(57)【要約】本開示は、ポリエチレングリコールまたはその誘導体でＰＥＧ化されたエキセンジン−４類似体、調製法、および活性成分としてこれを含有する、糖尿病を予防または処置するための薬学的組成物に関する。本発明によれば、エキセンジン−４類似体の収率は、システインがＣ末端の＃４０部位に導入されたエキセンジン−４を使用することによる選択的ＰＥＧ化を介して上げることができ、薬物の治療効果を増大させることができ、その結果、該エキセンジン−４類似体は、インスリン過分泌により引き起こされる疾患を予防または処置するための組成物として有用に適用することができる。
2014520798.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
システイン（Ｃｙｓ）がＣ末端の＃４０部位に導入され、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体でＰＥＧ化されたエキセンジン−４類似体。
【請求項２】
前記ポリエチレングリコールまたは前記その誘導体が、直鎖型または分枝型である、請求項１に記載のエキセンジン−４類似体。
【請求項３】
前記ポリエチレングリコールまたは前記その誘導体が、二量体型または三量体型である、請求項１に記載のエキセンジン−４類似体。
【請求項４】
前記ポリエチレングリコールまたは前記その誘導体が、前記三量体型である、請求項３に記載のエキセンジン−４類似体。
【請求項５】
前記ポリエチレングリコールまたは前記その誘導体が、５〜６０ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載のエキセンジン−４類似体。
【請求項６】
前記ポリエチレングリコールまたは前記その誘導体が、２０〜５０ｋＤａの分子量を有する、請求項５に記載のエキセンジン−４類似体。
【請求項７】
前記ポリエチレングリコール誘導体が、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルプロピオネート、メトキシポリエチレングリコールＮ−ヒドロキシスクシンイミド、メトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、メトキシポリエチレングリコールマレイミド、または該誘導体の複数分枝型である、請求項１に記載のエキセンジン−４類似体。
【請求項８】
前記ポリエチレングリコール誘導体が、直鎖メトキシポリエチレングリコールマレイミド、二量体メトキシポリエチレングリコールマレイミド、または三量体メトキシポリエチレングリコールマレイミドからなる群から選択される、請求項７に記載のエキセンジン−４類似体。
【請求項９】
前記ポリエチレングリコール誘導体が、三量体メトキシポリエチレングリコールマレイミドである、請求項８に記載のエキセンジン−４類似体。
【請求項１０】
請求項１に記載のエキセンジン−４類似体を調製する方法であって、システインがＣ末端の＃４０部位に導入されたエキセンジン−４、およびポリエチレングリコールまたはその誘導体をリン酸緩衝食塩溶液に溶解させるステップと、溶解させた該成分を室温で反応させるステップとを含む、方法。
【請求項１１】
前記リン酸緩衝食塩水が、７．２〜７．８のｐＨ範囲を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
導入された前記システインを有する前記エキセンジン−４と、前記ポリエチレングリコールまたは前記その誘導体との反応モル比が１：１〜３である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
活性成分として請求項１に記載のエキセンジン−４類似体を含有する、インスリン過分泌により引き起こされる疾患を予防または処置するための薬学的組成物。
【請求項１４】
インスリン過分泌により引き起こされる前記疾患が、１型糖尿病、２型糖尿病、または糖尿病合併症である、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ポリエチレングリコールまたはその誘導体でＰＥＧ化されたエキセンジン−４類似体、その調製法、および活性成分としてこれを含有する、糖尿病を予防または処置するための薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬学的技術の中で、治療目的のためのペプチドおよびタンパク質のＰＥＧ化は、最も有効な技術である。ペプチドおよびタンパク質をＰＥＧ化すると、その分子量、タンパク質分解部位防御力、および免疫原性部位防御力が増大し、したがってそれにより、ｉｎ  ｖｉｖｏ薬物の半減期が長くなり、ペプチドおよびタンパク質の免疫原性が低減する。したがって、ＰＥＧ化技術は、元の薬物の問題を解決することによって治療効果を増大させる効果を有し、このような強みのために、ＰＥＧ化ペプチドおよびタンパク質薬物送達システムの効果の増大に重要な役割を果たす。
