(57)【要約】本発明は、RNAおよび細胞壁を含む新規の細菌およびマイコバクテリアの組成物、並びにこれらの組成物を製造および使用する方法に関する。これらの組成物は、免疫刺激活性および抗癌活性を有する。本発明は、マイコバクテリアの培養のための合成培地にも関する。
2014502256.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコバクテリアRNA、およびマイコバクテリア細胞壁を含む組成物であって、フェノー
ルまたはプロナーゼを含まないことを特徴とする、組成物。
【請求項２】
無傷のマイコバクテリア細胞をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記RNAは、オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドの形態であり、前記オ
リゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドの長さは、約2〜約4000塩基、約2〜約150塩基または約20〜約40塩基であることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
前記無傷のマイコバクテリア細胞が前記組成物の約0.05重量%〜約95重量％であることを
特徴とする、請求項2に記載の組成物。
【請求項５】
薬学的に許容される担体または送達系をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
以下の逐次的工程を含むことを特徴とする、請求項1に記載の組成物を製造する方法：
A）マイコバクテリア細胞バイオマスを破壊して、破壊されたマイコバクテリア細胞、
無傷のマイコバクテリア細胞、破壊されたマイコバクテリア細胞壁およびRNAを生成する
こと；
B）無傷のマイコバクテリア細胞を、破壊されたマイコバクテリア細胞壁およびRNAから分離すること；並びに
C）破壊されたマイコバクテリア細胞部分の可溶性細胞質成分を前記破壊されたマイコ
バクテリア細胞壁およびRNAから分離して、マイコバクテリア細胞壁、リボ核酸組成物を
得ること。
【請求項７】
前記RNAは、約2〜約4000塩基の長さ、約2〜約150塩基の長さ、または約2〜約40塩基の長
さのオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドの形態であることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
約2〜約150塩基の長さまたは約2〜約40塩基の長さのオリゴリボヌクレオチドおよびポリ
リボヌクレオチドを生成するために十分な温度にて工程B後に無傷のマイコバクテリア細
胞を加熱することをさらに含み、前記無傷のマイコバクテリア細胞は、不活性化されることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
破壊工程Aは、約10,000psi以上での高圧ホモジナイゼーションを含むことを特徴とする、請求項6に記載の方法。
【請求項１０】
前記破壊工程は、前記分離工程BまたはCの前に2〜5回繰り返されることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
【請求項１１】
前記分離工程Cの後に前記破壊工程を2〜5回繰り返すことをさらに含むことを特徴とする
、請求項6に記載の方法。
【請求項１２】
前記分離工程Bは高速遠心であり、かつ前記分離工程Cは高速遠心であることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
【請求項１３】
次の逐次的工程をさらに含むことを特徴とする、請求項6に記載の方法：
工程AおよびBを繰り返して無傷のマイコバクテリア細胞の数を制御すること、並びに、
約2〜約150塩基の長さまたは約2〜約40塩基の長さのオリゴリボヌクレオチドおよびポ
リリボヌクレオチドを得るために十分な温度に、マイコバクテリア細胞壁、リボ核酸組成物を加熱すること。
【請求項１４】
以下を含む、癌を有する動物を治療するための請求項1〜5のいずれかの組成物の使用：
癌を有する動物に、前記動物において癌細胞の増殖を阻害するのに有効な量または癌細胞におけるアポトーシスを誘導するのに有効な量にて、請求項1〜5のいずれかの組成物を投与すること。
【請求項１５】
以下を含む、動物において免疫系を刺激するための請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物の使用：
前記動物に、前記動物において免疫系を刺激するのに有効な量にて、請求項1〜5のいずれかの組成物を投与すること。
【請求項１６】
前記動物において免疫系を刺激することは、造血性の前駆体の分化を刺激すること、サイトカインもしくはケモカインの分泌を増加させること、造血性の成長因子の合成を増加させること、ヌクレオチド結合オリゴマー形成ドメイン2（NOD2）受容体を活性化すること
、またはToll様受容体2（TLR2）受容体を活性化することを含むことを特徴とする、請求
項15に記載の使用。
【請求項１７】
癌治療または免疫刺激治療に対するアジュバントとしての請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１８】
Middlebrook 7H9粉末状培地、グルコース、グリセロール、付加的な鉄、付加的な炭素、
付加的な窒素、および水を含むことを特徴とする、マイコバクテリアの培養のための合成培地。
【請求項１９】
付加的な鉄は、クエン酸鉄アンモニウムであり、付加的な炭素は、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸アンモニウムまたはアスパラギンであり、付加的な窒素は、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸アンモニウムまたはアスパラギンであることを特徴とする、請求項18に記載の合成培地。
【請求項２０】
クエン酸アンモニウム、L-グルタミン酸；ピリドキシン、ビオチン、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、クエン酸鉄アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸亜鉛、オレイン酸、グリセロール、グルコース、および水を含むことを特徴とする、マイコバクテリアの培養のための合成培地。
【請求項２１】
さらにアスパラギンを含むことを特徴とする、請求項20に記載の合成培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌RNAおよび細菌細胞壁を含む新規組成物、並びにこれらの組成物を製造
および使用する方法に関する。これらの組成物は、免疫刺激活性および抗癌活性を有する。
【背景技術】
【０００２】
癌の治療は、臨床的および獣医学的医薬にとって問題であり続ける。今日利用可能な治療法は、外科手術、放射線、化学療法、免疫療法（自己の、および異種の細胞療法を含む）またはこれらの組み合わせを含む。
【０００３】
外科手術は、腫瘍組織が見分けられずかつ取り出されないことによりたいていうまくいかない。放射線および化学療法もまたうまくいかないことが多く、そして治療の副作用は、患者に対する生活の質をたいてい減少させる。外科手術および化学療法は、著しい、かつたいてい非特異的な免疫系の抑制と関連する（Hammer et al., Eur. Surg. Res. , 1992 24:133-137; Joos and Tam, Proc. Am. Thorac. Soc., 2005 2:445-448）。この免疫抑制は、たいてい日和見感染の発生と関連し、高用量全身放射線照射を受けている個人において感染性の合併症の割合が高いことが知られていることによって例証される（Gil et al., Infection、2007 35：421-427）。放射線、外科手術および化学療法は、限定されな
いが白血球減少、好中球減少、血小板減少および／または貧血などの、多系列造血性および骨髄性の抑制（骨髄抑制）とさらに関連する（Montoya. J. Infus. Nurs. 2007 30:168-172）。これらの状態は、患者にとって致命的であり得る。化学療法は、たいてい耐性の存在または耐性のその後の発症によって危ぶまれ、たいてい様々な種類の薬物に及び得る（多種薬剤の耐性）。
【０００４】
癌のための免疫療法は、長年の間使用されている。第1の免疫治療の１つは混合細菌ワ
クチン（Coleyワクチン）であり、その活性成分は細菌リポ多糖体である。規制当局は、
望まれず、かつたいてい毒性作用のために医薬品薬剤からリポ多糖体の存在を制限し、または除去するよう努めることに注意すべきである。より最近では、照射を受けた悪性メラノーマ細胞の混合物が、悪性メラノーマを有する患者における免疫応答を誘導するために使用されており、いくらかの患者における生存を増加させた（Morton、et al. Ann. Surg. 1992, 216：463-482）。免疫療法（イムノセラピー）によって提供される1つの主要な
利益は、一般に外科手術、放射線または化学療法の副作用と伴わないということである。癌を有する患者における樹状細胞免疫療法を使用した3つの研究において、副作用が最低
限から全くなしが報告された（Hsu、et al. Nature Medicine、1996 2：52-58；Murphy、et al. Prostate、1996 29：371-380；Nestle、et al. Nature Medicine、1998、4（3）
：328-332）。
【０００５】
マイコバクテリア細胞壁は、宿主免疫防衛機構（病原体関連分子パターン受容体-PAMP
との相互作用を介する先天性の、および免疫原性分子種の存在を介する後天性の両方）を刺激することが公知である。生存可能なマイコバクテリア全体を使用する免疫療法は、膀胱癌の治療において臨床的に使用される。マイコバクテリア桿菌Calmette- Guerin（BCG
）、ウシ結核菌の減弱された株を、可能な場合、および好ましくは、外科手術による腫瘍除去後のアジュバント状況において、膀胱癌を有する個体の膀胱に繰り返し注入させる（たとえばEuropean Association of Urology Guidelines 2007 edition, 8-9ページに記載されているとおり）。しかし、その使用は、その生存可能な性質に関連したさまざまな有害な副作用と（Koya、et al. J. Urology 2006、175：2004-2010）、並びに特に治療の再発を経験した患者において、しばしば低い臨床的有効性および応答率の持続と関連する（
Witjes and Hendricksen. Eur. Urol. 2008, 53：24-26）。それは、生きているマイコバクテリアを含むので、その他の癌の治療に対する使用は禁忌であり、そして致命的な全身性の感染症を生じさせ得る（Orifice, et al. Tumori 1978、64：437-443）。無傷であるが不活性化されたマイコバクテリアを使用した癌の免疫療法が、マイコバクテリア属であるマイコバクテリウム・バッカエを使用して試みられてきたが、その使用後の決定的な長期生存は臨床的研究において今までに確認されていない（Stanford et al., Eur. J. Cancer 2008、44：224-227を参照されたい）。無傷のマイコバクテリアは、生存可能であろ
うと不活性化されていようと、癌の治療のための免疫療法における最も有効な形を示さないことは、明らかである。
【０００６】
動物腫瘍モデルにおいて、癌に罹患している患者において（米国特許第4,503,048号、
第5,759,554号および第6,326,357号）、並びに細菌およびウイルス感染症などの感染性疾患のための治療として（米国特許第3,172,815号および第4,744,984号）、細菌細胞壁および細菌抽出物を利用する免疫療法は、広範囲に評価されてきた。
【０００７】
免疫刺激活性および抗癌活性を有するマイコバクテリア細胞壁組成物（たとえば米国特許第4,503,048号、第5,759,554号および第6,329,347号またはRibi et al., J. Bacteriol. 1965、91：975-983に記載のとおり）は、有害な化学薬品および外来タンパク質混入の
可能性と共に、これらの調製のために生物学的試薬および材料、化学的試薬、溶媒または希釈剤、並びに酵素処理が必要とされるという不都合に悩まされている。その上、高度に精製したマイコバクテリア細胞壁（長い化学的および酵素的処理後の細胞壁骨格から本質的になる）で最適な抗癌活性を得るために、油乳剤としての製剤が必要とされることが、報告されている（Yarkoni and Rapp、Cancer Res., 1979 39：535-7）。マイコバクテリ
ア細胞壁を含む油乳剤は、たいてい物理的に不安定であり、かつ再現的に調製するのが困難であり、また過敏性反応を誘導するという周知の可能性のため、レシピエントに毒性であり得る。免疫療法活性および抗癌活性の両方を有し、かつ油の存在に依存しない、生物活性な複合型DNAを含むマイコバクテリア細胞壁もまた記述されているが（米国特許第6,326,357）、これらもまた、有害な化学薬品および外来タンパク質混入の可能性と共に、これらの調製のために化学的および酵素的な処理が必要とされるという不都合に悩まされている。加えて、このような組成物を使用する場合に、免疫療法活性または抗癌活性のどちらかを優先的に最適化することが可能であることは証明されていない。
【０００８】
少ない容積の試料および平方インチあたり40,000-45,000ポンドの高圧（PSI、276-317mPaと同等）にて冷蔵された圧力セル（Sorvall圧力セルなど）を使用して微生物の破壊を
達成することができることは、当業者によって認識されている（Ribi et al., J. Bacterial.、1966、91：975-983を参照されたい）。このようなプロセスは、時間を消費し、非
効率的で、および低容積におけるものであり、そしてまた、この種の設備が現在入手不可能であることによって妨げられる。高圧ホモジナイゼーションを使用する、より効率的なプロセスは、遺伝的に操作された微生物からのタンパク質（封入体として）の単離について記述されている（Peternel and Komel: Isolation of biologically active nanomaterial [inclusion bodies] from bacterial cells. Microbial Cell Factories 2010 9:66
を参照されたい）。しかし、グラム陽性生物がそのペプチドグリカン含量および構造の長所によってこのようなプロセスに耐性であることは、当業者によって認識されている（Diels and Michaels: High pressure homogenization as a non-thermal technique for the inactivation of microorganisms. Crit. Rev. Microbiol., 2006; 32:201-216を参照
されたい）ホモジナイゼーション回数の数を最小限にする技術の使用もまた、当業者によって教示されている（Bailey et al., Improved homogenization of recombinant Escherichia coli following pretreatment with guanidinium chloride: Biotech. Prog., 1995; 11:533-539を参照されたい）。このような手順の使用は、実際には、明らかに細胞壁
断片を取り除くように設計されており、これらを保存するためではない。高圧破壊技術を
使用するDNAなどの核酸の存在は、保存されず除去されるべき混入物質としてさらに教示
される（Rathore et al., Analysis for residual host cell proteins and DNA in process streams of a recombinant protein product expressed in Escherichia coli cells: J. Pharm. Biomed. Anal., 2003; 32:1199-1211を参照されたい）。計測可能な数mLか
ら多リットルの容積の範囲の作業用容積を使用し、新たな細菌核酸および細胞壁組成物の効率的な生産をもたらす、新たな細菌核酸組成物の調製のための新たな手順が要求される。
【０００９】
マイコバクテリア細胞壁およびその成分は、マクロファージ、単球および樹状細胞を刺激し活性化して生物活性分子を産生させることができ、生物活性分子は、免疫系の応答性細胞を惹起し、促進し、増幅し、および刺激して、その結果免疫刺激効果を達成することができることが知られている。これらの生物活性分子は、造血性および骨髄性の増殖因子、サイトカインおよびケモカインを含むが、限定されない。
【００１０】
増殖因子は、細胞表面上の受容体に結合して、主に細胞の増殖および／または分化を活性化するタンパク質である。サイトカインは、調節性タンパク質の独特のファミリーである。サイトカインは、限定されないが白血球などの免疫系の細胞から主に分泌され、細胞間メディエーターとして作用して、液性および細胞性免疫応答、並びに食作用性細胞の活性化を刺激する。リンパ球から分泌されるサイトカインはリンホカインと称されるのに対し、単球またはマクロファージによって分泌されるものはモノカインと称される。リンホカインの多くはインターロイキン（IL）としても知られ、その理由は、これらは白血球によって分泌されるだけでなく、白血球の細胞応答に影響を及ぼすこともできるからである。ケモカインは、特に感染に対する応答において、白血球を誘引および活性化する能力を有するサイトカインの種類である（化学走性といわれるプロセス）。これらは、共有するシステインモチーフにおけるバリエーションに従って、少なくとも3つの構造的な部門に
分けることができる：c（ケモカイン、c）、cc（ケモカイン、cc）、およびcxc（ケモカ
イン、cxc）（Johrer et al. Exp. Opin. Biol. Ther. 2008 8:269-290）。これらの造血性および骨髄性の増殖因子、サイトカイン、並びにケモカインを産生する役割を果たす免疫系細胞の産生に対する、化学療法剤または放射線治療の有害な効果は、日和見感染に対する罹病性の増加をもたらす。
【００１１】
癌（100以上の疾患がある）は、異型細胞の異常な正味の蓄積であり、無制御の細胞分
裂、アポトーシスの不全もしくは欠陥、または二者の組み合わせにより生じる。限定されないがFas、TNFR1およびp53/p21などのアポトーシス関連の遺伝子における突然変異は、
それぞれ癌の病原性に関係している（Levine, A. Cell 88：323-331, 1997; Fisher, D. Cell 78:529-542, 1994）。異常なアポトーシスは、癌の病原性に対してだけでなく、多
くの抗癌療法に対する癌の耐性の可能性にもまた重要である。
【００１２】
アポトーシス誘導に対する耐性は、治療不全のかなりの部分を説明し得る1つである、
多剤耐性（MDR）の重要なカテゴリーとして浮かび上がってきた。MDR、構造的および機能的に無関係な種類の化学療法剤に対する同時耐性は、先天性および後天性の両者であり得る。すなわち、いくつかの癌は、治療に必ず応答しないが、その他の癌は、最初は治療に感受性であり、その後耐性クローンの選択を介して薬物耐性を発症する。化学療法剤は、それらの治療効果について、癌細胞におけるアポトーシスの誘導に主に依存するので、薬物耐性は、化学療法剤の有効性を減少させ、直接的または間接的にアポトーシスの減少を引き起こし、種々の癌における不十分な臨床的予後と一般に関連している。
【００１３】
従来技術の抗癌剤は、臨床適用のために十分ではないことが判明している。これらの薬剤の多くは、非効率的（Bischoff et al. Science 274:373-376, 1996）または中毒性で
あり、有意な副作用を有し（Lamm et al. Journal of Urology 153:1444-1450, 1995）、
薬物耐性または免疫感作および過敏性応答の発症をもたらし、そしてレシピエントを衰弱させる。
【００１４】
したがって、免疫系の応答性細胞を刺激して、サイトカイン、ケモカイン、並びに造血性および骨髄性の増殖因子を産生し、癌細胞の増殖を阻害し、そして癌細胞におけるアポトーシスを誘導する、新規の治療的組成物に対する需要がある。これらの治療的組成物は、これら自体が抗癌剤として有用であり、並びにその他の抗癌剤に関してアジュバント活性を有しているべきである。この治療的組成物は、癌、外科手術、放射線または化学療法と関連した骨髄抑制の予防または治療において有用であるべきである。その上、このような治療的組成物は、調製することが簡単であり、かつ比較的安価であるべきであり、その活性は、調製の際に再現可能であるべきであり、その活性は、長時間安定のままであるべきであり、そしてその癌細胞に対する効果は、最小限の有害な反応性および毒性を伴う用法で達成可能であるべきである。加えて、効率的であり、かつこれらの調製の際に使用される酵素または化学物質が存在しないこととなる、新規の治療的組成物を製造する方法に対する需要がある。
【００１５】
また、自己免疫疾患、炎症性もしくは感染性の疾患、骨髄抑制または造血性および骨髄性の異常を治療し、予防し、軽減し、または改善する新規の治療的組成物に対する需要もある。治療的組成物は、その他の治療的薬剤と共にアジュバントとして有用であるべきである。その上、このような治療的組成物は、調製することが簡単であり、かつ比較的安価であるべきであり、調製の際にその活性が再現可能であるべきであり、その活性は、長時間安定のままであるべきであり、そしてその効果は、最小限の毒性を伴う用法で達成可能であるべきである。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、細菌またはマイコバクテリア由来のリボ核酸（RNA）および細胞壁（本明細
書においてRNCとして定義される）を含む新規組成物を提供することによって、上記の需
要を満たす。本発明は、細菌リボ核酸（RNA）および細菌細胞壁（BRNCとして定義される
）を含む新規組成物、並びにこれらの組成物を製造し、および使用する方法を提供することによって、上記の需要を満たす。本発明はまた、マイコバクテリアRNAおよびマイコバ
クテリア細胞壁（MRNCとして定義される）を含む新規組成物、並びにこれらの組成物を製造し、および使用する方法を提供することによって、上記の需要を満たす。これらの新規組成物は、オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドの形態の細菌またはマイコバクテリアのRNAであって、一本鎖（ss）、二本鎖（ds）または一本鎖−二本鎖ハイブ
リッド鎖（hs）として存在することができ、細菌またはマイコバクテリアから単離されたRNAと、細菌またはマイコバクテリアの細胞壁とを含み、RNAは、薬学的に許容される媒体中に製剤化され、または薬学的に許容される担体系に複合体化される（ここで、用語複合体は、2つ以上の分子種の化学的会合を記述するために使用される）。当業者に公知の医
薬品担体系を使用することができるが、一つの態様において、担体系は細菌細胞壁またはマイコバクテリア細胞壁に基づいている。本発明の組成物はまた、無傷の細菌またはマイコバクテリア細胞を含んでもよく、その含量は所望の治療目的のために選択される。
【００１７】
本発明の組成物は、抗癌活性を有する。本発明の組成物はまた、免疫系刺激活性を含む。本発明の組成物はまた、その他の治療法のアジュバントとして作用する。
【００１８】
これらの新規組成物を記述するために、本出願において3つの異なる名前が使用される
。最初に、用語細菌RNA組成物（BRNC）は、細菌の異なる種から製造される組成物を記述
するために一般に使用される。BRNCは、本明細書において開示される方法で、異なるグラム陰性細菌またはグラム陽性細菌から調製されてもよい。第2に、用語マイコバクテリアRNA組成物（MRNC）は、異なるマイコバクテリアから製造される組成物を記述するために使
用される。異なる態様において、MRNCは、任意のマイコバクテリアから調製されてもよい。第3に、その他の態様において、特異的マイコバクテリア種、マイコバクテリア複合物
またはマイコバクテリア株を使用してMRNCを調製する。例には、これらに限定されないが、本明細書において開示される方法でトリ結核菌（Mycobacterium avium）（一般にMAPといわれる、亜種副結核菌を含む）、ウシ結核菌BCG（Mycobacterium bovis BCG）、チモテ菌（Mycobacterium phlei）、マイコバクテウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）、またはマイコバクテウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）である。本明細書において記述した組成物を製造する方法を、詳細な説明および実施例において記述したもの以外のマイコバクテリア由来のMRNCの製造に適用できることは、当業者によって認識されるだろう。
【００１９】
用語マイコバクテリアRNA組成物（MpRNC）は、チモテ菌から製造されるRNAおよび細胞
壁を含む組成物を記述するために使用される。用語ウシ結核菌BCG RNA組成物（MbRNC）、マイコバクテウム・スメグマチスRNA組成物（MsRNC）、トリ結核菌亜種副結核菌（MAP）RNA組成物（MapRNC）およびマイコバクテウム・バッカエRNA組成物（MvRNC）は、それぞれ、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌およびマ
イコバクテウム・バッカエから製造されるRNAおよび細胞壁を含む組成物を記述するため
に使用される。各組成物、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCにおいて、RNAは、オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドを効率的な生産をもたらす手
順を使用して、マイコバクテリアから単離される。
【００２０】
もう一つの態様において、各MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCまたはMvRNCはまた、種々の量の無傷のマイコバクテリア細胞を含んでもよい。無傷の細胞は、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCまたはMvRNC内に、およそ0〜99重量%、0.05〜95重量%、0.07〜50重
量%、0.1〜20重量%もしくは0.19〜19重量％の量、またはこれらの範囲内のいずれかの量
、または0.75重量%未満もしくは0.2重量%未満において、存在してもよい。
【００２１】
もう一つの態様において、これらの新規組成物は、2〜4000塩基の長さのオリゴリボヌ
クレオチドおよびポリリボヌクレオチドの形態で、RNA成分（総核酸成分のおよそ30%から100%までの範囲であり得る）を有する。もう一つの態様において、これらの新規組成物は、2〜150塩基の長さのオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドの形態で、オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチド成分（総核酸成分のおよそ30〜100%）を有する。さらにもう一つの態様において、これらの新規組成物は、150または151〜4000塩基の長さより大きいオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドの形態で、オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチド成分（総核酸成分のおよそ30〜100%）を有する。もう一つの態様において、これらの新規組成物は、主に20〜40塩基の長さのオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドの形態で、オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチド成分（総核酸成分のおよそ30〜100%）を有する。
【００２２】
本組成物の抗癌活性は、無傷のマイコバクテリア細胞の含量が最小限であるときに、最大となる。免疫刺激活性は、無傷のマイコバクテリア細胞の含量が5〜50%w/wの範囲であ
るときに、最大となる。無傷のマイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバ
クテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌またはマイコバクテウム・バッカエ細胞の所望の含量は、実施例において詳述される製造プロセスを制御することによって、またはMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCもしくはMvRNCに無傷のマイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌もし
くはマイコバクテウム・バッカエ細胞を添加することによって、達成することができる。MRNCは、1つのマイコバクテリア種、株、亜株もしくは複合物から調製される組成物とし
て単独で、またはその他のマイコバクテリア種、株、亜株もしくは複合物からのMRNCと組み合わせて使用されてもよい。たとえば、MpRNCおよびMvRNCの組み合わせは、免疫刺激お
よびサイトカイン誘導のために最適なNOD2およびTLR2活性化を与えるであろう。同様に、MpRNCおよびMvRNCの組み合わせは、最適な抗癌活性および免疫刺激を与えるであろう。
【００２３】
これらの新たな組成物は、免疫刺激活性、抗癌活性、並びに造血性および骨髄性の幹細胞増殖因子刺激活性を有する。従来技術の標品とは対照的に、これらの新たな組成物は、オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチド（限定されないが一本鎖（ss）、二本鎖（ds）またはその混合物など）を含み、意図した目的に適した無傷のマイコバクテリアレベルを含む。また、従来技術とは対照的に、合成薬剤の組み合わせが必要とされる場合（Uehara et al., Muramyldipeptide and diaminopimelic acid-containing desmuramylpeptides in combination with chemically synthesized Toll-like receptor agonists
synergistically induced production of interleukin-8 in a NOD2- and NOD-dependent manner, respectively, in human monocytic cells in culture: Cell. Microbiol., 2005; 7:53-61）、これらの新たな組成物は、ヌクレオチド結合オリゴマー形成ドメイン2
（NOD2）およびToll様受容体2（TLR2）受容体の両方を活性化する能力を有し、したがっ
て、免疫系の刺激のために有用である免疫系受容体に対し予想外の二機能性アゴニスト活性を示し、造血性および骨髄性の幹細胞増殖を刺激し、そして予防的または治療的な治療法の両方において癌を治療する。異なる態様において、これらの組成物は、動物の免疫系の応答性細胞における応答を誘導するのに、細胞周期停止またはアポトーシスを誘導するのに、および細胞の増殖を阻害するのに有効である。これらの組成物は、免疫系の応答性細胞を誘導し、サイトカイン、ケモカイン、並びに造血性および骨髄性の幹細胞増殖因子を産生させる。
【００２４】
MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCは、調製するのが比較的安価であると共に、これらの活性は調製の際に再現可能である。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC
およびMvRNCは、長時間、および最小限の毒性を伴う用法にて、安定かつ有効なままであ
る。
【００２５】
本発明の一つの態様において、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCは、以下のように、それぞれマイコバクテリアまたはチモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテ
ウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌またはマイコバクテウム・バッカエから調製される：マイコバクテリアを増殖させて、収集する。マイコバクテリアは、必要に応じて高圧ホモジナイゼーション、続いて必要に応じていくらかの残留する無傷のマイコバクテリア細胞を除去するための遠心分離プロセスの利用により無傷のマイコバクテリアを破壊して取り除く。重要なことに、RNaseフリーおよびまたは非特異的ヌクレアーゼフリー
の試薬を使用して、RNCの回収を最適化する。
【００２６】
必要に応じて低い相対遠心力を使用して、無傷のマイコバクテリアを取り除く。次いで、オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドを従来の抽出技術、たとえばグアニジウムチオシアナート-フェノール-クロロホルム抽出を使用して単離することができ、または高い相対遠心力を、無傷のマイコバクテリアの除去後の上清に適用して、細胞破壊後にマイコバクテリア細胞壁と共に調製されて残ったオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドを単離する。重要なことは、ヌクレアーゼ混入（非特異的エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼ）を含まない試薬を使用して、RNA分解を排除し、または最小限にし、これにより調製工程での収率を最適化する。
【００２７】
MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCは、限定されないが、悪性、自己免疫性および免疫不全症疾患、骨髄抑制、並びに造血性および骨髄性の異常を含む種々の疾患を予防し、治療し、影響を緩和し、および無くすのに有効な治療的薬剤である。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCは、癌などの、望ましくなくかつ制御されていない細胞増殖によって媒介される疾患およびプロセスを治療するために、特に有用である。
これらの組成物はまた、その他の抗癌剤の有効性を増強するアジュバントとして有効である。このような抗癌剤は、限定されないが、薬物、免疫刺激薬、抗原、抗体、ワクチン、放射線、化学療法剤、遺伝的、生物学的に操作された、および化学的に合成された薬剤、並びに活性化または不活性化のための細胞死分子を標的とする薬剤、癌細胞の増殖を阻害する薬剤、並びに癌細胞におけるアポトーシスを誘導する薬剤を含む。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCはまた、癌の治療または癌それ自体に伴う骨髄抑制（単球減少およびまたは好中球減少）の予防または治療のために、並びに薬物または限定されないが、後天性免疫不全症候群（AIDS）、骨髄異形成症候群、自己免疫疾患、末期腎臓疾患もしくはウイルス感染などの疾患に関連した種々の造血性および骨髄性の異常の予防または治療のために有効である。
【００２８】
MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCまたはMvRNCは、薬学的に許容される担体中で、免疫系の応答性細胞における応答を刺激し、および応答性細胞において増殖を阻害してアポトーシスを誘導するために有効な用量にて、動物またはヒトに投与されてもよい。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCまたはMvRNCは、限定されないが、水性製剤中の懸濁液、クリームおよびゲル中に、油またはその他の疎水性液剤中の乳化によって、リポソームにおける封入、並びに天然もしくは人工の担体と、組織もしくは細胞特異的なリガンドと、または組織もしくは細胞特異的抗体との複合体形成などの方法によって投与することができる。
【００２９】
一つの態様において、本発明は、BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCまたはMvRNCを含む新規組成物およびこれらの組成物を製造する方法を提供する。
【００３０】
もう一つの態様において、本発明は、マイコバクテリア細胞塊の製造のための培養培地における炭素、窒素および鉄の供与源の含量を最適化する、BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCまたはMvRNC組成物の調製のための新規の製造手順を提供する。
【００３１】
もう一つの態様において、本発明は、増殖するマイコバクテリア細胞塊のために有用な新規の合成培地を提供する。
【００３２】
さらにもう一つの態様において、本発明は、培養培地における炭素、窒素および鉄の含量を最適化し、およびマイコバクテリア細胞塊の製造のための外来性生物学的材料の要求を排除し、および下流の製造手順の間の外来性生物学的または化学的な薬剤の使用を無くす、BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCまたはMvRNC組成物の調製のための新規の製造手順を提供する。
【００３３】
さらにもう一つの態様において、本発明は、薬学的に許容される担体における、新規の治療的なBRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCまたはMvRNCを提供する。
【００３４】
さらなる態様において、本発明は、BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCまたはMvRNCを含む治療的組成物、およびこれらの治療的組成物を使用して動物またはヒトの応答性細胞における治療的応答を誘導する方法を提供する。
【００３５】
もう一つの態様において、本発明は、動物またはヒトにこれらの治療的組成物を投与することによって免疫系の応答性細胞を刺激する方法を提供する。
【００３６】
さらにもう一つの態様において、本発明は、動物またはヒトにこれらの治療的組成物を投与することによって、免疫系の応答性細胞を刺激して、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、並びに／または造血性および骨髄性の増殖因子などの生物活性分子を生じさせる方法を提供する。
【００３７】
さらなる態様において、本発明は、動物またはヒトにこれらの治療的組成物を投与することによって、動物またはヒトにおける疾患を治療するために有効である方法を提供する。
【００３８】
さらにもう一つの態様において、本発明は、動物またはヒトにこれらの治療的組成物を投与することによって、動物またはヒトにおける癌を治療するために有効である方法を提供する。
【００３９】
もう一つの態様において、本発明は、動物の応答性細胞の増殖を阻害する組成物および方法を提供する。
【００４０】
もう一つの態様において、本発明は、動物の応答性細胞におけるアポトーシスを誘導する組成物および方法を提供する。
【００４１】
さらにもう一つの態様において、本発明は、その他の抗癌療法に対するアジュバントとして有効である組成物および方法を提供する。
【００４２】
さらにもう一つの態様において、本発明は、その他の免疫刺激療法に対するアジュバントとして有効である組成物および方法を提供する。
【００４３】
さらなる態様において、本発明は、免疫不全症の治療のために有効である組成物および方法を提供する。
【００４４】
さらにもう一つの態様において、本発明は、骨髄抑制（白血球減少、好中球減少、血小板減少もしくは貧血）または造血性および骨髄性の異常の治療または予防のために有効である組成物および方法を提供する。
【００４５】
さらにもう一つの態様において、本発明は、骨髄抑制または造血性および骨髄性の異常の予防または治療のためのその他の療法に対するアジュバントとして有効である、組成物および方法を提供する。
【００４６】
もう一つの態様において、本発明は、動物またはヒトにこれらの治療的組成物を投与することによって、動物またはヒトにおける自己免疫疾患を治療するために有効である方法を提供する。
【００４７】
さらにもう一つの態様において、本発明は、組成物における化学物質または酵素の存在を生じない製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００４８】
これらおよびその他の本発明の目的、特徴および利点は、以下の開示された実施例の詳細な記述および添付の特許請求の範囲を見れば、明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１−１】チモテ菌（a）、MCWE（b）、MCC（c）、低MpRNC（d）、中間MpRNC （e）および高MpRNC（f）の透過型電子顕微鏡写真（TEM）。バーは、（a）、（b）および（c）については1μm、並びに（d）、（e）および（f）については2μmである。
【図１−２】チモテ菌（a）、MCWE（b）、MCC（c）、低MpRNC（d）、中間MpRNC （e）および高MpRNC（f）の透過型電子顕微鏡写真（TEM）。バーは、（a）、（b）および（c）については1μm、並びに（d）、（e）および（f）については2μmである。
【図２ａ】核酸オリゴヌクレオチド長さの電気泳動的解析。（a）RNAナノ6000キットを使用するRNAラダー標準およびオートクレーブ前の中間MpRNC。（b）small RNAキットを使用するオートクレーブ後の様々な比率のオートクレーブ処理したチモテ菌細胞を含むMpRNC（高MpRNC、低MpRNCまたはおよび中間MpRNC）（4つのヌクレオチドのピークは、内部オリゴヌクレオチド標準であり、MpRNCにおける核酸と関連していない。FU =蛍光単位、nt=ヌクレオチド長さ
【図２ｂ】核酸オリゴヌクレオチド長さの電気泳動的解析。（a）RNAナノ6000キットを使用するRNAラダー標準およびオートクレーブ前の中間MpRNC。（b）small RNAキットを使用するオートクレーブ後の様々な比率のオートクレーブ処理したチモテ菌細胞を含むMpRNC（高MpRNC、低MpRNCまたはおよび中間MpRNC）（4つのヌクレオチドのピークは、内部オリゴヌクレオチド標準であり、MpRNCにおける核酸と関連していない。FU =蛍光単位、nt=ヌクレオチド長さ
【図３】RNase A処理の前後に決定される、様々な比率のオートクレーブ処理した無傷のチモテ菌細胞（(a) 高、(b） 低または(c) 中間）およびオートクレーブ処理したチモテ菌（d）を含むMpRNCにおけるRNAおよびDNA含量。
【図４】MpRNC、MbRNC、MsRNCおよびMvRNCにおけるRNase感受性の核酸（NA）。（a）：抽出された対照処理およびRNase処理した核酸の尿素-PAGEゲル電気泳動;(b)：走査型デンシトメトリーによって決定される、抽出された核酸におけるRNAの比率。
【図５】中間MpRNCのミコール酸プロファイル。(a)：抽出可能な脂質の定量化のためのベヘン酸標準を用いたミコール酸プロファイル;(b)：けん化性脂質の定量化のための、低および高ミコール酸炭素数の標準（〜C40および〜C110であると見積もられる）を使用したミコール酸プロファイル。
【図６】マイコバクテリアRNCによるNOD2活性化。NOD2を発現しているHEK293細胞を使用して、4つのマイコバクテリア種―チモテ菌、ウシ結核菌株BCG、マイコバクテウム・スメグマチスおよびマイコバクテウム・バッカエ―から調製されるRNCのNOD2アゴニスト活性を決定した。NOD2活性化は、NF-B駆動の分泌型胚性アルカリホスファターゼ（SEAP）誘導を生じる。細胞培養上清におけるSEAPによる基質の加水分解の後、酵素活性は、630nmにおけるO.D.として現れ、NOD2活性と比例する。3回の決定の平均。
【図７】マイコバクテリアRNCによるTLR2活性化。TLR2受容体を発現しているHEK293細胞を使用して、4つのマイコバクテリア種―チモテ菌、ウシ結核菌株BCG、マイコバクテウム・スメグマチスおよびマイコバクテウム・バッカエ―から調製されるMRNCのTLR2アゴニスト活性を決定した。TLR2活性化は、NF-κB駆動SEAP誘導を生じる。細胞培養上清におけるSEAPによる基質の加水分解の後、酵素活性は、630nmにおけるO.D.として現れ、NOD2活性化と比例する。3回の決定の平均。
【図８】オートクレーブ処理した無傷のチモテ菌の様々な比率を含む中間MpRNC による、ヒト末しょう血単核細胞（PBMC）におけるIL-10およびIL-12産生の刺激。MpRNCおよびオートクレーブ処理したチモテ菌で処理した後のヒトPBMCによるIL-10およびIL-12p40サブユニット産生は、ELISAによって決定した。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明は、細菌またはマイコバクテリア由来のリボ核酸（RNA）および細胞壁（本明細
