(57)【要約】  本発明は抗体系二重標的化分子に関すると共に、斯かる二重標的化分子を生成するための方法、例えばライブラリー系アプローチに関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変（ＶＨ）ドメイン及び軽鎖可変（ＶＬ）ドメインからなる少なくとも１つの可変結合ドメインを含む抗体又はその機能断片であって、前記結合ドメインが２つの非関連エピトープに対する２つのパラトープを含み、ここで（ｉ）各パラトープの対応するエピトープに対する結合が、他方のパラトープの対応するエピトープに対する同時結合を妨げず、（ii）両パラトープが、少なくとも１つのＶＨ ＣＤＲに由来する少なくとも１つの残基と、少なくとも１つのＶＬ ＣＤＲに由来する少なくとも１つの残基とを含む、抗体又はその機能断片。
【請求項２】
二重特異性抗体である、請求項１の抗体又はその機能断片。
【請求項３】
両エピトープ同時存在時の各パラトープの対応するエピトープに対する結合量が、他方のエピトープが不在である他は同一の条件下で達成される結合量の少なくとも２５％である、請求項１又は２の抗体又はその機能断片。
【請求項４】
結合量が少なくとも５０％、特に少なくとも７５％、とりわけ少なくとも９０％である、請求項３の抗体又はその機能断片。
【請求項５】
第一のパラトープが、ＶＬドメインのＣＤＲ１及びＣＤＲ３並びにＶＨドメインのＣＤＲ２に由来する残基を含み、第二のパラトープが、ＶＨドメインのＣＤＲ１及びＣＤＲ３並びにＶＬドメインのＣＤＲ２に由来する残基を含む、請求項１〜４の何れか一項の抗体又はその機能断片。
【請求項６】
ヒト抗体又はその機能断片である、請求項１〜５の何れか一項の抗体又はその機能断片。
【請求項７】
ヒトＶＨ３ファミリー重鎖配列及びヒトＶkappa１ファミリー軽鎖配列に基づく、請求項６の抗体又はその機能断片。
【請求項８】
ヒトＶＨ３ファミリー重鎖配列及びヒトＶlambda１ファミリー軽鎖に基づく、請求項６の抗体又はその機能断片。
【請求項９】
単鎖Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、及びＩｇＧから選択される、請求項１〜８の何れか一項の抗体又はその機能断片。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか一項に係る抗体又はその機能断片をコードする核酸配列。
【請求項１１】
請求項１０に係る核酸配列を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１０に係る核酸配列又は請求項１１に係るベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１〜９の何れか一項の抗体又はその機能断片を生成する方法であって、請求項１０に係る核酸配列又は請求項１１に係るベクターをインビトロ（in vitro）で、或いは請求項１２に係る宿主細胞を含む適切な宿主細胞から、発現させる工程を含む方法。
【請求項１４】
抗体又はその機能断片の集合であって、前記集合が抗体可変ドメイン配列の多様集合を含み、ここで（ｉ）Lib1位由来の少なくとも３つのＣＤＲ残基が多様化され、但し少なくとも１つの多様化残基がＶＨドメイン内に存在し、少なくとも１つの多様化位置がＶＬドメイン内に存在し、Lib2位由来の残基は何れも多様化されておらず、或いは（ii）少なくとも３つのＣＤＲLib2位由来の残基が多様化され、但し少なくとも１つの多様化残基がＶＨドメイン内に存在し、少なくとも１つの多様化位置がＶＬドメイン内に存在し、Lib1位由来の残基は何れも多様化されていない、抗体又はその機能断片の集合。
【請求項１５】
（ｉ）の場合には、ＶＬドメインのＣＤＲ１及びＣＤＲ３並びにＶＨのＣＤＲ２の各々の少なくとも１つの残基が多様化され、或いは（ii）の場合には、ＶＨドメインのＣＤＲ１及びＣＤＲ３並びにＶＬのＣＤＲ２の各々の少なくとも１つの残基が多様化されている、請求項１４の抗体又はその機能断片の集合。
【請求項１６】
（ｉ）の場合には、前記可変結合ドメイン内のLib1E位の少なくとも１つの残基が更に多様化され、及び／又は、（ii）の場合には、前記可変結合ドメイン内のLib2E位の少なくとも１つの残基が更に多様化されている、請求項１４の抗体又はその機能断片の集合。
【請求項１７】
二重特異性抗体分子又はその機能断片を生成する方法であって、
ａ．ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ可変領域を各々含む抗体分子又はその機能断片の第一の集合を生成し、ここで抗体分子又はその機能断片は、Lib1の群から選択される少なくとも３つのＣＤＲ位に多様性を有し、但し少なくとも１つの多様化残基がＶＨドメイン内に存在すると共に、少なくとも１つの多様化位置がＶＬドメイン内に存在し、ここでLib2位由来の残基は何れも多様化されておらず；
ｂ．前記第一の集合から、第一の標的又はエピトープに特異的な第一の抗体分子又はその機能断片を選択し；
ｃ．ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ可変領域を各々含む抗体分子又はその機能断片の第二の集合を生成し、ここで抗体分子又はその機能断片は、Lib2の群から選択される少なくとも３つのＣＤＲ位に多様性を有し、但し少なくとも１つの多様化残基がＶＨドメイン内に存在すると共に、少なくとも１つの多様化位置がＶＬドメイン内に存在し、ここでLib1位由来の残基は何れも多様化されておらず；
ｄ．前記第二の集合から、第二の標的又はエピトープに特異的な第二の抗体分子又はその機能断片を選択し；
ｅ．ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ可変領域を含む第三の抗体分子又はその機能断片をコードする核酸配列を生成し、ここで第三の抗体分子又はその機能断片は、第一の抗体分子又はその機能断片内のLib1位の群に含まれる少なくとも３つの残基を含み、その中の少なくとも１つの残基がＶＨドメイン内に存在すると共に、少なくとも１つの残基がＶＬドメイン内に存在し、ここで第三の抗体分子又はその機能断片は更に、第二の抗体分子又はその機能断片内のLib2位の群に含まれる少なくとも３つの残基を含み、その中の少なくとも１つの残基がＶＨドメイン内に存在すると共に、少なくとも１つの残基がＶＬドメイン内に存在する
工程を含む、方法。
【請求項１８】
二重特異性抗体分子又はその機能断片を生成する方法であって、
ａ．ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ可変領域を各々含む抗体分子又はその機能断片の第一の集合を生成し、ここで抗体分子又はその機能断片は、Lib1の群から選択される少なくとも３つのＣＤＲ位に多様性を有し、但し少なくとも１つの多様化残基がＶＨドメイン内に存在すると共に、少なくとも１つの多様化位置がＶＬドメイン内に存在し、ここでLib2位由来の残基は何れも多様化されておらず；
ｂ．前記第一の集合から、第一の標的又はエピトープに特異的な第一の抗体分子又はその機能断片を選択し；
ｃ．Lib2の群から選択される少なくとも３つのＣＤＲ位に多様性を導入し、前記第一の抗体分子又はその機能断片を多様化することにより、ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ可変領域を各々含む抗体分子又はその機能断片の第二の集合を生成し、但し少なくとも１つの多様化残基がＶＨドメイン内に存在すると共に、少なくとも１つの多様化位置がＶＬドメイン内に存在し、ここでLib1位由来の残基は何れも多様化されておらず；
ｄ．前記第二の集合から、第二の標的又はエピトープに特異的な第二の抗体分子又はその機能断片を選択する
工程を含み、
ｅ．或いは、工程ａ．における第一の集合を、Lib2の群から選択される少なくとも３つのＣＤＲ位を多様化することにより生成すると共に、工程ｃ．において、前記第一の抗体又はその抗体断片を、Lib1の群から選択される少なくとも３つのＣＤＲ位で多様化するように変更して、工程ａ．〜ｄ．を実施する、方法。
【請求項１９】
ｆ．工程ａ．〜ｅ．で生成される核酸配列を宿主細胞で発現させるか、前記核酸をタンパク質に翻訳して、第三の抗体分子又はその機能断片を作成する
工程を更に含む、請求項１７又は１８の方法。
【請求項２０】
Lib1群から選択される多様性を有する前記集合の何れかが、Lib1Eの群から選択される少なくとも１つの増強位置（enhancing position）に更なる多様性を含み、及び／又は、Lib1群から選択される多様性を有する前記集合の何れかが、Lib2Eの群から選択される少なくとも１つの増強位置（enhancing position）に更なる多様性を含む、請求項１７〜１９の何れか一項の方法。
【請求項２１】
前記第一の集合が、Lib D1L1、Lib D1L2、及びLib D2L1から選択されるライブラリーと同一であるか、Lib D1L1、Lib D1L2、又はLib D2L1に存在する多様化位置を有すると共に、フレームワーク領域において９０％超の配列同一性、特に９５％超の配列同一性を有するライブラリーに由来し；前記第一の集合が、Lib D1H1、Lib D1H2、Lib D1H3、及びLib D2H1から選択されるライブラリーと同一であるか、Lib D1H1、Lib D1H2、Lib D1H3、又はLib D2H1に存在する多様化位置を有すると共に、フレームワーク領域において９０％超の配列同一性、特に９５％超の配列同一性を有するライブラリーに由来する、請求項１７〜２０の何れか一項の方法。
【請求項２２】
抗体分子又はその機能断片が、単鎖Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、及びＩｇＧから選択される、請求項１７〜２１の何れか一項の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗体系二重標的化分子に関すると共に、斯かる二重標的化分子を生成するための方法、例えばライブラリー系アプローチに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は二重特異性抗体（bispecific antibodies）又はその機能断片の新規な設計に関する。
【０００３】
二重特異性抗体分子の生成に関して、文献ではこれまで種々のアプローチが報告されてきた。これらのアプローチは二つのカテゴリーに分類される。１）一方のカテゴリーで生成される二重特異性抗体の形態によれば、二つの標的又は二つのエピトープを認識する２つのパラトープが、何れも一つの相補的ＶＨ−ＶＬ対により形成される一つのヘテロ二量体抗体可変領域内に存在し、何れもこの相補的ＶＨ−ＶＬ対に属するＣＤＲ残基を含む。２）他方のカテゴリーで生成される二重特異性抗体の形態によれば、二つの標的又はエピトープを認識する２つのパラトープが、一つの相補的ＶＨ−ＶＬ対により形成される同一のヘテロ二量体抗体可変領域内には存在せず、同一の相補的ＶＨ−ＶＬ対に属するＣＤＲ残基を含まない。
【０００４】
第一のカテゴリーに属するアプローチのうち、二重特異性抗体分子を予測可能に設計する方法として報告されているものは二つしかない。これらについては段落［００１４］〜［００１５］で詳細に論じる。しかし、斯かる研究を説明する都合上、まずは第二のカテゴリーに属するアプローチについて要約する。
【０００５】