【０００３】
また、ペプチドおよびタンパク質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と共有結合することによって治療効果を増大させる。このような技術により、分子量、代謝部位の防御力、および免疫原性部位の阻害が増大し、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期および安定性が増大し、免疫原性が低減する。さらに、ＰＥＧと結合したペプチドおよびタンパク質の腎排泄は、ＰＥＧによってペプチドおよびタンパク質の分子量が増大しているために低減され、その結果、ＰＥＧ化は、薬物動態学的および薬力学的の両方における効果を増大させる利点を有する。
【０００４】
ペプチドおよびタンパク質のＰＥＧ化反応部位は、ランダムに分散しており、場合によっては生理活性部位に近い。しかし、従来のＰＥＧ化では、ＰＥＧ反応部位、ＰＥＧ結合の数、および生物活性を考慮しない非特異的ＰＥＧ化法が使用される。しかし、このような非特異的ＰＥＧ化法は、異なる生理化学的、生物学的、および薬物動態学的特性を有する様々な分枝型のＰＥＧ結合異性体を生じさせることにより、不十分なコンフォメーションをもたらすことによって治療効果を低下させる。このような問題を解決するために、特異的ＰＥＧ化法が研究されており、最近、特異的ＰＥＧ化法が急速に発展して、薬物の治療効果を最大にする方法となっており、その理由は、遺伝子操作技術および選択的官能基導入技術が急速に発展しているためである。関連技術において、顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および腫瘍壊死因子受容体に関する遺伝子操作法を使用して、第一級アミン部位を異なるアミノ酸で置換することによって反応部位を除去した後、Ｎ末端部位にＰＥＧを選択的に結合させる研究が以前に行われていた。
【０００５】
また、薬物、例えば、スタフィロキナーゼ、インターフェロンａ−２、抗体単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）のために、遺伝子操作法および置換技術を使用して特定の置換基を導入した後、置換基を選択的にＰＥＧ化する技術を使用する研究が行われている。
【０００６】
エキセンジン−４はポリペプチド物質であり、アメリカドクトカゲの唾液物質のエキセンジン−４を合成することによって調製された、最初のインクレチン類似体の糖尿病薬である。エキセンジン−４は、＃２および＃３部位のみがエキセンジン−３と異なり、酵素であるＤＰＰ−ＩＶに対して２分より短い半減期を有する糖尿病薬であるグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）より長い半減期を有することが公知であり、摂取後に哺乳動物の胃の中で生成されるインクレチンを直接分解する酵素、ＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼ−４）に対して耐性であることによって、インスリン分泌を促進し、血糖値を下げる有益な役割を果たし、またこれは、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験で２〜４時間の半減期を示す。これは、１日当たり２〜３回の腹腔内注射で十分な血中濃度に到達し得ることが確認されている。
【０００７】
また、エキセンジン−４は、胃腸管の運動性を制御することが公知であり、食物摂取量を低減し、血漿グルカゴンを抑制する。最近、ＰＬＧＡ微小球型合成エキセンジン−４（製品名：Ｂｙｅｔｔａ）がＵＳ  ＦＤＡによって承認されており、発売間近である。しかし、このＢｙｅｔｔａ  ＬＡＲ製品は、複雑な調製プロセスを有し、エキセンジン−４についてｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が約４〜６時間と短いので、高用量のエキセンジン−４の頻繁な投与を必要とし、４２００未満という低分子量に起因する急速排泄に基づく薬物放出制御の問題、および免疫原性などの問題が依然として存在する。
【０００８】