書においてRNCとして定義される）を含む新規組成物を提供する。本発明は、細菌RNAおよび細菌細胞壁（BRNCとして定義される）を含む新規組成物、並びにこれらの組成物を製造し、および使用する方法を提供する。本発明はまた、マイコバクテリアRNAおよびマイコ
バクテリア細胞壁（MRNCとして定義される）を含む新規組成物、並びにこれらの組成物を製造し、および使用する方法を提供する。これらの組成物は、担体および／または細胞と共に製剤化させることができる。これらの新規組成物は、細菌またはマイコバクテリア由来の細胞壁、並びに細菌またはマイコバクテリアRNA由来のオリゴリボヌクレオチドおよ
びポリリボヌクレオチドの形態のRNAを含み、オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌ
クレオチドは、一本鎖（ss）、二本鎖（ds）または一本鎖−二本鎖ハイブリッド鎖（hs）
として存在することができる。これらの組成物は、薬学的に許容される媒体中に製剤化すること、または薬学的に許容される担体系に複合体化することができる（ここで、用語複合体は、2つ以上の分子種の化学的会合を記述するために使用される）。本発明の組成物
はまた、無傷の細菌またはマイコバクテリア細胞を含んでもよく、その含量は所望の治療目的のために最適化される。
【００５１】
これらの新たな組成物は、免疫刺激活性、抗癌活性、並びに造血性および骨髄性の幹細胞増殖因子刺激活性を有する。従来技術の標品とは対照的に、これらの新たな組成物は、オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチド（限定されないが、一本鎖（ss）、二本鎖（ds）またはその混合物など）を含み、任意に、意図した目的に適した無傷のマイコバクテリアの選択されたレベルを含む。また、従来技術とは対照的に、合成薬剤の組み合わせが必要とされる場合（Uehara et al., Muramyldipeptide and diaminopimelic acid-containing desmuramylpeptides in combination with chemically synthesized Toll-like receptor agonists synergistically induced production of interleukin-8 in a NOD2- and NOD-dependent manner, respectively, in human monocytic cells in culture: Cell. Microbiol., 2005; 7:53-61）、これらの新たな組成物は、ヌクレオチド結合オリゴマー形成ドメイン2（NOD2）およびToll様受容体2（TLR2）受容体の両方を活性化する能力を有し、したがって、免疫系の刺激のために有用である免疫系受容体に対し予想外の二機能性アゴニスト活性を示し、造血性および骨髄性の幹細胞増殖を刺激し、そして予防的または治療的な治療法の両方において癌を治療する。異なる態様において、これらの組成物は、動物の免疫系の応答性細胞における応答を誘導するのに、細胞周期停止またはアポトーシスを誘導するのに、および細胞の増殖を阻害するのに有効である。これらの組成物は、免疫系の応答性細胞を誘導して、サイトカイン、ケモカイン、並びに造血性および骨髄性の幹細胞増殖因子を産生させる。
【００５２】
MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCは、限定されないが、悪性、自己免疫性および免疫不全症疾患、骨髄抑制、並びに造血性および骨髄性の異常を含む種々の疾患を予防し、治療し、影響を緩和し、および無くすのに有効な治療的薬剤である。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCは、癌などの、望ましくなくかつ制御されていない細胞増殖によって媒介される疾患およびプロセスを治療するために、特に有用である。これらの組成物はまた、その他の抗癌剤の有効性を増強するアジュバントとして有効である。このような抗癌剤は、薬物、免疫刺激薬、抗原、抗体、ワクチン、放射線、化学療法剤、遺伝的、生物学的に操作された、および化学的に合成された薬剤、並びに活性化または不活性化のための細胞死分子を標的とする薬剤、癌細胞の増殖を阻害する薬剤、並びに癌細胞におけるアポトーシスを誘導する薬剤を含むが、限定されない。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCはまた、癌の治療または癌それ自体に伴う骨髄抑制（単球減少およびまたは好中球減少）の予防または治療のために、並びに薬物または限定されないが、後天性免疫不全症候群（AIDS）、骨髄異形成症候群、自己免疫疾患、末期腎臓疾患もしくはウイルス感染などの疾患に関連した種々の造血性および骨髄性の異常の予防または治療のために有効である。
【００５３】
MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCまたはMvRNCは、薬学的に許容される担体中で、免疫系の応答性細胞における応答を刺激し、および応答性細胞において増殖を阻害してアポトーシスを誘導するために有効な用量にて、動物またはヒトに投与されてもよい。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCまたはMvRNCは、限定されないが、水性製剤中の懸濁液、クリームおよびゲル中に、油またはその他の疎水性液剤中の乳化によって、リポソームにおける封入、並びに天然もしくは人工の担体と、組織もしくは細胞特異的なリガンドと、または組織もしくは細胞特異的抗体との複合体形成などの方法によって投与することができる。
【００５４】
＜定義＞
用語製造プロセスの最適化は、それによって、マイコバクテリア細胞集合を得るための発酵において、適切な炭素、窒素および鉄の成分がある培養培地が利用され、マイコバクテリア細胞塊の収量の改善を生じるプロセスを記述するために使用される。
用語製造プロセスの最適化はまた、マイコバクテリア細胞壁組成物の製造における化学物質または酵素の使用の要求を無くすことをいう。
【００５５】
本出願において、3つの異なる名前が、これらの新規組成物を記述するために使用され
る。最初に、用語細菌RNA組成物（BRNC）は、種々の種類の細菌から製造される組成物を
記述するために一般に使用される。BRNCは、本明細書において開示される方法で、異なるグラム陰性またはグラム陽性細菌から調製されてもよい。第2に、用語マイコバクテリアRNA組成物（MRNC）は、異なるマイコバクテリアから製造される組成物を記述するために使用される。異なる態様において、MRNCは、任意のマイコバクテリアから調製されてもよい。第3に、その他の態様において、特異的マイコバクテリア種、マイコバクテリア複合物
またはマイコバクテリア株を使用してMRNCを調製する。例には、これらに限定されないが、本明細書において開示される方法でトリ結核菌（一般にMAPといわれる、亜種副結核菌
を含む）、ウシ結核菌BCG、チモテ菌、マイコバクテウム・スメグマチスまたはマイコバ
クテウム・バッカエである。本明細書において記述した組成物を製造する方法を、詳細な説明および実施例において記述したもの以外のマイコバクテリア由来のMRNCの製造に適用できることは、当業者によって認識されるであろう。
【００５６】
用語マイコバクテリアRNA組成物（MpRNC）は、チモテ菌から製造されるRNAおよび細胞
壁を含む組成物を記述するために使用される。用語ウシ結核菌株BCG RNA組成物（MbRNC）、マイコバクテウム・スメグマチスRNA組成物（MsRNC）、トリ結核菌亜種副結核菌（MAP
）RNA組成物（MapRNC）およびマイコバクテウム・バッカエRNA組成物（MvRNC）は、それ
ぞれ、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌およ
びマイコバクテウム・バッカエから製造されるRNAおよび細胞壁を含む組成物を記述する
ために使用される。各組成物、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCにおいて、RNAは、オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドの効率的な生産をもたら
す手順を使用して、マイコバクテリアから単離される。
【００５７】
用語マイコバクテリアRNA組成物（MRNC）は、種々のマイコバクテリアから製造される
組成物を記述するために使用される。異なる態様において、MRNCは、任意のマイコバクテリアから調製されてもよい。その他の態様において、特異的マイコバクテリア種、マイコバクテリア複合物またはマイコバクテリア株を使用してMRNCを調製する。具体例は、これらに限定されないが、本明細書において開示される方法におけるトリ結核菌（一般にMAP
という亜種副結核菌を含む）、ウシ結核菌BCG、チモテ菌、マイコバクテウム・スメグマ
チスまたはマイコバクテウム・バッカエである。本明細書において記述した組成物を製造する方法が、詳細な説明および実施例において記述したもの以外のマイコバクテリア由来の細胞壁組成物の製造に適用できることは、当業者によって認識されるだろう。
【００５８】
用語チモテ菌RNA組成物（MpRNC）は、チモテ菌から製造される組成物を記述するために使用される。用語ウシ結核菌株BCG RNA組成物（MbRNC）、マイコバクテウム・スメグマチスRNA組成物（MsRNC）、トリ結核菌亜種副結核菌（MAP）RNA組成物（MapRNC）およびマイコバクテウム・バッカエRNA組成物（MvRNC）は、それぞれ、ウシ結核菌BCG、マイコバク
テウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌およびマイコバクテウム・バッカエから製造される組成物を記述するために使用される。各組成物、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC
、MapRNCおよびMvRNCにおいて、RNAは、オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドの効率的な生産をもたらす手順を使用して、マイコバクテリアから単離される。
【００５９】
本明細書で定義されるように、マイコバクテリア培養培地組成物（MCMC）は、マイコバクテリア細胞塊を調製するために使用される、最適化された炭素、窒素および鉄の供与源を含む新規の合成培養培地をいい、培地の炭素、窒素および鉄の含量は、炭素が最適に利用され、かつマイコバクテリアのウェット細胞塊収率が最適であるようになっている。
【００６０】
本明細書で定義されるように、培養は、マイコバクテリア細胞塊を産生するプロセスをいい、マイコバクテリアは、限定されないが、細菌またはマイコバクテリアの最適な分裂を保証するうち培養される。当業者に公知の設備および培養条件が使用されてもよい。
【００６１】
本明細書で定義されるように、下流の処理または製造は、培養によって調製されるマイコバクテリア細胞塊を回収し、高圧ホモジナイゼーション、分画遠心分離法および熱処理の適切な組み合わせを使用することによってRNA含有組成物またはRNA含有細胞壁組成物を製造するプロセスをいう。本発明の範囲または教示を逸脱しない範囲で、高圧ホモジナイゼーションに対する効果に相当する、当業者に公知の技術を使用してもよい。
【００６２】
本明細書で定義されるように、細菌細胞壁は、細胞壁分子成分を含む細菌界のメンバー由来の細胞壁をいい、少なくともこれらの分子は、ペプチドグリカンと一般に呼ばれる多糖およびアラニン（ALA）含有ペプチド鎖を含む。
【００６３】
本明細書で定義されるように、マイコバクテリア細胞壁は、少なくともペプチドグリカンおよびミコール酸を含むマイコバクテリア科およびマイコバクテリア属のメンバーから調製される任意の細胞壁組成物をいい、ペプチドグリカンは、［N-アセチルグルコサミン-N-アシルムラミン酸］nのリピート単位からなる重合体で構成され、N-アシルは、N-アセチルまたはN-グリコリルのどちらかであり、重合体がペプチドブリッジによって連結され、そしてミコール酸は、α-置換されβ-ヒドロキシル化された非常に長い長鎖脂肪酸である。これらのペプチドブリッジの完全なアミノ酸組成物は、異なるマイコバクテリア種およびこれらの株の間で高度に保存されており、当業者に公知であるが、たいていジアミノピメリン酸（DAP）を含み、そして知られる限り、乳酸部分を介してN-アシルムラミン酸
に連結されるアラニン（ALA）を常に含む。ミコール酸のタイプは、個々のマイコバクテ
リア種に特異的であり、分子の長さ（〜60-90炭素原子の範囲）に依存して複数のクラス
ターに細分される。
【００６４】
本明細書で定義されるように、外来性混入は、限定されないが、従来、細菌またはマイコバクテリア由来の組成物の製造（細菌またはマイコバクテリア細胞バイオマスおよび細菌またはマイコバクテリア細胞壁組成物の調製を含む）において使用されるタンパク質、生化学物質または化学物質などの任意の外来性材料の存在をいう。細菌およびマイコバクテリア細胞壁組成物を製造する従来の方法とは対照的に、本方法で製造されるRNC組成物
に付随する細菌およびマイコバクテリアのタンパク質は、外来性タンパク質分解酵素処理をしないため保存される。細菌およびマイコバクテリア細胞壁組成物を製造する従来の方法とは対照的に、細菌およびマイコバクテリア細胞壁の脂質は、外来性脱脂溶媒処理をしないため保存される。
【００６５】
本明細書で定義されるように、用語製造は、それによってRNCを単離するプロセスをい
い、無傷の細菌またはマイコバクテリア細胞を破壊して細胞壁断片を形成し、次いでこのような断片を、RNAと共に単離し、細菌またはマイコバクテリア細胞壁RNCを与える。
【００６６】
本明細書で定義されるように、用語オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドは、それぞれ、細菌、マイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌株BCG、マイコバクテ
ウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌またはマイコバクテウム・バッカエから得られる長さ2〜およそ20塩基または20〜およそ4000塩基の、RNA分子をいう。細菌またはマ
イコバクテリア細胞壁と共にあるRNAは、RNCと定義される。RNAは一本鎖（ss）、二本鎖
（ds）、一本鎖−二本鎖ハイブリッド鎖（hs）により構成されてもよく、RNAは、細菌か
ら、より好ましくはマイコバクテリアから、および最も好ましくはチモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌またはマイコバクテウ
ム・バッカエから得られる。RNCは、異なる細菌またはマイコバクテリア由来の1つまたは複数のRNCを含んでもよく、異なる細菌またはマイコバクテリア由来の無傷の細胞をさら
に含んでもよい。RNCはまた、1つまたは複数の細菌またはマイコバクテリア由来の細胞壁を使用して製剤化することができる。
【００６７】
本明細書で定義されるように、細菌またはマイコバクテリアの高圧ホモジナイゼーションは、それによって水性賦形剤中の無傷の細菌またはマイコバクテリアの懸濁液が、圧力下で、高渦および剪断力の条件を作り出す弁内の微小な溝を通過するプロセスをいい、それは細菌またはマイコバクテリアを細胞壁断片へと崩壊させ、またタンパク質および脂質を含む細胞質成分を放出させる。
本明細書で定義されるように、低速遠心分離は、破壊されていない細菌またはマイコバクテリアを沈殿させるのに十分な相対遠心力（RCF）をいう。
本明細書で定義されるように、高速遠心分離は、細菌またはマイコバクテリア細胞壁RNCを沈殿させるのに十分な相対遠心力をいう。
【００６８】
本明細書で定義されるように、免疫刺激は、先天性およびまたは後天性免疫系を、免疫応答が誘発されるように刺激することをいう。この免疫応答は、以下の1つまたは複数に
より構成されてもよいが、限定されない：免疫細胞分化および分裂、Toll様受容体の活性化、NOD受容体の活性化、Toll様もしくはNOD以外の受容体の活性化、ケモカインおよびサイトカイン合成の誘導、増殖因子合成の誘導、細胞表面マーカーの発現増加、細胞表面マーカーの発現減少、細胞破壊もしくは細胞毒性活性の活性化、抗体産生の刺激または細胞性免疫の刺激。
【００６９】
本明細書で定義されるように、抗癌活性は、癌細胞の阻害およびまたは死をもたらす任意のプロセスをいう。このような抗癌活性は、標的癌細胞に対する直接効果の結果でもよいし、免疫系の刺激による間接効果の結果でもよい。
用語動物は、この出願においてヒトを含む。
用語生産は、この出願において合成および／または放出を意味する。
【００７０】
＜マイコバクテリアの培養のための新規組成物＞
本発明は、適時の様式においてマイコバクテリア細胞塊の産生のための炭素、窒素および鉄の最適化されたレベルおよび比率を含む、マイコバクテリアを培養するための新規培地を提供する。これらの新規培地は、有機窒素源または無機の窒素源を利用し、並びにさらなる炭素、窒素および鉄が1つの分子内で提供され得る手順を提供する。これらの新規
培養培地は、マイコバクテリア細胞塊の効率的な生産のために、ウシアルブミンまたはカタラーゼなどの外来性タンパク質の添加を必要としない。
【００７１】
一つの態様において、最適化された窒素は、限定されないが硫酸アンモニウムを含む無機のアンモニウム塩の添加によって提供される。最適化された炭素は、限定されないがグルコース（デキストロース）などの糖、グリセロールなどのグリコールまたはクエン酸などの酸を含む、有機分子の添加によって提供され、そしてそれはマイコバクテリアによって代謝され得る炭素を含む。
【００７２】
もう一つの態様において、最適化された窒素および炭素は、限定されないがクエン酸アンモニウム（二塩基）または限定されないがアスパラギンなどのアミノ酸を含む、両方の原子を含む分子によって、提供される。
【００７３】
さらにもう一つの態様において、最適化された炭素、窒素および鉄は、限定されないがクエン酸鉄アンモニウムを含む、全ての3つの原子を含む分子によって提供される。
【００７４】
さらなる態様において、最適化された炭素、窒素および鉄、並びに限定されないがカルシウムおよびマグネシウムを含むさらなる二価のカチオンを提供する培養培地を使用してもよい。
【００７５】
さらにもう一つの態様において、培養培地は、限定されないがアルブミン、酵素または限定されないがミコバクチンを含む増殖増強材料を含む、さらなる外来性生物学的薬剤を伴わずに製剤化される。
【００７６】
さらにもう一つの態様において、酸素への接近を最適化して細菌またはマイコバクテリアの迅速な好気性増殖を保証するための、混合および通気手順が使用される。
【００７７】
＜新規の細菌およびマイコバクテリア組成物＞
本発明は、細菌もしくはマイコバクテリアから単離されたRNA、細菌またはマイコバク
テリア細胞壁を含む、新規の細菌およびマイコバクテリア組成物を提供する。以前に定義したとおり、これらの組成物はBRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCを含む。これらの組成物は、異なる量の無傷の細菌またはマイコバクテリア細胞を任意に含む。もう一つの態様において、各組成物、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCまたはMvRNCはまた、異なる量の無傷のマイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバク
テウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌またはマイコバクテウム・バッカエ細胞を含んでもよい。無傷の細胞は、0〜99%、0.05〜95%、0.07〜50%、0.1〜20%もしくは0.19〜19重量％の量またはこれらの範囲内のいずれかの量でMRNC、MpRNC、MbRNC MsRNC、MapRNCまたはMvRNC中に存在してもよい。
【００７８】
もう一つの態様において、これらの新規組成物は、長さ2〜4000塩基のオリゴリボヌク
レオチドおよびポリリボヌクレオチドの形態でRNA組成物成分（総核酸成分のおよそ30%から100%までの範囲であり得る）を有する。さらにもう一つの態様において、これらの新規組成物は、長さ150塩基より大きい、または151〜4000塩基のオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドの形態でRNA成分（総核酸成分の30〜100%）を有する。もう一つ
の態様において、これらの新規組成物は、大部分が長さ20〜40塩基のオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドの形態であるRNA成分（総核酸成分の30〜100%）を有す
る。
【００７９】
一つの態様において、オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドの形態で約90%またはより多くのRNAを含む新規のRNC組成物は、たとえばグアニジウムチオシアナー
ト-フェノール-クロロホルム抽出を用いて、マイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌（MAP）またはマイコバクテウム・バッカエからのRNAの抽出によって調製される。このようなRNA標品は、オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチド鎖長が2〜4000塩基であるRNC組成物を与えるために、熱処理してもよい（たとえば限定されないが5〜30分間121℃によって）。このRNC組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせてもよい。
【００８０】
無傷のマイコバクテリア細胞の含量が最小であるときに、抗癌活性が最適化される。無傷のマイコバクテリア細胞含量が5〜50% w/wの範囲にあるときに、免疫刺激活性が最適化される。無傷の細菌、マイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム
・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌（MAP）もしくはマイコバクテウム・バッカエ
細胞の数は、実施例において詳述される製造プロセスを制御することにより、またはMRNC
、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCもしくはMvRNCに無傷のマイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌（MAP）もしくはマイコバクテウム・バッカエ細胞を添加することにより、調整することができる。
【００８１】
これらの新規組成物、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCまたはMvRNCは、免疫刺激活性、抗癌活性、並びに造血性および骨髄性の細胞増殖因子刺激活性を有する。従来技術の調製とは対照的に、これらの新たな組成物は、単一の、一本鎖（ss）、二本鎖（ds）および一本鎖−二本鎖ハイブリッド鎖（hs）を含み、免疫刺激性および抗癌活性のために最適化され、そしてマイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメ
グマチス、トリ結核菌亜種副結核菌（MAP）またはマイコバクテウム・バッカエ細胞壁と
共に製剤化される。一つの態様において、これらの組成物は、意図した目的に適したレベルの無傷のマイコバクテリア細胞をさらに含む。
【００８２】
本発明の組成物は、免疫系を刺激するのに、造血性および骨髄性の増殖因子合成を刺激するのに、並びに癌を治療するのに有効である。異なる態様において、これらの組成物は、動物の免疫系の応答性細胞における応答を誘導するのに、細胞周期停止またはアポトーシスを誘導するのに、並びに細胞の増殖を阻害するのに有効である。これらの組成物は、免疫系の応答性細胞を誘導して、サイトカイン、ケモカイン、並びに造血性および骨髄性の増殖因子を産生させる。
【００８３】
本発明の組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて治療的組成物を形成して動物に投与されるときに、免疫系を刺激するのに、および癌を治療することにおいて有効である。異なる態様において、これらの治療的組成物は、動物の免疫系の応答性細胞における応答を誘導して、細胞周期停止またはアポトーシスを誘導し、そして癌細胞増殖を阻害する。これらの組成物は、免疫系の応答性の細胞を誘導して、サイトカイン、ケモカイン、並びに造血性および骨髄性の細胞増殖因子を産生させる。
【００８４】
MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCは、限定されないが悪性、自己免疫性および免疫不全症疾患、骨髄抑制、並びに造血性および骨髄性の異常を含む多様な疾患を予防し、治療し、緩和し、および無くすのに有効な治療的薬剤である。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCは、限定されないが、望ましくなくかつ制御されていない細胞増殖によって媒介される癌などの疾患およびプロセスを治療するために、特に有用である。これらの組成物はまた、その他の抗癌剤の有効性を増強するアジュバントとして有効である。このような抗癌剤は、限定されないが、薬物、免疫機能刺激薬、免疫機能阻害剤、抗原、抗体、ワクチン、放射線、化学療法剤（単独で、または当業者に公知の適切な組み合わせにおいてのいずれか）、遺伝的、生物学的に操作された、および化学的に合成された薬剤、並びに活性化または不活性化のための細胞死分子を標的とする薬剤、癌細胞の増殖を阻害する薬剤、並びに癌細胞におけるアポトーシスを誘導する薬剤を含む。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCはまた、癌の治療に伴う、または癌それ自体によって誘導される骨髄抑制（白血球減少、好中球減少）の予防または治療のために、並びに薬物療法、または限定されないが後天性免疫不全症候群（AIDS）、骨髄異形成症候群、自己免疫疾患、末期腎臓疾患もしくはウイルス感染などの疾患に関連した多様な造血性および骨髄性の異常の予防または治療のために有効である。本発明の2つ以上の組成物の
組み合わせを、免疫系の調整を最適化するために、および癌を治療するために使用してもよい。たとえば、MpRNCおよびMvRNCの組み合わせは、免疫刺激およびサイトカイン誘導のために最適なNOD2およびTLR2活性化を与えるであろう。同様に、MpRNCおよびMvRNCの組み合わせは、最適な抗癌活性および免疫刺激を与えるであろう。
【００８５】
一つの態様において、細菌は、オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドの形態における細菌RNA、細菌細胞壁、並びに医薬品担体、賦形剤または溶媒を含むBRNC組
成物を提供するために使用してもよい。もう一つの態様において、マイコバクテリアは、オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドの形態におけるマイコバクテリアRNA、マイコバクテリア細胞壁、並びに医薬品担体または溶媒を含むMRNC組成物を提供する
ために使用されてもよい。もう一つの態様において、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCまた
はMvRNC組成物は、チモテ菌RNA、ウシ結核菌BCG RNA、マイコバクテウム・スメグマチスRNA、トリ結核菌亜種副結核菌RNAまたはマイコバクテウム・バッカエRNAをそれぞれ、オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドの形態において、これらの種からの細胞壁および医薬品担体、賦形剤または溶媒との組み合わせにおいて含む。
【００８６】
一つの態様において、BRNC、MRNC、MpRNC MbRNC、MsRNCまたはMvRNC組成物は、限定さ
れないがキトサンナノ粒子またはカチオン性リポソームなどの医薬送達系と共に製剤化される。
【００８７】
これらの組成物、BRNC、MRNAC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCのそれぞれ
は、当業者に公知の薬学的に許容される担体などの許容される担体、賦形剤、溶媒またはその他の送達系と組み合わせて、動物またはヒトに投与され得る組成物を形成してもよい。これらの組成物、BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCのそれぞれは、無傷の細菌細胞、マイコバクテリア細胞、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウ
ム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌またはマイコバクテウム・バッカエ細胞それぞれの選択された量と組み合わせて、動物またはヒトに投与され得る組成物を形成してもよい。
【００８８】
BRNC、MRNAC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCは、動物で、免疫系の応答性
細胞を誘導して、サイトカイン、ケモカイン、並びに造血性および骨髄性の増殖因子を産生するのに、並びに限定されないが癌細胞を含む応答性細胞において増殖を阻害して、アポトーシスを誘導するのに有効である。
【００８９】
真正細菌種は、本発明を実施するために使用することができ、限定されないがBRNCまたはMRNCを作製するためのコリネ型（Coryneform）種、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）種、ロドコッカス属（Rhodococcus）種、ボルデテラ属（Bordetella）種、エシュリヒア属（Escherichia）種、リステリア（Listeria）種、ノカルジア属（Nocardia）種
およびマイコバクテリア（Mycobacterial）種を含む。限定されないが、マイコバクテウ
ム・スメグマチス、マイコバクテウム・フォルチトム（Mycobacterium fortuitum）、マ
イコバクテウム・カンサイ（Mycobacterium kansaii）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ウシ結核菌、マイコバクテウム・バッカエ、トリ結核菌（Mycobacterium avium）および関連する亜種、並びにチモテ菌を含むマイコバクテリア種は、MRNCを作製するために使用することができる。さらにもう一つの態様において、マイコバクテリウム種チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌また
はマイコバクテウム・バッカエは、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCまたはMvRNCを作製するために使用する。さらにもう一つの態様において、古細菌（Archaebacterial）種は、BRNCを調製するために使用することができる。
【００９０】
＜マイコバクテリア細胞壁RNA含有組成物（MRNC）の製造方法＞
本発明はさらに、任意のマイコバクテリア種からマイコバクテリア細胞壁RNA組成物を
製造する方法を提供する。本発明の方法を使用してマイコバクテリア細胞壁-RNAを調製するために使用することができるマイコバクテリア種、マイコバクテリア複合物、マイコバクテリア亜種およびマイコバクテリア株の包括的なリストは、たとえば米国のNCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい）により維持され、かつ容易に入手可能である
。本発明は全てのマイコバクテリア種および株からMRNCを製造する方法を提供するが、好ましいマイコバクテリア種および株は、培養において急速に増殖することが公知であり、
したがって短期間でマイコバクテリア細胞バイオマスを提供することができるものである。また、急速に増殖することが公知であり、かつ加えて、免疫適格性個体に非病原性であるマイコバクテリア種および株が好ましい。
【００９１】
BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCは、調製するのが比較的安価であり、これらの活性は調製の間に再現可能であり、長時間安定のままであり、また、これらは、限定されないが、マイコバクテリア細胞壁組成物を調製するために当業者によって使用される、タンパク質、酵素、生化学物質または化学物質を含む外来性材料が混入していない。さらに、BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCの標品は、仮にあったとしても、レシピエントに対する毒性が最小限である。
【００９２】
BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCを調製するために、細菌種、マイコバクテリア種、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ
結核菌亜種副結核菌またはマイコバクテウム・バッカエをそれぞれ、炭素供与源の完全な利用を保証する最適化された炭素、窒素および鉄の含量を有する適切な液体培地において増殖して、収集する。アミノ酸は、窒素の供与源を提供する。限定されないがアスパラギンを含む二塩基性アミノ酸は、窒素の好ましい供与源である。窒素のその他の供与源は、アンモニウム塩またはこれらの同等物を含む。鉄のさらなる供与源は、無機の塩または限定されないが、炭素のさらなる供与源を提供するクエン酸塩を含む有機塩である。限定されないがクエン酸鉄アンモニウム（クエン酸アンモニウム鉄）を含む鉄錯体は、さらなる鉄、窒素および炭素供与源を提供する。炭素（グルコースまたはその他の代謝的に利用できる炭素供与源として）の好ましい濃度は、500〜2500 mMol/リットルである。異なる態
様において、CとNの比は約1：0.0095〜約1：0.06、約1：0.02〜1：0.06、またはちょうどもしくは約1：0.06である。異なる態様において、CとFeの比は、ちょうどもしくは約1：1.8×10-4〜1：3.2×10-3;ちょうどもしくは約1：1.8×10-3〜2.7×10-4;またはちょうど
もしくは約1：2.7×10-4である。当業者に公知の任意の許容される炭素源、窒素源または鉄源が利用されてもよい。このような培地はまた、さらなる塩、並びにビタミンを含んでもよく、これらの存在および濃度が特定の必要に従って調整され得ることが期待される。
【００９３】
細菌またはマイコバクテリアを破壊させて、RNAを遊離させ、かつ無傷の細菌、マイコ
バクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ結核菌
亜種副結核菌またはマイコバクテウム・バッカエ細胞の制御された除去を確実にする。破壊は、高圧ホモジナイゼーションプロセス、続く遠心分離プロセスの使用を介して起こる。低相対遠心力により、無傷の細菌またはマイコバクテリアを取り除く。BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCからのRNAは、この段階にてグアニジウムチオシ
アナート-フェノール-クロロホルムまたは当業者に公知の類似の手順を使用して抽出してもよい。あるいは、細菌またはマイコバクテリア細胞破壊の後、高相対遠心力を使用して、細菌、マイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチ
ス、トリ結核菌亜種副結核菌またはマイコバクテウム・バッカエ細胞壁と製剤化されるBRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCを単離することができる。重要なことは、ヌクレアーゼフリーおよびDNase/RNaseフリー（エンドヌクレアーゼおよびエキソ
ヌクレアーゼ活性の両方）試薬を使用し、プロセスをちょうどまたは約4℃で実施して、
調製工程の間のRNA分解を最小限にする。
【００９４】
細菌RNAのオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチド配列、オリゴリボヌク
レオチドおよびポリリボヌクレオチド長さ、並びにオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチド構造（限定されないが、一本鎖分子、二本鎖分子、一本鎖および二本鎖またはオリゴリボヌクレオチド内およびポリリボヌクレオチド内塩基対形成構造を含むハイブリッドなど）は、BRNCの生物学的活性のために必要である。より具体的には、マイコバクテリアRNAのオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチド配列、オリゴリボヌ
クレオチドおよびポリリボヌクレオチド長さ、並びにオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチド構造（限定されないが、一本鎖分子、二本鎖分子、一本鎖および二本鎖またはオリゴリボヌクレオチド内およびポリリボヌクレオチド内塩基対形成構造を含むハイブリッドなど）は、MRNCの生物学的活性のために必要である。細菌、マイコバクテリアまたはチモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副
結核菌もしくはマイコバクテウム・バッカエを、BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC細胞壁を製剤化するために使用することにより、BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCの生物学的活性（免疫刺激および抗癌活性）を最大にするために重要である生物学的担体および送達系を生じる。
【００９５】
＜種々の数の無傷の細菌またはマイコバクテリア細胞を含むBRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCの製造方法＞
本発明はさらに、任意の細菌種および株からBRNCを製造する方法を提供する。加えて、本発明はさらに、任意のマイコバクテリア種からMRNCを製造する方法を提供する。本発明の方法を使用してマイコバクテリア細胞壁-RNCを調製するために使用することができるマイコバクテリア種、マイコバクテリア複合物、マイコバクテリア亜種およびマイコバクテリア株の包括的なリストは、たとえばUSAのNCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.govを参照
されたい）により維持され、かつ容易に入手可能である。好ましいマイコバクテリア種は、培養において急速に増殖することが公知であり、したがって短期間でマイコバクテリアバイオマスを提供することができるものである。また、好ましいものは、急速に増殖することが公知であり、かつ免疫適格性個体に非病原性であると認識されている種である。
【００９６】
一つの態様において、BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCにおいて存在する無傷の細菌細胞の数は、ホモジナイゼーションの間に規定された高圧を適切に使用することによって、並びに細菌、マイコバクテリア、またはチモテ菌、ウシ結核菌BCG
、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌もしくはマイコバクテウム・バッカエ細胞壁を含むBRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC製剤の調製において使用される規定数のホモジナイゼーションサイクルと組み合わせて制御することができる。本発明者らは、BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCに存在する無傷の細菌細胞の数を変化させることにより、これらの組成物の免疫刺激および抗癌活性に影響を及ぼすことができ、所望の、かつ最適な免疫調節または所望の、かつ最適な抗癌活性を達成することができることを予想外に見いだした。
【００９７】
一つの態様において、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCのマイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副
結核菌またはマイコバクテウム・バッカエ細胞壁製剤における無傷のマイコバクテリア細胞の数は、高圧ホモジナイゼーションおよび低速遠心分離処理を行わなかったマイコバクテリアにおける同等の試料と比較して、少なくとも20倍減少させることができる。もう一つの態様において、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCにおける無傷のマイコバクテリア細胞の数は、細菌細胞調製において高圧ホモジナイゼーション、低速遠心分離、続くさらなる高圧ホモジナイゼーション処理を行わなかったマイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌またはマイ
コバクテウム・バッカエの同等試料と比較して、少なくとも30倍減少させることができる。さらなる態様において、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCにおける無傷のマイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、ト
リ結核菌亜種副結核菌またはマイコバクテウム・バッカエ細胞の数は、マイコバクテリア、またはチモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種
副結核菌もしくはマイコバクテウム・バッカエ細胞調製において高圧ホモジナイゼーション、低速遠心分離、続くさらなる高圧ホモジナイゼーション処理を行わなかったマイコバクテリアの同等試料と比較して、少なくとも35倍減少させることができる。
【００９８】
一つの態様において、高レベルの無傷のマイコバクテリア細胞含量またはチモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌もしくはマイ
コバクテウム・バッカエ細胞含量（たとえばおよそ1〜50% w/wより上）をそれぞれ含むMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC組成物を調製してもよい。たとえば、このような技術は、4サイクルの高圧ホモジナイゼーションを含み、高圧ホモジナイゼーショ
ンの4サイクルのうちの2つは高速遠心分離工程の前に行われ、そして高圧ホモジナイゼーション工程のうちの2つは高速遠心分離工程の後に行われる。
【００９９】
もう一つの態様において、中間レベルの無傷のマイコバクテリア細胞含量、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌またはマイ
コバクテウム・バッカエ細胞含量（たとえば約0.2〜約0.9% w/w）をそれぞれ含むMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC標品を調製してもよい。たとえば、このような
技術は、7サイクルの高圧ホモジナイゼーションを含み、高圧ホモジナイゼーションの7サイクルのうちの5つは高速遠心分離工程の前に行われ、そして2つの高圧ホモジナイゼーション工程は高速遠心分離工程の後に行われる。
【０１００】
さらなる態様において、超低レベルの無傷のマイコバクテリア細胞含量、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌またはマイコ
バクテウム・バッカエ細胞含量（たとえば約0.2% w/wより少ない）を含むMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC標品を調製してもよい。たとえば、このような技術は、10サイクルの高圧ホモジナイゼーションを含み、高圧ホモジナイゼーションの10サイクルのうちの5つは低速遠心分離工程の前に行われ、3サイクルの高圧ホモジナイゼーションは低速遠心分離の後に行われ、そして2つの高圧ホモジナイゼーション工程は高速遠心分離
工程の後に行われる。
【０１０１】
上記の技術において、「高圧ホモジナイゼーション」は、マイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌またはマ
イコバクテウム・バッカエの効率的な破裂を生じさせ、その結果RNAを含む細胞壁断片組
成物を得るために十分な、高圧ホモジナイゼーションのサイクルを意味する。限定されないが、マイクロ流動化法などの高圧ホモジナイゼーションと同等であるその他の手順もまた、使用することができる。細菌およびマイコバクテリア細胞破壊の技術における当業者は、本発明を読んだ後に、破壊される予定の特異的マイコバクテリア種、株、亜株または複合物のために最適な圧力を容易に決定することができることを理解すべきである。
【０１０２】
本明細書で定義されるように、低速遠心分離は、破壊されていない細菌、マイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副