第二のカテゴリーに属するアプローチ（二つの標的又はエピトープを認識する２つのパラトープが、一つの相補的ＶＨ−ＶＬ対により形成される同一のヘテロ二量体抗体可変領域内には存在せず、同一の相補的ＶＨ−ＶＬ対に属するＣＤＲ残基を含まない）は、過去の種々の研究者による膨大な研究からなり、斯かる二重特異性抗体としては多種多様な例が報告されている。
【０００６】
第二のカテゴリーのアプローチに属する例の第一の群は、特異性の異なる二以上の抗体断片（例えばＦａｂ断片、単鎖Ｆｖ、又は単一ドメイン抗体等）を、化学結合により、或いは一又は二以上のペプチドリンカーを介した遺伝子融合により連結したものである。この群に属する二重特異性抗体の形態として報告されている例としては、以下が挙げられる。
ａ．ダイアボディ（Diabodies）（Perisic et al., Structure. 1994 Dec 15;2(12):1217-26; Kontermann, Acta Pharmacol Sin. 2005 Jan;26(1):1-9; Kontermann, Curr Opin Mol Ther. 2010 Apr;12(2):176-83.）
ｂ．TandAbs等（Cochlovius et al., Cancer Res. 2000 Aug 15;60(16):4336-41.）
ｃ．異なる標的に特異的な複数の単一ドメインを、ペプチドリンカーを介して遺伝子的に融合したもの（例えばDomantis：国際特許公開第２００８／０９６１５８号；Ablynx：国際特許公開第２００７／１１２９４０号）
ｄ．その他（総説として、Enever et al., Curr Opin Biotechnol. 2009 Aug; 20(4):405-11. Epub 2009 Aug 24.; Carter, Nat. Rev. Immunol. 6, 343 (2006); P. Kufer et al., Trends Biotechnol. 22, 238 (2004)）
【０００７】
医療用途におけるpotential 有用性を改善するべく、上記の二重特異性抗体の形態のインビボ（in vivo）での血清半減期を、種々の技術により延長することが可能である。斯かる技術としては以下が挙げられる。
ａ．血清アルブミン又は血清アルブミン結合部分（binding entity）の付加
ｂ．ＰＥＧ化
ｃ．遺伝子融合によるタンパク質ポリマーの付加、例えばＨＡＰ化（Schlapschy et al., Protein Eng Des Sel. 2007 Jun; 20(6):273-84. Epub 2007 Jun 26） 又はXTEN（Schellenberger, Nat. Biotechnology 12 (2009) 1186）
【０００８】
これらの例の群では、抗体断片からなる二重特異性抗体がＦｃ領域を含まないため、概して新生児Ｆｃ受容体ＦｃＲｎに対する天然の結合を示さず、全長ＩｇＧ抗体の天然のエフェクター機能（例えばＡＤＣＣやＣＤＣ等）を示さず、通常は超抗原由来の親和性樹脂、例えばＦｃ領域に特異的なタンパク質Ａ樹脂等によって、ＩｇＧ抗体と同様の手法で精製することができない。斯かるＦｃ領域欠落の結果ゆえ、達成可能な血清半減期や、活性医薬成分として実現可能な用途や、斯かる二重特異性抗体の経済的な製造には、限界がある。
【０００９】
第二のカテゴリーのアプローチに属する第二の群の例によれば、二重特異性抗体はＩｇＧ様分子と、１つ又は数個の更なる付加結合ドメイン又は部分とを含む。斯かる抗体としては、単鎖Ｆｖが重鎖又は軽鎖の一末端に融合されてなるＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合タンパク質（University of California, Biogen Idec, CAT/MedImmune）や、追加のＶＨドメイン及びリンカーが重鎖のＮ末端に融合され、追加のＶＬドメイン及びリンカーが軽鎖のＮ末端に融合されてなる二重可変ドメイン（ｄｖｄ−ＩｇＧ）分子（Abbott）が挙げられる。これらのアプローチには概して、コンストラクトの製造、入手容易性、及び安定性の面で課題がある。
【００１０】
第二のカテゴリーのアプローチに属する第三の群の例によれば、二重特異性抗体は、更なる結合ドメインや部分を追加しなくとも二重特異性を示すように生成又は修飾されたＩｇＧ様抗体を含む。斯かる抗体としては、天然ではホモ二量体のＣＨ３ドメインを、遺伝子改変による突起形成（protuberation）（Ridgway et al., Protein Eng. 1996 Jul; 9(7):617-21）や、鎖交換（Davis et al., Protein Eng Des Sel. 2010 Apr; 23(4):195-202. Epub 2010 Feb 4）や、遺伝子改変による電荷逆転（Novo Nordisk）等により、ヘテロ二量体型となるように修飾し、Ｆｃ領域に付与された結合部分（通常はＮ末端のＦａｂ領域）を介して、ＩｇＧ様分子の二つの部分の各々が異なる標的に結合し得るようにしたＩｇＧ分子が挙げられる。この第三の群に属する例としては、可変領域ＣＤＲループを介して天然に結合する標的に加えて、天然では抗原との接触に関与しない構造的ループの一部を、例えばＦｃ領域における点突然変異（例えばFcgRIIbに対するXencor Fcs結合）や構造的ループの多様化（例えば多様化ＣＨ３ドメインを有するf−star Mab2）等の手法で修飾することにより、更なる標的にも結合するように改変したＩｇＧ分子が挙げられる。これらのアプローチには、安定性、製造、価数、及び親和性／用途の制限等の課題がある。
【００１１】
以上説明した第二のカテゴリーに属する二重特異性抗体の何れの例とも異なり、第一のカテゴリーに属する二重特異性抗体は、２つの標的に特異的な２つのパラトープを有し、これらは同一のヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ抗体可変領域内に存在するＣＤＲ残基を含む。この第一のカテゴリーに分類される抗体分子として報告されているのは４種類のみである。これら４種のうち、第一の種類の抗体は、関連を有さない２つの標的を特異的に認識することはできないので、実質的に二重特異性と言うことはできない。第二の種類の抗体は天然の抗体であるが、この抗体を予測可能に設計することができるか否かは、実験結果が示されていないため不明である。よって、文献によれば、第三及び第四の種類の抗体のみが、二つの非関連性標的に対する特異性を有するように設計可能であると言える。第一のカテゴリーに属するこれら４種の抗体分子は以下の通りである。
【００１２】
交差反応性抗体。二以上の構造的に関連する抗原又はエピトープに対応する、単一の広範な特異性を有する。斯かる抗体の場合、２つの抗原は配列及び構造上関連している。斯かる抗体は、異なる種由来の関連する標的（例えば鶏卵白リゾチームと七面鳥リゾチーム等）に対して（国際公開第９２／０１０４７号）、或いは異なる状態又は形態にある同一の標的（例えばハプテンと担体結合ハプテン等）に対して（Griffiths AD et al. EMBO J 1994 13: 14 3245-60）交差反応し得る。抗体の交差反応性を意図的に改変することは可能である。例として、２つの異なる種に由来する２つの関連する抗原を認識するように改変された抗体がある（例えばGenentech：ヒトLFA1に結合する抗体を、更に赤毛猿LFA1にも結合するように改変した結果、首尾よく医薬Raptiva／Efalizumabの開発に繋がった）。同様に、国際公開第０２／０２７７３号には、「二重特異性」を有する抗体分子が記載されている。本文献で述べられている抗体分子は、複数の構造的に関連する抗原を用いて産生又は選択された抗体であって、二つ以上の構造的に関連する標的を包含する単一の結合特異性を有する。しかし、上述のように、これらの交差反応性抗体は何れも本当の意味で二重特異性と言うことはできず、関連しない二つの標的を特異的に認識するように改変することはできない。
【００１３】
また、天然の多反応性自己抗体（polyreactive autoantibodies）も存在する（Casali &#38;#38;#38; Notkins, Ann. Rev. Immunol. 7, 515-531）。これらの多反応性抗体は、構造的に関連しない少なくとも２つ（通常はさらに多く）の異なる抗原又はエピトープを認識する能力を有する。また、モノクローナル抗体に対するファージディスプレイ技術を用いてランダムなペプチドのレパートリーから選択を行うことにより、抗原結合部位に適合する一連のペプチド配列を特定し得ることも示されている。斯かる配列の中には、高い関連性を有し、コンセンサス配列に適合するものがあるのに対し、他方では極めて相違し、ミモトープと呼ばれているものもある（Lane &#38;#38;#38; Stephen, Current Opinion in Immunology, 1993, 5, 268-271）。従って、一部のヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ抗体の結合部位が、複数の異なる抗原や、場合によっては関連しない抗原に結合しない可能性があるのは明らかである。しかし、上述のように、斯かる多反応性抗体の存在は確認されているものの、既報の予測可能な方法を用いて意図的に改変した例は知られていない。
【００１４】
単一の相補的ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ対内に存在し、この相補的ＶＨ−ＶＬ対に属するＣＤＲ残基を含む２つのパラトープを介して、２つの構造的に関連しない標的に結合するように二重特異性抗体を意図的に改変する方法の一つとして、「２イン１」（two-in-one）型抗体に関する方法が挙げられる。斯かる「２イン１」型抗体は、従前の交差反応改変法（cross-reactivity-engineering methods）とは幾分異なる方法を用いて、２つの重複するパラトープを含むように改変されたものである。斯かる研究は、国際公開第２００８／０２７２３６号や、Bostrom等の文献（Bostrom et al., Science. 2009 Mar 20; 323(5921):1610-4）に記載されている。既報の例では、１つの標的（ＨＥＲ２）に特異的なヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ抗体可変領域を単離した後、軽鎖を再度多様化することにより、第二の標的（ＶＥＧＦ又はデスレセプター５）に対する更なる特異性を達成している。得られた抗体のうち一つについて、構造解析により結合を特定した結果、一方の抗体抗原複合体においてＨＥＲ２に接触する１３のＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ残基のうち１１の残基が、他方の抗体抗原複合体ではＶＥＧＦにも接触していることが明らかになった。既報の「２イン１」型抗体がHER2に対してナノモル単位の親和性を維持していたのに対し、Bostrom等により報告された（２００９年）クローンの中で、更なる標的であるＶＥＧＦに対してナノモル単位の親和性を有していたのは、３００ｎＭの親和性を有する１つのクローンだけだったのに対し、他のクローンのうち４つは更なる標的に対してマイクロモル単位の親和性を有していた。このアプローチによって構造的に関連しない２つの標的への結合が達成されているのは確かではあろうが、２つの重複するパラトープの特異性を達成するには、これら２つの標的の間にある程度の表面適合性（surface compatibility）が必要である。また、斯かる「２イン１」型抗体が２つの標的のみに高い特異性を有するか否かや、斯かる抗体に多少の普遍的非特異結合、或いは「粘着性」（stickiness）（これはおそらく、２つのパラトープの重複部分内に存在する側鎖に幾分の配座柔軟性が必要であるゆえに生じ得る）が観察され得るか否かは、詳細には述べられていない。