したがって、エキセンジン−４の投与頻度を減らし、エキセンジン−４の低分子量問題を解決するための方法を研究しながら、本発明者らは、エキセンジン−４のＣ末端の＃３９部位の次の部位（＃４０部位）にシステイン（Ｃｙｓ）アミノ酸を挿入することを介する選択的ＰＥＧ化を実施することによって、ＰＥＧ化エキセンジン−４の生成収率および薬物の治療効果を増大させることが可能であるという事実を確認した後、本発明を完成させた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の一目的は、システイン（Ｃｙｓ）がＣ末端の＃４０部位に導入され、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体でＰＥＧ化されたエキセンジン−４類似体を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、エキセンジン−４類似体を調製する方法を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、活性成分としてエキセンジン−４類似体を含有する、インスリン過分泌により引き起こされる疾患を予防または処置するための薬学的組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するために、本発明は、Ｃ末端の＃４０部位に導入されたシステイン（Ｃｙｓ）を有し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体でＰＥＧ化されたエキセンジン−４類似体を提供する。
【００１３】
本発明は、上記エキセンジン−４類似体を調製する方法も提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、活性成分としてエキセンジン−４類似体を含有する、インスリン過分泌により引き起こされる疾患を予防または処置するための薬学的組成物を提供する。
【００１５】
有利な効果
本発明によれば、選択的ＰＥＧ化を実施することによって、システイン（Ｃｙｓ）がＣ末端の＃４０部位に導入され、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体でＰＥＧ化されたエキセンジン−４類似体の収率を上げることができ、薬物の治療効果を増大させることができ、したがって、該エキセンジン−４類似体は、インスリン過分泌により引き起こされる疾患を予防または処置するための組成物として有利に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、システイン（Ｃｙｓ４０）が本発明の実施例１のＣ末端に導入されたエキセンジン−４のＰＥＧ化を例示する概略図である。
【図２】図２は、本発明の比較実施例１のエキセンジン−４のリシンアミンについてのＰＥＧ化を例示する概略図である。
【図３】図３は、本発明の比較実施例２のエキセンジン−４のＮ末端についてのＰＥＧ化を例示する概略図である。
【図４】図４は、本発明の実施例１の吸光度を例示する図である。
【図５】図５は、本発明の比較実施例１ａ〜１ｃの吸光度を例示する図である。
【図６】図６は、本発明の比較実施例２の吸光度を例示する図である。
【図７】図７は、本発明の実施例１の生成収率を例示する図である。
【図８】図８は、本発明の比較実施例１ａ〜１ｃの生成物収率を例示する図面である。
【図９】図９は、本発明の比較実施例２の生成収率を例示する図である。
【図１０】図１０は、本発明の一実施例による、ＧＬＰ−１受容体に対するＰＥＧ結合エキセンジン−４類似体の親和性を例示する図である。
【図１１】図１１は、本発明の実施例４および５のＰＥＧ結合エキセンジン−４類似体を例示する概略図である。
【図１２】図１２は、本発明の一実施例によるＰＥＧ結合エキセンジン−４類似体を投与された糖尿病マウスの血糖値を例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明を実施するための態様
以下で本発明を詳細に記載する。
【００１８】
本発明は、システイン（Ｃｙｓ）がＣ末端の＃４０部位に導入され、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体でＰＥＧ化されたエキセンジン−４類似体を提供する。
【００１９】
本発明によるポリエチレングリコールまたはその誘導体の分子量は、５〜６０ｋＤａ、好ましくは２０〜５０ｋＤａであるが、それに限定されない。
【００２０】
また、本発明によるポリエチレングリコールまたはその誘導体は、直鎖型または分枝型であり、分枝型については、好ましくは二量体型または三量体型を使用することができ、より好ましくは三量体型を使用することができる。
【００２１】