結核菌またはマイコバクテウム・バッカエを沈殿させるのに十分な相対遠心力（RCF）を
いう。遠心分離技術における当業者は、本発明を読んだ後に、上記のような細胞破壊の後に残る任意の無傷の細菌またはマイコバクテリアの沈澱のために最適なRCFを容易に決定
することができることを理解すべきである。
【０１０３】
高速遠心分離は、本明細書で定義されるように、細菌、マイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌またはマイ
コバクテウム・バッカエ細胞壁を沈殿させるのに十分な相対遠心力をいう。遠心分離技術における当業者は、本発明を読んだ後に、上記のような低速遠心分離によって所望の量の無傷の細菌およびマイコバクテリアの破壊および除去の後、細菌またはマイコバクテリアから細胞壁を沈殿させるために最適な相対遠心力を容易に決定することができることが期待される。
【０１０４】
上記の高圧ホモジナイゼーション技術の使用は、高圧のホモジナイゼーション圧力、低速遠心分離および高速遠心分離またはこれらの組み合わせの適切な使用により、種々のレベルの無傷のマイコバクテリア（たとえば、高、中間または低）を含むMRNCを調製するために使用することができる。加えて、記述された高圧ホモジナイゼーション技術を使用して、高、低または中間レベルのマイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバ
クテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌またはマイコバクテウム・バッカエをそれぞれ含むMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCを調製されてきた。
【０１０５】
一つの態様において、分画遠心分離を行って標品（すなわち、高圧ホモジナイゼーション処理しない）から無傷のマイコバクテリア細胞、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバ
クテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌またはマイコバクテウム・バッカエ細胞を取り除いたマイコバクテリア標品と比較して、上述される高圧ホモジナイゼーション法を介して調製されるMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC標品は、減少した数の無傷のマイコバクテリア細胞、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメ
グマチス、トリ結核菌亜種副結核菌またはマイコバクテウム・バッカエ細胞をそれぞれ含む。
【０１０６】
一つの態様において、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC標品当たりの無傷のマイコバクテリア細胞、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチ
ス、トリ結核菌亜種副結核菌またはマイコバクテウム・バッカエ細胞の割合（w/w）は、
それぞれ、約50% w/w未満、約40% w/w未満、約30% w/w未満、約20% w/w未満、約10% w/w
未満、約5% w/w未満、約1% w/w未満または約0.5% w/w未満である。
【０１０７】
もう一つの態様において、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC標品は、熱処理のプロセス、たとえば限定されないが、組成物に残っている任意の無傷のマイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種
副結核菌またはマイコバクテウム・バッカエを不活性化するために十分である5〜30分間95℃にて加熱、またはたとえば5〜30分間121℃加熱などに供される。
【０１０８】
もう一つの態様において、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC標品の熱処理（たとえば121℃、5〜30分または当業者に公知のその他の条件）は、約2〜150、約10〜100、または約20〜40塩基の長さの範囲のオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレ
オチドを生成するために使用される。
【０１０９】
一つの態様において、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCを製造する方法は、マイコバクテリア細胞バイオマス、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・
スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌またはマイコバクテウム・バッカエを破壊して、それらから細胞壁、並びに関連するオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドを調製すること、無傷の破壊されていないマイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG
、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌またはマイコバクテウム・バッカエ細胞を分離すること；並びに破壊された細菌、マイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌またはマイコ
バクテウム・バッカエ細胞部分の可溶性のサイトゾル成分を、細胞壁、並びにオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドから分離して、細菌、マイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌また
はマイコバクテウム・バッカエ細胞壁RNC（BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC）を得ることを含む。
【０１１０】
もう一つの態様において、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC標品を製造する方法は、マイコバクテリア細胞バイオマスを破壊してオリゴリボヌクレオチドおよび
ポリリボヌクレオチドを放出すること；オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドを、破壊されていない無傷のマイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコ
バクテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌またはマイコバクテウム・バッカエ細胞から分離すること；無傷のマイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバ
クテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核菌またはマイコバクテウム・バッカエ細胞の数を制御する工程を繰り返すこと；並びに、次いで、オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドを、約20〜40ヌクレオチド塩基の長さのオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドを得るために十分な温度まで加熱することを含む。
【０１１１】
＜組成物の核酸含量＞
これらの組成物、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCの核酸含量は、約500〜50000ng/mg、約500〜5000ng/mg、または約500〜3000ng/mgである。異なる態様におい
て、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCにおける抽出されたオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドの長さは、約2〜約4000塩基の長さ、約2〜約150塩
基の長さ、または150塩基を超える長さである。異なる態様において、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCにおける抽出されたオリゴリボヌクレオチドおよびポリリ
ボヌクレオチドの長さは、約150塩基〜約4000塩基の長さ、または約10〜約50塩基の長さ
、または約20〜約40塩基の長さである。異なる態様において、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCにおける抽出されたオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドの長さは、150塩基未満、または100塩基未満である。
【０１１２】
上記の手順は、その他の工程を含むように改変されてもよいことは、当業者にとって明らかであろうが、ただし、これらの工程はMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCの品質および全体の回収に負の影響を与えないことを条件とする。
【０１１３】
高圧ホモジナイゼーション手順では、オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドを生成することにより抽出されたRNA分子の長さが減少し、またそれぞれの標品から
無傷のマイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス
、トリ結核菌亜種副結核菌またはマイコバクテウム・バッカエ細胞を除去するため、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCは、高圧ホモジナイゼーションおよび低速遠心分離によって、これらの治療的有効性が増加する。オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドの長さのさらなる減少は、限定されないが、熱処理の使用によって（たとえば、30分間121℃の熱処理によって）、または塩基配列制限エンドヌクレアーゼの適
切な使用によって、容易に達成することができる。本発明者らは、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC標品が、RNAを消化するRNase処理後に、これらの免疫刺激薬または抗癌剤として作用する能力を有意に減少させるということを、予想外に発見した。したがって、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC標品は、RNase（エンドまた
はエキソ）またはヌクレアーゼの分解作用に対するRNAのアクセスを制限する製剤および
担体系の使用によってRNAを保護しない限り、RNase処理または不注意によるリボヌクレアーゼへの曝露に対して制限された治療的有効性を有する。
【０１１４】
＜MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCの免疫刺激性および抗癌活性＞
MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC標品に存在する無傷のマイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結
核菌またはマイコバクテウム・バッカエ細胞の総数の減少が、サイトカイン誘導アッセイ法によって測定される免疫刺激活性に有意な効果を有することを見いだした。また、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCに存在する無傷のマイコバクテリア細胞の総数の減少が、末梢血単核細胞におけるIL-10およびIL-12p40誘導の増加などの免疫刺激活
性に有意な正の効果を有することを見いだした。さらにまた、上記標品に存在する無傷のマイコバクテリア、チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテウム・スメグマチス、トリ
結核菌亜種副結核菌またはマイコバクテウム・バッカエ細胞の総数の減少は、癌細胞増殖の阻害によって測定されるように、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCの抗癌活性に正の増強効果を有することを見いだした。
【０１１５】
一つの態様において、動物またはヒトにおける造血性および骨髄性の増殖因子に対するMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCの免疫刺激活性は、サイトカイン誘導アッセイ法を使用して測定することができる。もう一つの態様において、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCは、限定されないがIL-10およびIL-12を含むサイトカインの免疫刺激活性を誘導する。
【０１１６】
さらなる態様において、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCを含む治療的組成物は、抗癌活性を有する。一つの態様において、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC Cの抗癌活性は、当業者に公知の癌細胞増殖アッセイ法を使用して決定してもよい。抗癌活性を同定するこのようなアッセイ法の使用は、インビボ抗癌活性の予測についての当業者に公知である。
【０１１７】
予防的または治療的状況におけるMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCを含む組成物の投与は、それ自体は免疫化プロセスではない。免疫系の応答性細胞における応答を刺激すること、および限定されないが癌細胞などの応答性細胞の増殖を阻害して、アポトーシスを誘導することは、予防的または治療的な治療である。この予防的または治療的な治療は、限定されないが癌を含む疾患を予防し、治療し、寛解し、または無くすために有用である。
【０１１８】
しかし、製剤において使用されるときに、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC標品の投与が、マイコバクテリア細胞壁成分に対する免疫応答を誘発し、それがMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCの免疫刺激活性によってさらに増強されるであろうことが、認識されるであろう（免疫アジュバント効果）。当業者は、MRNCがそこから調製されるときに、このような応答が、日和見性または病原性のマイコバクテリア感染症を治療するのに有効であろうことを認識するであろう。具体的には、限定されないが、結核、ヨーネ病またはクローン病に伴う炎症および罹患率を減少させることができる治療の必要がある。より具体的には、最適化された免疫刺激性、並びにワクチン抗原およびワクチンアジュバント活性を有するMapRNCを含む組成物の使用では、ウシおよびヒトにおけるMAP感染症を予防または治療する利点と共に使用され得る。MAPのものと交差反応する抗原を含む1つ以上のマイコバクテリア種からのRNCを含む組成物を、MAP感染の制御をもた
らす保護反応を生じさせるために使用してもよい。
【０１１９】
MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCを含む組成物の治療有効性は、限定されないが、免疫系の応答性細胞を刺激してサイトカインを産生することを含み、それが応答性細胞において、免疫系細胞の活性化およびその後の細胞溶解、またはカスパーゼの活性化およびアポトーシスを生じさせ得る。細胞溶解およびアポトーシスは、個々に、および組み合わせの両方において、抗癌活性およびアジュバント活性の両方を有する。すなわち、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNCおよびMvRNCを含む治療的組成物は、抗癌剤として単独で投与することができ、このMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCを含む組成物は、治療有効性を増加させるために別の抗癌剤の前、同時、または後に投与することができる。
【０１２０】
MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCは、限定されないが、悪性、自己免疫性および免疫不全症疾患、骨髄抑制、並びに造血性および骨髄性の異常を含む多様な疾患を予防し、治療し、軽減し、または無くすのに有効な予防的および治療的薬剤である。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCはまた、その他の薬剤の有効性を増強する
アジュバントとして有効である。このような薬剤は、限定されないが、薬物、抗生物質、その他の免疫刺激薬、抗原、抗体、ワクチン、放射線および化学療法薬、遺伝的、生物学的に操作された、および化学的に合成した薬剤、並びに活性化または不活性化のための細胞死分子を標的とする薬剤、癌細胞における増殖を阻害する薬剤およびアポトーシスを誘導する薬剤を含む。
【０１２１】
本発明の上述した側面および態様のそれぞれにおいて、上記のもの以外のアジュバントまたは療法の組み合わせもまた、本明細書において明確に想定される。
【０１２２】
一つの態様において、本発明の組成物は、当業者に公知の現在利用できる化学療法剤の１つまたは複数と共に投与してもよい。
【０１２３】
もう一つの態様において、本発明の組成物は、1つまたは複数の抗生物質、抗殺菌剤、
抗ウイルス剤、駆虫性薬剤、抗炎症剤もしくは免疫刺激性薬物または当業者に公知の薬剤と共に投与してもよい。
【０１２４】
さらにもう一つの態様において、本発明の組成物は、骨髄抑制または造血性および骨髄性の異常の予防または治療のための当業者に公知の1つまたは複数の薬物または薬剤と共
に投与してもよい。
【０１２５】
本発明の組成物は、動物被験体または患者、およびより好ましくは、ヒトを含む哺乳類、並びに非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、齧歯類などの哺乳類および魚の治療のために使用してもよい。
【０１２６】
＜薬学的に許容される担体および組成物を投与する方法＞
MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCの組成物は、薬学的に許容される担体と共に、容易に製剤化され、調製され、または投与されてもよい。このような標品は、種々の技術によって調製され得る。このような技術は、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCの組成物およびその担体を結合させることを含む。一つの態様において、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC組成物は、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC組成物を、液体担体と、固体の担体と、または両方と均一かつ均質に結合させることによって調製される。液体担体は、水性製剤、非水性製剤または両方を含むが、限定されない。固体担体は、生物学的担体、化学的担体または両方を含むが、限定されない。
【０１２７】
MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC組成物は、水性懸濁液、油乳剤、油中水型エマルジョンおよび水中油中水型エマルジョン中に、並びにクリーム、ゲル、リポソーム（中性、アニオン性もしくはカチオン性）、脂質ナノスフェアまたはマイクロスフェア、中性、アニオン性もしくはカチオン性のポリマーのナノ粒子またはマイクロ粒子、部位特異的エマルジョン、長期滞留エマルジョン、粘着性エマルジョン、ミクロエマルジョン、ナノエマルジョン、マイクロスフェア、ナノスフェア、ナノ粒子およびミニポンプを含むが、限定されない担体中に、並びにアニオン性、中性もしくはカチオン性の多糖およびアニオン性、中性、カチオン性のポリマーまたはコポリマー、組成物の送達が必要とされるところの近傍に植込されたミニポンプまたはポリマーを含む組成物を持続して放出させる種々の天然もしくは合成のポリマーと共に投与されてもよい。たとえば、重合体およびこれらの使用は、Brem et al.（Journal of Neurosurgery 1991, 74:441-446）に記述
されている。さらにまた、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCは、担体のいずれか1つまたは任意の組み合わせと共に使用することができる。これらは、抗酸化剤、
緩衝液および静菌剤を含むが、限定されず、並びに懸濁剤および増粘剤を含んでもよい。
【０１２８】
一つの態様において、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC組成物または担体に基づく標品は、RNaseフリーの、水性懸濁液として投与される。水性懸濁液としての
投与については、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCは、限定されないが注射用水、生理食塩水もしくはデキストロース溶液を含むRNaseフリーおよびヌクレアーゼ
フリーの薬学的に許容される賦形剤、緩衝液もしくは担体中に、または限定されないが高圧ホモジナイゼーション、超音波処理およびマイクロ流動化を含む技術によって懸濁し、そして無菌的に処理するか、または最後に滅菌することができる。別の実施例において、フリーズドライした（凍結乾燥した）MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCは、使用の前に即時に、薬学的に許容される賦形剤、緩衝液または担体、たとえばRNaseフ
リーおよびヌクレアーゼフリーの滅菌水の添加のみを必要とする密封したアンプルまたはバイアルに貯蔵することができる。
【０１２９】
非水性担体中の投与については、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCは、鉱油と、または限定されないがジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、脂質、油およびそれらの混合物などの中性油と乳化してもよく、油は、多価不飽和および飽和脂肪酸の適切な混合物を含む。例には、限定されないがダイズ油、カノーラ油、パーム油、オリーブ油およびミグリオール（myglyol）を含み、脂肪酸炭素の数は12〜22であり、および脂
肪酸は飽和または不飽和であることができる。任意に、荷電した脂質またはリン脂質を中性油中に懸濁することができる。より具体的には、マクロファージ上の受容体を標的とするホスファチジルセリンを使用することができる。水性媒体中に製剤化したMRNC、MpRNC
、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCまたは凍結乾燥したMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC粉末を、当業者に公知の技術を使用してエマルジョンを調製するのに使
用することができる。
【０１３０】
したがって、本発明は、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC組成物を、1
つまたは複数の薬学的に許容される担体、並びに任意に、その他の治療的成分および／または予防的成分と共に提供する。担体およびその他の治療的成分は、組成物のその他の成分との適合性という意味で許容可能でなければならず、およびそのレシピエントに有害であってはならない。
【０１３１】
MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC組成物は、ヒトを含む動物における治療的応答を誘導するために有効な量で投与される。投与されるMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC組成物の用量は、治療される条件、特定の製剤、並びにレシピエントの体重および状態、並びに投与の経路などのその他の臨床的要因に依存するであろう。一つの態様において、投与されるMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCの量は、用量あたり約0.00001mg/kg〜約100mg/kgである。もう一つの態様において、投与されるMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCの量は、用量あたり約0.0001mg/kg〜約50mg/kgである。さらなる態様において、投与されるMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC
およびMvRNCの量は、用量あたり約0.001mg/kg〜約10mg/kgである。もう一つの態様において、投与されるMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCの量は、用量あたり約0.01mg/kg〜約5mg/kgである。さらなる態様において、投与されるMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCの量は、用量あたり約0.1mg/kg〜約1mg/kgである。
【０１３２】
本発明の化合物の有用な用量は、動物モデルにおけるこれらのインビトロ活性およびインビボ活性を比較することによって決定することができる。マウスおよびその他の動物における、ヒトに対する有効な用量の外挿のための方法は、当該技術分野において公知であり;たとえば、米国特許第4,938,949を参照されたい。
【０１３３】
本発明において使用される組成物の投与の様式は、以下に例証してある。しかし、組成物は、以下を含む多様な経路のいずれによって送達することもできる：注射（たとえば、
皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内）によって、持続的静脈内注入によって、皮膚に、真皮に、経皮的に、経口的に（たとえば、錠剤、丸剤、液体の医薬、食用フィルムストラップ）、植込された浸透ポンプによって、坐薬またはエアロゾル噴霧によって。投与の経路は、限定されないが、局所的、皮内、髄腔内、病巣内、腫瘍内、膀胱内、膣内、眼内、直腸内、肺内、脊椎内、真皮性、皮下、関節内、体の空洞内配置、経鼻吸入、肺吸入、皮膚への圧入および電気穿孔法を含む。
【０１３４】
投与の経路に応じて、許容される担体におけるMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCお
よびMvRNCを含む組成物の容積は、用量当たり、約0.001ml〜約100mlである。一つの態様
において、許容される担体におけるMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCを含む組成物の容積は、用量当たり、約0.01ml〜約50mlである。もう一つの態様において、許容される担体におけるMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCを含む組成物の容積は、用量当たり、約0.1ml〜約30mlである。許容される担体におけるMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCを含む組成物は、単一用量治療において、もしくは複数の
用量治療において、予定の上で、または治療されている疾患、レシピエントの状態および投与の経路に適した時間にわたって投与してもよい。所望の用量は、単一用量において、または適切な間隔にて投与される分割された用量として、たとえば、一日当たり2、3、4
またはそれ以上の副用量として、都合よく提供されてもよい。副用量それ自体は、たとえば多数の分離したゆるやかに間隔を置いた投与に、さらに分割してもよい。
【０１３５】
＜免疫系受容体を活性化する方法＞
本発明は、その必要がある被験体に、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCの治療上有効な量、並びに薬学的に許容される担体を投与することを含む、免疫系受容体を活性化する方法を提供する。本発明によって活性化することができる免疫系受容体は、（限定されないが）ヌクレオチド結合オリゴマー形成ドメイン2（NOD2）、病原体関連分
子パターン（PAMP）分子ムラミルジペプチド、免疫刺激活性を有する細菌ペプチドグリカンの最小構造成分、並びにToll様受容体2（TLR2）、ペプチドグリカン、リポマンナン（LM）、リポアラビノマンナン（LAM）、および（パルミチン酸）n由来のN末端システインまたはシステイン類を含むリポプロテインおよびリポペプチドなどの広範囲の病原体関連分子パターン（PAMP）分子を検出する役割を担うパターン認識受容体（PRR）である。これ
らの2つの免疫系受容体の活性化は、抗癌活性および抗感染活性（細菌、真菌およびウイ
ルスの感染を含むが、限定されない）の生成、並びにワクチンアジュバント活性の刺激およびヒト骨髄CD14+細胞の分化を生じることが当業者に公知である。これらの受容体の両
方に対するアゴニストとして機能するMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCの能力は、満たされていない需要を提供し、また腫瘍学、感染性疾患またはワクチンの分野における治療的薬剤として使用される単機能のNOD2またはTLR2アゴニストを超える有意な利点をさらに提供する。
【０１３６】
＜癌および免疫系の障害を含む疾患を治療する方法＞
本発明は、その必要がある被験体に、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC並びに薬学的に許容される担体の治療上有効な量を投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。
【０１３７】
もう一つの側面において、本発明の方法および組成物は、癌および免疫系の疾患または障害の治療的処置において有用である。さらなる態様において、いくつかの癌は、症候もしくは徴候の発症の前に、または癌疾患の重篤な症候もしくは徴候の発症の前に、予防としての組成物の適時の投与によって、予防することができる。したがって、特定の癌疾患について危険な状態にある患者は、予防策として本発明の組成物の1つまたは複数によっ
て治療することができる。
【０１３８】
さらにもう一つの側面において、本発明は、癌もしくは腫瘍発生、転移、癌細胞における細胞の増殖を軽減もしくは改善させ、および／または、上で特定された癌疾患もしくは癌徴候の任意の1つもしくは複数に罹患する被験体における、上で特定された癌疾患およ
び／または癌徴候の任意の1つもしくは複数に伴う症候を阻害する方法に関する。この方
法は、薬学的に許容される担体におけるMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCの治療上有効な量を、その必要のある被験体に投与することを含む。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCは、薬学的に許容される担体と共に、単独で、または1つも
しくは複数の抗炎症化合物、免疫刺激性薬剤もしくは抗癌剤と組み合わせて、いずれかで投与されてもよく、該MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCは、癌もしくは腫瘍発生、転移および／または癌細胞における細胞増殖を阻害するために十分である。
【０１３９】
MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCは、限定されないが癌を含む疾患を治療し、軽減し、または無くすための治療的薬剤として有効である。癌は、限定されないが、原発性または転移性癌、扁平細胞癌腫、線維肉腫、サルコイド癌腫、メラノーマ、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、腎臓癌、骨肉腫、皮膚メラノーマ、基底細胞癌、膵臓癌、膀胱癌、尿道癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫およびこれら由来の転移を含む。
【０１４０】
一つの側面において、本発明のMRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC組成物を使用して治療され得る癌疾患および癌障害は、たとえば、限定されないが、AIDSに関連する癌、膀胱癌、骨癌、脳および脊髄癌、転移性脳腫瘍、小児性脳腫瘍、乳癌、男性乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜およびその他の子宮癌、食道癌、胆嚢および胆管癌、胃（胃）癌、頭頚部癌、腎臓癌、白血病、肝癌、肝転移、肺癌、リンパ腫、乳腺癌、メラノーマ、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽細胞腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、小児癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、血液疾患、肉腫、固形腫瘍、網膜芽細胞腫、皮膚癌、軟部組織肉腫、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、ウィルムス腫瘍、気管支癌、結腸および直腸癌、尿癌、非ホジキンリンパ腫、皮膚のメラノーマ、腎臓および腎臓癌、骨盤癌、膵臓癌、口腔癌および咽頭癌、胃食道癌、肝内性胆管癌、喉頭癌、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、心臓を含む軟組織癌、GIST（消化管間質腫瘍）、小腸癌、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、肛門および肛門管癌、肛門直腸癌、外陰部癌、肋膜癌、悪性中皮腫、骨および関節の癌、下咽頭癌、眼および眼窩の癌、鼻および鼻腔癌、中耳癌、鼻部癌、尿管癌、腹膜癌、網および腸間膜癌、並びに胃腸カルチノイド腫瘍またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【０１４１】
さらにもう一つの側面において、本発明を使用して治療され得る癌疾患および癌障害は、限定されないが、結腸直腸癌、胃癌、卵巣癌、骨肉腫、肝細胞癌、バーキットリンパ腫、原発性流出リンパ腫、血管免疫芽細胞性リンパ節症、後天性免疫不全症候群（AIDS）関連リンパ腫、T細胞リンパ腫、口腔毛様白斑症、リンパ組織増殖性疾患、リンパ上皮癌腫
、体腔に基づいたリンパ腫またはB細胞リンパ腫、非角化癌腫、扁平細胞上咽頭癌、腎臓
移植関連上皮性腫瘍、血管肉腫、カポジ肉腫、アンギオリンパ様増殖、前立腺癌、網膜芽細胞腫、リフラウメニ症候群、ガードナー症候群、ヴェルナー症候群、母斑様基底細胞癌症候群、神経線維腫症タイプ1、子宮頸部異形成、神経芽細胞腫、原発性マクログロブリ
ン血症、インスリノーマ、菌状息肉腫、骨原性肉腫、妊娠前皮膚病変（局所的）、横紋筋肉腫、骨形成、真性多血症、本態性血小板増加症またはこれらの任意の組み合わせを含む。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCは、抗感染剤として使用してもよい。本発明はまた、ウイルスおよび細菌などの病原性の材料に曝露された動物を保護するためにも有用である。本発明は、哺乳動物の血球新生を調節するために、または照射、外科手術もしくは化学療法治療から回復した癌を有する動物における造血性および骨髄性の回復（白血球減少、好中球減少、血小板減少もしくは貧血）を誘導するためにも有用である。本発明は、薬物療法または限定されないが後天性免疫不全症候群（AIDS）、骨髄異形成症
候群、自己免疫疾患、末期腎臓疾患もしくはウイルス感染などの疾患と関連している多様な造血性および骨髄性の異常の予防または治療のために有用である。
【０１４２】
本発明はまた、自己免疫障害、炎症性および感染性の疾患の治療または減少のためにも有用である。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCは、ウイルス、細菌、マイコバクテリア（限定されないが結核菌またはトリ結核菌亜種副結核菌など）または細胞内生物によって生じる多様な感染症を治療するために使用することができ、限定されないが、ウマ鼻肺炎、ウシ感染性鼻気管炎、子宮内膜炎、単純ヘルペス、帯状ヘルペス、眼性ヘルペス、ネコウイルス鼻気管炎およびネコ呼吸器管に感染するヘルペスウイルスなどのヘルペスウイルスによる感染を含む。本発明はまた、若いイヌのパルボウイルス感染症の治療にも有効である。本発明の組成物は、ヒト陰部ヘルペス感染症および後天性免疫不全症候群、並びに動物およびヒトのその他のウイルス感染のための治療薬として有効である。たとえば、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCは、限定されないがウマのヘルペスウイルス、ウマインフルエンザウイルス、単純ヘルペス、限定されないがストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）などの連鎖球菌種、大
腸菌（E. coli）およびラマバーベシア属などの、ウイルス、細菌、原虫および真菌感染
を治療するために使用することができる。
【０１４３】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するのに役に立つであろうが、同時に、それらのいかなる限定も構成することはない。反対に、種々のその他の態様、改変およびその均等物を用いてもよいことが明らかに理解されるべきであり、本明細書の記述を読んだ後に、それら自体が発明および／または添付された請求項の範囲の精神を逸脱しない範囲で、当業者に示唆され得る。当業者であれば、本発明の詳細な説明および実施例を読むことにより、それらの中の所見を、本発明の精神および目的または添付の請求項の範囲を逸脱しない範囲で、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌からの免疫刺激性および抗癌RNCの標品
に適用するであろうことが理解されるべきである。
【実施例】
【０１４４】
[実施例１]
＜合成培地におけるマイコバクテリアの培養＞
米国特許第4,744,984号および米国特許第6,326,357号において教示したマイコバクテリア細胞壁組成物の調製は、マイコバクテリア細胞塊の調製のためにBACTO（商標）ACブロ
ス（Difco Labs, now Becton Dickenson）の使用を特定した。このブロスは、プロテオースペプトンNo. 3、牛肉抽出物、酵母抽出物および麦芽抽出物を含む（Difco（商標）& BBL（商標）Manual of Microbiological Culture Media, second edition, 2009, pp 35-36）。加えて、これらの特許における実施例に使用されたチモテ菌のシードストックは、バイオマスの生成の前に、ウシ乳中に貯蔵されていた。上述した特許はまた、培養が静置であること、およびマイコバクテリア培養が培養液上の表面菌膜として増殖することを教示する。
【０１４５】
上述した物質によるマイコバクテリアバイオマスの混入の可能性を無くすために、新規合成培地が、マイコバクテリアの培養のために開発された。Middlebrook 7H9ブロスは、
マイコバクテリアの純粋培養物の培養に適していることが当業者に公知であるが、動物から供給された材料（ウシ血清アルブミンおよびカタラーゼを含むMiddlebrook ADC濃縮）
を含む補助剤の添加、並びにポリソルベート80またはグリセロールの使用によるさらなる恩恵を必要とする（Difco（商標）& BBL（商標）Manual of Microbiological Culture Media, second edition, 2009, pp355-356）。しかし、Middlebrook ADC濃縮培地において
見いだされる外因性タンパク質ウシアルブミンもしくはカタラーゼまたは非イオン性界面活性剤ポリソルベート80を用いないMiddlebrook 7H9において、マイコバクテリアの効率
的な増殖が生じることが、予想外に見いだされた。さらなる鉄（クエン酸鉄アンモニウム
として）、並びにさらなる炭素および窒素の供給源（限定されないが、アスパラギンまたはクエン酸アンモニウムなど）の使用により、Middlebrook 7H9ブロス単独における培養
と比較したときに、優れたマイコバクテリア量の収率を生じることもまた、予想外に見いだされた。適切な比率においてさらなる炭素、窒素および鉄を使用して、タンパク質、核酸およびその他の細胞の構成要素の合成のために炭素対窒素の比率の最適化を介して代謝活性および細胞分裂を促進し、並びに鉄の利用能の増加を介して代謝を増強し、これにより、マイコバクテリア分裂割合およびマイコバクテリア細胞塊を増加させる。
【０１４６】
以下の結果は、代表的なマイコバクテリア種の一例として本明細書において使用されるチモテ菌の増殖に対する、培養培地のC：N：Fe比率を変えることの影響を証明するために役に立つ。下に記述される所見は、C、NおよびFeにおける代替の供与源を使用して再現され得るし、並びに本発明の範囲および目的を逸脱しない範囲でその他のマイコバクテリアに適用することができることは、理解されるべきである。
【０１４７】
Middlebrook 7H9ブロスおよびADCの組成物は、たとえばDifcoおよびMicrobiological Culture Media, 2nd Edition, 2009, pages 355-356のBBL Manualにおいて入手できる。チモテ菌の増殖は、マイコバクテリア培養培地組成物（MCMC）として以後定義される、以下の新しく開発された培養培地において決定した：
【０１４８】
A. Middlebrook 7H9（BD Canada、Mississauga、Ontario）、グルコースおよびグリセ
ロールを含むMCMC組成物。
【０１４９】
B. Middlebrook 7H9グルコース、グリセロールおよびさらなるFe（クエン酸鉄アンモニウムとして）、並びに鉄、炭素源および窒素源としてのアスパラギンを含むMCMC組成物。
【０１５０】
C. グルコース、グリセロールを含み、並びに鉄、炭素および窒素源としてFe（クエン
酸鉄アンモニウムとして）、アスパラギンおよびクエン酸アンモニウム（二塩基性）を含む、MCMC組成物。
【０１５１】
D. 鉄、炭素および窒素源としてグルコース、グリセロール、Fe（クエン酸鉄アンモニ
ウムとして）およびクエン酸アンモニウム（二塩基性）を含むMCMC組成物。
別々の研究において、鉄およびL、DLまたはD立体異性体としてアスパラギンを含むMCMC組成物の影響もまた、上述する組成物Cを使用して決定した。
【０１５２】
MCMC AおよびMCMC BのMiddlebrook 7H9ブロスを調製するために、9.4gのMiddlebrook 7H9粉末状培地は、グルコースを除いた添加剤と合わせ、グリセロールおよび添加剤と合わせて、水（900mL）に溶解して、蒸気加圧滅菌によって滅菌した。グルコースは、水に溶
解して、常に別々に濾過滅菌し、その後に添加して、1000mLの最終的な容積を与えた。MCMC CおよびMCMC Dは、Middlebrook 7H9粉末状培地を含まない。表1は、上述したグリセロール、グルコースおよび添加剤を含むMiddlebrook 7H9ブロスの培養培地、並びにMiddlebrook 7H9ブロス粉末を含まない2つの培養培地1リットルあたりのC、NおよびFeのモル含量を示す。
【０１５３】
【表１】
2014502256.tif 000003
【０１５４】
Middlebrook 7H9粉末は、BD Canada、Mississauga、Ontarioから入手し、および当業者に公知である。約900mLのDifco（商標）Middlebrook 7H9ブロスを作製するためのおよそ
の処方は、以下の通りである：硫酸アンモニウム（0.5g）、L-グルタミン酸（0.5g）、クエン酸ナトリウム（0.1g）、ピリドキシン（1.0mg）、ビオチン（0.5mg）、リン酸二ナトリウム（2.5g）、リン酸一カリウム（1.0g）、クエン酸鉄アンモニウム（0.04g）、硫酸
マグネシウム（0.05g）、塩化カルシウム（0.5mg）、硫酸亜鉛（1.0mg）、硫酸銅（1.0mg）。
【０１５５】
その他の全ての試薬は、Sigma、Oakville、Ontarioからであった。MCMC-A、MCMC-B、MCMC-CおよびMCMC-Dを調製するために使用した組成物の培養培地におけるg/Lを下に示して
ある。しかしながら、リストされたそれぞれの具体的な数字がMCMC-A、MCMC-B、MCMC-CおよびMCMC-Dの1つのレシピのためにあるとき、これらのそれぞれの数字が約10%〜約20%増
減して、対応して変化したC：NおよびC：Fe比率を有する、MCMC-A、MCMC-B、MCMC-Cおよ
びMCMC-D培養培地のバリエーションを作製してもよいことを理解すべきである。
【０１５６】
MCMC-A. 