【００１５】
単一の相補的ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ対内に存在し、この相補的ＶＨ−ＶＬ対に属するＣＤＲ残基を含む２つのパラトープを介して、２つの構造的に関連しない標的に結合するように二重特異性抗体を意図的に改変する第二の既報の方法は、単一ドメイン抗体の相補対を含む抗体に関する。国際公開第２００３／００２６０９号及び米国特許公開第２００７／０２６４８２号に記載のヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ抗体は、重鎖可変ドメインが一の標的を認識すると共に、軽鎖可変ドメインが第二の構造的に関連しない標的を認識し、これら特異性の異なる２つの単一のドメインが連結されて単一の連結ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ可変領域を構成する。斯かる抗体の既報の例では、まず２つの関連しない標的を結合する不対ＶＨドメイン又は不対ＶＬドメインとして、これら２つの単一のドメインを個別に選択した後に、これらを連結し、両標的に特異的な連結ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ可変領域を形成する。
【００１６】
第一のカテゴリーの二重特異性抗体（何れも同一の相補的ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ対内に存在し、何れもこの相補的ＶＨ−ＶＬ対に属するＣＤＲ残基を含む、２つのパラトープを介して２つの標的を結合し得る抗体）に属する分子は何れも、二重特異性を達成するために、更なるドメイン又は部分をＩｇＧ分子に融合する必要がなく、ＩｇＧ分子の構造的ループを多様化する必要がなく、更には限定されたヘテロ二重特異性Ｆｃ領域を用いる必要がない。これには幾つかの潜在的な利点がある。
【００１７】
構造的ループを多様化する必要する必要がなく、定常ドメインの界面を修飾する必要もないので、タンパク質の安定性を損なう危険性が低減される。その結果、抗体の生物物理学的特性を大きく改善できる可能性がある。
【００１８】
容易にタンパク質分解されたり免疫原性を生じたりする可能性のあるリンカーを必要としない。その結果、抗体を用いた活性医薬成分を開発できる可能性が大きく高まる。
【００１９】
単一の固有のＶＨ領域と単一の固有のＶＬ領域しか必要としないため、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に不所望の対合が生じる可能性がなく、発現時に誤対合ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ可変領域を含む副生成物の可能性を回避することができる。
【００２０】
従来の単一特異性抗体と比べて、更なるジスルフィド結合が必要とされないので、異常な共有結合性凝集体の発現や形成の低減を考慮する必要がない。
【００２１】
単一の相補的ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ対内に２つのパラトープを含む二重特異性ヘテロ二量体可変領域を、Ｆｃ領域を含む異なる定常ドメインに連結してもよい。これにより幾つかの利点がある。
ａ．十分に確立された方法、例えば従来の単一特異性ＩｇＧの製法で使用されるものと同一の方法を用いて、製法を改善できる可能性がある。
ｂ．ＦｃＲｎを介して患者及び動物モデルの血清半減期を調節できる可能性がある。
ｃ．非細胞毒性の本質的に不活性の挙動（例えば受容体を遮断するよう設計された抗体）から、攻撃的な細胞毒性の挙動（例えば腫瘍細胞を死滅させるよう設計された抗体）まで、異なるアイソタイプに関連するエフェクター機能を自由に選択できる。
【００２２】
交差反応性改変に関する方法から導かれた「２イン１」型抗体の上記第三の例は、これら２つの関連しない標的が、ＣＤＲループ内の重複する、少なくとも部分的に共有されている結合残基と競合するため、その医療用途への応用可能性は大きく制限される可能性がある。更に、「２イン１」型抗体の選択は、まずある標的に対する特異性を達成した後、再度多様化を行い、更なる標的に対して特異的なクローンを見いだすという、順次選択を行う必要があるため、時間がかかる上に予測が困難である。なぜなら、第一の標的に特異的な限られた数の抗体のみを再度多様化して、選択可能なライブラリーを作成する訳であるが、第一の特異的クローンのうち何れが、更なる所望の特異性を付与する上で最も改変され易いクローンか、知ることができないからである。最後に、ある標的への結合性を向上させるべく可変ドメイン配列を改変した場合、他方の標的に対する親和性を損なう危険性は常に避けられないため、「２イン１」型抗体の単離及び親和性成熟は著しく複雑なものとなる。
【００２３】
軽鎖ＣＤＲループ残基を介して一の標的を結合し、重鎖ＣＤＲループ残基を介して別の標的を結合する上記第四の例は、最終的に構成された二重特異性ヘテロ二量体抗体可変領域において、第一の標的への結合にとって重要な可能性がある軽鎖ＣＤＲ残基の一部と、第二の標的への結合にとって重要な可能性がある重鎖ＣＤＲ残基の一部が、直接隣接してしまう可能性があるため、著しく複雑なものとなる。これは即ち、結合状態において、斯かる抗体によって認識される第一の標的と、斯かる抗体によって認識される第二の標的とが、立体障害によって競合してしまう可能性があることを意味する。これにより、斯かる抗体の医療上の応用性は、極めて限定されたものとなる。更に、斯かる抗体の軽鎖と重鎖とを、米国特許公開第２００７−０２６４８２号（Abbott Laboratories）の従来例に記載されたような選択及びスクリーニング法によって独立に単離すると、これらを連結して二重特異性抗体を構成した場合に、形成された二重特異性分子においてＣＤＲに立体構造の変化が生じ、重鎖と軽鎖との対合が生じることによって、本体は独立のこれらのドメインが個別の標的に対して示す親和性に影響を及ぼす可能性がある。最後に、種々のＣＤＲループを有する、予め単離されたＶＨ及びＶＬ可変ドメインを組み合わせた場合、結果として予測し得ない抗体安定性が生じる可能性が高い。これはWoern及びPlueckthun（１９９８年）やRoethlisberger等（２００５年）が報告しているように、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に重要な相互作用や、抗体の重鎖及び軽鎖の相互安定化が生じるためである。
【００２４】
一方で、２つのパラトープを同一の相補的ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ対内に含む二重特異性ヘテロ二量体可変領域を、Ｆａｂ断片や単鎖Ｆｖ等の抗体断片として用いることができる。この場合、二重特異性を達成するには、Ｆｃ領域の存在を必要とすることがない。これにより、哺乳類のＮ−グリコシル化機構の不在下での微生物産生や、低分子量や短い血清半減期が望まれる治療又は診断用途での使用という選択肢も可能となる。
【００２５】
即ち、２つのパラトープを単一の相補的ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ対内に有するアプローチは、多数の利点を有する一方で、上に説明してきたような従来の試みは、限られた成果しか上げていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
即ち、２つのパラトープを単一の相補的ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ対内に有する利点を保持しつつ、従来のコンストラクトに見られた課題が改善された、二重特異性抗体の新たな形態を提供するとの要請は、依然として達成されていない。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
この課題に対して本発明が提供しようとする解決策は、各相補的ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ対に応じた２つのパラトープを設計し、各パラトープに、ＶＨ及びＶＬドメインの双方に由来するＣＤＲ領域の残基を用いるという、従来技術文献では提案も達成もされていないものである。
【００２８】
本発明の二重特異性抗体は、各相補的ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ対に応じた２つのパラトープを有し、各パラトープに、ＶＨ及びＶＬドメインの双方に由来するＣＤＲ領域の残基を用いることを特徴とする。
【００２９】
即ち、第一の側面によれば、本発明は、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン及び軽鎖可変（ＶＬ）ドメインからなる少なくとも１つの可変結合ドメインを含む抗体又はその機能断片であって、前記結合ドメインが２つの非関連エピトープに対する２つのパラトープを含み、ここで（ｉ）各パラトープの対応するエピトープに対する結合が、他方のパラトープの対応するエピトープに対する同時結合を妨げず、（ii）両パラトープが、少なくとも１つのＶＨ ＣＤＲに由来する少なくとも１つの残基と、少なくとも１つのＶＬ ＣＤＲに由来する少なくとも１つの残基とを含む、抗体又はその機能断片に関する。
【００３０】
第二の側面によれば、本発明は、本発明に係る抗体又はその機能断片をコードする核酸配列に関する。
【００３１】
第三の側面によれば、本発明は、本発明に係る核酸配列を含むベクターに関する。
【００３２】
第四の側面によれば、本発明は、本発明に係る核酸配列又は本発明に係るベクターを含む宿主細胞に関する。
【００３３】
第五の側面によれば、本発明は、本発明に係る抗体又はその機能断片を生成する方法であって、本発明に係る核酸配列又は請求項１１に係るベクターをインビトロ（in vitro）で、或いは本発明に係る宿主細胞を含む適切な宿主細胞から、発現させる工程を含む方法に関する。
【００３４】
第六の側面によれば、本発明は、抗体又はその機能断片の集合であって、前記集合が抗体可変ドメイン配列の多様集合を含み、ここで（ｉ）Lib1位由来の少なくとも３つのＣＤＲ残基が多様化され、但し少なくとも１つの多様化残基がＶＨドメイン内に存在し、少なくとも１つの多様化位置がＶＬドメイン内に存在し、Lib2位由来の残基は何れも多様化されておらず、或いは（ii）少なくとも３つのＣＤＲLib2位由来の残基が多様化され、但し少なくとも１つの多様化残基がＶＨドメイン内に存在し、少なくとも１つの多様化位置がＶＬドメイン内に存在し、Lib1位由来の残基は何れも多様化されていない、抗体又はその機能断片の集合に関する。
【００３５】
第七の側面によれば、本発明は、二重特異性抗体分子又はその機能断片を生成する方法であって、