具体的には、上記ポリエチレングリコール誘導体は、例えば、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルプロピオネート、メトキシポリエチレングリコールＮ−ヒドロキシスクシンイミド、メトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、メトキシポリエチレングリコールマレイミド、またはこれらの誘導体の複数分枝型（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｔｙｐｅ）である。好ましくは、上記ポリエチレングリコール誘導体は、直鎖メトキシポリエチレングリコールマレイミド、分枝型メトキシポリエチレングリコールマレイミド、または三量体メトキシポリエチレングリコールマレイミドであり、より好ましくは、三量体メトキシポリエチレングリコールマレイミドである。
【００２２】
また、本発明は、上記ポリエチレングリコールまたはその誘導体でＰＥＧ化されたエキセンジン−４類似体を調製する方法であって、システインがＣ末端の＃４０部位に導入されたエキセンジン−４、およびポリエチレングリコールまたはその誘導体をリン酸緩衝食塩溶液に溶解させ、これらを室温で反応させるプロセスを含む、方法を提供する。
【００２３】
具体的には、ポリエチレングリコールまたはその誘導体でＰＥＧ化されたエキセンジン−４類似体は、７．２〜７．８のｐＨ範囲、好ましくはｐＨ７．５を有するリン酸緩衝食塩水中１：１〜３のモル比で、システインがＣ末端の＃４０部位に導入されたエキセンジン−４、およびポリエチレングリコールまたはその誘導体をリン酸緩衝食塩溶液に添加し、これらの成分を溶解させ、反応温度は特に限定されないが、室温で１〜３時間反応を実施し、反応が完了した後、カラムクロマトグラフィーを実施することによって調製することができる。
【００２４】
上記リン酸緩衝食塩水が上記ｐＨ範囲内でない場合、上記収率が低下し得る。
【００２５】
本発明では、ポリエチレングリコールまたはその誘導体でＰＥＧ化されたエキセンジン−４類似体を調製した後、該エキセンジン−４類似体の分子構造を、質量分析装置、液体クロマトグラフィー、Ｘ線回折分析、偏光分析法、および該エキセンジン−４類似体を構成する代表的な元素の計算値と測定値との比較によって確認することができる。
【００２６】
また、本発明は、活性成分として上記エキセンジン−４類似体を含有する、インスリン過分泌により引き起こされる疾患を予防または処置するための薬学的組成物を提供する。
【００２７】
さらに、本発明は、インスリン過分泌により引き起こされる疾患を処置する必要のある患者への、ポリエチレングリコールまたはその誘導体でＰＥＧ化されたエキセンジン−４類似体の投与を特徴とする処置法を提供する。
【００２８】
インスリン過分泌により引き起こされる疾患として、１型糖尿病、２型糖尿病、および糖尿病合併症を挙げることができる。
【００２９】
本発明によるポリエチレングリコールまたはその誘導体でＰＥＧ化されたエキセンジン−４類似体のＧＬＰ−１受容体への親和性を測定した結果として、ＩＣ５０値は１．０４ｎＭであり、これは、実施例１の化合物（Ｎｔｅｒ−ＰＥＧ−Ｅｘ４）（ＩＣ５０＝１２１．７８ｎＭ）より１２０倍大きい活性を示すことが確認された（実験例１、表３、および図１０を参照）。
【００３０】
また、より良好に理解するために、Ｃ４０部位で三量体ＰＥＧと結合した本発明のエキセンジン−４の模式図を図１１に示す。
【００３１】
上記結合したＰＥＧの分子量が２３Ｋであるとき、３ＫＤのＰＥＧがＰＥＧスペーサーとして使用され、１０ＫＤの分子量を有するＰＥＧが該３ＫＤの末端に結合している（実施例４）。また、これと同様に、上記結合したＰＥＧの分子量が５０であるとき、１０ＫＤのＰＥＧがＰＥＧスペーサーとして使用され、２０ＫＤの分子量を有するＰＥＧが該１０ＫＤの末端に結合している（実施例５）。この時、実施例４（Ｃ４０−ＰＥＧ２３Ｋ−Ｅｘ４）および実施例５（Ｃ４０−ＰＥＧ５０Ｋ−Ｅｘ４）のエキセンジン−４を注射した後、血糖値が８．３５ｍｍｏｌ／Ｌに上昇して戻るのに必要とされる時間を測定した結果として、低血糖値は、その薬物を投与した後、４５．５〜５６．１時間維持し（実験例２、表４、および図１２を参照）、これは、Ｃ４０−ＰＥＧ２０Ｋ−Ｅｘ４（２３．２時間）および対照群（７．３時間）の２倍超であり、血糖値を７〜８倍より安定に維持することを可能にすることが確認された。
【００３２】