Middlebrook 7H9粉末             9.5g 
グリセロール                    2mL 
グルコース                      20g
蒸留水                          1Lまで
【０１５７】
MCMC-B
Middlebrook 7H9粉末             9.5g 
DL-アスパラギン                 0.75g
クエン酸鉄アンモニウム          0.03g 
グリセロール                    2mL 
グルコース                      20g
蒸留水                          1Lまで
【０１５８】
MCMC-C
クエン酸アンモニウム            4.84g 
DL-アスパラギン                 0.75g
L-グルタミン酸                  1.0g
ピリドキシン                    0.002g
ビオチン                        0.0005g
リン酸2ナトリウム               5g
リン酸1カリウム                 2.0g 
クエン酸鉄アンモニウム          0.12g 
硫酸マグネシウム                0.25g 
塩化カルシウム                  0.0005g
硫酸亜鉛                        0.005g
オレイン酸                      0.125g
グリセロール                    2mL 
グルコース                      20g
蒸留水                          1Lまで
【０１５９】
MCMC-C（D-アスパラギン）
クエン酸アンモニウム            4.84g 
D-アスパラギン                  0.75g 
L-グルタミン酸                  1.0g
ピリドキシン                    0.002g
ビオチン                        0.0005g
リン酸2ナトリウム               5g
リン酸1カリウム                 2.0g 
クエン酸鉄アンモニウム          0.12g 
硫酸マグネシウム                0.25g 
塩化カルシウム                  0.0005g
硫酸亜鉛                        0.005g
オレイン酸                      0.125g
グリセロール                    2mL 
グルコース                      20g
蒸留水                          1Lまで
【０１６０】
MCMC-C（Lアスパラギン）
クエン酸アンモニウム            4.84g
L-アスパラギン                  0.75g 
L-グルタミン酸                  1.0g
ピリドキシン                    0.002g
ビオチン                        0.0005g
リン酸2ナトリウム               5g
リン酸1カリウム                 2.0g 
クエン酸鉄アンモニウム          0.12g 
硫酸マグネシウム                0.25g 
塩化カルシウム                  0.0005g
硫酸亜鉛                        0.005g
オレイン酸                      0.125g
グリセロール                    2mL 
グルコース                      20g
蒸留水                          1Lまで
【０１６１】
MCMC-D
クエン酸アンモニウム            4.84g 
L-グルタミン酸                  1.0g
ピリドキシン                    0.002g
ビオチン                        0.0005g
リン酸2ナトリウム               5g
リン酸1カリウム                 2.0g 
クエン酸鉄アンモニウム          1.2g
硫酸マグネシウム                0.25g 
塩化カルシウム                  0.0005g
硫酸亜鉛                        0.005g
オレイン酸                      0.125g
グリセロール                    2mL 
グルコース                      20g
蒸留水                          1Lまで
【０１６２】
以下の手順は、チモテ菌からのマイコバクテリア細胞塊の調製を記述し、したがって、通常マイコバクテリアからマイコバクテリア細胞塊を調製するための一般的な例として役に立つ。この実施例を読んだ当業者は、個々のマイコバクテリア種、複合物および株の具体的な要求に対処するために手順を適切に改変するであろうことが認識される。
【０１６３】
チモテ菌（株110）は、4℃にてペトリアガニスラント（Petriagani slants）上のコロ
ニーとして、または-80℃にて20%グリセロールを含むMiddlebrook 7H9における懸濁液と
して貯蔵した。最適な培養炭素、窒素および鉄の比率の決定は、Petriaganiスラントから調製される種培養物を使用して行った。ペトリアガニスラントからのコロニーを1.2LのM Medium内に置き、分散後7日間培養した（オービタルシェーカー、Lab-Line Instruments
、Melrose Park、IL、USAにおいて250rpm、37℃）。標準化されたODの調整の後、200mLをそれぞれ1LのMCMCを含む一連の培養フラスコに添加した。培養を続けて（LAB-Lineオービタルシェーカーにおいて250rpm、37℃）、同型フラスコを10日間にわたる間隔で取り外した。マイコバクテリア細胞塊を低速遠心分離洗浄することによって単離して、凍結乾燥し、乾燥重量を決定した。凍結乾燥が現実的でない場合、乾燥重量は、変換因子湿細胞塊/6.81=乾燥細胞塊（この因子の平均±SDは6.81±1.16、n=7であるとして、実験によって事
前に決定された）を使用して、湿細胞塊から算出した。
【０１６４】
表２の結果は、チモテ菌の収率、並びに最適な収率の日時に対する、MCMCにおける異なる炭素、窒素および鉄の比率の影響を示し、表３の結果は、マイコバクテリア細胞塊の収率に対する、ラセミDL-、D-またはL-アスパラギンを使用することの影響を示す。これら
の研究は異なる時間に行われ、およびマイコバクテリア細胞塊の絶対収率は研究ごとに変化することを理解すべきである。
【０１６５】
【表２】
2014502256.tif 000004
【０１６６】
【表３】
2014502256.tif 000005
【０１６７】
表２に示した結果は、利用可能な炭素、窒素および鉄の量を増加させることが細胞塊の収率を増大させること、並びに最大収率を得るために必要な時間を減少させることを示す。その結果はまた、たとえば、限定されないが、アスパラギンまたはクエン酸アンモニウム（すなわち、それが有機または無機の分子の形態かどうかにかかわらず利用可能な窒素源）の使用が収率を増大させることを示す。硫酸アンモニウムよりもむしろクエン酸アンモニウムの使用に伴う2つの利点は、クエン酸塩（弱酸の塩であり、それは培地に実質的
な緩衝能力を提供する）の炭素の代謝が相対的に遅いこと、および代謝され得ない硫酸塩（強酸の塩）からの硫酸の生成に合致する培養中のブロスのpH変動の減少が観察されたことである。
【０１６８】
表３に示した結果は、D-アスパラギンまたはラセミ混合物、DLアスパラギンを使用する場合、L-立体異性体を使用するときより低いマイコバクテリア細胞塊収率を与えることを示す。これらのデータは、D-立体異性体またはラセミ混合物よりもむしろ、アスパラギンのL-立体異性体の利用がより効率的であることと合致する。クエン酸アンモニウムは、アンモニウムイオンがラセミでないという点で、窒素源としてさらなる利点を有するであろう。
【０１６９】
最適化されたMCMC-Cを使用して、チモテ菌およびマイコバクテウム・スメグマチスの収率を比較する第3の研究を行った。マイコバクテウム・スメグマチス（ATCC、Manassas、VA、株ATCC14468）をチモテ菌について記述されるように調製して、直接の培養を上記の通りに行った。
【０１７０】
【表４】
2014502256.tif 000006
【０１７１】
表４に示した結果は、MCMC組成物Cの使用が相対的に短期間でマイコバクテリア細胞塊
の有意な量を生じること、およびこのような収率はチモテ菌に制限されないことを示す。
【０１７２】
培養の間、培地のさらなる通気の効果を決定するために、別の研究を行った。チモテ菌の培養は、培地の混合および大気の酸素との接触を増加させるために、3つのバッフルつ
きFermbachフラスコを使用したことを除き、上記の通りに実施した。MCMC-C培地におけるチモテ菌の増殖をBacto（商標）ACブロスおよびMCMC-Aにおけるその増殖と比較した。120時間でのチモテ菌細胞塊収率は、マイコバクテリア細胞塊乾燥重量g/リットル培養培地として決定した。その結果は、Bacto（商標）ACブロスを使用した収率が5.0g/Lであり、MCMC-Aを使用した収率は、3.15g/Lであり、MCMC-Cを使用した収率は、9.2g/L（MCMC-Aに対し2.9倍の増大およびBacto（商標）ACブロスに対し1.84倍の増大）であることを示した。これらのデータは、混合および通気を増大させる培養条件（限定されないがFermbachフラスコなど）において、チモテ菌の収率がさらに増大し、また新たな培地組成物における収率がBacto（商標）ACブロスまたはMCMC-Aのいずれかで見られるものよりも優れることを示
す。
【０１７３】
凍結ストックから調製したマイコバクテリアの種培養を使用して、本発明のマイコバクテリア細胞壁RNCの調製を行った。修正培養液の600mLに1バイアルの凍結ストックを添加
することによって、種培養を凍結ストックから調製し、160〜250rpm（Lab-Line, Melrose
Park, IL, USA）にてオービタルシェーカーにおいて撹拌しながら37℃にて7日間培養を
実施した。次いで種培養を1:10の希釈にてより大きな培養容積を播種するために使用し、培養は7日間同じ条件を使用することにより実施した。マイコバクテリアバイオマスを低
速遠心分離洗浄によって収集し、その後、ペレットにしたマイコバクテリアを注射用水（ヌクレアーゼフリー）に再懸濁して10% w/v懸濁液を得た。本発明の組成物は、下記の実
施例に記載されているように、この懸濁液から調製した。
【０１７４】
典型的には、米国特許第6,326,357号に記載されているようなチモテ菌の培養は、種培
養の生成のために7〜10日間およびマイコバクテリア細胞バイオマスの生成のためにさら
に10〜20日間かかる（17〜30日間の総培養時間）。この製作プロセスの収率は、およそチモテ菌湿重量20g/培養液リットルであり、これはおよそ2〜3gのチモテ菌乾燥重量/リットルに対応する。MCMC組成物および培養条件を使用する上述した新たな製作プロセスは、全体で14日かかり、かつ収率はおよそ6.5〜7.6gのチモテ菌乾燥重量/リットルであり、この
ように、マイコバクテリア細胞塊の収率における有意な増大に加えてバイオマスを調製するために必要とされる時間の有意な減少を提供する。このような改善は、以前の教示と比較したときに、バイオマス生産効率における予想外の増大を提供する。
【０１７５】
この実施例において記述した重要な原則は、外来性動物、植物または真菌の材料を含まないマイコバクテリア細胞塊の調製のための培養培地の使用であり、および最適化された培地を撹拌との組み合わせに使用することにより、静置増殖培養条件の特徴である菌膜よりむしろ懸濁液にマイコバクテリアを維持することにより、マイコバクテリアの増殖を最適化する培養プロセスであることが、理解されるべきである。これらの原則に対する改変は、本発明の精神および／または添付された請求項の範囲を逸脱しない範囲で、特定のマイコバクテリア種、複合物または株の最適な増殖を生じるこの実施例を読んだ後に当業者によってなされてもよい。
【０１７６】
[実施例２]
＜免疫刺激性および抗癌組成物の調製の間での無傷のマイコバクテリアの数の制御＞
以下の実施例では、計測可能な、数mL〜マルチリットル容積の範囲である作業容積を使用し、並びに核酸および細胞壁を含む新たな細菌組成物の効率的な生産を生じる、本発明の組成物の調製のための新たな手順を確認する。
【０１７７】
マイコバクテリア細胞塊（チモテ菌をマイコバクテリア細胞塊の例証および代表例として使用してある）は、実施例１に記載されているように調製した。低速遠心分離によってペレットにして培養液成分を取り除いた後、チモテ菌細胞（DNaseフリーおよびRNaseフリー注射用水中の10% w/v懸濁液として調製した）を、Avestin EmulsiFlex-C5高圧ホモジナイザー（Avestin、Ottawa、Ontario、Canada）を使用する高圧ホモジナイゼーション（1
平方インチにつき18,000ポンド［PSI］、5サイクル、4℃の温度にて）によって破壊した
。本発明から逸脱しない範囲で、類似の、または均等なシステムを用いてもよい。次いでホモジェネートを、無傷のマイコバクテリアの除去のために最適であることが同定された相対遠心力にて、遠心分離した（4℃にて30分間3,160×g）。この実施例において、10% w/v チモテ菌懸濁液の試料、高圧ホモジナイゼーション後のホモジェネート、低速遠心分
離からの上清（無傷および混入しているチモテ菌を含む）およびさらなるサイクルの高圧ホモジナイゼーションに供された低速遠心分離からの上清を連続的に希釈（注射用水中に10-2〜10-7の希釈）して、トリプシン性大豆寒天増殖培地上にプレーティングし、37℃にて72〜96時間インキュベートし、コロニーを計数し、およびCFU/mLとしてこれらを表すことによってコロニー形成単位（CFU）の数を決定した。
【０１７８】
Avestin高圧ホモジナイゼーションシステムは、1〜3サイクル後に酵母および大腸菌細
胞の〜100%破壊を達成することが報告されている（http://www.avestin.com/English/efapplications.html#Rupture）。チモテ菌の100%破壊を達成するための5回のホモジナイゼ
ーション工程の失敗は、これがこの微生物に対する有効性の限界でありうることを当業者に示すであろう。しかし予想外に、5サイクルの高圧ホモジナイゼーションに明らかに耐
性であった無傷のチモテ菌細胞を含む低速遠心分離上清を、4℃の温度にて18,000PSIでの高圧ホモジナイゼーションのさらなる工程（2〜3）に供することが、無傷のチモテ菌細胞をさらに減少させることが判明した（表５）。さらなる高圧ホモジナイゼーション工程における予想外の利益は、無傷のチモテ菌細胞の数のさらなる制御された減少およびマイコバクテリア細胞壁-RNCの収率の増大である。
【０１７９】
チモテ菌は懸濁液培養において細胞の凝集体で増殖するため、マイコバクテリア懸濁液におけるCFUsの数を直接決定することは不可能である（およそ100倍の過小評価であると
決定される）。以下のように決定した算出される評価を使用した：図１に示したような微生物のサイズは、大腸菌のものに類似し（0.5×2μm：Imaging whole Escherichia coli 
bacteria by using single-particle x-ray diffraction.Miao J, et al. PNAS 2003, 100:110-112）、したがって、665フェムトグラム（fg）である個々の大腸菌の重量に基づいてチモテ菌の10% w/v懸濁液の推定CFUの算出が可能になる（Single cell detection with
micromechanical oscillators. Illic, B, et al., J. Vac. Sci. Technol. B. 2001, 19(6):2825-2828）。
【０１８０】
【表５】
2014502256.tif 000007
【０１８１】
表５に示した結果は、5サイクルの高圧ホモジナイゼーションの使用が、懸濁液におけ
るマイコバクテリアの効率的な破壊（99.42%-上記算出に基づく）と合致すること、示す
。高圧ホモジナイゼーションを受けなかった同等のチモテ菌試料と比較して、5サイクル
の高圧ホモジナイゼーション後の低速遠心分離は、無傷の、生存可能なマイコバクテリア細胞の数を5,000倍減少させた。低速遠心分離からの上清を使用するさらなる高圧ホモジ
ナイゼーション工程の使用は、高圧ホモジナイゼーションを受けなかった同等のチモテ菌試料と比較して、無傷の、生存可能なマイコバクテリア細胞の数の2,895倍の減少を示す
さらなる0.007%の量を生じた。
【０１８２】
この実施例において示される重要な原則は、さらなるホモジナイゼーション工程の使用から生じる予想外の利益が、無傷のマイコバクテリアのさらなる破壊であり、それはグラム陽性微生物は高圧ホモジナイゼーションに耐性であると考えられるためであり、および異なるホモジナイゼーション工程の使用を介して低速遠心分離上清に含まれるマイコバクテリア細胞壁RNC画分における無傷のマイコバクテリアのレベルを制御する能力であると
理解されるべきである。
【０１８３】
[実施例３]
＜マイコバクテリア細胞壁およびRNAを含む組成物の調製（MpRNC）＞
【０１８４】
マイコバクテリア細胞壁組成物を調製するための上述した新たなアプローチの有用性をさらに示すために、マイコバクテリア細胞壁と共に製剤化され、かつ以下を含む、新たなマイコバクテリア細胞壁-RNA組成物（MRNC）の調製を可能にする、異なるホモジナイゼーション圧力の使用およびホモジナイゼーションサイクルの数を必要とする新たな手順が開
発された：a)無傷のマイコバクテリア細胞成分の制御された減少;b)規定の長さのオリゴ
リボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドの生成、およびc)予想外の免疫刺激活性の生成。
【０１８５】
この実施例において、マイコバクテリア細胞塊（チモテ菌をマイコバクテリア細胞塊の例証および代表例として使用し、並びにこの実施例において記述した製造手順を細菌およびマイコバクテリアの両方に適用できることが理解されるべきである）は、実施例１に記載されているように調製した。無傷のチモテ菌細胞は、まず低速遠心分離によって洗浄して培養液成分を除去し、次いでAvestin EmulsiFlex-C5高圧ホモジナイザー（Avestin、Ottawa、Ontario、Canada）で高圧ホモジナイゼーションを使用して破壊した。高圧ホモジ
ナイゼーションの後、残りの無傷のマイコバクテリア細胞を任意の残留する無傷の破壊されていないマイコバクテリアの制御された除去、並びに可溶性材料（タンパク質を含む細胞質成分）の除去のために最適化された相対遠心力を使用して、分画遠心法によって取り除いた。マイコバクテリア細胞壁断片を伴うオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドの形態のマイコバクテリアのRNAを含む無傷のマイコバクテリア細胞フリーの標
品を、可溶性混入物を取り除くために、より高い相対遠心力にて遠心分離洗浄することによってさらに精製した。MpRNC画分を高い相対遠心力にて遠心分離洗浄後のペレットとし
て単離した。MpRNC画分における生きているマイコバクテリアの数は、トリプシン性大豆
寒天増殖培地上にマイコバクテリアの無傷の細胞フリーの画分の段階希釈物をプレートにまき、37℃にて72〜96時間インキュベートして、コロニー形成単位（CFU）の数を決定す
ることによって決定した。次いでMpRNC懸濁液を121℃にて5〜30分間熱処理した。表６は
、高い、中間の、または低い無傷のマイコバクテリア細胞塊（それぞれ、以下高MpRNC、
中間MpRNCおよび低MpRNCという）を有するMpRNCを調製するために使用した工程を示す。
【０１８６】
【表６】
2014502256.tif 000008
【０１８７】
表７において示す結果は、表６において記述した種々の手順を使用して調製されるMpRNCにおけるCFUsの数を示す。
【０１８８】
【表７】
2014502256.tif 000009
【０１８９】
このデータは、MpRNCが受けるホモジナイゼーション圧力およびホモジナイゼーション
サイクルの数を増加させることによる、MpRNC内に存在する生存可能な無傷のチモテ菌細
胞の数における有意な、かつより重要なことに制御された減少を示す。無傷のマイコバクテリアの重量%の算出（細菌重量665fgに基づく）は、＜0.2%（低MpRNC）から19.6%（高MpRNC）までの制御された範囲を示した。したがって、当業者であれば、MpRNCにおける生存可能なマイコバクテリア細胞の数は、本発明に記載されているようなホモジナイゼーショ
ン圧力の制御された使用、ホモジナイゼーションサイクルの数および特異な遠心分離の使用などの規定された方法の適切な使用によって、100倍の範囲を超えて容易に制御するこ
とができると認識するであろう。
【０１９０】
[実施例４]
＜ウシ結核菌株BCG、マイコバクテウム・スメグマチスおよびマイコバクテウム・バッカ
エからのMRNCの調製＞
この実施例において、3つの異なるマイコバクテリア、培養における増殖が遅いことが
知られている1つおよび培養における増殖が速いことが知られている2つを使用して、異なるMRNC組成物を調製した。したがって、本実施例は、本発明の実施例1、2および3と組み
合わせて、任意のマイコバクテリア種または株からMRNCを調製する方法を当業者に教示する。核酸組成物を保存するために、ヌクレアーゼフリー（RNaseフリーおよびDNaseフリー）試薬を全体にわたって使用した。本発明を読んだ当業者はまた、チモテ菌からのMpRNC
の調製のための実施例1、2および3に詳細に記載されているような、異なるホモジナイゼ
ーションサイクルおよび圧力の使用の適用、並びに分画遠心分離法の選択的な使用により、所望の用途のためにその他の種から最適なレベルの無傷のマイコバクテリア細胞を含むRNC組成物の調製が可能になることを認識するであろう。
【０１９１】
マイコバクテリアバイオマスからの、または市販の供与源からのウシ結核菌BCGをMbRNC組成物を調製するために使用することができる。この実施例では、BCGのConnaught株を使用した。BCGは、2〜10x108 CFU/mgを含む凍結乾燥粉末（Immucyst、Aventis、Toronto、ON、Canada）として商業的に入手可能である。凍結乾燥粉末は、まず30分間20℃で断続的
にボルテックスしながら注射用水（Wisent）に再懸濁した。懸濁された細胞を低速遠心分離によってペレットにし、次いでAvestin EmulsiFlex-C5高圧ホモジナイザーによる高圧
ホモジナイゼーションを使用して破壊して、続く分画遠心分離法によって、中間MpRNCに
ついて記述したように、少し変更してMbRNCを単離した。具体的には、注射用水中の0.243% w/vウシ結核菌BCG懸濁液を4℃にて水を循環させた熱交換器で、18,000psiにて5サイク
ルの高圧ホモジナイゼーションに供した。次いでホモジェネートを30分間3,160×gにて遠心分離して、任意の残留した、無傷の破壊されていないウシ結核菌BCGを沈殿させた。マ
イコバクテリア細胞壁断片を伴うマイコバクテリアのRNCを含む上清を、次いで1時間38,400×gにて遠心分離して、可溶性混入物を除去して、RNCおよびウシ結核菌BCG細胞壁（MbRNC）をペレットにした。次いでこのペレットを注射用水に再懸濁して、上記のようにさらなる2サイクルにてホモジナイズした。このウシ結核菌MbRNCを含む懸濁液を5〜30分間121℃にて、熱処理した。
【０１９２】
培養したマイコバクテリアバイオマスからのマイコバクテウム・スメグマチス（ATCC、Manassas、VA、株14468から得られる）を使用してMsRNCを調製した。マイコバクテウム・スメグマチス細胞は、実施例１に記載されているように調製した。無傷のマイコバクテリア（マイコバクテウム・スメグマチス）は、MpRNCについて記載したように、最初に低速
遠心分離によって洗浄して培養液成分を除去し、次いでAvestin EmulsiFlex-C5高圧ホモ
ジナイザーによる高圧ホモジナイゼーションを使用して破壊して、続いて分画遠心分離した。詳細には、注射用水中の10% w/v マイコバクテウム・スメグマチス細胞懸濁液を18,000psiにて5サイクルの高圧ホモジナイゼーションに供した。ホモジェネートを、次いで4
℃にて30分間3,160×gにて遠心分離して、無傷の破壊されていないマイコバクテリアを沈殿させた。マイコバクテリア細胞壁断片を伴うマイコバクテリアのRNAを含む上清を、次
いで4℃にて1時間38,400×gにて遠心分離して、可溶性混入物を除去して、MsRNCをペレットにした。このMsRNCペレットを、次いで注射用水に再懸濁して、上記のようにさらなる2サイクルにてホモジナイズした。このマイコバクテウム・スメグマチス RNC（MsRNC）を
含む懸濁液を、5〜30分間、121℃にて熱処理した。
【０１９３】
マイコバクテウム・バッカエ（株ATCC15483、American Typing Culture Collections、Manassas、Virginia、USA）は、OADC濃縮（BD Diagnostic System、Sparks、Maryland、USA）を供給したMiddlebrook 7H9ブロス中で培養した。ペレットにした細菌は、使用の前
に-20℃にて貯蔵した。OADC濃縮（BD）を供給したMiddlebrook 7H9ブロスの使用により、合成培地における増殖と比較して、OADC濃縮における未知の増殖因子の存在のために、マイコバクテウム・バッカエの最適な増殖が可能になった。この実施例では、外来性材料へのさらなる曝露がないことを保証するために、本明細書において記述した新たな製造方法を使用した。細胞を、MpRNCについて記述したように、まず低速遠心によって洗浄して培
養液成分を除去し、次いでAvestin EmulsiFlex-C5高圧ホモジナイザーによる高圧ホモジ
ナイゼーションを使用して破壊して、続いて分画遠心分離した。詳細には、注射用水中の10% w/vマイコバクテウム・バッカエ懸濁液を18,000psiにて高圧ホモジナイゼーションの5回の通過に供した。マイコバクテリア細胞壁断片を伴うマイコバクテリアのRNAを含む上清を、次いで38,400×gにて1時間遠心分離して、可溶性混入物を除去して、MvRNCをペレ
ットにした。このペレットを、次いで注射用水に再懸濁して、上記の通りにさらなる2サ
イクルにてホモジナイズした。マイコバクテウム・バッカエ RNC（MvRNC）を含む懸濁液
を5〜30分間121℃にて熱処理した。
【０１９４】
[実施例５]
＜グラム陰性細菌からのBRNCの調製＞
本発明のBRNC組成物は、たとえば細菌の破壊後にフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出およびエタノール沈澱することによって、1つまたはいくつかのグラム
陰性細菌から調製することができる（Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, Ausubel et al. Eds., John Wiley & Sons Inc., New York, USAに記載されるよう
に）。核酸を含む組成物の抽出の前に、不要な化学的種を消化するように設計されている酵素処理を使用し、これにより収率を最適化してもよい。たとえば、グラム陰性細菌を5mL RNaseフリー50mM Tris-HCl、5mM EDTA、pH 8.0中に懸濁し、RNaseフリーのリゾチーム
（Sigma-Aldrich）を1mg/mLの濃度で添加し、37℃にて90分間インキュベートした。次い
でRNaseフリーのプロテイナーゼK（Invitrogen, Burlington, Ontario, Canada）を添加
して0.1mg/mLの終濃度を与え、RNaseフリーのドデシル硫酸ナトリウム（BioRad、Richmond、California）を添加して1% w/vの終濃度を与え、65℃で10分間インキュベーションを
続けた。核酸を、次いでフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出によって単離した。RNA含有組成物を任意に処理して（たとえば、高圧ホモジナイゼーションの使用
、機械的分断、超音波処理または加圧滅菌によって）、本発明のオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドを生成することができる。
【０１９５】
本発明の実施例１、２、３および４に記載されているように、高圧ホモジナイゼーションの使用、並びに分画遠心分離法および熱処理によって、細菌RNAを任意に使用して細菌
細胞壁RNC製剤（BRNC）を調製することができ、その結果、これらは抗癌および免疫刺激
性の活性を有する。BRNCは、実施例３６および３７に記載されているように、限定されないがカチオン性リポソームまたはナノ粒子などの医薬品担体と組み合わせることができる。
【０１９６】
[実施例６]
＜グラム陽性菌からのBRNCまたはMRNCの調製＞
BRNC組成物および本発明のMRNC組成物は、1つのまたはいくつかのグラム陽性菌（マイ
コバクテリアを含む）から、たとえば、細菌またはマイコバクテリアの破壊、続くフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出およびエタノール沈澱によって調製することができる（Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, Ausubel et al. Eds., John Wiley & Sons Inc., New York, USAに記載されているように）。RNAの抽出前に不要な化学的種を消化するように設計されている酵素的手順を使用して、これにより収率
を最適化してもよい。上述した新規な手順の適用性における一例として。グラム陽性菌はを5mL RNaseフリー50mM Tris-HCl、5mM EDTA、pH 8.0中に懸濁し、RNaseフリーのリゾチ
ーム（Sigma-Aldrich）を1mg/mLの濃度まで添加して、37℃にて90分間インキュベートし
た。次いでRNaseフリーのプロテイナーゼK（Tritirachium album. Invitrogen, Burlington, Ontario, Canadaから調製される）を、0.1mg/mLの終濃度を与えるように添加し、RNaseフリーのドデシル硫酸ナトリウム（BioRad、Mississauga、Ontario、Canada）を1% w/v終濃度を与えるように添加して、65℃にて10分間インキュベーションを続けた。次いでRNAをフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出およびエタノール沈澱によって
単離した
【０１９７】
BRNCおよびMRNCを任意に処理して（たとえば、高圧ホモジナイゼーションの使用、機械的分断、超音波処理または熱処理によって）、本発明のオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドを生成することができる。
【０１９８】
本発明の実施例１、２、３および４に記載したように、高圧ホモジナイゼーションの使用、並びに分画遠心分離法および熱処理によって、細菌RNAを任意に使用してBRNC製剤を
調製することができ、その結果、これらは抗癌および免疫刺激性の活性を有する。細菌RNCは、実施例３６および３７に記載したように、限定されないがカチオン性リポソームま
たはナノ粒子などの医薬品担体とさらに組み合わせることができる。
【０１９９】
本発明の実施例１、２、３および４に記載したように、高圧ホモジナイゼーションの使用、並びに分画遠心分離法および熱処理によって、マイコバクテリアRNAを任意に使用し
てMRNC製剤を調製することができ、その結果、これらは抗癌および免疫刺激性の活性を有する。MRNCは、実施例３６および３７7に記載されているように、限定されないがカチオ
ン性リポソームまたはナノ粒子などの医薬品担体とさらに組み合わせることができる。
【０２００】
[実施例７]
＜無傷のマイコバクテリア細胞のためのマイコバクテリア細胞壁組成物の形態学的調査＞
マイコバクテリア細胞壁組成物の形態比較を、透過型電子顕微鏡法（TEM）を使用して
実施した。この実施例において、MpRNCは、BRNCおよびMRNCにおける無傷の細胞成分の例
証および代表例として使用されることが理解されるべきである。
【０２０１】
チモテ菌バイオマスの試料は、実施例１に記載したように調製し、高、中間および低MpRNCの試料は、実施例３に記載したように調製し、MCCの試料は、米国特許第6,326,357号
に記載したように調製し、MCWEの試料は、米国特許第5,759,554号に記載したように調製
した。後者の2つの製造方法の両方共が、プロナーゼ/トリプシン消化およびフェノール/
尿素処理を利用する手順を使用する。全ての試料を、TEMを使用して形態学的に調査した
。注射用水中の懸濁液（1mg/mL w/v）として調製した試料を、5% w/vグルタルアルデヒドで1時間事前に固定した（体積比：1: 1）。遠心分離（10分間8,000×g）の後、ペレット
を新鮮な2.5% v/vグルタルアルデヒド中に懸濁して、4℃にて一晩インキュベートした。
インキュベーションの後、試料を洗浄バッファーで洗浄し、さらなる処理の前に4℃にて
洗浄バッファー中に保持した。洗浄バッファー中で3回洗浄した後に、試料を四酸化オス
ミウムおよびフェロシアン化カリウムで2時間予め染色して、洗浄して、アセトン中で脱
水した。次いで試料をアセトン中のEpon（商標）の濃度を増大させながら浸潤させ、48時間58℃にて重合させた。厚切片（90〜100nm）を200-メッシュの銅の網の上に置いて、酢
