(57)【要約】分子的診断検査で癌を特定するための方法と組成物を提供する。その検査は抗血管形成治療薬に反応する癌のサブタイプを特定し、このサブタイプの範疇での患者の分類を可能にする。本発明は、癌を有する患者が治療計画に対して臨床的に応答するか、応答しないか、任意の抗血管形成剤を投与する前に判定するために用いることができる。本検査は、様々な種類の癌で、血管形成または血管形成のシグナル伝達に直接的または間接的に影響する様々な薬品と共に用いることができる。さらに、本発明はある種の癌の予後指標として用いることができる。特に、本発明は、発現が治療計画に対する応答性または非応答性と相関する予測マーカーのある特定の組合せの使用を対象とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の抗血管形成治療薬に対する応答性を予測する方法であって、
発現シグネチャによって定義される１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを、前記対象から得た疾患組織の検査試料において測定して試料発現スコアを決定すること、
前記試料発現スコアを閾値発現スコアと比較すること、および
前記試料発現スコアが前記閾値発現スコアより上回るかまたは下回るかに基づいて、前記対象を応答性または非応答性であると分類すること、を含む前記方法。
【請求項２】
前記疾患組織が癌組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記癌が卵巣癌，神経膠芽腫または乳癌である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記の試料発現値が、各バイオマーカーの発現レベルを測定し、前記発現シグネチャによって決定される各バイオマーカーの対応するウェイトによって前記発現レベルを乗算することにより決定される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記発現シグネチャを、
疾患組織の試料セットから全ＲＮＡを単離すること、
前記の単離された全ＲＮＡをマイクロアレイにハイブリダイズして試料発現データセットを得ること、
定義した有意性閾値を越えるばらつきを有する前記マイクロアレイ上のプローブを選択して予備的なバイオマーカーセットを形成すること、
前記の予備的なバイオマーカーセット内で同様の発現プロファイル有するバイオマーカーからなるクラスターを、クラスタリングアルゴリズムを使用して形成すること、
生物学的プロセスまたは生物学的経路をバイオマーカーの各クラスターについて特定すること、
目的の前記の生物学的プロセスまたは生物学的経路に対応するクラスターを選択すること、および
教師あり学習アルゴリズムまたは教師なし学習アルゴリズムを使用して、疾患組織の前記試料セット内の前記の選択されたクラスターにおける前記バイオマーカーの発現レベルを分析することにより、発現シグネチャを定義すること、を含む方法によって得る、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記マイクロアレイが、検査試料セットに由来するＲＮＡ転写物を単離および配列決定し、前記の単離されたＲＮＡ転写物の配列を既知のＲＮＡ転写物配列に対して交差検定することにより、前記検査試料セットにおいて発現していると検証されたＲＮＡ転写物に結合するプローブセットを含むトランスクリプトームアレイであり、前記検査試料セットは患者検査試料と同じ組織を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記プローブセットが各ＲＮＡ転写物の３’末端から３００ヌクレオチド以内に結合するプローブを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＲＮＡ転写物が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、オルタナティブスプライシングを受けたｍＲＮＡ、リボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）およびアンチセンスＲＮＡを包含する、コード転写物および非コード転写物を含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記発現シグネチャが、ＰＬＳ分類器、ＳＶＭ分類器、ＳＤＡ分類器、またはＤＳＤＡ分類器を使用して定められる、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記発現シグネチャがＰＬＳ分類器を使用して定められる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記発現シグネチャが表１Ａまたは表１Ｂからの２つ以上の遺伝子を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記発現シグネチャが表２Ａまたは２Ｂからの２つ以上の遺伝子を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記発現シグネチャが、配列番号６３２〜８０１（グループＩ）または配列番号８０２〜９７４（グループＩＩ）の配列を含む２つ以上の遺伝子を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記発現シグネチャがＡＬＰＫ２、ＢＧＮ、ＣＯＬ８Ａ１、ＦＡＰ、ＦＮ１、ＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＡ５、ＬＯＸＬ１、ＬＵＭ、ＭＩＲ１２４５、ＭＭＰ２、ＮＫＤ２、ＰＬＡＵ、ＲＡＢ３１、ＳＦＲＰ２、ＴＨＢＳ２、ＴＩＭＰ３、ＶＣＡＮを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記発現シグネチャが表２Ａに記載される遺伝子を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現シグネチャが表２Ｂに記載される遺伝子を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記発現シグネチャがグループＩまたはグループＩＩの配列を含む遺伝子を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記発現シグネチャがＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＴＨＢＳ２、ＳＦＲＰ２およびＰＬＡＵを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗血管形成治療薬が、ＶＥＧＦ経路標的化治療薬、アンジオポエチン‐ＴＩＥ２経路阻害剤、内在性血管形成阻害剤および免疫調節剤である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＶＥＧＦ経路標的化治療薬に、ベバシズマブ（アバスチン）、アフィバーセプト（Ａｆｉｂｅｒｃｅｐｔ）（ＶＥＧＦトラップ）、ＩＭＣ−１１２１Ｂ（ラムシルマブ）、イマチニブ（グリベック）、ソラフェニブ（ネクサバール）、ゲフィチニブ（イレッサ）、スニチニブ（スーテント）、エルロチニブ、チボジニブ（Ｔｉｖｏｚｉｎｉｂ）、セディラニブ（レセンチン（Ｒｅｃｅｎｔｉｎ））、パゾパニブ（ヴォトリエント）、ＢＩＢＦ１１２０（バルガテフ（Ｖａｒｇａｔｅｆ））、ドビチニブ（Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ）、セマクサニブ（スーゲン（Ｓｕｇｅｎ））、アキシチニブ（ＡＧ０１３７３６）、バンデタニブ（ザクチマ（Ｚａｃｔｉｍａ））、ニロチニブ（タシグナ（Ｔａｓｉｇｎａ））、ダサチニブ（スプリセル）、バタラニブ、モテサニブ、ＡＢＴ−８６９、ＴＫＩ−２５８またはそれらの組合せが包含される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記アンジオポエチン‐ＴＩＥ２経路阻害剤に、ＡＭＧ−３８６、ＰＦ−４８５６８８４ＣＶＸ−０６０、ＣＥＰ−１１９８１、ＣＥ−２４５６７７、ＭＥＤＩ−３６１７、ＣＶＸ−２４１、トラスツズマブ（ハーセプチン）またはそれらの組合せが包含される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記内在性血管形成阻害剤に、トンボスポンジン（Ｔｈｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）、エンドスタチン、タムスタチン、カンスタチン（Ｃａｎｓｔａｔｉｎ）、アレスチン、アンギオスタチン、バソスタチン、インターフェロンαまたはそれらの組合せが包含される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫調節剤に、サリドマイドおよびレナリドマイドまたはそれらの組合せが包含される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
対象を、抗血管形成治療薬に反応する癌を有している、または抗血管形成治療薬に反応する癌を発生しやすいと診断する方法であって、
発現シグネチャによって定められるバイオマーカーの発現レベルを前記対象から得た疾患組織の検査試料において測定して試料発現スコアを決定すること、
前記試料発現値を閾値スコアと比較すること、および
前記発現スコアが前記閾値スコアより上回るかまたは下回るかに基づいて、前記対象を応答性または非応答性であると分類すること、を含む前記方法。
【請求項２５】
前記癌が卵巣癌または神経膠芽腫である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記基準発現値が、各バイオマーカーの発現値を計算し、前記発現シグネチャによって決定される各バイオマーカーの対応するウェイトによって前記発現値を乗算することにより決定される、請求項２４〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記発現シグネチャを、
疾患組織の試料セットから全ＲＮＡを単離すること、
前記の単離された全ＲＮＡをマイクロアレイにハイブリダイズして試料発現値セットを得ること、
定義した有意性閾値を越えるばらつきを有する前記マイクロアレイ上のプローブを選択して予備的なバイオマーカーセットを形成すること、
前記の予備的なバイオマーカーセット内で同様の発現プロファイル有するバイオマーカーからなるクラスターを、クラスタリングアルゴリズムを使用して形成すること、
生物学的プロセスまたは生物学的経路をバイオマーカーの各クラスターについて特定すること、
目的の前記の生物学的プロセスまたは生物学的経路に対応するクラスターを選択すること、および
教師あり学習アルゴリズムまたは教師なし学習アルゴリズムを使用して、癌の前記試料セット内の前記の選択されたクラスターにおける前記バイオマーカーの発現レベルを分析することにより、発現シグネチャを得ることを含む方法であって、前記の発現値が、バイオマーカー、各バイオマーカーに対応するウェイトおよび前記基準発現値からなるセットを定める方法
によって得る、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記マイクロアレイが、癌組織に由来するＲＮＡ転写物を単離および配列決定し、前記の単離されたＲＮＡ転写物の配列を既知のＲＮＡ転写物配列に対して交差検定することにより、前記癌組織の試料セットにおいて発現していると検証されたＲＮＡ転写物に結合するプローブセットを含むトランスクリプトームアレイである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記プローブセットが各ＲＮＡ転写物の３’末端から３００ヌクレオチド以内に結合するプローブを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＲＮＡ転写物が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、オルタナティブスプライシングを受けたｍＲＮＡ、リボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）およびアンチセンスＲＮＡを包含する、コード転写物および非コード転写物を含む、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記発現シグネチャが、ＰＬＳ分類器、ＳＶＭ分類器、ＳＤＡ分類器、またはＤＳＤＡ分類器を使用して定められる、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記発現シグネチャがＰＬＳ分類器を使用して定められる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記発現シグネチャが表１Ａまたは表１Ｂからの２つ以上の遺伝子を含む、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記発現シグネチャが表２Ａまたは表２Ｂからの２つ以上の遺伝子を含む、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記発現シグネチャが、グループＩまたはグループＩＩの配列を含む２つ以上の遺伝子を含む、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記発現シグネチャがＡＬＰＫ２、ＢＧＮ、ＣＯＬ８Ａ１、ＦＡＰ、ＦＮ１、ＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＡ５、ＬＯＸＬ１、ＬＵＭ、ＭＩＲ１２４５、ＭＭＰ２、ＮＫＤ２、ＰＬＡＵ、ＲＡＢ３１、ＳＦＲＰ２、ＴＨＢＳ２、ＴＩＭＰ３、ＶＣＡＮを含む、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記発現シグネチャが表２Ａに記載される遺伝子を含む、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記発現シグネチャが表２Ｂに記載される遺伝子を含む、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記発現シグネチャがグループＩまたはグループＩＩの配列を含む遺伝子を含む、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記発現シグネチャがＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＴＨＢＳ２、ＳＦＲＰ２およびＰＬＡＵを含む、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗血管形成治療薬が、ＶＥＧＦ経路標的化治療薬、アンジオポエチン‐ＴＩＥ２経路阻害剤、内在性血管形成阻害剤および免疫調節剤である、請求項２４〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＶＥＧＦ経路標的化治療薬に、ベバシズマブ（アバスチン）、アフィバーセプト（Ａｆｉｂｅｒｃｅｐｔ）（ＶＥＧＦトラップ）、ＩＭＣ−１１２１Ｂ（ラムシルマブ）、イマチニブ（グリベック）、ソラフェニブ（ネクサバール）、ゲフィチニブ（イレッサ）、スニチニブ（スーテント）、エルロチニブ、チボジニブ（Ｔｉｖｏｚｉｎｉｂ）、セディラニブ（レセンチン（Ｒｅｃｅｎｔｉｎ））、パゾパニブ（ヴォトリエント）、ＢＩＢＦ１１２０（バルガテフ（Ｖａｒｇａｔｅｆ））、ドビチニブ（Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ）、セマクサニブ（スーゲン（Ｓｕｇｅｎ））、アキシチニブ（ＡＧ０１３７３６）、バンデタニブ（ザクチマ（Ｚａｃｔｉｍａ））、ニロチニブ（タシグナ（Ｔａｓｉｇｎａ））、ダサチニブ（スプリセル）、バタラニブ、モテサニブ、ＡＢＴ−８６９およびＴＫＩ−２５８が包含される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記アンジオポエチン‐ＴＩＥ２経路阻害剤に、ＡＭＧ−３８６、ＰＦ−４８５６８８４ＣＶＸ−０６０、ＣＥＰ−１１９８１、ＣＥ−２４５６７７、ＭＥＤＩ−３６１７、ＣＶＸ−２４１、トラスツズマブ（ハーセプチン）が包含される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記内在性血管形成阻害剤に、トンボスポンジン（Ｔｈｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）、エンドスタチン、タムスタチン、カンスタチン（Ｃａｎｓｔａｔｉｎ）、アレスチン、アンギオスタチン、バソスタチン、インターフェロンαが包含される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記免疫調節剤にサリドマイドおよびレナリドマイドが包含される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
癌を有する対象の予後を決定する方法であって、
発現シグネチャによって定義される１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを、前記対象から得た疾患組織の検査試料において測定して試料発現スコアを決定すること、
前記試料発現スコアを閾値発現スコアと比較すること、および
前記試料発現スコアが前記閾値発現スコアより上回るかまたは下回るかに基づいて、前記対象を応答性または非応答性であると分類すること、を含む方法。
【請求項４７】
前記疾患組織が癌組織である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記癌が卵巣癌，神経膠芽腫または乳癌である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記試料発現値が、各バイオマーカーの発現レベルを測定し、前記発現シグネチャによって決定される各バイオマーカーの対応するウェイトによって前記発現レベルを乗算することにより決定される、請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記発現シグネチャを、
疾患組織の試料セットから全ＲＮＡを単離すること、
前記の単離された全ＲＮＡをマイクロアレイにハイブリダイズして試料発現データセットを得ること、
定義した有意性閾値を越えるばらつきを有する前記マイクロアレイ上のプローブを選択して予備的なバイオマーカーセットを形成すること、
前記の予備的なバイオマーカーセット内で同様の発現プロファイル有するバイオマーカーからなるクラスターを、クラスタリングアルゴリズムを使用して形成すること、
生物学的プロセスまたは生物学的経路をバイオマーカーの各クラスターについて特定すること、
目的の前記の生物学的プロセスまたは生物学的経路に対応するクラスターを選択すること、および