したがって、本発明によるＣ４０部位特異的ＰＥＧ結合エキセンジン−４化合物は、既存のエキセンジン−４の低分子量に起因する薬物の急速排泄という欠点を解決することができ、上記ＧＬＰ−１受容体への優れた親和性を有し、上記薬物を投与した後最大３〜４日血糖値を維持することができる、強い低血糖維持能力を有し、したがって、これは、インスリン過分泌関連１型糖尿病、２型糖尿病、および糖尿病合併症に関係した疾患を予防または処置するのに有利に使用することができる。
【００３３】
本発明の組成物が薬物として使用される場合、ポリエチレングリコールまたはその誘導体でＰＥＧ化されたエキセンジン−４類似体を含有する薬学的組成物は、臨床投与の場合では、以下のような様々な経口または非経口投与形態に製剤化した後、投与することができるが、それに限定されない。
【００３４】
経口投与目的の製剤については、例えば、錠剤、ペレット剤、硬／軟カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤などがあり、これらの製剤は、活性成分に加えて、賦形剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、および／またはグリシン）、滑沢剤（ｓｌｉｐ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（例：シリカ、タルク、ステアリン酸およびそのマグネシウムもしくはカルシウム塩、ならびに／またはポリエチレングリコール）を含む。錠剤は、結合剤、例えば、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプンペースト、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリジンを含んでもよく、必要な場合、崩壊剤、例えば、デンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、または沸騰混合物（ｂｏｉｌｉｎｇ  ｍｉｘｔｕｒｅ）および／または吸収剤、着色剤、香味剤、および甘味剤を含むことができる。
【００３５】
ポリエチレングリコールまたはその誘導体でＰＥＧ化されたエキセンジン−４類似体を含有する薬学的組成物は、非経口投与してもよく、その投与は、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、または胸腔内注射によって行われる。
【００３６】
この時、ポリエチレングリコールまたはその誘導体でＰＥＧ化されたエキセンジン−４類似体は、これを水中で安定剤または緩衝剤と混合することによって調製して液体または懸濁液にして、これを製剤化して（ｆｏｒｍｕｌｉｚｅ）非経口的投与目的の製剤にすることができ、これは、アンプルまたはバイアル単位投与形態に調製することができる。その組成物は、滅菌され、かつ／または、補助剤、例えば、防腐剤、安定剤、ハイドレーターもしくは乳化刺激物質（ｅｍｕｌｓｉｆｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）、浸透圧制御目的の塩および／もしくは緩衝剤、ならびに処置に有益な他の物質を含むことができ、混合、造粒、もしくは被覆の従来の方法によって製剤化することができる。
【００３７】
本発明によるポリエチレングリコールまたはその誘導体でＰＥＧ化されたエキセンジン−４類似体を含有する薬学的組成物の人体用量は、患者の年齢、体重、性別、投与形態、健康状態、および疾患のレベルに応じて変更することができ、好ましくは０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、医師または薬剤師が決定した後、経口または非経口経路を介して投与することができる。
発明を実施するための形態
本発明を、以下の実施例および実験例によって詳細に説明する。
【００３８】
実施例および実験例は、本発明を実証しているだけであり、本発明の内容はこれらに限定されない。
【実施例】
【００３９】
（実施例１〜５）
Ｃ４０部位特異的ＰＥＧ結合エキセンジン−４の生成
Ｃ４０部位特異的ＰＥＧ結合エキセンジン−４を調製するために、システインがＣ末端部位（＃４０部位）に導入されたエキセンジン−４−Ｃｙｓを使用し（エキセンジン−Ｃｙｓ、分子量：４２９０．７、配列：ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＣ）、マレイミド活性化モノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＭＡＬ、ＭＷ：５、２０ｋＤａ（直鎖型）、２０ｋＤａ（分枝型）、２３、５０ｋＤａ（三量体型））を、日本油脂（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｏｉｌ  ａｎｄ  Ｆａｔｓ）、日油（ＮＯＦ）、東京から購入し、使用した。