酸ウラニルで、続いてレイノルズ鉛で染色した。試料をJEOL JEM-2011 200kV w/Fas TEM w/ Quartz XOne Microanalytical SystemおよびGatan DualView 300W 1.3k×1k CCDカメ
ラまたはAMT 2k×2k CCDカメラを備えたPhilips CM200 200 kV TEMで調査した。
【０２０２】
形態学的解析の結果を図１に示してある。図１ａは、無傷のチモテ菌（参考材料として
使用した）を示し、図１ｂは、米国特許第6,326,357号にしたがって調製したMCCを示し、および図１ｃは、米国特許第5,759,554号にしたがって調製したMCWEを示す。破壊されて
いないチモテ菌細胞は、電子密度の高い構造として観察され、もしあったとしても極めて少ない細胞膜または細胞壁断片を含んでいた。予想外なことに、MCWEおよびMCCの調製に
おいて使用した分画遠心分離法工程を考慮すれば、これらの組成物が、無傷のマイコバクテリアおよび細胞壁断片の混合物と合致する電子高密度および電子透過的構造の混合物であることが観察された（それぞれ無傷の細菌の8.5および3.0%であると見積もられる）。
図１ｄ、１ｅおよび１ｆは、本発明の実施例３における製造手順を用いることにより、低、中間および高MpRNCにおける無傷のマイコバクテリアの数がそれぞれ制御されることを
示す（それぞれ0.0、2.5および12.5%であると見積もられる）。
この形態学的解析の結果は、本発明の製造方法がMpRNC製剤における制御可能な無傷の
マイコバクテリア細胞成分をもたらすことを示す。
【０２０３】
[実施例８]
＜マイコバクテリア細胞壁組成物における製造混入物＞
米国特許第5,759,554号（MCWE）および米国特許第6,326,357号（MCC）にしたがって製
造するマイコバクテリア細胞壁の両方では、フェノール/尿素処理工程と組み合わせたタ
ンパク質分解酵素消化（ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）プロナーゼ/ウシトリプシン）を使用する。たとえこれらの特許の両方がこれらおよびその他
の混入物を除去するための洗浄手順の使用を教示するとしても、このような手順は最終的な細胞壁組成物におけるタンパク質分解酵素およびフェノールの混入を生じるであろう。
【０２０４】
この実施例では、米国特許第5,759,554号、米国特許第6,326,357号にしたがって製造したマイコバクテリア細胞壁および本発明の実施例３にしたがって製造したMRNCのフェノール成分/混入物を、HPLCによって決定した。中間MpRNCをMRNCの代表例として使用していること、および本発明の実施例３において教示した製造原理が全てのMRNCに対し、並びにBRNCに対して適用できることは理解されるべきである。
【０２０５】
異なるマイコバクテリア細胞壁組成物の懸濁液（注射用水中の1mg/mL）または水中の適切なフェノール標準（0〜10μg/mL）を60分間100℃にて12M HClで処理した。冷却の後、
マイコバクテリア細胞壁組成物またはフェノール標準をジエチルエーテル（2mLジエチル
エーテル/mg細胞壁組成物）で抽出した。ジエチルエーテル相を取り除いてメタノール中
の0.05M NaOHと混合した（3mL/mg細胞壁組成物）。窒素気流を用いた蒸発乾固の後、残渣を水に溶解して（0.2mL/mgマイコバクテリア細胞壁）、100μLをHPLCによってフェノール成分について解析した。解析のためのHPLCシステムは、4μmシリカ（Waters Ltd.、Lachine、Quebec、Canada）が詰められたC-18逆相分析4.6×150mmカラム（Waters、Nova-Pak C18、WAT 044375）に接続したオートサンプラー、Waters 1525 Binary HPLC PumpおよびWaters 248L 二波長吸光度検出器を加えた717からなるWaters Breeze HPLCシステムを利用
した。HPLC分離は、100μLの試料容積を使用して室温にて、および以下の勾配溶出条件を使用して1.0mL/分の流速にて行った：溶出剤Aは1%酢酸（v/v）で酸性化した水であり、溶出剤Bは100%アセトニトリルであった。溶出剤Aを2分間95%にて維持し、次いで15分にわたって60%まで直線的に減少させ、それを3分間保持した。フェノールのUV検出を270nmにて
行った。
【０２０６】
外因性タンパク質の検出のために、20mLの異なるマイコバクテリア細胞壁組成物を72時間の間、凍結乾燥した。タンパク質を、修正RIPA抽出バッファー（1% Triton X-100、0.5% NP-40%、1%SDS、150mM NaCl、1mM EDTA、10mM Tris pH 7,5、4℃にて）を使用して、凍結乾燥したマイコバクテリア細胞壁組成物から抽出した。抽出物の総タンパク質含量をMacart法にしたがって測定した（Macart and Gerbaut, 1982 Clin. Chim. Acta 122:93-101）。試料をLaemmliサンプルバッファー（62.5mM Tris-HCl、pH 6.8、2%SDS、25%グリセロ
ール、0.01%ブロムフェノールブルーおよび5%メルカプトエタノール）で希釈して、1mLあたり1mgのタンパク質の濃度を与えた。60μLの希釈した試料の全量を10%〜20%の勾配SDS-PAGEゲル（Bio-Rad、Mississauga、Ontario、Canada）上にロードして、電気泳動を6〜8
時間140Vで室温にて実施した。キャリブレーションのため、分子量標準混合物（Bio-Rad
、Mississauga、Ontario、Canada）を試料と平行して泳動した。ゲルを室温にて38時間、コロイダルブルー染色（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）を使用して、タンパク質につ
いて染色した。所定のバンド（80、異なる分子量のタンパク質を含む）をゲルから切り出して、96ウェルプレートに置き、次いで水で洗浄した。トリプシン消化を製造者の説明書にしたがってMassPrep液体ハンドリングロボット（Waters、Milford、MA、USA）で行った。簡潔には、タンパク質を10mM DTTで還元させ、55mMヨードアセトアミドでアルキル化した。トリプシン消化を1時間58℃にて105mM修正ブタトリプシン（Sequencing grade、Promega、Madison、WI、USA）を使用して行った。消化産物を1%ギ酸、2%アセトニトリル、続
いて1%ギ酸、50%アセトニトリルを使用して抽出した。回収した抽出物をプールし、真空
遠心分離乾燥させ、次いで、8μLの0.1%ギ酸に懸濁して、4μLを質量分光測定によって解析した。ペプチド試料をオンライン逆相（RP）ナノスケール毛管液体クロマトグラフィー（nanoLC）によって分離して、エレクトロスプレー質量分光測定（ES MS/MS）によって解析した。実験は、ナノエレクトロスプレーイオン源（ThermoFisher）を備えたLTQリニア
イオントラップ質量分光計（ThermoFisher、San Jose、CA、USA）に接続しているThermo Surveyor MSポンプで行った。ペプチド分離は、30分間2〜50%の溶媒B（アセトニトリル、0.1%ギ酸）による直線勾配で、200nL/分（流れを分割することによって得られる）にて、PicoFritカラムBioBasic C18、10cm×0.075mmの内径、（New Objective、Woburn、MA）で行った。質量スペクトルは、Xcaliburソフトウェアバージョン2.0を使用してデータ依存
的捕捉モードを使用して取得した。各フルスキャン質量スペクトル（400〜2000m/z）は、7つの最も強いイオンの衡突解離を行った。動的排除（30秒排除期間）機能を可能にし、
相対衝突断片化エネルギーは35%にセットした。全てのMS/MS試料は、Mascotを使用して解析した（Matrix Science, London, UK; version 2.2.0）。消化酵素がトリプシンである
場合、MascotはUniref100データベースを検索するようにセットアップした。Mascotは、0.50Daのフラグメントイオン質量寛容性および2.0Daの親イオン寛容性により検索した。システインのヨードアセトアミド誘導体は固定された修飾として特定され、メチオニンの酸化は多様な修飾として特定された。2つの失敗したトリプシン消化切断部位が認められた
。Scaffold（Proteome Software Inc., Portland, OR）を使用して、MS/MSに基づいたペ
プチドおよびタンパク質同定を確認した。ペプチド同定は、Peptide Prophetアルゴリズ
ムによって特定されるように、これらを95.0%を超える蓋然性にて確立することができた
場合、受け入れた（Keller、A et al Anal. Chem. 2002; 74(20):5383-92)。タンパク質
同定は、これらを95.0%を超える蓋然性にて確立することができ、かつ最低2つの同定されたペプチドを含む場合、受け入れた。タンパク質の蓋然性は、Protein Prophetアルゴリ
ズムによって与えられた（Nesvizhskii, AI Anal Chem. 2003 Sep 1;75(17):4646-58）。類似のペプチドを含んでおり、MS/MS解析のみに基づいて区別することができないタンパ
ク質は、最少の数のタンパク質を生成するように分類した。
【０２０７】
得られた結果（表８）は、MCWEおよびMCCの両方がフェノールおよびプロテアーゼアミ
ノペプチダーゼ、ストレプトマイセス・グリセウスのプロナーゼにおいて見いだされる主要なタンパク質分解酵素による混入があることを示す。実施例３、表７に記載したように製造したMpRNCは、フェノールまたは任意の検出可能なプロナーゼ成分を含まなかった。
【０２０８】
【表８】
2014502256.tif 000010
【０２０９】
表８のデータは、マイコバクテリア細胞壁の製造におけるフェノールの使用が、検出可能なフェノール、並びにMCWEおよびMCCの場合において比較可能である外来性タンパク質
（プロナーゼアミノペプチダーゼ）混入を引き起こしたことを示す。本発明の製造手順を使用することの1つの利点は、それによってRNaseフリーの注射用水のみがMRNC組成物を得るのに使用され、生じる組成物がフェノールおよび外来性タンパク質混入についてフリーであるということである。
【０２１０】
フェノールは両親媒性であり、マイコバクテリア細胞壁におけるそのその後の存在はマイコバクテリア細胞壁（ミコール酸に共有結合される）の疎水性領域における局在化と合致し、それは、繰り返される遠心分離に基づく洗浄にもかかわらずトラップされたままである。
【０２１１】
MCWEおよびMCCにおける混入タンパク質、具体的にはストレプトマイセス・グリセウス
のアミノペプチダーゼの解析は陽性であり、このように、マイコバクテリア細胞壁の調製において使用される酵素処理が、外来性および潜在的に免疫原性のタンパク質の存在を生じることを確認した。
【０２１２】
[実施例９]
＜電気泳動によって決定したMpRNC組成物の核酸成分およびプロファイル＞
中間MpRNCをMRNCの代表例として使用していること、およびこの実施例において教示し
た解析が全てのMRNCおよびBRNC組成物に適用できることは理解されるべきである。
【０２１３】
熱処理（121℃、30分）の前後に回収される注射用水中の中間MpRNC懸濁液を、その核酸プロファイルについてBioanalyzerシステム（Bioanalyzer model # 2100, Agilent, Santa Clara, CA, USA）を使用して電気泳動により解析した。核酸画分は、実施例６に記載したように得た。核酸画分は、30ng/μLの濃度に希釈した。抽出された核酸の長さの電気泳動解析は、RNA 6000 nano kit（Agilent # 5067-1511）を使用してBioanalyzer電気泳動
ユニットにより達成した。このキットは、25〜6000ヌクレオチドの範囲のRNAの質につい
ての情報を提供する。次いで、加圧滅菌後の中間MpRNCを、6〜150ヌクレオチドのサイズ
範囲における小さな核酸の解析のために設計されているSmall RNA Kit（Agilent Technologies Canada Inc., St. Laurent, Quebec, Canada, kit # 5067-1548）を使用してさら
に解析した。高MpRNCおよび低MpRNCはまた、Small RNA kit（Agilent）を使用して、熱処理（121℃、30分）後に解析した。種々の電気泳動解析の結果を図２ａおよび図２ｂに示
してある。
【０２１４】
図２ａは、RNA nano 6000 kitを使用して解析したときに、加圧滅菌前の中間MpRNCがおよそ25塩基から4000塩基近くまでの間の核酸プロファイルを有することを示す。結果は、中間MpRNCを調製するために高圧ホモジナイゼーション工程（種々の圧力およびサイクル
の数）を使用することにより、25〜4000塩基のポリリボヌクレオチド鎖長を含む組成物を生じることを示す。加圧滅菌後、中間MpRNCは、25塩基〜200塩基の範囲のより小さい核分布を示す（図２ｂ）。Small RNA Kitを使用したさらなる解析は、加圧滅菌前の標品から
得られるプロファイルと比較して、全てのMpRNC標品（高、中間および低）が、比較可能
である（図２ｂ）が、量の異なる（高＞中間＞低）核酸プロファイルを有することを示す。
【０２１５】
図２ｂは、中間MpRNCが、20〜40塩基に最大のオリゴリボヌクレオチドピークを有し、
および5〜60塩基の長さの核酸プロファイルを有することを示す。MpRNC組成物は、100塩
基にて溶出する核酸材料を少量のみ有し、および長さ約150塩基にて溶出するさらにより
少ないオリゴリボヌクレオチド物質を有した。MpRNCを調製するために高圧ホモジナイゼ
ーションおよび熱処理工程（熱処理に加えて種々の圧力およびサイクルの数）を使用することにより、60塩基未満のオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチド鎖長を含む組成物を生じることを示す。比較可能な核酸プロファイルはまた、低MpRNCおよび高MpRNCにおいても観察される（図２ｂ）。
【０２１６】
[実施例１０]
＜チモテ菌およびMpRNC組成物における核酸の解析＞
この実施例において、チモテ菌およびMpRNC組成物（高、低および中間）の核酸含量を
決定した。MpRNC組成物は、実施例３に記載されているように調製した。この実施例にお
いて、MpRNCは、MRNCの核酸成分の例証および代表例として使用されることが理解される
べきである。
【０２１７】
核酸は、以下の手順を使用してそれぞれの組成物から抽出した。それぞれの組成物の一定分量（1mg/mlの濃度にて700μL）をDNaseフリーおよびRNaseフリーのリゾチームで消化して、続いてDNaseフリーおよびRNaseフリーのプロテイナーゼKで不活性化し、さらに消
化した（両方ともSigma-Aldrich Canada、Oakville、Ontarioから）。核酸をフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24:1 v/v）によって抽出して、グリコーゲン
、酢酸ナトリウムおよびエタノールの添加によって沈殿させた。沈殿物を80%の氷冷エタ
ノールで洗浄して、50μL蒸留水において可溶化した。濃度は、UV分光光度計において260/280nmにて吸光度を測定することによって決定した。各組成物の核酸含量を表９に示してある。
【０２１８】
【表９】
2014502256.tif 000011
【０２１９】
これらの結果は、MpRNC（たとえば高MpRNC）における無傷のマイコバクテリア細胞の量の増加が、MpRNC組成物における核酸の量の増加と関連していることを示す。結果はまた
、MpRNCの核酸含量（2,683〜15,686 ng/mg）が無傷のチモテ菌のもの（44,786ng/mg）と
有意に異なることを示す。
【０２２０】
[実施例１１]
＜MpRNCおよびオートクレーブ処理したチモテ菌におけるRNAに対するDNAの比率の決定＞
MpRNC組成物をMRNCの代表例として使用していること、およびこの実施例において教示
した解析を全てのMRNCおよびBRNC組成物に適用できることは理解されるべきである。
【０２２１】
実施例３のように調製した高MpRNC、中間MpRNCおよび低MpRNC、並びにオートクレーブ
処理したチモテ菌細胞（実施例１に記載したように調製した）のRNAに対するDNA比率の解析は、まず抽出した核酸のRNase Aによる酵素消化、続いてBioanalyzer 2100電気泳動プ
ロファイリングおよびAgilent Small RNA Kit（キット# 5067-1548）を使用したオリゴリボヌクレオチド含量の定量化を使用して行った。
【０２２２】
抽出した核酸（RNaseバッファー中の1260ng/μL）のRNase A消化は、DNaseフリーのリ
ボヌクレアーゼA（RNAse-A、DNase活性を除去するために30分間100℃にて処理した）（0.1μg酵素、37℃にて2時間）を使用することによって実施した。RNAse-Aは、Ameresco（Solon, OH, USA）から得た。RNase A処理した核酸の試料（20ng/μL）を、Bioanalyzerを使用して解析した。DNAおよびRNAの量を高MpRNC、中間MpRNCおよび低MpRNC、並びに無傷の
オートクレーブ処理したチモテ菌細胞において以下の式を使用して決定した：
DNA含量=（総核酸含量−RNase A処理後の核酸含量）。
【０２２３】
Bioanalyzer解析の結果を、高MpRNCについて図３ａ、中間MpRNCについて図３ｂ、低MpRNCについて図３ｃおよびオートクレーブ処理したチモテ菌全細胞について図３ｄに示してある。RNAおよびDNA含量に関するMpRNC（高、低および中間）の解析の結果を表１０に示
してある。
【０２２４】
【表１０】
2014502256.tif 000012
【０２２５】
第2に、本発明のMpRNC（低、中間および高）の核酸含量およびRNAに対するDNA比率の解析は、以下のようにより高感度定量的方法を使用して行った：実施例６において得られた核酸画分を、Microsep 1Kユニットを使用して、限外濾過によって回収した（分子量カッ
トオフ=1000Da、Pall（登録商標）、Life Sciences, Ann Arbor, MI, USA）。次いで核酸溶液をLiangによって報告された手順（Liang et al., Ann. Chim. Acta 2009, 650:106-110）の後、ヌクレアーゼP1（Sigma-Aldrich、Oakville、ON、Canada）を使用して、ヌク
レオシド5'-モノホスフェートの混合物に消化した。最適なヌクレアーゼP1消化を保証す
るために、調査されるべき合計50μLの核酸水溶液を10分間95〜100℃にて湯煎において加熱して、続いて氷上で即時に冷やした。ヌクレアーゼP1は、0.5mM ZnCl2、pH 5.3を含む30mM酢酸ナトリウムバッファー中に5ユニット/μLにて調製した。酵素消化のために、50μLの核酸水溶液を同じ容積のヌクレアーゼP1溶液と混合して、次いで30分間50℃にてイン
キュベートした。生じる混合物を室温まで冷却し、HPLC分析の前に室温にて20分間10,000gにて遠心分離することによってNanosep 10Kフィルターを通して濾過した。
【０２２６】
また、DNAおよびRNAに存在するそれぞれ100、10、5、2.5、1ng/μLのモノヌクレオチドを含むモノヌクレオチド標準の混合物の段階希釈（デオキシリボおよびリボヌクレオチド、Sigma-Aldrich）をヌクレアーゼP1処理に処理して、HPLC分析における標準として使用
するために濾過した。これらのヌクレオチドの溶出順序を同じHPLC条件下で個々のヌクレオチドの滞留時間を比較することによって確認した。HPLC解析は、脱ガス器を備えた四級ポンプ、オートサンプラー、カラムヒーターおよび多波長UV検出器を備えた1200シリーズHPLCシステム（Agilent、StLaurent、Quebec、Canada）を使用して行った。Zorbax Bonus-RPカラム（Agilent）を使用し、移動相は10mMリン酸カリウムバッファー、pH 7.2およびメタノール（0〜10%メタノール）の直線勾配を含んだ。モノヌクレオチドは、260nmにて
検出した。
【０２２７】
DNA：RNA比率はをDNAおよびRNAデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの定量化の後に決定した（表１１）。
【０２２８】
【表１１】
2014502256.tif 000013
【０２２９】
これらの結果は、高MpRNCから低MpRNCへ行くにつれて減少した無傷のチモテ菌細胞含量と合致する核酸含量における〜50%の全体的な減少があることを示す。この解析における
全てのMpRNC組成物は、DNAおよびRNAの両方を有し、中間MpRNCおよび低MpRNCにおける比
率を比較可能であった。これらのデータは、全マイコバクテリア細胞核酸が高MpRNCから
低MpRNCへ行くにつれて除去されることに合致しており、したがってMpRNCにおけるRNAは
細胞壁結合しており、したがって生物学的活性に関して最適な活性である。
【０２３０】
[実施例１２]
＜MpRNC、MbRNC、MsRNCおよびMvRNCのRNAおよびDNA割合＞
マイコバクテリアRNC組成物を、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を使用
して、これらのRNA：DNA比率について電気泳動で解析した。この実施例において使用したマイコバクテリアが、一般的にマイコバクテリアのための代表例として使用されることを理解すべきである。チモテ菌、ウシ結核菌株BCG、マイコバクテウム・スメグマチスおよ
びマイコバクテウム・バッカエからのMRNCは、実施例３および４に記載したように調製した。核酸画分は、実施例６に記載したように調製した。核酸画分（50μL）をそれぞれ25
μLの2つの一定分量に分けた。2.5時間25V/cmにて予め泳動した変性尿素-PAGEゲル上にロードする前に、2時間37℃にて、1つの一定分量を10μgのRNase A（Amresco、Solon、Ohio、USA）で処理し、もう一方を注射用水（Wisent, RNase and DNase-free）で処理した。
ゲルを、312nmの波長にてUVによって視覚化される前に、15分間1×Trisホウ酸塩バッファー（89mM Tris、89mMホウ酸、2mM EDTA、pH 8.0）中に10,000×に希釈したSYBRGold（登
録商標）溶液（Invitrogen）で染色した。ゲルイメージをNIH（Bethesda, Maryland, USA）からのImageJイメージプロセシングおよび解析ソフトウェアを使用してデジタル化した。結果を図４に示してある。変性PAGE電気泳動（図４の（ａ））によって示される核酸のサイズ分布を、チモテ菌RNCについて実施例１１に記載したように、マイクロ流体チップRNA解析によって確認した。
【０２３１】
RNase感受性のRNAの割合を図４ｂに示してある。マイコバクテリアRNCのRNA画分のRNase Aによる処理により、MbRNCについてシグナル強度における26.3%の減少、MsRNCについて46.1%の減少、MpRNCについて53%の減少およびマイコバクテウム・スメグマチスRNCについて60%の減少を生じた。したがって、本発明のMRNC組成物は、RNAse感受性のRNAを含む。
【０２３２】
ウシ結核菌BCG RNCと比較したときに、マイコバクテウム・バッカエRNC、チモテ菌RNC
およびマイコバクテウム・スメグマチスRNCにおけるRNAのより高い割合は、チモテ菌、マイコバクテウム・スメグマチスおよびマイコバクテウム・バッカエが、ウシ結核菌BCGと
比較したときに全て迅速に増殖する種であるという事実、並びにこれらがより強力なリボソームRNA発現プロモーターおよびさらなるリボソームRNAオペロンを有するという事実と合致している（Gonzalez-Y-Merchand, et al. 1997. J. Bacteriol. 179(22): 6949-6958)。このようなデータは、代謝要求の増加と合致しており、より速く増殖するマイコバク
テリア種のmRNAおよびrRNAプールの両方におけるRNAレベルの増加として現れる。
【０２３３】
[実施例１３]
＜MpRNCの脂質含量＞
MpRNCの脂質含量およびMpRNCに存在する分子の種類を決定した。この実施例において、本発明の実施例２および３において記述した手順を使用して製造されるMRNCの脂質含量の例証および代表例として中間MpRNCを使用することが理解されるべきである。異なるマイ
コバクテリア種は異なるミコール酸プロファイルを有するが、この実施例において教示した原則をマイコバクテリア科およびマイコバクテリア属に適用可能であることもまた、理解されるべきである。
【０２３４】
マイコバクテリア由来の細胞壁組成物は、たいていこれらの調製において溶媒で処理されて脂質が除去される（たとえばRibi et al., 1966, J. Bacteriol., 91:975-983を参照、これには石油エーテルまたはアセトンの使用が記述される）。このような手順は、共有結合して抽出不可能な脂質種中の化学物質の可溶化のために、溶媒混入のリスクを伴う。マイコバクテリアの脂質は、従来は2つのグループに分けられる：非共有結合しており、
したがって有機溶媒または洗浄剤で抽出可能であるもの（トレハロースモノおよびジミコレートおよびリポプロテインを含む）、および細胞壁に共有結合しているもの（ミコール酸）。けん化が行われない限り、有機溶媒または洗浄剤抽出のみが非共有結合した脂質を除去する。MpRNCの脂質含量に対する、本発明の実施例３において記述したMpRNCのための製作プロセスの影響を決定した。
【０２３５】
リン脂質、糖脂質および遊離脂肪酸を含む非共有結合した遊離脂質の抽出のためのDole手順の改変を使用した（Dole and Meinertz, 1960, J. Biol. Chem. 235:2595-2599, Puttmann et al.,1993 Clin. Chem. 39:825-832によって改良されるように）。注射用水中の10mg/mLの中間MpRNC懸濁液から調製して、高速遠心分離に供した実施例３における製作プロセスの工程3からの中間MpRNCのペレットまたは上清の1mLを3mLの溶媒混合物n-ヘプタン/イソプロパノール/リン酸（10/40/1、v/v/v）に添加して、テフロン（登録商標）のラインキャップを有するガラスチューブ中で勢いよく混合した。混合物を30分間室温にてインキュベートした。1mLのn-ヘプタン、続いて1mLの水を添加した後に、チューブをきつくキャップして、徹底的に混合し、置いて安定させた。上の有機相を収集し、脱脂された細胞壁または上清を含む残りの水相を1mLのヘプタンの添加によって抽出した。抽出可能な非
共有結合した遊離脂質を含む2つのヘプタン相を、次いでプールして、テフロン（登録商
標）のラインキャップを有するガラスチューブ中で窒素気流下で徹底的に乾燥するまで50℃にて乾燥した。乾燥した脂質抽出物を誘導体化まで光から保護して4℃にて貯蔵した。
遊離脂質が除去されたMpRNCを含む残渣を収集して、-20℃にて保持し、共有結合した脂質の抽出のために使用した（共有結合したミコール酸細胞壁画分として定義される）。
【０２３６】
HPLCのための脂肪酸の誘導体化は、以下のように実施した。まず、0.1mLのKHCO3溶液（98mL水および98mLメタノール中に溶解した4gのKHCO3）を添加して、遊離脂質抽出物を乾
燥させ、濾過空気の流れのもとで、50℃にて空気乾燥した。次いで、1mLのn-ヘプタンお
よび50μlのp-ブロモフェナシル-8試薬（Pierce Chemical Co. Rockford, IL, USA）を添加して、徹底的に混合した。チューブを密封して85℃にて30分間加熱した。室温まで冷却
した後、溶液を1mLのHCl（6M）-メタノール-水混合物（1:2:1）を添加すること、および
勢いよくボルテクスすることによって浄化した。チューブを5分間立てておき、次いで、
有機層をガラスバイアルに回収して、窒素気流下で乾燥した。乾燥したp-ブロモフェナシル誘導体化された遊離脂質をUV検出解析（RP-HPLC-UV）による逆相HPLCまで光から保護して4℃にて保持した。
【０２３７】
非共有結合した脂質および遊離脂肪酸のp-ブロモフェナシルエステル誘導体のRP-HPLC-UV解析を、バイナリポンプを有するWaters Breeze HPLCシステムおよび二波長吸光度UV検出器（Waters Ltd.、Lachine、Quebec、Canada）を使用して実施した。4ミクロン逆相分
離カラム（Waters、Nova-Pak、C18 4.6mm×150mm）を解析のために使用した。乾燥したp-ブロモフェナシルエステル脂肪酸誘導体を100μLアセトニトリルに溶解して、5μLをカラムに注入し、0〜20分において77%アセトニトリルおよび23%水：20分から25分までアセト
ニトリルの濃度を77%から96%まで上げ、次いで解析の最後の5分間96%から77%に減少させ
た勾配混合物を使用して、0.25mL/分の流速にて分離した。カラム温度は30℃であり、お
よびピークは254nmにて検出した。ミリスチン酸（C14：0）（Sigma-Aldrich、Oakville、Ontario、Canada）を遊離脂質の定量化のための脂肪酸標準として使用した。
【０２３８】
非共有結合した脂質の抽出後に残っている工程3のペレットおよび工程3の上清からの画分を50℃にて窒素気流下で乾燥し、次いでテフロン（登録商標）のラインキャップを有するガラスチューブ中で100℃にて1時間2mL加水分解試薬（水および50%のメタノールにおける50% w/v水酸化カリウム、1:1、v/v）により加水分解して、共有結合した脂質を放出し
た。室温まで冷却後、2mLのクロロホルム、続いて1.5mL酸性化試薬（濃縮HCl/メタノール（1:1、v/v））を添加した。力強く混合した後、チューブを相分離のために5分間立てて
おいた。クロロホルム相（下相）を回収して、テフロン（登録商標）のラインキャップを有する新たなガラスチューブに移した。残りの水相を、次いでさらに2回、1mLクロロホルムで再抽出した。3回分のクロロホルム相をプールし、窒素気流下で80℃にて乾燥して、
誘導体化まで光から保護して4℃にて保持した。
【０２３９】
加水分解した共有結合した脂肪酸の誘導体化は、クロロホルムをn-Heptaneの代わりに
使用したことを除いて、抽出可能な脂質について記述したように実施した。乾燥したp-ブロモフェナシル誘導体化された脂肪酸をRP-HPLC-UV遊離脂質解析まで光から保護して4℃
にて保持した。
【０２４０】
共有結合した脂質のp-ブロモフェナシルエステル誘導体のRP-HPLC-UV解析（この解析においてミコール酸画分として定義される）を、バイナリポンプを有するWaters Breeze HPLCシステムおよび二波長吸光度UV検出器を使用して実施した。4ミクロン逆相分離カラム
（Waters、Nova-Pak、C18 4.6mm×150mm）を使用して分離した。乾燥したp-ブロモフェナシルエステルミコール酸誘導体を100μLジクロロメタンに溶解して、20μLをカラムに注
入し、254nmにて検出した。ベヘン酸（C22：0、Sigma-Aldrich）を共有結合脂質の定量化のための内標準として使用した。カラムを2.5mL/分の流速にてメタノール/ジクロロメタ
ン勾配（20分にわたって98%メタノール/2%ジクロロメタンから20%メタノール/80%ジクロ
ロメタン）を使用して溶出した。ベヘン酸（C22：00、Sigma-Aldrich、Oakville、Ontario、Canada）を定量化のための内標準として使用し、低および高ミコール酸内標準（一般
にそれぞれ〜C40：nおよび〜C110：nであることが認められ、および元来はCorixa Corporation Seattle、Washington、USAによって供給される）をクラスター1およびクラスター2におけるミコール酸の炭素鎖長を見積もるために使用した。
【０２４１】
中間MpRNCについての非共有結合した脂質（抽出可能な）および共有結合した脂質解析
の結果を図５ａおよび図５ｂに、および表５に示してある。図５ａは、抽出および加水分解後の結合脂質がC22未満の炭素鎖長を有する短鎖脂肪酸の大多数からなること、および
チモテ菌の特徴であるミコール酸の2つのクラスターが存在することを示す。図５ｂは、
けん化後に得られた加水分解性脂質が低および高分子量種の両方で構成されること、並びに2つのミコール酸クラスターは2つのミコール酸標準の間に位置すること（図５ｂ）を示す。ミコール酸標準のための滞留時間と炭素鎖長との関係は、直線的であると決定された。
【０２４２】
けん化後に得られた脂質ピークは、0.5〜5分の溶出時間を有する短鎖脂肪酸（この解析において、低分子量ジカルボン酸およびアルコールへの加水分解の間のミコール酸ワックスエステルの崩壊の結果として定義される）、ミコール酸クラスター1（溶出時間7〜9分
、45〜55炭素のミコール酸を含む）およびミコール酸クラスター2（溶出時間10.5〜13.5
分、70〜85炭素のミコール酸を含む）と分類された。工程3のペレットおよび上清におけ
るこれらの画分のそれぞれの量を表１２に示してある。
【０２４３】
【表１２】
2014502256.tif 000014
【０２４４】
MpRNC組成物を含む実施例３の工程3からの中間MpRNCの高速遠心分離ペレットは、抽出
可能な脂質、並びに共有結合脂質を含んでいた。共有結合脂質は、ミコール酸によって代表されると考えられ、総脂質の90%を示した。高速上清は、対照的に、ごくわずかな共有
結合脂質しか含まず、大部分の脂質が非共有結合されていた（93%）。
【０２４５】
もう一つの実験において、中間MpRNCおよびMCCの30mgの総量を50℃にて窒素気流下で乾燥し、次いでテフロン（登録商標）のラインキャップを有するガラスチューブ中で100℃
にて1時間、2mL加水分解試薬（水および50%メタノール中の50% w/v水酸化カリウム、1:1
、v/v）で加水分解して、共有結合脂質を放出した。室温まで冷却後、2mLのクロロホルム、続いて1.5mL酸性化試薬（濃縮HCl/メタノール（1:1、v/v））を添加した。力強く混合
の後、チューブを相分離のために5分間立てておいた。クロロホルム相（下相）を回収し
て、テフロン（登録商標）のラインキャップを有する新たなガラスチューブに移した。残りの水相を、次いでさらに2回、1mLクロロホルムで再抽出した。3回分のクロロホルム相