教師あり学習アルゴリズムまたは教師なし学習アルゴリズムを使用して、疾患組織の前記試料セット内の前記の選択されたクラスターにおける前記バイオマーカーの発現レベルを分析することにより、発現シグネチャを定義すること、を含む方法によって得る、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記マイクロアレイが、検査試料セットに由来するＲＮＡ転写物を単離および配列決定し、前記の単離されたＲＮＡ転写物の配列を既知のＲＮＡ転写物配列に対して交差検定することにより、前記検査試料セットにおいて発現していると検証されたＲＮＡ転写物に結合するプローブセットを含むトランスクリプトームアレイであり、前記検査試料セットは患者検査試料と同じ組織を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記プローブセットが各ＲＮＡ転写物の３’末端から３００ヌクレオチド以内に結合するプローブを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ＲＮＡ転写物が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、オルタナティブスプライシングを受けたｍＲＮＡ、リボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）およびアンチセンスＲＮＡを包含する、コード転写物および非コード転写物を含む、請求項５０〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記発現シグネチャが、ＰＬＳ分類器、ＳＶＭ分類器、ＳＤＡ分類器、またはＤＳＤＡ分類器を使用して定められる、請求項５０〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記発現シグネチャがＰＬＳ分類器を使用して定められる、請求項４６〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記発現シグネチャが表１Ａまたは表１Ｂからの２つ以上の遺伝子を含む、請求項４６〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記発現シグネチャが表２Ａまたは２Ｂからの２つ以上の遺伝子を含む、請求項４６〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記発現シグネチャが、配列番号６３２〜８０１（グループＩ）または配列番号８０２〜９７４（グループＩＩ）の配列を含む２つ以上の遺伝子を含む、請求項４６〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記発現シグネチャがＡＬＰＫ２、ＢＧＮ、ＣＯＬ８Ａ１、ＦＡＰ、ＦＮ１、ＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＡ５、ＬＯＸＬ１、ＬＵＭ、ＭＩＲ１２４５、ＭＭＰ２、ＮＫＤ２、ＰＬＡＵ、ＲＡＢ３１、ＳＦＲＰ２、ＴＨＢＳ２、ＴＩＭＰ３、ＶＣＡＮを含む、請求項４６〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記発現シグネチャが表２Ａに記載される遺伝子を含む、請求項４６〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記発現シグネチャが表２Ｂに記載される遺伝子を含む、請求項４６〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記発現シグネチャがグループＩまたはグループＩＩの配列を含む遺伝子を含む、請求項４６〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記発現シグネチャがＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＴＨＢＳ２、ＳＦＲＰ２およびＰＬＡＵを含む、請求項４６〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記抗血管形成治療薬がＶＥＧＦ経路標的化治療薬、アンジオポエチン‐ＴＩＥ２経路阻害剤、内在性血管形成阻害剤および免疫調節剤である、請求項４６〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＶＥＧＦ経路標的化治療薬に、ベバシズマブ（アバスチン）、アフィバーセプト（Ａｆｉｂｅｒｃｅｐｔ）（ＶＥＧＦトラップ）、ＩＭＣ−１１２１Ｂ（ラムシルマブ）、イマチニブ（グリベック）、ソラフェニブ（ネクサバール）、ゲフィチニブ（イレッサ）、スニチニブ（スーテント）、エルロチニブ、チボジニブ（Ｔｉｖｏｚｉｎｉｂ）、セディラニブ（レセンチン（Ｒｅｃｅｎｔｉｎ））、パゾパニブ（ヴォトリエント）、ＢＩＢＦ１１２０（バルガテフ（Ｖａｒｇａｔｅｆ））、ドビチニブ（Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ）、セマクサニブ（スーゲン（Ｓｕｇｅｎ））、アキシチニブ（ＡＧ０１３７３６）、バンデタニブ（ザクチマ（Ｚａｃｔｉｍａ））、ニロチニブ（タシグナ（Ｔａｓｉｇｎａ））、ダサチニブ（スプリセル）、バタラニブ、モテサニブ、ＡＢＴ−８６９、ＴＫＩ−２５８またはそれらの組合せが包含される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記アンジオポエチン‐ＴＩＥ２経路阻害剤に、ＡＭＧ−３８６、ＰＦ−４８５６８８４ＣＶＸ−０６０、ＣＥＰ−１１９８１、ＣＥ−２４５６７７、ＭＥＤＩ−３６１７、ＣＶＸ−２４１、トラスツズマブ（ハーセプチン）またはそれらの組合せが包含される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記内在性血管形成阻害剤に、トンボスポンジン（Ｔｈｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）、エンドスタチン、タムスタチン、カンスタチン（Ｃａｎｓｔａｔｉｎ）、アレスチン、アンギオスタチン、バソスタチン、インターフェロンαまたはそれらの組合せが包含される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記免疫調節剤にサリドマイドおよびレナリドマイドまたはそれらの組合せが包含される、請求項６４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本発明は、２０１１年６月２日に提出された米国特許仮出願第６１／４９２，４８８号の優先権による利益を主張する。その仮出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、様々な解剖学的部位に由来する癌の診断に有用な、血管形成に関連する共通のサブタイプの使用を含む分子的診断検査に関する。本発明は、遺伝子発現レベルに基づく遺伝子分類モデルの導出を含む。１つの用途は複数のクラスの癌治療薬への応答の層別化とそれらの癌治療薬に適した患者の選択であり、そうして、患者の治療選択を導くことである。別の用途は、癌患者の抗血管形成治療薬に応答する患者と応答しない患者への層別化である。本発明は、新規治療薬の治験評価の際に治療選択ならびに濃縮戦略のための患者群の選択を導くことができる検査を提供する。本発明は、卵巣癌、乳癌および神経膠芽腫を含むある特定の癌の予後指標として用いることができる。血管形成サブタイプは、新鮮／凍結（ＦＦ）患者サンプルまたはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）患者サンプルに基づいて特定することができる。
【背景技術】
【０００３】
製薬産業は、現在投与されている薬品よりも効果的で、特異的で、または悪性の副作用がほとんどない新しい薬品治療オプションを常に探求している。多くの開発された薬品の効果にかなりの差異がヒト集団の遺伝的ばらつきによって生じるため、代替の薬物療法が常に開発されている。それ故、多種多様な薬物治療法オプションが現在のところ利用可能ではあるが、患者が応答できずにいる事例ではより多くの治療法が常に必要となる。
【０００４】
伝統的に、医師が用いる治療パラダイムは、疾患の治療に可能な最高の成功率を生じる最良の薬物治療法を処方することである。その最良の薬物治療法が有効でない場合に、代替の薬物治療法が処方される。このパラダイムは明らかにある特定の疾患には最良の治療方法ではない。例えば、癌のような疾患では、第一の治療は、多くの場合、最も重要であり、治療が成功する最良の機会を提供し、そのため、その特定の患者の疾患に対して最も効果的である最初の薬品を選択する高い必要性がある。
【０００５】
卵巣癌は西洋諸国において全ての婦人科系の癌のなかで主要な死因である。この高い死亡率はほとんどの患者が進行期に診断されることに起因する。上皮性卵巣癌（ＥＯＣ）は、卵巣悪性腫瘍の９０％を構成し、漿液性サブタイプ、粘液性サブタイプ、類内膜性サブタイプ、明細胞性サブタイプ、移行性サブタイプ、混合性サブタイプ、および未分化性サブタイプを含む明確な組織学的区分に分類される。これらの異なる組織構造は異なる原因論から生じることの証拠が増えつつある。近年、上皮性卵巣癌を分類するために用いられる方法論の進歩があった (McCluggage, W.G. “Morphological subtypes of ovarian carcinoma: a review with emphasis on new developments and pathogenesis,” PATHOLOGY 2011 Aug;43(5):420-32)。このことの結果の１つは、以前なら類内膜性と分類されただろう多くの腫瘍が現在では漿液性と分類されていることである。
【０００６】
現行の卵巣癌の標準的な治療法は減量手術および標準プラチナタキサン系細胞傷害性化学療法である。しかしながら、全ての患者がこれに応答する訳ではなく、応答する患者のうち約７０％が再発を経験する。組織学的分類または分子的分類に基づく卵巣癌に対する特異的な標的化治療法は未だ市場に届いていない。他の種類の癌についても同様に、適切な細胞傷害性化学療法剤を選択する正確な方法は未だ無い。
【０００７】
マイクロアレイと分子的ゲノミクスの出現は、疾患についての診断能力と予後分類に対して著しい影響を与える可能性が有り、それらは所定の治療計画に対する個々の患者の応答の予測を補助することができる。マイクロアレイは多量の遺伝情報を分析し、それによって個体の遺伝的フィンガープリントを提供する。この技術が究極的にはカスタムメイド薬物治療計画のために必要なツールを提供するという大きな熱意が存在する。
【０００８】
現在、医療専門家は、化学療法剤から利益を得るだろう癌患者を特定するのに役立つ機構をほとんど持っていない。最適で最良の薬品の特定は、どの薬品が特定の癌の生理にとって最も効果的であるか正確に予測するために利用できる方法が無いため、難しい。この欠陥のため、単一薬剤奏効率が比較的に貧弱になり、癌罹患率と死が増える。さらに、患者は、多くの場合、効果が無い有毒な薬物治療を不必要に受ける。
【０００９】
血管形成は腫瘍の血管新生の主要な構成要素であり、そして、腫瘍形成と転移に必須である。したがって、血管形成は治療介入の主要な領域であり、そして予後不良と生存率の低下と関連づけられている。このことが血管形成に関連のプロセスと経路を標的とする、売れ行きトップのＦＤＡ認可抗血管形成治療薬であるジェネンテック社／ロッシュ社製のベバシズマブ（アバスチン）を含む、多数の薬剤の開発を推し進めてきている。
【００１０】
ベバシズマブを含む治療計画は広範囲の臨床活性を示している１〜１０。しかしながら、ほとんどの癌で、ベバシズマブを細胞傷害性化学療法に加えた後に全生存期間（ＯＳ）ベネフィットが示されていない８、１２〜１３。このことは、腫瘍のかなりの部分がＶＥＧＦ遮断（ベバシズマブの作用機序）に最初から抵抗性であるか、それへの抵抗性を急速に発生させることを示唆している。実際には、卵巣癌患者の２１％、腎臓癌患者の１０％および直腸癌患者の３３％がベバシズマブ単一療法を受けると部分的な軽減を示し、このことは、ベバシズマブは小部分群の患者では活性がある場合があるが、そのような漸進的な利益は非選択的な患者では有意に達しないことを示唆する。したがって、ベバシズマブに応答的なバイオマーカーを使用すれば治療結果の評価が改善することとなり、そうして、ベバシズマブ治療から最も多く臨床的利益を受けるだろう患者の部分群の特定を可能にする。このことは、転移性乳癌の場合には特に妥当であるが、転移性乳癌の場合では臨床的に有益なバイオマーカーの欠如がベバシズマブの使用を減少させてきた。これまで、ベバシズマブの効力を予測するために臨床的に検証されているそのようなバイオマーカーは無い。高血圧およびＶＥＧＦの多型がこれまでで可能性を示す唯一のバイオマーカーであるが、臨床の現場ではそれらの使用について重大な疑問が残っている。
【００１１】
抗血管形成治療法の別のアプローチは、ＶＥＧＦ経路の選択的標的化よりもむしろ複数の血管形成経路の同時標的化である。理論的には、複数標的性抗血管形成剤はベバシズマブなどの薬剤よりも完全に血管形成を阻害し、そうしてより高い治療効果をもたらすことができる。いくつかの腫瘍では、血管形成は疾患の初期のステージでのみＶＥＧＦを必要とする場合があるが、その疾患が進行するにつれその他の血管形成経路によって血管形成が推進されることが主張されている。それ故、複数の経路を標的とすることにより、ＶＥＧＦ阻害に対する抵抗性を引き起こし得る補償的回避機構に対抗することが可能である場合がある。
【００１２】
他の種類の癌については、どの患者が抗血管形成治療薬または単一薬剤による抗血管形成治療法を用いる標準治療に応答し、または応答しないか患者を選択する正確な方法はまだ無い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
それ故、標準治療と組み合わせるか、単一薬剤治療法としての抗血管形成治療薬への予測される患者の応答に基づく患者の層別化を容易にするだろう分子的診断検査が必要な事である。これによれば代替的な治療法を受けるべき患者の迅速な特定が可能になるだろう。そのような分子的診断検査は様々な種類の癌にわたって十分な精度をもって治療応答性を予測するだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
転写物のうちのいくつか、または全てが過剰発現または過小発現しているとき、それらが血管形成に関連する分子的シグナル伝達の発現上昇を有する癌のサブタイプを特定するような、癌において発現するバイオマーカーのコレクションを使用する方法が開示される。本発明は抗血管形成剤への応答性または非応答性を示すための方法も提供する。異なる態様では、このバイオマーカーのコレクションは、マイクロアレイ、Ｑ‐ＰＣＲ、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、またはｍＲＮＡの発現もしくはタンパク質の発現を定量することができる他の技術などの当技術分野において公知の方法を用いて実施され得る単一パラメータ性予測試験または多重パラメータ性予測試験の基盤を形成することができる。
【００１５】
さらに、本明細書に記載される癌のサブタイプは多くの種類の癌に共通であり、単一の種類の癌疾患に限定されない。それ故、本明細書において開示される発現シグネチャは様々な組織の様々な種類の癌にわたって癌治療薬の応答性または非応答性を予測するために使用することができる。本発明の１つの実施形態では、これらのバイオマーカーは抗血管形成治療薬への癌腫瘍の応答性の評価に有用である。１つの例示的な実施形態では、癌は卵巣癌である。別の例示的な実施形態では、癌は神経膠芽腫である。別の例示的な実施形態では、癌は乳癌である。
【００１６】
本明細書に記載される発明はいずれか１つの薬品に限定されず、直接的または間接的に血管形成プロセスに影響する、またはそれを標的とする現在使用中の、開発中および新規の一連の薬品のうちのいずれかに応答するものおよび応答しないものを特定するために使用することができる。１つの実施形態では、本発明はアジュバント療法またはネオアジュバント療法のベバシズマブまたはダサタニブ（ｄａｓａｔａｎｉｂ）を単一薬剤として、または標準治療法と組み合わせて評価するために使用することができる。別の実施形態では、本発明は卵巣癌のアバスチン治療、ＶＥＧＦ‐ＴＲＡＰ治療を評価するために使用することができる。
【００１７】
本発明は、全生存期間、無増悪生存、ＲＥＣＩＳＴによって定義される放射線治療応答、完全応答、部分応答、安定している疾患ならびに、限定されないが、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５‐３およびＣＡ１９‐９のような血清学的マーカーなど、少なくとも１０または最大で１０の異なる応答分類を用いる薬品への応答の予測に関する。ある特定の実施形態では、本発明は、卵巣癌、乳癌および神経膠芽腫での生存を評価するために使用することができる。
【００１８】
別の態様では、本発明は癌における血管形成サブタイプの特定に関する。そのサブタイプはある特定のバイオマーカーの発現レベルを測定することにより検出することができる。発現シグネチャは、抗血管形成剤に対して応答的または非応答的である種類の癌がバイオマーカーの発現によって予測される、そのバイオマーカーの集合を明らかにする。ある特定の例示的な実施形態では、発現シグネチャは、表１Ａおよび１Ｂに記載されるバイオマーカーから選択される２つ以上のバイオマーカーを含む。別の例示的な実施形態では、発現シグネチャは、配列番号６３２〜８０１（グループＩ）または配列番号８０２〜９７４（グループＩＩ）の配列から選択される２つ以上のバイオマーカーを含む。別の例示的な実施形態では、発現シグネチャは、表２Ａおよび２Ｂに記載されるバイオマーカーから選択される２つ以上のバイオマーカーを含む。別の例示的な実施形態では、発現シグネチャは、表２Ａおよび２Ｂに記載されるバイオマーカーならびにＰＬＳ分類器を使用して決定されるそれらに対応するウェイトを含む。
【００１９】
別の態様では、本発明は、ｑＰＣＲ、マイクロアレイ、ならびに免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどのような免疫アッセイなど、上で記載した従来の診断用途のためのキットに関する。そのようなキットには、遺伝子または遺伝子産物の発現をアッセイするための、およびｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を定量するための適切な試薬および指示書が含まれる。
【００２０】
血管形成の表現型を持つ、または持たないヒトの腫瘍を特定するための方法も開示される。ある特定の例示的な実施形態では、そのような方法は、血管形成に関連するプロセスを直接的または間接的に阻害する薬品に感受性であり、それに応答する患者を特定するために使用することができる。ある特定の他の例示的な実施形態では、そのような方法は、血管形成に関連するプロセスを直接的または間接的に阻害する薬品に抵抗性であり、またはそれに応答しない患者を特定するために使用することができる。
【００２１】
別の態様では、本発明はある種の癌における予後指標として使用することができる。１つの例示的な実施形態では、癌は卵巣癌である。別の例示的な実施形態では、癌は乳癌である。さらに別の例示的な実施形態では、癌は神経膠芽腫である。
【００２２】
本発明は、患者の効果的な治療のガイドにも関する。さらに、患者の治療計画の選択、および血管形成に直接的または間接的に影響する現行の薬品または開発段階の薬品の臨床試験のための患者の選択に関する方法が提供される。
【００２３】
さらに、保管されているホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検材料ならびに新鮮／凍結（ＦＦ）組織の使用を全ての転写物のアッセイについて受け入れ、そのため、最も広範に入手可能な種類の生検材料に適合する方法が本明細書に記載される。バイオマーカー発現レベルは、ＦＦＰＥ組織、新鮮凍結組織またはＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）などの溶液に保存されていた新鮮組織から得られたＲＮＡを使用して決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】アルマック・ダイアグノスティクス社（Ａｌｍａｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の上皮性卵巣癌サンプルセットの１９９種の漿液性試料にわたって最も変動する遺伝子の階層的凝集型クラスター分析を表すヒートマップを提供する。プローブセットクラスターの機能分析はイメージの右側に要約されている。イメージの上にあるキャプションは、分類器形成のために各試料が割り当てられている分類器群（すなわち、クラスラベル）を示す。
【００２５】
【図２Ａ】上皮性卵巣癌トレーニングセット内の１９９種の漿液性のみの試料中の血管形成プローブセットクラスターの、機能性濃縮解析を用いる機能分析の結果を表す。トップ１０の濃縮化遺伝子オントロジー生物学的プロセスの有意度を表すヒストグラムを示す。赤色のバーは偽陽性率の補正の後の０．０５のｐ値でのプロセスの有意度を示す。