【００４０】
Ｃ末端＃４０部位特異的ＰＥＧ結合エキセンジン−４を調製するために、エキセンジン−４−ＣｙｓおよびｍＰＥＧ−ＭＡＬ（ＭＷ：５、２０（直鎖型）、２０（分枝型）、２３、５０ｋＤａ）を、２０ｍＭのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．５）で１：２のモル比で完全に溶解させ、室温で２時間反応させた（図１を参照）。反応後、５．０ｍｌ／分の流速で、Ｃａｐｃｅｌｌ−ｐａｋ  ＲＰ−１８カラム（２５０×１０ｍｍ、５μｍ、資生堂（Ｓｈｉｓｅｉｄｏ）、日本）を用いて逆相クロマトグラフィーによって反応した溶液を分離した。その分離は、２１５ｎｍの波長の紫外線でモニターした。０．１％のＴＦＡ蒸留水（移動相Ａ）および０．１％のＴＦＡアセトニトリル（移動相Ｂ）に対して直線濃度勾配法（３０分にわたって３６〜４２％のＢ）を使用して移動相を分離した（図４を参照）。
【００４１】
この方法によって分離されたピークを別個に収集し、窒素ガスを使用してアセトニトリルを取り出し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（Ｍｗカットオフ３０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して、その取り出した溶液を濃縮した。調製した物質を４℃で貯蔵し、試料−マトリックス試料溶液１μｌとマトリックス溶液２μｌを混合することによって調製し、該マトリックス溶液は、０．１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡを含有する水／ＣＡＮ（５０：５０）溶液を用いてα−シアノヒドロキシケイ皮酸（α−ＣＨＣＡ）を溶解させることによって調製した。調製した試料−マトリックス溶液１μｌを試料プレート上に置き、真空状態で乾燥させ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計で分析し、Ｃ４０部位特異的ＰＥＧ結合反応物（Ｃ４０−ＰＥＧ−Ｅｘ４）を、０、２０、４０、６０、および８０分において分析し、エキセンジン−４およびＣ４０−ＰＥＧ−Ｅｘ４の初期状態と比較したクロマトグラム面積比を用いて示した。結果を表１および図７に例示する。
【００４２】
【表１】
2014520798.tif 000003
表１に示したように、反応時間は、平均で８０分であり、９０％超の平均の収率で生成が行われた（図７を参照）。
【００４３】
（比較実施例１）
非特異的ＰＥＧ結合エキセンジン−４の生成
システインが導入されたエキセンジン−４−Ｃｙｓおよびマレイミド活性化モノメトキシＰＥＧを使用する代わりに、エキセンジン−４（分子量：４１８６．６、配列：ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）およびスクシンイミジル活性化モノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、ＭＷ：５、２０ｋＤａ（直鎖型））を使用することを除いて、上記実施例１と等価な方法を実施して、非特異的ＰＥＧ結合エキセンジン−４を調製した（図２および図５を参照）。
【００４４】
スクシンイミジル活性化モノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）を、日本油脂、日油、東京から購入し、使用した。
【００４５】
【表２】
2014520798.tif 000004
表２に示したように、非特異的な第一級アミンＰＥＧ結合反応の反応時間は、平均で８０分であり、平均収率は、比較実施例１ａ（Ｌｙｓ１２−ＰＥＧ２０Ｋ−Ｅｘ４）で２０％であり、比較実施例１ｂ（Ｌｙｓ２７−ＰＥＧ２０Ｋ−Ｅｘ４）で３１％であった（図８を参照）。
【００４６】
（比較実施例２）
Ｎ末端特異的ＰＥＧ結合エキセンジン−４の生成
システインが導入されたエキセンジン−４−Ｃｙｓおよびマレイミド活性化モノメトキシＰＥＧを使用する代わりに、エキセンジン−４（分子量：４１８６．６、配列：ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）およびモノメトキシＰＥＧ−アルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ、ＭＷ：５ｋＤａ（直鎖））を使用することを除いて、上記実施例１と等価な方法を実施して、非特異的ＰＥＧ結合エキセンジン−４を調製した（図３および図６を参照）。