ａ．ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ可変領域を各々含む抗体分子又はその機能断片の第一の集合を生成し、ここで抗体分子又はその機能断片は、Lib1の群から選択される少なくとも３つのＣＤＲ位に多様性を有し、但し少なくとも１つの多様化残基がＶＨドメイン内に存在すると共に、少なくとも１つの多様化位置がＶＬドメイン内に存在し、ここでLib2位由来の残基は何れも多様化されておらず；
ｂ．前記第一の集合から、第一の標的又はエピトープに特異的な第一の抗体分子又はその機能断片を選択し；
ｃ．ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ可変領域を各々含む抗体分子又はその機能断片の第二の集合を生成し、ここで抗体分子又はその機能断片は、Lib2の群から選択される少なくとも３つのＣＤＲ位に多様性を有し、但し少なくとも１つの多様化残基がＶＨドメイン内に存在すると共に、少なくとも１つの多様化位置がＶＬドメイン内に存在し、ここでLib1位由来の残基は何れも多様化されておらず；
ｄ．前記第二の集合から、第二の標的又はエピトープに特異的な第二の抗体分子又はその機能断片を選択し；
ｅ．ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ可変領域を含む第三の抗体分子又はその機能断片をコードする核酸配列を生成し、ここで第三の抗体分子又はその機能断片は、第一の抗体分子又はその機能断片内のLib1位の群に含まれる少なくとも３つの残基を含み、その中の少なくとも１つの残基がＶＨドメイン内に存在すると共に、少なくとも１つの残基がＶＬドメイン内に存在し、ここで第三の抗体分子又はその機能断片は更に、第二の抗体分子又はその機能断片内のLib2位の群に含まれる少なくとも３つの残基を含み、その中の少なくとも１つの残基がＶＨドメイン内に存在すると共に、少なくとも１つの残基がＶＬドメイン内に存在する
工程を含む、方法に関する。
【００３６】
第八の側面によれば、本発明は、二重特異性抗体分子又はその機能断片を生成する方法であって、
ａ．ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ可変領域を各々含む抗体分子又はその機能断片の第一の集合を生成し、ここで抗体分子又はその機能断片は、Lib1の群から選択される少なくとも３つのＣＤＲ位に多様性を有し、但し少なくとも１つの多様化残基がＶＨドメイン内に存在すると共に、少なくとも１つの多様化位置がＶＬドメイン内に存在し、ここでLib2位由来の残基は何れも多様化されておらず；
ｂ．前記第一の集合から、第一の標的又はエピトープに特異的な第一の抗体分子又はその機能断片を選択し；
ｃ．Lib2の群から選択される少なくとも３つのＣＤＲ位に多様性を導入し、前記第一の抗体分子又はその機能断片を多様化することにより、ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ可変領域を各々含む抗体分子又はその機能断片の第二の集合を生成し、但し少なくとも１つの多様化残基がＶＨドメイン内に存在すると共に、少なくとも１つの多様化位置がＶＬドメイン内に存在し、ここでLib1位由来の残基は何れも多様化されておらず；
ｄ．前記第二の集合から、第二の標的又はエピトープに特異的な第二の抗体分子又はその機能断片を選択する
工程を含み、
ｅ．或いは、工程ａ．における第一の集合を、Lib2の群から選択される少なくとも３つのＣＤＲ位を多様化することにより生成すると共に、工程ｃ．において、前記第一の抗体又はその抗体断片を、Lib1の群から選択される少なくとも３つのＣＤＲ位で多様化するように変更して、工程ａ．〜ｄ．を実施する、方法に関する。
【００３７】
第九の側面によれば、本発明は、抗体分子又はその機能断片と、任意により、医薬的に許容可能な担体及び／又は賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、本発明のある実施形態の抗体ライブラリーにおいて全部または一部を多様化すべき好ましいＣＤＲ位のリスト（Ａ）、本発明のある実施形態の抗体ライブラリーにおいて多様化すべきフレームワーク領域内の好ましい追加の増強位置（enhancing position）のリスト（Ｂ）、並びに、本発明の全ライブラリー（即ち、Lib1残基が多様化されたライブラリー及びLib2残基が多様化されたライブラリーの双方）において全部または一部を変更せずに残すことが好ましいＣＤＲ位のリスト（Ｃ）を示す図である。
【００３９】
【図２】図２は、新規な二重特異性抗体の発見プロセスを、上面（空中）図を用いて概略的に示す図である。まず、ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ抗体足場（scaffold）を、Lib1及びLib2 ＣＤＲ残基を表す２つの領域において個別に多様化する。これにより、２つの抗体クローンを得るように個別に選択された２つのライブラリーが得られる。一方のクローンは第一のパラトープを介して第一の標的又はエピトープを結合するものであり、第二のクローンは第二のパラトープを介して第二の標的又はエピトープを結合するものである。次にこれらのクローンを組み合わせ、第一の抗体クローン内のLib1位において選択された標的特異的残基を第二の抗体クローンに導入し、或いは第二の抗体クローン内のLib2位において選択された標的特異的残基を第一の抗体クローンに導入することにより、本発明に係る二重特異性抗体を形成することができる。また、図２は、本発明に係るこれら可能性のある増強残基（enhancing residues）が、フレームワーク領域内のどこに存在するかを上方（空中）視で概略的に示す。
【００４０】
【図３】図３は、試験対象とした４つの好ましいライブラリー設計（ライブラリーLib D1L1、Lib D1L2、Lib D1H1 及び Lib D1H2）を示す。本発明者等はこれら４つのライブラリーの各々を、ヒトＦａｂ断片をコードする合成遺伝子のプールとして、表示のＶＨ３−ＶＫ１対合をヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ足場（scaffold）に用いて作製した。各ライブラリー内の合成遺伝子は、具体的なアミノ酸が一文字表記で記載されている位置では一定であり、「Ｘ」と表示された位置では多様化されていた。これら４つのライブラリーは各々ファージディスプレイライブラリーとして作成され、従来既知の手法を用いて、幾つかの抗原に対して分類された。これら４つのライブラリーから選択された抗体クローンを組み合わせたのが、図４に詳述する二重特異性抗体である。図３は更に、３つの好ましいライブラリー設計（Lib D1H3、Lib D2L1 及び Lib D2H1）についても述べる。
【００４１】
【図４】図４は、本発明に従って生成された二重特異性抗体の配列の例を示す。
【００４２】
【図５】図５は、抗ＭＢＰ抗ＧＳＴ二重標的化クローンＨＭ２ＬＧ１のＥＬＩＳＡ分析によって実証された、図４に開示の抗体の特異性を示す図である。
【００４３】
【図６−１】図６は、本発明に係る二重特異性コンストラクトの高い特異性を示すバイアコア（Biacore）（登録商標）データである。
【図６−２】同上。
【００４４】
【図７−１】図７は、親抗体及びＶＥＧＦとＩＬ６とに対する二重特異性抗体のバイアコア（Biacore）（登録商標）分析を示す図である。
【図７−２】同上。
【図７−３】同上。
【００４５】
【図８−１】図８は、本発明に係る二重特異性コンストラクトに対して２つの標的が独立して共結合することを示すバイアコア（Biacore）（登録商標）データである。Ａ：ＧＭＣＳＦ＋抗体＋ＩＬ６の共結合；Ｂ：抗ＬＣ＋抗体＋ＩＬ６の共結合。
【図８−２】同上。
【図８−３】同上。
【図８−４】同上。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
二重特異性抗体の構築に関する従前のアプローチと比較した場合、本発明の独自性は、相補的ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ対の各々について２つのパラトープを有し、各パラトープにＶＨ及びＶＬの両ドメインに由来するＣＤＲ領域の残基を用いるという、これまで知られていない可能性を採用したところにある。
【００４７】
即ち、第一の側面において、本発明は、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン及び軽鎖可変（ＶＬ）ドメインからなる少なくとも１つの可変結合ドメインを含む抗体又はその機能断片であって、前記結合ドメインが２つの非関連エピトープに対する２つのパラトープを含み、ここで（ｉ）各パラトープの対応するエピトープに対する結合が、他方のパラトープの対応するエピトープに対する同時結合を妨げず、（ii）両パラトープが、少なくとも１つのＶＨ ＣＤＲに由来する少なくとも１つの残基と、少なくとも１つのＶＬ ＣＤＲに由来する少なくとも１つの残基とを含む、抗体又はその機能断片に関する。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「抗体」（antibody）という語は、免疫グロブリン（immunoglobulin：Ｉｇ）分子を指す。Ｉｇ分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、又はＩｇＤのクラス（或いはその任意のサブクラス）に属するタンパク質として定義され、従来既知のあらゆる抗体及びその機能断片を含む。ここで抗体／免疫グロブリン分子の「機能断片」（functional fragment）とは、抗原結合領域を保持する抗体／免疫グロブリン分子の断片（例えばＩｇＧの可変領域）として定義される。抗体の「抗原結合領域」（antigen-binding region）は、通常は抗体分子の一又は二以上の超可変領域（或いは相補性決定領域（complementarity determining region）、「ＣＤＲ」）、即ちＣＤＲ−１、−２、及び／又は−３領域に見出される。しかし、可変「フレームワーク」領域も、例えばＣＤＲの足場（scaffold）を提供する等、抗原結合において重要な役割を有する。中でも、少なくとも可変軽（variable light：ＶＬ）鎖のアミノ酸残基4〜103及び可変重（variable heavy：ＶＨ）鎖のアミノ酸残基５〜１０９を含む「抗原結合領域」が好ましく、ＶＬのアミノ酸残基３〜１０７及びＶＨのアミノ酸残基４〜１１１を含むものがより好ましい。特に好ましいのは、完全ＶＬ及びＶＨ鎖（ＶＬのアミノ酸位置１〜１０９及びＶＨのアミノ酸位置１〜１１３；番号付けは国際公開第９７／０８３２０号による）である。本発明で好ましい抗体分子のクラスはＩｇＧである。
【００４９】
本発明の「機能断片」は、Ｆ（ａｂ’）２断片のドメイン、Ｆａｂ断片のドメイン、ｓｃＦｖ、又は単一免疫グロブリン可変ドメイン又は単一ドメイン抗体ポリペプチドを含むコンストラクトである。Ｆ（ａｂ’）２又はＦａｂは、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間に生じる分子間ジスルフィド相互作用を最小化し、或いは完全に除去するように改変されたものでもよい。
【００５０】