【図２Ｂ】上皮性卵巣癌トレーニングセット内の１９９種の漿液性のみの試料中の血管形成プローブセットクラスターの、機能性濃縮解析を用いる機能分析の結果を表す。プロセスがクラスター３内のプローブセットがコードする１つ以上の遺伝子を含む場合の遺伝子オントロジー生物学的プロセスツリーの部分集合を表す。赤で色付けされたプロセスは、偽陽性率の補正の後の０．０５のｐ値でのそのプロセスの有意度を示す。黒で色づけられたプロセスは、クラスター３内のプローブセットによってコードされるが有意ではない１つ以上の遺伝子を含む。
【００２６】
【図３】血管形成に関連する分子的サブタイプを特定する代表的な２５遺伝子の発現シグネチャ内の遺伝子の機能性濃縮の結果を表す。赤色のバーは偽陽性率の補正の後の０．０５のｐ値でのプロセスの有意度を示す。
【００２７】
【図４】先行治療を受けていない、高悪性度の神経膠芽腫を有する患者からの (Phillips HS, Kharbanda S, Chen R, Forrest WF et al. “Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis,” CANCER CELL 2006 Mar;9(3):157-73. PMID: 16530701、Costa BM, Smith JS, Chen Y, Chen J et al. “Reversing HOXA9 oncogene activation by PI3K inhibition: epigenetic mechanism and prognostic significance in human glioblastoma,” CANCER RES 2010 Jan 15;70(2):453-62. PMID: 20068170) 、最初の外科的切除の後の無再発生存率についての カプラン・マイヤー曲線を提供する。
【００２８】
【図５】ダサタニブ（Ｄａｓａｔａｎｉｂ）を使用する処置後の１６種の前立腺細胞株内での代表的な２５遺伝子の分類器からなるモデルの分類性能についてのＲＯＣ曲線の図表を提供する。ＡＵＣはその分類器モデルの適用の後で約０．８４である。９５％信頼限界は１０００回のブートストラップ反復法を用いて決定された (Wang XD, Reeves K, Luo FR, Xu LA et al. “Identification of candidate predictive and surrogate molecular markers for dasatinib in prostate cancer: rationale for patient selection and efficacy monitoring,” GENOME BIOL 2007;8(11):R255. PMID: 18047674)。
【００２９】
【図６】更新された病理学的分類基準に従って再分類された上皮性卵巣癌サンプルセットの２６５種の漿液性試料にわたって最も変動する遺伝子の階層的凝集型クラスター分析を表すヒートマップを提供する。プローブセットクラスターの機能分析はイメージの右側に要約されている。イメージの上にあるキャプションは、分類器形成のために各試料が割り当てられている分類器群（すなわち、クラスラベル）を示す。
【００３０】
【図７Ａ】機能性濃縮ツール（ＦＥＴ）アルゴリズムを用いた、上皮性卵巣癌トレーニングセットにおける２６５種の漿液性のみの試料の血管形成プローブセットの機能分析の結果を表す。トップ１０の濃縮化遺伝子オントロジー生物学的プロセスの有意度を表すヒストグラムを示す。赤色のバーは偽陽性率の補正の後の０．０５のｐ値でのプロセスの有意度を示す。
【図７Ｂ】機能性濃縮ツール（ＦＥＴ）アルゴリズムを用いた、上皮性卵巣癌トレーニングセットにおける２６５種の漿液性のみの試料の血管形成プローブセットの機能分析の結果を表す。プロセスがクラスター２（血管形成）内のプローブセットがコードする１つ以上の遺伝子を含む場合の遺伝子オントロジー生物学的プロセスツリーの部分集合を表す。赤で色付けされたプロセスは、偽陽性率の補正の後の０．０５のｐ値でのそのプロセスの有意度を示す。黒で色づけられたプロセスは、血管形成クラスター内のプローブセットによってコードされるが有意ではない１つ以上の遺伝子を含む。
【００３１】
【図８】血管形成に関連する分子的サブタイプを特定する代表的な４５遺伝子分類器モデル内の遺伝子の機能性濃縮の結果を表す。赤色のバーは偽陽性率の補正の後の０．０５のｐ値でのプロセスの有意度を示す。
【００３２】
【図９】ダサタニブ（Ｄａｓａｔａｎｉｂ）を使用する処置後の１６種の前立腺細胞株内での４５遺伝子の分類器からなるモデルの分類性能についてのＲＯＣ曲線の図表を提供する。ＡＵＣはその分類器モデルの適用の後で約０．９５である。９５％信頼限界は１０００回のブートストラップ反復法を用いて決定された。
【００３３】
【図１０】更新された病理学的分類基準に従って再分類された上皮性卵巣癌サンプルセットの２６５種の漿液性試料にわたって最も変動する遺伝子の階層的凝集型クラスター分析を表すヒートマップを提供する。プローブセットクラスターの機能分析はイメージの右側に要約されている。イメージの上にあるキャプションは、非血管形成群分類器または非応答群分類器の形成のために各試料が割り当てられている分類器群を示す。
【００３４】
【図１１】再分類された卵巣サンプルセット内の非血管形成試料群（図３ａ、試料クラスター１）と血管形成試料群（図１０、試料クラスター２および３）の（数週間の）無増悪生存についてのカプラン・マイヤー曲線を提供する。
【００３５】
【図１２Ａ】乳癌サンプルセットの５１種のＥＲ陰性試料にわたって最も変動する遺伝子の階層的凝集型クラスター分析を表すヒートマップを提供する。プローブセットクラスターの機能分析は、脈管構造の発生／血管形成または免疫応答／ＩＦＮシグナル伝達を示すクラスターの画像の右側に要約されている。
【図１２Ｂ】乳癌サンプルセットの５６種のＥＲ陽性試料にわたって最も変動する遺伝子の階層的凝集型クラスター分析を表すヒートマップを提供する。プローブセットクラスターの機能分析は、脈管構造の発生／血管形成または免疫応答／ＩＦＮシグナル伝達を示すクラスターの画像の右側に要約されている。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
配列表
添付の配列表に記載される核酸配列およびアミノ酸配列は、米国特許規則§１．８２２において定義されるとおり、ヌクレオチド塩基を表す標準的な略字を用いて示される。各核酸配列の１本の鎖だけが示されているが、提示されている鎖へのどのような参照によっても、相補鎖が含まれるものと理解される。
【００３７】
配列表は、２０１２年６月４日に作成され、サイズは３５２，８３９バイトであり、ＡＤＬ＿０８０１ＷＰ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称のファイルの形式でＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出される。そのファイルは参照により本明細書に組み込まれる。
【００３８】
本発明の詳細な説明
別途定義されない限り、本明細書において使用されている技術用語および科学用語は、この開示が属する分野の当業者が共通して理解するものと同じ意味を有する。分子生物学における一般的な用語の定義は、Jones and Bartlet社が 2008年に出版のBenjamin Lewin, Genes IX, (ISBN 0763752223)、Blackwell Science Ltd.社が1994年に出版のKendrew et al. (編), The Encyclopedia of Molecular Biology, (ISBN 0632021829)、VCH Publishers, Inc. 社が1995年に出版のRobert A. Meyers (編), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, (ISBN 9780471185710)、Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第２版, J. Wiley & Sons社 (New York, N.Y. 1994), および March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure第４版, John Wiley & Sons社 (New York, N.Y. 1992)内に見出すことができる。
【００３９】
単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別途文脈から明確に示されない限り、複数の指示物を包含する。同様に、「または」という単語は、別途文脈から明確に示されない限り、「および」を包含するものと考えている。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は「包む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」を意味する。対立する場合は、用語の説明を含む本明細書が制御を行う。
【００４０】
本明細書において使用される場合、「マーカーパネル」、「発現分類器」、「分類器」、「発現シグネチャ」、または「シグネチャ」という用語は互換的に使用することができる。
【００４１】
本願において引用されている全ての刊行物、特許公開文書、および特許出願は、本願が関連する分野の技術レベルを示すものである。本明細書において引用されている全ての刊行物、特許公開文書、および特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許公開文書、および特許出願が特定的および個別に参照により組み込まれると示されたかのように、それと同じ程度で参照によりここに組み込まれる。
【００４２】
大要
癌分野での本研究努力の主要な目標は、分子的パラメータを臨床治療の決定に組み込むことにより、患者における周術期の全身性治療法の効力を増加させることである。薬理遺伝学／ゲノミクスは外来の化合物または薬品に対する個体の応答に関与する遺伝的要因／ゲノム的要因についての研究である。本発明のバイオマーカーの発現に対する促進効果または阻害効果を有する薬剤または修飾因子は、個体に投与されて患者の癌を処置（予防的または治療的に）することができる。そのような処置と併せて個体の薬理ゲノミクスを考慮することも理想である。おそらく治療薬の代謝の差によって、その薬理学的に活性がある薬品の用量と血中濃度の間の関係を変化させることにより、重大な中毒性か治療不全が引き起こされる可能性がある。したがって、個体の薬理ゲノミクスを理解することにより予防処置または治療処置のために効果的な薬剤（例えば、薬品）の選択が可能になる。そのような薬理ゲノミクスは、適切な投薬量および治療計画を決定するためにさらに使用することができる。したがって、個体における本発明のバイオマーカーの発現レベルは、それによりその個体の治療処置または予防処置のために適切な薬剤を選択すると判断することができる。
【００４３】
本発明は、様々な解剖学的部位に由来する癌の診断に有用な、血管形成に関連する共通のサブタイプの使用を含む分子的診断検査に関する。本発明は、対象が抗血管形成治療薬に対して応答的または非応答的であると特定する発現シグネチャを含む。その発現シグネチャは、病状および／または臨床転帰が知られているサンプルセットに由来する試料の発現プロファイルを得ることにより、得られる。その試料は同じ種類の試料組織または異なる種類の組織に由来してよい。本明細書において使用される場合、「発現プロファイル」は所与の試料から分析した各バイオマーカーの発現レベルを表す値の集合を含む。
【００４４】
サンプルセットの発現プロファイルは次に数理モデルを使用して分析される。様々な数理モデルを適用することができ、それには、パターン認識 (Duda et al. Pattern Classification, 2nd ed., John Wiley, New York 2001)、機械学習 (Schoelkopf et al. Learning with Kernels, MIT Press, Cambridge 2002, Bishop, Neural Networks for Pattern Recognition, Clarendon Press, Oxford 1995)、統計 (Hastie et al. The Elements of Statistical Learning, Springer, New York 2001)、バイオインフォマティクス (Dudoit et al., 2002, J. Am. Statist. Assoc. 97:77-87, Tibshirani et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6567-6572) または計量化学 (Vandeginste, et al., Handbook of Chemometrics and Qualimetrics, Part B, Elsevier, Amsterdam 1998) の分野のモデルが含まれるが、これらに限定されない。数理モデルにより、所与の疾患表現型を最もよく予測する、サンプルセットで発現する１つ以上のバイオマーカーが特定される。これらの１つ以上のバイオマーカーは発現シグネチャを定める。したがって、発現シグネチャには、所与の疾患表現型を最もよく予測するものとして特定されたバイオマーカーが含まれる。ある特定の例示的な実施形態では、数理モデルはそれぞれの特定されたバイオマーカーにウェイトなどの変数を定める。ある特定の例示的な実施形態では、数理モデルは決定関数を定める。その決定関数は、サンプルセットを、限定されないが、抗血管形成治療薬に対して応答的な試料および非応答的な試料など、２つの疾患表現型に分ける閾値スコアをさらに定めることができる。１つの例示的な実施形態では、その決定関数および発現シグネチャは線形分類器を用いて定められる。
【００４５】
所定の発現シグネチャを用いて新しい試料を分類するために、その発現シグネチャによって定義されるバイオマーカーを分離し、そのバイオマーカーの発現プロファイルを決定する。その新しい試料のバイオマーカーの発現プロファイルは、前記の発現シグネチャを定めるために使用したのと同じ数理モデルを用いて分析される。ある特定の例示的な実施形態では、その数理モデルは、その新しい試料の発現スコアを定める。発現スコアは、単一のスカラー値を導出するための非線形法、代数法、三角法または相関法を用い、バイオマーカーの発現値と対応するスカラーウェイトを組み合わせることにより決定することができる。発現スコアは閾値スコアと比較され、試料が抗血管形成治療薬に対して応答的または非応答的であると分類される。１つの例示的な実施形態では、基準発現値よりも大きい試料発現値が、患者が抗血管形成治療薬に対して応答的であることを示している。別の例示的な実施形態では、閾値スコアより下の試料発現スコアが、患者が抗血管形成治療薬に対して非応答的であることを示している。別の例示的な実施形態では、閾値発現スコアより下の試料発現スコアが、患者が抗血管形成治療薬対して応答的ではない１種の癌を有するか、その１種の癌を発生するリスクを有することを示している。別の例示的な実施形態では、基準発現スコアより上の試料発現スコアが、患者が抗血管形成治療薬に応答的である１種の癌を有するか、その１種の癌を発生するリスクを有することを示している。発現シグネチャが１種の癌組織を含む組織サンプルセットに由来する場合、その発現シグネチャは、同じ種類の癌の組織においてのみ同じ癌サブタイプを特定することに限定されず、同じ癌サブタイプを共有する他の種類の癌について使用することができる。例えば、発現シグネチャが卵巣癌試料に由来する場合、その発現シグネチャは、神経膠芽腫または乳癌などの異なる癌の同様の血管形成サブタイプを特定するために使用することができる。
【００４６】
本明細書において開示される発現シグネチャの１つの用途は、抗血管形成療法を網羅する複数のクラスの治療薬への応答の層別化とそれらの治療薬に適した患者の選択である。腫瘍での特定したバイオマーカーのコレクションの発現を調査することにより、どの治療薬または治療薬の組合せが癌の増殖速度を低下させる可能性が最も高いか決定することができる。どの治療薬または治療薬の組合せが癌の増殖速度を低下させる可能性が最も低いか決定することもできる。したがって、バイオマーカーの発現のコレクションを調査することにより、効果が無い治療薬または不適切な治療薬を排除することができる。重要なことに、ある特定の実施形態では、これらの決定は患者ごとに、または薬剤ごとに行うことができる。したがって、特定の治療計画が特定の患者もしくは特定の種類の患者に有益である可能性が有るかどうか、および／または特定の治療計画を継続すべきか決定することができる。本発明は、新規治療薬の治験評価の際に治療選択ならびに濃縮戦略のための患者群の選択を導くことができる検査を提供する。例えば、推定上の抗血管形成剤または抗血管形成治療計画を評価するとき、本明細書において開示される発現シグネチャおよび方法を、抗血管形成剤に対して応答的な種類の癌を有する臨床試験のための個体を選択するために用いることができる。血管形成サブタイプは、新鮮／凍結（ＦＦ）患者サンプルまたはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）患者サンプルから特定することができる。１つの例示的な実施形態では、癌の種類は卵巣癌である。別の例示的な実施形態では、癌の種類は神経膠芽腫である。さらなる例示的な実施形態では、癌の種類は乳癌である。
【００４７】
癌は、治療薬と接触していない場合のその増殖と比較して、その治療薬と接触した結果としてその癌の増殖速度が抑制される場合、その治療薬に対して「応答的」である。癌の増殖は様々な方法で測定することができる。例えば、腫瘍のサイズまたはその種類の腫瘍に適切な腫瘍マーカーの発現を測定すること。
【００４８】
癌は、治療薬と接触していない場合のその増殖と比較して、その治療薬と接触した結果としてその癌の増殖速度が抑制されない場合、または非常に低い程度でしか抑制されない場合、その治療薬に対して「非応答的」である。上述のように、癌の増殖は様々な方法、例えば、腫瘍のサイズまたはその種類の腫瘍に適切な腫瘍マーカーの発現を測定することで測定することができる。治療薬に対して非応答的である性質は非常に可変的な性質であり、様々な条件下で異なる癌で異なるレベルの所与の治療薬に対する「非応答性」を示す。さらに、非応答性の程度は、腫瘍の成長サイズ以外のその他の基準、例えば、限定されないが、患者の生活の質および転移の程度を用いて評価することができる。
【００４９】
発現シグネチャの特定
本発明の発現シグネチャは、患者サンプルセットにおいてある特定のバイオマーカーの発現プロファイルを分析することにより特定される。本発明での使用に適切なバイオマーカーには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質が含まれる。そのバイオマーカーは患者サンプルから分離され、およびそれらの発現レベルは、患者サンプルセットにおいて分析される各試料について発現プロファイルの集合を導出すると判断される。
【００５０】
ａ．発現プロファイル
ある特定の実施形態では、得られた発現プロファイルはゲノム発現プロファイルまたは核酸発現プロファイルであり、それらでは試料中の１つ以上の核酸の量またはレベルが決定されている。これらの実施形態では、診断方法または予後診断方法において使用される発現プロファイルを形成するために検定される試料は、核酸試料であるものである。その核酸試料には、核酸集団が含まれ、分析している細胞または組織の表現型決定バイオマーカーについての発現情報が含まれる。いくつかの実施形態では、その核酸には、その試料が、その試料を得た宿主細胞または組織の発現情報を保持する限り、ＲＮＡ核酸またはＤＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡなどが含まれ得る。その試料は、当技術分野において公知であるように、多種多様な方法、例えば、細胞からｍＲＮＡを単離して調製することができ、その場合、単離したｍＲＮＡを、示差的遺伝子発現の分野で知られているようにｃＤＮＡ、ｃＲＮＡなどを調製するために単離、増幅または使用するように、使用する。したがって、試料中のｍＲＮＡのレベルの決定には、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡまたはｃＲＮＡの調製およびその後のｃＤＮＡまたはｃＲＮＡの測定が含まれる。試料は通常、治療の必要がある対象から、例えば、組織生検により採取した細胞または組織から標準的なプロトコルを使用して調製し、その場合、そのような核酸を作製することができる細胞種または組織には、病気の細胞または組織、体液などを含むが、これらに限定されない、判定されるべき表現型の発現パターンが存在するあらゆる組織が含まれる。