【００４７】
上記モノメトキシＰＥＧ−アルデヒドを、日本油脂、日油、東京から購入し、使用した。
【００４８】
結果として、Ｎ末端特異的ＰＥＧ結合反応物（Ｎｔｅｒ−ＰＥＧ５Ｋ−Ｅｘ４）の反応時間は、７２０分であり、平均収率は、７２％であった（図９を参照）。
【００４９】
（実験例１）
ＰＥＧ結合エキセンジン−４類似体のＲＩＮ−ｍ５Ｆ細胞受容体結合親和性の分析
以下の実験を実施して、実施例１、比較実施例１および２で調製した実施例１（Ｃ４０−ＰＥＧ５Ｋ−Ｅｘ４）、比較実施例１ａ（Ｌｙｓ１２−ＰＥＧ５Ｋ−Ｅｘ４）、比較実施例１ｂ（Ｌｙｓ２７−ＰＥＧ５Ｋ−Ｅｘ４）、および比較実施例２（Ｎｔｅｒ−ＰＥＧ５Ｋ−Ｅｘ４）のＰＥＧ結合エキセンジン−４類似体のＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）親和性を実施した。
【００５０】
非常に多量のＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）を発現する島細胞（ＲＩＮ−ｍ５Ｆ、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、１２ウェルプレートに接種した。４８時間後に、結合緩衝液（１２０ｍＭのＮａＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＳＯ４、１３ｍＭの酢酸ナトリウム、５ｍＭのＫＣｌ、１．２ｇ／ｌのＴｒｉｓ、２ｇ／ｌのウシ血清アルブミン、１．８ｇ／ｌのグルコース、ｐＨ７．６）でこれを２回洗浄し、未標識ＰＥＧ結合エキセンジン−４類似体（最終濃度範囲：０．００１〜１０００ｎＭ）および３０ｐＭの濃度のＩ−１２５で標識したエキセンジン−４（９−３９、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を同時に処理した。２時間後に、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで完全な洗浄を行った。最後に、細胞溶解緩衝液（１％のＳＤＳを含む０．５ＮのＮａＯＨ）を使用して１５分間上記細胞を徹底的に分解し、Ｉ−１２５の放射線レベルを、ガンマカウンター（ＧＭＩ，Ｉｎｃ．、Ｒａｍｓｅｙ、ＭＮ）を使用して測定した。結果を表３および図１０に例示する。
【００５１】
【表３】
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表３に示したように、本発明による実施例１（Ｃ４０−ＰＥＧ５Ｋ−Ｅｘ４）のＩＣ５０は、ＧＬＰ−１受容体に対する親和性を測定した後、１．０４ｎＭであることが確認された。これは、比較実施例１ｂ（Ｌｙｓ２７−ＰＥＧ５Ｋ−Ｅｘ４）（ＩＣ５０値＝２．４２ｎＭ）より２倍良好で、比較実施例１ａ（Ｌｙｓ１２−ＰＥＧ５Ｋ−Ｅｘ４）（ＩＣ５０値＝６．４５ｎＭ）より６倍良好な活性を示すことが確認された。また、本発明による実施例１（Ｃ４０−ＰＥＧ５Ｋ−Ｅｘ４）は、比較実施例２（Ｎｔｅｒ−ＰＥＧ５Ｋ−Ｅｘ４）（ＩＣ５０値＝１２１．７８ｎＭ）より１２０倍良好な活性を示すことが確認された。
【００５２】
したがって、本発明によるＣ４０部位特異的ＰＥＧ結合エキセンジン−４組成物は、エキセンジン−４の低分子量に起因する薬物の急速排泄という欠点を解決することができるだけでなく、糖尿病薬として有利に使用することもでき、その理由は、ＧＬＰ−１受容体親和性により、エキセンジン−４と同様の生物活性が示されるためである（図１０を参照）。
【００５３】
（実験例２）
非空腹の２型糖尿病マウスにおける低血糖持続可能性の評価
以下の実験を実施して、２型糖尿病マウスにおける、本発明によるＣ４０部位特異的ＰＥＧ結合エキセンジン−４組成物の低血糖持続可能性を評価した。
【００５４】
２型糖尿病のＣ５７ＢＬ／６  ｄｂ／ｄｂマウス（雄、４〜５週齢、Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｌａｂ．Ａｎｉｍａｌ  Ｉｎｃ．）を使用し、上記動物を、食物および水を自由に摂取させることによって２週間安定させた後、１２時間サイクルで光に曝露し、成長させた。実験動物は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）の指針に従って管理し、Ｓｕｎｇｋｙｕｎｋｗａｎ大学の所内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。実験を人道的に実施した。
【００５５】