抗体は、動物を免疫化して、或いは組換抗体ライブラリーから得ることができる。抗体ライブラリーとしては、コンピューターで（in silico）で設計され、合成により産生された核酸によりコードされるアミノ酸配列に基づくライブラリーが挙げられる。抗体配列のコンピューターによる（in silico）設計は、例えばヒト配列のデータベースを分析し、そこから得られたデータを用いてポリペプチド配列を作出することにより実施できる。コンピューター（in silico）生成配列を設計及び取得する方法は、例えばKnappik et al., J. Mol. Biol. (2000) 296:57; Krebs et al.、J. Immunol. Methods. (2001) 254:67や、米国特許第６，３００，０６４号（Knappik等）に記載されている。
【００５１】
本発明との関連において、「二重特異性抗体分子」（bispecific antibody molecule）という語は、２つの異なる標的生物分子や、２つの異なるエピトープ（これは同一の標的生物分子に存在するものでも、２つの異なる分子、例えば標的生物分子と第二の生物分子とに存在するものでもよい）に対する特異的結合部位を有する抗体分子（抗体分子の機能断片を含む）を指す。
【００５２】
本明細書で使用する場合、結合分子（binding molecule）が、標的、例えば標的生物分子（又は斯かる生物分子のエピトープ）に対して「特異的である」（specific to／for）、「特異的に認識する」（specifically recognizes）、或いは「特異的に結合する」（specifically binds to）とは、斯かる結合分子が標的生物分子を一又は二以上の基準分子から識別することができることをいう。即ち、結合特異性は絶対的な特性ではなく、相対的な特性だからである。最も一般的な形態によれば（また、特に何らの明確な基準も述べられていない場合には）、「特異的結合」（specific binding）とは、結合分子が所望の標的生物分子と非関連の生物分子とを識別する能力を意味する。これは例えば、従来公知の特異性アッセイ法により決定することができる。斯かる方法としては、これらに限定されるものではないが、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡテスト及びペプチドスキャンが挙げられる。例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを実施すればよい。スコア化は標準的な発色現像法により（例えば二次抗体をホースラディッシュペルオキシドで、テトラメチルベンジジンを過酸化水素で）実施することができる。個別のウェルの反応は、例えば４５０ｎｍでの光学濃度によりスコア化することができる。典型的なバックグラウンド（＝陰性反応）は例えば０．１ ＯＤ程度である。典型的な陽性反応は例えば１ ＯＤ程度である。即ち、陽性スコアと陰性スコアとの比は、１０倍以上ということになる。通常、結合特異性の決定は、単一の基準生物分子のみを用いて行うのではなく、約３〜５個の非関連生物分子（例えば粉ミルク、ＢＳＡ、トランスフェリン等）の組を用いて行う。
【００５３】
本発明との関連において「約」（about）又は「およそ」（approximately）との語は、所定の値又は範囲の９０％から１１０％を意味する。
【００５４】
但し、「特異的結合」は、結合分子が標的生物分子と、基準点として用いられる一又は二以上の密接に関連する生物分子とを識別する能力を意味する場合もある。更に「特異的結合」は、結合分子がその標的抗原の異なる複数の部分（例えば標的生物分子の異なる複数のドメイン、領域又はエピトープ、或いは標的生物分子の一種又は二種以上の主要アミノ酸残基又はアミノ酸残基群等）を識別する能力にも関する。
【００５５】
本発明との関連において「パラトープ」という語は、所与の抗体分子と標的との特異的結合に必要な抗体分子の部分を意味する。パラトープは連続的であっても（即ち抗体分子内に存在する隣接するアミノ酸残基により形成されても）よく、不連続であっても（即ち抗体分子の一次配列内の異なる位置に存在するアミノ酸残基、例えば抗体分子の異なるＣＤＲ配列に存在するアミノ酸残基であって、抗体分子が取る三次元構造内では近接した位置にあるアミノ酸残基により形成されても）よい。
【００５６】
本発明との関連において「エピトープ」という語は、所与の標的と抗体との特異的結合に必要な標的の部分を意味する。エピトープは連続的であっても（即ち標的内に存在する隣接する構造要素により形成されても）よく、不連続であっても（即ち標的の一次配列内、例えば標的がタンパク質の場合にはそのアミノ酸配列内の異なる位置に存在する構造要素であって、標的がその天然環境内、例えば体液中等で取る三次元構造内では近接した位置にあるアミノ酸残基により形成されても）よい。
【００５７】
一態様によれば、抗体又はその機能断片は、二重特異性抗体である。
【００５８】
本発明の抗体又は機能断片の更なる実施形態によれば、両エピトープの同時存在下における各パラトープの対応するエピトープに対する結合量は、他方のエピトープが不在である他は同一の条件下で達成される結合量の少なくとも２５％である。
【００５９】
本発明の抗体又は機能断片の更なる実施形態によれば、当該結合量は少なくとも５０％、特に少なくとも７５％、とりわけ少なくとも９０％である。
【００６０】
本発明の抗体又は機能断片の更なる実施形態によれば、第一のパラトープは、ＶＬドメインのＣＤＲ１及びＣＤＲ３並びにＶＨドメインのＣＤＲ２に由来する残基を含み、第二のパラトープは、ＶＨドメインのＣＤＲ１及びＣＤＲ３並びにＶＬドメインのＣＤＲ２に由来する残基を含む。
【００６１】
特定の実施形態によれば、抗体又はその機能断片は、ヒト抗体又はその機能断片である。
【００６２】
更なる実施形態によれば、本発明の抗体又は機能断片は、ヒトＶＨ３ファミリー重鎖配列と、ヒトＶkappa１ファミリー軽鎖配列とに基づく。
【００６３】
更なる実施形態によれば、本発明の抗体又は機能断片は、ヒトＶＨ３ファミリー重鎖配列と、ヒトＶlambda１ファミリー軽鎖とに基づく。
【００６４】
更なる実施形態によれば、本発明の抗体又は機能断片は、単鎖Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、及びＩｇＧから選択される。
【００６５】
本発明の抗体又はその機能断片の更なる実施形態によれば、Lib1位又はLib2位の一方のみを変異させることにより、一のエピトープに対する結合を破壊する一方で、他方のエピトープに対する結合は無傷のまま保持するすることができる。
【００６６】
これに関して、「結合を破壊する」（binding ... [is] knocked out）とは、エピトープに対する親和性を少なくとも１０分の一に（例えば１ｎＭから１０ｎＭに）低減することを意味し、「結合を無傷のまま保持する」（binding ... is kept intact）とは、エピトープに対する親和性を最大３倍に（例えば１ｎＭから３ｎＭに）抑えることを意味する。
【００６７】
斯かる特定の実施形態によれば、ＶＬ位置２７又はＶＨ位置６１の一方を変異させることにより、或いはLib2位のＶＬ位置５６又はＶＨ位置２８を変異させることにより、一のエピトープに対する結合を破壊することができる。
【００６８】
斯かる特定の実施形態によれば、段落［００６６］に記載の残基の一方を、斯かる残基がＤ、Ｎ、Ｅ及びＱから選択される残基である場合にはＲに、斯かる残基がＤ、Ｎ、Ｅ又はＱとは異なる残基である場合にはＤに変異させることにより、一のエピトープに対する結合を破壊することができる。
【００６９】
更なる側面によれば、本発明は、一の可変軽鎖と一の可変重鎖とを含む少なくとも１つの抗体可変ドメインを含む結合分子であって、前記抗体可変ドメインが少なくとも第一及び第二の標的に結合し、前記抗体可変ドメインの前記第一の標的に対する結合が、前記抗体可変ドメインの前記第二の標的に対する結合とは独立であり、その逆も独立であると共に、前記第一及び第二の標的が抗イディオタイプ抗体でも非生理的ペプチド（例えばエピトープマッピングに用いられるペプチド）でもない、結合分子に関する。
【００７０】
本発明との関連において、一方の標的に対する抗体可変ドメインの結合が、他方の標的に対する結合から「独立である」（independent）とは、両標的の同時存在時における第一のパラトープの対応するエピトープ（第一の標的）に対する結合量が、他方の標的が不在である他は同じ条件下で達成される結合量の少なくとも２５％であることを言う。特に、結合量は少なくとも５０％、特に少なくとも７５％、とりわけ少なくとも９０％である。
【００７１】
特定の実施形態によれば、前記第一及び第二の標的は何れも、生理的に関連する標的及び／又はそのエピトープである。例としては、疾患関連標的、例えば癌関連抗原、細胞表面受容体、サイトカイン及び／又は他のシグナル伝達分子が挙げられる。
【００７２】
第二の側面によれば、本発明は、本発明に係る抗体又はその機能断片をコードする核酸配列に関する。
【００７３】
第三の側面によれば、本発明は、本発明に係る核酸配列を含むベクターに関する。
【００７４】
第四の側面によれば、本発明は、本発明に係る核酸配列又は本発明に係るベクターを含む宿主細胞に関する。
【００７５】
第五の側面によれば、本発明は、本発明に係る抗体又はその機能断片を作製する方法であって、本発明に係る核酸配列又は本発明に係るベクターをインビトロ（in vitro）で、又は適切な宿主細胞（本発明に係る宿主細胞）から発現させる工程を含む方法に関する。
【００７６】
第六の側面によれば、本発明は、抗体又はその機能断片の集合であって、前記集合が抗体可変ドメイン配列の多様集合を含み、ここで（ｉ）Lib1位由来の少なくとも３つのＣＤＲ残基が多様化され、但し少なくとも１つの多様化残基がＶＨドメイン内に存在し、少なくとも１つの多様化位置がＶＬドメイン内に存在し、Lib2位由来の残基は何れも多様化されておらず、或いは（ii）少なくとも３つのＣＤＲLib2位由来の残基が多様化され、但し少なくとも１つの多様化残基がＶＨドメイン内に存在し、少なくとも１つの多様化位置がＶＬドメイン内に存在し、Lib1位由来の残基は何れも多様化されていない、抗体又はその機能断片の集合に関する。
【００７７】
この第六の側面の一態様によれば、本発明は、抗体又はその機能断片の集合であって、上記（ｉ）の場合には、ＶＬドメインのＣＤＲ１及びＣＤＲ３並びにＶＨのＣＤＲ２の各々の少なくとも１つの残基が多様化され、或いは上記（ii）の場合には、ＶＨドメインのＣＤＲ１及びＣＤＲ３並びにＶＬのＣＤＲ２の各々の少なくとも１つの残基が多様化されている、抗体又はその機能断片の集合に関する。
【００７８】
この第六の側面の別の態様によれば、本発明は、抗体又はその機能断片の集合であって、（ｉ）の場合には、前記可変結合ドメイン内のLib1E位の少なくとも１つの残基が更に多様化され、及び／又は、（ii）の場合には、前記可変結合ドメイン内のLib2E位の少なくとも１つの残基が更に多様化されている、抗体又はその機能断片の集合に関する。
【００７９】
第七の側面によれば、本発明は、二重特異性抗体分子又はその機能断片を生成する方法であって、
ａ．ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ可変領域を各々含む抗体分子又はその機能断片の第一の集合を生成し、ここで抗体分子又はその機能断片は、Lib1の群から選択される少なくとも３つのＣＤＲ位に多様性を有し、但し少なくとも１つの多様化残基がＶＨドメイン内に存在すると共に、少なくとも１つの多様化位置がＶＬドメイン内に存在し、ここでLib2位由来の残基は何れも多様化されておらず；
ｂ．前記第一の集合から、第一の標的又はエピトープに特異的な第一の抗体分子又はその機能断片を選択し；