【００５１】
最初の核酸試料からあらゆる従来のプロトコルを用いて発現プロファイルを作成することができる。示差的遺伝子発現／バイオマーカー分析の分野で用いられるものなど、発現プロファイルを作成する多種多様な方法が知られているが、発現プロファイルを作成するための１つの代表的であり、使いやすい種類のプロトコルはアレイベースの遺伝子発現プロファイル作成プロトコルである。そのような適用例は、作成するプロファイルにおいて検定される／プロファイル解析される遺伝子のそれぞれの「プローブ」核酸を示す核酸が使用されるハイブリダイゼーションアッセイである。これらのアッセイでは、標的核酸の試料はまず、アッセイされる最初の核酸試料から調製され、その場合、調製は、標識、例えば、シグナル発生系のメンバーを用いる標的核酸の標識を含み得る。標的核酸試料の調製の後、その試料をハイブリダイゼーション条件下でアレイと接触させ、それにより、アレイの表面に付着しているプローブ配列に相補的である標的核酸の間で複合体が形成される。次に、ハイブリダイズした複合体の存在が定性的または定量的に検出される。前記対象方法で用いられる発現プロファイルを作成するために実施され得る具体的なハイブリダイゼーション技術には、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，２８８，６４４号、同第５，３２４，６３３号、同第５，４３２，０４９号、同第５，４７０，７１０号、同第５，４９２，８０６号、同第５，５０３，９８０号、同第５，５１０，２７０号、同第５，５２５，４６４号、同第５，５４７，８３９号、同第５，５８０，７３２号、同第５，６６１，０２８号、同第５，８００，９９２号に記載される技術が含まれ、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれ、ならびに国際公開第９５／２１２６５号、同第９６／３１６２２号、同第９７／１０３６５号、同第９７／２７３１７号、欧州特許第３７３２０３号、および同第７８５２８０号に記載される技術が含まれる。これらの方法では、発現がアッセイされているバイオマーカーのそれぞれに対するプローブを含む、「プローブ」核酸のアレイを上述のように標的核酸と接触させる。接触をハイブリダイゼーション条件下で、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上述のよう実行し、その後、未結合の核酸を除去する。その結果のハイブリダイズした核酸のパターンが、探索されたバイオマーカーのそれぞれについての発現に関する情報を提供し、その場合、その発現情報は、その遺伝子が発現しているかどうか、および典型的には、発現データすなわち発現プロファイルが定性的且つ定量的であり得る場合には、どのレベルで発現しているかに関するものである。
【００５２】
ｂ．疾患組織および試料組織の供給源
ある特定の例示的な実施形態では、患者サンプルセットは保管試料などの癌組織試料を含む。患者サンプルセットは、予後、再発の可能性、長期生存率、臨床転帰、治療応答、診断結果、癌の分類、または個人のゲノミクスプロファイルによって特徴づけられている癌組織試料に由来することが好ましい。本明細書において使用される場合、癌には白血病、脳の癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、胃癌、大腸癌、咽喉癌、乳癌、皮膚癌、黒色腫、肺癌、肉腫、子宮頚部癌、精巣癌、膀胱癌、内分泌癌、子宮内膜癌、食道癌、神経膠腫、リンパ腫、神経芽腫、骨肉腫、膵臓癌、下垂体癌、腎臓癌などが含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、本明細書に記載される方法は、抗血管形成剤、抗血管形成性標的化治療、血管形成シグナル伝達の阻害剤を用いるが、これらのクラスに限定されないものを用いて治療される癌に関連している。これらの癌には、様々な発病段階にあるこれらの癌のサブクラスおよびサブタイプも含まれる。ある特定の例示的な実施形態では、患者サンプルセットは卵巣癌試料を含む。別の例示的な実施形態では、患者サンプルセットは乳癌試料を含む。さらに別の例示的な実施形態では、患者サンプルセットは神経膠芽腫試料を含む。
【００５３】
「生物試料」、「試料」、および「検査試料」は、個体から得られた、または他の場合では、個体に由来するあらゆる物質、体液、組織または細胞を指すために本明細書において互換的に使用される。これには血液（全血、白血球、末梢血、単核球、バフィーコート、血漿、および血清を含む）、痰、涙、粘液、鼻洗浄液、鼻吸引液、呼気、尿、精液、唾液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、滑液、関節吸引液、腹水、細胞、細胞抽出液、および脳脊髄液が含まれる。これには、前述の全ての物の実験的に分離された画分も含まれる。例えば、血液試料は血清または赤血球もしくは白血球（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ））などの特定の種類の血液細胞を含む画分に分画することができる。必要に応じて、試料は、組織および液体試料の組合せなど、個体由来の試料の組合せであり得る。「生物試料」という用語には、例えば、大便試料、組織試料、または組織生検試料などからの、ホモジェナイズした固体材料を含む材料も含まれる。「生物試料」という用語には、培養組織または培養細胞に由来する材料も含まれる。生物試料を得るためのあらゆる適切な方法を用いることができ、例となる方法には、例えば、静脈切開術、ふき取り採取（例えば、頬粘膜ふき取り採取）、および細針吸引生検法が含まれる。試料は、例えば、マイクロダイセクション（例えば、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）またはレーザーマイクロダイセクション（ＬＭＤ））、膀胱洗浄、塗抹採取（例えば、ＰＡＰ塗抹採取）、または腸管洗浄によって採取することもできる。個体から得られる、または個体に由来する「生物試料」には、その個体から得た後に任意の適切な方法、例えば、新鮮凍結またはホルマリン固定および／またはパラフィン包埋で処理されたあらゆるそのような試料が含まれる。
【００５４】
本明細書において使用される場合、「患者」という用語はヒトおよび非ヒト動物を含む。治療に好ましい患者はヒトである。「患者」および「対象」は本明細書において互換的に使用される。
【００５５】
ｃ．バイオマーカー
本明細書において使用される場合、「バイオマーカー」という用語は遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンス転写物、ｍｉＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質断片、または遺伝子発現レベルもしくはタンパク質産生レベルのどちらかを示すあらゆるその他の核酸配列もしくはポリペプチド配列を指す。バイオマーカーが個体における異常なプロセス、疾患もしくは他の健康状態の徴候を示す、またはその徴候であるとき、そのバイオマーカーは一般的に、個体の正常なプロセス、疾患の欠如もしくは他の健康状態の徴候を示す、またはその徴候であるバイオマーカーの発現レベルまたは発現値と比較して過剰発現または過小発現していると説明される。「発現上昇」、「発現上昇した」、「過剰発現」、「過剰発現した」、およびそれらのあらゆるバリエーションは、生物試料におけるバイオマーカーの値またはレベルであって、健康または正常な個体に由来する同様の生物試料において通常検出されるそのバイオマーカーの値またはレベル（または値もしくはレベルの範囲）よりも高い値またはレベルに言及するために、互換的に使用される。それらの用語は、特定の疾患の異なるステージで検出され得るバイオマーカーの値またはレベル（または値もしくはレベルの範囲）よりも高い、生物試料におけるそのバイオマーカーの値またはレベルにも関連し得る。
【００５６】
「発現低下」、「発現低下した」、「過小発現」、「過小発現した」、およびそれらのあらゆるバリエーションは、生物試料におけるバイオマーカーの値またはレベルであって、健康または正常な個体に由来する同様の生物試料において通常検出されるそのバイオマーカーの値またはレベル（または値もしくはレベルの範囲）よりも低い値またはレベルに言及するために、互換的に使用される。それらの用語は、特定の疾患の異なるステージで検出され得るバイオマーカーの値またはレベル（または値もしくはレベルの範囲）よりも低い、生物試料におけるそのバイオマーカーの値またはレベルにも関連し得る。
【００５７】
さらに、過剰発現または過小発現しているバイオマーカーは、個体の正常なプロセス、疾患の欠如もしくは他の健康状態の徴候を示す、またはその徴候であるそのバイオマーカーの「正常な」発現レベルまたは発現値と比較して、「示差的に発現している」または「示差的レベル」もしくは「示差的値」を有していると言うこともできる。したがって、バイオマーカーの「示差的発現」はそのバイオマーカーの「正常な」発現レベルからの変化と言うこともできる。
【００５８】
「示差的バイオマーカー発現」および「示差的発現」という用語は、特定の疾患を患う対象におけるバイオマーカーの発現が活性化されて、正常な対象におけるその発現と比較して、または、特定の治療法に対して異なる応答を示す患者、もしくは異なる予後を有する患者におけるその発現と比較して、高いレベルまたは低いレベルになっている、そのバイオマーカーに言及するために、互換的に使用される。それらの用語は、同じ疾患の異なるステージでバイオマーカーの発現が活性化されてより高いレベルまたはより低いレベルになっている、そのバイオマーカーにも関連する。示差的に発現するバイオマーカーは核酸レベルもしくはタンパク質レベルで活性化もしくは抑制化され得る、またはオルタナティブスプライシングの対象となって異なるポリペプチド産物を生じ得ることも理解される。そのような差異は、ｍＲＮＡレベル、ｍｉＲＮＡレベル、アンチセンス転写物レベル、またはタンパク質表面発現、ポリペプチドの分泌またはポリペプチドの他の分配を含む、様々な変化によって証明され得る。示差的バイオマーカー発現は２つ以上の遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物の間の発現の比較、または２つ以上の遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物の間の発現の比率の比較、または同じ遺伝子の２つの異なる様にプロセッシングを受けた産物の比較さえ包含することができ、それらは正常な対象と疾患を患っている対象の間、または同じ疾患の様々なステージの間で異なる。示差的発現は、例えば、正常および病気の細胞の間で、または異なる疾患事象もしくは疾患ステージを経験した細胞の間でのバイオマーカーの時間的または細胞内発現パターンの定量的且つ定性的な差異を包含する。
【００５９】
ある特定の例示的な実施形態では、バイオマーカーはＲＮＡ転写物である。本明細書において使用される場合、「ＲＮＡ転写物」は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、オルタナティブスプライシングを受けたｍＲＮＡ、リボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、およびアンチセンスＲＮＡを含む、コードＲＮＡおよび非コードＲＮＡの両方を指す。生物試料においてｍＲＮＡを測定することは、その生物試料において対応するタンパク質および遺伝子のレベルを検出することの代わりとして用いることができる。したがって、本明細書に記載されるバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルのいずれも適切なＲＮＡを検出することにより検出することもできる。バイオマーカー発現プロファイリングの方法には、定量的ＰＣＲ、ＮＧＳ、ノーザンブロット、サザンブロット、マイクロアレイ、ＳＡＧＥ、免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、凝集、比ろう分析、比濁分析、ウエスタンブロット、免疫沈澱、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、ルミネックスアッセイ）、およびマススペクトロメトリーが含まれるが、これらに限定されない。所与の試料の全発現データは、出発物質の量の差、抽出効率の差および増幅反応の効率の差について補正するために、当業者に知られている方法を用いて正規化することができる。
【００６０】
ある特定の例示的な実施形態では、抗血管形成治療薬に対して応答的および非応答的である種類の癌の区別に有用なバイオマーカーは、上で考察した発現検出方法および患者サンプルセットを用いて決定する、患者データセット中の試料間の最も高い程度のばらつきを示すバイオマーカーを特定することにより、決定することができる。発現データ内で非常に可変的なデータ点を特定するための当技術分野において公知の標準的な統計学的方法は、非常に可変的なバイオマーカーを特定するために用いることができる。例えば、患者データセットに対するバックグラウンドおよび分散混合型フィルタ。バックグラウンドフィルターは、発現Ｅ、およびバックグラウンド標準偏差σＢｇ（エクスプレッション・コンソール・ソフトウェアより）によって限定される閾値よりも上の発現分散ｖａｒＥを有するプローブセットの選択に基づき、指定された有意度ａでの標準正規分布の分位値ｚαは、ａが有意度の閾値を限定している次式：
Ｅ＞ｌｏｇ２（（ｚａσＢｇ））；ｌｏｇ２（（ｖａｒＥ）＞２［ｌｏｇ２（σＢｇ）−Ｅ−ｌｏｇ２（ｌｏｇ（２））］
が成り立つ場合、保持されるだろう。ある特定の例示的な実施形態では、有意度の閾値は６．３×１０−５である。別の例示的な実施形態では、有意度の閾値は１．０×１０−７〜１．０×１０−３の間であり得る。
【００６１】
ある特定の例示的な実施形態では、非常に可変的なバイオマーカーはさらに分析されて、同様の遺伝子発現プロファイルに基づき、患者データセット内の試料をサブタイプまたはクラスターに分類することができる。例えば、バイオマーカーは、それらの発現の上方制御または下方制御がどの程度高度に互いに相関しているかに基づいてクラスター化され得る。当技術分野において公知の様々なクラスター分析技術を用いることができる。１つの例示的な実施形態では、階層的凝集型クラスタリングは、癌サブタイプを特定するために使用する。各サブタイプの生物学的妥当性を判定するために、各クラスター内のバイオマーカーをさらにそれらの対応する遺伝子にマップし、その遺伝子に関係する生物活性および生物学的経路についての情報を含む１つ以上の遺伝子オントロジーデータベースへの相互参照によりそのバイオマーカーに注釈をつけることができる。１つの例示的な実施形態では、血管形成、脈管構造の発生および免疫応答という一般的機能項について濃縮されているクラスター内のバイオマーカーは推定上の血管形成試料群に分類され、発現シグネチャの作成のために使用される。別の例示的な実施形態では、血管形成、脈管構造の発生および免疫応答という一般的機能項について発現上昇され、且つ濃縮されているクラスター内のバイオマーカーは推定上の血管形成試料群に分類され、発現シグネチャ作成のために使用される。別の例示的な実施形態では、血管形成、脈管構造の発生および免疫応答という一般的機能項について発現低下され、且つ濃縮されているクラスター内のバイオマーカーは推定上の血管形成試料群に分類され、発現シグネチャ作成のために使用される。バイオマーカークラスターの機能分析の実施についてのさらなる詳細は以下の実施例の節に提供される。
【００６２】
１つの例示的な実施形態では、抗血管形成治療薬に対して応答的または非応答的である癌サブタイプを区別するための発現シグネチャを得ることに有用なバイオマーカーは表１Ａ、表１Ｂ、または両方に記載されるバイオマーカーを含む。別の例示的な実施形態では、抗血管形成治療薬に対して応答的または非応答的である癌サブタイプを区別するための発現シグネチャを得ることに有用なバイオマーカーはグループＩ（配列番号６３２〜８０１を含む）またはグループＩＩ（配列番号８０２〜９７４を含む）、または両方に記載されるバイオマーカーを含む。これらのバイオマーカーは、治療薬に対して応答的な患者を判定するための予測値を有するものとして特定されている。それらの発現は、薬剤、より具体的には、抗血管形成治療薬に対する応答またはその欠如と相関する。腫瘍において特定したバイオマーカーのコレクションの発現を調査することにより、どの治療薬または治療薬の組合せが癌の増殖速度を低下させる可能性が最も高いか決定することができる。腫瘍において特定したバイオマーカーのコレクションを調査することにより、どの治療薬または治療薬の組合せが癌の増殖速度を低下させる可能性が最も低いか決定することもできる。したがって、バイオマーカーの発現のコレクションを調査することにより、効果が無い治療薬または不適切な治療薬を排除することができる。重要なことに、ある特定の実施形態では、これらの決定は患者ごとに、または薬剤ごとに行うことができる。したがって、特定の治療計画が特定の患者もしくは特定の種類の患者に有益である可能性が有るかどうか、および／または特定の治療計画を継続すべきか決定することができる。
【００６３】
【表１Ａ】
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【表１Ｂ】
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【００６４】
ある特定の例示的な実施形態では、表１Ａおよび表１Ｂに列挙されているバイオマーカーの全てまたは一部が発現シグネチャにおいて使用され得る。ある特定の他の例示的な実施形態では、グループＩまたはグループＩＩに列挙されているバイオマーカーの全てまたは一部が発現シグネチャにおいて使用され得る。例えば、表１Ａ、表１Ｂ、グループＩ、およびグループＩＩのバイオマーカーを含む発現シグネチャは、本明細書において提供される方法を用いて作成することができ、表１Ａ、１Ｂ、グループＩ、グループＩＩならびにその間の各組合せおよび全ての組合せに示されるマーカーのうちの１つと全ての間（例えば、４個の選択されたマーカー、１６個の選択されたマーカー、７４個の選択されたマーカーなど）を含むことができる。いくつかの実施形態では、発現シグネチャは、少なくとも５個、１０個、２０個、４０個、６０個、１００個、１５０個、２００個、または３００個またはそれ以上のマーカーを含む。他の実施形態では、予測的バイオマーカーパネルは５個以下、１０個以下、２０個以下、４０個以下、６０個以下、１００個以下、１５０個以下、２００個以下、３００個以下、４００個以下、５００個以下、６００個以下または７００個以下のマーカーを含む。１つの例示的な実施形態では、発現シグネチャは表１Ａに記載される複数のマーカーを含む。別の例示的な実施形態では、発現シグネチャは表１Ｂに記載される複数のバイオマーカーを含む。さらに別の例示的な実施形態では、発現シグネチャは表１Ａおよび表１Ｂに記載される複数のバイオマーカーを含む。別の例示的な実施形態では、発現シグネチャはグループＩに記載される複数のバイオマーカーを含む。別の例示的な実施形態では、発現シグネチャは表グループＩＩに記載される複数のバイオマーカーを含む。さらに別の例示的な実施形態では、発現シグネチャはグループＩおよびＩＩに記載される複数のバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、発現シグネチャは表１Ａ、表１Ｂ、グループＩ、グループＩＩ、またはそれらの組合せに記載されるマーカーの少なくとも約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％を含む。選択される発現シグネチャは、本明細書に記載される方法および当技術分野において公知の類似の方法を用いて提供されるバイオマーカーから集めることができる。１つの実施形態では、発現シグネチャは表１Ａの２５０種全ての遺伝子または遺伝子産物を含む。別の例示的な実施形態では、発現シグネチャは表１Ｂの４８６種全ての遺伝子または遺伝子産物を含む。別の例示的な実施形態では、発現シグネチャは配列番号６３２〜８０１を含む。別の例示的な実施形態では、発現シグネチャは配列番号８０２〜９７４を含む。