をプールし、窒素気流下で80℃にて乾燥して、計量した。抽出は、2回実施し、また脂質
含量は、14.1±5.1 mg/30mgMCCおよび9.7±0.14 mg/30mg中間MpRNCであった。
【０２４６】
上清におけるこのような高脂質含量（および低ミコール酸含量）の存在は、高圧ホモジナイゼーションによるマイコバクテリアの破壊後の非細胞壁脂質（抽出可能な、非共有結合した脂肪酸および非共有的に連結したミコレート）の遊離と合致しており、それは、実施例３において記述した特異な高速遠心分離工程によって細胞壁組成物から取り除かれる。したがって、この手順は、有機溶媒または洗浄剤抽出の必要性およびマイコバクテリア細胞壁組成物の脂質含量を減少させる手段のような混入のリスクを無くす。しかし、共有結合したミコール酸は、マイコバクテリア細胞壁の不可欠な構成要素であり、実施例３の製造方法によって保存され、したがって、ミコール酸クラスター解析によって所定のマイコバクテリア種からの細胞壁の決定的な同定の利益をもたらす。
【０２４７】
[実施例１４]
＜高MpRNC、中間MpRNC、低MpRNCおよびオートクレーブ処理したチモテ菌のジアミノピメ
リン酸（DAP）およびアラニン含量＞
この実施例において、中間MpRNC組成物をMRNCの代表例として使用していること、およ
びこの実施例において教示した解析が、全てのMRNC、並びに限定されないがノカルジア属（Nocardia）種、ロドコッカス属（Rhodococcus）種およびコリネバクテリウム属（Corynebacterium）種から調製される多くのBRNC組成物に適用できることは理解されるべきである。
【０２４８】
ジアミノピメリン酸（2,6-diaminoheptanediotic acid、DAP）およびアラニン（ALA）
は、チモテ菌のペプチドグリカンの主要な成分である。ペプチドグリカンは、それ自体がマイコバクテリア細胞壁の主要な成分である。DAPはペプチド鎖間結合に含まれており、ALAはペプチドグリカンのペプチド鎖の成分である。したがって、DAPおよびALA含量の測定は、それによってマイコバクテリア細胞含量を増加させ、DAP含量の減少を生じる無傷の
マイコバクテリア細胞含量の程度の間接的定量を提供する。高MpRNC、中間MpRNC、低MpRNCおよびオートクレーブ処理したチモテ菌細胞のDAPおよびALA含量は、HPLC分析によって
決定した。高MpRNC、中間MpRNC、低MpRNCおよびオートクレーブ処理したチモテ菌細胞をHPLC等級の水中に0.2mg/mLの濃度に希釈した。それぞれの希釈した試料標品の20μL分を、それぞれの加水分解ブランクおよびウシ血清アルブミンコントロールと共に、熱分解チューブにおける真空下で乾燥して、6MのHCl蒸気を使用して60分間165℃にて加水分解した。DAPおよびALAを6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシンイミジル（hydroysuccinimidyl
）カルボナート（AQC）（AccQ Fluor Reagent kit、Waters、Milford、MA、USA）で誘導
体化した。標準曲線を、合成および市販のDAPおよびALAを使用して調製した。高MpRNC、
中間MpRNC、低MpRNCおよびオートクレーブ処理したチモテ菌細胞のDAPおよびALA含量をHPLCによって3つの試料を使用して決定した（各試料5μLの注入容量、CCQ-Tag Novo-Pak C18 4μm, 3.9×150 mm カラム [Waters]、並びに蛍光およびUV検出器を備えたAgilent Model 1100, Santa Clara, CA, USA HPLCを使用する）。DAPおよびALA含量の決定の結果を表１３に示してある。
【０２４９】
【表１３】
2014502256.tif 000015
【０２５０】
表１３は、MpRNC（高から低）に存在する無傷のマイコバクテリア細胞の数の減少と共
に、ALAおよびDAP含量の両方において対応する増大があることを示す。結果は、高MpRNC
から低MpRNCへ行くにつれて、無傷のマイコバクテリア細胞の減少と共に、MpRNC組成物における細胞壁ペプチドグリカン含量が増大することと合致する。表１１および表１３はまた共に、細胞壁を含むオリゴリボヌクレオチド/ポリリボヌクレオチド製剤組成物の単離
がペプチドグリカンの量の増加と関連していること（DAPおよびアラニン測定によって、
またはアラニン測定（DAPを含まない細菌およびマイコバクテリアについて）によって決
定されるとおり）、並びにDAPおよびアラニンの量の減少は、無傷のマイコバクテリアの
レベルの増加と関連していることを示す。したがって、このような測定は、このような組成物の無傷のマイコバクテリア（または細菌）含量を正確に検証して制御するために使用することができる。
【０２５１】
[実施例１５]
＜MpRNCタンパク質含量＞
この実施例において、中間MpRNC組成物をMRNCの代表例として使用していること、およ
びこの実施例において教示した解析は、全てのMRNCおよびBRNC組成物に適用できることが理解されるべきである。
【０２５２】
本発明の実施例３に記載したように調製した中間MpRNCのタンパク質含量をチモテ菌細
胞のものと比較した。タンパク質含量の正確な決定を保証するために、試料を注射用水中の1mg/mL懸濁液として調製し、プローブ超音波処理に供して、任意の無傷のマイコバクテリアの破壊を保証し、そしてしたがって、タンパク質の正確な決定を保証した。タンパク質含量は、超音波処理の前後で決定した。無傷のチモテ菌細胞（MCMC-Cを使用して本発明の実施例１にしたがって増殖する）および本発明の実施例３にしたがって製造した中間MpRNC（両方とも注射用水における1mg/mLの濃度にて）をプローブ超音波処理（Misoni×Inc、シ" probe、setting 8、氷上に1〜15分）に供した。試料を、Macart法を使用してタン
パク質解析のために数回取りだした。簡潔には、15μLの適切なチモテ菌または中間MpRNCを300μLのMACART溶液（L. Gerbaut and M. Macart, Clinical Chemistry (1982) 32, 353-355）とマイクロタイタープレートのウェルにおいて混合して、室温にて5分間インキュ
ベートして、その後、マイクロプレートリーダーを使用して630nmにてODを決定すること
によって、タンパク質含量を決定した。各試料におけるタンパク質の量を、ウシ血清アルブミン（2mg/mL Protein Standard、Sigma）を参照段階希釈として使用して決定した。解析の結果を表１４に示してある。
【０２５３】
【表１４】
2014502256.tif 000016
【０２５４】
表１４に示したデータは、実施例３において記述した方法にしたがって製造した中間MpRNCが、チモテ菌と比較したときに有意に異なるタンパク質含量を有したこと（それぞれ13% w/v対45% w/v）を示し、したがって本製造プロセスは、最初の細胞バイオマスと比較
したときに、タンパク質含量の減少を生じることを示した。これらのデータはまた、さらなる破壊手順を使わずに、MpRNCのタンパク質含量がおよそ30%まで過小評価されたことを示す。中間MpRNCの超音波処理後に得られたタンパク質のわずかな増加は、3つのタンパク質含有コンパートメント−タンパク質解析試薬にアクセス可能な細胞壁断片タンパク質、タンパク質解析試薬にアクセス不可能な細胞壁断片内のタンパク質、およびタンパク質解析試薬にまたアクセス不可能な残留した無傷のマイコバクテリア内のタンパク質の存在と合致する。これらのタンパク質は、超音波処理またはその他の手段によって細胞壁断片または細胞の破壊後にアクセス可能になる。低MpRNCおよび中間MpRNCおよび高MpRNCのタン
パク質レベルは、それぞれの製剤における細胞壁断片に対する無傷の細胞の割合の反映であろうことを理解すべきである。
【０２５５】
[実施例１６]
＜MpRNCは、ヒト病原体関連分子パターン受容体（PAMP）NOD2の活性化を誘導する＞
ヌクレオチド結合オリゴマー形成ドメイン2（NOD2）は、パターン認識受容体（PRR）、微生物病原体または細胞のストレスと関連する病原体関連分子パターン（PAMPs）を感知
する役割を担う受容体の多様なファミリーの1つである。NOD2は、ムラミルジペプチド（MDP）の受容体であり、免疫刺激活性を有する細菌ペプチドグリカンの最小構造であることが公知である。NOD2 MDPアゴニストは、先天性免疫系細胞（単球、マクロファージおよび樹枝状細胞）を活性化して、炎症を和らげ、鎮痛性活性を有し、抗癌活性を有し、抗感染
活性を有し、ヒト骨髄CD34+細胞の分化を誘導し、そしてこれらの免疫アジュバント活性
を介してワクチン保護を増大させることが公知である。MDP、並びに多数の類似体および
誘導体は、癌および感染の治療のための有効な薬剤であることが示され、またワクチンのアジュバントとして作用し得る。
【０２５６】
MpRNCのNOD2を活性化する活性を、NOD2で駆動されるNF-κBの制御下でヒトNOD2受容体
および下流のシグナリングマーカーIL-8を発現するように操作されたHEK-293細胞を使用
して評価した。MpRNCをMRNCの一例として使用すること、この実施例において教示した原
則をマイコバクテリア科由来のMRNCに適用できることを理解すべきである。中間MpRNCがNOD2を活性化する能力を、米国特許第6,326,357号に従って調製したMCCと比較した。
【０２５７】
ヒトHEK293-NOD2株化細胞（InvivoGen、San Diego、CA、USA）を10%ウシ胎児血清（両
方ともWisent、StBruno、Quebec、Canadaから）、100μg/mL Normocin（商標）および10g/mLブラストサイジン（両方ともInvivoGenから）を補った高グルコースDMEM中で、5%CO2
を含む加湿環境において37℃にて培養し、および維持した。HEK293-NOD2細胞を上述した
細胞培養液中で無菌の96ウェル平底組織培養マイクロプレートに0.2mL容積で5×105細胞/mLにて播種し、5%CO2を含む加湿環境において37℃にて、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80および160μg/mLの中間MpRNCまたはMCCと共に48時間インキュベートした。上清を
インキュベーション後に収集し、4℃にて5分間4,000×RCFにて遠心分離して細胞および細片を除去して、上清を解析のために-20℃にて貯蔵した。上清におけるヒトIL-8を中間MpRNC懸濁液と共に48時間培養した後、BioSource、Camarillo、CA、USAからの市販の酵素結
合抗体免疫吸着アッセイ（ELISA）法によって測定した。データをKCジュニアソフトウェ
アパッケージ（BioTek Instruments、Winooski、VT、USA）を使用してELISAプレートリーダー（ELx-808IU BioTek Instruments, Winooski, VT, USA）から取り込み、合成されたIL-8のpg/mLで表した。
【０２５８】
表１５は、中間MpRNCが、NOD2で駆動されるIL-8放出を濃度依存的様式で誘導すること
によって強力なNODアゴニストとして用量相関的な様式で機能するが、米国特許第6,326,357号にしたがって調製したMCCは、NODアゴニストとして効力が著しく低く、試験した最高の濃度にてほんのわずかな活性が見られたのみであったことを示した。
【０２５９】
【表１５】
2014502256.tif 000017
【０２６０】
MpRNCは、NOD2受容体を介して媒介される免疫刺激活性に関して、MCCなどのその他のマイコバクテリア細胞壁組成物に対して有意な、かつ予想外の利点を有することが明らかである。
【０２６１】
別々の研究において、高MpRNC、中間MpRNCおよび低MpRNCのNOD2を活性化する活性を、
高MpRNCおよび低MpRNCの効力を中間MpRNCのものと比べて決定することによって比較した
。NOD2を活性化する活性を上述したように用量範囲0.625、1.25、2.5、5、10、20、40お
よび80μg/mLにおいて決定し、相対効力を、PHARM/PCSバージョン4.2ソフトウェア（Microcomputer Specialists, Philadelphia, PA, USA）を使用して算出した。表１６に示した結果は、高MpRNCの、および低MpRNCのNOD2活性化活性が中間MpRNCのものと異ならないこ
とを示す。
【０２６２】
【表１６】
2014502256.tif 000018
【０２６３】
これらのデータは、異なるMpRNC組成物における様々なレベルの無傷のマイコバクテリ
アの存在が、これらのNOD2を活性化する能力に対し効果を有しないこと、および全てのMpRNC組成物（高、中間および低）がこの先天性免疫系受容体を活性化する同じ能力を有す
ることを示す。
【０２６４】
[実施例１７]
＜マイコバクテリアRNCは、ヒト病原体関連分子パターン受容体（PAMP）NOD2の活性化を
誘導する＞
ウシ結核菌BCG、マイコバクテリウム・スメグマチスおよびマイコバクテリウム・バッ
カエから調製されるマイコバクテリアRNCのNOD2活性化活性を、その活性化がNOD2で駆動
されるNF-κBの制御下の分泌型胚性アルカリ性リン酸塩（SEAP）の合成を駆動するヒトNOD2受容体（InvivoGen、San Diego、CA、USA）を発現するように操作されたHEK-Blue（商
標）-NOD2細胞を使用してチモテ菌からのRNCと比較した。上清におけるSEAPの測定は、NOD2活性化の測定を提供する。
【０２６５】
チモテ菌、ウシ結核菌BCG、マイコバクテリウム・スメグマチスおよびマイコバクテリ
ウム・バッカエ由来のMRNCをマイコバクテリア科の代表例として使用していること、およびこの実施例において教示した原則および示したデータは、その他のマイコバクテリアからのMRNCに適用できることを理解すべきである。実施例１６における高、中間および低MpRNCの間の活性の比較の実証を考慮して、チモテ菌由来のMRNC中間組成物（MpRNC）をこの実施例において使用した。
【０２６６】
HEK293-NOD2株化細胞を10%ウシ胎児血清（両方ともWisent、StBruno、Quebec、Canada
から）、30μg/mLブラストサイジン、100μg/mL Normocin（商標）およびZeocin（商標）（両方ともInvivoGenから）、並びに50U/mLペニシリンおよび50μg/mLストレプトマイシ
ン（すべてWisentから）を補った高グルコースDMEM中で、5%CO2を含む加湿環境において37℃にて培養し、および維持した。細胞を上述した細胞培養液中の無菌の96ウェル平底の
組織培養マイクロプレートに0.2mL容積で1×105細胞/mLにて播種し、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、および80μg/mLの中間MRNCと共に72時間インキュベートした。上清をイ
ンキュベーション後に解析のために収集し、4℃にて5分間4,000×RCFにて遠心分離して、細胞および細片を除去した。上清20μLを96ウェル平底マイクロタイタープレートにおい
て2時間37℃にて180μLの QUANTI-Blue（商標）（InvivoGen）と混合した。SEAP発現を、KCジュニアソフトウェアパッケージ（BioTek Instruments）を使用して、ELx-808IUのマ
イクロプレートリーダー（BioTek Instrument、Winooski、VT）を使用して、630nmにて測定した。図６は、4つ全てのMRNC組成物によるNOD2の用量相関的な活性化を示す。
【０２６７】
全てのMRNC組成物は、NOD2活性化活性を示した。チモテ菌RNCは、NOD2の最も有効な活
性化因子であり、続いてマイコバクテリウム・スメグマチス、ウシ結核菌BCGおよびマイ
コバクテリウム・バッカエであった。ウシ結核菌BCGおよびマイコバクテリウム・バッカ
エは、試験された最高の用量（80μg/mL）にて、NOD2の周辺の活性化を示した。NOD2の活性化についてのチモテ菌RNCと相対的なマイコバクテリアRNC組成物の効力をPharmPC V4.2（Microcomputer Specialists, Philadelphia, PA）を使用して決定し、および表１７に
示した。
【０２６８】
【表１７】
2014502256.tif 000019
【０２６９】
[実施例１８]
＜MpRNCは、ヒト病原体関連分子パターン受容体（PAMP）TLR2の活性化を誘導する＞
Toll様受容体2（TLR2）は、一般に微生物病原体と関連している病原体関連分子パター
ン（PAMPs）を感知する原因となるパターン認識受容体（PRR）である。ペプチドグリカン、リポマンナン（LM）、リポアラビノマンナン（LAM）、リポプロテインおよびリポペプ
チドなどの細菌およびマイコバクテリア細胞壁構造成分は、主にTLR2の活性化の役割を担うのは明らかである。TLR2が、マクロファージを含む多くの免疫系細胞上で発現すること、並びにTLR2のアゴニストがこのような細胞による多数のケモカインおよびサイトカインの合成を誘導することができることは、当業者に公知である。本発明の実施例３に記載したように調製した中間MpRNCおよび米国特許第6,326,357号にしたがって調製したMCCのTLR2活性化活性を、ヒトTLR2受容体を発現するように操作されたHEK293細胞を使用して比較
し、こうして免疫刺激性の潜在性を決定するための便利な、かつ受け入れられる方法を提供した。
【０２７０】
中間MpRNCをMRNCの一例として使用したち、この実施例において教示した原則をその他
のマイコバクテリア、並びにマイコバクテリア科由来のMRNCに適用できることを理解すべきである。
【０２７１】
ヒトHEK293-TLR2株化細胞は、InvivoGen、San Diego、CA、USAから得た。HEK293-TLR2
細胞に、NF-κB遺伝子の制御下に配置されたTLR2遺伝子および受容体で駆動される分泌型胚性アルカリ性ホスファターゼ遺伝子（SEAP）を安定してトランスフェクションする。したがって、TLR2の活性化により細胞培養液におけるアルカリ性リン酸塩活性の生成を生じ、それを使用して受容体活性化を定量化する。細胞を10%ウシ胎児血清（両方ともWisent
、StBruno、Quebec、Canadaから）および1×Normocin（商標）（InvivoGen）を補った高
グルコースDMEM中で5%CO2を含む加湿環境において37℃にて培養し、および維持した。HEK293-TLR2細胞をHEK-Blue（商標）Detection培地（InvivoGen）中で無菌の96ウェル平底組織培養マイクロプレートに0.2mLの容積で5×105細胞/mLにて播種し、5%CO2を含む加湿環
境において37℃にて、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80および160μg/mL中間MpRNC
またはMCCと共に18時間インキュベートした。ウェルに添加するHEK-Blue（商標）Detection培地は、NF-κBで誘導される可溶性胚性アルカリホスファターゼ酵素活性（SEAP活性）の検出のために設計してある。18時間のインキュベーションの後、光学密度（TLR2結合を介したNF-κBの活性化に比例する）を、マイクロプレートリーダー（ELx-808IUモデル、BioTek Instrument、Winooski、VT、USA）を使用して630nmにて決定した。データを、KCジュニアソフトウェアパッケージ（BioTek Instruments）を使用して取り込んだ。
【０２７２】
表１８は、TLR2の活性化（630nmにおけるODとして表される）を示し、実施例3において記述した手順を使用して調製した中間MpRNCが用量相関的なTLR2活性化活性を有すること
を示す。MCCに対して相対的な中間MpRNCの効力の決定は、それにもかかわらずその活性が米国特許第6,326,357号に記載したように調製したMCCのものと同等だったことを示した。中間MpRNCは、TLR2活性化因子としてMCCより10.6倍強力だった（PHARM/PCS version 4.2 software, Microcomputer Specialists, Philadelphia, PA, USAを使用して決定した）。
【０２７３】
【表１８】
2014502256.tif 000020
【０２７４】
これらのデータは、実施例１６に示すようなMpRNCがNOD2を活性化する能力の評価から
のデータと組み合わせて、MpRNC細胞壁組成物が先天性免疫系の2つの重要な受容体に対する二重のアゴニスト活性、特に合成のアゴニストの使用に頼らずにNOD2およびTLR2の両方を活性化する能力を有することを示す。
【０２７５】
[実施例１９]
＜マイコバクテリアRNCは、ヒト病原体関連分子パターン受容体（PAMP）TLR2の活性化を
誘導する＞
実施例４において調製したマイコバクテリアRNC組成物のTLR2活性化活性を、ヒトTLR2
受容体を発現するように操作されたHEK-293細胞レポーターシステムを使用して決定し、
チモテ菌中間RNCと比較した。
【０２７６】
ヒトHEK293-TLR2株化細胞は、InvivoGen、San Diego、CA、USAから得た。HEK293-TLR2
細胞にNF-κBの制御下に配置されたTLR2遺伝子および受容体で駆動される分泌型胚性アルカリ性ホスファターゼ遺伝子（SEAP）を安定してトランスフェクションする。したがって、TLR2の活性化により細胞培養液におけるアルカリ性リン酸塩活性の生成を生じ、それを使用して受容体活性化を定量化する。細胞を10%ウシ胎児血清（両方ともWisent、St-Bruno、Quebec、Canadaから）および1×Normocin（商標）（InvivoGen）を補った高グルコー
スDMEM中で5%CO2を含む加湿環境において37℃にて培養し、および維持した。HEK293-TLR2細胞をHEK-Blue（商標）Detection培地（InvivoGen）中で無菌の96ウェル平底組織培養マイクロプレートに0.2mLの容積で5×105細胞/mLにて播種し、5%CO2を含む加湿環境におい
て37℃にて、2.5、5、10、20、40、および80μg/mLマイコバクテリアRNCと共に18時間イ
ンキュベートした。ウェルに添加するHEK-Blue（商標）Detection培地は、TLR2/NF-κBで誘導される可溶性胚性アルカリホスファターゼ酵素活性（SEAP活性）を検出するために設計してある。18時間のインキュベーションの後、光学密度（TLR2結合を介するNF-κBの活性化と比例する）を、マイクロプレートリーダー（ELx-808IUモデル、BioTek Instrument、Winooski、VT）を使用して630nmにて決定した。データを、KCジュニアソフトウェアパ
ッケージ（BioTek Instruments）を使用して取り込んだ。
【０２７７】
図７は、4つ全てのマイコバクテリアRNCが、用量範囲2.5〜80μg/mLにおいて用量相関
的な様式でTLR2の活性化を誘導したことを示す。マイコバクテリウム・バッカエRNCは、
最も活性であり、続いてマイコバクテリウム・スメグマチス、ウシ結核菌BCGおよびチモ
テ菌RNCの順で活性が減少した。TLR2の活性化についてのチモテ菌RNCに対して相対的なマイコバクテリアRNC組成物の効力を、PharmPC v4.2（Microcomputer Specialists, Philadelphia, PA, USA）を使用して決定し、表１９に示した。
【０２７８】
【表１９】
2014502256.tif 000021
【０２７９】
TLR2の活性化について観察される効力の範囲（＜6倍異なる範囲）は、4つ全てのマイコバクテリアRNC組成物が同等のTLR2アゴニスト活性を有することを示す。この実施例およ
び本出願におけるその他の実施例（たとえばNOD2活性化）を読んだ当業者は、特定の、または特異的な予防または治療の用途のために特異的マイコバクテリアRNCまたはその組み
合わせの適用性を決定するのに、特定のマイコバクテリアRNC組成物と関連する免疫刺激
活性および免疫系受容体アゴニスト機能の最も適切な組み合わせの使用に想到するだろうことは明らかである。
【０２８０】
[実施例２０]
＜MpRNC中間体によるTLRsの刺激＞
TLR2アゴニストは、一般に、グラム陽性菌およびマイコバクテリアからの細胞壁PAMPs
と関連しているとして認識される。TLR3アゴニストは、一般に、二本鎖ウイルスRNAとし
て認識される。TLR4アゴニストは、一般に、リポ多糖体であるとして認識される。TLR5は、細菌フラジェリンと特異的に相互作用する。TLR7およびTLR8アゴニストは、一般に、一本鎖RNAであるとして認識される。TLR9アゴニストは、一般に、非メチル化されたDNAを含
むCpGジヌクレオチド配列（CpGモチーフ）であるとして認識される。実施例１８は、中間MpRNCがTLR2を刺激したことを示した。中間MpRNCはまた、RNAおよびDNAの両方を含む（実施例１０）。したがって、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8およびTLR9を刺激する中間MpRNCの能力を決定し、中間MpRNCにおけるRNAおよびDNAの存在が核酸特異的なTLRsまたは任意のその他のTLRの活性化を生じたかどうかを見た。中間MpRNCがMRNCの一例として使用されること、およびこの実施例において教示した原則をマイコバクテリア科由来のMRNCに適用できることを理解すべきである。
【０２８１】
中間MpRNCのTLR刺激活性を、1つの特異的なTLRを発現するように操作されたHEK293細胞（InvivoGen）で試験した。所定のTLRの活性化により、NF-κBで駆動されるSEAP合成を生じ、その酵素活性を実施例１９に記載したように上清において検出する。中間MpRNCを用
いた異なるTLRsを発現するHEK293細胞の処理を、90μg/mLの終濃度を使用して、実施例１８に記載したように実施した。この研究において使用したポジティブコントロールのTLR
アゴニスト、並びにアッセイにおいて使用した終濃度を表２０に示してある。
【０２８２】
【表２０】
2014502256.tif 000022
【０２８３】
評価の結果を表２１に示してある。全てのTLRアゴニストコントロールは、ポジティブ
な応答を与えた。TLR2を発現するHEK293細胞の有意な刺激が中間MpRNCで見られたが、TLR3またはTLR5を発現するHEK293細胞のいくつかの弱い刺激が観察され、これはそれぞれの
ポジティブコントロール、ポリ（I：C）およびフラジェリンより有意に低かった（それぞれポジティブコントロール活性の3%および4%）。TLR3およびTLR5の明らかな刺激は、再現可能または用量相関的でなく、また標準の濃度にて活性でなく、したがって人為的結果であると考えられることがその後に示された。中間MpRNCは、RNA特異的なTLR7およびTLR8を
含む任意のその他のTLR、並びにDNA CpG-モチーフ特異的TLR9を刺激しなかった。
【０２８４】
【表２１】
2014502256.tif 000023
【０２８５】
３つの結論が、これらのデータから導き出されるであろう。第1に、MpRNCは、TLR TLR2を活性化するのみである;第2に、中間MpRNCにおけるRNAの存在は、RNA特異的なTLRsであ
るTLR3、TLR7またはTLR8の活性化を生じない;そして、第3に、中間MpRNCにおけるDNAの存在は、CpG受容体TLR9の活性化を生じず、これは中間MpRNCにおける機能的CpGモチーフの
非存在を示す。
【０２８６】
[実施例２１]
＜MpRNC組成物の免疫刺激活性に対する無傷のチモテ菌細胞の影響＞
実施例２に記載したように調製したMpRNCの免疫刺激活性に対する無傷のチモテ菌細胞
の存在の影響を、サイトカイン/ケモカイン-誘導アッセイを使用して決定した。具体的には、種々の比率の無傷のチモテ菌細胞を含むMpRNC組成物の免疫刺激活性を決定した。こ
の実施例は、MRNCの免疫刺激活性に対する無傷のマイコバクテリア細胞の影響の例証および代表例として使用されることが理解されるべきである。MpRNCがMRNCの一例として使用
され、およびこの実施例において教示した原則をマイコバクテリア科由来のMRNCに適用できることを理解すべきである。
【０２８７】
末梢血単核細胞（PBMC）を、Ficoll-Hypaque（GE Healthcare、Ste-Anne-de-Bellevue
、Quebec、Canada）での密度-遠心によって6人の健康な個体から単離した。血液凝固を阻止された血液（ヘパリンのリチウム塩）を低速度にて遠心分離して血小板を除去し、PBMCをFicoll-Hypaqueを使用して緩衝遠心によって単離した。単離したPBMCを10%の熱不活性
化されたウシ胎児血清（Wisent Inc.）および10μg/mLゲンタマイシン（Sigma-Aldrich、Oakville、Ontario、Canada）を含むRPMI 1640（Wisent Inc., St Bruno, Quebec, Canada）中で低速遠心（4℃にて10分間150×RCF）によって洗浄して、5×105の生存可能な細胞/mL培地の濃度にて懸濁した。1mLを24ウェル組織培養プレートのウェルにまいた。細胞を5%CO2の雰囲気下で37℃にて24時間インキュベートした。熱処理したチモテ菌細胞（121℃
、30分）の様々な量を含んでいる中間MpRNCまたは中間MpRNCを組織培養プレートに添加し（終濃度はIL-10誘導について10μg/mL、IL-12p40誘導について1μg/mL）、細胞をさらに48時間5%CO2の雰囲気下で37℃にてインキュベートした。上清を取り除き、0.2ミクロン膜濾過によって浄化して、供給元が推奨する手順を使用してキットELISA（BioSource、Camarillo、CA、USA、それぞれカタログ番号KHC0102およびKHC0122）によってIL-10およびIL-12p40のレベルを決定した。
【０２８８】
結果を図８に示してある。様々な比率の無傷のオートクレーブ処理したチモテ菌細胞（試験した範囲は、新たな製造手順および組成物における固有の無傷のマイコバクテリアの潜在的レベルを反映するように、100%の中間MpRNCから100%の無傷のオートクレーブ処理
したチモテ菌細胞までである）を含む、中間MpRNC（算出された0.7% w/w無傷のマイコバ
クテリアを含む）がベル型の応答でIL-10産生を誘導し（図８の上段パネル）、無傷のオ
ートクレーブ処理したチモテ菌細胞の最適な比率がおよそ5〜30% w/wの範囲であったことが分かる。およそ5〜30% w/wの比率で無傷のオートクレーブ処理したチモテ菌細胞を含む中間MpRNCによるIL-10誘導は、100%の中間MpRNC組成物または100%の無傷のオートクレー
ブ処理したチモテ菌細胞を含む組成物より高いことが見いだされた。
【０２８９】
図８（下段パネル）は、様々な比率の無傷のオートクレーブ処理したチモテ菌細胞を含む中間MpRNC組成物（試験した範囲：100%の中間MpRNCから100%の無傷のオートクレーブ処理したチモテ菌まで）がベル型の応答でりIL-12p40産生を誘導し、無傷のオートクレーブ処理したチモテ菌細胞の最適の比率は、およそ10〜50% w/wの範囲であったことを示す。
およそ10〜50 % w/wの比率で無傷のオートクレーブ処理したチモテ菌細胞を含んでいる中間MpRNC組成物によるIL-12誘導は、100%の中間MpRNCを含む組成物または100%の無傷のオ
ートクレーブ処理したチモテ菌細胞を含む組成物より高かった。
【０２９０】
分散分析（ANOVA、繰り返しなしで双方向）は、MpRNCにおける無傷のチモテ菌細胞の比率がサイトカイン誘導に有意に影響したこと（0.05のαにてp<0.025）、並びにMpRNCによって誘導されるIL-10およびIL-12のレベルが統計学的に異なったこと（0.05のαにてp<0.05E-6）を示した。
【０２９１】
[実施例２２]
＜MpRNCは、免疫エフェクター細胞におけるケモカインおよびサイトカイン合成を誘導す
る＞
MpRNCのケモカインおよびサイトカイン誘導活性を、Milliplex（登録商標）ケモカイン/サイトカイン解析キットの使用によって解析した。MpRNCをMRNCの一例として使用していること、およびこの実施例において教示した原則をマイコバクテリア科由来のMRNCに適用できることを理解すべきである。
【０２９２】
ヒトPBMCを全血のフィコール密度勾配遠心法によって単離した（全体で13人の健康な個体）。PBMCを10% v/v熱不活性化されたウシ胎児血清（56℃/30分）（両方ともWisent、StBruno、Quebec、Canadaから）および50μg/mL硫酸ゲンタマイシン（Sigma-Aldrich Canada、Oakville、Ontario、Canada）を含むRPMI 1640培地中に調製した。PBMC（1×106細胞
）を6ウェル平底マイクロプレートにおいて1.0mLの容積で播種し、160μg/mL終濃度の中
間MpRNC有りまたは無し（無処理コントロール）で、上述した細胞培養液中に37℃/5%CO2/100%の湿度にてインキュベートした。培養液中のサイトカイン、ケモカインおよび造血性成長因子のレベルを、Bio-Plex 200系（BioRad ory、Hercules、CA、USA）でヒトケモカ
イン/サイトカインについてMilliplex（登録商標）MAPキット（Millipore Corporation, Billerica、MA、USA）を使用して48時間のインキュベーションの後に測定した。
【０２９３】
示した結果は、未処理のPBMCに対するケモカイン/サイトカインレベルの平均増大倍率
として表してある。表２２に示した結果は、中間MpRNCがPBMCに存在する免疫エフェクタ
ー細胞からのケモカイン、サイトカインおよび細胞成長因子の範囲を刺激する能力を有することを示し、したがって、それがケモカイン、サイトカインおよび細胞成長因子の誘導のための免疫刺激薬として作用する能力を示す。
【０２９４】
【表２２】
2014502256.tif 000024
【０２９５】
[実施例２３]
＜MpRNCによるヒト末梢血単核細胞におけるGM-CSF、MU-CSF、M-CSF、G-CSF、SDF-1aおよ
びLIF合成の刺激＞
マルチコロニー刺激因子（Mu-CSF;IL-3としても知られる）は、赤血球、樹状細胞、顆
粒球、骨髄巨核球および単球、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、間質細胞
由来因子-1アルファ（SDF-1a）、並びに白血病阻害因子（LIF）の産生を刺激することに