ｃ．ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ可変領域を各々含む抗体分子又はその機能断片の第二の集合を生成し、ここで抗体分子又はその機能断片は、Lib2の群から選択される少なくとも３つのＣＤＲ位に多様性を有し、但し少なくとも１つの多様化残基がＶＨドメイン内に存在すると共に、少なくとも１つの多様化位置がＶＬドメイン内に存在し、ここでLib1位由来の残基は何れも多様化されておらず；
ｄ．前記第二の集合から、第二の標的又はエピトープに特異的な第二の抗体分子又はその機能断片を選択し；
ｅ．ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ可変領域を含む第三の抗体分子又はその機能断片をコードする核酸配列を生成し、ここで第三の抗体分子又はその機能断片は、第一の抗体分子又はその機能断片内のLib1位の群に含まれる少なくとも３つの残基を含み、その中の少なくとも１つの残基がＶＨドメイン内に存在すると共に、少なくとも１つの残基がＶＬドメイン内に存在し、ここで第三の抗体分子又はその機能断片は更に、第二の抗体分子又はその機能断片内のLib2位の群に含まれる少なくとも３つの残基を含み、その中の少なくとも１つの残基がＶＨドメイン内に存在すると共に、少なくとも１つの残基がＶＬドメイン内に存在する
工程を含む、方法に関する。
【００８０】
第八の側面によれば、本発明は、二重特異性抗体分子又はその機能断片を生成する方法であって、
ａ．ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ可変領域を各々含む抗体分子又はその機能断片の第一の集合を生成し、ここで抗体分子又はその機能断片は、Lib1の群から選択される少なくとも３つのＣＤＲ位に多様性を有し、但し少なくとも１つの多様化残基がＶＨドメイン内に存在すると共に、少なくとも１つの多様化位置がＶＬドメイン内に存在し、ここでLib2位由来の残基は何れも多様化されておらず；
ｂ．前記第一の集合から、第一の標的又はエピトープに特異的な第一の抗体分子又はその機能断片を選択し；
ｃ．Lib2の群から選択される少なくとも３つのＣＤＲ位に多様性を導入し、前記第一の抗体分子又はその機能断片を多様化することにより、ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ可変領域を各々含む抗体分子又はその機能断片の第二の集合を生成し、但し少なくとも１つの多様化残基がＶＨドメイン内に存在すると共に、少なくとも１つの多様化位置がＶＬドメイン内に存在し、ここでLib1位由来の残基は何れも多様化されておらず；
ｄ．前記第二の集合から、第二の標的又はエピトープに特異的な第二の抗体分子又はその機能断片を選択する
工程を含み、
ｅ．或いは、工程ａ．における第一の集合を、Lib2の群から選択される少なくとも３つのＣＤＲ位を多様化することにより生成すると共に、工程ｃ．において、前記第一の抗体又はその抗体断片を、Lib1の群から選択される少なくとも３つのＣＤＲ位で多様化するように変更して、工程ａ．〜ｄ．を実施する、方法に関する。
【００８１】
第七及び第八の側面の特定の実施形態によれば、本発明は更に、
ｆ．工程ａ．〜ｅ．で生成される核酸配列を宿主細胞で発現させるか、前記核酸をタンパク質に翻訳して、第三の抗体分子又はその機能断片を作成する
工程を更に含む方法に関する。
【００８２】
斯かる特定の実施形態において、本発明は、Lib1群から選択される多様性を有する前記集合の何れかが、Lib1Eの群から選択される少なくとも１つの増強位置（enhancing position）において更なる多様性を含み、及び／又は、Lib1群から選択される多様性を有する前記集合の何れかが、Lib2Eの群から選択される少なくとも１つの増強位置（enhancing position）において更なる多様性を含む、方法に関する。
【００８３】
斯かる特定の実施形態において、本発明は、前記第一の集合が、Lib D1L1、Lib D1L2、及びLib D2L1から選択されるライブラリーと同一であるか、Lib D1L1、Lib D1L2、又はLib D2L1に存在する多様化位置を有すると共に、フレームワーク領域において９０％超の配列同一性、特に９５％超の配列同一性を有するライブラリーに由来し；前記第一の集合が、Lib D1H1、Lib D1H2、Lib D1H3、及びLib D2H1から選択されるライブラリーと同一であるか、Lib D1H1、Lib D1H2、Lib D1H3、又はLib D2H1に存在する多様化位置を有すると共に、フレームワーク領域において９０％超の配列同一性、特に９５％超の配列同一性を有するライブラリーに由来する、方法に関する。
【００８４】
斯かる特定の実施形態において、抗体分子又はその機能断片は、単鎖Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、及びＩｇＧから選択される。
【００８５】
第九の側面において、本発明は、抗体分子又はその機能断片を含み、任意により医薬的に許容可能な担体及び／又は賦形剤を更に含む、医薬組成物に関する。当該組成物は、例えば一日一回投与、一日二回投与、又は一日三回投与等に応じて処方してもよい。
【００８６】
本発明の組成物との関連で「医薬的に許容可能な」（pharmaceutically acceptable）という語句は、斯かる組成物の分子成分及び他の成分であって、生理的に耐容され得ると共に、哺乳類（例えばヒト等）に投与した場合に通常は不所望の反応を引き起こさない成分を意味する。また、「医薬的に許容可能な」という語句は、哺乳類、とりわけヒトへの使用において、米連邦又は州政府の規制機関によって認められ、或いは米国薬局方や他の一般的に認められている薬局方に記載されていることも意味する。
【００８７】
本発明との関連において「約」（about）又は「およそ」（approximately）との語は、所定の値又は範囲の９０％から１１０％を意味する。
【００８８】
本発明の医薬組成物に適用される「担体」（carrier）という語は、活性化合物（例えば二重特異性抗体断片等）と共に投与される希釈剤、賦形剤、又はビヒクルを意味する。斯かる医薬担体としては、滅菌液、例えば水、食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール水溶液等、及び油類、例えば石油、動物、植物又は合成由来の油類、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等が挙げられる。適切な医薬担体は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、A.R. Gennaro著、20th Editionに記載されている。
【００８９】
本発明の活性成分（例えば二重特異性抗体断片等）又は組成物は、少なくとも１つの疾患又は障害の治療に使用することができる。ここで、斯かる治療剤は、本明細書に開示の特定の投与形式（例えば一日一回投与、一日二回投与、又は一日三回投与等）に応じて適合させ、或いは適切に調製する。斯かる目的の場合、製品説明書及び／又は患者情報には、対応する情報が含まれる。
【００９０】
本発明の活性成分（例えば二重特異性抗体分子又はその断片）又は組成物は、少なくとも１つの疾患又は障害の治療用の薬剤の製造に使用することができる。ここで、斯かる薬剤は、本明細書に開示の特定の投与形式（例えば一日一回投与、一日二回投与、又は一日三回投与等）に応じて適合させ、或いは適切に調製する。斯かる目的の場合、製品説明書及び／又は患者情報には、対応する情報が含まれる。
【実施例】
【００９１】
以下、実施例により本発明を説明するが、その範囲は限定されない。
【００９２】
上述した第一のカテゴリーの二重特異性抗体分子（２つの標的に特異的な２つのパラトープであって、何れも同一のヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ抗体可変領域内に存在するＣＤＲ残基を含むパラトープを有する）は、上述のような種々の潜在的な利点を有する一方で、本発明者等は、この第一のカテゴリーの抗体分子に属するものの、文献に記載の上記４つの例とは全く異なる全く新規なクラスの抗体分子が作れるのではないかという仮説を立てた。更に、全く新規なアプローチに従うことにより、この第一のカテゴリーを意図的に改変することにより、上記の例と比較して顕著な改善が達成できるかもしれないという仮説を立てた。この仮説は、上述の従来の方法には、抗体を活性医薬成分として開発する上で重要な、幾つかの潜在的な制限を有するという事実を考慮したものである。
【００９３】
本発明ではこれらの点に対処し、予測し得ない顕著な利点を有する、全く新規なクラスの二重特異性抗体を提供する。本発明者等は、２つの独立したパラトープであって、各々が重鎖及び軽鎖両方のＣＤＲ残基を含むものの、互いに重複せず、好ましくは互いに直接隣接もしないパラトープを、ヘテロ二量体抗体のＶＨ−ＶＬ可変領域内に作成すれば、一方の結合部位の変異によって他方の結合部位の立体構造が変化するのを防止すると共に、（結合状態において２つの標的間に生じ得る立体障害を最小化することにより）これら２つの標的が抗体への結合時に競合する可能性を低減することができるかも知れないと予想した。本発明者等は更に、まず２つの合成抗体ライブラリーを、各々パックされたヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ対の背景の下で作成し、一方のライブラリーでは第一の重及び軽鎖ＣＤＲ位の組（Lib1）を多様化し、他方のライブラリーでは、第一の組とは異なる、重複しない重及び軽鎖ＣＤＲ位の組（Lib2）を多様化することにより、この新規なクラスの抗体分子を作成できるかも知れないと予想した。そこから、斯かる２つのライブラリーを作成し、２つの関連しない標的に対して首尾よく選択することができれば、第一の標的に対する選択時に選択されたLib1位内の特定の残基を、第二の標的に対する選択時に選択されたLib2位内の特定の残基を有する抗体クローンに導入することにより、二重特異性抗体を迅速に作製できる可能性があると結論付けた。また、これとは逆に、斯かる２つのライブラリーを作成し、２つの関連しない標的に対して首尾よく選択することができれば、第二の標的に対する選択時に選択されたLib2位内の特定の残基を、第一の標的に対する選択時に選択されたLib1位内の特定の残基を有する抗体クローンに導入することにより、やはり二重特異性抗体を迅速に作製できる可能性があると結論付けた。本発明者等は、第一の特異性を規定する第一の抗体由来の残基群を、第二の特異性を有する第二の抗体に導入するこの方策は、パックされたＶＨ−ＶＬ対を規定する同一又は極めて類似する足場（scaffold）内に、両ライブラリーを作製することにより、大幅に促進されるであろうと予測した。
【００９４】