【００６５】
４．数理モデル
次の方法が、上で開示したバイオマーカーに由来する発現シグネチャを含む、抗血管形成治療薬に対して応答的もしくは非応答的である対象を区別するための、またはある種の癌の予後指標としての発現シグネチャを得るために用いられ得る。ある特定の他の例示的な実施形態では、発現シグネチャは、決定木法 (Hastie et al. The Elements of Statistical Learning, Springer, New York 2001)、ランダムフォレスト法 (Breiman, 2001 Random Forests, Machine Learning 45:5)、ニューラルネットワーク法 (Bishop, Neural Networks for Pattern Recognition, Clarendon Press, Oxford 1995) 、線形判別分析、対角線形判別分析、二次判別分析およびロジスティック判別分析を含むが、これらに限定されない判別分析法 (Duda et al. Pattern Classification, 2nd ed., John Wiley, New York 2001) 、マイクロアレイ予測分析法（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：ＰＡＭ） (Tibshirani et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6567-6572)) またはクラス類似性ソフト独立モデリング（Ｓｏｆｔ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｌａｓｓ  Ａｎａｌｏｇｙ：ＳＩＭＣＡ）分析 (Wold, 1976, Pattern Recogn. 8:127-139)) を用いて得られる。
【００６６】
バイオマーカー発現値は、変化する大きさに応じて、実際の規模で対応するスカラーウェイトと組み合わせて定められ得るが、それらは、数学的に導出されたそのスカラー値に関する決定関数と共に、試料からの発現プロファイルを、特定の薬品、薬品分類または治療計画に対して応答するものまたは応答しないもの、抵抗性のものまたは非抵抗性のものからなる別々の分類に分けることができる予測モデルを提供する代数アルゴリズム、統計的学習アルゴリズム、ベイズアルゴリズム、回帰アルゴリズム、または同様のアルゴリズムにより、線形法または非線形法、代数法、三角法、または相関法を介して単一のスカラー値にさらに統合される。バイオマーカーメンバーシップを含むそのような予測モデルはウェイト学習および決定閾値により開発され、薬品応答および／または抵抗性が知られている過去の患者サンプルに由来する代表的な発現プロファイルの集合から、交差検証、ブートストラッピングまたは同様のサンプリング技法に基づき、感度、特異度、陰性的中率および陽性的中率、ハザード比、またはそれらの組合せについて最適化される。
【００６７】
１つの実施形態では、バイオマーカーは、それらのシグナルの加重和を形成するために使用されるが、その場合、個々のウェイトは陽性または陰性であり得る。結果生じる和（「発現スコア」）は既定の基準点または基準値と比較される。その基準点または基準値との比較は臨床状態または臨床転帰を診断または予測するために用いることができる。
【００６８】
上述したように、当業者は、表１Ａ、１Ｂ、グループＩおよびグループＩＩにおいて提供される分類器に含まれるバイオマーカーは治療薬への応答性または抵抗性についての分類器に不均等なウェイトを有することを理解するだろう。それ故、わずかに１つの配列を使用して治療薬への応答性などの結果を診断または予測することができるが、より多くの配列を用いることで特異度および感度または診断精度または予測精度が上昇し得る。
【００６９】
本明細書において使用される場合、「ウェイト」という用語は、統計計算の項目の相対的な重要度を指す。遺伝子発現分類器における各バイオマーカーのウェイトは、当技術分野において公知の分析方法を用いて、患者サンプルのデータセットについて決定され得る。
【００７０】
ある特定の例示的な実施形態では、発現シグネチャは決定関数により定められる。決定関数は線形分類器を使用して得られる、ウェイトが付けられている発現値の集合である。全ての線形分類器は次の等式：
ｆ（ｘ）＝ｗ’×ｘ＋ｂ＝Σｗｉ×ｘｉ＋ｂ（１）
を用いて決定関数を定義する。
【００７１】
ある特定の試料について、マイクロアレイ遺伝子発現強度ｘｉなどの全ての測定値がベクトルｘとして収集される。次に、各強度を対応するウェイトｗｉで乗算し、オフセット項ｂを加算して決定関数ｆ（ｘ）の値を得る。決定関数の導出において、線形分類器は遺伝子発現データスペースを、交わりを持たない２つのスペースに分割する閾値をさらに定める。例となる線形分類器には部分最小二乗（ＰＬＳ）法(Nguyen et al., Bioinformatics 18 (2002) 39-50)、 サポートベクターマシン（ＳＶＭ）法 (Schoelkopf et al., Learning with Kernels, MIT Press, Cambridge 2002)、 および収縮判別分析法（ｓｈｒｉｎｋａｇｅ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ＳＤＡ） (Ahdesmaki et al., Annals of applied statistics 4, 503-519 (2010)) が含まれるが、これらに限定されない。１つの例示的な実施形態では、線形分類器はＰＬＳ線形分類器である。
【００７２】
決定関数は、例えば、治療薬への応答性または抵抗性を示す患者に由来する大きなトレーニングサンプルセットについて経験的に導出される。閾値が、限定されないが、治療への応答性／非応答性などの様々な特徴に基づいて患者群を分割する。この数、すなわち、治療薬に対するカットオフ閾値応答性または抵抗性についての解釈は開発段階（「トレーニング」）において転帰が知られている患者の集合から導出される。決定スコアの対応するウェイトおよび応答性／抵抗性カットオフ閾値は当業者に知られている方法によってトレーニングデータから先験的に確定される。１つの例示的な実施形態では、部分最小二乗法判別分析（ＰＬＳ‐ＤＡ）法がウェイトの決定のために用いられる (L. Stahle, S. Wold, J. Chemom. 1 (1987) 185-196、D. V. Nguyen, D.M. Rocke, Bioinformatics 18 (2002) 39-50) 。
【００７３】
実際上、このことは、データスペース、すなわち、バイオマーカー発現値の全ての可能な組合せの集合が、異なる臨床的分類または予測に対応する相互に交わらない２つの集合、例えば、治療薬への応答性に対応する集合および非応答性に対応する他方の集合に分けられることを意味する。全体分類器に関して、ある特定のバイオマーカーの相対的な過剰発現は決定スコアを増加させるか（陽性ウェイト）、または、決定スコアを減少させる（陰性ウェイト）ことができ、そうして、例えば、治療薬への応答性または抵抗性の全体的な決定に寄与することができる。
【００７４】
本発明のある特定の例示的な実施形態では、データは、上述のように加重和を適用する前に、非線形的に変換される。この非線形変換はデータの次元数の増加を包含してよい。非線形変換および加重合計は、例えば、核関数 (Schoelkopf et al. Learning with Kernels, MIT Press, Cambridge 2002) の使用によって暗に実行してもよい。
【００７５】
ある特定の例示的な実施形態では、患者トレーニングセットデータは、対応する癌組織サンプルセットに由来する単離ＲＮＡと、その単離ＲＮＡのマイクロアレイへのハイブリダイゼーションによる発現値の決定によって導出される。ある特定の例示的な実施形態では、発現シグネチャの導出において使用されるマイクロアレイはトランスクリプトームアレイである。本明細書において使用される場合、「トランスクリプトームアレイ」は、目的の疾患組織で発現していると検証された配列にハイブリダイズするように設計されているプローブセットを含むマイクロアレイを指す。オルタナティブスプライシングならびに組織間および生物学的環境間で変わり得るポリＡテールプロセッシングを考慮すると、別の組織供給源または生物学的環境に由来する同じ遺伝子配列に対して設計されているプローブは目的の疾患組織において発現している転写物に効果的に結合せず、潜在的に適切な生物学的情報を失うことになる可能性がある。したがって、マイクロアレイプローブセットを得る前に、目的の疾患組織においてどの配列が発現しているか検証することが有益である。特定の疾患状況において発現している配列の検証は、例えば、疾患組織サンプルセットに由来する全ＲＮＡの単離および配列決定、ならびにその単離された配列の公知の核酸配列データベースとの相互参照により行って、トランスクリプトームアレイ上のプローブセットが目的の疾患組織において実際に発現している配列に対して設計されていることを検証することができる。トランスクリプトームアレイを作製するための方法は米国特許出願公開第２００６／０１３４６６３号に記載されており、それは参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の例示的な実施形態では、トランスクリプトームアレイのプローブセットは転写物の３’末端から３００ヌクレオチド以内に結合するように設計されている。標的転写物の３’末端から３００ヌクレオチド以内に結合するプローブセットを有するトランスクリプトームアレイを設計するための方法は米国特許出願公開第２００９／００８２２１８号に記載されており、それは参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の例示的な実施形態では、本発明の遺伝子発現プロファイルの導出に使用されるマイクロアレイはアルマック（Ａｌｍａｃ）卵巣癌ＤＳＡ（商標）マイクロアレイ（アルマックグループ、クレイガボン、英国）である。
【００７６】
最適な線形分類器は、「曲線下面積」（ＡＵＣ）などの診断法を用いて線形分類器の性能を評価することにより選択することができる。ＡＵＣは受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下面積を指し、それらの両方は当技術分野において周知である。ＡＵＣ法は全範囲のデータにわたって分類器の精度を比較するのに有用である。高いＡＵＣを有する線形分類器ほど２つの目的の群（例えば、卵巣癌試料と正常試料または対照試料）の間で未知のものを正確に分類する能力が高い。ＲＯＣ曲線は、２つの集団（例えば、治療薬に応答する個体と応答しない個体）の区別において特定の特色（例えば、本明細書に記載されるバイオマーカーのいずれか、および／またはその他の生物医学情報のいずれかの項目）の実績をプロットするのに有用である。典型的には、全集団（例えば、症例および対照）にわたる特色データが、一つの特色の値に基づいて昇順でソートされる。次に、その特色の各値について、そのデータの真陽性率および偽陽性率が計算される。真陽性率は、その特色の値よりも上の症例の数を数え、次に、症例の総数で除算することにより決定される。偽陽性率はその特色の値よりも上の対照の数を数え、次に、対照の総数で除算することにより決定される。この定義は、対照と比較した場合に特色が増加するシナリオに関連するが、この定義は、対照と比較した場合に特色が減少しているシナリオにも当てはまる（そのようなシナリオでは、その特色の値より少ない試料が計数されるだろう）。ＲＯＣ曲線は一つの特色について、ならびに他の一つの出力項目について作成されることができ、例えば、２つ以上の特色の組合せが数学的に統合されて（例えば、加算、減算、乗算などされて）一つの総和の値をもたらすことができ、およびこの一つの総和の値がＲＯＣ曲線にプロットされ得る。さらに、複数の特色の任意の組合せが、その組合せは一つの出力値を導き出すのだが、ＲＯＣ曲線にプロットされ得る。これらの特色の組合せは試験を含むことができる。ＲＯＣ曲線は試験の真陽性率（感度）のその検査の偽陽性率（１−特異度）に対するプロットである。
【００７７】
１つの例示的な実施形態では、発現シグネチャは、表２Ａに詳述されている対応する順位およびウェイトと共に、または、例えば、疾患の状況に応じて代わりの順位づけおよび加重と共に、その表に詳述されている２５バイオマーカーを対象とする。別の例示的な実施形態では、発現シグネチャは、表２Ｂに詳述されている対応する順位およびウェイトと共に、または、例えば、疾患の状況に応じて代わりの順位づけおよび加重と共に、その表に詳述されている４５バイオマーカーを対象とする。表２Ａおよび２Ｂでは分類器におけるウェイトが下がる順番でバイオマーカーに順位をつけており、交差検証で測定されている複合決定スコア関数における平均ウェイトの順位として定義される。
【表２Ａ】
2014516552.tif 000031
【表２Ｂ】
2014516552.tif 000032
2014516552.tif 000033
2014516552.tif 000034
【００７８】
１つの例示的な実施形態では、発現シグネチャは、ＣＣＤＣ８０、ＩＮＨＢＡ、ＴＨＢＳ２、ＳＦＲＰ２、ＭＭＰ２、ＰＬＡＵ、ＦＡＰ、ＦＮ１、ＣＯＬ８Ａ１、ＲＡＢ３１、ＦＡＭ３８Ｂ、ＶＣＡＮ、ＧＪＢ２、ＩＴＧＡ５、ＣＲＩＳＰＬＤ２、Ｃ１７、ｆ９１、ＢＧＮ、ＴＩＭＰ３、ＡＬＰＫ２、ＬＵＭ、ＮＫＤ２、ＬＯＸ、ＭＩＲ１２４５、ＬＯＸＬ１、およびＣＸＣＬ１２からなる群より選択される１つ以上のバイオマーカーを含む。
【００７９】
別の例示的な実施形態では、発現シグネチャは少なくともＣＣＤＣ８０、ＩＮＨＢＡ、ＴＨＢＳ２およびＳＦＲＰ２および表２ａ中のバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮ個の追加のバイオマーカーを含み、その場合、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１である。さらなる態様では、治療応答性は個体において、その個体に由来する生物試料に対するアッセイを行い、バイオマーカーであるＣＣＤＣ８０、ＩＮＨＢＡ、ＴＨＢＳ２およびＳＦＲＰ２および表２ａ中のバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮ個の追加のバイオマーカーのうちの１つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を検出することにより予測され、その場合、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１である。さらなる態様では、治療応答性は個体において、その個体に由来する生物試料に対するアッセイを行い、バイオマーカーであるＣＣＤＣ８０および表２ａ中のバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮ個の追加のバイオマーカーのうちの１つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を検出することにより予測され、その場合、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３または２４である。さらなる態様では、治療応答性は個体において、その個体に由来する生物試料に対するアッセイを行い、バイオマーカーであるＩＮＨＢＡおよび表２ａ中のバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮ個の追加のバイオマーカーのうちの１つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を検出することにより予測され、その場合、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３または２４である。さらなる態様では、治療応答性は個体において、その個体に由来する生物試料に対するアッセイを行い、バイオマーカーであるＴＨＢＳ２および表２ａ中のバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮ個の追加のバイオマーカーのうちの１つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を検出することにより予測され、その場合、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３または２４である。さらなる態様では、治療応答性は個体において、その個体に由来する生物試料に対するアッセイを行い、バイオマーカーであるＳＦＲＰ２および表２ａ中のバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮ個の追加のバイオマーカーのうちの１つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を検出することにより予測され、その場合、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３または２４である。
【００８０】
別の例示的な実施形態では、発現シグネチャは、ＴＭＥＭ２００Ａ、ＧＪＢ２、ＭＭＰ１３、ＧＦＰＴ２、ＰＯＳＴＮ、ＢＩＣＣ１、ＣＤＨ１１、ＭＲＶＩ１、ＰＭＰ２２、ＣＯＬ１１Ａ１、ＩＧＦＬ２、ＬＵＭ、ＮＴＭ、ＢＧＮ、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ１０Ａ１、ＲＡＢ３１、ＡＮＧＰＴＬ２、ＰＬＡＵ、ＣＯＬ８Ａ１、ＭＩＲ１２４５、ＰＯＬＤ２、ＮＫＤ２、ＦＺＤ１、ＣＯＰＺ２、ＩＴＧＡ５、ＶＧＬＬ３、ＩＮＨＢＡ、ＭＭＰ１４、ＶＣＡＮ、ＴＨＢＳ２、ＲＵＮＸ２、ＴＩＭＰ３、ＳＦＲＰ２、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ５Ａ２、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＫＩＦ２６Ｂ、ＴＮＦＡＩＰ６、ＭＭＰ２、ＦＮ１、ＡＬＰＫ２、ＣＴＳＫ、ＬＯＸＬ１およびＦＡＰからなる群より選択される１つ以上のバイオマーカーを含む。
【００８１】
