ａ）」および「ある（ａｎ）」は、事例、すなわち、要素または構成成分の出現の数に関して非限定的であることを意図する。したがって、「ある（ａ）」または「ある（ａｎ）」は、１つまたは少なくとも１つを含むと読み取るべきであり、また、要素または構成成分の単数形の単語の形は、数が単数形であることが明らかに意図されない限り、複数形も含む。
【図１】
2014520530.tif 000027
【図２】
2014520530.tif 000028
【図３】
2014520530.tif 000029
【図４−１】
2014520530.tif 000030
【図４−２】
2014520530.tif 000031
【図５】
2014520530.tif 000032
【図６】
2014520530.tif 000033
【図７】
2014520530.tif 000034
【図８】
2014520530.tif 000035
【図９】
2014520530.tif 000036
【図１０】
2014520530.tif 000037
【図１１】
2014520530.tif 000038
【図１２】
2014520530.tif 000039
【図１３】
2014520530.tif 000040
【図１４】
2014520530.tif 000041
【図１５】
2014520530.tif 000042
【図１６】
2014520530.tif 000043
【図１７−１】
2014520530.tif 000044
【図１７−２】
2014520530.tif 000045
【図１８】
2014520530.tif 000046
【図１９】
2014520530.tif 000047
【図２０】
2014520530.tif 000048
【図２１】
2014520530.tif 000049
【図２２】
2014520530.tif 000050
【図２３】
2014520530.tif 000051
【図２４】
2014520530.tif 000052
【配列表】
2014520530000001.app
【国際調査報告】
2014520530.tif 000053
2014520530.tif 000054
2014520530.tif 000055
2014520530.tif 000056