本明細書において、本発明者等は、全く関連性を有さない２つの標的に対する二重特異性ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ抗体を幾つか作製し、本発明を首尾よく実現することができた。ここで重要なのは、所望の抗体を迅速に作製できたと共に、得られた抗体が２つの標的のみに高い特異性を示す一方で、別の関連しない標的には全く結合しなかった点である。驚くべきことに、作製された二重特異性抗体は高い生物物理学的安定性を示した（斯かる特性は、軽鎖ＣＤＲループ残基を介して一方の標的を結合し、重鎖ＣＤＲループ残基を介して他方の標的を結合する抗体にはみられなかったものである）のみならず、「２イン１」型抗体の作成に使用された足場（scaffold）と比較しても、更には市販医薬の活性成分として用いられている、確立された単一特異性抗体クローンと比較しても、極めて高い生物物理学的安定性を示した。最後に、これも驚くべきことであるが、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αに対する二重特異性抗体の例を用いて、Lib1結合領域内のＣＤＲ位の単一の保存的点突然変異により、ＴＮＦ−α結合に関与する推定上のパラトープを提供することにより、ＴＮＦ−αに対する結合は本質的に破壊された一方で、ＧＭ−ＣＳＦに対する結合は無傷のまま維持されたこと、また、Lib2結合領域のＣＤＲ位の異なる単一の保存的点突然変異により、ＧＭ−ＣＳＦ結合に関与する推定上のパラトープを提供することにより、ＧＭ−ＣＳＦに対する結合は本質的に破壊された一方で、ＴＮＦ−αに対する結合は無傷のまま維持されたことを、実証することができた。ここから、本発明の抗体は実際に、一般的な「粘着性」（stickiness）よりもむしろ、高い特異性を持った方法で２つの関連しない標的を結合できること、また、従来公知の二重特異性抗体と比較して、２つの重複しないパラトープとして設計された２つの結合部位が、何れも１つのヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ可変領域内に存在し、何れも同一のヘテロ二量体可変領域に属するＣＤＲ残基を含むにもかかわらず、本質的に独立の挙動を示すことが分かる。従って、本発明の抗体は、従来の二重特異性抗体と比較して顕著な利点を有する。
【００９５】
本発明の好ましい実施形態によれば、好ましい発見プロセスは、（１）同一の又は極めて類似のヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ抗体の足場（scaffold）に基づく一対のライブラリーを生成すると共に、第一のライブラリーと第二のライブラリーとで異なるＣＤＲ位を変異させ、（２）任意により、２つのライブラリーの一方又は両方のＶＨ−ＶＬ足場（scaffold）内の選択されたフレームワーク位置に、２つのライブラリーから選択されるクローンの結合特性を増強する可能性がある多様化を導入し、（３）両ライブラリーを独立に、２つの標的分子又はエピトープ並びに特徴的な結合部に対する選択に供し、所望の特性を有する標的特異的又はエピトープ特異的抗体クローンを同定し、（４）一方のライブラリーから選択された抗体クローンの多様化位置内から選択された、第一の標的又はエピトープに特異的な残基の全て又は前記の残基のサブセット（好ましくは斯かる残基の過半数であるが、斯かる残基のうち少なくとも３つ）を、他方のライブラリーから選択された、第二の標的又はエピトープに特異的な標的特異的抗体クローンに導入する、という工程を含む。この発見プロセスを最適化するには、主要な残基のうち一部の群が重要な役割を有する。
【００９６】
本発明者等は、ヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ抗体の分子モデルをコンピューターで（in silico）解析すると共に、選択されない非特異的なヘテロ二量体ＶＨ−ＶＬ抗体「ダミー」（dummies）（データは示さず）に突然変異形成を行うことにより、多様化によって第一の標的に対する第一の潜在的な結合部位を形成し得るＣＤＲ残基（Lib1残基）のリストと、多様化によって第二の標的に対する第一の潜在的な結合部位を形成し得るＣＤＲ残基（Lib2残基）のリストを導出した。更に、抗体フレームワーク領域内の潜在的な増強残基（enhancing residues）として、フォールディングされた抗体分子内でLib1又はLib2 ＣＤＲ残基に隣接する残基であって、これらを多様化することによって、Lib1 ＣＤＲ残基を含む第一のパラトープの特性を改変し、その第一の標的に対する結合を増強する残基（Lib1E増強残基（enhancing residues））と、Lib2 ＣＤＲ残基を含む第二のパラトープの特性を改変し、その第二の標的に対する結合を増強する残基（Lib2E増強残基（enhancing residues））のリストを導出した。最後に、両ライブラリー内の抗体分子の中心コア領域の不変パッキングを維持するために、両ライブラリーにおいて同一又は極めて類似した状態で維持することが好ましいＣＤＲ残基のリストを導出した。これらは何れも、標的１特異的Lib1及び任意によりLib1E残基の群と、標的２特異的Lib2及び任意によりLib2E残基の群とを含む、組み合わせの二重特異性抗体クローン内にも存在することが好ましい。本発明者等は、この不変パックされたコア領域が、２つの結合部位を互いに遮蔽することにより、第一の標的に対する第一のパラトープを、第二の標的に対する第二のパラトープの変化に起因する有害な配座効果に対して、何らかの形で耐性のあるものとしているものと結論付けた。実際に、親クローン由来の二重特異性抗体クローンを組み合わせることにより、親抗体クローンの親和性及び結合キネティクスに対して、通常は厳密に適合することを示すことができた。実施例８に示すように、例示抗原としてＶＥＧＦ及びＩＬ６を用い、親抗体である親和性３８ｎＭのＩＬ６Ｐと、親和性１１ｎＭのＶＥＧＦＰとを組み合わせたところ、得られた二重特異性抗体ＶＨ６Ｌは、ＩＬ６に対する親和性が４０ｎＭ、ＶＥＧＦに対する親和性が７．８ｎＭであった。このように、２つの結合部位が驚くべき高いレベルの独立性を有するために、これらを従来の「２イン１」型抗体（上記の第三の従来例）や二重特異性対合単一ドメインヘテロ二量体（上記の第四の従来例）では不可能な手法で、並行に親和性成熟させることができる。また、本発明者等は、不変コア領域がこれら２つの結合部位の間にスペースを形成することにより、２つの標的を独立に連結すると共に、パラトープの重複や第一の結合標的と第二の非結合標的との間の立体障害により、各標的分子の性質や分子サイズに応じて生じる競合を回避できるものと結論付けた。実際に、例示抗原としてＧＭＣＳＦ及びＩＬ６を用いることにより、本発明の新規なクラスの二重特異性抗体分子が、クローンの組み合わせによっては、両抗原の単一ＶＨ−ＶＬ可変領域への結合も許容し得るものであることを示すことに成功した。更に、例９に示すように、第二の抗原の可変領域に対する共結合の親和性が、第一の標���の存在又は不在とは独立となる場合もある。このように、同一のＶＨ−ＶＬ可変領域への共結合や、共結合親和性の独立性は、他の従来の種類の二重特異性抗体では立証できなかったものであり、本発明に係る新規な抗体の独自の特徴を示すものである。更に、実施例１０に示すように、斯かる新規な二重特異性抗体の一部については、結合挙動の独立性を更に変異によって示すことができた。斯かる抗体によれば、点突然変異をLib1位に導入することにより、第一の標的の親和性を破壊又は大幅に低減させる一方で、第二の標的に対する親和性を無傷のまま維持することができた。また、これとは逆に、点突然変異をLib2位に導入することにより、第二の標的の親和性を破壊又は大幅に低減させる一方で、第一の標的に対する親和性を無傷のまま維持することができた。
【００９７】
例１：ライブラリーの構築
ライブラリーLib D1L1及びLib D1H1のための合成遺伝子プールはGeneArtから購入し、ライブラリーD1L2及びD1H2のための合成遺伝子プールはSloning Biotechnologyから購入した。４つのライブラリーは何れも新たに構築したファージディスプレイベクターにクローン化した。ファージディスプレイベクターはpUC19（NEBから購入）骨格に対して、Ｍ１３起点、抗体重及び軽鎖の発現を誘導する２つの合成リボゾーム結合部位、並びに、抗体ポリペプチドの大腸菌（E. coli）ペリプラズムへの分泌を誘導する２つのシグナルペプチドをコードする合成遺伝子、ヒトＣＨ１及びＣＫ定常ドメイン、及びヒトＣＨ１定常ドメインのＣ末端に融合されたＭ１３タンパク質IIIの切断Ｃ末端部を追加して構築したものである。ライブラリーをＴＧ１大腸菌（E. coli）細胞に形質転換し、各々１０９の形質転換多様性を有する４つのライブラリーを作製した。形質転換ＴＧ１大腸菌（E. coli）細胞から、M13KO7ヘルパーファージを用いて、既報の標準的な分子生物学的手法により、多様化されたＦａｂ断片を提示するファージのライブラリーとして、４つのライブラリーを作製した（Barbas et al., Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1st ed., 2001; Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 3rd ed., 2001）。
【００９８】
例２：パニング
Ｆａｂ提示ファージ粒子のライブラリーからのバインダーは、標準的なパニング法に従って（Barbas et al., Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1st ed., 2001; Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 3rd ed., 2001）、固定化された標的ＭＢＰ及びＧＳＴを用いて得ることができる。
【００９９】
例３：スクリーニング
例２で選択されたファージ粒子は、細菌宿主細胞を感染させることによりレスキューすることができる（Barbas et al., Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1st ed., 2001; Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 3rd ed., 2001）。個別のクローンから発現されたＦａｂタンパク質の標的ＭＰＢ及びＧＳＴに対する特異的結合を試験する。陽性ヒットを次工程に使用し、二重特異性コンストラクトをクローン化する。
【０１００】
例４：二重特異性抗体のクローニング
抗体遺伝子は所望のアミノ酸配列に基づいて設計し、GeneArt又はDNA2.0から合成遺伝子又は合成遺伝子断片として購入した。点突然変異を有する抗体変異体をコードする遺伝子はＰＣＲ又はオーバーラップＰＣＲにより、ポリメラーゼPwo Master（Rocheより購入）及び所望の点突然変異をコードする合成オリゴヌクレオチド（Thermo Fisher Scientificより購入）を用いて、メーカーの使用説明書に従って生成した。大腸菌（E. coli）Ｆａｂ発現ベクターは、プラスミドｐＵＣ１９（New England Biolabsより購入）を改変することにより作製した。ｐＵＣ１９骨格に対して、抗体重及び軽鎖の発現を誘導する２つの合成リボゾーム結合部位、抗体鎖の大腸菌（E. coli）ペリプラズムへの分泌を誘導する２つの合成シグナルペプチド配列、及び、一本鎖産生を可能とする１つのＭ１３ファージ起点を追加する改変を行った。合成抗体遺伝子、抗体遺伝子の合成断片、及び点突然変異をコードする抗体遺伝子のＰＣＲ生成変異体を、制限エンドヌクレアーゼ（Rocheより購入）を用いた制限酵素消化、次いでLigaFast（Promegaより購入）を用いたライゲーションにより、メーカーの使用説明書に従って、この大腸菌（E. coli）Ｆａｂ発現ベクターにクローン化した。ライゲーション反応物を、コンピテントＴＧ１大腸菌（E. coli）細胞（StrataGene又はZymoresearchより購入）に形質転換した。