別の例示的な実施形態では、発現シグネチャは少なくともＴＭＥＭ２００Ａ、ＧＪＢ２、ＭＭＰ１３およびＧＦＰＴ２および表２ａ中のバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮ個の追加のバイオマーカーを含み、その場合、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または４１である。さらなる態様では、治療応答性は個体において、その個体に由来する生物試料に対するアッセイを行い、バイオマーカーであるＴＭＥＭ２００Ａ、ＧＪＢ２、ＭＭＰ１３およびＧＦＰＴ２および表２Ｂ中のバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮ個の追加のバイオマーカーのうちの１つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を検出することにより予測され、その場合、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０または４１である。さらなる態様では、治療応答性は個体において、その個体に由来する生物試料に対するアッセイを行い、バイオマーカーであるＴＭＥＭ２００Ａおよび表２Ｂ中のバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮ個の追加のバイオマーカーのうちの１つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を検出することにより予測され、その場合、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４である。さらなる態様では、治療応答性は個体において、その個体に由来する生物試料に対するアッセイを行い、バイオマーカーであるＧＪＢ２および表２ａ中のバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮ個の追加のバイオマーカーのうちの１つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を検出することにより予測され、その場合、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４である。さらなる態様では、治療応答性は個体において、その個体に由来する生物試料に対するアッセイを行い、バイオマーカーであるＭＭＰ１３および表２Ｂ中のバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮ個の追加のバイオマーカーのうちの１つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を検出することにより予測され、その場合、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４である。さらなる態様では、治療応答性は個体において、その個体に由来する生物試料に対するアッセイを行い、バイオマーカーであるＧＦＰＴ２および表２Ｂ中のバイオマーカーのリストから選択される少なくともＮ個の追加のバイオマーカーのうちの１つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を検出することにより予測され、その場合、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４である。
【００８２】
１つの例示的な実施形態では、発現シグネチャは、ＡＬＰＫ２、ＢＧＮ、ＣＯＬ８Ａ１、ＦＡＰ、ＦＮ１、ＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＡ５、ＬＯＸＬ１、ＬＵＭ、ＭＩＲ１２４５、ＭＭＰ２、ＮＫＤ２、ＰＬＡＵ、ＲＡＢ３１、ＳＦＲＰ２、ＴＨＢＳ２、ＴＩＭＰ３およびＶＣＡＮからなる群より選択される１つ以上のバイオマーカーを含む。
【００８３】
別の例示的な実施形態では、発現シグネチャは少なくともＡＬＰＫ２、ＢＧＮ、ＣＯＬ８Ａ１、ＦＡＰならびにバイオマーカーであるＦＮ１、ＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＡ５、ＬＯＸＬ１、ＬＵＭ、ＭＩＲ１２４５、ＭＭＰ２、ＮＫＤ２、ＰＬＡＵ、ＲＡＢ３１、ＳＦＲＰ２、ＴＨＢＳ２、ＴＩＭＰ３およびＶＣＡＮからなるリストより選択される少なくともＮ個の追加のバイオマーカーを含み、その場合、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５である。さらなる態様では、治療応答性は個体において、その個体に由来する生物試料に対するアッセイを行い、バイオマーカーであるＡＬＰＫ２、ＢＧＮ、ＣＯＬ８Ａ１およびＦＡＰならびにバイオマーカーであるＦＮ１、ＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＡ５、ＬＯＸＬ１、ＬＵＭ、ＭＩＲ１２４５、ＭＭＰ２、ＮＫＤ２、ＰＬＡＵ、ＲＡＢ３１、ＳＦＲＰ２、ＴＨＢＳ２、ＴＩＭＰ３およびＶＣＡＮからなるリストより選択される少なくともＮ個の追加のバイオマーカーのうちの１つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を検出することにより予測され、その場合、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５である。さらなる態様では、治療応答性は個体において、その個体に由来する生物試料に対するアッセイを行い、バイオマーカーＡＬＰＫ２ならびにバイオマーカーであるＢＧＮ、ＣＯＬ８Ａ１、ＦＡＰ、ＦＮ１、ＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＡ５、ＬＯＸＬ１、ＬＵＭ、ＭＩＲ１２４５、ＭＭＰ２、ＮＫＤ２、ＰＬＡＵ、ＲＡＢ３１、ＳＦＲＰ２、ＴＨＢＳ２、ＴＩＭＰ３およびＶＣＡＮからなるリストより選択される少なくともＮ個の追加のバイオマーカーのうちの１つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を検出することにより予測され、その場合、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５である。さらなる態様では、治療応答性は個体において、その個体に由来する生物試料に対するアッセイを行い、バイオマーカーＢＧＮならびにバイオマーカーであるＡＬＰＫ２、ＣＯＬ８Ａ１、ＦＡＰ、ＦＮ１、ＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＡ５、ＬＯＸＬ１、ＬＵＭ、ＭＩＲ１２４５、ＭＭＰ２、ＮＫＤ２、ＰＬＡＵ、ＲＡＢ３１、ＳＦＲＰ２、ＴＨＢＳ２、ＴＩＭＰ３およびＶＣＡＮからなるリストより選択される少なくともＮ個の追加のバイオマーカーのうちの１つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を検出することにより予測され、その場合、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５である。さらなる態様では、治療応答性は個体において、その個体に由来する生物試料に対するアッセイを行い、バイオマーカーＣＯＬ８Ａ１ならびにバイオマーカーであるＡＬＰＫ２、ＢＧＮ、ＦＡＰ、ＦＮ１、ＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＡ５、ＬＯＸＬ１、ＬＵＭ、ＭＩＲ１２４５、ＭＭＰ２、ＮＫＤ２、ＰＬＡＵ、ＲＡＢ３１、ＳＦＲＰ２、ＴＨＢＳ２、ＴＩＭＰ３およびＶＣＡＮからなるリストより選択される少なくともＮ個の追加のバイオマーカーのうちの１つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を検出することにより予測され、その場合、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５である。さらなる態様では、治療応答性は個体において、その個体に由来する生物試料に対するアッセイを行い、バイオマーカーＦＡＰならびにバイオマーカーであるＡＬＰＫ２、ＢＧＮ、ＣＯＬ８Ａ１、ＦＮ１、ＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＡ５、ＬＯＸＬ１、ＬＵＭ、ＭＩＲ１２４５、ＭＭＰ２、ＮＫＤ２、ＰＬＡＵ、ＲＡＢ３１、ＳＦＲＰ２、ＴＨＢＳ２、ＴＩＭＰ３およびＶＣＡＮからなるリストより選択される少なくともＮ個の追加のバイオマーカーのうちの１つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を検出することにより予測され、その場合、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５である。
【００８４】
１つの例示的な実施形態では、発現シグネチャは発現低下しているバイオマーカーの集合を含む。１つの例示的な実施形態では、発現シグネチャは少なくともＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＴＨＢＳ２、ＳＦＲＰ２、ＰＬＡＵおよび表１Ａまたは表１Ｂからの少なくともＮ個の追加のバイオマーカーを含み、その場合、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０である。別の例示的な実施形態では、発現シグネチャは、少なくともＧＪＢ２および表１Ａまたは表１Ｂからの少なくともＮ個の追加のバイオマーカーを含み、その場合、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、または７４である。別の例示的な実施形態では、発現シグネチャはＩＮＨＢＡおよび表１Ａまたは表１Ｂからの少なくともＮ個の追加のバイオマーカーを含み、その場合、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、または７４である。別の例示的な実施形態では、発現シグネチャはＴＨＢＳ２および表１Ａまたは表１Ｂからの少なくともＮ個の追加のバイオマーカーを含み、その場合、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、または７４である。別の例示的な実施形態では、発現シグネチャは少なくともＳＦＲＰ２を含み、その場合、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、または７４である。別の例示的な実施形態では、発現シグネチャはＰＬＡＵおよび表１Ａまたは表１Ｂからの少なくともＮ個の追加のバイオマーカーを含み、その場合、Ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０である。別の例示的な実施形態では、発現シグネチャはＧＪＢ２、ＩＮＨＢＡ、ＴＨＢＳ２、ＳＦＲＰ２、ＰＬＡＵおよび表１Ａ、表１Ｂ、またはそれらの組合せに記載されるバイオマーカーの少なくとも約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９９％を含む。
【００８５】
発現シグネチャを用いる新規検査試料の分類
上記のもののような発現シグネチャを用いる新規検査試料の分類のために、癌組織におけるバイオマーカーの相対発現レベルを測定して、検査試料の発現プロファイルを形成する。ある特定の例示的な実施形態では、その検査試料発現プロファイルは複合決定スコア（「発現スコア」）の形でまとめられ、患者データのトレーニングセットから数学的に得られる閾値スコアと比較される。スコア閾値は、限定されないが、治療に対する応答性／非応答性などの異なる特徴に基づいて患者群を分割する。患者トレーニングセットデータは、予後、再発の可能性、長期生存率、臨床転帰、治療応答、診断結果、癌の分類、または個人のゲノミクスプロファイルによって特徴づけられている癌組織試料に由来することが好ましい。患者サンプルに由来する発現プロファイルおよび対応する決定スコアは数学的に得られたスコア決定閾値の同じ側面にあるトレーニングセット内の患者サンプルの特徴と相関づけられる場合がある。線形分類器スカラー出力の閾値は、トレーニングデータセット内で観察されるように、交差検証されている感度と特異度の総和を最大化するように最適化される。
【００８６】
所与の試料の全発現データは、出発物質の量の差、抽出効率の差および増幅反応の効率の差などについて補正するために、当業者に知られている方法を用いて正規化する。
【００８７】
１つの実施形態では、患者組織試料のバイオマーカー発現プロファイルは線形分類器により評価される。本明細書において使用される場合、線形分類器は、個々のバイオマーカー強度の複合決定スコアへの加重和（「決定関数」）を指す。次に、決定スコアは、試料がスコア閾値より上（決定関数陽性）であるか、下（決定関数陰性）であるか示す感度および特異度に関するある特定の認定点に対応する限定前のカットオフスコア閾値と比較される。
【００８８】
診断コールまたは予後診断コール（例えば、治療薬に対する応答性または抵抗性）を作成するための正規化されたデータへの線形分類器の使用は、事実上、データスペース、すなわち、分類器内の全ての遺伝子の発現値の全ての可能な組合せを分離超平面によって２つの交わりを持たないスペースに分割することを意味する。この分割は、例えば、治療薬への応答性または抵抗性を示す患者に由来する大きなトレーニングサンプルセットについて経験的に導出される。一般性を失わずに、１つのバイオマーカーを除いた全てについての値からなるある特定の確定された集合を仮定することができ、その集合は自動的にこの残りのバイオマーカーの閾値を定め、そこでは、例えば、治療薬に対する応答性または抵抗性についての決定が変わる。この動的な閾値よりも上の発現値は、次に、治療薬に対する抵抗性（陰性ウェイトを有するバイオマーカーについて）または応答性（陽性ウェイトを有するバイオマーカーについて）のどちらかを示すだろう。この閾値の正確な値は分類器内の全ての他のバイオマーカーの実際に測定された発現プロファイルに左右されるが、ある特定のバイオマーカーの一般的な示度は固定されたままであり、すなわち、高い値または「相対的過剰発現」は常に応答性（陽性ウェイトを有する遺伝子）か抵抗性（陰性ウェイトを有する遺伝子）のどちらかの原因となる。それ故、全体遺伝子発現分類器に関して、相対的発現は、ある特定のバイオマーカーの発現上昇または発現低下が治療薬に対する応答性または抵抗性を示すかどうかを示すことができる。
【００８９】
アッセイされるバイオマーカーの種類に応じて検査試料の発現プロファイルを測定するための多数の適切な方法が存在する。生物試料におけるｍＲＮＡの測定は、その生物試料での対応するタンパク質のレベルの検出の代わりとして用いることができる。したがって、本明細書に記載されるバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルのいずれも適切なＲＮＡを検出することにより検出することもできる。遺伝子発現プロファイリングの方法にはマイクロアレイ、ＲＴ‐ＰＣＴ、ｑＰＣＲ、ＮＧＳ、ノーザンブロット、ＳＡＧＥ、マススペクトロメトリーが含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
ｍＲＮＡ発現レベルは逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ後ｑＰＣＲ）によって測定される。ＲＴ‐ＰＣＲはｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製するために用いられる。そのｃＤＮＡは、ＤＮＡ増幅プロセスが進行するにつれ蛍光を発するｑＰＣＲアッセイにおいて使用することができる。検量線に対する比較により、ｑＰＣＲは、細胞あたりのｍＲＮＡのコピー数などの絶対測定値をもたらすことができる。ノーザンブロット、マイクロアレイ、インベーダーアッセイ、およびキャピラリー電気泳動連結型ＲＴ‐ＰＣＲは全て、試料中のｍＲＮＡの発現レベルを測定するために用いられている。 Gene Expression Profiling: Methods and Protocols, Richard A. Shimkets, 編, Humana Press, 2004 を参照のこと。
【００９１】
ｍｉＲＮＡ分子は遺伝子をコードしていないが遺伝子発現を調節することができる低分子ＲＮＡである。ｍＲＮＡ発現レベルの測定に適した方法のいずれも対応するｍｉＲＮＡについて用いることもできる。近年、多くの研究室が疾患のバイオマーカーとしてのｍｉＲＮＡの使用について研究してきている。多くの疾患が広義の転写調節と関わりがあり、ｍｉＲＮＡがバイオマーカーとしての役割を見出す可能性があることは驚くにあたらない。ｍｉＲＮＡの濃度と疾患の間の関係は、多くの場合、タンパク質レベルと疾患の間の関係よりもさらに明確性が低いが、それでも、ｍｉＲＮＡバイオマーカーの値が重要である可能性がある。もちろん、疾患の際に示差的に発現するあらゆるＲＮＡのように、インビトロ診断製品の開発が直面する問題は、ｍｉＲＮＡが病気の細胞の中で残り続け、分析のために容易に抽出され、または、ｍｉＲＮＡが、血液その他のマトリックス中に放出されて、測定されるために十分長い間残存しなければならないという必要性を含むだろう。タンパク質バイオマーカーは同様の必要条件を有するが、多くの可能性があるタンパク質バイオマーカーが、疾患の際にパラクリンの様式で病気の部位および機能部位において意図的に分泌されている。多くの可能性があるタンパク質バイオマーカーが、それらのタンパク質が合成される細胞の外で機能するように設計されている。
【００９２】
遺伝子発現は、マススペクトロメトリー法を用いて評価することもできる。様々な構成のマススペクトロメーターを使用してバイオマーカーの値を検出することができる。いくつかのタイプのマススペクトロメーターが利用可能であり、または、マススペクトロメーターを様々な構成で作製することができる。一般に、マススペクトロメーターは次の主要な構成要素、すなわち、サンプルインレット、イオン供給源、質量分析器、検出器、真空システムおよび装置制御システムおよびデータシステムを有する。サンプルインレット、イオン供給源および質量分析器の違いが一般的に装置のタイプとその能力を定義する。例えば、インレットはキャピラリーカラム液体クロマトグラフィー供給源であり得、または、マトリックス支援レーザー脱離において使用されるような直接プローブまたはステージであり得る。共通のイオン供給源は、例えば、ナノスプレーおよびマイクロスプレーを含むエレクトロスプレーまたはマトリックス支援レーザー脱離である。共通の質量分析器には四重極マスフィルター、イオントラップ質量分析器および飛行時間質量分析器が含まれる。その他のマススペクトロメトリー方法は当技術分野において周知である ( Burlingame et al., Anal. Chem. 70:647 R-716R (1998)、Kinter and Sherman, New York (2000)を参照のこと)。
【００９３】
タンパク質バイオマーカーおよびバイオマーカー値は次のうちのいずれかにより検出および測定することができる：エレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリー（ＥＳＩ‐ＭＳ）、ＥＳＩ‐ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ‐ＭＳ／（ＭＳ）ｎ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間マススペクトロメトリー（ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ‐ＭＳ）、表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間マススペクトロメトリー（ＳＥＬＤＩ‐ＴＯＦ‐ＭＳ）、シリコン上脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）、二次イオンマススペクトロメトリー（ＳＩＭＳ）、四重極飛行時間（Ｑ‐ＴＯＦ）、ウルトラフレックスＩＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦと呼ばれるタンデム飛行時間（ＴＯＦ／ＴＯＦ）技術、大気圧化学イオン化マススペクトロメトリー（ＡＰＣＩ‐ＭＳ）、ＡＰＣＩ‐ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ‐（ＭＳ）Ｎ、大気圧光イオン化マススペクトロメトリー（ＡＰＰＩ‐ＭＳ）、ＡＰＰＩ‐ＭＳ／ＭＳ、およびＡＰＰＩ‐（ＭＳ）Ｎ、四重極マススペクトロメトリー、フーリエ変換マススペクトロメトリー（ＦＴＭＳ）、定量的マススペクトロメトリー、およびイオントラップマススペクトロメトリー。
【００９４】
試料調製ストラテジーが、タンパク質バイオマーカーの質量分析器による特性解析およびバイオマーカー値の決定の前に試料を標識し、濃縮するために用いられる。標識方法には、相対的定量および絶対的定量のためのアイソバリック・タグ（ｉｓｏｂａｒｉｃ  ｔａｇ）（ｉＴＲＡＱ）ならびに細胞培養中アミノ酸安定アイソトープ標識（ＳＩＬＡＣ）が含まれるが、これらに限定されない。質量分析器による分析の前に候補バイオマーカータンパク質の試料を選択的に濃縮するために用いられる捕捉試薬にはアプタマー、抗体、核酸プローブ、キメラ、小分子、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖抗体断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ断片、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、アフィボディ、ナノボディ、アンキリン類、ドメイン抗体、代替抗体スキャホルド（例えば、ディアボディなど）、インプリント化ポリマー、アビマー、ペプチド模倣物、ペプトイド、ペプチド核酸、トレオース核酸、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、および合成受容体、ならびにこれらの修飾物および断片が含まれるが、これらに限定されない。