加えて、多能性造血細胞の骨髄性前駆体細胞への分化を刺激し、成長促進および異なるタイプの標的細胞（前駆体細胞）の細胞分化、血球新生の刺激並びに幹細胞流動化を含む広範囲の生物活性を示すヒト造血成長因子である。中間MpRNCが免疫細胞からのこれらの成
長因子の合成を刺激する能力を決定した。中間MpRNCをMRNCの一例として使用しているこ
と、およびこの実施例において教示した原則をマイコバクテリア科由来のMRNCに適用できることを理解すべきである。
【０２９６】
末梢血単核細胞（PBMC）をFicoll-Hypaqueでの密度-遠心によって6人の健康な個体から単離した。PBMCを6ウェル組織培養プレートにおいて1.6〜160μg/mL中間MpRNC（本明細書において記述したように調製した、表2および3を参照されたい）と共に、mLあたり0.5×106細胞にて48時間インキュベートした。MU-CSF、M-CSF、GM-CSF、G-CSF、SDF-1aおよびLIFのレベルを、適切なビーズおよび抗体でBi-RadまたはMillipore試薬を使用し、Bioplex
（登録商標）システム（Bio-Rad、Mississauga、Ontario、Canada）を使用して上清にお
いて48時間後に測定した。コントロール処理した細胞に対する、中間MpRNCによるPBMCの
処理後の上清における成長因子のレベルの50%の増大（1.5倍以上の増大）を、ポジティブな刺激効果を定義するために使用した。
表23は、中間MpRNCが、測定した全ての成長因子の合成において用量相関的刺激（＞1.5倍の増大）を誘導したことを示す。
【０２９７】
【表２３】
2014502256.tif 000025
【０２９８】
表２３からのデータは、MpRNCが末梢血において見いだされる免疫細胞からの造血性成
長因子の合成を刺激し、最も大きな増大倍率がGM-CSFおよびG-CSFで、続いて多能性成長
因子MU-CSFで見られたことを示す。M-CSF、SDF-1aおよびLIFはまた、定義された反応閾値
レベルを上回る増大を示した。
【０２９９】
[実施例２４]
＜MpRNCによる正常なヒト尿路上皮細胞におけるGM-CSF、MU-CSFおよびLIF合成の刺激＞
中間MpRNCが非免疫性細胞による成長因子合成を刺激する能力を、ヒト膀胱上皮細胞を
使用して調査した。これらを一般的な上皮細胞の一例として使用した。中間MpRNCをMRNC
の一例として使用していること、およびこの実施例において教示した原則をマイコバクテリア科由来のMRNCに適用できることを理解すべきである。
【０３００】
正常なヒト尿路上皮細胞系列SV-HUC-1（ATCC、Manassas、VAから得られる）を96ウェル組織培養プレートにおいて0.016〜160μg/mL終濃度の中間MpRNC（実施例３に記載したよ
うに調製した）と共に組織培養液mLあたり1.0×105細胞にて48時間インキュベートした（ATCCによって推奨されるように）。MU-CSF、M-CSF、GM-CSF、G-CSF、SDF-1aおよびLIFは
、Bioplex（登録商標）システム（Bio-Rad Laboratories (Canada) Inc. 、Mississauga
、Ontario、Canada）を使用して、適切なMilliplex（登録商標）ビーズおよび抗体（Millipore Corporation、Billerica、Massachusetts、USA）と共に、上清において48時間後に測定した。コントロール処理した細胞に対する成長因子のレベルにおける50%の増大を、
中間MpRNC処理後のポジティブな刺激を同定するために使用した（1.5倍以上の増大）。
【０３０１】
表２４は、中間MpRNCによる処理後の正常なヒト膀胱上皮細胞由来の成長因子産生にお
ける増大を示す。
【０３０２】
【表２４】
2014502256.tif 000026
【０３０３】
表２４からのデータは、1.5倍増大より大きい閾値によって定義されるように、中間MpRNCによる正常ヒト尿路上皮細胞の処理により、MU-CSF（ベル型の反応）、GM-CSFおよびLIF（ベル型の反応）の合成の用量相関的な刺激を生じたことを示す。
【０３０４】
[実施例２５]
＜MpRNCによるヒト膀胱癌細胞におけるGM-CSFおよびMU-CSF合成の刺激＞
【０３０５】
中間MpRNCが非免疫性細胞における成長因子合成を刺激する能力を、ヒト膀胱癌細胞を
使用して調査した。これらを一般的な癌細胞の一例として使用した。中間MpRNCをMRNCの
一例として使用していること、およびこの実施例において教示した原則をマイコバクテリア科由来のMRNCに適用できることを理解すべきである。
【０３０６】
ヒト膀胱癌株化細胞SV-HUC-2およびT24（両方ともATCC、Manassas、VAから得た）を、96ウェル組織培養プレートにおいて（ATCCによって推奨される組織培養液を使用して）、0.016〜160μg/ml終濃度の中間MpRNCと共に、1mlあたり1.0x105細胞にて48時間インキュベートした。MU-CSF、M-CSF、GM-CSF、G-CSF、SDF-1aおよびLIFのレベルを、Bioplex（登録商標）200システムを使用して、Bio-Radおよび／またはMillipore試薬を使用して適切な
ビーズおよび抗体とと共に、上清において48時間後に測定した。コントロール処理した細胞に対する成長因子のレベルにおける50%の増大（1.5倍以上の増大）を、中間MpRNC処理
後のポジティブな刺激を同定するために使用した。
【０３０７】
表２５は、中間MpRNCによる処理後のSV-HUC-2細胞からの成長因子産生の増大を示し、
表２３は、中間MpRNCによる処理後のT24細胞からの成長因子産生の増大を示す。
【０３０８】
【表２５】
2014502256.tif 000027
【０３０９】
ヒト膀胱癌株化細胞SV-HUC-2の中間MpRNCとのインキュベーションにより、GM-CSFおよ
びMU-CSFの合成の用量相関的な刺激を生じたことは、表２６に示したデータから明らかである。
【０３１０】
【表２６】
2014502256.tif 000028
【０３１１】
表２６に示したデータは、ヒト膀胱癌株化細胞T24の中間MpRNCによる処理が、用量相関的な様式（1.6μg/mL MpRNCにて50%の増大および160μg/mL MpRNCにて100%の増大）でGM-CSF合成の誘導を刺激することを示す。したがって、MpRNCは、癌細胞からの造血性成長因子合成を刺激する。
【０３１２】
[実施例２６]
＜マウスにおける腹腔内（IP）投与後のMpRNCによるコロニー刺激因子の刺激＞
本実施例は、中間MpRNCがインビボで成長因子の産生を刺激することを示すのに役に立
つ。中間MpRNCをMRNCの一例として使用していること、およびこの実施例において教示し
た原則をマイコバクテリア科由来のMRNCに適用できることを理解すべきである。
【０３１３】
２匹の雌性のC57BL/6マウスのグループを1.0mg/kg体重の中間MpRNC（実施例３に記載したように注射用水中に1mg/mLの濃度にて調製した）によって、IP経路を介して処理した。血清における顆粒球-単球コロニー刺激因子（GM-CSF）および顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）のレベルを、注射の1、4、7および24時間後に、適切なビーズおよび抗体（Bio-Radおよび／またはMillipore試薬）と共に、Bioplex（登録商標）システムを使用して決定した。コントロール処理したマウスに対する成長因子のレベルにおける50%の増大（1.5倍の増大閾値レベル）を、MpRNC処理後のポジティブな成長因子刺激を同定するために使用し
た。
表２７は、中間MpRNCの注射後、種々の時間での、処理したマウスの血清におけるGM-CSFおよびG-CSFレベルの増大を示す。
【０３１４】
【表２７】
2014502256.tif 000029
【０３１５】
表２７からのデータは、中間MpRNCがGM-CSFおよびG-CSFの合成をインビボで刺激し、GM-CSFの処理後4時間にて、およびG-CSFの処理後4〜7時間にてピークに達することを示す。結果は、コントロール処理したマウスと比較したときに中間MpRNC注射の4時間後にGM-CSF血清レベルの最大56倍の平均の増大およびコントロールマウスと比較したときに注射の4
〜7時間後にG-CSF血清レベルの最大300倍の平均の増大があったことを示した。これらの
データは、中間MpRNCが全身投与後にインビボで免疫刺激活性（コロニー刺激因子誘導）
を有することを示す。
【０３１６】
[実施例２７]
＜MpRNCの抗癌活性および無傷のチモテ菌細胞の影響＞
本実施例は、MpRNCが抗癌活性を有することを示すのに役に立つ。中間MpRNCをMRNCの一例として使用していること、およびこの実施例において教示した原則をマイコバクテリア科由来のMRNCに適用できることを理解すべきである。実施例３において（すなわちマイコバクテリアRNC細胞壁製剤を使用して）調製される中間MpRNCまたは低MpRNCの抗癌活性に
対する無傷のチモテ菌細胞の存在の影響を、癌細胞増殖阻害アッセイを使用して決定した。この実施例は、一般的なMRNCの抗癌活性に対する無傷のマイコバクテリア細胞の影響の例証および代表例として使用されることを理解すべきである。
【０３１７】
RT4ヒト膀胱癌細胞（ATCC、Manassas、VA、カタログ# HTB-2（商標））は、10%の熱不
活性化されたFBS（両方ともWisentから）および10μg/mLゲンタマイシン（Sigma-Aldrich）を補ったDMEM培養液中で、96ウェル組織培養プレート（50μL容積）において5×105細
胞/mlの濃度にてまき、5%CO2雰囲気下で37℃の温度にて一晩ウェルの表面に接着させた。オートクレーブ処理したチモテ菌細胞（121℃、30分）、熱処理した中間もしくは低MpRNC（121℃、30分）、またはオートクレーブ処理した中間もしくは低MpRNCと混合したオートクレーブ処理したチモテ菌細胞の組み合わせを、50μL組織培養液の容積で細胞に添加し
て、終濃度0.01、0.1、1.0および10μg/mL MpRNCを与えた。細胞を、次いで48時間37℃にて5%CO2雰囲気下でインキュベートした。RT4膀胱癌株化細胞に対する抗増殖活性を、MTT
（（3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）還元アッセイを使用して決定した。簡潔には、10μLのMTT溶液（PBS中の5mg/mL）を48時間
のインキュベーションの後にそれぞれのウェルに添加して、さらに4時間インキュベーシ
ョンを続けた。反応を、次いで100μLイソプロパノール：HCl（24:1 v/v）の添加によっ
て止めた。MTTの還元は、ホルマザンの生産を生じる。ホルマザンをマイクロピペットの
使用によって可溶化して、光学密度（O.D.）を適切なコントロールに対して570nmの波長
にてマイクロプレートリーダーにおいて決定した。細胞増殖阻害の割合は、以下の式を使用して決定した：
%阻害＝100−[（試験O.D.−コントロールO.D.）/コントロールO.D.］。
【０３１８】
低MpRNC（実施例３、表６;第３の組成物を参照）を加えた制御されたチモテ菌細胞含量および中間MpRNC（実施例３、表６;第３の組成物）を加えた制御されたチモテ菌細胞含量について、ヒト膀胱癌株化細胞RT4を使用して得られた結果をそれぞれ表２８および29に
示してある。チモテ菌と相対的な効力の決定は、PharmPC v4.2（Microcomputer Specialists、Philadelphia、PA、USA）を使用して決定した。
【０３１９】
【表２８】
2014502256.tif 000030
【０３２０】
【表２９】
2014502256.tif 000031
【０３２１】
結果は、低MpRNCおよび中間MpRNCが抗癌活性を有すること、並びにオートクレーブ処理したチモテ菌（すなわち、無傷のマイコバクテリア細胞を含む調製物）が低MpRNCまたは
高MpRNCにおけるおのと同等の添加されたチモテ菌を含んでいるMpRNCより少ない抗増殖活性をRT4膀胱癌細胞に対して有することを示す。その上、無傷のチモテ菌を有するMpRNC組成物は、最適な抗増殖活性より少ない活性を有した。無傷のマイコバクテリア細胞含量を増加させたMpRNCに対して相対的な、無傷のマイコバクテリア細胞を添加しないMpRNCの相対的効力の算出では、両方のマイコバクテリアRNCが無傷のチモテ菌より著しく強力であ
ったことを示した（それぞれ低および中間MpRNCについて91倍および263倍）。無傷のマイコバクテリア細胞の添加により、10% w/w以上のときに効力の有意な減少を生じ、最適な
無傷のマイコバクテリア細胞含量は、無傷のマイコバクテリア細胞含量の最初の程度に依存して1.0% w/w以下であった（中間MpRNCについて0%および低MpRNCについて1%。したがって、抗癌用途を目的としたMRNC組成物および製剤は、低い無傷のマイコバクテリア細胞含量から利益を受ける。
【０３２２】
[実施例２８]
＜ルイス肺癌に対する中間MpRNCの抗癌活性＞
本実施例は、中間MpRNCがインビトロおよびインビボにおいて抗癌活性を有することを
示すのに役に立つ。中間MpRNCをMRNCの一例として使用していること、およびこの実施例
において教示した原則をマイコバクテリア科由来のMRNCに適用できることを理解すべきである。
【０３２３】
本発明の方法にしたがって製造し、RNaseフリーの水中に製剤化した中間MpRNCの直接の抗癌活性を、ルイス肺癌（LLC）株化細胞を使用して決定した。LLC細胞は、ATCC（Manassas、VA、USA）から得た。LLCは、化学療法および免疫療法の抗癌剤の開発において、広範囲に使用される（たとえばKimura, Y. New Anticancer agents: In vitro and in vivo evaluation of antitumor and antimetastatic action of various compounds isolated from medicinal plants. in vivo 2005; 19:37-60を参照)。LLC細胞を10% v/v熱不活性化
されたウシ胎児血清（30分間56℃）（両方ともWisent、St-Bruno、Quebec、Canadaから）および10.0μg/mLゲンタマイシン硫酸塩（Sigma-Aldrich、Oakville、Ontario、Canada）を含んでいるDMEM培地中で5%CO2雰囲気下で37℃にて維持した。ゲンタマイシンのないDMEM/10%熱不活性化されたFBS中のLLC細胞を4.0×104細胞にて0.1mLの容積で96ウェル平底組織培養マイクロプレートに播種し、中間MpRNC懸濁液（0.1mL）を3連のウェルに添加して0.01〜100.0μg/mLの終濃度を与えた。プレートを、次いで48時間37℃にて5%CO2雰囲気下
でインキュベートした。MpRNCの抗増殖活性は、実施例27においてRT4膀胱癌株化細胞（ホルマザン還元）について記述したように決定した。結果を表３０に示してある。
【０３２４】
【表３０】
2014502256.tif 000032
【０３２５】
増殖阻害の測定により決定されるように、表３０に示した結果は、MpRNCがLLC細胞に対して用量相関的な抗癌活性を有することを示す。したがって、実施例２８およびこの実施例（実施例２８）は、MpRNCの直接の抗癌活性が癌細胞タイプでないこと、ひいては癌特
異的でないことを示す。
【０３２６】
遠隔部位転移は、癌に関連する死亡率の主要な原因である（Kim et al., Carcinoma produced factors activate myeloid cells via TLT2 to stimulate metastasis. Nature 2009;457:102-106）。実験的な肝転移は、脾臓へのLLC細胞の注射によって生じさせることができる（Ligo et al., Therapeutic activity and tissue distribution of ME2303, a
new anthracycline containing fluorin, and its metabolites in mice bearing hepatic metastases of Lewis lung carcinoma. Anti-Cancer Drugs 1990;1:77-82およびAlino
et al Morpho-functional study of vascular fluorochrome delivery to lung and liver metastases of Lewis lung carcinoma (3LL), Tumori 1991;77:206-211）。LLC細胞の脾臓内注射によって肝臓において誘導される腫瘍部位は、肝臓に対する転移性伝播のモデルとみなされており、腫瘍巣の数は、カラギナンでのクッパー細胞（肝臓の洞様脈管に沿って並ぶ分化したマクロファージ）の活性を遮断することによって増加する。したがって、このモデルは、肝転移の異なる側面を研究するための有用なツールを提供する（Kopper
et al., Experimental model for liver metastasis formation using Lewis lung tumor. J. Cancer Res and Clin. Oncol. 1982;103:31-38)。以下の研究の目的は、C57BL/6マウスにおけるLLC細胞の脾臓内注射によって誘導される実験的な肝臓転移に対する処置と
して、静脈内(IV)投与後の、MpRNC懸濁液の有効性を決定することであった。
【０３２７】
LLC細胞を、上述したように10% v/v熱不活性化されたウシ胎児血清を含んでいるDMEM培地中で維持した。細胞は、3〜4日ごとに連続継代して、継代2〜3にて使用した。細胞を収集して、トリプシン処理（37℃にて4分）によって、ウシ胎児血清およびゲンタマイシン
硫酸塩のないDMEM培地中で2回洗浄し、250×gにて5分間4℃にて遠心分離して、細胞ペレ
ットをウシ胎児血清およびゲンタマイシン硫酸塩のないDMEM培地中に懸濁した。細胞の数を、トリパンブルー排除および血球計算板における計数を使用して細胞生存度を決定した後、必要な濃度に調整した。細胞を脾臓内注射まで氷上で保持した。
【０３２８】
雌C57BL/6マウス、10〜12週齢は、Charles River Laboratories Ltd.、St. Constant、Quebec、Canadaから得た。このマウス株は、LLC細胞と同系である。肝臓転移を全身麻酔
下でLLC細胞（100μLの容積における1.0〜3.0×105のLLC細胞）の脾臓内注射によって誘
導した。脾臓を癌細胞注射後に摘出した。LLC注射の前（予防的処置）またはLLC細胞注射後（治療的処置）にマウスを処置する効果を、まず調査した。中間MpRNCを、10匹のマウ
スのグループを使用してLLC細胞注射後の1日前に（予防的療法）、2、5、7、9および12日目に（治療的療法）、または-1、2、45、7、9および12日目に（予防的および治療的な療
法）、注射した。実施例３に記載したようにRNaseフリー注射用水中に製剤化した中間MpRNCを、5mg/kg体重の用量に対応する100μLの用量容積で投与した。肝臓転移の数をLLC細
胞注射後15日目に決定した。結果（表３１）は、治療的+予防的投与プロトコルが最も有
効な処置法であり、続いて予防的な処置法であり、および治療的な処置法が最も少なく有効であったことを示す。したがって、予防的および治療的な療法の組み合わせは、肝臓LLC転移の治療のために最も有効なものである。
【０３２９】
【表３１】
2014502256.tif 000033
【０３３０】
これらのデータは、スタンドアロン療法としての、または癌の治療のためのネオアジュバントおよびアジュバント状況における中間MRNCの使用は、原発性癌腫の転移から生じる腫瘍を減少させるのに有益であろうことを示す。表３１に示した結果は、癌細胞に対する曝露の前の標的器官における宿主-防衛機構の活性化（予防的活性）、これにより肝臓に
おける腫瘍細胞接種の減少を生じ、並びに標的器官におけるこれらの最初の移植後の癌細胞上の治療効果（治療的活性）と合致している。表３０において示されたLLC細胞標的に
対する直接的な抗癌の実証は、このような作用様式を支持する。
【０３３１】
第2の研究は、より多数の動物において予防的/治療的処置法を使用してLLC肝転移に対
する中間MpRNC懸濁液処置の効果を決定するために行った。実験的なLLC肝転移を、20匹のマウスのグループを使用して上述したように確立して、5mg/kg体重の用量にて中間MpRNC
による予防的/治療的処置を実施した。
【０３３２】
この研究の結果は、コントロール群において141±72（平均±SD）の転移があったこと
、並びに上述したような予防的および治療的な処置プロトコルを使用することによって、中間MpRNC処置が転移の数を62±41（平均±SD、p<0.0002、Mann-Whitney U-試験）まで有意に減少させたことを示し、したがって、実験的に誘導される肝転移に対してインビボで有意な抗癌活性を示した。したがって、インビトロでLLC細胞に対して示された抗癌活性
は、インビボでの肝転移の発症に対する予測的な阻害効果測定として確認される。
【０３３３】
[実施例２９]
＜マイコバクテリアRNCの抗癌活性＞
本実施例は、MRNCが抗癌活性を有することを示すのに役に立つ。この実施例において教示した原則をマイコバクテリア科由来のMRNCに適用できることを理解すべきである。
【０３３４】
実施例３および4において調製したようなマイコバクテリアRNCの抗癌活性を、癌細胞増殖阻害アッセイを使用して決定した。当業者は、このような研究がインビボでの抗癌活性を予測するために公知であることを認識する。この実施例において、膀胱癌株化細胞を一般的な癌株化細胞の代表例として使用しており、および当業者であれば、このような癌株化細胞を使用した抗癌活性研究が、その他の癌株化細胞に容易に推定されることができると即時に認識するであろうことが理解されるべきである。
【０３３５】
合計４つのヒト膀胱癌細胞を実施例において使用し、および全てATCC（Manassas、VA、USA）から得た。株化細胞の培養をATCCによって推奨されるように実施した。膀胱癌株化
細胞の詳細を表３２に示してある。
【０３３６】
【表３２】
2014502256.tif 000034
【０３３７】
膀胱癌株化細胞を熱不活性化された10%FBS（両方ともWisentから）および10μg/mLゲンタマイシン（Sigma-Aldrich）を補ったDMEM培養液中で5×105細胞/mlの濃度にて96ウェル組織培養プレート（50μL容積）にまき、5%CO2雰囲気下で37℃の温度にて一晩ウェルの表面に接着させた。実施例３および実施例４に記載したように調製した50μL組織培養液の
容積の中間マイコバクテリアRNCを細胞に添加して、終濃度0.0016、0.016、0.16、1.6、16および80μg/mL MpRNCを与えた。細胞を、次いで48時間37℃にて5%CO2雰囲気下でインキュベートした。抗増殖活性を、MTT（（3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフ
ェニルテトラゾリウムブロミド）還元アッセイを使用して決定した。簡潔には、48時間のインキュベーション後にそれぞれのウェルに10μLのMTT溶液（PBS中の5mg/mL）を添加し
て、さらに4時間インキュベーションを続けた。反応を、次いで100μLイソプロパノール
：HCl（24:1 v/v）の添加によって止めた。MTTの還元は、ホルマザンの生産を生じる。ホルマザンをマイクロピペットの使用によって可溶化して、光学密度（O.D.）を、適切なコントロールに対して570nmの波長にてKCジュニアソフトウェアパッケージ（BioTek Instruments）を使用してELx-808IUマイクロプレートリーダー（BioTek Instrument、Winooski
、VT、USA）を使用して決定した。癌細胞増殖阻害の割合は、以下の式を使用して決定し
た：
%阻害＝100−[（試験O.D.−コントロールO.D.）/コントロールO.D.］。
MRNC組成物の効力を、PharmPC v4.2（Computer Associates, Philadelphia, PA）を使
用して決定した
【０３３８】
４つのヒト膀胱癌株化細胞を使用してMRNCについて得た結果を表３３に示してある。全てのMRNC組成物は、膀胱癌株化細胞に対して用量依存的抗増殖活性を示した。ウシ結核菌株BCG由来のMbRNCは、最少の有効性を有し、用量相関的な抗増殖活性を示し、試験した最高の用量にて〜20〜40%の阻害（膀胱癌株化細胞に依存する）であった。その他のMRNCの
全ては、用量相関的な抗増殖活性を示し、試験した最高の用量にて〜35〜70%の阻害（膀
胱癌株化細胞に依存する）であった。この理由のため、ウシ結核菌株BCG由来のMRNCに対
して相対的な異なるMRNCの効力を決定し、その結果を表３３に示してある。
【０３３９】
【表３３】
2014502256.tif 000035
【０３４０】
膀胱癌増殖阻害について最も強力なMRNCは、マイコバクテリウム・バッカエから得られたものであり、続いてチモテ菌からのMpRNC、マイコバクテリウム・スメグマチスからのMsRNCおよびウシ結核菌株BCGからのMbRNCの順で効力が減少した。マイコバクテリアRNC組
成物についての効力の大きさおよび順序は、4つ全ての膀胱癌株化細胞について維持され
、これらの起源（下等、高等）または突然変異の状態にかかわりなく、マイコバクテリウム・バッカエMvRNCおよびチモテ菌MpRNCは、それぞれウシ結核菌BCG MbRNCより数倍〜6800倍および〜4000倍強力であった。
【０３４１】
この実施例は3つの重要な原則を教示することが理解されるべきである。第1に、異なるマイコバクテリア種（病原性、非病原性、増殖が早い、増殖が遅い）から調製されるMRNCが抗癌活性を有し、したがってこのような活性は、マイコバクテリア科のメンバー種から調製したMRNCに適用可能である。第2に、標的癌細胞の突然変異の状態は、抗癌活性を決
定する役割を担うようには見えない。事実、有意な抗癌活性が、公知の治療耐性の遺伝子型（p53およびp21突然変異）およびMDR表現型（たとえばHT1376）を有する癌株化細胞に
ついて見られる。当業者は、このような突然変異および耐性表現型が一般的な癌の特徴であり、そして膀胱癌細胞に制限されないことを知っており、したがってMRNCの抗癌活性が
その他の多くの癌タイプに適用可能であると認識するであろう。第3に、3つの成長の早いマイコバクテリア種から調製されたMRNCは、ウシ結核菌株BCGなどのゆっくり成長するマ
イコバクテリア種から調製されたMRNCより有効である。
【０３４２】
[実施例３０]
＜トリ結核菌亜種副結核のRNA含有組成物（MapRNC）の調製および抗癌活性の決定＞
この実施例では、無傷のトリ結核菌亜種副結核細胞をまず低速遠心によって洗浄して培養液成分を除去し、次いで実施例３に記載したようにAvestin EmulsiFlex-C5高圧ホモジ
ナイザーによる高圧ホモジナイゼーションを使用して破壊する。高圧ホモジナイゼーション後、残っている無傷のマイコバクテリアを、任意の残留する無傷の破壊されていないマイコバクテリアの制御された除去のために最適化された相対遠心力を使用して、分画遠心によって取り除く。最適な抗癌活性について、マイコバクテリア細胞壁断片に付随したマイコバクテリアの核酸、並びに所望の、および制御された量の無傷のマイコバクテリア細胞を含むマイコバクテリア細胞を除去した画分を、相対的により高い遠心力での遠心洗浄によってさらに精製して可溶性混入物を除去する。MapRNCを、高い相対遠心力での遠心洗浄後のペレットとして単離する。MapRNCを、次いで5〜30分間121℃にて熱処理する。MapRNCの抗癌活性を、実施例８および９に記載したように、主要な癌細胞タイプの癌株化細胞の代表を使用して決定する。結果は、熱処理したMapRNCが癌株化細胞に対しておよび肝転移に対して用量相関的な抗増殖活性を有することを示す。
【０３４３】
[実施例３１]
＜チモテ菌の総RNAの抗癌活性＞
チモテ菌細胞由来の総RNA調製の生物学的活性を、癌細胞増殖アッセイを使用して決定
した。RNAを、レベル4.5にて1分間FastPrep FP120ビーズ攪拌装置（Savant, Thermo-Fisher, Nepean, $ON, Canada）を使用してFastRNA Blue-Tubes（Bio-101 Inc.）において細
胞溶解した後に、製造業者の説明書に従ってTrizol試薬（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）を使用して調製した。RNA調製を、次いで製造業者の説明書に従って「DNAフリー」試
薬で処理して、残留するゲノムDNAを除去して（Ambion、Austin、TX、USA）。RT4（ATCC catalog # HTB-2）、HT1376ヒト膀胱癌細胞（ATCC catalog # CRL-1472）を、10%FBS（両方ともWisentから）および10μg/mlゲンタマイシン（Sigma-Aldrich）を補ったDMEM培養
液中に2×105細胞/mlの濃度にて96ウェル組織培養プレート（50μL容積）にまき、37℃の温度にて5%CO2雰囲気下で一晩ウェルの表面に付着させた。50μLの容積の組織培養液中の総RNAを細胞に添加して0.01、0.1、1.0μg/mLの終濃度のRNAを与えた。細胞を、次いで72時間37℃にて5%CO2雰囲気下でインキュベートした。癌株化細胞に対する抗増殖活性を、MTT（（3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）還元アッセイを使用して決定した。簡潔には、72時間のインキュベーション後に10μLのMTT溶液（PBS中の5mg/mL）をそれぞれのウェルに添加して、さらに4時間インキュベーションを続けた。反応を、次いで100μLイソプロパノール：HCl（24:1 v/v）の添加によって
止めた。MTTの還元は、ホルマザンの産生を生じる。ホルマザンをマイクロピペットの使
用によって可溶化し、光学密度（O.D.）を、適切なコントロールに対して570nmの波長に
てマイクロプレートリーダーにおいて決定した。細胞増殖阻害の割合を、以下式を使用して決定した：
%阻害＝100−[（試験O.D.−コントロールO.D.）/コントロールO.D.］。
【０３４４】
結果は、チモテ菌の総RNAの中等度の抗癌活性を示し、HT1376に対して0.1μg/mL、1.0
μg/mLおよび10.0μg/mL RNAにてそれぞれ2.2%、7.1%および6.8%の阻害活性を有し、並びにRT4に対して0.1μg/mL、1.0μg/mLおよび10.0μg/mL RNAにてそれぞれ3.1%、7.6%およ
び18.6%の増殖阻害によるわずかにより高い阻害活性を有する。実施例２７または実施例
２９において得られた結果と比較したときに、マイコバクテリアRNAは、マイコバクテリ
ア細胞壁と共に製剤化されたオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドの形態
であり、マイコバクテリア細胞壁RNA組成物（または、キトサンもしくはカチオン性リポ
ソームなどのその他の薬学的に許容される担体）を使用したときに、生物学的活性に関して得られる、異なる、および予想外の利点があることが明らかである。
【０３４５】
[実施例３２]
＜マイコバクテリア細胞壁RNCの統合化効力インデックスの決定＞
本発明のマイコバクテリア細胞壁RNC（MRNCs）は、2つの異なる受容体系を介して免疫
系を刺激する能力、および癌細胞分裂を阻害する能力を有し、したがって、三機能の治療的組成物である。実施例２９、１７および１９からのデータ（抗増殖効力、NOD2活性化効力およびTLR2活性化効力のそれぞれ）を使用することによって、中間MbRNCに対して相対
的な中間MpRNC、中間MsRNCおよび中間MvRNCについての統合化効力インデックスを、全体
的な抗癌および免疫刺激活性を統合する手段として決定した。異なるアッセイ間の相対的効力についての数値が広範（≧3桁）なため、自然対数（log）変換をこの決定に使用して、各活性についての値を合計した。MbRNCには1の効力を割り当て、その他のMRNCの効力をMbRNCに対して相対的に決定した。1の自然対数が0であることは理解されるはずである。
結果を表３４に示してある。
【０３４６】
【表３４】
2014502256.tif 000036
【０３４７】
全てのMRNCがTLR2活性化に関して類似の、同等の効力を有する一方で、MpRNC、MsRNCおよびMvRNCが抗癌活性に関してMbRNCよりすべて強力であったことは、明らかである。しかし、MpNACは、NOD2活性化に関して最も強力なMRNCであった。統合効力インデックスの決
定では、MpRNCが全体的に最高の効力を有し、続いてMvRNC、MsRNCおよびMbRNCの順に下がることを示した。
【０３４８】
[実施例３３]
＜免疫刺激のための無傷のマイコバクテリア細胞の制御された量を有するMpRNC組成物の
調製＞
MpRNCは、低MpRNCを調製し（実施例２および実施例３において詳述したように）、MpRNCに無傷のオートクレーブ処理したマイコバクテリア細胞を添加して、免疫応答の誘導の
ために最適な所望の比率を与えることによって、無傷のオートクレーブ処理したマイコバクテリアの制御された量により都合よく調製される。概して、本発明者らは、免疫応答を誘導するために必要な無傷のチモテ菌細胞の最適の比率がおよそ5〜50重量％の範囲であ
り、このような比率が最適の免疫刺激活性を生じさせることを見いだした。
【０３４９】
[実施例３４]
＜免疫刺激のための無傷のマイコバクテリア細胞の制御された量を有するMRNC組成物の調製＞
【０３５０】
MRNCは、低MRNCを調製し（MpRNCについて実施例３に記載したように）、MRNCに無傷の
オートクレーブ処理したマイコバクテリア細胞を添加して、免疫応答の誘導のために最適な所望の比率を与えることによって、限定されないがウシ結核菌株BCG、トリ結核菌亜系
副結核、マイコバクテリウム・スメグマチスまたはマイコバクテリウム・バッカエなどのマイコバクテリア科の所定のマイコバクテリア種から都合よく調製される。概して、本発明者らは、免疫応答を誘導するために必要な無傷のマイコバクテリア細胞の最適の比率がおよそ5〜50重量％の範囲であり、このような比率が最適の免疫刺激活性を生じさせるこ
とを見いだした。
【０３５１】
[実施例３５]
＜リボヌクレアーゼ-AによるMpRNCの処理＞
リボヌクレアーゼによるMpRNCの処理（たとえば、実施例１０において記述した酵素消