【０１０１】
例５：抗体発現及び精製
Ｆａｂ発現コンストラクトを担持するTG1大腸菌（E. coli）クローンを、LB及びTB固体及び液体培地（Carl Rothより購入）で増殖させた。培地にはカルベニシリン及びグルコース（VWRより購入）を添加した。液体培養物中の抗体発現は、三角フラスコを振盪培養器に入れて一晩かけて実施し、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）（Carl Rothより購入）を培養培地に添加して誘導した。発現培養物を遠心分離して、分泌されたＦａｂ断片を含む培養上清を単離した。清明な培養上清に、1％量のストレプトマイシン／ペニシリン溶液（PAA Laboratoriesより購入）、２％量の１Ｍ Tris ｐＨ８．０（VWRより購入）、及び０．４％量のSTREAMLINE rProtein A樹脂（GE Healthcareより購入）を添加した。添加後の培養上清を回転培養器で3時間又は一晩インキュベートし、Ｆａｂ断片をProtein A樹脂に結合させた。その後、樹脂を重力流カラムに移送し、３０床体積の２×ＰＢＳ ｐＨ７．４（Invitrogenより購入）で１回洗浄し、１０ｍＭ Tris ｐＨ６．８及び１００ｍＭ ＮａＣｌを含む５床体積の緩衝剤（VWRより購入）で１回洗浄し、１０ｍＭ クエン酸 ｐＨ３及び１００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝剤（VWRより購入）を用いて溶出した。溶出されたＦａｂ断片に８％量の１Ｍ Tris ｐＨ８．０を加えて中和した。中和された精製Ｆａｂ断片を、illustra NAP−5 脱塩カラム（GE Healthcareより）を用い、メーカーの使用説明書に従って、純粋な１×ＰＢＳ ｐＨ７．４（１．０６ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、２．９７ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4−７Ｈ2Ｏ、及び１５５．１７ｍＭ ＮａＣｌ含有、他の添加物なし；Invitrogenカタログ番号10010056）へとバッファー交換した。
【０１０２】
例６：抗体安定性測定
精製及びバッファー交換されたＦａｂ断片の生物物理学的安定性を、１×ＰＢＳ ｐＨ７．４（Invitrogenカタログ番号10010056）中、差分走査熱量法（differential scanning calorimetry：ＤＳＣ）により測定した。何れの測定でも、オートさんぷらーを装着したキャピラリーセルマイクロ熱量計を用い、VPViewer2000 CapDSCソフトウェア（MicroCalより）で制御を行った。何れのＦａｂ断片も、抗体を含まない純粋な緩衝剤（１×ＰＢＳ ｐＨ７．４；Invitrogenカタログ番号10010056）に対して走査した。走査パラメーターは、３２℃から１０５℃と１１５℃との間までの温度域を分析するように設定し、走査前サーモスタットは２分間、走査後サーモスタットは０分間、ゲイン無とした。走査速度は、スクリーニング用途については毎時２５０℃、最も安定な組み合わせ変異体の再分析については毎時６０℃に設定した。スクリーニングモード（走査速度毎時２５０℃）で決定されたＦａｂ断片の絶対融点温度は、再分析モード（走査速度毎時６０℃）で決定された温度よりも３．７℃〜４．５℃高かったが、クローンの順位は両モードで同一であった。Ｆａｂ断片の融点温度はＰＢＳ基準減算に従い、Origin 7.0ソフトウェア（MicroCalより）を用いて決定した。
【０１０３】
例７：抗体特異性測定
１の標的に基づいてLib1及びLib2ライブラリーから選択された抗体の特異性、及び、両標的に結合するように設計された二重特異性抗体の特異性を試験するために、標準的な方法を用いて酵素結合免疫吸着法（enzyme-linked immunosorbent assay：ＥＬＩＳＡ）を実施した。要約すると、Nunc Maxisorpプレートを１×ＰＢＳ中ストレプトアビチンで被覆し、ＰＢＳ−Ｔ（０．３％Tween−20を１×ＰＢＳに溶解）中２０ｎＭビオチニル化標的（ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＨＥＬ、又はＶＥＧＦ）を結合させ、ＰＢＳ−Ｔ中５％脱脂粉乳でブロックすることにより調製した。その後、マイクロタイタープレート中、抗体クローンを溶解性Ｆａｂ断片として発現する５０μｌの大腸菌（E. coli）ＴＧ１培養上清を加え、続いてヤギ抗ヒトkappa軽鎖ポリクローナル抗体（Sigma）、又は、溶解性Ｆａｂ発現コンストラクト内の重鎖のＣ末端に融合されたStrep-IIタグに特異的なマウス抗Strepタグ抗体（ＩＢＡ）を用いて、結合したＦａｂ断片を検出した。ＨＲＰ標識三級抗体を用いて二次抗体を検出し、ＴＭＢ基質（KPL）を用いてＥＬＩＳＡを展開し、Victorプレートリーダー（PerkinElmerより）を４５０ｎｍにセットしてシグナルを定量化した。大腸菌（E. coli）培養上清に分泌されたダミー１Ｆａｂは４つの標的の何れにも結合せず、Ｆａｂ ＬＧ１（ライブラリーLib D1L1から分泌された）はGSTのみに結合し、Ｆａｂ ＨＭ２（ライブラリーLib D1H1から分泌された）はMBPのみに結合し、Ｆａｂ ＤＴ３（Ｆａｂ ＬＧ１及びＨＭ２に存在する全ての標的特異的残基を組み合わせた）はＧＳＴ及びＭＢＰのみに結合した。何れのクローンも対照標的であるＨＥＬ又はＶＥＧＦには結合しなかった（図５）。各Ｆａｂについて２つの独立のコロニーを用い、実験を二重に行った。
【０１０４】
例８：親及び二重特異性抗体の親和性
ヒトＶＥＧＦ（Peprotechカタログ番号100-20）及びヒトＩＬ６（Peprotechカタログ番号200-06）に対して抗体ライブラリーの選択を行った。単離された親抗体クローンのうち、ＩＬ６Ｐ及びＶＥＧＦＰを組み合わせて二重特異性抗体クローンＶＨ６Ｌとした。ＶＨ６Ｌの配列を図４に示す。図示するように、更なる点突然変異が軽鎖のアミノ酸４に存在する。親及び二重特異性抗体の親和性を検証するべく、バイアコア（Biacore）（登録商標）分析を実施して、ＩＬ６Ｐ、ＶＨ６Ｌ、及びＶＥＧＦＰの結合挙動を分析した。このために、アミンカップリングを用いて抗軽鎖捕捉抗体をＣＭ５チップ上に固定化したところ、１２０００ＲＵであった。Ｆａｂ断片は４００〜５００ＲＵのレベルで捕捉され、種々濃度の異なるＩＬ６及びＶＥＧＦ（０〜４５０ｎＭ）をチップ状に通過させた。図７に図示するように、クローンＩＬ６ＰはＩＬ６に結合するがＶＥＧＦには結合せず、クローンＶＥＧＦＰはＶＥＧＦに結合するがＩＬ６には結合せず、組み合わせクローンＶＨ６ＬはＩＬ６及びＶＥＧＦの双方に結合した。表１に示すように、標的に対する親和性は親と二重特異性抗体とでほぼ同等であった。解離定数ＫＤは、ＩＬ６Ｐ及びＶＨ６Ｌについてはそれぞれ３８ｎＭ及び４０ｎＭであり、ＶＥＧＦＰ及びＶＨ６Ｌについてはそれぞれ１１ｎＭ及び７．８ｎＭであった。
【表１】
2014516542.tif 000003
【０１０５】
例９：２つの抗原による同一のＶＨ−ＶＬ可変領域への共結合
本発明に係る二重特異性抗体が同一のＶＨ−ＶＬ可変領域において２つの異なる抗原に同時に結合し得ることを立証するために、ヒトＧＭＣＳＦ及びヒトＩＬ６に特異的な二重特異性抗体クローンＧＨ６Ｌを用いてバイアコア（Biacore）（登録商標）実験を実施した。GH6Lの配列を図４に示す。図示するように、更なる点突然変異が軽鎖のアミノ酸４に存在する。ＧＨ６Ｌ重及び軽鎖並びにシグナルペプチドｃＤＮＡを担持する標準的な哺乳類発現ベクターを用いてＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞を一時的に形質転換することにより、抗体をヒトＩｇＧ１フォーマットで発現させた。発現されたＩｇＧをProtein A樹脂により親和性精製した。バイアコア（Biacore）（登録商標）分析のために、アミンカップリングを用いてGMCSF（Peprotechカタログ番号300-03）又は抗軽鎖捕捉抗体をＣＭ５チップ上に固定化したところ、それぞれ４０００ＲＵ及び１２０００ＲＵのＧＭＣＳＦ及び抗軽鎖捕捉抗体が固定化された。
【０１０６】
GH6Lを調製された表面に捕捉させ、何れの場合も種々異なる濃度のＩＬ６（Peprotechカタログ番号200-06）を流し、BIAevaluation ソフトウェアを用いてデータを解析した。図８Ａに示すように、ＧＭＣＳＦに捕捉されたＧＨ６ＬはＩＬ６に結合し得る。ＧＭＣＳＦを注入した対照実験ではシグナルは生じなかったことから、ＩＬ６結合シグナルは同一のＶＨ−ＶＬ可変領域での同時結合によるものであって、チップ表面のＧＭＣＳＦと相互作用しないＧＨ６Ｌの「自由端部」（free arm）の結合によるものではないことが示された。図８Ｂでは、ＧＨ６ＬのＩＬ６結合親和性をＧＭＣＳＦの不在下で測定するべく、ＧＨ６Ｌを汎用の抗軽鎖捕捉抗体に結合させる。図８Ａ及び８Ｂを比較すると、ＧＨ６ＬがＧＭＳＣＦに結合しているか否かによらず、ＧＨ６ＬがＩＬ６に結合する親和性は同等であることが分かる。
【０１０７】
例１０：独立結合挙動
幾つかの本発明に係る二重特異性抗体について、２つの結合部位の独立した挙動を示すべく、Lib1又はLib2結合領域内に存在する単一の残基に位置特異的に突然変異形成した。一例では、標的Ａ及び標的Ｂを対象とする二重特異性抗体クローンを突然変異させた。
【０１０８】
標的Ａの結合に関与する推定上のパラトープを提供するLib1結合領域内に、単一の保存的ＬＣＤＲ３点突然変異Ｈ９３Ｙを導入することにより、標的Ｂへの親和性を無傷のまま維持しつつ、標的Ａの親和性を大幅に破壊することができた。
【０１０９】
他方で、標的Ｂの結合に関与する推定上のパラトープを提供するLib2結合領域内に、単一の保存的ＬＣＤＲ２点突然変異Ｗ５６Ｙを導入することにより、標的Ａへの親和性を無傷のまま維持しつつ、標的Ｂの親和性を大幅に破壊することができた。
【０１１０】
別の例では、標的Ｃ及び標的Ｄを対象とする二重特異性抗体クローンを突然変異させた。標的Ｃの結合に関与する推定上のパラトープを提供するLib1結合領域内に、単一の保存的ＬＣＤＲ１点突然変異Ｎ２７Ｄを導入することにより、標的Ｄへの親和性を無傷のまま維持しつつ、標的Ｃの親和性を大幅に破壊することができた。
【０１１１】
他方で、標的Ｂの結合に関与する推定上のパラトープを提供するLib2結合領域内に、単一の保存的ＬＣＤＲ２点突然変異Ｙ５６Ｄを導入することにより、標的Ｃへの親和性を無傷のまま維持しつつ、標的Ｄの親和性を大幅に破壊することができた。
【０１１２】
本発明は本明細書記載の具体的な実施形態の範囲に限定されるものではない。事実、明細書に記載された変形例の他にも、本発明に対して種々の変更を加え得ることは、本明細書に接した当業者には明らかであろう。斯かる変更も添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【０１１３】
特許法の規定に合致する範囲において、本明細書に引用する特許、出願、公報、試験方法、文献、及び他の資料は、援用により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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