【００９５】
前述のアッセイは癌治療薬の応答性の予測のための方法に有用であるバイオマーカー値の検出を可能にし、その場合、その方法は、個体に由来する生物試料において、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２ＢまたはグループＩおよびＩＩにおいて提供されるバイオマーカーからなる群より選択されるバイオマーカーにそれぞれ対応する少なくともＮ個のバイオマーカーの値を検出することを含み、その場合、以下で詳細に説明されるように、そのバイオマーカー値を用いる分類がその個体が治療薬に対して応答的であるかどうかを示す。説明された予測的バイオマーカーのうちのある特定のものは治療薬に対する応答性の予測にのみ有用であるが、２つ以上のバイオマーカーからなるパネルとしてそれぞれ有用であるバイオマーカーの複数の部分集合のグループ分けのための方法も本明細書に記載される。したがって、本願の様々な実施形態は、Ｎが少なくとも３個のバイオマーカーである、Ｎ個のバイオマーカーを含む組合せを提供する。Ｎは上述の範囲ならびに類似しているが、より高い桁の範囲のいずれかのうちの任意の数であるように選択することができることが理解される。本明細書に記載される方法のいずれかに従って、バイオマーカー値は個々に検出および分類され得、または、それらは、集合的に、例えば、多重アッセイ形式で検出および分類され得る。
【００９６】
ｂ）マイクロアレイ方法
１つの実施形態では、本発明は「オリゴヌクレオチドアレイ」（本明細書において「マイクロアレイ」とも呼ばれる）を使用する。マイクロアレイは細胞におけるバイオマーカーの発現の分析のために、および特に癌組織のバイオマーカーの発現の測定のために使用することができる。
【００９７】
１つの実施形態では、バイオマーカーアレイは、細胞に存在するｍＲＮＡ転写物を表す検出できるように標識されたポリヌクレオチド（例えば、全細胞ｍＲＮＡから合成された蛍光標識されたｃＤＮＡまたは標識化ｃＲＮＡ）をマイクロアレイにハイブリダイズすることにより作製される。マイクロアレイは、細胞または生物の遺伝子の多く、好ましくは大半の、もしくはほとんど全ての遺伝子の産物に対する結合（例えば、ハイブリダイゼーション）部位の整列したアレイを有する表面である。マイクロアレイは、当技術分野において公知の多数の方法で作製することができる。どのように作製されたとしても、マイクロアレイはある特定の特徴を共有する。アレイは再現性が有り、複数コピーの所与のアレイを作製することができ、および容易に互いを比較することができる。好ましくは、マイクロアレイは小さく、通常５ｃｍ２よりも小さく、そして、それらは結合（例えば、核酸ハイブリダイゼーション）条件下で安定な材料から作られている。マイクロアレイ内の所与の結合部位、または結合部位の固有セットは、細胞中の単一遺伝子の産物に特異的に結合する。特定的な実施形態では、各位置に既知の配列の付着核酸を含有する、位置アドレスを呼び出すことができるアレイが使用される。
【００９８】
細胞性ＲＮＡに対して相補的なｃＤＮＡが作製され、適切なハイブリダイゼーション条件下でマイクロアレイにハイブリダイズするとき、任意の特定の遺伝子に対応するアレイ中の部位へのハイブリダイゼーションのレベルは、その遺伝子／バイオマーカーから転写されるｍＲＮＡを有する細胞の有病率を反映することが理解されるだろう。例えば、全細胞性ｍＲＮＡに対して相補的な検出できるように（例えば、フルオロフォアで）標識されたｃＤＮＡまたはｃＲＮＡがマイクロアレイにハイブリダイズされると、その細胞で転写されていない遺伝子に対応する（すなわち、その遺伝子の産物に特異的に結合することができる）アレイ上の部位はほとんど、またはまったくシグナル（例えば、蛍光シグナル）を有さず、また、コードするｍＲＮＡがいたる所に存在する遺伝子は相対的に強いシグナルを有する。核酸ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、プローブが特定のアレイ部位に「特異的に結合する」または「特異的にハイブリダイズする」ように、すなわち、プローブが相補的な核酸配列を有する配列アレイ部位にハイブリダイズする、その部位と二本鎖形成する、またはその部位と結合するが、非相補的な核酸配列を有する部位にはハイブリダイズしないように選択される。本明細書において使用される場合、１つのポリヌクレオチド配列は、そのポリヌクレオチドの長さが２５塩基以下である場合には標準的な塩基対合則を用いてミスマッチが存在しないとき、または、そのポリヌクレオチドの長さが２５塩基より長い場合にはミスマッチが５％を越えないとき、別のポリヌクレオチド配列に対して相補的であるとみなされる。ポリヌクレオチドは完全に相補的である（ミスマッチが無い）ことが好ましい。陰性対照を含むハイブリダイゼーションアッセイを日常的な実験法を用いて行うことにより、特異的なハイブリダイゼーション条件が特異的なハイブリダイゼーションをもたらすことを実証することができる。
【００９９】
最適のハイブリダイゼーション条件は標識化プローブと固定化ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの長さ（例えば、オリゴマー対２００塩基を越えるポリヌクレオチド）および種類（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ）に左右される。核酸に特異的な（すなわち、ストリンジェントな）ハイブリダイゼーション条件の一般的なパラメータは、前述の Sambrook et al., および Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing and Wiley-interscience, NY (1987) に記載されており、後者はあらゆる目的のためにその全体が組み込まれる。ｃＤＮＡマイクロアレイを使用するとき、典型的なハイブリダイゼーション条件は５×ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳ中６５Ｃで４時間のハイブリダイゼーションとそれに続く低ストリンジェンシー洗浄緩衝液（１×ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳ）中で２５℃の洗浄とその後の高ストリンジェンシー洗浄緩衝液 (0.1SSC および 0.2% SDS)中で２５℃１０分の洗浄である (Shena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, p. 10614 (1996)を参照のこと) 。有用なハイブリダイゼーション条件は、例えば、Tijessen, Hybridization With Nucleic Acid Probes", Elsevier Science Publishers B.V. (1993) および Kricka, "Nonisotopic DNA Probe Techniques", Academic Press, San Diego, Calif. (1992) においても提供される。
【０１００】
ｃ）免疫アッセイ方法
免疫アッセイ方法は抗体のその対応する標的または分析物への反応に基づいており、そして、特定のアッセイ形式に応じて試料中の分析物を検出することができる。免疫反応性に基づくアッセイ方法の特異度および感度を向上させるため、モノクローナル抗体が多くの場合、それらの特異的なエピトープ認識のため、使用される。ポリクローナル抗体も、モノクローナル抗体と比較して上昇した標的へのそれらの親和性のため、様々な免疫アッセイで首尾よく使用されてきている。免疫アッセイは広範囲の生物試料マトリックスとの使用のために設計されている。免疫アッセイの形式が定性的、半定量的、および定量的な結果を提供するように設計されている。
【０１０１】
定量的な結果は既知の濃度の検出される特定の分析物を用いて作成された検量線を介して生じ得る。未知の試料からの応答またはシグナルが検量線にプロットされ、およびその未知の試料中の標的に対応する量または値が明らかになる。
【０１０２】
多くの免疫アッセイの形式が設計されている。ＥＬＩＳＡまたはＥＩＡは分析物／バイオマーカーの検出について定量的であり得る。この方法は分析物か抗体のどちらかへの標識の結合によるものであり、その標識成分は直接的または間接的に酵素を含む。ＥＬＩＳＡ試験は分析物の直接検出、間接検出、競合検出またはサンドイッチ検出用に構成され得る。他の方法は、例えば、放射性同位体（Ｉ１２５）または蛍光などの標識によるものである。その他の技術には、例えば、凝集法、比ろう分析、比濁分析、ウエスタンブロット、免疫沈澱、免疫細胞化学、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ルミネックスアッセイ、およびその他が含まれる (ImmunoAssay: A Practical Guide, Brian Law編,published by Taylor & Francis, Ltd.社出版、2005年版を参照のこと) 。
【０１０３】
例となるアッセイ形式には酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイ、化学発光免疫アッセイ、および蛍光共鳴エネルギートランスファー（ＦＲＥＴ）または時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ‐ＦＲＥＴ）免疫アッセイが含まれる。バイオマーカーを検出するための方法の例には、バイオマーカーの免疫沈澱の後のゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、平面エレクトロクロマトグラフィーなどのようなサイズおよびペプチドレベルの識別を可能にする定量的方法が含まれる。
【０１０４】
検出可能な標識またはシグナル発生物質の検出および／または定量の方法はその標識の性質に左右される。適切な酵素（検出可能な標識が酵素である場合；上を参照のこと）によって触媒される反応の産物は、限定されないが、蛍光性、発酵性、もしくは放射性であり得、または、それらは可視光または紫外光を吸収し得る。そのような検出可能な標識の検出に適切な検出器の例にはＸ線フィルム、放射活性カウンター、シンチレーションカウンター、分光光度計、比色計、蛍光光度計、ルミノメーターおよび濃度計が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０５】
検出のための方法のいずれも、反応のあらゆる適切な調製、処理および分析を許容するあらゆる形式で行うことができる。これは、例えば、マルチウェルアッセイプレート（例えば、９６ウェルまたは３８４ウェル）での、または任意の適切なアレイもしくはマイクロアレイを用いる形式であり得る。様々な薬剤のストック溶液は手作業またはロボットにより作製することができ、そして、その後の全てのピペット作業、希釈、混合、分配、洗浄、保温、試料読み出し、データ収集および分析は、市販の分析ソフトウェア、ロボティクス、および検出可能な標識を検出することができる検出装置を用いてロボット制御により行うことができる。
【０１０６】
キット
本明細書に記載される方法を行うための試薬、道具および／または説明書がキットで提供され得る。例えば、キットは癌患者に適切な治療法を決定するための試薬、道具および説明書を含むことができる。そのようなキットは患者に由来する生検などによる組織試料を収集するための試薬、およびその組織の処理のための試薬を含むことができる。キットは遺伝子または遺伝子産物の発現分析を実行するための１つ以上の試薬、例えば、患者の試料中の遺伝子または遺伝子産物マーカーの発現レベルを決定するためのＲＴ‐ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ノーザンブロット、プロテオーム分析、または免疫組織化学を実行するための試薬を含むこともできる。例えば、ＲＴ‐ＰＣＲを実行するためのプライマー、ノーザンブロット分析を実行するためのプローブ、ならびに／またはウエスタンブロット分析、免疫組織化学分析およびＥＬＩＳＡ分析などのプロテオーム分析を実行するための抗体がそのようなキットに含まれ得る。アッセイに適切な緩衝液も含まれ得る。これらのアッセイのいずれかに必要な検出試薬も含まれ得る。適切な試薬および方法は以下でさらに詳細に説明されている。
【０１０７】
本明細書に取り上げられるキットは、遺伝子または遺伝子産物の発現を測定するためのアッセイを実行する方法を記載する指示シートを含むこともできる。指示シートは、基準群を決定する方法についての指示を含むこともでき、その基準群での遺伝子または遺伝子産物マーカーの発現レベルの決定方法、および発現データを収取して試験患者との比較のための基準を構築するための方法を含むこともできる。指示シートは、試験患者での遺伝子または遺伝子産物の発現を検定するための指示、および基準群での発現とその発現レベルを比較して、その後でその検査患者の適切な化学療法を決定するための指示を含むこともできる。適切な化学療法を決定するための方法は上で説明されており、指示シートに詳細に記載することができる。
【０１０８】
キットに含まれる資料は、本明細書に記載される方法および／または本明細書に記載される方法のための試薬の使用に関連する説明資料、教示資料、宣伝資料、または他の資料であり得る。例えば、キットの資料は、問い合わせ先、例えば、実際の住所、Ｅメールアドレス、ウェブサイト、または電話番号を含むことができ、その場合、そのキットの使用者は遺伝子発現分析の実行およびその結果、特に結果がヒトの特定の治療薬への陽性応答を有している可能性に合う場合のその結果の解釈についての実質がある情報を得ることができる。
【０１０９】
本明細書に取り上げられるキットは、遺伝子産物マーカーの発現から患者が特定の治療薬への陽性応答を有している可能性を推測するために必要なソフトウェアを含むこともできる。
【０１１０】
治療薬
上述したように、本明細書に記載される方法により、患者を、腫瘍内での血管形成プロセスおよびシグナル伝達を標的とする治療薬に対して応答性または非応答性であると分類することができる。癌を治療するために使用されるいくつかの現行のそのような治療薬には次の薬剤、すなわち、多重標的化経路阻害剤（ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦ／ＦＧＦ／ＥＧＦＴ／ＦＬＴ‐３／ｃ‐ＫＩＴ）を含むＶＥＧＦ経路標的化治療薬、アンジオポエチン‐ＴＩＥ２経路阻害剤、内在性血管形成阻害剤、免疫調節剤が含まれるが、これらに限定されない。ＶＥＧＦ特異的阻害剤にはベバシズマブ（アバスチン）、アフィバーセプト（Ａｆｉｂｅｒｃｅｐｔ）（ＶＥＧＦトラップ）、ＩＭＣ‐１１２１Ｂ（ラムシルマブ）が含まれるが、これらに限定されない。多重標的化経路阻害剤にはイマチニブ（グリベック）、ソラフェニブ（ネクサバール）、ゲフィチニブ（イレッサ）、スニチニブ（スーテント）、エルロチニブ、チボジニブ（Ｔｉｖｏｚｉｎｉｂ）、セディラニブ（レセンチン（Ｒｅｃｅｎｔｉｎ））、パゾパニブ（ヴォトリエント）、ＢＩＢＦ１１２０（バルガテフ（Ｖａｒｇａｔｅｆ））、ドビチニブ（Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ）、セマクサニブ（スーゲン（Ｓｕｇｅｎ））、アキシチニブ（ＡＧ０１３７３６）、バンデタニブ（ザクチマ（Ｚａｃｔｉｍａ））、ニロチニブ（タシグナ（Ｔａｓｉｇｎａ））、ダサチニブ（スプリセル）、バタラニブ、モテサニブ、ＡＢＴ‐８６９、ＴＫＩ‐２５８が含まれるが、これらに限定されない。アンジオポエチン‐ＴＩＥ２経路阻害剤にはＡＭＧ‐３８６、ＰＦ‐４８５６８８４ＣＶＸ‐０６０、ＣＥＰ‐１１９８１、ＣＥ‐２４５６７７、ＭＥＤＩ‐３６１７、ＣＶＸ‐２４１、トラスツズマブ（ハーセプチン）が含まれるが、これらに限定されない。内在性血管形成阻害剤にはトンボスポンジン（Ｔｈｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）、エンドスタチン、タムスタチン、カンスタチン（Ｃａｎｓｔａｔｉｎ）、アレスチン、アンギオスタチン、バソスタチン、インターフェロンαが含まれるが、これらに限定されない。免疫調節剤にはサリドマイドおよびレナリドマイドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
本発明は次の実施例によってさらに例示されるが、それらの実施例は本発明の範囲を限定するものと多少なりとも解釈されてはならない。反対に、本明細書における説明を読んだ後では、本発明の精神および／または添付の特許請求の範囲の範囲から逸脱することなく当業者の念頭に浮かぶ本発明の様々な他の実施形態、変更および均等物に頼ることもできることが明確に理解されるものとする。
【実施例】
【０１１２】
実施例１：組織の処理、階層的クラスタリング、サブタイプの特定および分類器の開発
腫瘍材料
例となる発現シグネチャは、ＮＨＳロジアン（Ｌｏｔｈｉａｎ）およびエジンバラ大学から供給された、マクロダイセクトした上皮性漿液性卵巣腫瘍のＦＦＰＥ組織試料の群の遺伝子発現分析から特定された。
【０１１３】
漿液性組織像、類内膜性組織像、明細胞性組織像および粘液性組織像を定義する上皮性卵巣癌の組織学的な分類のためのプロトコルが近年更新された。このことの結果の１つは、以前であれば類内膜性と分類されているだろう多くの腫瘍が現在では漿液性と分類されていることである(McCluggage, W.G. “Morphological subtypes of ovarian carcinoma: a review with emphasis on new developments and pathogenesis,” PATHOLOGY 2011 Aug;43(5):420-32) 。本研究において使用された漿液性試料は、１９８４年と２００６年の間に採取された全ての組織像の上皮性卵巣癌試料の大規模な集合からのものであった。組織像の状況を指定するための病理検査は試料採取時にそれぞれのセンターで病理医によって行われた。２０１２年の３月と４月の間にこれらの上皮性卵巣試料のうちの３５７試料が、改訂されたプロトコルに従って２人の卵巣がんの顧問病理医によって組織分類のために再調査された。これにより、表３に示されるように、これらの試料のいくつかを再分類することになった。
【表３】
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以下で特定される元の３種の漿液性サブタイプと以下の実施例に記載される、その結果としての２５遺伝子シグネチャ（図１）が、病理医による元の報告に従って漿液性と分類された１９９試料から特定された。バイオインフォマティクス分析が、更新された病理分類方法を用いてステージＩＩＩおよびステージＩＶ高悪性度漿液性卵巣癌と分類された２７７試料に対して行われた。この分析により、図２に詳述され、結果として４５遺伝子シグネチャを定めるために使用される更新された漿液性サブグループが特定された。
【０１１４】
ＦＦＰＥからの遺伝子発現プロファイリング