化条件）では、MRNCまたはMpRNC組成物の中に含まれるRNAの量の有意な減少を生じる。このような減少は、MRNCまたはMpRNCが治療的薬剤として作用する能力を有意に減少させる
。
【０３５２】
中間MpRNCは、高圧ホモジナイゼーションの最後の2サイクル前に、洗浄した中間MpRNC
ペレットをRNase A有りまたは無し（Sigma、終濃度10μg/mL;それぞれMpRNC-RNaseおよびMpRNC-Control）の注射用水中に37℃にて3時間再懸濁させることを除いて、実施例３に記載したように作製した。MpRNCsを、次いで高速遠心によって洗浄してRNase Aを除去し、1mg/mLの濃度にて注射用水に再懸濁した。懸濁液を、その後ホモジナイズして、最後に滅
菌した。MpRNC-RNaseおよびMpRNC Controlの抗癌活性を、実施例２７に記載したように膀胱癌株化細胞HT1376およびRT-4を使用して決定した。2つのMpRNC製剤の相対的効力を、PharmPC v4.2（Microcomputer Specialists、Philadelphia、PA、USA）を使用して、用量−反応曲線の直線部分から算出した。
【０３５３】
両方のMpRNC製剤は、用量相関的な様式においてHT1376およびRT-4膀胱癌細胞の増殖を
阻害した（それぞれ表３５および３６）。しかし、RNase処理では、両方の膀胱癌株化細
胞に対するMpRNCの抗増殖活性の減少を生じた。
【０３５４】
【表３５】
2014502256.tif 000037
【０３５５】
【表３６】
2014502256.tif 000038
【０３５６】
HT-1376およびRT-4膀胱癌株化細胞に対する、処理した中間MpRNC-コントロールに対す
る相対的な中間MpRNC-RNase処理の抗増殖効力を表３７に示してある。
【０３５７】
【表３７】
2014502256.tif 000039
【０３５８】
RNase処理の結果としての中間MpRNCにおけるRNAの除去は、抗癌効力のかなりの減少（HT1376およびRT-4膀胱癌細胞についてそれぞれ4倍および7倍）を生じ、したがって、MpRNCにおけるRNAの保存が最適な抗癌活性のために必要であることを示している。
【０３５９】
[実施例３６]
＜カチオン性リポソームによるBRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCの製剤化および抗癌活性の決定＞
以下の手順の全ては、無菌条件下で行われる。BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCを、高圧ホモジナイゼーションを使用する無傷の細菌、マイコバクテリアまたはチモテ菌の破壊、低RCFでの遠心による破壊されていない細菌、マイコバクテリア
またはチモテ菌の除去、並びにフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールおよびエタノール沈澱を使用するRNC組成物の抽出によって調製する。RNC組成物における抽出されたRNAを、121℃にて5分間の熱処理によって鎖長を減少させて、およそ20〜40塩基を含む
オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドを調製する。モル比1:1の1,2-ジオ
レイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン/1,2-ジオレイル-3-トリメチルアンモニ
ウム-プロパン（DOPE/DOTAP）で構成されるカチオン性リポソームを、リン脂質およびカ
チオン性脂質を無水クロロホルムに溶解し（1mg/mL）、続いて丸底フラスコにおいて回転減圧蒸発させて薄いリン脂質/脂質フィルムを形成させることによって調製する。コント
ロールのリポソームを、薄いリン脂質/脂質フィルムにNaCl（0.85% w/v）の必要な容積を添加すること、および65℃にて撹拌してリポソームを形成させることによって調製する。BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCを含むカチオン性リポソームを、薄いリン脂質/脂質フィルムに、0.1mg/mLの濃度にてBRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCを含むNaCl溶液を添加し、65℃にて撹拌してリポソームを形成させる
ことによって調製する。BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCを含むカチオン性リポソームは、およそ825nmの平均直径およびおよそ+36 mVの(-電位を有するで
あろう。ネズミB16黒色腫増殖阻害アッセイを、実施例２７に記載したように、0.01〜10
μg/mLの濃度範囲のリポソーム型BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCを使用して実施する。コントロールのインキュベーションを、対応する濃度のコントロールのカチオン性リポソームまたは非リポソーム型BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCを使用して行う。MTT還元を実施例２７に記載したように実施し、細胞増
殖阻害の量を決定する。結果は、BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCを含むカチオン性リポソームが用量依存的様式でB16黒色腫細胞の増殖を阻害すること、
並びにカチオン性リポソーム単独は阻害活性を有しないことを示す。BRNC、MRNC、MpRNC
、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCを含むカチオン性リポソームの阻害活性は、BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC単独より有意に大きい。これらのデータ
は、カチオン性リポソーム製剤がBRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCのための医薬送達システムとして作用することを示す。
【０３６０】
RNAを、グラム陰性菌およびグラム陽性菌から、並びにマイコバクテリア、チモテ菌、
ウシ結核菌BCG、マイコバクテリウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核およびマイ
コバクテリウム・バッカエから単離して、これらの種からの細胞壁を添加せずにこの実施例に記載したようにカチオン性リポソームと共に製剤化してもよいことを理解すべきである。
【０３６１】
B16黒色腫細胞が典型的な癌細胞の代表例としてこの実施例において使用されること、
またカチオン性リポソームがこの実施例においてNAのための典型的な医薬送達システムとして使用されること、そして当業者であれば、一般的な癌治療においてこのようなタイプの医薬送達システムおよび製剤を使用することの適用性を認識するであろうことは、理解されるべきである。
【０３６２】
[実施例３７]
＜キトサンナノ粒子によるBRNC、MRNC、MRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCの製剤
化および抗癌活性の決定＞
以下の手順の全てを無菌条件下で行う。BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCお
よびMvRNCを、高圧ホモジナイゼーションを使用する無傷の細菌、マイコバクテリアまた
はチモテ菌の破壊、低RCFでの遠心による破壊されていない細菌、マイコバクテリアまた
はチモテ菌の除去、並びにフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールおよびエタノール沈澱を使用するRNAの抽出によって調製する。抽出されたRNAを121℃にて5分間の加圧滅菌によって鎖長を減少させて、およそ20〜40塩基を含むオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドを調製する。キトサンナノ粒子を、トリポリリン酸塩（水における0.5mg/mL）およびキトサン（平均分子量500,000、水中に1mg/mLの濃度）の同等の容積を20℃にて2分間混合してコントロールキトサンナノ粒子を形成させることによって、または細菌、マイコバクテリア、もしくはチモテ菌のオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチド（BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC、水中に0.5mg/mL）、並びにキトサン（平均分子量500,000、水中に1mg/mLの濃度）の同等の容積を20℃にて2分間混合することによって調製する。キトサンナノ粒子におけるBRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCの取り込みは、100%である。キトサンナノ粒子を遠心分離によって洗浄して、これらのサイズおよび(−電位（粒子表面電荷の間接的測定）を決定
する。キトサンナノ粒子は、およそ200〜1000nmの範囲のサイズおよびおよそ-20〜-35mV
の(-電位を有する。B16黒色腫細胞をMEM非必須アミノ酸、ゲンタマイシン（50μg/mL）および10% v/v熱不活性化した胎児血清を補ったMEM中で37℃および5%CO2にて、コンフルエ
ンスまで増殖させる。細胞をトリプシン処理によって収集し、MEM組織培養液に再懸濁し
て、組織培養プレート（96ウェルプレート、5×103の細胞を含む100μL）のウェルにまき、5%CO2において37℃にて3時間接着させる。BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC
およびMvRNCを含むキトサンナノ粒子を、次いでB16黒色腫細胞（ATCC）に添加して、範囲0.001〜100μg/mLのBRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCの終濃度を与える。コントロールキトサンナノ粒子またはキトサンナノ粒子のないBRNC、MRNC、MpRNC
、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCをB16黒色腫細胞に添加して、BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCキトサンナノ粒子と同等の濃度を与える。ネズミB16黒
色腫細胞を48時間37℃/5%CO2においてインキュベートし、MTT還元アッセイを使用してこ
の時間にわたる細胞増殖を決定する。生存可能な細胞の数に対応する還元されたMTTのレ
ベルを、ELISAプレートリーダーを使用して570nmにて決定する。結果は、BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCを含むキトサンナノ粒子が用量依存的様式でB16
黒色腫細胞の増殖を阻害すること、キトサンナノ粒子単独が阻害活性を有しないこと、並びにBRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNCを含むキトサンナノ粒子の阻害活性がBRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNCおよびMvRNC単独より有意に大きいことを示す。これらのデータは、キトサンナノ粒子製剤がBRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRN
C、MapRNCおよびMvRNCのための医薬送達システムとして作用することを示す。
【０３６３】
RNAを、グラム陰性菌およびグラム陽性菌から、並びにマイコバクテリア、チモテ菌、
ウシ結核菌BCG、マイコバクテリウム・スメグマチス、トリ結核菌亜種副結核およびマイ
コバクテリウム・バッカエから単離して、これらの種からの細胞壁を添加せずにこの実施例に記載したようにキトサンナノ粒子と共に製剤化してもよいことを理解すべきである。
【０３６４】
B16黒色腫細胞が典型的な癌細胞としてこの実施例において使用されること、またキト
サンナノ粒子がNAのための典型的な医薬送達システムとしてこの実施例において使用されること、そして当業者が、一般的な癌治療においてこのようなタイプの医薬送達システムおよび製剤を使用する適用性を認識するであろうことは、理解されるべきである。
【０３６５】
[実施例３８]
＜トリ結核菌亜種副結核RNA含有組成物（MapRNC）の調製＞
この実施例では、無傷のトリ結核菌亜種副結核細胞を、まず低速遠心によって洗浄して培養液成分を除去し、次いでAvestin EmulsiFlex-C5高圧ホモジナイザーによる高圧ホモ
ジナイゼーションを使用して破壊する。高圧ホモジナイゼーション後に、残っている無傷のマイコバクテリアを、任意の残留する無傷の破壊されていないマイコバクテリアの制御された除去のために最適化された相対遠心力を使用して、分画遠心法によって取り除く。マイコバクテリア細胞壁断片に付随するマイコバクテリアの核酸および無傷のマイコバクテリア細胞の所望の、および制御された量を含むマイコバクテリア細胞が除去された画分を、より高い遠心力での遠心洗浄によってさらに精製して、可溶性混入物を除去する。マイコバクテリア細胞が除去された画分を、高い相対遠心力での遠心洗浄後のペレットとして単離する。マイコバクテリア細胞が除去された画分を、次いで5〜30分間121℃にて熱処理し、トリ結核菌副結核からのマイコバクテリアRNC（MapRNC）として使用する。
【０３６６】
[実施例３９]
＜MapRNCにおける核酸の解析＞
この実施例では、核酸タイプ、オリゴリボヌクレオチド鎖長およびMapRNC含量を決定する。MapRNCは、実施例３８に記載したように調製する。核酸を以下の手順を使用して抽出する。1mg/mlの濃度の700μLの一定分量をDNaseフリーおよびRNaseフリーのリゾチームで消化し、続いてDNaseフリーおよびRNaseフリーのプロテイナーゼK（両方ともSigma-Aldrich Canada、Oakville、Ontarioから）で不活性化およびさらなる消化を行う。核酸をフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24:1 v/v）によって抽出して、グリコーゲン、酢酸ナトリウムおよびエタノールの添加によって沈殿させる。沈殿物を80%の氷
冷エタノールで洗浄し、50μL蒸留水に再懸濁する。濃度をUV分光光度計において260/280nmでの吸光度の測定によって決定する。各組成物の核酸含量を決定する。
【０３６７】
熱処理（121℃、30分）の前後に収集したMapRNC調製物を、Bioanalyzerシステム（Bioanalyzer model # 2100、Agilent、Santa Clara、CA、USA）を使用して、これらの核酸プ
ロファイルについて電気泳動で解析する。核酸画分を30ng/μLの濃度に希釈する。抽出した核酸の長さの電気泳動解析は、RNA 6000ナノキット（Agilent # 5067-1511）を使用し
てBioanalyzer電気泳動ユニットで達成する。このキットは、25から6000ヌクレオチドま
でのサイズ範囲のRNAの質について情報を提供する。次いで、加圧滅菌後のMapRNCを、6〜150のヌクレオチドのサイズ範囲の小さな核酸の解析のために設計されているSmall RNA Kit（Agilent Technologies Canada Inc.、St. Laurent、Quebec、Canada、kit # 5067-1548）を使用してさらに解析する。熱処理前のMapRNCを、RNAナノ6000キットを使用して解
析するときに、およそ25塩基から4000塩基近くまでの核酸プロファイルを有する。結果は、MapRNCを調製するための高圧ホモジナイゼーション工程（異なる加圧およびサイクル数）の使用が25〜4000塩基のポリリボヌクレオチド鎖長を含む組成物を生じることを示す。
熱処理後、MapRNCは、よりコンパクトな分布を示す。MapRNCは、20〜40塩基の間に最大であるオリゴリボヌクレオチドピークを有し、および長さが5〜60塩基の核酸プロファイル
を有する。MapRNC組成物は、100塩基にて溶出する核酸を少量のみ有し、および長さがお
よそ150塩基にて溶出するさらにより少ないオリゴリボヌクレオチド物質を有する。結果
は、MapRNCを調製するための高圧ホモジナイゼーションおよび熱処理工程（加圧滅菌に加えて異なる加圧およびサイクル数）の使用により、60塩基未満のオリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチド鎖長を含む組成物を生じることを示す。
【０３６８】
実施例３８のように調製したMapRNCのRNAに対するDNA比率の解析を、抽出した核酸のRNase Aでの酵素消化、続いてBioanalyzer 2100電気泳動プロファイリングおよびAgilent Small RNA Kit（kit # 5067-1548）を使用することによるオリゴリボヌクレオチド含量定
量化を使用して、まず行う。抽出した核酸のRNase A消化を、DNaseフリーのリボヌクレアーゼA（RNase A、DNase活性を除去するために30分間100℃にて処理する）（0.1μg酵素、37℃にて2時間）を使用することによって実施する。RNase Aは、Ameresco（Solon、OH、USA）から得られる。RNase A処理した核酸の試料（20ng/μL）を、Bioanalyzerを使用して解析する。DNAおよびRNAの量を、以下の式を使用してMapRNCにおいて決定する：
DNA含量＝（総核酸含量−RNase A処理後の核酸含量）。MapRNCの解析は、MapRNCの抽出物におけるDNAおよびRNAの存在を示す。
【０３６９】
本発明のMapRNCのRNAに対するDNA比率の解析は、以下の通りに行う。核酸画分を、Microsep 1Kユニットを使用して限外濾過によって回収する（分子量カットオフ=1000Da、Pall（登録商標）、Life Sciences、Ann Arbor、MI、USA）。核酸溶液を、次いでLiang（Liang et al., Ann. Chim. Acta 2009, 650:106-110）によって報告された手順に従って、ヌ
クレアーゼP1（Sigma-Aldrich、Oakville、ON、Canada）を使用して、ヌクレオシド5'-モノホスフェートの混合物に消化する。最適なヌクレアーゼP1消化を保証するために、調査すべき核酸水溶液の合計50μLを10分間95〜100℃にて湯煎において加熱し、続いて即時に氷上で冷やす。ヌクレアーゼP1は、0.5mM ZnCl2、pH5.3を含む30mM酢酸ナトリウムバッファーにおける5ユニット/μLにて調製する。酵素消化のために、水溶液中の50μLの核酸を同じ容積のヌクレアーゼP1溶液と混合し、次いで30分間50℃にてインキュベートした。生じる混合物を室温まで冷却し、HPLC解析の前に室温にて20分間10,000gでの遠心によってNanosep 10Kフィルターを介して濾過する。
【０３７０】
また、DNAおよびRNAに存在する100、10、5、2.5、1ng/μLのモノヌクレオチドのそれぞれを含むモノヌクレオチド標準（5'-デオキシリボヌクレオチドおよび5'-リボヌクレオチド、Sigma-Aldrich）の混合物の段階希釈をヌクレアーゼP1処理に対して処理し、HPLC解
析における標準として使用するために濾過する。これらのヌクレオチドの溶出順序を同じHPLC条件下で個々のヌクレオチドの保持時間を比較することによって確認する。HPLC解析を、デガッサーを有する四つ組ポンプ、オートサンプラー、カラムヒーター、および多波長UV検出器を備えている1200シリーズHPLCシステム（Agilent、StLaurent、Quebec、Canada）を使用して行う。Zorbax Bonus-RPカラム（Agilent）を使用し、移動相は10mMリン酸カリウムバッファー、pH 7.2およびメタノール（0〜10%メタノール）の直線勾配からなる。モノヌクレオチドを260nmにて検出する。DNA：RNA比率をDNAおよびRNA含量の決定後に
決定する。結果は、DNAに加えてRNAがMapRNCに存在することを示す。
【０３７１】
[実施例４０]
＜MapRNCは、ヒト病原体関連分子パターン受容体（PAMP）NOD2の活性化を誘導する＞
実施例３８において調製したMapRNCのNOD2活性化活性を、NF-κBおよび下流のシグナリングマーカーIL-8を駆動するヒトNOD2受容体を発現するように操作されたHEK-293細胞を
使用して評価する。
【０３７２】
ヒトHEK293-NOD2株化細胞（InvivoGen、San Diego、CA、USA）を10%のウシ胎児血清（
両方ともWisent、St-Bruno、Quebec、Canadaから）、100μg/mL Normocin（商標）および10μg/mLブラストサイジン（両方ともInvivoGenから）を補った高グルコースDMEM中で5%CO2を含む加湿雰囲気下で37℃にて培養し、および維持する。HEK293-NOD2細胞を上述した
細胞培養液中に無菌の96ウェル平底組織培養マイクロプレートにおいて0.2mLの容積で5×105細胞/mLにて播種し、5%CO2を含む加湿雰囲気下で37℃にて、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80および160μg/mL MapRNCと共に48時間インキュベートした。上清はインキュベーション後に収集し、4℃にて5分間4,000×RCFにて遠心分離して細胞および細片を除去して、上清を解析のために-20℃にて貯蔵する。上清におけるヒトIL-8をMapRNCと共に48
時間培養した後、BioSource、Camarillo、CA、USAからの市販の酵素結合抗体免疫吸着ア
ッセイ（ELISA）法によって、上清において測定する。データを、KCジュニアソフトウェ
アパッケージ（Bio Tek Instruments、Winooski、VT、USA）を使用してELISAプレートリ
ーダー（ELx-808IU Bio Tek Instruments、Winooski、VT、USA）から取り込み、合成されるIL-8のpg/mLで表す。MapRNCは、用量依存的様式でIL-8の合成および分泌を誘導する。
したがって、結果は、MapRNCが用量依存的様式でNOD2で駆動されるIL-8放出を誘導することによりNOD2アゴニストとして機能することを示す。
【０３７３】
[実施例４１]
＜MapRNCはヒトTLR2活性化活性を有する＞
実施例３８において調製したMapRNCのTLR2活性化活性を、ヒトTLR2受容体を発現するように操作されたHEK-293細胞を使用して測定する。
【０３７４】
ヒトHEK293-TLR2株化細胞は、InvivoGen、San Diego、CA、USAから得られる。HEK293-TLR2細胞に、NF-κB遺伝子の制御下に配置されたTLR2遺伝子およびTLR2受容体で駆動され
る分泌型胚性アルカリホスファターゼ遺伝子（SEAP）を安定してトランスフェクションする。したがって、TLR2の活性化により細胞培養液におけるアルカリ性リン酸塩活性の生成を生じ、それを使用して受容体活性化を定量化する。細胞を10%ウシ胎児血清（両方ともWisent、StBruno、Quebec、Canadaから）および1×Normocin（商標）（InvivoGen）を補った高グルコースDMEM中で5%CO2を含む加湿雰囲気下で37℃にて培養し、および維持する。HEK293-TLR2細胞をHEK-Blue（商標）Detection培地（InvivoGen）中で無菌の96ウェル平底組織培養マイクロプレートにおいて0.2mL容積で5×105細胞/mLにて播種し、5%CO2を含む
加湿雰囲気下で37℃にて、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80および160μg/mL MapRNCと共に18時間インキュベートした。ウェルに添加するHEK-Blue（商標）Detection培地は、NF-κBで誘導される可溶性胚性アルカリホスファターゼ酵素活性（SEAP活性）の検出のために設計されている。18時間のインキュベーションの後、光学密度（TLR2結合を介したNF-κBの活性化に比例する）を、マイクロプレート分光光度計リーダー（ELx-808IUモデ
ル、Bio Tek Instrument、Winooski、VT、USA）を使用して、630nmにて決定する。データを、KCジュニアソフトウェアパッケージ（Bio Tek Instruments）を使用して取り込む。
細胞上清におけるSEAP活性は、MapRNC処理の後、用量相関的な様式で増加する。したがって、結果は、MapRNCが用量依存的様式でTLR2を活性化することができることを示す（すなわち、MapRNCはTLR2アゴニストとして作用する）。
【０３７５】
[実施例４２]
＜MapRNCの抗癌活性＞
実施例３８において調製したMapRNCの抗癌活性を、主要な癌細胞タイプの癌株化細胞の代表を使用して決定する。RT4ヒト膀胱癌細胞（ATCC catalog # HTB-2（商標））をDMEM
培養液中に、CT26マウス大腸癌株化細胞（ATCC catalog # CRL-2638（商標））をRPMI1640培地中に、96ウェル組織培養プレート（50μL容積）において5×105細胞/mLの濃度にて
まき、両方とも10%熱不活化FBS（両方ともWisentから）および10μg/mLゲンタマイシン（Sigma-Aldrich）補ってあり、そして処理の前に5%CO2雰囲気下で37℃の温度にて一晩ウェ
ルの表面に接着させる。ヒト白血病細胞Jurkat（ATCC TIB-152（商標））を10%の熱不活
化FBSおよび10μg/mLゲンタマイシンを補ったDMEM培養液中で96ウェル組織培養プレート
（50μL容積）において1x106細胞/mLの濃度にて懸濁する。50μLの容積の組織培養液中の熱処理MapRNC（たとえば121℃、30分）を細胞に添加して、0.01、0.1、1.0および10μg/mL MapRNCの終濃度を与える。細胞を、次いで5%CO2の雰囲気下で37℃にて48時間インキュ
ベートする。癌株化細胞に対する抗増殖活性をMTT（（3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）還元アッセイを使用して決定する。簡潔
には、10μLのMTT溶液（PBSにおける5mg/mL）を48時間のインキュベーションの後にそれ
ぞれのウェルに添加して、さらに4時間インキュベーションを続ける。反応を、次いで100μLイソプロパノール：HCl（24:1 v/v）の添加によって止める。MTTの還元は、ホルマザ
ンの生産を生じる。ホルマザンをマイクロピペットの使用によって可溶化して、光学密度（O.D.）を適切なコントロールに対して570nmの波長にてマイクロプレートリーダーにお
いて決定する。細胞増殖阻害の割合を、以下の式を使用して決定する：
%阻害＝100−[（試験O.D.−コントロールO.D.）/コントロールO.D.］。
【０３７６】
結果は、熱処理MapRNCが、RT4膀胱癌細胞およびCT26大腸癌細胞、並びにJurkat白血病
細胞に対して用量相関的な抗増殖活性を有することを示す。したがって、MapRNCは、癌タイプに制限されない抗癌活性を有する。
【０３７７】
[実施例４３]
＜免疫刺激のためのMRNC製剤組み合わせ＞
上記実施例を読んだ後の当業者は、所望の適用のために最適な治療的活性を達成するMRNCの適切な組み合わせを使用するであろう。したがって、MpRNCおよびMvRNCの組み合わせは、免疫刺激およびサイトカイン誘導のための最適なNOD2およびTLR2活性化を与えるであろう。同様に、MpRNCおよびMvRNCの組み合わせは、最適な抗癌活性および免疫刺激を与えるであろう。
【０３７８】
[実施例４４]
＜MRNCと癌治療において使用される治療的薬剤との組み合わせ＞
本発明のMRNC組成物を、臨床的有効性を増強するために、化学療法および／または免疫療法と組み合わせる。以下の化学療法処方計画に対するMRNCの添加は、包括的なリストであることが意図されず（このようなリストは、たとえば癌の治療における220を超える一
般的な薬物処方計画を記述するThe Elsevier Guide to Oncology Drugs and Regimens, 2006において入手できる）、また当業者であれば、本発明の実施例を読んだ後に、最適な
化学療法処方計画で、ネオアジュバントまたはアジュバント状況における癌の治療において本発明の組成物を使用するであろうことを理解すべきである。以下の2つのプロトコル
は、MRNCがどのように化学療法および免疫療法と組み合わせて使用されるかという原則を説明するために役に立つ：
【０３７９】
結腸および直腸癌：局所的に進行した疾患を有する結腸および直腸癌を患う患者は、肝臓の肝門脈接種を介した肝転移についてのリスクが高い。化学療法は、肝転移およびその後のその他の器官への二次転移の発病率を減少させる目的で、外科的な切除の前または後にたいてい開始される（ネオアジュバントまたはアジュバント状況）。5-フルオロウラシルは、5日間毎日の持続点滴静脈内注射による1000mg/m2の処方計画を使用して、転移性または進行性疾患の治療においてたいてい使用され、それが28日毎に繰り返される。本発明のMRNCは、治療的に活性な用量（臨床的評価研究を介して決定される）にて静脈内のボーラスまたは点滴として、5-フルオロウラシルによる治療の前、間または後に与えることができる。MRNC製剤は、前臨床試験および臨床的評価（1相、2相および3相の臨床試験）に
おいて最も有効であると決定される用量にて投与してもよい。このような用量は、用量あたり0.00001mg/kgからおよそ100mg/kgまでの範囲であるであろう。併用療法を受ける患者
は、5-フルオロウラシル療法を単独で受ける患者と比較したときに、再発までの時間の増加、転移の減少、腫瘍量の減少または腫瘍の根絶による利益を得る。限定されないが、5-フルオロウラシル、ロイコボリンおよびオキサリプラチン、ベバシズマブ有りもしくは無し；イリノテカン、ロイコボリンおよび5-フルオロウラシル、セツキシマブ有りもしくは無し;またはマイトマイシンcおよび5-フルオロウラシル；などの当業者に公知のその他の化学療法処方計画における使用が、MRNCの有効性を制限することなく、なされてもよい。
【０３８０】
肺癌：その他の化学療法剤と組み合わせたシクロホスファミドが、これまで無治療の患者または進行性、再発性もしくは転移性の癌を患う患者の治療のために使用される。典型的な処方計画は、限定されないがシクロホスファミド、ドキソルビシン（アドリアマイシン）およびエトポシド（CAE）であり、シクロホスファミドは1日目に1000mg/m2 I.V.の用量にて投与され、ドキソルビシンは1日目に45mg/m2 I.V.の用量にて投与され、およびエ
トポシドは1〜3日目に100mg/m2 I.V.の用量にて投与される。治療サイクルは、28日毎に
繰り返される。本発明のMRNCは、適量にてI.V.ボーラスとして投与され、（決定されたMRNC製剤は、前臨床の試験および臨床的評価（1相、2相および3相の臨床試験）において、
各化学療法的薬物治療サイクルの前、間または後のいずれかでMU-CSF、G-CSFおよびGM-CSFの刺激を介してマクロファージおよび顆粒球産生を増強するために最も有効であると決
定される用量にて投与してもよい。このような用量は、用量あたり0.00001mg/kgからおよそ100mg/kgまでの範囲であるであろう。MRNCにより治療される患者は、化学療法単独により治療される患者と比較したときに、感染症の発病率の減少、並びに単球および好中球のカウントにおける化学療法で誘導される減少に対する治療サイクルの遅延を有する。肺癌（原発性または転移性）の治療のためのその他の化学療法処方計画における使用は、MRNCの有効性を制限することなく、なされてもよい。
【０３８１】
子宮頸癌：子宮頸癌は、HPV感染と関連している。約15個のHPV型が発癌性であるが、HPV16および16が全ての子宮頸癌の70%の原因となると考えられる。現在の免疫化プロトコルは、感染を予防するのに有効であるが、確立された感染症を治療するのには有効でない。頚部の機能が保存されるべきである場合、癌細胞および進行中のウイルス感染に対する療法が必要とされる子宮頸癌の治療には、満たされていない需要がある。進行性、再発性または転移性の疾患は、1日目にカルボプラチン50〜100 mg/m2 I.V.およびドキソルビシン45〜60 mg/m2 I.V.で治療され、サイクルが21日毎に繰り返される。MRNCは、以前の臨床的研究を介して免疫刺激のために最適であると決定された用量にて、化学療法の前、間または後に、子宮頸内注射によって頚部に局所的に投与される。MRNC製剤は、前臨床および臨床的評価（1相、2相および3相の臨床試験）において最も有効であると決定される用量に
て投与されてもよい。このような用量は、用量につき0.00001mg/kgからおよそ100mg/kgまでの範囲であるであろう。MRNCは、2つの効果を有し、第1に、免疫応答の誘導を経てウイルスに感染した細胞に対して免疫応答を生じさせることを介して頚部におけるHPVウイル
ス（HPV 16および18を含む）のウイルス量を減少させること、並びに第2に、MU-CSF、G-CSFおよびGM-CSFの誘導を介した化学療法剤の臨床的有効性の拡大である。
【０３８２】
前述の全ての特許、刊行物および要約は、これらの全体が参照により本明細書に援用される。前述は本発明の異なる態様にのみ関し、並びにその中で多数の修飾または変更が、以下の請求項に記載の本発明の精神および範囲を逸脱しない範囲でなされてもよいことを理解すべきである。
【図２ａ】
2014502256.tif 000040
【図２ｂ】
2014502256.tif 000041
【図３】
2014502256.tif 000042
【図５】
2014502256.tif 000043
【図６】
2014502256.tif 000044
【図７】
2014502256.tif 000045
【図８】
2014502256.tif 000046
【図１−１】
2014502256.tif 000047
【図１−２】
2014502256.tif 000048
【図４】
2014502256.tif 000049
【国際調査報告】
2014502256.tif 000050
2014502256.tif 000051
2014502256.tif 000052