実施例１〜５から調製したＣ４０−ＰＥＧ５Ｋ−Ｅｘ４（直鎖）、Ｃ４０−ＰＥＧ２０Ｋ−Ｅｘ４（直鎖）、Ｃ４０−ＰＥＧ２０Ｋ−Ｅｘ４（分枝）、Ｃ４０−ＰＥＧ２３Ｋ−Ｅｘ４（三量体）、およびＣ４０−ＰＥＧ５０Ｋ−Ｅｘ４（三量体）、ならびに比較実施例１ｂで調製したＬｙｓ２７−ＰＥＧ２０Ｋ−Ｅｘ４を、雄のｄｂ／ｄｂマウス（６〜７週齢）に２５ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で腹腔内注射し、フロート時間（ｆｌｏａｔ  ｔｉｍｅ）：０、０．５、１、２、３、４、６、８、１２、２４、３６、４８、６０、７２、９６時間の後に、マウスの尾静脈から血液を収集し、血糖濃度をＡＣＣＵ−ＣＨＥＫ  Ｓｅｎｓｏｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．、ＵＳＡ）で測定した。その後、低血糖持続時間（血糖値＜８．３５ｍｍｏｌ／ｌ（１５０ｍｇ／ｄＬ））をさらに測定し、表４および図１２に示した。本実験では、エキセンジン−４を対照群として使用した。
【００５６】
【表４】
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表４に示したように、本発明による実施例１〜５のＣ４０部位特異的ＰＥＧ結合エキセンジン−４の血糖値が８．３５ｍｍｏｌ／ｌに上昇して戻るのに必要とされる時間は、エキセンジン−４（７．３時間）より長いことが確認され、特に、三量体ＰＥＧが導入された実施例４（Ｃ４０−ＰＥＧ２３Ｋ−Ｅｘ４）および実施例５（Ｃ４０−ＰＥＧ５０Ｋ−Ｅｘ４）については、低血糖値は、それぞれ４５．５時間および５６．１時間持続した（図１２を参照）。
【００５７】
したがって、本発明によるＣ４０部位特異的ＰＥＧ結合エキセンジン−４組成物は、エキセンジン−４の低分子量に起因する薬物の急速排泄という欠点を解決し、したがって、比較実施例より７〜８倍安定な血糖値を維持することによって、糖尿病薬として有利に使用することができる。
【００５８】
その一方で、本発明によるＣ４０部位特異的ＰＥＧ結合エキセンジン−４類似体は、目的に従って様々な形態に製剤化することができる。以下は、活性成分として本発明によるＣ４０部位特異的ＰＥＧ結合エキセンジン−４類似体を含む、いくつかの製剤方法の実例であり、本発明は、これらに限定されない。
【００５９】
（製剤化実施例１）
散剤の生成
Ｃ４０部位特異的ＰＥＧ結合エキセンジン−４類似体  ２ｇ
ラクトース  １ｇ。
【００６０】
上記成分を混合し、密封パッケージに詰めて散剤を調製した。
【００６１】
（製剤化実施例２）
錠剤の生成
Ｃ４０部位特異的ＰＥＧ結合エキセンジン−４類似体  １００ｍｇ
コーンスターチ  １００ｍｇ
ラクトース  １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム  ２ｍｇ。
【００６２】
錠剤についての一般的な調製法に従って上記成分を混合し、圧縮して、錠剤を調製した。
【００６３】
（製剤化実施例３）
カプセル剤の生成
Ｃ４０部位特異的ＰＥＧ結合エキセンジン−４類似体  １００ｍｇ
コーンスターチ  １００ｍｇ
ラクトース  １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム  ２ｍｇ。
【００６４】
カプセル剤についての一般的な調製法に従って上記成分を混合し、ゼラチンカプセルに詰めて、カプセル剤を調製した。
【００６５】
（製剤化実施例４）
注射剤の生成
Ｃ４０部位特異的ＰＥＧ結合エキセンジン−４類似体  １００ｍｇ
マンニトール  １８０ｍｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  ２６ｍｇ
蒸留水  ２９７４ｍｇ。
【００６６】
注射剤についての一般的な調製法に従って、上記成分を所与の量で含めて、注射剤を調製した。
【００６７】
産業上の利用可能性
本発明によれば、選択的ＰＥＧ化を実施することによって、システイン（Ｃｙｓ）がＣ末端の＃４０部位に導入され、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体でＰＥＧ化されたエキセンジン−４類似体の収率を上げることができ、薬物の治療効果を増大させることができ、したがって、該エキセンジン−４類似体は、インスリン過分泌により引き起こされる疾患を予防または処置するための組成物として有利に使用することができる。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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