マクロダイセクトしたＦＦＰＥ組織からハイ・ピュアＲＮＡパラフィン・キット（ロッシュ・ダイアグノスティクスＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）を使用して全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを相補性デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）に変換し、その後、それを増幅し、ＷＴ‐Ｏｖａｔｉｏｎ（商標）ＦＦＰＥ  ＲＮＡ増幅システムＶ２（ＮｕＧＥＮテクノロジー社、サンカルロス、カリフォルニア州、米国）のＳＰＩＡ（登録商標）テクノロジーを使用して一本鎖形態に変換した。次に、その増幅された一本鎖ｃＤＮＡを断片化し、ＦＬ‐Ｏｖａｔｉｏｎ（商標）ｃＤＮＡビオチンモジュールＶ２（ＮｕＧＥＮテクノロジー社）を使用してビオチン標識した。その断片化され、標識化されたｃＤＮＡを次にアルマック（Ａｌｍａｃ）卵巣癌ＤＳＡ（商標）にハイブリダイズした。アルマックの卵巣癌ＤＳＡ（商標）研究ツールはＦＦＰＥ組織試料の分析に最適化されており、貴重な保管組織バンクの使用を可能とする。アルマック卵巣癌ＤＳＡ（商標）研究ツールは、正常な卵巣組織および癌性卵巣組織の両方におけるトランスクリプトームを提示する革新的なマイクロアレイプラットフォームである。結果として、卵巣癌ＤＳＡ（商標）は、汎用マイクロアレイプラットフォームを使用した場合には利用可能でない卵巣疾患および組織環境内でのトランスクリプトームの包括的提示を提供する。アレイは、アフィメトリクス・ジーンチップ（登録商標）スキャナー７Ｇ（アフィメトリクス社、サンタクララ、カリフォルニア州）を使用してスキャンした。
【０１１５】
データの調製
プロファイルした試料の品質管理（ＱＣ）はＭＡＳ５プリプロセッシングアルゴリズムを使用して行った。平均ノイズおよびバックグラウンド均一性、プレゼント・コールのパーセンテージ（アレイ品質）、シグナル品質、ＲＮＡ品質およびハイブリダイゼーション品質など様々な技術的態様が処理された。対応するパラメータの分布と中央絶対偏差が分析され、異常値の可能性があるものを特定するために用いられた。
【０１１６】
アルマックの卵巣癌ＤＳＡ（商標）は、３’末端から３００ヌクレオチド以内の領域を主に標的とするプローブを含む。それ故、標準的なアフィメトリクスのＲＮＡ品質指標が適応された。すなわち、ハウスキーピング遺伝子については、通常の３’／５’比率に加えて、３’末端プローブセット強度の平均バックグラウンド強度に対する比率を伴った３’末端プローブセットが使用された。ハイブリダイゼーション対照は、それらの強度とプレゼント・コールがアフィメトリクス社によって規定されている要求事項に適合していることを確認するためにチェックされた。
【０１１７】
上皮性漿液性卵巣癌トレーニングセットの発現プロファイリングから作製された生データのプリプロセッシングはロバスト・マルチアレイ・アナライシス（ＲＭＡ）付きエクスプレッション・コンソールｖ１．１で実行された。
【０１１８】
階層的クラスタリングおよび機能分析
ａ．階層的クラスター分析
階層的クラスタリングテクニックが、卵巣癌ＤＳＡ（商標）（疾患特異的アレイ）プラットフォームを使用して分析された上皮性漿液性卵巣腫瘍に由来するマイクロアレイデータに適用された。生発現データを、標準的なロバスト・マルチチップ・アルゴリズム（ＲＭＡ）法を用いてプリプロセスした。そのデータセット中の非生物学的な系統的相違が特定され、除去された。発現レベルが腫瘍ごとに著しく変化するプローブセットが特定された。これらのプローブセットが固有のリストを形成した。
【０１１９】
二次元クラスター分析（腫瘍、プローブセット）が実行されて、固有のリストに基づく腫瘍との関係を構築した。階層的凝集型クラスタリングが適用された（元の分析としてピアソン相関分析、更新された分析としてユークリッド距離分析およびウォード連結分析）。最適なパーティション数がＧＡＰインデックスを用いて選択された (Tibshirani et al., 2002, J. R. Stat. Soc., 63:411-423) 。クラスターサブグループにおいて利用可能な全てのプローブセットが遺伝子名に対してマップされた。
【０１２０】
ｂ．遺伝子クラスターの機能分析
プローブセットクラスターの機能的有意度を確立するために、プローブセットを遺伝子（Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子ＩＤ）にマップし、そして、濃縮解析を行った。濃縮有意度は超幾何関数（偽陽性率が適用された(Benjamini and Hochberg, 1995, J. R. Stat. Soc. 57:289:300)) に基づいて算出された。生物学的プロセスと経路の過剰提示が、上皮性漿液性卵巣癌試料の階層的クラスタリングにより作製された各遺伝子群についてアルマック・ダイアグノスティクス社所有の機能性濃縮ツール（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ：ＦＥＴ）を使用して分析された。アンチセンスプローブセットは分析から排除された。超幾何的ｐ値がそれぞれの濃縮化機能性実体クラスについて評価された。最も高いｐ値を有する機能性実体クラスがその群の代表として選択され、これらの機能性実体を表す一般機能性分類が代表の有意度（すなわち、ｐ値）に基づいて遺伝子クラスターに割り当てられた。
【０１２１】
元の１９９種の上皮性漿液性卵巣腫瘍を使用して血管形成分類器を作成するために、血管形成、脈管構造の発生および免疫応答という一般的機能項について濃縮されたクラスター内の遺伝子が推定上の血管形成遺伝子群にグループ化され、シグネチャ作成のために使用された。血管形成、脈管構造の発生および免疫応答という一般的機能項に関与する遺伝子について高発現を示す試料クラスターが分類のために選択され、「血管形成」とラベルを付けられた。これらの項に関与する遺伝子について高発現を示さない試料クラスターは「非血管形成」とラベルを付けられた。
【０１２２】
再分類された２６５種の上皮性漿液性卵巣腫瘍を使用して血管形成分類器を作成するために、血管形成および脈管構造の発生という一般的機能項について濃縮されたクラスター内の遺伝子が推定上の血管形成遺伝子群にグループ化され、シグネチャ作成のために使用された。血管形成および脈管構造の発生という一般的機能項に関与する遺伝子について高発現を示す試料クラスターが分類のために選択され、「血管形成」とラベルを付けられた。これらの項に関与する遺伝子について高発現を示さない試料クラスターは「非血管形成」とラベルを付けられた。
【０１２３】
遺伝子レベルでの分類器の開発
複数のアレイプラットフォームにわたる分類器の検証を促進するために、遺伝子レベルで血管形成分類器が作成された。次のステップで遺伝子レベルシグネチャの開発のためにとられた方法の要点を説明する（各ステップは、５分割交差検証を１０回反復して内部交差検証に対して実行された）：
遺伝子レベルシグネチャの開発
プリプロセッシング：
ＲＭＡバックグラウンド補正
遺伝子の基準セットは卵巣ＤＳＡプラットフォームに固有な遺伝子（センスプローブセットのみ）である。
遺伝子レベルの要約が２段階で行われた。まず、プローブ対プローブセットの要約がプローブセットにおけるプローブの発現の中央値を算出することにより行われた。次に、基準分布における各遺伝子に位置する（センスのみ）プローブセットの発現の中央値が算出され、「遺伝子レベル」発現マトリックスを生じる。
分位値補正が全遺伝子発現データマトリックスに対して行われ、トレーニングデータから得られる基準分位値が各回の交差検証でその検査試料を補正するために使用された。
特徴選択：分散、強度およびｃＤＮＡ濃度に対する相関により遺伝子の７５％をフィルタリングにより取り除き、ＣＡＴスコアに基づく帰納的特徴消去法（ＲＦＥ）またはフィルタ特徴選択法（ＦＦＳ）のどちらかを行った。
分類アルゴリズム：部分最小二乗法（ＰＬＳ）、ＳＤＡ（収縮判別分析）法およびＤＳＤＡ（対角ＳＤＡ）
【０１２４】
モデル選択
モデル選択に用いられた基準は内部交差検証と特徴消去に対するＡＵＣであった。ＦＥＴを用いる交差検証に対するシグネチャの機能性濃縮は、遺伝子オントロジー、反復試料についてのシグネチャスコアの標準偏差を交差検証と特徴消去について評価するための２セットの技術的複製を含む暫定的検証セット、および交差検証に対する臨床的因子および技術因子（表４に記載される因子）に対する独立性の評価に基づく。
【０１２５】
サブグループ（すなわち、クラスラベル）の導出が、シグネチャ開発のために使用された同じ試料群に由来するマイクロアレイ発現を使用して行われたので、ＡＵＣに基づくあらゆる性能評価に正のバイアスが予測されたことに留意すべきである。このことは、機能性濃縮などのその他の評価指数を含むこと、ならびに臨床的因子および技術因子に対する独立性を評価することによりモデル選択のために使用される基準を拡大することの重要性を強調する。
【表４】
2014516552.tif 000036
【０１２６】
検証データセットのための分類器スコアの算出
全てのデータセットがＲＭＡを用いてプリプロセッシングを受けた。各検証セットについて、分類器遺伝子に位置するプローブセットが決定され、（もし該当するならば）アンチセンスプローブセットを排除した。アフィメトリクスＰｌｕｓ２．０アレイおよびＵ１３３Ａアレイに対するアノテーションはアフィメトリクス社のウェブサイトから入手可能である。分類器内の各遺伝子に位置する全てのプローブセットについての中央値強度が算出され、遺伝子強度マトリックスが生じた。次に、分類器がこのデータマトリックスに適用されて、各試料についての分類器スコア／予測が作成された。
【０１２７】
一変量解析および多変量解析
一変量解析と多変量解析を神経膠芽腫データセットに関して行い、血管形成サブタイプ分類器と生存率の間の関連を評価し、もしあれば、その関連が既知の臨床的予測因子に独立であったかどうか決定することができる。一変量解析のｐ値がＭＡＴＬＡＢのロジスティック回帰を用いて算出された。我々が使用した多変量解析について、ロジスティック回帰による尤度比検定が使用された。その場合、ｐ値は、そのモデルを臨床的共変数と比較したときの対数尤度の減少と臨床的共変数のみを有する減少モデルに対する予測を表す。尤度比検定は生存率のモデル化における遺伝子予測因子の重要度を測定し、臨床的予測因子に対して予測因子としての独立性を強調する。一変量解析と多変量解析の両方において、０．０５未満のｐ値が有意度の基準として用いられた。さらに、未知の臨床的因子を有する試料はこの評価から排除された。
【０１２８】
結果
元の組織学的分類と更新された組織学的分類に基づくサブグループの特定とシグネチャの作成
階層的クラスター分析
特徴選択により、元の上皮性漿液性卵巣癌データセット（１９９試料）から１２００プローブセットが、および、再分類された上皮性漿液性卵巣癌データセット（２６５試料）から１４００ＰＳ（プローブセット）が選択された。ＧＡＰ分析により、両方のサンプルセット内で３つの試料クラスターと３つのプローブセットクラスター群が明らかになった（図１、図６）。
【０１２９】
腫瘍の「血管形成」試料群または「非血管形成」試料群への分類
試料の「血管形成」または「非血管形成」との分類は上皮性漿液性卵巣癌データセットの機能分析の結果に基づいた（図１、図６）。この研究の目的は、病原性細胞の抗血管形成剤に対する応答性または抵抗性を決定することができ、抗血管形成治療法から利益を得ることができるだろう患者を特定する可能性があるだろう遺伝子のセットをトランスクリプトームレベルで特性解析することであった。このことを考慮して、この生物学を最もよく表す上皮性漿液性卵巣癌データセット内の試料が選択され、分類器作成のために残りの試料と比較されるものとした（次の節を参照のこと）。元の上皮性漿液性卵巣癌サンプルセット（１９９試料）内の試料血管形成クラスターに由来する試料は機能分析によって明らかにされる血管形成および免疫応答のプロセスおよび経路に関与する遺伝子（図２Ａおよび２Ｂ）の発現上昇を示したので、これらの試料はこの選択に最も適切な試料であると決定した。再分類された上皮性漿液性卵巣癌サンプルセット（２６５試料）内の試料クラスター３に由来する試料は機能分析によって明らかにされる血管形成および免疫応答のプロセスおよび経路に関与する遺伝子（図２Ａおよび２Ｂ）の発現上昇を示したので、これらの試料はこの選択に最も適切な試料であると決定した。
【０１３０】
同一の階層的クラスタリングアプローチが１０５種の乳癌試料に適応された。乳癌において優勢な生物学はＥＲの状態であり、したがって、試料における生物学の構造を特定するために、クラスター分析のためにこの群を２集団に分割した。我々は、血管形成および脈管構造の発生のサブタイプを特定し（図１２Ａおよび１２Ｂ）、乳癌試料に由来する血管形成サブタイプの説明を示した。
【０１３１】
血管形成サブタイプ分類器モデルの開発と検証
参照しやすいように、表１Ａまたは表１Ｂから得られる発現シグネチャに関して次のステップを詳述する。しかしながら、同様の方法を、配列番号６３２〜８０１および配列番号８０２〜９７４）に開示されるものなどの、血管形成サブタイプ関連バイオマーカーからなる他の推定上のクラスターに適用することができる。推定上の「血管形成」サブグループを形成する、腫瘍のクラスの特定に続いて、機能性「血管形成」（血管形成、脈管構造の発生、免疫応答）遺伝子リスト（表１Ａまたは表１Ｂ）に関する、腫瘍群におけるこれらの腫瘍と他の全ての腫瘍の間のコンピュータ分類を行って、「血管形成」サブタイプを分類する改良遺伝子分類モデルを特定した。
【０１３２】
分類パイプラインを使用して、上皮性漿液性卵巣癌試料からなるセットを使用するモデルを得た。分類パイプラインは、一般的に受け入れられている実施基準 (MAQC Consortium, Nat Biotechnol 2010) に従って開発されている。そのプロセスは、並行的に、交差検証しながら、１）経験的なデータから遺伝子分類モデルを導出し、そして、２）そのモデルの分類性能を評価するものである。分類器作成の実施とその成功は、多数の変化し得るパラメータ、例えば、分類方法またはプローブセットフィルタリングの選択に左右される。このことを考慮して、２つの特徴セットである（ｉ）７５％分散／強度フィルタリングを有する全特徴リスト（血管形成遺伝子リスト、表１Ａの強制算入を含む）および（ｉｉ）血管形成遺伝子リストのみを評価し、３つの分類アルゴリズム、すなわちＰＬＳ、ＳＤＡおよびＤＳＤＡを評価した。各繰返しで最低ランクの部分を除去し、最小の数の特徴が残るまで停止しない反復法であるＲＦＥをモデル開発の間に使用した。ＡＵＣが、この測定法はデータ中の群と有病率の間のカットオフに独立しているので、使用されて分類性能を評価した。それは、分類性能のために選択される、認識されている測定方法のうちの１つでもある。したがって、各モデルに最適な数の特徴は交差検証されている平均ＡＵＣに基づいて選択された。
【０１３３】
上述の分析から、ＰＬＳ  ＦＦＳモデルは最も適切な分類器モデルであると見なされた。ＰＬＳ回帰を用いて、各遺伝子についてウェイトを計算し、異なるアレイプラットフォームに由来する外部データセットの検証に使用することができる最終的な遺伝子分類器モデル（元のアプローチについて２５遺伝子分類器モデル、および、標準的な組織学プロトコルに対する最近の変化を反映する、再分類された試料について４５遺伝子分類器）が生じた。遺伝子シグネチャ開発プロセスを血管形成に適切なオントロジー的なプロセスと経路の特定に対して集中させて、開発された任意のシグネチャの生物学的関連性を確保した。したがって、機能分析を両方のシグネチャに対して実行し、血管形成と関連のプロセスへのそれらの関連性を適格とした。図３および図８における有意性プロセスは血管形成および脈管構造の発生に関連する。
【０１３４】
実施例２：血管形成サブタイプおよび血管形成分類器モデルのインシリコ検証
２５遺伝子（元のアプローチ）血管形成分類器モデルと４５遺伝子（再分類アプローチ）血管形成分類器モデルの両方の性能が元のＡｌｍａｃ上皮性漿液性卵巣癌データセットおよび２つの独立データセット内でＲＯＣ（受信者操作特性）曲線下面積（ＡＵＣ）により検証された。ＡＵＣは観察された疾患スケールに基づく統計値であり、分類器モデルを用いる表現型の予測の効力についての測定値である (Wray et. al., PLoS Genetics Vol 6, 1-9) 。０．５のＡＵＣはランダム分類器に典型的であり、１．０のＡＵＣなら分類の完全な分離を表すだろう。それ故、その血管形成サブタイプ分類器モデルが、標準治療法に関して単一の薬剤または組合せのどちらかとしての抗血管形成性卵巣がん治療薬のクラスに対する応答を予測することができ、その治療薬クラスに適した患者を選択することができるか判定するために、これらのデータセット内での適用後のＡＵＣは０．５より上であり、最小信頼区間も０．５より上であることが仮説である。
【０１３５】
独立マイクロアレイ臨床的データセットへの分類器モデルの適用
２５遺伝子分類器モデルおよび４５遺伝子分類器モデルの予後診断力を評価するため、先行治療を受けていない患者（２１歳より高齢）から初めての外科的切除の時に採取された７７種の神経膠芽腫試料からなるデータセットにそれらを適用した (Phillips et. al., 2006) 。
この分析により、２５遺伝子分類器モデルは神経膠芽腫における予後と独立的に関連があることが明らかになった。重要なことに、多変量Ｃｏｘ分析において、血管形成シグネチャは生存率について予後予測的であり、国際保健機構（ＷＨＯ）腫瘍グレードおよび／または壊死の存在から独立していることが分かった（ｐ＝０．３７）。これらの臨床的要因の両方が神経膠芽腫における生存率と相関している。高血管形成群は低血管形成群と比較して有意に低い生存率と関連した（ハザード比＝１．７８１４、ｐ＝０．０２６９）。このことは、２５遺伝子分類器は神経膠芽腫における生存率についての独立した予後診断バイオマーカーであることを示している。
【０１３６】
分類器モデルの独立前立腺癌細胞株データセットへの適用
２５遺伝子分類器モデルおよび４５遺伝子分類器モデルの予測力を評価するため、ダサタニブ（Ｄａｓａｔａｎｉｂ）による治療後の１６前立腺細胞株からなるデータセットにそれらを適用した。その細胞株は細胞増殖アッセイに基づいて「応答物」または「非応答物」のどちらかであると明らかにされた。この分析により、２５遺伝子分類器モデルは０．８３６４のＡＵＣ（ＣＩ＝０．５２５５〜１．００００）でダサタニブに対する応答と関連することが明らかになった。このことは、２５遺伝子分類器はダサタニブに対する応答を予測することを示している。分析により、４５遺伝子分類器モデルは０．９４５５のＡＵＣ（ＣＩ＝０．７９４９〜１．００００）で同化合物に対する応答と関連することが明らかになった。このことは、４５遺伝子分類器もダサタニブに対する応答を予測することを示している。
【０１３７】
実施例４：卵巣癌の抗血管形成治療薬「非応答性」サブグループの特定とインシリコ検証
プローブセットクラスター２内の血管形成遺伝子の発現は漿液性と新しく分類された２６５試料の階層的クラスタリングのクラスター２内の全ての試料で発現低下している（図６および図１０）。試料クラスター２内のこれらの試料は、図１１に示されるように、クラスター１と３を一緒にまとめたものに由来する試料中の残りの漿液性試料よりも良好な予後を有する。このことにより、この群は表２Ｂにおいて特定されている血管形成遺伝子の発現の下方制御によって規定されることが示された。血管形成に関与する遺伝子の発現低下を有する患者、およびしたがってこのサブグループは「非応答性」群と称される。この表現型も、図１２Ａの中央の試料群および図１２Ｂの２番目の試料群で見ることができるように、ＥＲ＋乳癌およびＥＲ−乳癌においても特定されている。
【０１３８】
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【図１】
2014516552.tif 000037
【図２Ａ】
2014516552.tif 000038
【図２Ｂ】
2014516552.tif 000039
【図３】
2014516552.tif 000040
【図４】
2014516552.tif 000041
【図５】
2014516552.tif 000042
【図６】
2014516552.tif 000043
【図７Ａ】
2014516552.tif 000044
【図７Ｂ】
2014516552.tif 000045
【図８】
2014516552.tif 000046
【図９】
2014516552.tif 000047
【図１０】
2014516552.tif 000048
【図１１】
2014516552.tif 000049
【図１２Ａ】
2014516552.tif 000050
【図１２Ｂ】
2014516552.tif 000051
【配列表】
2014516552000001.app
【国際調査報告】
2014516552.tif 000052
2014516552.tif 000053